(57)【要約】本発明はエキソヌクレアーゼによる分解に対して安定化した次の成分をもつ核酸に関する。すなわちａ）所定の蛋白質のためにコードするコード配列、ｂ）選択的に、コード配列の発現を制御するプロモーター配列、およびｃ）少なくとも１つの線状配列の末端に、非固定化大容積分子Ｂと結合する成分ａおよびｂを含有して接合した分子Ａ。【特許請求の範囲】
【請求項１】
次の構成要素：
ａ）所定のペプチドまたは蛋白質のためにコードするコード配列、
ｂ）選択的に、コード配列の発現を制御するプロモーター配列、および
ｃ）少なくとも１つの線状配列の末端に非固定化大容積分子Ｂと結合する成分ａおよびｂを含有して接合した分子Ａをもつエキソヌクレアーゼによる分解に対して安定化した核酸。
【請求項２】
線状配列の両末端が各々１つの分子Ａと結合している、請求項１記載の核酸。
【請求項３】
成分ａおよび／またはｂと分子Ａまたは分子群Ａとの間にスペーサー配列が配置される、請求項１または２記載の核酸。
【請求項４】
各分子Ａが各々１つの分子Ｂと結合するか、または両分子Ａがただ１つの、分子Ａのために少なくとも２つの結合部位を有する分子Ｂと結合する、請求項２または３のいずれか１項記載の核酸。
【請求項５】
分子Ａがビオチンまたはジゴキシゲニンであり、分子Ｂがアビジン、ストレプトアビジンまたは抗ジゴキシゲニン抗体である、請求項１ないし４のいずれか１項記載の核酸。
【請求項６】
請求項１ないし５のいずれか１項記載の核酸の製造方法において、
１）構成要素ａ）および選択的にｂ）を含有する線状配列が製造される方法ステップと、
２）ステップ１）の線状配列がＰＣＲによって増幅され、少なくとも１つのプライマーまたは分子Ａを持っているプライマー対が使用される方法ステップと、
３）ステップ２）の産物が分子Ｂを含有する溶液でインキュベートされる方法ステップと、を有する方法。
【請求項７】
細胞を含有しない蛋白質生合成系または細胞による蛋白質生合成系におけるコード配列によってコードする蛋白質の製造方法における、請求項１ないし５のいずれか１項記載の核酸の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、安定化した核酸、その製造方法ならびにその使用に関する。核酸は、一本鎖または二本鎖のＤＮＡまたはＲＮＡ、さらにＰＮＡとしてよい。
【背景技術】
【０００２】
蛋白質はバイオテクノロジーおよび医療上の適用のために高純度で、特にまた大量に、すなわちミリグラム（ｍｇ）規模およびグラム（ｇ）規模で必要になる。巨大蛋白質の場合は、慣用的な合成が全く不可能であり、いずれにしても不経済である。
【０００３】
大規模な蛋白質の製造の可能なのは遺伝子技術による製造である。そのために所望の蛋白質のためにコードするクローン化ＤＮＡが外来ＤＮＡとして細胞内、特に原核細胞内にベクターもしくはプラスミドの形で導入される。次いでこれらの細胞が培養され、外来ＤＮＡによってコードした蛋白質が発現かつ獲得される。確かにこの方法ですでに相当量の蛋白質を、その限りで公知の措置、特にクローニングで獲得することはできるが、コストがかかる。とりわけ細胞はたいてい過渡的にのみトランスフェクトされ、とりわけ例外的な場合にのみ安定して固定化される。それ故、蛋白質の連続的な産生は、さらに前記コストのかかる措置によって製造しなければならない新鮮な細胞の常時補給を必要とする。
【０００４】
もう１つの試みは、いわゆる細胞を含有しないインビトロ蛋白質生合成である。この場合は天然に存在する細胞にある核酸から広範囲に放出され、アミノ酸、エネルギー供給物質および少なくとも１つの核酸によって置換される生物学的に活性の細胞抽出物が使用される。その際に付加した核酸が被製造蛋白質のためにコードする。核酸としてＤＮＡを使用するときは、ＤＮＡ依存性のＲＮＡポリメラーゼの存在が必要である。もちろん直接ＲＮＡ、ｍＲＮＡを使用してもよい。この方法により、このような蛋白質を短時間かつ、比較的適度の、遺伝子技術的にも、製造可能である費用で製造できるのみならず、むしろたとえば細胞毒性があり、そのため通常の遺伝子技術的細胞系で全く発現可能ではない蛋白質を製造することができる。もちろん付加した核酸自体を製造する必要があり、これは遺伝子技術的方法によりさらにコストがかかる。それに対して、しばしば天然による方法では蛋白質配列と結合した調節配列ならびにスペーサーのようなその他の配列を蛋白質合成の効率を改善するために使用することが望ましいことがある。
【０００５】
完全な、細胞を含有しない蛋白質生合成に使用可能な核酸の遺伝子技術的製造のための別法が、いわゆる発現ＰＣＲである。この関連性において被製造核酸内への調節配列（ならびに別の翻訳効率を促進する配列）の効率的な導入が増幅の枠組の中で特別の役割を果たしている。標的核酸内へのこのような別の配列の導入には非常に長いＰＣＲプライマーが必要である。長いプライマーは、一方で製造にさらにコストがかかり、他方では不均一ＰＣＲ産物の発生の確率を高める。
