(57)【要約】本発明は、洗浄段階が不要であり、かくして液体廃棄物が生じず、費用のかからない使い捨ての定量免疫学的センサ２０に関する。さらに、センサ２０の好ましい実施形態では、ユーザの時間調整段階が不要であり、センサ２０を広い反応速度範囲にわたり抗原−抗体反応に容易に適合させることができる。
2004505246.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｐＨを持つ流体サンプル中の標的抗原を検出する際に用いられる使い捨て器具であって、内面、近位端部及び遠位端部を備えた反応チャンバと、反応チャンバ内に固定されていて、標的抗原に結合可能な固定化された抗体と、反応チャンバ内に存在していて、プローブを構成し、サンプルと混ざり合うことができるレポータ錯体と、壁、内面、遠位端部及び近位端部を備えた検出チャンバと、反応チャンバの遠位端部のところに設けられたサンプル入口と、反応チャンバの遠位端部と検出チャンバの近位端部との間に設けられたサンプル通路とを有することを特徴とする器具。
【請求項２】
反応チャンバ内に収納されていて、反応チャンバの内面への蛋白質の非特異性結合を阻止できる薬剤を更に有していることを特徴とする請求項１記載の器具。
【請求項３】
薬剤は、界面活性剤及び遮断蛋白質から成る群から選択されていることを特徴とする請求項２記載の器具。
【請求項４】
遮断蛋白質は、ＢＳＡ（ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ）であることを特徴とすることを請求項３記載の器具。
【請求項５】
レポータ錯体は、固定化抗体に結合できるよう標的抗原と競合できる第２の抗原又は標的抗原に結合できる第２の抗体を更に含むことを特徴とする請求項１記載の器具。
【請求項６】
プローブは、発色団及び蛍光体から成る群から選択されていることを特徴とする請求項１記載の器具。
【請求項７】
プローブは、酵素から成ることを特徴とする請求項１記載の器具。
【請求項８】
酵素は、グルコースオキシダーゼから成ることを特徴とする請求項７記載の器具。
【請求項９】
酵素は、グルコースデヒドロゲナーゼから成ることを特徴とする請求項７記載の器具。
【請求項１０】
検出チャンバは、酵素基体を更に有していることを特徴とする請求項７記載の器具。
【請求項１１】
酵素基体は、酸化可能な基体であることを特徴とする請求項７記載の器具。
【請求項１２】
酸化可能な基体は、ガラクトース及び酢酸から成る群から選択されていることを特徴とする請求項１１記載の器具。
【請求項１３】
酵素基体は、グルコースから成ることを特徴とする請求項１１記載の器具。
【請求項１４】
検出チャンバは、メディエイタを更に有していることを特徴とする請求項７記載の器具。
【請求項１５】
メディエイタは、ジクロロフェノリンドフェノール及び遷移金属と窒素含有ヘテロアトミック化学種の錯体から成る群から選択されていることを特徴とする請求項１４記載の器具。
【請求項１６】
メディエイタは、フェリシアン化物から成ることを特徴とする請求項１４記載の器具。
【請求項１７】
器具は、サンプルのｐＨを調整できる緩衝剤を更に有していることを特徴とする請求項７記載の器具。
【請求項１８】
緩衝剤は、ホスフェート及びシトレートから成る群から選択された物質であることを特徴とする請求項１７記載の器具。
【請求項１９】
検出チャンバは、少なくとも２つの電極を有していることを特徴とする請求項１記載の器具。
【請求項２０】
電極は、パラジウム、白金、金、イリジウム、炭素、炭素と結合剤の混合物、酸化インジウム、酸化錫及びこれらの混合物から成る群から選択された材料で構成されていることを特徴とする請求項１９記載の器具。
【請求項２１】
検出チャンバの壁は、プローブによって放出され又は吸収された放射線に対して透明であり、前記放射線は、検出チャンバ内のレポータ錯体の存否を示していることを特徴とする請求項１記載の器具。
【請求項２２】
反応チャンバが実質的に満たされている状態を検出できる検出器を更に有していることを特徴とする請求項１記載の器具。
【請求項２３】
検出チャンバガス抜きを検出チャンバの遠位端部に形成できる穿孔手段を更に有していることを特徴とする請求項１記載の器具。
【請求項２４】
反応チャンバの遠位端部のところに反応チャンバガス抜きを更に有していることを特徴とする請求項１記載の器具。
【請求項２５】
ｐＨを持つ流体サンプル中の標的抗原を検出するのに用いられる使い捨て器具の製造方法であって、
近位端部及び遠位端部を備えた第１の材料シートを貫通し、反応チャンバ側壁、検出チャンバ側壁及び反応チャンバの遠位端部と検出チャンバの近位端部との間の第１のサンプル通路を構成する第１の孔を形成する工程と、
前記孔を覆った状態で第１の層を第１のシートの第１の面に取り付けて第１の反応チャンバ端壁及び第１の検出チャンバ端壁を構成する工程と、
前記孔を覆った状態で第２の層を第１のシートの第２の面に取り付けて第２の反応チャンバ端壁及び第２の検出チャンバ端壁を第１の層と実質的に重なり合った関係で構成し、シート及び層が複数の外面を備えたストリップを形成するようにする工程と、
ストリップの外面を貫通し、反応チャンバの遠位端部のところで反応チャンバ内へ延びていて、反応チャンバガス抜きを構成している第２の通路を形成する工程と、
ストリップの外面を貫通し、反応チャンバの近位端部のところで反応チャンバ内へ延びていて、サンプル入口を構成している第３の通路を形成する工程と、
抗体を反応チャンバ内に固定化する工程と、
プローブを構成するレポータ錯体を反応チャンバ内に配置する工程とを有することを特徴とする方法。
【請求項２６】
第１のシート、第１の層及び第２の層は、電気抵抗材料で構成され、第１の層は、第１のシートの第１の面に向いた第１の電極を構成し、第２の層は、第１のシートの第２の面に向いた第２の電極を構成していることを特徴とする請求項２５記載の方法。
【請求項２７】
第２の電極は、第１の電極から約５００ミクロン以下の距離を置いて向かい合った関係で設けられていることを特徴とする請求項２６記載の方法。
【請求項２８】
第２の電極は、第１の電極から約１５０ミクロン以下の距離を置いて向かい合った関係で設けられていることを特徴とする請求項２６記載の方法。
【請求項２９】
第２の電極は、第１の電極から約１５０ミクロン以下かつ約５０ミクロン以上の距離を置いて向かい合った関係で設けられていることを特徴とする請求項２６記載の方法。
【請求項３０】
前記層のうち少なくとも１つは、赤外光、可視光及び紫外光から成る群から選択された放射線の波長に対して透明であることを特徴とする請求項２５記載の方法。
【請求項３１】
酵素基体及びメディエイタを準備する工程を更に有し、酵素基体及びメディエイタは、検出チャンバに入れられ、プローブは、酵素であり、メディエイタは、電気化学的反応の発生を指示するよう酵素電極の反応を媒介できることを特徴とする請求項２５記載の方法。
【請求項３２】
ｐＨを持つ流体サンプル中の標的抗原を検出するのに用いられる使い捨て器具の製造方法であって、
近位端部及び遠位端部を備える第１の電気抵抗材料シートを貫通した第１の孔を形成する工程を有し、第１の孔は、第１の孔の反応チャンバ部分及び第１の孔の検出チャンバ部分を有すると共に反応チャンバ側壁の第１の部分、検出チャンバ側壁及び反応チャンバ遠位端部と検出チャンバ近位端部との間のサンプル通路を構成し、
近位端部及び遠位端部を備える第２の電気抵抗材料シートを貫通した第２の孔を形成する工程を有し、第２の孔は、反応チャンバ側壁の第２の部分を構成し、
近位端部及び遠位端部を備える第３の電気抵抗材料シートを貫通した第３の孔を形成する工程を有し、第３の孔は、反応チャンバ側壁の第３の部分を構成し、
第２のシートの第１の面を第１のシートの第１の面に取り付ける工程を有し、第２のシートは、第１の孔の検出チャンバ部分を覆って延びて第１の検出チャンバ端壁を構成し、反応チャンバ側壁の第２の部分は、反応チャンバ側壁の第１の部分と実質的に重なり合った関係にあり、
第３のシートの第１の面を第１のシートの第２の面に取り付ける工程を有し、第３のシートは、第１の孔の検出チャンバ部分を覆って延びて第２の検出チャンバ端壁を構成し、反応チャンバ側壁の第３の部分は、反応チャンバ側壁の第１の部分と実質的に重なり合った関係にあり、
