(57)【要約】本発明は、bcl-2、bcl-xl、bcl-w、bfl-1、brag-1、Mcl-1およびA1からなる群より選択されるbcl-2のメンバーから転写されるmRNAを特異的に切断するDNAザイムを提供する。該DNAザイムは、(a)ヌクレオチド配列GGCTAGCTACAACGA（配列番号1）を有し、標的とする任意のプリン：ピリミジン切断部位でmRNAを切断する触媒ドメイン、（b）触媒ドメインの5’末端に隣接する結合ドメイン、および（c）触媒ドメインの3’末端に隣接するもう１つの結合ドメインからなり、両結合ドメインは、bcl-2遺伝子ファミリーのmRNA内の、DNAザイムにより触媒切断されるべき切断部位のプリン残基に隣接する2つの領域に相補的であるためにこれらにハイブリダイズし、各結合ドメインは少なくとも6ヌクレオチド長からなり、両結合ドメインは合計すると少なくとも14ヌクレオチド長であることを特徴とする。【特許請求の範囲】
【請求項１】
bcl-2、bcl-xl、bcl-w、bfl-1、brag-1、Mcl-1およびA1からなる群より選択されるbcl-2遺伝子ファミリーのメンバーから転写されたmRNAを特異的に切断するDNAザイムであって：(a)ヌクレオチド配列GGCTAGCTACAACGAを有し、標的とする任意のプリン：ピリミジン切断部位でmRNAを切断する触媒ドメイン、（b）触媒ドメインの5’末端に隣接する結合ドメイン、および（c）触媒ドメインの3’末端に隣接するもう１つの結合ドメインからなり、両結合ドメインは、bcl-2遺伝子ファミリーのmRNA内の、DNAザイムにより触媒切断されるべき切断部位のプリン残基に隣接する2つの領域に相補的であるために、これらにハイブリダイズし、各結合ドメインは少なくとも6ヌクレオチド長からなり、両結合ドメインは合計すると少なくとも14ヌクレオチド長であることを特徴とする、上記DNAザイム。
【請求項２】
29〜39ヌクレオチド長である請求項１に記載のDNAザイム。
【請求項３】
bcl-2遺伝子ファミリーのメンバーがbcl-2またはbcl-xlである、請求項１または２に記載のDNAザイム。
【請求項４】
配列番号7〜61に記載の配列からなる群より選択される配列を有する、請求項１〜３のいずれか1項に記載のDNAザイム。
【請求項５】
bcl-2 mRNAを、その455位、729位、1432位、1806位または2093位で切断する、請求項１〜４のいずれか1項に記載のDNAザイム。
【請求項６】
配列番号24、45、53、55または57に示す配列を有する、請求項１〜５のいずれか1項に記載のDNAザイム。
【請求項７】
配列番号62〜87に記載の配列からなる群より選択される配列を有する、請求項１〜３のいずれか1項に記載のDNAザイム。
【請求項８】
bcl-xl mRNAを、その126位、129位または135位で切断する、請求項１〜３および請求項７のいずれか1項に記載のDNAザイム。
【請求項９】
配列番号82、83または84に示す配列を有する、請求項１〜３、請求項７および請求項８のいずれか1項に記載のDNAザイム。
【請求項１０】
1〜6個のホスホロチオネート結合がDNAザイムの5’末端および3’末端のそれぞれに導入されている、請求項１〜９のいずれか1項に記載のDNAザイム。
【請求項１１】
DNAザイムが3'-3'転位、N3'-P5'ホスホルアミデート結合、ペプチド核酸結合および2'-O-メチルからなる群より選択される少なくとも１つの修飾を含む、請求項１〜１０のいずれか1項に記載のDNAザイム。
【請求項１２】
薬学的に許容され得る担体および少なくとも１つの請求項１〜１１のいずれか1項に記載のDNAザイムを含む医薬組成物。
【請求項１３】
タキソール、ダウノルビシン、ダシチノマイシン、ドキソルビシン、ブレオマイシン、マイトマイシン、ナイトロジェンマスタード、クロランブシル、メルファラン、シクロホスファミド、6-メルカプトプリン、6-チオグアニン、シタラビン、5-フルロウラシル、フロクスウリジン、メトトレキセート、コルヒチン、ビンクリスチン、ビンラスチン、エトポシドおよびシスプラチンからなる群から選択される少なくとも１つの化学療法剤をさらに含む、請求項1２に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
被検者に請求項12または13に記載の組成物を投与することを含む、被検者の腫瘍を治療する方法。
【請求項１５】
治療のために、悪性腫瘍またはウィルス感染細胞の感受性を強化する方法であって、請求項１〜11のいずれか1項に記載のDNAザイムまたは請求項12もしくは13に記載の医薬組成物を用いて、bcl-2、bcl-xl、bcl-w、bfl-1、brag-1、Mcl-1およびA1からなる群より選択されるbcl-2遺伝子ファミリーのメンバーの発現レベルを調節することを含む、上記方法。
【請求項１６】
少なくとも１つの請求項１〜12のいずれか1項に記載のDNAザイムを含む第1成分と抗癌剤を含む第2成分とを被験者に投与することを含む、被験者の腫瘍を治療する方法。
【請求項１７】
抗癌剤が、タキソール、ダウノルビシン、ダシチノマイシン、ドキソルビシン、ブレオマイシン、マイトマイシン、ナイトロジェンマスタード、クロランブシル、メルファラン、シクロホスファミド、6-メルカプトプリン、6-チオグアニン、シタラビン、5-フルロウラシル、フロクスウリジン、メトトレキセート、コルヒチン、ビンクリスチン、ビンラスチン、エトポシドおよびシスプラチンからなる群から選択される、請求項16に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、bcl-2遺伝子ファミリーを標的とするDNAザイムおよびそれらの癌治療への使用に関する。本発明はさらに、ヒト癌の治療および／または発症の抑制のために、これらのDNAザイムの使用に関する。DNAザイムは、bcl-2遺伝子ファミリーのメンバーから転写されるmRNAを切断することにより、直接癌細胞のアポトーシスを誘発するか、かつ／または癌細胞の化学療法剤への感受性を増大させることによって、これを達成する。
【背景技術】
【０００２】
アポトーシスおよびbcl-2遺伝子ファミリー
アポトーシスは、細胞の破壊の調節をもたらす複雑なプロセスであり、正常な発達、外傷および発癌に対する細胞応答において、重要な役割を担っている(Ellisら、1991)。アポトーシスの構成因子は、癌、ウィルス感染およびいくつかの神経疾患を含む多くのヒト疾患病理に貢献したり、または原因となっていることが示唆されている（AshkenaziおよびDixit、1998、Vocero Akbaniら、1999、Yakovlevら、1997）。
【０００３】
