(57)【要約】本発明は、高骨量（ＨＢＭ）遺伝子、対応する野生型遺伝子（Ｚｍａｘ１）、およびその変異体に関する。本発明で同定された遺伝子は、生理学的脂質レベルならびに脂質媒介疾患および病態の調節に関連する。本発明はまた、クローニング配列、オリゴヌクレオチドプライマー、およびプローブを含む核酸、タンパク質、クローニングベクター、発現ベクター、形質転換宿主、薬学的組成物の開発法、被験体における脂質レベル調節に関連する分子の同定法を提供する。好ましい実施形態では、本発明は、アテローム性動脈硬化症、動脈硬化症心血管疾患、アテローム性動脈硬化症および動脈硬化症関連疾患を治療および予防する方法に関する。
2004523724.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＨＢＭまたはＺｍａｘ１に結合する分子、またはＨＢＭまたはＺｍａｘ１への分子の結合を阻害する分子を同定するステップを含む、脂質調節に関連する分子を同定する方法。
【請求項２】
前記分子がタンパク質である、請求項２に記載の方法。
【請求項３】
前記タンパク質に対する抗体を産生するステップをさらに含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
ＨＢＭ遺伝子を含む第２の宿主と比較した場合、Ｚｍａｘ１遺伝子を含む第１の宿主と異なる発現レベルを有するタンパク質を同定するステップを含む、脂質調節に関連するタンパク質を同定する方法。
【請求項５】
前記宿主が動物である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
（Ａ）配列番号１の核酸配列または表４の多型を含むＺｍａｘ１核酸に結合する分子、または配列番号１の核酸配列または表４の多型を含むＺｍａｘ１核酸への分子の結合を阻害する分子を同定するステップと、
（Ｂ）配列番号２の核酸配列に結合する分子、または配列番号２の核酸配列への分子の結合を阻害する分子を同定するステップと、
（Ｃ）各核酸配列への分子の結合程度または各核酸配列への結合の阻害程度を比較するステップであって、前記配列番号２の核酸配列または配列番号１の核酸配列または表４の多型を含むＺｍａｘ１核酸に結合するか結合を阻害する分子が候補分子であることを特徴とするステップと
を含む、脂質調節に関連する候補分子を同定する方法。
【請求項７】
前記候補分子がタンパク質、ｍＲＮＡ、またはアンチセンス核酸である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
配列番号２を含む核酸またはＨＢＭ多型を含む核酸配列を被験体に投与するステップと、脂質レベルが調節されるかどうかを評価するステップとを含む、脂質レベルを調節するための治療薬としての物質を試験する方法。
【請求項９】
前記被験体が動物であり、前記動物が、家畜、霊長類、ヒト、イヌ類、ネコ類、げっ歯類、鳥類、爬虫類、魚類、および両生類からなる群から選択される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
配列番号４を含むタンパク質または表４の多型を含むＺｍａｘ１タンパク質を被験体に投与するステップと、脂質レベルが調節されるかどうかを評価するステップとを含む、脂質レベルを調整するための治療薬としての物質の試験方法。
【請求項１１】
配列番号４のアミノ酸配列に結合する分子または表４の多型を含むＺｍａｘ１タンパク質に結合する分子を同定するステップを含む、脂質が関与する疾患を治療するための医薬品の開発方法。
【請求項１２】
前記分子が前記アミノ酸の機能を阻害するか増強する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
（Ａ）Ｚｍａｘ１遺伝子またはＺｍａｘ１タンパク質を含む第１の宿主を作成するステップと、
（Ｂ）ＨＢＭ遺伝子またはＨＢＭタンパク質を含む第２の宿主を作成するステップと、
（Ｃ）前記第１の宿主と前記第２の宿主との間の相違を分析するステップと、
（Ｄ）前記第１の宿主に添加した場合、前記第１の宿主が前記第２の宿主の特徴を示す分子を同定するステップと
を含む、脂質が関与する疾患の治療のための医薬品開発方法。
【請求項１４】
前記宿主が無細胞抽出物、細胞、または動物である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記相違がサロゲートマーカーである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記配列番号４を含むアミノ酸配列を脂質が関与する疾患を罹患した宿主の体細胞または生殖系列細胞に投与するステップを含む、宿主の脂質レベルを調節する方法。
【請求項１７】
前記宿主が、家畜、霊長類、ヒト、イヌ類、ネコ類、げっ歯類、鳥類、爬虫類、魚類、または両生類である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
【請求項１９】
配列番号２を含む核酸配列または表４の多型を含むＺｍａｘ１核酸を脂質が関与する疾患を罹患した動物の体細胞または生殖系列細胞に導入するステップを含む、動物における脂質が関与する疾患を治療または予防する方法。
【請求項２０】
前記動物が、家畜、霊長類、ヒト、イヌ類、ネコ類、げっ歯類、鳥類、爬虫類、魚類、または両生類である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
動脈硬化症または動脈硬化症関連病態を治療または予防する方法であって、配列番号４を含むアミノ酸を、治療又は予防が必要な患者に投与するステップを含む方法。
【請求項２２】
前記患者が、家畜、霊長類、ヒト、イヌ類、ネコ類、げっ歯類、鳥類、爬虫類、魚類、または両生類である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記治療または予防が必要な患者に投与したアミノ酸配列が配列番号４を含むアミノ酸配列の細胞外ドメインを含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
前記治療または予防が必要な患者に投与したアミノ酸配列が配列番号４を含むアミノ酸配列の細胞内ドメインを含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２５】
脂質が関与する疾患を治療または予防する方法であって、配列番号２を含む核酸配列に結合する分子または表４の多型を含むＺｍａｘ１核酸に結合する分子を必要な患者に投与するステップを含む方法。
【請求項２６】
前記患者が、家畜、霊長類、ヒト、イヌ類、ネコ類、げっ歯類、鳥類、爬虫類、魚類、または両生類である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
脂質が関与する疾患を治療または予防する方法であって、抗体を治療または予防が必要な患者に投与するステップを含み、前記抗体が配列番号４を含むアミノ酸配列に対するものであることを特徴とする方法。
【請求項２８】
ＨＢＭのゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡ核酸配列に由来するヌクレオチド配列により、患者由来のサンプルをスクリーニングするステップを含む、動脈硬化症または動脈硬化症関連病態または脂質が関与する疾患に対する遺伝的素因の診断的スクリーニングをする方法。
【請求項２９】
前記スクリーニングが、配列番号２を含む核酸配列を使用するハプロタイプ分析を行うステップと、前記被験体がＺｍａｘ１遺伝子を含むかまたはＨＢＭ多型を欠いているかどうかを同定するステップとを含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
ＨＢＭタンパク質に対する抗体およびＺｍａｘ１タンパク質に対する抗体を含む脂質が関与する疾患の素因を同定するための診断的アッセイ。
【請求項３１】
配列番号２に作動可能に連結された、組織中での発現を指示するプロモーターを含む発現ベクターを構築するステップを含み、ＨＢＭタンパク質を発現する組織が脂質調節細胞または脂質代謝に関連する細胞である、組織においてＨＢＭタンパク質を発現する方法。
【請求項３２】
前記組織が肝臓である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記組織中の発現を指示するプロモーターがオステオカルシンプロモーターまたはＡＭＬ−３プロモーターである、請求項３１に記載の方法。
【請求項３４】
表４の多型を含むＨＢＭタンパク質またはＺｍａｘ１タンパク質を投与することによる、被験体の脂質レベルを調節する方法。
【請求項３５】
前記ＨＢＭタンパク質が配列番号４を含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記調節された脂質が、ＶＬＤＬ、ＬＤＬ、ＩＤＬ、ＨＤＬ、ＬＩＰＯａ、ＡＰＯ  Ａ−１、ＡＰＯ  Ｂ、およびＡＰＯ  Ｅからなる群から選択される、請求項３４に記載の方法。
【請求項３７】
ＨＢＭまたはＺｍａｘ１活性を制御する薬剤を投与することによる、被験体の脂質レベルを調節する方法。
【請求項３８】
前記調整された脂質が、ＶＬＤＬ、ＬＤＬ、ＩＤＬ、ＨＤＬ、ＬＩＰＯａ、ＡＰＯ  Ａ−１、ＡＰＯ  Ｂ、およびＡＰＯ  Ｅからなる群から選択される、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記ＨＢＭまたはＺｍａｘ１活性の制御により、遺伝子転写、タンパク質翻訳、またはＺｍａｘ１もしくはＨＢＭタンパク質のその同族標的への結合が調整され、それにより脂質レベルが調節される、請求項３７に記載の方法。
【請求項４０】
Ｚｍａｘ１またはＨＢＭ活性の制御によって脂質レベルを調節する薬剤および薬学的に許容可能なキャリアを含むリポタンパク質調節薬を含む、脂質が関与する疾患病態を治療するための組成物。
【請求項４１】
前記リポタンパク質調節薬が、ブロフィブレート、ゲムフィブロジル、ニコチン酸、コレスチラミン、コレスチポル、ロバスタチン、シンバスタチン、プラバスタチン、プロブコール、プレマリン、またはエストラジオールである、請求項４０に記載の組成物。
【請求項４２】
前記リポタンパク質調節薬がＬＤＬレベルを調節する、請求項４０に記載の組成物。
【請求項４３】
前記リポタンパク質調節薬が、胆汁酸結合樹脂、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼインヒビター、およびエストロゲンからなる群から選択される、請求項４２に記載の組成物。
【請求項４４】
請求項４０に記載の組成物を投与するステップを含む、脂質が関与する疾患病態を罹患した被験体を治療する方法。
【請求項４５】
前記脂質が関与する疾患病態が、アテローム性動脈硬化症、動脈硬化症、またはアテローム性動脈硬化症もしくは動脈硬化症関連疾患である、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
ＨＢＭまたはＺｍａｘ１を制御する薬剤およびリポタンパク質を制御する薬剤を被験体に投与するステップを含む、脂質が関与する疾患または病態を罹患した被験体を治療するための組み合わせ療法。
【請求項４７】
前記リポタンパク質濃度を調節する薬剤が、ブロフィブレート、ゲムフィブロジル、ニコチン酸、コレスチラミン、コレスチポル、ロバスタチン、シンバスタチン、プラバスタチン、プロブコール、プレマリン、またはエストラジオールである、請求項４６に記載の組み合わせ療法。
【請求項４８】
前記脂質が関与する疾患が、アテローム性動脈硬化症、動脈硬化症、アテローム性動脈硬化症関連病態、または動脈硬化症関連病態である、請求項４６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
［関連出願）］
本出願は、１９９８年１月１３日に提出された米国特許仮出願番号６０／０７１，４４９および１９９８年１０月２３日に提出された米国特許仮出願番号６０／１０５，５１１の利益を主張した、１９９９年１月１３日に提出された出願番号０９／２２９，３１９の一部継続出願である、２０００年４月５日に提出された出願番号０９／５４３，７７１および２０００年４月５日に提出された出願番号０９／５４４，３９８の一部継続出願（引用することによりその全体を本明細書中に組み込むものとする）である。
【０００２】
［発明の分野］
本発明は、一般に、遺伝学、ゲノミクス、および分子生物学分野に関する。より詳細には、本発明は、脂質レベルの調整に関連し得る高骨量遺伝子（ｈｉｇｈ ｂｏｎｅ ｍａｓｓ ｇｅｎｅ）、対応する野生型遺伝子、およびその変異体を単離、検出、および配列決定する方法ならびにそのために使用する物質に関する。本発明はまた、高骨量遺伝子、対応する野生型遺伝子、およびその変異体に関する。本発明で同定された遺伝子は、アテローム性動脈硬化症、動脈硬化症、ならびに関連疾患および病態の本体論および生理学に関する。本発明はまた、核酸、タンパク質、クローニングベクター、発現ベクター、形質転換された宿主、薬学的組成物の開発方法、動脈硬化症および関連病態に関連する分子の同定方法、ならびに異常な脂質レベルに関連する疾患を治療または予防する方法を提供する。好ましい実施形態では、本発明は、正常および動脈硬化症、心血管疾患、および脳卒中を含む異常な脂質関連病態を治療、診断、予防、およびスクリーニングする方法に関する。
【０００３】
［発明の背景］
心血管疾患は、合衆国では最も死亡率が高く、アテローム性動脈硬化症は主要な心疾患および脳卒中の病因である。コレステロールがアテローム性動脈硬化症に重要な役割を果たしていることが広く一般に認識されている。通常、ほとんどのコレステロールは細胞壁中の構造要素として作用するが、残りのほとんどは血液を通過するか、肝臓中の胆汁酸合成の出発物質、内分泌腺細胞中のステロイドホルモン、および皮膚中のビタミンＤとして機能する。循環系を介したコレステロールおよび他の脂質の輸送は、リポタンパク質キャリアへの封入によって促進される。これらの球状粒子は、非エステル化（「遊離」）またはエステル化コレステロールおよびトリグリセリドを含む、中性脂質中心を取り囲むタンパク質およびリン脂質殻を含む。アテローム性動脈硬化症のリスクは、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）コレステロール濃度の増加に伴って増加し、このリスクは高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）コレステロールレベルに反比例する。血漿ＬＤＬレベルの受容体媒介調節は十分に定義されており、最近の研究でＨＤＬ代謝の新規の洞察が得られている。
【０００４】
ＬＤＬ代謝の解明は、Ｍｉｃｈａｅｌ  ＢｒｏｗｎおよびＪｏｓｅｐｈ  Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎによって１９７４年に開始された。簡単に述べれば、肝臓は、前駆体リポタンパク質（超低密度リポタンパク質、ＶＬＤＬ）を合成し、循環中に中密度リポタンパク質（ＩＤＬ）、その後ＬＤＬに変換される。体内で発現したＬＤＬ受容体の大部分は、肝細胞表面に存在するにもかかわらず、事実上全ての他の組織（「末梢組織」）は幾らかのＬＤＬ受容体を発現する。結合後、受容体−リポタンパク質複合体は、被覆小窩および被覆小胞を介して細胞によって内在化され、全ＬＤＬ粒子はリソソームに送達し、酵素加水分解によって分離してその後の細胞代謝のためのコレステロールを放出する。この全粒子取り込み経路は、「受容体媒介エンドサイトーシス」と呼ばれている。ＬＤＬ受容体および細胞コレステロール生合成レベルのコレステロール媒介フィードバック調節は、細胞コレステロール恒常性を確実にする一助となる。ヒトのＬＤＬ受容体の遺伝子欠損により、家族性高コレステロール血症、血漿ＬＤＬコレステロールの上昇によって特徴付けられる疾患、アテローム性動脈硬化症、および心臓発作が発症する。過剰な血漿ＬＤＬコレステロールの悪影響についての１つの仮説は、ＬＤＬが動脈壁に侵入し、化学修飾され、動脈中のＬＤＬコレステロールの細胞蓄積を媒介するマクロファージスカベンジャー受容体と呼ばれる特別なクラスの受容体によって認識され、最終的にアテローム硬化性病変を形成することである。
【０００５】
主要なリポタンパク質のクラスには、脂肪およびコレステロールを直接輸送するカイロミクロン、肝臓由来ＶＬＤＬ、ＩＤＬ、および粥腫発生性であり得るＬＤＬ、ならびに抗粥腫発生性である肝臓および腸由来ＨＤＬが含まれる。アポタンパク質Ｂ（ＡｐｏＢ）は、カイロミクロン（Ａｐｏ  Ｂ４８）およびＶＬＤＬ、ＩＤＬおよびＬＤＬ（Ａｐｏ  Ｂ１００）の分泌に必要である。ＶＬＤＬトリグリセリドの血漿レベルは、主にＬＰＬ脂肪分解活性における分泌速度によって同定される。ＬＤＬコレステロールの血漿レベルは、主にＡｐｏ  Ｂ１００の血漿への分泌、ＶＬＤＬのＬＤＬへの変換効率、およびＬＤＬ受容体媒介クリアランスによって同定される。ＨＤＬコレステロールレベルの調節は複雑であり、そのＡｐｏタンパク質の合成速度、ＬＣＡＴによる遊離コレステロールのコレステロールエステルへのエステル化、ＨＤＬからのコレステロールエステルのトリグリセリドリッチリポタンパク質およびＣＥＴＰ媒介輸送のレベル、ならびにＨＤＬ脂質およびＡｐｏタンパク質の血漿からのクリアランスに影響を受ける。
【０００６】
正常なリポタンパク質輸送は、低レベルのトリグリセリドおよびＬＤＬコレステロールならびに高レベルのＨＤＬコレステロールに関連する。リポタンパク質輸送が異常である場合、リポタンパク質レベルは、個体がアテローム性動脈硬化症および動脈硬化症を罹患しやすくするように変化し得る（Ｇｉｎｓｂｅｒｇ、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｍｅｔａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｎｏｒｔｈ  Ａｍ．、２７：５０３−１９（１９９８）を参照のこと）。
【０００７】
いくつかのリポタンパク質受容体は、細胞脂質取り込みに関連し得る。これらの受容体には、スカベンジャー受容体；ＬＤＬ受容体関連タンパク質／α２−マクログロブリン受容体（ＬＲＰ）；ＬＤＬ受容体；およびＶＬＤＬ受容体が含まれる。ＬＤＬ受容体を除いて、これらの全ての受容体は、アテローム硬化性病変中で発現する一方で、スカベンジャー受容体は主にマクロマージ中で発現し、ＬＲＰおよびＶＬＤＬ受容体は、平滑筋細胞中での脂質取り込みの媒介に重要な役割を果たし得る（Ｈｉｌｔｕｎｅｎら、Ａｒｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ、１３７（増補版）：Ｓ８１−８（１９９８））。
【０００８】
高コレステロール血症の薬理学的治療における主要な進展は、「スタチン」クラスの３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡレダクターゼ（ＨＭＧ  ＣｏＡレダクターゼ）阻害薬の開発であった。３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡレダクターゼは、コレステロール生合成速度調節酵素であり、肝臓におけるその阻害によりＬＤＬ受容体発現が刺激される。結果として、血漿ＬＤＬコレステロールレベルおよびアテローム性動脈硬化症のリスクを減少させる。ＬＤＬ受容体系の発見および分析は、細胞生物学、生理学、および医学に強い影響を与えた。
【０００９】
ＨＤＬは、末梢組織から非エステル化（すなわち、「遊離」）コレステロール（ＦＣ）を除去し、その後ほとんどのコレステロールが血漿中の酵素によってコレステロールエステル（ＣＥ）に変換されると考えられている。その後、ＨＤＬコレステロールは、選択的取り込み経路およびＨＤＬ受容体ＳＲ−ＢＩ（クラスＢのＩ型スカベンジャー受容体）を介して肝臓およびステロイド合成組織に有効且つ直接送達されるか、いくつかの種では、代謝でのさらなる輸送のために他のリポタンパク質に転送される。ＨＤＬおよびＬＤＬ代謝についてのさらなる考察については、Ｋｒｉｅｇｅｒ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９５：４０７７−４０８０、１９９８を参照のこと。
【００１０】
最近、骨粗鬆症分野で最大骨量の遺伝子調節について強い関心が寄せられている。この主に、正常範囲内での骨量のばらつきとの関連についての試験に適切な多型を有する候補遺伝子または骨粗鬆症患者で見出される低骨量範囲に関連する遺伝子および遺伝子座の実験に関心が寄せられている。ビタミンＤ受容体遺伝子座（ＶＤＲ）（Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ、３６７：２８４−２８７（１９９４））、ＰＴＨ遺伝子（Ｈｏｗａｒｄら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｍｅｔａｂ．、８０：２８００−２８０５（１９９５）；Ｊｏｈｎｓｏｎら、Ｊ．Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎｅｒ．Ｒｅｓ．、８：１１−１７（１９９５）；Ｇｏｎｇら、Ｊ．Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎｅｒ．Ｒｅｓ．、１０：Ｓ４６２（１９９５））およびエストロゲン受容体遺伝子（Ｈｏｓｏｉら、Ｊ．Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎｅｒ．Ｒｅｓ．、１０：Ｓ１７０（１９９５）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ、３６７：２８４−２８７（１９９４））が本研究で最も顕著に記載されている。骨量（表現型）が連続的、定量的、多遺伝子性であり、栄養素、共存症、年齢、身体活動度、および他の要因などの環境要因に混同されるのでこれらの研究は困難である。また、この型の研究デザインは、多数の被験体を必要とする。特に、これまでのＶＤＲ研究の結果は、混乱し、矛盾していた（Ｇａｒｎｅｒｏら、Ｊ．Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎｅｒ．Ｒｅｓ．、１０：１２８３−１２８８（１９９５）；Ｅｉｓｍａｎら、Ｊ．Ｂｏｎｅ．Ｍｉｎｅｒ．Ｒｅｓ．、１０：１２８９−１２９３（１９９５）；Ｐｅａｃｏｃｋ、Ｊ．Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎｅｒ．Ｒｅｓ．、１０：１２９４−１２９７（１９９５））。さらに、これまでのところ、研究によって機構について十分に明らかにされていないので、遺伝子による影響は骨量に対して効果を発揮し得る。
【００１１】
最大骨量の多くが環境要因よりもむしろ遺伝的に決定されていることが周知である一方で、骨量のばらつきに関連した遺伝子座（最終的には、遺伝子）を同定するための研究は困難且つ高価である。連鎖分析の力を利用する研究デザイン（例えば、同胞対または大家系）は、一般に、価値があるにもかかわらず単純な関連研究よりも有益である。しかし、骨量を含む遺伝子連鎖研究は、２つの主要な問題によって妨げられる。第１の問題は、上記の簡単に考察した表現型である。骨量は、連続的、定量的性質を示し、個別の表現型の確立は困難である。測定のための各解剖学的部位はいくつかの遺伝子に影響を受け、その多数が部位ごとに異なり得る。第２の問題は、表現型の年齢構成である。低骨量を有する個体を同定することができるまでに、その親または他の前世代のメンバーが減少するので研究に利用不可能であり、より若い世代は最大骨量に到達し得ず、遺伝子分析のための表現型が不確定となる可能性が高い。
【００１２】
それに関係なく、連鎖分析を使用して、遺伝性「障害」の原因遺伝子の位置を見出すことができ、これにはいかなる障害の生化学的性質の知識を必要としない（すなわち、障害を引き起こすと考えられている成熟タンパク質を知る必要がない）。伝統的アプローチは、評価されるべき候補として既知のタンパク質を意図し得る疾患過程に関する仮定に依存する。連鎖分析を使用した遺伝子位置決定アプローチを使用して、最初に欠失遺伝子が存在する一般的な染色体領域を見出し、その後特異的変異遺伝子の位置をできるだけ正確に同定するためにこの領域のサイズを段階的に減少させることができる。遺伝子自体を候補領域内で発見した後、伝令ＲＮＡおよびタンパク質を同定し、ＤＮＡと共に変異についてチェックする。
【００１３】
疾患を引き起こす遺伝子の変化が見出される前でさえも出生前診断に疾患の位置を使用することができるので、遺伝子位置決定アプローチは実践的である。連鎖分析は、その大半が病気の子供を有していなくとも、家族が疾患遺伝子のキャリアであるかどうかを知り、分子診断により出生していない子供の病態を評価することができる。次いで、家族内の疾患の伝播を使用して、欠失遺伝子を見出すことができる。本明細書中で使用される、「高骨量」（ＨＢＭ）の基準は、疾患状態の基準に類似するが、実践的観点から、高骨量は実際に被験体が骨粗鬆症として公知の疾患を回避するための一助となることができる。
【００１４】
親から子孫へ染色体が遺伝する性質により、連鎖分析が可能である。減数分裂中に、娘細胞への適切な分裂を導くように２つの親ホモログが対合する。これらが一列に並んで対合し、２つのホモログは、「交差」または「組換え」と呼ばれる事象の間に染色体片を交換する。得られた染色体はキメラである（すなわち、これらは両方の親のホモログ由来の部分を含む）。２つの配列が染色体上により接近して存在するほど、これらの間で組換えが起こる可能性が低くなり、より密接に連結する。連鎖分析実験では、染色体上の２つの位置はある世代から次世代までの間の組換え頻度の同定に従う。遺伝性疾患の研究では、一方の染色体位置を、疾患遺伝子またはその正常な類似物質によってマークする（すなわち、染色体領域の遺伝を個体が障害の症状の有無の試験によって同定することができる）。他方の位置を、２つのホモログをこれらが保有する「マーカー」のコピーに基づいて区別することができるように集団中の天然のばらつきを示すＤＮＡ配列によってマークする。各家族において、遺伝子マーカー配列の遺伝を、疾患状態の遺伝と比較する。高骨量などの常染色体優性障害を保有する家族内で各罹患個体が同一形態のマーカーを保有し、全ての非罹患個体が少なくとも１つの異なる形態のマーカーを保有する場合、疾患遺伝子およびそのマーカーは互いに隣接して存在する可能性が高い。この方法では、染色体を既知のマーカーで体系的にチェックして疾患状態と比較することができる。異なる家族から得たデータを合わせ、統計学的方法を使用したコンピュータによって互いに分析する。結果は、遺伝子マーカーと疾患との間の連鎖の可能性を示し、これらの間の距離が異なることを示す情報である。陽性の結果は、疾患がマーカーに非常に近接することを意味し、負の結果は疾患がこの染色体上で非常に離れているか全く異なる染色体上に存在することを示す。
【００１５】
罹患家族全員の所与のマーカー遺伝子座の分類およびマーカープローブでの特定の疾患状態の同時遺伝の評価によるこれらのうちの２つの同時遺伝の頻度の同定によって連鎖分析を行う。組換え頻度を、２つの遺伝子座の間の遺伝距離の基準として使用することができる。１％の組換え頻度は、１地図単位または１センチモルガン（ｃＭ）に等しく、これはおよそ１０００ｋｂのＤＮＡに等しい。この関係は、約２０％または２０ｃＭの頻度に維持されている。
【００１６】
全ヒトゲノムは３，３００ｃＭ長である。５〜１０ｃＭのマーカー遺伝子座内未知の疾患遺伝子を見出すために、全ヒトゲノムを、約１０ｃＭ間隔をあけたおよそ３３０個の情報マーカーを使用して調査することができる（Ｂｏｔｓｔｅｉｎら、Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．、３２：３１４−３３１（１９８０））。連鎖結果の信頼度を、多数の統計学的方法の使用によって確立する。ヒトの連鎖分析に最も一般的に使用される方法は、Ｏｔｔ、Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．、２８：５２８−５２９（１９７６）によってコンピュータプログラムＬＩＰＥＤに組み込まれたＬＯＤスコア法（Ｍｏｒｔｏｎ、Ｐｒｏｇ．Ｃｌｉｎ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｓ．、１４７：２４５−２６５（１９８４）、Ｍｏｒｔｏｎら、Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．、３８：８６８−８８３（１９８６））である。ＬＯＤスコアは、２つの遺伝子座が連鎖しない所与の距離（５０ｃＭを超える距離）で連鎖する尤度の対数である。対数値使用の利点は、同一の疾患を罹患する家族間で判断することができる点である。これには、所与の比較的小さなヒト家族の規模が必要である。
【００１７】
慣例により、＋３．０（すなわち、特定の組換え頻度での連鎖の確率は連鎖なしの確率の１０００倍である）を超える全ＬＯＤスコアは、特定の組換え頻度での連鎖についての有意な証拠であると考えられる。−２．０（すなわち、連鎖しない確率は、特定の頻度での連鎖の確率より１００倍高い）未満の全ＬＯＤスコアは、考慮される２つの遺伝子座が特定の組換え頻度で連鎖しないという強力な証拠であると考えられる。最近まで、ほとんどの連鎖分析は、目的の障害と特異的の遺伝子マーカーとの間の関連である二点データに基づいて行われていた。しかし、ここ数年にわたる急速なヒトゲノムマッピングの利点および付随するコンピュータ法の改良の結果として、多点データを使用した連鎖分析が容易に行えるようになった。多点分析により、マーカー間の組換え距離が既知の場合、疾患といくつかの関連遺伝子マーカーとの間の同時連鎖分析が得られる。
【００１８】
多点分析は、２つの理由で有利である。第１に、通常、血統の有益性が増大する。各血統は一定量の潜在的情報を有し、これはマーカー遺伝子座についてヘテロ接合性である親の数および家族内の罹患個体数に依存する。しかし、これら全ての個体で有益なほど十分に多型を有するマーカーはほとんどない。多数のマーカーを同時に考慮する場合、個体が少なくとも１つのマーカーにヘテロ接合性である可能性が非常に増大する。第２に、マーカー間の疾患遺伝子の位置の適応症を同定することができる。これにより隣接マーカーの同定が可能であるので、最終的に疾患遺伝子が存在する小さな領域を単離可能である。Ｌａｔｈｒｏｐら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８１：３４４３−３４４６（１９８４）は、最も広く使用されている多点分析用コンピュータパッケージＬＩＮＫＡＧＥを記載している。
【００１９】
当該分野で高骨量表現型に関連する遺伝子の同定が必要である。本発明は、この同定および他の重要な目的に関する。
【００２０】
［発明の要旨］
本発明は、遺伝子連鎖分析および変異分析による染色体１１ｑ１３．３上のＺｍａｘ１遺伝子およびＨＢＭ遺伝子を記載する。遺伝子に連結したさらなる遺伝子マーカーの使用は、この発見の一助となる。連鎖分析および変異分析により、脂質関連障害に罹患しやすい患者を容易に同定することができる。細菌人工染色体を使用したクローニング法により、発明者らは１１ｑ１３．３の染色体領域に注目し、常染色体優性遺伝子の配列決定を加速することができた。さらに、本発明はにより、Ｚｍａｘ１遺伝子およびＨＢＭ遺伝子が同定され、ＨＢＭ遺伝子およびＨＢＭ表現型を産生し、脂質レベルを変化させるＺｍａｘ１遺伝子中の第５８２位でのグアニン−チミン多型変異が同定される。
【００２１】
本発明により、Ｚｍａｘ１遺伝子およびＨＢＭ遺伝子が同定され、これらを使用して、ヒトが異常な脂質レベルに陥りやすいか、脂質によって媒介される疾患（例えば、アテローム性動脈硬化症、動脈硬化症、および関連疾患）に感受性を示すかどうかを同定することができる。ＨＢＭ遺伝子を有する個体は、ＬＤＬ、トリグリセリド、およびＶＬＤＬレベルが低く、ＨＤＬレベルが高い。言い換えれば、ＨＢＭ遺伝子はアテローム性動脈硬化症、動脈硬化症、および関連疾患のサプレッサーである。このインビボ所見は、ＨＢＭ遺伝子もしくはタンパク質またはそのフラグメントを有する正常な個体の治療により、アテローム性動脈硬化症、動脈硬化症、および関連病態を改善する有力な証拠である。
【００２２】
さらに、このような治療は、脂質関連疾患、特に動脈硬化症および関連病態の治療で必要である。例えば、脂質レベルが上昇しやすいヒト（すなわち、糖尿病、高コレステロール血症、および他の遺伝病、肥満症、男性自認（ｍａｌｅ  ｇｅｎｄｅｒ）、および喫煙者）を、本発明の手段で同定および／または治療することができる。さらに、本発明の方法および組成物は、糖尿病性アテローム性動脈硬化症、プラークの形成によって引き起こされる神経血管病態（例えば、脳卒中）、心血管疾患、関連する不十分な創傷治癒でのプラーク形成による不十分な循環の治療または予防に有用である。
【００２３】
種々の実施形態では、本発明は、ＨＢＭおよびＺｍａｘ１の核酸、タンパク質、ベクター、および形質転換宿主に関する。
【００２４】
さらに、本発明は、例えば、骨発育障害の遺伝子治療、医薬品開発、および診断アッセイを含む本発明の上記実施形態の適用に関する。好ましい実施形態では、本発明は、骨粗鬆症の治療、診断、予防、およびスクリーニング法に関する。
【００２５】
本発明のこれらおよび他の態様を、以下により詳細に記載する。
【００２６】
［発明の詳細な説明］
明細書および特許請求の範囲の理解を助けるために、以下の定義を記載する。
【００２７】
「遺伝子」は、そのテンプレートまたは伝令ＲＮＡによって特異的ペプチドに特徴的なアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列をいう。用語「遺伝子」には、介在領域、非コード領域、および調節領域が含まれ、５’末端および３’末端が含まれる。
【００２８】
「遺伝子配列」は、非転写または非翻訳配列を含む両方のＤＮＡ分子を含むＤＮＡ分子をいう。この用語はまた、同一のＤＮＡ分子上に存在する遺伝子、遺伝子フラグメント、非転写配列、または非翻訳配列の任意の組み合わせを含むことを意図する。
【００２９】
本発明の配列は、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡ、合成ＲＮＡ、またはその組み合わせを含む種々の供給源に由来し得る。このような配列は、ゲノムＤＮＡを含み得るが、これは天然に存在するイントロンを含んでも含まなくても良い。さらに、プロモーター領域またはポリ（Ａ）配列に会合したこのようなゲノムＤＮＡを得ることができる。この配列、ゲノムＤＮＡ、またはｃＤＮＡを、任意のいくつかの方法で得ることができる。ゲノムＤＮＡを、当該分野で周知の手段によって適切な細胞から抽出および精製することができる。あるいは、ｍＲＮＡを細胞から単離し、これを使用して逆転写酵素または他の手段によってｃＤＮＡを産生することができる。
【００３０】
「ｃＤＮＡ」は、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ（逆転写酵素）の作用によってＲＮＡテンプレートから産生された相補またはコピーＤＮＡをいう。したがって、「ｃＤＮＡクローン」は、クローニングベクターに含まれるかＰＣＲ増幅された目的のＲＮＡ分子に相補的な二重らせんＤＮＡ配列を意味する。この用語には、介在配列が除去された遺伝子が含まれる。
【００３１】
「組換えＤＮＡ」は、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ配列のインビトロスプライシングによって組換えられた分子を意味する。
【００３２】
