(57)【要約】本発明は、実質的に純粋なHDAC9、HDAC9a、HDAC9(ΔNLS)、HDAC9a(ΔNLS)、HDRP(ΔNLS)ポリペプチド、およびそれらのポリペプチドをコードする単離された核酸分子を特徴とする。本発明はまた、HDAC9、HDAC9a、HDAC9(ΔNLS)、HDAC9a(ΔNLS)、およびHDRP(ΔNLS)核酸配列、およびそれらのベクターを含む細胞を特徴とする。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８、または配列番号：１０を含む単離された、または組換えポリペプチド
および
ｂ）配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８、または配列番号：１０のいずれか１つと少なくとも60％の配列同一性を有する単離された、または組換えポリペプチド
から選ばれる単離された、または組換えヒストンデアセチラーゼポリペプチド。
【請求項２】
ａ）配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８、または配列番号：１０からなるポリペプチド
から選ばれる請求項１記載の単離された、または組換えヒストンデアセチラーゼポリペプチド。
【請求項３】
前記ポリペプチドがヒトである請求項１記載の単離された、または組換えヒストンデアセチラーゼポリペプチド。
【請求項４】
ａ）配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：７、または配列番号：９を含む単離された核酸；
ｂ）配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：７、または配列番号：９を含む単離された核酸の相補体；
ｃ）配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８、または配列番号：１０のヒストンデアセチラーゼポリペプチドをコードする単離された核酸
ｄ）配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８、または配列番号：１０のヒストンデアセチラーゼポリペプチドをコードする単離された核酸の相補体；
ｅ）配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６、または配列番号：８のいずれかをコードする核酸分子に高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズ可能な核酸またはその相補体；または
ｆ）配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、または配列番号：７を含む核酸に高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズ可能な核酸分子；および
ｇ）配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：７、配列番号：９のいずれか１つと少なくとも55％の配列同一性を有する単離された核酸分子、またはその相補体
の群から選ばれる単離された核酸分子。
【請求項５】
前記核酸分子が配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：７、および配列番号：９からなる群より選ばれる核酸分子からなる請求項４記載の単離された核酸分子。
【請求項６】
前記核酸分子がヒトである請求項４記載の単離された核酸分子。
【請求項７】
請求項４の単離された核酸分子を含有してなるベクター。
【請求項８】
請求項７のベクターを含有する細胞。
【請求項９】
請求項４の単離された核酸分子を含有してなる細胞。
【請求項１０】
請求項１のポリペプチドに選択的に結合する精製抗体。
【請求項１１】
ａ）発現に適した条件下で前記核酸分子と候補化合物とを接触させる工程；および
ｂ）前記核酸分子の発現のレベルを評価する工程
を含み、
対照と比べて前記核酸分子の発現を増大または減少させる候補化合物が前記核酸分子の発現を調節する化合物である、請求項４記載の核酸分子の発現を調節する化合物を同定する方法。
【請求項１２】
細胞または動物において行われる請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
細胞非含有系において行われる請求項１１記載の方法。
【請求項１４】
ａ）酵素反応に適切な条件下で前記ポリペプチドと候補化合物とを接触させる工程；および
ｂ）該ポリペプチドの酵素活性レベルを評価する工程
を含み、対照と比べて該ポリペプチドの酵素活性レベルを増大または減少させる候補化合物が前記ポリペプチドの酵素活性を調節する化合物である請求項１記載のポリペプチドの酵素活性を調節する化合物の同定方法。
【請求項１５】
細胞または動物において行われる請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
細胞非含有系において行われる請求項１４記載の方法。
【請求項１７】
前記ポリペプチドが該ポリペプチドの基質とさらに接触され、該基質が細胞増殖疾患結合因子、アポトーシス疾患結合因子、および細胞分化結合因子からなる群より選ばれる請求項１４記載の方法。
【請求項１８】
前記候補化合物がインヒビターである請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
前記候補化合物が活性化因子である請求項１７記載の方法。
【請求項２０】
ａ）転写抑制反応に適切な条件下で前記ポリペプチドと候補化合物とを接触させる工程；および
ｂ）該ポリペプチドの転写抑制活性レベルを評価する工程
を含み、対照と比べて該ポリペプチドの転写抑制活性レベルを増大または減少させる候補化合物が前記ポリペプチドの転写抑制活性を調節する化合物である請求項１記載のポリペプチドの転写抑制活性を調節する化合物の同定方法。
【請求項２１】
細胞または動物において行われる請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
細胞非含有系において行われる請求項２０記載の方法。
【請求項２３】
前記ポリペプチドがポリペプチドの基質とさらに接触され、該基質が細胞増殖疾患結合因子、アポトーシス疾患結合因子、および細胞分化疾患結合因子からなる群より選ばれる請求項２０記載の方法。
【請求項２４】
前記候補化合物がインヒビターである請求項２３記載の方法。
【請求項２５】
前記該候補化合物が活性化因子である請求項２３記載の方法。
【請求項２６】
ａ）レポーター遺伝子に作動可能に連結された請求項４記載の核酸のプロモーター領域または請求項４記載の核酸のプロモーター領域の一部を含有する核酸分子を提供する工程：
ｂ）該核酸分子と候補化合物とを接触させる工程；および
ｃ）該レポーター遺伝子のレベルを評価する工程
を含み、対照と比べて該レポーター遺伝子の発現を増大または減少させる候補化合物が請求項４記載の核酸分子の発現を調節する分子である請求項４記載の核酸分子の発現を調節する化合物の同定方法。
【請求項２７】
細胞において行われる請求項２６記載の方法。
【請求項２８】
ａ）DNA結合ドメインおよび請求項１記載のポリペプチドコードする核酸分子を含有する第１の核酸ベクターを提供する工程；
ｂ）転写活性化ドメインをコードする核酸およびテストポリペプチドをコードする核酸を含有する第２の核酸ベクターを提供する工程；
ｃ）酵母ツーハイブリッドシステムにおいて該第１の核酸ベクターと該第２の核酸ベクターとを接触させる工程；および
ｄ）該酵母ツーハイブリッドシステムにおける転写活性化を評価する工程
を含み、対照と比べた転写活性化における増大により、テストポリペプチドが請求項１記載のポリペプチドと相互作用するポリペプチドであることが示される酵母スーハイブリッド系において請求項１記載のポリペプチドと相互作用するポリペプチドの同定方法。
【請求項２９】
請求項１記載のポリペプチドを含有する医薬組成物。
【請求項３０】
ａ）被験体からサンプルを得ること；および
ｂ）該サンプル中の請求項１記載のポリペプチドの活性または発現のレベルを評価すること、または請求項４記載の核酸分子のレベルを検出すること
を含み、該レベルが対照と比べて増大した場合、該被験体は細胞増殖疾患、アポトーシス疾患、または細胞分化疾患を有する可能性が増大しており、該レベルが対照と比べて減少した場合、該被験体は細胞増殖疾患、アポトーシス疾患、または細胞分化疾患を有する可能性が減少している、被験体における細胞増殖疾患、アポトーシス疾患、または細胞分化疾患の診断方法。
【請求項３１】
前記サンプル中の請求項１記載のポリペプチドの活性または発現のレベルが免疫組織化学的技術を用いて測定される請求項３０記載の方法。
【請求項３２】
前記サンプル中の請求項４記載の核酸分子のレベルがインサイチュハイブリダイゼーション技術を用いて測定される請求項３０記載の方法。
【請求項３３】
請求項１４記載の方法により同定される化合物を投与することを含む細胞増殖疾患、アポトーシス疾患、または細胞分化疾患の処置方法。
【請求項３４】
請求項２０記載の方法により同定される化合物を投与することを含む細胞増殖疾患、アポトーシス疾患、または細胞分化疾患の処置方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
関連出願
本発明は、2001年６月14日に出願された米国特許仮出願第60/298,173号、2001年８月10日に出願された米国特許仮出願第60/311,686号、および2001年９月４日に出願された米国特許仮出願第60/316,995号の利益を主張する。上記出願の全開示は参考として本明細書中に援用される。
【０００２】
政府支援
本発明は、国立癌研究所から助成金CA-0974823によって全体または一部が支援された。政府は本発明に所定の権利を有する。
【０００３】
発明の背景
コアヒストンのN-末端尾部は、アセチル化およびリン酸化を含む翻訳後修飾により共有結合的に改変される。証拠は、これらの共有結合性修飾が転写および複製等のクロマチンを含むいくつかの生物学的活性において役割を果たすことを示唆している。ヒストンデアセチラーゼ（HDAD）は、染色体リジン残基からのアセチル基の除去を触媒する。Ｎ末端尾部のリジン残基からアセチル基の除去を触媒し、よりコンパクトなクロマチン構造、転写の抑制に一般に関連する立体配置を生じる。
【０００４】
触媒ドメインに有意な相同性を共有する酵母の５つのタンパク質およびオープンリーディングフレーム（RPD3、HDA1、HOS1、HOS2およびHOS3）は、ヒトHDAC1への配列相同性に基づいてHDACとして同定された。今日まで、８つのHDACが哺乳動物において同定されており、それらの構造および酵母RPD3またはHDA1タンパク質への類似性に基づいて２つのクラスに分類されている。最近、前述の５つのタンパク質に構造的に無関係であるSir2ファミリータンパク質は、NAD-依存性HDACとして同定された。クラスIHDACは、酵母RPD3ホモログHDAC1、2、3、および8であり、主に触媒ドメインからなる。クラスII HDACは、酵母HDA1ホモログHDAC4、５、６および７である。HDAC4、5および7は、長い非触媒N-末端およびC-末端HDAC触媒ドメインを含み、一方、HDAC6は２つのHDAC触媒ドメインを有する。
【０００５】
また、ヒストンデアセチラーゼが、トリクロスタチンA（TSA）、トラポキシン、および酪酸塩を含む小分子に感受性でありうることが示されている。例えば、酵母RPD3およびHDA1ならびに哺乳動物HDAC1、2、3、4、5、6、7および8は、トリコスタチンA（TSA）による阻害に感受性である。しかし、Sir2ファミリーHDAC、酵母HOS3およびDrosophilamelanogaster dHDAC6は、TSAに比較的に非感受性であるようである。スベロイルアニリドヒドロキサム酸（SAHA）等のハイブリッド双極性化合物のクラスはまた、ヒストンデアセチラーゼを阻害し、種々の形質転換細胞における末端分化および／またはアポトーシスを有することが示された。かかる化合物の例は、1994年11月29日に発行された米国特許第5,369,108号、1997年12月23日に発行された米国特許第5,700,811号、および1998年６月30日に発行されたBreslowら、米国特許第5,773,474号、1991年10月８日に発行された米国特許第5,055,608号、および1992年12月29日に発行されたMarksら、米国特許第5,175,191号に見出され得、それら全ての完全な内容が参考として本明細書中に援用される。
【０００６】
ヒストンが脱アセチル化される機構の同定、およびヒストンデアセチラーゼ機能の特徴づけは、いかにして遺伝子転写が制御されるか、いかにして細胞終期が調節されるか、およびいかにして細胞が末端分化および／またはアポトーシスを起こすようにシグナルを受けるのかを理解することに大きな利点がある。かかる機構の解明により、多くの疾患、特に細胞増殖または細胞分化もしくはアポトーシスの欠損により特徴づけられる疾患、例えば、癌の治療の改善を導きうる。
【０００７】
発明の要旨
本発明は単離された、または、組み換えられたヒストンデアセチラーゼポリペプチドおよびこれらのポリペプチドをコードする単離された、または、組み換えられたヒストンデアセチラーゼ核酸分子、並びにこれらの単離された核酸分子を含有するベクターおよび細胞に関する。
【０００８】
本発明の１つの局面において、単離された、または、組み換えられたヒストンデアセチラーゼポリペプチドは、a)配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８または配列番号：１０を含む単離された、または組み換えポリペプチド；およびb) 配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８または配列番号：１０の何れか１つと少なくとも60％の配列同一性を有するポリペプチドから選択される。１つの態様において、単離された、または、組み換えられたヒストンデアセチラーゼポリペプチドは配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８または配列番号：１０よりなる。別の態様においては、単離された、または、組み換えられたヒストンデアセチラーゼポリペプチドは哺乳類由来のものであり；好ましくは単離された、または、組み換えられたヒストンデアセチラーゼポリペプチドはヒト由来である。
【０００９】
別の局面において、本発明は、a）配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：７または配列番号：９を含む単離された核酸；ｂ）  配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：７または配列番号：９を含む単離された核酸の相補体；c)配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８または配列番号：１０のヒストンデアセチラーゼポリペプチドをコードする単離された核酸；d) 配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８または配列番号：１０のヒストンデアセチラーゼポリペプチドをコードする単離された核酸の相補体；e)配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６、または配列番号：８の何れかをコードする核酸分子に高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズ可能な核酸、またはその相補体；あるいはf)配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、または配列番号：７を含む核酸に高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズ可能な核酸分子；およびg) 配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：７、または配列番号：９の何れか１つと少なくとも55％の配列同一性を有する単離された核酸分子、またはその相補体から選択される単離された核酸分子を特徴とする。１つの態様において、単離された核酸分子は配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：７または配列番号：９よりなる。別の態様において、単離された核酸分子は哺乳類由来のものであり；好ましくは単離された核酸分子はヒト由来である。
【００１０】
別の局面において、本発明は上記した単離されたヒストンデアセチラーゼ核酸分子、ベクターを含む細胞、および、上記した単離されたヒストンデアセチラーゼ核酸分子を含む細胞を特徴とする。
【００１１】
別の局面において、本発明は上記したヒストンデアセチラーゼポリペプチドに選択的に結合する精製抗体を特徴とする。
【００１２】
さらに別の局面において、本発明は上記したヒストンデアセチラーゼ核酸分子の発現を調節する化合物の同定方法を特徴とする。この方法は、a)発現に適する条件下で候補化合物に核酸分子を接触させること、b)核酸分子の発現のレベルを評価すること、を含む。対照と比較して核酸分子の発現を増大または低減する候補化合物は核酸分子の発現を調節する化合物である。１つの態様において、方法は細胞または動物において行われる。別の態様において、方法は細胞非含有の系で行なわれる。
【００１３】
本発明はまた、上記方法により同定される化合物を投与することを含む、個体における細胞増殖疾患、アポトーシス疾患または細胞分化疾患、例えば、癌、例えばリンパ腫、白血病、黒色腫、卵巣癌、乳癌、膵臓癌、前立腺癌、結腸癌および肺癌、および、骨髄増殖障害、例えば、真性赤血球増加症、本態性血小板血症、原因不明骨髄様化生、および、慢性骨髄原生白血病の治療方法を特徴とする。
【００１４】
さらに別の局面において、本発明は上記したヒストンデアセチラーゼポリペプチドの酵素活性を調節する化合物の同定方法に関する。この方法は、a)酵素反応に適する条件下で候補化合物とポリペプチドとを接触させること；および、b)ポリペプチドの活性レベルを評価すること、を含む。対照と比べてポリペプチドの活性レベルを上昇または低下させる候補化合物は、ポリペプチドの酵素活性を調節する化合物である。１つの態様において、この方法は細胞または動物において行われる。別の態様において、方法は細胞非含有の系で行なわれる。
【００１５】
さらに別の態様において、ポリペプチドはさらに、ポリペプチドの基質に接触され、その際、基質は、細胞増殖疾患結合因子、アポトーシス疾患結合因子、および細胞分化疾患結合因子よりなる群から選択される。１つの態様において、候補化合物は阻害剤である。別の態様において、候補化合物は活性化剤である。
【００１６】
別の局面において、本発明は上記したヒストンデアセチラーゼポリペプチドの転写抑制活性を調節する化合物の同定方法を特徴とする。この方法は、a)転写抑制反応に適する条件下で候補化合物とポリペプチドとを接触させること；およびb)ポリペプチドの転写抑制活性レベルを評価することを含む。対照と比較してポリペプチドの転写抑制活性レベルを上昇または低下させる候補化合物は、ポリペプチドの転写抑制活性を調節する化合物である。１つの態様において、方法は細胞または動物において行われる。別の態様において、方法は細胞非含有の系で行なわれる。
【００１７】
さらに別の態様において、ポリペプチドはさらに、ポリペプチドの基質に接触され、その際、基質は、細胞増殖疾患結合因子、アポトーシス疾患結合因子、および細胞分化疾患結合因子よりなる群から選択される。１つの態様において、候補化合物は阻害剤である。別の態様において、候補化合物は活性化剤である。
【００１８】
別の局面において、本発明は上記したヒストンデアセチラーゼ核酸分子の発現を調節する化合物の同定方法を特徴とする。この方法は、a)レポーター遺伝子に作動可能に連結した、上記したヒストンデアセチラーゼ核酸分子のプロモーター領域、またはそのようなプロモーター領域の一部を含む核酸分子を準備すること；b)候補化合物と核酸分子とを接触させること；および、c)レポーター遺伝子のレベルを評価することを含む。対照と比較してレポーター遺伝子の発現を増大または低下させる候補化合物は、上記したヒストンデアセチラーゼ核酸分子の発現を調節する化合物である。１つの態様において、方法は細胞において行なわれる。
【００１９】
さらに別の局面において、本発明は酵母ツーハイブリッド系において上記したヒストンデアセチラーゼポリペプチドに対して相互作用を示すポリペプチドを同定する方法を特徴とする。この方法は、a)ＤＮＡ結合ドメインおよび上記したヒストンデアセチラーゼポリペプチドをコードする核酸分子を含む第１の核酸ベクターを提供すること；b)転写活性化ドメインをコードする核酸および被験ポリペプチドをコードする核酸を含む第２の核酸ベクターを提供すること；c)酵母ツーハイブリッド系において第２の核酸ベクターに第１の核酸ベクターを接触させること；およびd)酵母ツーハイブリッド系における転写活性化を評価すること、を含む。対照と比較した場合の転写活性化の増大は、被験ポリペプチドが上記ヒストンデアセチラーゼポリペプチドに対して相互作用を示すポリペプチドであることを示している。
【００２０】
本発明はまた、上記ヒストンデアセチラーゼポリペプチドを含む医薬組成物を特徴とする。
【００２１】
さらに本発明は、被験体における細胞増殖疾患、アポトーシス疾患または細胞分化疾患の診断方法を特徴とする。この方法は、a)対象から試料を採取すること；および、b)試料中の上記したヒストンデアセチラーゼポリペプチドの活性または発現レベル、または上記した核酸分子のレベルを評価すること、を含む。対照と比較してレベルが上昇している場合、被験体は細胞増殖疾患、アポトーシス疾患、または細胞分化疾患を有する可能性が増大しており、対照と比較してレベルが低下している場合は、被験体が細胞増殖疾患、アポトーシス疾患または細胞分化疾患を有する可能性が低下している。１つの態様において、ポリペプチドのレベルは免疫組織化学的方法を用いて評価する。別の態様において、核酸分子のレベルはインサイチュハイブリダイゼーション技術を用いて評価する。
【００２２】
上記したスクリーニング方法において同定された化合物および／またはポリペプチドもまた本発明の一部である。
【００２３】
発明の詳細な説明
ヒストンデアセチラーゼ4（HDAC4）およびヒストンデアセチラーゼ5（HDAC5）のN-末端ドメインと50％同一であるHDRPと命名されたタンパク質(Zhouら、Proc.Natl. Acad. Sci. USA, 97:1056-1061(2000)参照)(MITRとも称する(Sparrowら、EMBOJ.18:5085-5098(1999); Zhangら、J.Biol.Chem., 276:35-39(2001);およびZhangら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,98:7354-7359(2001)も参照)が最近同定された。新しいヒストンデアセチラーゼHDAC9のクローニングとその特徴を本明細書に記載するが、そのうちHDRPはオルタナティブスプライスされたイソフォームである。HDAC9のcDNA配列は図1A〜１Cに示すとおりであり（配列番号：１）、HDAC9のアミノ酸配列は図2Aに示すとおりである（配列番号：２）。HDAC9をクローニングするほかに、HDAC9aと命名されたHDAC9の他のオルタナティブスプライスされたイソフォーム（HDAC9よりもC末端で132アミノ酸短いポリペプチド）、および、HDAC9(ΔNLS)、HDAC9a(ΔNLS)およびHDRP(ΔNLS)とそれぞれ命名されたHDAC9のN末端非触媒末端において核局在化シグナル（NLS）を欠失したHDAC9、HDAC9aおよびHDRPポリペプチドのイソフォームも同定された。HDAC9aのcDNA配列は図1D〜1Gに示すとおりであり（配列番号：３）、HDAC9aのアミノ酸配列は図2Bに示すとおりである（配列番号：４）。NLSをコードするアミノ酸を欠失したHDAC9（HDAC9(ΔNLS)）のcDNA配列は図1J〜ILに記載するとおりであり（配列番号：５）、そしてNLSアミノ酸配列を欠失したHDAC9は図2Cに示すとおりであり（配列番号：６）、NLSを欠失したポリペプチドをコードするHDAC9a（HDAC9a(ΔNLS)）のcDNA配列は図1M〜1Oに示すとおりであり（配列番号：７）、NLSアミノ酸配列を欠失したHDAC9aを図2Dに示す（配列番号：８）。NLSを欠失したポリペプチドをコードするDHRP（HDRP(ΔNLS)）のcDNA配列を図1H〜1Iに示し（配列番号：９）、そしてNLSアミノ酸配列を欠失したHDRPを図2Eに示す（配列番号：１０）。
【００２４】
本発明のポリペプチド
本発明は、単離された、または組み換えHDAC9ポリペプチド、HDAC9aポリペプチド、HDAC9(ΔNLS)ポリペプチド、HDAC9a(ΔNLS)ポリペプチドおよびHDRP(ΔNLS)ポリペプチドおよびそのフラグメント、誘導体およびバリアント、並びに、明細書に記載したヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチド（例えば他のバリアント）を特徴とする。本明細書において、「ポリペプチド」という用語はアミノ酸の重合体を指し、特定の長さを指さず、即ち、ペプチド、オリゴペプチドおよびタンパク質がポリペプチドの定義に含まれる。
【００２５】
本明細書においては、ポリペプチドは、それが実質的に細胞成分を非含有の場合、それが組み換えまたは非組み換えの細胞から単離された場合、または、化学合成されたものである場合は化学的前駆体物質または他の物質を非含有である場合に、「単離」、「実質的に純粋」または「実質的に純粋で単離されている」と説明するものとする。典型的には、HDAC9、HDAC9a、HDAC9(ΔNLS)、HDAC9a(ΔNLS)またはHDRP(ΔNLS)ポリペプチドは、それが全HDACの濃度または活性と比較して、HDAC9、HDAC9a、HDAC9(ΔNLS)、HDAC9a(ΔNLS)またはHDRP(ΔNLS)の相対的に増大した濃度または活性を有する場合に、単離された、実質的に純粋な、または、実質的に純粋で単離されたものとする。好ましくは、HDAC9、HDAC9a、HDAC9(ΔNLS)、HDAC9a(ΔNLS)またはHDRP(ΔNLS)の増大した活性または濃度は、全HDAC濃度または活性と比較して、少なくとも2倍、より好ましくは少なくとも5倍、最も好ましくは少なくとも10倍である。さらに、ポリペプチドは、それが通常は細胞内で関連していない別のペプチドに連結させられることができ（例えば「融合タンパク質」として）、そしてなお、「単離された」、「実質的に純粋な」または「実質的に純粋で単離された」ものとすることができる。単離された、実質的に純粋な、または、実質的に純粋で単離されたポリペプチドは、例えば、本明細書に記載するアフィニティー精製法、並びに本明細書に記載する、そして、当業者の知る別の方法を用いて得てもよい。
【００２６】
「ヒストンデアセチラーゼポリペプチド」とは、ヒストンデアセチラーゼ活性、転写抑制活性、および/または、他の物質、例えば転写因子、例えばp53、CoRest、E2F、GATA-1、TFIIeおよびTFIIFのような通常細胞内では核または原形質に位置するものを脱アセチル化する能力を有するポリペプチドを指す。ヒストンデアセチラーゼポリペプチドはまたHDAC阻害活性を有する分子によりその活性が阻害され得るポリペプチドでもある。これらの分子は4種の一般的クラス：1)短鎖脂肪酸（例えば、4-フェニルブチレートおよびバルプロ酸）；2)ヒドロキサム酸（例えばSAHA、ピロキサミド、トリクロスタチンA（TSA)、オキサムフラチンおよびCHAP類、例えばCHAP1およびCHAP31)；3)環状テトラペプチド（トラポキシンA、アピシジンおよびデプシペプチド(FK-228別名FR9011228）；4)ベンズアミド類（例えばMS-275)；およびスクリプタイドのような他の化合物に分類される。このような化合物の例はBreslow等への1994年11月29日発行の米国特許5,369,108号、1997年12月23日発行の5,700,811号、および1998年6月30日発行の5,773,474号、Marks等への1991年10月8日発行の米国特許5,055,608号および1992年12月29日発行の5,175,191号、並びに、Yoshidaら、Bioassays17, 423-430 (1995), Saitoら、PNAS USA 96, 4592-4597, (1999), Furamaiら、PNAS USA98(1), 87-92 (2001), Komatsuら、Cancer Res. 61 (11), 4459-4466 (2001), Suら、CancerRes. 60, 3137-3142 (2000), Leeら、Cancer Res. 61(3), 931-934および Suzukiら、J.Med.Chem.42 (15), 3001-3003(1990)に記載されており、これらの開示内容全体を参考により本明細書に援用する。このようなヒストンデアセチラーゼポリペプチドの例は、HDAC9、HDAC9a、HDAC9(ΔNLS)、HDAC9a(ΔNLS)、HDRP(ΔNLS)；配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８、または配列番号：１０を含む実質的に純粋なポリペプチド；および、本明細書に記載したBLASTプログラムおよびパラメーターを用いて測定した場合に配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８または配列番号：１０の何れかに対して好ましくは少なくとも60％、より好ましくは70％、75％、80％、85％または90％、最も好ましくは95％の配列同一性を有するポリペプチドを含む。
【００２７】
１つの態様において、ヒストンデアセチラーゼポリペプチドはヒストンデアセチラーゼ活性、転写抑制活性、基質を脱アセチル化する能力を有するか、または、トリコスタチンAまたはハイブリッド極性化合物、例えばSAHAにより阻害される。別の態様において、HDAC9(ΔNLS)ポリペプチドは上記した生物学的活性の何れか２つを有する。さらに別の態様においてHDAC9(ΔNLS)ポリペプチドは上記した生物学的活性の何れか３つを有する。さらに別の態様において、HDAC9(ΔNLS)ポリペプチドは上記した生物学的活性の全てを有する。
【００２８】
HDAC9ポリペプチドは上記したヒストンデアセチラーゼポリペプチドである。HDAC9ポリペプチドは好ましくは明細書に記載したBLASTプログラムおよびパラメーターを用いて測定した場合に配列番号：２に対して少なくとも60％、より好ましくは70％、75％、80％、85％または90％、最も好ましくは95％の配列同一性を有する。HDAC9ポリペプチドはまた図1A〜１C、図4および図５A〜５Dに示すとおり、エキソン23、24、25および/または26によりコードされるアミノ酸を含み、HDAC9核酸配列のエキソン13によりコードされるアミノ酸を含まないポリペプチドである。好ましくはHDAC9ポリペプチドは配列番号：２の配列を含む。より好ましくはHDAC9ポリペプチドは配列番号：２の配列よりなる。HDACポリペプチドはまた配列番号：１の核酸配列によりコードされるポリペプチドのアミノ酸配列を含むポリペプチドである。
【００２９】
HDAC9aポリペプチドは上記したヒストンデアセチラーゼポリペプチドである。HDAC9aポリペプチドは好ましくは明細書に記載したBLASTプログラムおよびパラメーターを用いて測定した場合に配列番号：４に対して少なくとも60％、より好ましくは70％、75％、80％、85％または90％、最も好ましくは95％の配列同一性を有する。HDAC9aポリペプチドはまた図1D〜１G、図4および図５A〜５Dに示すとおり、エキソン22によりコードされるアミノ酸を含み、そしてHDAC9の核酸配列のエキソン13、23、24、25または26によりコードされるアミノ酸を含まないポリペプチドである。好ましくはHDAC9aポリペプチドは配列番号：４の配列を含む。より好ましくはHDAC9aポリペプチドは配列番号：４の配列よりなる。HDAC9aポリペプチドはまた配列番号：３の核酸配列によりコードされるポリペプチドのアミノ酸配列を含むポリペプチドである。