bcl-2タンパク質ファミリーは、アポトーシス経路の分子のうち最も研究されている１つである。bcl-2遺伝子は、最初にBリンパ球細胞で同定され、病因となる遺伝子傷害がbcl-2遺伝子を配置する染色体転移（t（14:18））として解析されているが、これにより免疫グロブリンプロモーターの制御下に位置することになる。その結果生じるbcl-2の過剰発現は、Ｂ細胞ホメオスタシスを維持するアポトーシス細胞死の正常な経過を遅延させ、Ｂ細胞蓄積およびろ胞性リンパ腫をもたらす（AdamsおよびCory、1998）。この観察は、厳密には、癌は無秩序な細胞増殖に起因するのではなく、不十分なアポトーシスによる代謝回転による場合があることを示した。ろ胞性リンパ腫の他の広範なヒト癌において、bcl-2レベルは上昇する。このことは、この分子が、広範な癌性障害におけるアポトーシスの閾値を上昇させる役割を有し得ることを示す。
【０００４】
bcl-2遺伝子ファミリーは、アポトーシス経路に関与する少なくとも16のメンバーを有する。このファミリーの遺伝子には、bax、bak、bcl-X、bad、bid、bikおよびhrk等のアポトーシス誘導因子と、その他のbcl-2、bcl-XL、bcl-w、bfl-1、brag-1、Mcl-1およびA1のアポトーシス抑制因子がある（Reed、1998）。bcl-2ファミリーメンバーは、例えば、ミトコンドリア外膜におけるチトクロームc（Cyt c）および他の膜間タンパク質が通過できる小孔の形成、プロアポトーシスファミリーメンバーと抗アポトーシスファミリーメンバーとのヘテロ二量体形成などの多くの異なる機構で作用することが提唱されてきた（Reed、2000）。
【０００５】
bcl-2レベルの減少またはbcl-2活性の阻害が、アポトーシスを引き起こし得るか、またはアポトーシス死に対する細胞の感度を高め得ることが示唆された。細胞死調節タンパク質（これらのタンパク質に対して、従来のインヒビターは開発された）のこのファミリーの生化学的作用機構または活性が明らかにされることなく、遺伝子治療およびアンチセンス・アプローチが合理的な代替法となってきていた。例えば、全ホスホロチオネート化bcl-2の18merのアンチセンス・オリゴデオキシヌクレオチド（ODN）、ヒトbcl-2オープンリーディングフレームの最初の6つのコードンを標的とするアンチセンス・オリゴデオキシヌクレオチドG 3139は、前臨床および臨床研究の両方において非常に有望な結果を示した（Jansenら、1998; Waterら、2000）。このアンチセンス分子は、bcl-2mRNAに結合して、mRNAのbcl-2タンパク質への翻訳を阻害し、該mRNAをRNAse Hによる分解の対象とする。その結果、処理された細胞でのbcl-2レベルは減少し、これにより、プロアポトーシスファミリーのメンバーと抗アポトーシスファミリーのメンバーとのバランスを変え、プロアポトーシスメンバーによりアポトーシスが起こる。
【０００６】
同様の方法を用いて、他のbcl-2遺伝子ファミリーメンバーである、bcl-xlに対するアンチセンス・オリゴヌクレオチドもまた、bcl-xl発現のダウンレギュレーションを活性化し、一部の癌細胞で化学療法感受性を増加させることが示されている（Zangemeiste-Wittkeら、2000）。
【０００７】
触媒DNA（DNAザイム）
ヒト遺伝子治療において、アンチセンスの核酸工学は、その発現が疾患を引き起こすので望ましくない遺伝子を不活性化するために選択される主要なツールの1つであった。アンチセンスアプローチは、それが望ましくない遺伝子をコードするmRNA分子に相補的であるためにハイブリダイズする核酸分子を使用する。この種のハイブリダイゼーションは、遺伝子発現の阻害をもたらす。
【０００８】
アンチセンス技術には、欠点がある。アンチセンスハイブリダイゼーションは、DNA/標的mRNAヘテロ二量体形成を生じさせる。このヘテロ二量体形成が、RNAse Hによる標的mRNA分子分解の基質が標的mRNA成分となる。ここで、それが単に内因性のRNAse H酵素によって必然的な切断を容易にするだけであるという点で、DNAアンチセンス分子は、消極的に働き、内因性のRNAse H酵素によって所望の切断が容易になるに過ぎない。RNAse Hへの依存は、それらの化学構造に基づくアンチセンス分子の設計およびそれらの標的mRNAとの安定なヘテロ二量体の形成能力に限界を与える。アンチセンスＤＮＡ分子も、高濃度における非特異的活性に関する課題があり、かつ毒性も問題である。
【０００９】
アンチセンス分子の代替として、触媒核酸分子が、遺伝子発現を抑制するための治療薬としての将来性を示し、文献において広く議論されている（HaseloffおよびGerlach 1988; Breaker 1994; Koizumi、1993; Kashani-Sabetら1992;Raillardら1996; およびCarmiら1998）。したがって、従来のアンチセンス分子とは異なり、触媒核酸分子は、分子が単にそれに結合するだけではなく、その標的mRNA分子を実際に切断することによって機能する。その標的配列が、特定の最小必要量を満たす場合、触媒核酸分子は標的核酸配列のみを切断することが可能である。標的配列は触媒核酸のハイブリダイズする領域に相補的でなければならず、かつ標的は切断の部位で特異的な配列を含まなければならない。
【００１０】
触媒リボゾームRNA（「リボザイム」）は、よく論述されており（HaseloffおよびGerlach, 1988; Simonds, 1994; およびSunら1997）、RNA（HaseloffおよびGerlach 1988）およびDNA（Raillardら1996）分子の両方を切断することができることが示された。実際に、in vitroでの選抜および進化技法の発達は、開始点として周知のリボザイムのいずれのランダム変異株またはランダム配列RNAを用いて周知の基質に対する新しいリボザイムを得ることを可能にした（Pan, 1997; TsangおよびJoyce1996; およびBreaker 1994）。
【００１１】
しかし、リボザイムはそれらが機能しようとする細胞内で非常に酵素的加水分解を受け易い。これが、かえって、リボザイムの薬剤用途の制限となる。
【００１２】
最近、「DNAザイム」と呼ばれる新規な類の触媒分子が作製された（BreakerおよびJoyce 1995; SantoroおよびJoyce 1997）。DNAザイムは、一本鎖であり、RNA（Breaker 1994;SantoroおよびJoyce 1997）およびDNA（Carmiら1998）の両方を切断する。DNAザイムの一般的モデルが提唱され、「10-23」モデルとして知られている。「10-23」モデルに沿ったDNAザイムは、単に「10-23 DNAザイム」と呼ばれ、それぞれ７〜９デオキシリボヌクレオチドからなる２つの基質認識ドメインに挟まれた15デオキシリボヌクレオチドからなる触媒ドメインを含む。in vitro分析により、この種のDNAザイムが、生理学的条件下で効果的にその基質RNAをプリン：ピリミジン結合部で切断することができることが示された（SantoroおよびJoyce 1998）。
【００１３】
いくつかのグループは、生物学的な系でのDNAザイムの活性を検討した。c-mycを標的とするDNAザイム分子が、血清刺激後、SMC増殖を抑制することがわかった（Sunら1997）。2つの研究により、フィラデルフィア染色体陽性白血病細胞のbcr-abl融合を標的とするDNAザイムの活性および特異性が調べられた（Wuら1999）。これらのDNAザイムの活性は、有利にハンマーヘッド型リボザイムおよびアンチセンス・オリゴヌクレオチドを用いたそれ以前の研究に匹敵した（Gewirtzら1998）。
