(57)【要約】被験試料において少なくとも２つの異なる標的配列を検出するための方法を提供する。かかる方法は、異なる標的配列を検出するために、互いに完全に相補的ではない（例えばＳＮＰ）が、それにもかかわらず互いにハイブリダイズするプローブを用いる。プローブによる検出の前に標的配列を増幅することができる。単一配列の変異形態が、ここで提供するこの方法による検出に特に適する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験試料において２個の関連する標的核酸配列の少なくとも１個を検出するための方法であって、
ａ）被験試料を第一及び第二プローブと接触させること、ここで、
（ｉ）プローブは、少なくとも１個のミスマッチを除いて互いに完全に相補的であり、
（ｉｉ）第一プローブは、第二プローブに対してよりも第一標的配列のセンス鎖により相補的であり、
（ｉｉｉ）第二プローブは、第一プローブに対してよりも第二標的配列のアンチセンス鎖により相補的であり、および
（ｉｖ）プローブは外界温度で互いにハイブリダイズする
ｂ）少なくとも第一又は第二プローブを第一又は第二標的配列にハイブリダイズさせて、少なくとも１個の標的配列／プローブハイブリッドを形成すること、および
ｃ）被験試料中に少なくとも１個の標的配列が存在することの指標としてハイブリッドを検出すること、を含む方法。
【請求項２】
第二標的配列が第一標的配列の変異形態である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
第一標的配列の変異形態が一ヌクレオチド多型を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
プローブが、配列番号５と、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０及び配列番号１１から成る群の一成員である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
プローブが、配列番号１６と、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９及び配列番号２０から成る群の一成員である、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
被験試料にプライマーセットと増幅試薬を与る段階と、被験試料を第一及び第二プローブに接触させる前又は接触させるのと同時に被験試料中の標的配列を増幅する段階と、をさらに含む請求項１に記載の方法。
【請求項７】
プライマーセットが、配列番号３と配列番号４；及び配列番号１４と配列番号１５から成る群より選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
第一及び第二プローブが、第一プローブが３’突出を持つように互いにハイブリダイズする、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
第二プローブが３’突出を持つ、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
突出が１から５ヌクレオチドの長さである、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
第一及び第二プローブを含む物質の組成物であって、ここで、
（ａ）プローブは、少なくとも１個のミスマッチを除いて互いに完全に相補的であり、
（ｂ）第一プローブは、第二プローブに対してよりも標的配列のセンス鎖により相補的であり、
（ｃ）第二プローブは、第一プローブに対してよりも第二標的配列のアンチセンス鎖により相補的であり、および
（ｄ）プローブは外界温度で互いにハイブリダイズする、組成物。
【請求項１２】
プローブが個々に１０から１００ヌクレオチドの長さである、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
第一及び第二プローブが、第一プローブが３’突出を持つように互いにハイブリダイズする、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１４】
第二プローブが３’突出を持つ、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
突出が１から５ヌクレオチドの長さである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
ミスマッチが一ヌクレオチド多型である、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１７】
プローブが、配列番号５と、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０及び配列番号１１から成る群の一成員である、請求項３に記載の方法。
【請求項１８】
プローブが、配列番号１６と、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９及び配列番号２０から成る群の一成員である、請求項３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（技術分野）
本発明は核酸配列を検出することに関し、特に、異なる核酸配列を、そのような異なる核酸配列に相補的であり、同時に互いに相補的であるプローブで検出することに関する。
【０００２】
（発明の背景）
様々な生物のゲノム配列を決定するために設計された試験、ならびにゲノム配列を比較するために設計された試験により、ヒトゲノムからＨＩＶゲノムまでにわたる様々なゲノムにおける多型についての情報が得られた。そのような生物のゲノムにおける極めて多様な多型がこれまで報告されてきた。遺伝的多型の様々な種類には、一塩基置換、挿入又は欠失、様々な数のタンデムリピート、遺伝子の全部又は大部分の欠失、及び染色体再構成が含まれる。一般に、単一ヌクレオチドに関わる多型は一ヌクレオチド多型又は「ＳＮＰｓ（スニップス）」と呼ばれる。ゲノムが特定のＳＮＰを含む場合、ＳＮＰを含む領域からの配列は２又はそれ以上の形態の１つとして存在しうる。形態の１つが個体群の大半に生じると同定できる場合、又は完全な機能を保持するタンパク質生成物と協同しうる場合、それは「野生型」配列と称される。ＳＮＰの他の形態は「突然変異体」と称される。
【０００３】
ある遺伝子におけるいくつかの変異は様々な疾患様相の原因となる。例えば、静脈血栓症は年間およそ１０００人に１人が罹患するかなり一般的な疾患である。ある場合、血栓症は、血液凝固の原因となる事象のカスケードに関与するタンパク質をコードする遺伝子内のＳＮＰｓであったことが判明した。例えば、第Ｖ因子をコードする遺伝子内の突然変異、いわゆる「第Ｖ因子ライデン（Ｌｅｉｄｅｎ）」突然変異が血栓症の原因となる因子であると報告された。さらに、プロトロンビン遺伝子の３’非翻訳領域の変異も血栓症の原因であることが報告されている。上記の遺伝子変異のいずれか又は両方を有する個人は、例えば手術を受ける、妊娠する、又は経口避妊薬を服用する場合、血栓症の危険度がさらに一層高いと報告されている。
【０００４】
一部の場合、突然変異体配列と野生型配列が１個のゲノム内に含まれることがある。例えば、配列が１組より多い染色体を含む（場合によって「倍数性」と称される）生物に由来する場合にそのような事態が起こりうる。さらに、１本の染色体を含む生物が、その染色体が遺伝子増幅を含む場合、同時に２個以上の遺伝子の変異形態を含むことがある。ゲノムは問題となる配列の野生型又は突然変異体バージョンのいずれかの複製コピーを含みうるが（場合によって特定配列についての「ホモ接合性」と称される）、ゲノムが野生型と突然変異体配列の各々の１コピーを含む（場合によって特定配列についての「ヘテロ接合性」と称される）さらなる可能性が存在する。被験試料においてこれらの配列を検出しようとするとき、密接に関連する配列が存在することでいくつかの課題が提示される。
