(57)【要約】本発明は、インターロイキン９ によって発現がアップレギュレートされる核酸分子の単離に関する。本核酸分子に対応するタンパク質のアミノ酸配列は、サイトカインの構造的特徴をいくつか示す。核酸分子およびタンパク質に加えて、これらの分子の様々な用途も開示する。これらの分子をＴ 細胞誘導性因子と呼ぶ。これらの分子はＳＴＡＴ分子の活性化、急性期タンパク質、および炎症に関与する。【選択図】　　　　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＳＴＡＴ転写因子の発現を刺激する方法であって、前記発現が可能な細胞を、前記細胞に対して前記発現を刺激するのに十分な量のＩＬ−ＴＩＦ／ＩＬ−２１と接触させることを含む方法。
【請求項２】
前記ＳＴＡＴ転写因子がＳＴＡＴ３ またはＳＴＡＴ１ である請求項１の方法。
【請求項３】
前記ＳＴＡＴ転写因子がＳＴＡＴ３ である請求項２の方法。
【請求項４】
前記ＩＬ−ＴＩＦ／ＩＬ−２１が哺乳類ＩＬ−ＴＩＦ／ＩＬ−２１である請求項１の方法。
【請求項５】
前記哺乳類ＩＬ−ＴＩＦ／ＩＬ−２１、ＩＬ−ＴＩＦ／ＩＬ−２１がヒトＩＬ−ＴＩＦ／ＩＬ２１ である請求項４の方法。
【請求項６】
前記ヒトＩＬ−ＴＩＦ／ＩＬ−２１が配列番号２５または配列番号２６によってコードされる請求項５の方法。
【請求項７】
細胞における急性期タンパク質の産生を誘導する方法であって、前記細胞を、前記急性期タンパク質の産生を誘導するのに十分な量のＩＬ−ＴＩＦ／ＩＬ−２１と接触させることを含む方法。
【請求項８】
前記細胞が肝細胞である請求項７の方法。
【請求項９】
前記急性期タンパク質がヒト血清アミロイドＡ 、α１−キモトリプシン、またはハプトグロビンである請求項７の方法。
【請求項１０】
前記ＩＬ−ＴＩＦ／ＩＬ−２１が哺乳類ＩＬ−ＴＩＦ／ＩＬ−２１である請求項７の方法。
【請求項１１】
前記哺乳類ＩＬ−ＴＩＦ／ＩＬ−２１がヒトＩＬ−ＴＩＦ／ＩＬ−２１である請求項１０の方法。
【請求項１２】
前記ヒトＩＬ−ＴＩＦ／ＩＬ−２１が配列番号２５または配列番号２６によってコードされる請求項１１の方法。
【請求項１３】
ＩＬ−ＴＩＦ／ＩＬ−２１分子の活性を調節する方法であって、ＩＬ−ＴＩＦ／ＩＬ−２１活性に対して感受性を持つ細胞を、ＩＬ−ＴＩＦ／ＩＬ−２１活性を調節するのに十分な量のＩＬ−ＴＩＦ−ＩＬ−２１調節物質と接触させることを含む方法。
【請求項１４】
前記調節物質がＩＬ−１０Ｒβ分子に結合する物質である請求項１３の方法。
【請求項１５】
前記調節物質がＩＬ−１０Ｒβ分子に特異的に結合する抗体である請求項１４の方法。
【請求項１６】
前記調節物質がＩＬ−１０Ｒ分子のアンタゴニストである請求項１６の方法。
【請求項１７】
前記ＩＬ−１０Ｒ分子がＩＬ−１０Ｒ分子のアゴニストである請求項１６の方法。
【請求項１８】
前記分子がＩＬ−１０Ｒ分子のアゴニストである請求項１４の方法。
【請求項１９】
前記ＩＬ−１０Ｒ分子がＩＬ−１０Ｒβである請求項１８の方法。
【請求項２０】
炎症物質へのばく露を決定する方法であって、その炎症物質にばく露したと考えられる対象から採取した試料を、ＩＬ−ＴＩＦ／ＩＬ−２１の発現についてアッセイすることを含み、ＴＩＦ の発現が炎症物質へのばく露の指標となる方法。
【請求項２１】
ＩＬ−ＴＩＦ／ＩＬ−２１の調節物質を同定する方法であって、ＩＬ−ＴＩＦ／ＩＬ−２１の調節物質であると考えられる物質を、ＩＬ−ＴＩＦ／ＩＬ−２１の供給源と、急性期タンパク質を発現させる細胞とに接触させ、前記細胞によって産生される急性期タンパク質を決定することを含み、前記物質の不在下での前記細胞による産生と比較した前記急性期タンパク質の産生の変化が、前記物質がＩＬ−ＴＩＦ／ＩＬ−２１調節物質であることの指標となる方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（関連出願）
本願は、出願番号第０９／４１９，５６８号（１９９９年１０月１８日出願）の一部継続出願であり、前記第０９／４１９，５６８号は出願番号第０９／３５４，２４３号（１９９９年７ 月１６日出願）の一部継続出願であり、さらに前記第０９／３５４，２４３号は出願番号第０９／１７８，９７３号（１９９８年１０月２６日出願）の一部継続出願である。これらの出願は全て参照によりそのまま本明細書に組み込まれる。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は新たに単離された核酸分子およびそれらの用途に関する。これらの核酸分子はサイトカイン・インターロイキン９ （「ＩＬ−９」）によってアップレギュレートされることを明らかにする。また、これらの核酸分子によってコードされるタンパク質も開示する。これらの分子は「Ｔ 細胞由来誘導性因子」または「ＴＩＦ 」と記載されていたが、現在では「インターロイキン−２１ 」または「ＩＬ−２１ 」、ならびに「ＩＬ−ＴＩＦ」として知られている。そのため、本明細書ではこれらの用語を可換的に使用することにする。これらの核酸分子は、細胞においてＳＴＡＴ活性化を誘導するタンパク質をコードする。これらは、例えば標的組織の再生の刺激などに使用することができる。さらに、その阻害剤またはアンタゴニストは、他の組織の分化を遅延、防止または阻害するために使用することができる。
【０００３】
（背景および従来技術）
免疫系とその調節に関する知識はこの十年間に著しく増加した。特に重要な一領域は、免疫系を調節するタンパク質および糖タンパク質に関する研究領域であった。最もよく知られているこれらの分子のファミリーの一つはサイトカインである。サイトカインは細胞相互間の「コミュニケーション」に関与する分子である。サイトカインファミリーの個々の構成要員は、広範囲にわたる種々の病理学的状態、例えば癌およびアレルギーなどに関与することがわかっている。サイトカインは、それらの状態の病理に関与する場合もあるが、治療上有用であることも知られている。
【０００４】
インターロイキンはサイトカインの一種である。インターロイキンについては膨大な文献がある。この分野の代表的な特許としては、Ｍｅｒｔｅｌｓｍａｎｎ らの米国特許第４，７７８，８７９ 号、Ｓｔｅｒｎ の米国特許第４，４９０，２８９ 号、Ｍａｒｋらの米国特許第４，５１８，５８４ 号、およびＭｉｙａｊｉらの米国特許第４，８５１，５１２ 号（これらは全てインターロイキン２ （「ＩＬ−２」）に関する）が挙げられるが、これらに限るわけではない。その他、インターロイキン１ （「ＩＬ−１」）に関する特許、例えばＣｏｓｍａｎの米国特許第４，８０８，６１１ 号なども発行されている。これらの特許の開示はいずれも参照により本明細書に組み込まれる。他のインターロイキンに関する最近の特許には、例えば米国特許第５，６９４，２３４ 号（ＩＬ−１３ ）、第５，６５０，４９２ 号（ＩＬ−１２ ）、第５，７００，６６４ 号、第５，３７１，１９３ 号および第５，２１５，８９５ 号（ＩＬ−１１ ）、第５，７２８，３７７ 号、第５，７１０，２５１ 号、第５，３２８，９８９ 号（ＩＬ−１０ ）、第５，５８０，７５３ 号、第５，５８７，３０２ 号、第５，１５７，１１２ 号、第５，２０８，２１８ 号（ＩＬ−９）、第５，１９４，３７５ 号、第４，９６５，１９５ 号（ＩＬ−７）、第５，７２３，１２０ 号、第５，１７８，８５６ 号（ＩＬ−６）、ならびに第５，０１７，６９１ 号（ＩＬ−４）などがある。これらの特許文献を概観しただけでも、インターロイキンファミリーの構成要員の性質の多様性がわかる。さらに大きいサイトカインファミリーになれば、多様性はさらに増加すると推定できる。例えばＡｇｇａｒｗａｌら編「Ｈｕｍａｎ Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ： Ｈａｎｄｂｏｏｋ Ｆｏｒ Ｂａｓｉｃ Ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ 」１９９２年，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ 、Ｐａｕｌ編「Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」１９９３年，Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ ，ｐ．７６３−８３６ ，「Ｔ−Ｃｅｌｌ Ｄｅｒｉｖｅｄ Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ Ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ」および「Ｐｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ」を参照されたい。引用した文献は全て参照により本明細書に組み込まれる。
【０００５】
様々なサイトカイン間の関係は複雑である。ここに引用した文献からわかるように、個々のサイトカインのレベルは増減するので、これは対象によって産生される他の分子のレベルに直接的または間接的な影響を及ぼしうる。影響を受ける分子には他のサイトカインも含まれる。
【０００６】
以前「Ｐ４０ 」と呼ばれていたリンホカインＩＬ−９は、最初はＴ４細胞株の抗原非依存的永久増殖を維持する因子として同定されたＴ 細胞由来分子である。例えば、Ｕｙｔｔｅｎｈｏｖｅら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８５：６９３４ （１９８８）およびＶａｎ Ｓｎｉｃｋ ら，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６９：３６３（１９８９）を参照されたい。これらの文献は、Ｓｉｍｐｓｏｎ ら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１８３：７１５（１９８９）と共に、参照により本明細書に組み込まれる。
【０００７】