【００１４】
近年、転写因子Egr-1を標的とする10-23DNAザイムが、培養細胞において平滑筋細胞増殖を抑制すること、および結合損傷（ligation injury）またはバルーン血管形成術によって損傷を受けたラット頸動脈の新規内膜（neointima）形成を抑制することが示された（Santiagoら1999）。Egr-1の抑制はまた、それぞれノーザンまたはウェスタンブロット解析による処理後の平滑筋細胞のRNAおよびタンパク質レベルにより解析された。これにより初めて、生体内DNAザイムの作用が証明され、さらに、この抗Egr-1分子によって示される活性には、再狭窄のような心臓血管疾患のさまざまな形式での潜在的な用途が見出された。
【発明の開示】
【００１５】
本発明の発明者は、bcl-2の遺伝子ファミリーメンバーの発現レベルがDNAザイムによって抑制されることができることを見出した。
【００１６】
したがって、本発明の第１の態様は、bcl-2遺伝子ファミリーのメンバーから転写されたmRNAを特異的に切断するDNAザイムであって：(a)ヌクレオチド配列GGCTAGCTACAACGA（配列番号１）を有し、標的とする任意のプリン：ピリミジン切断部位でmRNAを切断する触媒ドメイン、（b）触媒ドメインの5’末端に隣接する結合ドメイン、および（c）触媒ドメインの3’末端に隣接するもう１つの結合ドメインからなり、両結合ドメインは、bcl-2遺伝子ファミリーのmRNA内の、DNAザイムにより触媒切断されるべき切断部位のプリン残基に隣接する2つの領域に相補的であるためにこれらにハイブリダイズし、各結合ドメインは少なくとも6ヌクレオチド長からなり、両結合ドメインは合計すると少なくとも14ヌクレオチド長であることを特徴とする、上記DNAザイムである。
【００１７】
本発明はまた、触媒性DNAザイムを用いて、bcl-2遺伝子ファミリーのメンバーの発現レベルを調節することによる、悪性腫瘍またはウィルス感染細胞の感受性を強化する治療方法を提供する。
【００１８】
bcl-2遺伝子ファミリーメンバーが、bcl-2、bcl-xl、bcl-w、bfl-1、brag-1、Mcl-1およびA1からなる群より選択されることが好ましい。特に好ましくは、bcl-2遺伝子ファミリーメンバーがbcl-2またはbcl-xlである。
【００１９】
発明の詳細な説明
本発明の第１の態様において、bcl-2、bcl-xl、bcl-w、bfl-1、brag-1、Mcl-1およびA1からなる群より選択されるbcl-2遺伝子ファミリーのメンバーから転写されたmRNAを特異的に切断するDNAザイムであって：(a)ヌクレオチド配列GGCTAGCTACAACGA（配列番号1）を有し、標的とする任意のプリン：ピリミジン切断部位でmRNAを切断する触媒ドメイン、（b）触媒ドメインの5’末端に隣接する結合ドメイン、および（c）触媒ドメインの3’末端に隣接するもう１つの結合ドメインからなり、両結合ドメインは、bcl-2遺伝子ファミリーのmRNA内の、DNAザイムにより触媒切断されるべき切断部位のプリン残基に隣接する2つの領域に相補的であるためにこれらにハイブリダイズし、各結合ドメインは少なくとも6ヌクレオチド長からなり、両結合ドメインは合計すると少なくとも14ヌクレオチド長であることを特徴とする、上記DNAザイムが提供される。
【００２０】
本発明はまた、触媒性DNAザイムを用いて、bcl-2、bcl-xl、bcl-w、bfl-1、brag-1、Mcl-1およびA1からなる群より選択されるbcl-2遺伝子ファミリーのメンバーの発現レベルを調節することを含む、悪性腫瘍またはウィルス感染細胞の感受性を強化する治療方法を提供する（表6を参照）。
【００２１】
好ましい実施例において、DNAザイムは29〜39ヌクレオチド長である。
【００２２】
bcl-2遺伝子ファミリーメンバーがbcl-2またはbcl-xlであることが好ましい。bcl-2遺伝子ファミリーメンバーがbcl-2である場合、好ましくは、DNAザイムは表1に列挙されるものから選ばれる。bcl-2遺伝子ファミリーメンバーがbcl-xlである場合、好ましくは、DNAザイムは表2に列挙されるものから選ばれる。
【００２３】
DNAザイムがbcl-2 mRNAを切断する場合、DNAザイムがbcl-2 mRNA（配列番号2）の455、729、1432、1806または2093位でbcl-2 mRNAを切断することが更に好ましい。DNAザイムの配列が配列番号24、45、53、55または57に示される配列を有することは、特に好ましい。
【００２４】
DNAザイムがbcl-xl mRNAを切断する場合、DNAザイムがbcl-xl mRNA（配列番号3）の126、129または135位で、bcl-xl mRNAを切断することが更に好ましい。DNAザイムの配列が配列番号82、83または84に示される配列を有することは、特に好ましい。
【００２５】
本発明は、bcl-2遺伝子ファミリーメンバー、特にヒトbcl-2およびbcl-xl遺伝子の発現を調節することができるDNAザイム化学物質を包含する。これらの遺伝子はアポトーシスを抑制するので、これらの遺伝子のインヒビター、特に本発明のDNAザイム化学物質などのbcl-2およびbcl-xlの特異的インヒビターはアポトーシスの促進因子として必要とされる。
【００２６】
より具体的には、本出願は、bcl-2およびbcl-xl遺伝子のmRNAを特異的に切断するDNAザイムを提供する。該DNAザイムは、(a)ヌクレオチド配列GGCTAGCTACAACGAを有し、標的とする任意のプリン：ピリミジン切断部位でmRNAを切断する触媒ドメイン、（b）触媒ドメインの5’末端に隣接する結合ドメイン、および（c）触媒ドメインの3’末端に隣接するもう１つの結合ドメインからなり、両結合ドメインは、bcl-2およびbcl-xl遺伝子それぞれのmRNA内の、DNAザイムにより触媒切断されるべき切断部位のプリン残基に隣接する2つの領域に相補的であるためにこれらにハイブリダイズし、各結合ドメインは少なくとも6ヌクレオチド長からなり、両結合ドメインは合計すると少なくとも14ヌクレオチド長であることを特徴とする。
【００２７】
本明細書中で使用する場合、「DNAザイム」は特定の標的核酸配列を特異的に認識するDNA分子を意味し、標的核酸配列は、標的遺伝子から転写されたプレ体mRNAまたはmRNAのいずれかである。該DNAザイムはRNAを切断し、図１に示すように歴史的な理由から「10-23」モデルと呼ばれる。このタイプのDNAザイムは、Santoroら1997に記載されている。10-23DNAザイムが必要とするRNA標的配列は、NNNNNNNR*YNNNNNN、NNNNNNNNR*YNNNNNまたはNNNNNNR*YNNNNNNN（R*Yが切断部位であり、RはAまたはGであり、YはUまたはCであり、かつ、NはG、U、CまたはAである）からなる任意のRNA配列である。
【００２８】
