(57)【要約】本発明の目的は、病理または障害、特に、過剰な脈管形成によって一般に特徴付けられる、脈管形成依存性であるか、または脈管形成媒介性の病理を処置するための薬物の製造における、ＡＧＴまたはその誘導体からなる、少なくとも１つの脈管形成のインヒビターの、使用である。本発明はまた、少なくとも１つの発現ベクターを用いてトランスフェクトされた細胞に関する。ここでこの発現ベクターは、脈管形成媒介性病理の治療における使用のための、ＡＧＴまたはその誘導体の１つをコードする組み換え核酸を受け入れる。本発明はさらに、この細胞における使用のための発現ベクターに関する。
2004526794.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
脈管形成媒介性または脈管形成依存性の病理の処置における使用のための薬物の製造における、ｄｅｓ（ＡｎｇＩ）ＡＧＴ、またはＲＣＬ切断ＡＧＴからなる、アンジオテンシノーゲン、またはその誘導体の少なくとも１つの分子の使用。
【請求項２】
ＡＧＴ誘導体が、ｄｅｓ（ＡｎｇＩ）ＡＧＴである、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
ＡＧＴ誘導体が、ＲＣＬ切断ＡＧＴである、請求項１に記載の使用。
【請求項４】
ＡＧＴが、ヒト組み換えＡＧＴ、およびその酵素的切断を介した誘導体である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の使用。
【請求項５】
前記病理が、以下：例えば、固形腫瘍および転移を含む脈管形成依存性癌、良性腫瘍、例えば、血管腫、関節リウマチ、乾癬、例えば、未熟児網膜症のような虚血性網膜症、増殖性糖尿病網膜症、および加齢性黄斑変性症からなる群において選択される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の使用。
【請求項６】
前記病理が、グリア芽細胞腫、および乏突起細胞腫のような脳の病理である、請求項５に記載の使用。
【請求項７】
発現ベクター内に挿入されたＡＧＴ、またはその誘導体の１つをコードする少なくとも１つの組み換え核酸を含む化合物の使用であって、ここで該発現が、脈管形成媒介性病理、または脈管形成依存性病理を処置するための薬物の製造における抗脈管形成タンパク質の産生を生じる、使用。
【請求項８】
前記ＡＧＴ誘導体が、ｄｅｓ（ＡｎｇＩ）ＡＧＴである、請求項７に記載の使用。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の使用であって、抗脈管形成化合物、抗癌化合物、抗有糸分裂化合物、もしくは血管壁不安定化剤、または細胞外マトリックスの成分を標的する分子からなる群において選択された他の化合物の使用と組み合わせた、使用。
【請求項１０】
抗脈管形成処置が、局所的経路または全身的経路によって行われる、請求項１〜９のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１１】
請求項１０に記載の使用であって、前記投与の形態が、静脈内、筋肉内、クモ膜下、皮内、腹腔内、皮下、胸膜内、子宮内、直腸、膣、局所的、腫瘍内、経皮的、または経粘膜的である、使用。
【請求項１２】
少なくとも１つの発現ベクターを用いてトランスフェクトした細胞の使用であって、ここで該発現ベクターが、脈管形成媒介性病理、または脈管形成依存性病理を処置するための薬物の製造における、脈管形成媒介性病理の治療における使用のための、ＡＧＴまたはその誘導体の１つをコードする組み換え核酸を含む、使用。
【請求項１３】
前記細胞が、グリア細胞、血球、または内皮細胞からなる群において選択される、請求項１２に記載の使用。
【請求項１４】
前記細胞が、腫瘍細胞からなる群において選択される、請求項１２に記載の使用。
【請求項１５】
脈管形成媒介性病理、または脈管形成依存性病理を処置するための薬物の製造における、請求項１３および１４のいずれか１項に記載の細胞における使用のための発現ベクターの使用。
【請求項１６】
前記発現ベクターが、ｄｅｓ（ＡｎｇＩ）ＡＧＴである組み換え核酸を受け入れる、請求項１５に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は該して、過剰な脈管形成によって一般に特徴付けられる、病理または障害、詳細には、増殖性糖尿病網膜症のような虚血性網膜症、および加齢性黄斑変性症、関節炎、癌、乾癬、癌および転移、乾癬、関節炎、十二指腸潰瘍、乳幼児血管腫、脈管形成不全に関連する雌性生殖の障害を処置するための薬物の製造における脈管形成の少なくとも１つのインヒビターの使用に関する。
【０００２】
より詳細には、本発明は、非阻害性セルピン（ｓｅｒｐｉｎ）のサブファミリーに属する分子の使用に関連する。
【背景技術】
【０００３】
