(57)【要約】ウィルスを使用して、宿主において生産されるタンパク質およびその他の有機低分子を分離および精製する方法が開示される。ウィルスを使用して、宿主において生産されるタンパク質およびその他の有機低分子を視覚化および／または位置決定する方法も開示される。ウィルスに結合したタンパク質または低分子を含む物質の組成物も開示される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
目的のタンパク質または非タンパク性低分子を精製する方法であって、
（ａ）表面に少なくとも１つの認識ペプチドを有するウィルスを用意するステップ、または、生物への感染時に前記ウィルスの粒子を生じるウィルス発現ベクターを調製するステップと；
（ｂ）中にウィルスが存在することと無関係に、またはウィルスが存在することに依存して、前記タンパク質または低分子を生産する宿主を入手するステップと；
（ｃ）前記ウィルスまたは前記ウィルス発現ベクターにより前記宿主を感染させ、これによって前記ウィルスの粒子が前記ペプチド認識配列を介して前記タンパク質または低分子と複合体を形成し、続いて前記宿主から前記ウィルスとタンパク質の前記複合体を収集するステップ、または、前記宿主の溶解産物もしくは溶液を前記ウィルスと接触させ、これによって前記ウィルス粒子が前記ペプチド認識配列を介して前記タンパク質または低分子と複合体を形成し、前記タンパク質または低分子が前記溶液から分離されるステップと
を含む方法。
【請求項２】
（ｄ）目的のタンパク質または低分子を前記ウィルス粒子から分離するステップをさらに含む請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記認識ペプチドが天然のコートタンパク質の一部であり、前記目的のタンパク質が、前記認識ペプチドと結合する親和性ペプチドと融合された請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記親和性ペプチドが、前記認識ペプチドと結合する抗体の一本鎖断片（ｓｃＦｖ）または抗体を含む請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記認識ペプチドがＦＬＡＧポリペプチドまたはポリヒスチジンポリペプチドであり、前記目的のタンパク質が、前記認識ペプチドと結合する親和性ペプチドと融合された請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記親和性ペプチドが、前記ＦＬＡＧポリペプチドまたは前記ポリヒスチジンポリペプチドと結合する抗体の一本鎖断片（ｓｃＦｖ）または抗体を含む請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記認識ペプチドが、非タンパク性低分子と結合する親和性ペプチド、抗体の一本鎖断片（ｓｃＦｖ）または抗体である請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記認識ペプチドがウィルスのコートタンパク質に導入されたポリペプチド配列であり、前記目的のタンパク質に親和性を有する請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記（ａ）が、前記目的のタンパク質または別のタンパク質をコードする導入遺伝子を含むウィルス発現ベクターを調製するステップを含み、その生産により前記宿主において前記目的のタンパク質または低分子が生産される請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記（ｂ）が、前記タンパク質または別のタンパク質をコードする導入遺伝子によって前記宿主を形質転換するステップを含み、その生産により前記目的のタンパク質または低分子が生産される請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記導入遺伝子が、切断可能な結合を介して、前記認識ペプチドと結合する親和性ペプチドに結合した前記目的のタンパク質を含む融合タンパク質をコードする請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
切断可能な結合が、エンテロキナーゼ部位を含む請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
切断可能な結合が、臭化シアン感受性部位を含む請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
切断可能な結合が、切断可能なインテインまたはその断片を含む請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
ウィルスが、バクテリオファージである請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
ウィルスが、タバコモザイクウィルスである請求項１１に記載の方法。
【請求項１７】
ウィルスが、アデノウィルスである請求項１１に記載の方法。
【請求項１８】
前記（ａ）が、植物に感染するウィルスを提供するステップ、または、植物ウィルスベクターであるウィルス発現ベクターを調製するステップを含む請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記（ａ）が、酵母に感染するウィルスを提供するステップ、または、酵母ウィルスベクターであるウィルス発現ベクターを調製するステップを含む請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
前記（ａ）が、細菌に感染するバクテリオファージを提供するステップ、または、細菌ウィルスベクターであるウィルス発現ベクターを調製するステップを含む請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
前記（ａ）が、動物細胞に感染するウィルスを提供するステップ、または、動物ウィルスベクターであるウィルス発現ベクターを調製するステップを含む請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
前記宿主が、植物細胞、植物組織または植物である請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
前記宿主が、細菌である請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
前記宿主が、酵母である請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
前記宿主が、動物細胞である請求項１に記載の方法。
【請求項２６】
前記ウィルスの前記表面が、同じまたは異なる親和性を有する１つ以上の認識ペプチドを含む請求項１に記載の方法。
【請求項２７】
目的のタンパク質を生産および精製する方法であって、
（ａ）表面に認識ペプチドを有するコートタンパク質を含む植物ウィルスを用意するステップ、または、植物のプロセッシングおよび感染時に前記ウィルスの粒子を生じるウィルス発現ベクターまたはプロベクターを用意するステップと；
（ｂ）前記目的のタンパク質を生産するように植物宿主を遺伝子修飾するステップと；
（ｃ）前記ウィルスまたはウィルス発現ベクターにより宿主を感染させ、これによって前記ウィルスの粒子が前記ペプチド認識配列を介して前記タンパク質または低分子と複合体を形成し、続いて前記植物宿主から前記ウィルスとタンパク質の前記複合体を収集するステップ、または、前記植物宿主の溶解産物もしくは溶液を前記ウィルスと接触させ、これによって前記ウィルス粒子が前記ペプチド認識配列を介して前記タンパク質または低分子と複合体を形成し、前記タンパク質または低分子が溶液から分離されるステップと
を含む方法。