本発明のパラメータのうち、結合ドメインの長さ（本願明細書において「アームの長さ」とも呼ぶ）はいかなる組み合わせでもよく、同じであっても異なってもよい。好ましい実施形態において、各々の結合ドメインは、9ヌクレオチド長である。
【００２９】
本発明では、bcl-2、bcl-xl、bcl-w、bfl-1、brag-1、Mcl-1およびA1からなる群より選択されるbcl-2遺伝子ファミリーメンバーから転写されたmRNA内の任意の隣接プリン：ピリミジンヌクレオチド対は、切断部位として提供され得る。好ましい実施形態において、プリン：ウラシルがプリン：ピリミジン切断部位である。
【００３０】
本明細書中で使用する場合、用語「特異的に切断する」とは、特にin vivoで特定の遺伝子から転写されたmRNAを切断し、遺伝子の活性を調節するDNAザイムをいう。
【００３１】
DNAザイム化学物質が特定の核酸を標的とすることは、一般に多段階式のプロセスである。該プロセスは通常、機能調節を受け得る核酸配列を認識することに始まる。該核酸配列は、例えば、発現が特定の障害または疾病状態に関連する細胞の遺伝子（または遺伝子から転写されたmRNA）または感染物質由来の核酸分子のものでありうる。本発明において、好適な標的はbcl-2遺伝子ファミリーメンバー、特に、bcl-2およびbcl-xlをコードする核酸である。標的化プロセスはまた、所望の効果、例えばタンパク質の検出または修飾が可能なように、DNAザイム触媒活性に対する該遺伝子内の部位を特定することを含む。本発明に関連して、好適な標的部位は複合的なin vitroでの選択または細胞に基づくスクリーニング・アッセイにより決定される。
【００３２】
DNAザイムによる処理を適用することにおいて、DNAザイムが細胞内の環境での分解に対してできるだけ安定性を有していることが重要である。これを達成する1つの手段は、DNAザイムの両方の末端をホスホロチオネート(phosphorothioate)修飾を施すことである。したがって、好ましい実施形態において、2つのホスホロチオネート結合は、DNAザイムの5'末端および3'末端の両方ともに導入される。ホスホロチオネート修飾に加えて、DNAザイムはさらなる修飾を含むことができる。例えば、3'末端の3'-3'転位、N3'-P5'ホスホルアミデート結合、ペプチド核酸結合および2'-O-メチルが挙げられる。これらは、当技術分野の公知技術である（Wagner 1995）。
【００３３】
本発明のDNAザイムは、診断、治療および予防のための、ならびに研究試薬およびキットとして利用できる。好ましい治療では、bcl-2遺伝子ファミリーメンバー、特にbcl-2およびbcl-xlの発現調節により治療可能な疾患または障害を有することが疑われる動物、好ましくはヒトに、本発明のDNAザイム化学物質を投与することにより治療されうる。
【００３４】
本発明のDNAザイム化学物質は試験および診断に有用である。その理由は、以下のとおりである。これらの化学物質は、bcl-2およびbcl-xlをコードする核酸にハイブリダイズし、これを切断するので、これを検出するためのアッセイは容易に確立できる。検出のための手段は、例えば、DNAザイムの基質に蛍光色素および失活剤を連結することを含む。
【００３５】
本発明はまた、本発明のDNAザイム化学物質を含む医薬組成物および製剤を包含する。
【００３６】
本発明の医薬組成物は、局部または全身処理のいずれが好ましいか、および治療される部位に応じて、種々の方法で投与することができる。投与は、局部投与、肺投与、経口投与でありえるか非経口投与であり得る。
【００３７】
局所的投与用の医薬組成物および製剤は、経皮パッチ、軟膏、ローション、クリーム、ゲル、ドロップ、坐薬、噴霧、液体および粉末を含むことができる。通常の製薬に用いられる担体、水溶液、粉末または油性基剤、増粘剤などが必須であるか、または望ましい場合がある。
【００３８】
経口投与用組成物および製剤は粉末または粒剤、水または非水性媒体の懸濁液または溶液、カプセル被覆剤または錠剤を含む。
【００３９】
本発明のDNAザイムは、抗腫瘍治療（例えば化学療法および放射線療法）に、腫瘍細胞の感受性を増大させるために用いることができる。
【００４０】
したがって、本発明のある実施形態では、(a)1種以上の本発明のDNAザイム化学物質および(b)非ハイブリダイゼーションメカニズムにより機能する1種以上の化学療法剤を含むリポソームならびに他の組成物が提供される。この種の化学療法剤の例としては、抗癌薬（例えばタキソール、ダウノルビシン、ダシチノマイシン、ドキソルビシン、ブレオマイシン、マイトマイシン、ナイトロジェンマスタード、クロランブシル、メルファラン、シクロホスファミド、6-メルカプトプリン、6-チオグアニン、シタラビン、5-フルロウラシル、フロクスウリジン、メタトレキセート、コルヒチン、ビンクリスチン、ビンラスチン、エトポシド、シスプラチン）を含むが、これに限定されるものではない。一般的には、The Merck Manual of Diagnosis and Therapy、第15版.、Berkowら編、1987、Rahway、N.J.、pp 1206 1228を参照。
【００４１】
治療用組成物の製剤およびこれに続く投与は、当業者には公知である。投薬は治療されるべき疾患の重篤度および応答に依存している。治療は、治癒が見とめられるかまたは疾患症状の減少が得られるまで数日〜数カ月まで持続して遂行される。最適投薬スケジュールは、患者の身体の薬剤蓄積の計測から決定されることができる。当業者であれば、容易に最適供与量、投薬方法論および反復速度を決めることができる。一般に、投与量は体重１kgにつき0.01gから100gまでであり、毎日、毎週、毎月または毎年の周期で投与することができる。
【００４２】
更なる態様においては、本発明は、本発明の第1の態様のDNAザイムを含む組成物を被験者に投与する方法である。
【００４３】
好ましい態様においては、組成物は化学療法剤を更に含む。
【００４４】
この明細書中では、用語「含む」またはその活用形は、記載された、要件、整数もしくは工程、または要件、整数もしくは工程の群を含むことを意味し、他の要件、整数もしくは工程または要件、整数もしくは工程の群を排除する意味ではない。
【００４５】
本明細書中に引用する刊行物はすべて、本願明細書に援用するものとする。
【００４６】
本願明細書に含まれる行為、材料、装置、条項等の記述は、単に本発明を説明するためのものである。これらの一部または全部が、優先権主張の基礎となる出願の一部をなすものであると解釈されるべきではなく、また、本出願の各請求項の優先日前にオーストラリアに存在した本出願の関連技術分野の一般的な技術常識であると解釈されるべきではない。
【００４７】
本発明の特徴がより明確に理解されるために、本発明の好ましい実施形態を以下の実施例により説明する。
【実施例】
【００４８】
実施例1
bcl-2およびbcl-xl mRNAの切断可能部位の確認