【０００５】
これまで、被験試料における関連配列の検出はＲＦＬＰとゲル電気泳動を用いて実施された。また試料中の突然変異体及び野生型配列の存在を調べるための二元的な別の増幅反応も、被験試料中の複数の関連配列の存在を検出するために実施されてきた。例えば、第Ｖ因子ライデン及びプロトロンビン突然変異についての遺伝的試験が文献において報告されている。これまでに報告された遺伝子ベースのアッセイの多くは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）又はリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）のような増幅反応を利用して実施されている。特定突然変異を含むと思われる領域を増幅した後、しばしばゲル電気泳動を用いて増幅産物を検出する。上記の突然変異に関する増幅ベースのアッセイは、野生型配列を検出するために設計された１つの反応と突然変異体配列を検出するために設計されたもう１つの反応を個々に別々に実施する。従って、これらのアッセイは実施が煩雑で費用がかかる。それ故、関連する２つの配列についてのアッセイを１つの反応容器中で実施することができるアッセイ及びアッセイ試薬を提供することは有用であろう。そのような試薬と方法は、それ故、被験試料において関連配列を検出するための二元的な別々の反応の使用及びゲル電気泳動の使用を回避するであろう。
【０００６】
（発明の簡単な説明）
本発明は、被験試料において２個の関連する標的核酸配列の少なくとも１個を検出するための方法を提供する。該方法は、１つの反応容器中で好都合に実施することができる核酸増幅手法と共に用いることができる。一般に、該方法は被験試料を第一及び第二プローブと接触させる段階を含む。プローブは、（ｉ）それらが少なくとも１個のミスマッチを除いて互いに完全に相補的であり、（ｉｉ）第一プローブは、第二プローブに対してよりも標的配列のセンス鎖により相補的であり、（ｉｉｉ）第二プローブは、第一プローブに対してよりも第二標的配列のアンチセンス鎖により相補的であり、および（ｉｖ）プローブが外界温度で互いにハイブリダイズするように設計される。少なくとも第一又は第二プローブを第一又は第二標的配列にハイブリダイズさせることによって標的配列／プローブハイブリッドを形成する。そのようにして形成されたハイブリッドを、被験試料中に関連標的配列の１個が存在することの指標として検出する。上記の方法を実施するための試薬も提供する。
【０００７】
（発明の詳細な説明）
本発明は、互いにハイブリダイズするが、互いに完全に相補的ではない一対のプローブを使用して、被験試料中の２個の異なる標的配列を検出するための方法を提供する。一般に、該方法は、必要に応じて周知の増幅手法のいずれかを使用して標的配列を増幅し、増幅した標的配列を、もし存在する場合には、プローブで検出することを含む。好都合にも、異なる標的配列はしばしば共通の増幅試薬を用いて増幅することができる。標的配列が十分な濃度で存在するときのように、ある種の状況下では、標的配列はプローブで検出する前の増幅を必要としないことがある。プローブは一般に、それらのそれぞれの標的配列に完全に相補的ではなく、互いにハイブリダイズするのには十分相補的であるように設計される。典型的には、プローブは、好ましくはそれぞれのプローブの５’と３’末端ヌクレオチドの間に位置する、少なくとも１個の不適正塩基対を有する。相互に対してよりもそれぞれの標的配列により相補的であるプローブの使用は、別々の増幅反応の産物に別々のプローブを導入する必要なしに、１つの被験試料中の異なるが関連する標的配列の検出を可能にすることが認められた。本発明は、被験試料中の変異形態の核酸配列の存在を検出するのに特に適する。
【０００８】
ここで使用するとき「標的配列」は、検出される、増幅される、増幅され且つ検出される、若しくは増幅プライマー又はプローブの１つに相補的である核酸配列を意味する。それに加えて、標的配列の語はここではしばしば一本鎖の核酸を指すために使用されるが、当業者は標的配列が二本鎖でもよいことを認識するであろう。先に述べたように、ここで提供する方法を用いて検出できる標的配列は関連する。そのような標的配列は、１個の標的配列が通常他方の標的配列の変異である限り関連する。特に、検出できる標的配列は、典型的には、標的配列の１個が、例えばその配列組成物を他方の標的配列と異なるものにする多型を含むことを除いて同じ配列を有する。それ故、例えば、第一標的配列と第二標的配列は、第二標的配列が１又はそれ以上のヌクレオチド置換、欠失、及び／又は挿入を含むことを除いて同じでありうる。標的配列は核酸ゲノムを含むいかなる生物からも誘導しうる。
【０００９】
ここで使用するとき「被験試料」の語は、標的配列を含むことが疑われる何らかのものを意味する。被験試料は、例えば血液、気管支肺胞洗浄、唾液、咽喉スワブ、眼房水、脳脊髄液、汗、痰、尿、乳、腹水、粘液、滑液、腹腔内液、羊水、心組織のような組織等、又は発酵肉汁、細胞培養、化学反応混合物等のような何らかの生物学的ソースから誘導することができる。被験試料は、（ｉ）ソースから得られたものを直接に、又は（ｉｉ）試料の特性を改変するための前処理後に、使用することができる。すなわち、被験試料は、例えば血液から血漿を調製する、細胞を破壊する、固体材料から液体を調製する、粘性液体を希釈する、液体をろ過する、液体を蒸留する、液体を濃縮する、干渉する成分を不活性化する、試薬を加える、核酸を精製する、等により、使用に先立って前処理することができる。
【００１０】
「プライマー配列（単数）」、「プライマー配列（複数）」又は「プライマー（単数又は複数）」は、標的配列の多数のコピーの合成を開始する試薬、最も典型的には短鎖核酸又は「オリゴヌクレオチド」を指す。オリゴヌクレオチドの大きさは極めて多様であるが、典型的には１０から１０００ヌクレオチドの範囲の長さ、より典型的には１５から１００ヌクレオチドの範囲の長さである。標的配列の多数のコピーを合成する（又は標的配列を増幅する）ためにプライマー配列を用いる増幅反応は、現在では当該技術において周知である。欧州特許第３２０  ３０８号に述べられているＬＣＲ及び米国特許第５，７９２，６０７号（参照してここに組み込まれる）に述べられているギャップＬＣＲのようなその変法、ＮＡＳＢＡ又は米国特許第５，３９９，４９１号（参照してここに組み込まれる）に述べられているＴＭＡのような同様の反応、好ましくはＰＣＲ、及び米国特許第４，６８３，１９５号、同第４，６８３，２０２号及び同第５，３１０，６５２号（すべて参照してここに組み込まれる）に述べられているＰＣＲの変法は、本発明により使用することができる増幅反応の例である。
【００１１】
ここで使用するとき「増幅反応試薬」の語句は、核酸増幅反応における使用が周知である試薬を意味し、単一又は多重試薬（単数）、試薬（複数）、酵素（単数）あるいは別々に又は個々に逆転写酵素、ポリメラーゼ、及び／又はリガーゼ活性を持つ酵素（複数）；マグネシウム又はマンガンのような酵素補因子；塩；ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）；及び、例えばデオキシアデノシン三リン酸、デオキシグアノシン三リン酸、デオキシシチジン三リン酸及びチミジン三リン酸のようなデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰｓ）を含むが、これらに限定されない。使用する正確な増幅試薬は、用いる個々の増幅反応に基づいて、主として当業者の選択の問題である。
