(57)【要約】本発明は、培地にレクチンを添加し、ひとたび発酵が開始した時点でｐＨ制御を実施することによって、Ｂｌａｋｅｓｌｅａ， Ｃｈｏａｎｅｐｈｏｒａ又はＰｈｙｃｏｍｙｃｅｓといったようなムコール真菌の液内培養からβ−カロテンを産生するための新規方法に関する。該方法には、プロセスを単純化し、収量を最適化し、産物の精製を増大させることを可能にするβ−カロテン回収段階が関与している。【特許請求の範囲】
【請求項１】
カロテノイドの製造方法において、
（１）液内培養においてムコラーレス（Ｍｕｃｏｒａｌｅｓ）を主成分としてバイオマスを発酵させる段階と、
（２）前記バイオマスを分離する段階と、
（３）前記バイオマスを乾燥しこれを粉状化する段階と、
（４）有機溶剤を使って前記バイオマスに含まれるカロチノイドを固体／液体抽出する段階と、
（５）カロチノイド豊富な抽出物を濃縮する段階と、
（６）アルコールを添加することによりカロチノイドを沈降−結晶化する段階と、
（７）ろ過し、最終乾燥する段階と、
を含み、
前記段階（１）において培地にレシチンを添加し、前記カロチノイド生成バイオマスを精製してこれから親油性物質を取り除き、前記抽出段階（４）においてＩＣＨの第ＩＩＩ 種に含まれる低毒性溶剤を利用することを特徴とする方法。
【請求項２】
前記液内培養が、好気性条件下で実施され、前記ムコラーレスがブラケスラ（Ｂｌａｋｅｓｌｅａ）属特にブラケスラ・トリスポラ（Ｂ．ｔｒｉｓｐｏｒａ）に属し、得られるカロテノイドがβ−カロテンであることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
大豆レシチンが０．１−１０％、望ましくは０．５−５％、より望ましくは０．５−１．５％の割合で添加されることを特徴とする、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
β−カロチン超生成の遺伝素（＋）及び（または）（−）またはブラケスラ・トリスポラ（Ｂ． ｔｒｉｓｐｏｒａ）から選択される突然変異株が培養されることを特徴とする、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
発酵中の温度が２０−３２℃の間である、請求項１から４までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
親油性物質を取り除くための前記バイオマス精製工程が、カロテノイド溶解度の低いアルコール中にバイオマスを懸濁することから成ることを特徴とする、請求項１から５までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記バイオマス精製が前記培地自体の中で実施されるか、あるいは前記培地から分離した後実施されることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
添加されるアルコールの量が１ｍｌ／ｇから１０ｍｌ／ｇまでの範囲にあり、懸濁中の温度が周囲温度と添加されるアルコールの沸点の間であり、接触時間が５時間から２４時間までであることを特徴とする、請求項１、６及び７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記バイオマス精製が培養基に対して直接行なわれる場合培養基：アルコール比率が１：０．５〜１：５の間にあることを特徴する、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記バイオマス乾燥−粉状化段階（３）が、酸素なしで、周囲温度及び１５０℃の間の温度で１時間から７２時間までの時間、バッチでまたは連続して実施することができることを特徴とする、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記バイオマス粉状化が、３ｍｍ未満の粒度に達するまで従来の手段によってもたらされることを特徴とする、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記バイオマス精製に使用される前記アルコールが、メタノール、エタノール、プロパノールまたはイソプロパノールまたはこれらの混合物の中から選択されることを特徴とする、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記抽出段階（４）が、１回から３回までの間で反復され、周囲温度と溶剤の沸点の間に含まれる温度で１秒から１時間までの間の時間、５ｍｌ／ｇから２０ｍｌ／ｇまでの間の量で、低毒性の有機溶剤を使って乾燥され粉状化されたバイオマスを洗浄することから成り、カロテノイド含有量が８５％を超え、望ましくは９０％を超え、より望ましくは９５％を超えるカロテノイド豊富な抽出物が得られることを特徴とする、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記抽出段階（４）において使用される前記溶剤が、アシルエステル、望ましくは酢酸エチル、プロピル、イソプロピル、ブチルまたはイソブチルまたはその混合物から成ることを特徴とする、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記カロテノイド豊富な抽出物が、１０〜４０ｇ／ｌ程度のカロテノイド濃度に達するまで８０℃未満の温度で１時間未満の時間、従来の手段による濃縮段階（５）に付されることを特徴とする、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
前記カロテノイド豊富な抽出物が、２５℃未満の結晶化温度で、１５分から２４時間の間での結晶化時間の間、前記抽出段階（４）において使用される前記溶剤の体積に対して１／１から１／６の比率でアルコールを添加することにより沈降−結晶化段階（６）に付されることを特徴とする、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
ひとたび発酵が開始されたら発酵がｐＨ調整の下で継続されることを特徴とする、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
前記ｐＨ調整が、発酵開始後１２時間から５０時間までの間実施されることを特徴とする、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