セルピン（ｓｅｒｐｉｎ）は、脈管形成において予期されない機能を有すると考えられる。一般に脈管形成とは、既存の血管からの新しい血管の増殖をいう。２つの抗脈管形成セルピンの特性は、培養物中で内皮細胞増殖をブロックするセルピンの能力によって同定された。実際には、本発明において引用された先行技術文献１８、２６は、抗凝固活性について周知のタンパク質である、抗トロンビンＩＩＩ（ＡＴＩＩＩ）の反応性中心ループ（ＲＣＬ）切断型が、抗脈管形成特性を有することを教示する。
【０００４】
さらに、他のセルピンの１つであるＰＥＤＦ（向神経性活性を有するタンパク質である）が、脈管形成の強力なインヒビターであることが、本明細書で引用された７の文献から公知である。ＰＥＤＦの抗脈管形成活性は、網膜芽細胞腫馴化培養培地中に存在する推定の抗脈管形成因子の系統的な検索から発見されたが、この活性は、血管が角膜および硝子体に進入することを防ぎ得る。ＰＥＤＦは、酸素濃度によって制御され、そして発生の間、眼における脈管形成を生理的に調節すると考えられる。まとめると、これらの結果によって、ＰＥＤＦが、治療に役立ち得、特に、病理的な新血管新生が視覚を損ない、かつ盲目をもたらす網膜症において、役立ち得ることが示唆される。
【０００５】
さらに、公開された文献である、引用文献３９は、マスピン（ｍａｓｐｉｎ）と名付けられた、精製されたセルピンが、インビボで新血管新生を効率的に阻害したことを教示する。さらに、マスピンは、抗腫瘍活性を保有し、これも、脈管形成を阻害することによって作用し得る。
【０００６】
まとめると、これらの研究によって、脈管形成の間の内皮細胞の増殖、および／または移動（遊走）のセルピンによる阻害について、共通の機構が示唆される。この機構は明らかに、阻害性のセルピン機能には関係していない。なぜなら、ＰＥＤＦおよびマスピンは、非阻害性のセルピンであり、ＲＣＬ切断ＡＴＩＩＩは、特定の標的に結合する能力を失っているからである。ＡＴＩＩＩの切断型の三次構造は、なかでも決定される最初のセルピン構造であった。そしてマスピンについてはセルピン折り畳みが予想された。従って、セルピンの抗脈管形成性の効果は、セルピンの活性ではなく、セルピンに対して共通の構造的特徴に関係し得る。
【０００７】
セルピンサブファミリーのなかでも、アンジオテンシノーゲン（ＡＧＴ）は、アンジオテンシンＩ（ＡｎｇＩ）の前駆体であり、この前駆体は、レニン−アンジオテンシン系（ＲＡＳ）の主なエフェクターである、アンジオテンシンＩＩ（ＡｎｇＩＩ）に変換される不活性なデカププチドである。
【０００８】
本発明者らによれば、ＡＧＴのこれまでに公知の唯一の役割は、高度に特異的なアスパルチルプロテアーゼ、レニンの基質であることである。レニンは、ＡＧＴのＮ末端を切断して、ＡｎｇＩを生成し、ｄｅｓ（ＡｎｇＩ）アンジオテンシノーゲン（ｄｅｓ（ＡｎｇＩ）ＡＧＴ）と呼ばれる、インタクトなかなり大きいフラグメント（全アミノ酸配列の９７．８％）を残すが、このフラグメントは、現在までなんら公知の機能を有さない。
【０００９】
ＡＧＴの生化学、酵素学、および構造的な特徴付けは、徹底的に検討された。なぜなら、ＡＧＴは、ＲＡＳカスケードの最初の反応における律速段階であるからである：その血漿濃度（１μＭ）は、レニンについてのその親和性（Ｋｍ）に近い。肝臓が、ＡＧＴ合成の主な部位であるが、産生の他の部位（例えば、グリア細胞、脂肪細胞、腎臓、および大動脈のような太い血管の血管壁）がかなり文書化されている。血漿ＡＧＴ濃度は、ホルモン性因子（エストロゲン、糖質コルチコイド、甲状腺ホルモン、アンジオテンシンＩＩ）、およびアンジオテンシン変換酵素の阻害の処置によって調節される。血漿ＡＧＴ濃度はまた、ＡＧＴ遺伝子型に依存する。位置２３５におけるＡＧＴ遺伝子改変体（２３５Ｔ）は、血漿ＡＧＴ濃度の１０〜２０％の増大、および高い血圧に関連している。
【００１０】
国際出願番号ＷＯ００／７１７５１は、糖尿病を予防または処置するための方法を示唆する。この方法は、野生型ＡＧＴフラグメントまたは変異体ＡＧＴを、アゴナイズまたはアンタゴナイズする化合物を被験体に投与する工程を包含する。国際出願番号ＷＯ９７／２８．６８４は、抗高血圧薬物をスクリーニングするためのラットの動物モデルの作成において、ラットにおいて機能的なプロモーターに結合したヒトアンジオテンシノーゲンをコードするＤＮＡを示している。
【００１１】
Ｄｅｓ（ＡｎｇＩ）ＡＧＴ（任意の目立った役割が欠けている）は、分解産物であると考えられ、従って広範には研究されなかった。ｄｅｓ（ＡｎｇＩ）ＡＧＴは、レニンＡＧＴ反応を阻害し得ることが示唆されているが、本発明者らは、純粋なレニンおよび純粋なｄｅｓ（ＡｎｇＩ）ＡＧＴを用いることによって、この観察を確認することはできなかった（Ｃｏｒｖｏｌら、未公開データ）。ＡＧＴは、セリンプロテアーゼインヒビター（ｓｅｒｐｉｎ（セルピン））ファミリーのタンパク質と、アミノ酸配列、および構造的相同性を共有するが、オボアルブミン、色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ）、およびマスピンと同様に、インヒビター活性は有さない。
【００１２】