【請求項２８】
（ｄ）前記目的のタンパク質を前記ウィルスから分離するステップを含む請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
目的のタンパク質または非タンパク性低分子を視覚化または位置決定する方法であって、
（ａ）前記タンパク質または低分子に対する親和性と、視覚化剤に対する親和性とを有するウィルスを用意するステップと；
（ｂ）前記目的のタンパク質または低分子を生産する宿主を入手するステップと；
（ｃ）前記宿主またはその調製物を前記ウィルスに接触させるステップと；
（ｄ）このように接触させた宿主またはその調製物を、前記視覚化剤に曝露するステップと；
（ｅ）前記タンパク質または低分子の存在または位置を検出するステップと
を含む方法。
【請求項３０】
表面に少なくとも１つの認識ペプチドを有するウィルス粒子を含むヒト以外の宿主であって、前記粒子に、直接的または前記認識ペプチドを介して間接的に目的のタンパク質または非タンパク性低分子が結合している宿主。
【請求項３１】
表面に少なくとも１つの認識ペプチドを有するウィルス粒子を含む物質の組成物であって、前記粒子に、直接的または前記認識ペプチドを介して間接的に目的のタンパク質または非タンパク性低分子が結合している組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［優先権］
本出願は、2001年1月18日提出の米国出願No.60/262,466に基づく優先権を請求する。
【０００２】
［技術分野］
本発明は生産、タンパク質と低分子を、それらが生産された宿主から検出または分離するためのウィルスの使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
［背景技術］
ここ数年、工業用油、プラスチック、食用ワクチン、産業上重要な組み換えタンパク質の生産に、遺伝子組み換え植物とその他の生きている生物を利用する方法は、めざましい進歩を遂げた。後者２例において、植物は、安全な機能性組み換えタンパク質を高レベルで生産でき、また産業界の要求を満たすために農業レベルに容易に拡大できることが明らかにされた(Fischer et al.,1999a,b)。バイオテクノロジーにおける植物、微生物、動物細胞の現行の適用例には、ホルモン、酵素、抗体、血漿タンパク質、サイトカイン、ワクチンの生産が含まれる。組み換えタンパク質は、遺伝子組み換え植物における遺伝子発現により、またはウィルス感染植物における一過性発現により生産できる。
【０００４】
植物における組み換えタンパク質の大規模生産は、植物ＲＮＡウィルスを用いることにより数年前に革新的な躍進を遂げた(Kumagai et al.,1993;Hamamoto et al.,1993)。全てのＲＮＡ発現系の原理は同じで、接種時に、ウィルスＲＮＡが細胞質内で高コピー数まで複製し、ウィルス子孫ＲＮＡが翻訳され、ウィルスにコードされたタンパク質の発現に至る。ウィルスは、細胞から細胞へ、長距離移動することにより、植物全体に移動する。ベクターを構築するためには、ウィルスＲＮＡゲノムがin vitroで逆転写され、in vitroまたはin vivoで全長ｃＤＮＡとして転写ベクターにクローニングされる(Boyer,Haenni,1994)。クローン化ウィルスゲノムは、標準ＤＮＡ技術により操作することができる。植物に接種するためには、組み換えウィルスベクターが通常in vitroで転写され、合成されたＲＮＡが、弱い表皮剥脱用具で葉をそっとこすることで、植物に機械的に接種される。これらの感染植物の抽出物は、大量の植物を引き続き接種するためにも利用できる。最も効率的な一過性発現ウィルスベクターは、タバコモザイクウィルス（ＴＭＶ）に基づくハイブリッドベクターで、異種コートタンパク質サブゲノムｍＲＮＡプロモーターとコートタンパク質オープンリーディングフレームおよびＴＭＶまたは異種３’非翻訳領域を含む(Shivprasad et al.,1999)。ウィルスベクターにより発現可能な遺伝子の大きさは、通常２ｋｂを超えない。
【０００５】
植物、酵母、細菌、動物系における組み換えタンパク質生産の特徴の比較は、Fishcer et al.,(1999a,b)に提示されている。形質転換植物と植物ウィルス系はいずれも、酵母、細菌、動物系と比べ、多くの利点を有する。植物における組み換えタンパク質生産の最も印象的な利点の１つは、生産コストである。ウィルスベクターに感染した植物からのタンパク質生産量は、安定な形質転換植物と比較すると数倍低い。さらに、新しい植物を作製するために要する時間は、形質転換植物と比較すると顕著に少ない。この低コストと高転換時間は、バイオテクノロジー会社にとって特に重要である。Large Scale Biotechnology（以前はBiosource）により提示されたデータによれば、精製タンパク質産物を回収、精製するために、遺伝子発現実現可能試験から温室および／または試験場生産に至るまでに要する時間は、約１年である。形質転換植物の場合、理想的な環境で少なくとも３年はかかると思われる。ウィルスＲＮＡベクター系は、４ｋｄから約７０ｋｄの質量の種々のタンパク質およびポリペプチドの生産に利用できる。
【０００６】
小さな抗原決定基オリゴペプチド（例えば、２５アミノ酸長未満）も、コートタンパク質遺伝子を用いて作製された遺伝子融合物により、ウィルス粒子の表面に生産できる(Hamamoto et al.,1997;Fitchen et al.,1995;McLain et al.,1995;Yusibov et al.,1997;Johnson et al.,1997;Koo et al.,1999)。ＴＭＶまたはその他の植物ウィルスの表面の抗原決定基オリゴペプチドが、ワクチンを接種した動物において、強力な免疫反応を誘発することを証明する重要なデータが存在する。
【０００７】
一方、タンパク質または分子は高度の純度を必要とするため、植物バイオマスからの下流のプロセッシング(processing)は、一般的に多くの問題を抱え、高価であると推定される。概して、組み換え産物は、総バイオマスのわずかな部分しか構成していない。生産収率に関して最適化されている微生物生産系において、総生産費用の９０％が、生産そのものの費用ではなく、宿主からの目的の分子の精製に関連する費用である。形質転換植物から経済的に生産するために、目的の組み換えまたは内因性タンパク質または非タンパク性分子をその他の内因性植物分子から、迅速かつ安価に分離できる方法が必要である。効率的な精製基盤の殆どが、目的の分子と精製基質間の特異的親和性に基づいているため、目的の分子を特異的に結合するために使用できる単純で安価な高親和性基質を開発することにより、この問題は最も良好に解決される。本発明において意図されたこのような基質の１つは、ウィルス粒子のタンパク質表面である。
【０００８】
タンパク質の大きさと生化学的特徴は全て異なるため、精製方法はタンパク質ごとに異なっていなくてはならない。一般的に応用できると思われる方法の１つは、親和性を介する分離法によりタンパク質を濃縮精製する分離技術の使用である。微生物系の場合のように、融合産物として（すなわち親和性標識を持つ）タンパク質を発現させることにより、植物抽出物から回収するために親和性分離を使用することが容易となる場合もある。細菌および動物系に関して、多くの多様な市販融合標識がある。その内少なくともいくつかは植物において機能するが、大規模生産には高価すぎる。
【０００９】
理想的な親和性標識に基づく精製システムの理想的な特徴には、均質、安価、均一かつ特異的な分子表面であって、そのものが２００−３００ｋｄよりもかなり大きな質量を有し、大きな安定した凝集体を形成できる分子表面が含まれる。この凝集体は、目的のタンパク質により結合され、沈殿によりタンパク質を精製できる位十分強力な親和性標識をその表面に持っていなくてはならない。目的のタンパク質との複合体は次に比較的穏やかなイオン条件で容易に解離する。理想的には、親和性基質は再利用可能である。このようなシステムは、植物のバイオテクノロジーばかりでなく、細菌と動物のバイオテクノロジーにおいても使用できるものと思われる。