ｐＨが発酵開始後２４時間から３６時間までの間調整され、６．７−６．９の範囲に固定されることを特徴とする、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記培地へのレシチンの添加の効果が４０％を超えるγ−カロテンの生成の減少であり、発酵が開始された後さらにｐＨ調整が実施される場合この減少が６０％より大きく増大することを特徴とする、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
請求項１〜１９のいずれか１項に記載の方法に従って得られるβ−カロテンであり、他のカロテノイド含有量が４％未満、望ましくは２％未満で、９０％を超える純度、望ましくは９５％を超える純度、より望ましくは９８％を超える純度の結晶生成物であることを特徴とする、β−カロテン。
【請求項２２】
特に食品産業における、着色料として１〜８５％の間を変動する比率での請求項２０のβ−カロテンの使用。
【請求項２３】
該使用において、β−カロチンが、賦形剤及び（または）特に様々なタイプのスターチ、大豆油、コーン油またはオリーブ油など化合物と混合され、アスコルビン酸パルミテート及び（または）トコフェロール・タイプの酸化防止剤を添付される、請求項２１に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明は、ブラケスラ（Ｂｌａｋｅｓｌｅａ）属のムコラーレス（Ｍｕｃｏｒａｌｅｓ）目の菌の液内培養から、カロテノイド特にβ−カロテンを製造するための新しいプロセスに関する。培地内への大豆レシチンの取込みならびに発酵中の明確なｐＨ制御戦略に基づいて、達成すべきβ−カロテンの製造及びその他のカロテノイドとの関係におけるその相対的濃度の増大を可能にする発酵方法が開示されている。
同様にして、本発明は、精製プロセスの単純化及び、「天然」とみなされている溶剤及び／又はＩＣＨ（国際調和会議）のクラスＩＩＩに内含される溶剤を使用した回収収量の増大を用いて、先に得られた発酵ブロスから高純度の結晶質β−カロテンを精製し単離するための最適化されたプロセスを開示している。
【０００２】
技術の現状
カロテノイドは、それらを提供する主たる供給源である野菜の中に豊富な化合物である。これらは、酸化防止剤として及びビタミンＡ前駆物質としてのその特性に起因して、数多くの研究の対象となってきた。これらは、天然に存在する最も広範な天然色素である。これらは、マーガリン、オイル、ソース、スープなどの中で補助食品及び着色料として工業的に使用されている（Ｎｉｎｅｔ Ｌ． 及びＲｅｎａｕｔ Ｊ．， １９７９． Ｐｅｐｐｌｅｒ Ｈ．Ｊ．， Ｐｅｒｌｍａｎ Ｄ．（編）．微生物技術、第２版、第１巻、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ． ＮＹ， ｐ５２９〜５４４）。
【０００３】
カロテノイドは、２つのゲラニルゲラニル前駆物質の縮合に由来する共役２重結合の特徴的ポリエン鎖を含有するイソプレノイドである（Ｐｆａｎｄｅｒ（１９９２）． Ｍｅｔｈ． Ｅｎｚｉｍｏｌ．） 。２つのグループの色素つまりカロテン及びその含酸素誘導体、キサントフィルが存在する。
β−カロテンの経験的分子構造式はＣ４０Ｈ５６であり、分子量は５３６．８５であり、展開構造式は以下の通りである：
【０００４】
【化１】
2004504853.tif 000002
【０００５】
トランスベータカロテン
高純度の化合物としてのβ−カロテンの産生は、さほど強烈でない溶剤及び反応条件を用いた抽出方法と合わせた天然産物の発酵による天然供給源から出発した代替的経路がより有利であるとみなされていることから今日論議の的となっている方法において、古典的化学合成反応に結びつけられてきた。
【０００６】
カロテノイド及びその他のテルペン誘導体成分全般そして特にβ−カロテンは、非常にわずかな百分率しか存在しないトマト及びニンジンといったような植物産物であれ、これらの成分の割合が増大しうる選択された藻類、真菌などの培養から出発するものであれ、天然の供給源から得ることが可能である。
カロテノイドを及びβ−カロテンを富有するオレオレジンを野菜、オイル又は藻類から得るための方法は、さまざまな特許の中で記述されている。
【０００７】
大部分のケースにおいて、記述された抽出物プロセスは、溶剤の抽出を容易にしβ−カロテンを富有する細胞内含有物を放出するために果物をすりつぶし押出す段階を必要とする。
これらの成分のための抽出工程は、比較的濃度が低いこと及び細胞内団粒内へそれらが特に集合することに対処するものである。その結果、β−カロテンの抽出には、細胞壁貫入を通してか又は細胞壁を予め破壊して細胞内含有物を放出することによって、生成物を可溶化できるようにする適切な方法が必要である。
【０００８】
ＵＳ３２６８６０６号、ＵＳ２９５９５２２号に記述されている方法は、固有の毒性という問題を有し、このことはすなわち薬品又は食品の利用分野において使用されている残留溶剤についての指針のＩ群及びＩＩ群の中に内含されるということを意味する（この指針によると、ＩＶ群に属するものを使用することが推奨されている）、ジクロロメタン、ジクロロホルムなど又は芳香族炭化水素つまりベンゼン、トルエンなどといったハロゲン化溶剤を使用している。
【０００９】
藻類からのβ−カロテンの抽出のための方法の大部分は、油を使用している。これらの方法は、β−カロテンを結晶の形で得るには適していないが、むしろ、β−カロテンが可溶化されその状態で商品化されている米国特許第４６８０３１４号、ＵＳ４７１３３９８号、ＵＳ５０１９６６８号、ＵＳ５３７８３６９号の中で記述されているもののようなオレイン酸抽出物を獲得するために適している。
超臨界ＣＯ２の使用は、β−カロテンの可溶性が低いことによって制限されている。超臨界条件で加圧下の又は液化ガスとしてのその他の溶剤の使用が考慮されてきた。例としては、可溶性がより大きいものであるプロパン又はエチレンが含まれる。それでも、これらの炭化水素溶剤の使用は、食品業界におけるβ−カロテンの使用をより困難にすることになる。
【００１０】
あるいは、β−カロテンは、フィコミセス（Ｐｈｙｃｏｍｙｃｅｓ）， ブラケスラ（Ｂｌａｋｅｓｌｅａ）などといったような或る種のムコラーレス（Ｍｕｃｏｒａｌｅｓ）目の菌の発酵ブロスから得ることができ、これは、上述の天然供給源に比べた場合、乾燥バイオマスの量との関係においてこの化合物の濃度が高いこと； ならびに、複合原料、或る種の産生誘発物質又はその産生を回避するその他の構造的に関連するカロテノイドの産生の阻害物質を用いた発酵プロセスの最適化を利用してか又は従来の突然変異誘発技術又は分子生物学によって得られる超産生菌株を用いて、産生を増大させることが可能であることといった利点を提供する。
【００１１】
