(57)【要約】本発明は、核酸をマッピングする方法であって、ａ）マッピング対象の核酸に由来する複数の核酸試料を含むＨＡＰＰＹマッピングパネルを作製するステップと、ｂ）マッピングパネルの核酸を標識するステップと、ｃ）マッピング対象の核酸に存在するマーカー配列に相補的な複数のプローブを作製し、固相にプローブを固定するステップと、ｄ）プローブが、マッピングパネルの相補的な配列にハイブリダイゼーションするように、マッピングパネルの１つ以上のメンバーを各プローブに接触させるステップと、ｅ）ハイブリダイゼーションしなかった核酸を除去し、マッピングパネルの核酸のプローブへのハイブリダイゼーションを検出するステップとを含む方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸をマッピングする方法であって、
ａ）マッピング対象の核酸に由来する複数の核酸試料を含むＨＡＰＰＹマッピングパネルを調製するステップであって、該パネルの各メンバーが、質量について、マッピング対象の該核酸の０．０５〜２コピーと等しい量を示すＤＮＡ断片のサンプリングを含有するステップと、
ｂ）該マッピングパネルの該核酸を標識するステップと、
ｃ）マッピング対象の該核酸に存在するマーカー配列に相補的な複数のプローブを調製し、固相にプローブを固定するステップと、
ｄ）該プローブが、該マッピングパネルの相補的な配列にハイブリダイゼーションするように、該マッピングパネルの１つ以上のメンバーを該複数のプローブの各々に接触させるステップと、
ｅ）ハイブリダイゼーションしなかった核酸を除去し、マッピングパネルの核酸の該プローブへのハイブリダイゼーションを検出するステップと
を含む方法。
【請求項２】
前記パネルのメンバーが、前記プローブとのハイブリダイゼーションの前に事前増幅される請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記事前増幅が非特異的である請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記パネルメンバーの前記核酸が、事前増幅中に標識される請求項２または請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記マッピングパネルの前記１つ以上のメンバーの各々が、複数のプローブにより同時にスクリーニングされる請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記マッピングパネルの複数のメンバーが、複数のプローブにより同時にスクリーニングされる請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記固相が、マルチウェルプレート、ガラススライドまたは膜である請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
前記パネルメンバーが選択的に事前増幅されて、マッピングパネルメンバーの複雑さを低減する請求項２に記載の方法。
【請求項９】
プローブに相補的な配列を含む配列だけが増幅される請求項８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、迅速で、自動化されたゲノムのマッピングを可能にする、核酸分子をマッピングする改良された方法に関する。本発明の方法は、ＨＡＰＰＹマッピングに基づいており、分子アレイに実施される。
【背景技術】
【０００２】
ＨＡＰＰＹマッピングは、任意の生物のゲノムの連鎖マッピングのために開発された方法である。それは、当初、Dearらによって1989年に、ＤＮＡ源として１つの一倍体精子を使用して記載され(DearおよびCook、(1989)Nucleic Acids Res.17:6795)、後に、ＤＮＡ源として多数の二倍体細胞を使用し、次にＤＮＡ希釈し、各々が理想的には０．６９一倍体当量(0.69 haploid equivalents)を含有するマッピングパネルメンバーに分割し、評価することができるマーカー連鎖を使用するように適合された。この技法はいくつかの文献において総説され、使用されている（例えば、DearおよびCook、(1993)Nucleic Acids Res.21:13-20、Piperら、(1998)Genome Res.8:1299-130およびそこに引用されている種々の文献）。
【０００３】
基本的には、ＨＡＰＰＹマッピングは、ゲノムＤＮＡを物理的に分離された断片に切断し、試料パネルであって、各々が当該ゲノムの１一倍体当量（理想的には、バルクゲノムＤＮＡからサンプリングする場合には、０．６９一倍体当量）以下に等しい量のＤＮＡを含有するものを提供することに関する。次いで、一連のマーカーの存在について試料をスクリーニングする。ゲノム内で接近して位置するマーカーは、ゲノム内で距離をおいて位置するマーカーと比べて、より多く同時分離(cosegreagte)する。マーカーパネルを用いて得られる同時分離の表を分析することによって、ゲノム内のマーカーの順序および空間的位置を推定することができる。
【０００４】
ＨＡＰＰＹマッピングの主な用途には、ゲノムおよび遺伝子マッピング、菌株の多様性の検出、集団解析、疫学、遺伝子発現、ならびに系統発生学的および分類学的関係の証明が挙げられる。
【０００５】
ＨＡＰＰＹマッピング、実際には任意のマッピング手法の欠点の１つは、連鎖を決定するために、大きい試料パネルについて大多数の分析を実施する必要があることである。例えば、ＨＡＰＰＹマッピングパネルは、一般に、少なくとも９６の試料を含み、連鎖マップを作製するために、２つ以上のマーカーの存在についてその各々をスクリーニングしなければならない。精密な解像マッピングは、当然のことながら、３つ以上のマーカーを用いてパネルメンバーをスクリーニングする必要がある。従って、マッピングは労働集約性が高い手法である。
【０００６】
ＨＡＰＰＹマッピングの別の欠点は、ほとんどの共通の実施態様において、スクリーニングステップは、各マーカーについて、試料核酸からマーカー領域を増幅するためのＰＣＲプライマーセットを必要とするということである。ＰＣＲの使用は自動化および高スループットのスクリーニング反応を助けるが、マーカーあたり少なくとも２つのプライマー、入れ子ＰＣＲ(nested PCR)または半入れ子ＰＣＲ(heminested PCR)を使用する場合にはそれ以上のプライマーを作製する必要があり、費用と複雑さが増す。
【０００７】
従って、ＨＡＰＰＹマッピング方法の分野には、ＰＣＲに基づいたマーカー検出の複雑さを低下し、大多数のマッピング反応の効率的な実施を可能にする必要性がある。
【発明の開示】
【０００８】
本発明は、パネルメンバーを個々のプローブで試験する従来の方法とは異なり、プローブパネルをＨＡＰＰＹマッピングパネルのメンバーで試験する逆ハイブリダイゼーションＨＡＰＰＹマッピング手法を提供する。これにより、大多数のマーカーをＨＡＰＰＹマッピングパネルで同時にマッピングすることができ、潜在的には、数千のマーカーを１日以内でマッピングすることができる。
【０００９】
第１の態様によると、核酸をマッピングする方法であって、
