(57)【要約】本発明は、前癌性または癌性の増殖（頸部内皮新形成（ＣＩＮ）を含む）の発達または再発に関して、ＨＰＶに感染した患者の予後を診断するために、その患者における細胞媒介性応答を評価するための、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）由来のＥ６ペプチドおよび／またはＥ７ペプチドの使用に関する。１つの実施形態において、本発明のペプチドの使用は、以下：ａ）ＨＰＶのＥ６ペプチドまたはＥ７ペプチドのうち少なくとも１つを、患者由来のサンプルと共にインキュベートする工程；およびｂ）サンプルをペプチドに対する細胞媒介性免疫応答についてアッセイする工程、を包含する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）に感染している患者またはＨＰＶに感染している疑いのある患者における前癌性または癌性の増殖の再発の可能性を決定する方法であって、ここで、該患者はまた、頸部上または頸部周辺の前癌性または癌性の増殖を有するか、または有していたことがあり、該方法は、以下：
ａ）ＨＰＶのＥ６ペプチドまたはＥ７ペプチドのうち少なくとも１つを、該患者由来のサンプルと共にインキュベートする工程；および
ｂ）該サンプルを該ペプチドに対する細胞媒介性免疫応答についてアッセイする工程、
を包含する、方法。
【請求項２】
前記サンプルが、少なくとも２つのＥ６ペプチドまたは少なくとも２つのＥ７ペプチドと共にインキュベートされる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記サンプルが、ＨＰＶのＥ６ペプチドと共にインキュベートされる、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記Ｅ６ペプチドがＫ９Ｌ、Ｅ１０Ｉ、Ｃ１０Ｒ、Ｑ１５Ｌ、Ｖ１０Ｃ、Ｐ９Ｌ、Ｐ１０Ｉ、Ｑ２０Ｐ、Ｒ１６Ｒ、またはＧ１０Ｓである、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記Ｅ６ペプチドが、Ｋ９Ｌ、Ｅ１０Ｉ、Ｃ１０Ｒ、Ｑ１５Ｌ、Ｖ１０Ｃ、またはこれらの組み合わせである、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記サンプルが、ＨＰＶのＥ７ペプチドと共にインキュベートされる、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記Ｅ７ペプチドが、Ｔ１０Ｑ、Ｍ９Ｔ、Ｄ９Ｌ、Ｑ１９Ｄ、Ｒ９Ｆ、Ｒ９Ｖ、Ｌ９Ｖ、Ｇ１０Ｃ、またはＤ２０Ｃである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記Ｅ７ペプチドが、Ｑ１９Ｄ、Ｒ９Ｆ、Ｒ９Ｖ、Ｌ９Ｖ、Ｇ１０Ｃまたはこれらの組み合わせである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記サンプルが、少なくとも１つのＥ６ペプチドおよび少なくとも１つのＥ７ペプチドと共にインキュベートされる、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記患者が、ＨＰＶに感染していることが既知である、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記患者がＨＰＶに感染しているか否かを決定する工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記患者が、前癌性増殖を有するか、または有していた、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記前癌性増殖が、頸部上皮内新形成（ＣＩＮ）である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記患者が、もはや前癌性増殖も、癌性増殖も有さない、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記患者が、もはや前癌性増殖を有さない、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記前癌性増殖が、ＣＩＮである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記サンプルが、血液である、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記サンプルが、膣スワブにより得られる、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記サンプルが、末梢血液単核細胞を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
前記サンプルを得た後に、培地中で該サンプルをインキュベートする工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
前記アッセイする工程が、前記サンプルを、前記ペプチドと接触させること、および該サンプルを、Ｔ細胞増殖について測定することを包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
Ｔ細胞増殖が、トリチウム化チミジンの取りこみを測定することによりアッセイされる、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記サンプルが、細胞媒介性免疫応答を示す、２．０以上のＳＩ値を有する、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記サンプルが、細胞媒介性免疫応答を示す、３．０以上のＳＩ値を有する、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記アッセイする工程が、ＴＨ１サイトカインまたはＴＨ２サイトカインの量を測定することを包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項２６】
前記ＴＨ１サイトカインの量が、測定される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記ＴＨ１サイトカインが、ＩＬ−２、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、またはＴＮＦ−βである、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記ＴＨ２サイトカインの量が、測定される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２９】
前記ＴＨ２サイトカインが、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１０、またはＩＬ−１３である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記ＴＨ１サイトカインまたはＴＨ２サイトカインが、イムノアッセイを用いて測定される、請求項２５に記載の方法。
【請求項３１】
前記イムノアッセイが、ＥＬＩＳＡまたは放射免疫アッセイである、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記ＴＨ１サイトカインまたはＴＨ２サイトカインが、フローサイトメトリーにより測定される、請求項２５に記載の方法。
【請求項３３】
前記サンプルが、１回より多くアッセイされる、請求項１に記載の方法。
【請求項３４】
前記サンプルが、種々のアッセイを用いてアッセイされる、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記患者から第二のサンプルを得る工程、および該第二のサンプルを、少なくとも１つのＨＰＶ  Ｅ６ペプチドまたはＨＰＶ  Ｅ７ペプチドに対する、細胞媒介性免疫応答についてアッセイする工程をさらに包含する、請求項に記載の方法。
【請求項３６】
前記サンプルが、前癌性または癌性の増殖の処置の少なくとも１ヶ月後の患者から得られる、請求項１に記載の方法。
【請求項３７】
前記患者が、尿生殖路における前癌性または癌性の増殖の切除処置を受けている、請求項１に記載の方法。
【請求項３８】
前癌性または癌性の増殖の再発の危険性のあるＨＰＶに感染した患者を同定する方法であって、該方法は、以下：
ａ）該患者由来の血液サンプルを、Ｅ６ペプチドまたはＥ７ペプチドと共にインキュベートする工程；
ｂ）該サンプルを、該ペプチドに対する細胞媒介性免疫応答について評価する工程、
を包含する、方法。
【請求項３９】
前記Ｅ６ペプチドまたはＥ７ペプチドがＫ９Ｌ、Ｅ１０Ｉ、Ｃ１０Ｒ、Ｑ１５Ｌ、Ｖ１０Ｃ、Ｐ９Ｌ、Ｑ２０Ｐ、Ｐ１０Ｉ、Ｒ１６Ｒ、Ｇ１０Ｓ、Ｔ１０Ｑ、Ｍ９Ｔ、Ｄ９Ｌ、Ｑ１９Ｄ、Ｒ９Ｆ、Ｒ９Ｖ、Ｌ９Ｖ、Ｇ１０Ｃ、またはＤ２０Ｃのアミノ酸配列を有する、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記ヒトパピローマウイルスが高いグレードの型である、請求項１に記載の方法。
【請求項４１】
前記ヒトパピローマウイルスが、ＨＰＶ１６である、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
ＨＰＶに感染し、そして該増殖について処置された患者における前癌性または癌性の増殖の再発を予防するための方法であって、該方法は、以下：
ａ）ＨＰＶ関連性の前癌性または癌性の増殖の再発の危険性のある患者を同定する工程；および
ｂ）該患者に、有効量の少なくとも１つのＥ６  ＨＰＶペプチドまたは少なくとも１つのＥ７  ＨＰＶペプチドを投与して、該ペプチドに対する細胞媒介性免疫応答を誘導する工程、
を包含する方法。
【請求項４３】
ＨＰＶに罹患し、そして該増殖について処置された患者における前癌性または癌性の増殖の再発の可能性を決定するためのキットであって、該キットは、適切な容器手段中に、少なくとも１つのＥ６  ＨＰＶペプチドまたは少なくとも１つのＥ７  ＨＰＶペプチド、抗体、および検出試薬を含む、キット。
【請求項４４】
前記キットが、少なくとも１つのＥ６ペプチドを含む、請求項４３に記載のキット。
【請求項４５】
前記Ｅ６ペプチドが、Ｋ９Ｌ、Ｅ１０Ｉ、Ｃ１０Ｒ、Ｑ１５Ｌ、Ｖ１０Ｃ、Ｐ９Ｌ、Ｐ１０Ｉ、Ｑ２０Ｐ、Ｒ１６Ｒ、またはＧＳ１０Ｓである、請求項４４に記載のキット。
【請求項４６】
前記キットが、少なくとも１つのＥ７ペプチドを含む、請求項４３に記載のキット。
【請求項４７】
前記Ｅ７ペプチドが、Ｔ１０Ｑ、Ｍ９Ｔ、Ｄ９Ｌ、Ｑ１９Ｄ、Ｒ９Ｆ、Ｒ９Ｖ、Ｌ９Ｖ、Ｇ１０ＣまたはＤ２０Ｃである、請求項４６に記載のキット。
【請求項４８】
前記抗体が、ＴＨ１サイトカインに対して指向される（対する抗体である）、請求項４３に記載のキット。
【請求項４９】
前記抗体が、ＴＨ１サイトカインレセプターに対して指向される、請求項４３に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の背景）
本願は、２００１年７月２０日に出願された米国仮特許出願第６０／３０６，８０９号（本明細書中にその全体が参考として援用される）に対する優先権を主張する。合衆国政府は、国立癌研究所からの助成金番号ＣＡ６５５６１およびＣＡ７７３７８ならびに国立衛生研究所からの助成金番号ＣＡ１６６７２に従い、本発明における権利を有し得る。
【０００２】
（１．発明の分野）
本発明は、一般に、免疫学、ウイルス学、および腫瘍学の分野に関する。より詳細には、本発明は、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）により引き起こされる、前癌性増殖および癌性の増殖または病変（頸部上皮内新形成（ＣＩＮ））の発生および再発に関する診断方法および治療方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
（関連分野の説明）
頸部癌は、世界中の女性における２番目に最も一般的な悪性疾患であり、女性において診断された全ての癌の１５％を占める（Ｐａｒｋｉｎら、１９９３）。合衆国において、頸部癌は、女性の生殖管の最も一般的な新生物の１つである。実験室的研究および表皮学的研究は、頸部新形成の病因論における、いくつかの型のヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）の病因論的役割に集中した（Ｂｒｉｎｔｏｎ、１９９２；Ｍｕｎｏｚら、１９９２）。概して、ＨＰＶ  ＤＮＡは、明確な頸部疾患を有する女性の検体の７９％より多くにおいて検出されてきた。最も優勢なＨＰＶの型は、ＨＰＶ１６であり、これは、高いグレードの扁平上皮内の病変および扁平上皮癌において検出される（Ｌｏｅｒｉｎｃｚら、１９９２）。上皮学的研究の結果は、頸部新形成とＨＰＶとの間の関連を支持し、これは、１６型ＨＰＶと非常に強く関連する（Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、１９９１；Ｋｏｕｔｓｋｙら、１９９２；およびＭｕｎｏｚら、１９９２）。新形成は、細胞の異常な増殖により特徴付けられ、これは、しばしば、正常な組織の浸潤（例えば、原発性腫瘍または離れた器官への拡散（例えば、転移））  を生じる。
【０００４】
ＨＰＶ１６のＥ６遺伝子およびＥ７遺伝子は、頻繁に、同時発現され、そしてＨＰＶ１６陽性頸部癌由来の生検において最も豊富なウイルス転写物である（Ｗｅｔｔｓｔｅｉｎ、１９９０；Ｓｅｅｄｏｒｆら、１９８７）。Ｅ６オープンリーディングフレームおよびＥ７オープンリーディングフレームの両方の同時発現が、種々の哺乳動物細胞の効率的な悪性トランスフォーメーションのために必要かつ十分であるという強力な証拠が存在する（Ｍｕｎｇｅｒら、１９８９）。さらに、ウイルスゲノムのＥ６領域およびＥ７領域の連続する発現は、悪性表現型を維持するために必要とされるようである（ｖｏｎ  Ｋｎｅｂｅｌ  Ｄｏｅｂｅｒｉｔｚら、１９８８）。
【０００５】
一部のＨＰＶ感染した患者が、頸部新形成を発生させるが、それ以外の患者は、それを発生させない。また、高い比率の自発的後退が観察され、このことは、宿主免疫応答の役割を示す。細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）応答の誘導は、ウイルス感染に対する有意な防御機構を構成し；しばしば、ウイルス特異的ＣＴＬ応答は、随伴性抗体応答を伴わない完全な防御をあたえ得る（Ｓａｓｔｒｙら、１９９２；Ｂｅｖａｎ、１９８９；Ｌｕｋａｃｈｅｒ、１９８４）。抗ＨＰＶ抗体（特に、Ｅ７癌タンパク質に対する抗ＨＰＶ抗体）の増加した有病率と、頸部疾患の重篤さとの関係を記載する文献における報告（Ｃａｓｏｎら、１９９２；Ｈａｍｓｉｋｏｖａら、１９９４；Ｊｈａら、１９９３）に基づき、ＨＰＶ特異的体液性応答が、ＨＰＶ関連頸部新形成に対する保護的役割を果たさない可能性があることが示唆されている（Ｎａｋａｇａｗａら、１９９６）。一方、ＣＭＩに欠損を有する個体が、ヒトにおけるＨＰＶ関連頸部新形成の増加した有病率を有することが報告されており、このことは、Ｔ細胞が、ＨＰＶ関連新形成の制御に関与することを示している（Ｎａｋａｇａｗａら、１９９６；Ｔｓｕｋｕｉら、１９９６；Ｆｅｌｔｋａｍｐら、１９９３およびＣｌｅｒｉｃｉら、１９９７）。減少したＩＬ−２産生およびマイトジェン（例えば、ＰＨＡおよびコンカナバリン−Ａ）に対する増殖応答が、浸潤性頸部癌を有する患者において観察されている（Ｐａｒｋら、１９９２）。マウスおよびヒトにおいてＴ細胞活性を誘導するＨＰＶ−１６Ｅ６タンパク質、ＨＰＶ−１６Ｅ７タンパク質、およびＬ１タンパク質由来のペプチドを同定するための、多数のインビトロおよびインビボでの戦略が、記載されている（Ｆｅｌｔｋａｍｐら、１９９３；Ｓｔｒａｎｇら、１９９０；Ｔｉｎｄｅｌら、１９９１；Ｓｈｅｐｈｅｒｄら、１９９２；Ｓｔａｕｓｓら、１９９２；Ｋａｓｔら、１９９３）。代表的に、ウイルス特異的ＣＴＬの誘導が、ウイルス性遺伝子産物を発現するウイルスまたは組み替えウイルスを用いた感染によりもたらされ得る。ウイルス性遺伝子産物が、プロセシングされ、そしてＣＴＬによる認識について、ＭＨＣクラスＩ分子と会合して、感染した細胞の表面上のペプチドとして提示される（Ｕｎａｎｕｅ、１９８９）。
【０００６】
さらに、精力的な研究が、ウイルス特異的ＣＴＬ応答を誘発するＨＩＶペプチドを同定および特徴付けることに集中された。Ｔｏｗｎｓｅｎｄらは、ワクチン候補物としてのタンパク質におけるＴ細胞エピトープを用いることの概念を例示し、この時、彼らのグループは、ＣＴＬ応答についてのエピトープとしてのインフルエンザ核タンパク質由来の短い合成ペプチドの使用を示した（Ｔｏｗｎｓｅｎｄら、１９８６）。本発明者ら等は、インフルエンザウイルス、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス、センダイウイルスおよびＨＩＶに対するウイルス特異的ＣＴＬをインビボで産生するために合成ペプチドを使用することを報告した（Ｋａｓｔら、１９９１；Ａｉｃｈｅｌｅら、１９９０；Ｄｅｒｅｓら、１９８９；Ｓａｓｔｒｙら、１９９２；Ｓａｓｔｒｙら、１９９４；Ｃａｓｅｍｅｎｔら、１９９５）。
【０００７】
９０％を超える頸部癌は、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）のＥ６タンパク質およびＥ７タンパク質を発現する。これらの特有の抗原は、抗腫瘍免疫治療のための細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）の発生についての理想的な標的である。インビボでＨＰＶ特異的ＣＴＬ応答の関与に有効であったＨＰＶ−１６のＥ６癌タンパク質およびＥ７癌タンパク質に対応する合成ペプチドが同定されている（Ｓａｒｋａｒら、１９９５）。最近、Ｎａｋａｇａｗａらは、ＨＰＶ−１６ペプチドおよびＨＰＶ−１６タンパク質に対する全身性のＴ細胞増殖応答およびＣＴＬ応答が、頸部病変を有さない多数の純潔の女性および性的に活動的な女性において、検出可能であったが、活性な疾患を有する女性において検出されなかったことを報告した（Ｎａｋａｇａｗａら、１９９７）。同様に、Ｔｓｕｋｕｉらは、ＨＰＶ抗原に対するＴＨリンパ球応答（特にＩＬ−２産生）が、細胞学的に正常な女性において、種々の程度の進行性頸部新形成を有する女性においてよりも強かったことを報告した（Ｔｓｕｋｕｉら、１９９６）。また、Ｃｌｅｒｉｃｉらは、ＣＭＩを潜在的に増強するＴＨ１サイトカイン（ＩＬ−２およびＩＦＮ−γ）の産生が、広範なＨＰＶ感染を有する女性において欠損していること、ならびにＣＩＮへの進行が、ＴＨ１サイトカイン産生からＴＨ２サイトカイン産生への移行に関連することを観察した（Ｃｌｅｒｉｃｉら、１９９７）。ＴＨ活性を決定するために、長期にわたりインビトロでの刺激プロトコルを使用し、Ｋａｄｉｓｈらは、特定のＨＰＶペプチドに対するリンパ球増殖応答が、ＨＰＶクリアランスおよびＣＩＮへの後退に関連したことを報告した（Ｋａｄｉｓｈら、１９９７）。一方、ｄｅ  Ｇｒｕｉｊｉｌらは、ＨＰＶ１６  Ｅ７ペプチドに対するＴ細胞増殖応答が、ＨＰＶ感染の存続に相関するが、抗原特異的ＩＬ−２産生は、ウイルスクリアランスおよび頸部病変の進行に関連したことを報告した（ｄｅ  Ｇｒｕｉｊｉｌら、１９９６）。
【０００８】
ＣＩＮ患者のための一般的な臨床管理戦略は、切除（ｅｘｃｉｓｉｏｎａｌ）処置または剥離（ａｂｌａｔｉｖｅ）処置を含む。しかし、追跡調査は、有意な人数の患者が再発を経験することを示している。現在、ＣＩＮについての切除（ｅｘｃｉｓｉｏｎａｌ）処置または剥離（ａｂｌａｔｉｖｅ）処置を受けた患者における前癌性または癌性の増殖の発生、これらの再発、または疾患を有さない状態に関して、明確に理解されていない。ＨＰＶ関連性の前癌性および癌性の増殖および病変の有効な診断のための、より良好かつ改善された戦略が必要とされる。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
（発明の要旨）
本発明は、ＨＰＶのＥ６ペプチドおよび／またはＥ７ペプチドに対するヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）に感染した患者による細胞媒介性免疫（ＣＭＩ）応答が、これらの診断に相関するという観察に基づく。細胞媒介性免疫応答は、尿生殖路（特に頸部）における前癌性増殖および癌性増殖の発生について、細胞媒介性免疫応答を示さない患者についての危険性より減少した危険性を示す；言い換えると、特定のＥ６ペプチドおよび／またはＥ７ペプチドに対する陽性の細胞媒介性免疫応答を示す患者は、ＨＰＶ関連性の前癌性および癌性の増殖の発生に対する良好な予後を有する。あるいは、ＨＰＶのＥ６タンパク質化合物およびＥ７タンパク質性化合物に対してＣＭＩ応答を示さないかまたは低いＣＭＩ応答を示す患者は、ＨＰＶ感染の結果としての生理学的効果に関して、悪性の予後のより高い危険性を有する。従って、本発明は、ＨＰＶ関連性の過剰増殖状態（いぼ、ＣＩＮ、および悪性増殖または他の前癌性もしくは癌性の増殖を含む）の危険性のある患者を同定するための組成物および方法を包含する；本発明は、特に、患者を、過剰増殖状態の再発について評価することに適する。本明細書中で使用される場合、用語「増殖」および「病変」は、互換的に用いられる。また、用語「前癌性または癌性の増殖」とは、ＨＰＶ関連性の増殖をいう。頸部の前癌性または癌性の増殖または病変に加えて、そのような増殖または病変は、尿生殖路を通して生じ得、そしてそれらは、会陰性、外陰性、および陰茎性の増殖または病変を含む。これらの方法が適用され得る患者としては、ＨＰＶ感染し得る任意の哺乳動物が挙げられる；いくつかの実施形態において、患者は、特に、ヒト（男性または女性に関わりなく）が企図される。
【００１０】
いくつかの実施形態において、本発明は、ヒトパピローマウイルスに感染した患者における前癌性または癌性の増殖の発生または再発の可能性を決定するための方法を包理する。いくつかの場合において、この患者は、増殖について処置されている。これらの方法は、以下の工程の利用を包含する：患者からサンプルを得る工程；このサンプルを、少なくとも１つのＨＰＶ  Ｅ６ペプチドまたはＨＰＶ  Ｅ７ペプチドと共にインキュベートする工程；およびサンプルを、このペプチドに対する細胞媒介性免疫（ＣＭＩ）応答についてアッセイする工程。Ｅ６ペプチドもしくはＥ７ペプチド、またはこれらの組み合わせに対する細胞媒介性免疫応答は、そのような応答を示さないヒトと比較して減少した再発の危険性を示す。頸部癌の発生と共に頻繁に観察される前癌性の増殖は、頸部上皮内新形成（すなわちＣＩＮ）である。本発明のいくつかの実施形態において、本発明の方法は、任意の病期のＣＩＮ（ＣＩＮ１、ＣＩＮ２、もしくはＣＩＮ３または扁平上皮内病変（ＳＩＬ）、低いグレードのＳＩＬ（Ｌ−ＳＩＬ）および高いグレードのＳＩＬ（Ｈ−ＳＩＬ））を有するかまたはそれらを有していた患者に対して用いられる。さらに、他の実施形態において、これらの方法は、ＣＩＮより重篤な過剰増殖性増殖の病期（例えば、悪性増殖または癌性増殖）を有するかまたは有していた患者で実行され得る。本願において使用される場合、用語「再発」とは、第一の前癌性または癌性の増殖が軽減、排除または処置された後の、前癌性または癌性の増殖の発生、または第一の増殖の再発もしくはその証拠をいう。本明細書中で使用される場合、用語「インキュベートする工程」とは、サンプルを、ペプチドを含む組成物に曝すかまたはそれと接触させる工程をいう。
【００１１】
本願の方法は、ヒトパピローマウイルス感染に対する適用性を有する。ヒトパピローマウイルスは、高いグレードの型または、高い危険性の型（例えば、ＨＰＶ１６、ＨＰＶ１８、ＨＰＶ３１、ＨＰＶ４５、ＨＰＶ５６、またはＨＰＶ５８）であり得る。いくつかの実施形態において、ヒトパピローマウイルスは、ＨＰＶ１６である。他の実施形態において、ヒトパピローマウイルスは、中間の危険性の型（例えば、ＨＰＶ３３、ＨＰＶ３５、ＨＰＶ３７、ＨＰＶ５１、ＨＰＶ５２、ＨＰＶ５９、ＨＰＶ６６、またはＨＰＶ６８）である。なおさらなる実施形態において、ＨＰＶは、低い危険性の型またはいぼに関連する低いグレードの型（例えば、６型、１１型、２６型、４０型、４２型、４３型、４４型、５３型、５５型、６２型、または６６型）である。
【００１２】
このサンプルは、細胞媒介性免疫反応を惹起する細胞を含む。いくつかの実施形態において、このサンプルは血液サンプルまたは血清サンプルであり、一方他の実施形態においては、このサンプルは、感染の疑いのある領域または感染されてることが既知の領域（例えば、膣領域、子宮頸部領域、または陰茎領域）の洗浄、スメアまたはスワブによって得られる。末梢血単球細胞（ＰＢＭＣ）は、細胞媒介性免疫応答を提供し得、そしてこのような細胞を含有する任意のサンプルはまた、本発明の方法において使用され得る。いくつかの実施形態において、サンプル由来の細胞は、それらが入手された後だがそれらがアッセイされる前に、培地中でインキュベートされることが企図される。このサンプルは、１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１１時間、１２時間以上まで、そして１日、２日、３日、４日、５日、６日、または７日まで、そして１週間、２週間、３週間、４週間、または５週間以上まで、そして１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、５ヶ月、６ヶ月、７ヶ月、８ヶ月、９ヶ月、１０ヶ月、１１ヶ月、または１２ヶ月まで、アッセイする前に培地中でインキュベートされ得ることが企図される。これらの細胞は、培地中でインキュベートされ得、そして／またはアッセイする前に０℃以下の条件下で保存され得ることもまた、企図される。これらの細胞自体、または細胞培養物上清（培地であってインタクトな細胞ではない）は、その後の細胞媒介性免疫応答についてのアッセイのために使用され得る。いくつかの実施形態において、これらの細胞は、フローサイトメトリーによる細胞内サイトカイン分析を実施する前に、２時間と８時間との間（いくつかの場合において６時間）、培地中でインキュベートされる。他の実施形態において、これらの細胞は、クロム放出アッセイを実施して細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）活性を決定する前に、２日と２０日との間（いくつかの場合、１５日の間）、培地中でインキュベートされる。
【００１３】
本発明の方法は、患者がＨＰＶペプチドに対する細胞媒介性免疫応答を提示するかどうかを決定する工程を包含する。いくつかの実施形態において、これらペプチドはＥ６ペプチドまたはＥ７ペプチドであり、これらが、Ｅ６ポリペプチドまたはＥ７ポリペプチドにおいて連続するアミノ酸配列に対して、その長さにわたって少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列を有することを意味する。具体的には、配列番号１９（ＨＰＶ１６由来のＥ６）または配列番号２０（ＨＰＶ１６由来のＥ７）の、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、３１個、３２個、３３個、３４個、３５個、３６個、３７個、３８個、３９個、４０個、４１個、４２個、４３個、４４個、４５個、４６個、４７個、４８個、４９個、５０個以上の連続するアミノ酸を含むペプチドの使用が企図される。いくつかの実施形態において、１つの配列のみのペプチドが試験され（例えば、Ｅ６ペプチド、または別の場合においてはＥ７ペプチド）、一方、他の実施形態において、複数の配列が試験され得ることが、企図される。１つの実施形態において、Ｅ６ペプチドおよびＥ７ペプチドは、本発明の方法において使用される。他の実施形態において、少なくとも２つのＥ６ペプチド（少なくとも２つの異なるＥ６配列を言及している）、少なくとも２つのＥ７ペプチド（少なくとも２つの異なるＥ７配列を言及している）、または両方が、与えられ得る。１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１２個、１３個、１４個、１５個以上のＥ６ペプチドまたはＥ７ペプチド、ならびにそれらのＥ６ペプチドまたはＥ７ペプチドの任意の組み合わせが使用され得ることが企図される。なおさらなる実施形態において、このＥ６ペプチドは、Ｋ９Ｌ、Ｅ１０Ｉ、Ｃ１０Ｒ、Ｑ１５Ｌ、Ｖ１０Ｃ、Ｐ９Ｌ、Ｐ１０Ｉ、Ｑ２０Ｐ、Ｒ１６Ｒ、Ｇ１０Ｓまたはそれらの組み合わせである。特定の実施形態において、以下のＥ６ペプチドが個別に使用されるか、または以下のペプチドの１つ以上を含むカクテルとして使用される：Ｋ９Ｌ、Ｅ１０Ｉ、Ｃ１０Ｒ、Ｑ１５Ｌ、またはＶ１０Ｃ。一方、他の実施形態において、Ｅ７ペプチドは、Ｔ１０Ｑ、Ｍ９Ｔ、Ｄ９Ｌ、Ｑ１９Ｄ、Ｒ９Ｆ、Ｒ９Ｖ、Ｌ９Ｖ、Ｇ１０Ｃ、もしくはＤ２０Ｃまたはそれらの組み合わせである。特定の実施形態において、以下のＥ７プチドが個別にまたはカクテルとして使用される：Ｑ１９Ｄ、Ｒ９Ｆ、Ｒ９Ｖ、Ｌ９Ｖ、Ｇ１０Ｃ。さらに、以下に由来する少なくとも１つのＥ６ペプチドおよび少なくとも１つのＥ７ペプチドを含むカクテルが企図される：Ｋ９Ｌ、Ｅ１０Ｉ、Ｃ１０Ｒ、Ｑ１５Ｌ、Ｖ１０Ｃ、Ｑ１９Ｄ、Ｒ９Ｆ、Ｒ９Ｖ、Ｌ９Ｖ、またはＧ１０Ｃ。いくつかの実施形態において、上記のカクテル中の１つ以上のペプチドが除外されることが特に企図される。本発明の診断方法に関して考察された組成物がまた、本発明の予防方法または治療方法に適用され得ることもまた特に企図される。
【００１４】
本発明の方法は、ヒトパピローマウイルスに対する細胞媒介性免疫（ＣＭＩ）応答に関する。細胞媒介性免疫を同定しそして評価する異なる方法（血清免疫応答または抗体媒介性免疫応答から区別される）がある。本発明の１つの実施形態において、Ｔ細胞増殖が測定される。Ｔ細胞増殖は、トリチウム化チミジンの取り込みを測定することによってアッセイされ得る。少なくとも１つのＥ６ペプチドおよびＥ７ペプチドに対する、ＳＩスケールを使用して２．０以上である増殖応答は、ポジティブと見なされ、そして前癌性もしくは癌性の増殖または病変の再発についてリスクが低減している患者について示す。少なくとも１つのＥ６ペプチドまたはＥ７ペプチドに対する、ＳＩスケールを使用して３．０以上の増殖応答は、細胞媒介性応答について示し、従って、前癌性増殖または癌性増殖の発達に関して向上した予後を有する患者を同定する。あるいは、２．０未満のＳＩ（０のＳＩを含む）を有する患者は、Ｅ６ペプチドまたはＥ７ペプチドに対して、非常に低い細胞媒介性応答を有するかまたは応答を有さないと見なされ、そして前癌性増殖または癌性増殖の発達または再発に関して増大したリスクを有すると見なされる。
【００１５】
細胞媒介性応答はまた、生細胞（Ｔ細胞増殖）についての比色定量アッセイであるＭＴＴ（３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド）色素アッセイもしくは還元アッセイ（ｄａＣｏｓｔａら、１９９９）、またはアラマーブルーアッセイ（ＩＬ−２応答細胞を測定する別の比色定量アッセイ（Ｇｌｏｅｃｋｎｅｒら、２００１；Ｋｗａｃｋら、２０００））のような、非放射性手段を使用して測定され得る。
【００１６】
本発明の別の実施形態において、細胞媒介性免疫応答についてアッセイすることは、ＴＨ１サイトカイン量またはＴＨ２サイトカイン量を測定する工程を包含する。患者がＴ細胞増殖アッセイによってＣＭＩ応答を提示しない場合であっても、増大した再発リスクはＴＨ２サイトカイン（例えば、ＩＬ−１０）の産生と関連し得る。低減した再発リスクは、Ｅ６ペプチドおよび／またはＥ７ペプチドに応答してＴＨ１サイトカイン（例えば、ＩＦＮ−γおよびＩＬ−２）の産生を示す患者に観察される。いくつかの実施形態において、ＴＨ１サイトカイン（例えば、ＩＬ−２、インターフェロン（ＩＦＮ）γ、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）α、またはＴＮＦ−β、ＩＬ−３、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、あるいはＩＬ−１８）の量が測定される。特定の実施形態において、ＩＬ−１８の量が測定される。さらなる実施形態において、ＴＨ２サイトカイン（例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１３、またはＩＬ−１４）の量が測定される。
