(57)【要約】本発明は、哺乳類αヘリックス−５３（Ｚａｌｐｈａ５３）についてのポリヌクレオチド及びポリペプチドに関する。それらをコードするポリペプチド及びポリヌクレオチドは、ホルモン性であり、そして免疫系の機能を調節するために使用され得る。本発明はまた、Ｚａｌｐｈａ５３ポリペプチドに対する抗体を包含する。Ｚａｌｐｈａ５３に対するアンタゴニストが、炎症及び炎症関連疾患を処理するために使用される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２〜１８及び２０〜３７から成る群から選択されたアミノ酸配列から構成される単離されたポリペプチド、又は前記ポリペプチドに対して少なくとも９０％同一であるポリペプチド。
【請求項２】
配列番号２〜１８及び２０〜３７から成る群から選択されたアミノ酸配列から構成されるポリペプチド、又は前記ポリペプチドに対して少なくとも９０％同一であるポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド。
【請求項３】
配列番号２〜１８及び２０〜３７から成る群から選択されたアミノ酸配列から構成されるポリペプチドに対して特異的に結合する抗体。
【請求項４】
配列番号２〜１８及び２０〜３７から成る群から選択されたアミノ酸配列から構成されるポリペプチドに対して特異的に結合する抗体に対して特異的に結合する抗−イディオタイプ抗体。
【請求項５】
配列番号２〜１８及び２０〜３７から成る群から選択されたポリペプチドに対する抗体の炎症性疾患の処理のための薬剤の製造のためヘの使用。
【請求項６】
配列番号３から構成されるポリペプチドの免疫系を刺激するためへの使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の背景：
炎症は通常、有害な剤及び損傷を与えられた組織を破壊し、希釈し、又は隔てる、外傷又は微生物侵入に対する局在化されたそれぞれの反応である。それは、急性形においては、痛み、発熱、赤変、腫脹及び機能の損失の従来の徴候により特徴づけられる。微生物学的には、それは、複雑な一連の現象、例えば細動脈、毛細管及び細静脈の拡張、並びに高められた透過性及び血流、流体、例えば血漿タンパク質の滲出、及び炎症領域中への白血球移動を包含する。
【０００２】
炎症により特徴づけられる疾病は、ヒトにおける罹病率及び死亡率の有意な原因である。通常、炎症は、外来性、特に微生物物質による宿主ヘの侵入に対する防御応答として生じる。機械的外傷、毒素及び新形成に対する応答もまた、炎症反応をもたらすことができる。白血球の蓄積及び続く活性化は、ほとんどの形の炎症の病因の中心的現象である。炎症の欠失は、宿主を危険にさらす。外来性物質としての宿主組織の異状認識又は炎症工程の延長により引き起こされる過剰炎症は、糖尿病、動脈硬化症、白内障、再灌流損傷及び癌、後−感染症症候群、例えば感染性髄膜炎、リュウマチ性発熱、及びリウマチ性疾病、例えば全身性エリテマトーデス及びリウマチ様関節炎のような種々の炎症性疾患を導くことができる。
【０００３】
それらの種々の疾病工程における炎症応答の求心性は、その調節を、ヒト疾病の予防的制御又は治癒における主要素にする。従って、アンタゴニスト、例えば抗体が炎症を改善するためにサイトカインをダウンレギュレートするために投与され得るよう、炎症及び炎症関連疾患に寄与するサイトカインを発見する必要性が存在する。
【０００４】
発明の記載：
序説
本発明は、新規ポリペプチド類及び関連する組成物類及び方法、並びにそれらのアンタゴニストを提供することによってこの必要性と取り組んでいる。１つの観点においては、本発明は、Ｚａｌｐｈａ５３ と称する哺乳類サイトカインをコードする単離されたポリヌクレオチドを提供する。サイトカインが炎症応答に関与することをデータは示している。従って、Ｚａｌｐｈａ５３のアンタゴニストは、炎症、特に冠状心臓疾患、リウマチ様関節炎、動脈硬化症、クローン病及び炎症性腸疾患を軽減するために使用され得る。
【０００５】
２種の変異体が発見されている。第１の変異体は配列番号１及び２である。ポリペプチドは、アミノ酸残基１からアミノ酸残基２５まで延長するシグナル配列を有する。成熟ポリペプチドは配列番号３である。Ｚａｌｐｈａ５３ポリペプチドは、４種のαヘリックス、Ａ， Ｂ， Ｃ及びＤを有する。ヘリックスＡは、アミノ酸残基２８からアミノ酸残基４３まで延長し、そしてまた、配列番号４により表される。ヘリックスＢは、アミノ酸残基７４からアミノ酸残基８８まで延長し、そしてまた、配列番号５により表される。配列番号２のヘリックスＣは、アミノ酸残基９１からアミン酸残基１０６まで延長し、そしてまた、配列番号６により表される。ヘリックスＤは、アミノ酸残基１４７からアミノ酸残基１６２まで延長し、そして配列番号７により表される。
【０００６】
第２変異体は配列番号１０及び２０である。配列番号２０のポリペプチドは、アミノ酸残基１からアミノ酸残基２５まで延長するシグナル配列を有する。成熟ポリペプチドは配列番号２１である。ポリペプチドはまた、４種のαヘリックス、Ａ， Ｂ， Ｃ及びＤを有する。ヘリックスＡは、配列番号２０のアミノ酸残基２８からアミノ酸残基４３まで延長し、そしてまた、配列番号２８により表される。ヘリックスＢは、配列番号２０のアミノ酸残基６１からアミノ酸残基７６まで延長し、そしてまた配列番号２９により表される。ヘリックスＣは、配列番号２０のアミノ酸残基７９からアミノ酸残基９５まで延長し、そしてまた、配列番号３０により表される。ヘリックスＤは、配列番号２０のアミノ酸残基１３５からアミノ酸残基１５０Ｂまで延長し、そしてまた、配列番号３１により表される。
【０００７】
本発明の第２の観点においては、（ａ）転写プロモーター；（ｂ）Ｚａｌｐｈａ５３ポリペプチドをコードするＤＮＡセグメント、及び（ｃ）転写ターミネーターを含んで成る発現ベクター（ここで前記プロモーター、ＤＮＡセグメント及びターミネーターは作用可能に連結されている）が提供される。
本発明の第３の観点においては、上記に開示されるような発現ベクターを組み込まれている、前記ＤＮＡセグメントによりコードされるタンパク質ポリペプチドを発現する培養された原核又は真核細胞が提供される。
【０００８】
本発明のさらなる観点においては、ペプチド結合により連結される第１部分及び第２部分から実質的に成るキメラポリペプチドが提供される。前記キメラポリペプチドの第１部分は、（ａ）Ｚａｌｐｈａ５３ポリペプチド；（ｂ）Ｚａｌｐｈａ５３の対立遺伝子変異体；及び（ｃ）（ａ）又は（ｂ）に対して少なくとも９０％同一であるタンパク質ポチペプチドから実質的に成る。前記キメラポリペプチドの第２部分は、もう１つのポリペプチド、例えば親和性標識から実質的に成る。１つの観点においては、前記親和性標識は、免疫グロブリンＦｃポリペプチドである。本発明はまた、前記キメラポリペプチドをコードする発現ベクター、及び前記キメラポリペプチドを生成するようトランスフェクトされた宿主細胞も提供する。
【０００９】
本発明のさらなる観点においては、上記に開示されるようなＺａｌｐｈａ５３ポリペプチドに対して特異的に結合する抗体、及びまた、Ｚａｌｐｈａ５３ポリペプチドに対する抗体を中和する抗−イディオタイプ抗体が提供される。
【００１０】
本発明のさらなる観点は、上記アミノ酸配列を有するＺａｌｐｈａ５３ポリペプチドのエピトープ−担持部分のアミノ酸配列を有するペプチド又はポリペプチドに関する。本発明のＺａｌｐｈａ５３ポリペプチドのエピトープ−担持部分のアミノ酸配列を有するペプチド又はポリペプチドは、少なくとも９個、好ましくは少なくとも１５個及びより好ましくは少なくとも３０〜５０個のアミノ酸を有するそのようなポリペプチドの部分を包含するが、但し上記本発明のポリペプチドの全アミノ酸配列までのいずれかの長さのエピトープ−担持ポリペプチドもまた、本発明に包含される。そのようなエピトープ担持領域の例は、配列番号２〜１８及び２０〜３７である。もう１つのポリペプチド又はキャリヤー分子に融合されるそれらのいずれかのポリペプチドもまた提供される。
【００１１】
本明細書に引用されるすべての引例の教授は、引用により完全に本明細書に組み込まれる。
本発明を詳細に記載する前、次の用語を定義することで本発明の理解を助けることができる：
【００１２】
“親和性標識”とは、第２ポリペプチドの精製又は検出を提供し、又は基質への第２ポリペプチドの結合のための部位を供給するために、第２ポリペプチドに結合され得るポリペプチドセグメントを示すために本明細書において使用される。主に、抗体又は、他の特異的結合剤が利用できるいずれかのペプチド又はタンパク質が親和性標識として使用され得る。
【００１３】
親和性標識は、ポリ−ヒスチジン系、すなわちプロテインＡ （Ｎｉｌｓｓｏｎ など．，  ＥＭＢＯ Ｊ． ４： １０７５， １９８５； Ｎｉｌｓｓｏｎ など．，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ． １９８： ３， １９９１）， グルタチオンＳ  トランスフェラーゼ（Ｓｍｉｔｓ ａｎｄ Ｊｏｈｎｓｏｎ， Ｇｅｎｅ ６７； ３１， １９８８）， Ｇｌｕ−Ｇｌｕ親和性標識 （Ｇｒｕｓｓｅｎｍｅｙｅｒなど．，  Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８２： ７９５２−４， １９８５）， 物質Ｐ、すなわちＦｌａｇＴＭ ペプチド（Ｈｏｐｐなど．，  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６： １２０４−１２１０， １９８８）、ストレプタビジン結合ペプチド、又は他の抗原性エピトープ又は結合ドメインを包含する。一般的に、Ｆｏｒｄ など．， Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ２：９５−１０７， １９９１を参照のこと。ＤＮＡコードの親和性標識は、商品供給者（例えばＰｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ， Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ， ＮＪ； Ｅａｓｔｍａｎ Ｋｏｄａｋ， Ｎｅｗ Ｈｅｖｅｎ， ＣＴ； Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ， Ｂｅｖｅｒｌｙ， ＭＡ）から入手できる。
【００１４】
用語“対立遺伝子変異体”とは、同じ染色体遺伝子座を占める遺伝子の複数の遺伝子の二者択一形のいずれかを示すために、本明細書において使用される。対立遺伝子変異は、突然変異を通して天然では生じ、そして集団内の表現型多型現象をもたらすことができる。遺伝子突然変異は、サイレントであり（コードされたポリペプチドにおいて変化がない）、又は変更されたアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードすることができる。用語、対立遺伝子変異体はまた、遺伝子の対立遺伝子変異体によりコードされるタンパク質を示すために本明細書において使用される。
【００１５】
用語“アミノ−末端”及び“カルボキシル−末端”とは、ポリペプチド内の位置を示すために本明細書において使用される。その情況が可能である場合、それらの用語は、接近性又は相対的位置を示すためにポリペプチドの特定の配列又は一部に関して使用される。例えば、ポリペプチド内の対象配列のカルボキシル末端側に位置する一定の配列は、その対象配列のカルボキシル末端に隣接して位置するが、しかし完全なポリペプチドのカルボキシル末端では必ずしも必要ではない。
【００１６】
用語“相補体／抗−相補体対”とは、適切な条件下で、非共有的に会合される安定した対を形成する非同一性成分を示す。例えば、ビオチン及びアビジン（又はストレプタビジン）は、相補体／抗−相補体対の基本型メンバーである。他の典型的な相補体／抗−相補体対は、受容体／リガンド対、抗体／抗原（又はハプテン又はエピトープ）対、センス／アンチセンス  ポリヌクレオチド対、及び同様のものを包含する。相補体／抗−相補体対の続く解離が所望される場合、その相補体／抗−相補体対は好ましくは、＜１０９Ｍ−１の結合親和性を有する。
【００１７】
用語“ポリヌクレオチド分子の補体”とは、相補的塩基配列、及び対照配列に比較して逆の配向を有するポリペプチド分子である。例えば、配列５’ ＡＴＧＣＡＣＧＧＧ ３’ は、５’ ＣＣＣＧＴＧＣＡＴ ３’に対して相補的である。
用語“ｃｏｎｔｉｇ ”とは、他のポリヌクレオチドに対する一連の連続した同一の又は相補的な配列を有するポリヌクレオチドを示す。連続した配列とは、ポリヌクレオチドの全体において、又はその一部に沿って、一定の長さのポリヌクレオチド配列を“オーバーラップ”すると言われる。例えば、ポリヌクレオチド配列５’−ＡＴＧＧＣＴＴＡＧＣＴＴ−３’ に対する代表的なｃｏｎｔｉｇ とは、５’−ＴＡＧＣＴＴｇａｇｔｃｔ−３’及び３’−ｇｔｃｇａｃＴＡＣＣＧＡ−５’である。
【００１８】
用語“縮重ヌクレオチド配列”とは、１又は複数の縮重コドンを含むヌクレオチドの配列（ポリペプチドをコードする対照ポリヌクレオチドに比較して）を示す。縮重コドンは、ヌクレオチドの異なったトリプレットを含むが、しかし同じアミノ酸残基をコードする（すなわち、ＧＡＵ及びＧＡＣトリプレットはそれぞれＡｓｐをコードする）。
【００１９】
用語“発現ベクター”とは、その転写を提供する追加のセグメントに作用可能に連結される興味あるポリペプチドをコードするセグメントを含んで成る線状又は環状ＤＮＡ分子を示すために使用される。そのような追加のセグメントは、プロモーター及びターミネーター配列及び複製の１又は複数の起点、１又は複数の選択マーカー、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル、及び同様のものを包含する。発現ベクターは一般的に、プラスミド又はウィルスＤＮＡから誘導され、又は両者の要素を含むことができる。
【００２０】
用語“単離された”とは、ポリヌクレオチドに適用される場合、ポリヌクレオチドがその天然の遺伝的環境から除去され、そして従って、他の無関係な又は所望しないコード配列を有さず、そして遺伝子的に構築されたタンパク質生成システム内での使用のために適切な形で存在することを示す。そのような単離された分子は、それらの天然の環境から分離され、そしてｃＤＮＡ及びゲノム  クローンを含む分子である。本発明の単離されたＤＮＡ分子は、通常関係しない他の遺伝子を含まないが、しかし天然において存在する５’及び３’ 未翻訳領域、例えばプロモーター及びターミネーターを含むことができる。関連する領域の同定は、当業者に明らかであろう（例えば、Ｄｙｎａｎ ａｎｄ Ｔｉｊａｎ， Ｎａｔｕｒｅ ３１６： ７７４―７８， １９８５を参照のこと）。
【００２１】
“単離された”ポリペプチド又はタンパク質は、その生来の環境以外の条件、例えば血液及び動物組織とは別の条件下で見出されるポリペプチド又はタンパク質である。好ましい形においては、単離されたポリペプチドは、他のポリペプチド、特に動物起源の他のポリペプチドを実質的に含まない。高く精製された形、すなわち９５％異状の純度、より好ましくは９９％以上の純度でポリペプチドを供給することが好ましい。この情況下で使用される場合、用語“単離された”とは、他の物理的形、例えばダイマー形又は他のグリコシル化された又は誘導体化された形での同じポリペプチドの存在を排除しない。
【００２２】
“作用可能に連結された”とは、ＤＮＡセグメントに適用される場合、前記セグメントが、それらの意図された目的のために協力して機能し、例えば転写がプロモーターにおいて開始し、そしてコードセグメントを通してターミネーターに進行するよう配列されることを示す。
用語“オルト体（ｏｒｔｈｏｌｏｇｙ）”とは、異なった種からのポリペプチド又はタンパク質の機能的相対物である、１つの種から得られるポリペプチド又はタンパク質を示す。オルト体間の配列の差異は、特定化の結果である。
“パラ体（ｐａｒａｌｏｇｓ）”とは、生物によって製造される、異なっているが，しかし構造的に関連するタンパク質である。パラ体は、遺伝子重複を通して生じると思われる。例えば、α−グロビン、β−グロビン及びミオグロビンは、お互いパラ体である。
【００２３】
“ポリヌクレオチド”は、５’末端から３’末端に読み取られるデオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチド塩基の一本鎖又は二本鎖ポリマーである。ポリヌクレオチドは、ＲＮＡ及びＤＮＡを包含し、そして天然源から単離され、インビトロで合成され、又は天然及び合成分子の組み合わせから調製され得る。ポリヌクレオチドのサイズは、塩基対（略語“ｂｐ”）、ヌクレオチド（“ｎｔ”）、又はキロ塩基（“ｋｂ”）として表される。ここで、後者の２つの用語は、一本鎖又は二本鎖であるポリヌクレオチドを記載する。
【００２４】
この用語が二本鎖分子に適用される場合、それは全体の長さを示すために使用され、そして用語、“塩基対”に等しいことが理解されるであろう。二本鎖ポリヌクレオチドの二本の鎖は長さにおいてわずかに異なり、そしてその末端が酵素分解の結果として異なることは、当業者により理解されており；従って、二本鎖ポリヌクレオチド分子内のすべてのヌクレオチドは一対に成り得ない。そのような対になっていない末端は、長さ２０ｎｔを超えない。
【００２５】
“ポリペプチド”は、天然において生成されても又は合成的に生成されてもいずれにせよ、ペプチド結合により連結されるアミノ酸残基のポリマーである。約１０個以下のアミノ酸残基のポリペプチドが、通常“ポリペプチド”として言及される。
用語“プロモーター”とは、ＲＮＡ ポリメラーゼの結合及び転写の開始を提供するＤＮＡ配列を含む遺伝子の部分を示すために本明細書において使用される。プロモーター配列は通常、遺伝子の５’ 非コード領域に見出されるが、しかし必ずしもそうではない。
【００２６】
“タンパク質”は、１又は複数のポリペプチド鎖を含んで成る高分子である。タンパク質はまた、非ペプチド成分、例えば炭水化物基を含むことができる。炭水化物及び他の非ペプチド置換基は、タンパク質が生成される細胞により付加され、そして細胞型により変化するであろう。タンパク質は、それらのアミノ酸主鎖により本明細書において定義され；置換基、例えば炭水化物基は一般的に、特定されないが、しかしそれにもかかわらず、存在することができる。
【００２７】
用語“受容体”は、生物活性分子（すなわち“リガンド”）に結合し、そして細胞上のリガンドの効果を仲介する細胞関連タンパク質を示す。膜結合受容体は、細胞外リガンド結合ドメイン、及び典型的には、シグナルトランスダクションに関与する細胞内エフェクタードメインを含んで成る多ペプチド構造により特徴づけられる。受容体へのリガンドの結合は、細胞におけるエフェクタードメインと他の分子との間の相互作用を引き起こす受容体におけるコンホメーション変化をもたらす。
【００２８】