ａ）マッピング対象の核酸に由来する複数の核酸試料を含むＨＡＰＰＹマッピングパネルを調製するステップであって、該パネルの各メンバーが、質量について、マッピング対象に該核酸の２コピー以下と等しい量を示すＤＮＡ断片のサンプリングを含有するステップと、
ｂ）該マッピングパネルの該核酸を標識するステップと、
ｃ）マッピング対象の該核酸に存在するマーカー配列に相補的な複数のプローブを調製し、固相にプローブを固定するステップと、
ｄ）該プローブが、該マッピングパネルの相補的な配列にハイブリダイゼーションするように、該マッピングパネルの１つ以上のメンバーを該複数のプローブの各々に接触させるステップと、
ｅ）ハイブリダイゼーションしなかった核酸を除去し、マッピングパネルの核酸の該プローブへのハイブリダイゼーションを検出するステップと
を含む方法が提供される。
【００１０】
有利なことに、前記マッピングパネルメンバーは、前記プローブとのハイブリダイゼーションの前に事前増幅(pre-amplified)される。有利なことに、前記事前増幅は非特異的である。標識は事前増幅段階で組み込まれてもよい。
【００１１】
従って、マッピングパネルの各メンバーを多数のプローブで同時にスクリーニングすることができる。例えば、マルチウェルプレートをハイブリダイゼーション反応に使用する場合には、１つのプローブを各ウェルに固定し、試験対象のマッピングパネルメンバーの核酸を各ウェルに添加することができる。マッピングパネルメンバーの核酸に相補的なプローブを含有するウェルにだけ陽性のハイブリダイゼーションが生じる。または、プローブをガラススライドまたは膜にスポットし、マッピングパネルメンバーの核酸と共に１反応でインキュベーションしてもよい。従って、マッピングパネルの各メンバーは各プローブと順次または同時に接触される。
【００１２】
本発明の手法は高度に自動化することができる。例えば、プローブを含む大多数のプレートまたはスライドまたは他の支持体のレプリカを作製し、全てのマッピングパネルメンバーを同時にスクリーニングするために使用することができる。従って、マッピングパネルが９６のメンバーを含む場合には、プローブパネルの９６のレプリカを使用して、全てのプローブの有無について全てのメンバーを１つのセッションでスクリーニングすることができる。次いで、プローブパネルを読み取り、シグナルを自動的にデコンボリュートすることもでき、十分に自動化され、高スループットなマッピング手法となる。
【００１３】
以前に記載されているＨＡＰＰＹマッピング手法とは異なり、上記の本発明の手法はマーカー特異的ＰＣＲを必要としない。しかし、マッピングパネルメンバーの複雑さは、事前増幅する条件を変更することによって調節することができる。マッピングパネルメンバーのある割合のゲノム配列を増幅する場合には、メンバーの複雑さは低下され、ハイブリダイゼーションの特異性を増すことが望ましい場合もある。任意のマーカーは、その対応物が事前増幅後マッピングパネルのメンバー内に発現されている少なくとも１つの配列を含有する場合には、マッピング可能である。
【００１４】
ある場合では、マッピングパネルメンバーに存在する核酸および固定したプローブの複雑さの大きさにより、ハイブリダイゼーションが複雑になったり、選択性が低下することがある。従って、プローブがある種のクラスの配列を含有することが（それらの作製方法から）知られている場合には、有利なことには、そのクラスの配列を優先的に増幅するように設計されたＰＣＲプライマーを使用して、マッピングパネルメンバーを事前増幅することができる。極端な例では、特にプローブセットに存在することが既知の正確な配列だけを増幅するように設計された特異的なＰＣＲプライマーセットを用いてマッピングパネルを事前増幅することができる。従って、本発明の好ましい態様において、プローブに存在することが既知または期待される配列に対応する核酸を選択的に増幅するように設計されたプライマーを使用して、マッピングパネルメンバーの核酸の事前増幅が実施される。例えば、ＰＣＲプライマーは、マーカー自体に基づいていてもよく、マーカーを含有する配列について増幅した配列を濃縮するためにある割合のランダムプライマーと共に使用することができる。この手法は、有利なことに、各マッピングパネルメンバーにおいて無差別に実施され、関連するクラスの全配列が、存在する全パネルメンバーにおいて優先的に増幅される。その後のハイブリダイゼーション反応は、どのマーカーがどのマッピングパネルメンバーに存在するかを同定する。
【００１５】
増幅反応に使用するプライマーへのプローブのハイブリダイゼーションは、プライマーを除去するためのパネルメンバーのサイズ分画、その後のハイブリダイゼーション反応において検出されない非標識プライマーの使用、または、これらが増幅産物より実質的に短い場合には、プライマーのハイブリダイゼーションを防ぐのに充分なストリンジェンシーの洗浄条件の使用によって防ぐことができる。
【００１６】
従って、有利な態様において、本発明は、事前増幅ステップ中に、マッピングパネルメンバーが、プローブに相補的なメンバーに存在する配列について濃縮される上記方法を提供する。好ましくは、マッピングパネルメンバーは、プローブまたはプローブ内の代表される一般的なクラスの配列に相同または相補的なプライマーを使用して増幅される。複雑さは、例えば、プローブ内の核酸断片のサイズ選択、制限酵素特異性による選択等によっても低下することができる。一例として、プローブが、鎖長＞５００ヌクレオチドのクローニングされたＥｃｏＲＩ断片である場合には、マッピングパネルメンバーの核酸をＥｃｏＲＩで切断し、サイズ選択し、約５００ヌクレオチド未満の物質を除去することができる。これは、プローブの複雑さ、従って反応の複雑さを大幅に低下する。
【００１７】
プローブ自体が複雑である（さらに、特定のクラスの配列を必ずしも代表していないもの、例えば、ゲノムＤＮＡの任意に選択した大きいクローニング断片である）場合、特に、全てのプローブに見出されることを期待できる配列メンバーの任意のサブセットを増幅する１つ以上のプライマーを用いた事前増幅によって、それらの複雑さを固定の前に低下させることができる。例えば、プローブがヒトＤＮＡの大きいクローニング断片である場合には、事前増幅は、ヒトＤＮＡに共通のＡｌｕ要素または他のモチーフの末端に相補的なプライマーを用いて実施することができ、それによってこのようなモチーフの近接して対立する例の間に偶然に存在する配列のサブセットだけを増幅することができる。または、当技術上既知の技法を適用して、規定のサイズ範囲の制限酵素断片内に偶然存在するプローブの部分だけを優先的に増幅することができる。
【００１８】
このような選択的な事前増幅を使用してプローブの複雑さを低下するいずれの場合においても、好ましくは、同じ方法をまたは同様の方法をマッピングパネルの全メンバーに一様に適用して、マッピングパネルメンバーの核酸の複雑さを低下すると同時に、マッピングパネルメンバーの核酸とプローブ内に保持されている配列サブセットの対応性を維持する。
【００１９】
例えば、プローブの最初のセットは大きい（＞＞１０ｋｂ）クローニングゲノム断片からなってもよい（宿主細菌由来のＤＮＡが混入している可能性もある）。このような場合には、例えば、任意の配列サブセット（および、有利なことには、宿主細菌ではなくクローニングされたＤＮＡに特徴的な配列）だけを増幅するように設計されているプライマーを用いた増幅によって、固定する前にプローブの複雑さを低下することが有利なこともある。このような場合には、マッピングパネルメンバーの事前増幅は、有利なことには、プローブとパネルの両方に保存されている配列サブセット間の対応性を確実にするために、同様のプライマーを使用して実施してもよい。
