(57)【要約】本発明は配列番号１の１〜３４２のアミノ酸を有するアミノ酸配列又は配列番号１、配列番号２、配列番号３又は配列番号４から選択されるアミノ酸配列を有することを特徴とするカルパインプロテアーゼ１２（Ｃａｐｎ１２）並びにその機能的類似体、これをコードする核酸；これらのコーディング配列を有する組み換えベクター；それでトランスフェクションされた微生物；Ｃａｐｎ１２の組み換えによる製造のための方法；Ｃａｐｎ１２及びコレをコードする核酸の種々の使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１のアミノ酸１〜３４２を有するアミノ酸配列を有するカルパインプロテアーゼ１２（Ｃａｐｎ１２）並びにその機能的等価物。
【請求項２】
配列番号１、配列番号２、配列番号３又は配列番号４から選択されるアミノ酸配列を有する、請求項１記載のＣａｐｎ１２並びにその機能的等価物。
【請求項３】
システイン−プロテアーゼ活性を有する、請求項１又は２記載のＣａｐｎ１２。
【請求項４】
請求項１から３までのいずれか１項記載の少なくとも１種のＣａｐｎ１２を有する、カルパインタンパク質。
【請求項５】
請求項１から３までのいずれか１項記載のＣａｐｎ１２をコードするポリヌクレオチド並びにその機能的等価物及びそれとハイブリダイズ可能な又はそれに相補的なポリヌクレオチド。
【請求項６】
配列番号５、配列番号６、配列番号７又は配列番号８から選択される核酸配列を有する、請求項５記載のポリヌクレオチド。
【請求項７】
請求項５又は６記載のポリヌクレオチドと機能的に結合された少なくとも１つの調節核酸配列を有する、発現カセット。
【請求項８】
請求項５又は６記載のポリヌクレオチド又は請求項７記載の発現カセットを有する、組み換えベクター。
【請求項９】
請求項８記載の少なくとも１種の組み換えベクターを有する、微生物。
【請求項１０】
請求項１から３までのいずれか１項記載のＣａｐｎ１２を、Ｃａｐｎ１２を生産する微生物を培養し、かつＣａｐｎ１２を培地から単離して製造する方法。
【請求項１１】
請求項１から３までのいずれか１項記載のＣａｐｎ１２又は請求項４記載のカルパインタンパク質の、システインプロテアーゼとしての使用。
【請求項１２】
請求項１から３までのいずれか１項記載のＣａｐｎ１２、請求項４記載のカルパインタンパク質又は請求項８記載の組み換えベクターを有する医薬品。
【請求項１３】
Ｃａｐｎ１２の不十分な発現と関連がある疾患又は疾患状態の治療のための医薬品の製造のための、請求項１から３までのいずれか１項記載のＣａｐｎ１２、請求項４記載のカルパインタンパク質又は請求項８記載の組み換えベクターの使用。
【請求項１４】
カルパイン−プロテアーゼエフェクターのスクリーニングのための、請求項１から３までのいずれか１項記載のＣａｐｎ１２又は請求項４記載のカルパインタンパク質の使用。
【請求項１５】
請求項１から３までのいずれか１項記載のＣａｐｎ１２に特異性を有する免疫グロブリン。
【請求項１６】
Ｃａｐｎ１２発現に関連がある疾患又は疾患状態の診断のための、請求項１５記載の免疫グロブリン又はＣａｐｎ１２に結合する分子の使用。
【請求項１７】
Ｃａｐｎ１２発現に関連がある疾患又は疾患状態の診断のための、請求項５又は６記載のポリヌクレオチドの使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明はカルパインプロテアーゼ１２の名称を有する新規のカルパインプロテアーゼ及びそれらの機能的類似体（以下にＣａｐｎ１２と呼称する）；それをコードする核酸；これをコードする配列を有する組み換えベクター；Ｃａｐｎ１２の組換による製造のための方法；並びにＣａｐｎ１２及びこれらをコードする核酸の種々の使用に関する。
【０００２】
カルパインは細胞質性のシステインプロテアーゼのファミリーである。これらの分類されたカルパインは、アイソフォーム特異的な大きなサブユニット（８０ｋＤａ）及び不変の小さなサブユニット（３０ｋＤａ）からなり、これはＣａｐｎ４と呼ばれる。典型的なカルパインの大きなサブユニットはプロテアーゼ活性を有するドメイン及びＣ−末端のカルシウムを結合できるカルモジュリン様ドメインを有する４ドメイン構造を有する。しかしながら最近では、プロテアーゼの活性中心の特徴を欠損し（Ｃａｐｎ６；Ｄｅａｒ ｅｔ ａｌ．， １９９７）、かつ／又はできる限りカルシウムを結合しない代替のＣ−末端ドメインを有する（Ｃａｐｎ５、Ｃａｐｎ６、Ｃａｐｎ７、Ｃａｐｎ８；Ｄｅａｒ ｅｔ ａｌ．， １９９７； Ｂｒａｕｎ ｅｔ ａｌ．， １９９９； Ｆｒａｎｚ ｅｔ ａｌ．， １９９９）大きなカルパインサブユニットの多くの不定形のホニュウ類動物ホモログが見出された。現段階で公知の、ホニュウ類動物−カルパインの遺伝子ファミリーのメンバーの概要はインターネットにおいて入手できる（ｈｔｔｐ：／／Ａｇ．Ａｒｉｚｏｎａ．Ｅｄｕ／ｃａｌｐａｉｎｓ）。
【０００３】
カルパインの生理学的役割は明らかではない。カルパインは多数の基質を開裂し（Ｃａｒａｆｏｌｉ ｕｎｄ Ｍｏｌｉｎａｒｉ， １９９８）、かつアポトーシス（Ｗａｎｇ， ２０００）、細胞分裂（Ｍｅｌｌｇｒｅｎ，１９９７）、インテグリン細胞骨格の相互作用（Ｓｃｈｏｅｎｗａｅｌｄｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９９７）及びシナプス可塑性（Ｃｈａｎ ｕｎｄ Ｍａｔｔｓｏｎ， １９９９）を含めた多数のプロセスとの関連がある。更にこれらのカルパインは多くの病理学的な疾患状態、例えばアルツハイマー、白内障、脱髄、心臓虚血、炎症及び脳損傷に関連している（概要文献：Ｃａｒａｆｏｌｉ ｕｎｄ Ｍｏｌｉｎａｒｉ， １９９８； Ｓｏｒｉｍａｃｈｉ ｅｔ ａｌ．， １９９７； Ｗａｎｇ ｕｎｄ Ｙｕｅｎ， １９９７）。Ｃａｐｎ３遺伝子における突然変異は骨盤帯筋ジストロフィー タイプ２Ａの要因となる（Ｒｉｃｈａｒｄ ｅｔ ａｌ．， １９９５）。
【０００４】
カルパインの多岐にわたる生理学的及び病理学的機能に基づいて、大きなカルパインサブユニットの遺伝子ファミリーの新規のホモログを準備することが課題である。それによって、カルパイン及びその基質又はそれらに作用する物質に関連している疾患状態の診断、治療及び／又は予防において使用可能な新規の作用物質もしくは新規の作用物質ターゲットを見出すことができ、又は開発することができる。前記課題は、意想外にも新規のカルパインプロテアーゼ、カルパインプロテアーゼ１２（Ｃａｐｎ１２）及びそれらの機能的等価物を準備することによって解決された。
【０００５】
Ｃａｐｎ１２は、配列番号１のアミノ酸１〜３４２を有するアミノ酸配列を有することを特徴としている。本発明の対象は、これらの部分配列の機能的等価物でもある。
【０００６】
それらの有利な変異体は、これらが配列番号１、配列番号２、配列番号３又は配列番号４から選択されるアミノ酸配列を有することを特徴としている。配列番号１はスプライス変異体Ｃａｐｎ１２Ａのアミノ酸配列を表し、配列番号２はスプライス変異体Ｃａｐｎ１２Ｂのアミノ酸配列を表し、配列番号３はスプライス変異体Ｃａｐｎ１２Ｃのアミノ酸配列を表し、かつ配列番号４はマウスＥＳＴデータバンクのクローン９１４４１３からのＣａｐｎ１２のアミノ酸配列を表す。この場合、配列番号１〜４のアミノ酸配列はアミノ酸１〜３４２のＮ−末端断片において互いに同一である。スプライス変異体Ｃａｐｎ１２Ａに相応して予測されるタンパク質は７２０個のアミノ酸及び８０．５ｋＤａの分子量を有する。
【０００７】
本発明の対象は、Ｃａｐｎ１２もしくは具体的に開示されたアミノ酸配列の機能的等価物でもある。機能的等価物は、具体的な配列から誘導でき、かつ該配列と比較して１つ以上のアミノ酸が置換、欠失、逆位又は付加されており、システインプロテアーゼ活性及び／又はＣａｐｎ１２の少なくとも１つの他の特性に実質的に影響がないアミノ酸配列を含む。他のＣａｐｎ１２特性は、後の節で記載される。本発明によれば、タンパク質溶解による消化、ペプチドシンテーゼ又は組み換えＤＮＡ技術によって製造できるＣａｐｎ１２に特徴的な部分配列又はＣａｐｎ１２の断片でもある。これらは、例えばモノクローナル抗体又はポリクローナル抗体の製造のために使用できる。
【０００８】
具体的に開示されたアミノ酸配列はマウス−ＥＳＴデータバンクから規定されるＣａｐｎ１２のスプライス変異体のアミノ酸配列を表している。しかしながら本発明の対象は真核生物種、すなわち無脊椎動物及び脊椎動物、特にホニュウ類動物、例えばラット、ネコ、イヌ、ブタ、ヒツジ、ウシ、ウマ、サル及び、特に有利にはヒトの全てのＣａｐｎ１２ホモログ及び他の天然に存在する変異体でもある。本発明によれば、発生特異的及び器官特異的もしくは組織特異的に発現されたＣａｐｎ１２形及び人工的に作成された、前記の構造的かつ／又は機能的な特性を有するホモログも含まれる。
【０００９】
本発明によるＣａｐｎ１２は、特に、これらがシステイン−プロテアーゼ活性を有することを特徴とする。これらは、そのアミノ酸配列においてアミノ酸Ｃｙｓ、Ｈｉｓ及びＡｓｎを有し（スプライス変異体Ｃａｐｎ１２Ａ、Ｂ及びＣにおいて：Ｃｙｓ１０５、Ｈｉｓ２５９及びＡｓｎ２８３）、これらはシステイン−プロテアーゼの活性中心のために特徴的であり、かつその機能に関して重要である。スプライス変異体Ｃａｐｎ１２Ａは更に顕著に酸性の領域及びカルモジュリン様のおそらくＣａ２＋を結合する領域を有する。
