(57)【要約】組換え核酸分子について記載している。該分子は2種以上の細胞溶解性Tリンパ球(CTL)エピトープを含有する抗原をコードする第1の核酸配列を有し、該エピトープは、配列番号1、2、3、4、5、もしくは6のいずれか1種のアミノ酸配列を有するエピトープを認識するCD8+ T細胞によって認識されうる、配列番号1、2、3、4、5、および6のアミノ酸配列ならびにそれらのいずれかの類似体から選択されたものである。該分子によってコードされるペプチドおよび該分子を含有しているベクターと組成物についても記載している。これらの分子を用いた免疫応答を引き出す方法についても記載している。【特許請求の範囲】
【請求項１】
組換え核酸分子であって、2種以上の細胞溶解性Tリンパ球(CTL)エピトープを含んでいる抗原をコードする第1の核酸配列を含んでなり、該エピトープは、配列番号1、2、3、4、5、もしくは6のいずれか1種のアミノ酸配列を有するエピトープを認識するCD8+ T細胞によって認識されうる、配列番号1、2、3、4、5、および6のアミノ酸配列ならびにそれらのいずれかの類似体から選択されたものである、組換え核酸分子。
【請求項２】
抗原が4個以上のエピトープを含んでなる、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項３】
抗原が次のものを含有する：
(i)配列番号1のアミノ酸配列を有するエピトープ、またはそれの類似体でであるエピトープ配列であって、配列番号1のアミノ酸配列を有するエピトープを認識するCD8+ T細胞によって認識されうるもの；
(ii)配列番号2のアミノ酸配列を有するエピトープ、またはそれの類似体でであるエピトープ配列であって、配列番号2のアミノ酸配列を有するエピトープを認識するCD8+ T細胞によって認識されうるもの；
(iii)配列番号3のアミノ酸配列を有するエピトープ、またはそれの類似体でであるエピトープ配列であって、配列番号3のアミノ酸配列を有するエピトープを認識するCD8+ T細胞によって認識されうるもの；
(iv)配列番号4のアミノ酸配列を有するエピトープ、またはそれの類似体でであるエピトープ配列であって、配列番号4のアミノ酸配列を有するエピトープを認識するCD8+ T細胞によって認識されうるもの；
(v)配列番号5のアミノ酸配列を有するエピトープ、またはそれの類似体でであるエピトープ配列であって、配列番号5のアミノ酸配列を有するエピトープを認識するCD8+ T細胞によって認識されうるもの；ならびに
(vi)配列番号6のアミノ酸配列を有するエピトープ、またはそれの類似体でであるエピトープ配列であって、配列番号6のアミノ酸配列を有するエピトープを認識するCD8+ T細胞によって認識されうるもの；
請求項１または２に記載の核酸分子。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか1項に記載の核酸分子であって、さらにB型肝炎ウイルスコア抗原をコードする第2の核酸配列を含んでなり、そのコア抗原には主要イムノドミナントコアエピトープ(ICE)領域が含まれるか、またはそのコア抗原からは該ICE領域の全てもしくは一部分が除去されており、該第２の核酸配列は第１の核酸配列に対して異種であり、該第1の核酸配列が該第2の核酸配列中の該ICE領域中に挿入されているか、または除去された該ICE領域もしくはその一部分が異種の核酸配列で置換されている、核酸分子。
【請求項５】
請求項４に記載の核酸分子であって、さらに哺乳類細胞からの、付着させたペプチド配列の分泌を提供するペプチドリーダー配列をコードする第3の核酸配列を含んでなり、第1、第2、および第3の核酸配列が共に連結されてハイブリッド配列を形成し、該第3の核酸配列が第1および第2の配列に対して5'の上流位置の分子中に配置されている、核酸分子。
【請求項６】
DNA分子である請求項１〜５のいずれか1項に記載の核酸分子。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか1項に記載の核酸分子と機能しうる形で連結されて該核酸分子の発現を制御するプロモーター配列を含んでなる発現カセット。
【請求項８】
請求項７に記載の発現カセットを含んでなるベクター。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか1項で定義された抗原を含んでなるポリペプチド。
【請求項１０】
請求項８に記載のベクターまたは請求項９に記載のポリペプチドを含んでなるワクチン組成物。
【請求項１１】
請求項８に記載のベクターまたは請求項９に記載のポリペプチドのコピーをコートした生物学的に不活性な粒子を含んでなる、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
該粒子が金粒子である、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
製薬上許容される担体または賦形剤と組み合わされた請求項８に記載のベクターまたは請求項９に記載のポリペプチドを含んでなる請求項１０に記載の組成物。
【請求項１４】
粒子によってメディエートされる免疫に適した粒子加速デバイスであって、該器具が請求項１１で定義されたコートされた粒子でロードされるものである、粒子加速デバイス。
【請求項１５】
被験体の体内で細胞性免疫応答を引き出す方法であって、被験体の細胞を2種以上の細胞溶解性Tリンパ球(CTL)エピトープを含んでいる抗原をコードする第1の核酸配列を含んでいる組換え核酸でトランスフェクトすることを含んでなり、該エピトープは、配列番号1、2、3、4、5、または6のいずれか1種のアミノ酸配列を有するエピトープを認識するCD8+ T細胞によって認識されうる、配列番号1、2、3、4、5、および6のアミノ酸配列ならびにそれらのいずれかの類似体から選択されたものであり、トランスフェクトすることが該被験体の体内で該抗原に対して細胞性応答が引き出されることとなるように該抗原を発現しうる条件下で行われる、方法。
【請求項１６】
請求黄１５に記載の方法であって、組換え核酸分子がさらにB型肝炎ウイルスコア抗原をコードする第2の核酸配列を含んでなり、そのコア抗原には主要イムノドミナントコアエピトープ(ICE)領域が含まれるか、またはそのコア抗原からは該ICE領域の全てもしくは一部分が除去されており、該第２の核酸配列は第１の核酸配列に対して異種であり、該第1の核酸配列が該第2の核酸配列中の該ICE領域中に挿入されているか、または除去された該ICE領域もしくはその一部分が異種の核酸配列で置換されている、方法。
【請求項１７】
組換え核酸分子が抗原および哺乳類細胞からの付着させたペプチド配列の分泌を提供するペプチドリーダー配列をコードする、請求項１５または１６に記載の方法。
【請求項１８】
該組換え核酸分子が該B型肝炎ウイルスコア抗原担体、該抗原、および哺乳類細胞からの付着させたペプチド配列の分泌を提供するペプチドリーダー配列を含んでなるハイブリッドタンパク質をコードする、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
請求項１５から１８のいずれか1項に記載の方法であって、さらに第2の組成物を被験対に投与することを含んでなり、該第2の組成物が少なくとも1個の細胞溶解性Tリンパ球(CTL)エピトープを含んでなり、該エピトープが、配列番号1、2、3、4、5、もしくは6のいずれか1種のアミノ酸配列を有するエピトープを認識するCD8+ T細胞によって認識されうる、配列番号1、2、3、4、5、および6のアミノ酸配列ならびにそれらのいずれかの類似体から選択されたものである、方法。
【請求項２０】
第2の組成物が、少なくとも1個のエピトープをコードする核酸配列を含んでいる組換えウイルスベクターを含んでなる、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
組換えウイルスベクターがワクシニアウイルスベクターである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
トランスフェクトのステップが粒子がメディエートするトランスフェクション技法を用いてin vivoで行われる、請求項１５から２１のいずれか1項に記載の方法。
【請求項２３】
トランスフェクトのステップが、第2の組成物の投与の前に該被験体の体内に導入されることとなるトランスフェクトされた細胞を得るためにex vivoで行われる、請求項１５から２１のいずれか1項に記載の方法。
【請求項２４】
被験体の体内で細胞性の免疫応答を引き出す方法であって、該方法が2種以上の細胞溶解性Tリンパ球(CTL)エピトープを含有するポリペプチド抗原を該被験対に該抗原に対する細胞性免疫応答を引き出すために十分な量投与することを含んでなり、該エピトープが、配列番号1、2、3、4、5、もしくは6のいずれか1種のアミノ酸配列を有するエピトープを認識するCD8+ T細胞によって認識されうる、配列番号1、2、3、4、5、および6のアミノ酸配列ならびにそれらのいずれかの類似体から選択されたものである、方法。
【請求項２５】
ポリペプチドが、標的細胞に直接的に送達されるために十分な密度を有する生物学的に不活性な粒子上にコートされたものであり、該粒子が被験体の標的細胞中に加速されてもたらされるものである、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
標的細胞が皮膚細胞である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
被験体がヒトである、請求項１５から２６のいずれか1項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はHIVエピトープに対する免疫応答を引き出すための、ペプチドおよび核酸技法に有用な試薬に関する。より特定して述べれば、本発明はHIVの治療および予防のための、エピトープをベースとしてHIVワクチンに関する。
【背景技術】
【０００２】
抗原特異的T細胞応答がHIV感染の抑制において重要な役割を果たしていることを示唆する証拠は多数ある。AIDSのSIVアカゲザルモデルにおける実行可能性研究ではHIV特異的T細胞応答を誘導するワクチンはHIV感染およびAIDSに対する予防または治療のための効果的な方策となりうることが示されている。例えばHIV-1とHIV-2単離体、それらには種々の遺伝子型サブタイプのメンバーを含むが、それらの多数でgp120などのHIV抗原が既知であり、報告されている(例えば、Myerら, Los Alamos Database, Loa Alamos National Library, Los Alamos, New Mexico(1992); およびModrowら(1987)J. Virol., 61:570-578を参照せよ)。しかし、HIVに対して有効なワクチンに必要なエピトープの最少数については、現在不明である。
【０００３】
DNAおよびRNAを、発現産物に対しての免疫を起こさせる目的で哺乳類の組織中に注射する技法は、当業界では既に報告されている。例えば、欧州特許明細書EP 0 500 799および米国特許第5,589,466号を参照せよ。この技法は、本明細書中では「核酸免疫」と呼ぶが、液性免疫と細胞性免疫の双方を引き出すことが示されている。例えば、エンベロープの糖タンパク質であるgp160をコードするDNA構築物で免疫されたマウスから得た血清はイムノアッセイで組換えgp160と反応することが示され、その注射されたマウスから得たリンパ球は組換えgp120に応答して増殖することが示された。Wangら, (1993), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:4156-4160。哺乳類のプロモーターで駆動されるインフルエンザ核タンパク質をコードするDNAの筋肉内注射はCD8+ CTL応答を引き出し、それはその後にウイルスの致死量をチャレンジさせても、マウスを防護することができる。Ulberら(1993), Science, 259:1745-1749。注射部位の免疫組織化学的研究から、そのDNAが骨髄球に取り込まれたことが示され、ウイルスタンパク質の細胞質内での産生が少なくとも6ヶ月間認められた。
【０００４】
B型肝炎ウイルスコア抗原をコードする第1の配列とその第1の配列内に挿入された、少なくとも1つのT細胞エピトープをコードする第2の配列を有する組換え核酸分子は国際特許出願 WO 00/26385に述べられている。少なくとも1個のT細胞エピトープをコードする配列が、HBcAg分子の外部からのアクセスが可能なループ領域中に存在するイムノドミナントなコアエピトープ(ICE)中に挿入され、その組換え核酸分子が種々の核酸免疫法で試薬として用いられる。
【０００５】
タンパク質または担体を有さないペプチド免疫原を、生物学的に不活性な粒子上に固定させた、そのタンパク質またはペプチドの標的である細胞中に直接的に送達するための技法については報告されている。例えば、国際特許出願 WO 96/14855を参照せよ。
【発明の開示】
【０００６】
本発明の要旨
本発明の発明者らは、HIV感染またはAIDSの予防および/または治療のためのワクチン中で、組み合わせて用いることのできるCTLエピトープを同定した。本発明者らはAIDSのSIVアカゲザルモデルでHIVのものと等価のSIVエピトープを試験した。このモデル系を用いて、本発明者らは、選択されたエピトープを用いてCTL応答が検出可能であり、それらのエピトープを用いた免疫をウイルスのロードとウイルスの伝播を低減するために用いることができることを示した。
【０００７】
本発明の1態様においては、組換え核酸分子が提供される。その分子は2つ以上の細胞溶解性Tリンパ球(CTL)エピトープを含んでいる抗原をコードする第2の核酸配列を有し、そのエピトープは配列番号1、2、3、4、5、および6の配列のアミノ酸配列ならびにそれらのいずれかの類似体のアミノ酸配列から選択されたものであって、それらは配列番号1、2、3、4、5、もしくは6のいずれか1つのアミノ酸配列を有するエピトープを認識するCD8+ T細胞によって認識されうるものである。
【０００８】
好ましい1態様においては、該組換え核酸分子は次のものをコードする：
(i)  配列番号1のアミノ酸配列を有するエピトープ、またはそれの類似体であるエピトープ配列であって、配列番号1のアミノ酸配列を有するエピトープを認識するCD8+ T細胞によって認識されうる、エピトープ；
(ii)  配列番号2のアミノ酸配列を有するエピトープ、またはそれの類似体であるエピトープ配列であって、配列番号2のアミノ酸配列を有するエピトープを認識するCD8+ T細胞によって認識されうる、エピトープ；
(iii)  配列番号3のアミノ酸配列を有するエピトープ、またはそれの類似体であるエピトープ配列であって、配列番号3のアミノ酸配列を有するエピトープを認識するCD8+ T細胞によって認識されうる、エピトープ；
(iv)  配列番号4のアミノ酸配列を有するエピトープ、またはそれの類似体であるエピトープ配列であって、配列番号4のアミノ酸配列を有するエピトープを認識するCD8+ T細胞によって認識されうる、エピトープ；
(v)  配列番号5のアミノ酸配列を有するエピトープ、またはそれの類似体であるエピトープ配列であって、配列番号5のアミノ酸配列を有するエピトープを認識するCD8+ T細胞によって認識されうる、エピトープ；
(vi)  配列番号6のアミノ酸配列を有するエピトープ、またはそれの類似体であるエピトープ配列であって、配列番号6のアミノ酸配列を有するエピトープを認識するCD8+ T細胞によって認識されうる、エピトープ。
【０００９】
該組換え核酸分子は、B型肝炎ウイルスコア抗原をコードする第2の核酸配列を含んでなることができ、その配列には、イムノドミナントなコアエピトープ(ICE)領域を含んでいるか、またはその配列からICE領域の全てもしくは一部を除去したものであり、該第2核酸配列は該第1核酸配列とは異種のものであって、該第1核酸配列が第2核酸配列のICE領域中に挿入されているか、もしくは除去され得たICE領域もしくはその一部分に置き換わったものである。そのようなHBcAg配列を含んでなる組換え核酸分子は核酸による免疫に用いるための特に優れた試薬であり、免疫された被験体の体内で対象の抗原に対するCTL応答を高頻度に引き出すために用いられる。さらに追加としてまたは代替として1個以上のエピトープをコードする配列を該第2核酸配列のカルボキシル末端もしくはアミノ末端に挿入することができる。
【００１０】
本発明のさらに関連する1態様においては、本発明の組換え核酸分子はペプチドリーダー配列をコードする第3の核酸配列を含む。その第3の配列はその分子中で第1、または第2および第1の核酸配列に対して5'方向の上流に位置し、これらの配列と連結されてハイブリッド配列を形成している。このコードされたリーダー配列によって、該組換え核酸分子でトランスフェクトされた細胞からのコードされた抗原もしくはハイブリッド抗原-HBcAg担体分子の効率的な分泌がもたらされる。
【００１１】
本発明の組換え核酸分子は全て典型的には該核酸分子の発現を制御するために必要な配列を含んでいる発現カセットの形態で提供される。これらの発現カセットは、典型的には、ベクター(例えば、プラスミドまたは組換えウイルスベクター)中に入った形で提供され、これは核酸による免疫の試薬として用いるために適切なものである。
【００１２】