真菌ブラケスラ・トリスポラ（Ｂ．ｔｒｉｓｐｏｒａ）でのβ−カロテンの産生方法のいずれにおいても、単一の培養が利用される場合に比べ、菌株（＋）及び（−）のものよりはるかに高いβ−カロテン収量が得られるという理由で、混合培養が使用される（Ｃｉｅｇｌｅｒ， Ａ， １９６５）。Ａｄｖａｎ． Ａｐｐｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ７：１９）及びＵＳ５４２２２４７。
生合成経路の化学的刺激物質であるβ−イオノンに対する代用品として、β−カロテンの発酵培地には、クエン酸粉末が添加された〔Ｃｉｅｇｌｅｒ， Ａ．１９６５。Ａｄｖ． Ａｐｐｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ７． １−３４〕。予めアルカリで処理されたクエン酸誘導体の添加により、β−カロテンの含有量を１ｌあたり１．７ｇまで増大させることができた［Ｕｐｊｏｈｎ Ｃｏ．， １９６５。オランダ特許６５／００， ７８８］ 。
【００１２】
クエン酸粉末内に含まれたβ−カロテンの産生１又は複数の刺激因子を同定することをねらいとした分析研究により、クエン酸が、少量のリンゴ酸ならびにグルコン酸又は２−ケトグルコン酸に似たＲｆをもつ第３の未同定酸に加えた主要成分であることが判明した。この研究は、産生増加におけるクエン酸の機能が特異的でなく、生合成経路において早期代謝産物の前駆物質として作用しうるという結論を下した。さらに４２％の炭水化物が発見され、そのうち５０％がスクロースであり、残りは還元糖（グリコース及びフルクトース）であった［Ｐａｚｏｌａ Ｚ．， Ｃｉｅｇｌｅｒ Ａ．， Ｈａｌｌ Ｈ．Ｈ． １９９６。Ｎａｔｕｒｅ ５０４３；１３６７−１３６８］。
【００１３】
レシチンは、グリセロフォスファチジルコリン構造を伴う化合物であり、全ての生体（植物及び動物）の体内に存在し、神経及び脳組織の有意な成分である。これらは、無色で触れると油っぽい物質であり、６０℃前後で融解し、１００℃を超えた後短時間加熱した時点で分解する。レシチン分子は、リン酸コリンエステルに結合したステアリン酸ジグリセリド、パルミチン酸、及びオレイン酸の混合物から成る。分子は、双極性をもつことから、それは、天然由来の表面活性剤及び食用乳化剤として広く使用され、一般的食品業界（チョコレート、マーガリンなど）、食事療法、薬品業界及び化粧品業界で応用されている〔Ｆｕｒｉａ， Ｔ．Ｅ．（編）． ＣＲＣ食品添加物便覧、第２版． Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ ： Ｔｈｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｕｂｂｅｒ Ｃｏ．， １９７２， ８７９〕。
【００１４】
市販のレシチンは主として、大豆油の製造における副作物として得られた大豆に由来するが、これは又、スイートコーン及びその他の野菜の種子から得ることもできる ［Ｈａｗｌｅｙ， Ｇ．Ｇ． 要約化学辞典、第９版、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ： Ｖａｎ Ｎｏｓｔｒａｎｄ Ｒｅｉｎｈｏｌｄ Ｃｏ．， １９７７． ５０９］。大豆レシチンは、１１．７％のパルミチン酸、４％のステアリン酸、８．６％のパルミトレイン酸、９．８％のオレイン酸、５５％のリノール酸、４％のリノレン酸、Ｃ２０−Ｃ２２酸（アラキドン酸を含む）５．５％を含有する。［Ｔｈｅ Ｍｅｒｃｋ Ｉｎｄｅｘ． 第９版、Ｒａｈｗａｙ， Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ ： Ｍｅｒｃｋ ＆ Ｃｏ．， Ｉｎｃ．， １９７６． ７１２］。
【００１５】
発酵に対する大豆レシチンの効果は、主として、リン脂質補給剤として飼料中でのその使用及び第一胃の発酵に対する効果に関してと共に、子ウシ及びヒツジにおける脂肪の消化性及び血清トリグリセリド及びコレステロールレベルに対する効果（Ｊｅｎｋｉｎｓ ＴＣ， Ｊｉｍｅｎｅｚ Ｔ 及び Ｃｒｏｓｓ ＤＩ （１９８９）「ｉｎ ｖｉｔｒｏでの第１胃発酵及びヒツジの栄養消化及び血清脂質に対するリン脂質の影響」 Ｊ．Ａｎｉｍ． Ｓｃｉ ６７（２）；５２９−５３７；Ｊｅｎｋｉｎｓ ＴＣ及びＦｏｔｏｕｈｉ Ｗ（１９９０） 「ヒツジにおける消化、第１胃発酵及び微生物タンパク質合成の部位に対するレシチン及びコーン油の効果」Ｊ．Ａｒｉｍ． Ｓ．ｃｉ． ６８１２１：４６０−４６６；Ｊｅｎｋｉｎｓ ＴＣ（１９９０）「水素添加脂肪及びレシチンの組合せで飼育された去勢ウシにおける栄養消化、第１胃発酵及び血漿脂質」Ｊ．Ｄａｉｒｙ Ｓｃｉ． ７３（１０）：２９３４−２９３９）ならびに雌牛における牛乳の産生（Ａｋｅｌ−Ｃａｉｎｅｓ ＳＦ． Ｇｒａｎｔ ＲＪ 及びＭｏｒｒｉｓｏｎ Ｍ（１９９８）「乳牛における第１胃発酵及び乳組成に対する大豆もみ殻、大豆レシチン及び石けん原料混合物の効果」Ｊ．Ｄａｉｒｙ Ｓｃｉ． ８１（２）；４６２−４７０）に対する効果に関して研究されてきた。
【００１６】
放線菌類の発酵を用いたミルジオマイシンの産生においては、一部のケースで、Ｎメチルの性質をもつ成分（特にトリメチル、アンモニウム基）、なかんづくコリン、ペタイン、レシチン、テトラメチルアンモニウムなど、又はこれらの化合物を富有する天然物質さらにはその両方の組合せを培地に取込んで問題の天然物質のその他の成分の過剰用量を回避した後、大幅な産生増加が見られた［ＵＳ．４，３３４，０２２］。
【００１７】
８０年代に開発されたその他の特許は、その加工及び消化の容易さを改善し［ＪＰ５８１１ ６６４８］ 食品加工において用いられる微生物の培養に対するその活性化効果を改善する［ＤＥ３５４６５１１；ＥＰ０２２３１６１］目的で脂肪を含まない大豆もみ殻内の発酵プロセスに有利に作用するためのレシチンの取込みに関するものである。一方で、この化合物の乳化する性質は、微生物による油の除去の利用分野［ＤＥ １４９０５６］又は有機廃棄物廃液の酵素処理［ＥＰ０４２１２２３］及び高い脂肪含有率をもつ残渣からの堆肥の形成［ＪＰ７０３３５７０］ において考慮に入れられてきた。
【００１８】
最近の出願では、レシチンは、同じく、より大きな成長と同時にそのような条件下でインキュベートされた真菌の蚊に対する生物的制御剤としてのより大きな有効性を可能にするべくラゲニシウム・ギナンテウム（Ｌａｇｅｎｉｄｉｕｍ ｇｉｇａｎｔｅｕｍ）真菌の培地を改善する目的でも使用されてきている［ＷＯ９８／５８０４９］。
ＵＳ２９５９５２１では、β−カロテンは、酸化防止剤としてレシチンを含有する栄養培地内でＢ．ｔｒｉｓｐｏｒａを培養させ、かくしてβ−カロテン産生を刺激することによって調製されている。