「クローニング」は、特定の遺伝子または他のＤＮＡ配列をベクター分子に挿入するためのインビトロ組換え技術の使用をいう。所望の遺伝子を首尾よくクローン化するために、ＤＮＡフラグメントの作製方法、フラグメントのベクター分子への連結方法、合成ＤＮＡ分子の複製することができる宿主細胞への導入方法、およびレシピエント宿主細胞由来の標的遺伝子を有するクローンの選択方法を使用する必要がある。
【００３３】
「ｃＤＮＡライブラリー」は、生物の全ゲノムを共に含むｃＤＮＡ挿入断片を含む組換えＤＮＡ分子の集合体をいう。このようなｃＤＮＡライブラリーを、当業者に公知の方法によって調製することができ、これは、例えば、Ｃｏｗｅｌｌ  ａｎｄ  Ａｕｓｔｉｎ、″ｃＤＮＡ  ライブラリープロトコール″Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９７）に記載されている。一般に、最初にそのゲノムから特定の遺伝子をクローン化することが望まれる生物の細胞からＲＮＡを単離する。
【００３４】
「クローニング伝達体」は、宿主細胞中で複製することができるプラスミド、ファージＤＮＡ、または他のＤＮＡ配列をいう。クローニング伝達体は、形質転換細胞の同定での使用に適切なマーカーを含み得るＤＮＡの不可欠な生物学的機能を損なうことのない同定可能な様式でこのようなＤＮＡ配列を切断することができる１つまたは複数のエンドヌクレアーゼ認識部位によって特徴付けられる。
【００３５】
「発現調節配列」は、これらの遺伝子に作動可能に連結した場合、構造遺伝子の発現を調節または制御するヌクレオチド配列をいう。これらには、例えば、ｌａｃ系、ｔｒｐ系、λファージの主要なオペレーターおよびプロモーター領域、ｆｄ被覆タンパク質の調節領域、および原核細胞または真核細胞での遺伝子発現を調節することが公知の他の配列が含まれる。発現調節配列は、ベクターが原核生物または真核生物宿主において作動可能に連結された遺伝子を発現するようにデザインされているかどうかによって変化し、エンハンサーエレメント、終止配列、組織特異性エレメントなどの転写エレメントならびに／または翻訳開始および終止部位を含み得る。
【００３６】
「発現伝達体」は、クローニング伝達体に類似しているが、宿主への形質転換後に伝達体中でクローン化される遺伝子を発現することができる伝達体またはベクターをいう。クローン化遺伝子は、通常、発現調節配列の調節下（すなわち、作動可能に連結されている）で存在する。
【００３７】
「オペレーター」は、特異的リプレッサーと相互作用して隣接遺伝子の転写を調節することができるＤＮＡ配列をいう。
【００３８】
「プロモーター」は、ＲＮＡポリメラーゼによって認識することができるＤＮＡ配列をいう。このような配列の存在により、ＲＮＡポリメラーゼが結合し、作動可能に連結された遺伝子配列の転写が開始される。
【００３９】
「プロモーター領域」は、プロモーターおよび転写開始に必要であり得る他の遺伝子配列を含むことが意図される。プロモーター領域の存在は、作動可能に連結された配列の発現に十分である。
【００４０】
「作動可能に連結された」は、プロモーターが遺伝子発現の開始を調節することを意味する。宿主細胞への移入の際にプロモーターが１つまたは複数のＲＮＡ種への近位ＤＮＡ配列の転写を決定する場合、近位ＤＮＡ配列に作動可能に連結される。プロモーターがこのＤＮＡ配列の転写を開始することができる場合、プロモーターはＤＮＡ配列に作動可能に連結されている。
【００４１】
「原核生物」は、細菌を含む真の核を含まない全ての生物をいう。
【００４２】
「真核生物」は、哺乳動物細胞を含む真の核を有する生物および細胞をいう。
【００４３】
「宿主」には、酵母および糸状菌ならびに植物および動物などの原核生物および真核生物が含まれる。この用語には、複製可能な発現伝達体のレシピエントである生物または細胞が含まれる。
【００４４】
「動物」は、脊椎動物を含むことを意味する。好ましい脊椎動物には哺乳動物および鳥類だけでなく、魚類、爬虫類、および両生類も含まれる。好ましい哺乳動物には、ヒト、霊長類、げっ歯類、イヌ、ネコ、および家畜が含まれる。
【００４５】
遺伝子の「フラグメント」は、この遺伝子の生物活性を保有する任意の種々の遺伝子をいう。
【００４６】
「変異体」は、全遺伝子または遺伝子のフラグメントに構造および生物活性または免疫学的特長が実質的に類似する遺伝子をいう。２つの遺伝子が類似の活性を有する場合、これらを変異体とみなし、アミノ酸残基配列が同一でなくとも本明細書中でこの用語を使用する。
【００４７】
「核酸の増幅」は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、ライゲーション増幅（またはリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ））、およびＱ−βレプリカーゼの使用に基づいた増幅法などの方法をいう。これらの方法は当該分野で周知であり、例えば、米国特許第４，６８３，１９５号および同第４，６８３，２０２号に記載されている。ＰＣＲを実施するための試薬およびハードウェアは市販されている。ＨＢＭ領域由来の配列の増幅に有用なプライマーは、ＨＢＭ領域またはその標的領域に隣接する領域中の配列に相補的であるか特異的にハイブリッド形成することが好ましい。増幅によって作製したＨＢＭ配列を、直接配列決定することができる。あるいは、増幅配列を、配列分析前にクローン化することができる。
【００４８】
「抗体」は、ＨＢＭおよびＺｍａｘ１タンパク質およびそのフラグメントまたはＨＢＭもしくはＺｍａｘ１領域、特にＨＢＭ遺伝子座もしくはその一部由来の核酸配列に結合することができるポリクローナル抗体および／またはモノクローナル抗体およびそのフラグメント、ならびにその免疫学的結合等価物をいうことができる。抗体という用語を、均一な分子構成要素または複数の異なる分子構成要素から作製された血清産物などの混合物の両方をいうために使用する。タンパク質をタンパク質合成機で合成し、キャリア分子に結合し、数ヶ月にわたりウサギに注射することができる。ウサギ血清を、ＨＢＭタンパク質またはフラグメントに対する免疫反応性について試験する。モノクローナル抗体を、タンパク質またはそのフラグメントでのマウスの注射によって作製することができる。ＥＬＩＳＡによってモノクローナル抗体をスクリーニングし、ＨＢＭタンパク質またはそのフラグメントを使用して特異的免疫活性を試験する。Ｈａｒｌｏｗら、「抗体：実験マニュアル」、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ（１９８８）。これらの抗体は、アッセイおよび医薬品に有用である。抗体は、抗体フラグメント（例えば、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２など）ならびにヒト抗体、ヒト化抗体、および霊長類化抗体を含み得る。
【００４９】
「ＨＢＭ」は、高骨量をいうが、脂質調整にも関連し得るＨＢＭ遺伝子に関連する多型をいう。
【００５０】
「ＨＢＭタンパク質」は、グリシン１７１→バリンの変化を含むこと以外はＺｍａｘ１タンパク質と同一のタンパク質をいう。ＨＢＭタンパク質を、Ｚｍａｘ１の真のホモログをコードする任意の生物について定義する。例えば、マウスＨＢＭタンパク質は、グリシン１７０→バリン置換を有するマウスＺｍａｘ１タンパク質をいう。
【００５１】
「ＨＢＭ遺伝子」は、配列が配列番号４で示されるタンパク質をコードするＨＢＭの特徴または表現型を示す個体で見出されるゲノムＤＮＡ配列をいう。ＨＢＭ遺伝子およびＺｍａｘ１遺伝子は、対立遺伝子である。ＨＢＭ遺伝子によってコードされるタンパク質は、骨量を増加させ、生理学的脂質レベルを変化させる特性を有するが、Ｚｍａｘ１遺伝子によってコードされるタンパク質は、この特性を示さない。ＨＢＭ遺伝子およびＺｍａｘ１遺伝子は、ＨＢＭ遺伝子が第５８２位にチミジンを有するのに対し、Ｚｍａｘ１遺伝子は第５８２位にグアニンを有するという点が異なる。ＨＢＭ遺伝子は、配列番号２に示す核酸配列を含む。ＨＢＭ遺伝子を、「ＨＢＭ多型」ということもできる。
【００５２】
「正常」、「野生型」、「非罹患」、および「Ｚｍａｘ１」は全て配列番号３によって示されるタンパク質をコードするゲノムＤＮＡ配列をいう。Ｚｍａｘ１遺伝子は、第５８２位にグアニンを有する。Ｚｍａｘ１遺伝子は、配列番号１の核酸配列を含む。「正常」、「野生型」、「非罹患」、および「Ｚｍａｘ１」はまた、骨量の増加に寄与しないタンパク質をコードするゲノム配列の対立遺伝子変異体をいう。Ｚｍａｘ１遺伝子は、ヒト集団で一般的であり、ＨＢＭ遺伝子は稀である。
【００５３】
「５ＹＷＴ＋ＥＧＦ」は、５つのＹＷＴ反復の後にＥＧＦ反復からなるＺｍａｘ１タンパク質で見出される反復単位をいう。
【００５４】
「骨発達」は、一般に、例えば正常な発達を含む長期の骨の変化、疾患状態の際に生じる変化、および加齢で生じる変化に関連する任意の過程をいう。「骨発達障害」は、特に、例えば疾患状態の際に生じる変化および加齢で生じる変化を含む骨発達の任意の障害をいう。骨発達は、天然に進行性でも周期的でもよい。発達の際に変化し得る骨の局面には、例えば、鉱化作用、特定の解剖学的特長の形成、および種々の細胞型の相対数または絶対数が含まれる。
【００５５】
「骨調整」または「骨形成の調整」は、当業者が認識するように骨再構築に関連する任意の生理学的過程に影響を与える能力をいい、例えば、特に破骨細胞および骨芽細胞活性による骨吸収および骨付加成長が含まれ、本明細書中で使用されるいくつかまたは全ての骨形成および骨発達を含み得る。
【００５６】
「正常骨密度」は、Ｚスコアが０の２つの標準偏差内の骨密度をいう。
【００５７】
「脂質調節」または「脂質調整」は、ＨＢＭもしくはＺｍａｘ１遺伝子、ｍＲＮＡまたはこれらによってコードされるタンパク質の調整によって脂質レベルを調整する能力を意味する。脂質レベルの変化には、超低密度リポタンパク質（ＶＬＤＬ）、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）、高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）、およびトリグリセリドが含まれる。調節または調整は、被験体に投与した場合にＨＢＭまたはＺｍａｘ１活性を調整する薬剤による脂質レベルの増加または減少であり得る。「脂質代謝」は、種々のトリグリセリドおよびリポタンパク質が進行する生理学的サイクルを意味する。本発明の薬剤はまた、種々の脂質代謝を調整するということができる。
【００５８】
「脂質」には、好ましくは、超低密度リポタンパク質（ＶＬＤＬ）、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）、中密度リポタンパク質（ＩＤＬ）、高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）、およびトリグリセリドが含まれる。脂質には、アポリポタンパク質Ａ−１（アポリポタンパク質Ａ−１（ＡＰＯ  Ａ−１）、アポリポタンパク質Ｂ（ＡＰＯ  Ｂ）、アポリポタンパク質Ｅ（ＡＰＯ  Ｅ）など）およびリポタンパク質（リポタンパク質ａ（ＬＩＰＯａ）など）も含み得る。
【００５９】
「脂質媒介疾患または病態」は、動脈硬化症および関連病態、高コレステロール血症、高脂血症、アテローム性動脈硬化症、および脂質レベルの上昇に関連する病態または生活様式（例えば、真性糖尿病、喫煙、および肥満）（本明細書中で考察のものなど）を含むことを意味する。
【００６０】
「動脈硬化症」は、拡張症、動脈瘤、収縮期血圧の上昇、血栓形成、および塞栓症を発症し得るガラス質変性を伴う中膜肥大および内膜下線維症を含むことを意味する。動脈硬化症関連障害には、非アテローム性動脈硬化症（真性糖尿病、慢性腎不全、慢性ビタミンＤ中毒、弾性線維性仮性黄色腫、新生児特発性動脈カルシウム沈着、成人大動脈弁カルシウム沈着、およびウェルナー症候群など）が含まれるが、これらに限定されない。動脈硬化症およびアテローム性動脈硬化症に関連するさらなる障害には、真性糖尿病、高血圧、家族性高コレステロール血症、家族性混合型高脂血症、家族性異βリポ蛋白血症、家族性低αリポ蛋白血症、甲状腺機能低下症、コレステロールエステル貯蔵病、全身性紅斑性狼瘡、ホモシステイン血症（ｈｏｍｏｃｙｓｔｅｉｎｅｍｉａ）およびが含まれる。
【００６１】
「アテローム性動脈硬化症」は、動脈内腔上を侵食し、閉塞症を発症し得る内膜下の斑状壁内肥厚を意味する。アテローム性動脈硬化症プラークは、脂質、細胞、結合組織（ａｎｎｅｃｔｉｖｅ  ｔｉｓｓｕｅ）、グルコサミノグリカンの蓄積からなる。これは、以下の病態を発症することができる：狭窄症、血栓症、動脈瘤、または続発性塞栓（ｅｍｂｏｌｕｓ  ｓｕｐｅｒｖｅｎｅｓ）、および狭心症ならびに上記病態。
【００６２】
「Ｚｍａｘ１系」は、精製タンパク質、細胞抽出物、細胞、動物、ヒト、またはＺｍａｘ１が正常または変異形態で存在する物質の任意の他の組成物をいう。
【００６３】
「サロゲートマーカー」は、ＨＢＭ遺伝子または骨量の増加またはその両方に相関するが、骨密度よりも測定が容易な、細胞、組織、ヒト、または動物で認められる診断用の適応症、症状、兆候、または他の特徴をいう。サロゲートマーカーの一般的概念は、診断薬で十分に受け入れられている。
【００６４】
本発明は、それぞれ配列番号１および３で示された形態のＺｍａｘ１遺伝子およびＺｍａｘ１タンパク質ならびに他の密接に関連する変異体およびその正確な発現に必要なＺｍａｘ１の隣接染色体領域を含む。好ましい実施形態では、本発明は、配列番号１の核酸配列の少なくとも１５個の連続したヌクレオチドに関する。
【００６５】
本発明はまた、それぞれ配列番号２および４で示された形態のＨＢＭ遺伝子およびＨＢＭタンパク質ならびに他の密接に関連する変異体およびその正確な発現に必要なＨＢＭの隣接染色体領域を含む。好ましい実施形態では、本発明は、配列番号２の核酸配列の少なくとも１５個の連続したヌクレオチドに関する。より好ましくは、配列番号２の核酸配列の少なくとも１５個の連続したヌクレオチドに関し、少なくとも１５個の連続したヌクレオチドの１つが、第５８２位でチミジンである。
【００６６】
本発明はまた、Ｚｍａｘ１遺伝子領域のヌクレオチド配列およびＨＢＭ遺伝子領域のヌクレオチド配列に関する。より詳細には、好ましい実施形態は、Ｚｍａｘ１遺伝子領域Ｂ２００Ｅ２１−ＨおよびＢ５２７Ｄ１２−Ｈのセグメントを含むＢＡＣクローンである。好ましい実施形態は、配列番号５〜１２からなるＢＡＣクローンのヌクレオチド配列である。
【００６７】
本発明はまた、Ｚｍａｘ１遺伝子およびＨＢＭ遺伝子のＤＮＡプローブを同定するためのヌクレオチド配列、Ｚｍａｘ１遺伝子およびＨＢＭ遺伝子を増幅するためのＰＣＲプライマー、Ｚｍａｘ１遺伝子およびＨＢＭ遺伝子中のヌクレオチド多型、およびＺｍａｘ１遺伝子およびＨＢＭ遺伝子の調節エレメントに関する。
【００６８】
本発明は、遺伝子マーカーＤ１１Ｓ９８７とＳＮＰ＿ＣＯＮＴＩＧ０３３−６、ならびにＺｍａｘ１遺伝子およびＨＢＭ遺伝子のＤＮＡ配列との間の１１ｑ１３．３上のＺｍａｘ１遺伝子およびＨＢＭ遺伝子の染色体位置のさらなる位置決定を記載する。染色体位置を、遺伝子のマッピングに使用するマッピングパネルへのさらなる遺伝子マーカーの添加およびより多数の個体を含めるための血統の拡大によってさらに正確にした。遺伝子型分類した新規の個体は領域を小さくする重要な組換え事象を保有するので、血統拡大は重要であった。１１ｑ１３．３上の領域中の遺伝子を同定するために、この染色体領域を含むＢＡＣクローン組を同定した。ゲノムＤＮＡ配列決定用のテンプレートおよび直接ｃＤＮＡ選択によるコード配列の同定用の試薬としてＢＡＣクローンを使用した。ゲノム配列決定および直接ｃＤＮＡ選択を使用して、１１ｑ１３．３由来の１５０万塩基対を超えるＤＮＡを特徴付けた。Ｚｍａｘ１遺伝子がこの領域内で同定され、ＨＢＭ遺伝子が罹患および非罹患個体の変異分析後に発見された。
【００６９】
遺伝子が特定の染色体領域に遺伝的に位置決定された場合、この領域内の遺伝子を、以下を含む一連のステップによって分子レベルで特徴付けることができる：重複クローン組中の全ＤＮＡ領域のクローニング（物理的マッピング）；直接ｃＤＮＡ選択と、エクソントラッピングと、ＤＮＡ配列決定（遺伝子同定）との組み合わせによるこれらのクローンによってコードされる遺伝子の特徴づけ、ＨＢＭ一族の罹患および非罹患メンバーのＤＮＡ配列決定比較によるこれらの遺伝子の変異の同定（変異分析）。
【００７０】
目的の染色体領域中の固有の分子標識を増幅するようにデザインしたＰＣＲアッセイを使用した大腸菌またはサッカロミセス・セレヴィシエ中で増殖するベクターでクローン化されたヒトＤＮＡライブラリーのスクリーニングによって、物理的マッピングを行う。ＨＢＭ候補領域の物理的マップを作製するために、細菌人工染色体（ＢＡＣ）中でクローン化したヒトＤＮＡライブラリーを、ヒトゲノム計画の努力によって染色体１１ｑ１２−ｑ１３に以前にマッピングされている配列タグ部位（ＳＴＳ）マーカー組を使用してスクリーニングした。
【００７１】
ＳＴＳは、ＰＣＲによってアッセイすることができるヒトゲノム中の固有の分子標識である。ヒトゲノム計画の努力の組み合わせにより、２２個の上染色体上の数千のＳＴＳおよび２つの性染色体の位置が同定された。位置クローニングのために、ゲノムマッピングに使用するマーカーもまた物理的マッピング用のＳＴＳとして使用することができるので、物理的マップを遺伝子マップと関連付ける。遺伝子マーカー由来のＳＴＳと、遺伝子と、ランダムＤＮＡフラグメントとの組み合わせを使用したＢＡＣライブラリーのスクリーニングにより、目的の染色体領域中の全ＤＮＡを示すクローンの重複から構成される物理的マップを構築することができる。
【００７２】
ＢＡＣは、ヒトの巨大な（８０キロベース〜２００キロベース）セグメントまたは大腸菌中で増殖する他のＤＮＡ用のクローニングベクターである。ＢＡＣを使用して物理的マップを構築するために、所与のＳＴＳまたはＳＴＳ組に対応するＤＮＡ配列を保有する各クローンが同定されるようにＢＡＣクローンのライブラリーをスクリーニングする。ほとんどのヒトゲノムを通して、各ＢＡＣクローンが典型的には少なくとも２つのＳＴＳマーカーを含むようにＳＴＳマーカーを約２０〜５０キロベースの間隔をあけて配置する。さらに、スクリーニングしたＢＡＣライブラリーは、６倍を超えるヒトゲノムを対象とするのに十分なクローン化ＤＮＡを含む。したがって、各ＳＴＳは、典型的には、１つを超えるＢＡＣクローンを同定する。約５０キロベースの間隔をあけた一連のＳＴＳマーカーを使用した６倍を対象とするＢＡＣライブラリーのスクリーニングにより、一連の重複ＢＡＣクローン（すなわち、ＢＡＣコンティーグ）からなる物理的マップを、ヒトゲノムの任意の領域について構築することができる。物理的マップの調製に使用した多数のＳＴＳマーカーもまた遺伝子マーカーであるので、このマップをゲノムマップに関連付ける。
【００７３】
物理的マップを構築する場合、ゲノムのＳＴＳマップ中に所与の位置で重複しているＢＡＣクローンを同定できなくなくギャップが存在することが起こる。典型的には、最初に、物理的マップを、公的に利用可能な文献およびワールド・ワイド・ウェブリソースから同定されたＳＴＳ組から構築する。最初のマップは、未知の分子距離のギャップによって分離されたいくつかの個別のＢＡＣコンティーグからなる。これらのギャップを満たすＢＡＣクローンを同定するために、ギャップの両側のクローンの末端から新規のＳＴＳマーカーを開発することが必要である。ＢＡＣ隣接ギャップの末端２００〜３００塩基対の配列決定および１００以上の塩基対配列を増幅するためのＰＣＲアッセイの開発によってこれを行う。末端配列がヒトゲノム内で固有であることが証明された場合、新規ＳＴＳを使用して、ＢＡＣライブラリーをスクリーニングして物理的マップ中のギャップ由来のＤＮＡを含むさらなるＢＡＣを同定することができる。ＨＢＭ候補領域サイズ（２，０００，０００またはそれ以上の塩基対）の領域を対象とするＢＡＣコンティーグを構築するために、いくつかのクローンの末端から新規のＳＴＳマーカーを開発する必要がしばしばある。
【００７４】
ＢＡＣコンティーグの構築後、この重複クローン組を、染色体領域中でコードされる遺伝子の同定のためのテンプレートとして使用する。遺伝子同定を、多数の方法によって行うことができる。一般に、以下の３つの方法が使用されている。（１）全染色体領域を示すようにＢＡＣコンティーグから選択されたＢＡＣ組を配列決定し、コンピュータ法を使用して全遺伝子を同定することができる、（２）ＢＡＣコンティーグ由来のＢＡＣを直接ｃＤＮＡ選択と呼ばれる方法によって領域中でコードされる遺伝子に対応するｃＤＮＡをクローン化するための試薬として使用することができる、または（３）ＢＡＣコンティーグ由来のＢＡＣを使用して、エクソントラッピングと呼ばれる手順における特異的ＤＮＡ配列の選択によってコード配列を同定することができる。本発明は、最初の２つの方法によって同定された遺伝子を含む。
【００７５】
ＨＢＭ候補領域を示す全ＢＡＣコンティーグを配列決定するために、プラスミドベクターでのサブクローニングおよびその後のこれらのサブクローンのＤＮＡ配列決定のためにＢＡＣ組を選択した。ＢＡＣ中でクローン化されたＤＮＡがゲノムＤＮＡを示すので、この配列決定はｃＤＮＡ配列決定と区別するためにゲノム配列決定と呼ぶ。目的の染色体領域のゲノム配列決定を開始するために、いくつかの重複ＢＡＣクローンを選択する。各ＢＡＣクローンのＤＮＡを調製し、クローンをランダムな小さなフラグメントに切断し、ｐＵＣ１８などの標準的なプラスミドベクターにクローン化する。次いで、プラスミドクローンを小さなフラグメントを増殖させるために成長させ、これらは配列決定用テンプレートである。ＢＡＣ  ＤＮＡ配列の適切な範囲および配列の質を確保するために、ＢＡＣクローンの６倍の範囲が得られるように十分なプラスミドクローンを配列決定する。例えば、ＢＡＣが１００キロベース長である場合、６００キロベースの配列が得られるようにファージミドを配列決定する。ＢＡＣ  ＤＮＡがファージミドベクターでのクローニング前に無作為に切断されているので、６００キロベースの未処理ＤＮＡ配列を、コンピュータ法による配列コンティーグと呼ばれる重複ＤＮＡ配列に構築することができる。コンピュータ法による最初の遺伝子同定の目的のために、各ＢＡＣの６倍の範囲は、１０００塩基対〜２０，０００塩基対の１０〜２０個の配列コンティーグを得るのに十分である。
【００７６】
本発明で使用した配列決定ストラテジーは、最初にＨＢＭ候補領域中のＢＡＣコンティーグから「種」ＢＡＣを配列決定する個であった。ついで、「種」ＢＡＣ配列を使用して、コンティーグ由来の最小重複ＢＡＣを同定し、続いてこれらを配列決定した。この様式では、全候補領域を、各ＢＡＣ中に残存するいくつかの小さな配列ギャップを使用して配列決定した。この配列を、コンピュータ遺伝子同定用のテンプレートとして使用した。１つのコンピュータ遺伝子同定法は、ＢＡＣコンティーグとｃＤＮＡおよびゲノム配列の公的に利用可能なデータベース（例えば、ｕｎｉｇｅｎｅ、ｄｂＥＳＴ、ｇｅｎｂａｎｋ）との配列比較である。これらの比較は、典型的には、コンピュータアルゴリズムのＢＬＡＳＴファミリーおよびプログラムを使用して行う（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２１５：４０３−４１０（１９９０））。ＢＡＣ配列をタンパク質配列に翻訳することができ、このタンパク質配列を使用し、タンパク質配列を分析するためにデザインされたＢＬＡＳＴバージョンを使用して公的に利用可能なタンパク質データベースを検索することができる（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、２５：３３８９−３４０２（１９９７））。別の方法は、全てのエクソンに共通の特異的ＤＮＡ配列モチーフの存在およびヒトタンパク質コード配列に典型的にコドン使用頻度の存在に基づいた配列中のエクソンの位置を予想するＭＺＥＦ（Ｚｈａｎｇ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、９４：５６５−５６８（１９９７））およびＧＲＡＩＬ（Ｕｂｅｒｂａｃｈｅｒら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．、２６６：２５９−２８１（１９９６））などのコンピューターアルゴリズムを使用することである。
【００７７】
コンピュータ法による遺伝子同定に加えて、遺伝子を、直接ｃＤＮＡ選択によっても同定した（Ｄｅｌ  Ｍａｓｔｒｏら、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．５（２）：１８５−１９４（１９９５））。直接ｃＤＮＡ選択では、目的の組織由来のｃＤＮＡプールを調製し、候補領域由来のＢＡＣを脂質ハイブリッド形成アッセイで使用して塩基対がＢＡＣ中のコード領域に対応しているｃＤＮＡを捕捉する。本明細書中に記載の方法では、ポリＡ  ＲＮＡ由来の第１のｃＤＮＡ鎖のランダムプライミング、標準的方法による第２のｃＤＮＡ鎖の合成、およびｃＤＮＡフラグメント末端へのリンカーの添加によっていくつかの異なる組織からｃＤＮＡプールを作製した。リンカーを使用してｃＤＮＡプールを増幅する。ＢＡＣクローンを、インビトロＤＮＡ合成用のテンプレートとして使用して、ＢＡＣ  ＤＮＡのビオチン標識コピーを作製する。ＢＡＣ  ＤＮＡのビオチン標識コピーを変性し、過剰の増幅ＰＣＲとインキュベートし、変性させたｃＤＮＡプールに結合させる。ＢＡＣ  ＤＮＡおよびｃＤＮＡを溶液中でアニーリングし、ストレプトアビジンコート磁性ビーズを使用してＢＡＣとｃＤＮＡとの間のヘテロ二重らせんを単離する。ＢＡＣによって捕捉されたｃＤＮＡを、リンカー配列に相補的なプライマーを使用して増幅し、第２ラウンドでハイブリッド形成／選択ステップを繰り返す。２ラウンドの直接ｃＤＮＡ選択後、ｃＤＮＡフラグメントをクローン化し、これらの直接選択フラグメントのライブラリーを作製する。
【００７８】
直接選択によって単離されたｃＤＮＡクローンを２つの方法で分析する。ＨＢＭ候補領域由来のＢＡＣプールを使用してゲノムＤＮＡ配列が得られるので、各ＢＡＣに対してｃＤＮＡがマッピングされるはずである。マイクロタイター皿でのＢＡＣの整列および高密度グリッドでのそのＤＮＡの複製によってこれを行う。次いで、各ｃＤＮＡクローンをグリッドにハイブリッド形成させ、直接選択で使用した組由来の各ＢＡＣと配列同一性を有することを確認し、このＢＡＣの特異的同一性を同定する。各ＢＡＣに対応することが確認されたｃＤＮＡクローンを配列決定する。直接選択によって単離したｃＤＮＡクローンが以前に同定した遺伝子と配列同一性または類似性を共有するかどうかを同定するために、ＤＮＡおよびタンパク質コード配列を、ＢＬＡＳＴプログラムファミリーを使用して公的に利用可能なデータベースと比較する。
【００７９】
ＢＡＣ配列決定および直接ｃＤＮＡ選択によって得られたＤＮＡ配列とｃＤＮＡ配列との組み合わせにより、領域中の最初の推定遺伝子リストが得られる。領域中の遺伝子は全てＨＢＭ遺伝子座の候補であった。各遺伝子をさらに特徴付けるために、ノーザンブロットを行って、各遺伝子に対応する転写物のサイズを決定し、推定エクソンが共に転写されて各遺伝子が作製されるかどうかを同定した。各遺伝子のノーザンブロット分析のために、直接選択されたｃＤＮＡクローンからか目的の推定遺伝子をコードするゲノムＤＮＡまたはＢＡＣ由来の特異的フラグメントのＰＣＲ増幅によってプローブを調製した。ノーザンブロットにより、転写物のサイズおよび発現される組織の情報が得られる。高度に発現しない転写物のために、反応のテンプレートとして目的の組織由来のＲＮＡを使用した逆転写ＰＣＲアッセイを行う必要がある場合がある。
【００８０】
コンピュータ法および直接ｃＤＮＡ選択による遺伝子同定により、染色体領域中の遺伝子についての固有の情報が得られる。遺伝子が同定された場合、各遺伝子について異なる個体を試験することが可能である。
【００８１】
Ｉ．ＤＸＡ測定を使用した表現型分類
クレイトン大学（Ｏｍａｈａ、Ｎｅｂｒａｓｋａ）で行った脊椎骨塩含量（ＢＭＣ）および骨塩密度（ＢＭＤ）測定を、Ｎｏｒｌａｎｄ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓの密度計（Ｎｏｒｌａｎｄ  ＸＲ２６００  Ｄｅｎｓｉｔｏｍｅｔｅｒ、二重エネルギーＸ線吸収法、ＤＸＡ）を使用したＤＸＡによって行った。他の位置での脊椎ＢＭＣおよびＢＭＤには、利用可能な装置を使用した。現在合衆国で操作されているＤＸＡ装置は８００台であると推定される。ほとんどの大都市は、ＤＸＡ（通常、ＬｕｎａｒまたはＨｏｌｏｇｉｃ装置）を有するオフィスおよび画像処理センターを有する。脊椎ＢＭＣおよびＢＭＤデータが得られた各位置は、ＢＭＤの測定のための目的の領域が適切に選択される評価が得られるようなその装置からのプリントアウトのコピーを含んでいた。完全な病歴および骨のラジオグラフが得られた。
【００８２】
ＨＢＭ表現型を、以下の基準によって定義する：超高脊髄ＢＭＤ；いかなる公知の高骨量症候群も欠く病歴；および体肢骨格の正常な形態を示す骨のラジオグラフ。
【００８３】
ＩＩ．マイクロサテライトマーカーの遺伝子型分類
Ｊｏｈｎｓｏｎら、Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．、６０：１３２６−１３３２（１９９７）によって最初に報告されたものより小さい領域の遺伝子間隔を狭くするために、染色体１１ｑ１２−１３上のさらなるマイクロサテライトマーカーを分類した。新規のマーカーを以下を含んでいた。Ｄ１１Ｓ４１９１、Ｄ１１Ｓ１８８３、Ｄ１１Ｓ１７８５、Ｄ１１Ｓ４１１３、Ｄ１１Ｓ４１３６、Ｄ１１Ｓ４１３９、（Ｄｉｂ，ら、Ｎａｔｕｒｅ、３８０：１５２−１５４（１９９６）、ＦＧＦ３（Ｐｏｌｙｍｅｒｏｐｏｌｏｕｓ，ら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．、１８：７４６８（１９９０））およびＧＴＣ＿ＨＢＭ＿マーカー＿１、ＧＴＣ＿ＨＢＭ＿マーカー＿２、ＧＴＣ＿ＨＢＭ＿マーカー＿３、ＧＴＣ＿ＨＢＭ＿マーカー＿４、ＧＴＣ＿ＨＢＭ＿マーカー＿５、ＧＴＣ＿ＨＢＭ＿マーカー＿６、ａｎｄ  ＧＴＣ＿ＨＢＭ＿マーカー＿７（図２を参照のこと）。
【００８４】
資格を有する瀉血専門医によってラベンダーキャップ（ＥＤＴＡ含有）に採血した（２０ｍｌ）。ＤＮＡ抽出まで血液を冷蔵保存した。収量の質および量を損なうことなく冷蔵庫で７日まで保存した血液からＤＮＡを抽出した。異なる施設で採血したこれらの被験体のために、１ダースを超える検体に対して運搬プロトコールを首尾よく使用した。血液サンプルを、冷却用フリーザーパックを入れたスタイロフォームコンテナに入れ、夜行列車で運搬した。ラベンダーキャップチューブを各プラスチック製運搬チューブに入れ、さらに「ジップ・ロック」バイオハザードバッグに入れた。翌日にサンプルが到着した場合、即座にＤＮＡ抽出処理を行った。
【００８５】
ＤＮＡ抽出法では、Ｇｅｎｔｒａ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｉｎｃ．（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、Ｍｉｎｎｅｓｏｔａ）から購入したキットを使用した。簡単に述べれば、この手順は、全血への３倍体積赤血球溶解緩衝液の添加を含む。室温で１０分間のインキュベーション後、溶液をＢｅｃｋｍａｎ卓上遠心分離機にて２，０００×ｇで１０分間遠心分離した。白血球ペレットを、細胞溶解緩衝液に再懸濁した。一旦ペレットが完全に再懸濁して細胞凝集体が遊離すると、溶液をＲＮアーゼＡにて３７℃で１５分間消化した。市販のタンパク質沈殿溶液の添加によってタンパク質を沈殿させ、遠心分離によって除去した。イソプロパノールの添加によってＤＮＡを上清から沈殿させた。この方法はたった１〜２時間しか必要としない簡単且つ迅速な方法であり、数ダースのサンプルを同時に処理可能である。通常、２０ｍｌの全血サンプルから８ｍｇを超えるＤＮＡの収量が得られ、５０ｋｂのＭＷであった。ＤＮＡを、エタノール沈殿物として−８０℃でコードした５０ｇアリコートの保存によって保存した。
【００８６】
１つの蛍光標識オリゴヌクレオチドプライマーおよび１つの非標識オリゴヌクレオチドプライマーを使用して、ＤＮＡを遺伝子分類した。標識および非標識オリゴヌクレオチドを、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｉｎｃ．（Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ、Ｉｏｗａ）から得た。マイクロサテライト遺伝子分類用の他の全ての試薬を、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ−Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｉｎｃ．（「ＰＥ−ＡＢＩ」）（Ｎｏｒｗａｌｋ、Ｃｏｎｎｅｃｔｉｃｕｔ）から購入した。ＰＥ−ＡＢＩか説明するように、ＡｍｐｌｉＴａｇ  ＤＮＡポリメラーゼを使用して各マーカーについてそれぞれＰＣＲ反応を行った。反応物を、脱イオンホルムアミド、ブルーデキストラン、およびＴＡＭＲＡ３５０サイズ標準（ＰＥ−ＡＢＩ）を含む３．５ｌμｌのローディング緩衝液に添加した。ＤＮＡ変性のための９５℃で５分間の加熱後、モデル３７７ＤＮＡシークエンサー（ＰＥ−ＡＢＩ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）の操作マニュアルに記載のようにサンプルをロードし、電気泳動を行った。ゲル電気泳動後、ＰＥ−ＡＢＩ  ＧＥＮＥＳＣＡＮ（商標）およびＧＥＮＯＴＹＰＥＲ（商標）ソフトウェアを使用してデータを分析した。第１に、ＧＥＮＥＳＣＡＮ（商標）ソフトウェア内で、第１の分析ステップの前にレーン追跡をマニュアルで最適化した。ゲルレーンデータの抽出後、各レーンの検量線プロフィールを試験し、直線性およびサイズ呼び出し（ｃａｌｌｉｎｇ）について評価した。これらのパラメータのいずれかに問題を有するレーンを再追跡し、評価した。一旦全てのレーンが追跡され、サイズ標準が正確に同定されると、対立遺伝子同定のためにデータをＧＥＮＯＴＹＰＥＲ（商標）にインポートした。対立遺伝子呼び出し（ビニング）を迅速に行うために、ガイ・ファン・カンプ博士のインターネットウェブサイト（ｈｔｔｐ：／／ａｌｔ．ｗｗｗ．ｕｉａ．ａｃ．ｂｅ／ｕ／ｄｎａｌａｂ／ｌｄ．ｈｔｍｌ）のプログラムＬｉｎｋａｇｅ  Ｄｅｓｉｇｎｅｒを使用した。このプログラムは、ＧＥＮＯＴＹＰＥＲ（商標）によって作成したデータの血統ドローイングプログラムＣｙｒｉｌｌｉｃ（Ｖｅｒｓｉｏｎ  ２．０、Ｃｈｅｒｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｌｉｍｉｔｅｄ、Ｏｘｆｏｒｄ、Ｇｒｅａｔ  Ｂｒｉｔａｉｎ）へのインポートおよびその後のプログラムＬＩＮＫＡＧＥ（Ｌａｔｈｒｏｐら、Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．、３７：４８２−４９８（１９８５））を使用した連鎖分析を非常に容易にする。
【００８７】
ＩＩＩ．連鎖分析
図１は、本発明の遺伝子連鎖研究で使用した個体の血統を示す。詳細には、プログラムＬＩＮＫＡＧＥ（Ｌａｔｈｒｏｐら、Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．、３７：４８２−４９８（１９８５））のＭＩＬＩＮＫおよびＬＩＮＫＭＡＰコンポーネントを使用して２点連鎖分析を行った。血統／マーカーデータを、プレファイルとしてＣｙｒｉｌｌｉｃからＭａｋｅｐｅｄプログラムにエクスポートし、連鎖分析のために適切なプレファイルに変換した。
【００８８】