【００１０】
本発明によるＣａｐｎ１２は更に、これらをコードするマウスの遺伝子が染色体７でマーカーＤ７Ｍｉｔ７２（１０．４ｃＭ）及びＤ７Ｍｉｔ２６７（１１．０ｃＭ）の間に局在していることを特徴としている。
【００１１】
更に本発明によるＣａｐｎ１２は、これらが、例えばマウスにおいて皮膚の毛嚢の皮質発現されることを特徴としている。
【００１２】
更に本発明によるＣａｐｎ１２は、これらが毛周期の発育段階において発現されることを特徴としている。
【００１３】
本発明の対象は、これらが少なくとも１種の本発明によるＣａｐｎ１２を有することを特徴とするカルパイン−タンパク質である。有利にはかかるカルパインタンパク質はＣａｐｎ１２の他に大きなサブユニットとして更に小さなカルパインタンパク質サブユニットとしてのＣａｐｎ４を有する。更に他のタンパク質サブユニット、例えば調節サブユニット又は定義された細胞区画におけるタンパク質の局在化を促すサブユニットを含有していてよい。
【００１４】
更に本発明は、本発明によるＣａｐｎ１２をコードするポリヌクレオチド、並びにそれらの機能的等価物及びそれとハイブリダイズ可能な又はそれに相補的な、二本鎖及び一本鎖のＤＮＡ配列及びＲＮＡ配列を含むポリヌクレオチドを含む。これらのポリヌクレオチドはゲノムライブラリー又はｃＤＮＡライブラリーの精査において探し出すことができ、かつ場合により該ライブラリーから適当なプライマーを用いてＰＣＲによって増幅させ、かつ引き続き例えば適当な適当なプローブで単離できる。他の可能性は、適当な微生物の本発明によるポリヌクレオチド又はベクターによる形質転換、微生物及びポリヌクレオチドの増大及び引き続きの単離によって提供される。更に本発明によるポリヌクレオチドは化学的な経路でも合成できる。
【００１５】
本発明の対象はまた配列番号５、配列番号６、配列番号７又は配列番号８から選択される核酸配列を有するポリヌクレオチドである。配列番号５はスプライス変異体Ｃａｐｎ１２ＡのｃＤＮＡの核酸配列を表し、配列番号６はＣａｐｎ１２ＢのｃＤＮＡの核酸配列を表し、配列番号７はＣａｐｎ１２ＣのｃＤＮＡの核酸配列を表し、かつ配列番号８は全てのエキソン配列及びイントロン配列を含むマウスのＣａｐｎ１２のゲノム核酸配列を表す。マウスのＣａｐｎ１２の予測されるゲノム配列は２１個のエキソン及び１３１１６塩基対の１つのゲノム断片を含む。
【００１６】
本発明によるポリヌクレオチドの機能的等価物は、遺伝子コードの縮重によって導かれる配列及びサイレントのヌクレオチド置換（すなわち得られたアミノ酸配列に変化無し）及び保存的ヌクレオチド置換（すなわち当該アミノ酸を同じ電荷、大きさ、極性及び／又は溶解性のアミノ酸と交換する）を含む。本発明によるポリヌクレオチドの機能的等価物は従ってヌクレオチド置換、ヌクレオチド欠失、ヌクレオチド逆位又はヌクレオチド付加によって変更された配列を有するが、同様に機能的に等価なＣａｐｎ１２、例えば同じ又は匹敵するシステイン−プロテアーゼ活性を有するＣａｐｎ１２をコードしている。特に、本発明により適当なポリヌクレオチドは、Ｃａｐｎ１２の特徴的なアミノ酸配列をコードする部分配列の少なくとも１つを有する。
【００１７】
本発明の対象は、本発明によるポリヌクレオチドとハイブリダイズ可能であるかもしくはこれと相補的でありかつ、例えばＲＴ−ＰＣＲ又はＰＣＲによる増幅のために使用できるプライマー配列 配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７及び配列番号１８である。
【００１８】
ポリヌクレオチドにハイブリダイズできる特性とは、ポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドがストリンジェントな条件下にほぼ相補的な配列に結合でき、その条件下に非相補的なパートナーの間に非特異的な結合が起こらない能力を表す。このために、これらの配列は７０〜１００％、有利には９０〜１００％まで相補的でなければならない。相補的な配列の特異的に相互に結合できる特性は、例えばノーザンブロット技術又はサザンブロット技術において、又はＰＣＲ又はＲＴ−ＰＣＲにおけるプライマー結合の際に利用できる。通常は３０塩基対の長さまでののオリゴヌクレオチドが使用される。ストリンジェントな条件とは、例えばノーザンブロット技術においては５０〜７０℃、有利には６０〜６５℃に温められた洗浄液、例えば０．１％ＳＤＳを有する０．１×ＳＳＣバッファー（２０×ＳＳＣ：３ＭのＮａＣｌ、０．３Ｍのクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）を非特異的にハイブリダイズしたｃＤＮＡプローブ又はオリゴヌクレオチドの溶出のために使用することを表す。この場合には、前記で述べたように、高い規模で相補的な核酸のみが互いに結合したままになる。
【００１９】
本発明の対象は、少なくとも１つの調節核酸配列と機能的に結合している本発明による少なくとも１つのポリヌクレオチドを有する発現カセットでもある。有利には本発明によるポリヌクレオチドの５′鎖上流にプロモーター配列があり、かつ前記のようにＣａｐｎ１２の制御された発現を可能にする。特に有利には本発明によるポリヌクレオチドの３′鎖下流にターミネーター配列並びに場合により他の慣用の調節エレメントを有し、特にＣａｐｎ１２をコードする配列とそれぞれ機能的に結合されている。
【００２０】
機能的な結合とは、調節配列及びコーディング配列、例えばプロモーター、コーディング配列、ターミネーター及び場合により他の調節エレメントが、調節エレメントのそれぞれがコーディング配列の発現の前、間又は後にその機能を規定のように満たすように連続的に配置されていることを表す。他の機能的に結合可能な配列のための例は、ターゲティング配列、翻訳増強因子、エンハンサー、ポリアデニル化シグナルなどである。役に立つ調節エレメントは選択可能なマーカー、増幅シグナル、複製起点なども含む。
【００２１】
人工的な調節配列の他に、天然の調節配列が固有の構造遺伝子の前に更に存在してよい。遺伝的改変によって、これらの本来の調節は場合により排除され、かつ遺伝子の発現は増大又は減少される。しかしながら該発現カセットは容易に構成できる、すなわち付加的な調節シグナルを構造遺伝子の前に挿入し、かつその調節を有する本来のプロモーターを取り除かない。その代わりに、例えば本来の調節配列を、調節がもはや行われず、かつ遺伝子発現が増大又は低減されるように突然変異させてよい。これらの核酸配列は１つ以上のコピーで発現カセット中に含まれていてよい。
【００２２】
役立つプロモーターのための例は：ｃｏｓ−プロモーター、ｔａｃ−プロモーター、ｔｒｐ−プロモーター、ｔｅｔ−プロモーター、ｔｒｐ−ｔｅｔ−プロモーター、ｌｐｐ−プロモーター、ｌａｃ−プロモーター、ｌｐｐ−ｌａｃ−プロモーター、ｌａｃＩｑプロモーター、Ｔ７−プロモーター、Ｔ５−プロモーター、Ｔ３−プロモーター、ｇａｌ−プロモーター、ｔｒｃ−プロモーター、ａｒａ−プロモーター、ＳＰ６−プロモーター、λ−ＰＲ−プロモーター又はλ−ＰＬ−プロモーターであり、これらは有利にはグラム陰性細菌中で使用され；並びにグラム陽性プロモーターａｍｙ及びＳＰＯ２、酵母プロモーターＡＤＣ１、ＭＦａ、ＡＣ、Ｐ−６０、ＣＹＣ１、ＧＡＰＤＨ又は植物プロモーターＣａＭＶ／３５Ｓ、ＳＳＵ、ＯＣＳ、ｌｉｂ４、ｕｓｐ、ＳＴＬＳ１、Ｂ３３、ｎｏｓ又はユビキチンプロモーター又はファセオリンプロモーターである。特に有利には誘導可能なプロモーター、例えば光及び、特に温度で誘導可能なプロモーター、例えばＰｒＰｌプロモーターを使用することである。
【００２３】
原則的に、その調節配列を有する全ての天然のプロモーターを使用してよい。更にまた合成プロモーターも有利には使用してよい。
【００２４】
前記の調節配列は、核酸配列の意図された発現及びタンパク質発現を可能にすべきである。このことは、例えば宿主生物に応じて、遺伝子がまず誘導の後に発現又は過剰発現されるか、又は直ちに発現又は過剰発現されることを意味する。発現はこの調節エレメントによって、ベクターを高等生物、例えば動物又は植物中に導入する場合には組織特異的、細胞特異的又は発生特異的に行われる。
【００２５】
調節配列もしくは調節因子はこの場合、有利には発現に正に作用し、かつそれによって発現は増大されるか又は低減される。このように調節エレメントの増強は有利には転写レベルで行われ、その際、強力な転写シグナル、例えばプロモーター及び／又は“エンハンサー”を使用してよい。しかしながらその他に、翻訳の強化も可能であり、その際、例えばｍＲＮＡの安定性が高められる。“エンハンサー”とは、例えば改善されたＲＮＡポリメラーゼ及びＤＮＡの間の相互作用を介して高められた発現を引き起こすＤＮＡ配列を表す。
【００２６】