【０００６】
細胞を含有しない蛋白質生合成のための核酸の製造方式に関係なく、以下の基本的な問題がある。この蛋白質の合成方法の枠組の中では、いわゆる細胞溶解物が使用される。すなわち蛋白質生合成に本質的な成分および細胞基質を含有する細胞からの抽出物である。このような細胞溶解物の使用は、さらにまた原細胞の中に天然に存在する（エキソ）ヌクレアーゼが溶解物中に同時に引きずりこまれることも引き起こす。これらのヌクレアーゼは蛋白質生合成のために製造かつ使用した核酸の分解を生ぜしめ、その結果その半減期と共に最終的に蛋白質収率を低下させる。これは明白な理由から妨げとなる。同じ問題はもちろん細胞系の沈殿にも現れる。
【０００７】
実務から細胞を含有しない蛋白質生合成の枠組の中で天然に少量の（エキソ）ヌクレアーゼを含有する細胞溶解物を使用することが公知である。その一例は、Ｅｓｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉＳ−３０溶解物である。確かにそれによって合成系内で他の溶解物よりも改善された完全な核酸の半減期とそれによって核酸の同量の使用時に蛋白質収率の増加とを達成することはできるが、それにもかかわらず妨害的規模でのヌクレアーゼによる核酸による分解も行われる。
【０００８】
同様に実務から、洗浄の目的のために核酸の末端をアフィニティ分子たとえばビオチンを付与することが公知である。ビオチンはその場合に固定化したストレプトアビジンに結合することができ、それによって核酸が固定化され、溶液と該溶液の他の成分とから分離され、その後に−洗浄して−再び固相から分離される。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、たとえば細胞を含有しない蛋白質生合成系への使用時に改善された半減期と、それによって改善された蛋白質収率とを達成する核酸を提供する技術的問題を基礎においている。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
この技術的問題の解決のために本発明はエキソヌクレアーゼによる分解に対して安定化した次の成分をもつ核酸を教示する。すなわち
ａ）所定の蛋白質のためにコードするコード配列、ｂ）コード配列の発現を制御するプロモーター配列、ｃ）少なくとも１つの線状配列の末端で非固定化大容積分子Ｂと結合する成分ａおよびｂを含有して接合した分子Ａ。分子量が５００以上、好ましくは１０００以上、好ましくは１００００以上を有する分子を大容積分子Ｂと呼ぶ。合目的的には大容積分子Ｂは蛋白質である。分子Ａは少なくとも１つの自由な結合部位を分子Ａと対になる分子Ｂのために有する比較的小さい分子である。分子Ｂは、さらにまた分子Ｂと対になる分子Ａのために複数の結合部位を有してもよい。分子Ａと分子Ｂとの間の結合は、非共有的でも共有的でもよい。線状配列の末端のヌクレオチドへの分子Ａの結合は合目的的に共有的である。線状配列の３’末端にも５’末端にも各々１つの分子Ａが取り込まれるときは、３’−および５’−エキソヌクレアーゼに対する本発明による核酸の安定化が行われる。両末端で、二本鎖の核酸のセンス鎖でもアンチセンス鎖でもそれぞれ５’−末端に１つのプライマーを分子Ａで非ハイブリダイズすることによって分子Ａを接合することができる。
【発明の効果】
【００１１】
本発明は、調節したプライマーすなわち分子Ａをもっているプライマーによって簡単な方法でＰＣＲを利用し大量に少なくとも１つの末端に分子Ａをもつ核酸を製造できるという認識に基づいている。エキソヌクレアーゼの攻撃の防止のための大容積の保護基は、分子Bの形で簡単に付着させることができる。分子Ｂは、そのためにたとえば市販の廉価な蛋白質を使用できるので、容易に所望必要量を使用することができる。
【００１２】
分子Ｂが分子Ｂと対をなす分子Ａのために複数の結合部位ｎを有する場合には、この結合部位の一部、特にｎ−１結合部位を、まだ少量の分子Ａのみが、特に１つの分子Ａだけが分子Ｂに結合するように飽和することを合目的的としてよい。分子Ｂの結合部位の飽和のためにプライマーに結合しない分子Ａも、分子Ｂの分子Ａのための結合部位に結合する別の分子も使用してよい。溶液中に分子Ｂが所望必要量で使用され、飽和にもかかわらず各分子Ａが分子Ｂと結合できることは自明である。分子Ｂの結合に必要である分子Ｂの結合部位の飽和によって、分子Ｂが複数の分子Ａを結合することを防止することができ、それによって分子Ｂで分子Ａに結合したプライマーの凝集が生じ、これが核酸塩基配列の増幅を妨げうる。また分子Ｂでプライマーによって接合された分子Ａを介して複数の増幅した核酸塩基配列の会合が生じることもでき、これが核酸塩基配列の転写および／または翻訳を困難にし、それによって核酸塩基配列によりコードした蛋白質の翻訳量を縮小することができる。
