(57)【要約】以下の一次構造を含むグルコシル化ポリペプチド：ＮＨ２−Ｘ−Ｐｐ−ＣＯＯＨ（式中、Ｘはグリコシル化部位を含むか、あるいはそれに関与するペプチド付加物であり、Ｐｐは目的ポリペプチドである）または、ＮＨ２−Ｐｘ−Ｘ−Ｐｙ−ＣＯＯＨ（式中、Ｐｘは目的ポリペプチドＰｐのＮ末端部分であり、Ｐｙは該ポリペプチドＰｐのＣ末端部分であり、ならびにＸはグリコシル化部位を含むか、あるいはそれに関与するペプチド付加物である）。このグリコシル化ポリペプチドは目的ポリペプチドと比較して改善された性質を有する。
2004504016.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の一次構造を含むグリコシル化ポリペプチド：
ＮＨ２−Ｘ−Ｐｐ−ＣＯＯＨ
［式中、
Ｘは、グリコシル化部位を含むか、あるいはそれに関与するペプチド付加物であり、ならびに、
Ｐｐは目的のポリペプチドである］。
【請求項２】
以下の一次構造を有するグリコシル化ポリペプチド：
ＮＨ２−Ｐｘ−Ｘ−Ｐｙ−ＣＯＯＨ
［式中
Ｐｘは目的ポリペプチドＰｐのＮ末端部分であり、
Ｐｙは目的ポリペプチドＰｐのＣ末端部分であり、ならびに、
Ｘはグリコシル化部位を含むか、あるいはそれに関与するペプチド付加物である］。
【請求項３】
Ｐｐが成熟ポリペプチドである、請求項１または２に記載のポリペプチド。
【請求項４】
Ｐｘが成熟ポリペプチドＰｐの非構造性Ｎ末端部分であり、Ｐｙが該成熟ポリペプチドの構造性Ｃ末端部分である、請求項２または３に記載のポリペプチド。
【請求項５】
Ｐｐが天然ポリペプチドである、請求項１〜４のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項６】
Ｐｐが天然ポリペプチドの変異体である、請求項１〜５のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項７】
Ｐｐが、対応する天然ポリペプチドと比較して、非ペプチド部分に関する、少なくとも１の導入されたグリコシル化部位、および／または少なくとも１の除去されたグリコシル化部位を含む、請求項６に記載のポリペプチド。
【請求項８】
Ｐｐが哺乳類起源である、請求項１〜７のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項９】
Ｐｐがヒト起源である、請求項８に記載のポリペプチド。
【請求項１０】
Ｐｐが治療用ポリペプチドである、請求項１〜９のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項１１】
Ｐｐが、抗体または抗体断片、血漿タンパク質、赤血球または血小板タンパク質、サイトカイン、成長因子、線維素溶解促進タンパク質、プロテアーゼインヒビター、抗原、酵素、リガンド、レセプター、またはホルモンからなる群から選択される、請求項１〜１０のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項１２】
Ｐｐが微生物起源である、請求項１〜７、１０または１１のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項１３】
Ｐｐが微生物酵素である、請求項１２に記載のポリペプチド。
【請求項１４】
Ｐｐがプロテアーゼ、アミラーゼ、アミログルコシダーゼ、ペクチナーゼ、リパーゼおよびクチナーゼからなる群から選択される、請求項１３に記載のポリペプチド。
【請求項１５】
Ｘが１〜５００アミノ酸残基を含む、請求項１〜１４のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項１６】
Ｘが２〜５０アミノ酸残基、例えば３〜２０アミノ酸残基を含む、請求項１５に記載のポリペプチド。
【請求項１７】
Ｘが１〜２０、特に１〜１０グリコシル化部位を含む、請求項１〜１６のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項１８】
Ｘが一連の３０アミノ酸残基内に少なくとも１のグリコシル化部位、例えば２０アミノ酸残基内に少なくとも１のグリコシル化部位、特に１０アミノ酸残基内に少なくとも１のグリコシル化部位、特に１〜３グリコシル化部位を含む、前記いずれかの請求項に記載のポリペプチド。
【請求項１９】
Ｘが少なくとも２のグリコシル化部位を含み、ここに該部位のうちの２つが、グリコシル化部位を含まない最大１０アミノ酸残基によって分離されている、請求項１〜１８のいずれかに記載の記載のポリペプチド。
【請求項２０】
ポリペプチドＰｐが天然ポリペプチドの変異体であり、これは、該天然ポリペプチドと比較して、少なくとも１の導入されたグリコシル化部位または少なくとも１の除去されたグリコシル化部位を含む、請求項６〜１９のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項２１】
ポリペプチドＰｐが少なくとも１の導入されたグリコシル化部位、特に１〜５の導入されたグリコシル化部位を含む、請求項２０に記載のポリペプチド。
【請求項２２】
Ｘが第−２または−１位にＮ残基を有し、ならびにＰｐが、それぞれ、第＋１または＋２位にＴまたはＳ残基を有し、ここにこの残基の番号付けはＰｐのＮ末端アミノ酸残基と比較して施されたものである、請求項１〜２１のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項２３】
Ｘが構造式：Ｘ１−Ｎ−Ｘ２−［Ｔ／Ｓ］−Ｚ（式中、Ｘ１は少なくとも１のアミノ酸残基を含むペプチドであるか、あるいは不存在であり、Ｘ２は、プロリン残基以外の任意のアミノ酸残基であり、ならびにＺは不存在または少なくとも１のアミノ酸残基を含むペプチドであり、そのＮ末端アミノ酸残基はプロリン以外である）を有する、請求項１〜２２のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項２４】
Ｘ１が不存在であり、Ｘ２が、Ｉ、Ａ、Ｇ、ＶおよびＳからなる群から選択されるアミノ酸残基であり、ならびにＺが少なくとも１のアミノ酸残基を含み、そのＮ末端アミノ酸残基がプロリン以外である、請求項２３に記載のポリペプチド。
【請求項２５】
Ｚが１〜５０アミノ酸残基を含み、好ましくは１〜１０グリコシル化部位を含むペプチドである、請求項２４に記載のポリペプチド。
【請求項２６】
Ｘ１が少なくとも１のアミノ酸残基を含み、Ｘ２がＩ、Ａ、Ｇ、ＶおよびＳからなる群から選択され、Ｚが不存在である、請求項２５に記載のポリペプチド。
【請求項２７】
Ｘ１が１〜５０アミノ酸残基を含み、好ましくは１〜１０グリコシル化部位を含むペプチドである、請求項２６に記載のポリペプチド。
【請求項２８】
Ｘが以下からなる群から選択されるペプチド配列を含む、請求項１〜２７のいずれかに記載のポリペプチド：
ＩＮＡ［Ｔ／Ｓ］， ＧＮＩ［Ｔ／Ｓ］， ＶＮＩ［Ｔ／Ｓ］， ＳＮＩ［Ｔ／Ｓ］， ＡＳＮＩ［Ｔ／Ｓ］， ＮＩ［Ｔ／Ｓ］， ＳＰＩＮＡ［Ｔ／Ｓ］， ＡＳＰＩＮＡ［Ｔ／Ｓ］， ＡＮＩ［Ｔ／Ｓ］ＡＮＩ［Ｔ／Ｓ］ＡＮＩ， ＡＮＩ［Ｔ／Ｓ］ＧＳＮＩ［Ｔ／Ｓ］ＧＳＮＩ［Ｔ／Ｓ］， ＦＮＩ［Ｔ／Ｓ］ＶＮＩ［Ｔ／Ｓ］Ｖ
ＹＮＩ［Ｔ／Ｓ］ＶＮＩ［Ｔ／Ｓ］Ｖ， ＡＦＮＩ［Ｔ／Ｓ］ＶＮＩ［Ｔ／Ｓ］Ｖ， ＡＹＮＩ［Ｔ／Ｓ］ＶＮＩ［Ｔ／Ｓ］Ｖ， ＡＰＮＤ［Ｔ／Ｓ］ＶＮＩ［Ｔ／Ｓ］Ｖ， ＡＮＩ［Ｔ／Ｓ］， ＡＳＮＳ［Ｔ／Ｓ］ＮＮＧ［Ｔ／Ｓ］ＬＮＡ［Ｔ／Ｓ］， ＡＮＨ［Ｔ／Ｓ］ＮＥ［Ｔ／Ｓ］ＮＡ［Ｔ／Ｓ］， ＧＳＰＩＮＡ［Ｔ／Ｓ］， ＡＳＰＩＮＡ［Ｔ／Ｓ］ＳＰＩＮＡ［Ｔ／Ｓ］， ＡＮＮ［Ｔ／Ｓ］ＮＹ［Ｔ／Ｓ］ＮＷ［Ｔ／Ｓ］， ＡＴＮＩ［Ｔ／Ｓ］ＬＮＹ［Ｔ／Ｓ］ＡＮ［Ｔ／Ｓ］Ｔ， ＡＡＮＳ［Ｔ／Ｓ］ＧＮＩ［Ｔ／Ｓ］ＩＮＧ［Ｔ／Ｓ］， ＡＶＮＷ［Ｔ／Ｓ］ＳＮＤ［Ｔ／Ｓ］ＳＮＳ［Ｔ／Ｓ］， ＧＮＡ［Ｔ／Ｓ］， ＡＶＮＷ［Ｔ／Ｓ］ＳＮＤ［Ｔ／Ｓ］ＳＮＳ［Ｔ／Ｓ］， ＡＮＮ［Ｔ／Ｓ］ＮＹ［Ｔ／Ｓ］ＮＳ［Ｔ／Ｓ］， ＡＮＮＴＮＹＴＮＷＴ， ＡＮＩ［Ｔ／Ｓ］ＶＮＩ［Ｔ／Ｓ］Ｖ， ＮＤ［Ｔ／Ｓ］ＶＮＦ［Ｔ／Ｓ］ および ＮＩ［Ｔ／Ｓ］ＶＮＩ［Ｔ／Ｓ］Ｖ（ここに ［Ｔ／Ｓ］ は Ｔ または Ｓ 残基のいずれかであり， 好ましくは Ｔ 残基である）。
【請求項２９】
ペプチド付加物Ｘが配列：ＮＳＴＱＮＡＴＡ または ＡＮＬＴＶＲＮＬＴＲＮＶＴＶ を含む、請求項１〜２９のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項３０】
第二の非ペプチド部分に関する結合基をさらに含み、該結合基が第二の非ペプチド部分と連結されている、前記請求項のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項３１】
非ペプチド部分がポリマー分子、親油性基および有機誘導体化物質からなる群から選択される、請求項３０に記載のポリペプチド。
【請求項３２】
非ペプチド部分に関する結合基が、Ｎ末端アミノ酸残基、Ｃ末端アミノ酸残基、リシン、システイン、アルギニン、グルタミン、アスパラギン酸、グルタミン酸、セリン、チロシン、ヒスチジン、フェニルアラニンおよびトリプトファンからなる群から選択されるアミノ酸残基上に存在するものである、請求項３０または３１のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項３３】
ポリペプチドＰｐが天然ポリペプチドの変異体であり、該天然ポリペプチドと比較して、第二の非ペプチド部分に関する少なくとも１の導入された結合基および／または少なくとも１の除去された結合基を含む、請求項３０〜３２のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項３４】
ポリペプチドＰｐが少なくとも１の導入された結合基、特に１〜５の導入された結合基を含む、請求項３３に記載のポリペプチド。
【請求項３５】
少なくとも６７ｋＤａ、特に少なくとも７０ｋＤａの分子量を有する、前記請求項のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項３６】
同等の条件下で測定された、ポリペプチドＰｐと比較した以下の性質のうち少なくとも１個を有する、前記請求項のいずれかに記載のポリペプチド：
同等の条件下で測定された場合にポリペプチドＰｐの活性の少なくとも２５％であるインビトロ生物活性、マンノースレセプターまたは他の炭水化物レセプターに対する増大した親和性、増大した血清半減期、増大した機能的インビボ半減期、減少した腎クリアランス、減少した免疫原性、タンパク質分解に対する増大した耐性、リソソーム、マクロファージおよび／又は他のヒト細胞のサブ集団に対する改善された標的化、生産時の改善された安定性、改善された保存寿命、改善された製剤化、例えば液状製剤、改善された精製、改善された溶解性、および／または改善された発現。
【請求項３７】
請求項１〜３６のいずれかに記載のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列。
【請求項３８】
請求項３７に記載のヌクレオチド配列を含むベクター。
【請求項３９】
請求項３７に記載のヌクレオチド配列または請求項３８に記載のベクターで形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞。
【請求項４０】
グリコシル化を行う宿主細胞である、請求項３９に記載の宿主細胞。
【請求項４１】
哺乳類細胞、無脊椎動物細胞、例えば昆虫細胞、酵母細胞、または植物細胞、またはトランスジェニック動物である、請求項４０に記載の宿主細胞。
【請求項４２】
請求項１〜３６のいずれかに記載のポリペプチドを製造する方法であって、請求項３９〜４１のいずれかに記載の宿主細胞を、このポリペプチドの発現を許容する条件下で培養し、培養物からポリペプチドを回収することを含む方法。
【請求項４３】
第二の非ペプチド部分と結合した、請求項３０〜３６のいずれかに記載のポリペプチドを製造する方法であって、このポリペプチドを、コンジュゲートを生じさせるための条件下で非ペプチド部分とのコンジュゲートに付することを含む方法。
【請求項４４】
ポリペプチドが請求項４２または４３に記載の方法によって製造される、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
請求項３７に記載のヌクレオチド配列の製造方法であって、以下の工程を含む方法：
ａ）ポリペプチドＰｐをコードするヌクレオチド配列を伸張突然変異誘発に付し、
ｂ）工程ａ）で得られた突然変異したヌクレオチド配列を適当な宿主細胞内で発現させ、
場合により、
ｃ）工程ｂ）で発現されたポリペプチドを第二の非ペプチド部分とコンジュゲートし、
ｄ）少なくとも１つのオリゴサッカライド部分を含み、任意的にポリペプチドのペプチド付加部分に結合した第二の非ペプチド部分を含む、工程ｂ）またはｃ）で得られたポリペプチドを選択し、ならびに、
ｅ）工程ｄ）において選択されるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を単離する。
【請求項４６】
工程ｂ）またはｃ）から得られたポリペプチドを少なくとも１の改善された性質に関してスクリーニングすることをさらに含み、ここに選択工程ｄ）がそのような改善された性質を有するポリペプチドを選択することをさらに含む、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
伸張突然変異誘発がグリコシル化部位を含むアミノ酸残基をコードするコドンを豊富化するように行われる、請求項４５または４６に記載の方法。
【請求項４８】
伸張突然変異誘発が第二の非ペプチド部分に関する結合基の導入に必要とされるコドンを豊富化するように行われる、請求項４５または４６に記載の方法。
【請求項４９】
Ｐｐをコードするヌクレオチド配列の部分を突然変異誘発に付し、グリコシル化部位および、任意的に、第二の非ペプチド部分に関する結合基を含むアミノ酸残基を除去および／または導入することをさらに含む、請求項４４〜４８のいずれかに記載の方法。
【請求項５０】
工程ｄ）の選択が請求項３６に記載の性質の少なくとも１つを有するコンジュゲートを選択するように行われる、請求項４５〜４９のいずれかに記載の方法。
【請求項５１】
請求項４５〜５０にしたがって製造されるヌクレオチド配列にコードされるグリコシル化ポリペプチドを製造する方法であって、ここに工程ｃ）で選択されるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、グリコシル化を行う宿主細胞内で発現され、得られたグリコシル化発現ポリペプチドが回収される方法。
【請求項５２】
目的ポリペプチドＰｐの１またはそれ以上の選択された性質を改善する方法であって、以下の工程を含む方法：
ａ）以下の一次構造を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を調製し：
ＮＨ２−Ｘ−Ｐｐ−ＣＯＯＨ
［式中、
Ｘは、グリコシル化部位を含むか、あるいはそれに関与するペプチド付加物である（このペプチド付加物はポリペプチドＰｐに改善された選択性質を付与することができるものである）］、
ｂ）適当な宿主細胞中で、ａ）のヌクレオチド配列を発現させ、任意的に、
ｃ）発現されたｂ）のポリペプチドを第二の非ペプチド部分とコンジュゲートさせ、ならびに、
ｄ）工程ｃ）から得られたポリペプチドを回収する。
【請求項５３】
ポリペプチドＰｐおよび／またはペプチド付加物Ｘが請求項１〜４０のいずれかに記載のものである、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
工程ａ）のヌクレオチド配列が、ポリペプチドＰｐをコードするヌクレオチド配列をランダム伸張突然変異誘発に付することによって製造される、請求項５２または５３に記載の方法。
【請求項５５】
ランダム伸張突然変異誘発が、グリコシル化部位および／または第二の非ペプチド部分に関する結合基を含むか、あるいはそれに関与するアミノ酸残基をコードするコドンに関して豊富化するように行われる、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
ａ）のヌクレオチド配列の製造において、ポリペプチドＰｐをコードするヌクレオチド配列の部分を突然変異誘発に付し、グリコシル化部位を除去および／または導入するか、あるいは第二の非ペプチド部分に関する結合基を除去および／または導入する、請求項５２〜５５のいずれかに記載の方法。
【請求項５７】
改善される性質が請求項３７に記載の性質から選択される、請求項５２〜５６のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の属する分野
本発明は新規グリコシル化ポリペプチドならびにその製造手段および方法に関する。
【０００２】
発明の背景
産業上の使用およびヒトまたは獣医学治療を含む広範な適用に関してタンパク質を含むポリペプチドを用いる。
【０００３】
ポリペプチドに関して一般に認識されている欠点の１つは、これらが十分に高い安定性を有さず、免疫原性またはアレルギー原性であり、減少した血清半減期を有し、クリアランスを受けやすく、タンパク質分解を受けやすいことなどである。ポリペプチドの性質の改善方法の１つは、このポリペプチドに非ペプチド部分を結合させ、その性質を改善することであった。例えば、ポリマー分子、例えばＰＥＧを用いて、免疫原性を減少させ、ならびに／あるいは、治療的性質の血清半減期を増大させ、ならびに産業上の酵素のアレルギー原性を減少させる。グリコシル化は、ポリペプチドの性質、例えば安定性、半減期などを改善する別の好都合な経路として示された。
【０００４】
Ｍａｃｈａｍｅｒ ａｎｄ Ｒｏｓｅ， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， １９８８， ２６３， ５９４８−５９５４ ａｎｄ ５９５５−５９６０ は、水疱性口内炎ウイルスの修飾された糖タンパク質Ｇであって、ポリペプチドバックボーンに導入されたさらなるＮ−グリコシル化部位がグリコシル化されているものを開示している。
【０００５】
ＵＳ５，２１８，０９２は、それに結合した、少なくとも１の新規または追加の炭水化物基を有する、生理学的に活性なポリペプチドを開示している。追加の炭水化物分子（群）は、１またはそれ以上の追加Ｎ−グリコシル化部位をポリペプチドバックボーンに追加し、グリコシル化を行う宿主細胞においてこのポリペプチドを発現することによって提供される。
【０００６】
ＵＳ５，０４１，３７６は、輸送可能タンパク質のエピトープを同定するか、あるいは保護する方法であって、Ｎ−グリコシル化部位が（このタンパク質をコードするヌクレオチド配列のオリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発を用いて）タンパク質バックボーンの曝露表面上に導入され、得られたタンパク質が発現され、グリコシル化され、タンパク質活性および保護されたエピトープに関してアッセイされている方法を開示している。
【０００７】
ＷＯ００／２６３５４は、タンパク質バックボーンに追加のグリコシル化部位を含ませ、得られたタンパク質変異体をグリコシル化することによって、タンパク質のアレルギー原性を減少させる方法を開示している。
【０００８】
Ｇｕａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ， １９８５， Ｖｏｌ． ４２， ４８９−４９６ は、水疱性口内炎ウイルス糖タンパク質の貫膜および細胞質性ドメインを用いてＣ末端拡張されたラット成長因子バックボーン（ここに成長ホルモンバックボーンは２つの追加Ｎ−グリコシル化部位を包含するように修飾されている）を含むグリコシル化された融合タンパク質変異体を開示している。
【０００９】
ＷＯ９７／０４０７９は、特に酵素に対する洗浄性能において、改善された性能を付与することができる、Ｎ末端またはＣ末端ペプチド拡張によって修飾された脂溶性酵素を開示している。
【００１０】
Ｍａｔｓｕｕｒａ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， １９９９， Ｖｏｌ． １７， ５８−６１ は、非グリコシル化微生物カタラーゼの熱安定性を改善するための、ランダムの伸張された突然変異誘発の使用を開示している。ランダムな伸張された突然変異誘発はカタラーゼのＣ末端において行われている。
【００１１】
ＣＴＰ拡張型のＦＳＨと題されるＵＳ５，３３８，８３５は、ＣＧ、ＦＳＨおよびＬＨのＣ末端を拡張するための、ＣＧベータサブユニットまたはその変異体のＣ末端部分の使用を記載している。該Ｃ末端部分はＯ−グリコシル化部位を含み得る。同様のアプローチが他のタンパク質でも使用できることが推測されている。
【００１２】
ＵＳ５，５０８，２６１は、脊椎動物黄体形成ホルモン（ＬＨ）レセプターおよび脊椎動物濾胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）レセプターとの結合親和性を有するアルファ、ベータ−ヘテロ二量体ポリペプチドであって、糖タンパク質ホルモンアルファサブユニットポリペプチドおよび特定される天然に存在しないベータサブユニットポリペプチドを含むものを開示している。
【００１３】
ＷＯ９７／３０１６１は、２の同時発現されたアミノ酸配列を含み、二量体を形成するハイブリッドタンパク質であって、それぞれ、ａ）ホモマーレセプター、ヘテロマーレセプターの鎖、リガンド、およびその断片から選択される少なくとも１のアミノ酸配列；およびｂ）ヘテロ二量体プロテイネース性ホルモン（ｐｒｏｔｅｉｎａｃｅｏｕｓ ｈｏｒｍｏｎｅ）またはその断片のサブユニット；（ここにａ）およびｂ）は直接結合されているか、あるいはペプチドリンカーを介して連結され、ならびに、各カップリング物において、２サブユニット（ｂ）は異なっており、凝集して二量複合体を形成する能力を有する）を含むものを開示している。
【００１４】
上記参考文献のいずれにも、目的のポリペプチドは、１またはそれ以上の追加のグリコシル化部位を含むペプチド配列でＮ末端拡張することにより、追加のグリコシル化部位を含むように修飾できることは開示されていない。本発明はこの発見に基づくものである。
【００１５】
発明の簡単な説明
したがって、第一の側面では、本発明は以下の一次構造を含むグリコシル化ポリペプチドに関する：
ＮＨ２−Ｘ−Ｐｐ−ＣＯＯＨ
［式中、
Ｘは、グリコシル化部位を含むか、あるいはそれに関与するペプチド付加物であり、ならびに、
Ｐｐは目的のポリペプチドである］。
【００１６】
ペプチド付加による追加のグリコシル化部位の導入は、目的のポリペプチドに追加のグリコシル化部位を提供する精密で簡潔な方法である。より具体的には、本発明は、変更されたグリコシル化パターンを有するポリペプチドがより簡単に得られる利点を有し、例えば、変異体は詳細な知識なしで、あるいはポリペプチドの構造的および／または機能的性質の使用なしに設計可能である。また、ペプチド付加により導入されたグリコシル化部位の利用は、ポリペプチドＰｐの構造部分内に導入されたグリコシル化部位と比較して改善されていることがわかった。また、このペプチド拡張ポリペプチドの他の性質、例えば特定細胞内の取り込みは、構造部分内のグリコシル化部位によって修飾されたポリペプチド（およびペプチド拡張に付されていないもの）と比較して改善することができる。
【００１７】
第二の側面では、本発明は、以下の一次構造を有するグリコシル化ポリペプチドに関する：
ＮＨ２−Ｐｘ−Ｘ−Ｐｙ−ＣＯＯＨ
［式中
Ｐｘは目的ポリペプチドＰｐのＮ末端部分であり、
Ｐｙは目的ポリペプチドＰｐのＣ末端部分であり、ならびに、
Ｘはグリコシル化部位を含むか、あるいはそれに関与するペプチド付加物である］。
【００１８】
別の側面では、本発明は、本発明のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、該ヌクレオチド配列を含む発現ベクターおよび本発明のポリペプチドを調製する方法に関する。
【００１９】
さらなる側面では、本発明は、目的ポリペプチドＰｐの選択された性質を改善する方法であって、以下の工程を含む方法に関する：
ａ）以下の一次構造を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を調製し：
ＮＨ２−Ｘ−Ｐｐ−ＣＯＯＨ
［式中、
Ｘは、グリコシル化部位を含むか、あるいはそれに関与するペプチド付加物であある（このペプチド付加物はポリペプチドＰｐに改善された選択性質を付与することができるものである）］、
ｂ）オリゴサッカライド部分の結合を確実にする条件下、適当な宿主細胞中で、ａ）のヌクレオチド配列を発現させ、任意的に、
ｃ）発現されたｂ）のポリペプチドを第二の非ペプチド部分とコンジュゲートさせ、ならびに、
ｄ）工程ｃ）から得られたポリペプチドを回収する。
【００２０】
発明の詳しい説明
定義
本明細書および請求の範囲では、次の定義が採用される：
「結合体（コンジュゲート）」なる用語は、１つまたはそれ以上のポリペプチド（群）の、１つまたはそれ以上の非ペプチド部分への共有結合について用いられる。共有結合なる用語は、ポリペプチドおよび非ペプチド部分が、共有結合により互いに直接結合していること、または架橋、スペーサーもしくは連結部分（群）などの介在部分（群）を介して共通結合により互いに間接的に結合していることのいずれかを意味する。
【００２１】
「非ペプチド部分」なる用語は、アミノ酸モノマーからなり、ペプチド結合によって互いに連結されているペプチドポリマーとは異なる分子であって、本発明のポリペプチドの結合基と結合可能である分子を示すことを意図するものである。このような分子の好ましい例には、ポリマー、例えばポリアルキレンオキシド部分親油性基、例えば脂肪酸およびセラミドが含まれる。用語「重合体（ポリマー）分子」とは、２つまたはそれ以上の単量体（モノマー）の共有連結によって形成される分子であり、「重合体（ポリマー）基」なる用語と交換可能に使用することができる。ポリペプチドに結合した非ペプチド部分、例えばポリマー基の数が明示されている場合を除き、本明細書中の「非ペプチド部分」への言及はそれぞれ、ポリペプチドに結合した１またはそれ以上の非ペプチド部分への言及を意図するものである。
【００２２】
「オリゴサッカライド部分」なる用語は、１またはそれ以上のモノサッカライド残基を含み、インビボまたはインビトログリコシル化によりポリペプチドに結合可能（でグリコシル化ポリペプチドを生産可能）な炭水化物含有分子を示すことを意図するものである。ポリペプチドに結合しているオリゴサッカライド部分の数が明示されている場合を除き、本明細書中の「オリゴサッカライド部分」への言及はそれぞれ、ポリペプチドに結合した１またはそれ以上のこのような部分への言及を意図するものである。
【００２３】
「インビボグリコシル化」なる用語は、インビボ、すなわちポリペプチドの発現に用いられるグリコシル化細胞内での翻訳後プロセッシング時に、例えばＮ−連結およびＯ−連結グリコシル化によって生じるオリゴサッカライド部分の任意の結合を意味することを意図するものである。通常、Ｎ−グリコシル化オリゴサッカライド部分は、５モノサッカライド残基、すなわち２Ｎ−アセチルグルコサミン残基および３マンノース残基からなる共通の塩基性コア構造を有する。正確なオリゴサッカライド構造は用いられるグリコシル化生物および具体的ポリペプチドに大きく依存する。用いられる宿主細胞に依存して、グリコシル化は、高マンノース型、複合型またはハイブリッド型に分類される。用語「インビトログリコシル化」は、インビトロで行われる合成グリコシル化を表すことを意図するものであり、これには、通常、任意的に架橋剤を用いて、オリゴサッカライド部分をポリペプチドの結合基に共有連結することが含まれる。インビボおよびインビトログリコシル化はさらに以下に詳細に議論される。
【００２４】
「Ｎ−グリコシル化部位」は、配列：Ｎ−Ｘ’−Ｓ／Ｔ／Ｃ−Ｘ’’、ここにＸ’はプロリンを除く任意のアミノ酸残基であり、Ｘ’’はＸ’と同一であってもなくてもよい、好ましくはプロリンとは異なる任意のアミノ酸残基であり、Ｎはアスパラギンであり、Ｓ／Ｔ／Ｃはセリン、スレオニンまたはシステインであり、好ましくはセリンまたはスレオニンであり、最も好ましくはスレオニンである）を有する。オリゴサッカライド部分はこの部位のＮ−残基に結合する。「Ｏ−グリコシル化部位」は、セリンまたはスレオニン残基のＯＨ基である。「インビトログリコシル化部位」は、例えば、ポリペプチドのＮ−末端アミノ酸残基、ポリペプチドのＣ−末端残基、リシン、システイン、アルギニン、グルタミン、アスパラギン酸、グルタミン酸、セリン、チロシン、ヒスチジン、フェニルアラニンおよびトリプトファンからなる群から選択される。特に興味深いインビトログリコシル化部位は、イプシロンアミノ基、特にリシン残基の部分である。
【００２５】
「ペプチド付加」なる用語は、目的のポリペプチドＰｐのアミノ酸配列に付加される１またはそれ以上の連続するアミノ酸残基を示すことを意図するものである。通常、ペプチド付加は、ポリペプチドＰｐのアミノ酸配列に、ペプチド結合を介して連結される。
【００２６】
「結合基」なる用語は、目的の非ペプチド部分と結合可能な、ポリペプチドの官能（機能性）基、特にそのアミノ酸残基またはポリペプチドに結合したオリゴサッカライド部分を示すことを意図するものである。有用な結合基およびその適合非ペプチド部分は以下の表から明らかである。
【００２７】
【表１】
2004504016.tif 000003
【表２】
2004504016.tif 000004
【００２８】
「結合基を含む」なる用語は、結合基が、関連するペプチドまたはポリペプチドのアミノ酸残基上または、該ペプチドまたはポリペプチドに結合したオリゴヌクレオチド部分上に存在することを意味することを意図するものである。
【００２９】
ペプチド付加基Ｘに関して、「グリコシル化部位に関与する」なる用語は、（Ｎ−グリコシル化部位の場合にあることであるが、）グリコシル化部位が１以上のアミノ酸残基から形成され、ならびに少なくとも１つのそのようなアミノ酸残基がペプチドＸ起源であり、少なくとも１つのアミノ酸残基がポリペプチドＰｐ起源であり、これにより、グリコシル化部位がＸおよびＰｐ（、または関連物では、ＰｘまたはＰｙ）を架橋すると考え得る状態を含むことを意図するものである。
【００３０】
目的のポリペプチドＰｐの部分について使用される「非構造部分」なる用語は、第一の構造要素、例えばα−ヘリックスまたはβ−シート構造に含まれない部分であるフォールディングされたポリペプチド（例えばタンパク質）のＣ−またはＮ−末端のいずれかの部分を示すことを意図するものである。ポリペプチドの三次元構造またはモデルにおいて非構造部分は容易に同定できる。構造またはモデルが入手できない場合、非構造部分は、典型的に、最初または最後の１−２０（１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０）アミノ酸残基、例えば目的のポリペプチドの成熟型を構成するアミノ酸配列の１−１０アミノ酸残基を含むか、あるいはからなる。
【００３１】
アミノ酸名および元素名（例えば、ＣＡ、ＣＢ、ＮＺ、Ｎ、Ｏ、Ｃなど）はＰｒｏｔｅｉｎ ＤａｔａＢａｎｋ （ＰＤＢ） （ｗｗｗ．ｐｄｂ．ｏｒｇ） にしたがって使用しており、これは、ＩＵＰＡＣ 命名法 （ＩＵＰＡＣ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ ａｎｄ Ｓｙｍｂｏｌｉｓｍ ｆｏｒ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ ａｎｄ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ （残基名、元素名など）， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１３８、９−３７ （１９８４） を基準にしてＥｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， １５２、１ （１９８５）にて修正されている。「アミノ酸残基」なる用語は、以下からなる群に含有されるアミノ酸残基を示すことを意図している：アラニン （ＡｌａまたはＡ）、システイン （ＣｙｓまたはＣ）、アスパラギン酸 （ＡｓｐまたはＤ）、グルタミン酸 （ＧｌｕまたはＥ）、フェニルアラニン （ＰｈｅまたはＦ）、グリシン （ＧｌｙまたはＧ）、ヒスチジン （ＨｉｓまたはＨ）、イソロイシン （ＩｌｅまたはＩ）、リシン （ＬｙｓまたはＫ）、ロイシン （ＬｅｕまたはＬ）、メチオニン （ＭｅｔまたはＭ）、アスパラギン （ＡｓｎまたはＮ）、プロリン （ＰｒｏまたはＰ）、グルタミン （ＧｌｎまたはＱ）、アルギニン （ＡｒｇまたはＲ）、セリン （ＳｅｒまたはＳ）、スレオニン （ＴｈｒまたはＴ）、バリン （ＶａｌまたはＶ）、トリプトファン （ＴｒｐまたはＷ）、およびチロシン （ＴｙｒまたはＹ） 残基である。アミノ酸部位／置換を同定するために使用する用語は次のようである：
Ａ１５はポリペプチドにおいてアラニンが１５位を占めていることを示している。Ａ１５Ｔは、１５位のアラニン残基がスレオニン残基と置換されていることを示している。Ａ１５［Ｔ／Ｓ］は１５位のアラニン残基がスレオニン残基またはセリン残基と置換されていることを示している。多数の置換は「＋」によって示され、例えばＡ１５Ｔ＋Ｆ５７Ｓは、１５位のアラニン残基がスレオニン残基残基と置換され、かつ５７位のフェニルアラニン残基がセリン残基と置換されているアミノ酸配列を意味している。
【００３２】
「ヌクレオチド配列」なる用語は、２つまたはそれ以上のヌクレオチドの連続した繋がりを示している。ヌクレオチド配列はゲノム、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、半合成または合成起源、またはこれらの任意の組合わせであることができる。
【００３３】
「細胞」、「宿主細胞」、「細胞系統（セルライン）」および「細胞培養（物）」は本明細書では交換可能に用いられ、これらはすべて、細胞の発育または培養から生じる子孫を包含するものと理解すべきである。「形質転換」および「トランスフェクション」は交換可能に用いられ、ＤＮＡを細胞に導入するプロセスを意味する。
【００３４】
「作動可能に連結」とは、２つまたはそれ以上のヌクレオチド配列が、その通常の機能を実行可能であるように共有連結されていることを意味する。例えば、プレ配列または分泌リーダーをコードするヌクレオチド配列がポリペプチドのヌクレオチド配列と作動可能に連結しているとは、それがポリペプチドの分泌に関与するプレタンパク質として発現された場合である；　プロモーターまたはエンハンサーが作動可能にコード配列と連結されているとは、それが配列の転写に影響する場合である。
【００３５】
非ペプチド部分に関する、グリコシル化部位または結合基の「導入」または「除去」は、通常、簡便には、コードするヌクレオチド配列の適当な修飾により、そのような部位または基に含まれるか、あるいは関与するアミノ酸を関連するアミノ酸配列に導入、あるいは、から除去することによって達成される。例えば、Ｎ−グリコシル化部位が導入あるいは除去される場合、これは機能性Ｎ−グリコシル化部位に関して必要とされるアミノ酸残基（群）に対するコドンを導入／除去することによって行うことができる。ＰＥＧ分子用の結合基が導入／除去される場合、これは、そのような基を含むアミノ酸残基、例えばリシン残基に対するコドンを、コードするヌクレオチド配列に導入／から除去することによって行われることが理解されよう。「導入」なる用語は、存在するアミノ酸残基の置換によるものを主に意図するが、また付加的なアミノ酸残基の挿入によるものを意味し得る。「除去」なる用語は、別のアミノ酸残基によって除去されるアミノ酸残基の置換によるものを主に意図するが、また除去するアミノ酸残基の欠失（置換を除く）によるものを意味し得る。
【００３６】
「エピトープ」なる用語は、ポリペプチド表面において特定の３Ｄおよび／または電荷性質を示す１またはそれ以上のアミノ酸残基（群）であって、哺乳類において免疫応答を生じさせることができ、ならびに／あるいは、該エピトープに対して作成された抗体と特異的に結合することができ、あるいはアレルギー応答を生じさせることができるものを示す、その慣用の意味において使用される。
【００３７】
「保護されていないエピトープ」なる用語は、エピトープが保護されておらず、したがって上記性質を有していることを示すことを意図するものである。「保護されたエピトープ」なる用語は、非ペプチド部分が保護され、したがってエピトープが不活化されており、これが、例えば抗原提示細胞における不適当なプロセッシングおよび／または提示のせいで、哺乳類において、もはやいかなる実質的な免疫応答をも生じさせない、ならびに／あるいは、保護されていないエピトープに対して作成された抗体ともはや反応しないことを示すことを意図するものである。したがって、未処置の哺乳類および、保護されていないエピトープと反応する抗体をすでに産生している哺乳類の両者において、保護は有効であるはずである。
【００３８】
エピトープの保護の程度は、当分野に既知の方法を用いて、減少した免疫原性および／または減少した抗体反応性および／またはこのエピトープ（群）に対して作成されたモノクローナル抗体との減少した反応性として測定できる。アレルギー性エピトープの保護の程度は、例えばＷＯ ００／２６３５４に記載されるように測定できる。
【００３９】
免疫原性またはアレルギー応答について使用される、「減少した」なる用語は、匹敵する条件下で測定した場合、規定の分子が、参照分子より低い免疫またはアレルギー応答を測定可能に生じさせることを示すことを意図するものである。好ましくは、関連する応答は少なくとも２５％、例えば、少なくとも５０％、好ましくは少なくとも７５％、少なくとも９０％または少なくとも１００％でさえも減少する。
【００４０】
「血清半減期」なる用語は通常の意味で用いており、即ち関連分子の５０％が消失前に血漿または血流中に循環する時間である。血清半減期の別の用語には、「血漿半減期」、「循環半減期」、「血清クリアランス」、「血漿クリアランス」および「クリアランス半減期」などがある。「機能的インビボ半減期」なる用語は、インビボ試験時に、関連分子の規定の機能（例えば生物学的活性）の５０％が保持されている時間（例えばこの分子の生物学的活性の５０％が体内／標的器官において依然存在している時間、またはポリペプチドの活性が初期値の５０％になる時間）である。この分子は、通常、細網内皮系（ＲＥＳ）、腎（例えば糸球体ろ過による）、脾または肝臓の１つまたはそれ以上の作用により、受容体介在性排除により、あるいは特異的または非特異的タンパク質分解により消失する。通常、クリアランスは、サイズまたは水力学的容量（糸球体ろ過の遮断性と比較したサイズ）、形／堅さ、帯電性、結合する炭水化物鎖、およびこの分子に対する細胞受容体の存在に応じて変動する。機能的インビボ半減期または血清半減期について使用している「増大」なる用語は、関連分子の関連する半減期が、参照分子に対して、同等の条件下で測定して統計的に有意に増大していることを示している。例えば、相当する半減期は、少なくとも約２５％、例えば少なくとも約５０％、例えば少なくとも約１００％、または１０００％増大することがある。
【００４１】
「機能」なる用語は、目的のポリペプチドの１またはそれ以上の機能を示すことを意図するものであり、これは、定性的（すなわち目的のポリペプチドと同様の機能を有するもの）であり、必ずしも定量的ではない（すなわち機能の大きさは必ずしも同様ではない）ように理解されるべきである。典型的には、規定のポリペプチドは、多くの種々の機能を有し、この例は以下、「機能に関するスクリーニングまたは測定」という見出しの段落にさらに挙げられている。治療的に有用なポリペプチドに関して、重要な「機能」は生物学的活性、例えばインビトロまたはインビボ生物活性である。酵素に関して、重要な機能は生物学的活性、例えば触媒活性である。