【００１２】
プローブ配列は、それらが標的配列にハイブリダイズし、標的配列の検出を容易にし、典型的にはオリゴヌクレオチドである限り、プライマー配列と同様である。プローブは一般に核酸であるか、又は、例えばメチルホスホネート及びホスホトリエステルのような非荷電アルキル類似体、ペプチド核酸（ＷＯ９３／２５７０６号に開示されているような）、及びモルホリン類似体（米国特許第５，１４２，０４７号、同第５，２３５，０３３号、同第５，１６６，３１５号、同第５，２１７，８６６号及び同第５，１８５，４４４号に開示されているような）のような核酸類似体で構成されうる。さらに、当業者であれば他の目的のために他のヌクレオチドをプローブに付加できるので、プローブという語は、あらかじめ定められた又はその標的配列にハイブリダイズするように設計された核酸配列の部分又は連続するヌクレオチド群を意味することが意図されている。例えば、そのようなプローブの伸長又は尾部は一般にプローブの検出又は精製のために付加される。
【００１３】
プローブは対で提供され、特定対の各々のプローブはその対の他の成員にハイブリダイズする。プローブは、しかし、互いに完全に相補的ではない、すなわちそれは、各プローブ上に少なくとも１個の不適正塩基対が存在することを意味する。「不適正塩基対」（場合によって簡単に「ミスマッチ」と称される）は、１つのプローブ上の１個又はそれ以上ヌクレオチドが、他方のプローブ上の１個又はそれ以上の対応するヌクレオチドと典型的なワトソン−クリック式に水素結合していないことを意味する。一般に、プローブは、それらが互いに対して相補的であるよりも、それらのそれぞれの標的配列に対してより相補的である。好ましくは、しかしながら、プローブは、異なる標的配列に対して完全に相補的であるように設計され、それ故個々のプローブ上の各々のヌクレオチドは、その標的配列上に、プローブをその標的と完全に相補的にする、対応する相補的ヌクレオチドを見出す。
【００１４】
プローブがとりうる立体配置は数多く存在し、正確なプローブの立体配置は主として選択する個々の標的配列に依存する。特に、プローブを部分的に非相補的にするプローブ間のミスマッチは、いかなる部位でも起こることがあり、プローブの長さに依存していかなる範囲もとりうる。しかしながら、プローブは、それらのそれぞれの標的配列がなければ外界温度（例えば１５℃から３０℃）で互いにハイブリダイズするが、標的配列があればそれぞれの標的配列に優先的に結合するように立体配置されているべきである。プローブは、周知のハイブリダイゼーション原理又はアニーリング反応速度論を用いて、外界温度で互いにハイブリダイズするが、標的配列が存在するときには標的配列に優先的に結合するように設計することができる。ハイブリダイゼーションは、温度、イオン強度、配列長、相補性、及び配列のＧ：Ｃ含量を含めたいくつかのパラメータにかなり予測可能に依存する。例えば、相補的核酸配列の環境温度を低下させればアニーリングが促進される。所与のセットの配列について、融点又は「Ｔｍ」はいくつかの既知の方法によって評価することができる。小さなカチオンがホスホジエステル骨格上の負電荷を無効にすることによって複製の形成を安定化する傾向があるので、イオン強度又は「塩」濃度も融点に影響を及ぼす。典型的な塩濃度はカチオンの性質と原子価に依存することは、当業者には容易に理解される。同様に、Ｇ：Ｃ含量が高く及び配列が長い場合、Ａ：Ｔ対が二個の水素結合だけであるとＧ：Ｃ対は３個の水素結合を含み、またより長い配列は配列を保持しうるより多くの水素結合を持つので、複製の形成を安定化させることが知られている。それ故、Ｇ：Ｃ含量が高く、長い配列が長ければ、Ｔｍが上昇し、ハイブリダイゼーション条件に影響を及ぼす。
【００１５】
所与のセットの標的配列についてプローブが選択されれば、Ｇ：Ｃ含量と長さが既知となり、どのようなハイブリダイゼーション条件を含むかを正確に決定する際の根拠となりうる。イオン強度は典型的には酵素活性に合わせて至適化されるので、その次に最も明らかな多様なパラメータは温度である。一般に、ハイブリダイズするプローブのＴｍは、プローブとそれぞれの標的配列間で形成されるハイブリッド産物のＴｍよりも低い。それ故、当業者にとって適当なプローブ立体配置を得ることは明らかに技術水準の範囲内である。さらに、所与のプローブの立体配置が上記の判定基準に合致するかどうかを判定することは経験的に実施できる。例えば、特定のセットのプローブ及びそれらのそれぞれの標的配列についてのハイブリダイゼーション特性は、プローブの環境温度及びプローブと標的の環境温度を変化させることによって決定できる。一般的に言えば、プローブはそれぞれの標的により相補的であるように選択されるので、相補的プローブは本質的にプローブとそれぞれの標的配列間のＴｍよりも低いＴｍを持つことになる。
【００１６】
プローブの正確な大きさは、主として標的配列及び２個の配列間の変異に関わるヌクレオチドの数に依存する。好ましくは、しかしながら、プローブは１０から１０００ヌクレオチドの長さ、より好ましくは１０から１００ヌクレオチドの長さ、最も好ましくは１０から５０ヌクレオチドの長さである。プローブは、プローブがそれぞれに特異的である２個の標的配列間の変異を含む領域を除いて互いにハイブリダイズする。相補的でないプローブの領域（単数又は複数）も、プローブが外界温度でハイブリダイズしうるために十分に相補的である領域を同時に持つ限り、いかなる長さでもよい。相補的でないプローブの領域はまた、プローブが外界温度で互いにハイブリダイズする限り、プローブ内のいかなる部位にも位置しうる。典型的には、プローブは、例えば１０又はそれ未満のヌクレオチド、より典型的には５未満のヌクレオチド、好ましくは３未満のヌクレオチド、最も好ましくは１ヌクレオチド多型に関わる塩基置換、欠失、又は挿入のような「小さな変異」又は「小さな多型」を含む標的配列にハイブリダイズするために使用される。
【００１７】
また、相補的でないプローブの領域（単数又は複数）はプローブのいかなる領域にも位置しうるが、一方又は両方のプローブが下記で詳述する突出を含む場合を除いて、プローブの５’と３’末端ヌクレオチドの内側にこれらの領域を持つことが好ましい。末端ヌクレオチドは、標的配列にハイブリダイズするように設計されたプローブの各々の末端の最後のヌクレオチドである。より好ましくは、相補的でないプローブの領域（単数又は複数）は、プローブの末端ヌクレオチドと中央ヌクレオチド（単数又は複数）の間に位置する。ここで使用するとき、「中央ヌクレオチド」の語は、個々のプローブの中央に位置するヌクレオチド（単数又は複数）を意味することが意図されている。例えば、５個のヌクレオチドのプローブの場合には、中央ヌクレオチドは５’末端ヌクレオチドから内側に３番目のヌクレオチドになる。６個のヌクレオチドのプローブの場合には、中央ヌクレオチドは５’末端ヌクレオチドから内側に３番目と４番目のヌクレオチドになる。それ故、相補的でないプローブの領域（単数又は複数）は、中央から離れて（例えば１つのプローブの５’末端の近くに）位置することが好ましい。ミスマッチが中央から離れて位置することは、ミスマッチが標的配列間の変異の結果であり、プローブ間の唯一のミスマッチである場合に特に好ましい。
【００１８】
上記を考慮すると、プローブが互いにハイブリダイズするとき、いくつかのプローブ対の立体配置が可能である。好ましくは、プローブは、プローブが互いにハイブリダイズするときプローブの３’末端が相補的プローブの５’末端と完全には整列しない限り、共伸長性（ｃｏ−ｅｘｔｅｎｓｉｖｅ）ではない。言い換えると、一方のプローブが１つの末端で他方よりも長く、これは一般に当該技術において「突出」と称される。それ故、１つのプローブの３’末端の突出は、該プローブが１個又はそれ以上のヌクレオチド分だけその相補的プローブの５’末端を越えて伸長していることを意味する。好ましくは、プローブの一方が３’末端に突出を含む。代替的には、両方のプローブ上に３’突出を持つことが好ましい。
