(57)【要約】免疫グロブリンの折畳みを含み、骨格として使用できるタンパク質が開示される。本明細書には、このようなタンパク質をコードする核酸、ならびに診断方法におけるこのようなタンパク質の使用法、および化合物に結合する新規の分子種およびそれらのリガンドを展開する方法におけるこのようなタンパク質の使用法も開示されている。【特許請求の範囲】
【請求項１】
免疫グロブリン様の折畳みをもつドメインを含む非抗体誘導体タンパク質であって、変異したアミノ酸配列を持つことにより基準タンパク質から誘導され、該基準タンパク質がそれほど強く結合しない化合物に対して少なくとも１０ｎＭの強さのＫｄで結合する、非抗体誘導体タンパク質。
【請求項２】
少なくとも１ ｎＭの強さ、少なくとも５００ ｐＭの強さ、少なくとも１００ ｐＭの強さ、または少なくとも２０ ｐＭの強さのＫｄで結合する、請求項１記載の誘導体タンパク質。
【請求項３】
１、２、または３個の変異したループを含み、該ループの少なくとも１個が化合物に対する誘導体タンパク質の結合に寄与する、請求項１記載の誘導体タンパク質。
【請求項４】
変異ループのうちの少なくとも２つ、または３つの変異ループが化合物に対する誘導体タンパク質の結合に寄与する、請求項３記載の誘導体タンパク質。
【請求項５】
基準タンパク質がジスルフィド結合を持たない、請求項１記載の誘導体タンパク質。
【請求項６】
誘導体タンパク質が少なくとも１つのジスルフィド結合を持つ、請求項１記載の誘導体タンパク質。
【請求項７】
免疫グロブリン様折畳みを持つドメインが、１０ ｋＤ未満、７．５ ｋＤを越える、または７．５〜１０ ｋＤの間の分子量を持つ、請求項１記載の誘導体タンパク質。
【請求項８】
生理的条件下でモノマーまたはダイマーである、請求項１記載の誘導体タンパク質。
【請求項９】
基準タンパク質が天然に存在する哺乳類タンパク質である、請求項１記載の誘導体タンパク質。
【請求項１０】
免疫グロブリン様折畳みを持つドメインが、変異しており、基準タンパク質の免疫グロブリン様折畳みと比較して、３４％までの変異アミノ酸を含む、請求項１記載の誘導体タンパク質。
【請求項１１】
免疫グロブリン様折畳みを持つドメインが、約５０〜１５０アミノ酸、好ましくは約５０アミノ酸からなる、請求項１記載の誘導体タンパク質。
【請求項１２】
固相支持体上に固定された、請求項１記載の誘導体タンパク質。
【請求項１３】
固相支持体上に固定されたアレイの一部である、請求項１２記載の誘導体タンパク質。
【請求項１４】
固相支持体がチップまたはビーズである、請求項１２記載の誘導体タンパク質。
【請求項１５】
該化合物に結合できない異種タンパク質に結合した、請求項１記載の誘導体タンパク質。
【請求項１６】
異種タンパク質が抗体または抗体ドメインであり、免疫グロブリンＦｃドメインを含むまたは補体タンパク質、毒素タンパク質、およびアルブミンタンパク質からなる群より選択される、請求項１５記載の誘導体タンパク質。
【請求項１７】
核酸に共有結合している、請求項１記載の誘導体タンパク質。
【請求項１８】
核酸がそのタンパク質をコードしている、請求項１記載の誘導体タンパク質。
【請求項１９】
フィブロネクチンまたはフィブロネクチン二量体、テナシン、Ｎ−カドヘリン、Ｅ−カドヘリン、ＩＣＡＭ、タイチン、ＧＣＳＦ受容体、サイトカイン受容体、グリコシダーゼ阻害剤、抗生物質色素蛋白質、ミエリン膜接着分子ＰＯ、ＣＤ８、ＣＤ４、ＣＤ２、クラスＩ ＭＨＣ、Ｔ細胞抗原受容体、ＶＣＡＭ−１のＣＤ１、Ｃ２およびＩ−ｓｅｔドメイン、ミオシン結合タンパク質ＣのＩ−ｓｅｔ免疫グロブリンドメイン、ミオシン結合タンパク質ＨのＩ−ｓｅｔ免疫グロブリンドメイン、テロキンのＩ−ｓｅｔ免疫グロブリンドメイン、ＮＣＡＭ、トウィチン、ニューログリアン、成長ホルモン受容体、エリスロポエチン受容体、プロラクチン受容体、インターフェロンγ受容体、βガラクトシダーゼ／グルクロニダーゼ、βグルクロニダーゼ、トランスグルタミナーゼ、Ｔ細胞抗原受容体、スーパーオキシド・ジスムターゼ、組織因子ドメイン、シトクロームＦ，緑色蛍光タンパク質、ＧｒｏＥＬ、またはタウマチンから誘導される、請求項１記載の誘導体タンパク質。
【請求項２０】
請求項１記載の誘導体タンパク質をコードする核酸。
【請求項２１】
以下の段階を含む、化合物に結合する誘導非抗体タンパク質を得る方法：
（ａ） 免疫グロブリン様の折畳みを含む非抗体骨格タンパク質を提供する段階であって、該骨格タンパク質が１０ ｎＭの強さのＫｄで化合物に結合しない段階；
（ｂ） 該非抗体骨格タンパク質の変異した誘導体を作製し、それによって変異タンパク質のライブラリーを構築する段階；
（ｃ） 該化合物を該ライブラリーに接触させる段階；
（ｄ） 少なくとも１０ ｎＭの強さのＫｄで該化合物に結合する少なくとも１つの誘導体タンパク質を該ライブラリーから選択する段階；および
（ｄ） 選択的に、段階（ｂ）の非抗体骨格タンパク質をその前の段階（ｄ）の産物で置き換えて段階（ｂ）〜（ｄ）を繰り返す段階。
【請求項２２】
以下の段階を含む、化合物に結合する非抗体タンパク質を得る方法：
（ａ） 候補タンパク質を該化合物に接触させる段階であって、該候補タンパク質は免疫グロブリン様の折畳みを持つドメインを含む誘導非抗体タンパク質であって、該非抗体タンパク質は変異したアミノ酸配列を持つことにより基準タンパク質から誘導され、該非抗体タンパク質は該基準タンパク質がそれほど強く結合しない化合物に少なくとも１０ ｎＭの強さのＫｄで化合物に結合し、該接触が化合物−タンパク質複合体の形成が可能な条件下で行われる段階；および
（ｂ） 該複合体から該化合物に結合する該誘導体タンパク質を得る段階。
【請求項２３】
以下の段階を含む、非抗体タンパク質に結合する化合物を得る方法であって、非抗体タンパク質は免疫グロブリン様の折畳みを持つドメインを含み、変異したアミノ酸配列を持つことで基準タンパク質から誘導され、該非抗体タンパク質は該基準タンパク質がそれほど強く結合しない化合物に少なくとも１０ ｎＭの強さのＫｄで化合物に結合する方法：
（ａ） 候補化合物を該誘導体タンパク質に接触させる段階であって、接触は化合物−タンパク質複合体の形成は可能な条件下で行われる；および
（ｂ） 該複合体から、該誘導体タンパク質に結合する該化合物を得る段階。
【請求項２４】
以下の段階を含む、試料中の化合物を検出する方法：
（ａ）免疫グロブリン様の折畳みを持つドメインを含む非抗体タンパク質を該試料に接触させる段階であって、該非抗体タンパク質は変異したアミノ酸配列を持つことによって基準タンパク質から誘導され、該非抗体タンパク質は該基準タンパク質がそれほど強く結合しない化合物に少なくとも１０ ｎＭの強さのＫｄで化合物に結合し、該接触が化合物−タンパク質複合体の形成が可能な条件下で行われる段階；および
（ｂ） 該複合体を検出することによって該試料中の該化合物を検出する段階。
【請求項２５】
腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）受容体に対する同一性が２０％未満の配列を持つ、少なくとも１μＭの強さのＫｄでＴＮＦ−αに結合する非抗体タンパク質。
【請求項２６】
ＤＥ、ＢＣおよびＦＧループに変異を持つ、変異したフィブロネクチン３型ドメインを含む、請求項２５記載の非抗体タンパク質。
【請求項２７】
ＦＧループが野生型のＦＧループと同じ長さである、請求項２６記載の非抗体タンパク質。
【請求項２８】
免疫グロブリン様の折畳みを含む、請求項２５記載の非抗体タンパク質。
【請求項２９】
免疫グロブリン様の折畳みが１０ ｋＤ未満、７．５ ｋＤを越える、または７．５〜１０ ｋＤの間の分子量を持つ、請求項２８記載の非抗体タンパク質。
【請求項３０】
免疫グロブリン様の折畳みが、約５０〜１５０アミノ酸、および好ましくは約５０アミノ酸からなる、請求項２９記載の非抗体タンパク質。
【請求項３１】
少なくとも５００ ｎＭ、１００ ｎＭ、１０ ｎＭ、１ ｎＭ、５００ ｐＭ、１００ ｐＭ、または２０ ｐＭの強さのＫｄでＴＮＦ−αに結合する、請求項２５記載の非抗体タンパク質。
【請求項３２】
１個、２個、または３個の変異ループを含む、請求項２５記載の非抗体タンパク質。
【請求項３３】
少なくとも１個、および好ましくは２個または３個すべての変異ループがＴＮＦ−αに対する非抗体タンパク質の結合に寄与する、請求項３２記載の非抗体タンパク質。
【請求項３４】
少なくとも１つのジスルフィド結合を持つ、請求項２５記載の非抗体タンパク質。
【請求項３５】
生理的条件下で単量体または二量体である、請求項２５記載の非抗体タンパク質。
【請求項３６】
固相支持体上に固定されている、請求項２５記載の非抗体タンパク質。
【請求項３７】
固相支持体がチップまたはビーズである、請求項３６記載の非抗体タンパク質。
【請求項３８】
固相支持体上に固定されたアレイの一部である、請求項３６記載の非抗体タンパク質。
【請求項３９】
異種タンパク質に結合している、請求項２５記載の非抗体タンパク質。
【請求項４０】
異種タンパク質がＴＮＦ−α、免疫グロブリンＦｃドメイン、補体タンパク質、またはアルブミンタンパク質に結合しない抗体または抗体ドメインである、請求項３９記載の非抗体タンパク質。
【請求項４１】
変異したフィブロネクチン３型ドメインおよび好ましくは変異したヒトフィブロネクチン３型ドメインを含む、請求項２５記載の非抗体タンパク質。
【請求項４２】
変異したフィブロネクチン３型ドメインが、フィブロネクチン３型ドメインの変異した１０番目のモジュール（１０Ｆｎ３）である、請求項４１記載の非抗体タンパク質。
【請求項４３】
１０Ｆｎ３インテグリン結合モチーフを持たない、請求項４２記載の非抗体タンパク質。
【請求項４４】
１０Ｆｎ３のループ中に非天然の配列および好ましくはループ配列ＰＷ（Ａ／Ｇ）を含み、および／または１０Ｆｎ３のβシート中に非天然の配列を含む、請求項４２記載の非抗体タンパク質。
【請求項４５】
図２５（配列番号：３４〜１４０）の配列の任意の１つを含む、請求項２５記載の非抗体タンパク質。
【請求項４６】
請求項２５記載の非抗体タンパク質をコードする核酸。
【請求項４７】
ループが図２５（配列番号：３４〜１４０）のアミノ酸配列の任意の１つを含む、タンパク質のループ構造。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の背景
本発明は、例えば新規の結合特性を持つ生成物の生産に有用なタンパク質骨格に関する。
【０００２】
一般にタンパク質骨格と呼ばれる比較的限定された三次元構造を持つタンパク質は、操作された生成物を設計するための試薬として用いることができる。これらの骨格は、特定の、もしくは無作為な配列の変異を受け入れる１つまたは複数の領域を典型的に含んでおり、このような配列の無作為化は、タンパク質ライブラリーを生産し、そのライブラリーから求める生成物を選択するためにしばしば行われる。このような骨格が有用な１つの特定の分野は、抗体設計の分野である。
【０００３】
試薬または薬剤を得るために哺乳類の免疫系を操作する多くの方法が以前より試みられてきた。これらには、特定の抗原に反応するポリクローナル抗体の混合物を得るために関心対象の抗原を動物に注射する段階、ハイブリドーマ培養細胞にモノクローナル抗体を生産させる段階（ＫｏｅｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ、Ｎａｔｕｒｅ、第２５６巻、第４９５頁、１９７５年）、新規の認識特性または最適化された認識特性を得るために現存のモノクローナル抗体を改変する段階、望ましい結合特性を持つ新規の抗体断片を作製する段階、ならびに単鎖抗体（抗体分子の重鎖および軽鎖の可変領域を可動性のペプチドリンカーと連結することにより作製される）を無作為化してファージディスプレイ法で抗原との結合により選択する段階（Ｃｌａｃｋｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ、第３５２巻、第６２４頁、１９９１年）が含まれる。
【０００４】
さらに、新規の結合特性を持つタンパク質を得るために、免疫グロブリン以外のいくつかのタンパク質骨格が提案されている。例えば「ミニボディ」骨格は、免疫グロブリンの折り畳みに関連しており、モノクローナル抗体の重鎖の可変ドメインから３つのβ鎖を除去することで設計されている（Ｔｒａｍｏｎｔａｎｏら、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｒｅｃｏｇｎｉｔ．、第７巻、第９頁、１９９４年）。このタンパク質は６１残基を含んでおり、これを使用して２つの超可変ループを生じうる。これらの２つのループは無作為化され、抗原との結合により生成物が選択されるが、これまでのところ、溶解性の問題により、この枠組みには幾らかの限定された効用しかないようである。ループを示すのに使用される別の枠組みは、テンダミスタット（ｔｅｎｄａｍｉｓｔａｔ）であり、７４残基で、サンドイッチ状の６本のβシート鎖が２つのジスルフィド結合によって結合している（ＭｃＣｏｎｎｅｌｌおよびＨｏｅｓｓ、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．、第２５０巻、第４６０頁、１９９５年）。この骨格には３つのループが含まれているが、これまでのところ、これらのループのうちの２つについてのみ、無作為化の可能性が試されている。
【０００５】
他のタンパク質も枠組みとして試験されてきており、αヘリックスの表面に無作為化された残基（Ｎｏｒｄら、Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、第１５巻、第７７２頁、１９９７年、Ｎｏｒｄら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．、第８巻、第６０１頁、１９９５年）、αヘリックス束中のαヘリックス間にあるループ（ＫｕおよびＳｃｈｕｌｔｚ、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、第９２巻、第６５５２頁、１９９５年）、および小さいプロテアーゼ阻害剤のようにジスルフィド架橋で束ねられたループを提示するために使用されている（Ｍａｒｋｌａｎｄら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第３５巻、第８０４５頁、１９９６年；Ｍａｒｋｌａｎｄら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第３５巻、第８０５８頁、１９９６年；ＲｏｔｔｇｅｎおよびＣｏｌｌｉｎｓ、Ｇｅｎｅ、第１６４巻、第２４３頁、１９９５年；Ｗａｎｇら、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．、第２７０巻、第１２２５０頁、１９９５年）。
【０００６】
発明の概要
本発明は、関心対象のどのような化合物とも結合するように導出（ｅｖｏｌｖｅ）しうる新規のタンパク質のファミリーを提供する。フィブロネクチン型ＩＩＩ（Ｆｎ３）もしくはＦｎ３様ドメイン由来の骨格を一般に使用したこれらのタンパク質は、特徴的な天然型抗体または操作された抗体（すなわち、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、もしくは単鎖の抗体）の様式で機能し、さらに構造的な利点を持つ。特に、これらの抗体模倣物の構造は、標準的には抗体の構造および機能の喪失につながるような条件下でさえも、最適な折り畳み、安定性、および溶解性を持つように設計されている。
【０００７】
これらの抗体模倣物は、実質的に関心対象の任意の化合物（例えば任意のタンパク質）とも結合しうるタンパク質を設計する目的で使用することができる。例えば、本明細書に述べられた１０Ｆｎ３に基づく分子を、抗体の可変領域の相補性決定領域（ＣＤＲ）と位置および構造において類似した無作為化されたＦｎ３ループを１つまたは複数有する集団を形成するために、および／または、Ｆｎ３の他の３つの可溶性露出ループを無作為化するために、定方向展開（ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ）に供する骨格として使用することができる。このような定方向展開の方法により、関心対象の抗原に高い親和性を持つ抗体様分子が生産される。さらに、本明細書に述べられた骨格を規定された露出ループ（例えば、前もって無作為化され、抗原との結合に基づいて選択されたループ）を示し、このように導入されたループと結合する分子の展開（ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ）の方向付けをするためにも使用することができる。この型の選択は、個々の任意のＣＤＲ様ループ、または非線形エピトープに結合した２つもしくは３つ全部のＣＤＲ様ループを認識する認識分子を同定するために行ってもよい。
【０００８】
したがって、第１の局面では、本発明は無作為化されたまたは変異した骨格タンパク質に関する。特に、本発明は免疫グロブリン様の折畳みを持つドメインを含む非抗体タンパク質に関するが、その非抗体タンパク質は変異したアミノ酸配列を持つことにより基準タンパク質から誘導され、この非抗体タンパク質は基準タンパク質が非抗体タンパク質ほど強く結合しない化合物に対して少なくとも１μＭの強さのＫｄで結合する。
【０００９】
さらに、本発明は免疫グロブリン様の折畳みをもつドメインを含む骨格タンパク質から誘導される非抗体タンパク質に関し、誘導体タンパク質中のドメインのアミノ酸配列は、骨格タンパク質中のドメインのアミノ酸配列と５０％以上同一である。
【００１０】
別の態様では、本発明は少なくとも１つの無作為化ループを持つフィブロネクチン３型ドメインを含むタンパク質に関するが、このタンパク質はＦｎ３ドメインが対応する天然に存在するＦｎ３ドメインの結合しない化合物に結合できるということにより特徴づけられる。
【００１１】