【００４２】
「測定可能な機能」および「機能性」なる用語は交換可能に用いられ、本発明のポリペプチドの関連する機能（好ましくは意図された使用を反映するもの）が、当分野に既知の標準的方法で、例えばインビトロ生物活性および／またはインビボ生物活性として測定される場合に、検出リミットより上であることを示すことを意図するものである。例えば、このポリペプチドがホルモンであり、目的の機能は、特定のレセプターに対するホルモンの親和性である場合、測定可能な機能は、このような親和性の測定に用いられる通常の方法によって測定される、本発明にしたがって修飾されたホルモンおよびこのレセプター間の検出可能な親和性であると規定される。ポリペプチドが酵素であり、目的の機能が触媒活性である場合、測定可能な機能は、問題の酵素活性を測定する通常の方法によって測定されるこの酵素に対する通常の基質が関与する反応を触媒する酵素の能力である。典型的には、本明細書中で特に記載しない限り、測定可能な機能は、同等な条件下で測定された場合に、未修飾ポリペプチドＰｐの機能の少なくとも２％、例えば少なくとも５％であり、これは例えば、未修飾ポリペプチドの機能の２−１０００％、例えば２−５００％または２−１００％、例えば５−１００％の範囲である。
【００４３】
「機能性部位」なる用語は、このポリペプチドの基能または性能に不可欠であるか、あるいは関与する１またはそれ以上のアミノ酸、すなわちポリペプチドＰｐの所望の生物学的活性を媒介するアミノ酸残基（群）を示すことを意図するものである。このようなアミノ酸残基は、機能性部位に「位置する」。例えば、機能性部位とは、結合部位（例えばホルモンまたは成長因子のレセプター結合部位またはレセプターのリガンド結合部位）、触媒部位（例えば酵素の触媒部位）、抗原結合部位（例えば抗体）、調節部位（例えば調節を受けるポリペプチドの調節部位）、または相互作用部位（例えば、調節タンパク質または阻害剤に関するもの）であり得る。機能性部位は当分野に既知の方法によって測定でき、関連するリガンドと複合体化したポリペプチドの三次元構造またはモデル構造の分析によって都合良く同定される。
【００４４】
「ポリペプチド」なる用語は、翻訳後修飾（例えばアセチル化、カルボキシル化、リン酸化、脂質化（ｌｉｐｉＤａｔｅ）、またはアシル化）されていてもいなくてもよい、５以上のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列の任意の構造形態（例えば、一次、二次または三次形態（すなわちタンパク質形態））を示すことを意図するものである。天然に見られる配列と同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドについての、「天然」および「野生型」なる用語は交換可能に用いられる。天然ポリペプチドは、典型的に、天然に存在するソース、特に、哺乳類または微生物起源、例えばヒト起源から単離されるか、あるいは天然に存在するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を使用することによって組換え的に生産される。用語「天然」とは、当ポリペプチドの対立変異体を含むことを意図するものである。「変異体」は、１またはそれ以上のアミノ酸残基において天然のポリペプチドと異なっているアミノ酸配列を有するポリペプチドである。変異体は、典型的に、天然ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を修飾することによって調製され（例えば、ポリペプチドの１またはそれ以上のアミノ酸残基の置換、欠失またはトランケーションを生じるか、または１またはそれ以上のアミノ酸残基をポリペプチド内へ導入（付加または挿入）することによる）、該天然ポリペプチドを構成するアミノ酸配列が修飾される。「断片」なる用語は、親天然または変異体ポリペプチドの部分であり、典型的には、１またはそれ以上のＣ末端またはＮ末端アミノ酸残基が除去されているか、このような残基の両者が除去されている点で、親ポリペプチドと異なっている。通常には、変異体または断片は、対応する親ポリペプチドの少なくとも１の機能（例えば生物学的機能、例えば酵素活性またはレセプター結合能）を保持している。通常、ポリペプチドＰｐは完全長タンパク質またはその変異体もしくは断片である。
【００４５】
「抗体」なる用語には、単一のモノクローナル抗体（アゴニストおよびアンタゴニスト抗体を含む）およびポリエピトープ特異性を有する抗体組成物（ポリクローナル抗体とも称される）が含まれる。
「モノクローナル抗体」なる用語は、慣用的な意味で用いられ、実質的に均質の抗体集団を示す。この集団に含まれる個々の抗体は、同一の結合部位を有し、限られた程度にしか構造的に異なっていないものである。モノクローナル抗体は、高度に特異的であり、単一のエピトープに対するものである。さらに、典型的に種々のエピトープに対する種々の抗体を含む慣用の（ポリクローナル）抗体調製物とは対照的に、各モノクローナル抗体は、抗原の単一のエピトープに対するものである。この抗体は好ましくはヒトまたはヒト化モノクローナル抗体である。
【００４６】
「抗体断片」とは、無傷の抗体の部分であって、抗原結合部位または、無傷の抗体の可変領域の全体または部分を含む（ここにこの部分は、無傷の抗体のＦｃ領域の定常重鎖ドメイン（すなわちＣＨ２、ＣＨ３、およびＣＨ４、抗体イソ型に依存）を含まない）ものであると定義される。抗体断片の例には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦｖ断片；ディアボディー（ｄｉａｂｏｄｉｅｓ）；連続アミノ酸残基の中断されない配列からなる一次構造を有するポリペプチドである任意の抗体断片（これはまた、単一鎖抗体断片または単一鎖ポリペプチドと称することもできる）が含まれる。
【００４７】
本発明のポリペプチド
第一の側面では、本発明は以下の一次構造を含むグリコシル化ポリペプチドに関する：
ＮＨ２−Ｘ−Ｐｐ−ＣＯＯＨ
［式中、
Ｘは、グリコシル化部位を含むか、あるはそれに関与するペプチド付加物であり、ならびに、
Ｐｐは目的のポリペプチドである］。
【００４８】
一態様では、ポリペプチドは一次構造：ＮＨ２−Ｘ−Ｐｐ−ＣＯＯＨを有するポリペプチドを本質的に含むか、あるいはこれから構成される。
【００４９】
この側面のペプチド付加物は、好ましくは、天然の完全長タンパク質と９０％以下の同一性を有するものである。同一性はペプチド付加物を、完全長天然タンパク質の完全アミノ酸配列とアライメントすることに基づいて測定され、このアライメントはアミノ酸残基間の同一性の最も高い可能な程度を保証するように行われる。例えば、プログラムＣＬＵＳＴＡＬＷバージョン１．７４（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， １９９４， ＣＬＵＳＴＡＬ Ｗ： ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ ｔｈｅ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｔｈｒｏｕｇｈ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｗｅｉｇｈｔｉｎｇ， ｐｏｓｉｔｉｏｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｇａｐ ｐｅｎａｌｔｉｅｓ ａｎｄ ｗｅｉｇｈｔ ｍａｔｒｉｘ ｃｈｏｉｃｅ， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， ２２：４６７３−４６８０）を用いることができる。
【００５０】
通常、ペプチド付加物は、上記構造式に反映されているように、ポリペプチドＰｐのＮ末端と融合され、ポリペプチドＰｐのＮ末端伸張を提供する。しかし、ペプチド付加物をポリペプチドＰｐのアミノ酸配列内に挿入することもまた可能である。これは、本発明の第二の側面に記載のポリペプチド中に反映されており、ここでは、ポリペプチドは以下の一次構造を有する：
ＮＨ２−Ｐｘ−Ｘ−Ｐｙ−ＣＯＯＨ
［式中、
Ｐｘは目的ポリペプチドＰｐのＮ末端部分であり、
Ｐｙは目的ポリペプチドＰｐのＣ末端部分であり、ならびに、
Ｘはグリコシル化部位を含むか、あるいはそれに関与するペプチド付加物である］。
【００５１】
一態様では、ポリペプチドは一次構造：ＮＨ２−Ｐｘ−Ｘ−Ｐｙ−ＣＯＯＨを有するポリペプチドを本質的に含むか、あるいはこれから構成される。
【００５２】
ポリペプチドＰｐの配列内へのペプチド付加物の挿入によって影響される構造の変化を最少にするために、これは非構造部分に挿入されることが望ましい。例えば、Ｐｘは成熟ポリペプチドＰｐの非構造性Ｎ末端部分であり、Ｐｙは該成熟ポリペプチドの構造性Ｃ末端部分であるか、あるいはＰｘは成熟ポリペプチドＰｐの構造性Ｎ末端部分であり、Ｐｙは該成熟ポリペプチドの非構造性Ｃ末端部分である。概して、最良のＮ−グリコシル化はポリペプチドのＮ末端部分中で獲得されるため、導入されるグリコシル化部位がＮ−グリコシル化部位である場合、好ましくはＰｘは非構造性Ｎ末端部分である。
【００５３】
ペプチド付加物がいくつかのアミノ酸残基、例えば１−５、例えば１−３アミノ酸残基、特に１アミノ酸残基しか含まない場合、このペプチド付加物はポリペプチドＰｐのループ構造中に挿入可能であり、これにより該ループが伸張される。ペプチド付加物が１アミノ酸残基から構成される場合、これは機能的グリコシル化部位の導入が保証されるように選択されることが理解されよう。
【００５４】
本発明のポリペプチドは、グリコシル化されたポリペプチドである。通常、本発明のポリペプチドのポリペプチド付加部分は少なくとも１のオリゴサッカライド部分を結合している。ポリペプチドのポリペプチドＰｐ部分は少なくとも１のオリゴサッカライド部分を結合していてもいなくてもよい。グリコシル化は「グリコシル化」と題される段落に記載されている。
【００５５】
好ましくは、本発明のポリペプチドは、本明細書中に開示されている任意のクリアランス機構、特に腎クリアランスによるクリアランスを減少させるか、あるいは回避するのに十分な、サイズ、電荷、分子量および／または水力学的容量のような性質を有する。このような性質は、例えばオリゴサッカライドおよびそれに結合した第二の非ペプチド部分の性質および数により決定可能である。一態様では、本発明のポリペプチドは、Ｌａｅｍｍｌｉ， Ｕ．Ｋ．， Ｎａｔｕｒｅ Ｖｏｌ ２２７ （１９７０）， ｐ６８０−８５ に記載されるようにＳＤＳ−ＰＡＧＥによって測定された場合、少なくとも６７ｋＤａ、特に少なくとも７０ｋＤａの分子量を有する。これは、目的のポリペプチドが、機能的インビボ半減期が延長されるべき治療的に有用なタンパク質である場合に、特に重要である。少なくとも６７ｋＤａの分子量は、十分な数のグリコシル化部位を挿入し、このようなＭｗを有するグリコシル化ポリペプチドを得ること、あるいはグリコシル化ペプチドを十分な数およびタイプの第二の非ペプチド部分とコンジュゲートし、このようなＭｗを得ることによって獲得可能である。例えば、２ｋＤａのペプチド付加物に連結された少なくとも２５ｋＤａの分子量を有するグリコシル化された目的ポリペプチド、少なくとも２ＰＥＧ結合基を有する組み合わせの拡張ポリペプチドに関して、それぞれ２０ｋＤａの分子量を有する２またはそれ以上のＰＥＧ分子へのコンジュゲートにより、少なくとも６７ｋＤａのトータルの分子量が得られる。
【００５６】
好ましくは、本発明のポリペプチドは、ポリペプチドＰｐと比較して、少なくとも１の以下の性質を有する（この性質は同等の条件下で測定される）：
同等の条件下で測定された場合の、ポリペプチドＰｐの生物活性の少なくとも２５％、例えば少なくとも３０％、または少なくとも４５％のインビトロ生物活性、マンノースレセプター、マンノース−６−ホスフェートレセプターまたは他の炭水化物レセプターに対する増大した親和性、増大した血清半減期、増大した機能的インビボ半減期、減少した腎クリアランス、減少した免疫原性、タンパク質分解に対する増大した耐性、改善されたリソソームマクロファージおよび／またはヒト細胞の他のサブ集団への標的化、改善された調製時の安定性、改善された保存寿命、改善された製剤化、例えば液状製剤化、改善された精製、改善された可溶性、および／または改善された発現。
改善された性質は、このような性質を測定するための当分野に既知の慣用の方法によって測定される。この改善は検出リミット内である大きさのものである。
【００５７】
改善された、マンノースレセプターに対する親和性またはマンノースレセプターによる取り込みは、食細胞（例えばマクロファージ）内のポリペプチドの改善された取り込みについて、食細胞、好ましくは単球、マクロファージ（例えば、Ｋｕｐｆｆｅｒ 細胞、グリア／ミクログリア、肺胞性食細胞、細網細胞、または他の末梢性マクロファージ）またはマクロファージ様細胞（例えば、破骨細胞、樹状細胞、または星状細胞）内の改善された取り込みを生じることが予測される。これは、目的ポリペプチドが、その生物学的活性を発揮するのにこのような取り込みを必要とするものである場合に、特に重要である。このようなポリペプチドは、例えばワクチン目的での使用を意図される抗原またはリソソーム酵素である。
【００５８】
目的ポリペプチド
本発明は広く適用可能である。したがって、目的ポリペプチドは任意の機能を有し、任意の起源であり得る。したがって、ポリペプチドはタンパク質、特に成熟タンパク質またはその前駆体型または、成熟タンパク質の生物学的活性を本質的に保持しているその機能的断片であってよい。さらに、ポリペプチドは、３０〜４５００の範囲のアミノ酸、好ましくは４０〜３０００の範囲のアミノ酸を含有するオリゴペプチドであってよい。
【００５９】
ポリペプチドは天然ポリペプチドまたはその変異体であってよい。例えば、ポリペプチドは、対応する天然ポリペプチドと比較して、少なくとも１の導入されたグリコシル化部位および／または少なくとも１の除去されたグリコシル化部位を含む変異体である。この変異体は、少なくとも１の対応する天然ポリペプチドの機能、特にその生物学的活性を保持している。
【００６０】
ポリペプチドは、ヒト治療または獣医学的治療において有用な治療的ポリペプチド、すなわち循環系へ導入されるか、あるいは別法によりヒトまたは動物に投与された場合に生理学的に活性なポリペプチド；診断に有用な診断用ポリペプチド；または工業上の目的、例えばポリペプチドが機能的成分を構成するか、あるいは製造工程時にポリペプチドが未処理の成分のプロセッシングまたは他の修飾のために用いられる製品の製造に有用な工業用ポリペプチドであってよい。
【００６１】
ポリペプチドは、哺乳類起源、例えばヒト、ブタ、ヒツジ、ｕｒｃｉｎｅ、マウス、ウサギ、ロバ、またはコウモリ起源、微生物起源、例えば真菌、酵母または細菌起源であってよく、あるいは他のソース、例えば毒液、ヒル、カエルまたは蚊起源由来でもあり得る。好ましくは、目的の工業用ポリペプチドは微生物起源であり、治療用ポリペプチドはヒト起源である。
【００６２】
本発明にしたがって修飾されるポリペプチド群の具体例には、以下が含まれる：抗体または抗体断片、免疫グロブリンまたは免疫グロブリン断片、血漿タンパク質、赤血球、血小板タンパク質、サイトカイン、成長因子、線維素溶解促進性タンパク質、結合タンパク質、プロテアーゼインヒビター、抗原、酵素、リガンド、レセプター、またはホルモン。特に興味深いのは、患者に投与された場合に、細胞性レセプターに結合することによってその生物学的作用を媒介するポリペプチドである。抗体は、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体であってよく、ヒト、ウサギ、およびマウス起源を含む任意の起源であってよい。好ましくは、抗体はヒトまたはヒト化モノクローナル抗体である。目的の免疫グロブリンには、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、およびＩｇＤおよびその断片、例えばＦａｂ断片が含まれる。特定の抗体およびその断片はすぐ下に述べられているいずれかのタンパク質と反応するものである。
【００６３】
目的の非抗体ポリペプチドは、以下のものであり得る：ｉ）血漿タンパク質、例えば凝固系由来の因子、例えば因子ＶＩＩ、因子ＶＩＩＩ、因子ＩＸ、因子Ｘ、因子ＸＩＩＩ、トロンビン、タンパク質Ｃ、抗トロンビンＩＩＩまたはヘパリン補因子ＩＩ、組織因子インヒビター（例えば１または２）、内皮細胞表面タンパク質Ｃレセプター、線維素溶解系由来の因子、例えばプロウロキナーゼ、ウロキナーゼ、組織プラスミノーゲンアクチベーター、プラスミノーゲンアクチベーターインヒビター１（ＰＡＩ−１）またはプラスミノーゲンアクチベーターインヒビター２（ＰＡＩ−２）、フォンウィルブランド因子、またはα−１−プロテイナーゼインヒビター、ｉｉ）赤血球または血小板タンパク質（ｔｈｒｏｍｂｏｃｙｔｅ ｐｒｏｔｅｉｎ）、例えばヘモグロビン、トロンボスポンジン、または血小板因子４（ｐｌａｔｅｌｅｔ ｆａｃｔｏｒ ４）、ｉｉｉ）サイトカイン、例えばインターロイキン、例えばＩＬ−１（例えばＩＬ−１αまたはＩＬ−１β）、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＬ−１９、ＩＬ−２０、ＩＬ−２１、ＩＬ−２２、ＩＬ−２３、サイトカイン関連ポリペプチド、例えば ＩＬ−１Ｒａ， インターフェロン、例えばインターフェロン−α、インターフェロン−β、またはインターフェロン−γ、コロニー刺激因子、例えば ＧＭ−ＣＳＦ または Ｇ−ＣＳＦ， 幹細胞因子 （ＳＣＦ）， 結合タンパク質、腫瘍壊死因子ファミリーのメンバー （例えば ＴＮＦ−α， リンフォトキシン−α， リンフォトキシン−β， ＦａｓＬ， ＣＤ４０Ｌ， ＣＤ３０Ｌ， ＣＤ２７Ｌ， Ｏｘ４０Ｌ， ４−ｌＢＢＬ， ＲＡＮＫＬ， ＴＲＡＩＬ， ＴＷＥＡＫ， ＬＩＧＨＴ， ＴＲＡＮＣＥ， ＡＰＲＩＬ， ＴＨＡＮＫ または ＴＡＬＬ−１）， ｉｖ） 成長因子， 例えば血小板由来成長因子 （ＰＤＧＦ）， トランスフォーミング成長因子 α （ＴＧＦ−α）， トランスフォーミング成長因子 β （ＴＧＦ−β）， 上皮細胞成長因子 （ＥＧＦ）， 血管内皮成長因子 （ＶＥＧＦ）， ソマトトロピン （成長ホルモン）， ソマトメジン、例えばインシュリン様成長因子 Ｉ （ＩＧＦ−Ｉ） またはインシュリン様成長因子 ＩＩ （ＩＧＦ−ＩＩ）， エリスロポエチン （ＥＰＯ）， トロンボポエチン （ＴＰＯ） またはアンジオポエチン， ｖ）線維素溶解促進性タンパク質， 例えば スタフィロキナーゼまたはストレプトキナーゼ， ｖｉ） プロテアーゼインヒビター， 例えばアプロチニンまたは ＣＩ−２Ａ， ｖｉｉ） 酵素， 例えばスーパーオキシドジスムターゼ， カタラーゼ， ウリカーゼ， ビリルビンオキシダーゼ， トリプシン， パパイン， アスパラギナーゼ， アルギナーゼ， アルギニンデイミナーゼ， アデノシンデアミナーゼ， リボヌクレアーゼ， アルカリホスファターゼ， β−グルクロニダーゼ， プリンヌクレオシドホスホリラーゼまたはバトロキソビン， ｖｉｉｉ） オピオイド， 例えばエンドルフィン， エンケファリンまたは非天然オピオイド， ｉｘ） ホルモンまたはニューロペプチド， 例えばインシュリン， カルシトニン， グルカゴン， 副腎皮質刺激ホルモン （ＡＣＴＨ）， ソマトスタチン， ガストリン， コレシストキニン， 副甲状腺ホルモン （ＰＴＨ）， 黄体形成ホルモン （ＬＨ）， 濾胞刺激ホルモン （ＦＳＨ）， ｇ生殖腺刺激ホルモン放出ホルモン，ヒト絨毛性ゴナドトロピン， コルチコトロピン放出因子， バソプレシン， オキシトシン， 抗利尿ホルモン， 甲状腺刺激ホルモン，甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン， リラキシン， グルカゴン様ペプチド １ （ＧＬＰ−１）， グルカゴン様ペプチド ２ （ＧＬＰ−２）， プロラクチン， ニューロペプチド Ｙ， ペプチド ＹＹ， 膵臓ポリペプチド， レプチン， オレキシン， ＣＡＲＴ （コカインおよびアンフェタミン制御性転写）， ＣＡＲＴ 放出ペプチド， メラノコルチン （メラニン細胞刺激ホルモン）， メラニン凝集ホルモン，ナトリウム利尿ペプチド， アドレノメデュリン， エンドセリン， エキセンジン （ｅｘｅｎｄｉｎ）， セクレチン， アミリン （ＩＡＰＰ；島アミロイドポリペプチド前駆体）， 血管作働性腸管ペプチド （ＶＩＰ），脳下垂体アデニル酸シクラーゼ活性化ポリペプチド （ＰＡＣＡＰ）， アグーチおよびアグーチ関連ペプチドまたはソマトトロピン放出ホルモン， または ｘ） 別の型のタンパク質またはペプチド、例えばチモシン， ボンベシン， ボンベシン様ペプチド， ヘパリン結合タンパク質， 可溶性 ＣＤ４， 色素性ホルモン， 視床下部放出因子， マラノトニン （ｍａｌａｎｏｔｏｎｉｎｓ）， ホスホリパーゼ活性化タンパク質， 解毒酵素、例えばアシルオキシアシルヒドラーゼ， または抗菌ペプチド。
【００６４】
本発明の特定目的のポリペプチドの一群は、リソソーム酵素 （ＵＳ ５，９２９，３０４ に規定されている）、例えばリソソーム保存疾患の原因であるか、別に関与するもの， すなわちリソソーム保存疾患の患者に対する治療作用を有する酵素からなる群から選択される。このような酵素は、例えば、グルコセレブロシダーゼ， α−Ｌ−イズロニダーゼ， 酸 α−グルコシダーゼ， α−ガラクトシダーゼ， 酸 スフィンゴミエリナーゼ， ガラクトセレブロシダーゼ， アリールスルファターゼ ， シアリダーゼ， およびヘキソサミニダーゼを含む。また、リソソーム保存疾患に関与する他のタンパク質、例えばサポシンＡ、Ｂ、ＣまたはＤ （Ｓａｐｏｓｉｎ Ａ， Ｂ， Ｃ ｏｒ Ｄ） （Ｎａｋａｎｏ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． （Ｔｏｋｙｏ） １０５， １５２−１５４， １９８９； Ｇａｖｒｉｅｌｉ−Ｒｏｒｍａｎ ａｎｄ Ｇｒａｂｏｗｓｋｉ， Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ５， ４８６−４９２， １９８９） を本明細書中に記載されるように修飾できる。好ましくは、これらのポリペプチドはヒト起源である。
【００６５】
発明者らは、追加のＮ連結オリゴサッカライド部分を有するこのような酵素を提供することが、その性質、例えば安定性、標的化、発現、およびインビボ活性および標的化をかなり改善することを示した。したがって、一態様では、本発明のポリペプチドは、グリコシル化されたリソソーム酵素であって、グリコシル化部位を含むか、あるいはそれに関与するペプチド付加物を含むものである。
【００６６】
工業用ポリペプチドは典型的に酵素、特に微生物酵素であり、界面活性剤、家庭用品、個人ケア製品、農薬、織物、食品、特にベーカリー製品、餌製品のような製品または製品の製造、または工業プロセス、例えば舗装面クリーニングにおいて用いることができる。工業用ポリペプチドは、通常、ヒトまたは動物への内部投与用には意図されない。具体例には、ヒドラーゼ、例えばプロテアーゼ， リパーゼまたはクチナーゼ， オキシドレダクターゼ， 例えばラケース （ｌａｃｃａｓｅ） およびペルオキシダーゼ， トランスフェラーゼ、例えばトランスグルタミナーゼ， イソメラーゼ， 例えばタンパク質ジスルフィドイソメラーゼおよびグルコースイソメラーゼ， 細胞壁分解酵素、例えばセルラーゼ， キシラナーゼ， ペクチナーゼ， マンナナーゼ， など， アミロ溶解酵素（ａｍｙｌｏｌｙｔｉｃ ｅｎｚｙｍｅｓ）、例えばエンドアミラーゼ， 例えばαアミラーゼ， またはエキソ−アミラーゼ， 例えばβ−アミラーゼまたはアミログルコシダーゼ， などが含まれる。さらなる具体例は、ＷＯ ００／２６３５４（この開示内容は引用により本明細書中に包含される）に列記されているものである。通常、本発明にしたがって修飾された酵素は、以下からなる群から選択される１またはそれ以上の改善された性質を有する：例えば改善された保存寿命および改善された使用性能を生じさせる増大した安定性（特にタンパク質分解または熱分解に対するもの）；改善された調製、例えば（例えば発現酵素の改善された分泌および／または改善された安定性の結果としての）改善された発現および改善された精製に関するもの、減少したアレルギー原性、この酵素が用いられる目的の工業プロセスにおける増大した活性、および固定に関する改善された性質。
【００６７】
ポリペプチドＰｐが工業用酵素である場合、Ｎ末端ペプチド付加物はグリコシル化部位を含むか、あるいはそれに関与し得るものである。しかし、工業用酵素および、ポリマー、例えばＰＥＧである第二の非ペプチド部分用の結合基を含むＣ末端またはＮ末端ペプチド付加物を含むポリペプチドを提供することもまた本発明の範囲内である。ペプチド付加物はグリコシル化部位を含んでいてもいなくてもよい。ペプチド付加物は、好ましくは、本明細書中に記載されているものである。例えば、このような結合基はリシンまたはシステイン残基によって提供され得る。
【００６８】
一態様では、本発明のポリペプチドは個人ケア用酵素（すなわち個人ケア適用に有用な酵素）を含み、このようなポリペプチドは、このポリペプチドに曝露された哺乳類、特にヒトの粘膜を通過できないものである。それゆえ、アレルギー原性は減少するか、あるいは回避できる。さらに、このような酵素の安定性は、増大し得る。この態様のポリペプチドは、グリコシル化部位および／または第二の非ペプチド部分、例えばＰＥＧのようなポリマー用の結合基を含むか、あるいはそれに関与するＮ末端またはＣ末端ペプチド付加物を含む。
【００６９】
別の態様では、このポリペプチドは、ＷＯ９７／０４０７９に開示されているようなリパーゼ、特に Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｌａｎｕｇｉｎｏｓａ リパーゼを含み、ここに、ＮまたはＣ末端ペプチド付加物はグリコシル化部位および／または第二の非ペプチド部分、例えばＰＥＧのようなポリマー用の少なくとも１の結合基を含む。これにより、ＮまたはＣ末端ペプチド付加物は分解から保護され、および／または、酵素の発現（分泌を含む）の増大が獲得され得る。この態様に関して、Ｎ末端ペプチド付加物は、ＷＯ９７／０４０７９に開示されている任意のペプチド付加物を含み得る。
【００７０】
さらに別の態様では、ポリペプチドＰｐはアミログルコシダーゼであり、ＮまたはＣ末端ペプチド付加物はグリコシル化部位および／または、第二の非ペプチド部分、例えばＰＥＧのようなポリマー用の結合基を含むか、あるいはそれに関与する。ペプチド付加物がＮ末端である場合、この酵素の修飾は減少したかあるいは消滅した該酵素のＮ末端分解（アミログルシダーゼの組換え生産に伴う周知の別の問題）を生じさせるものと考慮される。言いかえれば、酵素のＮ末端は、アミログルコシダーゼのＮ末端ペプチドに結合した非ペプチド部分で保護されている。
【００７１】
さらに別の態様では、ペプチドＰｐは抗原、特に免疫応答を生じさせるために用いられることを意図される抗原（ワクチン目的用）である。抗原性を変化するリスクが減少するという点において、本発明にしたがって抗原にＮ末端グリコシル化部位（群）を追加するのは有益であることが考慮される。抗原は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）を含む広範な標的細胞によって認識され、効率的な細胞内プロセッシングおよび免疫系の他の細胞、例えばＴ細胞への提示用にこれらの細胞によって取り込まれ、所望の免疫応答が誘導または誘発される。抗原（およびその断片、例えば抗原ペプチド）は、本発明のペプチド付加物および非ペプチド部分によって修飾することができる。このような修飾は、そのような標的細胞による、プロセッシング区画への抗原の取り込みおよび／または標的化を促進および／または最適化する。例えば、Ｎ末端拡張された本発明の抗原ポリペプチドは標的細胞により効率的に、および／または高められたか、あるいは改善された割合で取り込まれる（非ペプチド部分がこのような取り込みに関与している場合）。このような効率的な、改善されたか、あるいは高められた、標的細胞による修飾抗原の取り込みは、免疫抗原への免疫応答の動力学および強度を増大させる。抗原に対するこれらの修飾はまた、標的細胞上の特定の細胞レセプター（例えばマンノースレセプターおよび他の炭水化物レセプターを含む）に対する抗原の親和性を改善する（特に非ペプチド部分がオリゴサッカライド部分である場合）。
【００７２】
本発明の抗原ポリペプチドには、以下のタイプの標的細胞における改善されたか、高められたか、あるいは変更された抗原の取り込みが望まれるものが含まれるがこれらに限定されない：抗原提示細胞および抗原プロセッシング細胞、例えば単球、Ｂ細胞、抗原提示マクロファージ、辺縁帯マクロファージ， 濾胞樹状細胞， 樹状細胞， ランゲルハンス細胞， ケラチノサイト， Ｍ−細胞 （例えば 腸の Ｍ−細胞）， 筋肉内免疫化用の筋細胞または粘膜免疫化用の上皮細胞， 肝臓内の Ｋｕｐｐｆｅｒ 細胞など。毛細内皮およびいくつかの内分泌細胞を含む、他の多数の細胞がいくつかの環境中で抗原を提示でき；この細胞は、抗原提示機能を付与するＭＨＣクラスＩＩ分子を発現している。さらに、ＭＨＣクラスＩ分子は、例えば筋肉細胞を含むほとんどの有核細胞表面に発現されており、したがってこれらの細胞もまた抗原をＣＤ８＋Ｔ細胞に提示できる。活性化されたＴ細胞は、ＩＦＮ−ガンマを放出し、いくつかの組織細胞におけるＭＨＣ分子の発現を活発に誘発する。好ましくは、このような細胞は哺乳類起源、特にヒト（ヒトの免疫化用に使用）または動物（獣医学的目的用）起源である。
広範な抗原が本発明にしたがって修飾できる。例は以下に挙げる。
【００７３】
癌抗原
本発明にしたがって修飾可能な癌抗原には以下のものが含まれるが、これらに限定されない：
類天疱瘡抗原 ２， 前立腺ムチン抗原 （ＰＭＡ） （Ｂｅｃｋｅｔｔ ａｎｄ Ｗｒｉｇｈｔ （１９９５） Ｉｎｔ． Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ ６２： ７０３−７１０）， 腫瘍関連 Ｔｈｏｍｓｅｎ−Ｆｒｉｅｄｅｎｒｅｉｃｈ 抗原 （Ｄａｈｌｅｎｂｏｒｇ ｅｔ ａｌ． （１９９７） Ｉｎｔ． Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ ７０： ６３−７１）， 前立腺特異的抗原 （ＰＳＡ） （Ｄａｎｎｕｌｌ ａｎｄ Ｂｅｌｌｄｅｇｒｕｎ （１９９７） Ｂｒ． Ｊ． Ｕｒｏｌ． １： ９７−１０３）， ＥｐＣａｍ／ＫＳＡ 抗原， 乳癌および膀胱移行細胞癌 （ＴＣＣ） の管腔上皮抗原 （ＬＥＡ．１３５） （Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ． （１９９７） Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． １７： ６８５−６８７）， 癌関連血清抗原 （ＣＡＳＡ） および癌抗原 １２５ （ＣＡ １２５） （Ｋｉｅｒｋｅｇａａｒｄ ｅｔ ａｌ． （１９９５） Ｇｙｎｅｃｏｌ． Ｏｎｃｏｌ． ５９： ２５１−２５４）， 上皮性糖タンパク質 ４０ （ＥＧＰ４０） （Ｋｉｅｖｉｔ ｅｔ ａｌ． （１９９７） Ｉｎｔ． Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ ７１： ２３７−２４５）， 扁平上皮細胞癌抗原 （ＳＣＣ） （Ｌｏｚｚａ ｅｔ ａｌ． （１９９７） Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． １７： ５２５−５２９）， カセプシン Ｅ （Ｍｏｔａ ｅｔ ａｌ． （１９９７） Ａｍ． Ｊ． Ｐａｔｈｏｌ． １５０： １２２３−１２２９）， 黒色腫内チロシナーゼ （Ｆｉｓｈｍａｎ ｅｔ ａｌ． （１９９７） Ｃａｎｃｅｒ ７９： １４６１−１４６４）， 脳空洞性腫瘍 （ｃｅｒｅｂｒａｌ ｃａｖｅｒｎｏｍａｓ） の細胞核抗原 （ＰＣＮＡ） （Ｎｏｔｅｌｅｔ ｅｔ ａｌ． （１９９７） Ｓｕｒｇ． Ｎｅｕｒｏｌ． ４７： ３６４−３７０）， ＤＦ３／ＭＵＣ１ 乳癌抗原 （Ａｐｏｓｔｏｌｏｐｏｕｌｏｓ ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． ７４： ４５７−４６４； Ｐａｎｄｅｙ ｅｔ ａｌ． （１９９５） Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５５： ４０００−４００３）， 癌胎児性抗原 （Ｐａｏｎｅ ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． Ｃｌｉｎ． Ｏｎｃｏｌ． １２２： ４９９−５０３； Ｓｃｈｌｏｍ ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． Ｔｒｅａｔ． ３８： ２７−３９）， 腫瘍関連抗原 ＣＡ １９−９ （Ｔｏｌｌｉｖｅｒ ａｎｄ Ｏ’Ｂｒｉｅｎ （１９９７） Ｓｏｕｔｈ Ｍｅｄ． Ｊ． ９０： ８９−９０； Ｔｓｕｒｕｔａ ｅｔ ａｌ． （１９９７） Ｕｒｏｌ． Ｉｎｔ． ５８： ２０−２４）， ヒト黒色腫抗原 ＭＡＲＴ−１／Ｍｅｌａｎ−Ａ２７−３５ および ｇｐ１００ （Ｋａｗａｋａｍｉ ａｎｄ Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ （１９９７） Ｉｎｔ． Ｒｅｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １４： １７３−１９２； Ｚａｊａｃ ｅｔ ａｌ． （１９９７） Ｉｎｔ． Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ ７１： ４９１−４９６）， Ｔ および Ｔｎ パンカルシノーマ （ｐａｎｃａｒｃｉｎｏｍａ） （ＣＡ） グルコペプチドエピトープ （Ｓｐｒｉｎｇｅｒ （１９９５） Ｃｒｉｔ． Ｒｅｖ． Ｏｎｃｏｇ． ６： ５７−８５）， 乳頭甲状腺癌の ３５ ｋＤ 腫瘍関連自己抗原 （Ｌｕｃａｓ ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． １６： ２４９３−２４９６）， ＫＨ−１ 腺癌抗原 （Ｄｅｓｈｐａｎｄｅ ａｎｄ Ｄａｎｉｓｈｅｆｓｋｙ （１９９７） Ｎａｔｕｒ��� ３８７： １６４−１６６）， Ａ６０ ミコバクテリア抗原 （Ｍａｅｓ ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． Ｃｌｉｎ． Ｏｎｃｏｌ． １２２： ２９６−３００）， 熱ショックタンパク質 （ＨＳＰｓ） （Ｂｌａｃｈｅｒｅ ａｎｄ Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ （１９９５） Ｓｅｍｉｎ． Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｌ． ６： ３４９−３５５）， および ＭＡＧＥ， チロシナーゼ， メラン−Ａ （ｍｅｌａｎ−Ａ） および ｇｐ７５ および変異体発現遺伝子産物 （例えば， ｐ５３， ｒａｓ， および ＨＥＲ−２／ｎｅｕ （Ｂｕｅｌｅｒ ａｎｄ Ｍｕｌｌｉｇａｎ （１９９６） Ｍｏｌ． Ｍｅｄ． ２： ５４５−５５５； Ｌｅｗｉｓ ａｎｄ Ｈｏｕｇｈｔｏｎ （１９９５） Ｓｅｍｉｎ． Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｌ． ６： ３２１−３２７； Ｔｈｅｏｂａｌｄ ｅｔ ａｌ． （１９９５） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ’ｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９２： １１９９３−１１９９７）； ＴＡＧ−７２， ほとんどのヒト腺癌において発現されている ムチン ａｇ （ＭｃＧｕｉｎｎｅｓｓ ｅｔ ａｌ． （１９９９） Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ １０：１６５−７３）。
【００７４】
細菌抗原
本発明にしたがって修飾可能な細菌抗原には、以下のものが含まれるがこれらに限定されない：
Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ 抗原 ＣａｇＡ および ＶａｃＡ （Ｂｌａｓｅｒ （１９９６） Ａｌｉｍｅｎｔ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． Ｔｈｅｒ． １： ７３−７； Ｂｌａｓｅｒ ａｎｄ Ｃｒａｂｔｒｅｅ （１９９６） Ａｍ． Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｐａｔｈｏｌ． １０６： ５６５−７； Ｃｅｎｓｉｎｉ ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ’ｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９３： １４６４８−１４６４３）．　他の適当な Ｈ． ｐｙｌｏｒｉ 抗原には以下が含まれる：例えば， ４免疫反応性タンパク質 ４５−６５ ｋＤａ （Ｃｈａｔｈａ ｅｔ ａｌ． （１９９７） Ｉｎｄｉａｎ Ｊ． Ｍｅｄ． Ｒｅｓ． １０５： １７０−１７５） および Ｈ． ｐｙｌｏｒｉ ＧｒｏＥＳ 相同体 （ＨｓｐＡ） （Ｋａｎｓａｕ ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ｍｏｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ２２： １０１３−１０２３）。他の適当な細菌抗原には以下が含まれるがこれらに限定されない：