【発明の開示】
【００１０】
［発明の概要］
出願者等は、ウィルスを用いるタンパク質または低分子の精製または可視化の方法を発明した。この方法は、植物、動物、細菌を含む多種多様のタンパク質発現系に応用できる。
【００１１】
本発明の第一の側面は、目的のタンパク質または非タンパク性低分子の精製方法に関する。この方法は、（ａ）表面に少なくとも１つの認識ペプチドを有するウィルスを用意するステップを含む。認識ペプチドは、（１つのまたは複数の）ウィルスコートタンパク質の表面に下位配列(sub-sequence)として存在してもよい。代わりに、ウィルス発現ベクターであって、これが存在する生物または細胞（例えば宿主）において、ウィルスの粒子の再構築を指示するベクターが用意される。この方法は、（ｂ）中にウィルスが存在することと無関係に、またはウィルスが存在することに依存して、前記タンパク質または低分子を生産する宿主を入手するステップも含む。タンパク質または低分子は、宿主により内因性に生産することもでき、または、ウィルス発現ベクターにより、もしくは別個の核酸配列ベクターによる形質転換イベントを介して、１つ以上の導入遺伝子が存在する結果外因性に生産することもできる。ウィルスは、タンパク質または低分子と結合させる（例えば、複合体を形成させる）ために、それらと接触させられる。これは、ウィルスまたはウィルス発現ベクターにより宿主を感染させることにより達成され、続いて宿主からウィルスとタンパク質の複合体を収集する。代わりに、宿主（およびタンパク質を含むもの）の溶解産物(lysate)または宿主の別の種類の溶液（例えば、ホモジェネート）を調製してもよい。タンパク質は、溶液を、例えば、カラムのような親和性基質に吸収させたウィルスと接触させることにより溶液から分離できる。ウィルスとタンパク質または低分子との結合は、ウィルスの親和性が、タンパク質そのものに対するものでも、タンパク質と同時発現される融合相手に対するものでも構わないという意味で、直接的でも間接的でもよい。認識ペプチドは、ウィルスにとって内因性でも（すなわち、天然の野生型または突然変異ウィルスとして存在する）、またはウィルスに対する遺伝子修飾であって、それにより親和性または認識ペプチドがウィルスのコートタンパク質の表面に組み込まれたものの結果であってもよい。目的のタンパク質または低分子が結合したウィルス粒子を収集し、その後ウィルスとタンパク質を互いに解離することができる。
【００１２】
種々の好ましい実施態様において、宿主は、タバコ、アブラナ、シロイヌナズナ、ダイズ、コムギ、アワ、トウモロコシなどの形質転換植物であり、ウィルスは、タバコモザイクウィルス（ＴＭＶ）、インゲンゴールデンモザイクウィルス、アデノウィルス、バキュロウィルスまたは、Ｔ偶数系ファージおよびＴ奇数系ファージのようなファージであり、タンパク質は融合タンパク質の形態で発現され、タンパク質とその融合相手との切断可能な結合は、エンテロキナーゼ部位(enterokinase site)または臭化シアン部位(cyanogens site)であり、ウィルスと融合タンパク質は、ウィルス核酸を含むベクター（例えば、植物、動物、細菌または酵母ウィルスベクター）により植物を感染させることにより接触させられる。ウィルスの認識配列に対する親和性を有するペプチドである融合相手は、抗体の一本鎖断片または抗体であり、認識配列は、ポリヒスチジンまたはＦＬＡＧペプチドのようなウィルスに天然には存在しないものである。従って、本発明のこの側面にかかる好ましい実施態様は、植物宿主において生産される外因性タンパク質の生産および精製方法に関する。この方法は、（ａ）コートタンパク質の表面に認識ペプチド（より好ましくはウィルスに天然には存在しない認識ペプチド）を有するコートタンパク質を含む植物ウィルスを用意するステップ、または、発現時に、植物宿主の細胞においてウィルスの粒子を生じる（組み換え）ウィルス発現ベクターまたはプロベクター(pro-vector)を用意するステップを含む。宿主は、目的のタンパク質を生産する、（より好ましくは、タンパク質に結合したペプチドが、ウィルス表面の認識ペプチドを結合する融合体の形態でタンパク質を生産するために）、１つ以上の導入遺伝子により遺伝子修飾されている。ウィルス粒子は、タンパク質と接触させられる。この接触は、ウィルスまたはウィルス発現ベクターにより宿主を感染させることにより達成され、ウィルス発現ベクターは宿主の中に導入され、続いてウィルスとタンパク質の複合体が宿主から収集される。代わりに、植物宿主から得られ、かつタンパク質を含む溶解産物または溶液（例えば、ホモジェネート）を、ウィルス、好ましくは、カラムのような基質に固定されたウィルスと接触させ、これによってウィルスの粒子がタンパク質と結合し（例えば、複合体を形成し）、タンパク質を溶解産物または溶液から分離する。次に、タンパク質をウィルスから解離することができる。
【００１３】
本発明のこの側面にかかる別の好ましい実施態様は、植物宿主からの内因性タンパク質の分離方法に関する。方法は、（ａ）コートタンパク質の表面に認識ペプチド（より好ましくはウィルスに天然には存在しない認識ペプチド）を有するコートタンパク質を含む植物ウィルスを用意するステップ、または、発現時に、植物宿主の細胞においてウィルスの粒子を生じる（組み換え）ウィルス発現ベクターまたはプロベクターを用意するステップを含む。宿主は、タンパク質の生産を引き起こすように培養される。ウィルス粒子は、タンパク質と接触させられる。この接触は、ウィルスまたはウィルス発現ベクターにより宿主を感染させることにより達成され、ウィルス発現ベクターは宿主の中に導入され、続いてウィルスとタンパク質の複合体が収集される。代わりに、植物宿主から得られ、かつタンパク質を含む溶解産物または溶液（例えば、ホモジェネート）を、ウィルス、好ましくは、カラムのような基質に固定されたウィルスと接触させ、これによってウィルスの粒子がタンパク質と結合し（例えば、複合体を形成し）、タンパク質を溶解産物または溶液から分離する。次に、タンパク質をウィルスから解離することができる。好ましいタンパク質は、ストレプトアビジンである。
【００１４】
本発明のさらなる側面は、目的のタンパク質または非タンパク性低分子を視覚化または位置決定する方法に関する。方法は、（ａ）タンパク質または低分子に対する親和性と視覚化物質に対する親和性とを有するウィルスを提供するステップと、（ｂ）目的のタンパク質または低分子を生産する宿主を入手するステップと、（ｃ）宿主またはその調製物をウィルスと接触させるステップと、（ｄ）このように接触させた宿主またはその調製物を視覚化物質に曝露するステップと、（ｅ）タンパク質または低分子の存在を検出または位置決定するステップとを含む。
【００１５】
本発明のさらなる側面は組成物に関する。このような組成物の１つは、表面に認識ペプチドを有するウィルス粒子を含むヒト以外の宿主であって、粒子に、直接的にまたは認識ペプチドを介して間接的にタンパク質または非タンパク性低分子が結合している。別の組成物は、表面に認識ペプチドを持つウィルス粒子であって、粒子に、直接的にまたは認識ペプチドを介して間接的にタンパク質または非タンパク性低分子が結合している。組成物はさらに、（例えば、別の認識ペプチドにより）ウィルスに付着または結合した検出可能な標識のような視覚化物質を含むことができる。これらの組成物は、本発明の方法を実施する課程で形成される。
【００１６】
本発明の方法および組成物は、タンパク質または低分子の分離、精製、または検出、視覚化または位置決定を迅速かつ安価に行うために、生きている生物系またはその抽出物に導入できる、容易にプログラム可能で自己複製生物学的親和性基質(self-replicating biological affinity matrix)としてウィルスを利用している。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
