(57)【要約】本発明は、ｈ−ｅｒｇ２タンパク質をコード化する新規なヒトＤＮＡ配列、このＤＮＡ配列によってコードされるタンパク質、このＤＮＡ配列を含むベクター、このベクターを含む宿主細胞、ｈ−ｅｒｇ２タンパク質を含有するカリウムチャンネルの阻害剤および活性化剤を特定する方法に関する。
2004535760.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｈ−ｅｒｇ２をコード化するヌクレオチドを含む単離されたＤＮＡ。
【請求項２】
配列番号２、配列番号４、配列番号６および配列番号８からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコード化するヌクレオチドを含む、請求項１に記載のＤＮＡ。
【請求項３】
配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号１の５７位から２９３０位、配列番号３の５７位から２９３０位、配列番号５の５７位から３０３８位および配列番号７の５７位から２６９３位からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項１に記載のＤＮＡ。
【請求項４】
請求項３に記載されるＤＮＡにストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションし、かつｈ−ｅｒｇ２と実質的に同じ生物学的活性を有するタンパク質をコード化する単離されたＤＮＡ。
【請求項５】
請求項３に記載されるＤＮＡを含む発現ベクター。
【請求項６】
請求項３に記載されるＤＮＡを含む組換え宿主細胞。
【請求項７】
単離されたｈ−ｅｒｇ２タンパク質。
【請求項８】
配列番号２、配列番号４、配列番号６および配列番号８からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、請求項７に記載のタンパク質。
【請求項９】
一アミノ酸の置換を含む、請求項８に記載のタンパク質。
【請求項１０】
２つ以上のアミノ酸置換を含み、アミノ酸置換が保存位置に存在しない、請求項８に記載のタンパク質。
【請求項１１】
ｈ−ｅｒｇ２タンパク質に特異的に結合する抗体。
【請求項１２】
配列番号１、配列番号３、配列番号５または配列番号７に由来する少なくとも１０個の連続したヌクレオチドを含むＤＮＡオリゴヌクレオチドプローブまたはＲＮＡオリゴヌクレオチドプローブ。
【請求項１３】
（ａ）ｈ−ｅｒｇ２タンパク質を含有するカリウムチャンネルを発現する細胞を提供すること、
（ｂ）ｈ−ｅｒｇ２タンパク質を含有するカリウムチャンネルと結合することが知られていない物質に細胞をさらすこと、
（ｃ）細胞に対する物質の結合量を測定すること、
（ｄ）工程（ｃ）における結合量をコントロール細胞に対する物質の結合量と比較すること（この場合、コントロール細胞は、コントロール細胞がｈ−ｅｒｇ２タンパク質を発現しないことを除いて、工程（ａ）の細胞と実質的に同一である）、を含み、
工程（ｃ）における結合量が、コントロール細胞に対する物質の結合量よりも大きい場合、その物質は、ｈ−ｅｒｇ２タンパク質を含有するカリウムチャンネルに結合する、ｈ−ｅｒｇ２タンパク質を含有するカリウムチャンネルに結合する物質を特定する方法。
【請求項１４】
（ａ）ｈ−ｅｒｇ２タンパク質を含有するカリウムチャンネルを発現する細胞を提供すること、
（ｂ）ｈ−ｅｒｇ２タンパク質を含有するカリウムチャンネルに結合することが知られていない物質の存在下および非存在下で、細胞を、ｈ−ｅｒｇ２タンパク質を含有するカリウムチャンネルに結合することが既知の化合物にさらすこと、
（ｃ）ｈ−ｅｒｇ２タンパク質を含有するカリウムチャンネルに結合することが知られていない物質の存在下および非存在下における細胞に対する化合物の結合量を測定すること、を含み、
物質の存在下における化合物の結合量が、物質の非存在下における結合量と異なる場合、その物質は、ｈ−ｅｒｇ２タンパク質を含有するカリウムチャンネルと結合する、ｈ−ｅｒｇ２タンパク質を含有するカリウムチャンネルと結合する物質を特定する方法。
【請求項１５】
（ａ）組換え発現したｈ−ｅｒｇ２タンパク質が単独でカリウムチャンネルを形成するように、または他のカリウムチャンネルサブユニットタンパク質とのヘテロマーを形成することによってカリウムチャンネルを形成するように宿主細胞においてｈ−ｅｒｇ２タンパク質を組換え発現させること、
（ｂ）ｈ−ｅｒｇ２タンパク質を含有するカリウムチャンネルの活性化剤または阻害剤であることが疑われる物質の存在下および非存在下において、工程（ａ）で形成されたカリウムチャンネルの生物学的活性を測定すること
を含み、
物質の非存在下と比較したとき、物質の存在下における工程（ａ）で形成されたカリウムチャンネルの生物学的活性の変化により、その物質が、ｈ−ｅｒｇ２タンパク質を含有するカリウムチャンネルの活性化剤または阻害剤であることが示される、ｈ−ｅｒｇ２タンパク質を含有するカリウムチャンネルの活性化剤または阻害剤を特定する方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（関連出願に対する相互参照）
本出願は米国仮特許出願第６０／２４９，９８１号（２０００年１１月２０日出願）の利益を主張し、その内容はその全体が参考として本明細書中に組み込まれる。
【０００２】
（連邦政府補助金による研究開発に関する言及）
該当補助金なし
（マイクロフィッシュ添付に対する参照）
該当物なし
【０００３】
（発明の分野）
本発明は、カリウムチャンネルサブユニットをコード化する新規なヒトＤＮＡ配列、このＤＮＡ配列によってコードされるタンパク質、このタンパク質を組換え細胞において発現させる方法、このサブユニットを含むカリウムチャンネルの活性化剤および阻害剤を特定する方法に関する。
【０００４】
（発明の背景）
カリウムチャンネルは、カリウムイオンが膜を通過することを選択的に許す膜貫通孔が形成されるイオンチャンネルであり、ほぼすべての細胞において見出されるイオンチャンネルである。カリウムチャンネルは、その分子構造、その生物物理的性質および薬理学的性質、およびカリウムチャンネルが発揮する機能に基づいて、様々なタイプに分類することができる。
【０００５】
種々のタイプのカリウムチャンネルは、内向きまたは外向きのいずれかの方向でカリウム電流を優先的に伝えることができ、およびこれらの異なるタイプのチャンネルは、カリウムチャンネルを発現する細胞および組織において異なる機能を発揮する。例えば、古典的な内向きの整流カリウムチャンネルは、カリウム平衡電位（ＥＫ）に対して負側の電圧でカリウム電流を細胞内に優先的に伝え、それにより主として、細胞膜電位をカリウムイオンの平衡電位の近くで安定化させるように機能する。対照的に、遅延型整流カリウムチャンネルは、典型的には、膜がチャンネルの活性化閾値に脱分極するまで閉じており、その後、遅延型整流が、これらの脱分極した電位において細胞からのカリウム電流を優先的に伝える。遅延型整流は、細胞が興奮した後の膜の再分極に寄与する。両方のクラスは、ある種の心臓血管系および神経学的な細胞および組織の興奮性を調節することにおいて重要である。
【０００６】
ｅｔｈｅｒ−ａ−ｇｏ−ｇｏ（ｅａｇ）ファミリーのカリウムチャンネルは、最初に発見されたメンバー（ｅａｇ）が、その変異型の脚震え表現型によりショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）で特定されたカリウムチャンネルの一群である（Ｋａｐｌａｎ＆Ｔｒｏｕｔ、１９６９、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、６１：３９９）。クローン化されたとき、ｅａｇは、遅延型整流カリウムチャンネルの特徴的な構造的特徴を有することが見出され、アフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ）の卵母細胞における発現研究により、ｅａｇが機能的なカリウムチャンネルであり、実際に遅延型整流を産生することが見いだされた（Ｗａｒｍｋｅ他、１９９１、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５２：１５６０〜１５６２；Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ他、１９９３、Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．Ａｂｓｔｒ．６４：Ａ３４０；Ｂｒｕｇｇｅｒｍａｎ他、１９９３、Ｎａｔｕｒｅ、３６５：４４５〜４４８；Ｌｕｄｗｉｇ他、１９９４、ＥＭＢＯ  Ｊ．１３：４４５１〜４４５８）。ｅａｇファミリーのメンバーは、それらの中心部の疎水性コアにおいて約４７％のアミノ酸配列同一性をともに有し、環状ヌクレオチド結合ドメインに対して相同的なセグメントを含有する。ｅａｇファミリーの各メンバーの中心部の疎水性コアは、推定膜貫通ドメインに対応する６個の疎水性ドメイン（Ｓ１〜Ｓ６）、ならびに電位依存性イオンチャンネルの多くの他のファミリーに見出される典型的な細孔（Ｐ）領域を含有する（Ｄｒｙｓｄａｌｅ他、１９９１、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、１２７：４９７〜５０５；Ｗａｒｍｋｅ他、１９９１、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５２：１５６０〜１５６２；Ｇｕｙ他、１９９１、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５４：７３０）。
【０００７】
ｅａｇファミリーは少なくとも２つの他の関連するサブファミリーの遺伝子を含むことがまもなく明らかになった：ｅｌｋ（ｅａｇ様Ｋ＋チャンネル）サブファミリーおよびｅｒｇ（ｅａｇ関連遺伝子）サブファミリー（Ｗａｒｍｋｅ＆Ｇａｎｅｔｚｋｙ、１９９４、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９１：３４３８）。このファミリーのｅａｇメンバーおよびｅｌｋメンバーは機能的には典型的な遅延型整流チャンネルであるが、発見されたｅｒｇサブファミリーの最初のメンバー（ｅｒｇ１）は、少し異なる生物物理的性質を有することが見出された。例えば、ｅｒｇ１は、実際には、その活性化閾値よりも正側の電圧において外向きの電流を伝える遅延型整流であるが、その電流はまた、ある程度、内向きに整流される（すなわち、電圧が増大するに従い、外向きの電流を伝えるチャンネルの能力が減少する）（Ｔｒｕｄｅａｕ他、１９９５、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２６９：９２〜９５）。ヒトｅｒｇ１（ｈ−ｅｒｇ１）は、罹患者を心臓心室性不整脈による突然死の危険性にさらす、心電図における長くなったＱＴ間隔を特徴とする遺伝型障害であるＬＱＴ２型の長ＱＴ症候群に対する遺伝子座である（Ｃｕｒｒａｎ他、１９９５、Ｃｅｌｌ、８０：７９５）。
【０００８】
ｅｒｇサブファミリーの他のメンバーが特定されている。Ｓｈｉ他（１９９７、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１７：９４２３〜９４３２）は、ｅｒｇ１と非常に類似する、ラットの神経系でもっぱら発現する２つのラット遺伝子（ｅｒｇ２およびｅｒｇ３）を特定した。
【０００９】
できる限り広範囲の様々な新規なカリウムチャンネルサブユニット、特に、ヒトに由来する新規なカリウムチャンネルサブユニット、および制限された組織発現を示す新規なカリウムチャンネルサブユニットを発見することは望ましい。そのような新規なサブユニットは、様々な他の薬物標的に対する逆スクリーニングにおいて有用な、薬物発見に対する注目される標的であり、イオンチャンネルの生物学についてより多くを理解するための有益な研究道具である。
【００１０】
（発明の概要）
本発明は、カリウムチャンネルサブユニットのヒトｅｒｇ２（ｈ−ｅｒｇ２）をコード化する新規なヒトＤＮＡ配列に関する。本発明には、ｈ−ｅｒｇ２のいくつかのスプライス変化体および多型変化体が包含される。本発明には、配列番号１、配列番号３、配列番号５および配列番号７として示されるヌクレオチド配列を含むＤＮＡ、ならびに配列番号１、配列番号３、配列番号５および配列番号７のコード領域を含むＤＮＡが包含される。また、本発明の新規なＤＮＡ配列によってコードされる推定タンパク質配列も提供される。本発明のヒトｅｒｇ２タンパク質は、配列番号２、配列番号４、配列番号６および配列番号８として示されるアミノ酸配列、ならびにそのフラグメントを含む。新規なｈ−ｅｒｇ２カリウムチャンネルサブユニットタンパク質を組換えシステムにおいて発現させる方法が提供される。また、ｈ−ｅｒｇ２サブユニットを含むカリウムチャンネルの活性化剤および阻害剤を特定することによって薬物標的としてｈ−ｅｒｇ２を使用する方法もまた提供される。また、他の薬物標的の活性化剤および阻害剤を特定するために設計されたアッセイに対する逆スクリーニングにおいて、新規なｈ−ｅｒｇ２サブユニットおよびこれらのサブユニットをコード化するＤＮＡを使用する方法も提供される。
