(57)【要約】本発明は、植物におけるアブシシン酸シグナル伝達を調節する方法を提供する。本方法は、ＡＢＨ１ポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーターを含む組換え発現カセットを植物に導入する工程を包含する。本発明の好ましい実施形態において、このＡＢＨ１ポリヌクレオチドは、（ａ）配列番号１に少なくとも約７０％同一である配列を含むか、または（ｂ）配列番号２に少なくとも約７０％同一である配列を有するＡＢＨ１ポリペプチドをコードする。【特許請求の範囲】
【請求項１】
植物におけるアブシシン酸シグナル伝達を調節する方法であって、該方法は、植物におけるＡＢＡシグナル伝達を調節するＡＢＨ１ポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーターを含む組換え発現カセットを、該植物に導入する工程を包含し；そして該ポリヌクレオチドは、
（ａ）配列番号１に少なくとも約７０％同一である配列を含むか、または
（ｂ）配列番号２に少なくとも約７０％同一である配列を有するＡＢＨ１ポリペプチドをコードする、
方法。
【請求項２】
前記プロモーターは、組織特異的プロモーターである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記プロモーターは、孔辺細胞における発現を優先的に指向し、それにより前記植物中の孔辺細胞における膨圧を減少させる、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記プロモーターは、ＫＡＴ１プロモーターである、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記ＡＢＨ１ポリヌクレオチドは、配列番号１に少なくとも８０％同一である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記ＡＢＨ１ポリヌクレオチドは、配列番号１に示された配列を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記ＡＢＨ１ポリペプチドは、配列番号２に少なくとも８０％同一である配列を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記ＡＢＨ１ポリペプチドは、配列番号２に示された配列を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記発現カセットは、雌雄交配を介して前記植物に導入される、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記発現カセットは、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍを使用して前記植物に導入される、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
植物におけるＡＢＡシグナル伝達を調節するＡＢＨ１ポリヌクレオチドを含む、単離された核酸分子であって；そして該ポリヌクレオチドは、
（ａ）配列番号１に少なくとも約７０％同一である配列を含むか、または
（ｂ）配列番号２に少なくとも約７０％同一である配列を有するＡＢＨ１ポリペプチドをコードする、
単離された核酸分子。
【請求項１２】
前記ＡＢＨ１ポリヌクレオチドは、配列番号１に少なくとも８０％同一である、請求項１１に記載の核酸分子。
【請求項１３】
前記ＡＢＨ１ポリヌクレオチドは、配列番号１に示された配列を有する、請求項１１に記載の核酸分子。
【請求項１４】
前記ＡＢＨ１ポリペプチドは、配列番号２に少なくとも８０％同一である配列を有する、請求項１１に記載の核酸分子。
【請求項１５】
前記ＡＢＨ１ポリペプチドは、配列番号２に示された配列を有する、請求項１１に記載の核酸分子。
【請求項１６】
前記ＡＢＨ１ポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーターをさらに含む、請求項１１に記載の核酸分子。
【請求項１７】
前記プロモーターは、組織特異的プロモーターである、請求項１６に記載の核酸分子。
【請求項１８】
前記プロモーターは、孔辺細胞における発現を優先的に指向する、請求項１７に記載の核酸分子。
【請求項１９】
前記プロモーターは、ＫＡＴ１プロモーターである、請求項１８に記載の核酸分子。
【請求項２０】
植物におけるＡＢＡシグナル伝達を調節するＡＢＨ１ポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーターを含む組換え発現カセットを含む、トランスジェニック植物細胞であって；そして該ポリヌクレオチドは、
（ａ）配列番号１に少なくとも約７０％同一である配列を含むか、または
（ｂ）配列番号２に少なくとも約７０％同一である配列を有するＡＢＨ１ポリペプチドをコードする、
トランスジェニック植物細胞。
【請求項２１】
前記プロモーターは、組織特異的プロモーターである、請求項２０に記載のトランスジェニック植物細胞。
【請求項２２】
前記プロモーターは、孔辺細胞における発現を優先的に指向する、請求項２０に記載のトランスジェニック植物細胞。
【請求項２３】
前記プロモーターは、ＫＡＴ１プロモーターである、請求項２２に記載のトランスジェニック植物細胞。
【請求項２４】
前記ＡＢＨ１ポリヌクレオチドは、配列番号１に少なくとも８０％同一である、請求項２０に記載のトランスジェニック植物細胞。
【請求項２５】
前記ＡＢＨ１ポリヌクレオチドは、配列番号１に示された配列を有する、請求項２０に記載のトランスジェニック植物細胞。
【請求項２６】
前記ＡＢＨ１ポリペプチドは、配列番号２に少なくとも８０％同一である配列を有する、請求項２０に記載のトランスジェニック植物細胞。
【請求項２７】
前記ＡＢＨ１ポリペプチドは、配列番号２に示された配列を有する、請求項２０に記載のトランスジェニック植物細胞。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本出願は、米国特許法第１１９条（ｅ）項の下、２０００年６月１４日に出願されたＵＳＳＮ６０／２１２，０６８（この開示は、参考として援用される）に対する優先権を主張する。
【０００２】
（連邦政府支援による研究および開発の下でなされた発明に対する権利に関する声明）
（発明の背景）
本発明は、植物における植物ホルモンアブシジン酸（ＡＢＡ）の作用を調節する方法の能力を改善することに関する。植物におけるＡＢＡ活性の調節は、例えば、植物に対して耐乾性を付与するために使用され得る。
【０００３】
植物ホルモンＡＢＡは、植物の生活環を通して、多くの農業上重要なストレス応答および発生応答を調節する。種子において、ＡＢＡは、栄養貯蔵、乾燥耐性、成熟および休眠の獲得を担う（Ｍ．Ｋｏｏｒｎｎｅｅｆら、Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，３６：８３（１９９８）；Ｊ．Ｌｅｕｎｇ　＆　Ｊ．Ｇｉｒａｕｄａｔ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｌａｎｔ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｔ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４９：１９９（１９９８））。栄養生長中において、ＡＢＡは、種々の有害な環境条件（乾燥、塩ストレスおよび寒冷を含む）に対する植物応答を誘発する、中心的な内部シグナルである（Ｍ．Ｋｏｏｒｎｎｅｅｆら、Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，３６：８３（１９９８）；Ｊ．Ｌｅｕｎｇ　＆　Ｊ．Ｇｉｒａｕｄａｔ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｌａｎｔ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｔ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４９：１９９（１９９８））。ＡＢＡによって媒介される迅速な応答は、乾燥に応答する気孔の閉鎖である（Ｊ．Ｌｅｕｎｇ　＆　Ｊ．Ｇｉｒａｕｄａｔ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｌａｎｔ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｔ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４９：１９９（１９９８）；Ｅ．Ａ．Ｃ．ＭａｃＲｏｂｂｉｅ、Ｐｈｉｌｏｓ．Ｔｒａｎｓ．Ｒ　Ｓｏｃ．Ｌｏｎｄ．Ｂ　Ｂｉｏｌ．Ｓｃｉ．，３５３：１４７５（１９９８）；Ｊ．Ｍ．Ｗａｒｄら、Ｐｌａｎｔ　Ｃｅｌｌ，７：８３３（１９９５））。葉表面上の気孔は、孔辺細胞の対によって形成され、その孔辺細胞の膨圧が、気孔の開口を調節する（Ｅ．Ａ．Ｃ．ＭａｃＲｏｂｂｉｅ、Ｐｈｉｌｏｓ．Ｔｒａｎｓ．Ｒ　Ｓｏｃ．Ｌｏｎｄ．Ｂ　Ｂｉｏｌ．Ｓｃｉ．，３５３：１４７５（１９９８）；Ｊ．Ｍ．Ｗａｒｄら、Ｐｌａｎｔ　Ｃｅｌｌ，７：８３３（１９９５））。ＡＢＡは、孔辺細胞においてイオンチャネルを調節するサイトゾルカルシウム（［Ｃａ２＋］ｃｙｔ）増加を誘発することによって、気孔の閉鎖を誘導する（Ｅ．Ａ．Ｃ．ＭａｃＲｏｂｂｉｅ、Ｐｈｉｌｏｓ．Ｔｒａｎｓ．Ｒ　Ｓｏｃ．Ｌｏｎｄ．Ｂ　Ｂｉｏｌ．Ｓｃｉ．，３５３：１４７５（１９９８）、Ｊ．Ｍ．Ｗａｒｄら、Ｐｌａｎｔ　Ｃｅｌｌ，７：８３３（１９９５））。この応答は、乾季中の蒸散による水の損失を制限するために、植物にとって重要である。孔辺細胞は、初期のＡＢＡシグナル伝達に影響を及ぼす遺伝子を特徴付けるための、非常に適した系を提供する（Ｆ．Ａｍｓｔｒｏｎｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９２：９５２０（１９９５）；Ｚ．−Ｍ．Ｐｅｉら、Ｐｌａｎｔ　Ｃｅｌｌ，９：４０９（１９９７）；Ｊ．Ｌｉら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８７：３００（２０００））。
【０００４】
ＡＢＡシグナル伝達における初期事象を優位に破壊する２つのタンパク質ホスファターゼ変異（ａｂｉ１−１およびａｂｉ２−１）およびタンパク質キナーゼ変異体（ａａｐｋ）（Ｊ．Ｌｅｕｎｇ　＆　Ｊ．Ｇｉｒａｕｄａｔ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｌａｎｔ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｔ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４９：１９９（１９９８）；Ｆ．Ａｍｓｔｒｏｎｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９２：９５２０（１９９５）；Ｚ．−Ｍ．Ｐｅｉら、Ｐｌａｎｔ　Ｃｅｌｌ，９：４０９（１９９７）；Ｊ．Ｌｉら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８７：３００（２０００）；Ｋ．Ｍｅｙｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６４：１４５２（１９９４）；Ｊ．Ｌｅｕｎｇら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６４：１４４８（１９９４））、ならびに初期ＡＢＡシグナル伝達を増強する劣性ファルネシルトランスフェラーゼβサブユニット（ｅｒａ１−２）変異（Ｓ．Ｃｕｔｌｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７３：１２３９（１９９６）；Ｚ．−Ｍ．Ｐｅｉら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８２：２８７（１９９８））が、同定されている。