【００２０】
さらに別の態様において、本発明は、マイクロタイタープレートの内容物をさらに別の手法および操作により追跡できるように、それらをコード化する方法に関する。マイクロタイタープレートの内容物を別のプレートに移したりもしくは別のプレートの試料と合わせたりまたはゲルにロードしても、本発明の方法により、マイクロタイタープレートの内容物を追跡することができる。
【００２１】
本発明のこの態様の第１の実施態様において、不活性な蛍光マイクロスフェア（例えば、Molecular Probes A3703）などの固相マーカーをプレートのウェルのいくつかに添加する。このように標識したウェルのパターンは、プレート内容物の独自の「サイン」となる。例えば、マーカーの位置は二進数でコード化することができる。
【００２２】
好ましい実施態様において、ＰＣＲを目的とするマイクロタイタープレートにマイクロスフェアを添加する。粒子は反応を妨害せず、試料をその後分析する場合には、ゲルにロードされる。マイクロタイタープレートの「コード」はゲルに移され、蛍光粒子を含有するウェルは、ゲルをＵＶ光線下で撮影すると光る。粒子は電気泳動中ゲル内に移動しない。これは、電気泳動中に試料を追跡する際の一般的な問題を克服する。すなわち、マイクロタイタープレート上のバーコード等をプリントすることは容易であるが、ゲルにコード番号を移すことは困難である。別の実施態様において、ＤＮＡをゲルの未使用のウェルのいくつかにロードして、２進コード化する。しかし、これにより、ユーザーは、マイクロタイタープレートの数を読み取り、同じ数がゲル上にコード化されるように配列しなければならない。本発明のシステムによると、ＰＣＲを開始するロボットは、蛍光粒子を添加することもでき、さらなる介入やエラーの発生を生じることなく、ロード時に「コード」はゲルに移される。
【００２３】
本発明は、さらに別の実施態様にさらに適用可能である。例えば、１つのプレートの試薬セット（例えば、ＰＣＲ鋳型セット）および別のプレートの別のセット（例えば、ＰＣＲプライマーセット）によって反応液を調製する場合には、ウェルに粒子を固定することによって各起源−プレートをコード化することができる。便利なことに、コード化は１つのプレートの最初の列のウェルを占め、他のプレートの最後の列を占めることができる。（２つの起源のプレートの内容物を含有する）反応プレートは両方のセットのコード用マーカーを保有する。ＵＶ照射下でプレートを画像化することによって、コードを見ることができ、確証することができる。または、試料をゲル電気泳動で分析するとき、コードが見られる。
【００２４】
より複雑なコードを提供するためまたは同一セットのウェル内に２つ以上のコードを重複させられるように、多数の色を使用することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２５】
［発明の詳細な説明］
本明細書に記載する一般的な技法は当技術上既知であるが、特に、Sambrookら、分子クローニング、実験マニュアル(Molecular Cloning, A Laboratory Manual)(1989)およびAusubelら、分子生物学の簡単なプロトコール(Short Protocols in Molecular Biology)(1999)第4版John Wiley & Sons, Inc（並びに、分子生物学の最新プロトコール(Current Protocols in Molecular Biology)の完全版）を参照することができる。
【００２６】
１．定義
本明細書において言及される「マッピングパネル」は、別個の試料またはメンバーに分離されている核酸断片のパネルである。パネルの各メンバーは、Dear&Cook(1989)におけるように、１つの一倍体細胞から単離された断片状ＤＮＡのいくつかの分画（典型的には、１／２または１／３）からなってもよい。さらに一般的には、各メンバーは、２つ以上の一倍体細胞または１つ以上の二倍体細胞から調製され、理想的には質量が０．６９ゲノムに等しい量のＤＮＡ（すなわち、０．６９一倍体当量）を含有する断片状ＤＮＡ試料からなってもよい。この量は、バルクＤＮＡからサンプリングされた配列のポアゾン分布とすると、全てのマーカーの約半分が各試料に提供されるが、約０．２〜１の量のＤＮＡも許容可能な範囲内である。
【００２７】
本発明に使用するマッピングパネルは、ゲノムＤＮＡまたはマッピングすることが意図されている任意の他の起源に由来するＤＮＡ断片を含有する任意のマッピングパネルであってもよい。有利なことに、それは少なくとも２つのメンバーを含み、有利なことに約４、８、１６、３２、６４、９６、１００、１１０、１２８、２５６またはそれ以上のメンバーを含む。９６メンバーの使用が都合がよい。さらに別のメンバーは、対照試料として存在してもよい。
【００２８】
「マーカー」は、例えば、ＰＣＲまたはハイブリダイゼーション分析によって連鎖の検討において同定することができる核酸配列である。有利なことに、それは分析中のゲノム内では実質的に独自であるので、その同定は明白である。
【００２９】
「プローブ」は、マーカーを検出するために使用することができる核酸分子である。本発明に関しては、プローブは固相に固定され、マッピングパネルは液相に存在する。
【００３０】
２．ＨＡＰＰＹマッピング
ＨＡＰＰＹマッピングの一般的な技法は当技術上既知であり、文献に広範に記載されている。ＨＡＰＰＹマッピングの詳細な説明を含む以下の開示内容は全体の内容が参照として本明細書に組み入れられている：Konfortovら、Genome Res.2000 Nov;10(11):1737-42、WilliamsおよびFirtel,Genome Res.2000 Nov;10(11):1658-9、Piperら、Genome Res.1998 Dec;8(12):1299-307、Lynchetら、Genomics.1998 Aug 15;52(1):17-26、Dearら、Genomics.1998 Mar 1;48(2):232-41、Walterら、Nucleic Acids Res.1993 Sep 25;21(19):4524-9、Dearおよびcook、Nucleic Acids Res.1993 Jan 11;21(1):13-20、DearおよびCook、Nucleic Acids Res.1989 Sep 12;17(17):6795-807。
【００３１】
ＨＡＰＰＹマッピングに使用するマーカーは、クローニング、ＰＣＲ増幅または他の手段によって単離することができる任意の単コピープラスミドであってもよい。従来のＨＡＰＰＹマッピングでは、マーカーは、マッピングパネル内で増幅によってマーカーを検出するために使用することができるＰＣＲプライマー対によって規定される。これは本発明の方法に必要ではない。従って、本発明はＰＣＲに依存し、うまく増幅できないマーカーのマッピングを可能にする。望ましい場合には、ＰＣＲ増幅したＨＡＰＰＹマッピングマーカーを本発明の方法に使用することができる。しかし、好ましくは、マーカーは、ＰＣＲ増幅によって同定および／または入手されない。
