(57)【要約】要約書なし。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３の少なくとも１に示される配列をもつヌクレオチドをからなるか、またはｐＣＭ−Ｈ−６０８−６６３−Ｎ語と呼ばれ、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３６３８で寄託されたプラスミドに組み込まれた配列をもつヌクレオチド、それらの補体およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３とは異なる配列または遺伝コードの縮重によるＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３６３８で寄託されたｐＣＭ−Ｈ−６０８−６６３−Ｎ語と呼ばれるプラスミドに挿入された配列または厳密な条件下にｐＣＭ−Ｈ−６０８−６６３−Ｎ語と呼ばれるプラスミドにハイブリダイズする配列またはその機能的部分をもつポリヌクレオチドまたは少なくとも実質的にそれと相同または同一であるポリヌクレオチドからなる単離された核酸分子。
【請求項２】
核酸分子が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３からの少なくとも１５、好ましくは少なくとも３０、さらに好ましくは少なくとも５０の近接するヌクレオチドをもつポリヌクレオチドからなり、またはＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３６３８で寄託されたｐＣＭ−Ｈ−６０８−６６３−Ｎ語と呼ばれるプラスミドに挿入された配列をもつポリヌクレオチドからなる、請求項１記載の単離された核酸分子。
【請求項３】
請求項１記載の単離された核酸分子からなる組成物。
【請求項４】
請求項１記載の単離された核酸分子からなるベクター。
【請求項５】
請求項４記載のベクターからなる組成物。
【請求項６】
骨粗鬆症を予防、治療またはコントロールするための、または骨折治癒、骨伸展または骨減少症、歯根膜炎、または低骨密度または対象の機械的ストレスまたはその不足を含む他の状態の治療のための、対象に有効量の請求項３記載の組成物を投与することからなる方法。
【請求項７】
骨粗鬆症を予防、治療またはコントロールするための、または骨折治癒、骨伸展または骨減少症、歯根膜炎、骨折または低骨密度または骨粗鬆症またはその兆候を引き起こすかまたは寄与する他の因子または対象の機械的ストレスまたはその不足を含む他の状態の治療のための、対象に請求項４記載のベクターを投与することからなる方法。
【請求項８】
請求項１記載の単離された核酸分子を発現することからなるポリペプチドを調製する方法。
【請求項９】
請求項４記載のベクターからポリペプチドを発現することからなるポリペプチドを調製する方法。
【請求項１０】
骨粗鬆症を予防、治療またはコントロールするための、または骨折治癒、骨伸展または骨減少症、歯根膜炎、骨折または低骨密度または骨粗鬆症またはその兆候を引き起こすかまたは寄与する他の因子または対象の機械的ストレスまたはその不足を含む他の状態の治療のための、請求項１記載の単離された核酸分子またはその機能的部分または遺伝子の発現生成物からなるポリペプチドまたはそのポリペプチドの機能的部分またはそのポリペプチドに対する抗体またはその抗体の機能的部分を投与することからなる方法。
【請求項１１】
核酸分子が６０８タンパク質の１０ｋＤないし１００ｋＤ Ｎ−末端開裂生成物を符号化する、請求項１記載の単離された核酸分子。
【請求項１２】
Ｎ−末端開裂生成物が約２５ｋＤのポリペプチドまたは約７０−８０ｋＤのポリペプチドからなる、請求項１１記載の単離された核酸分子。
【請求項１３】
請求項１記載のポリヌクレオチドによって符号化された単離されたポリペプチド。
【請求項１４】
ポリペプチドがタンパク質６０８、またはタンパク質６０８の機能的部分またはアドリカン、または少なくとも実質的にそれと相同または同一であるポリペプチドとして同定される、請求項１３記載の単離されたポリペプチド。
【請求項１５】
ポリペプチドが約６６３ないし約１６３４アミノ酸からなる、請求項１４記載の単離されたポリペプチド。
【請求項１６】
ポリペプチドが約７４１ないし約１６３４アミノ酸からなる、請求項１４記載の単離されたポリペプチド。
【請求項１７】
ポリペプチドが約６６３アミノ酸からなる、請求項１４記載の単離されたポリペプチド。
【請求項１８】
ポリペプチドが約７４１アミノ酸からなる、請求項１４記載の単離されたポリペプチド。
【請求項１９】
ポリペプチドが約１６３４アミノ酸からなる、請求項１４記載の単離されたポリペプチド。
【請求項２０】
ポリペプチドがヒトタンパク質６０８、またはタンパク質６０８の機能的部分またはアドリカンである、請求項１３記載の単離されたポリペプチド。
【請求項２１】
機能的部分が１０ｋＤないし１００ｋＤの分子量をもつポリペプチドからなる、請求項２０記載の単離されたポリペプチド。
【請求項２２】
機能的部分が約２５ｋＤの分子量をもつポリペプチドまたは約７０−８０ｋＤのポリペプチドからなる、請求項２０記載の単離されたポリペプチド。
【請求項２３】
請求項１３記載の１またはそれ以上の単離されたポリペプチドからなる組成物。
【請求項２４】
請求項１３記載のポリペプチドまたはその機能的部分によって誘発された抗体。
【請求項２５】
請求項２４記載の抗体またはその機能的部分からなる組成物。
【請求項２６】
骨粗鬆症を予防または治療するため、または骨折治癒、骨伸展、または対象の歯根膜炎の治療のため、対象に有効量の請求項２１記載の単離されたポリペプチドを投与することからなる方法。
【請求項２７】
骨関節炎、骨粗鬆症、または骨硬化症を治療または予防するため、請求項２１記載のポリペプチドの活性を阻害する化学または中和モノクローナル抗体の有効量を対象に投与することからなる方法。
【請求項２８】
請求項１３記載のポリペプチドまたはその機能的部分のための受容体。
【請求項２９】
受容体を精製、単離そして配列決定することからなる、請求項２８記載の受容体を得る方法。
【請求項３０】
請求項２９記載の方法を実施することによって得られた受容体。
【請求項３１】
タンパク質またはポリペプチドの結合定数および結合度を決定するため、そして受容体、結晶性受容体製剤、または膜受容体製剤を用いてそのようなポリペプチドの機能化をテストするため、受容体に結合し、会合しまたはブロックするタンパク質またはポリペプチドを同定するために請求項２８記載の受容体を使用する方法。
【請求項３２】
ＯＣＰ遺伝子に対し特異的なプロモーターからなり、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４に示される配列を有するヌクレオチドからなる単離された核酸分子。
【請求項３３】
機能的部分がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１−ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５に示される配列をもつアミノ酸からなる単離されたポリペプチド。
【請求項３４】
配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１、またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４に示される配列の最初の６６３アミノ酸からなる請求項３３記載の単離されたポリペプチド。
【請求項３５】
配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１、またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５に示される配列の最初の２４１アミノ酸からなる請求項３３記載の単離されたポリペプチド。
【請求項３６】
ｐＣｍ−Ｈ−６０８−６６３−Ｎ−語と呼ばれる発現プラスミド。
【請求項３７】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８、またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８に示される配列をもつヌクレオチドからなり、またはプラスミドｐＫＳ Ｈ６０８ ５’−２．４Ｋｂ ｂＡｃ＃１、ｐＫＳ Ｈ６０８ ｍ．ＦＲＧ．３．５Ｋｂ＃３４またはｐＭ Ｈ６０８ ３’−１．９Ｋｂ ＨＳＴＧ＃３．３またはその補体に組み込まれた配列をもつヌクレオチドおよびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８、またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８とは異なる配列または遺伝コードの縮重による、プラスミドｐＫＳ Ｈ６０８ ５’−２．４Ｋｂ ｂＡｃ＃１、ｐＫＳ Ｈ６０８ ｍ．ＦＲＧ．３．５Ｋｂ＃３４またはｐＭ Ｈ６０８ ３’−１．９Ｋｂ ＨＳＴＧ＃３．３に組み込まれた配列または厳密な条件でプラスミドｐＫＳ Ｈ６０８ ５’−２．４Ｋｂ ｂＡｃ＃１、ｐＫＳ Ｈ６０８ ｍ．ＦＲＧ．３．５Ｋｂ＃３４またはｐＭ Ｈ６０８ ３’−１．９Ｋｂ ＨＳＴＧ＃３．３における配列にハイブリダイズする配列またはその機能的部分をもつポリヌクレオチドまたは少なくとも実質的にそれと相同または同一であるポリヌクレオチドからなる単離された核酸分子。
【請求項３８】
核酸分子が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８、またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８からの少なくとも１５、好ましくは少なくとも３０、さらに好ましくは少なくとも５０の近接するヌクレオチドをもつポリヌクレオチドからなり、または配列がプラスミドｐＫＳ Ｈ６０８ ５’−２．４Ｋｂ ｂＡｃ＃１、ｐＫＳ Ｈ６０８ ｍ．ＦＲＧ．３．５Ｋｂ＃３４またはｐＭ Ｈ６０８ ３’−１．９Ｋｂ ＨＳＴＧ＃３．３に組み込まれている、請求項３７記載の単離された核酸分子。
【請求項３９】
請求項３７記載の単離された核酸分子からなる組成物。
【請求項４０】
請求項３７記載の単離された核酸分子からなるベクター。
【請求項４１】
請求項４０記載のベクターからなる組成物。
【請求項４２】
骨粗鬆症を予防、治療またはコントロールするための、または骨折治癒、骨伸展または骨減少症、歯根膜炎、または低骨密度または対象の機械的ストレスまたはその不足を含む他の状態の治療のための、対象に有効量の請求項３９記載の組成物を投与することからなる方法。
【請求項４３】
骨粗鬆症を予防、治療またはコントロールするための、または骨折治癒、骨伸展または骨減少症、歯根膜炎、骨折または低骨密度または骨粗鬆症またはその兆候を引き起こすかまたは寄与する他の因子または対象の機械的ストレスまたはその不足を含む他の状態の治療のための、対象に請求項４０記載のベクターを投与することからなる方法。
【請求項４４】
請求項３７記載の単離された核酸分子を発現することからなるポリペプチドを調製する方法。
【請求項４５】
請求項４０記載のベクターからポリペプチドを発現することからなるポリペプチドを調製する方法。
【請求項４６】
骨粗鬆症を予防、治療またはコントロールするための、または骨折治癒、骨伸展または骨減少症、歯根膜炎、骨折または低骨密度または骨粗鬆症またはその兆候を引き起こすかまたは寄与する他の因子または対象の機械的ストレスまたはその不足を含む他の状態の治療のための、請求項３７記載の単離された核酸分子またはその機能的部分または遺伝子の発現生成物からなるポリペプチドまたはそのポリペプチドの機能的部分またはそのポリペプチドに対する抗体またはその抗体の機能的部分を投与することからなる方法。
【請求項４７】
核酸分子が６０８タンパク質の１０ｋＤないし１００ｋＤ Ｎ−末端開裂生成物を符号化する、請求項３７記載の単離された核酸分子。
【請求項４８】
Ｎ−末端開裂生成物が約２５ｋＤのポリペプチドまたは約７０−８０ｋＤのポリペプチドからなる、請求項４７記載の単離された核酸分子。
【請求項４９】
請求項３７記載のポリヌクレオチドによって符号化された単離されたポリペプチド。
【請求項５０】
ポリペプチドがタンパク質６０８、またはタンパク質６０８の機能的部分またはアドリカン、または少なくとも実質的にそれと相同または同一であるポリペプチドとして同定される、請求項４９記載の単離されたポリペプチド。
【請求項５１】
ポリペプチドが約６６３ないし約１６３４アミノ酸からなる、請求項５０記載の単離されたポリペプチド。
【請求項５２】
ポリペプチドが約７４１ないし約１６３４アミノ酸からなる、請求項５０記載の単離されたポリペプチド。
【請求項５３】
ポリペプチドが約６６３アミノ酸からなる、請求項５０記載の単離されたポリペプチド。
【請求項５４】
ポリペプチドが約７４１アミノ酸からなる、請求項５０記載の単離されたポリペプチド。
【請求項５５】
ポリペプチドが約１６３４アミノ酸からなる、請求項５０記載の単離されたポリペプチド。
【請求項５６】
ポリペプチドがヒトタンパク質６０８、またはタンパク質６０８の機能的部分またはアドリカンである、請求項４９記載の単離されたポリペプチド。
【請求項５７】
機能的部分が１０ｋＤないし１００ｋＤの分子量をもつポリペプチドからなる、請求項５６記載の単離されたポリペプチド。
【請求項５８】
機能的部分が約２５ｋＤの分子量をもつポリペプチドまたは約７０−８０ｋＤのポリペプチドからなる、請求項５６記載の単離されたポリペプチド。
【請求項５９】
請求項４９記載の１またはそれ以上の単離されたポリペプチドからなる組成物。
【請求項６０】
請求項４９記載のポリペプチドまたはその機能的部分によって誘発された抗体。
【請求項６１】
請求項６０記載の抗体またはその機能的部分からなる組成物。
【請求項６２】
骨粗鬆症を予防または治療するため、または骨折治癒、骨伸展、または対象の歯根膜炎の治療のため、対象に有効量の請求項５７記載の単離されたポリペプチドを投与することからなる方法。
【請求項６３】
骨関節炎、骨粗鬆症、または骨硬化症を治療または予防するため、請求項５７記載のポリペプチドの活性を阻害する化学または中和モノクローナル抗体の有効量を対象に投与することからなる方法。
【請求項６４】
請求項４９記載のポリペプチドまたはその機能的部分のための受容体。
【請求項６５】
受容体を精製、単離そして配列決定することからなる、請求項６４記載の受容体を得る方法。
【請求項６６】
請求項６５記載の方法を実施することによって得られた受容体。
【請求項６７】
タンパク質またはポリペプチドの結合定数および結合度を決定するため、そして受容体、結晶性受容体製剤、または膜受容体製剤を用いてそのようなポリペプチドの機能化をテストするため、受容体に結合し、会合しまたはブロックするタンパク質またはポリペプチドを同定するために請求項６７記載の受容体を使用する方法。
【請求項６８】
ｐＫＳ Ｈ６０８ ５’−２．４Ｋｂ ｂＡｃ＃１、ｐＫＳ Ｈ６０８ ｍ．ＦＲＧ．３．５Ｋｂ＃３４またはｐＭ Ｈ６０８ ３’−１．９Ｋｂ ＨＳＴＧ＃３．３と呼ばれるプラスミドからなる群から選択された発現プラスミド。
【請求項６９】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９またはその補体に示される配列をもつヌクレオチドおよび遺伝コードの縮重によるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９とは異なる配列またはその機能的部分をもつポリヌクレオチドまたは少なくとも実質的にそれに相同または同一であるポリヌクレオチドからなる単離された核酸分子。
【請求項７０】
請求項６９記載の単離された核酸分子からなる組成物。
【請求項７１】
請求項６９記載の単離された核酸分子からなるベクター。
【請求項７２】
請求項７０記載のベクターからなる組成物。
【請求項７３】
骨粗鬆症を予防、治療またはコントロールするための、または骨折治癒、骨伸展または骨減少症、歯根膜炎、または低骨密度または対象の機械的ストレスまたはその不足を含む他の状態の治療のための、対象に有効量の請求項７０記載の組成物を投与することからなる方法。
【請求項７４】
骨粗鬆症を予防、治療またはコントロールするための、または骨折治癒、骨伸展または骨減少症、歯根膜炎、骨折または低骨密度または骨粗鬆症またはその兆候を引き起こすかまたは寄与する他の因子または対象の機械的ストレスまたはその不足を含む他の状態の治療のための、対象に請求項７１記載のベクターを投与することからなる方法。
【請求項７５】
請求項６９記載の単離された核酸分子を発現することからなるポリペプチドを調製する方法。
【請求項７６】
請求項７１記載のベクターからポリペプチドを発現することからなるポリペプチドを調製する方法。
【請求項７７】
骨粗鬆症を予防、治療またはコントロールするための、または骨折治癒、骨伸展または骨減少症、歯根膜炎、骨折または低骨密度または骨粗鬆症またはその兆候を引き起こすかまたは寄与する他の因子または対象の機械的ストレスまたはその不足を含む他の状態の治療のための、請求項６９記載の単離された核酸分子またはその機能的部分または遺伝子の発現生成物からなるポリペプチドまたはそのポリペプチドの機能的部分またはそのポリペプチドに対する抗体めたはその抗体の機能的部分を投与することからなる方法。
【請求項７８】
核酸分子がヒトアドリカンまたはヒトアドリカン−２タンパク質のＮ−末端開裂生成物を符号化する、請求項６９記載の単離された核酸分子。
【請求項７９】
請求項６９のポリヌクレオチドによって符号化される単離されたポリペプチド。
【請求項８０】
ポリペプチドがヒトアドリカンまたはヒトアドリカン−２タンパク質またはその機能的部分または少なくとも実質的にそれに相同または同一であるポリペプチドである、請求項７９記載の単離されたポリペプチド。
【請求項８１】
ポリペプチドがヒトアドリカンまたはヒトアドリカン−２タンパク質またはその機能的部分である、請求項８０記載の単離されたポリペプチド。
【請求項８２】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０で示される配列をもつアミノ酸からなる単離されたポリペプチド。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
関連出願のクロスレファランス
本出願は、２００１年１１月６日に出願した米国特許出願第０９／９９１，６３０号、前記出願の優先権の基礎となる２００１年７月１３日に出願した米国特許出願第０９／９０５，１２９ 号の一部継続出願であり、前記出願の優先権の基礎となる２００１年３月８日に出願した米国特許出願第０９／８０２，３１８号の一部継続出願であり、２０００年１２月４日に出願した米国特許出願第０９／７２９，４８５号の一部継続出願である、に基づく優先権を主張する。１９９８年５月１１日に出願した米国仮出願第６０／０８４，９４４号；及び１９９９年５月１１日に出願した全米国実用特許出願第０９／３０９，８６２号、及び米国仮出願第６０／０８４，９４４号からの優先権を主張（ここでは「１９９９年５月１１日Ｅｉｎａｔらの全米国実用特許出願」）；及び１９９９年５月１４日に出願した米国出願第０９／３１２，２１６号；１９９８年５月１５日に出願した６０／０８５，６７３号；１９９８年５月１５日に出願した米国仮出願第６０／０８５，６７３号；２０００年５月３０日に出願した米国仮出願第６０／２０７，８２１号；１９９９年５月１４日に出願した米国出願第０９／３１２，２１６号；米国仮出願第６０／０８４，９４４号；及び１９９９年５月１１４日Ｅｉｎａｔらの全米国実用特許出願もまた参照される。これら出願、ならびにこれら出願に引用された各文書または参考文献を、ここに参考文献として特に組み込む。また文書または参考文献は次のテキストに引用され、そしてこれら文書または参考文献（「ここに引用した文書または参考文献」）、ならびにここに引用した文書または参考文献に引用された各文書または参考文献も、ここに特に参考文献として組み込む。１９９９年５月１１４日Ｅｉｎａｔらの全米国実用特許出願の発明の実体及び前記出願の発明の実体は本出願の発明の実体に関して別物ではないことは明確である；そして、本発明の発明の実体は１９９９年５月１１日Ｅｉｎａｔらの全米国実用特許出願の発明の実体に関して別物ではないことは明確である。
【０００２】
【発明の属する技術分野】
本発明は機械的ストレス誘導遺伝子及びそれらの機能当量、そのためのプローブ、そのような遺伝子の同定のためのテスト、そのような遺伝子の発現生成物、そのような遺伝子及び発現生成物の用途、例えば、骨粗ショウ症、オステオペニア、骨化石症、骨硬化症、骨関節炎、歯根膜変性症及び骨折へと導く骨粗ショウ症または因子または過程の診断（例えばリスクの決定）、治療、予防、またはコントロールにおいて；及び、診断、治療、予防、またはコントロール方法、ならびにそのための組成物、及びそのような発現生成物のための受容体及びそのような受容体を手に入れる方法及び用途に関する。
【０００３】
【従来技術】
骨はミネラル、多くはカルシウム及び燐酸塩を含浸するコラーゲンの豊富な有機基質からなる。骨の２つの主形態があり、緻密な皮骨は骨格の外被を形成し、柱骨または髄骨は骨格の内腔を通過するプレートを形成する。代謝影響及び骨折の感受性に対するこれら２つの形態の応答は異なる。
骨は生涯再成形（反転、再生）を続ける。機械的及び電気的力、ホルモン及びローカルの調節因子は再成形に影響する。骨は時間及び空間を結合する２つの対抗する活動によって再生される。Ｐａｒｆｉｔｔ（１９７９）Ｃａｌｃｉｆ．Ｔｉｓ．Ｉｎｔ．２８：１−５。これらの活動、再吸収および形成は骨−再生ユニットとして知られる仮の解剖上の構造に含まれる。Ｐａｒｆｉｔｔ（１９８１）Ｒｅｓ． Ｓｔａｆｆ Ｐｈｙｓｉｃ． Ｄｅｃ．：６０−７２。所定の骨−再生ユニットでは、古い骨は破骨細胞によって再吸収される。破骨細胞によって生じた再吸収空洞は次に破骨細胞によって新しい骨で埋められ、骨有機基質を合成する。
【０００４】
食餌因子及び身体活動がプラスの効果をもたらすが、最大骨質量は主として発生学的に決定される。最大骨質量は骨格の成長が停止したとき最高になるが、その後に骨のロスが始まる。
成長する間に起きる正のバランスと対照的に、骨粗ショウ症では、再吸収空洞は骨で完全に埋められない。Ｐａｒｆｉｔｔ（１９８９），Ｏｓｔｅｏｐｏｒｏｓｉｓ：Ｅｔｉｏｌｏｇｙ，Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ，及びＭａｎａｇｅｍｅｎｔ（Ｒｉｇｇｓ ａｎｄ Ｍｅｌｔｏｎ著）Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐｐ．７４−９３。骨粗ショウ症、または有孔骨は、骨質量が小さく骨組織の構造が劣化する特徴のある進行性の慢性の病気であり、骨が脆くなり腰、脊椎、及び手首の骨折の受け易くなる（骨力が減る）。
【０００５】
骨のロスは兆候なく起きる。Ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ（（１９９３）Ａｍ． Ｊ．Ｍｅｄ．９４：６４６−６５０）は骨粗ショウ症を「骨の脆性及び骨折の受け易さが常に大きくなる、低骨質量及び骨組織のミクロ構造劣化を特徴とする組織的骨格病」と定義した。
通常のタイプの骨粗ショウ症は閉経後の骨粗ショウ症を含む；そして高齢の骨粗ショウ症、これは一般に遅くなって起きる、例えば、７０才以上。参照、例えば、Ｕ．Ｓ．特許第５，６９１，１５３号。骨粗ショウ症は米国の２千５百万人以上に影響すると予測される（Ｒｏｓｅｎ（１９９７）Ｃａｌｃｉｆ．Ｔｉｓ．Ｉｎｔ．６０：２２５−２２８）；そして、少なくとも１の概算では女性３人のうち１人が骨粗ショウ症にかかると断言される。Ｋｅｅｎら（１９９７）Ｄｒｕｇｓ Ａｇｉｎｇ １１：３３３−３３７．さらに、予測寿命は伸びて、西欧では１７％の婦人が今や５０才以上である：女性は閉経後に寿命の３分の１を生きる。従って、女性２人のうち１人、男性５人のうち１人は結局、骨粗ショウ症になると予測するものもいる；そして、米国、日本およびヨーロッパの７千５百万人は骨粗ショウ症になる。骨粗ショウ症学会の世界サミットは世界の２億人以上がこの病気に悩むと予測している。この病気の実際の発病率は骨折が起きるまで無症候性の状態であるから予測が難しい。米国では１年間に１５０万以上の骨粗ショウ症関連の骨折があると思われる。これらのうち、３０万は腰の骨折であり通常入院や手術を要し、長期または永久の不具となり死亡さえもある。Ｓｐａｎｇｅｒら「Ｔｈｅ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ ｏｆ Ｏｓｔｅｏｐｏｒｏｓｉｓ Ｍｉｎｉ−ｒｅｖｉｅｗ」；および（ｈｔｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｓａ．ｃｏｍ．ｏｓｔｅｏｉｎｔｒｏ．ｈｔｍｌ）。
【０００６】
粗ショウ症はまた事実上あらゆる社会で主要な健康問題である。Ｅｉｓｍａｎ（１９９６）；Ｗａｒｋ（１９９６）Ｍａｔｕｒｉｔａｓ ２３：１９３−２０７；及び米国特許５，８３４，２００。老齢の女性での腰骨折に関連した死亡率は２０−３０％である（米国特許５，６９１，１５３）；そして、そのような腰骨折の患者は同年齢のほかの患者よりも１０−１５％以上も死亡する。さらに、女性よりは男性は腰の損傷は少ないが、損傷１年以内に死亡する割合は女性よりも２５％も多い。Ｓｐａｎｇｌｅｒら、前記参照。また、腰骨折の前に独立して住んでいた患者の約２０％は１年後には長期のケア施設に入ることになる。骨粗ショウ症と関連する骨折の治療には年間百億ドル以上かかる。
【０００７】
骨粗ショウ症治療はさらに骨のロスと骨折をストップさせる。普通の治療にはＨＲＴ（ホルモン置換治療）、二燐酸塩、例えば、アレンドロネート（Ｆｏｓａｍａｘ）、エストロゲンおよびエストロゲン受容体モジュレーター、プロゲスチン、カルシトニン、及びビタミンＤを含む。任意特定の人が骨粗ショウ症を発現しているかどうか決定する多くの因子があるが、骨粗ショウ症の予防、抑制または治療の段階は骨粗ショウ症の危険があるかどうかの決定である。発生学的因子は骨粗ショウ症の病因に重要な役割を演ずる。Ｒａｌｓｔｏｎ（１９９７）；また参照Ｋｅｅｎら（１９９７）；Ｅｉｓｍａｎ（１９９６）；Ｒｏｓｅｎ（１９９７）；Ｃｏｌｅ（１９９８）；Ｊｏｈｎｓｏｎら（１９９５）Ｂｏｎｅ １７（２補足）１９Ｓ−２２Ｓ；Ｇｏｎｇら（１９９６）Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．５９：１４６−１５１；及びＷａｓｎｉｃｈ（１９９６）Ｂｏｎｅ（３補足）：１７９Ｓ−１８３Ｓ。いくつかは骨領域に依存する全骨変化の５０−６０％が発生学的影響となる（骨ミネラル密度「ＢＭＤ」）。Ｌｉｖｓｈｉｔｓら（１９９６）Ｈｕｍ．Ｂｉｏｌ．６８：５４０−５５４．しかし、骨ミネラル密度の８５％−９０％までの変化は発生学的に決定される。