2つの遺伝子、Bcl-2およびBcl-XLは、癌の治療のためのDNAザイムの標的として選択した。これらの遺伝子は、bcl-2ファミリーに属し、両方ともアポトーシス抑制因子である。これらの産物は、悪性黒色腫、卵嚢癌、リンパ腫および前立腺癌を含む多種の癌で高いレベルで見とめられる。
【００４９】
DNAザイムの設計のためのbcl-2mRNAの切断部位の確認：
31bpの5'UTR、720bpのORF、および2.2kbの3'UTR配列を含むBcl-2 cDNAの一部分を、細胞のRNAから得た。bcl-2クローンに対応するmRNAを走査することによって、210の潜在的AUおよびGUの切断部位が同定され、これらの部位を更に2種の熱力学解析に供した。第1の解析は、ハイブリダイゼーション自由エネルギーによって予測される酵素基質ヘテロ二量体の熱力学的安定度にあった（Sugimotoら1995、Cairnsら1999）。ハイブリダイゼーション（最も近い隣方法を使用することを算出した）の自由エネルギーの低さによって示される最大のヘテロ二量体安定度を有するDNA酵素が、最大の動力学的活性を有する場合があることがわかった。選抜パラメータ−は、-ΔG kcal/molのカットオフ値25未満を含むこととした。DNAザイムのアームが高いヘアーピン融解温度（Tｍ）を有する場合、これによる分子内結合を避けるために、第２の解析を行った（Cairnsら1999; Santoro & Joyce 1998）。これらの解析の後、55種のDNAザイムが設計されて、in vitro多重選択のために合成された。これらのDNAザイムの配列は表1に示す。
【００５０】
表1：bcl-2 DNAザイムの概要表
【表１】
2004532046.tif 000002
2004532046.tif 000003
【００５１】
2. in vitro選択の課程で、26種の活性DNAザイムが同定された（26/55）。
【００５２】
3. in vitro選択されたDNAザイムは、更に2つのホスホロチオネート結合を両方の末端に用いて化学修飾され、表中に示したように名前を改変した（Wagner 1995）。
【００５３】
4. 修飾DNAザイムは細胞に基づくアッセイに供し、bcl-2タンパク質レベルをウエスタンブロットで測定した。8種のDNAザイムがBcl-2タンパク質のダウンレギュレーション活性を有することが示された。
【００５４】
DNAザイム設計のためのbcl-xl mRNAの切断部位の同定：
bcl-2DNAザイムの選択に関しては、配列決定および-ΔG/Tm解析に基づいて、bcl-xl mRNAに対して合計26種のDNAザイムが設計、合成された。これらのDNAザイムの配列を、表2に示す。
【００５５】
表2：bcl-xl DNAザイムの概要表
【表２】
2004532046.tif 000004
2004532046.tif 000005
【００５６】
1.926bp bcl-xlc DNAクローンをスクリーニングした後に、81個の潜在的に切断可能なAUまたはGU部位を見い出し、これらの部位を熱力学解析に供した。選択基準として-25のkcal/モルを閾値としてこれに基づいて、in vitro切断選択のために26のDNAザイムを合成した（26/81）。
【００５７】
2. in vitro選択の課程で、18種の活性DNAザイムが同定された（18/26）。
【００５８】
3.全ての26種のDNAザイムは、更に2つのホスホロチオネート結合を両方の末端に用いて化学修飾され、表中に示したように名前を改変した（Wagner 1995）。
【００５９】
4. 修飾DNAザイムは細胞に基づくアッセイに供し、bcl-2タンパク質レベルをウエスタンブロットで測定した。6種のDNAザイムがBcl-2タンパク質のダウンレギュレーション活性を有することが示された（6/26）。
【００６０】
実施例２
活性DNAザイムin vitroの多重選択：
活性DNAザイムを効率的に選択するために、in vitro選択は多重法を使用して実行された。これによって、スクリーニングされるDNAザイムのプールを、疑似生理的条件下でRNA基質に接近してこれを切断する能力についてスクリーニングすることが可能である。DNAザイム（0nM、5nM、50nMおよび500nM）およびRNA基質（400nM）は、等量の50mMのトリ-HCl、10mM MgCl2、150mM NaClおよび0.01% SDS（pH7.5）で37℃で10分間、別々に予め平衡化した。反応は、DNAザイムおよび基質を混合することによって開始した。1時間後、反応を100μlフェノール/クロロホルム抽出によって停止させ、エタノール沈殿によって回収した。
【００６１】
bcl-2切断の検出用プライマーは、以下の通りである：
2004532046.tif 000006
2004532046.tif 000007
【００６２】
bcl-xl切断の検出用プライマーは、以下の通りである：
2004532046.tif 000008
【００６３】
その後、プライマーの伸長は、Superscript IIリバーストランスクリプターゼによって行った。該反応で、標識プライマー4pmolを、300nmolのRNAと混合し、2分間の90℃で変性させた。プライマーを、その後、第1鎖バッファー、ジチオトレイトール、デオキシヌクレオチドおよび酵素）を加える前に65℃〜45℃の間でゆっくりとアニールさせた。この混合液（20μl）を、1時間45℃でインキュベートし、反応を氷上に静置して止めた。サンプルは、等量の停止バッファー中に入れ、6%ポリアクリルアミドゲルで泳動した。配列決定は、鎖終結の存在下で、ジデオキシヌクレオチド（ddNTP）二本鎖cDNAテンプレートのプライマー伸長により実行した（Sambrookほか（1989））。配列は、切断されたバンドを特異的DNAザイムに帰するための指標として使用した。相対的な切断強度は、切断産物の量で決定した。DNAザイムは低濃度（5nM）での切断能力にしたがってランク付けした。bcl-2DNAザイムのin vitro選択は、10mMのMg2+存在下で、37℃にて60分間RNA基質と共にBcl-2DNAザイムをインキュベートすることにより実施した。プライマー伸長は、bcl-2mRNAに対する配列特異的プライマーを使用して行った。反応は、ポリアクリルアミドゲルのＤＮＡ塩基配列決定によって分析された。bcl-xl DNAザイムのin vitro選択は、10mMのMg2+存在下で、37℃にて60分間RNA基質と共にBcl-xL DNAザイムをインキュベートすることにより実施した。プライマー伸長は、bcl-xl mRNAに対する配列特異的プライマーを使用して行った。反応は、ポリアクリルアミドゲルのＤＮＡ塩基配列決定によって分析された。
【００６４】
実施例３
癌細胞におけるポルフィリン介在性DNAザイムの取込み
細胞培養系において選択されたDNAザイムを試験するために、前立腺癌細胞系PC3を用いて、まず最初にbcl-2およびbcl-xl 遺伝子発現のダウンレギュレーションおよびその細胞の機能への影響を検討した。細胞内でのmRNAの送達を容易にするためには、カチオンポルフィリン、テトラメソ-(4-メチルピリジル)ポルフィリン（TMP）を、細胞内送達のためのトランスフェクション試薬として使われた（Benimetskayaら1998）。