【００３２】
マッピングパネル自体は、ゲノムをマッピングする場合には、１つ以上の一倍体細胞もしくは１つ以上の二倍体細胞から、またはマッピングすることが意図されている核酸の１つ以上の代表的なコピーに由来する。広義には、マッピングパネルの各メンバーは、マッピング対象のゲノムまたは他の核酸のランダムに選択された断片を含有するべきであり、その結果、ゲノム（または他の核酸）の任意の所定の配列は、パネルの任意の特定のメンバーに存在する確率が約５０％になる（ポアソン）。パネルが多数の一倍体細胞または１つ以上の二倍体細胞のＤＮＡに由来する場合には、これは、各試料が［一倍体］ゲノムまたは他の核酸の質量の０．６９倍を（理想的には）含有する場合に達成されうる。一般に、ＤＮＡは、アガロースカプセル化などによって意図的でない鎖切断を最小にするように取り扱われる（アガロース「マイクロビース」へのカプセル化を言及しているCook、(1984)EMBO J.3:1837-1842、「ブロック状」または「帯状」のアガロースへのカプセル化は、本明細書に記載されているさらに最近のＨＡＰＰＹマッピングの文献に記載されている）。ＤＮＡは望ましいサイズの断片に切断される。典型的には、ゲノムマッピングのためのＨＡＰＰＹマッピング断片はサイズが１０〜３０００ｋｂ程度である。さらに小さい断片は精密な解像を増すが、マーカーが大きく離れており、小さい断片サイズを上回る連鎖を示さないマップのギャップを回避するために大きい断片が必要であることが理解される。マッピングパネル断片のサイズは、適宜当業者によって最適化することができる。
【００３３】
次いで、マッピングパネルを作製する試料に核酸を分割する。核酸を試料に分割するまではさらなる切断は回避されるべきである。次いで、パネル内に存在する全ての配列を増幅するために全ゲノムＰＣＲ方法を使用して試料を増幅しても、または上記のさらに特異的な事前増幅に付してもよい。
【００３４】
３．プローブパネル
本発明によると、マッピングパネルメンバーは、固相表面に固定されているプローブセットにハイブリダイゼーションされる。好ましくは、プローブは位置指定的に固定される。例えば、それらは整列されてもよい。
【００３５】
プローブは、有利なことに、マッピングパネルを作製するために使用される一倍体ゲノム当量内に単コピーで存在する天然または合成核酸分子であってもよい。好ましくは、プローブは、増幅、制限エンドヌクレアーゼ切断およびクローニングまたは核酸配列を単離することができる任意の他の手段によってマッピングすることができる。有利なことに、プローブは、それらがゲノム内に単コピーで存在することを確実にするために試験される。
【００３６】
プローブは、マッピング対象の核酸から得られる配列情報に基づいて合成により作製されてもよい。本明細書において言及するプローブは、ヌクレオチドまたはヌクレオチド類似物である単位を含む。一般的にいうと、ヌクレオチド類似物は、ヌクレオチド残基の鎖に組み込まれることができ、相補的な核酸鎖の塩基と、塩基特異的な方法でハイブリダイゼーションすることができる化合物である。本発明に有用な類似物は、さらに、鎖伸長酵素の基質である。
【００３７】
ヌクレオチド類似物は、例えば、塩基対形成特性に影響するように、塩基が改変されている、および／または例えば、ＰＮＡのアミド結合骨格におけるように、糖または骨格部分が改変されている、および／またはリン酸部分が改変されている、改変されたヌクレオチドであってもよい。
【００３８】
骨格が改変された核酸には、メチルホスホネート、非架橋酸素の両方が硫黄で置換されているホスホロジチオエートおよびホスホロジチオエート、ホスホロアミダイト、アルキルホスホトリエステル並びにボラノホスフェートが挙げられる。アキラルホスフェート誘導体には、３’−Ｏ’−５’−Ｓ−ホスホロチオエート、３’−Ｓ−５’−Ｏ−ホスホロチオエート、３’−ＣＨ2−５’−Ｏ−ホスホネートおよび３’−ＮＨ−５’−Ｏ−ホスホロアミデートが挙げられる。ペプチド核酸は、ホスホジエステル骨格全体がペプチド結合で置換されている。
【００３９】
安定性および親和性を増強するために、糖改変も使用される。塩基が天然のβ−アノマーに対して逆であるデオキシリボースのα−アノマーを使用してもよい。リボース糖の２’−ＯＨを変更して、親和性を損なうことなく分解されにくい２’−Ｏ−メチルまたは２’−Ｏ−アリル糖を形成してもよい。
【００４０】
複素環塩基の改変は、好ましくは、適切な塩基対形成を維持する。いくつかの有用な置換には、デオキシウリジンとデオキシチミジン、５−メチル−２’−デオキシシチジンおよび５−ブロモ−２’−デオキシシチジンとデオキシシチジンが挙げられる。５−プロピニル−２’−デオキシウリジンおよび５−プロピニル−２’−デオキシシチジンは、それぞれ、デオキシチミジンおよびデオキシシチジンと置換されると、親和性および生物学的活性を増加することが示されている。
【００４１】
合成プローブは、好ましくは、鎖長全体が７〜４０残基である。通常、８〜１０残基の短いプローブが使用されるが、２０残基以下もしくは４０残基以下プローブも有用である。しかし、ほとんどの場合において、固定されたプローブは、典型的に大きいＤＮＡ断片であり、ＤＮＡ産物（典型的には、５０〜２０００ｂｐ）またはクローニングされたＤＮＡ断片（現在利用可能な技法を使用したとき数百ｋｂ以下のもの）である。
【００４２】
プローブは、天然の塩基の２つまたは３つと塩基対形成する能力を有することによって、または一般的には、区別することなしに天然の塩基の各々と塩基対を形成することによって、変性結合(degenerate binding)を促進する塩基類似物を組み入れることができる。このような類似物は、プローブを製造する際に従来のランダム化技法と併用して使用することができる。しかし、プローブは結合の際に配列特異性が高く、ハイブリダイゼーションして配列を変性しないことが好ましい。
【００４３】
４．固定
核酸プローブを固相表面に固定する方法は当技術上既知である。例えば、既知の組成の複数の分子を固相に固定することによってプローブアレイを作製する。典型的には、固相基材の別個の領域上または内に分子を固定する。基材は多孔性で基材内への固定を可能にしても、または実質的に非多孔性であってもよく、非多孔性の場合は、分子は、典型的には、基材表面に固定される。
【００４４】
固相基材は、分子が直接または間接的に結合することができる任意の材料製であってもよい。好適な固相基材の例には、平坦なガラス、シリコンウェハー、マイカ、セラミックおよびポリスチレンおよびポリメタクリレートを含むプラスチックなどの有機ポリマーが挙げられる。電極または熱伝導性基材（ハイブリダイゼーションまたは識別方法を増強することができる）として作用するように表面を構成してもよい。これらに透過層または緩衝層を接続してもよい。広範に利用可能なニトロセルロースまたはナイロン膜などの半透膜を使用することも可能な場合がある。半透膜を、ガラスなどの粗い固相面に取り付けてもよい。必要に応じて、表面に、金、白金または他の遷移金属などの金属層をコーティングしてもよい。好適な固相基材の例は、市販のBiaCore（商標）チップ(Pharmacia biosensors)である。
【００４５】