前記第２の孔を覆った状態で第１の層を第２のシートの第２の面に取り付けて第１の反応チャンバ端壁を構成する工程を有し、
前記第３の孔を覆った状態で第２の層を第３のシートの第２の面に取り付けて第２の反応チャンバ端壁を第１の薄い層と実質的に重なり合った関係で構成する工程を有し、シート及び層は、複数の外面を備えたストリップを形成し、
ストリップの外部を貫通し、反応チャンバの遠位端部のところで反応チャンバ内へ延びる第２の通路を形成する工程を有し、第２の通路は、反応チャンバガス抜きを構成し、
ストリップの外部を貫通し、反応チャンバの近位端部のところで反応チャンバ内へ延びる第３の通路を形成する工程を有し、第３の通路は、サンプル入口を構成し、
抗体を反応チャンバ内に固定化する工程を有し、
プローブを構成するレポータ錯体を反応チャンバ内に配置する工程を有し、レポータ錯体は、プローブを構成していることを特徴とする方法。
【請求項３３】
流体サンプル中の標的抗原の存否を判定する方法であって、請求項１記載の器具を準備する段階を有し、レポータ錯体は、固定化抗体に結合できるよう標的抗原と競合できる第２の抗原を更に含み、
流体サンプルをサンプル入口に接触させる段階を有し、
サンプルがサンプル入口から反応チャンバに向かって流れるようにすることにより反応チャンバを流体サンプルで実質的に満たす段階を有し、
サンプル中に抗原が存在していない状態で実質的に全てのレポータ錯体が固定化抗体に結合するのに十分な所定の時間が経過するようにする段階を有し、
サンプルが反応チャンバからサンプル通路を通って検出チャンバに向かって流れるようにすることにより検出チャンバを流体サンプルで実質的に満たす段階を有し、
検出チャンバ内における抗原−プローブ錯体の存否を検出する段階を有し、抗原−プローブ錯体の存否は、サンプル中の抗原の存否を表していることを特徴とする方法。
【請求項３４】
ｐＨを持つ流体サンプル中の標的抗原を検出する際に用いられる使い捨て器具の製造方法であって、
第１の電気抵抗材料シートを貫通した第１の孔を形成する工程を有し、第１の孔は、検出チャンバ部分を有すると共に検出チャンバ側壁を構成し、検出チャンバは、近位端部及び遠位端部を有し、
前記孔を覆った状態で第１の層を第１のシートの第１の面に取り付けて第１の検出チャンバ端壁を構成する工程を有し、
前記孔を覆った状態で第２の層を第１のシートの第２の面に取り付けて第２の検出チャンバ端壁を第１の層と実質的に重なり合った関係で構成する工程を有し、シート及び層は、ストリップを形成し、
ストリップを貫通して延びる第２の孔を形成する工程を有し、ストリップは、近位端部及び遠位端部を有し、第２の孔は、反応チャンバ部分を有し、反応チャンバは、遠位端部及び近位端部を有し、第２の孔は、反応チャンバ側壁及び反応チャンバの遠位端部と検出チャンバの近位端部との間のサンプル通路を構成し、
第３の層の第１の面をストリップの第１の面に取り付ける工程を有し、第３の層は、第２の孔反応チャンバ部分を覆って延びて第１の反応チャンバ端壁を構成し、
第４の層の第１の面をストリップの第２の面に取り付ける工程を有し、第４の層は、第２の孔の反応チャンバ部分を覆って延びて第２の反応チャンバ端壁を第１の反応チャンバ端壁と実質的に重なり合った関係で構成し、
器具の表面を貫通して反応チャンバ遠位端部のところで反応チャンバ内に延びる第３の孔を形成する工程を有し、第３の孔は、反応チャンバガス抜きを構成し、
器具の表面を貫通して反応チャンバ近位端部のところで反応チャンバ内に延びる第４の孔を形成する工程を有し、第４の孔は、サンプル入口を構成し、
抗体を反応チャンバ内に固定化する工程を有し、
レポータ錯体を反応チャンバ内に配置する工程を有し、レポータ錯体はプローブを構成していることを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、免疫学的検定を行なう器具及び方法に関する。この器具は、使い捨て、免疫学的センサを有する。
【０００２】
【従来の技術】
多種多様な分析物の存否及び（又は）濃度を記録するために生物医学的センサが用いられている。分析物が蛋白質である場合、用いられる検出要素は通常、抗体である。というのは、抗体と蛋白質（抗原）の相互作用は非常に特異であるからである。かかる免疫学的検定は、２つのカテゴリー、即ち、例えば単純な視覚検出又は定量法により決定される抗原の濃度によって得られる「イエス／ノーの答」に分けられるのが通例である。たいていの定量法では、高価な機器、例えば、シンチレーション計数器（放射能のモニタのため）、分光光度計、分光蛍光計（例えば、米国特許第５，１５６，９７２号明細書を参照）、表面プラスモン共鳴器械（例えば、米国特許第５，９６５，４５６号明細書を参照）などが必要である。したがって、家庭又は現場使用に適するに足るほど安価であると共に使い方が簡単な定量免疫学的検定を開発すれば有利である。
【０００３】
従来型免疫学的検定は、２つのカテゴリー、即ち、競合検定とサンドイッチ検定に分類される。競合検定では、検査サンプル中の抗原を抗原−プローブ錯体と混合し、混合物は次に、抗体への結合のために競合する。プローブは、酵素、蛍光体又は発色団（色基）であるのがよい。第２に、サンドイッチ免疫学的検定では、検査サンプル中の抗原は、抗体に結合し、次に、第２の抗体−プローブ錯体は、抗原に結合する。これら従来型検定法では通常、１回以上の洗浄段階が必要である。洗浄段階は、検定手順に複雑さをもたらし、生態に有害な液体廃棄物を生じさせる場合がある。したがって、洗浄段階を必要としない免疫学的検定を行なう器具を開発すれば有利である。必然的に、かかる器具は、１回使用の使い捨て器具であるように設計されたものである。
【０００４】
発明の概要
洗浄段階を必要とせず、かくして液体廃棄物を生じさせない安価な定量的使い捨て免疫学的センサが提供される。さらに、好ましい実施形態のセンサでは、ユーザの側での時間調整段階を必要とせず、センサは、広い反応速度範囲にわたり抗原−抗体反応に容易に適合できる。
【０００５】
一実施形態では、ｐＨを持つ流体サンプル中の標的抗原を検出する際に用いられる使い捨て器具であって、内面、近位端部及び遠位端部を備えた反応チャンバと、反応チャンバ内に固定されていて、標的抗原に結合可能な固定化された抗体と、反応チャンバ内に存在していて、プローブを構成し、サンプルと混ざり合うことができるレポータ錯体（ｒｅｐｏｒｔｅｒ ｃｏｍｐｌｅｘ）と、壁、内面、遠位端部及び近位端部を備えた検出チャンバと、反応チャンバの遠位端部のところに設けられたサンプル入口と、反応チャンバの遠位端部と検出チャンバの近位端部との間に設けられたサンプル通路とを有することを特徴とする器具が提供される。
【０００６】
この実施形態の一特徴では、反応チャンバ内に収納されていて、反応チャンバの内面への蛋白質の非特異性結合を阻止できる薬剤が設けられる。薬剤は、界面活性剤及び遮断蛋白質、例えば、ＢＳＡ（ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ）から成る群から選択されている。
【０００７】
この実施形態の別の特徴では、レポータ錯体は、固定化抗体に結合できるよう標的抗原と競合できる第２の抗原又は標的抗原に結合できる第２の抗体を更に含む。
【０００８】
この実施形態の別の特徴では、プローブは、発色団及び蛍光体から成る群から選択されている。プローブは、酵素、例えば、グルコースオキシダーゼ又はグルコースデヒドロゲナーゼから成るのがよい。また、酵素基体、例えば、酸化可能な基体、例えば、ガラクトース、酢酸又はグルコースを更に設けるのがよい。
【０００９】
この実施形態の別の特徴では、検出チャンバは、メディエイタを更に有する。メディエイタは、ジクロロフェノリンドフェノール、遷移金属と窒素含有ヘテロアトミック化学種の錯体、又はフェリシアン化物から成るのがよい。
【００１０】
この実施形態の別の特徴では、器具は、サンプルのｐＨを調整できる緩衝剤、例えばホスフェート又はシトレートを含むものを更に有する。
【００１１】
この実施形態の別の特徴では、固定化抗体及び（又は）レポータ錯体は、反応チャンバの内面上に支持されている。レポータ錯体を約１ｍｍ以下だけ固定化抗体から離すのがよい。
【００１２】