家族の歴史、双子の研究、及び人種の因子から研究され、骨粗ショウ症の素因があった。Ｊｏｕａｎｎｙら（１９９５）Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ．３８：６１−６７；Ｇａｒｎｅｒｏら（１９９６）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｒｏｃｒｉｎｏｌ．Ｍｅｔａｂ．８１：１４０−１４６；Ｃｕｍｍｉｎｇｓ（１９９６）Ｂｏｎｅ １８（３補足）：１６５Ｓ−１６７Ｓ：及びＬｏｎｚｅｒら（１９９６）Ｃｌｉｎ．Ｐｅｄｉａｔｒ． ３５：１８５−１８９．いくつかの候補遺伝子はこの、大抵は多遺伝子のプロセスに含まれる。
【０００８】
サイトカインは、エストロゲン／テストステロン、上皮小体ホルモン及び１，２５（ＯＨ）２Ｄ３のコントロール下に骨再吸収及び形成の強力な調節器である。いくつかのサイトカインは最初に破骨細胞の骨再吸収を高める、例えばＩＬ−１（インターロイキン−１）、ＴＮＦ（腫瘍壊死因子）およびＩＬ−６（インターロイキン−６）；一方他のものは先ず骨形成を刺激する、例えばＴＦＧ−β（トランスフォーミング成長因子−β）、ＩＧＦ（インスリン様成長因子）およびＰＤＧＦ（血小板由来増殖因子）。
骨細胞活性および骨ミネラルの調整および基質形成および改造をコントロールする因子をさらに良く知るために骨粗ショウ症の予防と治療のための臨床と疫学的研究が必要である。
【０００９】
骨は多くのプロセスを経て発育する。間葉性細胞は直接骨に分化でき、頭蓋骨格の平らな骨になる；このプロセスは膜内骨化作用で終わる。あるいは、軟骨は骨形態形成のための鋳型を提供し、大多数の人骨で生じる。軟骨鋳型は軟骨内骨化作用として知られるプロセスで骨によって置き換えられる。Ｒｅｄｄｉ（１９８１）Ｃｏｌｌａｇｅｎ Ｒｅｌ．Ｒｅｓ．１：２０９−２２６。骨はまた成長と発育の間に絶えず作られ、物理学的化学的信号に応答して器官の寿命全体で改造される。胚形成中及び脊椎動物の寿命の間に軟骨と軟骨組織の発育と維持は非常に複雑である。組織のホルモンから、ＴＧＦ−β上科、サイトカイン及びプロスタグランジンのメンバーのような局部の調節因子まで多くの因子が、骨形成および骨再吸収の絶え間ないプロセスを調整するように協力して働く。骨芽細胞骨沈着及び破骨細胞骨再吸収との間のバランスの妨害は多くの骨格の病気の原因である。
骨ロスの病気は全西欧社会での特に女性のための主要な健康問題である。オステオペニアの最も一般的な原因は骨粗ショウ症である；他の原因は骨軟化症と上皮小体機能亢進症に関連した骨の病気を含む。オステオペニアはＸ線撮影で骨ミネラル含量の減少が認められるものとして定義されるが、この語はさらに適切には骨量の減少から骨折や疾患までの連続した段階を指す。
３千万のアメリカ人がこれら病気の中でもっとも普通に骨粗ショウ症の危険があり、同様に世界中では１億人に危険がある。Ｍｅｌｔｏｎ（１９９５）Ｂｏｎｅ Ｍｉｎ．Ｒｅｓ．１０：１７５。これらの数は世界の人口の中で老齢の割合が増加するにつれて多くなる。骨再吸収を阻害する薬品の最近の成功にも拘わらず、既に実質的な骨ロスを罹患した人々の骨の形成がかなり増加する特異的同化作用剤の必要性は明らかである。そのような薬剤は最近認可されていない。
機械的刺激は生体内で新しい骨形成を惹起し、培養中に骨芽細胞分化と代謝活性を増加する。骨組織での機械的変換は複数の工程を含む：１）信号の機械的化学的変換；２）細胞から細胞への信号化；及び３）骨芽細胞の数と活性の増加。機械的刺激の後の細胞から細胞への信号化はプロスタグランジン、特にＣＯＸ−２によって生成されたもの、及び一酸化窒素を含む。プロスタグランジンは骨原種細胞の増殖と分化の両方を促進することによって新しい骨を形成する。
【００１０】
発明の対象と概要
骨芽細胞増殖／分化及び骨形成を高める薬剤の研究では、機械的力を骨形成誘導物として用い、所有者の遺伝子の発見体系を行い非常に早く骨、軟骨−原種細胞に特異的に発現される遺伝子を検出した。
本発明はヒト機械的ストレス誘発遺伝子と、それらの機能的同等のもの、そのような遺伝子の発現生成物、そのような遺伝子と発現生成物の、骨粗ショウ症または因子またはプロセスの治療、予防、コントロールのための用途、それらには、これに限られないが、骨粗ショウ症、オステオペニア、骨石化症、骨硬化症、骨関節炎、歯根膜変性症及び骨折が含まれる。本発明はさらに診断、治療、予防、コントロールの方法またはプロセスならびに組成物を提供する。
本発明はさらに単離された核酸分子、およびその補体、タンパク質６０８またはその機能的部分またはポリペプチドを符号化するもの、少なくとも実質的に相同またはそれに同一のもの、を提供する。本発明はヒトタンパク質６０８（または「ＯＣＰ」）またはその機能的部分を符号化する単離された核酸分子を含む。
本発明はさらに骨粗ショウ症または低い骨密度または、これに限られないが、オステオペニア、骨石化症、骨硬化症、骨関節炎、歯根膜変性症それらの兆候、または機械的ストレスまたはそれらの不足を含む他の状態を含む骨の病気を引き起こすかまたは一因となることに関連した他の因子を、ここに提供するポリペプチドまたはその部分をその必要に応じて患者に投与することによって、予防、治療またはコントロールする方法を含む；そして従って、本発明はそのような予防、治療またはコントロールのための薬剤または治療を用意する際のポリペプチドの使用を包含する。
本発明はまた骨粗ショウ症または低い骨密度または、骨粗ショウ症またはその兆候または機械的ストレスまたはそれらの不足を含む他の状態を引き起こすかまたは一因となる他の因子を、遺伝子またはその機能的部分、そのような発現生成物またはその部分によって導き出された抗体またはその部分からなる組成物を投与することによって、予防、治療またはコントロールする方法を包含し；そして従って本発明は、そのようなコントロール、予防または治療のための薬剤または治療を準備する際の、そのような遺伝子、発現物質、抗体、それらの部分の用途を包含する。
上記のＯＣＰ関連の記述に類似して、本発明はさらにＯＣＰの任意の用途に対しここに記述したようなアドリカンの使用方法を含む。アドリカン遺伝子、またはその機能的部分は、同様にＯＣＰ遺伝子に対しここに記述した目的に用いられる。さらに本発明は生理的に受容可能な賦形剤および少なくとも１のアドリカン、アドリカン遺伝子およびアドリカンに特異的な抗体から成る組成物を含む。
さらに本発明はヒト機械的ストレスを誘発した遺伝子とそれらの機能的同等物、例えばＯＣＰとアドリカン、の発現生成物のための受容体、およびそのような受容体を得る方法および用いる方法またはプロセスを提供する。本発明はまたアッセイにおいて、例えば受容体に結合し、会合しまたはブロックするタンパク質またはポリペプチドを同定するため、そしてそのようなポリペプチドの効果をテストするため、そのような受容体を用いる方法を提供する。これらおよび他の実施例は開示されまたは以下の記述から自明である。
【００１１】
発明の詳細な説明
本発明は新規の遺伝子、ＣＭＦ６０８（”ＯＣＰ”）の発見に関し、その発現は一次頭蓋冠細胞の機械的ストレスによって上方制御される。複数の機能的特徴は骨または軟骨原種細胞の最も特異的初期マーカーとしてならびに骨芽細胞増殖および分化の誘導物質としてＯＣＰを同定する。
ここに用いられるように、本発明の同じ遺伝子は”６０８”または”ＯＣＰ”のいずれかであることができる。ＲＮＡは細胞培養基、培養した組織または細胞、または刺激され、分化され、化学物質に曝され、病原体で感染され、または刺激される有機体から単離した組織から単離されたＲＮＡである。ここで用いられるように、翻訳はｍＲＮＡ鋳型によって符号化されたタンパク質の合成として定義される。
ここに用いられるように、翻訳、転写、未知の標的ｍＲＮＡまたは刺激要素の安定性または輸送の刺激は、病理学的および／またはストレス条件下に自然の組織および／または細胞から誘導された遺伝子によって符号化されたｍＲＮＡ個体群を、化学的に、病原的に、物理的に、または別の方法で誘発しまたは阻止することを含む。換言すると、ストレス誘発要素または「ストレス要因」をもつｍＲＮＡの発現の刺激は、限定されないが、外部の合図、刺激、またはサンプルから細胞中に翻訳していないｍＲＮＡとして蓄えられるｍＲＮＡの翻訳を刺激または開始する刺激の適用を含む。ストレス要因は一定のｍＲＮＡの安定性の増加を引き起こし、または核から細胞質まで特定のｍＲＮＡの輸送を誘発する。ストレス要因はまた特定の遺伝子転写を誘発する。自然の細胞／組織での遺伝子からｍＲＮＡの翻訳を刺激することに加えて、刺激は病理学的および／またはストレス条件下に遺伝子の誘発および／または阻止を含むことができる。その方法はストレス誘発要素またはストレス要因によって種々の可能なレベルで調整された未知の標的遺伝子を同定するための刺激またはストレス要因を用いる。
【００１２】
さらに特に、核酸分子（ラット６０８およびヒト６０８遺伝子）およびそれらから発現したポリペプチドに関して、本発明はさらに単離されたおよび／または精製された核酸分子、および／または少なくとも約７０％、好ましくは少なくとも約７５％または約７７％の同一性または相同性（「実質的に相同または同一」）をもつ単離されたおよび／または精製されたポリペプチドを包含し、有利には少なくとも約８０％または約８３％、例えば少なくとも約８５％または８７％の相同性または同一性（「実質的に相同または同一」）；たとえば少なくとも約９０％または約９３％の同一性または相同関係（「大いに相同または同一」）；さらに有利には少なくとも約９５％、例えば、少なくとも約９７％、約９８％、約９９％または約１００％さえもある同一性または相同性（「非常に高い相同または同一」ないし「同一」）；または約８４−１００％の同一性が考慮される（高く維持される）。本発明はまたこれら核酸分子およびポリペプチドはここにまたは前に述べた核酸分子およびポリペプチドと同じ型で用いられる。
ヌクレオチド配列の相同性はＭｙｅｒｓ ａｎｄ Ｍｉｌｌｅｒ， （（１９８８）ＣＡＢＩＯＳ ４：１１−１７）およびＮＣＢＩで入手できる「整列」プログラムを用いて決定される。或いは追加として、「相同」または「同一」の語は、例えば、ヌクレオチドまたはアミノ酸配列に関して、２つの配列間の相同性の定量的基準を示すことができる。パーセントの配列の相同性は（Ｎｒｅｆ−Ｎｄｉｆ）＊１００／Ｎｒｅｆ、として計算でき、式中のＮｄｉｆは整列したときの２つの配列での同一でない残基の全数であり、Ｎｒｅｆは配列のうち１つの配列の残基数である。したがって、ＡＧＴＣＡＧＴＣはＡＡＴＣＡＡＴＣに対し７５％の配列類似性をもつ（Ｎｒｅｆ＝８；Ｎｄｉｆ＝２）
あるいはまたは追加として、配列に関して「相同」または「同一」は、２つの配列のうち短い方のヌクレオチドまたはアミノ酸残基の数によって割った同一のヌクレオチドまたはアミノ酸残基をもつ位置の数を指すことができ、２つの配列の整列はＷｉｌｂｕｒ ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ ａｌｇｏｒｉｔｈｍ（（１９８３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８０：７２６）に従って決定され、例えば２０個のヌクレオチドのウインドゥサイズ、４個のヌクレオチドのワード長、および４のギャップペナルティを用い、そしてコンピューターアシスト分析、および整列を含む配列データーの解釈は、便利に市販のプログラムを用いて行われる（例えば、Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅｔｉｃｓ（登録商標）Ｓｕｉｔｅ、Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｉｎｃ．，ＣＡ）。ＲＮＡ配列が類似であると言えるとき、またはＤＮＡ配列とある程度の配列同一性または相同性をもつとき、ＤＮＡ配列のチミジン（Ｔ）はＲＮＡ配列においてウラシル（Ｕ）に等しいと考えられる（また図面に用いた整列を参照）。本発明の範囲内のＲＮＡ配列は、ウラシル（Ｕ）でＤＮＡ配列中のチミジン（Ｔ）を置換することによって、ＤＮＡ配列またはそれらの補体から誘導できる。
追加的または二者択一的に、アミノ酸配列の類似性または同一性または相同性は、例えば、ＢｌａｓｔＰプログラム（Ａｌｔｓｈｕｌ ｅｔ ａｌ． Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２５：３３８９−３４０２）そしてＮＣＢＩで入手できる、を用いて決定される。次の参考文献は２個のタンパク質のアミノ酸残基の相対的同一性または相同性を比較するためのアルゴリズムを提供し、追加的に、または二者択一的に、前述に関しては、これら参考文献をパーセントの相同性または同一性を決定するために用いることができる。Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．（１９８１）Ａｄｖ． Ａｐｐｌ． Ｍａｔｈ． ２：４８２−４８９； Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．（１９８３）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １１：２２０５−２２２０； Ｄｅｖｅｒｅｕｘ ｅｔ ａｌ．（１９８４） Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １２：３８７−３９５； Ｆｅｎｇ ｅｔ ａｌ．（１９８７） Ｊ． Ｍｏｌｅｃ． Ｅｖｏｌ． ２５：３５１−３６０； Ｈｉｇｇｉｎｓ ｅｔ ａｌ． （１９８９） ＣＡＢＩＯＳ ５：１５１−１５３； ａｎｄ Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ． （１９９４） Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２２：４６７３−４８０。
用途に関して、本発明の遺伝子および発現生成物ならびにここに記載した方法によって同定された遺伝子およびその発現生成物およびアドリカンまたはアドリカン遺伝子からなる組成物（そのような発現生成物の「機能的」変異物、および発現生成物の機能的部分を符号化するここに定義された遺伝子の部分のようなここに定義された遺伝子の切断部分を含む）は機械的ストレス条件を、または機械的ストレス条件がなく、またはそのような条件を減らして、取扱い、回避、防止またはコントロールまたは診断する際に有用である。
ここに述べたように、アドリカンは、その機能的部分を含め、ＯＣＰに適当なすべての方法に用いられる。アドリカンとヒトＯＣＰとの間の配列相同性はアドリカンタンパク質のこの新規な用途を提供する。アドリカンは、例えば、ＡＦ２４５５０５．１：１．８４８７で提供される。アドリカンは「ロイシンの豊富な繰り返しをもつ接着タンパク質は真珠型カプセルＣＡＮに関する免疫グロブリンドメインを有する」ことから命名される；そして骨関節症患者からカートリッジでの高められた発現を示す。アドリカン遺伝子、またはその機能性タンパク質は、同様にＯＣＰ遺伝子に対しここに記述された任意の目的のために用いられる。本発明はさらに生理学的に受け入れられる賦形剤および少なくとも１のアドリカン、アドリカン遺伝子およびアドリカンに特異的な抗体からなる組成物を含む。
ＯＣＰ発現は骨芽細胞および軟骨細胞の増殖および分化に関連する。ＯＣＰ、または細胞またはＯＣＰを発現するベクターは細胞を選択的に増殖および分化させ、これによって骨密度を増加または変更する。ＯＣＰ ｍＲＮＡの検出レベルおよび発現およびそれを「正常」非骨障害性レベルと比較することは骨粗鬆症または低レベルの骨芽細胞および軟骨細胞に対するリスクで対象を検出可能にできる。
薬物または治療は骨粗鬆症に対する任意通常の薬物または治療であることができる。あるいは、または追加として、薬物または治療は本発明の方法で検出された遺伝子の特定のタンパク質であることができ、またはタンパク質が、例えば、それに結合することを阻害するものであることができる。同様に、追加的に、または代わりに、薬物または治療は本発明の方法で検出された遺伝子のタンパク質を発現するベクター、またはその遺伝子の発現を阻害するものであることができる；また、例えば、それに結合できるものおよび／またはさもなければその転写または翻訳を妨げるものであることができる。タンパク質またはそれを発現するものを投与すること、またはタンパク質または遺伝子発現を阻害するものを投与することの選択は、例えば、本発明の方法で決定されるような下方制御または上方制御に基づき（例えば、骨粗鬆症モデルで）過度の実験をすることなく行うことができる。
【００１３】
本発明の実施では、分子生物学での一般的方法を用いることができる。この分野で知られており特に記述されていない標準分子生物学技術は一般にＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（１９８９，１９９２） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ； およびＡｕｓｂｕｅｌ ｅｔ ａｌ．（１９８９） Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ， Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ， ＭＤに従う。
本発明の方法からなるＰＣＲは代表的に＜１０ｎｇ−２００ｎｇ間の鋳型核酸；５０−１００ｐｍｏｌの各オリゴヌクレオチドプライマー；１−１．２５ｍＭの各デオキシヌクレオチドトリフォスフェート；増幅反応を触媒するために用いられるポリメラーゼに適当な緩衝液；および０．５−２ユニットのポリメラーゼ、最も好ましくは熱安定性ポリメラーゼ（例えば、ＴａｑポリメラーゼまたはＴｔｈポリメラーゼ）からなる反応混合物において行われる。
抗体は本発明の種々の局面、例えば、検出または治療または予防方法で用いられる。抗体はイムノアッセイまたは本発明の実施に必要な他の分析方法に用いるためのモノクローナル、ポリクローナルまたは組み換え体であることができる。都合のよいことには、抗体は免疫原またはその抗原部分に対して調製することができ、例えば配列に基づき、またはクローニング技術によって組み換えにより調製された合成ペプチド、または天然遺伝子生成物および／またはその部分を単離し免疫原として用いることができる。遺伝子は本発明においてそして同定された遺伝子生成物において示すように同定される。 免疫原を用いて一般に以下に記載されているように当業者に良く知られている標準の抗体生成技術によって抗体を生成することができる。Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ （１９８８） Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， ＮＹ； およびＢｏｒｒｅｂａｅｃｋ （１９９２） Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ−Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ， Ｗ．Ｈ． Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ。抗体断片はまた抗体から調製することができ、当業者によって知られた方法で調製されたＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、ＦｖおよびｓｃＦｖを含む。Ｂｉｒｄ ｅｔ ａｌ． （１９８８） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３−４２６。十分な柔軟性と長さをもつ任意のペプチドをｓｃＦｖリンカーとして用いることができる。通常リンカーは免疫原性が殆どないように選択される。連結ペプチドの例は（ＧＧＧＧＳ）３であり、１のＶ領域のＣ末端と他のＶ領域のＮ末端の間の約３．５ｎｍを架橋する。他のリンカー配列もまた用いられ、薬剤または固体支持体を結合するための手段のような追加の機能を与えることができる。
ポリクローナル抗体を生成するため、ウサギまたはヒツジのような宿主を免疫原またはその免疫原断片で、一般にはアジュバントで免疫化し、必要ならば、キャリヤに結合させる；そして免疫原への抗体は免疫化した動物の血清から収集する。血清は交叉反応抗体が単一特異的なポリクローナル抗体を与える血清に残らないように関連する免疫原に吸収される。
【００１４】
モノクローナル抗体（ｍＡｂｓ）生成に対し、適当なドナー、一般にはマウスは免疫原と過免疫化し脾臓の抗体生成細胞を単離する。これら細胞はミエローマ細胞のような、不死細胞に融合され、抗体を分泌する不死融合細胞ハイブリッドを与える。次いで細胞は原体で培養され、ｍＡｂｓは使用するために培養基から収集される。ハイブリドーマ細胞ラインは化学的に同一な抗体の一定の安い供給源であり、そのような抗体の調製は容易に標準化される。ｍＡｂｓを製造する方法は当業者には良く知られている。例えば米国特許番号４，１９６，２６５参照。
組換え抗体を生成するため、動物のＢリンパ球を生成する抗体からのｍＲＮＡｓ、またはハイブリドーマは逆転写されｃＤＮＡｓを得る。一般にＨｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ． （１９９１） Ｍｅｔ． Ｅｎｚｙｍｏｌ． ２０３：４６−８８； Ｊｏｈｎｓｏｎ ａｎｄ Ｂｉｒｄ （１９９１） Ｍｅｔ． Ｅｎｚｙｍｏｌ． ２０３：８８−９９； およびＭｅｒｎａｕｇｈ ａｎｄ Ｍｅｒｎａｕｇｈ （１９９５） Ｉｎ， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｐｌａｎｔ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ （Ｓｉｎｇｈ ａｎｄ Ｓｉｎｇｈ ｅｄｓ．） ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ． Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ， ＦＬ， ｐｐ．３５９−３６５）を参照。抗体ｃＤＮＡは、全長又は部分長であり、ファージまたはプラスミドに増幅およびクローニングされる。ｃＤＮＡは重または軽鎖ｃＤＮＡの部分長であり、リンカーによって分離または結合される。抗体、または抗体断片は、適当な発現系を用いて発現され、組換え抗体を得る。抗体ｃＤＮＡはまた妥当な発現ライブラリーをスクリーニングすることによって得られる。
抗体は固体支持体物質に結合しまたは検出できる部分と接合しまたは当該分野で良く知られているように結合および接合される。蛍光または酵素部分の接合の一般的な議論は、Ｊｏｈｎｓｏｎ ａｎｄ Ｔｈｏｒｐｅ （１９８２） Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｉｎ Ｐｒａｃｔｉｃｅ， Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ， Ｏｘｆｏｒｄを参照。固体支持体物質への抗体の結合は当該分野では良く知られている。一般的な議論は、Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ （１９８８）； およびＢｏｒｒｅｂａｅｃｋ （１９９２）を参照。本発明で企図される検出できる部分は、制限されないが、蛍光、金属、酵素および放射性のマーカー、例えばビオチン、金、フェリチン、アルカリ性フォスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、パーオキシダーゼ、ウレアーゼ、フルオレセイン、ローダミン、トリチウム、１３Ｃおよびヨウ素化を含む。
また抗体は治療組成物における活性剤として用いられ、そのような抗体は例えばそれらの効果を高めるようにヒト化される。Ｈｕｌｓ ｅｔ ａｌ． Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ． １７：１９９９を参照。「ヒト化」した抗体は少なくとも一部の配列がその元の形から変更されさらにヒトイムノグロブリンに似ているようにする抗体である。一の変更では、Ｈ鎖とＬ鎖の領域がヒト配列と置き換えられる。他の変更では、ＣＤＲ領域は関心のある抗体からのアミノ酸配列からなり、Ｖフレームワーク領域はまたヒト配列に変換された。例えば、ＥＰ０３２９４００を参照。第三の変更はＶ領域がヒトおよびマウスＶ領域のコンセンサス配列を設計することによってヒト化され、コンセンサス配列間で異なるＣＤＲｓの外側の残基を変更する。本発明はヒト化ｍＡｂｓを含む。
遺伝子からの発現生成物またはその部分はモノクローナルまたはポリクローナル抗体のような抗体を生成するために用いられ、診断の目的に、または発現生成物またはその部分または遺伝子またはその部分の活性をブロックするために、例えば治療に有用である。
【００１５】