種々の好ましい態様では、本発明のこれらの任意のタンパク質は、少なくとも５００ ｎＭのＫｄ、好ましくは少なくとも１００ ｎＭまたは１０ ｎＭのＫｄ、およびより好ましくは少なくとも１ ｎＭ、５００ ｐＭ、１００ ｐＭ、または２０ ｐＭの強さのＫｄでその標的化合物に結合する。タンパク質は好ましくは１個、２個、または３個の変異ループを含み、少なくとも１個のループ、および好ましくは２個または３個全てのループが化合物に対するタンパク質の結合に貢献する。さらに、基準タンパク質は好ましくはジスルフィド結合を持たず、誘導体タンパク質は少なくとも１つのジスルフィド結合を持つ可能性がある。
【００１２】
特定の態様に関して、免疫グロブリン様の折畳みをもつドメインは、好ましくは１０ ｋＤ未満または７．５ ｋＤを越える分子量、およびより好ましくは７．５〜１０ ｋＤの間の分子量を持つ。本発明のタンパク質は生理的条件下で単量体であるか、例えば二量体のような多量体である。他の好ましい態様では、本発明の変異タンパク質を誘導するために用いた基準タンパク質は、天然に存在する哺乳類タンパク質（例えば、ヒトのタンパク質）である；免疫グロブリン様の折畳みをもつドメインは、変異しており、基準タンパク質の免疫グロブリン様の折畳みと比較して最高５０％、および好ましくは最高３４％の変異したアミノ酸を含む。さらに、免疫グロブリン様の折畳みをもつドメインは、約５０〜１５０アミノ酸を含み、より好ましくは約５０アミノ酸を含む。
【００１３】
本発明の誘導体タンパク質は、好ましいタンパク質、フィブロネクチンまたはフィブロネクチン二量体、テナシン、Ｎ−カドヘリン、Ｅ−カドヘリン、ＩＣＡＭ、タイチン、ＧＣＳＦ受容体、サイトカイン受容体、グリコシダーゼ阻害剤、抗生物質色素蛋白質、ミエリン膜接着分子Ｐ０、ＣＤ８、ＣＤ４、ＣＤ２、クラスＩ ＭＨＣ、Ｔ細胞抗原受容体、ＣＤ１、Ｃ２、およびＶＣＡＭ−１のＩ−ｓｅｔドメイン、ミオシン結合タンパク質ＣのＩ−ｓｅｔ免疫グロブリンドメイン、ミオシン結合タンパク質ＨのＩ−ｓｅｔ免疫グロブリンドメイン、テロキンのＩ−ｓｅｔ免疫グロブリンドメイン、ＮＣＡＭ、トウィチン、ニューログリアン、成長ホルモン受容体、エリスロポエチン受容体、プロラクチン受容体、インターフェロンγ受容体、βガラクトシダーゼ／グルクロニダーゼ、βグルクロニダーゼ、トランスグルタミナーゼ、Ｔ細胞抗原受容体、スーパーオキシド・ジスムターゼ、組織因子ドメイン、シトクロームＦ，緑色蛍光タンパク質、ＧｒｏＥＬ、およびタウマチンを含むがこれらに限定されることのない任意の適当な基準タンパク質から誘導され得る。
【００１４】
Ｆｎ３ドメインを含むタンパク質の別の好ましい態様では、フィブロネクチン３型ドメインは哺乳類（例えばヒト）フィブロネクチン３型ドメインである；このタンパク質はフィブロネクチン３型ドメインの１０番目のモジュール（１０Ｆｎ３）を含む。そのようなタンパク質では、化合物の結合は、好ましくは１個、２個、または３個の１０Ｆｎ３ループによって媒介される。別の好ましい態様では、１０Ｆｎ３の第２の（ＤＥ）ループが天然に存在する分子に比較して伸長しているか、１０Ｆｎ３がインテグリン結合モチーフを欠いている場合がある。これらの分子では、インテグリン結合モチーフは、アミノ酸配列によって置換されている可能性があり、ここでは極性アミノ酸−中性アミノ酸−酸性アミノ酸の配列（Ｎ末端からＣ末端の方向）がインテグリン結合モチーフを置き換えている；または、１つの好ましい配列は、セリン−グリシン−グルタミン酸である。別の好ましい態様では、フィブロネクチン３型ドメインを含む本発明のタンパク質は、ジスルフィド結合を欠いている。
【００１５】
本発明の任意のタンパク質（例えば、フィブロネクチン３型ドメインを含むタンパク質）は、融合タンパク質の一部として製剤化されていてもよい。化合物との結合または化合物との結合の選択に融合タンパク質が使用される場合は、融合タンパク質はそれ自身は関心対象の化合物に結合しない異種のタンパク質を含む。異種タンパク質は、例えば、抗体または抗体ドメイン（たとえば免疫グロブリンＦｃドメイン）、補体タンパク質、毒素タンパク質，またはアルブミンタンパク質でよい。また、本発明の任意のタンパク質（たとえば、フィブロネクチン３型ドメインタンパク質）は、核酸（たとえば、ＲＮＡ）と共有結合していてもよく、核酸はタンパク質をコードしていてもよい。さらに、このタンパク質は多量体でもよく、または特にインテグリン結合モチーフを欠失する場合には、生理学的に許容される担体として製剤化されていてもよい。
【００１６】
本発明はさらに、βシート配列に少なくとも１つの変異を持つフィブロネクチン３型ドメインを含むタンパク質の特徴を含んでいる。また、これらのタンパク質は、対応する天然型のフィブロネクチンとは結合しないまたはそれほどは強く結合しない化合物と結合することができることにより特徴付けられる。
【００１７】
本発明の任意のタンパク質は、固相支持体（例えば、ビーズまたはチップ）上に固定することができ、これらの骨格は固相支持体上でアレイを含む任意の形に配置できる。
【００１８】
関連する局面では、本発明はさらに本発明の任意のタンパク質をコードする核酸を特徴とする。好ましい態様では、核酸はＤＮＡまたはＲＮＡである。
【００１９】
別の関連する局面では、本発明はまた、フィブロネクチン３型ドメインのインテグリン結合ドメインの除去を伴う、フィブロネクチン３型ドメインを含み、哺乳類に対して薬学的に許容される、タンパク質の生成方法も特徴とする。本方法は、上述の任意のフィブロネクチン３型ドメイン含有タンパク質に適用でき、ヒトの治療的応用のためのタンパク質の生成に特に有用である。本発明は、インテグリン結合ドメインを持たない、そのようなフィブロネクチン３型ドメイン含有タンパク質も特徴とする。
【００２０】
別の関連する局面では、本発明は、関心対象の化合物に結合する誘導非抗体タンパク質を得る方法を特徴とする。そのような方法の１つは：（ａ） 免疫グロブリン様の折畳みを含む非抗体骨格タンパク質を提供する段階であって、骨格タンパク質は１μＭほどの強いＫｄで化合物には結合しない；（ｂ） 非抗体骨格タンパク質の変異した誘導体を作製し、それによって変異したタンパク質のライブラリーを作製する段階；（ｃ） ライブラリーに化合物を接触させる段階；（ｄ） ライブラリーから少なくとも１μＭのＫｄの強さで化合物に結合する少なくとも１つの誘導体タンパク質を選択する段階；および（ｅ） 選択的に、繰り返しの段階（ｂ）の非抗体骨格タンパク質をその前の段階（ｄ）で置き換えて段階（ｂ）〜（ｄ）を繰り返す段階を含む。このテクニックは、本発明の任意のタンパク質（例えば、フィブロネクチン３型ドメインを含む任意のタンパク質）についても行なうことができる。
【００２１】
さらに別の関連する局面において、本発明は関心対象の化合物と結合しうる無作為化または変異した本発明のタンパク質を得る、もしくは導出するために、または無作為化または変異したモチーフを含む特定のタンパク質と結合しうる化合物（例えば、タンパク質）を得る、もしくは導出するために使用されうるスクリーニング法を特徴としている。さらに、本発明は、関心対象の化合物またはタンパク質のいずれかを得るために、２つの方法を任意の順番で結合したスクリーニング法を特徴としている。
【００２２】
特に、関心対象の無作為化または変異したタンパク質を単離または同定するのに有用な最初のスクリーニング法は、（ａ）関心対象の化合物に候補タンパク質を接触させる段階であって、候補タンパク質は免疫グロブリン様の折畳みをもつドメインを含む誘導非抗体タンパク質であり、非抗体タンパク質は変異したアミノ酸配列を持つことにより基準タンパク質から誘導され、非抗体タンパク質は基準タンパク質がそれほどは強く結合しない化合物に対して少なくとも１μＭのＫｄの強さで結合し、接触が化合物とタンパク質の複合体の形成を可能にする条件下で行われる段階；および（ｂ） 複合体からタンパク質に結合する化合物を得る段階を含んでいる。この一般的なテクニックは、少なくとも１つの無作為化または変異したループを持つフィブロネクチン３型ドメインタンパク質で実行してもよい。
【００２３】
第２のスクリーニング方法は、本発明のタンパク質に結合する化合物を単離または同定するためのものである。この方法は、免疫グロブリン様の折畳みをもつドメインを含み、変異したアミノ酸配列を持つことで基準タンパク質から誘導される非抗体タンパク質から始めるが、この非抗体タンパク質は基準タンパク質がそれほど強く結合しない化合物に対して少なくとも１μＭの強さのＫｄで結合する。この誘導体タンパク質に候補化合物を接触させるが、接触は化合物とタンパク質の複合体の形成が可能な条件下で行われ、誘導体タンパク質に結合する化合物を複合体から得る。やはり、この一般的テクニックは、例えば、変異したフィブロネクチン３型ドメインを持つタンパク質のような、本発明の任意のタンパク質を用いて実行できる。
【００２４】
また、本発明は、本発明のタンパク質（たとえば、フィブロネクチン３型骨格タンパク質およびその誘導体）を用いる診断方法を特徴とする。そのような診断方法は、試料（例えば、生物試料）に対して行ない、試料中で１つの分析物を検出したり、または多くの異なる分析物を同時に検出することができる。本方法では、本明細書中に記述される任意の骨格分子を利用できる。好ましくは、本方法は、（ａ）化合物分析物に結合する本発明のタンパク質を、試料に接触させる段階であって、化合物−タンパク質複合体の形成を可能にする条件下で接触が行われる段階；および （ｂ） 複合体を検出し、それにより試料中の化合物を検出する段階、を含む。また、この方法は試料中の化合物レベルを検出するのみならず定量するためにも使用できる。
【００２５】
本明細書に記載される任意の選択または診断方法の好ましい態様では、本発明のタンパク質は標的化合物に対して少なくとも１μＭまたは５００ ｎＭの強さのＫｄ、好ましくは少なくとも１００ ｎＭまたは１０ ｎＭの強さのＫｄ、およびより好ましくは少なくとも１ ｎＭ、５００ ｐＭ、１００ ｐＭ、または２０ ｐＭの強さのＫｄですらその標的化合物に結合する。タンパク質は好ましくは１個、２個、または３個の変異ループを含み、少なくとも１個のループ、および好ましくは２個または３個全てのループが化合物に対するタンパク質の結合に貢献する。さらに、基準タンパク質は好ましくはジスルフィド結合を持たず、誘導体タンパク質は少なくとも１つのジスルフィド結合を持つ可能性がある。
【００２６】
本方法の特定の態様に関して、免疫グロブリン様の折畳みをもつドメインは、好ましくは１０ ｋＤ未満または７．５ ｋＤを越える分子量、およびより好ましくは７．５〜１０ ｋＤの間の分子量を持つ。本発明のタンパク質は生理的条件下で単量体であるか、例えば二量体のような多量体である。他の好ましい態様では、本発明の変異タンパク質を誘導するために用いた基準タンパク質は、天然に存在する哺乳類タンパク質（例えば、ヒトのタンパク質）である；免疫グロブリン様の折畳みをもつドメインは変異しており、基準タンパク質の免疫グロブリン様の折畳みと比較して最高５０％、および好ましくは最高３４％の変異したアミノ酸を含む。さらに、免疫グロブリン様の折畳みをもつドメインは、約５０〜１５０アミノ酸を含み、より好ましくは約５０アミノ酸を含む。
【００２７】
本発明の方法で使用される誘導体タンパク質は、好ましいタンパク質、フィブロネクチンまたはフィブロネクチン二量体、テナシン、Ｎ−カドヘリン、Ｅ−カドヘリン、ＩＣＡＭ、タイチン、ＧＣＳＦ受容体、サイトカイン受容体、グリコシダーゼ阻害剤、抗生物質色素蛋白質、ミエリン膜接着分子ＰＯ、ＣＤ８、ＣＤ４、ＣＤ２、クラスＩ ＭＨＣ、Ｔ細胞抗原受容体、ＣＤ１、Ｃ２、およびＶＣＡＭ−１のＩ−ｓｅｔドメイン、ミオシン結合タンパク質ＣのＩ−ｓｅｔ免疫グロブリンドメイン、ミオシン結合タンパク質ＨのＩ−ｓｅｔ免疫グロブリンドメイン、テロキンのＩ−ｓｅｔ免疫グロブリンドメイン、ＮＣＡＭ、トウィチン、ニューログリアン、成長ホルモン受容体、エリスロポエチン受容体、プロラクチン受容体、インターフェロンγ受容体、βガラクトシダーゼ／グルクロニダーゼ、βグルクロニダーゼ、トランスグルタミナーゼ、Ｔ細胞抗原受容体、スーパーオキシド・ジスムターゼ、組織因子ドメイン、シトクロームＦ，緑色蛍光タンパク質、ＧｒｏＥＬ、およびタウマチンを含むがこれらに限定されることのない任意の適当な基準タンパク質から誘導され得る。
【００２８】
また、本明細書に記述される選択方法の段階は、サイクルの間にさらなる変異または無作為化を行なって繰り返すことができる。例えば、変異または無作為化したフィブロネクチン３型ドメインを持つタンパク質に関する方法では、段階（ｂ）で得られたタンパク質のフィブロネクチン３型ドメインの少なくとも１個のループを変異させ、さらに無作為化されたタンパク質を用いて段階（ａ）および（ｂ）を繰り返すか、段階（ｂ）で得られた化合物を修飾し、さらに修飾された化合物を用いて段階（ａ）および（ｂ）を繰り返すことができる。これらの方法では、化合物は好ましくはタンパク質であり、フィブロネクチン３型ドメインは好ましくは哺乳類（例えばヒト）フィブロネクチン３型ドメインである。別の好ましい態様では、このタンパク質はフィブロネクチン３型ドメインの１０番目のモジュール（１０Ｆｎ３）を含み、結合は１個、２個、または３個の１０Ｆｎ３ループによって媒介される。また、１０Ｆｎ３の第２の（ＤＥ）ループが天然に存在する分子と比較して伸長しているか、１０Ｆｎ３がインテグリン結合モチーフを欠いている場合がある。やはり上述のように、インテグリン結合モチーフは置換されている場合があり、ここでは、極性アミノ酸−中性アミノ酸−酸性アミノ酸の配列（Ｎ末端からＣ末端の方向）がインテグリン結合モチーフを置き換えている；または、１つの好ましい配列は、セリン−グリシン−グルタミン酸である。
【００２９】
本明細書に記述される選択および診断方法は、本発明の任意のタンパク質を用いて実行できる（例えば、フィブロネクチン３型ドメインを含むタンパク質）。また、これらの任意のタンパク質は、それ自身は関心対象の化合物に結合しない異種のタンパク質（例えば、抗体または抗体ドメイン（免疫グロブリンＦｃドメインを含む）、または補体タンパク質、毒素タンパク質、またはアルブミンタンパク質）との融合タンパク質の一部として製剤化されていてもよい。また、選択および診断方法は、核酸（たとえば、ＲＮＡまたはタンパク質をコードする任意の核酸）と共有結合していてもよい。さらに、単量体または二量体のような多量体としてのこれらのタンパク質（例えば、フィブロネクチンドメインを含むタンパク質）を用いて、選択および診断方法を実行することができる。
【００３０】
好ましくは、選択および診断方法は、固相支持体上への結合した標的の固定化を含んでいる。好ましい固相支持体には、カラム（例えば、アガロースカラムのような親和性カラム）またはマイクロチップ、またはビーズが含まれる。または、タンパク質（例えばＦｎ３ドメインを含むタンパク質）を固定化し、これに１個または複数の潜在的結合標的を接触させることもできる。
【００３１】
診断方法では、化合物はしばしばタンパク質であるが、試料中の任意の他の分析物でもよい。検出は、Ｘ線撮影、蛍光検出、質量分光、または表面プラズモン共鳴を含むが、これらに限定されない、任意の標準的な手法で行われる。
【００３２】
最後の局面では、本発明は少なくとも１μＭの強さのＫｄで腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）に結合する非抗体タンパク質で、ＴＮＦ−α受容体（例えば、天然に存在するＴＮＦ−α受容体、例えば哺乳類またはヒトのＴＮＦ−α受容体）とは２０％未満の同一な配列を持つタンパク質の特徴を含んでいる。
【００３３】
好ましい態様では、このタンパク質は、変異したフィブロネクチン３型ドメインを含み、タンパク質はＤＥ、ＢＣ、およびＦＧループに変異を持つ。好ましくは変異したＦＧループは野生型のＦＧループと同じ長さである。別の好ましい態様では、タンパク質は、約５０〜１５０アミノ酸、および好ましくは約５０アミノ酸からなる、免疫グロブリン様の折畳み（好ましくは１０ ｋＤ未満、７．５ ｋＤを越える、または７．５〜１０ ｋＤの間の分子量を持つ）を含む。
【００３４】
本発明のＴＮＦ−α結合体は、少なくとも１μＭの強さ、好ましくは少なくとも５００ ｎＭ、１００ ｎＭ、または１０ ｎＭの強さのＫｄ、およびより好ましくは少なくとも１ ｎＭまたは５００ ｐＭの強さ、および最も好ましくは１００ ｐＭまたは２０ ｐＭの強さのＫｄでＴＮＦ−αに結合する。これらのタンパク質は好ましくは１個、２個、または３個の変異ループを含み、少なくとも１個のループ、および好ましくは２個または３個全てのループが、ＴＮＦ−αに対するこの非抗体タンパク質の結合に貢献する。別の好ましい態様では、この非抗体タンパク質は少なくとも１つのジスルフィド結合を持ち、非抗体タンパク質は生理的条件下で単量体または二量体である。
【００３５】
ＴＮＦ−α結合体は、固相支持体、（例えば、ビーズまたはチップ）上に固定することができ、アレイの一部となっていてもよい。また、ＴＮＦ−α結合体には、異種タンパク質（例えば、ＴＮＦ−α、免疫グロブリンＦｃドメイン、補体タンパク質、またはアルブミンタンパク質に結合しない抗体または抗体ドメインである異種タンパク質）が結合していてもよい。
【００３６】
必要ならば、タンパク質は変異フィブロネクチン３型ドメイン（例えば、フィブロネクチン３型ドメインの変異した１０番目のモジュール（１０Ｆｎ３）のようなヒトフィブロネクチン３型ドメイン由来のもの）を含むことができる。また、タンパク質は１０Ｆｎ３インテグリン結合モチーフを欠如していてもよい。ＴＮＦ−α結合体は、好ましくは１０Ｆｎ３のループ（例えば、ループ配列ＰＷ（Ａ／Ｇ））に非天然配列を含み、１０Ｆｎ３のβシートに非天然配列を含む可能性がある。本発明の特に好ましいＴＮＦ−α結合体は、図２５（配列番号：３４〜１４０）に示されている。
【００３７】
また、関連する局面では、本発明は本発明の任意のＴＮＦ−α結合タンパク質、および図２５（配列番号：３４〜１４０）の任意のアミノ酸配列を含む任意のタンパク質上のループ構造をコードする核酸の特徴を含んでいる。
【００３８】
本明細書では「非抗体タンパク質」は、天然でも哺乳類の免疫後でも哺乳類のＢ細胞によって産生されないタンパク質を意味する。この用語はまた、長さが１００アミノ酸以上、好ましくは８０アミノ酸以上、および最も好ましくは５０アミノ酸以上の抗体断片も含まない。
【００３９】