【０００５】
ＡＢＡシグナル伝達を制御する新たな方法の同定が望ましい。このような方法は、例えば、植物における孔辺細胞の膨圧、および従って、蒸散の制御において、特に有用である。このような方法は、乾季中の蒸散による水の損失を制限し、そして従って、植物をより耐乾性にするために特に有用である。本発明は、これらの種子および他の種子に取り組む。
【０００６】
（発明の簡単な要旨）
本発明は、植物におけるＡＢＡシグナル伝達を調節する方法を提供する。いくつかの実施形態において、これらの方法は、孔辺細胞中の膨圧を減少し、それによって、植物に耐乾性を付与するために使用される。この方法は、組換え発現カセットを植物に導入する工程を包含し、この組換え発現カセットは、プロモーターが作動可能に連結されているＡＢＨ１ポリヌクレオチドを含み、このＡＢＨ１ポリヌクレオチドが、植物におけるＡＢＡシグナル伝達を調節する。本発明のＡＢＨ１ポリヌクレオチドは、配列番号１に少なくとも約７０％同一な配列を含むか、または配列番号２に少なくとも約７０％同一な配列を有するＡＢＨ１ポリペプチドをコードする。
【０００７】
本発明の方法において、ＡＢＨ１ポリヌクレオチドの発現を駆動するために使用されるプロモーターは、代表的には、組織特異的プロモーターである。多くの実施形態において、これは、孔辺細胞において発現を優先的に指向するプロモーター（例えば、ＫＡＴ１プロモーター）である。
【０００８】
発現カセットは、多くの周知技術のいずれかを使用して、植物中に導入され得る。これらの技術としては、例えば、有性交配（ｓｅｘｕａｌ　ｃｒｏｓｓ）またはＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介形質転換が挙げられる。
【０００９】
本発明はまた、本発明のＡＢＨ１ポリヌクレオチドを含む、単離された核酸を提供する。いくつかの実施形態において、これらの核酸は、発現カセットを含み、これは、プロモーターが作動可能に連結されているＡＢＨ１ポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、組織特異的プロモーターは、孔辺細胞において発現を優先的に指向する。
【００１０】
本発明はさらに、トランスジェニック植物細胞を提供し、このトランスジェニック植物細胞は、プロモーターが作動可能に連結された本発明のＡＢＨ１ポリヌクレオチドを含む、組換え発現カセットを含む。
【００１１】
（定義）
句「核酸配列」とは、５’から３’末端に読み取られる、デオキシリボヌクレオチド塩基またはリボヌクレオチド塩基の一本鎖ポリマーまたは二本鎖ポリマーをいう。これには、染色体ＤＮＡ、自己複製プラスミド、ＤＮＡまたはＲＮＡの感染性ポリマー、および主に構造的役割を果たすＤＮＡおよびＲＮＡが挙げられる。
【００１２】
用語「プロモーター」とは、転写開始点から上流および／または下流に位置し、そして転写を開始するためのＲＮＡポリメラーゼまたは他のタンパク質の認識および結合に関与する領域または配列をいう。「植物プロモーター」は、植物細胞において転写を開始し得るプロモーターである。
【００１３】
用語「植物」には、植物全体、苗条の栄養器官および／または構造（例えば、葉、茎および塊茎）、根、花および花器（例えば、包葉、萼片、花弁、雄ずい、心皮、葯）、胚珠（卵および中心細胞を含む）、種子（接合子、胚、内乳、および種皮を含む）、果実（例えば、成熟卵）、実生、植物組織（例えば、維管束組織、基本組織など）、細胞（例えば、孔辺細胞、卵細胞、細胞子など）、ならびにその子孫が挙げられる。本発明の方法において使用され得る植物のクラスは、一般に、形質転換技術に受け入れられる高等植物および下等植物のクラスと同じぐらいに広範であり、これらには、被子植物（単子葉植物および双子葉植物）、裸子植物、シダ類、および多細胞藻類が挙げられる。これには、種々の倍数レベルの植物（異数体、多倍数体、二倍体、半数体および半接合体を含む）が含まれる。
【００１４】
ポリヌクレオチド配列は、それが外来種を起源とする場合、または同じ種を起源にし、その元の形態から改変されている場合、生物または第２のポリヌクレオチド配列「に対して異種」である。例えば、プロモーターが作動可能に連結された異種コード配列とは、そのプロモーターが由来する種と異なる種由来のコード配列、または同じ種由来の場合、そのプロモーターとは天然において関連しないコード配列（例えば、遺伝子操作されたコード配列、または異なる生態系もしくは変種由来の対立遺伝子）をいう。
【００１５】
個々の植物「に対して外因的な」ポリヌクレオチドは、有性交配以外の任意の手段によって植物中に導入されるポリヌクレオチドである。このことが達成され得る手段の例は、以下に記載され、そしてこれらには、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介形質転換、微粒子銃による方法、エレクトロポレーションなどが挙げられる。このような外因的な核酸を含む植物は、本明細書中で、Ｔ１（例えば、減圧浸透によるＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓにおける）またはＲ０（形質転換された細胞からインビトロで再生された植物について）世代トランスジェニック植物という。有性交配または自家受粉から生じるトランスジェニック植物は、このような植物の子孫である。
【００１６】
本発明の「ＡＢＨ１核酸」または「ＡＢＨ１ポリヌクレオチド配列」は、ＡＢＨ１ポリペプチド（配列番号２）をコードする部分配列または全長配列ポリヌクレオチド配列（配列番号１）、およびその相補体である。本発明のＡＢＨ１遺伝子産物（例えば、ｍＲＮＡまたはポリペプチド）は、ＡＢＡシグナル伝達を調節し、それによって、以下のような表現型を制御する能力によって特徴付けられる：種子発芽、気孔の閉鎖、孔辺細胞の［Ｃａ２＋］ｃｙｔ上昇、および乾季中の植物全体の蒸散による水の損失。さらに、本発明のＡＢＨ１ポリペプチドは、ＣＢＰ８０と名付けられたヒトおよび酵母の核ＲＮＡキャップ結合タンパク質に対する相同性を示す。本発明のＡＢＨ１ポリヌクレオチドは、代表的に、少なくとも約３０〜４０ヌクレオチド長〜約２５００ヌクレオチド長、通常、約３０００ヌクレオチド長未満のコード配列を含む。通常、本発明のＡＢＨ１核酸は、約１００〜約５０００ヌクレオチド長、しばしば、約５００〜約３０００ヌクレオチド長である。
【００１７】
導入遺伝子の発現および内因性遺伝子の阻害（例えば、アンチセンスまたはコサプレッションによる）の両方の場合において、当業者は、挿入されたポリヌクレオチド配列が、それが由来する遺伝子の配列に同一である必要はないが、単に「実質的に同一」であればよいことを認識する。以下に説明するように、これらの実質的に同一な改変体は、厳密には、用語ＡＢＨ１核酸に包含される。
【００１８】
挿入されたポリヌクレオチド配列を転写および翻訳し、機能的ポリペプチドを産生する場合、当業者は、コドン縮重に起因して、多くのポリヌクレオチド配列が同じポリペプチドをコードすることを認識する。これらの改変体は、厳密には、用語「ＡＢＨ１核酸」、「ＡＢＨ１ポリヌクレオチド」およびそれらの等価物に包含される。さらに、これらの用語は、厳密には、ＡＢＨ１ポリヌクレオチド配列と実質的に同一であり、ＡＢＨ１ポリペプチドの機能を維持するタンパク質（例えば、ＡＢＨ１ポリペプチドにおけるアミノ酸の保存的置換から生じる）
をコードする、（以下に記載のように決定される）全長配列を含む。
【００１９】
２つの核酸配列またはポリペプチドは、それぞれ、その２つの配列のヌクレオチドまたはアミノ酸残基の配列が、以下に記載されるように、最大一致について整列された場合に同じである場合、「同一」であるといわれる。２以上の核酸配列またはポリペプチド配列の状況下で、用語「同一」または「同一性」パーセントとは、以下の配列比較アルゴリズムのうちの１つを使用してかまたは手動の整列化および目視検査によって測定されるような、比較ウインドウにわたって最大一致について比較および整列された場合に同じであるかまたは特定のパーセンテージの同じアミノ酸残基またはヌクレオチドを有する、２以上の配列または部分配列をいう。配列同一性のパーセンテージが、タンパク質またはペプチドに対して使用される場合、同一でない残基位置は、しばしば、保存的アミノ酸置換（ここで、アミノ酸残基は、類似の化学特性（例えば、電荷または疎水性）を有する他のアミノ酸残基で置換され、従って、その分子の機能的特性を変化しない）によって異なることが認識される。配列が保存的置換で異なる場合、配列同一性パーセントは、上方調整され、その置換の保存的特性について補正し得る。この調整を行う手段は、当業者に周知である。代表的には、これは、保存的置換を、完全な不一致としてではなく、部分的な不一致としてスコアし、それによって、配列同一性のパーセンテージを増加することを含む。従って、例えば、同一のアミノ酸に１のスコアを与え、そして非保存的置換に０のスコアを与える場合、保存的置換に、０と１との間のスコアを与える。保存的置換のスコアリングは、例えば、Ｍｅｙｅｒｓ　＆　Ｍｉｌｌｅｒ、Ｃｏｍｐｕｔｅｒ　Ａｐｐｌｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｓｃｉ．４：１１−１７（１９８８）のアルゴリズム（これは、例えば、プログラムＰＣ／ＧＥＮＥ（Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ　Ｖｉｅｗ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）において実行される）に従って計算される。
【００２０】
２つの核酸またはポリペプチドの状況下で、句「実質的に同一」とは、参照配列に対する少なくとも２５％の配列同一性を有する、配列または部分配列をいう。あるいは、同一性パーセントは、２５％〜１００％の任意の整数であり得る。より好ましい実施形態は、本明細書中に記載されるプログラム（好ましくは、以下に記載するような標準的なパラメーターを使用するＢＬＡＳＴ）を使用して参照配列と比較して、少なくとも２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または９９％を含む。この定義はまた、試験配列が参照配列に対する実質的同一性を有する場合に、その試験配列の相補体についても言及される。
【００２１】
配列比較について、代表的には、１つの配列が参照配列として作用し、それに対して試験配列が比較される。配列比較アルゴリズムを使用する場合、試験配列および参照配列がコンピューターに入力され、部分配列の座標が指定され（必要な場合）、そして配列アルゴリズムプログラムパラメーターが指定される。デフォルトプログラムパラメーターが使用され得るか、または代替的なパラメーターが指定され得る。次いで、これらの配列アルゴリズムは、これらのプログラムパラメーターに基づいて、参照配列と比較した試験配列についての配列同一性パーセントを計算する。
【００２２】
本明細書中で使用される場合、「比較ウインドウ」は、２０〜６００、通常には、約５０〜約２００、より通常には、約１００〜約１５０からなる群より選択される連続する位置数の任意の１つのセグメントに対する言及を含み、ここで、配列は、同数連続する位置の参照配列に対して、その２つの配列が最適に整列された後に比較され得る。比較のために配列を整列する方法は、当該分野で周知である。比較のための配列の最適な整列化は、例えば、Ｓｍｉｔｈ　＆　Ｗａｔｅｒｍａｎ、Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）の局所的相同性アルゴリズムによって、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ　＆　Ｗｕｎｓｃｈ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）の相同性整列化アルゴリズムによって、Ｐｅａｒｓｏｎ　＆　Ｌｉｐｍａｎ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８５：２４４４（１９８８）の類似性検索方法によって、これらのアルゴリズムのコンピューター実行（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　Ｓｏｆｔｗａｒｅ　Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　Ｃｏｍｐｕｔｅｒ　Ｇｒｏｕｐ，５７５　Ｓｃｉｅｎｃｅ　Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩにおけるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡ）によって、または手動の整列化および目視検査によって、行われ得る。