Ｐ． ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ の ４３−ｋＤａ およびフィムブリリン （ｆｉｍｂｒｉｌｉｎ） （４１ ｋＤａ） タンパク質 （Ｂｏｕｔｓｌ ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ｏｒａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １１： ２３６−２４１）； 肺炎球菌表面タンパク質 Ａ （Ｂｒｉｌｅｓ ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ａｎｎ． ＮＹ Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ７９７： １１８−１２６）； Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｐｓｉｔｔａｃｉ 抗原， ８０−９０ ｋＤａ タンパク質および １１０ ｋＤａ タンパク質 （Ｂｕｅｎｄｉａ ｅｔ ａｌ． （１９９７） ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｌｅｔｔ． １５０： １１３−９）； クラミジア エキソ糖脂質抗原 （ｔｈｅ ｃｈｌａｍｙｄｉａｌ ｅｘｏｇｌｙｃｏｌｉｐｉｄ ａｎｔｉｇｅｎ） （ＧＬＸＡ） （Ｗｈｉｔｔｕｍ−Ｈｕｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ． ２： １１１６−１１２１）； Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ 種特異的抗原（分子量範囲 ９２−９８， ５１−５５， ４３−４６ および ３１．５−３３ ｋＤａ）およびａｎｄ 属特異的抗原（分子量範囲 １２， ２６ および ６５−７０ ｋＤａ）（Ｈａｌｍｅ ｅｔ ａｌ． （１９９７） Ｓｃａｎｄ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ４５： ３７８−８４）； Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ （ＧＣ） または Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ 相可変性 （ｐｈａｓｅ−ｖａｒｉａｂｌｅ） 不透明 （Ｏｐａ） タンパク質 （Ｃｈｅｎ ａｎｄ Ｇｏｔｓｃｈｌｉｃｈ （１９９６） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ’ｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９３： １４８５１−１４８５６）， Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ ｍａｎｓｏｎｉ の任意の１２免疫優性タンパク質 （分子量範囲 １４−２０８ ｋＤａ） （Ｃｕｔｔｓ ａｎｄ Ｗｉｌｓｏｎ （１９９７） Ｐａｒａｓｉｔｏｌｏｇｙ １１４： ２４５−５５）； Ｂｒｕｃｅｌｌａ ａｂｏｒｔｕｓ の １７−ｋＤａ タンパク質抗原 （Ｄｅ Ｍｏｔ ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ｃｕｒｒ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ３３： ２６−３０）； ノカルジオ型 （ｎｏｃａｒｄｉｏｆｏｒｍ） 放線菌 Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ． において同定された ＮＩ８６／２１グラム陰性病原性 Ｂｒｕｃｅｌｌａ ａｂｏｒｔｕｓ の １７−ｋＤａ タンパク質抗原の遺伝子相同体 （Ｄｅ Ｍｏｔ ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ｃｕｒｒ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ３３： ２６−３０）； ブドウ球菌エンテロトキシン （ＳＥｓ） （Ｗｏｏｄ ｅｔ ａｌ． （１９９７） ＦＥＭＳ Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｄ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． １７： １−１０）， ４２−ｋＤａ Ｍ． ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ ＮｒｄＦ リボヌクレオチドレダクターゼ Ｒ２ タンパク質または Ｍ． ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ の １５−ｋＤａ サブユニットタンパク質 （Ｆａｇａｎ ｅｔ ａｌ． （１９９７） Ｉｎｆｅｃｔ． Ｉｍｍｕｎ． ６５： ２５０２−２５０７）， 髄膜炎菌抗原 ＰｏｒＡ タンパク質 （Ｆｅａｖｅｒｓ ｅｔ ａｌ． （１９９７） Ｃｌｉｎ． Ｄｉａｇｎ． Ｌａｂ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ３： ４４４−５０）； 肺炎球菌表面タンパク質 Ａ （ＰｓｐＡ） （ＭｃＤａｎｉｅｌ ｅｔ ａｌ． （１９９７） Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． ４： ３７５−３７７）； Ｆ． ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ 外膜タンパク質 ＦｏｐＡ （Ｆｕｌｏｐ ｅｔ ａｌ． （１９９６） ＦＥＭＳ Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｄ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． １３： ２４５−２４７）； Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ 属の株に含まれる主要外膜タンパク質 （Ｈａｒｔｍａｎｎ ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ｚｅｎｔｒａｌｂｌ． Ｂａｋｔｅｒｉｏｌ． ２８４： ２５５−２６２）； Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ の ｐ６０ またはリステリオリシン （ｌｉｓｔｅｒｉｏｌｙｓｉｎ） （Ｈｌｙ） 抗原 （Ｈｅｓｓ ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ’ｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９３： １４５８−１４６３）； Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ および Ｓ． ｐｕｌｌｏｒｕｍ に観察される鞭毛 （Ｇ） 抗原 （Ｈｏｌｔ ａｎｄ Ｃｈａｕｂａｌ （１９９７） Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ３５： １０１６−１０２０）； Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓ 保護抗原 （ＰＡ） （Ｉｖｉｎｓ ｅｔ ａｌ． （１９９５） Ｖａｃｃｉｎｅ １３： １７７９−１７８４）； Ｅｃｈｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｇｒａｎｕｌｏｓｕｓ 抗原 ５ （Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ｐａｒａｓｉｔｏｌｏｇｙ １１３： ２１３−２２２）； Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ １ および Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ−１２ の ｒｏｌ 遺伝子 （Ｋｌｅｅ ｅｔ ａｌ． （１９９７） Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １７９： ２４２１−２４２５）； グループ Ｂ ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ の細胞表面タンパク質 Ｒｉｂ および アルファ （Ｌａｒｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ｉｎｆｅｃｔ． Ｉｍｍｕｎ． ６４： ３５１８−３５２３）； 病原性 Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｓｐｐ． の ７０ ｋｂ 病原性プラスミド上にコードされる ３７ ｋＤａ 分泌性ポリペプチド （Ｌｅａｒｙ ｅｔ ａｌ． （１９９５） Ｃｏｎｔｒｉｂ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １３： ２１６−２１７ ａｎｄ Ｒｏｇｇｅｎｋａｍｐ ｅｔ ａｌ． （１９９７） Ｉｎｆｅｃｔ． Ｉｍｍｕｎ． ６５： ４４６−５１）； ライム病スピロヘータ Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ の ＯｓｐＡ （外側表面タンパク質 Ａ）　（Ｌｉ ｅｔ ａｌ． （１９９７） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ’ｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９４： ３５８４−３５８９， Ｐａｄｉｌｌａ ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ｊ． Ｉｎｆｅｃｔ． Ｄｉｓ． １７４： ７３９−７４６， ａｎｄ Ｗａｌｌｉｃｈ ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ２４： ３９６−３９７）； Ｏｍｐ２８ をコードする Ｂｒｕｃｅｌｌａ ｍｅｌｉｔｅｎｓｉｓ グループ ３ 抗原遺伝子 （Ｌｉｎｄｌｅｒ ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ｉｎｆｅｃｔ． Ｉｍｍｕｎ． ６４： ２４９０−２４９９）； Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ の ＰＡｃ 抗原 （Ｍｕｒａｋａｍｉ ｅｔ ａｌ． （１９９７） Ｉｎｆｅｃｔ． Ｉｍｍｕｎ． ６５： ７９４−７９７）； ニューモライシン （ｐｎｅｕｍｏｌｙｓｉｎ）， 肺炎球菌ノイラミニダーゼ，自己溶菌酵素， ヒアルロニダーゼ， および ３７ ｋＤａ 肺炎球菌表面アドヒシンＡ （ａｄｈｅｓｉｎ Ａ） （Ｐａｔｏｎ ｅｔ ａｌ． （１９９７） Ｍｉｃｒｏｂ． Ｄｒｕｇ Ｒｅｓｉｓｔ． ３： １−１０）； Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉ の ２９−３２， ４１−４５， ６３−７１ ｘ １０（３） ＭＷ 抗原 （Ｐｅｒｅｚ ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ８９： ２６２−２６７）； Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ のマーカー Ｋ−抗原 （Ｐｒｉａｍｕｋｈｉｎａ ａｎｄ Ｍｏｒｏｚｏｖａ （１９９６） Ｋｌｉｎ． Ｌａｂ． Ｄｉａｇｎ． ４７−９）； 分子量約 ６０， ４０， ２０ および １５−１０ ｋＤａ のノカルジア抗原 （Ｐｒｏｋｅｓｏｖａ ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ｉｎｔ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌ． １８： ６６１−６６８）； Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ 抗原 ＯＲＦ−２ （Ｒｉｅｎｅｃｋ ｅｔ ａｌ． （１９９７） Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ １３５０： １２８−１３２）； Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｈｅｒｍｓｉｉ の ＧｌｐＱ 抗原 （Ｓｃｈｗａｎ ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ３４： ２４８３−２４９２）； コレラ保護抗原 （ＣＰＡ） （Ｓｃｉｏｒｔｉｎｏ （１９９６） Ｊ． Ｄｉａｒｒｈｏｅａｌ Ｄｉｓ． Ｒｅｓ． １４： １６−２６）； Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ の １９０−ｋＤａ タンパク質抗原 （Ｓｅｎｐｕｋｕ ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ｏｒａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １１： １２１−１２８）； Ａｎｔｈｒａｘ トキシン保護抗原 （ＰＡ） （Ｓｈａｒｍａ ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ． Ｐｕｒｉｆ． ７： ３３−３８）； Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ 抗原およびトキソイド （Ｓｔｒｏｍ ｅｔ ａｌ． （１９９５） Ｂｒ． Ｊ． Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ． ３４： １０９５−１０９６）； Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ の ＳＥＦ１４ 海馬采抗原 （Ｔｈｏｒｎｓ ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ｍｉｃｒｏｂ． Ｐａｔｈｏｇ． ２０：　２３５−２４６）； Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｐｅｓｔｉｓ 莢膜（カプセル）抗原 （Ｆ１ 抗原） （Ｔｉｔｂａｌｌ ｅｔ ａｌ． （１９９７） Ｉｎｆｅｃｔ． Ｉｍｍｕｎ． ６５： １９２６−１９３０）； Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｅｐｒａｅ の ３５−キロダルトンタンパク質 （Ｔｒｉｃｃａｓ ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ｉｎｆｅｃｔ． Ｉｍｍｕｎ． ６４： ５１７１−５１７７）； 主要外膜タンパク質， ＣＤ， Ｍｏｒａｘｅｌｌａ （Ｂｒａｎｈａｍｅｌｌａ） ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ から抽出 （Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ． （１９９７） ＦＥＭＳ Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｄ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． １７： １８７−１９９）； Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｐｅｓｔｉｓ の ｐＨ６ 抗原 （ＰｓａＡ タンパク質） （Ｚａｖ’ｙａｌｏｖ ｅｔ ａｌ． （１９９６） ＦＥＭＳ Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｄ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． １４： ５３−５７）； Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ｍａｊｏｒ の主要表面糖タンパク質， ｇｐ６３ （Ｘｕ ａｎｄ Ｌｉｅｗ （１９９４） Ｖａｃｃｉｎｅ １２： １５３４−１５３６； Ｘｕ ａｎｄ Ｌｉｅｗ （１９９５） Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ８４： １７３−１７６）； 放線菌熱ショックタンパク質 ６５， 放線菌抗原 （Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｅｐｒａｅ ｈｓｐ６５） （Ｌｏｗｒｉｅ ｅｔ ａｌ． （１９９４） Ｖａｃｃｉｎｅ １２： １５３７−１５４０； Ｒａｇｎｏ ｅｔ ａｌ． （１９９７） Ａｒｔｈｒｉｔ���ｓ Ｒｈｅｕｍ． ４０： ２７７−２８３； Ｓｉｌｖａ （１９９５） Ｂｒａｚ． Ｊ． Ｍｅｄ． Ｂｉｏｌ． Ｒｅｓ． ２８： ８４３−８５１）； Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ 抗原 ８５ （Ａｇ８５） （Ｈｕｙｇｅｎ ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ｎａｔ． Ｍｅｄ． ２： ８９３−８９８）； Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ， Ｍ． ｂｏｖｉｓ および ＢＣＧ の ４５／４７ ｋＤａ 抗原複合体 （ＡＰＡ） （Ｈｏｒｎ ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ １９７： １５１−１５９）； 放線菌抗原， ６５−ｋＤａ 熱ショックタンパク質， ｈｓｐ６５ （Ｔａｓｃｏｎ ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ｎａｔ． Ｍｅｄ． ２： ８８８−８９２）； 放線菌抗原 ＭＰＢ６４， ＭＰＢ７０， ＭＰＢ５７ およびアルファ抗原 （ＹａｍａＤａ ｅｔ ａｌ． （１９９５） Ｋｅｋｋａｋｕ ７０： ６３９−６４４）； Ｍ． ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ ３８ ｋＤａ タンパク質 （Ｖｏｒｄｅｒｍｅｉｅｒ ｅｔ ａｌ． （１９９５） Ｖａｃｃｉｎｅ １３： １５７６−１５８２）； Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ 由来 ＭＰＴ６３， ＭＰＴ６４ および ＭＰＴ−５９ 抗原 （Ｍａｎｃａ ｅｔ ａｌ． （１９９７） Ｉｎｆｅｃｔ． Ｉｍｍｕｎ． ６５： １６−２３； Ｏｅｔｔｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ． （１９９７） Ｓｃａｎｄ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ４５： ４９９−５０３； Ｗｉｌｃｋｅ ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ｔｕｂｅｒ． Ｌｕｎｇ Ｄｉｓ． ７７： ２５０−２５６）； Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｅｐｒａｅ の ３５−キロダルトンタンパク質 （Ｔｒｉｃｃａｓ ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ｉｎｆｅｃｔ． Ｉｍｍｕｎ． ６４： ５１７１−５１７７）； 病原性放線菌の ＥＳＡＴ−６ 抗原 （Ｂｒａｎｄｔ ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５７： ３５２７−３５３３； Ｐｏｌｌｏｃｋ ａｎｄ Ａｎｄｅｒｓｅｎ （１９９７） Ｊ． Ｉｎｆｅｃｔ． Ｄｉｓ． １７５： １２５１−１２５４）； Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ １６−ｋＤａ 抗原 （Ｈｓｐ１６．３） （Ｃｈａｎｇ ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７１： ７２１８−７２２３）； および Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｅｐｒａｅ の １８−キロダルトンタンパク質 （Ｂａｕｍｇａｒｔ ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ｉｎｆｅｃｔ． Ｉｍｍｕｎ． ６４： ２２７４−２２８１）； Ｂ． ａｎｔｈｒａｃｉｓ の保護抗原 （ＰＡ）； Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｐｅｓｔｉｓ， Ｙ． ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ， および Ｙ． ｐｓｅｕｄｏｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ 由来 Ｖ 抗原； 細菌 Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ に対する抗原， コレラトキシン Ｂ サブユニット， およびエンテロトキシン原性 Ｅ． ｃｏｌｉ 株由来熱不安定性エンテロトキシン （ＬＴ）。
【００７５】
ウイルス性病原
例えばハンタウイルス （例えばハンタウイルス糖タンパク質）， フラビウイルス， 例えばデング熱ウイルス （例えばエンベロープタンパク質）， 日本， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ および Ｍｕｒｒａｙ Ｖａｌｌｅｙ 脳炎ウイルス， マダニ由来（ｔｉｃｋ−ｂｏｒｎｅ）脳炎ウイルスを含むがこれらに限定されない種々のウイルス性病原に対応するか、あるいは関連するポリペプチドまたはタンパク質は本発明にしたがって修飾可能である。 【００７６】
本発明にしたがって修飾可能なウイルス抗原には以下のものが含まれるがこれらに限定されない：
インフルエンザ Ａ ウイルス Ｎ２ ノイラミニダーゼ （Ｋｉｌｂｏｕｒｎｅ ｅｔ ａｌ． （１９９５） Ｖａｃｃｉｎｅ １３： １７９９−１８０３）； デング熱ウイルスエンベロープ （Ｅ） およびプレ膜 （ｐｒＭ） 抗原 （Ｆｅｉｇｈｎｙ ｅｔ ａｌ． （１９９４） Ａｍ． Ｊ． Ｔｒｏｐ． Ｍｅｄ． Ｈｙｇ． ５０： ３２２−３２８； Ｐｕｔｎａｋ ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ａｍ． Ｊ． Ｔｒｏｐ． Ｍｅｄ． Ｈｙｇ． ５５： ５０４−１０）； ＨＩＶ 抗原 Ｇａｇ， Ｐｏｌ， Ｖｉｆ および Ｎｅｆ （Ｖｏｇｔ ｅｔ ａｌ． （１９９５） Ｖａｃｃｉｎｅ １３： ２０２−２０８）； ＨＩＶ 抗原 ｇｐ１２０ および ｇｐ１６０ （Ａｃｈｏｕｒ ｅｔ ａｌ． （１９９５） Ｃｅｌｌ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．　４１： ３９５−４００； Ｈｏｎｅ ｅｔ ａｌ． （１９９４） Ｄｅｖ． Ｂｉｏｌ． Ｓｔａｎｄ． ８２： １５９−１６２）； ヒト免疫不全ウイルスの ｇｐ４１ エピトープ （Ｅｃｋｈａｒｔ ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ｊ． Ｇｅｎ． Ｖｉｒｏｌ． ７７： ２００１−２００８）； ロータウイルス抗原 ＶＰ４ （Ｍａｔｔｉｏｎ ｅｔ ａｌ． （１９９５） Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６９： ５１３２−５１３７）； ロータウイルス抗原 ＶＰ７ または ＶＰ７ｓｃ （Ｅｍｓｌｉｅ ｅｔ ａｌ． （１９９５） Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６９： １７４７−１７５４； Ｘｕ ｅｔ ａｌ． （１９９５） Ｊ． Ｇｅｎ． Ｖｉｒｏｌ． ７６： １９７１−１９８０）； ヘルペス単純ウイルス （ＨＳＶ） 糖タンパク質 ｇＢ， ｇＣ， ｇＤ， ｇＥ， ｇＧ， ｇＨ， および ｇＩ （Ｆｌｅｃｋ ｅｔ ａｌ． （１９９４） Ｍｅｄ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． （Ｂｅｒｌ） １８３： ８７−９４ ［Ｍａｔｔｉｏｎ， １９９５］； Ｇｈｉａｓｉ ｅｔ ａｌ． （１９９５） Ｉｎｖｅｓｔ． Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ． Ｖｉｓ． Ｓｃｉ． ３６： １３５２−１３６０； ＭｃＬｅａｎ ｅｔ ａｌ． （１９９４） Ｊ． Ｉｎｆｅｃｔ． Ｄｉｓ． １７０： １１００−１１０９）； ヘルペス単純ウイルス−１型 （ＨＳＶ−１） の前初期タンパク質 ＩＣＰ４７ （Ｂａｎｋｓ ｅｔ ａｌ． （１９９４） Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２００： ２３６−２４５）； ヘルペス単純ウイルスの前初期 （ＩＥ） タンパク質 ＩＣＰ２７， ＩＣＰ０， および ＩＣＰ４ （Ｍａｎｉｃｋａｎ ｅｔ ａｌ． （１９９５） Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６９： ４７１１−４７１６）； インフルエンザウイルス核タンパク質およびヘマグルチニン （Ｄｅｃｋ ｅｔ ａｌ． （１９９７） Ｖａｃｃｉｎｅ １５： ７１−７８； Ｆｕ ｅｔ ａｌ． （１９９７） Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７１： ２７１５−２７２１）； Ｂ１９ パルボウイルスキャプシドタンパク質 ＶＰ１ （Ｋａｗａｓｅ ｅｔ ａｌ． （１９９５） Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２１１： ３５９−３６６） または ＶＰ２ （Ｂｒｏｗｎ ｅｔ ａｌ． （１９９４） Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １９８： ４７７−４８８）； Ｂ 型肝炎ウイルスコアおよび ｅ 抗原およびキャプシドタンパク質 （Ｓｃｈｏｄｅｌ ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ ３９： １０４−１０６）； Ｂ 型肝炎表面抗原 （Ｓｈｉａｕ ａｎｄ Ｍｕｒｒａｙ （１９９７） Ｊ． Ｍｅｄ． Ｖｉｒｏｌ． ５１： １５９−１６６）； ウイルスのコア抗原と融合した Ｂ 型肝炎表面抗原 （Ｉｄ．）； Ｂ 型肝炎ウイルスコア−プレＳ２ 粒子 （Ｎｅｍｅｃｋｏｖａ ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ａｃｔａ Ｖｉｒｏｌ． ４０： ２７３−２７９）； ＨＢＶ プレＳ２−Ｓ タンパク質 （Ｋｕｔｉｎｏｖａ ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ｖａｃｃｉｎｅ １４： １０４５−１０５２）； ＶＺＶ 糖タンパク質 Ｉ （Ｋｕｔｉｎｏｖａ ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ｖａｃｃｉｎｅ １４： １０４５−１０５２）； 狂犬病ウイルス糖タンパク質 （Ｘｉａｎｇ ｅｔ ａｌ． （１９９４） Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １９９： １３２−１４０； Ｘｕａｎ ｅｔ ａｌ． （１９９５） Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓ． ３６： １５１−１６１） またはリボヌクレオキャプシド （Ｈｏｏｐｅｒ ｅｔ ａｌ． （１９９４） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ’ｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９１： １０９０８−１０９１２）； ヒトサイトメガロウイルス （ＨＣＭＶ） 糖タンパク質 Ｂ （ＵＬ５５） （Ｂｒｉｔｔ ｅｔ ａｌ． （１９９５） Ｊ． Ｉｎｆｅｃｔ． Ｄｉｓ． １７１： １８−２５）； Ｃ 型肝炎ウイルス （ＨＣＶ） ヌクレオキャプシドタンパク質 （分泌型または非分泌型、または、Ｂ 型肝炎ウイルス （ＨＢＶ） のミドル （プレ−Ｓ２ および Ｓ） または メジャー （Ｓ） 表面抗原との融合タンパク質として） （Ｉｎｃｈａｕｓｐｅ ｅｔ ａｌ． （１９９７） ＤＮＡ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． １６： １８５−１９５； Ｍａｊｏｒ ｅｔ ａｌ． （１９９５） Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６９： ５７９８−５８０５）； Ｃ 型肝炎ウイルス抗原： コアタンパク質 （ｐＣ）； Ｅ１ （ｐＥ１） および Ｅ２ （ｐＥ２） （単独または融合タンパク質として） （Ｓａｉｔｏ ｅｔ ａｌ． （１９９７） Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ １１２： １３２１−１３３０）；呼吸器合胞体ウイルス融合タンパク質 （ＰＦＰ−２） をコードする遺伝子 （Ｆａｌｓｅｙ ａｎｄ Ｗａｌｓｈ （１９９６） Ｖａｃｃｉｎｅ １４： １２１４−１２１８； Ｐｉｅｄｒａ ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ｐｅｄｉａｔｒ． Ｉｎｆｅｃｔ． Ｄｉｓ． Ｊ． １５： ２３−３１）； ロータウイルスの ＶＰ６ および ＶＰ７ 遺伝子 （Ｃｈｏｉ ｅｔ ａｌ． （１９９７） Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２３２： １２９−１３８； Ｊｉｎ ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ａｒｃｈ． Ｖｉｒｏｌ． １４１： ２０５７−２０７６）； ヒト乳頭腫ウイルスの Ｅ１， Ｅ２， Ｅ３， Ｅ４， Ｅ５， Ｅ６ および Ｅ７ タンパク質 （Ｂｒｏｗｎ ｅｔ ａｌ． （１９９４） Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２０１： ４６−５４； Ｄｉｌｌｎｅｒ ｅｔ ａｌ． （１９９５） Ｃａｎｃｅｒ Ｄｅｔｅｃｔ． Ｐｒｅｖ． １９： ３８１−３９３； Ｋｒｕｌ ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ． ４３： ４４−４８； Ｎａｋａｇａｗａ ｅｔ ａｌ． （１９９７） Ｊ． Ｉｎｆｅｃｔ． Ｄｉｓ． １７５： ９２７−９３１）； ヒト Ｔ−リンパ指向性ウイルス Ｉ 型 ｇａｇ タンパク質 （Ｐｏｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ． （１９９５） Ｊ． Ｍｅｄ． Ｖｉｒｏｌ． ４５： ４６９−４７４）； Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ ウイルス （ＥＢＶ） ｇｐ３４０ （Ｍａｃｋｅｔｔ ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ｊ． Ｍｅｄ． Ｖｉｒｏｌ． ５０： ２６３−２７１）； Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ ウイルス （ＥＢＶ） 潜伏膜タンパク質 ＬＭＰ２ （Ｌｅ��� ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ｅｕｒ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２６： １８７５−１８８３）； Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ ウイルス核抗原 １ および ２ （Ｃｈｅｎ ａｎｄ Ｃｏｏｐｅｒ （１９９６） Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７０： ４８４９−４８５３； Ｋｈａｎｎａ ｅｔ ａｌ． （１９９５） Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２１４： ６３３−６３７）； はしかウイルス核タンパク質 （Ｎ） （Ｆｏｏｋｓ ｅｔ ａｌ． （１９９５） Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２１０： ４５６−４６５）； およびサイトメガロウイルス糖タンパク質 ｇＢ （Ｍａｒｓｈａｌｌ ｅｔ ａｌ． （１９９４） Ｊ． Ｍｅｄ． Ｖｉｒｏｌ． ４３： ７７−８３） または糖タンパク質 ｇＨ （Ｒａｓｍｕｓｓｅｎ ｅｔ ａｌ． （１９９４） Ｊ． Ｉｎｆｅｃｔ． Ｄｉｓ． １７０： ６７３−６７７）。
【００７７】
寄生生物
寄生生物由来の抗原もまた、本発明にしたがって修飾可能である。これらには以下のものが含まれるがこれらに限定されない：
Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ ｍａｎｓｏｎｉ， Ｓ． ｈａｅｍａｔｏｂｉｕｍ または Ｓ． ｊａｐｏｎｉｃｕｍ における住血吸虫腸関連抗原 ＣＡＡ （循環性陽極抗原 （ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ａｎｏｄｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ）） および ＣＣＡ （循環性陰極抗原 （ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ｃａｔｈｏｄｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ）） （Ｄｅｅｌｄｅｒ ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ｐａｒａｓｉｔｏｌｏｇｙ １１２： ２１−３５）； 寄生生物 Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ ｍａｎｓｏｎｉ 由来の２つの別個の保護抗原から構成される複数抗原ペプチド （ＭＡＰ） （Ｆｅｒｒｕ ｅｔ ａｌ． （１９９７） Ｐａｒａｓｉｔｅ Ｉｍｍｕｎｏｌ． １９： １−１１）； Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ 寄生生物表面分子 （Ｌｅｚａｍａ−Ｄａｖｉｌａ （１９９７） Ａｒｃｈ． Ｍｅｄ． Ｒｅｓ． ２８： ４７−５３）； Ｌ． ｌｏａ の第三幼生期 （Ｌ３） 抗原 （Ａｋｕｅ ｅｔ ａｌ． （１９９７） Ｊ． Ｉｎｆｅｃｔ． Ｄｉｓ． １７５： １５８−６３）； Ｔｈｅｉｌｅｒｉａ ａｎｎｕｌａｔａ （Ｔａ） の ３０−および ３２−ｋＤａ 主要メロゾイト表面抗原をコードする遺伝子 Ｔａｍｓ１−１ および Ｔａｍｓ１−２ （ｄ’Ｏｌｉｖｅｉｒａ ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ｇｅｎｅ １７２： ３３−３９）； Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ メロゾイト表面抗原 １ または ２ （ａｌ−Ｙａｍａｎ ｅｔ ａｌ． （１９９５） Ｔｒａｎｓ． Ｒ． Ｓｏｃ． Ｔｒｏｐ． Ｍｅｄ． Ｈｙｇ． ８９： ５５５−５５９； Ｂｅｃｋ ｅｔ ａｌ． （１９９７） Ｊ． Ｉｎｆｅｃｔ． Ｄｉｓ． １７５： ９２１−９２６； Ｒｚｅｐｃｚｙｋ ｅｔ ａｌ． （１９９７） Ｉｎｆｅｃｔ． Ｉｍｍｕｎ． ６５： １０９８−１１００）； Ｐ． ｂｅｒｇｈｅｉ Ｔ−ヘルパーエピトープ ＫＱＩＲＤＳＩＴＥＥＷＳ を伴う、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｂｅｒｇｈｅｉ， （ＰＰＰＰＮＰＮＤ）２ および Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｙｏｅｌｉｉ， （ＱＧＰＧＡＰ）３ＱＧ， 由来の周囲スポロゾイト （ｃｉｒｃｕｍｓｐｏｒｏｚｏｉｔｅ） （ＣＳ） タンパク質を含む Ｂ−エピトープ （Ｒｅｅｄ ｅｔ ａｌ． （１９９７） Ｖａｃｃｉｎｅ １５： ４８２−４８８）； 寄生生活環の、スポロゾイト （周囲スポロゾイトタンパク質およびスポロゾイト表面タンパク質 ２）， 肝臓 （肝臓段階抗原 １）， 血液 （メロゾイト表面タンパク質 １， セリンリピート抗原， および頂端膜抗原 １）， および性的 （２５−ｋＤａ 性的段階抗原） 段階が単一 ＮＹＶＡＣ ゲノムに挿入され、ＮＹＶＡＣ−Ｐｆ７ が作成されることにより生じる ＮＹＶＡＣ−Ｐｆ７ にコードされる Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ 抗原 （Ｔｉｎｅ ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ｉｎｆｅｃｔ． Ｉｍｍｕｎ． ６４： ３８３３−３８４４）； Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ 抗原 Ｐｆｓ２３０ （Ｗｉｌｌｉａｍｓｏｎ ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ｍｏｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｐａｒａｓｉｔｏｌ． ７８： １６１−１６９）； Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ ） 頂端膜抗原 （ＡＭＡ−１） （Ｌａｌ ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ｉｎｆｅｃｔ． Ｉｍｍｕｎ． ６４： １０５４−１０５９）； Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ タンパク質 Ｐｆｓ２８ および Ｐｆｓ２５ （Ｄｕｆｆｙ ａｎｄ Ｋａｓｌｏｗ （１９９７） Ｉｎｆｅｃｔ． Ｉｍｍｕｎ． ６５： １１０９−１１１３）； Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ メロゾイト表面抗原， ＭＳＰ１ （Ｈｕｉ ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ｉｎｆｅｃｔ． Ｉｍｍｕｎ． ６４： １５０２−１５０９）； マラリア抗原 Ｐｆ３３２ （Ａｈｌｂｏｒｇ ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ８８： ６３０−６３５）； Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ 赤血球膜タンパク質 １ （Ｂａｒｕｃｈ ｅｔ ａｌ． （１９９５） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ’ｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９３： ３４９７−３５０２； Ｂａｒｕｃｈ ｅｔ ａｌ． （１９９５） Ｃｅｌｌ ８２： ７７−８７）； Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ メロゾイト表面抗原， ＰｆＭＳＰ−１ （Ｅｇａｎ ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ｊ． Ｉｎｆｅｃｔ． Ｄｉｓ． １７３： ７６５−７６９）； Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ 抗原 ＳＥＲＡ， ＥＢＡ−１７５， ＲＡＰ１ および ＲＡＰ２ （Ｒｉｌｅｙ （１９９７） Ｊ． Ｐｈａｒｍ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． ４９： ２１−２７）； Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ ｊａｐｏｎｉｃｕｍ パラミオシン （Ｓｊ９７） またはその断片 （Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ． （１９９５） Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ． ２１２： １０２９−１０３９）； および寄生生物中の Ｈｓｐ７０ （Ｍａｒｅｓｃａ ａｎｄ Ｋｏｂａｙａｓｈｉ （１９９４） Ｅｘｐｅｒｉｅｎｔｉａ ５０： １０６７−１０７４）。