「免疫グロブリン様の折畳み」は、逆方向に平行の２層のβシートを含む約８０〜１５０アミノ酸残基のタンパク質ドメインであって、２つのβシートの平らな疎水性の面が互いに押し付けられているタンパク質ドメインを意味する。本発明のタンパク質は、共有結合または非共有結合で、より大きな構造に会合したいくつかの免疫グロブリン様の折畳みを含む可能性がある。
【００４０】
「骨格」は、結合のような特定の好ましい性質を持つタンパク質枠組みを選択または設計するために用いられるタンパク質を意味する。骨格からタンパク質を設計するときには、枠組みの望ましい特性に重要なアミノ酸残基は保持され、他の残基を変化させることができる。そのような骨格は、異なる性質を持つタンパク質誘導体の間で変化するアミノ酸残基を５０％未満持ち、そのような誘導体の間で一定の残基を５０％以上持つ。最も一般的には、これらの一定の残基は、その性質に関係なく、全ての変化するドメインに、同一の全体的な３次元折畳みを与える。
【００４１】
「フィブロネクチン３型ドメイン」は互いに充填し合ってタンパク質のコアを形成する２個のβシート間に散在する７個もしくは８個のβ鎖を持つドメインであって、かつβ鎖を互いに連結して、溶媒に露出されたループをさらに含むドメインを意味する。βシートサンドイッチの両端には、このようなループが少なくとも３個存在し、この端はβ鎖の方向と垂直なタンパク質の境界である。好ましくは、フィブロネクチン３型ドメインは、ＲＣＳＢ （Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｆｏｒ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ） プロテインデータベース（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｓｅ）より入手可能であって、「１ｔｔｇ」（ＩＤ＝「１ｔｔｇ」（１つのｔｔｇ））として引用される１０Ｆｎ３ドメインの構造をコードする配列とアミノ酸レベルで少なくとも３０％の同一性を呈し、および好ましくはアミノ酸レベルで少なくとも５０％の同一性を呈する配列を含んでいる。この定義において引用される配列の同一性は、モレキュラー・シミュレーション（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎ）（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）より入手可能なホモロジー・プログラムによって決定される。本発明はさらに、１０Ｆｎ３関連分子の重合体であって、単量体構造の使用の延長に当たり、ポリタンパク質のサブユニットが配列において同一であるかもしくはないものを含む。
【００４２】
「天然に存在する」とは、生きている生物によってコードされる任意のタンパク質を意味する。
【００４３】
「無作為化された」または「変異した」とは、鋳型配列に比べて１個または複数のアミノ酸変異を含むことを意味する。「無作為化する」または「変異させる」とは、そのようなアミノ酸変異を配列中の導入する過程を意味する。無作為化または変異は、一般的には核酸コード配列の意図的な、盲目の、または自発的な変異の変化によって形成され、例えば、ＰＣＲ、変異性ＰＣＲ、またはＤＮＡ化学合成のような任意の手法によって作製される。「対応する非変異タンパク質」とは、導入されたアミノ酸変異以外は、配列の同一なタンパク質を意味する。
【００４４】
「タンパク質」とは、長さ、翻訳後修飾、もしくは機能にかかわらず、２個またはそれ以上のアミノ酸の任意の配列を意味する。「タンパク質」および「ペプチド」は、本明細書において互換的に用いられる。
【００４５】
「ＲＮＡ」とは、二つまたはそれ以上の共有結合した、天然または改変されたリボヌクレオチドの配列を意味する。この用語に含まれる改変されたＲＮＡの一つの例は、ホスホロチオエートＲＮＡである。
【００４６】
「ＤＮＡ」とは、二つまたはそれ以上の共有結合した、天然または改変されたデオキシリボヌクレオチドの配列を意味する。
【００４７】
「核酸」とは、任意の２つまたはそれ以上の共有結合したヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体もしくは誘導体を意味する。本明細書において用いられるように、この用語にはＤＮＡ、ＲＮＡ、およびＰＮＡが含まれるが、これらに限定されることはない。
【００４８】
「薬学的に許容される」とは、重大な医学的に有害な結果なしに、動物（例えば哺乳類）に投与しうる化合物またはタンパク質を意味する。
【００４９】
「生理学的に許容される担体」とは、処理された宿主に対して重大な有害な影響を持たず、投与される化合物の治療上の性質を維持する担体を意味する。一つの例示的な生理学的に許容される担体は生理食塩水である。他の生理学的に許容される担体およびその処方は当業者には自明であって、例えば「レミントンの薬剤科学（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）」、（第１８版）、Ａ． Ｇｅｎｎａｒｏ編、１９９０年、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ、に述べられており、参照として本明細書に組み入れられている。
【００５０】
「融合タンパク質」とは、（ｉ）本発明の骨格タンパク質が（ｉｉ）第２の異なる（異種）タンパク質に結合したタンパク質を意味する。「融合タンパク質」はすべてアミノ酸から構成されるが、「核酸−タンパク質融合体」および「ＲＮＡ−タンパク質融合体」はどちらもアミノ酸のひと配列（タンパク質成分）に結合した核酸のひと配列（核酸またはＲＮＡ成分）を含むという点で、「融合タンパク質」は「核酸−タンパク質融合体」および「ＲＮＡ−タンパク質融合体」とは異なっている。
【００５１】
「選択」とは、ある分子を集団の他の分子から実質的に分離することを意味する。本明細書において用いられるように、「選択」段階は、選択段階後には集団中の望ましい分子が望ましくない分子に比べて少なくとも２倍、好ましくは少なくとも３０倍、より好ましくは少なくとも１００倍、最も好ましくは少なくとも１０００倍に濃縮されることを提供する。選択段階は何回繰り返してもよく、所与の方法中で異なる型の選択段階が組み合わされていてもよい。
【００５２】
本明細書において用いられる「結合パートナー」とは、所望の関心対象の化合物（例えば、タンパク質）のある部分に対する特異的、共有結合、または非共有結合親和性を有するいかなる分子も意味する。結合パートナーの例には、抗原／抗体対、タンパク質／阻害剤対、受容体／リガンド対（例えば、ホルモン受容体／ペプチドホルモン対のような細胞表面受容体／リガンド対）、酵素／基質対（例えば、キナーゼ／基質対）、レクチン／炭化水素対、オリゴマーまたはヘテロオリゴマータンパク質凝集体、ＤＮＡ結合タンパク質／ＤＮＡ結合部位、ＲＮＡ／タンパク質対、および核酸二本鎖、ヘテロ二本鎖、または連結鎖のメンバー、並びに、他の分子（例えば、化合物またはタンパク質）のいかなる部分とも１つもしくはそれ以上の共有結合または非共有結合を形成することができる任意の分子が含まれるが、これらに限定されることはない。
【００５３】
「固相支持体」とは、それに対して直接または間接的に（例えば、他の抗体またはプロテインＡのような他の結合パートナー中間体を通じて）抗体模倣体もしくは親和性複合体が結合してもよい、またはその中に抗体模倣体もしくは親和性複合体が埋め込まれてもよい（例えば、受容体またはチャンネルを通じて）、任意のカラム（もしくはカラム材料）、ビーズ、試験管、マイクロタイター皿、固体粒子（例えば、アガロースもしくはセファロース）、マイクロチップ（例えば、シリコン、シリコンガラス、もしくは金チップ）、またはメンブレン（例えば、無機メンブレン、ニトロセルロース、またはリポソームもしくは小胞のメンブレン）を意味するがこれらに限定されることはない。
【００５４】
本発明によって、多くの利点が提供される。例えば、以下により詳細に述べられているように、本抗体模倣物は還元条件下での安定性および高濃度での溶解性など、改良された生物物理学的性質を呈する。さらに、これらの分子は大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）などの原核生物系、酵母などの真核生物系、およびウサギ網状赤血球溶解物系などのインビトロ翻訳系において容易に発現し、折り畳まれる。さらに、これらの分子は、ＲＮＡ−タンパク質融合技術を用いたインビトロ選択（ＲｏｂｅｒｔｓおよびＳｚｏｓｔａｋ、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、第９４巻、第１２２９７頁、１９９７年；Ｓｚｏｓｔａｋら、米国特許出願第０９／００７，００５号および米国特許出願第０９／２４７，１９０号；Ｓｚｏｓｔａｋら、国際公開公報第９８／３１７００号）、ファージ・ディスプレイ（例えば、ＳｍｉｔｈおよびＰｅｔｒｅｎｋｏ、Ｃｈｅｍ． Ｒｅｖ．、第９７巻、第３１７頁、１９９７年を参照）、および酵母ディスプレイ系（例えば、ＢｏｄｅｒおよびＷｉｔｔｒｕｐ、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．、第１５巻、第５５３頁、１９９７年を参照）を含む選択を多回数繰り返すことを含む親和性成熟（ａｆｆｉｎｉｔｙ ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ）技術にきわめて適している。
【００５５】
本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明および特許請求の範囲から明らかになると思われる。
【００５６】
詳細な説明
本明細書に記載される新規の抗体模倣物は、抗体に由来する断片、および例えば前掲の枠組みのような非抗体の枠組みのどちらよりも優れているように設計されている。
【００５７】
これらの抗体模倣物が抗体断片に勝っている主要な利点は構造である。これらの抗体模倣体は、安定性で、可溶性の構造の骨格全体に由来している。例えば、Ｆｎ３骨格は人体で見いだされる。結果として、これらの作製は、抗体の天然の折り畳みの一部を除去することを含み、無傷の抗体における可変ドメインおよび定常ドメイン間の界面のような疎水性環境に埋まっているアミノ酸残基がしばしばさらされている抗体断片よりも、これらは優れた折り畳みおよび熱安定性の性質を呈する。このような疎水性残基の溶媒への曝露は、抗体断片の凝集の可能性を増加させる。
【００５８】
さらに、本明細書に記載の骨格は、特定の条件下で抗体断片の正しい折り畳みを妨害もしくは阻害すると報告されているジスルフィド結合を持たない。本骨格の自然な折り畳み安定性はジスルフィド結合に依存していないため、ジスルフィド結合が減少すると分解してしまう抗体およびそれらの断片とは異なり、還元条件下でも安定である。
【００５９】
さらに、これらの骨格は、抗体分子の機能的な利点を提供する。特に、１０Ｆｎ３モジュールは免疫グロブリンではないという事実にかかわらず、その全体的な折り畳みはＩｇＧの重鎖の可変領域に近く（図２）、ＣＤＲに類似した３つのフィブロネクチン・ループを天然抗体と同様な相対的配向性で示すことが可能にされている。この構造のために、本抗体模倣物は、天然と類似した抗原結合の性質および抗体への親和性を持ち、インビボにおける抗体の親和性成熟化の過程に類似したインビトロでループを無作為化して混合する戦略をとることができる可能性を有する。
【００６０】
例示的な骨格（例えばフィブロネクチンに基づく骨格）、ならびにその標的リガンドと同様に新規の結合タンパク質を同定し、選択し、および導出するための使用が以下に述べられている。これらの実施例は本発明を例示する目的で提供されており、本発明を限定するためのものではない。
【００６１】
１０Ｆｎ３の構造モチーフ
本発明の好ましい抗体模倣物は、哺乳類の血液および構造タンパク質で見出された共通ドメインであるフィブロネクチン３型モジュール（Ｆｎ３）の構造に基づいている。このドメインはタンパク質配列データベースの中に４００回よりも多く出現し、フィブロネクチン、テンシン、細胞内の細胞骨格タンパク質、および原核生物の酵素を含むこれまでにシークエンシングされたタンパク質の２％に出現すると見積もられている（ＢｏｒｋおよびＤｏｏｌｉｔｔｌｅ、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、第８９巻、第８９９０頁、１９９２年；Ｂｏｒｋら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．、第１５巻、第５５３頁、１９９７年；Ｍｅｉｎｋｅら、Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、第１７５巻、第１９１０頁、１９９３年；Ｗａｔａｎａｂｅら、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．、第２６５巻、第１５６５９頁、１９９０年）。特定の骨格は９４個のアミノ酸残基を含むヒトＦｎ３の１０番目のモジュール（１０Ｆｎ３）である。このドメインの全体的な折り畳みは、最も小さな機能的抗体断片であり、ラクダおよびラマのＩｇＧ（図１、図２）において抗原認識単位の全体を含む重鎖の可変領域のものと密接に関連している。ラクダおよびラマのドメインと１０Ｆｎ３ドメインの間の主要な差異は、（ｉ）１０Ｆｎ３のほうがβ鎖が少ないこと（７対９）、および（ｉｉ）ラクダおよびラマのドメインでは、互いに充填し合う２個のβシートがジスルフィド架橋により連結されているが、１０Ｆｎ３ではそうでないことである。
【００６２】
ＩｇＧの重鎖にある抗原結合ループに対応する１０Ｆｎ３の３個のループは、アミノ酸残基２１〜３１位（ＢＣ）、５１〜５６位（ＤＥ）、７６〜８８位（ＦＧ）の間を通っている（図３）。ＢＣのループの長さおよびＤＥのループの長さはそれぞれ１０残基および６残基であり、抗体の重鎖で見出される対応する抗原認識ループの狭い範囲内、すなわちそれぞれ７〜１０残基および４〜８残基に位置する。したがって、無作為化され、抗原との高親和性によって選択される場合には、これらの２個のループは抗体中の対応するループと同等に抗原と接触できる。
【００６３】
対照的に、１０Ｆｎ３のＦＧループは長さが１２残基で、一方で抗体の重鎖にある対応するループは４残基〜２８残基の範囲である。それゆえ、抗原との結合を最適化するために、１０Ｆｎ３のＦＧループの長さは、好ましくは４残基〜２８残基のＣＤＲ３の範囲を覆うように、長さおよび配列が無作為化され、抗原結合において可能な最も高い可動性および親和性を獲得する。実際に、一般的には、インビトロもしくはインビボの親和性成熟化において、（以下により詳細に述べるように）抗体模倣物のＣＤＲ様ループの配列と同様に長さも無作為化してもよい。
【００６４】
１０番目のヒトフィブロネクチン３型ドメインである１０Ｆｎ３は、低温においてさえ急速に再び折り畳まれる。その背骨のコンフォメーションは、５℃において１秒間以内に回復する。１０Ｆｎ３の熱力学的安定性は高く（ΔＧＵ＝２４ｋＪ／ｍｏｌ＝５．７ｋｃａｌ／ｍｏｌ）、１１０℃の高い融解温度と相関する。
【００６５】
１０Ｆｎ３の生理学的な役割の１つは、体液中に可溶型としておよび細胞外マトリックス中で不溶型として存在する糖タンパク質であるフィブロネクチンのサブユニットである（Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎら、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．、第２３６巻、第１０７９頁、１９９４年）。２２０〜２５０ｋＤのフィブロネクチンの単量体は、１２個の１型モジュール、２個の２型モジュール、および１７個のフィブロネクチン３型モジュールを含んでいる（ＰｏｔｔｓおよびＣａｍｐｂｅｌｌ、Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．、第６巻、第６４８頁、１９９４年）。インテグリン、ヘパリン、およびコンドロイチン硫酸塩とフィブロネクチンとの結合には異なる３型モジュールが含まれている。１０Ｆｎ３は、その曝露されたループの１つにあるインテグリン結合Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＲＧＤ）モチーフを介して細胞接着を媒介することが見出されている。フィブリノーゲン、フォン・ビルブラント因子、およびビトロネクチンのような他のタンパク質でも、類似のＲＧＤモチーフがインテグリン結合に含まれることが示されている（Ｈｙｎｅｓら、Ｃｅｌｌ、第６９巻、第１１頁、１９９２年）。１０Ｆｎ３については、他のマトリックスもしくは細胞結合的な役割は述べられていない。
【００６６】
ＲＧＤを含む短いペプチドに比べて１０Ｆｎ３の接着活性がわずかに強いという知見は、１０Ｆｎ３の細胞結合活性が１０Ｆｎ３の構造全体に分散しているというよりはＲＧＤペプチドに局在しているという結果（Ｂａｒｏｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第３１巻、第２０６８頁、１９９２年）と一致する。ＲＧＤモチーフを持たない１０Ｆｎ３は他の血漿タンパク質もしくは細胞外マトリックスと結合しそうもないという事実から、１０Ｆｎ３は抗体に換わる有用な骨格である。さらに、血流の天然フィブリノーゲン中に１０Ｆｎ３が存在することは、元々の生物において１０Ｆｎ３自体が免疫原生ではないとおもわれることを示唆している。
【００６７】
さらに、本発明者らは、無作為化に耐性を持ち、抗体模倣物の多様なプールの生産を助ける曝露されたループ配列が１０Ｆｎ３の枠組みにあることを決定した。この決定は、１０Ｆｎ３の配列の可動性を試すことで行われた。特に、関連タンパク質の配列はもちろん、他の源から得られたフィブロネクチンの配列とヒト１０Ｆｎ３の配列を整列化させ（図４）、この整列化の結果をヒト１０Ｆｎ３ドメインの三次元構造上に位置づけた（図５）。この整列化により、保存された残基の大部分はβシートサンドイッチのコアに見出され、著しく変異しやすい残基は両βシートの溶媒に接触しうる表面上、および抗体模倣物の親和性成熟化において超可変ループとして働き、溶媒と接触しうる３つのループ上でＮ末端およびＣ末端を含むβシートの端に沿って局在することが判明した。これらの結果を考慮すると、これら３つのループの無作為化には、１０Ｆｎ３の枠組み自体の全体的な折り畳みもしくは安定性に反する効果はないように思われる。