【００１９】
ブラケスラ・トリスポラ（Ｂｌａｋｅｓｌｅａ ｔｒｉｓｐｏｒａ）の発酵によるβ−カロテンの産生においては、菌糸体の分散成長を可能にすることを通して、産生を増大させるためのいくつかの表面活性剤（例えばＳｐａｎ２０， モノラウリン酸ソルビタン、ＳＩＧＭＡ）の使用が記述されてきた（Ｓｅｏｎ−Ｗｏｎ Ｋｉｍ， Ｗｏｅｎ−Ｔａｅｋ Ｓｅｏ 及びＹｏｕｎｇ−Ｈｏｏｎ Ｐａｒｋ（１９９７） 「Ｓｐａｎ２０を用いたブラケスラ・トリスポラ（Ｂｌａｋｓｌｅａ ｔｒｉｓｐｏｒａ）からのβ−カロテンの増強された産生」Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ １９（６１；５６１−５６２）。しかしながら、ブラケスラ・トリスポラ（Ｂｌａｋｅｓｌｅａ ｔｒｉｓｐｏｒｅ）の培養中に同じく存在するその他のカロテノイド （γ−カロテン、β−トウモロコシカロテンなど）との関係における産生されたβ−カロテンの含有量の比率に対する効果については全く記述されていない。
【００２０】
今日までに記述されてきた発酵ブロスからβ−カロテンを得るためのプロセスは、一般に、抽出段階及び連続する結晶化及び再結晶化そしてさらには、それらの物質の性質に起因してこれらの物質の低い可溶性のために溶剤の高い消費量を必要とする（ＵＳ ５３１０５５４；ＥＰ０２４２１４８；ＵＳ３３６９９７４， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ， ３９， １０７７−１０８４（１９９６）） クロマトグラフィーによる精製段階を包含しており、往々にして達成される産物の純度は過度に低いものである。
【００２１】
さらに、通常用いられる溶剤すなわちジクロロメタン、クロロホルム、ヘキサン、ベンゼン又はトルエンは、その毒性のために、得られたβ−カロテンの食品業界における使用を困難にしている。最近になってＵＳ ５７１４６５８号の中で、β−カロテンの抽出は、Ｃ１−Ｃ４アルコールの酢酸エステルを含む液体有機抽出剤によって達成された。
【００２２】
β−カロテンの結晶が溶剤の直接的蒸発を通して発酵ブロスから有機抽出物の結晶化により直接得られる場合、得られた結晶は、合成β−カロテンに比べ所要の純度をもたず、その後の溶剤消費、工程の複雑性及び産物の損失を伴ういくつかの再結晶化及び／又は精製段階が必要とされ、低い回収収量がもたらされることになる。
【００２３】
最近になって、ＰＣＴ ＷＯ９８／０３４８０号において、非常に純度の高いβ−カロテン結晶を生み出すものの、酢酸エチル及びエタノールといったような溶剤の高い消費量、産物の低い回収収量を発生させる洗浄及び結晶化の連続的段階を必要とする、発酵ブロスからのバイオマスの抽出により得られる酢酸エチルの抽出物から出発した低分子量のアルコール又は水での連続的洗浄を通したβ−カロテンの結晶の調製が記述されてきた。ＷＯ９８／５０５７４では、９３．９％の純度をもつβ−カロテンを産生するために使用されたβ．ｔｒｉｓｐｏｒａ のバイオマスから、低級アルコールを用いて脂質を除去する段階が開示されている。
【００２４】
発明の要約
本発明の目的は、発酵中のｐＨの制御のための明確な戦略を応用して、可変的な量のレシチン特に大豆レシチンを含有する発酵培地の中での真菌の培養を通して、ムコラーレス（Ｍｕｃｏｒａｌｅｓ）目の菌（ブラケスラ（Ｂｌａｋｅｓｌｅａ）、フィコミセス（Ｐｈｙｃｏｍｙｃｅｓ）など）を用いた発酵プロセスの中でのβ−カロテンの産生を増大させることにある。
同様にして、本発明では、天然のものとみなされている溶剤を用いた発酵ブロスからの高純度の結晶質β−カロテンの産生が記述されている。天然溶剤というのは、一方では毒物学的に無害性であるもの及び／又は、ＩＣＨ指針（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｆｅｒｅｎｅｅ ｏｆ Ｈｏｒｍｏｎｉｚａｔｉｏｎ）のクラスＩＩＩの中に内含されるものである。
【００２５】
一般的に考慮した場合、プロセスは、以下の段階を含んで成る：
（Ｏ） 予め定められたｐＨ制御条件における、レシチンを用いた培地内での発酵；
１）　生合成天然供給源（例えば発酵ブロス）からの湿潤バイオマスの分離
２）　アルコールでの処理による湿潤バイオマスの精製
３）　アルコールからの精製バイオマスの分離
４）　乾燥及び粉末化又は破壊を通しての精製されたバイオマスの条件づけ
５）　有機溶剤を用いたβ−カロテノイドの固体−液体抽出
６）　富化された抽出物の濃縮
７）　アルコールの添加による沈殿／結晶化
８）　ろ過
９）　乾燥
ここで記述された方法は、９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上の純度で結晶質β−カロテンを回収することを可能にする。
【００２６】
発明の詳細な説明
本発明は、ムコラーレス（Ｍｕｃｏｒａｌｅｓ）目の菌（ブラケスラ（Ｂｌａｋｅｓｌｅａ）、コアネホラ（Ｃｈｏａｎｅｐｈｏｒａ）又はフィコミセス（Ｐｈｙｎｃｏｍｙｃｅｓ）， より特定的にはブラケスラ・トリスポラ（Ｂｌａｋｅｓｌｅａ ｔｒｉｓｐｏｒａ）） での発酵プロセスにおけるβ−カロテンの産生を増大させるためのプロセスについて記述している。本発明は、水酸化カルシウムでの処理及び連続するｐＨ変更処理を通してのペクチンの除去プロセスを用いて得られたクエン酸物質特にクエン酸粉末の操作から誘導された副産物を含有する発酵培地内で真菌Ｂｔｒｉｓｐｏｒａを培養すること、及びβ−カロテンの産生を誘発する或る種の成分を濃縮するように洗浄することから成る。クエン酸粉末の中で、例えばオレンジ、グレープフルーツ、マンダリンなど由来の粉末、そしてこれらの各々の中でも、その各々の異なる品種例えばＮａｖｅｌ， Ｎａｖｅｌｉｎｅ， Ｃｌｅｍｅｎｔｉｎｅ， Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ， Ｖａｌｅｎｃｉａ−ｌａｔｅなど由来の粉末を使用することができる。
【００２７】
一方で、本発明は、培地が大豆レシチンをも含有すること、そして他方では発酵中のｐＨを制御するための明確な戦略を応用することから成る。これらの変数の合同効果により、その他の少数のカロテノイドとの関係におけるβ−カロテンの産生及びその相対的濃度の増加が可能になる。
発酵に用いられる生体は、ムコラーレス（Ｍｕｃｏｒａｌｅｓ）目の菌、より特定的にはＢ． ｔｒｉｓｐｏｒａ又はＢ． ｔｒｉｓｐｏｒａのβ−カロテン超産生性突然変異体の単離された菌株（＋）又は（−）又はこれらの菌株（＋）及び（−）の混合物であり得る。真菌の菌株（＋）及び（−）のいくつかの混合物を、本発明の発酵プロセスの中で使用することが可能である。