【００６５】
DNAザイムの化学修飾：
細胞のDNAザイム安定度を増大させるために、2つのホスホロチオネート結合を、DNAザイム（PS Dz）の各々のアームに導入した（Wagnerら1995）。これは、ヒト血清において有意にDNAザイム安定度を増大させることを示した。その一方で、DNAザイム切断活性への明らかな影響はなかった（図2）。
【００６６】
DNAザイムのトランスフェクション効率：
1.2x106個の細胞を100mmの培養ディッシュに接種し、37℃で5%CO2下で一晩インキュベートした。細胞は、チャージ比率(charge ratio)3（+/-）でTMPと複合体を形成させたFITC標識DNAザイムで細胞をトランスフェクトした。トランスフェクションした細胞を、FACSおよび蛍光顕微鏡検査法を用いて分析した。図3に示すように、POS DzがTMPと複合体を形成した場合は、正常なリン酸ジエステルDNAザイム（PO-Dz）と比較して、より効率的な送達が観察された。さらに、DNAザイム（標識化FITC）の核への送達が証明された。
【００６７】
実施例４
癌細胞におけるbcl-2およびbcl-xl の発現のサプレッション
試験管内の多重選択から、bcl-2に対する26種のDNAザイム（26/55）およびbcl-xlに対する16種のDNAザイム（16/26）は、それらの対応する基質の効率的な切断剤であることを示した。これらの分子の修飾型を、細胞内でのbcl-2およびbcl-xlをダウンレギュレーションする能力について試験した。アッセイは、PC3細胞（前立腺癌細胞系）において行った。チャージ比率3でTMPと複合体形成した2μMのDNAザイムで細胞をトランスフェクションした。一晩インキュベート後、細胞をタンパク質(ウェスタンブロット)またはRNA(リボヌクレアーゼプロテクションアッセイ)解析に供した(Sambrookら1989)。
【００６８】
PC3細胞でのbcl-2発現におけるbcl-2DNAザイムの効果：
26種のDNAザイムは全て、DNAザイム活性をウエスタンブロットによりトランスフェクション・アッセイで試験された。26種のDNAザイムのうちの5種は、bcl-2タンパク質レベルにおいて一貫した阻害効果を示した（表3）。bcl-2遺伝子ファミリーの発現に対するbcl-2DNAザイム（2μM）の効果は、PC3細胞に、5種の活性のあるDNAザイムをトランスフェクションさせることにより測定した。DT907を、活性のないDNAザイムのコントロールして用いた。bcl-2、bcl-xl、Baxおよびβアクチンに対する抗体を、それぞれ対応するタンパク質を検出するために用いた。TMPのみおよび活性のないDNAザイムのコントロールが全く効果も示さないのに対し、5つのDNAザイム全て、有意にbcl-2レベルを抑制した。これらのDNAザイムは、bcl-2遺伝子ファミリー（例えばbcl-xlおよびBax）の他のメンバーまたはハウスキーピング遺伝子βアクチンのいずれにも影響を及ぼさなかった。
【００６９】
表３：ウェスタン解析において特定された活性のあるbcl-2DNAザイム
【表３】
2004532046.tif 000009
* ヒトbcl-2m RNA配列の切断部位を示す。
【００７０】
bcl-xl 発現上のbcl-xl DNAザイムの効果：
全ての16種のDNAザイムのスクリーニングでは、3種のDNAザイム、DT882、DT883およびDT884が、bcl-xlタンパク質発現（表4）に対して非常に強い阻害効果を呈した。bcl-xl DNAザイムによるbcl-xl タンパク質レベルの抑制は、3種の活性のあるDNAザイム（2μM）をPC3細胞にトランスフェクションさせることにより測定した。DT867およびDT880を、活性のないDNAザイムのコントロールとして、DT888をアンチセンスのコントロールとして使用した。bcl-2およびβアクチンに対する抗体を、それぞれ対応するタンパク質の検出用に用いた。このスクリーニングにおいて、DT880およびDT867は活性のないDNAザイムである。更に、PC3細胞に対する効果をbcl-xl DNAザイムのRNAaseプロテクションアッセイ（RPA）を使用して確認した。RNAアーゼプロテクションアッセイにおいて、DNAザイムはチャージ比率3でTMPと複合体形成させ、PC3細胞にトランスフェクションした。細胞RNAを、トランスフェクションした細胞から抽出してRPA解析に用いた。アポトーシス関連リボプローブセットは、Pharmingenキットから得た。
【００７１】
表４：ウェスタン解析において同定された活性のあるbcl-xl DNAザイム
【表４】
2004532046.tif 000010
* ヒトbcl-xlmRNA配列の切断部位を示す。
【００７２】
実施例５
細胞周期に対するbcl-2およびbcl xL特異的DNAザイムが介在する効果
DNAザイムをウェスタンおよびRPAアッセイで試験した後、更に、活性のある分子についてアポトーシス応答の指標としての細胞周期に対する効果を調べた。2つの最も活性のあるDNAザイムが、FACSアッセイにおいて選択された。これらは、DT 895（bcl-2DNAザイム）およびDT882（bcl-xl DNAザイム）であった。該アッセイにおいては、細胞をDNAザイムと共に一晩インキュベーションした後にPI染色に供する以外は、ウェスタン・アッセイに記載の同じトランスフェクション手順を使用した。表5は、DNAザイム処理された細胞（DT895：12.82%およびDT882：23.17%）では、サブG1群の実質的な増加があることを明らかに示した。これは、抗bcl-2およびbcl-xl DNAザイムによって処理された細胞が、アポトーシスを起こしていることを示す。
【００７３】
表５：DNAザイムをトランスフェクションしたPC3細胞の細胞周期解析
【表５】
2004532046.tif 000011
【００７４】
実施例６
チトクロームc放出へのbcl-xl DNAザイムの効果
チトクロームcは、全て好気性生物のエネルギー変換にとって不可欠な可動性の電子輸送タンパク質として、よく解析されている。哺乳動物細胞において、このタンパク質このよく保存されており、ミトコンドリア膜間隙に通常局所化する。より最近の研究で、細胞質性チトクロームcがアポトーシスの活性化における必須因子であると確認された。アポトーシスの際、チトクロームcはミトコンドリア膜からサイトゾルまで移行し、これはカスパーゼ-3（CPP32）の活性化に必要である。チトクロームcのトランスロケーションがbcl-2またはbcl-xlの過剰発現によって遮断され得ることが報告されている。これに基づいて、細胞からのCyto C放出の計測は、bcl-xlのダウンレギュレーションによるアポトーシスの初期の現象に対するbcl-xl DNAザイムの効果を判定するための理想的なアッセイである。bcl-xl DNAザイムでのPC3細胞のトランスフェクションの後、細胞質画分由来のタンパク質は、抽出してウェスタン解析に供した。出願人らによる研究により、bcl-xl DNAザイムにより媒介されるbcl-xlのダウンレギュレーションと値とクロームCの放出の増加が確認された。これらの研究では、PC3細胞は、TMPと複合体形成した2μMのDNAザイムでトランスフェクションした。ウェスタン解析は、bcl-xlおよびチトクロームCに対する抗体を使用して行った。PC3細胞におけるDNAザイムによって媒介されるbcl-xlの減少は、チトクロームCの放出増加をもたらした。この結果は、細胞周期解析による以前のデータを確認するだけでなく、PC3細胞のアポトーシス経路に対してDNAザイムの特異性をも確認するものである。