【００６８】
この解析は、ヒト１０Ｆｎ３の配列では最小限でもアミノ酸１〜９位、４４〜５０位、６１〜５４位、８２〜９４位（βシートの端）；１９位、２１位、３１〜４６位（偶数）、７９〜６５位（奇数）（両βシートの溶媒に接触しうる表面）；２１〜３１位、５１〜５６位、７６〜８８位（ＣＤＲ様の溶媒に接触しうるループ）；ならびに１４〜１６位および３６〜４５位（溶媒に接触しうる他のループおよびβターン）は、新規のもしくは改良された化合物結合タンパク質を導出するために無作為化されてもよいことを示している。さらに、以上に討議されたように、溶媒に曝露された１つもしくは複数のループの長さにおける変化も、このような定方向展開法に含まれる。
【００６９】
または、βシート配列の変化を利用して新規のタンパク質を導出してもよい。これらの変異は骨格を変化させ、それにより間接的に１つまたは複数のループ構造を変化させる。この方法を用いた場合は、配列に変異を過剰に行うことなく、むしろほとんど変異を導入してはいけない。この方法では、βシート配列に、好ましくは３−２０の間以下の変異が導入されるべきである。
【００７０】
配列の変異は、例えばＴａｑポリメラーゼによる変異導入（ＴｉｎｄａｌｌおよびＫｕｎｋｅｌ， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２７：６００８ （１９８８））、断片の組換え、またはその組み合せを含む任意の手法で行なえる。同様に、例えば、ＣＤＲ様ループの長さおよび配列の変化、または選択されたループに見つかった有利な枠組みの変異に基づく構造の再設計による、ライブラリーの構造の多様性の増加を用いて、抗体模倣物骨格をさらに改良することができる。
【００７１】
抗体模倣体融合体
本明細書に述べられた抗体模倣物は、他のタンパク質ドメインと融合していてもよい。例えばこれらの模倣物は、ＩｇＧ（Ｆｃ）の定常領域と１０Ｆｎ３モジュール、好ましくは１０Ｆｎ３のＣ末端のような抗体模倣体を融合させることで、ヒト免疫応答に組み込まれていてもよい。このような１０Ｆｎ３−Ｆｃ融合分子などにおけるＦｃは、免疫応答の補体構成要素を活性化し、抗体模倣物の治療上の価値を増加させる。同様に、１０Ｆｎ３のような抗体模倣体とＣ１ｑのような補体タンパク質との融合は、細胞を標的化するために用いることができ、１０Ｆｎ３の抗体模倣体と毒素の融合は、特定の抗原を運搬する細胞を特異的に破壊するために用いることができる。さらに、いかなる型の抗体骨格（例えば１０Ｆｎ３）であっても、アルブミンと融合させて血流中での半減期および組織への浸透を増加させることができる。これらの任意の融合体を、例えば一般的に入手可能な遺伝子配列を用いて構築した組換え融合遺伝子から融合タンパク質を発現させるなどの常法により生産することができる。
【００７２】
骨格の多量体
単量体に加えて、本明細書に述べられている任意の骨格構築物を、結合価を増加させて、それにより抗原との結合活性を増加させるために、抗体模倣物の二量体または多量体として生産してもよい。このような多量体は、共有結合により生産されてもよい。例えば、個々の１０Ｆｎ３モジュールは天然の８Ｆｎ３−９Ｆｎ３−１０Ｆｎ３のＣ末端からＮ末端の結合を模倣したり、または定常領域を介して結合した抗体の二量体を模倣することによって結合させてもよい。１０Ｆｎ３−Ｆｃ構築物を、１０Ｆｎ３−Ｆｃ：：Ｆｃ−１０Ｆｎ３という一般的な図式の二量体を設計するために利用してもよい。Ｆｃ：：Ｆｃの界面に操作された結合は共有結合であっても、非共有結合であってもよい。さらに、このようなより高いオーダーの構造を作製するために、１０Ｆｎ３ハイブリッドのようなハイブリッドにおいてＦｃ以外の相手との二量体化もしくは多量体化を利用することができる。
【００７３】
特定の例としては、共有結合した多量体は、多量体をコードする融合遺伝子を構築する段階によって、または単量体の配列中にシステイン残基のコドンを操作し、発現した生成物間でジスルフィド結合の形成を生じさせる段階によって作製されてもよい。非共有結合した多量体もまた、様々な技術により生産することができる。これらには、正電荷および／または負電荷を帯びた残基に対応するコドンを単量体の配列に導入し、発現した生成物間（および、その結果として単量体間）において、これらの残基間で相互作用を生じさせておくことが含まれる。本方法は、例えばフィブロネクチンの負電荷を帯びた残基のように、単量体サブユニット中に天然に存在する荷電残基の利点を用いることで単純化することができる。非共有結合した抗体模倣物を生産する別の方法は、相互作用することが知られているタンパク質またはタンパク質ドメインのコード配列を単量体遺伝子（例えば、アミノ末端もしくはカルボキシル末端）に導入することである。このようなタンパク質もしくはタンパク質ドメインは、コイルドコイルモチーフ、ロイシンジッパーモチーフ、および二量体もしくはより高いオーダーの多量体を直接形成することが知られている任意の多数のタンパク質サブユニット（またはその断片）を含んでいる。
【００７４】
フィブロネクチン様分子
１０Ｆｎ３は抗体模倣物の生産に好ましい骨格を表すにもかかわらず、本明細書に記載の分子においては、他の分子が１０Ｆｎ３を置換していてもよい。これらに限定されることはないが、ヒト以外の動物および原核生物から得られる関連したＦｎ３モジュール、ならびにヒトフィブロネクチンモジュール１Ｆｎ３−９Ｆｎ３および１１Ｆｎ３−１７Ｆｎ３を含む。さらに、テネイシンおよびアンジュリンのような１０Ｆｎ３と配列に相同性を持つ他のタンパク質から得られたＦｎ３モジュールを使用してもよい。免疫グロブリン様の折畳みを持つ（ただしＶＨドメインに関連しない配列を持つ）他の代表的な骨格は図２１に示されており、Ｎ−カドヘリン、ＩＣＡＭ−２、タイチン、ＧＣＳＦ受容体、サイトカイン受容体、グリコシダーゼ阻害剤、Ｅ−カドヘリン、および抗生物質色素蛋白質が含まれる。関連する構造を持つ別のドメインは、ミエリン膜接着分子ＰＯ、ＣＤ８、ＣＤ４、ＣＤ２、クラスＩ ＭＨＣ、Ｔ細胞抗原受容体、ＣＤ１、Ｃ２、およびＶＣＡＭ−１のＩ−ｓｅｔドメイン、ミオシン結合タンパク質ＣのＩ−ｓｅｔ免疫グロブリンドメイン、ミオシン結合タンパク質ＨのＩ−ｓｅｔ免疫グロブリンドメイン、テロキンのＩ−ｓｅｔ免疫グロブリンドメイン、テリキン、ＮＣＡＭ、トウィチン、ニューログリアン、成長ホルモン受容体、エリスロポエチン受容体、プロラクチン受容体、ＧＣ−ＳＦ受容体、インターフェロンγ受容体、βガラクトシダーゼ／グルクロニダーゼ、βグルクロニダーゼ、トランスグルタミナーゼに由来する可能性がある。または、免疫グロブリン様の折畳みを１つまたは複数含む任意の他のタンパク質が利用できる。そのようなタンパク質は、例えば、プログラムＳＣＯＰ（Ｍｕｒｚｉｎら、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２４７：５３６ （１９９５）； Ｌｏ Ｃｏｎｔｅら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ， ２５：２５７ （２０００））を用いて同定できる。
【００７５】
一般に、ＶＨドメインに構造的関連性を示す任意の分子（例えば、上述のコンピュータプログラムで同定される）は、抗体模倣物として使用できる。そのような分子は、フィブロネクチンのように、分子のＮ末端に３つのループ、Ｃ末端に３つのループを含んでおり、その各々を無作為化して多様なライブラリーを作製できる；または、そのような表面の無作為化可能なループが抗原結合に参加できるほど空間的に近接しているかぎり、より多くのループを持つより大きなドメインも使用できる。図２２は、互いに近接した３個を越える数のループをもつ有用なドメインの例を示す。これらの例には、各々無作為化できるループを４つ持つＴ細胞抗原受容体およびスーパーオキシド・ジスムターゼ；および３つの無作為化可能なループが２つのドメインの一部である（ループの合計数が６となる）ような２つの類似したドメインを３セットずつ持つ、Ｆｎ３二量体、組織因子ドメイン、およびサイトカイン受容体ドメインが含まれる。
【００７６】
または、空間的に充分近接した可変ループを持つ任意のタンパク質を用いて、候補結合タンパク質の生産ができる。例えば、免疫グロブリン様の折畳みには構造的に関連していなくても、空間的に関連した、溶媒が接することのできるループを持つ大きなタンパク質が使用できる。例には、シトクロームＦ、緑色蛍光タンパク質、ＧｒｏＥＬ、およびタウマチンが含まれるが、これらに限定されない（図２３）。これらのタンパク質のディスプレイするループを無作為化して、本明細書に記載するように無作為化したライブラリーから優れた結合をする分子を選択できる。そのサイズのために、抗体−抗原相互作用よりも、はるかに大きな抗原結合表面を示す分子が得られる可能性がある。このタイプの他の有用な折畳みは、数多くのループ、特に平行するβシートまたはいくつかのαへリックスの間に位置するループを持つ候補タンパク質を見るためにプログラムＳＣＯＰ（Ｍｕｒｚｉｎら、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２４７：５３６ （１９９５））を用いても同定できる。
【００７７】
異なる生物および親タンパク質から得られるモジュールは、異なる適用に適切である可能性がある。例えば、抗体模倣物の設計では、治療薬を意図する生物に天然に存在するフィブロネクチンまたはフィブロネクチン様分子から、そのタンパク質を作製するのが最も望ましいことがある。反対に、診断薬または研究用試薬のようなインビトロ適用に使用する抗体模倣物は、起源の生物の重要度は低いまたは関係ない。
【００７８】
これらの任意の分子について、本明細書に記述する任意の方法によりライブラリーを作製し、結合するタンパク質を選択するために使用できる。
【００７９】
骨格に基づく結合タンパク質の定方向展開
本明細書に記載の抗体模倣物は、新規または改良された結合タンパク質を導出するために、いかなる技術において使用してもよい。一つの特定の例として、結合の標的をカラム樹脂またはマイクロタイタープレートのウェルのような固相支持体に固定化し、候補となる骨格に基づく結合タンパク質のライブラリーに標的を接触させる。このようなライブラリーは、１０Ｆｎ３のＣＤＲ様ループの配列および／または長さを無作為化することで野生型１０Ｆｎ３の骨格から構築された１０Ｆｎ３クローンのような抗体模倣体クローンから成っていてもよい。望ましい場合には、このライブラリーは、例えばショスタック（Ｓｚｏｓｔａｋ）ら、米国特許出願第０９／００７，００５号および同第０９／２４７，１９０号；ショスタック（Ｓｚｏｓｔａｋ）ら、国際公開公報第９８／３１７００号；ならびにロバーツ（Ｒｏｂｅｒｔｓ）およびショスタック（Ｓｚｏｓｔａｋ）、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、１９９７年、第９４巻、第１２２９７〜１２３０２頁に記載の技術によって生産されたＲＮＡ−タンパク質融合体ライブラリーであってもよい。またはＤＮＡ−タンパク質ライブラリーであってもよい（例えば、Ｌｏｈｓｅ、「ＤＮＡ−タンパク質融合体およびそれらの使用法（ＤＮＡ−Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｆｕｓｉｏｎｓ ａｎｄ Ｕｓｅｓ Ｔｈｅｒｅｏｆ）」、米国特許出願第６０／１１０，５４９号、米国特許出願第０９／４５９，１９０号、および国際公開公報第００／３２８２３号）。この融合体ライブラリーを固定された標的と共にインキュベートし、支持体を洗浄して非特異的な結合物を除去し、高ストリンジェントな条件下における最も強い結合物を溶出してＰＣＲにかけて配列情報を回収するか、または配列にさらなる変異を加えたりもしくは加えなかったりして選択段階を繰り返すのに使用することができる結合物の新規のライブラリーを作製する。抗原に対して十分な親和性を持つ結合物を得られるまでには、選択ラウンドが多数回行われる可能性がある。
【００８０】
一つの特定の例においては、１０Ｆｎ３の骨格を選択の標的として使用することができる。例えば、１０残基のループ中に存在する特異的なペプチド配列に結合するタンパク質が必要な場合は、このループの１つが１０の長さで所望の配列に設定された単一の１０Ｆｎ３クローンを構築する。新規のクローンをインビボで発現させて精製し、次に支持抗体に固定化する。適切な骨格に基づいたＲＮＡ−タンパク質融合体ライブラリーを支持体と相互作用させ、その後洗浄して、所望の分子を溶出し、上述したように再度選択する。
【００８１】
同様に、本明細書に記載の骨格（例えば１０Ｆｎ３の骨格）は、例えば１０Ｆｎ３のループにおいて、骨格によって提示されたペプチド配列と相互作用する天然タンパク質を見出すためにも使用することができる。上述したように１０Ｆｎ３タンパク質のような骨格タンパク質を固定化し、提示されたループへの結合物に対してＲＮＡ−タンパク質融合体ライブラリーをスクリーニングする。選択ラウンドを複数回行うことで結合物を濃縮し、ＤＮＡのシークエンシングにより同定される。
【００８２】
さらに上述の方法において、ＲＮＡタンパク質ライブラリーを定方向展開のための例示的なライブラリーとして示したが、いかなる型の骨格に基づくライブラリーも本発明の選択方法において使用することができる。
【００８３】
使用
本明細書に記載の抗体模倣物は、関心対象の任意の抗原とも結合するように導出することができる。これらのタンパク質は天然抗体に比べて熱力学的に優れた性質を持ち、インビトロで急速に導出することができる。したがって、これらの抗体模倣物は、研究、治療、診断の分野を含む、抗体が使用されるすべての分野においても抗体の代わりに用いることができる。さらに、これらの骨格は抗体に比べて可溶性でかつ安定性の性質を持つので、本明細書に述べられた抗体模倣物は抗体分子が破壊されたり、または不活性化されたりするような条件下でも使用することができる。最後に、本発明の骨格は事実上いかなる化合物とも結合するように導出することができるので、これらの分子は完全に新規であり、研究、治療、および診断の分野における使用も見出されている結合タンパク質を提供する。
【００８４】
実験結果
上述された例示的な骨格分子は、例えば以下のような選択手順で生産され、かつ検査された。
【００８５】
ライブラリーの構築
複合体のライブラリーは、ＣＤＲ様ループに対応する無作為化された部位を各々１個含む３つの断片から構築した。無作為化された残基は、図１８に下線をつけた配列で示されているが、１０Ｆｎ３ ＢＣループ（ラマＶＨのＣＤＲ−Ｈ１に対応）の残基２３〜２９；１０Ｆｎ３ ＤＥループ（ラマＶＨのＣＤＲ−Ｈ２に対応）の残基５２〜５５；および１０Ｆｎ３ ＦＧループ（ラマＶＨのＣＤＲ−Ｈ３に対応）の残基７８〜８７である。断片は、その中にあるＣＤＲ−Ｈ様ループの名前に基づいて、ＢＣ、ＤＥ、およびＦＧと名付けた。各々の断片には、１０Ｆｎ３および無作為化された配列に加えて、Ｈｉｓ６ドメインのＮ末端またはＦＬＡＧペプチドタグのＣ末端をコードする伸長部分が含まれた。各ＤＮＡ断片には、２つの断片間（すなわち、ＢＣおよびＤＥ断片間もしくはＤＥおよびＦＧ断片間）の各接合部にＥａｒ ＩタイプＩＩＳ制限エンドヌクレアーゼの認識配列が含まれた。この制限酵素は、すべての外来非１０Ｆｎ３配列を除去し、隣接する断片を一緒にスプライシングさせた。さらに変異および選択ラウンドの間に、３つの１０Ｆｎ３断片を組換えのように混合させる。
【００８６】
野生型のヒト１０Ｆｎ３遺伝子は、プライマー
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を用いて、ヒト肝臓ライブラリー（Ｍａｘｉｍ Ｂｉｏｔｅｃｈ、カリフォルニア州南サンフランシスコ）からクローニングした。１０Ｆｎ３クローンのＰＣＲで得られた野生型セグメントおよびオリゴヌクレオチド合成で得られた無作為化セグメントから、３つの異なるライブラリーが構築された。ＢＣｒ−ＤＥｒ−ＦＧｒライブラリーは、ＢＣ、ＤＥ、およびＦＧループの選択された残基を無作為化することによって得られた；ＢＣｒ−ＤＥｗｔ−ＦＧｒライブラリーは、ＢＣおよびＦＧループの選択された残基を無作為化し、ＤＥループ配列を野生型のまま残すことによって得られた；ＢＣｗｔ−ＤＥｗｔ−ＦＧｒライブラリーは、ＦＧループのみの選択された残基を無作為化することによって得られた。
【００８７】
ＢＣｒ、ＤＥ ｒおよびＦＧｒ断片は、合成された。各断片は２つの重複するオリゴヌクレオチドから構成され、最初にアニーリングさせた後、断片の２本鎖ＤＮＡの形状を形成するように伸長させた。３つの断片を構築および加工するのに使用されるオリゴヌクレオチドを以下の表に示す：「先端（ｔｏｐ）」および「末尾（ｂｏｔｔｏｍ）」の種は、１０Ｆｎ３コード配列全体を含むオリゴヌクレオチドである。これらのオリゴヌクレオチドの呼称において、「Ｎ」は、Ａ、Ｔ、Ｃ、またはＧを示し、「Ｓ」は、ＣおよびＧを示す。
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Ｔ７Ｔｍｖ（インビトロ翻訳に必要なＴ７プロモーターおよびＴＭＶ非翻訳領域を導入する）：
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Ｕｎｉｓｐｌ−ｓ（Ｒｏｂｅｒｔｓら、１９９７、上記、ピューロマイシン含有リンカーにｍＲＮＡを連結するために用いられるスプリントオリゴヌクレオチド）
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Ａ１８−−−２ＰＥＧ（ＤＮＡ−ピュロマイシンリンカー）：
５’−（Ａ）１８（ＰＥＧ）２ＣＣＰｕｒ（配列番号：１４）
【００８８】