【００３０】
HDAC9(ΔNLS)は上記したヒストンデアセチラーゼポリペプチドである。HDAC9(ΔNLS)ポリペプチドは核局在化シグナル（NLS）を含まない。HDAC9(ΔNLS)ポリペプチドは好ましくは本明細書に記載したBLASTプログラムおよびパラメーターを用いて測定した場合に配列番号：６に対して少なくとも60％、より好ましくは70％、75％、80％、85％または90％、最も好ましくは95％の配列同一性を有する。HDAC9(ΔNLS)ポリペプチドはまた図1J〜１L、および図５A〜５Dに示すとおり、エキソン23、24，25および/または26によりコードされるアミノ酸を含み、そしてHDAC9核酸配列のエキソン7または13によりコードされるアミノ酸を含まないポリペプチドである。好ましくはHDAC9(ΔNLS)ポリペプチドは配列番号：６の配列を含む。より好ましくはHDAC9(ΔNLS)ポリペプチドは配列番号：６の配列よりなる。HDAC9(ΔNLS)ポリペプチドはまた配列番号：５の核酸配列によりコードされるポリペプチドのアミノ酸配列を含むポリペプチドである。
【００３１】
HDAC9a(ΔNLS)ポリペプチドは上記したヒストンデアセチラーゼポリペプチドである。HDAC9a(ΔNLS)は核局在化シグナル（NLS）を含まない。HDAC9a(ΔNLS)ポリペプチドは好ましくは明細書に記載したBLASTプログラムおよびパラメーターを用いて測定した場合に配列番号：８に対して少なくとも60％、より好ましくは70％、75％、80％、85％または90％、最も好ましくは95％の配列同一性を有する。HDAC9a(ΔNLS)ポリペプチドはまた図1M〜１O、および図５A〜５Dに示すとおり、エキソン22によりコードされるアミノ酸を含み、そしてHDAC9の核酸配列のエキソン7、13，23，24，25または26によりコードされるアミノ酸を含まないポリペプチドである。好ましくはHDAC9a(ΔNLS)ポリペプチドは配列番号：８の配列を含む。より好ましくはHDAC9a(ΔNLS)ポリペプチドは配列番号：８の配列よりなる。HDAC9a(ΔNLS)ポリペプチドはまた配列番号：７の核酸配列によりコードされるポリペプチドのアミノ酸配列を含むポリペプチドである。
【００３２】
HDRP(ΔNLS)ポリペプチドは、上記したヒストンデアセチラーゼポリペプチドである。HDRP(ΔNLS)は核局在化シグナル（NLS）を含まない。HDRP(ΔNLS)ポリペプチドは好ましくは明細書に記載したBLASTプログラムおよびパラメーターを用いて測定した場合に配列番号：１０に対して少なくとも60％、より好ましくは70％、75％、80％、85％または90％、最も好ましくは95％の配列同一性を有する。HDRP(ΔNLS)ポリペプチドはまた図1H〜１I、および図５A〜５Dに示すとおり、HDAC9の核酸配列のエキソン7または13〜26によりコードされるアミノ酸を含まないポリペプチドである。好ましくはHDRP(ΔNLS)ポリペプチドは配列番号：１０の配列を含む。より好ましくはHDRP(ΔNLS)ポリペプチドは配列番号：１０の配列よりなる。HDRP(ΔNLS)ポリペプチドはまた配列番号：９の核酸配列によりコードされるポリペプチドのアミノ酸配列を含むポリペプチドである。
【００３３】
本発明のポリペプチドは精製して均質化することができる。しかしながら、ポリペプチドを均質化するまで精製しない調製物も有用である。重要な特徴は調製物がかなりの量の他の成分の存在下であってもポリペプチドの所望の機能を与える点である。従って、本発明は種々の程度の純度を含む。１つの態様において、「細胞成分を実質的に含有しない」という表現は、他のタンパク質（即ち混在タンパク質）約30％（乾燥重量）未満、他のタンパク質約20％未満、他のタンパク質約10％未満、または他のタンパク質約5％未満を有するポリペプチドの調製物を含む。
【００３４】
ポリペプチドが組み換えにより製造される場合、これはまた実質的に培地非含有であることができ、即ち培地はポリペプチド調製物の体積の約20％未満、約10％未満、または約5％未満である。「化学的前駆体または他の化合物を実質的に含有しない」という表現は、その合成に関与する化学的前駆体または他の化合物からそれが分離されているポリペプチドの調製物を含む。１つの態様においては、「化学的前駆体または他の化合物を実質的に含有しない」という表現は、化学的前駆体または他の化合物約30％（乾燥重量）未満、化学的前駆体または他の化合物約20％未満、化学的前駆体または他の化合物約10％未満、または化学的前駆体または他の化合物約5％未満を有するポリペプチドの調製物を含む。
【００３５】
１つの態様においては、本発明のポリペプチドは、配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：７、配列番号：９およびその相補体および一部（例えば配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：７、配列番号：９の何れか１つの相補体または配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：７または配列番号：９の何れか１つの一部）よりなる群から選択される核酸配列を含む核酸分子によりコードされるアミノ酸配列を含む。
【００３６】
本発明のポリペプチドはまたフラグメントおよび配列のバリアントを含む。バリアントにはある生物の同じ遺伝子座によりコードされる実質的に相同なポリペプチド、即ち対立遺伝子バリアント並びに他のバリアントを含む。バリアントはまた生物の他の遺伝子座に由来するが、配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：７、配列番号：９およびその相補体および一部よりなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸分子によりコードされるポリペプチドに実質的な相同性を有するか、または、配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８または配列番号：１０の何れか１つをコードするヌクレオチド配列よりなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸分子によりコードされるポリペプチドに実質的な相同性を有するポリペプチドを含む。バリアントはまた、これらのポリペプチドに実質的に相同または同一であるが他の生物に由来するポリペプチド、即ちオーソログ（ortholog）を含む。バリアントはまた化学合成により生成されるポリペプチドに実質的に騒動または同一であるポリペプチドも含む。バリアントはまた、組み換え法により生成されるこれらのポリペプチドに実質的に相同または同一であるポリペプチドも含む。
【００３７】
本明細書で使用される場合、2種のポリペプチド（またはポリペプチドの領域）は、アミノ酸配列が少なくとも約60〜65％、典型的には少なくとも約70〜75％、より典型的には少なくとも約80〜85％、そして最も典型的には約90〜95％より高度に相同または同一である場合に、実質的に相同または同一である。本発明によれば実質的に同一または相同であるアミノ酸配列は、本明細書により特定して記載するストリンジェントな条件下、配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：７、配列番号：９またはその一部にハイブリダイズする核酸分子によりコードされるか、または、本発明により特定して記載するストリンジェントな条件下、配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８、配列番号：１０またはその一部をコードする核酸配列にハイブリダイズする核酸分子によりコードされる。
【００３８】
２種のヌクレオチドまたはアミノ酸配列の％同一性は、最適な比較目的のために配列をアラインすることにより調べることができる（例えばギャップを最初の配列の配列内に導入することができる）。次に相当する位置のヌクレオチドまたはアミノ酸を比較し、2つの配列の間の％同一性を配列により共有される同一の位置の数の関数とする（即ち、％同一性＝同一位置の数/位置の総数x100）。特定の態様においては、比較目的のためにアラインされたHDAC9、HDAC9a、HDAC9(ΔNLS)、HDAC9a(ΔNLS)およびHDRP(ΔNLS)アミノ酸またはヌクレオチド配列の長さは、比較対象配列、例えば図1A〜1Oおよび2A〜2Eに示す配列の長さの少なくとも30％、好ましくは少なくとも40％、より好ましくは少なくとも60％、さらにより好ましくは少なくとも70％、80％、90％または100％である。２種の配列の実際の比較はよく知られた方法、例えば数学的アルゴリズムを用いて行なうことができる。このような数学的アルゴリズムの好ましい、非限定的な例はKarlinら、Proc.Natl. Acad. Sci. USA, 90:5873-5877(1993)により記載されている。このようなアルゴリズムはSchafferら、NucleicAcids Res., 29:2994-3005(2001)に記載されているBLASTNおよびBLASTXプログラム（バージョン2.2）に組み込まれている。BLASTおよびGappedBLASTプログラムを利用した場合、該当するプログラム（例えばBLASTN）のデフォルトパラメーターを使用することができる。2001年8月10日に有効となったhttp://www.ncbi.nlm.nih.govを参照できる。１つの態様において、検索するデータベースは非冗長（NR)データベースであり、配列比較のためのパラメーターはノーフィルター；推定値10；ワードサイズ3；マトリックスはBLOSUM62；ギャップコストはエグジステンス11およびエクステンション1に設定されている。
【００３９】
配列の比較のために利用される数学的アルゴリズムの別の好ましい非限定的な例はMyersおよびMiller, CABIOS (1989)のアルゴリズムである。このようなアルゴリズムはGCG（Accelrys)配列アライメントソフトウエアパッケージの一部であるALIGNプログラム（バージョン2.0）に組み込まれている。アミノ酸配列の比較のためにALIGNプログラムを利用する場合はPAM120加重残基表、ギャップ長ペナルティー12およびギャップペナルティー4を使用する。配列分析のための他のアルゴリズムは当該分野で知られており、TorellisおよびRobotti,Comput. Appl. Biosci., 10:3-5(1994)により記載されているADVANCEおよびADAM；およびPearsonおよびLipman,Proc. Natl. Acad. Sci USA,85:2444-8(1988)に記載されているFASTAが含まれる。
【００４０】
別の態様において、２つのアミノ酸配列の間の％同一性は、Blossom63マトリックスまたはPAM250マトリックスおよびギャップ加重12、10、8、6または4および長さ加重2、3または4を用いて、GCGソフトウエアパッケージのGAPプログラム（2001年8月31日に有効になったhttp://www.accelrys.comより入手可能）を用いて行なうことができる。さらに別の態様においては、アミノ酸配列の間の％同一性は、ギャップ加重50および長さ加重3を用いて、GCGソフトウエアパッケージのGAPプログラム（http://www.cgc.comより入手可能）を用いて行なうことができる。
【００４１】
本発明はまた、より低い程度の同一性を有するが、本発明の核酸分子によりコードされるHDAC9、HDAC9a、HDAC9(ΔNLS)、HDAC9aΔNLSまたはHDRP(ΔNLS)ポリペプチドの発揮する機能と同じ機能１つ以上を発揮する程度に十分な類似性を有するHDAC9、HDAC9a、HDAC9(ΔNLS)、HDAC9aΔNLSおよびHDRP(ΔNLS)ペプチドを含む。類似性は保存的アミノ酸置換により決定される。このような置換は同様の特性の別のアミノ酸によりポリペプチド中の所定のアミノ酸を置換するものである。保存的な置換は表現型的にはサイレントであると考えられる。保存的置換として典型的に観察されるものは、脂肪族アミノ酸Ala、Val、LeuおよびIleの間の相互の置き換え；ヒドロキシル残基SerおよびThrの相互交換；酸性残基AspおよびGluの交換；アミド残基AsnおよびGLnの間の置換；塩基性残基LysおよびArgの間の交換；および芳香族残基PheおよびTyrの間の置き換えである。どのアミノ酸の変化が表現型的にサイレントであるかに関する指針はBowieら、Science247:1306-1310(1990)に記載されている。
【００４２】
バリアントポリペプチドは１つ以上の置換、欠失、挿入、逆位、融合および短縮またはこれらのいずれかの組み合わせによりアミノ酸配列が異なりうる。さらに、バリアントポリペプチドは１つ以上の活性において、例えばヒストンデアセチラーゼ活性または転写抑制活性において、完全に機能してもよく、または機能を失っていてもよい。完全に機能するバリアントは典型的には保存的変異または重要ではない残基または重要ではない領域における変異のみを含んでいる。機能的バリアントは機能を変化させないか、無視できる変化しかもたらさない類似のアミノ酸の置換を含むこともできる。或いは、このような置換はある程度まで陽性または陰性に機能に影響してよい。非機能的バリアントは典型的には、１つ以上の非保存的なアミノ酸の置換、欠失、挿入、逆位または短縮または、重要でない残基または重要でない領域における置換、挿入、逆位または欠失を含んでおり、そのような重要な領域とはHDACドメインを含み、これは図１A〜１Gの核酸配列および図4の模式図に示すデアセチラーゼ活性を有するポリペプチドを与えるものである。
【００４３】
機能のために必須であるアミノ酸は、当該分野で知られている方法、例えば部位特異的変異誘発またはアラニンスキャン変異誘発により同定することができる(Cunninghamら、Science, 244:1081-1085(1989))。後者の方法は分子の残基の各々において１アラニン変異を導入する（分子当たり１変異）。次に形成した変異分子のインビトロの生物学的活性を試験する。ポリペプチド活性に必須な部位はまた、構造分析、例えば結晶化、核磁気共鳴またはフォトアフィニティー標識により測定することができる(Smithら、J.Mol.Biol.,224:899-904(1992);およびde Vosら、Science, 255:306-312(1992)参照）。
【００４４】
本発明はまた本発明のポリペプチドのHDAC9、HDAC9a、HDAC9(ΔNLS)、HDAC9a(ΔNLS)およびHDRP(ΔNLS)ポリペプチドフラグメントを含む。フラグメントは配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８または配列番号：１０を含むポリペプチドから、または配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：７または配列番号：９またはその一部もしくは相補体または他のバリアントを含む核酸分子によりコードされるポリペプチドから誘導することができる。本発明はまた、本明細書に記載したポリペプチドのバリアントのフラグメントを含む。有用なフラグメントはポリペプチドの生物学的活性の１つ以上を保持しているもの、並びに、ポリペプチド特異的な抗体を生成するための免疫原として使用できるフラグメントを含む。
【００４５】
生物学的に活性なフラグメント（例えば6、9、12、15、16、20、30、35、36、37、38、39、40、50、100アミノ酸長以上のペプチド）は、よく知られた方法を用いてポリペプチド配列の分析により同定されている例えばHDACドメインのようなドメイン、セグメントまたはモチーフ、例えば、シグナルペプチド、細胞外ドメイン、１つ以上の膜貫通セグメントまたはループ、リガンド結合領域、亜鉛フィンガードメイン、DNA結合ドメイン、アシル化部位、グリコシル化部位またはホスホリル化部位を有することができる。
【００４６】
フラグメントは個別のもの（他のアミノ酸またはポリペプチドに融合していないもの）であり得、またはより大きいポリペプチド内にありうる。さらにまた、幾つかのフラグメントは単一のより大きいペプチド内に含まれうる。１つの態様において、宿主内の発現のために設計されたフラグメントはポリペプチドフラグメントのアミノ末端に融合した異種のプレ-およびプロ-ポリペプチド領域およびフラグメントのカルボキシ末端に融合した別の領域を有することができる。
【００４７】
即ち本発明はキメラまたは融合ポリペプチドを提供する。これらには、そのポリペプチドに実質的に相同でないアミノ酸配列を有する異種のタンパク質またはポリペプチドに作動可能に連結した本発明のHDAC9、HDAC9a、HDAC9(ΔNLS)、HDAC9aΔNLSおよびHDRP(ΔNLS)ポリペプチドが含まれる。「作動可能に連結した」とはポリペプチドおよび異種のタンパク質がインフレームで融合していることを指す。異種のタンパク質はポリペプチドのN末端またはC末端に融合することができる。１つの態様において、融合ポリペプチドはポリペプチド自体の機能に影響しない。例えば、融合ポリペプチドはポリペプチドの配列がGST配列のC末端に融合しているGST融合ポリペプチドでありうる。他の型の融合ポリペプチドには、これに限定されないが、酵素融合ポリペプチド、例えばβ-ガラクトシダーゼ融合体、酵母ツーハイブリッドGAL融合体、ポリ-His融合体、およびIg融合体が含まれる。このような融合ポリペプチド、特にポリ-His融合体は組み換えポリペプチドの精製を容易にすることができる。特定の宿主細胞（例えば哺乳類宿主細胞）において、ポリペプチドの発現および/または分泌を異種シグナル配列を用いて増大することができる。従って別の態様において融合ポリペプチドはそのN末端に異種のシグナル配列を含む。
【００４８】
EP-A0464533号は免疫グロブリンの定常領域の種々の部分を含む融合タンパク質を開示している。Fcは治療および診断において有用であり、例えば改善された薬物動態特性を示す（EP-A0232262号）。薬剤の発見において、例えばヒトタンパク質は拮抗剤を同定するために高スループットのスクリーニング試験を目的としてFc部分と融合されている（Bennettら、Journalof Molecular Recognition, 8:52-58(1995)およびJohansonら、The Journal of BiologicalChemistry, 270, 16:9459-9471(1995)を参照）。即ち、本発明はまた、本発明のポリペプチドおよび種々のサブクラスの免疫グロブリン（IgG、IgM、IgA、IgE）の重鎖または軽鎖の定常領域の種々の部分を含む可溶性融合ポリペプチドを含む。
【００４９】
キメラまたは融合ポリペプチドは標準的な組み換えDNA法により生成することができる。例えば、種々のポリペプチド配列をコードするDNAフラグメントを従来の方法に従ってインフレームで共に連結する。別の態様においては、融合遺伝子は自動化DNA合成を含む従来法により合成できる。或いは、核酸セグメントのPCR増幅は、キメラ核酸配列を生成するために続いてアニーリングまたは再増幅される2つの連続する核酸フラグメントの間に相補的な突出部を与えるアンカープライマーを用いて行なうことができる(Ausubelら、"CurrentProtocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons, (1998)参照。 その内容は参照により本明細書に援用される）。さらにまた、既に融合部分（例えばGSTタンパク質）をコードしている多くの発現ベクターが市販されている。融合部分をインフレームでポリペプチドに連結できるように本発明のポリペプチドをコードする核酸分子をこのような発現ベクターにクローニングすることができる。
【００５０】
実質的に純粋な、単離された、または実質的に純粋かつ単離されたHDAC9、HDAC9a、HDAC9(ΔNLS)、HDAC9aΔNLSまたはHDRP(ΔNLS)ポリペプチドは、天然にそれを発現する細胞から精製でき、それを発現する様に改変されている（組み換えの）細胞から精製でき、または、知られたタンパク質合成方法を用いて合成できる。１つの態様においては、ポリペプチドは組み換えDNA法により生成される。例えば、ポリペプチドをコードする核酸分子を発現ベクターにクローニングし、発現ベクターを宿主細胞に導入し、宿主細胞内でポリペプチドを発現させる。次にポリペプチドを標準的なタンパク質精製方法を用いて適切な精製スキームにより細胞から単離することができる。
【００５１】
一般的に本発明のHDAC9、HDAC9a、HDAC9(ΔNLS)、HDAC9aΔNLSおよびHDRP(ΔNLS)ポリペプチドは、当該分野で公知の方法を用いたSDS-PAGE上またはモレキュラーシーブゲル濾過カラム上の分子量マーカーとして使用できる。本発明のポリペプチドは抗体を惹起するため、または免疫応答を誘発するために使用できる。ポリペプチドはまた生物学的液体中のポリペプチドまたはそれが結合する分子(例えば受容体またはリガンド)の量を定量的に測定するためのアッセイにおいて、試薬、例えば標識試薬として、使用できる。ポリペプチドはまた、相当するポリペプチドが組織分化の間に構成的に、または、罹患状態において優先的に発現される細胞または組織のためのマーカーとして使用できる。ポリペプチドは相当する結合因子を単離するため、および、結合相互作用のペプチドまたは小分子の拮抗剤またはアゴニストをスクリーニングするために使用できる。本発明のポリペプチドはまた治療薬としても使用できる。
【００５２】
本発明の核酸分子
本発明はまたHDAC9、HDAC9a、HDAC9(ΔNLS)、HDAC9a(ΔNLS)およびHDRP(ΔNLS)核酸分子を特徴とする。
【００５３】
「ヒストンデアセチラーゼ核酸分子」とは、ヒストンデアセチラーゼポリペプチドをコードする核酸分子を意味する。このようなヒストン核酸には、例えば、本明細書に詳述するHDAC9、HDAC9a、HDAC9(ΔNLS)、HDAC9a(ΔNLS)またはHDRP(ΔNLS)核酸分子；配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：７または配列番号：９を含む単離された核酸；配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：７または配列番号：９を含む単離された核酸の相補体；配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８または配列番号：１０のヒストンデアセチラーゼポリペプチドをコードする単離された核酸；配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８または配列番号：１０のヒストンデアセチラーゼポリペプチドをコードする単離された核酸の相補体；配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６または配列番号：８の何れかをコードする核酸分子に高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズ可能な核酸、またはその相補体；配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５または配列番号：７を含む核酸に高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズ可能な核酸分子；ならびに配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：７、配列番号：９の何れかと少なくとも55％、より好ましくは60％、65％、70％、75％、80％、85％または90％、そして最も好ましくは95％または99％の配列同一性を有する単離された核酸分子またはその相補体が包含される。
【００５４】
HDAC9核酸分子はHDAC9ポリペプチドをコードする核酸分子である。１つの態様において、HDAC9核酸分子は配列番号：１の核酸配列を含む核酸分子；配列番号：１を含む単離された核酸の相補体；配列番号：２のヒストンデアセチラーゼポリペプチドをコードする単離された核酸；配列番号：２のヒストンデアセチラーゼポリペプチドをコードする単離された核酸の相補体；配列番号：２をコードする核酸分子に高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズ可能な核酸；配列番号：１を含む核酸に高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズ可能な核酸分子；および本明細書に記載したBLASTプログラムおよびパラメーターを用いて測定した場合に、配列番号：１と少なくとも55％、より好ましくは60％、65％、70％、75％、80％、85％または90％、そして最も好ましくは95％または99％の配列同一性を有する単離された核酸分子から選択される。別の態様においては、HDAC9核酸分子は配列番号：１の核酸配列よりなる。
【００５５】
HDAC9a核酸分子はHDAC9aポリペプチドをコードする核酸分子である。HDAC9a核酸分子は好ましくは配列番号：３と少なくとも１つ55％の配列同一性を有する。１つの態様において、HDAC9a核酸分子は配列番号：３の核酸配列を含む核酸分子；配列番号：３を含む単離された核酸の相補体；配列番号：４のヒストンデアセチラーゼポリペプチドをコードする単離された核酸；配列番号：４のヒストンデアセチラーゼポリペプチドをコードする単離された核酸の相補体；配列番号：４をコードする核酸分子に高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズ可能な核酸；配列番号：３を含む核酸に高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズ可能な核酸分子；および本明細書に記載したBLASTプログラムおよびパラメーターを用いて測定した場合に、配列番号：3と少なくとも55％、より好ましくは60％、65％、70％、75％、80％、85％または90％、そして最も好ましくは95％または99％の配列同一性を有する単離された核酸分子から選択される。別の態様においては、HDAC9a核酸分子は配列番号：３の核酸配列よりなる。
【００５６】
HDAC9(ΔNLS)核酸分子はHDAC9(ΔNLS)ポリペプチドをコードする核酸分子である。１つの態様において、HDAC9(ΔNLS)核酸分子は配列番号：５の核酸配列を含む核酸分子；配列番号：５を含む単離された核酸の相補体；配列番号：６のヒストンデアセチラーゼポリペプチドをコードする単離された核酸；配列番号：６のヒストンデアセチラーゼポリペプチドをコードする単離された核酸の相補体；配列番号：６をコードする核酸分子に高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズ可能な核酸；配列番号：５を含む核酸に高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズ可能な核酸分子；および本明細書に記載したBLASTプログラムおよびパラメーターを用いて測定した場合に、配列番号：5またはその相補体と少なくとも55％、より好ましくは60％、65％、70％、75％、80％、85％または90％、そして最も好ましくは95％または99％の配列同一性を有する単離された核酸分子から選択される。別の態様においては、HDAC9(ΔNLS)核酸分子は配列番号：５の核酸配列よりなる。
【００５７】
HDAC9a(ΔNLS)核酸分子はHDAC9a(ΔNLS)ポリペプチドをコードする核酸分子である。１つの態様において、HDAC9a(ΔNLS)核酸分子は配列番号：７の核酸配列を含む核酸分子；配列番号：7を含む単離された核酸の相補体；配列番号：８のヒストンデアセチラーゼポリペプチドをコードする単離された核酸；配列番号：８のヒストンデアセチラーゼポリペプチドをコードする単離された核酸の相補体；配列番号：８をコードする核酸分子に高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズ可能な核酸；配列番号：７を含む核酸に高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズ可能な核酸分子；および本明細書に記載したBLASTプログラムおよびパラメーターを用いて測定した場合に、配列番号：７またはその相補体と少なくとも55％、より好ましくは60％、65％、70％、75％、80％、85％または90％、そして最も好ましくは95％または99％の配列同一性を有する単離された核酸分子から選択される。別の態様においては、HDAC9a(ΔNLS)核酸分子は配列番号：７の核酸配列よりなる。
【００５８】
「HDRP(ΔNLS)核酸分子」はHDRP(ΔNLS)ポリペプチドをコードする核酸分子である。１つの態様において、HDRP(ΔNLS)核酸分子は配列番号：９の核酸配列を含む核酸分子；配列番号：９を含む単離された核酸の相補体；配列番号：１０のヒストンデアセチラーゼポリペプチドをコードする単離された核酸；配列番号：10のヒストンデアセチラーゼポリペプチドをコードする単離された核酸の相補体；および本明細書に記載したBLASTプログラムおよびパラメーターを用いて測定した場合に、配列番号：９またはその相補体と少なくとも55％、より好ましくは60％、65％、70％、75％、80％、85％または90％、そして最も好ましくは95％または99％の配列同一性を有する単離された核酸分子から選択される。別の態様においては、HDRP(ΔNLS)核酸分子は配列番号：９の核酸配列よりなる。
【００５９】
本発明の単離された核酸分子はRNA、例えばmRNA、またはDNA、例えばcDNAおよびゲノムDNAでありうる。DNA分子は二本鎖または一本鎖であり得；一本鎖RNAまたはDNAはコード鎖、即ちセンス鎖、または非コード鎖即ちアンチセンス鎖の何れかであることができる。核酸分子は遺伝子のコード配列の全てまたは一部を含むことができ、そして、さらにイントロンや非コード3'および5'配列（例えば調節配列を含む）のような非コード配列も含むことができる。さらにまた、核酸分子はマーカー配列、例えばポリペプチドの単離または精製を容易にするポリペプチドをコードする配列に融合することもできる。このような配列は例えば、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ(GST)融合タンパク質をコードするもの、およびインフルエンザ由来のヘマグルチニンA（HA）ポリペプチドマーカーをコードするものであるが、これらに限定されない。
【００６０】
「単離された」、「実質的に純粋な」または「実質的に純粋で単離された」核酸分子は、本明細書においては、遺伝子およびヌクレオチド配列に通常は隣接し(ゲノム配列の場合）、そして/または他の転写配列から完全にまたは部分的に精製されている(例えばRNAまたはcDNAライブラリーの場合）核酸から分離されたものである。例えば、本発明の単離された核酸は、それが天然に存在する複合細胞環境、または、組み換え法により製造される場合は培地、または、化学合成される場合は化学的前駆体または他の化合物に対して実質的に単離されてもよい。場合により、単離された物質は組成物（例えば他の物質を含む粗製の抽出物）、緩衝液または試薬混合物の一部を形成する。別の状況においては、物質は、例えばアガロースゲル電気泳動またはHPLCのようなカラムクロマトグラフィーで測定した場合に本質的に均質にまで精製されてもよい。好ましくは、単離された核酸分子は存在する全てのマクロ分子種の少なくとも約50、80、または90％(モル基準で)を含む。
【００６１】
ゲノムDNAに関しては、「単離された」という用語はまた、ゲノムDNAが天然に会合している染色体から分離された核酸分子を指す。例えば、単離された核酸分子は、その核酸分子の由来元となる細胞のゲノムDNA中の核酸分子に隣接する約5kb、4kb、3kb、2kb、1kb、0.5kbまたは0.1kb未満のヌクレオチドを含みうる。
【００６２】