【００１７】
ＣＭＩ応答を測定することは、免疫アッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡもしくは放射性免疫アッセイ）またはフローサイトメトリーをによって達成され得る。本発明の実施形態において、サンプルは、二連のサンプルとしてかまたは異なるアッセイによるかのいずれかで１回より多くアッセイされ得る。いくつかの実施形態において、１つより多くのサンプルが患者から得られ得る。この複数のサンプルは、同型（例えば、複数の血液サンプル）であり得るか、または複数のサンプルは、異型（例えば、血液サンプルおよび膣スワブ）であり得る。
【００１８】
本発明の方法が適用可能性を示す患者としては、まだＨＰＶを有すると診断されていないがＨＰＶを有することが予測される患者、一旦ＨＰＶで感染したがもはやＨＰＶ感染の徴候を示さない患者、ＨＰＶで感染されたことが既知の患者、子宮頸部または他の尿生殖器の領域にかまたはその周囲に、前癌性増殖または癌性増殖を有する患者（自分がＨＰＶで感染されていることを知っていてもよいし、知らなくても良い）、前癌性増殖または癌性増殖が首尾良く処置されたかまたはうまく処置されなかった患者、ならびに前癌性増殖または癌性増殖の少なくとも１つの再発を有する患者、が挙げられる。前癌性または癌性の増殖または病変は、増殖が制御されない過増殖性細胞をいい、そして前新生物（例えば、ＣＩＮ）および新形成（良性および悪性）は、扁平上皮細胞および重要性が不確定の扁平上皮細胞（ＡＳＣＵＳ）を含む。患者が１つを超える増殖または病変を有することが、企図される。任意の増殖に対する処置は、外科手術（剥離（ａｂｌａｔｉｖｅ）または切除（ｅｘｃｉｓｉｏｎａｌ））ならびに従来の癌治療およびＨＰＶに対する処置に関し得る。このような処置としては、化学治療法、放射線治療法、ホルモン治療法、免疫治療法、ホスルカルネット、Ｔｈｉｏｖｉｒ、チオビル類似体（ＢｉｏＫｅｙｓ）、ポドフィロックス（ｐｏｄｏｆｉｌｏｘ）、ポドフィリン、トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）または５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）の投与、病変内インターフェロンおよび鼻腔内（ｉｎｔｒａｎｓａｌ）インターフェロン、イミキミド（Ｉｍｉｑｕｉｍｉｄ）クリームが挙げられる。剥離技術としては、液体窒素、電気焼灼もしくは電気剥離、外科的切除、またはレーザー技術の使用が挙げられる。首尾よい処置とは、任意の増殖の兆候を完全に除去する処置をいい、一方、部分的に首尾よい処置とは、増殖物のサイズもしくは増殖速度を低減すること、またはその肥大化を妨げること、または１つより多く存在する場合の増殖物の数を低減することによって、増殖に影響する処置をいう。一旦ＨＰＶに感染した患者は、後の時間にＨＰＶ感染の兆候を提示し得ない。しかし、そのような患者は依然として、継続性のＨＰＶ感染の兆候を有する患者のように、前癌性増殖または癌性増殖の再発を経験し得る。
【００１９】
本発明のいくつかの方法において、患者は、その患者がＨＰＶで感染されるかどうかについて決定するために評価される。さらなる実施形態において、ＨＰＶの血清分類（ｓｅｒｏｔｙｐｉｎｇ）もまた含まれるか、またはこれはまた、感染の初期決定の一部である。なおさらなる実施形態において、患者が前癌性または癌性の増殖を有するかどうか、そしてそれが癌性である場合、その増殖が良性か悪性であるかを決定するために評価される。
【００２０】
本発明の方法は、サンプルが、前癌性または癌性の増殖のための処置の少なくとも一月後の患者から得られる実施形態を包含する。この患者は、少なくとも１つの前癌性または癌性の増殖物に対する処置（例えば、剥離のいくつかの形態による処置）を受け得る。
【００２１】
本発明はまた、本発明の診断方法と共に使用され得る治療法も含む。本発明のいくつかの実施形態において、患者は、前癌性または癌性の増殖物の再発について増大したリスクを有するとして認識される。患者がこの増大したリスクを有するとして確認される前に、これまでに見なされていなかった作用の進行を受けていなくてもよい。いくつかの実施形態において、別の方法で処置されていない患者は、前癌性または癌性の増殖物に対して予防処置を施されるかもしくはより頻繁に試験されるか、またはその両方がなされる。予防処置は、前癌性または癌性の増殖物の生理学的兆候の非存在下で施される処置であり；「治療処置」は、患者が提示する生理学的状態の医療的処置を包含する。これらの予防処置は、上記のように、ＨＰＶ感染およびＨＰＶ関連の前癌性および癌性の増殖の両方に対する治療処置の使用を包含する。
【００２２】
いくつかの実施形態において、前癌性および癌性の増殖物の発達のリスクに対して保護するかまたはそれを低減するための予防方法は、本明細書中に記載されるＨＰＶのＥ６ペプチドおよびＥ７ペプチドを用いる免疫療法を包含する。患者が、特定のＥ６ペプチドまたはＥ７ペプチドに対するか、またはそれらのようなペプチドの組み合わせに対する細胞媒介性免疫応答を低度に有するかまたは有さないとして確認される場合、Ｅ６の配列またはＥ７の配列のペプチドは、ＣＭＩ応答を引き出すために患者に投与され得る。これらのようなペプチドは、Ｅ６ペプチドまたはＥ７ペプチドのいずれかを含み、具体的には表３のペプチドの全てまたは一部を含む。また、Ｅ６ポリペプチドまたはＥ７ポリペプチド由来のペプチド（例えば、本発明の診断方法に関して考察されたペプチド）も、同様に予防方法において使用され得る。患者が１つ以上のペプチド配列、そしていくつかの実施形態において、アジュバント、リポソームベースの化合物、またはその両方とを共に含む組成物を投与され得ることが、企図される。さらなる実施形態において、患者はペプチドを１回より多く投与される。
【００２３】
いくつかの実施形態において、本明細書中に開示された方法を使用してＨＰＶ関連増殖の再発についてリスクのある患者を同定することによって、ＨＰＶで感染されかつ増殖に対して処置された患者において、前癌性または癌性の増殖（例えば、ＣＩＮ）の再発を予防するための方法があり、そして、いずれかの再発を予防するかまたは処置するために患者を処置するための方法がある。処置の選択肢は、上記のように、外科手術（剥離または切除）ならびに従来の癌治療およびＨＰＶに対する処置を包含し得る。いくつかの実施形態において、この処置は、上記のＨＰＶ由来の少なくとも１つのＥ６ペプチドまたはＥ７ペプチドを含む免疫処置である。
【００２４】
さらに、本発明はまた、一旦、ＨＰＶで感染したかまたは、増殖に対して処置された患者において、前癌性または癌増殖の再発可能性を決定するためのキットを含み、これは、適切な容器手段中に、少なくとも１つのＨＰＶ由来のＥ６ペプチドまたはＥ７ペプチド、およびそのペプチドに対する細胞媒介性免疫応答の検出を可能とする抗体を含む。いくつかの実施形態において、この抗体は、非反応性の構造物に結合され、この構造物上（例えば、ウェルを有するプレート）にサンプルが適用され得る。さらなる実施形態において、この非反応性の構造物はメンブレンを有し、これはその構造物に付加され得るかまたは接着され得る。いくつかの実施形態において、このキットは、サイトカイン分泌細胞を検出し、そしていくつかの実施形態の場合において定量するために、Ｅｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎｋｅｄ  Ｉｍｍｕｎｏｓｐｏｔ（ＥＬＩＳＰＯＴ）アッセイで使用され得る。なおさらなる実施形態において、このキットは、本明細書中に開示されるＴＨ１またはＴＨ２のサイトカインに対する抗体を含む。他の実施形態は、含有される抗体を検出するための検出試薬を包含する。検出試薬は、別の化合物の検出を可能とする任意の化合物であり、これは、視覚的に（例えば、比色定量性の検出試薬によって）検出を可能とする試薬を含む。
【００２５】
語「１つの（ａ）」または「１つの（ａｎ）」の使用は、本請求項および／または本明細書中で用語「〜を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」と組み合わせて使用される場合、「１つ（ｏｎｅ）」を意味し得るが、「１つ以上」「少なくとも１つ」または「１つまたは１つより多く」の意味もまた一致する。
【００２６】
本発明の他の目的、特徴および利点は、以下の詳細な記載から明らかになる。しかし、この詳細な記載および特定の例は、本発明の特定の実施形態を示すが、単なる例示の目的で示されることが理解されるべきである。なぜなら、本発明の本質および範囲以内の種々の変更および改変が、この詳細な記載から当業者に明らかになるからである。
【００２７】
（例示の実施形態の記載）
ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）感染は、子宮頸癌の主要なリスク因子であり、そして強力なＨＰＶ特異的細胞媒介性免疫とより低い重篤度の段階のＣＩＮとの間の関連がある。ＣＩＮ患者についての通常の医療治療技術ストラテジーは、切除処置または剥離処置を含むが、追従する研究が、有意な数の患者が再発を経験することを示す。現在、これらの患者における疾患再発状態にも疾患なしの状態にも、関係する明確な理解が存在しない。感染、非感染の両方において、ＣＩＮに対する予後および処置治療または予防治療、ならびに疾患が再発したヒトは、重要である。多くの処置治療が試験されそして実行されているが、これらは未だ疾患を排除しなければならないかまたは疾患の再発を予防しなければならない。有意な数の患者が、ＣＩＮの再発を経験するが、再発の可能性および確率を試験するのに利用可能な手段がない。
【００２８】
本発明は、ＨＰＶで感染され、かつＣＩＮに対して処置された患者において、予後または生物マーカーとしてＣＩＮの再発可能性を決定するための方法を提供する。本方法は、Ｅ６およびＥ７のようなＨＰＶ癌タンパク質のペプチドに対する細胞媒介性免疫応答のアッセイおよび分析に関する。本方法はまた、ＣＩＮ再発についてのリスクにあるＨＰＶ感染患者を確認する際に役立つ。本発明はさらに、ＣＩＮの再発を予防するため、そして高リスクのＣＩＮを有する患者を診断するための、標的化送達システム、キット、および免疫治療手段を利用する。
【００２９】
（Ｉ．ＨＰＶ）
ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）は、子宮頸の新生物および癌のステージの発達の際の重要な補因子として以前に同定された。しかし、ＨＰＶでの感染は、子宮頸癌を引き起こすのに十分ではない。ＨＰＶで感染された全ての女性が子宮頸癌を進行するわけではない。女性はしばしば、年１回のＰａｐスメアで検出される形成異常の子宮頸部疾患に対して処置される。Ｐａｐスメアスクリーニングの存在にも関わらず、疫学的調査は、子宮頸の新生物および癌の進行についての単独のもっとも大きなリスク因子としてＨＰＶを包含し続ける。子宮頸部上皮内腫瘍（ＣＩＮ）は、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）によって引き起こされる１つの型の子宮頸癌である。ＨＰＶ、特にＨＰＶの１６型、１８型、３１型、４５型、５６型、および５８型は、子宮頸癌の発達と関連する。これらは、高グレード型／高リスク型のＨＰＶを含む。中程度グレード／リスク型としては、ＨＰＶの３３型、３５型、３７型、５１型、５２型、５９型、６６型、および６８型が挙げられる。いぼと関係する他の低グレード型／低リスク型は、６型、１１型、２６型、４０型、４２型、４３型、４４型、５３型、５４型、５５型、６２型、および６６型である。これらの低グレード型は、本来悪性ではない。このＨＰＶゲノムは、ＣＩＮにおいてエピソーム形態（組み込まれない、環状）で提供されるが、このゲノムはしばしば、侵襲性子宮頸癌において、宿主ＤＮＡ中に組み込まれる。高リスク型のＨＰＶにより発現されるＥ６癌タンパク質およびＥ７癌タンパク質は、それらが結合し、次いで２つの重要な腫瘍抑制因子（ｐ５３および網膜芽細胞腫遺伝子（Ｒｂ））を不活性化する能力の結果として、子宮頸部上皮細胞の悪性形質転換に重要であるようである。これらの腫瘍抑制タンパク質の不活性化は、ＨＰＶの癌遺伝子の能力の重要な成分であるようである。
【００３０】
（Ａ．子宮頸癌の診断および治療）
ヒトパピローマウイルスは、子宮頸癌の発達と関連することがこれまでに確認されており、悪性腫瘍状態は子宮頸部上皮内腫瘍（ＣＩＮ）のいくつかのステージによって進行されるようである。Ｐａｐスメアスクリーニングの実験にも関わらず、疫学的調査は、ＣＩＮへの進行についての単独のもっとも大きなリスク因子としてＨＰＶを包含し続け、多くの研究者がＣＩＮのリスクにあるＨＰＶで感染された女性を確認するのを補助する宿主マーカーおよび／またはウイルスマーカーを探し続ける。処置された患者におけるＣＩＮの再発可能性が、同等に重要である。切除処置または剥離処置を受けた患者における追従研究は、有意な数の患者が再発を経験することを示す。従って、ＣＩＮの再発可能性を評価し得ることは非常に重要である。再発の予後は、医者が予防または治療の選択肢を検討するのを可能にする。
【００３１】
ＨＰＶを頸部癌と結びつける最初の報告は、１９８０年代初頭になされているので（ｚｕｒ  Ｈａｕｓｅｎ、１９９４）、高リスクのＨＰＶ型が、浸潤性になる前の上皮内病変の、腫瘍の開始および癌腫への進行に寄与することが、一般に受け入れられている。実際、ＨＰＶ感染は、核の異型性を伴う核周辺の清澄化によって特徴付けられる、パパニコラウスミア中の特徴的な細胞病理において最高に達することが、留意されてきた（Ｋｕｒｍａｎら、１９９４）。これらのＨＰＶ変化は、弱い異形成と組み合わされて、改定されたＢｅｔｈｅｓｄａの命名法における名称ＬＳＩＬと称される（ＫｕｒｍａｎおよびＳｏｌｏｍｏｎ、１９９４）。ＨＰＶ試験の有用性は、低リスク（Ｌ−ＳＩＬ）ＨＰＶ型と高リスク（Ｈ−ＳＩＬ）ＨＰＶ型（後者のみが異形成→癌腫への進行に関連する有意な危険性をもたらす）との間、および進行の実際の危険性を識別する必要があるという事実によって、複雑化される。前者の場合、ＨＰＶについての新規ハイブリッド捕捉試験は、高リスクＨＰＶ型を識別する（Ｓｈｅｒｍａｎら、１９９５；Ｐｏｉｊａｋら、１９９９；Ｃｌａｖｅｌら、２０００）。ＤＮＡ画像サイトメトリーが、頸部病変の危険性がある患者を診断するために、本発明の方法に加えて使用され得る（Ｌｏｒｅｎｚａｔｏら、２００１）。
【００３２】
（１．パパニコラウスミア）
過去５０年にわたり、パパニコラウ染色塗沫標本（「パパニコラウスミア」）は、頸部癌死亡率を低減する試みの基礎になっている。パパニコラウスミアは、頸部癌の初期段階を同定するので、有効である。毎年米国において６千万〜７千万のパパニコラウスミアが行われているという現在の概算がある。従って、パパニコラウスミアは、頸部癌の検出において基準になっている。医学界において広く受容されているにもかかわらず、研究は、パパニコラウスミアスクリーニングが、低い悪性度分類の癌性病変の５０％〜８０％を検出できず、そして高い悪性度分類の癌性病変の１５％〜３０％さえも検出できないことを示している。
【００３３】
任意の細胞学的診断方法の第一工程は、検査のために適切なパパニコラウスミア細胞を獲得する工程である。従来のパパニコラウスミア試験において、細胞学者は、頸部の内層からいくつかの細胞を掻き取り、細胞をスライドに塗沫し、そしてパパニコラウ染色によって染色することによって得られた、剥脱性細胞検体を試験する。細胞学者は、悪性状態の存在を示す、異常に見える細胞の存在について、染色されたスミアを試験する。用語「悪性状態」は、上皮内腺癌（ＡＩＳ）、浸潤性癌腫（ＣＡ）、新生物、悪性細胞または腫瘍細胞などを含む異形成の存在をいう。
【００３４】
本発明の方法において、剥脱性細胞検体は、患者から得られ、この患者は、悪性状態を有しても有さなくてもよい。この検体は、細胞サンプルを得るために、頸部サンプリングデバイス（例えば、スワブ、スパチュラまたは細胞ブラシ（ｃｙｔｏｂｒｕｓｈ）を、頸部粘膜または膣粘膜の一部に沿って回転させることによって得られ得る。適切な検体は、扁平上皮細胞および／または腺細胞と共に頸管内細胞を含む。
【００３５】
剥脱性細胞検体は、一般に、スライドの表面上に検体の薄層を提供するために、スライド上に塗沫される。しかし、細胞異常の手動観察または細胞学的物質の自動化分析は、検体スライド上の細胞の「単層」を調製することによって、最適化され得る。「単層」は、主に単一細胞および細胞の小クラスターからなる、均一に分布した細胞性物質の実質的に二次元の層として定義される。
【００３６】
パパニコラウスミアスクリーニングを実施する場合、産婦人科医は、頸部の表面から剥脱性細胞を収集し、そしてこの細胞をスライド上に配置し、このスライドを、さらなる試験のために細胞学者に送る。次いで、細胞学者は、スライド上に配置された細胞を検査し、そして異常な細胞を探す。異常な細胞が見出されると、パパニコラウスミアは、陽性とみなされる。異常な細胞が見出されない場合、パパニコラウスミアは、陰性とみなされる。パパニコラウスミアスクリーニングは、一般に、頸部癌の早期検出のための実際的かつ経済的な手順として認識されている。本発明において、ＨＰＶ陽性を、Ｖｉｒａｐａｐ／Ｖｉｒａｔｙｐｅアッセイ（Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）によって決定した。
【００３７】
（２．コルポスコピー）
パパニコラウスミアプロセスは、最初のスクリーニングのために設計されたが、コルポスコピーおよび関連手順は、一般に、パパニコラウスミアの異常性を確認し、そして癌性病変および潜在的癌性病変を病期分類するために使用される。コルポスコピーは、１９２５年に導入されたので、コルポスコピーは、パパニコラウスミアスクリーニングによって潜在的な頸部異常を有すると同定された患者についての追跡臨床手順としての、広い認識を得た。コルポスコピーは、異常なパパニコラウスミアを有する患者を評価する際に非常に有効であり、従って、この状況についての、西洋世界での医療の標準となっていることが、一般に認識されている。約４００万回のコルポスコピー試験が、米国において現在毎年実施されていると概算される。
【００３８】
（３．蛍光分光法）
前癌性および癌性の増殖または病変を検出するための別の方法としては、蛍光分光法が挙げられ、これは、組織が新生物になるときに生じる生化学的変化および形態学的変化を、迅速に、非侵襲的に、かつ定量的に探索する能力を有する。新生物組織の変更された生化学的状態および形態学的状態は、測定された蛍光のスペクトル特徴に反映される。米国特許第６，２５８，５７６号および同第６，１３５，９６５号は、頸部扁平上皮内（ＣＩＮ）病変の診断について考察しており、参考として具体的に援用される。
【００３９】
（４．前癌性増殖および癌性増殖の処置）
処置は、この増殖の排除、低減または退行をもたらすために意図される。癌性増殖は、切除（ｅｘｃｉｔｉｏｎ）または剥離（ａｂｌａｔｉｏｎ）手順によって処置され得る。以下でさらに詳細に考察される免疫療法に加えて、以下の処置は、本発明の方法において治療的または予防的に使用され得る。
【００４０】
（ｉ）化学療法）
癌治療はまた、化学物質ベースの処置および照射ベースの処置の両方との、種々の併用療法を含む。併用化学療法としては、例えば、シスプラチン（ＣＤＤＰ）、カルボプラチン、プロカルバジン、メクロレタミン、シクロホスファミド、カンプトテシン、イホスファミド、メルファラン、クロラムブシル、ブスルファン、ニトロソウレア（ｎｉｔｒｏｓｕｒｅａ）、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ブレオマイシン、プリカマイシン（ｐｌｉｃｏｍｙｃｉｎ）、マイトマイシン、エトポシド（ＶＰ１６）、タモキシフェン、ラロキシフェン、エストロゲンレセプター結合剤、タキソール、ゲムシタビン、ナベルバイン（ｎａｖｅｌｂｉｎｅ）、ファルネシル−タンパク質トランスフェラーゼインヒビター、トランスプラチン（ｔｒａｎｓｐｌａｔｉｎｕｍ）、５−フルオロウラシル、ビンクリスチン、ビンブラスチンおよびメトトレキサート、または上記ものの任意のアナログもしくは誘導体。
【００４１】
（ｉｉ）放射線療法）
ＤＮＡ損傷を引き起こし、そして広範に使用されてきた他の因子としては、γ線、Ｘ線および／または腫瘍細胞への放射性同位体の指向された送達として一般に公知の因子が挙げられる。ＤＮＡ損傷因子の他の形態（例えば、マイクロ波およびＵＶ照射）もまた、意図される。これらの因子の全てが、ＤＮＡ、ＤＮＡの前駆体、ＤＮＡの複製およびＤＮＡの修復、ならびに染色体の凝集および維持に対して広範な損傷をもたらす可能性が最も高い。Ｘ線についての線量範囲は、長い期間（３〜４週間）にわたって、５０〜２００レントゲンの毎日線量から、２０００〜６０００レントゲンの単回線量までの範囲である。放射性同位体についての線量範囲は、広く変動し、そして同位体の半減期、放射される照射の強度および型、ならびに新生物細胞による取り込みに依存する。
【００４２】
用語「接触された」および「曝された（曝露された）」は、細胞に対して適用される場合、治療的もしくは診断的なペプチドもしくはポリヌクレオチド、または化学療法剤もしくは放射線療法剤が標的細胞に送達されるか、あるいは標的細胞の直ぐそばに配置されるプロセスを記載するために、本明細書中で使用される。細胞の殺傷および停止を達成するために、両方の因子が、細胞を殺傷するかまたは細胞の分裂を防止するのに有効な併用量で送達される。
【００４３】
（ｉｉｉ）遺伝子）
なお別の実施形態において、二次的治療は、治療的ポリヌクレオチドが、本発明のキメラポリペプチドの投与の前、後または同時に投与される、遺伝子治療である。以下の遺伝子産物の１つをコードする第二のベクターと組み合わせたキメラポリペプチドの送達は、標的組織に対する併用抗過剰増殖効果を有する。あるいは、両方の遺伝子をコードする単一のベクターが使用され得る。種々のタンパク質が本発明に包含され、このタンパク質としては、細胞増殖の誘導因子（例えば、増殖因子レセプター）、細胞増殖のインヒビター（例えば、腫瘍サプレッサー）およびアポトーシスの調節因子が挙げられる。
【００４４】
（ｉｖ）切除手順）
任意の癌を有する人の多くは、一般に、予防的、診断的または病期分類的な、治療的手術および緩和手術を含む、いくつかの型の手術を受ける。治療的手術は、他の治療（例えば、本発明の処置、化学療法、放射線療法、ホルモン治療、遺伝子治療、免疫治療および／または代替的治療）と組み合わせて使用され得る、前癌処置または癌処置である。
【００４５】
治療的手術は、前癌性組織または癌性組織の全てまたは一部が、物理的に除去、切除および／または破壊される切除を含む。腫瘍切除は、腫瘍の少なくとも一部の物理的除去をいう。腫瘍切除に加えて、手術による処置としては、レーザー手術、凍結外科手術、電気外科手術、および顕微鏡により制御される手術（モース氏手術）が挙げられる。本発明は、表在性の癌、前癌または偶発量の正常組織の除去と組み合わせて使用され得ることが、さらに意図される。
【００４６】
癌性の細胞、組織または腫瘍の一部または全てを切除する際に、空洞が、身体内に形成され得る。処置は、さらなる抗癌治療を用いて、その領域の灌流、直接的注射または局所的適用によって達成され得る。このような処置は、例えば、１日、２日、３日、４日、５日、６日もしくは７日毎、または１週間、２週間、３週間、４週間および５週間毎、または１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、５ヶ月、６ヶ月、７ヶ月、８ヶ月、９ヶ月、１０ヶ月、１１ヶ月もしくは１２ヶ月毎に、繰り返され得る。これらの処置は、変動する投薬量の処置でもある。
【００４７】
（ｖ）他の薬剤）
他の薬剤が本発明と組み合わせて使用されて、処置の治療的効力を改善し得ることが意図される。これらのさらなる薬剤としては、免疫調節剤、細胞表面レセプターおよびＧＡＰジャンクションのアップレギュレーションに影響を与える薬剤、細胞分裂停止因子および分化因子、細胞接着のインヒビター、またはアポトーシス誘導因子に対する過剰増殖細胞の感受性を増大させる薬剤が挙げられる。免疫調節剤としては、腫瘍壊死因子；インターフェロンα、インターフェロンβおよびインターフェロンγ；ＩＬ−２および他のサイトカイン；Ｆ４２Ｋおよび他のサイトカインアナログ；またはＭＩＰ−１、ＭＩＰ−１β、ＭＣＰ−１、ＲＡＮＴＥＳおよび他のケモカインが挙げられる。細胞表面レセプターまたはそのリガンド（例えば、Ｆａｓ／Ｆａｓリガンド、ＤＲ４またはＤＲ５／ＴＲＡＩＬ）のアップレギュレーションが、過剰増殖細胞に対するオートクライン効果またはパラクライン効果の確立によって、本発明のアポトーシス誘導能力を増強することが、さらに意図される。ＧＡＰジャンクションの数を増加させることによる細胞内シグナル伝達の増大は、隣接する過剰増殖細胞集団に対する抗過剰増殖効果を増大させる。他の実施形態において、細胞分裂停止因子または分化因子は、本発明と組み合わせて使用されて、処置の抗過剰増殖効果を改善し得る。細胞接着のインヒビターが、本発明の効力を改善するために意図される。細胞接着インヒビターの例は、フォーカルアドヒージョンキナーゼ（ＦＡＫ）インヒビターおよびロバスタチンである。アポトーシスに対する過剰増殖細胞の感受性を増大させる他の薬剤（例えば、抗体ｃ２２５）が、本発明と組み合わせて使用されて、処置効力を改善し得ることが、さらに意図される。
【００４８】
ホルモン治療もまた、本発明と組み合わされるか、または以前に記載された任意の他の癌治療と組み合わされて使用され得る。ホルモンの使用は、特定の癌（例えば、乳房癌、前立腺癌、卵巣癌または頸部癌）の処置において使用されて、特定のホルモン（例えば、テストステロンまたはエストロゲン）のレベルを低減させるか、またはその効果をブロックし得る。この処置は、しばしば、処置の選択肢としてか、または転移の危険性を低減するために、少なくとも１つの他の癌治療と組み合わせて使用される。
【００４９】
（ｖ）抗ウイルス剤）
ＨＰＶに感染した患者は、抗ウイルス剤を、単独でかまたは抗癌治療と組み合わせて用いて処置され得る。「抗ウイルス剤」は、ウイルス感染を予防または阻害する組成物；ウイルス感染の進行を予防または阻害する組成物；ウイルスの感染性を低減する組成物；ウイルス感染の生理学的症状を予防、阻害または低減する組成物；ウイルス活性化の発生を予防または低減する組成物；ウイルスの宿主である細胞を阻害する組成物；宿主細胞がアポトーシスを受けるように誘導する組成物；身体の全てまたは一部からウイルスを除去する組成物；ウイルスの不活化を誘導する組成物；あるいは上記の任意の組み合わせをいう。
【００５０】
ＨＰＶに対して使用される薬剤としては、ホスカネット、Ｔｈｉｏｖｉｒ、ｔｈｉｏｖｉｒアナログ（ＢｉｏＫｅｙｓ）、ポドフィロックス、ポドフィリン、トリクロロ酢酸（ｔｒｉｃｌｏｒａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ）（ＴＣＡ）または５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、病変内インターフェロンもしくは鼻腔内（ｉｎｔｒａｎｓａｌ）インターフェロン、あるいはＩｍｉｑｕｉｍｉｄクリームの投与が挙げられる。他の薬剤は、米国特許第６，２４５，５６８号、同第６，２３８，６５９号および同第６，２１４，８７４号に開示される。
【００５１】
（ＩＩ．タンパク質およびペプチドの選択、合成および使用）
本発明において、ペプチドが、診断方法および処置方法において使用される。これらのペプチドは、ＨＰＶ  １６腫瘍タンパク質に対応する。
【００５２】
（Ａ．タンパク質性組成物）
特定の実施形態において、本発明は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９のペプチド、ならびに配列番号２０および配列番号２１のポリペプチド中に見出され得るような、少なくとも１つのタンパク質性分子を含む、新規組成物に関する。本明細書中で使用される場合、「タンパク質性分子」、「タンパク質性組成物」、「タンパク質性化合物」、「タンパク質性鎖」または「タンパク質性物質」は、一般に以下をいうが、これらに限定されない：約２００アミノ酸より大きいタンパク質もしくはある遺伝子から翻訳された全長の内在性配列；約１００アミノ酸より大きいポリペプチド；および／または約３〜約１００アミノ酸のペプチド。上記の全ての「タンパク質性」との用語は、本明細書中で相互交換可能に使用され得る。
【００５３】
特定の実施形態において、少なくとも１つのタンパク質性分子の大きさは、以下を含むが、これらに限定されない：１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００、５２５、５５０、５７５、６００、６２５、６５０、６７５、７００、７２５、７５０、７７５、８００、８２５、８５０、８７５、９００、９２５、９５０、９７５、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１５００、１７５０、２０００、２２５０、２５００またはそれより多いアミノ酸残基、およびこれらから誘導される任意の範囲。本発明のペプチドは、配列番号１〜２１由来の４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または１００までの連続アミノ酸を包括的に含む。配列番号１〜１０は、ＨＰＶのＥ６ポリペプチド由来のペプチドであり、一方、配列番号１１〜１９は、ＨＰＶのＥ７ポリペプチド由来である。配列番号２０および２１は、それぞれ、ＨＰＶ腫瘍タンパク質Ｅ６およびＥ７についてのポリペプチド配列である。ＨＰＶ１６中のＥ６についてのＧｅｎＢａｎｋ登録番号は、ＡＦ３２７８５１であり（配列番号２６）、一方、ＨＰＶ１６中のＥ７についてのＧｅｎＢａｎｋ登録番号は、Ｕ７６４０４（配列番号２７）であり、これらは共に、参考として具体的に援用される。表３に基づいて、本発明の一部として具体的に意図されるペプチドとしては、以下のＥ６ペプチドが挙げられることが理解される：Ｋ９Ｌ（配列番号２６のアミノ酸１８−２６）、Ｅ１０Ｉ（配列番号２６のアミノ酸２３−３４）、Ｃ１０Ｒ（配列番号２６のアミノ酸３７−４６）、Ｑ１５Ｌ（配列番号２６のアミノ酸４３−５７）、Ｖ１０Ｃ（配列番号２６のアミノ酸４９−５８）、Ｐ９Ｌ（配列番号２６のアミノ酸６６−７４）、Ｐ１０Ｉ（配列番号２６のアミノ酸１０２−１１１）、Ｑ２０Ｐ（配列番号２６のアミノ酸９７−１１６）、Ｒ１６Ｒ（配列番号２６のアミノ酸１３１−１４６）、Ｇ１０Ｓ（配列番号２６のアミノ酸１４１−１５０）またはこれらの組み合わせ。表３に基づいて、本発明の一部として具体的に意図されるペプチドとしては、以下のＥ７ペプチドが挙げられることが理解される：Ｔ１０Ｑ（配列番号２７のアミノ酸７−１５）、Ｍ９Ｔ（配列番号２７のアミノ酸１２−２０）、Ｄ９Ｌ（配列番号２７のアミノ酸１４−２２）、Ｑ１９Ｄ（配列番号２７のアミノ酸４４−６２）、Ｒ９Ｆ（配列番号２７のアミノ酸４９−５７）、Ｒ９Ｖ（配列番号２７のアミノ酸６６−７４）、Ｌ９Ｖ（配列番号２７のアミノ酸８２−９０）、Ｇ１０Ｃ（配列番号２７のアミノ酸８５−９４）、Ｄ２０Ｃ（配列番号２７のアミノ酸７５−９４）またはこれらの組み合わせ。
【００５４】
本明細書中で使用される場合、「アミノ分子」とは、当業者に公知の任意のアミノ酸、アミノ酸誘導体またはアミノ酸模倣物をいう。特定の実施形態において、タンパク質性分子の残基は連続であり、アミノ分子残基の配列を中断する任意の非アミノ分子を有さない。他の実施形態において、この配列は、１以上の非アミノ分子部分を含み得る。特定の実施形態において、これらのタンパク質性分子の残基の配列は、１以上の非アミノ分子部分によって中断され得る。
【００５５】
従って、用語「タンパク質性組成物」は、天然に合成されたタンパク質中に、２０種の一般的アミノ酸のうち少なくとも１種、または以下の表１に示されるものが挙げられるがこれらに限定されない、少なくとも１種の改変アミノ酸もしくは通常でないアミノ酸を含む、アミノ分子配列を包含する。
【００５６】
【表１】