本発明による発現カセットの製造は、適当なプロモーターと適当なＣａｐｎ１２をコードするポリヌクレオチド並びにターミネーター又はポリアデニル化シグナルとの融合によって行われる。このために、慣用の組み換え技術及びクローニング技術、例えば制限酵素切断部位を介しての挿入が使用され、又はこれらは例えばＴ． Ｍａｎｉａｔｉｓ， Ｅ． Ｆ． Ｆｒｉｔｓｃｈ ｕｎｄ Ｊ． Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， ＮＹ （１９８９）並びにＴ． Ｊ． Ｓｉｌｈａｖｙ， Ｍ． Ｌ． Ｂｅｒｍａｎ ｕｎｄ Ｌ． Ｗ． Ｅｎｑｕｉｓｔ， Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｗｉｔｈ Ｇｅｎｅ Ｆｕｓｉｏｎｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， ＮＹ （１９８４）及びＡｕｓｕｂｅｌ， Ｆ． Ｍ． ｅｔ ａｌ．， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃ． ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ （１９８７）に記載されている。
【００２７】
本発明の対象は真核性又は原核性の宿主の形質転換のための、本発明によるポリヌクレオチド又は本発明による発現カセットを有する組み換えベクターでもある。これらのベクターは、適当な宿主生物中でＣａｐｎ１２の発現を可能にする。これらのベクターは当業者に広く知られており、かつ例えば“Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｖｅｃｔｏｒｓ”（Ｐｏｕｗｅｌｓ Ｐ． Ｈ． ｅｔ ａｌ．， Ｈｒｓｇ， Ｅｌｓｅｖｉｅｒ， Ａｍｓｔｅｒｄａｍ−Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ−Ｏｘｆｏｒｄ， １９８５）から引用できる。ベクターとは、プラスミドの他に全ての別の当業者に公知のベクター、例えばファージ、ウイルス、例えばＳＶ４０、ＣＭＶ、バキュウロウイルス及びアデノウイルス、トランスポゾン、ＩＳ因子、プラスミド、コスミド及び直鎖状又は環状のＤＮＡを意味する。これらのベクターは自律的に宿主生物中で又は染色体により複製される。
【００２８】
本発明の対象は、本発明によるベクターを有する微生物又はＣａｐｎ１２を内在的に発現する微生物でもある。これらは、組み換えＣａｐｎ１２の製造のために使用してよい。有利には、前記の本発明による組み換え発現カセットをベクターの一部として適当な宿主形に導入し、かつ発現させる。この際に、有利には当業者に公知の慣用のクローニング法及びトランスフェクション法、例えば共沈、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、レトロウイルストランスフェクションなどを使用して、前記の核酸をそれぞれの発現系に発現のために導入できる。適当な系は、例えばＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｆ． Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．， Ｈｒｓｇ．， Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ １９９７及びＪ． Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｅ． Ｆ． Ｆｒｉｔｓｃｈ ｕｎｄ Ｔ． Ｍａｎｉａｔｉｓ， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ， ＮＹ（１９８０）に記載されている。
【００２９】
本発明によるベクターでの形質転換のための宿主生物として、原則的に、本発明によるポリヌクレオチド、そのアレル変異体、その機能的等価物又は誘導体の発現を可能にする全ての生物が適当である。宿主生物とは、例えば細菌、菌類、酵母、植物細胞又は動物細胞を意味する。有利な生物は、細菌、例えばエシェリキア属の細菌、例えばエシェリキア コリ、ストレプトマイセス、バシラス又はシュードモナス、真核性微生物、特に酵母、例えばサッカロマイセス セレビシエ、アスペルギルス、高等な動物又は植物からの真核性細胞、例えばＳｆ９又はＣＨＯ細胞である。望ましくは、遺伝子産物を遺伝子導入生物、例えば遺伝子導入動物、例えば特にマウス、ヒツジ又は遺伝子導入植物に導入して発現させてよい。遺伝子導入生物はいわゆるノックアウト動物又は植物であってよく、これらにおいて相当する内因性遺伝子は、例えば突然変異又は部分的又は完全な欠失によってオフになっていてよい。
【００３０】
効果的に形質転換された生物の選択は、同様にベクター又は発現カセット中にも含まれているマーカー遺伝子によって行ってよい。かかるマーカー遺伝子のための例は、抗生物質耐性のための遺伝子及び、形質転換された細胞の着色をもたらす着色反応を触媒する酵素のための遺伝子である。これらを、次いで自動的なセルソーティングによって選択してよい。効果的にベクターで形質転換された、相応の抗生物質耐性（例えばＧ４１８又はハイグロマイシン）を有する微生物は相応の抗生物質含有培地又は栄養培地によって選択することができる。細胞表面に提示されるマーカータンパク質は選択のためにアフィニティークロマトグラフィーを用いて利用できる。
【００３１】
宿主生物及び該生物に適当なベクター、例えばプラスミド、ウイルス又はファージ、例えばＲＮＡポリメラーゼ／プロモーター系を有するプラスミド、ファージλ、μ又は別のテンペレートファージ又はトランスポゾン及び／又は他の有利な調節配列からなる組合せは発現系を形成する。例えば“発現系”という概念はホニュウ類動物細胞、例えばＣＨＯ細胞並びにホニュウ類動物細胞のために適当なベクター、例えばｐｃＤＮＡ３ｎｅｏベクターからなる組合せを意味する。
【００３２】
前記のように、該遺伝子産物は有利には遺伝子導入動物、例えばマウス、ヒツジ又は遺伝子導入植物に発現のために導入してよい。同様に、核酸から導かれるＲＮＡを有する細胞フリーの翻訳系を作成することも可能である。
【００３３】
更に本発明の対象は、本発明によるＣａｐｎ１２の製造方法であり、その際、Ｃａｐｎ１２生産性の微生物を培養し、場合によりＣａｐｎ１２の発現を誘導し、かつ該培養からＣａｐｎ１２を単離する。Ｃａｐｎ１２は従って望ましい場合には大工業的にも製造できる。
【００３４】
微生物は公知方法によって培養及び発酵させることができる。これらの細菌は、例えばＴＢ培地又はＬＢ培地中でかつ２０〜４０℃の温度で、かつ６〜９のｐＨ値において増大させることができる。詳細には適当な培養条件は、例えばＴ． Ｍａｎｉａｔｉｓ， Ｅ． Ｆ． Ｆｒｉｔｓｃｈ ａｎｄ Ｊ． Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， ＮＹ（１９８９）に記載されている。
【００３５】
これらの細胞を次いで、Ｃａｐｎ１２が培養培地中に分泌されない場合には溶解し、かつＣａｐｎ１２を公知のタンパク質単離法によって溶解物から得ることができる。これらの細胞を、選択的に高周波の超音波によって、例えばフレンチプレスセル中での高圧によって、浸透圧溶解によって、界面活性剤、溶解酵素又は有機溶剤の作用によって、均質化によって、又は複数の挙げられた方法の組合せによって溶解することができる。Ｃａｐｎ１２の精製は公知のクロマトグラフィーによる方法によって、例えば分子ふるいクロマトグラフィー（ゲル濾過）、例えばＱ−セファロース−クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー及び疎水性クロマトグラフィー、並びに別の慣用の方法、例えば限外濾過、晶出、塩析、透析及び本来のゲル電気泳動によって達成できる。適当な方法は、例えばＣｏｏｐｅｒ， Ｆ． Ｇ．， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｃｈｅ Ａｒｂｅｉｔｓｍｅｔｈｏｄｅｎ， Ｖｅｒｌａｇ Ｗａｌｔｅｒ ｄｅ Ｇｒｕｙｔｅｒ， Ｂｅｒｌｉｎ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ又はＳｃｏｐｅｓ， Ｒ．， Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ， Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ， Ｂｅｒｌｉｎに記載されている。
【００３６】
組み換えタンパク質の単離のために、ｃＤＮＡを規定のヌクレオチド配列だけ延長し、かつ更により簡単な精製に役立つ変更されたポリペプチド又は融合タンパク質をコードするベクター系又はオリゴヌクレオチドを使用することが特に有利である。そのような適当な修飾は、例えばアンカーとして融合するいわゆる“タグ”、例えばヘキサヒスチジンアンカーとして公知の修飾又は抗原として抗体によって認識されうるエピトープである（例えばＨａｒｌｏｗ， Ｅ． ａｎｄ Ｌａｎｅ， Ｄ．， １９８８， Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ． Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ （Ｎ． Ｙ．）Ｐｒｅｓｓ）。これらのアンカーは、タンパク質を固体の担体、例えばポリマーマトリクスに付着させるために用いられ、これらの担体は、例えばクロマトグラフィーカラム中に充填されてよく、又はマイクロタイタープレート又はその他の担体において使用できる。
