(57)【要約】リゾープス−デレマの濃縮リパーゼおよび付加的にアスペルギルス−メレウスのプロテアーゼならびにアスペルギルス−オリゼのアミラーゼを含有する新規の微生物酵素の混合物を記載する。さらに、微生物酵素を含有するこの混合物の医薬調製物を記載する。新規の医薬調製物は特に、哺乳動物およびヒトにおける消化不良、特に膵機能不全に起因する消化不良の治療および／または予防のために好適である。
2004524838.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
酵素混合物において、
ａ）リゾープス−デレマの濃縮リパーゼ、
ｂ）アスペルギルス−メレウスの中性プロテアーゼおよび
ｃ）アスペルギルス−オリゼのアミラーゼ
を含有することを特徴とする酵素混合物。
【請求項２】
リパーゼが少なくとも１８０００００ＦＩＰ−Ｕ／ｇの比活性を有する、請求項１記載の酵素混合物。
【請求項３】
プロテアーゼが少なくとも７５００ＦＩＰ−Ｕ／ｇの比活性を有する、請求項１記載の酵素混合物。
【請求項４】
プロテアーゼがｐＨ６〜ｐＨ８の至適ｐＨを有する、請求項１記載の酵素混合物。
【請求項５】
医薬調製物において、請求項１記載の酵素混合物ならびに通例の助剤および／または担体材料を含有することを特徴とする医薬調製物。
【請求項６】
粉末、ペレット、マイクロスフェア、カプセル、サッシェ、錠剤の形で、懸濁液もしくは溶液として存在する、請求項５記載の調製物。
【請求項７】
リパーゼ、プロテアーゼおよびアミラーゼから選択される酵素の少なくとも１種が単独でペレット化されて存在している、請求項５記載の調製物。
【請求項８】
リパーゼ、プロテアーゼおよびアミラーゼから選択される酵素の少なくとも１種が胃液耐性の層でフィルム被覆されている、請求項５から７までのいずれか１項記載の調製物。
【請求項９】
プロテアーゼおよび／またはリパーゼが単独でペレット化されて存在しており、かつ胃液耐性の層でフィルム被覆されている、請求項８記載の調製物。
【請求項１０】
酵素リパーゼ：アミラーゼ：プロテアーゼの比がそれぞれ５０〜５００ＦＩＰ−Ｕ：４０〜１２０ＦＩＰ−Ｕ：１ＦＩＰ−Ｕである、請求項５記載の調製物。
【請求項１１】
用量単位あたりリパーゼを少なくとも１００００ＦＩＰ−Ｕ、アミラーゼを８０００ＦＩＰ−Ｕおよびプロテアーゼを２００ＦＩＰ−Ｕ含有する、請求項５記載の調製物。
【請求項１２】
哺乳動物およびヒトの消化不良を治療および／または予防するための薬剤を製造するための請求項１記載の酵素混合物の使用。
【請求項１３】
消化不良が膵機能不全に起因する、請求項１２記載の使用。
【請求項１４】
哺乳動物およびヒトにおける消化不良を治療および／または予防するための薬剤を製造するための、少なくとも１８０００００ＦＩＰ−Ｕ／ｇの比活性を有するリゾープス−デレマの濃縮リパーゼの使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は微生物リパーゼ、プロテアーゼおよびアミラーゼの特定の組合せを含む新規の酵素混合物に関する。本発明はさらにこれらの微生物酵素の混合物を含有する医薬調製物に関する。この新規の医薬調製物は特に、哺乳動物およびヒトにおける消化不良を治療および／または予防するため、特に慢性膵外分泌機能不全に起因する消化不良治療および／または予防するために好適である。
【０００２】