ＩＬ−９の活性は、最初は限られたＴ４細胞株に観察され、ＣＴＬ または新鮮単離Ｔ 細胞には活性を認めることができなかった。例えばＵｙｔｔｅｎｈｏｖｅら（前掲）およびＳｃｈｍｉｔｔ ら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９：２１６７（１９８９）を参照されたい。この活性の範囲は、Ｈｕｌｔｎｅｒ らがＥｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．および米国特許第５，１６４，３１７ 号に記載しているように（これらは参照によって本明細書に組み込まれる）、ＩＬ−９およびＴ 細胞成長因子ＩＩＩ （「ＴＣＧＦ ＩＩＩ」）と呼ばれる分子は、ＩＬ−３に対する骨髄由来マスト細胞の増殖応答を強化する因子ＭＥＡ （マスト細胞成長促進活性）と同一であることが、実験的に明らかになったことによって拡大した。ヒト型のＩＬ−９が巨核芽球性白血病細胞の増殖を刺激することもわかった。Ｙａｎｇら，Ｂｌｏｏｄ ７４：１８８０（１９８９）を参照されたい。ＩＬ−９に関する研究によって、ＩＬ−９が赤芽球コロニー形成を支援すること（Ｄｏｎａｈｕｅ ら，Ｂｌｏｏｄ ７５（１２）：２２７１−２２７５ （６−１５−９０ ））、骨髄赤芽球バースト形成細胞の増殖を促進すること（Ｗｉｌｌｉａｍｓら，Ｂｌｏｏｄ ７６：３０６−３１１ （９−１−９０）、そして成人および胎児由来のＢＦＵ−Ｅ のクローン成熟を支援すること（Ｈｏｌｂｒｏｏｋら，Ｂｌｏｏｄ ７７（１０）：２１２９−２１３４ （５−１５−９１） ）も明らかになっている。ＩＬ−９の発現は、ホジキン病および大細胞型退形成リンパ腫にも関連づけられている（Ｍｅｒｚら，Ｂｌｏｏｄ ７８（８）：１３１１−１３１７（９−１−９０））。気管支反応亢進を発症しやすいまたは発症しにくいマウスの遺伝子解析によって、ＩＬ−９遺伝子との連鎖ならびにこのモデルにおけるＩＬ−９産生と感受性との相関関係が解明された（Ｎｉｃｏｌａｉｄｅｓら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９４，１３１７５−１３１８０，１９９７ ）。ヒト遺伝子研究でもＩＬ−９およびＩＬ−９Ｒ 遺伝子が喘息の候補として示されている（Ｄｏｕｌｌ ら，Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｒｉｔ．Ｃａｒｅ Ｍｅｄ．，１５３，１２８０−１２８４，１９９６、Ｈｏｌｒｏｙｄ ら，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ５２，２３３−２３５，１９９８ ）。また、ＩＬ−９トランスジェニックマウスにより、ＩＬ−９発現が肺肥満細胞症、過好酸球増加症、気管支反応亢進および高レベルのＩｇＥ をもたらすことの証明も可能になった（Ｔｅｍａｎｎら，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８８，１３０７−１３２０，１９９８ 、Ｇｏｄｆｒａｉｎｄ ら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６０，３９８９−３９９６，１９９８ 、ＭｃＬａｎｅら，Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐ．Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．１９：７１３−７２０（１９９９））。これらの知見を総合すると、ＩＬ−９はこの疾患に主要な役割を果たすことが強く示唆される。他の研究でも、ＩＬ−９およびこのサイトカインの突然変異タンパク質が喘息およびアレルギーに関連づけられている。例えば、ＰＣＴ 出願ＵＳ９６／１２７５７（Ｌｅｖｉｔｔら）およびＰＣＴ／ＵＳ９７／２１９９２（Ｌｅｖｉｔｔら）を参照されたい（これらの出願はどちらも参照により本明細書に組み込まれる）。
【０００８】
ＩＬ−９は対象における他の分子のレベルにも影響を及ぼすことが知られている。Ｌｏｕａｈｅｄ ら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５４：５０６１−５０７０（１９９５）、Ｄｅｍｏｕｌｉｎら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１６：４７１０−４７１６ （１９９６）を参照されたい（これらの文献はどちらも参照により本明細書に組み込まれる）。影響を受ける分子が生体系でそれら自身の機能を持つことは理解されるだろう。例えばＤｅｍｏｕｌｉｎらは、ＩＬ−９の既知の活性の多くが、ＳＴＡＴ転写因子の活性化によって媒介されることを明らかにしている。したがって、その存在および／ またはレベルが他の分子、例えばサイトカインなどによる影響を受ける分子を同定する努力には、絶えず関心が払われている。
【０００９】
本明細書では、そのような分子を、以下に記載する。本発明のタンパク質をコードする核酸分子はＩＬ−９の存在下では発現されるが、ＩＬ−９の不在下では発現されないことがわかった。したがって、これらの分子は、とりわけ、対象におけるＩＬ−９の発現または効果の「マーカー」となる。かつてＴ 細胞由来誘導性因子または「ＴＩＦ 」と呼ばれていたこれらの分子は、現在インターロイキン２１または「ＩＬ−２１ 」と呼ばれている。本発明のこれらの特徴および他の特徴は以下の説明から理解されるだろう。
【００１０】
（好ましい態様の詳細な説明）
実施例１
ネズミリンパ腫細胞株ＢＷ５１４７は、培養培地にサイトカイン類を添加しなくてもインビトロで成長することができる細胞としてよく知られている。ＩＬ−９によって誘導される遺伝子を同定するために、ＩＬ−９（２００Ｕ／ｍｌ ）を添加して、またはＩＬ−９を添加せずに、ＢＷ５１４７の試料を２４時間培養した。次に、グアニジンイソチオシアネート溶解およびＣｓＣｌ勾配遠心分離によって全ＲＮＡ を単離した。これらの技術は当技術分野ではよく知られている。続いて、オリゴ（ｄＴ）セルロースカラムを使って、ポリアデニル化ＲＮＡ を全ＲＮＡ から精製した。次に、単離されたポリＡ ＲＮＡ を使って、二本鎖ｃＤＮＡを作製した。市販のオリゴ（ｄＴ）プライマーを使用した。３ 〜５ μｇ のポリＡ ＲＮＡ を１ μｇ のオリゴ（ｄＴ）と共に７０℃に１０分間加熱した後、５ ×第一鎖バッファー（２５０ｍＭ ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、３７５ｍＭ ＫＣｌ 、１５ｍＭ ＭｇＣｌ２）、１０ｍＭジチオスレイトール、５００ μＭ のデオキシヌクレオチド三リン酸、および８００Ｕの逆転写酵素と共にインキュベートした。反応混合物の総液量は２０μｌ とし、３７℃で１ 時間にわたって反応を進行させた。これにより、ｃＤＮＡの第一鎖が合成された。第二鎖合成は、３０μｌ の５ ×第二鎖バッファー（１００ｍＭ トリス−ＨＣｌ（ｐＨ６．９） ）、４５０ｍＭ ＫＣｌ 、２３ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．７５ｍＭβ−ＮＡＤ＋ 、５０ｍＭ （ＮＨ４）２ＳＯ４を、６０Ｕ の大腸菌由来ＤＮＡ ポリメラーゼＩ 、２Ｕの大腸菌ＲＮアーゼＨ 、１０Ｕ の大腸菌ＤＮＡ リガーゼ、および２５０ μＭ のデオキシヌクレオチド三リン酸と共に添加することによって行い、最終液量は１５０ μｌ にした。その混合物を１６℃で２ 時間インキュベートした。
【００１１】
フェノール− クロロホルムを使って産物を抽出し、エタノールで沈殿させた。次に、最終ｃＤＮＡ産物を２００ μｌ のＴＥに再懸濁した。
【００１２】
これらのステップを、刺激ＢＷ５１４７細胞（以下「テスター（ｔｅｓｔｅｒ）」）と、非刺激ＢＷ５１４７（以下「ドライバー（ｄｒｉｖｅｒ）」）との両方について、並行して行なった。
【００１３】
実施例２
次に、実施例１ で作製したｃＤＮＡを周知の方法によるサブトラクションクローニングにかけた。これを行なうために、以下の６ つのオリゴヌクレオチドを作製した：
５’−ＡＧＣＡＣＴＣＴＣＣ ＡＧＣＣＴＣＴＣＡＣ ＣＧＣＡ−３’（配列番号１ ）、
５’−ＧＡＴＣＴＧＣＧＧＴ ＧＡ−３’ （配列番号２ ）、
５’−ＡＣＣＧＡＣＧＴＣＧ ＡＣＴＡＴＣＣＡＴＧ ＡＡＣＡ−３’（配列番号３ ）、
５’−ＧＡＴＣＴＧＴＴＣＡ ＴＧ−３’ （配列番号４ ）、
５’−ＡＧＧＣＡＡＣＴＧＴ ＧＣＴＡＴＣＣＧＡＧ ＧＧＡＡ−３’（配列番号５ ）、および
５’−ＧＡＴＣＴＴＣＣＣＴ ＣＧ−３’ （配列番号６ ）。
【００１４】
これらの使用方法は以下に説明するとおりである。二本鎖ｃＤＮＡ（２ μｇ ）を制限エンドヌクレアーゼＤｐｎＩＩ で消化し、フェノール− クロロホルムで抽出し、エタノールで沈殿させ、２０μｌ のＴＥ（１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５） 、１ｍＭ ＥＤＴＡ）に再懸濁した。脱塩した配列番号１ （２ｍｇ／ｍｌ）４ μｌ 、脱塩した配列番号２ （１ｍｇ／ｍｌ）４ μｌ 、５ ×アダプターバッファー（３３０ｍＭ トリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．６ 、５０ｍＭ ＭｇＣｌ２、５ｍＭ ＡＴＰ ）１０μｌ 、ＤＴＴ （１００ｍＭ ）７ μｌ 、および Ｈ２Ｏ ２８ μｌ を含む混合液中で、１２μｌ （１．２ μｇ ）の切断済みｃＤＮＡを、二本鎖状の配列番号１ および２ に連結した。この混合物を５０℃に加熱した後、それを１ 時間かけて１０℃に冷却することによって、オリゴヌクレオチドを互いに、そして試料ＤＮＡ にアニールさせ、次に５ μｌ のＴ４ ＤＮＡリガーゼを添加し、１２〜１６℃で１２〜１４時間インキュベートした。１４０ μｌ のＴＥを添加することによって、混合物を希釈した。次に、試料２００ μｌ に対して以下に述べるようにＰＣＲ を行なった。
【００１５】
実施例３