オリゴヌクレオチド対ＢＣＴｏｐおよびＢＣＢｏｔ−ｆｌａｇ８を用いて無作為化ＢＣループを含む断片が構築された；対ＤＥＴｏｐおよびＤＥ Ｂｏｔ−ｆｌａｇ８を用いて無作為化ＤＥループを含む断片が構築された；対ＢＣＴｏｐおよびＤＥ３−ｆｌａｇ８を用いてＢＣｗｔ−ＤＥ ｗｔ断片をＰＣＲ増幅した；および対ＦＧＴｏｐおよびＦＧ Ｂｏｔ−ｆｌａｇ８を用いて無作為化ＦＧループを含む断片が作製された。オリゴヌクレオチド対（各５００ｐｍｏｌ）を１００μｌの１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ７．５、５０ｍＭ ＮａＣｌ中で８５℃にて１０分間アニーリングさせ、次にゆっくりと（０．５〜１時間）室温に冷却した。１本鎖の突出部分にアニーリングした断片を、アニーリングしたオリゴ各１００μｌアリコートに対して１００Ｕのクレノー（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）ならびに８３８．５μｌのＨ２Ｏ、９μｌの１Ｍ Ｔｒｉｓ ７．５、５μｌの１Ｍ ＭｇＣｌ２、２０μｌの１０ｍＭ ｄＮＴＰ、および７．５μｌの１Ｍ ＤＴＴで調製された緩衝液を用いて伸長させた。伸長反応は、２５℃にて１時間行った。
【００８９】
無作為配列によって導入される停止コドンの頻度を下げるために、無作為化された残基は、（ＮＮＳ）ｎによってコードされたが、Ｎは任意のヌクレオチド、ＳはＣおよびＧの等モル混合物を表す；３つの停止コドンのうちの１つのみ（ＴＡＧ）がＮＮＳの制限に従う。遺伝子断片は、１０Ｆｎ３をコードする配列に加えて、５’タバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）非翻訳領域およびＴ７プロモーター、ならびに５’ヘキサヒスチジンタンパク質精製タグおよび３’ ＦＬＡＧエピトープ精製タグをコードする配列も含んでいた。また、３つの断片の組み立てを容易にするために、上述のように、Ｅａｒ Ｉ制限エンドヌクレアーゼ認識部位が、隣接する断片の重複部分に組み込まれた。
【００９０】
次に、ショスタック（Ｓｚｏｓｔａｋ）ら、米国特許出願第０９／００７，００５号および同第０９／２４７，１９０号；ショスタック（Ｓｚｏｓｔａｋ）ら、国際公開公報第９８／３１７００号；ならびにロバーツ（Ｒｏｂｅｒｔｓ）およびショスタック（Ｓｚｏｓｔａｋ）、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、１９９７年、第９４巻、第１２２９７〜１２３０２頁によって開発された技術を用いて、各２本鎖断片をＲＮＡ−タンパク質融合体（ＰＲＯｆｕｓｉｏｎ（商標））に形質転換した。簡単に言えば、アンビオンインビトロ転写キット（Ａｍｂｉｏｎ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｋｉｔ）、Ｔ７−ＭＥＧＡｓｈｏｒｔｓｃｒｉｐｔ（商標）（Ａｍｂｉｏｎ、Ａｕｓｔｉｎ、ＴＸ）を用いて断片を転写し、得られたｍＲＮＡをゲル精製し、かつＤＮＡリガーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ、ウィスコンシン州マジソン）を用いて５’リン酸化ＤＮＡ−ピューロマイシンリンカー（好ましくは５’ ｄＡ１８ＰＥＧ２ｄＣｄＣＰｕｒ）に連結した。ショスタック（Ｓｚｏｓｔａｋ）（上記）に記述されるようにして、ｍＲＮＡはＤＮＡスプリントオリゴヌクレオチド
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を用いてＤＮＡリンカーと整列化させた。アンビオンウサギ網状赤血球溶解物に基づく翻訳キット（Ａｍｂｉｏｎ ｒａｂｂｉｔ ｒｅｔｉｃｕｌｏｃｙｔｅ ｌｙｓａｔｅ−ｂａｓｅｄ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ ｋｉｔ）を用いて、３５Ｓメチオニンの存在下で、ｍＲＮＡ−ＤＮＡ−ピューロマイシン分子を翻訳した。得られたｍＲＮＡ−ＤＮＡ−ピューロマイシン−融合体タンパク質をオリゴ（ｄＴ）セルロース（タイプ７、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ、ニュージャージー州ピスカタウェイ）を用いて精製し、逆転写酵素（Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ（商標）ＩＩ、Ｇｉｂｃｏ， Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、メリーランド州ロックビル）および上述したＲＴプライマー（Ｕｎｉｓｐｌｉｎｔ−ＳもしくはｆｌａｇＡＳＡ）を用いて、製造者の指示（好ましくは、７０℃で２分間アニーリングおよび４２℃で４０分間反応）に従ってＤＮＡの相補鎖を合成した。
【００９１】
各断片について得られたアニーリングｃＤＮＡを持つＲＮＡタンパク質融合体は、そのペプチド精製タグに適した樹脂、すなわちＨｉｓ６タグにはＮｉ−ＮＴＡアガロース（Ｑｉａｇｅｎ、カリフォルニア州バレンシア）およびＦＬＡＧタグにはＭ２抗Ｆｌａｇアガロース（Ｓｉｇｍａ、ミズーリ州セントルイス）を用いて、製造者に推奨された方法に従って精製した。ＫＯＨ溶出によって回収された断片のコードする遺伝情報を、ファルマシアレディートゥゴーＰＣＲビーズ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｒｅａｄｙ−ｔｏ−Ｇｏ ＰＣＲ Ｂｅａｄｓ）、１０ｐｍｏｌの５’および３’ ＰＣＲプライマーを用いて、以下のＰＣＲプログラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）に従ってＰＣＲにより増幅した：１段階目は９５℃で３分間、２段階目は９５℃で３０秒間、５８／６２℃で３０秒間、７２℃で１分間を必要に応じて２０／２５／３０サイクル、３段階目は７２℃で５分間、４段階目は最後まで４℃（通常、２５サイクル）。
【００９２】
得られたＤＮＡを、１μｇのＤＮＡにつき５〜６ ＵのＥａｒ Ｉ（ニュー・イングランド・バイオラボ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ））で切断した。反応は、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ緩衝液（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）中で３７℃にて１時間行い、続いて選択的に、Ｅａｒ Ｉを失活させるために７０℃にて１５分間インキュベートした。無作為化されたループを持つ１０Ｆｎ３遺伝子の全長を形成させるために、等量のＢＣ断片、ＤＥ断片、およびＦＧ断片を混合して連結した。連結には１０Ｕの新鮮なＥａｒ Ｉ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）および２０ＵのＴ４ ＤＮＡリガーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ、ウィスコンシン州マディソン）が必要であり、３７℃にて１時間かかった。Ｅａｒ Ｉおよびリガーゼは、６５℃で１５分間インキュベートして失活させた。
【００９３】
３つの異なるライブラリーＢＣｗｔ−ＤＥｗｔ−ＦＧｒ、ＢＣｒ−ＤＥｗｔ−ＦＧｒ、および、ＢＣｒ−ＤＥｒ−ＦＧｒは、上述のようにして構築された。各々が１０個の無作為化された残基を持つＦＧループの形を含んでいた。最初のライブラリーのＢＣおよびＤＥループは、野生型の１０Ｆｎ３配列を持っていた；７個の無作為化された残基を持つＢＣループおよび野生型のＤＥループが第２のライブラリーを構成していた；７つの無作為化された残基を持つＢＣループおよび４つの無作為化された残基を持つＤＥループが第３のライブラリーを構成していた。これら３つのライブラリーの各々におけるＦＧループの複雑性は１０１３だった；さらなる２つの無作為化されたループを合わせると、潜在的な複雑性は研究室で標本抽出するには高すぎるほどになった。これらのライブラリーの組み合せは１０１２のユニークなクローンをもつマスターライブラリーを提供していた。
【００９４】
元の無作為化されたＢＣｒ−ＤＥｒ−ＦＧｒライブラリーから無作為に選んだ７６個のクローンの配列は、無作為化されたループに何のパターンも示さなかった（データは示さず）；ライブラリーのアミノ酸頻度は、各残基をコードするコドンの数に比例しており、各位置あたり１％（グルタミン酸、メチオニン、トリプトファン）と１４％（プロリン）の間だった。反対に、保存されたβシート枠組中の残基が野生型のまま保存される平均確率は、９９％だった。
【００９５】
等モルの３つのライブラリーは（各々ＤＮＡ ２ ｐｍｏｌ）、選択工程を単純化するために混合され、１つのマスターライブラリーとし、標的との結合それ自体によって、特定の誘発に最も適したライブラリーを選択することにした。ラウンド３から１０の親和性による精製ではＭ２−セファロース（以下参照）が使用されたこと以外、ショスタック（Ｓｚｏｓｔａｋ）ら、米国特許出願第０９／００７，００５号および同第０９／２４７，１９０号；ショスタック（Ｓｚｏｓｔａｋ）ら、国際公開公報第９８／３１７００号；ならびにロバーツ（Ｒｏｂｅｒｔｓ）およびショスタック（Ｓｚｏｓｔａｋ）、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、１９９７年、第９４巻、第１２２９７〜１２３０２頁に述べられた一般的な方法に従って、マスターライブラリーからＲＮＡ−タンパク質融合体を得た（図８）。
【００９６】
融合体の選択
ＲＮＡ−タンパク質融合体の形態のマスターライブラリーが、ＴＮＦ−αとの結合を選択するために供された（Ｐｅｐｒｏ Ｔｅｃｈ、ニュージャージー州ロッキーヒル）。最初に２つの方法が行われた：１つでは標的をアガロースカラムに固定化し、１つでは標的をＢＩＡＣＯＲＥチップに固定化した。最初に、アガロースカラムへのバックグラウンドの結合体を最小限にするために条件の大幅な最適化を行い、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ ７．４、０．０２％ Ｔｒｉｔｏｎ、１００μｇ／ｍｌ変性されたサケ精子ＤＮＡという好ましい緩衝液の条件を得た。この緩衝液中では、１０Ｆｎ３−ＲＮＡ融合体のＴＮＦ−α−セファロースへの非特異的結合は０．３％であった。１０Ｆｎ３−ＲＮＡ／ｃＤＮＡライブラリーのＴＮＦ−α−セファロースへの非特異的結合バックグラウンドは０．１％であることが見出された。
【００９７】
ＴＮＦ−α−セファロース上での各々の選択ラウンドにおいて、残存している非特異的な結合体のいかなるものも除去するために、最初にライブラリーを非誘導体化されたセファロースと共に１時間プレインキュベートし、この前除去により得られた流出液をＴＮＦ−α−セファロースと共にさらに１時間インキュベートした。ＴＮＦ−α−セファロースは３〜３０分間洗浄した。
【００９８】
各選択後に、０．３Ｍ ＮａＯＨまたは０．１Ｍ ＫＯＨを用いて複合体のｃＤＮＡ成分を固相支持体から溶出させ、ＰＣＲにより増幅させた。所望の大きさのＤＮＡのバンドは、選択ラウンドを複数回行っても残留していた（図９）。２つの他の選択法でも同様な結果が観察されたが、アガロースカラム選択で得られたデータのみを図９に示す。
【００９９】
この選択の最初の７ラウンドにおいては、Ｆｎ３−ＲＮＡ／ｃＤＮＡ分子の標的への結合は低いままであり；対照的に、選択の異なる段階においてＤＮＡプールから遊離タンパク質が翻訳された場合には、カラムに結合した種の割合はラウンド間で有意に増加した（図１０）。
【０１００】
後の選択では、選択の最初の８ラウンド（Ｒ１〜Ｒ８）で選択された融合体プールは、バックグラウンドに近いレベル（＜０．２５％）でＴＮＦ−α−セファロースに結合した（図１３）。選択の第９ラウンド（Ｒ９）後、ＴＮＦ−α−セファロースへの融合体の結合は、０．７％と急上昇し、第１０ラウンド（Ｒ１０）後は、結合はさらに７％に増加した（図１３）。選択は、１０ ｍＬ中１０ ｍｇ ＴＮＦ／ｇセファロースでエポキシ活性化セファロース（商標）６Ｂ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に固定化されたＴＮＦ−αを用いて行われた。使用前にＴＮＦ−α誘導化セファロースは、結合緩衝液（５０ ｍＭ ＨＥＰＥＳ， ｐＨ ７．４， ０．０２％ Ｔｒｉｔｏｎ， ０．１ ｍｇ／ｍＬ変性されたサケ精子ＤＮＡ（Ａｍｂｉｏｎ））中で、４℃で一晩ブロックされた。
【０１０１】
上述のように、１０Ｆｎ３に基づくマスターライブラリーを転写し、ピュロマイシンを持つリンカーに連結し、５−１０μＬ／３００μＬ ３５Ｓ−メチオニンの存在下でｍＲＮＡ−タンパク質ライブラリーに翻訳し、オリゴ（ｄＴ）セルロース上で親和性により精製し、ＤＮＡ／ｍＲＮＡ−タンパク質ライブラリーに逆転写し、Ｍ２−セファロース上で親和性により精製した（３〜１０ラウンド）。ＤＮＡ−ｍＲＮＡ−タンパク質融合体ライブラリー分子４ ｘ １０１２の異なる配列２０コピーに当たる４０ ｐｍｏｌを回収し、第１ラウンド（Ｒ１）の選択を行なった。
【０１０２】
選択の第１段階では、４０ ｐｍｏｌのＤＮＡ−ｍＲＮＡ−タンパク質ライブラリーを、ＴＮＦ−αの非存在下で誘導化したエポキシセファロース３０μＬを含む３００μＬの結合緩衝液中で、回転させながら４℃で１時間インキュベートした。第２ラウンドでは、２４ ｐｍｏｌのライブラリーを添加し、残りの８ラウンドでは、０．１〜２ ｐｍｏｌのライブラリーを添加した。上清はＭｉｃｏ Ｂｉｏ−Ｓｐｉｎ（登録商標）クロマトグラフィーカラム（ＢＩＯ−ＲＡＤ、カリフォルニア州ハーキュリーズ）で微量遠心して回収し、３００μＬの結合緩衝液中で３０μＬのＴＮＦ−α−セファロース（６μＭ）と４℃で１時間インキュベートした（７〜１０ラウンドでは、結合緩衝液にはさらに１ ｍｇ／ｍＬのＢＳＡが含まれていた）。ＴＮＦ−α−セファロースはスピンカラムで回収し、３ ｘ ３００μＬの結合緩衝液で洗い、１００μＬの０．１ Ｍ ＫＯＨで溶出し、最後に１μＬの１ Ｍ Ｔｒｉｓ ８．０， ８μＬの１ Ｍ ＨＣｌで中和した。ライブラリー、溶出前後のＴＮＦ−α−セファロース、洗浄液、および溶出液のサンプルは、シンチレーションカウンターでサンプル中の３５Ｓ−メチオニンを計数して定量した。選択の次のラウンドは、ＰＣＲ増幅によって新しいＤＮＡ／ｍＲＮＡ−タンパク質プールを形成することから始まり、これをＰＣＲ産物から転写、翻訳、および逆転写した。
【０１０３】
第９ラウンドおよび第１０ラウンド後の溶出から得られたＤＮＡプールをＴＯＰＯ（商標）ＴＡ（登録商標）， ｐＣＲ２．１クローニングベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州カールズバッド）にクローニングし、大腸菌を形質転換した。３０〜１００クローンを選択し、プラスミドミニプレップ（Ｑｉａｇｅｎ）に増殖させた。Ｒ９から３８クローン、Ｒ１０から２９クローンを無作為に選択し、配列決定した（ＤＮＡシーケンシングコアファシリティー、マサチューセッツ総合病院、分子生物学部門、マサチューセッツ州ボストン）。得られたタンパク質配列の整列化には、プログラムＣｌｕｓｔａｌＷ６０を使用した。
【０１０４】
ＴＮＦ−α結合クローンのアミノ酸残基配列
Ｒ９およびＲ１０から得られた６１クローンのうちの３８は、ユニークなアミノ酸配列を持っており、これは驚くべき多様性である。おそらくＴＮＦ−αに対する優れた結合のために複数回単離された１０のクローンは、表１に示されている（全体の配列は図２５）。
【０１０５】
得られたプールから無作為に選択された６１のクローンのうち、１つ（クローンＴ０９．０８、配列は示さず）のみがＢＣｗｔ−ＤＥｗｔ−ＦＧｒライブラリー由来で、別の６個がＢＣｒ−ＤＥｗｔ−ＦＧｒライブラリー由来だった。残りの５４個（ウィナーの８８％）がＢＣｒ−ＤＥｒ−ＦＧｒライブラリーから選択されたということは、いくつかのループが標的に協力してＴＮＦ−αに結合することの重要性を示す。
【０１０６】
選択されたループ配列の最も一般的なモチーフはＰＷＡ（Ｓ／Ｔ）で、これは６１のクローンのうちの３３のＤＥループに見られた；より緩く定義されたＰＷ（Ａ／Ｇ）の配列は４１／６１のクローンに見られた。抗体ＶＨドメインの類似したＣＤＲ−Ｈ２ループは一般的に抗原結合には小さな貢献しかしないので、特定のＤＥ配列に対するそのような強い選択は、驚くべきことである。一方、ＤＥループの長さが短いために、ライブラリーには可能なテトラペプチド配列がそれぞれ１０７コピー存在すると期待され、そのため選択された性質に対するＤＥループの任意の貢献を最適化するのが容易になる。他のＦｎ３ドメインの調査（Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎら、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２３６：１０７９−１０９２ （１９９４））は、１０Ｆｎ３の残基５２に相当する位置には、野生型のグリシンと同様の頻度でプロリンが見られることを示す；同様に、アラニン、グリシン、および野生型リジンは、すべて１０Ｆｎ３位置５４に相当する位置によく見られる。その結果、位置５２および５４で選択される残基は、少なくとも好ましい生物物理学的性質を持つ点で一貫していると思われる。対照的に、１０Ｆｎ３残基５３に相当する位置ではトリプトファンは見られず、トリプトファン５３はＴＮＦ−αとの結合への貢献のためというような、本発明に特異的な理由で選択された可能性がある。これは他の抗原に対する後の選択でもこのモチーフが見られないこととも一致しており、やはりＰＷＡ／Ｇモチーフは１０Ｆｎ３ドメインの安定性または溶解性というよりも、ＴＮＦ−αへの結合に直接貢献している可能性が高い。ループＤＥでＰＷＡ／Ｇが好まれることは、選択時にＢＣｒ−ＤＥｒ−ＦＧｒライブラリーが好まれる別の理由を示唆する：ＢＣｒ−ＤＥｒ−ＦＧｒライブラリーのみが無作為化されたＤＥループを含み、標的との結合にＰＷＡ／Ｇ配列が重要ならば他の２つのライブラリーとの競争に勝つと考えられる。
【０１０７】