【００７５】
実施例7
抗-bcl-xl DNAザイムを有するPC3細胞の化学感受性
bcl-xlタンパク質は、多くの細胞系において、抗新生物剤により誘導される細胞のアポトーシスの強力な保護剤であることが示された。したがって、PC3細胞のbcl-xl発現を減少させるのに効率的なDNAザイムは、細胞障害能治療の効果に対する細胞の感度を高め得る。このことを試験するために、DNAザイムだけまたはカルボプラチンなどの抗癌剤とDNAザイムDNAザイムによって処理されたPC3細胞の細胞生存度をMTSアッセイにより測定した。図4の結果は、抗bcl-xl DNAザイム DT882が、5μMでカルボプラチン処理に対するPC3細胞の感度を高めることを証明した。この感受性により、カルボプラチンのみ使用した場合は細胞死が17％であるのに対して、DNAザイムおよびカルボプラチンを組合わせて使用した場合は細胞死が約50%にまで増加した。
【００７６】
実施例８
他の腫瘍細胞系における抗bcl-2およびbcl-xl DNAザイムの使用
bcl-2およびbcl-xlの高発現は、種々の癌で見とめられている。in vivoでの抗bcl-2およびbcl-xl DNAザイムの治療用途の可能性を調べるために、前立腺癌細胞系（PC3およびDU145）によって示されるDNAザイムの効能に加えて、他の細胞に基づくアッセイは、行った。タイプの異なる癌細胞系を数種用いて、異なる設定条件でのDNAザイムの効能を確認した。これらは、膀胱癌細胞株T24; 大腸癌細胞株HCT116;および肺癌細胞株A549とした。
【００７７】
bcl-2による種々の腫瘍細胞中のBcl-2発現の阻害を分析するために、T24（膀胱）、A549（肺臓）およびHCT116（大腸）細胞を、チャージ比率3でTMPと複合体形成させた2μMのbcl-2 DNAザイムで処理した。トランスフェクションの24時間後、細胞のタンパク質を抽出して、bcl-2抗体またはβアクチン抗体によってイムノブロットした。bcl-xl DNAザイムによる種々の腫瘍細胞のbcl-xl発現の阻害もまた、上記と同様TMPと複合体形成させた2μMのbcl-2 DNAザイムで処理したT24（膀胱）、A549（肺臓）およびHCT116（大腸）細胞を用いたbcl-xl抗体またはβアクチン抗体によるイムノブロットで調べた。これらの実験により、抗bcl-2および抗bcl-xl DNAザイムが試験した全ての細胞系で、それぞれの遺伝子発現レベルを低減させることを示す。
【００７８】
実施例９
抗bcl-xl DNAザイムDT882によるヒト腫瘍異種移植モデルの化学感受性
bcl-2遺伝子ファミリーのダウンレギュレーションが抗癌薬に対する腫瘍細胞の化学感受性をもたらすことを示すために、ヒトPC3前立腺癌およびMDA-MB-231乳癌細胞を有するマウスモデルを用いて、化学療法剤にたいする感受性が増強されるか否かを調べた。
【００７９】
実験では、4群（生理的緩衝液、DNAザイム、タキソール、タキソール+DNAザイム）のマウス（1群当たりマウス8匹）を使用し、1日目には、胸腺欠失雄Balb/Cマウスに、0.1mlの間とリゲルに懸濁した1x 106個の腫瘍細胞を注射した。腫瘍増殖は、デジタルカリパー（digital caliper）を用いて2週間毎に測定し、腫瘍体積を式（l x w x h x/6）を用いて算出した。腫瘍の平均体積が100-200 mm3に至った時点で、Alzet浸透ポンプ（腫瘍を有するマウス内でのDNAザイムオリゴヌクレオチド送達ビヒクルとして用いた）を、腹腔を介して外科的に腹膜に移植した。Alzet model1002ポンプは、小型ポンプ（1.5x 0.6cm）であって、0.25μｌ/時間の速度で総量0.5mlを送達する。該ポンプを、DNAザイムオリゴヌクレオチドを含む生理的食塩水で満たした。これは、12.5mg/kg/日の用量である。外科処置後は実験の間ずっと週に1回ずつ、200μlを腹腔内注射により25mg/kgのタキソールを一部のマウスに投与した。
【００８０】
図5および図6に示すように、DNAザイムおよびタキソールの処理の組合わせは、DNAザイムのみまたはタキソールのみの群と比較して、顕著にPC3およびMDA-MB-231腫瘍成長を抑制した。
【００８１】
実施例１０
抗bcl-2 DNAザイム DT912によるヒト腫瘍異種移植モデルの化学感受性
実施例9に記載のように、前立腺および乳癌モデルを、また、bcl-2DNAザイムの効果を試験するのに用いた。さらに、ヒト黒色細胞種モデル（518A2）を用いて、腫瘍増殖におけるダカルバジン（DTIC）と組合わせた場合のbcl-2の治療効果を判定した。図7、9および10に示すように、抗bcl-2 DNAザイムDT912は、3種全ての腫瘍における化学療法剤処理に対する感度を高めた。また、この効果はbcl-2タンパク質レベルのダウンレギュレーションに密接に関連していた（図8）。
【００８２】
実施例１１
アンチセンス・オリゴヌクレオチドの接近可能性および効果はDNAザイムターゲッティングと相関し得ない
癌原遺伝子c-mybは、造血細胞の増殖および分化における重要な役割を担っている。C-mybタンパク質レベルは、通常の造血細胞の分化レベルによって異なり、最終分化後の細胞において検出されるタンパク質発現は低い。骨髄性前駆細胞が急速に増殖している白血病細胞において、c-mybが過剰発現されることが多いことがわかった。文献では、それはアンチセンス・オリゴヌクレオチドの使用が、in vitroでc-myb発現を抑制することができ、白血病症状を抑制したことが示されている。アンチセンス・オリゴヌクレオチドによって標的とされる同じ領域に対してDNAザイムを設計して白血病細胞培養系において試験した。
【００８３】
実験において、０日目と1日目に、K562細胞をチャージ比率（+/-）5でTMPと複合体形成した2μMオリゴでトランスフェクションした。細胞のタンパク質を、2日目に抽出し、c-Mybにモノクローナル抗体を使用したウェスタンブロットにより分析した。アンチセンスおよびDNAザイムによるc-Mybタンパク質発現の阻害は、ウエスタンブロット解析で測定した。2種のアンチセンスのオリゴヌクレオチドDT860（gtgccggggtcttcgggc）（配列番号105）、およびDT1019（gctttgcgatttctg）（配列番号106）は共に、c-Mybタンパク質発現の抑制に効果を示した。その一方で、これらの部位に対応するDNAザイムはいずれも、c-Mybタンパク質レベルを効果的に低減させることができなかった。
【００８４】