ＰＣＲ を行なうために、６６ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．８） バッファー中の連結産物２ μｌ 、４ｍＭ ＭｇＣｌ２ 、１６ｍＭ （ＮＨ４）２ＳＯ４、３３μｇ／ｍｌ ＢＳＡ、０．３ｍＭ の各ｄＮＴＰ（濃度５００ μＭ ）および２ μｇ の配列番号１ を含む試料２００ μｌ を、まず７２℃で３ 分間加熱することにより、実施例２ の産物にハイブリダイズしている配列番号２ を全て除去した。次に、５ＵのＴａｑ ポリメラーゼを使って３’端を埋めた（７２℃、５ 分間）。２０サイクルの増幅（１ サイクルは９５℃で１ 分、７２℃で３ 分）を行なった後、産物を合わせ、フェノール抽出し、エタノール沈殿し、ＴＥバッファーに０．５ μｇ／μｌ の濃度で再懸濁した。以下、これをレプレゼンテーション（ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ）という。
【００１６】
実施例４
次に、サブトラクティブハイブリダイゼーションに備えて、ＤｐｎＩＩ での消化によって配列番号１ をレプレゼンテーションから除去した。得られた消化物をフェノール抽出し、エタノール沈殿した。非刺激試料の場合はこれによってドライバーが得られ、刺激試料ではテスターを得た。テスターの一部（２０μｇ ）を１．２ ％アガロースゲルでゲル精製し、単離した。配列番号１ および２ を連結した時と同じ上述の方法で、試料（２ μｇ ）を配列番号３ および４ に連結した。
【００１７】
サブトラクティブハイブリダイゼーションの第１ サイクルでは、配列番号３ および４ を連結したテスターの試料０．４ μｇ を、４０μｇ のドライバーｃＤＮＡと混合した。その混合物をフェノール抽出し、エタノール沈殿し、２ μｌ の３ ×ＥＥバッファー（３０ｍＭ ＥＰＰＳ ｐＨ８．０ ）、３ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ８．０、３ｍＭ ＥＤＴＡに溶解した。これに３０μｌ の鉱油を重層し、９８℃で５ 分間変性した。５Ｍ ＮａＣｌ 溶液（０．５ μｌ ）を加え、ＤＮＡ を６７℃で２０時間ハイブリダイズさせた。反応混合物をＴＥおよびｔＲＮＡキャリヤで２００ μｌ に希釈した。この試料を７２℃で３ 分間インキュベートして配列番号４ を融解除去した後、４ つのＰＣＲ 反応（２００ μｌ ）を用意した。これらはプライマーを含まない希釈ハイブリダイゼーションミックス２０μｌ を含み、再アニールしたテスターの末端を埋めた後、配列番号３ の試料を添加して１０サイクルの増幅を行ない（１ サイクルは９５℃で１ 分、７０℃で３ 分）、次に産物を合わせ、フェノール抽出し、エタノール沈殿し、４０μｌ の０．２ ×ＴＥバッファーに再懸濁した。この物質２０μｌ を２０Ｕ のマングビーンヌクレアーゼと共に４０μｌ の総液量で３０分間処理することによって、一本鎖ＤＮＡ を分解した。試料をｐＨ８．９ の５０ｍＭトリス−ＨＣｌに希釈（１ ：５ ）した後、９８℃で５ 分間加熱して、酵素を失活させた。上述の産物２０μｌ 、配列番号３ （１ｍｇ／ｍｌ）２ μｌ 、およびＴａｑ ＤＮＡ ポリメラーゼ１ μｌ （５Ｕ）を使って、第２ のＰＣＲ を行なった。合計１８サイクルした（１ サイクルは９５℃で１ 分、７０℃で３ 分）。産物を合わせ、フェノール抽出し、エタノール沈殿し、０．５ 〜１ μｇ／μｌ の濃度で再懸濁した。以下、この産物を「ＤＰ１ 」または第１ 差分産物（ｆｉｒｓｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ ｐｒｏｄｕｃｔ）という。
【００１８】
実施例５
次にＤＰ１ をエンドヌクレアーゼＤｐｎＩＩ で上述のように消化し、配列番号１ 、２ 、３ および４ に関する説明と同じ手順で、配列番号５ および６ に連結した。実施例４ に記載のサブトラクティブハイブリダイゼーションおよび選択的増幅を繰り返して、第２ 差分産物（「ＤＰ２ 」）を得た。これらの実験では、５０ｎｇのＤＰ１ をテスターとした。ドライバー（４０μｇ ）は上述のとおりとした。アダプターとして配列番号３ および４ を使用してこのプロセスを繰り返すことにより、第３ 差分産物を得た。第３ 産物を得るために、１００ｐｇ のテスターを４０μｇ のドライバーと混合した。９５℃で１ 分および７０℃で３ 分を１ サイクルとして最終増幅を２２サイクル行った点以外は、上述したプロトコールの全ステップを繰り返した。これにより、最終差分産物を得た。
【００１９】
実施例６
最終差分産物をＤｐｎＩＩ で消化した後、市販のベクター、すなわちｐＴＺ１９ＲのＢａｍＨＩ 部位にクローニングした。標準的方法で二本鎖ＤＮＡ プラスミドを調製し、配列決定した。その配列を、ＧｅｎＢａｎｋ およびＥＭＢＬデータベースの既知配列と、ＢＬＡＳＴ 検索プログラムを使って比較した。
【００２０】
このサブトラクション操作を経て、短いｃＤＮＡフラグメント、すなわち約２００ 塩基対長のフラグメントが同定された。このフラグメントを使って、ＢＷ５１４７細胞由来のｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングした。最も大きいクローンを配列決定した。これについて以下に述べる。これはどの既知配列とも一致しない。
【００２１】
このヌクレオチド配列（配列番号７ ）は１１１９塩基長であり、１７９ アミノ酸長のタンパク質をコードする５３７ 塩基対のオープンリーディングフレームを含んでいる。このタンパク質の予想分子量は２０，０９３である。ＡＴＧ コドンはさらに２ つあり、これらが開始コドンとして作用したとすると、それぞれ１９，３３５ダルトンおよび１８，７７０ダルトンの分子量を持つ１７２ アミノ酸長および１６７ アミノ酸長のタンパク質が生成する。各形態のタンパク質は、小胞体によって分子から切り離されて成熟タンパク質を与える疎水性アミノ酸の配列を特徴とする。
【００２２】
配列を解析すると、３ つのＡＴリッチなモチーフ（ＴＴＡＴＴＴＡＴ）が見つかる。これらのモチーフはサイトカインおよび癌遺伝子の５’非翻訳領域にしばしば見いだされる。Ｋｒｕｙｓ ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４５：８５２（１９８９）には、これらの反復配列がｍＲＮＡの安定性を調節することが示されている。
【００２３】
実施例７
次に、ＴＩＦ αのゲノムＤＮＡ を同定するために、上記実施例６ で単離し解析したｃＤＮＡをプローブとして使用した。
【００２４】
１２９ 系統マウスから作製したゲノムライブラリーを、標準的方法に従って配列番号７ でスクリーニングした。陽性クローンから得られるＥｃｏＲＩ フラグメントをプラスミドｐＺＥＲＯ にサブクローニングし、部分的に配列決定した。その部分配列を配列番号８ に記載する。
【００２５】
実施例８
上記実施例７ に記載の陽性クローンから得られる別のＥｃｏＲＩ フラグメントもサブクローニングした。ホモロジーは高かったが、同一配列ではなかった。具体的に述べると、この配列のイントロン１ は配列番号８ と９８％同一、イントロン２ は１００ ％同一、イントロン３ は９２％同一だった。
【００２６】
これらの配列で目を引くのはプロモーターが全く相同ではないことである。これは独立した調節を受けることを示唆している。５’非翻訳領域は９２％同一である。ＴＩＦ αの第１ エキソンはエキソン１ αとエキソン１ βとに分割される。第１ コーディングエキソン（ＴＩＦ αの場合はエキソン１ｂ、ＴＩＦ βの場合はエキソン１ ）は９９．５％同一であり、第２ エキソンは１００ ％同一、第３ エキソンは９７％同一、第４ エキソンは９８．５％同一、第５ エキソンは９６％同一である。３’非翻訳領域におけるホモロジーは９６％である。
【００２７】
実施例９
上記実施例８ に記載した情報を使って、ＴＩＦ βと名付けた第２ クローンのｃＤＮＡ配列を推定した。これを配列番号９ に記載する。ゲノムＤＮＡ 配列も上記と同じ方法で確認した。これを配列番号４２に記載する。アミノ酸配列は配列番号４１である。
【００２８】
ＴＩＦ αのコード領域と比較して、ＴＩＦ βのコード領域は６ つのサイレント変異を持つ。重要でないアミノ酸変異をもたらす変化は２ つ存在する（３６位でも１０３ 位でもＴＩＦ αのＶａｌ がＴＩＦ βではＩｌｅ になる）。１１２ 位には、Ｇｌｎ がＡｒｇ になるという、重要度の高い変異もある。
【００２９】
実施例１０
ＴＩＦ 類の発現を調べるための実験を計画した。ＢＷ５１４７細胞を様々な時間（０．２ 、０．５ 、１ 、２ および２４時間）にわたって組換えネズミＩＬ−９（２００Ｕ／ｍｌ ）で刺激した。次に、標準的な方法と試薬を使って、全ＲＮＡ を単離した。次に、５ μｇ の全ＲＮＡ とオリゴ（ｄＴ）プライマーとを使って、逆転写を行なった。次に、２０ｎｇの全ＲＮＡ に相当するｃＤＮＡの試料を、異なるプライマーを使って２５サイクル増幅した（１ サイクルは９４℃で４ 分、５７℃で１ 分、および７２℃で２ 分である）。使用したＴＩＦ プライマーは、
５’−ＣＴＧＣＣＴＧＣＴＴ ＣＴＣＡＴＴＧＣＣＣ Ｔ−３’ （配列番号１０）
および
５’−ＣＡＡＧＴＣＴＡＣＣ ＴＣＴＧＧＴＣＴＣＡ Ｔ−３’ （配列番号１１）
（それぞれセンスおよびアンチセンス）である。
【００３０】
これらは、それぞれ配列番号７ のヌクレオチド１０７−１２７ およびヌクレオチド７６６−７８６ に相当する。対照として、β− アクチンも１８サイクル増幅した（第１ サイクルは９４℃で４ 分、６０℃で１ 分、７２℃で２ 分とし、続くサイクルは９４℃で１ 分、６０℃で１ 分、７２℃で２ 分とした）。
【００３１】
増幅に続いて、ＰＣＲ 後の産物を１ ％アガロースゲルで解析し、特異的増幅を確認した後、放射性内部プローブを使ってブロッティングを行なった。使用したＴＩＦ 用プローブは、
５’−ＧＡＣＧＣＡＡＧＣＡ ＴＴＴＣＴＣＡＧＡＧ−３’ （配列番号１２）