ヒトＡＧＴは、Ｓｔｒｅａｔｆｅｉｌｄ−Ｊａｍｅｓ（１９９８）、および本発明者らによって、セルピンとしてモデル化されている。このＮ末端部分（デカペプチドアンジオテンシンＩを保有する）は、本発明のモデルから除外される。この分子の残り（アミノ酸配列全体の９７．８％を表す）は、ｄｅｓ（ＡｎｇＩ）ＡＧＴと名付けられる。ＡＧＴ、およびｄｅｓ（ＡｎｇＩ）ＡＧＴは、非阻害性セルピンのクラスに属しており、かつセルピン折り畳み構造を有すると予想されている。しかし、それにもかかわらず、ＡＧＴまたはｄｅｓ（ＡｎｇＩ）ＡＧＴ一次配列の８５％によって、セルピンのような折り畳みが予測される。
【００１３】
ＡＧＴは、実際は、抗トロンビンＩＩＩのような阻害性セルピンの古典的な緊張−弛緩経路を通過できない。さらに、ＡＧＴは、その反応性中心の切断ＡＧＴ型（本明細書において、以降は「ＲＣＬ切断ＡＧＴ（ＲＣＬ−ｃｌｅａｖｅｄ  ＡＧＴ）」と略される）において、ブドウ球菌（ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）Ｖ８プロテイナーゼによって切断され得る。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
上記に記載された先行技術の観点から、本発明者らに従って、以下のような、特に解決されるべき問題が残っている：
１．二次的な作用もしくは副作用を伴わないか、またはあまり伴わずに、上述の病理を処置する。
２．本発明者らの最高の知識では、ヒトの治療分野において、現在利用可能な分子または治療ストラテジーがない。
−さらに、脈管形成依存性疾患／脈管形成媒介性疾患について現在提唱される処置は、副作用が避けられない。
−２つ以上の抗脈管形成経路が存在するので、新しいインヒビター、または２つ以上のタイプのインヒビターの併用が、より効果的であり得る可能性がある。従って、より適切な処置を見出すために、脈管形成の新しいインヒビターを開発する必要がある。
【００１５】
従って、本発明者らによれば、脈管形成依存性疾患／脈管形成媒介性疾患の処置において効率を改善し、かつ毒性を減少する必要性がなお存在する。
【００１６】
本発明の目的の１つはまさに、このような必要性を満足させることである。
【００１７】
この必要性は、脈管形成媒介性病理または脈管形成依存性病理の処置における使用のための薬物の製造における、アンジオテンシノーゲンまたはその誘導体（とりわけ、ｄｅｓ（ＡｎｇＩ）ＡＧＴ、またはＲＣＬ切断ＡＧＴからなる）の少なくとも１つの分子の使用によって満足される。
【００１８】
従って、本発明の目的は、病理または障害、特に、過剰な脈管形成によって一般に特徴付けられる、脈管形成依存性病理、または脈管形成媒介性病理を処置するための薬物の製造における、ＡＧＴまたはその誘導体からなる、少なくとも１つの脈管形成のインヒビターの、使用である。
【００１９】
本発明者らによれば、本発明の使用の利点は、特に、現在の処置に比べて、副作用が少ないか、または全く伴わない、脈管形成媒介性疾患の、より適切な処置を提供することである。ｄｅｓ（ＡｎｇＩ）ＡＧＴの使用によって、例えば、あらゆる他の公知の生理学的効果または薬理学的効果を欠いた脈管形成化合物を送達することが、可能になる。この提案されている治療剤からは副作用がないことが期待できる。
【００２０】
（本発明の他の目的のまとめ）
本発明はまた、脈管形成媒介性病理または脈管形成依存性病理の治療における使用のための薬物の製造における、少なくとも１つの発現ベクターを用いてトランスフェクトした細胞の使用に関する。ここでこの発現ベクターは、ＡＧＴまたはその誘導体の１つをコードする組み換え核酸を受け入れる。
【００２１】
本発明はさらに、発現ベクターであって、この細胞における使用のための、または脈管形成媒介性病理もしくは脈管形成依存性病理を処置するための薬物の製造のための発現ベクターの、使用に関する。
【００２２】
本発明はさらに、脈管形成媒介性疾患または脈管形成依存性疾患について処置される必要のある個体を処置する方法に関する。
【００２３】
本発明の別の目的は、ＡＧＴまたはその誘導体分子（ｄｅｓ（ＡｎｇＩ）ＡＧＴ、およびＲＣＬ切断ＡＧＴ）を含む）を用いて、過剰な脈管形成によって特徴付けられる病理または障害を処置する方法である。
【００２４】
（発明の詳細な説明）
本発明の開示において、以下の略号を用いる：ＡＧＴ、アンジオテンシノーゲン；ｄｅｓ（ＡｎｇＩ）ＡＧＴ、ｄｅｓ（ＡｎｇＩ）アンジオテンシノーゲン；ＡＴＩＩＩ、アンチトロンビンＩＩＩ；ＰＥＤＦ、色素上皮由来因子；ｐＶ８ＡＧＴ、プロテアーゼＶ８切断ＡＧＴ；ＲＣＬ、反応性中心ループ（ｒｅａｃｔｉｖｅ  ｃｅｎｔｅｒ  ｌｏｏｐ）；ＨＵＶＥＣ、ヒト臍静脈内皮細胞；ＨＭＶＥＣ−Ｌ、肺由来のヒト微小血管内皮細胞；ＡｏＳＭＣ、大動脈平滑筋細胞；ＶＥＧＦ、血管内皮増殖因子；ｂＦＧＦ、塩基性線維芽細胞成長因子。
【００２５】
本発明は、脈管形成媒介性病理、または脈管形成依存性病理の処置における使用のための薬物の製造における、少なくとも１分子のアンジオテンシノーゲンおよびその誘導体（詳細にはｄｅｓ（ＡｎｇＩ）ＡＧＴ、またはＲＣＬ切断ＡＧＴからなる）の使用に関する。