【００１３】
複数の増幅した核酸塩基配列の会合を分子Ｂでプライマーによって接合した分子Ａを介して低減するために、特に防止するために、転写／翻訳を時間的に、直接増幅に続けて実施することを長所とすることができる。
【００１４】
本発明により、エキソヌクレアーゼは全く蛋白質合成のために製造かつ使用した核酸を攻撃かつ分解できず、または非常に低減した規模でのみできるということが達成される。それによって製造に費用がかかり、従って高価な核酸の半減期が発現系で著しく増加され、その結果、量的に同等またはさらに低減した核酸の使用により、同様に著しく増加した蛋白質の収率が生じる。
【００１５】
本発明は、さらに次の方法ステップを有する本発明による核酸の製造方法を教示する。すなわち１）構成要素ａ）およびｂ）を含有する線状配列が製造される、２）ステップ１）の線状配列がＰＣＲによって増幅され、少なくとも１つのプライマーまたは分子Ａをもっているプライマー対が使用される、３）ステップ２）の産物が分子Ｂを含有する溶液でインキュベートされる。
【００１６】
このような方法の特に好ましい実施形態は、次のハイブリダイゼーションステップを有するＰＣＲによる長い核酸の調製製造方法である。すなわち
ａ）核酸塩基配列が３’および５’末端でそれぞれ１つのアダプタープライマーでハイブリダイズされる、ｂ）ステップａ）の産物が３’および５’末端で伸長配列を含有するそれぞれ１つの伸長プライマーとハイブリダイズされ、核酸塩基配列から核酸塩基配列の３’および５’末端で伸長配列分だけ伸長かつ増幅された核酸配列が形成され、好ましくは最後の増幅ステップで使用したプライマーが分子Ａをもっている。
【００１７】
蛋白質のためにコードする配列が核酸塩基配列と呼ばれる。これは特に遺伝子であってよく、さらにまたイントロンを含まないゲノムからなる配列としてよい。伸長配列は、特に調節配列を包含する配列および／またはリボソーム結合配列を含有する配列であってよい。アダプタープライマーは比較的短い。アダプター配列の一部は核酸塩基配列に特異的であり、別の一部は一定であり、それぞれ１つの伸長配列にハイブリダイズする。
【００１８】
そこから様々な核酸塩基配列のためにそれぞれ「合致する」長さの伸長配列を使用する必要のないことが生じる。むしろ単に比較的短いアダプタープライマーを所定の核酸塩基配列に合わせなければならず、他方、伸長配列は、いわば汎用にすることができる。すなわち種々の核酸塩基配列に対して常に等しくもしくは若干少なく選択した伸長配列が使用可能である。比較的費用のかかる被製造伸長配列は幅広い利用に供することができ、特異的な核酸塩基配列のために単にアダプター配列を製造するだけである。しかしながらアダプタ配列は比較的短くすることができるので、これはあまり費用がかからない。
【００１９】
これは、たとえば調節配列もリボソーム結合配列も、それぞれ伸長プライマーの１つを介して、しかもさらにＰＣＲステップで核酸塩基配列に接合することを可能にする。特に高い転写−および／または翻訳効率の細胞を含有しない蛋白質生合成の原核系の中に付与する核酸を得ることができる。
【００２０】
本発明のこの実施形態の特別の長所は、一般的に適用可能の任意にコードする配列のための方法である。
【００２１】
最後に本発明は、細胞を含有しない蛋白質生合成系または細胞による蛋白質生合成系におけるコード配列によってコードする蛋白質の製造方法による本発明による核酸の使用を教示する。
【００２２】
細胞を含有しない蛋白質生合成の方法ステップに関しては、当業者が難なく基本的な特徴を一般化できる実施例を参照されたい。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
本発明による核酸に関しては、そこでエキソヌクレアーゼに対して配列の両末端の完全な安定化が保証されているので、線状配列の両末端が各々１つの分子Ａと結合した場合に有利である。
【００２４】
発現を大容積分子Ｂによって妨害しないために、構成要素ａおよび／またはｂと分子Ａまたは分子群Ａとの間にスペーサー配列が配置される場合が望ましいとすることができる。
【００２５】
個別的に各分子Ａは各々１つの分子Ｂと結合してよく、または両分子Ａが１つの分子Ａを有する分子Ｂのためにただ１つの、または、少なくとも２つの結合部位と結合してよい。前者の場合は線状産物が得られる。後者の場合は安定性に関してさらに改善できる環状化産物が得られる。
【００２６】
