(57)【要約】グループＢストレプトコッカスポリペプチド、及びそれらをコードするポリヌクレオチドが開示される。前記ポリペプチドは、哺乳類におけるストレプトコッカス感染の予防、診断及び／又は治療のために有用である。ポリペプチド抗原を生成する組換え方法、及びストレプトコッカス感染、特にＧＢＳを検出するための診断アッセイがまた開示される。
2004510450.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）配列番号３，４，７及び８、又はそのフラグメント又は類似体から選択された配列を含んで成る第２ポリペプチドに対して少なくとも７０％の同一性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号３，４，７及び８、又はそのフラグメント又は類似体から選択された配列を含んで成る第２ポリペプチドに対して少なくとも９５％の同一性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号３，４，７及び８、又はそのフラグメント又は類似体から選択された配列を含んで成るポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号３，４，７及び８、又はそのフラグメント又は類似体から選択された配列を有するポリペプチドに対して結合特異性を有する抗体を生ぜしめ得るポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｅ）配列番号３，４，７及び８、又はそのフラグメント又は類似体から選択された配列を有するポリペプチドのエピトープ担持部分をコードするポリヌクレオチド；
（ｆ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）又は（ｅ）におけるポリヌクレオチドに対して相補的なポリヌクレオチドから選択されたポリヌクレオチドを含んで成る単離されたポリヌクレオチド。
【請求項２】
（ａ）配列番号３，４，７及び８から選択された配列を含んで成る第２ポリペプチドに対して少なくとも７０％の同一性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号３，４，７及び８から選択された配列を含んで成る第２ポリペプチドに対して少なくとも９５％の同一性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号３，４，７及び８から選択された配列を含んで成るポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号３，４，７及び８から選択された配列を有するポリペプチドに対して結合特異性を有する抗体を生ぜしめ得るポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｅ）配列番号３，４，７及び８から選択された配列を有するポリペプチドのエピトープ担持部分をコードするポリヌクレオチド；
（ｆ）上記（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）又は（ｅ）におけるポリヌクレオチドに対して相補的なポリヌクレオチドから選択されたポリヌクレオチドを含んで成る単離されたポリヌクレオチド。
【請求項３】
前記ポリヌクレオチドがＤＮＡである請求項１記載のポリヌクレオチド。
【請求項４】
前記ポリヌクレオチドがＤＮＡである請求項２記載のポリヌクレオチド。
【請求項５】
前記ポリヌクレオチドがＲＮＡである請求項１記載のポリヌクレオチド。
【請求項６】
前記ポリヌクレオチドがＲＮＡである請求項２記載のポリヌクレオチド。
【請求項７】
（ａ）ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、又は
（ｂ）ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの相補体のいずれかに対して、緊縮条件下でハイブリダイズし；ここで前記ポリペプチドが配列番号３，４，７及び８、又はそのフラグメント又は類似体を含んで成る請求項１記載のポリヌクレオチド。
【請求項８】
（ａ）ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、又は
（ｂ）ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの補体のいずれかに対して、緊縮条件下でハイブリダイズし；ここで前記ポリペプチドが配列番号３，４，７及び８、又はそのフラグメント又は類似体を含んで成る請求項２記載のポリヌクレオチド。
【請求項９】
（ａ）ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、又は
（ｂ）ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの補体のいずれかに対して、緊縮条件下でハイブリダイズし；ここで前記ポリペプチドが、配列番号３，４，７及び８、又はそのフラグメント又は類似体を含んで成るポリペプチドからの少なくとも１０個の連続したアミノ酸残基を含んで成る請求項１記載のポリヌクレオチド。
【請求項１０】
（ａ）ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、又は
（ｂ）ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの補体のいずれかに対して、緊縮条件下でハイブリダイズし；ここで前記ポリペプチドが、配列番号３，４，７及び８、又はそのフラグメント又は類似体を含んで成るポリペプチドからの少なくとも１０個の連続したアミノ酸残基を含んで成る請求項２記載のポリヌクレオチド。
【請求項１１】
前記ポリヌクレオチドが、発現制御領域に作用可能に連結される請求項１記載のポリヌクレオチドを含んで成るベクター。
【請求項１２】
前記ポリヌクレオチドが、発現制御領域に作用可能に連結される請求項２記載のポリヌクレオチドを含んで成るベクター。
【請求項１３】
請求項１１記載のベクターによりトランスフェクトされた宿主細胞。
【請求項１４】
請求項１２記載のベクターによりトランスフェクトされた宿主細胞。
【請求項１５】
ポリペプチドの発現のために適切な条件下で請求項１３記載の宿主細胞を培養することを含んで成るポリペプチドの生成方法。
【請求項１６】
ポリペプチドの発現のために適切な条件下で請求項１４記載の宿主細胞を培養することを含んで成るポリペプチドの生成方法。
【請求項１７】
（ａ）配列番号３，４，７及び８、又はそのフラグメント又は類似体から選択されたアミノ酸配列を有する第２ポリペプチドに対して少なくとも７０％の同一性を有するポリペプチド；
（ｂ）配列番号３，４，７及び８、又はそのフラグメント又は類似体から選択されたアミノ酸配列を有する第２ポリペプチドに対して少なくとも９５％の同一性を有するポリペプチド；
（ｃ）配列番号３，４，７及び８、又はそのフラグメント又は類似体から選択された配列を含んで成るポリペプチド；
（ｄ）配列番号３，４，７及び８、又はそのフラグメント又は類似体から選択された配列を有するポリペプチドに対して結合特異性を有する抗体を生ぜしめ得るポリペプチド；
（ｅ）配列番号３，４，７及び８、又はそのフラグメント又は類似体から選択された配列を有するポリペプチドのエピトープ担持部分；
（ｆ）Ｎ−末端Ｍｅｔ残基が欠失している、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）又は（ｅ）のポリヌクレオチド；
（ｇ）分泌アミノ酸配列が欠失している、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）又は（ｅ）のポリヌクレオチドから選択されたメンバーを含んで成る単離されたポリペプチド。
【請求項１８】
（ａ）配列番号３，４，７及び８から選択されたアミノ酸配列を有する第２ポリペプチドに対して少なくとも７０％の同一性を有するポリペプチド；
（ｂ）配列番号３，４，７及び８から選択されたアミノ酸配列を有する第２ポリペプチドに対して少なくとも９５％の同一性を有するポリペプチド；
（ｃ）配列番号３，４，７及び８から選択された配列を含んで成るポリペプチド；
（ｄ）配列番号３，４，７及び８から選択された配列を有するポリペプチドに対して結合特異性を有する抗体を生ぜしめ得るポリペプチド；
（ｅ）配列番号３，４，７及び８から選択された配列を有するポリペプチドのエピトープ担持部分；
（ｆ）Ｎ−末端Ｍｅｔ残基が欠失している、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）又は（ｅ）のポリヌクレオチド；
（ｇ）分泌アミノ酸配列が欠失している、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）又は（ｅ）のポリヌクレオチドから選択されたメンバーを含んで成る単離されたポリペプチド。
【請求項１９】
配列番号３，４，７及び８、又はそのフラグメント又は類似体から選択された配列を有する、キメラポリペプチドを形成するために連結される複数のポリペプチドを含んで成るキメラポリペプチド。
【請求項２０】
配列番号３，４，７及びから選択された配列を有する、キメラポリペプチドを形成するために連結される複数のポリペプチドを含んで成るキメラポリペプチド。
【請求項２１】
請求項１７〜２０のいずれか１項記載のポリペプチド、及び医薬的に許容できるキャリヤー、希釈剤又はアジュバントを含んで成る医薬組成物。
【請求項２２】
グループＢストレプトコッカス（ＧＢＳ）感染に対して敏感な個人におけるＧＢＳ細菌感染の予防又は治療処理方法であって、治療又は予防量の請求項２１記載の組成物を前記個人に投与することを含んで成る方法。
【請求項２３】
前記個人が新生児又は幼児である請求項２２記載の方法。
【請求項２４】
前記感染が、敗血症、髄膜炎、肺炎、蜂巣炎、骨髄炎、敗血性関節炎、心内膜炎又は喉頭蓋を引き起こす請求項２３記載の方法。
【請求項２５】
前記個人が妊娠した女性である請求項２２記載の方法。
【請求項２６】
前記感染が、生命をおびやかす敗血症に対する軽い尿路感染、及び髄膜炎、例えば骨髄炎、心内膜炎、羊膜炎、子宮内膜炎、創傷感染（帝王切開後及び会陰切開後）、蜂巣炎又は筋膜炎を引き起こす請求項２５記載の方法。
【請求項２７】
前記個人が非妊娠成人である請求項２２記載の方法。
【請求項２８】
前記感染が、一次菌血症、柔組織感染の皮膚、肺炎、尿路性敗血症、心内膜症、腹膜炎、髄膜炎又は蓋膿症を引き起こす請求項２７記載の方法。
【請求項２９】
前記個人がウシである請求項２２記載の方法。
【請求項３０】
前記感染が乳腺炎を引き起こす請求項２９記載の方法。
【請求項３１】
ＧＢＳ感染に対して敏感な個人におけるＧＢＳ細菌感染の診断方法であって、
ａ． 個人から生物学的サンプルを得；
ｂ． 混合物を形成するために、前記生物学的サンプルと共に、本発明のＧＢＳポリペプチドと反応性の抗体又はそのフラグメントをインキュベートし；そして
ｃ． ＧＢＳの存在を示す混合物における特異的に結合される抗体又は結合されるフラグメントを検出する；
ことを含んで成る方法。
【請求項３２】
配列番号１，２，５及び６、又はそのフラグメント又は類似体から選択された配列を有する単離されたポリヌクレオチド。
【請求項３３】
治療又は予防量の請求項２１記載の組成物を、ＧＢＳ感染に対して敏感な個人に投与することを含んで成る、前記個人におけるＧＢＳ細菌感染の予防又は治療処理のためへの請求項２１記載の医薬組成物の使用。
【請求項３４】