この実施形態の別の特徴では、器具は、抗原、酵素及び抗体のうち１以上を安定化させる安定化剤を更に有する。
【００１３】
この実施形態の別の特徴では、酵素基体は、検出チャンバの内面上に支持されている。
【００１４】
この実施形態の別の特徴では、器具は、支持材料を更に有する。支持材料を検出チャンバに入れるのがよく、１以上の物質、例えば、酵素基体、メディエイタ及び緩衝剤を支持材料上に支持し、又は支持材料内に入れるのがよい。支持材料を反応チャンバに入れ、１以上の物質、例えば、固定化抗体、レポータ錯体及び反応チャンバの内面への蛋白質の非特異性結合を阻止できる薬剤を支持材料上に支持し、又は支持材料内に入れてもよい。支持材料は、ポリオレフィン、ポリエステル、ナイロン、セルロース、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリスルホン及びこれらの混合物から成る群から選択されたポリマーを含むメッシュ又は繊維充填材料、多孔質材料、例えば、ポリスルホン、ポリビニリデンジフルロリド、ナイロン、セルロースアセテート、ポリメタクリレート、ポリアクリレート及びこれらの混合物から成る群から選択されたポリマー材料を含むマクロ孔質メンブレン、又は焼結粉末を有するのがよい。
【００１５】
この実施形態の別の特徴では、検出チャンバは、少なくとも２つの電極を有する。電極は、パラジウム、白金、金、イリジウム、炭素、炭素と結合剤の混合物、酸化インジウム、酸化錫及びこれらの混合物から成る群から選択された材料で構成されるのがよい。
【００１６】
この実施形態の別の特徴では、検出チャンバの壁は、プローブによって放出され又は吸収された放射線に対して透明であり、放射線は、検出チャンバ内のレポータ錯体の存否を示している。
【００１７】
この実施形態の別の特徴では、反応チャンバが実質的に満たされている状態を検出できる検出器が更に設けられる。また、検出チャンバガス抜きを検出チャンバの遠位端部に形成できる穿孔手段を更に設けるのがよい。反応チャンバの遠位端部のところにも反応チャンバガス抜きを更に設けるのがよい。
【００１８】
第２の実施形態では、ｐＨを持つ流体サンプル中の標的抗原を検出するのに用いられる使い捨て器具の製造方法であって、近位端部及び遠位端部を備えた第１の材料シートを貫通し、反応チャンバ側壁、検出チャンバ側壁及び反応チャンバの遠位端部と検出チャンバの近位端部との間の第１のサンプル通路を構成する第１の孔を形成する工程と、孔を覆った状態で第１の層を第１のシートの第１の面に取り付けて第１の反応チャンバ端壁及び第１の検出チャンバ端壁を構成する工程と、孔を覆った状態で第２の層を第１のシートの第２の面に取り付けて第２の反応チャンバ端壁及び第２の検出チャンバ端壁を第１の層と実質的に重なり合った関係で構成し、シート及び層が複数の外面を備えたストリップを形成するようにする工程と、ストリップの外面を貫通し、反応チャンバの遠位端部のところで反応チャンバ内へ延びていて、反応チャンバガス抜きを構成している第２の通路を形成する工程と、ストリップの外面を貫通し、反応チャンバの近位端部のところで反応チャンバ内へ延びていて、サンプル入口を構成している第３の通路を形成する工程と、抗体を反応チャンバ内に固定化する工程と、プローブを構成するレポータ錯体を反応チャンバ内に配置する工程とを有することを特徴とする方法が提供される。
【００１９】
この実施形態の一特徴では、孔は、第１のシートの近位端部を貫通して第３の通路を形成している。
【００２０】
この実施形態の別の特徴では、第１のシート、第１の層及び第２の層は、電気抵抗材料で構成され、第１の層は、第１のシートの第１の面に向いた第１の電極を有し、第２の層は、第１のシートの第２の面に向いた第２の電極を有する。電極のうち少なくとも一方は、パラジウム、白金、金、イリジウム、炭素、炭素と結合剤の混合物、酸化インジウム、酸化錫及びこれらの混合物から成る群から選択された材料で構成されている。第１の電極は、第１の検出チャンバ端壁を実質的に覆い、第２の電極は、第２の検出チャンバ端壁を実質的に覆っている。電極のうち少なくとも一方は、スパッタ被覆金属付着物であるのがよい。第２の電極は、第１の電極から約５００ミクロン以下、第１の電極から約１５０ミクロン以下、又は第１の電極から約１５０ミクロン以下かつ約５０ミクロン以上の距離を置いて向かい合った関係で設けられている。
【００２１】
この実施形態の別の特徴では、層は、接着剤、例えば、熱活性化接着剤、感圧接着剤、熱硬化接着剤、化学的硬化接着剤、ホットメルト接着剤及びホットフロー接着剤でシートにくっつけられる。少なくともシート又は層のうち１つは、ポリマー材料、例えば、ポリエステル、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリオレフィン及びこれらの混合物又はポリエチレンテレフタレートから成るのがよい。層のうち少なくとも１つは、赤外光、可視光及び紫外光から成る群から選択された放射線の波長に対して透明であるのがよい。
【００２２】
この実施形態の別の特徴では、この方法は、酵素基体及びメディエイタを準備する工程を更に有するのがよく、酵素基体及びメディエイタは、検出チャンバに入れられ、プローブは、酵素であり、メディエイタは、電気化学的反応の発生を指示するよう酵素電極の反応を媒介できる。
【００２３】
この実施形態の別の特徴では、この方法は、サンプルのｐＨを調整できる緩衝剤を準備する工程を更に有する。
【００２４】
第３の実施形態では、ｐＨを持つ流体サンプル中の標的抗原を検出するのに用いられる使い捨て器具の製造方法であって、近位端部及び遠位端部を備える第１の電気抵抗材料シートを貫通した第１の孔を形成する工程を有し、第１の孔は、第１の孔の反応チャンバ部分及び第１の孔の検出チャンバ部分を有すると共に反応チャンバ側壁の第１の部分、検出チャンバ側壁及び反応チャンバ遠位端部と検出チャンバ近位端部との間のサンプル通路を構成し、近位端部及び遠位端部を備える第２の電気抵抗材料シートを貫通した第２の孔を形成する工程を有し、第２の孔は、反応チャンバ側壁の第２の部分を構成し、近位端部及び遠位端部を備える第３の電気抵抗材料シートを貫通した第３の孔を形成する工程を有し、第３の孔は、反応チャンバ側壁の第３の部分を構成し、第２のシートの第１の面を第１のシートの第１の面に取り付ける工程を有し、第２のシートは、第１の孔の検出チャンバ部分を覆って延びて第１の検出チャンバ端壁を構成し、反応チャンバ側壁の第２の部分は、反応チャンバ側壁の第１の部分と実質的に重なり合った関係にあり、第３のシートの第１の面を第１のシートの第２の面に取り付ける工程を有し、第３のシートは、第１の孔の検出チャンバ部分を覆って延びて第２の検出チャンバ端壁を構成し、反応チャンバ側壁の第３の部分は、反応チャンバ側壁の第１の部分と実質的に重なり合った関係にあり、第２の孔を覆った状態で第１の層を第２のシートの第２の面に取り付けて第１の反応チャンバ端壁を構成する工程を有し、第３の孔を覆った状態で第２の層を第３のシートの第２の面に取り付けて第２の反応チャンバ端壁を第１の薄い層と実質的に重なり合った関係で構成する工程を有し、シート及び層は、複数の外面を備えたストリップを形成し、ストリップの外部を貫通し、反応チャンバの遠位端部のところで反応チャンバ内へ延びる第２の通路を形成する工程を有し、第２の通路は、反応チャンバガス抜きを構成し、ストリップの外部を貫通し、反応チャンバの近位端部のところで反応チャンバ内へ延びる第３の通路を形成する工程を有し、第３の通路は、サンプル入口を構成し、抗体を反応チャンバ内に固定化する工程を有し、プローブを構成するレポータ錯体を反応チャンバ内に配置する工程を有し、レポータ錯体は、プローブを構成していることを特徴とする方法が提供される。
【００２５】