分子Ａはビオチンまたはジゴキシゲニンであってよく、分子Ｂはアビジン、ストレプトアビジンまたは抗ジゴキシゲニン抗体であってよい。これは大量かつ廉価に得られる市販品である。
【００２７】
分子Ｂがアビジンまたはストレプトアビジンである場合は、少量の分子ビオチンのみが、特にただ１つの分子ビオチンが分子アビジンまたはストレプトアビジンに結合するように、結合部位ｎの一部、特にｎ−１結合部位を飽和することを合目的的としてよい。アビジンまたはストレプトアビジンの結合部位の飽和のために、プライマーに結合しないビオチンも、アビジンまたはストレプトアビジンでビオチンのための結合部位に結合する他の分子も使用してよい。溶液中に分子アビジンおよび／またはストレプトアビジンが、飽和にもかかわらず各分子ビオチンが分子アビジンまたはストレプトアビジンを結合できる多さの必要量で使用されることも自明である。ビオチンの結合のためのアビジンまたはストレプトアビジンの結合の飽和によって、分子アビジンまたはストレプトアビジンが複数の分子ビオチンを結合し、それによって核酸塩基配列の増幅、転写または翻訳を妨害することができるので、ビオチンに結合したプライマーが分子アビジンまたはストレプトアビジンに凝集することを防止することができる。
【００２８】
本発明による核酸の製造方法の枠組の中で、継続形成が自明的な重要性をもち、ステップｂ）の産物がステップｃ）で３’末端と５’末端に各々１つの増幅プライマーでハイブリダイズすることができ、増幅した核酸塩基配列が形成される。次にステップｃ）のプライマーが分子Ａを供給することは自明である。また増幅プライマーは、一方で比較的短くかつ汎用に使用可能であり、従って容易に提供可能である。増幅プライマーを利用して、特に翻訳効率をさらに高める別の（より短い）配列を末端に接合することができる。また短い増幅プライマーを利用して核酸の末端で別の変形体および調節も僅かな費用で導入可能である。これは、それによって変形体および調節のために再び妨害する規模の費用がかかりうる様々な伸長プライマーを製造する必要がないので、特に長所となる。
【００２９】
特に本発明によるビオチン基を増幅プライマーの５’末端に結合することができる。それによってビオチン結合ストレプトアビジンによる核酸塩基配列のインキュベーション後にエキソヌクレアーゼ分解に対して安定化した核酸塩基配列が得られ、この核酸塩基配列はインビトロ蛋白質生合成系で安定化しない核酸塩基配列中で数倍、典型的には５倍以上、たとえば約１５分から約２時間の半減期の増加を有する。慣用的な環状プラスミドの各々と比較可能であり、このプラスミドをその限りで実質的に等価に置換できる線状構造物の安定化が達成される。
【００３０】
分子Ａは二重機能または多重機能を有し、たとえば同時にアンカー基として機能しうることも見て取ることができる。
【００３１】
アダプタプライマーは典型的にヌクレオチド＜７０、特に２０〜６０を含有する。伸長プライマーは典型的にヌクレオチド≧７０、また９０およびそれ以上を含有する。さらに増幅プライマーは、典型的にヌクレオチド＜７０、大抵は＜３０、典型的にヌクレオチド＞９を含有する。単にアダプタプライマーを所定の核酸塩基配列に特異的に適合させなければならず、これが比較的短い配列のために、僅かな費用と結びついている。
【００３２】
好ましくはステップａ）、ｂ）および選択的にステップｃ）が核酸塩基配列、アダプタープライマー、伸長プライマーおよび選択的に増幅プライマーを含有するＰＣＲ溶液中で実施される。これは合計６プライマー、２アダプタ配列、２伸長配列および２増幅配列を有する１段階ＰＣＲである。この場合、アダプタープライマーおよび伸長プライマーを低濃度で使用し、その限りで少量の中間産物のみを作るだけで充分である。中間産物は特に均質に存在する必要がなく、それによって費用のかかる最適化を廃止することができる。増幅プライマーの短縮によって増幅時に大量の核酸塩基配列への最適化が不要である。
【００３３】
上記実施形態の別法として、２段階のＰＣＲで作業する変形体は自明的な重要性をもつ。この場合、方法ステップＡ）のステップａ）およびｂ）は所定の第１サイクル数のための核酸塩基配列、アダプタープライマーおよび伸長プライマーを含有するプレＰＣＲ溶液中で実施され、方法ステップＢ）のステップｃ）が所定の第２サイクル数のためのステップＡ）からのＰＣＲ産物と増幅プライマーとを含有する主ＰＣＲ溶液中で実施される。この場合、ステップＡ）は、ステップＢ）の反応容積の１／２〜１／１０になる反応容積で実施してよい。次にステップＡ）で、少量の容積に限定されて、中間産物により高い濃度が生じ、もしくは明らかに少ない核酸塩基配列を使用してよい。ステップＡ）からステップＢ）へ移行する際にＰＣＲ開始容積による希釈によって再びアダプタープライマーならびに伸長プライマーが強く希釈され、その結果、増幅プライマーを介した核酸塩基配列の中への変形体および／または修飾体の組込みの確率は増大する。