【００１９】
プローブは一般にそれぞれの標的配列に完全に相補的であるように設計されるが、プローブは、プローブ間のミスマッチの数が上記の判定基準に合致するのに十分である（すなわちプローブ外界温度で互いにハイブリダイズするが、それぞれの標的に優先的に結合する）限り、それぞれの標的配列とミスマッチを有しうる。プローブはまた、それらが、例えば標的配列に相補的でない核酸尾部で官能基化されるとき、それぞれの標的配列とミスマッチを有していてもよい。先に述べたように、尾部は典型的には、例えばプローブとそれぞれの標的配列間で形成されるハイブリッドを検出するために使用される。
【００２０】
先に述べたように、プローブは、異なるが関連する標的配列にハイブリダイズする。特に、第一プローブは第一標的配列にハイブリダイズし、第二プローブは、第一標的配列と第二標的配列間の変異の存在を除いて第一標的に相補的である、第一標的配列の変異形態にハイブリダイズする。従って、プローブは、関連標的配列の反対の鎖にハイブリダイズするように設計される。それ故、例えば標的配列が二本鎖である場合には、第一プローブは第一標的配列のセンス鎖に相補的となり、第二プローブは第二標的配列のアンチセンス鎖に相補的となる。さらに、標的配列又はその変異形態が被験試料中に存在しない可能性があるという事実にもかかわらず、プローブは両方の形態の標的配列にハイブリダイズするようにあらかじめ設計される。標的配列の変異形態は、例えば、第一標的配列と、１個又はそれ以上のヌクレオチド置換、欠失、及び／又は挿入を含む同じ配列を含みうる。それ故、例えば、標的配列が一塩基対置換のような一ヌクレオチド多型を除いて同じであるとき互いにハイブリダイズする場合、一対のプローブは一ヌクレオチドミスマッチを含みうる。
【００２１】
ここで提供するプローブを用いて様々な標的配列及びそのような標的配列の変異を検出することができる。例えば、プローブが相補的であるそれぞれの標的配列は、一本鎖ＲＮＡウイルスゲノム及びその特定ウイルスゲノムの変異体又は突然変異株からのものでありうる。特に、第一プローブは、通常生じるような一本鎖ゲノムの領域に相補的であり、第二プローブは、一塩基対置換のような突然変異を含む同じゲノムの反対の鎖に相補的でありうる。この特定の場合、ＲＮＡが最初にＤＮＡに逆転写され、第二プローブがハイブリダイズする鎖は、ＲＮＡゲノムから逆転写されたｃＤＮＡ鎖の増幅の結果として存在することは明白であろう。さらに、この実施形態によると、ウイルスの１つのバージョンだけが被験試料中に存在する可能性がある。従って、１個のプローブだけがその標的にハイブリダイズするであろう。
【００２２】
代替的に、原標的配列をヒトゲノムから誘導することができる。この場合、第一プローブは遺伝子（「野生型配列」）のセンス鎖に相補的であり、第二プローブは２つの一塩基置換を含む同じ遺伝子（「突然変異体配列」）のアンチセンス鎖に相補的でありうる。個々の試料の遺伝子型に依存して、遺伝子型が野生型配列についてホモ接合であれば第一プローブだけがその標的にハイブリダイズし、ゲノムがヘテロ接合であれば第一と第二プローブの両方がそれらの標的にハイブリダイズし、ゲノムがホモ接合突然変異体であれば第二プローブだけがハイブリダイズすることになる。
【００２３】
プライマー及び／又はプローブ配列は、標的配列とプローブ間で形成されるハイブリッドを検出するために周知の標識又は標識化学のいずれかを用いて標識することができ、主として当業者が選択しうる。配列を標識するための手法は周知であり、例えば、いずれも参照してここに組み込まれる、米国特許第４，７６２，７７９号及び同第４，９８９，８８２号に述べられている手法を含む。典型的には、プライマー及びプローブ配列は、標的配列と相補的プローブ間で形成されるハイブリッド（単数又は複数）が識別できるように標識される。言い換えると、相補的プローブは、第一プローブ／標的配列ハイブリッドが第二プローブ／標的配列ハイブリッドから識別できるように標識される。上記の識別を行うための様々な立体配置が周知であり、検出装置の選択に基づいてやはり当業者が選択しうる。
【００２４】
ここで使用する「標識」の語は、検出可能な特性又は特徴を有する分子又は部分を意味する。標識は、例えば放射性同位元素、発蛍光団、化学発光団、酵素、コロイド粒子、蛍光微粒子等の場合のように直接検出可能であるか、又は例えば特異的結合成員の場合のように間接的に検出することができる。直接検出可能な標識は、標識の検出を可能にするための、例えば基質、誘因となる試薬、光等のような付加成分を必要とする場合があることは明白であろう。間接的に検出可能な標識を使用するときには、典型的には「コンジュゲート」との組合せで使用する。コンジュゲートは、典型的には直接検出可能標識に付着した又は結合した特異的結合成員である。コンジュゲートを合成するためのカップリング化学は当該技術において周知であり、例えば特異的結合成員の特異的結合特性又は標識の検出可能な特性を失わず、何らかの化学的手段及び／又は物理的手段を含みうる。ここで使用するとき、「特異的結合成員」は、結合対の成員、すなわち一方の分子が、例えば化学的又は物理的手段を通して他方の分子に特異的に結合している２個の異なる分子の成員を意味する。抗原と抗体の特異的結合対に加えて、他の特異的結合対には、アビジンとビオチン、ハプテンとハプテンに特異的な抗体、相補的核酸又は核酸類似体配列、等が含まれる、これらに限定されることを意図しない。
【００２５】
相補的プローブとそれらのそれぞれの標的配列との間で形成されるハイブリッドを検出するために使用できる検出プラットフォームは、当該技術において周知の均質又は不均質手法のいずれかを含む。均質検出プラットフォームの例は、標的配列の存在下でシグナルを発する、プローブに結合したＦＲＥＴ標識の使用を含む。米国特許第５，２１０，０１５号（参照してここに組み込まれる）に述べられている、いわゆるＴａｑＭａｎアッセイは、核酸配列を均質に検出するために使用できる手法の例である。簡単に述べると、例えばＴａｑＭａｎ様式により、１個のプローブを、第一波長でシグナルを発する第一発蛍光団と、第一発蛍光団からのシグナルをクエンチングすることができる適切なクエンチング単位で標識することができる。第二プローブは、第二波長でシグナルを発する第二発蛍光団と、第二発蛍光団からのシグナルをクエンチングすることができる適切なクエンチング単位で標識することができる。ＴａｑＭａｎ型アッセイの原理によると、プローブは、５’から３’へのエキソヌクレアーゼ活性を持つ酵素を用いた増幅反応の際にそれぞれの標的の存在下で開裂する。結果として、標的の存在に依存して２つの異なるシグナルが検出できるか又は全くシグナルが検出できない。
【００２６】
不均質様式は、典型的には増幅した配列を、標的配列を増幅する及び／又は検出するために用いた他の物質から分離するための捕獲試薬を用いる。捕獲試薬は典型的には、同じか又は異なる結合成員に特異的な１又はそれ以上の特異的結合成員で被覆した保持体物質である。ここで使用するとき「保持体」は、不溶性であるか又はその後の反応によって不溶性にすることができる物質を指す。保持体物質は、それ故、ラテックス、プラスチック、誘導体化プラスチック、磁性又は非磁性金属、ガラス又はシリコン表面あるいは試験管の表面、マイクロタイタープレート、シート、ビーズ、微粒子、チップ、及び当業者に既知の他の形状でありうる。例示的な捕獲試薬は、一般に空間的に規定された方法で保持体物質に固定されたオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドを含むアレイを包含する。
【００２７】