ＢＣループで最も頻繁に選択された配列はＮＲＳＧＬＱＳ （１２／６１）（配列番号：３１）であり、ＦＧループで最も頻繁に選択された配列はＡＱＴＧＨＨＬＨＤＫ （６／６１）（配列番号：３２）だった。ＮＲＳＧＬＱＳ ＢＣループとＡＱＴＧＨＨＬＨＤＫ ＦＧループは同一の分子には見つかれなかったが、３つの無作為化されたループのうちの２つに、最も頻繁に単離された配列を含むクローンが２つ見つかった。これらのクローン
2004526419.tif 000009
は、調べたクローンのうちでＴＮＦ−αからの解離定数が最も低い４つのうちの２つだった（表１）。
【０１０８】
プルーフリード活性を持たないＴａｑポリメラーゼを使用したため、ＰＣＲのラウンドごとに、１０Ｆｎ３のＣＤＲ様ループとβシート折畳みの両方に、１塩基対につき０．０１％の割合、すなわちＰＣＲの１ラウンドにつき１０Ｆｎ３遺伝子につき３％、および選択１ラウンドにつき約７５％の割合で、さらなる無作為化変異が導入された。したがって、野生型のまま保存された残基、および非野生型の安定した配列として保存された残基は、これらの配列はその優れた性質のために選択されたことを意味すると考えられる。変異したループでは、オリゴヌクレオチド合成によって導入された変異かＰＣＲ変異導入による変異かを区別するのは不可能だが、βシートの折畳みでは、選択された変異の大部分はＴａｑエラーに起因する。選択されたクローンはタンパク質の折畳みにいくつかの保存された変化を示すが、これは意図的に無作為化したものではない。図１８は無作為化されなかったが、それでも選択中に変異した１０Ｆｎ３βシートにおける残基を示す。この変異導入は、６１クローンのうちの２６〜２８の頻度で起こった；これらの変異は野生型１０Ｆｎ３配列の下に矢印で示されており選択された残基を示す文字が付けられている。特に、６１クローンのうちの２８ではロイシン１８からアルギニンまたはグルタミンへ変異しており、２６クローンではスレオニン５６からイソロイシンに変異している。図１９はこれらの折畳みの変異の位置を示す。位置５６はループＤＥの幹にあり、したがってこのループの立体配座および標的結合特性に影響すると期待される。ＴＮＦ−α結合ループからの位置１８の距離は、この変異の選択的優位性は、ループＢＣの立体配座への間接的影響、またはタンパク質の安定性への影響に起因する可能性を示唆する（図１９）。これは、頻繁に見られる野生型からの変異Ｌ１８ＲおよびＴ５６Ｉを含むクローンＴ１０．０６の位置１８を野生型のロイシンに復帰させた変異導入の実験でも支持されている。この変化により、変異体のＫｄは約１０倍に上昇した。Ｔ１０．０６（Ｌ１８）タンパク質のＴＮＦ−αに対する弱くなった結合は、位置１８の残基は、おそらくループＢＣへβ鎖を通して伝えられる小さな構造変化によって、ＣＤＲ様ループによる標的への結合に影響することを示唆する。
【０１０９】
選択されたＴＮＦ−α結合プールの親和性と特異性
９回および１０回目の選択後のＴＮＦ−αの遊離タンパク質プールの見かけの平均Ｋｄ値は、区別不可能（それぞれ４ｎＭおよび６ ｎＭ；表１）だった；この親和性の類似は最後のラウンドの選択での濃縮が比較的低レベル（１０倍）だったこと、および２つのプールの配列組成が類似していることと一貫している。さらに４回の選択を行なった後の遊離タンパク質プールの見かけの平均Ｋｄは３ ｎＭで、やはりＲ９およびＲ１０プールと区別不能だった。
【０１１０】
１０回目の選択後に選択されたプールの結合特異性を評価するために、我々はセファロースに固定された３つのサイトカイン、選択の標的であるＴＮＦ−α、および無関係のＩＬ−１αおよびＩＬ−１３に対する２つの異なる遊離タンパク質プールの結合を比較した。第１のプールは最初の選択前（Ｒ０）の無作為化ＤＮＡライブラリーから、第２のプールは１０回目の選択後（Ｒ１０）のライブラリーから転写および翻訳した。
【０１１１】
これらの実験を実行するために、１０回目の選択後の溶出液のＰＣＲ産物を３５Ｓメチオニンの存在下でインビトロで転写および翻訳したが、ｍＲＮＡ−タンパク質融合体の形成はさせなかった。ＴＮＦ−α−セファロース、ＩＬ−１α−セファロース、ＩＬ−１３−セファロースに、それぞれ約１０μＭ、３０μＭ、および５０μＭで結合した、および未誘導化セファロースに結合した、得られた遊離タンパク質の画分は、ＴＮＦ−α−セファロースに対するＤＮＡ／ｍＲＮＡタンパク質融合体の結合について上述の手順を用いて、比較した（図２０）。各標的に結合した選択されたプールの量は、洗浄したビーズのシンチレーション計測で測定した。
【０１１２】
図２０は、Ｒ０のＴＮＦ−α、ＩＬ−１α、およびＩＬ−１３に対する結合は類似していたが（それぞれ２％、４％、および３％）、１０回の選択度には標的ＴＮＦ−αには３２％、ＩＬ−１αには３％、およびＩＬ−１３には１％結合することを示す。ＴＮＦ−αに対する絶対的および相対的なタンパク質結合の増加は、１０Ｆｎ３骨格および標的特異的結合体を選択するためのＤＮＡ／ｍＲＮＡタンパク質融合体に基づく選択システムの能力を示す。
【０１１３】
結合の特異性をさらに調べるために、クローンＴ０９．１２をマイクロアレイ形式（以下に一般的に説明されている）に固定し、可溶性ＴＮＦ−αに対する結合を調べた。このクローンに対するＴＮＦ−αの特異的結合は、蛍光検出（図２４Ａ）および質量分光（図２４Ｂ）で検出した。質量分光については、干渉する可能性のある様々なタンパク質を含む代表的な複雑な生体液である、牛胎児血清の存在下で結合測定が行われた。蛍光検出（図２４Ａ）については、野生型１０Ｆｎ３およびＴ０９．１２変異体のＲＮＡ−１０Ｆｎ３融合体の混合物（表１）を、融合分子のＲＮＡ部分に相補的なオリゴヌクレオチドが２４の反復フィーチャーで６００ミクロンのピッチで固定されたＤＮＡマイクロアレイにハイブリダイズさせた。洗浄によりハイブリダイズしなかった融合体を除去した後、その表面をビオチン−ＴＮＦ−α（ＴＢＳ、０．０２％ Ｔｗｅｅｎ−２０、０．２％ ＢＳＡ中２．６μｇ／ｍＬ）に暴露し、洗浄し、空気乾燥した。キャプチャーされたビオチン−ＴＮＦ−αは、ＳｃａｎＡｒｒａｙ ５０００システム（ＧＳＩ Ｌｕｍｏｎｉｃｓ）を用いて、Ｃｙ３標識の抗ビオチンモノクローナル抗体（Ｓｉｇｍａ）により、検出した。質量分光検出については、Ｔ０９．１２変異体のＲＮＡ−１０Ｆｎ３融合体（図２４Ｂ）および野生型１０Ｆｎ３（図２４Ｃ）をＲＮａｓｅ Ａで処理してタンパク質およびＤＮＡリンカーの融合体を作製した。得られたＤＮＡ結合タンパク質をＤＮＡリンカーに相補的なオリゴヌクレオチドを固定したガラスカバースリップアレイにハイブリダイズさせた（図２４Ｂおよび２４Ｃ；融合体は図２４Ｄには使用されていない）。洗浄後、上述の表面をＴＮＦ−α（９０％ ｖ／ｖ ＰＢＳ／１０％牛胎児血清中１．５ ｍｇ／ｍＬ）に暴露した。乾燥したチップにＭＡＬＤＩマトリックスをスポットし、Ｖｏｙａｇｅｒ ＤＥ ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分光計（ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で分析した。モノマーのＴＮＦ−αに期待される分子質量に対応する１７．４ ｋＤのシグナルが、Ｔ０９．１２タンパク質を含む２００μｍフィーチャー上に検出されたが（図２４Ａ）、野生型１０Ｆｎ３（図２４Ｂ）およびＤＮＡタンパク質融合体を含まないフィーチャー（図２４Ｃ）には検出されなかった。
【０１１４】
選択されたＴＮＦ−α結合クローンのＫｄ
９回および１０回目の選択で作製された２つのプールに複数回現れる全てのクローン、およびＢＣｗｔ−ＤＥｗｔ−ＦＧｒライブラリーに由来する唯一のクローン（クローンＴ０９．０８）について、解離定数が決定された。
【０１１５】
これらの結合定数を決定するために、ピエス（Ｐｉｅｒｃｅ）（イリノイ州ロックフォード）のＮＨＳ−ＬＣ−ＬＣビオチン試薬を用いてビオチン化ＴＮＦ−αを調製した。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分光を用いて、モノマーのＴＮＦ−αの８０％以上、したがって、三量体の９９％以上がビオチン化されていると見積もられた。
【０１１６】
Ｒ９およびＲ１０プール（および以下に説明されるＲ１４およびＭ１２プール）ならびにこれらの２つのプールに由来する解析されたクローンについて、２００μＬ １０ ｍＭ ＨＥＰＥＳ， ｐＨ ７．４， １５０ ｍＭ ＮａＣｌ， １％ ＢＳＡ， ０．０２％ Ｔｒｉｔｏｎ中で、０．２５ ｎＭのインビトロ翻訳３５Ｓ−メチオニン標識遊離タンパク質を、ビオチン化ＴＮＦ−αと１７ ｐＭおよび２３ ｎＭの間の濃度で室温で１時間インキュベートした。その後、９６ウェルのイージータイター（Ｅａｓｙ−Ｔｉｔｅｒ）（商標）ＥＬＩＦＡシステム（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いて各サンプルをあらかじめぬらしたＳＡＭ２Ｒ ビオチンキャプチャーメンブレン（Ｐｒｏｍｅｇａ、ウィスコンシン州マジソン）にかけた。減圧下で、各スポットを２００μＬのＨＢＳ ｐＨ ７．４， １％ ＢＳＡ， ０．０５％ Ｔｒｉｔｏｎで洗った。次に、メンブレン全体を緩衝液ですすいで空気乾燥した。メンブレンをストレージ・ホスホ・スクリーン（Ｓｔｏｒａｇｅ Ｐｈｏｓｐｈｏｒ Ｓｃｒｅｅｎ）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ、カリフォルニア州サニーベール）に一晩露出し、得られた各々のスポットの強度を、ＳＴＯＲＭ ８６０ホスホイメージャーを用いてＩｍａｇｅＱｕａＮＴ濃度計プログラム（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ）をにより定量した。結合のＫｄは平衡状態を得られた結合曲線に当てはめて決定された（ＫａｌｅｉｄａＧｒａｐｈ、Ｓｙｎｅｒｇｙ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）。実験誤差は２〜４の独立した実験から見積もられた。
【０１１７】
これらの実験では、Ｋｄは１〜２４ ｎＭの狭い範囲に入っていた（表１）。各々２つのループに最も多く単離される配列を含むＴ０９．１２およびＴ１０．０６クローンは、それぞれ４および２ ｎＭという低いＫｄを持っていた。それに対して、クローンＴ０９．０７およびＴ１０．１５のような頻度のより低いループを持ついくつかのクローンも、同様に強い結合を示した。
【０１１８】
遊離タンパク質と、同じ配列に由来するｃＤＮＡ／ｍＲＮＡ−タンパク質複合体のＴＮＦ−α結合の比較の標本を見ると、２つの解離定数は互いの実験誤差範囲内であり、これはタンパク質自身の標的結合特性を選択するために、ｃＤＮＡ／ｍＲＮＡ−タンパク質複合体を使用することが可能になるというシステムの性質を示す。
【０１１９】
ＴＮＦ−α結合クローンの厳密度の高い選択
重複したクローンが単離されたにも関わらず、９回および１０回の選択後のＴＮＦ−α結合プールには、数多くの異なるクローン、すなわち、標本にした６１クローンでは３８の異なる配列が、含まれていた。したがって、これらのクローンの中で優れたＴＮＦ−α結合を示すサブセットを回収するために、より厳密な結合要件を用いたさらなる選択が行われた。従って、さらに４回の選択（Ｒ１１−Ｒ１４）が標的濃度のコントロールが容易な溶液中で行われた。ＴＮＦ−αの濃度は０．５ ｎＭに限定され、ＤＮＡ／ｍＲＮＡ−１０Ｆｎ３プールの濃度は０．１ ｎＭに限定された。さらに、ストレプトアビジンコートの常磁性ビーズに結合した１０Ｆｎ３／ ＴＮＦ−α複合体の洗浄の長さと温度も、引き上げられた。
【０１２０】
具体的には、以下のように選択が行われた。ラウンド１１−１３では、上述のように構築された０．１ ｎＭ ＤＮＡ／ｍＲＮＡ−１０Ｆｎ３融合体ライブラリーを、結合緩衝液であらかじめブロックした１００μＬのダイナビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ）（登録商標） Ｍ−２８０（ストレプトアビジンコートの常磁性ビーズ、Ｄｙｎａｌ、ニューヨーク州レークサクセス）と４℃で１時間回転させて、あらかじめきれいにした。得られた融合体混合物を、上述の結合緩衝液３００ μＬ中で０．５ ｎＭビオチン化ＴＮＦ−αと混合し、複合体を４℃で１時間インキュベートした。次に、結合緩衝液中で一晩ブロックした１．３ ｇ／ｃｍ３で再懸濁したダイナビーズ（登録商標） Ｍ−２８０ストレプトアビジン１００μｌを混合物に添加し、回転させながらさらに４５分間４℃でインキュベートした。Ｄｙｎａｌ ＭＰＣ−Ｓラック上で常磁性ビーズを上清から分離し、上清を除去し、結合緩衝液を用いてビーズをＲ １１およびＲ１２の場合は１分間、１５分間、および３０分間洗浄し、Ｒ１３〜Ｒ１４の場合は１分間洗浄後、９回の１０分間洗浄を行なった。１００μｌ ０．１ Ｍ ＫＯＨで２回洗うことによって、洗浄したＤＮＡ／ｍＲＮＡ−１０Ｆｎ３：ＴＮＦ−αビオチン：ストレプトアビジンビーズ複合体からＤＮＡを溶出し、上述のように、カラムを用いた選択によって次の世代のＤＮＡ／ｍＲＮＡ−１０Ｆｎ３融合ライブラリーを作製した。ラウンド１４は、選択がさらに１５０ ｍＭ ＮａＣｌを加えた条件で３０分間行われたという点でＲ１１〜Ｒ１３とは異なっていた。温度を上昇させた以外は、Ｒ１４とＲ１３の洗浄手順は同じだった。
【０１２１】
さらに４回の選択後（Ｒ１４）に溶出されたＤＮＡ由来の無作為に選択した２２のクローンは、１５の異なるループ構造を持っていた（表２；全体の配列は図２５）。上述のようにＲ１０で単離されていたクローンＴ１０．０６は、８回選択されたが、Ｒ９プールで単離されたＲ０９．３１を含めた残りの配列は、各々１回単離された。９回目および１０回目の単離株と同様に、Ｒ１４クローンはＤＥループ中ＰＷＡ／Ｇ配列に偏っており（２２クローン中１８）、４つの新しい非野生型ＤＥ配列も観察された。
【０１２２】
Ｒ１４遊離タンパク質プールの見かけの平均Ｋｄ値３ ｎＭは９回および１０回のプール（それぞれ４および６ ｎＭ）と類似していたが、Ｒ１４プールから単離されたいくつかのクローンのＫｄ値は、Ｒ９およびＲ１０プールで観察された最低値よりも１桁低かった（表２）。ＴＮＦ−αに最も強く結合したクローンＴ１４．０７およびＴ１４．２５のＫｄは９０ ｐｍｏｌだった。したがって、最後の４回の選択に使用した条件は、ナノモル以下のＫｄを持つ１０Ｆｎ３分子に有利になるために充分厳密でありながら、そのような分子を排除してしまうほど厳密ではなかった。
【０１２３】
突然変異誘発による親和性成熟
上述のように、本明細書に記述される選択では、さらにライブラリーの多様性を増やすために、選択段階の全てまたは一部の後に変異誘発を行なうこともできる。１つの平行選択戦略では、ラウンドの間のＤＮＡ増幅に変異性ＰＣＲを組み込んだ（ＣａｄｗｅｌｌおよびＪｏｙｃｅ， ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ａｐｐｌ． ２：２８ （１９９２））。このテクニックは、上述のＲ８後に溶出される多様なＤＮＡプールから始められた。このプールを変異性ＰＣＲで増幅したが、プールを７つの等量の部分に分け、標的頻度０．８％， １．６％， ２．４％， ３．２％， ４．０％， ４．８％， および５．６％で変異誘発した。この７つのＰＣＲ反応を合わせ、混合物からｃＤＮＡ／ＲＮＡ−タンパク質融合体を作製し、溶液中で選択ラウンドを行なった。第２回の変異誘発ラウンドＭ１０の前に、３つの別の反応０．８％， １．６％， および２．４％で変異性ＰＣＲを行なった。２つの残るラウンドＭ１１およびＭ１２は、標準的なＴａｑ ＰＣＲを用いて行なった。変異誘発以外は、Ｍ９−Ｍ１２の選択条件はＲ１１−Ｒ１４と同じだった。調べた２０のＭ１２クローンは、前の２つの選択プロトコールを用いて選択したクローンよりも強い結合を示した（表３；全配列は図２５）。ＴＮＦ−αへの最も強い結合はＭ１２．０４で、観察されたＫｄは２０ ｐＭだった。これらの結果は、選択後期における低レベルの無作為の変異導入が、選択された抗体模倣物の結合親和性（２０ ｐＭ対９０ ｐＭ）、および選択できる速度（１２回対１４回）の両方を改善し得ることを示す。さらに、この変異導入の手法における強い結合体の頻度は約５％であるのに対し、他の選択では約３％だった。
【０１２４】
Ｆｎ結合体の優位性
選択単位として共有結合のｍＲＮＡ−タンパク質融合体を用いておこなったＴＮＦ−αに結合できる１０Ｆｎ３の選択は、２０ ｐＭという低い解離定数を持つ分子が勝ち残った。これらのＫｄ値は、他の抗体模倣物骨格および選択方法を用いる他の選択の基準と比較して勝るものである。したがって、１０Ｆｎ３に基づく骨格および共有結合のｍＲＮＡ−タンパク質融合体に基づくインビトロの選択方法は、広範囲の抗原に対する抗体模倣物の開発に利用できる可能性がある。さらに、本明細書に記述されるナノモルレベル以下のＴＮＦ−α結合１０Ｆｎ３変異体は、治療、研究、診断のための薬剤となる可能性がある。さらに、このインビトロ選択方法は自動化できるので、そのような骨格および選択方法の組み合せは、ゲノムスケールでの用途がある。
【０１２５】
本選択の成功に寄与した１つの要素は、１０Ｆｎ３の３つのＣＤＲ様ループの全ての無作為化である。１つまたは２つの無作為化ループのみを含む類似のライブラリーは、３つの無作為化ＣＤＲ様ループを持つライブラリーよりも、強い結合体を含む可能性が低い。
【０１２６】
上記に報告された選択では、無作為化ループは対応する野生型の１０Ｆｎ３ループの長さのままである。ライブラリーの多様性をさらに高めるために、ループの長さおよびその配列も変化させ、ライブラリーの構築に使用した野生型骨格に１０Ｆｎ３βシート中の好ましい変異を組み込み、抗体の模倣という点ではさらにうまく構造の選択ができる無作為化βシート骨格を持つライブラリーを作製できる。
【０１２７】
本明細書に記述した選択と類似したものは、他の結合種標的（例えばＩＬ−１またはＩＬ−１３）を用いても実行できる。
【０１２８】
動物実験
野生型１０Ｆｎ３は、インテグリン結合性のトリペプチドモチーフであるアルギニン７８−グリシン７９−アスパラギン酸８０（「ＲＧＤモチーフ」）をＦＧループの先端に含んでいる。このトリペプチドに基づくインテグリンとの結合および潜在性の炎症応答をインビボで回避するために、密接に関連した野生型１１Ｆｎ３ドメインで見出される配列で、活性を持たない配列であるセリン７８−グリシン７９−グルタミン酸８０（「ＳＧＥ変異体」）を含む１０Ｆｎ３の変異体を生産した。このＳＧＥ変異体は、Ｎ末端にＨｉｓ６タグを付けて大腸菌中で遊離タンパク質として発現し、金属キレートカラムに続いてサイズ排除カラム上で均質性によって精製される。