である。ここに記載する条件およびプローブはどちらのＴＩＦ にも特異的ではないが、ＴＩＦ αの増幅産物はＫｐｎＩ制限部位を含み、ＴＩＦ βの場合はこの制限部位を含まない。増幅産物をＫｐｎＩで消化したところ、ＩＬ−９によって誘導されるＴＩＦ ｍＲＮＡの全てではないにしても大半がＴＩＦ αであることがわかった。これは、ＴＩＦ α発現がＩＬ−９によって迅速に誘導されることを示唆している。ＴＩＦ αのｍＲＮＡは３０分の刺激後には検出することができ、１ 時間から２４時間までの期間をかけてプラトーに達した。
【００３２】
実施例１１
次に、上述したＩＬ−９によるＴＩＦ ｍＲＮＡの誘導がタンパク質合成を必要としないことを示す実験を行なった。これらの実験では、実施例１０で述べたように２４時間刺激した細胞（ただし、１０μｇ／ｍｌのタンパク質合成阻害剤シクロヘキシミドを４．５ 時間加えたもの、またはシクロヘキシミドを加えなかったもの）から、全ＲＮＡ を抽出した。並行して行なったもう一組の実験では、細胞を刺激しなかった。全ＲＮＡ を抽出し、実施例１０で述べたようにＲＴ−ＰＣＲ増幅を行なった。ＰＣＲ 後の産物を臭化エチジウム染色した１ ％アガロースゲルで解析した。タンパク質合成を遮断してもＩＬ−９による誘導は起こることがわかった。したがってＩＬ−９の効果は媒介タンパク質の合成を必要としない直接的効果である。
【００３３】
実施例１２
これらの実験では、ＴＩＦ ｍＲＮＡの誘導におけるＳＴＡＴタンパク質の役割を、細胞株ＢＷ５１４７の誘導株で調べた。第１ の細胞株ＢＷｈ９Ｒ は野生型ヒトＩＬ−９受容体を発現させる。ＢＷ−Ｐｈｅ１１６ 株は、ＩＬ−９受容体のＳＴＡＴ転写因子活性化能力を失わせる単突然変異を（１１６ 位に）持つトランスフェクタントである。さらにもう一つの株ＢＷ−ｍｕｔ６ は、ＩＬ−９受容体のＳＴＡＴ５ 活性化能力を失わせるが、ＳＴＡＴ１ およびＳＴＡＴ３ 活性化能力は変化させない突然変異を持つ。最後に、細胞株ＢＷ−ｍｕｔ７ は、ＩＬ−９受容体のＳＴＡＴ１ およびＳＴＡＴ３ 活性化能力を失わせるが、ＳＴＡＴ５ 活性化能は変化させない単突然変異を持つ。
【００３４】
細胞刺激、全ＲＮＡ の単離、ｃＤＮＡの逆転写および増幅は全て、実施例１０に記載した通りに行なった（細胞は２４時間刺激した。ヒト組換えＩＬ−９およびネズミ組換えＩＬ−９の両方を使用した）。ＰＣＲ 産物を上述のように臭化エチジウム染色した１ ％アガロースゲルで解析した。
【００３５】
この解析により、ヒトＩＬ−９はＢＷ−Ｐｈｅ１１６ での発現を誘導しないことがわかった。これはＳＴＡＴ転写因子の関与を示唆している。ＩＬ−９はＢＷ−ｍｕｔ６ 突然変異株ではＴＩＦ 発現を誘導するが、ｍｕｔ７変異株ではＴＩＦ 発現を誘導しないことがわかった。これは、ＳＴＡＴ１ またはＳＴＡＴ３ が関与し、ＳＴＡＴ５ は関与しないことを示唆している。
【００３６】
実施例１３
次に、正常マウス脾細胞におけるＴＩＦ ｍＲＮＡの発現を調べた。
【００３７】
１０〜１２週齢のＢａｌｂ／ｃマウスから得た脾細胞を、対照培地または２０μｇ／ｍｌのＬＰＳ （これはＢ リンパ球およびマクロファージを活性化する）もしくはＣｏｎＡ（これはＴ 細胞を活性化する）もしくはＣｏｎＡ＋ネズミＩＬ−９に対する１ ％遮断抗血清を補足した対照培地で２４時間培養した。対照としてβ− アクチンを使用した。ＲＮＡ の精製、ＲＴ−ＰＣＲ解析は上述のように行なった。
【００３８】
得られたデータから、ＴＩＦ は休止脾細胞ではせいぜい極めて弱く発現されるに過ぎず、ＬＰＳ では誘導されないが、ＣｏｎＡでは強く誘導されることがわかった。抗ＩＬ−９抗血清はＣｏｎＡによる誘導に影響を及ぼさなかった。これは、この効果がＩＬ−９によって媒介されるのではないこと、すなわち他のサイトカインによって媒介されることを示唆している。
【００３９】
ＣｏｎＡによって活性化された脾細胞をＲＴ−ＰＣＲ産物の配列を使って解析したところ、これらの細胞は主として、またはもっぱら、ＴＩＦ αを発現していることがわかった。
【００４０】
実施例１４
さらなる実験により、ＴＩＦ ｍＲＮＡはＩＬ−９誘導が無くても発現されることがわかった。
【００４１】
５ 週齢のＦＶＢ マウスから得た脾細胞中のＴ 細胞を、ナイロンウールカラムを使って濃縮した。次に、ＩＬ−９の存在下または不在下に、ＣｏｎＡ（Ｔ 細胞活性化因子）またはＰＭＡ （これはほとんどの細胞でＰＫＣ を活性化する）を補足した培地で細胞を２４時間刺激した。
【００４２】
全ＲＮＡ を標準的技術を使って単離した後、２．２Ｍホルムアミドを含む１．３ ％アガロースゲルでの電気泳動によって、１０μｇ の試料を分画した。次に、それらの画分をニトロセルロース膜に転写し、標識し、参照により本明細書に組み込まれるＶａｎ Ｓｎｉｃｋ ら，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６９：３６３（１９８９）に準拠したハイブリダイゼーションアッセイでアッセイした。
【００４３】
その結果、ＣｏｎＡによるＴＩＦ の誘導は変化しないことと、ＰＭＡ によって活性化された脾細胞ではＴＩＦ ＲＮＡ はＩＬ−９によって誘導されないことがわかった。
【００４４】
実施例１５
様々な細胞株におけるＴＩＦ ｍＲＮＡの発現を調べた。これらの実験では、ネズミ細胞株を特定のサイトカインで少なくとも１ 日間刺激した。具体的に述べると、９Ｔ７ はＩＬ−２、ＩＬ−４またはＩＬ−９に応答するＴ 細胞リンパ腫である。細胞株ＴＳ３ およびＴＳ６ はＴ ヘルパー細胞クローンに由来し、ＩＬ−２またはＩＬ−９の存在下で増殖する。ＭＣ９ およびＬＩ３８は、ＩＬ−３またはＩＬ−９の存在下で増殖するマスト細胞株である。
【００４５】
刺激に続いて、標準的なグアニジウムイソチオシアネート溶解およびＣｓＣｌ勾配遠心分離によって、全ＲＮＡ を調製した。
【００４６】
次に、９Ｔ７ 株はノーザンブロット法により、実施例１４で述べたように解析し、他の株は上述のＲＴ−ＰＣＲ解析法でアッセイした。
【００４７】
ＩＬ−９はＴ ヘルパー細胞およびマスト細胞におけるＴＩＦ 発現をアップレギュレートするが、ＩＬ−２およびＩＬ−３はＴ ヘルパー細胞およびマスト細胞におけるＴＩＦ 発現をアップレギュレートしないことが明らかになった。しかし９Ｔ７ 細胞株はサイトカインとは無関係にほぼ同じレベル発現を示した。これは、ＩＬ−９がＴＩＦ 発現にとって必須ではないことを示している。
【００４８】
実施例１６
次に、Ｂ 細胞株におけるＴＩＦ ｍＲＮＡの発現を調べた。細胞株Ａ２０ 、７０Ｚ／３ 、およびＢＣＬ−１ は、サイトカイン類が存在しなくてもインビトロで成長するＢ 細胞白血病細胞株である。これらの細胞をＩＬ−４およびＩＬ−９で２４時間刺激し、標準的方法で全ＲＮＡ を単離した。発現は、ＲＴ−ＰＣＲを３５サイクル行なった後、上述のようにブロッティングおよびハイブリダイゼーションを行なうことによって解析した。
【００４９】
その結果、Ｂ 細胞にＴＩＦ 発現を検出することはできるが、ＩＬ−９およびＩＬ−４の存在下でもせいぜい弱くアップレギュレートされるにすぎないことがわかった。
【００５０】
実施例１７
次に、Ｔ ヘルパー細胞株における本発明分子の発現を調べるために実験を行なった。ＴＳ２ およびＴＳ１ は、Ｔ ヘルパー細胞クローンに由来する既知のＴ ヘルパー細胞株であり、ＩＬ−９またはＩＬ−２（ＴＳ２ ）およびＩＬ−９またはＩＬ−４（ＴＳ１ ）の存在下で増殖する。具体的に述べると、ＴＳ１ またはＴＳ２ 細胞を、上記サイトカインの存在下で少なくとも１０日間成長させた後、既知の方法でＲＮＡ を抽出した。分子の発現は、上述のプロトコールを使って、ＲＴ−ＰＣＲ（３５サイクル）によって調べた。ＴＳ１ 細胞ではＩＬ−４もＩＬ−９もＴＩＦ 発現を誘導するが、ＩＬ−２はＴＳ２ 細胞でのＴＩＦ 発現を誘導しない。
【００５１】
実施例１８
様々なマウス器官におけるＴＩＦ ｍＲＮＡの発現を調べた。標準的グアニジンイソチオシアネート法およびＣｓＣｌ勾配遠心法を使って、肝臓、腎臓、心臓、脳、腸、脾臓、胸腺、肺、筋肉および骨髄から全ＲＮＡ を調製した。上述のプロトコールを用いて、４０サイクルのＲＴ−ＰＣＲを行なった。最も強い発現は胸腺組織に見いだされ、脳組織にはそれより弱いシグナルは見いだされ、残りの組織ではさらに弱い発現が見いだされた。
【００５２】
実施例１９
以下の実施例では、２９３−ＥＢＮＡ細胞におけるＴＩＦ αの産生について説明する。
【００５３】
ＴＩＦ αの相補ＤＮＡ については上述した。これを市販の発現ベクターｐＣＥＰ−４に、ＣＭＶ プロモーターが作動できるような形でサブクローニングした。得られたプラスミドを２９３−ＥＢＮＡ細胞に標準的なリポフェクトアミン法を使ってトランスフェクトした。トランスフェクションに続いて、３５Ｓ 標識メチオニンを補足したメチオニン不含培地で、細胞を２４時間インキュベートした。上清を収集し、アクリルアミドゲルにのせた後、電気泳動にかけた。次にゲルを乾燥し、１ 日間、オートラジオグラフィーにさらした。次に、ｃＤＮＡがアンチセンス方向にクローニングされた同じプラスミドを細胞にトランスフェクトすることによって、対照実験を行なった。
【００５４】
センス方向のＴＩＦ をトランスフェクトした細胞からは、約２５〜３０キロダルトンの外来バンドが見つかった。予想分子量と系内での実際の分子量との不一致および不均一性は、糖鎖付加に起因すると考えることができる。一連の並行実験では、ネズミｃＤＮＡを発現させた方法と同じ方法で、ヒトＴＩＦ をコードするｃＤＮＡを発現させた。ｃＤＮＡを変えた点以外は、全て同じ実験パラメータを使用した。
【００５５】
実施例２０
ＣＯＳ 細胞におけるＴＩＦ αの産生を調べるために、さらに実験を行なった。具体的に述べると、ＴＩＦ α ｃＤＮＡ を、Ｄｅｍｏｕｌｉｎらの文献（前掲）に記載のプラスミドｐＥＦ−ＢＯＳ．ｐｕｒｏ に、ＥＦ−１αプロモーターが作動できるような形でサブクローニングした。そのプラスミドｃＤＮＡを、上記と同じリポフェクトアミン法を使って、ＣＯＳ 細胞にトランスフェクトした。３５Ｓ メチオニンを補足したメチオニン不含培地でＣＯＳ 細胞を２４時間インキュベートした後、上清を上記実施例１９で述べたように処理した。ここでも２５〜３０キロダルトンの外来バンド、ならびにおそらく非糖鎖付加型の分子に相当すると思われる１８キロダルトンバンドが観察された。