【００２３】
有用なアルゴリズムの１つの例は、ＰＩＬＥＵＰである。ＰＩＬＥＵＰは、順次的な対合整列を使用して、関連する配列の群から多重配列アライメントを作製し、関連性および配列同一性パーセントを示す。これはまた、このアライメントを作製するために使用されたクラスター関係を示す、ツリーまたは系統樹をプロットする。ＰＩＬＥＵＰは、Ｆｅｎｇ　＆　Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｖｏｌ．３５：３５１−３６０（１９８７）の順次的整列方法の簡略化を使用する。この使用される方法は、Ｈｉｇｇｉｎｓ　＆　Ｓｈａｒｐ、ＣＡＢＩＯＳ　５：１５１−１５３（１９８９）によって記載される方法に類似する。このプログラムは、各々最大５０００ヌクレオチド長または５０００アミノ酸長の、３００個までの配列を整列し得る。この多重整列手段は、２つの最も類似する配列の対合整列から開始し、これは、２つの整列された配列のクラスターを生成する。次いで、このクラスターは、次に最も関連する配列または整列された配列のクラスターと整列される。配列の２つのクラスターは、２つの個々の配列の対合整列の単純な伸長によって整列される。最終的な整列は、一連の順次的な対合整列によって達成される。このプログラムは、配列比較の領域について特定の配列およびそれらのアミノ酸座標またはヌクレオチド座標を指定し、そしてプログラムパラメーターを指定することによって実行される。例えば、参照配列は、以下のパラメーターを使用して、他の試験配列と比較して配列同一性関連パーセントを決定し得る：デフォルトギャップ重（３．００）、デフォルトギャップ長重（０．１０）、および重みつきエンドギャップ。
【００２４】
配列同一性パーセントおよび配列類似性パーセントを決定するために適切なアルゴリズムの別の例は、ＢＬＡＳＴアルゴリズムであり、これは、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０（１９９０）に記載される。ＢＬＡＳＴ分析を行うためのソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｅｎｔｅｒ　ｆｏｒ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）を通じて公に入手可能である。このアルゴリズムは、最初に、クエリ（問い合わせ）（ｑｕｅｒｙ）配列中の長さＷの短いワードを同定することによって、高スコアリング配列対（ＨＳＰ）を同定することを含み、ＨＳＰは、データベース配列中の同じ長さのワードと整列させた場合に、ある正の値の閾値スコアＴに一致するかまたは閾値スコアＴを満足するかのいずれかである。Ｔは、隣接ワードスコア閾値と呼ばれる（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、前出）。これらの初期隣接ワードヒットは、検索を開始するためのシードとして作用し、そのシードを含むより長いＨＳＰが見出される。ワードヒットは、累積アライメントスコアが増加され得る限り、各配列に沿って両方向に伸長される。各方向におけるワードヒットの伸長は、以下の場合に停止される：累積アライメントスコアが、その最大達成値から量Ｘ低下する場合；累積スコアが、１以上の負のスコアリング残基のアライメントの蓄積に起因して、０以下になる場合；またはいずれかの配列の末端に到達した場合。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメーターＷ、Ｔ、およびＸは、そのアライメントの感度および速度を決定する。ＢＬＡＳＴプログラムは、デフォルトとして、ワード長（Ｗ）１１、ＢＬＯＳＵＭ　６２スコアリングマトリックス（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ　＆　Ｈｅｎｉｋｏｆｆ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８９：１０９１５（１９８９）を参照のこと）アライメント（Ｂ）５０、期待値（Ｅ）１０、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、および両鎖の比較を使用する。
【００２５】
ＢＬＡＳＴアルゴリズムはまた、２つの配列間の類似性の統計的解析を実行する（例えば、ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　９０：５８７３〜５７８７（１９９３）を参照のこと）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムにより提供される類似性の１つの尺度は、最小の合計確率（Ｐ（Ｎ））であり、これは、２つのヌクレオチド配列間またはアミノ酸配列間の一致が偶然生じる確率の指標を提供する。例えば、核酸は、参照核酸に対する試験核酸の比較における最小の合計確率が約０．０１未満、より好ましくは約１０〜５未満、および最も好ましくは約１０〜２０未満の場合に、参照配列に類似すると考えられる。
【００２６】
「保存的に改変された改変体」とは、アミノ酸配列および核酸配列の両方に適用される。特定の核酸配列に関して、保存的に改変された改変体とは、同一アミノ酸配列または基本的に同一のアミノ酸配列をコードする核酸をいうか、または核酸がアミノ酸配列をコードしない場合は、基本的に同一の配列をいう。遺伝コードの縮重が原因で、多数の機能的に同一な核酸が、任意の所定のタンパク質をコードする。例えば、コドンＧＣＡ，ＧＣＣ、ＧＣＧおよびＧＣＵは全て、アミノ酸（アラニン）をコードする。従って、アラニンがコドンにより特定されるどの位置でも、そのコドンは、コードされるポリペプチドを変更することなく、記載される対応するコドンのいずれかに変更され得る。このような核酸の改変体は、「サイレント改変体」であり、これは保存的に改変された改変体の１種である。あるポリペプチドをコードする本明細書中のあらゆる核酸配列はまた、その核酸のすべての可能なサイレント改変形をも記載する。当業者は、核酸における各々のコドン（ＡＵＧを除外する、ＡＵＧは、通常、メチオニンに関する唯一のコドンである）が、機能的に同一な分子を得るために改変され得ることを認識する。従って、ポリペプチドをコードする核酸のサイレント改変体の各々が、各々の記載された配列に含まれる。
【００２７】
アミノ酸配列に関して、核酸、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の配列における個々の置換（これは、コードされる配列中の１つのアミノ酸またはほんの少し割合のアミノ酸を変化する）は、その変化により、あるアミノ酸と化学的に類似したアミノ酸との置換が生じる場合に、「保存的に改変された改変体」であることを、当業者は認識する。機能的に類似のアミノ酸を提供する保存的置換の表は、当該分野で周知である。
【００２８】
以下の６つの群は各々、互いについて保存的な置換であるアミノ酸を含む：
１）アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）；
２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；
３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；
４）アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）；
５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；および
６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプシン（Ｗ）。
（例えば、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ（１９８４）を参照のこと）。
【００２９】
２つの核酸配列またはポリペプチドが実質的に同一であるという指標は、第１の核酸によりコードされるポリペプチドが、第２の核酸によりコードされるポリペプチドに対して惹起された抗体と免疫学的に交叉反応性であることである。従って、例えば、２つのペプチドが保存的置換によってのみ異なる場合に、１つのポリペプチドは、代表的に、第２のポリペプチドに対して実質的に同一である。２つの核酸配列が実質的に同一であるという別の指標は、その２つの分子またはそれらの相補体が、以下に記載のような、ストリンジェントな条件下で互いにハイブリダイズすることである。
【００３０】
句「〜に（対して）選択的に（または特異的に）ハイブリダイズする」とは、配列が複合混合物（例えば、総細胞ＤＮＡもしくはＲＮＡ、またはライブラリーＤＮＡもしくはＲＮＡ）中に存在する場合に、ストリンジェントな条件下での特定のヌクレオチド配列に対してのみ、分子が、結合、二重鎖形成、またはハイブリダイズすることをいう。
【００３１】
句「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」とは、プローブが、代表的には、核酸の複合混合物の中のこのプローブの標的部分配列に対してはハイブリダイズするが、他の配列に対してはハイブリダイズしない、条件をいう。ストリンジェントな条件は、配列依存性であり、そして種々の環境において異なる。配列が長ければ長いほど、より高い温度で特異的にハイブリダイズする。核酸のハイブリダイゼーションに対する広範な手引きは、Ｔｉｊｓｓｅｎ、Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　ｉｎ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ａｎｄ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ　ｗｉｔｈ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ｐｒｏｂｅｓ，「Ｏｖｅｒｖｉｅｗ　ｏｆ　ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ　ｏｆ　ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｓｔｒａｔｅｇｙ　ｏｆ　ｎｕｃｌｅｉｃ　ａｃｉｄ　ａｓｓａｙｓ」（１９９３）に見出される。一般的に、高ストリンジェントな条件は、特定の配列について、規定されたイオン強度、ｐＨでの熱融解点（Ｔｍ）よりも約５〜１０℃低いように選択される。低いストリンジェンシー条件は、一般的に、Ｔｍより約１５〜３０℃低いように選択される。Ｔｍとは、標的に相補的なプローブの５０％が、平衡状態で標的配列にハイブリダイズする（標的配列が過剰に存在する場合に、Ｔｍにて、プローブの５０％が平衡状態を占める）、（規定されたイオン強度、ｐＨ、および核酸濃度の下での）温度である。ストリンジェントな条件は、塩濃度が、ｐＨ７．０〜８．３で、約１．０Ｍ未満のナトリウムイオン、代表的には、約０．０１〜１．０Ｍのナトリウムイオン（または他の塩）の濃度であり、そして、温度が、短いプローブ（例えば、１０〜５０ヌクレオチド）については少なくとも約３０℃であり、そして長いプローブ（例えば、５０ヌクレオチドよりも長いヌクレオチド）については少なくとも約６０℃である。ストリンジェントな条件はまた、ホルムアミドのような変性剤の添加により達成され得る。選択的または特異的なハイブリダイゼーションについて、ポジティブシグナルとは、バックグラウンドの少なくとも２倍、好ましくはバックグラウンドハイブリダイゼーションの１０倍である。
