(57)【要約】本発明は、分子生物学の分野における種々の適用のための生物学的対象物を分離および単離するための小型装置の使用、ＤＮＡまたはタンパク質チップを作製するための方法、特に、前記方法を用いることによって得られるＤＮＡまたはタンパク質チップに関する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
分子生物学に関する適用のための、生物学的対象物を分離および／または単離するための小型装置の使用であって、該装置へ一体化された少なくとも１つの第一電極および該装置へ一体化されたまたは該装置に対して外部にある少なくとも１つの第二電極を備え、反応マイクロキュベットのマトリックスを備えた構造からなり、各マイクロキュベットが受入領域（ｒｅｃｅｐｔｉｏｎ  ｚｏｎｅ）を構成する底部を備え、該底部がホールを有さないことおよび各マイクロキュベットの該底部の最大表面積が単一の生物学的対象物を単離するように規定されていることを特徴とし、該構造が第一電極と第二電極との間に電位差を生じるように供給回路へ接続されている、使用。
【請求項２】
核酸チップ（ＤＮＡチップ）を作製すること、タンパク質チップを作製すること、ゲノムライブラリーを選別すること、転写物ライブラリーを分析すること、機能性タンパク質の活性における変化を測定すること、アンチバイログラムを成し遂げることのための、並びにタンパク質スクリーニングまたは薬学的スクリーニングのための、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
各マイクロキュベットの底部の最大表面積が単離される生物学的対象物の最小表面積の二倍より小さいか、または等しいことを特徴とする、請求項１または２に記載の使用。
【請求項４】
前記底部の表面積が単離される生物学的対象物の最小表面積より小さいか、またはそれに等しいことを特徴とする、請求項３に記載の使用。
【請求項５】
各マイクロキュベットの底部の最大表面積が１μｍ2〜４００μｍ2であることを特徴とする、先の請求項のいずれか一つに記載の使用。
【請求項６】
各マイクロキュベットの底部の最大表面積が１〜５０μｍ2であることを特徴とする、請求項５に記載の使用。
【請求項７】
マイクロリザーバーのマトリックスを形成するために、装置の反応マイクロキュベットのマトリックスの上に、少なくとも部分的に、１つ以上の絶縁材料（ｉｓｏｌａｔｉｎｇ  ｍａｔｅｒｉａｌ）の層および／または生体適合性プラスチック製の付属グリッドが載せられることを特徴とする、先の請求項のいずれか一つに記載の使用。
【請求項８】
絶縁材料がポリイミドおよび樹脂から選択されることを特徴とする、請求項７に記載の使用。
【請求項９】
マイクロリザーバーが５〜５００μｍの長さおよび／または幅であることを特徴とする、先の請求項のいずれかに記載の使用。
【請求項１０】
装置が少なくとも２層の絶縁材料を備えること、および該層の１つが装置の一体部品ではなく、該装置を少なくとも一部分覆う取り外し可能な取り付け部品の形態であることを特徴とする請求項７〜９のいずれか一つに記載の使用。
【請求項１１】
該装置へ一体化された第一電極の１つの面がマイクロキュベットの底部を構成することを特徴とする、先の請求項のいずれか一つに記載の使用。
【請求項１２】
マイクロキュベットの底部が、ガラス、プラスチックまたはシリコン製の層からなることを特徴とする、請求項１〜１０のいずれか一つに記載の使用。
【請求項１３】
第二電極が装置へ一体化されていること、およびそれがマイクロキュベットの底部から離れた水平面に設置されていることを特徴とする、先の請求項のいずれ一つかに記載の使用。
【請求項１４】
第二電極が装置に外付けされていること、およびそれがキャップ（ｃａｐ）またはリッド（ｌｉｄ）へ接合されることを特徴とする、請求項１〜１２のいずれかに記載の使用。
【請求項１５】
単離される生物学的対象物を付着させること（ａｔｔａｃｈｉｎｇ）ができる試薬が、反応マイクロキュベットの受入領域の少なくとも一部に付着されている（ａｔｔａｃｈｅｄ）ことを特徴とする、先の請求項のいずれか一つに記載の使用。
【請求項１６】
試薬が、付着されるべき生物学的対象物の型に特異的なタンパク質、ペプチドまたは任意の分子が付着される導電性コポリマーから選択されることを特徴とする、請求項１１、１３または１４のいずれか一つと組み合わせられた、請求項１５に記載の使用。
【請求項１７】
導電性コポリマーがポリピロール類から選択されることを特徴とする、請求項１６に記載の使用。
【請求項１８】
試薬が、ピロール−ビオチン−ストレプトアビジン−ビオチン−特異的分子コポリマーであることを特徴とする、請求項１６または１７に記載の使用。
【請求項１９】
試薬が、付着されるべき生物学的対象物の型に特異的でないポリマーから選択されることを特徴とする、請求項１２〜１４のいずれか一つと組み合わせられた、請求項１５に記載の使用。
【請求項２０】
前記ポリマーがポリ−Ｌ−リシンであることを特徴とする、請求項１９に記載の使用。
【請求項２１】
試薬がタンパク質またはペプチドであること、および前記試薬が付着される−ＮＨＳまたはアルデヒド官能基により修飾されたシランの層で、前記ガラス、プラスチックまたはシリコン製の層が覆われていることを特徴とする、請求項１２〜１４のいずれか一つに組み合わせられた、請求項１５に記載の使用。
【請求項２２】
装置がクロージング手段を備えている、先の請求項のいずれか一つに記載の使用。
【請求項２３】
単離される生物学的対象物が原核生物または真核生物細胞、ウイルス、リポソームおよび微細藻類であることを特徴とする、先の請求項のいずれか一つに記載の使用。
【請求項２４】
生物学的対象物がゲノム配列のライブラリーに由来する細菌から選択されることを特徴とする、先の請求項のいずれか一つに記載の使用。
【請求項２５】
少なくとも以下の工程ａ）およびｂ）：
ａ）生物学的対象物を分離および／または単離するための少なくとも一つの小型装置（該装置へ一体化された少なくとも１つの第一電極および装置へ一体化されたかまたは該装置に対して外部にある少なくとも１つの第二電極を備え、反応マイクロキュベットのマトリックスを備えた構造からなり、各マイクロキュベットがホールを有さず且つ受入領域を構成する底部を備え、該各マイクロキュベットの底部の最大表面積が単一の生物学的対象物を単離するように規定されており、該構造が第一電極と第二電極との間に電位差を生じるように供給回路へ接続されている）を、マイクロキュベット当たり多くとも１つの生物学的対象物の割合にて、受入領域（ｒｅｃｅｐｔｉｏｎ  ｚｏｎｅ）上のマイクロキュベットの底部に該生物学的対象物の付着を可能にするために生物学的対象物の均質化された溶液と接触させること、
ｂ）単離されるべき生物学的対象物が固定化されている小型装置を得るために、付着していない生物学的対象物を取り除くこと、
を含むことを特徴とする、核酸チップまたはタンパク質チップを得るためか、または機能性タンパク質を検出するための、生物学的対象物を分離および／または単離するための方法。
【請求項２６】
生物学的対象物が電場によって付着されることを特徴とする、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
生物学的対象物が、反応マイクロキュベットの底部の少なくとも一部へ付着した試薬を介して付着されることを特徴とする、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
生物学的対象物の付着がこのタンパク質と前記タンパク質に特異的な試薬との間の相互作用を介して起こるように、生物学的対象物の表面に存在する特定のタンパク質をコードする遺伝子を有するクローニングベクターを用いて、および／または、組換え生物学的対象物に対して毒性であるタンパク質をコードする遺伝子の発現を抑制するＤＮＡフラグメントをベクターへクローニングすることにより、生物学的対象物を形質転換することを含む、
工程ａ）に先立つ工程である工程を含むことを特徴とする、請求項２５〜２７のいずれか一つに記載の方法。
【請求項２９】
マイクロリザーバーを備える装置が使用されること、およびその間に生物学的対象物の遺伝物質が該マイクロリザーバーへ放出される工程を包含することを特徴とする、請求項２５〜２８のいずれか一つに記載の方法。
【請求項３０】
マイクロリザーバーおよび付着した生物学的対象物の透過化（ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ）に適した内部または外部の第二電極を備えた装置が使用されることを特徴とする、請求項２５〜２８のいずれか一つに記載の方法。
【請求項３１】
核酸チップを得るために使用されること、および増幅された配列を得るために、その間に単離された対象物の遺伝物質が増幅される工程を包含することを特徴とする、請求項２５〜３０のいずれかに記載の方法。
【請求項３２】
増幅された配列が、電解重合（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ）によって、使用される装置の第二電極へ付着されることを特徴とする、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
タンパク質チップを得るためか、または機能性タンパク質を検出するために使用されること、および工程ｂ）の後に、単離された生物学的対象物の遺伝物質のタンパク質への転写および翻訳のための工程を包含することを特徴とする、請求項２５〜３０のいずれか一つに記載の方法。
【請求項３４】
使用される装置の第二電極への前記タンパク質の付着の工程を包含することを特徴とする、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
機能性タンパク質を検出するために使用されること、および翻訳工程の後に、単離されたタンパク質の少なくとも１つの特徴を明らかにするための工程を包含することを特徴とする、請求項３３または３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記機能性タンパク質の活性に及ぼす種々の分子の影響をアッセイすることを含む、前記機能性タンパク質の活性における変化を測定するための工程を包含することを特徴とする、請求項３３または３４のいずれかに記載の方法。
【請求項３７】