この相互作用は、細胞の代謝の変更を誘導する。受容体−リガンド相互作用に連結される代謝現象は、遺伝子転写、リン酸化、脱リン酸化、ＡＭＰ生成の上昇、細胞カルシュウムの代謝、膜脂質の代謝、細胞付着、イノシトール脂質の加水分解、及びリン脂質の加水分解を包含する。一般的に、受容体は、膜結合され、シトソール性又は核性であり；モノマー（例えば甲状腺刺激ホルモン受容体、β−アドレナリン性受容体）、又はマルチマー（例えばＰＤＧＦ受容体、成長ホルモン受容体、ＩＬ−３受容体、ＧＭ―ＣＳＦ受容体、Ｇ−ＣＳＦ受容体、エリトロポイエチン受容体及びＩＬ―６受容体）であり得る。
【００２９】
用語“分泌シグナル配列”とは、それが合成される細胞の分泌路を通してより大きなポリペプチドを、より大きなポリペプチドの成分として方向ずけるポリペプチド（“分泌ペプチド”）をコードするＤＮＡ配列を示す。前記のより大きなポリペプチドは、分泌路を通しての移動の間、分泌ペプチドを除去するために通常分解される。
【００３０】
用語“スプライス変異体”とは、遺伝子から転写されるＲＮＡの二者択一の形を示すために、本明細書において使用される。スプライス変異は、転写されたＲＮＡ分子内の、又は通常低いが、別々に転写されたＲＮＡ分子間の二者択一のスプライシング部位の使用を通して天然において生じ、そして同じ遺伝子から転写されるいくつかのｍＲＮＡをもたらすことができる。スプライス変異体は、変更されたアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードすることができる。用語スプライス変異体はまた、遺伝子から転写されるｍＲＮＡのスプライス変異体によりコードされるタンパク質を示すために本明細書において使用される。
【００３１】
不正確な分析方法（例えば、ゲル電気泳動）により決定されるポリマーの分子量及び長さは、おおよその値であることが理解されるであろう。そのような値が“約”Ｘ又は“おおよそ”Ｘとして表される場合、その言及されたＸの値は、正確には±１０％であることが理解されるであろう。
【００３２】
Ｚａｌｐｈａ５３の発現
Ｚａｌｐｈａ５３遺伝子の発現は、精巣においてのみ見られる。発現のこのパターンは、Ｚａｌｐｈａ５３が成長において一般的な役割を演じて、そして精巣分化、視床下部−下垂体−生腺軸、及び性腺ステロイド形成及び精子形成の重要な調節制御を発揮することを示唆する。
【００３３】
精巣ホルモン形成の進行は初期及び後期段階に分割され、そして後者は、黄体形成ホルモン（ＬＨ）による、機能的に決定されたライディヒ細胞前駆体の活性化に依存する。しかしながら、この工程における初期段階を制御する因子は未知のままであり、Ｈｕｈｔａｎｉｅｍｉ， Ｒｅｐｒｏｄ． Ｆｅｒｔｉｌ． Ｄｅｖ． ７： １０２５−１０３５ （１９９５） は、Ｚａｌｐｈａ５３ が非−ステロイド形成、非−ＬＨ応答前駆体細胞の活性化を担当できることを示唆する。
【００３４】
ライディヒ細胞分化が起こると、精巣におけるステロイドホルモンの生成は、下垂体によるゴナドトロピン、ＬＨ及び卵胞−刺激ホルモン（ＦＳＨ）の分泌に依存する。ＬＨはライディヒ細胞によるテストステロンの生成を刺激し、そして精子形成はＦＳＨ及び高い精巣内テストステロン濃度の両者に依存する。ＬＨ及びＦＳＨ分泌は、視床下部において生成されるゴナドトロピン放出ホルモン（ＧｎＲＨ）の制御下にある。Ｋａｕｆｍａｎ， Ｔｈｅ ｎｅｕｒｏ ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｍａｌｅ ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ． Ｉｎ： Ｍａｌｅ Ｉｎｆｅｒｔｉｌｉｔｙ． Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ， Ｃａｕｓｅ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ．， ＦＨ Ｃｏｍｈａｉｒｅ， ｅｄ．， ｐｐ２９−５４ （Ｃｈａｐｍａｎ ａｎｄ Ｈａｌｌ， Ｌｏｎｄｏｎ， １９９６） を参照のこと。精巣生成物はＬＨ及びＦＳＨ生成を制御することが示されているので、これは、Ｚａｌｐｈａ５３が視床下部によりホルモン生成を調節することを示唆する。
【００３５】
ステロイド形成及び精子形成が精巣の２つの異なった細胞区画内で起こることは良く知られており、そしてライディヒ及びセルトリ細胞がそれぞれ、前者及び後者を担当している。Ｓａｅｚ， Ｅｎｄｏｃｒｉｎ． Ｒｅｖ． １５： ５７４−６２６ （１９９４） を参照のこと。それらの細胞型の個々の活性は、他の分泌生成物により調節されると思われる。セルトリ細胞由来の腫瘍壊死因子−ａ、 線維芽細胞成長因子、インターロイキン−１、形質転換成長因子−Ｂ、 上皮成長因子／形質転換成長因子−ａ、 アクチビン、インヒビン、インスリン−様成長因子−１、血小板由来の成長因子、エンドセリン及びアルギニン−バソプレッシンはすべて、ライディヒ細胞機能を調節することが示されている。Ｓｅａｚ， Ｅｎｄｏｃｒｉｎ． Ｒｅｖ． １５： ５７４−６２６ （１９９４） を参照のこと。従って、Ｚａｌｐｈａ５３は、それらの遺伝子の１つ又は複数の遺伝子の活性を制御し、又は調節することができる。
【００３６】
男性においては、老化は精巣機能における前進性衰退に関連している。それらの変化は、相対的な精巣欠損を示す、低められた生殖能力、精力及びリビドーにより臨床学的に明白である。Ｖｅｒｍｅｕｌｅｎ， Ａｎｎ． Ｍｅｄ． ２５： ５３１−５３４ （１９９３）； Ｐｕｇｅａｔ など．， Ｈｏｒｍ． Ｒｅｓ． ４３： １０４−１１０ （１９９５） を参照のこと。初老期の男性におけるホルモン置換療法は、現在、推薦されていないが、それは、男性更年期のための新規療法が非常に価値あることを示唆する。
【００３７】
ポリヌクレオチド
本発明はまた、本明細書に開示されるＺａｌｐｈａ５３ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド分子、例えばＤＮＡ及びＲＮＡ分子も提供する。当業者は、遺伝子コードの縮重の観点から、かなりの配列変動がそれらのポリヌクレオチド分子間で可能であることを容易に認識するであろう。
本発明のポリヌクレオチド、一般的にはｃＤＮＡ 配列は、本発明に記載されるポリペプチドをコードする。本発明のポリペプチドをコードするｃＤＮＡ配列は、一連のコドンから構成され、ポリペプチドの個々のアミノ酸残基はコドンによりコードされ、そして個々のコドンは３個のヌクレオチドから構成される。アミノ酸残基は、次の通りに、それらのそれぞれのコドンによりコードされる。
【００３８】
アラニン（Ａｌａ）は、ＧＣＡ， ＧＣＣ， ＧＣＧ又はＧＣＴによりコードされ；
システイン（Ｃｙｓ）は、ＴＧＣ又はＴＧＴによりコードされ；
アスパラギン酸（Ａｓｐ）は、ＧＡＣ又はＧＡＴによりコードされ；
グルタミン酸（Ｇｌｕ）は、ＧＡＡ又はＧＡＧによりコードされ；
フェニルアラニン（Ｐｈｅ）は、ＴＴＣ又はＴＴＴによりコードされ；
グリシン（Ｇｌｙ）は、ＧＧＡ， ＧＧＣ， ＧＧＧ又はＧＧＴによりコードされ；
ヒスチジン（Ｈｉｓ）は、ＣＡＣ又はＣＡＴによりコードされ；
イソロイシン（Ｉｌｅ）は、ＡＴＡ，ＡＴＣ又はＡＴＴによりコードされ；
リシン（Ｌｙｓ）は、ＡＡＡ又はＡＡＧによりコードされ；
ロイシン（Ｌｅｕ）は、ＴＴＡ， ＴＴＧ， ＣＴＡ， ＣＴＣ， ＣＴＧ又はＣＴＴによりコードされ；
【００３９】
メチオニン（Ｍｅｔ）は、ＡＴＧによりコードされ；
アスパラギン（Ａｓｎ）は、ＡＡＣ又はＡＡＴによりコードされ；
プロリン（Ｐｒｏ）は、ＣＣＡ， ＣＣＣ， ＣＣＧ又はＣＣＴによりコードされ；
グルタミン（Ｇｌｎ）は、ＣＡＡ又はＣＡＧによりコードされ；
アルギニン（Ａｒｇ）は、ＡＧＡ， ＡＧＧ， ＣＧＡ， ＣＧＣ， ＣＧＧ又はＣＧＴによりコードされ；  セリン（Ｓｅｒ）は、ＡＧＣ，ＡＧＴ， ＴＣＡ， ＴＣＣ， ＴＣＧ又はＴＣＴによりコードされ；
トレオニン（Ｔｈｒ）は、ＡＣＡ， ＡＣＣ， ＡＣＧ又はＡＣＴによりコードされ；
バリン（Ｖａｌ）は、ＧＴＡ， ＧＴＣ， ＧＴＧ又はＧＴＴによりコードされ；
トリプトファン（Ｔｒｐ）は、ＴＧＧによりコードされ；そして
チロシン（Ｔｙｒ）は、ＴＡＣ又はＴＡＴによりコードされる。
【００４０】
本発明によれば、ポリヌクレオチドが本明細書に記載のように請求される場合、請求されるものは、センス鎖、アンチセンス鎖、及びそれらのそれぞれの水素結合により一緒にアニーリングされるセンス及びアンチセンス鎖を有する二本鎖としてのＤＮＡであることが理解されるべきである。本発明のポリペプチドをコードし、そして本明細書に記載されるｃＤＮＡによりコードされるメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）もまた、請求される。ｍＲＮＡは、本明細書に定義されるそれらのコドンと同じコドンを用いて、ポリペプチドをコードするが、但し個々のチミンヌクレオチド（Ｔ）はウラシルヌクレオチド（Ｕ）により置換される。
【００４１】
当業者はまた、異なった種が“選択的コドン使用法”を示すことも理解するであろう。一般的には、Ｇｒａｎｔｈａｍ，など．， Ｎｕｃ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ８： １８９３−９１２， １９８０； Ｈａａｓ， など．， Ｃｕｒｒ． Ｂｉｏｌ． ６： ３１５−２４， １９９６；  Ｗａｉｎ−Ｈｏｂｓｏｎ、など．，Ｇｅｎｅ  １３：３５５−６４，１９８１；Ｇｒｏｓｊｅａｎ  ａｎｄ  Ｆｉｅｒａ，Ｇｅｎｅ  １８：１９９−２０９、１９８２；Ｈｏｌｍ，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１４：３０７５−８７、１９８６；Ｉｋｅｍｕｒａ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５８：５７３−９７，１９８２を参照のこと。本明細書において使用される場合、用語、“選択的コドン使用法”又は“選択的コドン”とは、一定の種の細胞に最も頻繁に使用され、従って個々のアミノ酸をコードする可能なコドンの１又は少数の代表を好むタンパク質翻訳コドンを言及する技術的用語である（表２を参照のこと）。
【００４２】
例えば、アミノ酸トレオニン（Ｔｈｒ）は、ＡＣＡ、ＡＣＣ、ＡＣＧ、又はＡＣＴによりコードされるが、しかし哺乳類細胞においては、ＡＣＣが最も通常に使用されるコドンであり；他の種においては、例えば昆虫細胞、酵母、ウィルス又は細菌においては、異なったＴｈｒコドンが好ましい。特定の種のための選択的コドンは、当業界において知られている種々の方法により、本発明のポリヌクレオチド中に導入され得る。例えば、組換えＤＮＡ中への選択的コドン配列の導入は、特定の細胞型又は種内でタンパク質の翻訳により効果的にすることによって、そのタンパク質の生成を増強する。選択コドンを含む配列は、種々の種における発現について試験され、そして本明細書に開示される官能性について試験され得る。
【００４３】
本発明の好ましい態様においては、単離されたポリペプチドは、配列番号１又は１９、又はそれに対して相補的な配列の類似するサイズの領域に対して、緊縮条件下でハイブリダイズするであろう。一般的に、緊縮条件は、定義されたイオン強度及び特定配列についての熱溶融点（Ｔｍ）よりも約５℃低くなるよう選択される。Ｔｍは、標的配列の５０％が完全に適合されるプローブに対してハイブリダイズする温度（定義されたイオン強度ｐＨ下で）である。典型的な緊縮条件は、塩濃度がｐＨ７で約０．０３までであり、そして温度が少なくとも約６０℃であるそれらの条件である。
【００４４】
これまでに示されたように、本発明の単離されたポリヌクレオチドは、ＤＮＡ及びＲＮＡを包含する。ＤＮＡ及びＲＮＡを調製するための方法は、当業界において良く知られている。一般的には、ＲＮＡは、多量のＺａｌｐｈａ５３ ＲＮＡを生成する組織又は細胞から単離される。そのような組織及び細胞は、ノザンブロット（Ｔｈｏｍａｓ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７７： ５２０１， １９８０）により同定され、そして下記で論じられる。
【００４５】
全ＲＮＡは、グアニジウムＨｃｌ抽出、続くＣｓＣｌグラジエントにおける遠心分離による単離により調製され得る（Ｃｈｉｒｇｗｉｎなど．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １８：５２−９４， １９７９）。ポリ（Ａ）＋  ＲＮＡは、Ａｖｉｖ ａｎｄ Ｌｅｄｅｒ （Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．ＵＳＡ ６９： １４０８−１４１２， １９７２ ）の方法を用いて全ＲＮＡから調製される。相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）は、既知の方法を用いて、ポリ（Ａ）＋  ＲＮＡから調製される。他方では、ゲノムＤＮＡが単離され得る。次に、Ｚａｌｐｈａ５３ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが、例えばハイブリダイゼーション又はポリメラーゼ鎖反応により同定され、そして単離される。
【００４６】
Ｚａｌｐｈａ５３ポリペプチドをコードする十分な長さのクローンは、従来のクローニング方法により得られる。相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）クローンが好ましいが、但し、いくつかの用途（例えば、トランスジェニック動物における発現）に関しては、ゲノムクローンを使用し、又は少なくとも１つのゲノムイントロンを含むようｃＤＮＡクローンを修飾することが好ましい。ｃＤＮＡ及びゲノムクローンを調製するための方法は、よく知られており、そして当業者のレベルの範囲内であり、そしてライブラリーをプローブし又は感作するために、本明細書に開示される配列又はその一部の使用を包含する。発現ライブラリーは、Ｚａｌｐｈａ５３に対する抗体、受容体フラグメント、又は他の特定の結合パートナーによりプローブされ得る。
【００４７】
本発明のポリヌクレオチドはまた、ＤＮＡ合成機を用いても合成され得る。現在、選択の方法は、ホスホラミジット方法である。化学的に合成された二本鎖ＤＮＡが遺伝子又は遺伝子フラグメントの合成のために必要とされる場合、個々の相補的鎖が別々に製造される。短い遺伝子（６０〜８０ｂｐ）の生成は技術的に直接的であり、そして相補的鎖の合成及び続いて、それらのアニーリングにより達成され得る。しかしながら、より長い遺伝子（３００ｂｐ以上）の生成に関しては、化学的にＤＮＡ合成の間、個々のサイクルのカップリング効率はめったに１００％ではないので、特定の方法が所望される。この問題を克服するためには、合成遺伝子（二本鎖）が、２０〜１００個の長さのヌクレオチドである一本鎖フラグメントから調整形でアセンブルされる。
【００４８】
Ｇｌｉｃｋ ａｎｄ Ｐａｓｔｅｒｎａｋ， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ＆ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ， （ＡＳＭ Ｐｒｅｓｓ， Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ， Ｄ．Ｃ． １９９４）； Ｉｔａｋｕｒａ など．， Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ５３： ３２３−５６， １９８４及びＣｌｉｍｉｅ など．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓａ． ＵＳＡ ８７： ６３３−７， １９９０を参照のこと。
【００４９】
本発明はさらに、他の種（オルト体）からの相対物リガンド及びポリヌクレオチドを供給する。これらの種は、哺乳類、鳥類、両性類、ハ虫類、魚類、昆虫及び他の脊椎及び無脊椎動物種を包含するが、但しそれらだけには限定されない。特に興味あるものは、他の哺乳類種、例えばネズミ、ブタ、羊、ウシ、犬、ネコ、馬及び他の霊長類リガンドからのＺａｌｐｈａ５３ポリペプチドである。ヒトＺａｌｐｈａ５３ポリペプチドのオルト体は、従来のクローニング技法と組合して、本発明により供給される情報及び組成物を用いてクローン化され得る。
【００５０】
例えば、ｃＤＮＡは、本明細書に開示されるようなＺａｌｐｈａ５３を発現する組織又は細胞型から得られるｍＲＮＡを用いてクローン化され得る。ｍＲＮＡの適切な源は、本明細書に開示される配列から企画されたプローブによりノザンブロットをプローブすることによって同定され得る。次に、ライブラリーが陽性の組織又は細胞系のｍＲＮＡから調製される。次に、Ｚａｌｐｈａ５３−コードのｃＤＮＡが種々の方法、例えば完全な又は部分的なヒトｃＤＮＡにより、又は前記開示される配列に基づく１又は複数の変性プローブにより、プローブすることによって単離され得る。
【００５１】
ｃＤＮＡはまた、本明細書に開示される代表的なヒトＺａｌｐｈａ５３ポリヌクレオチド配列から企画されたプライマーを用いて、ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）（Ｍｕｌｌｉｓ， アメリカ特許第４，６８３，２０２号）を用いてもクローン化され得る。さらなる方法においては、ｃＤＮＡライブラリーが宿主細胞を形質転換し、又はトランスフェクトするために使用され、そして興味あるｃＤＮＡの発現がＺａｌｐｈａ５３ポリペプチドに対する抗体により検出され得る。類似する技法がまた、ゲノム  クローンの単離に適用され得る。
【００５２】
当業者は、配列番号１又は１９に開示される配列がヒトＺａｌｐｈａ５３の特定の対立遺伝子を表し、そして対立遺伝子変動及び交互のスプライシングが生じることが予測されることを認識するであろう。この配列の対立遺伝子変異体は、標準の方法に従って、異なった個人からのｃＤＮＡ又はゲノムライブラリーをプローブすることによってクローン化され得る。
【００５３】
配列番号１に示されるＤＮＡ配列の対立遺伝子変異体、例えばサイレント突然変異を含むそれらの変異体及び突然変異がアミノ酸配列変更をもたらすそれらの変異体は、配列番号２、２、２０又は２１の対立遺伝子変異体であるタンパク質と同じように、本発明の範囲内である。Ｚａｌｐｈａ５３ポリペプチドの性質を保持する、もう１つのスプライスされたｍＲＮＡから生成されるｃＤＮＡは、そのようなｃＤＮＡ及びｍＲＮＡによりコードされるポリペプチドと同じように、本発明の範囲内に包含される。それらの配列の対立遺伝子変異体及びスプライス変異体は、当業界において知られている標準の方法に従って、異なった個人又は組織からのｃＤＮＡ又はゲノムライブラリーをプローブすることによってクローン化され得る。
【００５４】