【００３４】
個別的に前記第１の別法において、ＰＣＲは１０〜１００μｌ、好ましくは２０〜４０μlの反応容積中で、核酸塩基配列０．０１〜１００ｐｇ、好ましくは１〜５０ｐｇ、アダプタープライマー０．０５〜１０μＭ、好ましくは０．１〜５μＭおよび伸長プライマー０．００５〜０．５μＭ、好ましくは０．００１〜０．１μＭで実施され、所定の初期サイクル数後に増幅プライマー０．０１〜１０μＭ、好ましくは０．１〜１０μＭが添加され、それに続く所定数のサイクルによって増幅した核酸塩基配列が製造されるように処理することができる。前記第２の別法において次の反応条件が望ましい：ステップＡ）：反応容積＜１０μｌ、核酸塩基配列０．００１〜５０ｐｇ、好ましくは０．０１〜５ｐｇ、アダプタープライマー０．０５〜１０μＭ、好ましくは０．１〜５μＭおよび伸長プライマー０．０５〜１０μＭ、好ましくは０．１〜５μＭ、第１サイクル数１０〜３０、好ましくは１５〜２５、ステップＢ）：反応容積１０〜１００μｌ、好ましくは１５〜５０μｌ、ＰＣＲ開始溶液によりステップＡ）の溶液の補給によって得た、増幅プライマー０．０１〜１０μＭ、好ましくは０．１〜５μＭ、第２サイクル数１５〜５０、好ましくは２０〜４０。
【００３５】
本発明による核酸は、たとえば細胞を含有しないインビトロ蛋白質生合成のために、特に原核系に、好ましくはＥｓｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉＤ１０からの翻訳系に使用可能である。
【００３６】
本発明による使用は、好ましくは核酸ライブラリから所定の核酸塩基配列の選択的増幅に使用可能である。これは遺伝子配列の特性化を可能にし、この遺伝子配列が核酸塩基配列として使用され、得られた蛋白質は構造および／または機能に関して解析される。この観点の背景は、多数の遺伝子のための配列が知られているが、それによってコードした蛋白質の構造と機能が知られていないことである。従って単に配列自体として知られている遺伝子ライブラリの各エレメントをその機能について有機体で調査することができる。得られた蛋白質の構造および機能の調査は、この場合通常の生化学の作業方法に従う。
【００３７】
本発明による方法を利用して、１つの蛋白質のためにコードする核酸塩基配列および１つのリボソーム結合配列ならびに「プロモーター配列、転写ターミネータ配列、発現エンハンサー配列、安定化配列、およびアフィニティタグ配列」からなるグループから１つまたは複数の配列を含有する核酸を得ることができる。アフィニティタグ配列は精製のために分離系の中で（大抵が固定化した）結合部位に対して高いアフィニティを有する構造のためにコードする。それによってアフィニティタグを含有しない蛋白質の容易にかつ高類似性の分離が可能である。その一例がＳｔｒｅｐ−ｔａｇＩＩであり、これはストレプトアクチンとのアフィニティを有する８アミノ酸基からなるペプチド構造である。安定化配列は、それ自身でまたは構造に特異的な結合分子との結合後に、特にヌクレアーゼによって減成に対する安定化を生ぜしめる構造のためにコードする。このような安定化配列は、分子Ａで修飾しない末端に取り込むことができる。発現エンハンサー配列は、発現エンハンサー配列なしで核酸に対する翻訳効率を高める。この場合は、たとえば（非翻訳）スペーサーとしてよい。転写ターミネータ配列はＲＮＡ合成を終結する。その一例はＴ７ファージ遺伝子１０転写ターミネータである。転写ターミネータ配列は、３’エキソヌクレアーゼによる減成に対して安定化することができる。前記配列要素相互の好ましい相対的な配置は、以下の実施例から一般化することができる。
【実施例】
【００３８】
以下、本発明は単に有利な実施形態を示した例を利用してより詳しく説明する。
【００３９】
ＰＣＲ：
ＰＣＲは、トリス−ＨＣｌ１０ｍＭ（２０℃でｐＨ８．８５）、ＫＣｌ２５ｍＭ、（ＮＨ４）２ＳＯ４５ｍＭ、ＭｇＳＯ４２ｍＭ、各ｄＮＴＰ０．２５ｍＭ、ＰｗｏＤＮＡポリメラーゼ３Ｕ（ロシュ）ならびに本例で指示した量の核酸塩基配列を含む本例で定量化した反応容積で実施した。サイクルは９４℃で０．５分、５５℃で１分および７２℃で１分で実施した。
【００４０】
インビトロ発現：