【００５６】
実施例２１
これらの実験では、メサンギウム細胞、神経メラノーマ（ｎｅｕｒｏｎａｌ ｍｅｌａｎｏｍａ ）細胞、および肝癌細胞においてＴＩＦ がＳＴＡＴ活性化を誘導することを見いだした。サイトカインがＳＴＡＴ因子を活性化すると、これらの因子は二量化し、細胞質から核に移動し、プロモーター中の標的配列に結合することが知られている。実験の詳細を以下に述べる。
【００５７】
上述のトランスフェクト２９３−ＥＢＮＡ細胞を、通常の培地で４８時間インキュベートした後に使用した。また、やはり上述した対照から得られる上清も同様に使用した。マウス腎臓メサンギウム細胞株（以下「ＭＥＳ１３ 」）、ラット褐色細胞腫細胞株（以下「ＰＣ１２」）、４ 種類のヒトメラノーマ（ＳＫ２３、ＡＵＭＡ、ＮＡ−８ｍｅｌ およびＭＵＬＬ）、ヒト肝癌（ＨｅｐＧ３ ）およびラット肝癌（Ｈ−４−ＩＩ−Ｋ）の試料を使用した。細胞試料（０．５ ×１０６ ）を、１ ％の上清の存在下で５ 〜１０分間刺激した。次に、参照により本明細書に組み込まれるＤｅｍｏｕｌｉｎら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１６：４７１０（１９９６）に従って、核抽出物を調製した。簡単に述べると、細胞をＰＢＳ で洗浄した後、１ｍｌ の氷冷低張バッファーに１５分間再懸濁した（使用したバッファーは１０ｍＭヘペスバッファー、ｐＨ７．５ 、１０ｍＭ ＫＣｌ、１ｍＭ ＭｇＣｌ２ 、５ ％グリセロール、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１ｍＭ ＥＧＴＡ、０．５ｍＭ ジチオスレイトール、１ｍＭ Ｐｅｆａｂｌｏｃ（登録商標）、１ｍＭ Ｎａ３Ｖ４ 、および５ｍＭ ＮａＦ である）。次に、６５μｌ のＮＰ−４０ を加えてボルテックスすることにより、細胞を溶解した。１４，０００ｒｐｍ で３０秒間ボルテックスすることによって核をペレット化した後、ＨＥＰＥＳ （２０ｍＭ ）、グリセロール（２０％）およびＮａＣｌ（４２０ｍＭ ）を補足したバッファーで抽出を行なった。核破片を２ 分間の遠心分離によって除去した。ＤＮＡ 結合活性は、ＦｃγＲＩ遺伝子プロモーターのＳＴＡＴ結合部位、すなわち
５’−ＡＴＧＴＡＴＴＴＣＣ ＣＡＧＡＡＡ−３’ （配列番号１３）
および
５’−ＣＣＴＴＴＴＣＴＧＧ ＧＡＡＡＴＡＣ−３’（配列番号１４）
（ＧＲＲ プローブ中の結合部位の上の鎖および下の鎖に相当）を含む「ＧＲＲ 」と呼ばれる３２Ｐ 標識二本鎖オリゴヌクレオチドを使用し、Ｄｅｍｏｕｌｉｎら（前掲）に従って決定した。簡単に述べると、５ μｌ の核抽出物を結合バッファー（１２ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．６ 、１０ｍＭ ＫＣｌ、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ、２．５ ％グリセロール、１ｍｌ あたり０．１ｍｇ のポリ（ｄＩ−ｄＣ） ）中で５ 分間インキュベートした。放射標識ＧＲＲ プローブ（１０５ｃｐｍ、約０．５ｎｇ ）を加え、インキュベーションを２５分間続けた後、非変性ポリアクリルアミドゲルにのせた。
【００５８】
また、ＭＥＳ１３ 細胞で観察された複合体（上述）は、抗ＳＴＡＴ５ 抗体でも抗ＳＴＡＴ３ 抗体でも、部分的にオーバーシフトすることがわかった。これは、（ｉ ）試験した細胞がＴＩＦ の標的であること、および（ｉｉ）ＳＴＡＴ３ およびＳＴＡＴ５ は、ＴＩＦ によって活性化される複合体の主要成分であることを示している。上記実施例１２のプロフィールと比較したＳＴＡＴプロフィールの相違は、細胞源の相違（ヒト対マウス）に起因すると考えられる。また、ヒトＴＩＦ はネズミ細胞でも機能し、その逆も起こることが観察された。
【００５９】
実施例２２
この実施例ではヒトＴＩＦ をコードする核酸分子の単離およびクローニングについて詳述する。まず、ヒト末梢血単核細胞を標準的な密度勾配遠心分離によって調製した。この調製に続いて、試料を、抗ＣＤ３ モノクローナル抗体の存在下または不在下に、３ ×１０６ 細胞／ｍｌ の密度で２４時間培養した（使用した抗体は市販のＯＫＴ３ ｍＡｂで、希釈率１／５００ の腹水の形で使用した）。一般にＴ 細胞由来のサイトカインは例えばＣＤ３ 特異抗体などによって活性化された場合にのみ発現されるので、この抗体を使用した。
【００６０】
標準的なグアニジンイソチオシアネート／ＣｓＣｌ 超遠心分離技術を使って、これらの細胞から全ＲＮＡ を単離した。単離に続いて、そのＲＮＡ の試料１０μｇ をオリゴ（ｄＴ）１５プライマーを使って逆転写した。
【００６１】
上に概説したｃＤＮＡの作製に続いて、１００ｎｇ の全ＲＮＡ に相当する試料を、ネズミｃＤＮＡ配列（すなわち配列番号７ ）に基づく以下のプライマーを使って、ＰＣＲ で増幅した：
５’−ＡＧＧＴＧＣＴＧＡＡ ＣＴＴＣＡＣＣＣＴＧ ＧＡ−３’（配列番号１５）
５’−ＣＣＡＣＴＣＴＣＴＣ ＣＡＡＧＣＴＴＴＴＴ ＣＡ−３’（配列番号１６）。
【００６２】
ＰＣＲ 条件は増幅サイクル数を３０とし、１ サイクルを９４℃で１ 分の後、４２℃で１ 分、次に７２℃で２ 分とした。増幅産物を標準的方法によってアガロースゲルで分離した後、配列決定した。その結果、ｃＤＮＡのフラグメントが増幅されていることがわかった。そこで、配列番号１６の代わりに配列番号１７、すなわち
５’−ＣＡＡＧＴＣＴＡＣＣ ＴＣＴＧＧＴＣＴＣＡ Ｔ−３’
を用いた点以外は同じ材料を使って、第２ の反応を行なった。この第２ のＰＣＲ 反応は２５サイクル行い、１ サイクルは９４℃で１ 分の後、４５℃で１ 分、次に７２℃で２ 分とした。増幅産物を第１ＰＣＲと同じ工程に供した。４１８ ヌクレオチドのフラグメントが増幅された。このフラグメントは抗ＣＤ３ 刺激細胞には見いだされたが、休止ＰＢＭＣには見いだされなかった。このフラグメントのヌクレオチド配列を配列番号１８に示す。
【００６３】
実施例２３
増幅産物を調製した後、標準的な５’−ＲＡＣＥ 法を使ってｃＤＮＡの５’端を単離した。簡単に述べると、プライマーとして配列番号１９、すなわち
５’−ＴＧＧＣＣＡＧＧＡＡ ＧＧＧＣＡＣＣＡＣＣ Ｔ−３’
を使用して、第一鎖ｃＤＮＡを作製した。このプライマーは実施例２２に従って得た配列情報に基づいたものである。簡単に述べると、上述のように調製した１ μｇ の全ＲＮＡ 、２．５ ピコモルの配列番号１９、逆転写酵素、逆転写酵素バッファー、２．５ μｌ のｄＮＴＰミックス（１０ｍＭ）、２．５ μｌ のＭｇＣｌ２ （２５ｍＭ）、および２．５ μｌ のジチオスレイトール（０．１Ｍ）を混合することによって、５’−ＲＡＣＥ 法を行なった。反応を行い、反応完了後に、ＲＮアーゼＨ およびＲＮアーゼＴＩを加えることによって元のＲＮＡ を除去した。組み込まれなかったｄＮＴＰならびにプライマーおよびタンパク質を全て除去した。ターミナルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ ）を使ってｃＤＮＡにテールを付加した。この酵素により、後述する短縮型アンカープライマーの３’結合部位が生成する。テール付加は、精製した第一鎖ｃＤＮＡ、ＴｄＴ 、バッファー（１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、２５ｍＭ ＫＣｌ、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２ ）、および２００ μＭ のｄＣＴＰを混合することによって行なった。
【００６４】
テール付加反応に続いて、
５’−ＣＣＴＡＴＣＡＧＡＴ ＴＧＡＧＧＧＡＡＣＡ Ｇ−３’ （配列番号２０）
および
５’−ＲＡＣＥ 短縮型アンカープライマー：５’−ＧＧＣＣＡＣＧＣＧＴ ＣＧＡＣＴＡＧＴＡＣ ＧＧＧＩＩＧＧＧＩＩＧＧＧＩＩＧ−３’（配列番号２１）
を使って ＰＣＲを行なった。増幅は３５サイクル（１ サイクルは９４℃で１ 分、５６℃で１ 分、および７２℃で２ 分とした）行なった。これに続いて、増幅産物の１／１００ 希釈液５ μｌ に対して、配列番号２０および短縮型汎用増幅プライマー：
５’−ＧＧＣＣＡＣＧＣＧＴ ＣＧＡＣＴＡＧＴＡＣ−３’ （配列番号２２）
を使って、ネスト型の増幅を行なった。増幅は３０サイクル（１ サイクルは９４℃で１ 分、５６℃で１ 分、および７２℃で２ 分とした）行なった。その結果得られたＰＣＲ 産物を標準的方法に従ってクローニングし、配列決定した。
【００６５】
これらの３ つのプロトコール、すなわちフラグメントを得た上述の２ 実験と、やはり上述した５’−ＲＡＣＥ ＰＣＲ とにより、配列決定した増幅産物を整列して、完全配列を得ることが可能になった。
【００６６】
整列に続いて、推定オープンリーディングフレームに隣接するオリゴヌクレオチド、すなわち
５’−ＣＣＴＴＣＣＣＣＡＧ ＴＣＡＣＣＡＧＴＴＧ−３’ （配列番号２３）
および
５’−ＴＡＡＴＴＧＴＴＡＴ ＴＣＴＴＡＧＣＡＧＧ−３’ （配列番号２４）
を作製した。これらのプライマーを使用し、上述のようにＣＤ３ 特異ｍＡｂ で刺激した細胞のｍＲＮＡを使って、オープンリーディングフレーム全体を増幅した。増幅は２５サイクル行なった（１ サイクルは９４℃で１ 分、５６℃で１ 分、および７２℃で２ 分とした）。
【００６７】
ヒトｃＤＮＡの完全配列を配列番号２５に示す。これは、１７９ アミノ酸のタンパク質をコードする５３７ 塩基対のＯＲＦ を含んでいる。これはネズミタンパク質と同じ長さである。ヒトタンパク質はネズミタンパク質と７９％のアミノ酸ホモロジーを有し、ＩＬ−１０ とは２５％のホモロジーを有する。ヒトタンパク質およびマウスタンパク質をそれぞれ配列番号４３および配列番号４０に記載する。
【００６８】