本発明の遺伝子またはその部分、例えば全長タンパク質と同じかまたは類似する作用をするタンパク質を発現する部分、またはここにある方法によって同定される遺伝子は、組換えによって、例えばエシェリシア・コリまたはインヴィヴォ発現またはインヴィトロ発現のいずれかのための他のベクターまたはプラスミドにおいて発現される。本発明のまたはインヴィヴォまたはインヴィトロのいずれかで本発明によって同定された遺伝子またはその部分の遺伝子生成物の発現のためのベクターまたは組換え体またはプラスミドを作りおよびまたは投与する方法は、任意の所望の方法、例えば、米国特許４，６０３，１１２； ４，７６９，３３０； ５，１７４，９９３； ５，５０５，９４１； ５，３３８，６８３； ５，４９４，８０７； ４，３９４，４４８； ４，７７２，８４８； ４，７４５，０５１； ４，７６９，３３１； ５，５９１，６３９； ５，５８９，４６６； ４，９４５，０５０； ５，６７７，１７８； ５，５９１，４３９； ５，５５２，１４３； および５，５８０，８５９； １９８６年１０月６日出願の米国特許出願９２０，１９７； ＷＯ９４／１６７１６； ＷＯ９６／３９４９１； ＷＯ９１／１１５２５； ＷＯ９８／３３５１０； ＷＯ９０／０１５４３； ＥＰ０ ３７０ ５７３； ＥＰ２６５７８５； Ｐａｏｌｅｔｔｉ （１９９６）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ９３：１１３４９−１１３５３； Ｍｏｓｓ （１９９６） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９３：１１３４１−１１３４８； Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ （Ｅｄ） （１９９５） Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ３９， ”Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，” Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．； Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ． （１９８３） Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． ３：２１５６−２１６５； Ｐｅｎｎｏｃｋ ｅｔ ａｌ． （１９８４） Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． ４：３９９−４０６； Ｒｏｉｚｍａｎ Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９３：１１３０７−１１３１２； Ａｎｄｒｅａｎｓｋｙ ｅｔ ａｌ． Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９３：１１３１３−１１３１８； Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ ｅｔ ａｌ． Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９３：１１３３４−１１３４０； Ｆｒｏｌｏｖ ｅｔ ａｌ． Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９３：１１３７１−１１３７７； Ｋｉｔｓｏｎ ｅｔ ａｌ． （１９９１） Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６５：３０６８−３０７５； Ｇｒｕｎｈａｕｓ ｅｔ ａｌ． （１９９２） Ｓｅｍ． Ｖｉｒｏｌ． ３：２３７−５２； Ｂａｌｌａｙ ｅｔ ａｌ． （１９９３） ＥＭＢＯ Ｊ． ４：３８６１−６５； Ｇｒａｈａｍ （１９９０） Ｔｉｂｔｅｃｈ ８：８５−８７； Ｐｒｅｖｅｃ ｅｔ ａｌ． Ｊ． Ｇｅｎ． Ｖｉｒｏｌ． ７０：４２９−４３４； Ｆｅｌｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ． （１９９４） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６９：２５５０−２５６１； （１９９３） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５９：１７４５−４９； ＭｃＣｌｅｍｅｎｔｓ ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９３：１１４１４−１１４��０； Ｊｕ ｅｔ ａｌ． （１９９８） Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ ４１：７３６−７３９； およびＲｏｂｉｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ． （１９９７） Ｓｅｍ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ９：２７１−２８３に開示された方法または類似の方法によることができる。
ベクターまたは組換え体によって生成した発現生成物はまた感染またはトランスフェクションした細胞から単離および／または精製することができ；たとえば、患者に投与するための組成物を調製する。しかし、ある場合には、例えば細胞またはその部分がポリペプチドの効果を高めるとき、細胞からの発現生成物を単離および／または精製しないことが有利である。
【００１６】
ここに用いられる「治療または処理」の語は個々のまたは処理される細胞の自然過程を変えるような試みでの臨床介入を指し、予防または臨床病理の過程の間に行われる。治療の望ましい効果は病気の発生または再発の予防、症状の緩和、病気の任意の直接のまたは間接の病状の因果関係の減少、転移の予防、病気の進行速度の減少、病状の改善または軽減、および予後の軽減または改善を含む。
ここに同定したまたはこのにある方法からの遺伝子またはその部分を発現する本発明のベクターまたは組換え体は、適当な投与レベルで、例えば、ここに記述した投与レベル（遺伝子生成物が直接存在する）に似た投与レベルで、発現を達成するように任意適当な量で投与できる。本発明のベクターまたは組換え体ヌクレオチドを患者または感染またはトランスフェクションした細胞に約少なくとも１０３ｐｆｕ、さらに好ましくは約１０４ないし約１０１０ｐｆｕ、例えば約１０５ないし約１０９ｐｆｕ、例えば１０６ないし約１０８ｐｆｕの量で投与することができる。プラスミド組成物では、投与は遺伝生成物またはその部分が直接存在する組成物に似た応答を顕在化させるように；またはそのような組成物での投与に似た発現をするように；または組換え組成物によってインヴィヴォで得た発現に似た発現をするように、十分なプラスミド量でなければならない。例えば、プラスミド組成物での適当な量のプラスミドＤＮＡは１μｇないし１００ｍｇ、好ましくは０．１ないし１０ｍｇ、例えば５００μｇであることができ、しかし低レベルの０．１ないし２ｍｇまたは好ましくは１−１０μｇが用いられる。ＤＮＡプラスミドベクターに関しここに引用される文献で、過度の実験をせずに、本発明のＤＮＡプラスミドベクター組成物に対し他の適当な投与量を確実にするように当業者には調べてみることができる。
ベクターを投与するための組成物はここに引用した文献の組成物と同じかまたは類似するものであることができ、または例えば、製薬または治療組成物等、ここに記載した組成物と同じかまたは類似するものであることができる。
【００１７】
従って、本発明は「遺伝子治療」と呼ぶこともあるインヴィヴォ遺伝子発現を含む。遺伝子治療は関心のある遺伝子物質（例えばＤＮＡまたはＲＮＡ）を宿主対象または患者に遺伝子のまたは捕捉した病気、症状または表現型を治療または予防するため運ぶことを指す。標的遺伝子として用いられまたは同定される特定の遺伝子は、ここに示されるように同定される。関心のある遺伝子物質は生成物（例えば、タンパク質、ポリペプチド、ペプチドまたは機能的ＲＮＡ）を符号化する、そのインヴィヴォ生成が望ましい。例えば、関心のある遺伝子物質は治療価値のあるホルモン、受容体、酵素、ポリペプチドまたはペプチドを符号化する。参考文献には、一般にテキスト”Ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ” （Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ４０， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， １９９７） がある。
遺伝子治療の２つの基本的アプローチは（１）エキソヴィヴォ；および（２）インヴィヴォ遺伝子治療がある。エキソヴィヴォ遺伝子治療では患者から細胞を取り、培養はインヴィトロで処理される。一般に、機能的置換遺伝子は適当な遺伝子配達ビヒクル／方法（トランスフェクション、相同組換え等）によって細胞に導入され、必要な発現系および改変細胞が培養基に広げられ宿主／患者に戻される。これら遺伝子的に再移殖された細胞は、そのままトランスフェクションした遺伝子生成物を生成することが示された。インヴィトロ遺伝子治療では、標的細胞は対象から移動せず；むしろ、移動されるべき遺伝子がそのまま受容者の細胞に導入され、それは受容者内にある。或いは、宿主遺伝子が不完全であるならば、遺伝子はそのまま治療される。Ｃｕｌｖｅｒ （１９９８） Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ＤＮＡ ＆ ＲＮＡ Ｂａｓｅｄ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ， Ｆｅｂｒｕａｒｙ， １９９８， Ｃｏｒｏｎａｄｏ， ＣＡ。これら遺伝子的に改変した細胞はトランスフェクションした遺伝子生成物をそのまま生成することが示された。
遺伝子発現ビヒクルは非相同核酸を宿主細胞に供給／移動することができる。発現ビヒクルは当該分野で知られているような細胞選択法で核酸の標的、発現および転写をコントロールする要素を含むことができる。遺伝子の５’ＵＴＲおよび／または３’ＵＴＲが発現ビヒクルの５’ＵＴＲおよび／または３’ＵＴＲによって置き換えられル事は注目すべきである。従って、ここに用いたように、発現ビヒクルは、必要に応じて、ここでの配列に示された５’ＵＴＲおよび／または３’ＵＴＲを含まず、特定のアミノ酸コード化領域を含むことができる。
発現ビヒクルは非相同物質の転写をコントロールするためのプロモーターを含み、選択的転写を可能にする本質的または誘導できるプロモーターであることができる。必要な転写レベルを得るために必要なエンハンサーは選択的に含まれる。エンハンサーは一般に任意の非翻訳ＤＮＡ配列であり、プロモーターによって指図される基礎的転写レベルを変えるように（シスで）コード配列と継続して働く。発現ビヒクルはまたここに記載したような選択遺伝子を含むことができる。
【００１８】
ベクターは当該分野で知られている種々の方法のどれか１によって細胞または組織に導入される。このような方法は一般にＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ． （１９８９，１９９２）； Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ． （１９８９）； Ｃｈａｎｇ ｅｔ ａｌ． （１９９５） Ｓｏｍａｔｉｃ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ， ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ， Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ， ＭＩ； Ｖｅｇａ ｅｔ ａｌ． （１９９５） Ｇｅｎｅ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ， ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ， Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ， ＭＩ； Ｖｅｃｔｏｒｓ： Ａ Ｓｕｒｖｅｙ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｖｅｃｔｏｒｓ ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ Ｕｓｅｓ， Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈｓ， Ｂｏｓｔｏｎ ＭＡ （１９８８）； Ｇｉｌｂｏａ ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ｂｉｏ Ｔｅｃｈ． ４：５０４−５１２、ならびにここに引用された他の文献にも記載されており、例えば、安定または一過性のトランスフェクション、リポフェクション、電気穿孔法および組換えウイルスベクターを用いる感染を含む。さらに、中枢神経系をふくむベクターについて米国特許４，８６６，０４２を参照；そしてまた正−負選択法については米国特許５，４６４，７６４および５，４８７，９９２を参照。
感染による核酸の導入は他のリストの方法に対し利点を提供する。高効率はそれらの感染の性質により得られる。さらに、ウイルスは非常に特定化され代表的には特定の細胞系で感染し増殖する。従って、それらの性質の特異性はインヴィヴォまたは組織または混合細胞培養基内で特異的細胞系にベクターを標的にするために用いられる。ウイルスベクターはまた特異的受容体またはリガンドを用いて改変され受容体媒介現象によって標的特異性を変える。
追加の特徴はベクターに追加されその安全性を確実にしおよび／またはその治療有効性を高めることである。このような特徴は、例えば、組換えウイルスで感染した細胞に対して負に選択されるように用いられるマーカーを含む。そのような負に選択されたマーカーの例は、上述のＴＫ遺伝子であり、抗生物質のガンシクロビルに感受性を与える。負の選択は従って感染が抗生物質の追加によって誘導できる自滅を与えるのでコントロールできる。そのような保護は、例えば、ウイルスベクターまたは組換え配列の変更形態を生成する突然変異が生じる場合に、細胞質の形質転換は起こらないであろう。発現特定の細胞型に制限する特徴も含まれる。そのような特徴は、例えば、所望の細胞型に特異的であるプロモーターおよび調節要素を含む。
さらに、組換えウイルスベクターは、外側の感染および標的特異性のような利点を与えるので所望の核酸のインヴィヴォ発現に有用である。外側の感染は、例えば、レトロウイルスの生命サイクルに固有であり、単一の感染細胞は近隣細胞を分離し感染する多くの子孫のビリオンを生むプロセスである。その結果、大抵は元のウイルス粒子によって最初は感染しなかった大きい範囲で急速に感染する。これは感染剤が娘子孫によってのみ広がる垂直タイプの感染に対照である。また外側に広がることができないウイルスベクターが生成される。この特徴は所望の目的が特異的遺伝子を局在化した数の標的細胞にのみ導入することであるならば、有用である。
【００１９】
遺伝子生成物（ここに定義された遺伝子からの生成物：ここに定義された遺伝子または本発明の方法によってまたはその部分）および／または抗体またはその部分および／またはアゴニストまたはアンタゴニスト（集合的または個々に“治療用物質”）、および同じものからなる組成物、ならびにベクター発現遺伝子生成物からなる組成物の供給は、この開示および当該分野の知識から過度の実験なしで行うことができる。
ここにおける目的のための製薬学的“有効量”は従って当該分野で知られているような考察によって決定される。その量は、寿命を改善したり回復を早めることに限られないが改善するために有効でなければならず、または例えば骨粗鬆症の兆候および他の指標の改善または改良または症状の緩和または除去、例えば骨密度の改善は当業者によって適当な測定単位として選択される。
特に、ヒトは一般にマウスまたはここに例示される実験動物よりも長く治療される。ヒトの治療は病気のプロセスの長さおよび薬剤の有効性に比例した長さである。投薬量は一回の投与または数日間にわたる複数回の投与であるが、一回の投与が好ましい。従って、動物実験、例えば、ラット、マウス、等からヒトに、この開示および当該分野の知識からの技法によって、過度の実験なしで増量できる。
本発明はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３の少なくとも１に示される配列をもつヌクレオチドを含む単離された核酸分子、またはｐＣｍ−Ｈ−６０８−６６３−Ｎ用語を表し、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３６３８で寄託されたプラスミドに挿入されるとき、そのサプリメントおよびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３とは異なる配列をもつポリヌクレオチド、または遺伝コードの縮重によるＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３６３８で寄託されたｐＣｍ−Ｈ−６０８−６６３−Ｎ語で呼ばれるプラスミドに挿入されるとき、または厳密な条件でｐＣＭ−Ｈ−６０８−６６３−Ｎ語で呼ばれるプラスミドにハイブリダイズする配列またはその機能的部分または少なくとも実質的にそれと相同または同一であるポリヌクレオチドを提供する。好適例では、核酸分子はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３からの少なくとも１５のヌクレオチドをもつポリヌクレオチドからなり、またはＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３６３８で寄託されたｐＣｍ−Ｈ−６０８−６６３−Ｎ語と呼ばれるプラスミドに挿入されるとき、好ましくは少なくとも５０のヌクレオチドそしてさらに好ましくは少なくとも１００のヌクレオチドである。
さらに本発明は少なくとも１のＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８、またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８に示される配列をもつヌクレオチドをふくむ単離された核酸分子を提供し、またはｐＫＳ Ｈ６０８ ５’−２．４Ｋｂ ｂＡｃ＃１（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ （ＡＴＣＣ）、１２３０１ Ｐａｒｋｌａｗｎ Ｄｒｉｖｅ， Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ， Ｍｅｄ．， ２０８５２，  ＵＳＡによるブダペスト条約下に２００１年１１月２１日に寄託されたＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３８７８）、ｐＫＳ Ｈ６０８ ｍ．ＦＲＧ．３．５Ｋｂ＃３４（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ （ＡＴＣＣ）、１２３０１ Ｐａｒｋｌａｗｎ Ｄｒｉｖｅ， Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ， Ｍｅｄ．， ２０８５２， ＵＳＡによるブダペスト条約下に２００１年１１月２１日に寄託されたＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３８７６）またはｐＭ Ｈ６０８ ３’−１．９Ｋｂ ＨＳＴＧ＃３．３（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ （ＡＴＣＣ）、１２３０１ Ｐａｒｋｌａｗｎ Ｄｒｉｖｅ， Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ， Ｍｅｄ．， ２０８５２  ＵＳＡによるブダペスト条約下に２００１年１１月２１日に寄託されたＡＴＣＣ受託番号３８７７）と呼ばれるプラスミドに挿入されるとき、そのサプリメントおよびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８、またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８に示される配列をもつポリヌクレオチド、または遺伝コードの縮重によるｐＫＳ Ｈ６０８ ５’−２．４Ｋｂ ｂＡｃ＃１、ｐＫＳ Ｈ６０８ ｍ．ＦＲＧ．３．５Ｋｂ＃３４またはｐＭ Ｈ６０８ ３’−１．９Ｋｂ ＨＳＴＧ＃３．３と呼ばれるプラスミドに挿入されるとき、または厳密な条件でｐＫＳ Ｈ６０８ ５’−２．４Ｋｂ ｂＡｃ＃１、ｐＫＳ Ｈ６０８ ｍ．ＦＲＧ．３．５Ｋｂ＃３４またはｐＭ Ｈ６０８ ３’−１．９Ｋｂ ＨＳＴＧ＃３．３と呼ばれるプラスミドにハイブリダイズする配列またはその機能的部分または少なくとも実質的にそれと相同または同一であるポリヌクレオチドを提供する。好適例では、核酸分子はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８、またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８からの少なくとも１５のヌクレオチドをもつポリヌクレオチドからなり、またはｐＫＳ Ｈ６０８ ５’−２．４Ｋｂ ｂＡｃ＃１、ｐＫＳ Ｈ６０８ ｍ．ＦＲＧ．３．５Ｋｂ＃３４またはｐＭ Ｈ６０８ ３’−１．９Ｋｂ ＨＳＴＧ＃３．３と呼ばれるプラスミドに挿入されるとき、好ましくは少なくとも５０のヌクレオチドそしてさらに好ましくは少なくとも１００のヌクレオチドである。
【００２０】
また本発明は単離された核酸分子の組成物、その単離された核酸分子からなるベクター、前記ベクターを含む組成物および、これに限らないが、骨粗ショウ症、オステオペニア、骨化石症、骨硬化症、骨関節炎、歯根膜変性症、骨折または低骨密度または他の機械的ストレスまたは対象のその不足を含む他の状態を含む骨の病気を、本発明の組成物または本発明のベクターを投与し、予防、治療またはコントロールする方法、および単離した核酸分子を発現してなるかまたはベクターからのポリペプチドを発現してなるポリペプチドを調製する方法を提供する。さらに本発明は、骨粗ショウ症、オステオペニア、骨化石症、骨硬化症、骨関節炎、歯根膜変性症、骨折または低骨密度または他の機械的ストレスまたは対象のその不足を含む他の状態を含む骨の病気を治療、予防、またはコントロールする方法を提供し、それは単離した核酸分子またはその機能的部分、または遺伝子の発現生成物からなるポリペプチド、またはポリペプチドの機能的部分、または抗体をポリペプチドまたは、抗体の機能的部分に投与してなる。本発明の１実施例では、単離された核酸分子はＯＣＰタンパク質の１０ｋＤないし１００ｋＤの Ｎ−末端開裂生成物を符号化する。好ましくは、Ｎ−末端開裂生成物は約２５ｋＤのポリペプチドからなる。さらに好ましくは、Ｎ−末端開裂生成物は約７０−８０ｋＤのポリペプチドからなる。
【００２１】
本発明は、本発明のポリヌクレオチドによって符号化された単離したポリペプチドを提供する。本発明の１実施例では、ポリペプチドはヒトＯＣＰまたはその機能的部分または少なくとも実質的にそれに相同か同一であるポリペプチドとして同定される。好ましくは、機能的部分は１０ｋＤないし１００ｋＤの分子量をもつＮ−末端ポリペプチドからなる。さらに好ましくは、機能的部分は分子量が約２５ｋＤのＮ−末端ポリペプチドからなる。さらに好ましくは、機能的部分は分子量が約７０−８０ｋＤのＮ−末端ポリペプチドからなる。
本発明はまた、１または単離されたポリペプチドからなる組成物、ポリペプチドまたはその機能的部分に特異的な抗体、抗体またはその機能的部分からなる組成物、および骨粗鬆症、または骨折治癒、骨伸長、または対象の歯根膜変性症を治療または予防する方法を提供し、１０ｋＤおよび１００ｋＤの間の分子量、好ましくは約２５ｋＤ、最も好ましくは約７０−８０ｋＤの分子量をもつＮ−末端ポリペプチドを対象に投与してなる。
本発明は骨粗鬆症、骨石化症、または硬骨化症を治療または予防する方法を提供し、対象に、１０ｋＤおよび３０ｋＤの間、好ましくは約２５ｋＤ分子量をもつＮ−末端ポリペプチドの活性を阻害する有効量の化学または中和ｍＡｂｓを投与することからなる。
ここで用いられる語、「対象」、「患者」、「宿主」は、これに限られないが、ヒト、ウシ、ブタ、マウス、ラット、ヤギ、ヒツジおよびウマを含む。
当業者は組成物の成分は遺伝子生成物および任意のアジュバントまたは添加物に関して化学的に不活性であるように選択されなければならない。これは化学および製薬源の当業者には問題がなく、または問題点は、この開示およびここに引用された文献から、標準テキストを参照してまたは（過度の実験を含まない）簡単な実験によって容易に避けられる。
【００２２】
本発明は、ＯＣＰおよびアドリカンのような、ヒトの機械的ストレスを誘発する遺伝子およびそれらの機能的同等物の発現生成物の受容体、およびそのような受容体を入手および使用する方法またはプロセスを提供する。本発明の受容体は機械的ストレス誘発遺伝子およびそれらの機能的同等物の発現生成物が従来のアッセイ、ならびにインヴィヴォで決定されるとき結合または連結するものである。例えば、本発明のポリペプチドの受容体への結合はインヴィトロで決定され、脂質膜と会合する候補者の受容体分子を用いる。参照、例えばＷａｔｏｓｏｎ， Ｊ， ｅｔ ａｌ．， Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ＦｌａｓｈＰｌａｔｅ（登録商標）技術、クローニングしたヒト５−ＨＴ１Ｂ受容体を発現するチャイニーズハムスター卵巣膜に結合する（３５Ｓ）ＧＴＰガンマＳを測定する、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ， Ｓｕｍｍｅｒ， １９９８； ３（２）１０１−１０５； Ｋｏｍｅｓｌｉ−Ｓｙｌｖｉａｎｅ ｅｔ ａｌ．，ＴＧＦ−ベータアンタゴニストとしてヒトイムノグロブリンのＦｃ領域に融合した成長因子（ＴＧＦ）−ベータ受容体を形質転換するタイプＩＩのキメラ細胞外ドメイン、Ｅｕｒｏｐｉａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ． Ｊｕｎｅ， １９９８；２５４（３） ５０５−５１３。参照、一般に、Ｄａｒｎｅｌｌ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ， ６４４−６４６， Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｂｏｏｋｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （１９８６）。走査電子顕微鏡（「ＳＥＭ」）、ｘ−線結晶学および標識ポリペプチドを用いる反応は、ポリペプチドが受容体分子と結合または会合しているかどうか決定するための従来の方法の例である。例えば、ｘ−線結晶学は詳細な構造情報を提供し、結合または会合が生じるかどうかどの程度かを決定することができる。参照、例えば、米国特許第６．０３７，１１７号；米国特許第６，１２８，５８２号および米国特許第６，１５３，５７９号。さらに、Ｘ−線結晶学を含む結晶学は、三次元構造を提供し、候補のポリペプチドリガンドが標的分子、例えば受容体と結合または会合することができるかどうかを示す。参照、例えば、ＷＯ９９／４５３７９；米国特許第６，０８７，４７８号および６，１１０，６７２号。このような結合または会合は受容体分子が候補のポリペプチドに対する受容体であることを示す。