例えば、それぞれの標的配列にハイブリダイズしたプローブを検出するために使用できる不均質様式は、第一及び第二結合成員で標識された第一及び第二プローブを含みうる。それぞれの標的配列を増幅するために用いるプライマーを第三の結合成員で標識することができる。標的配列が存在する場合、ひとたびプローブが標的配列にハイブリダイズして標的配列／プローブハイブリッドを形成すれば、プライマー配列に結合した第三結合成員を用いてハイブリッドを保持体に固定することができる。所望する場合には、保持体を洗って過剰の試薬を除去し、ハイブリッドが存在する場合には、異なる直接検出可能な標識を有するコンジュゲートを用いてハイブリッドを検出することができる。固相に結合したシグナルを、もし存在する場合には、検出して被験試料中の標的配列の存在を示すことができる。
【００２８】
好ましい実施形態によると、参照してここに組み込まれる、１９９５年８月１４日出願の米国特許願通し番号第０８／５１４，７０４号に述べられているような「オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションＰＣＲ」（場合によってここでは「ＯＨ  ＰＣＲ」と称する）を用いる。簡単に述べると、好ましい方法において使用する試薬は、プライマー、相補的プローブ、ならびに増幅反応を実施するための増幅試薬を含む。プライマーは標的配列（又はその相補物）のコピーの伸長を開始するために使用し、捕獲標識又は検出標識で標識する。プローブ配列は、プライマーによって生成された配列とハイブリダイズするため、典型的にはプライマーを含まない配列とハイブリダイズするために使用される。プライマーと同様に、プローブも捕獲標識又は検出標識のいずれかで標識するが、但しプライマーが捕獲標識で標識されるときにはプローブは検出標識で標識され、逆もまた同様である。検出標識は先に規定した「標識」と同じ定義を持ち、「捕獲標識」は典型的には伸長産物及びそのような産物に結合したプローブを他の増幅反応物から分離するために使用される。特異的結合成員（先に定義したような）はこの目的に非常に適する。また、この方法により使用されるプローブは、ハイブリダイゼーション条件下で伸長しないように、好ましくはそれらの３’末端で遮断される。プローブの伸長を防ぐための方法は周知であり、当業者の選択の問題である。典型的には、プローブの３’末端にリン酸基を加えればプローブの伸長を遮断するのに十分である。
【００２９】
上記の好ましい実施形態によると、プローブは最初、反応混合物の一部である。さらに、反応混合物を増幅条件下に置いたとき標的配列又はその相補物のコピーがプローブのＴｍより高い温度で産生されるために、プローブ配列がプライマー配列よりも低い融点を持つようにプライマー、プローブ及び増幅条件を選択することが好ましい。そのようなコピーが合成された後、それらを変性し、混合物を冷却してプローブと標的又はその相補物間でハイブリッドを形成させる。変性温度からプローブが一本鎖コピーに結合する温度への温度低下の速度は、好ましくは極めて急速であり（例えば８から１５分間）、特にポリメラーゼ活性を持つ酵素がプライマー伸長のために活性である温度範囲である。そのような急速冷却は、プライマー／コピー配列のハイブリダイゼーション及び伸長よりもコピー配列／プローブのハイブリダイゼーションを促進する。
【００３０】
上記で指摘したように、様々な標的配列及び標的配列の変異形態を１つの反応容器内で検出することができる。例えば、第Ｖ因子ライデン突然変異が起こる、第Ｖ因子をコードする遺伝子の部分、及び第Ｖ因子ライデン突然変異は、それぞれ標的配列及び標的配列の変異形態として使用できるであろう。代替的に、血栓症の原因となる突然変異を含む可能性が高いプロトロンビン遺伝子の３’非翻訳領域及び突然変異を含む同じ領域は、標的配列及び標的配列の変異形態として使用できるであろう。これらの遺伝子の配列及び既知の突然変異に基づき、例えば野生型配列のセンス鎖及び変異体又は突然変異体配列のアンチセンス鎖に完全に相補的なプローブが、上述したような突出を伴って又は突出なしで合成できるであろう。上記の突然変異の性質（すなわち一塩基置換）を考慮すると、そのようなプローブは少なくとも突然変異が起こる１個のミスマッチを有しているが、それでもなお、それぞれの標的配列に優先的にハイブリダイズする一方で、外界温度で互いにハイブリダイズするのに十分に相補的である。第Ｖ因子及び第Ｖ因子ライデン突然変異についての上記判定基準に合致する例示的なプローブ対は、配列番号５と、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、又は配列番号１１のいずれか１つを含む。プロトロンビン遺伝子の３’非翻訳領域及びプロトロンビン遺伝子の３’非翻訳領域の突然変異についての上記判定基準に合致する例示的なプローブ対は、配列番号１６と、配列番号１７、配列番号１８、又は配列番号１９のいずれかを１つを含む。
【００３１】
上記に例示したもの又は上述した判定基準に合致するもののような本発明に従ったプローブ対は、標的配列及びその変異体（例えば、第Ｖ因子遺伝子、又は第Ｖ因子ライデン突然変異を含むと考えられるその部分、及び第Ｖ因子ライデン突然変異を実際に含む部分）を検出するためのアッセイにおいて使用できる。特に、標的配列及び標的配列の変異形態を含むことが疑われる被験試料を１つの反応容器内でプローブ対に接触させることができる。当業者に既知の適当な条件下で、プローブは、それらのそれぞれの標的配列が存在する場合には該標的配列にハイブリダイズして、プローブ標的配列ハイブリッドを形成する。プローブと標的配列間で形成されるハイブリッドを、その後、被験試料中に標的配列が存在することの指標として検出することができる。
【００３２】
標的配列が検出に十分な量だけ存在しないときのように、一部の場合には、プローブを被験試料と接触させる前又は接触させるのと同時に、被験試料にプライマーと増幅試薬を加えてもよい。プローブとそれらがハイブリダイズする標的配列の性質により、しばしば両方の標的配列を増幅するために一組の増幅プライマーを選択することができる。特に、第二標的配列の変異が、もし存在する場合には増幅産物中にも含まれるような様式でプローブが標的配列を増幅するように、プローブを選択することができる。例えば、第Ｖ因子及び第Ｖ因子ライデン突然変異を含む配列を増幅することができるプライマーは、配列番号３及び配列番号４を含む。さらに、プロトロンビン遺伝子の３’非翻訳領域及びプロトロンビン遺伝子の３’非翻訳領域の突然変異を増幅することができるプライマーは、配列番号１４及び配列番号１５を含む。
【００３３】
（実施例）
実施例１
配列
Ａ．ライデン第Ｖ因子配列：下記の実施例は、ＤＮＡオリゴマープライマーとここで提供するプローブを使用した野生型及び突然変異体ライデン第Ｖ因子の検出を示す。これらのＤＮＡプライマー及びプローブは、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０及び配列番号１１として同定される。野生型ライデン第Ｖ因子の代表的配列の一部をここでは配列番号１と称し、突然変異体ライデン第Ｖ因子の同様の代表的配列の一部をここでは配列番号２と称する。配列番号２は、突然変異体ライデン第Ｖ因子を野生型と区別する点突然変異である１個の塩基においてのみ配列番号１と異なる。配列番号３と配列番号４は、野生型と突然変異体ライデン第Ｖ因子の両方で認められる領域に特異的である。配列番号５は野生型ライデン第Ｖ因子においてのみ認められる領域に特異的である。配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０及び配列番号１１は、突然変異体ライデン第Ｖ因子においてのみ認められる領域に特異的である。
【００３４】