以下の３つのモデルを使用して元の連鎖分析を行った：（ｉ）常染色体優性の完全に浸透性形質のモデル、（ｉｉ）浸透性が減少した常染色体優性モデル、（ｉｉｉ）量的形質モデル。ＨＢＭ遺伝子座を、巨大な家系を拡大した２２人由来の結合マーカーのＤＮＡの分析によって染色体１１ｑ１２−１３にマッピングした。６〜２２ｃＭの範囲の間隔で２２個の常染色体にわたる３４５個の蛍光マーカーのパネルを使用した高度に自動化された技術を使用した。第１１染色体のこの領域由来のマーカーのみが連鎖の証拠を示した（ＬＯＤスコアは約３．０）。２点および多点分析によって得られた最も高いＬＯＤスコア（５．７４）は、Ｄ１１Ｓ９８７であった（図２のマップ位置５５）。マーカーＤ１１Ｓ９０５とＤ１１Ｓ９３７との間のＨＢＭ遺伝子座に９５％の信用度で間隔が存在した（図２のマップ位置４１−７１）。ハプロタイプ分析により、これと同一の領域内にＺｍａｘ１遺伝子が配置される。マーカーＤ１１Ｓ９８７、Ｄ１１Ｓ９０５、およびＤ１１Ｓ９３７についてのさらなる説明を、Ｇｙａｐａｙら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、第７巻、（１９９４）に見出すことができる。
【００８９】
本発明では、本発明者らは、マーカーＤ１１Ｓ９８７とＧＴＣ＿ＨＢＭ＿マーカー＿５との間の領域のＨＢＭ間隔の縮小を報告する。これら２つのマーカーは、最初の分析由来の範囲確定マーカー（Ｄ１１Ｓ１１Ｓ９０５およびＤ１１Ｓ９３７）の間に存在し、互いに約３ｃＭである。以下のマーカー由来の遺伝子型データを使用して、間隔の縮小を行った：Ｄ１１Ｓ４１９１、Ｄ１１Ｓ１８８３、Ｄ１１Ｓ１７８５、Ｄ１１Ｓ４１１３、Ｄ１１Ｓ４１３６、Ｄ１１Ｓ４１３９、（Ｄｉｂら、Ｎａｔｕｒｅ、３８０：１５２−１５４（１９９６））、ＦＧＦ３（Ｐｏｌｙｍｅｒｏｐｏｌｏｕｓら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．、１８：７４６８（１９９０））（遺伝子マーカーについての情報は、ゲノムデータベースのインターネットサイトｈｔｔｐ：／／ｇｄｂｗｗｗ．ｇｄｂ．ｏｒｇ／で見出すことができる）およびマーカーＧＴＣ＿ＨＢＭ＿マーカー＿１、ＧＴＣ＿ＨＢＭ＿マーカー＿２、ＧＴＣ＿ＨＢＭ＿マーカー＿３、ＧＴＣ＿ＨＢＭ＿マーカー＿４、ＧＴＣ＿ＨＢＭ＿マーカー＿５、ＧＴＣ＿ＨＢＭ＿マーカー＿６、およびＧＴＣ＿ＨＢＭ＿マーカー＿７。
【００９０】
図１に示すように、上記遺伝子マーカーを使用したハプロタイプ分析により、Ｚｍａｘ１遺伝子が位置決定された第１１染色体の間隔を有意に正確にする個体９０１９および９０２０における組換え事象（交差）が同定される。個体９０１９はＨＢＭ遺伝子を有する母系染色体由来の第１１染色体の一部および第１１染色体ホモログ由来の一部を遺伝しているＨＢＭ罹患個体である。ＨＢＭ遺伝子保有染色体から遺伝した部分には、以下のマーカーが含まれる：Ｄ１１Ｓ９３５、Ｄ１１Ｓ１３１３、ＧＴＣ＿ＨＢＭ＿マーカー＿４、Ｄ１１Ｓ９８７、Ｄ１１Ｓ１２９６、ＧＴＣ＿ＨＢＭ＿マーカー＿６、ＧＴＣ＿ＨＢＭ＿マーカー＿２、Ｄ１１Ｓ９７０、ＧＴＣ＿ＨＢＭ＿マーカー＿３、Ｄ１１Ｓ４１１３、ＧＴＣ＿ＨＢＭ＿マーカー＿１、ＧＴＣ＿ＨＢＭ＿マーカー＿７およびＧＴＣ＿ＨＢＭ＿マーカー＿５。Ｄ１１Ｓ４１３６由来の部分およびテロメア方向での継続は、非ＨＢＭ  染色体由来である。このデータにより、マーカーＧＴＣ＿ＨＢＭ＿マーカー＿５にセントロメリック（ｃｅｎｔｒｏｍｅｒｉｃ）である位置にＺｍａｘ１遺伝子が置かれる。個体９０２０は、重要な組換え事象も示す非罹患個体である。この個体は以下のマーカーを含む組換え親第１１染色体を遺伝する：ＨＢＭ遺伝子を保有する父系（個体０１１５）第１１染色体ホモログ由来のＤ１１Ｓ９３５、Ｄ１１Ｓ１３１３、ＧＴＣ＿ＨＢＭ＿マーカー＿４、Ｄ１１Ｓ９８７、Ｄ１１Ｓ１２９６、およびＧＴＣ＿ＨＢＭ＿マーカー＿６、ならびにＨＢＭ遺伝子を保有しない父系第１１染色体由来のマーカー：ＧＴＣ＿ＨＢＭ＿マーカー＿２、Ｄ１１Ｓ９７０、ＧＴＣ＿ＨＢＭ＿マーカー＿３、ＧＴＣ＿ＨＢＭ＿マーカー＿１、ＧＴＣ＿ＨＢＭ＿マーカー＿７、ＧＴＣ＿ＨＢＭ＿マーカー＿５、Ｄ１１Ｓ４１３６、Ｄ１１Ｓ４１３９、Ｄ１１Ｓ１３１４、およびＤ１１Ｓ９３７。マーカーＤ１１Ｓ４１１３は、個体０１１５におけるホモ接合性のために有益ではない。この組換え事象により、マーカーＤ１１Ｓ１２９６とＤ１１Ｓ９８７との間のＨＢＭ領域のセントロメア境界が配置される。
【００９１】
２点連鎖分析を使用して、第１１染色体上のＺｍａｘ１遺伝子の位置も確認した。完全浸透度モデルにおける２点連鎖分析についての連鎖の結果を表１に示す。この表は、第１の列に遺伝子マーカーを、表のトップに組換え比を列挙している。列の各セルは、最初の行に示す組換え比でのＺｍａｘ１遺伝子に対する連鎖について試験した各マーカーについてのＬＯＤスコアを示す。例えば、マーカーＤ１１Ｓ９７０でピークスコア７．６６を示し、これはハプロタイプ分析によって定義された間隔内である。
【００９２】
【表１】
2004523724.tif 000003
【００９３】
単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）により、ＨＢＭ領域がさらに定義する。このＳＮＰはＳＮＰ＿コンティーグ０３３−６と呼ばれ遺伝子マーカーＧＴＣ＿ＨＢＭ＿マーカー＿５に対して２５ｋｂセントロメリックで存在する。このＳＮＰは遺伝子マーカーＧＴＣ＿ＨＢＭ＿マーカー＿７にテロメリックである。ＳＮＰ＿コンティーグ０３３−６は、ＨＢＭ罹患個体０１１３に存在する。しかし、ＨＢＭ罹患個体９０１９（０１１３の息子）は、このＳＮＰを保有していない。したがって、これは、交差はこのＳＮＰにセントロメリックであることを示す。遺伝子  マーカーＧＴＣ＿ＨＢＭ＿マーカー＿５およびＧＴＣ＿ＨＢＭ＿マーカー＿７のプライマー配列を、以下の表２に示す。
【００９４】
【表２】
2004523724.tif 000004
【００９５】
記載の一族は、非常に興味深いいくつかの特徴を有し、その最も重要なことは、その骨が非常に密度が高い一方で絶対的に正常な形態を有することである。ＨＢＭ罹患個体の骨の外のり寸法は正常である一方で髄腔が存在し、造血は妨害されない。ＨＢＭ罹患メンバーは骨折に耐性を示すようであり、試験したメンバーにおいて神経学的症状および任意の器官または系の機能障害の症状は認められない。一族のＨＢＭ罹患メンバーは、過度の疾患または障害を罹患することなく加齢する。さらに、ＨＢＭ表現型は、骨粗鬆症、骨粗鬆症性偽神経膠腫、エンゲルマン病、リビング病、高ホスファターゼ血症、ファン・ブッヘム病、メロレオストーシス、大理石骨病、ピクノディスオストーシス、硬化狭窄症、オステオポイキリー、先端巨大症、パジェット病、線維性骨形成異常、血管狭窄、骨形成不全症、甲状腺機能低下症、偽性上皮小体機能低下症、偽性偽性副甲状腺機能低下症、原発性および二次性副甲状腺機能亢進症および関連症候群、高カルシウム尿症、甲状腺髄様癌、骨軟化症および他の疾患などの他の骨障害に適合しない。この家族のＨＢＭ遺伝子座は、骨密度の調節に関して非常に強力且つ実質的役割を有し、その同定は、骨密度および骨粗鬆症などの疾患の病因を調節する経路の理解における重要なステップであることが明白である。
【００９６】
さらに、ＨＢＭ遺伝子を保有する（すなわち、ＨＢＭタンパク質の発現する）高齢の個体は、正常な個体に特有の骨量の損失が認められない。さらに、ＨＢＭ遺伝子を保有する固体は、トリグリセリド、ＶＬＤＬ、およびＬＤＬが低く、そして／またはＨＤＬが増加する。言い換えれば、ＨＢＭ遺伝子は骨粗鬆症のサプレッサーであり、心血管リスクである動脈硬化症および／またはアテローム性動脈硬化症関連病態を低減することができる。基本的に、ＨＢＭ遺伝子を保有する個体にＨＢＭタンパク質を投与すると、結果として有害脂質レベル（例えば、ＶＬＤＬ、ＬＤＬ、およびトリグリセリド）が低下する。このインビボ所見は、正常な個体のＨＢＭ遺伝子もしくはタンパク質またはそのフラグメントでの治療により骨粗鬆症および動脈硬化症またはアテローム動脈硬化症が改善されることの有力な証拠である。
【００９７】
ＩＶ．物理的マッピング
ＨＢＭ遺伝子座のクローニングおよび特徴づけのための試薬を得るために、上記の遺伝子マッピングデータを使用して、染色体１１ｑ１３．３上にＺｍａｘ１を含む領域の物理的マップを構築した。物理的マップは、整列した分子標識組および染色体１１ｑ１３．３由来のＺｍａｘ１遺伝子領域を含むＢＡＣクローン組からなる。
【００９８】
種々の公的に利用可能なマッピングリソースを利用して、ＨＢＭ領域中の既存のＳＴＳマーカー（Ｏｌｓｏｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４５：１４３４−１４３５（１９８９））を同定した。リソースには、ＧＤＢ（ホワイトヘッドゲノムセンター）、ｄｂＳＴＳおよびｄｂＥＳＴ（ＮＣＢＩ）、１１ｄｂ（テキサス大学サウスウェスタン医学センター、ＧＥＳＴＥＣ、スタンフォード大学ヒトゲノムセンター、およびいくつかの参考文献（Ｃｏｕｒｓｅａｕｘら、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、４０：１３−２３（１９９７）、Ｃｏｕｒｓｅａｕｘら、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、３７：３５４−３６５（１９９６）、Ｇｕｒｕら、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、４２：４３６−４４５（１９９７）、Ｈｏｓｏｄａら、Ｇｅｎｅｓ  Ｃｅｌｌｓ、２：３４５−３５７（１９９７）、Ｊａｍｅｓら、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．、８：７０−７６（１９９４）、Ｋｉｔａｍｕｒａら、ＤＮＡ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、４：２８１−２８９（１９９７）、Ｌｅｍｍｅｎｓら、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、４４：９４−１００（１９９７）、Ｓｍｉｔｈら、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．、７：８３５−８４２（１９９７）））を含んでいた。マップを手動で取り込んで、Ｚｍａｘ１を含む領域へのマーカーマッピングを同定した。
【００９９】
既存のＳＴＳのプライマーをＧＤＢから得るか、参考文献を以下の表３に列挙する。したがって、表３は、Ｚｍａｘ１遺伝子領域の物理的マップの作製に使用したＳＴＳマーカーを示す。
【０１００】
【表３−１】
2004523724.tif 000005
【０１０１】
【表３−２】
2004523724.tif 000006
【０１０２】
【表３−３】
2004523724.tif 000007
【０１０３】
【表３−４】
2004523724.tif 000008
【０１０４】
【表３−５】
2004523724.tif 000009
【０１０５】
公的に利用可能なゲノム配列または配列由来ＢＡＣ挿入断片末端から新規のＳＴＳを開発した。Ｃｒｏｓｓ＿ｍａｔｃｈ（Ｐ．Ｇｒｅｅｎ、Ｕ．ｏｆ  Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ）を使用した自動的にベクターおよび反復配列作製を行うスクリプトおよびプライマー３（Ｒｏｚｅｎ、Ｓｋａｌｅｔｓｋｙ（１９９６、１９９７）を使用したその後のプライマー選択を使用してプライマーを選択した。プライマー３は、ｗｗｗ．ｇｅｎｏｍｅ．ｗｉ．ｍｉｔ．ｅｄｕ／ｇｅｎｏｍｅ＿ｓｏｆｔｗａｒｅ／ｏｔｈｅｒ／ｐｒｉｍｅｒ３．ｈｔｍｌで利用可能である。
【０１０６】
各プライマー対についてのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）条件を、ＭｇＣｌ２濃度に関して最初に至適化した。標準的緩衝液は、１０  ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ  ８．３）、５０  ｍＭ  ＫＣｌ、ＭｇＣｌ２、０．２  ｍＭのｄＮＴＰ、０．２μＭの各プライマー、２．７  ｎｇ／ｌ  ヒトＤＮＡ、０．２５  ＵのＡｍｐｌｉＴａｑ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）、および１．０  ｍＭ、１．５  ｍＭ、２．０  ｍＭ  ｏｒ  ２．４  ｍＭ濃度のＭｇＣｌ２であった。サイクリング条件は、９４℃で２分間の最初の変性、その後９４℃で１５秒間、５５℃で２５秒間、７２℃で２５秒間を４０サイクル、その後７２℃で３分間の最後の伸長を含んでいた。最初の至適化ラウンドの結果に依存して、必要ならば条件をさらに至適化した。変形形態は、５８℃または６０℃へのアニーリング温度の増加、４２回へのサイクル数および３０秒への伸長時間の増加、およびＡｍｐｌｉＴａｇ  Ｇｏｌｄ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）の使用を含んでいた。
【０１０７】
目的のＳＴＳマーカーを含むＢＡＣクローン（Ｋｉｍら、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、３２：２１３〜２１８（１９９６）、Ｓｈｉｚｕｙａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８９：８７９４〜８７９７（１９９２））を、Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓから購入した全ヒトＢＡＣライブラリー由来のＤＮＡプールのＰＣＲベースのスクリーニングによって得た。ヒトＤＮＡの９つのゲノム等価物に対応するライブラリープレート１〜５９６由来のＤＮＡプールを使用した。最初のスクリーニングプロセスは、スーパープール（すなわち、８つの３８４ウェルライブラリープレート由来の全ＢＡＣクローン由来のＤＮＡ混合物）に対する各マーカーのＰＣＲ反応を含んでいた。各陽性のスーパープールのために、プレート（８）、行（１６）、列（２４）プールをスクリーニングして、固有のライブラリーアドレスを同定した。ＰＣＲ産物を、０．５μｇ／ｍｌの臭化エチジウムの１×ＴＢＥ溶液を含む２％アガロースゲル（Ｓｉｇｍａ）にて、１５０ボルトで４５分間電気泳動した。使用した電気泳動ユニットは、Ｏｗｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ＰｒｏｄｕｃｔｓのモデルＡ３−１システムであった。典型的には、ゲルは、１０列のレーン（５０ウェル／列）を含んでいた。分子量マーカー（１００ｂｐラダー、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ）を、ゲルの両側にロードした。ゲルの画像を、Ｋｏｄａｋ  ＤＣ４０ＣＣＤカメラで撮影し、Ｋｏｄａｋ  １Ｄソフトウェアで処理した。ゲルデータを区切りテキストファイルとしてエクスポートし、ファイル名は、スクリーニングしたライブラリー、ゲル画像ファイル、およびスクリーニングしたマーカーの情報を含んでいた。これらのデータを、データ保存および分析のためにカスタマイズしたＰｅｒｌスクリプトを使用してＦｉｌｅｍａｋｅｒ（商標）ＰＲＯ（Ｃｌａｒｉｓ  Ｃｏｒｐ．）データベースに自動的にインポートした。不完全またはあいまいなクローンアドレス情報が得られた場合、さらなる実験を行って固有且つ完全なライブラリーアドレスを回収した。
【０１０８】
ライブラリーからのクローンＢＡＣ培養物の回収は、ライブラリーウェル由来のサンプルの１２．５μｇ／ｍｌクロラムフェニコール（Ｓｉｇｍａ）を含むＬＢ寒天（Ｍａｎｉａｔｉｓら、「分子クローニング：実験マニュアル」、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ（１９８２））への画線を含んでいた。２つの各コロニーおよび最初の画線培養の１／４を、確認のために適切なＳＴＳマーカーを使用したコロニーＰＣＲで試験した。陽性のクローンを、１２．５μｇ／ｍｌクロラムフェニコールおよび１５％グリセロールを含むＬＢブロスにて７０℃で保存した。
【０１０９】
ＢＡＣ  ＤＮＡの単離にいくつかの異なる型のＤＮＡ調製法を使用した。以下に列挙の手動アルカリ溶解ミニプレッププロトコール（Ｍａｎｉａｔｉｓら、「分子クローニング：実験マニュアル」、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ（１９８２））は、ほとんどの用途（すなわち、制限マッピング、ＣＨＥＦゲル分析、ＦＩＳＨマッピング）で首尾よく使用されたが、末端配列決定では首尾のよい再現性は得られなかった。末端配列決定のためのＢＡＣ  ＤＮＡ調製のために特にＡｕｔｏｇｅｎ  ａｎｄ  Ｑｉａｇｅｎプロトコールを使用した。
【０１１０】
細菌を、１２．５μｇ／ｍｌクロラムフェニコールの１５ｍｌ  Ｔｅｒｒｉｆｉｃブロスを含む５０ｍｌのコニカルチューブにて３００ｒｐｍで震盪しながた３７℃で２０時間増殖させた。培養物を、３０００ｒｐｍ（約１８００ｇ）のＳｏｒｖａｌｌ  ＲＴ６０００Ｄにて４℃で１５分間遠心分離した。次いで、上清をできるだけ完全に吸引した。いくつかの場合、細胞ペレットを、この段階で２週間まで−２０℃に凍結した。次いで、ペレットをボルテックスして細胞を均一にし、凝集を最小にした。２５０μｌのＰ１溶液（５０ｍＭグルコース、１５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ、および１００μｇ／ｍｌ  ＲＮアーゼＡ）を添加し、混合物を上下にピペッティングして混合した。次いで、混合物を、２ｍｌのエッペンドルフチューブに移した。３５０μｌのＰ２溶液（０．２Ｎ  ＮａＯＨ、１％ＳＤＳ）を添加し、混合物を穏やかに混合し、室温で５分間インキュベートした。３５０μｌのＰ３溶液（３ＭＫＯＡｃ（ｐＨ５．５））を添加し、混合物を白色沈殿が形成されるまで穏やかに混合した。溶液を氷上で５分間インキュベートし、その後微量遠心分離機にて４℃で１０分間遠心分離した。上清を新鮮な２ｍｌのエッペンドルフチューブに慎重に（白色沈殿を避ける）移し、０．９ｍｌのイソプロパノールを添加し、溶液を混合し、氷上で５分間放置した。サンプルを１０分間遠心分離し、上清を慎重に除去した。ペレットを７０％エタノールで洗浄し、５分間乾燥させた。ペレットを、２００μｌのＴＥ８（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１．０ｍＭ  ＥＤＴＡ）中に再懸濁し、１００μｇ／ｍｌのＲＮアーゼＡ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を添加した。サンプルを３７℃で３０分間インキュベートし、次いで、０．５ＭのＣ２Ｈ３Ｏ２Ｎａ・３Ｈ２Ｏおよび２倍体積のエタノールの添加によって沈殿させた。サンプルを１０分間遠心分離し、ペレットを７０％エタノールで洗浄し、その後風乾し、５０μｌ  ＴＥ８に溶解した。このＤＮＡ調製物の典型的な収量は、３〜５μｇ／１５ｍｌ細菌培養物であった。１５μｌのうち、ＨｉｎｄＩＩＩ制限分析のために１０μｌを使用し、ＮｏｔＩ消化およびＣＨＥＦゲル電気泳動によるクローン挿入断片サイズ測定のために５μｌを使用した。
【０１１１】
ＢＡＣを、１２．５μｇ／ｍｌクロラムフェニコールを含む１５ｍｌの２×ＬＢブロスを含む５０ｍｌコニカルチューブに接種した。各クローンあたり４つのチューブに接種した。培養物を、激しく振動しながら（＞３００ｒｐｍ）３７℃で一晩（約１６時間）増殖させた。ＢＡＣ  ＤＮＡ単離の標準的条件は、Ａｕｔｏｇｅｎ７４０の製造者の推奨に従う。３ｍｌの培養サンプルを、全部で６０ｍｌかクローンあたり２０チューブでＡｕｔｏｇｅｎチューブに入れた。サンプルを、最終的にＡｕｔｏｇｅｎプロトコールの一部として震盪しながら１５秒間１００μｌのＴＥ８中に溶解した。Ａｕｔｏｇｅｎプロトコールの終了後、ＤＮＡ溶液を各チューブから移し、２ｍｌエッペンドルフチューブにプールした。大量の残屑（残屑ペレット化ステップに引き継ぐ）を回避した。次いで、チューブを、０．５ｍｌのＴＥ８で連続的にリンスし、この溶液をプールした物質に添加した。ＤＮＡ溶液を４℃で保存し、−２０℃での凍結の際に凝集が起こりやすくなった。このＤＮＡを制限マッピング、ＣＨＥＦゲル分析またはＦＩＳＨマッピングのいずれかに直接使用するか、末端配列決定反応で使用するために下記のようにさらに精製した。
【０１１２】
ＤＮＡ溶液の体積をＴＥ８で２ｍｌに調整し、サンプルを穏やかに混合し、６０℃で１０分間加熱した。次いで、ＤＮＡ溶液を４℃で５分間遠心分離し、上清を１５ｍｌのコニカルチューブに移した。ＮａＣｌ濃度を０．７５Ｍ（２ｍｌのサンプルに約０．３ｍｌの５Ｍ  ＮａＣｌの添加）に調整した。Ｑｉａｇｅｎカラム平衡緩衝液（緩衝液ＱＢＴ）で全体積を６ｍｌに調整した。ＤＮＡを含む上清を、カラムにアプライし、重力で溶出した。カラムを、１０ｍｌＱｉａｇｅｎ緩衝液ＱＣで２回洗浄した。結合ＤＮＡを、４つの個別の１ｍｌアリコートの緩衝液ＱＦで溶出し、６５℃に維持した。ＤＮＡを０．７倍体積のイソプロパノール（約２．８ｍｌ）で沈殿させた。次いで、各サンプルを４つの各２．２ｍｌのエッペンドルフチューブに移し、室温で２時間または一晩インキュベートした。サンプルを、微量遠心分離機で４℃で１０分間遠心分離した。上清を慎重に除去し、１ｍｌの７０％エタノールを添加した。サンプルを再び遠心分離し、ＤＮＡペレットはこの段階でしばしば軟らかくなくので、上清を慎重に除去した。サンプルを再び遠心分離して残存脂質を濃縮し、マイクロピペットチップで除去した。次いで、ＤＮＡペレットをデシケーターで１０分間乾燥させた。２０μｌの滅菌蒸留脱イオン水を各チューブに添加し、４℃で一晩静置した。各クローンあたり４つの２０μｌサンプルをプールし、チューブを最終体積１００μｌの別の２０μｌの滅菌蒸留脱イオン水でリンスした。次いで、サンプルを６５℃で５分間加熱し、穏やかに混合した。ＮｏｔＩ消化および非切断λＤＮＡとの比較で評価したところ、典型的な収量は２〜５μｇ／６０ｍｌ培養物であった。
【０１１３】
１２．５μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含む３ｍｌのＬＢブロスを、オートクレーブしたＡｕｔｏｇｅｎチューブに分注した。各クローンあたり１つのチューブを使用した。接種のために、−７０℃で保存したグリセロールストックを取り出し、ドライアイス上に置いた。グリセロールストックの一部を滅菌楊枝で元のチューブから取り出し、Ａｕｔｏｇｅｎチューブに移した；楊枝を少なくとも２分間Ａｕｔｏｇｅｎチューブ中に放置し、破棄した。接種後、チューブをテープで覆い、確実に強く密封した。全サンプルを接種後、チューブユニットをＡｕｔｏｇｅｎラックホルダーに移し、２５０ｒｐｍの回転震盪器に３７℃で１６〜１７時間置いた。増殖後、製造者が規定したＢＡＣ  ＤＮＡ調製の標準的条件を使用して、Ａｕｔｏｇｅｎのプログラムをつくった。プログラムの一部通りサンプルをＴＥ８に溶解させず、ＤＮＡペレットを風乾させた。プログラムの完了後、チューブをアウトプットトレイから取り出し、３０μｌの滅菌蒸留脱イオン水をチューブの底に直接添加した。次いで、チューブを２〜５秒間穏やかに震盪し、パラフィルムで覆い、室温で１〜３時間インキュベートした。次いで、ＤＮＡサンプルをエッペンドルフチューブに移し、直接配列決定に使用するか４℃で保存後使用した。
【０１１４】
Ｖ．物理的マッピングのためのＢＡＣクローンの特徴づけ
手動のアルカリ溶解またはＡｕｔｏｇｅｎプロトコールのいずれかによって調製したＤＮＡサンプルを、制限フラグメントサイズ分析のためにＨｉｎｄＩＩＩで消化した。このデータを使用して、クローン間の重複範囲を比較した。典型的には、各反応について１〜２μｇを使用した。反応混合物は、２５μｌの最終体積中に以下を含んでいた：１×緩衝液２（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）、０．１ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミン（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）、５０μｇ／ｍｌ  ＲＮアーゼＡ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）、および２０単位のＨｉｎｄＩＩＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）。消化物を、３７℃で４〜６時間インキュベートした。ＢＡＣ  ＤＮＡを、ＣＨＥＦゲル分析による挿入断片サイズ評価のためにＮｏｔＩでも消化した（以下を参照のこと）。反応条件は、２０単位のＮｏｔＩを使用する以外はＨｉｎｄＩＩＩと同一の条件であった。ブロモフェノールブルーおよびキシレンシアノールを含む６μｌの６×Ｆｉｃｏｌｌローディング緩衝液を添加して、電気泳動を行った。
【０１１５】
ＨｉｎｄＩＩＩ消化物を、０．５μｇ／ｍｌ臭化エチジウムを含む１×ＴＢＥを含む０．６％アガロース（Ｓｅａｋｅｍ、ＦＭＣ  Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ）で分析した。ゲル（２０ｃｍ×２５ｃｍ）をモデルＡ４電気泳動ユニット（Ｏｗｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）にて５０ボルトで２０〜２４時間電気泳動した。分子量サイズマーカーは、未消化λＤＮＡ、ＨｉｎｄＩＩＩ消化λＤＮＡ、およびＨａｅＩＩＩ消化＿Ｘ１７４ＤＮＡを含んでいた。分子量マーカーを６５℃で２分間加熱後、ゲルにロードした。ＫｏｄａｋＤＣ４０  ＣＣＤカメラで画像を取り、Ｋｏｄａｋ  １Ｄソフトウェアで分析した。
【０１１６】
ＮｏｔＩ消化物を、製造者の説明書にしたがってＣＨＥＦ  ＤＲＩＩ（ＢｉｏＲａｄ）電気泳動ユニットで分析した。簡単に述べれば、１％アガロースゲルの０．５×ＴＢＥ溶液（ＢｉｏＲａｄパルスフィールドグレード）を調製し、１４℃の電気泳動ユニット中で３０分間平衡化し、循環させながら６ボルト／ｃｍで１４時間電気泳動した。切り替え時間は１０秒〜２０秒の範囲であった。電気泳動後、ゲルを０．５μｇ／ｍｌの臭化エチジウム中で染色した。分子量サイズマーカーは、未消化λＤＮＡ、ＨｉｎｄＩＩＩ消化λＤＮＡ、λラダーＰＦＧラダー、および低範囲ＰＦＧマーカー（全てＮｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を含んでいた。
【０１１７】
手動のあるアルカリ溶解またはＡｕｔｏｇｅｎプロトコールのいずれかによって調製したＢＡＣ  ＤＮＡを、ＦＩＳＨ分析のために少し修正した製造者の説明書にしたがってＢｉｏｐｒｏｍｅ標識キット（ＢｉｏＲａｄ）を使用して標識した。各５０μｌの反応物について約２００ｎｇのＤＮＡを使用した。３μｌを２％アガロースゲルで分析して、標識範囲を同定した。反応物をＳｅｐｈａｄｅｘＧ５０スピンカラムを使用して精製後、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリッド形成を行った。記載のように中期ＦＩＳＨを行った（Ｍａら、Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔ．Ｃｅｌｌ  Ｇｅｎｅｔ、７４、２６６〜２７１（１９９６））。
【０１１８】
ＶＩ．ＢＡＣ末端配列決定
ＢＡＣ挿入断片末端の配列決定は、上記の２つの方法のいずれかで調製したＤＮＡを使用した。配列決定反応のために、ＡｍｅｒｓｈａｍのＤＹＥｎａｍｉｃエネルギー移動プライマーおよびダイナミックダイレクトサイクル配列決定キットを使用した。Ｔ７  ＢＡＣベクター末端にはＭ１３〜４０正方向配列決定プライマーを含む既製配列決定混合物（カタログ番号ＵＳ７９７３０）を使用し、ＳＰ６ＢＡＣベクター末端には既製の決定混合物（カタログ番号ＵＳ７９５３０）をＭ１３−２８逆方向配列決定プライマー（カタログ番号ＵＳ７９３３９）と混合した。配列決定反応混合物は、４つの蛍光標識色素プライマーのうちの１つ、４つのジデオキシ終結混合物のうちの１つ、ｄＮＴＰ、反応緩衝液、およびサーモシークエナーゼを含んでいた。各ＢＡＣ  ＤＮＡサンプルのために、３μｌのＢＡＣ  ＤＮＡサンプルを４つのＰＣＲストリップチューブに等分した。２μｌの４つの色素プライマー／終結混合物の組み合わせのうちの１つを４つの各チューブに添加した。次いで、チューブを密封し、ＰＣＲの前に短時間遠心分離した。熱サイクリング条件は、９５℃で１分間の変性、４５℃で１５秒間のアニーリング、７０℃で１分間の伸長を全部で３５サイクルを含んでいた。サイクリング後、プレートを短時間遠心分離して、全ての液体をチューブの底に集めた。５μｌの滅菌蒸留脱イオン水を各チューブに添加し、プレートを密封し、再び短時間遠心分離した。各ＢＡＣについての４つのサンプルをプールした。次いで、各チューブへの１．５μｌの７．５Ｍ  ＮＨ４ＯＡｃおよび１００μｌの−２０℃の１００％エタノールの添加によって、ＤＮＡを沈殿させた。ピペッティングを１回行ってサンプルを混合した。次いで、プレートを密封し、氷上で１０分間インキュベートした。プレートを、４０００ｒｐｍ（３，２９０×ｇ）の卓上Ｈａｒａｅｕｓ遠心分離機にて４℃で３０分間遠心分離して、ＤＮＡを回収した。上清を除去し、過剰な液体を紙タオル上で吸い取った。各チューブへの１００μｌの−２０℃の７０％エタノールの添加によってペレットを洗浄し、４０００ｒｐｍ（３，２９０×ｇ）、４℃で１０分間再遠心分離を行った。上清を除去し、過剰な液体を紙タオルで吸い取って除去した。残存する微量の液体を、紙タオル上でプレートを逆さまにして除去し、遠心分離機が８００ｒｐｍに到達するまで遠心分離した。次いで、サンプルを室温で３０分間乾燥させた。チューブに蓋をし、電気泳動まで−２０℃の乾燥状態で保存した。電気泳動の直前に、ＤＮＡを１．５μｌのＡｍｅｒｓｈａｍローディング色素に溶解した。次いで、プレートを密封し、２０００ｒｐｍ（８２５×ｇ）で遠心分離した。次いで、プレートをプレート震盪機上で１〜２分間ボルテックスした。次いで、サンプルを、２０００ｒｐｍ（８２５×ｇ）で短時間遠心分離した。次いで、サンプルを６５℃で２分間加熱し、即座に氷上に置いた。製造者の説明書にしたがって、ＡＢＩ３７７蛍光シークエンサーで標準的な電気泳動を行った。
【０１１９】
ＶＩＩ．ＨＢＭ  ＢＡＣ  ＤＮＡのサブクローニングおよび配列決定
Ｚｍａｘ１遺伝子領域の物理的マップにより、Ｚｍａｘ１遺伝子およびＨＢＭ遺伝子を含むＢＡＣクローン組が得られる。領域由来のいくつかのＢＡＣのＤＮＡ配列決定が完了している。ＤＮＡ配列データは、当業者がＺｍａｘ１遺伝子およびＨＢＭ遺伝子の同定あたは遺伝子を同定するためのプローブの調製、または遺伝子を同定するＤＮＡ配列多型の同定に使用することができるデータを含む固有の試薬である。
【０１２０】
２つのプロトコールＢＡＣ  ＤＮＡのＱｉａｇｅｎ精製（Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．、製品カタログに記載）またはプラスミドＤＮＡの標準的アルカリ溶解／塩化セシウム調製の修正形態である手動精製（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら、「現代の分子生物学プロトコール」、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（１９９７）を参照のこと）のうちの１つにしたがってＢＡＣ  ＤＮＡを単離した。手動プロトコールを簡単に述べれば、細胞をペレット化し、ＧＴＥ（５０ｍＭグルコース、２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ８）、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ）、リゾチーム（５０ｍｇ／ｍｌ溶液）、ＮａＯＨ／ＳＤＳ（１％ＳＤＳ／０．２ＮＮａＯＨ）、氷冷３Ｍ  ＫＯＡｃ溶液（ｐＨ４．５〜４．８）に再懸濁した。ＲＮアーゼＡを濾過上清に添加し、プロテイナーゼＫおよび２０％ＳＤＳを添加した。次いで、ＤＮＡをイソプロパノールで沈殿させ、乾燥させ、ＴＥ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０））に再懸濁した。ＢＡＣ  ＤＮＡを、塩化セシウム密度勾配遠心分離によってさらに精製した（Ａｕｓｕｂｅｌら、「現代の分子生物学プロトコール」、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（１９９７））。
【０１２１】
単離後、ＢＡＣ  ＤＮＡを、ＨＰＬＣ（Ｈｅｎｇｅｎ、Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．、２２、２７３〜２７４（１９９７））を使用して水力学的に２０００〜３０００ｂｐの挿入断片サイズに切断した。切断後、ＤＮＡを濃縮し、標準的な１％アガロースゲルで分離した。おおよそのサイズに対応する１つの画分をゲルから切り出し、電気泳動によって精製した（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、「分子クローニング：実験マニュアル」、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ、ＮＹ（１９８９））。
【０１２２】
次いで、精製ＤＮＡフラグメントを、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼを使用して平滑末端にした。次いで、平滑末端ＤＮＡを固有のＢｓｔＸＩリンカーアダプター（１００〜１０００倍モル過剰の５’−ＧＴＣＴＴＣＡＣＣＡＣＧＧＧＧおよび５’−ＧＴＧＧＴＧＡＡＧＡＣ）にライゲーションした。これらのリンカーは、ＢｓｔＸＩ切断ｐＭＰＸベクター（本発明者らによって構築）に相補的である一方で、オーバーハングは自己相補的ではなかった。したがって、リンカーは連結も切断ベクター自体も容易に再ライゲーションもしなかった。リンカー適合挿入断片を１％アガロースゲルで非組み込みリンカーから分離し、ＧｅｎｅＣｌｅａｎ（ＢＩＯ  １０１，Ｉｎｃ．）を使用して精製した。次いで、リンカー適合挿入断片を改変ｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔベクターにライゲーションして、「ショットガン」サブクローンライブラリーを構築した。ベクターは、アダプター−二量体がクローン化される事象でインフレームとなり、その青色によってこれらが回避されるクローニング部位でフレーム外のｌａｃＺ遺伝子を含んでいた。
【０１２３】
全てのその後のステップは、ＡＢＩ３７７自動化ＤＮＡ配列決定法による配列決定に基づいた。プロトコールの主な修正のみを強調する。簡単に述べれば、ライブラリーをＤＨ５αコンピテント細胞（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ、ＤＨ５α形質転換プロトコール）に形質転換した。アンピシリンおよびＩＰＴＧ／Ｘｇａｌを含む抗生物質プレートへのプレーティングによってこれを評価した。プレートを、３７℃で一晩インキュベートした。クローンのプレーティングおよび配列決定のための選択のための首尾の良い形質転換体を使用した。培養物を、３７℃で一晩増殖させた。ＤＮＡを、シリカビーズＤＮＡ調製法（Ｎｇら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、２４：５０４５〜５０４７（１９９６））を使用して精製した。この様式では、１クローンあたり２５μｇのＤＮＡが得られた。
【０１２４】