【００２３】
本発明の遺伝子、発現生成物およびその使用を本発明において開示することにより、当業者は従来法により本発明の発現生成物に対する受容体を得ることができる。受容体を得るための従来法は候補の受容体に対しモノクローナル抗体（Ｍａｂｓ）を産生させ、アフィニティカラムを用いて組織サンプルから受容体を精製し、緩衝液で処理し溶出受容体分子を収集することを含む。受容体を単離精製する他の手段は当該分野では既知であり、例えば透析による単離精製、塩析、および電器泳動（例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）およびクロマトグラフ法（例えばイオン交換およびゲル濾過、さらにアフィニティ）技法である。このような方法は一般にＳｔｒｙｅｒ， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ４４−５０， Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ＆ Ｃｏ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （３ｄ ｅｄ． １９８８）； Ｄａｒｎｅｌｌ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ， ７７−８０ （１９８６）； Ａｌｂｅｒｔｓ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｅｌｌ， １６７−１７２， １９３ Ｇａｒｌａｎｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （２ｄ ｅｄ． １９８９）に見られる。
単離した受容体の配列決定は当該分野で既知の方法を含み、例えば受容体の短Ｎ−末端配列を直接配列決定、核酸プローブを構築、受容体遺伝子を単離、および核酸配列から受容体のアミノ酸配列を決定することを含む。あるいは、全受容体タンパク質を直接配列決定することができる。自動化エドマン分解は受容体タンパク質を部分的にまたは全体的に配列決定するために用いられ、化学的または酵素による開裂によって促進される従来法の一つである。自動化した配列決定装置、例えばＡＢＩ−４９４ Ｐｒｏｃｉｓｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いることができる。参照、一般に、Ｓｔｒｙｅｒ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，５０−５８（３ｄ ｅｄ．１９８８）。
本発明は、このような受容体をアッセイで用いる方法、例えばタンパク質または本発明の受容体に結合し、会合しまたはブロックするポリペプチドを同定し、結合定数と結合度を決定し、そして例えば膜受容体調製物を用い、このようなポリペプチドの効果を試験するための方法を提供する。参照Ｗａｔｓｏｎ（１９９８）；Ｋｏｍｅｓｌｉ−Ｓｙｌｖｉａｎｅ（１９９８）。例えば、ＦｌａｓｈＰｌａｔｅ（登録商標）（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ， Ｍａｓｓａｃｈｓｅｔｔｓ， ＵＳＡ）技法を本発明に用い候補のポリペプチドが結合しているかどの程度まで結合しているか、本発明の受容体に関して機能的であるか決定する。
本発明およびその多くの利点をさらに理解するため以下の実施例は概略および本発明のさらなる詳細を示す。
【００２４】
実験詳細
ＴＧＦ−β１は結合性の組織成長因子（ＣＴＧＦ、ｃｅｆ１０，ｆｉｓｐ１２，ｃｙｒ６１，βＩＧ−Ｍ１， βＩＧ−Ｍ２，非プロトオンコジーン）発現の基本的誘導物質として知られている。後者は４つの別個の構造モジュールを含み、それらの各々はウイルブランド因子、スリトオ、トロンボスポンジン、原繊維コラーゲン、ＩＧＦ−結合タンパク質およびムチンのような他の細胞外タンパク質での別個のドメインに相同である。ＣＴＧＦ発現はＴＧＦ−β１だけでなくＢＭＰ２（骨形態形成因子２）によって創傷修復の間に誘発される。胚形成では、その発現は手足、肋骨、前椎、軟骨頭蓋および頭蓋要素（メッケルの軟骨）を含む軟骨要素を発育する際に見出される。従って、ＣＴＧＦ転写は中胚葉および外胚葉起源の両者の軟骨細胞の分化と関連する。培養では、ＣＴＧＦは軟骨細胞で発現するが、骨芽細胞では発現しない。軟骨内骨化作用でのＣＴＧＦに対する可能な役割はＢＭＰ２へのその応答のためと推測される。繊維芽細胞では、ＣＴＧＦ発現はα−１−コラーゲン、α−５−インテグリンおよびフィブロネクチンのアップレギュレーションの原因となる。
【００２５】
実施例１
インシトゥハイブリダイゼーションによるＣＭＦ６０８遺伝子発現
ＣＭＦ６０８遺伝子発現パターンは卵巣切除し偽手術したラットからの骨の切片でのインシトゥハイブリダイゼーションによって研究した。体重３００−３５０ｇの雌ウィスターラットを一般の麻酔下に卵巣切除した。コントロールラットを同じ方法で操作したが、卵巣は摘出しなかった−偽手術。
手術３週間後、ラットは殺し脛骨を膝関節とともに摘出した。骨を３日間４％のパラホルムアルデヒドに固定し、４日間５％蟻酸および１０％ホルマリンを含む溶液で石灰質を除いた。石灰質を除いた骨を１０％ホルマリンに３日間固定しパラフィンに埋め込んだ。
異所性の骨形成モデルを用いて骨発現ＣＭＦ６０８遺伝子発現パターンを研究した。ラットの骨髄細胞をラット脛骨から調製した脱塩骨母材の円筒に接種した。円筒を成熟ラットの皮下に埋めた。３週間後、ラットを殺し埋め込んだものの石灰質を除き上記の脛骨と同様にパラフィンに埋め込んだ。
６μｍの切片を調製しそのままハイブリダイゼーションした。ハイブリダイゼーション後、切片を核トラックエマルジョンに浸け３週間４℃で暴露した。オートラジオグラフィーを発生させ、ヘモトキリン−エオシンで染色し明視野および暗視野照明を用いて顕微鏡下に研究した。
さらにＣＭＦ遺伝子発現の細胞と組織の特異性を評価するため、インシトゥハイブリダイゼーション研究を成熟ラット組織の多数サンプルを含む多組織ブロックの断片で行った。ＣＭＦ６０８発現発生パターンを１２．５、１４．５および１６．５日の受胎後（ｄｐｃ）段階のマウス胎児の矢状切片で研究した。
長骨のハイブリダイゼーション切片を顕微鏡でみるとＣＭＦ６０８プローブハイブリダイゼーションの独特のパターンを表していた。ハイブリダイゼーション信号は主として切片全体の複数の箇所で見られた繊維芽細胞様細胞に見られる。これら細胞の顕著な蓄積は骨幹端の骨膜モデリング領域に見られ、また骨幹での緻密な骨の活性リモデリングの領域にも見られる：骨髄と骨内膜性骨芽細胞と間の境界でそして骨膜で；また骨芽細胞と近接して。また骨幹と骨端での緻密骨のフォルクマン管を充填する血管周囲の接合組織はＣＭＦ６０８−発現細胞を含む。海綿状骨および骨髄内にハイブリダイゼーションは見られなかった。このハイブリダイゼーションパターンは細胞発現ＣＭＦ６０８を発現する細胞が発現骨の再構築領域に関連し一次軟骨内骨化作用に含まれないことを示唆している。
成長板レベルでは、ＣＭＦ６０８発現細胞はＬａＣｒｏｉｘの軟骨膜繊維性リングに見られる。若干の研究者はこの繊維性組織を骨芽細胞および軟骨細胞の両方に分化させることができる残留する間葉細胞の集合体としみなしている。この観点ではＣＭＦ６０８を発現する単一細胞は骨端軟骨に見られることは注目すべきである。これらのＣＭＦ６０８−発現細胞は骨端（ときにはＬａＣｒｏｉｘリングに近接する）の側面区域内の丸い細胞であり、関節表面を覆う平な細胞である。関節軟骨の大抵の細胞および成長板の全軟骨細胞はＣＭＦ６０８発現を示さない。卵巣切除は骨組織でのＣＭＦ６０８発現の強度とパターンを変えない。
異所性の骨断片では、ＣＭＦ６０８ハイブリダイゼーション信号は、脱塩した結合組織母材内に散乱しているかまたはこの組織と未成熟骨の骨芽細胞との間の境界に集中しているかの何れかである若干の繊維芽細胞様細胞に見られる。
骨および軟骨でのインシトゥハイブリダイゼーションによって明らかにされたＣＭＦ６０８遺伝子発現パターンは、その発現が２つの骨格細胞タイプ−骨芽細胞と軟骨細胞に分化することができる若干の骨格組織要素をマークすることを示している。これらの細胞の末端分化はＣＭＦ６０８の発現のダウンレギュレーションによって伴われるように出現する。後者の観察はラット胎児の頭蓋冠骨から単離された骨原性細胞の一次培養におけるＣＭＦ６０８の発現の独特の一時のパターンによって支持される。これらの培養基では、発現はインヴィトロでのインキュベーションの１，２週間後の大多数の細胞でのインシトゥハイブリダイゼーションによって表された。骨形成の兆候を示す３週間および４週間の古い培養基はＣＭＦ６０８発現細胞を含んでいなかった。意義深いことには、成熟生物の骨格組織に対するこの遺伝子発現の高特異性を示すＣＭＦ６０８プローブにハイブリダイゼーションした多組織ブロックの区域にはハイブリダイゼーション信号は見られなかった。
胚性区画のインシトゥハイブリダイゼーション研究では１２．５ｄｐｃでは胚性体全体のいくつかの区域で若干の間葉細胞で弱いハイブリダイゼーション信号が見分けられることが示された。最も顕著な信号は嗅上皮を取り囲み鼻先の表面上皮の下にある緩い間葉組織での頭部に見出される。 頭部での他の間葉組織はまたハイブリダイゼーション信号を示す：下顎骨での歯積層（歯原基）を囲む間葉と蝶形骨基底骨原基の非軟骨部分。
体幹では、発現は胸−腰領域の発現の少ない堆骨原基で検出できる。ここではハイブリダイゼーション信号は硬節の濃縮部をマークする。ハイブリダイゼーション信号を示す体幹の他の領域は胸部体壁の前部で薄層の間葉細胞からなる。
発生の後の段階では、１４．５および１６．５ｄｐｃ、プローブＣＭＦ６０８はハイブリダイゼーション信号を与えなかった。従って、胚性の発達中はＣＭＦ６０８遺伝子は過度的に少なくとも若干の間葉の骨格形成細胞によって発現されることが明らかである。この発現は発達の後の段階ではダウンレギュレーションされる。発達の後の胚性および出生後の段階のさらに詳細な研究は骨組織でのＣＭＦ６０８発現細胞の出現のタイミングを明らかにする。
【００２６】
実施例２
ラットＯＣＰの単離
２０分間延伸した弾性膜で成長した一次ラット頭蓋冠細胞は機械力に続く骨形成の刺激のためのモデル系を与えた。遺伝子発現パターンは機械力を加える前後を比較した。
ＯＣＰ発現は機械力によって約３倍に制御された。これは、機械力を加える前後の頭蓋冠細胞からのポリ（Ａ）＋ＲＮＡを用い、ミクロアレイ分析とノーザンブロット分析の両方によって検出された。ラット頭蓋冠一次細胞とラット骨抽出物では、この遺伝子は約８．９ｋｂの主ＲＮＡ種および約９ｋｂの少ないＲＮＡ転写として発現した。ハイブリダイゼーション信号は、精巣、大腸、腸、腎臓、胃、胸腺、肺、子宮、心臓、脳、肝臓、目、およびリンパ節を含む種々の組織源から任意の他のＲＮＡにおいて検出されなかった。
ラット頭蓋冠ｃＤＮＡファージライブラリイから単離された部分ＯＣＰラットｃＤＮＡクローン（４０６７ｂｐ）は３’末端で閉鎖した３３５６ｂｐ読み取り枠を含むことが見出された。公のマウスデーターベースと比べて配列の相同性は認められなかった。完全ＯＣＰラットｃＤＮＡクローンはラット頭蓋冠ｃＤＮＡライブラリイから、５’ＲＡＣＥ技術（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、５’ｃＤＮＡ断片のＲＴ−ＰＣＲ、および後者の生成物の元の３’クローンへの連結を組み合わせて単離された。発生した（Ｆｉｇｕｒｅ１と、Ｆｉｇｕｒｅ２のｐＣＤＮＡ３．１−６０８参照）全ラットｃＤＮＡクローンを配列決定し、突然変異は見られなかった。全配列伸展は２５９７アミノ酸残基タンパク質に対し８８８３ｂｐの長さでＯＲＦ（ｎｔ５７５−８３６６）を含む。Ｆｉｇｕｒｅ３。ｃＤＮＡはポリアデニル化部位を含まないが、３’ポリＡ伸張を含む。
ＣＭＦ６０８は大きいタンパク質を符号化し細胞外母材の一部である。遺伝子は活動的に支持する骨芽細胞分化に含まれる。他のオプションではリモデシングが行われた領域に発現する。そのような仮定はまた破骨細胞作用を支配する際の役割と比較でき、したがって小分子による阻害のための標的であることができる。
正常骨形成では、骨芽細胞の活性化は、骨再吸収の過程を開始する骨形成の部位に破骨細胞前駆体を誘因するかまたは破骨細胞を成熟させる種々の因子の分泌を導く。正常骨形成では両方の要素にバランスが取れている。任意の側へのアンバランスは骨髄炎変形（造骨細胞要素が圧倒）または骨粗鬆症（破骨細胞が圧倒）のいずれかを引き起こす。
既知の造骨細胞の中では活性化因子−機械力刺激−が実際に本発明のモデルで適用される。基本の証拠として、転写アップレギュレーションによって機械的ストレスに応答することが知られているいくつかの遺伝子の増加した発現が見出された。それらはテネイシン、エンドセリンおよびあるいはトロンボスポンジンを含む。
【００２７】
実施例３
全長ＯＣＰ ｃＤＮＡ 構築および発現
ＴＮＴ（転写−翻訳）アッセイは製造者の指示（Ｐｒｏｍｅｇａ−ＴＮＴカップル網状赤血球可溶化液システム）に従って、遺伝子の種々の領域から取り出した特異的断片を用いて行った。全アッセイでは明確な翻訳生成物が観察された。Ｆｉｇｕｒｅ４．次の断片をテストした。
ＴＮＴ生成物
2004524824.tif 000002
【００２８】
実施例４
マウスＯＣＰ遺伝子
ラット−６０８ｃＤＮＡの５’ＵＴＲ領域への部分相同性に基づき、マウスＯＣＰ遺伝子プロモーター領域とコード化領域を含む２匹のマウスのゲノムＢａｃクローンを同定した。これらクローン（平均挿入長〜２００Ｋｂの２３−２６１Ｌ４および２３−２４１Ｈ７）をＴＩＧＲからもたらした。Ｆｉｇｕｒｅ５と６。
マウス−ＯＣＰプロモーター領域の一部の増幅に特異的なプライマーをデザインしマウスゲノムファージライブラリイのＰＣＲスクリーニングに用いた（出願人のためＬｅｘｉｃｏｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｉｎｃ．によって行われた）。マウス６０８遺伝子のゲノム領域の部分を含む１のファージクローンを検出し完全に配列決定した。このクローンの長さは１１，９６３ｂｐであると報告された。物理的“Ｌｅｘｉｃｏｎ”クローンの部分は発明者らによって再配列決定され修正された。再配列決定したクローン（Ｆｉｇｕｒｅ７）は１１，９６７の長さであった。エキソン位置予測（Ｆｉｇｕｒｅ８）は出願人の会社のＢｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃユニットで、マウスゲノムおよびラットｃＤＮＡ配列の整列化に基づき行われた。それぞれ、Ｆｉｇｕｒｅ９および１０。
【００２９】
実施例５
ヒトＯＣＰ遺伝子
ヌクレオチドレベルで、ラットＯＣＰ ｃＤＮＡ配列は染色体３に位置するヒトゲノムＤＮＡ配列に相同である。相同性と生命情報科学分析（Ｆｉｇｕｒｅ１０と１１）に基づき、推定上のｃＤＮＡ配列を生成した。Ｆｉｇｕｒｅ１２。最高の類似性はＦｉｇｕｒｅ１３に示した表に表されるようにｎｔ １−１９６５（１−６５５ａ．ａ）；２１９７−２３３７（７２７−７７９ ａ．ａ）；および４８９４−７８３３（１６３５ ａ．ａ−ｅｎｄ）の間で明らかである。タンパク質レベルでは、データーバンクでは相同性が見られなかった。
【００３０】
実施例６
推論されたＯＣＰタンパク質
推論されたＯＣＰタンパク質はラット、マウスおよびヒトｃＤＮＡ配列（それぞれ、Ｆｉｇｕｒｅ１，７および１２）、および対応するラット、マウスおよびヒトのアミノ酸配列（それぞれ、Ｆｉｇｕｒｅ３、２１および２２）の整列化（Ｆｉｇｕｒｅ１−４）に従い生成した。
推論されたＯＣＰタンパク質は次の特徴を含む（Ｆｉｇｕｒｅ１８）：
イ．切断できる良く限定されたＮ−末端信号ペプチド（ａａ１−２８）；
ロ．ロイシンリッチの繰り返し領域（ａａ２８−２８０）。この領域はロイシンリッチ繰り返し（それぞれａａ２８−６１および２１９−２８０）のＮ−末端とＣ−末端ドメインに分けられる。それらの間で、６個のロイシンリッチの繰り返し飛び地がある（ａａ７４−９６、９８−１２０、１２２−１４４、１４６−１６８、１７８−２００、２０２−２２４）。ロイシンリッチの繰り返しは通常多様な因子をもつタンパク質の数の細胞外の位置に見出される。これらの繰り返しはタンパク質−タンパク質相互作用に含まれると考えられる。各ロイシンリッチの繰り返しはβ−シートとα−螺旋からなる。そのようなユニットは伸張する非球状構造を形成する。
ハ．アミノ酸の位置４８８−５５８、５８６−６５２、１６３６−１７０４、１７３２−１８０１、１８２９−１８９８、１９２８−１９９７、２０２５−２１００、２１２８−２１９４、２２３３−２２９４、２３２４−２３９２、２４１９−２４８７、２５１５−２５８６での１２のイムノグロブリンＣ−２タイプの繰り返し。このように、２つのＩｇ様繰り返しが直ちにロイシンリッチ領域のダウンストリームに見出されるが、残りの１０の繰り返しはタンパク質のＣ−末端で密集する。イムノグロブリンＣ−２タイプの繰り返しはタンパク質−タンパク質相互作用に含まれ通常細胞外タンパク質部分に見出される。
ニ．膜貫通のドメインなし；および
７２４、７４７、１０２６、１３４６および１６１８での５つの核局在化ドメイン（ＮＬＳ）。
これらの観察はＯＣＰがＩｇスーパーファミリイに属することを示す。ＯＣＰはセリンリッチタンパク質（１０．３％対約６．３％）であり、中央核予測ドメインおよびＮ−末端細胞外予測ドメインをもつ。
【００３１】
実施例７
骨折治癒
６０８ＲＮＡの発現は骨特異的である。さらに、既知の骨特異的マーカーをまだ発現していない骨前駆体に特異的であるようだ（骨での位置、正常骨モデリングでの複雑さおよびリモデリングの過程によって判断される）。骨形成の系列への６０８−発現細胞の関連をさらに証拠とするため、骨形成過程の活性化を含む骨折治癒の動物モデルでの６０８発現のパターンを研究した。
骨折に続く生理的現象の配列は現在比較的よく理解されている。治癒は３つの段階で行われる−炎症、修復およびリモデリング。各段階の一定の細胞では優勢で特異的組織学および生化学の事象が観察される。これらの段階は別々に見られるが、１段階での事象は次に存続し、続く段階に現れる事象はこの特定の段階が優勢になる前に始まる。これら事象は研究報告と総説論文で数年間記載されてきた。Ｈａｍ （１９６９） Ｉｎ， Ｈｉｓｔｏｌｏｇｙ， ６ｔｈ ｅｄ． Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ， Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ， ｐ． ４４１； ａｎｄ Ｕｒｉｓｔ ａｎｄ Ｊｏｈｎｓｏｎ （１９４３） Ｊ． Ｂｏｎｅ Ｊｏｉｎｔ Ｓｕｒｇ． ２５：３７５。
骨折直後の第一段階の間（炎症段階）、広く広がった血管拡張と血漿の浸出は新しい骨折の領域に見える急性の浮腫を導く。急性の炎症細胞は、多形核白血球次いでマクロファージがするように、移動する。第二段階中（修復段階）に骨折修復において直接関与する細胞は、間葉起源であり多能性である。これらの細胞はコラーゲン、軟骨および骨を形成する。若干の細胞は骨膜の形成層から誘導され、初期の骨を形成する。骨内膜性細胞も関与する。しかし、骨折治癒に直接関与する大多数の細胞は取り囲む血管からの領域に浸入する肉芽形成組織とともに骨折部位に入る。Ｔｒｕｅｔａ （１９６３） Ｊ． Ｂｏｎｅ Ｊｏｉｎｔ Ｓｕｒｇ． ４５：４０２。骨折後に末端の全血管床は短時間にひろがるが、骨形成の応答は骨折自体を取り囲むゾーンに大きく限られていることに注目。 Ｗｒａｙ （１９６３） Ａｎｇｉｏｌ． １４：１３４。
侵略する細胞は「仮骨」として知られる組織を生成し（繊維性組織、軟骨、および若い未成熟な繊維性骨）、骨の末端に急速に発生し、骨折断片の安定性を次第に増加させることになる。このように形成された軟骨は、軟骨内の骨形成からの組織化の不足を除き区別がつかないプロセスによってついに再吸収される。骨は適当な酸素の供給のある細胞によって形成され適切な機械的刺激に委ねられる。修復プロセスの初期に、軟骨形成は優勢であり、グリコサミノグリカンが高濃度で見出される。後に、骨形成はさらに明らかになる。この段階の修復が行われるとき、骨末端は増加した量の骨を含む仮骨の密集に次第に囲まれる。修復段階の中頃にはリモデリング段階が始まり、仮骨の部分を再吸収し、ストレスのラインに沿って柱骨が形成される。最後に、運動により骨修復の割合が増す。Ｈｅｉｋｋｉｎｅｎ ｅｔ ａｌ． Ｓｃａｎｄ Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｌａｂ． Ｉｎｖｅｓｔ． ２５ （ｓｕｐｐｌ １１３）：３２。インシトゥハイブリダイゼーションの結果、ＯＣＰ発現は骨および軟骨の形成が開始した非常に特異的な領域に限られることが見出された。
ＯＣＰ発現が骨折治癒の動物モデルに起きるかどうかを見出すために、標準の中央シャフト骨折を、落下重により運転する鈍い断裁機によってラット大腿骨に作った。Ｂｏｎｎａｒｅｎｓ ｅｔ ａｌ． （１９８４） Ｏｒｔｈｏｐ． Ｒｅｓ． ２：９７−１０１。２，３および４週骨折骨を削り取り、緩衝液ホルマリンに固定し、ＥＤＴＡ溶液で石灰質を除き、パラフィンに埋めた。全区分をＯＣＰプローブでハイブリダイゼーションした。インシトゥハイブリダイゼーションの結果は、仮骨（Ｆｉｇｕｒｅ２６−２８）、骨内膜（Ｆｉｇｕｒｅ２９）、ウーブンボーン（Ｆｉｇｕｒｅ３０）および骨膜（Ｆｉｇｕｒｅ３１）内の結合組織の高脈管化の領域に骨折治癒の１週目および２週目に強いハイブリダイゼーション信号が現れた。骨膜は骨折部位で仮骨生成に関与する分化していない原種源とみなされる。ハイブリダイゼーション信号が、骨折治癒のさらなる分化段階（３，４週間）の間に徐々に消え、脈管化組織にのみ保持された。Ｆｉｇｕｒｅ３２は４週間治癒した骨折部分の明視野（左）と暗視野（右）の顕微鏡写真を示す。これら後の治癒段階では、完全に分化した仮骨組織は、軟骨またはウーブンボーンが少し存在し、主に緻密な骨に再生する海綿骨質からなることが見出された。管化骨膜性組織は減少しているが仮骨を覆う海綿骨質の活性な再生の骨膜組織での多数の細胞はハイブリダイゼーション信号を示す。この組織は仮骨の中心を覆い、また骨内に閉じ込められる。Ｆｉｇｕｒｅ３２と３３参照。Ｆｉｇｕｒｅ３２の四角はＦｉｇｕｒｅ３３に拡大する。初期段階におけるように、軟骨細胞と骨芽細胞にハイブリダイゼーション信号は見られなかった。Ｆｉｇｕｒｅ２７と３３．いくつかのＯＣＰ発現細胞は破骨細胞活性の結果の空洞を充填する管組織に集中する（星印）。
若い骨の骨折は治癒が速いが、成熟した骨の骨折は治癒が遅い。その原因は成熟した骨では回復プロセスのための特別な軟骨−／骨−原種の補充がゆっくりしているからである。除神経は骨折部位の全域でストレスを少なくすることによって骨折治癒を遅らすが、機械的ストレスは、特別の骨原種細胞の増殖と分化を増加することによりたぶん修復速度を増し、結果として、骨形成の速度を速める。上の結果は、ＯＣＰが皮質と柱骨の形成および再生、発達中の軟骨内性骨の成長、および骨修復プロセスの導入にたぶん含まれる（以下も参照）。さらに、ＯＣＰ発現がきびしく制御され、軟骨−／骨−原種細胞が補充されるとき骨折の修復の初期段階中に誘発される強い証拠がある。この観察はＯＣＰがこのプロセスで役割を演じていることを示唆している。
骨折治癒の過程で６０８発現のパターンを考慮に入れると、６０８−ポジティブの前駆体細胞が処女骨のリモデリングだけでなく同様に骨折した骨の修復プロセスにも含まれることを示唆する。
【００３２】
実施例８
ＯＣＰ転写調節
ＯＣＰ調節性の領域を含む最長可能なフラグメントをクローニングするため、ｂａｃｓ Ｌ４およびＨ７を３種の酵素：ＢａｍＨＩ、Ｂｇ１ＩＩおよびＳａｕＩＩＩＡで限定した。えられたフラグメントはｐＫＳのＢａｍＨＩ部位にクローニングした。連結混合物をバクテリア（Ｅ．ｃｏｌｉ−ＤＨ５α）にトランスフォーメーションして、１７２０個のコロニイをニトロセルロースフィルターで移し、マウス−ＯＣＰ−エキソン１をスパンする３２Ｐ−標識ＰＣＲフラグメントでスクリーニングした。ポジティブコロニイを単離した。
２個の同じクローン、１４Ｃ１０と１５Ｅ１１は最大の挿入物（ＢａｍＨＩ誘導〜１３Ｋｂ挿入物）を含んでいた。先に述べた“Ｌｅｘｉｃｏｎ”クローンと比較した挿入物の構造をＦｉｇｕｒｅ４５に示す。１４Ｃ１０クローンは５’末端で〜８Ｋｂ ＯＣＰ“Ｌｅｘｉｃｏｎ”クローンよりも長い。
イ．レポーター遺伝子−ＥＧＦＰへのマウスプロモーターとＵＴＲ上流のクローニング
ＢａｍＨＩ部位（クローンｐ１４Ｃ１０のスタート部位である“Ｌｅｘｉｃｏｎ”クローンのｎｕｃ５０９８）および最初のＡＴＧコドン（エキソン２の最初のヌクレオチド）によって隣接されたマウスＯＣＰ遺伝子の１．４Ｋｂゲノム領域を、鋳型および前設計のプライマーとして“Ｌｅｘｉｃｏｎ”クローンを用いるゲノムＰＣＲによって合成した：５’プライマー（Ｆｏｒ１）はＢａｍＨＩ部位（Ｌｅｘｉｃｏｎクローンのヌクレオチド４５８７−４６１１）に対し上流に位置し３’プライマー（Ｒｅｖ２）は最初のＡＴＧ（Ｌｅｘｉｃｏｎクローンのヌクレオチド６５６０−６５４０）に対し上流に位置しＮｏｔＩ部位で終わる。ＰＣＲ生成物はＢａｍＨＩとＮｏｔＩで切断され得られた１．４ＫｂフラグメントはｐＭＣＳＩＥに対しＢａｍＨＩに／ＥＧＦＰレポーター遺伝子に対し上流のＮｏｔＩ部位に結合した。得られたクローンはｐＭＣＳＩＥｍ６０８ｐｒｍ１．４と呼ぶ。クローンｐ１４Ｃ１０はＸｂａＩ部位とＢａｍＨＩによって切断され切除された４．０８８Ｋｂフラグメントは１．４Ｋｂ挿入物に対し上流の、ｐＭＣＳＩＥ６０８ｐｒｍ１．４のＢａｍＨＩとＸｂａＩ部位に連結された。得られたクローン（Ｆｉｇｕｒｅ４６参照）はｐＭＣＳＩＥｍ６０８ｐｒｍ５．５と呼ばれ、ＥＧＦＰに対し上流のマウス６０８プロモーターとＵＴＲの５５５２ヌクレオチドを含む。ｐＭＣＳＩＥｍ６０８ｐｒｍ５．５クローンの挿入は、Ｆｉｇｕｒｅ４７に見られるように、完全に配列決定された。
ｐ１４Ｃ１０の全１３ＫｂはＢａｍＨＩで切除されＢａｍＨＩ部位へのｐＭＣＳＩＥｍ６０８ｐｒｍ１．４の１．４Ｋｂ挿入物に対し上流に連結された。得られた構成物、ｐＭＣＳＩＥｍ６０８ｐｒｍ１４．５はＥＧＦＰに対し上流のマウス−ＯＣＰプロモーターおよびＵＴＲの１４．５Ｋｂフラグメントを含む。
ロ．一過性トランスフェクションの結果