ＧＢＳ感染の診断の検出のために請求項１７〜２０のいずれか１項記載のポリペプチドを含んで成るキット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野：
本発明は、個人、例えばヒトにおけるグループＢストレプトコッカス（ＧＢＳ）（ストレプトコッカス・アガラクチアエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ）感染を予防し、診断し、そして／又は処理するために有用である、ＧＢＳのポリペプチド及び対応するＤＮＡフラグメントに関する。
【０００２】
発明の背景：
ストレプトコッカスは、それらの細胞表面上に見出されるグループ特異的炭水化物抗原Ａ〜Ｏにより識別されるグラム（＋）細菌である。ストレプトコッカスグループはさらに、タイプ−特異的莢膜多糖抗原により区別される。いくつかの血清型は、ＧＢＳについて次のように同定されている：Ｉａ， Ｉｂ， ＩＩ， ＩＩＩ， ＩＶ， Ｖ， ＶＩ， ＶＩＩ及びＶＩＩＩ。ＧＢＳはまた、“Ｃ−タンパク質”（α、β、γ及びδ）として知られている抗原性タンパク質を含み、それらのいくつかはクローン化されている。
【０００３】
ＧＢＳは正常なヒト腔及び結腸フローラの共通成分であるが、この病原体は、新生児、妊娠している母親、非妊娠の成人、及び酪農獣群における感染の主要原因として長く認識されて来た。ＧＢＳに対して暴露された妊娠している母親は、分娩後感染の危険性下にあり、そして子供が分娩路を通過する場合、感染を彼らの子供にトランスファーすることができる。
【０００４】
幼児におけるＧＢＳ感染は、非常に初期の幼児に制限される。幼児感染の約８０％が、出生の最初の日に存在し、いわゆる初期−開始疾病である。後期−開始感染は、出生の１週−２〜３ヶ月で幼児において存在する。新生児におけるＧＢＳ疾病の臨床的症候群は、敗血症、髄膜炎、肺炎、蜂巣炎、骨髄炎、敗血性関節炎、心内膜炎又は喉頭蓋を包含する。それ自体費用がかかる、ＧＢＳによる急性疾病の他に、新生児におけるＧＢＳ感染は、死、障害、及びまれな場合、感染の再発をもたらす。生物は抗生物質に対して敏感であるが、新生児における敗血症及び幼児における髄膜炎の高い攻撃速度及び急速な開始が、高い罹病率及び死亡率をもたらす。
【０００５】
妊娠女性の間で、ＧＢＳは、生命をおびやかす敗血症に対する軽い尿路感染、及び髄膜炎、例えば骨髄炎、心内膜炎、羊膜炎、子宮内膜炎、創傷感染（帝王切開後及び会陰切開後）、蜂巣炎又は筋膜炎からの範囲の臨床学的疾病を引き起こす。
【０００６】
非妊娠成人の間で、侵入性ＧＢＳ疾病の臨床学的代表は、一次菌血症のみならず、また、柔組織感染の皮膚、肺炎、尿路性敗血症、心内膜症、腹膜炎、髄膜炎又は蓋膿症の形をしばしば取る。柔組織感染の皮膚は、蜂巣炎、感染された末梢潰瘍、骨髄炎、敗血性関節炎及び圧迫潰瘍又は創傷性感染を包含する。危険性のある人々の中で、消耗された宿主、例えば慢性疾病、例えば真性糖尿病及び癌を有する人々、又は老人が存在する。
ＧＢＳ感染はまた、動物においても存在し、そして酪農獣群において腺炎を引き起こす。
【０００７】
ＧＢＳ感染から宿主保護するであろうワクチンを見出すために、研究者は、タイプ−特異的抗原に向けた。不運なことには、それらの多糖類は、宿主において完全には免疫原性ではなく、そして多糖が起因する特定の血清型に制限される。さらに、筴膜多糖は、Ｔ細胞−非依存性応答を誘発し、すなわちＩｇＧ生成を誘発しない。従って、筴膜多糖抗原は、ＧＢＳ感染に対する保護のためのワクチン成分として不適切である。
【０００８】
マウス及びウサギモデルにおいて免疫原性質を示すＣ−タンパク質β抗原に焦点が向けられた。このタンパク質は、ヒトＩｇＡのＦｃ領域と、高い親和性で及び非免疫原性態様で相互作用する所望しない性質のために、ヒトワクチンとして不適切であることが見出された。Ｃ−タンパク質α抗原は、ほとんどのＧＢＳ介在性条件を担当する血清型であり、そして従って、ワクチン成分としてほどんど有用でないＧＢＳのＩＩＩ型血清型においてはまれである。
個人、例えばヒトにおけるＧＢＳ感染を予防し、診断し、そして／又は処理するために有用であるＧＢＳポリペプチドについての必要性が存続する。
【０００９】
発明の要約：
１つの観点によれば、本発明は、配列番号３，４，７及び８、又はそのフラグメント又は類似体から選択された配列を含んで成る第２ポリペプチドに対して少なくとも７０％の同一性を有するポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドを提供する。
１つの観点によれば、本発明は、配列番号３，４，７及び８、又はそのフラグメント又は類似体から選択されたアミノ酸配列を含んで成るポリペプチドに関する。
【００１０】
他の観点においては、本発明のポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド、医薬組成物、発現制御領域に作用可能に連結される本発明のポリペプチドを含んで成るベクター、及び前記ベクターによりトランスフェクトされた宿主細胞、並びに発現のために適切な条件下で前記宿主細胞を培養することを含んで成る、ポリペプチドの生成方法が提供される。
【００１１】
発明の特定の記載：
本発明は、ストレプトコッカス感染を予防し、処理し、そして／又は診断するために使用され得るグループＢストレプトコッカスポリペプチドをコードする、精製され、そして単離され、そして単離されたポリヌクレオチドを提供する。本発明は、配列番号１，３，５及び６の１つにより、それぞれの個々の且つ別々に定義される、４種の別々の好ましいポリヌクレオチドを提供する。さらに、配列番号３，４，７及び８の１つにより、それぞれ個々に且つ別々に定義される。
【００１２】
４種の別々のポリペプチドが、発明において定義される。当業者は、本特許出願における明細書に記載されるように、そのようなポリペプチドの類似体、例えば変異体、変異種、相同体及び誘導体をコードするポリヌクレオチドを包含する。本発明はまた、本発明のＤＮＡ分子に対応するＲＮＡ分子も包含する。ＤＮＡ及びＲＮＡ分子の他に、本発明は、その対応するポリペプチド、及びそのようなポリペプチドに対して特異的に結合する単一特異的抗体を包含する。
【００１３】
１つの観点によれば、本発明は、配列番号３，４，７及び８、又はそのフラグメント又は類似体から選択された配列を含んで成る第２ポリペプチドに対して少なくとも７０％の同一性を有するポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドを提供する。
【００１４】
１つの観点によれば、本発明は、配列番号３，４，７及び８、又はそのフラグメント又は類似体から選択された配列を含んで成る第２ポリペプチドに対して少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドを提供する。
１つの観点によれば、本発明は、配列番号３，４，７及び８、又はそのフラグメント又は類似体から選択された配列を含んで成る第２ポリペプチドに対して少なくとも８５％の同一性を有するポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドを提供する。
【００１５】
１つの観点によれば、本発明は、配列番号３，４，７及び８、又はそのフラグメント又は類似体から選択された配列を含んで成る第２ポリペプチドに対して少なくとも９０％の同一性を有するポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドを提供する。
１つの観点によれば、本発明は、配列番号３，４，７及び８、又はそのフラグメント又は類似体から選択された配列を含んで成る第２ポリペプチドに対して少なくとも９５％の同一性を有するポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドを提供する。
【００１６】
１つの観点によれば、本発明は、配列番号３，４，７及び８、又はそのフラグメント又は類似体から選択された配列を含んで成るポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドを提供する。
１つの観点によれば、本発明は、配列番号３，４，７及び８、又はそのフラグメント又は類似体から選択された配列を有するポリペプチドのエピトープ担持部分をコードするポリヌクレオチドに関する。
【００１７】
１つの観点によれば、本発明は、配列番号３，４，７及び８、又はそのフラグメント又は類似体から選択された配列を有するポリペプチドのエピトープ担持部分に関する。
１つの観点によれば、本発明は、配列番号３，４，７及び８、又はそのフラグメント又は類似体から選択された配列を含んで成るアミノ酸配列を含んで成るポリペプチドに関する。
【００１８】
１つの観点によれば、本発明は、配列番号３，４，７及び８から選択された配列を含んで成る第２ポリペプチドに対して少なくとも７０％の同一性を有するポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドを提供する。
１つの観点によれば、本発明は、配列番号３，４，７及び８から選択された配列を含んで成る第２ポリペプチドに対して少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドを提供する。
【００１９】
１つの観点によれば、本発明は、配列番号３，４，７及び８から選択された配列を含んで成る第２ポリペプチドに対して少なくとも８５％の同一性を有するポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドを提供する。
１つの観点によれば、本発明は、配列番号３，４，７及び８から選択された配列を含んで成る第２ポリペプチドに対して少なくとも９０％の同一性を有するポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドを提供する。
【００２０】
１つの観点によれば、本発明は、配列番号３，４，７及び８から選択された配列を含んで成る第２ポリペプチドに対して少なくとも９５％の同一性を有するポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドを提供する。
１つの観点によれば、本発明は、配列番号３，４，７及び８から選択された配列を含んで成るポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドを提供する。
１つの観点によれば、本発明は、配列番号３，４，７及び８から選択された配列を有するポリペプチドのエピトープ担持部分をコードするポリヌクレオチドに関する。
【００２１】
１つの観点によれば、本発明は、配列番号３，４，７及び８から選択された配列を有するポリペプチドのエピトープ担持部分に関する。
さらなる態様においては、本発明はまた、配列番号３，４，７及び８、又はそのフラグメント又は類似体から選択された配列を有するポリペプチドに対して結合特異性を有する抗体を生ぜしめ得るポリペプチドをコードするポリヌクレオチドにも関する。
【００２２】
さらなる態様においては、本発明はまた、配列番号３，４，７及び８から選択された配列を有するポリペプチドに対して結合特異性を有する抗体を生ぜしめ得るポリペプチドをコードするポリヌクレオチドにも関する。
相同性の％は、アミノ酸型の同一性の％＋類似性又は保存性の％の合計として定義される。
【００２３】
アミノ酸配列を比較するために１つのプログラム、例えばＣＬＵＳＴＡＬプログラムを使用することができる。このプログラムは、アミノ酸配列を比較し、そして適切な場合、いずれかの配列に空間を挿入することによって最適な一列整列を見出す。最適な一列整列についてのアミノ酸同一性又は類似性（アミノ酸型の同一性＋保存性）を計算することは可能である。ＢＬＡＳＴｘのようなプログラムは最長の範囲の類似性配列を一列整列し、そしてその適合性に値を割り当てるであろう。従って、類似性のいくつかの領域が見出される（それぞれは、異なった評点を有する）比較を得ることが可能である。両タイプの同一性分析が、本発明において企画される。