組換えタンパク質チップを得るために使用されること、および工程ａ）の前に、組換えタンパク質をユニバーサルエピトープ（ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ｅｐｉｔｏｐｅ）で標識することを可能にするために、クローニングベクターで生物学的対象物を形質転換するための工程を包含することを特徴とする、請求項３３〜３５のいずれか一つに記載の方法。
【請求項３８】
請求項２５に記載の少なくとも工程ａ）およびｂ）、さらに発現において差異がみられる遺伝子を検出するための工程を含むことを特徴とする、転写物ライブラリーを分析するための方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、分子生物学の分野における様々な適用のために、生物学的対象物の分離および単離のための小型装置の使用、特にＤＮＡチップまたはプロテインチップ製造のための方法、並びにこれらの方法を用いて得られるＤＮＡチップおよびプロテインチップに関する。
【背景技術】
【０００２】
生物学、そして特にゲノミクスは、現在、この分野にて進められる分析からデータが生み出され、そして処理される方法において、大きな変革に直面している。生物の配列決定のための大きなプロジェクトに起因して、ますます多くの遺伝子配列データが利用可能になる一方、生物学、医学および製薬産業における従事者らは、大規模かつマルチパラメーター分析においてこれらのデータの全てを統合しようとしている。
【０００３】
マイクロ技術、特にマイクロシステムの世界は、小型化、表面官能化、マイクロ流体工学（ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ）および大規模かつ低コストの製造技術において習得した能力により、この要求を満たす手段を有する。
【０００４】
現在、これら２つの世界の一体化は、ＤＮＡチップとして知られる、マルチパラメトリック分析のための手段を生み出した。これらの手段は、生物学的高分子（たんぱく質、および主にＤＮＡ）の分析に捧げられる。
【０００５】
さまざまな分野において、マイクロ技術を介して、さらに小サイズでの生物学的プロトコールを統合する、多くの研究調査が、世界中に存在する。
【０００６】
例えば、マイクロタイトレーションプレート（ｍｉｃｒｏｔｉｔｒａｔｉｏｎ  ｐｌａｔｅ）は、一般的な９６−ウェルフォーマットから３８４−ウェルそして、その後、ロボット工学の進歩とともに１５３６‐ウェルフォーマットになっていった。これらのさらに小型化されたマイクロ技術の使用は、使用される試薬の容量を減らすことを可能にし、およびしたがって、分析コストの削減を可能にする。
【０００７】
ＤＮＡチップの特定の場合、分析原理は、２０μｍオーダーという、ますます小さいピッチ（ｐｉｔｃｈ）でのＸ−Ｙマトリックスにおいて、核酸プローブを配列（ａｒｒａｎｇｅ）することを含む。
【０００８】
同様に、生物学的試料を処理する工程は、重合連鎖反応（ｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）（ＰＣＲ）のＤＮＡチップへの統合、または細胞溶解機能へのますます一般的な統合を伴う、サイズ減少プロセスに供せられる。
【０００９】
したがって、誘電泳動によって電子チップ上に細胞を分離および付着することが、特にＵＳ  ｐａｔｅｎｔ  ６，０７１，３９４において、すでに提案され、好適な緩衝液中に懸濁された細胞が、それらの誘電性の関数として分離される。しかし、この技術は、個別化分析のために、単一の生物学的対象物を分離および単離することはできない。
【００１０】
使用される試薬量を減少させることに関する現在の傾向は、固体表面に付着した生物学的試薬上での検体アッセイの使用をもたらし、均質溶液を含むチューブにおけるアッセイの使用を徐々に止める。
【００１１】
したがって、所定の生物学的分子を、ガラス、プラスチックまたは金属等の様々な材料に付着させるための、様々な溶液が、すでに提案されている。例えば、支持体に核酸プローブを付着させるため、現在３つの主なアプローチが公知である：
−核酸プローブとの親和性を示すポリマーである、ポリ−Ｌ−リシンで覆われたガラス製支持体の使用（Ｓｃｈｅｎａ  Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  １９９５，  ２７０  （５２３５），  ４６７−４７０）、
−官能化シランで覆われたガラスの使用、その際、シランとの共有結合を形成するために核酸プローブは相補的機能を有する（Ｏ’Ｄｏｎｎｅｌｌ  Ｍ．Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎａｌ．  Ｃｈｅｍ．，  １９９７，  ６９，  ２４３８−２４４３）、
−例えば、金製の、金属電極の使用、単純なモノマーおよび核酸プローブを有するモノマーの共重合を可能にする。
【００１２】
プロテオミック分野において同様に、ピロール官能基を有する導電性ポリマー（ポリピロール類）によるペプチドの付着が、特に報告されている（Ｌｉｖａｃｈｅ  Ｔ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ  ＆  Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ，  １９９８，  １３，  ６２９−６３４）。
【００１３】
また、バクテリアまたは真核細胞等の生きた生物学的対象物を、以下の様々な技術によって、固体支持体に付着させることも可能である：
−付着させる細胞に特異的な抗体を固体支持体上へのグラフト（ｇｒａｆｔｉｎｇ）すること；分子生物学において一般的に使用される微生物（バクテリア、酵母）に対する抗体、Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，  Ｉｎｃ．社によって販売される抗−Ｅ．  ｃｏｌｉ  １４３４抗体等、さらに、より高等な真核リンパ系細胞の表面レセプター（ＣＤレセプター）に対する抗体が実際に存在する、
−特定の細胞タイプに特異的なぺプチドを該支持体へのグラフトすること（Ｈｏｌｌａｎｄ  Ｊ．  ｅｔ．  ａｌ．，  Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，  １９９６，  １７，  ２１４７−２１５６）、
−細胞接着を可能にするポリマーによる、該支持体の非特異的官能化（Ａｆｒａｍｉａｎ  Ｄ．Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇ．，  ２０００，  ６（３），  ２０９−２１６）。
【００１４】
これらの技術は、付着させる生物学的対象物と該支持体間に特異的結合の形成をつくり出している限り、有益である；しかし、それらは、最終的に該支持体に個別に付着できるようになる前に、調整および単離の多くの工程を必要とする。
【００１５】
さらに、特に国際出願ＷＯ００／０９７４７、ＷＯ００／３４５１２、およびＷＯ００／３４５１４において、核酸の試料からポリヌクレオチド配列および／または対応するたんぱく質を特定するための方法が、すでに提案されている。しかし、これらの方法は、ＤＮＡ断片の個々の調製および、多くのピペッティング作業を必要とする。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
したがって、本発明者らは、生物学的対象物を分離および単離するための小型装置を提供し、分子生物学の分野において様々なタイプの適用を行うことを可能にすると同時に、一方で、多数のポイントを有するマトリシアル（ｍａｔｒｉｃｉａｌ）アプローチを保存すること、［ここで各ポイントは、それぞれ、生物学的対象物の１つ、かつ１つだけのタイプまたはカテゴリー含むが、調製、分離または単離の前作業を回避、または削減でき、したがって操作、およびピペッティング作業の回数、ならびに費用を大幅に削減することができる］という目的を自らに課した。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
したがって、本発明の主題は、該装置内に一体化された少なくとも１つの第一電極、および該装置に一体化された、または外側の少なくとも１つの第二電極を含み、反応マイクロキュベットのマトリックスを備えた構造からなり、各マイクロキュベットは、受入領域（ｒｅｃｅｐｔｉｏｎ  ｚｏｎｅ）から構成される底部を含み、前記底部がホール（ｈｏｌｅ）を有さず、かつ各マイクロキュベットの前記底部の最大表面積が、単一の生物学的対象物を単離できるように規定されることに特徴付けられる、分子生物学に関連する適用のため、特に、核酸チップ（ＤＮＡチップ）製造、たんぱく質チップの製造、ゲノムライブラリーの分類、転写産物ライブラリーの分析、機能たんぱく質の活性変動の測定、アンチバイログラム（ａｎｔｉｖｉｒｏｇｒａｍｓ）の実施、およびたんぱく質スクリーニングまたは薬学的スクリーニングのために、前記第一電極および前記第二電極間の電位差を生じるように、前記構造が供給回路（ｆｅｅｄ  ｃｉｒｃｕｉｔ）に接続される、生物学的対象物の分離および／または単離のための小型装置の使用である。
【００１８】
本発明に従って使用される該装置のおかげで（各マイクロリザーバ（ｍｉｃｒｏｒｅｓｅｒｖｏｉｒ）が少なくとも１つのマイクロキュベットを有する）、今では、１マイクロキュベットあたり、１つだけの生物学的対象物を付着することが可能であり（付着する生物学的対象物の付着表面は、前記受入領域を覆う）、したがって、各マイクロキュベットは、選択された生物学的対象物の１つだけのタイプを含む。
【００１９】
したがって、本発明によれば、付着する生物学的対象物の付着ゾーン、またはマイクロキュベットの底部の生物学的対象物によって覆われるゾーン、実質的に受入領域と同等の表面積か、または受入領域の表面積よりも大きな表面積を有する。
【００２０】
本発明によれば、各マイクロキュベットの底部の最大表面積は、好ましくは、単離される生物学的対象物の最小表面積の２倍未満であるか、またはこれに等しい。本発明の好ましい実施態様において、前記底部の表面積が、単離される生物学的対象物の最小表面積以下である。
【００２１】
さらに詳しくは、この表面積が、一般的に、１μｍ2から４００μｍ2の間、さらに好ましくは、１から５０μｍ2の間である。
【００２２】