２つの構成物、ｐＭＣＳＩＥｍ６０８ｐｒｍ５．５とｐＭＣＳＩＥｍ６０８ｐｒｍ１４．５は、受精したマウス卵に注入し２週齢の遺伝子組換えおよびコントロールのマウスを殺し頭蓋冠と長骨においてＧＦＰ活性を検出した。一部は種々の組織からのバックグラウンド蛍光のため、一部はＯＣＰ発現の細胞特異性のために、特異的蛍光は検出されなかった。したがって、本発明者らはさらに感度の高いルシフェラーゼ遺伝子をレポーター遺伝子として用いることにした。
ハ．レポーター遺伝子ルシフェラーゼに対し上流のクローニングマウスＯＣＰプロモーターおよびＵＴＲ
プロメガのｐＧＬ３−ベーシックベクターにおいて、ｐＭＣＳＩＥｍ６０８ｐｒｍ５．５およびｐＭＣＳＩＥｍ６０８ｐｒｍ１４．５の両方の挿入物もルシフェラーゼに対し上流にクローニングした。ｐＭＣＳＩＥｍ６０８ｐｒｍ５．５の５．５Ｋｂ挿入物をＥｃｏＲＶとＸｂａＩによって切除し、ｐＧＬ３−ベーシックベクターのＳｍａＩとＮｈｅＩ部位に連結した。得られたクローンはｐＧＬ３ｂａｓｉｃｍ６０８ｐｒｍ５．５と呼ばれる。
プラスミドｐＭＣＳＩＥｍ６０８ｐｒｍ１４．５はＮｏｔＩによって制限され直線化したプラスミドの凝集性末端を充填し平滑末端にした。１４．５Ｋｂ挿入物は次いでＳａｌＩによって線形プラスミドを切断して切除した。精製した１４．５Ｋｂフラグメントをルシフェラーゼ遺伝子に対し上流のｐＧＬ３−ベーシックのＸｈｏＩとＨｉｎｄＩＩＩ（充填）部位に連結しｐＧＬ３ ｂａｓｉｃｍ６０８ｐｒｍ１４，５と呼ばれる構成物を作った。Ｆｉｇｕｒｅ４８は配列決定された４６１０ｂｐを表す。
ニ．一過性トランスフェクションの結果
この段階では一次頭蓋冠細胞への両方の構成物の一過性トランスフェクションはｐＭＣＳＩＥｍ６０８ｐｒｍ１４．５トランスフェクションのみで１０倍の発現となった。高いプロモーター活性はｐＭＣＳＩＥｍ６０８ｐｒｍ５．５トランスフェクションには観察されなかった。これらの観察はｐＭＣＳＩＥｍ６０８ｐｒｍ１４．５の５’末端とｐＭＣＳＩＥｍ６０８ｐｒｍ５．５の５’末端との間の領域が全プロモーター活性に必要であることを示唆している。さらに分析すると、種々の細胞系において最大のプロモーター活性および組織特異的ＯＣＰ誘導または抑圧に必要で十分である全配列を検出する。
ホ．マウスとヒトのＯＣＰに普通のＴＦ結合ＤＮＡ要素の分析
既知の転写因子（ＴＦ）結合ＤＮＡ要素は、ヒトとマウスのＯＣＰ ＡＴＧの上流の類似性に対し、Ｇｅｎｏｍａｔｉｘ ＧｍｂＨのＤｉＡｌｉｇｎプログラムを用い分析した。用いたゲノム片は所有者のマウスゲノムＯＣＰおよびＡＣ０２４８８６ ９２００１ないし１１１０９０の逆補体である。これらＤＮＡ片のＡＴＧの位置は：
・ラットｃＤＮＡの５７５
・マウスゲノムの＊６５２１
・ヒトゲノムＤＮＡ ＡＣ００２４８８６から抽出された片の＊３３８１
１４個の要素をこの方法で抽出し、ＭａｔＩｎｓｐｅｃｔｏｒを用いて転写結合モチーフに対し分析した。
若干の主“マスター遺伝子”結合部位はＦｉｇｕｒｅ４９に示す。それらのうち、骨芽細胞−／軟骨細胞−特異的Ｃｂｆａ１因子；軟骨−特異的ＳＯＸ９因子；筋芽細胞−特異的Ｍｙｏ−ＤおよびＭｙｏ−Ｆ因子；脳−および骨−特異的ＷＴ１；Ｅｇｒ３およびＥｇｒ２因子（Ｅｇｒスーパーファミリイ）；ビタミンＤ−応答（ＶＤＲ）因子；脂肪細胞−特異的ＰＰＡＲ因子；および偏在性アクチベーターＳＰ１がある。
【００３３】
実施例９
遺伝子６０８の発現パターンおよび制御
他の骨形成系列マーカーに関する遺伝子６０８の発現
遺伝子６０８の発現は一次細胞において、細胞ラインにおいて、骨形成および軟骨形成系列の種々のマーカーの発現に関して試験した。この分析の結果を次表にまとめ、６０８の発現が関係づける初期の骨芽前駆細胞に限られることを示している。
【００３４】
【表１】
2004524824.tif 000003
【００３５】
実施例１０
ＯＣＰ発現は機械的にＭＣ３Ｔ３ Ｅ１細胞に誘導される
ＯＣＰ転写はＲＴ−ＰＣＲによってマウス頭蓋冠細胞、Ｕ２ＯＳ細胞（ヒト骨肉腫細胞ライン）、およびヒト胚性骨に検出された。Ｆｉｇｕｒｅ２４。ＯＣＰは最初、頭蓋冠細胞において機械的ストレス中に上方制御されるとき見出された。本発明では、われわれはＯＣＰ発現の機械的ストレスの影響が他の細胞系で異なるタイプの機械的刺激を用いて再生されることを示す。血清欠乏ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１前筋芽細胞では、機械的刺激はＯＣＰ ｍＲＮＡ蓄積を顕著に誘発したマイルドな（２８７ｘｇ）遠心分離によって起きた。Ｆｉｇｕｒｅ２５。他の筋芽細胞マーカー遺伝子（オステオポンチン、ＡＬＰ（染色、図に示していない）およびＣｂｆａ１）を転写的にこの方法で増大させた。Ｆｉｇｕｒｅ２５。非筋芽細胞マーカー遺伝子（ＧＡＰ−ＤＨ）のＲＴ−ＰＣＲ生成物はサンプル間のＲＮＡレベルを比較するためコントロールとして用いた。後のプライマーを用いたとき発現の増加は見られなかった。非筋芽細胞に発現が検出されず（Ｆｉｇｕｒｅ２４）、ＯＣＰ発現が特異的に骨形成において誘発されていることを示唆する。
【００３６】
実施例１１
軟骨内の成長中のＯＣＰ誘導−インシトゥハイブリダイゼーション分析
我々の先の結果はＯＣＰが成長したマウスの骨のモデリングとリモデリングの間に発現することを示した。発現は次の領域に限られた：
１  軟骨膜
２  骨膜
３  活性リモデリングおよびモデリング領域
４  血管周囲接続組織
５  関節軟骨被覆細胞
６  胚凝縮間葉細胞−頭、椎骨および体幹
７  異所性骨形成
先の観察は骨発生または軟骨内骨形成の開始（長骨の縦方向の成長）におけるＯＣＰのための役割は何も示唆していない。したがって、１週齢のマウスからの骨の断片のインシトゥハイブリダイゼーションによってＯＣＰの発現パターンを分析した。骨発生のこの段階で、骨形成が骨端内でスタートする（第二の骨形成中心）。１週齢ラット子の後肢骨格（脛骨とともに大腿骨）を緩衝ホルマリンに固定し脱灰した組織の縦方向の区画を標準インハウスプロトコルに従いインシトゥハイブリダイゼーションのために処理した。放射能写真を現像し、ヘマトキシリン−エオシンで染色し、明視野と暗視野照明を用いて顕微鏡下で研究した。
強い蛍光信号を第二の骨形成中心全体にＯＣＰプローブを用いて観察した。Ｆｉｇｕｒｅ２７。さらに、ハイブリダイゼーション信号は成長した骨で先に見つけたものに似た方法で骨膜と軟骨膜組織を描写した。まわりの成熟した軟骨細胞は信号を示さなかった。非常にかすかな信号が成熟した骨芽細胞のマーカーであるオステオカルシンプローブを用いて観察された。
結論としては、ＯＣＰが骨発生中に軟骨内骨形成を開始する骨芽前駆細胞に発現する。
【００３７】
実施例１２
骨形成を抑圧または促進する刺激によるインヴィヴォ制御：エストロゲン
投与、血液ロスおよび座骨神経切断術
骨形成細胞を髄間質に骨表面に沿って存在する前駆体細胞に由来すると信じられている。血液ロスの状態は、造血性基部細胞を刺激し、骨髄の骨芽前駆細胞を活性化し、全身の骨形成応答を開始する。エストロゲンの高投与量はまた骨髄の骨芽前駆細胞からの骨芽細胞の生成の刺激によってたぶん新規の延髄の骨形成を増す。反対に、宇宙飛行、長期の病床、麻痺またはギブス固定により骨格の体重を減らすと、ヒトおよび研究室の動物モデルの骨ロスとなる。上の方法に続きＯＣＰ発現パターンの変化を検出するため、次の実験は２ヶ月齢のマウスで行った：
・エストロゲン投与（５００μｇ／１匹／週）
・放血（約体重１．６％を取り除く）
・片側の（右肢）座骨神経切断
・各処理のコントロールグループ
全ＲＮＡは長骨から処理２日後に抽出しＯＣＰ特異的プライマーを用いるＲＴ−ＰＣＲを行った。その結果はＯＣＰ発現が血液ロスとエストロゲン投与に従い非常に高められたが、座骨神経切断に従い下方制御が観察された。Ｆｉｇｕｒｅ２９。
単一の細胞マーカー（ＯＣＰ）をもつことによって、われわれは上の方法が骨芽前駆細胞の数を増加または現象することによって骨形成を誘発または減らすことを示すことができる。上の結果はさらにＯＣＰが骨特異的前駆細胞の蓄積を制御する「骨特異的遺伝子」のグループの主メンバーであることを示唆する。
【００３８】
実施例１３
骨髄間質細胞の骨芽細胞分化中のＯＣＰ誘発
骨形成は骨粗鬆症患者の小柱状骨と皮質骨に増大されなければならない。われわれは先にＯＣＰ発現を骨膜および骨内（皮質骨をとりまく）に検出したが骨髄間質細胞には信号はなかった。後者の細胞は通常分化して小柱状および皮質骨母材に埋められた骨芽細胞を成熟する。
骨髄前駆体細胞のＯＣＰ発現をさらに評価するため、本発明者らは全ＲＮＡを、マウスおよびラットの骨髄からそれを得た直後および培養基で１５日間まで培養した後、抽出した。ＯＣＰ特異的ＲＴ−ＰＣＲ生成物は新しく得られた骨髄（粘着性および非粘着性）細胞からＲＮＡを用いて検出されなかった。しかし、かすかな信号が培養基に５日後に見られ、培養基で１５日間成長した細胞からのＲＮＡを用いたときさらに高められた。ＡＬＰ（アルカリ性ホスファターゼ）発現（骨芽細胞マーカー）はまた１５日後に高められることが見出された。両方の時点で、粘着性および非粘着性細胞を再接種し、ＲＮＡ抽出物５および１５日おくれて調製した。さらに強いＲＴ−ＰＣＲ生成物が元の粘着性細胞から抽出されたＲＮＡで観察され、これは骨髄細胞の非粘着性母集団では成熟した前駆体が少ないことを示唆している。非骨芽細胞マーカー遺伝子（ＧＡＰ−ＤＨ）のＲＴ−ＰＣＲ生成物はコントロールとして用い、サンプル間のＲＮＡレベルを比較した。
結論として、骨髄前駆体細胞はＯＣＰを発現しないが、この遺伝子を発現する細胞を関係づけるように分化する。
【００３９】
実施例１４
骨形成に向う間葉細胞分化中のＯＣＰ誘発
間葉の基部細胞（ＭＳＣ）は、骨芽細胞のような、特異的系列の単能細胞まで上がるように分化と拘束を受ける多能自己再生細胞母集団である。拘束と自己再生の機構は完全には理解されていないが、骨形態形成タンパク質（ＢＭＰｓ）のような因子、レチノイン酸（ＲＡ）のような分化因子およびグルココルチコイドのようなステロイドホルモンによって制御できる。さらに、ＢＭＰとＲＡは相乗的に働き、骨芽細胞拘束および細胞増殖を刺激する。
ＯＣＰ発現が骨芽細胞拘束の際に誘発されるならば見出すために、静止状態のＣ３Ｈ１０Ｔ１／２マウスＭＳＣ培養基をＢＭＰとＲＡで２４時間刺激し、さらに３日間完全培養基で培養した。ＲＮＡは未処理細胞ならびに処理開始後２４時間、４８時間、７２時間で収集した細胞から抽出し、ＯＣＰ特異的プライマーでＲＴ−ＰＣＲ分析に用いた。並行して、細胞をＡＬＰに対し染色し骨芽細胞拘束を決定した。ＡＬＰ染色は３日（７２時間）でのみ現れ、ＯＣＰ発現は１日（２４時間）で増大し、未処理培養基は検出できなかった。さらに実験してさらに強いＡＬＰ染色とＯＣＰ発現が増殖６日後にさらに骨芽前駆細胞の分化が観察された。Ｆｉｇｕｒｅ２６。
これらの結果は、ＭＳＣｓの造骨細胞の拘束の際に、ＯＣＰ発現がＡＬＰ発現の開始前にスイッチオンされ、この候補が起算するように見出された骨芽前駆細胞の初期のマーカー遺伝子であることを示唆する。特に、われわれの先のインシトゥハイブリダイゼーションの結果はまた非常に初期の軟骨−／骨−前駆体細胞でのみＯＣＰ転写の存在を示した。これら細胞はＡＬＰを発現せず、さらに成熟したＡＬＰポジティブ細胞（小柱状骨）はＯＣＰネガティブであった。
【００４０】
実施例１５
骨芽細胞への前筋芽細胞の分化スイッチ中のＯＣＰ誘発
前筋芽細胞（Ｃ２Ｃ１２）は筋芽細胞を成熟させる。Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２と同様に、これら細胞へのＢＭＰとＲＡの投与は骨芽細胞分化を誘発することができる。この分化スイッチ中にＯＣＰの発現パターンを調べるため、われわれはＢＭＰとＲＡをＣ２Ｃ１２細胞へ導入し、上記のように（Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞）細胞の死と発現パターンを分析した。期待されたようにＯＣＰとＡＬＰの発現はＢＭＰ導入２４時間後に誘発させた。Ｆｉｇｕｒｅ２６。
これらアッセイはもう一度、骨形成の初期段階でＯＣＰの関与を示す。
【００４１】
実施例１６
骨形成でのＯＣＰの役割
骨芽細胞関連遺伝子を誘発する重大な要素としてＯＣＰの役割のための究極のテストは、前骨芽細胞と骨芽細胞でのこれら遺伝子を上方制御する能力である。一次頭蓋冠細胞では、ＣＭＶプロモーター駆動ＯＣＰ構成での一過性トランスフェクションは骨形成系列マーカーＡＬＰの発現をかなり上方制御する。Ｆｉｇｕｒｅ３４はＡＬＰ染色での誘発を示す。ＯＣＰ遺伝子の２個のさらに小さい欠失構成物の一過性のトランスフェクションはまた同じ誘発を与えた（Ｆｉｇｕｒｅ３５）、これはＮ末端４０３アミノ酸タンパク質ストレッチ（これは信号ペプチドを含む）が必須であり、骨芽細胞増殖と分化を増大するのに必要で十分であることを示している。さらに、ＲＯＳ１７／２．８（骨芽細胞ラインを分化する）細胞へのＯＣＰの安定なトランスフェクションは、またＡＬＰとＢＳＰ発現をかなり上方制御する。さらに、骨芽細胞増殖での顕著な増加が観察された。Ｆｉｇｕｒｅ３７。
さらなる実験は頭蓋冠細胞でのＯＣＰ発現の骨形成効果が非細胞自律性であることを示した。ＯＣＰトランスフェクション頭蓋冠細胞をトランスフェクションした頭蓋冠細胞（ミリポアフィルターで成長させた）の存在で培養した共培養アッセイでは、骨形成の誘発効果もまたＦｉｇｕｒｅ３８に示されるように明確であった。ＯＣＰトランスフェクションした細胞の存在で培養したトランスフェクションしていない細胞はコントロールアッセイと比較して高いＡＬＰ活性を保持していた。
筋芽細胞、骨芽細胞、脂肪細胞または軟骨細胞へ分化できる多能性前駆細胞Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞、またはＣ２Ｃ１２前筋芽細胞への一過性のトランスフェクションの際には同様の効果は観察されなかった。しかし、Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞へのＯＣＰ発現ベクターの安定なトランスフェクションは達成され、骨芽細胞／軟骨形成分化でのＯＣＰタンパク質フラグメントの役割を示した。この細胞ラインは、骨芽細胞と軟骨細胞の系列への分化に対する能力を用い、間葉細胞の決定の比較的初期の段階を示す。Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞はＣＭＶプロモーターを含む次の構成物でトランスフェクションされた：
１．６０８−６６３ａ．ａ−β−アクチンの５’非翻訳の領域を含む構成物、Ｆｉｇｕｒｅ３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）および３’ Ｆｌａｇ Ｔａｇの位置１でのＡＴＧから位置６６３でのアミノ酸までのＯＣＰコード領域。追加の構成物はｐＣｍ−Ｈ６０８−６６３Ｎｔｅｒｍと命名され、β−アクチンの５’非翻訳領域をもつ、Ｆｉｇｕｒｅ３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）のＦｌａｇ Ｔａｇのない位置１でのＡＴＧから位置６６３でのアミノ酸までのＯＣＰコード領域；この構成物は２００１年８月１４日にＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−３６３８で寄託された。
２．ｐＣＭＶ−ネオ−ネガティブコントロールとして。
骨芽細胞と軟骨形成の分化はアリザリンレッド染色（石灰化した領域を染色する）、アルシアンブルー（軟骨母材析出物を染色する）およびアルカリホスファターゼ染色（ＡＬＰ）を用いて決定された。染色は播種後、種々の時点で行った。結果はコントロールと比較して、構成物−１でトランスフェクションした細胞でＡＬＰの発現が高かった。アリザリンレッド染色は播種１２日後に開始す細胞をトランスフェクションした構成物−１において石灰化した小結節を広範囲に形成したことを示した。これらの培養物はまたアルシアンブルー染色によって示されるように軟骨の小結節を形成した。
この研究はＯＣＰポリペプチドが間葉前駆体Ｃ１３Ｈ１０Ｔ１／２細胞において骨形成／軟骨形成の引き金となることを示した。
この構成物を用いて発現した哺乳類ＯＣＰの機能的部位はＯＣＰポリペプチド配列の最初の６６３アミノ酸、さらに３’ Ｆｒａｇ Ｔａｇのいくつかの追加のアミノ酸を含む。
これらの結果はＯＣＰが、骨形成と軟骨形成の系列に委ねられた他の表現型特異的遺伝子の系列発現へ導く、信号カスケードの開始に必要な基本的要素である証拠を強制的に提供する。さらに、これらの結果は、分泌要素として働くように見えるＯＣＰ依存骨形成要素の蓄積を示す。ＯＣＰの機能的部位の分泌に関する実験データーは実施例２５にある。
【００４２】
実施例１７
骨培養アッセイ
骨形成においてＯＣＰの関与をさらに確認するため、われわれはＥ１６マウス胚性肢の器官培養を行った。肢骨を６日間の培養に続いてアリザリンレッドで染色し骨石灰化率を比較した。Ｅ１６マウスの胚性肢をＯＣＰ−トランスフェクション頭蓋冠細胞で共培養するとき、軟骨内と膜性骨形成の両方がＦｉｇｕｒｅ４２に示したように高められた。コントロール肢（ベクタートランスフェクション頭蓋冠細胞）と比べて、頭蓋冠細胞へのＯＣＰトランスフェクションは基部および末端ではさらに長く広い骨の形成となった。したがって、インヴィトロで観察されたＯＣＰの骨形成誘発効果はまた、軟骨原基痕跡での骨形成の誘発によって生体外でも示される。骨原基痕跡でのＯＣＰの役割はたぶんマウス胎仔の軟骨内骨形成と骨発生での役割を模倣する。
【００４３】
実施例１８
Ｏｃ−ＯＣＰ遺伝子組換えマウス
本発明に示した結果を立証するため、本発明者らはオステオカルシン（Ｏｃ）プロモーターにＯＣＰｃＤＮＡをカップリングすることによって６０８発現を成熟骨芽細胞に誘発する遺伝子組換えマウスを生成した。
ｐＯＣ−６０８ベクターの作成
Ｏｃプロモーターを文献に従ってプライマーを用い増幅した。プロモーターはプラスミドｐＳＲＯＣＡＴ（Ｌｉａｎ ｅｔ ａｌ． （１９８９） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ．８６：１１４３−１１４７）からＳｍａＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ（平滑末端化した）を用いて取り出し、ベクターｐＯＣ−ＮＳＶを生成するベクターｐＭＣＳ−ＳＶの平滑末端化したＢａｍＨＩおよびＸｂａＩ部位にサブクローニングした。
ＣＭＦ６０８Ｆｌａｇ断片をＮｏｔＩおよびＳｐｅＩ消化後にｐＣＤＡ３．１−６０８構成物（Ｆｉｇｕｒｅ２）から単離した。断片をｐＯＣ−ＭＣＳベクターのＮｏｔＩ−ＳｐｅＩ部位にサブクローニングした。Ｆｉｇｕｒｅ４３。
微量注入のためのＤＮＡの調製
微量注入のためのＤＮＡ挿入物を調製するため、プラスミドをＡｓｃＩ（ｂｐ４３とｂｐ１０５９５で切断）で消化した。〜１０．６Ｋｂ断片をアガロースゲルからＱｉａｅｘ ＩＩキット（Ｑｉａｇｅｎ Ｃａｔ Ｎｏ．２００２１）を用いて単離し次いでＥｌｕｔｉｐ−Ｄカラム（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ＆ Ｓｃｈｕｅｌｌ Ｃａｔ． Ｎｏ． ＮＡ０１０／１）で精製した。
遺伝子組換えマウスの誘導
ＤＮＡを純Ｔｒｉｓ／ＥＤＴＡ微量注入溶液に溶解し濃度２ｎｇ／μｌに調整した。ＦＶＢ／Ｎ系からの受精卵への標準前核微量注入およびＩＣＲ乳母への胚移動を文献記載のように行った。参照、Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏ， Ｈｏｇａｎ， Ｂｅｄｄｉｎｇｔｏｎ， Ｃｏｎｓｔａｎｔｉｎｉ ａｎｄ Ｌａｃｙ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ。
胚回収
胚移動１８日後に乳母を頚部脱臼によって殺した。胚を回収し胎盤を、マウスゲノムにおいて注射したＯＣ６０８−Ｆｌａｇ ＤＮＡの存在の分析とＤＮＡ調製のために取り出した。
ゲノムＤＮＡ分析
マウスゲノムＤＮＡを標準方法を用いて胎盤から回収した。Ｌａｉｒｅｄ ｅｔ ａｌ． （１９９１） Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １９：４２９３。ゲノムＤＮＡはＥｃｏＲＶで消化し、１％アガロースゲルで分離し、Ｎｙｔｒａｎナイロン膜にブロットした（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ＆ Ｓｃｈｕｅｌｌ）。ブロットをＳＶ４０ ｉｎｔｒ＆Ｐｏｌ Ａ標識プローブ（マップ参照）で終夜ハイブリダイズして次の日に洗浄した。膜をＸ線フイルムに曝し２４時間と４８時間後に現像した。Ｆｉｇｕｒｅ４４。
ＯＣＰ外来ＲＮＡ発現分析
どれが外来ＯＣＰを発現した遺伝子組換え胚であるかを決定するため、全ＲＮＡを製造者の指示に従って（ＥＺ−ＲＮＡ、全ＲＮＡ単離キット、Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ）後肢から単離した。全ＲＮＡ５μｇを製造者の指示に従って（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（登録商標）ＩＩ）ＲＴ−ＰＣＲによってアッセイした。ネガティブコントロールとして、ＲＴをオミットした。それぞれ、１０２０ｂｐおよび４５０ｂｐのｃＤＮＡ生成物を増幅するＧａｐＤＨプライマーまたは外来ＯＣＰプライマーおよびＴａｑポリメラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて、ＰＣＲを３０サイクル（９４℃で１分間、５９℃で１分間、７２℃で２分間）行った。
次のプライマーは外来ＯＣＰ検出のために用いた：
正：５’ ＧＣＡＣＴＧＡＡＣＴＧＣＴＣＴＧＴＧＧＡＴ ３’ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２）；および
逆：５’ ＣＣＡＣＡＧＡＡＧＴＡＡＧＧＴＴＣＣＴＴＣＡＣ ３’ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３）。
反応生成物（レーン当り５μｌ）を１．５％アガロースゲルで電気泳動し、臭化エチジウムで染色した。Ｆｉｇｕｒｅ４５に示されるように、同様の量のＧａｐＤＨ転写物を全ＲＮＡサンプルで全テスト胚から検出し、これはＯＣＰ転写物の存在量の差はＲＴ反応の効率における変動を反映していなかいことを示していた。さらに、ＧａｐＤＨ ＰＣＲ生成物はＲＴをオミットしたとき、どのＲＮＡサンプルにも検出されなかった。この結果はＯＣＰが、胚の番号５，７，９，１１，１５，２１，２６および２７でのみオステオカルシンプロモーター転写制御下に骨芽細胞によって発現されたことを示す。Ｆｉｇｕｒｅ４５。
オステオカルシンプロモーター−６０８遺伝子組換え胚における骨成長の特徴
結果はＦｉｇｕｒｅ４６−４８に示した。これはマウス胚発生（Ｅ１７）中のＯＣＰの過発現が長骨の軟骨内（縦方向）および膜状骨化を増加し、頭蓋冠平骨の膜状骨化を増加したことになる。上の結果をまとめると、この表現型は先ず骨芽細胞増殖、分化および最後には骨芽細胞の活性において十分な増加となることを示す。
【００４４】
実施例１９
読み出しシステムの作成
読み出しシステムを作成しＯＣＰ骨−前駆体−特異的プロモーターを活性化または不活性化できる小分子を同定する。
実施例２０
ヒト６０８の生命情報科学
ヒトＯＣＰをＡＣ０２４８８６と命名した断片を符号化するＤＮＡ配列を、ｎｔではなくｈｔｇｓデーターベースに見出す。ラットｃＤＮＡに対応するゲノムＤＮＡはない。ＢＬＡＳＴを用いたラットｃＤＮＡに対するＡＣ０２４８８６の整列は２領域の長い整列（およびいくつかの短領域）を示す：
１．ｃＤＮＡ：６４６２−８１８６
ゲノム：８９２２８−９０９５２
プラス／プラス配向：８１％同一性
２．ｃＤＮＡ：５５８１−６４５１
ゲノム：１０７７１０−１０６８４０
プラス／マイナス配向：８０％同一性
このように、ＡＣ０２４８８６は位置６４６２（ラットｃＤＮＡによる）の上流領域に間違って集合しており、これは不正確な配向である。不正確な配向を用いると、不正確なコード配列を与え、ヒトＯＣＰタンパク質を生成しない。
ＡＣ０２４８８６のジーンバンクレポートは次の通りである：
ＬＯＣＵＳ     ＡＣ０２４８８６  １７５３１９ｂｐ  ＤＮＡ
ＨＴＧ        ０６−ＳＥＰ−２０００
ＤＥＦＩＮＩＴＩＯＮ  ホモサピエンス染色体３クローン ＲＰ１１−２５Ｋ２４、ＷＯＲＫＩＮＧ
ＤＲＡＦＴ ＳＥＱＥＮＣＥ， ９ 不規則小片
ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＡＣ０２４８８６
ＶＥＲＳＩＯＮ   ＡＣ０２４８８６．１０  ＧＩ：９４３８３３０
ＫＥＹＷＯＲＤＳ  ＨＴＧ；ＨＴＧｓ＿ＰＨＡＳＥＩ；ＨＴＧＳ＿ＤＲＡＦＴ．
ＳＯＵＲＣＥ    ヒト
＊注：これは「ワーキングドラフト」配列である。一般に９コンティグからなる。小片の真の順番は知られていない、この配列レコードでの順番は任意である。コンティグ間のギャップはＮのランとして表されるが、正確なギャップの大きさは未知である。このレコードは入手でき受け入れ番号が保存されると直ぐに完成した配列で更新される。
＊      １    ６２５２３：長さ６２５２３ｂｐのコンティグ
＊  ６２５２４    ６２６２３：未知の長さのギャップ
＊  ６２６２４    ８５４４５：長さ２２８２２ｂｐのコンティグ
＊  ８５４４６    ８５５４５：未知の長さのギャップ
＊  ８５５４６   １０６０５９：長さ２０５１４ｂｐのコンティグ
＊ １０６０６０   １０６１５９：未知の長さのギャップ
＊ １０６１６０   １２７９０８：長さ２１７４９ｂｐのコンティグ
＊ １２７９０９   １４８００８：未知の長さのギャップ
＊ １２８００９   １４３０６８：長さ１５０６０ｂｐのコンティグ
＊ １４３０６９   １４３１６８：未知の長さのギャップ
＊ １４３１６９   １５８７３４：長さ１５５６６ｂｐのコンティグ
＊ １５８７３５   １５８８３４：未知の長さのギャップ
＊ １５８８３５   １７００４２：長さ１１２０８ｂｐのコンティグ
＊ １７００４３   １７０１４２：未知の長さのギャップ
＊ １７０１４３   １７３７１５：長さ３５７３ｂｐのコンティグ
＊ １７３７１６   １７３８１５：未知の長さのギャップ
＊ １７３８１６   １７５３１９：長さ１５０４ｂｐのコンティグ。
イ．ヒトゲノム６０８エキソンのマッピング
１０個のエキソンを塩基１０７から６４５１までのラットｃＤＮＡ配列にマッピングした。このようにしたヒトゲノム小片の最初のエキソンは欠乏しているかもしれない。ｃＤＮＡの塩基６４６２（ＡＣ０２４８８６ ９２００１ないし１１１０９０の塩基の逆補体）の上流（１９０９０塩基）のヒトゲノム小片（ＡＣ０２４８８６）をプログラムＧｅｎｏｍａｔｉｘのＥｘｏｎＭａｐｐｅｒを用いてラットｃＤＮＡと比較した。表において、塩基１は使用したゲノム小片では実際に１１３１であり、実際のゲノムの位置は９１８７０で始まる。