［発明の最良の実施方法］
本発明は、宿主（本発明の目的のために、ヒト以外のあらゆる生物タンパク質生産設備を意味する）において生産されるタンパク質の精製または視覚化を目的として、ウィルスの種々の特性を利用している。特に、本発明は、ウィルスと目的のタンパク質の間で形成される複合体を他の分子から、特に分子量がウィルスと目的の複合体の重量よりも遙かに低い分子量のタンパク質と低分子から分離するために、高親和性リガンドとしてウィルス粒子のタンパク質表面と比較的高分子量のウィルス粒子を利用している。ウィルスは、天然の野生型もしくは突然変異ウィルス、または遺伝子工学により作製されたウィルスのどちらであっても、自己複製「マシーン」であり、それ自体は非常に安価である。ウィルスはまた、精製処置が必要なタンパク質または低分子の大多数よりも遙かに大きい。重量または物理化学的特性における大きな差は、目的の分子をウィルス粒子に結合し、得られた複合体を混合物の残りから分離することにより、目的の分子を組織ホモジェネートのような混合物から分離する簡単な手順の開発に有効に活かされている。ウィルス粒子と目的の分子の結合は、後にアフィニティークロマトグラフィーの技術に精通する者にとって公知の多くの方法で解離できる。
【００１８】
ウィルスは通常１つまたは少数のいわゆるコートタンパク質分子の反復から構成されるエンベロープを有する。従って、ウィルスの表面は、十分に定義された構造を有するポリペプチドモチーフを表示するモノマーの反復である。本技術に精通する者は、特異的ウィルス表面モチーフを認識し、野生型ウィルスに結合するリガンドをデザインすることができる。このような認識ペプチドは、特異的親和特性を有する特異的表面をデザインするために、ウィルスのコートタンパク質構造を遺伝子修飾することにより、ウィルス表面に組み入れることもできる。１つ以上のコートタンパク質を持ち、複数の認識ペプチドを必要とするウィルスを利用する本発明の実施形態において、認識ペプチドは同じコートタンパク質または異なるコートタンパク質上に存在することができる。認識ペプチドの部位および組成は、ウィルスの感染、複製、組み立てまたは伝播を干渉しないように選択される。ウィルスは通常複数のコピーとして細胞内または精製調製物内に存在するため、天然のアフィニティーカラムとして使用できる。
【００１９】
本発明は、ウィルス粒子そのものよりも小さいタンパク質またはその他の分子の精製に使用できる。好ましい実施態様において、本発明は、タンパク質の分離に使用できる。もっとも好ましい実施態様において、本発明は、野生型もしくは遺伝子工学により作製された、または形質転換生物により生産されるタンパク質を分離するために使用される。本発明の目的のために、ウィルスは生産宿主でもある細胞において増殖でき、または別の生物において生産でき、後者の場合ウィルスと目的の分子は次に、例えば、生産宿主（例えば、生物またはその組織または細胞）のホモジェネートまたは溶解産物と精製／非精製ウィルスとの混合により接触させられる。本発明の一実施態様において、ウィルスは目的のタンパク質の発現ベクターとしても、またタンパク質の親和性リガンドとしても機能するように作製される。好ましい実施態様は、植物ウィルスの使用を必要とし、特に限定されるものではないが、この方法は、植物ウィルス、動物ウィルス、真菌ウィルス、バクテリオファージ、または上記の特性を持つ遺伝子工学により作製されたレプリコンまたは合成されたレプリコンのようなあらゆるウィルスにより実施できる。同様に、この方法は、植物（その細胞および組織培養を含む）、ヒト以外の動物を含む動物、動物およびヒト細胞培養、真菌、細菌、酵母を含む広範にわたる宿主発現系を用いて実施できる。
【００２０】
タンパク質または低分子を精製する本方法は、宿主に関するタンパク質の性質および宿主においてタンパク質が生産される方法、ウィルスとタンパク質の親和性の性質などのいくつかの因子に基づき、多くの異なる方法で実施できる。タンパク質または低分子が宿主により内因性に生産される実施態様において、方法は比較的簡単に実施される。細胞は培養され、溶解される。溶解産物またはタンパク質を含むより精製された溶液を、ウィルスと接触させる。ウィルスは、カラムのような基質に固定できる。代わりに、宿主を（宿主ではない生物において増殖したであろう）ウィルス、または無処理（intact）のウィルス粒子が感染宿主において形成されるようにウィルス複製ベクターにより感染させることができる。宿主により内因性に生産されないタンパク質の精製は、宿主に機構を、すなわちタンパク質をコードまたはタンパク質の発現を命令する少なくとも１つの導入遺伝子を供給するために、遺伝子操作を必要とする。これらの実施態様において、導入遺伝子は、ウィルス発現／複製ベクターの一部として、または別の形質転換イベントを介して、宿主に導入できる。タンパク質に対するウィルスの親和性は、直接的でもよく、または、導入遺伝子が、ウィルスの対応する認識配列により認識、結合される結合ペプチドとの融合物の形態でタンパク質をコードできるという意味で間接的でもよい。
【００２１】
これらの変数を超えて、タンパク質に対するウィルスの親和性は、ウィルスにとって内因性でもよく、または、（例えば、ウィルスのコートタンパク質の表面に存在する抗原決定基ペプチドの導入による）ウィルスの遺伝子組み立て操作の結果であってもよい。本発明の種々の実施態様を実行するためのキメラウィルスの好ましい作製方法は、以下の通りである。目的のタンパク質または低分子への直接的親和性を有する短いペプチドリガンドの配列（例えば、一般的に５から１２アミノ酸長）が選択される。コートタンパク質コーディング領域の３’末端部分付近と短いペプチドリガンドとの融合物が作製される。対応する組み換えタンパク質により認識される表面抗原決定基標識を持つＴＭＶ粒子を作製することができる。本発明の認識ペプチドは、５−１２アミノ酸に限定されない。分離と精製または視覚化と位置決定の目的のために、タンパク質または低分子に対する必須の結合親和性が維持されている限り、認識ペプチドは長くても、さらに短くてもよい。
【００２２】
本発明の実行に有用な植物ウィルス群を以下に一覧する。
ＤＮＡウィルス：環状二本鎖ＤＮＡウィルス：科：Caulimoviridae、属：Badnavirus、基準種：ツユクサ黄斑ウィルス、属：Caulimovirus、基準種：カリフラワーモザイクウィルス、属：「SbCMV-様ウィルス」、基準種：ダイズクロロティックモットルウィルス、属「CsVMV様ウィルス」、基準種：カッサバ葉脈モザイクウィルス、属：「ＲＴＢＶ様ウィルス」、基準種：コメツングロ棹状ウィルス、属：「ペチュニア葉脈クリアリング様ウィルス」、基準種：ペチュニア葉脈クリアリングウィルス；
環状一本鎖ＤＮＡウィルス：科：Geminiviridae、属：Mastrevirus（Geminivirus亜群Ｉ）、基準種：トウモロコシ線条ウィルス、属：Curtovirus（Geminivirus亜群II）、基準種：ビートカーリートップウィルス、属：Begomovirus（Geminivirus亜群III）、基準種：インゲンゴールデンモザイクウィルス；
ＲＮＡウィルス：
一本鎖ＲＮＡウィルス：科：Bromoviridae、属：Alfamovirus、基準種：アルファルファモゾイクウィルス、属：Ilarvirus、基準種：タバコ線条ウィルス、属：Bromovirus、基準種：スズメノチャヒキモザイクウィルス、属：Cucumovirus、基準種：キュウリモザイクウィルス；