【００３７】
同時に、これらのアンカーはタンパク質の認識のために使用してよい。タンパク質の認識のために、更に慣用のマーカー、例えば蛍光色素、基質との反応によって検出可能な反応生成物を形成する酵素マーカー、又は放射性マーカーを単独又はアンカーと組み合わせてタンパク質の誘導体化のために使用してよい。
【００３８】
本発明の対象はシステイン−プロテアーゼとしての、本発明によるＣａｐｎ１２又は本発明によるカルパイン−タンパク質の使用である。Ｃａｐｎ１２の天然の基質と組み合わせて使用することが有利であるが、Ｃａｐｎ１２の活性中心に結合され、かつそこで開裂される全ての基質を使用してよい。Ｃａｐｎ１２は例えばシステイン−プロテアーゼとして、分子生物学的及び化学的方法において使用してよい。
【００３９】
更に本発明の対象は、本発明によるＣａｐｎ１２、本発明によるカルパイン−タンパク質又は本発明による組み換えベクター並びに少なくとも１種の製薬学的に認容性の担体又は希釈剤を含有する医薬品である。本発明によるＣａｐｎ１２、本発明によるカルパインタンパク質又はベクターはそれ自体で使用できるが、有利には担体又は希釈剤と組み合わせて使用できる。この担体は、望ましい投与形に依存して固体形又は液体形で存在していてよい。適当な医薬品は、更に本発明によるＣａｐｎ１２、本発明によるカルパインタンパク質又は本発明による組み換えベクターの他に望ましくは更に他の医薬品作用物質を混合して、又は組合せ調剤において別個に含有してよい。例えば、かかる作用物質は含有するＣａｐｎ１２、カルパインタンパク質又はベクターの作用を強化し、別の作用機構を有し、それにより付加的に作用し、又は患者の全体質を改善することができる。
【００４０】
本発明の対象は、更に本発明によるＣａｐｎ１２、本発明によるカルパインタンパク質又は本発明によるベクターの、Ｃａｐｎ１２の不十分な発現に関連がある疾患又は疾患状態の治療のための薬剤の製造のための使用である。更に、本発明による処理は、相応の素因を有する患者における発症を抑えること又は既に発生している疾患の、進行の遅延又はできれば完治まで患者の状態を改善することによる治療を含む。
【００４１】
Ｃａｐｎ１２の不足が保たれている場合において、代用のために多くの方法を使用できる。一方では本発明による医薬品においてＣａｐｎ１２又は本発明によるカルパインタンパク質を直接又は遺伝子治療的に、それらをコードしている核酸（ＤＮＡ又はＲＮＡ）の形で適用してよい。遺伝子治療的使用のために、任意の運搬体、例えばウイルス性運搬体（レトロウイルス性トランスフェクション）も非ウイルス性運搬体（例えばリポソーム−トランスフェクション）を使用してよい。適当な運搬体は適当なレセプター分子又は同等物を介して特異的に厳密に定義された目的細胞に結合し、これらを意図的に形質転換させてよい。トランスフェクションは患者の体内で行うか、又は採取された細胞をインビトロでトランスフェクションさせ、次いで再び患者に適用してよい。適当な方法は、例えばＳｔｒａｕｓｓ及びＢａｒｒａｎｇｅｒによってＣｏｎｃｅｐｔｓ ｉｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ （１９９７）， Ｗａｌｔｅｒ ｄｅ Ｇｒｕｙｔｅｒ， Ｈｒｓｇ．に記載されている。Ｃａｐｎ１２代用のための他の方法は、内因性の個体固有の遺伝子の刺激である。また本発明によるＣａｐｎ１２の、例えばプロテアーゼによるターンオーバー又は不活性化を遮断して、高められた数の活性のＣａｐｎ１２分子を得ることができる。最後にＣａｐｎ１２のアゴニストを使用して、現存のＣａｐｎ１２分子の活性を増大させてよい。低減されたＣａｐｎ１２発現の場合には、これは治療を支持する方法の１つであるに過ぎない。
【００４２】
本発明による医薬品又は薬剤は、腸内投与及び非経口投与のための錠剤、顆粒剤、粉剤、糖剤、香錠、ペレット剤、カプセル剤、坐剤、液剤、エマルジョン及び懸濁液の形で存在していてよい。有利には本発明による医薬品は皮膚内適用のためのゲル剤、ローション剤及びクリーム剤中に含まれていてよい。
【００４３】
本発明による医薬品又は薬剤のその都度の用量及びその都度の投与計画は治療する医者が決断を下す。選択される投与経路、その都度の薬剤の作用、治療されるべき病気の種類及び重度、患者の体調及び治療に対する判定に依存して適当な投与用量及び適当な投与計画が選択される。例えば薬理学的に作用する物質をホニュウ類動物（ヒト及び動物）に体重１ｋｇあたり１日に約０．５ｍｇ〜１００ｍｇの用量で投与してよい。これらの物質は単一投与又は複数の投与において投与してよい。
【００４４】
使用分野は、不十分なＣａｐｎ１２発現に関連がある疾患及び疾患状態を含む。
【００４５】
更に本発明の対象は、カルパイン−プロテアーゼエフェクターに対するスクリーニングのための、本発明によるＣａｐｎ１２又は本発明によるカルパインタンパク質の使用である。カルパインプロテアーゼエフェクターとは、Ｃａｐｎ１２および／またはカルパインの活性に影響を及ぼす物質、例えばアクチベーター又はインヒビター又はＣａｐｎ１２の基質に酵素触媒の間に作用できる物質又はＣａｐｎ１２に結合する分子、例えば同時にＣａｐｎ１２の生物学的機能を調節できる免疫グロブリン又は低分子のＣａｐｎ１２に結合する分子を意味する。Ｃａｐｎ１２に結合する分子とは、全ての天然及び合成のリガンド及びＣａｐｎ１２の相互作用パートナーを表す。
【００４６】
適当なスクリーニング方法において、例えばＣａｐｎ１２又は本発明によるカルパインタンパク質を、生理学的又は病理学的なＣａｐｎ１２活性、例えばシステインプロテアーゼ活性のエフェクターを含有する分析物と一緒にインキュベートし、かつＣａｐｎ１２の活性を、場合により基質及び補助基質の添加によって規定する。
【００４７】
以下の方法の基礎となるものは、それに対して目的タンパク質に結合する多くのエフェクターの特性である。このようにＣａｐｎ１２又は本発明によるカルパインタンパク質は、場合により相応の誘導体化の後に担体に固定化され、かつ少なくとも１つのＣａｐｎ１２結合パートナーであると推定される分析物と接触させる。固定化されたＣａｐｎ１２又は固定化された本発明によるカルパインタンパク質に結合する分析物の成分は次いで場合によりインキュベーション相により溶出でき、測定及び特徴付けることができる。しかしながら相応して分析物を固定して、かつ引き続きＣａｐｎ１２分子又は結合可能なＣａｐｎ１２断片の分析物の成分への結合に基づいて調査できる。
【００４８】
本発明の対象は更に本発明によるＣａｐｎ１２についての特異性を有する免疫グロブリンである。かかる免疫グロブリンはＣａｐｎ１２の特徴的なエピトープに結合できるモノクローナル抗体又はポリクローナル抗体並びにそのフラグメントを含む。抗Ｃａｐｎ１２免疫グロブリンの製造は、当業者によく知られた方法において行われる。免疫グロブリンとはポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、場合によりヒトの又は人化された抗体又はそのフラグメント、単鎖抗体又は合成抗体、並びに抗体フラグメント、例えばＦｖ、Ｆａｂ及びＦ（ａｂ′）２を意味する。適当な製造方法は、例えばＣａｍｐｂｅｌｌ， Ａ． Ｍ．， Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， （１９８７）Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｖｅｒｌａｇ， Ａｍｓｔｅｒｄａｍ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｏｘｆｏｒｄ及びＢｒｅｉｔｌｉｎｇ， Ｆ． ｕｎｄ Ｄｕｅｂｅｌ， Ｓ．， Ｒｅｋｏｍｂｉｎａｔｅ Ａｎｔｉｋｏｅｒｐｅｒ（１９９７）， Ｓｐｅｋｔｒｕｍ Ａｋａｄｅｍｉｓｃｈｅｒ Ｖｅｒｌａｇ， Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇに記載されている。このように、例えば本発明によるアミノ酸配列から出発して、単独で又は組み合わせて抗原としてモノクローナル抗体又はポリクローナル抗体の製造のために使用できるペプチドを合成できる。
【００４９】
また本発明の対象は、Ｃａｐｎ１２発現と関連する疾患又は疾患状態の診断のための本発明による免疫グロブリン又は本発明によるポリヌクレオチドの使用である。この場合、Ｃａｐｎ１２又はその元となるｍＲＮＡの量、活性及び分布をヒトの身体において測定できる。免疫グロブリン又はＣａｐｎ１２に結合する分子を用いて、例えば生物学的試料、例えば細胞又は体液中のＣａｐｎ１２濃度を測定できる。本発明によるポリヌクレオチドを用いて、例えばノーザンブロット技術又はＲＴ−ＰＣＲによって発現をｍＲＮＡレベルで評価し、かつ例えば少数の発現を検出し、かつそれと結びつく疾患を診断できる。更に本発明によるポリヌクレオチドを用いて、その適当なプローブの形において、Ｃａｐｎ１２遺伝子に関連する遺伝子欠失又は突然変異及び規定された疾患のための患者の素因を検出できる。更に多数の患者の調査から臨床的モニタリングにおいて遺伝的原因及び規定の患者の素因に関して証明できる。
【００５０】
本発明をここで以下の制限されない実施例において、添付された図面に関連して詳細に記載する。