本発明はまた、配列番号２、３、２０又は２１のポリペプチド、及びそれらのオルト体に対して実質的に同一である単離されたＺａｌｐｈａ５３ポリペプチドも提供する。用語“実質的に同一である”とは、配列番号２、３、２０又は２１又はそれらのオルト体に示される配列に対して、５０％、 ６０％、７０％、８０％及び最も好ましくは少なくとも９０％、９５％又は９９％の配列同一性を有するポリペプチドを示すために本明細書において使用される。％配列同一性は、従来の方法により決定される。例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌなど．， Ｂｕｌｌ． Ｍａｔｈ． Ｂｉｏ． ４８ ： ６０３−６１６， １９８６及びｈｅｎｉｋｏｆｆ ａｎｄ Ｈｅｎｉｋｏｆｆ， Ｐｒｕｃ．Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８９ ：１０９１５−１０９１９， １９９２を参照のこと。
【００５５】
手短に言及するば、２種のアミノ酸配列が、１０のギャップ開始ペナルティー、１のギャップ拡張ペナルティー、及び表１（アミノ酸は標準の１文字コードにより示される）に示されるようなＨｅｎｉｋｏｆｆ ａｎｄ Ｈｅｎｉｋｏｆｆ （前記）の“ｂｌｏｓｕｍ ６２”評点マトリックスを用いて、その整合評点を最適化するために整合される。次に、％同一性が次のようにして計算される：
【００５６】
【数１】
2004526446.tif 000002
【００５７】
【表１】
2004526446.tif 000003
【００５８】
当業者は、２種のアミノ酸配列を整列するために多くの確立されたアルゴリズムが存在することを理解している。Ｐｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎの“ＦＡＳＴＡ”類似性調査アルゴリズムは、本明細書に開示されるアミノ酸配列及び推定上の変異体のアミノ酸配列により共有される同一性のレベルを試験するための適切なタンパク質整列方法である。前記ＦＡＳＴＡアルゴリズムは、Ｐｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８５： ２４４４ （１９８８）， 及びＰｅａｒｓｏｎ， Ｍｅｔｈ． Ｅｎｚｙｍｏｌ． １８３： ６３ （１９９０） により記載される。
【００５９】
手短には、ＦＡＳＴＡがまず、問題の配列（例えば、配列番号２、３、２０又は２１）及び保存性アミノ酸置換、挿入又は欠失を考慮しないで、最高密度の同一性（ｋｔｕｐ変数が１である場合）又は対の同一性（ｋｔｕｐ＝２である場合）のいずれかを有する試験配列により共有される領域を同定することによって配列を特徴づける。次に、最高密度の同一性を有する１０の領域が、アミノ酸置換マトリックスを用いて、すべての対合されたアミノ酸の類似性を比較することによって再評価され、そして前記領域の末端が、最高の評点に寄与するそれらの残基のみを含むよう“整えられる”。
【００６０】
“カットオフ”値（配列の長さ及びｋｔｕｐ値に基づいて予定された式により計算される）よりも高い評点を有するいくつかの領域が存在する場合、その整えられた初期領域が、その領域がギャップとのおおよその一列配列を形成するために結合され得るかどうかを決定するために試験される。最終的に、２種のアミノ酸配列の最高評点領域が、アミノ酸挿入及び欠失を可能にする、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈ アルゴリズム（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ ｗｉｎｓｃｈ， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ４８： ４４４， １９７０； Ｓｅｌｌｅｒｓ， ＳＩＡＭ Ｊ． Ａｐｐｌ． Ｍａｔｈ． ２６： ７８７， １９７４）の変法を用いて整列される。
【００６１】
ＦＡＳＴＡ 分析のための例示的なパラメーターは次のものである：ｋｔｕｐ＝１、ギャップ開始ペナルティー＝１０、ギャップ拡張ペナルティー＝１及び置換マトリックス＝ＢＬＯＳＵＭ６２。それらのパラメーターは、Ａｐｐｅｎｄｉｘ ２ ｏｆ Ｐｅａｒｓｏｎ， １９９０ （前記）に説明されるように、評点マトリックスを調節することによってＦＡＳＴＡプログラム中に導入され得る。
【００６２】
ＦＡＳＴＡはまた、上記に開示されるような割合を用いて、核酸分子の配列同一性を決定するためにも使用され得る。ヌクレオチド配列比較のためには、ｋｔｕｐ値は、誤りとして設定される他のパラメーターを伴って、１〜６、好ましくは４〜６であり得る。
【００６３】
本発明は、配列番号２，３、２０又は２１のアミノ酸配列に比較して、１又は複数の保存性アミノ酸変化を有するポリペプチドをコードする核酸分子を包含する。ＢＬＯＳＵＭ６２表は、関連するタンパク質の５００以上のグループの高く保存された領域を表す、タンパク質配列セグメントの約２，０００の局部の複数整列に由来するアミノ酸置換マトリックスである［Ｈｅｎｉｋｏｆｆ ａｎｄ Ｈｅｎｉｋｏｆｆ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８９： １０９１５ （１９９２） ］。
【００６４】
従って、ＢＬＯＳＵＭ６２置換頻度は、本発明のアミノ酸配列中に導入され得る保存性アミノ酸置換を定義するために使用され得る。本明細書において使用される場合、用語“保存性アミノ酸置換”とは、−１よりも大きなＢＬＯＳＵＭ６２値により表される置換を言及する。例えば、アミノ酸置換は、その置換が０，１，２又は３のＢＬＯＳＵＭ６２値により特徴づけられる場合、保存性である。好ましい保存性アミノ酸置換は、少なくとも１（例えば、１，２又は３）のＢＬＯＳＵＭ６２値により特徴づけられ、ところがより好ましくは保存性置換は、少なくとも２（例えば、２又は３）のＢＬＯＳＵＭ６２値により特徴づけられる。
ポリヌクレオチド分子の配列同一性は、上記に開示されるような比を用いて、類似する方法により決定される。
【００６５】
変異体Ｚａｌｐｈａ５３ポリペプチド及び実質的に相同のＺａｌｐｈａ５３ポリペプチドは、１又は複数のアミノ酸置換、欠失又は付加を有するものとして特徴づけられる。それらの変化は、好ましくは、保存性アミノ酸置換（表２を参照のこと）及びタンパク質及びポリペプチドの折りたたみ又は活性に実質的に影響を及ぼさない他の置換；小さな欠失、典型的には１〜約３０個のアミノ酸の欠失；及び小さなアミノ−又はカルボキシル−末端の延長、例えばアミノ−末端メチオニン残基、約２０〜２５個までの残基の小さなリンカーペプチドの延長、又は親和性標識の延長である。
【００６６】
従って、本発明は、配列番号２，３、２０又は２１のその対応する領域に対して、少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、及びより好ましくは９９％又はそり以上の同一性である配列を含んでなる２０〜３０個のアミノ酸残基のポリペプチドを包含する。親和性標識を含んで成るポリペプチドはさらに、Ｚａｌｐｈａ５３ポリペプチドと親和性標識との間にタンパク質分解部位を含む。好ましいそのような部位は、トロンビン分解部位及び第Ｘａ因子分解部位を含む。
【００６７】
【表２】
2004526446.tif 000004
【００６８】
本発明はさらに、種々の他のポリペプチド融合体（及び１又は複数のポリペプチド融合体を含んで成る関連するマルチマータンパク質）を提供する。例えば、Ｚａｌｐｈａ５３ポリペプチドは、アメリカ特許第５，１５５，０２７号及び第５，５６７，５８４号に開示されるようなダイマータンパク質への融合として調製され得る。それに関しての好ましいダイマータンパク質は、免疫グロブリン不変領域ドメインを包含する。免疫グロブリン−Ｚａｌｐｈａ５３ポリペプチド融合体は、種々のマルチマーＺａｌｐｈａ５３類似体を生成するために、遺伝子的に構築された細胞において発現され得る。補助ドメインは、特定の細胞、組織又は高分子（例えばコラーゲン）に対してそれらを標的化するためにＺａｌｐｈａ５３ポリペプチドに融合され得る。
【００６９】
例えば、Ｚａｌｐｈａ５３ポリペプチド又はタンパク質が、標的細胞の表面上の受容体に特異的に結合するリガンドにＺａｌｐｈａ５３ポリペプチドを融合せしめることによって、予定された細胞型に標的化され得る。この場合、ポリペプチド及びタンパク質は、治療又は診断目的のために標的化され得る。Ｚａｌｐｈａ５３ポリペプチドは、複数の成分、例えば精製のための親和性標識及び標的化ドメインに融合され得る。ポリペプチド融合はまた、特にドメイン間に、１又は複数の切断部位を含むことができる。Ｔｕａｎなど．， Ｃｏｎｎｅｃｔｉｖｅ Ｔｉｓｓｕｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３４： １−９， １９９６を参照のこと。
【００７０】
本発明のタンパク質はまた、天然に存在しないアミノ酸残基を含んで成る。天然に存在しないアミノ酸は、トランス−３−メチルプロリン、２，４−メタプロリン、シス−４−ヒドロキシプロリン、トランス−４−ヒドロキシプロリン、Ｎ−メチルグリシン、アロ−トレオニン、メチルトレオニン、ヒドロキシエチルシステイン、ヒドロキシエチルホモシステイン、ニトログルタミン、ホモグルタミン、ピペコリン酸、チアゾリジンカルボン酸、デヒドロプロリン、３−及び４−メチルプロリン、３，３−ジメチルプロリン、ｔｅｒｔ−ロイシン、ノルバリン、２−アザフェニルアラニン、３−アザフェニルアラニン、４−アザフェニルアラニン、及び４−フルオロフェニルアラニンを包含する。天然に存在しないアミノ酸残基をタンパク質中に導入するためのいくつかの方法が当業界において知られている。例えばナンセンス突然変異が化学的にアミノアシル化されたサプレッサーｔＲＮＡを用いて抑制されるインビトロシステムが使用され得る。
【００７１】
アミノ酸を合成し、そしてｔＲＮＡをアミノアシル化するための方法は、当業者において知られている。ナンセンス突然変異を含むプラスミドの転写及び翻訳は、Ｅ．コリＳ３０抽出物及び市販の酵素及び他の試薬の含んで成る細胞フリーシステムにおいて実施される。タンパク質は、クロマトグラフィーにより精製される。例えば、Ｒｏｖｅｒｔｓｏｎなど．， Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． １１３：２７２２， １９９１； Ｅｌｌｍａｎ など．， Ｍｅｔｈ． Ｅｎｚｙｍｏｌ． ２０２： ３０１，１９９１； Ｃｈｕｎｇ など．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５９： ８０６−０９， １９９３； 及びＣｈｕｎｇなど．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９０： １０１４５−４９， １９９３を参照のこと。
【００７２】
第２の方法においては、翻訳は、突然変異誘発されたｍＲＮＡ及び化学的にアミノアミル化されたサプレッサ−ｔＲＮＡのマイクロインジェクションによりアフリカツメガエル卵母細胞において行われる（ Ｔｕｒｃａｔｔｉ など．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７１： １９９１−９８， １９９６ ）。 第３の方法においては、Ｅ．コリ細胞が、置換される予定である天然のアミノ酸（例えば、フェニルアラニン）の不在下で及び所望する天然に存在しないアミノ酸（例えば、２−アザフェニルアラニン、３−アザフェニルアラニン、４−アザフェニルアラニン又は４−フルオロフェニルアラニン）の存在下で培養される。
【００７３】
天然に存在しないアミノ酸は、その天然の相対物の代わりにタンパク質中に導入される。Ｋｏｉｄｅ など．， Ｂｉｏｃｈｅｍ． ３３： ７４７０−４６， １９９４を参照のこと。天然に存在するアミノ酸残基は、インビトロ化学的に修飾により天然に存在しない種に転換され得る。化学的修飾は、置換の範囲をさらに拡張するために特定部位の突然変異誘発と組み合わされ得る（Ｗｙｎｎ ａｎｄ Ｒｉｃｈａｒｄｓ，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ． ２： ３９５−４０３， １９９３）。
【００７４】
限定された数の非保存性アミノ酸、遺伝子コードによりコードされないアミノ酸、天然に存在しないアミノ酸、及び不自然なアミノ酸が、Ｚａｌｐｈａ５３アミノ酸により置換され得る。
【００７５】
本発明のポリペプチドにおける必須アミノ酸は、当業界において知られている方法、例えば特定部位の突然変異誘発又はアラニン−走査突然変異誘発により同定され得る（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ ａｎｄ Ｗｅｌｌｓ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４： １０８１−１０８５， １９８９； Ｂａｓｓなど．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ｓｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８８： ４４９８−５０２， １９９１）。後者の技法においては、単一のアラニン突然変異が分子中のあらゆる残基で導入され、そして得られる変異体分子が、前記分子の活性に対して決定的であるアミノ酸残基を同定するために、下記に開示されるようして、生物学的活性について試験される。
【００７６】
また、Ｈｉｌｔｏｎなど．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７１： ４６９９−５７０８， １９９６を参照のこと。リガンド−受容体相互作用の部位はまた、推定上の接触部位アミノ酸の突然変異に関して、核磁気共鳴、結晶学、電子回折又は光親和性ラベリングのような技法により決定され得る。例えば、ｄｅ Ｖｏｓ など．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５５： ３０６−３１２， １９９２； Ｓｍｉｔｈ など．， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２２４： ８９９−９０４， １９９２； Ｗｌｏｄａｖｅｒ など．， ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ． ３０９： ５９−６４， １９９２を参照のこと。
【００７７】
複数アミノ酸置換は、突然変異誘発及びスクリーニングの既知方法、例えばＲｅｉｄｈａａｒ−Ｏｌｓｏｎ ａｎｄ Ｓａｕｅｒ （ｓｃｉｅｎｃｅ ２４１： ５３−５７， １９８８）又はＢｏｗｉｅ ａｎｄ Ｓａｕｅｒ（ Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ８６：２１５２−２１５６，１９８９ ）により開示される方法を用いて行われ、そして試験される。手短に言及すれば、それらの著者は、ポリペプチドにおける複数の位置を同時ランダム化し、機能的ポリペプチドをスクリーンし、そして次に個々の位置での可能な置換の範囲を決定するために、突然変異誘発されたポリペプチドを配列決定するための方法を開示する。使用され得る他の方法は、ファージ表示（例えば、Ｌｏｗｍａｎ など．， Ｂｉｏｃｈｅｍ． ３０ ： １０８３２−１０８３７，１９９１； Ｌａｄｎｅｒ など．， アメリカ特許第５，２２３，４０９号； Ｈｕｓｅ， ＷＩＰＯ公開ＷＯ ９２／０６２０４号）、及び領域−指図された突然変異誘発（Ｄｅｒｂｙｓｈｉｒｅ など．， Ｇｅｎｅ ４６ ： １４５， １９８６； Ｎｅｒ など．， ＤＮＡ ７ ： １２７， １９８８ ）を包含する。
【００７８】
開示されるＺａｌｐｈａ５３ ＤＮＡ及びポリペプチド配列の変異体は、Ｓｔｅｍｍｅｒ， Ｎａｔｕｒｅ ３７０ ： ３８９−９１， １９９４， Ｓｔｅｍｍｅｒ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９１： １０７４７−５１， １９９４及びＷＩＰＯ公開ＷＩ９７／２００７８により開示されるように、ＤＮＡ  シャフリングを通して生成され得る。手短に言及すれば、変異体ＤＮＡが、ランダムに導入された点突然変異をもたらす、親ＤＮＡのランダム断片化、続く、ＰＣＲを用いてのアセンブリーによるインビトロ相同組換えにより生成される。この技法は、前記工程中に追加の変動性を導入するために、親ＤＮＡのファミリー、例えば異なった種からの対立遺伝子変異体又はＤＮＡを用いて改良され得る。所望する活性の選択又はスクリーニング、突然変異誘発及びアッセイの続くさらなる相互作用が、有害な変化に対して同時に選択しながら、所望する突然変異について選択することによって、配列の急速な“進化”を提供する。
【００７９】
本明細書に開示されるような突然変異誘発方法は、宿主細胞におけるクローン化された突然変異誘発されたポリペプチドの活性を検出するために高処理量の自動化されたスクリーニング方法と組み合わされ得る。活性ポリペプチドをコードする突然変異誘発されたＤＮＡ分子が、宿主細胞から回収され、そしてすぐに、近代的装置を用いて配列され得る。それらの方法は、興味あるポリペプチドにおける個々のアミノ酸残基の重要性の急速な決定を可能にし、そして未知の構造のポリペプチドに適用され得る。
【００８０】
本明細書において論じられた方法を用いて、当業者は、野生型Ｚａｌｐｈａ５３タンパク質の性質を保持する、配列番号２、３、２０又は２１の種々のポリペプチドフラグメントを同定し、そして／又は調製することができる。
変異体及び融合タンパク質を包含するいずれかのＺａｌｐｈａ５３ポリペプチドに関しては、当業者は、上記表１及び２に示される情報を用いて、その変異体をコードする十分な縮重ポリヌクレオチド配列を用意に生成することができる。
【００８１】
タンパク質生成
本発明のＺａｌｐｈａ５３ポリペプチド、例えば十分な長さのポリペプチド、生物学的に活性のフラグメント及び融合ポリペプチドは、従来の技法に従って、遺伝的に構築された宿主細胞において生成され得る。適切な宿主細胞は、外因性ＤＮＡにより形質転換又はトランスフェクトされ得、そして培養において増殖され得るそれらの細胞型であり、そして細菌、菌類細胞、及び培養された高等真核細胞を包含する。真核細胞、特に多細胞生物の培養された細胞が好ましい。クローン化されたＤＮＡ分子を操作し、そして種々の宿主細胞中に外因性ＤＮＡを導入するための技法は次の文献に開示される：Ｓａｍｂｒｏｏｌ など．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ２ｎｄ ｅｄ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， ＮＹ， １９８９， 及びＡｕｓｕｂｅｌ など．， ｅｄｓ．， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｓ．， ＮＹ， １９８７。
【００８２】
一般的に、本発明のＺａｌｐｈａ５３ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列は、その発現のために必要とされる他の遺伝子的要素、例えば一般的に、発現ベクター内の転写プロモーター及びターミネーターに作用可能に連結される。ベクターはまた、通常、１又は複数の選択マーカー及び１又は複数の複製の起点を含むであろうが、しかし当業者は、一定のシステム内で、選択マーカーが別のベクター上に供給され得、そして外因性ＤＮＡの複製が宿主細胞ゲノム中への組み込みにより供給され得ることを認識するであろう。プロモーター、ターミネーター、選択マーカー、ベクター及び要素の選択は、当業者のレベルの範囲内の通常のことである。多くのそのような要素は文献に記載されており、そして商業的供給者を通して入手できる。