HDAC9、HDAC9a、HDAC9(ΔNLS)、HDAC9a(ΔNLS)、またはHDRP(ΔNLS)核酸分子は他のコード配列または調節配列に融合することができ、そしてなお単離されたと見なすことができる。即ち、ベクター中に含まれる組み換えDNAは本明細書においては「単離された」の定義に含まれる。また、単離された核酸分子は異種宿主細胞中の組み換えDNA分子、並びに、溶液中の部分的または実質的に精製されたDNA分子を含む。「単離された」核酸分子はまた、本発明のDNA分子のインビボおよびインビトロのRNA転写物も含む。単離された核酸分子またはヌクレオチド配列は化学合成されるか、または、組み換え法により得られる核酸分子またはヌクレオチド配列を含む。従って、ベクター中に含まれる組み換えDNAは本明細書においては「単離された」の定義に包含される。
【００６３】
単離されたヌクレオチド分子はまた、異種生物中の組み換えDNA並びに溶液中の部分的または実質的に精製されたDNA分子も含む。本発明のDNA分子のインビボおよびインビトロのRNA転写物もまた「単離された」ヌクレオチド配列に包含される。このように単離されたヌクレオチド配列はコードされたポリペプチドの製造において、(例えば他の哺乳類種から）相同配列を単離するためのプローブとして、遺伝子マッピングのため(例えば染色体とのインサイチュのハイブリダイゼーションによる）、またはノーザンブロット分析により組織(例えばヒト組織）中の遺伝子の発現を検出するために有用である。
【００６４】
本発明はまた、必ずしも天然では見出されないが、HDAC9、HDAC9a、HDAC9(ΔNLS)、HDAC9a(ΔNLS)またはHDRP(ΔNLS)ポリペプチドをコードするバリアントHDAC9、HDAC9a、HDAC9(ΔNLS)、HDAC9a(ΔNLS)およびHDRP(ΔNLS)核酸分子にも関する。即ち、例えば、天然に存在するHDAC9、HDAC9a、HDAC9(ΔNLS)、HDAC9a(ΔNLS)またはHDRP(ΔNLS)ヌクレオチド配列とは異なるが、遺伝子コードの縮重により本発明のHDAC9、HDAC9a、HDAC9(ΔNLS)、HDAC9a(ΔNLS)またはHDRP(ΔNLS)ポリペプチドをコードする配列を含むDNA分子もまた本発明の主題である。
【００６５】
本発明はまたHDAC9、HDAC9a、HDAC9(ΔNLS)、HDAC9a(ΔNLS)またはHDRP(ΔNLS)ポリペプチドの一部(フラグメント）をコードする、またはその類縁体または誘導体のようなバリアントポリペプチドをコードする、HDAC9、HDAC9a、HDAC9(ΔNLS)、HDAC9a(ΔNLS)およびHDRP(ΔNLS)ヌクレオチド配列を含む。このようなバリアントは、対立遺伝子変異または１ヌクレオチド多型の場合のような天然のもの、または、種々の変異誘発物質または変異誘発処理により誘導されるもののような非天然のものであることができる。意図する変異には、例えば、保存的または非保存的なアミノ酸の変化、例えば付加および欠失をもたらすことのできる、ヌクレオチド１個以上の付加、欠失および置換を含む。好ましくは、HDAC9、HDAC9a、HDAC9(ΔNLS)、HDAC9a(ΔNLS)またはHDRP(ΔNLS)のヌクレオチド(および/またはその結果生じるアミノ酸)の変化はサイレントであるか保存されており；即ち、それらはHDAC9、HDAC9a、HDAC9(ΔNLS)、HDAC9a(ΔNLS)またはHDRP(ΔNLS)ポリペプチドの性質または活性を変化させない。１つの好ましい態様においては、ヌクレオチド配列は多型マイクロサテライトマーカー１つ以上を含むフラグメントである。
【００６６】
本発明のHDAC9、HDAC9a、HDAC9(ΔNLS)、HDAC9a(ΔNLS)またはHDRP(ΔNLS)核酸分子の他の変化は、例えば、標識、メチル化、ヌクレオチド間の修飾、例えば非荷電連結(例えばメチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホアミダイトおよびカルバメート)、荷電連結(例えばホスホロチオエートまたはホスホロジチオエート)、懸垂部分(例えばポリペプチド)、インタカレーター(例えばアクリジンまたはソラレン)、キレート剤、アルキル化剤および修飾連結(例えばαアノマー核酸)である。さらに挙げられるものは、水素結合または他の化学的相互作用を介して指定された配列に結合する能力において核酸分子を模倣する合成分子である。このような分子には、例えば、分子の骨格内でホスフェート結合をペプチド結合が代替するものを含む。
【００６７】
本発明はまた、本明細書に記載したヌクレオチド配列に選択的ハイブリダイゼーションの場合のような高ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするHDAC9、HDAC9a、HDAC9(ΔNLS)、HDAC9a(ΔNLS)およびHDRP(ΔNLS)核酸分子(例えば、本明細書に記載したポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に特異的にハイブリダイズする核酸分子であり、必要に応じてポリペプチドの活性を有する)に関する。１つの態様において、本発明は配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：７、配列番号：９および配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：７または配列番号：９の相補体から選択されるヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列に高ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件（例えば選択的ハイブリダイゼーション用の）下でハイブリダイズする本発明に記載したバリアントを含む。別の態様においては配列番号：２(HDAC9)、配列番号：４(HDAC9a)、配列番号：６(HDAC9(ΔNLS))、配列番号：８(HDAC9a(ΔNLS))または配列番号：１０(HDRP(ΔNLS))のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列に高ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件（例えば選択的ハイブリダイゼーション用の）下でハイブリダイズする本発明に記載したバリアントを含む。好ましい態様においては、高ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするバリアントはHDAC9、HDAC9a、HDAC9(ΔNLS)、HDAC9a(ΔNLS)またはHDRP(ΔNLS)ポリペプチドの生物学的活性(例えばヒストンデアセチラーゼ活性または転写抑制活性)を有するポリペプチドをコードする。
【００６８】
このような核酸分子は特異的ハイブリダイゼーション(例えば高ストリンジェントな条件下のもの)により検出および/または単離することができる。「特異的ハイブリダイゼーション」とは、本明細書においては、第１の核酸が第２の核酸以外の核酸にはハイブリダイズしないような(例えば第１の核酸が、ハイブリダイゼーションを行う試料中の如何なる他の核酸に対するよりも高い類似性を第２の核酸に対して有している場合のような)様式で第２の核酸にハイブリダイズする第１の核酸の能力を指す。ハイブリダイゼーションに関する「ストリンジェントな条件」とは、特定の核酸の第２の核酸に対するハイブリダイゼーションを可能にするインキュベーションおよび洗浄の条件、例えば、温度および緩衝液の濃度の条件を指す当該分野の用語であり；第１の核酸は第２のものに対して完全(即ち100％)相補性であるか、または第１および第２のものが完全未満のある程度(例えば70％、75％、85％、95％)の相補性を共有している場合もある。例えば、特定の高ストリンジェントな条件はより低い相補性のものから完全に相補的な核酸を識別するために使用できる。核酸ハイブリダイゼーションに関する「高ストリンジェントな条件」、「中程度にストリンジェントな条件」および「低ストリンジェントな条件」は、CurrentProtocols in Molecular Biology, p.2.10.1-2.10.16およびp6.3.1-6.3.6に記載されている（前出のAusubelらも参照、これらの記載内容はすべて、参考により本明細書に援用される）。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを決定する厳密な条件はイオン強度(例えば、0.2XSSCまたは0.1XSSC)、温度(例えば室温、42℃または68℃)および脱安定化剤、例えばホルムアミドまたは変性剤、例えばSDSの濃度のみならず、核酸配列の長さ、塩基の組成、ハイブリダイズする配列間の％ミスマッチ、および他の非同一配列内のその配列のサブセットの存在頻度により異なる。即ち、同等の条件は２種の核酸分子の間の同一性または類似性を同じ程度に維持しながらこれらのパラメーターの１種以上を変化させることにより決定できる。典型的には、少なくとも約60％、少なくとも約70％、少なくとも約80％、少なくとも約90％または少なくとも約95％以上相互に同一である配列が相互にハイブリダイズされた状態で維持されるような条件を用いる。ハイブリダイゼーションが起こらないストリンジェンシーのレベルからハイブリダイゼーションが最初に観察されるレベルまでハイブリダイゼーション条件を変化させることにより、所定の配列を試料中の大部分の類似の配列にハイブリダイズさせる(例えば選択的に)ことのできる条件が決定できる。
【００６９】
例示的な条件は、KrauseおよびAaronson, Methods in Enzymology, 200:546-556（1991）に記載される。さらにまた、前出のAusubelらは、中程度のまたは低いストリンジェンシー条件のための洗浄条件の決定について記載している。洗浄は、条件が通常はハイブリッドの相補性の最低レベルを決定するように設定される工程である。一般的に、相同ハイブリダイゼーションのみが起こる最低温度から出発して、最終洗浄温度を１℃下げる（SSC濃度は一定に維持）と、ハイブリダイズする配列中のミスマッチの最大程度を１％増大させることができる。一般的に、SSCの濃度を2倍にすることによりTmが17℃上昇する。これらの指針を用いながら、高、中または低ストリンジェンシーのための洗浄温度は、想定されるミスマッチのレベルに応じて経験的に決定され得る。
【００７０】
例えば、低ストリンジェンシー洗浄は、室温で10分間0.2×SSC/0.1％SDSを含有する溶液での洗浄工程を含み得；中ストリンジェンシー洗浄は、42℃で15分間0.2×SSC/0.1％SDSを含有する予備加温（42℃）された溶液での洗浄工程を含み得；高ストリンジェンシー洗浄は、68℃で15分間0.1×SSC/0.1％SDSを含有する予備加温（68℃）された溶液での洗浄工程を含み得る。さらに、洗浄は、当該分野で公知のように、所望の結果を得るために、繰り返しまたは連続して行なわれ得る。同等の条件は、標的核酸分子と使用されるプライマーまたはプローブとの間の同一性または類似性を同様のレベルに維持しながら、当該分野で公知のように、例示されるパラメーターのうちの１つ以上を変化させることにより決定され得る。
【００７１】
２つの核酸配列のパーセント相同性または同一性を測定するために、配列が最適比較目的のために整列される（例えば、別のポリペプチドまたは核酸分子との最適配列のため、ギャップが１つのポリペプチドまたは核酸分子の配列内に導入され得る）。次に、対応するアミノ酸位置またはヌクレオチド位置におけるアミノ酸残基またはヌクレオチドが上記のように比較される。
【００７２】
本発明はまた、配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：７、配列番号：９から選択されるヌクレオチド配列、および配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：７または配列番号：９のいずれかの相補体を含むヌクレオチド配列に高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするフラグメントまたは部分を含む単離されたHDAC9、HDAC9a、HDAC9(ΔNLS)、HDAC9a(ΔNLS)、およびHDRP(ΔNLS)核酸分子を提供し、そしてまた、配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８および配列番号：１０から選択されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列に高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするフラグメントまたは部分を含む単離された核酸分子を提供する。本発明の核酸フラグメントは少なくとも約15、好ましくは少なくとも約18、20、23、または25ヌクレオチドであり、そして30、40、50、100、200以上のヌクレオチド長であり得る。本明細書に記載される抗原性ポリペプチドをコードするより長いフラグメント（例えば、30以上のヌクレオチド長）は、例えば、上記の抗体の生成のために特に有用である。
【００７３】
関連する局面において、本発明のHDAC9、HDAC9a、HDAC9(ΔNLS)、HDAC9a(ΔNLS)、およびHDRP(ΔNLS)核酸フラグメントは、本明細書に記載されるアッセイにおけるプローブまたはプライマーとして使用される。「プローブ」または「プライマー」は、核酸分子の相補鎖に塩基特異的様式でハイブリダイズするオリゴヌクレオチドである。このようなプローブおよびプライマーとしては、Nielsenら、Science,254, 1497-1500（1991）に記載されているポリペプチド核酸が挙げられる。本明細書において使用される場合、用語「プライマー」は、とりわけ、周知の方法（例えば、PCR、LCR）（本明細書に記載されるものが挙げられるがそれらに限定されない）を用いる鋳型指向DNA合成の開始点として作用する一本鎖オリゴヌクレオチドをいう。
【００７４】
典型的には、プローブまたはプライマーは、配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：７、配列番号：９から選択される隣接ヌクレオチド配列、配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：７、配列番号：９のいずれかの相補体、および配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８または配列番号：１０のアミノ酸配列をコードする配列を含む核酸分子の少なくとも約15、典型的には約20〜25、より典型的には約40、50または75個連続するヌクレオチドにハイブリダイズするヌクレオチド配列の領域を含む。
【００７５】
好ましい態様において、プローブまたはプライマーは、100ヌクレオチド以下、好ましくは6〜50ヌクレオチド、より好ましくは12〜30ヌクレオチドを含む。別の態様においては、プローブまたはプライマーは、隣接ヌクレオチド配列に対して、または隣接ヌクレオチド配列の相補体に対して少なくとも70％同一、好ましくは少なくとも80％同一、より好ましくは少なくとも90％同一、なおより好ましくは少なくとも95％同一であるか、あるいは、隣接ヌクレオチド配列または隣接ヌクレオチド配列の相補体に選択的にハイブリダイズすることさえもできる。しばしば、プローブまたはプライマーはさらに、標識、例えば、放射性同位体、蛍光化合物、酵素、または酵素の補因子を含む。
【００７６】
上記のような本発明の核酸分子は、標準的な分子生物学手法および配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：７、配列番号：９、配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８および/または配列番号：１０に示された配列情報を用いて同定および単離され得る。例えば、核酸分子は、上で提供された核酸配列および/またはそれらの配列の相補体の１つ以上に基づいて設計された合成オリゴヌクレオチドプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応により増幅および単離され得る。あるいは、このような核酸分子は、配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８または配列番号：１０に示されたアミノ酸配列の１つ以上をコードするヌクレオチド配列に基づいて設計され得る。一般的に、PCRTechnology: Principles and Applications for DNA Amplification（H.A.Erlich編,Freeman Press, NY, NY,（1992）; PCR Protocols: A guide to Methods andApplications（Innisら編、Academic Press, San Diego, CA,（1990）; Mattilaら、NucleicAcids Res., 19:4967（1991）; Eckertら、PCR Methods and Applications, 1:17（1991）;PCR（McPhersonら編、IRL Press, Oxford））および米国特許第4,683,202号を参照のこと。核酸分子は、鋳型としてcDNA、mRNAまたはゲノムDNAを用いて増幅され、適切なベクターにクローニングされ、そして、DNA配列分析により特性化され得る。
【００７７】
他の好適な増幅方法としては、リガーゼ連鎖反応（LCR）（WuおよびWallace, Genomics, 4:560（1989）, Landegrenら、Science,241:1077（1988）参照）、転写増幅（Kwohら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:1173（1989））および自己保持配列複製（Guatelliら、Proc.Nat. Acad. Sci. USA, 87:1874（1990）参照）および核酸に基づく配列増幅（NASBA）が挙げられる。後者の２つの増幅方法は、等温転写に基づいた等温反応を含むが、これは、一本鎖RNA（ssRNA）と二本鎖DNA（dsDNA）の両方を増幅産物としてそれぞれ約30または100:１の比で生成する。
【００７８】
増幅されたDNAは、放射標識され、ヒト細胞由来のcDNAライブラリー、zap発現におけるmRNA（ZIPLOX）、または他の好適なベクターをスクリーニングするためのプローブとして使用され得る。対応するクローンが単離され得、DNAがインビボ除去により得られ得、クローニングされた挿入物は、当該分野で公知の方法により片方または両方の方向に配列決定されて、適切な分子量のポリペプチドをコードする正しいリーディングフレームを同定することができる。例えば、本発明の核酸分子のヌクレオチド配列の直接分析は、市販されている周知の公知の方法を用いて達成され得る。例えば、Sambrookら、MolecularCloning, A Laboratory Manual（第二版, CSHP, New York（1989））; Zyskindら、RecombinantDNA Laboratory Manual,（Acad. Press,（1988））を参照のこと。これらまたは同様の方法を用いて、ポリペプチドおよびポリペプチドをコードするDNAが単離され、配列決定され、さらに特性化され得る。
【００７９】
本発明のアンチセンス核酸分子は、配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：７、配列番号：９のヌクレオチド配列および／または配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：７、配列番号：９のいずれかの相補体および/またはこれらの配列の一部、および/またはそれらの一部もしくは配列の相補体、および/または配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８、配列番号：１０のアミノ酸配列をコードする、または、配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８または配列番号：１０の一部をコードする配列を用いて設計され得る。このようなアンチセンス核酸分子は、当該分野で公知の手順を用いる化学合成および酵素ライゲーション反応を用いて構築され得る。例えば、アンチセンス核酸分子（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド）は、天然に存在するヌクレオチドを用いて化学的に合成され得、または、分子の生物学的安定性を増大させるか、またはアンチセンスとセンス核酸との間に形成される二本鎖の物理学的安定性を増大させるように設計された多様に修飾されたヌクレオチド（例えば、ホスホロチオエート誘導体およびアクリジン置換ヌクレオチド）が用いられ得る。あるいは、アンチセンス核酸分子は、アンチセンス方向に核酸分子がサブクローニングされている発現ベクターを用いて生物学的に生成され得る（すなわち、挿入された核酸分子から転写されたRNAは目的の標的核酸に対してアンチセンス方向のものとなる）。
【００８０】
一般的に、本発明の単離されたHDAC9、HDAC9a、HDAC9(ΔNLS)、HDAC9a(ΔNLS)およびHDRP(ΔNLS)核酸配列は、サザンブロット上の分子量マーカーとして、そして、関連遺伝子位置のマッピングのために標識される染色体マーカーとして使用され得る。核酸配列はまた、遺伝的障害を同定するために患者における内因性DNA配列と比較するため（例えば、細胞増殖疾患、アポトーシス疾患、または細胞分化疾患の素因または感受性）に、および、例えば、関連DNA配列にハイブリダイズして発見するため、または、試料から公知配列を減算するためのプローブとして使用され得る。本発明の核酸分子はまた、治療剤として使用され得る。
【００８１】
「細胞増殖疾患」とは、細胞分裂の望ましくない高値、アポトーシスの望ましくない低値または双方によりもたらされるか、これらをもたらす疾患を意味する。例えば、リンパ腫、白血病、黒色腫、卵巣癌、乳癌、膵臓癌、前立腺癌、結腸癌および肺癌のような癌は、細胞増殖疾患の全ての例である。骨髄増殖性障害（真性赤血球増加症、本態性血小板血症、原因不明骨髄様化生、および、慢性骨髄性白血病が挙げられる）もまた細胞増殖疾患である。
【００８２】
「細胞分化疾患」とは、細胞分化の望ましくない低値によりもたらされるかこれをもたらす、あるいは、細胞分化の望ましくない高値によりもたらされる疾患を意味する。例えば、リンパ腫、白血病、黒色腫、卵巣癌、乳癌、膵臓癌、前立腺癌、結腸癌および肺癌のような癌は全て、細胞分化疾患の例である。骨髄増殖性障害（真性赤血球増加症、本態性血小板血症、原因不明骨髄様化生、および、慢性骨髄性白血病が挙げられる）もまた細胞分化疾患である。
【００８３】
「アポトーシス疾患」とは、アポトーシス応答が異常である状態を意味する。これは、適切な条件下で細胞死を受けない細胞または細胞集団に関係し得る。例えば、通常、細胞は、アポトーシス誘発因子（例えば、化学療法剤）またはイオン化照射に曝露されると死滅する。しかしながら、被験体がアポトーシス疾患（例えば、癌）を有する場合、細胞または細胞集団は、アポトーシス誘発因子との接触に応答する細胞死を受けない。さらに、細胞死の発生が極めて低値である場合、例えば、増殖している細胞の数が細胞死を受ける細胞の数より多い場合、被験体はアポトーシス疾患を有し得、このような細胞が適切に分化しない場合癌を生じる。
【００８４】
アポトーシス疾患はまた、アポトーシスの望ましくない高値の発生を特徴とする状態であり得る。例えば、特定の神経変性疾患（アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、多発性硬化症、再狭窄、卒中および虚血性脳傷害は神経細胞が挙げられるが、これらに限定されない）は、神経細胞が望ましくない細胞死を受けるアポトーシス疾患である。
【００８５】
本発明のポリペプチドおよび核酸分子が診断および/または治療のために有用であり得る他の疾患としては、ハンチントン病が挙げられるが、これに限定されない。
【００８６】
本発明のHDAC9、HDAC9a、HDAC9(ΔNLS)、HDAC9a(ΔNLS)およびHDRP(ΔNLS)核酸分子はさらに、遺伝子フィンガープリンティングのためのプライマーを誘導するため、DNA免疫化技術を用いて抗ポリペプチド抗体を惹起させるため、および抗DNA抗体を惹起または免疫応答を顕在化するための抗原として使用され得る。本明細書で同定されたヌクレオチド配列の部分またはフラグメント（および対応する完全な遺伝子配列）は、ポリヌクレオチド試薬として多くの方法に使用され得る。例えば、これらの配列は、（i）染色体上にそれぞれの遺伝子をマッピングし；そしてこれにより遺伝的疾患に関与する遺伝子領域の位置を突きとめるため；（ii）微小な生物学的試料から個体を同定するため（組織タイピング）；および（iii）生物学的試料の法医学的同定を促進するために使用され得る。
【００８７】
さらに、本発明のHDAC9、HDAC9a、HDAC9(ΔNLS)、HDAC9a(ΔNLS)およびHDRP(ΔNLS)ヌクレオチド配列は、分析、特性化または治療上の使用のための組み換えポリペプチドを同定し発現するため、または、対応するポリペプチドが組織分化の間に本質的に、または疾患状態のいずれかにおいて発現される組織のためのマーカーとして使用され得る。核酸配列はさらに、本明細書に記載されるスクリーニングおよび/または診断アッセイにおける試薬として使用され得、そして、本明細書に記載されるスクリーニングおよび/または診断アッセイにおける使用用のキット（例えば、試薬キット）の成分としても含まれ得る。
【００８８】
標準的な技術、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）およびDNAハイブリダイゼーションを用いて、他の種におけるHDAC9、HDAC9a、HDAC9(ΔNLS)、HDAC9a(ΔNLS)、またはHDRP(ΔNLS)相同体、例えば、哺乳動物相同体をクローニングし得る。HDAC9、HDAC9a、HDAC9(ΔNLS)、HDAC9a(ΔNLS)、またはHDRP(ΔNLS)相同体は、ヒトHDAC9、HDAC9a、HDAC9(ΔNLS)、HDAC9a(ΔNLS)、またはHDRP(ΔNLS)プローブまたはプライマーを用いた低ストリンジェンシーDNAハイブリダイゼーションまたは低ストリンジェンシーPCRを用いて容易に同定され得る。ヒトHDAC9、HDAC9a、HDAC9(ΔNLS)、HDAC9a(ΔNLS)、またはHDRP(ΔNLS)ポリペプチドをコードする変性プライマーを用いてRT-PCRによりHDAC9、HDAC9a、HDAC9(ΔNLS)、HDAC9a(ΔNLS)、またはHDRP(ΔNLS)相同体をクローニングし得る。
【００８９】
あるいは、さらなるHDAC9、HDAC9a、HDAC9(ΔNLS)、HDAC9a(ΔNLS)、またはHDRP(ΔNLS)相同体は、HDAC9、HDAC9a、HDAC9(ΔNLS)、HDAC9a(ΔNLS)、またはHDRP(ΔNLS)ポリペプチドに関するコンセンサス配列情報を利用して同定され、他種の同様のポリペプチドを検索し得る。例えば、他種のポリペプチドデータベースは、本明細書に記載されるHDACドメインを有するタンパク質について探索され得る。次に、このようなモチーフを含む候補ポリペプチドは、HDAC9、HDAC9a、HDAC9(ΔNLS)、HDAC9a(ΔNLS)、またはHDRP(ΔNLS)の生物学的活性について、本明細書に記載する方法を用いて試験され得る。
【００９０】
本発明の核酸分子の発現
本発明の別の局面は、HDAC9、HDAC9a、HDAC9(ΔNLS)、HDAC9a(ΔNLS)、またはHDRP(ΔNLS)核酸分子、例えば、配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：７、配列番号：９、および配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：７、または配列番号：９のいずれかの相補体（またはその部分）よりなる群から選択されるものを含む核酸構築物に関する。本発明のさらに別の局面は、配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８、または配列番号：１０のアミノ酸配列をコードする核酸分子を含むHDAC9、HDAC9a、HDAC9(ΔNLS)、HDAC9a(ΔNLS)、およびHDRP(ΔNLS)核酸構築物に関する。構築物は、本発明の配列がセンスまたはアンチセンス方向に挿入されているベクター（例えば、発現ベクター）を含む。
【００９１】
本明細書において使用される場合、用語「ベクター」または「構築物」は、それが連結されている別の核酸を輸送することのできる核酸分子を指す。ベクターの１つの型は、「プラスミド」であり、これはさらなるDNAセグメントが連結され得る環状二本鎖DNAループをいう。ベクターの別の型は、ウィルスベクターであり、ここでは、さらなるDNAセグメントがウィルスゲノムに連結され得る。特定のベクターは、それらが導入される宿主細胞において自律複製することができる（例えば、細菌の複製起点を有する細菌ベクターおよびエピソーム哺乳動物ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソーム哺乳動物ベクター）は、宿主細胞への導入の際に宿主細胞のゲノム内に統合され、これにより宿主ゲノムとともに複製される。さらに、特定のベクター、発現ベクターは、それらが作動可能に連結された遺伝子の発現を指向することができる。一般的に、組み換えDNA技術に有用な発現ベクターは、しばしばプラスミドの形態である。しかしながら、本発明は、かかる形態の発現ベクター、例えば、同等の機能の要求を満たすウィルスベクター（例えば、複製欠損レトロウィルス、アデノウィルスおよびアデノ随伴ウィルス）を含むことが意図される。
【００９２】
本発明の好ましい組み換え発現ベクターは、宿主細胞中での核酸分子の発現に好適な形態で本発明の核酸分子を含む。このことは、発現ベクターが、発現対象の核酸配列に作動可能に連結された、発現のために使用されるべき宿主細胞に基づいて選択された１つ以上の調節配列を含むことを意味する。組み換え発現ベクター内において、「作動可能に連結した」とは、目的のヌクレオチド配列が、ヌクレオチド配列の発現を可能にする様式で（例えば、インビトロ転写/翻訳系において、または、ベクターが宿主細胞に導入される場合は宿主細胞において）調節配列に連結されることを意味することが意図される。用語「調節配列」は、プロモーター、エンハンサーおよび他の発現制御要素（例えば、ポリアデニル化シグナル）を含むものとする。このような調節配列は、例えば、Goeddel,Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, SanDiego, Ca（1990）に記載されている。調節配列としては、多くの型の宿主細胞におけるヌクレオチド配列の構成的発現を指向するもの、および、特定の宿主細胞においてのみヌクレオチドの発現を指向するもの（例えば、組織特異的調節配列）が挙げられる。
【００９３】
発現ベクターの設計が、形質転換されるべき宿主細胞の選択および所望のペプチドの発現のレベルのような要因に依存し得ることは、当業者にとって自明である。本発明の発現ベクターは、宿主細胞に導入されて、本明細書に記載されるような核酸分子によりコードされるポリペプチド（融合ポリペプチドを含む）を生成し得る。
【００９４】
本発明の組み換え発現ベクターは、原核細胞または真核細胞、例えば、細菌細胞（例えば、E.coli）、昆虫細胞（バキュロウィルス発現ベクターを使用）、酵母細胞または哺乳動物細胞における本発明のポリペプチドの発現のために設計され得る。好適な宿主細胞は、前出のGoeddelにおいてされに考察される。あるいは、組み換え発現ベクターは、例えば、T7プロモーター調節配列およびT7ポリメラーゼを用いてインビトロで転写および翻訳され得る。
【００９５】