【００２４】
さらなる態様においては、本発明のポリペプチドは、抗原性である。
さらなる態様においては、本発明のポリペプチドは、免疫原性である。
さらなる態様においては、本発明のポリペプチドは、個々において免疫応答を誘発することができる。
さらなる態様においては、本発明はまた、上記に定義されるような本発明のポリペプチドに対して結合特異性を有する抗体を生ぜしめ得るポリペプチドに関する。
【００２５】
さらなる態様においては、本発明はまた、配列番号３，４，７及び８、又はそのフラグメント又は類似体から選択された配列を有するポリペプチドに対して結合特異性を有する抗体を生ぜしめ得るポリペプチドに関する。
さらなる態様においては、本発明はまた、配列番号３，４，７及び８から選択された配列を有するポリペプチドに対して結合特異性を有する抗体を生ぜしめ得るポリペプチドに関する。
【００２６】
“結合特異性を有する”抗体とは、選択されたポリペプチドを認識し、そして結合するが、しかしサンプル、例えば天然において、選択されたペプチドを含む生物学的サンプルにおける他の分子を実質的に認識せず、そして結合しない抗体である。特異的結合は、選択されたポリペプチドが抗原として使用されるＥＬＩＳＡアッセイを用いて測定され得る。
【００２７】
本発明によれば、生物学的サンプルにおける“保護”とは、生存曲線、速度又は期間における有意な上昇により定義される。生存曲線を比較するためのＬｏｇ評価試験、及びそれぞれ、生存割合及び死までの日数を比較するためのＦｉｓｈｅｒ精度試験を用いての統計学的分析は、ｐ値を計算し、そして２種のグループ間の差異が統計学的に有意であるかどうかを決定するために有用である。０．０５のｐ値は、有意でないとして見なされる。
本発明のさらなる観点においては、本発明のポリペプチド又はその類似体の抗原性／免疫原性フラグメントが提供される。
【００２８】
本発明のフラグメントは、１又は複数のそのようなエピトープ領域を含むべきであるか、又はそれらの抗原／免疫原性質を保持するためにそのような領域に十分に類似するべきである。従って、本発明のフラグメントに関しては、同一性の程度は、それらが本明細書に記載されるように、ポリペプチド又はその類似体の特定部分に対して１００％同一であるので、たぶん見当違いである。本発明はさらに、本発明のポリペプチド配列からの少なくとも１０個の連続したアミノ酸残基を有するフラグメントを提供する。１つの態様においては、少なくとも１５個の連続したアミノ酸残基が存在する。さらに１つの態様においては、少なくとも２０個の連続したアミノ酸残基が存在する。
【００２９】
当業者は、本発明のポリペプチドの“フラグメント”、“類似体”、又は“誘導体”はまた、本発明において有用であり、すなわち抗原／免疫原材料として有用であることを理解するであろう。従って、例えば、１又は複数の付加、欠失、置換又は同様のものを包含するポリペプチドは、本発明により包含される。
【００３０】
本明細書において使用される場合、本発明のポリペプチドの“類似体”とは、１又は複数のアミノ酸残基が、保存されたアミノ酸残基（好ましくは保存された）により置換されており、そして天然において、又は非天然において存在するそれらのポリペプチドを包含する。１つの態様においては、本発明のポリペプチドの類似体は、図に示されるそれらの配列又はそのフラグメントに対して約７０％の同一を有するであろう。すなわち、残基の７０％が同じである。さらなる態様においては、ポリペプチドは、８０％以上の同一性を有するであろう。さらなる態様においては、ポリペプチドは９０％以上同一性を有するであろう。さらなる態様においては、ポリペプチドは９５％以上の同一性を有するであろう。さらなる態様においては、ポリペプチド９９％以上の同一性を有するであろう。さらなる態様においては、本発明のポリペプチドの類似体は、約２０個よりも少ない、及びより好ましくは１０個以下のアミノ酸残基の置換、修飾又は欠失を有するであろう。
【００３１】
１つの態様においては、本発明のポリペプチドの誘導体及び類似体は、図に示されるそれらの配列又はそのフラグメントと約７０％の同一性を有するであろう。さらなる態様においては、ポリペプチドの誘導体及び類似体は、８０％以上の相同性を有するであろう。さらなる態様においては、ポリペプチドの誘導体及び類似体は、９０％以上の相同性を有するであろう。さらなる態様においては、ポリペプチドの誘導体及び類似体は、９５％以上の相同性を有するであろう。さらなる態様においては、ポリペプチドの誘導体及び類似体は、９９％以上の相同性を有するであろう。さらなる態様においては、本発明のポリペプチドの誘導体及び類似体は、約２０個よりも少ない、及びより好ましくは１０個以下のアミノ酸残基の置換、修飾又は欠失を有するであろう。
【００３２】
さらなる観点によれば、本発明は、配列番号３，４，７及び８、又はそのフラグメント又は類似体から選択されたアミノ酸配列を有する第２ポリペプチドに対して少なくとも７０％の同一性を有するポリペプチドを提供する。
さらなる観点によれば、本発明は、配列番号３，４，７及び８、又はそのフラグメント又は類似体から選択されたアミノ酸配列を有する第２ポリペプチドに対して少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチドを提供する。
【００３３】
さらなる観点によれば、本発明は、配列番号３，４，７及び８、又はそのフラグメント又は類似体から選択されたアミノ酸配列を有する第２ポリペプチドに対して少なくとも８５％の同一性を有するポリペプチドを提供する。
さらなる観点によれば、本発明は、配列番号３，４，７及び８、又はそのフラグメント又は類似体から選択されたアミノ酸配列を有する第２ポリペプチドに対して少なくとも９０％の同一性を有するポリペプチドを提供する。
【００３４】
さらなる観点によれば、本発明は、配列番号３，４，７及び８、又はそのフラグメント又は類似体から選択されたアミノ酸配列を有する第２ポリペプチドに対して少なくとも９５％の同一性を有するポリペプチドを提供する。
さらなる観点によれば、本発明は、配列番号３，４，７及び８、又はそのフラグメント又は類似体から選択された配列を含んで成るポリペプチドを提供する。
さらなる観点によれば、本発明は、配列番号３，４，７及び８、又はそのフラグメント又は類似体から選択された配列により特徴づけられるポリペプチドを提供する。
【００３５】
さらなる観点によれば、本発明は、配列番号３，４，７及び８から選択されたアミノ酸配列を有する第２ポリペプチドに対して少なくとも７０％の同一性を有するポリペプチドを提供する。
さらなる観点によれば、本発明は、配列番号３，４，７及び８から選択されたアミノ酸配列を有する第２ポリペプチドに対して少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチドを提供する。
さらなる観点によれば、本発明は、配列番号３，４，７及び８から選択されたアミノ酸配列を有する第２ポリペプチドに対して少なくとも８５％の同一性を有するポリペプチドを提供する。
【００３６】
さらなる観点によれば、本発明は、配列番号３，４，７及び８から選択されたアミノ酸配列を有する第２ポリペプチドに対して少なくとも９０％の同一性を有するポリペプチドを提供する。
さらなる観点によれば、本発明は、配列番号３，４，７及び８から選択されたアミノ酸配列を有する第２ポリペプチドに対して少なくとも９５％の同一性を有するポリペプチドを提供する。
さらなる観点によれば、本発明は、配列番号３，４，７及び８から選択された配列を含んで成るポリペプチドを提供する。
【００３７】
さらなる観点によれば、本発明は、配列番号３，４，７及び８から選択された配列により特徴づけられるポリペプチドを提供する。
それらの置換は、ポリペプチドの二次構造及び水治療性質に対して最少の影響を有するそれらの置換である。好ましい置換は、保存されるものとして当業者において知られているそれらの置換であり、すなわち置換された残基は、物理的又は化学的性質、例えば疎水性、サイズ、電荷又は官能基を共有する。それらは、置換、例えばＤａｙｈｏｆｆ， Ｍ． Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ５， １９７８ 及びＡｒｇｏｓ． Ｐ． ＥＭＢＯ Ｊ． ８， ７７９−７８５， １９８９により記載されるそれらの置換を包含する。
【００３８】
例えば、次のグループの１つに属するアミノ酸（天然か又は非天然）が、保存性変化を表す：
ａｌａ， ｐｒｏ， ｇｌｙ， ｇｌｎ， ａｓｎ， ｓｅｒ， ｔｈｒ， ｖａｌ；
ｃｙｓ， ｓｅｒ， ｔｙｒ， ｔｈｒ；
ｖａｌ， ｉｌｅ， ｌｅｕ， ｍｅｔ， ａｌａ， ｐｈｅ；
ｌｙｓ， ａｒｇ， ｏｒｎ， ｈｉｓ； 及び
ｐｈｅ， ｔｙｒ， ｔｒｐ， ｈｉｓ。
好ましい置換はまた、その対応するＬ−アミノ酸についてのＤ−鏡像異性体の置換を包含する。
【００３９】
好ましくは、本発明のポリペプチドのフラグメント、類似体又は誘導体は、少なくとも１つの抗原性領域、すなわち少なくとも１つのエピトープを包含するのであろう。
もう１つのアプローチにおいては、類似体は、例えば所望するポリペプチドを効果的に標準化することによって、精製をより早くする成分を組み込むポリペプチドであり得る。“標識”を除去する必要があるか、又は融合ポリペプチド自体が有用である十分な抗原性を保持する場合があり得る。
【００４０】
従って、類似体は、誘導体及びフラグメントのために重要であることは、それらが、誘導される本発明のポリペプチドの少なくともある程度の抗原性／免疫原性を有することである。
ポリペプチドの生物学的又は薬理学的性質を変更する他の化合物、すなわち半減期を高めるためのポリエチレングルコール（ＰＥＧ）、精製の容易さのためのリーダー又は分泌アミノ酸配列、プレプロ−及びプロ−配列、及び（多）糖類を、そこに融合したポリペプチドもまた包含される。
【００４１】
さらに、アミノ酸領域が多形現象であることが見出されているそれらの情況下で、異なったＧＢＳ株の異なったエピトープをより効果的に模倣するよう１又は複数の特定のアミノ酸を変更することが所望される。
さらに、本発明のポリペプチドは、支持体又は他の分子への連結又は結合のために安定性、すなわち高められた疎水性を付与するために、末端−ＮＨ２アシル化により（例えば、アセチル化又はチオグリコール酸アミド化、すなわちアンモニア又はメチルアミンによる末端カルボキシアミド化により）、修飾され得る。
【００４２】
ポリペプチドフラグメント及び類似体のヘテロ及びホモポリペプチドマルチマーがまた、企画される。それらのポリマー形は、例えば架橋剤、例えばアビジン／ビオチン、グルタルアルデヒド又はジメチルスペルイミデートにより架橋された１又は複数のポリペプチドを包含する。そのようなポリマー形はまた、組換えのＤＮＡ技法により生成された複シストロン性ｍＲＮＡから生成された複数のタンデム又は逆方向の連続配列を含むポリペプチドを包含する。
【００４３】
さらなる態様においては、本発明はまた、本出願の図に定義されるように、１又は複数のポリペプチド、又はそのフラグメント、類似体又は誘導体を含んで成るキメラ性ポリペプチドにも関する。
さらなる態様においては、本発明はまた、配列番号３，４，７及び８、又はそのフラグメント又は類似体から選択された配列を有する、キメラポリペプチドを形成するために連結される複数のポリペプチドを含んで成るキメラポリペプチドにも関する。
【００４４】