実施例２４
これらの実験では、上述のｃＤＮＡに対応するヒトゲノムＤＮＡ を単離する作業について詳述する。
【００６９】
ｃＤＮＡ配列に基づいて、配列番号２５のヌクレオチド５１−７０ に相当するプライマーおよびヌクレオチド６３１−６５０ の相補鎖に対応するプライマーを開発した。標準的方法でＰＣＲ を行なった。具体的に述べると、ＣＥＳＳ細胞（ＥＢＶ 形質転換リンパ芽球様細胞株）から得た１００ｎｇ のゲノムＤＮＡ をテンプレートとして使用し、３３サイクルの増幅を行なった（増幅１ サイクルは、９４℃で３０秒、５０℃で３０秒、および７２℃で５ 分とした）。配列が単離されたら、それを配列決定した。これを配列番号２６に記載する。この配列は約４．８ キロ塩基長であり、ＴＩＦ 分子をコードする全ゲノム配列を含み、欠けているのは５’隣接領域、プロモーター、および３’端だけであると考えられる。解析したところ、これはネズミのゲノム配列と同様に、６ つのエキソンと５ つのイントロンを含むことがわかった。
【００７０】
標準的な方法を使ってサザンブロットハイブリダイゼーションを行なった。これにより、ゲノムはＴＩＦ 遺伝子を１ コピーだけ含んでいることがわかった。
【００７１】
実施例２５
上述したゲノムＤＮＡ がヒトゲノムのどこに位置するか確認することは、興味深い。この目的を達成するために、２ つの異なるアプローチをとった。第１ のアプローチでは、上述の配列、すなわち配列番号２６を蛍光ラベルで標識し、それを使って、標準的方法による蛍光インサイチューハイブリダイゼーション（「ＦＩＳＨ」）で、ヒトゲノムをプローブした。
【００７２】
もう一つのアプローチでは、放射性ハブリッドクローンのパネルを、配列番号２５のヌクレオチド５１−７１ および５’−ＡＴＣＡＧＡＴＧＧＡ ＴＴＡＣＴＧＡＡＴＧ−３’ （配列番号２７）からなるプローブを使ってスクリーニングした。テンプレートとして２５ｎｇのゲノムＤＮＡ を使って、ＰＣＲ を３５サイクル（１ サイクルは９４℃で１ 分、５５℃で１ 分、および７２℃で２ 分とする）行なった。
【００７３】
どちらの方法論でも、上記遺伝子は染色体１２ｑ１５ に位置することが示された。いくつかの研究により、喘息に関係する疾患がこの部位に関連づけられている。例えば、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．１５：３８９−３９２（１９９７）、Ｏｂｅｒら，Ｈｕｍ．Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ．７（９）：１３９３−１３９８ （１９９８）、Ｎｉｃｋｅｌら，Ｇｅｎｏｍｉｃ ４６（１）：１５９−１６２（１９９７）、Ｔａｋａｈａｓｈｉ ら，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ４４（１）：１５０−２ （１９９７）、Ｂａｒｎｅｓら，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ３７（１）：４１−５０ （１９９６）を参照されたい。これらの文献は全て参照により本明細書に組み込まれる。
【００７４】
公開データベースにあたって、それらのデータベースにこれらの配列の一部が登録されていないかどうかを決定した。ＴＩＦ の最後のエキソンが、染色体１２ｑ１５ 由来のＢＡＣ クローン（アクセッション番号ＡＣ００７４５８；１９１，１１１ 塩基対、ＢＡＣ ＲＤＣＩ１１−４４４Ｂ２４ ）に見つかった。このクローン上に最後のエキソンが同定されたことから、ＴＩＦ 遺伝子はＩＦＮ 遺伝子から約９０キロ塩基の位置にあり、ＩＬ−１０ 関連サイトカインであってＡＫ１５５ と呼ばれる遺伝子からは３０キロ塩基未満に位置することが示唆される（Ｋｎａｐｐｅら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ ７４：３８８１−３８８７ （２０００）） 。
【００７５】
実施例２６
これらの実験ではＴＩＦ タンパク質に結合する抗体の製造について説明する。これらの抗体を作製するために、配列番号７ がコードするアミノ酸４０−６１ からなるペプチドを、ＫＬＨ キャリアタンパク質に、標準的方法により、ペプチド１ｍｇ 対キャリアタンパク質１ｍｇ の比率でカップリングした。この複合体１５０ μｇ を使って、対象動物（ウサギ）を、２ 週間間隔で３ 回免疫処置した。１ 回目の注射では完全フロイントアジュバントに免疫原を乳化し、次の２ 回は不完全フロイントアジュバントに免疫原を乳化した。
【００７６】
最初の採血は最後の注射の１ ヶ月後に行ない、既知の方法に従って血清を調製した。
【００７７】
次にその血清を標準的ウェスタンブロットで試験した。簡単に述べると、配列番号７ または配列番号２５をトランスフェクトした細胞から得られる上清１０μｌ をＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動によって分離した後、ＰＶＤＦ膜にブロットした。抗血清を１：５００ に希釈し、それを、二次抗体としての抗ウサギ抗体および市販の検出キットと共に、標準的ウェスタンブロットプロトコールで使用した。
【００７８】
血清は実際にＴＩＦ タンパク質を認識することがわかった。
【００７９】
実施例２７
この実施例では、ヒトＴＩＦ に応答する細胞株を同定するために行なった実験について述べる。上述のＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ ヒト胎児腎臓細胞を６ 穴プレートに３ ×１０５ 細胞／ ウェルの密度でトランスフェクションの前日に接種した。それらの細胞に、ＣＭＶ プロモーターの制御下にヒトＴＩＦ のｃＤＮＡを含んでいるｐＣＥＰ−４プラスミド２ μｇ をトランスフェクトした。組換えヒトＴＩＦ の産生量を最大にするために、トランスフェクション後に細胞を１．５ｍｌ の通常培地で３ 日間インキュベートした。
【００８０】
ヒトＴＩＦ はネズミ因子と同じ方法でＳＴＡＴ転写因子の活性化を誘導するという仮説を設けた。上記実施例２１のプロトコールに従った。核抽出物と標識ＤＮＡ プローブとの混合物に、抗ＳＴＡＴ抗体（０．７５μｇ の抗ＳＴＡＴ１ 、１ μｇ の抗ＳＴＡＴ３ 、または１ μｇ の抗ＳＴＡＴ５ｂ）を加え、インキュベートすることによって、スーパーシフトアッセイを行なった。
【００８１】
肝癌細胞株ＨｅｐＧ２ を使用すると、ＴＩＦ によって誘発されるバンドシフトが観察された。上述の抗体を使って、その応答をさらに特徴付けた。抗ＳＴＡＴ３ 抗体は遅延複合体（ｒｅｔａｒｄａｔｉｏｎ ｃｏｍｐｌｅｘ ）の大半をシフトさせたが、残りのわずかな複合体は抗ＳＴＡＴ１ 抗体によってスーパーシフトした。抗ＳＴＡＴ−５抗体には効果がなかった。これは、ＳＴＡＴ−３がＴＩＦ によって活性化される主要転写因子であり、ＳＴＡＴ−３ほどではないがＳＴＡＴ−１もＴＩＦ によって活性化される主要転写因子であることを示している。これらの結果は、ヒト肝癌細胞株ＨｅｐＧ３ を使った場合にも、また肝癌細胞株Ｈ４ＩＩＥ を使った場合にも得られた。
【００８２】
実施例２８
この実施例では、レポーター遺伝子を利用してＳＴＡＴ活性化を測定するために計画した実験について説明する。使用したレポーターは「ｐＧＲＲ５ 」である。これは、ＴＫプロモーターの制御下にあるルシフェラーゼ遺伝子の上流に、実施例２１に記載の配列を５ コピー含んでいる。使用した対照は、ＴＫプロモーターの制御下にあるウミシイタケ・ルシフェラーゼ遺伝子を含むベクターｐＲＬ−ＴＫである。
【００８３】
アッセイは、１０６ 個のＨｅｐＧ２ 細胞を１５μｇ のｐＧＲＲ５ および１ μｇ のＰｒｌ−ＴＫと混合することによって行なった（２５０Ｖ、７４Ω、１，２００ μＦ ）。トランスフェクタントのプールを２４穴プレートに分注した（４２，０００細胞／ ウェル）。
【００８４】
１ 時間後に、ヒトＴＩＦ （１ ％ＨＥＫ２９３細胞上清）と３００Ｕ／ｍｌ のヒトＩＬ−６、モックトランスフェクトＨＥＫ２９３細胞から得た１ ％上清、または培地のみで、細胞を刺激した。
【００８５】
２ 時間後に、細胞をペレット化し、溶解した。ルシフェラーゼ活性を標準的方法でモニターした。その結果、本発明の分子による刺激は、ＳＴＡＴ結合部位を含むプロモーターの転写活性を増大させることがわかった。
【００８６】
実施例２９
ＩＬ−６のようなサイトカインによるＳＴＡＴ−３の活性化は、肝癌細胞における急性期タンパク質誘導をもたらすことが知られている。ＴＩＦ が同じ活性を発揮するかどうかを決定するために、５ ×１０６ 個のＨｅｐＧ２ 細胞を、一過性に感染したＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ 細胞から得た１ ％上清で２ 、１３、または２４時間刺激した。一部の実験では、タンパク質合成阻害剤シクロヘキシミドを１０μｇ／ｍｌの濃度で使用し、これを細胞および上清と混合した。刺激に続いて、標準的方法で全ＲＮＡ を単離し、全ＲＮＡ の試料１０μｇ に対してオリゴ（ｄＴ）プライマーを使った逆転写を行なった。次に、
ヒト血清アミロイドＡ （「ＳＡＡ 」）に特異的なプライマー：
ａｇｃｔｃａｇｃｔａ ｃａｇｃａｃａｇａｔ （センス、配列番号２８）
ｃｃｔｇｃｃｃｃａｔ ｔｔａｔｔｇｇｃａｇ （アンチセンス、配列番号２９）、
ヒトα１−アンチキモトリプシンに特異的なプライマー：
ｔｇｔｃｃｔｃｔｇｃ ｃａｃｃｃｔａａｃａ （センス、配列番号３０）
ｔａａｔｔｃａｃｃａ ｇｇａｃｃａｔｃａｔ （アンチセンス、配列番号３１）、
ヒトハプトグロビンに特異的なプライマー：
ｇｔｇｇａｃｔｃａｇ ｇｃａａｔｇａｔｇｔ （センス、配列番号３２）
ａｃａｔａｇａｇｔｇｔ ｔａａａｇｔｇｇｇ （アンチセンス、配列番号３３）、
ヒトβ− アクチンに特異的なプライマー：
ｇｃｔｇｇａａｇｇｔ ｇｇａｃａｇｃｇａｇ （センス、配列番号３４）
ｔｇｇｃａｔｃｇｔｇ ａｔｇｇａｃｔｃｃｇ （アンチセンス、配列番号３５）