【００１１】
（図面の簡単な説明）
図１Ａは、ｈ−ｅｒｇ２をコード化するｃＤＮＡ配列（配列番号１）を示す。図１Ｂは、対応するアミノ酸配列（配列番号２）を示す。図１Ａにおける開始ＡＴＧコドンは５７位〜５９位に存在し、停止コドンは２９３１位〜２９３３位に存在する。
【００１２】
図２Ａは、配列番号１と比較して、単一ヌクレオチド多型を有する、ｈ−ｅｒｇ２をコード化するｃＤＮＡ配列（配列番号３）を示す。配列番号３における２７２２位は、配列番号１におけるようなＴではなく、Ｃである。図２Ｂは、配列番号３によってコードされるアミノ酸配列（配列番号４）を示す。配列番号４は、８８９位において、Ｍではなく、Ｔを有することにおいて配列番号２と異なる。
【００１３】
図３Ａは、配列番号１と比較して、２２８９位に１０８塩基対の挿入を有するｈ−ｅｒｇ２の推定スプライス変化体をコード化するｃＤＮＡ配列（配列番号５）を示す。挿入部には下線が付される。図３Ｂは、配列番号５によってコードされるアミノ酸配列（配列番号６）を示す。
【００１４】
図４Ａは、配列番号１と比較して、２６３７位から始まる２３７塩基対の欠失を有するｈ−ｅｒｇ２の推定スプライス変化体をコード化するｃＤＮＡ配列（配列番号７）を示す。図４Ｂは、配列番号７によってコードされるアミノ酸配列（配列番号８）を示す。
【００１５】
図５Ａ〜図５Ｂは、ｈ−ｅｒｇ２（配列番号２）、ヒトｅｒｇ１（ｈ−ｅｒｇ１）（配列番号９；ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号Ｕ０４２７０）およびラットｅｒｇ２（配列番号１０；ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号ＡＦ０１６１９２）のアミノ酸配列アラインメントを示す。コンセンサス配列が配列番号２３である。
【００１６】
図６は、ｈ−ｅｒｇ２が腎臓および前立腺において特異的に発現することを明らかにする多組織ノーザンブロットの結果を示す。レーンは下記の通りであった：１＝心臓；２＝脳；３＝胎盤；４＝肺；５＝肝臓；６＝骨格筋；７＝腎臓；８＝膵臓；９＝脾臓；１０＝胸腺；１１＝前立腺；１２＝精巣；１３＝子宮；１４＝小腸；１５＝結腸；１６＝末梢血白血球。
【００１７】
（発明の詳細な説明）
本発明の趣旨により、
「他のタンパク質を実質的に含まない」は、他のタンパク質を少なくとも９０％（好ましくは９５％、より好ましくは９９％、さらにより好ましくは９９．９％）含まないことを意味する。従って、他のタンパク質を実質的に含まないｈ−ｅｒｇ２タンパク質調製物は、その全タンパク質の百分率として、ｈ−ｅｒｇ２タンパク質でないタンパク質を多くても１０％（好ましくは多くても５％、より好ましくは多くても１％、さらにより好ましくは多くても０．１％）含む。所与のｈ−ｅｒｇ２タンパク質調製物が他のタンパク質を実質的に含まないかどうかは、タンパク質の純度を評価する従来の技術によって、例えば、適切な検出法（例えば、銀染色または免疫ブロッティング）と組み合わせたドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）などによって明らかにすることができる。
【００１８】
「他の核酸を実質的に含まない」は、他の核酸を少なくとも９０％（好ましくは９５％、より好ましくは９９％、さらにより好ましくは９９．９％）含まないことを意味する。従って、他の核酸を実質的に含まないｈ−ｅｒｇ２ＤＮＡ調製物は、その全核酸の百分率として、ヒトｈ−ｅｒｇ２の核酸でない核酸を多くても１０％（好ましくは多くても５％、より好ましくは多くても１％、さらにより好ましくは多くても０．１％）含む。所与のｈ−ｅｒｇ２ＤＮＡ調製物が他の核酸を実質的に含まないかどうかは、核酸の純度を評価する従来の技術によって、例えば、適切な検出法（例えば、臭化エチジウム染色）と組み合わせたアガロースゲル電気泳動などによって明らかにすることができる。
【００１９】
「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が別の化学的に類似するアミノ酸残基により置換されることを示す。そのような保存的置換の例には、疎水性残基（イソロイシン、ロイシン、バリンまたはメチオニン）相互の置換；同じ荷電の極性残基相互の置換（例えば、リシンのアルギニンへの置換、アスパラギン酸のグルタミン酸への置換）；芳香族アミノ酸（トリプトファン、チロシンまたはフェニルアラニン）相互の置換がある。
【００２０】
ポリペプチドは、そのポリペプチドが、ｈ−ｅｒｇ２チャンネルの性質と類似する性質を有する機能的なカリウムチャンネルを、単独で、すなわち、ホモ多量体として形成し得る場合、または機能的なカリウムチャンネルを構成する複合体が形成されるように、少なくとも１つの他のカリウムチャンネルサブユニットと組み合わせられ得る場合、「ｈ−ｅｒｇ２と実質的に同じ生物学的活性」を有する。この場合、このポリペプチドは、（そのような他のサブユニット単独と比較したとき）、配列番号２を有するｈ−ｅｒｇ２タンパク質がそのような他のサブユニットにもたらす電気生理学的性質または薬理学的性質と類似する変化した電気生理学的性質または薬理学的性質を複合体にもたらす。このポリペプチドは、ＢＬＡＳＴまたはＦＡＳＴＡのような標準的なプログラムにより測定されたとき、配列番号２に対する同一性が少なくとも約５０％（好ましくは少なくとも約８０％、さらにより好ましくは少なくとも約９５％）であるアミノ酸配列を有する。配列比較プログラムの例については、例えば、Ｇｉｓｈ＆Ｓｔａｔｅｓ、１９９３、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、３：２６６〜２７２；Ａｌｔｓｃｈｕｌ他、１９９０、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３〜４１０を参照のこと。
【００２１】
本発明は、ヒトｅｒｇ２（ｈ−ｅｒｇ２）タンパク質をコード化するＤＮＡの特定およびクローニングに関する。ラットｅｒｇ２をコード化するｃＤＮＡが単離されている（Ｓｈｉ他、１９９７、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１７：９４２３〜９４３２；ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号ＡＦ０１６１９２）が、完全な正しいｅｒｇ２（ｈ−ｅｒｇ２）をコード化するＤＮＡは以前には報告されていない。ｈ−ｅｒｇ２の一部を表し得るＥＳＴがＧｅｎＢａｎｋにアクセション番号Ｈ９６１７０で寄託されていた。別の配列Ｘ５６４１５（ｇｅｎｅｓｅｑｎデータベース）は、ｈ−ｅｒｇ２に関連する遺伝子の部分配列であり得る。
【００２２】
本発明は、配列番号１を有するｈ−ｅｒｇ２をコード化するｃＤＮＡを提供する。配列番号１は、配列番号２を有するｈ−ｅｒｇ２タンパク質をコード化する。ｈ−ｅｒｇ２の他の配列変化体もまた特定されている：
１．単一ヌクレオチド多型（ＴまたはＣ）が配列番号１において２７２２位に特定された。この多型に対応するｃＤＮＡ配列が配列番号３であり、これは、配列番号４を有するタンパク質をコード化する。Ｔを２７７２位に有する２つのクローンが特定され、Ｃを２７７２位に有する２つのクローンが特定された。これらは、推定アミノ酸配列のアミノ酸位置８８９においてメチオニン（配列番号２）またはトレオニン（配列番号４）のいずれかをもたらす。
【００２３】
【化１】
2004535760.tif 000003
【００２４】
２．挿入を有する変化体（おそらくは、スプライス変化体）もまた単離された（配列番号５）。配列番号１と比較したとき、配列番号５は、下記に示される１０８塩基対の挿入を２２８９位に含有する。
【００２５】
挿入ｃＤＮＡのＤＮＡ配列は、下記のとおりである。
【００２６】
【化２】
2004535760.tif 000004
【００２７】
この配列の挿入により、配列番号２と比較したとき、下記の３６アミノ酸の挿入を７４５位に有するタンパク質（配列番号６）が産生する。
【００２８】
【化３】
2004535760.tif 000005
【００２９】
３．配列番号１と比較したとき、欠失を含む別の変化体が特定された（これもまた、おそらくはスプライス変化体である）。この変化体は、配列番号１のヌクレオチド位置２６３７から始まる２３７塩基対の欠失を含有した。この変化体のＤＮＡ配列が配列番号７に示され、この変化体のアミノ酸配列が配列番号８に示される。配列番号１の欠失した配列が下記に太字で示され、下線が付される。
【００３０】
【化４】
2004535760.tif 000006
これにより、配列番号２のアミノ酸８６１から始まる、推定アミノ酸配列の７９アミノ酸の欠失が生じる。配列番号２の欠失したアミノ酸配列が下記に太字で示され、下線が付される。
【００３１】
【化５】
2004535760.tif 000007
【００３２】
ノーザンブロット分析により、腎臓および前立腺におけるｈ−ｅｒｇ２の強い発現が明らかにされた。本明細書中に開示されるｈ−ｅｒｇ２変化体のすべてが腎臓から単離された。この発現パターンから、ｈ−ｅｒｇ２カリウムチャンネルサブユニットは、低血圧症および高血圧症、腎不全、良性前立腺肥大、前立腺ガンおよび不妊症に対する治療的関連性を有し得ることが示唆される。
【００３３】
本発明は、他の核酸を実質的に含まない、ｈ−ｅｒｇ２サブユニットをコード化する核酸を提供する。核酸はＤＮＡまたはＲＮＡであり得る。本発明はまた、ｈ−ｅｒｇ２サブユニットをコード化する単離されたＤＮＡ分子および／または組換えＤＮＡ分子を提供する。本発明は、配列番号１、配列番号３、配列番号５または配列番号７に示されるヌクレオチド配列を含む、他の核酸を実質的に含まないＤＮＡ分子ならびに単離されたＤＮＡ分子および／または組換えＤＮＡ分子を提供する。
【００３４】
本発明には、配列番号１、配列番号３、配列番号５または配列番号７のコード領域を含む単離されたＤＮＡ分子、ならびに配列番号１、配列番号３、配列番号５または配列番号７のコード領域を含む、他の核酸を実質的に含まないＤＮＡ分子が包含される。従って、本発明には、配列番号１の５７位〜２９３０位、配列番号３の５７位〜２９３０位、配列番号５の５７位〜３０３８位または配列番号７の５７位〜２６９３位を含む配列を有する単離されたＤＮＡ分子、および配列番号１の５７位〜２９３０位、配列番号３の５７位〜２９３０位、配列番号５の５７位〜３０３８位または配列番号７の５７位〜２６９３位を含む配列を有する、他の核酸を実質的に含まないＤＮＡ分子が包含される。
【００３５】
また、配列番号１の５７位〜２９３０位、配列番号３の５７位〜２９３０位、配列番号５の５７位〜３０３８位または配列番号７の５７位〜２６９３位を含むヌクレオチド配列を有する組換えＤＮＡ分子も包含される。ｈ−ｅｒｇ２タンパク質をコード化する本発明の新規なＤＮＡ配列は、全体または一部を他のＤＮＡ配列（すなわち、ｈ−ｅｒｇ２タンパク質をコード化するＤＮＡが自然の状態では連結されていないＤＮＡ配列）と連結させて、ｈ−ｅｒｇ２タンパク質をコード化する「組換えＤＮＡ分子」を形成させることができる。そのような他の配列には、転写または翻訳を制御する様々なＤＮＡ配列、例えば、翻訳開始配列、内部リボソーム進入部位、ＲＮＡポリメラーゼＩＩに対するプロモーター、転写終結配列もしくは翻訳終結配列、エンハンサー配列、微生物における複製を制御する配列、抗生物質抵抗性を付与する配列、またはポリペプチド「標識」（例えば、ポリヒスチジン領域、ＦＬＡＧエピトープもしくはｍｙｃエピトープなど）をコード化する配列などを挙げることができる。本発明の新規なＤＮＡ配列は、プラスミド、コスミド、ウイルスベクター、Ｐ１人工染色体または酵母人工染色体などのベクターに挿入することができる。
【００３６】