さらなる態様においては、本発明はまた、配列番号３，４，７及び８から選択された配列を有する、キメラポリペプチドを形成するために連結される複数のポリペプチドを含んで成るキメラポリペプチドにも関する。
抗原性ポリマー（すなわち、合成マルチマー）の形成を達成するためには、ビスハロアセチル基、ニトロアリールハロゲン化物又は同様のものを有するポリペプチドが使用され得る（ここで、前記試薬はチオ基に対して特異的である）。従って、異なったペプチドの２つのメルカプト基間の結合は、単結合であるか、又は２個、典型的には少なくとも４個〜１６個、通常約１４個までの炭素原子の結合基から構成され得る。
【００４５】
特定の態様においては、本発明のポリペプチドフラグメント又は類似体は、メチオニン（Ｍｅｔ）出発残基を含まない。好ましくは、ポリペプチドは、リーダー又は分泌配列（シグナル配列）を組み込まないであろう。本発明のポリペプチドのシグナル部分は、標準の分子生物学的技法に従って決定され得る。一般的に、本発明のポリペプチドは、ＧＢＳ培養物から単離され、そして続いて配列決定され、成熟タンパク質の初期残基及び成熟ポリペプチドの配列が決定される。
【００４６】
本発明のもう１つの観点によれば、次のものがまた提供される：（ｉ）キャリヤー、希釈剤又はアジュバントと共に、本発明のポリペプチドを含む物質の組成物；（ｉｉ）本発明のポリペプチド、及びキャリヤー、希釈剤又はアジュバントを含んで成る医薬組成物；（ｉｉｉ）本発明のポリペプチド、及びキャリヤー、希釈剤はアジュバントを含んで成るワクチン；（ｉｖ）免疫応答、例えばＧＢＳに対する保護免疫応答を誘発するために、免疫学的に有効な量の本発明のポリペプチドを、個人に投与することによって、その個人においてＧＢＳに対する免疫応答を誘発するための方法；及び特に、（ｖ）予防又は治療量の本発明のポリペプチドを、その必要な個人に投与することによって、ＧＢＳ感染を予防し、そして／又は処理するための方法。
【００４７】
免疫化の前、本発明のポリペプチドはまた、キャリヤータンパク質、例えば破傷風毒素、ジフテリア毒素、Ｂ型肝炎ウィルス表面抗原、ポリオウィルスＶＰ１抗原又はいずれかの他のウィルス又は細菌毒素又は抗原、又はより強い免疫応答の進行を刺激するいずれかの適切なタンパク質にカップリングされるか又は接合され得る。このカップリング又は接合は、化学的に又は遺伝学的に行われ得る。ペプチド−キャリヤー接合のより詳細な記載は、Ｖａｎ Ｒｅｇｅｎｍｏｒｔｅｌ， Ｍ． Ｈ． Ｖ．， Ｂｒｉａｎｄ Ｊ． Ｐ．， Ｍｕｌｌｅｒ Ｓ．， Ｐｌａｕｅ Ｓ．， “Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｓ Ａｎｔｉｇｅｎｓ” ｉｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌ． １９ （ｅｄ．） ｂｕｒｄｏｕ， Ｒ． Ｈ． ＆ Ｖａｎ Ｋｎｉｐｐｅｎｂｅｒｇ Ｐ．Ｈ． （１９８８）， Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋから入手できる。
【００４８】
もう１つの観点によれば、医薬的に許容できるキャリヤー、希釈剤又はアジュバントと混合し、１又は複数の本発明のＧＢＳポリペプチドを含んで成る医薬組成物が提供される。適切なアジュバントは、（１）水中油エマルジョン配合物、例えばＭＦ５９ＴＭ， ＳＡＦＴＭ， ＲｉｂｉＴＭ；（２）完全又は不完全フロイントアジュバント；（３）塩、すなわちＡｌｋ （ＳＯ４）２， ＡｌＮａ（ＳＯ４）２， ＡｌＮＨ４（ＳＯ４）２， Ａｌ（ＯＨ）３， ＡｌＰＯ４， シリカ、カオリン；（４）サポニン誘導体、例えばＳｔｉｍｕｌｏｎＴＭ， 又はそれから生成される粒子、例えばＩＳＣＯＭ（免疫刺激複合体；（５）サイトカイン、例えばインターロイキン、インターフェロン、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＰ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）；（６）他の物質、例えば炭素ポリヌクレオチド、すなわちポリＩＣ及びポリＡＵ、解毒されたコレラ毒素（ＣＴＢ）及び粘膜免疫性の誘発のためのＥ．コリ熱不安定毒素を包含する。
【００４９】
アジュバントのより詳細な記載は、Ｍ．Ｚ．Ｉ． Ｋｈａなど．， Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， Ｖｏｌ．１１， Ｎｏ． １（１９９４） ｐｐ． ２−１１， 及びＧｕｐｔａなど．， Ｖａｃｃｉｎｅ， Ｖｏｌ． １３， Ｎｏ．１４， ｐｐ． １２６３−１２７６ （１９９５） による再考、及びＷＯ９９／２４５７８号から入手できる。好ましいアジュバントは、ＱｕｉｌＡＴＭ， ＱＳ２１ＴＭ， ＡｌｈｙｄｒｏｇｅｌＴＭ 及びＡｄｊｕｐｈｏｓＴＭ を包含する。
本発明の医薬組成物は、注射、急速な注入、鼻咽頭吸収、皮膚吸収又は頬又は経口により非経口投与され得る。
【００５０】
本発明の医薬組成物は、ストレプトコッカス感染、特にグループＡストレプトコッカス（Ｓ． ピロゲネス）、グループＢストレプトコッカス（ＧＢＳ又はＳ．アガラクチアエ）、Ｓ．ダイスガラクチアエ（Ｓ． ｄｙｓｇａｌａｃｔｉａｅ）、Ｓ．ウベリス（Ｓ．ｕｂｅｒｉｓ）、Ｓ．ノカルジア（Ｓ．ｎｏｃａｒｄｉａ）、及びＳ．アウレウス（Ｓ． ａｕｒｅｕｓ）により介在される疾病及び病状の処理又は予防のために使用される。ストレプトコッカス及びより特定には、ＧＢＳについての一般情報は、Ｐ．Ｒ． Ｍｕｒｒａｙなど．， ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ， ６ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ， ＡＳＭ Ｐｒｅｓｓ， Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ， Ｄ．Ｃ．， １９９５から入手できる。
【００５１】
１つの態様においては、本発明の医薬組成物は、ＧＢＳ感染及び／又はＧＢＳ感染により介在される疾病及び症状の処理又は予防のために使用される。
特定の態様いおいては、本発明の医薬組成物は、ＧＢＳ感染の危険性のあるそれらの個人、例えば生命をおびやかす敗血症に対する軽い尿路感染、及び髄膜炎、例えば骨髄炎、心内膜炎、羊膜炎、子宮内膜炎、創傷感染（帝王切開後及び会陰切開後）、蜂巣炎又は筋膜炎についての妊娠女性に投与される。
特定の態様においては、本発明の医薬組成物は、ＧＢＳ感染の危険性のあるそれらの個人、例えば敗血症、髄膜炎、肺炎、蜂巣炎、骨髄炎、敗血性関節炎、心内膜炎又は喉頭蓋についての新生児及び幼児に投与される。
【００５２】
特定の態様においては、本発明の医薬組成物は、ＧＢＳ感染の危険のあるそれらの個人、例えば一次菌血症、柔組織感染の皮膚、肺炎、尿路性敗血症、心内膜症、腹膜炎、髄膜炎又は蓋膿症について非妊娠成人に投与される。柔組織感染の皮膚は、蜂巣炎、感染された末梢潰瘍、骨髄炎、敗血性関節炎及び圧迫潰瘍又は創傷感染を包含する。危険性ある人々の中では、衰弱した個人、例えば慢性疾患、例えば真性糖尿病及び癌を有する人々、又は老人が存在する。
特定の態様においては、本発明の医薬組成物は、ＧＢＳ感染の危険性のあるそれらの個人、例えば家畜における乳腺炎の処理のためにウシに投与される。
【００５３】
さらなる観点においては、本発明は、治療又は予防量の本発明の組成物を、ＧＢＳ感染に対して敏感な個人に投与することを含んで成る、前記個人におけるＧＢＳ細菌感染の予防又は治療処理のためへの本発明の医薬組成物の使用を提供する。
さらなる観点によれば、本発明のＧＢＳポリペプチドは、ＧＢＳ感染の診断の検出のために本発明のポリペプチドを含んで成るキットに使用され得る。
本発明において使用される場合、用語“個人”とは、哺乳類を包含する。さらなる態様においては、哺乳類はヒトである。さらに態様においては、哺乳類は非ヒト、例えば家畜である。
【００５４】
特定の態様においては、本発明の医薬組成物は、ＧＢＳ感染の危険性のあるそれらの個人、例えば新生児に投与される。
本発明の医薬組成物は好ましくは、約０．００１〜１００μｇ／ｋｇ（抗原／体重）及びより好ましくは０．０１〜１０μｇ／ｋｇ及び最も好ましくは０．１〜１μｇ／ｋｇの単位用量形で、免疫化の間、約１〜６週間隔で１〜３度、投与される。
本発明の医薬組成物は好ましくは、約０．１〜１０μｇ／ｋｇ及びより好ましくは１μ〜１ｍｇ／ｋｇ及び最も好ましくは１０〜１００μｇ／ｋｇの単位用量形で、免疫化の間、約１〜６週間隔で１〜３度、投与される。
【００５５】
１つの態様においては、ポリヌクレオチドは、本発明のポリペプチドをコードする、読み取り枠（ＯＲＦ）を包含する配列番号１、２，５及び６に示されるそれらである。
１つの態様においては、ポリヌクレオチドは、本発明のポリペプチドをコードする、配列番号１，２，５及び６に示されるそれらである。
【００５６】
図に示されるポリヌクレオチド配列は、本発明のポリペプチドをコードする、縮重されたコドンにより変更され得ることが理解されるであろう。従って、本発明はさらに、配列間で５０％の同一性を有する、上記に記載されるポリヌクレオチド（又はその補体配列を）を提供する。１つの態様においては、配列間で少なくとも７０％の同一性が存在する。１つの態様においては、配列間で少なくとも７５％の同一性が存在する。１つの態様においては、配列間で少なくとも８０％の同一性が存在する。１つの態様においては、配列間で少なくとも８５％の同一性が存在する。１つの態様においては、配列間で少なくとも９０％の同一性が存在する。さらなる態様においては、ポリヌクレオチドは、緊縮条件下でハイブリダイズでき、すなわち少なくとも９５％の同一性を有する。さらなる態様においては、９７％以上の同一性が存在する。
【００５７】
ハイブリダイゼーションのための適切な緊縮条件は、当業者いより容易に決定され得る（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋなど．， （１９８９） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ２ｎｄ ｅｄ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎ．Ｙ．； Ａｕｓｕｂｅｌ Ｆ．Ｍ． など．， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．， Ｎ．Ｙ． により出版されたＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ （１９９９） を参照のこと）。
【００５８】
さらなる態様においては、本発明は、
（ａ）ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、又は
（ｂ）ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの相補体のいずれかに対して、緊縮条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドを提供し；ここで前記ポリペプチドは配列番号３，４，７及び８、又はそのフラグメント又は類似体を含んで成る。
【００５９】
さらなる態様においては、本発明は、
（ａ）ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、又は
（ｂ）ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの相補体のいずれかに対して、緊縮条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドを提供し；ここで前記ポリペプチドは、配列番号３，４，７及び８、又はそのフラグメント又は類似体を含んで成るポリペプチドからの少なくとも１０個の連続したアミノ酸残基を含んで成る。