【００５１】
図１はＣａｐｎ１２の予測されたアミノ酸配列と大きなカルパインサブユニットの脊椎動物遺伝子ファミリーの代表的なメンバーとの配列比較を示している。
【００５２】
スプライス変異体Ｃａｐｎ１２Ａの予測されたアミノ酸配列（ここでは１文字コードで示す）を種々のＣ末端ドメインによって異なる大きなカルパインサブユニットの最も重要なクラスのメンバーと比較した。Ｃａｐｎ１は典型的なカルモジュリン様Ｃ−末端ドメインを有するが、Ｃａｐｎ５、Ｃａｐｎ７及びＣａｐｎ１０はＮ、ＴもしくはＸで示されるＣ−末端ドメインを有する。Ｃａｐｎ１２のアミノ酸と同一の別のタンパク質のアミノ酸は黒色にしている。ハイフンは、配列の対比及びそれによる最善な比較のために挿入された空白を特徴付けている。カルパインの活性中心の一部である３つの保存アミノ酸は矢印で表示している。カルシウムに結合するＣａｐｎ１のＥＦハンドドメイン（Ｌｉｎ ｅｔ ａｌ．， １９９７； Ｂｌａｎｃｈａｒｄ ｅｔ ａｌ．， １９９７）はそれぞれの配列にわたるバーによって強調し、かつ部分的に番号付けした。結晶構造から予測される（Ｈｏｓｆｉｅｌｄ ｅｔ ａｌ．， １９９９）カルパインドメインを同様に特徴付けした。より良好に明確にするために、このタンパク質のみを有する予測されるＣａｐｎ７タンパク質の最初の１２２個のアミノ酸は示さず、かつ“イコール記号”（＝）によって置き換えた。カルシウムと相互作用でき、かつできるだけプロテアーゼ活性の“静電的スイッチ”として作用するドメインＩＩＩにおける明らかな酸性領域を●によって関連配列にわたって認識できるようにした。９１４４１３ｃＤＮＡから予測されるタンパク質配列及びスプライス変異体Ｂ及びＣの予測されるタンパク質配列のスプライス変異体Ａとは異なるＣ−末端は、これらがスプライス変異体Ｃａｐｎ１２Ａのタンパク質配列とは異なるという点から明らかである。カルパイン配列のＥＭＢＬ／遺伝子バンクアクセッション番号を図３に対する説明文において示した。
【００５３】
図２はＣａｐｎ１２遺伝子のゲノム構造を示している：
Ａ．　Ｃａｐｎ１２遺伝子のイントロン／エキソン構造の概略図。黒色の長方形はＣａｐｎ１２のエキソンを表す。これらは通し番号が打ってある。格子柄の長方形は最も外部の３′−末端にあるＡｃｔｎ４のエキソンを特徴付けている。点が打たれた長方形はＣａｐｎ１２及びＡｃｔｎ４を分割するエキソン配列を特徴付けている。矢印は両方の遺伝子の転写方向を示している。配列中に見られる配列繰り返しの位置を上方に示した。クローン９１４４１３のｍＲＮＡ転写物が得られるエキソン９及び２０とＣａｐｎ１２のエキソン９及び２０のスプライスドナー及びスプライスアクセプタ部位を取り囲む部分配列との間のスプライスイベントを同様に示している。大文字はそれぞれコーディング配列を示し、かつ小文字はイントロン配列を示している。異常なスプライスドナー及びスプライスアクセプタ部位に共通であり、かつ異常なスプライスイベントを生じる配列ＣＡＣＴＧには下線を引いた。それに引き続く２つのエキソンを互いに結合する９１４４１３−ｃＤＮＡを同様に示している。
【００５４】
Ｂ．　エキソン１１、１２及び１３の概略図は選択的なスプライス変異体Ａ、Ｂ及びＣを示している。共通のエキソン１１の配列は左側に示しており、かつそれと結合されるそれぞれのスプライス変異体で使用されるエキソンを右側に示した。予測されるアミノ酸配列を相応のヌクレオチド配列の下方に示した。スプライス変異体Ｂで使用されるエキソン１２中のスプライスアクセプタの最後の２つのヌクレオチド、ＡＧは肉太活字で示した。
【００５５】
Ｃ．　この表はそれぞれのスプライスドナー及びスプライスアクセプターを取り囲むヌクレオチド配列を有する個々のエキソンのスプライスイベントを示している。スプライスドナー及びスプライスアクセプターは肉太活字で示している。それぞれのエキソン及びイントロンのサイズが示されている。
【００５６】
図３は大きなカルパインサブユニットのホニュウ類動物遺伝子ファミリーの系統図を示している。
【００５７】
分析はプログラムＣＬＵＳＴＡＬを用いて実施し、系統図はＣＬＵＳＴＲＥＥで作成した。水平線のそれぞれの長さは予測される系統的距離に比例し；垂直距離は意味を有さない。１０００バンド繰り返し（Ｂａｎｄｗｉｅｄｅｒｈｏｌｕｎｇ）を実施し、かつこれらの値を合流点の内側に示している。有利にはマウスの配列を使用する。これらはＣａｐｎ８、Ｃａｐｎ９及びＣａｐｎ１１のために利用できないので、代わりにラット及びヒトのオルソログ配列を使用する。これらの配列のＥＭＢＬ／遺伝子バンク−アクセッション番号は：Ｃａｐｎ１（ＡＦ０２１８４７）、Ｃａｐｎ２（Ｙ１０１３９）、Ｃａｐｎ３（Ｘ９２５２３）、Ｃａｐｎ５（Ｙ１０６５６）、Ｃａｐｎ６（Ｙ１２５８２）、Ｃａｐｎ７（ＡＪ０１２４７５）、ラットＣａｐｎ８（Ｄ１４４８０）、ヒトのＣａｐｎ９（ＡＦ０２２７９９）、Ｃａｐｎ１０（ＡＦ１２６８６７）及びヒトのＣａｐｎ１１（ＡＪ２４２８３２）。
【００５８】
図４はＡｃｔｎ４及びＣａｐｎ１２のｍＲＮＡ発現分析を示している。
【００５９】
Ａ．　種々のマウス組織におけるＡｃｔｎ４の発現。マウスのＡｃｔｎ４−ｃＤＮＡの３′末端に相当する３２Ｐ標識されたプローブをクロンテックのマウスマスターブロット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｍａｕｓｅ−Ｍａｓｔｅｒ−Ｂｌｏｔ）にハイブリダイズさせた。フィルター上のＲＮＡの位置確認を右側に示している。ブロットをストリップし、かつＲＮＡ負荷の調査のためにマウスのＨｐｒｔプローブとハイブリダイズさせた（中央）。暴露時間は４８時間であった。
【００６０】
Ｂ．　３２Ｐ標識されたプローブを、示された齢のマウスの皮膚からのＲＮＡを有するノーザンフィルターにハイブリダイズさせる。該ブロットを施与されたＲＮＡレベルの調査のために引き続いて再びβ−アクチンｃＤＮＡプローブとハイブリダイズさせる。２８Ｓ−ｒＲＮＡ及び１８Ｓ−ｒＲＮＡの位置を特徴付け、かつ特異的なＣａｐｎ１２ＲＮＡバンドを矢印で記す。Ｃａｐｎ１２の場合の暴露時間は１４４時間であり、β−アクチンの場合には２時間であった。
【００６１】
Ｃ．　生後の種々の齢のマウスの皮膚のＲＮＡのＣａｐｎ１２−ＲＴ−ＰＣＲ。Ｍ、分子量マーカーとしてのＨｉｎｄＩＩＩで消化されたｐＳＭ。バンドのサイズは塩基対で示している。Ｎｅｇ、使用されるＤＮＡを用いないネガティブコントロール。強調されたＰＣＲ産物の配列決定は、増幅されたバンドがＣａｐｎ１２−ｃＤＮＡに相当することを証明している。
【００６２】
図５はマウス胚からの皮膚組織切片へのインサイチューハイブリダイゼーションを示している。
【００６３】
左側には、組織切片の光学顕微鏡写真が示されている。その右側に、インサイチューハイブリダイゼーションの相応のイメージが見られる。Ｃａｐｎ１２は選択的に毛嚢の皮質で発現される（ｉｒｓ：内部毛根鞘；ｏｒｓ：外部毛根鞘；ｃｏ：皮質）。
【００６４】
例１
ゲノムライブラリーのスクリーニング
Ｓａｕ３Ａによって部分的に消化されたマウス−１２９／Ｓｖ−ＤＮＡをコスミドベクターｐＳｕｐｅｒ−Ｃｏｓ（ストラタジーン）中にクローニングすることによって作成されるコスミドライブラリーをＣａｐｎ１２特異的プライマー５′−ｇａａｔｇｇｃｇａｇｔｇｇｃａａｃａｇｇａａｇ−３′（配列番号９）及び５′−ｔｇｇｇｇｃｔｃａｇｃａｃａａａａｃｔｃａｔ−３′（配列番号１０）を使用してＰＣＲ分析によってスクリーニングした。該コスミドＤＮＡをキアゲンプラスミドＭｉｄｉキット（Ｑｉａｇｅｎ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｉｄｉ Ｋｉｔ）を用いて製造者の指示に従って精製した。
【００６５】
例２
ＰＣＲによるｃＤＮＡ増幅
５マイクログラムの全ＲＮＡをＡＭＶ逆転写酵素を用いてプロメガリバーストランスクリプションシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｋｒｉｐｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を使用してｃＤＮＡに転写した。ＰＣＲを５０ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭのトリスＨＣｌ、ｐＨ９、０．１％のトライトンＸ−１００、２ユニットのＴａｑ−ＤＮＡポリメラーゼ、５０ピコモルのフォワードプライマーと同様にリバースプライマー及び０．１ｎｇのｃＤＮＡを含有する５０μｌの反応容量中で、９４℃で１５秒、５５℃で３０秒、及び７２℃で１分間のサーモサイクルプロトコールで３５サイクルで実施した。ＲＴ−ＰＣＲのためのＣａｐｎ１２フォワードプライマー配列及びリバースプライマー配列は５′−ｔｔｃａａｇａｃｔｔｔｃｔｃａｃｇ−３′（配列番号１１）及び５′−ｔｃｇｃｃｃｃｃｔｔｇａｇｔｔｔａｔｔｃｔｇａ−３′（配列番号１２）であった。Ｈｐｒｔフォワードプライマー配列及びリバースプライマー配列は５′−ａｔｇｃｃｇａｃｃｃｇｃａｇｔｃｃｃａｇｃｇ−３′（配列番号１３）及び５′−ｇｇｃｔｔｔｇｔａｔｔｔｇｇｃｔｔｔｔｃｃ−３′（配列番号１４）であった。
【００６６】
例３
ＤＮＡ配列決定