2004535816.tif 000002
特定の実施形態において、このタンパク質性組成物は、少なくとも１つのタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドを含む。さらなる実施形態において、このタンパク質性組成物は、生体適合性のタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドを含む。本明細書中で使用される場合、用語「生体適合性」は、本明細書中に記載される方法および量に従って所定の生物に適用または投与された場合に、有意な有害効果を生じない物質をいう。生物としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない。このような有害効果または所望でない効果は、例えば、有意な毒性または有害な免疫学的反応である。好ましい実施形態において、生体適合性のタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドを含有する組成物は、一般に、哺乳動物のタンパク質もしくはペプチド、または合成のタンパク質もしくはペプチドであり、その各々は、毒性も病原性も有害な免疫原も、実質的に含まない。
【００５７】
タンパク質性組成物は、当業者に公知の任意の技術（標準的な分子生物学的技術による、タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドの発現、天然の供給源由来のタンパク質性化合物の単離、あるいはタンパク質性物質の化学的合成）によって作製され得る。種々の遺伝子についてのヌクレオチド配列、ならびにタンパク質配列、ポリペプチド配列およびペプチド配列が以前に開示されており、そして当業者に公知の電子化データベースにおいて見出され得る。１つのこのようなデータベースは、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ’ｓ  ＧｅｎＢａｎｋ  ａｎｄ  ＧｅｎＰｅｐｔデータベースである（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）。これらの既知の遺伝子についてのコード領域は、本明細書中に開示されるか、または当業者に公知の技術を使用して、増幅および／または発現され得る。あるいは、タンパク質、ポリペプチドおよびペプチドの種々の市販の調製物が、当業者に公知である。
【００５８】
特定の実施形態において、タンパク質性化合物が、精製され得る。一般に、「精製される」は、種々の他のタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドを除去するための分画に供された、特定のタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドの組成物をいい、そしてこの組成物は、例えば、特定または所望のタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドについて、当業者に公知のタンパク質アッセイによって評価され得るように、その活性を実質的に保持する。
【００５９】
実質的に任意のタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドを含む組成物が、本明細書中に開示される組成物および方法において使用され得ることが意図される。しかし、タンパク質性物質が生体適合性であることが好ましい。特定の実施形態において、手順の間中、この組成物が、より正確もしくは容易に、組織に適用されるか、または組織と接触したままで維持されることを可能にする点で、より粘性のある組成物の形成が有利であることが想定される。このような場合、ペプチド組成物、またはより好ましくはポリペプチド組成物もしくはタンパク質組成物の使用が、意図される。粘性の範囲は、約４０ポイズ〜約１００ポイズを含むが、これに限定されない。特定の局面において、約８０ポイズ〜約１００ポイズの粘性が好ましい。
【００６０】
（Ｂ．ポリペプチドの選択、合成および使用）
ＨＰＶ１６のＥ６およびＥ７腫瘍性タンパク質（ｏｎｃｏｐｒｏｔｅｉｎ）に対応するペプチド配列を、両親媒性構造および文献に記載される既知のＴ細胞エピトープに関する情報に基づいて選択する。
【００６１】
本発明のペプチドは、従来の技術に従って、溶液中または固体支持体上で合成され得る。種々の自動化合成機が、市販されており、そして公知のプロトコルに従って使用され得る。小さい合成ペプチド配列（代表的には、１００残基長未満）が、段階的固相合成を使用して慣用的に調製される。このような固相合成は、成長オリゴマーのための不溶性樹脂支持体を使用する。所望のポリマーを含むことになっているサブユニットの配列は、この支持体上で、順に一緒に反応する。末端アミノ酸は、初期の反応において、直接的またはキーイング剤（ｋｅｙｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）を介してのいずれかで、固体支持体に結合される。末端残基は、一連のさらなる残基（例えば、アミノ酸またはブロックされたアミノ酸部分）と順に反応して、末端残基を介して固体支持体に結合した成長オリゴマーを生成する。この合成スキームの各段階において、未反応の反応物質は、洗浄されるか、またはそうでなければ、固相と接触させることにより除去される。このサイクルは、所望のポリマーが完全に合成されるまで、予め選択した残基配列を用いて続けられるが、固体支持体に結合したままである。次いで、このポリマーは、この固体支持体から切断され、使用するために精製される。上記の一般的な合成スキームは、特定のペプチドの調製における使用のために、Ｒ．Ｂ．Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄにより開発された（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，１９８６）。これらのペプチドは、改変されたＶｅｇａ  ２５０自動化ペプチド合成機（Ｖｅｇａ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｔｕｃｓｏｎ，ＡＺ）でか、またはＨｏｕｇｈｔｅｎ（Ｈｏｕｇｈｔｅｎ，１９８５）により記載されるような「バッグ方法」によってのいずれかで、合成され得る。例えば、ＳｔｅｗａｒｔおよびＹｏｕｎｇ，（１９８４）；Ｔａｍら（１９８３）；ならびにＢａｒａｎｙおよびＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄ（１９７９）（各々は本明細書中で参考として援用される）もまた参照のこと。
【００６２】
本明細書中に記載される選択された領域に対応する、短いペプチド配列または重複ペプチドのライブラリー（通常、約６から約３５〜５０までのアミノ酸）は、容易に合成され得、次いで、反応性ペプチドを同定するために設計されたスクリーニングアッセイにおいてスクリーニングされる。配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０および配列番号２１の、少なくとも４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５または約１００までの連続するアミノ酸残基を有するペプチドが、本発明により企図される。
【００６３】
本発明の組成物は、その活性を増強するように、または生物学的に保護されるように改変されたペプチドを含み得る。生物学的に保護されたペプチドは、米国特許第５，０２８，５９２号（本明細書中で参考として援用される）に開示されるように、ヒト被験体に投与された場合、保護されていないペプチドを越える特定の利点を有し、保護されたペプチドは、しばしば、増加した薬理学的活性を示す。
【００６４】
本発明における使用のための組成物はまた、全てのＬ−アミノ酸、全てのＤ−アミノ酸またはそれらの混合物を含むペプチドを含み得る。Ｄ−アミノ酸の使用は、ヒト身体内に本来見出されるプロテアーゼに対するさらなる耐性を与え得、そしてそれほど免疫原性ではなく、従って、より長い生物学的半減期を有すると予測され得る。
【００６５】
（ＩＩＩ．タンパク質精製）
ＨＰＶ由来のペプチドおよびタンパク質は、多くの方法で精製され得る。一般に、「精製された」とは、種々の他のタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドを除去するための分画化に供された、特定のタンパク質、ポリペプチドまたはペプチド組成物をいい、この組成物は、例えば、本明細書中以下に記載されるような、または当業者に公知であるような、タンパク質アッセイにより、所望のタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドについてアッセイされ得る場合、その活性を実質的に保持する。
【００６６】
タンパク質精製技術は、当業者に周知である。これらの技術としては、ある水準において、ポリペプチド分画および非ポリペプチド分画への細胞環境の粗分画化が挙げられる。他のタンパク質からポリペプチドを分離すると、目的のポリペプチドは、部分的または完全な精製（または同質になるまでの精製）を達成するために、クロマトグラフィー技術および電気泳動技術を使用して、さらに精製され得る。純粋なペプチドの調製に特に適した分析方法は、イオン交換クロマトグラフィー、イオン排除クロマトグラフィー；ポリアクリルアミドゲル電気泳動；等電集束法である。ポリペプチドを精製するために特に有効な方法は、高速タンパク質液体クロマトグラフィー、さらにはＨＰＬＣである。
【００６７】
本発明の特定の局面は、コードされたタンパク質またはペプチド（例えば、Ｅ６およびＥ７腫瘍性タンパク質由来のペプチド）の精製に関し、そして特定の実施形態において、このようなタンパク質またはペプチドの実質的な精製に関する。用語「精製されたタンパク質またはペプチド」は、本明細書中で使用される場合、他の成分から単離可能な組成物をいうことが意図され、ここでタンパク質またはペプチドは、天然で取得可能な状態に対して任意の程度まで精製される。従って、精製されたタンパク質またはペプチドとはまた、これらが天然で存在し得る環境を含まないタンパク質またはペプチドをいう。
【００６８】
一般に、「精製された」とは、種々の他の成分を除去するための分画化に供されたタンパク質またはペプチド組成物をいい、この組成物は、その発現された生物学的活性を実質的に保持する。用語「実質的に精製された」が使用される場合、この記載は、タンパク質またはペプチドが組成物の主要成分を形成している（例えば、この組成物中のタンパク質の約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％またはそれ以上を構成している）組成物をいう。
【００６９】
タンパク質またはペプチドの精製の程度を定量するための種々の方法が、本開示の観点で、当業者に公知である。これには、例えば、活性分画の比活性を決定する工程、またはＳＤＳ／ＰＡＧＥ分析によって分画中のポリペプチドの量をアッセイする工程が包含される。分画の純度をアッセイするための好ましい方法は、この分画の比活性を計算すること、この比活性を、初期の抽出物の比活性と比較すること、および純度を計算すること（ここでは、「〜倍の精製数」により評価される）である。この活性量を表すために使用される実際の単位は、もちろん、精製を追跡するために選択された特定のアッセイ技術、および発現されたタンパク質またはペプチドが検出可能な活性を示すか否かに依存する。
【００７０】
タンパク質精製における使用に適切な種々の技術が、当業者に周知である。これには、例えば、硫酸アンモニウム、ＰＥＧ、抗体などを用いる沈降、または熱変性に続く遠心分離による沈降；クロマトグラフィー工程（例えば、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィーおよびアフィニティクロマトグラフィー）；等電集束法；ゲル電気泳動；ならびにこのような技術と他の技術の組合せが挙げられる。当該分野で一般的に公知であるように、種々の精製工程を実施する順序は、変えられ得ること、または特定の工程が省略され得、そしてなお実質的に精製されたタンパク質またはペプチドの調製のために適切な方法が生じ得ると考えられる。
【００７１】
タンパク質またはペプチドが、常に最も精製された状態で提供されるという一般的な要件はない。実際に、実質的には精製されていない生成物が特定の実施形態における有用性を有することが企図される。部分的な精製は、いくつかの精製工程を組合せで使用することによって、または同じ一般的な精製スキームの異なる形態を使用することによって、達成され得る。例えば、ＨＰＬＣ装置を使用して実施される陽イオン交換カラムクロマトグラフィーは、一般に、低圧クロマトグラフィーシステムを使用する同じ技術よりも、より「倍」の大きい精製を生じることが理解される。低い程度の相対的精製を示す方法は、タンパク質産物の全回収率、または発現されたタンパク質の活性の維持における利点を有し得る。
【００７２】
ペプチドの移動は、ＳＤＳ／ＰＡＧＥの異なる状態に伴って、時折、有意に変化し得る（Ｃａｐａｌｄｉら、１９７７）。従って、異なる電気泳動条件下で、精製されたかまたは部分的に精製された発現産物の見かけの分子量は、変動し得ることが理解される。
【００７３】
高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）は、ピークの並外れた分解能での非常に迅速な分離により特徴付けられる。これは、適切な流速を維持するために非常に微細な粒子および高圧を使用することにより達成される。分離は、数分足らず、またはせいぜい１時間で達成され得る。さらに、少量のサンプルしか必要ではない。なぜなら、粒子は、非常に小さくかつ密に充填されているので、空隙容量が床容量の非常に小さな割合であるからである。また、サンプルの濃縮はそれほど大幅には必要ではない。なぜなら、バンドは、非常に狭いので、サンプルをほんのわずかだけ希釈するからである。
【００７４】
ゲルクロマトグラフィー、またはモレキュラーシーブクロマトグラフィーは、分子サイズに基づく特殊なタイプの分配クロマトグラフィーである。ゲルクロマトグラフィーの背後にある理論は、小さい細孔を含む不活性物質の非常に小さい粒子を用いて調製されるカラムが、細孔の大きさに依存して細孔を通過するか周りを通過するのでより小さい分子からより大きい分子を分離するということである。この粒子が作製される材料が分子を吸着しない限り、流速を決定する唯一の因子は、サイズである。従って、分子は、その形状が比較的一定である限り、サイズが減少しながら、カラムから溶出される。ゲルクロマトグラフィーは、異なるサイズの分子を分離するために卓絶している。なぜなら、分離は、全ての他の因子（例えば、ｐＨ、イオン強度、温度など）と無関係であるからである。また、実質的に吸着はなく、領域の分散はほとんどなく、そして溶出容量は、分子量にとって単純な事項である。
【００７５】
アフィニティクロマトグラフィーは、単離される物質と、この物質が特異的に結合し得る分子との間の特定の親和性に依存する、クロマトグラフィー手順である。これは、レセプター−リガンド型相互作用である。カラム材料は、結合パートナーの１つを不溶性マトリクスに共有結合することによって、合成される。次いで、このカラム材料は、溶液から物質を特異的に吸着し得る。この条件を、結合が生じない条件に変えることによって（例えば、ｐＨ、イオン強度および温度を変える）、溶出が生じる。
【００７６】
炭化水素含有化合物の精製に有用な特定のタイプのアフィニティクロマトグラフィーは、レクチンアフィニティクロマトグラフィーである。レクチンは、種々の多糖類および糖タンパク質に結合するクラスの物質である。レクチンは、通常、ブロモシアンによってアガロースに結合される。セファロースに結合したＣｏｎｃｏｎａｖａｌｉｎ  Ａは、使用されるこの種類の第１の材料であり、そして多糖類および糖タンパク質、レンズマメレクチンを含む他のレクチン、Ｎ−アセチルグルコサミニル残基の精製において有用であるコムギ胚芽アグルチニン、ならびにＨｅｌｉｘ  ｐｏｍａｔｉａレクチンの単離において広く使用されてきた。レクチン自体は、炭化水素リガンドを用いるアフィニティクロマトグラフィーを使用して精製される。ラクトースは、ヒマの実およびピーナツからレクチンを精製するために使用されており；マルトースは、レンチルマメおよびジャックマメからのレクチンの抽出において有用であり；Ｎ−アセチル−Ｄガクトサミンは、ダイズからレクチンを精製するために使用され；Ｎ−アセチルグルコサミルは、コムギ胚芽由来のレクチンに結合し；Ｄ−ガラクトサミンは、二枚貝からレクチンを得る際に使用され；そしてＬ−フルコースは、スイレン由来のレクチンに結合する。
【００７７】
マトリクスは、それ自体が任意の有意な程度まで分子を吸着せず、かつ広い範囲の化学的安定性、物理的安定性および熱的安定性を有する物質でなければならない。リガンドは、その結合特性に影響を与えない様な様式で、結合されなければならない。このリガンドはまた、比較的密な結合を提供しなければならない。そして、サンプルまたはリガンドを破壊することなく、物質を溶出することが可能でなければならない。アフィニティクロマトグラフィーの最も一般的な形態の１つは、イムノアフィニティクロマトグラフィーである。本発明に従う使用に適切な抗体の作製は、以下で考察する。
【００７８】
（ＩＶ．核酸）
（Ａ．ＤＮＡのスクリーニング）
本発明において、核酸のスクリーニングは、サンプルを感染についてスクリーニングするためだけではなく、疾患の再発の可能性を検出するために、用いられ得る。核酸ハイブリダイゼーションに依存するスクリーニング手順により、適切なプローブが利用可能である限り、任意の生物由来の任意の遺伝子配列を単離することが可能になる。オリゴヌクレオチドプローブ（これは、問題のタンパク質をコードする配列の一部に対応する）は、化学的に合成され得る。これは、アミノ酸配列の短いオリゴペプチドストレッチが、既知でなければならないことを必要とする。このタンパク質をコードするＤＮＡ配列は、遺伝コードから推定され得るが、このコードの縮重を考慮しなければならない。この配列が縮重配列である場合、混合付加反応を実施することが可能である。これは、変性二本鎖ＤＮＡの異種混合物を含む。このようなスクリーニングのために、ハイブリダイゼーションが、好ましくは、一本鎖ＤＮＡまたは変性二本鎖ＤＮＡのいずれかについて実施される。ハイブリダイゼーションは、目的のポリペプチドに関連する非常に少量のｍＲＮＡ配列が存在する供給源由来のｃＤＮＡクローンの検出において、特に有用である。言い換えると、非特異的結合の回避に関するストリンジェントなハイブリダイゼーション条件を使用することによって、例えば、標的ＤＮＡの完全な相補体である、混合物中の単一のプローブへのこの標的ＤＮＡのハイブリダイゼーションによって行われる特定のｃＤＮＡのオートラジオグラフ的可視化を可能にすることができる（Ｗａｌｌａｃｅら、１９８１）。１３ヌクレオチド長と１００ヌクレオチド長との間、好ましくは１７ヌクレオチド長と１００ヌクレオチド長との間、または本発明のいくつかの局面において、１〜２キロベースまで、またはそれ以上の長さのプローブまたはプライマーの使用により、安定かつ選択的である二重分子の形成を可能にする。２０塩基長より長い連続したストレッチにわたって相補配列を有する分子が、得られたハイブリッド分子の安定性および／または選択性を増大するために、一般に好ましい。当業者は、一般に、２０〜３０ヌクレオチド、または所望される場合、さらに長い１つ以上の相補配列を有する、ハイブリダイゼーションのための核酸分子を設計することを好む。このようなフラグメントは、例えば、化学的手段によってフラグメントを直接合成することによって、または組換え産生のための組換えベクター中に選択した配列を導入することによって、容易に調製され得る。
【００７９】
従って、本発明のヌクレオチド配列は、ＤＮＡおよび／またはＲＮＡの相補ストレッチを有する二重分子を選択的に形成する能力、またはサンプル由来のＤＮＡまたはＲＮＡの増幅のためのプライマーを提供する能力のために、使用され得る。想定される用途に依存して、当業者は、様々なハイブリダイゼーション条件を用いて、標的配列に対するプローブまたはプライマーの様々な選択性の程度を達成することを望む。
【００８０】
高い選択性を必要とする用途について、当業者は、代表的に、比較的高いストリンジェンシーの条件を用いて、ハイブリッドを形成することを望む。例えば、約５０℃〜約７０℃の温度で、約０．０２Ｍ〜約０．１０ＭのＮａＣｌにより提供されるような比較的低い塩および／または高い温度の条件。このような高いストリンジェンシーの条件は、存在したとしてもわずかしかプローブまたはプライマーとテンプレートまたは標的鎖との間のミスマッチを許容せず、そして特定の遺伝子を単離するため、または特定のｍＲＮＡ転写を検出するために特に適切である。この条件は、増量したホルムアミドを添加することにより、よりストリンジェントにされ得ることが一般的に理解されている。
【００８１】
特定の用途（例えば、部位特異的変異）について、より低いストリンジェンシー条件が好ましいことが理解される。これらの条件下で、ハイブリダイズする鎖の配列が、完全には相補的ではなく、１つ以上の位置でミスマッチしているにもかかわらず、ハイブリダイゼーションが生じ得る。塩濃度を増加することによって、および／または温度を下げることによって、条件は、ストリンジェンシーを低くされ得る。例えば、培地のストリンジェンシー条件は、約３７℃〜約５５℃の温度で、約０．１〜０．２５ＭのＮａＣｌにより提供され得、一方、低いストリンジェンシー条件は、約２０℃〜約５５℃の範囲の温度で、約０．１５Ｍ〜約０．９Ｍの塩により提供され得る。ハイブリダイゼーション条件は、所望の結果に依存して、容易に操作され得る。
【００８２】
他の実施形態において、ハイブリダイゼーションは、例えば、約２０℃〜約３７℃の温度で、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、７５ｍＭ  ＫＣｌ、３ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１．０ｍＭ  ジチオスレイトールの条件下で達成され得る。使用される他のハイブリダイゼーション条件としては、約４０℃〜約７２℃の範囲の温度で、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、５０ｍＭ  ＫＣｌ、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２が挙げられ得る。
【００８３】
特定の実施形態において、ハイブリダイゼーションを決定するために、適切な手段（例えば、標識）と組み合わせて本発明の規定された配列の核酸を用いることが有利である。広範な適切な指示手段が、当該分野で公知であり、これには、蛍光リガンド、放射性リガンド、酵素リガンドまたは検出され得る他のリガンド（例えば、アビジン／ビオチン）が挙げられる。好ましい実施形態において、当業者は、放射性試薬または他の環境的に望ましくない試薬の代わりに、蛍光標識または酵素タグ（例えば、ウレアーゼ、アルカリホスファターゼまたはペルオキシダーゼ）を用いることを望み得る。酵素タグの場合、相補核酸を含むサンプルとの特異的ハイブリダイゼーションを同定するために、視覚的または分光学的に検出可能な検出手段を提供するために用いられ得る比色指示物質が、公知である。
【００８４】
一般に、本明細書中に記載のプローブまたはプライマーは、対応する遺伝子の発現を検出するための、溶液ハイブリダイゼーションにおいて（ＰＣＲＴＭにおけるように）、および固相を用いる実施形態において、試薬として有用であることが想定される。固相に関する実施形態において、試験ＤＮＡ（またはＲＮＡ）は、吸着されるか、またはそうでなければ選択されたマトリクスまたは表面に固定される。この固定された一本鎖核酸は、次いで、所望の条件下で、選択されたプローブとのハイブリダイゼーションに供される。この選択される条件は、特定の環境に依存する（例えば、Ｇ＋Ｃ含量、標的核酸のタイプ、核酸の供給源、ハイブリダイゼーションプローブのサイズなどに依存する）。特定の目的の用途についてのハイブリダイゼーション条件の最適化は、当業者に周知である。ハイブリダイズした分子を洗浄して、非特異的に結合したプローブ分子を除去した後、ハイブリダイゼーションが検出され、そして／または結合した標識の量を決定することによって、定量される。代表的な固相ハイブリダイゼーション方法は、米国特許第５，８４３，６６３号、同第５，９００，４８１号および同第５，９１９，６２６号に開示される。本発明の実施において使用され得る他のハイブリダイゼーション方法は、米国特許第５，８４９，４８１号、同第５，８４９，４８６号および同第５，８５１，７７２号に開示される。本明細書のこの節で特定されるこれらおよび他の参考文献の関連の部分は、本明細書中で参考として援用される。
【００８５】
（Ｂ．ＤＮＡの合成）
ＤＮＡ配列の合成は、しばしば、所望のポリペプチド産物のアミノ酸残基の配列全体が基地である場合に適切な方法である。所望のポリペプチドのアミノ酸残基の配列全体が、既知ではない場合、ＤＮＡ配列の直接合成は可能ではなく、そして適切な方法は、ｃＤＮＡ配列の合成である。目的のｃＤＮＡ配列を単離するための標準的な手順には、高レベルの遺伝子発現を有するドナー細胞に豊富に存在するｍＲＮＡの逆転写から誘導されるプラスミ保有ｃＤＮＡライブラリーまたはファージ保有ｃＤＮＡライブラリーの形成がある。ポリメラーゼ連鎖反応技術と共に使用される場合、より稀な発現産物が、クローニングされ得る。このポリペプチドのアミノ酸配列のかなりの部分が既知である場合、標的ｃＤＮＡ中に存在すると推定される配列を複製する、標識された一本鎖ＤＮＡまたは二本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡプローブの配列の生成が、一本鎖形態に変性されたｃＤＮＡのクローン化コピーで実施されるＤＮＡ／ＤＮＡハイブリダイゼーション手順において用いられ得る。
【００８６】
（１．バイオチップ）
種々の支持体上の生体分子のアレイ（バイオチップと呼ばれる）を単離する方法が、開発され、そしてＤＮＡの合成、配列決定、変異研究、遺伝子発現分析および遺伝子の発見において用いられている。バイオチップは、本発明において有用である。なぜなら、このバイオチップにより、後の診断的価値を有し得る病理学的状態のマーカー（この場合、ＨＰＶ感染）を同定することが可能となるからである。
【００８７】
バイオチップの使用は、バイオチップ上に固定された標的への、標識分子または分子のプールのハイブリダイゼーションを含む。この標識分子は、通常、細胞または組織のｍＲＮＡ内容物のｃＤＮＡコピーである。この例において、各別個のタイプのｃＤＮＡのコピー数は、初期の単離物中の対応するｍＲＮＡ種のコピー数を反映する。一般的に、バイオチップ上に固定された標的へのハイブリダイゼーションの強度は、ｃＤＮＡの濃度に比例し、従って、ハイブリダイゼーション強度の測定により、初期の単離物中のｍＲＮＡの相対量を推定することが可能となる。単離された２つの異なるｍＲＮＡ中の同じｍＲＮＡの相対量は、同じ標的スポットへのハイブリダイゼーションの強度を、２つのサンプルの間で比較することによって、決定され得る。これらの測定値は、特定の細胞型または後の診断的価値を有し得る病理学的状態マーカーを同定するために使用され得る。あるいは、所定の疾患状態における特定のｍＲＮＡの量における急激な増加が、薬物攻撃のための可能な標的を示し得、それにより、新規の治療標的を提供する。
【００８８】
（Ｃ．核酸増幅反応）
核酸分子は、種々の技術（増幅反応を含む）を使用して、検出され得る。本発明は、細胞媒介性免疫応答を検出するため、またはＨＰＶに感染し、そして／または前癌増殖または癌増殖を有する患者を同定するために、これらの増幅反応を使用することを意図する。例えば、細胞媒介性免疫応答は、本明細書中で開示されるＴＨ１サイトカインまたはＴＨ２サイトカインのＲＴ−ＰＣＲによって検出され得る。
【００８９】
（１．ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲＴＭ））
増幅のためのテンプレートとして使用される核酸は、標準的な方法論（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，１９８９）に従って、生物学的サンプル中に含まれる細胞から単離される。この核酸は、ゲノムＤＮＡ、または分画化された細胞ＲＮＡもしくは総細胞ＲＮＡであり得る。ＲＮＡが使用される場合、ＲＮＡをｃＤＮＡに変換することが望ましくあり得る。
【００９０】
ＫＡＴＰチャネルタンパク質またはその変異体に対応する核酸に選択的にハイブリダイズするプライマー対を、選択的なハイブリダイゼーションを可能にする条件下で、単離された核酸と接触させる。用語「プライマー」とは、本明細書中で定義される場合、テンプレート依存プロセスにおいて新生核酸の合成を刺激し得る任意の核酸を含むことを意味する。代表的には、プライマーは、１０〜２０塩基対長のオリゴヌクレオチドであるが、より長い配列が用いられ得る。プライマーは、二本鎖形態または一本鎖形態で提供され得るが、一本鎖形態が好ましい。
【００９１】
一旦、ハイブリダイズすると、核酸：プライマー複合体を、テンプレート依存性核酸合成を促進する１つ以上の酵素と接触させる。複数の回の増幅（「サイクル」とも呼ばれる）を、十分な量の増幅産物が作製されるまで行う。
【００９２】
次いで、増幅産物を検出する。特定の適用において、検出は、視覚的手段によって実施され得る。あるいは、検出は、組み込まれた放射標識もしくは蛍光標識の化学ルミネセンス、放射性シンチグラフィーを介するかまたは電気的もしくは熱的インパルスシグナル（Ａｆｆｙｍａｘ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を使用するシステムを介する、生成物の間接的な同定を包含し得る。
【００９３】
多数のテンプレート依存性プロセスが、所定のテンプレートサンプルに存在するマーカー配列を増幅するために利用可能である。最も良く知られた増幅方法のうちの１つは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲＴＭと呼ばれる）であり、これは、米国特許第４，６８３，１９５号、同第４，６８３，２０２号、および同第４，８００，１５９号に詳細に記載され、そしてそれぞれが、本明細書中において、その全体が参考として援用される。
【００９４】
簡単に述べると、ＰＣＲＴＭにおいて、マーカー配列の対向する相補鎖上の領域に対して相補的な２つのプライマー配列が、調製される。過剰なデオキシヌクレオシドトリホスフェートが、ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｔａｑポリメラーゼ）とともに反応混合物に添加される。マーカー配列がサンプル中に存在する場合、プライマーは、マーカーに結合し、そしてポリメラーゼによって、プライマーが、ヌクレオチド上に添加することによって、マーカー配列に沿って伸長される。反応混合物の温度を上昇および低下させることによって、伸長したプライマーは、マーカーから解離して反応生成物を形成し、過剰なプライマーが、マーカーおよび反応生成物に結合し、そしてこのプロセスが繰り返される。
【００９５】
逆転写酵素ＰＣＲＴＭ（ＲＴ−ＰＣＲＴＭ）増幅手順は、増幅されたｍＲＮＡの量を定量するために、または所望のｍＲＮＡからｃＤＮＡを調製するために実施され得る。ＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写する方法は、周知であり、そしてＳａｍｂｒｏｏｋら、１９８９に記載される。逆転写のための代替の方法は、熱安定性ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを利用する。これらの方法は、１９９０年１２月２１日に出願されたＷＯ９０／０７６４１（これは、本明細書中において参考として援用される）に記載される。ポリメラーゼ連鎖反応方法論は、当該分野において周知である。
【００９６】
（２．他の核酸増幅反応）