追加の２つのエキソンは塩基６４６２から８８８３までラットｃＤＮＡ配列にマップで表される。このように塩基６４５２−６４６１は欠乏している。用いたヒトゲノム片は塩基１６５，３３７から１７５，６６７（１０，３３１塩基）である。同じタイプのプログラムを用いてこの配列をＱＢＩゲノムマウス６０８と比較した。
ゲノム配列からのエキソン／イントロン境界の結合は予想したヒトおよびマウスｃＤＮＡを生成した。ヒト、マウスおよびラットタンパク質の良好な多整列ができるようにフレームシフトするために、マウスとヒトの予言したｃＤＮＡｓは改変された。整列はＣＬＵＳＴＡＬＸとＰｒｅｔｔｙを用いて行われた。
ＧｅｎｅＷｉｓｅによるヒトｃＤＮＡのラットｃＤＮＡへの整列後のｃＤＮＡ改変は次のように行われた。次の２つの表では、−ｘはｃＤＮＡ配列でのヌクレオチドｘの欠失を示し；＋ｘはｃＤＮＡ配列でのヌクレオチドｘの挿入を示す；そして全変化位置はもとの配列に関連する。
【００４５】
【表２】
2004524824.tif 000004
【００４６】
ヒト染色体の染色体位置：
２種のタイプのデーターが存在する。
イ．ゲノム小片ＡＣ０２４８８６は Ｆｕｋｕｉ ｅｔ ａｌ． （１９９４） Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ． ２０１：８９４−９０１ に記載されているようなＡＣＣＥＳＳＩＯＮ Ｄ１４４３６として同定された断片と同一である。
整列情報：
同一性＝３１５／３３５（９４％）
ｈｒｈ１：４ −３３８
ＡＣ０２４８８６：４１６６２−４１３２８
Ｈｒｈ１は染色体３と３ｐ２５にマッピングされ；そして
ロ．３ｑ．ＳＴＳ：２０−４３２でのＳＴＳへの同一はＡＣＣＥＳＳＩＯＮ Ｇ５４３７０と同一であり、Ｊｏｅｎｓｕｕ ｅｔ ａｌ． （２０００） Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ６３：４０９−４１６に記述されている。
【００４７】
実施例２１
ポリクローナル抗体調製
全６０８推定上のタンパク質に特異的なポリクローナル抗体は当該分野で良く知られた方法によって調製される（６０８の構造は成長因子前駆体のそれに似ている）。ポリクローナル抗体は同定されそして６０８の組換え活性形態が調製される。ポリクローナル抗体の活性はマウスでインヴィヴォでテストされる。抗体は、６０８タンパク質のフラクションを構成するらしいこのタンパク質の活性形態の同定のために用いられる。
実施例２２
ラットとヒト６０８タンパク質の境界で見出された塩基性アミノ酸の伸張、
およびその関連
６０８タンパク質のラットとヒトＮ−末端部分との間の相同性は特に最初の２５０個のアミノ酸内で有意である。
この保存された領域の境界では、完全に保存された伸展の塩基性アミノ酸がある：ＫＣＫＫＤＲ（ａａ２４２−２４７および２４０−２４５、ラットおよびヒトタンパク質においてそれぞれ）。塩基性アミノ酸の伸展はプロテアーゼ開裂部位として役立つ。このような伸展が多少保存された配列の境界に見出される事実およびＣ−末端ＬＲＲ、一般に保存されたドメイン内に起きる事実は、根本的な生物学の重要性を示唆する。
したがって、６０８タンパク質はその大いに保存されたＮ−末端部位の開裂によって翻訳後の処理を受けられ、この地点が６０８タンパク質の活性部分であり、またはその生物学活性の少なくとも一部をもつ。得られた〜２５ｋＤのタンパク質は信号ペプチドを保存するので、分泌される。
６０８タンパク質の２５ｋＤ開裂生成物が、６０８トランスフェクション頭蓋冠細胞によって左右される媒体の骨形成活性に応答するかどうかテストするため、われわれはラット６０８ｃＤＮＡ符号化アミノ酸１−２４１（ＫＣＫＫＤＲ伸展を含まない）のＮ−末端部を含み、ラット頭蓋冠でそれを一過性に発現するｐｃＤＮＡベクターを作成した。トランスフェクションした細胞は共培養した非トランスフェクション頭蓋冠細胞および細胞外培養したＥ１６マウス胚（上記）の両方で、骨形成を誘発するためのアッセイをした。その結果はＯＣＰの分泌されたＮ−末端部分は共培養細胞と胚骨において骨形成をするのに十分であったことを明らかに示した。
６０８の生物学的に活性な２５ｋＤ Ｎ−末端開裂生成物は従って、骨粗鬆症、骨折治癒、骨伸展および歯根膜変性症の治療および／または予防に用いられる。間接生成物として（化学品または中和ｍＡｂｓによって阻害）、フラグメントを用いて骨関節炎、骨粗鬆症、および骨硬化症を治療および／または予防する。
【００４８】
実施例２３
アドリカンタンパク質および遺伝子
アドリカンは最近記載されたタンパク質である。Ｃｒｏｗｌ ａｎｄ Ｌｕｋ （２０００） Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｂｉｏｌ． Ｒｅｓ． Ａｄｌｉｃａｎ、プロテオグリカンは胎盤から取り出された。アドリカンの全アミノ酸配列はＡＦ２４５５０５．１：１．８４８７として同定され、これによってここに参考文献として組み込まれる。Ｆｉｇｕｒｅ５１。
アドリカンの構造はここに記載した方法を用いて分析され、ロイシンリッチの繰り返しおよびＯＣＰタンパク質のそれに似たイムノグロブリン領域をもつことが見出された。２つのタンパク質に示された領域のアミノ酸残基間に見出された全体の相同性は次の通りである：
2004524824.tif 000005
したがって、本発明はＯＣＰタンパク質のためにここに記載した任意の方法でアドリカンの使用を包囲する。これら要素および用途はアドリカンについて先には開示されていなかった。アドリカンの用途、またはその機能的部分を含み、骨粗鬆症を予防、治療またはコントロールするため、骨折治癒、骨伸展または、骨減少症、歯根膜変性症、骨折または低骨密度、または対象において骨粗鬆症またはその兆候を引き起こす他の因子または機械的ストレスまたはその不足を含む他の状態の治療をすることを含む。
アドリカン遺伝子、またはその機能的部分は同様にＯＣＰ遺伝子のためにここに記載した任意の目的に用いられる。アドリカン遺伝子からなる組成物、アドリカンまたはアドリカンに特異的な抗体および生理学的に受け入れられる賦形剤は同様に本発明によって含まれる。そのような賦形剤は当該分野で知られており生理的食塩水、リン酸緩衝食塩水およびリンゲル溶液を含む。
【００４９】
実施例２４
ＯＣＰ遺伝子の再配列決定
ＯＣＰ遺伝子の再配列決定は６個の追加のヌクレオチドをＤＮＡ配列にＦｉｇｕｒｅ５３に示すように加えた（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３）、これら６個のヌクレオチドは下線した。
したがって符号化ＯＣＰタンパク質の対応するアミノ酸配列は追加の２個のアミノ酸をもつ、Ｆｉｇｕｒｅ５４、（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４）、これら２個の追加のアミノ酸は下線した。
実施例２５
ＯＣＰの組換え機能的部分の調製
実施例１６に記載した６６３アミノ酸構成は２９３Ｔ細胞に発現した。媒体のウェスタンブロット分析は、Ｆｌａｇタグへの抗体を用いて、６６３アミノ酸ポリペプチドの存在を示した。このポリペプチドは、抗−Ｆｌａｇタグ抗体のカラムを用いて、媒体から精製した。この精製したポリペプチドを２００ｎｇ／ｍｌの濃度で間葉細胞ラインＣ３Ｈ１０Ｔ１／２に添加した。投与７日後に、これらの培養体が軟骨／骨小結節を形成したことが注目された。骨芽細胞および軟骨形成の分化はアリザリンレッド染色（石灰化領域を染色する）およびアルシアンブルー（軟骨母材析出染色）をそれぞれ用いて決定した。
この鍵となる実験はＯＣＰポリペプチドの外来部分がＣ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞での骨形成／軟骨形成の引き金となったことを示し、この細胞は間葉前駆体であり、媒体に分泌される。したがってこの６６３アミノ酸ポリペプチドは、約７０−８０ｋＤのＭＷをもち、ＯＣＰタンパク質の機能的部分である。
本発明の好適例をこのように詳細に記載したが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００５０】
実施例２６
ラットＯＣＰでのＲＧＤと
サブチリシン様プロプロテインコンバターゼ（ＳＰＣ）モチーフの同定
Ｆｉｇｕｒｅ３に示したように、６０８ポリペプチドの最初の８４０アミノ酸残基を以下の表（ラット６０８ １−６６３ａａ、ＲＧＤおよびＳＰＣ開裂モチーフ）に示す。６６３アミノ酸配列は下線し、ＲＧＤ部位は四角で囲み、推定上の開裂モチーフサブチリシン様プロプロテインコンバターゼ（ＳＰＣ）コンセンサス配列は楕円で囲んだ。
【００５１】
【表３】
2004524824.tif 000006
【００５２】
６０８タンパク質は通常ＳＰＣによって開裂され、６６３ａａペプチドよりも活性なペプチドを生成した。上の配列に四角で囲んでいるように、この推定のペプチドはまたＲＧＤ配列を含んでいた。多くの粘着性タンパク質は、細胞外基質および血液に存在し、それらの細胞認識部位としてこのトリペプチドを含む。したがって、６０８ペプチド１−７４１アミノ酸、またはＲＧＤ配列を含むさらに短いペプチドは６６３ａａフラグメントよりもさらに有効な薬剤である。ＲＧＤおよびＲｘｘＲｘｘＲ（すなわち、Ｒ−ａａ１−ａａ２−Ｒ−ａａ３−ａａ４−Ｒ、換言すれば、ＳＰＣ開裂部位）配列はヒト６０８タンパク質配列に存在するがアドリカンにもアドリカン−２にも存在しない。
実施例２７
ラットＯＣＰの自然開裂
アミノ酸残基１−３１２を含むラット６０８フラグメントに対するポリクローナル抗体は当該分野で既知の方法によって調製した。この抗体を用いてウェスタンブロットで６０８ペプチドを同定した。いくつかの６０８配列は一過性にトランスフェクションた２９３Ｔ腎臓細胞ラインから誘導された細胞で発現した。配列はラット全長６０８ポリペプチド、アミノ酸残基１−１６３４を含むラットポリペプチドフラグメント、アミノ酸残基１−６６３を含むラットポリペプチドフラグメントだった。抗体は生成した全３個の構成物において約９０ｋＤのペプチドを同定した。このペプチドは、細胞抽出物ではなく、細胞の要件となる媒体において抗−６０８抗体によって検出された。
次の表は１−３１２アミノ酸残基からなるラット６０８フラグメントに対しポリクローナル抗体を用いたウェスタンブロット分析である。
2004524824.tif 000007
６０８全長と２９３Ｔ細胞で生成した６０８  １−１６３４ａａタンパク質を開裂し培地に分泌させた。開裂した生成物は同一の大きさであることが明らかになった。６０８  １−６６３ａａ タンパク質はまた培地に分泌させたが、開裂した全長および１−１６３４ａａタンパク質よりも僅かに小さいことが明らかになった。６０８  １−７４１ａａからの期待された大きさは、すなわち、推定のＳＰＣ開裂生成物は、約８９ｋＤａであった。
【００５３】
実施例２８
ラットＯＣＰペプチドフラグメント（ａａ残基１−６６３と１−１６３４）：
安定にトランスフェクションしたＣ２Ｃ１２細胞ラインの効果
筋部位に骨形態形成タンパク質（ＢＭＰｓ）の古典的移殖実験はＢＭＰｓが異所性のカートリッジと骨形成を誘発した。さらに、組織培養実験は、脱石灰骨に培養した筋は軟骨形成細胞を産生した。これらの事実は筋が骨軟骨形成前駆体細胞を含み、ＢＭＰｓが骨軟骨形成系列細胞の分化経路を迂回していることを示唆した。
さらにＢＭＰ−２によって筋性の分化の制御機構を研究するため、カタギリらはＣ２Ｃ１２筋芽細胞を用いた、これは筋組織サテライト細胞から始めた。（Ｋａｔａｇｉｒｉ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １２７： １７５５−１７６６， １９９４）。ＢＭＰ−２とＴＧＦ−β１は完全にＣ２Ｃ１２細胞での筋管生成を阻害したが、ＢＭＰ−２のみがそれらを骨芽細胞系列細胞に分化するように誘発した。
Ｃ２Ｃ１２筋芽細胞の６０８ペプチドの影響はインヴィトロでテストした。Ｃ２Ｃ１２安定なクローンは（ｉ）ラット６０８ａａ残基１−１６３４および（ｉｉ）ラットａａ残基１−６６３でｐＣＭＶｎｅｏにおいてトランスフェクションした。これらのクローンはＣ２Ｃ１２安定なクローンプールと比較し、ｐＣＭＶｎｅｏでトランスフェクションした。使用した培地は分化培地：ＤＭＥＭ＋１０％ＦＣＳ、１ｍＭβ−グリセロホスフェート、０．０５ｍｇ／ｍｌアスコルビン酸であった。分化培地に１，３および９日後にＣ２Ｃ１２安定クローンのアルカリホスファターゼ染色を観察した。
６０８ａａ残基１−１６３４でＣ２Ｃ１２安定クローンは分化培地中１日後にかなりのアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）活性を誘発した。活性は分化培地で３および９日後に次第に増加した。
６０８ａａ残基１−６６３でＣ２Ｃ１２安定クローンは分化培地中９日後にのみかなりのＡＬＰ活性を誘発した。
明らかに、Ｃ２Ｃ１２細胞中アルカリホスファターゼを誘発するため分化培地を用いてさらに長い処理過程が必要である。これらの結果は１６３４アミノ酸ポリペプチドが６６３ポリペプチドよりも高い活性を保持することを示した。
【００５４】
実施例２９
骨芽細胞増殖と分化のための候補としてのヒトアドリカン
実施例２３で議論したように、アドリカンは最近記述されたタンパク質である。アドリカンタンパク質はＬＲＲおよびＯＣＰタンパク質のそれに非常に似たイムノグロブリン領域をもつ。２つのヒトタンパク質に指示された領域のアミノ酸残基間に見出される全体の相同性は実施例２３に示される。
導き出されたアドリカンタンパク質は次の特徴からなる：
イ．開裂できる、１−２６ａａにてよく限定されたＮ−末端信号ペプチド
ロ．ＬＲＲ領域（２６−２０５ａａ）。この領域はＬＲＲのＮ−末端とＣ−末端ドメイン（それぞれａａ２６−５９と２１７−２７６）に分けられる。それらの間で、６個のＬＲＲ（ａａ５５−７７、７８−１０１、１０２−１２５、１２６−１４９、１５０−１７３、１８２−２０５）がある。
ハ．１２のイムノグロブリンＣ−２タイプはアミノ酸位置４９２−５６２、５９０−６５８、１８６６−１９３５、１９６３−２０３２、２０６０−２１２９、２１５９−２２２８、２２５６−２３３１、２３５９−２４２５、２４５７−２５２５、２５５５−２６２３、２６５０−２７１８、２７４６−２８１７で繰り返す。したがって、２つのＩｇ様繰り返しは直ちにＬＲＲ領域の下流に見つけられるが、残りの１０の繰り返しは、ＯＣＰと同様に、タンパク質のＣ−末端でクラスターされる。
ニ．アミノ酸：６７６−６８２、１１４６−１１６５、１２３０−１２３６および１７４７−１７６３での４個の核推定上の局在化ドメイン（ＮＬＳ）。
したがって、われわれはアドリカンは骨芽細胞増殖と分化の誘発物質として良い候補であると決定した。
ヒトアドリカン発現が骨芽細胞と軟骨細胞の増殖と分化を引き起こすか決定するために、アドリカンの発現生成物、またはアドリカンを発現する細胞またはベクターをモニターして、それらが細胞を選択的に増殖し分化するかそしてこれによって骨密度を増加または変化させるかを決定する。アドリカンｍＲＮＡまたは発現のレベルを検出し、それを「正常の」非骨障害性レベルと比較することは、骨粗鬆症または低レベルの骨芽細胞および軟骨細胞を発生する危険な状態にある個々のスクリーニングと検出を可能にする。
【００５５】
実施例３０
推論上のアドリカン−２タンパク質
推論上のアドリカン−２タンパク質（ゲノム位置：Ｙｑ１１．２１）はアドリカン−２予言配列（Ｆｉｇｕｒｅ５９と６０）と対応するヒトアドリカンアミノ酸配列（Ｆｉｇｕｒｅ６１）を比較する整列（Ｆｉｇｕｒｅ６２参照）に従い発生させた。このＤＮＡ分子と符号化したポリペプチドは新規の分子であり本発明の絶対必要な部分を構成する。
Ｙ染色体ＢＡＣクローン（ｇｉ８７４８８８４）はヒトアドリカンに９３％の相同性を示す。このＢＡＣクローンに１００％相同な２つのｍＲＮＡ配列を遺伝子バンクに提出した（ｇｉ１４７１９９４２、およびｇｉ１４７１９９４０）。しかし、これらクローンの配列はｃＤＮＡ配列に基づいていないが、ヒトゲノムデーターには基づいており、Ｃ−末端Ｉｇ領域でのヌクレオチド配列の短伸展をカバーする。われわれは上流ヌクレオチドと推定上のアミノ酸の配列決定を行った。アドリカンとアドリカン−２の配列アラインメントは１の可能な例外とともに全アドリカン配列に沿って存在する。アドリカンのａａ６６−２１５に沿ったアラインメントはアドリカン−２分子から行方不明である。これは６ＬＲＲの領域である。６ＬＲＲ領域のための符号化ｎｔはまだ観察されていないが、それらの存在は明確には除外されていない。
したがって、本発明はＯＣＰタンパク質についてここに記載した任意の方法でアドリカン−２を使用することを含む。機能または用途はアドリカン−２については先に開示されていなかった。提案された用途は、骨粗鬆症を予防、治療またはコントロールし、または骨折治癒、骨伸展または、骨減少症、歯根膜炎、骨折または対象の機械的ストレスまたはその不足を含む他の状態の治療のため、アドリカン−２、またはその機能的部分の使用を含む。間接的生成物として（化学品または中和ｍＡｂｓのいづれかによる阻害）、アドリカン−２を用いて骨関節炎、大理石骨病、および骨硬化症を治療および／または予防する。アドリカン−２遺伝子、またはその機能的部分は、同様にＯＣＰ遺伝子についてここに記載した任意の目的のために用いられる。アドリカン−２遺伝子、アドリカン−２またはアドリカン−２に特異的な抗体からなる組成物および生理学的に受容できる賦形剤は同様に本発明によって含まれる。そのような賦形剤は当該分野に既知であり、生理的食塩水、リン酸緩衝食塩水およびリンゲル溶液を含む。
【００５６】
【配列表】
2004524824.tif 000008
2004524824.tif 000009
2004524824.tif 000010
2004524824.tif 000011
2004524824.tif 000012
2004524824.tif 000013
2004524824.tif 000014
2004524824.tif 000015
2004524824.tif 000016
2004524824.tif 000017
2004524824.tif 000018
2004524824.tif 000019
2004524824.tif 000020
2004524824.tif 000021
2004524824.tif 000022
2004524824.tif 000023
2004524824.tif 000024
2004524824.tif 000025
2004524824.tif 000026
2004524824.tif 000027
2004524824.tif 000028
2004524824.tif 000029
2004524824.tif 000030
2004524824.tif 000031
2004524824.tif 000032
2004524824.tif 000033
2004524824.tif 000034
2004524824.tif 000035
2004524824.tif 000036
2004524824.tif 000037
2004524824.tif 000038
2004524824.tif 000039
2004524824.tif 000040
2004524824.tif 000041
2004524824.tif 000042
2004524824.tif 000043
2004524824.tif 000044
2004524824.tif 000045
2004524824.tif 000046
2004524824.tif 000047
2004524824.tif 000048
2004524824.tif 000049
2004524824.tif 000050
2004524824.tif 000051
2004524824.tif 000052
2004524824.tif 000053
2004524824.tif 000054
2004524824.tif 000055
2004524824.tif 000056
2004524824.tif 000057
2004524824.tif 000058
2004524824.tif 000059
2004524824.tif 000060
2004524824.tif 000061
2004524824.tif 000062
2004524824.tif 000063
2004524824.tif 000064
2004524824.tif 000065
2004524824.tif 000066
2004524824.tif 000067
2004524824.tif 000068
2004524824.tif 000069
2004524824.tif 000070
2004524824.tif 000071
2004524824.tif 000072
2004524824.tif 000073
2004524824.tif 000074
2004524824.tif 000075
2004524824.tif 000076
2004524824.tif 000077
2004524824.tif 000078
2004524824.tif 000079
2004524824.tif 000080
2004524824.tif 000081
2004524824.tif 000082
2004524824.tif 000083
2004524824.tif 000084
2004524824.tif 000085
2004524824.tif 000086
2004524824.tif 000087
2004524824.tif 000088
2004524824.tif 000089
2004524824.tif 000090
2004524824.tif 000091
2004524824.tif 000092
2004524824.tif 000093
2004524824.tif 000094
2004524824.tif 000095
2004524824.tif 000096
2004524824.tif 000097
2004524824.tif 000098
2004524824.tif 000099
2004524824.tif 000100
2004524824.tif 000101
2004524824.tif 000102
2004524824.tif 000103
2004524824.tif 000104
2004524824.tif 000105
2004524824.tif 000106
2004524824.tif 000107
2004524824.tif 000108
2004524824.tif 000109
2004524824.tif 000110
2004524824.tif 000111
2004524824.tif 000112
2004524824.tif 000113
2004524824.tif 000114
2004524824.tif 000115
2004524824.tif 000116
2004524824.tif 000117
2004524824.tif 000118
2004524824.tif 000119
2004524824.tif 000120
2004524824.tif 000121
2004524824.tif 000122
2004524824.tif 000123
2004524824.tif 000124
2004524824.tif 000125
2004524824.tif 000126
2004524824.tif 000127
2004524824.tif 000128
2004524824.tif 000129
2004524824.tif 000130
2004524824.tif 000131
2004524824.tif 000132
2004524824.tif 000133
2004524824.tif 000134
2004524824.tif 000135
2004524824.tif 000136
2004524824.tif 000137
2004524824.tif 000138
2004524824.tif 000139
2004524824.tif 000140
2004524824.tif 000141
2004524824.tif 000142
2004524824.tif 000143
2004524824.tif 000144
2004524824.tif 000145
2004524824.tif 000146
2004524824.tif 000147
2004524824.tif 000148
2004524824.tif 000149
2004524824.tif 000150
2004524824.tif 000151
2004524824.tif 000152
2004524824.tif 000153
2004524824.tif 000154
2004524824.tif 000155
2004524824.tif 000156
2004524824.tif 000157
2004524824.tif 000158
2004524824.tif 000159
2004524824.tif 000160
2004524824.tif 000161
2004524824.tif 000162
2004524824.tif 000163
2004524824.tif 000164
2004524824.tif 000165
2004524824.tif 000166
2004524824.tif 000167
2004524824.tif 000168
2004524824.tif 000169
2004524824.tif 000170
2004524824.tif 000171
2004524824.tif 000172
2004524824.tif 000173
2004524824.tif 000174
2004524824.tif 000175
2004524824.tif 000176
2004524824.tif 000177
2004524824.tif 000178
2004524824.tif 000179
2004524824.tif 000180
2004524824.tif 000181
2004524824.tif 000182
2004524824.tif 000183
2004524824.tif 000184
2004524824.tif 000185