科：Closteroviridae、属：Closterovirus、基準種：ビート萎黄ウィルス、属：Crinivirus、基準種：レタス感染性黄色ウィルス、科：Comoviridae、属：Comovirus、基準種：ササゲモザイクウィルス、属：Fabavirus、基準種：ソラマメウィルトウィルスＩ、属：Nepovirus、基準種：タバコ輪点ウィルスＩ、属：Nepovirus、基準種：タバコ輪点ウィルス；
科：Potyviridae、属：Potyvirus、基準種：ジャガイモＹウィルス、属：Rymovirus、基準種：ライグラスモザイクウィルス、属：Bymovirus、基準種：オオムギ縞萎縮ウィルス；
科：Sequiviridae、属：Sequivirus、基準種：アメリカボウフウ黄色斑点ウィルス、属：Waikavirus、基準種：コメツングロ球状ウィルス；科：Tombusvirus、基準種：カーネーション輪点ウィルス、属：Machlomovirus、基準種：トウモロコシクロティックモットルウィルス、属：Necrovirus、基準種：タバコネクローシスウィルス、属：Tombusvirus、基準種：トマトブッシースタントウィルス、属が割り当てられない一本鎖ＲＮＡウィルス、属：Capillovirus、基準種：アップルステムピッティングウィルス；
属：Carlairus、基準種カーネーション潜伏ウィルス；属：Enamovirus、基準種:エンドウひだ葉モザイクウィルス、
属：Furovirus、基準種：土壌感染性ムギ類萎縮ウィルス、属：Hordeivirus、基準種：ムギ斑葉モザイクウィルス、属：Idaevirus、基準種：キイチゴ萎縮ウィルス；
属：Luteovirus、基準種：オオムギ縞萎縮ウィルス；属：Marafivirus、基準種：トウモロコシラヤドフィノウィルス；属：Potexvirus、基準種：ジャガイモＸウィルス；
属：GOTOBUTTON BM Sobemovirus、基準種：GOTOBUTTON BM-サザンビーンモザイクウィルス、属：Tenuivirus、基準種：コメ縞葉枯ウィルス、
属：Tobamovirus、基準種：タバコモザイクウィルス、
属：Tobravirus、基準種：タバコ茎壊疽ウィルス、
属：Trichovirus、基準種：アップルクロロティックラットルウィルス；属Tymovirus、基準種：カブ黄斑モザイクウィルス；属：Umbravirus、基準種：ニンジン斑ウィルス；負一本鎖ＲＮＡウィルス：目：Mononegavirales、科：Phabdoviridae、属：Cytorhabdovirus、基準種：lettuce necrotic yellows virus、属：Nucleorhabdovius、基準種：ジャガイモ黄萎ウイルス;
Negative ssRNA Viruses：科：Bunyaviridae、属：Tospoviris、基準種：トマトスポッテッドウィルトウィルス；
二本鎖ＲＮＡウィルス：科：Partitiviridae、属：Alphacryptovirus、基準種：シロツメクサ潜在ウィルス１型、属：Betacryptovirus、基準種：”−シロツメクサ潜在ウィルス２型、科：”-Reoviridae  、属：Fijivirus、基準種：フィジー病ウィルス、属：Phytoreovirus、基準種：傷害腫瘍ウィルス、属：Oryzavirus、基準種：コメラッグドスタントウィルス；
割り当てられないウィルス：ゲノム一本鎖ウィルスＤＮＡ：種  バナナバンチートップウィルス、種  ココナツ葉腐れウィルス、種  サブタレニアンクローバー矮化ウィルス
ゲノム二本鎖ＤＮＡ、種  キュウリ葉脈黄色ウィルス；ゲノム二本鎖ＲＮＡ、種  タバコ矮化ウィルス、
ゲノム一本鎖ＲＮＡ、種  ニンニクＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄウィルス、種  グレープバイン斑点ウィルス、種  トウモロコシ白線モザイクウィルス、種  オリーブ潜伏ウィルス２型、種  アウアミアメロンウィルス、種  ゼラニウム帯状スポットウィルス；
【００２３】
種々の動物ウィルスも使用できる。好ましい動物ウィルスは、レトロウィルス、アデノウィルス、アデノ関連ウィルス、単純疱疹ウィルス、バキュロウィルスが含まれる。これらのウィルスは、キャプシドタンパク質の遺伝子工学による作製を促進するために（例えば、目的のタンパク質または低分子を間接的または直接的に結合する認識ペプチドを導入するために）、十分研究され、特徴が明らかにされている。
【００２４】
タンパク質または低分子が、ヒト（またはその他の動物）への投与またはそれらによる消費を目的とする実施態様においては、安全性がより高く、最終産物における残留汚染ウィルスの可能性がより低いことから植物由来のウィルスが好ましい。このようなウィルス系は、種々の植物宿主(概説は、Prota & Lomonossoff,1996を参照)、昆虫細胞系、例えば、バキュロウィルス発現系(Revi et al.,2000)、哺乳動物細胞(Colosimo et al.,2000)に関して、十分説明されている。
【００２５】
本発明の好ましい実施態様は、植物宿主（例えば、植物細胞、組織、ホモジェネートまたは全草）における外因性（例えば、異種）タンパク質の生産を含む。この実施態様は、コートタンパク質を有する植物ウィルスを提供するステップであって、そのコートタンパク質の表面が認識ペプチドを含むステップ、または、ウィルス発現ベクターまたはプロ−ベクターを提供するステップであって、植物のプロセッシングと感染により、ウィルスの粒子が生じるステップを含む。別の方法のステップは、例えば、一過性発現またはトランスフェクションまたは安定な形質転換により、目的のタンパク質を生産するように、植物宿主を遺伝子修飾するステップを含む。さらなる方法のステップは、ウィルスもしくはウィルス発現プロ−ベクターにより宿主を感染するステップ、または、宿主またはその溶解産物もしくは溶液をウィルスと接触させるステップであって、それによってウィルスの粒子が認識ペプチド配列を介して目的のタンパク質と複合体を形成するステップを含む。次に、タンパク質に結合したウィルスの粒子を抽出する。次に、目的のタンパク質を前記ウィルスから分離することができる。
【００２６】
本発明の別の好ましい実施態様において、植物宿主により作製されたタンパク質の精製に、タバコモザイクウィルス（ＴＭＶ）が使用される。ＴＭＶ粒子は、９５％のコートタンパク質（ビリオンあたり２１３０コピー）と約５％のＲＮＡから成る。コートタンパク質（ＣＰ）の１つのサブユニットの重さは１７．５ｋｄで、ゲノムの大きさは６３９５ヌクレオチドである。ＴＭＶウィルス粒子全体の大きさは約４００００ｋｄである(Creager et al.,1999)。ポリエチレングリコール沈殿と高速遠心分離を用いて、ＴＭＶを分離するのは非常に簡単である(Turpen and Reinl,1998)。ＴＭＶは非常に安価なタンパク質供給源である。接種後２週間以内に、１ｋｇの感染したタバコの葉あたり２ｇから１０ｇのウィルスを収集できる。しかし、一般的に、ウィルスの選択は、タンパク質の生産に使用するための宿主の種類に依る（例えば、動物細胞、細菌細胞または酵母細胞）。
【００２７】
いくつかの実施態様において、ウィルスは、タンパク質または低分子を認識または結合するオリゴペプチドを含むコートタンパク質を持つバクテリオファージである。使用されるウィルス（例えば、ＴＭＶ）に対する親和性が高い約５−１２ｍｅｒのオリゴペプチドを選択するために、ファージディスプレイシステムが使用される。現在、このようなシステムがいくつか市販されている。ファージディスプレイは、短い可変５−１２ｍｅｒオリゴペプチドがバクテリオファージのコートタンパク質に挿入される選択技術である。この可変オリゴペプチドをコードする配列が、バクテリオファージコートタンパク質の対応する遺伝子に含められる。通常、７−ｍｅｒファージディスプレイライブラリは、可変オリゴペプチドに７個のアミノ酸の種々の組み合わせを持つ１０9個の独立したクローンを有する。ファージディスプレイは、バクテリオファージと目的のタンパク質の間に親和性複合体を作製するため使用されており、それによって、「パニング」と呼ばれるin vitro選択工程による特定の標的タンパク質に対するペプチドリガンドの迅速な同定が可能となる(Parmley & Smith(1988);Cortese et al.(1995))。パニング工程後、作製されたファージ−タンパク質複合体は解離可能で、標的タンパク質に親和性を有するファージを増幅することができる。通常、高い親和性を有するバクテリオファージを得るには、３回のパニングが必要である。３回のパニングの後、ゲノムでの可変領域の配列決定により個々のクローンの特徴を明らかにできる。