本発明の別の局面は、本発明の組み換え発現ベクターが導入されている宿主細胞に関する。用語「宿主細胞」および「組み換え宿主細胞」は、本明細書においては互換的に使用される。このような用語は、特定の対象細胞のみならず、そのような細胞の後代または将来の後代もいうと理解される。特定の修飾が突然変異または環境の影響のいずれかにより次の世代において生じ得るので、このような後代は、実際は、親細胞と同一ではないが、しかしなお、本明細書において使用される用語の範囲に含まれる。
【００９６】
宿主細胞は、任意の原核または真核細胞であり得る。例えば、本発明の核酸分子は、細菌細胞（例えば、E.coli）、昆虫細胞、酵母、または哺乳動物細胞（例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞（CHO）またはCOS細胞、ヒト293T細胞、HeLa細胞、NIH3T3細胞、およびマウス赤白血病（MEL）細胞）において発現され得る。他の好適な宿主細胞は当業者にとって公知である。
【００９７】
ベクターDNAは、従来の形質転換またはトランスフェクション技術を介して原核細胞または真核細胞に導入され得る。本明細書で使用される場合、用語「形質転換」および「トランスフェクション」は、宿主細胞に外来核酸分子（例えば、DNA）を導入するための種々の公知の技術（リン酸カルシウムまたは塩化カルシウム共沈殿法、DEAEデキストラン媒介トランスフェクション、リポフェクション、またはエレクトロポレーションが挙げられる）をいうことが意図される。宿主細胞を形質転換またはトランスフェクトするための好適な方法は、Sambrookら（前出）および他の実験室マニュアルに見出され得る。
【００９８】
哺乳動物細胞の安定なトランスフェクションのためには、使用される発現ベクターおよびトランスフェクション技術に依存するが、ほんの少しの細胞のみがそのゲノムに外来性DNAを統合し得ることが公知である。これらの統合体を同定し選択するために、選択可能マーカー（例えば、抗生物質への耐性）をコードする遺伝子が、一般的に目的の遺伝子とともに宿主細胞に導入される。好ましい選択可能マーカーとしては、G418、ハイグロマイシンまたはメトトレキセートのような薬物への耐性を与えるものが挙げられる。選択可能マーカーをコードする核酸分子は、本発明の核酸分子と同じベクター上で宿主細胞に導入され得るか、または、別のベクター上で導入され得る。導入された核酸分子で安定にトランスフェクトされた細胞は、薬物選択により同定され得る（例えば、選択可能マーカー遺伝子を組み込んでいる細胞は生存するが、他の細胞は死滅する）。
【００９９】
培養中の本発明の宿主細胞（例えば、原核生物宿主細胞または真核生物宿主細胞）は、本発明のポリペプチドを生成（すなわち発現）するために使用され得る。従って、本発明はさらに、本発明の宿主細胞を用いたポリペプチドの製造方法を提供する。１つの態様において、方法はポリペプチドが生産されるような好適な培地で本発明の宿主細胞（本発明のポリペプチドをコードする組み換え発現ベクターが導入されている）を培養する工程を含む。別の態様において、方法はさらに、培地または宿主細胞からポリペプチドを単離する工程を含む。
【０１００】
本発明の宿主細胞はまた、非ヒトトランスジェニック動物を製造するために使用され得る。例えば、１つの態様において、本発明の宿主細胞は、本発明のHDAC9、HDAC9a、HDAC9(ΔNLS)、HDAC9a(ΔNLS)、またはHDRP(ΔNLS)核酸分子が導入されている受精卵母細胞または胚性幹細胞である。次に、このような宿主細胞を用いて、ゲノムに外来性ヌクレオチド配列が導入されている非ヒトトランスジェニック動物、または、内因性ヌクレオチド配列が改変されている相同組み換え動物を作製し得る。このような動物は、ヌクレオチド配列および配列によりコードされるポリペプチドの機能および/または活性を研究するため、および、その活性のモジュレーターを同定および/または評価するために有用である。
【０１０１】
本明細書において使用される場合、「トランスジェニック動物」は、動物の細胞の１つ以上がトランスジーンを含んでいる非ヒト動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはラットやマウスのようなげっ歯類である。トランスジェニック動物の別の例としては、非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ウシ、ヤギ、ニワトリ、および両生類が挙げられる。トランスジーンは、トランスジェニック動物が発生する細胞のゲノムに統合され、そして成熟動物のゲノム中に残存し、これによりトランスジェニック動物の１つ以上の細胞型または組織中でのコード遺伝子産物の発現を指向する外因性DNAである。本明細書において使用される場合、「相同組み換え動物」は、内因性遺伝子が内因性遺伝子と動物の細胞（例えば、動物の発生前の動物の胚細胞）に導入された外来性DNA分子との間の相同組み換えにより改変されている、非ヒト動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはマウスである。
【０１０２】
胚操作およびマイクロインジェクションによりトランスジェニック動物、特にマウスのような動物を作製するための方法は、当該分野において慣習的になってきており、例えば、米国特許第4,736,866号および同第4,870,009号、米国特許第4,873,191号、およびHogan, Manipulating theMouse Embryo（Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.,（1986））に記載される。相同組み換えベクターおよび相同組み換え動物を構築するための方法は、さらに、Bradley,Current Opinion in Bio/Technology, 2:823-829（1991）およびPCT公報第WO90/11354号、同第WO91/01140号、同第WO92/0968号、および同第WO93/04169号に記載される。本明細書に記載される非ヒトトランスジェニック動物のクローンはまた、Wilmutら、Nature,358:810-813（1997）ならびにPCT公報第WO97/07668号および同第WO97/07669号に記載される方法に従って作製され得る。
【０１０３】
本発明の抗体
HDAC9、HDAC9a、HDAC9(ΔNLS)、HDAC9a(ΔNLS)、またはHDRP(ΔNLS)ポリペプチドのうち１つの形態を選択的に結合するが、別の形態のポリペプチドを結合しないポリクローナルおよび/またはモノクローナル抗体もまた提供される。多型部位を含むバリアントまたは参考HDAC9、HDAC9a、HDAC9(ΔNLS)、HDAC9a(ΔNLS)、またはHDRP(ΔNLS)ポリペプチドのいずれかの一部を結合する抗体もまた提供される。
【０１０４】
別の局面において、本発明は、HDAC9、HDAC9a、HDAC9(ΔNLS)、HDAC9a(ΔNLS)、およびHDRP(ΔNLS)ポリペプチド、および本発明のポリペプチドフラグメント（例えば、配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８、配列番号：１０、またはその部分によりコードされるアミノ酸配列を有する、あるいは、配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：７、または配列番号：９の全てまたは一部を含む核酸分子によりコードされるアミノ酸配列（例えば、配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８、または配列番号：１０、あるいは別のバリアント、あるいはその部分）を有する）の各々に対する抗体を提供する。
【０１０５】
本明細書で使用される場合、用語「精製された抗体」は、免疫グロブリン分子および免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分、すなわち抗原を選択的に結合する抗原結合部位を含む分子をいう。本発明のポリペプチドに選択的に結合する分子は、試料（例えば、ポリペプチドを天然に含有する生物学的試料）中のポリペプチドまたはそのフラグメントに結合するが、実質的に他の分子を結合しない分子である。好ましくは、抗体は、それが天然に会合しているタンパク質および天然の有機分子から少なくとも60重量％遊離している。より好ましくは、抗体調製物は、少なくとも75重量％または90重量％、最も好ましくは99重量％が抗体である。免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分の例としては、抗体をペプシンのような酵素で処理することにより生成され得るF(ab)およびF(ab')2フラグメントが挙げられる。
【０１０６】
本発明は、本発明のHDAC9、HDAC9a、HDAC9(ΔNLS)、HDAC9a(ΔNLS)、またはHDRP(ΔNLS)ポリペプチドに選択的に結合するポリクローナルおよびモノクローナル抗体を提供する。本明細書で使用される場合、用語「モノクローナル抗体」または「モノクローナル抗体組成物」は、本明細書においては、本発明のポリペプチドの特定のエピトープと免疫反応し得る１種のみの抗原結合部位を含む抗体分子の集団をいう。従って、モノクローナル抗体組成物は、典型的には、それが免疫反応する本発明の特定のポリペプチドに対して単一結合親和性を示す。
【０１０７】
ポリクローナル抗体は、所望の免疫原（例えば、本発明のHDAC9、HDAC9a、HDAC9(ΔNLS)、HDAC9a(ΔNLS)、またはHDRP(ΔNLS)ポリペプチドあるいはそのフラグメント）で好適な被験体を免疫化することにより上記のように調製され得る。免疫化された被験体における抗体力価は、標準的な手法、例えば、固定化されたポリペプチドを用いた酵素結合免疫吸着試験（ELISA）により経時的にモニタリングされ得る。所望により、ポリペプチドに対して惹起された抗体分子は、哺乳動物から（例えば、血液から）単離され、さらに、周知の技術、例えば、プロテインAクロマトグラフィーにより精製され、IgG画分を得ることができる。
【０１０８】
免疫化後の適切な時点、例えば、抗体力価が最高となったときに、抗体産生細胞が被験体から得られ、標準的な技術、例えば、KohlerおよびMilstein, Nature, 256;495-497（1975）が最初に報告したハイブリドーマ技術、ヒトB細胞ハイブリドーマ技術（Kozborら、Immunol.Today, 4:72（1983））、EBV-ハイブリドーマ技術（Coleら、Monoclonal Antibodies and CancerTherapy, Alan R. Liss, Inc., pp.77-96（1985））またはトリオーマ技術によってモノクローナル抗体を調製するために使用され得る。ハイブリドーマを生成するための技術は周知である（一般的に、CurrentProtocols in Immunology, Coliganら、（編）John Wiley & Sons, Inc., New York, NY（1994）を参照のこと）。概略すれば、不朽化細胞株（典型的には骨髄腫）が、上記した免疫原で免疫化された哺乳動物に由来するリンパ球（典型的には脾細胞）に融合され、得られたハイブリドーマ細胞の培養上澄みをスクリーニングして、本発明のポリペプチドを結合するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを同定する。
【０１０９】
リンパ球と不朽化細胞株を融合するために使用される多くの周知のプロトコルの何れも、本発明のポリペプチドに対するモノクローナル抗体を生成するために適用され得る（例えば、Current Protocols in Immunology, 前出；Galfreら、（1977） Nature,266:55052; R.H. Kenneth, Monoclonal Antibodies: A New Dimension In BiologicalAnalyses, Plenum Publishing Corp., New York, New York（1980）;およびLerner, Yale J.Biol. Med., 54:387-402（1981）を参照のこと）。さらに、当業者は、これらの方法には多くのバリエーションがあり、それらもまた有用であること正しく認識する。
【０１１０】
モノクローナル抗体分泌ハイブリドーマを調製する代わりに、本発明のHDAC9、HDAC9a、HDAC9(ΔNLS)、HDAC9a(ΔNLS)、またはHDRP(ΔNLS)ポリペプチドに対するモノクローナル抗体は、ポリペプチドを用いて組み換えコンビナトリアル免疫グロブリンライブラリー（例えば、抗体ファージディスプレイライブラリー）をスクリーニングして、ポリペプチドを結合する免疫グロブリンライブラリーメンバーを単離することにより同定および単離され得る。ファージディスプレイライブラリーを作製しスクリーニングするためのキットは市販されている（例えば、PharmaciaRecombinant Phage Antibody System, カタログ番号27-9400-01;およびStratagene SurfZAPTMPhage Display Kit, カタログ番号240612）。さらに、抗体ディスプレイライブラリーを作製しスクリーニングする際に用いるのに特に敏感に反応する方法および試薬の例は、例えば、米国特許第5,223,409号；PCT公報第WO92/18619号；PCT公報第WO91/17271号；PCT公報第WO92/20791号；PCT公報第WO92/15679号；PCT公報第WO93/01288号；PCT公報第WO92/01047号；PCT公報第WO92/09690号；PCT公報第WO90/02809号；Fuchsら、Bio/Technology,9:1370-1372（1991）;Hayら、Hum. Antibod. Hybridomas, 3:81-85（1992）; Huseら、Science,246:1275-1281（1989）;およびGriffithsら、EMBOJ., 12:725-734（1993）に記載され得る。
【０１１１】
さらに、標準的な組み換えDNA技術を用いて作製され得るヒトおよび非ヒトの両方を含む組み換え抗体（例えば、キメラおよびヒト化モノクローナル抗体）は、本発明の範囲内である。このようなキメラおよびヒト化モノクローナル抗体は、当該分野で公知の組み換えDNA技術により作製され得る。
【０１１２】
一般的に、本発明の抗体（例えば、モノクローナル抗体）は、標準的な技術、例えば、アフィニティークロマトグラフィーまたは免疫沈降法により本発明のHDAC9、HDAC9a、HDAC9(ΔNLS)、HDAC9a(ΔNLS)、またはHDRP(ΔNLS)ポリペプチドを単離するために使用され得る。ポリペプチド特異的抗体は、細胞からの天然のポリペプチドおよび宿主細胞において発現される組み換え的に産生されたポリペプチドの精製を容易にし得る。さらに、本発明のHDAC9、HDAC9a、HDAC9(ΔNLS)、HDAC9a(ΔNLS)、またはHDRP(ΔNLS)ポリペプチドに特異的な抗体を用いて、（例えば、細胞溶解物、細胞上澄み、または組織試料中で）ポリペプチドを検出し、ポリペプチドの遍在度および発現パターンを評価し得る。
【０１１３】
本発明の抗体はまた、例えば、所定の処置養生法の有効性を測定するために、臨床試験手順の一部として組織中のタンパク質レベルをモニタリングするために診断的に使用され得る。検出可能な物質に抗体をカップリングすることにより検出が容易になり得る。検出可能な物質の例としては、種々の酵素、補欠分子族、蛍光物質、発光物質、生体発光物質、および放射性物質が挙げられる。好適な酵素の例としては、セイヨウワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β-ガラクトシダーゼ、およびアセチルコリンエステラーゼが挙げられ；好適な補欠分子族複合体の例としては、ストレプトアビジン/ビオチンおよびアビジン/ビオチンが挙げられ；好適な蛍光物質の例としてはウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロリドおよびフィコエリスリンが挙げられ；発光物質の例としては、ルミノールが挙げられ；生体発光物質の例としては、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、およびエクオリンが挙げられ、そして、好適な放射性物質の例としては、125I、131I、35S、および3Hが挙げられる。
【０１１４】
本発明の診断およびスクリーニングアッセイ
本発明はまた、HDAC9、HDAC9a、HDAC9(ΔNLS)、HDAC9a(ΔNLS)、またはHDRP(ΔNLS)遺伝子発現を評価するため、あるいは、本発明のHDAC9、HDAC9a、HDAC9(ΔNLS)、HDAC9a(ΔNLS)、またはHDRP(ΔNLS)ポリペプチドの活性を評価するための診断アッセイに関する。１つの態様において、アッセイは、生物学的試料（例えば、血液、血清、細胞、組織）に関連して使用され、これにより個体が細胞増殖疾患、アポトーシス疾患、または細胞分化疾患に罹患しているか、あるいは、細胞増殖疾患、アポトーシス疾患、または細胞分化疾患を発症する危険性を有している（疾病素質または感受性を有している）かどうかを測定する。本発明はまた、個体が細胞増殖疾患、アポトーシス疾患、または細胞分化疾患を発症しやすいかどうかを決定するための予後（または予測）アッセイを提供する。例えば、HDAC9、HDAC9a、HDAC9(ΔNLS)、HDAC9a(ΔNLS)、またはHDRP(ΔNLS)核酸分子中の突然変異が生物学的試料においてアッセイされ得る。このようなアッセイは、予後または予測目的に使用され、それにより細胞増殖疾患、アポトーシス疾患、または細胞分化疾患関連する症状の発症に先だって個体を予防的に治療し得る。
【０１１５】
本発明の別の局面は、核酸分子の発現または本発明のポリペプチドの生物学的活性に対する薬剤、または候補化合物（例えば、薬物または他の薬剤）の影響をモニタリングするためのアッセイ、ならびに、HDAC9、HDAC9aポリペプチド、HDAC9(ΔNLS)ポリペプチド、HDAC9a(ΔNLS)ポリペプチド、またはHDRP(ΔNLS)ポリペプチドに結合する候補化合物を同定するためのアッセイに関する。これらおよび他のアッセイおよび薬剤は、以下の節においてさらに詳細に記載される。
【０１１６】
診断アッセイ
HDAC9、HDAC9a、HDAC9(ΔNLS)、HDAC9a(ΔNLS)、またはHDRP(ΔNLS)核酸分子、プローブ、プライマー、ポリペプチド、およびHDAC9、HDAC9aタンパク質、HDAC9(ΔNLS)タンパク質、HDAC9a(ΔNLS)タンパク質、またはHDRP(ΔNLS)タンパク質に対する抗体は、細胞増殖疾患、アポトーシス疾患、または細胞分化疾患への感受性、またはこれらを有する可能性の診断方法において、ならびに、細胞増殖疾患、アポトーシス疾患、または細胞分化疾患に対する感受性の診断に有用なキットとして使用され得る。
【０１１７】
本発明の１つの態様においては、細胞増殖疾患、アポトーシス疾患、または細胞分化疾患に対する感受性の減少の診断が、HDAC9、HDAC9a、HDAC9(ΔNLS)、HDAC9a(ΔNLS)、またはHDRP(ΔNLS)における多型を検出することによりなされる。多型は、HDAC9、HDAC9a、HDAC9(ΔNLS)、HDAC9a(ΔNLS)、またはHDRP(ΔNLS)における変異（例えば、フレームシフト変異をもたらす１ヌクレオチドのまたは１より多いヌクレオチドの挿入または欠失；コードされたアミノ酸の変化をもたらす少なくとも1ヌクレオチドの変化；早発停止コドンの生成をもたらす少なくとも１ヌクレオチドの変化；ヌクレオチドによりコードされる１個以上のアミノ酸の欠失をもたらす数ヌクレオチドの欠失；遺伝子のコーディング配列の中断をもたらす、例えば、不等組み換えまたは遺伝子変換による１個または数個のヌクレオチドの挿入；遺伝子のすべてまたは部分の重複；遺伝子の全てまたは部分の転位；または遺伝子の全てまたは部分の再配置、または、種々のHDAC9イソフォームの発現パターンの変化）であり得る。１つより多くのこのような変異が単一の核酸分子中に存在し得る。
【０１１８】
このような配列変化は、HDAC9、HDAC9a、HDAC9(ΔNLS)、HDAC9a(ΔNLS)、またはHDRP(ΔNLS)によりコードされるポリペプチドにおける変異をもたらす。例えば、変異がフレームシフト変異である場合、フレームシフトは、コードされるアミノ酸の変化をもたらし得、および/または、切断ポリペプチドの発生をもたらす早発停止コドンの発生をもたらし得る。あるいは、細胞増殖疾患、アポトーシス疾患、または細胞分化疾患への感受性の減少に関連する多型は、１個より多いヌクレオチドにおける同義の変異（すなわち、HDAC9、HDAC9a、HDAC9(ΔNLS)、HDAC9a(ΔNLS)、またはHDRP(ΔNLS)ポリペプチドにおける変化をもたらさない変異）であり得る。このような多型は、部位を変化させ、mRNAの安定性または輸送に影響を及ぼし、そうでなければ、核酸分子の転写または翻訳に影響を及ぼし得る。上記した変異の何れかを有するHDAC9、HDAC9a、HDAC9(ΔNLS)、HDAC9a(ΔNLS)、またはHDRP(ΔNLS)は、本明細書で「変異核酸分子」という。
【０１１９】
細胞増殖疾患、アポトーシス疾患、または細胞分化疾患への感受性の減少を診断する第１の方法において、ハイブリダイゼーション法（例えば、サザン分析、ノーザン分析、またはインサイチュハイブリダイゼーション）が使用され得る（前出のAusubelら参照）。例えば、ゲノムDNA、RNA、またはcDNAの試験被験体（「試験試料」）由来の生物学的試料は、細胞増殖疾患、アポトーシス疾患、または細胞分化疾患を有している、罹患しやすい、その素因を有する、またはそれに関する欠損を保有すると疑われる個体（「試験個体」）から得られる。個体は成人、子供、または胎児であり得る。試験試料は、ゲノムDNAを含有する任意の供給源（例えば、血液試料、羊水試料、脳脊髄液試料、あるいは皮膚、筋肉、口腔または結膜粘膜、胎盤、胃腸管、または他の器官由来の組織試料）由来であり得る。胎児の細胞または組織に由来するDNAの試験試料は、適切な方法、例えば、羊水穿刺または絨毛膜絨毛サンプリングにより得られ得る。次にDNA、RNA、またはcDNA試料は、HDAC9、HDAC9a、HDAC9(ΔNLS)、HDAC9a(ΔNLS)、またはHDRP(ΔNLS)における多型が存在するかどうかを決定するため、および/または、HDAC9、HDAC9a、HDAC9(ΔNLS)、HDAC9a(ΔNLS)、またはHDRP(ΔNLS)によりコードされるバリアントが存在するかどうかを決定するために試験される。多型またはバリアントの存在は、核酸プローブへのゲノムDNA、RNA、またはDNA中の遺伝子のハイブリダイゼーションにより示され得る。本明細書で使用される場合、「核酸プローブ」は、DNAプローブまたはRNAプローブであり得；核酸プローブは、HDAC9、HDAC9a、HDAC9(ΔNLS)、HDAC9a(ΔNLS)、またはHDRP(ΔNLS)において少なくとも１多型を含み得るか、または、HDAC9、HDAC9a、HDAC9(ΔNLS)、HDAC9a(ΔNLS)、またはHDRP(ΔNLS)の特定のバリアントをコードする核酸を含み得る。プローブは、上記いずれかの核酸分子（例えば、全核酸分子、フラグメント、遺伝子を含むベクター、プローブ、またはプライマーなど）であり得る。
【０１２０】
細胞増殖疾患、アポトーシス疾患、または細胞分化疾患に対する感受性の減少を診断するために、HDAC9、HDAC9a、HDAC9(ΔNLS)、HDAC9a(ΔNLS)、またはHDRP(ΔNLS)を含む試験試料を少なくとも１つの核酸プローブと接触させることによりハイブリダイゼーション試料が形成される。mRNAまたはゲノムDNAを検出するための好ましいプローブは、本明細書に記載されるHDAC9、HDAC9a、HDAC9(ΔNLS)、HDAC9a(ΔNLS)、またはHDRP(ΔNLS)mRNAまたはゲノムDNA配列にハイブリダイズし得る標識された核酸プローブである。核酸プローブは、例えば、全長核酸分子、またはその部分（例えば、少なくとも15、30、50、100、250、または500ヌクレオチド長であり適切なmRNAまたはゲノムDNAにストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズするのに十分なオリゴヌクレオチド）であり得る。例えば、核酸プローブは、配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：７、配列番号：９、または、配列番号：１もしくは配列番号：３、配列番号：５、配列番号：７、配列番号：９の相補体の全体または部分であり得；または、配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８、または配列番号：１０の全体または部分をコードする核酸分子であり得る。本発明の診断アッセイで用いられる他の好適なプローブは、上記したとおりである（例えば、見出し「本発明の核酸」で考察したプローブおよびプライマーを参照）。
【０１２１】
ハイブリダイゼーション試料は、HDAC9、HDAC9a、HDAC9(ΔNLS)、HDAC9a(ΔNLS)、またはHDRP(ΔNLS)への核酸プローブの特異的ハイブリダイゼーションを可能にするのに十分である条件下で維持される。本明細書で使用される場合、「特異的ハイブリダイゼーション」は、厳密なハイブリダイゼーション（例えば、ミスマッチのない）を指す。特異的ハイブリダイゼーションは、例えば、上記した高ストリンジェンシー条件または中ストリンジェンシー条件の下で行われ得る。特に好ましい態様においては、特異的ハイブリダイゼーションのためのハイブリダイゼーション条件は高ストリンジェンシーである。
【０１２２】
次に、特異的ハイブリダイゼーションが起こった場合、これは標準的方法を用いて検出される。特異的ハイブリダイゼーションが核酸プローブと試験試料中のHDAC9、HDAC9a、HDAC9(ΔNLS)、HDAC9a(ΔNLS)、またはHDRP(ΔNLS)との間で起こる場合、次いで、HDAC9、HDAC9a、HDAC9(ΔNLS)、HDAC9a(ΔNLS)、またはHDRP(ΔNLS)は、多型を有するか、または核酸プローブ中に存在するバリアントである。１個より多い核酸プローブはまた、本方法において同時に使用され得る。核酸プローブの何れか１つの特異的ハイブリダイゼーションは、HDAC9、HDAC9a、HDAC9(ΔNLS)、HDAC9a(ΔNLS)、またはHDRP(ΔNLS)中の多型、あるいは、HDAC9、HDAC9a、HDAC9(ΔNLS)、HDAC9a(ΔNLS)、またはHDRP(ΔNLS)によりコードされる特定のバリアントの存在を示し、従って、細胞増殖疾患、アポトーシス疾患、または細胞分化疾患への感受性の減少の診断である。
【０１２３】
ノーザン分析（前出のCurrent Protocols in Molecular Biology, Ausubelら前出、を参照のこと）において、上記したハイブリダイゼーション法を用いて、細胞増殖疾患、アポトーシス疾患、または細胞分化疾患への低減された感受性に関連する多型または特定のバリアントの存在を同定する。ノーザン分析のためには、RNAの試験試料は、適切な手段で個体より得られる。個体由来のRNAへの上記核酸プローブの特異的ハイブリダイゼーションは、HDAC9、HDAC9a、HDAC9(ΔNLS)、HDAC9a(ΔNLS)、またはHDRP(ΔNLS)における多型、または、HDAC9、HDAC9a、HDAC9(ΔNLS)、HDAC9a(ΔNLS)、またはHDRP(ΔNLS)によりコードされる特定のバリアントの存在を示しており、従って細胞増殖疾患、アポトーシス疾患、または細胞分化疾患への感受性の減少の診断である。
【０１２４】
核酸プローブの使用の代表例に関しては、例えば、米国特許第5,288,611号および4,851,330号を参照のこと。
【０１２５】
あるいは、ペプチド核酸（PNA）プローブは、上記ハイブリダイゼーション法において核酸プローブの代わりに使用され得る。PNAは、メチレンカルボニルリンカーを介してグリシン窒素に連結された有機塩基（A、G、C、T、またはU）を有するペプチド様の無機骨格（例えば、N-（2-アミノエチル）グリシン単位）を有するDNA模倣物である（例えば、Nielsenら、BioconjugateChemistry, 5（1994）, American Chemical Society, p.1（1994）参照）。PNAプローブは、細胞増殖疾患、アポトーシス疾患、または細胞分化疾患への感受性に関連する多型を有する遺伝子に特異的にハイブリダイズするように設計され得る。HDAC9、HDAC9a、HDAC9(ΔNLS)、HDAC9a(ΔNLS)、またはHDRP(ΔNLS)へのPNAプローブのハイブリダイゼーションは、細胞増殖疾患、アポトーシス疾患、または細胞分化疾患への感受性が低減していることを診断する。
【０１２６】
本発明の別の態様においては、制限消化による変異解析は、遺伝子における変異または多型が制限部位の生成または除去をもたらす場合、変異核酸分子、または多型を含む核酸分子を検出するために使用され得る。ゲノムDNAを含む試験試料は個体から得られる。ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を用いて、試験個体由来のゲノムDNAの試験試料においてHDAC9、HDAC9a、HDAC9(ΔNLS)、HDAC9a(ΔNLS)、またはHDRP(ΔNLS)（および必要に応じてフランキング配列）を増幅し得る。RFLP解析は、記載どおりになされる（前出のCurrentProtocols in Molecular Biology参照）。関連DNAフラグメントの消化パターンは、HDAC9、HDAC9a、HDAC9(ΔNLS)、HDAC9a(ΔNLS)、またはHDRP(ΔNLS)における変異または多型の存在または非存在を示し、従って、細胞増殖疾患、アポトーシス疾患、または細胞分化疾患への感受性の減少の存在または非存在を示している。
【０１２７】
配列解析は、またHDAC9、HDAC9a、HDAC9(ΔNLS)、HDAC9a(ΔNLS)、またはHDRP(ΔNLS)における特定の多型を検出するために使用され得る。DNAまたはRNAの試験試料は試験個体から得られる。PCRまたは他の適切な方法を用いて、核酸分子および/または所望の場合そのフランキング配列を増幅し得る。HDAC9、HDAC9a、HDAC9(ΔNLS)、HDAC9a(ΔNLS)、もしくはHDRP(ΔNLS)、もしくはHDRP(ΔNLS)、またはこれらの核酸分子のいずれかのフラグメント、あるいはHDAC9、HDAC9a、HDAC9(ΔNLS)、HDAC9a(ΔNLS)、もしくはHDRP(ΔNLS)のcDNA、またはこれらのcDNAのいずれかのフラグメント、あるいはHDAC9、HDAC9a、HDAC9(ΔNLS)、HDAC9a(ΔNLS)、もしくはHDRP(ΔNLS)のmRNA、またはこれらのmRNAのいずれかのフラグメントの配列は、標準的な方法を用いて決定される。上記した遺伝子、遺伝子フラグメント、cDNA、cDNAフラグメント、mRNA、またはmRNAフラグメントの配列は、適切に、核酸分子、cDNA（例えば、配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：７、配列番号：９、または、配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８、配列番号：１０のタンパク質をコードする核酸配列、またはそのフラグメント）またはmRNAの公知核酸配列と比較される。HDAC9、HDAC9a、HDAC9(ΔNLS)、HDAC9a(ΔNLS)、またはHDRP(ΔNLS)中の多型の存在は、個体が細胞増殖疾患、アポトーシス疾患、または細胞分化疾患に対して感受性の減少を有していることを示す。
【０１２８】