本発明には、高ストリンジェントな条件下で配列番号１にハイブリダイゼーションするＤＮＡ配列が含まれる。例として（限定ではなく）、高ストリンジェントな条件を使用する手法は下記の通りである：ＤＮＡを含有するフィルターの予備ハイブリダイゼーションが、６ＸＳＳＣ、５Ｘデンハルト溶液および１００μｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡからなる緩衝液において６５℃で２時間から一晩行われる。フィルターは、１００μｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡおよび５〜２０Ｘ１０６ｃｐｍの３２Ｐ標識プローブを含有する予備ハイブリダイゼーション混合物において６５℃で１２時間から４８時間ハイブリダイゼーションされる。フィルターの洗浄が、２ＸＳＳＣ、０．１％ＳＤＳを含有する溶液において３７℃で１時間行われる。この後、０．１ＸＳＳＣ、０．１％ＳＤＳにおける洗浄が５０℃で４５分間行われ、その後、オートラジオグラフィーが行われる。
【００３７】
高ストリンジェントな条件を使用する他の手法には、５ＸＳＳＣ、５Ｘデンハルト溶液、５０％ホルムアミドにおいて４２℃で１２時間から４８時間行われるハイブリダイゼーション、または０．２ＸＳＳＰＥ、０．２％ＳＤＳにおいて６５℃で３０分間から６０分間行われる洗浄工程のいずれかが含まれる。
【００３８】
高ストリンジェントなハイブリダイゼーションを行うための前記手法において述べられた試薬は、当該技術では十分に知られている。これらの試薬の組成の細部は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、ＦｒｉｔｓｃｈおよびＭａｎｉａｔｉｓ、１９８９、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）に見出すことができる。前記に加えて、使用され得る高ストリンジェントな他の様々な条件が、当該技術では十分に知られている。
【００３９】
遺伝暗号の縮重により、２つのアミノ酸を除くすべてについて、２つ以上のコードが１つの特定のアミノ酸をコード化するようになる。これにより、ｈ−ｅｒｇ２タンパク質をコード化する合成ＤＮＡで、合成ＤＮＡのヌクレオチド配列が、配列番号１、配列番号３、配列番号５または配列番号７のヌクレオチド配列と著しく異なるｈ−ｅｒｇ２タンパク質をコード化し、しかし依然として、配列番号１、配列番号３、配列番号５または配列番号７と同じｈ−ｅｒｇ２タンパク質をコード化する合成ＤＮＡの構築が可能になる。そのような合成ＤＮＡは本発明の範囲に含まれるものとする。
【００４０】
配列番号１、配列番号３、配列番号５または配列番号７の変異型形態は発明の範囲に含まれるものとする。特に、配列番号１、配列番号３、配列番号５または配列番号７によりコードされるタンパク質によって形成されるカリウムチャンネルと比較したとき、変化した電圧感受性、電流搬送性質または他の性質を有するカリウムチャンネルを形成するタンパク質をコード化する、配列番号１、配列番号３、配列番号５または配列番号７の変異型形態が本発明の範囲に含まれる。そのような変異型形態は、ヌクレオチドの欠失、置換または付加を有することにより、配列番号１、配列番号３、配列番号５または配列番号７と異なり得る。
【００４１】
また、本発明の範囲内には、配列番号１、配列番号３、配列番号５もしくは配列番号７に対応する配列、または配列番号１、配列番号３、配列番号５もしくは配列番号７のコード領域に対応する配列を有するＲＮＡ分子が含まれるものとする。ＲＮＡ分子は、他の核酸を実質的に含まなくてもよく、あるいは単離されたＲＮＡ分子および／または組換えＲＮＡ分子であり得る。配列番号１、配列番号３、配列番号５もしくは配列番号７の逆相補体であるアンチセンスヌクレオチド（ＤＮＡもしくはＲＮＡ）またはその一部分もまた本発明の範囲に含まれる。さらに、少数の位置が非天然ヌクレオチドまたは修飾ヌクレオチド（イノシン、メチル−シトシンまたはデアザ−グアノシンなど）で置換されている、配列番号１、配列番号３、配列番号５または配列番号７に基づくポリヌクレオチドは本発明の範囲に含まれるものとする。本発明のポリヌクレオチドはまた、非天然型の結合がヌクレオチド間に存在する、配列番号１、配列番号３、配列番号５または配列番号７に基づく配列を含むことができる。そのような非天然型の結合には、例えば、メチルホスホナート、ホスホロチオアート、ホスホロジチオナート、ホスホロアミダイトおよびリン酸エステルを挙げることができる。本発明のポリヌクレオチドはまた、ヌクレオチド間の架橋としてデホスホ結合（例えば、シロキサン架橋、カーボナート架橋、カルボキシメチルエステル架橋、アセトアミダート架橋、カルバマート架橋およびチオエーテル架橋）を有する、配列番号１、配列番号３、配列番号５または配列番号７に基づく配列を含むことができる。存在し得る他のヌクレオチド間の結合には、Ｎ−ビニル結合、メタクリルオキシエチル結合、メタクリルアミド結合またはエチレンイミン結合が含まれる。配列番号１、配列番号３、配列番号５または配列番号７に基づくペプチド核酸もまた本発明に含まれる。一般に、非天然型ヌクレオチドもしくは修飾ヌクレオチドおよび／またはヌクレオチド間の非天然型の結合、ならびにペプチド核酸を含むそのようなポリヌクレオチドは、配列番号１、配列番号３、配列番号５または配列番号７によってコードされるのと同じタンパク質または非常に類似するタンパク質をコード化する。
【００４２】
本発明の別の局面には、ｈ−ｅｒｇ２タンパク質をコード化するＤＮＡ配列を含有し、かつ／または発現するように操作された宿主細胞が含まれる。そのような組換え宿主細胞は、ｈ−ｅｒｇ２タンパク質を産生させるために好適な条件のもとで培養することができる。ｈ−ｅｒｇ２タンパク質をコード化するＤＮＡを含有する発現ベクターを、組換え宿主細胞におけるｈ−ｅｒｇ２タンパク質の発現のために使用することができる。組換え宿主細胞は原核生物性または真核生物性であり得るが、これらには、大腸菌などの細菌、酵母などの菌類、哺乳動物細胞（ヒト起源、ウシ起源、ブタ起源、サル起源および齧歯類起源の細胞株を含むが、これらに限定されない）、アフリカツメガエル卵母細胞などの両生類細胞、および昆虫細胞（ショウジョウバエおよびカイコに由来する細胞株を含むが、これらに限定されない）（例えば、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）が含まれるが、これらに限定されない。ｈ−ｅｒｇ２タンパク質の組換え発現に好適であり、一般に入手可能な細胞および細胞株には、Ｌ細胞Ｌ−Ｍ（ＴＫ−）（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ１．３）、Ｌ細胞Ｌ−Ｍ（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ１．２）、２９３（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１５７３）、Ｒａｊｉ（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ８６）、ＣＶ−１（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ７０）、ＣＯＳ−１（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１６５０）、ＣＯＳ−７（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１６５１）、ＣＨＯ−Ｋ１（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ６１）、３Ｔ３（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ９２）、ＮＩＨ／３Ｔ３（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１６５８）、ＨｅＬａ（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ２）、Ｃ１２７Ｉ（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１６１６）、ＢＳ−Ｃ−１（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ２６）、ＭＲＣ−５（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ１７１）、ＣＰＡＥ（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ２０９）、Ｓａｏｓ−２（ＡＴＣＣ  ＨＴＢ−８５）、ＡＲＰＥ−１９ヒト網膜色素上皮（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−２３０９）、アフリカツメガエル黒色素胞およびアフリカツメガエル卵母細胞が含まれるが、これらに限定されない。
【００４３】
様々な哺乳動物発現ベクターを、組換えｈ−ｅｒｇ２タンパク質を哺乳動物細胞において発現させるために使用することができる。好適である市販の哺乳動物発現ベクターには、ｐＭＣ１ｎｅｏ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＳＧ５（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐｃＤＮＡＩおよびｐｃＤＮＡＩａｍｐ、ｐｃＤＮＡ３、ｐｃＤＮＡ３．１、ｐＣＲ３．１（Ｉｎｖｉｔｏｇｅｎ）、ＥＢＯ−ｐＳＶ２−ｎｅｏ（ＡＴＣＣ３７５９３）、ｐＢＰＶ−１（８−２）（ＡＴＣＣ３７１１０）、ｐｄＢＰＶ−ＭＭＴｎｅｏ（３４２−１２）（ＡＴＣＣ３７２２４）、ｐＲＳＶｇｐｔ（ＡＴＣＣ３７１９９）、ｐＲＳＶｎｅｏ（ＡＴＣＣ３７１９８）、ｐＩＺＤ３５（ＡＴＣＣ３７５６５）ならびにｐＳＶ２−ｄｈｆｒ（ＡＴＣＣ３７１４６）が含まれるが、これらに限定されない。別の好適なベクターには、ＰＴ７ＴＳ卵母細胞発現ベクターがある。
【００４４】
組換え細胞における発現の後、ｈ−ｅｒｇ２タンパク質は、他のタンパク質を実質的に含まないレベルに、従来の技術によって精製することができる。使用され得る技術には、硫酸アンモニウム沈殿、疎水性相互作用または親水性相互作用のクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、調製用ゲル電気泳動およびアルコール沈殿が含まれる。場合により、タンパク質の変性工程および／またはリフォールディング工程をそのような技術に加えて用いることは好都合であり得る。
【００４５】
ある種のカリウムチャンネルサブユニットは、高レベルで適正に発現し、かつ膜に挿入されるためには、他のカリウムチャンネルサブユニットの発現を必要とすることが見出されている。例えば、いくつかの電位依存性カリウムチャンネルＫｖαサブユニットは、機能的なチャンネルを形成するために、他の関連するαサブユニットまたはＫｖβサブユニットを必要とする（Ｓｈｉ他、１９９５、Ｎｅｕｒｏｎ、１６：８４３〜８５２）。１つの具体的な例として、ＫＣＮＱ３の同時発現は、アフリカツメガエル卵母細胞におけるＫＣＮＱ２の発現を高めるようである（Ｗａｎｇ他、１９９８、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２８２：１８９０〜１８９３）。従って、ｈ−ｅｒｇ２タンパク質の組換え発現は、ある種の状況下では、他のカリウムチャンネルタンパク質の同時発現から利益を受けることができ、そのような同時発現は本発明の範囲に含まれるものとする。そのような同時発現は、ｈ−ｅｒｇ２タンパク質をコード化する発現ベクターを、別のカリウムチャンネルタンパク質を自然の状態で発現する細胞にトランスフェクションすることによって達成することができる。あるいは、ｈ−ｅｒｇ２タンパク質をコード化する発現ベクターを、別のカリウムチャンネルタンパク質をコード化する発現ベクターが同様にトランスフェクションされている細胞にトランスフェクションすることができる。好ましくは、そのような細胞は、ｈ−ｅｒｇ２サブユニットタンパク質またはそのような他のカリウムチャンネルサブユニットタンパク質を自然の状態で発現しない。
【００４６】
本発明には、他のタンパク質を実質的に含まないｈ−ｅｒｇ２タンパク質が包含される。全長のｈ−ｅｒｇ２サブユニットタンパク質の推定アミノ酸配列が、配列番号２、配列番号４、配列番号６および配列番号８に示される。従って、本発明には、配列番号２、配列番号４、配列番号６および配列番号８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、他のタンパク質を実質的に含まないｈ−ｅｒｇ２タンパク質が包含される。本発明にはまた、配列番号２、配列番号４、配列番号６および配列番号８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む単離されたｈ−ｅｒｇ２タンパク質が包含される。