【００２６】
本発明者らの最高の知識によれば、ＡＧＴまたはその誘導体は、上記で言及された病理の処置のための薬物の製造においては、決して用いられていない。
【００２７】
本発明はここで、添付の図面を参照して、以下の実施例によって、さらに詳細に記載される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２８】
（実施例の材料、および方法）
（タンパク質、酵素、および抗体）
Ｃｅｌｅｒｉｅｒによって前に報告されたとおり、ＣＨＯ細胞上清中で、ヒト組み換えＡＧＴを産生させて、均一性に精製した。ヒトＡＴＩＩＩ、およびブタ膵臓エラスターゼ（ＰＰＥ）を、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ（Ｂａｃｈｅｍ、Ｆｒａｎｃｅ）から入手した。Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙら（１９９９）によって前に記載されたように、ＰＰＥを用いて、ＲＣＬ切断ＡＴＩＩＩを調製した。精製したヒト組み換えレニンは、Ｈｉｆｆｍａｎｎ  Ｌａ  Ｒｏｃｈｅ（Ｂａｓｅｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）によって提供され、それをＡＧＴからのｄｅｓ（ＡｎｇＩ）ＡＧＴの生成のために用いた。
【００２９】
用いたアンギオテンシノーゲン抗ペプチド抗体は、以前に記載された、ＡｎｇＩ抗体（Ｎ−１３４５）、およびＣ末端抗体（Ｃ−１３５０）であった。合成ペプチドＮＨ２−Ｖａｌ１１−Ｉｌｅ−Ｈｉｓ−Ａｓｎ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ１８−ＣＯＯＨを用いて、レニン産物の最初の８アミノ酸残基に対して、特定のｄｅｓ（ＡｎｇＩ）アンジオテンシノーゲン抗体（Ｄ−８５４）を、特異的に惹起させた。同じウサギ由来の事前免疫血清、およびその血清が１μｇまでのＡＧＴを認識することができないことによって、ｄｅｓ（ＡｎｇＩ）ＡＧＴに対する反応の特異性を評価した。
【００３０】
（ｄｅｓ（ＡｎｇＩ）ＡＧＴ、およびプロテアーゼＶ８切断したＡＧＴ（ＲＣＬ切断ＡＧＴ）の調製）
精製した組み換えＡＧＴを、１００ｍＭのクエン酸塩／Ｎａ２ＨＰＯ４緩衝液（ｐＨ５．７）に含有される１．２５ｎＭの精製した組み換えヒトレニンを用いて広く加水分解した。このレニン反応を１μＭのペプスタチンの添加によって終了させて、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ（緩衝液Ａ）を含有する２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）緩衝液に対する大規模な透析によって、ＡｎｇＩを除去した。ＡＧＴから全てのＡｎｇＩが加水分解され、次いでｄｅｓ（ＡｎｇＩ）ＡＧＴ調製物から除去されたことを確認した。得られたｄｅｓ（ＡｎｇＩ）ＡＧＴの調製物は、同族のレニンによる広範な切断後、ＡｎｇＩを測定したところ、ＡｎｇＩを生成できなかった。しかし、以前に記載されたヒトＡＧＴポリクローナル抗体（同様にｄｅｓ（ＡｎｇＩ）ＡＧＴおよびＡＧＴを認識する）によって認識された。このレニン産物が、ＡｎｇＩ部分を失っていることをさらに実証するため、１セットの抗ペプチド抗体を用いた。図１に示されるとおり、ＡＧＴはＡｎｇＩエピトープ（Ｎ−１３４５）、および成熟タンパク質のインタクトなＣ末端配列（Ｃ−１３５０）を保有するが、ｄｅｓ（ＡｎｇＩ）ＡＧＴは、ＡｎｇＩ部分を失い、かつ、いまや４４２アミノ酸であるｄｅｓ（ＡｎｇＩ）ＡＧＴに特異的な新しいエピトープを獲得した。
【００３１】
ＡＧＴに対して結合したままである４０アミノ酸のペプチドを切断するプロテイナーゼによって、プロテイナーゼＶ８切断したＡＧＴ（ＲＣＬ切断ＡＧＴ）を生成した。
【００３２】
（鶏胚絨毛尿膜（ＣＡＭ）アッセイ）
発生の３日目に、Ｃｒｕｚら（２０００）に記載のように、受精したニワトリ胚を、殻から取り出して、プラスチックのペトリ皿にいれた。インキュベーションの７日目に、シリコンリング（内径：１０ｍｍ）を、ニワトリＣＡＭの進行する端に置いて、溶液中のタンパク質を、このリング内に入れた。全てのタンパク質サンプルを、ＣＡＭへの適用の前に、０．２２μｍのフィルターメンブレン（Ｐｒｏｓｐｉｎ  Ｘ）を通して濾過して、緩衝液Ａ中でとりあえず一時的に希釈した。少なくとも４０の胚において、この緩衝液単独で誘発される脈管形成の阻害も胚の致死性もないことが確認された。各々のタンパク質を、２０μｌの緩衝液に溶解して、このリングの内側に加えた。０日目の適用の直前、および処置後２日目に、写真を撮った。処置したゾーンの１／３を示すエリア上で、以前に記載された方法に従って、無作為に選択されたゾーンにおいて、一次および二次の血管の求心性の定量を行った。血管新生の全ての観察および評価を、厳格な二重盲検様式で行った。ノンパラメトリックｔ検定（ＳｔａｔＶｉｅｗソフトウェア）を用いて、データを統計的に処理した。同じアッセイにおいて、Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙらによって記載されたとおり、切断されたＡＴＩＩＩは、顕著な抗脈管形成効果を示したが、インタクトなＡＴＩＩＩではそのような効果を示さなかった。