これらの精製ＤＮＡサンプルを、ＡＢＩ色素ターミネーター化学を使用して配列決定を行った。ＡＢＩ色素ターミネーター配列の読み取りを、ＡＢＩ３７７装置で行い、データをゲルのレーン追跡後にＵＮＩＸマシンに直接移した。全ての読み取りを、デフォルトパラメータおよびクオリティースコアを具備するＰＨＲＡＰ（Ｐ．Ｇｒｅｅｎ、ＤＯＥヒトゲノム計画請負人−譲受人ワークショップＶの要約、１９９６年１月、ｐ．１５７）を使用して構築した。６倍の範囲で最初の構築を行い、平均８〜１５個のコンティーグが得られた。最初の構築後、対の喪失（１つの鎖のみが読み取られたクローン由来の配列）を同定し、ＡＢＩ技術で配列決定してさらなる重複コンティーグを同定した。ウォーキング用のプライマーを、クローン末端付近のゲノム治療プログラムＰｉｃｋ＿プライマーを使用して、ギャップ閉鎖を促進するように選択した。これらの範囲を選択したクローンおよびプライマーを使用して配列決定した。データを、ＰＨＲＡＰを使用して配列コンティーグに構築した。
【０１２５】
ＶＩＩＩ．コンピュータ法による遺伝子の同定
ＢＡＣ配列のコンティーグへの構築後、コンティーグをコンピュータ分析に供してコード領域および既知の遺伝子に対してＤＮＡ配列類似性を有する領域を同定した。このプロトコールは、以下のステップを含んでいた。
【０１２６】
１．デギャップコンティーグ：配列コンティーグはしばしば各ＡＢＩ配列読み取りが挿入または欠失を有する位置を示す印（ピリオド）を含む。コンティーグの自動化コンピュータ分析前に、ピリオドを除去した。後で参照するために元データを保存した。
【０１２７】
２．ＢＡＣベクター配列を、プログラムクロスマッチ（Ｐｈｉ  Ｇｒｅｅｎ、ｈｔｔｐ：／／ｃｈｉｍｅｒａ．ｂｉｏｔｅｃｈ．ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ．ｅｄｕ／ＵＷＧＣ）の使用によって配列内に「マスク」した。上で詳述のショットガンライブラリー構築により、ショットガンライブラリー中にいくつかのＢＡＣベクターが放出されるので、このプログラムを使用してＢＡＣコンティーグとＢＡＣベクターとの配列を比較し、その後のステップ前に任意のベクター配列をマスクした。マスクした配列を、配列ファイル中で「Ｘ」で示し、その後の分析中で不活性なままであった。
【０１２８】
３．ＢＡＣ配列で汚染されている大腸菌配列を、ＢＡＣコンティーグと全大腸菌ＤＮＡ配列との比較によってマスクした。
【０１２９】
４．ヒトゲノムで共通であることが公知の反復エレメントを、交差適合試験を使用してマスクした。この交差適合の実施では、ＢＡＣ配列をヒト反復エレメントのデータベース（Ｊｅｒｚｙ  Ｊｅｒｋａ、Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、ＣＡ）と比較した。マスクした反復をＸとマークし、これはその後の分析で不活性なままであった。
【０１３０】
５．配列内のエクソンの位置を、ＭＺＥＦコンピュータプログラム（Ｚｈａｎｇ、Ｐｒｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、９４：５６５〜５６８（１９９７））を使用して予想した。
【０１３１】
６．配列を、ｂｌａｓｔｎ２アルゴリズム（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、２５：３３８９〜３４０２（１９９７））を使用して、公的に利用可能なｕｎｉｇｅｎｅデータベース（全米バイオテクノロジー情報センター、国立医学図書館、３８Ａ、８Ｎ９０５、８６００  Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ  Ｐｉｋｅ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ  ２０８９４；ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）と比較した。この検索のパラメータは以下である。Ｅ＝０．０５、ｖ＝５０、Ｂ＝５０（Ｅは推定見込みスコアカットオフであり、Ｖは結果報告に戻るデータベース構成要素数であり、Ｂは結果報告に戻る配列アラインメント数である（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２１５：４０３〜４１０（１９９０）））。
【０１３２】
７．６つ全ての読み取り枠についての配列をタンパク質に翻訳し、タンパク質配列をＧｅｎｐｅｐｔ  Ｓｗｉｓｓｐｒｏｔ  ＰＩＲ（全米バイオテクノロジー情報センター、国立医学図書館、３８Ａ、８Ｎ９０５、８６００  Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ  Ｐｉｋｅ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ  ２０８９４；ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）からコンパイルした余剰のない（ｎｏｎ−ｒｅｄｕｎｄａｎｔ）タンパク質データベースと比較した。この検索のパラメータは、Ｅ＝０．０５、ｖ＝５０、Ｂ＝５０であり、Ｅ、Ｖ、およびＢは上記定義の通りである。
【０１３３】
８．ＢＡＣ  ＤＮＡ配列を、ｂｌａｓｔｎ２（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．、２５：３３８９〜３４０２（１９９７））を使用して直接選択実験（下記）由来のｃＤＮＡクローンのデータベースと比較した。この検索のパラメータは、Ｅ＝０．０５、ｖ＝２５０、Ｂ＝２５０であり、Ｅ、Ｖ、およびＢは上記定義の通りである。
【０１３４】
９．ＢＡＣ配列を、ｂｌａｓｔｎ２（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．、２５：３３８９〜３４０２（１９９７））を使用して染色体１１ｑ１２−１３上のＨＢＭ領域由来の全ての他のＢＡＣ配列と比較した。この検索のパラメータは、Ｅ＝０．０５、ｖ＝５０、Ｂ＝５０であり、Ｅ、Ｖ、およびＢは上記定義の通りである。
【０１３５】
１０．ＢＡＣ配列を、ｂｌａｓｔｎ２（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．、２５：３３８９〜３４０２（１９９７））を使用して染色体１１ｑ１２−１３上のＨＢＭ領域由来のＢＡＣ末端由来の配列と比較した。この検索のパラメータは、Ｅ＝０．０５、ｖ＝５０、Ｂ＝５０であり、Ｅ、Ｖ、およびＢは上記定義の通りである。
【０１３６】
１１．ＢＡＣ配列を、ｂｌａｓｔｎ２（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．、２５：３３８９〜３４０２（１９９７））を使用してＧｅｎｂａｎｋデータベース（全米バイオテクノロジー情報センター、国立医学図書館、３８Ａ、８Ｎ９０５、８６００  Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ  Ｐｉｋｅ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ  ２０８９４；ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）と比較した。この検索のパラメータは、Ｅ＝０．０５、ｖ＝５０、Ｂ＝５０であり、Ｅ、Ｖ、およびＢは上記定義の通りである。
【０１３７】
１２．ＢＡＣ配列を、ｂｌａｓｔｎ２（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、１９９７）を使用してＧｅｎｂａｎｋデータベース（全米バイオテクノロジー情報センター、国立医学図書館、３８Ａ、８Ｎ９０５、８６００  Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ  Ｐｉｋｅ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ  ２０８９４；ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）のＳＴＳ部門と比較した。この検索のパラメータは、Ｅ＝０．０５、ｖ＝５０、Ｂ＝５０であり、Ｅ、Ｖ、およびＢは上記定義の通りである。
【０１３８】
１３．ＢＡＣ配列を、ｂｌａｓｔｎ２（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．、２５：３３８９〜３４０２（１９９７））を使用してＧｅｎｂａｎｋデータベース（全米バイオテクノロジー情報センター、国立医学図書館、３８Ａ、８Ｎ９０５、８６００  Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ  Ｐｉｋｅ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ  ２０８９４；ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）の発現配列（ＥＳＴ）タグと比較した。この検索のパラメータは、Ｅ＝０．０５、ｖ＝２５０、Ｂ＝２５０であり、Ｅ、Ｖ、およびＢは上記定義の通りである。
【０１３９】
ＩＸ．直接ｃＤＮＡ選択による遺伝子の同定
一次結合ｃＤＮＡプールを、骨髄、頭蓋骨、大腿骨、腎臓、骨格筋、精巣、および全脳から調製した。ポリ（Ａ）＋ＲＮＡを、頭蓋骨および大腿骨組織から調製し（Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１６２，１５６〜１５９（１９８７）；Ｄ’Ａｌｅｓｓｉｏら、Ｆｏｃｕｓ、９：１〜４（１８９７））、残りｍＲＮＡをＣｌｏｎｔｅｃｈ（Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）から購入した。オリゴ（ｄＴ）および同一の組織由来のランダムプライミングｃＤＮＡプールを作製するために、一方の反応で２．５μｇのｍＲＮＡをオリゴ（ｄＴ）プライマーと混合し、別の反応で２．５μｇのｍＲＮＡをランダムな６量体と混合し、この両方を製造者の説明書（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ）にしたがって第１および第２のｃＤＮＡ鎖に変換した。対合リン酸化ｃＤＮＡリンカー（以下の配列を参照のこと）を、６５℃で５分間インキュベートした１：１の比（各１０μｇ）での混合により互いをアニーリングし、室温に冷却した。
【０１４０】
対合リンカーオリゴ１／２
オリゴ１：５’ＣＴＧ  ＡＧＣ  ＧＧＡ  ＡＴＴ  ＣＧＴ  ＧＡＧ  ＡＣＣ３’（配列番号１２）
オリゴ２：５’ＴＴＧ  ＧＴＣ  ＴＣＡ  ＣＧＴ  ＡＴＴ  ＣＣＧ  ＣＴＣ  ＧＡ３’（配列番号１３）
対合リンカーオリゴ３／４
オリゴ３：５’ＣＴＣ  ＧＡＧ  ＡＡＴ  ＴＣＴ  ＧＧＡ  ＴＣＣ  ＴＣ３’（配列番号１４）
オリゴ４：５’ＴＴＧ  ＡＧＧ  ＡＴＣ  ＣＡＧ  ＡＡＴ  ＴＣＴ  ＣＧＡ  Ｇ３’（配列番号１５）
対合リンカーオリゴ５／６
オリゴ５：５’ＴＧＴ  ＡＴＧ  ＣＧＡ  ＡＴＴ  ＣＧＣ  ＴＧＣ  ＧＣＧ３’（配列番号１６）
オリゴ６：５’ＴＴＣ  ＧＣＧ  ＣＡＧ  ＣＧＡ  ＡＴＴ  ＣＧＣ  ＡＴＡ  ＣＡ３’（配列番号１７）
対合リンカーオリゴ７／８
オリゴ７：５’ＧＴＣ  ＣＡＣ  ＴＧＡ  ＡＴＴ  ＣＴＣ  ＡＧＴ  ＧＡＧ３’（配列番号１８）
オリゴ８：５’ＴＴＧ  ＴＣＡ  ＣＴＧ  ＡＧＡ  ＡＴＴ  ＣＡＧ  ＴＧＧ  ＡＣ３’（配列番号１９）
対合リンカーオリゴ１１／１２
オリゴ１１：５’ＧＡＡ  ＴＣＣ  ＧＡＡ  ＴＴＣ  ＣＴＧ  ＧＴＣ  ＡＧＣ３’（配列番号２０）
オリゴ１２：５’ＴＴＧ  ＣＴＧ  ＡＣＣ  ＡＧＧ  ＡＡＴ  ＴＣＧ  ＧＡＴ  ＴＣ３’（配列番号２１）
リンカーを、製造者の説明書（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ）にしたがって全てのオリゴ（ｄＴ）およびランダムプライミングｃＤＮＡプール（以下を参照のこと）にライゲーションした。
【０１４１】
オリゴ１／２を、オリゴ（ｄＴ）および骨髄から調製したランダムプライミングｃＤＮＡプールにライゲーションした。オリゴ３／４を、オリゴ（ｄＴ）および頭蓋骨から調製したランダムプライミングｃＤＮＡプールにライゲーションした。オリゴ５／６を、オリゴ（ｄＴ）および脳および骨格筋から調製したランダムプライミングｃＤＮＡプールにライゲーションした。オリゴ７／８を、オリゴ（ｄＴ）および腎臓から調製したランダムプライミングｃＤＮＡプールにライゲーションした。オリゴ１１／１２を、オリゴ（ｄＴ）および大腿骨から調製したランダムプライミングｃＤＮＡプールにライゲーションした。
【０１４２】
ｃＤＮＡプールを、それぞれ１μｌの１：１、１：１０、および１：１００希釈のライゲーション反応を使用したＰＣＲ増幅によって長さの分布について評価した。Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ９６００にてＰＣＲ反応を行い、２５μｌの反応は、１μｌのＤＮＡ、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、５０ｍＭ  ＫＣｌ、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．００１％ゼラチン、２００ｍＭ各ｄＮＴＰ、１０μＭプライマー、および１単位のＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を含み、以下の条件下で増幅した：９４℃で３０秒間、６０℃で３０秒間、７２℃で２分間を３０サイクル。増幅ｃＤＮＡプールの長さの分布を、１％アガロースゲルでの電気泳動によって評価した。ランダムプライミングｃＤＮＡおよびオリゴ（ｄＴ）プライミングｃＤＮＡプールの最高の発現量を与えるＰＣＲ反応物を、２〜３μｇの各ｃＤＮＡプールが得られるようにスケールアップした。直接選択反応用の出発ｃＤＮＡは、０．５μｇのオリゴ（ｄＴ）プライミングｃＤＮＡと混合した０．５μｇのランダムプライミングｃＤＮＡから構成されていた。
【０１４３】
直接ｃＤＮＡ選択法で使用する５４ＢＡＣ由来のＤＮＡを、製造者（Ｎｅｓｔ  Ｇｒｏｕｐ，Ｉｎｃ．）記載のようにＮｕｃｌｅｏｂｏｎｄＡＸカラムを使用して単離した。
【０１４４】
ＢＡＣを等モル量でプールし、１μｇの単離ゲノムＤＮＡを、製造者の説明（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）にしたがってニックトランスレーションによってビオチン１６−ＵＴＰで標識した。ビオチン組み込みを、当業者が実施可能な方法（Ｄｅｌ  Ｍａｓｔｒｏ  ａｎｄ  Ｌｏｖｅｔｔ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．、ＮＪ、１９９６）によってモニターした。
【０１４５】
当業者が実施可能な方法（Ｄｅｌ  Ｍａｓｔｒｏ  ａｎｄ  Ｌｏｖｅｔｔ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．、ＮＪ、１９９６）を使用して直接ｃＤＮＡ選択を行った。簡単に述べれば、ｃＤＮＡプールをを以下の２つの条件を複合した：一方の反応では、骨髄、頭蓋骨、脳、および精巣由来のｃＤＮＡプールを混合し、骨格筋、腎臓、および大腿骨由来の他方のｃＤＮＡプールを混合した。反復、酵母配列、およびｃＤＮＡプール中のプラスミドの抑制を、Ｃｏｔ２０で行った。１００ｎｇのビオチン化ＢＡＣ  ＤＮＡを、抑制ｃＤＮＡと混合し、溶液中にてＣｏｔ２００でハイブリッド形成させた。ビオチン化ＤＮＡおよび同族ｃＤＮＡを、ストレプトアビジン被覆パラ磁性ビーズ上に捕捉した。ビーズを洗浄し、一次選択ｃＤＮＡを溶出させた。これらのｃＤＮＡをＰＣＲ増幅し、第２ラウンドの直接選択を行った。第２ラウンドの直接選択の産物を、二次選択物質と呼ぶ。以前に１１ｑ１２−１３へのマッピングが示されているＧａｌａｍｉｎｃＤＮＡクローン（Ｅｖａｎｓ、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、１８：４７３〜４７７（１９９３））を使用して、２ラウンドの選択の際の濃縮をモニターした。
【０１４６】
製造者の説明書に従って、骨髄、頭蓋骨、大腿骨、腎臓、骨格筋、精巣、および全脳由来の二次選択物質を下記の改変オリゴ１、３、５、７、および１１を使用してＰＣＲ増幅し、ＵＤＧベクターｐＡＭＰ１０（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ）にクローン化した。改変プライマー配列を以下に示す。
【０１４７】
オリゴ１−ＣＵＡ：５’ＣＵＡ  ＣＵＡ  ＣＵＡ  ＣＵＡ  ＣＴＧ  ＡＧＣ  ＧＧＡ  ＡＴＴ  ＣＧＴ  ＧＡＧ  ＡＣＣ３’（配列番号２２）
オリゴ３−ＣＵＡ：５’ＣＵＡ  ＣＵＡ  ＣＵＡ  ＣＵＡ  ＣＴＣ  ＧＡＧ  ＡＡＴ  ＴＣＴ  ＧＧＡ  ＴＣＣ  ＴＣ３’（配列番号２３）
オリゴ５−ＣＵＡ：５’ＣＵＡ  ＣＵＡ  ＣＵＡ  ＣＵＡ  ＴＧＴ  ＡＴＧ  ＣＧＡ  ＡＴＴ  ＣＧＣ  ＴＧＣ  ＧＣＧ３’（配列番号２４）
オリゴ７−ＣＵＡ：５’ＣＵＡ  ＣＵＡ  ＣＵＡ  ＣＵＡ  ＧＴＣ  ＣＡＣ  ＴＧＡ  ＡＴＴ  ＣＴＣ  ＡＧＴ  ＧＡＧ３’（配列番号２５）
オリゴ１１−ＣＵＡ：５’ＣＵＡ  ＣＵＡ  ＣＵＡ  ＣＵＡ  ＧＡＡ  ＴＣＣ  ＧＡＡ  ＴＴＣ  ＣＴＧ  ＧＴＣ  ＡＧＣ３’（配列番号２６）
【０１４８】
各組織供給源由来のクローン化した二次選択物質を、製造者の説明のようにＭＡＸ  Ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ  ＤＨ５ａコンピテント細胞（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ）に形質転換した。各形質転換供給源から３８４個のクローンを選択し、４つの９６ウェルマイクロタイタープレートに並べた。
【０１４９】
全ての二次選択ｃＤＮＡクローンを、Ｍ１３色素プライマーターミネーターサイクル配列決定キット（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して配列決定し、ＡＢＩ３７７自動化蛍光シークエンサー（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）によってデータを収集した。
【０１５０】
全ての配列を、ＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＸ、およびＦＡＳＴＡプログラム（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２１５：４０３−４１０（１９９０）、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、２５：３３８９−３４０２（１９９７））を使用して分析した。ｃＤＮＡ配列を、ヒト反復、ミトコンドリアＤＮＡ、リボゾームＲＮＡ、大腸菌ＤＮＡ由来の配列を含むデータベースと比較し、プログラムｃｒｏｓｓ＿ｍａｔｃｈを使用してデータセットからバックグラウンドクローンを除去した。プログラムＢＬＡＳＴＮ２を使用して、公知の遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ）およびＨＢＭ領域由来のＢＡＣ配列に対するさらなる比較ラウンドを行った。これらの配列と９０％を超えて相同であるｃＤＮＡを、結果にしたがってファイルし、さらなる分析のためにデータベースにデータを保存した。同定されたがＨＢＭ領域由来のＢＡＣ配列と有意な類似性を示さないかｃｒｏｓｓ＿ｍａｔｃｈによって排除されないｃＤＮＡ配列を、ＨＢＭ領域由来のＢＡＣを含むナイロン膜にハイブリッド形成し、標的にハイブリッド形成するかどうかを確認した。
【０１５１】
ハイブリッド形成分析を使用して、選択されたＢＡＣ標的にｃＤＮＡクローンをマッピングした。ＨＢＭ領域から同定したＢＡＣを並べ、９６ウェルマイクロタイタープレートで増殖させた。２５μｇ／ｍｌのカナマイシンンを含むＬＢ寒天を、９６ウェルマイクロタイタープレートのリッドに分注した。一旦寒天が固化すると、プレカットＨｙｂｏｕｎｄＮ＋ナイロン膜（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を寒天に重層し、手持ち式の９６ウェルレプリカプレーター（Ｖ＆Ｐ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｉｎｃ．）を使用して、ＢＡＣを２連で膜状にスタンプした。プレートを、３７℃で一晩インキュベートした。製造者の説明書にしたがって、膜を処理した。
【０１５２】
ハイブリッド形成によってマッピングする必要があるｃＤＮＡを、このクローンを増幅する関連プライマー（オリゴ１、３、５、７、および１１）を使用してＰＣＲ増幅した。このＰＣＲ増幅のために、オリゴヌクレオチドの５’末端に連結ジゴキシゲニン分子を含むようにプライマーを改変した。ｃＤＮＡプールの調製と同一の条件下（上記）で、ＰＣＲ増幅を行った。ＰＣＲ産物を、５μｌのＰＣＲ反応物のローディングによる１％アガロースゲルでの電気泳動によって質および量について評価した。スタンプしたＢＡＣを含むナイロン膜を、１０ｍｌのハイブリッド形成溶液（５×ＳＳＰＥ、０．５×Ｂｌｏｔｔｏ、２．５％ＳＤＳ、および１ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０））を含む５０ｍｌのコニカルチューブ中で個別にハイブリッド形成した。５０ｍｌのコニカルチューブを、ローティッセリーオーブン（Ｒｏｂｂｉｎｓ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）にて６５℃で２時間置いた。２５ｎｇの各ｃＤＮＡプローブを変性させ、ナイロン膜およびハイブリッド形成溶液を含む５０ｍｌの各コニカルチューブに添加した。６５℃で一晩ハイブリッド形成を行った。フィルターを以下の各溶液にて６５℃で２０分間洗浄した：３×ＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳ；１×ＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳ、および０．１×ＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳ。
【０１５３】
５０ｍｌのコニカルチューブから膜を取り出し、皿に置いた。酢酸シートを各膜の間に置いて互いに削られないようにした。膜の抗ＤＩＧ−ＡＰおよびＣＤＰ−Ｓｔａｒとのインキュベーションを、製造者の説明書（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）にしたがって行った。膜をサランラップで包み、Ｋｏｄａｋ  Ｂｉｏ−Ｍａｘ  Ｘ線フィルムに１時間感光した。
【０１５４】
Ｘ．ｃＤＮＡクローニングおよび発現分析
直接ｃＤＮＡ選択および公的に利用可能なデータベースと比較したゲノムＤＮＡ配列決定の発現を特徴付けるために、一連の実験を行ってＨＢＭ領域中の遺伝子をさらに特徴付けた。第１に、ｃＤＮＡ、ＥＳＴ、またはゲノムＤＮＡの一部がＤＮＡ分子のプール（ｃＤＮＡライブラリー）またはＲＮＡ集団（ＲＴ−ＰＣＲおよびＲＡＣＥ）から増幅することができるように、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）で使用するためにオリゴヌクレオチドプライマーをデザインした。ゲノムＤＮＡを含む反応物中でＰＣＲプライマーを使用して、これらがゲノム（ＢＡＣ）配列に基づいて推定されるサイズの産物を作製するかを実証した。次いで、多数のｃＤＮＡライブラリーを、特異的ｃＤＮＡまたはＥＳＴの存在について試験した。特定のｃＤＮＡライブラリー中の転写単位のフラグメントの存在は、同一の転写単位のさらなる部分が同様に存在する可能性の高さを示す。
【０１５５】
新規の遺伝子が特徴付けられたときに必要な重要なデータ部分は、ヌクレオチド、処理した転写物、または伝令ＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の長さである。当業者は、主にノーザンブロットハイブリッド形成によってｍＲＮＡの長さを決定する（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、「分子クローニング：実験マニュアル」、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ（１９８９））。重要な領域で配列決定ＢＡＣと有意な配列類似性を示すＥＳＴおよび直接選択ｃＤＮＡクローン群を、便宜上約３０キロベース単位にグループ化した。３０キロベース単位内に、１つまたは複数の独立した転写単位を含む１から５０個までのＥＳＴおよび直接選択ｃＤＮＡクローンが存在した。１つまたは複数のＥＳＴまたは直接選択ｃＤＮＡを、ハイブリッド形成プローブとして使用し、製造者が推奨する条件下で市販の試薬（多組織ノーザンブロット；Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を使用して、種々の組織中のｍＲＮＡの長さを決定した。
【０１５６】
大腿骨および頭蓋骨組織由来の一方向クローン化ｃＤＮＡライブラリーを、当業者に周知の方法（例えば、Ｓｏａｒｅｓ、「自動化ＤＮＡ配列決定および分析」、Ａｄａｍｓ，Ｆｉｅｌｄｓ  ａｎｄ  Ｖｅｎｔｅｒ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ、ｐｐ１１０〜１１４（１９９４））によって構築した。最初に骨をハンマーで断片に破壊し、小片を液体窒素中で凍結し、組織微粉砕機（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）で粉末に粉砕した。ポリトロンホモジナイザー（Ｂｒｉｎｋｍａｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を使用した標準的な酸グアニジン−チオシアネート−フェノール−クロロホルム抽出緩衝液（例えば、Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ  ａｎｄ  Ｓａｃｃｈｉ、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１６２：１５６〜１５９（１９８７））での粉末骨の均一化によって粉末骨からＲＮＡを抽出した。さらに、ヒトの脳および肺の全ＲＮＡを、Ｃｌｏｎｔｅｃｈから購入した。ポリＡ  ＲＮＡを、製造者（Ｄｙｎａｌ，Ｉｎｃ．）の説明書に従って、ダイナビーズ−ｄＴを使用して全ＲＮＡから単離した。
第１のｃＤＮＡ鎖合成を、以下の配列を有するオリゴヌクレオチドプライマーを使用して開始させた。５’−ＡＡＣＴＧＧＡＡＧＡＡＴＴＣＧＣＧＧＣＣＧＣＡＧＧＡＡＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ−３’（配列番号２７）。このプライマーは、ｃＤＮＡの３’末端にＮｏｔＩ制限部位（下線）が移入されている。製造者（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ）が記載のように、「１チューブ」ｃＤＮＡ合成キットを使用して第１および第２の鎖の合成を行った。二本鎖ｃＤＮＡをＴ４ポリヌクレオチドキナーゼで処理して、分子の末端が平滑末端であることを確認し（Ｓｏａｒｅｓ、「自動化ＤＮＡ配列決定および分析」、Ａｄａｍｓ，Ｆｉｅｌｄｓ  ａｎｄ  Ｖｅｎｔｅｒ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ、ｐｐ１１０〜１１４（１９９４）、平滑末端ｃＤＮＡをＢｉｏｇｅｌカラム（Ｈｕｙｎｈら、「ＤＮＡクローニング」、第１巻、Ｇｌｏｖｅｒ編、ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ、４９〜７８（１９８５））またはｓｉｚｅ−ｓｅｐ４００セファロースカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、カタログ番号２７−５１０５−０１）によってサイズ選択した。４００塩基対異常のｃＤＮＡのみをその後のステップで使用した。ＥｃｏＲＩアダプター（配列：５’ＯＨ−ＡＡＴＴＣＧＧＣＡＣＧＡＧ−ＯＨ３’（配列番号２８）および５’ｐ−ＣＴＣＧＴＧＣＣＧ−ＯＨ３’（配列番号２９））を、当業者に周知の方法（Ｓｏａｒｅｓ、１９９４）によって二本鎖ｃＤＮＡにライゲーションした。ＥｃｏＲＩアダプターを、ＮｏｔＩでの消化（Ｓｏａｒｅｓ、１９９４）によってｃＤＮＡの３’末端から除去した。次いで、ｃＤＮＡをプラスミドベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ＫＳ＋（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）にライゲーションし、ライゲーションした物質を当業者に周知のエレクトロポレーション法（Ｓｏａｒｅｓ、１９９４）によって大腸菌宿主ＤＨ１０ＢまたはＤＨ１２Ｓに形質転換した。３７℃で一晩の増殖後、Ｍｅｇａ−ｐｒｅｐキット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）の指示どおりの処理によってプレートの画線後に大腸菌コロニーからＤＮＡを回収した。ＤＮＡライブラリーの量を、全一次形質転換体数の一部の計数および平均挿入断片サイズおよびｃＤＮＡ挿入断片を含まないプラスミドの比率の同定によって評価した。さらなるｃＤＮＡライブラリー（ヒト全脳、心臓、腎臓、白血球、および胎児脳）を、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤから購入した。
【０１５７】
ｃＤＮＡライブラリー、プライミングしたオリゴ（ｄＴ）およびランダム６量体（Ｎ６）を、以下のＨＢＭ領域内で転写されたｃＤＮＡクローンの単離に使用した：ヒト骨、ヒト脳、ヒト腎臓、およびヒト骨格筋（骨格筋（ｄＴ）および腎臓（ｄＴ）のｃＤＮＡライブラリー以外の全ｃＤＮＡライブラリーを本発明者らが作製した）。各ｃＤＮＡライブラリーの４つの１０×１０アレイを、以下のように調製した。一次形質転換体を使用してｃＤＮＡライブラリーを２．５×１０６に滴定した。適切な体積の凍結ストックを使用して、２ＬのＬＢ／アンピシリン（１００ｍｇ／ｍｌ）を接種した。この接種脂質培養物を各４ｍｌの４００個のチューブに等分した。各チューブはほぼ５０００ｃｆｕを含んだ。チューブを、穏やかに撹拌しながら３０℃で一晩インキュベートした。培養物をＯＤ０．７〜０．９に増殖させた。１００μｌの培養物および３００μｌの８０％グリセロールの等分によって各培養物のための凍結ストックを調製した。ストックとドライアイス／エタノール浴中で凍結し、−７０℃で保存した。残りの培養物を、製造者の指示に従ってＱｉａｇｅｎ（Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ、ＣＡ）スピンミニプレップキットを使用してＤＮＡ調製した。４００個の培養物由来のＤＮＡをプールして、８０行および列を作製した。ｃＤＮＡライブラリーがＰＣＲによって目的のＨＢＭ  ｃＤＮＡクローンを含むと同定した。マーカーを、推定エクソンを増幅するようにデザインした。一旦標準的ＰＣＲ最適化が行われ、特異的ｃＤＮＡライブラリーが目的のｃＤＮＡクローンを含むと同定されると、マーカーを使用してアレイライブラリーをスクリーニングした。ｃＤＮＡクローンの存在を示す陽性のアドレスを、同一のマーカーを使用した第２のＰＣＲによって確認した。
【０１５８】
一旦ｃＤＮＡライブラリーがＨＢＭ領域由来の目的の特異的転写物に対応するｃＤＮＡクローンを含む可能性があると同定された場合、目的のＥＳＴまたは直接選択ｃＤＮＡと同一のｃＤＮＡ挿入断片を含むクローンを単離する操作をした。標準的な「コロニースクリーニング」法（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、「分子クローニング：実験マニュアル」、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ（１９８９））の修正形態によってこれを行った。特に、２０個の１５０ｍｍＬＢ＋アンピシリン寒天プレートに２０，０００コロニー形成単位（ｃｆｕ）のｃＤＮＡライブラリーを画線し、コロニーを３７℃で一晩増殖させた。コロニーをナイロン膜（ＡｍｅｒｓｈａｍのＨｙｂｏｎｄまたは同等品）に移し、本質的に（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、「分子クローニング：実験マニュアル」、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ（１９８９））に記載のように２つのフィルターを互いにプレスすることによって２連で調製した。「マスター」プレートをさらに６〜８時間インキュベートし、コロニーを再度増殖させた。細菌コロニー由来のＤＮＡを、２分間の変性溶液（０．５Ｎ  ＮａＯＨ、１．５Ｍ  ＮａＣｌ）および２分間の中和溶液（０．５Ｍ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ８．０）、１．５Ｍ  ＮａＣｌ）（２回）でのフィルターの連続処理によってナイロンフィルターに固定した。２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ溶液での１分間の洗浄およびティッシュペーパーでの掻き取りによって細菌コロニーをフィルターから取り出す。フィルターを風乾し、８０℃で１〜２時間減圧下で焼き固めた。
【０１５９】
ｃＤＮＡハイブリッド形成プローブを、ランダム６量体標識（Ｆｉｎｅｂｅｒｇ  ａｎｄ  Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎ、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１３２：６〜１３（１９８３））または反応物中にランダム６量体を含まない遺伝子特異的プライマーの封入（小フラグメント用）によって調製した。比活性を計算し、５×１０８ｃｐｍ／１０８μｇ  ｃＤＮＡを超えていた。次いで、コロニーメンバーを、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ８．０）、１Ｍ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．１％ＳＤＳにて５５℃で３０分間予備洗浄した。予備洗浄後、フィルターを２ｍｌ／フィルターを超える６×ＳＳＣ、５０％脱イオンホルムアミド、２％ＳＤＳ、５×デンハート溶液、および１００ｍｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡにて４２℃で３０分間予備ハイブリッド形成させた。次いで、フィルターを、変性α３２Ｐ−ｄＣＴＰ標識ｃＤＮＡプローブを含むハイブリッド溶液（６×ＳＳＣ、２％ＳＤＳ、５×デンハート、１００ｍｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡ）に移し、４２℃で１６〜１６時間インキュベートした。
【０１６０】
１６〜１８時間のインキュベーション後、２×ＳＳＣ、２％ＳＤＳ中で２０分間室温で継続的に震盪しながらフィルターを洗浄し、２つをそれぞれ６５℃で１５分間洗浄する。０．５×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳにて６５℃で１５分間第２の洗浄を行った。次いで、フィルターをプラスチック製ラップで覆い、ラジオグラフ用フィルムに数時間から一晩感光した。フィルムの現像後、プレート上の各コロニーを、アンピシリンを含む１ｍｌのＬＢブロス溶液で選択することができるようにオートラジオグラフを使用して並べた。３７℃で１〜２時間の震盪後、第２のスクリーニングのために溶液のアリコートを１５０ｍｍプレートにプレートした。二次スクリーニングは、各コロニーが選択のために明白に同定することができるように約２５０コロニーを含むプレート上で行う以外は第１のスクリーニング（上記）と同一であった。