本発明はまた、2個以上のCTLエピトープを含んでなるポリペプチド抗原をも提供し、そこでは該エピトープは配列番号1、2、3、4、5、および6のアミノ酸配列、ならびにそれらのいずれかの類似体から選択されたものであって、配列番号1、2、3、4、5、もしくは6のアミノ酸配列のいずれか1つのアミノ酸配列を有するエピトープを認識するCD8+ T細胞によって認識されうるエピトープある。
【００１３】
また、免疫された被験体の体内でHIVに対する細胞性免疫応答を引き出すための方法を提供することも本発明の主な目的の１つである。その方法は、配列番号1、2、3、4、5、もしくは6のアミノ酸配列のいずれか1つのアミノ酸配列を有するエピトープを認識するCD8+ T細胞によって認識されうる、配列番号1、2、3、4、5、および6のアミノ酸配列、ならびにそれらのいずれかの類似体から選択された2個以上の細胞溶解性Tリンパ球(CTL)をコードする組換え核酸分子を用いて被験体の細胞をトランスフェクトする1つ以上のステップを含んでなる、一次免疫ステップを必要とする。本発明の組換え核酸分子のいずれか１つを含んでいる発現カセットおよび/またはベクターは該細胞をトランスフェクトするために用いることができ、トランスフェクションはその被験体の体内で抗原分子が発現できるような条件下で行われる。
【００１４】
この方法はさらに、第2の組成物を被験体に投与する1つ以上のステップを含んでなる、第2の、またはブースター免疫ステップを伴うものとすることができ、その第2の組成物は配列番号1、2、3、4、5、もしくは6のアミノ酸配列のいずれか1つのアミノ酸配列を有するエピトープを認識するCD8+ T細胞によって認識されうる、配列番号1、2、3、4、5、および6のアミノ酸配列、ならびにそれらのいずれかの類似体から選択された少なくとも1つのCTLエピトープを含んでなる。第1の免疫ステップまたは第1と第2の免疫ステップの組み合わせは標的抗原に対する細胞性の免疫応答を引き出すために十分なものである。
【００１５】
第1の免疫ステップの際に行われるトランスフェクション法はin vivoまたはex vivo(例えば、第2の免疫ステップを行う前に被験体の体内に導入されることとなるトランスフェクトされた細胞を得るために)のいずれかで行うことができる。in vivoでのトランスフェクションが用いられる場合には、該核酸分子はプラスミドDNAの筋肉内もしくは皮内注射で被験体に投与することができ、または、好ましくは、粒子によってメディエートされる送達技法を用いて被験体に投与することができる。あるいはまた、該プラスミドDNAは腹腔内、静脈内、直腸内、経口、または局所に投与することができる。第2の組成物には、対象の抗原を何らかの適切なワクチン組成物の形態で；例えば、ペプチドサブユニットワクチン組成物の形態で；ハイブリッドHBcAg粒子の形態で；または組換えウイルスベクターもしくはDNAワクチン、典型的には対象の抗原のコード配列を含んでいるDNAプラスミドの形態で、含むことができる。特定の実施形態においては、第2の組成物は、組換えワクシニアウイルスベクター、例えば標的抗原から得た少なくとも1個のCTLエピトープをコードする配列を含有する改変ワクシニアAnkara(MVA)ウイルスベクターが含まれる。
【００１６】
本発明はまた、被験体の体内で細胞性免疫応答を引き出す方法をも提供し、その方法は、2個以上の細胞溶解性Tリンパ球(CTL)エピトープを含んでいるペプチド抗原を、該抗原に対する細胞性免疫応答を引き出すのに十分な量を該被験体に投与することを含んでなるものであって、該エピトープは、配列番号1、2、3、4、5、もしくは6のアミノ酸配列のいずれか1つのアミノ酸配列を有するエピトープを認識するCD8+ T細胞によって認識されうる、配列番号1、2、3、4、5、および6のアミノ酸配列、ならびにそれらのいずれかの類似体から選択されたものである。
【００１７】
本発明の方法はHIVおよび/またはAIDSの予防的および/または治療的ワクチン接種に用いることができる。従って、本発明は、核酸、発現カセット、ベクター、または本発明のポリペプチドを含んでなるワクチン組成物を提供する。
【００１８】
本発明のこれらのおよびその他の目的、態様、実施形態、および利点は、本明細書の開示事項を見れば当業者であれば容易に思い浮かぶであろう。
【００１９】
配列の簡単な説明
配列番号1から6はHIV CTLエピトープのアミノ酸配列である。
【００２０】
配列番号7は配列番号3中に埋め込まれている追加のHIV CTLエピトープのアミノ酸配列である。
【００２１】
配列番号8および9は配列番号4中に埋め込まれている追加のHIV CTLエピトープのアミノ酸配列である。
【００２２】
配列番号10および11は配列番号5中に埋め込まれている追加のHIV CTLエピトープのアミノ酸配列である。
【００２３】
配列番号12は配列番号6中に埋め込まれている追加のHIV CTLエピトープのアミノ酸配列である。配列番号1から12の詳細は表１に示している。
【００２４】
配列番号13から30はSIV CTLエピトープのアミノ酸配列である。配列番号13から30の詳細は表２に示している。
【００２５】
配列番号31および32はSIVウイルス粒子RNAの検出のためのPCRプライマーのヌクレオチド配列である。
【００２６】
配列番号33はSIVウイルス粒子RNAの検出のためのプローブのヌクレオチド配列である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２７】
好ましい実施形態の詳細な説明
本発明を詳細に説明する前に、本発明が特に例示した分子またはプロセスのパラメーター、それらは当然のことながら変更しうるものであるが、それらに限定されるものでないことは理解されよう。また、本明細書中に用いている用語は本発明の特定の実施形態を説明する目的にのみ用いられており、限定することを意図したものでないことも理解されるべきである。さらに、本発明の実施は、特に示さない限りは、ウイルス学、微生物学、分子生物学、組換えDNA技法、および免疫学の従来の方法を用いて行われることとなり、それらの全ては当業者であれば行える範囲内のものである。そのような技法については文献中に十分に説明されている。例えば、Sambrookら, 「分子クローニング：実験室マニュアル(Molecular Cloning：A Laboratory Manual)」, (第2版, 1989); 「DNAクローニング：実際的なアプローチ(DNA Cloning: A Practical Approach)」, 第IおよびII巻(D. Glover編); 「オリゴヌクレオチド合成(Oligonucleotide Synthesis)」, (N. Gait編, 1984); 「分子クローニングへの実際的なガイド(A Practical Guide to Molecular Coning)」(1984); および「基礎ウイルス学(Fundamental Virology)」, 第2版, 第IおよびII巻, (B. N. FieldsとD. M. Knipe編)を参照せよ。
【００２８】
本明細書中で引用した刊行物、特許および特許出願の全ては、既に引用したもの、または今後引用するものにかかわらず、その全体を本明細書中に参照により組み入れる。
【００２９】
本明細書および添付の特許請求の範囲中で用いられている単数形の「a」、「an」および「the」は、その文章の内容が複数ではないことを明確に示すものでない限りはその指示物の複数をも含むものであることに留意すべきである。従って「CTLエピトープ(a CTL epitope)」との記載はそのようなエピトープの2個以上をも含み、「抗原(an antigen)」との記載はそのような抗原の2個以上をも含む、などである。
【００３０】
A.  定義
特に定義しない限りは、本明細書に用いている技術用語および科学用語の全ては本発明が関連する当業界の当業者に一般的に理解されている意味と同じ意味を有する。本発明の実施に際しては本明細書に記載のものと類似または同等の多数の方法および材料を用いることができるが、好ましい材料と方法は本明細書中に記載している。
【００３１】
本発明を記載するにあたっては、下記の用語が用いられ、それらは下記のとおり定義することを意図している。
【００３２】
本明細書で用いている「核酸免疫」という用語は、1種以上の選択された抗原をコードする核酸分子を、in vivoでのその抗原の発現のために宿主細胞中に導入することを意味している。該核酸分子はレシピエントの被験者の体内へ、例えば、標準的な筋肉内もしくは皮内注射；経皮的な粒子の送達；吸入；局所投与によって、または経口、鼻腔内、もしくは粘膜投与によって、直接導入することができる。あるいはまた、その分子をex vivoで、被験者から取った細胞中に導入することができる。後者の場合には、該核酸分子によってコードされる抗原に対する免疫応答が開始できるように対象の核酸分子を発現している細胞が被験者の体内に導入される。
【００３３】
「抗原」とは、個体の体内で免疫応答を引き出しうる何らかの作用物、通常は巨大分子を意味する。この用語は個々の巨大分子、または抗原性巨大分子の均一なもしくは不均一な集団を意味するものとして用いられうる。本明細書で用いている「抗原」とは、通常は、1個以上のエピトープを含んでいるタンパク質分子またはその一部分を意味するものとして用いられる。HIV抗原とは、HIVから得た、またはHIV由来の抗原である。さらに、本発明の目的においては、「抗原」とは、そのタンパク質が十分な免疫原性を維持している限りは、天然の配列に対して欠失、付加、および置換などの改変(通常、その性質が保存的なもの)を有するタンパク質が含まれる。それらの改変は、例えば部位特異的突然変異誘発によってもたらすことができ、またはその抗原を産生する宿主の突然変異を介して、などで偶発的に行うことができる。
【００３４】
「T細胞エピトープ」とは、通常、T細胞応答、典型的には抗原特異的CD4またはCD8 T細胞応答の誘導を行うことのできるペプチド構造の特徴を意味する。この点に関して、当業界では、T細胞エピトープが、MHC分子のペプチド結合性クレフト内の伸長されたコンフォメーションをまねた形となっている直鎖状ペプチド決定基を含んでなるものであると考えられている。Unanueら, (1987), Science, 236:551-557。本明細書で用いているT細胞エピトープは通常は少なくとも約3〜5個のアミノ酸残基、好ましくは少なくとも5〜10個またはそれ以上のアミノ酸残基を有するペプチドである。ある特定のエピトープの細胞がメディエートする免疫応答を刺激する能力は多数の周知のアッセイで測定することができ、それらのアッセイはリンパ球増殖(リンパ球活性化)アッセイ、CTL細胞傷害性細胞アッセイ、ELISPOT細胞内サイトカイン染色法、テトラマー染色、または感作された被験者の該エピトープに特異的なTリンパ球についてのアッセイなどがある。例えば、Ericksonら, (1993), J. Immunol. 151:4189-4199; およびDoeら, (1994), Eur. J. Immunol. 24:2369-2376を参照せよ。エピトープ特異的CD8 T細胞はCTLまたは非細胞溶解性のものでありうる。後者はIFN-γを分泌し、抗ウイルス性のエフェクター機能を有する。
【００３５】
「CTLエピトープ」とは細胞傷害性T細胞応答を刺激することのできるT細胞エピトープを意味する。典型的には、そのようなエピトープはMHCクラスI分子と結合することができる、および/またはCD8 T細胞応答を刺激することができる。TヘルパーエピトープはTh1エピトープまたはTh2エピトープとして作用することができる。「Th1エピトープ」とは、Th1ヘルパー細胞応答を刺激することのできるT細胞エピトープを意味し、「Th2エピトープ」とは、Th2ヘルパー細胞応答を刺激することのできるT細胞エピトープを意味する。単一のTヘルパーエピトープがTh1およびTh2応答の双方を誘導しうる(すなわち、平衡応答、またはThO応答を誘導する)。Tヘルパーエピトープは典型的には、MHCクラスII分子と結合することができる、および/またはCD4 T細胞応答を刺激することができる。
【００３６】
ある対象の抗原に対する「免疫応答」は個体内でのその抗原に対する細胞性の免疫応答の発生である。本発明の目的においては、「細胞性免疫応答」はTリンパ球および/または白血球によってメディエートされるものである。
【００３７】
複数の決定基(エピトープ)を有する複雑なタンパク質抗原で個体を免疫すると、多くの場合、応答するTリンパ球の多くはその抗原由来の1個もしくは2、3個の直鎖状アミノ酸配列(エピトープ)に対して特異的なもの、および/または、応答するBリンパ球の多くはその抗原由来の1個もしくは2、3個の直鎖状もしくは配座のエピトープに対して特異的なものとなろう。本発明の目的においては、そのようなエピトープを「イムノドミナントエピトープ」と呼ぶ。いくつかのイムノドミナントエピトープを有する抗原では、1個のエピトープが特異的T細胞またはB細胞応答を指令することにおいて最も支配的なものとなることができる。
【００３８】
「コード配列」またはある選択された抗原を「コードする」配列とは、適切な調節配列の制御下に置かれた場合に、in vivoで転写され(DNAの場合)およびポリペプチドに翻訳される(mRNAの場合)核酸分子である。コード配列の境界は5'(アミノ)末端にある開始コドンおよび3'(カルボキシ)末端にある翻訳停止コドンによって決定される。本発明の目的においては、コード配列としては、限定はされないが、ウイルス、原核生物、または真核生物のmRNA由来のcDNA、ウイルスまたは原核生物DNAから得たゲノムDNA配列、および合成DNA配列をも含まれうる。転写終結配列は該コード配列の3'に位置することができる。
【００３９】
「核酸」分子としては、限定はされないが、原核生物の配列、真核生物mRNA、真核生物mRNAから得たcDNA、真核生物(例えば哺乳類)DNA由来のゲノムDNA配列、および合成DNA配列をも含まれうる。この用語はDNAおよびRNAの既知の塩基類似体のどのようなものであってもそれを含む配列をも意味している。
【００４０】
「機能しうる形で連結された」とは、エレメントの配置であって、そのように記載されているコンポーネントがそれらが通常行いうる機能が発揮できるように構成されていることを意味する。従って、あるコード配列と機能しうる形で連結された所定のプロモーターは、適切な酵素が存在すればそのコード配列の発現を行わせることができる。そのプロモーターはそのコード配列の発現を指令するように機能するものである限りは、そのコード配列に隣接している必要はない。従って、例えば、プロモーター配列とコード配列の間に転写はされるが翻訳されない介在配列が存在していてもよく、そのプロモーター配列はそのような状態であってもコード配列に「機能しうる形で連結された」ものと見なすことができる。
【００４１】
本明細書で用いている「組換え」とは、ゲノムの、cDNAの、半合成性の、または合成起源の核酸分子(ポリヌクレオチド)であって、それは、その起源または操作によって、それが本質的には関連しているポリヌクレオチドの全体もしくは一部と関連していない、および/または、それが本質的に連結されているもの以外のポリヌクレオチドと連結されているものを説明するために用いられる。単一の組換え核酸分子内に含まれている2つの核酸配列は、それらが通常は本質的にはお互いが関連していない場合にはそれぞれお互いに関して「異種」なものである。
【００４２】
「ペプチド」、「ポリペプチド」、および「タンパク質」という用語は本明細書中では相互に交換可能な形で用いられており、それらはアミノ酸配列のいかなるものをも意味し、それらは2次構造、3次構造、もしくは4次構造を有していても、または有していなくともよく、また改変を含んでいても、または含んでいなくてもよい。これらの用語は連続的なアミノ酸配列および別々のアミノ酸配列をも包含し、それらは非共有結合によって会合していても、またはそうでなくともよい。
【００４３】
あるエピトープの「類似体」とは、該エピトープを含んでなるペプチドのT細胞受容体への結合を阻害することのできるペプチドである。従って通常、類似体の存在下では該T細胞受容体と結合することのできる該エピトープの量は低下する。このことはその類似体が該T細胞受容体と結合することができ、従ってそのT細胞受容体との結合においてエピトープと競合するために起こる。該類似体のそのT細胞受容体との結合は特異的なものである。通常は上述の結合の際にエピトープと類似体はMHCクラスIまたはMHCクラスII分子、例えば、HLA-A2、HLA-B62、HLA-Bw62、HLA-B35、HLA-DRB1、HLA-DRB2、HLA-DRB3、HLA-DRB5、HLA-DRB7、HLA-A25、HLA-B8、HLA-B52、HLA-DQB1、HLA-A3、HLA-A11、またはHLA-B27などに結合する(それらによって提示される)。
【００４４】
結合の阻害は当業界で既知の技法または本明細書に記載の技法のいずれかもしくは条件のいずれかのもとで測定することができる。用いられたT細胞受容体は該エピトープに特異的に結合する。そのような受容体を有するT細胞はナイーブT細胞をin vitroで、またはin vivoで該エピトープを用いて刺激することによって産生することができ、そのエピトープは通常は適切なHLA分子によってそのT細胞に提示される。
【００４５】
該類似体によるT細胞の抗原特異的な機能の活性化は適切な技法を用いて測定することができる。通常は該類似体は、MHCクラスI分子と関連した(例えばある細胞の表面上で)T細胞に提示された場合に、そのような活性化を引き起こす。
【００４６】