下記の実施例では、配列番号３と配列番号４を野生型と突然変異体ライデン第Ｖ因子の両方についての増幅プライマーとして使用する。配列番号５を野生型ライデン第Ｖ因子増幅産物についての内部ハイブリダイゼーションプローブとして使用する。配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０及び配列番号１１を突然変異体ライデン第Ｖ因子増幅産物についての内部ハイブリダイゼーションプローブとして使用する。
【００３５】
Ｂ．プロトロンビン配列：下記の実施例は、ＤＮＡオリゴマープライマーとここで提供するプローブを使用した野生型及び突然変異体プロトンビン遺伝子の検出を明らかにする。これらのＤＮＡプライマー及びプローブは、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９及び配列番号２０として同定される。野生型プロトンビン遺伝子の代表的配列の一部をここでは配列番号１２と称し、突然変異体プロトンビン遺伝子の同様の代表的配列の一部をここでは配列番号１３と称する。配列番号１３は、突然変異体プロトンビン遺伝子を野生型と区別する点突然変異である１個の塩基においてのみ配列番号１２と異なる。配列番号１４と配列番号１５は、野生型と突然変異体プロトンビン遺伝子の両方で認められる領域に特異的である。配列番号１６は野生型プロトンビン遺伝子においてのみ認められる領域に特異的である。配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９及び配列番号２０は、野生型プロトンビン遺伝子においてのみ認められる領域に特異的である。
【００３６】
下記の実施例では、配列番号１４と配列番号１５を野生型と突然変異体プロトンビン遺伝子の両方についての増幅プライマーとして使用する。配列番号１６を突然変異体プロトンビン遺伝子増幅産物についての内部ハイブリダイゼーションプローブとして使用する。配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９及び配列番号２０を野生型プロトンビン遺伝子増幅産物についての内部ハイブリダイゼーションプローブとして使用する。
【００３７】
実施例２
プライマーとプローブの調製
Ａ．野生型及び突然変異体ライデン第Ｖ因子プライマー：野生型と突然変異体ライデン第Ｖ因子の両方の標的配列をオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションＰＣＲによって検出するためにプライマーを設計した。これらのプライマーは配列番号３と配列番号４であった。標準的なオリゴヌクレオチド合成法を用いてプライマー配列を合成した。配列番号４のプライマーを、参照してここに組み込まれる米国特許第５，４２４，４１４号に述べられているような標準的シアノエチルホスホルアミダイトカップリング化学を用いて５’末端でカルバゾールによってハプテン化した。
【００３８】
Ｂ．野生型及び突然変異体ライデン第Ｖ因子プローブ：オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションによって野生型又は突然変異体ライデン第Ｖ因子の増幅した標的配列とハイブリダイズするためのプローブを設計した。これらのプローブは、野生型ライデン第Ｖ因子については配列番号５、突然変異体ライデン第Ｖ因子については配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０及び配列番号１１であった。プローブ配列は標準的なオリゴヌクレオチド合成法を用いて合成した。配列番号５の野生型プローブを５’末端でアダマンタンによってハプテン化し、次に１０個のチミジンで処理し、３’末端でリン酸によって遮断した。配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０及び配列番号１１突然変異体プローブを、５’末端でダンシルによってハプテン化し、次に１０個のチミジンで処理し、３’末端でリン酸によって遮断した。合成はすべて、米国特許第５，４６４，７４６号（参照してここに組み込まれる）に述べられているような標準的シアノエチルホスホルアミダイトカップリング化学を使用した。
【００３９】
Ｃ．野生型及び突然変異体プロトロンビンプライマー：野生型と突然変異体プロトロンビン遺伝子の両方の標的配列をオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションＰＣＲによって検出するためにプライマーを設計した。これらのプライマーは配列番号１４と配列番号１５であった。標準的なオリゴヌクレオチド合成法を用いてプライマー配列を合成した。配列番号１４のプライマーを、参照してここに組み込まれる米国特許第５，４２４，４１４号に述べられているような標準的シアノエチルホスホルアミダイトカップリング化学を用いて５’末端でカルバゾール又はアダマンタンのいずれかによってハプテン化した。配列番号１５のプライマーを同じ方法によって５’末端でアダマンタンによってハプテン化した。
【００４０】
Ｄ．野生型及び突然変異体プロトロンビンプローブ：オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションによって野生型又は突然変異体プロトロンビン遺伝子の増幅した標的配列とハイブリダイズするためのプローブを設計した。これらのプローブは、突然変異体プロトロンビン遺伝子については配列番号１６、野生型プロトロンビン遺伝子については配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９及び配列番号２０であった。プローブ配列は標準的なオリゴヌクレオチド合成法を用いて合成した。配列番号１６の突然変異体プローブを、３’末端で２カルバゾールによってハプテン化するか、又は５’末端で２ダンシルによってハプテン化し、次に１０個のチミジンで処理して、３’末端でリン酸によって遮断した。配列番号１７、配列番号１８及び配列番号１９の野生型プローブを、５’末端で２アダマンタンによってハプテン化し、次に１０個のチミジンで処理して、３’末端でリン酸によって遮断した。別途に、配列番号１７と配列番号２０の野生型プローブを３’末端で２カルバゾールによってハプテン化した。合成はすべて、米国特許第５，４６４，７４６号（参照してここに組み込まれる）に述べられているような標準的シアノエチルホスホルアミダイトカップリング化学を使用した。
【００４１】
実施例３
試料の調製
野生型、ヘテロ接合及びホモ接合突然変異体ライデン第Ｖ因子及びプロトロンビンＤＮＡを、ＱＩＡａｍｐ（登録商標）  Ｂｌｏｏｄ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（キアゲン・インク、ヴァレンシア、カリフォルニア）の核酸抽出手順とカラム法を用いて製造者が説明しているように各々の全血試料２００μｌから精製した。ＤＮＡ試料は同時に、両方の遺伝子についての野生型、ヘテロ接合又はホモ接合突然変異体であった。すべての試料の遺伝子型を配列決定によって確認した。分光光度計を用いて２６０ｎｍで吸光度を読み取ることにより、精製したＤＮＡを定量した。精製ＤＮＡの最終濃度は５０から２５ｎｇ／μｌの範囲内であった。
【００４２】
実施例４
オフセットプローブを使用した突然変異体対野生型ライデン第Ｖ因子の検出
野生型ライデン第Ｖ因子から突然変異体を区別する一塩基対突然変異を検出するために使用したプローブは、それぞれセンス鎖プローブとアンチセンス鎖プローブであり、従って一塩基対ミスマッチを除いて互いの正確な相補物である。それ故それらはまた、それらの特異的標的増幅ＤＮＡとではなく互いとハイブリダイズしうる。プローブを互いからわずかにオフセットすることはそれらの間でのハイブリダイゼーションを最小限に抑えるのに役立つであろうと仮定した。各々のプローブの５’末端から２個の塩基を欠失させることによってこれを試験した。