哺乳動物およびヒトにおける消化不良は多くの場合、消化酵素の不足、特に内因性リパーゼの不足に起因するが、しかしまたプロテアーゼおよび／またはアミラーゼの不足も原因となる。このような消化酵素の不足の原因はしばしば、大部分の、および最も重要な内因性消化酵素を産生する器官である膵臓の機能低下（＝膵機能不全）にある。病的な膵機能不全が存在している場合、これは先天的であるか、もしくは後天的でありうる。後天的な慢性膵機能不全はたとえばアルコール中毒が原因である可能性もある。先天的な膵機能不全はたとえば膵線維症に起因する可能性もある。消化酵素の不足は結果として重症の栄養不良もしくは栄養不足につながり、これは高い二次疾患の傾向を伴いうる。
【０００３】
内因性消化酵素の不足の治療法として同じような働きのある外因性消化酵素もしくは消化酵素混合物による補充が有利であることが証明された。この目的のために今日では、ブタパンクレアチン（＝パンクレアチン）を含有する医薬調製物（＝処方）が最も頻繁に使用される。ブタの膵臓腺から得られる消化酵素混合物はその中に含有されている酵素および随伴物質（Ｂｅｇｌｅｉｔｓｔｏｆｆｅ）と、ヒトの膵臓分泌物中に含有されている含有物質との大きな類似性に基づいてほぼ理想的な方法でヒトにおける酵素補充療法のために使用することができる。パンクレアチンの成分のいくつか、たとえば膵臓リパーゼおよび膵臓アミラーゼは、ｐＨ５を下回る酸性のｐＨ値に対して敏感であるので、経口投与を想定したパンクレアチン調製物は胃の中で酸により誘発される変性に対する保護のために胃液耐性の保護層で被覆しなくてはならない。このような保護層は酸に敏感なパンクレアチン成分を不可逆的な分解から保護し、かつ胃を通過した後で初めて、比較的高い、無害なｐＨ値、たとえばｐＨ５．５〜ｐＨ８が支配的である上部の小腸領域でその内容物を放出する。上部の小腸領域、たとえば十二指腸は同時に、通常酵素により分解した栄養成分の主要量が身体に吸収される場所である。
【０００４】
パンクレアチンは天然産物であるので、品質的に均一で高価な形で提供するためには極めて高い技術コストが必要である。さらにパンクレアチンへの加工のために適切な原料の供給は変動がある。
【０００５】
従ってすでに、身体固有（ｋｏｅｒｐｅｒｅｉｇｅｎｅｎ）の消化酵素を補充するために、パンクレアチンと比較して改善された特性を有する、パンクレアチンと同様に好適な消化酵素混合物を提供する種々の試みがなされている。
【０００６】
ヒトにおける消化酵素の補充のために適切であるためには、全ての補充酵素が一連の要求を満足しなくてはならない（たとえばＢ． Ｇ． Ｐｅｓｃｈｋｅ， ”Ａｃｔｉｖｅ Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ ａｎｄ Ｇａｌｅｎｉｃ Ａｓｐｅｃｔｓ ｏｆ Ｅｎｚｙｍｅ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｓ”、Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ Ｅｎｚｙｍｅｓ ｉｎ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｄｉｓｅａｓｅ、Ｐ． Ｇ． Ｌａｎｋｉｓｃｈ編、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ Ｂｅｒｌｉｎ， Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、１９９１年、第５５〜６４頁を参照のこと；以下では「Ｐｅｓｃｈｋｅ」として引用する）。これらの補充酵素は特にペプシンならびにその他の身体固有のプロテアーゼ、たとえば膵臓プロテアーゼに対して安定化されているべきである。身体固有の胆汁酸塩の存在下でも補充酵素はその活性を維持すべきである。
【０００７】