そのエピトープ配列を認識するCD8+ T細胞の存在又は不在は、そのエピトープ配列の存在下でのT細胞の状態の変化を検出することによって、またはそのT細胞がエピトープ配列と結合するか否かを調べることによって定めることができる。そのような状態の変化は通常は、T細胞受容体がそのエピトープ配列と結合した後に起こるT細胞の抗原特異的な機能的活性によって引き起こされる。通常は、該エピトープ配列はMHCクラスIまたはクラスII分子によって提示され、そのようなMHCクラスI又はクラスII分子は典型的にはAPC(抗原提示細胞)の表面上に存在する。単一のエピトープはMHC拘束され、限定されたMHC分子によって提示されうる。
【００４７】
T細胞の状態の変化はT細胞中のある物質の発現の開始もしくは増加、および/または、T細胞からのサイトカイン(例えば、IFN-γ、IL-2、もしくはTNF-α)などの物質の分泌の開始もしくは増加でありうる。IFN-γの発現または分泌の測定は状態の変化を検出するためには特に好ましい。そのような物質は典型的にはその物質を特異的結合剤と結合させた後、特異的結合剤/物質複合体の存在を測定することによって検出することができる。該特異的結合剤は典型的には、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体などの抗体である。サイトカインに対する抗体は市販されているか、または標準的な技法を用いて作製することができる。典型的には、該物質または特異的結合剤(例えば、その物質との複合体の形態で)は、ELISPOT、ELISA、またはICSアッセイに基づいた方法で検出され、それによってその物質の分泌が検出される。
【００４８】
あるいはまた、T細胞の状態の変化はそのT細胞による物質の取り込み、例えばチミジンの取り込みなどの増大によって測定することができる。状態の変化は、T細胞の大きさの増大、またはT細胞の増殖(例えば、増殖アッセイで測定される)、またはT細胞上の細胞表面マーカーの変化(例えば、フローサイトメトリーで測定)である可能性もある。
【００４９】
状態の変化は、エピトープ配列を提示している細胞の殺滅(そのT細胞による)である可能性もある。そのような場合、そのT細胞が該ペプチドを認識するか否かの決定はCTLアッセイを用いて行うことができる。
【００５０】
該類似体(またはあるより大きなペプチド内の類似配列)は典型的には、例えばヒトまたは動物に投与されたときに(本明細書に記載の何らかの形態で、または何らかのアジュバントと共に)該エピトープに向けられたCD8+ T細胞応答を刺激することができる。
【００５１】
該類似体は典型的には、その形状、大きさ、柔軟性、または電子配置が実質的に該エピトープと類似のものである。そのような類似体は典型的には、該エピトープの誘導体である。
【００５２】
上述のT細胞受容体との結合のみならず、該類似体はまた、該エピトープと結合する他の特異的結合剤と結合することができる。そのような結合剤はHLA-A2、HLA-B62、HLA-Bw62、HLA-B35、HLA-DRB1、HLA-DRB2、HLA-DRB3、HLA-DRB5、HLA-DRB7、HLA-A25、HLA-B8、HLA-B52、HLA-DQB1、HLA-A3、HLA-A11、またはHLA-B27とすることができる。該類似体ペプチドはペプチドまたは非ペプチドであり、またはペプチド部分および非ペプチド部分の双方を含んでなるものとすることができる。そのようなペプチドまたはペプチド部分は該エピトープと実質的に相同のもの(すなわち、配列番号1〜6のいずれかと実質的に相同のもの)とすることができる。
【００５３】
該類似配列は、1、2、3、4個またはそれ以上の数の非天然アミノ酸、例えば、天然のアミノ酸とは側鎖の異なるアミノ酸を含んでなるものとすることができる。通常は、その非天然アミノ酸はアミノ末端、および/またはカルボキシ末端（N末端および/またはC末端）を有するだろう。該非天然アミノ酸はL-アミノ酸またはD-アミノ酸とすることができる。
【００５４】
典型的には、該類似配列は、1つ以上の改変を含んでなるアミノ酸配列である。その改変は、本発明のポリペプチド上に存在しうる、本明細書で言及しているどのようなものであってもよい。そのような改変は該類似配列のアミノ酸のいずれに存在してもよく、例えばMHC分子との結合に関わっているアミノ酸のいずれか、またはT細胞による認識の際にT細胞受容体と接触するアミノ酸のいずれかとすることができる。
【００５５】
該類似配列は典型的にはコンピューター手段を用いてデザインまたは選択され、その後当業界で既知の方法によって合成される。あるいはまた、該類似体は化合物のライブラリーから選択することができる。該類似配列がそこから選択されるライブラリーは、典型的には、HLA-A2、HLA-B62、HLA-Bw62、HLA-B35、HLA-DRB1、HLA-DRB2、HLA-DRB3、HLA-DRB5、HLA-DRB7、HLA-A25、HLA-B8、HLA-B52、HLA-DQB1、HLA-A3、HLA-A11、またはHLA-B27結合モチーフを有するペプチドなどのペプチドを含んでなるライブラリーである。
【００５６】
該ライブラリーはコンビナトリアルライブラリー、またはファージディスプレイライブラリーなどの微生物ディスプレイライブラリーとすることができる。化合物のライブラリーは、HLA-A2、HLA-B62、HLA-Bw62、HLA-B35、HLA-DRB1、HLA-DRB2、HLA-DRB3、HLA-DRB5、HLA-DRB7、HLA-A25、HLA-B8、HLA-B52、HLA-DQB1、HLA-A3、HLA-A11、またはHLA-B27などのMHCクラスIまたはMHCクラスII分子に結合している形態でディスプレイライブラリーで発現されているものとすることができる。
【００５７】
ある類似ペプチドまたは配列は該ライブラリーから、該エピトープの結合特性を模倣する能力、例えばT細胞受容体すなわち該エピトープを認識するMHC-1分子と結合する能力などの上述の特性のいずれかに基づいて選択することができる。該類似体は、該エピトープを認識するT細胞の抗原特異的な機能活性を生じさせる能力に基づいて選択することができる。
【００５８】
2つの核酸配列、または2つのペプチド配列は、少なくとも約70%、好ましくは少なくとも約80〜90%、最も好ましくは少なくとも約95%のヌクレオチドまたはアミノ酸が、該分子のある定められた長さでマッチする場合に「実質的に相同」である。タンパク質の相同性を測定する方法は当業界ではよく知られており、当業者であれば、本明細書の文脈では相同性がアミノ酸の同一性(時に「ハードな相同性」と呼ばれる)に基づいて計算されることが理解されよう。
【００５９】
例えば、UWGCGパッケージは相同性を計算するために用いることのできるBESTFITプログラムを提供する(例えばそのデフォルトのセッティングで用いて)(Devereuxら, (1984) Nucleic Acids Research, 12:p387-395)。PILEUPおよびBLASTアルゴリズムは相同性の計算または配列をラインナップするために用いることができ(典型的にはそれらのデフォルトのセッティングで)、それについては例えばAltschul, S. F.(1993), J. Mol. Evol. 36:290-300; Altschul, S. F. ら, (1990), J. Mol. Biol., 215:403-10に記載されている。
【００６０】
BLAST分析を行うためのソフトウェアはNational Center for Biotechnology Information(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)を通じて公的に利用可能である。このアルゴリズムは、第1に、データベース配列中の同じ長さのワードとアラインメントさせるとき正の値の閾値スコアTとマッチするかまたはそれを満足する問合せ配列中のWの長さの短ワードを同定することによって高スコアの配列ペア(HSP)を同定することを含んでいる。Tとは隣接するワードのスコア閾値を意味する(Altschulら, 上述の文献)。これらの初回隣接ワードヒットはそれらを含有しているHSPを見つけるための検索を始めるためのシードとして作用する。そのワードヒットは累積アラインメントスコアが増加しうる限りは各配列に沿って両側に伸長される。各方向へのワードヒットについての伸長は、次の場合に停止される：累積アラインメントスコアがその最大到達値から量Ｘだけ下降した場合；累積スコアが1つ以上の負のスコアリング残基アラインメントの累積によって０もしくはそれ以下となった場合；または、どちらかの配列が末端に達した場合。BLASTアルゴリズムのパラメーターW、T、およびXはアラインメントの感度と速度を決定する。BLASTプログラムはデフォルトとしてワード長さ(W)11、BLOSUM62スコアリングマトリックス(HenikoffとHenikoff, (1992), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:10915-10919を参照せよ)アラインメント(B)50、期待値(E)10、M=5、N=4を用い、また、双方の鎖の比較を用いている。
【００６１】
BLASTアルゴリズムは2つの配列間の類似性の統計的分析を行う；例えば、KarlinとAltschul, (1993), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:5873-5787を参照せよ。BLASTアルゴリズムによって提供される類似性の1つの尺度は最小合計確率(smallest sum probability)(P(N))であり、それは2つのヌクレオチド配列またはアミノ酸配列の間のマッチが偶然に起こる確率の指標を提供する。例えば、ある配列は、第1の配列と第2の配列を比較したとき最小合計確率が約1未満の場合、好ましくは約0.1未満の場合、より好ましくは約0.01未満の場合、および最も好ましくは約0.001未満の場合、もう一方の配列と類似しているものと見なされる。
【００６２】
相同な配列は典型的には関連配列と少なくとも(またはそれ以下の)2、5、10、15、20以上の突然変異(その突然変異は置換、欠失、または挿入とすることができる)で異なっている。これらの突然変異は相同性を計算することに関して上述の領域の全てを通じて測定することができる。置換は「保存的」なものが好ましい。それらは下記の表に従って定義される。第2のカラムの同一ブロック内のアミノ酸および好ましくは第3のカラムの同一行のアミノ酸をお互いに置換することができる：
2004535799.tif 000002
類似配列の場合には、この配列は典型的にはエピトープ配列(配列番号1または2など)と少なくとも(またはそれ以下で)1、2、3、4、またはそれ以上の突然変異(その突然変異は挿入、欠失、または置換(例えば保存的置換)とすることができる)だけ異なる。
【００６３】
本明細書で言及している相同配列は、関連のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドとハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるものとすることができ、典型的にはバックグラウンドより有意に高いレベルで選択的にハイブリダイズする。選択的ハイブリダイゼーションは中程度〜高度のストリンジェンシー(例えば0.03M 塩化ナトリウムおよび0.003M クエン酸ナトリウム、約50℃〜約60℃)の条件を用いて達成される。しかし、そのようなハイブリダイゼーションは当業界で既知の適切な条件下のいずれかで行うことができる(Sambrookら, (1989), 「分子クローニング：実験室マニュアル(Molecular Cloning：A Laboratory Manual)」を参照せよ)。例えば、高ストリンジェンシーを必要とする場合には、適切な条件としては、0.2 X SSCを60℃で行うことが含まれる。より低いストリンジェンシーを必要とする場合、適切な条件としては、2 X SSCで60℃が挙げられる。また、そのような配列はPCR産物の直接的な配列分析によって確認し、さらに特徴を調べることができる。
【００６４】
「個体」と「被験者」という用語は本明細書中では交換可能な形で用いられ、サブフィルム・コルダータ(subphylum cordata)のどのメンバーをも意味し、そのようなものとしては限定はされないが、ヒトおよびその他の霊長類が含まれる。該用語は、特定の年齢を示していない。従って、成人および新生児の双方の個体を包含することを意図している。好ましくはその個体はヒトである。
【００６５】
B.  一般的方法
1実施形態においては、組換え核酸分子が提供される。その組換え核酸分子は、2個以上の細胞溶解性Tリンパ球(CTL)エピトープを含んでいる抗原をコードする第1の核酸配列を本質的に含んでなるか、またはその配列からなるものとすることができ、ここで該エピトープは、配列番号1、2、3、4、5、または6のいずれかのアミノ酸配列を有するエピトープを認識するCD8+ T細胞によって認識されうる配列番号1、2、3、4、5、および6のアミノ酸配列およびそれらのいずれかの類似体から選択されたものである。
【００６６】
該組換え核酸分子は3、4、5、または6個のCTLエピトープを含んでいる抗原をコードするものとすることができ、ここで該エピトープは、配列番号1、2、3、4、5、または6のいずれか1つのアミノ酸配列を有するエピトープを認識するCD8+ T細胞によって認識されうる配列番号1、2、3、4、5、および6のアミノ酸配列およびそれらのいずれかの類似体から選択されるものである。その抗原は1種以上の該エピトープの2個以上のコピーを含んでなるものとすることができる。好ましくは、該抗原は本質的に下記のものを含んでなるか、または下記のものからなるものとすることができる：
(i)  配列番号1のアミノ酸配列を有するエピトープ、またはその類似体であるエピトープ配列であって、配列番号1のアミノ酸配列を有するエピトープを認識するCD8+ T細胞によって認識されうるもの；
(ii)  配列番号2のアミノ酸配列を有するエピトープ、またはその類似体であるエピトープ配列であって、配列番号2のアミノ酸配列を有するエピトープを認識するCD8+ T細胞によって認識されうるもの；
(iii)  配列番号3のアミノ酸配列を有するエピトープ、またはその類似体であるエピトープ配列であって、配列番号3のアミノ酸配列を有するエピトープを認識するCD8+ T細胞によって認識されうるもの；
(iv)  配列番号4のアミノ酸配列を有するエピトープ、またはその類似体であるエピトープ配列であって、配列番号4のアミノ酸配列を有するエピトープを認識するCD8+ T細胞によって認識されうるもの；
(v)  配列番号5のアミノ酸配列を有するエピトープ、またはその類似体であるエピトープ配列であって、配列番号5のアミノ酸配列を有するエピトープを認識するCD8+ T細胞によって認識されうるもの；および
(vi)  配列番号6のアミノ酸配列を有するエピトープ、またはその類似体であるエピトープ配列であって、配列番号6のアミノ酸配列を有するエピトープを認識するCD8+ T細胞によって認識されうるもの。
【００６７】
該組換え核酸分子は、さらに、配列番号7、8、9、10、11、または12のいずれか1つのアミノ酸配列を有するエピトープを認識するCD8+ T細胞によって認識されうる配列番号7、8、9、10、11、および12のアミノ酸配列ならびにそれらのいずれかの類似体から選択されたエピトープを含んでなる抗原をコードすることができる。
【００６８】
本発明の核酸分子によってコードされる抗原は単一のポリペプチドであるかまたは2つ以上のポリペプチドを含んでなるものであってもよい。それらのエピトープは単一のポリペプチド分子中に「エピトープストリング」として含めることができ、または別々のポリペプチド中に含めるかもしくはエピトープストリングと別々のポリペプチドとの組み合わせとして含めることができる。それらのエピトープは融合タンパク質の一部として、すなわち1個以上のエピトープを完全長のHIVタンパク質と融合させてもよい。本発明の核酸分子でコードされる適切なポリペプチドについては本明細書中に述べている。下記のとおり、該核酸でコードされるポリペプチドはTヘルパーエピトープを含んでなるものとすることができる。
【００６９】
該組換え分子はまた、B型肝炎ウイルスヌクレオカプシド抗原(HBcAg)をコードする配列および細胞溶解性Tリンパ球(CTL)エピトープをコードする配列を含ませることができる。CTLエピトープをコードする配列はHBcAg分子のイムノドミナントコアエピトープ(ICE)ループ領域中に挿入することができる。あるいはまた、そのICE領域をその分子から欠失し、CTLエピトープをコードする配列をICE領域の替わりに挿入することができる。別の方法としては、CTLエピトープをその分子のHBcAg部分のその他のN末端、C末端、または内部のいずれかに挿入することができる。従って、HBcAg分子中の別のどこか、例えばICE領域またはICE領域の一部もしくは全体の替わりの位置などの、1個以上のCTLエピトープに加えてまたはその替わりに、CTLエピトープはHBcAgのアミノ末端の位置でのN末端の延長として提供することができ、および/またはCTLエピトープはHBcAgのカルボキシ末端の位置でC末端の延長として提供することができる。該分子からICE領域が欠失され、本発明の1個以上のCTLエピトープで置換されたものであることが好ましい。ハイブリッド分子のHBcAg部分への該CTLエピトープをコードする配列の挿入が発現産物のハイブリッドコア担体粒子への自己アセンブルする能力を妨害しないものであることが好ましい。