【００３２】
ストリンジェントな条件下で互いにハイブリダイズしない核酸であっても、これらの核酸がコードするポリペプチドが実質的に同一である場合には、実質的に同一である。このことは、例えば、１コピーの核酸が、遺伝コードにより許容される最大限のコドン縮重を用いて作製される場合に生じる。このような場合、その核酸は、代表的には、中程度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする。
【００３３】
本発明において、本発明のＡＢＨ１核酸を含むゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡは、本明細書中で開示される核酸配列を使用して、ストリンジェントな条件下での標準的なサザンブロットにおいて同定され得る。本開示の目的のために、このようなハイブリダイゼーションのために適切なストリンジェントな条件は、４０％　ホルムアルデヒド、１Ｍ　ＮａＣｌ、１％　ＳＤＳの緩衝液における３７℃でのハイブリダイゼーション、および少なくとも約５０℃（通常は約５５℃〜約６０℃）の温度にて２０分間の、０．２×ＳＳＣで少なくとも１回の洗浄を含む条件、またはこれらと同等の条件である。ポジティブなハイブリダイゼーションは、バックグラウンドの少なくとも２倍である。当業者は、代替のハイブリダイゼーション条件および洗浄条件を利用して、同様のストリンジェンシーの条件を提供し得ることを、容易に認識する。
【００３４】
２つのポリヌクレオチドが実質的に同一であるというさらなる指標は、参照配列を、一対のオリゴヌクレオチドプライマーによって増幅させて、次いで、この参照配列を、プローブとしてストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で使用して、ｃＤＮＡライブラリーまたはゲノムライブラリーから試験配列を単離し得るか否か、または、例えば、ＲＮＡゲルブロットハイブリダイゼーション分析もしくはＤＮＡゲルブロットハイブリダイゼーション分析において試験配列を同定し得るか否か、ということである。
【００３５】
（発明の詳細な説明）
本発明は、新規の劣性ＡＢＡ高感受性Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ変異体（本明細書中でａｂｈ１といわれる）の特徴付けに少なくとも一部は基づいている。この表現型を生じる遺伝子のクローニングおよび特徴付けもまた記載される。本明細書中に記載される実験は、ｍＲＮＡキャップ結合活性と初期のＡＢＡシグナル伝達の調節との間の新規の機能的関連を示す。
【００３６】
本明細書中に提示される結果は、ＡＢＨ１が、ＡＢＡシグナル伝達の調節因子であることを示す。ＡＢＨ１は、種子発芽のＡＢＡ感受性、ＡＢＡ誘導気孔閉鎖のＡＢＡ感受性、ＡＢＡ誘導孔辺細胞［Ｃａ２＋］ｃｙｔ上昇のＡＢＡ感受性、および乾燥の間の植物全体の蒸散水の損失を調節する。他の植物ホルモンを用いる成長分析は、ａｂｈ１のＡＢＡ特異性を示した。ａｂｈ１変異体は、シグナル誘導型［Ｃａ２＋］ｃｙｔ上昇を増大することが示されている、最初の植物変異体である。カルシウムイメージングデータは、ＡＢＨ１が、初期のＡＢＡシグナル伝達事象を調節することを実証する。ヒトおよび酵母の核ＣＢＣは、プレｍＲＮＡスプライシングにおいて機能し（Ｅ．Ｉｚａｕｒｒａｌｄｅら、Ｃｅｌｌ，７８：６５７（１９９４）；Ｊ．Ｄ．Ｌｅｗｉｓら、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．，２４：３３３２（１９９６））、そして酵母における遺伝子の特定のサブセットの発現に影響する（Ｐ．Ｆｏｒｔｅｓら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１９：６５４３（１９９９））。核ＣＢＣは、さらに、ヒトにおけるｍＲＮＡの３’末端形成およびＲＮＡ搬出、ならびに酵母における翻訳を調節する（Ｅ．Ｉｚａｕｒｒａｌｄｅら、Ｎａｔｕｒｅ，３７６：７０９（１９９５）；Ｐ．Ｆｏｒｔｅｓら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．，６：１９１（２０００））。興味深いことに、このヒト核ＣＢＣは、最近、成長因子およびストレス活性型シグナル伝達における標的として機能して、特定の遺伝子の発現を調節することが示唆されている（Ｋ．Ｆ．Ｗｉｌｓｏｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７４：４　１６６（１９９９））。ａｂｈ１の発見は、核キャップ結合タンパク質が、植物におけるＡＢＡシグナル伝達を調節することの遺伝的証拠を提供する。ｍＲＮＡキャップ結合活性に基づいて、ＡＢＨ１は、初期のＡＢＡシグナル伝達遺伝子のｍＲＮＡプロセシングを制御し得る。さらに、ＡＢＨ１は、ＡＢＡに対する植物応答の強度を調節し、従って、ストレスの間の作物のＡＢＡ応答性を操作するための新規の制御機構を提供し得る。
【００３７】
（ＡＢＨ１活性またはＡＢＨ１遺伝子発現の増大）
当該分野で周知の多数の手段のいずれかを用いて、植物におけるＡＢＨ１活性を増大させ得る。増大した発現は、ＡＢＡに対する植物の感受性を低下させるのに有用である。例えば、増大した発現を用いて、葉柄における器官脱離帯の発生を制御して、それにより落葉を制御し得る。
【００３８】
（ＡＢＨ１遺伝子発現の増大）
本明細書中に記載されるように調製される単離された配列を使用して、当業者に周知の方法を用いて、特定のＡＢＨ１核酸の発現を導入し、内因性遺伝子発現を増大させ得る。適切な構築物の調製およびこれらの調製物を植物へと導入するための手段を以下に記載する。
【００３９】
当業者は、本発明の遺伝子によりコードされるポリペプチドが、他のタンパク質と同様に、異なる機能を果たす様々なドメインを有することを理解する。従って、この遺伝子配列は、このタンパク質の所望の機能的ドメインを発現する限り、全長である必要はない。ＡＢＨ１ポリペプチドの独特の特徴を以下に記載する。
【００４０】
改変タンパク質鎖もまた、当業者に周知でありそして以下に詳細に記載される、種々の組換えＤＮＡ技術を利用して、容易に設計し得る。例えば、この鎖は、アミノ酸の置換、付加、欠失などにより、一次構造レベルで天然に存在する配列と異なり得る。これらの改変を多数の組合せで用いて、最終的な改変タンパク質鎖を産生し得る。
【００４１】
（内因性ＡＢＨ１遺伝子の改変）
植物遺伝子中に遺伝的変異を導入するための方法、および所望の形質を有する植物を選択する方法は、周知である。例えば、種子および他の植物材料は、標準的な技術に従って、変異原性化学物質で処理され得る。このような化学物質としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：ジエチルスルフェート、エチレンイミン、エチルメタンスルホネート、およびＮ−ニトロソ−Ｎ−エチルウレア。あるいは、Ｘ線またはγ線のような線源由来の電離放射線が、使用され得る。
【００４２】
あるいは、相同組換えが、インビボでＡＢＨ１遺伝子を特異的に標的化することにより、標的化遺伝子の改変を誘導するために使用され得る（一般的には、ＧｒｅｗａｌおよびＫｌａｒ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　１４６：１２２１−１２３８（１９９７）ならびにＸｕら、Ｇｅｎｅｓ　Ｄｅｖ．１０：２４１１−２４２２（１９９６）を参照のこと）。相同組換えは、植物において実証されている（Ｐｕｃｈｔａら、Ｅｘｐｅｒｉｅｎｔｉａ　５０：２７７−２８４（１９９４）、Ｓｗｏｂｏｄａら、ＥＭＢＯ　Ｊ．１３：４８４−４８９（１９９４）；Ｏｆｆｒｉｎｇａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　９０：７３４６−７３５０（１９９３）；およびＫｅｍｐｉｎら、Ｎａｔｕｒｅ　３８９：８０２−８０３（１９９７））。
【００４３】
本発明の遺伝子に相同組換え技術を適用することにおいて、本明細書に開示されるような、ＡＢＨ１遺伝子配列の選択部分（５’上流領域、３’下流領域、および遺伝子内領域を含む）における変異が、インビトロで作製され、次いで、標準的な技術を用いて所望の植物に導入される。相同組換えの効率は、使用されるベクターに依存することが公知であるので、Ｍｏｕｎｔｆｏｒｄら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９１：４３０３−４３０７（１９９４）；およびＶａｕｌｏｎｔら、Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ　Ｒｅｓ．４：２４７−２５５（１９９５）によって記載されるような、二シストロン遺伝子ターゲティングベクターの使用が、都合よく用いられて、トランスジェニック植物中の変化したＡＢＨ１遺伝子発現の選択の効率を増大させる。変異した遺伝子は、相同組換えおよび野生型遺伝子の標的置換が、トランスジェニック植物細胞において生じるような様式で、標的野生型遺伝子と相互作用して、ＡＢＨ１活性の調節をもたらす。
【００４４】
あるいは、末端に二重のヘアピンキャップを有する二重鎖コンホメーションをとる、ＲＮＡ残基およびＤＮＡ残基の連続するストレッチから構成されるオリゴヌクレオチドが使用され得る。このＲＮＡ／ＤＮＡ配列は、標的ＡＢＨ１遺伝子の配列と整列するように、および所望のヌクレオチド変化を含むように設計される。染色体外Ｔ−ＤＮＡプラスミド上へのキメラオリゴヌクレオチドの導入は、少数の形質転換植物細胞におけるキメラ分子によって方向付けられる、効率的かつ特異的なＡＢＨ１遺伝子転換を生じる。この方法は、Ｃｏｌｅ−Ｓｔｒａｕｓｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７３：１３８６−１３８９（１９９６）およびＹｏｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９３：２０７１−２０７６（１９９６）に記載されている。
【００４５】
（ＡＢＨ１活性を増大させるための他の手段）
ＡＢＨ１発現を増大させる１つの手段は、「活性突然変異（ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ　ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）」（例えば、Ｈｉｙａｓｈｉら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５８：１３５０−１３５３（１９９２）を参照のこと）を使用することである。この方法では、内因性ＡＢＨ１遺伝子は、Ｔ−ＤＮＡ配列の挿入により、構成的にか、異所的にか、または過剰に発現されるように改変され得、このＴ−ＤＮＡ配列は、内因性ＡＢＨ１遺伝子の上流の、強力なプロモーター／構成的プロモーターを含む。以下に説明するように、ＡＢＨ１を過剰発現するトランスジェニック植物の調製もまた、ＡＢＨ１発現を増大させるために用いられ得る。内因性ＡＢＨ１遺伝子の活性突然変異は、トランスジェニック植物におけるトランスジェニックＡＢＨ１核酸の過剰発現と同じ効果を与える。あるいは、内因性ＡＢＨ１遺伝子のＡＢＨ１活性またはＡＢＨ１発現のエンハンサーをコードする内因性遺伝子を、類似の様式で、Ｔ−ＤＮＡ配列の挿入により発現されるように改変し得、そしてＡＢＨ１活性を増大し得る。
【００４６】
ＡＢＨ１発現を増大させる別のストラテジーは、改変ＡＢＨ１導入遺伝子を発現させることによる、ＡＢＨ１の優性な高活性変異体の使用であり得る。例えば、ＡＢＨ１活性の負の調節因子との相互作用に重要である不完全なドメインを有する改変ＡＢＨ１の発現は、優性な高活性ＡＢＨ１タンパク質を産生するために用いられ得る。あるいは、負の調節因子と相互作用するドメインのみを有する短縮型ＡＢＨ１タンパク質の発現は、負の調節因子を力価測定（ｔｉｔｅｒ）し得、これにより内因性ＡＢＨ１活性を増大させる。高活性標的遺伝子に対する優性の変異体の使用は、Ｍｉｚｕｋａｍｉら、Ｐｌａｎｔ　Ｃｅｌｌ，８：８３１−８４５（１９９６）に記載される。
【００４７】