【００８３】
Ｚａｌｐｈａ５３ポリペプチドを、宿主細胞の分泌路中に方向づけるためには、分泌シグナル配列（又は、シグナル配列、リーダー配列、プレプロ配列又はプレ配列としても知られている）が、発現ベクターに供給される。分泌シグナル配列は、Ｚａｌｐｈａ５３の配列であり得、又はもう１つの分泌されたタンパク質（例えばｔ−ＰＡ ）に由来し、又は新たに合成され得る。分泌シグナル配列は、Ｚａｌｐｈａ５３ ＤＮＡ配列に作用可能に連結され、すなわち２つの配列は正しく読み取り枠を整合して連結され、そして宿主細胞の分泌経路中に新しく合成されたポリヌクレオチドを方向づけるように配置される。分泌シグナル配列は通常、興味あるポリペプチドをコードするＤＮＡ配列の５’ 側に位置するが、但し一定の分泌シグナル配列は、興味あるＤＮＡ配列の他の場所に位置することもできる（例えば、Ｗｅｌｃｈなど．，アメリカ特許第５，０３７，７４３号；Ｈｏｌｌａｎｄなど．， アメリカ特許第５，１４３，８３０号を参照のこと）。
【００８４】
他方では、本発明のポリペプチドに含まれる分泌シグナル配列は、分泌路中に他のポリペプチドを方向づけるために使用される。本発明はそのような融合ポリペプチドを提供する。本発明の融合ポリペプチドに含まれる分泌シグナル配列は好ましくは、分泌路中い追加のペプチドを方向づけるためにその追加のペプチドにアミノ末端的に融合される。そのような構造体は、当業界において知られている多くの用途を有する。例えば、それらの新規の分泌シグナル配列融合構造体は、通常分泌されないタンパク質、例えば受容体の活性成分の分泌を方向づけることができる。そのような融合は、分泌路を通してペプチドを方向づけるためにインビボ又はインビトロで使用され得る。
【００８５】
培養された哺乳類細胞または、本発明内の適切な宿主である。外因性ＤＮＡを 、哺乳類宿主細胞中に導入するための方法は、リン酸カルシュウム−仲介トランスフェクション（Ｗｉｇｌｅｒなど．， Ｃｅｌｌ １４ ： ７２５， １９７８； Ｃｏｒｓａｒｏ ａｎｄ Ｐｅａｒｓｏｎ， Ｓｏｍａｔｉｃ Ｃｅｌｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ７ ：６０３， １９８１； Ｇｒａｈａｍ など．， Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ５２； ４５６， １９７３），エレクトロポレーション（ Ｎｅｕｍａｎｎ など．， ＥＭＢＯ Ｊ． １： ８４１−８４５， １９８２ ）； ＤＥＡＥ−デキストラン仲介トランスフェクション（Ａｕｓｕｂｅｌ など．， 前記）、及びリポソーム−仲介トランスフェクション（Ｈａｗｌｅｙ −Ｎｅｌｓｏｎ など．， Ｆｏｃｕｓ １５： ７３， １９９３； Ｃｉｃｃａｒｏｎｅ  など．，Ｆｏｃｕｓ １５： ８０， １９９３ ）を包含する。
【００８６】
培養された哺乳類細胞における組換えポリペプチドの生成は、例えばｌｅｖｉｎｓｏｎ など．， アメリカ特許第４，７１３，３３９ 号； Ｈａｇｅｎ など．， アメリカ特許第４，７８４，９５０ 号； Ｐａｌｍｉｔｅｒ など．， アメリカ特許第 ４，５７９，８２１ 号； 及びＲｉｎｇｏｌｄ， アメリカ特許第 ４，６５６，１３４ 号により開示される。培養された適切な哺乳類細胞は、ＣＯＳ−１（ＡＴＣＣ Ｎｏ． ＣＲＬ １６５）、ＣＯＳ−７（ＡＴＣＣ Ｎｏ． ＣＲＬ １６５１）、ＢＨＫ（ＡＴＣＣ Ｎｏ． ＣＲＬ １６３２）、ＢＨＫ ５７０ （ＡＴＣＣ Ｎｏ． ＣＲＬ １０３１４ ）、２９３（ＡＴＣＣ Ｎｏ． ＣＲＬ １５７３ ； Ｇｒａｈａｍ など．， Ｊ． Ｇｅｎ． Ｖｉｒｏ． ３６： ５９−７２， １９７７ ）、及びチャイニーズ  ハムスター卵巣（例えば  ＣＨＯ−Ｋ１； ＡＴＣＣ Ｎｏ． ＣＣＬ６１ ）細胞系を包含する。
【００８７】
追加の適切な細胞系は当業界において知られており、そして公的な寄託所、例えば Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ， Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ， Ｍａｒｙｌａｎｄから入手できる。一般的に、強い転写プロモーター、例えばＳＶ−４０ 又はサイトメガロウィルスからのプロモーターが好ましい。例えば、アメリカ特許第４，９５６，２８８ 号を参照のこと。他の適切なプロモーターは、メタロチオネイン遺伝子からのプロモーター（アメリカ特許 ４，５７９，８２１ 号及び第 ４，６０１，９７８ 号）、アデノウィルス主要後期プロモーターを包含する。
【００８８】
薬物選択は一般的に、外来性ＤＮＡが挿入されている、培養された哺乳類細胞を選択するために使用される。そのような細胞は通常、“トランスフェクタント”として言及される。選択剤の存在下で培養され、そしてそれらの子孫に興味ある遺伝子を伝達することができる細胞は、“適切なトランスフェクタント”として言及される。好ましい選択マーカーは、抗生物質ネオマイシンに対する耐性をコードする遺伝子である。選択は、ネオマイシン型薬物、例えばＧ−４１８又は同様のもの存在下で実施される。“増幅”として言及される方法である選択システムは、興味ある遺伝子の発現レベルを高めるためにも使用される。
【００８９】
増幅は、低レベルの選択剤の存在下でトランスフェクタントを培養し、そして次に、導入された遺伝子の生成物を高レベルで生成する細胞を選択するために選択剤の量を高めることによって実施される。好ましい増幅可能選択マーカーは、メトトレキセートに対する耐性を付与するジヒドロ葉酸レダクターゼである。他の耐薬物性遺伝子（例えば、ヒグロマイシン耐性、複数薬物耐性、ピューロマイシン  アセチルトランスフェラーゼ）もまた、使用され得る。変更された表現型を導入する他のマーカー、例えば緑色蛍光タンパク質、又は細胞表面タンパク質、例えばＣＤ４，  ＣＤ８，クラスＩ  ＭＨＣ、胎盤アルカリホスファターゼが、ＦＡＣＳ分類又は磁気ビース分離技法のような手段により、トランスフェクトされていない細胞とトランスフェクトされた細胞とを分類するために使用され得る。
【００９０】
他の高等真核細胞、例えば昆虫細胞、植物細胞及び鳥類細胞もまた、宿主として使用され得る。植物細胞において遺伝子を発現するためのベクターとしてのアグロバクテリウム・リゾゲネス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ ）の使用は、Ｓｉｎｋａｒなど．、Ｊ． Ｂｉｏｓｃｉ． （ Ｂａｎｇａｌｏｒｅ ） １１： ４７−５８， １９８７ により再考されている。昆虫細胞の形質転換、及びそこにおける外来性ポリペプチドの生成は、Ｇｕａｒｉｎｏ など．，アメリカ特許第５，１６２，２２２号；及びＷＩＰＯ公開ＷＯ９４／０６４６３号により公開される。昆虫細胞は、オートグラファ・カリホルニカ（ Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ ）核多角体病ウィルス（ＡｃＮＰＶ）に通常由来する組換えバキュロウィルスにより感染され得る。
【００９１】
Ｚａｌｐｈａ５３ポリペプチドをコードするＤＮＡは、２種の方法の１つにより、ＡｃＮＰＶポリヘドリン遺伝子コード配列の代わりにバキュロウィルスゲノム中に挿入される。第１の方法は、野生型ＡｃＮＰＶと、ＡｃＮＰＶ配列を端に有するＺａｌｐｈａ５３を含むトランスファーベクターとの間の相同ＤＮＡ組換えの従来の方法である。適切な昆虫細胞、例えばＳＦ９細胞が野生型ＡｃＮＰＶにより感染され、そしてＡｃＮＰＶポリヘドリン遺伝子プロモーター、ターミネーター及びフランキング配列に作用可能に連結されるＺａｌｐｈａ５３ポリヌクレオチドを含んで成るトランスファーベクターによりトランスフェクトされる。
【００９２】
Ｋｉｎｇ， Ｌ． Ａ． ａｎｄ Ｐｏｓｓｅｅ， Ｒ．Ｄ．， Ｔｈｅ Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ Ｅｘｐｒｏｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｇｕｉｄｅ， Ｌｏｎｄｏｎ， Ｃｈａｐｍａｎ ＆ Ｈａｌｌ； Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙ， Ｄ． Ｒ． ．， Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｖｅｃｔｏｒ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ．， １９９４； 及びＲｉｃｈａｒｄｓｏｎ， Ｃ． Ｄ．， Ｅｄ．， Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ． Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｔｏｔｏｗａ， ＮＪ， Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ， １９９５を参照のこと。昆虫細胞内の天然組換えは、ポリヘドリンプロモーターにより駆動されるＺａｌｐｈａ５３を含む組換えバキュロウィルスをもたらすであろう。組換えウィルスストックは、当業界において通常使用される方法により製造される。
【００９３】
組換えバキュロウィルスを製造するための第２の方法は、Ｌｕｃｋｏｗ （ Ｌｕｃｋｏｗ， ＶＡ， など．， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ ６７： ４５６６−７９， １９９３ ） により記載されるトランスポゾンに基づくシステムを利用する。このシステムは、Ｂａｃ−ｔｏ−Ｂａｃ （ ＴＭ ）キット（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，  ＭＤ）として市販されている。このシステムは、“ｂａｃｍｉｄ”  と呼ばれる大きなプラスミドとして、Ｅ．コリに維持されるバキュロウィルスゲノム中に、Ｚａｌｐｈａ５３ポリペプチドをコードするＤＮＡを移動せしめるために、Ｔｎ７トランスポゾンを含むトランスファーベクター、ｐＦａｓｔＢａｃＩ （ＴＭ ） （Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ）を利用する。
【００９４】
ＰＦａｓｔＢａｃｌＴＭ トランスファーベクターは、興味ある遺伝子、この場合、Ｚａｌｐｈａ５３の発現を誘導するためにＡｃＮＰＶポリヒドリンプロモーターを使用する。しかしながら、ｐＦａｓｔＢａｃｌＴＭは相当の程度まで修飾され得る。前記ポリヒドリンプロモーターは、除去され、そしてバキュロウィルス感染において早めに発現され、そして分泌されたタンパク質を発現するために好都合であることが知られているバキュロウィルス塩基性タンパク質プロモーター（また、Ｐｃｏｒ， ｐ６．９又はＭＰプロモーターとしても知られている）により置換され得る。Ｈｉｌｌ−Ｐｅｒｋｉｎｓ， Ｍ．Ｓ． ａｎｄ Ｐｏｓｓｅｅ， Ｒ．Ｄ．， Ｊ． Ｇｅｎ． Ｖｉｒｏｌ． ７１： ９７１−６， １９９０； Ｂｏｎｎｉｎｇ， Ｂ．Ｃ． など．， Ｊ． Ｇｅｎ． Ｖｉｒｏｌ． ７５： １５５１−６， １９９４； 及びＣｈａｚｅｎｂａｌｋ， Ｇ． Ｄ．， ａｎｄ  Ｒａｐｏｐｏｒｔ， Ｂ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ． ２７０： １５４３−９，１９９５ を参照のこと。
【００９５】
そのようなトランスファーベクター構造体においては、塩基性タンパク質プロモーターの短いか又は長いバージョンが使用され得る。さらに、昆虫タンパク質に由来する分泌シグナル配列により天然のＺａｌｐｈａ５３分泌シグナル配列を置換しているトランスファーベクターが構成さえ得る。例えば、エクジステロイド・グルコシルトランスフェラーゼ（ＥＧＴ）、ミツバチＭｅｌｉｔｔｉｎ （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｃａｒｌｓｂａｄ， ＣＡ） 又はバキュロウィルスｇｐ６７（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｍ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ）は、生来のＺａｌｐｈａ５３分泌シグナル配列を置換するために、構造体に使用され得る。
【００９６】
さらに、トランスファーベクターは発現されたＺａｌｐｈａ５３ポリペプチドのＣ−又はＮ−末端でエピトープ標識、例えばＧｌｕ−Ｇｌｕ  エピトープ標識をコードするＤＮＡとのイン−フレーム融合体を含むことができる（Ｇｒｕｓｓｅｎｍｅｙｅｒ， Ｔ． など．， Ｐｅｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ８２： ７９５２−６， １９８５）。当業界において知られている技法を用いて、Ｚａｌｐｈａ５３を含むトランスファーベクターにより、Ｅ．コリが形質転換され、そして組換えバキュロウィルスの表示である断続的ｌａｃＺ遺伝子を含むｂａｃｍｉｄａ についてスクリーンされる。
【００９７】
組換えバキュロウィルスゲノムを含むｂａｃｍｉｄ ＤＮＡ が、通常の技法を用いて単離され、そしてスポドプテラ・フルギペルダ（ Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ ）細胞、例えばＳｆ９ 細胞をトランスフェクトするために使用される。Ｚａｌｐｈａ５３を発現する組換えウィルスが結果的に生成される。組換えウィルス  ストックは、当業者において通常使用される方法により製造される。
【００９８】
組換えウィルスは、宿主細胞、典型的には、アワヨトウの幼虫、スポドプテラ・フルギペルダに由来する細胞系を感染せしめるために使用される。一般的には、Ｇｌｉｃｋ ａｎｄ Ｐａｓｔｅｒｎａｋ， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ： Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ， ＡＳＭ Ｐｒｓｓ， Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ， Ｄ．Ｃ．， １９９４を参照のこと。もう１つの適切な細胞系は、トリコプルシア・ニ（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ）に由来するＨｉｇｈ ＦｉｖｅＯＴＭ細胞系（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）である（アメリカ特許第５，３００，４３５号）。市販の血清フリー培地が、細胞を増殖し、そして維持するために使用される。
【００９９】
適切な培地は、Ｓｆ９細胞のためには、ＳＦ９００ＩＩＴＭ （Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ），又はＥＳＴ  ９２１ＴＭ（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）； 及びＴ． ｎｉ 細胞のためには、Ｅｘ−ＣｅｌｌＯ４０５ＴＭ（ＪＲＨ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｌｅｎｚａ， ＫＳ）又はＥｘｐｒｅｓｓ ＦｉｖｅＯＴＭ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ）である。細胞は、約２〜５×１０５個の細胞〜１〜２×１０６個の細胞の接種密度から増殖され、この時点で、組換えウィルスストックが、０．１〜１０，より典型的にはほぼ３の感染の多重度（ＭＣＩ）で添加される。組換えウィルス−感染された細胞は典型的には、感染後１２〜７２時間で、組換えＺａｌｐｈａ５３ポリペプチドを生成し、そして培地中にそれを、種々の効率を伴って分泌する。
【０１００】
培養物は通常、感染後４８時間で収穫される。遠心分離が、培地（上清液）から細胞を分離するために使用される。Ｚａｌｐｈａ５３ポリペプチドを含む上清液は、微小孔、通常０．４５μｍの孔サイズのフィルターを通して濾過される。使用される方法は一般的に、入手できる実験用マニュアルに記載されている（Ｋｉｎｇ， Ｌ． Ａ． ａｎｄ Ｐｏｓｓｅｅ， Ｒ． Ｄ．， 前記； Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙ， Ｄ． Ｒ． など．， 前記；Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ， Ｃ． Ｄ．， 前記）。上清液からのＺａｌｐｈａ５３ポリペプチドの続く精製は、本明細書に記載される方法を用いて達成され得る。
【０１０１】
菌類細胞、例えば酵母細胞はまた、本発明内で使用され得る。これに関して、特に興味ある酵母種は、サッカロミセス・セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）， ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）及びピチア・メタノリカ（ｐｉｃｈｉａ ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ） を包含する。外因性ＤＮＡによりＳ．  セレビシアエ細胞を形質転換し、そしてそれから組換えポリペプチドを生成するための方法は、例えばＫａｗａｓａｋｉ， アメリカ特許第４，５９９，３１１号；Ｋａｗａｓａｋｉ など．， アメリカ特許第４，９３１，３７３号；Ｂｒａｋｅ， アメリカ特許第４，８７０，００８号；Ｗｅｌｃｈなど．， アメリカ特許第５，０３７，７４３号；及びＭｕｒｒａｙ など．， アメリカ特許第４，８４５，０７５号により開示される。形質転換された細胞は、選択マーカー、通常、耐薬物性、又は、特定の栄養物（例えばロイシン）の不在下で増殖する能力により決定される表現型により選択される。
【０１０２】
サッカロミセス・セレビシアエへの使用のための好ましいベクターシステムは、グルコース含有培地における増殖により形質転換された細胞の選択を可能にする、Ｋａｗａｓａｋｉ など． （アメリカ特許第４，９３１，３７３号）により開示されるＰＯＴ１ベクターシステムである。酵母への使用のための適切なプロモーター及びターミネーターは、解糖酵素遺伝子（例えば、Ｋａｗａｓａｋｉ， アメリカ特許第４，５９９，３１１号；Ｋｉｎｇｓｍａｎなど．， アメリカ特許第４，６１５，９７４号；及びＢｉｔｔｅｒ， アメリカ特許第４，９７７，０９２ 号を参照のこと）及びアルコール  デヒドロゲナーゼ遺伝子からのものを包含する。また、アメリカ特許第４，９９０，４４６ 号；第５，０６３，１５４号；第５，１３９，９３６ 号；及び第４，６６１，４５４号を参照のこと。