【００７０】
適切な宿主細胞中にトランスフェクトされると、該組換え核酸分子はハイブリッドHBcAg担体部分をコードし、ここでそのHBcAg部分は担体として働き、CTLエピトープ部分は免疫原として働く。本発明の組換え核酸分子は種々の核酸を用いる免疫ストラテジーで試薬として用いることができる。その組換え核酸分子のHBcAg部分は既知の供給源から得ることができる。この点に関して言えば、B型肝炎ウイルス(HBV)は二本鎖DNAゲノムを有する、小さな、エンベロープを持つウイルスである。HBVゲノムの配列(例えば、特にサブタイプadwおよびayw)は既知であり、特徴はよく調べられている。Tiollaisら, (1985), Nature, 317:489; Chisariら, (1989), Microb. Pathog. 6:311。そのHBcAgは180個のアミノ酸残基を含んでなるポリペプチドであり、いくつかのイムノドミナントな部分を有していてそれらは非常によく調べられている(例えば、ICEループ領域)。HBcAgは大腸菌(E.coli)およびその他の原核生物中に容易に発現させることができ、それらの生物ではHBcAgは自己アセンブルして粒子となる。このため、多数のペプチド抗原をHBcAgと融合させて、B細胞の免疫原性が増強されているハイブリッドコア担体粒子が提供されている。Schodelら, (1994), J. Exper. Med., 180:1037; Clarkeら, (1987), Nature, 330:381; Borisovaら, (1989), FEBS Lett. 259：121；Stahlら, (1989), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:6283。HBcAgをコードする核酸配列も既知であり、そのHBcAg配列を含有するプラスミド構築物は記載されている。Schodelら, 上述の文献。発現産物中では、イムノドミナントなループ領域は180個の残基を有するHBcAg分子の72〜85の位置の残基にかけて存在し、ICEはほぼ74〜81の位置の残基にある。
【００７１】
いくつかの分子では、さらに1以上の補助的な配列、例えば、哺乳類細胞からの付着したハイブリッドHBcAg-抗原分子の分泌をもたらす配列などを含むことができる。そのような分泌リーダー配列は当業者には既知であり、そのようなものとしては例えば、組織プラスミノーゲンアクチベーター(tpa)リーダーシグナル配列が含まれる。さらにユニバーサル(universal)Tヘルパーエピトープである補助配列を含むことができる。
【００７２】
該核酸配列は既知の方法を用いて入手および/または調製することができる。例えば、実質的に純粋な抗原調製物は標準的な分子生物学のツールを用いて得ることができる。すなわち、上述の部分をコードするポリヌクレオチド配列は組換え法、例えば、抗原を発現している細胞から作製したcDNAライブラリーおよびゲノムライブラリーをスクリーニングすることによって、またはHBcAgのコード配列をそれを含んでいることが既知であるベクターから得ることによって、得ることができる。さらに、所望の配列はそれを含んでいる細胞および組織から、フェノール抽出およびcDNAまたはゲノムDNAのPCRなどの標準的な技法を用いて直接的に単離することができる。例えば、DNAを取得し、単離するために用いられる技法の説明にSambrookら, 上述の文献、を参照せよ。また、ポリヌクレオチド配列もクローン化ではなく合成で生産することもできる。
【００７３】
特定の核酸分子を単離するための別の好都合な方法は、ポリメラーゼ連鎖反応法(PCR)によるものである。Mullisら(1987), Methods Enzymol. 155:335-350。この技法はDNAポリメラーゼ、通常は熱安定性のDNAポリメラーゼを、DNAの所望の領域を複製するために用いる。複製されることとなるDNAの領域は、複製反応を開始するために所望のDNAの反対側の末端および反対側の鎖と相補的な特定の配列を有するオリゴヌクレオチドによって同定される。複製の第1ラウンドの産物はそれ自体がそれに引き続く複製の鋳型となり、このような複製の連続的サイクルが反復されると、用いられたプライマーのペアによって境界を定められたDNA断片の幾何級数的増幅がもたらされる。
【００７４】
ひとたび配列が得られれば、標準的なクローニングまたは分子生物学的技法を用いてそれらをお互いに連結させて核酸分子が得られる。あるいはまた、その配列はクローン化ではなく合成で生産することができる。該ヌクレオチド配列は所望の特定のアミノ酸配列を得るために適切なコドンを用いてデザインすることができる。通常、その配列が発現されることを意図する宿主に好ましいコドンが選択されることとなる。次いで、完全長の配列が、標準的な方法によって調製されたオーバーラップするオリゴヌクレオチドからアセンブルされて完全なコード配列にアセンブルさせることができる。例えば、Edge, (1981), Nature, 292:756; Nambairら, (1984), Science, 223:1299; Jayら, (1984), J. Biol. Chem. 259:6311を参照せよ。
【００７５】
該組換え核酸分子は発現カセット中に挿入することができ、それはベクター中であってもよく、挿入された配列に機能しうる形で連結された制御配列を含み、それによって標的とした被験種の体内でin vivoで該抗原分子の発現が可能となる。例えば、哺乳類細胞での発現のための典型的なプロモーターとしては、SV40初期プロモーター、CMV前初期プロモーターなどのCMVプロモーター、マウス乳腺腫瘍ウイルスLTRプロモーター、アデノウイルス主要後期プロモーター(AdMLP)、およびその他の適切で効率的なプロモーター系が含まれる。マウスメタロチオネイン遺伝子由来のプロモーターなどの非ウイルス性プロモーターも哺乳類での発現に用いることができる。典型的には、転写終結およびポリアデニル化配列も存在し、翻訳停止コドンの3'側に位置するだろう。コード配列の5'側に位置する翻訳開始の最適化のための配列があることが好ましい。転写終結/ポリアデニル化シグナルの例としては、Sambrookら, 上述の文献に記載のSV40由来のもの、ならびにウシ成長ホルモンターミネーター配列が含まれる。スプライスドナーおよびアクセプター部位を含んでいるイントロンも発現カセット中に含まれるようにデザインすることができる。
【００７６】
さらに、エンハンサーエレメントを発現レベルを増大させるために発現カセット中に含めることができる。適切なエンハンサーの例としては、SV40初期遺伝子エンハンサー(Dijkemaら, (1985), EMBO J. 4:761)、ラウス肉腫ウイルスの長い端部反復配列(LTR)由来のエンハンサー/プロモーター(Gormanら, (1982), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79:6777)、およびヒトまたはマウスCMV由来のエレメント(Boshartら, (1985), Cell, 41:521)、例えば、CMVイントロンA配列中に含まれるエレメントが含まれる。
【００７７】
これらの構築物は、完成後は、標準的な遺伝子送達プロトコールを用いて核酸免疫に用いられる。遺伝子送達の方法は当業界では既知である。例えば、米国特許第5,399,346号、第5,580,859号、および第5,589,466号を参照せよ。遺伝子は被験者に直接的に送達するか、または別の方法として、ex vivoで被験者由来の細胞に送達させ、その後その細胞を被験者の体内に再移植させることができる。
【００７８】
哺乳類細胞をトランスフェクトさせるためのウイルスをベースとした多数の系が開発されている。例えば、ある選択された組換え核酸分子をベクター中に挿入し、当業界で既知の技法を用いてレトロウイルス粒子としてパッケージさせることができる。次いで組換えウイルスを単離し、被験者の細胞にin vivoまたはex vivoのいずれかで送達することができる。レトロウイルス系は既知であり、通常はパッケージング細胞系統を用い、それはウイルスの全ての遺伝子を発現するが、ψ配列として知られているパッケージングシグナルを欠くためそれ自身のゲノムをパッケージすることのできない、組み込んだ欠損プロウイルス(「ヘルパーウイルス」)を有している。従ってこの細胞系統は空のウイルスの殻を産生する。プロデューサー細胞系統はパッケージング細胞系統由来のものとすることができ、これはヘルパーウイルスに加えて、長い端部反復配列(LTR)として知られている、ウイルスの複製とパッケージングのために必要な配列をcisで含んでいるウイルスベクターを含有している。対象の遺伝子はそのベクター中に挿入され、レトロウイルスヘルパーによって合成されたウイルスの殻の内部にパッケージすることができる。次いでその組換えウイルスを単離し被験者に送達することができる。代表的なレトロウイルスベクターとしては限定はされないが、例えば米国特許第5,219,740号、これはその全体を本明細書中に参照により組み入れるが、その中に述べられている、LHL、N2、LNSAL、LSHL、およびLHL2ベクターなど、ならびに本明細書に記載の改変N2ベクターなどの、これらのベクターの誘導体が含まれる。レトロウイルスベクターは当業界ではよく知られた技法を用いて構築することができる。例えば米国特許第5,219,740号; Mannら, (1983), Cell,  33:153-159を参照せよ。
【００７９】
レトロウイルス系については、Millerら, (1989), BioTechniques, 7:980-990; Miller, A. D., (1990), Human Gene Therapy, 1:5-14; およびBurnsら, (1993), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:8033-8037にも記載されている。
【００８０】
アデノウイルスをベースとする系が遺伝子送達用に開発されており、それは本明細書に記載のポリヌクレオチドの送達に適したものである。ヒトアデノウイルスは受容体がメディエートするエンドサイトーシスによって細胞内に入り込む二本鎖DNAウイルスである。これらのウイルスは増殖と取扱が容易で、in vivoとin vitroで広範な宿主範囲を示すので、遺伝子導入に特によく適合している。例えば、アデノウイルスはヒトの造血系、リンパ系および骨髄起源の細胞に感染することができる。さらに、アデノウイルスは静止期および複製している標的細胞に感染する。宿主のゲノム中に組み込まれるレトロウイルスとは異なり、アデノウイルスは染色体外で存続するので、挿入による突然変異誘発に伴う危険性を最小限に抑えられる。このウイルスは容易に高力価で産生させることができ、安定であるので、精製して貯蔵することができる。アデノウイルスは複製可能な形態であっても罹患率は低いレベルであり、ヒトの悪性腫瘍には関わっていない。従って、これらの利点を利用するアデノウイルスベクターが開発された。アデノウイルスベクターとその使用についての説明は、例えばHaj-AhmadとGraham, (1986), J. Virol. 57:267-274; Bettら, (1993), J. Virol. 67:5911-5921; Mitterederら, (1994), Human Gene Therapy, 5:717-729; Sethら, (1994), J. Virol. 68:933-940; Barrら, (1994), Gene Therapy, 1:51-58; Berkner, K. L., (1998), BioTechniques, 6:616-629; Richら, (1993), Huma Gene Therapy, 4:461-476を参照せよ。
【００８１】
アデノ関連ウイルスベクター(AAV)も本明細書に記載のポリヌクレオチドの投与に用いることができる。AAVベクターはどの血清型のAAVから由来したものでもよく、そのようなものとしては限定はされないが、AAV-1、AAV-2、AAV-3、AAV-4、AAV-5、AAVX7、その他が含まれる。AAVベクターは、1個以上のAAV野生型遺伝子でその全体または一部分、好ましくはrepおよび/もしくはcap遺伝子が欠失しているが、1つ以上の機能を有する隣接する逆方向末端反復配列(ITR)を保持している。機能を有するITR配列は、AAVウイルス粒子のレスキュー、複製、およびパッケージングに必要である。従ってAAVベクターには少なくとも、ウイルスの複製とパッケージングにcisの形で必要な配列(例えば機能を有するITR)を含んでいる。そのITR配列は野生型ヌクレオチド配列である必要はなく、その配列がレスキュー、複製、およびパッケージングにおいて機能を有するものである限りは、例えば、ヌクレオチドの挿入、欠失、または置換によって変化させることができる。
【００８２】
AAV発現ベクターは既知の技法で構築され、転写の方向に機能しうる形で連結されたコンポーネントとして少なくとも転写開始領域を含む制御エレメント、対象のDNA、および転写終結領域を提供する。制御エレメントは哺乳類細胞中で機能するものが選択される。この結果得られた、機能しうる形で連結されたコンポーネントを含んでいる構築物は、機能を有するAAV ITR配列と境界をなす(5'および3')。適切なAAV構築物は当業界ではよく知られている技法を用いてデザインすることができる。例えば、米国特許第5,173,414号および第5,139,941号; 国際特許公開 WO 92/01070(1992年1月23日公開)およびWO 93/03769(1993年3月4日公開); Lebkowskiら, (1988), Molec. Cell. Biol. 8:3988-3996; Vincentら, (1990), Vaccines 90(Cold Spring Harbor Laboratory Press); Carter, B. J., (1992), Current Opinion in Biotechnology, 3:533-539; Muzyczka, N., (1992), Current Topics in Microbiol. and Immunol., 158:97-129; Kotin, R. M.,(1994), Human Gene Therapy, 5:793-801; ShellingとSmith, (1994), Gene Therapy, 1:165-169; およびZhouら, (1994), J. Exp. Med., 179:1867-1875を参照せよ。
【００８３】
本発明の組換え核酸分子を送達するために用いることのできるさらに別のウイルスベクターとしては、限定はされないが、ポックスウイルス属由来のものが挙げられ、それにはワクシニアウイルスおよびトリポックスウイルスが含まれる。
【００８４】
ウイルスベクターを望まない場合には、代替法としてリポソーム調製品を、本発明の核酸分子の送達に用いることができる。有用なリポソーム調製品としては、陽イオン性(正に荷電)、陰イオン性(負に荷電)、および中性の調製品が含まれ、陽イオン性のリポソームが特に好ましい。陽イオン性リポソームはプラスミドDNA(Felgnerら, (1987), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84:7413-7416)およびmRNA(Maloneら, (1989), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:6077-6081)の細胞内送達をメディエートすることが示されている。
【００８５】
ウイルスベクター系のまた別の代替法としては、本発明の核酸分子を粒子状担体で被包、吸着、または会合させることができる。適切な粒子状担体としては、ポリメチルメタクリレートポリマー、ならびにポリ(ラクチド)およびポリ(ラクチド-コグリコリド)由来のPLG微粒子が含まれる。例えば、Jefferyら, (1993), Pharm. Res. 10:362-368を参照せよ。その他の粒子系およびポリマーも用いることができ、例えばポリマー、例えばポリリジン、ポリアルギニン、ポリオルニチン、スペルミン、スペルミジン、ならびにこれらの分子のコンジュゲートを用いることができる。
【００８６】
本発明はまた、本明細書に記載の組換え核酸によってコードされるポリペプチドをも提供する。該ポリペプチドは通常はその長さがアミノ酸18個〜2000個で、例えば長さがアミノ酸数で18個〜1000個、10個〜500個、11個〜200個、12個〜100個、または15個〜50個などである。典型的には、該ポリペプチドはアミノ酸が50個までの長さを有する。該ポリペプチドは典型的には非天然タンパク質、例えば同一のもしくは異なるタンパク質由来の配列を含んでなる融合タンパク質などである。好ましい融合タンパク質は、本明細書に記載の配列番号1、2、3、4、5、もしくは6のエピトープもしくはそれの類似体と融合させたHIV遺伝子を含んでなるものである。
【００８７】
本発明のポリペプチドは、配列番号1、2、3、4、5、および6のアミノ酸配列から選択された1個、2個、またはそれ以上のCTLエピトープ、ならびに配列番号1、2、3、4、5または6のいずれか1つのアミノ酸配列を有するエピトープを認識するCD8+T細胞によって認識することができるそれらのいずれの類似体の1個または複数のコピーを含んでなるものとすることができる。そのポリペプチドは典型的には各エピトープ配列の0、1、2、3、4個、もしくは5個〜10個、またはそれ以上のコピー数を含んでなる．