【００６０】
さらなる態様においては、本発明は、
（ａ）ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、又は
（ｂ）ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの補体のいずれかに対して、緊縮条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドを提供し；ここで前記ポリペプチドは配列番号３，４，７及び８を含んで成る。
【００６１】
さらなる態様においては、本発明は、
（ａ）ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、又は
（ｂ）ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの補体のいずれかに対して、緊縮条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドを提供し；ここで前記ポリペプチドは、配列番号３，４，７及び８を含んで成るポリペプチドからの少なくとも１０個の連続したアミノ酸残基を含んで成る。
当業者により容易に理解されるように、ポリヌクレオチドは、ＤＮＡ及びＲＮＡの両者を包含する。
【００６２】
本発明はまた、本出願に記載されるポリヌクレオチドに対して相補的なポリヌクレオチドも包含する。
さらなる観点においては、本発明のポリペプチド又はそのフラグメント又は類似体をコードするポリヌクレオチドが、ＤＮＡ免疫化方法に使用され得る。すなわち、それらは、注入に基づいて複製でき、そして発現できるベクター中に組み込まれ得、それによりインビボで抗原性ポリペプチドを生成する。例えば、ポリヌクレオチドは、真核細胞下で機能的であるＣＭＶプロモーターの制御下でプラスミドベクター中に組み込まれ得る。好ましくは、ベクターは筋肉内注射される。
【００６３】
もう１つの観点によれば、前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを宿主細胞において発現し、そしてその発現されたポリペプチド生成物を回収することによる組換え技法により本発明のポリペプチドを生成するための方法が提供される。他方では、ポリペプチドは、確立された化学合成技法、すなわち十分なポリペプチドを生成するために連結されるオリゴヌクレオチドの液相又は固相合成に従って生成され得る。
【００６４】
ポリヌクレオチド及びポリペプチドの獲得及び評価のための一般的方法は、引用により本明細書に組み込まれる次の文献に記載される：Ｓａｍｂｒｏｏｋ など．， （１９８９） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ３５ ２ｎｄ ｅｄ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎ．Ｙ．， Ｃｕｒｒｅｎｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， （１９９９） Ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ａｕｓｕｂｅｌ Ｆ．Ｍ． など．， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．， Ｎ．Ｙ．； ＰＣＲ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ， ｆｒｏｍ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ ｔｏ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， （１９９７） Ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ｗｈｉｔｅ Ｂ．Ａ．， Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ， Ｔｏｔｏｗａ， Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ， ４９０ ｐａｇｅｓ； Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ， ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅｓ， （１９９３） Ｓｃｏｐｅｓ Ｒ．Ｋ．， Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ， ５Ｎ．Ｙ．， ３ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ， ３８０ ｐａｇｅｓ； Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， （１９９９） Ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ｃｏｌｉｇａｎ Ｊ．Ｅ． など．， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ Ｉｎｃ．， Ｎ．Ｙ．。
【００６５】
組換え体生成に関しては、宿主細胞が前記ポリペプチドをコードするベクターによりトランスフェクトされ、そして次に、プロモーターの活性化、形質転換体の選択又は遺伝子の修飾のために適切なように変性された栄養培地において培養される。適切なベクターは、選択された宿主において生存し、そして複製できるそれらのベクターであり、そして染色体、非染色体及び合成ＤＮＡ配列、例えば細菌プラスミド、ファージＤＮＡ、バキュロウィルス、酵母プラスミド、プラスミド及びファージＤＮＡの組合せに由来するベクターを包含する。
【００６６】
ポリペプチド配列は、それが、プロモーター、リボソーム結合部位（コンセンサス領域又はシャイン−ダルガルノの配列）及び任意には、オペレーター（制御要素）を含んで成る発現制御領域に作用可能に連結されるように、制限酵素を用いて、適切な部位でベクターに組み込まれ得る。確立された分子生物学的原理（Ｓａｍｂｒｏｏｋなど．， （１９８９） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ． ２ｎｄ ｅｄ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎ．Ｙ．； Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， （１９９９） Ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ａｕｓｕｂｅｌ Ｆ．Ｍ． など．， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ　＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．， Ｎ．； それらは引用により本明細書に組み込まれる）に従って、所定の宿主及びベクターのために適切である発現制御領域の個々の成分選択することができる。
【００６７】
適切なプロモーターは、ＬＴＲ又はＳＶ４０プロモーター、Ｅ．コリｌａｃ， ｔａｃ又はｔｒｐプロモーター及びファージλ、ＰＬプロモーターを包含するが、但しそれらだけには限定されない。ベクターは好ましくは、複製の起点、及び選択マーカー、すなわち抗生物質耐性遺伝子を組み込むであろう。適切な細菌ベクターは、次のものを包含する：ｐＥＴ， ｐＱＥ７０， ｐＱＥ６０， ｐＱＥ−９， ｐＤ１０ｐｈａｇｅｓｃｒｉｐｔ， ＰＳＩＸ１７４， ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ， ｐｂｓｋｓ， ｐＮＨ８Ａ， ｐＮＨ１６Ａ， ｐＮＨ４６Ａ， ｐｔｒｃ９９ａ， ｐＫＫ２２３−３， ｐＫＫ２３３−３， ｐＤＲ５４０， ｐＲＩＴ５及び真核ベクターｐＢｌｕｅＢａｃＩＩＩ， ｐＷＬＮＥＯ， ｐＳＶ２ＣＡＴ， ｐＯＧ４４， ｐＸＴ１， ｐＳＧ， ｐＳＶＫ３， ｐＢＰＶ， ｐＭＳＧ， 及びｐＳＶＬ。宿主細胞は、細菌（すなわち、Ｅ．コリ、バチルス・サブチリス、ストレプトマイセス）、菌類（すなわち、アスペルギラス・ニガー、アスペルギラス・ニジュリンス）、酵母（すなわち、サッカロミセス）又は真核生物（すなわち、ＣＨＯ， ＣＯＳ）であり得る。
【００６８】
培養でのポリペプチドの発現に基づいて、細胞は典型的には、遠心分離により収穫され、次に、物理的又は化学的手段により破壊され（発現されたポリペプチドが培地中に分泌されない場合）、そしてその得られる粗抽出物が、興味あるポリペプチドを単離するために保持される。培養培地又は溶解物からのポリペプチドの精製は、ポリペプチドの性質に依存して、確立された技法により、例えば硫酸アンモニウム又はエタノール沈殿法、酸抽出、アニオン又はカチオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー及びレクチンクロマトグラフィーを用いて達成され得る。最終精製は、ＨＰＬＣを用いて達成され得る。
【００６９】
ポリペプチドは、リーダー又は分泌配列を伴なって又はそれを伴なわないで発現され得る。前者の場合、リーダーは、後−翻訳プロセッシングを用いて除去され得るか（引用により本明細書に組み込まれるアメリカ特許第４，４３１，７３９号、第４，４２５，４３７号及び第４，３３８，３９７号を参照のこと）、又は発現されたポリペプチドの精製に続いて化学的に除去され得る。
【００７０】
さらなる観点によれば、本発明のＧＢＳポリペプチドは、ＧＢＳ感染についての診断試験に使用され得る。いくつかの診断方法が、生物学的サンプルにおけるＧＢＳ生物を検出するために可能であり、ここで前記方法は、
ａ． 個体から生物学的サンプルを得；
ｂ． 混合物を形成するために、前記生物学的サンプルと共に、本発明のＧＢＳポリペプチドと反応性の抗体又はそのフラグメントをインキュベートし；そして
ｃ． ＧＢＳの存在を示す混合物における特異的に結合される抗体又は結合されるフラグメントを検出することを含んで成る。
【００７１】
他方では、ＧＢＳ抗原に対して特異的な抗体を含むか又は含むと思われる生物学的サンプルにおけるそのような抗体の検出方法であって、ここで前記方法は、
ａ． 個体から生物学的サンプルを得；
ｂ． 混合物を形成するために、前記生物学的サンプルと共に、本発明の１又は複数のＧＢＳポリペプチド又はそのフラグメントをインキュベートし；そして
ｃ． ＧＢＳに対して特異的な抗体の存在を示す混合物における特異的に結合される抗原又は結合されるフラグメントを検出することを含んで成る。
【００７２】
当業者は、この診断試験が、ポリペプチドに対して特異的な抗体が生物に存在するかどちらかを決定するために、いくつかの形、例えば免疫学的試験、例えば酵素結合の免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ又はラテックス凝集アッセイをとることができることを認識するであろう。
【００７３】
発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドはまた、ＧＢＳ細胞を含むと思われる生物学的サンプルにおけるＧＢＳの存在の検出への使用のためのＤＮＡプローブを企画するためにも使用され得る。本発明の検出方法は、
ａ． 個体から生物学的サンプルを得；