【００４３】
精製した野生型、ヘテロ接合及びホモ接合突然変異体ライデン第Ｖ因子／プロトロンビンＤＮＡ試料の各々のデュープリケートをＰＣＲ増幅し、配列番号５の野生型プローブと配列番号６の突然変異体プローブと共に配列番号３及び配列番号４のプライマーを使用して検出した。ＰＣＲは、５０ｍＭ  Ｂｉｃｉｎｅ（Ｎ，Ｎ−ビス［２−ヒドロキシエチル］グリシン）、ｐＨ８．１、１５０ｍＭカリウム、８％ｗ／ｖグリセロール、０．００１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ及び０．０２％アジ化ナトリウムの最終濃度を含む緩衝液中で実施した。各々１５０μＭの最終濃度で存在するｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ及びｄＣＴＰ）と共に、組換えＴｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓポリメラーゼを５単位／反応の濃度で使用した。配列番号３のプライマーは１２０ｎＭの濃度で使用し、配列番号４のプライマー（カルバゾールで標識）は６０ｎＭの濃度で使用した。配列番号５の野生型プローブは４０ｎＭの濃度で存在し、配列番号６の突然変異体プローブは３０ｎＭの濃度で存在した。２０μｌの試料容量に関して、３．２５ｍＭ塩化マンガンの最終濃度を０．２ｍｌの総反応容量中で使用した。
【００４４】
反応混合物をＬＣｘ（登録商標）  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒにおいて増幅した。反応混合物を最初に９７℃で４分間インキュベートし、次いで９４℃で３０秒間、５５℃で４５秒間の４５サイクルのＰＣＲ増幅に供した。反応混合物を熱サイクルに供した後、混合物を５分間９７℃に保持し、温度を１５℃に下げてプローブオリゴハイブリダイゼーションを実施した。試料を少なくとも５分間、その後反応産物を分析し、検出するときまで１２℃に保持した。
【００４５】
反応産物をＡｂｂｏｔｔ  ＬＣｘ（登録商標）システム（Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ａｂｂｏｔｔ  Ｐａｒｋ，ＩＬより入手可能）で検出した。抗カルバゾール被覆微粒子の懸濁液、抗アダマンタン抗体／アルカリホスファターゼコンジュゲート及び抗ダンシル抗体／β−ガラクトシダーゼコンジュゲート（すべてＡｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ａｂｂｏｔｔ  Ｐａｒｋ，ＩＬより入手可能）をＬＣｘ（登録商標）と共に使用して反応産物を捕獲し、検出した。使用した酵素基質は４−メチル−ウンベリフェリルホスフェート（ＭＵＰ）と７−β−Ｄ−ガラクトピラノシルオキシクマリン−４−酢酸−（２−ヒドロキシエチル）アミド（ＡＵＧ）であり、基質から生成物への変換速度を測定し、計数／秒／秒（ｃ／ｓ／ｓ）として報告した。
【００４６】
表１の結果は、野生型プローブはホモ接合野生型及びヘテロ接合ＤＮＡの両方を検出できるが、ホモ接合突然変異体ＤＮＡは検出できないこと（すべて予想されたように）、突然変異体プローブはホモ接合突然変異体又はヘテロ接合ＤＮＡのいずれも検出できないことを示している。
【００４７】
【表１】
2004523221.tif 000002
【００４８】
５’末端の２個の塩基を除去して、脱安定化のためのミスマッチＧと共に（配列番号７、Ａ）又はミスマッチなしで（配列番号１１、Ｅ）３’末端に付加塩基を加えて、あるいは５’末端でさらに２個の塩基を欠失させるが３、４又は５個の塩基を３’末端に加えて（それぞれ配列番号８（Ｂ）、９（Ｃ）又は１０（Ｄ））、突然変異体プローブへの修飾を行った。配列番号５の野生型プローブによる別個の反応において、配列番号６の代わりにこれらの突然変異体プローブの各々を使用して上述した実験手順を反復した。結果を下記の表２に示す。
【００４９】
【表２】
2004523221.tif 000003
【００５０】
すべての突然変異体プローブは先の配列番号６突然変異体プローブよりも良好な成績を示し、ヘテロ接合及びホモ接合突然変異体ＤＮＡの両方を検出する能力を有していた。突然変異体プローブＤを除いて、突然変異体プローブはまた、野生型ＤＮＡを検出しなかったことから、良好な特異性を示した。野生型プローブは引き続き良好な成績を収め、野生型及びヘテロ接合ＤＮＡの両方を検出したが、ホモ接合突然変異体ＤＮＡは検出しなかった。最良のシグナルは、突然変異体プローブＣ（配列番号９）及びＤ（配列番号１０）を用いて達成された。従って、野生型又は突然変異体ライデン第Ｖ因子ＤＮＡを検出するためのプローブの最良の組合せは、５’末端に２塩基の欠失を有する野生型プローブ（配列番号５）と、やはり５’末端に２塩基の欠失を有するが３’末端に４個の付加塩基を含む突然変異体プローブＣ（配列番号９）を使用することであった。これは、野生型と突然変異体ライデン第Ｖ因子配列間の塩基対ミスマッチを中央から５’末端近くに移動させて、塩基対ミスマッチを有効に相殺する。
【００５１】
それ故、概して、オフセットプローブはそれらの適切な増幅標的配列に特異的にハイブリダイズすることができた。
【００５２】
実施例５
突然変異体対野生型プロトロンビンの検出
Ａ．センス鎖プローブの使用：プロトロンビン遺伝子上の野生型対突然変異体多型を検出するための初期実験を、別々の反応において同様のセンス鎖プローブ、一方は突然変異体遺伝子（配列番号１６）についてのプローブ、他方は野生型遺伝子（配列番号２０）についてのプローブを使用して実施した。野生型対突然変異体遺伝子座における一塩基対の相違に加えて、野生型プローブは同時に５’末端に２個の付加塩基対を含んだ。
【００５３】
精製ヘテロ接合及びホモ接合突然変異体ライデン第Ｖ因子／プロトロンビンＤＮＡ試料のデュープリケートをＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｒａｄｅ  Ｗａｔｅｒ（５’−３’，Ｉｎｃ．，Ｂｏｕｌｄｅｒ，ＣＯ）中で１：１００、１：１０００及び１：１０，０００に希釈し、アダマンタンで標識した配列番号１４及び配列番号１５プライマーを用いてＰＣＲ増幅して、別々の反応においてカルバゾール標識した配列番号１６突然変異体プローブ又はカルバゾール標識した配列番号２０野生型プローブを用いて検出した。ＰＣＲは、５０ｍＭ  Ｂｉｃｉｎｅ（Ｎ，Ｎ−ビス［２−ヒドロキシエチル］グリシン）、ｐＨ８．１、１５０ｍＭカリウム、８％ｗ／ｖグリセロール、０．００１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ及び０．０２％アジ化ナトリウムの最終濃度を含む緩衝液中で実施した。各々１５０μＭの最終濃度で存在するｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ及びｄＣＴＰ）と共に、組換えＴｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓポリメラーゼを５単位／反応の濃度で使用した。プライマーは各々２５０ｎＭの濃度で使用し、プローブは各々５ｎＭの濃度で存在した。２０μｌの試料容量に関して、３．２５ｍＭ塩化マンガンの最終濃度を０．２ｍｌの総反応容量中で使用した。２０ｎｇ／μｌのポリ−Ａの対も陰性対照として試験した。
【００５４】
反応混合物をＬＣｘ（登録商標）  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒにおいて増幅した。反応混合物を最初に９５℃で４分間、次に５６℃で３０秒間、さらに９７℃で２分間インキュベートし、その後９５℃で４０秒間、次いで５８℃で６０秒間の４０サイクルのＰＣＲ増幅に供した。反応混合物を熱サイクルに供した後、混合物を７２℃に５分間、次いで９７℃に５分間保持し、２分間温度を１５℃に下げてプローブオリゴハイブリダイゼーションを実施した。その後反応産物を分析し、検出するときまで、試料を４℃に保持した。