好ましくは、固相基材は、一般に、硬質または半硬質表面を有する材料である。好ましい実施態様において、基材の少なくとも１つの表面は実質的に平坦である。
【００４６】
固相基材は、便利なことに、数セクションに分割される。これは、フォトエッチングまたは疎水性インキ、例えば、Teflon系インキ（Cel-line、米国）の適用によるなどの技法によって実施することができる。
【００４７】
異なる分子または分子種群各々が配置される別個の位置は、任意の便利な形状、例えば、円形、矩形、楕円形状、楔形状等を有してもよい。
【００４８】
複数の分子の基材への結合は共有結合または非共有結合（静電的）手段によってもよい。複数の分子は、複数の分子が結合する中間分子層を介して基材に結合してもよい。例えば、複数の分子をビオチンで標識し、基材にアビジンおよび／またはストレプトアビジンをコーティングしてもよい。ビオチン化分子を使用する便利な特徴は、固相基材への結合効率を容易に測定することができるということである。複数の分子はある種の固相基材には結合しにくい場合があるので、その固相基材（ガラスの場合など）と複数の分子との間に化学的なインターフェイスを供する必要がある場合がある。好適な化学的インターフェイスの例には、種々のシランリンカーおよびポリエチレングリコールスペーサーが挙げられる。別の例は、ポリリジンコーティングし、適宜標準的な手法を使用して親和性リガンドを導入してポリリジンを化学的に改変したガラスの使用である。核酸をポリリジン表面に直接固定してもよい（静電的に）。カップリング剤を使用することによって固相基材の表面に分子を結合する他の方法は当技術上既知であり、例えば、国際公開公報第98/49557号参照。分子は、切断可能なリンカーによって表面に結合することもできる。
【００４９】
一実施態様において、スポッティング（ロボットマイクロピペテッィング技法の使用など−Schenara,1995、Science 270:467-470）または例えば、当技術上既知の電気的ピンまたは圧電装置を備えたロボット装置を使用したインクジェットプリンティングによって固相基材に分子を適用する。
【００５０】
マスキング技法および感光試薬によって特定の位置へのモノマーの導入をコントロールしながら分子を段階的に合成するフォトリトグラフィーおよび他のマスキング技法を使用して、核酸またはポリペプチドなどのポリマーをインサイチューで合成することもできる。例えば、米国特許第5,837,832号は、超大規模集積技法に基づいてシリコン基材にＤＮＡアレイを固定したものを製造する方法を記載している。特に、米国特許第5,837,832号は、基材の空間的に規定された位置において特定のプローブセットを合成する「タイル張り(tiling)」と呼ばれる方法を記載している。米国特許第5,837,832号は、使用することができる早期技法の参照文献も提供している。
【００５１】
アレイ要素のサイズは、パターン形成した表面にインクジェットプリントできるようにまたはフォトリトグラフィーもしくは物理的なマスキングによって形成できるように０．１×０．１ミクロン以上である。
【００５２】
固定された分子は、さらに別の分子を結合してアレイの製造を完了させる働きをすることもある。例えば、固相基材に結合した核酸は、ハイブリダイゼーションによる核酸またはポリペプチドをさらに捕獲する働きをすることもある。同様に、ポリペプチドを他のポリペプチドなどの他の化合物とインキュベーションすることができる。例えば、ＵＶ架橋を使用してこれらの相互作用を永久的に「固定する」ことが望ましい場合がある。
【００５３】
５．スクリーニング
固定したプローブにマッピングパネル試料核酸をハイブリダイゼーションすることによって本発明によるプローブセットをスクリーニングすることができる。有利な実施態様において、マッピングパネルの全試料は、固定したプローブアレイのレプリカを使用することによって平行してスクリーニングすることができる。従って、９６のマッピングパネルメンバーを作製する場合には、９６のプローブアレイレプリカを使用して９６全てを平行してスクリーニングすることができる。
【００５４】
または、プローブが固定されているので、プローブアレイを再使用することができ、ハイブリダイゼーション反応後、プローブアレイを洗浄してマッピングパネル核酸を除去し、別のマッピングパネルメンバーをスクリーニングするために使用することができる。例えば、３２のプローブアレイのレプリカを使用して、３つのハイブリダイゼーション実験において９６−試料のマッピングパネルをスクリーニングすることができる。
【００５５】
２つ以上のパネルメンバーのプローブアレイへの同時のハイブリダイゼーションを可能にするためにマルチカラー（または他の識別方法）を使用することもある。例えば、１つのパネルメンバーを１つの色の蛍光で標識し、第２のメンバーを第２の色の蛍光で標識する場合には、２つの蛍光色を識別してシグナルを解明でき、１つのマッピングパネルメンバーの成分のハイブリダイゼーションが他方の成分のハイブリダイゼーションを妨害しないように、アレイ状のプローブがマッピングパネルメンバーに対して過剰である限り、メンバーを混合し、アレイ状のプローブに同時にハイブリダイゼーションすることができる。（理論では、解像可能な十分な蛍光団等があれば本発明の方法を任意の数のマッピングパネルメンバーに拡張することができる。多数の別個の従来の蛍光団を見つけることは困難であるが、厳密に規定されたスペクトル特徴を有するナノ結晶を使用することができる場合もある。）
【００５６】
この方法では、大きいゲノムを高い効率で、迅速にスクリーニングすることができる。
【００５７】
ハイブリダイゼーション条件は、当業者に既知の原則により決定することができる。一般に、プローブと試料核酸配列との間の正確な同一性だけを検出することが望ましい。従って、ハイブリダイゼーションは、好ましくは、高ストリンジェントな状態で実施される。
【００５８】
ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは、ポリ核酸ハイブリッドが安定である条件をいう。このような条件は当業者に明白である。当業者に既知であるように、ハイブリッドの安定性は、ハイブリッドの融解温度（Ｔｍ）に反映されており、配列の相同性が１％低下するごとに約１〜１．５℃低下する。一般に、ハイブリッドの安定性はナトリウムイオン濃度と温度の関数である。典型的には、ハイブリッド反応は高ストリンジェントな条件下で実施される。
【００５９】
本明細書において使用する高ストリンジェントな状態は、１Ｍ  Ｎａ＋、６５〜６８℃において安定なハイブリッドを形成する核酸配列だけのハイブリッドを可能にする条件をいう。高ストリンジェントな状態は、例えば、６×ＳＳＣ、５×デンハルト、１％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）、０．１Ｎａ＋ピロリン酸および非特異的競合因子としての０．１ｍｇ／ｍｌ変性サケ精子を含有する水溶液中におけるハイブリダイゼーションによって提供することができる。ハイブリダイゼーション後、高ストリンジェントな洗浄を数段階実施し、ハイブリダイゼーション温度、０．２〜０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳにおいて最終洗浄（約３０分）を実施することができる。プローブおよび／または標的が反復モチーフに豊富に存在する可能性がある場合には、反復配列間のハイブリダイゼーションを遮断するために、関心対象の種の競合反復配列が豊富な（または単に全ゲノム）ＤＮＡとして使用することが一般的である。例えば、ヒトＤＮＡに関係するハイブリダイゼーションは、ヒト「Ｃｏｔ１  ＤＮＡ」（これは、変性後迅速に再ハイブリダイゼーションするバルクヒトＤＮＡの分画である）または単純に全ヒトＤＮＡ（少量の任意の特定の非反復配列を含有する）を使用して遮断されることが多い。