【００２８】
発酵プロセスは、単数又は複数の炭素供給源、単数又は複数の窒素供給源、鉱物塩、チアミン及び可変的割合の単一クエン酸供給源からのクエン酸粉末又は異なるクエン酸果実及び／又は品種からの粉末の混合物及び大豆レシチンを０．１ ％〜１０％， 好ましくは０．５％から５％、より好ましくは０．５％〜１．５％の範囲内の可変的割合で含有するあらゆる培地の中で実施可能である。
【００２９】
単一又は複合栄養分として使用できる炭素供給物としては、でんぷん、グルコース、スクロース、フルクトース、動物及び植物油、デキストリンといった脂肪又は炭水化物が内含される。窒素供給源の中では、例えば大豆のもみ殻、トウモロコシ粉、可溶性留出物、酵母エキス、コットン粉、ペプトン、カゼイン又は硫酸アンモニウムといったような有機及び無機供給源が使用可能である。培地に添加できる鉱物塩には、ナトリウム、カリウム又はアンモニウムといった一価のカチオン又はカルシウム又はマグネシウムといった二価のカチオンのリン酸塩、硫酸塩、塩化物が内含される。栄養物の割合は、微生物の成長の必要性及び産生レベルの関数として決定される。
【００３０】
発酵は、好気性条件及び液内培養内で行なわれる。発酵温度は、２０℃〜３２℃の範囲内にあるが、２５℃〜２８℃の間の範囲が好ましい。
培養のｐＨは、発酵装置内の真菌の初期成長が存在する最初の数時間自由に推移する。このときｐＨは、酸及び／又はアルカリを添加することによって、６．５〜７．２の範囲内で制御されるが、好ましくは６．７〜６．９の範囲で制御される。ｐＨ制御の開始は、成長の推移により左右されるが、一般に、それは１２〜５０時間、好ましくは２４〜３６時間の発酵後に起こる。
【００３１】
培地内へのレシチンの取込みは、この分子の両親媒性に起因して、β−カロテンの発酵培地の場合が往々にしてそうであるように、高濃度でこれらが発見される培地中の油の乳濁に有利に作用する。この作用は、一方では微生物による油の使用に有利に作用し、他方では、驚くべきことに、カロテン生成経路を活性化させて、ベータ−カロテンへのガンマカロテンの変態に有利に作用し、このベータカロテンの産生及びその他のカロテノイド特にガンマカロテンとの関係におけるその相対的濃度を増大させ、かくして最終産物内のこの物質の存在の大幅な低減を導き、全てのトランスベータカロテンの純度を増大させることになる、ということが発見されてきた。
【００３２】
さらに、この効果は、発酵の間に適切なｐＨ制御が実施された場合に増強され、かくして２４〜３６時間の発酵後のｐＨの調整が、ガンマ−カロテンの低減にさらに顕著な形で有利に作用し、ベータ形態の相対的濃度を増大させることになる。
【００３３】
静止期にある培養中のムコラーレス（Ｍｕｃｏｒａｌｅｓ）目の菌の発酵液内のガンマ−カロテンの存在については、以前に記述されてきた。（Ｍｕｒｉｌｌｏ ＦＪ， Ｔｏｒｒｅｓ−Ｍａｒｔｉｎｅｚ Ｓ， Ａｒａｇｏｎ ＣＭ及びＣａｒｄａ−ｏｌｍｅｄｏ Ｅ （１９８１） 「ヒゲカビ内でのカロテン生合成における基質移入」 Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． １１９（３）：５１１−５１６；Ｃａｎｄａｕ Ｒ．， Ｂｅｊａｒａｎｏ ＥＲ， Ｃａｒｄａ−Ｏｌｍｅｄｏ Ｅ （１９９１） 「ベータカロテン生合成のための酵素集合体内の基質のｉｎ ｖｉｖｏチャネリング」． Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８８（１１）：４９３６−４９４０ ； Ｅｒａｓｅｒ ＰＤ， Ｒｕｉｚ−Ｈｉｄａｌｇｏ ＭＪ， Ｌｏｐｅｚ−Ｍａｔａｓ ＭＡ， Ａｌｖａｒｅｚ ＭＩ， Ｅｓｌａｖａ ＡＰ ａｎｄ Ｂｒａｍｌｅｙ ＰＭ （１９９６）「ムコール属 ｃｉｔｃｉｎｅｌｌｏｉｄｅｓ の野生型及び突然変異体菌株におけるカロテノイド生合成」Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ１２８９（２）：２０３−２０８）。
【００３４】
この存在については、Ｂｌａｋｅｓｌｅａ ｔｒｉｓｐｏｒａにおいても記述されてきた（Ｍｅｈｔａ ＢＪ及び Ｃａｒｄａ−Ｏｌｍｅｄｏ Ｅ （１９９９）「ブラケスラ・トリスポラ（Ｂｌａｋｅｓｌｅａ ｔｒｉｓｐｏｒａ）におけるリコペン環化」Ｍｙｃｏｓｃｉｅｎｃｅ ４０（３） ３０７−３１０）。両方のケースにおいて、これらの阻害効果は、ベータ−カロテンの産生に対してニコチン、２−（４−クロロフェニルチオ）−トリエチルアミン、アルファ−ピコリン及びイミダゾールといったようないくつかの物質について記述されているが、これらはリコペン−シクラーゼの遮断に起因してリコペン−ガンマ−カロテンの蓄積には有利に作用する。しかしながら、ブラケスラ・トリスポラ（Ｂ． ｔｒｉｓｐｏｒａ）の発酵におけるガンマーカロテンの含有量を低減させ、ベータ−カロテンの産生ひいては得られた最終産物の純度を増大させることを目的とするプロセスはこれまでに全く記述されたことがない。
【００３５】
本発明の成果であるブラケスラ・トリスポラ（Ｂｌａｋｅｓｌｅａ ｔｒｉｓｐｏｒａ）の発酵ブロス内におけるガンマーカロテンの含有量の減少というこの効果は、それが、最終産物中少なくとも９６％のベータ−カロテンの純度を要求する最終産物の食品業界向け及び薬局方レベルの両方で設定された仕様を満たすことができるようにするという意味で、重要なものである。
【００３６】
発酵において生合成されたカロテノイド成分の特性がわかっていることから、現行のプロセスに従って調製された培養ブロスからの回収プロセスは、細胞内プロセスとなった時点で、バイオマス無くブロス内での損失を無くするか又は低減させる目的でプロスからバイオマスを分離させることを包含している。
【００３７】
この分離は、Ａ） ろ過用材料により構成されたバリヤがバイオマスを分離し液体がバイオマス無しで通過できるようにする、ストリップ、回転式、プレスなどのいずれかの現行のフィルタ技術を用いたろ過、又はＢ） ブロスとバイオマス（通常は密度がより高い）の間の異なる密度を使用して、できるかぎり低い量のバイオマスで重量相が濃縮され液相から分離される遠心分離機、デカンタ又はそれに類するものといったような機械が用いられる遠心分離、という実証済みのプロセスによって行なうことができる。損失を低減させ、それぞれの各相の収量を最適化しかくして乾燥残渣の最高の含有量を伴う最大量のバイオマスを達成し、発酵ブロスから最大量を除去することが、本発明の目的の１つである。
【００３８】