インビトロ発現、文献箇所Ｚｕｂａｙ、ｇ．； Ａｎｎｕ． ＲｅＶ． Ｇｅｎｅｔ． ７：２６７−２８７（１９７３）に基づき以下のような変更によって実施した。Ｅｓｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉＳ−３０溶解物をＴ７ファージＲＮＡポリメラーゼ７５０Ｕ／ｍｌ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）および３００μＭ［１４Ｃ］Ｌｅｕ（１５ｄｐｍ／ｐｍｏｌ、アマースハム）で補充した。ＰＣＲ産物および制御プラスミドは、１ｎＭ〜１５ｎＭの濃度で使用した。反応は３７℃で実施し、その経過は後の時点で部分標本５μｌを反応混合物から抽出し、ＴＣＡ沈降によって［１４Ｃ］Ｌｅｕの組込みを評価した。別の部分標本１０μｌは、合成した蛋白質の分析のためにＳＤＳ−ＰＡＧＥを利用してオートラジオグラフィーに続いてホスホイメージャ−システム（モレキュラーダイナミクス）で抽出した。
【００４１】
プラスミド構造：
ウシ心臓脂肪酸結合蛋白質のためにコードして構成されたプラスミドｐＥＴ ＢＨ−ＦＡＢＰ（Ｓｐｅｃｈｔ，Ｂ．ら；Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ３３：２５９−２６９（１９９４））の高複製誘導体がｐＨＭＦＡと呼ばれる。ｐＥＴ ＢＨ−ＦＡＢＰのフラグメントはエンドヌクレアーゼＳｐｈＩとＥｃｏＲＩによる消化によって生成し、ベクターｐＵＣ１８の中に挿入した。Ｈ−ＦＡＢＰの合成にとり重要である配列に関して、プラスミドｐＨＭＦＡはオリジナルプラスミドと同一である。ここで線状化プラスミドは環状プラスミドよりも良好に挙動しないことを注記しておく。
【００４２】
プロモーターの上流に種々の配列領域を有する核酸の構造：
プラスミドｐＨＭＦＡは、プロモーターの下流に種々の配列領域を有する核酸の構造のためのマトリックスとして利用する。プロモーターの上流に塩基対０．５および２４９を有する構造体（例参照）ＦＡ１、ＦＡ２およびＦＡ４は、プライマーＰ１、Ｃ１およびＰ２ならびに下流のプライマーＰ３によって発生した。プロモーターの上流に１５塩基対の配列領域を有する構造体ＦＡ３は、エンドヌクレアーゼＢｇｌＩＩによるＦＡ４の消化によって得た。３０４０塩基対の配列領域を有する制御プラスミドｐＨＭＦＡ（ＥｃｏＲＶ）は、ＥｃｏＲＶによるプラスミドの消化によって得た。全産物は、「高純度ＰＣＲ産物精製キット」によるゲル抽出に続き、アガロースゲル電気泳動によって洗浄した。
【００４３】
アフィニティ洗浄：
Ｓｔｒｅｐ−ｔａｇＩＩを含有する脂肪酸結合蛋白質の洗浄（Ｖｏｓｓ，  Ｓ．ら；Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ． １０：９７５−９６２（１９９７））は、アフィニティカラム（２００μｌ）の容積を低減したほかは、製造者規則（ＩＢＡゲッティンゲン、ドイツ）に基づくアフィニティクロマトグラフィーを利用して実施した。結合した転写／翻訳の反応混合物は短く遠心分離し、次にカラムに取り込んだ。単離した画分はＳＤＳ−ＰＡＧＥ（上記参照）によるＴＣＡ沈降とオートラジオグラフィーによって分析した。
【００４４】
Ｈ−ＦＡＢＰ活性アッセイ：
インビトロ合成Ｈ−ＦＡＢＰを含む完全な反応混合物は、オレイン酸の結合の活性について調査した。様々な容積（０〜３０μｌ）にＨ−ＦＡＢＰを含有しない反応混合物を３０μｌまで充填し、翻訳緩衝溶液（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．６、７０ｍＭ ＫＯＡｃ、３０ｍＭ ＮＨ４Ｃｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．００２％ＮａＮ３）で最終容積１２０μｌに希釈した。比活性１０００ｄｐｍ／ｐｍｏｌを有するオレイン酸（アマースハム）２μｌ５ｍＭ［９．１０（ｎ）−３Ｈ］の添加後、サンプルを１時間３７℃でインキュベートした。サンプル５０μｌをゲル濾過（マイクロバイオスピンクロマトグラフィカラム；バイオ−ラート）を利用して非結合オレイン酸の除去のために使用した。溶離した画分の３Ｈ放射能は、シンチレーションカウンターで測定した。
【００４５】
核酸の安定化の分析：
放射性標識核酸を前記条件に従って、ただしｄＣＴＰ０．１６７μＣｉ／μｌ［α−３５Ｓ］の存在下に合成した。標識した核酸は、結合した転写／翻訳、反応容積４００μｌに使用した。部分標本３０μｌは、連続する時点で抽出した。リボヌクレアーゼＡ１５μｇ（ＤＮＡｓｅなし、ロシュ）の添加後、これを１５分間３７℃でインキュベートした。さらに３７℃で３０分間のインキュベートは、ＳＤＳ０．５％、ＥＤＴＡ２０ｍＭおよびプロテイナーゼＫ５００μｇ／ｍｌ（ジブコＢＲＬ）を全反応容積６０μｌで実施した。残留するＰＣＲ産物は、さらにエタノール沈降によって洗浄し、その後に減成電気泳動（ポリアクリルアミド５．３％、尿素７Ｍ、ＳＤＳ０．１％、ＴＢＥ）にかけた。乾燥したゲルは放射能の定量化のためにホスイメージャシステム（モレキュラーダイナミクス）を通過させた。
【００４６】
配列：
使用したプライマー配列は図１に示した。
【００４７】
例１：４プライマーによるＰＣＲ