【００６０】
中ストリンジェントな状態は、上記の溶液を使用するが、約６０〜６２℃においてのハイブリダイゼーションに等価な条件をいう。その場合には、最終洗浄は１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳにおいてハイブリダイゼーション温度において実施される。
【００６１】
低ストリンジェントな条件は、上記溶液、約５０〜５２℃におけるハイブリダイゼーションに等価な条件をいう。その場合には、最終洗浄は２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳにおいてハイブリダイゼーション温度において実施される。
【００６２】
これらの条件は、種々の緩衝液、例えばホルムアミド系緩衝液や種々の温度を使用して適合させ、再現させることができることが理解される。デンハルト液およびＳＳＶは、他の好適なハイブリダイゼーション緩衝液と同様に当業者に既知である（例えば、Sambrookら編(1989)分子クローニング：実験マニュアル(Molecular Cloning:A Laboratory Manual)、Cold Spring Harbor Laboratory Press, New YorkまたはAusubelら編(1990)分子生物学の最新プロトコール(Current Protocols in Molecular Biology)、JohnWiley & Sons,Inc.参照）。プローブの鎖長およびＧＣ含有量も影響するので、最適のハイブリダイゼーション条件を実験的に決定しなければならない。
【００６３】
６．用途
本発明の改善されたＨＡＰＰＹマッピング技法は任意のマッピングプロジェクトに適用することができる。従って、染色体などのゲノムまたはゲノムＤＮＡのマッピングは、ＨＡＰＰＹマッピング技法の適用が可能であることがすでに示されており、本明細書に記載されている改善された方法の適用が可能である。本発明のさらに別の用途は、本発明の明細書に基づいて当業者に明らかになる。
【００６４】
本発明のＨＡＰＰＹマッピング技術または実際には任意のＨＡＰＰＹマッピング技術の好ましい適用を以下に記載する。
【００６５】
Ａ．ハプロタイプ決定
上記のように、ＨＡＰＰＹマッピング方法は、ゲノムＤＮＡのラムダム切断およびランダムサンプリングにより、（典型的には）サブ−ゲノム量のＤＮＡを含有する試料セット（パネル）を作製する。パネルの同一メンバーに見出される（すなわち、同時切断する）ことが多い配列（マーカー）は、断片の平均サイズと比較して、ゲノム内で接近して存在すると推論することができる。放射線ハイブリッドマッピングは、ＨＡＰＰＹマッピングといくつかの特徴を共有するが、切断は生きている「ドナー」細胞を照射し、次に異なる種の未照射の「宿主」細胞と融合することによって実施される。ドナーの染色体断片には結果として生ずるハイブリッドに保持されるものもあり、生ずるハイブリッドは、次いで、ドナーマーカーの内容について分析される
【００６６】
通常の用途では、どちらかの方法によって分析されるマーカーは単型であり、それらが多型である場合には、多型は無視される（マーカーの対立遺伝子は１つとしてスコアリングされる）。しかし、多型マーカーの対立遺伝子がマッピングパネル上で識別され、個別にスコアリングされる場合には、ハプロタイプ情報（すなわち、二倍体ゲノムの２つ以上のマーカーの対立遺伝子間の連鎖相）を求めることができる。
【００６７】
ハプロタイプ情報は、多型（特に、一塩基多型、ＳＮＰｓ）と、現在では広範に調査されている疾患または薬剤に対する有害作用の罹患性との関係、ＳＮＰハプロタイプと集団間の「通常の」可変的な特徴との関係、およびヒトの集団移動を追跡するためのＳＮＰハプロタイプの使用を含むが、これらに限定されない数多くの用途にＳＮＰハプロタイプ情報が有用である、特にヒトゲノムにおいてかなり興味深い。
【００６８】
ＨＡＰＰＹマッピングは、以下のように、ハプロタイプ決定に適用することができる。マッピングパネルは通常の方法で作製されるが、マーカーの検出およびスコアリングは、多型マーカーの対立遺伝子を識別するような方法で実施され（マーカーの２つの対立遺伝子は、本明細書においては大文字および小文字、例えば、Ａ、ａによって示される）、各対立遺伝子の結果は個別に記録される。２つ以上の多型マーカーがスコアリングされる場合には、各々の対立遺伝子の近さを求めることができる。例えば、親ゲノムがハプロタイプＡＢおよびａｂを含有し、マーカーＡ／ａがマーカーＢ／ｂに十分に近い位置に存在する場合には、同時分離（従って、連鎖）はＡとＢの間およびａとｂの間には観察されるが、Ａとｂの間またはａとＢの間には観察されない。従って、親ハプロタイプを決定することができる。ハプロタイプ情報を得ることができる距離は、マッピングパネルを作製する際に使用する断片のサイズによって決定される。
【００６９】
多型の性質に応じて、必要なスコアリングおよび対立遺伝子の識別のために多数の方法が存在する。これらの方法のいずれかを本発明に関連して適用することができる。
【００７０】
多くの例において、ゲノム内のマーカーの位置はすでに決定されており、連鎖相だけが必要である。これらの場合には、先験的にマーカーの順序および空間的位置を決定するのに必要であると思われるより少ない数のパネルメンバーを分析するだけでよい。また、マップ情報がすでに存在する場合には、マッピングパネルの解像はほとんど問題とされない。このように、ハプロタイプを決定することができる範囲を最大にするために、パネルはできるだけ大きいＤＮＡ断片から作製することができる。極端な例では、ゲノムＤＮＡは切断されないままで、完全な染色体ＤＮＡ分子（または染色体）はパネルメンバーに分離され、この例では、結果は染色体上のマーカーの順序または空間的位置を決定することができないが、染色体の長さ分のハプロタイプデータを生ずる。各対立遺伝子が独立マーカーと考えられるので、理想的には、ハプロタイプ決定に使用するために作製されるＨＡＰＰＹパネルは、通常のマッピングに使用されるもののほぼ２倍の量のＤＮＡを含有しなければならない。しかし、標準的なＨＡＰＰＹパネルにとって許容されうるＤＮＡの濃度範囲は、ハプロタイプ決定に対応するのに十分に広い。
【００７１】
本発明の改善された方法により、１セットのハイブリダイゼーション反応において複数の異なるマーカーの迅速なハプロタイプ決定が可能になる。
【００７２】
Ｂ．染色体のマッピング
上記のように、切断された核酸の代わりに染色体全体を使用してハプロタイプ情報をマッピングするまたは得ることが有利な場合がある。さらに、より大きいＤＮＡ断片を使用することにより、通常中程度から高い解像において有用なＨＡＰＰＹマッピングを、低解像度マップを提供するように拡大適用することができる。