その後、選択され、付着された前記生物学的対象物は、特に付着していない生物学的対象物の除去、組換え生物学的対象物の分離および／または単離、例えば、化学的または電気的な溶解による、該生物学的対象物からの遺伝物質の放出（ｒｅｌｅａｓｅ）、それらが含む遺伝物質またはその一部の増幅のための工程、を含む分子生物学に関連する適用を実施するため、集合的に処理される。
【００２３】
組換え生物学的対象物の分離および／または単離のための本発明に係る前記装置の使用の場合、生物学的対象物を付着させるための工程の前に、これら２つの実施態様のうち一つまたはこれらを組み合わせが使用される：
−前記生物学的対象物を形質転換するためのクローニングベクター（（例えば、ＩＰＰ遺伝子の開始との融合によって）該生物学的対象物の表面に提示される特定のたんぱく質をコードする遺伝子を有し、その結果、本発明による装置で定義されるような試薬（小さい分子、または特定の抗体）と該タンパク質との間の相互作用を介し、該生物学的対象物の付着が起こる）。その結果、形質転換していない生物学的対象物は、本発明による小型装置に付着しない；
−ＤＮＡ断片のクローニングベクターへのクローニング、前記断片は、組換え生物学的対象物に対して有毒なタンパク質をコードする遺伝子発現を抑制する。
【００２４】
本発明の目的のため、“分子生物学に関連する適用”という表現は、特に、化学的または電気的エレクトロポレーション、マイクロキャピラリーによるマイクロインジェクション、生物学的対象物の溶解、例えばＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）またはＮＡＳＢＡ（核酸配列に基づく増幅）タイプの反応を用いた核酸の増幅、ローリングサークル核酸複製、遺伝子の転写および翻訳等において、ＲＮＡ、ＤＮＡまたはタンパク質を本発明に係る装置上にて得ることを可能にする適用を意味することを意図する。同様に、これらの適用は、ＤＮＡをメッセンジャーＲＮＡに転写する反応、およびメッセンジャーＲＮＡをタンパク質に翻訳する反応にも対応し得る。それらは同様に、組換えタンパク質発現、核酸またはタンパク質組成に従うゲノムライブラリーもしくは細胞培養物の分類、スクリーニング（組換えタンパク質、酵素または薬学的スクリーニング）、特に、与えられた標的に対するタンパク質またはヌクレオチドリガンドの探索において、診断、“ディファレンシャルディスプレイ”タイプの適用、核酸チップ、タンパク質チップ、転写産物ライブラリーの分析、ダブルハイブリッド、機能タンパク質の活性変動の計測、等の他の概念に関連し得る。
【００２５】
特に、該装置は、酵素のスクリーニングに使用され得る。
【００２６】
本発明に従って使用される装置は、実際には捕捉領域を構成する、受入領域に関心のある単一の生物学的対象物を付着させることを可能にする。
【００２７】
本発明によれば、該装置の反応マイクロキュベットのマトリックスは、マイクロリザーバのマトリックスを形成するため、少なくとも一部分は、１またはそれ以上の絶縁材料の層により、および／または生体適合性のあるプラスチック製の付属グリッドにより、載せられている（ｓｕｒｍｏｕｎｔ）．例えば、絶縁された材料を、ポリイミド、または、例えばＳＵ‐８樹脂のような樹脂等の絶縁ポリマーから選ぶことができる。
【００２８】
本発明によれば、生物学的対象物は、その容器および内容物によって特徴付けられる。前記容器は、前記内容物を区切ることを可能にするあらゆるエレメントに相当する。該容器は、例えば、バクテリア細胞の壁、ウイルスのエンベロープ、細胞膜、脂質二重膜、ミセル、内因性のタンパク質が貫通しているリン脂質二重層等でもよい。該内容物は、コンパートメント、即ち容器内に単離された生物学的対象物に相当する。前記内容物は、例えば、核酸、タンパク質、リボソーム、膜粒子、またはこれらの複雑な混合物に相当し得る。
【００２９】
生物学的対象物として、原核、真核、ウイルス、またはリポソーム等であろうとなかろうと、健常または健常でない全ての細胞があげられる。
細胞として、バクテリア、酵母、真菌、微細藻類、並びに、植物、動物およびヒト起源の細胞があげられる。
【００３０】
ウイルスとして、ＨＩＶウイルス、バクテリオファージ等があげられる。
【００３１】
同様に、この装置の内部、または外部の第二電極は、前もって付着していた所定の生物学的対象物から得られる１またはそれ以上のエレメント、該生物学的対象物の溶解、および／もしくは、例えば局所的ＰＣＲまたは他のあらゆる生物学的、化学的、または電気的処理等の増幅方法による処理から得られた産物を含むこれらの誘導体の、その後の付着を可能にする。これらの誘導体が、核酸に対応する場合、核酸チップまたはＤＮＡチップが参照される。これらの誘導体が、タンパク質に対応する場合、タンパク質チップが参照される。
【００３２】
該マイクロリザーバのサイズは、単離された単一の生物学的対象物を最小容量で処置するように規定される。これらのマイクロリザーバは、一般的に、幅および／また長さにおいて５〜５００μｍの間であり、好ましくは５〜１００μｍの間である。
【００３３】
本発明の特定の実施態様によれば、使用される小型装置は、代替の導電層（電極）および絶縁材料層を含むことができる。
【００３４】
本発明の１つの実施態様によれば、該装置内に一体化される第一電極の１面は、前記マイクロキュベットの底部を構成し得る。
【００３５】
本発明の他の実施態様によれば、前記装置のマイクロキュベットの底部は、ガラス、プラスチックまたはシリコン製の層からなる。
【００３６】
本発明に従って使用される該装置が一体化された第二電極を含む場合、この電極を、絶縁材料の第一層上に置き、そして前記マイクロキュベットの底部から離れた水平面に位置する。
【００３７】
本発明に従って使用される該装置が外部の第二電極を含む場合、この電極を、キャップまたは蓋に連結することができ、好ましくは１またはそれ以上の絶縁材料層を構成している。
【００３８】
したがって、絶縁材料層の１つは、本発明による装置の一体化部品でなく、取り外し可能な、少なくとも前記装置の一部を覆い、必要に応じて、少なくとも１つの電極を含有する、取り付け部品（ｍｏｕｎｔｅｄ  ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ）（カバー、キャップ、蓋）の形態にすることができる。
【００３９】
同様に、本発明に従って使用される装置は、該装置内に一体化された少なくとも１つの第三電極、第二および第三電極の間に介在する絶縁材料の第二層を含むことができる。この場合、および本発明の変化に従い、該装置は、互いに絶縁された数個の第二および／または第三電極を含むことができる。
【００４０】
本発明に従う装置において、第二及び／又は第三電極の一つ、並びに／或いは絶縁材料の第一及び／又は第二層の１つの少なくとも１つのエッジがマイクロリザーバのエッジの少なくとも一部を構成し得る。
本発明によれば、第一、第二および第三電極、ならびに外部電極は、例えば、クロミウム製、金製、またはプラチナ製の、少なくとも１つの金属層からなる。
【００４１】
これらの金属層は、一般的には、厚さ０．１〜１０μｍの間である。
【００４２】
本発明の１つの実施態様によれば、単離される生物学的対象物を付着させることができる試薬を、前記反応マクロキュベットの受入領域の少なくとも一部分に付着させる。
【００４３】
該生物学的対象物の付着に使用される試薬の性質は、それらの性質、および前記マイクロキュベットの底部の性質に従って変更することができる。
【００４４】
具体的には、該マイクロキュベットの底部が、上記の電極からなる場合、使用される試薬は、好ましくは、タンパク質、ペプチド、または付着される生物学的対象物のタイプに特異的なあらゆる分子、例えば、抗体、受容体、糖タンパク質、レクチン、細胞接着分子（ＣＡＭ）、ラミニン、フィブロネクチン、インテグリン、糖等が付着する、例えばポリピロール等の導電性コポリマーから選ばれる。
【００４５】
同一の装置内において、マイクロキュベット用の試薬は、同一であってもよく、または異なってもよい。
【００４６】
前記導電性コポリマーは、例えば、国際出願ＷＯ  ９４／２２８８９に記載される。
【００４７】
本発明によれば、ポリピロールが、特に好ましい。
【００４８】
前記導電性コポリマーのモノマーに付着し得るペプチドのうち、特に、Ｃ3ｂ補体断片等、および、例えばアルギニン−グリシン−アスパルテート（ＲＧＤとも呼ばれる）配列を含むペプチドといった、該生物学的対象物に対する膜表面受容体（ｓｕｒｆａｃｅ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）等の単離される生物学的対象物に特異的に結合するペプチドが、特にあげられる。
【００４９】
導電性コポリマーのモノマーに付着する特異的分子を、とりわけ、プロテインＡおよびプロテインＧから選ぶことができる。
【００５０】
下記の様々な技術に従い、特定の分子を、導電性コポリマーのモノマー、特に、ピロールモノマーに付着させることができる；
−前記特異的分子を、導電性ポリマーのモノマーに、直接的に付着させる（前記モノマーは使用される特異的分子の第一級アミン官能基と反応し得る−ＮＨＳ、またはアルデヒド官能基を有する）か、
−または、該特異的分子は連続的なストレプトアビジン−ビオチン−特異的分子化学的スタッキング（ｓｔａｃｋｉｎｇ）によってビオチン官能基を有する導電性ポリマーのモノマーに、間接的に付着させるかのいずれかである。この化学的スタッキングを生み出すため、本発明に従って使用される前記装置を、ビオチン官能基を有する導電性ポリマーのモノマーの共重合に影響を及ぼすように、その後、ピロール‐ビオチン‐ストレプトアビジン−ビオチン特異的分子コポリマーを得るように前期装置をストレプトアビジンで、そしてその後、ビオチンに結合した特異的分子で処理するために集合的に処理する。
【００５１】
第一の実施態様において、生物学的対象物を付着させるために使用される試薬は、直接的な相互作用、即ちマイクロキュベット試薬−生物学的対象物を可能にするため、前記対象物に特異的であり得る。
【００５２】
第二の実施態様において、使用される試薬は、該生物学的対象物に特異的ではない。したがって、前記対象物を、例えば、使用される試薬と反応し得る特異的な抗体で、前もって官能化しなければならない。該導電性ポリマーを介して前記捕捉領域にのみ付着した試薬、例えば、プロテインＡまたはタンパク質Ｂ等は、免疫化される該生物学的対象物に前もって付着させた抗体のＦｃ断片を認識する。