（ＡＢＨ１活性またはＡＢＨ１遺伝子発現の阻害）
上記に説明されるように、ＡＢＨ１活性は、ＡＢＡシグナル伝達を制御する際に重要である。いくつかの実施形態では、孔辺細胞におけるＡＢＨ１の発現を制御し、それにより、気孔の開口を制御する。ＡＢＨ１遺伝子発現活性の阻害は、例えば、トランスジェニック植物において蒸散を低下させることにより、乾燥耐性を増大させるために用いられ得る。内因性遺伝子発現を阻害する（例えば、アンチセンスまたは相互抑制効果）ＡＢＨ１核酸の標的発現を、本目的のために用い得る。
【００４８】
（ＡＢＨ１遺伝子発現の阻害）
本明細書中に開示される核酸配列を用いて、植物におけるＡＢＨ１遺伝子発現または関連の遺伝子発現を阻害する多数の方法に有用な核酸を設計し得る。例えば、アンチセンス技術が都合よく使用され得る。これを達成するために、所望の遺伝子由来の核酸セグメントを、クローニングし、そしてＲＮＡのアンチセンス鎖を転写するようにプロモーターと作動可能に連結する。次いで、その構築物を、植物に形質転換し、そしてＲＮＡのアンチセンス鎖が産生される。植物細胞において、アンチセンス抑制は、ＲＮＡの翻訳の抑制を含む遺伝子調節の全てのレベルで作用し得（Ｂｏｕｒｑｕｅ　Ｐｌａｎｔ　Ｓｃｉ．（Ｌｉｍｅｒｉｃｋ）１０５：１２５−１４９（１９９５）；Ｐａｎｔｏｐｏｕｌｏｓ　Ｉｎ　Ｐｒｏｇｒｅｓｓ　ｉｎ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　ａｎｄ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，第４８巻．Ｃｏｈｎ，Ｗ．Ｅ．およびＫ．Ｍｏｌｄａｖｅ（編）．Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．：Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ；Ｌｏｎｄｏｎ，Ｅｎｇｌａｎｄ，ＵＫ．１８１−２３８頁；Ｈｅｉｓｅｒら　Ｐｌａｎｔ　Ｓｃｉ．（Ｓｈａｎｎｏｎ）１２７：６１−６９（１９９７）を参照のこと）、そして目的のタンパク質をコードするｍＲＮＡの蓄積を妨害することによって作用し得る（Ｂａｕｌｃｏｍｂｅ　Ｐｌａｎｔ　Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．３２：７９−８８（１９９６）；ＰｒｉｎｓおよびＧｏｌｄｂａｃｈ　Ａｒｃｈ．Ｖｉｒｏｌ．１４１：２２５９−２２７６（１９９６）；Ｍｅｔｚｌａｆｆら　Ｃｅｌｌ　８８：８４５−８５４（１９９７）、Ｓｈｅｅｈｙら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８５：８８０５−８８０９（１９８８）、ならびにＨｉａｔｔら、米国特許第４，８０１，３４０号を参照のこと）ことが示唆されている。
【００４９】
一般的に導入される核酸セグメントは、抑制される内因性のＡＢＨ１遺伝子の少なくとも一部と、実質的に同一である。しかし、この配列は、発現を阻害するために完全に同一である必要はない。本発明のべクターは、阻害効果が、標的遺伝子に対して同一性を示すかまたは実質的な同一性を示す、遺伝子のファミリー内の他の遺伝子に適用されるように、設計され得る。
【００５０】
アンチセンス抑制について、導入される配列はまた、一次転写産物または完全にプロセシングされたｍＲＮＡのいずれかに関して、全長である必要はない。一般的に、より短い配列の使用を補うために、より高い同一性が用いられ得る。さらに、導入される配列は、同じイントロンパターンもしくはエキソンパターンを有する必要はなく、そして非コードセグメントの同一性は、同様に有効であり得る。通常、約３０ヌクレオチドまたは４０ヌクレオチド〜全長ヌクレオチドの配列が使用されるべきであるが、少なくとも約１００ヌクレオチドの配列が好ましく、少なくとも２００ヌクレオチドの配列がより好ましく、そして約５００〜約３５００ヌクレオチドの配列が特に好ましい。
【００５１】
多数の遺伝子領域が、ＡＢＨ１遺伝子発現を抑制するために標的化され得る。この標的としては、例えば、コード領域、イントロン、エキソン／イントロン連結部由来の配列、５’非翻訳領域または３’非翻訳領域などが、挙げられ得る。
【００５２】
別の周知の抑制方法は、センス相互抑制（ｃｏｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ）である。センス方向で構成された核酸の導入は、最近、標的遺伝子の転写をブロックするための有効な手段であることが示されている。内在性遺伝子の発現を調節するためのこの方法の使用の例については、Ａｓｓａａｄら、Ｐｌａｎｔ　Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．２２：１０６７−１０８５（１９９３）；Ｆｌａｖｅｌｌ　Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　９１：３４９０−３４９６（１９９４）；Ｓｔａｍら、Ａｎｎａｌｓ　Ｂｏｔ．７９：３−１２（１９９７）；Ｎａｐｏｌｉら、Ｔｈｅ　Ｐｌａｎｔ　Ｃｅｌｌ　２：２７９−２８９（１９９０）；ならびに米国特許第５，０３４，３２３号、同第５，２３１，０２０号、および同第５，２８３，１８４号を参照のこと。
【００５３】
抑制効果は、導入された配列が、それ自体コード領域を含まないが、内在性配列の一次転写物に存在する配列と相同なイントロンまたは非翻訳配列のみを含む場合に、生じ得る。導入される配列は、一般に、抑制が意図される内在性の配列と実質的に同一である。この最小の同一性は、代表的には約６５％より大きいが、より高い同一性は、内在性配列の発現のより効果的な抑制を発揮し得る。約８０％を超えるかなりより大きい同一性が好ましいが、約９５％同一性〜完全な同一性が、最も好ましい。アンチセンス調節のように、この効果は、同一性または実質的な同一性を示す遺伝子の類似のファミリー内の任意の他のタンパク質に適用されるはずである。
【００５４】
相互抑制について、完全に満たない同一性しか必要としない導入配列はまた、一次転写物または完全にプロセシングされたｍＲＮＡのいずれかに関して、全長である必要はない。これは、過剰発現体であるいくつかの植物の同時発生的な生成を回避するために好まれ得る。全長よりも短い配列で同一性が高いことは、より長くが同一性がより低い配列を補う。さらに、導入配列は、同じイントロンパターンまたはエキソンパターンを有する必要がなく、そして非コードセグメントの同一性は等しく有効である。通常、アンチセンス調節のために上記されたサイズ範囲の配列が、使用される。さらに、アンチセンス調節について記述された同じ遺伝子領域が、相互抑制技術を使用して標的化され得る。
【００５５】
オリゴヌクレオチドベースの三重らせん形成もまた、ＡＢＨ１遺伝子発現を破壊するために使用され得る。三重鎖ＤＮＡは、ＤＮＡの転写および複製を阻害し得、そして部位特異的変異を生成し得、ＤＮＡを切断し得、そして相同組換えを誘導し得る（例えば、ＨａｖｒｅおよびＧｌａｚｅｒ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、６７：７３２４〜７３３１（１９９３）；Ｓｃａｎｌｏｎら、ＦＡＳＥＢ　Ｊ．９：１２８８〜１２９６（１９９５）；Ｇｉｏｖａｎｎａｎｇｅｌｉら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　３５：１０５３９〜１０５４８（１９９６）；ＣｈａｎおよびＧｌａｚｅｒ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（Ｂｅｒｌｉｎ）、７５：２６７〜２８２（１９９７）を参照のこと）。三重鎖ＤＮＡは、アンチセンス調節について同定された同じ配列を標的化するために使用され得る。
【００５６】
触媒ＲＮＡ分子すなわちリボザイムもまた、ＡＢＨ１遺伝子の発現を阻害するために使用され得る。事実上すべての標的ＲＮＡと特異的に対合形成して特定の位置でホスホジエステル骨格を切断し、それによってその標的ＲＮＡを機能的に不活化する、リボザイムを設計することが可能である。この切断を実行する際、このリボザイムは、それ自体は変化せず、従って、再利用して他の分子を切断することが可能であり、これによりリボザイムは、真の酵素となる。アンチセンスＲＮＡ中にリボザイム配列を含めると、そのアンチセンスＲＮＡにＲＮＡ切断活性が付与され、それにより、その構築物の活性が増加する。従って、リボザイムは、アンチセンス調節について同定された同じ配列を標的化するために使用され得る。
【００５７】
多数の種類のリボザイムが同定されている。１つの種類のリボザイムは、自己切断して植物中で複製可能である、多数の小環状ＲＮＡに由来する。このＲＮＡは、単独でか（ウイロイドＲＮＡ）またはヘルパーウイルス（サテライトＲＮＡ）とともにかのいずれかで、複製する。例としては、アボカドサンブロッチウイロイド由来のＲＮＡ、およびタバコ輪点ウイルス由来のサテライトＲＮＡ、アルファルファ一過性条斑（ｌｕｃｅｒｎｅ　ｔｒａｎｓｉｅｎｔ　ｓｔｒｅａｋ）ウイルス由来のサテライトＲＮＡ、ベルベットタバコ斑（ｖｅｌｖｅｔ　ｔｏｂａｃｃｏ　ｍｏｔｔｌｅ）ウイルス由来のサテライトＲＮＡ、ナス斑（ｓｏｌａｎｕｍ　ｎｏｄｉｆｌｏｒｕｍ　ｍｏｔｔｌｅ）ウイルス由来のサテライトＲＮＡ、およびサブタレニアンクローバ斑（ｍｏｔｔｌｅ）ウイルス由来のサテライトＲＮＡが、挙げられる。標的ＲＮＡ特異的リボザイムの設計および使用は、ＺｈａｏおよびＰｉｃｋ、Ｎａｔｕｒｅ　３６５：４４８〜４５１（１９９３）；ＥａｓｔｈａｍおよびＡｈｌｅｒｉｎｇ、Ｊ．Ｕｒｏｌｏｇｙ　１５６：１１８６〜１１８８（１９９６）；ＳｏｋｏｌおよびＭｕｒｒａｙ、Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ　Ｒｅｓ．５：３６３〜３７１（１９９６）；Ｓｕｎら、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　７：２４１〜２５１（１９９７）；ならびにＨａｓｅｌｏｆｆら、Ｎａｔｕｒｅ　３３４：５８５〜５９１（１９８８）に記載される。
【００５８】
（内在性ＡＢＨ１遺伝子の改変）
上記の遺伝子変異を導入するための方法もまた、ＡＢＨ１発現が減少した植物についてスクリーニングするために使用され得る。
【００５９】
ＡＢＨ１活性は、ＡＢＨ１細胞特異的遺伝子発現を必要とするタンパク質を除去することによって、調節され得る。従って、調節タンパク質の発現および／またはＡＢＨ１発現を制御する配列の発現が、本明細書中に記載される方法を使用して、調節され得る。
【００６０】
別のストラテジーは、ＡＢＨ１タンパク質がそれ自体または他のタンパク質と相互作用する能力を、阻害することである。これは、例えば、ＡＢＨ１に特異的な抗体を使用して、達成され得る。この方法において、ＡＢＨ１特異的抗体の細胞特異的発現が、抗体：抗原認識を介して機能的ドメインを不活化するために使用される（Ｈｕｐｐら、Ｃｅｌｌ　８３：２３７〜２４５（１９９５）を参照のこと）。ＡＢＨ１相互作用性タンパク質の活性を妨げることは、同様の様式で適用され得る。あるいは、ＡＢＨ１のドミナントネガティブ変異体が、短縮型ＡＢＨ１タンパク質をコードするトランスジーンを発現させることによって、調製され得る。トランスジェニック植物中の標的遺伝子を不活化するためにドミナントネガティブ変異体を使用することは、Ｍｉｚｕｋａｍｉら、Ｐｌａｎｔ　Ｃｅｌｌ　８：８３１〜８４５（１９９６）に記載されている。
【００６１】
（ＡＢＨ１核酸の単離）
一般に、下記の組換えＤＮＡ技術における術語および実験室手順は、当該分野で周知でありかつ一般的に使用されるものである。クローニング、ＤＮＡおよびＲＮＡの単離、増幅および精製のための標準的技術が、使用される。一般的に、ＤＮＡリガーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ、制限エンドヌクレアーゼなどを含む酵素反応は、製造業者に仕様書に従って実施される。これらの技術および他の種々の技術は、一般に、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ（１９８９）またはＣｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌｕｍｅ　１〜３、Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（１９９４〜１９９８）に従って、実施される。