結果として得られた湿潤菌糸体は、発酵において産生されたカロテノイドを９５％以上、好ましくは９７％以上、そして好ましくは９９％以上含有する。水相のカロテノイドの含有量は、従って５％未満、好ましくは３％未満、より好ましくは１％未満である。
この湿潤な菌糸体固体は、その後の段階を通して、ベータ−カロテンの分離を可能にするが、発酵に関連してそれが１５〜２０％という比較的高い百分率の脂質親和性成分（脂肪酸及び油）を維持すること及びその後の段階で精製の問題が発生することという発見事実は、この点に起因するバイオマス精製段階の導入を導くことになる。
【００３９】
この精製段階は、脂質成分の最大の精製を達成するのに適した割合での、一定量のアルコール、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール又はβ−カロテンの可溶性が非常に低いその他の任意のアルコール又はそれらの混合物でのバイオマスの再懸濁を包含しており、換言すると、ここで湿潤菌糸体は、その１ｇあたり１ｍｌ〜１０ｍｌの範囲内のアルコール量で再懸濁させられる。接触時間は、５分から２４時間の範囲内にある。このように調製されたアルコール再懸濁液は、ろ過され、遠心分離に付され、かくして、ろ過物又は上清中の固体の含有量は事実上ゼロとなる。結果として得られた、異なる割合でアルコール及び水を含有することになる湿潤菌糸体は、発酵中に産生されたカロテノイドを９３％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９７％以上含有する。
【００４０】
結果として得られたアルコールとブロスの残留物の混合物中、カロテノイドの含有量は２％未満、好ましくは１％未満である。アルコールでのこの処理を通して、先行するきわめて重要な精製及び高純度の最終結晶質産物を得ることができるようにする精製を実施しながら、使用されたブロスの特性の関数として変動するアルコール中で可溶な一連の脂質親和性物質を除去することが可能である。さらに、当初の湿潤菌糸体から可変的な割合の水を除去することにより、乾燥プロセスが著しく容易になる。
【００４１】
バイオマスの分離及び再懸濁による精製というこれら２つの段階のセットに対する代替案として、記述されたものと等価の精製効果が達成される最小接触時間を保ち、かくして固体／液体分離作業を削除することによってプロセスが単純化されるようにしながら、室温と混合物の沸点の間好ましくは、室温と５０℃の間の温度で１：０．５及び１．５（ブロス／アルコール）の間の体積割合でアルコールと収獲済みブロスを直接混合する可能性が考慮されている。
【００４２】
カロテノイド産物が細胞内のものであるという事実は、精製されたバイオマスが、溶剤との混合に有利に作用し抽出を容易にする乾燥とすりつぶし、乾燥と粉末化又は粉末化のみによる条件づけを必要とする、ということを意味する。
脱水した精製済み菌糸体は乾燥させられる。固体バッチでの又は連続的な正規のプロセスを用いて、乾燥を行なうことができる。乾燥温度は、室温から１５０℃の範囲内にあり、好ましくは６０℃を超えてはならず、さらに好ましくは、５０℃未満でなくてはならない。乾燥時間は、１時間から７２時間の範囲内で使用温度に左右される。大気中の酸素による酸化を通してこれらのカロテノイドが分解する可能性があることから、窒素雰囲気下又は少なくとも真空下で、酸素の無い状態でこの乾燥プロセスを実施するのが適切である。
【００４３】
抽出されるべきカロテノイドに対し溶剤がうまくアクセスできるようにするためには、表面接触面積が最大になるように、菌糸体に対する破壊作業を予め行なうことが必要である。乾燥しかつ破壊された菌糸体の最適な粒度は、３ｍｍ未満、好ましくは１ｍｍ未満、より好ましくは０．５ｍｍ未満でなくてはならない。
【００４４】
バイオマス粉末化は、例えば、回転又は固定部品を伴う機械的すりつぶし手段すなわち乳棒、ふるいなどを使用することによって、又は回転シリンダに通過させて互いにプレスすることによって、又は高温で循環ガス流に湿潤産物が補給されかくして液体成分の含有物の気化を達成するべく滞留時間が最小限になっており、産物の密度の差に起因してそれがサイクロンまで輸送されそこで回収されるようになっているジェット−ミル機器内のフラッシュタイプの乾燥によって、といったように従来の手段により乾燥産物に対して実施することができる。
乾燥時間及びその走行の間、粒子が壁に衝突するにつれての質化効果が存在する。
【００４５】
ここで記述されているように条件づけされた菌糸体からのβ−カロテンの抽出のためには、異なる有機溶剤を使用することができる。本発明は、カロテノイド成分についての適正に高い可溶性とＩＣＨのクラスＩＩＩの群に含まれる溶剤としてのそれらの相溶性とを組合せる、アシルエステル、好ましくはエチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチルエステル又はそれらの混合物といったような、天然とみなされる食品グレードの溶剤の使用に関する。これらの溶剤は、スペインでも欧州共同体内でも、薬品及び食品の両方の利用分野のために許容されているものである（ＲＤＬ＜マ＞１２／０４／９６及びＲＤｌ １６／１０／９６） 。
【００４６】
抽出温度は、室温と溶剤の沸点の間、好ましくは５０℃〜８０℃の間で変動する。抽出時間は、１秒〜１時間の間、好ましくは１分〜１５分の間の、可溶化を達成するのに必要な最小時間となる。使用される溶剤の量は、５ｍｌ／ｇと２０ｍｌ／ｇの間の範囲内で、カロテノイド中の菌糸体の富有度及び温度により左右される。抽出の回数は１〜３回の間で変動する。抽出されたカロテノイドの量は８５％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上である。
【００４７】
カロテノイドを富有する抽出物がひとたび得られたならば、それを或る一定の体積まで濃縮することが必要である。濃縮後の溶剤中のカロテノイドの最終濃度は、好ましくは１０〜４０ｇ／ｌ の間で変動する。濃縮温度は、８０℃未満、好ましくは７０℃未満、より好ましくは５０℃未満であるべきである。濃縮時間は、１時間未満、好ましくは３０分未満、より好ましくは１５分未満であるべきである。
【００４８】
抽出物がひとたび所要体積まで濃縮された時点で、カロテノイド不溶化剤、特定的にはアルコールそしてより特定的には無水メタノール、エタノール、イソプロパノール又はβ−カロテンの溶解度が低い任意のその他のアルコールを、濃縮後の溶剤の体積との関係において１／１〜６／１の割合で添加し、これにより結晶性β−カロテンの収量を著しく増大させることが必要である。アルコールの添加は同様に、精製効果があり、それが添加されない場合に比べ純度の高い産物を回収する。結晶化時間は、１５分と２４時間の間、好ましくは１時間と１２時間の間、より好ましくは３時間〜８時間の間で変動する。結晶温度は、２５℃未満、好ましくは５℃未満であるべきである。