【００３３】
（内皮細胞増殖）
ヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）、および肺由来のヒト微小血管内皮細胞（ＨＭＶＥＣ−Ｌ）を、Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）から得て、製造業者によって推奨されたとおり、ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）、１μｇ／ｍｌヒドロコルチゾン−２１−酢酸、ＶＥＧＦ、ＩＧＦ、ｂＦＧＦ、およびＥＧＦを補充したＥＢＭ−２（Ｃｌｏｎｔｅｉｃｓ）中で培養した。３〜７継代しか細胞を用いなかった。増殖実験のために、コラーゲンでコーティングしたウェル（２４ウェル組織培養プレート（Ｃｏｓｔａｒ））に、５，０００個（ＨＵＶＥＣ）、または１０，０００個（ＨＭＶＥＣ−Ｌ）の細胞を播種した。２４時間後、０．２％  ＦＣＳ（ｖ／ｖ）を含有するＥＢＭ−２倍地中で３０時間、内皮細胞を枯渇させた。増殖因子［ＶＥＧＦ１６５（３ｎｇ／ｍｌ）、またはｂＦＧＦ（２．５ｎｇ／ｍｌ）］、およびＡＧＴ、またはｄｅｓ（ＡｎｇＩ）ＡＧＴを、同時にこのウェルに添加した。この細胞を、３Ｈチミジン（０．５μＣｉ／ウェル）（Ａｍｅｒｓｈａｍ）とともに２４時間インキュベートさせた。個々のウェルを、氷冷ＰＢＳを用いて２回洗浄し、その後トリクロロ酢酸（１０％）を１時間４℃で添加し、５％トリフルオロ酢酸を用いて２回洗浄した。残りの材料を、５００μｌの２００ｍＭ  ＮａＯＨを用いて可溶化して、取り込まれた放射能を、液体シンチレーションカウントによって測定した。
【００３４】
（内皮細胞移動）
８．０μｍの細孔サイズのフィルターを有する上部チャンバを供える、改変Ｂｏｙｄｅｎチャンバ（Ｃｏｓｔａｒ）中で、内皮細胞移動（遊走）アッセイを実施した。下部チャンバをラットの尾のコラーゲン（０．２μｇ／ｍｌ）を用いてコーティングした。１ウェルあたり（２００μｌの移動培地（ＥＢＭ−２／０、１％  ＢＳＡ）中に）５０，０００個の細胞密度で、上部チャンバにＨＵＶＥＣを播種した。下部チャンバ中で、３０ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦ（６００μｌ）を含有する移動緩衝液の添加によって、移動を誘導させた。ＶＥＧＦと同じ時点で、移動培地に対して、示した用量で、ＡＧＴ、およびｄｅｓ（ＡｎｇＩ）ＡＧＴを、添加した。ＨＵＶＥＣの移動を、３７℃で６時間実施させた。フィルターの上側に残った細胞を機械的に取り除いた。このフィルターを３．７％パラホルムアルデヒドを用いて１／２時間固定させた。次いで、この細胞をクリスタルバイオレットまで染色した。次いで、このフィルターをガラススライド上に置いて、１フィルターあたり３つの無作為に選択したエリアで、下部表面に移動した細胞の数をカウントした（倍率×２５）。各々のアッセイを三連で行った。
【００３５】
（毛細血管様の管の形成）
毛細血管様の管の形成のアッセイ（ｃａｐｉｌｌａｒｙ−ｌｉｋｅ  ｔｕｂｅ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ａｓｓａｙ）のために、２４ウェルの組織培養プレート中に、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（マトリゲル）（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を加えた（１ウェルあたり４００μｌ）。Ｍａｔｒｉｇｅｌ（１μＭ  ＡＧＴ、またはｄｅｓ（ＡｎｇＩ）ＡＧＴを含有するか、または含有しない）の重合後、ＡＧＴ、またはｄｅｓ（ＡｎｇＩ）ＡＧＴの有無のもとで、培養培地にＨＵＶＥＣを播種した（１ウェルあたり１０，０００細胞）。３７℃で２４時間後、その培地を吸引して、４％（ｗ／ｖ）ホルムアルデヒドを含有するＰＢＳ中に細胞を固定した。
【００３６】
本発明は、好ましい実施形態および他の利点において記載されている。
【００３７】
好ましくは、本発明による使用において、ＡＧＴの少なくとも１つの誘導体（詳細にはｄｅｓ（ＡｎｇＩ）ＡＧＴについてはレニンを介し、またはＲＣＬ切断ＡＧＴ（反応性中心ループ切断ＡＧＴ）についてはブドウ球菌Ｖ８プロテアーゼを介する、その酵素的誘導体である）を利用する。
【００３８】
より好ましくは、本発明は、ＡＧＴが、ＡＧＴヒト組み換えＡＧＴ、およびその酵素的切断による誘導体である使用、に関する。
【００３９】