【００６２】
本明細書中に提供される配列を使用して、本明細書中に提供されるＡＢＨ１核酸配列の単離が、多数の技術により達成され得る。例えば、本明細書中に開示される配列に基づくオリゴヌクレオチドプローブが、ｃＤＮＡライブラリーまたはゲノムＤＮＡライブラリー中の所望の遺伝子を同定するために使用され得る。ゲノムライブラリーを構築するために、ゲノムＤＮＡの大きなセグメントが、（例えば、制限エンドヌクレアーゼを使用する）ランダムな断片化によって作製され、そして、適切なベクター中にパッケージングされ得るコンカテマーを形成するための、ベクターＤＮＡと連結され得る。ｃＤＮＡライブラリーを調製するために、ｍＲＮＡが、所望の器官（例えば、花）から単離され、そしてＡＢＨ１遺伝子転写物を含むｃＤＮＡライブラリーが、このｍＲＮＡから調製される。あるいは、ｃＤＮＡが、ＡＢＨ１遺伝子またはホモログが発現される他の組織から抽出されたｍＲＮＡから調製され得る。
【００６３】
次いで、そのｃＤＮＡライブラリーまたはゲノムライブラリーが、本明細書中に開示されたクローンＡＢＨ１遺伝子の配列に基づくプローブを使用してスクリーニングされ得る。プローブは、同じ植物種中または異なる植物種中の相同遺伝子を単離するために、ゲノムＤＮＡ配列またはｃＤＮＡ配列とハイブリダイズするために使用され得る。あるいは、ＡＢＨ１ポリペプチドに対して惹起される抗体が、ｍＲＮＡ発現ライブラリーをスクリーニングするために使用され得る。
【００６４】
あるいは、目的の核酸は、増幅技術を使用して、核酸サンプルから増幅され得る。例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術が、ゲノムＤＮＡ、ｃＮＤＡ、ゲノムライブラリーまたはｃＤＮＡライブラリーから、ＡＢＨ１遺伝子配列を直接増幅するために使用され得る。ＰＣＲおよび他のインビトロ増幅方法もまた、例えば、発現されるべきタンパク質をコードする核酸配列をクローニングするため、サンプル中の所望のｍＲＮＡの存在を検出するためのプローブとして使用するための核酸を作製するため、核酸配列決定のため、または他の目的のために、有用であり得る。ＰＣＲの一般的概説について、ＰＣＲ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ　Ｇｕｉｄｅ　ｔｏ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ａｎｄ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｉｎｎｉｓ，Ｍ、Ｇｅｌｆａｎｄ，Ｄ．、Ｓｎｉｎｓｋｙ，Ｊ．およびＷｈｉｔｅ，Ｔ．編）Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ（１９９０）を参照のこと。；
ポリヌクレオチドはまた、技術文献に記載される周知の技術によって合成され得る。例えば、Ｃａｒｒｕｔｈｅｒｓら、Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．４７：４１１〜４１８（１９８２）、およびＡｄａｍｓら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０５：６６１（１９８３）を参照のこと。次いで、二本鎖ＤＮＡフラグメントが、その相補鎖を合成し適切な条件下でそれらの鎖をともにアニーリングするか、または適切なプライマーとともにＤＮＡポリメラーゼを使用してその相補鎖を付加することのいずれかによって、得られ得る。
【００６５】
（組換えベクターの調製）
上記の技術において単離された配列を使用するために、植物細胞の形質転換に適切な組換えＤＮＡベクターが、調製される。広範な種々の高等植物種を形質転換するための技術は、周知であり、そして技術文献および科学文献に記載される。例えば、Ｗｅｉｓｉｎｇら、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．２２：４２１−４７７（１９８８）を参照のこと。所望のポリペプチドをコードするＤＮＡ配列（例えば、全長タンパク質コードするｃＤＮＡ配列）は、好ましくは、形質転換された植物の意図される組織においてその遺伝子からのその配列の転写を指示する、転写開始調節配列および翻訳開始調節配列と組み合わされる。
【００６６】
例えば、過剰発現のために、植物プロモーターフラグメントが使用され得、これは、再生された植物の全ての組織において遺伝子の発現を指示する。このようなプロモーターは、本明細書中で「構成的」プロモーターと呼ばれ、そしてほとんどの環境条件および発生または細胞分化の状況下で活性である。構成的プロモーターの例としては、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）３５Ｓ転写開始領域、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍａｆａｃｉｅｎｓのＴ−ＤＮＡ由来の１’−プロモーターまたは２’−プロモーター、および当業者に公知の種々の植物遺伝子由来の他の転写開始領域が挙げられる。このような遺伝子としては、例えば、以下が挙げられ得る：Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ由来のＡＣＴ１１（Ｈｕａｎｇら、Ｐｌａｎｔ　Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３３：１２５−１３９（１９９６））、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ由来のＣａｔ３（ＧｅｎＢａｎｋ番号Ｕ４３１４７、Ｚｈｏｎｇら、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２５１：１９６−２０３（１９９６））、Ｂｒａｓｓｉｃａ　ｎａｐｕｓ由来のステアロイル−アシルキャリアタンパク質デサチュラーゼをコードする遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ番号Ｘ７４７８２、Ｓｏｌｏｃｏｍｂｅら、Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ．１０４：１１６７−１１７６（１９９４））、トウモロコシ由来のＧＰｃ１（ＧｅｎＢａｎｋ番号Ｘ１５５９６、Ｍａｒｔｉｎｅｚら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ　２０８：５５１−５６５（１９８９））、およびトウモロコシ由来のＧｐｃ２（ＧｅｎＢａｎｋ番号Ｕ４５８５５、Ｍａｎｊｕｎａｔｈら、Ｐｌａｎｔ　Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３３：９７−１１２（１９９７））。
【００６７】
あるいは、植物プロモーターは、特定の組織、器官または細胞型におけるＡＢＨ１核酸の発現を指向し得る（すなわち、組織特異的プロモーター）か、またはより正確な環境制御下もしくは発生制御下にあり得る（すなわち、誘導性プロモーター）。誘導性プロモーターによって転写をもたらし得る環境条件の例としては、嫌気的条件、高温、光の存在、化学物質／ホルモンのスプレーが挙げられる。当業者は、組織特異的プロモーターが、標的組織以外の組織において作動可能に連結された配列の発現を駆動し得ることを理解する。従って、本明細書中で使用される場合、組織特異的プロモーターは、標的組織または標的細胞型において優先的発現を駆動するプロモーターであるが、他の組織においても同様にいくらかの発現を誘導し得る。
【００６８】
多数の組織特異的プロモーターもまた、本発明において使用され得る。例えば、孔辺細胞における核酸の発現を指示するプロモーターが、乾燥耐性を付与するために有用である。このような特に好ましい１つのプロモーターは、ＫＡＴ１であり、これは、トランスジェニック植物において、主に孔辺細胞中の発現を駆動することが示されている（Ｎａｋａｍｕｒａ，Ｒら、Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ．１０９：３７１〜３７４（１９９５）を参照のこと）。特に好ましい別のプロモーターは、ポテトＡＤＰ−グルコースピロホスホリラーゼの短縮型５’付近フラグメント０．３ｋｂであり、これは、トランスジェニック植物の孔辺細胞のみにおける発現を駆動することが示されている。例えば、Ｍｕｌｌｅｒ−Ｒｏｂｅｒ，Ｂ．ら、Ｐｌａｎｔ　Ｃｅｌｌ　６：６０１〜６１２（１９９４）を参照のこと。
【００６９】
適切なポリペプチド発現が望ましい場合、コード領域の３’末端のポリアデニル化領域を含めるべきである。このポリアデニル化領域は、天然の遺伝子、種々の他の植物遺伝子、またはＴ−ＤＮＡに由来し得る。
【００７０】
本発明の遺伝子に由来する配列（例えば、プロモーターまたはコード領域）を含むベクターは、代表的には、選択的表現型を植物細胞に付与するマーカー遺伝子を含む。例えば、このマーカーは、殺生物剤耐性（特に、抗生物質耐性（例えば、カナマイシン（Ｇ４１８、ブレオマイシンまたはハイグロマイシン）に対する耐性）または除草剤耐性（例えば、クロロスルフロンまたはＢａｓｔａに対する耐性）をコードし得る。
【００７１】
本発明はまた、ＡＢＨ１遺伝子（配列番号３）由来のプロモーター配列を提供し、これは、所望の組織におけるＡＢＨ１コード配列または相同配列の発現を指令するために使用され得る。
【００７２】
（トランスジェニック植物の産生）
本発明のＤＮＡ構築物は、種々の従来技術によって、所望の植物宿主のゲノム中に導入され得る。例えば、このＤＮＡ構築物は、植物細胞プロトプラストのエレクトロポレーションおよびマイクロインジェクションのような技術を使用して、植物細胞のゲノムＤＮＡ中に直接的に導入され得るか、またはＤＮＡ構築物は、バリスティック（ｂａｌｌｉｓｔｉｃ）法（例えば、ＤＮＡパーティクルボンバードメント）を使用して、直接的に植物組織に導入され得る。
【００７３】
マイクロインジェクション技術は、当該分野において公知であり、そして科学技術文献および特許文献において十分に記載される。ポリエチレングリコール沈降を使用するＤＮＡ構築物の導入は、Ｐａｓｚｋｏｗｓｋｉら、Ｅｍｂｏ　Ｊ．３：２７１７−２７２２（１９８４）に記載される。エレクトロポレーション技術は、Ｆｒｏｍｍら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８２：５８２４（１９８５）に記載される。バリスティック形質転換技術は、Ｋｌｅｉｎら、Ｎａｔｕｒｅ　３２７：７０−７３（１９８７）に記載される。
【００７４】
あるいは、このＤＮＡ構築物を、適切なＴ−ＤＮＡ隣接領域と連結し得、そして従来のＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ宿主ベクター中に導入し得る。Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ宿主のビルレンス機能は、細胞をこの細菌によって感染させた場合に、その植物細胞ＤＮＡ中へのこの構築物および隣接マーカーの挿入を指向する。Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ媒介性形質転換技術（無害化（ｄｉｓａｒｍｉｎｇ）およびバイナリーベクターの使用を含む）は、科学技術文献において十分に記載される。例えば、Ｈｏｒｓｃｈら、Ｓｃｉｅｎｃｅ　２３３：４９６〜４９８（１９８４）、およびＦｒａｌｅｙら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８０：４８０３（１９８３）、ならびにＧｅｎｅ　Ｔｒａｎｓｆｅｒ　ｔｏ　Ｐｌａｎｔｓ、Ｐｏｔｒｙｋｕｓ編（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｂｅｒｌｉｎ　１９９５）を参照のこと。