８μｌのＢｉｇＤｙｅリアクションミックス（ＢｉｇＤｙｅ Ｒｅａｋｔｉｏｎ Ｍｉｘ）（パーキンエルマーバイオシステムズ）、５００ｎｇの精製されたＤＮＡ及び１０ピコモルのプライマーを含有する２０μｌの反応混合物を９４℃で１５秒、５０℃で１５秒及び６０℃で２分を３０サイクルでインキュベートした。反応生成物をＡＢＩ３７７ＤＮＡシーケンサーを使用してポリアクリルアミド−ゲル電気泳動によって分離し、該配列をパーキンエルマーバイオシステムズの配列分析ソフトウェアヴァージョン３．３を用いて色素−ターミネーター蛍光によって配列決定した。合成されたオリゴヌクレオチドでの更なる配列決定によってＤＮＡ配列が拡張された。これらの配列をプログラムシリーズＤＮＡＳＴＡＲのＳｅｑＭａｎを用いてコンティグにまとめた。
【００６７】
例４
配列分析
ＤＮＡ及びアミノ酸配列をそれらのホモロジーに関して米国バイオテクノロジー情報センター（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）の重複を除いたヌクレオチドデータバンク、タンパク質データバンク及びＥＳＴデータバンクでプログラムシリーズＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．， １９９０）を用いて調査した。アミノ酸配列の配列比較及び対比をＣＬＵＳＴＡＬ Ｗ（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， １９９４）を用いて実施した。エキソンの予測は、サンガーセンターＷｅｂサーバ（ｗｗｗ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ）を介して得られるＦＧＮＥＮＥＳＨプログラムを用いて可能であった。反復配列を“ＲｅｐｅａｔＭａｓｋｅｒ”（ｈｔｔｐ：／／ｒｅｐｅａｔｍａｓｋｅｒ．ｇｅｎｏｍｅ．ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ．ｅｄｕ）を使用して同定した。系統分析をドイツ癌研究センター、ハイデルベルク（ｗｗｗ．ｄｋｆｚ−ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ．ｄｅ）のＨＵ−ＳＡＲサーバから得られるプログラムＣＬＵＳＴＲＥＥを用いて実施した。
【００６８】
例５
ノーザンブロットハイブリダイゼーション
マウス組織からの全ＲＮＡをグアニジン−イソチオシアネート法（Ｃｈｏｍｚｙｎｓｋｉ ｕｎｄ Ｓａｃｃｈｉ， １９８７）を用いて単離した。１０μｇの全ＲＮＡを、すでに記載されるように２．２Ｍのホルムアルデヒドを含有する１．４％（ｗ／ｖ）のアガロースゲル中での電気泳動によって分離し、かつ製造者の指示に従ってＨｙｂｏｎｄ−Ｎ−ナイロンメンブレン（アマシャム）上にブロットした。ブロットをＣａｐｎ１２のヌクレオチド３３〜８５２のｃＤＮＡ配列に相当する３２Ｐ−標識されたｃＤＮＡ断片とＥｘｐｒｅｓｓｈｙｂハイブリダイゼーション溶液（クロンテック）中でハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーションの条件及び高ストリンジェントな洗浄の条件を製造者の指示に従って選択した。ブロットを第２段階においてβ−アクチンのｃＤＮＡプローブとハイブリダイズさせ、ＲＮＡ負荷を調査した。
【００６９】
例６
組織切片におけるインサイチューＲＮＡハイブリダイゼーション
ＲＮＡの合成のためのテンプレートとして前記のヌクレオチド３３〜８５２に相応して使用されたＣａｐｎ１２−ｃＤＮＡをｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔのＥｃｏＲＶ部位にクローニングした。このｃＤＮＡ断片はＡｃｔｎ４遺伝子とオーバーラップしていない。３３Ｐ−標識されたセンスＲＮＡ及びアンチセンスＲＮＡを制限酵素で直鎖化されたプラスミドＤＮＡのインビトロ転写によって、１×転写バッファー（ストラタジーンからのＴ７−及びＴ３−ＲＮＡポリメラーゼのためのバッファー）、２００μＭのＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ、４０μＣｉのα−３３Ｐ−ＵＴＰ（アマシャム）、１０ｍＭのＤＴＴ、１μｇの直鎖化されたプラスミドＤＮＡ、４０ユニットのＲＡＮｓｉｎ（プロメガ）及び１０ユニットのＲＮＡポリメラーゼを含有する１２．５μｌの反応容量において製造した。３７℃での２時間のインキュベートの後に、鋳型ＤＮＡを２ユニットのＤＮＡアーゼＩ（ベーリンガーマンハイム）の添加によって、引き続き３７℃での３０分のインキュベートによって除去した。反応バッチを抽出し、エタノールで沈殿させ、かつ２６μｌのＤＥＰＣ処理されたｄＨ２Ｏ中に再懸濁した。これらの胚をＰＢＳ中の４％（ｗ／ｖ）パラホルムアルデヒド中に固定し、そこから得られる５μｍの組織切片をあらかじめ精製されたＳｕｐｅｒＦｒｏｓｔ Ｐｌｕｓ−載物ガラス（Ｍｅｎｚｅｌ−Ｇｌａｅｓｅｒ）上に移した。ハイブリダイゼーション条件及び洗浄条件はすでに記載されている（Ｄｒｅｓｓｌｅｒ ｕｎｄ Ｇｒｕｓｓ， １９８９）。５５℃のハイブリダイゼーション温度を選択した。
【００７０】
例７
照射ハイブリッドマッピング
Ｔ３１−照射ハイブリッドマッピングプレート（Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）のＤＮＡをＣａｐｎ１２［セット１：５′−ｇｇｇａｇｇｇｃｃａｇｇａｃａａｇｇａｃｔ−３′（配列番号１５）、５′−ａｇｇｇａａｇｇｃｔｇｇａａｃａａｔｇｇａｇａａ−３′（配列番号１６）、セット２：５′−ｇａａｔｇｇｃｇａｇｔｇｇｃａａｃａｇｇａａｇ−３′（配列番号１７）、５′−ｃｔｇｇｇｇｃｔｃａｇｃａｃａａａａｃｔｃａｔ−３′（配列番号１８）］及びＣａｐｎ５（セット１：５′−ｃｇｇｔｇａｃａｃｔｇｇａｃｔｇｇｇｃｃｔｔｇｃ−３′（配列番号１９）、５′−ａａｇｃｃｇｃｃｔｇｃａｇａｇｃａｃｔｇｔｇｇ−３′（配列番号２０）、セット２：５′−ｃｇｇｇａｇｔｇｇａｃｇｇｇｃｃｃｃｔｇ−３′（配列番号２１）、５′−ｃｔｃａｃｔｔｔｃｔｇｃｃａｔｔｃｃｔｃ−３′（配列番号２２））に相当する２つのプライマーセットを用いるＰＣＲによって分析した。ＰＣＲは、５０ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭのトリスＨＣｌ、ｐＨ９、１．５ｍＭのＭｇＣｌ２、１ユニットのＴａｑ−ＤＮＡポリメラーゼ及び２５ｎｇのＤＮＡを含有する２０μｌの反応溶液において、９４℃で１５秒、６０℃で３０秒及び７２℃で１分のサーモサイクリングプロトコール３５サイクルで実施した。生データをマウス−照射ハイブリッドデータバンクでの分析のためにジャクソン研究所（ｗｗｗ．ｊａｘ．ｏｒｇ／ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ／ｄｏｃｕｍｅｎｔｓ／ｃｍｄａｔａ／ｒｈｍａｐ／）に提出した。
【００７１】
例８
Ｃａｐｎ１２の同定
新規のカルパイン遺伝子の同定のために、公的に利用可能なＥＳＴデータバンクを調査した。一時的に得られるデータを使用して、細胞特異的な発現パターンによって特徴付けられる大きなカルパインサブユニットのホニュウ類動物遺伝子ファミリーの新規のメンバーを見いだし、かつ特徴付けた。
【００７２】
マウスＥＳＴデータバンクを公知の脊椎動物−カルパインのタンパク質配列で、ＴＢＬＡＳＴアルゴリズム（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．， １９９０）を使用して調査した。３′−ＥＳＴ、ＡＡ１３１４４１３の翻訳されたタンパク質は大きなカルパインサブユニットのファミリーに典型的であった。この結果から、このＥＳＴクローンに相当するｃＤＮＡクローン、９１４４１３を全体において配列決定した。ｃＤＮＡはポリＡテールを有し、かつ予測されるタンパク質は典型的なカルパインの大きなサブユニットのドメインＩ及びＩＩに対してホモロジーを示すオープンリーディングフレームを含んでいた。予測される配列はただし、ドメインＩＩに関しては典型的なカルパインから逸脱し、かつそれに対して短く終結する。
【００７３】
３つの観察は、このｃＤＮＡクローンが異常な転写物に由来することを意味している。第１に、該オープンリーディングフレームは別のカルパインのドメインＩＩＩ又はＩＶに対してホモロジーを有さないが、一方で全てのいままで同定されているカルパインは典型的な４つのドメイン構造を有する。第２に、得られる配列の両端から構成されるプライマーを用いて、多数の組織ｃＤＮＡからこの長さの転写物を増幅することができなかった。第３に、カルパインのカルモジュリン様ドメインＩＶに対する多くのホモロジーを示すＡＡ１３１４４１３の３′−末端に相同なヒトのＥＳＴが同定された。従ってｃＤＮＡクローン９１４４１３は非典型的な又は誤りのあるＲＮＡスプライシングイベントの結果をもたらし、これはドメインＩＩＩ及びＩＶをコードするカルパイン遺伝子のエキソンを欠失している。
【００７４】