【００５３】
前記マイクロキュベットの底部が、ガラス、プラスチック、またはシリコン製の層からなる場合、好ましく使用される試薬は、以下：
−例えば、ポリ−Ｌ−リシン等の付着される生物学的対象物のタイプに特異的でないポリマーであって、該ポリマーは前記受入領域上に局所的に付着される（“リフト−オフ”技術：光画像化（ｐｈｏｔｏｉｍａｇａｂｌｅ）樹脂の付着、局所的絶縁の後、該樹脂上の前記ポリマーの付着、および該樹脂の脱ブロック化）、
−タンパク質またはペプチド；この場合、該タンパク質およびペプチドを、前記試薬を付着させる−ＮＨＳまたはアルデヒド官能基によって修飾されたシラン層で覆われた、ガラス、プラスチック、またはシリコン製の前記層に付着させる；この場合に使用される該タンパク質およびペプチドは、上記のものと、同一の性質を有する。
【００５４】
本発明の第二の実施態様によれば、前記反応キュベットの受入領域は、その単離が所望されている生物学的対象物を付着できるあらゆる試薬を含まない。
【００５５】
この場合、該生物学的対象物の付着は、直接的に電場を介して行われる。
【００５６】
この実施態様は、単離される生物学的対象物を付着させることができる試薬を用いた、本発明による前記装置の事前の官能化を回避するので、特に有利である。本実施態様は、バクテリアの単離、またバクテリアの付着に最もよく適用される。
【００５７】
該装置内に一体化された少なくとも１つの第一電極の存在、および本発明に従って使用される該装置に一体化されたまたは外部の少なくとも１つの第二電極は、例えば、生物学的対象物を溶解するための電場、共重合のための電場、または膜透過化のための電場の適用のような全てのマイクロキュベットにおいて同一の処置を行うことを可能にする。
【００５８】
特に、これらの電極は、例えば、微生物等の生物学的対象物の特異的付着を可能にし、、次いで、ひとたび微生物がマイクロキュベット中に付着すれば、微生物の溶解または浸透、および、大量の核酸を有するマイクロリザーバーを得るため、ゲノム増幅から得られた核酸プローブの電解共重合による付着が、各マイクロリザーバーにおいて直接的に行われる。
【００５９】
本発明に従って使用される全ての装置に存在する第二電極は、例えば、特定のタンパク質を各生物学的対象物から抽出するための特異的な抗体で前もって官能化されるか、または、さらに一般的には、電気化学によって、例えば、増幅または転写反応に続いて、生物学的対象物から得られる産物を付着させるために使用され得る。
【００６０】
上記された該小型装置の様々な適用は、作製されるために単離された生物学的対象物の遺伝物質のレプリカを必要とし得る。
【００６１】
これらのレプリカを、様々な方法によって製造することができる：
−第一装置（親の生物学的対象物）上に単離された様々な生物学的対象物を、培養し；その後、各生物学的対象物の均一な集団を、各マイクロリザーバーにおいて得る。子孫生物学的対象物とも呼ばれる、細胞増殖から得られた生物学的対象物を、例えば、第一装置の完全な複製を構成するように、ピペッティングにより、第二装置中に回収するされ得るか；
−または、各親の生物学的対象物からの遺伝物質を、例えば、導電性ポリマーのモノマーを有するプライマーを用いて、ＰＣＲによって増幅するかの、いずれかである。この増幅産物は、したがって、電場によって容易に回収され、そして新たな装置内に置かれ、その後前記新たな装置の電極に付着される；
−または各生物学的対象物からの遺伝物質は、第一装置（母チップ）上にてメッセンジャーＲＮＡに転写され、その後、このようにして得られたメッセンジャーＲＮＡは、集合的ピペッティング、または電場の適用により、第二の新たな小型装置（娘チップ）内に移され、この新たな装置の電極に付着される。
【００６２】
同様に、上記の小型装置は、以下の様にも使用される：
−該生物学的対象物の内部または外部に、一部またはそれらの遺伝物質を発現するため；この発現は、特に、転写および翻訳工程を含む；
−本発明に従う該小型装置上に単離されたタンパク質の少なくとも１つの特性を、前記特性を明らかにすることによって、検出するため；
−国際出願ＷＯ００／０９７４７、ＷＯ００／３４５１２、ＷＯ００／３５４１４およびＷＯ００／３４５１３において記載される方法のコンテクストにおいて；
−転写産物を分析するためであって、発現における相違に直面した遺伝子の検出のための工程を含む；
−前記機能性タンパク質の活性に及ぼす、様々な分子の影響が試験されることに特徴付けられる、機能性タンパク質の活性変化測定のため；
−タンパク質または薬学的スクリーニングのため、特に与えられた標的に対するヌクレオチドリガンドタンパク質もしくは酵素の探索のため。
【００６３】
この一連の方法において産生されたタンパク質は、様々な方法において明らかにされる：
−電気ショックによって単離された生物学的対象物内に導入される、個々のの明示が望まれる、発現したタンパク質のための基質；
−この一連の方法において発現した、産生されたタンパク質は、マイクロリザーバー内で電気ショックによって単離された生物学的対象物から除去され、その結果それらは、マイクロリザーバー内に付着され得るその基質の存在下において、特異的に明らかにされ得る；
−該生物学的対象物を溶解し、例えば、マイクロリザーバー内に付着され得る、それらの基質の存在下においてタンパク質を発現させる。
【００６４】
該方法のこの実施態様は、生物学的対象物の粗試料の核酸によってコードされる機能性タンパク質を分離、および特徴づけすることを可能にするため、有利である。
【００６５】
生物学的対象物付着の工程の前に、例えば、幾つかのヒスチジンアミノ酸での標識のような組換えタンパク質をユニバーサルエピトープで標識することを可能にする、生物学的対象物を形質転換するためのクローニングベクターを使用し、組換えタンパク質のみを、タンパク質チップに付着させることが可能である。
【００６６】
本発明に従って使用される該小型装置は、好ましくは、例えば、キャップ、または透明フィルム等の、個別または集合的に全てのマイクロリザーバーを密閉することを可能にする、閉鎖手段を備える。
【００６７】
該装置に一体化される第一電極、および前記装置の外部の第二電極を含む装置の使用は、浸透、遺伝物質の放出、もしくは、付着した生物学的対象物の溶解、核酸もしくは生物学的対象物から、または様々な分子生物学方法から得られたタンパク質の共重合に、特に適している。
【００６８】
もちろん、これらの図に描かれた装置は、本発明の個々の実施態様に対応するが、これらを限定するものではない。
【００６９】
本発明に従って使用される該小型装置の他の特徴は、添付の図１および６において表される。
【００７０】
そのような装置を製造する方法は、例えば、フランス特許出願ＦＲ−Ａ−２  ７８１  ８８６おいて公知であり、記載されている。
【００７１】
本発明によれば、単離される生物学的対象物を、例えば、ウイルスに感染した細胞、または悪性の細胞のような健常または健常でない細胞から選ぶことができる。したがって、これらの生物学的対象物は、原核または真核細胞、ウイルス、リポソーム、もしくは微細藻類に相当し得る。特に好ましい本発明の実施態様によれば、単離される生物学的対象物は、バクテリアまたは酵母から選ばれ、好ましくは、ゲノムシーケンスライブラリーから得られたバクテリアである。
【００７２】
特定の本発明の実施態様によれば、これらの小型装置は、核酸チップ、またはタンパク質チップ、もしくは、その他、機能性タンパク質の検出のために使用され得る。これらのＤＮＡチップまたはタンパク質チップは、本発明の他の主題を構成する。
【００７３】
したがって、本発明の主題は、核酸チップまたはタンパク質チップを得るため、もしくは機能性タンパク質を検出するための、少なくとも以下の工程ａ）およびｂ）を含むことで特徴付けられる、生物学的対象物を分離及び／又は単離するための方法でもある：
ａ）１つのマイクロキュベットあたり多くとも１つの生物学的対象物の割合で、マイクロキュベットの底部において、受入領域上で、前記生物学的対象物の付着を可能にするため、生物学的対象物の均質化溶液、特に、生物学的細胞培養溶液を少なくとも１つの上記小型装置と接触させること、
ｂ）単離される生物学的対象物がその上で固定化されている小型装置を得るため、付着していない生物学的対象物を除去すること。
【００７４】
本発明に従った方法の第一の実施態様によれば、該生物学的対象物は、電場を介して付着される。この場合、装置に一体化された第一電極がマイクロキュベットの底部を構成する該装置を好ましく使用する。
【００７５】
本発明に従う方法の第二の実施態様によれば、該生物学的対象物は、反応マイクロキュベットの底部の少なくとも一部に付着した試薬を介して、付着される。この場合、前記マイクロキュベットの底部を、第一電極、またはガラス、プラスチックもしくはシリコン製の層で等しく構成することができる。
【００７６】
本発明に従った方法は、工程ａ）の予備工程である、生物学的対象物の表面に提示される特定のタンパク質をコードする遺伝子を有するクローニングベクターを用い、上記のように、生物学的対象物の付着がこのタンパク質と前記タンパク質に特異的な試薬間の相互作用を介しておよび／またはベクターへのＤＮＡ断片のクローニング（組換え生物学的対象物に対して有毒なタンパク質をコードする遺伝子の発現を前記断片が抑制する）によって起こるように、生物学的対象物を形質転換する工程を含むことができる。
【００７７】
本発明の好ましい実施態様によれば、マイクロリザーバーを含む装置の使用し、そしてこの方法は当業者に公知のあらゆる技術（溶解、電気的ショック等）によって、その間に前記マイクロリザーバー内に、生物学的対象物の遺伝物質を放出する工程を含む。
【００７８】
この方法の間に使用される該装置は、好ましくは、付着した生物学的対象物の透過化に適した内部又は外部の第二電極を含む。
【００７９】
核酸チップを得るためにこの方法が使用される場合、増幅された配列を得るため、単離された対象物の遺伝物質が増幅される工程を含む。一般的に、この増幅工程に、使用される装置の第二電極上で、増幅配列の電解重合による付着の工程が続く。
【００８０】
タンパク質チップを得るため、または機能性タンパク質を検出するためにこの方法を使用する場合は、好ましくは、工程ｂ）の後、単離された生物学的対象物のタンパク質への転写および翻訳のための工程を含む。このようにして発現したタンパク質を、上記のように、使用される装置の第二電極に付着させることができる。