そのポリペプチド内では該エピトープ配列をリンカー配列が分離させていても、もしくは分離させていなくともよいが、および/または、そのポリペプチドのN末端またはC末端に付加的な配列（エピトープでないもの）があってもよく、もしくはなくともよい。型的には該ポリペプチドは1、2、3、4、5、6個またはそれ以上のリンカーを含んでなる。そのリンカーは典型的には1、2、3、4個またはそれ以上の、例えば6個までのアミノ酸の長さである。従って、1個、2個以上、または全てのエピトープ配列がお互いに隣接しているかまたはお互いが分離されていてよい．それらのエピトープは単一のポリペプチド中に「エピトープストリング」として構成することができる。それらのエピトープは異なるポリペプチド中にあってもよく、それらのポリペプチドは非共有結合で連結されていてもいなくともよい。
【００８８】
好ましいエピトープストリングは2〜6個のAla残基を含んでなるリンカーを含み、またはいくつかの実施形態においては、エピトープストリングは2〜6個のAla残基を含んでなるリンカーから本質的になる。また該エピトープストリングは好ましくは2〜6個のC末端および/またはN末端のAla残基をも含んでなる。従って適切なエピトープストリングは次の式で示すことができる：
(Ala)a-エピトープ-(Ala)a-エピトープ-((Ala)a-エピトープ)n-(Ala)a
(この式で各々のaは独立に2〜6であり、nは1〜10、または2〜6などの0〜20の数である)。
【００８９】
該ポリペプチドはまた、該エピトープ配列の免疫原性を増強する、例えば本明細書に記載のHBVコア抗原配列などの配列を含んでなるものとすることができる。
【００９０】
該ポリペプチドはまた、他のCD8+ T細胞エピトープ配列（これは異なるT細胞に認識される）、またはTh1エピトープなどのCD4 T細胞エピトープ(ヘルパーエピトープ)などの、1、2、3、4個、もしくは5個〜10個、またはそれ以上の他のエピトープ配列を含んでなるものとすることができる。そのようなエピトープとしては配列番号7〜12のアミノ酸配列を有するものが含まれる。好ましい1実施形態においては、該ポリペプチドは少なくとも1個の、Th1およびTh2応答の双方を誘導するヘルパーエピトープを含んでなる。該ポリペプチドまたは発現ベクターを宿主に投与すると、これらの付加的なエピトープのいずれに対しても免疫応答が生じうる。
【００９１】
好ましい1実施形態においては、該ポリペプチドは、1、2、3、4個、もしくは5個〜10個、またはそれ以上の、HIV、典型的にはHIV-1由来のヘルパーエピトープ、またはHIV由来のヘルパーエピトープの類似体、すなわち、HIVタンパク質中に存在している配列によって代表されるエピトープ、またはHIV由来のヘルパーエピトープを認識するT細胞によって認識される類似体を含んでなる。下記の考察では「エピトープ」(例えばHIVユニバーサルヘルパーエピトープなどの文脈中では)という用語にはこのような類似体をも含む。
【００９２】
好ましくはこのようなヘルパーエピトープはユニバーサルヘルパーエピトープ、すなわち、例えば少なくとも2、3、4、5個もしくはそれ以上異なるクラスII分子に結合することができるものなどの、1個以上のクラスII分子に結合することができるものである。典型的には該ヘルパーエピトープは下記のクラスII分子の少なくとも2、3、4、5個以上と結合する：DPA1*0102、DPA1*0201、DPB1*0201、DPw4、DQ2、DQ7、DQA1*0501、DR1、DR4、DR11、DR12、DR13、DR15、DR17、DR51、DR52、DR53、およびDR9。
【００９３】
従って典型的には、該ポリペプチドは十分な数のユニバーサルヘルパーエピトープを含んでなり、それらはまとまって、クラスII分子との結合において、少なくとも50%、好ましくは少なくとも60%、70%、もしくは80%のワクチン接種されることとなる集団内の個体が該ポリペプチド内のヘルパーエピトープの少なくとも1つを認識/結合することのできるクラスII分子を発現するのに十分な入り交じった状態を有するだろう。
【００９４】
該ユニバーサルヘルパーエピトープは通常は10個〜30個のアミノ酸またはそれ以上の長さ、好ましくは14個〜20個のアミノ酸の長さである。
【００９５】
好ましいヘルパーエピトープは下記に列挙したHIVヘルパーエピトープ；または同じT細胞受容体によって認識されるそれの類似体(典型的には相同体)であるが、そのT細胞受容体は下記の(i)〜(xvi)の特異的エピトープのいずれかを認識/結合する：
(i)および(ii)については本実施例を参照せよ：
(i)     FRKQNPDIVIYQYMDDLYVG
(ii)    RIQRGPGRAFVTIGK
(iii)〜(v)については、Gaudebout, P.ら, Acquir. Immune Defic. Syndr. Hum. Retroviral, 14:91-101, 1997を参照せよ：
(iii)   SLKPCVKLTPLCVSL   gp160 (115-129)HXB2の位置
gp120 (115-129 LAI)
(iv)    KNCSFNISTSIRGKV    gp160 (155-169)HXB2の位置
gp120 (160-174)LAI
(v)     VITQACPKVSFEPIP    gp160 (200-214)HXB2の位置
gp120 (205-219 LAI)
(iii)〜(v)はHLR-DR*1101およびHLA-DR*0401の双方に高アフィニティーで結合し、細胞表面競合結合アッセイを用いて同定した。
【００９６】
(vi)〜(xvi)についてはWilson, C.C.ら, J. Virol., 75:4195-207, 2001を参照せよ：
(vi)    QGQMVHQAISPRTLN   gag 171-185
(vii)   GEIYKRWIILGLNKI   gag 294-308
(viii)  KRWIILGLNKIVRMY   gag 298-312
(ix)    FRKYTAFTIPSINNE   pol 303-317
(x)     SPAIFQSSMTKILEP   pol 335-349
(xi)    WEFVNTPPLVKLWYQ   pol 596-610
(xii)   EKVYLAWVPAHKGIG   pol 711-725
(xiii)  KVYLAWVPAHKGIGG   pol 712-726
(xiv)   HSNWRAMASDFNLPP   pol 758-772
(xv)    KTAVQMAVFIHNFKR   pol 915-929
(xvi)   QKQITKIQNFRVYYR   pol 956-970
(vi)〜(xvi)は62株のHIV-1単離株から配列分析アルゴリズムを用いて得たものである。エピトープ(vi)〜(xvi)を得るために、候補エピトープはそもそもはペプチド結合アッセイによってスクリーニングされたもので、結合アフィニティーが≧1000nMであって、少なくとも5種類の異なるHLA-DR分子と結合することに基づいて選択されたものである。事実、各エピトープは少なくとも7種のHLR-DR分子と結合した。エピトープはさらに、HIV-1に感染している、または感染していないドナーから得たPBMCを刺激し、T細胞増殖アッセイによってHTL想起応答を測定することによってスクリーニングした。11種のペプチドは全て、想起増殖応答においてHIV-1に感染した少なくとも6個体から得たPBMCで認識された。全体としては、試験した22例のHIV*ドナー(19種の異なるHLA-DRB1タイプ)のうち13例で1種以上のエピトープに応答した。
【００９７】
HIVからのユニバーサルヘルパーエピトープは当業界では既知の方法で同定することができる。そのような方法はHIVタンパク質配列の配列分析を行って、少なくとも2、3、4、5個またはそれ以上のHLAクラスII分子と結合するものと予測される配列を同定し、次いで典型的には、結合アッセイを行ってその同定した配列が少なくとも2、3、4、5個またはそれ以上のHLAクラスII分子と結合することが可能か確認することを含んでなるものとすることができる。さらにこの方法において、推定で定めたユニバーサルエピトープを試験して、それらが少なくとも2、3、4、5種またはそれ以上の異なるHLAクラスII分子によって提示された場合にT細胞によって認識されうるか否かを決定するために調べることもできる。Gaudeboutら、およびWilsonら(上述)はユニバーサルヘルパーエピトープの同定方法を報告している。
【００９８】
1実施形態においては、該ポリペプチドには修飾、例えば天然の翻訳後修飾(例えば糖鎖付加)または人工的な修飾が行われる。1実施形態においては、該ペプチドは糖鎖を欠いている。該修飾はアミノ基、アセチル基、ヒドロキシ基、もしくはハロゲン(例えばフッ素)基、または炭水化物の基などの化学的部分を提供することができる(典型的には、水素、例えばC-H結合の水素などを置換することによって)。典型的にはそのような修飾はN末端またはC末端に存在する。
【００９９】
該ポリペプチドは典型的にはクラスIおよび/またはクラスII抗原提示経路でプロセシングされてMHCクラスI分子を結合した細胞表面上にペプチド(ペプチド(I)または類似体ペプチド)を提示する。典型的にはそのような細胞はそのペプチドをT細胞に提示することができる。
【０１００】
該ポリペプチドは合成で生産するか、または組換え系で発現させることができる。合成で該ポリペプチドを生産するためには、固相合成法または液相合成法を用いることができる。固相合成法では、所望のペプチドのアミノ酸配列が、不溶性の樹脂に結合させたC末端のアミノ酸から順次形成されていく。所望のペプチドが産生されれば、それを樹脂から切り離す。液相合成法では、この場合も所望のペプチドはC末端のアミノ酸から形成されていく。このアミノ酸のカルボキシ基は適切な保護基でこの合成の際はブロックされたままであり、この合成の終了時にその保護基は除去される。固相合成および液相合成の双方で、反応系に添加される各アミノ酸は典型的には保護されたアミノ基と活性化されたカルボキシ基を有する。側鎖の官能基も保護される。合成の各ステップの後、アミノ保護基は除去される。側鎖の官能基は通常は合成の終了時にその保護基が除去される。
【０１０１】
上述の組換え核酸分子またはペプチドを含んでなる組成物の製剤化は標準的な製剤化に用いる化学的操作および方法を用いて行うことができ、そのようなものは全て当業者であれば容易に利用可能である。例えば、1種以上の核酸分子を含んでいる組成物は1種以上の製薬上許容される賦形剤またはビヒクルと組み合わせることができる。補助的な物質、例えば湿潤剤または乳化剤、pH緩衝剤、および類似のものを賦形剤またはビヒクル中に存在させることができる。それらの賦形剤、ビヒクル、および補助的物質は通常は該組成物の投与を受ける個体中で免疫応答を誘導しない製薬用剤であり、それらは不適当な毒性を示すことなく投与することができる。製薬上許容される賦形剤としては、限定はされないが、水、生理食塩水、ポリエチレングリコール、ヒアルロン酸、グリセロール、およびエタノールなどの液体が含まれる。製薬上許容される塩としては、例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、硫酸塩、および類似のものなどの無機酸塩；ならびに酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩、安息香酸塩、および類似のものなどの有機酸塩が含まれうる。核酸の取り込みおよび/または発現の特定の促進剤もその組成物中に含めることができ、例えば、ブピバカイン、心臓毒性(cardiotoxin)、およびショ糖などの促進剤が挙げられる。製薬上許容される賦形剤、ビヒクル、および補助的物質の詳細な論述はREMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES(Mack Pub. Co., N.J. 1991)中にあり、これは参照により本明細書中に組み入れる。
【０１０２】
製剤化された組成物は、対象の抗原を上述のとおり免疫応答を起こさせるのに十分な量で含むだろう。適切で有効な量は当業者であれば容易に決定することができる。そのような量は日常的な試験によって決定することのできる比較的広い範囲の値となろう。該組成物は約0.1%〜約99.9%の該抗原を含むものとすることができ、当業者には既知の方法を用いて、被験者に直接投与するか、またはex vivoでその被験者由来の細胞へ送達することができる。例えば、ex vivoでの送達と形質転換された細胞の被験者の体内への再移植のための方法は、既知である(例えば、デキストランがメディエートするトランスフェクション、リン酸カルシウム沈殿、電気穿孔法、および核内への直接的なマイクロインジェクションが挙げられる)。in vivoでの送達の方法は従来のシリンジを用いる注射を伴うものでありうる。該構築物は皮下、表皮、皮内、粘膜内、例えば経鼻、経直腸、経膣など、腹腔内、静脈内、経口、または筋肉内に注射することができる。その他の投与方法としては、経口および肺への投与、坐剤、経皮適用が含まれる。
【０１０３】
しかし、該核酸分子またはペプチドが、標的組織中に核酸をコートした微粒子を打ち込むか、または粒子状核酸組成物を経皮的に送達する粒子加速装置を用いて送達されることが好ましい。この点に関して、遺伝子銃をベースとした核酸免疫が、ナノグラム単位の量のDNAの表皮への送達後に液性免疫応答および細胞傷害性Tリンパ球の免疫応答を共に引き出すことが示されている。Pertmerら, (1995), Vaccine, 13:1427-1430。粒子がメディエートする送達技法を他のタイプの核酸接種法と比較したところ、この方法が著しく優れていることが示されている。Fynanら, (1995), Int. J. Immunopharmacology, 17:79-83; Fynanら, (1993), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:11478-11482; およびRazら, (1994), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91:9519-9523。それらの研究では粒子がメディエートする核酸をベースとしたワクチンの皮膚表面および筋組織の双方への送達が研究されている。
【０１０４】
粒子がメディエートする核酸調製物およびペプチドを送達するための方法は当業界では既知である。従って、上述の核酸分子またはペプチドを調製し、適切に精製すれば、その後それらを当業界では既知の種々の技法を用いて担体粒子上にコートすることができる。担体粒子は、典型的には遺伝子銃装置からの細胞内への送達のために用いられる粒径の範囲内で適切な密度を有する物質から選択される。担体粒径の最適な値は、当然ことながら、標的細胞の直径によって変わるだろう。
【０１０５】
本発明の目的において、タングステン、金、白金、およびイリジウムの担体粒子を用いることができる。タングステンと金の粒子が好ましい。タングステン粒子は平均サイズが直径0.5〜2.0μmのものを容易に入手することができる。金粒子または微結晶性の金(例えばEngelhard Corp., East Newark, NJから入手できる金粉末A1570)を本発明で用いることもできるだろう。金粒子はその大きさの均一性を提供する(粒径が1〜3μmのものがAlpha Chemicalsから入手でき、または0.95μmのものを含む粒径範囲のものがDegussa, South Plainfield, NJから入手できる)。微結晶性の金は粒径分布が広く、典型的には0.5〜5μmの範囲である。しかし、微結晶性の金の不規則な表面積は核酸またはペプチドのコーティングには非常に効率的である。
【０１０６】
金またはタングステン粒子上にDNAまたはRNAをコーティングまたは沈殿させるための方法は多数知られており、報告されている。そのような方法のほとんどは、通常あらかじめ定められた量の金またはタングステンをプラスミドDNA、CaCl2、およびスペルミジンと組み合わせたものである。この結果得られた溶液をコーティング操作の間ボルテックスして、反応混液の均一性を確保する。核酸が沈殿した後、コートされた粒子を、適切な膜上に移して使用するまで乾燥させておくか、サンプルモジュールまたはカセットの表面上にコートさせるか、または特別な遺伝子銃装置中で用いるために送達カセット中にロードすることができる。
【０１０７】
粒子がメディエートする送達に適した種々の粒子加速装置が当業界では知られており、それらは全て本発明の実施における使用に適している。現行の装置のデザインは、コートされた担体粒子を標的細胞に向かって推進するために爆発性に、電気的に、またはガスで発射するものである。そのコートされた担体粒子はそれ自体が可動性の担体シートに放出可能な形で付着されているか、またはガス流に沿った表面に除去可能な形で付着され、その表面から粒子が剥がれて標的に向かって加速される。ガスを用いた発射装置の例は米国特許第5,204,253号に記載されている。爆発性のタイプの装置は米国特許第4,945,050号に記載されている。ヘリウム発射タイプの粒子加速装置の1例としてはPowderJect(登録商標) XR装置(PowderJect Vaccines, Inc., Madison, WI)があり、その装置については米国特許第5,120,657号に記載されている。本発明での使用に適した電気的な発射装置については米国特許第5,149,655号に記載されている。これらの特許全ての開示は本明細書中に参照により組み入れる。