これを調査するために、ゲノムＤＮＡコスミドクローンを単離し、かつ配列決定した。全１３１１６ｂｐの連続する配列（配列番号８）が得られた。遺伝子予測ソフトウェア（ＦＧＥ−ＮＥＳＨ）は２１個のエキソンを有する、カルパインの遺伝子ファミリーに典型的なエキソン／イントロン構造を有する潜在的な遺伝子を同定した。その中でも典型的なカルパインのドメインＩＩＩ及びＩＶに対して顕著なホモロジーを有するエキソンである。正確なエキソン／イントロン構造の規定のために、皮膚から単離されたｍＲＮＡをＲＴ−ＰＣＲによって分析した。該ソフトウェアは２１個のエキソンの２０個を予測し、その際、これらのエキソンはドナースプライス部位又はアクセプタースプライス部位の位置にいくつかの欠損を許した。完全な遺伝子のイントロン／エキソン境界は図２Ａに示され、かつ第１表にまとめている。マウスゲノム命名委員会はこの遺伝子にＣａｐｎ１２という名称を与えている。Ｃａｐｎ１２イントロン配列中に４つの簡単な配列繰り返し及び１６個のＳＩＮＥＳ（短い散在反復；４つのＢ１、１つのＢ２、３つのＢ４及び８つのＩＤ；図２Ａ）が見られる。ゲノム配列から予測されるｍＲＮＡ配列と比較して、ｃＤＮＡクローン９１４４１３は欠損したスプライスイベントの結果であると思われ、その際スプライスドナー部位と同様にスプライスアクセプター部位も非典型的であり、ドメインＩＩＩ及びＩＶのエキソンのより大きな部分はそれによって欠失されている。該スプライシングは両方のエキソンに共通である５−塩基対領域ＣＡＣＴＧ内でエキソン９及び２０の間で行われる。
【００７５】
ＲＴ−ＰＣＲによって、Ｃａｐｎ１２−ｍＲＮＡの３つの選択的なスプライス変異体が同定された（本願ではＣａｐｎ１２Ａ、Ｃａｐｎ１２Ｂ及びＣａｐｎ１２Ｃと呼ぶ）スプライス変異体Ａはおそらく７２０アミノ酸からなる１つのタンパク質（Ｍｒ８０．５ｋＤａ）をコードするオープンリーディングフレームを有する。提示された開始メチオニン（ｃｇａＡＴＧｇ）は翻訳開始部位の最小のコンセンサス配列に相当する（Ｋｏｚａｋ， １９９６）。他の５′−開始部位はリーディングフレーム中の前記ＡＴＧの３９ヌクレオチド上流に局在するＴＡＡ停止コドンによって排除される。予測されたアミノ酸配列は大きなカルパインサブユニットのファミリーのメンバーと類似性を示し、かつカルパインについて典型的な４つのドメインＩ〜ＩＶにおいて区分できる（図１）。本発明によるＣａｐｎ１２のドメインＩＩはシステイン−プロテアーゼの活性中心に重要な３つのアミノ酸残基（Ｃｙｓ１０５、Ｈｉｓ２５９及びＡｓｎ２８３）を有する（Ｂｅｒｔｉ ｕｎｄ Ｓｔｏｒｅｒ， １９９５）。それに応じて、本発明によるＣａｐｎ１２、例えばたいていの典型的なカルパインはシステインプロテアーゼ活性を有する。
【００７６】
Ｃａｐｎ２の場合に記載される５つのＣａ２＋結合配列（Ｂｌａｎｃｈａｒｄ ｅｔ ａｌ．， １９９７； Ｌｉｎ ｅｔ ａｌ．， １９９７）のそれぞれはある程度にはＣａｐｎ１２のアミノ酸配列に保存されている（図１）。Ｃａｐｎ２の結晶構造はＣａ２＋と相互作用し、かつプロテアーゼ活性の“静電的スイッチ”として作用しうるドメインＩＩＩ中の強酸性領域を出現させる（Ｓｔｒｏｂｌ ｅｔ ａｌ．， ２０００）。著者は、この領域における多数の酸性基は活性化のために必要なＣａ２＋濃度を低減できると推測している。Ｃａｐｎ１２の相応の領域は同様に顕著に酸性である（ＤＥＥＥＤＤＤＤＥＥ；図１）。全てをあわせて、一次アミノ酸配列は、このタンパク質がシステインプロテアーゼ活性を有し、かつカルシウムを結合すると理解できる。予測されたアミノ酸配列と別の脊椎動物カルパイン及び無脊椎動物カルパインとの比較はヒトのＣａｐｎ１とマウスのＣａｐｎ１に対して強い配列ホモロジーを示した（３９．９％もしくは３９．７５％）。
【００７７】
スプライス変異体Ａ及びＢの転写物はエキソン１２のスプライスアクセプターにおいて異なるが、変異体Ｃのそれはエキソン１２を完全に欠損している。選択的なスプライス変異体Ｂ及びＣの予測されるタンパク質はそれによってドメインＩＩＩにおいて異なるアミノ酸配列を示し、かつリーディングフレームのシフトに基づいてこのドメイン内の翻訳を停止させる（図２Ｂ）。従ってこれらにおそらくカルモジュリン様のＣａ２＋に結合するＣ−末端ドメインが欠損している。それと同様に、すでに、ラットのＣａｐｎ８及びマウスのＣａｐｎ５は選択的にスプライシングされた、Ｃ−末端ドメインを欠損したタンパク質をコードする転写物を形成することを示している（Ｓｏｒｉｍａｃｈｉ ｅｔ ａｌ．， １９９３； Ｄｅａｒ ｅｔ ａｌ．， １９９７）。意想外にもスプライス変異体ＢのＲＴ−ＰＣＲ産物がスプライス変異体ＡのＲＴ−ＰＣＲ産物より豊富であった。従ってＣａ２＋結合ドメインを欠損しているＣａｐｎ１２タンパク質はおそらくＣａｐｎ１２タンパク質プールのかなりの部分を示している。スプライス変異体ＣのＲＴ−ＰＣＲ産物はそれに対して最も少ない豊富な産物であった。
【００７８】
例９
ホニュウ類動物の大きなカルパインサブユニットの系統分析
ホニュウ類動物の全ての公知の大きなカルパインサブユニットの代表的なメンバーのそれぞれの完全なアミノ酸配列に系統分析を行った。それによって、カルパインは３つのメイングループに分けることができた（図３）。第１のグループ（Ａ）はＣａｐｎ１、Ｃａｐｎ２、Ｃａｐｎ３、Ｃａｐｎ８及びＣａｐｎ９によって表され、かつ第２のグループ（Ｂ）はＣａｐｎ５、Ｃａｐｎ６、Ｃａｐｎ７、Ｃａｐｎ１０及びＣａｐｎ１２によって表される。どのグループにも適合しない大きく異なるカルパインＣａｐｎ１１（Ｄｅａｒ ｅｔ ａｌ．， １９９９）はどのグループにも適合しない。グループ（Ａ）はカルモジュリン様Ｃ−末端ドメインを有する全てのカルパインを有するが、一方でグループ（Ｂ）全ては、おそらくＣａ２＋結合能力を欠損した“非典型的な”カルパインを有する。例外は、一般にグループ（Ｂ）に類似するＣａｐｎ１２であり、その際、これがカルモジュリン様のＣ−末端ドメインを有することが予測される。更に更に系統分析は、Ｃａｐｎ１２がこのグループの最も古いメンバーであるという推測をもたらす。従ってＣａｐｎ１２遺伝子の前駆体は非典型的な大きなカルパイン−サブユニットの遺伝子の前駆体であってよく、その際、Ｃａｐｎ１２は、選択的なスプライシングによってもしかすると典型的なタンパク質と同様に非典型的なタンパク質の起源としても利用されている。
【００７９】
例１０
染色体局在化
マウスの染色体上のＣａｐｎ１２遺伝子の局在化をＴ３１照射ハイブリッドマッピングプレートのＰＣＲ分析によってＣａｐｎ１２遺伝子のイントロン１内で結合するプライマーを用いて規定した。生データをマウスゲノムの照射ハイブリッドマップ（Ｖａｎ Ｅｔｔｅｎ ｅｔ ａｌ．， １９９９）及びそれに属するワールドワイドウェブサーバを用いて分析した。最も高いＬＯＤ値はマーカーＤ７Ｍｉｔ７２と関連して１６である。別の高いＬＯＤはＤ７Ｍｉｔ１１６と関連して１４．４であり、Ｄ７Ｍｉｔ７７と関連して１４．４であり、かつＤ７Ｍｉｔ２６７と関連して１３．９であった。これらのマーカーは染色体７上で９．４ｃＭ（Ｄ７Ｍｉｔ７７）、１０．７ｃＭ（Ｄ７Ｍｉｔ１１６）、１０．４ｃＭ（Ｄ７Ｍｉｔ７２）及び１１．０ｃＭ（Ｄ７Ｍｉｔ２６７）で局在化された。最も説得力のある順番は：基部−Ｄ７Ｍｉｔ７７−Ｄ７Ｍｉｔ１１６−Ｄ７Ｍｉｔ７２−Ｃａｐｎ１２−Ｄ７Ｍｉｔ２６７−末端位である。該領域はヒトの染色体１９ｑ１３に類似している。マウスのＣａｐｎ５遺伝子は最近では同様にマウスの体細胞の染色体の照射ハイブリッドマッピングプレートを用いてマウス染色体７に局在化された（Ｍａｔｅｎａ ｅｔ ａｌ．， １９９８）。染色体７上のＣａｐｎ５及びＣａｐｎ１２の間の正確な距離を規定するために、Ｔ３１プレートをマウス−Ｃａｐｎ５特異的なＰＣＲプライマーで評価した。最も高いＬＯＤ値はＤ７Ｍｉｔ３２１と関連して１３．４であった。別の高いＬＯＤはＤ７Ｍｉｔ１８４、Ｄ７Ｍｉｔ１７１もしくはＤ７Ｍｉｔ３９と関連して１０．９、８．５及び６．９であった。最も説得力のある遺伝子座の順番は：基部−Ｄ７Ｍｉｔ３２１−７ｃＲ−Ｃａｐｎ５−４２ｃＲ−Ｄ７Ｍｉｔ１４９−末端位である。Ｄ７Ｍｉｔ３２１マーカーは染色体７上で４８．５ｃＭで局在化された。従ってＣａｐｎ５及びＣａｐｎ１２はシンテニーであるが、明らかな距離で互いに染色体７上に存在する。遺伝子Ａｃｔｎ４及びＣａｐｎ１２は以下に記載のようにオーバーラップしているので、Ａｃｔｎ４は同様にマウス染色体７上になければならない。ヒトのＡｃｔｎ４遺伝子は染色体１９ｑ１３上に局在化されたので（Ｋａｐｌａｎ ｅｔ ａｌ．， ２０００）、ヒトのＣａｐｎ１２オルソログは同様にこの領域に存在する見込みが非常に高い。
【００８０】
例１１
発現分析
マウス胚からの組織切片での、鎖特異的なＲＮＡプローブの製造のために９１４４１３−ｃＤＮＡを用いて実施された第１のインサイチューハイブリダイゼーション分析は、混乱した結果をもたらす。それというのもコントロールとして使用される、Ｃａｐｎ１２のナンセンス鎖にハイブリダイズすべきセンスＲＮＡがそれぞれの実験においてハイブリダイズシグナルをもたらすからである。この現象のための可能な説明は、ナンセンスＤＮＡ鎖が同様にＲＮＡをコードすることである。ＤＮＡ遺伝データバンクの調査はＣａｐｎ１２遺伝子の３′−末端に相当する２００個を超えるＥＳＴを同定した。しかしながら、ＡＡ９１４４１３の例外を有する全てのＥＳＴは非コーディング鎖に相当する。オーバーラップするＥＳＴの順列はα−アクチニン−４（Ａｃｔｎ４）のマウスオルソログをコードするオープンリーディングフレームを有する配列を形成した。種々のマウス組織ＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲは該配列を証明する。予測されたマウスタンパク質はヒトのＡｃｔｎ４と９８．９％同一である。最後のエキソンはＣａｐｎ１２遺伝子の最後のエキソンと３３０ｂｐだけオーバーラップするが、反対の方向にある（図２）。最近では、ヒトのＡｃｔｎ４遺伝子における突然変異は、よく知られた部分的な限局腎炎を惹起しうることを示すことができる（Ｋａｐｌａｎ ｅｔ ａｌ．， ２０００）。