【００４７】
ｈ−ｅｒｇ２タンパク質の変異型形態は本発明の範囲に含まれるものとする。特に、配列番号２、配列番号４、配列番号６または配列番号８によって形成されるカリウムチャンネルと比較したとき、変化した電気生理学的性質または薬理学的性質を有するカリウムチャンネルを形成する、配列番号２、配列番号４、配列番号６または配列番号８の変異型形態が本発明の範囲に含まれる。
【００４８】
多くのタンパク質と同様に、ｈ−ｅｒｇ２タンパク質のアミノ酸の多くを修飾し、元のタンパク質の場合と実質的に同じ生物学的活性を依然として保持させることが可能である。従って、本発明には、アミノ酸の欠失、付加または置換を有するが、天然に存在するｈ−ｅｒｇ２タンパク質と実質的に同じ生物学的活性を依然として保持する修飾されたｈ−ｅｒｇ２タンパク質が包含される。一アミノ酸の置換は、通常、タンパク質の生物学的活性を変化させないことが一般には受け入れられている（例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｇｅｎｅ（Ｗａｔｓｏｎ他、１９８７、第４版、Ｔｈｅ  Ｂｅｎｊａｍｉｎ／Ｃｕｍｍｉｎｇｓ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｉｎｃ．）、２２６頁；Ｃｕｎｎｉｇｈａｍ＆Ｗｅｌｌｓ、１９８９、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４４：１０８１〜１０８５を参照のこと）。従って、本発明には、１個のアミノ酸置換が、配列番号２、配列番号４、配列番号６または配列番号８において行われているポリペプチドで、天然に存在するｈ−ｅｒｇ２タンパク質と実質的に同じ生物学的活性を依然として保持するポリペプチドが包含される。本発明にはまた、２つ以上のアミノ酸置換が、配列番号２、配列番号４、配列番号６または配列番号８において行われているポリペプチドで、天然に存在するｈ−ｅｒｇ２タンパク質と実質的に同じ生物学的活性を依然として保持するポリペプチドが包含される。特に、本発明には、上記に記載された置換が保存的置換である実施形態が包含される。特に、本発明には、上記に記載された置換が、保存された位置に存在しない実施形態が包含される。保存された位置は、配列番号２を有するｈ−ｅｒｇ２タンパク質、ｈｅｒｇ１タンパク質（配列番号９）およびラットｅｒｇ２タンパク質（配列番号１０）がともに同じアミノ酸を有するそのような位置である（図５を参照のこと）。
【００４９】
本発明のｈ−ｅｒｇ２タンパク質は、様々な翻訳後修飾、例えば、共有結合した炭水化物、リン酸化、ミリストイル化、パルミトイル化などを含むことができる。
【００５０】
本発明にはまた、キメラなｈ−ｅｒｇ２タンパク質が包含される。キメラなｈ−ｅｒｇ２タンパク質は、ｈ−ｅｒｇ２タンパク質に由来しないポリペプチド配列に融合されたｈ−ｅｒｇ２タンパク質の少なくとも一部分の連続したポリペプチド配列からなる。ｈ−ｅｒｇ２タンパク質の一部分は、配列番号２、配列番号４、配列番号６または配列番号８に由来する少なくとも１０個（好ましくは少なくとも２５個、最も好ましくは少なくとも５０個）の連続したアミノ酸を含まなければならない。
【００５１】
本発明にはまた、単離されたｈ−ｅｒｇ２タンパク質およびｈ−ｅｒｇ２タンパク質をコード化する単離されたＤＮＡが包含される。用語「単離された」の使用は、ｈ−ｅｒｇ２タンパク質またはＤＮＡがその通常の細胞環境から取り出されていることを示す。従って、単離されたｈ−ｅｒｇ２タンパク質は無細胞溶液の状態であってもよく、またはｈ−ｅｒｇ２タンパク質は自然の状態で存在する環境とは異なる細胞環境に置かれていてもよい。単離されたの用語は、単離されたｈ−ｅｒｇ２タンパク質が、（単離されたの意味の１つではあるが）存在する唯一のタンパク質または優勢なタンパク質であることを示すのではなく、むしろ、単離されたｈ−ｅｒｇ２タンパク質が、ｈ−ｅｒｇ２タンパク質と自然の状態で会合する非アミノ酸物質（例えば、核酸、脂質、炭水化物）を少なくとも９５％含まないことを意味する。
【００５２】
いくつかのカリウムチャンネルサブユニットは相互作用して、機能的なカリウムチャンネルをもたらすヘテロマー複合体を形成し得ることが知られている。例えば、ＫＣＮＱ２およびＫＣＮＱ３は組み合わさって、ヘテロマーの機能的なカリウムチャンネルを形成することができる（Ｗａｎｇ他、１９９８、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２８２：１８９０〜１８９３）。従って、本発明のｈ−ｅｒｇ２タンパク質もまた、機能的なカリウムチャンネルを形成する、他のタンパク質とのヘテロマー構造を形成し得ることが考えられる。従って、本発明には、ｈ−ｅｒｇ２タンパク質を含むそのようなヘテロマーが包含される。
【００５３】
ｈ−ｅｒｇ２タンパク質をコード化するＤＮＡは、当該分野で十分に知られている方法によって得ることができる。例えば、全長のｈ−ｅｒｇ２タンパク質をコード化するｃＤＮＡフラグメントを、好適なプライマー対を用いるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用することによってヒトの腎臓ｃＤＮＡまたは前立腺ｃＤＮＡから単離することができる。そのようなプライマー対は、配列番号１、配列番号３、配列番号５および配列番号７として図１〜図４に示される、ｈ−ｅｒｇ２タンパク質をコード化するＤＮＡ配列に基づいて選択することができる。好適なプライマーは、例えば、以下のものである。
【００５４】
【化６】
2004535760.tif 000008
【００５５】
上記のプライマーは単なる例示であることが意味される。当業者は、他の好適なプライマーを配列番号１、配列番号３、配列番号５および配列番号７に基づいて容易に設計することができる。そのようなプライマーは、当該分野で十分に知られているオリゴヌクレオチド合成法によって作製することができる。
【００５６】
ＰＣＲ反応は、ＡｍｐｌｉＴａｑ、ＡｍｐｌｉＴａｑ  ＧｏｌｄまたはＶｅｎｔポリメラーゼ（これらに限定されない）を含む様々な熱安定性酵素を用いて行うことができる。ＡｍｐｌｉＴａｑの場合、反応は、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、２．０ｍＭのＭｇＣｌ２、２００μＭの各ｄＮＴＰ、５０ｍＭのＫＣｌ、０．２μＭの各プライマー、１０ｎｇのＤＮＡテンプレート、０．０５ユニット／μｌのＡｍｐｌｉＴａｑにおいて行うことができる。反応物は９５℃で３分間加熱され、その後、９５℃で２０秒間、６２℃で２０秒間、７２℃で３分間のサイクル処理パラメーターを使用して３５回のサイクル処理が行われる。これらの条件に加えて、様々な好適なＰＣＲプロトコルを、ＰＣＲ  Ｐｒｉｍｅｒ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（編者：Ｃ．Ｗ．ＤｉｅｆｆｅｎｂａｃｈおよびＧ．Ｓ．Ｄｖｅｋｓｌｅｒ、１９９５、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）またはＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｍｉｃｈａｅｌ他編、１９９０、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ）に見出すことができる。
【００５７】
本発明のｈ−ｅｒｇ２タンパク質は他のカリウムチャンネルサブユニットタンパク質に対して非常に相同的であるので、所望するｈ−ｅｒｇ２タンパク質が実際に得られたことを確認するために、本明細書中に記載される方法により得られたクローンを配列決定することが望ましい。配列決定はまた、配列番号１、配列番号３、配列番号５および配列番号７の中から所望するｃＤＮＡを確実に得るために適切である。
【００５８】
これらの方法によって、ｈ−ｅｒｇ２タンパク質をコード化するｃＤＮＡクローンを得ることができる。これらのｃＤＮＡクローンは、好適なクローニングベクターまたは発現ベクター（例えば、哺乳動物発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ））にクローン化することができる。その後、ｈ−ｅｒｇ２またはその一部をコード化する発現ベクターを好適な宿主細胞にトランスフェクションして、宿主細胞を好適な条件下で生育させることによって、ｈ−ｅｒｇ２タンパク質を産生させることができる。その後、ｈ−ｅｒｇ２タンパク質を、当該分野で十分に知られている方法によって単離することができる。
【００５９】
上記に記載されたＰＣＲ法の代わりとして、ｈ−ｅｒｇ２タンパク質をコード化するｃＤＮＡクローンを、プローブとしてｈ−ｅｒｇ２に特異的なオリゴヌクレオチドを使用し、オリゴヌクレオチドプローブを用いてｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることに関して当該分野で十分に知られている方法を使用してｃＤＮＡライブラリーから単離することができる。そのような方法は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ他、１９８９、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）、Ｇｌｏｖｅｒ，Ｄ．Ｍ．他（編）、１９８５、ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｒｃｈ（ＭＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｌｔｄ．、Ｏｘｆｏｒｄ、Ｕ．Ｋ．、第Ｉ巻、第ＩＩ巻）に記載される。ｈ−ｅｒｇ２タンパク質に特異的であり、かつｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするために使用され得るオリゴヌクレオチドは、図１〜図４に示されるＤＮＡ配列（すなわち、配列番号１、配列番号３、配列番号５および配列番号７）に基づいて容易に設計することができ、当該分野で十分に知られている方法によって合成することができる。
【００６０】
ｈ−ｅｒｇ２の遺伝子を含有するゲノムクローンを、Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ、ＡＬ）から得られる市販のヒトＰＡＣライブラリーまたはヒトＢＡＣライブラリーから得ることができる。あるいは、ゲノムライブラリーを、例えば、Ｐ１人工染色体ベクターにおいて調製することができ、そのようなゲノムライブラリーから、ｈ−ｅｒｇ２の遺伝子を含有するゲノムクローンを、本明細書中に開示されるｈ−ｅｒｇ２のＤＮＡ配列に基づくプローブを使用して単離することができる。そのようなライブラリーの調製方法は当該技術では知られている（例えば、Ｉｏａｎｎｏｕ他、１９９４、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．６：８４〜８９を参照のこと）。
【００６１】
本発明の新規なＤＮＡ配列は様々な診断方法において使用することができる。本発明は、患者がｈ−ｅｒｇ２の遺伝子に変異を有するかどうかを明らかにするための診断方法を提供する。広い意味で、そのような方法は、患者に由来するｈ−ｅｒｇ２の遺伝子内または遺伝子付近の領域のＤＮＡ配列を決定すること、およびその配列を、非罹患者（すなわち、診断されている状態を有しない人）に由来するｈ−ｅｒｇ２の遺伝子の対応する領域から得られる配列と比較することを含む。この場合、患者由来の遺伝子のＤＮＡ配列と非罹患者由来の遺伝子のＤＮＡ配列との配列の違いにより、ｈ−ｅｒｇ２の遺伝子における変異を患者が有することが示される。
【００６２】
本発明はまた、ｈ−ｅｒｇ２遺伝子の変異型形態を有する患者を特定するために、またはｈ−ｅｒｇ２をコード化するＲＮＡの発現レベルを明らかにするために、またはｈ−ｅｒｇ２に相同的な遺伝子を他の種から単離するために、診断方法において使用することができる、配列番号１、配列番号３、配列番号５または配列番号７に基づくオリゴヌクレオチドプローブを提供する。特に、本発明には、配列番号１、配列番号３、配列番号５または配列番号７の少なくとも約１０個または１５個または１８個の連続したヌクレオチドを含むＤＮＡオリゴヌクレオチドが包含される。この場合、オリゴヌクレオチドプローブは、前記の少なくとも約１０個または１５個または１８個の連続したヌクレオチド以外に、配列番号１、配列番号３、配列番号５または配列番号７に由来する５個を越える連続したヌクレオチドの領域を含まない。オリゴヌクレオチドは他の核酸を実質的に含まない。また、本発明により、対応するＲＮＡオリゴヌクレオチドも提供される。ＤＮＡオリゴヌクレオチドまたはＲＮＡオリゴヌクレオチドはキットに含めることができる。