増幅のための別の方法は、ＥＰＡ番号３２０３０８（本明細書中において、その全体が参考として援用される）に開示されるリガーゼ連鎖反応（「ＬＣＲ」）である。ＬＣＲにおいて、２つの相補的なプローブ対が調製され、そして標的配列の存在下において、各対は、標的の対向する相補鎖に結合し、その結果、それらは、当接する。リガーゼの存在化において、２つのプローブ対は、連結して、単一の単位を形成する。温度サイクリング（ＰＣＲＴＭにおけるように）によって、結合した連結単位は、標的から解離し、次いで、過剰なプローブ対の連結のために「標的配列」として役立つ。米国特許第４，８８３，７５０号は、標的配列にプローブ対を結合するための、ＬＣＲと類似の方法を記載する。
【００９７】
Ｑｂｅｔａ  Ｒｅｐｌｉｃａｓｅ（ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ８７／００８８０（本明細書中において参考として援用される）に記載される）はまた、本発明におけるなお別の増幅方法として使用され得る。この方法において、標的の配列に相補的な領域を有するＲＮＡの複製配列は、ＲＮＡポリメラーゼの存在下においてサンプルに添加される。ポリメラーゼは、複製配列をコピーして、次いで、この複製配列が、検出され得る。
【００９８】
等温増幅方法（制限エンドヌクレアーゼおよびリガーゼが使用されて、制限部位の１つの鎖中のヌクレオチド５’−［α−チオ］−トリフォスフェートを含む標的分子の増幅を達成する）はまた、本発明における核酸の増幅において有用であり得る。
【００９９】
鎖置換増幅（Ｓｔｒａｎｄ  Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）（ＳＤＡ）は、複数回の鎖置換および合成（すなわち、ニックトランスレーション）を含む核酸の等温増幅を実施する別の方法である。類似の方法（修復鎖反応（Ｒｅｐａｉｒ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ（ＲＣＲ）と呼ばれる）は、増幅に対して標的化された領域全体にわたっていくつかのプローブをアニーリングし、続いて、４つの塩基のうちの２つのみが、存在する修復反応を行うことを包含する。他の２つの塩基が、簡単な検出のためにビオチニル化誘導体として添加され得る。類似のアプローチがＳＤＡにおいて使用される。標的特異的配列はまた、環式プローブ反応（ＣＰＲ）を使用して検出され得る。ＣＰＲにおいて、非特異的ＤＮＡの３’配列および５’配列ならびに特定のＲＮＡの中間配列を有するプローブが、サンプル中に存在するＤＮＡにハイブリダイズされる。ハイブリダイゼーションにおいて、反応は、ＲＮａｓｅ  Ｈを用いて処理され、そしてプローブの生成物が、消化後に放出される特徴的な生成物として同定される。元のテンプレートは、別のサイクリングプローブにアニールされ、そして反応が繰り返される。
【０１００】
ＧＢ出願番号２２０２３２８、およびＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ８９／０１０２５に記載されるなお別の増幅方法（それぞれが、本明細書中において、その全体が参考として援用される）は、本発明に従って使用され得る。前者の出願において、「改変」プライマーは、ＰＣＲＴＭ様のテンプレート依存性合成および酵素依存性合成において使用される。プライマーは、捕捉部分（例えば、ビオチン）および／または検出器部分（例えば、酵素）を用いて標識することによって改変され得る。後者の出願において、過剰標識プローブが、サンプルに添加される。標的配列の存在下において、プローブが結合し、そして触媒的に切断される。切断後、標的配列が、インタクトなまま放出され、過剰なプローブによって結合される。標識プローブの切断は、標的配列の存在を示す。
【０１０１】
他の核酸増幅手順は、転写ベースの増幅系（ＴＡＳ）を含み、これは、核酸配列ベースの増幅（ＮＡＳＢＡ）および３ＳＲ  Ｇｉｎｇｅｒａｓら、ＰＣＴ出願ＷＯ  ８８／１０３１５（本明細書中において参考として援用される）を含む。ＮＡＳＢＡにおいて、核酸は、標準的なフェノール／クロロホルム抽出、臨床的サンプルの熱変性、溶解緩衝液を用いる処理、ならびにＤＮＡおよびＲＮＡの単離のためのミニスピンカラムまたはＲＮＡの塩化グアニジニウム抽出によって増幅のために調製され得る。これらの増幅技術は、標的特異的配列を有するプライマーをアニーリングすることを包含する。重合に続いて、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドをＲＮａｓｅ  Ｈで消化し、二本鎖ＤＮＡ分子を再び熱変性する。いずれの場合においても、一本鎖ＤＮＡを、第２標的特異的プライマーの添加によって完全二本鎖を作製し、続いて、重合する。次いで、二本鎖ＤＮＡ分子をＲＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｔ７またはＳＰ６）によって複数転写する。等温サイクル反応において、ＲＮＡは、一本鎖ＤＮＡに逆転写され、次いでこれは、二本鎖ＤＮＡに変換され、次いで、もう一度ＲＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｔ７またはＳＰ６）を用いて転写される。得られる生成物は、短縮されているか完全であるかにかかわらず、標的特異的配列を示す。
【０１０２】
Ｄａｖｅｙら（ＥＰＡ番号３２９８２２、その全体が参考として本明細書中で参考として援用される）は、一本鎖ＲＮＡ（「ｓｓＲＮＡ」）、ｓｓＤＮＡ、および二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）（これらは、本発明に従って、使用され得る）をサイクル的に合成することを包含する核酸増幅プロセスを開示する。ｓｓＲＮＡは、第１のプライマーオリゴヌクレオチドに対するテンプレートであり、これを、逆転写酵素（ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ）によって伸長する。次いで、ＲＮＡを、リボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅ  Ｈ、ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれかとの二重鎖においてＲＮＡに特異的なＲＮａｓｅ）の作用によって、得られるＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖から除去される。得られたｓｓＤＮＡは、第２プライマーに対するテンプレートであり、これはまた、このテンプレートに対して相同な５’側のＲＮＡポリメラーゼプロモーター（Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼによって例示される）の配列を含む。次いで、このプライマーを、ＤＮＡポリメラーゼ（Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡポリメラーゼＩの大きな「Ｋｌｅｎｏｗ」フラグメントによって例示される）によって伸長され、二重鎖ＤＮＡ（「ｄｓＤＮＡ」）分子を生じ、この二重鎖分子は、プライマー間に元のＲＮＡの配列と同一の配列を有し、そしてさらに、１つの末端において、プロモーター配列を有する。このプロモーター配列は、ＤＮＡの多くのＲＮＡコピーを作製するために適切なＲＮＡポリメラーゼによって使用され得る。次いで、これらのコピーは、再びサイクルに入り得、非常に速い増幅を導く。酵素の適切な選択とともに、この増幅は、各サイクルにおける酵素の添加なしで、等温的になされ得る。これらのプロセスの臨床的性質に起因して、開始配列は、ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれかの形態であるように選択され得る。
【０１０３】
Ｍｉｌｌｅｒら（ＰＣＴ出願ＷＯ８９／６７００、その全体が本明細書中において参考として援用される）は、標的一本鎖ＤＮＡ（「ｓｓＤＮＡ」）へのプロモーター／プライマー配列のハイブリダイゼーション、続く、配列の多くのＲＮＡコピーの転写に基づく核酸配列増幅スキームを開示する。このスキームは、サイクル的ではなく、すなわち、新たなテンプレートが、得られたＲＮＡ転写物から作製されない。他の増幅方法としては、「ＲＡＣＥ」および「１側面（ｏｎｅ−ｓｉｄｅｄ）ＰＣＲ」が挙げられる（Ｆｒｏｈｍａｎ，１９９０、参考として援用される）。
【０１０４】
得られる「ジ−オリゴヌクレオチド」の配列を有する核酸の存在下での２個（またはそれ以上）のオリゴヌクレオチドの連結、それによるジ−オリゴヌクレオチドの増幅に基づく方法はまた、本発明の増幅工程において使用され得る。
【０１０５】
（Ｄ．核酸の検出）
任意の増幅に続いて、テンプレートおよび／または過剰なプライマーから増幅生成物を分離することは望ましくあり得る。核酸の検出は、ＨＰＶに感染した患者および／あるいは前癌増殖または癌増殖を有する患者の、細胞媒介免疫応答を同定する際に有用であり得る。
【０１０６】
１つの実施形態において、増幅生成物は、標準的方法（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９）を使用して、アガロース、アガロース−アクリルアミドまたはポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分離される。分離された増幅生成物は、切断され、されなる操作のためにゲルから溶出され得る。低融点アガロースゲルを使用して、分離されたバンドを、ゲルを加熱することによって除去し、続いて、核酸を抽出し得る。
【０１０７】
核酸の分離はまた、当該分野において公知のクロマトグラフィー技術によってもたらされ得る。本発明の実施において使用され得る多くの種類のクロマトグラフィーが存在し、これには、吸着クロマトグラフィー、分配クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、モレキュラーシーブクロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、カラムクロマトグラフィー、ペーパークロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィー、およびガスクロマトグラフィーならびにＨＰＬＣが挙げられる。
【０１０８】
特定の実施形態において、増幅生成物は、可視化される。代表的な可視化方法は、臭化エチジウムを用いるゲルの染色およびＵＶ光下でのバンドの可視化を含む。あるいは、増幅生成物が、放射線標識または蛍光分析標識ヌクレオチドを用いて一体的に標識される場合、分離された増幅生成物は、Ｘ線フィルムに暴露され得るか、または適切な励起スペクトル下で可視化され得る。
【０１０９】
１つの実施形態において、増幅生成物の分離に続いて、標識核酸プローブが、増幅マーカー配列と接触する。プローブは、好ましくは、発色団に結合されるが、放射標識され得る。別の実施形態において、プローブは、結合パートナー（例えば、抗体またはビオチン）、あるいは検出可能な部分を有する別の結合パートナーに結合される。
【０１１０】
特定の実施形態において、検出は、サザンブロットおよび標識プローブとのハイブリダイゼーションによる。サザンブロットに含まれる技術は、当業者に周知である（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９を参照のこと）。上記の１つの例は、米国特許第５，２７９，７２１号に（本明細書中において参考として援用される）に記載され、これは、核酸の自動化電気泳動および移動のための装置および方法を開示する。装置は、ゲルの外部操作なしに電気泳動およびブロットを可能にし、そして本発明に従って、方法を実施することに理想的に適する。
【０１１１】
ＨＰＶ感染はまた、触媒化シグナル増幅化比色ＤＮＡインサイチュハイブリダイゼーション（ＣＳＡＣ−ＩＳＨ）（ＧｅｎＰｏｉｎｔ  ｓｙｓｔｅｍ，ＤＡＫＯ）（Ｂｉｒｎｅｒら、２００１）によって検出され得る。
【０１１２】
本発明の実施において使用され得る核酸の検出の他の方法は、米国特許第５，８４０，８７３号、同第５，８４３，６４０号、同第５，８４３，６５１号、同第５，８４６，７０８号、同第５，８４６，７１７号、同第５，８４６，７２６号、同第５，８４６，７２９号、同第５，８４９，４８７号、同第５，８５３，９９０号、同第５，８５３，９９２号、同第５，８５３，９９３号、同第５，８５６，０９２号、同第５，８６１，２４４号、同第５，８６３，７３２号、同第５，８６３，７５３号、同第５，８６６，３３１号、同第５，９０５，０２４号、同第５，９１０，４０７号、同第５，９１２，１２４号、同第５，９１２，１４５号、同第５，９１９，６３０号、同第５，９２５，５１７号、同第５，９２８，８６２号、同第５，９２８，８６９号、同第５，９２９，２２７号、同第５，９３２，４１３号、および同第５，９３５，７９１号（これらのそれぞれは、本明細書中において、参考として援用される）に開示される。
【０１１３】
（Ｖ．細胞媒介免疫（ＣＭＩ））：
本願発明のいくつかの方法は、再発の予後診断インジケーターとして、またはＣＩＮの発生に対する予防的治療として、それらを使用することによってＴ細胞応答を有利にする。より詳細には、これらの方法は、ＨＰＶ１６のＥ６腫瘍タンパク質（ｏｎｃｏｐｒｏｔｅｉｎ）およびＥ７腫瘍タンパク質からの合成ペプチドに対するＣＭＩ応答についてアッセイする。ＨＰＶ１６のＥ６遺伝子およびＥ７遺伝子は、しばしば、同時に発現され、そしてＨＰＶ１６陽性頸部癌からの生検における最も豊富なウイルス転写物である（Ｗｅｔｔｓｔｅｉｎ，１９９０；Ｓｅｅｄｏｒｆら、１９８７）。Ｅ６オープンリーディングフレームおよびＥ７オープンリーディングフレームの両方の同時発現が、種々の哺乳動物細胞の種々の悪性疾患形質転換の有効な悪性疾患形質転換に必要であり、そして十分であるという強い証拠がある（Ｍｕｎｇｅｒら、１９８９）。さらに、ウイルスゲノムのＥ６領域およびＥ７領域の連続発現は、悪性疾患表現型を維持するのに必要とされるようである（ｖｏｎ  Ｋｎｅｂｅｌ  Ｄｏｅｂｅｒｉｔｚら、１９８８）。
【０１１４】
免疫能（ｉｍｍｕｎｅ  ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ）哺乳動物における大部分のウイルス感染は、ウイルス感染細胞に対する細胞媒介免疫応答を生じ、正味の効果が細胞の溶解である。ウイルス感染の間、ウイルスタンパク質は、新規なウイルス粒子への封入のために細胞内に合成される。内因性ウイルスタンパク質のうちのいくつかはまた、分解して、クラスＩ抗原提示経路に輸送され、ここで、外来抗原が、クラスＩ  ＭＨＣ分子と会合する。次いで、このペプチドＭＨＣ複合体は、細胞表面に輸送され、ここで、外来ペプチドが細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）に対して、自己ＭＨＣの文脈で提示される。
【０１１５】
ＣＴＬは、抗原特異的エフェクター細胞である。リンパ細胞表面マーカー研究は、当業者に公知の種々の手順（免疫蛍光およびフローサイトメトリーの使用を含む）を使用するこのようなＴ細胞表面マーカーの存在についてアッセイするために使用され得る。外来として抗原を認識するとすぐに、ＣＴＬは、アポトーシスを誘導する分子相互作用を介するかまたはその完全性を破壊する原形質膜に穴を作製する孔形成酵素の分泌によってのいずれかで、標的細胞を溶解する。従って、ＣＴＬ媒介免疫応答は、ウイルス感染細胞のクリアランスにおいて有意な役割を果たす。
【０１１６】
ＣＴＬエフェクター細胞がウイルス感染標的細胞を溶解する能力は、遺伝的制限および抗原的制限によって調製される。標的細胞は、もともとＣＴＬを誘導したウイルス抗原と同じかまたは等しいウイルス抗原を保有しなければならない。標的細胞および誘導ＣＴＬはまた、同じＭＨＣクラスＩ分子を有しなければならない。
【０１１７】
（Ａ．末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ））
増殖性応答は、ＰＢＭＣから得られる。ＰＢＭＣを単離し得る方法が少しある。
【０１１８】
単核細胞は、リムルス変形細胞溶解アッセイによって、内毒素を含まないことが決定された、２０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）を有するＲＰＭＩ  １６４０において、コラーゲンコーティングを有するかまたは有さないガラスまたはポリエチレン組織培養容器に接着させることによって非ロゼッティング（ｎｏｎ−ｒｏｓｅｔｔｉｎｇ）細胞から分離される；あるいは、自家血清、または１０％ＡＢ＋通常ドナー血清を、血清供給源として使用し得る。非接着細胞を、穏やかに洗浄することによって除去する。これらの方法を使用して、接着細胞は、通常、＞９０％の単核細胞である。組織学的分析が、Ｔ細胞、Ｂ細胞、またはＮＫ細胞の有意な混入が存在することを示唆する場合、これらの混入細胞は、モノクローナル抗体のカクテル（抗ｌｅｕ  ５ｂ、抗ｌｅｕ  １２および抗ｌｅｕ１１ｂならびに仔のウサギ相補物を含む）を用いる処理によって除去された（Ｒｏｓｓｅｎら、１９８５）。
【０１１９】
単核細胞は、テフロン（登録商標）コートされた容器中での懸濁培養のために、加湿５％ＣＯ２雰囲気下で３７℃で１時間以上の接着後に、放出される（Ｃｒｏｗｅら、１９８７）。コラーゲンでコーティングされた表面上にプレートされた細胞の場合において、１ｍｇ／ｍｌコラーゲナーゼ１型を培地に添加する。細胞を、５％ＦＳＣおよびＥＤＴＡを含む、カルシウムおよびマグネシウムを含まないＤｕｌｂｅｃｃｏリン酸緩衝化生理食塩水中で、１５分間以上、インキュベーションによって放出する。ＥＤＴＡを伴うインキュベーションを、氷上で行う。使い捨て可能な細胞スクレーパーを使用して、細胞の取り除きを助ける。取り除かれた細胞を、２回、カルシウムおよびマグネシウムを含まないＤｕｌｂｅｃｃｏのＰＢＳで洗浄し、そしてＣｒｏｗｅら（１９８７）によって記載されるように、Ｔｅｆｌｏｎｇ；ジャーにおいて、ＲＰＭＩ  １６４０および１０％ＡＢ＋ヒト血清中で培養する。
【０１２０】
末梢血単核細胞を単離するための第２のストラテジーは、ＨｅｓｔｅｒおよびＷａｌｋｅｒ（１９８１）に従う、単核細胞濃度を非ロゼッティング集団において濃縮するためのＰｅｒｃｏｌｌ密度勾配である。単核細胞濃縮集団を、必要に応じて、混入残渣Ｔ細胞、Ｂ細胞およびＮＫ細胞を取り除くために、モノクローナル抗体カクテル（上記）および相補物を用いて処理する。単核細胞は、この方法によって回収され、単核細胞が表面に接着する場合、必要に応じて生じる「活性化」無しに、Ｔｅｆｌｏｎコーティング容器内で直接的に培養される。しかし、Ｐｅｒｃｏｌｌ密度勾配工程、ならびに／あるいは抗体および相補物の暴露がまた、異なる様式で可能な場合、これらの細胞を「活性化」し得ることが可能である。
【０１２１】
末梢血単核細胞を単離するための第３のアプローチは、フローサイトメーターの高速細胞選別機能を使用して、前方角度光散乱に基づいて、それらを選別するための単核細胞の屈折特性を利用することである。この代替法は、高度に純粋な細胞を生成する可能性があり、この細胞は、抗体または相補物との接触による影響を受けていない。
【０１２２】
（Ｂ．Ｔ細胞応答）
Ｔ細胞応答は、当業者に公知の種々のプロトコルによって測定され得る。これらのアッセイのうちのいくつかは、以下にさらに詳細に記載される。
【０１２３】
（１．３［Ｈ］チミジン組み込みアッセイ）
異なるサンプルからのＰＢＭＣの増殖性応答は、公開された論文（Ｎｅｈｅｔｅ、１９９６；Ｎｅｈｅｔｅ、１９９５）に記載されるように、標準的な３［Ｈ］チミジン組み込みアッセイによって決定され得る。個々のＥ６ペプチドおよびＥ７ペプチドに対するＴ細胞増殖性応答の重要性（刺激指数［ＳＩ］の点で）は、ペプチドが添加されなかったコントロールよりも、そのペプチドに暴露された細胞によって３［Ｈ］チミジン組み込みを数倍増加するとして計算され得る。少なくとも２．０（少なくとも約２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３．０、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４．０またはそれ以上を含む）のＳＩ値が、ポジティブな応答であると考えられる。一般的に、ＳＩ値は、ペプチドとともにインキュベートされる細胞から培地における放射能（ｃｐｍ）の量を測定し、そしてペプチドとともにインキュベートされていない細胞からの培地（培地のみ）における放射能の量によって除算することによって計算される。
【０１２４】
（２．５１［Ｃｒ］を使用する溶解）
細胞媒介リンパ球溶解（ＣＭＬ）は、Ｔ細胞応答の指標として使用され得る。標的細胞を、エフェクター細胞への暴露の前に、放射性クロミウム−５１（５１［Ｃｒ］）を用いて標識し得る。培地に放出される５１［Ｃｒ］の量は、細胞媒介溶解のレベルに比例する。
【０１２５】
（３．γ−インターフェロン産生）
インターフェロンγ（γ−インターフェロン）（ＩＩ型または免疫インターフェロンとも呼ばれる）は、Ｔ細胞およびＮＫ細胞によって産生される。これは、ヘルパーＴ細胞の発生に重要である。これは、主要なマクロファージ活性化因子であるので、細胞媒介免疫において強力なサイトカインである。γ−インターフェロンは、ＭＨＣクラスＩ発現およびＭＨＣクラスＩＩ発現のレベルを増加し、これは、抗原提示および他の認識反応を改善する。さらに、これは、ＴＮＦ−αの効果を増幅し、そして脈管内皮細胞の表面上において接着分子の発現レベルを上昇させ、これは、Ｔ細胞接着および管外遊出を導く。
【０１２６】
（４．テトラマーアッセイ）
テトラマーアッセイは、当業者に周知である。Ａｌｔｍａｎ、１９９６を参照のこと。
【０１２７】
（５．サイトカイン産生）
サイトカインは、免疫応答の調節および種々の細胞型の分化経路において重要な役割を果たすタンパク質である。これらは、Ｔ細胞の調節および発生において重要な機能を有し、そしてこれらは、γ−インターフェロン、インターロイキン１（ＩＬ−１）、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、リンホトキシン、ＭＩＦ、ＴＧＦ−β、ＴＧＦ−α、および他の走化性サイトカインが挙げられる。ＴＨ１サイトカインは、ＩＬ−２、インターフェロン（ＩＦＮ）γ、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）α、またはＴＮＦ−β、ＩＬ−３、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、またはＩＬ−１８を含む。ＴＨ２サイトカインは、ＩＬ−１、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４またはＩＬ−１８を含む。サイトカインに対するアッセイは、当該分野において周知であり、これらのうちのいくつが本明細書中に開示される。
【０１２８】
（６．サイトカイン分析）
ＴＨ１サイトカインおよびＴＨ２サイトカインの測定は、ＥＬＩＳＡ、放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）またはフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）によってなされ得る。種々の有用な免疫検出方法の工程が、科学文献（例えば、ＤｏｏｌｉｔｔｌｅおよびＢｅｎ−Ｚｅｅｖ、１９９９；ＧｕｌｂｉｓおよびＧａｌａｎｄ、１９９３；およびＤｅ  Ｊａｇｅｒら、１９９３（それぞれが、本明細書中において参考として援用される）に記載されている。
【０１２９】
（７．イムノアッセイ）
なおさらなる実施形態において、本発明は、生物学的成分のタンパク質、ポリペプチド、またはペプチドを結合、精製除去、定量および／またはそれ以外で一般的に検出するための免疫検出方法に関する。いくつかの実施形態において、イムノアッセイは、ＨＰＶペプチドに対する細胞媒介免疫応答を検出するために使用される。いくつかの免疫検出法としては、少し挙げると、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）、免疫放射線アッセイ、蛍光イムノアッセイ、化学ルミネセンスアッセイ、生物ルミネセンスアッセイ、およびウェスタンブロットが挙げられる。種々の有用な免疫検出方法の工程は、科学文献（例えば、Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ  ＭＨおよびＢｅｎ−Ｚｅｅｖ  Ｏ、１９９９；ＧｕｌｂｉｓおよびＧａｌａｎｄ  Ｐ、１９９３；およびＤｅ  Ｊａｇｅｒら、１９９３（それぞれが、本明細書中において参考として援用される）に記載されている。
【０１３０】
一般的に、免疫結合方法は、タンパク質、ポリペプチドおよび／またはペプチドを含むことが推測されるサンプルを得る工程、およびサンプルを本発明に従って抗体と、場合によって、免疫複合体を形成させるのに有効な条件下で、接触させる工程を包含する。例えば、本発明において、Ｅ６ペプチドおよび／またはＥ７ペプチドは、Ｔ細胞応答を誘発するために、細胞をチャレンジするために使用され得る。抗体は、細胞媒介応答の結果として産生されるサイトカインに指向し得るか、またはＴ細胞上のサイトカインレセプターに指向し得る。あるいは、ＣＤ６９またはＣＤ４５、あるいはその両方に対する抗体が使用され得る。
【０１３１】
これらの方法は、細胞小器官、細胞、組織、または生物のサンプルからタンパク質、ポリペプチドおよび／またはペプチドを生成するための方法を包含する。これらの例において、抗体は、サンプルからタンパク質、ポリペプチドおよび／またはペプチド成分を除去する。この抗体は、好ましくは、固体支持体（例えば、カラムマトリクスの形態で）に結合され、そしてタンパク質、ポリペプチドおよび／またはペプチド抗原性成分を含むと推定されるサンプルは、固定化された抗体に適用される。望ましくない成分は、カラムから洗浄され、固定化抗体に免疫複合体化された抗原を残して溶出させる。
【０１３２】
サイトカイン応答検出によって、分析される生物学的サンプルは、サイトカインを含むと疑われる任意のサンプル（例えば、組織切片または標本、ホモジナイズされた組織抽出物、細胞、オルガネラ、上記抗原含有組成物のいずれかの分離および／もしくは精製された形態、または細胞もしくは組織と接触する任意の生物学的流体さえも（血液および／または血清を含む））であり得るが、組織サンプルまたは抽出物が好ましい。
【０１３３】
免疫複合体（一次免疫複合体）の形成を可能にするのに有効な条件下でかつそれに十分な時間の間、選択された生物学的サンプルを抗体と接触させることは、一般に、抗体組成物をサンプルに単に添加し、そして抗体が、存在する任意の抗原と免疫複合体を形成する、すなわち、この抗原に結合するに十分に長い時間の間、混合物をインキュベートすることである。この時点後、一般には、このサンプル−抗体組成物（例えば、組織切片、ＥＬＩＳＡプレート、ドットブロット、またはウェスタンブロット）は洗浄されて、いかなる非特異的結合抗体種も除去し、一次免疫複合体内で特異的に結合された抗体のみが検出されることを可能にする。
【０１３４】
一般に、免疫複合体形成の検出は、当該分野で周知であり、多数のアプローチの適用によって達成され得る。これらの方法は、一般に、標識またはマーカー（例えば、放射能タグ、蛍光タグ、生物学的タグおよび酵素タグのいずれか）の検出に基づく。このような標識の使用に関する米国特許としては、以下が挙げられる：３，８１７，８３７；３，８５０，７５２；３，９３９，３５０；３，９９６，３４５；４，２７７，４３７；４，２７５，１４９；および４，３６６，２４１（各々は、本明細書中に参考として援用される）。もちろん、当業者は、当該分野で公知であるように、二次結合リガンド（例えば、第二の抗体および／またはビオチン／アビジンリガンド結合配置）の使用によってさらなる利点を見出し得る。
【０１３５】
検出において使用される抗原抗体は、それ自体、検出可能な標識に結合され得る。ここで、当業者は、次いで、この標識を単に検出することにより、組成物中の一次免疫複合体の量を決定することが可能である。あるいは、一次免疫複合体中で結合されるようになる第一の抗体は、この抗体について結合親和性を有する第二の結合リガンドによって検出され得る。これらの場合において、この第二の結合リガンドは、検出可能な標識に結合され得る。この第二の結合リガンドは、それ自体、しばしば抗体であり、これは、従って、「二次」抗体と呼ばれ得る。一次免疫複合体は、二次免疫複合体の形成を可能にするのに有効な条件下でかつそれに十分な時間の間、標識された二次結合リガンド（または抗体）と接触される。一般には、次いで、この二次免疫複合体が洗浄されて、いかなる非特異的結合の標識された二次抗体またはリガンドを除去し、そして次いで、二次免疫複合体中の残存する標識が検出される。
【０１３６】
さらなる方法としては、二段階アプローチによる一次免疫複合体の検出が挙げられる。抗体について結合親和性を有する第二の結合リガンド（例えば、抗体）は、上記のように、二次免疫複合体を形成するために使用される。洗浄後、この二次免疫複合体は、この第二の抗体について結合親和性を有する第三の結合リガンドまたは抗体と、再度、免疫複合体（三次免疫複合体）の形成を可能にするのに有効な条件下でかつそれに十分な時間の間、接触される。第三のリガンドまたは抗体は、検出可能な標識に結合され、そのように形成される三次免疫複合体の検出を可能にする。この系は、このことが所望である場合に、シグナルの増幅を提供し得る。
【０１３７】
Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｃａｎｔｏｒにより設計された免疫検出の１つの方法は、２つの異なる抗体を使用する。第一の工程のビオチン化されたモノクローナル抗体もしくはポリクローナル抗体は、標的抗原（１つまたは複数）を検出するために使用され、そして第二の工程の抗体は、複合体化されたビオチンに付着されたビオチンを検出するために、次いで使用される。その方法において、試験されるべきサンプルがまず、第一の工程の抗体を含有する溶液中でインキュベートされる。標的抗原が存在する場合、抗体のいくつかが抗原に結合し、ビオチン化された抗体／抗原複合体を形成する。次いで、この抗体／抗原複合体が、ストレプトアビジン（もしくはアビジン）、ビオチン化ＤＮＡ、および／またはビオチン化された相補ＤＮＡの逐次溶液中でのインキュベーションによって増幅され、各工程において、さらなるビオチン部位を抗体／抗原複合体に添加する。この増幅工程は、適切なレベルの増幅が達成されるまで反復され、その時点で、サンプルは、ビオチンに対して第二の工程の抗体を含有する溶液中でインキュベートされる。この第二の工程の抗体は、例えば、色原体基質を用いる組織酵素的方法（ｈｉｓｔｏｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）によって抗体／抗原複合体の存在を検出するために使用され得る酵素を用いて、標識される。適切な増幅によって、肉眼で見える結合体が生成され得る。
【０１３８】
別の公知の免疫検出方法は、免疫ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）方法を利用する。ＰＣＲ法は、ビオチン化ＤＮＡとのインキュベーションまでＣａｎｔｏｒ法に類似するが、複数回のストレプトアビジンとビオチン化ＤＮＡとのインキュベーションを用いる代わりに、ＤＮＡ／ビオチン／ストレプトアビジン／抗体複合体が、抗体を遊離する低いｐＨまたは高い塩類の緩衝液で洗い流される。得られる洗浄溶液は、適切なコントロールと共に適切なプライマーを用いるＰＣＲ反応を実施するために、次いで使用される。この方法は、子宮頸癌またはＣＩＮを有するＨＰＶに感染した女性の集団を同定する有用な手段を提供する。
【０１３９】
ＨＰＶによって感染した人が前癌増殖または癌性増殖を有するかを決定する別の手段は、Ｂｉｒｎｅｒら２００１およびＣｌａｖｅｌら２０００（共に参考として援用される）において示されるようなハイブリッド捕捉によるものである。
【０１４０】