【００７８】
アレルゲン抗原
本発明にしたがって修飾可能なアレルゲン抗原には、以下のものが含まれるがこれらの動物に限定されない：
ダニ （例えば Ｄｅｒｍａｔｏｐｈａｇｏｉｄｅｓ ｐｔｅｒｏｎｙｓｓｉｎｕｓ， Ｄｅｒｍａｔｏｐｈａｇｏｉｄｅｓ ｆａｒｉｎａｅ， Ｂｌｏｍｉａ ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）， 例えばアレルゲン ｄｅｒ ｐ１ （Ｓｃｏｂｉｅ ｅｔ ａｌ． （１９９４） Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． Ｔｒａｎｓ． ２２： ４４８Ｓ； Ｙｓｓｅｌ ｅｔ ａｌ． （１９９２） Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １４８： ７３８−７４５）， ｄｅｒ ｐ２ （Ｃｈｕａ ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ｃｌｉｎ． Ｅｘｐ． Ａｌｌｅｒｇｙ ２６： ８２９−８３７）， ｄｅｒ ｐ３ （Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｔｈｏｍａｓ （１９９６） Ｃｌｉｎ． Ｅｘｐ． Ａｌｌｅｒｇｙ ２６： ５７１−５７９）， ｄｅｒ ｐ５， ｄｅｒ ｐ Ｖ （Ｌｉｎ ｅｔ ａｌ． （１９９４） Ｊ． Ａｌｌｅｒｇｙ Ｃｌｉｎ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ９４： ９８９−９９６）， ｄｅｒ ｐ６ （Ｂｅｎｎｅｔｔ ａｎｄ Ｔｈｏｍａｓ （１９９６） Ｃｌｉｎ． Ｅｘｐ． Ａｌｌｅｒｇｙ ２６： １１５０−１１５４）， ｄｅｒ ｐ ７ （Ｓｈｅｎ ｅｔ ａｌ． （１９９５） Ｃｌｉｎ． Ｅｘｐ． Ａｌｌｅｒｇｙ ２５：　４１６−４２２）， ｄｅｒ ｆ２ （Ｙｕｕｋｉ ｅｔ ａｌ． （１９９７） Ｉｎｔ． Ａｒｃｈ． Ａｌｌｅｒｇｙ Ｉｍｍｕｎｏｌ． １１２： ４４−４８）， ｄｅｒ ｆ３ （Ｎｉｓｈｉｙａｍａ ｅｔ ａｌ． （１９９５） ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ． ３７７： ６２−６６）， ｄｅｒ ｆ７ （Ｓｈｅｎ ｅｔ ａｌ． （１９９５） Ｃｌｉｎ． Ｅｘｐ． Ａｌｌｅｒｇｙ ２５： １０００−１００６）； Ｍａｇ ３ （Ｆｕｊｉｋａｗａ ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ｍｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ３３： ３１１−３１９）．　Ａｌｓｏ ｏｆ ｉｎｔｅｒｅｓｔ ａｓ ａｎｔｉｇｅｎｓ ａｒｅ ｔｈｅ ｈｏｕｓｅ ｄｕｓｔ ｍｉｔｅ ａｌｌｅｒｇｅｎｓ Ｔｙｒ ｐ２ （Ｅｒｉｋｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ． （１９９８） Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２５１： ４４３−４４７）， Ｌｅｐ ｄ１ （Ｓｃｈｍｉｄｔ ｅｔ ａｌ． （１９９５） ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ． ３７０： １１−１４）， およびグルタチオン Ｓ−トランスフェラーゼ （Ｏ’Ｎｅｉｌｌ ｅｔ ａｌ． （１９９５） Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｌｅｔｔ． ４８： １０３−１０７）； グルタチオン Ｓ−トランスフェラーゼと相同性を有する ２５，５８９ Ｄａ， ２１９ アミノ酸ポリペプチド （Ｏ’Ｎｅｉｌｌ ｅｔ ａｌ． （１９９４） Ｂｉｏｃｈｉｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ． １２１９： ５２１−５２８）； Ｂｌｏ ｔ ５ （ＡｒｒｕＤａ ｅｔ ａｌ． （１９９５） Ｉｎｔ． Ａｒｃｈ． Ａｌｌｅｒｇｙ Ｉｍｍｕｎｏｌ． １０７： ４５６−４５７）； ミツバチ毒液ホスホリパーゼ Ａ２ （Ｃａｒｂａｌｌｉｄｏ ｅｔ ａｌ． （１９９４） Ｊ． Ａｌｌｅｒｇｙ Ｃｌｉｎ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ９３： ７５８−７６７； Ｊｕｔｅｌ ｅｔ ａｌ． （１９９５） Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５４： ４１８７−４１９４）； ウシ 真皮／鱗屑抗原 ＢＤＡ １１ （Ｒａｕｔｉａｉｎｅｎ ｅｔ ａｌ． （１９９５） Ｊ． Ｉｎｖｅｓｔ． Ｄｅｒｍａｔｏｌ． １０５： ６６０−６６３） および ＢＤＡ２０ （Ｍａｎｔｙｊａｒｖｉ ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ｊ． Ａｌｌｅｒｇｙ Ｃｌｉｎ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ９７： １２９７−１３０３）； 主要ウマアレルゲン Ｅｑｕ ｃ１ （Ｇｒｅｇ��ｉｒｅ ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７１： ３２９５１−３２９５９）； ミルメキア （Ｊｕｍｐｅｒ ａｎｔ） Ｍ． ｐｉｌｏｓｕｌａ アルレゲン Ｍｙｒ ｐ Ｉ およびその相同性アレルゲン性ポリペプチド Ｍｙｒ ｐ２ （Ｄｏｎｏｖａｎ ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． Ｉｎｔ． ３９： ８７７−８８５）； ダニ Ｂｌｏｍｉａ ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ の １−１３， １４， １６ ｋＤ アレルゲン （Ｃａｒａｂａｌｌｏ ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ｊ． Ａｌｌｅｒｇｙ Ｃｌｉｎ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ９８： ５７３−５７９）； ゴキブリアレルゲン Ｂｌａ ｇ Ｂｄ９０Ｋ （Ｈｅｌｍ ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ｊ． Ａｌｌｅｒｇｙ Ｃｌｉｎ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ９８： １７２−８０） および Ｂｌａ ｇ ２ （ＡｒｒｕＤａ ｅｔ ａｌ． （１９９５） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７０： １９５６３−１９５６８）； ゴキブリ Ｃｒ−ＰＩ アレルゲン （Ｗｕ ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７１： １７９３７−１７９４３）； フシアリ毒液アレルゲン， Ｓｏｌ ｉ ２ （Ｓｃｈｍｉｄｔ ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ｊ． Ａｌｌｅｒｇｙ Ｃｌｉｎ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ９８： ８２−８８）； 昆虫 Ｃｈｉｒｏｎｏｍｕｓ ｔｈｕｍｍｉ 主要アレルゲン Ｃｈｉ ｔ １−９ （Ｋｉｐｐ ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ｉｎｔ． Ａｒｃｈ． Ａｌｌｅｒｇｙ Ｉｍｍｕｎｏｌ． １１０： ３４８−３５３）； イヌアレルゲン Ｃａｎ ｆ １ またはネコアレルゲン Ｆｅｌ ｄ １ （Ｉｎｇｒａｍ ｅｔ ａｌ． （１９９５） Ｊ． Ａｌｌｅｒｇｙ Ｃｌｉｎ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ９６： ４４９−４５６）； 例えばウマ、イヌまたはネコ由来のアルブミン （Ｇｏｕｂｒａｎ Ｂｏｔｒｏｓ ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ８８： ３４０−３４７）； 分子量 ２２ ｋＤ， ２５ ｋＤ または ６０ ｋＤ のシカアレルゲン （Ｓｐｉｔｚａｕｅｒ ｅｔ ａｌ． （１９９７） Ｃｌｉｎ． Ｅｘｐ． Ａｌｌｅｒｇｙ ２７： １９６−２００）； および ウシの ２０ ｋｄ 主要アレルゲン （Ｙｌｏｎｅｎ ｅｔ ａｌ． （１９９４） Ｊ． Ａｌｌｅｒｇｙ Ｃｌｉｎ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ９３： ８５１−８５８）。
【００７９】
花粉および草アレルゲンもまた、本発明にしたがって修飾できる。このようなアレルゲンには、例えば以下のものが含まれる：
Ｈｏｒ ｖ９ （Ａｓｔｗｏｏｄ ａｎｄ Ｈｉｌｌ （１９９６） Ｇｅｎｅ １８２： ５３−６２， Ｌｉｇ ｖ１ （Ｂａｔａｎｅｒｏ ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ｃｌｉｎ． Ｅｘｐ． Ａｌｌｅｒｇｙ ２６： １４０１−１４１０）； Ｌｏｌ ｐ １ （Ｍｕｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ｉｎｔ． Ａｒｃｈ． Ａｌｌｅｒｇｙ Ｉｍｍｕｎｏｌ． １０９： ３５２−３５５）， Ｌｏｌ ｐ ＩＩ （Ｔａｍｂｏｒｉｎｉ ｅｔ ａｌ． （１９９５） Ｍｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ３２： ５０５−５１３）， Ｌｏｌ ｐＶＡ， Ｌｏｌ ｐＶＢ （Ｏｎｇ ｅｔ ａｌ． （１９９５） Ｍｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ３２： ２９５−３０２）， Ｌｏｌ ｐ ９ （Ｂｌａｈｅｒ ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ｊ． Ａｌｌｅｒｇｙ Ｃｌｉｎ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ９８： １２４−１３２）； Ｐａｒ Ｊ Ｉ （Ｃｏｓｔａ ｅｔ ａｌ． （１９９４） ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ． ３４１： １８２−１８６； Ｓａｌｌｕｓｔｏ ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ｊ． Ａｌｌｅｒｇｙ Ｃｌｉｎ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ９７： ６２７−６３７）， Ｐａｒ ｊ ２．０１０１ （Ｄｕｒｏ ｅｔ ａｌ． （１９９６） ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ． ３９９： ２９５−２９８）； Ｂｅｔ ｖ１ （Ｆａｂｅｒ ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７１： １９２４３−１９２５０）， Ｂｅｔ ｖ２ （Ｒｉｈｓ ｅｔ ａｌ． （１９９４） Ｉｎｔ． Ａｒｃｈ． Ａｌｌｅｒｇｙ Ｉｍｍｕｎｏｌ． １０５： １９０−１９４）； Ｄａｃ ｇ３ （Ｇｕｅｒｉｎ−Ｍａｒｃｈａｎｄ ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ｍｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ３３： ７９７−８０６）； Ｐｈｌ ｐ １ （Ｐｅｔｅｒｓｅｎ ｅｔ ａｌ． （１９９５） Ｊ． Ａｌｌｅｒｇｙ Ｃｌｉｎ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ９５： ９８７−９９４）， Ｐｈｌ ｐ ５ （Ｍｕｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ｉｎｔ． Ａｒｃｈ． Ａｌｌｅｒｇｙ Ｉｍｍｕｎｏｌ． １０９： ３５２−３５５）， Ｐｈｌ ｐ ６ （Ｐｅｔｅｒｓｅｎ ｅｔ ａｌ． （１９９５） Ｉｎｔ． Ａｒｃｈ． Ａｌｌｅｒｇｙ Ｉｍｍｕｎｏｌ． １０８： ５５−５９）； Ｃｒｙ ｊ Ｉ （Ｓｏｎｅ ｅｔ ａｌ． （１９９４） Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ． １９９： ６１９−６２５）， Ｃｒｙ ｊ ＩＩ （Ｎａｍｂａ ｅｔ ａｌ． （１９９４） ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ． ３５３： １２４−１２８）； Ｃｏｒ ａ １ （Ｓｃｈｅｎｋ ｅｔ ａｌ． （１９９４） Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２２４： ７１７−７２２）； ｃｙｎ ｄ１ （Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ｊ． Ａｌｌｅｒｇｙ Ｃｌｉｎ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ９８： ３３１−３４３）， ｃｙｎ ｄ７ （Ｓｕｐｈｉｏｇｌｕ ｅｔ ａｌ． （１９９７） ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ． ４０２： １６７−１７２）； Ｐｈａ ａ １ および Ｐｈａ ａ ５ のイソ型 （Ｓｕｐｈｉｏｇｌｕ ａｎｄ Ｓｉｎｇｈ （１９９５） Ｃｌｉｎ． Ｅｘｐ． Ａｌｌｅｒｇｙ ２５： ８５３−８６５）； Ｃｈａ ｏ １ （Ｓｕｚｕｋｉ ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ｍｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ３３： ４５１−４６０）； 例えばオオアワガエリまたはシラカンバ花粉由来のプロフィリン （Ｖａｌｅｎｔａ ｅｔ ａｌ． （１９９４） Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ． １９９： １０６−１１８）； Ｐ０１４９ （Ｗ�� ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ３２： １０３７−１０４２）； Ｏｒｙ ｓ１ （Ｘｕ ｅｔ ａｌ． （１９９５） Ｇｅｎｅ １６４： ２５５−２５９）； および Ａｍｂ ａ Ｖ および Ａｍｂ ｔ ５ （Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ｍｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ３３： ８７３−８８０； Ｚｈｕ ｅｔ ａｌ． （１９９５） Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５５： ５０６４−５０７３）。
【００８０】
本発明にしたがって修飾可能な食品アレルゲンには、例えば以下のものが含まれる：
プロフィリン （Ｒｉｈｓ ｅｔ ａｌ． （１９９４） Ｉｎｔ． Ａｒｃｈ． Ａｌｌｅｒｇｙ Ｉｍｍｕｎｏｌ． １０５： １９０−１９４）； アルファ−アミラーゼ／トリプシンインヒビター遺伝子ファミリーに属するコメアレルゲン性 ｃＤＮＡｓ （Ａｌｖａｒｅｚ ｅｔ ａｌ． （１９９５） Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ １２５１： ２０１−２０４）； 主要オリーブアレルゲン， Ｏｌｅ ｅ Ｉ （Ｌｏｍｂａｒｄｅｒｏ ｅｔ ａｌ． （１９９４） Ｃｌｉｎ Ｅｘｐ Ａｌｌｅｒｇｙ ２４： ７６５−７７０）； アブラナ （ｍｕｓｔａｒｄ） 由来主要アレルゲン、Ｓｉｎ ａ １　（Ｇｏｎｚａｌｅｚ Ｄｅ Ｌａ Ｐｅｎａ ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ｅｕｒ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２３７： ８２７−８３２）；タイセイヨウサケの主要アレルゲン、パルブアルブミン （Ｌｉｎｄｓｔｒｏｍ ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ｓｃａｎｄ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ４４： ３３５−３４４）； リンゴアレルゲン， 例えば主要アレルゲン Ｍａｌ ｄ １ （Ｖａｎｅｋ−Ｋｒｅｂｉｔｚ ｅｔ ａｌ． （１９９５） Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ． ２１４： ５３８−５５１）； およびラッカセイアレルゲン， 例えば Ａｒａ ｈ Ｉ （Ｂｕｒｋｓ ｅｔ ａｌ． （１９９５） Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． ９６： １７１５−１７２１）。
【００８１】
本発明にしたがって修飾可能な真菌アレルゲンには以下のものが含まれるがこれらに限定されない：
Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ ｈｅｒｂａｒｕｍ のアレルゲン， Ｃｌａ ｈ ＩＩＩ （Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ． （１９９５） Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５４： ７１０−７１７）； 担子菌 Ｐｓｉｌｏｃｙｂｅ ｃｕｂｅｎｓｉｓ 由来のアレルゲン Ｐｓｉ ｃ ２， 真菌サイクロフィリン （Ｈｏｒｎｅｒ ｅｔ ａｌ． （１９９５） Ｉｎｔ． Ａｒｃｈ． Ａｌｌｅｒｇｙ Ｉｍｍｕｎｏｌ． １０７： ２９８−３００）； Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ ｈｅｒｂａｒｕｍ の ｃＤＮＡ ライブラリーからクローニングされた ｈｓｐ ７０ （Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ｃｌｉｎ Ｅｘｐ Ａｌｌｅｒｇｙ ２６： ８８−９５）； Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｎｏｔａｔｕｍ の ６８ ｋＤ アレルゲン （Ｓｈｅｎ ｅｔ ａｌ． （１９９５） Ｃｌｉｎ． Ｅｘｐ． Ａｌｌｅｒｇｙ ２６： ３５０−３５６）； アルデヒドデヒドロゲナーゼ （ＡＬＤＨ） （Ａｃｈａｔｚ ｅｔ ａｌ． （１９９５） Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ． ３２： ２１３−２２７）； エノラーゼ （Ａｃｈａｔｚ ｅｔ ａｌ． （１９９５） Ｍｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ３２： ２１３−２２７）； ＹＣＰ４ （Ｉｄ．）； 酸性リボソームタンパク質 Ｐ２ （Ｉｄ．）．
【００８２】
修飾可能な他のアレルゲンには、ラテックスアレルゲン， 例えば天然ラバーラテックス由来の主要アレルゲン （Ｈｅｖ ｂ ５） （Ａｋａｓａｗａ ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７１： ２５３８９−２５３９３； Ｓｌａｔｅｒ ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７１： ２５３９４−２５３９９） が含まれる。
【００８３】
自己免疫疾患および炎症性症状に関連する抗原
本発明にしたがって修飾可能な自己抗原には、以下のものが含まれるがこれらに限定されない：
ミエリン塩基性タンパク質 （Ｓｔｉｎｉｓｓｅｎ ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ｊ． Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． Ｒｅｓ． ４５： ５００−５１１） またはミエリン塩基性タンパク質融合タンパク質およびプロテオリピドタンパク質 （Ｅｌｌｉｏｔｔ ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． ９８： １６０２−１６１２）， プロテオリピドタンパク質 （ＰＬＰ）　（Ｒｏｓｅｎｅｒ ｅｔ ａｌ． （１９９７） Ｊ． Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ． ７５： ２８−３４）， ２’，３’−サイクリックヌクレオチド ３’−ホスホジエステラーゼ （ＣＮＰａｓｅ） （Ｒｏｓｅｎｅｒ ｅｔ ａｌ． （１９９７） Ｊ． Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ． ７５： ２８−３４）， Ｅｐｓｔｅｉｎ Ｂａｒｒ ウイルス核抗原−１ （ＥＢＮＡ−１） （Ｖａｕｇｈａｎ ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ｊ． Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ． ６９： ９５−１０２）， ＨＳＰ７０ （Ｓａｌｖｅｔｔｉ ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ｊ． Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ． ６５： １４３−５３； Ｆｅｌｄｍａｎｎ ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ｃｅｌｌ ８５： ３０７）。
【００８４】
本発明にしたがって修飾可能であり、強皮症、全身性硬化症， および全身性紅斑性狼蒼の処置に使用できる抗原には、例えば以下のものが含まれる：
（−２−ＧＰＩ， ５０ ｋＤａ 糖タンパク質 （Ｂｌａｎｋ ｅｔ ａｌ． （１９９４） Ｊ． Ａｕｔｏｉｍｍｕｎ． ７： ４４１−４５５）， Ｋｕ （ｐ７０／ｐ８０） 自己抗原， またはその ８０−ｋｄ サブユニットタンパク質 （Ｈｏｎｇ ｅｔ ａｌ． （１９９４） Ｉｎｖｅｓｔ． Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ． Ｖｉｓ． Ｓｃｉ． ３５： ４０２３−４０３０； Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ． （１９９４） Ｊ． Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ． １０７： ３２２３−３２３３）， 核自己抗原 Ｌａ （ＳＳ−Ｂ） および Ｒｏ （ＳＳ−Ａ） （Ｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ． （１９９７） Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １７： ２１２−２１９； Ｉｇａｒａｓｈｉ ｅｔ ａｌ． （１９９５） Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ ２２： ３３−４２； Ｋｅｅｃｈ ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ｃｌｉｎ． Ｅｘｐ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １０４： ２５５−２６３； Ｍａｎｏｕｓｓａｋｉｓ ｅｔ ａｌ． （１９９５） Ｊ． Ａｕｔｏｉｍｍｕｎ． ８： ９５９−９６９； Ｔｏｐｆｅｒ ｅｔ ａｌ． （１９９５） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ’ｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９２： ８７５−８７９）， プロテアソーム （−型サブユニット Ｃ９ （Ｆｅｉｓｔ ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １８４： １３１３−１３１８）， 強皮症抗原 Ｒｐｐ ３０， Ｒｐｐ ３８ または Ｓｃｌ−７０ （Ｅｄｅｒ ｅｔ ａｌ． （１９９７） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ’ｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９４： １１０１−１１０６； Ｈｉｅｔａｒｉｎｔａ ｅｔ ａｌ． （１９９４） Ｂｒ． Ｊ． Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ． ３３： ３２３−３２６）， 中心体自己抗原 ＰＣＭ−１ （Ｂａｏ ｅｔ ａｌ． （１９９５） Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ ２２： ２１９−２２８）， 多発性筋炎−強皮症自己抗原 （ＰＭ−Ｓｃｌ） （Ｋｈｏ ｅｔ ａｌ． （１９９７） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７２： １３４２６−１３４３１），強皮症 （および他の全身性自己免疫疾患） 自己抗原 ＣＥＮＰ−Ａ （Ｍｕｒｏ ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ｃｌｉｎ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ． ７８： ８６−８９）， Ｕ５， 小核リボヌクレオプロテイン （ｓｎＲＮＰ） （Ｏｋａｎｏ ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ｃｌｉｎ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ． ８１： ４１−４７）， ＰＭ−Ｓｃｌ 自己抗原の １００−ｋｄ タンパク質 （Ｇｅ ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ． ３９： １５８８−１５９５）， 核小体 Ｕ３− および Ｔｈ（７−２） リボヌクレオプロテイン （Ｖｅｒｈｅｉｊｅｎ ｅｔ ａｌ． （１９９４） Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ １６９： １７３−１８２）， リボソームタンパク質 Ｌ７ （Ｎｅｕ ｅｔ ａｌ． （１９９５） Ｃｌｉｎ． Ｅｘｐ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １００： １９８−２０４）， ｈＰｏｐ１ （Ｌｙｇｅｒｏｕ ｅｔ ａｌ． （１９９６） ＥＭＢＯ Ｊ． １５： ５９３６−５９４８）， および核基質抗原由来 ３６−ｋｄ タンパク質 （Ｄｅｎｇ ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ． ３９： １３００−１３０７）。
【００８５】
肝臓自己免疫障害の処置に有用な抗原もまた修飾できる；これらには、以下のものが含まれる：
シトクローム Ｐ４５０ および ＵＤＰ−グルクロノシル−トランスフェラーゼ （Ｏｂｅｒｍａｙｅｒ−Ｓｔｒａｕｂ ａｎｄ Ｍａｎｎｓ （１９９６） Ｂａｉｌｌｉｅｒｅｓ Ｃｌｉｎ． Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ． １０： ５０１−５３２）， シトクローム Ｐ４５０ ２Ｃ９ および Ｐ４５０ １Ａ２ （Ｂｏｕｒｄｉ ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ｃｈｅｍ． Ｒｅｓ． Ｔｏｘｉｃｏｌ． ９： １１５９−１１６６； Ｃｌｅｍｅｎｔｅ ｅｔ ａｌ． （１９９７） Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ． Ｍｅｔａｂ． ８２： １３５３−１３６１）， ＬＣ−１ 抗原 （Ｋｌｅｉｎ ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ｊ． Ｐｅｄｉａｔｒ． Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ． Ｎｕｔｒ． ２３： ４６１−４６５）， および ２３０−ｋＤａ ゴルジ−関連タンパク質 （Ｆｕｎａｋｉ ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ｃｅｌｌ Ｓｔｒｕｃｔ． Ｆｕｎｃｔ． ２１： ６３−７２）。
【００８６】
本発明にしたがって修飾可能な、皮膚の自己免疫障害の処置に有用な抗原には、以下のものが含まれるがこれらに限定されない：
４５０ ｋＤ ヒト上皮自己抗原 （Ｆｕｊｉｗａｒａ ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ｊ． Ｉｎｖｅｓｔ． Ｄｅｒｍａｔｏｌ． １０６： １１２５−１１３０）， ２３０ ｋＤ および １８０ ｋＤ 類天疱瘡抗原 （Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ （１９９５） Ｋｅｉｏ Ｊ． Ｍｅｄ． ４４： １１５−１２３； Ｍｕｒａｋａｍｉ ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ｊ． Ｄｅｒｍａｔｏｌ． Ｓｃｉ． １３： １１２−１１７）， 天疱瘡落葉状抗原 （デスモグレイン １）， 天疱瘡尋常性抗原 （デスモグレイン ３）， ＢＰＡｇ２， ＢＰＡｇ１， および ＶＩＩ 型コラーゲン （Ｂａｔｔｅｕｘ ｅｔ ａｌ． （１９９７） Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １７： ２２８−２３３； Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ｊ． Ｄｅｒｍａｔｏｌ． Ｓｃｉ． １２： １０−１７）， 瘢痕性天疱瘡患者の部分集団の １６８−ｋＤａ 粘膜抗原 （Ｇｈｏｈｅｓｔａｎｉ ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ｊ． Ｉｎｖｅｓｔ． Ｄｅｒｍａｔｏｌ． １０７： １３６−１３９）， および ２１８−ｋｄ 核タンパク質 （２１８−ｋｄ Ｍｉ−２） （Ｓｅｅｌｉｇ ｅｔ ａｌ． （１９９５） Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ． ３８： １３８９−１３９９）。
【００８７】
インシュリン依存性糖尿病の処置に関する抗原もまた修飾可能であり；これらには以下のものが含まれるが、これらに限定されない：
インシュリン， プロインシュリン， ＧＡＤ６５ および ＧＡＤ６７， 熱ショックタンパク質 ６５ （ｈｓｐ６５）， および島−細胞抗原 ６９ （ＩＣＡ６９） （Ｆｒｅｎｃｈ ｅｔ ａｌ． （１９９７） Ｄｉａｂｅｔｅｓ ４６： ３４−３９； Ｒｏｅｐ （１９９６） Ｄｉａｂｅｔｅｓ ４５： １１４７−１１５６； Ｓｃｈｌｏｏｔ ｅｔ ａｌ． （１９９７） Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ ４０： ３３２−３３８）， ＧＡＤ６５と相同なウイルスタンパク質 （Ｊｏｎｅｓ ａｎｄ Ｃｒｏｓｂｙ （１９９６） Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ ３９： １３１８−１３２４）， 島細胞抗原−関連タンパク質−チロシンホスファターゼ （ＰＴＰ） （Ｃｕｉ ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７１： ２４８１７−２４８２３）， ＧＭ２−１ ガングリオシド （Ｃａｖａｌｌｏ ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ｊ． Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ． １５０： １１３−１２０； Ｄｏｔｔａ ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ｄｉａｂｅｔｅｓ ４５： １１９３−１１９６）， グルタミン酸デカルボキシラーゼ （ＧＡＤ） （Ｎｅｐｏｍ （１９９５） Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ７： ８２５−８３０； Ｐａｎｉｎａ−Ｂｏｒｄｉｇｎｏｎ ｅｔ ａｌ． （１９９５） Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １８１： １９２３−１９２７）， 島細胞抗原 （ＩＣＡ６９） （Ｋａｒｇｅｓ ｅｔ ａｌ． （１９９７） Ｂｉｏｃｈｉｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ １３６０： ９７−１０１； Ｒｏｅｐ ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ｅｕｒ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２６： １２８５−１２８９）， Ｔｅｐ６９， 糖尿病患者由来のＴ細胞によって認識される単一 Ｔ 細胞エピトープ （Ｋａｒｇｅｓ ｅｔ ａｌ． （１９９７） Ｂｉｏｃｈｉｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ １３６０： ９７−１０１）， ＩＣＡ ５１２， Ｉ 型糖尿病の自己抗原 （Ｓｏｌｉｍｅｎａ ｅｔ ａｌ． （１９９６） ＥＭＢＯ Ｊ． １５： ２１０２−２１１４）， １ 型糖尿病における、島−細胞タンパク質チロシンホスファターゼおよびそれ由来の ３７−ｋＤａ 自己抗原 （ＩＡ−２， ＩＡ−２ を含む） （Ｌａ Ｇａｓｓｅ ｅｔ ａｌ． （１９９７） Ｍｏｌ． Ｍｅｄ． ３： １６３−１７３）， 島細胞表面抗体 （ＩＣＳＡ） を有する患者由来の血清を用いて免疫沈降された Ｉｎ−１１１ 細胞またはヒト甲状腺濾胞細胞由来の６４ ｋＤａ タンパク質 （Ｉｇａｗａ ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ｅｎｄｏｃｒ． Ｊ． ４３： ２９９−３０６）， フォグリン （ｐｈｏｇｒｉｎ）， ヒト貫膜タンパク質チロシンホスファターゼの相同体， １ 型糖尿病の自己抗原 （Ｋａｗａｓａｋｉ ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ． ２２７： ４４０−４４７）， ＩＤＤＭ における ４０ ｋＤａ および ３７ ｋＤａ トリプシン断片およびその前駆体 ＩＡ−２ および ＩＡ−２ （Ｌａｍｐａｓｏｎａ ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５７： ２７０７−２７１１； Ｎｏｔｋｉｎｓ ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ｊ． Ａｕｔｏｉｍｍｕｎ． ９： ６７７−６８２）， インシュリンまたはコレラトキソイド−インシュリンポリペプチド （Ｂｅｒｇｅｒｏｔ ｅｔ ａｌ． （１９９７） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ’ｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９４��� ４６１０−４６１４）， カルボキシペプチダーゼ Ｈ， ｇｐ３３０ のヒト相同体（これは、ラットの Ｈｅｙｍａｎｎ 腎炎の誘発に関与する腎上皮糖タンパク質である）および ３８−ｋＤ 島ミトコンドリア自己抗原 （Ａｒｄｅｎ ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． ９７： ５５１−５６１。
【００８８】
本発明にしたがって修飾可能な間接リウマチに関する有用な抗原には、以下のものが含まれるが、これらに限定されない：
４５ ｋＤａ ＤＥＫ 核抗原， 特に若年発症間接リウマチおよび虹彩毛様体炎 （Ｍｕｒｒａｙ ｅｔ ａｌ． （１９９７） Ｊ． Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ． ２４： ５６０−５６７）， ヒト軟骨糖タンパク質−３９， 間接リウマチにおける自己抗原 （Ｖｅｒｈｅｉｊｄｅｎ ｅｔ ａｌ． （１９９７） Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ． ４０： １１１５−１１２５）， 間接リウマチにおける ６８ｋ 自己抗原 （Ｂｌａｓｓ ｅｔ ａｌ． （１９９７） Ａｎｎ． Ｒｈｅｕｍ． Ｄｉｓ． ５６： ３１７−３２２）， コラーゲン （Ｒｏｓｌｏｎｉｅｃ ｅｔ ａｌ． （１９９５） Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５５： ４５０４−４５１１）， ＩＩ 型コラーゲン （Ｃｏｏｋ ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ． ３９： １７２０−１７２７； Ｔｒｅｎｔｈａｍ （１９９６） Ａｎｎ． Ｎ． Ｙ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ７７８： ３０６−３１４）， 軟骨連結タンパク質 （Ｇｕｅｒａｓｓｉｍｏｖ ｅｔ ａｌ． （１９９７） Ｊ． Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ． ２４： ９５９−９６４）， エズリン， ラディキシンおよびモエシン（これらは間接リウマチにおける自己免疫抗原である）（Ｗａｇａｔｓｕｍａ ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ｍｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ３３： １１７１−１１７６）， および 放線菌熱ショックタンパク質 ６５ （Ｒａｇｎｏ ｅｔ ａｌ． （１９９７） Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ． ４０： ２７７−２８３）。
【００８９】
修飾可能な自己免疫甲状腺障害の処置に有用な抗原には、例えば以下のものが含まれる：