【００８１】
この方法を、特に、組換えタンパク質チップを得るために使用することができ、この場合、工程ａ）の前に、この方法は、次にユニバーサルエピトープで組換えタンパク質を標識することを可能とするため、クローニングベクターで、該生物学的対象物を形質転換するための工程を含む。
【００８２】
機能性タンパク質を検出するために、この方法を使用する場合、翻訳工程の後に、単離されたタンパク質の少なくとも１つの特性を明らかにするための工程を含む。
【００８３】
このようにして単離された機能性タンパク質の活性変化の測定は、様々な分子が、前記機能性タンパク質の活性に及ぼす影響を試験することを含む方法に従って、同様に行われる。
【００８４】
本発明の特定の実施態様によれば、核酸チップ（ＤＮＡチップ）を製造するための方法は、以下の工程を含むことで特徴付けられる：
ａ）１つのマイクロキュベットあたり多くとも１つの生物学的対象物の割合で、マイクロキュベットの底部において、受入領域上で、前記生物学的対象物の付着を可能にするため、
生物学的対象物の均質化溶液、特に、生物学的細胞の培養溶液と少なくとも１つの上記の小型装置を接触させること、
ｂ）単離される生物学的対象物が固定化された小型装置を得るため、付着していない生物学的対象物を除去すること。
ｃ）遺伝子増幅に必要な全ての試薬を含む通常の反応混合物であって、特に、ピロール基によって官能化された少なくとも１つのプライマーを含む前記反応混合物を、前記マイクロリザーバー内に導入すること、
ｄ）前記マイクロキュベットの底部に付着した生物学的対象物を溶解または透過化（ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚｉｎｇ）させてそれらが含む遺伝物質を、該配列を増幅するために必要な試薬に接触させること、
ｅ）核酸チップを得るため、増幅された配列を第二電極に付着させること。
【００８５】
これらのＤＮＡチップを得るため、図１、３および６に図示された装置を使用することが可能である。この場合、底部におよそ１μｍ2の表面積を有するマイクロキュベットを含む装置の使用が好ましく、細胞培養物は、好ましくは、ヌクレオチド配列のバクテリアライブラリーである。
【００８６】
本発明に従った方法は、単離される対象物のマイクロピペッティングも、微妙な配置も必要としない。
【００８７】
本発明の有利な点は、チップの全てのプローブを、集合的に産生することであり、該プローブの性質、およびそれらの発現量の程度は、開始培養の多様性に直接的に関連している。
【００８８】
例えば、開始細胞（バクテリア、酵母）を、ヌクレオチド配列（ゲノム配列、ｃＤＮＡ配列、ディファレンシャル（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ）配列など）を持った、組換えベクターのライブラリーを用いた宿主細胞の形質転換から得ることができる。該プローブは、ベクターに含まれるプライマーによって組換えベクターに含まれる、ヌクレオチド配列の増幅により産生される。次に、該チップは、クローンのライブラリーをプレーティング（ｐｌａｔｉｎｇ  ｏｕｔ）するためのマトリックスとして使用される。該チップは、各マイクロキュベットにおける各プローブの正確な性質は不明であることにおいて、ランダムである。
【００８９】
実際、バクテリアまたは酵母のクローニングは、通常固体栄養培地上に細胞をプレーティングすることによって行われる。その結果、この細胞は、空間的に他と区別される。多くの分裂（少なくとも２０時間を超える培養）の後、他と区別された細胞は、全てが同一の細胞のコロニーを形成する。このようにして、細胞の増殖が、組換えベクター内に存在する配列の増幅を間接的に誘導する。
【００９０】
この従来のクローニング方法における問題は、関心のあるコロニーを単離するために、明確に独立である、最大２０−３０バクテリア／ｃｍ2のコロニーを、均一にプレーティングできることである。その後、この関心のあるコロニーを、再び培養液中に戻す必要があり、さらに数時間の追加培養を要する。
【００９１】
他方、本発明に従った方法によれば、５０００クローン／ｃｍ2の同等物を、規則正しくプレーティングすることで、迅速に実現することができる。一時間以内に増幅することができ、ポリピロールによるグラフトすることを即座に行うことができる。
【００９２】
したがって、特定の微生物の培養、膜上への転移、およびＤＮＡの付着における問題は、回避される。
【００９３】
本発明によるＤＮＡチップは、例えば、遺伝子ライブラリーの大規模スクリーニングに使用され得る。
【００９４】
それらは、特に以下の事項を可能にする：
−探索されている遺伝子配列を含む、標識された（ポジティブ）マイクロリザーバーである、該チップ上にて標識され、ハイブリダイズされる既知の断片を使用し、遺伝子の完全配列を見出すこと；
−相同遺伝子の配列を含むポジティブマイクロリザーバーである、該チップ上にて標識され、ハイブリダイズされる開始遺伝子の配列を用いて、比較的緩和な（ｎｏｎｓｔｒｉｎｇｅｎｔ）ハイブリダイゼーションによって相同遺伝子（種間相同遺伝子または同じファミリー内の遺伝子）を見出すこと；
−ライブラリーの質を評価するためおよび量およびサイズによる発現量の程度のための基準を評価するために、問題の遺伝子をプローブとして用いて、ならびに、ポジティブマイクロリザーバー数をマイクロリザーバーの総数で割ることにより、ライブラリーの特定遺伝子の発現量の程度を決定すること；
−標準化されたライブラリー（全ての遺伝子が同じ回数（ｓａｍｅ  ｎｕｍｂｅｒ  ｏｆ  ｔｉｍｅ）を発現する）の質、サブトラクションライブラリー（同一のマイクロリザーバー上でのクロス−ハイブリダイゼーションがない）の質を評価すること。
【００９５】
本発明によるＤＮＡチップは、標的タンパク質の関数としてＤＮＡをスクリーニングするために使用され得る。この場合、該チップに付着したプローブは、プロモーターのパネルである。与えられたトランス−レギュレーション（ｔｒａｎｓ−ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ）標的タンパク質が付着する配列が、探索される。このタンパク質は、前もって標識され、そして該チップの各マイクロリザーバーにおいてインキュベーションされる。前記ポジティブマイクロリザーバーは、前記タンパク質に特異的なプロモーター配列を含む。
【００９６】
本発明による装置、ならびに、とりわけ図１および３に図示される、第二電極がユニバーサルエピトープに対する特異的な抗体（抗ＨＡ、抗ｍｙｃ、または抗ポリヒスチジン抗体）で官能化された装置は、タンパク質チップの製造にも使用され得る。
【００９７】
これらのタンパク質チップは、本発明の他の主題を構成する。
【００９８】
したがって、本発明の主題は、以下の工程を含むことを特徴と刷る、タンパク質チップの製造方法でもある。
ａ）１つのマイクロキュベットあたり多くとも１つの細胞の割合で、マイクロキュベットの底部において、受入領域上で、前記細胞の付着を可能にするため、上記に記載した少なくとも１つの小型装置と、後で組換えクローンを分類することを可能にする遺伝子を有する組換えベクターで形質転換された生物学的細胞の培養溶液と接触させること、前記ベクターは組換えタンパク質をユニバーサルエピトープ（例えば、ポリヒスチジン型）で標識することをも可能にする、
ｂ）単離される前記細胞が固定化される小型装置を得るため、付着していない細胞を除去すること、
ｃ）対応するタンパク質の合成を可能にするため、前記遺伝物質の転写および翻訳を誘導する試薬を、前記マイクロリザーバー内に導入すること、
ｄ）例えば、前記マイクロキュベットの底部に付着した生物学的対象物を溶解することによって、発現された前記組換えタンパク質を放出すること、
ｅ）ユニバーサルエピトープを有する前記タンパク質を該装置の内部の第二電極に付着させること（前記電極は、例えば、抗−ユニバーサルエピトープ抗体で前もって官能化される）、
ｆ）タンパク質チップを得るため、必要に応じて、生物学的対象物の他の構成要素を、洗浄によって除去すること。
【００９９】
該組換えタンパク質のみが、このチップ上に保持される。
このようにして得られたランダムプロテインチップは、例えば、ダブルハイブリッドアッセイまたは他のタンパク質／ＤＮＡ  タンパク質／糖  認識アッセイ等のように、例えばライブラリー中で相互作用し得るタンパク質パートナーを同定することが所望される標識標的タンパク質を用いるタンパク質／タンパク質認識アッセイ（ｐｒｏｔｅｉｎ  ／ｐｒｏｔｅｉｎ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ａｓｓａｙ）または生化学的アッセイを行うために使用され得る。
【０１００】
プロテインチップの製造はまた、ライブラリーの事前の選別（ｓｏｒｔｉｎｇ）をすることなく行われ得る。
【０１０１】
特定の実施形態に従って、例えば、図１および３中に図示される装置が使用される場合に、全ての試薬がピロール基を介して付着され得る。次いで、−ＮＨＳ官能基をもつピロールモノマーが合成され、該モノマーは、ＮＨＳ−ＮＨ2結合を介して種々の抗体へ（例えば、ユニバーサルエピトープ（ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ｅｐｉｔｏｐｅ）に対する抗体、固定化される細胞に特異的な別の抗体へ結合される。このように、例えば、（固定化される細胞に対する）ピロール−抗体１のモノマーおよび（ユニバーサルエピトープに対する）ピロール−抗体２のモノマーが得られる。次いで、本発明に従う装置は、ピロール／ピロール−抗体１混合物を含む溶液中に浸され、そしてマイクロキュベット（ｍｉｃｒｏｃｕｖｅｔｔｅｓ）の底部を官能化させるために、第一電極（ｆｉｒｓｔ  ｅｌｅｃｔｒｏｄｅ）が活性化される。
【０１０２】
リンス後、本発明に従う装置は次いで、ピロール／ピロール−抗体２混合物を含む溶液中に浸され、そしてそれを官能化させるために、第二電極（ｓｅｃｏｎｄ  ｅｌｅｃｔｒｏｄｅ）が活性化される。
【０１０３】
次いで、このように官能化された装置は、細菌の溶液中に浸される。次いで、第一電極において、認識および立体障害により、１つの細菌が各々のマイクロキュベットの底部に付着する。
【０１０４】
次に、タンパク質は、前述のように、細菌の内部で翻訳され、次いで、その細菌は溶解され、合成されたユニバーサルエピトープタンパク質（これらは、抗体２によって認識される場合、第二電極へ付着されるだろう）が放出される。