【０１６１】
ラジオグラフィーを行ったプローブを使用したコロニースクリーニングによってｃＤＮＡを得た後、制限エンドヌクレアーゼ、ＰＣＲ、および直接配列決定によってクローンを特徴づけて、元のプローブと単離クローンとの間の配列同一性を確認した。全長ｃＤＮＡを得るために、同定されたクローンの末端由来の新規の配列を使用して、再びライブラリーを探索した。クローン化したｃＤＮＡの長さがノーザンブロット分析により全長であるとの評価と一致するまでこのプロセスを繰り返した。
【０１６２】
全長クローンを単離するための別の方法としてＲＴ−ＰＣＲを使用した。ｃＤＮＡを、「ＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔワンステップＲＴ−ＰＣＲ」キット（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）を使用して合成および増幅した。この手順は、ＭｇＳＯ４、ｄＮＴＰ、１μｌセンスプライマー（１０μＭ）、１μｌアンチセンスプライマー（１０μＭ）、１μｌ逆転写酵素、市販のＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ混合物、オートクレーブした水（全反応混合物が５０μｌとなる量）を含む独自仕様の緩衝液混合物である２５μｌの反応混合物への１．５μｇのＲＮＡの添加、を含んでいた。次いで、反応物を、１キロベースの推定産物あたり５０℃で１５〜３０分間を１サイクル、９４℃で１５秒間、５５〜６０℃で３０秒間、および６８〜７２℃で１分間、最後に７２℃で５〜１０分間を１サイクルのサーモサイクラーに置いた。アガロースゲルでサンプルを分析した。産物をゲルから切り出し、ゲルから精製した（ＧｅｎｅＣｌｅａｎ、Ｂｉｏ１０１）。精製産物を、ｐＣＴＮＲ（Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｃｏｎｔｒａｃｔｏｒ  ＤＮＡクローニングシステム、５Ｐｒｉｍｅ−３Ｐｒｉｍｅ，Ｉｎｃ．）にクローン化し、配列決定してクローンが目的の遺伝子に特異的であることを実証した。
【０１６３】
候補遺伝子の５’および３’末端クローニング法として、製造者の指示にしたがってＭａｒａｔｈｏｎｃＤＮＡ増幅キット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、ＣＡ）を使用してｃＤＮＡ末端の迅速な増幅（ＲＡＣＥ）を行った。ｃＤＮＡプールを、全ＲＮＡサンプルを改変オリゴ（ｄＴ）プライマーと混合し、７０℃に加熱し、氷上で冷却し、５×第１の標準緩衝液、１０ｍＭ  ｄＮＴＰ混合物、およびＡＭＶ逆転写酵素（２０Ｕ／μｌ）を添加する第１の標準的合成によって全ＲＮＡから調製した。チューブを４２℃で１時間インキュベートし、反応チューブを氷上に置いた。第２の標準的合成のために、反応チューブに５×第２の標準緩衝液、１０ｍＭ  ｄＮＴＰ混合物、滅菌水、２０×第２の標準酵素カクテルを直接添加し、反応チューブを１６℃で１．５時間インキュベートした。Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼを反応チューブに添加し、１６℃で４５分間インキュベートした。第２の鎖の合成をＥＤＴＡ／グリコーゲン混合物の添加によって停止させた。サンプルをフェノール／クロロホルム抽出および酢酸アンモニウム沈殿に供した。ｃＤＮＡプールを、サイズ分布についてのアガロースゲルでの分析によって質をチェックした。Ｍａｒａｔｈｏｎ  ｃＤＮＡアダプター（Ｃｌｏｎｔｈｅｃｈ）を、ｃＤＮＡ末端にライゲーションした。特異的アダプターは、５’または３’末端のいずれかを増幅させるプライミング部位を含んでおり、これは選択された遺伝子特異的プライマー（ＧＳＰ）の方向に依存する。二本鎖ｃＤＮＡのアリコートを以下の試薬に添加した：１０μＭ  Ｍａｒａｔｈｏｎ  ｃＤＮＡアダプター、５×ＤＮＡライゲーション緩衝液、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ。反応物を、１６℃で一晩インキュベートした。反応物を加熱して不活化し、反応を停止させた。以下の希釈二本鎖ｃＤＮＡプールへの添加によってＰＣＲを行った：１０×ｃＤＮＡ  ＰＣＲ反応緩衝液、１０μＭ  ｄＮＴＰ混合物、１０μＭ  ＧＳＰ、１０μＭ  ＡＰ１プライマー（キット）、５０×ＡｄｖａｎｔａｇｅｃＤＮＡポリメラーゼミックス。サーマルサイクリング条件は、９４℃で３０秒間、９４℃で５秒間を５サイクル、７２℃で４分間、９４℃で５秒間を５サイクル、７０℃で４分間、９４℃で５秒間を２３サイクル、６８度で４分間であった。ＧＳＰを使用して第１ラウンドのＰＣＲを行ってアダプタープライマー結合部位を作製するためのアダプター末端を伸長させた後、目的の特異的ＤＮＡの指数関数的増幅が認められた。通常、第２のネスト化ＰＣＲを行って、特異的ｃＤＮＡを確認する。ＲＡＣＥ産物をアガロースゲルで分析し、ゲルから切り出して精製した（ＧｅｎｅＣｌｅａｎ、ＢＩＯ１０１）。次いで、ＲＡＣＥ産物を、ｐＣＴＮＲ（一般的な制限ＤＮＡクローニングシステム、５’−３’、Ｉｎｃ．）にクローン化し、ＤＮＡを配列決定してクローンが目的の遺伝子に特異的であるかどうかを実証した。
【０１６４】
ＸＩ．変異分析
上記手順を使用して比較遺伝子を同定し、各遺伝子を変異検出分析に供した。比較ＤＮＡ配列決定を使用して、染色体１１ｑ１２−１３由来のＨＢＭ候補遺伝子の多型を同定した。候補遺伝子のＤＮＡ配列を、患者のリンパ芽球細胞株から増幅した。
【０１６５】
本発明者らは、原因多型を調査するための候補領域から増幅されたＰＣＲ産物の直接ＤＮＡ配列決定分析に基づく方法を開発した。この手順は、分離多型を見出すためのＨＢＭの異なるサブセットおよび多型頻度を評価するための集団パネルを使用する３つの段階からなる。ファミリーリソースは、全ての罹患個体が同一の原因多型を共有するという仮定を導く１人の創始者に起因する。
【０１６６】
発端者、娘、娘の母、父、および兄弟からなるＨＢＭファミリーのサブセットにおける候補領域を最初にスクリーニングした。単一染色体基準配列を同時に作製し、比較に使用した。母および娘は、この核家族でＨＢＭ多型を保有しており、多型伝達をモニターすることができる。全体的な結果は、２つのＨＢＭ染色体よび６つの非ＨＢＭ染色体をスクリーニングしたという点である。これにより、多数の対立遺伝子が頻繁に排除される。罹患個体に排他的に存在する対立遺伝子のみが、次の分析レベルを満たした。
【０１６７】
この元の家族でＨＢＭ表現型により排他的に分離される多型を、２つのさらなる核家族からなるＨＢＭ血統部分の拡大において再試験した。これらの家族は、ＨＢＭからなり、非罹患個体であった。この群中のＨＢＭ個体は、重要な領域のセントロメアおよびテロメア境界が得られる２人の重要な交差個体を含んでいた。これらの個体と罹患した親と間の多型遺伝の追跡により、重要な領域がさらに正確になる。この群は、スクリーニングした全ＨＢＭ染色体が７つであり、全非ＨＢＭ染色体が１７である。
【０１６８】
所与の多型が拡大した群中のＨＢＭ表現型で排他的に分離され続ける場合、集団パネルを試験した。この８４人のパネルは、正常な骨塩密度を有することが公知の４２人の個体および関連しないが非分類骨塩密度を有することが公知の４２人の個体からなっていた。正常な骨塩密度は、ＢＭＤ  Ｚスコア０の２つの標準偏差内である。第２の群は、広く使用されている個体のＣＥＰＨパネル由来であった。この手段では稀であることが見出された任意の分離多型を、全ＨＢＭ血統およびより大きな集団について試験した。
【０１６９】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用して、ＨＢＭファミリーのＤＮＡおよび単一染色体コントロール由来の配列決定テンプレートを作製した。各エクソンに隣接するオリゴヌクレオチドおよび各遺伝子の推定５’調節エレメントを使用したＰＣＲを使用して、１１ｑ１２−１３上のＨＢＭ領域内の遺伝子の酵素増幅を行った。各エクソンおよびいずれかのスプライス側の各イントロン内の１５以上の塩基対を増幅するためのプライマーを選択した。全てのＰＣＲプライマーを、色素プライマー配列決定を容易にするためのキメラとして作製した。Ｍ１３−２１Ｆ（５’−ＧＴＡ  Ａ  ＣＧＡ  ＣＧＧ  ＣＣＡ  ＧＴ  −３’）（配列番号３０）および−２８ＲＥＶ（５’−  ＡＡＣ  ＡＧＣ  ＴＡＴ  ＧＡＣ  ＣＡＴ  Ｇ  −３’）（配列番号３１）プライマー結合部位を、合成中にそれぞれ各正方向および逆方向ＰＣＲプライマーに構築した。２ＵＡｍｐｌｉＴａｇ、５００ｎＭプライマー、および１２５μＭ  ｄＮＴＰを含む５０μｌのＰＣＲにおいて、１５０ｎｇのゲノムＤＮＡを使用した。緩衝液およびサイクリング条件は各プライマーセットに特有であった。ホットスタートＰＣＲにＴａｑＳｔａｒｔ抗体（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を使用して、プライマー二量体形成を最小にした。１０％の産物をアガロースゲルで試験した。脱イオン水で適切なサンプルを１：２５に希釈し、配列決定した。
【０１７０】
標準的なエネルギー移動プライマー（Ａｍｅｒｓｈａｍ）プロトコールにしたがって、各ＰＣＲ産物を配列決定した。全ての反応を９６ウェルプレートで行った。各テンプレートについて４つの異なる反応（Ａ、Ｃ、Ｇ、およびＴ各１つ）を行った。各反応物は、２μｌの配列決定反応混合物および３μｌの希釈テンプレートを含んでいた。次いで、テンプレートを、ホイルテープで加熱密封し、サーマルサイクラーに置き、製造者の説明書に従ってサイクルを実行した。サイクリング後、４つの反応物をプールした。３μｌのプール産物を新規の９６ウェルプレートに移し、１μｌの市販のローディング色素を各ウェルに添加した。全ての９６ウェルへのピペッティング操作はＨｙｄｒａ９６ピペッティングステーション（Ｒｏｂｂｉｎｓ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＵＳＡ）で行った。１μｌのプール物質を４８レーンのゲルに直接ロードし、ＡＢＩ３７７ＤＮＡシークエンサーを２．４ｋＶで１０時間運転した。
【０１７１】
Ｐｏｌｙｐｈｒｅｄ（ワシントン大学）を使用して、Ｃｏｎｓｅｄ（ワシントン大学）と配列セットを構築した。全ての関連する家族のメンバーおよび特定の標的領域のためのコントロールを示す群中で配列を構築した。それぞれ３つの段階について個別にこれを行った。単一染色体テンプレートおよび色で示した基準配列からの読み取りと共に、各個体の正方向および逆方向の読み取りを含んでいた。Ｐｏｌｙｐｈｒｅｄに、紫色のフラッグをつけた潜在的多型部位を示した。２人のリーダーは、各アセンブリを個別に考察し、紫色のフラッグをつけた部位の正確さを評価した。
【０１７２】
成熟ｍＲＮＡおよびいくつかの他の一次転写部分に存在する全部で２３個のエクソンを、２人のＨＢＭ罹患個体および２人の非罹患個体の核家族におけるヘテロ接合性について評価した。以下の表に示すように、２５個の単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）を同定した。
【０１７３】
【表４】
2004523724.tif 000010
【０１７４】
表４に示した多型に加えて、２つのさらなる多型が配列番号２に存在し得る。これらは、配列番号２の第２００２位での変化である。グアニンまたはアデニンのいずれかが、この位置に出現し得る。この多型はサイレントであり、いかなるアミノ酸配列の変化にも関連しない。第２の変化は、シトシン（Ｃ）からチミジン（Ｔ）への変化に対応する配列番号２の第４０５９位に存在する。この多型により、バリン（Ｖ）からアラニン（Ａ）への対応するアミノ酸変化を生じる。候補遺伝子エクソンおよび隣接するイントロン配列中に他の多型が見出された。表４に列挙した任意の１つまたは組み合わせまたは上で考察の２つもまた、配列番号２に存在する場合、骨量または脂質レベルにわずかに影響を与え得る。
【０１７５】
本発明は、上記で同定した点変異を含む配列番号１の核酸配列を有する核酸配列を含む。
【０１７６】
好ましくは、本発明は、配列番号２の核酸を含む。特に、Ｚｍａｘ１（ＨＢＭ遺伝子）のコード配列中の第５８２位でのＧからＴへの塩基対の変化は、全てのＨＢＭ個体でヘテロ接合性であると同定され、非罹患個体（すなわち、ｂ５２７ｄ１２−ｈ＿コンティーグ０８７＿１．ｎｔ）では見出されなかった。図５は、Ｂ５２７Ｄ１２におけるコンティーグの順序を示す。ＨＢＭ遺伝子の転写方向は、左から右である。Ｂ５２７Ｄ１２のコンティーグ３０８Ｇ配列は、ＨＢＭ遺伝子のコード領域に逆方向で相補的である。したがって、ＣからＡへの塩基が変化する置換として表４に示すコンティーグ３０８Ｇの相対多型は、ＨＢＭ遺伝子におけるＧからＴへの置換に相補的である。この変異により、グリシン１７１がバリン（Ｇ１７１Ｖ）に置換する。
【０１７７】
ＨＢＭ多型を、異なる個体群のＤＮＡ配列の試験によって確認した。全てのＨＢＭ血統メンバー（３８人の個体）では、罹患（すなわち、骨量の増加）個体（Ｎ＝１８）においてのみヘテロ接合性形態でＨＢＭ多型が認められた。非罹患の親類（Ｎ＝２０）（ＢＭＤＺ＜２．０）では、ＨＢＭ多型は全く認められなかった。この遺伝子がＨＢＭ血統以外の個体で認められたことがあるかどうかを同定するために、２９７人の表現型分類された個体をＨＢＭ遺伝子部位で特徴付けた。ＨＢＭ多型部位でヘテロ接合性ではなかった。非表現型分類コントロール群では、４２人のうち１人の個体の第５８２位でヘテロ接合性が認められた。この個体は衰弱しているので、その骨塩密度は得られなかった。まとめると、これらのデータは、高血量表現型を示す血統で認められる多型は、Ｚｍａｘ１の第５８２位でのＧ→Ｔ多型に強く相関していることを提供している。まとめると、これらにより、ＨＢＭ多型は、一般に、ＨＢＭ表現型で分離され、ＨＢＭ多型および表現型は一般的集団では稀であることが確立される。
【０１７８】
ＸＩＩ．対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）分析
ＨＢＭ１多型を含むアンプリコンを、目的のエクソンに特異的なプライマーを使用してＰＣＲ増幅した。適切な個体集団を、以下のように９６ウェルマイクロタイタープレートでＰＣＲ増幅した。１×ＰｒｏｍｅｇａＰＣＲ緩衝液（カタログ番号Ｍ１８８３（１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２を含む））、１００ｍＭ  ｄＮＴＰ、２００ｎＭ  ＰＣＲプライマー（１８６３Ｆ：ＣＣＡＡＧＴＴＣＴＧＡＧＡＡＧＴＣＣおよび１８６４Ｒ：ＡＡＴＡＣＣＴＧＡＡＡＣＣＡＴＡＣＣＴＧ）、１Ｕ  Ａｍｐｌｉｔａｑ、および２０ｎｇのゲノムＤＮＡを含むＰＣＲ反応物（２０μｌ）を調製し、以下のＰＣＲ条件下で増幅した：９４℃で１分間、（９０℃で３０秒間、５８℃で３０秒間、７２℃で１分間）を３５サイクル、７２℃で５分間、４℃で保持。次いで、ローディング色素を添加し、１０μｌの産物を１μｇ／ｍｌの臭化エチジウムを含む１．５％アガロースゲルにて１００〜１５０Ｖで５〜１０分間電気泳動した。ゲルを変性溶液（１．５Ｍ  ＮａＣｌ、０．５Ｎ  ＮａＯＨ）中で２０分間処理し、短時間水でリンスした。次いで、ゲルを１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）１．５Ｍ  ＮａＣｌで２０分間中和し、水でリンスした。ゲルを１０×ＳＳＣに２０分間浸漬し、１０×ＳＳＣ中のナイロントランスファー膜（ＨｙｂｏｎｄＮ＋−Ａｍｅｒｓｈａｍ）に一晩ブロッティングした。フィルターを１０分間６×ＳＳＣでリンスし、ＵＶを交差結合した。
対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）を、多型を使用してほぼ中央にデザインした。オリゴヌクレオチドは５’末端にリン酸を含まず、Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬから購入した。オリゴヌクレオチド配列を以下に示す。
２３２６  Ｚｍａｘ１．ＡＳＯ．ｇ：ＡＧＡＣＴＧＧＧＧＴＧＡＧＡＣＧＣ
２３２７  Ｚｍａｘ１．ＡＳＯ．ｔ：ＣＡＧＡＣＴＧＧＧＴＴＧＡＧＡＣＧＣＣ
【０１７９】
多型ヌクレオチドには下線を引いている。オリゴを標識するために、１．５μｌの１μｇ／μｌ  ＡＳＯオリゴ（２３２６  Ｚｍａｘ１．ＡＳＯ．ｇまたは２３２７  Ｚｍａｘ１．ＡＳＯ．ｔ）、１１μｌ  ｄｄＨ２Ｏ、２μｌ  １０×キナーゼ正方向緩衝液、５μｌ  γ−３２Ｐ−ＡＴＰ（６０００Ｃｉ／ｍＭｏｌｅ）、および１μｌＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（１０Ｕ／μｌ）を混合し、反応物を３７℃で３０〜６０分インキュベートした。次いで、反応物を９５℃で２分間静置し、３０ｍｌの水を添加した。Ｇ２５マイクロスピンカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を使用して、プローブを精製した。
【０１８０】
ブロットを、５×ＳＳＰＥ、５×デンハート液、２％ＳＤＳ、および１００μｇ／ｍｌ変性、超音波処理サケ精子ＤＮＡにて４０℃で２時間予備ハイブリッド形成させた。キナーゼ処理オリゴの全反応混合物を、１０ｍｌの新鮮なハイブリッド形成緩衝液（５×ＳＳＰＥ、５×デンハート液、２％ＳＤＳ）に添加し、４０℃で少なくとも４時間から一晩ハイブリッド形成させた。
【０１８１】
全ての洗浄は、５×ＳＳＰＥおよび０．１％ＳＤＳで行った。第１の洗浄は、４５℃で１５分間であり、次いで、溶液を交換し、フィルターを５０℃で１５分間洗浄した。次いで、フィルターを２つの増感スクリーンを具備したＫｏｄａｋ  ｂｉｏｍａｘフィルムに−７０℃で１５分間感光した。必要ならばフィルターを５５℃で１５分間洗浄し、再びフィルムに感光する。０．１×ＳＳＣ，０．１％ＳＤＳで１０分間ボイルでの少なくとも３回の洗浄により、フィルターをはがす。
【０１８２】
２つのＡＳＯを使用した対立遺伝子特異的アッセイを最良にとらえた２つのフィルムを、Ａｄｏｂｅ  ＰｈｏｔｏＳｈｏｐへのスキャニングによってデジタル画像に変換した。これらの画像を、グラフィークコンバータで重ね合わせ、ＦｉｌｅＭａｋｅｒ  Ｐｒｏ４．０に保存した（図９を参照のこと）。
【０１８３】
ＸＩＩＩ．Ｚｍａｘ１の細胞位置決定
Ａ．非アイソトープｉｎ  ｓｉｔｕハイブリッド形成によるラット脛骨での遺伝子発現
国際病理協会（ＰＡＩ）、Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ、ＭＤによって、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリッド形成を行った。この研究は、骨成長および再構築領域が特に強調されたラット骨におけるＺｍａｘ１遺伝子を発現する特定の細胞型を同定を行った。本研究で使用したＺｍａｘ１プローブを、ヒト（ＨｕＺｍａｘ１）および８７％の配列同一性を示すマウス（ＭｓＺｍａｘ１）ｃＤＮＡの両方から作製した。ヒトおよびマウスＺｍａｘ１とラットＺｍａｘ１との相同性は未知である。
【０１８４】
例えば、非アイソトープｉｎ  ｓｉｔｕハイブリッド形成による遺伝子発現を、以下のように行ったが、他の方法も当業者に公知である。二酸化炭素窒息によって安楽死させた６〜８週齢の２匹のスピローグ・ドーリーラットから脛骨を採取した。遠位末端を取り出し、近位の脛骨を死の直後に液体窒素を含むＯＣＴ包埋培地中で瞬間冷凍した。組織を−８０℃のフリーザで保存した。
【０１８５】
ｃＤＮＡからのＰＣＲ産物の増幅用プローブを、以下のように調製した。ヒトＬＲＰ５（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＢＯ１７４９８）およびマウスＬＲＰ５（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＦＯ６４９８４）の公開配列を使用して、ｃＤＮＡクローンからＰＣＲ産物を増幅するためのプライマーを選択した。ＬＤＬ受容体ファミリーでの他の遺伝子との交差反応性を最小にするために、ＰＣＲ産物はタンパク質コード領域の細胞内部分由来であった。テンプレートとしてｃＤＮＡクローンを使用して、５０μｌの反応体積でＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応物は、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１単位のＡｍｐｌｉｔａｑ、２００μＭ  ｄＮＴＰ、および２μＭ各プライマーを含んでいた。ＰＣＲサイクリング条件は、以下であった：９４℃で１分間、その後９４℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、７２℃で３０秒間を３５サイクル；その後７２℃で５分間の伸長。次いで、反応物を１．５％アガロースＴｒｉｓ−Ａｃｅｔａｔｅゲルで泳動した。アガロースからＤＮＡを溶出させ、エタノール沈殿し、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）に再懸濁した。マウスおよびヒトｃＤＮＡについてのゲル精製ＰＣＲ産物を調製し、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリッド形成用に国際病理協会に供給した。
【０１８６】
ヒトおよびマウスＰＣＲプライマーおよび産物の配列は以下であった。
ヒトＺｍａｘ１センスプライマー（ＨＢＭ１２５３）
ＣＣＣＧＴＧＴＧＣＴＣＣＧＣＣＧＣＣＣＡＧＴＴＣ
ヒトＺｍａｘ１アンチセンスプライマー（ＨＢＭ１４６５）
ＧＧＣＴＣＡＣＧＧＡＧＣＴＣＡＴＣＡＴＧＧＡＣＴＴ
ヒトＺｍａｘ１  ＰＣＲ産物
ＣＣＣＧＴＧＴＧＣＴＣＣＧＣＣＧＣＣＣＡＧＴＴＣＣＣＣＴＧＣＧＣＧＣＧＧＧＧＴＣＡＧＴＧＴＧＴＧＧＡＣＣＴＧＣＧＣＣＴＧＣＧＣＴＧＣＧＡＣＧＧＣＧＡＧＧＣＡＧＡＣＴＧＴＣＡＧＧＡＣＣＧＣＴＣＡＧＡＣＧＡＧＧＴＧＧＡＣＴＧＴＧＡＣＧＣＣＡＴＣＴＧＣＣＴＧＣＣＣＡＡＣＣＡＧＴＴＣＣＧＧＴＧＴＧＣＧＡＧＣＧＧＣＣＡＧＴＧＴＧＴＣＣＴＣＡＴＣＡＡＡＣＡＧＣＡＧＴＧＣＧＡＣＴＣＣＴＴＣＣＣＣＧＡＣＴＧＴＡＴＣＧＡＣＧＧＣＴＣＣＧＡＣＧＡＧＣＴＣＡＴＧＴＧＴＧＡＡＡＴＣＡＣＣＡＡＧＣＣＧＣＣＣＴＣＡＧＡＣＧＡＣＡＧＣＣＣＧＧＣＣＣＡＣＡＧＣＡＧＴＧＣＣＡＴＣＧＧＧＣＣＣＧＴＣＡＴＴＧＧＣＡＴＣＡＴＣＣＴＣＴＣＴＣＴＣＴＴＣＧＴＣＡＴＧＧＧＴＧＧＴＧＴＣＴＡＴＴＴＴＧＴＧＴＧＣＣＡＧＣＧＣＧＴＧＧＴＧＴＧＣＣＡＧＣＧＣＴＡＴＧＣＧＧＧＧＧＣＣＡＡＣＧＧＧＣＣＣＴＴＣＣＣＧＣＡＣＧＡＧＴＡＴＧＴＣＡＧＣＧＧＧＡＣＣＣＣＧＣＡＣＧＴＧＣＣＣＣＴＣＡＡＴＴＴＣＡＴＡＧＣＣＣＣＧＧＧＣＧＧＴＴＣＣＣＡＧＣＡＴＧＧＣＣＣＣＴＴＣＡＣＡＧＧＣＡＴＣＧＣＡＴＧＣＧＧＡＡＡＧＴＣＣＡＴＧＡＴＧＡＧＣＴＣＣＧＴＧＡＧＣＣ
マウスＺｍａｘ１センスプライマー（ＨＢＭ１６５５）
ＡＧＣＧＡＧＧＣＣＡＣＣＡＴＣＣＡＣＡＧＧ
マウスＺｍａｘ１アンチセンスプライマー（ＨＢＭ１６５６）
ＴＣＧＣＴＧＧＴＣＧＧＣＡＴＡＡＴＣＡＡＴ
マウスＺｍａｘ１  ＰＣＲ産物
ＡＧＣＡＧＡＧＣＣＡＣＣＡＴＣＣＡＣＡＧＧＡＴＣＴＣＣＣＴＧＧＡＧＡＣＴＡＡＣＡＡＣＡＡＣＧＡＴＧＴＧＧＣＴＡＴＣＣＣＡＣＴＣＡＣＧＧＧＴＧＴＣＡＡＡＧＡＧＧＣＣＴＣＴＧＣＡＣＴＧＧＡＣＴＴＴＧＡＴＧＴＧＴＣＣＡＡＣＡＡＴＣＡＣＡＴＣＴＡＣＴＧＧＡＣＴＧＡＴＧＴＴＡＧＣＣＴＣＡＡＧＡＣＧＡＴＣＡＧＣＣＧＡＧＣＣＴＴＣＡＴＧＡＡＴＧＧＧＡＧＣＴＣＡＧＴＧＧＡＧＣＡＣＧＴＧＡＴＴＧＡＧＴＴＴＧＧＣＣＴＣＧＡＣＴＡＣＣＣＴＧＡＡＧＧＡＡＴＧＧＣＴＧＴＧＧＡＣＴＧＧＡＴＧＧＧＣＡＡＧＡＡＣＣＴＣＴＡＴＴＧＧＧＣＧＧＡＣＡＣＡＧＧＧＡＣＣＡＡＣＡＧＧＡＴＴＧＡＧＧＴＧＧＣＣＣＧＧＣＴＧＧＡＴＧＧＧＣＡＧＴＴＣＣＧＧＣＡＧＧＴＧＣＴＴＧＴＧＴＧＧＡＧＡＧＡＣＣＴＴＧＡＣＡＡＣＣＣＣＡＧＧＴＣＴＣＴＧＧＣＴＣＴＧＧＡＴＣＣＴＡＣＴＡＡＡＧＧＣＴＡＣＡＴＣＴＡＣＴＧＧＡＣＴＧＡＧＴＧＧＧＧＴＧＧＣＡＡＧＣＣＡＡＧＧＡＴＴＧＴＧＣＧＧＧＣＣＴＴＣＡＴＧＧＡＴＧＧＧＡＣＣＡＡＴＴＧＴＡＴＧＡＣＡＣＴＧＧＴＡＧＡＣＡＡＧＧＴＧＧＧＣＣＧＧＧＣＣＡＡＣＧＡＣＣＴＣＡＣＣＡＴＴＧＡＴＴＡＴＧＣＣＧＡＣＣＡＧＣＧＡ
【０１８７】
リボプローブを以下のように合成した。ＰＣＲ産物を、再増幅産物のＴ３プロモーター上流またはＴ７プロモーター下流のいずれかを組み込むようにデザインしたキメラプライマーを使用して再増幅した。得られたＰＣＲ産物を、インビトロ転写（ＩＶＴ）によるジゴキシゲニン標識リポプローブを合成するためのテンプレートとして使用した。アンチセンスおよびセンスリボプローブを、製造者の指示に従ってＭＡＸＩｓｃｒｉｐｔＩＶＴキット（Ａｍｂｉｎ）を使用して、ジゴキシゲニン−１１−ＵＴＰ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｈｅｉｍ）の存在下でＴ７およびＴ３  ＲＮＡポリメラーゼを使用して合成した。次いで、ＤＮＡをＤＮアーゼＩで分解し、非組み込みジゴキシゲニンを限外濾過によって除去した。リボプローブの完全性を、変性ポリアクリルアミドゲルによる電気泳動によって評価した。分子サイズを、１００〜１０００塩基対（ｂｐ）のＲＮＡラダー（Ａｍｂｉｏｎ）の電気泳動移動度と比較した。得られたプローブおよび標識を、ブロット免疫化学を使用して評価した。リボプローブを、５μｌアリコートにて−８０℃で保存した。
【０１８８】
ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリッド形成を以下のように行った。凍結ラット骨を、ＪｕｎｇＣＭ３０００低温槽（Ｌｅｉｃａ）で５μＭの切片に切断し、接着スライド（Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｄｉｃｓ）に置いた。切片を−２０℃の低温槽でｍＲＮＡ分解を防止するために全てのスライドが調製されるまで維持し、４％パラホルムアルデヒドで１５分間固定した。固定後、切片を国際病理協会（ＰＡＩ）特注のハイブリッド形成緩衝液中で１ｎｇ／μｌのアンチセンスまたはセンスリボプローブと５８℃で４０時間インキュベートした。ハイブリッド形成後、スライドを一連のハイブリッド後ストリンジェンシー洗浄に供して、非特異的プローブ結合を減少させた。ハイブリッド形成を、アルカリホスファターゼに接合した抗ジゴキシゲニン抗体（ＦＡＢフラグメント）を使用した免疫組織化学よって視覚化した。色素原としてニトロブルーテトラゾリウムクロリド／ブロモクロロインドリルホスフェート（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ）（沈殿アルカリホスファターゼ基質）を使用して、ハイブリッド形成細胞を染色の程度に依存して紫色からほぼ黒色に染色した。組織切片を、ニュークレアファーストレッドで対比染色した。アッセイコントロールは、プローブまたはプローブおよびジゴキシゲニン抗体を含まなかった。
【０１８９】
特異的細胞型を、ｍＲＮＡの陽性のハイブリッド形成シグナルを示す紫色から黒色の細胞質および／または核周辺染色の視覚化によってアンチセンスプローブとのハイブリッド形成について評価した。各細胞型を、各センスプローブとハイブリッド形成する複製切片と比較した。結果は、アンチセンスプローブで染色が認められ、センスプローブで染色が認められないかバックグラウンドが弱い場合に陽性であるとみなす。
【０１９０】
各研究プローブのハイブリッド形成シグナルの細胞位置決定を、表５にまとめる。Ｚｍａｘ１のハイブリッド形成は、骨幹端内の骨内膜および小柱骨を含む再構築に関連する骨領域で主に検出された。骨膜および骨端の選択された骨内層細胞でのハイブリッド形成もまた認められた。陽性のシグナルは、骨端軟骨内の軟骨細胞、特に増殖軟骨細胞でも認められた。ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリッド形成の結果の代表的な顕微鏡写真については、図１０、１１、および１２を参照のこと。
【０１９１】
【表５】
2004523724.tif 000011
【０１９２】
これらの研究により、骨再構築および骨形成に関連する細胞におけるＺｍａｘ１の発現位置を確認する。増殖領域ならびに近位骨幹端の骨芽細胞および破骨細胞でのＺｍａｘ１発現により、Ｚｍａｘ１遺伝子が骨成長および鉱化作用過程に関連することが示唆される。骨芽細胞および破骨細胞の活性および分化は、骨発達中に骨が形成されるにつれて、成長中、および成人期に骨が継続的に再構築されるにつれて密接に調和する。内部骨構造の形成および骨の再構成は、活性化破骨細胞による骨吸収と骨芽細胞による新規の物質のその後の沈着との連携に起因する。Ｚｍａｘ１は、ＬＤＬ受容体遺伝子に関連するので、骨再構成過程における機械的感覚およびその後のシグナル伝達に関連する受容体であり得る。したがって、この遺伝子の発現レベルの変化は、骨の再構築速度および鉱化の程度に影響を与え得る。他の細胞または組織におけるＨＢＭまたはＺｍａｘ１のｉｎ  ｓｉｔｕ分析のために類似の研究をデザインすることができる。
【０１９３】
ＸＩＶ．アンチセンス
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、標的化ＲＮＡに相補的な塩基配列を含む短い合成核酸である。生細胞中のＲＮＡのアンチセンスオリゴヌクレオチドとのハイブリッド形成により、ＲＮＡ機能が妨害され、最終的にタンパク質発現が遮断される。したがって、部分配列が公知の任意の配列を、アンチセンスオリゴヌクレオチドによって標的することができる。
【０１９４】
アンチセンス技術は、広く使用される研究ツールとなりつつあり、ゲノム配列決定によって同定された治療標的の確認および解明においてさらに重要な役割を果たしつつある。
【０１９５】
標的遺伝子をコードするｍＲＮＡに相補的なオリゴヌクレオチドの使用によって遺伝子発現を阻害するアンチセンス技術を開発した。アンチセンスオリゴヌクレオチドの阻害効果についていくつかの見込みのある機構が存在する。これらのうち、ＲＮアーゼＨによるｍＲＮＡの分解はタンパク質機能阻害の主要な機構であると考えら得ている。この技術を独創的に使用して標的遺伝子の機能を解明するが、伸長且つ適切にデザインする場合治療用途も有し得る。
【０１９６】
アンチセンスオリゴヌクレオチド調製のための材料と方法の例を、以下のように行うことができる。骨芽細胞様マウス細胞株ＭＣ３Ｔ３でのアンチセンス技術を使用したＳｅｑｕｉｔｅｒ（Ｎａｔｉｃｋ、ＭＡ）と連携して予備研究を行った。これらの細胞を、骨分化配列に沿って発達するするように誘発することができる。最初の増殖期間を、分化マーカーの最小発現およびコラーゲン細胞外基質の最初の合成によって特徴付ける。コラーゲン基質合成には、その後分化マーカーの誘導が必要である。一旦基質合成が開始されると、骨芽細胞マーカー遺伝子が明白な一過性配列で活性化される。アルカリホスファターゼが早期に誘導される一方で、骨唾液タンパク質およびオステオカルシンが分化過程の後期に認められる。遺伝子発現のこの一過性配列変異および鉱化過程のモニタリングに有用である。変異開始から数日後まで開始しない基質鉱化は、細胞層培養プレートの境界付近の基質内の深くの膠原原線維上および内部の無機質の蓄積を含む。培養骨芽細胞によって形成された膠原原線維関連無機質は、インビボでの網状骨で見出されるものと類似しているので、研究試薬として頻繁に使用されている。
【０１９７】
ＭＣ３Ｔ３細胞を、製造者の説明書にしたがって、第１週にアンチセンスオリゴヌクレオチドでトランスフェクトした（米国特許第５，８４９、９０２号）。
【０１９８】
Ｚｍａｘ１をデザインしたオリゴヌクレオチドは以下に示す：
１０８７５：ＡＧＵＡＣＡＧＣＵＵＣＵＵＧＣＣＡＡＣＣＣＡＧＵＣ
１０８７６：ＵＣＣＵＣＣＡＧＧＵＣＧＡＵＧＧＵＣＡＧＣＣＣＡＵ
１０８７７：ＧＵＣＵＧＡＧＵＣＣＧＡＧＵＵＣＡＡＡＵＣＣＡＧＧ
【０１９９】
図１３は、ＭＣ３Ｔ３細胞のＺｍａｘ１のアンチセンス阻害の結果を示す。上記の３つのオリゴヌクレオチドをＭＣ３Ｔ３にトランスフェクトし、標準的な手順にしたがってＲＮＡを単離した。ノーザンブロット分析により、Ｚｍａｘ１転写物の顕著に低い定常状態レベルを示す一方で、コントロール遺伝子ＧＡＰＤＨは変化しないままであった。したがって、上記のプライマーを使用したアンチセンス技術により、骨生物学におけるＺｍａｘ１発現の役割を研究する。類似のプライマーを使用して、Ｚｍａｘ１発現および動物における脂質レベルの調節能力を研究することができる。
【０２００】
Ｚｍａｘ１によってコードされるタンパク質は、低密度リポタンパク質受容体（ＬＤＬ受容体）に関連する。Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎら、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、１：１−３９（１９８５）；Ｂｒｏｗｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３２：３４−４７（１９８６）を参照のこと。ＬＤＬ受容体は、低密度リポタンパク質（コレステロールを含む脂質−タンパク質凝集体）の取り込みを担う。ＬＤＬ受容体が欠損した個体は、コレステロール除去が不完全であり、アテローム性動脈硬化症を発症する傾向がある。さらに、欠損ＬＤＬ受容体を有する細胞は、部分的にコレステロール合成酵素のフィードバック調節の変化およびこれらの酵素の遺伝子の転写の増加により、コレステロール産生量が増加を示す。いくつかの細胞型では、コレステロールは、ステロイドホルモンの形成のための前駆体である。
【０２０１】
したがって、ＬＤＬ受容体は、直接または間接的に、シグナル伝達タンパク質として機能し、遺伝子発現を調節することができる。Ｚｍａｘ１がＬＤＬ受容体に関連するので、このタンパク質はまた、骨再構築に影響を与え、脂質レベルを調節し、それにより脂質媒介疾患を発症する、細胞間のシグナル伝達に関連し得る。
【０２０２】
グリシン１７１アミノ酸は、このアミノ酸はＺｍａｘ１のマウスホモログでも見出されるので、Ｚｍａｘ１の機能に重要なようである。密接に関連すＬＲＰ６タンパク質はまた、対応する位置にグリシンを含む（Ｂｒｏｗｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｍｍ．、２４８、８７９−８８８（１９８８））。天然の選択により重要な位置でのアミノ酸の変化を伴う変異を予防するので、タンパク質の構造または機能において重要であるアミノ酸は種間で保存される傾向がある。
【０２０３】
さらに、Ｚｍａｘ１の細胞外ドメインは、５つのＹＷＴモチーフとその後のＥＦＧモチーフからなる４つの反復を含む。この５ＹＷＴ＋ＥＧＦ反復は、明白に折りたたまれたタンパク質ドメインを形成するようである。この反復はまたＬＤＬ受容体および他のＬＤＬ受容体関連タンパク質で見出される。第１の３つの５ＹＷＴ＋ＥＧＦ反復は、その構造が非常に類似しており、４番目は非常に異なる。グリシン１７１は、Ｚｍａｘ１中の第１の５ＹＷＴ＋ＥＧＦ反復の中央のＹＷＴモチーフ中に存在する。５ＹＷＴ＋ＥＧＦ反復がＬＤＬ受容体タンパク質中に含まれるように、Ｚｍａｘ１の他の２つの類似の５ＹＷＴ＋ＥＧＦ反復はまた、対応する位置にグリシンを含む。しかし、Ｚｍａｘ１中の第１の３つの５ＹＷＴ＋ＥＧＦ反復およびＬＤＬ受容体中の１つの反復の間で１７．６％のアミノ酸のみが同一である。これらの所見により、グリシン１７１はこの反復の機能に不可欠であり、グリシン１７１の変異によりＺｍａｘ１の機能が変化することが示される。ｃＤＮＡおよびペプチド配列を、図６Ａ〜６Ｅに示す。ヌクレオチド第５８２位の重要な塩基を、太字で示し、下線を引いている。