第４の実施形態では、流体サンプル中の標的抗原の存否を判定する方法であって、ｐＨを持つ流体サンプル中の標的抗原を検出する際に用いられる使い捨て器具であって、内面、近位端部及び遠位端部を備えた反応チャンバと、反応チャンバ内に固定されていて、標的抗原に結合可能な固定化された抗体と、反応チャンバ内に存在していて、プローブを構成し、サンプルと混ざり合うことができるレポータ錯体と、壁、内面、遠位端部及び近位端部を備えた検出チャンバと、反応チャンバの遠位端部のところに設けられたサンプル入口と、反応チャンバの遠位端部と検出チャンバの近位端部との間に設けられたサンプル通路とを有し、レポータ錯体が、固定化抗体に結合できるよう標的抗原と競合できる第２の抗原又は標的抗原に結合できる第２の抗体を更に含んでいる器具を準備する段階を有し、流体サンプルをサンプル入口に接触させる段階を有し、サンプルがサンプル入口から反応チャンバに向かって流れるようにすることにより反応チャンバを流体サンプルで実質的に満たす段階を有し、サンプル中に抗原が存在していない状態で実質的に全てのレポータ錯体が固定化抗体に結合するのに十分な所定の時間が経過するようにする段階を有し、サンプルが反応チャンバからサンプル通路を通って検出チャンバに向かって流れるようにすることにより検出チャンバを流体サンプルで実質的に満たす段階を有し、検出チャンバ内における抗原−プローブ錯体の存否を検出する段階を有し、抗原−プローブ錯体の存否は、サンプル中の抗原の存否を表していることを特徴とする方法が提供される。
【００２６】
この実施形態の第１の特徴では、この方法は、検出チャンバの壁を穿孔して検出チャンバガス抜きを検出チャンバの遠位端部に形成する段階を更に有し、穿孔段階は、所定時間が経過すると直ぐに実施される。
【００２７】
第５の実施形態では、ｐＨを持つ流体サンプル中の標的抗原を検出する際に用いられる使い捨て器具の製造方法であって、第１の電気抵抗材料シートを貫通した第１の孔を形成する工程を有し、第１の孔は、検出チャンバ部分を有すると共に検出チャンバ側壁を構成し、検出チャンバは、近位端部及び遠位端部を有し、孔を覆った状態で第１の層を第１のシートの第１の面に取り付けて第１の検出チャンバ端壁を構成する工程を有し、孔を覆った状態で第２の層を第１のシートの第２の面に取り付けて第２の検出チャンバ端壁を第１の層と実質的に重なり合った関係で構成する工程を有し、シート及び層は、ストリップを形成し、ストリップを貫通して延びる第２の孔を形成する工程を有し、ストリップは、近位端部及び遠位端部を有し、第２の孔は、反応チャンバ部分を有し、反応チャンバは、遠位端部及び近位端部を有し、第２の孔は、反応チャンバ側壁及び反応チャンバの遠位端部と検出チャンバの近位端部との間のサンプル通路を構成し、第３の層の第１の面をストリップの第１の面に取り付ける工程を有し、第３の層は、第２の孔反応チャンバ部分を覆って延びて第１の反応チャンバ端壁を構成し、第４の層の第１の面をストリップの第２の面に取り付ける工程を有し、第４の層は、第２の孔の反応チャンバ部分を覆って延びて第２の反応チャンバ端壁を第１の反応チャンバ端壁と実質的に重なり合った関係で構成し、器具の表面を貫通して反応チャンバ遠位端部のところで反応チャンバ内に延びる第３の孔を形成する工程を有し、第３の孔は、反応チャンバガス抜きを構成し、器具の表面を貫通して反応チャンバ近位端部のところで反応チャンバ内に延びる第４の孔を形成する工程を有し、第４の孔は、サンプル入口を構成し、抗体を反応チャンバ内に固定化する工程を有し、レポータ錯体を反応チャンバ内に配置する工程を有し、レポータ錯体はプローブを有することを特徴とする方法が提供される。
【００２８】
この実施形態の一特徴では、第１の層及び第２の層は、電気抵抗材料で構成され、第１の層は、第１のシートの第１の面に向いた第１の電極を有し、第２の層は、第１のシートの第２の面に向いた第２の電極を有する。
【００２９】
【発明の実施の形態】
以下において、本発明の好ましい実施形態を詳細に説明する。当業者であれば、本発明の範囲に含まれる本発明の多くの変形例及び改造例を想到できよう。したがって、好ましい実施形態の説明は、本発明の範囲を限定するものではない。
【００３０】
単一段階方式非洗浄形免疫学的センサが開示されている。このセンサは、２つの隣り合うチャンバ、即ち、反応チャンバと検出チャンバを利用した１回使用の使い捨て器具である。反応チャンバ内では、抗原−抗体反応が起こり、検出チャンバ内では、これら反応の結果物が検出され、サンプル中の抗原の存否が推定される。
【００３１】
任意適当な検出法を利用することができる。適当な検出法としては、例えば、発色が観察される視覚的検出又は反射又は透過光を用いて光吸収度の変化を測定する分光器的検出が挙げられる。好ましい実施形態では、検出法は、抗原−抗体反応の生成物により間接的に生じた電流又は電位差を測定する電気化学的方法である。
【００３２】
流体サンプルの電気化学的測定値を得る方法及び器具が、２０００年７月１４日に出願された同時係属米国特許出願第０９／６１５，６９１号明細書（発明の名称：ＡＮＴＩＯＸＩＤＡＮＴ ＳＥＮＳＯＲ）、２０００年７月１４日に出願された同時係属米国特許出願第０９／６１６，５１２号明細書（発明の名称：ＨＥＭＯＧＬＯＢＩＮ ＳＥＮＳＲＯＲ）及び２０００年７月１４日に出願された同時係属米国特許第０９／６１６，５５６号明細書（発明の名称：ＥＬＥＣＴＲＯＣＨＥＭＩＣＡＬ ＭＥＴＨＯＤ ＦＯＲ ＭＥＡＳＵＲＩＮＧ ＣＨＥＭＩＣＡＬ ＲＥＡＣＴＩＯＮ ＲＡＴＥＳ）に詳しく記載されており、これら米国特許明細書の各々の開示内容全体を本明細書の一部を形成するものとしてここに引用する。
【００３３】
種々の試験段階、即ち、反応段階及び検出段階の時間調整（タイミング）をマニュアル方式で行なうことができる。変形例として、時間調整を、反応チャンバが充電されると生じるトリガ信号に応動して自動的に行なってもよい。
電気化学的検出に用いるのに適したセンサの実施形態が、図１及び図２に示されている。図１は、センサストリップの平面図、図２は、反応チャンバ及び検出チャンバの細部を示す断面図である。
【００３４】
センサ
好ましい実施形態の免疫学的センサは、電気化学的グルコース検出器具を調製する際に用いられる周知の薄膜デバイス作製法を用いて調製できる（例えば、米国特許第５，９４２，１０２号明細書を参照されたい。なお、かかる米国特許明細書の記載内容全体を本明細書の一部を形成するものとしてここに引用する。）。かかる技術は、幾つかの設計変更を施すと、非電気化学的検出法を利用する免疫学的センサを調製するのにも利用される。
【００３５】
図１及び図２に示す免疫学的センサの好ましい実施形態では、検出チャンバ２８は、電気化学的セルを構成している。反応チャンバ２２及び検出チャンバ２８を調製するには、まず最初に、電気抵抗材料のシート３６を貫通して延びる孔を形成する。この孔は、反応チャンバ２２と検出チャンバ２８の両方の側壁並びに２つのチャンバ２２，２８相互間をサンプル通路３８を構成するように形作られている。孔を反応チャンバ２２の近位端部２４からこれを通ってシート３７の縁部まで孔を延長させることにより、サンプル入口２４もまた形成されている。一実施形態では、シート３６の厚さは、反応チャンバ２２及び検出チャンバ２８の全高を定め、これらの高さは同一である。別の実施形態では、反応チャンバ２２の高さは、検出チャンバ２８の高さよりも大きい。検出チャンバ２８よりも高さの大きい反応チャンバ２２は、多数のシート３２，３４，３６を互いに積層することにより調製される。層の中間のシート３６は、上述したように反応チャンバ２２と検出チャンバ２８の両方の側壁７４，７６を構成する孔を有している。次に、この中間層３６を２以上の追加の層３２，３４相互間にサンドイッチし、これら追加の層３２，３４は、反応チャンバ２２だけの側壁７４を構成する孔を有し、層３２，３４はそれにより、検出チャンバ２８の端壁６０，６２を構成する。この実施形態では、検出チャンバの端壁６０，６２は、以下に説明するように調製できる電極５２，５４を構成している。
【００３６】
反応チャンバ２２及び検出チャンバ２８の側壁７４，７６を形成した後、孔を覆った状態で第１の薄い電極層５２を電気抵抗材料のシート３６の片面７０上に被着し、検出チャンバ２８を形成すると共に端壁６０を形成する。層５２を例えば接着剤によりシート３６に接着させてもよい。適当な接着剤としては、例えば、熱活性化接着剤、感圧接着剤、熱硬化接着剤、化学的硬化接着剤、ホットメルト接着剤、ホットフロー接着剤などが挙げられる。電極層５２を調整するのに電気抵抗材料のシート３２を（例えばスパッタ被覆により）適当な金属、例えば、白金、パラジウム、炭素、酸化インジウム、酸化錫、インジウムと酸化錫の混合物、金、銀、イリジウム、これらの混合物等で被覆する。電極５２，５４として用いるのに適した材料は、センサ２０中に存在している試薬と共存性があり、即ち、これら材料は、試薬と化学的に反応しないものである。