【００７５】
上記の形質転換技術のいずれかによって誘導される形質転換植物細胞を培養して、形質転換された遺伝子型を保有し、従って所望の表現型（例えば、ファルネシルトランスフェラーゼ活性の減少）を保有する、完全な植物体を再生し得る。このような再生技術は、組織培養増殖培地における特定の植物ホルモンの操作に依存し、代表的に、所望のヌクレオチド配列と共に導入された殺生物マーカーおよび／または除草剤マーカーに依存する。培養されたプロトプラストからの植物の再生は、Ｅｖａｎｓら、Ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓ　Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｃｕｌｔｕｒｅ、Ｈａｎｄｂｏｏｋ　ｏｆ　Ｐｌａｎｔ　Ｃｅｌｌ　Ｃｕｌｔｕｒｅ、第１２４〜１７６頁、ＭａｃＭｉｌｌｉｌａｎ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、１９８３；およびＢｉｎｄｉｎｇ、Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｐｌａｎｔｓ，Ｐｌａｎｔ　Ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓ、第２１〜７３頁、ＣＲＣ　Ｐｒｅｓｓ、Ｂｏｃａ　Ｒａｔｏｎ、１９８５に記載される。再生はまた、植物のカルス、外植片、器官、またはそれらの部分から得られ得る。そのような再生技術は、一般に、Ｋｌｅｅら、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．ｏｆ　Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓ．３８：４６７〜４８６（１９８７）に記載される。
【００７６】
本発明の核酸を使用して、本質的にすべての植物に対して所望の形質を付与し得る。従って、本発明は、以下の属の種を含む広範な植物にわたって用途を有する：Ａｎａｃａｒｄｉｕｍ、Ａｒａｃｈｉｓ、Ａｓｐａｒａｇｕｓ、Ａｔｒｏｐａ、Ａｖｅｎａ、Ｂｒａｓｓｉｃａ、Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ、Ｃｉｔｒｕｓ、Ｃｉｔｒｕｌｌｕｓ、Ｃａｐｓｉｃｕｍ、Ｃａｒｔｈａｍｕｓ、Ｃｏｃｏｓ、Ｃｏｆｆｅａ，Ｃｕｃｕｍｉｓ、Ｃｕｃｕｒｂｉｔａ、Ｃｙｒｔｏｍｉｎｕｍ、Ｄａｕｃｕｓ、Ｅｌａｅｉｓ、Ｆｒａｇａｒｉａ、Ｇｌｙｃｉｎｅ、Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ、Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ、Ｈｅｔｅｒｏｃａｌｌｉｓ、Ｈｏｒｄｅｕｍ、Ｈｙｏｓｃｙａｍｕｓ、Ｌａｃｔｕｃａ、Ｌａｍｉｎａｒｉａ、Ｌｉｎｕｍ、Ｌｏｌｉｕｍ、Ｌｕｐｉｎｕｓ、Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ、Ｍａｃｒｏｃｙｓｔｉｓ、Ｍａｌｕｓ、Ｍａｎｉｈｏｔ、Ｍａｊｏｒａｎａ、Ｍｅｄｉｃａｇｏ、Ｎｅｒｅｏｃｙｓｔｉｓ、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ、Ｏｌｅａ、Ｏｒｙｚａ、Ｏｓｍｕｎｄａ、Ｐａｎｉｅｕｍ、Ｐａｎｎｅｓｅｔｕｍ、Ｐｅｒｓｅａ、Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ、Ｐｉｓｔａｃｈｉａ、Ｐｉｓｕｍ、Ｐｙｒｕｓ、Ｐｏｌｙｐｏｄｉｕｍ、Ｐｒｕｎｕｓ、Ｐｔｅｒｉｄｉｕｍ、Ｒａｐｈａｎｕｓ、Ｒｉｃｉｎｕｓ、Ｓｅｃａｌｅ、Ｓｅｎｅｃｉｏ、Ｓｉｎａｐｉｓ、Ｓｏｌａｎｕｍ、Ｓｏｒｇｈｕｍ、Ｔｈｅｏｂｒｏｍｕｓ、Ｔｒｉｇｏｎｅｌｌａ、Ｔｒｉｔｉｃｕｍ、Ｖｉｃｉａ、Ｖｉｔｉｓ、Ｖｉｇｎａ、およびＺｅａ。特に、本発明は、孔辺細胞を有する任意の植物に有用である。
【００７７】
当業者は、発現カセットがトランスジェニック植物に安定に組み込まれ、そして作動可能であることが確認された後には、この発現カセットが有性交雑によって他の植物中に導入され得ることを認識する。任意の多くの標準的な育種技術が、交雑されるべき種に依存して使用され得る。
【００７８】
公知の手順を使用して、当業者は、トランスジェニック植物中のＡＢＨ１　ｍＲＮＡまたはＡＢＨ１タンパク質の増加もしくは減少を検出することによって、本発明の植物についてスクリーニングし得る。ｍＲＮＡまたはタンパク質を検出および定量する手段は、当該分野で周知である。本発明の植物はまた、所望の表現型を検出することによって同定され得る。例えば、孔辺細胞における細胞質ゾルカルシウムレベル、気孔の開口、ＡＢＡの存在下での種子発芽、乾燥耐性を、下記のような方法を使用して測定することである。
【００７９】
以下の実施例は、例示のために提供され、限定のためには提供されない。
【００８０】
（実施例）
ａｂｈ１変異体を、３，０００個の活性化タグ化Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｔｈａｌｉａｎａ株より単離した。なぜなら、その発芽は、野生型種子の発芽を可能にする濃度である０．３μＭ　ＡＢＡによって阻害したからである。これを、Ｔ−ＤＮＡ（ＳＫ１０１５）（Ｄ．Ｗｅｉｇｅｌら、Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ．，１２２：１００３（２０００））で形質転換され、０．３μＭ　ＡＢＡを含む最小培地（０．２５ＸＭＳ）上にプレートされたＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ株（Ｃｏｌｕｍｂｉａ背景、Ｔ３種子）を使用して実施した。４℃で４日後、種子を、２８℃で連続照明に移した。さらに５日後、発芽を分析した。発芽していない種子を土に移し、さらに分析した。外因性ＡＢＡの非存在下で、ａｂｈ１種子は、４℃で４日間の前暴露の後に野生型の発芽速度を示した。２日間のみの４℃への前暴露は、ａｂｈ１のわずかに増強された休眠を示した。
【００８１】
遺伝的分析およびサザンブロット分析は、ａｂｈ１変異体が劣性でありかつ耐性マーカーに連結された単一の核遺伝子座（χ２＝０．５０、Ｐ＞０．４７）として分離されることを示した。このことは、ａｂｈ１が機能喪失変異体であることを示唆する。野生型植物およびａｂｈ１植物のＡＢＡ含有量（Ｓ．Ｈ．Ｓｃｈｗａｒｔｚら、Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ．１１４：１６１（１９９７））は類似した。このことは、ＡＢＨ１が生合成よりもＡＢＡ感受性に影響することを示唆する（野生型およびａｂｈ１について、それぞれ、種子中に０．１８および０．１６μｇ／ｇ　ＡＢＡ、ならびに栄養組織において０．１４および０．１２μｇ／ｇ　乾燥重量）。
【００８２】
ａｂｈ１変異体がＡＢＡシグナル伝達に特異的か否かを決定するために、種子発芽、胚軸および根の増殖アッセイを、１０ｎＭ〜１００μＭのホルモン濃度で、ＡＢＡ、サイトカイニン、ブラシノステロイド、オーキシン、エチレン（前駆体１−アミノシクロプロパン−１−カルボン酸を使用する）、ジャスモン酸メチル（ＪＡ）およびジベレリン酸（ＧＡ）の存在下で実施した。ａｂｈ１変異体は、ＡＢＡに対してのみ表現型の応答を示し、そしてＧＡに対してわずかに減少した感受性を示した。これは、ＧＡがＡＢＡに対してアンタゴニスト様であるので驚きはしない。他のホルモンシグナル伝達変異体を、コントロール実験で分析した：ａｘｒ１−３（オーキシン非感受性）（Ｃ．Ｌｉｎｃｏｌｎら、Ｐｌａｎｔ　Ｃｅｌｌ，２：１０７１（１９９０））、ｅｉｎ２−１（エチレン非感受性）（Ｊ．Ｍ．Ａｌｏｎｓｏら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８４：２１４８（１９９９））、ｇａｉ−１（ＧＡ非感受性）（Ｍ．Ｋｏｏｒｎｎｅｅｆら、Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｔ．，６５：３３（１９８５））、ｅｒａ１−２（ＡＢＡ高感受性）（Ｓ．Ｃｕｔｌｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７３：１２３９（１９９６））およびｊａｒ１−１（ＪＡ非感受性）（Ｐ．Ｅ．Ｓｔａｓｗｉｃｋら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８９：６８３７（１９９２））。興味深いことに、これらの変異体全ては、１より多い外因性に添加されたホルモンに対して、有意に変更された応答を示した。このことは、複数のシグナル伝達経路とのこれらの遺伝子座のクロストーク相互作用またはフィードバック相互作用を示唆する。これらのデータはさらに、他のホルモンに比べてａｂｈ１のＡＢＡ特異性を強調する。
【００８３】
ＡＢＨ１を、孔辺細胞において発現する。ＡＢＨ１が初期ＡＢＡシグナル伝達エレメントを調節するか否かを決定するために、ＡＢＡに応じた気孔閉鎖を調査した。気孔を、高湿度（９５％）に１２時間植物を暴露することによって開口させた。これらの条件下で、気孔開口部は、野生型およびａｂｈ１において類似した（２．０３±０．１９μｍ、野生型、ｎ＝６０；１．９２±０．２１μｍ、ａｂｈ１、ｎ＝６０；Ｐ＞０．３８）。ａｂｈ１における気孔閉鎖は、野生型と比較してＡＢＡ高感受性であった（Ｐ＜０．００１）。低湿度下（４０％）で生長した植物から直接回収した葉において、外因性のＡＢＡを添加することなく気孔開口部を測定した場合、ａｂｈ１の気孔開口部は、野生型植物のものより小さく（Ｐ＜０．００１）、これは、おそらく内因性ＡＢＡに対する高感受性の応答より生じる。
【００８４】
ＡＢＡに応じた気孔閉鎖は、孔辺細胞の遅いアニオンチャネルの活性化および内向き整流Ｋ＋チャネルの抑制を含む（Ｆ．Ａｍｓｔｒｏｎｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９２：９５２０（１９９５）；Ｚ．−Ｍ．Ｐｅｉら、Ｐｌａｎｔ　Ｃｅｌｌ，９：４０９（１９９７）；Ｊ．Ｌｉら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８７：３００（２０００）；Ｚ．−Ｍ．Ｐｅｉら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８２：２８７（１９９８））。ＡＢＡの添加なしのパッチクランプ実験は、４０％湿度で生長した植物由来のａｂｈ１孔辺細胞において、アニオンの流れは、野生型孔辺細胞のものよりも一貫してより大きかったことを示した（ａｂｈ１：ｎ＝３５、野生型：ｎ＝２６、Ｐ＜０．００１）；しかし、内向き整流Ｋ＋チャネルの流れは、ａｂｈ１孔辺細胞において実質的に小さかった（ａｂｈ１　ｎ＝１４、野生型　ｎ＝１３、Ｐ＜０．００１）（Ｙ．Ｍｕｒａｔａら、未公開データ）。これらのデータは、４０％湿度で生長した植物における気孔開口部とよく相関する。さらに、外因性ＡＢＡの存在下で、アニオンの流れは、野生型孔辺細胞（ｎ＝１７）よりもａｂｈ１孔辺細胞（ｎ＝１５）においてより大きかった（Ｐ＜０．０５）。
【００８５】