【０２０４】
ノーザンブロット分析（図７Ａ〜Ｂ）により、Ｚｍａｘ１はヒト骨組織および他の多数の組織で発現することが明らかである。多組織ノーザンブロット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、ＣＡ）を、Ｚｍａｘ１由来のエクソンで探索した。図７Ａに示すように、５．５ｋｂのＺｍａｘ１転写物は、心臓、腎臓、肺、肝臓、および膵臓で高度に発現し、骨格筋および脳での発現レベルは低い。第２のノーザンブロット（図７Ｂに示す）により、転写物サイズが５．５ｋｂであることが確認され、これは、Ｚｍａｘ１が脳、骨髄、頭蓋骨、およびヒト骨芽細胞株で発現することが示された。
【０２０５】
まとめると、これらの結果は、Ｚｍａｘ１遺伝子のＨＢＭ多型はＨＢＭ表現型を担い、Ｚｍａｘ１遺伝子は骨発達で重要であることを示す。さらに、Ｚｍａｘ１変異により骨鉱化および脂質レベルの増加を変化することができ、Ｚｍａｘ１に結合する分子が骨発達および脂質レベルを有用に変化させることができるようである。このような分子には、例えば、小分子、たんぱく質、ＲＮＡアプタマー、ペプチドアプタマーなどを含み得る。
【０２０６】
ＸＶ．核酸、ベクター、形質転換体、および宿主細胞の調製
大量の本発明の核酸を、適切な宿主細胞での複製によって産生することができる。所望のフラグメントをコードする天然または合成核酸フラグメントを、原核または真核細胞への移入および複製が可能な組換え核酸構築物（通常、ＤＮＡ構築物）に組み込む。通常、核酸構築物は、酵母または細菌などの単細胞宿主での複製に適切であるが、培養哺乳動物もしくは植物または他の真核細胞株への移入（ゲノム内へ取り込まれるか取り込まれずに）も意図することができる。本発明の方法で産生された核酸の精製は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、「分子クローニング：実験マニュアル」、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ（１９８９）またはＡｕｓｕｂｅｌら、「現代の分子生物学プロトコール」、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、ＮＹ（１９９７）に記載されている。
【０２０７】
本発明の核酸を、化学合成（例えば、Ｂｅａｕｃａｇｅ．ら、Ｔｅｔｒａ．Ｌｅｔｔｓ．，２２：１８５９−１８６２（１９８１）に記載のホスホロアミダイト法）またはＭａｔｔｅｕｃｃｉら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１０３：３１８５（１９８１）のトリエステル法によって産生することもでき、これを市販の自動化オリゴヌクレオチド合成器で行うことができる。二本鎖フラグメントを、相補鎖の合成および適切な条件下での鎖のアニーリングまたは適切なプライマー配列を有するＤＮＡポリメラーゼを使用した相補鎖の付加のいずれかによる化学合成の一本鎖産物から得ることができる。
【０２０８】
原核生物または真核生物宿主への移入のために調製された核酸構築物は、宿主によって認識される複製系（所望のタンパク質をコードする意図する核酸フラグメントを含む）を含み、好ましくは、タンパク質コードセグメントに作動可能に連結された転写および翻訳開始調節配列も含む。発現ベクターには、例えば、複製起点もしくは自立複製配列（ＡＲＳ）および発現調節配列、プロモーター、エンハンサー、ならびに必要なプロセシング情報部位（リボソーム結合部位、ＲＮＡスプライス部位、ポリアデニル化部位、転写終結配列、およびｍＲＮＡ安定化配列など）が含まれる。適切ならば、細胞膜中でタンパク質が交差および／またはとどまり、それによりその機能的トポロジーが達成されるか細胞から分泌される、天然のＨＢＭまたはＺｍａｘ１タンパク質または他の受容体または同一もしくは関連する種の分泌タンパク質のいずれか由来の分泌シグナルも含み得る。このようなベクターを、当該分野で周知の標準的組み換え技術によって調製することができ、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、「分子クローニング：実験マニュアル」、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ（１９８９）またはＡｕｓｕｂｅｌら、「現代の分子生物学プロトコール」、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、ＮＹ（１９９２）で考察されている。
【０２０９】
適切なプロモーターおよび他の必要なベクター配列を、宿主中で機能的なように選択し、これには、適切ならば、Ｚｍａｘ１またはＨＢＭ遺伝子と天然に会合したものを含み得る。細胞とベクターとの実行可能な組み合わせの例は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、「分子クローニング：実験マニュアル」、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ（１９８９）またはＡｕｓｕｂｅｌら、「現代の分子生物学プロトコール」、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、ＮＹ（１９９２）に記載されている。多数の有用なベクターが当該分野で公知であり、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ、Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｂｉｏｔｅｃｈなど販売者から得ることができる。ｔｒｐ、ｌａｃ、おいよびファージプロモーター、ｔＲＮＡプロモーター、および解糖酵素プロモーターなどのプロモーターを原核生物宿主で使用することができる。有用な酵母プロモーターには、メタロチオネイン、３−ホスホグリセレートキナーゼ、または他の解糖酵素（エノラーゼまたはグリセルアルデヒト−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼなど）、マルトースおよびガラクトース利用を担う酵素などが含まれる。酵母発現での使用に適切なベクターおよびプロモーターは、欧州特許第７３，６７５号に記載されている。適切な未変性哺乳動物プロモーターには、ＳＶ４０由来の初期および後期プロモーター（Ｆｉｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ、２７３：１１３（１９７８））またはモロニーマウス白血病ウイルス、マウス腫瘍ウイルス、トリ肉腫ウイルス、アデノウイルスＩＩ、ウシ乳頭腫ウイルス、またはポリオイーマ由来のプロモーターを含み得る。さらに、多数の遺伝子コピーを得ることができるように、構築物を増幅遺伝子（例えば、ＤＨＦＲ）に連結することができる。適切なエンハンサーおよび他の発現調節配列のために、「エンハンサーおよび真核生物遺伝子発現」、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ（１９８３）を参照のこと。
【０２１０】
このような発現ベクターが自立的に複製することができる一方で、これらはまた、当該分野で周知の方法による宿主細胞ゲノムへの挿入によって複製することができる。
【０２１１】
発現ベクターおよびクローニングベクターは選択マーカー（ベクターで形質転換された宿主細胞の生存または増殖に必要なタンパク質をコードする遺伝子）を含むようである。この遺伝子の存在により、挿入断片を発現するこれらの宿主細胞のみで増殖が確保される。典型的な選択遺伝子は、ａ）抗生物質または他の有毒物質（例えば、アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキセートなど）に対する耐性を付与するタンパク質、ｂ）栄養要求性欠損を補足するタンパク質、またはｃ）天然培地から利用不可能な重要な栄養素（例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属のＤ−アラニンラセマーゼをコードする遺伝子）を供給するタンパク質をコードする。適切な選択マーカーは宿主細胞に依存し、異なる宿主に適切なマーカーは当該分野で周知である。
【０２１２】
目的の核酸を含むベクターをインビトロで転写することができ、得られたＲＮＡを周知の方法（例えば、注射（Ｋｕｂｏら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．、２４１：１１９（１９８８）を参照のこと））によって宿主細胞に移入することができるか、ベクターを当該分野で周知の方法（エレクトロポレーション；塩化カルシウム、塩化ルビジウム、リン酸カルシウム、ＤＥＡＥデキストラン、または他の物質を使用したトランスフェクション；遺伝子銃；リポフェクチン；感染（ベクターがレトロウイルスゲノムなどの感染物質である場合）；および他の方法が含まれるが細胞宿主の型によって変化する）によって宿主細胞に直接移入することができる。一般に、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９およびＡｕｓｕｂｅｌら、１９９２を参照のこと。上記の方法を含む当該分野で公知の任意の方法による宿主細胞への核酸の移入を、本明細書中で「形質転換」という。上記の核酸が移入されている細胞はまた、このような細胞の子孫を含むことを意味する。
【０２１３】
大量の本発明の核酸およびタンパク質を、適合原核宿主細胞または真核宿主細胞におけるベクターまたは他の発現伝達体での  Ｚｍａｘ１またはＨＢＭ核酸またはその一部の発現によって調製することができる。最も一般的に使用される原核生物宿主は、大腸菌株であるにもかかわらず、枯草菌またはシュードモナスなどの他の原核生物も使用することができる。
【０２１４】
哺乳動物または他の真核生物宿主細胞（酵母、糸状菌、植物、昆虫、両生類、または鳥類などの宿主細胞）もまた、本発明のタンパク質産生に有用であり得る。培養による哺乳動物細胞の増幅自体も周知である。ＪａｋｏｂｙおよびＰａｓｔａｎ（編）、Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、第５８巻、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．、Ｈａｒｆｃｏｕｒｔ  Ｂｒａｃｅ  Ｊｏｖａｎｏｖｉｃｈ、ＮＹ（１９７９）を参照のこと。一般的に使用されている哺乳動物宿主細胞株の例は、ＶＥＲＯおよびＨｅＬａ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、Ｗ１３８、ＢＨＫ、およびＣＯＳ細胞株であるが、他の細胞株が、例えば、望ましいグリコシル化パターンをより大量に発現するか他の特徴が得られることが当業者に認識される。
【０２１５】
ベクター構築の様式に依存するマーカーの使用によってクローンを選択する。マーカーは同一または異なるＤＮＡ分子上に存在し得るが、同一のＤＮＡ分子上が好ましい。原核生物宿主では、形質転換体を、例えば、アンピシリン、テトラサイクリン、または他の抗生物質耐性によって選択することができる。温度感受性に基づいた特定の産物の産生もまた、適切なマーカーとして使用することができる。
【０２１６】
本発明の核酸で形質転換された原核生物または真核生物細胞は、本発明の核酸およびタンパク質の産生だけでなく、例えば、Ｚｍａｘ１またはＨＢＭタンパク質の特徴の研究にも有用である。
【０２１７】
アンチセンス核酸配列は、当業者が認識するように、Ｚｍａｘ１またはＨＢＭ発現の防止または減少んに有用である。例えば、Ｚｍａｘ１またはＨＢＭ遺伝子のすべてもしくは一部またはＺｍａｘ１またはＨＢＭ領域由来の他の配列を含む核酸ベクターを、アンチセンス方向でプロモーターの調節下に置き、細胞に移入することができる。細胞内へのこのようなアンチセンス構築物の発現により、Ｚｍａｘ１またはＨＢＭの転写および／または翻訳および／または複製が妨害される。
【０２１８】
本明細書中で開示のＺｍａｘ１およびＨＢＭ遺伝子配列に基づくプローブおよびプライマーを使用して、相同性Ｚｍａｘ１およびＨＢＭ遺伝子配列および他の種のタンパク質を同定する。これらのＺｍａｘ１およびＨＢＭ遺伝子配列およびタンパク質を、単離した種について本明細書中に記載の診断／予後、治療および薬物スクリーニング法で使用する。
【０２１９】
ＸＶＩ．タンパク質の発現および精製
本発明のＨＢＭタンパク質の発現および精製を、本質的に以下に概説のように行うことができる。ＨＢＭ遺伝子由来の膜タンパク質および分泌タンパク質のクローニング、発現、および精製を容易にするために、大腸菌における組換えタンパク質のクローニングおよび発現のための遺伝子発現系（ｐＥＴ系（Ｎｏｖａｇｅｎ）など）を選択した。また、ペプチドタグＨｉｓ−ＴａｐをコードするＤＮＡ配列を、目的のＤＮＡ配列の３’末端に融合して組換えタンパク質産物の精製を容易にした。任意の５’末端シグナル配列の変化を回避するために３’末端を選択した。
【０２２０】
例えば、ＨＢＭのクローニングのための配列番号１、３、および５〜１２に記載の核酸から選択した核酸を、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって調製した。ＨＢＭヌクレオチド配列の５’および３’末端に特異的な合成オリゴヌクレオチドプライマーをデザインし、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）から購入した。すべての正方向プライマー（配列の５’末端に特異的）を、５’末端にＮｃｏＩクローニング部位を含むようにデザインした。これらのプライマーを、ＮｃｏＩ部位内でコードされるメチオニン残基、その後のバリン残基ＨＢＭのＤＮＡ配列によってコードされるタンパク質のタンパク質翻訳を開始するようにデザインした。すべての逆方向プライマー（配列の３’末端に特異的）は、５’末端にｐＥＴ−２８ｂの読み取り枠にＨＢＭ配列をクローニングするためのＥｃｏＲＩ部位を含んでいた。ｐＥＴ−２８ｂベクターにより、ヒスチジン親和性タグを含む６つのヒスチジン残基（Ｃ末端）を含むさらなる２０個のカルボキシル末端アミノ酸をコードする配列が得られた。
【０２２１】
ＨＢＭ遺伝子から調製したゲノムＤＮＡを、ＰＣＲ用のテンプレートＤＮＡの供給源として使用した（Ａｕｓｕｂｅｌら、「現代の分子生物学プロトコール」、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（１９９４））。ＨＢＭヌクレオチド配列を含むＤＮＡ配列を増幅するために、ゲノムＤＮＡ（５０ｎｇ）を、最終体積１００μｌの２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、定義したＨＢＭに相補的であり且つ隣接する１μＭ合成オリゴヌクレオチドプライマー（正方向および逆方向）、０．２ｍＭの各デオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ）、および２．５単位の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ（Ａｍｐｌｉｔａｑ、Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．、Ｂｒａｎｃｈｂｕｒｇ、ＮＪ）を含む反応バイアルに入れた。
【０２２２】
サーマルサイクリング反応の完了後、各増幅ＤＮＡサンプル  を、Ｑｉａｑｕｉｃｋ  Ｓｐｉｎ  ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）を使用して精製した。すべての増幅ＤＮＡサンプルを、制限エンドヌクレアーゼ（例えば、ＮｃｏＩおよびＥｃｏＲＩ（Ｎｗｅ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ））での消化に供した（Ａｕｓｕｂｅｌら、「現代の分子生物学プロトコール」、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（１９９４））。次いで、ＤＮＡサンプルを、１．０％ＮｕＳｅｉｖｅ（ＦＭＣ  ＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ、Ｒｏｃｋｌａｎｄ、ＭＥ）アガロースゲルでの電気泳動に供した。ＤＮＡを、臭化エチジウムおよび長波長ＵＶ照射への暴露によって視覚化した。アガロースゲルから単離した薄片中に含まれるＤＮＡを、Ｂｉｏ１０１ＧｅｎｅＣｌｅａｎ  Ｋｉｔプロトコールを使用して精製した（Ｂｉｏｌｏｌ、Ｖｉｓｔａ、ＣＡ）。
【０２２３】
制限エンドヌクレアーゼ（例えば、ＮｃｏＩおよびＥｃｏＲＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ））での消化によってｐＥＴ−２８ｂベクターを調製した（Ａｕｓｕｂｅｌら、「現代の分子生物学プロトコール」、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（１９９４））。挿入遺伝子の５’末端に融合することができるヒスチジン親和性タグをコードするｐＥＴ−２８ｂベクターを、適切な制限エンドヌクレアーゼでの消化によって調製した。
【０２２４】
消化後、ＤＮＡ挿入断片を、先に消化したｐＥＴ−２８ｂ発現ベクターにクローン化した（Ａｕｓｕｂｅｌら、「現代の分子生物学プロトコール」、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ  Ｉｎｃ．（１９９４））。次いで、ライゲーション反応産物を使用して、大腸菌のＢＬ２１株を形質転換した（Ａｕｓｕｂｅｌら、「現代の分子生物学プロトコール」、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（１９９４））。
【０２２５】
コンピテント細菌大腸菌ＢＬ２１株または大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を、標準的な方法にしたがって、クローン化ＨＢＭ配列を保有する組換えｐＥＴ発現プラスミドで形質転換した（Ａｕｓｕｂｅｌら、「現代の分子生物学プロトコール」、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ  Ｉｎｃ．（１９９４））。簡単に述べれば、１μｌのライゲーション反応物を、５０μｌの電気コンピテント細胞と混合し、高電圧パルスに供し、その後サンプルを０．４５ｍｌＳＯＣ培地（０．５％酵母抽出物、２．０％トリプトン、１０ｍＭ  ＮａＣｌ、２．５ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ  ＭｇＳＯ４、および２０ｍＭグルコース）中にて震盪しながら３８℃で１時間インキュベートした。次いで、サンプルを２５μｇ／ｍｌの硫酸カナマイシンを含むＬＢ寒天プレートにプレートし、一晩増殖させた。次いで、下記のように、ＢＬ２１の形質転換コロニーを選択し、分析してクローン化挿入断片を評価した。
【０２２６】
組換えｐＥＴ−２８ｂＨＢＭヌクレオチド配列で形質転換した各ＬＢ２１クローンを、元のＰＣＲ増幅クローニング反応で使用したＨＢＭ配列に特異的な同一の正方向および逆方向プライマーを使用したクローン化挿入断片のＰＣＲ増幅によって分析した。首尾のよい増幅により、発現ベクターへのＨＢＭ配列の取り込みを確認する（Ａｕｓｕｂｅｌら、「現代の分子生物学プロトコール」、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ  Ｉｎｃ．（１９９４））。
【０２２７】
適切にクローン化したＨＢＭヌクレオチド配列を保有する組換えｐＥＴ−２８ｂベクターの各クローンを取り出し、５ｍｌのＬＢブロス＋２５μｇ／ｍｌ硫酸カナマイシンにて一晩インキュベートした。翌日、Ｑｉａｇｅｎプラスミド精製プロトコール（Ｑｉａｇｅｎ  Ｉｎｃ．、Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ、ＣＡ）を使用して、プラスミドＤＮＡを単離および精製した。
【０２２８】
クローニングまたはプラスミド調製のために、ｐＥＴベクターを、任意の大腸菌Ｋ−１２株（ＨＭＳ１７４、ＨＢ１０１、ＪＭ１０９、ＤＨ５など）で増殖させることができる。発現宿主には、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子の染色体コピーを含む大腸菌株が含まれる。これらの宿主は、バクテリオファージＤＥ３の溶原菌、ｌａｃＩ遺伝子を保有するλ誘導体、ｌａｃＵＵＶ５プロモーター、およびＴ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子であった。Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）の添加によって誘導し、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼはその目的の遺伝子を保有する機能的Ｔ７プロモーター（ｐＥＴ−２８ｂ）を含む任意の標的プラスミドを転写することができる。株には、例えば、ＢＬ２１（ＤＥ３）（Ｓｔｕｄｉｅｒら、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．、１８５：６０−８９（１９９０））が含まれる。
【０２２９】
組換えＨＢＭ配列を発現させるために、５０ｎｇのプラスミドＤＮＡを上記のように単離して、上記のようにコンピテントＢＬ２１（ＤＥ３）細菌を形質転換する（ｐＥＴ発現キットの一部としてＮｏｖａｇｅｎから提供）。ｌａｃＺ遺伝子（β−ガラクトシダーゼ）を、ＨＢＭ組換え構築物に記載のようにｐＥＴシステムで発現させる。形質転換細胞を、ＳＯＣ培地中で１時間培養し、培養物を２５μｇ／ｍｌの硫酸カナマイシンを含むＬＢ培地にプレートした。翌日、細菌コロニーをプールし、硫酸カナマイシン（２５μｇ／ｍｌ）を含むＬＢ培地中で６００ｎＭで０．５〜１．０のＯ．Ｄ．の工学密度まで増殖させた時点で、１ｍＭ
【０２３０】
ＩＰＴＧを３時間添加してＨＢＭ組換えＤＮＡ構築物の遺伝子発現を誘導した。
【０２３１】
ＩＰＴＧでの遺伝子発現の誘導後、細菌を４℃のＳｏｒｖａｌｌ  ＲＣ−３Ｂ遠心分離機での３５００×ｇで１５分間の遠心分離によって回収した。ペレットを、５０ｍｌの冷Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、０．１Ｍ  ＮａＣｌ、および０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ（ＳＴＥ緩衝液）に再懸濁した。次いで、細胞を４℃、２０００×ｇで２０分間遠心分離した。湿ったペレットを秤量し、タンパク質精製の準備ができるまで−８０℃に凍結した。
【０２３２】
当該分野で公知の種々の方法を使用して、単離タンパク質を精製することができる（Ｃｏｌｉｇａｎら、「現代のタンパク質科学プロトコール」、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（１９９５））。例えば、凍結細胞を解凍し、緩衝液に再懸濁し、少量用マイクロフリューダイザー（モデルＭ−１１０Ｓ、Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｒｐ．、Ｎｅｗｔｏｎ、ＭＡ）を数回使用することによって捕捉することができる。得られたホモジネートを遠心分離して、透明な上清（粗抽出物）を獲得し、濾過後、粗抽出物を、カラムで分画した。画分を、ＯＤ２８０ｎｍでの吸光度によってモニターし、ピーク画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析することができる。
【０２３３】
精製タンパク質調製物の濃度を、アミノ酸含有量から計算した吸光計数を使用して分光学的に定量する（Ｐｅｒｋｉｎｓ、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１５７：１６９−１８０（１９８６））。タンパク質濃度もまた、標準としてウシ血清アルブミンを使用したＢｒａｄｆｏｒｄ、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、７２：２４８−２５４（１９７６）およびＬｏｗｒｙら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、１９３：２６５−２７５（１９５１）の方法によって測定する。
【０２３４】
種々の濃度のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルを、ＢｉｏＲａｄ（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）から購入し、クマシーブルーで染色した。分子量マーカーは、ウサギ骨格筋ミオシン（２００ｋＤａ）、大腸菌βガラクトシダーゼ（１１６ｋＤａ）、ウサギ筋肉ホスホリラ−ぜＢ（９７．４ｋＤａ）、ウシ血清アルブミン（６６．２ｋＤａ）、オボアルブミン（４５ｋＤａ）、ウシカーボニックアンヒドラーゼ（３１ｋＤａ）、ダイズトリプシンインヒビター（２１．５ｋＤａ）、卵白リゾチーム（１４．４ｋＤａ）、およびウシアプロチニン（６．５ｋＤａ）を含み得る。
【０２３５】
一旦十分な量の所望のタンパク質が得られると、種々の目的に使用することができる。典型的な用途は、結合特異的抗体の産生である。これらの抗体は、ポリクローナルまたはモノクローナルのいずれであってもよく、当該分野で周知のインビトロまたはインビボ技術で産生することができる。上記のように同定および単離した任意のペプチドのエピトープに対するモノクローナル抗体を、マウスハイブリドーマから調製することができる（Ｋｏｈｌｅｒ、Ｎａｔｕｒｅ、２５６：４９５（１９７５））。まとめると、マウスを数μグラムのＨＢＭタンパク質と２週間にわたりインキュベートする。次いで、マウスを屠殺する。抗体産生細胞を、マウスの脾臓から取り出す。脾臓細胞を、マウス骨髄腫細胞を含むポリエチレングリコールと融合する。首尾よく融合した細胞をマイクロタイタープレートで希釈し、培養物の増殖を継続させる。ウェルあたりの抗体の量を、ＥＬＩＳＡなどの免疫アッセイ法によって測定する（Ｅｎｇｖａｌｌ、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．、７０：４１９（１９８０））。クローン産生抗体を拡大し、さらに増殖させてＨＢＭ抗体を産生する。他の適切な技術は、抗原性ポリペプチドへのリンパ球の曝露、またはファージまたは類似のベクター中の抗体ライブラリーの選択を含む。Ｈｕｓｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４６：１２７５−１２８１（１９８９）を参照のこと。抗体産生についてのさらなる情報については、Ｄａｖｉｓら、Ｂａｓｉｃ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、ＮＹ、Ｓｅｃｔｉｏｎ２１−２（１９８９）を参照のこと。
【０２３６】
薬剤（例えば、抗体、ＨＢＭタンパク質、タンパク質多型、またはＺｍａｘ１タンパク質または化合物）による細胞中の脂質レベルまたは被験体中の生理学的レベルの変化の影響についての標準的な評価プロトコールは公知である。例えば、Ｆ．Ｗ．Ｈｅｍｍｉｎｇ、「脂質分析」（Ｂｉｏｓ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂ．、１９９６）およびＪ．Ｍ．Ｏｒｄｏｖａｓ、「リポタンパク質プロトコール」（Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．、１９９７）を参照のこと。より詳細には、コレステロールおよびトリグリセリド分析を、ＯｌｙｍｐｕｓＡＵ５０００コレステロール法を使用して行うことができる。このコレステロール測定法は、ペルオキシダーゼ−フェノール−４−アミノアンチピリン系が改変された酵素の使用と、被験体血清中の総コレステロール測定のためのフェノール基の硫酸２−ヒドロキシ−３，５−ジクロロベンゼン（２−ＯＨ３，５ＤＣＢＳＡ）への置換とを組み合わせる。このアッセイは、一連の結合酵素反応に基づく。血清中に存在するコレステロールエステルをコレステロールエステラーゼによって加水分解してコレステロールと脂肪酸に遊離させる。同様に、コレステロールをコレステロールオキシダーゼでコレスト−４−エン−３−オンに酸化し、過酸化水素が同時産生される。過酸化水素は、２−ＯＨ−３，５−ＤＣＢＳＡの存在下で４−アミノアンチピリンと反応して、５７０ｎｍで吸収する発色団が賛成される。反応混合物の吸光度を、５７０／７５０で分光学的に測定し、これはサンプルのコレステロール濃度に比例する。
【０２３７】
血清トリグリセリド分析のために、Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＡＵ５０００トリグリセリド法も使用することができる。簡単に述べれば、この方法は一連の結合酵素反応に基づく。血清トリグリセリドをリポタンパク質リガーゼで加水分解して、脂肪酸とグリセロールに遊離させる。グリセロールを酵素でリン酸化し、次いで、グリセリンリン酸オキシダーゼで酸化する。硫酸ＤＣＢの存在下で色素原４−アミノ−アンチピリンと反応して、５２０／６６０ｎｍでの２色素が測定される吸収を有する発色団が得られる。反応混合物の吸光度の増加は、サンプルのトリグリセリド濃度に比例する。
【０２３８】
ＸＶＩＩ．使用法：遺伝子治療
近年、遺伝病および後天性疾患の両方の遺伝子治療領域で有意な技術上の利点が得られている（Ｋａｙら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９４：１２７４４−１２７４６（１９９７））。遺伝子治療を、治療目的のＤＮＡの意図的導入と定義することができる。遺伝子導入法の改良により、種々の疾患型の治療用遺伝子治療プロトコールが開発される。遺伝子治療はまた、新規の遺伝子治療の同定、ウイルスおよび非ウイルス送達系の改良、遺伝子調節のより深い理解、および細胞単離および移植の改良の近年の進歩を活用している。
【０２３９】
以下の実験は、骨量の増加および脂質レベルの変化を付与する優性変異としてＨＢＭ遺伝子を同定する。この変異が優性であるという事実は、ＨＢＭタンパク質の発現により骨量が増加し、おそらく脂質レベルが変化することを示す。ＨＢＭ遺伝子を保有するのでＨＢＭタンパク質を発現する老年個体は、骨粗鬆症を発症しない。これらの個体は、ＨＢＭタンパク質で治療した個体と等価である。これらの所見は、ＨＢＭタンパク質での治療により骨粗鬆症が予防される有力な実験結果である。骨量を増加させるＨＢＭ遺伝子活性を、「ＨＢＭ機能」という。
【０２４０】
したがって、本発明によれば、間葉幹細胞へのＨＢＭ機能の供給法が得られる（Ｏｎｙｉａら、Ｊ．Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎｅｒ．Ｒｅｓ．、１３：２０−３０（１９９８）；Ｋｏら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、５６：４６１４−４６１９（１９９６））。機能などの供給により、骨粗鬆症が予防される。脂質調節のために、ＨＢＭ機能を肝細胞ならびに脂質代謝および脂質調節に関連する他の細胞（例えば、筋細胞、病変細胞、脂質ｌａｉｄｅｎ泡沫細胞、および巨核芽球）に供給することができる。ＨＢＭ遺伝子または遺伝子の一部を、遺伝子が染色体外に残存するようにベクター中の細胞に移入することができる。このような状況では、遺伝子は、細胞によって染色体外の位置から発現する。
【０２４１】
組換えおよび染色体外での維持のための遺伝子移入用ベクターは当該分野で公知であり、任意の適切なベクターを使用することができる。細胞へのＤＮＡの移入法（エレクトロポレーション、リン酸カルシウム共沈、およびウイルス形質導入など）は当該分野で公知であり、方法の選択は当業者の能力の範囲内である（Ｒｏｂｂｉｎｓ編、「遺伝子治療プロトコール」、Ｈｕｍａｎ  Ｐｒｅｓｓ、ＮＪ（１９９７））。ＨＢＭ遺伝子で形質転換した細胞を、骨粗鬆症および骨成長を促進させる薬物治療ならびに脂質媒介疾患の研究のためのモデルとして使用することができる。
【０２４２】
上記の概説するように、適切な場合、ＨＢＭ遺伝子またはフラグメントを、遺伝子治療法で使用して、間葉幹細胞または他の細胞中でのこのような遺伝子産物の発現量を増加させることができる。この方法は、野生型遺伝子が正常に発現する細胞においてさえも、所与のＨＢＭタンパク質またはそのフラグメントの発現レベルを増加させることもできる。例えば、Ｆｒｉｅｄｍａｎ、「遺伝病治療」、Ｆｒｉｅｄｍａｎ編、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、１０５−１２１（１９９１）に記載のように、一般的に受け入れられている方法によって、遺伝子治療を行う。
【０２４３】
発現調節エレメントに連結したＨＢＭ遺伝子コピーを含み、間葉幹細胞または肝細胞中で複製することができるウイルスまたはプラスミドベクターを調製する。適切なベクターは公知であり、例えば、米国特許第５，２５２，４７９号およびＷＯ９３／０７２８２（参照することにより、その開示全体を本明細書中に組み込むものとする）に記載されている。次いで、ベクターを、骨髄もしくは肝臓に局所的に、または全身に（他の部位に存在する任意の間葉幹細胞に到達させるため（すなわち、血液中））患者に注射する。トランスフェクト遺伝子が各標的細胞のゲノムに恒久的に組み込まれない場合、定期的に治療を繰り返さなければならない。
【０２４４】