【００３７】
次に、これ又、孔を覆った状態で第２の薄い電極層５４を電気抵抗材料のシート３６の反対側の面７１に被着し、検出チャンバ２８を形成すると共に第２の端壁６２を形成する。好ましい実施形態では、電極層５２，５４を約５００ミクロン未満、より好ましくは、１５０ミクロン未満、最も好ましくは５０ミクロン乃至１５０ミクロンの距離を置いて対向した関係をなして設ける。サンプル入口２４が既に形成されていなくても、例えば反応チャンバ２２の近位端部２３と交差する切欠きを器具２０の縁部３７に形成することによりこれを設ける。
【００３８】
電極層５２，５４に、センサ２０を測定回路内に配置できる接続手段を設ける。セル２８内の電極のうちの少なくとも一方５２又は５４は、検出電極、即ち、酸化防止剤の場合においては、所定量の被還元レドックス剤、酸化体の場合においては所定量の被酸化レドックス剤の影響を受ける電極である。検出電極５２又は５４の電位差が分析物の存在レベルを表す電位差滴定センサ２０の場合、基準電極として働く第２の電極５４又は５２が基準電位をもたらすよう働くものとして存在する。検出電極電流がサンプル中の分析物のレベルを表す電流滴定センサ２０の場合、電気回路を構成する対向電極として働く少なくとも１つの他の電極５４又は５２が存在する。この第２の電極５４又は５２は、基準電極としても機能するのがよい。変形例として、別個の電極（図示せず）が、基準電極の機能を実行してもよい。
【００３９】
免疫学的センサ２０を電気化学的セル２８として動作させる場合、反応チャンバ２２及び（又は）検出チャンバ２８を構成する孔を有するシート３２，３４，３６は、電気抵抗材料から成ることが必要である。適当な電気抵抗材料としては、例えば、ポリエステル、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリオレフィン、これらの混合物などが挙げられる。好ましいポリエステルは、ポリエチレンテレフタレートである。免疫学的センサ２０を電気化学的検出法以外の検出法を用いて動作させる場合、構成材料は電気抵抗材料である必要はない。しかしながら、好ましい実施形態の免疫学的センサを構成する上で用いるものとして上述のポリマー材料が好ましい。というのは、これらは加工が容易であり、安価であり、しかも試薬及びサンプルに対しての反応性がないからである。特定周波数の光を吸収し、透過させ又は放出させる段階を含む検出方法の場合、端壁６０及び（又は）６２並びに検出チャンバ２８の端壁の上に位置する層３２，４６及び（又は）層３４，４２は、その光の周波数に対して透明である必要がある。
【００４０】
セル２８内に用いられる試薬、例えば、固定化抗体、プローブ結合（ｐｒｏｂｅ−ｌｉｎｋｅｄ）抗原、緩衝剤、メディエイタなどを反応チャンバ２２の壁４４，４８及び（又は）７４上、検出チャンバ２８の壁６０，６２及び（又は）７６上、チャンバ内に収納された別個独立の支持体上、マトリックス内に支持してもよく、或いは、自立形のものであってもよい。試薬をチャンバ壁又は電極５２，５４上に支持する場合、化学物質を当該技術分野において周知の印刷法、例えば、インクジェット印刷法、スクリーン印刷法、リソグラフィなどを利用して塗布するのがよい。好ましい実施形態では、試薬を含む溶液をチャンバ内の表面に塗布して乾燥させる。
【００４１】
抗体４４、プローブ結合抗原５０又は他の化学物質を反応チャンバ２２又は検出チャンバ２８の表面４０，４８，６０，６２，７４及び（又は）７６上に固定し、又は乾燥付着させないで、これらを１以上の別個独立の支持体上に支持し、又はこの中に納めてこれら支持体を次にチャンバ内に配置すると有利な場合がある。適当な別個独立の支持体としては、メッシュ材料、不織布材料、繊維充填材料、マクロ孔質メンブレン、又は焼結粉末が挙げられるが、これらには限定されない。別個独立の支持体を用いた場合の利点は、表面積が増すことが挙げられ、かくして、所望ならば、より多量の抗体及びプローブ結合抗原を反応チャンバ２８内に入れることができる。かかる実施形態では、抗体を１つの多孔質材料片上に固定し、第１の反応チャンバ内に配置し、そして、プローブ結合抗原を別の多孔質材料片上に乾燥付着させ、次にこれを反応チャンバ内に配置する。変形例として、抗体かプローブ結合抗原かのいずれかを多孔質材料上に付着させ、他方の成分を上述したように反応チャンバ壁上に支持する。さらに別の実施形態では、反応チャンバの壁それ自体は多孔質であり、抗体及び（又は）プローブ結合抗原をこれら壁内に含ませる。この実施形態では、液体は、多孔質壁内に染み込むことができるが、限定された領域から漏れ出ることはない。これは、マクロ孔質メンブレンを用いて反応チャンバ壁を形成し、このメンブレンを反応チャンバの周りで圧縮して所望の領域からのサンプルの漏出を阻止することによって達成される。
【００４２】
適当な別個独立の支持体、例えば、メッシュ材料、不織布材料及び繊維充填材料としては、ポリオレフィン、ポリエステル、ナイロン、セルロース、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリスルホン、これらの混合物などが挙げられる。適当なマクロ孔質メンブレンを、ポリマー材料で調製するのがよく、かかるポリマー材料としては、ポリスルホン、ポリビニリデンジフルロリド、ナイロン、セルロースアセテート、ポリメタクリレート、ポリアクリレート、これらの混合物などが挙げられる。
【００４３】
蛋白質又は抗体をマトリックス、例えば、ポリビニルアセテート内に含有させるのがよい。サンプル中のマトリックスの溶解性を変化させることにより、サンプル中への蛋白質又は抗体の制御された放出を達成することができる。
【００４４】
全ての場合において、センサ内において用いられる材料は、大量生産に適した形態であり、セルそれ自体は、１回の実験のために用いられ、次に処分できるように設計される。
【００４５】
上述したように製作された免疫学的センサの好ましい実施形態が、図１及び図２に示されている。この好ましい実施形態では、層３２，３４は導電性材料５２，５４で被覆された基体である。表面６０又は６２上の導電性材料５２，５４は、検出チャンバ２８に向き、表面３３又は３５上に被覆された接着材層（図示せず）はそれぞれ、層４２又は４６に向いている。
【００４６】
抗原の存否を判定するセンサの使用法
好ましい実施形態では、センサ２０は、図１、即ち、かかるセンサ２０の平面図に示すと共に、図２、即ち、センサのＡ−Ａ’矢視断面図に示すように、プローブとして酵素、例えば、グルコースオキシダーゼ又はグルコースデヒトロゲナーゼを利用した電気化学的セル２８である。分析物の存否は、この実施形態では次にように推定される。
【００４７】
まず最初に、ユーザは、サンプルをサンプル入口２４からセンサ２０の反応チャンバ２２内へ導入する。サンプルを毛管作用又は吸い上げ作用の影響下において反応チャンバ２２内へ吸い込ませる。充填中、反応チャンバのガス抜き（ベント）２６は、大気に開口しており、かくして、サンプルによって押し退けられた空気が逃げ出ることができるようになっている。サンプルは、反応チャンバガス抜き２６まで一杯になるまで反応チャンバ２２内へ吸い込まれ、一杯になった時点で充填が止まる。反応チャンバ２２の容積は、検出チャンバ２８の容積に少なくとも等しく、好ましくはこれよりも大きいものであるように選択されている。
【００４８】
図１の破線で示す円は、層４２，４６ではなく、層３２，３４，３６に設けられた孔３０を示しており、層３４の孔は、検出チャンバ２８内へ開口している。層４２，４６は最初に穿孔されるわけではないので、検出チャンバ２８が大気に対して開口しているのは、反応チャンバ２２内へ開口したサンプル通路３８だけである。かくして、反応チャンバ２２がサンプルで一杯になると、反応チャンバは、検出チャンバ２８に至る通路３８を遮断する。これにより、検出チャンバ２８内に空気が取り込まれ、検出チャンバがサンプルで一杯になるのが実質的に阻止される。少量のサンプルが、サンプルが最初に検出チャンバ２８に至る開口部３８に接触した時点とサンプルが開口部３８の遠い方の側部に接触した時点との間の期間中、検出チャンバ２８に入ることになる。しかしながら、サンプルが検出チャンバ２８に至る開口部３８を完全に横切っていったん濡れると、検出チャンバ２８のそれ以上の充填が起こらなくなる。