【００４９】
結晶化水からの結晶の分離は、ろ過又は遠心分離によって行なわれ、結晶をおおう結晶化水を移動させ、これらの結晶をその不溶化に用いられたものと同じアルコールで洗浄する。
得られた結晶は、法律により設定された最大濃度の仕様に従った溶剤の残留含有量が達成され、β−カロテンの場合には、０．２％未満の乾燥時の損失が確定されるまで、少なくとも１時間、室温で真空下で乾燥される。
【００５０】
得られた結晶のベータカロテン純度は、その他のカロテノイドの含有量が４％未満、好ましくは２％未満で、９０％以上、好ましくは９５％以上、そしてより好ましくは９８％以上という、ＵＳＰ， ＥＰ， ＢＰの分光光度方法に従ったシクロヘキサン（Ｅ１％ １ｃｍ＝２５００） 中に溶解させられた４５５ｎｍでの吸収度を読取ることによって、分光光度法により決定された力価に対応する。
【００５１】
同様にして、得られた結晶質産物は、そのままの状態で、又はβ−カロテンの割合が１〜８５％の間で変動する製剤の一部を成すものとして、大豆油、トウモロコシ油、オリーブ油などといった異なる賦形剤又は化合物と混合した状態で、異なる純度で、そしてトコフェロールタイプの酸化防止剤が随伴する状態で、取扱われ商品化され得る。本発明の１つの目的は、安定した条件で包埋された粉末の中に内含されたβ−カロテンを提供する食品品質のでんぷんマトリクス内に包埋されたカロテノイドの乾燥粉末を約１〜２５重量部分含有する水中に分散可能なカロテノイドの製剤を提供することにある。異なるタイプのでんぷんを使用することができる。
【００５２】
本発明の製品は、水中に分散可能なβ−カロテンの固体製剤である。
使用される好ましいでんぷんは、水中での有機相の単純な乳化を可能にする高分子量をもつ食品品質の改質コーンスターチである。溶剤を分離した後、分散は、β−カロテンの色範囲を満たす。この改質コーススターチは、乾燥粉末の充分な再分散性を生み出さない。かくして、もう１つのでんぷんも同様に添加される。第２の種類は、１０００〜７００，０００の範囲内の異なる分子量をもつ食品品質のでんぷんの混合物である。この第２のタイプのでんぷんは、最終産物の優れた分散性を提供する。
【００５３】
β−カロテンは、酸化に敏感であることから、劣化に対する安定性を強化するため、β−カロテンを含有する溶剤の中に酸化防止剤を溶解させることができる。本発明においては、なかでも天然又は合成由来のα−トコフェロールを含めた、食品に認可されたあらゆる酸化防止剤を使用することができる。酸化防止剤レベルは、β−カロテンを保護するのに充分なものとなる。これは、β−カロテンの量の０．１〜０．３倍でなくてはならない。２つの酸化防止剤の会合の相乗酸化防止効果のため、パルミチン酸アスコルビルを製剤に添加することもできる。
【００５４】
本発明の方法は、特に、微生物供給源、好ましくは藻類、真菌又は酵母、より好ましくは、ムコール目の真菌、より好ましくはブラケスラ・トリスポラ（Ｂ． ｔｒｉｓｐｏｒａ）からの結晶質β−カロテンの回収のために応用できる。
当該方法及び天然とみなされる溶剤の使用によって得られる結晶において達成される極度の純度は、これらの結晶が、食品業界、薬品業界又は化粧品業界でも利用可能であることを意味している。
【００５５】
例１．
培地に対する大豆レシチンの添加は、フラスコで発酵された場合にガンマーカロテンの含有量を低減させる。
１リットルあたり大豆もみ殻２３ｇ， トウモロコシ粉４７ｇ， 一カリウムリン酸塩０．５ｇ、塩酸チアミン０．００２ｇを含む接種材料培地を調製する。その初期ｐＨは６．３である。培地を、５００ｍｌ入りのエルレンマイヤーフラスコ内に、６７ｍｌ又は１００ｍｌのいずれかで分配させる。殺菌後、これらに、分離したフラスコ内のブラケスラ・トリスポラ（Ｂ． ｔｒｉｓｐｏｒａ）菌株（＋）とＢ． ｔｒｉｓｐｏｒａ菌株（−）の胞子の懸濁を播種し、４８時間２５℃でインキュベートする。
【００５６】
１リットルあたり大豆もみ殻 ４４ｇ，トウモロコシ粉、１９ｇ；オレンジ粉１０ｇ；塩酸チアミン，０．００２ｇ；植物油１００ｇを含む塩基発酵培地を調製する。前述のとおりに、大豆レシチンを含む培地を調製し、１％のレシチンを補足する。ｐＨを６．３に調整する。培地を２０ｍｌの部分に分けて２５０ｍｌ入りのエルレンマイヤーフラスコ内に分配させる。
【００５７】
β−カロテンの発酵のため、発酵培地を含むフラスコに、ブラケスラ・トリスポラ（Ｂ． ｔｒｉｓｐｏｒａ）（＋）及びブラケスラ・トリスポラ（Ｂ． ｔｒｉｓｐｏｒａ）（−）の菌株の１０％の混合培養を接種する。全てのフラスコを、２５０ｒｐｍの回転式振とう機の中で２５℃でインキュベートする。４８時間の発酵後、β−イオノンを、培地１リットルあたり１ｍｌの比率でフラスコに添加し、発酵６日目で菌糸体を収集する。
【００５８】
細胞内含有物を放出できるようにする任意の記述された細胞破壊方法を用いて、β−カロテンの抽出を実施する。例えばアセトンといったような、その中でそれが可溶であるような任意の溶剤の中で、それを可溶化する。その濃度は、分光光度法を用いて査定できるが、文献中に記述されている方法のいずれかを用いて、液体クロマトグラフィを使用することが好ましい（ＨＰＬＣ） 。
大豆レシチンの添加により、β−カロテンの産生は５％増加し、γ−カロテンの産生は６０％減少する（図１参照）。この実験は、レシチンは、β−カロテンの産生の増加を可能にし、より純度の高い産物の産生をも助長するということを示している。
【００５９】
例２．
培地内へのレシチンの取込みは、ベータ−カロテンの産生を増大させ、パイロット発酵装置内のガンマーカロテンの相対的レベルを低減させる。ｐＨの制御と組合された場合、ガンマーカロテンの産生に対する効果は、さらに一層大きくなる。
【００６０】
１リットルあたり大豆もみ殻２３ｇ，トウモロコシ粉４７ｇ、 一カリウムリン酸塩０．５ｇ、塩酸チアミン０．００２ｇを含む接種材料培地を調製する。その初期ｐＨは６．３である。培地を、２０００ｍｌ入りのエルレンマイヤーフラスコ内に、各フラスコに５００ｍｌの割合で分配させる。殺菌後、これらに、分離したフラスコ内のブラケスラ・トリスポラ（Ｂ． ｔｒｉｓｐｏｒａ）菌株（＋）とブラケスラ・トリスポラ（Ｂ． ｔｒｉｓｐｏｒａ）菌株（−）の胞子の懸濁を播種し、５ｃｍの離心距離及び２５０ｒｐｍで回転振とうさせながら４８時間２５℃でインキュベートする。