当該分野で公知の遺伝子導入系は、本発明の遺伝子治療法の実施に有用であり得る。これらには、ウイルスおよび非ウイルス導入法が含まれる。多数のウイルスが遺伝子導入ベクターとして使用されており、これらには、ポリオーマ、すなわち、ＳＶ４０（Ｍａｄｚａｋら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．、７３：１５３３−１５３６（１９９２））、アデノウイルス（Ｂｅｒｋｎｅｒ、Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５８：３９−６１（１９９２）；Ｂｅｒｋｎｅｒら、Ｂｉｏ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、６：６１６−６２９（１９８８）；Ｇｏｒｚｉｇｌｉａら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、６６：４４０７−４４１２（１９９２）；Ｑｕａｎｔｉｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８９：２５８１−２５８４（１９９２）；Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら、Ｃｅｌｌ、６８：１４３−１５５（１９９２）；Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、２０：２２３３−２２３９（１９９２）；Ｓｔｒａｔｆｏｒｄ−Ｐｅｒｒｉｃａｕｄｅｔら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．、１：２４１−２５６（１９９０））、ワクシニアウイルス（Ｍａｃｋｅｔｔら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２４：４９５−４９９（１９９２））、アデノ随伴ウイルス（Ｍｕｚｙｃｚｋａ、Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５８：９１−１２３（１９９２）；Ｏｈｉら、Ｇｅｎｅ、８９：２７９−２８２（１９９０））、ＨＳＶおよびＥＢＶを含むヘルペスウイルス（Ｍａｒｇｏｌｓｋｅｅ、Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５８：６７−９０（１９９２）；Ｊｏｈｎｓｏｎら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、６６：２９５２−２９６５（１９９２）；Ｆｉｎｋら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．、３：１１−１９（１９９２）；Ｂｒｅａｋｆｉｅｌｄら、Ｍｏｌ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．、１：３３７−３７１（１９８７；）Ｆｒｅｓｓｅら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．、４０：２１８９−２１９９（１９９０））、および鳥類（Ｂｒａｎｄｙｏｐａｄｈｙａｙら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．、４：７４９−７５４（１９８４）；Ｐｅｔｒｏｐｏｕｐｌｏｓら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、６６：３３９１−３３９７（１９９２））、マウス（Ｍｉｌｌｅｒ、Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５８：１−２４（１９９２）；Ｍｉｌｌｅｒら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．、５：４３１−４３７（１９８５）；Ｓｏｒｇｅら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．、４：１７３０−１７３７（１９８４）；Ｍａｎｎら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、５４：４０１−４０７（１９８５））、およびヒト起源（Ｐａｇｅら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、６４：５３７０−５２７６（１９９０）；Ｂｕｃｈｓｃｈａｌｃｈｅｒら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、６６：２７３１−２７３９（１９９２））のレトロウイルスが含まれる。ほとんどのヒト遺伝子治療は、無能マウスレトロウイルスに基づいている。
【０２４５】
当該分野で公知の非ウイルス遺伝子導入法には、以下が含まれる：化学的技術（リン酸カルシウム共沈（Ｇｒａｈａｍら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、５２：４５６−４６７（１９７３）；Ｐｅｌｌｉｃｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２０９：１４１４−１４２２（１９８０））など）、機械的技術（例えば、マクロインジェクション（Ａｎｄｅｒｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７７：５３９９−５４０３（１９８０）；Ｇｏｒｄｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７７：７３８０−７３８４（１９８０）；Ｂｒｉｎｓｔｅｒら、Ｃｅｌｌ、２７：２２３−２３１（１９８１）；Ｃｏｎｓｔａｎｔｉｎｉら、Ｎａｔｕｒｅ、２９４：９２−９４（１９８１））、リポソームを介した膜融合媒介導入（Ｆｅｌｇｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８４：７４１３−７４１７（１９８７）；Ｗａｎｇら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２８：９５０８−９５１４（１９８９）；Ｋａｎｅｄａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６４：１２１２６−１２１２９（１９８９）；Ｓｔｅｗａｒｔら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．、３：２６７−２７５（１９９２）；Ｎａｂｅｌら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４９：１２８５−１２８８（１９９０）；Ｌｉｍら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ、８３：２００７−２０１１（１９９２））、および直接ＤＮＡ取り込みおよび受容体媒介ＤＮＡ導入（Ｗｏｌｆｆら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４７：１４６５−１４６８（１９９０）；Ｗｕら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、１１：４７４−４８５（１９９１）；Ｚｅｎｋｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８７：３６５５−３６５９（１９９０）；Ｗｕら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６４：１６９８５−１６９８７（１９８９）；Ｗｏｌｆｆら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、１１：４７４−４８５（１９９１）；Ｗａｇｎｅｒら、１９９０；Ｗａｇｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８８：４２５５−４２５９（１９９１）；Ｃｏｔｔｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８７：４０３３−４０３７（１９９０）；Ｃｕｒｉｅｌら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８８：８８５０−８８５４（１９９１）；Ｃｕｒｉｅｌら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．、３：１４７−１５４（１９９１）））。ウイルス媒介遺伝子導入を、間葉幹細胞に対するが周辺細胞を対象としない直接インビボベクターと組み合わせることができる（Ｒｏｍａｎｏら、Ｉｎ  Ｖｉｖｏ、１２（１）：５９−６７（１９９８）；Ｇｏｎｅｚら、Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、７（１２）：１９１３−９（１９９８））。あるいは、レトロウイルスベクター産生細胞株を、骨髄に注射することができる（Ｃｕｌｖｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５６：１５５０−１５５２（１９９２））。産生細胞の注射により、連続的にベクター粒子源が得られる。この技術は、ヒトの手術不能の脳腫瘍への使用が許可されている。
【０２４６】
生物学的および物理的遺伝子導入法を組み合わせるアプローチでは、任意のサイズのプラスミドＤＮＡをアデノウイルスヘキソンタンパク質に特異的なポリリジン接合抗体と組み合わせ、得られた複合体をアデノウイルスベクターに結合する。次いで、三分子複合体を使用して、細胞に接種する。アデノウイルスベクターは、エンドソームへの有効な結合、内在化、および分解後、結合ＤＮＡが損傷を受ける。
【０２４７】
リポソーム／ＤＮＡ複合体は、直接インビボ遺伝子導入を媒介することができることが示されている。標準的なリポソーム調製では、遺伝子導入法は非特異的であるが、直接ｉｎ  ｓｉｔｕ投与後の腫瘍沈着物中の局在化インビボ取り込みおよび発現が報告されている（Ｎａｂｅｌ、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．、３：３９９−４１０（１９９２））。
【０２４８】
ＸＶＩＩＩ．使用法：形質転換宿主、医薬品および研究ツールの開発
ＨＢＭ遺伝子を保有する細胞および動物を、治療薬の可能性を有する物質の研究および試験用のモデル系として使用することができる（Ｏｎｙｉａら、Ｊ．Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎｅｒ．Ｒｅｓ．，１３：２０−３０（１９９８）；Ｂｒｏｄｅｒら、Ｂｏｎｅ、２１：２２５−２３５（１９９７））。典型的には、細胞を間葉幹細胞または肝細胞中で培養する。これらを、体細胞または生殖細胞ＨＢＭ遺伝子を有する個体から単離することができる。あるいは、上記のように、ＨＢＭ遺伝子を哺乳するように細胞株を操作することができる。試験物質を細胞に適用した後、細胞の形質転換表現型を同定する。形質転換細胞の任意の性質（培養物中の骨基質（Ｂｒｏｄｅｒら、Ｂｏｎｅ、２１：２２５−２３５（１９９７））、機械的性質（Ｋｉｚｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９４：１０１３−１０１８（１９９７）、および推定治療薬投与に対する反応を含む）を評価することができる。
【０２４９】
治療薬試験用動物を、生殖細胞または接合子の処理後に選択することができる。このような処理には、Ｚｍａｘ１遺伝子の挿入ならびにＨＢＭ遺伝子および破壊相同性遺伝子の挿入が含まれる。あるいは、動物の挿入Ｚｍａｘ１遺伝子および／またはＨＢＭ遺伝子を、従来技術（例えば、Ｃａｐｅｃｈｉ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４４：１２８８（１９８９）；Ｖａｌａｎｃｕｉｓら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．、１１：１４０２（１９９１）；Ｈａｓｔｙら、Ｎａｔｕｒｅ、３５０：２４３（１９９１）；Ｓｈｉｎｋａｉら、Ｃｅｌｌ、６８：８５５（１９９２）；Ｍｏｍｂａｅｒｔｓら、Ｃｅｌｌ、６８：８６９（１９９２）；Ｐｈｉｌｐｏｔｔら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５６：１４４８（１９９２）；Ｓｎｏｕｗａｅｒｔら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５７：１０８３（１９９２）；Ｄｏｎｅｈｏｗｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ、３５６：２１５（１９９２）に記載のものなど）を使用した他の遺伝子代替物の挿入または欠失変異によって破壊することができる。試験物質を動物に投与した後、骨の成長または脂質の調整を評価しなければならない。試験物質が骨成長または脂質レベルの調節を増強する場合、試験物質は候補治療薬である。これらの動物モデルにより、潜在的な治療産物用の非常に重要な賦形剤が得られる。好ましい脂質調整研究モデルには、マウス（Ｓｍｉｔｈら、Ｊ．Ｉｎｔｅｒｎ．Ｍｅｄ．２４２：９９−１０９（１９９７））およびモルモットが含まれる。
【０２５０】
以下の実施例で考察するように、ＨＢＭ遺伝子を保有する個体は骨量が増加し、脂質レベルが変化した。ＨＢＭ遺伝子により、骨発達に関連する活性、レベル、発現パターン、および他の分子の改変状態の変化によるこの表現型が得られる。種々の確立された技術を使用して、その活性、レベル、発現パターン、および改変状態がＺｍａｘ１遺伝子系とＨＢＭ遺伝子を含む系との間で異なる分子、このましくはタンパク質またはｍＲＮＡを同定可能である。このような系は、例えば、無細胞抽出物、細胞、組織、または生きた生物（マウスまたはヒトなど）であり得る。Ｚｍａｘ１の変異形態のために、Ｚｍａｘ１の完全な欠失、タンパク質の細胞外または細胞内部分を欠く変異、またはＺｍａｘ１遺伝子の任意の他の変異を使用することができる。Ｚｍａｘ１タンパク質産生を阻害するためのアンチセンスＺｍａｘ１  ＲＮＡまたはオリゴヌクレオチドの発現を使用することが可能である。ＨＢＭの変異形態のために、ＨＢＭの完全な欠失、ＨＢＭタンパク質の細胞外または細胞内部分を欠く変異、またはＨＢＭ遺伝子の任意の他の変異を使用することができる。ＨＢＭタンパク質産生を阻害するためのアンチセンスＨＢＭ  ＲＮＡまたはオリゴヌクレオチドの発現を使用することが可能である。
【０２５１】
Ｚｍａｘ１系とＨＢＭ系との比較によって同定される分子を、ヒトもしくは動物の骨疾患の医薬品開発または診断におけるサロゲートマーカーとして使用することができる。あるいは、このような分子を、骨疾患の治療に使用することができる。Ｓｃｈｅｎａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２７０：４６７−４７０（１９９５）を参照のこと。
【０２５２】
例えば、マウスホモログ中にＨＢＭ遺伝子を哺乳するトランスジェニックマウスを構築する。遺伝子型ＨＢＭ＋のマウスは、生存可能且つ健康で骨量が増加している。骨量増加用のサロゲートマーカーを同定するために、ＨＢＭ−／＋（すなわち、ヘテロ接合性）および同遺伝子型＋／＋（すなわち、野生型）マウスを屠殺する。骨組織ｍＲＮＡを各動物から抽出し、＋／＋個体で発現するｍＲＮＡに対応する「遺伝子チップ」を構築する。異なる組織由来のｍＲＮＡを各遺伝子型の動物から単離し、逆転写し、蛍光標識し、固体支持体に固定した遺伝子フラグメントとハイブリッド形成させる。２つの集団の間の蛍光強度の比は、＋／＋およびＨＢＭ／＋動物における特異的ｍＲＮＡの相対的存在量の指標である。野生型コントロールと比較して過剰および過少発現されるｍＲＮＡをコードする遺伝子は、ＨＢＭ遺伝子によって同等に調節される遺伝子の候補である。このストラテジーを同様に使用して、脂質調節を研究することができる。
【０２５３】
マウスはまた、アテローム性動脈硬化症研究の最も一般的な実験動物モデルとして使用されている。マウスでは、以下の少なくとも３つのアテローム性動脈硬化症の誘導法が存在する。（１）食餌による誘導、ａｐｏＥ欠損誘導、およびＬＤＬ受容体欠損誘導。インビボで脂質レベルを調整する薬剤の試験でのマウスモデルの使用法を、Ｓｍｉｔｈら、Ｊ．Ｉｎｔｅｒｎ．Ｍｅｄ．、２４２、９９−１０９（１９９７）に記載のように行うことができる。
【０２５４】
既に発見されているタンパク質と同一のシグナル伝達カスケードの一部である新規のタンパク質の１つの標準的な同定法を以下に示す。細胞を放射性リンで処理し、既に発見されているタンパク質を多少活性であるように操作する。次いで、細胞中の他のタンパク質のリン酸化状態を、ポリアクリルアミドゲルおよびオートラジオグラフィーまたは類似の技術によってモニターする。既知のタンパク質の活性レベルを、多数の方法（薬物または抗体などの特異的インヒビターを使用した野生型変異タンパク質の比較、公知の細胞外タンパク質の単純な添加の有無、または公知のタンパク質発現のアンチセンスインヒビターの使用が含まれる）で操作することができる（Ｔａｍｕｒａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２８０（５３６９）：１６１４−７（１９９８）；Ｍｅｎｇ、ＥＭＢＯ  Ｊ．、１７（１５）：４３０９１−４０３（１９９８）；Ｃｏｏｐｅｒら、Ｃｅｌｌ、１：２６３−７３（１９８２））。
【０２５５】
別の例では、Ｚｍａｘ１のセンスまたはアンチセンスｃＤＮＡのいずれかを発現するＴＥ８５骨肉種細胞におけるリン酸化レベルの異なるタンパク質を同定する。ＴＥ８５細胞は、高レベルのＺｍａｘ１を発現する（Ｄｏｎｇら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．＆  Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．、２５１：７８４−７９０（１９９８））。センス構築物を含む細胞は、さらに高レベルのＺｍａｘ１を発現する一方で、アンチセンス構築物を発現する細胞のＺｍａｘ１発現は低い。細胞を３２Ｐの存在下で増殖させ、回収し、溶解し、溶解物をＳＤＳポリアクリルアミドゲルにて電気泳動してタンパク質を分離し、ゲルをオートラジオグラフィーに供した（Ａｕｓｕｂｅｌら、「現代の分子生物学プロトコール」、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（１９９７））。センスおよびアンチセンス株で強度が異なるバンドは、リン酸化状態または絶対レベルがＺｍａｘ１レベルに応答して変化するリンタンパク質を示す。３２Ｐ標識の代わりに、非標識タンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、プローブとして市販の抗ホスホチロシン抗体を使用した免疫ブロッティングに供することができる（Ｔｈｏｍａｓら、Ｎａｔｕｒｅ、３７６（６５３７）：２６７−７１（１９９５））。アンチセンスＲＮＡ発現の代替法として、化学修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドでのトランスフェクションを使用することができる（Ｗｏｏｌｆら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、１８（７）：１７６３−９（１９９０））。
【０２５６】
骨粗鬆症などの多数の骨障害は発症が遅く、治療反応が遅い。したがって、骨発達および鉱化作用についてのサロゲートマーカーの開発が有用である。このようなマーカーは、骨障害の治療および骨障害の遅延型発症の危険性があり得る患者の診断の開発に有用であり得る。好ましいマーカーの例は、例えば、米国特許第５，４４５，１７９号、同第５，６４１，８３７号、および同第５，６５２，１１２号（その開示全体が本明細書中で参考として援用される）に記載のＮ末端およびＣ末端テロペプチドである。ＨＩＶ疾患領域では、ＣＤ４数およびウイルス負荷は、疾患進行用のサロゲートマーカーとして有用である（Ｖｌａｈｏｖら、ＪＡＭＡ、２７９（１）：３５−４０（１９９８））。骨疾患領域における類似のサロゲートマーカーが必要である。
【０２５７】
容易に試験され、非特異的な影響に相対的感受性を示すことがサロゲートマーカーの特徴であり得る。例えば、サロゲートマーカーは、組織または血清中のタンパク質またはｍＲＮＡなどの分子であり得る。あるいは、サロゲートマーカーは、痛みに対する感受性、反射反応などの診断兆候であり得る。
【０２５８】
さらに別の例では、骨量増加のサロゲートマーカーを、ＨＢＭ遺伝子を保有する血統を使用して同定する。血液サンプルをＨＢＭ遺伝子を保有する３人の個体および保有しない密接に関連する３人の個体から採取する。これらの個体由来の血清タンパク質を、一方の次元がサイズによってタンパク質を分離し、他方の次元が等電点によってタンパク質を分離する二次元ゲルシステムで電気泳動する（Ｅｐｓｔｅｉｎら、Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ、１７（１１）：１６５５−７０（１９９６））。タンパク質に対応するスポットを同定する。数個のスポットは、その正常な親類と比較してＨＢＭ個体は異なる量またはわずかに異なる位置に存在すると予想される。これらのスポットは、候補サロゲートマーカーであるタンパク質に対応する。タンパク質の同一性を、微量配列決定によって同定し、タンパク質に対する抗体を、診断試験法で使用する標準的方法によって賛成することができる。ＨＢＭタンパク質またはたの候補サロゲートマーカーの診断アッセイには、本発明で記載の抗体およびヒト体液、膜、骨、細胞、組織、またはその抽出物中のＨＢＭを検出するためのレポーター分子が含まれる。抗体を、検出可能なシグナルを発生する物質との共有結合または比共有結合によって標識することができる。多数の科学文献および特許書類では、放射性核種、酵素、蛍光、化学発光、または色素形成薬を含む種々のレポーター分子または標識を記載している（米国特許第３，８１７，８３７号、同第３，８５０，７５２号、同第３，９３９，３５０号、同第３，９９６，３４５号、同第４，２７７，４３７号、同第４，２７５，１４９号、および同第４，３６６，２４１号）。
【０２５９】
これらの抗体を使用して、候補サロゲートマーカーレベルを正常な個体および特に以下の疾患の罹患患者で測定する。骨粗鬆症、骨粗鬆症性偽神経膠腫、エンゲルマン病、リビング病、高ホスファターゼ血症、ファン・ブッヘム病、メロレオストーシス、大理石骨病、ピクノディスオストーシス、硬化狭窄症、オステオポイキリー、先端巨大症、パジェット病、線維性骨形成異常、血管狭窄、骨形成不全症、甲状腺機能低下症、偽性上皮小体機能低下症、偽性偽性副甲状腺機能低下症、原発性および二次性副甲状腺機能亢進症および関連症候群、高カルシウム尿症、甲状腺髄様癌、骨軟化症などの骨障害および脂質関連疾患を含む他の疾患。抗体を使用した薬物使用状況における血清タンパク質レベルの測定技術は十分に確立されている。特定の疾患または疾患型を保有する高レベルまたは低レベルの個体に一貫して存在するタンパク質は、有用なサロゲートマーカーである。
【０２６０】
サロゲートマーカーを、骨障害の診断に使用することができる。例えば、骨折頻度の高い幼児を医師に診断させるかを考慮する。根本的な原因は、小児虐待、幼児の不適切な挙動、または骨障害であり得る。骨障害を迅速に試験するために、上記の抗体を使用してサロゲートマーカータンパク質レベルを測定する。
【０２６１】
サロゲートマーカーの改変状態のレベルを、開発されたおそらく有効な薬物の指標として測定することができる。骨発達または鉱化作用の変化に長期の観察が必要であり得るので、骨障害治療の確立におけるサロゲートマーカーの使用は特に都合が良い。例えば、「ＨＢＭ誘導性ｍＲＮＡ組」と呼ばれる骨ｍＲＮＡ組は、上記のように、＋／＋マウスと比較してＨＢＭ／＋マウスで過剰発現することが見出されている。この組の発現を、サロゲートマーカーとして使用することができる。特に、化合物での＋／＋マウスの治療によりＨＢＭ誘導性ｍＲＮＡ組が過剰発現される場合、この化合物はさらなる開発のための有望な候補である。
【０２６２】
本発明は、任意の種々の薬物スクリーニング技術におけるＺｍａｘ１またはＨＢＭタンパク質またはその結合フラグメントの使用による化合物のスクリーニングに特に有用である。
【０２６３】
このような試験で使用されるＺｍａｘ１またはＨＢＭタンパク質またはフラグメントは、溶液中で遊離しているか、固体支持体に固定されているか、細胞表面に存在しているかのいずれかであり得る。１つの薬物スクリーニング法は、好ましくは競合結合アッセイでタンパク質またはフラグメントを発現する組換え核酸で安定に形質転換された真核生物または原核生物宿主細胞を使用する。生きているか固定化形態のこのような細胞を、標準的な結合アッセイに使用することができる。例えば、Ｚｍａｘ１またはＨＢＭタンパク質またはフラグメントと試験薬剤との間の複合体形成を測定するか、Ｚｍａｘ１またはＨＢＭタンパク質またはフラグメントと既知のリガンドとの間の複合体の形成が試験薬剤で妨害される程度を試験することができる。
【０２６４】
したがって、本発明は、当該分野で周知の方法によって、このような薬剤とＺｍａｘ１またはＨＢＭタンパク質またはそのフラグメントとを接触するステップと、（ｉ）前記薬剤とＺｍａｘ１またはＨＢＭタンパク質またはそのフラグメントとの複合体の存在または（ｉｉ）Ｚｍａｘ１またはＨＢＭタンパク質またはそのフラグメントとリガンドとの複合体の存在をアッセイするステップとを含む、薬物のスクリーニング法を提供する。このような競合的結合アッセイでは、典型的には、Ｚｍａｘ１またはＨＢＭタンパク質またはそのフラグメントを標識する。遊離のＺｍａｘ１またはＨＢＭタンパク質またはフラグメントを、タンパク質：タンパク質複合体から分離し、遊離（すなわち、非複合化）標識の量は、Ｚｍａｘ１またはＨＢＭに対して試験した薬剤の結合またはＺｍａｘ１またはＨＢＭ：リガンド結合での妨害の基準である。
【０２６５】
別の薬物スクリーニング技術により、Ｚｍａｘ１またはＨＢＭタンパク質に対する適切な結合親和性を有する化合物の高処理スクリーニングが得られ、これはＷＯ８４／０３５６４に詳述されている。簡単に述べれば、多数の異なる小さなペプチド試験化合物を、固体基質（プラスチックピンまたはいくつかの他の表面など）上で合成する。ペプチド試験化合物を、Ｚｍａｘ１またはＨＢＭタンパク質と反応させ、洗浄する。次いで、結合したＺｍａｘ１またはＨＢＭタンパク質を、当該分野で周知の方法で検出する。精製Ｚｍａｘ１またはＨＢＭを、上記薬物スクリーニング技術用のプレートに直接コートすることができる。しかし、タンパク質に対する非中和抗体を使用して、固相へのＺｍａｘ１またはＨＢＭタンパク質を抗体を捕捉することができる。
【０２６６】
本発明はまた、Ｚｍａｘ１またはＨＢＭタンパク質に特異的に結合することができる中和抗体がＺｍａｘ１またはＨＢＭタンパク質またはそのフラグメントとの結合について試験化合物と競合する競合的薬物スクリーニングアッセイの使用が意図される。この様式では、抗体を使用して、Ｚｍａｘ１またはＨＢＭタンパク質の１つまたは複数の抗原決定基を共有する任意のペプチドの存在を検出することができる。
【０２６７】
さらなる薬物スクリーニング技術は、非機能的Ｚｍａｘ１またはＨＢＭ遺伝子を有する宿主真核生物細胞（上記）の使用を含む。これらの宿主細胞株または細胞は、Ｚｍａｘ１またはＨＢＭタンパク質レベルで欠損している。宿主細胞株または細胞を、薬物化合物の存在下で増殖させた。宿主細胞の増殖速度または脂質代謝への影響を測定して、化合物がＺｍａｘ１またはＨＢＭ欠損細胞の増殖または脂質代謝を調節することができるかどうかを同定する。
【０２６８】
合理的な薬物デザインの目的は、例えば、より活性であるか安定な形態のタンパク質であるか、インビボでタンパク質機能を増強するか妨害する薬物を作製するための目的の生物活性タンパク質またはこれらが相互作用する小分子（例えば、アゴニスト、アンタゴニスト、インヒビター）の構造アナログを産生することである。例えば、Ｈｏｄｇｓｏｎ、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、９：１９−２１（１９９１）を参照のこと。１つのアプローチでは、最初に、目的のタンパク質（Ｚｍａｘ１またはＨＢＭタンパク質）または、例えばＺｍａｘ１−またはＨＢＭ−受容体複合体の三次元構造を、Ｘ線結晶学、コンピュータモデリング、または最も典型的にはこれらのアプローチの組み合わせによって決定する。稀であるが、タンパク質構造に関する有用な情報を、相同性タンパク質の構造に基づいたモデリングによって得ることができる。合理的薬物デザインの例は、ＨＩＶプロテアーゼインヒビターの開発である（Ｅｒｉｃｋｓｏｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４９：５２７−５３３（１９９０））。さらに、ペプチド（例えば、Ｚｍａｘ１またはＨＢＭタンパク質）を、アラニンスキャンによって分析する（Ｗｅｌｌｓ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．、２０２：３９０−４１１（１９９１））。この技術では、アミノ酸残基を、Ａｌａに置換し、ペプチド活性に対するその効果を同定する。ペプチドの各アミノ酸残基をこの様式で分析して、ペプチドの重要な領域を同定する。
【０２６９】
機能アッセイによって選択した標的特異的抗体を単離し、その結晶構造を解析することも可能である。原則的には、このアプローチにより、その後の薬物デザインに基づき得るファーマコア（Ｐｈａｒｍａｃｏｒｅ）が得られる。機能的な薬理学的に活性な抗体への抗イディオタイプ抗体（抗ｉｄｓ）の作製によってタンパク質結晶化学を完全に迂回可能である。鏡像の鏡像として、抗ｉｄｓの結合部位は、元の受容体のアナログであると予想される。次いで、抗ｉｄを使用して、化学的または生物学的に産生したペプチド集団からペプチドを同定および単離することができる。選択したペプチドは、ファーマコアとして作用する。
【０２７０】
したがって、例えばＺｍａｘ１またはＨＢＭタンパク質の活性または安定性が改良されているか、Ｚｍａｘ１またはＨＢＭタンパク質活性のインヒビター、アゴニスト、アンタゴニストなどとして作用する薬物をデザインすることができる。クローン化Ｚｍａｘ１またはＨＢＭ配列利用可能性によって、十分量のＺｍａｘ１またはＨＢＭタンパク質を、Ｘ線結晶学などの分析研究を実行するために利用可能にすることができる。さらに、本明細書中に記載のＺｍａｘ１またはＨＢＭタンパク質配列の知識は、Ｘ線結晶学の代わりまたはこれに加えてコンピュータモデリング技術の使用者を指示する。
【０２７１】
ＸＩＸ．使用法：鳥類および哺乳動物家畜学
Ｚｍａｘ１  ＤＮＡおよびＺｍａｘ１タンパク質ならびに／またはＨＢＭ  ＤＮＡおよびＨＢＭタンパク質を、脊椎動物、好ましくはヒト治療薬ならびに鳥類および哺乳動物の薬物（家畜交配を含む）に使用することができる。被験体として意図される動物には、家畜（例えば、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、バッファローなど）、霊長類、イヌ、ネコ、げっ歯類、鳥類、ならびに爬虫類、魚類、および両生類が含まれる。例えば、ニワトリ、オンドリ、メンドリ、シチメンチョウ、ダチョウ、アヒル、キジ、およびウズラを含む鳥類は、遺伝子の同定および高骨量経路の同定について利点を得ることができる。文献で引用された多数の例では（例えば、ＭｃＣｏｙら、Ｒｅｓ．Ｖｅｔ．Ｓｃｉ．，６０（２）：１８５−１８６（１９９６））、家畜条件による骨の脆弱により、ケージ層での疲労、骨粗鬆症、および死亡率が高くなる。鳥類の骨粗鬆症または他の骨障害を治療するためのさらなる治療薬は、鳥類の健康な暮らしおよび畜産業（例えば、食肉および卵の産生）の経済的条件に有意に有利な効果を示し得る。
【０２７２】
ＸＸ．使用法：骨発達および脂質調節に影響を与える遺伝子の変化の検出のためのＺｍａｘ１特異的オリゴヌクレオチドを使用した診断アッセイ
骨発達または脂質代謝の変化または疾患がＺｍａｘ１遺伝子またはＨＢＭ遺伝子の変化を含む場合、特異的オリゴヌクレオチドを構築し、これを使用して骨発達に影響を与える骨組織または他の組織におけるＺｍａｘ１  ｍＲＮＡまたはＨＢＭ  ｍＲＮＡレベルを評価することができる。
【０２７３】
例えば、ヒトが骨密度および脂質調節に影響を与えるＨＢＭ遺伝子を有するかどうかを試験するために、ポリメラーゼ連鎖反応を使用することができる。２つのオリゴヌクレオチドを標準的な方法で合成するか既製のオリゴヌクレオチドを販売者から得る。長さおよび塩基組成を、オリゴ４．０プライマーピッキングプログラム（Ｗｏｊｃｈｉｃｈ  Ｒｙｃｈｌｉｋ、１９９２）を使用した標準的基準によって同定する。１つのオリゴヌクレオチドを、使用したＰＣＲ条件下でＨＢＭ  ＤＮＡのみとハイブリッド形成するようにデザインする。他のオリゴヌクレオチドを、これらのオリゴヌクレオチドプライマーを使用したＤＮＡ複製により都合よく同定されたＤＮＡフラグメントが得られるようにＺｍａｘ１ゲノムＤＮＡのセグメントをハイブリッド形成するようにデザインする。例えば、プライマーＣＣＡＡＧＴＴＣＴＧＡＧＡＡＧＴＣＣ（配列番号３２）およびＡＡＴＡＣＣＴＧＡＡＡＣＣＡＴＡＣＣＴＧ（配列番号３３）は、以下の条件を使用した場合、ＤＮＡサンプルから５３０塩基対のＤＮＡフラグメントを増幅する：ステップ１、９５℃で１２０秒間；ステップ２、９５℃で３０秒間；ステップ３、５８℃で３０秒間；ステップ４、７２℃で１２０秒間；ステップ２〜４を３５回繰り返す。組織サンプルを毛包、全血、または口腔前庭から得ることができる。
【０２７４】
上記手順によって作製したフラグメントを、標準的に技術によって配列決定した。ＨＢＭ遺伝子にヘテロ接合性の個体は、グリシン１７１のコドン中の第２の位置で等量のＧおよびＴを示す。正常またはヘテロ接合性野性個体は、このタンパク質でＧのみを示す。
【０２７５】
代替法として、ライゲーション媒介ＰＣＲまたはＱ−βレプリカーゼを含む技術などのＰＣＲ以外の他の増幅技術を使用することができる（Ｃａｈｉｌｌら、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．、３７（９）：１４８２−５（１９９１））。例えば、オリゴヌクレオチドＡＧＣＴＧＣＴＣＧＴＡＧＣＴＧＴＣＴＣＴ  ＣＣＣＴＧＧＡＴＣＡＣＧＧＧＴＡＣＡＴＧＴＡＣＴＧＧＡＣＡＧＡＣＴＧＧＧＴ（配列番号３４）およびＴＧＡＧＡＣＧＣＣＣＣＧＧＡＴＴＧＡＧＣＧＧＧＣＡＧＧＧＡＴＡＧＣＴＴＡＴＴＣＣＣＴＧＴＧＣＣＧＣＡＴＴＡＣＧＧＣ（配列番号３５）を、変性ヒトＤＮＡサンプルとハイブリッド形成させ、ＤＮＡリガーゼで処理し、プライマーオリゴヌクレオチドＡＧＣＴＧＣＴＣＧＴＡＧ  ＣＴＧＴＣＴＣＴＣＣＣＴＧＧＡ（配列番号３６）およびＧＣＣＧＴＡＡＴＧＣＧＧＣＡＣＡＧＧＧＡＡＴＡＡＧＣＴ（配列番号３７７）を使用したＰＣＲに供することができる。第１の２つのオリゴヌクレオチドでは、外側の２７塩基はプライマー結合部位に対応するランダム配列であり、内側の３０塩基ｈ、Ｚｍａｘ１遺伝子中の配列に対応する。第１のオリゴヌクレオチドの末端のＴは、ＨＢＭ遺伝子に対応する。ＨＢＭ遺伝子を保有するヒトＤＮＡにハイブリッド形成する場合、第１の２つのオリゴヌクレオチドをライゲーションし、増幅可能な１１４ｂｐのＤＮＡフラグメントが形成される。
【０２７６】
増幅産物を、アガロースゲル電気泳動、定量的ハイブリッド形成、または分子生物学分野の当業者に公知の等価の核酸検出技術によって検出することができる（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、「分子クローニング：実験マニュアル」、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  ＮＹ（１９８９））。
【０２７７】
Ｚｍａｘ１遺伝子またはＨＢＭ遺伝子の他の変化を、同一の型の増幅−検出手順、これらの変化を検出するようにデザインされたオリゴヌクレオチドの使用によって診断することができる。これらの手順を動物およびヒトで使用して、骨発達および／または脂質代謝またはレベルに影響を与えるＺｍａｘ１またはＨＢＭの変化を同定することができる。
【０２７８】
組織中のＺｍａｘ１またはＨＢＭの発現を、Ｚｍａｘ１またはＨＢＭのｃＤＮＡの遺伝子操作脊椎動物細胞のベクターと関連する骨特異的プロモーターへの融合によって行うことができる。ＤＮＡ構築物を、ウイルスキャプシドへのＤＮＡのパッケージング、カチオニックリポソームの使用、エレクトロポレーション、またはリン酸カルシウム共沈によって細胞に移入する。トランスフェクト細胞、好ましくは骨芽細胞を培養物で研究するか、骨への直接注射または骨芽細胞の静脈内注射、その後の組織への組み込みによって動物の骨組織に移入することができる（Ｋｏら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、５６（２０）：４６１４−９（１９９６））。例えば、骨芽細胞中で特異的に活性なオステオカルシンプロモーターを使用して、Ｚｍａｘ１遺伝子またはＨＢＭ遺伝子の転写を支持することができる。任意のいくつかのベクターおよびトランスフェクション法（レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、またはカチオニックリポソームを使用したトランスフェクション後に維持されるベクター、または本明細書中に記載の他の方法およびベクターなど）を使用することができる。
【０２７９】