【０１０３】
他の酵素、例えばハンセヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、シゾサッカロミセス・ポンベ（ Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ ）、クルイベリミセス・ラクチス（ Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ ）、クルイベリミセス・フラギリス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓ ）、ウスチラゴ・マイジス（Ｕｓｔｉｌａｇｏ ｍａｙｄｉｓ ）、ピチア・パストリス（ Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ ）、ピチア・メタノリカ（Ｐｉｃｈｉａ ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）、ピチア・グイレルモンジ（ Ｐｉｃｈｉａ ｇｕｉｌｌｅｒｍｏｎｄｉｉ ）、及びカンジタ・マルトサ（Ｃａｎｄｉｄａ ｍａｌｔｏｓａ ）のための形質転換システムは、当業界において知られている。
【０１０４】
例えば、Ｇｌｅｅｓｏｎ など．， Ｊ． Ｇｅｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． １３２： ３４５９−３４６５， １９８６ 及びＣｒｅｇｇ， アメリカ特許第４，８８２，２７９ 号を参照のこと。アスペルギラス細胞は、Ｍｃｋｎｉｇｈｔ など．，アメリカ特許第４，９３５，３４９号の方法に従って使用され得る。アクレモニウム・クリソゲナム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）を形質転換するための方法は、Ｓｕｍｉｎｏ ．， アメリカ特許第５，１６２，２２８号により開示される。ニューロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）を形質転換するための方法は、Ｌａｍｂｏｗｉｔｚ， アメリカ特許第４，４８６，５３３号により開示される。
【０１０５】
組換えタンパク質の生成のための宿主としてのピチア・メタノリカの使用は、ＷＩＰＯ公開ＷＯ９７／１７４５０， ＷＯ９７／１７４５１、ＷＯ９８／０２５３６及びＷＯ９８／０２５６５に開示される。Ｐ．メタノリカの形質転換に使用するためのＤＮＡ分子は通常、形質転換の前、好ましくは線状化される、二本鎖の環状プラスミドとして調製されるであろう。Ｐ．メタノリカにおけるポリペプチド生成のためには、プラスミドにおけるプロモーター及びターミネーターは、Ｐ．メタノリカ遺伝子、例えばＰ．メタノリカ  アルコール利用遺伝子（ＡＵＧ１又はＡＵＧ２）のものであることが好ましい。他の有用なプロモーターは、ジヒドロキシアセトンシンターゼ（ＤＨＡＳ）、ギ酸デヒドロゲナーゼ（ＦＭＤ）、及びカタラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子のものを包含する。
【０１０６】
宿主染色体中へのＤＮＡの組み込みを促進するためには、宿主ＤＮＡ配列を両端に有するプラスミドの完全な発現セグメントを有することが好ましい。ピチア  メタノリカへの使用のための好ましい選択マーカーは、アデニンの不在下でａｄｅ２宿主細胞の増殖を可能にする、ホスホリボシル−５−アミノイミダゾールカルボキシラーゼ（ＡＩＲＣ； ＥＣ． ４．１．１．２１）をコードするＰ．メタノリカＡＤＥ２遺伝子である。メタノールの使用を最少にすることが所望される大規模産業方法のためには、両メタノール利用遺伝子（ＡＵＧ１及びＡＵＧ２）が欠失されている宿主細胞を使用することが好ましい。
【０１０７】
分泌されたタンパク質の生成のためには、液胞プロテアーゼ遺伝子（ＰＥＰ４及びＰＲＢ１）を欠いている宿主細胞が好ましい。エレクトロポレーションが、Ｐ．メタノリカ細胞中への、興味あるポリペプチドをコードするＤＮＡを含むプラスミドの導入を促進するために使用される。２．５〜４．５ｋＶ／ｃｍ，好ましくは約３．７５ｋＶ／ｃｍの電場の強さ、及び１〜４０ｍ秒、最も好ましくは約２０ｍ秒の時定数（ｒ）を有する、指数的に減衰する、パルスされた電場を用いて、エレクトロポレーションによりＰ．メタノリカ細胞を形質転換することが好ましい。
【０１０８】
原核宿主細胞、例えば細菌Ｅ．コリ、バシラス及び他の属の菌株はまた、本発明において有用な宿主細胞である。それらの宿主を形質転換し、そしてそこにクローン化される外来性ＤＮＡ配列を発現するための技法は、当業界において良く知られている（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋなど．， 前記を参照のこと）。細菌、例えばＥ．コリにおいてＺａｌｐｈａ５３ポリペプチドを発現する場合、そのポリペプチドは、典型的には不溶性顆粒として細胞質に保持され得、又は細菌の分泌配列により細胞周辺腔に向けられ得る。前者の場合、細胞は溶解され、そして顆粒が回収され、そして例えばグアニジンイソチオシアネート又はウレアを用いて変性される。
【０１０９】
次に、変性されたポリペプチドが再生され、そして例えばウレア、及び還元された及び酸化されたグルタチオンの組み合わせの溶液に対する透析、続く緩衝溶液に対する透析により、前記変成体を希釈することによってニ量体化され得る。後者の場合、ポリペプチドは、細胞周辺腔の内容物を開放するために細胞を破壊し（例えば、音波処理又は浸透ショックにより）、そしてタンパク質を回収することによって、細胞周辺腔から可溶性及び機能性形で回収され、それにより、変性及び再生のための必要性を回避することができる。
【０１１０】
形質転換され又はトランスフェクトされた宿主細胞は、選択された宿主細胞の増殖のために必要とされる栄養物及び他の成分を含む培養培地において、従来の方法に従って培養される。種々の適切な培地、例えば定義された培地及び複合培地は、当業界において知られており、そして一般的には、炭素源、窒素源、必須アミノ酸、ビタミン及び鉱物を含む。培地はまた、必要とされる場合、成長因子又は血清のような成分も含むことができる。増殖培地は一般的に、外因的に付加されたＤＮＡを含む細胞を、例えば発現ベクター上に担持される選択マーカーにより補足され、又は宿主細胞中に同時トランスフェクトされる必須栄養物における薬物選択又は栄養欠乏により選択するであろう。
【０１１１】
Ｐ．メタノリカ細胞は適切な炭素源、窒素源及び微量栄養物を含んでなる培地において、約２５℃〜３５℃の温度で培養される。液体培養物は、従来の手段、例えば小さなフラスコの振盪又は発酵器のスパージングにより十分なエアレーションを提供される。Ｐ．メタノリカのための好ましい培養培地は、ＹＥＰＤ（２％Ｄ−グルコース、２％のＢａｃｔｏＴＭペプトン（Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｄｅｔｒｏｉｔ， ＭＩ）， １％のＢａｃｔｏＴＭ  酵母抽出物（Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）， ０．００４％のアデニン及び０．００６％のＬ−ロイシン）である。
【０１１２】
本発明のもう１つの態様は、本発明のＺａｌｐｈａ５３ポリペプチドのエピトープ−担持部分を含んで成るペプチドまたはポリペプチドを提供する。このポリペプチド部分のエピオ−プは、本発明の免疫原性又は抗原性エピトープである。抗体が結合できるタンパク質の領域は、“抗原性エピトープ”として定義される。例えば、Ｇｅｙｓｅｎ， Ｈ． Ｍ． など．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８１： ３９９８−４００２ （１９８４） を参照のこと。
【０１１３】
抗原性エピトープ（すなわち、抗体が結合できるタンパク質分子の領域を含む）を担持するペプチド又はポリペプチドの選択に関しては、タンパク質配列の一部を模倣する比較的短い合成ペプチドが、その部分的に模倣されるタンパク質と反応する抗血清を通常誘発できることは、当業界において良く知られている。Ｓｕｔｃｌｉｆｆｅ， Ｊ．Ｇ． など． Ｓｃｉｅｎｃｅ ２１９： ６６０−６６６ （１９８３） を参照のこと。タンパク質反応性血清を誘発できるペプチドは、タンパク質の主要配列においてときおり表され、一組の単純な化学規則により特徴づけられ得、そして損なわれていないタンパク質の免疫優性領域（すなわち、免疫エピトープ）にも、又はアミノ又はカルボキシル末端にも制限されない。極端に疎水性であるペプチド及び６又はそれよりも少ない残基のそれらのペプチドは一般的に、模倣されたタンパク質に結合する抗体の誘発において無効果であり；より長い可溶性ペプチド、特にプロリン残基を含むそれらのペプチドが通常効果的である。
【０１１４】
本発明の抗原性エピトープ−担持のペプチド及びポリペプチドは、本発明のポリペプチドに特異的ニ結合する、抗体、例えばモノクローナル抗体を生ぜしめるためにも使用され得る。本発明の抗原性エピトープ−担持のペプチド及びポリペプチドは、本発明のポリペプチドのアミノ酸内に含まれる、少なくとも９及び好ましくは１５〜約３０個のアミノ酸を含む。しかしながら、本発明のアミノ酸配列の大きな部分、すなわち本発明のポリペプチドのアミノ酸配列の３０〜５０個のアミノ酸、又はその全体の長さまでのいずれかの長さ及び全体の長さのアミノ酸を含んで成るペプチド又はポリペプチドはまた、タンパク質と反応する抗体を誘発するためにも有用である。
【０１１５】
好ましくは、エピトープ−担持のペプチドのアミノ酸配列は、水性溶媒における実質的な溶解性を提供するために選択され（すなわち、前記配列は比較的親水性の残基を含み、そして疎水性残基は好ましくは回避される）；そしてプロリン残基を含む配列が特に好ましい。配列列挙に示されるポリペプチドのすべては、本発明に従って使用される抗原性エピトープを含む。本発明はまた、本明細書に記載されるＺａｌｐｈａ５３ポリペプチドのエピトープ−担持の部分を含んで成るポリペプチドフラグメント又はペプチドも提供する。
【０１１６】
そのようなフラグメント又はペプチドは、完全なタンパク質が免疫原として使用される場合、抗体応答を誘発するタンパク質の一部である“免疫原性エピトープを含んで成る。免疫原性エピトープ−担持のペプチドは、標準方法を用いて同定され得る（例えば、Ｇｅｙｓｅｎなど．，前記を参照のこと）。アメリカ特許第４，７０８，７８１号（１９８７）は、所望するタンパク質の免疫原性エピトープを担持するペプチドをいかにして同定するかをさらに記載する。
【０１１７】
タンパク質単離
本発明のポリペプチドを８０％以上の純度、より好ましくは９０％以上の純度、さらに好ましくは９５％以上の純度に精製することが好ましく、そして汚染性高分子、特に他のタンパク質及び核酸に対して、９９．９％以上の純度であり、そして感染性及び発熱性剤を有さない医薬的に純粋な状態が特に好ましい。好ましくは、精製されたポリペプチドは、他のポリペプチド、特に動物起源の他のポリペプチドを実質的に有さない。
【０１１８】
発現された組換え体Ｚａｌｐｈａ５３ ポリペプチド（又はキメラＺａｌｐｈａ５３  ポリペプチド）は、分別及び／又は従来の精製方法及び媒体を用いて精製され得る。硫酸アンモニウム沈殿及び酸又はカオトロピック剤抽出は、サンプルの分別のために使用される。典型的な精製段階は、ヒドロキシアパタイト、サイズ排除、ＦＰＬＣ及び逆相高性能液体クロマトグラフィーを包含する。適切なクロマトグラフィー用媒体は、誘導体化されたデキストラン、アガロース、セルロース、ポリアクリルアミド、特別なシリカ及び同様のものを包含する。ＰＥＩ、ＤＥＡＥ、ＱＡＥ及びＱ誘導体が好ましい。
【０１１９】
典型的なクロマトグラフィー用媒体は、フェニル、ブチル又はオクチル基により誘導体化されたもの、例えばフェニル−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ（ｐｈａｒｍａｃｉａ），Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ブチル６５０（Ｔｏｓｏ Ｈａａｓ， Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙｖｉｌｌｅ， ＰＡ）、オクチル−Ｓｅｐｈａｒｒｏｓｅ （Ｐｈａｒｍａｃｉａ）及び同様のもの；又はポリアクリル樹脂、例えばＡｍｂｅｒｃｈｒｏｍ ＣＧ７１ （Ｔｏｓｏ Ｈａａｓ）及び同様のものを包含する。適切な固体支持体は、ガラスビーズ、シリカ基材の樹脂、セルロース樹脂、アガロースビーズ、架橋されたアガロースビーズ、ポリスチレンビーズ、架橋されたポリアクリルアミド樹脂及びそれらが使用される条件下で不溶性である同様のものを包含する。それらの支持体は、アミノ基、カルボキシル基、スルフヒドリル基、ヒドロキシル基及び／又は炭水化物成分によるタンパク質の結合を可能にする反応性基より変性され得る。
【０１２０】
カップリング化学物質の例は、臭化シアン活性化、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド活性化、エポキシド活性化、スルフヒドリル活性化、ヒドラジド活性化及びカルボジイミド  カップリング化学物質のためのカルボキシル及びアミノ誘導体を包含する。それらの及び他の固体媒体は当業界において良く知られており、そして広く使用されており、そして商業的供給者から入手できる。支持媒体にリガンド又は受容体ポリペプチドを結合するための方法は当業界において良く知られている。特定方法の選択は、通常のことであり、そして選択された支持体の性質により一部決定される。例えば、Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｙ： Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ＆ Ｍｅｔｈｏｄｓ， Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＬＫＢ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｕｐｐｓａｌａ， Ｓｗｅｄｅｎ， １９８８を参照のこと。
【０１２１】
本発明のポリペプチドは、それらの性質の活用により単離され得る。例えば、固定された金属イオン吸着（ＩＭＡＣ）クロマトグラフィーが、ヒスチジンに富んでいるタンパク質、及びポリヒスチジン標識を含んでなるそれらのタンパク質を精製するために使用され得る。手短に言及すれば、ゲルがまず、二価金属イオンにより荷電され、キレートが形成される（ Ｓｕｌｋｏｗｓｋｉ， Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ． ３： １−７， １９８５）。ヒスチジンに富んでいるタンパク質が、使用される金属イオンに依存して、異なった親和性を有するこのマトリックスに吸着され、そして競争溶出、ｐＨの低下、又は強いキレート化剤の使用により溶出されるであろう。
【０１２２】
他の精製方法は、レクチン親和性クロマトグラフィー及びイオン交換クロマトグラフィーによるグリコシル化されたタンパク質の精製を包含する（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．， Ｖｏｌ． １８２， “Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ”， Ｍ． Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ， （ ｅｄ．）， Ａｃａｄ． Ｐｒｅｓｓ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， １９９０， ｐｐ． ５２９−３９）。本発明のさらなる態様においては、興味あるポリペプチド、及び親和性標識（例えばマルトース−結合タンパク質、免疫グロブリンドメイン）の融合体が、精製を促進するために構成され得る。
【０１２３】
さらに、当業界において記載される方法に従って、ポリペプチド融合又はハイブリッドＺａｌｐｈａ５３タンパク質が、本発明のＺａｌｐｈａ５３の領域又はドメインを用いて構成される（Ｓａｍｂｒｏｏｋ など．， 前記；Ａｌｔｓｃｈｕｌ など．， 前記；Ｐｉｃａｒｄ， Ｃｕｒ． Ｏｐｉｎ． Ｂｉｏｌｏｇｙ， ５： ５１１−５， １９９４）。それらの方法は、興味あるポリペプチドにおける大きなドメイン又は領域の生物学的重要性の決定を可能にする。そのようなハイブリッドは、反応運動学、結合を変更し、基質特異性を抑制し、又は拡張し、又はポリペプチドの組織及び細胞局在せいを変更し、そして未知の構造のポリペプチドに適用される。
【０１２４】
融合タンパク質は、その融合タンパク質の個々の成分を調製し、そしてそれらを化学的に接合することによって、当業者に知られている方法により調製され得る。他方では、正しく読み取り枠を整合して融合タンパク質の両成分をコードするポリヌクレオチドは、既知の技法を用いて生成され、そして本明細書に記載される方法により発現され得る。例えば、生物学的機能を付与するドメインの一部又はすべてが、本発明のＺａｌｐｈａ５３と、もう１つのファミリーメンバーからのその機能的に同等のドメインとの間で交換され得る。
【０１２５】
そのようなドメインは次のものを包含するが、但しそれらだけには限定されない：分泌シグナル配列、及びこのファミリーにおける有意なドメイン又は領域。そのような融合タンパク質は、構成される融合体に依存して、本発明のポリペプチド又は他の既知のファミリーのタンパク質と同じか又は類似する生物学的機能プロフィールを有することが予測される。さらに、そのような融合タンパク質は、本明細書に開示されるように、他の性質も示すことができる。
【０１２６】
Ｚａｌｐｈａ５３ポリペプチド又はそのフラグメントはまた、化学的合成により調製され得る。Ｚａｌｐｈａ５３ポリペプチドはモノマー又はマルチマーであり；グリコシル化されても又はグリコシル化されなくても良く；ペギレート化されても又はペギレート化されなくても良く；そして開始メチオニンアミノ酸残基を包含しても又はしなくても良い。
【０１２７】
ポリペプチドの化学的合成
ポリペプチド、特に本発明のポリペプチドはまた、排他的固相合成、部分固相法、フラグメント縮合、又は従来の溶液方法により合成され得る。ポリペプチドは、好ましくは、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ， Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． ８５： ２１４９， １９６３により記載のようにして、固相ペプチド合成により調製され得る。
【０１２８】
アッセイ
本発明の分子の活性は、種々のアッセイを用いて測定され得る。精子におけるステロイド形成、精子形成、ＬＨ及びＦＳＨ生成、及び視床下部におけるＧｎＲＨの変化が特に興味あるものである。そのようなアッセイは、当業界において良く知られている。
【０１２９】