対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドもまた、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド（ASO）プローブと増幅されたオリゴヌクレオチドのドットブロットハイブリダイゼーションの使用を介してHDAC9、HDAC9a、HDAC9(ΔNLS)、HDAC9a(ΔNLS)、またはHDRP(ΔNLS)における多型の存在を検出するために使用され得る（例えば、Saikiら、Nature（London）324:163-166（1986）参照）。「対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド」（本明細書においては「対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプローブ」ともいう）は、HDAC9、HDAC9a、HDAC9(ΔNLS)、HDAC9a(ΔNLS)、またはHDRP(ΔNLS)に特異的にハイブリダイズし、そして、細胞増殖疾患、アポトーシス疾患、または細胞分化疾患への感受性の減少に関連する多型を含む、約10〜50塩基対、好ましくは約15〜30塩基対のオリゴヌクレオチドである。HDAC9、HDAC9a、HDAC9(ΔNLS)、HDAC9a(ΔNLS)、またはHDRP(ΔNLS)における特定の多型に特異的な対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプローブは、標準的な方法（前出のCurrentProtocols in Molecular Biology参照）を用いて調製され得る。
【０１２９】
細胞増殖疾患、アポトーシス疾患、または細胞分化疾患への感受性の減少に関連する遺伝子における多型を同定するために、DNAの試験試料は、個体から得られる。PCRを用いてHDAC9、HDAC9a、HDAC9(ΔNLS)、HDAC9a(ΔNLS)、またはHDRP(ΔNLS)およびそのフランキング配列の全体またはフラグメントを増幅し得る。増幅されたHDAC9、HDAC9a、HDAC9(ΔNLS)、HDAC9a(ΔNLS)、またはHDRP(ΔNLS)（またはこれらの遺伝子のいずれかのフラグメント）を含むDNAは、標準的な方法（前出のCurrentProtocols in Molecular Biology参照）を用いてドットブロッテイングされ、そして、ブロットをオリゴヌクレオチドプローブと接触させる。次いで増幅されたHDAC9、HDAC9a、HDAC9(ΔNLS)、HDAC9a(ΔNLS)、またはHDRP(ΔNLS)へのプローブの特異的ハイブリダイゼーションの存在が検出される。個体由来のDNAへの対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプローブの特異的ハイブリダイゼーションは、HDAC9、HDAC9a、HDAC9(ΔNLS)、HDAC9a(ΔNLS)、またはHDRP(ΔNLS)内の多型を示しており、従って、細胞増殖疾患、アポトーシス疾患、または細胞分化疾患への感受性の減少を示している。
【０１３０】
別の態様において、個体由来の標的核酸配列セグメントに相補的なオリゴヌクレオチドプローブのアレイを用いてHDAC9、HDAC9a、HDAC9(ΔNLS)、HDAC9a(ΔNLS)、またはHDRP(ΔNLS)中の多型を同定し得る。例えば、１つの態様においては、オリゴヌクレオチドアレイが使用され得る。オリゴヌクレオチドアレイは、典型的には、種々の既知の位置の基質の表面にカップリングされた複数の種々のオリゴヌクレオチドプローブを含む。「GENECHIPSTM」とも記載されるこれらのオリゴヌクレオチドアレイは、当該分野において、例えば、米国特許第5,143,854号およびPCT特許公報WO90/15070および92/10092に一般的に記載されている。これらのアレイは、一般的には、機械的な合成法またはフォトリソグラフィー法と固相オリゴヌクレオチド合成法との組み合わせを取りこんだ光指向性合成法を用いて製造され得る。Fodorら、Science,251:767-777（1991）, Pirrungら、米国特許第5,143,854；PCT公開番号WO90/15070；Fodorら、PCT公開番号WO92/10092および米国特許第5,424,186号（それぞれの全教示は参考として本明細書に援用される）を参照のこと。機械的合成法を用いたこれらのアレイの合成技術は、例えば、米国特許第5,384,261号（その全教示は参考として本明細書に援用される）に記載される。
【０１３１】
オリゴヌクレオチドアレイを一旦調製すると、目的の核酸が、アレイにハイブリダイズされ、多型についてスキャンされる。ハイブリダイゼーションおよびスキャニングは、一般的には、本明細書および例えば、公開PCT出願WO92/10092およびWO95/11995および米国特許第5,424,286号（その全教示は参考として本明細書に援用される）中に記載される方法により行なわれる。概すれば、予め同定されている多型マーカー１種以上を含む標的核酸配列が、周知の増幅技術（例えば、PCR）により増幅される。典型的には、これは、多型の上流および下流の両方にある標的配列の２つの鎖に相補的であるプライマー配列の使用を含む。非対称PCR技術もまた使用され得る。次いで一般的には標識を取りこんでいる増幅された標的は、適切な条件下でアレイにハイブリダイズされる。ハイブリダイゼーションおよびアレイの洗浄の終了時、アレイをスキャンして標的配列がハイブリダイズするアレイ上の位置を決定する。スキャンから得られたハイブリダイゼーションデータは、典型的にはアレイ上の位置の関数とした蛍光強度の形態である。
【０１３２】
例えば、単一多型の検出について単一の検出ブロックに関して主に記載されるが、アレイは、複数の検出ブロックを含むことができ、従って、複数の特異的多型を分析することも可能である。交互配置において、検出ブロックは単一のアレイまたは複数の個別のアレイ内に分類され得、これにより、アレイへの標的のハイブリダイゼーションの間、可変の最適条件が使用され得ることが一般に理解される。例えば、ゲノム配列のG-Cリッチ範囲内にある多型をA-Tリッチセグメントにあるものとは分離して検出することがしばしば所望される。これにより各状況に対するハイブリダイゼーション条件の個別の最適化が可能になる。
【０１３３】
多型の検出のためのオリゴヌクレオチドアレイの使用のさらなる記載は、例えば、米国特許第5,858,659号および5,837,832号（その全教示が参考として本明細書に援用される）に見られ得る。
【０１３４】
核酸分析の他の方法を用いて、HDAC9、HDAC9a、HDAC9(ΔNLS)、HDAC9a(ΔNLS)、またはHDRP(ΔNLS)、あるいはHDAC9、HDAC9a、HDAC9(ΔNLS)、HDAC9a(ΔNLS)、またはHDRP(ΔNLS)によりコードされるバリアントにおける多型を検出し得る。代表的な例としては、直接手動配列決定（ChurchおよびGilbertProc. Natl. Acad. Sci. USA 81:1991-1995（1998）; Sangerら、Proc. Natl. Acad. Sci.74:5463-5457（1977）; Beavisら、米国特許第5,288,644号）；自動蛍光配列決定；一本鎖立体配座多型アッセイ（SSCP）；クランプ変性ゲル電気泳動（CDGE）；変性勾配ゲル電気泳動（DGGE）（Sheffieldら、Proc.Natl. Acad. Sci. USA 86:232-236（1991））、移動度シフト分析（Oritaら、Proc. Natl. Acad. Sci.USA 86:2766-2770（1989））、制限酵素分析（Flavellら、Cell 15:25（1978）;Geeverら、Proc. Natl.Acad. Sci. USA 78:5081（1981））;ヘテロ二本鎖分析；化学的ミスマッチ切断（CMC）（Cottonら、Proc. Natl.Acad. Sci. USA 85:4397-4401（1985））;RNアーゼ保護アッセイ（Myersら、Science 230:1242（1985））;E.colimutSタンパク質のようなヌクレオチドミスマッチを認識するポリペプチドの使用；および対立遺伝子特異的PCRが挙げられる。
【０１３５】
本発明の別の態様においては、細胞増殖疾患、アポトーシス疾患、または細胞分化疾患に対する感受性の診断はまた、例えば、当業者に公知のインサイチュハイブリダイゼーション技術を用いてHDAC9、HDAC9a、HDAC9(ΔNLS)、HDAC9a(ΔNLS)、またはHDRP(ΔNLS)核酸のレベルを調べることにより、または、種々の方法（酵素結合免疫吸着試験（ELISA）、ウエスタンブロット、免疫沈降、免疫組織化学、および免疫蛍光が挙げられる）によりHDAC9、HDAC9a、HDAC9(ΔNLS)、HDAC9a(ΔNLS)、またはHDRP(ΔNLS)ポリペプチドの発現、活性、および/または組成のレベルを調べることにより行なわ得る。個体由来の試験試料は、HDAC9、HDAC9a、HDAC9(ΔNLS)、HDAC9a(ΔNLS)、もしくはHDRP(ΔNLS)核酸のレベル、または、HDAC9、HDAC9a、HDAC9(ΔNLS)、HDAC9a(ΔNLS)、もしくはHDRP(ΔNLS)によりコードされるポリペプチドの発現および/または組成における変化の存在、あるいは、HDAC9、HDAC9a、HDAC9(ΔNLS)、HDAC9a(ΔNLS)、またはHDRP(ΔNLS)によりコードされる特定の変異体の存在について評価される。HDAC9、HDAC9a、HDAC9(ΔNLS)、HDAC9a(ΔNLS)、またはHDRP(ΔNLS)によりコードされるポリペプチドの発現における変化は、例えば、定量的ポリペプチド発現（すなわち生成されるポリペプチドの量）の変化；HDAC9、HDAC9a、HDAC9(ΔNLS)、HDAC9a(ΔNLS)、またはHDRP(ΔNLS)によりコードされるポリペプチドの組成の変化、あるいは定量的ポリペプチド発現（例えば、変異体HDAC9、HDAC9a、HDAC9(ΔNLS)、HDAC9a(ΔNLS)、もしくはHDRP(ΔNLS)ポリペプチドまたはそのバリアントの発現）における変化であり得る。好ましい態様において、細胞増殖疾患、アポトーシス疾患、または細胞分化疾患への感受性の診断は、HDAC9、HDAC9a、HDAC9(ΔNLS)、HDAC9a(ΔNLS)、またはHDRP(ΔNLS)によりコードされる特定のバリアント、あるいは特定のパターンのバリアントを検出することによりなされる。好ましくは、対照試料（例えば、細胞増殖疾患、アポトーシス疾患、または細胞分化疾患に関連しないことが解かっている試料）と比較し、HDAC9、HDAC9a、HDAC9(ΔNLS)、HDAC9a(ΔNLS)、またはHDRP(ΔNLS)のレベルの増加、あるいはHDAC9、HDAC9a、HDAC9(ΔNLS)、HDAC9a(ΔNLS)、またはHDRP(ΔNLS)ポリペプチドの発現または活性の増加は、感受性の増加あるいは個体が細胞増殖疾患、アポトーシス疾患、または細胞分化疾患を有する可能性の増加を示している。あるいは、対照試料（例えば、細胞増殖疾患、アポトーシス疾患、または細胞分化疾患に関連しないことが解かっている試料）と比較し、HDAC9、HDAC9a、HDAC9(ΔNLS)、HDAC9a(ΔNLS)、またはHDRP(ΔNLS)のレベルの減少、あるいはHDAC9、HDAC9a、HDAC9(ΔNLS)、HDAC9a(ΔNLS)、またはHDRP(ΔNLS)ポリペプチドの発現または活性の減少、感受性の減少あるいは個体が細胞増殖疾患、アポトーシス疾患、または細胞分化疾患を有する可能性の減少を示している。
【０１３６】
定量的および定性的な変化の両方が存在する場合もあり得る。本明細書で使用される場合、ポリペプチド発現、活性、または組成における「変化」または「調節」は、対照試料におけるHDAC9、HDAC9a、HDAC9(ΔNLS)、HDAC9a(ΔNLS)、もしくはHDRP(ΔNLS)ポリペプチドの発現または組成と比較した、試験試料における発現または組成の変化をいう。対照試料は、試験試料に対応する試料（例えば、同じ型の細胞由来）であり、そして、細胞増殖疾患、アポトーシス疾患、または細胞分化疾患に罹患していない個体由来である。対照試料と比較した試験試料におけるポリペプチドの発現または組成の変化は、細胞増殖疾患、アポトーシス疾患、または細胞分化疾患への感受性の減少を示している。同様に、対照試料と比較した、試験試料における１つ以上の種々のバリアントの存在、または、試験試料における種々のバリアントの有意に異なる量の存在は、細胞増殖疾患、アポトーシス疾患、または細胞分化疾患への感受性の減少を示している。
【０１３７】
ポリペプチド発現または機能における変化または調節は種々の程度で起こり得ることが理解される。例えば、発現における変化または調節は、例えば、対照と比較して少なくとも1.5倍〜2倍、少なくとも3倍、または少なくとも5倍の増加であり得る。あるいは、ポリペプチド発現における変化または調節は、例えば、対照と比較して少なくとも10％、少なくとも40％、50％または75%または少なくとも90％の減少であり得る。
【０１３８】
HDAC9、HDAC9a、HDAC9(ΔNLS)、HDAC9a(ΔNLS)、またはHDRP(ΔNLS)ポリペプチドの発現または組成を調べる種々の方法（分光学、比色定量、電気泳動、等電点電気泳動、および例えば、イムノブロッティング（前出のAusubelら、特に10章参照などの免疫アッセイ（例えば、Davidら、米国特許第4,376,110号）が挙げられる）が用いられ得る。例えば、１つの態様において、ポリペプチドに結合し得る抗体（例えば、上記したもの）、好ましくは検出可能な標識を有する抗体が使用され得る。抗体はポリクローナル、または、より好ましくは、モノクローナルであり得る。インタクト抗体、またはそのフラグメント（例えば、FabまたはF（ab'）2）が使用され得る。抗体に関して用語「標識された」は、抗体に検出可能な物質をカップリング（すなわち物理的連結）させることによる抗体の直接標識、ならびに直接標識された別の試薬と反応させることによる抗体の間接的標識を包含することが意図される。間接的標識の例は、蛍光標識された２次抗体を用いた１次抗体の検出である。
【０１３９】
変異体HDAC9、HDAC9a、HDAC9(ΔNLS)、HDAC9a(ΔNLS)、またはHDRP(ΔNLS)ポリペプチドに特異的に結合する上記した抗体、あるいは、非変異体HDAC9、HDAC9a、HDAC9(ΔNLS)、HDAC9a(ΔNLS)、またはHDRP(ΔNLS)ポリペプチドに特異的に結合する抗体、あるいはHDAC9、HDAC9a、HDAC9(ΔNLS)、HDAC9a(ΔNLS)、またはHDRP(ΔNLS)によりコードされた特定のバリアントに特異的に結合する抗体を用いたウエスタンブロット分析を用いて、多型または変異体HDAC9、HDAC9a、HDAC9(ΔNLS)、HDAC9a(ΔNLS)、またはHDRP(ΔNLS)によりコードされるポリペプチドの特定のバリアントの試験試料中の存在、あるいは、特定のバリアント、または非多型もしくは非変異体遺伝子によりコードされるポリペプチドの試験試料中の非存在を同定し得る。多型または変異体遺伝子によりコードされるポリペプチドの存在、あるいは、非多型または非変異体遺伝子によりコードされるポリペプチドの非存在は、HDAC9、HDAC9a、HDAC9(ΔNLS)、HDAC9a(ΔNLS)、またはHDRP(ΔNLS)核酸分子によりコードされる特定のバリアントの存在（または非存在）と同様、細胞増殖疾患、アポトーシス疾患、または細胞分化疾患への感受性の減少を診断するものである。
【０１４０】
本発明の１つの態様において、試験試料中のHDAC9、HDAC9a、HDAC9(ΔNLS)、HDAC9a(ΔNLS)、またはHDRP(ΔNLS)ポリペプチドのレベルまたは量は、対照試料中のHDAC9、HDAC9a、HDAC9(ΔNLS)、HDAC9a(ΔNLS)、またはHDRP(ΔNLS)ポリペプチドのレベルまたは量と比較される。差が統計学的に有意であるように対照試料中のポリペプチドのレベルまたは量より高値または低値である試験試料中のポリペプチドのレベルまたは量は、HDAC9、HDAC9a、HDAC9(ΔNLS)、HDAC9a(ΔNLS)、またはHDRP(ΔNLS)ポリペプチドの発現における変化を示しており、細胞増殖疾患、アポトーシス疾患、または細胞分化疾患への感受性の減少を診断するものである。
【０１４１】
あるいは、試験試料中のHDAC9、HDAC9a、HDAC9(ΔNLS)、HDAC9a(ΔNLS)、またはHDRP(ΔNLS)ポリペプチドの組成は、対照試料中のHDAC9、HDAC9a、HDAC9(ΔNLS)、HDAC9a(ΔNLS)、またはHDRP(ΔNLS)ポリペプチドの組成と比較される。対照試料中のポリペプチドの組成と比較した場合の試験試料中のポリペプチドの組成における差（例えば、異なるバリアントの存在）は、細胞増殖疾患、アポトーシス疾患、または細胞分化疾患への感受性の減少を診断するものである。別の態様においては、ポリペプチドのレベルまたは量および組成の両方とも、試験試料および対照試料で評価され得る。対照試料と比較した場合の試験試料中のポリペプチドの量またはレベルの差；対照試料と比較した場合の試験試料中の組成の差；あるいは量またはレベルの差および組成の差の両方は、細胞増殖疾患、アポトーシス疾患、または細胞分化疾患への感受性の減少を示している。
【０１４２】
診断方法に有用なキット（例えば、試薬キット）は、本明細書に記載される任意の方法に有用な成分（例えば、本明細書に記載されるハイブリダイゼーションプローブまたはプライマー（例えば、標識されたプローブまたはプライマー）、標識された分子の検出のための試薬、制限酵素（例えば、RFLP分析用）、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド、変異体または非変異体（ネイティブ）のHDAC9、HDAC9a、HDAC9(ΔNLS)、HDAC9a(ΔNLS)、またはHDRP(ΔNLS)ポリペプチドに結合する抗体が挙げられる）、HDAC9、HDAC9a、HDAC9(ΔNLS)、HDAC9a(ΔNLS)、またはHDRP(ΔNLS)を含む核酸の増幅手段、あるいは、HDAC9、HDAC9a、HDAC9(ΔNLS)、HDAC9a(ΔNLS)、もしくはHDRP(ΔNLS)の核酸配列を分析するため、またはHDAC9、HDAC9a、HDAC9(ΔNLS)、HDAC9a(ΔNLS)、もしくはHDRP(ΔNLS)ペプチドのアミノ酸配列を分析するための手段などを含む。
【０１４３】
スクリーニングアッセイおよびそれにより同定される薬剤
本発明は、本発明の核酸にハイブリダイズするヌクレオチドの存在を同定するため、ならびに、本発明の核酸によりコードされるポリペプチドの存在を同定するための方法（本明細書において「スクリーニングアッセイ」ともいう）を提供する。１つの態様においては、試料中の目的の核酸分子（例えば、HDAC9、HDAC9a、HDAC9(ΔNLS)、HDAC9a(ΔNLS)、またはHDRP(ΔNLS)の核酸とかなりの相同性を有する核酸）の存在（または非存在）が、上記したストリンジェントな条件下で、本発明の核酸を含む核酸（例えば、任意に少なくとも１つの多型を含み得る配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：７、または配列番号：９の配列を有する核酸、あるいはその相補体、あるいは、配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８、または配列番号：１０の配列を有するアミノ酸をコードする核酸、あるいはそのような核酸のフラグメントまたはバリアント）と試料を接触させること、次いでハイブリダイゼーションの存在（または非存在）について試料を評価することにより評価され得る。好ましい態様においては、高ストリンジェンシーな条件は、選択的ハイブリダイゼーションに適切な条件である。別の態様においては、目的の核酸分子を含む試料が、目的の核酸分子（例えば、HDAC9、HDAC9a、HDAC9(ΔNLS)、HDAC9a(ΔNLS)、またはHDRP(ΔNLS)核酸）の一部に少なくとも部分的に相補的である隣接ヌクレオチド配列（例えば、上記したプライマーまたはプローブ）を含む核酸と接触させられ、接触した試料は、ハイブリダイゼーションの存在または不存在について評価される。好ましい態様においては、隣接ヌクレオチド配列を含む核酸は、HDAC9、HDAC9a、HDAC9(ΔNLS)、HDAC9a(ΔNLS)、またはHDRP(ΔNLS)の核酸分子の一部に完全に相補的である。
【０１４４】
上記態様の何れかにおいて、目的の核酸の全体または一部は、ハイブリダイゼーションを行なう前に増幅に供され得る。
【０１４５】
別の態様において、試料中のHDAC9、HDAC9a、HDAC9(ΔNLS)、HDAC9a(ΔNLS)、またはHDRP(ΔNLS)ポリペプチド（例えば、本発明のポリペプチド、またはそのフラグメントもしくはバリアント）の存在（または非存在）は、HDAC9、HDAC9a、HDAC9(ΔNLS)、HDAC9a(ΔNLS)、またはHDRP(ΔNLS)のポリペプチドに特異的に結合する抗体（例えば、上記のような抗体）と試料を接触させ、次いで、HDAC9、HDAC9a、HDAC9(ΔNLS)、HDAC9a(ΔNLS)、またはHDRP(ΔNLS)ポリペプチドへの抗体の結合の存在（または非存在）について試料を評価することにより評価され得る。
【０１４６】
別の態様において、本発明は、本明細書に記載されるポリペプチドの活性を変更または調節（例えば、増加または減少）するか、またはそうでなければ、本明細書のポリペプチドと相互作用する薬剤または化合物（例えば、融合タンパク質、ポリペプチド、ペプチド模倣物、プロドラッグ、レセプター、結合因子、抗体、低分子または他の薬物、またはリボザイム）を同定するための方法を提供する。例えば、このような化合物は、本明細書に記載のポリペプチド（例えば、HDAC9、HDAC9a、HDAC9(ΔNLS)、HDAC9a(ΔNLS)、またはHDRP(ΔNLS) 基質または薬剤に結合する；例えば、本発明のポリペプチドの活性に対して刺激または阻害効果を有する；あるいは本発明のポリペプチドがHDAC9、HDAC9a、HDAC9(ΔNLS)、HDAC9a(ΔNLS)、またはHDRP(ΔNLS)結合因子と相互作用する能力を変化（例えば、増強または阻害）する；あるいは、HDAC9、HDAC9a、HDAC9(ΔNLS)、HDAC9a(ΔNLS)、またはHDRP(ΔNLS)ポリペプチドの翻訳後のプロセシングを変化させる化合物または薬剤（例えば、通常合成されるポリペプチドを細胞内の別の位置（例えば、細胞表面）に指向するようにタンパク質分解プロセシングを改変する薬剤；または、より多くのポリペプチドが細胞から放出されるようにタンパク質分解プロセシングを改変する薬剤等）であり得る。１つの態様においては、結合因子は、細胞増殖疾患結合因子、アポトーシス疾患結合因子、または細胞分化疾患結合因子である。本明細書で使用される場合、「細胞増殖疾患結合因子」、「アポトーシス疾患結合因子」または「細胞分化疾患結合因子」は、本発明のポリペプチドに結合し、細胞増殖疾患、アポトーシス疾患、または細胞分化疾患を調節する本明細書に記載した薬剤を意味する。調節は疾患の重症度または進行における増加または減少であり得る。さらに、細胞増殖疾患結合因子、アポトーシス疾患結合因子、または細胞分化疾患結合因子としては、本発明のポリペプチドにより媒介される細胞シグナル伝達事象の上流（早期）または下流（後期）にあるポリペプチドに結合し、これによりシグナル伝達経路の全体的活性を調節し；次いで、疾患状態が調節される薬剤が挙げられる。
【０１４７】
候補化合物はポリペプチドの活性の上昇をもたらし得る。例えば、ポリペプチドの活性は、対照と比較して少なくとも1.5倍〜2倍、少なくとも3倍または少なくとも5倍、上昇され得る。あるいは、ポリペプチドの活性は対照と比較して少なくとも10％、少なくとも20％、40％、50％もしくは75％または少なくとも90％の減少であり得る。
【０１４８】
１つの態様において、本発明は、本明細書に記載したポリペプチド（またはその生物学的に活性な部分）に結合するかまたはその活性を調節する化合物を同定するための候補化合物または被験薬剤をスクリーニングするためのアッセイ、ならびに、そのアッセイにより同定可能な薬剤を提供する。本明細書で使用される場合、「候補化合物」または「試験薬剤」は、天然に存在するか人工的に誘導された化学分子であり、そして、例えば、ペプチド、タンパク質、合成分子、例えば、合成有機分子、天然に存在する分子、例えば、天然に存在する有機分子、核酸分子、およびその成分が挙げられる。
【０１４９】
一般的に、本発明において使用される候補化合物は、当該分野で知られている方法に従って、天然産物または合成（または半合成）の抽出液の大きいライブラリー、または、化学的ライブラリーから同定してよい。薬剤の発見および開発の分野の当業者の知るとおり、被験抽出液または化合物の厳密な供給源は本発明のスクリーニング手順には重要ではない。従って、実質的に如何なる数もの化学的抽出液または化合物も、本明細書に記載した方法例を用いてスクリーニングすることができる。このような抽出液または化合物の例には、植物、真菌、原核生物または動物系の抽出液、醗酵液、および合成化合物、並びに既存の化合物の修飾物が挙げられるがそれらに限定されない。如何なる数の化学的物質（例えば糖類、脂質、ペプチドおよび核酸系の化合物が挙げられるがそれらに限定されない）の無作為または指向性の合成（例えば半合成または全合成）を行なうためには多くの方法が使用できる。合成化合物のライブラリーは例えばBrandon Associates (Merrimack, NH)およびAldrich Chemical (Milwaukee,WI)から市販により入手可能である。或いは、細菌、真菌、植物および動物抽出液の形態の天然の化合物のライブラリーが多くの製造元（例えばBiotics(Sussex, UK), Xenova(Slough, UK), Harbor Branch Oceangraphics Institute(Ft.Pierce, FL)およびPharmaMar, USA (Cambridge, MA)が挙げられる）から市販により入手可能である。更に、天然および合成により生成されたライブラリーも所望により当該分野で知られた方法に従って、例えば標準的な抽出および分画の方法により、作成される。例えば、候補化合物は、生物学的ライブラリー；空間的に目標設定できるパラレル固相または液相ライブラリーを含む当該分野で知られたコンビナトリアルなライブラリー法；逆重畳を必要とする合成ライブラリー法；「１ビーズ１化合物」ライブラリー法；およびアフィニティークロマトグラフィー選択を用いた合成ライブラリー法における多くの手法の何れかを用いて得ることができる。生物学的ライブラリー手法はポリペプチドライブラリーに限定されるが、他の4種の手法はポリペプチド、非ペプチドオリゴマーまたは化合物の小型分子ライブラリーに適用可能である(Lam,Anticancer Drug Des., 12:145(1997))。更にまた、所望により、いずれかのライブラリーまたは化合物は、標準的な化学的、物理的または生化学的な方法を用いて容易に修飾される。
【０１５０】
更に、薬剤の発見および開発の分野の当業者が容易に知るとおり、脱複製（例えば分類学的脱複製、生物学的脱複製および化学的脱複製またはこれらの組み合わせ）、または、その活性が既に知られている物質の複製または反復の排除のための方法は、可能な場合には使用すべきである。
【０１５１】
粗製の抽出液が本発明の核酸またはポリペプチドの発現および/または活性を調節（即ち刺激または阻害）することが解かった場合、観察された作用に関っている化学的構成要素を単離するために、最も陽性の抽出液の更なる分画が必要となる。即ち、抽出、分画および精製の工程の最終目標は、核酸の発現、ポリペプチドの発現またはポリペプチドの生物学的活性を刺激または阻害する作用を有する粗製の抽出液内の化学的実態の慎重な特性化および同定である。化合物の混合物の活性を検出するための本明細書に記載した同様の試験法を用いて、活性成分を精製し、そして、その誘導体を試験することができる。そのような異種の抽出液の分画および精製の方法は当該分野で知られている。所望により、治療に有用な薬剤であることが解かっている化合物は、当該分野で知られた方法に従って化学修飾される。治療上の価値のあると同定された化合物は次に、本発明の核酸またはポリペプチドの活性または発現を変化させることが望ましいような疾患のための動物モデルを用いて分析される。
【０１５２】
1つの態様においては、HDAC9、HDAC9a、HDAC9(ΔNLS)、HDAC9a(ΔNLS)またはHDRP(ΔNLS)ポリペプチドの生物学的活性、例えば酵素活性または転写抑制活性を変化させる候補化合物を同定するためには、HDAC9、HDAC9a、HDAC9(ΔNLS)、HDAC9a(ΔNLS)またはHDRP(ΔNLS)ポリペプチド(例えば配列番号：2、配列番号：4、配列番号：6、配列番号：8または配列番号：10またはHDAC9、HDAC9a、HDAC9(ΔNLS)、HDAC9a(ΔNLS)またはHDRP(ΔNLS)によりコードされる他の変異体)またはそのフラグメントまたは誘導物（上記）を含むか発現する細胞、組織、細胞溶解物、組織溶解物、または溶液を、本明細書に記載した酵素反応または転写抑制反応に適する条件下、試験すべき候補化合物と接触させうる。
【０１５３】
或いは、ポリペプチドを試験すべき候補化合物に直接接触させることができる。HDAC9、HDAC9a、HDAC9(ΔNLS)、HDAC9a(ΔNLS)またはHDRP(ΔNLS)の生物学的活性のレベル(量）を試験し（例えば、直接または間接的にHDAC9、HDAC9a、HDAC9(ΔNLS)、HDAC9a(ΔNLS)またはHDRP(ΔNLS)の生物学的活性のレベル（量）を測定する)、そして、対照の生物学的活性のレベル（即ち、試験すべき候補化合物の非存在下、または、候補化合物のベヒクルのみの存在下におけるHDAC9、HDAC9a、HDAC9(ΔNLS)、HDAC9a(ΔNLS)またはHDRP(ΔNLS)のポリペプチドまたはその活性フラグメントまたは誘導体の活性のレベル）と比較する。候補化合物存在下の生物学的活性のレベルと、候補化合物非存在下または候補化合物のベヒクルのみの存在下の生物学的活性のレベルとの間に、統計学的に有意な量で差がある場合、候補化合物はHDAC9、HDAC9a、HDAC9(ΔNLS)、HDAC9a(ΔNLS)またはHDRP(ΔNLS)ポリペプチドの生物学的活性を変化させる化合物である。例えば、HDAC9、HDAC9a、HDAC9(ΔNLS)、HDAC9a(ΔNLS)またはHDRP(ΔNLS)の酵素活性または転写抑制活性のレベルが対照と比較して増大していることは、候補化合物がHDAC9、HDAC9a、HDAC9(ΔNLS)、HDAC9a(ΔNLS)またはHDRP(ΔNLS)の活性を増強する（これらのアゴニストである）化合物であることを示している。同様に、HDAC9、HDAC9a、HDAC9(ΔNLS)、HDAC9a(ΔNLS)またはHDRP(ΔNLS)の活性の酵素的レベルまたは転写抑制レベルが対照と比較して低下していることは、候補化合物がHDAC9、HDAC9a、HDAC9(ΔNLS)、HDAC9a(ΔNLS)またはHDRP(ΔNLS)活性を阻害する（これらの拮抗剤である）化合物であることを示している。別の態様において、試験すべき候補化合物の存在下におけるHDAC9、HDAC9a、HDAC9(ΔNLS)、HDAC9a(ΔNLS)またはHDRP(ΔNLS)ポリペプチドまたはその誘導体またはフラグメントの生物学的活性のレベルを予め解明されている対照のレベルと比較する。候補化合物の存在下の生物学的活性のレベルと対照のレベルとの間に統計学的に有意な量で差がある場合、候補化合物がHDAC9、HDAC9a、HDAC9(ΔNLS)、HDAC9a(ΔNLS)またはHDRP(ΔNLS)の生物学的活性を変化させることが示されている。
【０１５４】