菌株の各々１つずつを、１リットルあたりファルマメディア（Ｐｈａｒｍａｍｅｄｉａ）２９ｇ；トウモロコシ粉４７ｇ；一カリウムリン酸塩０．５ｇ；塩酸チアミン０．００２ｇ；消泡剤１ｇ，という組成の培地の入った中間成長タンクに、無菌条件下で移す。その初期ｐＨは６．０である。
【００６１】
３６〜４８時間インキュベートした後、（＋）及び（−）菌株の混合物を作り、１リットルあたり大豆もみ殻５０ｇ，トウモロコシ粉、２５ｇ；オレンジ粉 １５ｇ；一カリウム二塩基リン酸 ０．５ｇ；イソニアジド ０．２８ｇ；塩酸チアミン０．００２ｇ；植物油 ８０ｇ，消泡剤０．１７５ｇという組成をもつ塩基性発酵培地を播種するために混合物の１０％を使用する。この培地に、１％の大豆レシチンを補足する。
【００６２】
１５０〜２５０ｒｐｍの可変的撹拌及び１〜１．５ｖ／ｖ／ｍの曝気を伴って、２５〜２８℃の温度で発酵を確認する。６．５〜７．５の範囲でｐＨ制御無しでか又は３６時間の発酵後６．８±０．１での制御を伴って、というテストに応じた２つの異なる条件を保ちながら、アンモニア又は硫酸を用いてｐＨ制御を実施する。発酵４０時間と５０時間の間で、植物油中のβ−イオノン１０％溶液を１０ｇ／Ｌ添加する。５０〜６０時間の間で、植物油中のエトキシキンの２．５％溶液１０ｇ／Ｌを添加する。
【００６３】
発酵を１００〜１４０時間延長し、この時間の後、β−カロテンの産生を検定する：すなわち細胞内含有物を放出できるようにする細胞破裂を伴う記述されたいずれかの方法によって、β−カロテンの抽出を実施する。例えば、アセトンといったような、その中でそれが可溶であるような任意の溶剤の中で、それを可溶化する。その濃度は、分光光度法を用いて決定できるが、文献中に記述されている方法のいずれかを用いて、液体クロマトグラフィを使用することが好ましい（ＨＰＬＣ） 。
レシチンを伴う及び伴わない培地で実施されたテストの結果及び上述の２つのｐＨ制御条件が、以下の表に紹介されている。
【００６４】
【表１】
2004504853.tif 000003
【００６５】
これらのデータは、培地内へのレシチンの取込みが、ベータ−カロテンの産生を増大させ（５％の増加）ガンマーカロテンの相対的レベルを低減させる（４３％）ということを明らかに示している。ｐＨ制御と組合せた場合、ガンマーカロテンの産生に対する効果は一層大きくなる（６３％） 。
【００６６】
例３．
３リットルの発酵ブロスが収獲される。ブロスの力価は１リットルあたりβ−カロテン６ｇである。これらのブロスのバイオマスは、ブフナーろ過を用いて回収され、１０００ｇの湿潤バイオマスが得られる。湿潤バイオマスを、３ｌの共沸イソプロパノール８５／１５中で再懸濁させ３０分間振とうさせる。精製したバイオマスを再びＢｕｃｈｎｅｒろ過により回収する。
【００６７】
このバイオマスを、真空下のオーブン内で４５°未満の温度で１８時間、残留溶剤の含有量が１〜２％の範囲内となるまで乾燥させる。合計２７０ｇの乾燥バイオマスが得られ、６．５％の純度と同等のβ−カロテン含有量で精製される。
乾燥バイオマスをハンマーミル及び１ｍｍのふるい内ですりつぶして、同じ比純度をもつ固体を得、溶剤での抽出を可能にするべくこれを条件づけする。
【００６８】
抽出は、５分間撹拌を保ちながら、７０℃で４５００ｍｌの酢酸イソブチルと２７０ｇのすりつぶしたバイオマスを混合することによって実施される。涸渇したバイオマスを、ろ板を通してろ過することによって濃厚な溶剤から分離させる。涸渇したバイオマスは、フィルタ自体の上で５００ｍｌの暖かい酢酸イソブチルで洗浄２つの溶剤を混合する。濃厚な酢酸イソブチル全てを、体積が７００ｍｌに縮小されるまで、４５℃未満に保った温度で真空下で濃縮させ、この時点でβ−カロテンの一部分が結晶化した。結晶化を完成させ、より純度の高いβ−カロテンを得るため、２１００ｍｌのイソプロパノールを添加する。混合物を０°〜５℃の間で、３時間、窒素下で振とう続ける。これをＢｕｃｈｎｅｒ漏斗を通してろ過し、この漏斗上で２５ｍｌのイソプロパノールで結晶を洗浄する。結晶を収集し乾燥させ、分光光度法で測定したところ９６％の純度をもつβ−カロテンの結晶１４ｇが得られる。
【００６９】
例４．
約５．５ｇ／ｌのβ−カロテン力価で、約５００ｌの発酵ブロスを収獲する。これを、水８５−１５を伴う共沸イソプロパノール１５００ｌと直接混合し、混合物を４０℃まで加熱する。３０分間撹拌した後、バイオマスを、デカンタでの遠心分離により液体から分離する。１８０ｋｇ前後の精製された湿潤バイオマスが収集される。
このバイオマスを、残留溶剤含有量が１〜２％の範囲内に達するまで真空下で回転式乾燥機の中で乾燥させる。温度は４５℃未満でなくてはならず、時間は１２〜２４時間でなくてはならない。わずかに低い純度である５．９％の比濃厚度と等価のβ−カロテン含有量をもつ４５ｋｇの乾燥バイオマスが得られる。
【００７０】
乾燥バイオマスは、ハンマーミル及び１ｍｍのふるい内ですりつぶして、同じ比純度をもつ固体を得、溶剤での抽出を可能にするべくこれを条件づけする。
１変形形態としては、湿潤バイオマスを、フラッシュターボ乾燥機（ジェットミルタイプ）の中で乾燥させるが、この場合、すりつぶし段階は不要である。
【００７１】
抽出は、１５分間振とうを保ちながら、７０℃で８００ｌの酢酸イソブチルと４５ｋｇのすりつぶした固体を混合することによって実施される。涸渇したバイオマスを、デカンタでの遠心分離によって濃厚な溶剤から分離させる。酢酸イソブチルの全てを、体積が１１０ｌまで縮小されてしまうまで４５℃未満に保たれた温度で真空下で濃縮させ、この時点で、β−カロテンの一部分が結晶化した。β−カロテンの結晶化を完成させるため、３３０ｌのイソプロパノールを添加する。混合物を０〜５℃で３時間、それが冷却する間振とうし続ける。これをＢｕｃｈｎｅｒ漏斗を通してろ過し、β−カロテンの結晶を収集してこれを乾燥させる。分光光度法で測定した場合に９６％の純度をもつ２．１ｋｇの産物が得られる。
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１において、Ａは、レシチンを伴う（右欄）又は伴わない（左欄）状態でのβ−カロテンの生成百分率を示し、Ｂは、レシチンを伴う（右欄）又は伴わない（左欄）状態でのγ−カロテンの生成百分率を示す。
【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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2004504853.tif 000037
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