【００４９】
反応チャンバ２２のベースを形成する基体４２の内面４０は、検出されるべき抗原に見合った抗体４４で被覆されている。抗体４４は基体４２の表面４０上に吸着され又は固定化されて検査中、基体４２からのぞかれないようにする。基体４２の内面４０への抗体４４の塗布後、この表面への蛋白質の非特異性の結合を阻止するよう調製された薬剤（図示せず）を塗布するのがよいが、このようにするかどうかは任意である。当該技術分野において周知のかかる一例は、ＢＳＡ（ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ）である。かかる薬剤として非イオン界面活性剤、例えばペンシルベニア州フィラデルフィア所在のローム・アンド・ハース社製のＴｒｉｔｏｎ　Ｘ１００（商標）又はデラウェア州ウィルミントン所在のアイシーアイ・アメリカズ社製のＴｗｅｅｎ（商標）を用いてもよい。選択した非イオン界面活性剤は、蛋白質を変性させない。基体４２の内面４０上の被膜４４は、検査にあたって使用準備ができた時は乾燥状態にある。
【００５０】
別の基体４６が、反応チャンバ２２の頂面４８を構成している。検出されるべき抗原５０に結合された酵素（ＥＮＺ）が、基体４６の内面４８上に塗布されている。適当な酵素の例としては、グルコース、オキシダーゼ及びグルコースデヒドロゲナーゼが挙げられるが、これらには限定されない。基体４６の内面４８がサンプルによって湿潤されると、酵素結合（ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ）抗原がサンプル中へ遊離できるようにこの内面４８上に酵素結合抗原５０を乾燥付着させる。したがって、基体４６の内面４８及び酵素結合抗原５０の塗布方法は、酵素結合抗原５０と基体４６の内面４８との間に弱い結合部だけが生じるように選択される。表面４８からの酵素結合抗原５０の溶解速度は、サンプルが反応チャンバ２２を充填するのに必要な時間の間、溶解がほとんど生じないように選択される。このようにすると、酵素結合抗原５０は、充填後、反応チャンバ２２の領域全体にわたって一様に分布されることになる。
【００５１】
酵素結合抗原５０及び抗体４４の相対量は、酵素結合抗原５０よりもほんの僅かに抗体４４が多いように選択される。この関連において、僅かな過剰分は、これがサンプル中の検出されるべき抗原分子の数と比較して僅かであるように定められる。
【００５２】
かくして、サンプルが反応チャンバ２２を充填すると、酵素結合抗原５０は、サンプルに入ってこれと混ざり合う。次に、十分な時間をかけて酵素結合抗原５０が抗体４４と接触するようにする。過剰の抗体４４が存在しているので、もしサンプル中に抗体が存在していないくても、酵素結合抗原５０の実質的に全ては、抗体４４に結合して効果的に固定化される。サンプル中に抗原が存在していると、酵素結合抗原５０よりも少なく、すでにサンプル中全体にわたって存在している抗原は、抗体４４に接触してこれに結合し、その後に酵素結合抗原５０が抗体４４に接触する。したがって、抗体４４は、酵素結合抗原５０への結合が遮られて阻止されることになる。したがって、抗原がサンプル中に当初存在していれば、反応段階の終わりに、酵素結合抗原５０はサンプル中で移動可能な状態のままであろう。抗原がサンプル中に当初存在していなければ、酵素結合抗原５０は、反応段階の終わりに基体４６の内面４８上に固定化されることになろう。
【００５３】
反応段階の終期は、サンプルを反応チャンバ２２に導入した後の時点の所定の位置である。所定の時点は、抗原がサンプル中に当初存在していない場合、酵素結合抗原５０が実質的に全て、検査条件下において抗体４４に結合するのに十分な時間があるように設定される。
【００５４】
サンプルを反応チャンバ２２内に導入する時間は、ユーザにより、例えば、センサ２０に接続された計器のボタンを押すことによって指示できる。この作用は、時間調整装置をトリガするのに用いられる。視覚検出方式の場合、計器は不要である。かかる実施形態では、ユーザは、手動で反応期間を時間調整する。
【００５５】
電気化学的検出法を利用して抗原−抗体反応の結果を検出する場合、サンプルを反応チャンバ２２内に導入したことの指示を自動化するのがよい。上述のように、サンプルが反応チャンバ２２を充填すると、反応チャンバ２２に通じる開口部３８のところの検出チャンバ２８の僅かな一部が、サンプルによって湿潤されることになる。電気化学的検出法を用いる場合、少なくとも２つの電極５２，５４が検出チャンバ２８内に設けられることになる。これら電極５２，５４を検出チャンバ２８内に配置して各電極５２，５４の少なくとも一部が反応チャンバ２２の充填中、サンプルと接触するようにする場合、サンプルが存在していれば、電極５２，５４が橋渡しされて時間調整装置をトリガするのに用いることができる電気信号が発生する。
【００５６】
ユーザにより、或いは自動的に時間調整装置をトリガした後、所定の時点において、検査の抗原−抗体反応段階は、完了したものと見なされる。検査の抗原−抗体反応段階が完了すると、大気に通じるガス抜き５６が開かれる。例えば、計器内のソレノイド作動式ニードルを用いて層４２又は層４６、或いは層４２，４６の両方を穿孔するのがよく、かくして、検出チャンバ２８の遠位端部５８を大気に開放させる。穿孔は、上述の例の場合のように計器によって自動的に行なってもよく、或いは、計器が用いられない視覚検出方式の場合ユーザによって手作業で行なってもよく、例えば、ユーザは、ニードルを層４２，４６に刺し通し、それによりガス抜き５６を形成する。
【００５７】
ガス抜き５６を大気に開放することにより、検出チャンバ２８内に閉じ込められている空気が逃げ出て、それにより検出チャンバ２８を反応チャンバ２２からの反応済みサンプルで満たすことができる。反応済みサンプルは、反応チャンバ２２内に存在している毛管作用力と比較して検出チャンバ２８内の毛管作用力が大きいので、検出チャンバ２８内に吸い込まれることになろう。好ましい実施形態では、毛管作用力の増大は、検出チャンバ２８の表面６０，６２を適当に被覆することにより、或いはより好ましくは、検出チャンバ２８についての毛管作用距離を、これが反応チャンバ２２の毛管作用距離よりも短いように選択することによって得られる。この実施形態では、毛管作用距離は、チャンバの最も小さな寸法であるように定められる。
【００５８】
検出チャンバ２８内には任意的に乾燥状態の試薬６４が設けられ、かかる乾燥状態の試薬は、酵素基体及びメディエイタから成っていて、酵素結合抗原５０の酵素部分と反応して検出可能な信号を出力することができる。酵素基体及びメディエイタ（もし存在していれば）は、存在している任意の酵素と酵素基体６４の反応速度が酵素の存在量によって決定されるのに十分な量のものであるべきである。例えば、酵素がグルコースオキシダーゼ又はグルコースデヒドロゲナーゼであれば、適当な酵素メディエイタ６４及びグルコース（既にサンプル中に存在していないくても）は、検出チャンバ２８内に設けられることになる。また、検出チャンバ２８内のサンプルのｐＨを調整するのに役立つ緩衝剤を用いるのがよい。電気化学的検出方式を用いる実施形態では、フェリシアン化物が適当なメディエイタである。他の適当なメディエイタとしては、ジクロロフェノリンドフェノール及び遷移金属と窒素含有ヘテロアトミック化学種の錯体が挙げられる。グルコース、メディエイタ及び緩衝剤６４は、酵素と酵素基体６４の反応速度が、存在している酵素の濃度によって制限されるように十分な量で存在している。
【００５９】
検出チャンバ２８を充填すると、試薬６４はサンプル中へ溶解する。試薬６４の酵素成分は、グルコース及びメディエイタと反応して被還元状態のメディエイタが生じる。この被還元メディエイタは、検出チャンバ２８内でアノードとして働く電極５２又は５４のところで電気化学的に酸化されて電流を生じさせる。一実施形態では、この電流の時間に対する変化率は、反応済みサンプル中における酵素の存在及び存在量の指標として用いられる。電流の変化率が所定の閾値よりも小さい場合、これは、有効量の酵素結合抗原５０が反応済みサンプル中に存在していないことを表しており、かくして、もともとのサンプル中に抗原が存在していないことを指示している。電流変化率が閾値よりも高い場合、これにより酵素結合抗原５０が反応済みサンプル中に存在し、かくして、抗原が当初サンプル中に存在していることも分かる。一実施形態では、電流の変化率は、サンプル中に当初存在している抗原の相対量の目安を与えるのに用いられる。