【００２８】
ファージディスプレイシステムは、タンパク質内部の非タンパク性低分子結合部位の同定のためにも開発されており、本技術において公知である(概説は、Rodi et al.,2001;Ehrlich et al.,2000)。このようなシステムは、パクリタキセル（例えば、タキソール）、ドセタキセル、２−メトキシエストラジオール、グリコサミノグリカンヒアルロナンを含む抗癌剤のような多くの薬物に対する高い親和性を有するペプチドを同定するために使用されてきた。例えば、ペンタペプチドＨＴＰＨＰは、パクリタキセルに対する高い親和性を有することが知られている。(Rodi et al.,1999参照)。このペンタペプチドは、本明細書に説明されているように、ウィルス表面タンパク質に組み込まれ、タキソール−生産植物組織からタキソールを分離することができる。治療薬と除草剤は、このような低分子の例である。一般に、植物、動物、細菌または酵母細胞のような宿主により生産され、認識可能である（例えば、ペプチドに対する結合親和性を有する）非ペプチド有機分子は全て、本発明に従って分離または検出可能である。これらの分子を結合するペプチドも、ファージディスプレイを用いて同定できる。一般に、低分子の分子量は、約２５０ダルトンから約１，０００ダルトンである。
【００２９】
ウィルスまたはウィルス発現ベクターにより宿主を感染させることにより、ウィルスを、無処理の宿主（例えば、生体内）においてタンパク質と接触および結合させることができる。代わりに、例えば、一旦タンパク質がホモジェネートまたは溶解産物に含められたなら、カラムのような基質にウィルス粒子を吸着させたアフィニティークロマトグラフィーによって、ウィルスは、宿主領域外部のタンパク質と接触させることができる。ウィルスをタンパク質（または低分子）から解離するために使用される条件は、相互作用の種類によって異なり、ｐＨ；温度；イオン；キレート剤の濃度のような物理化学的パラメータにより決定される。適正条件の選択は、タンパク質精製術の技術水準の範囲内である。Kent,1999;Gurgel et al.,2000;Wilchek & Chaiken,2000;Muronetzet al.,2001を参照。限外濾過は、ウィルスからタンパク質を分離するこのような方法の１つである。タンパク質が、ウィルス表面の認識ペプチドと結合する親和性ペプチド(affinity peptide)との融合物の形態で発現される実施態様において、タンパク質の分離は、タンパク質とその融合相手との間に切断可能な結合が存在することにより促進される。切断部位は、エンテロキナーゼ(Choi et al.,1001)または臭化シアン(Assadi-Porter et al.,200)により認識される部位が可能であるが、これらに限定されない。その他の切断部位の例として、トリプシン、Ｘａ因子プロテアーゼ、ヒドロキシルアミンがある。目的のタンパク質との切断可能な融合物を作製するさらなる別の方法は、インテイン(intein)の利用に基づく。Chong et al.,(1997)参照。このシステムは、親和性標識と組み合わせて、酵母由来のインテインと呼ばれるタンパク質−スプライシング成分を利用している。特定の穏やかな化学的条件でそのＮ−末端ペプチドで自己切断を受けるように、修飾インテインを誘導できる。インテイン−親和性標識融合物のＮ−末端により、標識タンパク質をインフレームでクローニングする。次に、固定された融合タンパク質を、（タンパク質分解切断を必要としない）穏やかな条件で自己切断を受けるように誘導し、その結果、標的タンパク質を解離させ、一方インテイン−親和性標識はカラムに結合させたままとする(Cantor & Chang,2001)。このように、本発明において、宿主に導入された導入遺伝子は、ウィルス表面に結合するインテインに基づく切断可能な親和性標識との融合物の形態で発現する。
【００３０】
本発明は、植物、動物および細菌界を含むが、これらに限定されない広範な宿主において、形質転換および内因性タンパク質、および天然または導入遺伝子発現の結果として存在する非タンパク性分子の精製に適している。このようなタンパク質の例として、例えば、免疫応答タンパク質、ＤＮＡ修飾酵素、デンプン変性酵素、細胞壁修飾酵素、プロテアーゼ、リパーゼを含む酵素のような製薬および産業上重要なタンパク質が含まれるが、これらに限定されない。
【００３１】
宿主にとって外因性のタンパク質または低分子の場合、（タンパク質そのものとして、またはウィルスの認識ペプチドと結合するペプチドとの融合の形態で）タンパク質をコードするか、またはその発現により低分子の生産を引き起こす導入遺伝子が、ヒト以外の宿主に標準技術により導入される。一般に、これらの技術は、安定な形質転換または一過性の形質転換を含み、またはウィルス送達による（例えば、ウィルス発現ベクターによる細胞の感染）。外来遺伝子が安定して組み込まれた形質転換生物の作製方法は、文献に詳細に報告されている。例えば、ＤＮＡは、アグロバクテリウムを介する送達により、植物細胞内に形質転換できる。米国特許：5,591,616;4,940,838;5,464,763を参照。その他の方法には、微粒子銃(米国特許5,100,792;欧州特許(EP)444,882B1;EP434,616B1)、マイクロインジェクション(WO09209696;WO09400583A1;EP175,966B1)、エレクトロポレーション(EP564,595B1;EP290,395B1;WO08706614A1)が含まれる。導入遺伝子の動物、細菌、酵母細胞への送達方法は、十分確立されている。一般的な動物細胞への導入遺伝子送達方法は、レトロウィルスを介する方法である(Robbins & Givizzani,1998;Reynolds et al.,1999)。合成（非ウィルス）担体を用いるその他の方法も適切である(概説は、Bown et al.,2001を参照)。酵母および細菌細胞に関する形質転換方法は、例えば、Yeast Protocol Handbook(2000)およびSambrook et al.,(1989)等の多くのマニュアルに詳細に記述されている。
【００３２】
本発明は、組織ホモジェナイゼーション、遠心分離、限外濾過などの技術を調整できるため、産業利用とスケールアップのために修正可能である。本発明は、原核または真核系の全てにおいて、タンパク質または低分子の生産に応用できる。従って、本発明により、タンパク質生産用にデザインされたあらゆる種類の原核または真核系から、目的のあらゆるタンパク質を精製するための万能、安価、かつスケールアップが容易な方法の開発を可能にする。
【００３３】
ウィルス粒子の使用により、均質なタンパク質（コートタンパク質）の安価な供給源が提供され、これは、同時に簡単に遺伝子修飾される。本発明の別の重要な利点は、標的タンパク質に対する高い親和性を有するオリゴペプチドを同定するための抗原決定基を使用できる点である。代用親和性基質融合物として、抗原決定基をウィルスコートタンパク質に組み入れることにより、目的のタンパク質または低分子を、修飾を加えず、またその後の切断工程を必要とせずに、分離することができる。その結果、目的の無処理のタンパク質が生産される。ウィルス粒子は、最大のタンパク質と比べてもはるかに大きいという事実により（約４００００ｋＤ対最大３００ｋＤ）、簡単な限外濾過により目的のタンパク質を効率的に分離することができる。