本発明のタンパク質は、精子生成を高めるために有用である。Ｚａｌｐｈａ５３は、培養された細胞を用いてインビトロで、又は適切な動物モデルに本発明の分子を投与することによってインビボで測定され得る。例えば、Ｚａｌｐｈａ５３トランスフェクトされた（又は同時トランスフェクトされた）発現宿主細胞が、アルギン酸塩環境下で包埋され、そして受容体動物中に注入（移植）され得る。アルギネート−ポリ−Ｌ−リシン微小封入、透過性膜封入及び拡散チャンバーは、トランスフェクトされた哺乳類細胞又は一次哺乳類細胞を捕獲するための手段として記載されている。
【０１３０】
それらのタイプの非免疫原性“封入”又は微小環境は、微小環境への栄養物ノトランスファーを可能にしそして又は、捕獲された細胞により分泌され又は開放されるタンパク質及び他の高分子の環境バリアーを通して受容体動物への拡散を可能にする。最も重要なことには、カプセル又は微小環境は、受容体動物の免疫応答から外来性の包埋された細胞をマスクし、そして遮断する。そのような微小環境は、注入される細胞の寿命を、数時間又は数日（裸細胞）から数週間（包埋された細胞）まで拡張することができる。
【０１３１】
アルギン酸塩糸は、包埋された細胞を生成するための単純且つ迅速な手段を提供する。アルギン酸塩糸を生成するために必要とされる材料は、容易に手に入れることができそして比較的安価である。製造されると、そのアルギン酸塩糸は、インビトロで、及びその糸を用いて得られるデータに基づいて、インビボで、比較的強く且つ耐久性がある。そのアルギン酸塩糸は容易に操作でき、そしてその方法論は多くの調製のために評価できる。典型的な方法においては、３％のアルギン酸塩が、無菌水において調製され、そして滅菌濾過される。アルギン酸塩糸の調製の直前、アルギン酸塩溶液が再び濾過される。約５０％の細胞懸濁液（１ｍｌ当たり約５×１０５個〜約５×１０７個の細胞を含む）が３％アルギン酸塩溶液と共に混合される。
【０１３２】
１ｍｌのアルギン酸塩／細胞懸濁液が、約  １５分間にわたって、１００ｍＭの滅菌濾過されたＣａｃｌ２ 溶液中に押し出され、“糸（Ｔｈｒｅａｄ）”が形成される。次に、押し出された糸は、５０ｍＭのＣａｃｌ２の溶液に移され、そして次に２５ｍＭのＣａｃｌ２の溶液に移される。次に、糸が、脱イオン水によりすすがれ、その後、ポリ−Ｌ−リシンの０．０１％溶液においてインキュベートすることによって糸を被覆する。最後に、糸は乳酸塩化されたリンガー溶液によりすすがれ、そして注射器（針のない）中に溶液から抜き取られる。次に大きな孔の針がその注射器につけられ、そして糸が最少量の乳酸塩化されたリンガー溶液において受容体中の腹腔内注入される。
【０１３３】
本発明のタンパク質をアッセイするための別のインビボアプローチは、ウィルス供給システムを包含する。この目的のための典型的なウィルスは、アデノウィルス、ヘルペスウィルス、ワクシニアウィルス及びアデノ関連ウィルス（ＡＡＶ）を包含する。アデノウィルス、すなわち二本鎖ＤＮＡウィルスは現在、異種拡散の供給のための最も研究されている遺伝子トランスファーベクターである（Ｔ． Ｃ． Ｂｅｃｋｅｒ など．， Ｍｅｔｈ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏ． ４３： １６１−８９， １９９４； 及びＪ． Ｔ． Ｄｏｕｇｌａｓ ａｎｄ Ｄ．Ｔ． Ｃｕｒｉｅｌ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ＆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ４： ４４−５３， １９９７ を参照のこと）。
【０１３４】
アデノウィルスシステムは次のいくつかの利点を付与する：（ ｉ ）アデノウィルスは比較的大きなＤＮＡ挿入体を適応せしめることができ；（ ｉｉ ）高い力価に増殖され得；（ ｉｉｉ ）広範囲の哺乳類細胞型を感染せしめ；そして（ ｉｖ ）異なったプロモーターを含む多数の利用できるベクターと共に使用され得る。また、アデノウィルスは血流において安定しているので、それらは静脈内注射により投与され得る。
【０１３５】
アデノウィルスゲノムの一部を欠失することによって、異種ＤＮＡのより大きな挿入体（７ｋｂまでの）が適応され得る。それらの挿入体は、直接的な結合により又は同時トランスフェクトされたプラスミドとの相同組換えにより、ウィルスＤＮＡ中に組み込まれ得る。典型的なシステムにおいては、必須Ｅ１遺伝子がウィルスベクターから欠失され、そしてウィルスは、Ｅ１遺伝子が宿主細胞（ヒト２９３細胞系が典型である）により供給されなければ、複製しないであろう。
【０１３６】
損なわれていない動物に静脈内投与される場合、アデノウィルスは主に、肝臓を標的化する。アデノウィルス供給システムがＥ１遺伝子欠失を有する場合、ウィルスは宿主細胞において複製することができない。しかしながら、宿主の組織（例えば、肝臓）は、異種タンパク質を発現し、そしてプロセッシングするのであろう（そして、分泌シグナル配列が存在する場合、分泌する）。分泌されたタンパク質は高く血管化された肝臓において循環に入り、そして感染された動物に対する効果が決定され得る。
【０１３７】
アデノウィルスシステムはまた、インビトロでのタンパク質生成のためにも使用され得る。アデノウィルス感染された非−２９３細胞を、その細胞が急速に分裂しないような条件下で培養することによって、前記細胞は長時間、タンパク質を生成することができる。たとえば、ＢＨＫ細胞は、細胞工場において集密性まで増殖され、次に興味ある分泌されたタンパク質をコードするアデノウィルス  ベクターに暴露される。
【０１３８】
次に、細胞が、有意な細胞分裂を伴わないで、感染された細胞の数週間の生存を可能にする血清フリー条件下で増殖せしめられる。他方では、アデノウィルス  ベクター感染された２９３Ｓ細胞が、有意な量のタンパク質を生成するために、比較的高い細胞密度で、付着細胞として又は懸濁培養において増殖せしめられ得る（ Ｇａｒｎｉｅｒ など．， Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌ． １５： １４５−５５， １９９４ を参照のこと）。いずれかのプロトコールにより、発現され、分泌された異種タンパク質が、細胞培養物の上清液から反復して単離され得る。感染された２９３Ｓ細胞生成プロトコールにおいては、分泌されていないタンパク質が効果的に得られる。
【０１３９】
アゴニスト及びアンタゴニスト：
Ｚａｌｐｈａ５３について観察される組織分布の観点から、アゴニスト（例えば、天然のリガンド／基質／補因子／等）及びアンタゴニストは、インビトロ及びインビボ用途において莫大な可能性を有する。Ｚａｌｐｈａ５３アゴニストとして同定される化合物は、免疫系又は精子形成を刺激するために有用である。例えば、Ｚａｌｐｈａ５３及びアゴニスト化合物は、定義された細胞培養培地の成分として有用であり、そして細胞培養に通常使用される血清を置換するために、単独で、又は他のサイトカイン及びホルモンと組合して使用され得る。
【０１４０】
アンタゴニスト：
アンタゴニストはまた、リガンド−受容体相互作用の部位を特徴づけるための研究試薬としても有用である。Ｚａｌｐｈａ５３のアンタゴニストはまた、下記により詳細に論じられるように炎症をダウン−レギュレートするためにも使用され得る。Ｚａｌｐｈａ５３活性のインヒビター（Ｚａｌｐｈａ５３アンタゴニスト）は、抗−Ｚａｌｐｈａ５３抗体及び可溶性Ｚａｌｐｈａ５３受容体、並びに他のペプチド及び非ペプチド剤（例えば、リボザイム）を包含する。
【０１４１】
Ｚａｌｐｈａ５３はまた、その活性のインヒビター（アンタゴニスト）を同定するためにも使用され得る。試験化合物は、Ｚａｌｐｈａ５３の活性を阻害する化合物を同定するために、本明細書に開示されるアッセイに添加される。本明細書に開示されるそれらのアッセイの他に、サンプルが、受容体結合又はＺａｌｐｈａ５３−依存性細胞応答の刺激／阻害を測定するよう企画された種々のアッセイにより、Ｚａｌｐｈａ５３活性の阻害について試験され得る。例えばＺａｌｐｈａ５３−応答性細胞系は、Ｚａｌｐｈａ５３−刺激された細胞経路に応答するレポーター遺伝子構造体によりトランスフェクトされ得る。このタイプのレポーター遺伝子構造体は、当業界において知られており、そして一般的に、アッセイできるタンパク質、例えばルシフェラーゼをコードする遺伝子に作用可能に連結されるＺａｌｐｈａ５３−ＤＮＡ応答要素を含むであろう。
【０１４２】
ＤＮＡ応答要素は、サイクリックＡＭＰ応答要素（ＣＲＥ）、ホルモン応答要素（ＨＲＥ）、インスリン応答要素（ＩＲＥ）（Ｎａｓｒｉｎ など．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８７： ５２７３−７， １９９０）及び血清応答要素（ＳＲＥ）（Ｓｈａｗ など．， Ｃｅｌｌ ５６： ５６３−７２， １９８９）を包含するが、但しそれらだけには限定されない。サイクリックＡＭＰ応答要素は、Ｒｏｅｓｔｌｅｒ など．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６３ （１９）： ９０６３−６， １９８８及びＨａｂｅｎｅｒ， Ｍｏｌｅｃ． Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ． ４ （８）： １０８７−９４， １９９０に再考される。ホルモン応答要素は、Ｂｅａｔｏ， Ｃｅｌｌ ５６： ３３５−４４ｌ， １９８９に再考される。候補体化合物、溶液、混合物又は抽出物は、レポーター遺伝子発現のＺａｌｐｈａ５３刺激の低下により明らかなように、標的細胞に対するＺａｌｐｈａ５３ の活性を阻害する能力について試験される。
【０１４３】
このタイプのアッセイは、細胞表面受容体に結合するＺａｌｐｈａ５３を直接的にブロックする化合物、及びレポーターリガンド結合に続く細胞経路における工程をブロックする化合物を検出するであろう。他方では、化合物又は他のサンプルが、検出できるラベル（例えば１２５Ｉ、  ビオチン、ホースラディシュ  ペルオキシダーゼ、ＦＩＴＣ、及び同様のもの）により標識されるＺａｌｐｈａ５３を用いて、受容体へのＺａｌｐｈａ５３結合の直接的なブロッキングについて試験され得る。このタイプのアッセイにおいては、受容体へのラベルされたＺａｌｐｈａ５３の結合を阻害する試験サンプルの能力は、二次アッセイを通して確かめられ得る阻害活性の表示である。結合アッセイ内に使用される受容体は、細胞受容体、又は単離され、固定された受容体であり得る。
【０１４４】
Ｚａｌｐｈａ５３ポリペプチドは、２種の領域ドメインを含み、そして可変領域を欠いている、免疫グロブリンＨ鎖不変領域、典型的にはＦｃフラグメントとの融合体として発現され得る。そのような融合体を調製するための方法は、アメリカ特許第５，１５５，０２７号及び第５，５６７，５８４号に開示される。そのような融合体は典型的には、マルチマー分子として分泌され、ここでＦｃ部分はお互いジスルフィド結合され、そして２つの非−Ｉｇポリペプチドはお互い密接に接近して配列される。このタイプの融合体は、リガンドを親和性精製するために使用され得る。アッセイへの使用のためには、キメラが、Ｆｃ領域を通して支持体に結合され、そしてＥＬＩＳＡ形式で使用される。
【０１４５】
Ｚａｌｐｈａ５３リガンド−結合ポリペプチドはまた、リガンドの精製のためにも使用され得る。ポリペプチドは、固体支持体、例えばアガロース、架橋されたアガロース、ガラス、セルロース樹脂、シリカ基材の樹脂、ポリスチレン、架橋されたポリアクリルアミド、又は使用の条件下で安定する同様の材料のビーズ上に同定される。
【０１４６】
固体支持体にポリペプチドを連結するための方法は、当業界において知られており、そしてアミン化学、臭化シアン活性化、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド活性化、エポキシド活性化、スルフヒドリル活性化及びヒドラジド活性化を包含する。得られる媒体は一般的に、カラムの形で形成され、そしてリガンドを含む流体がカラムを通して１又は複数回、通され、リガンドの受容体ポリペプチドへの結合を可能にされる。次に、リガンドは、塩濃度、カオトロピック（グアニジンＨＣｌ）、又はｐＨの変化を用いて溶離され、リガンド−受容体結合が破壊される。
【０１４７】
リガンド−結合受容体（又は抗体、相補体／抗相補体対の１つのメンバー）、又はその結合フラグメント、及び市販のバイオセンサー装置（ＢＩＡｃｏｒｅ， Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ， Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ， ＮＪ）を用いるアッセイシステムが、好都合には、使用され得る。そのような受容体、抗体、相補体／抗相補体対のメンバー、又はフラグメントは、受容体チップの表面上に固定される。この装置の使用は、Ｋａｒｌｓｓｏｎ， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ １４５： ２２９−４０， １９９１ 及びＣｕｎｎｉｎｇｈａｍ ａｎｄ Ｗｅｌｌｓ， Ｊ． Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ． ２３４： ５５４−６３，１９９３により開示される。
【０１４８】
受容体、抗体、メンバー又はフラグメントは、アミン又はスルフヒドリル化学を用いて、流動細胞内の金フィルムに結合されるデキストラン繊維に共有結合される。試験サンプルが細胞に通される。リガンド、エピトープ又は相補体／抗相補体対の反対のメンバーがサンプルに存在する場合、それは、それぞれ固定された受容体、抗体又はメンバーに結合し、金フィルムの表面のプラズモン共鳴の変化として検出される、媒体の屈折率の変化を引き起こす。このシステムは、オン−及びオフ−速度の決定を可能にし、これから、結合親和性が計算され、そして結合の化学量の評価が可能にされる。
【０１４９】
リガンド−結合受容体ポリペプチドはまた当業界において知られている他のアッセイシステム内でも使用され得る。そのようなシステムは、結合親和性の決定のためのスカチャード分析（Ｓｃａｔｃｈａｒｄ， Ａｎｎ． ＮＹ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ５１：６６０−７２， １９４９）及び熱量測定アッセイ（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ など．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５３： ５４５−４８， １９９１；Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ など．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４５： ８２１−２５， １９９１）を包含する。
【０１５０】
Ｚａｌｐｈａ５３ポリペプチドはまた、Ｚａｌｐｈａ５３エピトープ、ペプチド又はポリペプチドに特異的に結合する抗体を調製するためにも使用され得る。Ｚａｌｐｈａ５３ポリペピチド又はそのフラングメントは、動物を接種し、そして免疫応答を誘発するために抗原（免疫原）として作用する。適切な抗原は、配列番号２〜１８及び２０−３７によりコードされるＺａｌｐｈａ５３ポリペプチドである。この免疫応答から生成される抗体は、本明細書に記載のようにして、単離され得る。
【０１５１】
ポリクローナル及びモノクローナル抗体を調製し、そして単離するための方法は、当業界において良く知られている。例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， Ｃｏｏｌｉｇａｎ， など．， （ｅｄｓ．）， Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．， １９９５； Ｓａｍｂｒｏｏｋ など．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， ＮＹ， １９８９； 及びＨｕｒｒｅｌｌ， Ｊ．Ｇ．Ｒ．， Ｅｄ．， Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ， ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ．， Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ， ＦＬ， １９８２ を参照のこと。
【０１５２】
当業者に明らかなように、ポリクローナル抗体は、種々の温血動物、例えば馬、ウシ、ヤギ、羊、犬、鶏、ウサギ、マウス、及びラットを、Ｚａｌｐｈａ５３ポリペプチド又はそのフラグメントにより接種することにより生成され得る。Ｚａｌｐｈａ５３ポリペプチドの免疫性は、アジュバント、例えばミヨウバン（水酸化アルミニュウム）又はフロイント完全又は不完全アジュバントの使用により高められ得る。
【０１５３】
免疫化のために有用なポリペプチドはまた、免疫グロブリン  ポリペプチド又はマルトース結合タンパク質との融合体ポリペプチド、例えばＺａｌｐｈａ５３又はその一部の融合体を包含する。ポリペプチド免疫原は、十分な長さの分子又はその一部であり得る。ポリペプチド部分が“ハプテン−様”である場合、そのような部分は、免疫化のために、高分子キャリヤー（例えば、カサガイヘモシアニン（ＫＬＨ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）又は破傷風トキソイド）に都合良く連結又は結合され得る。
【０１５４】
本明細書で使用される場合、用語“抗体”とは、ポリクローナル抗体、親和性精製されたポリクローナル抗体、モノクローナル抗体及び抗原結合フラグメント、例えばＦ（ａｂ’）２及びＦａｂタンパク質分解性フラグメントを包含する。遺伝子的に構築された損なわれていない抗体又はフラグメント、例えばキメラ抗体、Ｆｖフラグメント、一本鎖抗体及び同様のもの、並びに合成抗原結合ペプチド及びポリペプチドもまた包含される。
【０１５５】
非ヒト抗体は、ヒト骨格及び不変領域上に非ヒトＣＤＲのみを移植することによって、又は完全な非ヒト可変ドメインを組み込むことによって（任意には、暴露された残基の置換によってヒト−様表面によりそれらのドメインを“おおう（ｃｌｏａｋｉｎｇ）”ことによって；ここで結果物は“張り合わされた”抗体である）、ヒト適合され得る。多くの場合、ヒト適合された抗体は、正しい結合特性を増強するために、ヒト可変領域骨格ドメイン内に非ヒト残基を保持することができる。ヒト適合化抗体を通して、生物学的半減期が高められ、そしてヒトへの投与に基づく有害な免疫反応の可能性が低められる。
【０１５６】