【００６３】
本発明は、様々な細胞タイプにおけるｈ−ｅｒｇ２タンパク質の組換え発現を可能にする。そのような組換え発現により、このタンパク質の研究が可能になり、その結果、腎不全、低カリウム血症、高血圧症、低血圧症、良性前立腺肥大、不妊症および前立腺ガンなどの様々な疾患におけるその生化学的活性およびその役割が解明され得るようになる。
【００６４】
本発明はまた、ｈ−ｅｒｇ２タンパク質を含有するカリウムチャンネルの生物学的活性を測定するアッセイの開発を可能にする。組換え発現されたｈ−ｅｒｇ２タンパク質を使用するアッセイが特に注目される。そのようなアッセイは、化合物のライブラリーまたは化合物の他の供給源をスクリーニングして、ｈ−ｅｒｇ２タンパク質を含有するカリウムチャンネルの活性の活性化剤または阻害剤である化合物を特定するために使用することができる。そのような特定された化合物は、カリウムチャンネルの活性を増強または抑制することが有益である疾患を有する患者を処置するために使用され得る医薬品を開発するための「リード化合物」として役立ち得る。
【００６５】
上記に記載されるアッセイの様々な様式において、変異型のｈ−ｅｒｇ２タンパク質を含有するカリウムチャンネルが使用され、変異型カリウムチャンネルの活性の阻害剤または活性化剤が特定される。
【００６６】
ｈ−ｅｒｇ２タンパク質を組換え発現するための好適な細胞株は、内因性のカリウムチャンネルを発現しない細胞株である（例えば、ＣＶ−１、ＮＩＨ−３Ｔ３、ＣＨＯ−Ｋ１、ＣＯＳ−７）。そのような細胞株は、カリウムチャンネルを通過し得るイオン、８６Ｒｂにさらすことができる。そのような細胞への８６Ｒｂの流入を、物質のコレクション（例えば、コンビナトリアルライブラリー、天然産物、医薬化学によって作製されたリード化合物のアナログ）、またはそのようなコレクションのメンバー、およびそれにより確認された８６Ｒｂの流入を変化させることができるそのような物質の存在下および非存在下でアッセイすることができる。そのような物質は、ｈ−ｅｒｇ２タンパク質を含有するカリウムチャンネルの活性化剤または阻害剤であると考えられる。同様に、細胞に８６Ｒｂを前もって負荷させることができ、カリウムチャンネルを開かせることによって、例えば、カリウムによる細胞の脱分極によって、イオンの流入を開始させることができる。そのような細胞からの８６Ｒｂの流出を、その後、物質のコレクション（例えば、コンビナトリアルライブラリー、天然産物、医薬化学によって作製されたリード化合物のアナログ）、またはそのようなコレクションのメンバー、およびそれにより確認された８６Ｒｂの流出を変化させることができるそのような物質の存在下および非存在下でアッセイすることができる。そのような物質は、ｈ−ｅｒｇ２タンパク質を含有するカリウムチャンネルの活性化剤または阻害剤であると考えられる。
【００６７】
ｈ−ｅｒｇ２タンパク質を含有するカリウムチャンネルの活性化剤または阻害剤は、ｈ−ｅｒｇ２タンパク質を含有するカリウムチャンネルに結合し得る物質であると考えられる。従って、１つのタイプのアッセイにより、物質コレクションの１つ以上がそのような結合を可能にするかどうかが明らかにされる。
【００６８】
従って、本発明により、ｈ−ｅｒｇ２タンパク質を含有するカリウムチャンネルに結合する物質を特定する方法が提供される。この方法は、
（ａ）ｈ−ｅｒｇ２タンパク質を含有するカリウムチャンネルを発現する細胞を提供すること、
（ｂ）ｈ−ｅｒｇ２タンパク質を含有するカリウムチャンネルに結合することが知られていない物質に細胞をさらすこと、
（ｃ）細胞に対する物質の結合量を測定すること、
（ｄ）工程（ｃ）における結合量をコントロール細胞に対する物質の結合量と比較すること（この場合、コントロール細胞は、コントロール細胞がｈ−ｅｒｇ２タンパク質を発現しないことを除いて、工程（ａ）の細胞と実質的に同一である）、を含む；
この場合、工程（ｃ）における結合量が、コントロール細胞に対する物質の結合量よりも大きい場合、その物質は、ｈ−ｅｒｇ２タンパク質を含有するカリウムチャンネルに結合する。
【００６９】
工程（ａ）の細胞と実質的に同一であるコントロール細胞の例には、工程（ａ）のｈ−ｅｒｇ２タンパク質を含有するカリウムチャンネルを発現する細胞を作製するためにｈ−ｅｒｇ２タンパク質をコード化する発現ベクターでトランスフェクションされる元の細胞株がある。
【００７０】
このアッセイの別の型では、ｈ−ｅｒｇ２タンパク質を含有するカリウムチャンネルに結合することが既知の化合物が使用される。新しい結合物質である物質が、これらの既知の化合物が結合することを増強または阻止するその能力によって特定される。これは、既知の化合物が、飽和よりもはるかに低い濃度で使用される場合に行うことができる。そのような場合、新しい結合物質である物質は、既知の化合物が結合することを増強または阻止することができると考えられる。このような能力を有する物質はそれ自体、ｈ−ｅｒｇ２タンパク質を含有するカリウムチャンネルの阻害剤または活性化剤であると考えられる。
【００７１】
従って、本発明には、ｈ−ｅｒｇ２タンパク質を含有するカリウムチャンネルと結合する物質、従って、ｈ−ｅｒｇ２タンパク質を含有するカリウムチャンネルの阻害剤または活性化剤であると考えられる物質を特定する方法が包含される。この方法は、
（ａ）ｈ−ｅｒｇ２タンパク質を含有するカリウムチャンネルを発現する細胞を提供すること、
（ｂ）ｈ−ｅｒｇ２タンパク質を含有するカリウムチャンネルに結合することが知られていない物質の存在下および非存在下で、細胞を、ｈ−ｅｒｇ２タンパク質を含有するカリウムチャンネルに結合することが既知の化合物にさらすこと、
（ｃ）ｈ−ｅｒｇ２タンパク質を含有するカリウムチャンネルに結合することが知られていない物質の存在下および非存在下における細胞に対する化合物の結合量を測定すること、を含む；
この場合、物質の存在下における化合物の結合量が、物質の非存在下における結合量と異なる場合、その物質は、ｈ−ｅｒｇ２タンパク質を含有するカリウムチャンネルと結合し、ｈ−ｅｒｇ２タンパク質を含有するカリウムチャンネルの阻害剤または活性化剤であると考えられる。
【００７２】
一般に、そのような既知の化合物は、カリウムチャンネルに対するその結合の測定を容易にするために、（例えば、放射能により、酵素的に、蛍光的に）標識される。
【００７３】
物質が上記の方法によって特定されると、その物質は、それが阻害剤または活性化剤であるかどうかを明らかにするために、本明細書中に記載される方法などの機能的な試験でアッセイすることができる。
【００７４】
特定の実施形態において、ｈ−ｅｒｇ２タンパク質を含有するカリウムチャンネルと結合することが既知の化合物は、ＭＫ−４９９、ドフェチリド、アステミゾール、テルフェナジン、Ｅ−４０３およびＥｒｇＴｘからなる群から選択される（Ｇｕｒｒｏｌａ他、１９９９、ＦＡＳＥＢ  Ｊ．１３：９５３〜９６２）。
【００７５】
本発明には、ｈ−ｅｒｇ２タンパク質を含有するカリウムチャンネルの活性化剤または阻害剤を特定する方法が包含される。この方法は、
（ａ）組換え発現したｈ−ｅｒｇ２タンパク質が単独でカリウムチャンネルを形成するように、または他のカリウムチャンネルサブユニットタンパク質とのヘテロマーを形成することよってカリウムチャンネルを形成するように宿主細胞においてｈ−ｅｒｇ２タンパク質を組換え発現させること、
（ｂ）工程（ａ）において形成されたカリウムチャンネルの生物学的活性を、ｈ−ｅｒｇ２タンパク質を含有するカリウムチャンネルの活性化剤または阻害剤であることが疑われる物質の存在下および非存在下で測定すること、を含み、
この場合、物質の非存在下と比較したとき、物質の存在下における、工程（ａ）において形成されるカリウムチャンネルの生物学的活性の変化により、その物質が、ｈ−ｅｒｇ２タンパク質を含有するカリウムチャンネルの活性化剤または阻害剤であることが示される。
【００７６】
本明細書中に記載される方法の特定の実施形態において、生物学的活性は、カリウム電流の産生、８６Ｒｂの流入、８６Ｒｂの流出、ＮＨ３の流入もしくは流出、またはｈ−ｅｒｇ２含有チャンネルの開放または閉鎖により引き起こされる膜電位の変化である。
【００７７】
特定の実施形態において、カリウムチャンネルのそれ以外のサブユニットを組換え発現することは好都合であり得る。あるいは、そのような他のサブユニットを内因的に発現する宿主細胞を使用することは好都合であり得る。
【００７８】
特定の実施形態において、ｈ−ｅｒｇ２タンパク質をコード化するベクターが、ｈ−ｅｒｇ２タンパク質の発現を卵母細胞において生じさせるために、アフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ）の卵母細胞に移される。あるいは、ｈ−ｅｒｇ２タンパク質をコード化するＲＮＡをインビトロで調製して、卵母細胞内に注入することができ、これによってもまた、卵母細胞におけるｈ−ｅｒｇ２タンパク質の発現がもたらされる。ｈ−ｅｒｇ２タンパク質を卵母細胞において発現させ、ｈ−ｅｒｇ２タンパク質を含有するカリウムチャンネルを形成させた後、膜電流が、トランスメンブラン電圧を段階的に変化させた後に測定される。膜電流の変化は、カリウムチャンネルが開くか、または閉じ、これにより、カリウムイオンの流れが調節されたときに観測される。類似する研究が、ＫＣＮＱ２およびＫＣＮＱ３のカリウムチャンネルについて、Ｗａｎｇ他、１９９８、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２８２：１８９０〜１８９３に報告され、ｍｉｎＫチャンネルについて、Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ＆Ｍｉｌｌｅｒ、１９９１、Ｎｅｕｒｏｎ、７：４０３〜４０８によって報告された。これらの参考文献およびそれらに引用される参考文献は、そのような研究を行う方法に関して参考のために考慮することができる。そのような研究では、ｈ−ｅｒｇ２に加えて、他のカリウムチャンネルサブユニットタンパク質を卵母細胞において同時に発現させることは好都合であり得る。類似する研究を様々な異なる細胞タイプにおいて行うことができる。
【００７９】
ｈ−ｅｒｇ２タンパク質を含有するカリウムチャンネルの阻害剤または活性化剤は、個々の物質または物質のコレクションに卵母細胞をさらし、物質の非存在下で観測された膜電流を物質が遮断／減少または増強させ得るかどうかを明らかにすることによって特定することができる。
【００８０】
従って、本発明により、ｈ−ｅｒｇ２タンパク質を含有するカリウムチャンネルの阻害剤または活性化剤を特定する方法が提供される。この方法は、
（ａ）ｈ−ｅｒｇ２タンパク質を含有するカリウムチャンネルが形成されるようにｈ−ｅｒｇ２タンパク質を発現させること、
（ｂ）ｈ−ｅｒｇ２タンパク質を含有するカリウムチャンネルの阻害剤または活性化剤であることが疑われる物質の存在下および非存在下において細胞のトランスメンブランポテンシャルを変化させること、
（ｃ）工程（ｂ）の後の膜カリウム電流を測定すること、を含み、
この場合、工程（ｃ）で測定されるカリウム膜電流が、物質の存在下よりも、物質の非存在下で大きい場合、その物質は、ｈ−ｅｒｇ２タンパク質を含有するカリウムチャンネルの阻害剤であり、
工程（ｃ）で測定されるカリウム膜電流が、物質の非存在下よりも、物質の存在下で大きい場合、その物質は、ｈ−ｅｒｇ２タンパク質を含有するカリウムチャンネルの活性化剤である。
【００８１】
本発明にはまた、ｈ−ｅｒｇ２タンパク質を含有するカリウムチャンネルの活性化剤および阻害剤を特定するためのアッセイで、第１の蛍光色素と第２の蛍光色素との間における蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）に基づくアッセイが包含される。この場合、第１の色素は、ｈ−ｅｒｇ２タンパク質を含有するカリウムチャンネルを発現する細胞の形質膜の一方の側に結合し、第２の色素は、膜電位の変化に応答して膜の一方の面から反対側の面に自由に行き来する。いくつかの実施形態において、第１の色素は細胞の形質膜に対して不透過性であり、形質膜の細胞外表面に主に結合する。第２の色素は形質膜内に捕捉されるが、膜内を自由に拡散する。膜の正常（すなわち、負）の静止電位において、第２の色素は形質膜の細胞外面の内側表面に主に結合し、従って、第２の色素は第１の色素の非常に近いところに置かれる。このように近くに接近することにより、２つの色素間に大きい量のＦＲＥＴの発生が可能になる。膜が脱分極した後、第２の色素は、膜の細胞外面から細胞内面に移動し、従って、色素間の距離が大きくなる。この増大した距離は、第１の色素に由来する蛍光放射の対応する増大、および第２の色素に由来する蛍光放射の対応する減少を伴うＦＲＥＴの減少をもたらす。このようにして、２つの色素間のＦＲＥＴ量を使用して、膜の脱分極状態を測定することができる。この技術の説明については、Ｇｏｎｚａｌｅｚ＆Ｔｓｉｅｎ、１９９７、Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ＆Ｂｉｏｌｏｇｙ、４：２６９〜２７７を参照のこと。Ｇｏｎｚａｌｅｚ＆Ｔｓｉｅｎ、１９９５、Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．６９：１２７２〜１２８０、および米国特許第５，６６１，０３５号もまた参照のこと。