を使って、２０ｎｇのＲＮＡ に相当するｃＤＮＡを１８サイクル増幅した。ＳＡＡ の場合、Ｔｍは５４℃だったが、ヒトα１−アンチキモトリプシンとハプトグロビンの場合は５２℃、β− アクチンの場合は５６℃だった。臭化エチジウム染色したアガロースゲルで、標準的方法によって、ＰＣＲ 産物を解析した。
【００８７】
その結果、ＴＩＦ はＳＡＡ およびα１−キモトリプシンを強く誘導し、これらよりは弱いがハプトグロビンも誘導することがわかった。ＴＩＦ がＳＡＡ を直接アップレギュレートするかどうか、またはタンパク質合成が必要かどうかを決定するために、ＨＥＰＧ２ 細胞をシクロヘキシミドの存在下で上述のように刺激した。ＳＡＡ 発現は影響を受けず、ＴＩＦ 活性にはタンパク質合成が必要でないことが示された。
【００８８】
実施例３０
上記の結果は、ＴＩＦ とＩＬ−６とが、急性期反応物質に対して類似した活性を持つらしいことを示している。ＩＬ−６活性はｇｐ１３０ によって媒介されるので、ＴＩＦ 活性もｇｐ１３０ によって媒介されるかどうかを決定するための実験を行なった。
【００８９】
そうであるかどうかを決定するために、ＨｅｐＧ２ 細胞に上述のようにルシフェラーゼレポーターをトランスフェクトした後、ｇｐ１３０ 相互作用サイトカインの活性を遮断することを前もって確認しておいたポリクローナル抗ｇｐ１３０ 抗体の存在下に、ＴＩＦ またはＩＬ−６で刺激した。
【００９０】
その結果、このポリクローナル抗体はＩＬ−６活性だけを遮断することがわかった。
【００９１】
ＩＬ−１０Ｒβ鎖が関与するかどうかを決定するための実験も並行して行なった。抗ＩＬ−１０Ｒβ抗体の存在下では、ＴＩＦ 活性は完全に遮断されたが、ＩＬ−６活性には影響がなかった。ＳＡＡ 発現に関するアッセイでも、同じ傾向が観察された。
【００９２】
実施例３１
インビボで急性期タンパク質を調節するＴＩＦ の能力を決定するために、これらの実験を計画した。
【００９３】
様々な量のネズミ組換えＴＩＦ （５０、１２．５、３．２ 、０．８ または０．２ μｇ ）をエンドトキシン耐性Ｃ３Ｈ／ＨｅＪ 雌マウス（１０〜１２週齢）に腹腔内注射した。注射の６ 時間後にマウスを屠殺した。ただし、例外として、５０μｇ のＴＩＦ を与えたマウスは、１ 、３ 、６ 、１２または２４時間後に屠殺した。肝臓を摘出し、液体窒素で直ちに凍結した。次に、標準的方法によって全ＲＮＡ を抽出した後、全ＲＮＡ の試料１０μｇ を、２．２ｍｌ／リットルのホルムアルデヒドを含む１．３ ％アガロースゲルで分画した。次に試料をニトロセルロース膜に移した。
【００９４】
市販のラベリングキットを使ってネズミＳＡＡ プローブを作製した。ハイブリダイゼーションアッセイは、参照により本明細書に組み込まれるＶａｎ Ｓｎｉｃｋ ら，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６９：３６３−３６８（１９８９）に従って行なった。プローブ自体は、上述のように単離したネズミ肝由来のｃＤＮＡを使って、上述のようにＰＣＲ によって得た。プローブの作製に使用したプライマーは、
ｔｃｔｇｃｔｃｃｃｔ ｇｃｔｃｃｔｇｇｇａ （センス、配列番号３６）
および
ｔｃｃａｇｇａｇｇｔ ｃｔｇｔａｇｔａａｔ （アンチセンス、配列番号３７）
である。その結果、最高用量のネズミＴＩＦ （５０μｇ ）は、ｉ．ｐ．注射後わずか１ 時間でＳＡＡ 発現を誘導することがわかった。６ 時間後には最大効果に到達した。ＳＡＡ の発現レベルは注射の２４時間後に低下した。
【００９５】
様々な用量のＴＩＦ を使った実験から得たデータにより、３．２ μｇ の投与量を用いても、最大のＳＡＡ 誘導が起こることがわかった。０．８ μｇ しか使わなかった場合でも、ＳＡＡ メッセージは検出可能だった。
【００９６】
実施例３２
当初、ＴＩＦ は、Ｔ 細胞由来サイトカインとして同定された。肝急性期を調節するサイトカインは、そのほとんどが、主として炎症中に産生される。インビボでＴＩＦ が炎症刺激によって産生されうるかどうかを決定するために、１２週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃマウスに２ μｇ の大腸菌リポ多糖抗原を腹腔内注射した。２ 時間後にマウスを屠殺し、器官を液体窒素で凍結した。標準的プロトコールに従って全ＲＮＡ を単離し、オリゴ（ｄＴ）プライマーを使って１０μｇ の全ＲＮＡ に対して逆転写を行なった。逆転写に続いて、２０ｎｇの全ＲＮＡ に相当するｃＤＮＡを、５５℃のＴｍを持つＴＩＦ に特異的なプライマー、すなわち
ｃｔｇｃｃｔｇｃｔｔ ｃｔｃａｔｔｇｃｃｃ ｔ （センス、配列番号３８）
および
ｃａａｇｔｃｔａｃｃ ｔｃｔｇｇｔｃｔｃａ ｔ （アンチセンス、配列番号３９）
を使って、２５サイクル増幅した。ＰＣＲ 産物をアガロースゲル電気泳動によって解析した。
【００９７】
その結果、ＬＰＳ は調べた器官の全てでＴＩＦ の発現を誘導することがわかった。これは、ＴＩＦ が炎症過程に関与することを示している。
【００９８】
上記の実施例では、ＴＩＦ タンパク質（例えば、配列番号７ 、２５または２６のヌクレオチド配列によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列を持つもの）をコードする単離された核酸分子を一側面とする本発明について説明した。遺伝コードの縮重により、配列番号７ 、２５または２６のヌクレオチド配列と同一ではないが同じタンパク質をコードする核酸分子の作製が容易であることは、当業者には理解されるだろう。もちろん配列番号７ 、２５および２６は本発明の好ましい態様であるが、他の態様も本発明の一部である。ゲノムＤＮＡ 、相補ＤＮＡ 、およびメッセンジャーＲＮＡ などのＲＮＡ はすべて本発明に包含されるものとする。他の哺乳動物を含む他の動物種に由来する単離された核酸分子も本発明の一部である。本発明の好ましい一側面は、その相補鎖が配列番号７ 、配列番号８ 、配列番号９ 、または配列番号２５もしくは配列番号２６にストリンジェントな条件でハイブリダイズする単離された核酸分子である。本明細書にいう「ストリンジェントな条件」とは、例えば、緩衝液（３．５ ×ＳＳＣ ）、０．０２％フィコール、０．０２％ポリビニルピロリドン、０．０２％ウシ血清アルブミン、２５ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４（ｐＨ７ ）、０．１ ％ＳＤＳ 、２ｍＭ ＥＤＴＡ中、６５℃でハイブリダイゼーションを行なった後、最終洗浄を室温の２ ×ＳＳＣ で行い、次に例えば約６５℃程度の高温の０．１ ×ＳＳＣ／０．２ ×ＳＤＳ で行なうような条件を指す。よりストリンジェントな条件、例えば０．１ ×ＳＳＣ なども使用することができる。これらの核酸分子は、ＳＴＡＴ１ 、ＳＴＡＴ３ および／ またはＳＴＡＴ５ などのＳＴＡＴタンパク質を活性化する約１７〜２２ｋＤ（ＳＤＳ−ＰＡＧＥで測定）のタンパク質をコードする。糖鎖付加型の場合、これらのタンパク質は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる測定で、約１７〜約３０キロダルトンである。また、配列番号７ 、２５または２６によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列と少なくとも３０％、好ましくは少なくとも４５％、より好ましくは少なくとも６０％、最も好ましくは９０％のアミノ酸一致度を持つタンパク質をコードする単離された核酸分子、例えば配列番号４２も、本発明の一部である。
【００９９】
また、ＤＮＡ の発現が促進されるようにプロモーターに作動可能な形で連結された本発明の核酸分子を含む発現ベクターも、本発明の一部である。このようなベクターを製造することは、当業者の技術で十分に可能である。
【０１００】
ベクターならびに核酸分子そのものは、発現ベクターまたは核酸分子そのものが組み込まれた真核または原核組換え細胞の作製に使用することができる。大腸菌細胞、ＣＯＳ 細胞、ＣＨＯ 細胞などは全て、本発明のこの側面に従って使用することができる細胞タイプの例である。
【０１０１】
上述の核酸分子（好ましくは単離されているもの）によってコードされるタンパク質は、本発明のもう一つの特徴である。「タンパク質」は、核酸分子の発現の直接産物、その糖鎖付加型、ならびに二量体、三量体などの多量体型を意味する。少なくとも１ つの本発明のタンパク質分子と、少なくとも１ つの異なるタンパク質分子とを含む、二量体などの多量体も本発明の一部である。この異なるタンパク質分子はＩＬ−１０ などのサイトカインであることが好ましい。また、上述のタンパク質の全部または一部が何らかの形で（例えば融合タンパク質として）少なくとも１ つの別のタンパク質もしくはペプチドまたはアミノ酸配列に連結されているコンストラクト（例えば融合タンパク質）も、本発明の一特徴として包含される。「融合パートナー」としては、例えば、認識可能なシグナルを直接的または間接的に与える分子（ＦＬＡＧペプチド、β− ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼなど）を挙げることができる。これらの融合パートナーは、好ましくは、タンパク質のＮ 端および／ またはＣ 端で上述の分子に接合されるが、分子をアミノ酸に接合する技術は数多く知られており、それらの方法論のどれを使っても、本発明の一部であるコンストラクトを製造することができると理解すべきである。
【０１０２】
個々の本発明タンパク質は、上述のように、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる測定で、約１７〜約３０キロダルトンの分子量を持つ。多量体型では、複合体の分子量はもちろん変化するだろうが、そこに含まれているＴＩＦ 分子はそれぞれに、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる測定で、約１７〜３０キロダルトンの分子量を持つだろう。