好ましくは、本発明の使用は、以下：例えば、固形腫瘍および転移を含む脈管形成依存性癌、良性腫瘍、例えば、血管腫、関節リウマチ、乾癬、例えば、未熟児網膜症のような虚血性網膜症、増殖性糖尿病網膜症、および加齢性黄斑変性症が挙げられるがこれらに限定されない病理からなる群において選択される、病理に関する。それらはまた、グリア芽細胞腫のような顕著な脈管形成を有する疾患の処置において有用である。これらの脳腫瘍は、集中的な新脈管形成によって拡大する。ＡＧＴ、およびその関連化合物は、それらが正常なグリア細胞中で産生されるので、有用であり得る。
【００４０】
より好ましくは、本発明は、病理が、脳の病理のグリア芽細胞腫、および乏突起細胞腫である、本発明による使用に関する。
【００４１】
本発明の別の好ましい実施形態は、発現ベクター内に挿入された、ＡＧＴ、またはその誘導体の１つをコードする組み換え核酸を含む化合物であって、ここでこの発現は、抗脈管形成タンパク質の産生を生じる化合物の使用、である。別の好ましい実施形態において、この使用は、他の抗癌療法（従来の細胞傷害性化学療法、放射線療法、ワクチン、または免疫療法、腫瘍抑制遺伝子の送達）と組み合わせた、本発明による化合物の組み合わせに関連する。
【００４２】
より好ましくは、本発明は、本明細書に記載のような、ｄｅｓ（ＡｎｇＩ）ＡＧＴ、またはＲＣＬ切断ＡＧＴからなる、アンジオテンシノーゲンまたはその誘導体の使用であって、抗脈管形成薬物、抗癌薬物、抗有糸分裂薬物、もしくは血管壁を不安定化する薬剤、または細胞外マトリックスの成分を標的する分子、からなる群において選択される別の化合物の使用と組み合わせた、使用に関する。
【００４３】
好ましくは、本発明による使用において、この処置は、局所経路または全身的経路によって行われる。
【００４４】
より好ましくは、本発明の使用において、投与の形態は、静脈内、筋肉内、クモ膜下、皮内、腹腔内、皮下、胸膜内、子宮内、直腸、膣、局所的、腫瘍内、経皮的、または経粘膜的である。
【００４５】
本発明の別の目的は、少なくとも１つの発現ベクターでトランスフェクトされた細胞であって、ここでこの発現ベクターが、抗脈管形成媒介性病理の治療における使用のためのＡＧＴ、またはその誘導体の１つをコードする組み換え核酸を含む、細胞である。
【００４６】
好ましくは、本発明による細胞は、グリア細胞、内皮細胞、造血幹細胞前駆体（血管芽細胞）、および肝細胞からなる群において選択される。
【００４７】
本発明のさらなる目的は、上記のような細胞における使用のための発現ベクターである。
【００４８】
ＡＧＴ、およびその誘導体は、インビトロで抗脈管形成の効果を有し、これらの特性は、組み換えベクターのインビボにおける細胞標的化によって再現され得る。これらのベクターとしては、標的された細胞における、ＡＧＴまたはその誘導体の、一過性の発現のためにはアデノウイルス、そして安定な発現のためにはレトロウイルスが挙げられる。このようなウイルス構築物の一次標的は、内皮細胞であり、これは本発明者らによって、本明細書で報告された実験から得られ、その主な部位で、ＡＧＴおよびその誘導体が抗脈管形成の効果を発揮する。治療的使用のこのストラテジーは、この技術の継続的な発展の恩恵を受ける。
【００４９】
本発明の別の目的は、ＡＧＴまたはその誘導体分子（ｄｅｓ（ＡｎｇＩ）ＡＧＴ、およびＲＣＬ切断ＡＧＴを含む）を用いて、過剰な脈管形成によって特徴付けられる病理または障害を処置する方法である。
【００５０】
好ましくは、このような方法は、上記のような、本発明による細胞を利用する。
【００５１】
より好ましくは、このような細胞は、完全なまたは部分的なＡＧＴタンパク質をコードするＤＮＡ構築物の一過性のトランスフェクションまたは安定なトランスフェクションによって、エキソビボまたはインビボで投与される。
【００５２】
本発明のなおさらなる目的は、ＡＧＴおよびその誘導体（ｄｅｓ（ＡｎｇＩ）ＡＧＴ、およびＲＣＬ切断ＡＧＴを含む）からなる群より選択された少なくとも１つの抗脈管形成分子をコードするＤＮＡの注入を包含する、方法である。
【００５３】
このような遺伝子治療は、全長抗脈管形成ＡＧＴタンパク質、またはとりわけ、上記のようなその２つの他の誘導体のうちの１つ（これも抗脈管形成活性を示す）をコードするＤＮＡを、病理的な脈管形成依存性領域に対して、インビボで発現および送達するために、本発明に従って使用され得る。
【００５４】
過剰な脈管形成に関連する種々のタイプの病理は、本発明に記載される分子（ＡＧＴまたはその誘導体）の新しい特性のおかげで処置され得る。詳細には、本発明に記載される分子は、相当数の患者に影響する網膜症の処置のために適用され得る。新血管新生の発達は、腫瘍増殖の重要な段階であるので、このような分子は、腫瘍の処置において用いられた古典的な抗癌薬物に加えて、明白な補完的な処置を示し得る。網膜症（未熟児網膜症、増殖性糖尿病網膜症）、加齢性黄斑変性症、乳幼児血管腫、脈管形成不全に関連した雌性生殖の障害、関節炎、乾癬、十二指腸潰瘍などの他の病理についても同じことが言える。
【００５５】
本発明の他の実施形態は、以下に対してより特別に関連する：