【００８２】
いくつかの実施形態において、第１の色素は、蛍光ドナーとして作用する蛍光性レクチンまたは蛍光性リン脂質である。そのような第１の色素の例には、クマリン標識されたホスファチジルエタノールアミン（例えば、Ｎ−（６−クロロ−７−ヒドロキシ−２−オキソ−２Ｈ−１−ベンゾピラン−３−カルボキサミドアセチル）−ジミリストイルホスファチジルエタノールアミンまたはＮ−（７−ニトロベンゾ−２−オキサ−１，３−ジアゾル−４−イル）−ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン）；蛍光標識されたレクチン（例えば、蛍光標識されたコムギ胚芽凝集素）がある。いくつかの実施形態において、第２の色素は、蛍光アクセプターとして作用するオキソノールである。そのような第２の色素の例には、ビス（１，３−ジアルキル−２−チオバルビツラート）トリメチンオキソノール（例えば、ビス（１，３−ジヘキシル−２−チオバルビツラート）トリメチンオキソノール）またはペンタメチンオキソノールアナログ（例えば、ビス（１，３−ジヘキシル−２−チオバルビツラート）ペンタメチンオキソノールもしくはビス（１，３−ジブチル−２−チオバルビツラート）ペンタメチンオキソノール）がある。本発明における使用に好適な様々な色素を合成する方法については、Ｇｏｎｚａｌｅｚ＆Ｔｓｉｅｎ、１９９７、Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ＆Ｂｉｏｌｏｇｙ、４：２６９〜２７７を参照のこと。いくつかの実施形態において、アッセイは、一重項酸素による光力学的損傷を軽減するために、天然カロテノイド（例えば、アスタキサンチン）を含むことができる。
【００８３】
上記に記載されたアッセイは、ｈ−ｅｒｇ２タンパク質を含有するカリウムチャンネルの活性化剤および阻害剤を発見するために利用することができる。そのようなアッセイでは、一般に、例えば、ｈ−ｅｒｇ２タンパク質および場合により他のカリウムチャンネルサブユニットをコード化する発現ベクターを用いたトランスフェクションによって、ｈ−ｅｒｇ２タンパク質を含有するカリウムチャンネルを発現する細胞が用いられる。
【００８４】
細胞の膜電位は、様々なイオンポンプおよびイオンチャンネルによる内向き（脱分極）イオン流束と外向き（再分極）イオン流束とのバランスによって決定される。ｈ−ｅｒｇ２などのカリウムチャンネルは、典型的にはＫ＋に対して非常に選択的であり、従って、カリウム平衡電位（ＥＫ）に近い逆の電位を示す。従って、そのようなカリウムチャンネルは、ＥＫの近くに細胞の静止膜電位を維持するように機能する。ｈ−ｅｒｇ２を含有するカリウムチャンネルの阻害剤の存在は、この分極した（すなわち、負の）膜電位を維持するこのチャンネルの能力を妨げるか、または減少させ、従って、細胞は脱分極する。従って、膜電位は、ｈ−ｅｒｇ２阻害剤の存在下では、より正側になることになる。ｈ−ｅｒｇ２タンパク質を含有するカリウムチャンネルの阻害剤により引き起こされる膜電位の変化を、上記に記載されたＦＲＥＴを使用するアッセイによってモニターすることができる。
【００８５】
従って、本発明により、ｈ−ｅｒｇ２タンパク質を含有するカリウムチャンネルの阻害剤を特定する方法が提供される。この方法は、
（ａ）下記：
（１）ｈ−ｅｒｇ２タンパク質を含有するカリウムチャンネルが細胞内で形成されるように細胞におけるｈ−ｅｒｇ２タンパク質の発現を行わせる発現ベクター、
（２）細胞の形質膜の一方の側に結合する第１の蛍光色素、および
（３）膜電位の変化に応答して細胞の形質膜の一方の面から反対側の面に自由に分布する第２の蛍光色素、を含む細胞を提供すること、
（ｂ）ｈ−ｅｒｇ２タンパク質を含有するカリウムチャンネルの阻害剤であることが疑われる物質に細胞をさらすこと、
（ｃ）物質の存在下および非存在下における蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）量を測定すること、
（ｄ）物質の存在下および非存在下における細胞により示されるＦＲＥＴ量を比較すること、を含み、
この場合、物質の存在下における細胞により示されるＦＲＥＴ量が、物質の非存在下における細胞により示されるＦＲＥＴ量よりも小さい場合、その物質は、ｈ−ｅｒｇ２タンパク質を含有するカリウムチャンネルの阻害剤である。
【００８６】
細胞の静止膜電位は、その細胞において活性である内向き電流と外向き電流のバランスに依存する。従って、例えば、ｈ−ｅｒｇ２によりもたらされるＫ＋電流が唯一または優勢な電流である場合、その静止膜電位はＥＫに近い。しかし、中和する脱分極電流もまた細胞において見出される場合、静止膜電位はより大きく脱分極し、その正確な値は、脱分極電流と過分極電流との相対的な大きさに依存する。従って、カリウムチャンネル（例えば、ｈ−ｅｒｇ２）を発現し、かつ同じ細胞における脱分極電流の同時発現によってＥＫよりも正側の静止膜電子を示す細胞株を構築することができる。そのような脱分極電流の例は、Ｎａ＋、Ｃａ＋＋またはＣｌ−のチャンネル、イオノホアまたはそれらの組合せによって運ばれる電流であり得る。これらの細胞において、カリウムチャンネルの活性化剤は、内向きの脱分極電流と比較して、外向きのカリウム電流の相対的な寄与を増大させ、そうすることで膜電位をより負側にする（すなわち、膜電位をＥＫに一層近づける）。ｈ−ｅｒｇ２タンパク質を含有するカリウムチャンネルの活性化剤によってそのような細胞において引き起こされる膜電位の変化は、上記に記載されるＦＲＥＴを使用するアッセイによってモニターすることができる。
【００８７】
従って、本発明により、ｈ−ｅｒｇ２タンパク質を含有するカリウムチャンネルの活性化を特定する方法が提供される。この方法は、
（ａ）下記：
（１）ｈ−ｅｒｇ２タンパク質を含有するカリウムチャンネルおよび脱分極チャンネルがともに同じ細胞内で発現するように細胞におけるｈ−ｅｒｇ２タンパク質および脱分極チャンネルの発現を行わせる発現ベクター、
（２）細胞の形質膜の一方の側に結合する第１の蛍光色素、および
（３）膜電位の変化に応答して細胞の形質膜の一方の面から反対側の面に自由に分布する第２の蛍光色素、を含む細胞を提供すること、
（ｂ）ｈ−ｅｒｇ２タンパク質を含有するカリウムチャンネルの活性化剤であることが疑われる物質に細胞をさらすこと、
（ｃ）物質の存在下および非存在下で細胞における蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）量を測定すること、
（ｄ）物質の存在下および非存在下における細胞により示されるＦＲＥＴ量を比較すること、を含み、
この場合、物質の存在下における細胞により示されるＦＲＥＴ量が、物質の非存在下における細胞により示されるＦＲＥＴ量よりも大きい場合、その物質は、ｈ−ｅｒｇ２タンパク質を含有するカリウムチャンネルの活性化剤である。
【００８８】
上記に記載される方法によって特定される物質は、ｈ−ｅｒｇ２タンパク質を含有するカリウムチャンネルの活性化剤であり得るか、または脱分極電流（１つまたは複数）の阻害剤であり得る。これらの２つの可能性は、脱分極チャンネルを単独で発現させることによって、すなわち、別の細胞株において、ｈ−ｅｒｇ２タンパク質を含有するカリウムチャンネルを伴うことなく、脱分極チャンネルを単独で発現させることによって区別することができる。その後、物質は、脱分極電流を単独で含有する細胞に対して試験することができ、それにより、物質が脱分極電流を阻害し得るどうかを明らかにすることができる。あるいは、これらの物質は、物質がそのようなチャンネルの活性化剤であるかどうかを明らかにするための電圧クランプ実験で、ｈ−ｅｒｇ２タンパク質を含有するカリウムチャンネルについて直接的に試験することができる。
【００８９】
上記に記載される方法は、ｈ−ｅｒｇ２タンパク質を含有するカリウムチャンネルの阻害剤を特定するために同様に使用することができる。これは、阻害剤の存在により、ｈ−ｅｒｇ２チャンネルを介する電流の移動が阻止されるか、または減少し、従って、脱分極チャンネルの作用を中和するｈ−ｅｒｇ２チャンネルの能力を妨げるか、または小さくするからである。従って、本発明には、ｈ−ｅｒｇ２タンパク質を含有するカリウムチャンネルの阻害剤であり得る物質を特定する方法が包含される。この方法は、
（ａ）下記：
（１）ｈ−ｅｒｇ２タンパク質を含有するカリウムチャンネルおよび脱分極チャンネルがともに同じ細胞内で発現するように細胞におけるｈ−ｅｒｇ２タンパク質および脱分極チャンネルの発現を行わせる発現ベクター、
（２）細胞の形質膜の一方の側に結合する第１の蛍光色素、および
（３）膜電位の変化に応答して細胞の形質膜の一方の面から反対側の面に自由に分布する第２の蛍光色素、を含む細胞を提供すること、
（ｂ）ｈ−ｅｒｇ２タンパク質を含有するカリウムチャンネルの阻害剤であることが疑われる物質に細胞をさらすこと、
（ｃ）物質の存在下および非存在下で細胞における蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）量を測定すること、
（ｄ）物質の存在下および非存在下における細胞により示されるＦＲＥＴ量を比較すること、を含み、
この場合、物質の存在下における細胞により示されるＦＲＥＴ量が、物質の非存在下における細胞により示されるＦＲＥＴ量よりも小さい場合、その物質は、ｈ−ｅｒｇ２タンパク質を含有するカリウムチャンネルの阻害剤である。
【００９０】
上記に記載される方法によって特定された物質は、ｈ−ｅｒｇ２タンパク質を含有するカリウムチャンネルの阻害剤であり得るか、または脱分極電流（１つまたは複数）の活性化剤であり得る。これらの２つの可能性は、脱分極チャンネルを単独で発現させることによって、すなわち、ｈ−ｅｒｇ２タンパク質を含有するカリウムチャンネルを伴うことなく、別の細胞株において脱分極チャンネルを単独で発現させることによって区別することができる。その後、物質は、脱分極電流を単独で含有する細胞に対して試験することができ、それにより、物質が脱分極電流を活性化し得るどうかを明らかにすることができる。あるいは、これらの物質は、物質がｈ−ｅｒｇ２チャンネルの阻害剤であるかどうかを明らかにするための電圧クランプ実験で、ｈ−ｅｒｇ２を含有するカリウムチャンネルについて直接的に試験することができる。
【００９１】
上記に記載される方法の特定の実施形態において、脱分極チャンネルは、ナトリウムチャンネル、カルシウムチャンネル、非特異的なカチオンチャンネルもしくは塩化物チャンネル、またはイオノホアである。
【００９２】
上記に記載されるアッセイにおける物質の作用が、ｈ−ｅｒｇ２タンパク質を含有するカリウムチャンネルにおけるその作用により生じていることを確実にするために、細胞が、ｈ−ｅｒｇ２タンパク質の発現を行わせる発現ベクターを含有しないことを除いて、上記の通りであるコントロール実験を行うことができる。
【００９３】
上記に記載される方法の特定の実施形態において、発現ベクターは試験細胞にトランスフェクションされる。
【００９４】
上記に記載される方法の特定の実施形態において、ｈ−ｅｒｇ２タンパク質は、配列番号２、配列番号４、配列番号６および配列番号８からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する。上記に記載される方法の特定の実施形態において、発現ベクターは、配列番号１の５７位〜２９３０位、配列番号３の５７位〜２９３０位、配列番号５の５７位〜３０３８位または配列番号７の５７位〜２６９３位を含む。
【００９５】
上記に記載される方法の特定の実施形態において、第１の蛍光色素は、蛍光性レクチン；蛍光性リン脂質；クマリン標識されたホスファチジルエタノールアミン；Ｎ−（６−クロロ−７−ヒドロキシ−２−オキソ−２Ｈ−１−ベンゾピラン−３−カルボキサミドアセチル）−ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン；Ｎ−（７−ニトロベンゾ−２−オキサ−１，３−ジアゾル−４−イル）−ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン；および蛍光標識されたコムギ胚芽凝集素からなる群から選択される。