【０１２９】
特に、Ｈｉｓ６−１０Ｆｎ３（ＳＧＥ）をコードするＤＮＡ配列をｐＥＴ９ａ発現ベクターにクローニングし、ＢＬ２１ ＤＥ３ ｐＬｙｓＳ細胞を形質転換した。次に、５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＬＢ培地中で３７℃にて振盪しながらＡ２６０＝１．０になるまで培養物を増殖させ、その後０．４ｍＭ ＩＰＴＧにより誘導された。誘導された培養物を同じ条件下でさらに一晩（１４〜１８時間）インキュベートし；標準の低速度遠心分離により細菌を回収した。元の培養容量の１／５０倍の溶解緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ８．０、０．５Ｍ ＮａＣｌ、５％ グリセロール、０．０５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、および１ｍＭ ＰＭＳＦ）に細胞沈殿を再懸濁し、得られたペーストをＭｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｚｅｒ Ｍ１１０−ＥＨに３回通すことにより細胞を溶解させた。溶解物を遠心分離して清澄化し、上清を０．４５μｍのフィルターに通して濾過し、続いて０．２μｍのフィルターに通して濾過した。清澄化された溶解物の１００ｍｌを５ｍｌのタロンコバルトカラム（クロンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、パロアルト（Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ）、ＣＡ）に載せ、７０ｍｌの溶解緩衝液で洗浄し、０ｍＭ〜３０ｍＭ イミダゾールの直線勾配を含む溶解緩衝液で溶出した。すべての段階を通じて、カラムを通す流速は１ｍｌ／分であった。溶出したタンパク質を１５，０００〜２０，０００のＰＥＧに対して透析し（分子量カットオフ値、３，５００）、１０倍に濃縮した。得られた試料を緩衝液１（グリセロールを含まない溶解緩衝液）中で透析し、緩衝液１で平衡化した１６×６０ｍｍのセファクリル１００のサイズ排除カラム上に１回に５ｍｌずつ載せた。カラムに０．８ｍｌ／分で緩衝液１を流し、所望の分子量のタンパク質を含む全画分をプールして、上述のように１０倍に濃縮し、次にＰＢＳ中で透析した。得られた試料でエンドトキシンスクリーニングおよび動物実験を行った（Ｔｏｘｉｋｏｎ（ＭＡ））。
【０１３０】
これまでに検査された試料中のエンドトキシンの水準は、検査法の検出水準以下であった。予備的な毒性学の研究において、このタンパク質を２匹のマウスに治療量の１００倍と見積もられる２．６ｍｇ／マウスを注射した。動物は研究の２週間のあいだ、はっきりとした悪い影響なしに生存した。これらの安全な結果は、静脈内薬に取り込まれた１０Ｆｎ３の使用を支持する。
【０１３１】
インビボでの使用するための他の構築物
８ｋＤの１０Ｆｎ３ドメインの半減期を延ばすために、天然抗体を模倣するより大きい分子も構築されている。この１０Ｆｎ３−Ｆｃ分子は、宿主のＩｇＧの定常領域にある−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３（図１１）もしくは−ＣＨ２−ＣＨ３ドメインを含んでおり、これらの構築物中では、１０Ｆｎ３ドメインはＩｇＧのＶＨドメインの代わりにＮ末端に結合されている（図１１および図１２）。このような抗体様構築物は、天然の免疫応答を利用できる可能性と同様に、タンパク質の薬物動態を改善させるべきである。
【０１３２】
１０Ｆｎ３−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３クローンのマウス型を構築するために、最初にマウス肝脾ｃＤＮＡライブラリー（クロンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ））から−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３領域を増幅し、次にｐＥＴ２５ベクターに連結した。クローニングに使用したプライマーは５’ Ｆｃ Ｎｅｓｔおよび３’ ５ Ｆｃ Ｎｅｓｔであり、回収したインサートの末端に適切な制限酵素部位を結合するのに使用したプライマーは、５’ Ｆｃ ＨＩＩＩおよび３’ Ｆｃ Ｎｈｅであった。
2004526419.tif 000010
【０１３３】
このクローンからＣＨ１領域を除去し、より短いＦｃ部分を作製して１０Ｆｎ３−ＣＨ２−ＣＨ３クローンとするために、さらなるＰＣＲを用いた。各クローンの５’末端に１０Ｆｎ３をコードする配列を連結した。同一のマウス脾臓ｃＤＮＡライブラリーからクローニングされた野生型１０Ｆｎ３でも、または分子の変異もしくは無作為化により得られた改変１０Ｆｎ３でも使用することができる。マウス野生型１０Ｆｎ３のクローニングに使用したオリゴヌクレオチドは、以下であった：
Ｍｏ ５ＰＣＲ−ＮｄｅＩ：
2004526419.tif 000011
Ｍｏ５ＰＣＲ−Ｈｉｓ−ＮｄｅＩ（Ｈｉｓ６精製タグを有する、代わりのＮ末端用）：
2004526419.tif 000012
【０１３４】
ヒトオリゴヌクレオチド配列において、同一の方法を用いることにより、ヒトの等価なクローンが構築される。
【０１３５】
タンパク質チップ適用における抗体模倣体の骨格
本明細書に記載の任意の抗体模倣体は、マイクロチップのような固体支持体上で免疫化してもよい。１０Ｆｎ３骨格のような本明細書の骨格がタンパク質チップ適用に適しているのは、 （１） ベンチまたは自動化装置で迅速に選択できる多くの結合基を支持する能力があり、かつ （２） 生物物理学的特性が優れているためである。
【０１３６】
１０Ｆｎ３の用途の広い結合特性は、Ｆｎ３免疫グロブリン様、βサンドイッチ型折畳みによって示されるループに関連する。上述のように、これらのループは抗体の可変ドメインの相補性決定領域に類似しており、抗体ループと同様な様式で共同して抗原に結合できる。本発明者らの系では、多様なｍＲＮＡ−１０Ｆｎ３融合体のライブラリーを作製するために、１０Ｆｎ３ループのＢＣ（例えば２１残基〜３０残基）、ＤＥ（例えば５１残基〜５６残基）、およびＦＧ（例えば７６残基〜８７残基）は、配列、長さ、または配列と長さの両方が、無作為化されている。そのようなライブラリーにおける結合物は、高親和性の結合物の小さな集団が得られるまで、固定化またはタグ付き標的に対する親和性に基づいて濃縮される。また、誤りがちの（ｅｒｒｏｒ−ｐｒｏｎｅ）ＰＣＲおよび組換えを用いて、選択された結合物の親和性の成熟を促進することができる。迅速で効率の良い選択および親和性成熟プロトコールにより、多数の標的に対する結合物を短時間で選択することができる。
【０１３７】
タンパク質チップ上に固定される結合物の骨格として、１０Ｆｎ３ドメインは、抗体断片および単鎖抗体よりも小さく、扱いやすいという利点を持つ。例えば、安定性および溶解度に大きな差があり、構造的に必須なジスルフィド結合を保つために酸化環境を必要とする単鎖骨格または単離された抗体可変ドメインとは異なり、１０Ｆｎ３は非常に安定で、その融解温度は１１０℃、溶解度は＞１６ ｍｇ／ｍＬである。また、１０Ｆｎ３骨格はジスルフィド結合も遊離のシステインも含まない；したがって、その環境の酸化還元電位には影響されない。１０Ｆｎ３のもう１つの利点は、抗原結合ループおよびＮ末端が、βサンドイッチの、Ｃ末端とは反対側の端にあるということである；そのため、１０Ｆｎ３骨格がＣ末端でチップに結合すると、抗原結合ループが、分析する溶液に最大限で接触可能になる。１０Ｆｎ３はわずか９４のアミノ酸残基からなる単一ドメインであるため、約２５０残基の単鎖抗体よりも高密度でチップ表面に固定することが可能である。また、１０Ｆｎ３骨格は、このドメインの溶解度が高いことからもわかるように、親水性であるため、チップ表面に対する望まれない結合を最小化する。
【０１３８】
１０Ｆｎ３骨格の安定性と、ライブラリー作製および結合物選択のための適合性は、テネイシン、Ｎカドヘリン、Ｅカドヘリン、ＩＣＡＭ、タイチン、ＧＣＳＦ−Ｒ、サイトカイン受容体、グリコシダーゼ阻害剤、および抗生物質色素タンパク質のドメインのような、免疫グロブリン様の折畳みを持つ、タンパク質ドメインの１０Ｆｎ３様の大きなクラスにも共通している可能性がある。このようなドメインに共通の重要な特徴は、２つのβシートが提供する安定した枠組みであり、このβシートは互いに圧縮され、シートの１つの縁につき、少なくとも３つの溶媒が接触可能であるループによって結合する。そのようなループを無作為化して、枠組みの構造を破壊することなく、潜在的な結合物のライブラリーを作製することができる（上記）。さらに１０Ｆｎ３と同様に、これらのループのいずれか（または他のタンパク質由来の類似のループ）は、単独でまたは他のループと組み合わせて、固体支持表面上に対して固定化させてもよい。
【０１３９】
Ｆｎ３を基にした抗体模倣体の固定化
チップ表面にＦｎ３を基にした抗体模倣体のような抗体模倣体を固定するために、いくつかの典型的な手法が利用できる。例えば、このような抗体模倣体はＲＮＡ−タンパク質融合体として、融合体のＲＮＡ部分をワトソン・クリックハイブリダイゼーションによって、チップ表面に固定化したベースの相補的ＤＮＡに固定することができる（例えば、Ａｄｒｅｓｓａｂｌｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙｓ、米国特許出願第６０／０８０，６８６号；米国特許出願第０９／２８２，７３４号、および国際公開公報第９９／５１７７３号；およびＭｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｅｎｃｏｄｉｎｇ ａｎｄ Ｓｏｒｔｉｎｇ Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｔｒａｎｓｌａｔｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ、米国特許出願第６０／１５１，２６１号および米国特許出願第０９／６４８，０４０号に記述）。または、抗体模倣体は、チップ表面に直接遊離のタンパク質として固定できる。チップ表面に抗体模倣体を沈着させるためには、手作業およびロボット装置が使用できる。アレイ形式で高密度に抗体模倣体を沈着させるためには、スポットロボットが使用できる（例えば、Ｌｕｅｋｉｎｇら、Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ． １９９９ Ｍａｙ １５； ２７０（１）：１０３−１１の方法による）。抗体模倣体をチップ表面に結合させるためには、別の方法も利用できる。「酵素学の方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ）」（Ｍ． ＭｏｓｂａｃｈおよびＢ． Ｄａｎｉｅｌｓｓｏｎ編）、第１３５巻および１３６巻、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｏｒｌａｎｄｏ、Ｆｌｏｒｉｄａ、１９８７；ニルソン（Ｎｉｌｓｓｏｎ）ら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ． Ｐｕｒｉｆ． １９９７ Ｏｃｔ；１１（１）：１〜１６、およびその参考文献に記述されるものを含め、いくつかの標準的な固定化手法が使用できる。抗体模倣体の方向性を持った固定化は、チップに結合した抗体模倣体の結合容量を増加させる際に役立つ。方向性を持った結合のための典型的な手法は、リュー（Ｌｕ）ら、Ｔｈｅ Ａｎａｌｙｓｔ （１９９６）、ｖｏｌ． １２１、ｐ２９Ｒ−３２Ｒ；およびターコバ（Ｔｕｒｋｏｖａ）、Ｊ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ Ｂ Ｂｉｏｍｅｄ Ｓｃｉ Ａｐｐ． １９９９ Ｆｅｂ ５；７２２（１−２）：１１−３１に記述されている。さらに、抗体模倣体をチップ表面に結合させるための本明細書に記述されるいかなる方法も、抗体模倣体をビーズ、または他の支持体に固定するために使用できる。
【０１４０】
標的タンパク質の捕捉と検出
骨格結合物の選択された集団を用いて、例えば、生物試料のような試料中で、分析物標的の検出および／または定量ができる。この種の診断解析を行なうためには、関心対象の標的に対する選択された骨格結合体を適当な支持体上に固定して、多機能タンパク質チップを作製する。次に、チップに試料を載せ、試料中の成分で結合物に結合するものを、固定化した結合物の標的特異性に基づいて同定する。この手法を用いると、試料中の１つまたは複数の成分が、同時に同定または定量できる（例えば、試料のプロファイリングのための手段として）。
【０１４１】
標的の検出方法は、結合したタンパク質標的レベルの測定を可能にするものであり、Ｘ線撮影、蛍光スキャニング、質量分光（ＭＳ）、および表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を含むがこれらに限定されるものではない。リン光画像化システム（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）を用いたオートラジオグラフィも、例えば３５Ｓメチオニンで放射標識した標的タンパク質の検出と定量に使用できる。レーザースキャナーを用いた蛍光スキャニング（以下を参照のこと）は、蛍光標識した標的の検出と定量に使用できる。または、蛍光スキャニングを用いて、それ自身が標的タンパク質に結合する蛍光標識リガンドを検出することもできる（例えば、蛍光標識した標的特異的抗体、または標的−ビオチンに結合する、蛍光標識したストレプトアビジン、以下に記述）。
【０１４２】
質量分光は、結合した標的をその分子量によって検出および同定するために使用できる。結合した標的タンパク質の脱離は、下記のようにして、チップ表面から直接レーザーを用いて行なうことができる。質量の検出では、分子量に基づいて、リン酸化またはグリコシル化のような翻訳後修飾を含む標的の修飾も決定することができる。表面プラズモン共鳴は、骨格結合物が適当な金表面（例えば、スウェーデンのＢｉａｃｏｒｅより入手可能）に固定されている場合に結合したタンパク質標的の定量に使用することができる。
【０１４３】
以下に、該結合物（この場合、タンパク質ＴＮＦ−αに特異的なＦｎ結合物）の選択方法、および選択された集団を用いたチップ上での検出を例示する。本実施例は、本発明を説明するためのものであり、制限するためのものではない。
【０１４４】
１０Ｆｎ３骨格に基づくＴＮＦ−α結合物の選択
チップ上で骨格を選択するための１つの典型例では、無作為化ループＢＣ、ＤＥ、およびＦＧを持つヒト１０Ｆｎ３変異体のライブラリーを用いて、ＴＮＦ−αに対して１０Ｆｎ３に基づく選択が行われた。ライブラリーは、１つの無作為化ループを含め、ヒト１０Ｆｎ３の約３分の１をコードするヌクレオチド配列をそれぞれ含む、３つのＤＮＡ断片から構築された。上記のループ残基をコードするＤＮＡ配列は、関心対象の残基のコドンが （ＮＮＳ）ｎで置換されたように、オリゴヌクレオチド合成によって再構築された。式中、Ｎは４つのデオキシリボヌクレオチド（Ａ， Ｃ， ＧまたはＴ）のいずれかであり、ＳはＣまたはＧを表す。各断片のＣ末端は、ＦＬＡＧ精製タグの配列を含んでいた。
【０１４５】
ショスタック（Ｓｚｏｓｔａｋ）ら（ＲｏｂｅｒｔｓおよびＳｚｏｓｔａｋ、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９４：１２２９７， １９９７； Ｓｚｏｓｔａｋら、米国特許出願第０９／００７，００５号、および米国特許出願第０９／２４７，１９０号；Ｓｚｏｓｔａｋら、国際公開公報第９８／３１７００号）に記述されるように、クレノー酵素で伸長後、各ＤＮＡを転写し、ピューロマイシン含有ＤＮＡリンカーと連結し、インビトロで翻訳し、ｍＲＮＡ−ペプチド融合体を作製し、これをＤＮＡ−ｍＲＮＡ−ペプチド融合体に逆転写した。ＦＬＡＧタグの付いたペプチドをＭ２アガロースに結合することにより、フレームシフトまたは余分の終止コドンを含むものから、全長の融合分子が分離された；精製した全長の融合体に結合したＤＮＡをＰＣＲにより増幅した後、３つのＤＮＡ断片をＥａｒ Ｉ 制限エンドヌクレアーゼにより切断し、連結して全長の鋳型を形成させた。鋳型を転写し、ピューロマイシン含有ＤＮＡリンカーに連結し、翻訳して１０Ｆｎ３−ＲＮＡ／ｃＤＮＡライブラリーを作製した。その後、これを逆転写してＤＮＡ−ｍＲＮＡ−ペプチド融合ライブラリーを作製し、後に選択に使用した。
【０１４６】
ＴＮＦ−α結合物の選択は、５０ ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ ７．４、０．０２％ Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ、０．１ ｍｇ／ｍＬサケ精子ＤＮＡ中で行われた。ＰＲＯｆｕｓｉｏｎ（商標）ライブラリーは、セファロース固定ＴＮＦ−αとインキュベートした；洗浄後、最も強い結合物に伴うＤＮＡを０．１ Ｍ ＫＯＨで溶出し、ＰＣＲ増幅、転写、連結、翻訳、逆転写し、次の選択ラウンドの開始材料とした。
【０１４７】
そのような選択を１０ラウンド行なった（図１３に示す）；見かけの平均Ｋｄが１２０ ｎＭでＴＮＦ−αセファロースに結合するＰＲＯｆｕｓｉｏｎ（商標）プールが得られた。解析されたプールの特定のクローン成分は、５０ ｎＭ〜５００ ｎＭの範囲でＴＮＦ−α結合を示した。
【０１４８】
固定化、標的タンパク質の捕捉、およびＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ検出