甲状腺ペルオキシダーゼおよび甲状腺刺激ホルモンレセプター （Ｔａｎｄｏｎ ａｎｄ Ｗｅｅｔｍａｎ （１９９４） Ｊ． Ｒ． Ｃｏｌｌ． Ｐｈｙｓｉｃｉａｎｓ Ｌｏｎｄ． ２８： １０−１８）， ヒトグレーブス甲状腺組織由来の甲状腺ペルオキシダーゼ （ＧａｒＤａｓ ｅｔ ａｌ． （１９９７） Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ． ２３４： ３６６−３７０； Ｚｉｍｍｅｒ ｅｔ ａｌ． （１９９７） Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． １０７： １１５−１２０）， 甲状腺関連眼障害に付随する ６４−ｋＤａ 抗原 （Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ｃｌｉｎ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ． ８０： ２３６−２４４）， ヒト ＴＳＨ レセプター （Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ｊ． Ｍｏｌ． Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ． １６： １５９−１７０）， および島細胞表面抗体 （ＩＣＳＡ） を有する患者由来の血清を用いて免疫沈降された Ｉｎ−１１１ 細胞またはヒト甲状腺濾胞細胞由来の ６４ ｋＤａ タンパク質 （Ｉｇａｗａ ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ｅｎｄｏｃｒ． Ｊ． ４３： ２９９−３０６）。
【００９０】
修飾可能な、他の関連する抗原には以下のものが含まれるがこれれに限定されない：
Ｓｊｏｇｒｅｎ 症候群 （−ｆｏｄｒｉｎ； Ｈａｎｅｊｉ ｅｔ ａｌ． （１９９７） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７６： ６０４−６０７），重症筋無力症 （ヒト Ｍ２ アセチルコリンレセプターまたはその断片， 特にヒト Ｍ２ アセチルコリンレセプターの第二の細胞外ループ； Ｆｕ ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ｃｌｉｎ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ． ７８： ２０３−２０７）， ビチリゴ （ｖｉｔｉｌｉｇｏ） （チロシナーゼ； Ｆｉｓｈｍａｎ ｅｔ ａｌ． （１９９７） Ｃａｎｃｅｒ ７９： １４６１−１４６４）， ｂｙ ｓｅｒｕｍ ｆｒｏｍ ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ ｗｉｔｈ疱疹皮膚疾患， および潰瘍性大腸炎を有する個体由来の血清によって認識される ４５０ ｋＤ ヒト上皮自己抗原 （染色体タンパク質 ＨＭＧ１ および ＨＭＧ２； Ｓｏｂａｊｉｍａ ｅｔ ａｌ． （１９９７） Ｃｌｉｎ． Ｅｘｐ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １０７： １３５−１４０）。
【００９１】
精子抗原
遺伝的ワクチンにおいて使用可能な精子抗原には、例えば以下のものが含まれる：
乳酸デヒドロゲナーゼ （ＬＤＨ−Ｃ４）， ガラクトシルトランスフェラーゼ （ＧＴ）， ＳＰ−１０， ウサギ精子自己抗原 （ＲＳＡ）， モルモット （ｇ）ＰＨ−２０， 分解シグナルタンパク質 （ＣＳ−１）， ＨＳＡ−６３， ヒト （ｈ）ＰＨ−２０， および ＡｇＸ−１ （Ｚｈｕ ａｎｄ Ｎａｚ （１９９４） Ａｒｃｈ． Ａｎｄｒｏｌ． ３３： １４１−１４４）， 合成精子ペプチド， Ｐ１０Ｇ （Ｏ’Ｒａｎｄ ｅｔ ａｌ． （１９９３） Ｊ． Ｒｅｐｒｏｄ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２５： ８９−１０２）， 精子の １３５ｋＤ， ９５ｋＤ， ６５ｋＤ， ４７ｋＤ， ４１ｋＤ および ２３ｋＤ タンパク質， および ＦＡ−１ 抗原 （Ｎａｚ ｅｔ ａｌ． （１９９５） Ａｒｃｈ． Ａｎｄｒｏｌ． ３５： ２２５−２３１）， およびサイトケラチン １ の ３５ ｋＤ 断片 （Ｌｕｃａｓ ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． １６： ２４９３−２４９６）。
【００９２】
また、抗原の例は以下に記載されている：
Ｐｕｎｎｏｎｅｎ ｅｔ ａｌ． （１９９９） ＷＯ ９９／４１３６９； Ｐｕｎｎｏｎｅｎ ｅｔ ａｌ． （１９９９） ＷＯ ９９／４１３８３； Ｐｕｎｎｏｎｅｎ ｅｔ ａｌ． （１９９９） ＷＯ ９９／４１３６８； ａｎｄ Ｐｕｎｎｏｎｅｎ ｅｔ ａｌ． （１９９９） ＷＯ ９９／４１４０２）（これらすべての全開示内容は、すべての目的に関して、引用により本明細書中に包含される）。他の有用な抗原は文献中に記載されているか、あるいはゲノム科学アプローチを用いて発見できる。
【００９３】
ペプチド付加
このペプチド付加の原理では、Ｘは、単一アミノ酸残基から大きなタンパク質、例えば成熟タンパク質までの範囲の任意の一連のアミノ酸残基であり得る。通常、このペプチド付加物Ｘは１〜５００アミノ酸残基、例えば２〜５００、通常２〜５０または３〜５０アミノ酸残基、例えば３〜２０アミノ酸残基を含む。あるポリペプチドの修飾に用いられるべきペプチド付加物の長さは、目的のポリペプチドのタイプおよびこの修飾によって達成される所望の作用を含む多数の要因に基づいて決定される。通常、ペプチド付加物は、天然完全長ポリペプチドのアミノ酸配列と、９０％より低い同一性、特に８０％より低い同一性、例えば７０％より低い同一性またはさらに低い程度の同一性ですらを有する。一態様では、ペプチド付加物は完全長タンパク質の部分（例えばその１〜５０アミノ酸残基）を構成するものであり得る。
【００９４】
ペプチド付加物は、例えば以下の方法段落にさらに詳細に概説されているように、部位特異的アプローチまたはランダムアプローチによって設計することができる。この段落にはまた、本発明において使用するためのペプチド付加物の調製に有用な一組のガイドラインが記載されている。これらのガイドラインは、例示目的のみを意図するものであり、当業者はペプチド付加物の設計に関する有用な代替の経路に気づくであろうことが理解されよう。したがって、本明細書中で使用するためのペプチド付加物の設計方法は材料段落において記載されているものに限定されるべきものではない。
【００９５】
グリコシル化部位の数は、所望の作用を提供するのに十分であるべきである。典型的には、ペプチド付加物Ｘは、１〜２０、例えば１〜１０のグリコシル化部位を含む。例えばペプチド付加物Ｘは、１，２，３，４，５，６，７，８，９または１０のグリコシル化部位を含む。例えばヒトタンパク質のアミノ酸配列を修飾した場合に頻繁に生じる結果は、そのような修飾によって新規エピトープが創出されることであることは周知である。ペプチド付加によって創出された任意の新規エピトープを保護するために、配列に導入されたすべてのエピトープの保護を可能にするのに十分なグリコシル化部位が存在することが望ましい。これは、例えば、ペプチド付加物Ｘが、一連の３０連続アミノ酸残基内に少なくとも１のグリコシル化部位を含む場合、例えば２０アミノ酸残基内に少なくとも１のグリコシル化部位または１０アミノ酸残基内に少なくとも１のグリコシル化部位、特にペプチド付加物Ｘの一連の１０連続アミノ酸残基内に１〜３グリコシル化部位を含む場合に達成される。
【００９６】
したがって、一態様では、ペプチド付加物Ｘは少なくとも２のグリコシル化部位を含み、ここに、該部位の２つが最大１０アミノ酸残基で分離されていて、そこにはグリコシル化部位が含まれない。さらに、ポリペプチドＰｐは少なくとも１の導入グリコシル化部位、特に１〜５の導入グリコシル化部位を含むことができる。同様に、ポリペプチドＰｐは少なくとも１の除去されるグリコシル化部位、特に１〜５の除去されるグリコシル化部位を含む。
【００９７】
ペプチド付加物のグリコシル化部位は、インビボまたはインビトログリコシル化部位であってよい。好ましくは、グリコシル化部位はインビボグリコシル化部位、特にＮ−グリコシル化部位である。これはこのような部位のグリコシル化が、Ｏ−グリコシル化部位より、制御が容易であるためである。したがって、好ましい態様では、ペプチド付加物Ｘは少なくとも１のＮ−グリコシル化部位を含む、典型的には少なくとも２のＮ−グリコシル化部位を含む。例えばペプチド付加物Ｘは構造式：Ｘ１−Ｎ−Ｘ２−［Ｔ／Ｓ］／Ｃ−Ｚ（式中、Ｘ１は、少なくとも１アミノ酸残基を含むペプチドであるか、あるいは不存在であり、Ｘ２は、Ｐｒｏ以外の任意のアミノ酸残基であり、ならびにＺは不存在であるか、あるいは少なくとも１のアミノ酸残基を有するペプチドである）を有する。例えばＸ１は不存在であり、Ｘ２は、Ｉ、Ａ、Ｇ、ＶおよびＳ（これらは比較的小さいアミノ酸残基）からなる群から選択されるアミノ酸残基であり、ならびにＺは少なくとも１のアミノ酸残基を含む。
【００９８】
例えばＺは１〜５０アミノ酸残基および、例えば１〜１０グリコシル化部位を含むペプチドであり得る。
【００９９】
本発明の別のポリペプチドでは、Ｘ１は少なくとも１のアミノ酸残基、例えば１〜５０アミノ酸残基を含み、Ｘ２は、Ｉ、Ａ、Ｇ、ＶおよびＳからなる群から選択されるアミノ酸残基であり、ならびにＺは不存在である。例えばＸ１は１〜１０グリコシル化部位を含む。例えば本発明で使用するためのペプチド付加物は以下からなる群から選択されるペプチド配列を含み得る：
ＩＮＡ［Ｔ／Ｓ］， ＧＮＩ［Ｔ／Ｓ］， ＶＮＩ［Ｔ／Ｓ］， ＳＮＩ［Ｔ／Ｓ］， ＡＳＮＩ［Ｔ／Ｓ］， ＮＩ［Ｔ／Ｓ］， ＳＰＩＮＡ［Ｔ／Ｓ］， ＡＳＰＩＮＡ［Ｔ／Ｓ］， ＡＮＩ［Ｔ／Ｓ］ＡＮＩ［Ｔ／Ｓ］ＡＮＩ， ＡＮＩ［Ｔ／Ｓ］ＧＳＮＩ［Ｔ／Ｓ］ＧＳＮＩ［Ｔ／Ｓ］， ＦＮＩ［Ｔ／Ｓ］ＶＮＩ［Ｔ／Ｓ］Ｖ
ＹＮＩ［Ｔ／Ｓ］ＶＮＩ［Ｔ／Ｓ］Ｖ， ＡＦＮＩ［Ｔ／Ｓ］ＶＮＩ［Ｔ／Ｓ］Ｖ， ＡＹＮＩ［Ｔ／Ｓ］ＶＮＩ［Ｔ／Ｓ］Ｖ， ＡＰＮＤ［Ｔ／Ｓ］ＶＮＩ［Ｔ／Ｓ］Ｖ， ＡＮＩ［Ｔ／Ｓ］， ＡＳＮＳ［Ｔ／Ｓ］ＮＮＧ［Ｔ／Ｓ］ＬＮＡ［Ｔ／Ｓ］， ＡＮＨ［Ｔ／Ｓ］ＮＥ［Ｔ／Ｓ］ＮＡ［Ｔ／Ｓ］， ＧＳＰＩＮＡ［Ｔ／Ｓ］， ＡＳＰＩＮＡ［Ｔ／Ｓ］ＳＰＩＮＡ［Ｔ／Ｓ］， ＡＮＮ［Ｔ／Ｓ］ＮＹ［Ｔ／Ｓ］ＮＷ［Ｔ／Ｓ］， ＡＴＮＩ［Ｔ／Ｓ］ＬＮＹ［Ｔ／Ｓ］ＡＮ［Ｔ／Ｓ］Ｔ， ＡＡＮＳ［Ｔ／Ｓ］ＧＮＩ［Ｔ／Ｓ］ＩＮＧ［Ｔ／Ｓ］， ＡＶＮＷ［Ｔ／Ｓ］ＳＮＤ［Ｔ／Ｓ］ＳＮＳ［Ｔ／Ｓ］， ＧＮＡ［Ｔ／Ｓ］， ＡＶＮＷ［Ｔ／Ｓ］ＳＮＤ［Ｔ／Ｓ］ＳＮＳ［Ｔ／Ｓ］， ＡＮＮ［Ｔ／Ｓ］ＮＹ［Ｔ／Ｓ］ＮＳ［Ｔ／Ｓ］， ＡＮＮＴＮＹＴＮＷＴ， ＡＮＩ［Ｔ／Ｓ］ＶＮＩ［Ｔ／Ｓ］Ｖ， ＮＤ［Ｔ／Ｓ］ＶＮＦ［Ｔ／Ｓ］ および ＮＩ［Ｔ／Ｓ］ＶＮＩ［Ｔ／Ｓ］Ｖ
（ここに［Ｔ／Ｓ］はＴまたはＳ残基のいずれか、好ましくはＴ残基である）。他の非限定的な例には、配列：ＮＳＴＱＮＡＴＡ（これはヒトカルシウム活性化チャネル２前駆体の第２３１位〜第２３８位に相当する（２Ｎ−グリコシル化部位を追加する））、または配列：ＡＮＬＴＶＲＮＬＴＲＮＶＴＶ（これはヒトＧタンパク質共役レセプター６４の第５３８位〜第５５１位に相当する（３Ｎ−グリコシル化部位を追加する））を含むペプチド付加物が含まれる。
【０１００】
ペプチド付加物は１またはそれ以上のこれらのペプチド配列、すなわち、互いに直接連結されているか、あるいは１またはそれ以上のアミノ酸残基で分離されている少なくとも２の該配列を含むか、あるいは２またはそれ以上コピーの任意のこれらのペプチド配列を含有し得る。上記特定配列が例示目的のために提供され、したがって本発明において使用するペプチド配列の排他的なリストを構成するものではないことが理解されよう。
【０１０１】
より具体的な態様では、ペプチド付加物Ｘは以下からなる群から選択される：ＩＮＡ［Ｔ／Ｓ］， ＧＮＩ［Ｔ／Ｓ］， ＶＮＩ［Ｔ／Ｓ］， ＳＮＩ［Ｔ／Ｓ］， ＡＳＮＩ［Ｔ／Ｓ］， ＮＩ［Ｔ／Ｓ］， ＳＰＩＮＡ［Ｔ／Ｓ］， ＡＳＰＩＮＡ［Ｔ／Ｓ］， ＡＮＩ［Ｔ／Ｓ］ＡＮＩ［Ｔ／Ｓ］ＡＮＩ， および ＡＮＩ［Ｔ／Ｓ］ＧＳＮＩ［Ｔ／Ｓ］ＧＳＮＩ［Ｔ／Ｓ］
（ここに、［Ｔ／Ｓ］はＴまたはＳ残基のいずれかであり、好ましくはＴ残基である）。
【０１０２】
上にさらに記載されるように、ポリペプチドＰｐは、１またはそれ以上のグリコシル化部位を含んでいてもいなくてもよい天然ポリペプチドであり得る。（ポリペプチドに結合したオリゴサッカライド部分の数に関して）目的ポリペプチドＰｐのグリコシル化部位をさらに修飾するために、ポリペプチドＰｐは、少なくとも１の導入されたか、あるいは除去されたグリコシル化部位において異なる該天然ポリペプチドの変異体であってよい。
【０１０３】
例えば、ポリペプチドＰｐは少なくとも１の導入されたグリコシル化部位、特に１〜５の導入されたグリコシル化部位、例えば２〜５の導入されたグリコシル化部位を含む。
【０１０４】
目的ポリペプチドのトータルのグリコシル化に影響するために、グリコシル化部位は、活性形態でフォールディングされた場合に、該グリコシル化部位のＮ残基がポリペプチドの表面に曝露されるように導入される。同様に、除去されるグリコシル化部位は、ポリペプチドの表面に曝露されるＮ残基を有するものから選択される。
【０１０５】
一態様では、ペプチド付加物Ｘは、第−２位または第−１位にＮ残基を有し、ポリペプチドＰｐまたはＰｘは、それぞれ、第＋１位または第＋２位にＴまたはＳ残基を有し、この残基の番号付けはＰｐまたはＰｘのＮ末端アミノ酸残基との関連で施され、それによりＮ−グリコシル化部位が形成される。
【０１０６】
グリコシル化
本発明のポリペプチドはグリコシル化され（すなわちインビボ結合Ｎ−またはＯ−連結オリゴサッカライド部分またはインビトロ結合オリゴサッカライド部分を含み）、さらに、ポリペプチドＰｐと比較して変更されたグリコシル化プロファイルを有する。例えば、変更されたグリコシル化プロファイルは、変更された、通常、増大した、数の結合オリゴサッカライド部分および／または変更された結合オリゴサッカライドの型または分布ゆえに生じるものである。
【０１０７】
さらに、治療的使用または獣医学的使用、あるいはこれらとは別の方法でヒトまたは動物が曝露されることを意図されるポリペプチドに関して、結合されるオリゴサッカライド部分の型は、通常、ポリペプチドＰｐと比較した場合にこのポリペプチドの増大した免疫原性を生じさせないものであるべきである。オリゴサッカライド部分のカップリングはインビボまたはインビトロで生じ得る。インビボグリコシル化を行うためには、このポリペプチドをコードするヌクレオチド配列をグリコシル化、真核生物発現宿主内に挿入すべきである。発現宿主細胞は真菌（糸状真菌または酵母）、昆虫、哺乳類細胞またはトランスジェニック植物細胞から選択することができる。これについては「本発明のポリペプチドの調製方法」と題される段落にさらに詳細に開示されている。また、遺伝子治療において本発明のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列が用いられる場合、グリコシル化はヒト体内においても行うことができる。
【０１０８】
インビトログリコシル化は、種々の異なる化学、例えばＰＥＧをタンパク質に結合させる場合に用いられる化学を用いて、化学的に合成されたオリゴサッカライド構造物をポリペプチドに結合させることによって行うことができ、ここではオリゴサッカライドは、任意的に短いスペーサーを介して官能基に連結されている（非オリゴサッカライド高分子部分へのコンジュゲートと題される段落を参照のこと）。インビトログリコシル化はｐＨ４〜７、タンパク質濃度０．５〜２ｍｇ／ｍＬおよび容量０．０２〜２ｍＬの適当なバッファー中で行うことができる。活性化されたマンノース化合物は２〜２００倍モル過剰で存在し、反応物は４〜２５℃で０．１〜３時間インキュベートされる。インビトログリコシル化ＧＣＢはポリペプチドは透析および標準的クロマトグラフィー技術によって精製される。
【０１０９】
他のインビトログリコシル化法は、例えば ＷＯ ８７／０５３３０， Ａｐｌｉｎ ｅｔｌ ａｌ．， ＣＲＣ Ｃｒｉｔ Ｒｅｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， ｐｐ． ２５９−３０６， １９８１， Ｌｕｎｄｂｌａｄ ａｎｄ Ｎｏｙｅｓ， Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒａｇｅｎｔｓ ｆｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ， ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ． Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ， ＦＩ， Ｙａｎ ａｎｄ Ｗｏｌｄ， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， １９８４， Ｊｕｌ． ３１： ２３（１６）： ３７５９−６５， および Ｄｏｅｂｂｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２５７， ｐｐ２１９３−２１９９， １９８２ に記載されている。
【０１１０】
さらに、タンパク質−およびペプチド−結合Ｇｌｎ残基へのインビトログリコシル化は、トランスグルタミナーゼ（ＴＧａｓｅｓ）によって行うことができる。トランスグルタミナーゼは、いわゆる架橋反応において、ドナーアミン基の、タンパク質−およびペプチド−結合Ｇｌｎ残基への転移を触媒する。ドナーアミン基は、タンパク質−またはペプチド−結合型、例えばリシン残基のε−アミノ−基であってよく、あるいは小さい有機分子または大きい有機分子の部分であってもよい。ＴＧａｓｅが触媒する架橋においてアミノドナーとして機能する小さい有機分子はプトレシン（１，４−ジアミノブタン）である。ＴＧａｓｅが触媒する架橋においてアミノドナーとして機能する大きい有機分子はアミノ含有ＰＥＧである（Ｓａｔｏ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３５， １９９６， １３０７２−１３０８０）。
【０１１１】
ＴＧａｓｅは、概して、高度に特異的な酵素であり、タンパク質表面に曝露されているすべてのＧｌｎ残基が、アミノ含有物質へのＴＧａｓｅが触媒する架橋に利用されるわけではない。タンパク質が、ＴＧａｓｅが触媒する架橋を受けるようにするために、ＴＧａｓｅ基質として非常に良好に機能することが既知である一連のアミノ酸配列を、ＧＣＢポリペプチドをコードするアミノ酸配列中の都合良い位置に挿入する。いくつかのアミノ酸配列、例えば物質Ｐ、エラフィン、フィブリノーゲン、フィブロネクチン、α２−プラスミンインヒビター、α−カゼイン、およびβ−カゼインが優秀な天然ＴＧａｓｅ基質としてか、あるいはそれを含有するものとして既知であり、したがってこれらは本発明のポリペプチドのアミノ酸配列に挿入され、その一部を構成することができる。
【０１１２】
本発明のグリコシル化されたポリペプチドのオリゴヌクレオチド部分の性質および数は、当分野に既知の多数の種々の方法、例えばレクチン結合実験 （Ｒｅｄｄｙ ｅｔ ａｌ．， １９８５， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｍｅｄ． ３３： ２００−２１０； Ｃｕｍｍｉｎｇｓ， １９９４， Ｍｅｔｈ． Ｅｎｚｙｍｏｌ． ２３０： ６６−８６； Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ （Ｗａｌｋｅｒ ｅｄ．）， １９９８， ｃｈａｐｔｅｒ ９）； 放出オリゴサッカライドの試薬アレイ分析法 （ＲＡＡＭ） 配列決定 （Ｅｄｇｅ ｅｔ ａｌ．， １９９２， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８９： ６３３８−６３４２； Ｐｒｉｍｅ ｅｔ ａｌ．， １９９６， Ｊ． Ｃｈｒｏｍ． Ａ ７２０： ２６３−２７４）； 質量分析法と組み合わされた 放出オリゴサッカライドの ＲＡＡＭ 配列決定 （Ｋｌａｕｓｅｎ， ｅｔ ａｌ．， １９９８， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　９： １９５−２０４）； またはタンパク質分解、ＨＰＬＣ による糖ペプチド精製、エキソグリコシダーゼ分解、および質量分析の組み合わせ （Ｋｒｏｇｈ ｅｔ ａｌ， １９９７， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２４４： ３３４−３４２） によって決定され得る。グリコシル化プロファイルを決定するための特定の方法は、本明細書中以下の実施例段落に記載されている。通常、本発明のグリコシル化ポリペプチドは１〜１５のオリゴサッカライド部分、例えば１〜１０または１〜６オリゴサッカライド部分を含む。通常、これらの少なくとも１つはペプチド付加物に結合され、さらにオリゴサッカライド構造はペプチド付加物またはポリペプチドＰｐに結合されている。
【０１１３】
第二の非ペプチド部分とコンジュゲートされた本発明のポリペプチド
本発明のグリコシル化ポリペプチドは、少なくとも１の第二の非ペプチド部分をさらに含むことが有益であり得る。用語「第二の非ペプチド部分」とは、オリゴサッカライド部分とは異なる非ペプチド部分、例えばポリマー分子、親油性化合物および有機誘導体化物質を示すことを意図するものである。
【０１１４】
この目的のため、ポリペプチドは、第二の非ペプチド部分用の少なくとも１の結合基を含まなければならない。この結合基は、例えば、本発明ポリペプチドのＮ末端またはＣ末端アミノ酸残基、リシン、システイン、アルギニン、グルタミン、アスパラギン酸、グルタミン酸、セリン、チロシン、ヒスチジン、フェニルアラニンおよびトリプトファンからなる群から選択されるアミノ酸残基上、またはポリペプチドに結合したオリゴサッカライド上に存在するものであってよい。例えば、非ペプチド部分に関する結合基はイプシロン−アミノ基である。
【０１１５】
第二の非ペプチド部分に関する結合基は、Ｎ末端ペプチド付加（ポリペプチドＰｐ内）および／またはＣ末端ペプチド付加（これはペプチド付加物Ｘに関して上に記載のものと同様の性質を有する）によって提供されることが理解されよう。一態様では、結合部位を含むか、あるいはそれに関与するペプチド付加物Ｘは、第二の非ペプチド部分に関する結合基をさらに含む。例えば、このペプチド付加物は、第二の非ペプチド部分に関する１〜２０、例えば１〜１０結合基を含んでいてもよい。このような結合基は、グリコシル化部位に関してすぐ上に異彩されているのと同様に分布し得るものである。また、ペプチド付加物Ｘは、第二の非ペプチド部分に関する少なくとも２の結合基を含み得る。
【０１１６】
また、ポリペプチドＰｐは、天然ポリペプチドと比較して、第二非ペプチド部分に関する少なくとも１の導入された結合基、および／または、少なくとも１の除去された結合基を含む天然ポリペプチドの変異体であってよい。例えば、ポリペプチドＰｐは少なくとも１の導入された結合基、特に１〜５の導入された結合基、例えば２〜５の導入された結合基を含む。
【０１１７】
結合基は、好ましくは、フォールディングされたタンパク質の表面に曝露されえている部位に位置し、ポリマー分子へのコンジュゲートに利用可能なものである。例えば、１またはそれ以上のポリマー分子への結合は、ポリペプチドの分子量を増大させ、さらに１またはそれ以上のそのエピトープを保護するように作用できる。このポリマー分子は、「ポリマー分子へのコンジュゲート」と題される段落に記載されている任意の分子であってよいが、好ましくは、直線状または分岐鎖状のポリエチレングリコールまたはポリアルキレンオキシドからなる群から選択される。最も好ましくは、ポリマー分子はｍＰＥＧ−ＳＰＡ、ｍＰＥＧ−ＳＣＭ、ｍＰＥＧ−ＢＴＣ （Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ， Ｉｎｃ）， ＳＣ−ＰＥＧ （Ｅｎｚｏｎ， Ｉｎｃ．）， トレシル化 （ｔｒｅｓｙｌａｔｅｄ） ｍＰＥＧ （ＵＳ ５，８８０，２５５） またはオキシカルボニル−オキシ−Ｎ−ジカルボキシイミド ＰＥＧ （ＵＳ ５，１２２，６１４） であ（り、関連する結合基はりシンまたはＮ末端残基上に存在するものである）る。別法では、ポリマー分子は、システイン残基と反応性の活性化されたＰＥＧ分子、例えばＶＳ−ＰＥＧ（Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ）である。
【０１１８】
特に、ポリペプチドＰｐが工業用酵素である場合、第二の非ペプチド部分は架橋可能であり、それにより適当な固形支持体状に固定できるものであり得る。このような架橋ポリマーは Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ， Ｉｎｃ． から入手できる。この態様に記載されるポリペプチドのペプチド付加物は、問題の架橋ポリマーに関する結合基を含むことが理解されよう。この態様に関連して、ポリペプチドＰｐは、好ましくは、アミログリコシダーゼ、α−アミラーゼ、グルコースイソメラーゼ、アミダーゼ、または脂肪分解性酵素である。
【０１１９】
以下の段落「親油性化合物へのコンジュゲート」、「ポリマー分子へのコンジュゲート」、および「有機誘導体化物質へのコンジュゲート」では、特定型の非ペプチド部分へのコンジュゲートが記載される。
【０１２０】
インビボグリコシル化は、発現宿主として、適当なグリコシル化（グリコシル化を行う）宿主細胞が用いられた場合の発現工程時に生じるため、本発明の任意の方法のコンジュゲート工程は、インビボ結合オリゴサッカライド部分以外の非ポリペプチド部分がポリペプチドにコンジュゲートされる場合に関連するものであることが理解されよう。したがって、本発明においてコンジュゲート工程が用いられる場合はいつでも、これは、グリコシル化宿主における発現時のインビボグリコシル化によって結合したオリゴサッカライド部分以外の非ポリペプチド部分へのコンジュゲートであることが意図される。インビトログリコシル化方法は「グリコシル化」と題される段落に記載されている。
【０１２１】
親油性化合物へのコンジュゲート
ポリペプチドおよび親油性化合物は互いに、直接、またはリンカーを使用してコンジュゲート可能である。親油性化合物は天然化合物、例えば飽和または不飽和脂肪酸、脂肪酸ジケトン、テルペン、プロスタグランジン、ビタミン、カロテノイドまたはステロイド、または合成化合物、例えば、１またはそれ以上のアルキル−、アリール−、アルケニル−、または他の複数の不飽和化合物を伴うカルボン酸（ｃａｒｂｏｎ ａｃｉｄ）、アルコール、アミンおよびスルホン酸であってよい。さらに、親油性化合物は、ＷＯ９７／３１０２２（これは引用によりその開示内容が本明細書中に包含される）に開示されている任意の親油性置換基であってよい。ポリペプチドおよび親油性化合物の、任意的にリンカーを介する、コンジュゲートは当分野に既知の方法、例えば ＢｏＤａｎｓｚｋｙ ｉｎ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９７６ および ＷＯ ９６／１２５０５ にしたがって、ならびに ＷＯ ９７／３１０２２ に記載されるように実行できる。
【０１２２】
ポリマー分子へのコンジュゲート
本発明のポリペプチドにカップリングされるポリマー分子は、任意の適当なポリマー分子、例えば天然または合成のホモ−ポリマーまたはヘテロポリマー、典型的には分子量３００〜１００，０００Ｄａの範囲、例えば３００〜２０，０００Ｄａ、より好ましくは５００〜１０，０００Ｄａの範囲、より好ましくは５００〜５０００Ｄａの範囲でさえあるものであり得る。
【０１２３】
ホモ−ポリマーの例には、ポリオール（すなわちポリ−ＯＨ）、ポリアミン（すなわちポリ−ＮＨ２）およびポリカルボン酸（すなわちポリ−ＣＯＯＨ）が含まれる。ヘテロポリマーは種々のカップリング基、例えばヒドロキシル基およびアミン基を含むポリマーである。
【０１２４】
適当なポリマー分子の例としては、ポリアルキレンオキサイド （ＰＡＯ）、例えばポリアルキレングリコール（ＰＡＧ）、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）およびポリプロピレングリコール （ＰＰＧ）、分岐状ＰＥＧｓ、ポリビニルアルコール （ＰＶＡ）、ポリカルボキシレート、ポリ（ビニルピロリドン）、ポリエチレン共マレイン酸無水物、ポリスチレン共マレイン酸無水物、デキストラン、例えばカルボキシメチルデキストラン、または意図される目的、例えば免疫原性の減少および／または機能的インビボ半減期および／または血清半減期の増大、またはこのポリペプチドに固定化性質を提供する（目的ポリペプチドと題される段落に議論されている）ために適した任意の他の生物ポリマーを挙げることができる。ポリマー分子の他の例としては、ヒトアルブミンまたは他の豊富な血漿炭水化物が挙げられる。一般に、ポリアルキレングリコール誘導化ポリマーは生分解性、非毒性、非抗原性、非免疫原性であり、種々の水溶解性を有し、生物から容易に抽出される。
【０１２５】
ＰＥＧは、例えばデキストランなどのポリサッカライドと比較して、架橋できる反応基が極めて少ないので、免疫原性、アレルゲン性の減少、および／または半減期の増大に好ましいポリマー分子である。具体的には、モノ機能性ＰＥＧ、例えばメトキシポリエチレングリコール（ｍＰＥＧ）が、そのカップリング化学が比較的単純であるので（ただ１つの反応基がポリペプチド上の結合基との結合（コンジュゲート）に利用される）、興味深い。結果、架橋の危険性が減じられ、得られるポリペプチドコンジュゲートは比較的均質であり、ポリマー分子とポリペプチドとの反応性を比較的制御しやすい。
【０１２６】
ポリマー分子（群）をポリペプチドに共有結合させるには、ポリマー分子のヒドロキシ末端基を活性化型にて提供、即ち反応性機能基を提示させる。適当な活性化ポリマー分子は市販されており、例えばＳｈｅａｒｗａｔｅｒ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ， Ｉｎｃ．， Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ， ＡＬ， ＵＳＡ から入手可能である。あるいは、ポリマー分子は当業者に既知の、例えばＷＯ ９０／１３５４０に記載されているような通常の方法によって活性化することができる。本発明に使用するための、活性化線状または分枝状ポリマー分子の具体例は、Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ， Ｉｎｃ． １９９７ および ２０００ カタログ （Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｚｅｄ Ｂｉｏｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ ｆｏｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ， Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ Ｇｌｙｃｏｌ ａｎｄ Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ、これは引用によって本明細書に包含される） に記載されている。活性化ＰＥＧポリマーの具体例としては次の線状ＰＥＧ：ＮＨＳ−ＰＥＧ （例えば ＳＰＡ−ＰＥＧ、ＳＳＰＡ−ＰＥＧ、ＳＢＡ−ＰＥＧ、ＳＳ−ＰＥＧ、ＳＳＡ−ＰＥＧ、ＳＣ−ＰＥＧ、ＳＧ−ＰＥＧ、および ＳＣＭ−ＰＥＧ）、および ＮＯＲ−ＰＥＧ）、ＢＴＣ−ＰＥＧ、ＥＰＯＸ−ＰＥＧ、ＮＣＯ−ＰＥＧ、ＮＰＣ−ＰＥＧ、ＣＤＩ−ＰＥＧ、ＡＬＤ−ＰＥＧ、ＴＲＥＳ−ＰＥＧ、ＶＳ−ＰＥＧ、ＩＯＤＯ−ＰＥＧ、および ＭＡＬ−ＰＥＧ、ならびに分枝状 ＰＥＧ、例えば ＰＥＧ２−ＮＨＳ、および ＵＳ ５，９３２，４６２ や ＵＳ ５，６４３，５７５に開示されているもの（これらは引用によって本明細書に包含される）が挙げられる。さらに、以下の文献（これらは引用によって本明細書に包含される）は有用なポリマー分子および／またはＰＥＧ化化学を開示している：ＵＳ ５，８２４，７７８， ＵＳ ５，４７６，６５３， ＷＯ ９７／３２６０７， ＥＰ ２２９，１０８， ＥＰ ４０２，３７８， ＵＳ ４，９０２，５０２， ＵＳ ５，２８１，６９８， ＵＳ ５，１２２，６１４， ＵＳ ５，２１９，５６４， ＷＯ ９２／１６５５５， ＷＯ ９４／０４１９３， ＷＯ ９４／１４７５８， ＷＯ ９４／１７０３９， ＷＯ ９４／１８２４７， ＷＯ ９４／２８０２４， ＷＯ ９５／００１６２， ＷＯ ９５／１１９２４， ＷＯ９５／１３０９０， ＷＯ ９５／３３４９０， ＷＯ ９６／０００８０， ＷＯ ９７／１８８３２， ＷＯ ９８／４１５６２， ＷＯ ９８／４８８３７， ＷＯ ９９／３２１３４， ＷＯ ９９／３２１３９， ＷＯ ９９／３２１４０， ＷＯ ９６／４０７９１， ＷＯ ９８／３２４６６， ＷＯ ９５／０６０５８， ＥＰ ４３９ ５０８， ＷＯ ９７／０３１０６， ＷＯ ９６／２１４６９， ＷＯ ９５／１３３１２， ＥＰ ９２１ １３１， ＵＳ ５，７３６，６２５， ＷＯ ９８／０５３６３， ＥＰ ８０９ ９９６， ＵＳ ５，６２９，３８４， ＷＯ ９６／４１８１３， ＷＯ ９６／０７６７０， ＵＳ ５，４７３，０３４， ＵＳ ５，５１６，６７３， ＥＰ ６０５ ９６３，　ＵＳ ５，３８２，６５７， ＥＰ ５１０ ３５６， ＥＰ ４００ ４７２， ＥＰ １８３ ５０３ および ＥＰ １５４ ３１６。
【０１２７】
ポリペプチドおよび活性化ポリマー分子のコンジュゲートは、以下の文献（ここにはポリマー分子を活性化するために適当な方法も記載されている）に記載されているような通常の方法によって行われる：Ｒ．Ｆ． Ｔａｙｌｏｒ、（１９９１）、”Ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｍｍｏｂｉｌｉｓａｔｉｏｎ． ＦｕｎＤａｍｅｎｔａｌ ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ”、Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ、Ｎ．Ｙ．； Ｓ．Ｓ． Ｗｏｎｇ， （１９９２）、”Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｉｎｇ”、ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ， Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ； Ｇ．Ｔ． Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ， （１９９３）， ”Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｌｉｇａｎｄ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ”、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｎ．Ｙ．。当業者は、使用される活性化方法および／またはコンジュゲート化学がポリペプチドの結合基（その例は上記した）、およびポリマー体の機能（官能）基（例えば、アミン、ヒドロキシル、カルボキシル、アルデヒド、スルフィドリル、スクシンイミジル、マレイミド、ビニルスルホン、またはハロアセテート）によって変動することは知っている。ＰＥＧ化は、ポリペプチド上の結合基において利用可能なものすべて（即ち、ポリペプチドの表面に曝露されているような結合基）に対するコンジュゲートを目的とすることができ、あるいは１つまたはそれ以上の特定の結合基、例えばＮ−末端アミノ基 （ＵＳ ５，９８５，２６５）を目的とすることができる。さらに、コンジュゲートは、１工程でも、段階的にでも行うことができる（例えば、ＷＯ ９９／５５３７７に記載されているようにして）。
【０１２８】
ＰＥＧ化は、結合するＰＥＧ分子の数、その分子のサイズおよび形態（例えば線状か分枝状かなど）、およびそのような分子が結合するポリペプチドの位置に関して最適な分子が調製されるようデザインできることは理解されよう。例えば使用するポリマーの分子量は、達成しようとする所望の効果を考慮して選択される。例えば、コンジュゲートの主たる目的が高分子量を有するポリペプチドを生じる（例えば、腎クリアランスを減じるため）ことである場合、通常、１、２個の高分子量ポリマー分子としてコンジュゲートさせ、所望の効果を達成することが望ましい。高い程度のエピトープ遮蔽を望む場合、ポリペプチドにおけるすべてまたはほとんどのエピトープを効果的に遮蔽するに充分に多くの数の低分子量ポリマー分子（例えば、分子量約５，０００ Ｄａ）を使用して達成することができる。例えば、２−８個、例えば３−６個のポリマーを使用できる。
【０１２９】
タンパク質上の唯一の結合基へのコンジュゲートに関して（ＵＳ５，９８５，２６５に記載されている）、重合体分子はそれが線状または分枝状であっても、高分子量、例えば約２０ ｋＤａを有するのが好都合である。
【０１３０】
通常、可能な限り多くの利用可能なポリマー結合基をポリマー分子と反応させることを目的とした条件下にて、ポリマーコンジュゲートは行われる。活性化ポリマー分子とポリペプチドとの典型的なモル比は、約１０００−１以下、例えば２００−１以下、好ましくは１００−１以下、例えば１０−１ または ５−１以下であるが、等しいモル比を用いて、最適な反応を得ることもできる。
【０１３１】
本発明では、ポリマー分子をリンカーを介してポリペプチドとカップリングさせることも考えられる。適当なリンカーは当業者に周知である。好ましい例は塩化シアヌル （Ａｂｕｃｈｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．、（１９７７）、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．、２５２、３５７８−３５８１； ＵＳ ４，１７９，３３７； Ｓｈａｆｅｒ ｅｔ ａｌ．、（１９８６）、Ｊ． Ｐｏｌｙｍ． Ｓｃｉ． Ｐｏｌｙｍ． Ｃｈｅｍ． Ｅｄ．、２４、３７５−３７８）である。
【０１３２】
コンジュゲート反応の後、残りの活性化ポリマー分子は、当分野に既知の方法、例えば第１級アミンを反応混合物に加えることによってブロックし、得られた不活化ポリマー分子を適当な方法によって取り出す。
【０１３３】
具体的態様では、本発明のポリペプチドは、ポリペプチドＰではなく、ペプチド付加物と結合した１またはそれ以上のＰＥＧ分子を含むものである。例えば、ＰＥＧ分子は、ペプチド付加物Ｘ中に存在する１またはそれ以上システイン残基と結合し、必要であれば、１またはそれ以上のシステイン残基を、それへのコンジュゲートを回避するために、目的のポリペプチドＰから除去しておく。
【０１３４】
別の具体的態様では、本発明のポリペプチドは、ペプチド付加物Ｘのリシン残基に結合された少なくとも１のＰＥＧ分子、特に線状または分岐状ＰＥＧ分子（分子量少なくとも５ｋＤａ）を含む。
【０１３５】
本発明のポリペプチドの製造方法
本発明は、さらに、本発明のポリペプチドの生産方法を含む。ここでは、この方法は、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列によって形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞を、このポリペプチドの発現を許容する条件下で培養し、この培養からポリペプチドを回収することを含む。