【００３４】
本発明のウィルス精製標識システムも、細胞の表面または異なるコンパートメントにおいて、タンパク質の位置決定または検出に使用される。金標識抗体を用いる免疫染色は、このような実験課題の解決に広く利用されている(Milne RG,1993)。この分野のもう一つの方法は、金標識ストレプトアビジンの利用である(Prendes et al.,1999)。本発明の方法は、目的のタンパク質または低分子を視覚化または位置決定する方法であって、（ａ）タンパク質または低分子に対する親和性と、視覚化剤に対する親和性とを有するウィルスを用意するステップと；（ｂ）目的のタンパク質または低分子を生産する宿主を入手するステップと；（ｃ）宿主またはその調製物をウィルスと接触させるステップと；（ｄ）このように接触させた宿主またはその調製物を視覚化剤に曝露するステップと；（ｅ）タンパク質または低分子の存在または部位を検出するステップとを含む方法も含む。本発明のこの側面において、ウィルスは、免疫学に基づく方法（例えば、ELISA）や電子顕微鏡（例えば、金による標識）のような標準技術により検出できるシグナルを増幅するための多数の相互作用部位を提供する基質として機能している。タンパク質または低分子を認識または結合する天然ウィルスまたは遺伝子工学により作製されたウィルスの選択は、十分本技術の水準範囲である。さらに、タンパク質／低分子と視覚化剤の両方を認識するキメラウィルスも作製できる。例えば、キメラＴＭＶ粒子は、in vitro自己組織化により生産される。宿主におけるタンパク質（例えば、細胞表面タンパク質）の位置を決定するために、ファージディスプレイシステムを使用し、そのタンパク質を認識するヘプタペプチドのような抗原決定基標識を同定する。次に、タンパク質のカルボキシル末端付近にこの抗原決定基標識を含む融合ＴＭＶ  ＣＰ（コートタンパク質）が作製される。ウィルスはさらに、ストレプトアビジンを認識する抗原決定基標識を持つＣＰを含むように作製され、その結果in vitroで自己組織化された時、両方の抗原決定基標識を持つキメラウィルスタンパク質粒子が生産される。タンパク質の位置を決定するために、キメラ自己組織化ＴＭＶ粒子を、従来の技術において報告されている抗体が関与する技術のように、宿主と組み合わせる。次に、細胞−ＴＭＶ複合体を、検出可能な標識（例えば、金標識）ストレプトアビジンとともにインキュベートする。電子顕微鏡分析により、非常に特異的な棹状ＴＭＶ粒子と金標識の黒い点の両者により、タンパク質の位置が決定される。平易にいうと、種々の視覚化剤または位置決定剤、例えば、検出可能な標識および物理的標識（例えば、紫外線、蛍光物質、酵素活性を引き起こす基質の視覚化−ウェスタンブロット法に使用されるものと同じ）を、使用される検出機序に基づき使用することができる。
【実施例】
【００３５】
［実施例］
下記に示す実施例は、ＴＭＶウィルス発現ベクターによる宿主の感染により、ＣＰ表面のストレプトアビジン認識ペプチド配列（抗原決定基）を含むウィルスの粒子を生じることを証明している。ストレプトアビジン認識ペプチドの部位と組成は、ウィルスの感染、複製、組み立てまたは伝播を顕著に干渉しなかった。in vitro転写ＲＮＡによる健康な若いN.benthamianaの接種後、ストレプトアビジンに対する親和性標識が生産されたウィルス粒子が得られた。
【００３６】
市販ストレプトアビジンを用いる実験により、ＴＭＶｆ２３粒子のストレプトアビジンとの高い親和性が証明され、それによって、精製を１回行い、その元の濃度から（葉組織１ｇあたり１００ｍｋｇ）ストレプトアビジンの分離と精製が可能となった。ＴＭＶｆ２３−ストレプトアビジン複合体を穏やかな条件で解離し、ストレプトアビジンを限外濾過によりＴＭＶｆ２３から分離した。
【００３７】
［実施例１：修飾コートタンパク質を有する感染性ＴＭＶの調製］
我々は、Dr.J.Culverの研究室由来のTMV304として知られるpBR322プラスミドの中に挿入されたＴＭＶのｃＤＮＡコピーを使用した。ＴＭＶの３’末端を有する937bp KpnI-NcoI断片（コートタンパク質（ＣＰ）全体を含む）をＴＭＶ３０４から切り出し、pICxxxxベクター（NcoIを含むさらなる制限部位を持つ修飾ＳＫベクター）に挿入した。これによって、プラスミドpICyyyy（ＴＭＶｃｐ３）が生産された。ストレプトアビジンに対する親和性を持つヘプタペプチドTLIAHPQをコードする２１ヌクレオチドの配列が、ＰＣＲ部位特異的突然変異によりＴＭＶ  ＣＰの遺伝子に挿入された。我々は、pICyyyyを以下の２通りのプライマーの組みあわせでインキュベートした。
【００３８】
１）フォワード24-mer Bluescriptプライマー；
【化１】
2004524842.tif 000002
およびcpfR 47-merプライマー；
【化２】
2004524842.tif 000003
と、リバース24-mer Bluescriptプライマー；
【化３】
2004524842.tif 000004
およびcpfR 46-merプライマー；
【化４】
2004524842.tif 000005
【００３９】
ＰＣＲ反応は、Pfu Turbo DNAポリメラーゼ（Stratagene）を用いて実施された。２つの同種ＰＣＲ産物は、Quiagen PCR-精製キットにより精製され、混合され、変性され、再変性され、フォワードおよびリバースBluescriptプライマーとPfu Turbo DNAポリメラーゼと共にインキュベートされた。最終同種ＰＣＲ産物は、KpnIおよびNcoI制限酵素を用いて消化され、pICxxxxベクターに挿入された。突然変異配列が正しいことは、配列決定により確認された。これにより、以下の配列を有する融合ＴＭＶｆ２３コートタンパク質が得られた。
【００４０】
【化５】
2004524842.tif 000006
（ストレプトアビジン抗原決定基標識配列を下線で示す。）
【００４１】
修飾ＣＰ遺伝子を、プラスミドTMV304に挿入して戻し、組み換えDNA pICzzzzを作製した。修飾ウィルス（ＴＭＶｆ２３と命名）の感染性ＲＮＡコピーは、Turpen and Reinl(1998)に従って、in vitroで転写され、Nicotina benthamianaの若い植物に接種された。ＴＭＶとＴＭＶｆ２３の両者に関する感染の最初の症状は、接種５−６日後に出現した。ＴＭＶは、非常に重度の症状を引き起こしたが、ＴＭＶｆ２３の症状はより軽度であったが、非常に明らかでもあった。接種２週間後に、ＴＭＶおよびＴＭＶｆ２３接種植物からウィルスが分離された。ＴＭＶとＴＭＶｆ２３の回収率は非常に良好で、いずれも葉組織１ｇあたり２ｍｇのウィルスが得られた。ＴＭＶｆ２３由来のＣＰの融合性は、ＴＭＶｆ２３の移動度の減少（サイズの拡大を示す）により、ＰＡＧＥにおける電気泳動により証明された（図１）。
【００４２】
［実施例２：ＴＭＶの修飾ＣＰによるストレプトアビジンの精製］
融合ＣＰ−標識を有するＴＭＶ粒子の、市販ストレプトアビジンに対する親和性を試験した。数グラムのN.benthamianaの葉を液体窒素を用いてホモジェネートした。その後、等量（１ｇ／１ｍＬ）の抽出用緩衝液を加え（50mMトリス塩酸、pH8.0;0.5M NaCl;0.25%ノニデットP-40;1.3%ポリビニルポリピロリドン(PVPP);1mMフェニルメチルスルフォニルフルオリド(PMSF);3mkg/mlペプスタチン;1mkg/mlロイペプチン;5mMアスコルビン酸）、および１ｇの葉組織あたり１００μｇに相当するストレプトアビジンも加えた。全ての操作を０℃から４℃で実施した。ホモジェネートを14000rpmで２分間遠心分離し、得られた上清を14000rpmで１０分間、２回遠心分離した。上清を25%(NH4)2SO4に調整し、14000rpmで１０分間遠心分離した。２５％（ＮＨ4）2ＳＯ4上清を飽和25%(NH4)2SO4に調整し、14000rpmで１０分間遠心分離した。沈殿を１０ｍＭリン酸緩衝液、pH7.2に懸濁し、遠心分離により清澄化し、氷の中で１ｇの葉組織あたり１ｍｇのＴＭＶｆ２３と共に３時間インキュベートした。懸濁液を14000rpmで１０分間遠心分離した。ペレットを１０ｍＭリン酸緩衝液に懸濁し、ポリアクリルアミドゲル（ＰＡＧＥ）により分析した。ストレプトアビジンが、植物タンパク質の混合物から有意に精製されたことが見いだされた（図２）。