【０１０５】
この方法の別の特定の実施形態に従って、図６に表されるように、例えばガラスの層からなるマイクロキュベットの底部（ｍｉｃｒｏｃｕｖｅｔｔｅｓ  ｔｈｅ  ｂｏｔｔｏｍ）を含む装置の使用がなされる場合、非特異的ポリマーを介してか、またはＮＨＳシラン化（ｓｉｌａｎｉｚａｔｉｏｎ）及び固定化された細胞型に特異的な抗体１の付着を介して細菌を付着させることが可能であり、次いで上記のような手順が行われる。
【０１０６】
この方法の改変に従って：
ａ）上記に定義されたような少なくとも１つの小型装置（ここで、マイクロキュベットの底部はガラスの層からなる）を、各ミセルが遺伝子及びその遺伝子を仕切られた態様でｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて発現させるために要求される反応培地を含んでいるエマルジョンと、接触させ、該ミセルを、１マイクロキュベット当たり多くとも１ミセルの割合で受入領域（ｒｅｃｅｐｔｉｏｎ  ｚｏｎｅ）上のマイクロキュベットの底部に付着させること、
ｂ）単離されるミセルが固定化された小型装置を得るために、必要に応じて、付着していないミセルを取り除くこと、
ｄ）マイクロキュベットの底部に付着したミセルを溶解し、発現したタンパク質を放出させること、
ｅ）該タンパク質を装置内部の第二電極へ付着させ、これを官能化させること
ｆ）  必要に応じて、洗浄することによりミセルの他の成分を取り除き、プロテインチップを得ること、
を含む上記の工程を行うことによって、プロテインチップの製造が行われ得る。
【０１０７】
このエマルジョンの調製は、公知の方法において、および例えば、ＴａｗｆｉｋおよびＧｒｉｆｆｉｔｈｓ（Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  １９９８，  １６，  ６５２−６５６）によって記載されるように、行われ得る。
【０１０８】
エマルジョンはまた、ＤＮＡフラグメントをミセル中に仕切るような方法で、ＤＮＡ溶液の存在下において調製され得る。
【０１０９】
次いで、上記のような小型装置を用いて各ミセルが単離され、次いで各マイクロリザーバー中でＤＮＡフラグメント（これは、後に特定の場所で（ｌｏｃａｌｌｙ）転写され、次いで翻訳され得る）が放出されるように溶解され、このように得られたタンパク質の機能が研究される。本発明の装置のこの実施形態によって、上記のような小型装置中の機能性タンパク質を分離し、キャラクタライゼーションを行うことが可能になる。
【０１１０】
本発明の更に別の改変に従って、本発明に従う小型装置は、ランダムプロテインチップを製造するために使用され、同時に、一方でタンパク質（これは、ランダムＤＮＡチップの形態で、上記のように合成される）をコードするＤＮＡ配列の情報を保つ。
【０１１１】
これを行うために、ライブラリーの細胞は、少しの細胞分裂（ｃｅｌｌ  ｄｉｖｉｓｉｏｎｓ）が行われる第一のチップＡのマイクロキュベットの底部に上記のように固定化される。チップＡのマイクロリザーバーから対応するチップＢのマイクロリザーバーへ整列された仕方で細胞を移動させることによって、第一のチップＡのコピーが第二のチップＢの中で産生される（チップＡのマイクロリザーバーは、必要に応じて、攪拌しながらチップＢのマイクロリザーバーに面して置かれる）。
【０１１２】
次いで、チップＡは、ランダムＤＮＡチップを製造するために上に記載された処理にかけられ、一方チップＢは、対応するランダムプロテインチップを得るために上記の処理にかけられる。陽性マイクロキュベットの同定の後（チップＢ上でのタンパク質アッセイか、あるいはチップＡ上でのＤＮＡアッセイのいずれかによる）、次いで、チップＡ上のＤＮＡの配列またはチップＢ上の対応するタンパク質のものが直接的に得られる。
【０１１３】
本発明の主題は、また、以下の工程：
ａ）  上記に定義されたような少なくとも１つの小型装置（母チップ（ｍｏｔｈｅｒ  ｃｈｉｐ））  を、生物学的対象物の均質化された溶液と（特に、微生物の培養物の溶液と）接触させ、該生物学的対象物を、１マイクロキュベット当たり多くとも１つの生物学的対象物の割合で受入領域（ｒｅｃｅｐｔｉｏｎ  ｚｏｎｅ）上のマイクロキュベットの底部に付着させること、
ｂ）  単離される生物学的対象物が固定化された小型装置を得るために、必要に応じて、付着していない生物学的対象物を取り除くこと、
ｃ）ゲノム増幅に要求される試薬を全て含む一般的な反応混合物をマイクロリザーバーへ導入すること（該反応混合物は、特に、ピロール基で官能化された少なくとも１つのプライマーを含む）、
ｄ）  マイクロキュベットの底部に付着した生物学的対象物を溶解するか、または透過化し（ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚｉｎｇ）、それらが含む遺伝物質を増幅に要求される試薬と接触させ、これにより前記増幅を可能にすること、
ｅ）増幅された配列をメッセンジャーＲＮＡ（転写物）へ転写するための少なくとも１つのＲＮＡポリメラーゼを含む反応混合物を各マイクロリザーバーへ導入すること、
ｆ）工程ｅ）で得られた転写物を対応するタンパク質へ翻訳するための反応混合物を、各マイクロリザーバーへ導入すること、
ｇ）各マイクロリザーバーへ適切な基質を導入することによって、工程ｆ）において得られたタンパク質の少なくとも１つの特徴を試験すること、および必要に応じて、
ｈ）生物学的対象物の溶解を行い（工程ｄ）の間にこれが行われなかった場合）、次いで、陽性のタンパク質／基質反応が起こったマイクロリザーバーにおいて得られた遺伝子のシークエンスを行うこと、
を包含することを特徴とする、タンパク質（組換えであってもよいし、組換えでなくてもよい）をスクリーニングするための方法である。
【０１１４】
このスクリーニング方法に従って、工程ｃ）およびｄ）は、必要に応じて、同時に行われ得る。
【０１１５】
生物学的対象物が工程ｄ）において溶解された場合、本発明に従う方法は、次いで増幅された配列を電解重合（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ）によって電極へ集合的に付着させることを含むさらなる工程を含み得る。この場合、次いで、溶解された生物学的対象物の残余、および必要に応じて電極へ付着していない増幅された配列を取り除くために、マイクロリザーバーを洗浄することからなる工程が行われ得る。
【０１１６】
また、生物学的対象物が工程ｄ）において溶解された場合、本発明に従うスクリーニング方法は、工程（ｅ）において合成されたメッセンジャーＲＮＡをマイクロリザーバーの底部へ付着させるために、電極を分極化することを含む別の更なる工程を包含し得、この分極工程の後に、必要に応じて、マイクロリザーバーを洗浄することからなる工程が行われる。
【０１１７】
本発明に従うスクリーニング方法は、単離される生物学的対象物のマイクロピペッティングも厳密な位置づけ（ｄｅｌｉｃａｔｅ  ｐｏｓｉｔｉｏｎｉｎｇ）も要求しない。
【０１１８】
この方法は、実際、整列されたマトリックス上のタンパク質のスクリーニングを可能にすると同時に、一方で該マトリックスを作製するための個別のピペッティングを必要としない。
【０１１９】
また、陽性のタンパク質／基質反応が示されたマイクロキュベット中に含まれる遺伝子のみがシークエンスされるので、シークエンスが行わなければならない回数を制限することが可能である。
【０１２０】
この方法の特に好ましい実施形態に従って、使用される装置は、種々の反応（生物学的対象物の溶解または透過化（ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ）、ゲノム増幅、増幅された配列のメッセンジャーＲＮＡへの転写、転写物の対応するタンパク質への翻訳など）が起こっている間、マイクロリザーバーを閉じることが出来るクロージング手段（ｃｌｏｓｉｎｇ  ｍｅａｎｓ）を備える。
【０１２１】
増幅配列のメッセンジャーＲＮＡへの転写および転写物のタンパク質への翻訳のための反応混合物は、これらの操作を行うために慣例的に使用されるものである。それらは、例えば、国際出願ＷＯ  ００／０９７４７に詳述される。
【０１２２】
本発明の好ましい実施形態に従って、工程（ｅ）および（ｆ）は同時に行われる。
【０１２３】
この方法の有利な改変に従って、工程（ｄ）において生物学的対象物が溶解され、そして増幅された配列が電解重合によって電極へ付着された場合、次いで、工程（ｅ）の終わりに得られたメッセンジャーＲＮＡが、例えば集合ピペッティング（ｃｏｌｌｅｃｔｉｖｅ  ｐｉｐｅｔｔｉｎｇ）によって、前述のものと同じ新しい小型装置（娘チップ（ｄａｕｇｈｔｅｒ  ｃｈｉｐ））へ移送され、上記に定義されたように工程（ｆ）および（ｇ）が行われるであろう。
【０１２４】
この移送によって、最初の装置のマイクロリザーバーにおいて増幅された配列の完全な状態（ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ）を保つことが可能になる。特に、翻訳工程（ｆ）の間に使用される試薬は、ＤＮａｓｅｓ（これは、増幅された配列のＤＮＡに損傷を与え、続いてそれらが含む情報の利用（ｅｘｐｌｏｉｔａｔｉｏｎ）を妨げる）を含む。
【０１２５】
この移送は、特に、メッセンジャーＲＮＡを引きつけるように電場がかけられている金属ピンを備えた負に帯電した道具（ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｔｏｏｌ）を用いて行われ得る。後者は、次いで、この道具の金属ピンを脱分極化することによって、娘チップのマイクロリザーバー中に付着されるであろう。このように娘チップ上へ移送されたメッセンジャーＲＮＡは、次に、電場をかけることによって、娘チップの電極上へ引きつけられてもよい。
【０１２６】
また、工程（ｂ）に続き、適切な培養培地の存在下における少しの細胞分裂の後、単に使用している小型装置を同じ型の別の新しい小型装置（娘チップ）と面するように置くことによって、母チップ（ｍｏｔｈｅｒ  ｃｈｉｐ）／娘チップコピーが作製され得る。次いで、母チップおよび娘チップは共に上記のような工程（ｃ）および（ｄ）を経て、一方、次に娘チップのみが工程（ｅ）を経る。
【０１２７】