【００６０】
電気化学的検出システムの好ましい実施形態では、検出チャンバ２８内の電極５２，５４は、例えば、国際公開第ＷＯ　９７／１８４６４号パンフレットに開示されているようにスパッタリングにより基体３２，３４の内面６０，６２上に被覆された導電層として形成される。これら導電層５２，５４は、存在している試薬と化学的に反応しない材料のものであり、選択の可能性として電極５２，５４として役立つ。適当な材料の例としては、パラジウム、白金、金、イリジウム、炭素、炭素と結合剤の混合物、酸化インジウム、酸化錫、及びインジウムと錫の酸化物の混合物が挙げられるが、これらには限定されない。
【００６１】
この実施形態では、不活性の電気絶縁層３６が、電極支持基体３２，３４を互いに分離している。好ましくは、絶縁層３６は、層３２，３４を所定の離隔状態に保つよう機能する。この離隔距離が、十分小さく、例えば、５００ミクロン未満、より好ましくは５０ミクロン乃至１５０ミクロンであれば、電極５２，５４相互間を流れる電流は、採用された検出時間に対し適当に短い時間が経つと被還元メディエイタの濃度に正比例することになる。この実施形態では、電流の増大速度は、酵素の反応速度、したがって、酵素の存在量に正比例する。
【００６２】
図１には接続端部６６が示されている。検出チャンバ２８内の電極５４，５６を、接続端部６６を介して計器（図示せず）と電気的接続状態に配置するのがよい。接続手段（図示せず）は、導電軌道（図示せず）により検出チャンバ２８内の電極５４，５６と電気的接触状態にある。図１に示す好ましい実施形態では、これらは導電軌道は、層３２，３４の内面上に被覆された導体５２，５４のフィルムの延長部から成っている。接続領域６６と接続状態にある計器は、電位差を検出チャンバ２８内の電極５２，５４相互間に印加し、生じた電気信号を分析し、応答結果を表示し、そして任意的にこの応答結果を記憶装置内に記憶させることができる。
【００６３】
電気化学的検出方式を利用する他の実施形態では、検出チャンバの内面のうち、一方又は両方に被着された導電材料のストライプが用いられ、この場合、少なくとも２つの電極、即ち、検出電極と、対向／基準電極が設けられる。任意的に別個の基準電極として役立つ第３の電極が設けられる。
【００６４】
視覚検出又は反射分光学が使用される検出方法である実施形態の場合、少なくとも層３２，４６又は層３４，４２は、観察されるべき放射線の波長に対して透明である。視覚検出方式の場合、検出チャンバ２８内の単純な色の変化が観察される。反射分光学の場合、検出放射線を層３２，４６、又は層３４，４２を通して照らし、検出チャンバ２８内の溶液から反射された放射線を分析する。検出方法として用いられた透過分光学の場合、少なくとも層３２，４６，３４，４２は、選択波長の放射線に対して透明である。放射線は、検出チャンバ２８内のサンプルを通して照らされ、ビームの減衰度を測定する。
【００６５】
センサを構成する方法の好ましい実施形態では、層３６は、基材の上面７０及び下面７２に接着剤の層（図示せず）を被着したものである。層３６の基材に適した材料の例としては、ポリエステル、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリオレフィン、好ましくはポリエチレンテレフタレートが挙げられる。適当な接着剤の例は、感圧接着剤、熱及び化学的硬化接着剤、ホットメルト及びホットフロー接着剤がある。
【００６６】
プローブとしてのメリチンの使用法
従来型ＥＬＩＳＡが、抗原を酵素に結合させる。しかしながら、抗原をハチの毒液中に見られるメリチン、ポリペプチドに結合することも可能である。この実施形態では、抗原−メリチン錯体を含むプローブ結合抗原を上述したように反応チャンバの壁に乾燥付着させるのがよい。検出チャンバは、フェロシアン化物をリポソーム又は脂質小嚢中に入れたものから成るメディエイタを収納するのがよい。抗原−メリチン錯体がリポソームに到達すれば、リポソームは破裂してフェロシアン化物を放出する。これにより、信号の急激な増幅が生じ、すなわち、少量の自由抗原が、抗体上の結合場所を求めて抗原−メリチン錯体と競合し、その結果、高濃度のフェロシアン化物が生じることになる。
【００６７】
電気化学的検定におけるホースラディッシュ（ワサビダイコン）ペルオキシダーゼ及びアルカリ性ホスファターゼの使用法
従来型ＥＬＩＳＡは、比色検定における酵素としてホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）又はアルカリ性ホスファターゼ（ＡＰ）を用いる。しかしながら、これら両方の酵素を電気化学的検定で用いることができるようにする基体が開発された。この実施形態では、ＡＰをｐ−アミノフェニルホスフェートと共に用いるのがよく、ＨＲＰをテトラチアフルバレンと共に用いるのがよい。
【００６８】
免疫学的センサを用いて電気化学的測定値を得る方法
或る幾つかの実施形態では、化学反応を、電気活性生成物を電気化学的に反応させるのに用いられる電極から遠くに位置する場所に局在化するようにすることにより、センサを用いて、少なくとも１種類の電気活性生成物を生じさせる化学反応の速度に関する情報を得ることができる。
【００６９】
化学反応の起こる場所は、この化学反応の場所から電極への電気活性化学種の物質移動が電極のところで流れる電流を任意の時点で効果的に制御するように電極から十分ずらされる。この構成により、化学反応場所と電極との間の電気活性化学種の濃度勾配が実質的に線形になる。電気活性化学種の濃度は、ここで電気化学反応が起こることにより電極のところでは効果的にゼロに保たれる。したがって、この濃度勾配の大きさの時間的推移は、化学反応場所での電気活性化学種の濃度の時間的推移及び液体媒体中の電気活性反応生成物の拡散係数だけで実質的に定められる。電極のところで流れる電流は、電極のところの電気活性化学種の濃度勾配に比例するので、この電流の時間的推移は、この遠隔の場所で生じる化学反応の時間的推移を反映することになろう。これにより、電極のところで測定された電流（又は、もし電流を積分した場合の通過した電荷）を、化学反応が起こる速度及び程度の都合のよい目安として用いることができる。
【００７０】
化学反応が作業電極から遠くの場所で生じるようにするための適当な方法の一例は、電極から見て遠くに位置する固体表面上の反応成分のうち１以上を固定化（不動化）することにある。反応成分を固体表面上で乾燥し、又はこれに取り付けられたポリマーマトリックス中に組み込むことにより、反応成分を固定化するのがよい。また、反応成分を化学的結合又は物理的結合により固体表面に直接結合してもよい。変形例として、特別な固定化手段を用いないで、反応成分うち１以上を固体表面上で単に乾燥させてこれに付着させてもよい。この状況では、反応成分のうち１以上は電気化学的セルを満たす液体マトリックス中において易動性が十分に低いので、電気化学的電流を効果的にモニタして所要の測定を行うことができる期間の間、乾燥した位置から実質的に移動しない。この場合、実質的に移動するとは、化学反応に必要な最も遅く移動する成分がコットレルタイプの減少速度論的状態が電極のところで流れる電流の時間的推移を達成し始めるのに足るほど作業電極に近いところに近づくことを意味している。
【００７１】
好ましい実施形態では、化学反応場所と作業電極の相互離隔距離の範囲は望ましくは、約１ｃｍ、好ましくは、５ｍｍ未満、より好ましくは５，１０，５０，１００，２００，５００ミクロン乃至５ｍｍ、より好ましくは、５，１０，５０，１００，２００ミクロン乃至５００ミクロン、最も好ましくは、５，１０，５０，１００ミクロン乃至２００ミクロンである。
【００７２】