【０１０８】
あるいはまた、粒子状の核酸組成物は注射針のないシリンジ装置を用いて経皮的に投与することができる。例えば、本発明の核酸分子を含んでなる粒子状組成物は一般的な製薬方法、例えば単純な蒸発法(結晶化)、真空乾燥、スプレー乾燥、または凍結乾燥などを用いて得ることができる。所望により、一般的に認められた国際特許公開WO 97/48485(本明細書中に参照により組み入れる)に記載の技法を用いて該粒子をさらに高密度とすることができる。次いで、これらの粒子状組成物を注射針のないシリンジシステム、例えば一般的に認められた国際特許公開 WO 94/24263、WO 96/04947、WO 96/12513、およびWO 96/20022、これらの全ては本明細書中に参照により組み入れるが、それらに記載のものなどから送達させることができる。
【０１０９】
上述の注射針のないシリンジシステムからの抗原またはアレルゲンを含んでなる粒子の送達は、一般的には0.1〜250μmの範囲、好ましくは約10〜70μmの範囲のおおよそのサイズを有する粒子を用いて行われる。約250μmより大きい粒子もこの装置から送達することができるが、その上限は皮膚細胞に望ましくないダメージを生じさせるような粒子のサイズ点である。送達された粒子が標的の表面に貫通する実際の距離は粒径(例えば、ほぼ球状の粒子幾何学であると仮定した場合の名目上の粒径)、粒子の密度、粒子が表面に衝突する際の初速、ならびに標的の皮膚組織の密度および運動学的な粘度によって変わる。この点に関して言えば、注射針のない注射中に用いるための粒子の密度の最適値は通常は約0.1〜25g/cm3の範囲であり、好ましくは約0.9〜1.5g/ cm3の範囲であって、射出速度は通常は約100〜3,000m/秒の範囲である。適切なガス圧を用いて、直径の平均が10〜70μmの粒子をノズルを経由して加速して駆動するガス流の速度を超音速に近いものにすることができる。
【０１１０】
該粒子状組成物またはコートされた粒子は、投与形態と両立しうる様式で、および本発明の目的に有益となるものと考えられる量で投与される。送達されることとなる該組成物の量(例えば、約0.1μg〜1mg、より好ましくは1〜50μgの抗原またはアレルゲン)は試験される個体によって異なる。正確な必要量は治療を受ける個体の年齢および一般状態によって異なることとなり、当業者であれば適切な有効量を容易に決定できる。
【０１１１】
本発明の組成物の有効量は、対照の被験者と比較して免疫された被験者でHIVのウイルス装填、および/またはHIV伝播の低減を示す量である。従って、本発明の組成物はAIDSの予防または治療的処置に用いることができる。AIDSの予防または治療的処置のための組成物の有効量は、典型的には、AIDSの1種以上の症状を防ぐ、もしくはその発症を遅らせるか、または、AIDSの1種以上の症状の重症度を低減させてAIDS患者の病状を緩和する。本発明の組成物は被験者のHIV感染の前もしくは後、または感染の前後ともに投与することができる。該組成物をHIV感染に先立って投与する場合には、該組成物はHIV感染の危険性が高い被験者に投与される。
【０１１２】
本発明の組成物は1種以上の抗ウイルス剤と共に投与することができる。従って本発明の組成物の有効量には、抗ウイルス剤の抗ウイルス作用を増大させるのに十分な量が含まれる。
【０１１３】
本発明の別の1実施形態においては、被験者の体内に細胞性免疫応答を引き出させる方法が提供される。その方法は被験者の細胞を本発明の組換え核酸でトランスフェクトすることを必要とし、そのトランスフェクションは被験者の体内で該抗原が発現されて該抗原に対する細胞性の免疫応答が引き出されうるような条件下で行われる。別の方法では、被験者の細胞に本発明のペプチドもしくはタンパク質の送達を必要とし、トランスフェクションは該被験者の体内で該抗原が発現されて該抗原に対する細胞性免疫応答が引き出されうるような条件下で行われる。
【０１１４】
そのような方法では、最初のステップで被験者の細胞を本発明の組換えハイブリッドHBcAg-抗原をコードする配列でトランスフェクトすること、次いで、ブースティングステップ(boosting step)において第2の組成物をその被験者に投与することを必要とし、その第2の組成物は本明細書中に定義した1種以上のHIV CTLエピトープを含んでなるかまたはコードするものである。第2の組成物は該抗原をコードする核酸分子を含んでいる適切なワクチン組成物、または該抗原をペプチドもしくはタンパク質の形態で含んでいる組成物のどのようなものであってもよい。第2の組成物のin vivoでの直接送達は、通常は上述のウイルスベクター(例えば、改変したワクシニアベクター)と共に、もしくはウイルスベクターを伴わずに、従来のシリンジを用いて、もしくはこれも上述した粒子がメディエートする送達システムを用いた注射によって達成されるだろう。投与は典型的には、皮下、表皮、皮内、粘膜内(例えば経鼻、経直腸、および/もしくは経膣)、腹腔内、静脈内、経口、または筋肉内に行われるだろう。その他の投与様式としては、経口および肺への投与、坐剤、経皮適用が含まれる。ウイルスベクターは局所投与によって投与することができる。投薬処置は単回投与スケジュール、または複数回投与スケジュールとすることができる。
【０１１５】
下記の実施例は本発明を説明するものである。
【実施例】
【０１１６】
実施例１: ワクチン組成物のためのエピトープの選択
HIVエピトープ(CTLエピトープを含む)の選択の判断基準は下記のとおりとした。
【０１１７】
1)  まずT細胞エピトープを、所定の地域集団内で優勢な特異的MHCクラスIまたはクラスII分子と結合する能力についてスクリーニングした。この実施例では、北アメリカを含むいくつかの集団内で優勢なクラスI分子であるHLA-A2への結合について、エピトープをスクリーニングした。ヒトで強い免疫原性を示すことが確認されているエピトープが選択され、次いで下記の判断基準にかけた。
【０１１８】
2)  同一クレード内の種々のHIV単離株の間で高度に保存されていることが示されたエピトープで、可能ならば該ウイルスがその適応度を低下させなければ逃れることのできないエピトープを標的とするためにクレードを横断したエピトープ。
【０１１９】
3)  封じ込めを容易にするエピトープを標的とするための、長期未発症者(LTNP)と関連するエピトープを選択した。
【０１２０】
4)  種々の複製ステージにあるHIVを標的とするための、結合した際に、HIVの複数の抗原に対する免疫応答を誘導するエピトープ。
【０１２１】
5)  異なるMHCを結合する2種以上のオーバーラップするかまたは入れ子状のエピトープを含んでいる、2種以上のMHCまたはペプチド配列と交叉反応するエピトープを、人口カバー率を最大にするために選択した。
【０１２２】
選択されたHIVエピトープを表1に概括している。それらの選択されたエピトープはHLA-A2拘束性であり、ヒトでの免疫原性が示されている。さらに各エピトープは上記の2から5項のうちの2項目以上の判断基準に合致する。
【表１】
2004535799.tif 000003
【０１２３】
マカク属におけるSIV感染はヒトでのHIV感染およびAIDSの動物モデルとなる。そのためSIV CTLエピトープをHIV CTLエピトープと同一の判断基準を用いて選択した。選択されたSIVエピトープは表２に示している。
【０１２４】
実施例２: プラスミド構築物
1.  プラスミドPJV7198
PJV7198は肝炎コア抗原のイムノドミナントな領域中ならびにN末端およびC末端にエピトープ融合体を受け入れるものと考えられた。イムノドミナントな領域(Bsp120I)およびカルボキシ末端(NotI)のコア配列中に作られた制限酵素切断部位によってそれらのどちらの部位にも同一のDNA断片をインフレームでクローニングすることができるが、それはどちらの酵素で消化しても同一の「粘着性の」5'突出末端が作製されるからである。N末端のNheI部位での挿入は試みなかった。WRG7198の構築についてはVaccine, 19(13-14):1717-26, 2001中に述べられている。WRG7198のマップは図１に示している。
【０１２５】
2. HIVエピトープストリングを含有しているプラスミドPJV7198
エピトープストリングをコードするDNAインサートは下記のとおり構築した。「仮想」ペプチド配列を、3種のHIVエピトープのアミノ酸配列を一列につなぎ合わせ、各エピトープ間に2個のアラニン残基、N末端とC末端の双方に2個のアラニン残基を付加することにより、組み立てた。それらアラニン残基はコア融合分子からのエピトープのプロセシングを増大させるために付加した。
【０１２６】
「仮想」ペプチド配列を、哺乳類細胞で好まれるコドンを用いてDNA配列に逆翻訳(RTS)した。このRTSに対応するオリゴヌクレオチドを合成し、PCR増幅の標的として用いた。末端にインフレームでBsp120I部位を有する合成オリゴヌクレオチドプライマーをRTSの増幅に用いた。このPCR産物をBsp120Iで消化し、HbcAgコード配列中のBsp120I部位またはNotI部位のいずれかに挿入した。
【０１２７】
第2のストリングを増幅し同じ方法で調製し、残っている部位に挿入した。その結果得られたプラスミドHBcAg-エピトープDNAワクチンのマップは図２に示している。2つのエピトープストリングは下記に示す。
【０１２８】
エピトープストリング#1：コードされたペプチド配列
GPAALLWKGEGAVAARIQRGPGRAFVTIGKAAEWRFDSRLAFHHVARELAAGP
エピトープストリング#1：PCR増幅から得られたDNA配列
gggcccgccgccctgctgtggaagggcgagggcgccgtggccgcccgcatccagcgcggccccggccgcgccttcgtgaccatcggcaaggccgccgagtggcgcttcgacagccgcctggccttccaccacgtggcccgcgagctggccgccgggccc
エピトープストリング#2：コードされたペプチド配列
GPAASLYNTVATLAAILKEPVHGVYAAFRKQNPDIVIYQYMDDLYVGAAGP
エピトープストリング#2：PCR増幅から得られたDNA配列
gggcccgccgccagcctgtacaacaccgtggccaccctggccgccatcctgaaggagcccgtgcacggcgtgtacgccgccttccgcaagcagaaccccgacatcgtgatctaccagtacatggacgacctgtacgtgggcgccgccgggccc
実施例３: 18個のCTLエピトープをコードするDNAをワクチン接種したアカゲザルは、SIV感染サルにおいて免疫原性が認められたエピトープと関連する7個のエピトープのサブセットに対してのみ、検出可能な応答を示す
8匹のMamuA*01陽性アカゲザルを、表2に示したウイルス抗原SIV17E/FrgagおよびSIV17E/Frgagならびに19個のMamuA*01拘束性SIVmac239特異的CTLエピトープをコードする11種のDNAワクチンベクターの混合カクテルを用いて免疫した。
【表２】
2004535799.tif 000004
【０１２９】
CTLエピトープはHBcAg遺伝子のイムノドミナントな抗体結合領域を置換する内部位置、またはそのC末端のいずれかに挿入した。単一ワクチン中の複数のCTLエピトープは2個のアラニンで隔てられ、示された順番で挿入された。*感染したマカク属サルから得たPBMCによるTat SL8およびTat TL8の認識は区別できず、それらは同一のエピトープであるものと考えられる。
【０１３０】
配列分析では各エピトープの正しい配列がHBcAgベクター内にコードされていることが確認された。インタクトなHBcAgタンパク質をin vitroで発現させることによって完全長の配列が発現されることを確認した。
【０１３１】
各々のサルは、1回の免疫あたり32.0μgのDNA(各DNAベクターを3.2μg)からなり、4〜8週間隔で行う合計4回の免疫を受けた。CD8+ T細胞の応答のエピトープ特異性は、1回目、2回目、3回目、または4回目のDNA免疫後にELISPOTで調べた。
【０１３２】
表３に示した結果は、A群のサルでは19種のMamu-A*01拘束性CTLエピトープがワクチン中に含まれていたが、そのワクチンで免疫されたMamu-A*01陽性のサルはそれらのエピトープのうちの7種のみに対して応答したことを、示している。著しい応答が検出されたのはGag181-189CM9、Tat28-35SL8、Vif144-152QA9、Env235-243CL9、Env622-630TL9、Gag372-380LA9、およびPol359-368GM10のペプチドに対してのみであった。
【０１３３】
これらのエピトープはSIV感染において免疫原性であることがすでに示されていた14種のエピトープ(Allen, J. Virol. 75:738-749, 2001)のうちの7種に該当する。
【表３】
2004535799.tif 000005
【０１３４】
実施例４: 感染したアカゲザルを、薬物療法と組み合わせてSIV DNAワクチンにより免疫すると、SIV特異的免疫応答が増強され、ウイルスの封じ込めが改善される
我々は、全SIV遺伝子およびHBcAgに融合させたSIVエピトープをコードするDNAプラスミドによるワクチン接種を抗レトロウイルス療法の補助的免疫療法として行う際の効果を検討した。我々は、抗ウイルス剤によって誘導されたT細胞の回復とウイルス量の低減の際にDNAワクチンがウイルス特異的CTLおよびTh細胞応答を誘導することにより、残存しているウイルスが低減し、抗ウイルス剤治療の中止後にウイルスに対する宿主媒介型免疫制御が誘導されるとの仮説を立てた。我々はまた、感染前にワクチン接種して免疫応答を開始させることにより感染後のワクチン免疫療法の有効性が増大するとの仮説も立てた。
【０１３５】
DNAワクチン: 
この研究に用いたHBc-SIV エピトープDNAワクチンはHBcAgのイムノドミナント領域またはカルボキシル末端のいずれかに挿入された19種のMamu-A*01拘束性CTLエピトープをコードするプラスミドのカクテルからなるものである(表２、実施例３)。
【０１３６】
SIV gagの全体、およびSIV tat遺伝子をコードする2種類のDNAワクチンも用いた。SIVgagベクターはSIVmac239由来であった。SIV tatベクターはSIV17E/Frからのものである。
【０１３７】
ワクチン接種: 
プラスミドDNAは、既に報告されているとおり(Royら, Vaccine, 19:764, 2000)、1〜3μmの金粒子上に、1mgの金あたり2.0μgのDNAの比率で沈殿させた。アカゲザルの腹部および脚の内側の毛を刈って、鼡径リンパ節の近傍およびその上の表皮に、PowderJect(登録商標) XR遺伝子送達デバイス(PowderJect Vaccines, Inc., Madison, WI)をヘリウム圧を1平方インチあたり500ポンド(psi)にて用いて、DNAでコートした金粒子を加速させて導入した。各送達は1.0mgの金と2.0mgのDNAからなる。1回の免疫あたり32μgのDNAの投与はDNAを16カ所の部位に投与することによって行った。連続的なDNA免疫化を4〜8週間間隔で行った。
【０１３８】
ELISPOTアッセイ: 
ELISPOTは本質的には報告されたとおりに(Royら, 2000)行った。簡潔に記せば、アカゲザルIFNγに対する抗体のペア(Cytech-BV, Amsterdam, オランダ)をIFNγを分泌するT細胞の数を測定するために用いた。PBMCを2種類の異なる希釈率で、あらかじめ抗サイトカインmAbでコートした96ウエルのニトロセルロースフィルタープレート(Millipore)中で培養した。次いで、適切なMamuA*01 CTLペプチドまたはpepset(Chiron)を2μg/ml添加した。24時間後、IFNγを分泌している細胞数を、ビオチニル化抗サイトカインmAbを用い、次いでストレプトアビジンをコンジュゲートさせたアルカリフォスファターゼを用いることにより可視化して、さらにImageProソフトウェアで計数した。
【０１３９】
増殖分析: 
各タイムポイントで、全血からFicoll-Hypaqueに対する密度勾配遠心でPBMCを分離し、10%ヒト血清含有の完全RPMI培地(R10培地)中に再懸濁した。96ウエル平底プレートで、2 X 105 PBMC/ウエルを0.2μg/ウエルのタンパク質と共にR10培地中で6日間インキュベートした。PBMCを10μg/mLのSIV gag組換えタンパク質(Intracel)で刺激した。アッセイ終了の16時間前に各ウエルを1μCiの3H-チミジンでパルス処理した。細胞を集め、シンチレーション分光法でアイソトープの取り込みを測定した。アッセイは全て3回重複して行った。
【０１４０】
血漿中のウイルス量