−脈管形成によって媒介される疾患および過程を処置する方法であって、ＡＧＴ、およびその誘導体であるｄｅｓ（ＡｎｇＩ）ＡＧＴ、およびＲＣＬ切断ＡＧＴを含む、方法。本発明のタンパク質を阻害する脈管形成は、脈管形成の過剰な刺激または異常な刺激によって特徴付けられる疾患の処置において有用である。これらの病理としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：例えば、固形腫瘍および転移を含む脈管形成依存性癌、良性腫瘍、例えば、血管腫、関節リウマチ、乾癬、例えば、未熟児網膜症のような虚血性網膜症、増殖性糖尿病網膜症、および加齢性黄斑変性症。
−ＡＧＴ、およびその誘導体であるｄｅｓ（ＡｎｇＩ）ＡＧＴ、およびＲＣＬ切断ＡＧＴを用いて脈管形成を阻害する方法であって、組み換え発現系においてこれらの分子を組み換え的に産生する工程、およびこの組み換え的に産生されたタンパク質を単離する工程を包含するプロセスによる、方法。
−ＡＧＴ、およびその誘導体であるｄｅｓ（ＡｎｇＩ）ＡＧＴ、およびＲＣＬ切断ＡＧＴを用いて脈管形成を阻害する方法であって、ここで投与の経路が、静脈内、筋肉内、クモ膜下、皮内、腹腔内、皮下、胸膜内、子宮内、直腸、膣、局所的、腫瘍内、経皮的、または経粘膜的である、方法。
−ＤＮＡの注入を包含する遺伝子治療のストラテジーを用いて、本発明の抗脈管形成性タンパク質（ＡＧＴ、およびその誘導体であるｄｅｓ（ＡｎｇＩ）ＡＧＴ、またはＲＣＬ切断ＡＧＴ）を送達する、方法。
−ＡＧＴ、ｄｅｓ（ＡｎｇＩ）ＡＧＴ、およびＲＣＬ切断ＡＧＴに特異的な検出手段の使用による、抗脈管形成性タンパク質の検出または測定のための、診断方法およびキット。
−このような方法またはキットは以下を含む：ＡＧＴまたはその誘導体の分子に対する抗体の使用；ペプチドであって、その配列がＡＧＴの配列由来であるペプチドの使用；化学的に改変されたペプチドの使用；ＡＧＴまたはその誘導体の抗脈管形成性特性の測定、刺激、または阻害のために設計されているこれらの化合物全て。
【実施例１】
【００５６】
（全長（ネイティブ）ＡＧＴ、およびｄｅｓ（ＡｎｇＩ）ＡＧＴ、およびＲＣＬ切断ＡＧＴは、ＣＡＭにおいて抗脈管形成性である）
インキュベーションの７日目に、集中的な脈管形成の時点で、ヒトＡＧＴ、およびその切断された誘導体を、ＣＡＭの上に加えた。３つの分子は、自発的な脈管形成を阻害し得た（図２Ｂ〜２Ｄ）。この効果を定量するために、一次および二次の微小血管を、このリング（直径：１ｃｍ）の内部表面の約１／３を示すゾーン中で盲検的にカウントした。ＡＧＴ、ｄｅｓ（ＡｎｇＩ）ＡＧＴ、およびＲＣＬ切断ＡＧＴの抗脈管形成性効果は、一次および二次の血管の減少に起因したが、より太い血管は影響されなかった。ＡＧＴ、またはｄｅｓ（ＡｎｇＩ）の両方とも、１μｇを用いた処置で、血管密度のわずかだが有意な阻害をもたらした（図３）。１０μｇを用いた処置では、研究した３つの分子について、自発的な脈管形成のより顕著な阻害をもたらした。ＡＧＴ、およびｄｅｓ（ＡｎｇＩ）ＡＧＴで処置したＣＡＭにおける、一次および二次の血管の密度は、同じ胚の非処置ゾーンの５０％未満に低下した（ｐ＜０．０１）。ＲＣＬ切断ＡＧＴは、１０μｇで、６５％の低下を示した。このアッセイにおけるＡＧＴ、およびｄｅｓ（ＡｎｇＩ）ＡＧＴの抗脈管形成の効果に有意な差異はなかった。
本発明者らによれば、ＣＡＭアッセイにおいて、ＡＧＴ、ｄｅｓ（ＡｎｇＩ）ＡＧＴ、およびＲＣＬ切断ＡＧＴのような分子の抗脈管形成の効果が開示されるのは、これが初めてである。
【実施例２】
【００５７】
（内皮細胞におけるＡＧＴ、およびｄｅｓ（ＡｎｇＩ）ＡＧＴの抗増殖性効果）
ＡＧＴ、ｄｅｓ（ＡｎｇＩ）ＡＧＴ、およびＲＣＬ切断ＡＧＴは、ＶＥＧＦによって誘導された内皮細胞（ＨＵＶＥＣ、およびＨＭＶＥＣ  ３−Ｌ）の増殖を、用量依存性の様式で阻害する（図４、ＡおよびＣ）。両方の分子が同様の効果を示し、これは、約１００〜２００ｎＭで最大半分阻害（ＥＣ５０％）であった。内皮細胞をＦＧＦ−２を用いて事前処置した場合、同様の結果（約１００ｎＭのＥＣ５０％を伴う）が得られた（図４、ＢおよびＤ）。非内皮細胞（ＡｏＳＭＣ、またはヒトケラチノサイト）は、１０倍高い濃度のインヒビターを用いてさえ、ＡＧＴ、およびｄｅｓ（ＡｎｇＩ）ＡＧＴの阻害性効果に反応性ではなかった（データ示さず）。
【００５８】
本発明者らによれば、内皮細胞において、ＡＧＴ、ｄｅｓ（ＡｎｇＩ）ＡＧＴ、およびＲＣＬ切断ＡＧＴのような分子の抗増殖性効果が開示されるのは、これが初めてである。
【実施例３】
【００５９】
ＡＧＴ、およびその誘導体が、内皮細胞の増殖に対してだけでなく、これらの細胞の別の本質的な特性（移動）に対しても強力な効果を発揮することが、本発明者らによって示された。
【００６０】
ＡＧＴ、またはその誘導体であるＤｅｓ（ＡｎｇＩ）ＡＧＴの漸増する濃度によって、細胞培養皿中の２つの区画を隔てるフィルター（細孔サイズ２０μｍ）を通じたＨＵＶＥＣの移動は阻害される。１つの区画（もともとの区画）に播種された細胞は、ＦＧＦ−２またはＶＥＧＦ（図５を参照のこと）によって他の区画（標的）に誘引される。そしてこの走化性の効果は、ＡＧＴおよびその誘導体によってアンタゴナイズされる。この阻害は、ＡＧＴの非存在下において（０％の阻害）標的区画に見出されたＨＵＶＥＣの数と比較した、ＡＧＴの存在において（ｎ％の阻害）標的区画に見出されたＨＵＶＥＣの数との間の比によって測定される。