【００５５】
反応産物をＡｂｂｏｔｔ  ＬＣｘ（登録商標）システム（Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ａｂｂｏｔｔ  Ｐａｒｋ，ＩＬより入手可能）で検出した。抗カルバゾール被覆微粒子の懸濁液及び抗アダマンタン抗体／アルカリホスファターゼコンジュゲート（すべてＡｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ａｂｂｏｔｔ  Ｐａｒｋ，ＩＬより入手可能）をＬＣｘ（登録商標）と共に使用して反応産物を捕獲し、検出した。使用した酵素基質は４−メチル−ウンベリフェリルホスフェート（ＭＵＰ）であり、基質から生成物への変換速度を測定し、計数／秒／秒（ｃ／ｓ／ｓ）として報告した。
【００５６】
下記の表３からわかるように、突然変異体プローブはヘテロ接合とホモ接合突然変異体試料の両方を検出し、野生型プローブは、ヘテロ接合プローブだけと反応し、ホモ接合突然変異体とは反応しないはずであるにもかかわらず、やはり両方の試料を検出した。それ故、どちらもセンス鎖からのプローブであるこのプローブの組合せは、プロトロンビン遺伝子の突然変異体多型から野生型を区別することができなかった。
【００５７】
【表３】
2004523221.tif 000004
【００５８】
Ｂ．センス対アンチセンスプローブの使用：センス鎖からのプローブはプロトロンビン遺伝子の突然変異体対立遺伝子から野生型を区別することができなかったので、野生型プローブをアンチセンス鎖に移して、これが２つの対立遺伝子の識別を容易にするかどうかを調べた。
【００５９】
この実験は、配列番号２０プローブの代わりにカルバゾール標識した配列番号１７野生型プローブを使用したこと及び試料のデュープリケートを１：１００希釈だけで試験したことを除いて、上記の実施例５．Ａ．で述べたように実施した。熱サイクリング条件も次のように変更した：反応混合物を最初に９７℃で２分間インキュベートし、次いで９５℃で４０秒間、５８℃で６０秒間の４０サイクルのＰＣＲ増幅に供した。反応混合物を熱サイクルに供した後、混合物を５分間９７℃に保持し、２分間温度を１５℃に下げてプローブオリゴハイブリダイゼーションを実施した。その後反応産物を分析し、検出するときまで、試料を１５℃に保持した。
【００６０】
【表４】
2004523221.tif 000005
【００６１】
上記の表４の結果は、野生型プローブをアンチセンス鎖に移すことによって野生型と生じた突然変異体対立遺伝子間の識別が可能になり、野生型プローブが、ホモ接合突然変異体試料に関してよりも、１個の野生型対立遺伝子を含むヘテロ接合試料に関してはるかに高い検出シグナルを示すことを明らかにしている。突然変異体プローブはまた、ヘテロ接合とホモ接合突然変異体試料の両方を検出する能力も保持している。さらに、これらの条件下で突然変異体プローブは、実施例５．Ａ．の実験で認められたものに比べて、１個の突然変異体対立遺伝子だけを含むヘテロ接合試料よりも２個の突然変異体対立遺伝子を含むホモ接合突然変異体試料に関してわずかに高いシグナルを生じる。
【００６２】
Ｃ．オフセットプローブの使用：上記の実施例５．Ｂ．において、センス鎖上の一方のプローブとアンチセンス鎖上の他方のプローブを使用して野生型と突然変異体プロトロンビンの識別が達成されたが、遺伝子型を決定するために試料を１回しかし検査しなくてもよいように、１つの反応混合物中で両方のプローブを組み合わせられることは好都合である。この実験も別々の反応においてセンス（突然変異体）／アンチセンス（野生型）プローブを使用したので、試料の遺伝子型を決定するために各々の試料について２つの試験を実施する必要があった。しかし、センス／アンチセンスプローブは一塩基対ミスマッチを除いて互いの正確な相補物であるので、それらはまた、それらの特異的標的増幅ＤＮＡとではなくお互いとハイブリダイズしうる。これを防ぐのを助けるために熱サイクリング条件を修正し、加えて、ライデン第Ｖ因子プローブに関して使用した、塩基対ミスマッチ付近でプローブを相互からオフセットするという戦略を利用した。
【００６３】
プロトンビン遺伝子の突然変異体対立遺伝子を検出するためのプローブ（配列番号１６）は、上記の実施例５．Ａ．及びＢ．で使用したものと同じであり、中央（１３塩基対のうちの塩基対６）に塩基対ミスマッチを含んだ。３個の野生型プローブをこの突然変異体プローブと共に試験した：野生型プローブＦ（配列番号１９）は一塩基対ミスマッチを除いて突然変異体プローブと相補的であった；野生型プローブＧ（配列番号１７）は３’末端に２個の付加塩基対を含んだ；および野生型プローブＨ（配列番号１８）は３’末端に２個の付加塩基対を含み、５’末端から２個の塩基を欠失しており、各々のプローブの３’末端に２塩基突出を創造していた。
【００６４】
精製野生型、ヘテロ接合及びホモ接合突然変異体ライデン第Ｖ因子／プロトロンビンＤＮＡ試料の各々のデュープリケートをＰＣＲ増幅し、別々の反応において配列番号１４と配列番号１５のプライマー、及び配列番号１６の突然変異体プローブを上述した３個の野生型プローブの各々と共に使用した（すなわち、同じ反応混合物中で突然変異体プローブと野生型プの各々１個を使用した）ことを除いて実施例４におけるように検出した。使用した反応条件は、プライマーとプローブの濃度が次のとおりであったことを除いて、上記の実施例４で述べたとおりであった：配列番号１４のプライマー（カルバゾールで標識）を２００ｎＭの濃度で使用し、配列番号１５のプライマーを１５０ｎＭの濃度で使用し、配列番号１６の突然変異体プローブを７０ｎＭの濃度で使用し、配列番号１７（Ｇ）、１８（Ｈ）又は１９（Ｆ）の野生型プローブのいずれかが４５ｎＭの濃度で各反応混合物中に存在した。この実験からの結果を下記の表５に示す。
【００６５】
【表５】
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【００６６】
すべての野生型／突然変異体プローブ対が適切な野生型又は突然変異体対立遺伝子の特異的検出を示し、野生型プローブは、ホモ接合野生型とヘテロ接合プロトロンビン試料を検出したが、ホモ接合突然変異体プロトンビンＤＮＡを陽性として検出しなかった。突然変異体プローブは、ホモ接合突然変異体とヘテロ接合プロトロンビン試料を検出したが、ホモ接合野生型プロトンビン試料を陽性として検出しなかった。予想されたように、ヘテロ接合試料は１個の野生型と１個の突然変異体対立遺伝子を含むので、すべてのプローブが用量依存的にヘテロ接合試料を検出した。従って、すべてのプローブが高い特異性を示した。
【００６７】
突然変異体プローブに完全に相補的である（一塩基対ミスマッチを除いて）野生型プローブ（Ｆ）は機能したが、ホモ接合野生型試料に関して最も低いシグナルを生じた。野生型対立遺伝子を検出する際に最良のシグナルを示した野生型プローブは突然変異体プローブＨ（配列番号１８）であり、両方の末端に２塩基対突出を生じるプローブの組合せであった。このプローブの組合せはまた、突然変異体と野生型陽性シグナル間の最良のバランス（等価性）を示した。
【００６８】
特定実施形態を参照して本発明を詳細に説明したが、本発明の精神と範囲から逸脱することなくそのような実施形態に様々な変更と修正を加えることは当業者には明白である。
【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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