本明細書において有用な抗体を生成し又は選択するための他の技法は、Ｚａｌｐｈａ５３タンパク質又はペプチドへのリンパ球インビトロ暴露、及びファージ又は類似するベクターにおける抗原表示ライブラリーの選択（例えば、固定された又はラベルされたＺａｌｐｈａ５３タンパク質又はペプチドの作用を通して）を包含する。可能性あるＺａｌｐｈａ５３ポリペプチド結合ドメインを有するポリペプチドをコードする遺伝子は、ファージ（ファージ表示）又は細菌、例えばＥ．コリ上に表示されるランダムペプチドライブラリーをスクリーニングすることによって得られる。前記ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、多くの手段、例えばランダム突然変異誘発及びランダムポリヌクレオチド合成を通して得られる。
【０１５７】
それらのランダムペプチド表示ライブラリーは、タンパク質又はポリペプチドであり得る既知の標的物、例えばリガンド又は受容体、生物学的又は合成高分子、又は有機又は無機物質と相互作用するペプチドについてスクリーンするために使用され得る。そのようなランダム  ペプチド表示ライブラリーを創造し、そしてスクリーニングするための技法は、当業界において知られており（Ｌａｄｎｅｒ など．， アメリカ特許第５，２２３，４０９ 号； Ｌａｄｎｅｒ など．， アメリカ特許第４，９４６，７７８ 号；Ｌａｄｎｅｒ など．， アメリカ特許第５，４０３，４８４ 号及びＬａｄｎｅｒ など．， アメリカ特許第５，５７１，６９８ 号）、そしてランダムペプチド表示ライブラリー及びそのようなライブラリーをスクリーニングするためのキットは、例えばＣｌｏｎｔｅｃｈ （Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ， ＣＡ）， Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｉｎｃ． （Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ）， Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ， Ｉｎｃ． （Ｂｅｖｅｒｌｙ， ＭＡ） 及びＰｈａｒｍａｃｉａ ＬＫＢ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｃ． （Ｐｉｃｃａｔａｗａｙ， ＭＪ） から市販されている。
【０１５８】
ランダムペプチド表示ライブラリーは、Ｚａｌｐｈａ５３に結合するタンパク質を同定するために、本明細書に開示されるＺａｌｐｈａ５３配列を用いてスクリーンされ得る。Ｚａｌｐｈａ５３ポリペプチドと相互作用するそれらの“結合タンパク質”は、細胞を標識するために；親和性精製により相同体ポリペプチドを単離するために使用され得る；それらは薬物、トキシン、放射性核種及び同様のものに直接的にまたは間接的に接合され得る。
【０１５９】
それらの結合タンパク質はまた、分析方法に、例えば発現ライブラリーをスクリーニングし、そして活性を中和するためにも使用され得る。結合タンパック質はまた、ポリペプチドの循環レベルを決定するために；根本的な病理学又は疾病のマーカーとして可溶性ポリペプチドを検出し又は定量化するために、診断アッセイにも使用され得る。それらの結合タンパク質はまた、Ｚａｌｐｈａ５３結合及びシグナルトランスダクションをインビトロ及びインビボで阻止するために、Ｚａｌｐｈａ５３ “アンタゴニスト”として使用することができる。
【０１６０】
抗体は、１）それらが限界レベルの結合活性を示す場合、及び２）それらが関連するポリペプチド分子と有意に交差反応しない場合、特異的に結合することが決定された。第１に、本明細書に置ける抗体は、それらが１０６Ｍ−１又はそれ以上、好ましくは１０７Ｍ−１又はそれ以上、より好ましくは１０８Ｍ−１又はそれ以上、及び最も好ましくは１０９Ｍ−１又はそれ以上の結合親和性（Ｋａ）を有するＺａｌｐｈａ５３ポリペプチド、ペプチド又はエピトープに結合する場合、特異的に結合する。抗体の結合親和性は、例えばＳｃａｔｃｈａｒｄ 分析（Ｓｃａｔｃｈａｒｄ， Ｇ．， Ａｎｎ． ＮＹ Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ５１： ６６０−６７２， １９４９）を用いて、当業者によって容易に決定され得る。
【０１６１】
第２に、抗体は、それらが関連するポリペプチド分子と有意に交差−反応しない場合、有意に結合することが決定される。抗体は、それらが、標準のウェスターンブロット分析を用いて、Ｚａｌｐｈａ５３を検出するが、しかし既知の関連するポリペプチドでない場合、関連するポリペプチド分子と有意に交差反応しない（Ａｕｓｕｂｅｌ など．， 前記）。既知の関連するポリペプチドの例は、オルト体、タンパク質ファミリーのメンバー（例えば、ＩＬ−１６）である同じ種からのタンパク質、Ｚａｌｐｈａ５３ポリペプチド及び非−ヒトＺａｌｐｈａ５３である。
【０１６２】
さらに、抗体は、本発明のポリペプチドに対して特異的に結合する集団を単離するために、既知の関連するポリペプチドに“対してスクリーンされ得る”。例えば、Ｚａｌｐｈａ５３に対して生ぜしめられた抗体は、不溶性マトリックスに付着される関連するポリペプチドに吸着され；Ｚａｌｐｈａ５３に対して特異的な抗体は、適切な緩衝液条件下で前記マトリックスを通して流れるであろう。
【０１６３】
そのようなスクリーニングは、既知の密接に関連するポリペプチドに対して交差反応しないポリクローナル及びモノクローナル抗体の単離を可能にする（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ （ｅｄｓ．）， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， １９８８； Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， Ｃｏｏｌｉｇａｎ， など． （ｅｄｓ．）， Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．， １９９５）。特異的抗体のスクリーニング及び単離は当業界において当業界において良く知られている。Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， Ｐａｕｌ （ｅｄｓ．）， Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ， １９９３； Ｇｅｔｚｏｆｆなど．， Ａｄｖ．ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ． ４３： １−９８， １９８８； Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ， Ｇｏｄｉｎｇ， Ｊ．Ｗ． （ｅｄｓ．）， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｌｔｄ．， １９９６； Ｂｅｎｊａｍｉｎ など．， Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２： ６７−１０１， １９８４を参照のこと。
【０１６４】
当業者に知られている種々のアッセイが、Ｚａｌｐｈａ５３タンパク質又はペプチドに特異的に結合する抗体を検出するために使用され得る。典型的なアッセイは、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ ｌａｎｅ （Ｅｄｓ．）， Ｃｏｌｄ Ｓｐｅｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， １９８８ に詳細に記載されている。そのようなアッセイの代表的な例は次のものを包含する：同時免疫電気泳動、ラジオイムノアッセイ、ラジオイムノ沈殿、酵素結合の免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ドットブロット又はウェスターンブロットアッセイ、阻害又は競争アッセイ。及びサンドイッチアッセイ。さらに、野生型対変異体のＺａｌｐｈａ５３  タンパク質又はペプチドに結合する抗体がスクリーンされ得る。
【０１６５】
Ｚａｌｐｈａ５３に対する抗体は、Ｚａｌｐｈａ５３を発現する細胞を標識するために；アフィニティー精製によりＺａｌｐｈａ５３を単離するために；Ｚａｌｐｈａ５３ポリペプチドの循環レベルを決定するための診断アッセイのために；根本的な病理学のマーカーとして可溶性Ｚａｌｐｈａ５３を検出し又は定量化するために；ＦＡＣＳ を使用する分析方法において、発現ライブラリーをスクリーニングするために；抗−インディオタイプ抗体を生成するために；及びインビトロでＺａｌｐｈａ５３介在性活性を阻止するための中和抗体又はアンタゴニスとして使用され得る。
【０１６６】
適切な直接的標識又はラベルは、放射性核種、酵素、基質、補因子、インヒビター、蛍光マーカー、化学発光マーカー、磁気粒子及び同様のものを包含し；間接的な標識又はラベルは、中間体としてのビオチン−アビジン又は他の補体／抗−補体対の使用を特徴とする。本発明書における抗体及び結合タンパク質はまた、薬物、トキシン、放射性核種、及び同様のものに直接的に又は間接的に接合され得、そしてそれらの接合体はインビボ診断又は治療用途のために使用され得る。さらに、Ｚａｌｐｈａ５３又はそのフラグメントに対する抗体は、アッセイ、例えば当業界において知られているウェスターンブロット又は他のアッセイにおいて、変性されたＺａｌｐｈａ５３又はそのフラグメントを検出するためにインビトロで使用され得る。
【０１６７】
生物活性接合体
本明細書に記載される抗体又はポリペプチドはまた、薬物、トキシン、放射性核種及び同様のものに直接的に又は間接的に接合され得、そしてそれらの接合体はインビボ診断又は治療用途のために使用され得る。例えば、本発明のポリペプチド又は抗体は、対応する抗−相補的分子（例えば、それぞれ受容体又は抗原）を発現する組織又は器官を同定し、又は処理するために使用され得る。より特定には、Ｚａｌｐｈａ５３ポリペプチド又は抗−Ｚａｌｐｈａ５３抗体、又はその生物活性フラグメント又は一部は、検出可能又は細胞毒性分子に結合され、そして抗−相補的分子を発現する、細胞、組織又は器官を有する哺乳類に供給され得る。
【０１６８】
適切な検出可能分子は、ポリペプチド又は抗体に直接的に又は間接的に結合され得、そして放射性核種、酵素、基質、補因子、インヒビター、蛍光マーカー、化学発光マーカー、磁気粒子、及び同様のものを包含する。適切な細胞毒性分子は、ポリペプチド又は抗体に直接的に又は間接的に結合され得、そして細菌又は植物毒性（例えば、ジフテリア毒素、プソイドモナシス内毒素、リシン、アブリン及び同様のもの）、及び治療用放射性核種、例えばＩ−１３１、レニウム−１８８又はイットニウム−９０（ポリペプチド又は抗体に直接的に結合されるか、又はキレ−ト成分により間接的に結合される）を包含する。
【０１６９】
ポリペプチド又は抗体はまた、細胞毒性薬物、例えばアドリアマイシンに結合され得る。検出可能又は細胞毒性分子の間接的な結合に関しては、検出可能又は細胞毒性分子は相補的／抗相補的対のメンバーにより結合され得、ここで他のメンバーはポリペプチド又は抗体部分に結合される。それらの目的のためには、ビオチン／ストレプタビジンが典型的な相補的／抗相補的対である。
【０１７０】
もう１つの態様においては、ポリペプチド−毒素融合タンパク質又は抗体−毒素融合タンパク質は、標的化された細胞又は組織阻害又は除去（例えば、癌細胞又は組織を処理するために）のために使用され得る。他方では、ポリペプチドが複数の機能ドメイン（すなわち、活性化ドメイン又はリガンド結合ドメイン、及び標的化ドメイン）を有する場合、標的化ドメインのみを包含する融合タンパク質は、検出可能分子、細胞毒性分子又は相補的分子を、興味ある細胞又は組織型に向けるために適切である。ドメインのみの融合タンパク質が相補的分子を含む場合、抗−相補的分子は検出可能又は細胞毒性分子に接合され得る。従って、そのようなドメイン−相補的分子融合タンパク質は、一般的抗−相補的−検出可能／細胞毒性分子接合体のための一般的標的化ビークルを表す。
【０１７１】
もう１つの態様においては、Ｚａｌｐｈａ５３−サイトカイン融合タンパク質又は抗体−サイトカイン融合タンパク質は、Ｚａｌｐｈａ５３ポリペプチド又は抗−Ｚａｌｐｈａ５３抗体が過剰増殖性血液及び骨髄細胞を標的化する場合、標的組織（例えば、血液及び骨髄癌）のインビボ殺害を増強するために使用され得る（一般的には、Ｈｏｒｎｉｃｋなど．， Ｂｌｏｏｄ ８９： ４４３７−４４４７， １９９７を参照のこと）。
【０１７２】
記載される融合タンパク質は、作用の所望する部位へのサイトカインの標的化を可能にし、それにより、サイトカインの高められた局部濃度を提供する。適切なＺａｌｐｈａ５３ポリペプチド又は抗−Ｚａｌｐｈａ５３抗体は、所望しない細胞又は組織（例えば、腫瘍又は白血病）を標的化し、そして融合されたサイトカインはエフェクター細胞による改良された標的細胞溶解を仲介する。例えば、この目的のための適切なサイトカインは、インターロイキン−２及び顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＭ）を包含する。
【０１７３】
さらにもう１つの態様においては、Ｚａｌｐｈａ５３ポチペプチド又は抗−Ｚａｌｐｈａ５３抗体が血管細胞又は組織を標的化する場合、そのようなポリペプチド又は抗体は、再狭窄を低めるために、放射性核種、及び特にβ線発光放射性核種により接合され得る。そのような治療アプローチは、放射性治療を管理する臨床医にほとんど危険性を与えない。例えば、患者のステントを入れられた血管中に、必要とされる放射線用量が供給されるまで、配置されるイリジウム−１９２含浸されたリボンは、血管における低められた組織増殖、及びプラシーボリボンを受けた対照グループよりも大きな管腔を示した。さらに、血管再生及びステント血栓症は、処理グループにおいて有意に低かった。類似する結果が、本明細書に記載されるように、放射性核種を含む生物活性接合体の標的化により予測される。
【０１７４】
本明細書に記載される生物活性ポリペプチド又は抗体接合体は、静脈内、動脈内又は管内供給され得、又は作用の意図された部位に局部的に導入され得る。
【０１７５】
ポリヌクレオチド／ポリペプチドの使用
本発明の分子は、精子形成、ステロイド形成、精巣分化、及び視床下部−下垂体−生腺軸調節制御に関係する受容体、又は免疫系の受容体を同定し、そして単離するために使用され得る。例えば、本発明のタンパク質及びペプチドがカラム上に固定され、そして膜調製物がそのカラム上に通される（Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｌｉｇａｎｄ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ， Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ など．， ｅｄｓ．， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ， １９９２）。
【０１７６】
タンパク質及びペプチドはまた、放射性ラベルされ（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．， ｖｏｌ． １８２， “Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ”， Ｍ． Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ， ｅｄ．， Ａｃａｄ． Ｐｒｅｓｓ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， １９９０， ７２１−７３７）、又は光親和性ラベルされ（Ｂｒｕｎｎｅｒ など．， Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ６２： ４８３−５１４， １９９３及びＦｅｄａｎ など．， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｐｈａｒｎａｃｏｌ． ３３： １１７６−１１８０， １９８４）、そして特定の細胞−表面タンパク質が同定され得る。
本発明の分子は、生殖システム及び免疫学的システムの疾患を試験するために有用であろう。
【０１７７】
遺伝子療法
Ｚａｌｐｈａ５３ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、Ｚａｌｐｈａ５３活性を高め、又は阻害することが所望される遺伝子治療用途内で有用である。哺乳類が突然変異誘発されたＺａｌｐｈａ５３遺伝子を有するか、又はそれを欠いている場合、Ｚａｌｐｈａ５３遺伝子が哺乳類の細胞中に導入され得る。１つの態様においては、Ｚａｌｐｈａ５３ポリペプチドをコードする遺伝子がウィルスベクターにおいてインビボで導入される。そのようなベクターは、弱毒化された又は欠陥ＤＮＡウィルス、例えばヘルペス単純ウィルス（ＨＳＶ）、乳頭種ウィルス、エプスタイン−バールウィルス（ＥＢＶ）、アデノウィルス、アデノ関連ウィルス（ＡＡＶ）及び同様のものを包含するが、但しそれらだけには限定されない。
【０１７８】
ウィルス遺伝子を完全に又はほとんど完全に欠いている欠陥ウィルスが好ましい。欠陥ウィルスは、細胞中への導入の後、感染性ではない。欠陥ウィルスベクターの使用は、ベクターが他の細胞を感染することを心配しないで、特定の局在化された領域における細胞への投与を可能にする。特定のベクターの例は、次のものを包含するが、但しそれらだけには限定されない：欠陥ヘルペスウィルス１（ＨＳＶ１）ベクター（Ｋａｐｌｉｔｔ など．， Ｍｏｌｃ． Ｃｅｌｌ． Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． ２： ３２０−３０， １９９１）、弱毒化されたアデノウィルス  ベクター、例えばＳｔｒａｔｆｏｒｄ−Ｐｅｒｒｉｃａｕｄａｔ など． （Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． ９０： ６２６−３０， １９９２） により記載されるベクター、及び欠陥アデノ−関連ウィルスベクター（Ｓａｍｕｌｓｋｉ など．， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６１： ３０９６−１０１， １９８７； Ｓａｍｕｌｓｋｉ など．， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６３： ３８２２−２８，１９８９）。
【０１７９】
もう１つの態様においては、Ｚａｌｐｈａ５３遺伝子は、次の文献に記載のようにして、レトロウィルスベクターに導入され得る：Ａｎｄｅｒｓｏｎ など．， アメリカ特許第５，３９９，３４６号；Ｍａｎｎ など．， Ｃｅｌｌ ３３： １５３， １９８３； Ｔｅｍｉｎ など．， アメリカ特許第４，６５０，７６４号；Ｔｅｍｉｎ など．， アメリカ特許第４，９８０，２８９号；Ｍａｒｋｏｗｉｔｚ など．， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６２： １１２０， １９８８； Ｔｅｍｉｎ など．， アメリカ特許第５，１２４，２６３ 号；Ｄｏｕｇｈｅｒｔｙ など．， ＷＩＰＯ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ ＷＯ９５／０７３５８ 号；及びｋｕｏ など．， Ｂｌｏｏｄ ８２： ８４５−５２， １９９３。