【０１３６】
組換え生産とは別に、本発明のポリペプチドは、比較的非効率的ではあるが、化学合成または、化学合成および組換えＤＮＡ技術の組み合わせによって生産することができる。
【０１３７】
本発明のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、親ポリペプチドをコードするヌクレオチドを単離するか、あるいは合成し、確立されている技術によって関連するペプチド付加物をコードするヌクレオチド配列を融合することによって構築することができる。親ポリペプチドに施されるアミノ酸修飾に関して、これらは突然変異誘発、例えば、周知の方法（例えば Ｎｅｌｓｏｎ ａｎｄ Ｌｏｎｇ， Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １８０， １４７−１５１， １９８９ に記載されているもの）である部位特異的突然変異誘発、ランダム突然変異誘発またはシャフリング（混合、ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ）を用いて都合良く行うことができる。
【０１３８】
ヌクレオチド配列は、化学合成、例えばオリゴヌクレオチド合成装置によって、調製することができ、ここでは、オリゴヌクレオチドは、所望のポリペプチドのアミノ酸配列に基づいて設計され、好ましくは、組換えポリペプチドが生産される宿主細胞において好まれるコドンが選択される。例えば、所望のポリペプチドの部分をコードするいくつかの小オリゴヌクレオチドを、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、ライゲーションまたはライゲーション連鎖反応（ＬＣＲ）によって合成し、組み立てることができる。個々のオリゴヌクレオチドは典型的に、相補的組立て用の５’または３’オーバーハングを含有する。
【０１３９】
（合成、部位特異的突然変異誘発または別の方法による）組立て後、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を組換えベクター中に挿入し、所望の形質転換宿主細胞内でのその発現に必要とされる制御配列に作動可能に連結される。
【０１４０】
当然ながら、すべてのベクターおよび発現制御配列が同等に、本発明のポリペプチド部分をコードするヌクレオチド配列を発現するよう良好に機能するとは限らないと考えられる。同じ発現系によってすべての宿主細胞が同等に良好に機能するとも限らない。しかし、当業者であれば、これらのベクター、発現制御配列および宿主細胞の中から不当な実験を行うことなく選択することが可能である。例えば、ベクターの選択に当たり、宿主細胞を考慮しなければならない、それはベクターは宿主細胞中で複製し、または染色体に組込まれなければならないからである。ベクターのコピー数、そのコピー数を制御する能力、およびベクターによってコードされている他のタンパク質の発現、例えば抗生物質マーカーも考慮しなければならない。発現制御配列を選択するには、種々の因子を考慮しなければならない。それには例えば、配列の相当する強度、その制御性、およびポリペプチドをコードするヌクレオチド配列との適合性、特に可能性ある二次構造に関するものがある。宿主は、その選択したベクターとの適合性、ヌクレオチドによってコードされる産物の毒性、その分泌特性、ポリペプチドが正しく折り畳まれる能力、発酵または培養要件、およびヌクレオチド配列によってコードされる産物の精製の容易さ、を考慮して選択すべきである。
【０１４１】
組換えベクターは自律的に複製するベクター、即ち染色体外物質として存在し、その複製が染色体の複製とは独立しているベクター、例えばプラスミドであることができる。別のベクターは、宿主細胞に導入されると宿主細胞ゲノムに組込まれ、組込まれた染色体と一緒に複製されるものである。
【０１４２】
ベクターは好ましくは、本発明のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列が、このヌクレオチド配列の転写に要する別のセグメントと作動可能に連結されている発現ベクターである。ベクターは典型的には、プラスミドまたはウイルスＤＮＡから誘導される。本明細書に記載している宿主細胞での発現に適した多くの発現ベクターが市販され、または文献に記載されている。真核生物宿主のための有用な発現ベクターには例えば、ＳＶ４０、ウシパピローマウイルス、アデノウイルスおよびサイトメガロウイルス由来の発現制御配列を含むベクターがある。具体的ベクターは例えば、ｐＣＤＮＡ３．１（＋） Ｈｙｇ （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ） および ｐＣＩ−ｎｅｏ （Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ、ＵＳＡ） である。酵母細胞に有用な発現ベクターは、２μ プラスミドおよびその誘導体、ＰＯＴ１ ベクター （ＵＳ ４，９３１，３７３）、Ｏｋｋｅｌｓ、Ａｎｎ． Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ７８２、２０２−２０７， １９９６に記載されているｐＪＳＯ３７ ベクター、およびｐＰＩＣＺ Ａ、Ｂ または Ｃ （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｃａｒｌｓｂａｄ， ＣＡ， ＵＳＡ）である。昆虫細胞に有用な発現ベクターには、ｐＶＬ９４１、ｐＢＧ３１１ （Ｃａｔｅ ｅｔ ａｌ．、”Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｂｏｖｉｎｅ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｓ ｆｏｒ Ｍｕｌｌｅｒｉａｎ Ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ Ｓｕｂｓｔａｎｃｅ Ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｉｎ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ”、Ｃｅｌｌ、４５、ｐｐ． ６８５−９８ （１９８６）、ｐＢｌｕｅｂａｃ ４．５ および ｐＭｅｌｂａｃ （両者ともＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｃａｒｌｓｂａｄ， ＣＡ， ＵＳＡから入手可能）がある。
【０１４３】
本発明に使用される他のベクターには、本発明のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列をコピー数に増幅できるものがある。このような増幅可能なベクターは当業界にて周知である。それには例えば、ＤＨＦＲ増幅によって増幅され得るベクター（例えば、Ｋａｕｆｍａｎ、Ｕ．Ｓ． Ｐａｔ． Ｎｏ． ４，４７０，４６１、Ｋａｕｆｍａｎ ａｎｄ Ｓｈａｒｐ、”Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ Ｏｆ Ａ Ｍｏｄｕｌａｒ Ｄｉｈｙｄｒａｆｏｌａｔｅ Ｒｅｄｕｃｔａｓｅ ｃＤＮＡ Ｇｅｎｅ： Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｏｆ Ｓｉｇｎａｌｓ Ｕｔｉｌｉｚｅｄ Ｆｏｒ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ”、Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ．、２、ｐｐ． １３０４−１９ （１９８２）を参照）、およびグルタミン合成（「ＧＳ」）増幅（例えば、ＵＳ ５，１２２，４６４ および ＥＰ ３３８，８４１を参照）がある。
【０１４４】
組換えベクターはさらに、ベクターを問題の宿主細胞にて複製できるＤＮＡ配列を含有できる。そのような配列の例としては（宿主細胞が哺乳類細胞の場合）、ＳＶ４０複製起点がある。宿主細胞が酵母細胞の場合、ベクターを複製できる適当な配列は酵母プラスミド２μ複製遺伝子ＲＥＰ １−３および複製起点である。
【０１４５】
ベクターは選択マーカー、例えばその産物が宿主細胞における欠陥を相補する遺伝子、例えばジヒドロ葉酸リダクターゼ（ＤＨＦＲ） をコードする遺伝子またはＳｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ ＴＰＩ遺伝子（Ｐ．Ｒ． Ｒｕｓｓｅｌｌ、Ｇｅｎｅ ４０， １９８５、ｐｐ． １２５−１３０に記載）、またはアンピシリン、カナマイシン、テトラサイクリン、クロラムフェニコール、ネオマイシン、ヒグロマイシンまたはメトトレキサートなどの薬物に対する耐性を付与する遺伝子を含有できる。糸状菌類の選択マーカーには、ａｍｄＳ、ｐｙｒＧ、ａｒｃＢ、ｎｉａＤ および ｓＣがある。
【０１４６】
「制御配列」なる用語は本明細書では、本発明のポリペプチドを発現させるのに必須のまたは有益なすべての成分を包含するものと規定される。各制御配列は天然でも、ポリペプチドをコードする核酸配列にとって外来性でもよい。このような制御配列には、リーダー配列、ポリアデニル化配列、プロペプチド配列、プロモーター、エンハンサーまたは上流活性化配列、シグナルペプチド配列、および転写ターミネーターがあるが、これらに限定されない。最小限度、制御配列は、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列が作動可能に連結されているプロモーターを含む。
【０１４７】
「作動可能に連結」とは、２つまたはそれ以上のヌクレオチド配列が、その通常の機能を実行可能であるような相互配置で、酵素による連結または他の方法によって共有連結されていることを意味する。例えば、プレ配列または分泌リーダーをコードするヌクレオチド配列がポリペプチドのヌクレオチド配列と作動可能に連結しているとは、それがポリペプチドの分泌に関与するプレタンパク質として発現された場合である；
プロモーターまたはエンハンサーが作動可能にコード配列と連結されているとは、それが配列の転写に影響する場合である；　リボゾーム結合部位がコード配列と作動可能に連結しているとは、それが翻訳できるように位置している場合である。一般に、「作動可能に連結」とは、連結するヌクレオチド配列が隣接しており、分泌リーダーの場合、隣接および解読枠内である。連結は、通常の制限部位における結合（ライゲーション）によって行われる。このような部位が存在しない場合、合成オリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーを標準的な組換えＤＮＡ法とともに使用する。
【０１４８】
本発明では、広範な発現制御配列を使用できる。このような有用な発現制御配列には、上記の発現ベクターの構造遺伝子と関連する発現制御配列、および原核生物または真核生物またはそれらのウイルスの遺伝子発現を制御すると知られている任意配列、およびそれらの種々の組合わせがある。
【０１４９】
哺乳類細胞において転写させるのに適当な制御配列の例としては、ＳＶ４０およびアデノウイルスの初期および後期プロモーター、例えばアデノウイルス２主要後期プロモーター、ＭＴ−１（メタロチオネイン遺伝子）プロモーター、ヒトサイトメガロウイルス即座遺伝子プロモーター（ＣＭＶ）、ヒト伸張因子１α（ＥＦ−１α）プロモーター、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ最小熱ショックタンパク質７０プロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、ヒトユビキチンＣ （ＵｂＣ）プロモーター、ヒト成長ホルモンターミネーター、ＳＶ４０またはアデノウイルス Ｅｌｂ 領域ポリアデニル化シグナル、および Ｋｏｚａｋ 共通配列 （Ｋｏｚａｋ、Ｍ． Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ １９８７ Ａｕｇ ２０；１９６（４）：９４７−５０）などが挙げられる。
【０１５０】
哺乳類細胞における発現を改良するには、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の５’非翻訳領域に合成イントロンを挿入すればよい。合成イントロンの例としては、プラスミドｐＣＩ−Ｎｅｏ由来の合成イントロンがある （Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ＷＩ、ＵＳＡから入手可能）。
【０１５１】
昆虫細胞において転写させるのに適当な制御配列の例としては、ポリヘドリンプロモーター、Ｐ１０ プロモーター、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ ポリヘドロシスウイルス塩基性タンパク質プロモーター、バキュロウイルス即座遺伝子１ プロモーター、バキュロウイルス３９Ｋ 遅延型−初期遺伝子プロモーター、およびＳＶ４０ ポリアデニル化配列が挙げられる。
【０１５２】
酵母細胞において有用な適当な制御配列の例としては、酵母α−交配系のプロモーター群、酵母トリオースホスフェートイソメラーゼ （ＴＰＩ） プロモーター、酵母解糖系遺伝子またはアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子由来のプロモーター群、ＡＤＨ２−４ｃ プロモーター、および誘導性ＧＡＬ プロモーターなどが挙げられる。
【０１５３】
糸状菌宿主細胞において有用な適当な制御配列の例としては、ＡＤＨ３ プロモーターおよびターミネーター、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ ＴＡＫＡ アミラーゼトリオースホスフェートイソメラーゼまたはアルカリホスファターゼ、Ａ． ｎｉｇｅｒ α−アミラーゼ、Ａ． ｎｉｇｅｒ またはＡ． ｎｉｄｕｌａｎｓ グルコアミラーゼ、Ａ． ｎｉｄｕｌａｎｓ アセトアミダーゼ、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉ アスパラギンプロテイナーゼまたはリパーゼをコードする遺伝子由来のプロモーター、ＴＰＩ１ ターミネーターおよびＡＤＨ３ ターミネーターが挙げられる。
【０１５４】
本発明のヌクレオチド配列はシグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んでいてもいなくてもよい。シグナルペプチドは、ポリペプチドが、発現される宿主細胞から分泌されるときに存在する。このようなシグナル配列は、存在するならば、ポリペプチドの発現に関して選択される細胞によって認識されるものであるべきである。シグナルペプチドはポリペプチドとホモローガス（例えば、問題の親ポリペプチドと通常に関連するもの）またはヘテロローガス（すなわち親ポリペプチドと別のソース起源のもの）であってよく、あるいは宿主細胞に対してホモローガスまたはヘテロローガス、すなわち、宿主細胞から通常に発現されるものあるいは宿主細胞から通常には発現されないものであってよい。したがって、シグナルペプチドは原核生物、例えば細菌由来であっても、あるいは真核生物、例えば哺乳類、または昆虫、糸状真菌または酵母細胞由来であってもよい。
【０１５５】
シグナルペプチドの存在または不存在は例えば、発現させようとするポリペプチド、タンパク質（それが細胞内または細胞外タンパク質のいずれでも）の産生に使用される発現宿主細胞に、およびそれが分泌されるのを望むか否かによって変動する。糸状菌にて使用するには、シグナルペプチドは通常、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｐ．アミラーゼまたはグルコアミラーゼをコードする遺伝子、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉリパーゼまたはプロテアーゼまたはＨｕｍｉｃｏｌａ ｌａｎｕｇｉｎｏｓａリパーゼをコードする遺伝子から誘導できる。シグナルペプチドは好ましくは、Ａ． ｏｒｙｚａｅ ＴＡＫＡアミラーゼ、Ａ． ｎｉｇｅｒ中性α−アミラーゼ、Ａ． ｎｉｇｅｒ酸安定アミラーゼ、またはＡ． ｎｉｇｅｒグルコアミラーゼをコードする遺伝子から誘導する。昆虫細胞にて使用するには、シグナルペプチドは通常、昆虫遺伝子（ＷＯ ９０／０５７８３を参照）、例えばｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａｎ Ｍａｎｄｕｃａ ｓｅｘｔａ脂質動員ホルモン前駆体（ＵＳ ５，０２３，３２８）、ミツバチメリチン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｃａｒｌｓｂａｄ， ＣＡ， ＵＳＡ）、エクジステロイドＵＤＰグルコシルトランスフェラーゼ（ｅｇｔ） （Ｍｕｒｐｈｙ ｅｔ ａｌ．、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ４、３４９−３５７ （１９９３）またはヒト膵リパーゼ（ｈｐｌ） （Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ２８４、ｐｐ． ２６２−２７２， １９９７）から誘導できる。
【０１５６】
哺乳類細胞にて使用されるシグナルペプチドの具体例には、本明細書中以下の実施例から明らかであるヒトグルコセレブロシダーゼのもの、またはマウスＩｇカッパー軽鎖シグナルペプチド （Ｃｏｌｏｍａ、Ｍ （１９９２） Ｊ． Ｉｍｍ． Ｍｅｔｈｏｄｓ １５２：８９−１０４）である。酵母細胞にて使用するのに適したシグナルペプチドは、Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｃｉａｅ由来のα−因子シグナルペプチド（ＵＳ ４，８７０，００８参照）、マウス唾液アミラーゼのシグナルペプチド （Ｏ． Ｈａｇｅｎｂｕｃｈｌｅ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ２８９， １９８１， ｐｐ． ６４３−６４６ を参照）、修飾カルボキシペプチダーゼ シグナルペプチド（Ｌ．Ａ． Ｖａｌｌｓ ｅｔ ａｌ．、Ｃｅｌｌ ４８， １９８７、ｐｐ． ８８７−８９７を参照）、酵母ＢＡＲ１ シグナルペプチド（ＷＯ ８７／０２６７０を参照）、および酵母アスパラギンプロテアーゼ ３ （ＹＡＰ３） シグナルペプチド（Ｍ． Ｅｇｅｌ−Ｍｉｔａｎｉ ｅｔ ａｌ．、Ｙｅａｓｔ ６， １９９０、ｐｐ． １２７−１３７を参照）であることが見出されている。
【０１５７】
細菌、真菌（酵母など）、植物、昆虫、哺乳類または他の適当な動物細胞もしくは細胞系統（セルライン）、ならびにトランスジェニック動物または植物など、適当な宿主を使用すれば、本発明のポリペプチドを調製できる。非グリコシル化生物、例えば Ｅ． ｃｏｌｉ を用いる場合で、ポリペプチドがグリコシル化ポリペプチドである場合は、Ｅ． ｃｏｌｉ における発現後、適当なインビトログリコシル化を行う。
【０１５８】
細菌宿主細胞の例としては、グラム陽性細菌、例えばバシラス株、例えばＢ． ｂｒｅｖｉｓ または Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ、シュードモナスまたはストレプトマイセス、またはグラム陰性細菌、例えば大腸菌株などがある。ベクターを細菌宿主細胞に導入するには、プロトプラスト形質転換（例えば Ｃｈａｎｇ ａｎｄ Ｃｏｈｅｎ， １９７９， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １６８： １１１−１１５ を参照）、コンピテント細胞の使用（例えばＹｏｕｎｇ ａｎｄ Ｓｐｉｚｉｚｉｎ， １９６１、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ ８１： ８２３−８２９、またはＤｕｂｎａｕ ａｎｄ Ｄａｖｉｄｏｆｆ−Ａｂｅｌｓｏｎ， １９７１、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ５６： ２０９−２２１を参照）、エレクトロポレーション（例えばＳｈｉｇｅｋａｗａ ａｎｄ Ｄｏｗｅｒ， １９８８、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ６： ７４２−７５１を参照）、またはコンジュゲーション（例えばＫｏｅｈｌｅｒ ａｎｄ Ｔｈｏｒｎｅ， １９８７、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ １６９： ５７７１−５２７８を参照）によって行うことができる。
【０１５９】
適当な糸状菌宿主細胞の例としては、アスペルギルスの株、例えばＡ． ｏｒｙｚａｅ、Ａ． ｎｉｇｅｒまたは Ａ． ｎｉｄｕｌａｎｓ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ または Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａが挙げられる。真菌細胞は、プロトプラスト形成、プロトプラストの形質転換、およびそれ自体既知の方法による細胞壁の再構成によって形質転換することができる。アスペルギルス宿主細胞を形質転換する適当な手法は、ＥＰ ２３８ ０２３ および ＵＳ ５，６７９，５４３に記載されている。Ｆｕｓａｒｉｕｍ種を形質転換する適当な方法はＭａｌａｒｄｉｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９８９、Ｇｅｎｅ ７８： １４７−１５６ および ＷＯ ９６／００７８７に記載されている。酵母は、Ｂｅｃｋｅｒ ａｎｄ Ｇｕａｒｅｎｔｅ、Ｉｎ Ａｂｅｌｓｏｎ、Ｊ．Ｎ． ａｎｄ Ｓｉｍｏｎ、Ｍ．Ｉ．、ｅｄｉｔｏｒｓ、Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｙｅａｓｔ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌｕｍｅ １９４、ｐｐ １８２−１８７、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ； Ｉｔｏ ｅｔ ａｌ．， １９８３、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ １５３： １６３； Ｈｉｎｎｅｎ ｅｔ ａｌ．， １９７８、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ＵＳＡ ７５： １９２０ に記載されている手法を用いて形質転換することができる。
【０１６０】
本発明のポリペプチドがインビボグリコシル化される場合、宿主細胞は、このポリペプチドの所望のグリコシル化を生じさせることができる宿主細胞の群から選択される。したがって、宿主細胞は酵母細胞、昆虫細胞、または哺乳類細胞から選択されるのが有益であり得る。
【０１６１】
適当な酵母宿主細胞の例としては、サッカロマイセス、例えばＳ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｋｌｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ、Ｐｉｃｈｉａ、例えばＰ． ｐａｓｔｏｒｉｓ または Ｐ． ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ、例えば Ｈ． ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ または Ｙａｒｒｏｗｉａが挙げられる。特に興味深いのは、例えば Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｃｉａｅ， Ｐ． ｐａｓｔｏｒｉｓ または Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｓｐｐ． 由来の酵母グリコシル化突然変異細胞 （例えば Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｃｉａｅ グリコシル化突然変異 ｏｃｈ１， ｏｃｈｉ ｍｎｍ１ または ｏｃｈ１ ｍｎｍ１ ａｌｇ３ （Ｎａｇａｓｕ ｅｔ ａｌ． Ｙｅａｓｔ ８， ５３５−５４７， １９９２ および Ｎａｋａｎｉｓｈｏ−Ｓｈｉｎｄｏ ｅｔ ａｌ． Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６８， ２６３３８−２６３４５， １９９３）） である。異種性（ヘテロローガス）ＤＮＡを用いて酵母細胞を形質転換する方法およびそれから異種性ポリペプチドを生産する方法は、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｉｎｃ， Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ， ＣＡ， ＵＳＡ （ＹｅａｓｔｍａｋｅｒＴＭ 酵母形質転換系キットの製品プロトコール）， および Ｒｅｅｖｅｓ ｅｔ ａｌ．， ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ ９９ （１９９２） １９３−１９８， Ｍａｎｉｖａｓａｋａｍ ａｎｄ Ｓｃｈｉｅｓｔｌ， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， １９９３， Ｖｏｌ． ２１， Ｎｏ． １８， ｐｐ． ４４１４−４４１５ および Ｇａｎｅｖａ ｅｔ ａｌ．， ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ １２１ （１９９４） １５９−１６４ に開示されている。
【０１６２】
適当な昆虫宿主細胞の例としては、鱗翅目（Ｌｅｐｉｄｏｐｔｏｒａ）細胞系統、例えばＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒＤａ （Ｓｆ９ または Ｓｆ２１） またはＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉｏａ ｎｉ 細胞 （Ｈｉｇｈ Ｆｉｖｅ） （ＵＳ ５，０７７，２１４）が挙げられる。昆虫細胞を形質転換し、ヘテロローガスなポリペプチドをそこで産生させるのは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃａｒｌｓｂａｄ， ＣＡ， ＵＳＡに記載されているようにして行うことができる。
適当な哺乳類宿主細胞の例としては、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞系統、（例えばＣＨＯ−Ｋ１； ＡＴＣＣ ＣＣＬ−６１）、ミドリザル細胞系統（ＣＯＳ） （例えば ＣＯＳ １ （ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１６５０）、ＣＯＳ ７ （ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１６５１））；マウス細胞 （例えば ＮＳ／Ｏ）、幼若ハムスター腎 （ＢＨＫ） 細胞系統 （例えば ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１６３２または ＡＴＣＣ ＣＣＬ−１０）、およびヒト細胞 （例えば ＨＥＫ ２９３ （ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１５７３））、ならびに組織培養における植物細胞などが挙げられる。さらに適当な細胞系統は当業者に既知であり、例えばＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、ロックビル、メリーランドのような公の寄託機関から入手可能である。本発明の目的のために興味深いのは、哺乳類グリコシル化突然変異体セルライン、例えば ＣＨＯ−ＬＥＣ１， ＣＨＯＬ−ＬＥＣ２ または ＣＨＯ−ＬＥＣ１８ （ＣＨＯ−ＬＥＣ１： Ｓｔａｎｌｅｙ ｅｔ ａｌ． Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． ＵＳＡ ７２， ３３２３−３３２７， １９７５ および Ｇｒｏｓｓｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７０， ２９３７８−２９３８５， １９９５， ＣＨＯ−ＬＥＣ１８： Ｒａｊｕ ｅｔ ａｌ． Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７０， ３０２９４−３０３０２， １９９５） である。
【０１６３】
外来性ＤＮＡを哺乳類宿主細胞に導入する方法には、リン酸カルシウム仲介トランスフェクション、エレクトロポレーション、ＤＥＡＥ−デキストラン仲介トランスフェクション、リボゾーム仲介トランスフェクション、ウイルスベクターおよびＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎ ２０００を使用するＬｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｌｔｄ、Ｐａｉｓｌｅｙ、ＵＫ に記載されているトランスフェクション方法などがある。これらの方法は当業界にて周知であり、例えばＡｕｓｂｅｌ ｅｔ ａｌ． （ｅｄｓ．）， １９９６、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＵＳＡに記載されている。哺乳類細胞の培養は、確立された方法、例えばＡｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、Ｎｉｇｅｌ Ｊｅｎｋｉｎｓ編， １９９９、Ｈｕｍａｎ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ、Ｔｏｔｏｗａ、Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ、ＵＳＡ および Ｈａｒｒｉｓｏｎ ＭＡ ａｎｄ Ｒａｅ ＩＦ、Ｇｅｎｅｒａｌ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ １９９７に記載されているようにして行う。
【０１６４】
本発明の生産方法では、当業者に既知の方法によりポリペプチド産生に適した栄養培地中にて細胞を培養する。例えば、細胞はフラスコ振盪培養、小規模または大規模発酵（例えば、連続、バッチ、床バッチ、または固体状態発酵）など、研究室または工業用発酵槽において培養し、ポリペプチドが発現および／または単離できるに適した培地および条件下に行う。培養は当業者に既知の手法により、炭素および窒素原および無機塩を含む適当な栄養培地において起こる。適当な培地は市販品として入手可能であり、または開示されている組成（例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎのカタログ）に従って調製することができる。ポリペプチドが栄養培地に分泌されるなら、そのポリペプチドは培地から直接回収することができる。ポリペプチドが分泌されないなら、細胞溶解によって回収することができる。
【０１６５】
得られたポリペプチドは当業者に既知の方法により回収できる。例えば、ポリペプチドは、遠心、濾過、抽出、スプレー乾燥、留去または沈降などの通常の手法（これらに限定されない）によって栄養培地から回収することができる。
【０１６６】
ポリペプチドは、クロマトグラフィー（例えばイオン交換、親和性、疎水性、クロマトフォーカシング、およびサイズ排除）、電気泳動法（例えば、調製用等電点電気泳動）、示差溶解性（例えば硫安沈殿）、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、または抽出（例えばＰｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ、Ｊ．−Ｃ． Ｊａｎｓｏｎ ａｎｄ Ｌａｒｓ Ｒｙｄｅｎ、ｅｄｉｔｏｒｓ、ＶＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９８９を参照）などの当業者に既知の種々の手法（これらに限定されない）によって精製することができる。
【０１６７】
本発明の他の方法
具体的側面では、本発明のポリペプチドをコードするヌクレオチドを以下の工程を含む方法によって製造する：
ａ）ポリペプチドＰｐをコードするヌクレオチド配列を伸張突然変異に付し、
ｂ）工程ａ）で得られた突然変異したヌクレオチド配列を適当な宿主細胞内で発現させ、
場合により、
ｃ）工程ｂ）で発現されたポリペプチドを第二の非ペプチド部分とコンジュゲートし、
ｄ）少なくとも１つのオリゴサッカライド部分を含み、任意的にポリペプチドのペプチド付加部分に結合した第二の非ペプチド部分を含む、工程ｂ）またはｃ）で得られたポリペプチドを選択し、ならびに、
ｅ）工程ｄ）において選択されるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を単離する。
【０１６８】
本明細書の記載中、用語「伸張突然変異誘発」とは、親ポリペプチドＰｐをコードするヌクレオチド配列がペプチド付加物をコードするようにさらに拡張できる任意の様式を示すことを意図するものである。例えば、適当な長さのペプチド付加物をコードするヌクレオチド配列を合成し、ポリペプチドＰｐをコードするヌクレオチド配列と融合することができる。得られた融合ヌクレオチド配列は、任意の適当な方法、例えば遺伝子シャフリング、ヌクレオチド配列間の他の組換え法、ランダム突然変異誘発、ランダム伸張突然変異誘発またはこれらの方法の任意の組み合わせによるさらなる修飾に付することができる。このような方法は、本明細書中の方法の段落にさらに記載されている。
【０１６９】
発現および任意的コンジュゲート工程は、当分野で利用可能な任意の適当な方法を用い、本出願の別の箇所、および工程ｄ）にさらに詳細に記載されているように行うことができる。
【０１７０】
一態様では、上記方法はさらに、選択工程前に、工程ｂ）またはｃ）から得られたポリペプチドを少なくとも１の改善された性質、特に本明細書中に列記される改善された性質のいずれかに関してスクリーニングすることを含み、ここに選択工程ｄ）はこのような改善された性質を有するポリペプチドを選択することをさらに含むものである。
【０１７１】
さらに、上記方法では、伸張突然変異誘発は、第二の非ペプチド部分に関する結合基を含むグリコシル化部位および／またはアミノ酸残基、特にインビボグリコシル化部位をコードするコドンを豊富化するように行うことができる。
【０１７２】
さらに上記方法は、目的のポリペプチドＰｐをコードするヌクレオチド配列の部分を突然変異誘発に付し、第二の非ペプチド部分に関する結合基を含むグリコシル化部位（群）および／またはアミノ酸残基（群）を除去および／または導入することを含み得る。このヌクレオチド配列は任意の型の突然変異誘発、例えば本明細書中に記載されているいずれかのものに付することができる。目的のポリペプチドＰｐをコードするヌクレオチド配列の突然変異誘発は、ペプチド付加物をコードする配列の組立て前に、組立てられたヌクレオチド配列のペプチド付加部分の任意の突然変異誘発と同時にまたはその後に、行うことができる。
【０１７３】
さらなる側面では、本発明は、上記方法によって調製された本発明のヌクレオチド配列によってコードされるグリコシル化ポリペプチドを生産する方法に関し、ここでは、工程ｃ）において選択されたポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、グリコシル化宿主細胞内で発現され、得られたグリコシル化された発現ポリペプチドが回収される。
【０１７４】
さらなる側面では、本発明は、目的ポリペプチドＰｐの１またはそれ以上の選択された性質の改善方法に関し、この方法は、以下の工程を含むものである：
ａ）以下の一次構造を含むから、本質的に以下からなるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を調製し：
ＮＨ２−Ｘ−Ｐｐ−ＣＯＯＨ，
［式中、
Ｘは、ポリペプチドＰｐに選択された改善された性質（群）を付与することができるグリコシル化部位および／または第二の非ペプチド部分用の結合基を含むペプチド付加物である］、
ｂ）工程ａ）のヌクレオチド配列を適当な宿主細胞内で発現させ、任意的に、
ｃ）発現されたｂ）のポリペプチドを第二の非ペプチド部分とコンジュゲートし、および、
ｄ）工程ｂ）またはｃ）から得られたペプチドを回収する。
【０１７５】
例えばポリペプチドは本明細書中に記載される任意のものである。例えば、工程ａ）のヌクレオチド配列は、ポリペプチドＰｐをコードするヌクレオチド配列を伸張突然変異誘発に付し、例えば、グリコシル化部位および／または、第二の非ペプチド部分に関する結合基、特にインビボグリコシル化部位を含むか、あるいはそれに関与するアミノ酸残基をコードするコドンに関して豊富化することによって調製することができる。また、ａ）のヌクレオチド配列の調製において、ポリペプチドＰｐをコードするヌクレオチド配列の部分は、突然変異誘発に付し、グリコシル化部位（群）および／または、第二の非ペプチド部分に関する結合基（群）を除去および／または導入することができる。
【０１７６】
この側面の方法は、スクリーニング工程（工程ｃ）の後）をさらに含み、ここでは、工程ｂ）またはｃ）から得られたポリペプチドは、１またはそれ以上の改善された性質、特に、本明細書中、上に記載されている改善された性質のいずれかに関してスクリーニングされる。
【０１７７】
通常、ポリペプチドが本発明の方法のスクリーニング工程において選択された場合、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列が単離され、より大量のポリペプチドの発現に用いられる。得られたポリペプチドのアミノ酸配列が決定され、このポリペプチドは大規模にコンジュゲートに付され得る。次いでこのポリペプチドは改善された性質に関してアッセイされる。
【０１７８】
本発明のポリペプチドの使用
本発明のポリペプチドは、ポリペプチドのタイプおよび性質に応じて種々の目的で用いることができることが理解されよう。例えば、治療用ポリペプチドから作成される本発明のポリペプチドは、親ポリペプチドと同じ治療目的に、すなわち特定疾患の処置に有用であることが考慮される。したがって、本発明のポリペプチドは医薬組成物として製剤化することができる。また、本発明のポリペプチドが、任意の他の型の非ペプチド部分を含まないインビボグリコシル化ポリペプチドである場合、確立されている原理にしたがって、このポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を遺伝子治療に用いることができる。ポリペプチドＰｐが抗原である場合、本発明のポリペプチドはワクチン形態で提供される。
【０１７９】
方法
ヌクレオチド配列の修飾方法