本発明はまた、核酸分子の発現（例えば転写または翻訳）を変化（増大または低減）させる、または、その他の態様で本明細書に記載した核酸に対して相互作用を示すHDAC9、HDAC9a、HDAC9(ΔNLS)、HDAC9a(ΔNLS)またはHDRP(ΔNLS)核酸分子（例えばアンチセンス核酸、融合タンパク質、ポリペプチド、ペプチド擬似物、プロドラッグ、受容体、結合因子、抗体、小型分子または他の薬物、またはリボザイム)の発現を変化させる化合物を同定するための試験法、並びにその試験法により同定可能な化合物に関する。例えば、HDAC9、HDAC9a、HDAC9(ΔNLS)、HDAC9a(ΔNLS)またはHDRP(ΔNLS)ポリペプチドをコードする核酸を含む溶液を試験すべき候補化合物と接触させることができる。溶液は例えば、核酸を含有する細胞または核酸を含有する細胞溶解物を含有し得；または、溶液は核酸の転写/翻訳に必要な要素を含む別の溶液でありうる。溶液中に懸濁していない細胞も所望により使用できる。HDAC9、HDAC9a、HDAC9(ΔNLS)、HDAC9a(ΔNLS)またはHDRP(ΔNLS)の発現のレベルおよび/またはパターン（例えば、発現したmRNAまたはタンパク質のレベルおよび/またはパターン、例えば種々の変異体のレベルおよび/またはパターン）を評価し、対照の発現のレベルおよび/またはパターン（即ち、候補化合物の非存在下、または候補化合物のベヒクルのみの存在下におけるHDAC9、HDAC9a、HDAC9(ΔNLS)、HDAC9a(ΔNLS)またはHDRP(ΔNLS)の発現のレベルおよび/またはパターン）と比較する。候補化合物の存在下のレベルおよび/またはパターンと、候補化合物非存在下、または、候補化合物のベヒクルのみの存在下のレベルおよび/またはパターンとの間に統計学的な有意な分量または態様で差がある場合、候補化合物はHDAC9、HDAC9a、HDAC9(ΔNLS)、HDAC9a(ΔNLS)またはHDRP(ΔNLS)の発現を変化させる化合物である。HDAC9、HDAC9a、HDAC9(ΔNLS)、HDAC9a(ΔNLS)またはHDRP(ΔNLS)の発現が増強されることは、候補化合物がHDAC9、HDAC9a、HDAC9(ΔNLS)、HDAC9a(ΔNLS)またはHDRP(ΔNLS)活性のアゴニストであることを示している。同様に、HDAC9、HDAC9a、HDAC9(ΔNLS)、HDAC9a(ΔNLS)またはHDRP(ΔNLS)の発現の阻害は、候補化合物がHDAC9、HDAC9a、HDAC9(ΔNLS)、HDAC9a(ΔNLS)またはHDRP(ΔNLS)活性の拮抗剤であることを示している。別の態様において、試験すべき候補化合物の存在下のHDAC9、HDAC9a、HDAC9(ΔNLS)、HDAC9a(ΔNLS)またはHDRP(ΔNLS)ポリペプチド（例えば種々の変異体）のレベルおよび/またはパターンを、予め解明されている対照のレベルおよび/またはパターンと比較する。候補化合物の存在下のレベルおよび/またはパターンと対照のレベルおよび/またはパターンとの間に統計学的に有意な分量または態様で差がある場合、候補化合物はHDAC9、HDAC9a、HDAC9(ΔNLS)、HDAC9a(ΔNLS)またはHDRP(ΔNLS)の発現を変化させることが示されている。
【０１５５】
本発明の別の態様において、HDAC9、HDAC9a、HDAC9(ΔNLS)、HDAC9a(ΔNLS)またはHDRP(ΔNLS)核酸分子の発現を変化させる、または、本明細書に記載した核酸に対して何らか別の態様で相互作用を示す化合物は、レポーター遺伝子に作動可能に連結したHDAC9、HDAC9a、HDAC9(ΔNLS)、HDAC9a(ΔNLS)またはHDRP(ΔNLS)遺伝子のプロモーター領域をコードする核酸を含む細胞、細胞溶解物または溶液を用いて同定することができる。試験すべき候補化合物と接触させた後、レポーター遺伝子の発現のレベル(例えば発現されたmRNAまたはタンパク質のレベル)を試験し、対照の発現レベル(即ち、候補化合物の非存在下、または候補化合物のベヒクルのみの存在下におけるレポーター遺伝子の発現のレベル)と比較する。候補化合物の存在下のレベルと候補化合物の非存在下、または候補化合物のベヒクルのみの存在下におけるレベルとの間に統計学的に有意な分量または態様で差がある場合、候補化合物は、HDAC9、HDAC9a、HDAC9(ΔNLS)、HDAC9a(ΔNLS)またはHDRP(ΔNLS)遺伝子プロモーターに作動可能に連結した遺伝子の発現を変化させるその能力により示されるとおり、HDAC9、HDAC9a、HDAC9(ΔNLS)、HDAC9a(ΔNLS)またはHDRP(ΔNLS)の発現を変化させる化合物である。レポーターの発現の増強は、その化合物がHDAC9、HDAC9a、HDAC9(ΔNLS)、HDAC9a(ΔNLS)またはHDRP(ΔNLS)活性のアゴニストであることを示している。同様に、レポーターの発現の阻害は、その化合物がHDAC9、HDAC9a、HDAC9(ΔNLS)、HDAC9a(ΔNLS)またはHDRP(ΔNLS)活性の拮抗剤であることを示している。別の態様において、試験すべき候補化合物の存在下のレポーターの発現のレベルを、既に解明されている対照のレベルと比較する。候補化合物の存在下のレベルと対照のレベルとの間に統計学的に有意な分量または態様で差がある場合には、候補化合物がHDAC9、HDAC9a、HDAC9(ΔNLS)、HDAC9a(ΔNLS)またはHDRP(ΔNLS)の発現を変化させることを示している。
【０１５６】
HDAC9、HDAC9a、HDAC9(ΔNLS)、HDAC9a(ΔNLS)またはHDRP(ΔNLS)によりコードされる種々の変異体の量を変化させる化合物(例えば第1の変異体の活性を増強し、第2の変異体の活性を阻害する化合物)並びに第1の変異体の活性のアゴニストであり第2の変異体の活性の拮抗剤である化合物は、本明細書に上記した方法を用いて容易に同定することができる。
【０１５７】
本発明の他の態様においては、HDAC9、HDAC9a、HDAC9(ΔNLS)、HDAC9a(ΔNLS)またはHDRP(ΔNLS)基質との関連においてポリペプチドの活性に対する候補化合物、例えばヒストンデアセチラーゼ活性の阻害剤の影響を調べるために、試験を用いることができる。このような阻害剤は以下の4種の一般的クラス、即ち1)短鎖脂肪酸（例えば4-フェニルブチレートおよびバルプロ酸）；2)ヒドロキサム酸（例えばSAHA、ピロキサミド、トリクロスタチンA（TSA)、オキサムフラチンおよびCHAP類、例えばCHAP1およびCHAP31)；3)環状テトラペプチド（トラポキシンA、アピシジンおよびデプシペプチド(FK-228別名FR9011228）；4)ベンズアミド類（例えばMS-275）；およびスクリプタイドのような他の化合物に分類される。このような試験法および化合物の例はBreslow等への1994年11月29日発行の米国特許5,369,108号、1997年12月23日発行の5,700,811号、および、1998年6月30日発行の5,773,474号、Marks等への1991年10月8日発行の米国特許5,055,608号および1992年12月29日発行の5,175,191号、並びに、前出のYoshidaら、前出のSaitoら、前出のFuramaiら、前出のKomatsuら、前出のSuら、前出のLeeら、および前出のSuzukiら、に見出されており、これらの開示内容全体は参考により本明細書に組み込まれる。
【０１５８】
1つの例においては、HDAC9、HDAC9a、HDAC9(ΔNLS)、HDAC9a(ΔNLS)またはHDRP(ΔNLS)に対して相互作用を示す化合物(本明細書においては、「HDAC9、HDAC9a、HDAC9(ΔNLS)、HDAC9a(ΔNLS)またはHDRP(ΔNLS)基質」と称し、HDAC9、HDAC9a、HDAC9(ΔNLS)、HDAC9a(ΔNLS)またはHDRP(ΔNLS)に対して相互作用を示すポリペプチドまたは他の分子でありうる)を発現するまたは含有する細胞または組織を候補化合物の存在下にHDAC9、HDAC9a、HDAC9(ΔNLS)、HDAC9a(ΔNLS)またはHDRP(ΔNLS)と接触させ、そして、HDAC9、HDAC9a、HDAC9(ΔNLS)、HDAC9a(ΔNLS)またはHDRP(ΔNLS)とHDAC9、HDAC9a、HDAC9(ΔNLS)、HDAC9a(ΔNLS)またはHDRP(ΔNLS)基質との間の相互作用を変化させる候補化合物の能力を例えばポリペプチドの活性を試験することにより調べる。或いは、HDAC9、HDAC9a、HDAC9(ΔNLS)、HDAC9a(ΔNLS)またはHDRP(ΔNLS)基質を含有する細胞溶解物または溶液を使用することができる。HDAC9、HDAC9a、HDAC9(ΔNLS)、HDAC9a(ΔNLS)もしくはHDRP(ΔNLS)またはHDAC9、HDAC9a、HDAC9(ΔNLS)、HDAC9a(ΔNLS)もしくはHDRP(ΔNLS)基質に結合する化合物は、HDAC9、HDAC9a、HDAC9(ΔNLS)、HDAC9a(ΔNLS)またはHDRP(ΔNLS)基質に結合するか、それと会合するか、または何らか別の態様で相互作用するHDAC9、HDAC9a、HDAC9(ΔNLS)、HDAC9a(ΔNLS)またはHDRP(ΔNLS)の能力を妨害ないしは増強することにより、相互作用を変化させることができる。
【０１５９】
HDAC9、HDAC9a、HDAC9(ΔNLS)、HDAC9a(ΔNLS)もしくはHDRP(ΔNLS)またはHDAC9、HDAC9a、HDAC9(ΔNLS)、HDAC9a(ΔNLS)もしくはHDRP(ΔNLS)基質に結合する候補化合物の能力の測定は、例えば、直接または間接的に125I、35S、14Cまたは3Hで標識したものを検出することにより、候補化合物のポリペプチドへの結合を測定できるように放射性同位体または酵素標識に候補化合物をカップリングし、そして放射線発光の直接の計数によるか、またはシンチレーション計数により放射性同位体を検出することにより行なうことができる。或いは、候補化合物は例えばセイヨウワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼまたはルシフェラーゼにより酵素的に標識することができ、そして、適切な基質から生成物への変換を測定することにより酵素標識を検出することができる。
【０１６０】
相互作用体のいずれかを標識することなくポリペプチドに対して相互作用を示す候補化合物の能力を測定することも、本発明の範囲に包含される。例えば、候補化合物、HDAC9、HDAC9a、HDAC9(ΔNLS)、HDAC9a(ΔNLS)もしくはHDRP(ΔNLS)、またはHDAC9、HDAC9a、HDAC9(ΔNLS)、HDAC9a(ΔNLS)もしくはHDRP(ΔNLS)基質の何れをも標識することなく、HDAC9、HDAC9a、HDAC9(ΔNLS)、HDAC9a(ΔNLS)もしくはHDRP(ΔNLS)、またはHDAC9、HDAC9a、HDAC9(ΔNLS)、HDAC9a(ΔNLS)もしくはHDRP(ΔNLS)基質との候補化合物の相互作用を検出するために、マイクロフィジオメーターを使用することができる(McConnellら、(1992)Science, 257:1906-1912)。本明細書で使用される場合、「マイクロフィジオメーター」(例えばCYTOSENSOR（登録商標）)とは、光指向性の電位測定センサー（LAPS)を用いて細胞がその環境を酸性化する速度を測定する分析機器である。この酸性化速度の変化をリガンドとポリペプチドとの間の相互作用の指標として使用できる。
【０１６１】
本発明の別の態様においては、本明細書に記載するとおり、HDAC9、HDAC9a、HDAC9(ΔNLS)、HDAC9a(ΔNLS)またはHDRP(ΔNLS)ポリペプチドの1種以上と相互作用するポリペプチドを同定するために試験を用いることができる。例えば、FieldsおよびSong(FieldsおよびSong, Nature 340:245-246(1989))に記載のものような酵母ツーハイブリッド系を用いてHDAC9、HDAC9a、HDAC9(ΔNLS)、HDAC9a(ΔNLS)またはHDRP(ΔNLS)ポリペプチドの1種以上と相互作用するポリペプチドを同定することができる。このような酵母ツーハイブリッド系においては、2つの機能的ドメイン(DNA結合ドメインおよび転写活性化ドメイン)を有する転写因子の柔軟性にもとづいてベクターを構築する。2つのドメインは分離されているが互いに相互作用する２種の異なるタンパク質に融合している場合、転写活性化が行なわれ、そして、特定のマーカー(例えば栄養マーカー、例えばHisおよびAde、または色マーカー、例えばlacZ)の転写を用いて相互作用および転写活性化の存在を同定することができる。例えば、本発明の方法においては、DNA結合ドメインおよびおよびHDAC9、HDAC9a、HDAC9(ΔNLS)、HDAC9a(ΔNLS)またはHDRP(ΔNLS)ポリペプチド、その変異体またはフラグメントまたは誘導体をコードする核酸を含む第1のベクターを使用し、そして、転写活性化ドメインをコードする核酸およびHDAC9、HDAC9a、HDAC9(ΔNLS)、HDAC9a(ΔNLS)またはHDRP(ΔNLS)ポリペプチド、その変異体またはフラグメントまたは誘導体に対して相互作用する可能性があるポリペプチド(例えばHDAC9、HDAC9a、HDAC9(ΔNLS)、HDAC9a(ΔNLS)またはHDRP(ΔNLS)ポリペプチド基質または受容体)をコードする核酸を含む第2のベクターを使用する。第1のベクターおよび第2のベクターを含む酵母を適切な条件下(例えばClontechのMATCHMAKER（登録商標）システムに使用されている接合条件等)にインキュベートすることにより、HDAC9、HDAC9a、HDAC9(ΔNLS)、HDAC9a(ΔNLS)またはHDRP(ΔNLS)のマーカーを発現するコロニーを同定できる。これらのコロニーを検査することにより、HDAC9、HDAC9a、HDAC9(ΔNLS)、HDAC9a(ΔNLS)またはHDRP(ΔNLS)ポリペプチド、またはそのフラグメントまたは誘導体に対して相互作用するポリペプチドが同定できる。このようなポリペプチドは上記したとおり、HDAC9、HDAC9a、HDAC9(ΔNLS)、HDAC9a(ΔNLS)またはHDRP(ΔNLS)ポリペプチドの活性または発現を変化させる化合物として有用でありうる。
【０１６２】
本発明の上記した試験法の１つより多くの態様において、HDAC9、HDAC9a、HDAC9(ΔNLS)、HDAC9a(ΔNLS)もしくはHDRP(ΔNLS)ポリペプチド、またはHDAC9、HDAC9a、HDAC9(ΔNLS)、HDAC9a(ΔNLS)もしくはHDRP(ΔNLS)基質または他の試験の成分を固体支持体に固定化することにより、ポリペプチドの一方または双方の非複合体型から複合体化型を分離しやすくしたり、試験の自動化に適合させることが望ましい場合がある。候補化合物の存在下または非存在下におけるポリペプチドへの候補化合物の結合または基質に対するポリペプチドの相互作用は、反応体を入れるのに適する如何なる容器内で行なうこともできる。このような容器の例としてはマイクロタイタープレート、試験管およびミクロ遠沈管が挙げられる。1つの態様においては、HDAC9、HDAC9a、HDAC9(ΔNLS)、HDAC9a(ΔNLS)もしくはHDRP(ΔNLS)またはHDAC9、HDAC9a、HDAC9(ΔNLS)、HDAC9a(ΔNLS)もしくはHDRP(ΔNLS)基質がマトリックスまたは他の固体支持体に結合できるようにするドメインを付加する融合タンパク質(例えばグルタチオン-S-トランスフェラーゼ融合タンパク質)が提供される。
【０１６３】
別の態様においては、本発明の核酸分子の発現の調節因子は、HDAC9、HDAC9a、HDAC9(ΔNLS)、HDAC9a(ΔNLS)またはHDRP(ΔNLS)をコードする核酸を含む細胞、細胞溶解物、組織、組織溶解物または溶液を候補化合物に接触させ、そして、細胞、細胞溶解物、組織、組織溶解物または溶液中の適切なmRNAまたはポリペプチド(例えば変異体)の発現を測定するという方法において、同定される。候補化合物存在下の適切なmRNAまたはポリペプチドの発現のレベルを、候補化合物の非存在下または候補化合物のベヒクルのみの存在下におけるmRNAまたはポリペプチドの発現のレベルと比較する。次に候補化合物をこの比較に基づいて発現のモジュレーターとして同定できる。例えば、候補化合物の非存在下よりも存在下においてmRNAまたはポリペプチドの発現が高値(統計学的に有意に高値）であった場合、候補化合物はmRNAまたはポリペプチドの発現の刺激物質または増強剤として同定される。或いは、候補化合物の非存在下よりも存在下においてmRNAまたはポリペプチドの発現が低値(統計学的に有意に低値）であった場合、候補化合物はmRNAまたはポリペプチドの発現の阻害剤として同定される。細胞内のmRNAまたはポリペプチドの発現のレベルは、mRNAまたはポリペプチドを検出するための本明細書に記載した方法により測定することができる。
【０１６４】
本発明は更に、上記したスクリーニング法により同定される新しい化合物に関する。従って、適切な動物モデルにおいて本明細書に記載したとおり同定される化合物を更に使用することも本発明の範囲内である。例えば本明細書に記載したとおり同定される化合物(例えばアンチセンス核酸分子、特定の抗体またはポリペプチド基質のような調節化合物である候補化合物）を動物モデルにおいて用いることにより、その化合物を用いた治療の薬効、毒性または副作用を調べることができる。或いは、本明細書に記載したとおり同定される化合物を動物モデルにおいて用いることによりその化合物の作用機序を調べることができる。更にまた、本発明は本明細書に記載した治療のための上記したスクリーニング試験法により同定される新しい化合物の使用に関する。更に、本明細書に記載したとおり同定される化合物を用いれば、本明細書に記載したとおり同定される化合物にポリペプチドまたは核酸分子を接触させることにより(またはポリペプチドまたは核酸分子を含有する細胞を接触させることにより)、HDAC9、HDAC9a、HDAC9(ΔNLS)、HDAC9a(ΔNLS)またはHDRP(ΔNLS)ポリペプチドの活性を変化させたり、あるいはHDAC9、HDAC9a、HDAC9(ΔNLS)、HDAC9a(ΔNLS)またはHDRP(ΔNLS)の発現を変化させたりすることができる。
【０１６５】
医薬組成物
本発明はまた、本明細書に記載した核酸、特に、本明細書に記載したポリペプチドをコードするヌクレオチドを含む；本明細書に記載したポリペプチド(例えば配列番号：2、配列番号：4、配列番号：6、配列番号：8、配列番号：10および/またはHDAC9、HDAC9a、HDAC9(ΔNLS)、HDAC9a(ΔNLS)またはHDRP(ΔNLS)によりコードされる他の変異体)を含む：および/または本明細書に記載したHDAC9、HDAC9a、HDAC9(ΔNLS)、HDAC9a(ΔNLS)もしくはHDRP(ΔNLS)の発現またはHDAC9、HDAC9a、HDAC9(ΔNLS)、HDAC9a(ΔNLS)もしくはHDRP(ΔNLS)のポリペプチド活性を変化(例えば上昇または低下)させる化合物を含む、医薬組成物に関する。例えば、ポリペプチド、タンパク質、フラグメント、その融合タンパク質もしくはプロドラッグ、またはヌクレオチドまたは本発明のヌクレオチドを含む核酸構築物(ベクター)、HDAC9、HDAC9a、HDAC9(ΔNLS)、HDAC9a(ΔNLS)またはHDRP(ΔNLS)のポリペプチド活性を変化させる化合物、HDAC9、HDAC9a、HDAC9(ΔNLS)、HDAC9a(ΔNLS)またはHDRP(ΔNLS)の核酸発現を変化させる化合物、または、HDAC9、HDAC9a、HDAC9(ΔNLS)、HDAC9a(ΔNLS)またはHDRP(ΔNLS)の基質または結合パートナーを、生理学的に許容される担体または賦形剤とともに製剤して、医薬組成物に調製することができる。担体および組成物は滅菌することができる。製剤は投与様式に適したものでなければならない。
【０１６６】
適切な製薬上許容しうる担体としては、水、塩溶液(例えばNaCl)、生理食塩水、緩衝生理食塩水、アルコール、グリセロール、エタノール、アラビアゴム、植物油、ベンジルアルコール、ポリエチレングリコール、ゼラチン、炭水化物、例えば乳糖、アミロースまたは澱粉、デキストロース、ステアリン酸マグネシウム、タルク、珪酸、流動パラフィン、香油、脂肪酸エステル、ヒドロキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドン等、並びにこれらの組み合わせが挙げられるがこれらに限定されない。医薬調製物は、所望により、活性化合物と望ましくない反応を起こさない補助剤、例えば潤滑剤、保存料、安定化剤、湿潤剤、乳化剤、浸透圧調節用の塩類、緩衝剤、着色料、フレーバー剤および/または芳香物質等と混合することができる。
【０１６７】
組成物は、所望により、少量の湿潤剤または乳化剤、またはpH緩衝剤も含有することができる。組成物は液体溶液、懸濁液、乳液、錠剤、丸薬、カプセル剤、除放性製剤または粉末でありうる。組成物は、慣用的な結合因子および担体、例えばトリグリセリドを用いて坐剤として製剤できる。経口用製剤は、標準的な担体、例えば医薬品等級のマンニトール、乳糖、澱粉、ステアリン酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウム等を含有できる。
【０１６８】
これらの組成物の導入方法としては、皮内、筋肉内、腹腔内、眼内、静脈内、皮下、局所、経口または経鼻が挙げられるがこれらに限定されない。他の適当な導入方法として、遺伝子治療(後述する)、再充填可能または生分解性の装置、粒子加速装置（「遺伝子銃」）および遅延放出重合体装置を挙げることもできる。本発明の医薬組成物はまた他の化合物とともに複合療法の一部として投与することができる。
【０１６９】
組成物は人間への投与に適合させた医薬組成物として通常の手順に従って製剤することができる。例えば、静脈内投与用の組成物は、典型的には、滅菌等張性水性緩衝液中の溶液である。必要に応じて、組成物は可溶化剤および注射部位の痛みを緩和するための局所麻酔剤を含有してよい。一般的に、成分は個別に、または、単位剤型中に混合して、例えば凍結乾燥粉末または水非含有濃縮物として、密封された容器、例えば活性成分の量を明示したアンプルまたは袋にいれて供給される。組成物を注入により投与する場合は、これを滅菌された医薬品等級の水、生理食塩水またはデキストロース/水を含んだ注入瓶を用いて供給することができる。組成物を注射により投与する場合は、投与前に成分を混合するための注射用滅菌水または生理食塩水のアンプルが提供されうる。
【０１７０】
局所投与用には、局所投与に適し、好ましくは水より大きい動的粘度を有する担体を含む非噴霧性の形態、粘稠〜半固体または固体の形態を使用することができる。適切な製剤としては、限定されないが、溶液、懸濁液、乳液、クリーム、軟膏、粉末、浣腸剤、ローション、ゾル、リニメント剤、膏薬、エアロゾル等が挙げられ、これらは所望により滅菌されるか、または、補助剤、例えば保存料、安定化剤、湿潤剤、緩衝剤または浸透圧調節用の塩類等と混合される。化合物は化粧品に組み込まれうる。局所適用のためには、活性成分を好ましくは固体または液体の不活性担体材料と組み合わせてスクイーズボトル中に、または加圧された揮発性、通常は気体の高圧ガス、例えば圧縮空気と混合して充填するスプレー可能なエアロゾル調製物もまた適切である。
【０１７１】
本明細書に記載した化合物は中性または塩の形態に製剤できる。製薬上許容しうる塩としては、遊離のアミノ基とともに形成されるもの、例えば、塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸等から誘導されるもの、および遊離のカルボキシル基とともに形成されるもの、例えばナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、水酸化鉄、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、2-エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカイン等から誘導されるものが挙げられる。
【０１７２】
化合物は治療有効量で投与する。特定の障害または症状の治療において治療上有効な化合物の量は、障害または症状の性質により異なり、標準的な臨床手法により決定することができる。更に、インビトロまたはインビボの試験もまた至適量範囲の同定を助けるために使用してよい。製剤中に使用される厳密な用量はまた、投与経路および細胞増殖疾患、アポトーシス疾患または細胞分化疾患の症状の重症度に依存し、そして、医師の判断により、各患者の状況に応じて決定しなければならない。有効な用量はインビトロまたは動物モデルの試験系で得られる用量応答曲線から推定されうる。
【０１７３】
本発明はまた本発明の医薬組成物の成分1種以上を充填した容器1個以上を含む医薬品パックまたはキットを提供する。任意に容器には医薬品または生物学的製品の製造、使用または販売を規制する当局により指定された形式の注意書きを付し、該注意書きはヒトへの投与のための製造、使用または販売の当局による認可を反映する。パックまたはキットは投与の形態、薬物投与の順序(例えば個別、逐次または同時投与）等に関する情報をラベル表示することができる。パックまたはキットはまた治療の敢行を患者に周知させる手段を含んでよい。パックまたはキットは、複合療法の1単位用量であり得、あるいは、単位用量の複数個でありうる。特に、化合物は個別に、いずれかの組み合わせにおいて混合され、1バイアルまたは1錠中に与えることができる。ブリスタパックまたは他の投薬手段にまとめられた化合物が好ましい。本発明の目的のためには、単位用量は、各化合物の個別の薬力学に依存し、標準的な時間経過においてFDA認可用量で投与される用量を意味する。
【０１７４】
治療方法
本発明はまたHDAC9、HDAC9a、HDAC9(ΔNLS)、HDAC9a(ΔNLS)またはHDRP(ΔNLS)の治療化合物を用いた細胞増殖疾患、アポトーシス疾患または細胞分化疾患の治療(予防、診断および/または治療)方法に関する。「HDAC9、HDAC9a、HDAC9(ΔNLS)、HDAC9a(ΔNLS)またはHDRP(ΔNLS)の治療化合物」とは、HDAC9、HDAC9a、HDAC9(ΔNLS)、HDAC9a(ΔNLS)またはHDRP(ΔNLS)ポリペプチドの活性および/またはHDAC9、HDAC9a、HDAC9(ΔNLS)、HDAC9a(ΔNLS)またはHDRP(ΔNLS)核酸分子の発現を、本明細書に記載したとおり変化(例えば増強または阻害)させる化合物である(例えばHDAC9、HDAC9a、HDAC9(ΔNLS)、HDAC9a(ΔNLS)またはHDRP(ΔNLS)アゴニストまたは拮抗剤)。HDAC9、HDAC9a、HDAC9(ΔNLS)、HDAC9a(ΔNLS)またはHDRP(ΔNLS)の治療化合物は、HDAC9、HDAC9a、HDAC9(ΔNLS)、HDAC9a(ΔNLS)またはHDRP(ΔNLS)のポリペプチドの活性または核酸分子の発現を、種々の手段により、例えば、別のHDAC9、HDAC9a、HDAC9(ΔNLS)、HDAC9a(ΔNLS)またはHDRP(ΔNLS)ポリペプチドを与えることにより、または、HDAC9、HDAC9a、HDAC9(ΔNLS)、HDAC9a(ΔNLS)またはHDRP(ΔNLS)核酸分子の転写または翻訳をアップレギュレートすることにより；HDAC9、HDAC9a、HDAC9(ΔNLS)、HDAC9a(ΔNLS)またはHDRP(ΔNLS)のポリペプチドの翻訳後のプロセシングを変化させることにより；HDAC9、HDAC9a、HDAC9(ΔNLS)、HDAC9a(ΔNLS)またはHDRP(ΔNLS)の変異体の転写を変化させることにより；または、HDAC9、HDAC9a、HDAC9(ΔNLS)、HDAC9a(ΔNLS)またはHDRP(ΔNLS)のポリペプチドの活性に緩衝することにより(例えばHDAC9、HDAC9a、HDAC9(ΔNLS)、HDAC9a(ΔNLS)またはHDRP(ΔNLS)ポリペプチドに結合することにより)、または、HDAC9、HDAC9a、HDAC9(ΔNLS)、HDAC9a(ΔNLS)またはHDRP(ΔNLS)核酸分子の転写または翻訳をダウンレギュレートすること等により、変化させることができる。代表的なHDAC9、HDAC9a、HDAC9(ΔNLS)、HDAC9a(ΔNLS)またはHDRP(ΔNLS)の治療化合物としては、以下のもの、即ち：本明細書に記載した核酸またはそのフラグメントもしくは誘導体、特に本明細書に記載したポリペプチドをコードするヌクレオチドおよびかかる核酸を含有するベクター(例えば核酸分子、cDNAおよび/またはRNA、例えばHDAC9、HDAC9a、HDAC9(ΔNLS)、HDAC9a(ΔNLS)またはHDRP(ΔNLS)ポリペプチドをコードする核酸またはその活性なフラグメントまたは誘導体、またはオリゴヌクレオチド；例えば、任意に少なくとも1つの多型を含んでよい配列番号：1、配列番号：3、配列番号：5、配列番号：7もしくは配列番号：9、または配列番号：2、配列番号：4、配列番号：6、配列番号：8、配列番号：10をコードする核酸またはそのフラグメントもしくは誘導体)；本明細書に記載したポリペプチド(例えば配列番号：2、配列番号：4、配列番号：6、配列番号：8、配列番号：10および/またはHDAC9、HDAC9a、HDAC9(ΔNLS)、HDAC9a(ΔNLS)またはHDRP(ΔNLS)またはそのフラグメントもしくは誘導体にコードされる他の変異体)；HDAC9、HDAC9a、HDAC9(ΔNLS)、HDAC9a(ΔNLS)またはHDRP(ΔNLS)基質；ペプチド擬似物；融合タンパク質またはそのプロドラッグ；抗体(例えば、上記のような、突然変異体のHDAC9、HDAC9a、HDAC9(ΔNLS)、HDAC9a(ΔNLS)またはHDRP(ΔNLS)ポリペプチドに対する抗体、または非突然変異体のHDAC9、HDAC9a、HDAC9(ΔNLS)、HDAC9a(ΔNLS)もしくはHDRP(ΔNLS)ポリペプチドに対する抗体、またはHDAC9、HDAC9a、HDAC9(ΔNLS)、HDAC9a(ΔNLS)もしくはHDRP(ΔNLS)によりコードされる特定の変異体に対する抗体)；リボザイム；他の小型分子；およびHDAC9、HDAC9a、HDAC9(ΔNLS)、HDAC9a(ΔNLS)またはHDRP(ΔNLS)核酸の発現またはポリペプチド活性を変化（例えば増強または阻害）する他の化合物、例えば本明細書に記載したスクリーニング方法において同定される化合物、または、HDAC9、HDAC9a、HDAC9(ΔNLS)、HDAC9a(ΔNLS)またはHDRP(ΔNLS)変異体の転写を調節するもの、例えば、どの変異体が発現されるかに影響する、または発現される各変異体の量に影響する化合物が挙げられる。1種より多くのHDAC9、HDAC9a、HDAC9(ΔNLS)、HDAC9a(ΔNLS)またはHDRP(ΔNLS)の治療化合物を所望により同時に用いることができる。
【０１７５】
核酸であるHDAC9、HDAC9a、HDAC9(ΔNLS)、HDAC9a(ΔNLS)またはHDRP(ΔNLS)の治療化合物は細胞増殖疾患、アポトーシス疾患または細胞分化疾患の治療において使用される。「治療」という用語は本明細書においては、疾患に伴う症状を緩解することのみならず、疾患の発症を防止または遅延させること、および、疾患の症状の重症度または頻度を低下させることを指す。治療は個体におけるHDAC9、HDAC9a、HDAC9(ΔNLS)、HDAC9a(ΔNLS)またはHDRP(ΔNLS)ポリペプチドの活性を変化(例えば、阻害または増強)、置き換えまたは補充するように考案される。例えば、HDAC9、HDAC9a、HDAC9(ΔNLS)、HDAC9a(ΔNLS)またはHDRP(ΔNLS)の治療化合物は、HDAC9、HDAC9a、HDAC9(ΔNLS)、HDAC9a(ΔNLS)もしくはHDRP(ΔNLS)核酸分子またはHDAC9、HDAC9a、HDAC9(ΔNLS)、HDAC9a(ΔNLS)もしくはHDRP(ΔNLS)の特定の変異体の発現または利用性をアップレギュレートまたは増大するため、または、逆に、HDAC9、HDAC9a、HDAC9(ΔNLS)、HDAC9a(ΔNLS)もしくはHDRP(ΔNLS)核酸分子またはHDAC9、HDAC9a、HDAC9(ΔNLS)、HDAC9a(ΔNLS)もしくはHDRP(ΔNLS)の特定の変異体の発現または利用性をダウンレギュレートまたは減少するために投与することができる。ネイティブのHDAC9、HDAC9a、HDAC9(ΔNLS)、HDAC9a(ΔNLS)またはHDRP(ΔNLS)核酸分子または特定の変異体の発現または利用性をアップレギュレーションまたは増大させると、欠陥遺伝子または他の変異体の発現または活性が妨害されるか補われ；ネイティブのHDAC9、HDAC9a、HDAC9(ΔNLS)、HDAC9a(ΔNLS)またはHDRP(ΔNLS)核酸分子または特定の変異体の発現または利用性をダウンレギュレーションまたは低減すると、欠陥遺伝子または特定の変異体の発現または活性が最小限に留められ、これにより、欠陥遺伝子または特定の変異体の影響を最小限にすることができる。