図２に、４プライマーによる本発明による１段階ＰＣＲの模式図を示した。中央にまずエンドヌクレアーゼＮｃｏｌおよびＢａｍＨＩによる消化によりｐＨＭＦＡから５４８ｂｐ制限断片として得たＨ−ＦＡＢＰ（「ウシ心臓由来の均質および機能活性脂肪酸結合蛋白質」“homogeneous and functionally active fatty acid binding protein from bovine heart”）のための完全なコーディング配列を含む蛋白質のためにコードする核酸塩基配列が識別される（ならびに翻訳されず、アダプタープライマーまたは伸長プライマーとも相補的ではない３’−末端の１５０ｂｐ配列）。それに核酸塩基配列の末端と均質の末端を包む両アダプタープライマーＡおよびＢがハイブリダイズされる。アダプタープライマーＡは、さらにリボソーム結合配列を含む。アダプタープライマーＡおよびＢの外部末端に伸長プライマーＣおよびＤがハイブリダイズされる。伸長プライマーＣはＴ７転写プロモーターを含むＴ７遺伝子１０リーダー配列と、選択により下流に、たとえば５ヌクレオチドの配列とを包む。伸長プライマーＤはＴ７遺伝子１０ターミネータ配列を含む。
【００４８】
例２：プロモーターの上流の配列領域に依存するＨ−ＦＡＢＰ合成の効率
プロモーターの上流に種々の配列領域（０、５、１５、２５０塩基対）を有する４ＰＣＲ産物（ＦＡ１〜ＦＡ４）およびプロモーターの上流に３０４０ｂｐを有する線状化制御プラスミドｐＨＭＦＡ（ＥｃｏＲＶ）は、様々な濃度（１、５、１０および１５ｍＭ）でインビトロ転写／翻訳について調査した。図３は、０（下側曲線）を除き、全配列領域が蛋白質生合成の増加を生ぜしめることを示す。すでに５塩基対で充分である。
【００４９】
例３：ファージＴ７遺伝子１０転写ターミネータ／５’リーダー配列ファージＴ７遺伝子１０によるＨ−ＦＡＢＰ合成の改善。
【００５０】
図４に、ファージＴ７遺伝子１０転写ターミネータによって少なくとも係数２．８分だけ合成を改善できることが識別される。三角形はＦＡΔｔを表し、四角形はＦＡｔを表す（図２も参照）。
【００５１】
さらに図４に、３４ｂｐの欠失が転写開始とε配列（Ｏｌｉｎｓ， Ｐ．Ｏ．ら；Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ．  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２６４：１６９７３−１６９７６（１９８９））との間で産物形成の橋渡しをすることが識別される。円は変形ＦＡΔ３４を表す（図２も参照）。
【００５２】
例４：転写ターミネータ配列の状態の影響
ターミネータ配列の状態の影響の調査のために、産物ＦＡｓｔおよびＦＡａｓｔ（図２参照）を生成した。両者とも、２２ｂｐスペーサー配列がストップコドンとターミネータとの間で異なるプライマーを用いて挿入したこと以外は、ＦＡｔおよびＦＡａｔと同一である。図５に、スペーサー配列が約２倍の発現の増加を生ぜしめることが識別される。
【００５３】
しかし図５に、さらにＦＡｔおよびＦＡａｔの比較から、アフィニティタグが発現に全く影響を及ぼさないことも識別される。
【００５４】
例５：複合ＤＮＡ混合物からのＰＣＲ
本発明による方法の効果性および特異性を大量の適格ＤＮＡの存在下に調査した。ＦＡｓｔのＰＣＲは、以下を例外として、前記説明に準じて実施した。すなわち核酸塩基配列は０．１６〜２０ｐｇ／５０μｌ反応器容積の濃度で実施し、反応をＥｓｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉからクロモソマールＤＮＡ０．８３μｇを用いて、５分間超音波処理して補充した。５００万倍過剰の適格ＤＮＡの存在によってＰＣＲ産物の質も量も影響されないことが見出された。
【００５５】
例６：Ｓｔｒｅｐ−ｔａｇＩＩによるアフィニティ洗浄
放射性標識ＦＡａｓｔ１０μｇを含む反応混合物をアフィニティ洗浄にかけた。装填物質約８１％をカラムから得て、純産物として６７％を溶離画分中で得ることができた（アフィニティカラムの画分のＴＣＡ沈降から計算）。
【００５６】
例７：ＰＣＲ産物のアフィニティ。
Ｈ−ＦＡＢＰのサンプルを、プラスミドまたはＰＣＲ産物ＦＡａｓｔのいずれかを利用して合成し、相互にオレイン酸の結合活性について調査した。転写／翻訳後、非標識Ｈ−ＦＡＢＰ０〜３３０ｐｍｏｌを有する種々の容積を結合アッセイ中で前記方法の説明に従って調査した。活性は、製造方法に関係なく同一であることが見出された。
【００５７】
例８：ＰＣＲ産物の安定性