例えばペプチド付加物は、ペプチド付加物を有する目的のポリペプチドをコードする２またはそれ以上のヌクレオチド配列から構築することができ、この配列は、配列間で、特にペプチド付加物をコードする部分について組換えを可能にするのに十分に相同であるものである。ヌクレオチド配列または配列部分の組み合わせは、当業者に既知の方法、例えば、相同的クロスオーバー（例えばＵＳ５，０９３，２５７に記載されているもの）、または遺伝子シャフリングを含む方法、すなわち２またはそれ以上の相同ヌクレオチド配列間の組換えを含む方法によって都合良く行い、出発ヌクレオチド配列と比較して、多数のヌクレオチド変更を有する新規ヌクレオチド配列を生じさせることができる。相同性に基づく遺伝子シャフリングを生じさせるために、ヌクレオチド配列の関連する部分は好ましくは少なくとも５０％同一、例えば少なくとも６０％同一、より好ましくは少なくとも７０％同一、例えば８０％同一である。組換えはインビトロまたはインビボで行うことができる。適当なインビトロ遺伝子シャフリングの例は、Ｓｔｅｍｍｅｒ ｅｔ ａｌ． （１９９４）、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ； ｖｏｌ． ９１、ｐｐ． １０７４７−１０７５１； Ｓｔｅｍｍｅｒ （１９９４）、Ｎａｔｕｒｅ、ｖｏｌ． ３７０、ｐｐ． ３８９−３９１； Ｓｍｉｔｈ （１９９４）、Ｎａｔｕｒｅ ｖｏｌ． ３７０、ｐｐ． ３２４−３２５； Ｚｈａｏ ｅｔ ａｌ．、Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １９９８、Ｍａｒ； １６（３）： ２５８−６１； Ｚｈａｏ Ｈ． ａｎｄ Ａｒｎｏｌｄ、ＦＢ、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， １９９７、Ｖｏｌ． ２５． Ｎｏ． ６ ｐｐ． １３０７−１３０８； Ｓｈａｏ ｅｔ ａｌ．、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １９９８、Ｊａｎ １５； ２６（２）： ｐｐ． ６８１−８３； および ＷＯ ９５／１７４１３ に開示されている。適当なインビボシャフリング方法の例は ＷＯ ９７／０７２０５に記載されている。
【０１８０】
さらにペプチド付加物は、本発明のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列またはペプチド付加物をランダム突然変異誘発に付することによって都合良く調製でき、多数の変異したヌクレオチド配列を創出する、ランダム突然変異されたライブラリーを調製することによって構築できる。ランダム突然変異誘発が完全にランダムである場合、ヌクレオチド配列内の突然変異誘発が生じる場所および突然変異誘発の性質の両者に関して、ペプチド付加物をコードする配列部分においてのみランダムに突然変異するように行うのが好ましい。またランダム突然変異誘発は、特定の型のアミノ酸残基、特に、結合基を含有するアミノ酸残基を、ポリペプチド分子へランダムに、あるいはそのペプチド付加物部分へランダムに導入するように行うことができる。置換以外に、ランダム突然変異誘発はまた、挿入または欠失のランダムな導入を含むことができる。好ましくは、挿入は、例えば、Ｈａｌｌｅｔ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １９９７， ２５（９）：１８６６−７ ａｎｄ Ｓｏｎｄｅｋ ａｎｄ Ｓｈｒｏｔｌｅ， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ ＵＳＡ １９９２， ８９（８）：３５８１−５ に記載されるように３ヌクレオチドの複数回の導入を行って、リーディングフレーム内に施される。
【０１８１】
ランダム突然変異誘発（全ヌクレオチド配列またはより好ましくはペプチド付加物をコードするその部分のいずれか）は、任意の適当な方法によって行うことができる。例えばランダム突然変異誘発は、適当な物理的または化学的突然変異誘発剤、適当なオリゴヌクレオチド、ＰＣＲによって生じる突然変異誘発またはこれらの突然変異誘発剤の任意の組み合わせ、および／または、例えば、ＷＯ９７／０７２０２に開示されているような分野技術の記載にしたがう他の方法を用いて行うことができる。
【０１８２】
ＰＣＲによって生じる突然変異誘発（例えば Ｊ．Ｏ． Ｄｅｓｈｌｅｒ （１９９２）， ＧＡＴＡ ９（４）： １０３−１０６ ａｎｄ Ｌｅｕｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ （１９８９） Ｖｏｌ． １， Ｎｏ． １， ｐｐ． １１−１５ に記載されているもの）は、比較的長いペプチド鎖（１００ｂｐ以上を含有するヌクレオチド配列に相当する）または完全遺伝子に関して特に有用であり、好ましくはヌクレオチドのミス包含を増大させる条件下で好ましく行うことができる。
【０１８３】
ドープされたか、あるいはスパイクされた（ｄｏｐｅｄ ｏｒ ｓｐｉｋｅｄ）オリゴヌクレオチドに基づくか、あるいは特定配列のランダム突然変異誘発は、ペプチド付加物をコードするヌクレオチド配列の部分の突然変異誘発に関して特に使用される。
【０１８４】
ペプチド付加物をコードするヌクレオチド配列の部分のランダム突然変異誘発は、ＰＣＲによって生じる突然変異誘発を用いて行うことができ、ここでは、突然変異誘発を受ける領域の両端に隣接する１またはそれ以上の適当なオリゴヌクレオチドプライマーが用いられる。さらに、オリゴヌクレオチドのドープまたはスパイクを用いて、突然変異を導入し、関連する非ペプチド部分に関する結合基を除去または導入するようにできる。当分野の知識水準およびコンピュータプログラム（例えば Ｓｉｄｅｒｏｖｓｋｉ ＤＰ ａｎｄ Ｍａｋ ＴＷ， Ｃｏｍｐｕｔ． Ｂｉｏｌ． Ｍｅｄ． （１９９３） Ｖｏｌ． ２３， Ｎｏ． ６， ｐｐ． ４６３−４７４ ａｎｄ Ｊｅｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， １９９８， Ｖｏｌ． ２６， Ｎｏ． ３ に記載されているもの）を用いて、与えらえたアミノ酸選択に対して最も最適なヌクレオチド混合物を計算できる。オリゴヌクレオチドは、例えばＰＣＲ、ＬＣＲまたは任意のＤＮＡポリメラーゼまたはリガーゼを用いる任意の開示されている技術によって、ペプチド付加物をコードするヌクレオチド配列に導入できる。
【０１８５】
慣用のＰＣＲ法にしたがって、本発明のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列および、特にそのペプチド付加物を鋳型として用い、例えばドープされたか、あるいは特異的なオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いる。さらに、標的化される領域の外側に位置するクローニングベクターを用いることができる。得られた得られたＰＣＲ産物は、適当な発現ベクター内に直接クローニングするか、あるいはゲル精製し、クローニングプライマーを用いる第二のＰＣＲ反応で増幅し、適当な発現ベクター内へクローニングすることができる。
【０１８６】
本明細書中に記載されているランダム突然変異誘発法に加えて、部位特異的突然変異誘発技術を用いて、ペプチド付加物中の１またはそれ以上の選択されるアミノ酸を修飾する、特にペプチド付加物をその結合基の数に関して最適化することが有用であることもある。
【０１８７】
さらに、Ｍａｔｓｕｕｒａ ｅｔ ａｌ， ｏｐ ｃｉｔ に記載されているランダム伸張突然変異誘発を用いて、Ｃ末端ペプチド付加物を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を構築することができる。Ｎ末端ペプチド付加物を有する本発明のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の構築は、同様の方法によって構築できる。
【０１８８】
また、引用によりその開示内容が本明細書中に包含されるＷＯ９７／０４０７９に開示されている方法は、本発明のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を構築するために用いることができる。
【０１８９】
突然変異誘発されるヌクレオチド配列（群）またはヌクレオチド領域（群）は、典型的に適当なベクター、例えばプラスミドまたはバクテリオファージ上に存在し、これは突然変異誘発剤とインキュベートされるか、あるいは別の方法で曝露される。突然変異誘発されるヌクレオチド配列（群）は、宿主細胞のゲノムに組み込むか、あるいは細胞内のベクターに存在させるかによって宿主細胞内に存在させることが可能である。別法では、突然変異されるヌクレオチド配列は単離型である。ヌクレオチド配列は、好ましくは、ＤＮＡ配列、例えばｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたは合成ＤＮＡ配列である。
【０１９０】
突然変異誘発剤とのインキュベーションまたはそれへの曝露後、通常増幅型の、突然変異したヌクレオチド配列は、このヌクレオチド配列を有する適当な宿主細胞を、発現が生じるのを許容する条件下で培養することによって発現させる。この目的のために用いられる宿主細胞は、任意的にベクター上に存在する、突然変異したヌクレオチド配列（群）で形質転換されたものか、突然変異誘発時にヌクレオチド配列を有するものか、またはいずれかの種類の遺伝子ライブラリーである。
【０１９１】
ペプチド付加物の設計
Ｎ−グリコシル化部位を含むＮ末端ペプチド付加物の設計に関する有用な指針の一例は以下の式によって特徴付けられる：
Ｘ１（ＮＸ２［Ｔ／Ｓ］）Ｘ３（ＮＸ２［Ｔ／Ｓ］）ｎＸ４−Ｐｐ
（式中、各Ｘ１、Ｘ３、およびＸ４は独立して、不存在であるか、あるいは任意の型の１、２、３または４アミノ酸残基であり、Ｘ２はプロリンを除く任意の型の単一アミノ酸残基であり、ｎは０から６の任意の整数であり、［Ｔ／Ｓ］ はスレオニンまたはセリン残基、好ましくはスレオニン残基であり、ならびにＮおよびＰｐは、本明細書中別の場所に規定される意味を有する）。Ｎ−グリコシル化部位のＮ−残基に対して第−１〜−４位のアミノ酸残基の性質は、該Ｎ−グリコシル化部位が使用される程度に関して重要であることがあるかもしれないことが発見された。したがって、Ｘ１、Ｘ３、およびＸ４は、（試行錯誤型の実験によって決定される）関連部位の使用の増大が獲得されるように選択することができる。第一の工程では、上記式を有する約１０の異なるムテインが作成される。例えば約１０のムテインは、各Ｘ１、Ｘ３、およびＸ４が独立して１または２アラニン残基であるか、あるいは不存在であり、Ｚが０〜５の範囲の任意の整数であり、［Ｔ／Ｓ］ がスレオニン、およびアラニンであることに基づいて設計される。例えば、これらのムテイン（または任意の他の関連する性質）を用いて得られるインビトロ生物活性および半減期の結果に基づいて、アミノ酸およびグリコシル化の最適数が決定でき、この情報に基づいて新規ムテインが構築される。このプロセスは最適にグリコシル化されたポリペプチドが得られるまで繰り返される。
【０１９２】
別法では、ランダム突然変異誘発を用いて、Ｎ末端拡張されたポリペプチドを創出することができる。例えば、上記式に基づいてランダム突然変異誘発されたライブラリーを作成する。Ｂ位に、あるアミノ酸残基（プロリン以外のアミノ酸残基）をコードするようにドープされたオリゴヌクレオチドを合成し、ここに各Ｘ１、Ｘ３およびＸ４は独立して、０、１または２の任意の型のアミノ酸残基であり、ｎは２であり、Ｔはスレオニンであり、これはランダム突然変異誘発されたライブラリーの構築に用いられる。
【０１９３】
ＰＥＧ化結合基を有するＮ末端ペプチド付加物の有用な指針の一例は、ＰＥＧ化部位の一例としてリシン残基を用いている以下の式によって特徴付けられる。他の結合基を有するペプチド付加物が同様の方法で設計できることが理解されよう。
Ｙ１（Ｋ）Ｙ２（Ｋ）ｎＹ３−Ｐｐ
（式中、各Ｙ１、Ｙ２およびＹ３は独立して、０、１、２、３または４の任意の型のアミノ酸残基（リシンを除く）であり、ｎは０〜６の整数であり、ならびにＰｐは本明細書の別の箇所に定義されているとおりである）。
【０１９４】
第一工程では、上記式を有する約１０の異なるムテインが作成される。例えば、約１０のムテインは、各Ｙ１、Ｙ２、およびＹ３が独立して、１または２アラニン残基であるか、あるいは不存在であり、ｎは０〜５の範囲の任意の整数であることに基づいて設計される。このムテインは、次いで、１０ｋＤａ ＰＥＧ（例えばｍＰＥＧ−ＳＰＡ）を用いてＰＥＧ化される。例えばこれらのムテインを用いて得られたインビトロ生物活性および半減期（または任意の他の関連性質）に基づいて、アミノ酸およびＰＥＧ化部位の最適数（群）が決定でき、この情報に基づいて新規ムテインが構築できる。このプロセスは最適にＰＥＧ化されたポリペプチドが得られるまで繰り返される。
【０１９５】
別法では、上記式に基づくランダム突然変異誘発されたライブラリーを作成することによってランダム突然変異誘発を行うことができる。Ｙ１位に１アミノ酸残基をコードし、Ｙ２および／またはＹ３は独立して０、１または２の任意の型のアミノ酸残基であり、ｎは２であるドープされたオリゴヌクレオチドが合成され、ランダム突然変異誘発されたライブラリーの構築に使用される。
【０１９６】
ＰＮＰ−グルコピラノシド基質を用いるグルコセレブロシダーゼ（ＧＣＢ）活性アッセイ
組換えＧＣＢの酵素活性は、ｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−グルコピラノシド（ＰＮＰ−Ｇｌｕ）を基質として用いて測定される。ＰＮＰ−Ｇｌｕ基質の加水分解は、ｐ−ニトロフェニルを生じさせ、これは、以前に記載される（Ｆｒｉｅｄｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．， １９９９， Ｂｌｏｏｄ ９３； ２８０７−２８１６）ように、分光器を用い、４０５ｎｍでの吸光度を測定することにより定量できる。このアッセイは、非ＧＣＢグルコシダーゼ活性を部分的に阻害する条件下、例えばリン酸／クエン酸バッファーｐＨ＝５．５、０．２５％トリトンＸ−１００および０．２５％タウロコール酸を用いて達成される条件下で行われる。
【０１９７】
このアッセイは、ＧＣＢ活性アッセイバッファーおよび４ｍＭ ＰＮＰ−Ｇｌｕを含有する最終容量２００μＬ中で実行される。酵素による加水分解はＧＣＢを加えることによって開始され、反応は３７℃で１時間進められた後、１Ｍ ＮａＯＨ５０μＬの添加により停止され、４０５ｎｍでの吸光度が測定される。並行アッセイされたｐ−ニトロフェニルの参照標準曲線を用いて、試験サンプル中のＧＣＢの濃度が定量される。
【０１９８】
マクロファージにおけるＧＣＢポリペプチドのインビトロ取り込み（摂取）および安定性
マウス単球／マクロファージセルライン、Ｊ７７４Ｅ（Ｍｕｋｈｏｐａｄｈｙａｙ ａｎｄ Ｓｔａｈｌ， Ａｒｃｈ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ １９９５ Ｄｅｃ １；３２４（１）：７８−８４ および Ｄｉｍｅｎｔ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｌｅｕｋｏｃ Ｂｉｏｌ １９８７ Ｎｏｖ；４２（５）：４８５−９０）を用いて、ＧＣＢポリペプチドの取り込みおよび安定性を研究する。細胞はα−ＭＥＭ（１０％胎児ウシ血清、１Ｘ Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ、および６０μＭ ６−チオグアニンを補足）中で培養し、１０μＭ コンディトールＢエポキシド（ｃｏｎｄｉｔｏｌ Ｂ ｅｐｏｘｉｄｅ）、ＣＢＥ（不可逆性ＧＣＢインヒビター）を含有する上記培地中にシード（２００，０００細胞／ウェル）し、３７℃で２４時間インキュベートする。
【０１９９】
取り込みアッセイの開始前に、細胞を０．５ｍＬ ＨＢＳＳ（Ｈａｎｋｓ 平衡化塩類溶液）中で洗浄する。適当な濃度のＧＣＢポリペプチドを含有する２００μＬ容量中で取り込みを行う（２５〜４００ｍＵ／ｍＬの範囲のＧＣＢ濃度を用いて用量応答曲線を作成する）。コントロールとして、酵母マンナン（最終濃度１．４ｍｇ／ｍＬ）を加え、マクロファージマンノースレセプターを介する取り込みを阻害する。細胞を１時間３７℃でインキュベートし、０．５ｍＬ冷ＨＢＳＳで３回洗浄する。
【０２００】
Ｊ７７４Ｅ細胞によって取り込まれたＧＣＢの量を測定するために、細胞を、４ｍＭ ＰＭＰ−Ｇｌｕを有するＧＣＢ活性アッセイバッファー２００μＬ中で溶解し、３７℃で１時間インキュベートする。次いで、１Ｍ ＮａＯＨ ５０μＬを加えて加水分解を停止させ、ＯＤ４０５を測定する。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｚｍ ２．０ （ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ） を用い、データを非線形回帰によって分析する。
【０２０１】
部位特異的突然変異誘発
部位特異的突然変異体の構築は、所望のアミノ酸交換物または付加物（例えばグリコシル化部位を導入するためのもの）を含有するオリゴヌクレオチドを用いるＰＣＲを使用して行った。適当な制限酵素を用いて、得られたＰＣＲ断片をＧＣＢ発現ベクター中にクローニングし、次いで所望の交換物を含有する構築物を確認するためにＤＮＡ配列決定を行った。
【０２０２】
材料
ＧＣＢ活性アッセイバッファー
１２０ｍＭ リン酸／クエン酸バッファー、ｐＨ＝５．５、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ＝８．０、０．２５％トリトンＸ−１００、０．２５％ タウロコール酸、４ｍＭ β−メルカプトエタノール
【０２０３】
ｐＧＣ−１２ベクター
ｐＶＬ１３９２（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ， ＵＳＡ）、ＥｃｏＲＶ および ＸｂａＩ 内へ挿入されたＧＣＢ ｗｔ ｃＤＮＡ配列（配列番号２）を有する
【０２０４】
表１
実施例１に記載されるように、ｗｔ ＧＣＢコーディング領域をクローニングし、ｐＧＣＢｍａｔプラスミド内へシグナルペプチドを導入するために用いられるプライマーの配列
ＳＯ４９ （ＷＴ−ｓｐ−ＢｇｌＩＩ）： ５’−ＣＧＣＡＧＡＴＣＴＧＡＴＧＧＣＴＧＧＣＡＧＣＣＴＣＡＣＡＧＧＡＴＴＧＣ−３’
ＳＯ５０ （ＷＴ−ｓｔｏｐ−ＥｃｏＲＩ）： ５’−ＣＣＧＧＡＡＴＴＣＣＣＡＴＣＡＣＴＧＧＣＧＡＣＧＣＣＡＣＡＧＧＴＡＧＧＴＧ−３’
ＳＯ５１ （ＷＴ−ｍａｔｕｒｅ−ＳａｃＩ）： ５’−ＡＣＧＣＧＡＧＣＴＣＧＣＣＣＣＴＧＣＡＴＣＣＣＴＡＡＡＡＧＣＴＴＣＧＧ−３’
ＳＯ５２ （ＳＰｅｇｔ−ＮｈｅＩ／ＳａｃＩ−ａｓ）： ５’−ＧＣＧＴＴＧＡＣＧＧＣＡＧＴＣＡＧＡＧＴＴＧＡＣＡＧＡＡＧＧＧＣＣＡＧＣＣＡＧＣＡＡＡＧＧＡＴＡＧＴＣＡＴＧ−３’
ＳＯ５３ （ＳＰｅｇｔ−ＮｈｅＩ／ＳａｃＩ−ｓ）： ５’−ＣＴＡＧＣＡＴＧＡＣＴＡＴＣＣＴＴＴＧＣＴＧＧＣＴＧＧＣＣＣＴＴＣＴＧＴＣＡＡＣＴＣＴＧＡＣＴＧＣＣＧＴＣＡＡＣＧＣＡＧＣＴ−３’
ＳＯ５４ （ＳＰｅｇｔ−ＮｈｅＩ／ＳａｃＩ−ａｓ）： ５’−ＣＣＴＧＣＴＡＣＴＧＣＴＣＣＣＡＧＣＡＧＣＡＧＴＧＡＡＡＧＡＧＴＣＣＡＡＡＧＴＧＧＣＡＧＣＡＴＧ−３’
ＳＯ５５ （ＳＰｅｇｔ−ＮｈｅＩ／ＳａｃＩ−ｓ）： ５’−ＣＴＡＧＣＡＴＧＣＴＧＣＣＡＣＴＴＴＧＧＡＣＴＣＴＴＴＣＡＣＴＧＣＴＧＣＴＧＧＧＡＧＣＡＧＴＡＧＣＡＧＧＡＧＣＴ−３’
Ｃｅｒｅｚｙｍｅ ｗａｓ ｋｉｎｄｌｙ ｐｒｏｖｉｄｅｄ ｂｙ Ｄｒ． Ｅ． Ｂｅｕｔｌｅｒ， Ｓｃｒｉｐｐｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ， ＣＡ， ＵＳＡ．
Ｊ７７４Ｅ ｗａｓ ｋｉｎｄｌｙ ｐｒｏｖｉｄｅｄ ｂｙ Ｇ． Ｇｒａｂｏｗｓｋｉ， Ｃｉｎｃｉｎｎａｔｉ， Ｏｈｉｏ， ＵＳ
【０２０５】
実施例１
ＷＴ ＧＣＢの生産
昆虫細胞内におけるクローニングおよび発現
ヒト線維芽細胞 ｃＤＮＡ ライブラリーを Ｃｌｏｎｔｅｃｈ （Ｈｕｍａｎ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｓｋｉｎ ｃＤＮＡ ｃｌｏｎｅｄ ｉｎ ｌａｍｂＤａ−ｇｔ１１， ｃａｔ＃ ＨＬ１０５２ｂ） から得た。標準的方法により、このライブラリーからラムダ ＤＮＡ を調製し、ＳＯ４９ および ＳＯ５０（第二ＡＴＧからのヒトシグナルペプチドを伴うＧＣＢコード領域の増幅）または ＳＯ５０ および ＳＯ５１（ＧＣＢコード領域の成熟部分を増幅）のいずれかをプライマーとして用いる ＰＣＲ 反応において鋳型として用いた（材料段落の表１を参照）。同一プライマーを用いて ＰＣＲ 産物を再増幅し、アガロースゲル精製した。次いで、ＳＯ４９／５０ ＰＣＲ 産物を ＢｇｌＩＩ および ＥｃｏＲＩ で消化し、ＢａｍＨＩ および ＥｃｏＲＩ で消化された ｐＢｌｕｅＢａｃ ４．５ ベクター （ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｃａｒｌｓｂａｄ， ＣＡ， ＵＳＡ， Ｃａｒｌｓｂａｄ， ＣＡ， ＵＳＡ） 中にクローニングした。配列決定により、挿入物が、配列番号２に記載のｗｔＧＣＢ配列と同一であることを確認した。得られたプラスミドを用いて、昆虫細胞をＧＣＢで感染させ、これは、Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．， ＤＮＡ ７， ｐｐ． ９９−１０６， １９８８ に記載されるように、ヒトシグナル配列のせいで細胞から部分的に分泌された。ＳＯ５０／５１ ＰＣＲ 産物を ＳａｃＩ および ＥｃｏＲＩ で消化し、同一酵素で消化された ｐＢｌｕｅＢａｃ ４．５ ベクター （ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｃａｒｌｓｂａｄ， ＣＡ， ＵＳＡ） 中にクローニングし、ｐＧＣＢｍａｔ プラスミドを得た。２つの異なるシグナル配列を、成熟ＧＣＢコドンの上流に挿入し、分泌される酵素量を増大させる。ＳＯ５２ および ＳＯ５３ （表 １） をアニーリングすることによって、バキュロウイルスエクジステロイドＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼ（ｅｇｔ）シグナル配列 （Ｍｕｒｐｈｙ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ４， ３４９−３５７， １９９３） を挿入し、ＳＯ５４ および ＳＯ５５ （表 １） をアニーリングすることによってヒト膵臓リパーゼシグナル配列 （Ｌｏｗｅ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６４， ２００４２， １９８９） を挿入し、これらを ＮｈｅＩ および ＳａｃＩ 消化された ｐＧＣＢｍａｔ プラスミド中へクローニングした。ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｃａｒｌｓｂａｄ， ＣＡ， ＵＳＡ のプロトコルにしたがって、得られたプラスミドを Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒＤａ （Ｓｆ９） 細胞に感染させた。
【０２０６】
昆虫細胞内で生産されたＧＣＢポリペプチドの精製
ＵＳ ５，２３６，８３８ に記載の方法を修飾して、ＧＣＢ活性を有するポリペプチドを精製した。細胞を培養培地から遠心分離 （１０ ｍｉｎ ａｔ ４０００ ｒｐｍ ｉｎ ａ Ｓｏｒｖａｌｌ ＲＣ５Ｃ ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ） して除去し、精製前に上清を０．２２μｍフィルターを用いてマイクロろ過した。ＤＴＴ を１ｍＭまで加え、Ｖｉｖａｆｌｏｗ ２００ 系 （Ｖｉｖａｓｃｉｅｎｃｅ） を用いて培養上清を限外ろ過し、出発容量の約１／１０にした。濃縮された溶媒を遠心分離し潜在性の凝集物を除去した後、５０ｍＭクエン酸ナトリウム、２０％（ｖ／ｖ）エチレングリコール、１ｍＭ ＤＴＴ、ｐＨ５．０で前もって平衡化されたＴｏｙｏｐｅａｒｌ Ｂｕｔｙｌ６５０Ｃ 樹脂 （ＴｏｓｏＨａａｓ） にアプライした。このクロマトグラフィー工程は室温で行った。樹脂を少なくとも３カラム容量の５０ｍＭクエン酸ナトリウム、２０％（ｖ／ｖ）エチレングリコール、１ｍＭ ＤＴＴ、ｐＨ５．０で洗浄（２８０ｎｍの吸光度がベースラインレベルに達するまで）し、０％〜１００％の線形濃度勾配の５０ｍＭクエン酸ナトリウム、８０％（ｖ／ｖ）エチレングリコール、１ｍＭ ＤＴＴ、ｐＨ５．０で ＧＣＢ を溶出させた。フラクションを収集し、ＧＣＢ活性アッセイを用いて ＧＣＢ 活性に関してアッセイした。通常、ｗｔ ＧＣＢ は約７０％（ｖ／ｖ）エチレングリコールで溶出を開始する。
以後の精製は、以下の２方法のいずれかによって行った。番号２の方法ではより高い純度のＧＣＢが得られる。
【０２０７】
方法１
第一のプロセス工程から得られた ＧＣＢ が豊富なフラクションをプールし、５０ｍＭクエン酸ナトリウム，５ｍＭ ＤＴＴ、ｐＨ５．０を含有するバッファーで約４倍希釈し、エチレングリコール含量を２０％（またはそれ以下）に減少させた。第二のＨＩＣ精製工程において、希釈され、かつ部分的に精製された ＧＣＢ を、５０ｍＭクエン酸ナトリウム、１ｍＭ ＤＴＴ、ｐＨ５．０（バッファーＡ）で使用前に平衡化された Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ フェニル樹脂 （ＴｏｓｏＨａａｓ） にアプライした。アプライ後、樹脂を少なくとも３カラム容量の５０ｍＭ クエン酸ナトリウム、ｐＨ５で洗浄（２８０ｎｍでの吸光度がベースラインレベルに達するまで）し、次いで ＧＣＢ を０％〜１００％の線状エタノール濃度勾配バッファーＢ （５０ ｍＭ クエン酸ナトリウム， ５０％ （ｖ／ｖ） エタノール， １ ｍＭ ＤＴＴ， ｐＨ ５．０） で溶出させた。ＧＣＢ活性アッセイを用いて同定されたＧＣＢの高度に精製されたフラクション （野生型 ＞ ９５％純粋） は約４０％エタノールで溶出を開始する。精製された ＧＣＢ バルク産物を５０ｍＭクエン酸ナトリウム、０．２Ｍマンニトール、０．０９％ ｔｗｅｅｎ８０， ｐＨ ６．１ に透析し、次いで４〜８℃または−８０℃で保存してＧＣＢ活性を保持した。
【０２０８】
方法２
Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ｂｕｔｙｌ６５０Ｃ 樹脂から溶出されたＧＣＢが豊富化されたフラクションをプールし、４℃で、前もって ２５ ｍＭ クエン酸ナトリウム， １ ｍＭ ＤＴＴ， １０％ エチレングリコール， ｐＨ ５．０ で平衡化したＳＰセファロース樹脂 （Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ） にアプライした。アプライ後、この樹脂を ２５ ｍＭ クエン酸ナトリウム， １ ｍＭ ＤＴＴ， １０％ エチレングリコール， ｐＨ ５．０ で洗浄 （２８０ ｎｍ での吸光度がベースラインレベルに達するまで） し、次いで ＧＣＢ を０〜１００％の線形濃度勾配の０．２５Ｍクエン酸ナトリウム， １ ｍＭ ＤＴＴ， １０％ エチレングリコール， ｐＨ ５．０ で溶出させた。ＧＣＢ は約０．１５Ｍクエン酸ナトリウムで溶出を開始する。ＧＣＢ を含有するフラクションをプールし、室温で、２５ ｍＭ クエン酸ナトリウム、１ ｍＭ ＤＴＴ， ｐＨ ５．０ で前もって平衡化されたフェニルセファロースハイパフォーマンス （Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ） にアプライした。アプライ後、樹脂を、２５ ｍＭ クエン酸ナトリウム、１ ｍＭ ＤＴＴ， ｐＨ ５．０ で洗浄（２８０ｎｍでの吸光度がベースラインに達するまで）し、および次いで ＧＣＢ を０〜１００％の線形濃度勾配の２５ｍＭクエン酸ナトリウム、１ ｍＭ ＤＴＴ ５０ ％ エタノール ｐＨ ５．０ で溶出させた。ＧＣＢ は典型的に、約３５％エタノールで溶出する。精製された ＧＣＢ バルク産物を ５０ ｍＭ クエン酸ナトリウム， １ ｍＭ ＤＴＴ， ｐＨ ５．０ または ５０ ｍＭ クエン酸ナトリウム， ０．２ Ｍ マンニトール， １ ｍＭ ＤＴＴ， ｐＨ ６．１ のいずれかに透析し、次いで保存時に ＧＣＢ 活性を保持した。精製された ＧＣＢ を濃縮し、滅菌ろ過し、次いで４〜８℃または−８０℃で保存した。典型的に、この方法によって精製された ＧＣＢ は＞９５％純粋である。
【０２０９】
実施例２
部位特異的またはランダム突然変異誘発アプローチを用いるＮ末端ペプチド付加物を伴うＧＣＢの調製
以下のＮ末端ペプチド付加物をコードするヌクレオチド配列を、ｗｔＧＣＢをコードする配列番号２に示されるヌクレオチド配列に加える： （Ａ−４）＋（Ｎ−３）＋（Ｉ−２）＋（Ｔ−１） （配列番号 １ に示されるアミノ酸配列のＮ末端へのアミノ酸残基ＡＮＩＴの拡張物を示す）， および （Ａ−７）＋（Ｓ−６）＋（Ｐ−５）＋（Ｉ−４）＋（Ｎ−３）＋（Ａ−２）＋（Ｔ−１） （ＡＳＰＩＮＡＴ）。
【０２１０】
Ｎ末端ペプチド付加物 （Ａ−４）＋（Ｎ−３）＋（Ｉ−２）＋（Ｔ−１） をコードするヌクレオチド配列を以下の条件を用いるＰＣＲによって調製した：
ＰＣＲ １：
鋳型： １０ ｎｇ ｐＢｌｕｅＢａｃ５ （ｗｔ ＧＣＢ ｃＤＮＡ 配列を伴う）
プライマー ＳＯ６０：　５’−ＣＡＧＣＴＧＧＣＣＡＴＧＧＧＴＡＣＣＣＧＧ−３’ および
プライマー ＳＯ８５：
５’−ＴＧＧＧＣＡＴＣＡＧＧＴＧＣＣＡＡＣＡＴＴＡＣＡＧＣＣＣＧＣＣＣＣＴＧＣＡＴＣＣＣＴＡＡＡＡＧＣ−３’
ＢＩＯ−Ｘ−ＡＣＴＴＭ ＤＮＡ ポリメラーゼ （Ｂｉｏｌｉｎｅ， Ｌｏｎｄｏｎ， Ｕ．Ｋ．）
１ｘＯｐｔｉＢｕｆｆｅｒＴＭ　（Ｂｉｏｌｉｎｅ， Ｌｏｎｄｏｎ， Ｕ．Ｋ．）
３０ サイクル （９６℃ ３０ｓ， ５５℃ ３０ｓ， ７２℃ １ ｍｉｎ）
ＰＣＲ ２：
鋳型： １０ ｎｇ ｐＢｌｕｅＢａｃ５ （ｗｔ ＧＣＢ を伴う），
バキュロウイルスフォワードプライマー：　５’−ＴＴＴＡＣＴＧＴＴＴＴＣＧＴＡＡＣＡＧＴＴＴＴＧ−３’ および
プライマーＳＯ８６：
５’− ＧＣＡＧＧＧＧＣＧＧＧＣＴＧＴＡＡＴＧＴＴＧＧＣＡＣＣＴＧＡＴＧＣＣＣＡＣＧＡＣＡＣＴＧＣＣＴＧ−３’
ＢＩＯ−Ｘ−ＡＣＴＴＭ ＤＮＡ ポリメラーゼ （Ｂｉｏｌｉｎｅ， Ｌｏｎｄｏｎ， Ｕ．Ｋ．）
１ｘＯｐｔｉＢｕｆｆｅｒＴＭ　（Ｂｉｏｌｉｎｅ， Ｌｏｎｄｏｎ， Ｕ．Ｋ．）
３０ サイクル （９６℃ ３０ｓ， ５５℃ ３０ｓ， ７２℃ １ ｍｉｎ）
ＰＣＲ ３：
３ μＬ アガロースゲル精製された ＰＣＲ１ および ＰＣＲ２ 産物 （約 １０ ｎｇ）
バキュロウイルスフォワードプライマー：　５’−ＴＴＴＡＣＴＧＴＴＴＴＣＧＴＡＡＣＡＧＴＴＴＴＧ−３’ および プライマー ＳＯ６０
ＢＩＯ−Ｘ−ＡＣＴＴＭ ＤＮＡ ポリメラーゼ （Ｂｉｏｌｉｎｅ， Ｌｏｎｄｏｎ， Ｕ．Ｋ．）
１ｘＯｐｔｉＢｕｆｆｅｒＴＭ　（Ｂｉｏｌｉｎｅ， Ｌｏｎｄｏｎ， Ｕ．Ｋ．）
３０ サイクル （９６℃ ３０ｓ， ５５℃ ３０ｓ， ７２℃ １ ｍｉｎ）
【０２１１】
ＰＣＲ ３ はアガロースゲル精製され、ＮｈｅＩ および ＮｃｏＩ で消化され、ＮｈｅＩ および ＮｃｏＩ で消化された ｐＢｌｕｅｂａｃ４．５＋ｗｔＧＣＢ 中にクローニングされた。
ＤＮＡ配列決定により、正しい突然変異を確認した後、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｃａｒｌｓｂａｄ， ＣＡ， ＵＳＡ の Ｂａｃ−Ｎ−ＢｌｕｅＴＭ トランスフェクションキットを用い、このプラスミドを昆虫細胞にトランスフェクトした。ムテインの発現は、ウェスタンブロッティングおよびＧＣＢ活性アッセイを用いるムテインの活性測定によって試験された。
実施例１に記載の方法と同様の方法を用い、昆虫細胞（Ｓｆ９）中、発現ベクター ｐＶＬ１３９２ を用いて発現された ｗｔＧＣＢ（配列番号１）の酵素活性は、１３ユニット／Ｌを与え、一方、Ｎ末端ペプチド付加物は ＡＳＰＩＮＡＴ は ２８．５ ユニット／Ｌ を与えた。
【０２１２】
Ｎ末端ペプチド付加物を有するＧＣＢのライブラリーの構築
ランダム突然変異誘発を用い、Ｎ末端拡張を伴うＧＣＢポリペプチドに基づく２つの異なるライブラリーを構築した − 以下のアミノ酸配列によってコードされるＮ末端拡張を伴うライブラリー Ａ：ＡＸＮＸＴＸＮＸＴＸＮＸＴ， および ＡＮＸＴＮＸＴＮＸＴ をコードするＮ末端拡張を伴うライブラリー Ｂ。
【０２１３】
ライブラリーＡ用のプライマーは以下のように設計された：
ＳＯ１６７： ５’−ＧＴＧＴＣＧＴＧＧＧＣＡＴＣＡＧＧＴＧＣＣＮＮ（Ｇ／Ｃ）ＡＡ（Ｃ／Ｔ）（Ｔ／Ａ／Ｇ）Ｎ（Ｇ／Ｃ）ＡＣ（Ａ／Ｔ／Ｃ）（Ｔ／Ａ／Ｇ）Ｎ（Ｇ／Ｃ）ＡＡ（Ｃ／Ｔ）（Ｔ／Ａ／Ｇ）Ｎ（Ｇ／Ｃ）ＡＣ（Ａ／Ｔ／Ｃ）（Ｔ／Ａ／Ｇ）Ｎ（Ｇ／Ｃ）ＡＡ（Ｃ／Ｔ）（Ｔ／Ａ／Ｇ）Ｎ（Ｇ／Ｃ）ＡＣ（Ａ／Ｔ／Ｃ）ＧＣＣＣＧＣＣＣＣＴＧＣＡＴＣＣＣＴＡＡＡＡＧＣ
ＳＯ１６８： ５’−ＧＧＣＡＣＣＴＧＡＴＧＣＣＣＡＣＧＡＣＡＣＴＧＣＣＴＧ
【０２１４】
ライブラリーＢ用のプライマーはランダムな位置にトリヌクレオチドを使用して設計された。
Ｘ はすべての天然アミノ酸残基（プロリンを除く）に対するトリヌクレオチドコドンの混合物である。用いられるトリヌクレオチドコドンは Ｋａｙｕｓｈｉｎ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， ２４， ３７４８−３７５５， １９９６ に記載されるものと同一である。
ＳＯ１６５： ５’− ＣＧＴＧＧＧＣＡＴＣＡＧＧＴＧＣＣＡＡＣ（Ｘ）ＡＣ（Ａ／Ｔ／Ｃ）ＡＡ（Ｃ／Ｔ）（Ｘ）ＡＣ（Ａ／Ｔ／Ｃ）ＡＡ（Ｃ／Ｔ）（Ｘ）ＡＣ（Ａ／Ｔ／Ｃ）ＧＣＣＣＧＣＣＣＣＴＧＣＡＴＣＣＣＴＡＡＡＡＧＣ
ＳＯ１６６： ５’− ＧＴＴＧＧＣＡＣＣＴＧＡＴＧＣＣＣＡＣＧＡＣＡＣＴＧＣＣＴＧ
【０２１５】
両ライブラリーに関しては：
ＳＯ６０ および ｐＢＲ１０： ５’− ＴＴＴ ＡＣＴ ＧＴＴ ＴＴＣ ＧＴＡ ＡＣＡ ＧＴＴ ＴＴＧ
【０２１６】
すべての ＰＣＲ 反応において、ＢＩＯ−Ｘ−ＡＣＴＴＭ ＤＮＡ ポリメラーゼ （Ｂｉｏｌｉｎｅ， Ｌｏｎｄｏｎ， Ｕ．Ｋ．） および １＊ＯｐｔｉｂｕｆｆｅｒＴＭ　（Ｂｉｏｌｉｎｅ， Ｌｏｎｄｏｎ， Ｕ．Ｋ．） を用いた。ＰＣＲ 条件は ３０ サイクル（９４℃ ３０ｓ， ５５℃ １ ｍｉｎ， および ７２℃ １ ｍｉｎ）であった。
【０２１７】
上記ＰＣＲによって、Ｎ末端拡張物をコードするヌクレオチド配列を調製するための鋳型およびプライマーは以下のものである：
ＰＣＲ １Ａ：
鋳型： ｐＧＣ１２
プライマー： ＳＯ６０ ＋ ＳＯ１６７
ＰＣＲ １Ｂ：
鋳型： ｐＧＣ１２
プライマー： ＳＯ６０ ＋ ＳＯ１６５
ＰＣＲ ２Ａ：
鋳型： ｐＧＣ１２
プライマー： ＳＯ１６８ ＋ ｐＢＲ１０
ＰＣＲ ２Ｂ：
鋳型： ｐＧＣ１２
プライマー： ＳＯ１６６ ＋ ｐＢＲ１０
ＰＣＲ ３Ａ：
鋳型： １ μＬの アガロースゲル精製された ＰＣＲ １Ａ および ２Ａ 産物
プライマー： ＳＯ６０ ＋ ｐＢＲ１０
ＰＣＲ ３Ｂ：
鋳型： １ μＬの アガロースゲル精製された ＰＣＲ １Ｂ および ２Ｂ 産物
プライマー： ＳＯ６０ ＋ ｐＢＲ１０
【０２１８】
ＰＣＲ ３Ａ および ３Ｂ をアガロースゲル精製し、ＮｈｅＩ および ＮｃｏＩ で消化し、 ＮｈｅＩ および ＮｃｏＩ で消化された ｐＧＣ−１２ に連結した。連結（ライゲーション）混合物をコンピーテントＥ． ｃｏｌｉ 内に導入した。ライブラリーの拡散を、種々の Ｅ． ｃｏｌｉ クローンのＤＮＡ配列決定により試験し、以下のアミノ酸配列を生じさせた：
【０２１９】
ライブラリー Ａ：
１：　ＡＦＮＸＴＬＮＫＴＷＮ（Ｆ／Ｌ）Ｔ
２：　ＴＭＮＮＴＷＮＷＴＷＮＷＴ
３：　−ＥＸＴ ｗｔ
４：　ＡＬＮＳＴＧＮＬＴＶＤＧＴ
５：　ＡＳＮＳＴＦＮＬＴＥＮＬＴ
６：　ＴＲＮＶＴＩＮＣＴＵＮＳＴ
７：　 −ＥＸＴ ｗｔ
８：　ＡＬＮＷＴＹＮＧＴＫＮＶＴ
９：　ＡＡＮＷＴＶＮＦＴＧＮＦＴ
１０： −ＥＸＴ　ｗｔ
１１： ＡＸＮＸＴＶＮＳＴＵＮＶＴ
１２： ＡＮＮＦＴＦＮＧＴＬＮＬＴ
１３： ＡＧＮＷＴＡＮＶＴＶＮＶＴ
１４： ＡＧＮＳＴＳＮＶＴＧＮＷＴ
１５： ＡＶＮＳＴＭＮＩＨＡＩＰＰ　　（ １ 欠失 − 非センス）
１６： ＡＧＮＧＴＶＮＧＴＩＮＧＴ
１７： ＡＶＮＳＴＧＮＸＴＧＮＷＴ
１８： ＡＧＮＧＴＵＮＧＴＳＮＬＴ
１９： −ＥＸＴ　ｗｔ
２０： ＡＭＮＳＴＫＮＳＴＬＮＩＴ
２１： ＡＦＮＹＴＳＫＮＳＴ
２２： −ＥＸＴ　ｗｔ
２３： ＡＶＮＡＴＭＮＷＴＡＮＧＴ
２４： ＡＳＮＳＴＮＮＧＴＬＮＡＴ
２５： ＡＲＮＫＴＫＮＦＴＩＮＬＴ
２６： ＡＰＮＩＴＵＮＤＴＶＮＭＴ
２７： ＡＱＮＫＴＦＮＦＴＭＮＣＴ
２８： ＡＬＮＶＴＷＮＣＴＬＮＬＴ
２９： ＡＬＮＴＴＷＴＮＬＴ
【０２２０】
ライブライリー Ｂ：
１：　ＡＮＴＴＮＦＴＮＥＴ
２：　ＡＮＷＴＮＲＴＮＣＴ
３：　ＡＮＷＴＮＦＴＮＷＴ
４：　ＰＴＧＬＩＧＴＮＦＴ
５：　ＡＮＷＴＮＫＴＮＦＴ
６：　ＡＮＮＴＮＬＴＮＡＴ
７：　ＡＮＹＴＮＷＴＮＦＴ
８：　ＡＮＴＴＮＱＴＮＤＴ
９：　− ＥＸＴ ｗｔ
１０： ＡＮＲＴＮＷＴＮＴＴ
１１： ＰＴＡＴＮＨＴＮＳＴ
１２： − ＥＸＴ ｗｔ
１３： ＡＮＷＴＮＱＴＮＱＴ
１４： ＡＮＷＴＮＷＴＮＡＴ
１５： ＡＮＦＴＮＫＴＮＭＴ
１６： ＡＮＨＴＮＥＴＮＡＴ
１７： ＡＮ（Ｃ／Ｗ）ＴＮＦＴＮＥＴ
１８： ＡＮＬＤＫＬＨＫＵＨ　（挿入 − 非センス）
１９： ＡＮＣＦＴＮＱＴＮＦＴ
２０： ＡＮＷＴＮＷＴＮＥＷＴ
２１： ＡＮＣＴＮＷＴＮＣＴ
２２： − ＥＸＴ ｗｔ
２３： − ＥＸＴ ｗｔ
２４： ＣＨＰＹＮＷＴＮＷＴ
２５： ＡＮＥＴＮＹＴＮＥＴ
２６： ＡＮＷＴＮＷＴ
２７： ＡＫＰＹＫＳＹＫＦＹ　 （挿入 − 非センス）
２８： ＡＮＩＴＮＫＴＮＷＴ
２９： ＡＮＷＴＮＭＴＮＩＴ
３０： ＡＮＮＴＮＲＴＮＦＴ
３１： ＡＮＷＴＮＷＴＮＷＴ
３２： ＡＮＷＲＴＮＨＴＮＫＴ
３３： − ＥＸＴ ｗｔ
３４： ＡＮＱＴＮＩＴＮＷＴ
【０２２１】
Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｃａｒｌｓｂａｄ， ＣＡ， ＵＳＡ の Ｂａｃ−Ｎ−ＢｌｕｅＴＭ トランスフェクションキットを用いて、ライブラリーＢを昆虫細胞内にトランスフェクトした。まず、ライブラリーＢ由来の ９６ プラークを選び、活性測定（ＧＣＢ活性アッセイ）によって試験した。プラークを以下のように選択し： 高度の活性を有する ３， 中度の活性を有する ３ および低度の活性を有するか、あるいは活性を有しない ３， ならびにウイルスをＤＮＡ配列決定用に精製し、以下のアミノ酸配列を得た：
高度の活性：
１−１： 混合配列
１−２： ＡＮＦＴＮＶＡＴＮＱＴ
１−３： （Ａ）（Ｎ）ＴＴＸＬＴＮ（Ｋ）Ｔ
中度の活性：
２−１： ＡＮＫＴＮ（Ｓ／Ｃ）ＴＮＩＴ
２−２： 混合配列
２−３： ＡＮＷＴＮＣＴＮ（Ｉ）Ｔ
低度の活性：
３−１： ＡＮＷＴＮ（Ｆ／Ｌ）ＴＮＷＴ
３−２： ＣＱＬＤＵＲＳＴＮＥＴ
３−３： 配列なし
【０２２２】
両ライブラリーから９６プラークを選択し、活性測定（ＧＣＢ活性アッセイ）に関して試験した。各ライブラリーから、高度の活性を有する６プラークを選択し、ウイルスをＤＮＡ配列決定用に精製した。種々のクローンによってコードされるアミノ酸配列は以下のものであった：
ライブラリー Ａ：
１： 混合配列
２：　混合配列
３：　混合配列
４： ＷＴ
５： ＡＮＮＴＮＹＴＮＷＴ
６： ＡＮＮＴＮＹＴＮＷＴ
ライブラリー Ｂ：
１： ＡＡＮＤＴＵＮＷＴＶＮＣＴ
２： ＡＴＮＩＴＬＮＹＴＡＮＴＴ
３： ＷＴ
４： ＡＡＮＳＴＧＮＩＴＩＮＧＴ
５： ＡＶＮＷＴＳＮＤＴＳＮＳＴ
【０２２３】
本発明の ＧＣＢ ポリペプチドを、ＧＣＢ活性、Ｊ７７４Ｅ 細胞内での安定性、Ｊ７７４Ｅ 細胞内への取り込みを含む種々の性質に関して試験した。特に記載しない限り、これらの性質は、本明細書中方法段落に記載されている方法を用いて試験した。