【０１０３】
本タンパク質は、好ましくは、少なくとも約１２０ 残基であってかつ約２００ 残基を越えないアミノ酸からなる。アミノ酸配列は、好ましくは、配列番号７ 、８ 、９ 、２５または２６によってコードされるアミノ酸配列の全部または一部からなるか、または配列番号７ 、８ 、９ 、２５または２６によってコードされるアミノ酸配列の全部または一部を含む。より好ましくは、アミノ酸配列は前記配列番号によってコードされる最初の約４０アミノ酸を除く全てのアミノ酸を含む。さらに好ましくは、これらの配列によってコードされる最初の約２０アミノ酸を除く全てのアミノ酸を含む。最も好ましくは、本タンパク質は配列番号４０または４１に記載のアミノ酸を含み、また上述のアミノ酸一致度によって定義されるタンパク質も含む。
【０１０４】
上に挙げた核酸分子によってコードされるタンパク質が本発明の一特徴であり、標準的プロトコールに従って、抗体の産生に利用することができることは、当業者には理解されるだろう。モノクローナル型およびポリクローナル型のそのような抗体は、それら抗体の断片、キメラ型、ヒト化型、組換え型などと共に、本発明のもう一つの特徴を構成する。また、本発明タンパク質のアミノ酸配列の全部または一部を含み、好ましくはアジュバント（完全または不完全フロイントアジュバントなど）と混合されている免疫原も、本発明の一特徴である。タンパク質配列の一部をキーホールリンペットヘモシアニンなどの他の分子に連結して免疫原性を向上させてもよい。これらの抗体は、例えば、本発明のタンパク質が存在するかどうかを決定するために使用することができる。これは、以下に説明するように、本発明のさらなる一特徴である。本発明の核酸分子がＩＬ−９の存在下で発現されることは実施例に示した。したがって、本発明のさらにもう一つの特徴は、ＩＬ−９が存在するかどうか、または存在していたかどうかを決定する方法であり、この方法では、本発明のタンパク質を例えば抗体を使って検出するか、または本発明の核酸分子をプローブとして利用してｍＲＮＡを検出する。ｍＲＮＡは直接決定するか、またはｃＤＮＡの形で決定することができる。このようなプローブを標識するか標識しないかは、使用者の選択次第であり、どちらでもよい。したがって例えば、ＩＬ−９の投与後に、本発明の核酸分子が存在するかどうかを決定することによって、このサイトカインがまだ有効であるかどうかを決定することができる。このタイプのアッセイは、例えば細胞がＩＬ−９に対して感受性を示すかどうか、また感受性を示すなら、それはどの程度の感受性であるかを決定する定量的試験に適合させることができる。また、ＳＴＡＴ１ 、ＳＴＡＴ３ および／ またはＳＴＡＴ５ などのＳＴＡＴタンパク質をリン酸化するために、本発明のタンパク質を利用することもできる。これは結果としてＳＴＡＴタンパク質の二量化をもたらし、続いて核への移動が起こって、これらのＳＴＡＴタンパク質が細胞に対して持っている効果が誘発される。
【０１０５】
また、これらの分子を使って、対象、例えばリンパ腫を患っている対象、アレルギー、後天性免疫不全症候群、自己免疫性糖尿病、甲状腺炎などの免疫系障害を患っている対象、または例えば米国特許第５，８３０，４５４ 号、同第５，８２４，５５１ 号、係属中の特許出願第０８／９２５，３４８号（１９９７年９ 月８ 日出願、特許査定済）（これらは全て参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている他の状態を患っている対象に投与した場合のＩＬ−９アゴニストまたはアンタゴニストの効力を試験することもできるだろう。また、これらの分子は、これらの状態および他の状態においてＩＬ−９の役割を媒介するためにも使用することができる。詳しく述べると、ＩＬ−９はＴＩＦ を誘導するので、ＴＩＦ はＩＬ−９活性媒介因子として有用である。したがって、本発明のさらにもう一つの側面は、例えば過剰なＩＬ−９活性が関係する喘息、アレルギー、およびリンパ腫などの状況において、内因性ＩＬ−９の活性を決定する方法である。また、例えばアンチセンス分子、ＴＩＦ に結合する抗体、またはこれらの分子の他のアンタゴニストなどを使ってＴＩＦ またはＴＩＦ 活性を遮断または阻害することにより、ＩＬ−９活性を遮断または阻害することもできる。例えば、ＴＩＦ 受容体に結合するがその受容体を活性化せず、よってＩＬ−９が誘導する活性を阻害するＴＩＦ の突然変異タンパク質は、本発明の一特徴である。このようなＴＩＦ 突然変異タンパク質を使って処置することができる状態の例は、アレルギー、喘息などである。本発明の突然変異タンパク質は、例えばＷｅｉｇｅｌら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ １８０（２）：２９５−３００ （１９８９）およびＥｐｐｓら，Ｃｙｔｏｋｉｎｅ ９（３）：１４９−１５６（１９９７）（これらの文献はどちらも参照により本明細書に組み込まれる）などに従って作製することができる。このような突然変異タンパク質は、喘息、アレルギーまたはその両方の処置に使用することができる。さらに、上述のモデルを使って適当な突然変異タンパク質を選別できることも当業者には明らかだろう。ＩＬ−９活性を調節する能力は、上に挙げたような状態、ならびにアポトーシス（コルチゾール誘発性アポトーシスを含む）などの状態、ＢＣＬ−３ の核発現を伴う状態において重要である。というのも、例えばＩＬ−９はこのような発現を誘導することが知られているからである。本明細書にいう「抗体」とは、ＴＩＦ に結合する抗体（キメラ抗体、ヒト化抗体を含む）の任意の部分を指す。
【０１０６】
本発明のもう一つの特徴は、本発明のＴＩＦ 型分子が活性を示す組織タイプの再生を促進するまたはその分化を阻害するという本発明ＴＩＦ 型分子の能力に関係する。上に示したように、ＴＩＦ 分子は様々な癌および正常細胞株（すなわちメサンギウム細胞およびニューロン細胞ならびにメラノーマおよび肝癌細胞）を標的とする。したがって、例えばＴＩＦ 分子が作用する組織の再生を必要とする試料にある量のＴＩＦ 型分子を加えることによって、組織の再生を刺激することができる。このアプローチはインビトロでもインビボでも使用することができる。同様に、メラノーマまたは肝癌などの特定組織タイプの分化を阻害することが目的であるような状況では、ＴＩＦ のアンタゴニストを加えることができる。
【０１０７】
上記実施例２５で述べたように、ＴＩＦ をコードする遺伝子は、染色体１２上に位置する。この染色体が喘息に関係することは、当技術分野で知られているとおりである。また、領域１２ｑ１５ は他の炎症性疾患に関係があることも知られている。したがって、本発明のさらにもう一つの態様は、ＴＩＦ 遺伝子の位置に多型、欠失、付加などの異常が存在するかどうかを決定することによって、喘息などの状態または喘息に関係する状態への陥りやすさを決定する方法である。このような異常は、喘息、アレルギー状態または１ もしくは複数の関連状態への陥りやすさ、または喘息、アレルギー状態、または１ もしくは複数の関連状態の存在の指標になりうる。あるＤＮＡ 配列中の異常を検出できることは当技術分野ではよく知られており、そのような方法は本明細書で説明するまでもない。好ましくは、上述の方法論およびプライマーを使ったＰＣＲ などの標準的な技術によって、１ または複数の異常を検出する。
【０１０８】
上記のデータ、特にＬＰＳ による本発明分子の発現の誘導と、この分子による急性期応答の調節は、本発明の分子が炎症応答に積極的に関与することを示している。したがって、本発明のさらにもう一つの特徴は、ＩＬ−ＴＩＦ／ＩＬ−２１を使った炎症誘発物質および抗炎症物質の同定に関する。ＩＬ−ＴＩＦ／ＩＬ−２１が炎症応答を調節できることは、当業者には明らかだろう。本発明の好ましい一側面は、ＩＬ−ＴＩＦ／ＩＬ−２１またはそのアンタゴニストを投与することによって、肝臓などの器官による急性期応答を調節することである。例えば、参照により本明細書に組み込まれるＪａｎｅｗａｙ ら著「Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ 」第４ 版を参照されたい。Ｊａｎｅｗａｙ は、ＩＬ−１、ＩＬ−６およびＴＮＦ−αなどの様々なサイトカインが肝細胞を活性化して、Ｃ 反応性タンパク質およびマンナン結合レクチンなどの急性期タンパク質ならびに上記実施例に記載したタンパク質などを合成させると説明している。
【０１０９】
急性期タンパク質を活性化するＩＬ−ＴＩＦ／ＩＬ−２１の役割は、推定上のアゴニストまたはアンタゴニストおよびＩＬ−ＴＩＦ／ＩＬ−２１の存在下で急性期タンパク質産生が変化するかどうか決定することによって、ＩＬ−ＴＩＦ／ＩＬ−２１のアゴニストおよびアンタゴニストを同定する方法にもつながる。産生量の増加は試験化合物がアゴニストであることを示し、その逆も同様であると解釈すべきである。
【０１１０】
インターロイキン１０受容体との関係でＩＬ−ＴＩＦ／ＩＬ−２１の活性を調節する方法も本発明の一部である。上に示したように、抗体などのＩＬ−１０Ｒβアンタゴニストを使用すると、ＩＬ−ＴＩＦ／ＩＬ−２１活性が阻害される。したがって本発明のもう一つの特徴は、ＩＬ−ＴＩＦ／ＩＬ−２１産生を調節を目的とする、ＩＬ−１０ＲβアゴニストおよびアンタゴニストなどのＩＬ−１０ 受容体のアゴニストおよびアンタゴニストの使用である。
【０１１１】
本発明の他の特徴は当業者には明らかであり、これ以上述べる必要はないだろう。
【０１１２】
本明細書で使用した用語および表現は限定のためではなく説明のために使用したものであって、かかる用語および表現の使用に、本明細書に示し説明した特徴またはその一部の均等物を排除する意図はなく、本発明の範囲内で様々な変更態様が可能であると理解される。
【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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