ＰＣＲ産物の安定性はできる限り発現の効果性を制限しうるかの調査のために、ＰＣＲ産物ＦＡａｓｔの減少を測定した。そのために放射性標識産物を使用した。所定の時間間隔で反応混合物の部分標本から抽出し、減成ポリアクリルアミドゲル電気泳動を利用して調査した。残留するＰＣＲ産物の量は、ゲルの放射能のスキャニングによって定量し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる反応混合物の分離後にゲル中のＨ−ＦＡＢＰの放射能のスキャニングによって測定して、蛋白質生合成の時間的推移と比較した。この結果は図６に示した。ＰＣＲ産物の半減期は約１００分になり、これがプラトー部でＨ−ＦＡＢＰ合成の流入に相当することが識別される。
【００５８】
例９：４プライマーによるＰＣＲの最適化条件
表１に、反応容積２５μｌ中の４プライマーによるＰＣＲ用の最適化条件をまとめた。
【００５９】
表１
ａ）反応成分
2004524035.tif 000002
ｂ）温度プログラム
2004524035.tif 000003
【００６０】
例１０：６プライマーによるＰＣＲ
例９からの物質を用いて、ただし付加的に２増幅プライマーｅ（２６ヌクレオチド）とｆ（３３ヌクレオチド）ならびに増加したアダプタープライマー濃度０．２μＭを用いて、変化させた伸長プライマー濃度を調節した。増幅プライマーに関しては、図１のＢＩＯＲおよびＢＩＯＦを参照されたい。ＢＩＯＦはビオチン標識フォワードプライマーであり、ＢＩＯＲはビオチン標識リザーブプライマーである。この構造は図７に示している。
【００６１】
高価な伸長プライマーの最小限の所要量は、初めに増幅プライマーなしで２５サイクル、それに続きさらに増幅プライマーつきで２５サイクル行ったときに生じた。伸長プライマーの濃度は、０．０２５μＭまでの増幅プライマーの使用によって低減することができた。これは係数の約１／２０であり、それにもかかわらずＰＣＲ産物の均質性と収率が改善された。
【００６２】
これらの長所は、中間産物の生成のために必要であるプライマーが低濃度で使用されるので、６プライマーの使用による高濃度での中間産物の形成の確率が、大幅に低減されることに基づく。従って中間産物は増幅プライマーによって指数関数的に富化させることができない。
【００６３】
例１１：２ステップでの６プライマーによるＰＣＲ
基本的に前記のような物質を用いて処理する。初めに反応容積５μｌ中のプレＰＣＲを核酸塩基配列０．１ｐｇ、しかもアダプタプライマー０．３μＭおよび伸長プライマー０．５μＭで２０サイクル以上実施する。次にこのように得た反応溶液をＰＣＲ開始容積で２５μｌに希釈する。次に増幅プライマーを最終濃度０．５μＭまで添加する。最後に、さらに３０サイクル増幅する。
【００６４】
例１２：ビオチンを含む核酸の安定化
プライマーＢＩＯＦおよびＢＩＯＲの使用下に６プライマーによるＰＣＲの方法で、前記のように核酸を製造し、その分解を時間の関数ならびに蛋白質合成の改善を調査する。これは図７および図８に示している。ビオチンにより、特にストレプトアビジンによる転換後、著しく改善された安定性が生じることが識別される。これは２０％までの高い蛋白質合成をもたらし、これは１つの系で少量の割合のエキソヌクレアーゼを有する。従ってこの例は、さらにこのような系で蛋白質合成効率の改善が達成されることを証明する。より多いエキソヌクレアーゼの量を有する溶解物を含む系内では、係数５まで、およびそれ以上の合成効率の改善が予想されている。
【産業上の利用の可能性】
【００６５】
前記例に関係なく、本発明による方法によって非常に容易な配列の変化も突然変異によって、たとえばタグポリメラーゼの使用および／または変化した反応条件によって可能であることを注記しておく。これが所望ではないときは、好ましくはより正確に機能し、プルーフリーディング活性を有するＰｗｏまたはＰｆｕを用いて処理してもよい。
【図面の簡単な説明】
【００６６】
【図１】ＰＣＲに用いたプラいマーの配列である。
【図２】図１に示す４プライマーを用いたＰＣＲの模式図である。
【図３】横軸に鋳型[ｎＭ]を示し、縦軸にＨ−ＦＡＢＰ合成［％］を示したグラフである。
【図４】横軸に鋳型［ｎＭ］を示し、縦軸にＴＣＡ沈降ロイシン［ｎＭ］を示したグラフである。
【図５】横軸に鋳型［ｎＭ］を示し、縦軸にＴＣＡ沈降ロイシン［ｎＭ］を示したグラフである。
【図６】横軸に時間［ｍｉｎ．］を示し、縦軸にＨ−ＦＡＢＰ合成［％］を示したグラフである。
【図７】５’−ビオチンの構造式と、ビオチン・ストレプトアビジンによる核酸の安定化を示した模式図、横軸に時間［ｍｉｎ］、縦軸にＴＣＡ沈降可能ＰＣＲ産物［％］を示したグラフである。
【図８】蛋白質合成に及ぼすストレプトアビジンの影響を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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