【００６１】
内皮細胞のこの遊走性の挙動は、脈管形成に必須であり、そしてこの移動をブロックする能力は、ＡＧＴおよびその誘導体を用いる抗脈管形成ストラテジーの一部である。
【実施例４】
【００６２】
（ＡＧＴ、およびｄｅｓ（ＡｎｇＩ）ＡＧＴによる、マトリゲル（Ｍａｔｒｉｇｅｌ）上での毛細管様構造の阻害）
マトリゲル（Ｍａｔｒｉｇｅｌ）中で毛細管様構造を形成する能力は、内皮細胞の別の特異的な特性であり、かつ脈管形成の別の重要な工程である。マトリゲル上に播種されたＨＵＶＥＣは、迅速に構造を形成する（６時間以内、図６Ａ）。毛細管様の網目状構造は、多くの細胞内接触を伴って拡張する。マトリゲル内のＡＧＴ、またはｄｅｓ（ＡｎｇＩ）ＡＧＴの添加（１００ｎＭおよび１μＭ）は、用量依存性の様式で、毛細管様構造の長さ、およびそれらの接合の数の明白な減少を生じた（図６、Ｂ〜Ｅ）。
【００６３】
本発明者らによれば、マトリゲル上でＡＧＴ、およびｄｅｓ（ＡｎｇＩ）ＡＧＴのような分子の毛細管様構造の阻害が開示されたのは、これが最初である。
【００６４】
本発明者らは、３つのＡＧＴの種類である：ＡＧＴ，ｄｅｓ（ＡｎｇＩ）ＡＧＴ、およびＲＣＬ切断ＡＧＴの新しい特性を、本明細書において実証した。脈管形成、および内皮細胞増殖、および移動（遊走）の十分に確立されたモデルにおいて、全てが同様の効果を示した。さらに、それらによって、ＡＧＴ、およびその誘導体の抗脈管形成活性は、そのセルピン阻害性活性とは独立していることが実証された。実際、ＡｎｇＩの放出もＲＣＬの切断もＡＧＴの抗脈管形成の特性には影響しなかった。
【００６５】
このような特性が、過剰な脈管形成によって特徴付けられる病理の処置における使用のための新しい薬物の製造を可能にする。
【図面の簡単な説明】
【００６６】
【図１】ＡＧＴ、およびその切断された誘導体の模式図を示す。Ａ．ＡＧＴ、４５２アミノ酸（ａａ）を含む。Ｂ．ＡＧＴは、レニンによって切断されて、デカペプチドのアンジオテンシンＩ、および４４２アミノ酸のｄｅｓ（ＡｎｇＩ）ＡＧＴを生じる。Ｃ．プロテアーゼＶ８は、ＡＧＴに結合したままである、４０アミノ酸のペプチドを切断する。
【図２】ＣＡＭアッセイにおいて、全長（ネイティブ）ＡＧＴ、およびその切断型であるｄｅｓ（ＡｎｇＩ）ＡＧＴ、およびＲＣＬ切断ＡＧＴの抗脈管形成効果を例示する。  Ａ．ヒヨコの発生の９日目のＣＡＭの正常な血管新生。  Ｂ．ＡＧＴが、ＣＡＭの新しい小血管の連続的な形成を阻害した（アスタリスク）。既存の中程度のサイズの血管、および大きいサイズの血管は影響されていないことに注意のこと（矢印）。同様の抗脈管形成効果が、ｄｅｓ（Ａｎｇ１）ＡＧＴ（Ｃ），およびＰＶ８−ＡＧＴ（Ｄ）で観察された。バー：２．５ｍｍ。
【図３】ＡＧＴ、およびその誘導体ｄｅｓ（ＡｎｇＩ）ＡＧＴ、およびＲＣＬ切断ＡＧＴによって誘導された血管の密度の阻害を示す。  同じＣＡＭの処置面積と、非処置面積（０％阻害）との間での比較によって、阻害のパーセンテージを評価した。★ｐ≦０．０５、★★ｐ＜０．０１。
【図４】ＡＧＴ、およびその誘導体ｄｅｓ（ＡｎｇＩ）ＡＧＴ、およびＲＣＬ切断ＡＧＴによって誘導された内皮細胞増殖の阻害を示す。  種々の濃度のＡＧＴ（■）、ｄｅｓ（ＡｎｇＩ）ＡＧＴ（●）、およびＲＣＬ切断ＡＧＴ（◇）を、ＶＥＧＦ（Ａ）またはＦＧＦ（Ｂ）で処置したＨＵＶＥＣ、およびＶＥＧＦ（Ｃ），またはＦＧＦ（Ｄ）で処置したＨＭＶＥＣ−Ｌとともにインキュベートした。インヒビターの非存在下におけるコントロール（０％の阻害）に対して比較することによって、組み込みのパーセンテージとして結果を表す。エラーバー（誤差棒）は、三連の平均±Ｓ．Ｄ．を示す。
【図５】ＡＧＴ、およびその誘導体ｄｅｓ（ＡｎｇＩ）ＡＧＴによるＨＵＶＥＣ移動（遊走）の阻害を例示する。  コントロール群に対する比較による統計学的有意差（０％阻害）。全ての群において、ｎ＝３。★ｐ≦０．０５、★★ｐ＜０．０１。
【図６】ＡＧＴ、および／またはｄｅｓ（ＡｎｇＩ）ＡＧＴによって誘導されたマトリゲル（Ｍａｔｒｉｇｅｌ）上でのインビトロの毛細管形成の阻害を例示する。  Ａ．コントロール：ＦＣＳおよび増殖因子（材料、および方法）を補充された完全ＣＢＭ−２におけるＨＵＶＥＣであって、これは毛細管網目構造を示す。ＡＧＴ（ＢおよびＣ）、および／またはＤＥＳ（Ａｎｇ１）ＡＧＴ（ＤおよびＥ）であって、これは用量依存性の様式で（１００ｎＭおよび１μＭ）、毛細管形成の阻害を示す。写真は、培養培地へのＡＧＴの添加後、２４時間で撮った。倍率×３０。
【００６７】
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【図１】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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