この実施例は、オリゴヌクレオチドおよびDNAザイムの異なる構造および立体構造により、これら２つの分子の標的RNAに対する接近可能性が異なることを明らかに示した。したがって、1種の薬剤の効果から他種の活性を予測することはできない。
【００８５】
表６：配列番号およびその説明
【表６】
2004532046.tif 000012
【００８６】
特定の実施形態において示されるように、広く記載されている本発明の精神から逸脱することなく、多数の変更および／または改変が本発明に加えることができることは当業者であれば理解し得る。したがって、本実施形態は、例示として理解されるべきであり、限定的に理解されるべきではない。
【００８７】
参考文献
2004532046.tif 000013
2004532046.tif 000014
2004532046.tif 000015
2004532046.tif 000016
【図面の簡単な説明】
【００８８】
【図１】「10-23」DNAザイム（PO-DNAザイム）およびそのホスホロチオネート修飾型（PS-DNAザイム）を示す。Aは、10-23DNAザイム.のための説明である。DNAザイム-基質複合体のワトソン・クリック相互作用は、標的（上）の通常のリボヌクレオチド（N）およびDNAザイム（下）のアーム部の対応するDNAザイム（N）によって示される。アーム部を接続し、モデルのRNA標的部位の単一の非対形成プリンに渡るループ部分の決定された配列は、保存された触媒モチーフを表す。Bは、DNAザイムの化学的に化学修飾型を示す。*は、ホスホロチオネート結合を表す。
【図２】ヒト血清中におけるホスホロチオネート修飾型DNAザイムオリゴヌクレオチドの安定性を示す。各々のアーム部の1、3または5つのホスホロチオネート結合を有するDNAザイムを新鮮なヒト血清とともにインキュベートし、さまざまな時点でサンプルを採取した。各々のサンプルから、完全なオリゴヌクレオチドをフェノールで抽出し、ポリヌクレオチドキナーゼを用いて32P標識を付した。標識した反応産物を、ゲル電気泳動に供した。完全なオリゴヌクレオチドのパーセンテージを、PhosphoImageによる測定を元に、式：（さまざまな時点での強度/0分時の強度）x 100から計算した。
【図３】TMPによるPC3細胞のDNAザイムのトランスフェクションを示す。2μMのFITCで標識したDNAザイムを、0、1、3、5、10および20の比で、TMPと複合体形成させた。FACS解析の結果を示す。
【図４】bcl-xl DNAザイムによるPC3細胞の化学感受性を示す。PC3細胞を、DNAザイム/TMP錯体によって4時間処理した。その後、10%のFBSおよび5μMのカルボプラチンとを含む新鮮なDMEMで培地交換し、更に72時間インキュベートした。MTSアッセイを全てのサンプルの細胞増殖を調べるために行った。細胞死の割合（%）は、カルボプラチン処理されたサンプルのOD490の未処置のPC3細胞のOD490に対するパーセンテージから求めた。
【図５】抗bcl-xlによるヒト異種移植マウスモデル（PC3）のPC3腫瘍細胞の化学感受性を示す。皮下で増殖する確立されたPC3腫瘍異種移植片を有するヌードマウスを、未処置の（生理的緩衝液）まま維持するか、またはDNAザイムによって処理されたオリゴ、タキソール、もしくははDNAザイム+タキソールで処理した。DNAザイムDT882は浸透ポンプを使用して送達し、タキソールは毎週腹腔内投与にて投与した。腫瘍サイズを、図中に示す時点で測定した。
【図６】抗bcl-xl DNAザイムによるMDA-MB231ヒト異種移植乳癌マウスモデルの化学感受性を示す。皮下で増殖する確立されたPC3腫瘍異種移植片を有するヌードマウスを、未処置の（生理的緩衝液）まま維持するか、またはDNAザイムによって処理されたオリゴ、タキソール、もしくははDNAザイム+タキソールで処理した。DNAザイムDT882は浸透ポンプを使用して送達し、タキソールは毎週腹腔内投与にて投与した。腫瘍サイズを、図中に示す時点で測定した。
【図７】抗bcl-2 DNAザイムによるMDA-MB231異種移植乳癌マウスモデルの化学感受性を示す。皮下で増殖する確立されたPC3腫瘍異種移植片を有するヌードマウスを、未処置の（生理的緩衝液）まま維持するか、またはDNAザイムによって処理されたオリゴ、タキソール、もしくははDNAザイム+タキソールで処理した。DNAザイムDT912は浸透ポンプを使用して送達し、タキソールは毎週腹腔内投与にて投与した。腫瘍サイズを、図中に示す時点で測定した。
【図８】MDA-MB 231腫瘍におけるbcl-2発現レベルのウェスタン解析結果を示す。bcl-2発現レベルは、処理後１５日目の6匹のマウス群から摘出した腫瘍のタンパク質抽出物のウェスタンブロットをデンシトメトリ解析で測定した。相対的なbcl-2の発現は、βアクチンに対するレベルbcl-2の比に基づいて算出された。
【図９】抗bcl-2 DNAザイムによる異種移植マウスモデルにおけるヒト前立腺腫瘍細胞の化学感受性を示す。皮下で増殖する確立されたPC3腫瘍異種移植片を有するヌードマウスを、未処置の（生理的緩衝液）まま維持するか、またはDNAザイムによって処理されたオリゴ、タキソール、もしくははDNAザイム+タキソールで処理した。DNAザイムDT912は浸透ポンプを使用して送達し、タキソールは毎週腹腔内投与にて投与した。腫瘍サイズを、図中に示す時点で測定した。
【図１０】抗bcl-2 DNAザイムによるヒト異種移植マウスモデル（518A2）におけるヒト黒色腫瘍細胞の化学感受性を示す。皮下で増殖する確立された518A2腫瘍異種移植片を有するSCIDマウスを、未処置の（生理的緩衝液）まま維持するか、またはDNAザイムによって処理されたオリゴ、DTIC、もしくはDNAザイム+DTICで処理した。DNAザイムDT912は浸透ポンプを使用して送達し、DTICは毎週腹腔内投与にて投与した。腫瘍サイズを、図中に示す時点で測定し、腫瘍成長の割合を図にプロットした。
【図１】
2004532046.tif 000017
【図２】
2004532046.tif 000018
【図３】
2004532046.tif 000019
【図４】
2004532046.tif 000020
【図５】
2004532046.tif 000021
【図６】
2004532046.tif 000022
【図７】
2004532046.tif 000023
【図８】
2004532046.tif 000024
【図９】
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【図１０】
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【国際公開パンフレット】
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2004532046.tif 000028
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【国際調査報告】
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