ｂ． 混合物を形成するために、前記生物学的サンプルと共に、本発明のポリペプチド又はそのフラグメントをコードするＤＮＡを有する１又は複数のＤＮＡプローブをインキュベートし；そして
ｃ． ＧＢＳ細菌の存在を示す混合物における特異的に結合されるＤＮＡプローブを検出することを含んで成る。
【００７４】
本発明のＤＮＡプローブはまた、ＧＢＳ感染の診断方法として、ポリメラーゼ鎖反応を用いて、サンプルにおける循環ＧＢＳ（すなわち、ＧＢＳ核酸）を検出するために使用され得る。プローブは、従来の技法を用いて合成され、そして固相上に固定されるか、又は検出可能なラベルによりラベルされ得る。本出願のための好ましいＤＮＡプローブは、本発明のＧＢＳポリペプチドの少なくとも約６個の連続したヌクレオチドに対して相補的な配列を有するオリゴマーである。
【００７５】
個体におけるＧＢＳの検出のためのもう１つの診断方法は、
ａ． 本発明のポリペプチド又はそのフラグメントと反応性の抗体を、検出可能なラベルによりラベリングし；
ｂ． 前記ラベルされた抗体又はラベルされたフラグメントを、前記個体に投与し；そして
ｃ． ＧＢＳの存在を示す個体における、特異的に結合され、ラベルされた抗体又はラベルされたフラグメントを検出することを含んで成る。
【００７６】
本発明のさらなる観点は、ＧＢＳ感染の診断及び特に処理のための特定の抗体の生成のためへの免疫原としての本発明のＧＢＳポリペプチドの使用である。適切な抗体は、適切なスクリーニング方法を用いて、例えば試験モデルにおけるＧＢＳ感染に対して受動的に保護する特定抗体の能力を測定することによって決定され得る。動物モデルの１つの例は、本明細書における例に記載されるマウスモデルである。抗体は、完全な抗体又はその抗体−結合フラグメントであり得、そしていずれかの免疫グロブリン種類に属することができる。
【００７７】
抗体又はフラグメントは、動物起源のもの、特に哺乳類起源のもの、及びより特定には、ネズミ、ラット又はヒト起源のものであり得る。それは天然の抗体又はそのフラグメント、又は所望には、組換え抗体又は抗体フラグメントであり得る。用語組換え抗体又は抗体フラグメントとは、分子生物学的技法を用いて生成された抗体又は抗体フラグメントを意味する。抗体又は抗体フラグメントは、ポリクローナル又は好ましくはモノクローナルであり得る。それは、ＧＢＳポリペプチドにより結合される多くのエピトープに対して特異的であるが、しかし好ましくは１つのエピトープに対して特異的であり得る。
【００７８】
本発明のさらなる観点は、予防又は治療量の本発明の組成物を個人に投与することを含んで成る、ＧＢＳ感染の予防又は治療処理のためへの前記組成物の使用である。
特にことわらない限り、本明細書に使用されるすべての技術的及び科学的用語は、当業者により通常理解されるのと同じ意味を有する。本明細書において言及されるすべての出版物、特許出願、特許及び他の文献は、引例により本明細書に組み込まれる。これに反する場合、定義を包含する本発明の規格が調整するであろう。さらに、材料、方法及び実施例は単なる例示であって、限定的ではない。
【００７９】
実施例
例１：
この例は、ＧＢＳ ＢＶＨ−Ａ２及びＢＶＨ−Ａ３遺伝子の同定を示す。
染色体ＤＮＡを、前に記載されたようにして（Ｊａｙａｒａｏ ＢＭなど．， １９９１， Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ２９： ２７７４−２７７８）、異なったＧＢＳ株から単離した。λＺＡＰＥｘｐｒｅｓｓゲノムライブラリーを、製造業者の説明書（Ｓｔｒａｔｏｇｅｎｅ， Ｌａ Ｊｏｌｌａ， ＣＡ）に従って、血清型ＩＩＩ ＧＢＳ株ＮＣＳ９５４から精製され、そしてスクリーンされた染色体ＤＮＡを、ヒト正常血清のプールと共に用いて構成した。手短には、精製された染色体ＤＮＡを、ｔｓｐ５０９Ｉ制限酵素により部分的に消化し、そして得られるフラグメントを、１％アガロースゲル（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）上で電気泳動した。
【００８０】
５〜１０ｋｂのサイズ範囲のフラグメントを、ゲルから抽出し、そしてλＺＡＰＥｘｐｒｅｓｓベクターのＥｃｏＲＩアームに連結し、そしてベクターを、Ｇｉｇａｐａｃｋ ＩＩパッケージング抽出物（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いてカプシド封入した。組換えファージを用いて、Ｅ．コリＸｌ１−Ｂｌｕｅ ＭＲＦ’ ［Δ（ｍｃｒＡ） １８３Δ（ｍｃｒＣＢ−ｈｓｄＳＭＲ−ｍｒｒ） １７３ ｅｎｄＡＪ ｓｕｐＥ４４ ｔｈｉ−１ ｒｅｃＡ１ ｇｙｒＡ９６ ｒｅｌＡＩ ｌａｃ （Ｆ’ ｐｒｏＡＢ ｌａｃｌｑＺΔＭ１５ Ｔｎ１０ ［ＴｅｔＲ］） を感染し、次にこれを、ＬＢ寒天上にプレートした。得られるプラークを、１０ｍＭのイソプロピル−β−ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ： ＩＣＮ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ Ｉｎｃ．， Ｃｏｓｔａ Ｍｅｓａ， ＣＡ）により予備含浸されたＨｙｂｏｎｄ−ｃニトロセルロース膜（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ． Ｂａｉｅ ｄ’Ｕｒｆｅｅ， Ｃａｎａｄａ）上にもち上げた。
【００８１】
膜を、３％脱脂乳と共に、リン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）をブロックし、そしてヒト血清のプール、ペルオキシダーゼ−ラベルされたヤギ抗−ヒト免疫グロブリン抗血清（Ｊｕｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．， Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ， ＰＡ）及び基質と共に連続的にインキュベートした。陽性プラークを単離し、２度、精製し、そして組換えｐＢＫ−ＣＭＶプラスミド（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を、製造業者の説明書に従って、ＥｘＡｓｓｉｓｔヘルパーファージ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）により切除した。
【００８２】
クローン化された挿入体を含むファゲミドベクターを用いてのイムノブロットは、プールされたヒト血清が、クローンＨ３１−２９について６５ｋＤａのおおよその分子量を有するタンパク質バンドに達し、そしてそれはクローンＦ８について４０〜６０ｋＤａのおおよその分子量を有する２種のタンパク質バンドに達したことを示した。それらのクローンを、それぞれＢＶＨ−Ａ２及びＢＶＨ−Ａ３として同定した。挿入体の配列を、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ． （Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ， ＣＡ） 自動配列決定機モデル３７３Ａを備えたＴＡＱ Ｄｙｅ Ｄｅｏｘｙ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ配列決定キットを用いて、その製造業者の推薦に従って決定した。
【００８３】
例２：
この例は、ＧＢＳ ＢＶＨ−Ａ２及びＢＶＨ−Ａ３遺伝子のクローニングを例示する。
グループＢストレプトコッカスＢＶＨ−Ａ２（配列番号１）及びＢＶＨ−Ａ３（配列番号５）遺伝子のコード領域をそれぞれ、制限部位ＮｄｅＩ（ＣＡＴＡＴＧ）及びＸｈｏＩ（ＣＴＣＧＡＧ）の付加のための塩基拡張を含むオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、精製された組換えファゲミドクローンＨ３１−２９及び血清型ＩＩＩグループＢストレプトコッカス株ＮＣＳ９５４のゲノムＤＮＡから、ＰＣＲ（ＤＮＡ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ ＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ ２４００ Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ， Ｓａｎ Ｊｏｓｅ， ＣＡ）により増幅した。
【００８４】
オリゴヌクレオチドプライマー（表１）ＤＭＡＲ１７Ｓ（配列番号９）及びＤＭＡＲ１７３（配列番号１０）を用いてＢＶＨ−Ａ２遺伝子を増幅し、そしてＤＭＡＲ２０４（配列番号１５）及びＤＭＡＲ２０５（配列番号１６）を用いて、ＢＶＨ−Ａ３遺伝子を増幅した。ＰＣＲ生成物を、ＱＩＡｇｅｎからのＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キットを用いて、その製造業者の説明書（Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ， ＣＡ）に従ってアガロースゲルから精製し、そしてＮｄｅＩ及びＸｈｏＩ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｃａｎａｄａ Ｉｎｃ Ｂａｉｅ ｄ’Ｕｒｆｅ， Ｃａｎａｄａ）により消化した。ＰＥＴ−２１ｂ（＋） ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ， Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩ）を、ＮｄｅＩ及びＸｈｏＩにより消化し、そしてＱＩＡｇｅｎ（Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ， ＣＡ）からのＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キットを用いて、アガロースゲルから精製した。
【００８５】
ＮｄｅＩ−ＸｈｏＩ ＰＣＲ生成物を、ＮｄｅＩ−ＸｈｏＩ ｐＥＴ−２１ｂ（＋） 発現ベクターに連結した。その連結された生成物を用いて、Ｅ．コリ株ＤＨ５α［φ８０ｄｌａｃＺΔＭ１５ Δ（ｌａｃＺＹＡ−ａｒｇＦ）Ｕ１６９ ｅｎｄＡ１ ｒｅｃＡ１ ｈｓｏｌＲ１７ （ｒＫ−ｍｋ＋） ｄｅｏＲ ｔｈｉ−１ ｓｕｐＥ４４ λ−ｇｙｒＡ９６ ｒｅｌＡ１］（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ， Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ， ＭＤ）を、Ｓｉｍａｎｉｓ（Ｈａｎａｋａｎ，Ｄ． ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ， １９８５， Ｄ．Ｍ． Ｇｌｏｖｅｒ （ｅｄ）， ｐｐ． １０９−１３５） の方法に従って、形質転換した。ＢＶＨ−Ａ２又はＢＶＨ−Ａ３遺伝子を含む組換えｐＥＴ−２１ｂ（＋）プラスミド（ｒｐＥＴ２１ｂ（＋））を、ＱＩＡｇｅｎプラスミドキット（Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ，ＣＡ）を用いて精製し、そしてＤＮＡ挿入体を配列決定した（Ｔａｇ Ｄｙｅ Ｄｅｏｘｙ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ， ＡＢＩ， Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ， ＣＡ）。
【００８６】