本発明の免疫検出方法は、特異性（例えば、癌特異的遺伝子産物など）が発現される、種々の疾患のような状態の診断および予後において明白な有用性を有する。ここで、ＣＩＮに至り得る、ＨＰＶに感染していると疑われる生物学的および／または臨床サンプルが使用される。しかし、これらの実施形態はまた、非臨床サンプル（例えば、抗原もしくは抗体サンプルの力価測定（例えば、ハイブリドーマの選択の際）におけるような）への適用を有する。
【０１４１】
（ａ．ＥＬＩＳＡ）
上記で詳述したように、免疫アッセイは、それらの最も簡素かつ／または直接的な意味において、結合アッセイである。特定の好ましい免疫アッセイは、当該分野で公知の種々のタイプの酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）および／または放射性免疫アッセイ（ＲＩＡ）である。組織切片を用いる免疫組織化学検出もまた、特に有用である。しかし、検出がこのような技術に制限されないことは容易に理解され、そして／またはウェスタンブロッティング、ドットブロッティング、ＦＡＣＳ分析、および／または同様のものもまた使用され得る。
【０１４２】
１つの例示のＥＬＩＳＡにおいて、本発明における、（抗原を含む）細胞媒介免疫応答の産物に対する抗体は、タンパク質親和性を提示する選択された表面（例えば、ポリスチレンマイクロタイタープレート中のウェル）上に固定化される。次いで、抗原を含有することが疑われる試験組成物（例えば、臨床サンプル）がこのウェルに添加される。結合および／または、非特異的結合免疫複合体を除去するための洗浄後、結合された抗原が検出され得る。検出は、一般に、検出可能な標識に連結される別の抗体の添加によって達成される。このタイプのＥＬＩＳＡは、シンプルな「サンドイッチＥＬＩＳＡ」である。検出はまた、第二の抗体の添加、次いで第二の抗体について結合親和性を有する第三の抗体（この第三の抗体は検出可能な標識に連結されている）の添加によって達成され得る。
【０１４３】
別の例示のＥＬＩＳＡにおいては、抗原を含有することが疑わしいサンプルが、ウェル表面上に固定化され、そして／または次いで、（抗原を含む）細胞媒介免疫応答の産物に対して産生される抗体と接触される。結合および／または、非特異的結合免疫複合体を除去するための洗浄後、結合された抗体が検出される。出発抗体が検出可能な標識に連結されている場合、免疫複合体は直接的に検出され得る。再度、免疫複合体が、第一の抗体について結合親和性を有する第二の抗体（第二の抗体は検出可能な標識に連結されている）を用いて検出され得る。
【０１４４】
抗原が固定化されている別のＥＬＩＳＡは、検出における抗体競合の使用を包含する。このＥＬＩＳＡにおいては、抗原に対する標識された抗体がウェルに添加されて、結合させられ、そして／またはそれらの標識によって検出される。未知のサンプル中の抗原の量は、コーティングされたウェルとのインキュベーションの間、抗原に対する標識された抗体とこのサンプルを混合することにより、次いで決定される。サンプル中の抗原の存在は、ウェルへの結合に利用可能な抗原に対する抗体の量を減少させるように作用し、そして従って、最終シグナルを減少させる。これはまた、未知のサンプル中の抗原に対する抗体を検出するために適切であり、ここで未標識の抗体は、抗原でコーティングされたウェルに結合し、そしてまた標識された抗体に結合するのに利用可能な抗原の量を減少させる。
【０１４５】
用いられるフォーマットにかかわらず、ＥＬＩＳＡは、共通するある特徴（例えば、コーティング、インキュベートおよび結合、非特異的結合種を除去するための洗浄、および結合免疫複合体の検出）を有する。これらを以下に説明する。
【０１４６】
抗原または抗体のいずれかでプレートをコーティングする際に、当業者は、一般に、このプレートのウェルを、その抗原または抗体の溶液と、一晩または特定の時間（時間単位）の間、インキュベートする。プレートのウェルは、次いで、不完全に吸着された材料を除去するために洗浄される。ウェルの残存する利用可能な表面がいずれも、次いで、試験抗血清に関して抗原的に中性である非特異的タンパク質で「コーティング」される。これらとしては、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、カゼインまたは乳粉末の溶液が挙げられる。このコーティングは、固定化表面上の非特異的吸着部位の遮断を可能にし、そして従って、表面上への抗血清の非特異的結合により引き起こされるバックグラウンドを減少させる。
【０１４７】
ＥＬＩＳＡにおいては、おそらく、直接的な手順よりむしろ、二次的なまたは三次的な検出手段を使用することが、より慣例的なことである。従って、ウェルへのタンパク質または抗体の結合、バックグラウンドを減少させる非反応性材料でのコーティング、および未結合材料の除去のための洗浄後、この固定化表面は、免疫複合体（抗原／抗体）形成を可能にするのに有効な条件下で、試験されるべき生物学的サンプルと接触される。免疫複合体の検出は、次いで、標識化された二次結合リガンドまたは抗体を必要とし、そして標識された三次抗体または第三の結合リガンドと組み合わせて二次結合リガンドまたは抗体を必要とする。
【０１４８】
「免疫複合体（抗原／抗体）形成を可能にするのに有効な条件下」とは、好ましくは抗原および／または抗体を溶液（例えば、ＢＳＡ、ウシガンマグロブリン（ＢＧＧ）、またはリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）／Ｔｗｅｅｎ）で希釈することを包含する条件を意味する。これらの添加された薬剤はまた、非特異的バックグラウンドの減少を補助する傾向にある。
【０１４９】
「適切な」条件はまた、このインキュベーションが有効な結合を可能にするのに十分な温度で、または時間の間にあることを意味する。インキュベーション工程は、代表的には、約１時間から、２時間まで、４時間などまでで、好ましくは２５℃〜２７℃の程度の温度であり、または約４℃で一晩などであり得る。
【０１５０】
ＥＬＩＳＡにおける全てのインキュベーション工程の後、接触された表面は、非複合体化材料を除去するように洗浄される。好ましい洗浄手順は、ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ、またはホウ酸緩衝液のような溶液での洗浄を包含する。試験サンプルと本来結合される材料との間の特異的免疫複合体の形成、および続く洗浄後、免疫複合体の微小な量の発生でさえも決定され得る。
【０１５１】
検出手段を提供するために、第二または第三の抗体は、検出を可能にする結合された標識を有する。好ましくは、これは、適当な色原体基質とのインキュベーションの際に発色を生じる酵素である。従って、例えば、当業者は、第一のおよび第二の免疫複合体を、ウレアーゼ結合体化抗体、グルコースオキシダーゼ結合体化抗体、アルカリホスファターゼ結合体化抗体、または水素ペルオキシダーゼ結合体化抗体と、さらなる免疫複合体の形成の発生に好都合である時間の間、かつその条件下で接触またはインキュベートすることを望む（例えば、ＰＢＳ含有溶液（例えば、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ）中での室温で２時間のインキュベーション）。
【０１５２】
標識された抗体とのインキュベーション、および未結合材料を除くための続く洗浄後に、標識の量は定量される（例えば、酵素標識としてペルオキシダーゼの場合において、色原体基質（例えば、尿素、またはブロモクレゾールパープル、または２，２’−アジノ−ジ−（３−エチル−ベンズチアゾリン−６−スルホン酸（ＡＢＴＳ）、またはＨ２Ｏ２）とのインキュベーションにより）。次いで、定量は、生成した色の程度を測定することにより（例えば、可視光分光光度計を用いて）達成される。
【０１５３】
（ｂ．免疫組織化学）
抗体はまた、免疫組織化学（ＩＨＣ）による研究のために調製した、新鮮に凍結したおよび／またはホルマリン固定した、パラフィン包埋した組織塊と共に使用され得る。これらの粒子状標本から組織塊を調製する方法は、種々の予後因子の以前のＩＨＣ研究において首尾よく使用されており、そして／または当業者に周知である（Ｂｒｏｗｎら、１９９０；Ａｂｂｏｎｄａｎｚｏら、１９９０；Ａｌｌｒｅｄら、１９９０）。
【０１５４】
簡潔には、凍結切片が、５０ｎｇの凍結「粉砕」組織を、プラスチック小カプセル中でリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）中で室温で再水和し；遠心分離により粒子をペレット化し；それらを粘性包埋培地（ＯＣＴ）中に再懸濁し；カプセルを逆にし、かつ／または遠心分離により再度ペレット化し；−７０℃イソペンタン中で瞬時凍結し；プラスチックカプセルを切断し、かつ／または凍結された組織シリンダーを取り出し；クリオスタットミクロトームチャック（ｃｒｙｏｓｔａｔ  ｍｉｃｒｏｔｏｍｅ  ｃｈｕｃｋ）上に組織シリンダーを固定し；かつ／または２５〜５０の連続した切片を切断することにより調製され得る。
【０１５５】
永久切片は、プラスチック遠心分離管中の５０ｍｇのサンプルの再水和；ペレット化：４時間固定のための１０％ホルマリン中の再懸濁；洗浄／ペレット化；温２．５％寒天中の再懸濁；ペレット化；寒天の硬化のための氷冷水中の冷却；管からの組織／寒天塊の取り出し；パラフィン中の塊の浸潤および／もしくは包埋；ならびに／または５０までの連続した永久切片の切断を包含する同様の方法によって調製され得る。
【０１５６】
（ｃ．蛍光選別細胞分光）
タンパク質はまた、Ｆｕｊｉｓｈｉｍａら、１９９６において記載されるようにフローサイトメトリーによって検出され得る。この方法の実施において、細胞が固定され、そして次いで検出されるべき発現タンパク質に対するモノクローナル抗体とインキュベートされる。次いで、結合された抗体は、例えば検出のために、標識された抗ＩｇＧと接触される。代表的な標識は、ＦＩＴＣである。次いで、蛍光強度が、フローサイトメーター（例えば、Ｏｒｔｈｏ  Ｃｙｔｒｏｎ、Ｏｒｔｈｏ  ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、またはＦＡＣＳｃａｎ；Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）により測定され得る。
【０１５７】
ＦＡＣＳは、それらがレーザビームを通して通過するような、それらの光散乱特性にまず基づいて、細胞の亜集団の分離を可能にする。前方光散乱（ＦＡＬＳ）は、細胞の大きさに関連し、そして右角光散乱は細胞密度、細胞輪郭、および核−細胞質比に関連する。細胞が蛍光標識抗体でタグ化されているので、次いで、それらは、蛍光強度、および明るい蛍光の細胞および低い蛍光の細胞を集めるようにＦＡＣＳにおいて設定されたポジティブウィンドウおよびネガティブウィンドウによってさらに特徴付けられ得る。細胞は、一秒あたり約３０００細胞の流動速度で選別され、そしてポジティブ細胞およびネガティブ細胞に集められる。
【０１５８】
（ｄ．ウェスタンブロット）
本発明の組成物は、免疫ブロット分析またはウェスタンブロット分析において用途を見出し得る。ペプチドは、サイトカインを産生する細胞をチャレンジするために使用され得る。本発明の抗体は、固体支持体マトリクス（例えば、ニトロセルロース、ナイロン、またはそれらの組み合わせ）上に固定化されたタンパク質の同定のための高親和性一次試薬として使用され得る。免疫沈降、続くゲル電気泳動と共に、これらは、その抗原の検出において使用される二次試薬が不利なバックグラウンドを引き起こす抗原を検出する際に使用するための一工程試薬として使用され得る。これは、研究される抗原が免疫グロブリン（細菌細胞壁成分を結合する免疫グロブリンの使用を除く）である場合、研究される抗原が検出剤と交差反応する場合、またはそれらが交差反応シグナルと同じ相対的分子量で移動する場合に、特に有用である。
【０１５９】
ウェスタンブロッティングと共に使用するための免疫学的に基づく検出方法は、タンパク質部分に対する酵素タグ化、放射能タグ化、または蛍光タグ化された二次抗体を包含し、これは、この点において特に有用であると考えられる。
【０１６０】
（ＶＩＩＩ．免疫療法）
感染または癌の処置へのアプローチとしての免疫療法は、特異的抗体および／または細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）の産生を惹起する抗原を腫瘍細胞が保有するという前提に基づく。
【０１６１】
（Ａ．免疫療法のタイプ）：
癌の免疫療法は、以下の節において記載されるように、養子免疫、受動免疫、および能動免疫として、広範に分類され得る。
【０１６２】
（１．受動免疫療法）
受動免疫療法のための多数の異なるアプローチが存在する。それらは、以下に広範にカテゴリー化され得る：抗体単独の注入；毒素または化学療法剤にカップリングされた抗体の注入；放射性同位体にカップリングされた抗体の注入；抗イディオタイプ抗体の注入；および最終的に、骨髄における腫瘍細胞の一掃。
【０１６３】
好ましくは、ヒトモノクローナル抗体は、それらが、患者において少数または全く副作用を生じないので、受動免疫療法において使用される。しかし、それらの適用は、それらの希少性によって幾分制限され、そしてこれまで病巣内投与のみされてきた。ガングリオシド抗原に対するヒトモノクローナル抗体は、皮膚再発性メラノーマを罹患する患者に病巣内投与されてきた（ＩｒｉｅおよびＭｏｒｔｏｎ、１９８６）。毎日のまたは週毎の病巣内注入後に、１０人の患者のうち６人において、退縮が観察された。別の研究においては、２つのヒトモノクローナル抗体の病巣内注入から、適度な成功が達成された（Ｉｒｉｅら、１９８９）。
【０１６４】
２つの異なる抗原に対する１つより多くのモノクローナル抗体、または複数の抗原特異性を有する抗体を投与することが有利であり得る。処置プロトコルはまた、Ｂａｊｏｒｉｎら（１９８８）におけるようなリンホカインまたは他の免疫増強剤の投与を包含し得る。ヒトモノクローナル抗体の発達は、明細書中の他の箇所においてさらに詳細に記載される。
【０１６５】
（２．能動免疫療法）
能動免疫療法において、抗原性ペプチド、ポリペプチド、もしくはタンパク質、または自己もしくは異種の腫瘍細胞組成物または「ワクチン」が、一般には、別個の細菌アジュバントと共に投与される（ＲａｖｉｎｄｒａｎａｔｈおよびＭｏｒｔｏｎ、１９９１；ＭｏｒｔｏｎおよびＲａｖｉｎｄｒａｎａｔｈ、１９９６；Ｍｏｒｔｏｎら、１９９２；Ｍｉｔｃｈｅｌｌら、１９９０；Ｍｉｔｃｈｅｌｌら、１９９３）。メラノーマの免疫療法において、高いＩｇＭ応答を惹起する患者は、しばしば、ＩｇＭ抗体を全く惹起しないまたは低いＩｇＭ抗体を惹起する患者よりもよく生存する（Ｍｏｒｔｏｎら、１９９２）。ＩｇＭ抗体は、しばしば一過性の抗体であり、そしてこの原則に対する例外は、抗ガングリオシド抗体または抗炭水化物抗体であるようである。
【０１６６】
（３．養子免疫療法）
養子免疫療法において、患者の循環リンパ球、または腫瘍浸潤リンパ球が、インビトロで単離されるか、リンホカイン（例えば、ＩＬ−２）によって活性化されるか、または腫瘍壊死の遺伝子で形質導入されるかされ、そして再投与される（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇら、１９８８；１９８９）。このことを達成するために、当業者は、動物またはヒト患者に、免疫学的に有効な量の活性化されたリンパ球を、本明細書中に記載のようにアジュバント取り込み抗原性ペプチド組成物と共に投与する。活性化されたリンパ球は、最も好ましくは、より早期に、そして血液または腫瘍サンプルから単離され、そしてインビトロで活性化（または「拡大」）された患者自身の細胞である。この形態の免疫療法は、メラノーマおよび腎臓癌の退縮のいくつかの例を生じたが、応答者の割合は、応答しなかったものに比較して少数でしかなかった。
【０１６７】
（Ｂ．ワクチン接種）
本発明は、細胞媒介免疫応答を誘発または改善するために、ＨＰＶに由来するＥ６ペプチドおよびＥ７ペプチドを用いる免疫療法の使用を包含する。これは、ＨＰＶ由来のＥ６ペプチドおよび／またはＥ７ペプチドに対してＣＭＩ応答を提示しないまたは低いＣＭＩ応答を提示する患者にとって特に意義を有する。配列番号１から１９のアミノ酸配列の全てまたは一部を含むペプチドまたはポリペプチドは、患者における細胞仲介免疫応答の誘導において、ＨＰＶ感染の処置および予防（ＨＰＶ関連の前癌性増殖もしくは癌性増殖の予防を含む）の両方のための有効なワクチンとして臨床的に非常に重要であり得る。
【０１６８】
一旦生成、合成および／または精製されると、本発明のペプチドおよびポリペプチドは、患者への投与のためのワクチンとして調製され得る。本発明のペプチド、ポリペプチド、およびワクチンは、抗原に対する免疫応答を刺激するために、他のワクチンまたはワクチン成分（例えば、他のさらなる抗原）と組み合わされ得ることもまた企図される。この実施形態において、好ましいさらなる抗原は、癌および過剰増殖性状態において特異的であるか、または優先的に発現されるとして示されるものである。本発明のペプチド、ポリペプチド、およびワクチンとの組み合わせが企図されるさらなる抗原およびワクチンとしては、米国特許第５，８４０，３１７号および第５，８８２，６５４号（本明細書中に参考として援用される）において記載されるものが挙げられる。
【０１６９】
当業者は、試験のための一連の潜在的な治療剤および送達プロトコールを構想し得る。例えば、潜在的な抗ＨＰＶ剤および抗腫瘍剤は、ヒト設計の天然産物または合成分子であり得る。さらに、このモデルは、公知の化合物および新規化合物の一群の中から有効な薬剤を選択するための媒体を提供する。任意の特定の潜在的な治療剤の投薬様式および送達様式は、薬学的に活性な組成物を調製するための十分に確立された指針を元にして決定され得る。試験化合物は、例えば、静脈内的に、皮内的に、筋内的に、局所的に、経口的に、または任意の他の薬学的に有効な経路によって投与され得る。本発明の方法によって生成される動物を使用して、研究者らは、ここに初めて、高いリスクのヒトパピローマウイルス誘導性疾患（おそらく、ウイルス複製および伝播を含む）に対する予防剤および治療剤を評価し得る。これらとしては、とりわけ、化学型の医薬、遺伝子治療、アンチセンス阻害的戦略、または予防的ワクチン接種もしくは治療的ワクチン接種が挙げられ得る。提案された治療の実験室的試験の結果を評価する多くの方法が、公知である。
【０１７０】
種々のアジュバントが、宿主種に依存して、免疫学的応答を増強するために使用され得、これらとしては、フロイント（完全および不完全）、鉱質ゲル（例えば、水酸化アルミニウム）、界面活性物質（例えば、リゾレシチン）、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油乳濁液、キーホールリンペットヘモシアニン、ジニトロフェノール、および潜在的に有用なヒトアジュバント（例えば、ＢＣＧ（カルメット−ゲラン杆菌）およびＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐａｒｖｕｍ）が挙げられるがこれらに限定されない。本発明の免疫療法における使用に加えて、アジュバントは、本発明の状況下における細胞媒介性免疫応答の検出を増強するために使用され得る。
【０１７１】
（Ｃ．標的化された送達系）
ウイルス特異的Ｔ細胞応答について試験するため、本願発明のいくつかの実施形態において、ＨＰＶポリペプチドまたはペプチドは、Ｔ細胞応答を誘発するために、細胞の表面上にこのウイルスタンパク質のフラグメントを発現するようにこれらの細胞を標的化するように送達され得る。灌流、発現構築物のトランスフェクション、ウイルスベクター、および以下に開示される他の手段を含む、種々の送達の方法が存在する。
【０１７２】
（１．灌流による移入）
本願発明の１つの実施形態は、灌流によって細胞にペプチドまたはペプチドの組み合わせを移入する。発現構築物またはウイルス構築物の連続的灌流がまた、企図される。連続的灌流において送達される構築物またはペプチドの量は、所望の取り込み量によって決定され得る。本発明は、灌流の実施例を開示し、それによって１０６細胞／ｍｌの初期濃度を有する細胞培養物が、まず標識され得、洗浄され得、次いで、２時間、１００μｇの合成ペプチドと共にインキュベートされ得る。
【０１７３】
（２．発現ベクター）
治療ペプチドの送達は、発現ベクターを使用して達成され得る。本発明の本実施形態において、ＨＰＶポリペプチドおよびペプチドは、発現構築物の使用を介して標的細胞に送達される。本願全体を通して、用語「発現構築物」は、ＨＰＶポリペプチドをコードする核酸を含む遺伝子構築物の任意の型を含むことを意味する。「ウイルスベクター」は、主にウイルス配列に由来する発現構築物をいう。この構築物を発現させるために、ＨＰＶポリヌクレオチドをコードするポリヌクレオチドは、プロモーターの転写制御下に置かれる。「プロモーター」は、宿主細胞の合成機構によって、または導入された合成機構によって認識されるＤＮＡ配列をいい、これは、遺伝子の特異的な転写を開始するために必要である。句「転写制御下」は、プロモーターが、ＲＮＡポリメラーゼの開始およびポリヌクレオチドの発現を制御するために、ポリヌクレオチドに対して正しい位置に存在することを意味する。
【０１７４】
用語プロモーターは、本明細書中で、転写制御モジュールの群をいうために使用され、このモジュールは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩの開始部位の周りにクラスター形成される。プロモーターがどのように配置されるかという考察の多くは、いくつかのウイルスプロモーター（これは、ＨＳＶチミジンキナーゼ（ｔｋ）およびＳＶ４０初期転写単位のプロモーターを含む）の分析から得られている。これらの研究は、より最近の研究によって補強され、プロモーターが別個の機能的モジュールから構成され、各モジュールは、約７〜２０ｂｐのＤＮＡからなり、そして転写活性化因子またはリプレッサータンパク質の１つ以上の認識部位を包含することが示されている。
【０１７５】
各プロモーター中の少なくとも１つのモジュールは、ＲＮＡ合成のための開始部位を位置づけるために機能する。この最も知られている例は、ＴＡＴＡボックスであるが、ＴＡＴＡボックスを欠失するいくつかのプロモーター（例えば、哺乳動物末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ遺伝子のプロモーターおよびＳＶ４０後期遺伝子のプロモーターおよびＳＶ４０後期遺伝子のプロモーター）では、開始部位そのものと重複する別個のエレメントが、開始位置を固定することを補助する。
【０１７６】
さらなるプロモーターエレメントは、転写開始の頻度を制御する。代表的には、これらは、開始部位の３０〜１１０ｂｐ上流の領域に位置するが、多くのプロモーターは、開始部位の下流にも同様の機能エレメントを含むことが最近示された。プロモーターエレメントの間の間隔は、しばしば変更され、その結果、プロモーター機能は、エレメントが互いに対して相対的に反対にされるかまたは移動される場合に保存される。ｔｋプロモーターにおいて、プロモーターエレメントの間の間隔は、活性が低減するまで、５０ｂｐ間隔まで増加し得る。プロモーターに依存して、個々のエレメントが、転写を活性化するために協調的または独立してのいずれかによって機能し得ることは明らかである。
【０１７７】
ＨＰＶポリヌクレオチドの発現を制御するために使用される特定のプロモーターは、標的細胞中でポリヌクレオチドを発現し得る限り、重要とは考えられない。従って、ヒト細胞が標的化される場合、ヒト細胞内で発現され得るプロモーターに隣接して、およびそのプロモーターの制御下に、ポリヌクレオチドコード領域を配置することが好ましい。概していえば、このようなプロモーターは、ヒトプロモーターまたはウイルスプロモーターのいずれかを含み得る。発現レベルがＴ細胞応答を誘導するのに十分であるという条件下で、ポリヌクレオチドの発現を達成するために、当該分野で周知である他のウイルスプロモーターまたは哺乳動物細胞プロモーターまたは細菌ファージプロモーターの使用も、同様に意図される。
【０１７８】
周知の特徴を有するプロモーターの使用によって、トランスフェクション後のポリヌクレオチドの発現レベルおよび発現パターンが、最適化され得る。例えば、特定の細胞において活性なプロモーター（例えば、チロシナーゼ（黒色腫）、α−フェトプロテインおよびアルブミン（肝臓腫瘍）、ＣＣ１０（肺腫瘍）ならびに前立腺特異的抗原（前立腺腫瘍））の選択により、ＨＰＶポリヌクレオチドの組織特異的発現が可能となる。さらに、特定の生理学的シグナルに応答して調節されるプロモーターを選択することにより、ＨＰＶポリペプチド構築物の誘導発現を可能にし得る。
【０１７９】
エンハンサーは、ＤＮＡの同一分子上の異なる位置に配置されるプロモーターからの転写を増大する遺伝子エレメントとしてもともと検出された。長い距離にわたって作用するこの能力は、原核生物転写制御の権威ある研究においてはほとんど知られていなかった。後の研究により、エンハンサー活性を有するＤＮＡ領域がほぼプロモーター様に組織化されていることが示された。すなわち、これらエンハンサーは、多くの個々のエレメントから構成され、これらの各々は、１つ以上の転写タンパク質に結合する。
【０１８０】
エンハンサーとプロモーターとの間の基本的な違いは、作動的な違いである。エンハンサー領域は、全体として、一定距離を置いて転写を刺激し得なければならず；このことは、プロモーター領域またはその成分エレメントでは当てはまる必要はない。他方、プロモーターは、特定の部位および特定の方向でＲＮＡ合成の開始を指示する１つ以上のエレメントを有さねばならない一方、エンハンサーは、これらの特異性を欠く。プロモーターおよびエンハンサーは、しばしば重複的および連続的であり、しばしば、非常に類似したモジュール構成を有するように見える。
【０１８１】
さらに、任意のプロモーター／エンハンサーの組み合わせ（Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  Ｐｒｏｍｏｔｅｒ  Ｄａｔａ  Ｂａｓｅ  ＥＰＤＢによる）もまた、ＨＰＶポリヌクレオチド構築物の発現を駆動するために使用され得る。Ｔ３、Ｔ７またはＳＰ６細胞質発現系の使用は、別の可能な実施形態である。真核生物細胞は、送達複合体の一部またはさらなる遺伝子発現ベクターのいずれかとして、適切なバクテリオファージポリメラーゼが提供される場合に、特定のバクテリオファージプロモーターからの細胞質転写を支持し得る。
【０１８２】
本発明の特定の実施形態において、細胞における発現ベクターの送達は、発現ベクター中にマーカーを含ませることによって、インビトロまたはインビボで同定をされ得る。マーカーは、トランスフェクト細胞に対して同定可能な変化を生じさせ、発現の同定を可能にする。通常、薬物選択マーカーを含ませることは、形質転換体のクローニングおよび選択を補助する。あるいは、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ｔｋ）（真核生物性）またはクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）（原核生物性）のような酵素が使用され得る。免疫学的マーカーもまた使用され得る。使用される選択マーカーは、ＨＰＶポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと共に発現され得る限り、重要ではないと考えられる。選択マーカーのさらなる例は、当業者に周知である。
【０１８３】
代表的に、適切にポリアデニル化された転写物を得るために、ポリアデニル化シグナルが含まれる。ポリアデニル化シグナルの性質は、本発明の首尾よい実施に重要であると考えられず、任意のこのような配列が、使用され得る。本発明者らは、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナルを使用した。このＳＶ４０ポリアデニル化シグナルは、都合がよく、そして使用される標的細胞において良好に機能することが公知である。ターミネーターもまた、発現構築物のエレメントとして企図される。これらのエレメントは、メッセージレベルを増加させ、そして構築物から他の配列へのリードスルーを最小化させるように作用し得る。
【０１８４】
（３．ウイルスベクター）
本発明のいくつかの実施形態において、発現構築物は、ウイルスまたはウイルスゲノム由来の遺伝子操作構築物を含む。特定のウイルスが、レセプター媒介性エンドサイトーシスを介して細胞に入る（いくつかの場合、宿主細胞の染色体に組込まれる）能力は、これらウイルスを哺乳動物細胞への遺伝子移入のための魅力的な候補にした。しかし、裸のＤＮＡの直接的な取り込みおよびＤＮＡ複合体（以下に議論される）のレセプター媒介性取り込みが示されたので、発現ベクターは、ウイルスである必要がなくなり、代わりに、哺乳動物細胞中にコードされる遺伝子の発現を支持し得る任意のプラスミド、コスミド、またはファージ構築物（例えば、ｐＵＣプラスミドシリーズまたはＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＴＭプラスミドシリーズ）でもあり得る。
【０１８５】
（ａ．レトロウイルス）
レトロウイルスのクラスは、以下の３つの主要な群にさらに分割される：オンコウイルス（例えば、マウス白血病ウイルス）；レンチウイルス、および泡沫状ウイルス（スプマウイルス）。レトロウイルスは、一本鎖ＲＮＡウイルスであり、感染細胞中で逆転写プロセス（Ｃｏｆｆｉｎ，１９９０）によって、これらのＲＮＡを二本鎖ＤＮＡに転換する能力によって特徴付けられる。次いで、得られたＤＮＡは、細胞染色体にプロウイルスとして安定に組込まれ、そしてウイルスタンパク質合成を指示する。この組み込みは、レシピエント細胞およびその子孫における、ウイルス遺伝子配列の保有を生じる。
【０１８６】
レトロウイルスゲノムは、３つの遺伝子（ｇａｇ、ｐｏｌ、およびｅｎｖ）を含み、これらは、それぞれキャプシドタンパク質、ポリメラーゼ酵素、およびエンベロープ成分をコードする。ｇａｇ遺伝子の上流に見出される配列（Ψと命名される）は、ゲノムのビリオンへのパッケージングのためのシグナルとして機能する。２つの長い末端反復（ＬＴＲ）配列は、ウイルスゲノムの５’末端および３’末端に存在する。これらは、強力なプロモーター配列およびエンハンサー配列を含み、そして、また、宿主細胞ゲノムにおける組込みに必要とされる（Ｃｏｆｆｉｎ，１９９０）。
【０１８７】
レトロウイルスベクターを構築するために、ＨＰＶポリペプチドをコードする核酸を、特定のウイルス配列の代わりにウイルスゲノムに挿入して、複製欠損のウイルスを産生する。あるいは、ＨＰＶ感染を誘導し得ない変異型ＨＰＶウイルスが、使用され得る。ビリオンを生成するために、ｇａｇ遺伝子、ｐｏｌ遺伝子、およびｅｎｖ遺伝子を含むがＬＴＲおよびΨ成分を含まないパッケージング細胞株が、構築される（Ｍａｎｎ，１９８３）。ヒトｃＤＮＡをレトロウイルスのＬＴＲとΨ配列と共に含む組換えプラスミドがこの細胞株に（例えば、リン酸カルシウム沈降法によって）導入される場合、Ψ配列は、組換えプラスミドのＲＮＡ転写物がウイルス粒子にパッケージングされ、次いで、培養培地に分泌されることを可能にする（ＮｉｃｏｌａｓおよびＲｕｂｅｎｓｔｅｉｎ，１９８８；Ｍａｎｎ，１９８３）。組換えレトロウイルスを含む培地は、次いで収集され、必要に応じて濃縮され、そして遺伝子移入に使用される。レトロウイルスベクターは、広い種類の細胞型に感染し得る。しかし、組込みおよび安定な発現は、宿主細胞の分裂を必要とする（Ｐａｓｋｉｎｄ，１９７５）。
【０１８８】
レトロウイルスベクターの特異的標的化を可能にするように設計された新規アプローチが、ウイルスエンベロープへのラクトース残基の化学的付加によるレトロウイルスの化学的改変に基づいて最近開発された。この改変は、肝細胞のシアロ糖タンパク質レセプターを介する特異的感染を可能にし得る。
【０１８９】
レトロウイルスエンベロープタンパク質および特定の細胞レセプターに対するビオチン化抗体を使用する、組換えレトロウイルスの標的化のための異なるアプローチが、設計された。この抗体は、ストレプトアビジンを使用することによって、ビオチン成分を介して結合された（Ｒｏｕｘ，１９８９）。主要組織適合性複合体クラスＩ抗原およびクラスＩＩ抗原に対する抗体を使用することによって、その研究者らは、インビトロでの表面抗原を保有する種々のヒト細胞の、エコトロピックウイルスでの感染を示した（Ｒｏｕｘ，１９８９）。