【０１８０】
他方では、ベクターは、リポソームを用いてのインビボリポフェクションにより導入され得る。合成カチオン脂質が、マーカーをコードする遺伝子のインビボトランスフェクションのためのリポソームを調製するために使用され得る（Ｆｅｌｇｎｅｒ など．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８４： ７４１３−１７， １９８７； 及びＭａｃｋｅｙ など．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８５： ８０２７−３１， １９８８）。インビボで特定の器官中に外因遺伝子を導入するためへのリポフェクションの使用は、一定の実際的な利点を有する。
【０１８１】
特定細胞へのリポソームの分子標的化は、１つの領域の利点を表す。特定細胞へのトランスフェクションの方向づけが１つの領域の利点を表すことは明白である。特定細胞型へのトランスフェクションの方向づけが、細胞異質性を有する組織、例えば膵臓、肝臓、腎臓及び脳において特に好都合であることは明白である。脂質は、標的化のために他の分子に科学的に得られる。標的化されたペプチド、例えばホルモン又は神経伝達物質、及びタンパク質、例えば抗体又は非ペプチド分子は、化学的にリポソームに結合され得る。
【０１８２】
身体から細胞を除去し、そして裸ＤＮＡプラスミドとしてベクターを導入し、そして次に、身体中に形質転換された細胞を再移植することは可能である。遺伝子治療のための裸ＤＮＡベクターは、所望する宿主細胞中に、当業界において知られている方法、例えばトランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、トランスダクション、細胞融合、ＤＥＡＥデキストラン、リン酸カルシウム沈殿、遺伝子ガンの使用、又はＤＮＡベクタートランスポーターの使用により導入され得る（例えば、Ｗｕ など．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６７： ９６３−７， １９９２； Ｗｕ など．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６３： １４６２１−２４， １９８８）。
【０１８３】
アンチセンス方法は、Ｚａｌｐｈａ５３遺伝子転写を阻害するために、例えばインビボでの細胞増殖を阻害するために使用され得る。Ｚａｌｐｈａ５３−コードのポリヌクレオチドのセグメントに対して相補的であるポリヌクレオチド（例えば、配列番号１又は１９に示されるようなポリヌクレオチド）は、Ｚａｌｐｈａ５３−コードのｍＲＮＡに結合し、そしてそのようなｍＲＮＡの翻訳を阻害するよう企画される。そのようなアンチセンスポリヌクレオチドは、細胞培養物又は対象において、Ｚａｌｐｈａ５３ポリペプチド−コードの遺伝子の発現を阻害するために使用される。
【０１８４】
本発明はまた、診断に使用できるであろう試薬を提供する。例えば、Ｚａｌｐｈａ５３遺伝子、Ｚａｌｐｈａ５３ ＤＮＡ又はＲＮＡを含んで成るプローブ、又はその副配列は、Ｚａｌｐｈａ５３遺伝子が染色体１０上に依存するかどうか、又は突然変異が生じたかどうかを決定するために使用され得る。Ｚａｌｐｈａ５３遺伝子座での検出できる染色体異常型は、異数性、遺伝子コピー数変化、挿入、欠失、制限部位変更及び転位を包含するが、但しそれらだけには限定されない。そのような異常性は、分子遺伝学的技法、例えば制限フラグメント長さ多型現象（ＲＦＬＰ）分析、ＰＣＲ技法を用いる短いタンデム反復体（ＳＴＲ）分析、及び当業界において知られている他の遺伝子連鎖分析技法を用いることによって、本発明のポリヌクレオチドを用いて検出され得る（Ｓａｍｂｒｏｏｋなど．， 前記；Ａｕｓｕｂｅｌ など．， 前記；Ｍａｒｉａｎ， Ｃｈｅｓｔ １０８： ２５５−６５， １９９５）。
【０１８５】
Ｚａｌｐｈａ５３遺伝子を発現するよう構築されたトランスジェニックマウス、及び“ノックアウトマウス”（Ｓｎｏｕｗａｅｒｔ など．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５７：１０８３， １９９２ ）として言及される、Ｚａｌｐｈａ５３遺伝子機能の完全な不在を示すマウスはまた、当業者により生成され得る（Ｌｏｗｅｌｌなど．， Ｎａｔｕｒｅ ３６６： ７４０−４２， １９９３ ）。それらのマウスは、Ｚａｌｐｈａ５３遺伝子及びそれによりコードされるタンパク質をインビボシステムにおいて研究するために使用される。
【０１８６】
染色体位置決定
Ｚａｌｐｈａ５３が、染色体１０に対してマッピングされた。放射腺ハイブリッドマッピングは、哺乳類染色体の高い解像度の連続地図を構成するために開発された体細胞遺伝子技法である（Ｃｏｘなど．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５０； ２４５−５０， １９９０）。遺伝子配列の部分的又は完全な知識は、染色体放射線ハイブリッドマッピングパネルによる使用のために適切なＰＣＲプライマーの企画を可能にする。完全なヒトゲノムをカバーする放射線ハイブリッドマッピングパネル、例えばＳｔａｎｆｏｒｄ Ｇ３ ＲＨパネル及びＧｅｎｅＢｒｉｄｇｅ ４ ＲＨパネルは市販されている（Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ， Ｉｎｃ．， Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ， ＡＬ）。
【０１８７】
それらのパネルは、遺伝子、配列−標識された部位（ＳＴＳ）、及び興味ある領域内の他の非多型現象及び多型現象マーカーの急速な、ＰＣＲに基づく染色体位置決定及び整列を可能にする。これは、興味ある新しく発見された遺伝子と前にマッピングされたマーカーとの間を直接的に比例する物理的距離の確立を包含する。遺伝子位置の正確な知識は、次のような多くの目的のために有用である：１）配列が存在するコンティグの一部であるかどうかの決定及び種々の形、例えばＹＡＣ， ＢＡＣ又はｃＤＮＡクローンにおける追加の周囲遺伝子配列の獲得；２）同じ染色体領域への結合を示す遺伝的な疾病についての可能な候補体遺伝子の提供；及び３）特定遺伝子が有する機能の決定を助けるモデル生物、例えばマウスの相互参照。
【０１８８】
配列標識された部位（ＳＴＳ）はまた、染色体位置決定のために独立的に使用される。ＳＴＳは、ヒトゲノムにおいてユニークであるＤＮＡ配列であり、そして特定の染色体又は染色体の領域のための参照点として使用され得る。ＳＴＳは、すべての他のゲノム配列の存在下でこの部位を特異的に検出するためにポリメラーゼ鎖反応に使用される一対のオリゴヌクレオチドプライマーにより定義される。ＳＴＳは、ＤＮＡ配列に単独で基づかれているので、それらは電子データベース、例えばＤａｔａｂａｓｅ ｏｆ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｔａｇｇｅｄ Ｓｉｔｅｓ （ｄｂＳＴＳ）、ＧｅｎＢａｎｋ （Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ， Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ， Ｂｅｔｈｅｓｄａ， ＭＤ， ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）内に完全に記載され得、そしてそれらの短いゲノムランドマークＳＴＳ配列内に含まれるマッピングデータにより、興味ある遺伝子配列を調べられ得る。
【０１８９】
医薬使用のためには、本発明のタンパク質は、従来の方法に従って、非経口、特に静脈又は皮下供給のために配合される。静脈内投与は、１〜数時間の典型的な期間、ボーラス注射又は注入により行われるであろう。一般的に、医薬製剤は、医薬的に許容できるビークル、例えば塩溶液、緩衝溶液、水中、５％デキストロース、又は同様のものと組合してＺａｌｐｈａ５３タンパク質を含むであろう。製剤はさらに、１又は複数の賦形剤、保存剤、溶解剤、緩衝剤、バイアル表面上のタンパク質損失を妨げるためのアルブミン、等を含むことができる。
【０１９０】
配合方法は、当業界において良く知られており、そして例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ： Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ， Ｇｅｎｎａｒｏ， ｅｄ．， Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．， Ｅａｓｔｏｎ， ＰＡ， １９ｔｈ ｅｄ．， １９９５に開示される。治療用量は、一般的に、０．１〜１００μｇ／ｋｇ患者の体重／日、好ましくは０．５〜２０ｍｇ／ｋｇ／日の範囲であり、そして正確な用量は処理される病状の性質及び重症度、患者の特徴、等を考慮して、許容できる標準に従って、臨床医により決定される。用量の決定は、当業者のレベル内である。タンパク質は、急性処理のために、１週間又はそれ以下にわたって、しばしば１〜３日間にわたって投与され得、又は慢性処理のためには、数ヶ月〜数年にわたって使用され得る。タンパク質の投与は、処理されるべき疾病に依存して、皮下、腹腔内又は直腸であり得る。
【０１９１】
組織発現及び使用
Ｚａｌｐｈａ５３は、推定上のシグナルペプチドリーダー配列及びαヘリックス構造を有する新規ポリペプチドを提供する。この遺伝子は、４個のヘリックス束のサイトカインファミリーのメンバーであることを示す二次構造を有する分泌されたポリペプチドをコードすることができる。他方では、このポリペプチドは、他の生物学的機能に関連する他の活性、例えば酵素活性、細胞膜との結合、又はキャリヤータンパク質としての機能を有することができる。
【０１９２】
Ｚａｌｐｈａ５３の使用
Ｚａｌｐｈａ５３は、免疫無防備状態にされた哺乳類、好ましくはヒト、例えば化学療法を受けたことがある癌患者、ＡＩＤＳ患者及び年配の人に投与され得る。これは、彼らの免疫系を刺激するであろう。Ｚａｌｐｈａ５３はまた、ワクチンの投与の前、投与と共に又は投与の後、投与されるべきワクチンアジュバントとして使用され得る。Ｚａｌｐｈａ５３はまた、腫瘍を攻撃する免疫系を刺激するためにも投与され得る。
【０１９３】
Ｚａｌｐｈａ５３のアンタゴニストの使用
Ｚａｌｐｈａ５３に対するアンタゴニスト、例えば抗体、可溶性受容体又は小分子アンタゴニストが、炎症応答を緩和するために、哺乳類、好ましくはヒトに投与され得る。Ｚａｌｐｈａ５３に対するアンタゴニスト、例えば抗体は、炎症関連の疾病、例えば動脈硬化性心疾患（Ｐａｕｌｓｓｏｎ， Ｇ． など．， Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ Ｔｈｒｏｍｂ． Ｖａｓｃ． Ｂｉｏｌ．， ２０： １０−１７ （２０００））、炎症性腸疾患、クローン病、リウマチ様関節炎及び膵炎を有する患者を処理するために使用され得る。
【０１９４】
Ｚａｌｐｈａ５３ポリペプチド、ポリヌクレオチド及び抗体の教育学的キットの利用性
本発明のポリヌクレオチド及びポリペプチドは、さらに、遺伝学及び分子生物学、タンパク質化学、及び抗体生成及び分析に関連する実験用実習キットにおいて教育用用具として有用であろう。その独得のポリヌクレオチド及びポリペプチド配列のために、Ｚａｌｐｈａ５３の分子は、試験のための標準として、又は“未知”として使用され得る。
【０１９５】
例えば、Ｚａｌｐｈａ５３ポリヌクレオチドは、Ｚａｌｐｈａ５３が発現されるべき遺伝子である、融合構造体を包含する、細菌、ウィルス又は哺乳類発現のための発現構造体をいかにして調製するかを学生に教授するために；ポリヌクレオチドの制限エンドヌクレアーゼ切断部位を決定するために；組成におけるＺａｌｐｈａ５３ポリヌクレオチドのｍＲＮＡ及びＤＮＡ位置を決定するために（すなわち、ノザン及びサザンブロット、及びポリメラーゼ鎖反応による）；そして核酸ハイブリダイゼーションにより関連するポリヌクレオチド及びポリペプチドを同定するために、補助体として使用され得る。
【０１９６】
Ｚａｌｐｈａ５３ポリペプチドは、抗体の調製；ウェスターンブロットによるタンパク質の同定；発現された合計のタンパク質に対する割合としての発現されたＺａｌｐｈａ５３ポリペプチドの重量の決定；ペプチド分解部位の同定；アミノ及びカルボキシル末端標識のカップリング；アミノ酸配列分析；及び生来の及び標識されたタンパク質の生物学的活性（すなわち、受容体結合、シグナルトランスダクション、増殖及び分化）のインビトロ及びインビボでのモニターリングのための補助体として使用され得る。
【０１９７】
Ｚａｌｐｈａ５３ポリペプチドはまた、分析熟練、例えば、質量分析学、コンホメーション、特にジスルフィド結合の位置を決定するために、円ニ色性を、原子の立体構造を詳細に決定するために、Ｘ−線結晶学を、溶液におけるタンパク質の構造を表すために、核磁気共鳴分光学を教授するためにも使用され得る。例えば、Ｚａｌｐｈａ５３ポリペプチドを含むキットが、学生の分析熟練を開発するために与えられ得る。アミノ酸配列は教授によって知られており、すなわちタンパク質は学生の熟練を決定し、又は熟練を進行せしめるための試験として学生に与えられるので、教授は、学生がポリペプチドを正しく分析したか否かを知るであろう。あらゆるポリペプチドはユニークであるので、Ｚａｌｐｈａ５３の教育的利用はそれ自体ユニークであろう。
【０１９８】
Ｚａｌｐｈａ５３に対して特異的に結合する抗体は、Ｚａｌｐｈａ５３を精製するために親和性カラムクロマトグラフィーをいかにして調製し、抗体をコードするポリペプチドをいかにしてクローニングし、そしていかにして配列決定するか、及び従って、ヒト適合された抗体をいかにして企画するかを学生に教授するための実習として使用され得る。次に、Ｚａｌｐｈａ５３遺伝子、ポリペプチド又は抗体は、分子生物学の技術における熟練の学生による獲得を可能にするために、試薬会社によりパッケージングされ、そして大学により市販されている。
【０１９９】
個々の遺伝子及びタンパク質はユニークであるので、個々の遺伝子及びタンパク質は、実験実習における学生のためにユニークな挑戦及び学習経験を創造する。Ｚａｌｐｈａ５３遺伝子、ポリペプチド又は抗体を含むそのような教育キットは、本発明の範囲内にあると思われる。
本発明は、次の非制限的例によりさらに例示される。
【０２００】
実施例
例１ Ｚａｌｐｈａ５３のクローニング
Ｚａｌｐｈａ５３ ｃＤＮＡを、精巣ｃＤＮＡライブラリーにおいて発見した。マラソンｃＤＮＡを、マラソン−ＲｅａｄｙＴＭ キット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ， Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ， ＣＡ）を用いて製造し、そしてクラスリンプライマーＺＣ２１１９５ ＧＡＧＧＡＧＡＣＣＡＴＡＡＣＣＣＣＣＧＡＣＡＧ（配列番号３８）及びＺＣ２１１９６ ＣＡＴＡＧＣＴＣＣＣＡＣＣＡＣＡＣＧＡＴＴＴＴ（配列番号３９）によりＱＣ試験し、そして次に、クラスリンバンドの強度に基づいて希釈した。パネルサンプルの性質を確かめるために、性質調節（ＱＣ）についての３種の試験を行った：
【０２０１】
（１）ライブラリーのために使用されるＲＮＡ性質を評価するために、内部ｃＤＮＡを、個々のｃＤＮＡライブラリーのためのベクター配列に対して特異的であるベクターオリゴヌクレオチドによるＰＣＲにより平均挿入体サイズについて試験し；
（２）パネルサンプルにおけるｃＤＮＡの濃度の標準化を、５’ベクターオリゴヌクレオチドＺＣ１４，０６３ ＣＡＣＣＡＧＡＣＡＴＡＡＴＡＧＣＴＧＡＣＡＧＡＣＴ（配列番号４０）及び３’αチューブリン特異的オリゴヌクレオチドプライマーＺＣ１７，５７４ ＧＧＴＲＴＴＧＣＴＣＡＧＣＡＴＧＣＡＣＡＣ（配列番号４１）、又は３’Ｇ３ＰＤＨ特異的オリゴヌクレオチドプライマーＺＣ１７，６００ ＣＡＴＧＴＡＧＧＣＣＡＴＧＡＧＧＴＣＣＡＣＣＡＣ（配列番号４２）を用いて、十分な長さのαチューブリン又はＧ３ＰＤＨ ｃＤＮＡを増幅するための標準ＰＣＲ方法により達成し；そして
【０２０２】
（３）サンプルを、可能性あるリボソーム又はミトコンドリアＤＮＡ汚染について調べるために配列決定に送った。パネルを、ヒトゲノムＤＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ， ＣＡ）陽性対照サンプルを包含する９６−ウェル形で組立てた。個々のウェルは、約０．２−１００ｐｇ／μｌのｃＤＮＡを含んだ。
【０２０３】
ＰＣＲ反応を、オリゴヌクレオチドＺＣ３７１９５ ＣＴＣＣＣＴＧＴＴＴＣＡＧＣＡＣＡＴＣＡＴＣ（配列番号４３）及びＺＣ３７１９４ ＧＴＣＴＴＣＣＴＣＣＴＣＴＡＴＣＡＴＴＴＧＴＴＴＣ（配列番号４４）、ＴａＫａＲａＥｘＴａｇＴＭ （ＴＡＫＡＲＡ Ｓｈｕｚｏ Ｃｏ． Ｌｔｄ．， Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ Ｇｒｏｕｐ， Ｊａｐａｎ） 及びＲｅｄｉｌｏａｄ色素（Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ， Ｉｎｃ．， Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ， ＡＬ）を用いて構成した。増幅を次の通りに行った：９４℃で２分（１サイクル）、９４℃で３０秒、５７．０℃で３０秒及び７２℃で３０秒（３５サイクル）、続いて、７２℃で５分（１サイクル）。約１０μｌのＰＣＲ反応生成物を、４％アガロースゲルを用いて、標準アガロースゲル電気泳動にゆだねた。約２７２ｂｐの正しく推定されるＤＮＡフラグメントが、４種の精巣サンプルにおいて観察された。
【０２０４】
精巣ｃＤＮＡ及び精巣１ＫライブラリープールについてのＤＮＡフラグメントを、Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ （Ｑｉａｇｅｎ， Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ， ＣＡ） を用いて、その製造業者の説明書に従って、切除し、そして精製した。精巣１Ｋライブラリープールについてのフラグメントを、それが実際、Ｚａｌｐｈａ５３であるが、しかし３６ｂｐの挿入を有したことを示すために配列決定により確かめた。
【０２０５】
前述から、本発明の特徴の態様が例示目的のために記載されて来たが、種々の修飾が本発明の範囲内で行われ得ることが理解されるであろう。従って、本発明は、付随する請求の範囲を除いて限定されない。
【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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