【００９６】
上記に記載される方法の特定の実施形態において、第２の蛍光色素は、蛍光アクセプターとして作用するオキソノール；ビス（１，３−ジアルキル−２−チオバルビツラート）トリメチンオキソノール；ビス（１，３−ジヘキシル−２−チオバルビツラート）トリメチンオキソノール；ビス（１，３−ジアルキル−２−チオバルビツラート）クアトラメチンオキソノール；ビス（１，３−ジアルキル−２−チオバルビツラート）ペンタメチンオキソノール；ビス（１，３−ジヘキシル−２−チオバルビツラート）ペンタメチンオキソノール；ビス（１，３−ジブチル−２−チオバルビツラート）ペンタメチンオキソノール；およびビス（１，３−ジアルキル−２−チオバルビツラート）ヘキサメチンオキソノールからなる群から選択される。
【００９７】
上記に記載される方法の特定の実施形態において、細胞は真核生物細胞である。別の実施形態において、細胞は哺乳動物細胞である。他の実施形態において、細胞は、Ｌ細胞Ｌ−Ｍ（ＴＫ−）（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ１．３）、Ｌ細胞Ｌ−Ｍ（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ１．２）、２９３（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１５７３）、Ｒａｊｉ（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ８６）、ＣＶ−１（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ７０）、ＣＯＳ−１（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１６５０）、ＣＯＳ−７（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１６５１）、ＣＨＯ−Ｋ１（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ６１）、３Ｔ３（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ９２）、ＮＩＨ／３Ｔ３（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１６５８）、ＨｅＬａ（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ２）、Ｃ１２７Ｉ（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１６１６）、ＢＳ−Ｃ−１（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ２６）、ＭＲＣ−５（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ１７１）である。
【００９８】
ｈ−ｅｒｇ２タンパク質を含有するカリウムチャンネルの活性化剤または阻害剤を特定するアッセイにおいて、ｈ−ｅｒｇ２に加えて別のカリウムチャンネルサブユニットを同時に発現させることは好都合であり得る。特に、ｅｒｇ１またはｅｒｇ３などの関連するカリウムチャンネルサブユニットを同時に発現させることが好都合であり得る。好ましくは、これは、そのような他のサブユニットをコード化する発現ベクターを細胞に同時トランスフェクションすることによって行われる。
【００９９】
上記に記載される方法は、「１つの」物質が、ｈ−ｅｒｇ２タンパク質を含有するカリウムチャンネルの活性化剤または阻害剤であるかどうかを試験することに明確に関しているが、そのような方法は、物質のコレクション（例えば、コンビナトリアルライブラリー、天然産物のコレクション）を試験して、そのようなコレクションのメンバーの複数が、ｈ−ｅｒｇ２タンパク質を含有するカリウムチャンネルの活性化剤または阻害剤であるかどうかを明らかにするために適合化され得ることは当業者には明かである。従って、物質のコレクション、またはそのようなコレクションの個々のメンバーもしくはそのようなメンバーの部分集団を、上記に記載される方法における物質として使用することは、本発明の範囲内である。特に、カリウムイオンチャンネルの調節に関係することが知られている化学構造を取り込むために設計されたライブラリー、例えば、カリウムチャンネルの活性化剤に関するジヒドロベンゾピランライブラリー（国際特許出願公開ＷＯ９５／３０６４２）またはカリウムチャンネルの阻害剤に関するビフェニル誘導体ライブラリー（国際特許出願公開ＷＯ９５／０４２７７）は特に注目されることが予想される。
【０１００】
本発明には、本明細書中に記載される方法によって特定された、ｈ−ｅｒｇ２タンパク質を含むカリウムチャンネルの活性化剤または阻害剤を含む医薬組成物が包含される。活性化剤または阻害剤は、一般には、医薬組成物を得るために、医薬適合性のキャリアと一緒にされる。そのようなキャリアの様々な例、活性化剤または阻害剤およびキャリアを含有する医薬組成物の配合方法の様々な例を、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（第１８版、１９９０、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ）に見出すことができる。効果的な投与に好適な医薬適合性の組成物を得るために、そのような組成物は、治療効果的な量の活性化剤または阻害剤を含有する。
【０１０１】
治療用または予防用の組成物は、ｈ−ｅｒｇ２タンパク質を含有するカリウムチャンネルの活性が異常である状態を処置または防止するために十分な量で個体に投与される。効果的な量は、個体の状態、体重、性別および年齢などの様々な要因に従って変化し得る。他の要因には、投与様式が含まれる。適切な量は通常の医師によって決定され得る。一般に、効果的な量は、成人１日あたり約０．０１ｍｇから約１，０００ｍｇであり、好ましくは約０．１ｍｇから約２５０ｍｇであり、さらにより好ましくは約１ｍｇから約５０ｍｇである。
【０１０２】
組成物は、適切な投薬量で単独で使用することができる。あるいは、他の薬剤との同時投与または連続投与が望ましいことがある。
【０１０３】
組成物は、従来の投与用ビヒクルにおける非常に様々な治療投薬形態物で投与することができる。例えば、組成物は、錠剤、カプセル（それぞれが徐放性および持続放出性の配合物を含む）、ピル、粉末剤、顆粒、エリキシル剤、チンキ剤、溶液剤、懸濁剤、シロップおよびエマルションのような経口投薬形態物で、または注射によって投与することができる。同様に、組成物はまた、静脈内（ボーラスおよび注入の両方）、腹腔内、皮下、閉塞を伴う局所的もしくは閉塞を伴わない局所的、または筋肉内の形態物で投与することができる。これらはすべて、製薬分野の当業者には十分に知られている形態物が使用される。
【０１０４】
組成物は単回日用量で投与することができ、または１日投薬量の総量を、１日あたり２回、３回、４回もしくはそれ以上の分割された用量で投与することができる。さらに、組成物は、好適な鼻腔内ビヒクルの局所的使用によって鼻腔内形態物で投与することができ、または当業者に十分に知られている経皮パッチのそのような形態物を使用して経皮経路によって投与することができる。経皮送達システムの形態で投与されるためには、投薬は、当然のことではあるが、投薬期間中を通して、断続的ではなく、連続している。
【０１０５】
本発明の組成物を利用する投薬法は、患者のタイプ、種、年齢、体重、性別および医学的状態；処置される状態の重篤度；投与経路；患者の腎機能、肝機能および心臓血管機能；ならびに用いられるその特定の化合物を含む様々な要因に従って選択される。通常の医師は、状態の進行を妨げるか、または打ち消すか、または停止させるために必要とされる組成物の効果的な量を容易に決定し、処方することができる。毒性を伴うことなく効き目をもたらす範囲に含まれる組成物濃度を達成することにおける最適な精度は、標的部位に対する組成物の利用性の速度論に基づく投薬法を必要とする。これには、組成物の分布、平衡および排出を検討することが含まれる。
【０１０６】
ｈ−ｅｒｇ２タンパク質を含有するカリウムチャンネルの阻害剤および活性化剤は、過度または不十分なカリウムチャンネル活性を伴う様々な疾患を処置するために有用である。
【０１０７】
ヒト腎臓におけるｈ−ｅｒｇ２の発現がノーザンブロット分析によって認められた。腎臓は、塩、水分およびｐＨバランスの調節に関与しており、多くの輸送体およびチャンネルの存在場所であり、その多くが現在利用できる利尿剤および他の抗高血圧剤に対する標的である（Ｐｕｓｃｈｅｔｔ、１９９４、Ｃａｒｄｉｏｌｏｇｙ、８４、増刊２：４〜１３）。ｈ−ｅｒｇ２の発現はまた前立腺でも認められた。ｈ−ｅｒｇ２の発現パターンは、ｈ−ｅｒｇ２タンパク質を含有するカリウムチャンネルの阻害剤および活性化剤が、低血圧症および高血圧症、腎不全、良性前立腺肥大、前立腺ガン、および不妊症を処置するために有用であり得ることを示唆している。
【０１０８】
本発明のｈ−ｅｒｇ２核酸およびｈ−ｅｒｇ２タンパク質は、他のイオンチャンネルの活性化剤および阻害剤を特定するために設計されたスクリーニングとの組合せにおいて有用である。標的のイオンチャンネルと特異的に相互作用する潜在的な医薬品を特定するために化合物をスクリーニングするとき、特定される化合物は標的のイオンチャンネルに対してできる限り特異的であることを確保することが必要がある。このためには、標的のイオンチャンネルに類似するイオンチャンネルのできる限り多数に対して化合物をスクリーニングすることが必要である。従って、イオンチャンネルＡと相互作用する潜在的な医薬品である化合物を見つけるためには、化合物がイオンチャンネルＡ（「プラス標的」）と相互作用し、イオンチャンネルＡを介して所望する薬理学的作用をもたらすことを確保することは十分ではない。化合物がイオンチャンネルＢ、Ｃ、Ｄなど（「マイナス標的」）と相互作用しないことを明らかにすることもまた必要である。薬物候補物である化合物がマイナス標的と相互作用しないことを明らかにするために使用される方法は、多くの場合、「逆スクリーニング」と呼ばれる。一般に、スクリーニングプログラムの一部として、できる限り多くのマイナス標的を逆スクリーニングにおいて使用することは重要である（Ｈｏｄｇｓｏｎ、１９９２、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１０：９７３〜９８０（９８０において）を参照のこと）。ｈ−ｅｒｇ２タンパク質、ｈ−ｅｒｇ２タンパク質をコード化するＤＮＡ、およびｈ−ｅｒｇ２タンパク質を発現するように操作されている組換え細胞は、それらが、他のイオンチャンネルと特異的に相互作用する化合物を特定するために設計されたスクリーニングにおける「マイナス標的」として使用され得るという点で有用である。例えば、Ｗａｎｇ他（１９９８、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２８２：１８９０〜１８９３）は、ＫＣＮＱ２およびＫＣＮＱ３が、「Ｍチャンネル」として知られているヘテロマーのカリウムイオンチャンネルを形成することを示している。Ｍチャンネルは、薬物開発に対する重要な標的である。これは、ＫＣＮＱ２およびＫＣＮＱ３における変異が、癲癇を生じさせることに関わっているからである（Ｂｉｅｒｖｅｒｔ他、１９９８、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２７９：４０３〜４０６；Ｓｉｎｇｈ他、１９９８、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．１８：２５〜２９；Ｓｃｈｒｏｅｄｅｒ他、Ｎａｔｕｒｅ、１９９８、３９６：６８７〜６９０）。Ｍチャンネルの活性化剤または阻害剤を特定するために設計されたスクリーニングプログラムは、ｈ−ｅｒｇ２タンパク質を含有するカリウムチャンネルをマイナス標的として使用することによって大きな利益を受ける。
【０１０９】
従って、本発明には、イオンチャンネルを調節する薬物候補物を特定するための方法であって、逆スクリーニングにおいてｈ−ｅｒｇ２を使用することを含む方法が包含される。そのような方法は、