【０１９０】
（ｂ．アデノウイルス）
ヒトアデノウイルスは、約３６ｋｂのゲノムサイズを有する二本鎖ＤＮＡ腫瘍ウイルスである（Ｔｏｏｚｅ，１９８１）。真核生物遺伝子発現についてのモデル系として、アデノウイルスは、広く研究され、そして十分に特徴付けられており、このことは、アデノウイルスを、遺伝子移入系としてのアデノウイルスの開発のために魅力的な系にする。このウイルスの群は、増殖および操作が比較的簡単であり、そしてインビトロおよびインビボでの広い宿主範囲を示す。溶解感染された細胞において、アデノウイルスは、宿主タンパク質合成を遮断し得、細胞の機構を多量のウイルスタンパク質合成の方に指向させ、そしておびただしい量のウイルスを産生し得る。
【０１９１】
ゲノムのＥ１領域は、Ｅ１ＡおよびＥ１Ｂを含み、これらは、ウイルスゲノムおよび少数の細胞遺伝子の転写制御を担うタンパク質をコードする。Ｅ２発現（Ｅ２ＡおよびＥ２Ｂを含む）は、ウイルス複製機能（例えば、ＤＮＡ結合タンパク質、ＤＮＡポリメラーゼ、および複製を開始する末端タンパク質）の合成を可能にする。Ｅ３遺伝子産物は、ＣＴＬおよび腫瘍壊死因子による細胞溶解を阻害し、そしてウイルス増殖のために重要であるようである。Ｅ４タンパク質に関連する機能は、ＤＮＡ複製、後期遺伝子発現、および宿主細胞停止を含む。後期遺伝子産物は、ビリオンキャプシドタンパク質のほとんどを含み、そしてこれらは、主要後期プロモーターからの単一の一次転写物のプロセシングの大半が生じた後にのみ発現される。主要後期プロモーター（ＭＬＰ）は、感染の後期の間、高い効率を示す（Ｓｔｒａｔｆｏｒｄ−ＰｅｒｒｉｃａｕｄｅｔおよびＰｅｒｒｉｃａｕｄｅｔ，１９９１）。
【０１９２】
ウイルスゲノムの小部分のみがインシス（ｉｎ  ｃｉｓ）で必要であるようである（Ｔｏｏｚｅ，１９８１）ので、アデノウイルス由来ベクターは、２９３細胞のような細胞株と共に使用された場合、大きなＤＮＡフラグメントの置換のための優れた能力を提供する。Ａｄ５形質転換ヒト胚性腎臓細胞株（Ｇｒａｈａｍ，１９７７）は、イントランス（ｉｎ  ｔｒａｎｓ）で必須のウイルスタンパク質を提供するために開発されてきた。アデノウイルスこれらの特徴は、アデノウイルスは、インビボでの細胞の標的化における使用のための良好な候補とする（ＧｒｕｎｈａｕｓおよびＨｏｒｗｉｔｚ，１９９２）。
【０１９３】
外来タンパク質を細胞に送達するためのアデノウイルス系の特定の長所としては、以下が挙げられる：（ｉ）外来ＤＮＡによって比較的大きなウイルスＤＮＡ片を置換する能力；（ｉｉ）組換えアデノウイルスの構造的安定性；（ｉｉｉ）アデノウイルスのヒトに対する投与の安全性；および（ｉｖ）アデノウイルス感染と癌または悪性腫瘍との任意の既知の関連の欠如；（ｖ）高力価の組換えウイルスを得る能力；および（ｖｉ）アデノウイルスの高い感染性。
【０１９４】
一般に、アデノウイルス遺伝子移入系は、組換えの遺伝子操作されたアデノウイルスに基づいており、これはそのゲノムの一部（例えば、Ｅ１）の欠失によって複製不能にされ、感染のためのその能力をなお依然として保持する。比較的大きな外来タンパク質をコードする配列は、さらなる欠失がアデノウイルスゲノム中に作製された場合に、発現され得る。例えば、Ｅ１領域およびＥ３領域の両方を欠失したアデノウイルスは、１０ｋｂまでの外来ＤＮＡを保有し得、そして２９３細胞において高力価まで増殖し得る（Ｓｔｒａｔｆｏｒｄ−ＰｅｒｒｉｃａｕｄｅｔおよびＰｅｒｒｉｃａｕｄｅｔ，１９９１）。驚いたことに、アデノウイルス感染後の導入遺伝子の持続的発現がまた、報告された。
【０１９５】
（ｃ．ＡＡＶベクター）
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、本発明の細胞形質導入における使用のための魅力的なベクター系である。なぜなら、アデノ随伴ウイルスは高頻度の組込みを有し、非分裂細胞に感染し得、従って、アデノ随伴ウイルスは遺伝子を哺乳動物細胞（例えば、組織培養物）（Ｍｕｚｙｃｚｋａ，１９９２）またはインビボで送達するために有用となるからである。ＡＡＶは、感染性について広い宿主範囲を有する（Ｌｅｂｋｏｗｓｋｉ，１９８８；ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎ，１９８８；Ｌａｕｇｈｌｉｎ，１９８６；Ｔｒａｔｓｃｈｉｎ，１９８４）。ｒＡＡＶベクターの生成および使用に関する詳細は、米国特許第５，１３９，９４１号および同第４，７９７，３６８号に記載され、各々は、参考として本明細書中に援用される。
【０１９６】
遺伝子送達におけるＡＡＶの使用を示す研究としては、ＬａＦａｃｅら（１９８８）；Ｚｈｏｕら（１９９３）；Ｆｌｏｔｔｅら（１９９３）；およびＷａｌｓｈら（１９９４）が挙げられる。組換えＡＡＶベクターは、マーカー遺伝子（Ｋａｐｌｉｔｔ，１９９４；ＳｈｅｌｌｉｎｇおよびＳｍｉｔｈ，１９９４；Ｙｏｄｅｒ，１９９４；Ｚｈｏｕ，１９９４；Ｓａｍｕｌｓｋｉ，１９８９；Ｌｅｂｋｏｗｓｋｉ，１９８８；ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎ，１９８８；Ｔｒａｔｓｃｈｉｎ，１９８５；ＨｅｒｍｏｎａｔおよびＭｕｚｙｃｚｋａ，１９８４）およびヒト疾患に関与する遺伝子（Ｌｕｏ，１９９４；Ｗａｌｓｈ，１９９４；Ｗｅｉ，１９９４；Ｆｌｏｔｔｅ，１９９２；Ｏｈｉ，１９９０）のインビトロおよびインビボでの形質導入のために首尾よく使用された。最近、ＡＡＶベクターは、嚢胞性線維症の処置のためのフェーズＩヒト試験について認可された。
【０１９７】
ＡＡＶは、培養細胞中での増殖性感染を生じるために、別のウイルス（アデノウイルスかまたはヘルペスウイルスファミリーのメンバーのいずれか）と同時感染することを必要とするという点で依存性パルボウイルスである（Ｍｕｚｙｃｚｋａ，１９９２）。ヘルパーウイルスと同時感染しない場合、野生型ＡＡＶゲノムは、その末端を介してヒト第１９染色体に組込まれ、ここでこれはプロウイルスとして潜伏状態で存在する（Ｓａｍｕｌｓｋｉ，１９９１；Ｋｏｔｉｎ，１９９０）。しかし、ｒＡＡＶは、ＡＡＶ  Ｒｅｐタンパク質もまた発現されなければ、組み込みについて、第１９染色体に制限されない（ＳｈｅｌｌｉｎｇおよびＳｍｉｔｈ，１９９４）。ＡＡＶプロウイルスを保有する細胞がヘルパーウイルスで二重感染される場合、ＡＡＶゲノムは、染色体からまたは組換えプラスミドから「レスキュー」され、正常な増殖性感染が確立される（Ｍｕｚｙｃｚｋａ，１９９２；Ｋｏｔｉｎ，１９９０；Ｓａｍｕｌｓｋｉ，１９８９；ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎ，１９８８）。
【０１９８】
代表的には、組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ウイルスは、２つのＡＡＶ末端反復（ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎ，１９８８；Ｓａｍｕｌｓｋｉ，１９８９；各々は、参考として本明細書中に援用される）が隣接した目的の遺伝子を含むプラスミドおよび末端反復のない野生型ＡＡＶコード配列を含む発現プラスミド（例えば、ｐＩＭ４５）（ＭｃＣａｒｔｙ，１９９１；参考として本明細書中に援用される）を同時トランスフェクトすることによって作製される。細胞はまた、アデノウイルス、またはＡＡＶヘルパー機能に必要とされるアデノウイルス遺伝子を保有するプラスミド、で感染されるかまたはトランスフェクトされる。このような様式で作製されたｒＡＡＶウイルスストックは、アデノウイルスで汚染され、このアデノウイルスは、ｒＡＡＶ粒子から（例えば、塩化セシウム密度勾配遠心分離によって）物理的に分離されなければならない。あるいは、ＡＡＶコード領域を含むアデノウイルスベクターまたはＡＡＶコード領域を含む細胞株およびアデノウイルスヘルパー遺伝子のいくつかまたは全てが使用され得る（Ｃｌａｒｋ，１９９５；Ｙａｎｇ，１９９４）。組込まれたプロウイルスとしてｒＡＡＶ  ＤＮＡを保有する細胞株もまた、使用され得る（Ｆｌｏｔｔｅ，１９９５）。
【０１９９】
（ｄ．発現構築物としての他のウイルスベクター）
他のウイルスベクターが、本発明において発現構築物として使用され得る。ウイルス（例えば、ワクシニアウイルス（Ｃｏｕｐａｒ，１９８８；Ｒｉｄｇｅｗａｙ，１９８８；ＢａｉｃｈｗａｌおよびＳｕｇｄｅｎ，１９８６）、およびヘルペスウイルス）に由来するベクターもまた、使用され得る。これらのウイルスは、種々の哺乳動物細胞に対していくつかの魅力的な特徴を提供する（Ｈｏｒｗｉｃｈ，１９９０；Ｆｒｉｅｄｍａｎｎ，１９８９；Ｃｏｕｐａｒ，１９８８；Ｒｉｄｇｅｗａｙ，１９８８；ＢａｉｃｈｗａｌおよびＳｕｇｄｅｎ，１９８６）。
【０２００】
欠損性Ｂ型肝炎ウイルスの最近の知見に伴う、新たな洞察が、異なるウイルス配列の構造−機能相関において得られた。インビトロ研究は、ウイルスゲノムの８０％までの欠失にも関わらず、そのウイルスがヘルパー依存性パッケージングおよび逆転写の能力を保持し得ることを示した（Ｈｏｒｗｉｃｈ，１９９０）。これは、ゲノムの大部分が外来遺伝物質で置換され得ることを示唆する。肝臓向性および持続性（組込み）は、肝臓指向性遺伝子移入のために特に魅力的な特徴であった。Ｃｈａｎｇ（１９９１）は、最近、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子を、アヒルＢ型肝炎ウイルスゲノムのポリメラーゼコード配列、表面コード配列、およびプレ表面コード配列の代わりに導入した。これは、トリ肝細胞癌細胞株に野生型ウイルスと共に同時トランスフェクトされた。高力価の組換えウイルスを含む培養培地は、初期雛アヒル肝細胞を感染するために使用された。安定なＣＡＴ遺伝子発現は、トランスフェクション後、少なくとも２４時間にわたり検出された（Ｃｈａｎｇ，１９９１）。
【０２０１】
（ｅ．非ウイルス移入法）
培養哺乳動物細胞への発現ベクターの移入のためのいくつかの非ウイルス法もまた、本発明によって企図される。これらとしては、リン酸カルシウム沈降法（ＧｒａｈａｍおよびＶａｎ  Ｄｅｒ  Ｅｂ，１９７３；ＣｈｅｎおよびＯｋａｙａｍａ，１９８７；Ｒｉｐｐｅ，１９９０）、ＤＥＡＥ−デキストラン法（Ｇｏｐａｌ，１９８５）、エレクトロポレーション法（Ｔｕｒ−Ｋａｓｐａ，１９８６；Ｐｏｔｔｅｒ，１９８４）、直接マイクロインジェクション法（ＨａｒｌａｎｄおよびＷｅｉｎｔｒａｕｂ，１９８５）、ＤＮＡ負荷リポソーム法（ＮｉｃｏｌａｕおよびＳｅｎｅ，１９８２；Ｆｒａｌｅｙ，１９７９）およびリポフェクタミン−ＤＮＡ複合体法、細胞超音波処理法（Ｆｅｃｈｈｅｉｍｅｒ，１９８７）、高速マイクロプロジェクタイル法を使用する遺伝子ボンバードメント法（Ｙａｎｇ，１９９０）、ポリカチオン法（Ｂｏｕｓｓｉｆ，１９９５）、およびレセプター媒介性トランスフェクション法（ＷｕおよびＷｕ，１９８８；ＷｕおよびＷｕ，１９８７）が挙げられる。これらの技術のいくつかは、インビボまたはエキソビボでの使用のために首尾よく適合され得る。
【０２０２】
（Ｄ．コロイド分散系）
コロイド分散系は、標的化送達ビヒクルを構成する。これらの分散系としては、高分子複合体、ナノカプセル複合体、ナノカプセル、ミクロスフェア、ビーズ、および脂質ベースの系（水中油エマルジョン、ミセル、混合ミセル、およびリポソームを含む）が挙げられる。本発明の好ましいコロイド系は、リポソームである。リポソームは、人工的な膜ベシクルであり、これは、インビトロおよびインビボにおける送達ベシクルとして有用である。大きな単一層ベシクル（ＬＵＶ）（大きさが０．２〜４．０μｍにわたる）は、大きな高分子を含むかなりの割合の水性緩衝液をカプセル化し得ることが示された。ＲＮＡ、ＤＮＡおよびインタクトなビリオンは、水性の内部にカプセル化され得、そして生物学的に活性な形態で細胞に送達され得る（Ｆｒａｌｅｙら）。哺乳動物細胞に加えて、リポソームは、植物、酵母および細菌細胞において、ポリヌクレオチドの送達のために使用されている。リポソームが効率的な遺伝子移入ビヒクルであるために、以下の特徴が存在するべきである：（１）高度に目的の遺伝子のカプセル化をするが、その生物学的活性を損なわない；（２）非標的細胞に比べて標的細胞に優先的および実質的に結合する；（３）標的細胞細胞質へのベシクルの水性内容物の高効率での送達；ならびに（４）遺伝的情報の正確かつ効果的な発現（Ｍａｎｎｉｎｇら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，６：６８２，１９８８）。本発明のこの実施形態は、合成ペプチドがリポソームとして処方され得ることを提案する。リポソーム組成物は、通常、リン脂質（特に、高い相転移温度のリン脂質）の組み合わせであり、通常、ステロイド（特に、コレステロール）との組み合わせである。他のリン脂質または他の脂質もまた使用され得る。リポソームの物理的特徴は、ｐＨ、イオン強度、および二価カチオンの存在に依存する。
【０２０３】
リポソーム生成において有用な脂質の例としては、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノールアミン、スフィンゴリピド、セレブロシド、およびガングリオシドのようなホスファチジル化合物が挙げられる。ジアシルホスファチジルグリセロールが特に有用であり、ここでこの脂質部分は、１４〜１８炭素原子、特に１６〜１８炭素原子を含み、飽和されている。例示的なリン脂質としては、卵ホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリンおよびジステアロイルホスファチジルコリンが挙げられる。
【０２０４】
リポソームの標的化は、解剖学的要因および機構的要因に基づいて分類され得る。解剖学的分類は、選択性（例えば、器官特異性、細胞特異性、およびオルガネラ特異性）のレベルに基づく。機構的標的化は、それが受動的であるか、能動的であるかに基づいて区別され得る。受動的標的化は、洞様毛細血管を含む器官における細網内皮系（ＲＥＳ）の細胞へ分布するリポソームの天然の傾向を利用する。一方、能動的標的化は、天然で生じる局在化の部位ではない器官型および細胞型への標的化を達成するために、特異的なリガンド（例えば、モノクローナル抗体、糖、糖脂質、またはタンパク質）へのリポソームの結合化によるか、またはリポソームの組成またはサイズを変えることによるリポソームの変質を伴う。
【０２０５】
標的化送達系の表面は、種々の方法で改変され得る。リポソーム標的化送達系の場合、脂質基は、リポソーム二重膜との安定な結合に標的化リガンドを維持するために、リポソームの脂質二重膜中に組み込まれ得る。脂質鎖を標的リガンドに連結するために、種々の連結基が使用され得る。
【０２０６】
（Ｅ．薬学的組成物）
本発明は、薬学的組成物の形態での合成ペプチドの使用を企図する。一般的に、薬学的組成物は、薬学的に受容可能なキャリア中に溶解または分散される１つ以上の有効量のタンパク質様配列、核酸または抗体あるいはさらなる因子を含有する。句「薬学的に受容可能な、または薬理学的に受容可能な」は、例えば、必要に応じて、ヒトのような動物に投与される場合、有害な（ａｄｖｅｒｓｅ）反応、アレルギー反応または他の有害（ｕｎｔｏｗａｒｄ）反応を生じさせない分子の実体または分子の組成物をいう。少なくとも１つのタンパク質様配列、核酸または抗体あるいはさらなる活性成分を含む薬学的組成物の調製は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，第１８版、Ｍａｃｋ  Ｐｒｉｎｔｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９０（本明細書中に参考として援用される）によって例示されるように、本開示に照らして当業者に知られる。さらに、動物（例えば、ヒト）投与について、調製物は、ＦＤＡ  Ｏｆｆｉｃｅ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｔａｎｄａｒｄによって要求されるように、無菌性基準、発熱性基準、一般的安全性基準および純度基準を満たすべきであることが理解される。
【０２０７】
本明細書中で使用される場合、「薬学的に受容可能なキャリア」は、当業者に公知であるように、任意の、および全ての溶媒、分散媒、コーティング、界面活性剤、抗酸化剤、保存剤（例えば、抗細菌剤、抗真菌剤）、等張剤、吸収遅延剤、塩、保存剤、薬物、薬物安定剤、結合剤、賦形剤、崩壊剤、潤沢剤、甘味剤、香料添加剤、色素、このような物質およびそれらの組合せを含む（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，第１８版、Ｍａｃｋ  Ｐｒｉｎｔｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９０，１２８９−１３２９頁（本明細書中に参考として援用される）を参照のこと）。任意の従来型キャリアが、この活性成分と不適合である範囲を除いて、治療組成物または薬学的組成物におけるその使用を企図される。
【０２０８】
タンパク質様配列、核酸または抗体は、それが固体形態投与されるのか、液体形態投与されるのか、またはエアロゾル形態で投与されるのか、およびそれが注射のような投与経路のために無菌であることを必要とするかどうかに依存して、異なる型のキャリアを含み得る。本発明は、当業者に公知であるような、エアロゾル、注射、注入、連続注入、標的細胞を直接浸ける局所還流、カテーテルを介して、洗浄を介して、クリームで、脂質組成物（例えば、リポソーム）で、あるいは他の方法または前述の任意の組合せのよって、静脈内に、皮内に、動脈内に、腹腔内に、病巣内に、頭蓋内に、関節内に、前立腺内に、胸膜内に、気管内に、鼻腔内に、硝子体内に、膣内に、直腸に、局所的に（ｔｏｐｉｃａｌｌｙ）、腫瘍内に、筋肉内に、腹腔内に、皮下に、膀胱内に、粘膜に、心膜内に、経口で、局所的に（ｔｏｐｉｃａｌｌｙ）、局部的に（ｌｏｃａｌｌｙ）投与され得る（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，第１８版、Ｍａｃｋ  Ｐｒｉｎｔｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９０（本明細書中に参考として援用される）を参照のこと）。
【０２０９】
動物患者に投与される、本発明の組成物の実際の投薬量は、物理的要因および生理学的要因（例えば、体重、状態の重篤度、処置される疾患の型、以前の治療的介入または併用している治療的介入、患者の特発症および投与経路）によって決定され得る。投与を担う医師は、任意の事象において、組成物中の活性成分の濃度および個々の被験体に対する適切な用量を決定する。
【０２１０】
特定の実施形態において、薬学的組成物は、例えば、少なくとも約０．１％の活性化合物を含み得る。他の実施形態において、活性化合物は、例えば、単位重量の約２％〜約７５％の間、または約２５％〜約６０％の間、およびそれらの中で導き出される任意の範囲を含み得る。他の限定的でない例において、用量はまた、１回の投与あたり約１μｇ／ｋｇ／体重、約５μｇ／ｋｇ／体重、約１０μｇ／ｋｇ／体重、約５０μｇ／ｋｇ／体重、約１００μｇ／ｋｇ／体重、約２００μｇ／ｋｇ／体重、約３５０μｇ／ｋｇ／体重、約５００μｇ／ｋｇ／体重、約１ｍｇ／ｋｇ／体重、約５ｍｇ／ｋｇ／体重、約１０ｍｇ／ｋｇ／体重、約５０ｍｇ／ｋｇ／体重、約１００ｍｇ／ｋｇ／体重、約２００ｍｇ／ｋｇ／体重、約３５０ｍｇ／ｋｇ／体重、約５００ｍｇ／ｋｇ／体重〜約１０００ｍｇ／ｋｇ／体重までか、またはそれ以上、およびそれらの中で導き出される任意の範囲を含み得る。本明細書中に列挙される数値から導き出される任意の範囲の限定的でない例において、約５ｍｇ／ｋｇ／体重〜約１００ｍｇ／ｋｇ／体重の範囲、約５μｇ／ｋｇ／体重〜約５００ｍｇ／ｋｇ／体重の範囲などが、上記の数値に基づいて投与され得る。
【０２１１】
任意の場合において、この組成物は、１つ以上の成分の酸化を遅らせるために、種々の抗酸化剤を含み得る。さらに微生物の作用の防止が、種々の抗細菌剤および抗真菌剤のような保存剤（パラベン（例えば、メチルパラベン、プロピルパラベン）、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールまたはそれらの組合せが挙げられるが、これらに限定されない）によってもたらされ得る。
【０２１２】
タンパク質様配列、核酸または抗体は、遊離塩基形態、中性形態または塩形態で組成物中に処方され得る。薬学的に受容可能な塩としては、酸付加塩（例えば、タンパク質様組成物の遊離アミノ基と共に形成される酸付加塩）が挙げられか、あるいは酸付加塩は、例えば、塩酸もしくはリン酸のような無機酸または酢酸、シュウ酸、酒石酸もしくはマンデル酸のような有機酸で形成される。遊離カルボキシル基で形成される塩はまた、例えば、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、または水酸化第２鉄のような無機塩基；あるいはイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジンまたはプロカインのような有機塩基から誘導され得る。
【０２１３】
この組成物が液体形態にある実施形態において、キャリアは、溶媒または分散媒（水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコールなど）、脂質（例えば、トリグリセリド、植物油、リポソーム）およびそれらの組合せが挙げられるが、これらに限定されない）であり得る。適切な流動性は、例えば、コーティング（例えば、レシチン）の使用によって；例えば、液体ポリオールまたは脂質のようなキャリア中の分散による所望の粒子サイズの維持によって；例えば、ヒドロキシプロピルセルロースのような界面活性剤の使用によって；またはこのような方法の組合せによって維持され得る。多くの場合、例えば、糖、塩化ナトリウムまたはそれらの組合せのような等張剤を含むことが好ましい。
【０２１４】
他の実施形態において、本発明では、点眼、鼻用溶液または鼻用スプレー、エアロゾルまたは吸入剤を使用し得る。このような組成物は、一般的に、標的組織型に適合性であるように設計される。限定的でない例において、鼻用溶液は、たいてい、液滴またはスプレーで鼻腔に投与されるように設計された水溶液である。鼻用溶液は、多くの観点で鼻の分泌液と類似するように調製され、その結果、正常な繊毛作用が維持される。故に、好ましい実施形態において、水性の鼻用溶液は通常、等張性であるか、または約５．５〜約６．５のｐＨに維持するためにわずかに緩衝化される。さらに、所望であれば、眼用調製物において使用されるものと同様の抗菌保存剤、薬物、または適切な薬物安定剤が、処方物中に含有され得る。例えば、種々の市販の鼻用調製物が公知であり、そして抗生物質または抗ヒスタミン剤のような薬物を含有する。
【０２１５】
特定の実施形態において、タンパク質様配列、核酸または抗体は、経口摂取のような経路による投与用に調製される。これらの実施形態において、固体組成物としては、例えば、溶液、懸濁液、エマルジョン、錠剤、丸薬、カプセル（例えば、硬い殻で覆われたゼラチンカプセルまたは軟らかい殻で覆われたゼラチンカプセル）、持続放出処方物、口腔組成物、トローチ、エリキシル剤、懸濁液、シロップ、ウエハー、またはそれらの組合せが挙げられ得る。経口組成物は、食事の食物とともに直接取り込まれ得る。経口投与に好ましいキャリアとしては、不活性な希釈剤、吸収可能な食用キャリアまたはそれらの組合せが挙げられる。本発明の他の局面において、経口組成物は、シロップまたはエリキシル剤として調製され得る。シロップまたはエリキシル剤は、例えば、少なくとも１つの活性成分、甘味剤、保存剤、香料添加剤、色素、保存剤、またはそれらの組合せを含み得る。
【０２１６】
特定の好ましい実施形態において、経口組成物は、１つ以上の結合剤、賦形剤、崩壊剤、滑沢剤、香料添加剤、およびそれらの組合せを含有し得る。特定の実施形態において、組成物は、以下のうちの１つ以上を含有し得る：結合剤（例えば、トラガカントゴム、アカシア、コーンスターチ、ゼラチン、またはそれらの組合せ）；賦形剤（例えば、リン酸二カルシウム、マンニトール、ラクトース、スターチ、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムまたはそれらの組合せ）；崩壊剤（例えば、コーンスターチ、ジャガイモデンプン、アルギン酸またはそれらの組合せ）；滑沢剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム）；甘味剤（例えば、スクロース、ラクトース、サッカリンまたはそれらの組合せ）；香料添加剤（例えば、ペパーミント、ウィンターグリーン油、チェリー香味料、オレンジ香味料など）；あるいは前述のものの組合せ。投薬単位形態がカプセルである場合、それは、上記の型の物質に加えて、脂質キャリアのようなキャリアを含み得る。種々の他の物質がまた、コーティングとしてか、または、そうでなく投薬単位の物理的形態を改変するために存在し得る。例えば、錠剤、丸薬、またはカプセルは、セラック、糖または両方でコーティングされ得る。
【０２１７】
投与の他の様式に適切なさらなる処方物としては、坐薬が挙げられる。坐薬は、直腸、膣または尿道への挿入のための、通常、薬用の、種々の重量および種々の形の固体投薬形態である。挿入後、坐薬は、軟らかくなり、腔体液中に融解または溶解する。一般的に、坐薬のための伝統的なキャリアとしては、例えば、ポリアルキレングリコール、トリグリセリドまたはそれらの組合せが挙げられ得る。特定の実施形態において、坐薬は、例えば、約０．５％〜約１０％、および好ましくは約１％〜約２％の範囲の活性成分を含む混合物から処方され得る。
【０２１８】
滅菌注射用溶液は、上記に列挙した種々の他の成分と共に、適切な溶媒中に活性成分を所望の量で組み込むこみ、必要な場合、次いで濾過滅菌することによって調製される。一般的に、種々の滅菌された活性成分を基本的な分散媒および／または他の成分を含む滅菌ビヒクル中に組み込むことによって、分散物が調製される。滅菌注射用溶液、懸濁液またはエマルジョンの調製のための滅菌粉末の場合、調製の好ましい様式は、真空乾燥技術または凍結乾燥技術（これらは、前もって濾過滅菌された、それらの液体媒体から活性成分プラス任意のさらなる所望の成分の粉末を生じさせる）である。この液体媒体は、必要であれば、適切に緩衝化されるべきであり、そしてこの液体希釈剤は、注射の前に十分な生理食塩水またはグルコースで、まず等張にされるべきである。直接の注射のための高濃縮組成物の調製がまた企図され、ここで溶媒としてのＤＭＳＯの使用が、極めて迅速な浸透（小さい領域に高濃度の活性薬剤を送達する）を生じるように、構想される。
【０２１９】
この組成物は、製造および保存の条件下で安定であり、そして細菌および真菌のような微生物の混入する行為から保護されなければならない。エンドトキシンの混入が、安全なレベル（例えば、０．５ｎｇ／ｍｇタンパク質より少ない）で最小限に保たれるべきであることが認識される。
【０２２０】
特定の実施形態において、注射用組成物の長期の吸収が、組成物中に吸収を遅らせる薬剤（例えば、モノステアリン酸アルミニウム、ゼラチンまたはそれらの組合せ）を使用することによって、もたらされ得る。
【０２２１】
ペプチドは、免疫療法として患者に投与され得るので、脂質ベースの組成物は、本発明に適切である。これらは、下記にさらに詳細に記載される。
【０２２２】
特定の実施形態において、本発明は、少なくとも１つのペプチドと結合した１つ以上の脂質を含有する新規の組成物に関する。脂質は、特徴として水に不溶性であり、そして有機溶媒で抽出可能な物質である。脂質としては、例えば、細胞質中に天然に存在する脂肪の液滴を含む物質、ならびに長鎖の脂肪族炭化水素およびそれらの誘導体（例えば、脂肪酸、アルコール、アミン、アミノアルコール、およびアルデヒド）を含む、当該分野で周知の化合物のクラスが挙げられる。当然、当業者により脂質として理解される、本明細書中に具体的に記載される化合物以外の化合物もまた、本発明の組成物および方法によって含まれる。
【０２２３】
脂質は、天然に存在するか、または合成（すなわち、ヒトによって設計または生成される）であり得る。しかし、脂質は、通常、生物学的物質である。生物学的脂質は、当該分野で周知であり、そして例えば、天然脂肪、リン脂質、ホスホグリセリド、ステロイド、テルペン、リゾリピド、グリコスフィンゴリピド、糖脂質、スルファチド、エーテル連結された脂肪酸およびエステル連結された脂肪酸を有する脂質、および重合可能な脂質、ならびにそれらの組合せが挙げられる。
【０２２４】
（Ａ．脂質型）
中性脂肪は、グリセロールおよび脂肪酸を含み得る。代表的なグリセロール３炭素アルコールである。脂肪酸は、一般的に、鎖の末端に酸性部分（例えば、カルボン酸）を有する炭素鎖を含む分子である。脂肪酸の炭素鎖は、任意の長さであり得るが、炭素鎖の長さが、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９、約２０、約２１、約２２、約２３、約２４、約２５、約２６、約２７、約２８、約２９から、約３０まで、またはより多い炭素原子、およびそれらの中で導き出される任意の範囲であることが好ましい。しかし、好ましい範囲は、脂肪酸の鎖部分において約１４炭素原子〜約２４炭素原子であり、特定の実施形態において、約１６炭素原子〜約１８炭素原子が特に好ましい。特定の実施形態において、脂肪酸炭素鎖は、奇数の炭素原子を含み得るが、鎖内の偶数の炭素原子が、特定の実施形態において好ましくあり得る。その炭素鎖内に単結合のみを含む脂肪酸は、飽和と呼ばれ、一方、その炭素鎖内に少なくとも１つの二重結合を含む脂肪酸は、不飽和と呼ばれる。
【０２２５】
具体的な脂肪酸としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：リノール酸、オレイン酸、パルミチン酸、リノレン酸、ステアリン酸、ラウリン酸、ミチスチン酸、アラキジン酸、パルミトレイン酸、アラキドン酸、リシノール酸、ツベルクロステアリン酸（ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｔｅｒｉｃ  ａｃｉｄ）、ラクトバシル酸。１つ以上の脂肪酸の酸性基は、グリセロールの１つ以上の水酸基と共有結合される。故に、モノグリセリドは、グリセロールおよび１つの脂肪酸を含み、ジグリセリドは、グリセロールおよび２つの脂肪酸を含み、トリグリセリドは、グリセロールおよび３つの脂肪酸を含む。
【０２２６】
リン脂質は、一般的に、グリセロール部分またはスフィンゴシン部分のいずれか、両親媒性化合物を産生するためのイオン性リン酸基、および１つ以上の脂肪酸を含む。リン脂質の型としては、例えば、ホスホグリセリド（ここで、リン酸基は、ジグリセリドのグリセロールの第１の炭素と連結される）、およびスフィンゴリン脂質（例えば、スフィンゴミエリン）（ここで、リン酸基は、スフィンゴシンアミノアルコールにエステル化される）が挙げられる。スフィンゴリン脂質の別の例は、スルファチド（この分子を両親媒性にするイオン性硫酸基を含む）である。当然、リン脂質は、リン酸基に結合されたアルコールのようなさらなる化学基を含み得る。このようなアルコール基の例としては、セリン、エタノールアミン、コリン、グリセロールおよびイノシトールが挙げられる。故に、特定のホスホグリセリドとしては、ホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルコリン、ホスファチジルグリセロールまたはホスファチジルイノシトールが挙げられる。他のリン脂質としては、ホスファチジン酸またはジアセチルリン酸が挙げられる。１つの局面において、ホスファチジルコリンとしては、以下が挙げられる：ジオレオイルホスファチジルコリン（カルジオリピンとしても公知）、卵ホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、モノミリストイルホスファチジルコリン、モノパルミトイルホスファチジルコリン、モノステアロイルホスファチジルコリン、モノオレオイルホスファチジルコリン、ジブトロイルホスファチジルコリン、ジバレロイルホスファチジルコリン、ジカプロイルホスファチジルコリン、ジヘプタノイルホスファチジルコリン、ジカプリロイルホスファチジルコリンまたはジステアロイルホスファチジルコリン。