【００７３】
ＨＡＰＰＹマッピングにおいて、ＤＮＡは、先ず従来通り、機械的または他の手段による切断の前に、比較的純粋な形態（溶液または保護用ゲルマトリックス）で単離される。しかし、長いＤＮＡ分子は不安定な性質であるので、鎖長数百万塩基対（Ｍｂ）より長い断片を操作するのが困難になる。このように、マーカー間の連鎖は、数Ｍｂまでの長さでは容易に求めることができる。
【００７４】
本発明は、「ネーキッド」ＤＮＡ断片ではなく、完全な染色体、染色体の断片またはクロマチンのサンプリングおよび分析（限界希釈において）に基づいたいくつかの用途を記載している。これらの形態のＤＮＡの天然のパッケージングにより、完全な染色体を含む、ネーキッドＤＮＡを取り扱う場合より大きい、断片を単離および操作することが可能になる。
【００７５】
ＤＮＡは、クロマチンまたは分裂中期の染色体の形態で細胞から放出される。これらの形態のどちらにおいても、ＤＮＡは安定化されており、ヒストンおよび他のタンパク質と結合することによって緻密にされている（必要に応じて、インサイチューハイブリダイゼーションまたはフロー−ソーティング用に分裂中期の染色体を調製する場合に使用される部分的な固定技法などの他の処理によってさらに安定化してもよい）。次いで、機械的な切断を使用して、クロマチン／染色体を断片に切断し、その溶液を希釈し、各々約０．０５〜１．５ゲノム当量のＤＮＡ（しかし、好ましくはパネルの各メンバー中ほぼ同じ量のＤＮＡ）を含有する試料パネルに分注する。約０．２〜約１．５の範囲が、一般に、有用であると考えられる。次いで、ＨＡＰＰＹマッピングパネルの分析についてすでに記載されている方法で試料を分析する。ＤＮＡを確実にＰＣＲ増幅されやすくするために、プロテイナーゼ−Ｋを用いた前処理または他の方法が必要な場合もある。
【００７６】
無傷の分裂中期の染色体は通常溶液で作製されており、溶液で取り扱われているので、パネルメンバーに分離される断片は完全な染色体に至るまでの任意のサイズであってもよいことは明白である。（試料への分離が完了したら、マーカー内容が保持されている限り、ＤＮＡのさらなる断片化は重要ではないことに注目される）。ＨＡＰＰＹマッピングによって連鎖を最もよく検出することができる長さは、典型的には、使用するＤＮＡ断片の平均長さの０．５〜０．７倍以下である。このように、粗く切断された染色体断片から作製されるパネルは、マーカー間の平均距離が数Ｍｂ以上である過疎化状態のマップを作製するために使用することができる。これは、そのサイズでは従来のＨＡＰＰＹマッピングによって作製される緻密なマップを作製することが実行不可能または不経済となるようなゲノムに有用である。
【００７７】
分裂中期の染色体の断片をフローソーティングすることもできる（実際、断片状の染色体は、通常、染色体をフローソーティングする場合「バックグラウンド」と見られ、望ましい無傷の染色体の望ましくない分解または剪断により生じる）。このように、フローソーティングを、必要な数およびサイズの断片をマッピングパネルのメンバーに分離する方法として（希釈およびランダムサンプリングの代わりに）使用することができる。このような方法には、（ａ）各パネルメンバーのＤＮＡの総量を精密にコントロールすることができ、（ｂ）断片のサイズ範囲を狭く選択することができるという利点を有する。このような厳重な選択により、パネルの範囲および解像を微調整して取り扱い中のマッピング問題に対処することができ、任意のマーカー間の連鎖を反映するには小さすぎる断片、または有用なマッピング情報を含有するには大きすぎる断片を排除することによってマッピングデータの品質を改善が改善される。
【００７８】
無傷の分裂中期染色体は、このような染色体溶液の限界希釈またはフローソーティングによってマッピングパネルのメンバーに分離することができる。この場合には、パネルは１つの染色体内のマーカーの順序および空間的位置に関する情報を与えないが、マーカーをそれぞれの染色体にグループ単位で同時局在化させることができる。これは、染色体がフローサイトメトリーで識別できないような種において、マーカーを染色体上に割り付けるのに特に有用である。例えば、ヒトの第９、第１０、第１１および第１２染色体はフローサイトメトリーで識別することができない。１つまたは２つの染色体（Ｃｈｒ９〜１２クラスターからランダムにサンプリング）を各パネルメンバーにフローソーティングすることによって、マッピングパネルを作製する場合には、パネル上のマーカーをタイプ分けすることにより、マーカーを染色体連鎖グループに迅速に割り付けることができると思われる。
【００７９】
上記の方法は全てハプロタイプの決定にも適用することができる（多型遺伝子座間の連鎖相）。このような場合には、（対立遺伝子を識別するために確立されている技法を使用して）各マーカーの２つの対立遺伝子を独立にスコアリングすることだけが必要である。次いで、各対立遺伝子を独立マーカーとして処理することができ、（例えば）連鎖をＡとＢ間およびａとｂ間で観察し、ハプロタイプＡＢおよびａｂを明らかにする。マッピングパネルを作製する際にクロマチン／染色体断片または無傷の染色体を使用することにより、かなりの（または染色体の）長さにわたってハプロタイプを決定することができる。
【００８０】
本発明は、以下の実施例において、例示目的のためだけに以下にさらに記載されている。
【実施例】
【００８１】
オオムギ（オオムギ(Hordeum vulgare)の葉細胞から核を単離し、アガロースの帯状物(strings)に包埋する。帯状物を溶解溶液（０．５Ｍ  ＥＤＴＡ、ｐＨ  ９．０、１％ラウリルサルコシンのナトリウム塩、０．１ｍｇ  ｍＬ-1プロテイナーゼ−Ｋ）に浸漬し、ゆっくり混合しながら４５℃において４８時間インキュベーションし、次いで０．５Ｍ  ＥＤＴＡ、ｐＨ  ９．０中で４５℃において１時間インキュベーションし、次いで０．０５Ｍ  ＥＤＴＡ、ｐＨ  ８．０中で氷上で１時間インキュベーションし、必要時まで０．０５Ｍ  ＥＤＴＡ、ｐＨ  ８．０中で４℃において保存した。この操作中、溶解溶液はアガロース中に拡散し、核を溶解し、洗浄段階で拡散して流出するタンパク質および他の核物質を除去／分解し、実質的に純粋なＤＮＡをアガロース内に捕獲させておく。ＤＮＡの切断頻度をコントロールすることは非常に重要であるので、アガロースは、望ましくない機械的な切断からＤＮＡを保護する働きをする。切断は、数メガ塩基（Ｍｂ）までの広い範囲のサイズの断片にＤＮＡを切断するのに十分なγ線照射によって誘導される。〜２Ｍｂ以下の断片は、好適なサイズの標品（サッカロミセス  セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)から単離した染色体ＤＮＡ）と共に低融点アガロースのパルス磁場ゲル電気泳動によって走査される。
【００８２】
毛細管ガラスを使用して、〜１ＭｂのオオムギＤＮＡ断片（既知のサイズ標品の移動度から判断）を含有するゲル領域から一定の規定されたサイズのアガロースプラグを取り出す。ゲルにロードされるオオムギＤＮＡの量、電気泳動の時間および毛細管の径は、〜０．７一倍体当量のＤＮＡ断片が各アガロースプラグに存在することが期待されるように選択される。各プラグの容量は＜１μｌである。各プラグを９６ウェルマイクロタイタープレートの別個のウェルに移し、制限酵素緩衝液を添加して総容量を５μｌとし、蒸発を防ぐために１滴（〜３０μｌ）の鉱物油を滴下する。試料を６５℃までの温度で４分間加熱し、ＤＮＡを変性させることなくアガロースを融解し、次いで冷却し、３７℃において維持する。