（ａ）化合物が、ｈ−ｅｒｇ２でないイオンチャンネルの活性化剤または阻害剤であることを明らかにすること；および
（ｂ）化合物がｈ−ｅｒｇ２の活性化剤または阻害剤でないことを明らかにすること
を含む。
【０１１０】
当然のことではあるが、ｈ−ｅｒｇ２はまた、一次薬物標的がイオンチャンネルでない逆スクリーニングにおいても有益であり得る。従って、本発明には、薬物候補物がｈ−ｅｒｇ２の活性化剤または阻害剤でないことを明らかにするための方法が包含される。この方法は、
（ａ）ｈ−ｅｒｇ２でない薬物標的を選択すること、
（ｂ）薬物標的の活性化剤または阻害剤である化合物を特定するために化合物のコレクションをスクリーニングすること、および
（ｃ）工程（ｂ）で特定された化合物がｈ−ｅｒｇ２の活性化剤または阻害剤でないことを明らかにすること、を含む。
【０１１１】
本発明にはまた、ｈ−ｅｒｇ２タンパク質に対する抗体が包含される。そのような抗体はポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体であり得る。本発明の抗体は、当該分野で十分に知られている方法によって、全長のｈ−ｅｒｇ２タンパク質に対して、または好適なキャリア（例えば、血清アルブミンまたはキーホールリンペットヘモシアニン）に結合された好適な抗原性フラグメントに対して惹起させることができる。タンパク質の好適な抗原性フラグメントを特定する様々な方法が当該技術では知られている。例えば、Ｈｏｐｐ＆Ｗｏｏｄｓ、１９８１、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７８：３８２４〜３８２８；Ｊａｍｅｓｏｎ＆Ｗｏｌｆ、１９８８、ＣＡＢＩＯＳ（Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、４：１８１〜１８６を参照のこと。
【０１１２】
ポリクローナル抗体を作製する場合、ｈ−ｅｒｇ２タンパク質または抗原性フラグメントが、好適なキャリアに結合されて、例えば、ウサギ、ヒツジ、ヤギ、ラット、マウスなどの適切な非ヒト宿主動物に定期的に注射される。動物は定期的に採血され、得られた血清が、注射されたサブユニットまたは抗原性フラグメントに対する抗体の存在について試験される。注射は、筋肉内、腹腔内、皮下などに行うことができ、アジュバントを伴い得る。
【０１１３】
モノクローナル抗体を作製する場合、ｈ−ｅｒｇ２タンパク質または抗原性フラグメントが、好適なキャリアに結合されて、ポリクローナル抗体を作製するための上記のような適切な非ヒト宿主動物に注射される。モノクローナル抗体の場合、動物は、一般にはマウスである。動物の脾臓細胞が、その後、Ｋｏｈｌｅｒ＆Ｍｉｌｓｔｅｉｎ、１９７５、Ｎａｔｕｒｅ、２５６：４９５〜４９７に記載されるように、多くの場合にはミエローマ細胞との融合によって不死化される。モノクローナル抗体の作製のより詳しい説明については、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（編者：Ｈａｒｌｏｗ＆Ｌａｎｅ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、１９８８）を参照のこと。
【０１１４】
遺伝子治療を、ｈ−ｅｒｇ２タンパク質を標的器官の細胞に導入するために使用することができる。ｈ−ｅｒｇ２タンパク質をコード化するヌクレオチドは、受容細胞の感染によるヌクレオチドの移入を媒介するウイルスベクターに連結することができる。好適なウイルスベクターには、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、レンチウイルスおよびポリオウイルスに基づくベクターが含まれる。あるいは、ｈ−ｅｒｇ２タンパク質をコード化するヌクレオチドは、リガンド−ヌクレオチド結合体を使用する受容体媒介による標的化移入、リポフェクション、膜融合または直接的な顕微注入を含む非ウイルス技術によって遺伝子治療のために細胞に移すことができる。これらの手法およびその変法は、エクスビボ遺伝子治療ならびにインビボ遺伝子治療のために好適である。野生型ｈ−ｅｒｇ２タンパク質を用いた遺伝子治療は、ｈ−ｅｒｇ２カリウムチャンネルの活性を上昇させることが有益である疾患を処置するために特に有用である。ｈ−ｅｒｇ２タンパク質の優性ネガティブ変異型を用いた遺伝子治療は、ｈ−ｅｒｇカリウムチャンネルの活性を低下させることが有益である疾患を処置するために特に有用である。
【０１１５】
下記の非限定的な実施例は、本発明をよりよく例示するために示される。
【０１１６】
実施例１
ｈ−ｅｒｇ２ｃＤＮＡの特定およびクローニング
全長のｈ−ｅｒｇ２ｃＤＮＡを、ＰＣＲによって、下記の重複する３つの分離フラグメントとしてクローン化した：１）アミノ末端から膜貫通領域Ｓ１までのフラグメント、２）Ｓ１における重複領域から、環状ヌクレオチド結合ドメイン（ＣＮＢＤ）の下流（３’）で、Ｈ９６１７０のＥＳＴ配列内の領域までのフラグメント、および３）ＥＳＴ内の領域から３’非コード領域の一部までのフラグメント。ＰＣＲプライマーは、ゲノムＤＮＡデータベース検索から得られた配列から設計された。アミノ末端配列をコード化する２つの同一のｃＤＮＡが、下記のプライマー対を使用する標準的なＰＣＲ技術によって得られた：
【０１１７】
【化７】
2004535760.tif 000009
【０１１８】
Ｓ１〜ＣＮＢＤ領域が、下記のプライマー対を用いたＰＣＲによって同様にクローン化された：
【０１１９】
【化８】
2004535760.tif 000010
【０１２０】
Ｃ末端のｃＤＮＡ（ＣＮＢＤ後〜３’非翻訳部）が、下記のプライマー対を用いたＰＣＲによってクローン化された：
【０１２１】
【化９】
2004535760.tif 000011
【０１２２】
３つのクローンを配列決定した。１つが、配列番号５に示される１０８塩基対の挿入を有していた。１つのクローンが、配列番号７に示される２３７塩基対の欠失を有していた。２７２２位における一ヌクレオチド多型もまた、これらのｃＤＮＡおよび対応するゲノムＤＮＡの配列を比較することによって特定された。全長のＯＲＦをコード化するｃＤＮＡを、その後、標準的な分子生物学的技術によって３つの部分ｃＤＮＡから構築した。
【０１２３】
実施例２
ｈ−ｅｒｇ２の発現の分析
ノーザンブロット分析：
ヒトの心臓、脳、胎盤、肺、肝臓、骨格筋、腎臓、膵臓、脾臓、胸腺、前立腺、精巣、子宮、小腸、結腸および末梢血白血球から単離されたポリ（Ａ＋）ＲＮＡのノーザンブロットをＣｌｏｎｔｅｃｈ（Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、ＣＡ）から購入し、ＥＳＴ  Ｈ９６１７０に由来する３２Ｐ標識プローブでプローブした。このプローブは、下記のプライマーを使用する標準的なＰＣＲ技術によって構築された：
【０１２４】
【化１０】
2004535760.tif 000012
【０１２５】
このＰＣＲフラグメントを精製し、ランダムプライミンングによって、１０９ｃｐｍ／μｇＤＮＡを越える比活性に［３２Ｐ］ｄＣＴＰで標識した。ハイブリダイゼーションは、５ＸＳＳＰＥ、１０Ｘデンハルト溶液、５０％ホルムアミド、１００μｇ／ｍｌのサケ精子ＤＮＡ、２％ＳＤＳ、および５ｘ１０７ｃｐｍの３２Ｐ標識プローブを含有する溶液において、４２℃で一晩行われた。ブロットは、２ＸＳＳＣ、０．０５％ＳＤＳにおいて、４２℃で１５分間〜２０分間、３回、その後、１ＸＳＳＣ、０．０５％ＳＤＳにおいて、５０℃で１５分間〜２０分間、３回行われた。ハイブリダイゼーションは、ブロットをＫｏｄａｋ社のＸ線フィルムに感光させることによって検出された。
【０１２６】
本発明は、本明細書中に記載される特定の実施形態によって範囲が限定されるべきではない。実際、本明細書中に記載される改変に加えて、本発明の様々な改変が、前記の記載から当業者には明らかになる。そのような改変は、添付された請求項の範囲に含まれるものとする。
【０１２７】
様々な刊行物が本明細書中に引用されているが、それらの開示はその全体が参考として組み込まれる。
【図面の簡単な説明】
【図１Ａ−１】
ｈ−ｅｒｇ２をコード化するｃＤＮＡ配列（配列番号１）を示す。
【図１Ａ−２】
ｈ−ｅｒｇ２をコード化するｃＤＮＡ配列（配列番号１）を示す。
【図１Ｂ】
図１ＡのｃＤＮＡに対応するアミノ酸配列（配列番号２）を示す。
【図２Ａ−１】
配列番号１と比較して、単一ヌクレオチド多型を有する、ｈ−ｅｒｇ２をコード化するｃＤＮＡ配列（配列番号３）を示す。
【図２Ａ−２】
配列番号１と比較して、単一ヌクレオチド多型を有する、ｈ−ｅｒｇ２をコード化するｃＤＮＡ配列（配列番号３）を示す。
【図２Ｂ】
配列番号３によってコードされるアミノ酸配列（配列番号４）を示す。
【図３Ａ−１】
配列番号１と比較して、２２８９位に１０８塩基対の挿入を有するｈ−ｅｒｇ２の推定スプライス変化体をコード化するｃＤＮＡ配列（配列番号５）を示す。
【図３Ａ−２】
配列番号１と比較して、２２８９位に１０８塩基対の挿入を有するｈ−ｅｒｇ２の推定スプライス変化体をコード化するｃＤＮＡ配列（配列番号５）を示す。
【図３Ｂ】
配列番号５によってコードされるアミノ酸配列（配列番号６）を示す。
【図４Ａ−１】
配列番号１と比較して、２６３７位から始まる２３７塩基対の欠失を有するｈ−ｅｒｇ２の推定スプライス変化体をコード化するｃＤＮＡ配列（配列番号７）を示す。
【図４Ａ−２】
配列番号１と比較して、２６３７位から始まる２３７塩基対の欠失を有するｈ−ｅｒｇ２の推定スプライス変化体をコード化するｃＤＮＡ配列（配列番号７）を示す。
【図４Ｂ】
図４Ｂは、配列番号７によってコードされるアミノ酸配列（配列番号８）を示す。
【図５Ａ−１】
ｈ−ｅｒｇ２（配列番号２）、ヒトｅｒｇ１（ｈ−ｅｒｇ１）（配列番号９；ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号Ｕ０４２７０）およびラットｅｒｇ２（配列番号１０；ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号ＡＦ０１６１９２）のアミノ酸配列アラインメントを示す。
【図５Ａ−２】
ｈ−ｅｒｇ２（配列番号２）、ヒトｅｒｇ１（ｈ−ｅｒｇ１）（配列番号９；ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号Ｕ０４２７０）およびラットｅｒｇ２（配列番号１０；ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号ＡＦ０１６１９２）のアミノ酸配列アラインメントを示す。
【図５Ｂ】
ｈ−ｅｒｇ２（配列番号２）、ヒトｅｒｇ１（ｈ−ｅｒｇ１）（配列番号９；ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号Ｕ０４２７０）およびラットｅｒｇ２（配列番号１０；ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号ＡＦ０１６１９２）のアミノ酸配列アラインメントを示す。
【図６】
ｈ−ｅｒｇ２が腎臓および前立腺において特異的に発現することを明らかにする多組織ノーザンブロットの結果を示す。
【図１Ａ−１】
2004535760.tif 000013
【図１Ａ−２】
2004535760.tif 000014
【図１Ｂ】
2004535760.tif 000015
【図２Ａ−１】
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【図２Ａ−２】
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【図２Ｂ】
2004535760.tif 000018
【図３Ａ−１】
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【図３Ａ−２】
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【図３Ｂ】
2004535760.tif 000021
【図４Ａ−１】
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【図４Ａ−２】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ−１】
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【図５Ａ−２】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【国際公開パンフレット】
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