作業電極に加え、液体サンプルと接触状態にある少なくとも対向電極が、電気化学的回路を構成するのに設けられる。対向電極は、対向電極と基準電極を組み合わせたものとして機能するのがよく、或いは、別個の基準電極を設けるのがよいが、このようにするかどうかは任意である。好ましい実施形態では、作業電極及び対向電極は望ましくは、互いに約３００ミクロン以上の距離、好ましくは、約５００ミクロン以上の距離、より好ましくは、約５００ミクロン乃至１０ｍｍの距離、より好ましくは、約５００ミクロン乃至１，２，５ｍｍの距離、最も好ましくは、１ｍｍ乃至２，５，１０ｍｍの距離を置いて設けられる。
【００７３】
作業電極は、使用中、電極の電流応答を邪魔する程度まで接触するどの成分とも化学的に反応しない材料で構成される。作業電極がアノードとして用いられる場合、適当な材料の例は、白金、パラジウム、炭素、不活性結合剤と組み合わせた炭素、イリジウム、酸化インジウム、酸化錫、インジウムと酸化錫の混合物である。作業電極がカソードとして用いられる場合、上述の材料に加えて、他の適当な材料として、鋼、ステンレス鋼、銅、ニッケル、銀及びクロムが挙げられる。
【００７４】
対向電極に適した材料の例は、白金、パラジウム、炭素、炭素と不活性結合剤の組合せ、イリジウム、酸化インジウム、酸化錫、インジウムと酸化錫の混合物、鋼、ステンレス鋼、銅、ニッケル、クロム、銀、実質的に不溶性の銀塩、例えば塩化銀、臭化銀、ヨウ化銀、フェロシアン化銀、フェリシアン化銀でコーティングされた銀が挙げられる。
【００７５】
化学反応場所を作業電極から遠くに位置した裸壁又は対向電極上に局在化するのがよい。化学反応場所は、作業電極と同一の平面上、より好ましくは作業電極に向いていて、これと実質的に平行な平面内に位置してもよい。
【００７６】
或る幾つかの実施形態に使用するのに適したセンサは、電気絶縁基体上に設けられた作業電極及び対向電極を有する。化学反応体の層が第２の基体上に被着され、反応体のうちの少なくとも１つは、基体上に実質的に固体化されている。使用にあたり、センサの壁相互間の空間を、少なくとも１つの電気活性化学種を生じさせるよう試薬と反応できる物質を含む液体で満たす。化学反応の生成物は、作業電極に向かって拡散し、ここで、電気活性化学種と電気的に反応して電流が生じる。電流の大きさ又は特定時刻に通過した電荷、或いは、電流又は通過した電荷の時間的推移を用いると、反応体層のところで起こる化学反応の速度又は程度の目安を得ることができる。
【００７７】
センサの別の実施形態では、反応体は、電気抵抗を基体上に設けられた対向電極に被着される。この実施形態では、対向電極の構成材料は、電極に被着された反応体の成分のいずれとも反応を起こさない。
【００７８】
上述の電気化学的の測定値を得る方法を、電気化学免疫学的検定システムを含む任意適当な電気化学的システムに適応することができる。非免疫学的検定であるが、代表的な電気化学的システムに適応される方法の一例は、酵素ＰＱＱ依存性グルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨｐｑｑ）及びレドックスメディエイタを利用した血液全体中のグルコースの測定である。この反応において、血液中のグルコースは、ＧＤＨｐｑｑと反応してグルコン酸を生じさせる。このプロセスにおいて、酵素中のＰＱＱは還元される。この場合、例えばフェリシアン化カリウムのようなメディエイタは、酵素中のＰＱＱを酸化してフェロシアン化物を生じさせる。すると、被酸化形態の酵素は、グルコースと更に反応することができる。この反応の正味の効果は、反応した各グルコース分子について２つのフェロシアン化物分子を生じさせることにある。フェロシアン化物は電気活性化学種であり、したがって、これを電極のところで酸化させると電流を生じさせることができる。この反応に適した他の酵素は、グルコースオキシダーゼ（ＧＯＤ）又はＮＡＤ依存性グルコースデヒドロゲナーゼである。他の反応の場合、ラクテートデヒドロゲナーゼ及びアルコールデヒドロゲナーゼを用いることができる。他の適当なレドックスメディエイタとしては、フェロシニウム、ビピリジンとのオスミウム錯体及びベンゾフェノンが挙げられる。
【００７９】
血液全体中のグルコースと酵素との反応は、遅い場合があり、完了するのに数分間かかる。また、血液サンプルのヘマトクリットが高ければ高いほど、それだけ一層反応が遅くなる。血液のヘマトクリットは、血液全体サンプル中の赤血球の体積分率である。例えば、５０ｍｇ／ｍｌＧＤＨｐｑｑ、０．９Ｍフェリシアン化カリウム及びｐＨが６．５の５０ｍＭの緩衝剤を含む溶液を対向電極に付着させ、そして水を除去した後に乾燥状態の反応体層を生じさせた。この層内においてＧＤＨｐｑｑは、対向電極上に効果的に固定化されるほど大きく、これに対し、フェリシアン化物は、電気化学的セル内の液体全体にわたり一層一様に混ざり合うことができる。血液サンプルをセル中に導入し、すぐに＋３００ｍＶの電位差を作業電極と対向電極との間に生じさせた。フェロシアン化物を酸化するには＋３００ｍＶの電位差が最も好ましいが、電位差は望ましくは、＋４０ｍＶ乃至＋６００ｍＶ、好ましくは、＋５０ｍＶ乃至＋５００ｍＶ、より好ましくは、＋２００ｍＶ乃至＋４００ｍＶである。セル内において、作業電極は、ポリエステル基体上にスパッタされた金の層から成り、対向電極は、ポリエステル基体上にスパッタされたパラジウムの層から成っていた。
【００８０】
ヘマトクリットの低い（即ち、血液中のヘマトクリットが２０％、４２％及び６５％）血液中の早い反応速度を示す互いに異なるヘマトクリットの血液サンプルについて電流のトレースを記録した。各血液サンプル中のグルコースレベルは、ほぼ同一であり、即ち、６５％ヘマトクリットサンプルについては５．４ｍＭ、４２％ヘマトクリットサンプルについては５．５ｍＭ、２０％ヘマトクリットサンプルについては６．０ｍＭである。
【００８１】
電流測定値は、次の方程式で近似的に表すことができる。
ｉ＝−ＦＡＤＣ／Ｌ
上式において、ｉは、電流、Ｆは、ファラデー定数（９６４８６．７Ｃ／モル）、Ａは、電極面積、Ｄは、サンプル中のフェロシアン化物の拡散係数、Ｃは、反応場所でのフェロシアン化物の濃度、Ｌは、反応場所と電極との間の距離である。したがって、時間に関するＣの変化率によって表される反応速度は次式で与えられる。
【００８２】
ｄＣ／ｄｔ＝−（Ｌ／ＦＡＤ）ｄｉ／ｄｔ
上述の反応の場合、２０％、４２％及び６５％のヘマトクリットサンプルについて６秒乃至８秒について平均ｄｉ／ｄｔはそれぞれ３．８２マイクロアンペア／秒、２．１４マイクロアンペア／秒及び１．３２マイクロアンペア／秒であった。これらサンプルについてのフェロシアン化物の拡散係数は、２０％、４２％及び６５％ヘマトクリットサンプルについてそれぞれ２．０×１０−６ｃｍ２ ／秒、１．７×１０−６ｃｍ２ ／秒及び１．４×１０−６ｃｍ２ ／秒であった。電極面積は、０．１２３８ｃｍ２ であり、Ｌは１２５ミクロンであった。これら値により、２０％、４２％及び６５％ヘマトクリットサンプルについてそれぞれ２．０ｍＭ／秒、１．３ｍＭ／秒及び０．９９ｍＭ／秒の反応速度が得られた。
【００８３】
血液中のグルコースの反応性を測定するための上述の方法は、当業者には理解されるように免疫学的検定方式を含む他の電気化学的システム、例えば、抗原の測定に当てはまるよう適当に設計変更できる。
【００８４】
上述の説明は、本発明の幾つかの方法及び物質を開示している。本発明は、かかる方法及び物質の設計変更が可能であると共に製作方法及び機器の改変が可能である。かかる改造は、本明細書の内容又は本明細書に開示した発明の実施の検討から当業者には明らかになろう。したがって、本発明は、本明細書に開示した特定の実施形態には限定されず、本発明は、特許請求の範囲に記載された本発明の真の範囲及び精神に属する全ての設計変更例及び改変例を含むものである。
【図面の簡単な説明】
【図１】
電気化学的セルが組み込まれた免疫学的センサの平面図（縮尺どおりには作成されていない）である。
【図２】
図１の免疫学的センサの実施形態のＡ−Ａ’線矢視断面図（縮尺どおりには作成されていない）である。
【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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2004505246.tif 000029
【国際調査報告】
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