同様に、Ｚｍａｘ１またはＨＢＭ遺伝子を肝臓組織またはたの脂質代謝もしくは脂質調節細胞（脂質ｌａｄｅｎ泡沫細胞および病変細胞）中で発現することができる。Ｚｍａｘ１またはＨＢＭのｃＤＮＡの遺伝子操作脊椎動物細胞のベクターと関連する、例えば肝臓特異的プロモーターまたは他の適切なプロモーターへの融合によってこれを行うことができる。ＤＮＡ構築物を、例えば、ウイルスキャプシドへのＤＮＡのパッケージング、カチオニックリポソームの使用、エレクトロポレーション、またはリン酸カルシウム共沈によって細胞に移入する。トランスフェクト細胞、好ましくは肝細胞を、培養物で研究するか、肝臓または脂質調節または代謝に関連する他の細胞への直接注射によって動物の骨組織に移入することができる。使用したベクターよびトランスフェクション法は、本明細書中に記載のものに類似する。
【０２８０】
機能的Ｚｍａｘ１タンパク質またはＨＢＭタンパク質レベルの変化は、骨鉱化レベルおよび脂質レベルに影響を与える。機能的Ｚｍａｘ１タンパク質またはＨＢＭタンパク質レベルの操作により、骨発達に影響を与え、骨鉱化および脂質レベルを増減することが可能である。例えば、骨粗鬆症患者の骨鉱化の増加に有用であり得る。あるいは、骨粗鬆症またはパジェット病患者の骨鉱化の減少に有用であり得る。Ｚｍａｘ１レベルまたはＨＢＭレベルの変化を、研究ツールとして使用することもできる。特に、タンパク質、ｍＲＮＡ、およびそのレベルまたは改変状態をＺｍａｘ１またはＨＢＭの機能的レベルの変化に対する反応が変化する他の分子の同定が可能である。骨障害の病理学および病原論は公知であり、例えば、Ｒｕｂｉｎ  ａｎｄ  Ｆａｒｂｅｒ（編）、Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ、第２版、Ｓ．Ｂ．Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｃｏｌ．、編、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、ＰＡ（１９９４）に記載されている。
【０２８１】
Ｚｍａｘ１またはＨＢＭタンパク質レベルを、細胞または被験体中の脂質レベルを調節するように変化させることができる。アテローム性動脈硬化症および動脈硬化症の病理学および病原論公知であり、例えば、Ｅｄｗｉｎ  Ｌ．Ｂｉｅｒｍａｎ、「アテローム性動脈硬化症および動脈硬化症の他の形態」、Ｈａｒｒｉｓｏｎ’ｓ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｉｎｔｅｒｎａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、１１０６−１１１６（第１３版、１９９４）に記載されている。Ｂｉｅｒｍａｎ（１９９４）に記載のように、脂質レベルの調整は、動脈硬化症および／またはアテローム性動脈硬化症ならびにアテローム性動脈硬化症および動脈硬化症患者の一定の脂質レベル（例えば、ＬＤＬ）の低下に有用であり得る。
【０２８２】
種々の技術を使用して、機能的Ｚｍａｘ１またはＨＢＭレベルを変化させることができる。例えば、Ｚｍａｘ１もしくはその変異体またはＨＢＭもしくはその変異体の細胞外部分の静脈内または骨内注射により、治療ヒト、動物、または鳥類の身体におけるＺｍａｘ１活性またはＨＢＭ活性レベルを変化させる。Ｚｍａｘ１タンパク質またはＨＢＭタンパク質の短縮変形形態を注射して、機能的Ｚｍａｘ１タンパク質またはＨＢＭタンパク質レベルを変化させることもできる。Ｚｍａｘ１またはＨＢＭの一定の形態は、内因性タンパク質活性を増強する一方で、他の形態は阻害性を示す。
【０２８３】
好ましい実施形態では、ＨＢＭタンパク質を使用して、骨粗鬆症または動脈硬化症を治療する。さらに好ましい実施形態では、ＨＢＭタンパク質の細胞外部分を使用する。このＨＢＭタンパク質を、タンパク質が細胞表面に接着する部分の付加によって任意選択的に改変することができる。タンパク質を、薬学的に許容可能な溶液中で調製し、注射または許容可能な薬物動態学および分布を達成する別の方法によって投与する。
【０２８４】
本方法の第２の実施形態では、Ｚｍａｘ１またはＨＢＭレベルを遺伝子治療法によって増減する。Ｚｍａｘ１またはＨＢＭレベルを増加させるために、骨芽細胞または別の有用な細胞型を、上記のように高レベルのＺｍａｘ１またはＨＢＭを発現するように遺伝子操作する。あるいは、Ｚｍａｘ１またはＨＢＭレベルを減少させるために、翻訳可能なＺｍａｘ１またはＨＢＭｍＲＮＡレベルを特異的に減少させるアンチセンス構築物を使用することができる。一般に、組織非特異的プロモーター（ＣＭＶプロモーターまたは発現ベクター中で見出される市販のプロモーターなど）を使用することができる（Ｗｕら、Ｔｏｘｉｃｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１４１（１）：３３０−９（１９９６））。好ましい実施形態では、Ｚｍａｘ１  ｃＤＮＡまたはアンチセンスを、骨特異的プロモーター（オステオカルシンまたは別のプロモーター）によって転写して骨組織中で特異的に発現させる。この方法では、Ｚｍａｘ１発現ＤＮＡ構築物またはＨＢＭ発現構築物を非骨組織に移入しても発現しない。同様に、肝臓特異的プロモーターを使用して脂質調節または代謝に関連する肝臓または他の細胞中にＨＢＭまたはＺｍａｘ１タンパク質を発現させ、例えば、肝臓特異的プロモーターを含むＤＮＡ構築物は、他の非肝臓組織で発現しない。
【０２８５】
本方法の第３の実施形態では、Ｚｍａｘ１またはＨＢＭに対する抗体を使用して、その機能を阻害する。このような抗体を本明細書中で同定する。
【０２８６】
本方法の第４の実施形態では、Ｚｍａｘ１機能またはＨＢＭ機能を阻害する薬物を使用する。このような薬物を本明細書中に記載し、医薬品開発分野の当業者に周知の医科化学技術にしたがって至適化する。
【０２８７】
Ｚｍａｘ１またはＨＢＭは、いくつかのタンパク質（ＡｐｏＥなど）と相互作用する。Ｚｍａｘ１またはＨＢＭおよびＡｐｏＥまたは他の結合パートナーとの間の相互作用を阻害する分子は、骨発達および鉱化を変化させると予想される。このようなインヒビターは、骨粗鬆症、大理石骨病、または他の骨鉱化疾患の治療用薬物として有用であり得る。このようなインヒビターは、低分子量の化合物、タンパク質、または他の型の分子であり得る。Ｋｉｍら、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（Ｔｏｋｙｏ）、１２４（６）：１０７２−１０７６（１９９８）を参照のこと。
【０２８８】
Ｚｍａｘ１またはＨＢＭと相互作用タンパク質との間の相互作用のインヒビターを、標準的な薬物巣クローニング技術によって単離することができる。例えば、Ｚｍａｘ１タンパク質（またはそのフラグメント）またはＨＢＭタンパク質（またはそのフラグメント）を、マイクロタイターウェルのベースなどの固体支持体上に固定することができる。第２のタンパク質またはタンパク質フラグメント（ＡｐｏＥなど）を、例えばフルオレセインでの検出の一助となるように誘導する。次いで、Ｚｍａｘ１またはＨＢＭのこのタンパク質−タンパク質ドメインを特異的に阻害することによりその膜貫通セグメントに関連する問題を回避することができる候補化合物の存在下でＺｍａｘ１またはＨＢＭにヨウ素またはビオチンを添加する。この型の薬物選別は医薬品開発分野の当業者に周知である。
【０２８９】
Ｚｍａｘ１およびＨＢＭが骨発達および脂質調製に関連するので、Ｚｍａｘ１およびＨＢＭに結合するタンパク質は、骨発達および脂質調節に関連すると予測される。このような結合タンパク質を、標準的な方法（同時免疫沈澱、同時断片化、または２ハイブリッド選別など）によって同定することができる（Ａｕｓｕｂｅｌら、「現代の分子生物学プロトコール」、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（１９９７））。例えば、２ハイブリッド系を使用したＺｍａｘ１相互作用タンパク質またはＨＢＭ相互作用タンパク質を同定するために、Ｚｍａｘ１またはＨＢＭの細胞外ドメインをＬｅｘＡに融合し、酵母ベクターｐＥＧ２０２（「ベイト」）を発現するか、酵母ＥＧＹ４８株で発現する。酵母株を、候補相互作用タンパク質に融合したガラクトース誘導性転写活性化配列をコードする適切なベクターにおいて（「プレイ」）ライブラリーで形質転換する。この方法による最初の選択およびその後の相互作用タンパク質の確認技術は、分子生物学分野の当業者に周知である（Ａｕｓｕｂｅｌら、「現代の分子生物学プロトコール」、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（１９９７））。
【０２９０】
好ましい実施形態では、ＨＢＭと相互作用するがＺｍａｘ１と相互作用しないタンパク質を、上記手順の変形形態を使用して同定する（Ｘｕら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９４（２３）：１２４７３−８（１９９７年１１月））。２ハイブリッド系のこの変形形態は、２つのベイトを使用し、Ｚｍａｘ１およびＨＢＭをそれぞれＬｅｘＡおよびＴｅｔＲに融合する。あるいは、ＨＢＭと相互作用するがＺｍａｘ１に相互作用しないタンパク質も単離する。これらの手順は分子生物学分野の当業者に周知であり、標準的な２ハイブリッド手順の簡単な変形形態である。
【０２９１】
Ｚｍａｘ１またはＨＢＭ相互作用タンパク質の別の単離法として、生物学的アプローチを使用する。Ｚｍａｘ１タンパク質またはそのフラグメント（細胞外ドメインなど）またはＨＢＭタンパク質またはそのフラグメント（細胞外ドメインなど）を、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅビーズに化学的に結合させる。Ｚｍａｘ１またはＨＢＭ結合ビーズを、カラムに注ぐ。血清タンパク質、骨生検の上清中のタンパク質、または穏やかに溶解したＴＥ８５骨芽細胞由来の細胞内タンパク質などのタンパク質の抽出物を、カラムに添加する。非特異的結合タンパク質を溶出し、カラムを低塩緩衝液で数回洗浄し、強力に結合しているタンパク質を、高塩緩衝液で溶出する。これらは、Ｚｍａｘ１またはＨＢＭに結合する候補タンパク質であり、標準的試験およびコントロール実験によって特異的結合について試験することができる。タンパク質の結合に使用するＳｅｐｈａｒｏｓｅビーズおよび結合法は市販されており（Ｓｉｇｍａ）、本明細書中に記載の手順はタンパク質生化学分野の当業者に周知である。
【０２９２】
上記手順の変形形態として、Ｚｍａｘ１−またはＨＢＭ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムから高塩で溶出したタンパク質を、ＨＢＭ−Ｚｍａｘ１−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムに結合する。重層することなく通過するタンパク質は、Ｚｍａｘ１に結合するがＨＢＭに結合しないタンパク質である。あるいは、ＨＢＭに結合するがＺｍａｘ１に結合しないタンパク質を、カラムを使用する順序を逆にして単離することができる。類似のカラムを、脂質調節および／または代謝に関連する肝臓ならびに他の組織および細胞における脂質調節の評価用に調製することができる。
【０２９３】
ＸＸＩ．使用法：形質転換−関連組換え（ＴＡＲ）クローニング
Ｚｍａｘ１の新規の対立遺伝子変異体は、個体における両方の遺伝子コピーの配列を実験する能力が不可欠である。これを達成するために、２つの「フック」または有意に類似の領域を、クローン化すべきＤＮＡの一部に隣接するようにゲノム配列内で同定する。より好ましくは、第１のこれらのフックは目的の最初のエクソンに対する配列５’由来であり、第２は目的の最後のエクソンに対する配列３’由来である。これら２つの「フック」を、細菌／酵母シャトルベクター（Ｌａｒｉｏｎｏｖら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９４：７３８４−７３８７（１９９７））に記載のものなど）にクローン化する。他の類似のベクター系を使用することもできる。Ｚｍａｘ１遺伝子の全コピーを回収するために、２つの「フック」を含むプラスミドを、制限エンドヌクレアーゼで線状化するか、ＰＣＲなどの別の方法で産生する。この線状ＤＮＡフラグメントを、ヒトゲノムＤＮＡと共に酵母細胞に移入する。典型的には、酵母サッカロミセス・セレヴィシエを宿主として使用するが、ニワトリ宿主細胞を同様に使用することができる（Ｌａｒｉｏｎｏｖら、Ｇｅｎｅｔ．Ｅｎｇ．（ＮＹ）、２１：３７−５５（１９９９））。形質転換の間および後に、内因性宿主細胞は、「フック」に対するヒトゲノムＤＮＡホモログ領域がプラスミドに挿入される組換え事象によって線状プラスミドを「環状」に変換する。このプラスミドを、回収し、当業者に周知の方法によって分析することができる。明白に、本反応の特異性は、線状フラグメント中に存在する「フック」と類似の配列を認識する宿主細胞機構が必要である。しかし、Ｋｏｕｐｒｉｎａら、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、５３（１）２１−２８（１９９８年１０月）に示すように、１００％配列同一性を必要なく、執筆者は、げっ歯類／ヒトハイブリッド細胞培養物由来のヒトＤＮＡフラグメントを対象とするためにヒトゲノムに共通の変性反復配列の使用を記載している。
【０２９４】
別の実施例では、Ｌａｒｉｏｎｏｖら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９５（８）：４４６９−７４（１９９８年４月）たった１つの「フック」が必要である。「ラジカルＴＥＲクローニング」と呼ばれるこの型の実験では、組換えを駆動する配列他の類似領域はゲノム由来の反復配列由来である。この方法では、Ｚｍａｘ１遺伝子コード領域に隣接するＤＮＡ領域を回収し、機能に影響を与える変化についての試験することができる。
【０２９５】
ＸＸＩＩ．使用法：ゲノムスクリーニング
ＨＢＭ遺伝子またはＺｍａｘ１に連結する多型遺伝子マーカーの使用は、骨粗鬆症または他の骨疾患に対する感受性の予測に非常に有用である。ＨＢＭ遺伝子またはＺｍａｘ１遺伝子に連結した多型遺伝子マーカーを使用して、動脈硬化症またはアテローム性動脈硬化症および関連病態に対する感受性を予測することもできる。Ｋｏｌｌｅｒら、Ａｍｅｒ．Ｊ．Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎ．Ｒｅｓ．、１３：１９０３−１９０８（１９９８）は、多型遺伝子マーカーの使用は、連鎖分析に有用であることを証明している。同様に、ＨＢＭ遺伝子内の多型遺伝子マーカーにより、骨発達に影響を与える他の遺伝子病変を含む連鎖不均衡である特異的対立遺伝子を同定可能である。ＢＡＣ由来のＤＮＡ配列を使用して、ジヌクレオチドＣＡｎ反復を同定し、この反復を含むゲノムＤＮＡを増幅する２つの固有のＰＣＲプライマーを医科に示すようにデザインし、ゲノムマッピング研究で使用した。
【０２９６】
Ｂ２００Ｅ２１Ｃ１６＿Ｌ：ＧＡＧＡＧＧＣＴＡＴＡＴＣＣＣＴＧＧＧＣ（配列番号３８）
Ｂ２００Ｅ２１Ｃ１６＿Ｒ：ＡＣＡＧＣＡＣＧＴＧＴＴＴＡＡＡＧＧＧＧ（配列番号３９）
【０２９７】
この方法を、当業者は首尾よく使用している（例えば、Ｓｈｅｆｆｉｅｌｄら、Ｇｅｎｅｔ．、４：１８３７−１８４４（１９９５）；ＬｅＢｌａｎｃ−Ｓｔｒａｃｅｓｋｉら、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、１９：３４１−９（１９９４）；Ｃｈｅｎｒａ，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、２５：１−８（１９９５））。集団または個体へのこれらの試薬の使用により、骨粗鬆症のリスクが予想される。同様に、上記の表４に記載の単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）を同様に使用して、骨疾患発症のリスクまたはＨＢＭ遺伝子の場合は骨粗鬆症への耐性を予想することができる。単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）（上記のものなど）を使用して、患者の動脈硬化症およびアテローム性動脈硬化症および関連病態の発症リスクを予想することができることも意図される。
【０２９８】
ＸＸＩＩＩ．使用法：組織カルシウム沈着の調整物質
ヒトの身体組織中のカルシウム沈着は十分に報告されている。Ｔｏｗｌｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７３：３０４２７−３４（１９９８）は、モデル系の発達頭蓋骨のカルシウム沈着を調節することが公知のいくつかのタンパク質がカルシウム沈着大動脈で発現することを証明している。カルシウム沈着血管組織におけるＭｓｘ２（前骨芽細胞細胞で転写される遺伝子）の発現により、骨発達に重要な遺伝子は他の組織のカルシウム沈着に関連することが示される。ＨＢＭタンパク質、アゴニスト、またはアンタゴニストでの治療により、骨塩類密度に対する証明された効果によりカルシウム沈着（血管系、象牙質、および頭蓋骨ビセラ（ｖｉｓｅｒａ）など）が緩和されるようである。組織カルシウム沈着が証明されている実験系では、Ｚｍａｘ１活性の過剰発現または抑制により、Ｚｍａｘ１遺伝子によって直接調節される分子を同定可能である。これらの遺伝子は、組織カルシウム沈着の調整を目的とする治療の潜在的な標的である。例えば、ＬＤＬＲ−／−などの動物えは、マウスに高脂肪食を与え、Ｚｍａｘ１を含む組織カルシウム沈着マーカーの発現を示すことが認められる。次いで、これらの動物を、Ｚｍａｘ１またはＨＢＭタンパク質、Ｚｍａｘ１またはＨＢＭ  ｃＤＮＡに指向するアンチセンスオリゴヌクレオチド、またはＺｍａｘ１もしくはＨＢＭタンパク質または結合パートナーもしくはリガンドと結合することが公知の化合物で治療する。ＲＮＡまたはタンパク質を血管組織から抽出し、組織で発現する遺伝子の相対的発現レベルを当該分野で周知の方法で同定する。組織中で緒節される遺伝子は、組織カルシウム沈着の調整物質として医薬品開発の潜在的治療標的である。
【０２９９】
個体に投与される本発明の核酸、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、小分子、または他の薬学的に有用な化合物を、当該分野で周知の薬学的に許容可能なキャリア、賦形剤、または希釈剤を含む組成物の形態で投与することができる。個体は、哺乳動物または鳥類、好ましくはヒト、ラット、マウス、または鳥類であり得る。このような組成物を、薬学的有効量で個体に投与することができる。投与量は、治療される病態および治療を受ける患者に依存して変化する。組成物は単独でも他の治療と組み合わせても投与することができる。
【０３００】
ＸＸＩＶ．薬学的組成物
本発明はまた、リポタンパク質調節薬（例えば、ブロフィブレート、ゲムフィブロジル、ニコチン酸、コレスチラミン、コレスチポル、ロバスタチン、シンバスタチン、プラバスタチン、プロブコール、プレマリン、またはエストラジオール）と組み合わせたＨＢＭおよび／またはＺｍａｘ１活性を調整する脂質媒介薬を含む薬学的組成物を意図する。リポタンパク質調節薬は、ＬＤＬ，ＶＬＤＬ，ＨＤＬ、またはＩＤＬレベルを調整（例えば、アップレギュレーションまたはダウンレギュレーション）する化合物または組成物を含み得る。
【０３０１】
ＨＢＭおよび／またはＺｍａｘ１活性を調整する脂質媒介薬は、タンパク質、モノクローナル抗体もしくはそのフラグメント、化学物質、および模倣物を含み得る。１つの意図する薬学的組成物は、モノクローナル抗体および薬学的に許容可能なキャリアを含み得る。本発明の目的のために、「薬学的に許容可能なキャリア」は、当該分野で周知の任意の標準的キャリアであり得る。例えば、適切なキャリアには、リン酸緩衝化生理食塩水、油／水乳濁液などの乳濁液、種々の型の潤滑剤を含み得る。他のキャリアはまた、滅菌溶液、錠剤、被覆錠剤、およびカプセルを含み得る。典型的には、このようなキャリアはまた、デンプン、ミルク、糖、泥、ゼラチン、ステアリン酸もしくはその塩、ステアリン酸マグネシウムもしくはカルシウム、植物性油脂、ガム、グリセロール、または他の公知の賦形剤を含み得る。このようなキャリアはまた、香料および着色料、防腐剤、または他の成分を含み得る。このようなキャリアを含む組成物を、周知の従来手段によって処方する。レミントンの薬学（第１５版）を参照のこと。
【０３０２】
診断目的で、抗体および組換え結合タンパク質は標識しても非標識でもよい。典型的には、診断アッセイは、モノクローナル抗体または組換え結合タンパク質のＨＢＭタンパク質またはＺｍａｘ１タンパク質への結合を介した複合体形成の検出を必要とする。非標識の場合、抗体および組換え結合タンパク質は、凝集アッセイで使用される。さらに、モノクローナル抗体または組換え結合タンパク質と特異的に反応する他の標識抗体（第２の抗体）（免疫グロブリンに特異的な抗体）と組み合わせて非標識抗体を使用することができる。あるいは、モノクローナル抗体または組換え結合タンパク質を直接標識することができる。広範な種々の標識（放射性核種（例えば、９９Ｔｃ、１１１Ｉｎ、１２３Ｉおよび１３１Ｉ）、蛍光剤、酵素、酵素基質、酵素補因子、酵素インヒビター、リガンド（特に、ハプテン）など）を使用することができる。多数の型の免疫アッセイが当該分野で周知である。
【０３０３】
一般に、本発明のモノクローナル抗体または組換え結合タンパク質は、本発明のモノクローナル抗体または組換え結合タンパク質が蛍光分子（フルオレセインイソチオシアナト（ＦＩＴＣ）など）と接合した蛍光活性で使用される。
【０３０４】
以下の実施例は、本発明のいかなる制限も意味しないが、本発明の好ましい実施形態を提供するために使用される。
【０３０５】
［実施例］
本発明を、以下の実施例を参考にして記載するが、これは本発明の例示のために提供し、本発明のいかなる様式での制限も意図しない。当該分野で周知の標準的技術または以下に特記した技術を使用した。
【０３０６】
＜実施例１＞
何が異常な骨密度と考えられるかを評価するために、クレイトン骨粗鬆症センターの医師に発端者を照会させた。彼女は１８歳で、彼女が乗車していた乗用車が背後から衝突された自動車事故によると認識される背痛のために２年前から診察を受けていた。彼女の傷は、疼痛および筋肉圧痛を発症する下方の背中の軽い柔組織損傷のみである。Ｘ線写真では骨折または亜脱臼の証拠は認められなかった。疼痛は２年前から継続しているにもかかわらず、彼女は全時間学校に通うことができた。彼女がセンターに訪れるまでに、疼痛はほぼ解決され、高校生としての通常の活動に復帰していた。身体検査により、伸長６６インチで体重１２８ポンドの正常な健康な若い女性であることが明らかとなった。全骨格のＸ線写真により、皮質の厚い密度の高い骨が明らかとなった。骨格の全ての骨を伴った。最も重要なことに、全ての骨の形が全く正常なことであった。脊椎ＢＭＣはＬ１−４で９４．４８であり、脊椎ＢＭＤはＬ１−４で１．６６７ｇｍ／ｃｍ２であった。ＢＭＤは、女性の最大骨量の標準偏差（ＳＤ）より５．６２高かった。これらを、Ｈｏｌｏｇｉｃ  ２０００〜を使用したＤＸＡによって測定した。次いで、彼女の母をスキャンし、腰椎ＢＭＣは５８．０５ｇであり、ＢＭＤは１，５００ｇｍ／ｃｍ２であった。彼女を母の値は、彼女の最大骨量より４．１２ＳＤ高く、彼女を同等者より４．９８ＳＤ高かった。彼女の母は５１歳であり、身長６５インチで体重１４０ポンドであった。彼女の母は、骨格筋または他の症状の病歴のない優れた健康体であった。彼女の父の腰椎ＢＭＣは７５．３３グラムであり、彼のＢＭＤは１．１１８ｇｍ／ｃｍ２であった。これらの値は男性の最大骨量より０．２５ＳＤ高い。彼の健康状態は良好で、伸長７２インチで体重１８７ポンドであった。
【０３０７】
これらの臨床データにより、発端者は非常に高い骨密度であるが正常な骨である彼女の母からの性質を遺伝していることが示唆されるので、母方の血統に注目した。米国特許第５，６９１，１５３号では、２２人のこれらのメンバーの骨密度をＤＸＡで測定した。１つの場合では、発端者の母方の祖父は死去しているが、医療記録、生前の骨のＸ線写真、およびＤＮＡ遺伝子分類用のパラフィン包埋胆嚢検体が得られた。彼のＸ線写真は、大腿骨および脊椎を含む実験に利用可能な全ての骨密度が明らかに非常に高く、罹患メンバーに含まれていた。本発明では、血統を、３７人の有益な個体を含むように拡大した。元の研究より付加された１４人の個体のうち２人の個体で鍵となる交差が認められたので、これらの付加により元の親族よりも有意に改善された（Ｊｏｈｎｓｏｎら、Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．、６０：１３２６−１３３２（１９９７））。それぞれ１２人から１４および１５人の雄−雄伝達の存在によってＸ連鎖を除外した。
【０３０８】
＜実施例２＞
本発明は、以下の表６で証明したこれらのクローンの集合体であるＨＢＭ遺伝子領域由来のＢＡＣクローン由来のＤＮＡ配列を記載する。クローンｂ２００ｅ２１−ｈ（ＡＴＣＣ番号９８０８１２；配列番号１０〜１１）を、１９９７年１０月３０日に、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）、１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｌｖｄ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ２０１１０−２２０９Ｕ．Ｓ．Ａ．に寄託した。クローンｂ５２７ｄ１２−ｈ（ＡＴＣＣ番号９８０７２０；配列番号５〜９）を、１９９８年１０月２日に、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）、１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｌｖｄ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ２０１１０−２２０９Ｕ．Ｓ．Ａ．に寄託した。これらの配列は、当業者がＺｍａｘ１遺伝子のＤＮＡプローブ、遺伝子増幅用ＰＣＲプライマー、Ｚｍａｘ１遺伝子のヌクレオチド多型、またはＺｍａｘ１遺伝子の調節エレメントを同定するために使用することができる固有の試薬である。
【０３０９】
【表６】
2004523724.tif 000012
【０３１０】
本明細書中で引用した各特許書類、特許出願書類、および刊行物は、引用することによりその全体を本明細書中に組み込むものとする。
【０３１１】
本発明を詳細に記載したが、当業者は、多数の変更形態および修正形態を行うことができ、このような変更形態および修正形態を本発明の精神および範囲を逸脱することなく行うことができることを認識する。
【０３１２】
＜実施例３＞
Ｚｍａｘ１はＬＤＬ受容体ファミリー遺伝子と類似性を有し、これは脂質代謝に関連し得る。しかし、他では、脂質プロフィールのばらつきは骨量と有意な関連を示さず、骨塩密度の指標として使用できないと報告されている（Ｚａｂａｇｌｉａら、「カンピナス付属病院（ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ｈｏｓｐｉｔａｌ）での女性の脂質プロフィールと骨塩密度との間の関連の調査研究」Ｃａｄ．Ｓａｕｄｅ  Ｐｕｂｌｉｃａ  １４：７７９−８６（１９９８））。Ｚｍａｘ１は、通常、骨再構築の際のカルシウム沈着による骨密度の調節に関連し得る。ＨＢＭ変異により沈着が増加し得るので、より密度の高い骨構造が得られる。興味深いことに、アテローム性動脈硬化症プラークは、カルシウム沈着物質を含み、骨分化に関連する種々の遺伝子を発現する。
【０３１３】
ＨＢＭ遺伝子が脂質調節に関連するかどうかを試験するために、生化学試験を行って、罹患および非罹患ＨＢＭファミリーメンバーにおける分子または前駆体を含む種々の血清脂質レベルを測定し、Ｚｍａｘ１遺伝子のＨＢＭ変異が脂質代謝に影響を与えるかどうかを試験した。表７は、８人のＨＢＭ個体おおび７人の非罹患個体の試験結果を示す。ウイルコクソンの順位和検定（ｔ検定の非パラメーター等価物）を行って、罹患ＨＢＭ個体由来の生化学マーカーレベルが非罹患個体から逸脱しているかどうかを評価した。得られたデータを、個別に年齢、ならびに適切ならば男性および女性由来の値の組み合わせによって分析した。
【０３１４】
標準的な診断プロトコールを使用して、トリグリセリド、コレステロール、高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）、超低密度リポタンパク質（ＶＬＤＬ）、アポリポタンパク質Ａ−１（ＡＰＯ  Ａ−１）、アポリポタンパク質Ｂ（ＡＰＯ  Ｂ）、およびリポタンパク質ａ（ＬＩＰＯａ）を同定した。このような手順については、例えば、Ｆ．Ｗ．Ｈｅｍｍｉｎｇ、「脂質分析」（Ｂｉｏｓ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂ．、１９９６）およびＪ．Ｍ．Ｏｒｄｏｖａｓ、「リポタンパク質プロトコール」（Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．、１９９７）を参照のこと。アポリポタンパク質Ｅ（ＡＰＯＥ）の遺伝子型もまた報告した。３つの共通の対立遺伝子（例えば、Ｅ２、Ｅ３、およぎＥ４）が存在する。罹患および非罹患ＨＢＭファミリーメンバーは、対立遺伝子に対してヘテロ接合性またはホモ接合性である。
【０３１５】
得られた結果は以下のように統計的に有意であった：（１）トリグリセリドレベルは、一般に、非罹患個体よりも罹患個体のほうが低かった、（２）超低密度リポタンパク質（ＶＬＤＬ）レベルは、一般に、非罹患個体よりも罹患個体で低かった。さらに、以下の比較は統計学的有意性（ｐ＝０．０６）に近かった：（１）高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）レベルは非罹患男性よりも罹患男性で高かった、（２）高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）に対する低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）の比は、一般に、比罹患男性よりも罹患男性で高かった。
表７では、「ＡＲＵＰ」は実験の１つを行ったＡＲＵＰ研究所、５００Ｃｈｉｐｅｔａ  Ｗａｙ、Ｓａｌｔ  Ｌａｋｅ  Ｃｉｔｙ、ＵＴ８４１０８である。「ＳＪＨ」は、これらの研究を行った第２のセンター（クレイトン医学研究所、２８ｔｈ＆Ｂｕｒｔ、Ｄｅｎｔａｌ−Ｒｍ３０６、Ｏｍａｈａ、ＮＥ６８１７８）をいう。ＡＰＯ−Ａ１、ＡＰＯ−Ｂ、およびＬＩＰＯ−ａは、ｍｇ／ｄＬで報告している。総血清レベルもまた、ｍｇ／ｄＬである。
【０３１６】
本出願で引用した全ての特許書類および刊行物は、引用することによりその全体を本明細書中に組み込むものとする。
【表７】
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【図面の簡単な説明】
【図１】
遺伝子連鎖研究で使用した個体の血統を示す図である。各個体の下はＩＤ番号、脊椎ＢＭＤのｚスコアであり、対立遺伝子は第１１染色体上の重要なマーカーを示す。黒塗りの印は、「罹患」個体を示す。「Ｎ」を含む印は、「非罹患」個体である。３７人の個体由来のＤＮＡの遺伝子型を分類した。クエスチョンマークは、未知の遺伝子型または遺伝子型分類を行っていない個体を示す。
【図２】
１１ｑ１３．３中のＨＢＭ領域のＢＡＣ／ＳＴＳ成分の物理的地図を示す図である。遺伝子、ＥＳＴ、マイクロサテライト、ランダム配列、およびＢＡＣ末端配列由来のＳＴＳマーカーを、長い横線の上に示す。ＧＤＢ中に存在するマーカーについては、同一の名前を使用した。遺伝子座名（Ｄ１１Ｓ＃＃＃＃）を、利用可能ならば最初の名称の後に括括弧中に示す。ＢＡＣ末端配列由来のＳＴＳを最初にＢＡＣ名と共に示し、その後にそれぞれクローンの左および右についてＬまたはＲで示す。２つの大きな矢印は、ＨＢＭの重要な領域を定義する遺伝子マーカーを示す。ＳＴＳの下の横線は、４倍の範囲のＢＡＣライブラリーのＰＣＲベースのスクリーニングによって同定されたＢＡＣクローンを示す。白抜きの円は、マーカーがライブラリースクリーニングの際に対応するＢＡＣライブラリーアドレスを増幅しなかったことを示す。クローン名は以下の慣習に従って使用する：ＢＡＣはＢ、プレート、列、およびカラムアドレス、その後のＨＢＭプロジェクトを示す−Ｈ（すなわち、Ｂ３６Ｆ１６−Ｈ）。
【図３Ａ〜３Ｆ】
隣接するイントロン配列を有するＺｍａｘ１のゲノム構造を示す。エクソン１中の下線の「ＡＴＧ」によって翻訳を開始する。ＨＢＭ遺伝子中の多型部位はエクソン３中に存在し、これを下線の「Ｇ」で示し、これによりこのヌクレオチドはＨＢＭ遺伝子中の「Ｔ」である。ｍＲＮＡの３’非翻訳領域を、エクソン２３（エクソン１、配列番号４０；エクソン２、配列番号４１；エクソン３、配列番号４２；エクソン４、配列番号４３；エクソン５、配列番号４４；エクソン６、配列番号４５；エクソン７、配列番号４６；エクソン８、配列番号４７；エクソン９、配列番号４８；エクソン１０、配列番号４９；エクソン１１、配列番号５０；エクソン１２、配列番号５１；エクソン１３、配列番号５２；エクソン１４、配列番号５３；エクソン１５、配列番号５４；エクソン１６、配列番号５５；エクソン１７、配列番号５６；エクソン１８、配列番号５７；エクソン１９、配列番号５８；エクソン２０、配列番号５９；エクソン２１、配列番号６０；エクソン２２、配列番号６１；ａｎｄ  エクソン２３；配列番号６２）中に下線を引いた。
【図４】
ＹＷＴＤスペーサー、細胞外結合部位、ＬＤＬおよびカルシウム結合部位、システインリッチ成長因子反復、膜貫通領域、ＣＫ−ＩＩリン酸化部位を有する理想的なＰＥＳＴ領域、ならびに内在化ドメインを含むＺｍａｘ１のドメイン構成を示す図である。ＨＢＭタンパク質を生じるグリシン→バリン変化部位も示す。シグナルペプチドは、アミノ酸１〜２２に存在し、細胞外ドメインはアミノ酸２３〜１３８５に存在し、膜貫通セグメントはアミノ酸１３８６〜１４１３に存在し、細胞質ドメインはアミノ酸１４１４〜１６１５に存在する。
【図５】
ＨＢＭ遺伝子に関するＢＡＣコンティーグＢ５２７Ｄ１２およびＢ２００Ｅ２１の略図である。
【図６Ａ〜６Ｅ】
野生型遺伝子Ｚｍａｘ１のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を示す図である。ヌクレオチド５８２でのグアニン→チミンの塩基対置換の位置に下線を引いている。この対立遺伝子変異体は、ＨＢＭ遺伝子である。ＨＢＭ遺伝子は、第１７１位でグリシン→バリンのアミノ酸が置換されたタンパク質をコードする。５’非翻訳領域（ＵＴＲ）境界は塩基１〜７０であり、３’ＵＴＲ境界は塩基４９１６〜５１２０である。
【図７Ａおよび７Ｂ】
種々の組織におけるＺｍａｘ１の発現を示すノーザンブロット分析を示す図である。
【図８】
ＰＣＲ産物分析を示す図である。
【図９】
Ｚｍａｘ１エクソン３変異の対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド欠失を示す図である。
【図１０】
センスおよびアンチセンスプローブを使用した１００倍のｉｎ  ｓｉｔｕハイブリッド形成によるマウスＺｍａｘ１の細胞位置決定を示す図である。
【図１１】
センスおよびアンチセンスプローブを使用した４００倍のｉｎ  ｓｉｔｕハイブリッド形成によるマウスＺｍａｘ１の細胞位置決定を示す図である。
【図１２】
センスおよびアンチセンスプローブを使用した４００倍の骨内膜中の骨芽細胞のｉｎ  ｓｉｔｕハイブリッド形成によるマウスＺｍａｘ１の細胞位置決定を示す図である。
【図１３】
ＭＣ−３Ｔ３細胞でのＺｍａｘ１発現のアンチセンス阻害を示す図である。
【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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