【０１７６】
HDAC9、HDAC9a、HDAC9(ΔNLS)、HDAC9a(ΔNLS)またはHDRP(ΔNLS)の治療化合物は治療有効量 (即ち疾患に伴う症状を緩解するか、疾患の発症を防止または遅延させるか、および/または疾患の症状の重症度または頻度を低下させることによりなどして疾患を治療するのに十分な量）で投与する。特定の個体の障害または症状の治療において治療上有効な量は疾患の症状および重症度に依存して異なり、そして、標準的な臨床手法により決定することができる。更に、インビトロまたはインビボの試験もまた任意に至適用量範囲を同定するのを助けるために使用してよい。製剤中に使用される厳密な用量はまた、投与経路および疾患または障害の重症度に依存し、そして、医師の判断により、各患者の状況に応じて決定しなければならない。有効な用量はインビトロまたは動物モデルの試験系に由来する用量応答曲線から推定されうる。
【０１７７】
1つの態様においては、本発明の核酸(例えばHDAC9、HDAC9a、HDAC9(ΔNLS)、HDAC9a(ΔNLS)またはHDRP(ΔNLS)ポリペプチドをコードする核酸、例えば、任意に少なくとも1つの多型を含んでよい配列番号：1、配列番号：3、配列番号：5、配列番号：7もしくは配列番号：9、またはHDAC9、HDAC9a、HDAC9(ΔNLS)、HDAC9a(ΔNLS)またはHDRP(ΔNLS)ポリペプチドまたはその変異体、誘導体もしくはフラグメントをコードする核酸、例えば配列番号：2、配列番号：4、配列番号：6、配列番号：8または配列番号：10のタンパク質をコードする核酸)を単独または上記した医薬組成物中において使用することができる。例えば、HDAC9、HDAC9a、HDAC9(ΔNLS)、HDAC9a(ΔNLS)もしくはHDRP(ΔNLS)またはHDAC9、HDAC9a、HDAC9(ΔNLS)、HDAC9a(ΔNLS)もしくはHDRP(ΔNLS)ポリペプチドをコードするcDNAを、単独で、またはベクター内に含有させて、ネイティブのHDAC9、HDAC9a、HDAC9(ΔNLS)、HDAC9a(ΔNLS)またはHDRP(ΔNLS)ポリペプチドを細胞が産生するように、細胞（インビトロまたはインビボのいずれか）内に導入することができる。所望により、遺伝子もしくはcDNAまたは、遺伝子もしくはcDNAを含むベクターにより形質転換されている細胞を疾患に罹患した個体内に導入(または再導入)することができる。即ち、天然ではネイティブのHDAC9、HDAC9a、HDAC9(ΔNLS)、HDAC9a(ΔNLS)またはHDRP(ΔNLS)の発現および活性を欠失しているか、または突然変異体のHDAC9、HDAC9a、HDAC9(ΔNLS)、HDAC9a(ΔNLS)またはHDRP(ΔNLS)の発現および活性を保有しているか、または疾患関連のHDAC9、HDAC9a、HDAC9(ΔNLS)、HDAC9a(ΔNLS)またはHDRP(ΔNLS)の変異体の発現を保有している細胞を操作することにより、HDAC9、HDAC9a、HDAC9(ΔNLS)、HDAC9a(ΔNLS)またはHDRP(ΔNLS)ポリペプチドまたはHDAC9、HDAC9a、HDAC9(ΔNLS)、HDAC9a(ΔNLS)またはHDRP(ΔNLS)ポリペプチドの活性フラグメント(またはHDAC9、HDAC9a、HDAC9(ΔNLS)、HDAC9a(ΔNLS)またはHDRP(ΔNLS)ポリペプチドの異なる変異体)を発現することができる。好ましい態様において、HDAC9、HDAC9a、HDAC9(ΔNLS)、HDAC9a(ΔNLS)またはHDRP(ΔNLS)ポリペプチドまたはその活性フラグメントもしくは誘導体をコードする核酸は、ウィルスベクターのような発現ベクターに導入することができ、そしてそのベクターを動物内の適切な細胞に導入することができる。他の遺伝子導入系（ウィルスおよび非ウィルスの導入系を含む）も使用できる。或いは、非ウィルス遺伝子導入法、例えばリン酸カルシウム共沈殿法、機械的手法(例えばマイクロインジェクション)；リポソームを介した膜融合媒介導入；または直接のDNAの取りこみもまた、所望の核酸分子を細胞に導入するために使用することができる。
【０１７８】
或いは、本発明の別の態様において、本発明の核酸；本発明の核酸に相補的な核酸；またはこのような核酸の部分（例えば後述するオリゴヌクレオチド）を、HDAC9、HDAC9a、HDAC9(ΔNLS)、HDAC9a(ΔNLS)またはHDRP(ΔNLS)のRNAおよび/またはゲノムDNAに特異的にハイブリダイズする核酸(例えばオリゴヌクレオチド)を投与するか、インサイチュで発生させる「アンチセンス」療法において用いることができる。RNAおよび/またはDNAに特異的にハイブリダイズするアンチセンス核酸は、例えば翻訳および/または転写を阻害することにより、HDAC9、HDAC9a、HDAC9(ΔNLS)、HDAC9a(ΔNLS)またはHDRP(ΔNLS)核酸分子の発現を阻害する。アンチセンス核酸の結合は、従来の塩基対相補性によるものであるか、または、例えばDNAの二本鎖への結合の場合は、二重らせんの主溝内の特異的な相互作用を介したものでありうる。
【０１７９】
本発明のアンチセンス構築物は例えば上記したとおり発現プラスミドとして供給することができる。プラスミドを細胞内で転写する場合、それはHDAC9、HDAC9a、HDAC9(ΔNLS)、HDAC9a(ΔNLS)またはHDRP(ΔNLS)ポリペプチドをコードするmRNAおよび/またはDNAの部分に相補的なRNAを産生する。あるいは、アンチセンス構築物はエクスビボで生成され細胞内に導入されるオリゴヌクレオチドプローブであり得；そしてそれは次にHDAC9、HDAC9a、HDAC9(ΔNLS)、HDAC9a(ΔNLS)またはHDRP(ΔNLS)のmRNAおよび/またはゲノムDNAにハイブリダイズすることにより発現を阻害する。1つの態様においては、オリゴヌクレオチドプローブは内因性のヌクレアーゼ、例えばエキソヌクレアーゼおよび/またはエンドヌクレアーゼに対して耐性である修飾されたオリゴヌクレオチドであり、これによりインビボで安定となる。アンチセンスオリゴヌクレオチドとして使用するための核酸分子の例は、DNAのホスホロアミデート、ホスホチオエートおよびメチルホスホネート類縁体である(米国特許5,176,996号；5,264,564号および5,256,775号をまた参照)。更に、アンチセンス療法に有用なオリゴマーを構築する一般的な方法はまた、例えばVander Krolら、 Biotechniques 6:958-976(1988);およびSteinら、Cancer Res48:2659-2668(1988)に記載されている。アンチセンスDNAに関しては、翻訳開始部位、例えばHDAC9、HDAC9a、HDAC9(ΔNLS)、HDAC9a(ΔNLS)またはHDRP(ΔNLS)核酸配列の-10から+10の間の領域から誘導したオリゴデオキシリボヌクレオチドが好ましい。
【０１８０】
アンチセンス療法を行なうためには、HDAC9、HDAC9a、HDAC9(ΔNLS)、HDAC9a(ΔNLS)またはHDRP(ΔNLS)ポリペプチドをコードするmRNAに相補的なオリゴヌクレオチド(RNA、cDNAまたはDNA)を設計する。アンチセンスオリゴヌクレオチドはHDAC9、HDAC9a、HDAC9(ΔNLS)、HDAC9a(ΔNLS)またはHDRP(ΔNLS)のmRNA転写産物に結合し、翻訳を妨げる。絶対的な相補性が好ましいが、必須ではない。RNAの部分に「相補的な」配列とは、本明細書においては、RNAにハイブリダイズして安定な二本鎖を形成できる程度に十分な相補性を配列が有していることを指し；従って、二本鎖アンチセンス核酸の場合は、二本鎖DNAの一本鎖を試験するか、または三本鎖の形成を調べてよい。ハイブリダイズする能力は詳細に上記したとおり、アンチセンス核酸の相補性の程度および長さの両方に依存する。一般的に、ハイブリダイズしている核酸が長いほど、RNAとの塩基ミスマッチをより多く含み、そしてなお安定な二本鎖（または適宜、三本鎖の場合もある）を形成する。当業者は、標準的な手順を使用することによりミスマッチの忍容性の程度を確認することができる。
【０１８１】
アンチセンス療法に使用されるオリゴヌクレオチドは、DNA、RNAまたはそのキメラ混合物または誘導体または修飾された型であり得、一本鎖でも二本鎖でもよい。オリゴヌクレオチドは塩基部分、糖部分またはホスフェート骨格において、例えば分子の安定性、ハイブリダイゼーション等が改善されるように修飾されうる。オリゴヌクレオチドは別の付随する基、例えばペプチド（例えばインビボで宿主細胞受容体をターゲティングするため）、または細胞膜（例えばLeitsingerらProc. Natl. Acad. Sci. USA 86:6553-6556(1989); Lemaitreら、Proc. Natl. Acad Sci.USA 84:648-652(1987);PCT国際公開WO88/09810）参照）または血液脳関門(例えば、PCT国際公開WO89/10134参照)を通過する輸送を容易にする化合物、またはハイブリダイゼーション誘発切断因子(例えばKrolら、BioTechniques6:958-976(1988)参照)またはインターカレーション剤(例えばZon, Pharm. Res. 5:539-549(1988)参照)を含むことができる。この目的のために、オリゴヌクレオチドを他の分子(例えばペプチド、ハイブリダイゼーション誘発架橋因子、輸送因子、ハイブリダイゼーション誘発切断因子)に連結しうる。
【０１８２】
アンチセンス分子はインビボでHDAC9、HDAC9a、HDAC9(ΔNLS)、HDAC9a(ΔNLS)またはHDRP(ΔNLS)を発現するように細胞に送達される。細胞へのアンチセンスDNAまたはRNAの送達のためには多くの方法が使用でき、例えば、アンチセンス分子を直接組織部位に注射するか、または、所望の細胞にターゲティングするように設計された修飾アンチセンス分子(例えば標的細胞の表面に発現される受容体または抗原に特異的に結合するペプチドまたは抗体に連結されたアンチセンス)を全身投与することができる。或いは、好ましい態様においては、アンチセンスオリゴヌクレオチドを強力なプロモーター（例えばpolIIIまたはpolII）の制御下に置いた組み換えDNA構築物を利用する。患者における標的細胞をトランスフェクトするためのこのような構築物の使用は、内因性のHDAC9、HDAC9a、HDAC9(ΔNLS)、HDAC9a(ΔNLS)またはHDRP(ΔNLS)転写産物と相補塩基対を形成する一本鎖RNAの十分な量の転写をもたらし、これによりHDAC9、HDAC9a、HDAC9(ΔNLS)、HDAC9a(ΔNLS)またはHDRP(ΔNLS)のmRNAの翻訳を妨げる。例えば、ベクターはそれが細胞により取り込まれアンチセンスRNAの転写を指向するようにインビボで導入することができる。このようなベクターはそれが転写されて所望のアンチセンスRNAを産生することができる限り、エピソームののままであってよく、または染色体に組み込まれるようになってもよい。このようなベクターは、当該分野で標準的であり、かつ前記した組み換えDNA手法により構築することができる。例えば、プラスミド、コスミド、YACまたはウィルス性のベクターを用いて組織部位に直接導入できる組み換えDNA構築物を調製することができる。あるいはウィルスベクターは所望の組織に選択的に感染するものを使用することができ、そのような場合、投与は別の経路（例えば全身投与）により行ってよい。
【０１８３】
内因性HDAC9、HDAC9a、HDAC9(ΔNLS)、HDAC9a(ΔNLS)またはHDRP(ΔNLS)の発現はまた、ターゲティングされた相同組み換えを用いてHDAC9、HDAC9a、HDAC9(ΔNLS)、HDAC9a(ΔNLS)またはHDRP(ΔNLS)核酸配列またはそのプロモーターを不活性化または「ノックアウト」することにより低減することもできる（例えばSmithiesら、Nature317:230-234(1985);ThomasおよびCapecchi, Cell 51:503-512(1987);Thompsonら、Cell5:313-321(1989)参照）。例えば内因性HDAC9、HDAC9a、HDAC9(ΔNLS)、HDAC9a(ΔNLS)またはHDRP(ΔNLS)に相同のDNA（HDAC9、HDAC9a、HDAC9(ΔNLS)、HDAC9a(ΔNLS)またはHDRP(ΔNLS)のコード領域または調節領域のいずれか）により隣接された突然変異体の非機能的なHDAC9、HDAC9a、HDAC9(ΔNLS)、HDAC9a(ΔNLS)またはHDRP(ΔNLS)（または完全に無関係のDNA配列）を、選択マーカーおよび/または陰性選択マーカーを用いるか用いることなく、インビボでHDAC9、HDAC9a、HDAC9(ΔNLS)、HDAC9a(ΔNLS)またはHDRP(ΔNLS)を発現する細胞をトランスフェクトするために使用することができる。ターゲティングされた相同組み換えによるDNA構築物の挿入はHDAC9、HDAC9a、HDAC9(ΔNLS)、HDAC9a(ΔNLS)またはHDRP(ΔNLS)の不活性化をもたらす。組み換えDNA構築物は直接投与するか、または、上記したとおり適切なベクターを用いてインビボで所要の部位にターゲティングすることができる。あるいは、非突然変異体のHDAC9、HDAC9a、HDAC9(ΔNLS)、HDAC9a(ΔNLS)またはHDRP(ΔNLS)の発現は同様の方法を用いて増大させることができ：ターゲティングされた相同組み換え体を用いて上記したとおり、細胞内で突然変異体のHDAC9、HDAC9a、HDAC9(ΔNLS)、HDAC9a(ΔNLS)またはHDRP(ΔNLS)の代わりに非突然変異体の機能的HDAC9、HDAC9a、HDAC9(ΔNLS)、HDAC9a(ΔNLS)またはHDRP(ΔNLS)を含むDNA構築物（例えば任意に少なくとも1個の多型を有しうる配列番号：1、配列番号：3、配列番号：5、配列番号：7または配列番号：9を有する遺伝子）を挿入することができる。別の態様においてはターゲティングされた相同組み換えを用いて細胞内に存在するものとは異なるHDAC9、HDAC9a、HDAC9(ΔNLS)、HDAC9a(ΔNLS)またはHDRP(ΔNLS)ポリペプチド変異体をコードする核酸を含むDNA構築物を挿入することができる。
【０１８４】
或いは、内因性HDAC9、HDAC9a、HDAC9(ΔNLS)、HDAC9a(ΔNLS)またはHDRP(ΔNLS)の発現は、HDAC9、HDAC9a、HDAC9(ΔNLS)、HDAC9a(ΔNLS)またはHDRP(ΔNLS)の調節領域（即ちHDAC9、HDAC9a、HDAC9(ΔNLS)、HDAC9a(ΔNLS)またはHDRP(ΔNLS)のプロモーターおよび/またはエンハンサー）に相補的なデオキシリボヌクレオチド配列をターゲティングして、身体の標的細胞内のHDAC9、HDAC9a、HDAC9(ΔNLS)、HDAC9a(ΔNLS)またはHDRP(ΔNLS)の転写を妨げる三重螺旋構造を形成することにより低減することができる（一般的にHeleneAnticancer Drug Des., 6(6):569-84(1991); Heleneら、Ann.N.Y.Acad.Sci.,660:27-36(1992);およびMaher, Bioassays 14(12):807-15(1992)参照）。同様に、本明細書に記載したアンチセンス構築物は、HDAC9、HDAC9a、HDAC9(ΔNLS)、HDAC9a(ΔNLS)またはHDRP(ΔNLS)タンパク質の1つの正常な生物学的活性を拮抗することにより、組織の操作、例えば組織の分化において、インビボとエクスビボの両方の組織培養において使用することができる。更にまた、アンチセンス手法（例えばアンチセンス分子のマイクロインジェクション、またはその転写産物がHDAC9、HDAC9a、HDAC9(ΔNLS)、HDAC9a(ΔNLS)またはHDRP(ΔNLS)のmRNAまたは遺伝子配列に関してアンチセンスであるプラスミドによるトランスフェクション）を用いて発生過程におけるHDAC9、HDAC9a、HDAC9(ΔNLS)、HDAC9a(ΔNLS)またはHDRP(ΔNLS)の役割ならびに成体組織におけるHDAC9、HDAC9a、HDAC9(ΔNLS)、HDAC9a(ΔNLS)またはHDRP(ΔNLS)の正常な細胞内機能を調べることができる。このような手法は細胞培養において利用することができるが、トランスジェニック動物の創生において使用することもできる。
【０１８５】
本発明の更に別の態様においては、本明細書に記載した他のHDAC9、HDAC9a、HDAC9(ΔNLS)、HDAC9a(ΔNLS)またはHDRP(ΔNLS)治療化合物もまた細胞増殖疾患、アポトーシス疾患または細胞分化疾患の治療または予防において使用することができる。治療化合物は上記した組成物中で、または単独で送達することができる。これらは全身投与することができ、または、特定の組織にターゲティングすることができる。治療化合物は種々の手段、例えば化学合成；組み換えによる生産；インビボ生産（例えばMeadeらへの米国特許4,873,316号のようなトランスジェニックな動物）により製造でき、そして本明細書に記載した標準的な手段を用いて単離することができる。
【０１８６】
上記した治療方法のいずれかの組み合わせ、例えば非突然変異体のHDAC9、HDAC9a、HDAC9(ΔNLS)、HDAC9a(ΔNLS)またはHDRP(ΔNLS)ポリペプチドを突然変異体のHDAC9、HDAC9a、HDAC9(ΔNLS)、HDAC9a(ΔNLS)またはHDRP(ΔNLS)のmRNAをターゲティングするアンチセンス療法と組み合わせた投与；HDAC9、HDAC9a、HDAC9(ΔNLS)、HDAC9a(ΔNLS)またはHDRP(ΔNLS)によりコードされる第1の変異体をHDAC9、HDAC9a、HDAC9(ΔNLS)、HDAC9a(ΔNLS)またはHDRP(ΔNLS)によりコードされる第2のものをターゲティングするアンチセンス療法と組み合わせた投与をまた使用することができる。
【０１８７】
別の態様においては、本発明は治療における医薬として使用するための、HDAC9、HDAC9a、HDAC9(ΔNLS)、HDAC9a(ΔNLS)またはHDRP(ΔNLS)の核酸分子およびHDAC9、HDAC9a、HDAC9(ΔNLS)、HDAC9a(ΔNLS)またはHDRP(ΔNLS)のポリペプチドに関する。例えば、本発明の核酸分子またはポリペプチドは細胞増殖疾患、アポトーシス疾患または細胞分化疾患の治療において使用することができる。更に、本明細書に記載したHDAC9、HDAC9a、HDAC9(ΔNLS)、HDAC9a(ΔNLS)またはHDRP(ΔNLS)核酸分子およびHDAC9、HDAC9a、HDAC9(ΔNLS)、HDAC9a(ΔNLS)またはHDRP(ΔNLS)ポリペプチドは細胞増殖疾患、アポトーシス疾患または細胞分化疾患の治療のための医薬の製造において使用することができる。
【０１８８】
本発明は以下の非限定的な実施例においてより詳細に記載される。本明細書において引用したすべての文献の教示はその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【実施例】
【０１８９】
HDAC9と命名された新規HDACをコードするcDNAのクローニング
以下に詳述するとおり、翻訳産物がHDAC4のHDACドメインに対して80％の同一性を示したヒト染色体7の配列から設計したプライマーを用いてcDNA末端のPCRおよび3'迅速増幅によりHDAC9をクローニングした。
【０１９０】
データベース分析によりHDRPは染色体7上(7p15-p12)に位置することが解かっている。GenBankのヒトゲノムデータベース(2001年2月公開)をヒトHDAC4アミノ酸配列を用いて検索した。TBLASTNプログラムを用いてHDAC4のHDACドメインに有意な相同性を示す染色体7上のHDRPの下流のオープンリーディングフレームを同定した。翻訳産物が58％を超える同一性を示す数個のフラグメントを取り出した。2個のセンスプライマー(OL486,5'-CCATGGAAACGGTACCCAGCAGGC-3'(配列番号：16)およびOL487,5'-CACTCCATCGCTATGATGAAGGG-3'(配列番号：17))ならびにアンチセンスプライマー(OL484,5'-AGTTCCCTTCATCATAGCGATGG-3'(配列番号：18)およびOL485,5'-AATGTACAGGATGCTGGGGT-3'(配列番号：19))は各々、翻訳産物がHDAC4のアミノ酸842〜873とマッチしているこれらのフラグメントの1つに基づいて設計した。RT-PCRはアンチセンスプライマーおよびHDRPのコード領域からのセンスプライマー(5'-CCCTTGTAGCTGGTGGAGTTCCCTT-3'(配列番号：20))の各々および鋳型としてのヒト脳cDNAを用いて行なった。PCRは、BiometraTGRADIENT Thermocyclerにおいて、95℃20秒、60℃20秒、および72℃120秒を30サイクル行なった。
【０１９１】
cDNA末端の3'急速増幅をセンスプライマーOL486およびアダプタープライマー1(Clontech)およびヒト脳由来のマラソンレディーcDNA(Clontech,Palo Alto, CA)を用いて、製造元の取扱説明書に従って実施した。産物はネステッドセンスプライマーOL487およびアダプタープライマー2(Clontech,Palo Alto, CA)を用いて再増幅した。PCR産物はpGEM-T-easyベクター(Promega, Madison, WI)にクローニングし、当業者に公知のDNA配列決定法を用いてDNASequencing Core Facility of the Memorial Sloan-Kettering Cancer Centerにおいて自動DNAシーケンサーを用いて配列決定した。
【０１９２】
2個のcDNAを上記した方法によりクローニングした。1つのcDNA(配列番号：1)は1011アミノ酸長であるHDAC9タンパク質をコードしている。他のcDNA(配列番号：3)は879アミノ酸長であるHDAC9aタンパク質をコードしている。HDAC9およびHDAC9aのcDNA配列およびアミノ酸配列はそれぞれ、図1A〜１Gおよび図2A〜2Bに示すとおりである。ヒトゲノムDNA配列に対するこれらのcDNAのデータ分析によれば、これら2個のcDNAはオルタナティブスプライシングにより生成されたことが解かった。HDAC9、HDAC9a、HDRPおよびHDAC4のアライメントは図3A〜3Cに示すとおりである。
【０１９３】
HDAC9およびHDAC9aの核酸配列の各々をc-末端FLAGタグと共にインフレームにpFLAG-CMV-5bベクター(Sigma)にクローニングした。HDAC9およびHDAC9aの核酸配列のcDNAのコード領域+3個の余剰塩基対(ACC)のみを構築物に包含させた。本明細書においては、これらの構築物をそれぞれHDAC9−FLAGおよびHDAC9a−FLAGと称する。これらの構築物はE.coliに含まれており、容易に発現することができる。HDAC9については挿入断片は3033bpであり、HDAC9aについては挿入断片のサイズは2637bpである。HDAC9およびHDAC9aは共にEcoRVおよびBamHI(これらの部位はクローニング目的により、HDAC9およびHDAC9aをコードするcDNAを得るためにプライマーに取りこまれている)制限酵素消化により放出することができる。
【０１９４】
本研究によりクローニングされたHDRPのcDNAの既知の5'末端から3'非翻訳領域までのHDAC9cDNA配列は染色体7のゲノムDNAの511kb超をカバーしている。図4に示すとおり、HDAC9のコード領域のcDNAはゲノム配列の458kbに渡る23エキソン中に存在している。エキソン21、22および23はHDAC9aの単一のエキソンであるが、インフレームの停止コドンを含む図4に示すエキソン22の番号が付された中央のエキソンはHDAC9ではスプライスアウトされている。更にエキソン12および13はHDRPにより使用される単一のエキソンである。エキソン13はHDAC9およびHDAC9aのイントロンの一部としてスプライスされる。
【０１９５】
更に分析することにより、核局在化シグナル(NLS)を含むエキソン7はHDRPイソフォーム中にオルタナティブにスプライシングされ、HDRP(ΔNLS)を生成することが解かった。エキソン6およびエキソン14より得た配列に基づいたプライマーを用いたRT-PCR分析によれば、このオルタナティブスプライシング事象はHDAC9および／またはHDAC9aにおいても起こっていることが解かる。即ち、少なくとも6種のタンパク質をそのRNAのオルタナティブスプライシングにより単一のHDAC9遺伝子から生成することができる。HDAC9、HDAC9a、HDAC9(ΔNLS)、HDAC9a(ΔNLS)およびHDRP(ΔNLS)のcDNA配列およびアミノ酸配列はそれぞれ図1A〜1Oおよび2A〜2Eに示すとおりである。
【０１９６】
HDAC9 mRNAはヒト組織中で異なって発現される
HDAC9 mRNAの発現はヒト多組織ノーザンブロット(Clontech, Palo Alto, CA)を用いたノーザンブロット分析により測定した。ExPressHyb溶液(Clontech,Palo Alto, CA)を用いて製造元の取扱説明書に従ってハイブリダイゼーションを行なった。HDRPと有意な配列相同性を共有していないHDAC9およびHDAC9aの両方に共通な32Pランダムプライミング標識3'非翻訳領域をプローブとして用いた。9.8および4.1kbの２種の転写産物が調べた全組織中に検出された(図6A)。4.1kbの転写産物は4.4kbのHDRP転写産物より短い(Zhouら、Proc.Natl. Acad. Sci. USA, 97:1056-1061(2000)参照)。1.2kbの第3の転写産物は胎盤で検出された(図6A)。HDRPと同様(Zhou,Xら、Proc.Natl. Acad. Sci. USA, 97:1056-1061(2000)参照)、高レベルのHDAC9転写産物が脳および骨格筋に検出された(図6A)。
【０１９７】
組織中のオルタナティブスプライシングされたmRNA変異体の分布をオルタナティブスプライシングされたエキソン22および多組織ノーザンブロットと同様の組織から得たcDNAパネルに渡るプライマー(OL516  5'−TGTGTCATCGAGCTGGCTTC−3'(配列番号：21)およびOL517  5'−ATCTTCTGCAAGTGGCTCCA−3'(配列番号：22))を用いたRT-PCRにより調べた。PCRを、BiometraTGRADIENT Thermocyclerにおいて、95℃20秒、60℃20秒、および72℃60秒を30サイクル行なった。PCR産物の予測されるサイズはHDAC9では680塩基対、HDAC9aでは993塩基対であった。HDAC9とHDAC9aの転写産物の比は組織毎に異なっていた(図6B)。胎盤と腎臓においては、２種の転写産物のレベルはほぼ同様であった(図6B)。脳、心臓および膵臓においては、HDAC9aよりもHDAC9の転写産物がより多く観察された。調べた別の組織においては、HDAC9転写産物よりHDAC9a転写産物が多かった(図6B)。試験の条件下においては、肝臓ではHDAC9転写産物は検出不能であった(図6B)。肺ではHDAC9産物は予測より多く、抱負に存在していた。肺ではまたHDAC9転写産物およびHDAC9a転写産物は低レベルであった(図6B)。別のPCR産物をやはり膵臓のcDNAから増幅し；この産物はHDAC9およびHDAC9aより得られる予測産物とは異なっていた(図6B)。種々のサイズの転写産物の同一性は未知である。
【０１９８】
HDAC9およびHDAC9aはヒストンデアセチラーゼ活性を有する
HDAC9はHDAC4に対する配列相同性に基づいて命名されている(図3A〜3C）。HDAC9およびHDAC9aがHDAC活性を有するかどうかを調べるために、HDAC酵素試験を抗FLAG免疫沈降HDAC9−FLAGおよびHDAC9a−FLAGを用いて行った。
【０１９９】
C末端FLAG-タグを有するHDAC9(HDAC9−FLAG)およびHDAC9a(HDAC9a−FLAG)の発現ベクターを、pFLAG-CMV-5bベクター（Sigma）、ならびにHDAC9およびHDAC9aのPCR増幅されたコード領域を用いてFLAG-タグとインフレームで構築し、pFLAG-CMV-5b-HDAC9(プラスミドVR1)およびpFLAG-CMV-5b-HDAC9a(プラスミドVR2)を形成した。全ての構築物をDNA配列決定により確認した。
【０２００】
ヒト腎臓293T細胞のトランスフェクション、抗FLAG  M2アガロース（Sigma）を用いた免疫沈降、ウエスタンブロット分析およびデュアルルシフェラーゼ試験を本質的にZhouら(Proc.Natl. Acad. Sci. USA, 97:1056-1061(2000))に以前記載されたように行った。慨すれば、細胞(American TypeCulture Collection)を5％CO2雰囲気下37℃で10％(vol/vol)FBS添加DME HG培地(GIBCO/BRL)中で培養した。一過性のトランスフェクションを製造元の取扱説明書に従ってリポフェクタミン(GIBCO/BRL)またはFugene6(Roche Molecular Biochemicals)を用いて行なった。細胞をトランスフェクション24〜48時間後に採取し、1ml当たり5x 107細胞でIP細胞溶解緩衝液(50mMTris・HCl, pH7.5/120mM NaCl/5mM EDTA/0.5% NP-40)中で細胞溶解した。抗-FLAG M2-アガロース(Sigma,St.Louis, MO)を用いた免疫沈降を製造元の取扱説明書に従って行なった。免疫沈降されたタンパク質をFLAG-ペプチドを用いてアガロースビーズから遊離させ、直接HDAC酵素活性試験に用いるか、または、SDS/PAGE上で分割してウエスタンブロットに付した。抗-FLAG抗体はSigma(St.Louis,MO)より購入した。ウエスタンブロット分析は標準的な方法を用いて行なった。
【０２０１】
HDAC9およびHDAC9aの酵素活性を、製造元の取扱説明書に従って基質としてのアセチル化リジン側鎖および免疫沈降されたHDAC9-FLAGおよびHDAC9a-FLAGポリペプチドを含むFLUORDE LYSTMを用いるHDAC蛍光活性試験/薬物検出キットAK-500(BIOMOL Research Laboratories)および455nmのカットオフフィルターを用いた励起波長355nmおよび発光波長460nmにおけるSOFTmax（登録商標）PROシステム(MolecularDevices)を使用したSPECTRAmax（登録商標）GEMINI XSマイクロプレート分光蛍光計を用いて試験した。慨すれば、HDAC9-FLAGおよびHDAC9a-FLAGを96穴プレート中、室温で一晩、基質と共にインキュベートした。FluorDe LysTMDeveloperを添加することにより反応を停止し、試料を蛍光計で読み取った。
【０２０２】
図7に示すとおり、HDAC9-FLAGおよびHDAC9a-FLAGはともに、FLUOR DE LYSTMのアセチル化リジンを脱アセチル化し、HDAC9とHDAC9aの活性は同等であった。HDAC9およびHDAC9aの活性を調べるために、室温で15分間TSAと共にHDAC9-FLAGおよびHDAC9a-FLAGを予備インキュベートすることにより、TSAを用いた阻害試験を行なった。次に上記したとおり試験した。図7に示すとおり、TSAはHDAC9およびHDAC9aのデアセチラーゼ活性を阻害した。図7に示すインセットゲルは試験で用いたタンパク質の量を示している。強力なHDAC阻害剤であるSAHA(Richonら、Proc.Natl. Acad. Sci. USA, 95:3003-3007(1998))もまたHDAC9-FLAGおよびHDAC9a-FLAGのヒストンデアセチラーゼ活性を完全に阻害した。HDAC9およびHDAC9aのHADC活性は今回試験した条件下において同等の量のタンパク質を使用した場合、HDAC4のデアセチラーゼ活性より約10倍低かった。