【００４３】
次に、ＴＭＶｆ２３−ストレプトアビジン複合体の解離が至適化された。ＴＭＶｆ２３からストレプトアビジンを解離する最適かつ効率的方法は、ＴＭＶｆ２３−ストレプトアビジン複合体を０．２Ｍ酢酸、ｐＨ４．６に懸濁し、それをCentriconTMフィルター（Nanosep300K）において遠心分離することであることが見いだされた。ストレプトアビジンはフィルターを定量的に通過し（図４Ａ）、ＴＭＶｆ２３はフィルターに定量的に残留した。
【００４４】
［実施例３：野生型ＴＭＶコートタンパク質を認識するヘプタペプチドの同定］
ファージディスプレイシステムを用いて、我々は、無処理の野生型ＴＭＶ粒子を認識するヘプタペプチド配列を決定した。この配列は、カセット：ＡＴＧ−ヘプタペプチド配列−エンテロキナーゼ切断部位の構築に使用された。カセット配列は、Ｂ型肝炎Ｓタンパク質の遺伝子と融合された。融合構築物は、ｃｒＴＭＶウィルス送達ベクターに挿入され、植物において発現された。
【００４５】
［実施例４：タンパク質検出におけるＴＭＶｆ２３とストレプトアビジンの使用］
ＴＭＶとＦ２３粒子は、「滴上の共培養(co-cultivation on the drop)」によりグリッドに室温で１５分間吸着させた。バックグラウンドを減少させるために、グリッドを、０．１Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ中の１％ウシ血清アルブミンを用いて、室温で１時間処理した。グリッドを金標識ストレプトアビジン（Sigma）を用いて、４℃で一晩インキュベートし、続いてリン酸緩衝液中の１％ウシ血清アルブミン、水の中で洗浄し、電子顕微鏡で分析した。図２ＡおよびＢは、金標識ストレプトアビジンにより処理されたＴＭＶ粒子を示す。ストレプトアビジンとＴＭＶの間に特異的相互作用は認められなかった。図２Ｃ、Ｄ、Ｅは、同じ方法で処理されたＦ２３粒子を示す。この場合、金標識ストレプトアビジンとＦ２３粒子の間に明らかな親和性を観察することができる。
【００４６】
［実施例５：Streptomyces afidiniiからのストレプトアビジンの精製］
ＴＭＶに基づく精製標識は、細菌と動物のバイオテクノロジーにおけるタンパク質精製にも使用できる。これを証明するために、ストレプトアビジンを天然の市販Streptomyces avidiniiから精製した。S.avidinii細胞を合成培地で成長させた。細菌を７日間培養してから、収集し、12000xgで５分間遠心分離した。ストレプトアビジンを含む上清（図４Ａ、レーン１）を、８０％硫酸アンモニウムで沈殿させ、４℃で一晩放置した。タンパク質または低分子を12000xgで１０分間遠心分離し、１０ｍＭリン酸緩衝液（元の容量の０．１）に溶解した。総タンパク質溶液をＦ２３と１：１０の比率で混合し、氷の中に１時間放置した。ストレプトアビジン−Ｆ２３凝集物を、遠心分離により沈殿させ、０．２Ｍ酢酸、ｐＨ３．５に溶解した。NANOSEP300Kによる遠心分離により、ストレプトアビジンをＦ２３から分離した（図４Ｂ）。精製ストレプトアビジンの収率は、約９０％であった。
【００４７】
Streptomyces avidiniiから分離されたストレプトアビジンは、市販の試料と比較して、Ｆ２３とより強力な複合体を形成した。（市販試料に関しては、ｐＨ４．６における解離が適切であった）。市販の精製手順と比較して、より穏やかなストレプトアビジン精製条件が使用された。従って、本発明により、より無処理で、その結果より活性型のストレプトアビジンの分離が可能となる。
【００４８】
［引用文献］
【表１Ａ】
2004524842.tif 000007
【００４９】
【表１Ｂ】
2004524842.tif 000008
【産業上の利用可能性】
【００５０】
［産業利用性］
本発明は、タンパク質または低分子精製分野において、また市販の有用な有機分子の製造に有用である。
【００５１】
本明細書の発明は、特定の実施態様を引用して説明されているが、これらの実施態様は、本発明の原理と応用法を単に説明するものであることは明らかである。従って、請求項に定義されている本発明の精神と範囲を逸脱せずに、実例となる実施態様に多くの修正を加えることができ、またその他の改変を考案できることは明らかである。
【００５２】
本明細書に引用されている全ての文献は、本発明が関係する技術に精通する者の技術水準を示している。これらの文献および特許明細書は、それぞれ個々の文献または特許明細書が、引用することにより本明細書の一部を成すこととするのと同等に、引用することにより本明細書の一部を成すものとする。
【図面の簡単な説明】
【００５３】
【図１】図１Ａ、１Ｂ、１Ｃ、１Ｄは、野生型ＴＭＶとＴＭＶｆ２３のコートタンパク質の比較分析を示す電気泳動ゲルの写真である。ウィルス粒子を９５℃で５分間インキュベートし、その直後１０−２０％直線勾配ドデシル硫酸ナトリウム−トリス−グリシンポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけた。Ａ−６μおよびＣ−０．６μｇの非修飾ＴＭＶ。Ｂ−６μｇおよびＤ−０．６μｇのＴＭＶｆ２３。ゲルはクマシンブルーで染色した。
【図２】図２Ａ−Ｅは、ストレプトアビジンに特異的な抗原決定基標識を持つＴＭＶｆ２３を用いてNicotiana benthamianaから抽出された葉全体のタンパク質からのストレプトアビジンの精製を示す電気泳動ゲルの写真である。対照として、野生型ＴＭＶ粒子を、あらかじめ混合されたストレプトアビジンを含む総タンパク質抽出物と氷中で３時間インキュベートし、１４０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。沈殿物は、多少のＴＭＶ粒子のみを含んでいた（Ａ）。上清は、ＴＭＶ粒子とストレプトアビジンの両方を含んでいた（Ｂ）。ＴＭＶｆ２３の沈殿物は、ストレプトアビジンも含んでいた（Ｃ）。最後の例の上清は、有意な量のＴＭＶｆ２３もストレプトアビジンも含んでいなかった。Ｅ−ＴＭＶまたはＴＭＶｆ２３とのインキュベーション前にストレプトアビジンがあらかじめ混合された総タンパク質抽出物。電気泳動条件は全て、図１と同じである。ストレプトアビジンのバンドの位置は、「＞」により表示されている。
【図３】図３は、複合体ＴＭＶｆ２３−ストレプトアビジンの分離を示す電気泳動ゲルの写真である。電気泳動の条件は図１の場合と同じである。
【図４】図４Ａは、ウェスタンブロット法の写真で、図４Ｂは、Streptomyces avidiniiから分離精製され、Bio-Safe Coomassie(BIo-Rad)により染色されたストレプトアビジンのドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（Ｂ）分析の写真である。Ａ１−１ｍｋｌの分泌されたストレプトアビジン（約５０ｎｇ）；Ａ２−１００ｎｇの市販ストレプトアビジン（Sigma）。Ｂ１−５００ｎｇの分泌された非精製ストレプトアビジン。Ｂ２−Ｆ２３により精製後の等量のストレプトアビジン。Ｂ３−１ｍｋｇの市販ストレプトアビジン（Sigma）。
【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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