ＢＶＨ−Ａ２遺伝子（配列番号１）をコードする読み取り枠（ＯＲＦ）が、１６２６−ｂｐを含み、そして８．９９の予測されるｐＩ及び５９７３０．６６Ｄａの予測される分子質量を有する、５４１個のアミノ酸残基のポリペプチドをコードすることが決定された。Ｓｐｃａｎソフトウェア（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐａｃｋａｇｅ； Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ）を用いての、予測されるアミノ酸残基配列（配列番号３）の分析は、アラニン残基とアスパラギン酸残基との間に位置する切断部位で終結する、３７個のアミノ酸残基のシグナルペプチド（ＭＲＧＳＬＳＴＫＱＳＹＳＬＲＫＹＫＦＧＬＡＳＶＩＬＧＳＦＩＭＶＴＳＰＶＦＡ）の存在を示した。このＯＲＦの分析は、反復構造又はＩｇＡ結合モチーフ（ＭＬＫＫＩＥ）の存在を示さなかったが、しかし推定の細胞壁固定のモチーフ（ＬＰＫＴＧ）が、アミノ酸残基４７９と４８３との間のＣ−末端近くに同定された。
【００８７】
ＢＶＨ−Ａ２のアミノ酸配列（配列番号３）と、入手できるデータバンクに包含される配列との比較は、唾液糖タンパク質とＳ．ムタンス（Ｓ． ｍｕｔａｎｓ）との相互作用に包含されるＳＲタンパク質をコードするｓｒ遺伝子上流に位置する、Ｓ．ムタンスの推測に基づく４０ｋＤａのトランスメンブラン輸送されたタンパク質との１８％の同一性を示した（ＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号：ｃ６０３２８： Ｏｇｉｅｒなど． １９９１， Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ， ５９： １６２０−１６２６）。
【００８８】
【表１】
2004510450.tif 000003
【００８９】
ＢＶＨ−Ａ３遺伝子（配列番号５）をコードする読み取り枠（ＯＲＦ）が、１５９０−ｂｐを含み、そして６．１４の予測されるｐＩ及び５９０１９．４８Ｄａの予測される分子質量を有する、５２９個のアミノ酸残基のポリペプチドをコードすることが決定された。Ｓｐｃａｎソフトウェア（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐａｃｋａｇｅ； Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ）を用いての、予測されるアミノ酸残基配列（配列番号７）の分析は、アラニン残基とアスパラギン酸残基との間に位置する切断部位で終結する、３８個のアミノ酸残基のシグナルペプチド（ＭＫＩＫＫＩＩＳＧＦＡＡＡＬＩＩＳＳＬＳＴＩＮＹＥＶＫＡ）の存在を示した。このＯＲＦの分析は、反復構造、細胞壁固定モチーフ（ＬＰＸＴＧ）、又はＩｇＡ結合モチーフ（ＭＬＫＫＩＥ）の存在を示さなかった。ＢＶＨ−Ａ３のアミノ酸配列（配列番号７）と、入手できるデータバンクに包含される配列との比較は、データバンクから入手できる配列といずれの有意な相同性も示さなかった。
【００９０】
例３：
この例は、他のＧＢＳ株からのＧＢＳ ＢＶＨ−Ａ２及びＢＶＨ−Ａ３遺伝子のＰＣＲ増幅を記載する。
ＢＶＨ−Ａ２（配列番号１）及びＢＶＨ−Ａ３（配列番号５）遺伝子のＰＣＲ増幅によりその存在を確かめるために、次の１１種の血清学的に異なったＧＢＳ株を使用した：Ｃ３８８／９０（血清型Ｉａ／ｃ）、ＡＴＣＣ１２４０１（血清型Ｉｂ）、ＡＴＣＣ２７５９１（血清型Ｉｃ）、ＮＣＳ２４６（血清型ＩＩ／Ｒ）、ＮＣＳ９５４（血清型ＩＩＩ）、ＮＣＳ９７ＳＲ３３１（血清型ＩＶ）、ＮＣＳ５３５（血清型Ｖ）、ＮＣＳ９８４２（血清型ＶＩ）、ＮＣＳ７２７１（血清型ＶＩＩ）、ＮＣＳ９７０８８６（血清型ＶＩＩＩ）、ＡＴＣＣ２７９５６（ウシ単離物）。
【００９１】
それらの株は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ （Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ， ＭＤ， ＵＳＡ） ａｎｄ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｒｅ ｆｏｒ ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ， Ｐｒｏｖｉｎｃｉａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ ｆｏｒ Ｎｏｒｔｈｅｒｎ Ａｌｂｅｒｔａ （Ｅｄｍｏｎｔｏｎ， Ｃａｎａｄａ） から得られた。Ｅ．コリ株ＸＬ１−Ｂｌｕｅ ＭＲＦ’を負の対照としてそれらの実験において使用した。染色体ＤＮＡを、前に記載されたようにして、個々のグループＢストレプトコッカス株から単離した（Ｊａｙａｒａｏ ＢＭなど．， １９９１， Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ２９： ２７７４−２７７８）。
【００９２】
ＢＶＨ−Ａ２（配列番号１）及びＢＶＨ−Ａ３（配列番号５）遺伝子を、表１に示されるオリゴヌクレオチドを用いて、前記１１種のＧＢＳ株及び対照Ｅ．コリ株から精製されたゲノムＤＮＡから、ＰＣＲ （ＤＮＡ Ｔｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ ＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ ２４００ Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ， Ｓａｎ Ｊｏｓｅ， ＣＡ） により増幅した。オリゴヌクレオチドプライマーＤＭＡＲ３７３（配列番号１１）及びＤＭＡＲ３７４（配列番号１２）を用いて、ＢＶＨ−Ａ２（配列番号１）遺伝子を増幅し、そしてＤＭＡ２０４（配列番号１５）及びＤＭＡＲ２０５（配列番号１６）を用いて、ＢＶＨ−Ａ３（配列番号５）遺伝子を増幅した。
【００９３】
ＰＣＲを次の条件下で３５サイクル行った：９４℃で４５秒、５５℃で４５秒、及び７２℃で２分、及び７２℃で１０分間の最終延長。ＰＣＲ生成物を、１％アガロースゲルにおいてサイズ分別し、そして臭化エチジウム染色により可視化した。それらのＰＣＲ増幅の結果は、表２に示される。増幅生成物の分析は、ＢＶＨ−Ａ２（配列番号１）及びＢＶＨ−Ａ３（配列番号５）遺伝子の両者がすべての試験された１１種のＧＢＳ株のゲノムに存在することを示した。そのような生成物は、対照Ｅ．コリＤＮＡが両組のオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、同一のＰＣＲ増幅に提供される場合、検出されなかった。
【００９４】
【表２】
2004510450.tif 000004
【００９５】
例４：
この例は、ＣＭＶプラスミドｐＣＭＶ−ＧＨにおけるＧＢＳ ＢＶＨ−Ａ２及びＢＶＨ−Ａ３のクローニングを例示する。
グループＢのストレプトコッカスＢＨＢ−Ａ２（配列番号４）及びＢＨＶ−Ａ３（配列番号８）ポリペプチドのＤＮＡコード領域を、プラスミドベクターｐＣＭＶ−ＧＨ（Ｔａｎｇなど．， Ｎａｔｕｒｅ， １９９２， ３５６： １５２）におけるサイトメガロウィルス（ＣＭＶ）プロモーターの転写制御下にあるヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）遺伝子の下流に挿入した。ＣＭＶプロモーターは、Ｅ．コリ細胞においては非機能的プラスミドであるが、しかし真核細胞においては、プラスミドの投与に基づいて、活性的である。ベクターはまた、アンピシリン耐性遺伝子を組み込んだ。
【００９６】
ＢＶＨ−Ａ２（配列番号２）及びＢＶＨ−Ａ３（配列番号６）遺伝子のコード領域（それらのリーダーペプチド領域を有さない）を、制限部位ＢａｍＨＩ（ＧＧＡＴＣＣ）及びＳａｌＩ（ＧＴＣＧＡＣ）の付加のための塩基延長部分を含むオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、血清型ＩＩＩ ＧＢＳ株ＮＣＳ９５４のゲノムＤＮＡから、ＰＣＲ（ＤＮＡ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ ＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ ２４００ Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ， Ｓａｎ Ｊｏｓｅ， （Ａ） により増幅した。オリゴヌクレオチドプライマーＤＭＡＲ４６４（配列番号１３）及びＤＭＡＲ４６５（配列番号１４）を用いて、ＢＶＨ−Ａ２（配列番号２）遺伝子を増幅し、そしてＤＭＡＲ４６６（配列番号１７）及びＤＭＡＲ４６７（配列番号１８）を用いて、ＢＶＨ−Ａ３（配列番号６）遺伝子を増幅した。
【００９７】
制限酵素により消化されたＰＣＲ生成物を、ＱＩＡｇｅｎ（Ｃｈａｔｓｏｒｔｈ， ＣＡ）からのＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キットを用いてアガロースゲルから精製した。ｐＣＭＶ−ＧＨベクター（Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｄｒ． Ｓｔｅｐｈｅｎ Ａ． Ｊｏｈｎｓｔｏｎ， Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， Ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｔｅｘａｓ， Ｄａｌｌａｓ， Ｔｅｘａｓ）を、ＢａｍＨＩ及びＳａｌＩにより消化し、そしてＱＩＡｇｅｎ （Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ， ＣＡ） からのＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キットを用いて、アガロースゲルから精製した。
【００９８】
Ｂａｍ ＨＩ−ＳａｌＩ ＤＮＡフラグメントを、Ｂａｍ ＨＩ−ＢａｌＩ ｐＣＭＶ−ＧＨベクターに連結し、ＣＭＶプロモーターの制御下でのｈＧＨ−ＢＶＨ−Ａ２及びｈＧＨ−ＢＶＨ−Ａ３融合ポリペプチドを創造した。その連結された生成物を用いて、Ｅ．コリ株ＤＨ５α［φ８０ｄｌａｃＺΔＭ１５ Δ（ｌａｃＺＹＡ−ａｒｇＦ）Ｕ１６９ ｅｎｄＡ１ ｒｅｃＡ１ ｈｓｏｌＲ１７ （ｒＫ−ｍｋ＋） ｄｅｏＲ ｔｈｉ−１ ｓｕｐＥ４４ λ−ｇｙｒＡ９６ ｒｅｌＡ１］（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ， Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ， ＭＤ）を、Ｓｉｍａｎｉｓ（Ｈａｎａｋａｎ，Ｄ． ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ， １９８５， Ｄ．Ｍ． Ｇｌｏｖｅｒ （ｅｄ）， ｐｐ． １０９−１３５） の方法に従って、形質転換した。組換えｐＣＭＶプラスミドを、ＱＩＡｇｅｎプラスミドキット（Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ， ＣＡ）を用いて精製し、そしてＤＮＡ挿入体のヌクレオチド配列を、ＤＮＡ配列決定により確かめた。
【００９９】
例５：
この例は、ＧＢＳ ＢＶＨ−Ａ２及びＢＶＨ−Ａ３ポリペプチド抗原に対する免疫応答を誘発するためへのＤＮＡの使用を例示する。