【００８１】
特異的なプローブを使用するＲＮＡ−ドット−ブロット分析及びインサイチューハイブリダイゼーションは、Ａｃｔｎ４遺伝子が偏在的に発現されることを示している（図４）。それに対して、３０を超える種々の試験されたポリ（Ａ＋）−ＲＮＡを成体組織又は胚組織からＣａｐｎ１２特異的なｃＤＮＡプローブで単離することにおいてハイブリダイゼーションシグナルを得ることは不可能であった。乳腺ｃＤＮＡライブラリーから９１４４１３ｃＤＮＡクローンが単離されたにもかかわらず、ノーザンブロット分析及びＲＴ−ＰＣＲ分析はその組織において重大な発現レベルを示さなかった。まず段階ｄＥ１０．５〜ｄＥ１８．５のマウス胚及び種々の成体組織におけるインサイチューハイブリダイゼーションと関連するより厳密なＲＴ−ＰＣＲ分析は、Ｃａｐｎ１２がもっぱら皮膚において発現されることを示した。ここでは毛嚢の皮質においてＣａｐｎ１２が発現する（図５）。
【００８２】
毛髪はマウスにおいて約２５日継続するサイクル下にある（Ｃｈａｓｅ， １９６５）。このサイクルは大きく３つの相に分けられている：発育相（増殖相）、退行相（退化相）及び休止相（休止相）。成体マウスの背中の皮膚は毛髪サイクルの全ての相の毛嚢を有する。どのサイクルの相においてＣａｐｎ１２ｍＲＮＡが発現されるかをより厳密に調査するために、マウスから生後の種々の時点で背中の皮膚から試料を取り、かつ抽出されたＲＮＡをノーザンブロットハイブリダイゼーションによって調査する。マウスの最初の毛髪サイクルは同期して進行し（Ｃｈａｓｅ， １９６５）、かつ従って比較的純粋な、特異的なサイクル相の毛嚢集団を調査できる。約３．５ｋｂのＣａｐｎ１２ｍＲＮＡは発育相（ほぼＰ１〜Ｐ１６）において検出できるが、休止相（Ｐ１９〜Ｐ２５）においては（図４Ｂ）検出できない。ｍＲＮＡはその最も高い発現レベルをほぼＰ１２の日に発育相の半ばで達成する。それ自体の皮膚試料のＲＴ−ＰＣＲ分析はこの結果を証明した（図４Ｃ）。従ってＣａｐｎ１２は高特異的なｍＲＮＡ発現パターンを示している。
【００８３】
大きいカルパインサブユニットの遺伝子ファミリーは種々の基準に基づいて、例えば前記に挙げたようにタンパク質構造に基づいて区分することができる。更なる分類基準は組織特異的な発現に対して偏在的な発現である。Ｃａｐｎ１、Ｃａｐｎ２、Ｃａｐｎ７及びＣａｐｎ１０は偏在的に発現するように思われるが、別のカルパインは種々に強く顕著な組織特異的発現によって特徴付けられる。例えばＣａｐｎ９は腸及び胃において主に発現するが、また別の組織においても検出できる（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．， １９９８）。それに対して、Ｃａｐｎ１１は精巣の規定の細胞において明らかに主に発現される（Ｄｅａｒ ｕｎｄ Ｂｏｅｈｍ， １９９９）。更に多くのカルパイン遺伝子は発生特異的に発現される。Ｃａｐｎ５は、例えば胚の胸腺においてＴ−前駆細胞中で発現されるが、一方で生後には胸腺での発現はダウンレギュレートされる（Ｄｅａｒ ｕｎｄ Ｂｏｅｈｍ， １９９９）。
【００８４】
参考文献
【００８５】
【外１】
2004503221.tif 000002
【００８６】
【外２】
2004503221.tif 000003
【００８７】
【外３】
2004503221.tif 000004
【００８８】
【外４】
2004503221.tif 000005
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１はＣａｐｎ１２の予測されたアミノ酸配列と大きなカルパインサブユニットの脊椎動物遺伝子ファミリーの代表的なメンバーとの配列比較を示している。
【図２】
図２はＣａｐｎ１２遺伝子のゲノム構造を示している：ａはＣａｐｎ１２遺伝子のイントロン／エキソン構造の概略図であり、ｂはエキソン１１、１２及び１３の概略図は選択的なスプライス変異体Ａ、Ｂ及びＣを示しており、ｃの表はそれぞれのスプライスドナー及びスプライスアクセプターを取り囲むヌクレオチド配列を有する個々のエキソンのスプライスイベントを示している。
【図３】
図３は大きなカルパインサブユニットのホニュウ類動物遺伝子ファミリーの系統図を示している。
【図４】
図４はＡｃｔｎ４及びＣａｐｎ１２のｍＲＮＡ発現分析を示している：ａは種々のマウス組織におけるＡｃｔｎ４の発現を示しており、ｂは３２Ｐ標識されたプローブを、示された齢のマウスの皮膚からのＲＮＡを有するノーザンフィルターにハイブリダイズさせた図を示し、ｃは生後の種々の齢のマウスの皮膚のＲＮＡのＣａｐｎ１２−ＲＴ−ＰＣＲを示している。
【図５】
図５はマウス胚からの皮膚組織切片へのインサイチューハイブリダイゼーションを示している。
【符号の説明】
ｉｒｓ　内部毛根鞘、　ｏｒｓ　外部毛根鞘、　ｃｏ　皮質
【図１】
2004503221.tif 000006
【図２】
2004503221.tif 000007
2004503221.tif 000008
【図３】
2004503221.tif 000009
【図４】
2004503221.tif 000010
【国際公開パンフレット】
2004503221.tif 000011
2004503221.tif 000012
2004503221.tif 000013
2004503221.tif 000014
2004503221.tif 000015
2004503221.tif 000016
2004503221.tif 000017
2004503221.tif 000018
2004503221.tif 000019
2004503221.tif 000020
2004503221.tif 000021
2004503221.tif 000022
2004503221.tif 000023
2004503221.tif 000024
2004503221.tif 000025
2004503221.tif 000026
2004503221.tif 000027
2004503221.tif 000028
2004503221.tif 000029
2004503221.tif 000030
2004503221.tif 000031
2004503221.tif 000032
2004503221.tif 000033
2004503221.tif 000034
2004503221.tif 000035
2004503221.tif 000036
2004503221.tif 000037
2004503221.tif 000038
2004503221.tif 000039
2004503221.tif 000040
2004503221.tif 000041
2004503221.tif 000042
2004503221.tif 000043
2004503221.tif 000044
2004503221.tif 000045
2004503221.tif 000046
2004503221.tif 000047
2004503221.tif 000048
2004503221.tif 000049
2004503221.tif 000050
2004503221.tif 000051
2004503221.tif 000052
2004503221.tif 000053
2004503221.tif 000054
2004503221.tif 000055
2004503221.tif 000056
2004503221.tif 000057
2004503221.tif 000058
2004503221.tif 000059
2004503221.tif 000060
2004503221.tif 000061
2004503221.tif 000062
2004503221.tif 000063
2004503221.tif 000064
2004503221.tif 000065
2004503221.tif 000066
2004503221.tif 000067
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004503221.tif 000068
【国際調査報告】
2004503221.tif 000069
2004503221.tif 000070
2004503221.tif 000071
2004503221.tif 000072
2004503221.tif 000073
2004503221.tif 000074
2004503221.tif 000075
2004503221.tif 000076
2004503221.tif 000077
2004503221.tif 000078
2004503221.tif 000079