【０２０３】
HDAC9およびHDAC9aの酵素活性をまた、基質としてネズミ赤白血病から単離した3H-ヒストンを用いるHDAC酵素測定法により測定した。この試験は本質的にRichonら(Proc.Natl. Acad. Sci. USA, 95:3003-3007(1998))に記載されたように実施した。慨すれば、HDAC9-FLAGおよびHDAC9a-FLAGを37℃で一晩3H-ヒストンと共にインキュベートした。1MHCl/0.1酢酸を添加することにより反応を停止した。放出された3H-酢酸を酢酸エチルで抽出し、シンチレーション計数により定量した。阻害試験のためには、免疫沈降した複合体を4℃で30分間種々のHDAC阻害剤と共に予備インキュベートした。
【０２０４】
図8に示すとおりHDAC9a-FLAGは3H-アセチルヒストンを脱アセチル化した。強力なHDAC阻害剤であるSAHAもHDAC9a-FLAGのヒストンデアセチラーゼ活性を完全に阻害した。TSAもHDAC9aのデアセチラーゼ活性を阻害した。HDAC9を酵素供給源として使用した場合同様の結果が得られた。
【０２０５】
HDAC9およびHDAC9aはMEF2媒介転写を抑制する
HDRPのアフリカツメガエル相同体であるMITRはMEF2相互作用転写抑制因子(Sparrowら、EMBO J.18:5085-5098(1999))として同定され、そしてマウスHDRPもまたMEF2媒介転写と相互作用を示し、それを抑制する(Zhangら、J.Biol. Chem. 276:35-39(2001))。本発明者等は、HDAC9-FLAGおよびHDAC9a-FLAGがMEF2と相互作用を示すかどうか先ず試験した。293細胞をベクター、HDAC9-FLAGまたはHDAC9a-FLAGでトランスフェクトした。その後細胞を溶解し、HDAC9-FLAGおよびHDAC9a-FLAGタンパク質を抗-FLAG抗体を用いて免疫沈降した。免疫沈降したタンパク質のウエスタンブロット解析を、ブロットをプローブするために抗-MEF2抗体を用いながら行なった。図9Aに示すとおり、HDAC9およびHDAC9aは共に293T細胞中のMEF2に対して相互作用を示した。
【０２０６】
次にHDAC9およびHDAC9aがMEF2媒介転写を抑制するかどうか調べた。この測定は以下のとおり行なった。p3XMEF2-ルシフェラーゼレポーター遺伝子(100ng)およびベクターpRL-TK(Promega)(5ng)をMEF2C(pCMV-MEF2C、100ng)の非存在下(pcDNA3エンプティーベクター)または存在下に293T細胞に共トランスフェクトした。HDAC9-F(pFLAG-HDAC9の1ng,10ngまたは100ng；pFLAG-HDAC9およびHDAC9-FLAGは異なる構築物であり、FLAG配列がHDAC9ヌクレオチドの逆側の末端に位置するが、機能的には同等である)またはHDAC9a-F(pFLAG-HDAC9aの1ng,10ngまたは100ng；pFLAG-HDAC9aおよびHDAC9a-FLAGは異なる構築物であり、FLAG配列がHDAC9aヌクレオチドの逆側の末端に位置するが、機能的には同等である)をMEF2Cベクターと共に実験群のサブセットに含めた。pFLAGエンプティーベクターを用いて各トランスフェクションでDNAを等しい量にあわせた。トランスフェクション後24〜36時間に細胞を回収し、製造元の取扱説明書に従ってPromegaより入手したDual-LuciferaseTMReporter Assay Systemを用いてルシフェラーゼ活性を測定した。ホタルルシフェラーゼ活性は先ず共トランスフェクトしたRenillaルシフェラーゼ活性(pRL-TKベクターによりコードされる)に対して正規化し、MEF2C単独でトランスフェクトした細胞に関するルシフェラーゼ活性の値を1に設定した。MEF2Cは転写のベースレベルの30倍超まで転写を活性化した。図9Bに示すとおり、HDAC9-FLAGおよびHDAC9a-FLAGは用量依存様式でMEF2C媒介転写活性化を抑制し、HDAC9およびHDAC9aの両方とも100ngの用量で活性化を完全に消失させた。MEF2C媒介転写に対するHDAC9およびHDAC9aの転写抑制作用は、TKプロモーターを含むトランスフェクション効率のために共トランスフェクトされたレポーター遺伝子がHDAC9またはHDAC9aにより抑制されなかったことから、特異的な作用であるといえる。
【０２０７】
本明細書に記載したものは新しいクラスIIのHDACであるHDAC9と命名されたものの同定および特徴である。HDAC9は幾つかのオルタナティブスプライシングされたイソフォームを有し、その1つは以前に同定されたHDRPである(Zhouら、Proc.Natl. Acad. Sci. USA, 97:1056-1061(2000))。HDAC9およびHDAC9aはHDAC活性を有しており、これはHDAC4よりも低値の特異的酵素活性を有していると考えられる。特定の理論に制約されることを望まないが、本質的な補因子は免疫沈降中に消失するか、293T細胞中に存在せず(例えば転移関連タンパク質2は触媒活性を有するHDAC1の組み立てのために必須である(Zhangら、Genes Dev.13:1924-1935(1999))、使用した基質はその天然の基質ではないか、または、FLAGタグがタンパク質の折りたたみを妨害した可能性もある。
【０２０８】
HDAC1またはHDAC9のいずれかに由来するHDACドメインを用いたヒトゲノムの検索により、現在完了しているヒトゲノム配列中で合計10個のHDACが同定され、その数は図10において模式的に示されている。HDAC1、2、3、8、4、5、6、7、9および9aは全てHDACドメインを有する。やはり図10に模式的に示されているHDRPは触媒ドメインを有していない。
【０２０９】
本明細書中に記載した全ての参考文献は、その全体が参照により組み込まれる。本発明はその好ましい態様を参照しながら特に示し、記載したが、当業者の知るとおり、形態および詳細における種々の変更が請求項に規定される本発明の精神および範囲から逸脱することなくなされうる。
【図面の簡単な説明】
【０２１０】
【図１】図１は図1A〜1Oを参照する順序の模式図である。  図1A〜1CはHDAC9（配列番号1）のcDNA配列を示す。HDAC9配列中の矢印および数字はエクソンを示す。配列のうち四角で囲んだ部分はHDACドメインを示す。  図1D〜1GはHDAC9a（配列番号3）のcDNA配列を示す。HDAC9a配列中の矢印および数字はエクソンを示す。配列のうち四角で囲んだ部分はHDACドメインを示す。  図1H〜1IはHDRP(ΔNLS)（配列番号9）のcDNA配列を示す。  図1J〜1LはHDAC9(ΔNLS)（配列番号5）のcDNA配列を示す。  図1M〜1OはHDAC9a(ΔNLS)（配列番号7）のcDNA配列を示す。
【図２】図２は図2A〜2Eを参照する順序の模式図である。  図2AはHDAC9（配列番号2）のアミノ酸配列を示す。  図2BはHDAC9a（配列番号4）のアミノ酸配列を示す。  図2CはHDAC9(ΔNLS)（配列番号6）のアミノ酸配列を示す。  図2DはHDAC9a(ΔNLS)（配列番号8）のアミノ酸配列を示す。  図2EはHDRP(ΔNLS)（配列番号10）のアミノ酸配列を示す。
【図３】図３は図3A〜3Cを参照する順序の模式図である。  図3A〜3CはDHRP(配列番号11)、HDAC9(配列番号2)、HDAC9a(配列番号4)およびHDAC4(配列番号12)ポリペプチドのアミノ酸配列のアラインメントを示している。HDAC9（GenBank受託番号：AY032737；配列番号2）およびHDAC9a（GenBank受託番号：AY032738；配列番号4）はHDRP（GenBank受託番号：BAA34464；配列番号11）およびHDAC4（GenBank受託番号：NP_006028;配列番号12）とともににアラインメントされる。全てのタンパク質において同一である残基は実線の箱で囲んである。類似の残基は破線で囲んである。
【図４】図４はヒトHDAC9遺伝子の構造の模式図である。斜線部分はイソフォームHDRP、HDAC9aおよびHDAC9中に存在するエクソンを示す。線はイントロンである。破線はより大きいイントロンを示す（塩基対サイズは上部に示す）。5'非翻訳領域cDNAおよびコード領域のcDNAをも本図に示す。エクソン1〜12はポリペプチドの非触媒ドメインをコードし、エクソン14〜21はポリペプチドのヒストンデアセチラーゼ触媒ドメインをコードし、これによりポリペプチドにデアセチラーゼ活性を付与する。
【図５】図５は図5A〜5Dを参照する順序の模式図である。  図5A〜5Dは、本発明のHDAC9、HDAC9a、HDAC9(ΔNLS)、HDAC9a(ΔNLS)およびHDRP(ΔNLS)の種々のイソフォームにおいて発現されている全エクソンを含むHDAC9の核酸配列を示す（配列番号13）。
【図６】図6Aは、HDAC9およびHDAC9aの両方を認識するcDNAプローブを用いたHDAC9のmRNA発現を測定するためにプローブした複数のヒト組織のノーザンブロットのスキャン画像である。試験した組織はレーン１が心臓；レーン2が脳；レーン3が胎盤；レーン4が肺；レーン5が肝臓；レーン6が骨格筋；レーン7が腎臓；そしてレーン8が膵臓である。キロ塩基（kb）単位のRNAサイズマーカーの位置はブロットの左側に示す。  図6Bは図6Aのノーザンブロットにおいて調べたものと同じ組織内のHDAC9およびHDAC9aのmRNAの分布を調べるための該組織由来のmRNAのRT‐PCR分析の結果を示す電気泳動ゲルのスキャン画像である。PCR産物をアガロースゲル電気泳動で分割し、UV光下で臭化エチジウムにより可視化した。1kbのDNAラダーをゲルの両側で泳動し、そのサイズ（kb）はゲルの左側に示した。右側には、HDAC9およびHDAC9aについて予測される産物をそれぞれ9および9aとして示した。
【図７】図７は、1μMTSAの存在下および非存在下に基質としてFLUORDELYS（登録商標）を用いながら蛍光単位として測定した場合の、ベクター対照、HDAC9-FLAGおよびHDAC9a-FLAGでトランスフェクトした293T細胞から単離したHDAC抗−FLAG免疫沈降タンパク質のHDAC酵素活性のグラフである。結果は3回の独立した試験の平均として示す。さしこみ図は試験で用いたタンパク質の量を示す抗−FLAGウエスタンブロットのスキャン画像である。Vはベクター対照；9はHDAC9-FLAG；そして9aはHDAC9a-FLAGを示す。
【図８】図８は、2μMのSAHAの存在下または非存在下に3H-ヒストンから放出された3H-酢酸により測定した場合の、ベクター対象およびHDAC9a-FLAG(2μMのSAHA投与で処置したかまたは未処置）をトランスフェクトした293T細胞から単離したHDAC抗−FLAG免疫沈降タンパク質のHDAC酵素活性のグラフである。ベクター対照；HDAC9a、HDAC9a-FLAG；およびHDAC9a+、HDAC9a-FLAG+SAHA。
【図９】図9Aは、293T全細胞溶解物、ならびにMEF2およびFLAGに対する抗体を用いたベクター、HDAC9-FLAGおよびHDAC9a-FLAGでトランスフェクトした293T細胞由来の抗-FLAG免疫沈降物のウエスタンブロットのスキャン画像を示す。上側が抗-MEF2ウエスタン；下側が抗-FLAGウエスタンである。Lは293T全細胞溶解物；Vはベクター対照IP；9はHDAC9-FLAGIP；9aはHDAC9a-FLAG IPである。  図9BはpcDNA3エンプティーベクター(-)、pCMV-MEF2Cおよび/またはpFLAG-HDAC9またはpFLAG-HDAC9aをコードするベクターの存在下または非存在下のp3XMEF2-Lucの転写レベルを示すグラフである。p3XMEF2-Luc(100ng)およびpRL-TK(5ng)を、pFLAG-HDAC9またはpFLAG-HDAC9aの記載量とともにpcDNA3エンプティーベクター(-)またはpCMV-MEF2C(100ng)(+)を用いて293T細胞にトランスフェクトした。pFLAGエンプティーベクターは各トランスフェクションでDNAを等量に調節するために用いた。ホタルルシフェラーゼ活性を先ず同時トランスフェクトRenillaルシフェラーゼ活性に標準化し、そして、MEF2Cのみに対する数値を1に設定した。結果は3回の独立したトランスフェクションの平均±標準偏差として記載した。
【図１０】図10はヒト非Sir2ファミリーHDACおよびHDRPのHDACドメインの模式図である。枠で囲んだ部分はヒストンデアセチラーゼ（HDAC）ドメインを示す。
【図１１】図11は図11A〜11Fを参照する順序の模式図である。  図11A〜11FはベクターpFLAG-CMV-5b-HDAC9(VR1)(配列番号14）のヌクレオチド配列を示す。小文字はベクター骨格、大文字はHDAC9配列である。「Acc」は翻訳開始のためのHDAC9配列の始めに付した。
【図１２】図12は図12-1〜12-66を参照する順序の模式図である。  図12-1〜12-66は記載した制限酵素部位を有するベクターpFLAG-CMV-5b-HDAC9a(VR2)のヌクレオチド配列を示す(配列番号14）。
【図１３】図13は図13A〜13Eを参照する順序の模式図である。  図13A〜13EはベクターpFLAG-CMV-5b-HDAC9a(VR2)(配列番号15）のヌクレオチド配列を示す。小文字はベクター骨格、大文字はHDAC9a配列である。「Acc」は翻訳開始のためのHDAC9a配列の始めに付した。
【図１４】図14は図14-1〜14-61を参照する順序の模式図である。  図14-1〜14-61は記載した制限酵素部位を有するpFLAG-CMV-5b-HDAC9a(VR2)のヌクレオチド配列を示す(配列番号15）。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図１−３】
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【図１−４】
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【図１−５】
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【図１−６】
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【図１−７】
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【図１−８】
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【図１−９】
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【図１−１０】
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【図１−１１】
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【図１−１２】
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【図１−１３】
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【図１−１４】
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【図１−１５】
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【図１−１６】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図２−３】
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【図２−４】
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【図２−５】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図３−３】
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【図４】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図５−３】
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【図５−４】
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【図５−５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１−１】
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【図１１−２】
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【図１１−３】
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【図１１−４】
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【図１１−５】
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【図１１−６】
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【図１２−１】
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【図１２−２】
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【図１２−３】
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【図１２−４】
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【図１２−５】
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【図１２−６】
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【図１２−７】
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【図１２−８】
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【図１２−９】
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【図１２−１０】
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【図１２−１１】
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【図１２−１２】
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【図１２−１３】
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【図１２−１４】
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【図１２−１５】
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【図１２−１６】
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【図１２−１７】
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【図１２−１８】
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【図１２−１９】
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【図１２−２０】
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【図１２−２１】
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【図１２−２２】
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【図１２−２３】
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【図１２−２４】
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【図１２−２５】
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【図１２−２６】
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【図１２−２７】
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【図１２−２８】
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【図１２−２９】
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【図１２−３０】
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【図１２−３１】
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【図１２−３２】
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【図１２−３３】
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【図１２−３４】
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【図１２−３５】
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【図１２−３６】
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【図１２−３７】
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【図１２−３８】
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【図１２−３９】
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【図１２−４０】
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【図１２−４１】
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【図１２−４２】
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【図１２−４３】
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【図１２−４４】
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【図１２−４５】
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【図１２−４６】
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【図１２−４７】
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【図１２−４８】
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【図１２−４９】
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【図１２−５０】
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【図１２−５１】
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【図１２−５２】
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【図１２−５３】
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【図１２−５４】
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【図１２−５５】
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【図１２−５６】
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【図１２−５７】
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【図１２−５８】
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【図１２−５９】
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【図１２−６０】
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【図１２−６１】
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【図１２−６２】
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【図１２−６３】
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【図１２−６４】
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【図１２−６５】
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【図１２−６６】
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【図１２−６７】
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【図１３−１】
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【図１３−２】
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【図１３−３】
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【図１３−４】
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【図１３−５】
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【図１４−１】
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【図１４−２】
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【図１４−３】
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【図１４−４】
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【図１４−５】
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【図１４−６】
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【図１４−７】
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【図１４−８】
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【図１４−９】
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【図１４−１０】
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【図１４−１１】
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【図１４−１２】
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【図１４−１３】
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【図１４−１４】
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【図１４−１５】
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【図１４−１６】
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【図１４−１７】
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【図１４−１８】
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【図１４−１９】
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【図１４−２０】
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【図１４−２１】
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【図１４−２２】
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【図１４−２３】
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【図１４−２４】
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【図１４−２５】
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【図１４−２６】
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【図１４−２７】
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【図１４−２８】
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【図１４−２９】
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【図１４−３０】
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【図１４−３１】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004532647.tif 000489
【国際調査報告】
2004532647.tif 000490
2004532647.tif 000491
2004532647.tif 000492