８匹の雌ＢＡＬＢ／ｃマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ， Ｓｔ−Ｃｏｎｓｔａｎｔ， Ｑｕｅｂｅｃ， Ｃａｎａｄａ）のグループを、５０μｇの顆粒球−マクロファージコロニー−刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）−発現プラスミド、ＣＭＶ−ＧＨ−ＧＭ−ＣＳＦ（Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｄｒ． Ｓｔｅｐｈｅｎ Ａ． Ｊｏｈｎｓｔｏｎ， Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， Ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｔｅｘａｓ， Ｄａｌｌａｓ， Ｔｅｘａｓ）の存在下で、ＢＶＨ−Ａ２（配列番号２）又はＢＶＨ−Ａ３（配列番号６）遺伝子をコードする組換えｐＣＭＶ−ＧＨ ５０μｇにより、２又は３週間隔で、３度の筋肉内注射（１００μｌ）により免疫化した。
【０１００】
対照として、マウスのグループに、５０μｇのｐＣＭＶ−ＧＨ−ＧＭ−ＣＳＦの存在下で５０μｇのｐＣＭＶ−ＧＨを注射した。血液サンプルを、個々の免疫化の前及び３回目の注射の７日後、眼窩洞から集め、そして血清抗体応答を、被覆抗原として、精製されたＢＶＨ−Ａ２−Ｈｉｓ・Ｔａｇ又はＢＶＨ−Ａ３−Ｈｉｓ・Ｔａｇ組換えポリペプチドのいずれかを用いて、ＥＬＩＳＡにより決定した。
【０１０１】
例６：
この例は、組換えＧＢＳ ＢＶＨ−Ａ２及びＢＶＨ−Ａ３ポリペプチドの生成及び精製を例示する。
配列番号１及び５にそれぞれ対応する、ＢＶＨ−Ａ２又はＢＶＨ−Ａ３遺伝子を有する組換えｐＥＴ−２１ｂ（＋）プラスミドを用いて、エレクトロポレーション（Ｇｅｎ ＰｕｌｓｅｒＩＩ装置、ＢＩＯ−ＲＡＤ Ｌａｂｓ， Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ， Ｃａｎａｄａ）により、Ｅ．コリ株ＢＬ２１（ＤＥ３）（Ｆ−ｏｍｐＴ ｈｓｄＳＢ（ｒ−Ｂｍ−Ｂ）ｇａｌ ｄｃｍ （ＤＥ３））（Ｎｏｖａｇｅｎ， Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩ） を形質転換した。このＥ．コリ株においては、組換えポリペプチドのＴ７プロモーター制御発現が、その遺伝子がイソプロピル−β−ｄ−チオ−ガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）により誘発できるｌａｃプロモーターの制御下にあるＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ（λＤＥ３プロファージ上に存在する）により特異的に認識される。
【０１０２】
形質転換体ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｒｐＥＴを、Ａ６００が０．６の値に達するまで、１ｍｌ当たり１００μｇのカルベニシリン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃａｎａｄａ Ｌｔｄ．， Ｏａｋｖｉｌｌｅ， Ｃａｂａｄａ）を含むＬＢブイヨン（ペプトン１０ｇ／ｌ， 酵母抽出物５ｇ／ｌ， ＮａＣｌ／ｌ）において、２５０ｒｐｍで撹拌しながら、３７℃で増殖した。ＧＢＳ ＢＶＨ−Ａ２−Ｈｉｓ・Ｔａｇ及びＢＶＨ−Ａ３−Ｈｉｓ・Ｔａｇ組換えポリペプチドの生成を誘発するために、細胞を、ＩＰＴＧの存在下でさらに３時間、１ｍＭの最終濃度でインキュベートした。５００ｍｌの培養物からの誘発された細胞を、遠心分離によりペレット化し、そして−７０℃で凍結した。
【０１０３】
ＩＰＴＧ−誘発されたＢＬ２１（ＤＥ３）／ｒｐＥＴ２１ｂ（＋）の可溶性細胞質画分からの組換えポリペプチドの精製を、Ｈｉｓ・Ｂｉｎｄ金属キレート化樹脂上に固定されたニ価カチオン（Ｎｉ２＋）に結合するＨｉｓ・Ｔａｇ配列（６個の連続したヒスチジン残基）の性質に基づいて、親和性クロマトグラフィーにより行った。手短には、ＩＰＴＧにより誘発された培養物５００ｍｌから得られた、ペレット化された細胞を、１ｍＭのＰＭＳＦを含む、溶解緩衝液（２０ｍＭのトリス、５００ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのイミダゾール、ｐＨ７．９）に再懸濁し、音波処理し、そして１２，０００Ｘｇで２０分間、遠心分離し、残骸を除去した。
【０１０４】
上清液を、Ｎｉ−ＮＴＡアガロースカラム（Ｑｉａｇｅｎ， ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇｅ， Ｏｎｔａｒｉｏ， Ｃａｎａｄａ）上に負荷した。ＧＢＳ ＢＶＨ−Ａ２−Ｈｉｓ・Ｔａｇ及びＢＶＨ−Ａ３−Ｈｉｓ・Ｔａｇ組換えポリペプチドを、２５０ｍＭのイミダゾール−５００ｍＭのＮａＣｌ−２０ｍＭのトリス（ｐＨ７．９）により溶出した。サンプルからの塩及びイミダゾールの除去を、４℃でのＰＢＳに対する透析により行った。Ｅ．コリの可溶性画分から得られた組換えポリペプチドの量を、ＭｉｃｒｏＢＣＡ（Ｐｉｅｒｃｅ， Ｒｏｃｋｆｏｒｄ， Ｉｌｌｉｎｏｉｓ）により測定した。
【０１０５】
例７：
この例は、ＧＢＳ株の表面でのＧＢＳ ＢＶＨ−Ａ２及びＢＶＨ−Ａ３ポリペプチドの抗体への接近性を例示する。
細菌を、０．５％酵母抽出物（Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）及び０．５％ペプトン抽出物（Ｍｅｒｃｋ， Ｄａｒｍｓｔａｄｔ， Ｇｅｒｍａｎｙ）を含むＴｏｄｄ Ｈｅｗｉｔｔ （ＴＨ）ブイヨン（Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｄｅｔｒｏｉｔ ＭＩ）において、８％ＣＯ２雰囲気下で３７℃で、０．６００のＯＤ４９０ｎｍ （約１０８ＣＦＵ／ｍｌ）まで増殖した。次に、抗−ＢＶＨ−Ａ２、抗−ＢＶＨ−Ａ３又は対照血清の希釈溶液を添加し、そして細胞への結合を可能にし、これを４℃で２時間インキュベートした。
【０１０６】
サンプルを、ブロッキング緩衝液［２％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むリン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）］により４度、洗浄し、そして次に、ブロッキング緩衝液により希釈された、ヤギフルオレセイン（ＦＩＴＣ）−接合の抗−マウスＩｇＧ−ＩｇＭ（１ｍｌ）を添加した。室温で６０分のさらなるインキュベーションの後、サンプルを、ブロッキング緩衝液により４度、洗浄し、そしてＰＢＳ緩衝液中、０．２５％ホルムアルデヒドにより４℃で１８〜２４時間、固定した。細胞をＰＢＳ緩衝液により２度、洗浄し、そしてＰＢＳ緩衝液５００μｌに再懸濁した。細胞を、流動細胞計測（Ｂｐｉｃｓ（商標）ＸＬ； Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ， Ｉｎｃ．）により分析されるまで、暗室において４℃で維持した。
【０１０７】
例８：
この例は、ウサギ超免疫血清によるマウスの受動的免疫化により誘発された胎児ＧＢＳ感染に対する保護を例示する。
Ｎｅｗ Ｚｅａｌａｎウサギ（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｓｔ−Ｃｏｎｓｔａｎｔ， Ｃａｎａｄａ）を、例６に記載のようにして生成され、そして精製され、そしてＡｌｈｙｄｒｏｇｅｌアジュバント（Ｓｕｐｅｒｆｏｓ Ｂｉｏｓｅｃｔｏｒ ａ／ｓ）に吸収された、５０μｇ及び１００μｇのＢＶＨ−Ａ２−Ｈｉｓ・Ｔａｇ又はＢＶＨ−Ａ３−Ｈｉｓ・Ｔａｇポリペプチドにより複数部位で皮下注射した。ウサギを、ＢＶＨ−Ａ２−Ｈｉｓ・Ｔａｇ又はＢＶＨ−Ａ３−Ｈｉｓ・Ｔａｇポリペプチドにより３週間隔で３度免疫化した。
【０１０８】
血液サンプルを、３度目の注射の３週間後に集めた。血清に存在する抗体を、４０％飽和硫酸アンモニウムを用いての沈殿により精製した。１０匹の雌ＣＤ−１マウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ）グループを、ＢＶＨ−Ａ２−Ｈｉｓ・Ｔａｇ又はＢＶＨ−Ａ３−Ｈｉｓ・Ｔａｇ免疫化されたウサギ、又は関連しない対照組換えタンパク質により免疫化されたウサギから収集された、精製された血清５００μｌにより静脈内注射した。１８時間後、マウスを、約×１０４ＣＦＵのＧＢＳ株Ｃ３８８／９０（Ｉａ／ｃ）により攻撃した。ＧＢＳ攻撃接種物のサンプルを、血液寒天プレート上にプレートし、ＣＦＵを決定し、そして攻撃用量を確かめた。死亡を、１４日間、記録した。
【０１０９】
例９：
この例は、免疫化により誘発された胎児ＧＢＳ感染に対するマウスの保護を例示する。
雌ＣＤ−１マウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ）グループを、１０μｇのＱｕｉｌＡアジュバント（Ｃｅｄａｒｌａｎｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｌｔｄ， Ｈｏｒｎｂｙ， Ｃａｎａｄａ）の存在下で、例６に記載のようにして生成され、そして精製された、２０μｇのＢＶＨ−Ａ２−Ｈｉｓ・Ｔａｇ又はＢＶＨ−Ａ３−Ｈｉｓ・Ｔａｇポリペプチドにより３週間隔で３度、皮下免疫化した。対照マウスを、ＰＢＳ中、ＱｕｉｌＡアジュバントにより注射した。血液サンプルを、個々の免疫化の前、１， ２２及び４３日目に、及び第３回目の注射の７日後（５日目）、眼窩洞から収集した。２週間後、マウスを、約×１０４ＣＦＵのＧＢＳ株Ｃ３８８／９０（Ｉａ／ｃ）により攻撃した。ＧＢＳ攻撃接種物のサンプルを、血液寒天プレート上にプレートし、ＣＦＵを決定し、そして攻撃用量を確かめた。死亡を、１４日間、記録した。
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は、血清型ＩＩＩグループＢストレプトコッカス株ＮＣＳ９５４からのＢＶＨ−Ａ２遺伝子のＤＮＡ配列（配列番号１）を示す。
【図２】
図２は、そのリーダーペプチドをコードする領域を有さない、血清型ＩＩＩグループＢストレプトコッカス株ＮＣＳ９５４からのＢＶＨ−Ａ２遺伝子のＤＮＡ配列（配列番号２）を示す。
【図３】
図３は、血清型ＩＩＩグループＢストレプトコッカス株ＮＣＳ９５４からのＢＶＨ−Ａ２ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号３）を示す。
【図４】
図４は、３７個のアミノ酸残基のリーダーペプチドを有さない、血清型ＩＩＩグループＢストレプトコッカス株ＮＣＳ９５４からのＢＶＨ−Ａ２ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号４）を示す。
【図５】
図５は、血清型ＩＩＩグループＢストレプトコッカス株ＮＣＳ９５４からのＢＶＨ−Ａ３遺伝子のＤＮＡ配列（配列番号５）を示す。
【図６】
図６は、そのリーダーペプチドをコードする領域を有さない、血清型ＩＩＩグループＢストレプトコッカス株ＮＣＳ９５４からのＢＶＨ−Ａ３遺伝子のＤＮＡ配列（配列番号６）を示す。
【図７】
図７は、血清型ＩＩＩグループＢストレプトコッカス株ＮＣＳ９５４からのＢＶＨ−Ａ３ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号７）を示す。
【図８】
図８は、２個のアミノ酸残基のリーダーペプチドを有さない、血清型ＩＩＩグループＢストレプトコッカス株ＮＣＳ９５４からのＢＶＨ−Ａ３ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号８）を示す。
【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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