Ｆｎ３融合体をチップ表面に固定するための第１段階として、自動ＤＮＡ合成装置（ＰＥ ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ Ｅｘｐｅｄｉｔｅ ８９０９）で、固相支持体ホスホラミダイド法でオリゴヌクレオチド捕捉プローブを調製した。全ての試薬はグレン・リサーチ（Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）から入手した。合成は、ジスルフィド結合を含む固相支持体から開始して、最終的に３’末端のチオール官能性が得られた。添加される最初の４つの単量体は、ヘキサエチレンオキシドユニットで、２０のＴ単量体が続いた。５’末端のＤＭＴ基は除去されなかった。捕捉プローブは固相支持体から開裂し、水酸化アンモニウムで脱保護し、真空遠心分離で乾燥するまで濃縮し、トリエチルアンモニウム酢酸緩衝液中のアセトニトリル勾配を用いて、逆相ＨＰＬＣで精製した。ＨＰＬＣの適当な画分を回収し、真空遠心分離で乾燥するまで蒸発させ、３０分間の８０％ ＡｃＯＨ処理によって５’末端のＤＭＴ基を除去した。酸は気化により除去し、次にオリゴヌクレオチドは１００ ｍＭ ＤＴＴで３０分間処理してジスルフィド結合を開裂させた。ＤＴＴはＥｔＯＡｃで繰り返し抽出して除去した。オリゴヌクレオチドは残りの水相からエタノール沈殿させ、逆相ＨＰＬＣによって純度を確認した。
【０１４９】
３’チオールの捕捉プローブは脱気した１×ＰＢＳ緩衝液中で２５０μＭに調節して、少量の水を含む、アルゴンをフラッシュした（ａｒｇｏｎ−ｆｌｕｓｈｅｄ）チェンバー中で、単一の液滴（７５μＬ）として９×９ ｍｍの金をコートしたチップ（Ｂｉａｃｏｒｅ）に塗布した。室温で１８時間後、捕捉プローブ溶液を除去し、機能化したチップを穏やかに撹拌しながら５０ ｍＬの１×ＰＢＳ緩衝液で洗浄し（各１５分間、２回）、同様にして５０ ｍＬの水ですすいだ（各１５分間、２回）。残りの液体を注意深く除去して、機能化したチップは直ちに使用するか、またはアルゴン下で４℃で保存した。
【０１５０】
ラウンド１０のＴＮＦ−α選択（上記）で得られた１０Ｆｎ３融合体プールの約１ ｐｍｏｌを数時間リボヌクレアーゼ処理し、７０μＬ中で５×ＳＳＣに調節し、上述の機能化した金チップに単一の液滴として塗布した。５０μＬ容量のガスケット装置を使って、機能化チップで融合混合液を密封し、装置を４℃で連続的に回転させた。１８時間後に、装置を解体し、金チップを穏やかに撹拌しながら５０ ｍＬの５×ＳＳＣで１０分間洗浄した。チップ表面から過剰な液体を注意深く除去し、チップを４℃で１０分間、ブロッキング溶液（１×ＴＢＳ ＋ ０．０２％ トゥイーン２０ ＋ ０．２５％ ＢＳＡ）で不動態化した。過剰な液体を注意深く除去し、同一組成のブロッキング溶液中に５００μｇ／ｍＬ ＴＮＦ−αを含む溶液を単一の液滴としてチップに塗布し、ピペットマンで液滴を時々混合しながら４℃で２時間インキュベートした。結合溶液を除去した後、チップを穏やかに撹拌しながら４℃で５分間洗浄（５０ ｍＬ １×ＴＢＳ ＋ ０．０２％トゥイーン２０）し、室温で乾燥させた。第２のチップは、ハイブリダイゼーション混合液に融合体が添加されなかったこと以外は、上記と同様に調製した。
【０１５１】
次に、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦマトリックス（１：１エタノール／１０％ 蟻酸水溶液中、１５ ｍｇ／ｍＬ ３，５−ジメトキシ−４−ヒドロキシケイ皮酸）を、高精度３軸ロボット（ＭｉｃｒｏＧｒｉｄ， ＢｉｏＲｏｂｏｔｉｃｓ）を用いて、金チップに均一に塗布した。マトリックスを３８４ウェルのマイクロタイタープレートからチップに移すのに１６ピンのツールが使用され、６００ミクロンのピッチを有する直径２００ミクロンの形質が作られた。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析器（Ｖｏｙａｇｅｒ ＤＥ， ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）の機器設定は以下の通りであった：加速電圧＝２５ｋ、グリッド電圧＝９２％、ガイドワイヤ電圧＝０．０５％、遅延＝２００オン、レーザー出力＝２４００、低質量ゲート＝１５００、陰イオン＝オフ。金チップはチップのレベルをステージのレベルと同じに保つように、改変されたＭＡＬＤＩ試料ステージ上に１つずつ置かれ、適切なフライト距離を可能にした。装置のビデオモニターおよび運動制御システムを用いて、レーザービームが個々のマトリックス形質に向かうようにした。
【０１５２】
図１４および図１５は、それぞれ１０Ｆｎ３融合体チップおよび非融合体チップの質量スペクトルを示す。いずれも、スペクトルを集めるために少数の２００ミクロンの形質が分析されたが、図１５のほうが、かなり多くのデータ収集を要した。１７．４ ｋＤａのシグナルはＴＮＦ−α単量体に相当する。
【０１５３】
固定化、標的タンパク質の捕捉、および蛍光検出
洗浄済の１×３インチの顕微鏡スライドグラス（Ｇｏｌｄｓｅａｌ， ＃３０１０）を、ナノストップ（Ｎａｎｏｓｔｒｉｐ）（Ｃｙａｎｔｅｋ）で１５分間、１０％ ＮａＯＨ水溶液、７０℃で３分間、および１％ ＨＣｌ水溶液で１分間、各試薬の後に脱イオン水で十分にすすぎながら処理した。その後、スライドは無水硫酸カルシウム上で真空乾燥器中で数時間乾燥させた。９５％アセトン／５％水中の１％アミノプロピルトリメトキシシランを調製し、２０分間加水分解させた。スライドグラスは、穏やかに撹拌しながら加水分解したシラン溶液に５分間浸した。毎回新しい９５％アセトン／５％水を用いて、スライドを５分間穏やかに撹拌しながら１０回洗浄し、過剰なシランを除去した。その後、スライドを１１０℃で２０分間加熱することにより、保存処理した。シラン処理したスライドは、新しく調製した９０％ ＤＭＦ／１０％ピリジン中の０．２％フェニレン１，４−ジイソチオシアネート溶液に、穏やかに撹拌しながら２時間浸した。その後、９０％ ＤＭＦ／１０％ピリジン、メタノール、およびアセトンで順次洗浄した。空気乾燥後、機能化したスライドは、真空乾燥器中で無水硫酸カルシウム上で０℃で保存した。市販のアミン反応性スライド（３−Ｄ Ｌｉｎｋ， Ｓｕｒｍｏｄｉｃｓ）を用いて、同様な結果が得られた。
【０１５４】
オリゴヌクレオチド捕捉プローブは、従来のホスホラミダイド化学を用いて、自動ＤＮＡ合成装置（ＰＥ ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ Ｅｘｐｅｄｉｔｅ ８９０９）で調製された。全ての試薬はグレン・リサーチ（Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）から入手した。合成は、保護されているアミノ官能性を直交して持つ固相支持体から開始し、それにより３’末端のアミンが最後の脱保護段階まで曝露されないようにした。添加される最初の４つの単量体は、ヘキサエチレンオキシドユニットで、標準的なＡ， Ｇ， ＣおよびＴ単量体が続いた。すべての捕捉オリゴ配列は、固相支持体から開裂され、水酸化アンモニウムで脱保護し、乾燥するまで濃縮し、エタノール沈殿し、かつトリエチルアンモニウム酢酸緩衝液中のアセトニトリル勾配を用いて、逆相ＨＰＬＣで精製した。ＨＰＬＣの適当な画分を回収し、真空遠心分離で乾燥するまで蒸発させ、水の一部とともに蒸発させた。
【０１５５】
精製したアミン標識捕捉オリゴは、１０％グリセロールを含む５０ ｍＭ炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ ９．０）中で、２５０μＭの濃度に調節した。プローブを３軸ロボット（ＭｉｃｒｏＧｒｉｄ， ＢｉｏＲｏｂｏｔｉｃｓ）を用いて、アミン反応性ガラス表面上の５×５×６アレイパターン中の規定の位置にスポットした。１６ピンのツールを用いて、３８４ウェルのマイクロタイタープレートから液体を移し、６００ミクロンのピッチを有する２００ミクロンの形質を作製した。２４の形質の各サブグリッドは、単一の捕捉プローブ（すなわち、２４の重複するスポット）に相当する。アレイは湿度が飽和した環境中で、室温で１２時間〜１８時間インキュベートした。接着反応は、チップを２％水酸化アンモニウム水溶液中に穏やかに撹拌しながら５分間浸すことで停止させ、蒸留水ですすいだ（各５分３回）。最後にアレイを室温で３０分間１０×ＰＢＳに浸漬してから、蒸留水で５分すすいだ。
【０１５６】
１０Ｆｎ３ ｍＲＮＡと共に特異的かつ熱力学的に等エネルギーの配列が、自己集合および１０Ｆｎ３タンパク質固定のための捕捉ポイントとして役立つことが明らかにされた。ソフトウェアプログラムＨｙｂＳｉｍｕｌａｔｏｒ ｖ４．０ （Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｇｅｎｅ Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｉｎｃ．）は、潜在的な捕捉プローブの同定および解析を容易にした。６つの固有の捕捉プローブが選択され、チップ上にプリントされ、そのうちの３つは１０Ｆｎ３融合体プールのｍＲＮＡの共通領域（ＣＰ３’， ＣＰ５’およびＣＰｆｌａｇ）に相補的である。残りの３つの配列（ＣＰｎｅｇ１， ＣＰｎｅｇ２およびＣＰｎｅｇ３）は相補的ではなく、部分的に陰性対照として働く。上述のように、捕捉プローブは各々３’アミノ末端および４つのヘキサエチレンオキシドスペーサーユニットを持っている。以下は、使用した捕捉プローブの配列リストである（５’→３’）：
2004526419.tif 000013
ラウンド１０のＴＮＦ−α選択由来の約１ ｐｍｏｌの１０Ｆｎ３融合体プールを、総容量３５０μＬ中での０．０２％トゥイーン２０および２ ｍＭバナジルリボヌクレオチド複合体を含む、５×ＳＳＣに調節した。４００μＬガスケット装置下で全体量をマイクロアレイに添加し、この集合を室温で１８時間、連続的に回転させた。ハイブリダイゼーション後、スライドを５００ ｍＬの５×ＳＳＣ、２．５×ＳＳＣ、および１×ＳＳＣで順次５分ずつ洗浄した。液体の痕跡は遠心分離で除去し、スライドを空気乾燥させた。
【０１５７】
組換えヒトＴＮＦ−α（５００μｇ、凍結乾燥、ＰｒｅｐｒｏＴｅｃｈ由来）を２３０μＬの１×ＰＢＳに入れ、Ｍｉｃｒｏｄｉａｌｙｚｅｒユニット（３，５００ ＭＷＣＯ， Ｐｉｅｒｃｅ）中で、７００ ｍＬの撹拌した１×ＰＢＳに対して４℃で１８時間透析した。透析したＴＮＦ−αをＥＺ−Ｌｉｎｋ ＮＨＳ−ＬＣ−ＬＣビオチン化試薬（２０μｇ、Ｐｉｅｒｃｅ）で０℃で２時間処理し、Ｍｉｃｒｏｄｉａｌｙｚｅｒユニット（３，５００ ＭＷＣＯ， Ｐｉｅｒｃｅ）中で、７００ ｍＬの撹拌した１×ＰＢＳに対して４℃で１８時間再び透析した。得られた結合体をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析器によって分析し、単一のビオチン部分でほぼ完全に機能化されることが見出された。
【０１５８】
以下の過程は、各々４℃で連続回転または混合しながら行なった。タンパク質マイクロアレイ表面は、０．０２％トゥイーン２０および０．２％ ＢＳＡを含む１×ＴＢＳ（２００μＬ）による６０分間の処理によって、不動態化した。ビオチン化ＴＮＦ−α（不動態化緩衝液中１００ ｎＭ濃度に作製）を、マイクロアレイに１２０分間接触させた。マイクロアレイは０．０２％トゥイーン２０を含む１×ＴＢＳで洗浄した（５０ ｍＬ３回、各５分間）。蛍光標識したストレプトアビジン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ由来の２．５μｇ／ｍＬ アレクサ ５４６−ストレプトアビジン結合体、不動態化緩衝液中に作製）をマイクロアレイに６０分間接触させた。マイクロアレイを０．０２％トゥイーン２０を含む１×ＴＢＳで洗浄し（５０ ｍＬ２回、各５分間）、続いて１×ＴＢＳで３分間すすいだ。液体の痕跡は遠心分離で除去し、スライドを室温で空気乾燥させた。
【０１５９】
蛍光レーザースキャニングは、ＧＳＩ Ｌｕｍｏｎｉｃｓ ＳｃａｎＡｒｒａｙ ５０００システムで、１０μＭピクセルの解像度ならびにアレクサ ５４６色素用の予め設定された励起波長および発光波長を用いて行なった。リン光画像（ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｍａｇｅ）分析は、分子動態学ストーム（ｓｔｏｒｍ）システムを用いて行なった。マイクロアレイとリン光体保存スクリーンを直接接触させて、曝露時間は４８時間であった。リン光画像スキャニングは５０ミクロンの解像度の設定で行われ、データはＩｍａｇｅＱｕａｎｔ ｖ．４．３ソフトウェアで抽出した。
【０１６０】
図１６および図１７は、同一アレイのリン光画像および蛍光スキャンである。リン光画像は、３５Ｓメチオニンシグナルに基づいて、１０Ｆｎ３融合体がどこにハイブリダイズしたかを示す。蛍光スキャンは、標識ＴＮＦ−αがどこに結合したかを示す。
【０１６１】
他の態様
他の態様は、特許請求の範囲内である。
【０１６２】
本明細書で言及される全ての刊行物、特許、および特許出願は、参照として本明細書に組み入れられる。
【図面の簡単な説明】
【図１】ラクダ（濃青）およびラマ（淡青）より得られた抗体の重鎖における可変領域の構造間の比較を２つの配向からそれぞれ示す写真である。
【図２】ラクダ抗体の重鎖の可変領域（濃青）、ラマ抗体の重鎖における可変領域（淡青）、および１０番目のフィブロネクチン３型モジュール（１０Ｆｎ３）（黄色）の構造間の比較を示す写真である。
【図３】１０番目のフィブロネクチン３型モジュール（１０Ｆｎ３）を示す写真であり、ＩｇＧ重鎖における抗原結合ループに対応するループを赤色で強調した。
【図４】フィブロネクチン３型タンパク質ドメインおよび関連タンパク質ドメイン間の配列の整列化を図示するグラフである。
【図５】１０Ｆｎ３ドメイン、ならびにフィブロネクチン、テネイシン、コラーゲン、およびアンジュリンを含む１５個の関連タンパク質間の構造の類似性を示す写真である。この写真では、領域は以下のように分類されている：定常領域は濃青、保存領域は淡青、中性領域は白、可変領域は赤、およびＲＧＤインテグリン結合領域（可変）は黄。
【図６】９番目および１０番目のフィブロネクチン３型モジュールの空間充填モデルを２つの異なる配向からそれぞれ示す写真である。２つのモジュールおよびインテグリン結合ループ（ＲＧＤ）が分類されている。この図では、青が正電荷を帯びた残基を示し、赤が負電荷を帯びた残基を示し、白が無電荷の残基を示している。
【図７】７〜１０番目のフィブロネクチン３型モジュールの空間充填モデルを３つの異なる配向からそれぞれ示す写真である。４つのモジュールが分類されている。この図では、青が正電荷を帯びた残基を示し、赤が負電荷を帯びた残基を示し、白が無電荷の残基を示している。
【図８】フィブロネクチン３型ドメインを含むＲＮＡ−タンパク質融合体の異なる塩条件下における構造を図示する写真である。
【図９】ＰＣＲシグナル解析によって測定されたフィブロネクチン３型ドメインを含むＲＮＡ−タンパク質融合体の選択を図示する一連の写真である。
【図１０】ＲＮＡ−タンパク質融合体および遊離タンパク質の選択間における比較、ならびに本明細書に記載の選択間において、ＴＮＦ−αとの結合％での増加を図示するグラフである。
【図１１】ＩｇＧ、１０Ｆｎ３、Ｆｎ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３、およびＦｎ−ＣＨ２−ＣＨ３を示す一連の概略図である（左上から時計回りに）。
【図１２】ＩｇＧ（Ｘ線結晶学）および１０Ｆｎ３（ＮＭＲおよびＸ線結晶学）の既知の三次元構造に基づいたＦｎ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３の分子モデルを示す写真である。
【図１３】ＴＮＦ−α結合物の１０Ｆｎ３に基づく核酸−タンパク質融合体の例示的な選択の時間経過を示すグラフである。ＴＮＦ−α−セファロースに結合した、核酸−タンパク質融合体のプール（白抜きのひし形）および遊離のタンパク質のプール（白抜きの丸）の割合、ならびに未誘導化セファロースに結合した遊離タンパク質のプール（黒丸）の割合が示されている。
【図１４および図１５】ＴＮＦ−αＦｎ結合物によるＴＮＦ−α結合を示すグラフである。特に、これらの図はそれぞれ１０Ｆｎ３融合体チップおよび非融合体チップから得られた質量スペクトルデータを示す。
【図１６および図１７】それぞれ１０Ｆｎ３アレイのリン光画像および蛍光スキャンであり、ＴＮＦ−α結合を示す。
【図１８】ラマＶＨドメインおよび野生型ヒト１０Ｆｎ３ドメインの一次配列の整列化を示すグラフである。２つの配列の間の相同残基が示されている。選択されたクローンの約４５％で変異している無作為化ループの外の１０Ｆｎ３残基は、野生型１０Ｆｎ３配列の下の矢印で示されており、選択された残基を示す文字が付けられている。
【図１９】ラマＶＨドメインおよび野生型ヒト１０Ｆｎ３ドメインの模式図である。変異した枠組みの残基が示されている。
【図２０】元のライブラリー（Ｒ０）およびＴＮＦ−αを用いた１０回の選択後（Ｒ１０）から翻訳された遊離タンパク質プールの結合効率および特異性を示すグラフである。未誘導化セファロース、ＴＮＦ−α−セファロース、ＩＬ−１α−セファロース、およびＩＬ−１３−セファロースに対するタンパク質プールの結合が比較されている。
【図２１】最大３個のループのディスプレイのための一連のＩｇＧ様骨格である。
【図２２】最大４個、または６個のループのディスプレイのための一連のＩｇＧ様骨格である。
【図２３】ループ構造のディスプレイのための、ＩｇＧに関連のない一連の骨格である。
【図２４】固相表面に固定化された模倣物による標的（ＴＮＦ−α）の特異的キャプチャを示す写真およびグラフである。
【図２５】本発明の典型的なＴＮＦ−α結合体（配列番号：３３〜１４０）を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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2004526419.tif 000232
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