2004524824.tif 000186
2004524824.tif 000187
2004524824.tif 000188
2004524824.tif 000189
2004524824.tif 000190
2004524824.tif 000191
2004524824.tif 000192
2004524824.tif 000193
2004524824.tif 000194
2004524824.tif 000195
2004524824.tif 000196
2004524824.tif 000197
2004524824.tif 000198
2004524824.tif 000199
2004524824.tif 000200
2004524824.tif 000201
2004524824.tif 000202
2004524824.tif 000203
2004524824.tif 000204
2004524824.tif 000205
2004524824.tif 000206
2004524824.tif 000207
2004524824.tif 000208
2004524824.tif 000209
2004524824.tif 000210
2004524824.tif 000211
2004524824.tif 000212
2004524824.tif 000213
2004524824.tif 000214
2004524824.tif 000215
2004524824.tif 000216
2004524824.tif 000217
2004524824.tif 000218
2004524824.tif 000219
2004524824.tif 000220
2004524824.tif 000221
2004524824.tif 000222
2004524824.tif 000223
2004524824.tif 000224
2004524824.tif 000225
2004524824.tif 000226
2004524824.tif 000227
2004524824.tif 000228
2004524824.tif 000229
2004524824.tif 000230
2004524824.tif 000231
2004524824.tif 000232
2004524824.tif 000233
2004524824.tif 000234
2004524824.tif 000235
2004524824.tif 000236
2004524824.tif 000237
2004524824.tif 000238
2004524824.tif 000239
2004524824.tif 000240
2004524824.tif 000241
2004524824.tif 000242
2004524824.tif 000243
2004524824.tif 000244
2004524824.tif 000245
2004524824.tif 000246
2004524824.tif 000247
2004524824.tif 000248
2004524824.tif 000249
2004524824.tif 000250
2004524824.tif 000251
2004524824.tif 000252
2004524824.tif 000253
2004524824.tif 000254
2004524824.tif 000255
2004524824.tif 000256
2004524824.tif 000257
2004524824.tif 000258
2004524824.tif 000259
2004524824.tif 000260
2004524824.tif 000261
2004524824.tif 000262
2004524824.tif 000263
2004524824.tif 000264
2004524824.tif 000265
2004524824.tif 000266
2004524824.tif 000267
2004524824.tif 000268
2004524824.tif 000269
2004524824.tif 000270
2004524824.tif 000271
2004524824.tif 000272
2004524824.tif 000273
2004524824.tif 000274
2004524824.tif 000275
2004524824.tif 000276
2004524824.tif 000277
2004524824.tif 000278
2004524824.tif 000279
2004524824.tif 000280
2004524824.tif 000281
2004524824.tif 000282
2004524824.tif 000283
2004524824.tif 000284
2004524824.tif 000285
2004524824.tif 000286
2004524824.tif 000287
2004524824.tif 000288
2004524824.tif 000289
2004524824.tif 000290
2004524824.tif 000291
2004524824.tif 000292
2004524824.tif 000293
2004524824.tif 000294
2004524824.tif 000295
2004524824.tif 000296
2004524824.tif 000297
2004524824.tif 000298
2004524824.tif 000299
2004524824.tif 000300
2004524824.tif 000301
2004524824.tif 000302
2004524824.tif 000303
2004524824.tif 000304
2004524824.tif 000305
2004524824.tif 000306
2004524824.tif 000307
2004524824.tif 000308
2004524824.tif 000309
2004524824.tif 000310
2004524824.tif 000311
2004524824.tif 000312
2004524824.tif 000313
2004524824.tif 000314
2004524824.tif 000315
2004524824.tif 000316
2004524824.tif 000317
2004524824.tif 000318
2004524824.tif 000319
2004524824.tif 000320
2004524824.tif 000321
2004524824.tif 000322
2004524824.tif 000323
2004524824.tif 000324
2004524824.tif 000325
2004524824.tif 000326
2004524824.tif 000327
2004524824.tif 000328
2004524824.tif 000329
2004524824.tif 000330
2004524824.tif 000331
2004524824.tif 000332
2004524824.tif 000333
2004524824.tif 000334
【図面の簡単な説明】
【図１】Ｆｉｇｕｒｅ １は全ラット６０８ ｃＤＮＡ配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）を示す図である。
【図２】Ｆｉｇｕｒｅ １の続である。
【図３】Ｆｉｇｕｒｅ１の続である。
【図４】Ｆｉｇｕｒｅ ２はＰｃＤＮＡ３．１−６０８構成を示す図である。
【図５】Ｆｉｇｕｒｅ ３はＯＣＰラットタンパク質アミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）を示す図である。
【図６】Ｆｉｇｕｒｅ ４はＴＮＴ（転写−翻訳）アッセイの結果を示す図である。
【図７】Ｆｉｇｕｒｅ ５はＢａｃ ２３−２６１Ｌ４の構造を示す図である。
【図８】Ｆｉｇｕｒｅ ６はＢａｃ ２３−２４１Ｈ７の構造を示す図である。
【図９】Ｆｉｇｕｒｅ ７はｍ６０８ｐ−レキシコンクローン（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）−部分再配列を示す図である。（１）再配列領域は下線。（２）推定エキソンは肉太文字。（３）コード領域（イタリック体）のＡＴＧ−ファーストＡＴＧ。
【図１０】Ｆｉｇｕｒｅ ７の続である。
【図１１】Ｆｉｇｕｒｅ ７の続である。
【図１２】Ｆｉｇｕｒｅ ７の続である。
【図１３】Ｆｉｇｕｒｅ ８はマウスＯＣＰエキソンおよびイントロンマップを示す図である。
【図１４】Ｆｉｇｕｒｅ ９はエキソン−イントロン境界のＯＣＰマップを示す図である。
【図１５】Ｆｉｇｕｒｅ ９の続である。
【図１６】Ｆｉｇｕｒｅ ９の続である。
【図１７】Ｆｉｇｕｒｅ ９の続である。
【図１８】Ｆｉｇｕｒｅ ９の続である。
【図１９】Ｆｉｇｕｒｅ ９の続である。
【図２０】Ｆｉｇｕｒｅ ９の続である。
【図２１】Ｆｉｇｕｒｅ ９の続である。
【図２２】Ｆｉｇｕｒｅ １１はヒトＯＣＰエキソンおよびイントロンリストを示す図である。
【図２３】Ｆｉｇｕｒｅ １２はＯＣＰヒトｃＤＮＡ配列（予言されたコード領域、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）を示す図である。
【図２４】Ｆｉｇｕｒｅ １２の続である。
【図２５】Ｆｉｇｕｒｅ １２の続である。
【図２６】Ｆｉｇｕｒｅ １３はＦｉｇｕｒｅ １２のＯＣＰヒトｃＤＮＡ配列に基づき、Ａ．ラットタンパク質／ヒトタンパク質；Ｂ．ラットタンパク質／マウスタンパク質；Ｃ．ラットｃＤＮＡ／ヒトｃＤＮＡ；およびＤ．ラットｃＤＮＡ／マウスｃＤＮＡ間のパーセント同一性を示す図である。
【図２７】Ｆｉｇｕｒｅ １４はラット、ヒト、およびマウスＯＣＰ ｃＤＮＡコード領域（ラットｃＤＮＡ：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７；ヒト５＋３補正：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８；およびマウスｃＤＮＡ５：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９）の配列を示す図である。
【図２８】Ｆｉｇｕｒｅ １４の続である。
【図２９】Ｆｉｇｕｒｅ １４の続である。
【図３０】Ｆｉｇｕｒｅ １４の続である。
【図３１】Ｆｉｇｕｒｅ １４の続である。
【図３２】Ｆｉｇｕｒｅ １４の続である。
【図３３】Ｆｉｇｕｒｅ １４の続である。
【図３４】Ｆｉｇｕｒｅ １４の続である。
【図３５】Ｆｉｇｕｒｅ １４の続である。
【図３６】Ｆｉｇｕｒｅ １４の続である。
【図３７】Ｆｉｇｕｒｅ １４の続である。
【図３８】ラット、ヒト、およびマウスＯＣＰタンパク質（ラット：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０；ヒト５＋３補正：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１；およびマウス５補正：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２）の配列を示す図である。
【図３９】Ｆｉｇｕｒｅ １５の続である。
【図４０】Ｆｉｇｕｒｅ １５の続である。
【図４１】Ｆｉｇｕｒｅ １５の続である。
【図４２】Ｆｉｇｕｒｅ １６はラットおよびヒトＯＣＰタンパク質（ラット：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３；およびヒト５＋３補正：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４）の配列を示す図である。
【図４３】Ｆｉｇｕｒｅ １６の続である。
【図４４】Ｆｉｇｕｒｅ １６の続である。
【図４５】Ｆｉｇｕｒｅ １７は部分マウスＯＣＰタンパク質アミノ酸配列（２３６ａａ）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５）を示す図である。
【図４６】Ｆｉｇｕｒｅ １８はＦｉｇｕｒｅ １２のＯＣＰヒトｃＤＮＡ配列に基づき、ＯＣＰヒトタンパク質アミノ酸配列（２５８７ａａ）を示す図である。
【図４７】Ｆｉｇｕｒｅ １９はＯＣＰ遺伝子から予言されたＯＣＰタンパク質構造を示す図である。
【図４８】Ｆｉｇｕｒｅ ２０は一次細胞および他の細胞ラインでのＯＣＰの発現パターンのリストを示す図である。Ａ．ラット一次頭蓋細胞およびＭＣ３Ｔ３細胞からのポリＡ＋ＲＮＡ ＲＴ−ＰＣＲのノーザンブロットを示す。主８．９ｋｂ転写物は頭蓋細胞のみに存在する。特異的ＯＣＰプライマーでのＲＴ−ＰＣＲアッセイは図の右側に示すように種々のラインから全ＲＮＡで行われる。全アッセイでは同様の量のＧａｐＤＨ ＲＴ−ＰＣＲ生成物が全ＲＮＡサンプルで検出された。さらに、Ｂ．ＲＴを無視するときＧａｐＤＨ生成物は任意のＲＮＡサンプルで検出されなかった。（−）はＯＣＰの発現を示さないが、（＋）は発現を示す。（−＋）を示すとき、ＯＣＰの発現は特別の状態でのみ引き起こされる。
【図４９】Ｆｉｇｕｒｅ ２１はＭＣ３Ｔ３プレ−骨芽細胞での機械的ストレスの影響を示す。ＯＣＰ、Ｃｂｆａ１、オステオポンチン（ＯＰＮ）およびＧＡＰＤＨに対するＲＴ−ＰＣＲを示す。その結果は、機械的ストレスを受けなかったＭＣ３Ｔ３細胞（１）、および機械的に刺激されたＭＣ３Ｔ３細胞（２）からの全細胞ＲＮＡを用いる３つの実験の代表を示す。ＲＴ−ＰＣＲ生成物は臭化エチジウムで染色した。
【図５０】Ｆｉｇｕｒｅ ２２は間葉（Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２）およびプレ筋芽（Ｃ２Ｃ１２）細胞からのインヴィトロ骨芽細胞分化の初期段階でのＯＣＰ（６０８）発現を示す図である。
【図５１】Ｆｉｇｕｒｅ ２３はＯＣＰがＰ７ラット大腿骨端での軟骨内の骨化の初期のマーカーであることを示す図である。
【図５２】Ｆｉｇｕｒｅ ２４はＯＣＰが骨髄間質細胞の骨芽細胞の分化の間に誘発され、骨髄での初期の分化前駆体の特異的マーカーであることを示す図である。
【図５３】Ｆｉｇｕｒｅ ２５は種々の処理による骨髄形成でのＯＣＰ発現のインヴィヴォ調節を示す図である。結果は処理した２ヶ月齢のマウスからの全細胞質ＲＮＡを用いる３つの実験の代表を示す。異なる処理を示す。ＲＴ−ＰＣＲ生成物をマークする。コントロールマウスは何も処理されていない。各処理グループでは左のレーンはＲＴを添加していない負のコントロールを示し、中央のレーンはＯＣＰ ＲＴ−ＰＣＲ生成物を示し、右のレーンはＧａｐＤＨ ＲＴ−ＰＣＲ生成物を示す。骨形成は血液のロスおよびエストロゲン投与で示される。骨ロスは座骨神経切離モデルで示す。
【図５４】Ｆｉｇｕｒｅ ２６は操作１週間後の骨折した骨の低出力顕微鏡写真を示す図である。良く発現したウォウブンボーンと繊維軟骨カルスが骨折部位に形成したことに注目。骨髄組織は骨折固定化に用いるワイヤの挿入により主に破壊された。マークした領域は次図において更に大きい拡大図で示される。
【図５５】Ｆｉｇｕｒｅ ２７はカルスの中央部分の顕微鏡写真を示す、Ａ．明るいフィールド、Ｂ．暗いフィールド。ＯＣＰ遺伝子を発現する細胞がカルスの繊維性部分に見られる。軟骨細胞からのハイブリッド形成信号はない。
【図５６】Ｆｉｇｕｒｅ ２８はＦｉｇｕｒｅ ２６で２によりマークしたカルス領域の顕微鏡写真を示す、Ａ．明るいフィールド、Ｂ．暗いフィールド。ＯＣＰ遺伝子を発現する細胞がカルスの軟骨部分に接する高血管化した骨膜下の領域に見られる。
【図５７】Ｆｉｇｕｒｅ ２９は高血管化した骨内膜性の組織の顕微鏡写真を示す図である。これはワイヤ挿入への反応で発現した（Ｆｉｇｕｒｅ ２８の領域３）、Ａ．明るいフィールド、Ｂ．暗いフィールド。この組織はＯＣＰ遺伝子を発現する多くの細胞を含む。
【図５８】Ｆｉｇｕｒｅ ３０は血管周囲の細胞の高出力顕微鏡写真を示す。血管周囲細胞はウォウブンボーン矢じりの小腔内の６０８遺伝子を発現する。
【図５９】Ｆｉｇｕｒｅ ３１はウォウブンボーンを覆う骨膜の高出力顕微鏡写真を示す図である。多細胞は骨膜での６０８遺伝子の発現を示す。矢じりはウォウブンボーン内の２つの６０８発現細胞を指す。
【図６０】Ｆｉｇｕｒｅ ３２は４週間で回復した骨折した骨の断面のＡ．明るいフィールドおよびＢ．暗いフィールドの顕微鏡写真を示す図である。カルスを覆う海綿状骨の活性再生の骨膜組織での多細胞はハイブリッド形成信号を示す。
【図６１】Ｆｉｇｕｒｅ ３３はさらに大きく拡大したＦｉｇｕｒｅ ３２の囲いの領域を示す図である。複数のＯＣＰ発現細胞が、破骨細胞活性の結果の空洞を充填する管組織に集中している（星印）。
【図６２】Ｆｉｇｕｒｅ ３４はトランスフェクションしたＯＣＰによる骨芽細胞分化のインヴィトロ誘導を示す図である。
【図６３】Ｆｉｇｕｒｅ ３５は頭蓋細胞へのＯＣＰ欠失構成物の一過性トランスフェクションを示す図である。２つのＯＣＰ欠失構成物（ＯＣＰ−４０３、ＯＣＰ−７６０）およびＯＣＰ全長構成物を一次頭蓋細胞に一過性にトランスフェクションした。ＡＬＰ染色を示す。全欠失構成物は、コントロールのｐＣＤＮＡベクターの一過性トランスフェクションと比べて骨芽細胞コロニイ数が増大しコロニイが大きくなったことを示す。
【図６４】Ｆｉｇｕｒｅ ３６はＯＣＰトランスフェクションＲＯＳ細胞において骨芽細胞分化が増大したことを示す図である。ＲＴ−ＰＣＲアッセイは上記のようにＯＣＰ、Ｃｂｆａｌ、ＡＬＰ、ＢＳＰおよびＧａｐＤＨ特異的プライマーを用いた。その結果、全細胞ＲＮＡを用いる２つの実験を示す。（１）安定なＯＣＰ−発現ＲＯＳ細胞ライン；および（２）コントロールＲＯＳ細胞ライン（ｐＣＤＮＡを用いた安定なトランスフェクション）。ＯＣＰ ＲＴ−ＰＣＲ生成物は１０２０ｂｐであり、Ｃｂｆａｌ生成物は２８９ｂｐであり、ＡＬＰ生成物は２２６ｂｐであり、ＢＳＰ生成物は１０４８ｂｐであり、ＧａｐＤＨ（コントロール）生成物は４５０ｂｐの長さである。Ｍはタンパク質マーカーを示す。
【図６５】Ｆｉｇｕｒｅ ３７はＯＣＰ−トランスフェクションＲＯＳ細胞での骨芽細胞増殖の増加を示す図である。
【図６６】Ｆｉｇｕｒｅ ３８は生体外の骨形成のＯＣＰ誘発を示す図である。骨が大きく骨量密度が大きくなることがＯＣＰトランスフェクション細胞と共培養した骨に見られた。
【図６７】Ｆｉｇｕｒｅ ３９はオステオカルシンプロモーターＯＣＰ遺伝子の構造を示す図である。
【図６８】Ｆｉｇｕｒｅ ４０は胎盤ＤＮＡｓのサザンブロット分析のオートラジオグラムを示す図である。”Ａ”は全発現胎児からのＤＮＡサンプルでのサザンブロットの結果を示す図である。（サンプル１０はサンプル中の胎児の不足によるミスである）。”Ｆ”は注入した断片で、期待された大きさに対する正のコントロールとして働き；矢印は期待された断片を印す。”Ｂ”は追加時間にサンプルに照射した”Ａ”のオートラジオグラムのセクションを示す。これらオートラジオグラムは胎児２０および２１が遺伝子組換えであることを示す。”Ｃ”はこれら選択された胎児、１１、２０および２１からのＤＮＡのサザンブロットの反復を示す。胎児２０および２１は再度遺伝子組換えとして検出される。胎児１１は、”Ａ”の長期照射で不明瞭な信号を示すが、また”Ｃ”において遺伝子組換えとして検出される。”Ｆ”は後で生成した安定な遺伝子組換えラインからのゲノムＤＮＡである。適当な断片は矢印で示す。以下に見られるさらに増強した断片はＳＶ４０プローブで時折観察される非特異的断片である。
【図６９】Ｆｉｇｕｒｅ ４１はＡ．遺伝子組換え胎児での外来ＯＣＰ発現を示す図である。外来ＯＣＰ転写物に対しＲＴ−ＰＣＲを行った。その結果は胎児尾からの全細胞ＲＮＡを用いる３つの実験の代表である。印をつけたＲＴ−ＰＣＲ生成物は臭化エチジウムで染色して視覚化した。Ｂ．ＧａｐＤＨプライマーを用いＯＣＰ転写物存在量における差はＲＴ反応の効率における変化を反映しないことを示した。
【図７０】Ｆｉｇｕｒｅ ４２はＯＣＰ遺伝子組換え胎児（Ｅ１７胎児）のオステオカルシンプロモーターの特徴づけを示す図である。頭蓋冠、脛骨および大腿骨の長さをμｍで測定した。全測量値はアリザリンレッドで染色した石灰化領域のみを含む。Ａ．頭蓋冠の長さ／幅を示す、Ｂ．頭蓋冠の長さ／幅（％）を示す。
【図７１】Ｆｉｇｕｒｅ ４３はＯＣＰがインヴィトロで骨形成を誘発することを示すＯＣ−ＯＣＰ遺伝子組換えた胎児長骨のアリザリンレッド染色を示す図である。細胞は骨芽細胞、軟骨細胞および肝臓／大動脈である。
【図７２】Ｆｉｇｕｒｅ ４４は形質転換したコントロール胎児からの頭蓋冠骨のアリザリンレッド染色を示す図である。更に高い石灰化（アリザリンレッド着色によって示された）は形質転換した胚頭蓋冠骨をそれらの同腹子と比較して着色されたとき検出された。形質転換した胚頭蓋冠骨はさらに長く幅広い。
【図７３】Ｆｉｇｕｒｅ ４５はクローン１４Ｃ１０とレキシコンクローンの比較。
【図７４】Ｆｉｇｕｒｅ ４６はｐＭＣＳＩＥｍ６０８ｐｒｍ５．５を示す図である。
【図７５】Ｆｉｇｕｒｅ ４７はｐＭＣＳＩＥ／ｐＧＬ３−ｂａｓｉｃにクローンしたマウスＯＣＰプロモーター領域（約５．５ｋｂ断片）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７）の配列を示す図である。
【図７６】Ｆｉｇｕｒｅ ４７の続である。
【図７７】Ｆｉｇｕｒｅ ４８はマウスＯＣＰプロモーター領域を符号化するクローンｐ１４Ｃ１０（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８）の５’末端の配列を示す図である。
【図７８】Ｆｉｇｕｒｅ ４８の続である。
【図７９】Ｆｉｇｕｒｅ ４９はヒトおよびマウスのＯＣＰ遺伝子の隣接調節領域を示す図である。
【図８０】Ｆｉｇｕｒｅ ５０はプライマー（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９）およびＱＢ３（ＣＭＦ６０８）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０）の配列を示す図である。
【図８１】Ｆｉｇｕｒｅ ５０の続である。
【図８２】Ｆｉｇｕｒｅ ５０の続である。
【図８３】Ｆｉｇｕｒｅ ５０の続である。
【図８４】Ｆｉｇｕｒｅ ５０の続である。
【図８５】Ｆｉｇｕｒｅ ５０の続である。
【図８６】Ｆｉｇｕｒｅ ５１はアドリカンアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１）を示す図である。
【図８７】Ｆｉｇｕｒｅ ５１の続である。
【図８８】Ｆｉｇｕｒｅ５２はアドリカンＤＮＡ配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２）を示す図である。
【図８９】Ｆｉｇｕｒｅ ５２の続である。
【図９０】Ｆｉｇｕｒｅ ５２の続である。
【図９１】Ｆｉｇｕｒｅ ５２の続である。
【図９２】Ｆｉｇｕｒｅ ５２の続である。
【図９３】Ｆｉｇｕｒｅ ５３ははヒトＯＣＰ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３）のコード領域ＯＲＦ（７８７２ｂｐ）の物理的ＤＮＡ配列を示す図である。
【図９４】Ｆｉｇｕｒｅ ５３の続である。
【図９５】Ｆｉｇｕｒｅ ５４はヒトＯＣＰ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４）のコード領域ＯＲＦに対応する予言したアミノ酸配列を示す図である。
【図９６】Ｆｉｇｕｒｅ ５５はＯＣＰラットタンパク質（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５）から誘導されたＮ末端６６３アミノ酸配列を示す図である。
【図９７】Ｆｉｇｕｒｅ ５６はｐＣＭ−Ｈ−６０８−６６３−Ｎ−末端構成マップを示す図である。
【図９８】Ｆｉｇｕｒｅ ５７はｐＫＳ Ｈ６０８ ５’−２．４Ｋｂ ｂＡｃ＃１構成の構造を示す（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ （ＡＴＣＣ）、１２３０１ Ｐａｒｋｌａｗｎ Ｄｒｉｖｅ， Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ， Ｍｄ．， ２０８５２， ＵＳＡ、によるブダペスト条約のもとにＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３８７８で２００１年１１月２１日に寄託）。
【図９９】Ｆｉｇｕｒｅ ５８はｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＫＳからＮｏｔＩ（５’）及びＨｉｎｄＩＩＩ（３’）部位までにクローンした５’断片（Ａ）の物理的配列を示す図である。断片Ａは全ヒトＯＣＰ配列の５’領域（２４４０ｂｐ）および５’末端、すなわち、β−アクチン「Ｋｏｚａｋ」領域（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６）の２１ヌクレオチドからなる。
【図１００】Ｆｉｇｕｒｅ ５９はｐＫＳ Ｈ６０８ ｍ．ＦＲＧ．３．５Ｋｂ＃３４構成（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ （ＡＴＣＣ）、１２３０１ Ｐａｒｋｌａｗｎ Ｄｒｉｖｅ， Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ， Ｍｄ．， ２０８５２， ＵＳＡ、によるブダペスト条約のもとにＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３８７６で２００１年１１月２１日に寄託）の構造を示す図である。
【図１０１】Ｆｉｇｕｒｅ ６０はｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＫＳからＨｉｎｄＩＩＩ（５’）及びＳａＩＩ（３’）部位までにクローンした中央断片（Ｂ）の物理的配列を示す図である。断片Ｂは全ヒトＯＣＰ配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７）の中心領域（３５１８ｂｐ）からなる。
【図１０２】Ｆｉｇｕｒｅ ６０の続である。