外因性ＡＢＡ添加のないａｂｈ１におけるアニオンチャネルおよびＫ＋チャネルの基本的な調節に起因して、実験を、さらなる上流に位置する機構がａｂｈ１におけるＡＢＡ高感受性を付与するのか否かを分析するために続行した。上流［Ｃａ２＋］ｃｙｔ上昇によって、アニオンチャネルは活性化され、そして内向き整流Ｋ＋チャネルは、ダウンレギュレートされた（Ｊ．Ｉ．Ｓｃｈｒｏｅｄｅｒ＆Ｓ．Ｈａｇｉｗａｒａ，Ｎａｔｕｒｅ，３３８：４２７（１９８９））。従って、本発明者らは、時間分解性カメレオン（ｃａｍｅｌｅｏｎ）［Ｃａ２＋］ｃｙｔイメージング実験（Ｇ．Ｊ．Ａｌｌｅｎら、Ｔｈｅ　Ｐｌａｎｔ　Ｊ．，１９：７３５（１９９９））において、ａｂｈ１がＡＢＡ誘導性［Ｃａ２＋］ｃｙｔ上昇を調節するか否かを直接調査した。気孔を、９５％湿度に１２時間植物を暴露することによって開口させた。野生型において、５６％（ｎ＝３２（５７のうち））の孔辺細胞は、低濃度の０．５μＭ　ＡＢＡに応じて［Ｃａ２＋］ｃｙｔ上昇を示さなかった。そして残りの４４％（ｎ＝２５）の細胞は、代表的には、１７０±２５ｎＭ［Ｃａ２＋］ｃｙｔの平均ピーク増加を伴う１回の［Ｃａ２＋］ｃｙｔ増加のみを示した（図２Ｄ下）。興味深いことに、ａｂｈ１孔辺細胞において、０．５μＭ　ＡＢＡは、６４％の孔辺細胞（ｎ＝４１（６６細胞のうち））において、２８０±２２μＭのより大きな平均ピーク増加を伴う［Ｃａ２＋］ｃｙｔ増加を誘発した（図２Ｅ）。０．５μＭ　ＡＢＡで、たった１９％の細胞（ｎ＝１２）は、１回の［Ｃａ２＋］ｃｙｔ上昇に反応したが、４５％のａｂｈ１細胞（ｎ＝２９）は、複数の反復性［Ｃａ２＋］ｃｙｔ増加を示した（図２Ｅ下）。たった３６％のａｂｈ１細胞（ｎ＝２３）は、０．５μＭ　ＡＢＡに対して応答を示さなかった。応答性の細胞対非応答性の細胞の統計的分析は、ａｂｈ１孔辺細胞のＡＢＡ応答性が有意に増強されたことを確認した（χ２＝４．９６、Ｐ＜０．０３）。さらに、細胞あたりの［Ｃａ２＋］ｃｙｔ過渡電流（ｔｒａｎｓｉｅｎｔ）の数（Ｐ＜０．００１）およびこれらの振幅（Ｐ＜０．０１）の両方は、野生型においてよりもａｂｈ１において有意に大きかった。［Ｃａ２＋］ｃｙｔイメージング分析（図２ＤおよびＥ）および気孔開口部測定は、ａｂｈ１変異がＡＢＡ誘導性［Ｃａ２＋］ｃｙｔ上昇の上流にある初期ＡＢＡシグナル伝達機構を増強することを例証する。
【００８６】
ａｂｈ１変異体は、わずかに遅延した生長および中程度な鋸歯状の葉を示した。植物全体の可視の表現型は、他には観察されなかった。植物が水ストレスに供された場合、ＡＢＡ含有量（Ｓ．Ｈ．Ｓｃｈｗａｒｔｚら、Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ．，１１４：１６１（１９９７））は、野生型とａｂｈ１とで同様のレベルにまで増加した（野生型およびａｂｈ１において、それぞれ１．３３μ／ｇおよび１．２６μｇ／ｇ乾燥重量（実験１）ならびに１．０５μｇ／ｇおよび１．２６μｇ／ｇ乾燥重量（実験２））。水をやることなく３週間たった後に、（４０％生長チャンバー湿度）、ａｂｈ１のロゼットおよび茎の葉は、緑であり続けそして膨張しているが、野生型の葉は、退緑およびしおれを示した（２回の独立した実験において、ｎ＝４０　ａｂｈ１植物、ｎ＝４０　野生型植物）。渇水の１０日後、ａｂｈ１植物は、水を与えたコントロールに比べて気孔閉塞をすでに示した（Ｐ＜０．０１）；しかし、野生型植物は、示さなかった（Ｐ＞０．５）（１０日間の渇水、気孔開口部：ａｂｈ１において１．１４±０．０４μｍ、ｎ＝６０；野生型において１．４１±０．０７μｍ、ｎ＝６０；水を与えたコントロール：ａｂｈ１において１．２５±０．０８μｍ、ｎ＝６０；野生型において１．４２±０．０５μｍ、ｎ＝６０）。これらの結果を合わせると、ＡＢＡ高感受性気孔閉塞が減少したａｂｈ１の葉の乾燥およびしおれに寄与することを示唆する。
【００８７】
ＡＢＨ１遺伝子を、プラスミドレスキューによって同定しそして対応するｃＤＮＡ（２５４７ｂｐ）を単離した。簡単には、Ｔ−ＤＮＡ挿入の右端に隣接する２７８ｂｐのゲノムフラグメントを、以下のようなプラスミドレスキューを使用してａｂｈ１植物より単離した：５μｇのゲノムＤＮＡを、ＨｉｎｄＩＩＩで消化し、自己連結しそしてＥ．ｃｏｌｉ　ＥｌｅｃｔｒｏＭＡＸ　ＤＨ１２Ｓ（ＧｉｂｃｏＢＲＬ，Ｌｉｆｅｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）に形質転換した。カルベニシリン上で増殖する細胞より抽出したプラスミドを、配列決定した。次いで、プライマーを生成して、レスキューされた配列に隣接する５３１６ｂｐのゲノムＤＮＡを増幅した（ＧｅｎｏｍｅＷｌｋａｅｒ　Ｋｉｔ，Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）。ＡＢＨ１遺伝子座の全長を含む８２４８ｂｐのＣｌａＩゲノムフラグメントを、ＢＡＣ　Ｔ１０Ｆ２（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｃｅｎｔｅｒ）より植物発現ベクターｐＲＤ４００にクローニングした。ＡＢＨ１コード配列を、ｃＤＮＡ末端の迅速な増幅（ＲＡＣＥ　ＰＣＲ，Ｍａｒａｔｈｏｎ　ｃＤＮＡ　Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ，Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）によって，プラスミドレスキュー配列内部プライマー（５’　ＧＡＡＧＣＴＣＡＡＣＴＣＧＴＴＧＣＴＧＧＡＡＡＧ　３’）およびその逆向きを使用して、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　Ｃｏｌｕｍｂｉａの葉のｃＤＮＡライブラリーから増幅した。次いで、２５４７ｂｐの総ｃＤＮＡを、ｐｆｕ　ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を使用して増幅し、ｐＭＯＮ５３０にクローニングしそして配列決定した。ＡＢＨ１　５’ＵＴＲ（１２５０ｂｐ）を、ｐｆｕ　ＤＮＡポリメラーゼを使用するＰＣＲによってゲノムＤＮＡから増幅し、そしてプロモーターのないグルクロニダーゼレポーター遺伝子を含むｐＣＡＭＢＩＡ１３０３（Ｇｅｎｂａｎｋ　ＡＦ２３２９９）にサブクローニングした。ＰＣＲによって増幅した全ての配列を、配列決定（Ｒｅｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ）によってチェックした。
【００８８】
ＡＢＨ１遺伝子は、第２染色体上に位置決定され、そして１８のエクソンからなる。ＡＢＨ１は、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓゲノムにおいて単一の遺伝子である（配列番号１）。ａｂｈ１中のＴ−ＤＮＡは、第８エクソンの末端で挿入されている。ノーザンブロット分析は、ＡＢＨ１転写物がａｂｈ１には非存在であるが野生型の葉には存在することを示した。ノーザンブロット分析はさらに、根、葉、茎および花におけるＡＢＨ１発現を示した。
【００８９】
ａｂｈ１植物を、その自身のプロモーターの制御下においてＡＢＨ１遺伝子で形質転換し、そしてＣａＭＶ　３５Ｓプロモーターの制御下においてＡＢＨ１　ｃＤＮＡで形質転換した。Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｎｅｆａｃｉｅｎｓ系統Ｃ５８を使用して、花浸漬法（ｆｌｏｒａｌ　ｄｉｐｐｉｎｇ　ｍｅｔｈｏｄ）（Ｓ．Ｊ．ＣｌｏｕｇｈおよびＡ．Ｆ．Ｂｅｎｔ，Ｐｌａｎｔ　Ｊ．，１６：７３５（１９９８））を用いてＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓトランスジェニック実生を生成した。いずれかの構築物で形質転換されたホモ接合性ａｂｈ１植物由来の種子は、０．３μＭ　ＡＢＡの存在下で野生型の発芽速度を示し、これはａｂｈ１相補性を例証した。ＡＢＨ１ゲノム構築物で形質転換されかつ４０％湿度で生育されたａｂｈ１植物の気孔開口部は、野生型植物の開口部に匹敵しそしてａｂｈ１開口部より有意に大きかった（Ｐ＜０．００１；ｎ＝６０、ＡＢＨ１遺伝子を有する３つの独立した相補株）。さらに、９５％湿度で１２時間生育された相補植物の気孔のＡＢＡ感受性は、野生型のものと類似した（ｎ＝６０、２つの相補株、Ｐ＞０．３２）。さらに、Ｋ＋ｉｎの流れ（Ｎ＝６）およびアニオンの流れ（ｎ＝６）は、ＡＢＨ１遺伝子で形質転換されかつ４０％湿度で生育された相補株において、野生型の程度を示した（それぞれ、Ｐ＞０．７およびＰ＞０．１３）。
【００９０】
ＡＢＨ１は、ヒトおよび酵母の核ＲＮＡキャップ結合タンパク質（ＣＢＰ８０と呼ばれる）の特定のクラスに対して有意な類似性を有する、８５０アミノ酸の大きなタンパク質をコードし、これは、いままでのところ植物においては記載されていない。ＡＢＨ１は、酵母のＣＢＰ８０（Ｐ３４１６０）およびヒトのＣＢＰ８０（ＮＰ＿００２４７７）と、それぞれ３３．８％および４５％の類似性を共有する。ヒトおよび酵母において、ＣＢＰ８０は、ＣＢＰ２０とともにヘテロ二量体核キャップ結合複合体（ＣＢＣ）のサブユニットである（Ｅ．Ｉｚａｕｒｒａｌｄｅら、Ｃｅｌｌ，７８：６５７（１９９４）；Ｅ．Ｉｚａｕｒｒａｌｄｅら、Ｎａｔｕｒｅ，３７６：７０９（１９９５）；Ｊ．Ｄ．Ｌｅｗｉｓら、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．，２４：３３３２（１９９６））。核ＣＢＣは、ｍＲＮＡプロセシングおよび神経成長因子およびストレス活性化シグナル伝達経路において重要な役割を担う（Ｅ．Ｉｚａｕｒｒａｌｄｅら、Ｃｅｌｌ，７８：６５７（１９９４）；Ｅ．Ｉｚａｕｒｒａｌｄｅら、Ｎａｔｕｒｅ，３７６：７０９（１９９５）；Ｊ．Ｄ．Ｌｅｗｉｓら、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．，２４：３３３２（１９９６）；Ｎ．Ｋａｔａｏｋａら、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．，２３：３６３８（１９９５）；Ｐ．Ｆｏｒｔｅｓら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１９：６５４３（１９９９）；Ｋ．Ｆ．Ｗｉｌｓｏｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７４：４１６６（１９９９））。Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｉ　ＣＢＰ２０ホモログ（ＡｔＣＢＰ２０）は、第５染色体上に同定された（ＡＡＤ２９６９７）。酵母２ハイブリッド実験は、ＡＢＨ１とＡｔＣＢＰ２０との間の相互作用を示した。これは、ＡＢＨ１がＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ核ＣＢＣのサブユニットであり得ることを示す。核ＣＢＣは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩによって転写されたＲＮＡのモノメチル化（ｍ７ＧｐｐｐＮ）キャップ構造に結合する（Ｅ．Ｉｚａｕｒｒａｌｄｅら、Ｃｅｌｌ，７８：６５７（１９９４）；Ｎ．Ｋａｔａｏｋａら、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．，２３：３６３８（１９９５）；Ｋ．Ｆ．Ｗｉｌｓｏｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７４：４１６６（１９９９））。ＡＢＨ１サブユニットおよびＡｔＣＢＰ２０サブユニットの両方を発現する酵母細胞からの総細胞抽出物は、ｍＲＮＡキャップ結合活性を示した。このキャップ結合活性は、コントロール野生型酵母系統抽出物においても２つのＣＢＣサブユニットの１つのみが単独で発現された場合でも検出可能ではなかった。このことは、この活性がＡＢＨ１およびＡｔＣＢＰ２０の両方の存在を必要とすることを示す。さらに、モノメチル化キャップ構造を競合剤として添加した場合は、キャップ結合活性は消滅したが、ＡｐｐｐＮキャップアナログを添加した場合は、消滅しなかった。ＡプライムされたＲＮＡをＲＮＡプローブとして使用した場合、結合活性は観察されなかった。これらの結果は、ＡＢＨ１がＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ＣＢＣのサブユニットとして機能することを強く示唆する。
【００９１】
上記の実施例は、本発明を例示するために提供されるがその範囲を限定するためではない。本発明の他の改変は、当業者には容易に明らかであり、かつ添付の特許請求の範囲によって包含される。本明細書中に列挙される全ての刊行物、特許および特許出願は、全ての目的のために本明細書中に参考として援用される。
【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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