血漿中のウイルス粒子関連RNAの定量はPrism7700(ABI)中でリアルタイムPCRで行った。1mLの血漿から14,000 x g、1時間の遠心によってウイルス粒子をペレットとした。総RNAをTrizol(Life Technologies)を用いてウイルスペレットから抽出し、各サンプルの20μLを96ウエルプレートで分析した。cDNAは、MgCl、1xPCRバッファーII、0.75mM dGTP、0.75mM ATP、0.75mM CTP、0.75mM TTP、1U RNase阻害剤、1.2U MULV逆転写酵素(RT)、2.5μm ランダムヘキサマー、および10%の総ウイルスRNAを含有する反応液での反応を3回行うことによって合成した。サンプルを混合し室温で10分間インキュベートした後、42℃で12分間インキュベートし、その反応は99℃で5分間の加熱により停止させ、次いで4℃まで5分間にわたり冷却した。PCR反応は、RTの添加後直ちに、1 x PCRバッファーA、5.5mM MgCl2、2.5U Amplitaq Gold、200mM dNTPs、450nM 各プライマー、および200nM プローブを含有する30μLのPCRマスター混合液を添加することによって開始させた。用いたプライマーとプローブはそれぞれ次のとおり：
5'-AGGCTGGCAGATTGAGCCCTGGGAGGTTTC-3'
5'-CCAGGCGGCGACTAGGAGAGATGGGAACAC-3'、および
5'-TTCCCTGCTAGACTCTCACCAGCACTTGG-3'。
【０１４１】
増幅は、Amplitaq Gold(Perkin Elmer)を活性化するために95℃で10分間加熱した後、95℃15秒間、55℃15秒間、および72℃30秒間を40サイクル行うことによってPrism 7700にて行った。LTR含有プラスミドのin vitroでの転写によって得られたRNAの108〜100コピー/反応液の範囲の連続希釈物を、サンプルと共にRT PCR反応に3回重複してかけて標準曲線を作成し、その感度の閾値は10コピー/反応液であった。未知の血漿サンプルから得られたRNAのコピー数を標準曲線から計算し、RNAコピー数/mL血漿として表記した。
【０１４２】
スケジュールと免疫計画(図３)
・この研究の態様は2群の動物からなるものとした。1群は感染の前と後の双方で免疫し、第2の群は感染後の免疫のみとした。
【０１４３】
・感染前と後の双方で免疫した動物はチャレンジの前に1〜2ヶ月間隔で4回のDNA免疫化を受けた。
【０１４４】
・全動物についてSIV Delta B670により静脈内投与でチャレンジした。SIV Delta B670はmac239および17Eをベースとしたワクチンとは異種である。ワクチン中の19種のA*01拘束性CTLエピトープのうちの14種はSIV Delta B670において100%または部分的に(アミノ酸1個の変化)保存されている。
【０１４５】
・全動物はチャレンジ後、抗レトロウイルス治療の間、1ヶ月間隔で6回の治療的DNA免疫を受けた。
【０１４６】
・各免疫は金ビーズ上にコートしたDNAの合計32μgからなり、それをPowderJect(登録商標) XR遺伝子送達デバイスを用いて腹部の皮膚中に投与した。
【０１４７】
・R-9-[2-ホスホニルメトキシプロピル]アデニン(PMPA)を日用量 20mg/kgにて用いる抗レトロウイルス治療を感染の2週間後に開始し、DNA最終免疫の4週間後に中止した。
【０１４８】
・この研究を通して、ウイルス量、gagに対するリンパ球増殖応答、およびウイルス特異的CD8+ T細胞応答をモニターした。
【０１４９】
実験群: 
・この研究の態様は6群からなり、各群は4または8匹のアカゲザルからなる。
【０１５０】
・A群：感染の前と後にHBc-SIVエピトープ＋SIVgag＋SIVtatDNAワクチンで免疫した8匹のMamu-A*01陽性のアカゲザル。
【０１５１】
・B群：感染の前と後にSIVgag＋SIVtatDNAワクチンで免疫した8匹のMamu-A*01陰性のアカゲザル。
【０１５２】
・C群：感染後のみHBc-SIVエピトープ＋SIVgag＋SIVtatDNAワクチンで免疫した8匹のMamu-A*01陽性のマカク属サル。
【０１５３】
・D群：感染後のみSIVgag＋SIVtatDNAワクチンで免疫した8匹のMamu-A*01陰性のマカク属サル。
【０１５４】
・E群：HBcAgのみを発現するSIVとは無関係なDNAワクチンで疑似ワクチン接種した対照。この対照群には4匹のA*01陽性および4匹のA*01陰性の動物を含む。
【０１５５】
・F群：SIVに感染したが、DNAワクチンまたはPMPAのいずれによっても治療されなかった4匹のアカゲザル(感染対照群)。
【０１５６】
免疫療法の有効性に対して用いる判断基準(図４)：
・パネルA：ヒトの場合と同様に、SIV/DeltaB670を感染させた動物のうちの非常に少数が長期未発症者(LTNP)の特徴を示す。それらの動物はAIDSへと進行することなく2年またはそれ以上臨床的には健康のままである。予想通り、4年以上前に感染した3匹のLTNPで測定されたウイルス量は持続的に低レベルで含まれており、ウイルス量の幾何平均は１mLあたり一貫してウイルスRNA5000コピーを下回った。
【０１５７】
・パネルB：これに対してDeltaB670で感染させた動物の大多数ではそのウイルス量は本研究のナイーブ群で見られたものと同程度であり、そのウイルス量の幾何平均はLTNPでのレベルより3〜4 log高いレベルで維持された。対照群の動物は通常は感染から3〜18ヶ月以内にAIDSへと進行する。
【０１５８】
・免疫療法の有効性に対して用いる判断基準：抗レトロウイルス剤の不在下でLTNPで観察される平均レベル(5000コピー)に匹敵するウイルス封じ込めがもたらされる場合、免疫療法の有効性を示すものと見なした。
【０１５９】
結果：ウイルス量: 
・ウイルス量は、抗ウイルス剤とDNAワクチン療法を組み合わせて実施している期間(5週〜28週)、および薬剤とワクチン療法の組み合わせの中止後から現在まで16週間(30週〜46週目)、2週間毎にリアルタイムPCRによって測定した。
【０１６０】
・本研究の各段階(治療中すなわち4週〜28週、および治療後、すなわち30週〜50週)についてのウイルス量の幾何平均(GMVL)を各群について計算し表４に示している。
【０１６１】
・治療中では、感染の前および後にSIVgag＋tat＋エピトープで免疫したサル(A群)は、対照のE群の20分の1未満のウイルス負荷を示した。ワクチン＋PMPA療法の中止後は、A群のサルは対照のE群の50分の1未満のウイルス量を維持した。
【０１６２】
・治療中では、感染の前および後にSIVgag＋tatワクチンで免疫したサル(B群)は、対照のE群のサルのほぼ2分の1のウイルス負荷を示した。
【０１６３】
・補完的なC群とD群では感染後のみ、それぞれSIVgag＋tat＋エピトープおよびSIVgag＋tatで免疫したが、これらも治療中には最低でも2分の1のウイルス量を示し、薬剤およびワクチン治療の中止後には、2分の1から4分の1のウイルス量を示した。
【０１６４】
・ウイルス負荷を長期未発症者のレベル(ウイルスRNA 5000コピー)と同程度のレベルに維持することとして定義される免疫療法の有効性は、32匹のワクチン接種されたサルのうちの合計17匹で示された(53%)。これに対して対照群の8匹のサルでは1匹のみ(12.5%)について有効性が示された。
【０１６５】
・全体としては、SIVgag＋tatに加えてSIVエピトープで免疫されたサル(A群とC群、16匹中11匹、すなわち68.8%)においては、免疫療法が有効であるレベルが、SIVgag＋tatワクチンのみで免疫されたサル(B群とD群、16匹中6匹、すなわち37.5%)よりも高いことが示された。
【０１６６】
・さらに、感染の前と後に免疫したサル(A群とB群、16匹中11匹、すなわち68.8%)は、感染後にのみ免疫されたサル(C群とD群、16匹中6匹、すなわち37.5%)より、有効率が高かった。これらの条件を組み合わせたA群では、有効であるレベルが最も高く、8匹のサルのうち7匹(87.5%)でLTNPのウイルス量に匹敵するウイルス量を維持していた。
【表４】
2004535799.tif 000006
【０１６７】
結果：CD8+ T細胞免疫応答の大きさ（図５）
・CD8+ T細胞応答はELISPOTで測定した。A*01陽性のサルでは、平均累積ELISPOT値を、ワクチン中に含まれる10種の代表的なエピトープで刺激した後の応答を、各タイムポイントで測定して求めた。A*01陰性のサルでは、累積ELISPOT値はgagおよびtatペプチドプールを用いて決定した。
【０１６８】
・対照のサル(E群)では、A*01+(パネルA)およびA*01-(パネルB)の双方のサルにおけるCD8+ T細胞応答がウイルス量と相関していた。CD8+ T細胞応答は急性感染時にピークとなり、薬剤治療中に減少したが、それはウイルス量の低下と相関していた。薬剤を中止すると、ウイルス量とCD8+ T細胞応答はいずれも逆戻りした。
【０１６９】
・パネルA：SIVエピトープ＋gag＋tatによる感染の前と後の両方に(A群)、または感染後のみに(C群)免疫したA*01陽性のサルは20週から30週の間はCD8+ T細胞応答を高レベルで持続したが、対照群(E群)ではCD8応答は低下した。注目すべきことに、A群とC群でのより低いウイルス量と免疫療法のより高い有効率は、本研究を通じて感染により上昇して維持されたSIV特異的CD8応答と相関していた。全体としては、ウイルス量が最も低く有効率が最も高かった(88%)A群では、最も高いCD8+ T細胞応答が認められた。
【０１７０】
・パネルB：SIVgag＋tatによる感染の前と後の両方に(B群)、または感染後のみに(D群)免疫したA*01陰性のサルはSIV特異的CD8+ T細胞応答において対照群と有意差を示さなかった。
【０１７１】
結果：増殖応答(表５)
・SIVgagに対する増殖応答をPMPA＋DNA組み合わせワクチン治療中(0週〜28週)およびその治療の中止後現在までの(30週〜46週)に測定した。
【０１７２】
・表５の結果は、対照のE群と比較して、ワクチン接種群の全てがSIVgagに対する増殖応答の著しい増強を示した。
【０１７３】
・ワクチン接種した4群間では増殖応答における有意差は認められなかった。
【０１７４】
・Mamu-A*01陽性のサル(A群とC群)とMamu-A*01陰性のサル(B群とD群)との間で増殖応答に有意差は認められなかった。この結果は、HBc-エピトープワクチンで免疫されたMamu-A*01マカク属サルで観察された免疫療法の有効性の改善が、ワクチン接種に対する生来の優れた免疫応答性によるものではなく、ワクチン組成物中にHBc-エピトーププラスミドが含まれることによって得られることを強く実証するものである。
【表５】
2004535799.tif 000007
【０１７５】
結果：CD8+ T細胞応答のレパートリー(表３参照)
感染後、CD8+ T細胞応答はA群では7種のエピトープに対して検出されたが、C群では4種のエピトープにすぎなかった。このことが、感染の前にワクチン接種すると感染後のCD8+ T細胞応答のレパートリーが増強されることを示す。感染の前と後の両方でワクチン接種を受けた動物で観察された免疫療法の有効性の全体的な改善に寄与しているのであろう。しかし、A群での感染の前と後での応答は、免疫していないSIV感染させたサルでこれまでに検出されたエピトープ特異的応答のレパートリー(Allenら, 2001)に依然として限定されていた。これらの結果はウイルス感染において免疫原性を示す数種のみのエピトープに対してワクチン接種を行えば免疫療法の有効性を得るには十分であることを示している。
【０１７６】
実施例５: 材料と方法
DNAワクチン  本研究に用いられたDNAワクチンと対照のプラスミドについては表６に記載している。イントロンA配列、ウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナル、pUC19複製起点、およびアンピシリン耐性遺伝子と共にサイトメガロウイルス(CMV)前初期プロモーターをコードしている発現ベクターp7134(PowderJect Vaccines Inc., Madison, WI)は、ワクチンのうちの2種の骨格ベクターとして用いた。最小の10アミノ酸HIV CTLエピトープであるRGPGRAFVTI(V3-10)、およびHIV特異的Tヘルパーエピトープをコードするより長い15量体ペプチドであるRIQRGPGRAFVTIGK(V3-15)は、Balb/cマウス中で認められる(Shirai, J. Immunol. 148, 1657-1667, 1992)。これらの配列をコードするオリゴヌクレオチドをp1734中に上述のとおりクローン化し、プラスミドpV3-10およびpV3-15を作製した。HBcAg担体発現ベクターpHBc(PowderJect Vaccines Inc., Madison, WI)はHBcAgをCMV前初期プロモーターの制御下で発現させる。pHBc-V3-10およびpHBc-V3-15プラスミドを作製するために、V3-10およびV3-15 HIV CTLエピトープを、報告されているとおりHBcAgのイムノドミナントなループ中のアミノ酸80と81の間にクローン化した。
【０１７７】
DNA免疫化  プラスミドDNAを1〜3μmの金粒子上に、既に報告されているようにして(Royら, 上述の文献)の方法で1mgの金あたり2.0μgのDNAの比率で沈殿させた。5〜6週齢のBalb/cマウスをPowderJect(登録商標) XR遺伝子送達デバイス(PowderJect Vaccines Inc., Madison, WI)を用いて、既に報告されているようにして(Eisenbraunら, DNA Cell Biology, 12:791-797, 1993)、表皮の細胞中にDNAを直接的に送達させて免疫した。初回免疫とブースター免疫は4週間の間隔をあけた。
【０１７８】
Tヘルパーサイトカインのin situ ELISA   in situでのT細胞サイトカインアッセイ(McKinneyら, J. Immunol. Methods, 237:105-117, 2000)を、マウスTヘルパー細胞によって分泌されるIFNγおよびIL-4の量の測定に適用した。マウスの脾臓細胞を抗マウスCD8 Dynabeads(Dynal, Oslo, Norway)を製造者の使用説明書に従って用いてCD8+ T細胞を枯渇させた。マウスIFNγおよびIL-4 ELISAキット(Biosource, Camarillo, CA)を分泌されたサイトカインを測定するために用いた。CD8を枯渇させた脾臓細胞を、あらかじめ抗IFNγまたは抗IL-4をコートした96ウエルプレートのウエル中で、ウエルを重複して用い、1ウエルあたり1 X 106個および1 X 105個にて、1μg/mLの組換えB型肝炎コア抗原タンパク質(Biodesign, Saco, ME)、1μg/mLのMHCクラスII(I-Ad)拘束性HIV-1 IIIBペプチド(残基308-322、RIQRGPGRAFVTIGK)(Shiraiら, 上述の文献)、抗原を含まない培地(陰性対照)、または5μg/mLのコンカナバリンA(陽性対照)の存在下で、3日間にわたり培養した。ELISAは製造者の使用説明書に従って行い、分泌されたサイトカインの量を標準曲線を用いて定量した。
【０１７９】
ELISPOTアッセイ  CD8 IFNγ ELISPOTアッセイは本質的には上述のとおり行った。簡潔に記せば、脾臓組織を穏和に解離させ、70μmの細胞ストレイナー(BD Falcon, Bedford, MA)を通してろ過することによりマウス脾臓細胞を集めた。そのろ液をACK溶解バッファー(BioWhittaker, Walkersville, MD)中で5分間インキュベートして赤血球を溶解させ、次いで、5%ウシ胎児血清(Harlan Bioproducts, Indianapolis, IN)およびペニシリン/ストレプトマイシン(Sigma Chemical Co., St. Louis, MO)を添加したRPMI1640(BioWhittaker)で3回洗った。脾臓細胞を、あらかじめ15μg/mLの抗マウスIFNγ mAb(BD Pharmingen, San Diego, CA)でコートした96ウエルのニトロセルロースフィルタープレート(Millipore, Bedford, MA)中、1ウエルあたり1 x 106、5 x 105、および2.5 x 105細胞にて、ウエルを重複して用いて培養した。H-2Dd拘束性のHIV gp120特異的CTLエピトープ(Takashitaら, J. Immunol. 154:1973-1986, 1995)をコードするペプチドを、終濃度が1μg/mLとなるように添加した。24時間後、IFNγを分泌している細胞の数を、ビオチニル化抗マウスIFNγ検出抗体(BD Pharmingen)を用い、続いてストレプトアビジンをコンジュゲートさせたアルカリフォスファターゼを用いることによって、可視化した。スポット形成細胞(SFC)の数をImagePro Plusソフトウェア(Media Cybernetics, Silver Spring, MD)で計数した。
【０１８０】
チャレンジ  雌のBalb/cマウスに対して、HIVIIIB gp160(Ian Ramshaw博士から好意により提供を受けた)を発現している組換えワクシニアウイルスの1 X 107プラーク形成ユニットを、2回目のDNAブースター免疫の12週間後にチャレンジした。チャレンジの3日および7日後に卵巣を集め、ホモジナイズし、超音波処理し、トリプシン処理し、プラークアッセイによってHIV-ワクシニアウイルス力価を測定した。10倍連続希釈物をCV-1インディケーター細胞上に、重複させてプレーティングした。48時間後にクリスタルバイオレットでプラークを染色し、各希釈について計数した。検出限界は100pfuであった。