【０２２４】
以下の表では、本発明の種々のＧＣＢポリペプチドのＧＣＢ活性が、プラーク精製後のライブラリーＡおよびＢ由来のポジティブな活性とともに列記されている。
【表３】
2004504016.tif 000005
【０２２５】
表２：プラスミドカラムは、ＧＣＢポリペプチドの番号を示す。ベクターカラムはポリペプチドの発現に用いられるプラスミドベクターを示す。突然変異カラムは、ＧＣＢポリペプチドのアミノ酸交換を示す。Ｎ末端拡張物は「Ｎ−拡張」と記載し、その後ろに拡張物を構成するアミノ酸残基を記載する。活性カラムは、ＧＣＢ活性アッセイによって測定された、１単一プラークで感染され、６ウェルプレートの培地３ｍＬ中で培養されたＳｆ９昆虫細胞由来の上清に対するＧＣＢ活性のユニット／Ｌを示す。Ｐ２でラベルされたものは１５ｍＬ Ｔ７５フラスコ中で培養されたウイルス感染細胞由来の上清の活性の測定値である。
【０２２６】
【表４】
2004504016.tif 000006
【０２２７】
表３：Ｊ７７４Ｅマクロファージセルラインにおける、種々のＧＣＢポリペプチドの取り込みに関して計算されたＶｍａｘおよびＫｍ。ＶｍａｘおよびＫｍは用量応答曲線から計算されたものである（例えば図１参照）。選択されたＧＣＢポリペプチドの取り込みは図１に示されている。
【０２２８】
表３から読み取れるように、Ｖｍａｘの増大は、Ｎ末端拡張されたＧＣＢポリペプチドに関して観察された（ｐＧＣ６０、ｐＧＣ６１、およびｐＧＣ６２）。
【０２２９】
実施例３
昆虫細胞において発現された本発明のＧＣＢポリペプチドのグリコシル化
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ 質量分析を用い、Ｓｆ９細胞において発現されたＧＣＢポリペプチドに結合した炭水化物量を調べた。
試験されたすべての ６ ＧＣＢ ポリペプチド変異体は ｗｔＧＣＢ と比較して追加のＮ−グリコシル化部位を含有していた。
ＷｔＧＣＢ は５の潜在的 Ｎ−グリコシル化部位を有し、そのうち４のみが使用される。
６ ＧＣＢ ポリペプチド変異体は：
ＧＣ−３６：　 ＡＳＰＩＮＡＴＳＰＩＮＡＴ−ＧＣＢ，
ＧＣ−３８：　 ＡＳＰＩＮＡＴ−ＧＣＢ（Ｋ１９４Ｎ，Ｋ３２１Ｎ），
ＧＣ−６０：　 ＡＮＮＴＮＹＴＮＷＴ−ＧＣＢ，
ＧＣ−６１：　 ＡＴＮＩＴＬＮＹＴＡＮＴＴ−ＧＣＢ，
ＧＣ−６２：　 ＡＡＮＳＴＧＮＩＴＩＮＧＴ−ＧＣＢ， および
ＧＣ−６３：　 ＡＶＮＷＴＳＮＤＴＳＮＳＴ−ＧＣＢ。
【０２３０】
ＷｔＧＣＢ：
ｗｔＧＣＢ の理論的ペプチド質量は ５５ ５９１ Ｄａ である。ＷｔＧＣＢ は ５ の潜在的 Ｎ−グリコシル化部位を有し、そのうち４のみが使用される。Ｓｆ９細胞上に発現された組換えタンパク質上の２の最も一般的なＮ−グリカン構造は、質量 １０３８．３８ Ｄａ および ８９２．３１ Ｄａ を有する Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２Ｆｕｃ および Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２ であり、それぞれ、４Ｎ−グリカンを有する ｗｔＧＣＢ の発現質量は ５９ １５９ Ｄａ および ５９ ７４３ Ｄａ 間である。
【０２３１】
ｗｔＧＣＢ の ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ 質量分析により、４Ｎ−グリカンを有する ｗｔＧＣＢ の予測される質量にしたがって、ピーク質量 ５９．３ ｋＤａ を有する糖タンパク質に特有の広いピークが示される。
【０２３２】
ＧＣ−３６ （ＡＳＰＩＮＡＴＳＰＩＮＡＴ−ＧＣＢ）：
ＧＣ−３６ の理論的ペプチド質量は ５６ ８２９ Ｄａ である。Ｎ末端拡張は、ｗｔＧＣＢ と比較して、さらに２の潜在的グリコシル化部位、Ｎ５ および Ｎ１１ を含有する。変異体の ｗｔＧＣＢ 部分は ｗｔＧＣＢ と同様にグリコシル化されるとすると、変異体は６の潜在的Ｎ−グリコシル化部位を有する。
【０２３３】
Ｓｆ９細胞において発現された組換えタンパク質上の２の最も一般的なＮ−グリカン構造は、それぞれ質量 １０３８．３８ Ｄａ および ８９２．３１ Ｄａ を有する Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２Ｆｕｃ および Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２ であるため、４Ｎ−グリカンを有する ＧＣ−３６ の予測される質量は ６０ ３９７ Ｄａ および ６０ ９８１ Ｄａ の範囲であり、５Ｎ−グリカンを有する ＧＣ−３６ の予測される質量は ６１ ２８９ Ｄａ および ６２ ０１９ Ｄａ の範囲であり、６Ｎ−グリカンを有する ＧＣ−３６ の予測される質量は ６２ １８１ Ｄａ および ６３ ０５７ Ｄａ の範囲である。
【０２３４】
ＧＣ−３６ の ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ 質量分析により、５または６Ｎ−グリカンを有する ＧＣ−３６ の予測される質量にしたがって、６１．５ ｋＤａ および ６２．９ ｋＤａ の範囲のピーク質量を有するやや広いピークが示される。
【０２３５】
ＧＣ−３６ のＮ末端アミノ酸配列分析により、質量分析を用いて得られた結果と完全に一致して、Ｎ５は完全にグリコシル化されており、Ｎ１１は部分的にグリコシル化されていることが示された。
【０２３６】
ＧＣ−３８ （ＡＳＰＩＮＡＴ−ＧＣＢ（Ｋ１９４Ｎ，Ｋ３２１Ｎ））：
ＧＣ−３８ 理論的ペプチド質量は ５６ ２１７ Ｄａ である。Ｎ末端拡張は、ｗｔＧＣＢ と比較して、Ｎ５においてさらに１の潜在的グリコシル化部位を含有する。さらに、Ｌｙｓ１９４ および Ｌｙｓ３２１ の Ａｓｎ 残基での置換により、さらに２の潜在的Ｎ−グリコシル化部位が導入される。変異体の ｗｔＧＣＢ 部分は ｗｔＧＣＢ と同様にグリコシル化されるとすると、変異体は７の潜在的Ｎ−グリコシル化部位を有する。
【０２３７】
ＧＣ−３６ に関して用いられたものと同じ思考に基づいて、４Ｎ−グリカンを有する ＧＣ−３８ の予測される質量は ５９ ７８５ Ｄａ および ６０ ３６９ Ｄａ の範囲であり、５Ｎ−グリカンを有する ＧＣ−３８ の予測される質量は ６０ ６７７ Ｄａ および ６１ ４０７ Ｄａ の範囲であり、６Ｎ−グリカンを有する ＧＣ−３８ の予測される質量は ６１ ５６９ Ｄａ および ６２ ４４５ Ｄａ の範囲であり、７Ｎ−グリカンを有する ＧＣ−３８ の予測される質量は ６２ ４６１ Ｄａ および ６３ ４８３ Ｄａ の範囲である。
【０２３８】
ＧＣ−３８ の ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ 質量分析により、７Ｎ−グリカンを有する ＧＣ−３８ の予測される質量にしたがって、６３．１ ｋＤａ のピーク質量を有する主要なピークが示される。さらに、６Ｎ−グリカンを有する ＧＣ−３８ に対応する ６２．３ ｋＤａ のピーク質量を有するマイナーなピークが見られる。
【０２３９】
ＧＣ−３８ のＮ末端アミノ酸配列分析は、Ｎ５が完全にグリコシル化されていることを示した。
【０２４０】
ＧＣ−６０ （ＡＮＮＴＮＹＴＮＷＴ−ＧＣＢ）：
ＧＣ−６０ の理論的ペプチド質量は ５６ ７７０ Ｄａ である。Ｎ末端拡張は、ｗｔＧＣＢ と比較して、さらに３の潜在的グリコシル化部位を Ｎ２， Ｎ５ および Ｎ８ において含有する。変異体の ｗｔＧＣＢ 部分は ｗｔＧＣＢ と同様にグリコシル化されるとすると、変異体は７の潜在的Ｎ−グリコシル化部位を有する。
【０２４１】
ＧＣ−３６ に関して用いられたものと同一の思考に基づいて、４Ｎ−グリカンを有する ＧＣ−６０ の予測される質量は ６０ ３３８ Ｄａ および ６０ ９２２ Ｄａ の範囲であり、５Ｎ−グリカンを有する ＧＣ−６０ の予測される質量は ６１ ２３０ Ｄａ および ６１ ９６０ Ｄａ の範囲であり、６Ｎ−グリカンを有する ＧＣ−６０ の予測される質量は ６２ １２２ Ｄａ および ６２ ９９８ Ｄａ の範囲であり、ならびに７Ｎ−グリカンを有する ＧＣ−６０ の予測される質量は ６３ ０１４ Ｄａ および ６４ ０３６ Ｄａ の範囲である。
【０２４２】
ＧＣ−６０ の ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ 質量分析は、５または６Ｎ−グリカンのいずれかを有する ＧＣ−６０ の予測される質量にしたがって、ピーク質量 ６１．９ ｋＤａ および ６２．８ ｋＤａ を有する２の広いピークを示す。
【０２４３】
ＧＣ−６０ のＮ末端アミノ酸配列分析により、質量分析を用いて得られた結果と許容可能に一致して、Ｎ２は主にグリコシル化され、Ｎ５は完全にグリコシル化され、Ｎ８はほとんどグリコシル化されていないことが示された。
【０２４４】
ＧＣ−６１ （ＡＴＮＩＴＬＮＹＴＡＮＴＴ−ＧＣＢ）：
ＧＣ−６１ の理論的ペプチド質量は ５６ ９７０ Ｄａ である。Ｎ末端拡張は、ｗｔＧＣＢ と比較して、さらに３の潜在的グリコシル化部位を Ｎ３， Ｎ７ および Ｎ１１ において含有する。変異体の ｗｔＧＣＢ 部分が ｗｔＧＣＢ と同様にグリコシル化されているとすると、変異体は７の潜在的Ｎ−グリコシル化部位を有する。
【０２４５】
ＧＣ−３６ に関して用いられたものと同一の思考に基づいて、４Ｎ−グリカンを有する ＧＣ−６１ の予測される質量は ６０ ５３８ Ｄａ および ６１ １２２ Ｄａ の範囲であり、５Ｎ−グリカンを有する ＧＣ−６１ の予測される質量は ６１ ４３０ Ｄａ および ６２ １６０ Ｄａ の範囲であり、６Ｎ−グリカンを有する ＧＣ−６１ の予測される質量は ６２ ３２２ Ｄａ および ６３ １９８ Ｄａ の範囲であり、ならびに７Ｎ−グリカンを有する ＧＣ−６１ の予測される質量は ６３ ２１４ Ｄａ および ６４ ２３６ Ｄａ の範囲である。
【０２４６】
ＧＣ−６１ の ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ 質量分析により、５または６Ｎ−グリカンのいずれかを有する ＧＣ−６１ の予測される質量にしたがって、６１．５ ｋＤａ および ６３．０ ｋＤａ の範囲のピーク質量を有する非常に広いピークが示される。
【０２４７】
ＧＣ−６１ のＮ末端アミノ酸配列分析により、質量分析を用いて得られた結果と許容可能に一致して、Ｎ３は完全にグリコシル化され、Ｎ７およびＮ１１は部分的にグリコシル化されている。
【０２４８】
ＧＣ−６２ （ＡＡＮＳＴＧＮＩＴＩＮＧＴ−ＧＣＢ）：
ＧＣ−６２ の理論的ペプチド質量は ５６ ８０６ Ｄａ である。Ｎ末端拡張は、ｗｔＧＣＢ と比較して、さらに３の潜在的グリコシル化部位をＮ３， Ｎ７ および Ｎ１１ において含有する。変異体の ｗｔＧＣＢ 部分が ｗｔＧＣＢ と同様にグリコシル化されるとすると、変異体は７の潜在的Ｎ−グリコシル化部位を有する。
【０２４９】
ＧＣ−３６ に関して用いられたものと同様の思考に基づいて、４Ｎ−グリカンを有する ＧＣ−６２ の予測される質量は ６０ ３７４ Ｄａ および ６０ ９５８ Ｄａ の範囲であり、５Ｎ−グリカンを有する ＧＣ−６２ の予測される質量は ６１ ２６６ Ｄａ および ６１ ９９６ Ｄａ の範囲であり、６Ｎ−グリカンを有する ＧＣ−６２ の予測される質量は ６２ １５８ Ｄａ および ６３ ０３４ Ｄａ の範囲であり、ならびに７Ｎ−グリカンを有する ＧＣ−６２ の予測される質量は ６３ ０５０ Ｄａ および ６４ ０７２ Ｄａ の範囲である。
【０２５０】
ＧＣ−６２ の ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ 質量分析により、５または６Ｎ−グリカンのいずれかを有する ＧＣ−６２ の予測される質量にしたがって、６１．６ ｋＤａ および ６２．７ ｋＤａ のピーク質量を有する２の広いピークが示される。
【０２５１】
ＧＣ−６２ のＮ末端アミノ酸配列分析により、質量分析を用いて得られた結果と許容可能に一致して、Ｎ３は完全にグリコシル化され、Ｎ７およびＮ１１は部分的にグリコシル化されていることが示された。
【０２５２】
ＧＣ−６３ （ＡＶＮＷＴＳＮＤＴＳＮＳＴ−ＧＣＢ）：
ＧＣ−６３ の理論的ペプチド質量は ５６ ９６９ Ｄａ である。Ｎ末端拡張は、ｗｔＧＣＢ と比較して、さらに３の潜在的グリコシル化部位を Ｎ３， Ｎ７ および Ｎ１１ 部位において含有する。変異体の ｗｔＧＣＢ 部分は ｗｔＧＣＢ と同様にグリコシル化されるとすると、変異体は７の潜在的Ｎ−グリコシル化部位を有する。
【０２５３】
ＧＣ−３６ に関して用いられたものと同一の思考に基づいて、４Ｎ−グリカンを有する ＧＣ−６３ の予測される質量は ６０ ５３７ Ｄａ および ６１ １２１ Ｄａ の範囲であり、５Ｎ−グリカンを有する ＧＣ−６３ の予測される質量は ６１ ４２９ Ｄａ および ６２ １５９ Ｄａ の範囲であり、６Ｎ−グリカンを有する ＧＣ−６３ の予測される質量は ６２ ３２１ Ｄａ および ６３ １９７ Ｄａ の範囲であり、ならびに７Ｎ−グリカンを有する ＧＣ−６３ の予測される質量は ６３ ２１３ Ｄａ および ６４ ２３５ Ｄａ の範囲である。
【０２５４】
ＧＣ−６３ の ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ 質量分析により、５Ｎ−グリカンを有する ＧＣ−６３ の予測される質量と比較して、６１．９ ｋＤａ のピーク質量を有する主要なピークが示される。さらに、６Ｎ−グリカンを有する ＧＣ−６３ に対応する ６２．９ ｋＤａ のピーク質量を有するマイナーなピークが見られる。
【０２５５】
ＧＣ−６３ のＮ末端アミノ酸配列分析により、Ｎ３およびＮ７が部分的にグリコシル化されていることが示された。Ｎ１１のグリコシル化状態を評価することが不可能であった。
【０２５６】
さらに、昆虫細胞で発現されたＮ末端拡張されたグリコシル化ポリペプチド （ＧＣ−６ および ＧＣ−１３） をＮ末端アミノ酸配列分析（ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ， Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ， ＣＡ の Ｐｒｏｃｉｚｅ を用いる）に付した。配列決定サイクルは ＡＮＩＴ および ＡＳＰＩＮＡＴ Ｎ末端ペプチド付加物の両者におけるＡｓｎ残基に関してブランクであり、導入グリコシル化部位がグリコシル化されていることが示された。
【０２５７】
Ｖｏｙａｇｅｒ ＤＥＲＰ 装置 （ＰＥ−Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ， Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ， ＣＡ） で、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ 技術を用い、ＧＣ−１３ を質量分析に付すると、以下の結果が得られた：
昆虫細胞においた発現された野生型および ＡＳＰＩＮＡＴ− 拡張野生型は、それぞれ ５９，７２７ Ｄａ および ６１，４２１ Ｄａ の計算された質量に非常に近い平均質量を有し、４グリコシル化部位が炭水化物 ＦｕｃＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ で占められていることが予想される。
【０２５８】
実施例４
ＦＳＨ発現用のプラスミド構築
ヒトＦＳＨ−アルファサブユニットをコードする遺伝子は、Ｓｔｅｍｍｅｒ ｅｔ ａｌ． （１９９５） Ｇｅｎｅ １６４， ｐｐ． ４９−５３ に記載される方法と同様の方法を用いるＰＣＲによる合成オリゴヌクレオチドを組み立てることによって構築した。天然ＦＳＨ−アルファシグナル配列はこの遺伝子産物の分泌を可能にするように維持された。遺伝子のコドン利用は哺乳類細胞内での高い発現に関して最適化された。さらに、高い遺伝子発現を達成するため、この遺伝子の５’非翻訳領域内にイントロン （ｐＣＩ−Ｎｅｏ 由来 （Ｐｒｏｍｅｇａ）） を包含させた。合成遺伝子は、ｐｃＤＮＡ３．１／Ｈｙｇｒｏ （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ） 中ＣＭＶプロモーターの後ろにサブクローニングされた。ｐＢｖｄＨ９７７ と称される得られたプラスミドの配列は配列番号３に記載する （ＦＳＨ−アルファ−コード配列第１２２５〜１５７０位）。同様に、野生型ヒトＦＳＨ−ベータサブユニットをコードする合成遺伝子を構築した。また、この構築物では、分泌を可能にするために、天然シグナル配列が（第２位のＬｙｓがＧｌｕに変異されていることを除いて）維持され、コドンの利用は高い発現用に最適化され、受入れベクター （ｐｃＤＮＡ３．１／Ｚｅｏ （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）） 中にはイントロンが包含された。ｐＢｖｄＨ１０２２ と称される得られたＦＳＨ−ベータ−含有プラスミドの配列は配列番号４に記載する （ＦＳＨ−ベータ−コード配列第 １２３１ − １６１７）。ｐＢｖｄＨ９７７ 由来ＦＳＨ−アルファ含有 ＮｒｕＩ−ＰｖｕＩＩ 断片を、ＮｒｕＩ で線状化された ｐＢｖｄＨ１０２２ 中にサブクローニングすることによって、ＦＳＨ−アルファおよびＦＳＨ−ベータをコードする合成遺伝子の両者を含有するプラスミドを調製した。ＦＳＨ−アルファおよびＦＳＨ−ベータ−発現カセットが直列方向（ｄｉｒｅｃｔ ｏｒｉｅｎｔａｔｉｏｎ）である得られたプラスミドは ｐＢｖｄＨ１１００ と称される。
【０２５９】
ＣＨＯ細胞におけるＦＳＨの発現
ＦＳＨ は Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ （ＡＴＣＣ， ＣＣＬ−６１） から得られた Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｈａｍｓｔｅｒ Ｏｖａｒｙ （ＣＨＯ） Ｋ１ 細胞において発現された。
ＦＳＨの一過性発現に関して、細胞を血清含有培地（リボヌクレオチドおよびデオキシリボヌクレオチドを伴うＭＥＭα （Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｃａｔ ＃ ３２５７１−０２８）（１：１０ＦＢＳ （ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ Ｃａｔ ＃ ０２−７０１Ｆ） および１：１００ペニシリンおよびストレプトマイシン （ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ Ｃａｔ ＃ １７−６０２Ｅ） を含有）または同一の添加物を含有するダルベッコ ＭＥＭ／Ｎｕｔ．−ｍｉｘ Ｆ−１２ （Ｈａｍ） Ｌ− グルタミン、１５ ｍＭ Ｈｅｐｅｓ， ピリドキシン −ＨＣｌ （Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｃａｔ ＃ ３１３３０−０３８））中９５％集密まで培養した。ＦＳＨをコードするプラスミドは、リポフェクタミン２０００ （Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ） を製造元の仕様書にしたがって用いて、トランスフェクトした。トランスフェクションの２４〜２８時間後、培養培地を集め、遠心分離し、０．２２マイクロメーターのフィルターを通してろ過し、細胞を除去した。
【０２６０】
ＣＨＯ Ｋ１ 細胞をＦＳＨをコードするプラスミドでトランスフェクションし、次いでこの細胞を選択培地（例えば、プラスミド ｐＢｖｄＨ１１００ でトランスフェクトされた細胞に対する０．５ｍｇ／ｍＬゼオシンを含有する上記培地の１つ）中でインキュベートして、ＦＳＨを発現する安定なクローンを作成した。安定にトランスフェクトされた細胞は、限界希釈によって単離およびサブクローニングした。高レベルのＦＳＨを産生するクローンはＥＬＩＳＡによって同定した。
【０２６１】
より詳細には、サンプル中のＦＳＨの濃度は市販の免疫アッセイ （ＤＲＧ ＦＳＨ ＥＩＡ， ＤＲＧ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ ＧｍｂＨ， Ｍａｒｂｕｒｇ， Ｇｅｒｍａｎｙ） を用いて定量した。ＤＲＧ ＦＳＨ ＥＩＡ は、サンドイッチ原理に基づく固相免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）である。ミクロタイターウェルを、ＦＳＨ−　サブユニット上の特有抗原部位に対するモノクローナル抗体でコーティングする。一定量のＦＳＨ含有サンプル（０．１％ ＢＳＡを伴うＨ２Ｏで希釈）および西洋ワサビペルオキシダーゼとコンジュゲートされた抗−ＦＳＨ抗血清をコーティングされたウェルに加える。インキュベート後、未結合コンジュゲートを水で洗い流す。結合ペルオキシダーゼ量はサンプル中のＦＳＨ濃度と比例する。基質溶液の添加時に呈する色の強度はサンプル中のＦＳＨ濃度と比例する。
【０２６２】
ＣＨＯ細胞におけるＦＳＨの大量発現
ヒトＦＳＨを安定に発現するセルライン ＣＨＯ Ｋ１ １１００−５ を、集密培養物から１：１０透過し、１０層細胞ファクトリー （ＮＵＮＣ ＃１６５２５０） において、血清含有培地ダルベッコ ＭＥＭ／Ｎｕｔ．−ｍｉｘ Ｆ−１２ （Ｈａｍ） Ｌ−グルタミン， １５ ｍＭ Ｈｅｐｅｓ， ピリドキシン−ＨＣｌ （Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｃａｔ ＃ ３１３３０−０３８）， １：１０ ＦＢＳ （ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ Ｃａｔ ＃ ０２−７０１Ｆ）， １：１００ ペニシリンおよびストレプトマイシン （ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ Ｃａｔ ＃ １７−６０２Ｅ） 中、接着細胞として増殖させ、集密させた。次いで培地を血清を含まない培地： ダルベッコ ＭＥＭ／Ｎｕｔ．−ｍｉｘ Ｆ−１２ （Ｈａｍ） Ｌ−グルタミン， ピリドキシン−ＨＣｌ （Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｃａｔ ＃ ２１０４１−０２５）（添加物 １：５００ ＩＴＳ−Ａ （Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ ＃ ５１３００−０４４）， １：５００ ＥＸ−ＣＹＴＥ ＶＬＥ （Ｓｅｒｏｌｏｇｉｃａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ Ｉｎｃ． ＃ ８１−１２９） および １：１００ ペニシリンおよびストレプトマイシン （ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ Ｃａｔ ＃ １７−６０２Ｅ） を伴う）に交換した。次いで２４時間毎に、培養培地を集め、１Ｌの新しい、血清を含まない同一培地で交換した。集められた培地を０．２２μｍフィルターに通してろ過し、細胞を除去した。培養培地の回収および交換を毎日行いながら、ＦＳＨ収量が最初の発現レベルの１／４に落ちるまで、細胞フラクション中での培養を継続した（典型的には１０〜１５日後）。
【０２６３】
実施例５
ＦＳＨ野生型および変異体の精製
３クロマトグラフィー工程を用いて、高度に精製されたＦＳＨを得た。第一にアニオン交換工程、次いで疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）および最後に、ＦＳＨ−βに特異的なモノクローナル工程を用いる免疫アフィニティー工程である。
【０２６４】
培養上清を実施例４に記載のように調製した。ろ過された培養上清を限外ろ過（１０ｋＤ カットオフメンブレン）によって１０〜２０倍濃縮し、ｐＨを８．０に調節し、伝導率を１０〜１５ｍＳ／ｃｍにした後、酢酸アンモニウムバッファー （０．１６ Ｍ， ｐＨ ８．０） 中で平衡化されたＤＥＡＥセファロース （Ｐｈａｒｍａｃｉａ） アニオン交換カラムにアプライした。未結合フロースルーフラクション中ならびに０．１６Ｍ 酢酸アンモニウムｐＨ８．０を用いる洗浄フラクション中のセミ精製されたＦＳＨを回収した。フロースルーおよび洗浄フラクションをプールし、硫酸アンモニウムを保存溶液（４．５Ｍ）から加え、最終濃度 １．５ Ｍ （ＮＨ４）２ＳＯ４ とした。ｐＨは７．０に調節した。
【０２６５】
部分的に精製されたＦＳＨを次いで、２５ｍＬブチルセファロース （Ｐｈａｒｍａｃｉａ） ＨＩＣ カラムにアプライした。アプライ後、このカラムを少なくとも３容量の １．５ Ｍ （ＮＨ４）２ＳＯ４、ｐＨ７で洗浄（２８０ｎｍの吸光度がベースラインレベルに達するまで）し、４カラム容量のバッファーＢ（２０ｍＭ 酢酸アンモニウム、ｐＨ７）を用いてＦＳＨを溶出した。ＨＩＣ工程からＦＳＨに富むフラクションをプールし、濃縮し、Ｖｉｖａｓｐｉｎ ２０ モジュール， １０ ｋＤ カットオフメンブレン （Ｖｉｖａｓｃｉｅｎｃｅ） を用いて ５０ ｍＭ リン酸ナトリウム， １５０ ｍＭ ＮａＣｌ， ｐＨ ７．２ にダイアフィルトレートした。
【０２６６】
第三のクロマトグラフィー工程に関して、抗−ＦＳＨ−βモノクローナル抗体（ＲＤＩ−ＦＳＨ９０９， Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を ＣＮＢｒ−活性化セファロース （Ｐｈａｒｍａｃｉａ） に対し、供給元の標準的手順を用いて固定した。樹脂１ｍＬ当たり抗体約１ｍｇをカップリングさせた。免疫アフィニティー樹脂をプラスチックカラムに詰め、５０ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．２で平衡化した後、アプライした。
【０２６７】
バッファー交換された、ブチルＨＩＣ工程からの溶出液を、重力フローを用いて抗体カラムにアプライした。次いで５０ｍＭ リン酸ナトリウム溶液 （０．５ Ｍ ＮａＣｌ および １ Ｍ ＮａＣｌ， ともに ｐＨ ７．２） 中、数回洗浄工程を行った。溶出は、１ Ｍ ＮＨ３ または ０．６ Ｍ ＮＨ３， ４０％（ｖ／ｖ） イソプロパノールを用いて行い、１Ｍ酢酸を用いて溶出物を直ちに中和し、ｐＨ６〜８にした。
【０２６８】
精製されたＦＳＨバルク産物を濃縮し、Ｖｉｖａｓｐｉｎ ２０ モジュール， １０ ｋＤ カットオフメンブレン （Ｖｉｖａｓｃｉｅｎｃｅ） を用いて、５０ ｍＭ リン酸ナトリウム， １５０ ｍＭ ＮａＣｌ， ｐＨ ７．２ へダイアフィルトレートした。その後の保存のために、ＢＳＡを０．１％（ｖ／ｖ）まで加え、０．２２μｍフィルターを用いて精製されたＦＳＨをマイクロフィルトレートした後、−８０℃で保存した。
【０２６９】
非解離条件下（煮沸なし）で行った ＳＤＳ−ＰＡＧＥ により野生型ＦＳＨは見かけの４２±３ｋＤａバンドとして移動したことが示され、これは、結合した炭水化物の不均一性のためにわずかに拡散していた。純度は約８０〜９０％であった。Ｎ末端配列決定により、α鎖は、残基１で出発する予測されるＮ末端配列（配列番号５）を有し、β鎖は残基３で出発している（配列番号６）ことが示された。これらのＮ末端配列は、ＣＨＯ細胞において生産された組換えＦＳＨに関して以前に見出されている （Ｏｌｉｊｖｅ， Ｗ． ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ｍｏｌ． Ｈｕｍ． Ｒｅｐｒｏｄ． ２， ３７１−３８２）。
【０２７０】
実施例６
ＦＳＨ インビトロ活性アッセイ
６．１ ＦＳＨ アッセイ概要
ＦＳＨによるＦＳＨレセプターの活性化は、ｃＡＭＰ細胞内濃度の増大を生じさせることが以前に公開されている。この結果、転写は、複数コピーのｃＡＭＰ応答因子（ＣＲＥ）を含有するプロモーターにおいて活性化される。したがって、ＦＳＨレセプターを発現しているＣＨＯ細胞に導入されたＣＲＥルシフェラーゼレポーター遺伝子を使用することによってＦＳＨ活性を測定することが可能である。
【０２７１】
６．２ ＣＨＯ ＦＳＨ−Ｒ ／ ＣＲＥ−ｌｕｃ セルラインの構築
ヒトＦＳＨレセプターを発現する安定なクローンは、ｐｃＤＮＡ３ （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ） 内へ導入されたレセプター ｃＤＮＡ を含有するプラスミドを用いて ＣＨＯ Ｋ１ 細胞をトランスフェクトし、次いで６００マイクロｇ／ｍＬ Ｇ４１８を含有する培地中で選択することによって作成した。市販の ｃＡＭＰ−ＳＰＡ ＲＩＡ （Ａｍｅｒｓｈａｍ） を用い、ＦＳＨ刺激に応答する能力に関してクローンをスクリーニングした。これらの結果に基づき、ＣＲＥ−ｌｕｃ レポーター遺伝子を用いるさらなるトランスフェクションに関してＦＳＨレセプター発現ＣＨＯクローンを選択した。ホタルルシフェラーゼ遺伝子に直面する６ＣＲＥ要素を有するレポーター遺伝子を含有するプラスミドをハイグロマイシンＢ耐性を付与するプラスミドと共にトランスフェクトした。６００マイクロｇ／ｍＬ Ｇ４１８および４００マイクロｇ／ｍＬハイグロマイシンＢの存在下で安定なクローンを選択した。ＦＳＨでの刺激時に強いルシフェラーゼシグナを発するクローン （ＥＣ５０ ￣ ０．０１ ＩＵ／ｍｌ） を得た。この ＣＨＯ ＦＳＨ−Ｒ ／ ＣＲＥ−ｌｕｃ セルラインを用いて、ＦＳＨを含有するサンプルの活性を測定した。
【０２７２】
６．３ ＦＳＨ ルシフェラーゼアッセイ
活性アッセイを実行するために、ＣＨＯ ＦＳＨ−Ｒ ／ ＣＲＥ−ｌｕｃ 細胞を約１５，０００細胞／ウェルの密度で白色９６ウェル培養プレート内にシードした。この細胞を１．２５％ ＦＢＳを含む１００　Ｌ ＤＭＥＭ／Ｆ−１２ （フェノールレッドなし） に入れた。一晩（３７℃、５％ＣＯ２）インキュベートした後、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ／Ｆ−１２（フェノールレッドなし）中で希釈された２５μＬのサンプルまたは標準物を各ウェルに加えた。このプレートをさらに３時間インキュベートし、次いで１２５μＬ ＬｕｃＬｉｔｅ 基質 （Ｐａｃｋａｒｄ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ） を加えた。次いで、プレートを密封し、ＳＰＣ（シングルフォトンカウント）モードの ＴｏｐＣｏｕｎｔ ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒ （Ｐａｃｋａｒｄ） で発光を測定した。
【０２７３】
実施例７
アルファサブユニットのＮ末端に２個のＮ連結グリコシル化を含有するＦＳＨの変異型の構築および分析
Ｎ末端にＮ連結グリコシル化に関する２個の追加部位を有する修飾型ＦＳＨ−アルファをコードする構築物を、当分野に既知の標準的ＤＮＡ技術を用いる部位特異的突然変異誘発によって調製した。配列 Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｉｌｅ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｉｌｅ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ をコードするＤＮＡ断片を、ｐＢｖｄＨ９７７ 中、成熟ＦＳＨ−アルファのすぐ上流に挿入した。ｐＢｖｄＨ１１６３ と称される、得られたプラスミドの配列は配列番号７に記載されている （修飾 ＦＳＨ−アルファ含有配列、第 １２２５ − １５９９ 位）。両サブユニットをコードするプラスミドを構築した。ｐＢｖｄＨ１１６３ 由来のＦＳＨ含有 ＮｒｕＩ−ＰｖｕＩＩ 断片を、ＰｖｕＩＩ を用いて線状化された ｐＢｖｄＨ１０２２（実施例４）中にサブクローニングすることによって両サブユニットをコードするプラスミドを構築した。得られたプラスミドは ｐＢｖｄＨ１２０８ と命名した。
【０２７４】
アルファサブユニットのＮ末端に２個のＮ連結グリコシル化部位を含有する変異型ＦＳＨ （ＦＳＨ１２０８ と称される） の発現に関して、ＣＨＯ Ｋ１ 細胞を、ｐＢｖｄＨ１２０８ を用いてトランスフェクトするか、あるいは修飾アルファサブユニットをコードする ｐＢｖｄＨ１１６３ および野生型ベータサブユニットをコードする ｐＢｖｄＨ１０２２ の組み合わせを用いて同時トランスフェクトした。一過性発現、安定発現クローンの単離、および ＦＳＨ１２０８ の大量生産は、野生型ＦＳＨに関して実施例４に記載されるように行った。
【０２７５】
サンプルのＦＳＨ含量はウェスタンブロッティングによって分析した：タンパク質を ＳＤＳ−ＰＡＧＥ によって分離し、ウサギ抗ヒトＦＳＨ （ＡＨＰ５１９， Ｓｅｒｏｔｅｃ） またはマウス抗ヒトＦＳＨ−アルファ （ＭＣＡ３３８， Ｓｅｒｏｔｅｃ） を一次抗体として用い、ＩｍｍｕｎｏＰｕｒｅ Ｕｌｔｒａ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ＡＢＣ ペルオキシダーゼ染色キット （Ｐｉｅｒｃｅ） を検出に用いて標準的ウェスタンブロットを行った。ウェスタンブロッティングは ＦＳＨ１２０８ が野生型ＦＳＨより大きい分子量を有することを示し、これによりアルファサブユニットのＮ末端におけるＮ連結グリコシル化に関するアクセプター部位の導入がＦＳＨの超過グリコシル化を実際に導くことが示される。ｐＩ分析に関して、サンプルを ｐＨ ３−７ ＩＥＦ ゲル （ＮＯＶＥＸ） 上で分離した。電気泳動後、タンパク質を Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐ （Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ） 膜上にブロットし、上記のように、同一抗体および検出キットを用いてウェスタンブロットを行った。等電点電気泳動では、ＦＳＨ１２０８ サンプル中のＦＳＨ型が野生型ＦＳＨより低いｐＩレンジにおいて観察された。したがって、ＦＳＨ１２０８ イソ型に関するｐＨ間隔は、野生型ＦＳＨの約 ４．０−５．２ に関して約 ３．０−４．５ であった。このことは、ＦＳＨ１２０８ 分子が平均して野生型より負の帯電し、これが追加のシアル酸残基の存在に帰することを示す。
【０２７６】
ＦＳＨ１２０８ は実施例５に記載のように精製され、特徴付けされた。非解離条件（煮沸なし）下で行われた ＳＤＳ−ＰＡＧＥ では、ＦＳＨ１２０８ が見かけ５５±５ｋＤａのバンドとして移動し、これは結合した炭水化物の不均一性のためにわずかに拡散している。純度は約８０−９０％であった。Ｎ末端配列決定により、β鎖は野生型ＦＳＨと同一のＮ末端配列を有するが、α鎖の配列は予測されるＮ末端拡張 ＡＮＩＴＶＮＩＴＶ を有するこのサブユニットと一致し、ここでは両アスパラギン残基はグリコシル化されている。
【０２７７】
ＦＳＨ１２０８ の具体的活性は、インビトロ生物活性（ＦＳＨルシフェラーゼアッセイ、実施例６）およびサンプル中のＦＳＨ含量の測定（ＥＬＩＳＡによる）によって決定された。ＦＳＨ１２０８ の具体的活性は野生型参照物の約１／３であることが観察された。
【０２７８】
薬物動態実験は以下のように行われた：
未成熟 ２６−２７ 日齢の雌性 Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ ラットに、上記のように生産され、精製され、分析されたＦＳＨ３−４マイクロｇを静脈内注射した。次いで、注射後種々の時点で血液サンプルを採取した。血清サンプル中の ＦＳＨ 濃度を ＥＬＩＳＡ によって上記のように測定した。
【０２７９】
野生型組換えＦＳＨおよび変異型のインビボ生物活性は、卵巣重量増加アッセイ （Ｓｔｅｅｌｍａｎ ａｎｄ Ｐｏｈｌｅｙ （１９５３） Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ ５３， ６０４−６１６） によって評価することができる。さらに、ＦＳＨおよび変異型が実験動物において濾胞の成熟を刺激する能力は、例えば超音波装置を用いて検出することができる。実験により、等量の野生型ＦＳＨおよびＦＳＨ１２０８の注射２４時間後、ＦＳＨ１２０８処置動物の血清は野生型ＦＳＨで処置された動物の血清より１０倍の残留免疫反応性物質を含有することが示された。
【０２８０】
実施例８
さらなるグリコシル化部位を含有する他のＦＳＨ変異体の構築および分析
Ｎ連結グリコシル化に関するさらなる部位を含有するＦＳＨ−アルファおよびＦＳＨ−ベータの変異型をコードするプラスミドは、当分野に既知の部位特異的突然変異誘発によって作成した。以下のアミノ酸置換および／または挿入が作成された：
ＦＳＨ１１４７： 成熟ＦＳＨ−ベータのアミノ酸 Ｔｙｒ５８ が Ａｓｎ に変更されている。
ＦＳＨ１３４９： 成熟ＦＳＨ−アルファのＮ末端が ＡＰＤ ＱＤＣ．．． から： ＡＰＮＤＴＶＮＦＴ ＱＤＣ ．．．に変更されている。
ＦＳＨ１３５４： 成熟ＦＳＨ−ベータのＮ末端が ＮＳ ＣＥＬ ．．． から： ＮＳＮＩＴＶＮＩＴＶ ＣＥＬ ．．．に変更されている。
【０２８１】
実施例４に記載されるように、変異型をコードするプラスミドを ＣＨＯ Ｋ１ 細胞において一過性発現した。ＦＳＨ−アルファ変異体をコードするプラスミドを野生型ＦＳＨ−ベータとともに同時トランスフェクトし、ならびにその逆も行った。
【０２８２】
上記のように、培養培地サンプル上でウェスタンおよび等電点電気泳動を行った。 変異型は野生型より高い分子量を有し、これによりＮ連結グリコシル化に関する追加アクセプター部位が実際にグリコシル化されたことが示された。さらに、等電点電気泳動により、３個のＦＳＨ変異型の種々のイソ型が野生型より低いｐＩレンジにわたって広がっていることが示された。これは変異型が野生型より高いシアル酸含量を有することを強く示唆する。
【０２８３】
得られた培地サンプルのインビトロＦＳＨ活性は実施例６．３に記載されるように分析した。すべての３変異型は ＣＨＯ ＦＳＨ−Ｒ ／ ＣＲＥ−ｌｕｃ 細胞を刺激可能であり、これにより、これらの変異ＦＳＨ型が有意なＦＳＨ活性を保持していることが示された。
【０２８４】
上記発明は明瞭さおよび理解のためにいくつかの詳細に関して記載されてきたが、この開示内容を読み取ることにより、本発明の真の範囲から逸脱することなく、形式および細部の種々の変更を施すことが可能であることは当業者には明らかであろう。例えば、上記すべての技術、方法、組成物、装置および系は種々の組み合わせで用いることができる。本明細書中に引用されるすべての刊行物、特許、特許出願、他の文献は、個々の各刊行物、特許、特許出願または他の文献が個別に、引用によりすべての目的のために包含されていることが示されているのと同程度に、引用によりその全体が、すべての目的のために本明細書中に包含されるものである。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１はグルコセレブロシダーゼ野生型および本発明の修飾型の、Ｊ７７４Ｅマクロファージへの取り込みに関する用量（ｄｏｓｉｓ）応答曲線である。活性はＧＣＢ活性アッセイによって測定される。
【図２】図２は、本発明にしたがって生産されたＦＳＨポリペプチドの薬物動態（力学）を示す。
【図１】
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【図２】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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