【００８３】
制限酵素ＤｐｎＩＩを含有する溶液を各アガロースプラグに添加し、消化をサポートする緩衝液の総容量７μｌに５ＵのＤｐｎＩＩを含有する混合物を提供する。溶液を３７℃において４時間インキュベーションし、酵素が認識する全ての部位における全ＤＮＡ断片の切断を可能にする。次いで、６５℃において４５分間加熱することによって酵素を失活させる。
【００８４】
オリゴデオキシヌクレオチドＬＩＢ１（５’ＡＧＴ  ＧＧＴ  ＡＴＴ  ＣＣＴ  ＧＣＴ  ＧＴＣ  ＡＧＧ  ３’）およびＬＩＢ２（５’ＧＡＴ  ＣＣＣ  ＴＧＡ  ＣＡＧ  Ｃ３’、３’残基は、ＤＮＡポリメラーゼによるこのオリゴヌクレオチドの伸長を防ぐようにジデオキシヌクレオチドである）を各ウェルに添加し、総容量１２μｌ中各オリゴの最終濃度１０μＭとする。オリゴＬＩＢ１は、５’末端に蛍光部分を保有する。溶液を６５℃においてさらに２０分間インキュベーションし、次いで１分あたり１℃の速度で１５℃まで冷却する。
【００８５】
５単位のＴ４  ＤＮＡリガーゼを各ウェルに添加し、ｒＡＴＰのように、総容量１５μｌ中最終濃度１ｍＭとし、反応液を１４℃において１５時間インキュベーションした。この過程中、ＬＩＢ１の３’末端は各制限断片の各鎖の５’末端にライゲーションされるが、ＬＩＢ２は相手の鎖の「添え木(splint)」として作用する。ＬＩＢ２は、制限断片の鎖の３’末端に利用可能なリン酸部分がないので、ライゲーションされない。
【００８６】
デオキシリボヌクレオチド三リン酸（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、本明細書において集合的にｄＮＴＰｓと呼ぶ）を、ＰＣＲ緩衝液濃縮物（Expand Long PCRキットの緩衝液１、Boehringer Mannheim)および７単位のExpand Long DNAポリメラーゼミックス(Boehringer Mannheim)と同様に各ウェルに添加して、各デオキシリボヌクレオチド三リン酸４００μＭおよび１×ＰＣＲ緩衝液を含有する最終容量５０μｌとする。次いで、混合液を以下のように熱サイクルした：９４℃×４０秒、５７℃×３０秒、６８℃×７５秒を１４サイクル、次いで９４℃×４０秒、５７℃×３０秒、６８℃×１００秒を３４サイクル、次いで９４℃×４０秒、５７℃×３０秒、６８℃×５分を１サイクル。このサイクル中、過剰のＬＩＢ１オリゴによってプライミングを実施する。ＬＩＢ２は反応に何らかの影響を及ぼさない。これにより、リンカーがライゲーションした制限断片の大多数が全体的に増幅されるが、より小さい（＜１ｋｂ）断片の増幅が優先的である。市販のキットおよびプロトコールを使用して、これらの増幅産物を精製する（すなわち、組み込まれていないｄＮＴＰｓおよびプライマーを除去する）。
【００８７】
オオムギゲノムＤＮＡを制限酵素ＤｐｎＩＩで切断し、＜５００ｂｐの断片を選択し、既知のpBluescriptベクターおよび確立されているプロトコールを使用して大腸菌(E.coli)のこれらの断片をクローニングすることによってマーカーのレパートリーを作製する。２０の組換えクローンをランダムに選択し、標準的なプロトコールを使用して各々から組換えプラスミドＤＮＡを単離する。マイクロアレイ装置(microarrayer)を使用して、このＤＮＡを使用し、ガラススライド基材にスポットすることによって２０のマーカーを含むアレイを作製する。９６のレプリカスライドを作製する。
【００８８】
次いで、６×ＳＳＣ、５×デンハルト液、１％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）、０．１Ｎａ＋ピロリン酸および競合因子としての０．１ｍｇ／ｍｌオオムギゲノムＤＮＡを含有する水溶液中で核酸をインキュベーションする１シリーズのハイブリダイゼーション反応においてマッピングパネルメンバーをプローブアレイにハイブリダイゼーションする。ハイブリダイゼーション後、高ストリンジェントな洗浄を数段階で実施し、０．２〜０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、ハイブリダイゼーション温度において最終洗浄（約３０分）を実施する。好適な画像形成システムを使用して、各レプリカスライド上の、蛍光を発生する増幅された制限断片のハイブリダイゼーションを示すシグナルを示すスポットを同定し、結果を記録する。
【００８９】
９６の分割量において増幅された断片がどれくらいの頻度で同時分離するかを調べることによって、増幅された断片を互いに対してマッピングする。種々の理由のいずれかにより事前増幅が失敗している、またはマーカーが単コピー配列ではない（９６の分割量における陽性の数を記録することによって容易に調べられる）、配列がクローニングアーティファクトであるというために、マーカーをマッピングできない場合がある。しかし、マーカーの大多数はある割合の試料中で検出することができ、表を作成し、連鎖頻度を算出することによってマッピングすることができる。
【００９０】
上記の明細書に記載されている全ての文献は参照として本明細書に組み入れられている。本発明の範囲および精神から逸脱することなく、記載されている本発明の方法およびシステムに種々の改良および変更を加えることができることは当業者に明らかである。本発明は具体的な好ましい実施態様に関連して記載されているが、主張されている本発明はこのような具体的な実施態様に不当に限定されるべきではないことが理解されるべきである。実際、分子生物学または関連の分野の当業者に明らかである、本発明を実施するために記載されている様式の種々の改良は、以下の特許請求の範囲内であることが意図されている。
【国際公開パンフレット】
2004529663.tif 000002
2004529663.tif 000003
2004529663.tif 000004
2004529663.tif 000005
2004529663.tif 000006
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2004529663.tif 000009
2004529663.tif 000010
2004529663.tif 000011
2004529663.tif 000012
2004529663.tif 000013
2004529663.tif 000014
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2004529663.tif 000019
2004529663.tif 000020
2004529663.tif 000021
2004529663.tif 000022
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004529663.tif 000023
【国際調査報告】
2004529663.tif 000024
2004529663.tif 000025
2004529663.tif 000026
2004529663.tif 000027