【０２２７】
糖脂質は、スフィンゴリン脂質に関与するが、リン酸基ではなく、スフィンゴシンの１級水酸基に結合された炭水化物基を含む。セレブロシドと呼ばれる糖脂質の型は、１級水酸基に結合された１つ以上の糖基（例えば、グルコースまたはガラクトース）を含む。糖脂質の別の例は、約２、約３、約４、約５、約６から約７程度までの糖基（１級水酸基に結合された分枝鎖であり得る）を含むガングリオシド（例えば、モノシアロガングリオシド、ＧＭ１）である。他の実施形態において、糖脂質は、セラミド（例えば、ラクトシルセラミド）である。
【０２２８】
ステロイドは、フェナントロリンの４員環系誘導体である。ステロイドは、しばしば、細胞、組織および生物（ｏｒｇａｎｉｓｍ）における調節機能を有し、そして例えば、黄体ホルモン（例えば、プロゲステロン）ファミリー、糖質コルチコイド（例えば、コルチゾル）ファミリー、鉱質コルチコイド（例えば、アルドステロン）ファミリー、アンドロゲン（例えば、テストステロン）ファミリーおよびエストロゲン（例えば、エストロン）ファミリーにおけるホルモンおよび関連化合物が挙げられる。コレステロールは、ステロイドの別の例であり、そして一般的に、調節機能よりむしろ構造的機能に働く。ビタミンＤは、ステロールの別の例であり、そして腸からのカルシウム吸収において関与する。
【０２２９】
テルペンは、１つ以上の５炭素イソプレン基を含む脂質である。テルペンは、種々の生物学的機能を有し、そして例えば、ビタミンＡ、補酵素Ｑおよびカロチノイド（例えば、リコペンおよびβ−カロチン）が挙げられる。
【０２３０】
（Ｂ．荷電脂質組成物および中性脂質組成物）
特定の実施形態において、組成物の脂質成分は、荷電していないか、または主として荷電していない。１つの実施形態において、組成物の脂質成分は、１つ以上の中性脂質を含む。別の局面において、組成物の脂質成分は、特定のリン脂質（例えば、ホスファチジルコリン）およびコレステロールのように、アニオン性脂質およびカチオン性脂質を実質的に含まなくてもよい。特定の局面において、荷電していない脂質組成物または主として荷電していない脂質組成物の脂質成分は、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、または約１００％の荷電のない脂質、実質的に荷電していない脂質、および／または正電荷と負電荷とを等しい数有する脂質混合物を含む。
【０２３１】
他の局面において、脂質組成物は、荷電され得る。例えば、荷電リン脂質は、本発明に従って、脂質組成物の調製のために使用され得、そして正味の正電荷または正味の負電荷を有し得る。限定的でない例において、ジアセチルリン酸が、脂質組成物に負電荷を与えるために使用され得、そしてステアリルアミンが、脂質組成物に正電荷を与えるために使用され得る。
【０２３２】
（Ｃ．脂質の作製）
当業者に公知であるように、脂質は、天然の供給源、商業的供給源から入手され得るか、または化学的に合成され得る。例えば、リン脂質は、天然の供給源（例えば、卵ホスファチジルコリンまたは大豆ホスファチジルコリン、脳ホスファチジン酸、脳ホスファチジルイノシトールまたは植物ホスファチジルイノシトール、心臓カルジオリピンおよび植物ホスファチジルエタノールアミンまたは細菌ホスファチジルエタノールアミン）由来であり得る。別の例において、本発明に従う使用に適切な脂質は、商業的供給源から入手され得る。例えば、ジミリスチルホスファチジルコリン（「ＤＭＰＣ」）は、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．から入手され得、ジセチルリン酸（「ＤＣＰ」）は、Ｋ  ＆  Ｋ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，ＮＹ）から入手され；コレステロール（「Ｃｈｏｌ」）は、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ−Ｂｅｈｒｉｎｇから入手され；ジミリスチルホスファチジルグリセロール（「ＤＭＰＧ」）および他の脂質は、Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄ，Ｉｎｃ．（Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，Ａｌａ．）から入手され得る。特定の実施形態において、クロロホルムまたはクロロホルム／メタノール中の脂質のストック溶液は、約−２０℃で保存され得る。好ましくは、クロロホルムは、唯一の溶媒として使用される。なぜなら、クロロホルムは、メタノールよりも容易に揮発されるからである。
【０２３３】
（Ｄ．脂質組成物構造）
本発明の好ましい実施形態において、ペプチドが、脂質と結合され得る。脂質と結合されたペプチドは、脂質を含む溶液中に分散され得、脂質で溶解され得、脂質で乳化され得、脂質と混合され得、脂質と組み合わされ得、脂質に共有結合され得、脂質中に懸濁液として含まれ得、ミセルもしくはリポソームに含まれるか、またはミセルもしくはリポソームと複合体化され得、あるいはそうでなく脂質または脂質構造と結合され得る。本発明の組成物と結合される脂質または脂質／キメラポリペプチドは、いかなる特定の構造にも制限されない。例えば、それらは、単に溶液中に分散され得る（おそらくサイズまたは形のいずれにおいても均一でない凝集体を形成する）。別の例において、それらは、ミセルとして、または「崩された」構造で、二重層構造で存在し得る。別の限定的でない例において、リポフェクトアミン（ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）−キメラポリペプチド複合体またはＳｕｐｅｒｆｅｃｔ（Ｑｉａｇｅｎ）−キメラポリペプチド複合体がまた、企図される。
【０２３４】
特定の実施形態において、脂質組成物は、約１％、約２％、約３％、約４％、約５％、約６％、約７％、約８％、約９％、約１０％、約１１％、約１２％、約１３％、約１４％、約１５％、約１６％、約１７％、約１８％、約１９％、約２０％、約２１％、約２２％、約２３％、約２４％、約２５％、約２６％、約２７％、約２８％、約２９％、約３０％、約３１％、約３２％、約３３％、約３４％、約３５％、約３６％、約３７％、約３８％、約３９％、約４０％、約４１％、約４２％、約４３％、約４４％、約４５％、約４６％、約４７％、約４８％、約４９％、約５０％、約５１％、約５２％、約５３％、約５４％、約５５％、約５６％、約５７％、約５８％、約５９％、約６０％、約６１％、約６２％、約６３％、約６４％、約６５％、約６６％、約６７％、約６８％、約６９％、約７０％、約７１％、約７２％、約７３％、約７４％、約７５％、約７６％、約７７％、約７８％、約７９％、約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、約１００％もしくはそれらの中で導き出される任意の範囲の特定の脂質成分、脂質型成分または非脂質成分（例えば、本明細書中に開示されるか、または当業者に公知の薬物、タンパク質、糖、核酸または他の物質）を含み得る。限定的でない実施形態において、脂質組成物は、約１０％〜約２０％の中性脂質、および約３３％〜約３４％のセレブロシド、および約１％のコレステロールを含み得る。別の限定的でない例において、リポソームは、約４％〜約１２％のテルペン（ここで、このミセルの約１％は詳細にはリコペンであり、このリポソームの約３％〜約１１％は、他のテルペンを含むものとして残す）；および約１０％〜約３５％のホスファチジルコリンならびに約１％の薬物を含み得る。故に、本発明の脂質組成物は、脂質成分、脂質型成分または他の成分の任意のものを、任意の組合せまたは任意のパーセンテージ範囲で含み得ることが企図される。
【０２３５】
（１．乳濁液）
脂質は、乳濁液中に含まれ得る。脂質乳濁液は、機械的攪拌によってまたは乳化剤として公知の少量のさらなる物質によって、通常は互いに溶け合わない、２種類以上の実質的に永久に不均一な脂質混合物である。脂質乳濁液の調製方法およびさらなる成分の添加方法は、当該分野で周知である（例えば、Ｍｏｄｅｒｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ，１９９０，参考として本明細書中に援用される）。
【０２３６】
例えば、１つ以上の脂質を、エタノールもしくはクロロホルムまたは任意の他の適切な有機溶媒に添加し、手または機械技術により攪拌する。次いで、混合物から溶媒をエバポレートして、乾燥した脂質薄膜を残す。この脂質を水性媒体（例えば、リン酸緩衝化生理食塩水）に再懸濁し、乳濁液を生じた。この混合物は、より均一なサイズ分布の乳濁化脂質の同種の人的分配を達成するために、従来の超音波破砕技術を用いて超音波処理され得、さらにミクロ流動化（例えば、Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｚｅｒ，Ｎｅｗｔｏｎ，Ｍａｓｓ．を用いる）を用いて乳化され得、そして／または、Ｅｘｔｒｕｄｅｒ  Ｄｅｖｉｃｅ（Ｌｉｐｅｘ  Ｂｉｏｍｅｍｂｒａｎｅｓ，Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，Ｃａｎａｄａ）を用いて、高圧（例えば、６００ｐｓｉ）下で押し出され得る。
【０２３７】
（２．ミセル）
脂質は、ミセル中に含まれ得る。ミセルは、脂質化合物のクラスターまたは凝集体であり、一般的に脂質一重層の形態であり、そして当業者に公知の任意のミセル生成プロトコル（例えば、Ｃａｎｆｉｅｌｄら，１９９０；Ｅｌ−Ｇｏｒａｂら，１９７３；Ｓｈｉｎｏｄａら，１９６３；およびＦｅｎｄｌｅｒら，１９７５；それぞれ、参考として本明細書中に援用される）を用いて調製され得る。例えば、代表的に、１種類以上の脂質を有機溶媒中で懸濁物とし、その溶媒をエバポレートし、脂質を水性媒体中に再懸濁し、超音波処理し、次いで遠心分離する。
【０２３８】
（３．リポソーム）
特定の実施形態において、脂質は、リポソームを構成する。「リポソーム」は、封入された脂質二重層または脂質凝集体の生成によって形成される一重層および多重層の多様な脂質ビヒクルを含む、包括的な用語である。リポソームは、一般的にリン脂質を含む二重層の膜、および一般的に水性組成物からなる内部媒体を持つ小胞構造を有すると、特徴付けられ得る。
【０２３９】
多重層リポソームは、水性媒体によって隔てられる複数の脂質層を有する。これらは、リン脂質を含む脂質を過剰量の水溶液中に懸濁すると、自然に形成される。この脂質成分は、閉鎖構造の形成前に、自己再配置を起こし、そして水および溶解した溶質を脂質二重層の間に閉じ込める（ＧｈｏｓｈおよびＢａｃｈｈａｗａｔ，１９９１）。親油性分子または親油性領域を有する分子はまた、脂質二重層中に溶解し得るか、または脂質二重層と結合し得る。
【０２４０】
特定のそれほど好ましいわけではない実施形態において、好ましくは、天然供給源由来のリン脂質（例えば、卵または大豆のホスファチジルコリン、脳ホスファチジン酸、脳または植物のホスファチジルイノシトール、心臓カルジオリピンおよび植物または細菌のホスファチジルエタノールアミン）は、主な（すなわち、全ホスファチド組成物またはリポソームの５０％以上を構成する）ホスファチドとしては用いられない。なぜなら、生じるリポソームの不安定性および漏れのためである。
【０２４１】
特定の実施形態において、脂質および／またはキメラポリペプチドは、例えば、リポソームの水性内部中にカプセル化され得るか、リポソームの脂質二重層内に分散され得るか、リポソームおよびキメラペプチドの両方と連結する結合分子を介してリポソームに連結し得るか、リポソーム中に封入され得るか、リポソームとの複合体を形成し得る、などである。
【０２４２】
（ａ．リポソームの作製）
本発明に従って用いられるリポソームは、当業者に公知のように、種々の方法で作製され得る。リン脂質は、水中に分散した場合、水に対する脂質のモル比に依存して、リポソーム以外の多様な構造を形成し得る。低い比率で、リポソームは、好ましい構造でなる。
【０２４３】
例えば、リン脂質（Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ，Ａｌａｂａｓｔｅｒ，ＡＬ）（例えば、中性リン脂質ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ））を、ｔｅｒｔ−ブタノールに溶解する。次いで、その脂質をキメラポリペプチド、および／またはその他の成分と混合する。Ｔｗｅｅｎ  ２０を、Ｔｗｅｅｎ  ２０がの組成物の重量の約５％濃度となるように、脂質混合物に添加する。過剰量のｔｅｒｔ−ブタノールを、ｔｅｒｔ−ブタノールの容量が、少なくとも９５％となるように、この混合物に添加する。この混合物をボルテックスし、ドライアイス／アセトン浴中で凍結し、そして一晩凍結乾燥する。凍結乾燥調製物は−２０℃で保存され、最高３ヶ月使用可能である。必要なときに、凍結乾燥リポソームを０．９％生理食塩水中で再構成する。キメラポリペプチドをカプセル化するためにＴｗｅｅｎ  ２０を用いて得られる粒子の平均直径は、直径約０．７〜約１．０μｍである。
【０２４４】
あるいは、リポソームは、容器（例えば、ナシ型ガラスフラスコ）内の溶媒中に脂質を混合物することにより、調製され得る。この容器は、リポソームの予想される懸濁物の容量より１０倍大きい容量を有すべきである。ロータリーエバポレーターを用いて、約４０℃、陰圧下で、溶媒を除去する。溶媒は、リポソームの所望の容量に依存して、通常約５分〜２時間以内に通常除去される。この組成物は、減圧下のデシケーターにおいて、さらに乾燥され得る。一般的に、この乾燥脂質は、約１週間後に廃棄される。なぜなら、時間と共に変質する傾向にあるからである。
【０２４５】
乾燥脂質は、全ての脂質フィルムが再懸濁するまで浸透することにより、発熱物質を含まない水中で、約２５〜５０ｍＭのリン脂質濃度にて、水和され得る。次いで、水性リポソームをアリコートに分け、各々をバイアルに入れ、凍結乾燥しそして減圧下でシールし得る。
【０２４６】
他の代替方法において、リポソームを、他の公知の実験室手順（例えば、Ｂａｎｇｈａｍら，１９６５；Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ，１９７９；ＤｅａｍｅｒおよびＵｓｔｅｒ  １９８３，ＳｚｏｋａおよびＰａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓ，１９７８を参照のこと，それぞれ、関連する部分で、参考として本明細書中に援用される）に従って調製し得る。これらの方法は、それぞれの水性物質封入能力および水性スペースと脂質とのそれぞれの比率において異なる。
【０２４７】
上記に記載されるように調製した乾燥脂質または凍結乾燥リポソームは、脱水され得、阻害ペプチドの溶液中で再構成され得、そして適切な溶媒（例えば、ＤＰＢＳ）で適切な濃度まで希釈され得る。次いで、この混合物を、ボルテックスミキサーで激しく攪拌する。カプセル化されないさらなる物質（例えば、ホルモン、薬物、核酸構築物などが挙げられるが、これらに限定されない薬剤）を、２９，０００×ｇでの遠心分離によって、そしてリポソームのペレットを洗浄する。洗浄したリポソームを、適切な総リン脂質濃度（例えば、約５０〜２００ｍＭ）で再懸濁する。カプセル化されたさらなる物質または活性薬剤の量を、標準的な方法に従って決定し得る。リポソーム調製物中にカプセル化されたさらなる物質または活性薬剤の量の決定の後、リポソームを適切な濃度に希釈し得、そして使用するまで４℃で保存し得る。リポソームを含む薬学的組成物は、通常、滅菌した、薬学的に受容可能なキャリアまたは希釈剤（例えば、水または生理食塩水の溶液）を含む。
【０２４８】
リポソームのサイズは、合成方法に依存して変化する。本発明におけるリポソームは、多様なサイズであり得る。特定の実施形態において、リポソームは小さい（例えば、外部直径が、約１００ｎｍより小さい、約９０ｎｍより小さい、約８０ｎｍより小さい、約７０ｎｍより小さい、約６０ｎｍより小さい、または約５０ｎｍより小さい）。このようなリポソームの調製において、本明細書中に記載される任意のプロトコル、または当業者に公知の任意のプロトコルが使用され得る。リポソーム調製のさらなる非限定的の例は、米国特許第４，７２８，５７８号、米国特許第４，７２８，５７５号、米国特許第４，７３７，３２３号、米国特許第４，５３３，２５４号、米国特許第４，１６２，２８２号、米国特許第４，３１０，５０５号および米国特許第４，９２１，７０６号；国際出願ＰＣＴ／ＵＳ８５／０１１６１およびＰＣＴ／ＵＳ８９／０５０４０；英国特許出願ＧＢ  ２１９３０９５  Ａ；Ｍａｙｅｒら，１９８６；Ｈｏｐｅら，１９８５；Ｍａｙｈｅｗら，１９８７；Ｍａｙｈｅｗら，１９８４；Ｃｈｅｎｇら，１９８７；ならびにＧｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ，１９８４（それぞれ、参考として本明細書中に援用される）に記載される。
【０２４９】
一般的に、水溶液中に懸濁されたリポソームは、脂質二重層分子の１つ以上の同円状層を有する、球状小胞の形状である。各々の層は、式ＸＹによって表される分子の平行な並びからなり、ここでＸは親水性部分であり、Ｙは疎水性部分である。水性懸濁物において、同心円状層は、親水性部分が水相と接し続ける傾向にあるように、そして疎水性領域が自己会合する傾向にあるように配置される。例えば、水相がリポソームの内側および外側の両方に存在する場合、脂質分子は、ラメラとして公知である、ＸＹ−ＹＸ配置の二重層を形成し得る。脂質の配置は、１を超える脂質分子の親水性部分および疎水性部分が互いに会合し始めると、脂質の凝集体が形成され得る。これらの凝集体のサイズおよび形状は、多くの種々の変動要因（例えば、溶媒の性質および溶液中の他の化合物の存在）に依存する。
【０２５０】
脂質処方物の生成は、しばしば、以下の後、リポソーム混合物の超音波処理または連続的な押出しを伴う：（Ｉ）逆相エバポレーション、（ＩＩ）脱水−再水和、（ＩＩＩ）界面活性剤透析および（ＩＶ）薄膜水和。１つの局面において、特定の実施形態における、意図されるリポソーム調製方法は、脂質の加熱、超音波処理、および孔径が徐々に小さくなるサイズのフィルターまたは膜を通した連続的な押出しであり、それにより、小さく、安定したリポソーム構造体が形成される。この調製は、構造的に安定でありかつ最大の活性を生じる、適切かつ均一なサイズのもののみの、リポソームの／キメラのポリペプチドまたはリポソームを生成する。そのような技術は、当業者に周知である（例えば、Ｍａｒｔｉｎ，１９９０を参照のこと）。
【０２５１】
一旦製造されると、脂質構造体は、循環で毒性（例えば、化学療法剤）であるかまたは不安定（例えば、核酸）である化合物をカプセル化するのに用いることが可能である。リポソームの物理学的特徴は、ｐＨ、イオン強度、および／または二価の陽イオンの存在に依存する。リポソームは、イオン物質および／または極性物質に対して、低い透過性を示し得るが、上昇した温度で、透過性が顕著に変化する層転移が起こる。この層転移は、ゲル状態として公知である、ぎっしり詰まった規則正しい構造から、流体状態として公知である、ゆるく詰まったそれほど規則正しくない構造への変化を含む。これは、特徴的な層転移温度で生じ、そして／またはイオン、糖および／または薬物に対する透過性の上昇を生じる。リポソームのカプセル化は、そのような化合物についての、より低い毒性およびより長い血清半減期を生じた（Ｇａｂｉｚｏｎら，１９９０）。
【０２５２】
リポソームは細胞と相互作用し、４つの異なる機構を介して、薬剤を送達する：細網内皮性系（の食細胞例えば、マクロファージおよび／または好中球）によるエンドサイトーシス；非特異的な弱い疎水性の力および／もしくは静電気力、ならびに／または細胞表面成分との特異的な相互作用のいずれかによる、細胞表面への吸着；同時にリポソーム内容物を細胞質に放出する、リポソームの脂質二重層の原形質膜への挿入による、原形質細胞膜との融合；ならびに／またはリポソーム内容物との一切の会合なしでの、リポソーム脂質の細胞膜および／または細胞内膜への移行、ならびに／またはその逆移行。一度に１を超える機構が有効であり得るとはいえ、リポソーム処方物を変化させることによって、どの機構が有効であるかが変化し得る。
【０２５３】
多くの疾患処置は、脂質ベースの遺伝子移入ストラテジーを使用して、従来の治療を増強しているかまたは新規の治療（特に、過剰増殖疾患を処置する治療法を確立している。リポソーム処方物の進歩は、インビボでの遺伝子移入効率を改善しており（Ｔｅｍｐｌｅｔｏｎら，１９９７）、リポソームがこれらの方法によって調製されることが意図される。核酸送達のための脂質ベースの処方物の代替調製方法が記載される（ＷＯ  ９９／１８９３３）。
【０２５４】
別のリポソーム処方物において、溶媒希釈マイクロキャリア（ＳＤＭＣ）と呼ばれる両親媒性ビヒクルは、脂質ビヒクルの二重層への特定の分子の組み込みを可能にする（米国特許第５，８７９，７０３号）。このＳＤＭＣは、リポ多糖体、ポリペプチド、核酸などの送達に用いられ得る。もちろん、リポソーム調製の他のあらゆる方法を当業者が使用して、本発明における所望のリポソーム処方物を得ることが可能である。
【０２５５】
（ｂ．標的化リガンド）
標的化リガンドは、複合体の疎水性部分に固着し得るか、または複合体の親水性部分の反応性末端基に結合し得るかの、いずれかである。標的リガンドは、親水性ポリマーの遠位末端上の反応性基への結合を介して、リポソームに結合し得る。好ましい反応性基としては、アミノ基、カルボキシル基、ヒドラジド基、およびチオール基が挙げられる。標的化リガンドの親水性ポリマーへのカップリングは、当業者に公知である有機化学の標準的な方法で実施され得る。特定の実施形態において、標的化リガンドの層濃度は、約０．０１％ｍｏｌ〜約１０％ｍｏｌであり得る。
【０２５６】
標的化リガンドは、標的化領域の特徴的な成分に対して特異的な、任意のリガンドである。好ましい標的化リガンドとしては、タンパク質（例えば、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体、抗体フラグメント、またはキメラ抗体、酵素、あるいはホルモン）、あるいは糖（例えば、単糖、オリゴ糖および多糖））が挙げられる（Ｈｅａｔｈら，１９８６を参照のこと）。例えば、ジシアロガングリオシドＧＤ２は、神経外胚葉性起源の腫瘍（例えば、神経芽腫、黒色腫、小細胞肺癌（ｃａｒｃｅｎｏｍａ）、神経膠腫および特定の肉腫）（Ｍｕｊｏｏら，１９８６，Ｓｃｈｕｌｚら，１９８４）において同定された腫瘍抗原である。抗ジシアロガングリオシドＧＤ２モノクローナル抗体を含むリポソームは、この腫瘍抗原を発現している細胞に対するリポソームの標的化を助けるために用いられている（Ｍｏｎｔａｌｄｏら，１９９９；Ｐａｇａｎら，１９９９）。別の非限定的な例において、乳癌抗原および婦人科学的癌抗原に特異的な抗体は、参考として本明細書中に援用される米国特許第５，９３９，２７７号に記載される。さらなる非限定的な例において、前立腺癌特異抗体は、参考として本明細書中に援用される米国特許第６，１０７，０９０号に開示される。従って、本明細書中に記載されるかまたは当業者に公知である抗体は、特定の組織および細胞型を標的化するための本発明の組成物および方法と組合せて用いられ得ることが意図される。本発明の特定の実施形態において、意図されるの標的化リガンドは、インテグリン、プロテオグリカン、糖タンパク質、レセプターまたはトランスポーターと相互作用する。適切なリガンドとしては、標的器官の細胞または局所的病状（例えば、腫瘍）の結果として循環に曝される標的器官の構造に特異的な任意のリガンドが挙げられる。
【０２５７】
本発明の特定の実施形態において、細胞の形質導入を促進するために、標的細胞の形質導入を増やすために、または望ましくない細胞の形質導入を制限するために、抗体または環状ペプチド標的化部分（リガンド）を、脂質複合体と会合させる。そのような方法が、当該分野で公知である。例えば、哺乳類中枢神経系の細胞を特異的に標的とするリポソームが、さらに記載されている（米国特許第５，７８６，２１４号、参考として本明細書中に援用される）。このリポソームは、本質的にＮ−グルタリルホスファチジルエタノールアミン、コレステロールおよびオレイン酸から構成され、ここで神経膠に特異的なモノクローナル抗体が、リポソームに結合している。モノクローナル抗体または抗体フラグメントは、動物における特定の細胞、組織または器官（例えば、脳、心臓、肺、肝臓など）へと送達を標的化するために使用され得ることが意図される。
【０２５８】
なおさらに、キメラポリペプチドを、レセプター媒介性送達および／または脂質もしくはリポソームを含む標的化ビヒクルを介して、標的細胞に送達し得る。これらは、標的細胞内で起こるレセプター媒介性エンドサイトーシスによる高分子の選択的取込みを利用する。多様なレセプターの細胞型特異的分布という点からみて、この送達方法は、別の程度の特異性を本発明に加える。
【０２５９】
従って、本発明の特定の局面において、リガンドは、標的細胞集団で特異的に発現されるレセプターに対応するように選択される。細胞特異的キメラポリペプチド送達および／または標的化ビヒクルは、リポソームと組合せて、特異的な結合リガンドを含み得る。送達されるべきキメラポリペプチドは、リポソーム内に収容され、特異的結合リガンドは、リポソーム膜内に機能的に取込まれる。従って、このリポソームは、標的細胞のレセプターに特異的に結合し、その内容物を細胞に送達する。このような系は、系（例えば、上皮成長因子（ＥＧＦ）が、ＥＧＦレセプターのアップレギュレーションを示す細胞への核酸のレセプター媒介性送達において用いられる系）を用いて機能的であることが示されている。
【０２６０】
特定の実施形態において、レセプター媒介性送達および／または標的化ビヒクルは、細胞レセプター特異的リガンドおよびペプチドを含む。他には、送達されるペプチドが機能的に結合している細胞レセプター特異的リガンドを含む。例えば、いくつかのリガンドは、レセプター媒介性遺伝子移入に対して用いられており（ＷｕおよびＷｕ，１９８７；Ｗａｇｎｅｒら，１９９０；Ｐｅｒａｌｅｓら，１９９４；Ｍｙｅｒｓ，ＥＰＯ  ０２７３０８５）、これは、この技術の作動性を確立する。別の例において、別の哺乳動物細胞型に関連する特定の送達について記載されている（ＷｕおよびＷｕ，１９９３；参考として本明細書中に援用される）。
【０２６１】
なおさらなる実施形態において、特定の結合リガンドは、細胞特異的結合を指示する１つ以上の脂質または糖タンパク質を含み得る。例えば、ガラクトース末端アシアロガングリオシド（ａｓｉａｌｇａｎｇｌｉｏｓｉｄｅ）であるラクトシルセラミドは、リポソームに組み込まれており、肝細胞によるインスリン遺伝子の取込みの増加が観察されている（Ｎｉｃｏｌａｕら，１９８７）。末端ガラクトシル残基を含むアシアロ糖タンパク質である、アシアロフェチュイン（ａｓｉａｌｏｆｅｔｕｉｎ）はまた、肝臓に対してリポソームを標的化することが実証されている（ＳｐａｎｊｅｒおよびＳｃｈｅｒｐｈｏｆ，１９８３；Ｈａｒａら，１９９６）。ポリペチド骨格に結合した場合、糖（マンノシルグルコサミン、フコーシルグルコサミンまたはＮ−アセチルグルコサミン）は、高親和性マンノース（ｍａｎｏｓｅ）レセプターと結合する（米国特許第５，４３２，２６０号，特にその全体が参考として本明細書中に援用される）。本発明の細胞特異的形質転換構築物または組織特異的形質転換構築物が、同様の方法で特異的に標的細胞または標的組織に送達され得ることが意図される。
【０２６２】
別の例において、ラクトシルセラミド、およびＬＤＬレセプター関連タンパク質（例えば、アポリポタンパク質Ｅ３（「アポＥ」）を標的とするペプチドは、肝臓に対するリポソームの標的化において有用である（ＳｐａｎｊｅｒおよびＳｃｈｅｐｈｏｆ，１９８３；ＷＯ  ９８／０７４８）。
【０２６３】
フォレートおよび葉酸レセプターはまた、細胞標的化に関して有用であると記載されている（米国特許第５，８７１，７２７号）。この例において、葉酸ビタミンは、複合体に結合される。葉酸レセプターは、そのリガンドに対して高親和性を有し、肺腫瘍、乳房腫瘍および脳腫瘍を含むいくつかの悪性細胞系株の表面上に過剰発現される。抗葉酸剤（例えば、メトトレキセート）はまた、標的化リガンドとして用いられ得る。トランスフェリン媒介性送達系は、トランスフェリンレセプターを発現する広い範囲の複製中の細胞を標的とする（Ｇｉｌｌｉｌａｎｄら，１９８０）。
【０２６４】
（ｃ．リポソーム／核酸の組み合わせ）
特定の実施形態において、リポソーム／キメラポリペプチドは、核酸（例えば、オリゴヌクレオチド構築物、ポリヌクレオチド構築物または核酸構築物物（例えば、発現ベクター））を含み得る。真核生物細胞にトランスフェクトさせるべきＤＮＡ構築物中で細菌プロモーターを用いる場合、リポソーム内に適切な細菌ポリメラーゼを含むこともまた望ましい。
【０２６５】
リポソーム／キメラポリペプチド組成物が細胞特異的核酸または組織特異的核酸を含む場合、この技術は、本発明における適用性を有し得ることが考えられる。特定の実施形態において、脂質をベースとする非ウイルス性処方物は、ウイルス遺伝子治療に対する代替物を提供する。多くの細胞培養研究は、脂質をベースとする非ウイルス性遺伝子移入を証明しているとはいえ、脂質ベースの処方物を介した全身性遺伝子送達は限定されている。非ウイルス性の脂質ベースの遺伝子送達の主な制限は、非ウイルス性の送達ビヒクルを含むカチオン性脂質の毒性である。リポソームのインビボでの毒性は、インビトロでの遺伝子移入の結果とインビボでの遺伝子移入の結果との間の矛盾を部分的に説明する。この矛盾するデータの一因となる別の要因は、血清タンパク質の存在下と非存在とでの、リポソーム安定性の違いである。リポソームと血清タンパク質との間の相互作用は、リポソームの安定的特性に対して劇的な影響を有する（ＹａｎｇおよびＨｕａｎｇ，１９９７）。カチオン性リポソームは、負に荷電した血清タンパク質を誘引し、そして結合する。血清タンパク質によってコートされたリポソームは、誘導するマクロファージによって溶解されるかまたは吸収されるかのいずれかであり、それらは循環から除去されることになる。最新の、インビボでのリポソームの送達方法は、循環におけるカチオン性脂質と関連する毒性および安定性の問題を避けるために、エアゾール化、皮下注射、皮内注射、腫瘍内注射、または頭蓋内注射注射を用いる。リポソームおよび血漿タンパク質の相互作用は、インビでの効率（Ｆｅｌｇｎｅｒら，１９８７）とインビボでの遺伝子移入（Ｚｈｕら，１９９３；Ｐｈｉｌｉｐら，１９９３；Ｓｏｌｏｄｉｎら，１９９５；Ｌｉｕら，１９９５；Ｔｈｉｅｒｒｙら，１９９５；Ａｋｓｅｎｔｉｊｅｖｉｃｈら，１９９６）との間の相違における大きな要因である。
【０２６６】
（ｄ．脂質投与）
患者に投与される脂質組成物（例えば、リポソーム−キメラポリペプチド）の実際の投与量は、身体的要因および生理学的要因（例えば、体重、状態の重篤度、患者の突発性疾患および投与の経路により決定され得る。これら考慮すべき事項を、処置の特定の被験者および／または経路のための脂質組成物の投薬量を、容易に決定し得る。
【０２６７】
本発明は、静脈内に、皮内に、動脈内に、腹腔内に、病巣内に、頭蓋内に、関節内に、前立腺内に、胸膜腔内に、気管内に、鼻腔内に、硝子体内に、膣内に、直腸表面に、腫瘍内に、筋肉内に、腹腔内に、皮下に、小嚢内に、粘膜に、心膜内に、口腔に、表面に、局所的に、および／またはエアゾール、注射、注入、継続的な注入、直接またはカテーテルおよび／もしくは洗浄液を介して標的細胞を浸す限局的な灌流を用いて投与され得る。
【０２６８】
（ＩＸ．キット）
本発明の特定の実施形態は、診断用または治療用のキットに関連する。ペプチドは、ＨＰＶを患う患者の中での前癌増殖または癌増殖の発達または再発の可能性を決定するためのキットの形態で用いられ得る。このキットは、Ｔ細胞リンパ球増殖の刺激および／またはＴヘルパー１サイトカイン産生の増加を決定し得る。多様なキットの構成要因は、適切な容器手段中で保存され得る。一般的に、この容器手段は、少なくとも１つのバイアル、試験管、フラスコ、瓶、シリンジまたは他の容器手段を備え、その中には、ペプチド処方物が配置され、好ましくは、適切に配分されている。このキットはまた、滅菌した、薬学的に受容可能な緩衝液または他の希釈剤を含むための、他の第２の容器手段を備え得る。本発明のキットはまた、代表的に、市販のために厳密に閉じ込めた状態でバイアルを含む所望のバイアルを保持するための手段を備え得る（例えば、注射出成型または譜き込み形成されたプラスチック容器）。