【０１８１】
結果
HIV特異的CTLエピトープをコードするDNAワクチンは、明確にHIV特異的なまたは無関係なCD4 Tヘルパー応答をマウスにおいて誘導する
HIV特異的CTLエピトープとHIVまたは無関係なTヘルパー(Th)抗原のいずれかとをコードするDNAワクチンを表６に示すとおり構築した。ここで用いた無関係なTh抗原はB型肝炎コア抗原(HBcAg)であり、それを高度に免疫原性の粒子中に組み立てると、強力なTh応答を実験動物およびヒトで誘導する(Milchら, J. Virol. 71:2192-2201, 1997)。粒子の構造を解離させることなく異種のエピトープをHBcAg中に挿入すると、これらのエピトープは高度に免疫原性となる。HIV特異的Th抗原(V3-15)は、Balb/c I-Ad MHCクラスII分子を含むいくつかのMHCタイプによって認識されるHIV-1 gp160のV3ループに対応する15量体のエピトープである(Shiraiら, 上述の文献)。HIV CTLエピトープ(V3-10)はV3-15 Thエピトープとオーバーラップする10量体である(Takashitaら, 上述の文献)。上記15量体と10量体のエピトープの双方を、エピトープ単独、またはHBcAgのイムノドミナントなループ内内に組み入れたエピトープのいずれかを発現するDNAワクチンベクター中にクローン化した。このクローニングによって、Th抗原の不在下にV3-10 CTLエピトープをコードするか(pV3-10)、HIV特異的Th抗原内にV3-10 CTLエピトープをコードするか(pV3-15)、または無関係なHBcAg Th抗原内にV3-10 CTLエピトープをコードする(HBcAg-V3-10)、4種のDNAワクチンを作製した。第4のワクチン(HBc-V3-15)はHIVおよびHBcAg Th抗原の双方においてCTLエピトープをコードする(表６)。
【０１８２】
DNAワクチンが明確にHIV特異的なまたは無関係なCD4 Tヘルパー細胞応答を誘導したかどうか確かめるために、4匹のマウスの群に4種のワクチンのうちの1種または2種の対照ベクター(pHBcまたはp7134)のうちの1種を用いて免疫した(表６)。初回免疫および2回のブースター免疫の後、各ワクチンによって誘導されるHIVおよびHBcAg特異的Thサイトカインの分泌応答を測定するためにin situELISAを用いた(McKinneyら, J. Immunol. Methods, 237:105-117, 2000)。新たに外植した、CD8を枯渇させた脾臓細胞を、HIVペプチド(V3-15)または精製肝炎コア抗原のいずれかで刺激した。IL-4は認められなかったが、測定可能な量のIFNγ Th細胞応答が、HIV ThエピトープをコードするDNAワクチン(pV3-15およびpHBc-V3-15)による場合にのみ、V3-15ペプチドに対して誘導された(図6A)。同様に、HBcAg担体を発現するワクチンのみがHBcAg特異的Th応答を引き出し(pHBc-V3-10、pHBc-V3-15、pHBc)(図6B)、このことはこのTヘルパー抗原がCD4 T細胞の交差反応性刺激を引き出さなかったことを確認するものである。HIV Thエピトープとは異なり、HBcAgはIL-4およびIFNγ Th細胞応答の双方を誘導した。予測したとおり、エピトープをHBcAgのイムノドミナントなループ中に挿入するとHBcAg担体の免疫原性が低減した。これに対して、HIVおよびHBcAg Tヘルパー抗原の組み合わせをコードするキメラpHBc-V3-15ワクチンを用いて免疫した群では、HIV特異的Th細胞応答の著しい上昇が観察された。この結果は、挿入された異種エピトープの免疫原性を増強するHBcAg担体の能力を示した我々の知見と一致するものである。
【０１８３】
HIV特異的なまたは無関係なTヘルパーはDNAワクチンによるHIV特異的CD8 T細胞応答の誘導において同等に有効である
HIV Tヘルパー抗原、無関係なTヘルパー抗原、または組み合わせたTヘルパー抗原をコードするDNAワクチンについて、それらのHIV特異的CD8エフェクターT細胞応答を誘導する能力をマウスで試験した。8匹ずつのBalb/cマウスからなる群の各々に、4種のDNAワクチンのうちの1種または2種の対照ベクターのうちの1種(表６)を、PowderJect(登録商標)送達デバイスを用いてそのDNAを直接的に表皮の細胞中に投与することにより(Eisenbraunら, 上述の文献)、初回免疫およびブースター免疫を行った。最終免疫の1週間後に脾臓細胞を単離し、IFNγを産生しているHIV特異的CD8エフェクターT細胞をELISPOTで計数した。図７に示すとおり、Th抗原の不在下でのHIV CTLエピトープ(pV3-10)により免疫すると、検出可能なCD8エフェクターT細胞応答が誘導された。しかし、HBcAg(pHBc-V3-10)、HIV Thエピトープ(pV3-15)、またはその両方のTh抗原と連結したエピトープ(pHBc-V3-15)のいずれかと連結した前記エピトープを用いて免疫したところ、HIV特異的CD8応答の大きな増大が引き起こされた。
【０１８４】
pHBc-V3-15 DNAワクチンは、HIV特異的IFNγを分泌するCD8 T細胞の出現頻度を著しく上昇させたが(図７)、このことはこれら2種のTh抗原の組み合わせが、エピトープ特異的CD8 T細胞応答の誘導に対して共働作用を及ぼすことを示している。興味深いことに、HIV特異的CD8応答のワクチンによる有効なプライミングにはCD4 Th細胞を必要とするが、Th応答の抗原特異性はその応答の大きさに影響を及ぼさなかった。無関係なHBcAgまたはHIV特異的Thエピトープのに連結した最小エピトープをコードするそれぞれpHBc-V3-10およびpV3-15のDNAワクチンは双方とも同程度のレベルのHIV特異的CD8エフェクターT細胞を誘導する(図７)。
【０１８５】
特異的Tヘルプのワクチンによる誘導は、HIV特異的CD8 T細胞の想起(recall)応答を維持し、組換えワクシニア-HIV感染後のウイルス血症を抑制するために必要である
HIV CTLエピトープをベースとしたDNAワクチンは、無関係なまたはHIV特異的なTヘルパー細胞応答の状況においてCD8エフェクターT細胞を同程度の頻度で誘導する能力を有し、それによりウイルス感染に対するCD8想起応答におけるウイルス特異的Th応答の役割を調べることができた。8匹のマウスからなる群を、表１に記載のHIV CTLエピトープをベースとしたDNAワクチンの各々、またはHBcAg制御プラスミドを用いて初回免疫およびブースター免疫して、次いで12週間後にHIV IIIBgp160をコードする組換えワクシニアウイルス(rVV)を用いてチャレンジした。我々がこのチャレンジ系を用いたのは、rVVのクリアランスがそのウイルスによって発現される遺伝子を認識するCD8 T細胞に依存することが先に示されていたためである。マウスをチャレンジ後3日目または7日目に屠殺し、ウイルスが容易に複製しうる場所である卵巣のrVV-HIV力価をアッセイした。
【０１８６】
チャレンジ後の7日目に、無関係なおよびHIV特異的なTヘルパー抗原の双方をコードするpHBc-V3-15ワクチンにより、ウイルス血の最も顕著な低下が示されたが(図８)、これはこのワクチンが最も高頻度なHIV特異的CD8 T細胞応答を誘導したという知見と一致する結果である(図７)。興味深いことに、無関係なHBcAgまたはHIV特異的なTヘルパー抗原（これらは同程度のレベルのHIV CD8 T細胞応答を誘導した）をコードするワクチンによって免疫すると、チャレンジ後のウイルスの抑制に大きな相違が認められた。図８に示すとおり、無関係なHBcAg Tヘルパー抗原(pHBc-V3-10)によって免疫された8匹のマウスは最初はチャレンジ後3日間は感染を抑制したが(P＜0.05)、7日目までには平均ウイルス力価が対照群で観察されたものと有意差のないレベル(P=0.50)まで増加したことによって示されるように、ウイルス封じ込め能力を喪失した。これに対して、HIV特異的Tヘルパー抗原(pV3-15)で免疫されたマウスは感染抑制を維持し、7日目まで有意な防護を示し続けた(P＜0.05)。Tヘルパー抗原が不在のHIV CTLエピトープ(pV3-10)により免疫されたマウスは、rVV-HIVチャレンジに対して防護することはできなかった。このように、感染後7日目には、HIV特異的Tヘルパー抗原(pV3-15、pHBc-V3-15)をコードするDNAを用いて免疫したマウスのみが、対照と比較してウイルス血の有意な低減を示したが、このことはCD8が媒介するウイルス感染抑制におけるウイルス特異的T細胞ヘルプの本質的な役割を示している。
【０１８７】
HIV特異的Tヘルパーのワクチンによるプライミングがチャレンジに対するCD8想起応答の大きさに影響を及ぼすかどうか調べるために、チャレンジの前ならびに3および7日後に存在するHIV特異的CD8 T細胞の数をELISPOTで数えた。予測したとおり、免疫の12週間後およびチャレンジ直前に検出されたCD8 T細胞応答の大きさ(図９)は小さかったが、ブースター免疫の1週間後に検出されたレベルには比例していた(図７)。さらに、無関係な(pHBc-V3-10)または特異的Tヘルパー抗原(pV3-15)のいずれかを用いてチャレンジ前に免疫されたマウスにおけるHIV特異的CD8 T細胞の数には有意差はなかった。しかし、チャレンジの3日後には(図９)、無関係なHBcAgまたはHIV特異的Tヘルパー抗原のいずれかで(pHBc-V3-10、pV3-15、pHBc-V3-15)初回免疫されたマウスの群では有意なHIV特異的CD8 想起応答が生じたが、Tヘルパー抗原の不在下(pV3-10)での初回免疫を受けたマウスではそのような応答が生じなかった。興味深いことに、CD8 T細胞想起応答は、HIV特異的Tヘルパー(pV3-15、pHBc-V3-15)により初回免疫を受けたマウスではチャレンジの7日後まで持続したが、無関係なHBcAg Tヘルパー抗原(PHBc-V3-10)のみの投与を受けたマウスでは持続しなかった。チャレンジの7日後までに、これらのマウスでのHIV特異的CD8 T細胞はチャレンジ前のレベルにまで低下した(図９)。この結果はこの群における感染の7日後のウイルス抑制の喪失と対応しており、このことはワクチンによる特異的Tヘルパーの誘導がワクチンによって引き起こされるCD8 T細胞想起応答の維持に必要であることを強く示している。
【０１８８】
ウイルス特異的CD4 T細胞ヘルプと、チャレンジ後にワクチンにより引き起こされるCD8 T細胞想起応答との関連をさらに調べるために、我々はチャレンジ前とチャレンジの7日後のHIVおよびHBcAg特異的CD4サイトカイン分泌を、CD8を枯渇させた脾臓細胞のin situ ELISAにより測定した。図10Aに示すとおり、HIV特異的Tヘルパー抗原(V3-15)によって初回免疫したマウスは、チャレンジ後に有意なHIV特異的Tヘルパーサイトカイン想起応答を示した。これに対して、チャレンジ前に存在していたHBcAg特異的Tヘルパー細胞応答は、チャレンジ後も変化なく維持されたが(図10B)、このことはHIV-ワクシニア感染が、サイトカインが媒介する、ワクチンによって引き起こされたHBcAg特異的Tヘルパー細胞のバイスタンダー交差活性化を誘導しなかったことを示している。この結果は、長期の休眠期間後のHBcAg Tヘルパー細胞のアネルギーによるものではないが、それは、HBcAg DNAワクチンをワクチン接種されたマウスに最初の初回免疫の1年後にブースター免疫を行ってさえ、HBcAg特異的Tヘルパー細胞応答の大幅な増加が誘導されることから言える(Fullerら, Ann. N.Y. Acad. Sci., 722:282-284, 1995)。これらの結果はウイルス特異的な二次CD8応答の持続およびウイルス感染の封じ込めがウイルス特異的CD4 T細胞の関連した想起におそらく依存していたことを示している。
【表６】
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【図面の簡単な説明】
【０１８９】
【図１】図１はWRG7198のマップである。WRG7198のエレメントとしては、CMV前初期プロモーター(CMVpro)、イントロンA、ヒト組織プラスミノゲンアクチベーターからのシグナルペプチド(TPAsigpep)、末端切断型B型肝炎コア抗原コード領域(HBcAg)、およびウシ成長ホルモンからのポリアデニル化領域(BGHpA)が含まれる。報告されているエピトープの挿入部位はBsp120IおよびNotIである。
【図２】図２はHBcAg-エピトープDNAワクチンのマップである。この図はBsp120IとNotI部位にエピトープが挿入されているWRG7198を図示したものである。エピトープの挿入に伴ってNotI部位が消失していることに注目せよ。
【図３】図３は実施例３の免疫および治療の投与計画を示している。感染前および後に免疫されたアカゲザルはSIV感染前に4週間から8週間の間隔をおあけて4回のDNAでの免疫を受けた。SIVgagDNAでのワクチン接種は3回目のDNA投与時に開始した。全てのアカゲザルに対して、異種のSIV/DeltaB670を静脈内注射してチャレンジし、抗レトロウイルス剤R-9-[2-ホスホニルメトキシプロピル]アデニン(PMPA)の20mg/kgをチャレンジの2週間後に開始した。DNAワクチンまたは対照のベクター(エピトープを含まないHBcAg)を用いる治療的免疫は、無処置の対照を除く全てのアカゲザルに対してチャレンジの6週間後に開始した。4週間間隔で合計6回の治療的なDNAでの免疫を26週目まで行った。抗レトロウイルス治療は30週目に停止した。
【図４】図４は実施例3におけるウイルス量を示す。パネルA：SIV/Delta B670を感染させた3匹の健康で長期未発症の感染している(long-term nonpregressor: LTNP)サルの少なくとも3年間のウイルス量の時間経過を示す。パネルB：SIV/Delta B670の感染後1年以内にAIDSの徴候を示した4匹の進行性のサルのウイルス量を示す。
【図５】図５は、実施例3においてPMPAおよびDNAワクチンの組み合わせでの免疫治療の間、およびその後のアカゲザルにおけるSIV特異的CD8+ T細胞応答を示している。CD8+エフェクターT細胞応答は、あらかじめHBcAg-SIVエピトープ+gag+tatワクチンで処置したMamu-A*01+アカゲザルでエピトープ特異的ペプチドを用いて、ならびにあらかじめSIV gag+tat DNAワクチンで処置したMamu-A*01-アカゲザルでオーバーラップしているgagとtatペプチドを用いて、ELISPOTで測定した。このアッセイの検出の下限はスポット形成細胞25個/106 PBMCである。パネルA：Mamu-A*01陽性のサル、パネルB：Mamu-A*01陰性のサル。
【図６】図６はHIVおよびHBcAg特異的Tヘルパー細胞応答を示す。Th応答は、図に示したDNAワクチンを用いてマウスに初回免疫および1回目のブースター免疫後、測定した。1群あたり4匹のマウスから得た脾臓細胞をブースター投与の7日後に単離し、プールし、CD8 T細胞を枯渇させた。(A)HIV Tヘルパーペプチド(V3-15)または(B)精製HBcAgタンパク質を用いた刺激に応答してのIFN-γおよびIL-4の放出を、「材料と方法」の項に記載のin situ ELISAで測定した。
【図７】図７はHIV特異的CD8エフェクターT細胞の応答を示している。CD8応答は図に示したDNAワクチンを用いてマウスに初回免疫および1回目のブースター免疫後、測定した。2回の別々の実験で、1群あたり8匹のマウスから得た脾臓細胞をプールし、1プールあたりのHIVエピトープ特異的IFN-γを産生しているCD8細胞の数を、単一細胞サイトカインELISPOTアッセイを用いて測定した。バー＝は、2回の実験から得られた平均値の標準誤差(SEM)を意味している。
【図８】図８はrVV-HIVチャレンジからの防護にはHIV特異的Tヘルプが必要であることを示している。1群あたり8匹のマウスを、図に示したDNAワクチンでの免疫後12週目にHIV-gp160を発現している組換えワクシニアウイルスでチャレンジした。結果は卵巣中のプラーク形成ユニット(pfu)の対数で表している。無処置のマウスを対照として用いた。バー＝1群あたり8匹のマウスのSEM。Studentのt検定を行い、そのPレベルでの有意差を示している。
【図９】図９はCD8エフェクター想起機能の維持にはHIV特異的Tヘルパーが必要であることを示している。CD8応答はHIV-ワクシニアチャレンジ後3日目と7日目のマウスで測定した。各群のマウスから得た脾臓細胞をプールし、IFN-γを産生しているエピトープ特異的CD8 T細胞を、単一細胞サイトカインELISPOTアッセイを用いて数えた。バー＝2回の重複実験(その各々が1群あたり4匹からなる)から得られた1群あたり8匹のマウスのSEM。
【図１０】HIVおよびHBcAg特異的Tヘルパー細胞はチャレンジ後に応答する。Th細胞応答はチャレンジ後7日目のマウスで測定した。1群あたり4匹のマウスから得た脾臓細胞をプールし、CD8 T細胞を枯渇させた。(A)HIV Tヘルパーペプチド(V3-15)または(B)精製HBcAgタンパク質を用いた刺激に応答したIFN-γの産生を、「材料と方法」の項に記載のin situ ELISAで測定した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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