【図１０３】Ｆｉｇｕｒｅ ６１はｐＭ Ｈ６０８ ３’−１．９Ｋｂ ＨＳＴＧ＃３．３構成（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ （ＡＴＣＣ）、１２３０１ Ｐａｒｋｌａｗｎ Ｄｒｉｖｅ， Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ， Ｍｄ．， ２０８５２， ＵＳＡ、によるブダペスト条約のもとにＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３８７７で２００１年１１月２１日に寄託）の構造を示す図である。
【図１０４】Ｆｉｇｕｒｅ ６２はｐＭＣＳ ＳＶ（Ａ）からＳａＩＩ（５’）及びＳｐｅＩ（３’）部位までにクローンした３’断片（Ｃ）の物理的配列を示す図である。断片Ｃは全ヒトＯＣＰ配列の３’領域（３ｂｐストップコドンを含まない１９２３ｂｐ）からなり３’末端で、すなわち、６ヒスチジン残基（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８）に対しコード化する１８ヌクレオチドで含む。また、クローン化した断片ＣはヒトＯＣＰ ＯＲＦの共通配列と比べてサイレント突然変異体（Ｃ＞Ｔ遷移）を含む。この遷移は符号化したアミノ酸残基の同一性を変えない。
【図１０５】Ｆｉｆｕｒｅ ６３はアドリカン−２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９）の予言されたＤＮＡ配列を示す図である。塩基１５５５及び５６３８は「ｇ」で表されるが任意の他の塩基であることができる。
【図１０６】Ｆｉｇｕｒｅ ６３の続である。
【図１０７】Ｆｉｇｕｒｅ ６３の続である。
【図１０８】Ｆｉｇｕｒｅ ６４はアドリカン−２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０）の予言されたアミノ酸配列を示す図である。
【図１０９】Ｆｉｇｕｒｅ ６５はアドリカン−２（ｇｉ｜９２８０４０５｜ＡＡＦ８６４０２．１）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０）のアミノ酸配列を示す図である。
【図１１０】Ｆｉｇｕｒｅ ６６はヒトアドリカン−２予言配列及びヒトアドリカン−２断片及びヒトアドリカンの配列を示す図である。
【図１１１】Ｆｉｇｕｒｅ ６６の続である。
【図１１２】Ｆｉｇｕｒｅ ６６の続である。
【図１】
2004524824.tif 000335
【図２】
2004524824.tif 000336
【図３】
2004524824.tif 000337
【図４】
2004524824.tif 000338
【図５】
2004524824.tif 000339
【図６】
2004524824.tif 000340
【図７】
2004524824.tif 000341
【図８】
2004524824.tif 000342
【図９】
2004524824.tif 000343
【図１０】
2004524824.tif 000344
【図１１】
2004524824.tif 000345
【図１２】
2004524824.tif 000346
【図１３】
2004524824.tif 000347
【図１４】
2004524824.tif 000348
【図１５】
2004524824.tif 000349
【図１６】
2004524824.tif 000350
【図１７】
2004524824.tif 000351
【図１８】
2004524824.tif 000352
【図１９】
2004524824.tif 000353
【図２０】
2004524824.tif 000354
【図２１】
2004524824.tif 000355
【図２２】
2004524824.tif 000356
【図２３】
2004524824.tif 000357
【図２４】
2004524824.tif 000358
【図２５】
2004524824.tif 000359
【図２６】
2004524824.tif 000360
【図２７】
2004524824.tif 000361
【図２８】
2004524824.tif 000362
【図２９】
2004524824.tif 000363
【図３０】
2004524824.tif 000364
【図３１】
2004524824.tif 000365
【図３２】
2004524824.tif 000366
【図３３】
2004524824.tif 000367
【図３４】
2004524824.tif 000368
【図３５】
2004524824.tif 000369
【図３６】
2004524824.tif 000370
【図３７】
2004524824.tif 000371
【図３８】
2004524824.tif 000372
【図３９】
2004524824.tif 000373
【図４０】
2004524824.tif 000374
【図４１】
2004524824.tif 000375
【図４２】
2004524824.tif 000376
【図４３】
2004524824.tif 000377
【図４４】
2004524824.tif 000378
【図４５】
2004524824.tif 000379
【図４６】
2004524824.tif 000380
【図４７】
2004524824.tif 000381
【図４８】
2004524824.tif 000382
【図４９】
2004524824.tif 000383
【図５０】
2004524824.tif 000384
【図５１】
2004524824.tif 000385
【図５２】
2004524824.tif 000386
【図５３】
2004524824.tif 000387
【図５４】
2004524824.tif 000388
【図５５】
2004524824.tif 000389
【図５６】
2004524824.tif 000390
【図５７】
2004524824.tif 000391
【図５８】
2004524824.tif 000392
【図５９】
2004524824.tif 000393
【図６０】
2004524824.tif 000394
【図６１】
2004524824.tif 000395
【図６２】
2004524824.tif 000396
【図６３】
2004524824.tif 000397
【図６４】
2004524824.tif 000398
【図６５】
2004524824.tif 000399
【図６６】
2004524824.tif 000400
【図６７】
2004524824.tif 000401
【図６８】
2004524824.tif 000402
【図６９】
2004524824.tif 000403
【図７０】
2004524824.tif 000404
【図７１】
2004524824.tif 000405
【図７２】
2004524824.tif 000406
【図７３】
2004524824.tif 000407
【図７４】
2004524824.tif 000408
【図７５】
2004524824.tif 000409
【図７６】
2004524824.tif 000410
【図７７】
2004524824.tif 000411
【図７８】
2004524824.tif 000412
【図７９】
2004524824.tif 000413
【図８０】
2004524824.tif 000414
【図８１】
2004524824.tif 000415
【図８２】
2004524824.tif 000416
【図８３】
2004524824.tif 000417
【図８４】
2004524824.tif 000418
【図８５】
2004524824.tif 000419
【図８６】
2004524824.tif 000420
【図８７】
2004524824.tif 000421
【図８８】
2004524824.tif 000422
【図８９】
2004524824.tif 000423
【図９０】
2004524824.tif 000424
【図９１】
2004524824.tif 000425
【図９２】
2004524824.tif 000426
【図９３】
2004524824.tif 000427
【図９４】
2004524824.tif 000428
【図９５】
2004524824.tif 000429
【図９６】
2004524824.tif 000430
【図９７】
2004524824.tif 000431
【図９８】
2004524824.tif 000432
【図９９】
2004524824.tif 000433
【図１００】
2004524824.tif 000434
【図１０１】
2004524824.tif 000435
【図１０２】
2004524824.tif 000436
【図１０３】
2004524824.tif 000437
【図１０４】
2004524824.tif 000438
【図１０５】
2004524824.tif 000439
【図１０６】
2004524824.tif 000440
【図１０７】
2004524824.tif 000441
【図１０８】
2004524824.tif 000442
【図１０９】
2004524824.tif 000443
【図１１０】
2004524824.tif 000444
【図１１１】
2004524824.tif 000445
【図１１２】
2004524824.tif 000446
【国際公開パンフレット】
2004524824.tif 000447
2004524824.tif 000448
2004524824.tif 000449
2004524824.tif 000450
2004524824.tif 000451
2004524824.tif 000452
2004524824.tif 000453
2004524824.tif 000454
2004524824.tif 000455
2004524824.tif 000456
2004524824.tif 000457
2004524824.tif 000458
2004524824.tif 000459
2004524824.tif 000460
2004524824.tif 000461
2004524824.tif 000462
2004524824.tif 000463
2004524824.tif 000464
2004524824.tif 000465
2004524824.tif 000466
2004524824.tif 000467
2004524824.tif 000468
2004524824.tif 000469
2004524824.tif 000470
2004524824.tif 000471
2004524824.tif 000472
2004524824.tif 000473
2004524824.tif 000474
2004524824.tif 000475
2004524824.tif 000476
2004524824.tif 000477
2004524824.tif 000478
2004524824.tif 000479
2004524824.tif 000480
2004524824.tif 000481
2004524824.tif 000482
2004524824.tif 000483
2004524824.tif 000484
2004524824.tif 000485
2004524824.tif 000486
2004524824.tif 000487
2004524824.tif 000488
2004524824.tif 000489
2004524824.tif 000490
2004524824.tif 000491
2004524824.tif 000492
2004524824.tif 000493
2004524824.tif 000494
2004524824.tif 000495
2004524824.tif 000496
2004524824.tif 000497
2004524824.tif 000498
2004524824.tif 000499
2004524824.tif 000500
2004524824.tif 000501
2004524824.tif 000502
2004524824.tif 000503
2004524824.tif 000504
2004524824.tif 000505
2004524824.tif 000506
2004524824.tif 000507
2004524824.tif 000508
2004524824.tif 000509
2004524824.tif 000510
2004524824.tif 000511
2004524824.tif 000512
2004524824.tif 000513
2004524824.tif 000514
2004524824.tif 000515
2004524824.tif 000516
2004524824.tif 000517
2004524824.tif 000518
2004524824.tif 000519
2004524824.tif 000520
2004524824.tif 000521
2004524824.tif 000522
2004524824.tif 000523
2004524824.tif 000524
2004524824.tif 000525
2004524824.tif 000526
2004524824.tif 000527
2004524824.tif 000528
2004524824.tif 000529
2004524824.tif 000530
2004524824.tif 000531
2004524824.tif 000532
2004524824.tif 000533
2004524824.tif 000534
2004524824.tif 000535
2004524824.tif 000536
2004524824.tif 000537
2004524824.tif 000538
2004524824.tif 000539
2004524824.tif 000540
2004524824.tif 000541
2004524824.tif 000542
2004524824.tif 000543
2004524824.tif 000544
2004524824.tif 000545
2004524824.tif 000546
2004524824.tif 000547
2004524824.tif 000548
2004524824.tif 000549
2004524824.tif 000550
2004524824.tif 000551
2004524824.tif 000552
2004524824.tif 000553
2004524824.tif 000554
2004524824.tif 000555
2004524824.tif 000556
2004524824.tif 000557
2004524824.tif 000558
2004524824.tif 000559
2004524824.tif 000560
2004524824.tif 000561
2004524824.tif 000562
2004524824.tif 000563
2004524824.tif 000564
2004524824.tif 000565
2004524824.tif 000566
2004524824.tif 000567
2004524824.tif 000568
2004524824.tif 000569
2004524824.tif 000570
2004524824.tif 000571
2004524824.tif 000572
2004524824.tif 000573
2004524824.tif 000574
2004524824.tif 000575
2004524824.tif 000576
2004524824.tif 000577
2004524824.tif 000578
2004524824.tif 000579
2004524824.tif 000580
2004524824.tif 000581
2004524824.tif 000582
2004524824.tif 000583
2004524824.tif 000584
2004524824.tif 000585
2004524824.tif 000586
2004524824.tif 000587
2004524824.tif 000588
2004524824.tif 000589
2004524824.tif 000590
2004524824.tif 000591
2004524824.tif 000592
2004524824.tif 000593
2004524824.tif 000594
2004524824.tif 000595
2004524824.tif 000596
2004524824.tif 000597
2004524824.tif 000598
2004524824.tif 000599
2004524824.tif 000600
2004524824.tif 000601
2004524824.tif 000602
2004524824.tif 000603
2004524824.tif 000604
2004524824.tif 000605
2004524824.tif 000606
2004524824.tif 000607
2004524824.tif 000608
2004524824.tif 000609
2004524824.tif 000610
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004524824.tif 000611
2004524824.tif 000612
2004524824.tif 000613
2004524824.tif 000614
2004524824.tif 000615
2004524824.tif 000616
2004524824.tif 000617
2004524824.tif 000618
2004524824.tif 000619
2004524824.tif 000620
2004524824.tif 000621
2004524824.tif 000622
2004524824.tif 000623
2004524824.tif 000624
2004524824.tif 000625
2004524824.tif 000626
2004524824.tif 000627
2004524824.tif 000628
2004524824.tif 000629
2004524824.tif 000630
2004524824.tif 000631
2004524824.tif 000632
2004524824.tif 000633
2004524824.tif 000634
2004524824.tif 000635
2004524824.tif 000636
2004524824.tif 000637
2004524824.tif 000638
2004524824.tif 000639
2004524824.tif 000640
2004524824.tif 000641
2004524824.tif 000642
2004524824.tif 000643
2004524824.tif 000644
2004524824.tif 000645
2004524824.tif 000646
2004524824.tif 000647
2004524824.tif 000648
2004524824.tif 000649
2004524824.tif 000650
2004524824.tif 000651
2004524824.tif 000652
2004524824.tif 000653
2004524824.tif 000654
2004524824.tif 000655
2004524824.tif 000656
2004524824.tif 000657
2004524824.tif 000658
2004524824.tif 000659
2004524824.tif 000660
2004524824.tif 000661
2004524824.tif 000662
2004524824.tif 000663
2004524824.tif 000664
2004524824.tif 000665
2004524824.tif 000666
2004524824.tif 000667
2004524824.tif 000668
2004524824.tif 000669
2004524824.tif 000670
2004524824.tif 000671
2004524824.tif 000672
2004524824.tif 000673
2004524824.tif 000674
2004524824.tif 000675
2004524824.tif 000676
2004524824.tif 000677
2004524824.tif 000678
2004524824.tif 000679
2004524824.tif 000680
2004524824.tif 000681
2004524824.tif 000682
2004524824.tif 000683
2004524824.tif 000684
2004524824.tif 000685
2004524824.tif 000686
2004524824.tif 000687
2004524824.tif 000688
2004524824.tif 000689
2004524824.tif 000690
2004524824.tif 000691
2004524824.tif 000692
2004524824.tif 000693
2004524824.tif 000694
2004524824.tif 000695
2004524824.tif 000696
2004524824.tif 000697
2004524824.tif 000698
2004524824.tif 000699
2004524824.tif 000700
2004524824.tif 000701
2004524824.tif 000702
2004524824.tif 000703
2004524824.tif 000704
2004524824.tif 000705
2004524824.tif 000706
2004524824.tif 000707
2004524824.tif 000708
2004524824.tif 000709
2004524824.tif 000710
2004524824.tif 000711
2004524824.tif 000712
2004524824.tif 000713
2004524824.tif 000714
2004524824.tif 000715
2004524824.tif 000716
2004524824.tif 000717
2004524824.tif 000718
2004524824.tif 000719
2004524824.tif 000720
2004524824.tif 000721
2004524824.tif 000722
2004524824.tif 000723
2004524824.tif 000724
2004524824.tif 000725
2004524824.tif 000726
2004524824.tif 000727
2004524824.tif 000728
2004524824.tif 000729
2004524824.tif 000730
2004524824.tif 000731
2004524824.tif 000732
2004524824.tif 000733
2004524824.tif 000734
2004524824.tif 000735
2004524824.tif 000736
2004524824.tif 000737
2004524824.tif 000738
2004524824.tif 000739
2004524824.tif 000740
2004524824.tif 000741
2004524824.tif 000742
2004524824.tif 000743
2004524824.tif 000744
2004524824.tif 000745
2004524824.tif 000746
2004524824.tif 000747
2004524824.tif 000748
2004524824.tif 000749
2004524824.tif 000750
2004524824.tif 000751
2004524824.tif 000752
2004524824.tif 000753
2004524824.tif 000754
2004524824.tif 000755
2004524824.tif 000756
2004524824.tif 000757
2004524824.tif 000758
2004524824.tif 000759
2004524824.tif 000760
2004524824.tif 000761
2004524824.tif 000762
2004524824.tif 000763
2004524824.tif 000764
2004524824.tif 000765
2004524824.tif 000766
2004524824.tif 000767
2004524824.tif 000768
2004524824.tif 000769
2004524824.tif 000770
2004524824.tif 000771
2004524824.tif 000772
2004524824.tif 000773
2004524824.tif 000774
2004524824.tif 000775
2004524824.tif 000776
2004524824.tif 000777
2004524824.tif 000778
2004524824.tif 000779
2004524824.tif 000780
2004524824.tif 000781
2004524824.tif 000782
2004524824.tif 000783
2004524824.tif 000784