【０２６９】
このキットは、サンプルと抗体との間の相互作用を検出するための試薬（検出試薬）を含み得る。提供された試薬は、放射標識、蛍光標識または酵素学的標識であり得る。このキットは、細胞媒介性免疫応答を検出および／または測定させる抗体と結合し得るかまたは相互作用し得る公知の放射標識薬剤を含み得る。一般的に、これらの方法は、始めに、このようなタンパク質、ペプチドまたは抗体を含む疑いにあるサンプルを得る工程、場合に応じて、免疫複合体の形成を可能にするに効果的な条件下で、本発明に従う抗体またはペプチドとこのサンプルとを接触させる工程、次いで免疫複合体の存在を検出する工程を包含する。
【０２７０】
いくつかの実施形態において、１つ以上のＥ６ペプチドおよび／またはＥ７ペプチドは、適切な容器に含まれる。サンプルは、ペプチドと接触させられ得るか、またはインキュベートされ得、次いで、サンプルは、ペプチドに対する細胞媒介性免疫応答についてアッセイされ得る。従って、いくつかの実施形態において、キットは、反応しない構造体を含む。いくつかの実施形態において、反応しない構造体は、プラスチックまたは何らかの他の合成材料であり得る。反応しない構造体は、サンプルを維持する一種の容器の型（例えば、ウェルを有する容器）であり得る。複数のウェルを有する容器もまた、本発明の一部として含まれる。いくつかの場合において、この構造体は、膜で内側が覆われているか、または結合している。膜で内側を覆われたウェルは、Ｅ６ペプチドまたはＥ７ペプチドとインキュベートされ得、次いで同じ容器を使用して細胞媒介性免疫応答についてアッセイされ得ることが意図される。これは、細胞媒介性免疫応答を検出するために使用され得る抗体を用いることによってなされ得る。このような抗体としては、ＴＨ１サイトカインに対する抗体またはＴＨ２サイトカインに対する抗体、サイトカインレセプターに対する抗体または細胞媒介性免疫応答の指標であるＴ細胞上の任意の他のレセプターに対する抗体が挙げられる。検出試薬もまた、キットに含まれ得る。
【０２７１】
キットの試薬は、液体溶液として、固体支持体に結合してまたは乾燥粉末として提供され得る。好ましくは、試薬が液体溶液中で提供される場合、液体溶液は、水溶液である。好ましくは、提供される試薬が、固体支持体に結合される場合、固体支持体は、クロマトグラフ、複数のウェルを有する試験プレートまたは顕微鏡用スライド媒体であり得る。提供される試薬が乾燥粉末である場合、この粉末は、提供され得る適切な溶媒の添加によって再構成され得る。
【０２７２】
一般的に、免疫複合体形成の検出は、当該分野において非常に周知であり、そして複数のアプローチの適用を介して達成され得る。例えば、本発明は、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、免疫ブロット（例えば、ドットブロット）、ＥＬＩＳＰＯＴ、間接的な免疫蛍光技術などの適用を意図する。一般的に、免疫複合体形成は、標識（例えば、放射標識または酵素タグ（例えば、アルカリホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼなど））の使用を介して検出される。もちろん、二次結合リガンド（例えば、当該分野において公知であるような、二次抗体またはビオチン／アビジンリガンド結合取合せ）の使用を介してさらなる利点を見出し得る。
【０２７３】
アッセイする目的のために、場合に応じて、細胞媒介性免疫応答の可能性のある細胞を含む疑いのある実質的に任意のサンプルが用いられ得ることを提案する。サンプルとしては、以下が挙げられる：細胞、細胞上清、細胞懸濁液、細胞抽出物、酵素画分、タンパク質抽出物または細胞媒介性免疫応答の可能性のある細胞を含む疑いのある他の無細胞組成物。一般的に言えば、本発明に従うキットは、免疫検出試薬ならびに抗体、ペプチドおよび試薬を含む手段と一緒になった、少なくとも１つのＥ６ペプチドまたはＥ７ペプチドおよび細胞媒介性免疫応答と関連するタンパク質様組成物に対して指向される抗体を含む。免疫検出試薬は、代表的に、抗体または抗原と結合した、あるいは二次結合リガンドと結合した標識を含む。例示的なリガンドとしては、結合した標識を有する一次抗体または抗原に対して指向される二次抗体、あるいは結合した標識を有するビオチンリガンドまたはアビジン（またはストレプトアビジン）リガンドが挙げられ得る。もちろん、上記のように、多数の例示的標識は、当該分野で公知であり、そして全てのこのような標識は、本発明と関連して用いられ得る。
【０２７４】
この容器は、一般的に、抗体、抗原または検出試薬が配置され得、好ましくは適切にアリコートに分けられ得る、バイアルを含む。本発明のキットはまた、代表的に、市販のために厳密に閉じ込められた状態で抗体、抗原および試薬容器を含むための手段を含む。このような容器は、所望のバイアルが保持される射出成形または吹き込み成形されたプラスチック容器を含み得る。
【０２７５】
１つの実施形態において、診断用キットは、核酸検出方法で、使用するためのプローブまたはプライマーを含む。生物学的サンプル中のペプチドマーカーを検出するために必要な全ての必須の材料および試薬は、キット中で一緒に構築され得る。一般的に、これは、特定のマーカーについて予め選択されたプライマーを含む。増幅のための必要な反応混合物を提供するための、核酸を増幅するのに適切な酵素（様々なポリメラーゼ（ＲＴ、Ｔａｑなど）を含む）、デオキシヌクレオチドおよび緩衝液もまた含まれ得る。
【０２７６】
このようなキットは、一般的に、適切な手段において、各個々の試薬および酵素のための異なる容器、ならびに各マーカーのプライマー対のための異なる容器を含む。核酸を増幅するための好ましいプライマー対は、配列番号１〜１９またはその相補体に特異的な配列を増幅するように選択される。
【０２７７】
別の実施形態において、このようなキットは、配列番号１〜１９で指定される配列またはその相補体に対応するペプチドについて特異的なハイブリダイゼーションプローブを含む。このようなキットは、一般的に、適切な手段において、各個々の試薬および酵素のための異なる容器、ならびに各ハイブリダイゼーションプローブのための異なる容器を含む。
【０２７８】
他の実施形態において、本発明は、上記の免疫検出方法で、使用するための免疫検出キットに関する。一般的に、ペプチドはタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドであるので、ペプチドは、好ましくはキットに含まれる。従って、免疫検出キットは、適切な容器手段において、ペプチドおよび必要に応じて免疫検出試薬を含む。
【０２７９】
このキットの免疫検出試薬は、所定の抗体に会合、または連結した検出可能な標識を含む、様々な形態のうちのいずれか１つを取り得る。二次結合リガンドに会合かまたは連結した検出可能な標識もまた、意図される。例示的な二次リガンドは、一次抗体に対する結合親和性を有する二次抗体である。
【０２８０】
このキットは、検出アッセイのための標準曲線を作成するために使用され得るように、標識されているかまたは標識されていなかにかかわらず、野生型または変異体のタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドの適切にアリコートに分けられた組成物をさらに含み得る。このキットは、完全な結合体化形態においてか、中間体の形態において、またはキットの使用者によって結合体化されるべき別個の部分として抗体標識結合体を含み得る。このキットの成分は、水溶性媒体中に、または凍結乾燥された形態で梱包され得る。
【０２８１】
本発明の治療的キットは、配列番号１〜１９のペプチドを含むキットである。一般的にこのようなキットは、適切な容器手段において、ポリペプチド、ペプチド、生物学的機能等価物、免疫学的フラグメント、ドメイン、インヒビター、抗体、遺伝子、ポリヌクレオチド、核酸、補体または上記のいずれかを発現するベクターの薬学的に受容可能な処方物を薬学的に受容可能な処方物中に含む。このキットは、単一容器手段を有し得るか、または各化合物のための異なる容器手段を有し得る。
【０２８２】
キットの成分が、１つ以上の液体溶液中に提供される場合、液体溶液は、水溶液であり、滅菌した水溶液が特に好ましい。ペプチド組成物はまた、注射可能な組成物であるように処方され得る。この場合、容器手段自体はシリンジ、ピペットまたは他の同様の装置であり得、ここから、処方物が身体の感染領域に適用され得るか、動物へと注射され得るか、またはキットの他の成分に適用されて混合されさえし得る。
【０２８３】
しかし、キットの成分は、乾燥粉末として提供され得る。試薬または成分が乾燥粉末として提供される場合、粉末は、適切な溶媒の添加によって再構築され得る。この溶媒はまた、他の容器手段中に提供され得ることが想定される。
【０２８４】
このキットの容器手段としては、一般的に、抗体が配置され得る（好ましくは適切にアリコートに分けられ得る）、少なくとも１つのバイアル、試験管、フラスコ、ボトル、シリンジまたは他の容器手段が挙げられる。ポリペプチドもしくはペプチド、または二次結合リガンドもしくは三次結合リガンド、またはさらなる成分が提供される場合、このキットはまた、一般的に、このリガンドまたは成分が配置され得る、第２の容器、第３の容器または他のさらなる容器を含む。本発明のキットはまた、市販のために厳密に閉じ込められた状態で、代表的に、抗体、抗原および任意の他の試薬容器を含むための手段を含む。このような容器は、所望のバイアルが維持される、射出成形または吹き込み成形されたプラスチック容器を含み得る。
【０２８５】
容器の数とも種類とも関係なく、本発明のキットはまた、動物の体内での最終的なペプチドの注射／投与または配置を補助するための機器を含み得るか、またはそれらと共に梱包され得る。このような機器は、シリンジ、ピペット、ピンセットまたは任意のこのような医療的認可送達ビヒクルであり得る。
【実施例】
【０２８６】
以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態を示すために挙げられる。以下に示す実施例に開示された技術は、本発明の実施において十分に機能することが発明者によって発見された技術を示し、従って、その実施のための好ましい形態を構成するとみなされ得る当業者によって認識されるべきである。しかし、当業者は、本開示を考慮し、開示される特定の実施形態において多くの変更がなされ得、そして本発明の精神および範囲から逸脱することなく同様のまたは類似の結果をなお得ることができることを認識すべきである。
【０２８７】
（実施例１）
（材料および方法）
（患者）
本発明の実施形態は、Ｔｈｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｔｅｘａｓ  Ｍ．Ｄ．Ａｎｄｅｒｓｏｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｎｔｅｒのコルポスコピー診療で診察を受けた患者から選択された研究集団を含む。インフォームドコンセントを患者から得て、そして全ての手段を、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  Ｂｏａｒｄにより承認されたプロトコルに従って行なった。女性は１７歳以上であり、そして免疫障害の病歴がなく妊娠していなかった。女性の４つグループを、これらの研究のために特定した。グループ１は、ＣＩＮの細胞学的診断も組織学的診断も有さず、そしてＨＰＶネガティブ試験を有する（ＣＩＮ（−）／ＨＰＶ（−））６人の女性から構成された。グループ２は、ＣＩＮの組織学的診断およびＨＰＶポジティブ試験（ＣＩＮ（＋）／ＨＰＶ（＋））有する３１人の女性を含んだ。グループ３および４は、研究の少なくとも６ヶ月前にコルポスポピー診療でＣＩＮについての切除（ａｂｌａｔｉｖｅ）処置または切除（ｅｘｃｉｓｉｏｎａｌ）処置を受けた女性から選択された。グループ３および４の女性は、ＣＩＴ処置の前に（ＣＩＮ（＋）／ＨＰＶ（＋））であった。しかし、登録時（ＣＩＮ処置の最少で６ヶ月後であった）に、女性を、疾患状態のみについて評価した。グループ３は、ＣＩＮの再発の証拠がない（再発（−））２２人の女性から構成され、そしてグループ４は、再発ＣＩＮの組織学的診断を有する（再発（＋））１０人を含む。ＨＰＶ陽性を、Ｖｉｒａｐａｐ／Ｖｉｒａｔｙｐｅ  アッセイ（Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を使用して決定した。このプロトコルにおいて、ＨＰＶ  ＲＮＡのドットブロットハイブリダイゼーションを、頸部スワブで得られた剥離された頸部上皮細胞を用いて行う。このアッセイ方法は、３２Ｐ標識化ＤＮＡプローブセット（これらは、ＨＰＶ型：６／１１、１６／１８および３１／３３／３５を同定する）の使用を含む。細胞を、製造者の指示書に従って単離し、そして処理した。研究の時点で、この試験を、コルポスコピー診療で標準的な看護プログラムの一部として使用した。ＨＰＶ陽性を、以前に記載されたように（Ｔｉｎｇら、１９９０；Ｓｃｈｉｆｆｍａｎら、１９９１）、パラフィン包埋生検物質から抽出されたＤＮＡを使用して、ＰＣＲによってさらに確認した。ＰＣＲ分析のために使用したコンセンサスなプライマーは、パピローマウイルスのＬ１オープンリーディングフレームに由来した（ＭＹ１１，ＧＣＭＣＡＧＧＧＷＣＡＴＡＡＹＡＡＴＧＧ（配列番号２３）およびＭＹ０９，ＣＧＴＣＣＭＡＲＲＧＧＡＷＡＣＴＧＡＴＣ（配列番号２４）；ここで、Ｍ＝Ａ＋Ｃ、Ｒ＝Ａ＋Ｇ、Ｗ＝Ａ＋Ｔ、Ｙ＝Ｃ＋Ｔ）。ＨＰＶ−１６陽性を、特定のオリゴヌクレオチドプローブ（ＣＡＴＡＣＡＣＣＴＣＣＡＧＣＡＣＣＴＡＡ（配列番号２５））を使用して確認した。研究被験体のＨＰＶ状態を含む臨床的特徴を、表２に列挙する。
【０２８８】
（表２  研究被験体の特徴）
【０２８９】
【表２】
2004535816.tif 000003
＊注意：グループ３について、研究への採用時点での診断は、ＣＩＮについてネガティブであったが、グループ４については、ＣＩＮ２／３について陽性であった。
【０２９０】
（ペプチド）
ＨＰＶ−１６のＥ６腫瘍タンパク質およびＥ７腫瘍タンパク質に対応するペプチド配列を、文献に記載される公知のＴ細胞エピトープに関連する両親媒性構造および情報に基づいて選択した。表３は、本発明の研究に使用したペプチドを列挙する。全てのペプチドを、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ固相方法（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，１９６３）を使用して、改変されたＶｅｇａ  ２５０自動ペプチド合成機（Ｖｅｇａ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｔｕｃｓｏｎ，ＡＺ）またはＨｏｕｇｈｔｅｎ，１９８５によって記載される「バッグ」方法のいずれかで、以前に報告されたように作製した（Ｓａｒｋａｒら、１９９５）。多くの実験において、使用したペプチドの純度は、約７０〜８０％であり、そしていくつかの実験において、９５％より高い純度を示すペプチドを、同一の結果と共に、使用した。Ｅ６ペプチドおよびＥ７ペプチドに加えて、発明者らは、ネガティブコントロールとしてｃ−ｍｏｓプロトオンコジーン由来のペプチド［ａａ  １５８−１７０，ＳＴＲＴＰＥＤＳＮＳＬＧＴ（配列番号２２）］を使用した。ペプチドストック溶液を、ＰＢＳ（ｐＨ７．０）中で調製し、そしてフィルター滅菌した。
【０２９１】
（Ｔ細胞増殖アッセイ）
ヘパリン処理した血液を、静脈穿刺によって研究参加者から回収した。ＰＢＭＣを、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ密度勾配（Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ−１０７３；Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）で遠心分離によって単離した。ＰＨＡ、ｃ−ｍｏｓペプチド、または個々のＥ６ペプチドおよびＥ７ペプチドを用いた刺激の後、異なる個体由来のＰＢＭＣの増殖応答（表４）を、以前に記載されたように（Ｎｅｈｅｔｅら、１９９６）、３［Ｈ］チミジン取りこみアッセイを使用して決定した。簡潔に言うと、各サンプルを、９６ウェルマイクロタイタープレート中に三連で播種し、そして加湿した５％ＣＯ２雰囲気下で、３７℃にて７日間インキュベートした。最後の１６〜１８時間の間、１μＣｉの［３Ｈ］チミジン（６．７Ｃｉ／ｍｍｏｌ；ＩＣＮ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．，Ｃｏｓｔａ  Ｍｅｓａ，ＣＡ）を添加した。この細胞を、３［Ｈ］チミジン取りこみを評価するためにフィルターストリップ上に回収した。種々の添加剤で処理した細胞の比放射活性を、培地単独で培養された細胞を用いて得られた１分あたりの計数（ｃｐｍ）値を減算することによって各場合において計算した。予備実験からのデータは、５μｇ／ｍｌで、各ペプチドが一貫したレベルの増殖を生じることを示した。個々のＥ６ペプチドおよびＥ７ペプチドに対するＴ細胞増殖応答の有意性（刺激指数［ＳＩ］での）は、ペプチドが添加されなかったコントロールよりも、ペプチドに曝露された細胞による［３Ｈ］チミジン取りこみの持続した増加として計算された。３．０以上のＳＩ値（これは陽性応答とみなされる）を、増殖応答の有意性および関連する疾患のない状態または疾患再発状態を決定するための全ての統計分析のために使用した。全ての実験において、三連サンプルからのデータを、１０％以下の標準誤差に匹敵した。試験された４つの研究グループにおける女性は、誰一人としてコントロールｃ−ｍｏｓペプチドに対して特異的な増殖応答を示さなかった（ＳＩ＜２．０）。
【０２９２】
（表３  ＨＰＶ−１６に由来するＥ６ペプチドおよびＥ７ペプチドのアミノ酸配列）
【０２９３】
【表３】
2004535816.tif 000004
ａａ、アミノ酸
（サイトカイン分析）
凍結保存したＰＢＭＣを、これらのアッセイのために使用した。ＰＢＭＣ（１×１０５）を、９６ウェルの丸底プレートの三組みウェルのＲＰＭＩ−１６４０培地（１０％ウシ胎仔血清を含有する）中で、様々なＨＰＶペプチドと共に４８時間、３７℃にて、インキュベートした。遠心分離後、上清（１００μｌ）を各ウェルから取り出し、そして別の９６ウェルプレート中で−７０℃で保存した。次いで、これらのプレートを解凍し、そしてＣｙｔｏｓｃｒｅｅｎ免疫アッセイキット（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｃａｍａｒｉｌｌｏ，ＣＡ）を使用して、製造者の指示書に従って、上清を様々なサイトカイン（ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−１０およびＩＬ−１２）についてアッセイした。
【０２９４】
（統計学的分析）
患者グループの間でのＳＩ値における差異を、Ｐｅａｒｓｏｎ  Ｘ２およびフィッシャーの直接確率検定によって評価した。統計学的アッセイの目的のために、有意な増殖応答を、３．０以上のＳＩとして定義した。統計学的有意性は、０．０５未満のｐとした。
【０２９５】
（実施例２）
１７〜５４歳（中央値３１歳）の範囲の年齢の全部で６９人の女性を、この研究に登録した。これらの６９人のうちの５２人は白人であり、各８人はアフリカ系アメリカ人およびラテンアメリカ人、そして１人はアジア人であった（表２）。これらの女性由来のＰＢＭＣを、ＨＰＶ−１６（表３）のＥ６オンコタンパク質およびＥ７オンコタンパク質の抗原性配列に対応する合成ペプチドに対する増殖応答について分析した（図１Ａ）。
【０２９６】
患者の４つの異なるグループの各々における様々なＥ６ペプチドおよびＥ７ペプチドに対して特異的な増殖応答の分析は、グループ３（再発（−））における患者の大部分が、試験した７つ全てのＥ６ペプチドおよび８つ中７つのＥ７ペプチドに対してポジティブな応答（ＳＩ≧３．０）を示すことを明らかにした（図１Ａ）。一方、グループ２（ＣＩＮ（＋）／ＨＰＶ（＋））における未処置の患者の３１人中５人のみが試験したペプチドのいずれかに応答し、そしてグループ１（ＣＩＮ（−）／ＨＰＶ（−）および４グループ（再発（＋））においては誰も、試験したペプチドのいずれかに対する応答も示さなかった。これは、図１Ｂに要約される。
【０２９７】
グループ３およびグループ４における女性のＥ６ペプチドおよび／またはＥ７ペプチドに対する増殖応答と処置後の疾患状態との関係を、表４に示す。グループ４（再発（−））の患者の誰もが、試験したＥ６ペプチドまたはＥ７ペプチドに対してどんな応答も示さなかったが、グループ３における患者の６４％が、Ｅ６ペプチドに対する有意な増殖応答を有し（ｐ＝０．００１）、Ｅ７ペプチドの少なくとも１つに対して８２％（ｐ＜０．００１）およびＥ６ペプチドまたはＥ７ペプチドの少なくとも一方に対して８６％（ｐ＜０．００１）の増殖応答を有することを示した。グループ３とグループ４との間で、一般的なマイトジェン様ＰＨＡに対する増殖応答において差異はなく（ｐ＝０．９１２、データは示さない）、このことは、これらの患者の不活性免疫状態において機能障害がないことを示唆する。これらの結果は、ＨＰＶ−１６のＥ６オンコタンパク質およびＥ７オンコタンパク質由来の合成ペプチドに対する増殖応答とＣＩＮ処置後の疾患のない状態との関係を、強く示唆する。
【０２９８】
発明者らは、Ｅ６（Ｑ１５ＬおよびＶ１０Ｃ）およびＥ７（Ｑ１９ＤおよびＲ９Ｆ）由来の各２つのペプチドに対する高レベルな増殖応答を同定した。ＳＩ値に関して、グループ３およびグループ４における２人の患者由来の、Ｅ６オンコタンパク質由来の７つの合成ペプチドおよびＨＰＶ−１６のＥ７オンコタンパク質由来の８つの合成ペプチドに対するそれぞれの増殖応答を、図２に示す。これらの４つのペプチドに対する増殖応答の比較は、グループ３とグループ４における女性の間で統計的有意差を示した（表５）。これらのペプチドに対する増殖応答は、グループ４で観察されなかったが、グループ３において、１１人全ての女性は、ペプチドＱ１５Ｌに対する応答を示し（ｐ＝０．００６）、ペプチドＶ１０Ｃに対して１０人（ｐ＝０．００６）、ペプチドＱ１９Ｄに対して１３人（ｐ＝０．００２）、そしてペプチドＲ９Ｆに対して１０人が応答を示した（ｐ＝０．０１３）。表３に示されるように、Ｅ６ペプチドＶ１０Ｃ中の１０アミノ酸うちの９アミノ酸が、Ｑ１５Ｌペプチドのアミノ酸と重複する。同様に、Ｅ７ペプチドＲ９Ｆの９アミノ酸が、Ｑ１９Ｄペプチドのアミノ酸と重複する。これらの４つのペプチドに特異的な増殖応答と一緒に、グループ３（再発（−））において観察された全ての応答（２２人中１９人の女性）を説明し得る。これらの結果は、ＨＰＶ特異的細胞性免疫応答に関して、ＨＰＶ−１６オンコタンパク質Ｅ６およびＥ７のＱ１５ＬペプチドおよびＱ１９Ｄペプチドのアミノ酸配列は、それぞれ免疫優性領域であり得ることを示唆する。
【０２９９】
発明者らまたは、研究集団のサブサンプルで、これらのペプチドがまた様々なＴＨ１サイトカインおよびＴＨ２サイトカインの生産を誘導するか否かを試験した。グループ３（再発（−））の８人の女性およびグループ４（再発（＋））からの６人の女性由来の凍結保存したＰＢＭＣを、インビトロでペプチドＱ１５ＬおよびペプチドＱ１９Ｄを用いて刺激した。刺激されていない培養を調節した後の、培養上清における様々なＴＨ１サイトカイン（ＩＬ−２、ＩＬ−１２およびＩＦＮ−□）およびＴＨ２サイトカイン（ＩＬ−４およびＩＬ−１０）の量を、図３に示す。グループ３（再発（−））において８人中７人（８７．５％）および８人中５人（６２．５％）の女性由来のＰＢＭＣは、Ｑ１５ＬおよびＱ１９Ｄの両方に対する応答において、それぞれＩＦＮ−□およびＩＬ−２の生産を示した（表６）。さらに、ＩＬ−１２産生は、このグループの８人中３人の女性由来のＰＢＭＣにおけるＱ１５Ｌに対する応答において観察されたが、ＩＬ−１２のＱ１９Ｄ媒介性産生は８人中６人の女性において明らかであった。一方、このグループの女性由来のＰＢＭＣのどれ１つも、ペプチドＱ１５ＬまたはペプチドＱ１９Ｄを用いた刺激に対する応答においてＩＬ−４を分泌せず、そして３人の女性のみが、これらのペプチドのいずれかに対する応答においてＩＬ−１０産生を示した。対照的に、グループ３（再発（−））の女性、グループ４（再発（＋））の女性は、ＩＬ−１０産生を優勢に示した（Ｑ１５Ｌを用いて６人中５人、Ｑ１９Ｄを用いて６人中６人）。ＰＢＭＣを試験された２つのペプチドのいずれかで刺激した場合、このグループの６人中１人の女性において、ＩＬ−４産生が、観察された（表６）。全体としては、これらの結果は、グループ３（再発（−））の患者はＴＨ１サイトカイン産生（ＩＬ−２、ＩＦＮ−γおよびＩＬ−１２）を優勢に示すが、グループ４の女性（再発（＋））は、ＨＰＶペプチドに対して指向された特異的増殖応答を示さないにもかかわらず、ＩＬ−１０、ＴＨ２サイトカインの産生を示したことを示した。
【０３００】
（表４  ＨＰＶ−１６オンコタンパク質Ｅ６および／またはＥ７の全ての合成ペプチドに対する増殖応答とＣＩＮ処置後の疾患状態との関係）
【０３０１】
【表４】
2004535816.tif 000005
（表５  ＨＰＶ−１６オンコタンパク質Ｅ６および／またはＥ７の特定の合成ペプチドに対する増殖応答とＣＩＮ処置後の疾患状態との関係）
【０３０２】
【表５】
2004535816.tif 000006
（表６  ＨＰＶ−１６ａのＥ６およびＥ７オンコタンパク質由来合成ペプチドを用いた刺激に対する応答におけるグループ３およびグループ４の患者由来のＰＢＭＣのサイトカイン生産）
【０３０３】
【表６】
2004535816.tif 000007
ａ  ポジティブな患者の数／試験した数。
【０３０４】
ｂ  サイトカイン生産の陽性は、ｐｇ／ｍｌ：ＩＬ−２＝８．７、ＩＦＮ−γ＝４．０、ＩＬ−１２＝１．０、ＩＬ−４＝２．０およびＩＬ−１０＝５．０に関してに関する各サイトカインに使用される試験キットの上記の感受性の値に基づく。
【０３０５】
ｃ  ＨＰＶ−１６のＥ６オンコタンパク質由来のＱ１５Ｌペプチド。
【０３０６】
ｄ  ＨＰＶ−１６のＥ７オンコタンパク質由来のＱ１９Ｄペプチド。
【０３０７】
本明細書中に開示されそして要求される全ての組成物および方法は、本開示にかんが見て、過度の実験をせずになされ、そして実施され得る。本発明の組成物および方法が好ましい実施形態に関して記載されるが、バリエーションが組成物および方法、ならびに本発明のコンセプト、精神および範囲から逸脱することなく、本明細書中に記載される方法の工程または工程の順序に適用され得ることは、当業者に明らかである。より詳細には、化学的および生理学的の両方に関連する特定の試薬が、本明細書中に記載される試薬に置換され得るが、同様または類似の結果が達成されることは明らかである。全てのこのような類似の置換および改変が、、添付される特許請求の範囲によって定義されるような本発明の精神、範囲およびコンセプト内であるとみなされることは、当業者に明らかである。
（参考文献）
以下の参考文献は、詳細に、本明細書中に参考として援用される。
【０３０８】
【表７】
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【０３０９】
【表８】
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【０３１０】
【表９】
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【０３１１】
【表１０】
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【０３１２】
【表１１】
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【０３１３】
【表１２】
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【０３１４】
【表１３】
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【０３１５】
【表１４】
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【０３１６】
【表１５】
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【０３１７】
【表１６】
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【図面の簡単な説明】
【０３１８】
以下の図は、本明細書の一部を形成し、そして本発明の特定の局面をさらに実証するために含まれる。本発明は、本明細書中にある特定の実施形態の詳細な記載と組み合わせて、これらの図の１つ以上を参照することによってよりよく理解され得る。
【図１Ａ】４つの異なる研究群中の女性からのＰＢＭＣによる、異なるＥ６およびＥ７の合成ペプチドに対する増殖応答。１群中の女性は、正常（ＣＩＮ（−）／ＨＰＶ（−）、ｎ＝６）であり、２群中はＨＰＶ関連ＣＩＮ（ＣＩＮ（＋）／ＨＰＶ（＋）、ｎ＝３１）であることが新たに診断され、３群は疾患なしの処置後（Ｒｅｃｕｒ（−）、ｎ＝２２）であり、そして４群は疾患の再発を有した（Ｒｅｃｕｒ（＋）、ｎ＝１０）。４つの異なる群中の女性からのＰＢＭＣを、ＨＰＶ−１６のＥ６癌タンパク質またはＥ７癌タンパク質由来のペプチドに対する増殖応答について試験した。Ａ．各々のペプチドに対して試験された、各々の患者についての、培地コントロールに対するペプチド処理されたサンプル中の３［Ｈ］チミジン取り込みの倍数増加として計算された刺激指標（ＳＩ）値を示した。
【図１Ｂ】４つの異なる研究群中の女性からのＰＢＭＣによる、異なるＥ６およびＥ７の合成ペプチドに対する増殖応答。１群中の女性は、正常（ＣＩＮ（−）／ＨＰＶ（−）、ｎ＝６）であり、２群中はＨＰＶ関連ＣＩＮ（ＣＩＮ（＋）／ＨＰＶ（＋）、ｎ＝３１）であることが新たに診断され、３群は疾患なしの処置後（Ｒｅｃｕｒ（−）、ｎ＝２２）であり、そして４群は疾患の再発を有した（Ｒｅｃｕｒ（＋）、ｎ＝１０）。４つの異なる群中の女性からのＰＢＭＣを、ＨＰＶ−１６のＥ６癌タンパク質またはＥ７癌タンパク質由来のペプチドに対する増殖応答について試験した。Ｂ．各々の群による、Ｅ６ペプチド、Ｅ７ペプチド、または両方のペプチドに対するポジティブな応答の概要。群の数をｘ軸に示し、一方、ポジティブな応答のパーセントをｙ軸に示す。
【図２】図２Ａ〜Ｄ。ＨＰＶ−１６のＥ６癌タンパク質またはＥ７癌タンパク質由来の合成ペプチドに対する、群３（Ｒｅｃｕｒ（−））および群４（Ｒｅｃｕｒ（＋））の患者由来のＰＢＭＣの増殖応答。コントロールペプチド（コントロール）、ＨＰＶ１６のＥ６癌タンパク質またはＥ７癌タンパク質それぞれ由来のペプチド７およびペプチド８の各々に対する増殖応答について、これらの群中の女性由来のＰＢＭＣを試験した。群３（パネルＡおよびＢ）ならびに群４（パネルＣおよびＤ）からの２人の患者各々由来のＳＩ値を示す代表的なデータを示す。
【図３】選択されたＥ６ペプチドおよびＥ７ペプチドでの刺激に応答した群３中の女性由来のＰＢＭＣによるＴＨ１サイトカインの産生。群３（Ｒｅｃｕｒ（−））および群４（Ｒｅｃｕｒ（＋））中の女性由来のＰＢＭＣを、Ｅ６ペプチドＱ１５ＬおよびＥ７ペプチドＱ１９Ｄの存在下で２日間培養し、そして各場合の上清の流体を、ＥＬＩＳＡによって、種々のＴＨ１サイトカイン（ＩＬ−２、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１２）およびＴＨ２サイトカイン（ＩＬ−４、ＩＬ−１０）の存在について分析した。群３および群４由来の試験された患者の各々について、産生された各々のサイトカインの量を、コントロール培地に対して調整した後に、示した。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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