本発明に従って、母チップおよび娘チップが使用される場合、図２に表されるような装置（すなわち、装置に一体化された第一電極および該装置に対して外部にある第二電極）が使用され得る。
【０１２８】
次いで、娘チップは、反応混合物（これは、メッセンジャーＲＮＡを対応するタンパク質（標識されたアミノ酸）へ翻訳するために要求される試薬および合成されたタンパク質の活性をアッセイするための反応性基質を有するベシクル（例えば、リポソームのような）を含む）を集合的に受ける。
【０１２９】
一旦タンパク質翻訳反応が起こると、分子（標識されたアミノ酸／タンパク質）のサイズの関数として放射された放射物を識別するように、マイクロリザーバーごとにタンパク質合成の最初の確認が行われる（例えば、偏光蛍光測定（ｐｏｌａｒｉｚｅｄ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ）による）。
【０１３０】
次に、超音波処理の影響下でベシクルを破壊することによって、合成されたタンパク質の活性をアッセイするための反応基質を各マイクロリザーバー中に局所的に放出させる。
次いで、合成されたタンパク質の作用によってこの基質が修飾され得、この基質の修飾が任意の適切な手段によって検出される。
【０１３１】
それゆえ、この方法により、マイクロリザーバーが、アッセイされた基質の修飾の原因となるタンパク質を生成したことを決定づけることが可能になる。このとき、母チップの対応するマイクロリザーバー（陽性マイクロリザーバー）に付着した増幅配列をシークエンスするのに十分である。
【０１３２】
次いで、ピロール官能基を含まないプライマーを用いて、母チップをゲノム増幅のさらなるサイクルにかける。
【０１３３】
その後、陽性マイクロリザーバーの内容物を、特定の位置においてピペッティングし、そして従来法によるシークエンスが行われ得る個々のチューブへ分配され得る。
【０１３４】
上記のように定義された小型装置を使用して転写物ライブラリーを分析する場合、これらは、遺伝子がストレス（例えば、熱ショック、薬物への暴露、病理学的条件のような）に応答して異なる発現を示すことを決定することができる。
【０１３５】
それゆえ、本発明の主題はまた、上記の工程（ａ）および（ｂ）（生物学的対象物の小型装置への付着および付着していない生物学的対象物の洗浄）、ならびに発現において差異がみられた遺伝子を検出するための工程を包含することを特徴とする、転写物ライブラリーを分析するための方法である。
【０１３６】
この方法は、好ましくは、最初の工程において、以下を包含する小工程（ｓｕｂ−ｓｔｅｐ）が行われることを特徴とする：
−上記のような第一小型装置（母チップＡ）上で生物学的対象物Ａを単離すること、
−単離される生物学的対象物が固定化される装置を得るように、付着していない生物学的対象物Ａを洗浄すること、次いで、
−生物学的対象物Ａ（「ストレスが加えられた」細胞Ａ）からメッセンジャーＲＮＡを抽出する（例えば、種々の単離された対象物を溶解することによる）；
−細胞内容物をＤＮａｓｅを用いる処理にかけること、
−抽出されたメッセンジャーＲＮＡを新しい装置（娘チップＡ）のマイクロリザーバーへ移送すること（例えば、メッセンジャーＲＮＡを引きつけ、次いで付着させるように、電場を一時的にかけた金属ピンを備えた負に帯電した道具（ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｔｏｏｌ）による）、
−電場を用いて、娘チップＡの電極上へメッセンジャーＲＮＡを引きつけること
−対応するｃＤＮＡを合成させること、
−このように合成されたｃＤＮＡを、少なくとも１つのｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写用プロモーターおよび娘チップＡのマイクロリザーバー中へのそれらの特異的な付着を可能にする少なくとも１つのセグメントを含むヌクレオチドセグメントを用いて、標識すること。
【０１３７】
各々の標識されたｃＤＮＡ鎖は、このように、娘チップＡのマイクロリザーバー中に付着される。
【０１３８】
生物学的対象物Ｂ（細胞Ａと同じであるが、ストレスを加えられていない細胞）を用いて、これらと同様の操作が行われ得る。同じ方法で、その対応するｃＤＮＡは、娘チップＢのマイクロリザーバー中に付着されるであろう。
【０１３９】
次に、第二の工程において、娘チップＡは、細胞Ｂ由来のｃＤＮＡの非標識の鎖を含む溶液中に浸される。もし、非標識の鎖が娘チップＡ上の相補鎖にハイブリダイズするならば、機能的な二重鎖転写プロモーターを再構成することが可能である。
【０１４０】
蛍光ヌクレオチドを用いて、各マイクロリザーバーにおけるｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写工程を行うことにより、マイクロリザーバーが細胞Ａ由来のｃＤＮＡ上にハイブリダイズし得る細胞Ｂ由来のｃＤＮＡを含んでいることを明確にすることが可能になる。
【０１４１】
これと同時に、娘チップＢは、細胞Ａ由来のｃＤＮＡの非標識の鎖を含む溶液中に浸され、同様の明確化（ｒｅｖｅｌａｔｉｏｎ）が行われる。その後、マイクロリザーバーが細胞Ｂ由来のｃＤＮＡ上にハイブリダイズすることができる細胞Ａ由来のｃＤＮＡを含むことが明らかにされる。
【０１４２】
第三の工程において、娘チップＡおよびＢは、作製されたｍＲＮＡおよび標識されていないｃＤＮＡを取り除くために、処理される。
【０１４３】
次いで、娘チップＡおよびＢは、それぞれ細胞ＡおよびＢのｃＤＮＡの非標識鎖を含む溶液中に浸され、さらに、転写によって明確化が行われる。
【０１４４】
次に、各マイクロリザーバーにおいて得られたシグナルは、先の工程において得られたシグナルと比較され、そして、第二工程の完了時に陰性であり且つ第三工程の完了時に陽性であるマイクロリザーバー中に存在する遺伝物質が回収され、例えば、逆転写を行い、他と異なる発現を示した遺伝子をシークエンスすることによりキャラクタライゼーションされる。
【０１４５】
上記のような小型装置はまた、アンチバイログラム（ａｎｔｉｖｉｒｏｇｒａｍｓ）を実施するために、使用され得る。
【０１４６】
単一の型のウイルスでの細胞の感染に相当する実施形態において、アンチバイログラムは、ウイルスの増殖サイクルに必須なウイルス酵素の阻害剤を明らかにすること、これにより、殺ウイルス性の有効成分の同定を可能にすることを包含する。
【０１４７】
それゆえ、本発明の主題はまた、
−上記のように、感染したか、または感染した可能性がある細胞を小型装置上で単離すること、
−該細胞を溶解し、ウイルスの増殖サイクルに必須の酵素をコードする遺伝子を放出すること、
−例えば、当業者に公知の任意の技術により前記遺伝子を増殖すること、
−増幅産物を第二電極へ付着させること；例えば、この目的のために共重合ポリマーが使用されるであろう、
−増幅産物のみを保持するように、必要に応じて、細胞の他の成分を洗浄により除去すること、
−マイクロリザーバー中の該増幅産物を転写し、次いでタンパク質へ翻訳すること、
−各マイクロリザーバーにおいて、複数の阻害剤（同一であってもよいし、同一でなくてもよい）の存在下において得られたタンパク質の活性を明らかにし、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいてウイルス増殖に必須のウイルス酵素を阻害し得る阻害剤を明らかにすること、
を含む上記の工程を包含することを特徴とする、アンチバイログラムを成し遂げるための方法である。
【０１４８】
このタイプの実験はまた、この酵素に数種類のアイソフォームが存在する場合の酵素の発現量（ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ）の程度を研究することを可能にする。
【０１４９】
上記のような小型装置はまた、アンチバイログラムの別の実施形態に従って使用され得る。
【０１５０】
この場合、ウイルスの増殖サイクルに必須なウイルス酵素の様々なアイソフォームをコードする遺伝子を用いて形質転換されたライブラリーの細胞が、上記のような小型装置によって単離される。組換え細胞のみが単離される（上記のようにライブラリーを選別することによるか、あるいは選択培地上で事前に選択することによる）。装置上に保持されていない細胞は、洗浄により取り除かれる。次いで、ウイルス酵素をコードするタンパク質が発現し、研究されるウイルス酵素のアンチバイログラムを得るために、前述のように研究する。
【発明を実施するための最良の形態】
【０１５１】
上記の手法（ａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔ）に加えて、本発明はまた、本発明に従う小型装置上での細菌の固定化の実施例について、本発明に従う装置上でＤＮＡチップを作製するためのプロトコールを記載する実施例について、さらに本発明に従う小型装置上での遺伝物質の発現の実施例について、言及する以下の記載から明らかになるであろう他の手法を含む。
【０１５２】
実施例１：プロテインＡによる小型装置上での細菌の単離および付着
【０１５３】
０．１ｍｇ／ｍｌのプロテインＡ  リン酸緩衝液（ＰＢＳ）溶液を調製する。
次いで、ピペットを用い、このプロテインＡ溶液の滴を、該滴がマイクロキュベット全てを覆うように、本発明に従い且つ添付の図１に記載のような小型装置上に付着させる。
この装置において、各マイクロリザーバーは２３０μｍの直径および４０μｍの深さを有する；各マイクロキュベットの底部の表面積は４０μｍ2である。
【０１５４】
次いで、１０秒間、チップの２つの電極の間に電場をかける：プロテインＡの付着が望まれる電極において＋２．９Ｖの電圧をかけ、他方の電極を接地する。
【０１５５】
付着を行ったら、次いでこの装置をＰＢＳ溶液でリンスする。
【０１５６】
さらに、細菌／抗体複合体を含むＰＢＳの溶液を調製する。
【０１５７】
これを行うために、最初に、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５αのＰＢＳ溶液（１０9細菌／ｍｌ）を、対応する抗−Ｅ．ｃｏｌｉ抗体（Ｄａｋｏ）の溶液（０．５ｍｇ／ｍｌ）と共に調製しておく。
【０１５８】
次いで、これら二つの溶液を混合し（Ｖ／Ｖ）そして１時間３０分の間周囲温度にて攪拌し続け、細菌／抗体複合体を形成させる。次いで、細菌／抗体複合体を遠心により濃縮し、上清を取り除くことによって過剰な抗体を除去する。細菌／抗体複合体をＰＢＳ中に再溶解した後、この操作を３回繰り返す。
【０１５９】
次いで、ピペットを用いて、細菌／抗体複合体を含む溶液の滴を、該滴がマイクロキュベット全てを覆うように、プロテインＡで官能化（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｚｅｄ）された小型装置上へ付着させる。
【０１６０】
次いで、マイクロキュベットの底部に細菌／抗体複合体を固定化させるために、小型装置を１時間３０分間周囲温度にてインキュベートする。
【０１６１】
インキュベーションが終了したら、次に、この装置をＰＢＳで徹底的にリンスし、プロテインＡと反応しなかった細菌／抗体複合体を取り除く。
【０１６２】
Ｅ．ｃｏｌｉ細菌がマイクロキュベット当たり１細菌の割合で固定化された装置を得る。
【０１６３】
このように作製された本発明に従う小型装置は、次に、種々の生物学的適用に用いられ得る。
【０１６４】
実施例２：電場の影響下における小型装置上での細菌の単離および付着
【０１６５】
１）電場による細菌の付着
１０9細菌／ｍｌの比率の  Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５α細菌の脱イオン水中の懸濁液を調製する。
【０１６６】
次に、実施例１において上記で使用されたものと同じ小型装置を、この細菌懸濁液中に浸す。
【０１６７】
次いで、１０秒間、チップの２つの電極間に電場をかける：細菌の付着が所望される電極において＋０．９Ｖの電圧をかけ、他方の電極の電圧を−２Ｖに固定する。
【０１６８】
付着を行ったら、次に、この装置を水でリンスし、窒素ブローガン（ｎｉｔｒｏｇｅｎ  ｂｌｏｗ  ｇｕｎ）を用いて乾燥させる。
【０１６９】
Ｅ．ｃｏｌｉ細菌がマイクロキュベット当たり１細菌の比率で固定化されている装置を得る。
【０１７０】
このように作製された本発明に従う小型装置は、次いで、種々の生物学的適用において使用され得る。
【０１７１】
実施例３：本発明に従う小型装置を用いる、ＰＣＲによるＤＮＡチップの作製
【０１７２】
この実施例は、本発明に従う小型装置上でＤＮＡチップを調製するための一般的なプロトコールを記載する。
【０１７３】
１）本発明に従う小型装置上にセンスプライマーの付着
ピロール基（０．７７μＭ）で５’位置において修飾されたセンスプライマーの溶液（２．３-4Ｍ）を、２．３-2Ｍ  過塩素酸リチウム中で調製する。
【０１７４】
本発明に従い、実施例２において上記に調製したように、この溶液を小型装置上へ付着させる。
【０１７５】
次いで、電場を、３秒間、チップの２つの電極間にかける：プライマーの付着が所望される電極へ＋２．９Ｖの電圧をかけ、他方の電極を接地する。
【０１７６】
次に、小型装置を水でリンスし、窒素ブローガンを用いて乾燥する。
２）細菌の溶解
この工程は、細菌を９４℃の温度にて２分間加熱することによって行う。
【０１７７】
３）ＰＣＲの実施
以下の溶液を用いて、ＰＣＲを行った：１ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、５ｍＭ  ＫＣｌ、２ｍＭ  ＭｇＣｌ2、０．８ｍＭ  ｄＮＴＰ；５’位置においてビオチンで標識されたアンチセンスプライマー：０．１μＭ、１ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ、ＲｏｃｈｅからのＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（０．０２ｕｎｉｔｓ／μｌ）およびセンスプライマー（０．０１μＭ）。
【０１７８】
次いで、チップをオイル中に浸す。
【０１７９】
以下の条件下においてＰＣＲを行う：９４℃にて３分間、次に９４℃にて３０秒間、６０℃にて３０秒間および７２℃にて１分３０秒間を３０サイクル；次に、７２℃にて３分間、そして最後に２５℃にて３０秒間。このサイクルは、Ｈｙｂａｉｄ  ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒ中で行われる。
【０１８０】
次に、ＰＣＲサイクルの終了後、小型装置を水でリンスする。
【０１８１】
増幅されたＤＮＡをストレプトアビジン−フィコエリトリンで蛍光標識する。
【０１８２】
次いで、蛍光顕微鏡を使用して、蛍光を視覚化する。
【０１８３】
実施例４：本発明に従う小型装置上での遺伝物質の発現
【０１８４】
この実施例において、実施例１〜３において使用されるものと同じであり、８１００ウェルを備える小型装置を使用した。
【０１８５】
ベータ−ラクタマーゼ  ＴＥＭ−１  ｂｌａ遺伝子を含むＥ．ｃｏｌｉ細菌を、実施例２に上述した固定化方法に従ってこの装置上に固定化した。
【０１８６】
次に、実施例３に上述した条件下におけるＰＣＲによって、ｂｌａ遺伝子を増幅した。
【０１８７】
このように得られたＰＣＲ産物（５’位置から３’位置まで）は、Ｔ７プロモーター、リボソーム結合部位およびｂｌａ遺伝子のオープンリーディングフレームを含む。
【０１８８】
同様の方法で緑色蛍光タンパク質ＧＦＰ遺伝子を増幅することにより、コントロールチップ（コントロールとして使用することが意図される）を作製した。
【０１８９】
タンパク質の発現を可能にするために、これらの２つのチップを、一組の（ａ  ｃｏｕｐｌｅｄ）ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写／翻訳反応混合物で覆った。
【０１９０】
この混合液を、ＰｒａｔｔおよびＮｅｖｉｎに記載されるような方法に従って調製した（Ｐｒａｔｔ  Ｊ．  Ｍ．，  “Ｃｏｕｐｌｅｄ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ  ｃｅｌｌ−ｆｒｅｅ  ｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ：  Ａ  ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ”，  Ｈａｍｅｓ  Ｂ．  Ｄ．  ＆  Ｈｉｇｇｉｎｓ  Ｓ．  Ｊ．，  ＪＬＲ  Ｐｒｅｓｓ，  １９８４，  １７９−２０９；  Ｎｅｖｉｎ  Ｄ．  Ｅ．  ａｎｄ  Ｐｒａｔｔ  Ｊ．  Ｍ．，  “Ａ  Ｃｏｕｐｌｅｄ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｅｘｃｌｕｓｉｖｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  Ｔ７  ｐｒｏｍｏｔｅｒ，  ＦＥＢＳ，  １９９１，  ２９１，  ２，  ２５９−２６３）。
【０１９１】
次いで、各チップをカバースライドガラス（ｃｏｖｅｒ  ｇｌａｓｓ  ｓｌｉｄｅ）で覆い、そして、脱気することにより各マイクロリザーバーの効率的な充填を可能にするために、鐘状真空装置（ｖａｃｕｕｍ  ｂｅｌｌ）中に置いた。
【０１９２】
このように作製したチップを、（これらの試薬の蒸発を制限するために）水で飽和させた雰囲気において９０分間、３０℃にてインキュベートした。
次に、カバースライドガラスを取りはずし、各チップをニトロセフィン（Ｏｘｏｉｄ，  ｒｅｆ．  ＳＲ１１２Ｃ）で覆った。この試薬は、ベータ−ラクタマーゼによって加水分解されるときに、黄色から赤色へ変色する特徴を有する。
【０１９３】
得られた結果（示されない）は以下のようである：
コントロールチップ（ＧＦＰ遺伝子）上で、試薬は黄色のままであった。
ｂｌａ遺伝子ＰＣＲ産物を含むチップ上で、試薬は赤色に変化し、ベータ−ラクタマーゼＴＥＭ−１がこのチップ上で発現したことが示唆された。
【図面の簡単な説明】
【０１９４】
【図１】−図１は、支持体７および電気供給回路（ｅｌｅｃｔｒｉｃａｌ  ｆｅｅｄ  ｃｉｒｃｕｉｔ）１０３を備えた、本発明に従う小型装置を表し、ここで、各マイクロキュベット５の底部が、必要に応じて試薬を付着させる受入領域９を形成する第一電極１からなり、第一電極１は、マイクロリザーバー６を形成する絶縁材料４の第二層によって載せられた第二電極３が置かれる絶縁材料２の第一層によって載せられる、
【図２】−図２は、支持体２７および電気供給回路１０３を備えた、本発明に従う小型装置を表し、ここで、各マイクロキュベット２５の底部が、必要に応じて試薬を付着させる受入領域２９を形成する第一電極２１からなり、第一電極２１はマイクロリザーバー２６を形成する絶縁材料２４の第二層によって載せられた絶縁材料２２の第一層によって載せられ、この装置は外部第二電極２８を備える、
【図３】−図３は、支持体３７および電気供給回路１０３を備えた、本発明に従う小型装置を表し、ここで、各マイクロキュベット３５の底部が、必要に応じて試薬を付着させる受入領域３９を形成する第一電極３１からなり、第一電極３１はマイクロリザーバー３６を形成する絶縁材料３４の第二層によって載せられた第二電極３３が置かれる絶縁材料３２の第一層によって載せられ、この装置は外部電極３８を備える、
【図４】−図４は、同様に、各マイクロリザーバー４６を閉鎖することを可能にする、取り外し可能な閉鎖手段１００を含む以外、図１に表されるものと同一である本発明に従う小型装置を表す。
【図５】−図５は、同様に、外部第二電極５８が一体化された各マイクロリザーバー４６を閉鎖することを可能にする、取り外し可能な閉鎖手段１００を含む以外、図２に表されるものと同一である本発明に従う小型装置を表す。
【図６】−図６は、支持体６７および電気供給回路１０３を備えた、本発明に従う小型装置を表し、ここで、各マイクロキュベット６５の底部が、必要に応じて試薬を付着させる受入領域６９を形成する、ガラスまたはシリコンの層６３からなり、前記ガラスまたはシリコンの層６３は、マイクロリザーバー６６を形成する絶縁材料６２の第一層によって載せられ、この層上に第一電極６１が位置し、それ自身が絶縁材料６４の第二層によって載せられ、この装置は外部第二電極６８を備える。
【国際公開パンフレット】
2004535177.tif 000003
2004535177.tif 000004
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【国際調査報告】
2004535177.tif 000045
2004535177.tif 000046
2004535177.tif 000047
2004535177.tif 000048