通常は病気によって条件付けられて産生が低下した身体固有のリパーゼの補充は、ヒトにおける消化酵素のための補充療法の重要な構成要素である。しかし以前から、産生の低下したプロテアーゼとアミラーゼとを同時に補充することは該当する患者に付加的な有利な影響を与えることが公知である（たとえばＰｅｓｃｈｋｅ、第５５頁；ＷＯ９６／３８１７０号、第６頁）。従って哺乳動物およびヒトにおける消化不良を治療および／または予防するための医薬調製物は脂肪分解活性以外に、蛋白分解およびデンプン分解活性もまた十分に代用すべきである。この場合に重要なことは、医薬調製物中に含まれている種々の補充酵素（リパーゼ、プロテアーゼ、アミラーゼ）がこのために想定された作用部位（これは通常、上部小腸領域である）でその活性をそのつど十分な高さで発揮することができることである。生理学的条件下ではヒトの胃の中で栄養摂取の際もしくはその直後に特に多くの場合、空の胃内（約ｐＨ１〜２）よりも高いｐＨ値、たとえばｐＨ４〜５が存在し、かつ上部の小腸領域での生理学的なｐＨ値は通常、５．５〜８であるので、ヒトの場合、この約４〜８のｐＨ範囲で良好なｐＨ安定性および良好なｐＨ活性を有する消化酵素が消化酵素の補充のために好適であると考えられる。
【０００８】
欧州特許出願ＥＰ−Ａ０３８７９４５号からすでに、哺乳動物の膵臓抽出物以外にさらに微生物リパーゼを含有する調製物が公知である。しかしその中になお含有されている動物性パンクレアチンの割合に基づいてこのような調製物は、簡単に標準化すべき実験室法によって常に同じ品質および任意の量で製造することはできない。
【０００９】
国際特許出願ＷＯ９６／３８１７０号には、特にアスペルギルス−ニガーからの酸安定性のアミラーゼおよび場合によりリゾープス−ジュバニクスからの酸安定性のリパーゼを含有しており、かつ消化助剤として使用することができる調製物が記載されている。しかし身体固有の蛋白分解活性の補充に関してこの文献中では具体的な提案はされていない。その代わりに単に、リパーゼおよびアミラーゼ以外のヒトの膵臓分泌物のその他の全ての成分をブタパンクレアチンにより交換する可能性が存在することが示唆されているのみである。このことはＷＯ９６／３８１７０号中に記載されている調製物が、身体固有の消化酵素の完全な補充のためのものではないか、または適切ではないことを示唆している。
【００１０】
さらにＳ． Ｓｃｈｅｌｅｒの論文：”Ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｕｎｉｔ−Ｚｕｂｅｒｅｉｔｕｎｇ ａｕｓ Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ−Ｅｎｚｙｍｅｎ ｈｏｈｅｒ Ａｋｔｉｖｉｔａｅｔ ｍｉｔ ｏｐｔｉｍｉｅｒｔｅｒ ｄｉｇｅｓｔｉｖｅｒ Ｐｏｔｅｎｚ”、Ｅｒｌａｎｇｅｎ−Ｎｕｅｒｕｎｂｅｒｇ大学（１９９５年）では、ほぼ製剤的な観点で、市販されている酵素であるリゾープス−オリゼのリパーゼ、アスペルギルス−オリゼのプロテアーゼおよびアスペルギルス−オリゼのアミラーゼの組合せが試験されている。しかしたとえばここで使用されているリパーゼは身体固有の膵臓プロテアーゼに対して十分な安定性を有していない。
【００１１】
前記の課題から、哺乳動物およびヒトの、身体固有の消化酵素を完全に補充するために想定されている医薬調製物は、身体固有の条件に慎重に適合させた補充酵素もしくは補充酵素の混合物を含有していなくてはならないことが明らかになる。
【００１２】
従って本発明の課題は、哺乳動物およびヒトにおける消化不良を治療および／または予防するために、身体固有の脂肪分解、蛋白質分解およびデンプン分解酵素活性を補充することができ、かつその中に含有されている補充酵素の高い比活性において比較的わずかな投与量が可能である、消化酵素の改善された混合物ならびにこのような混合物を含有する医薬調製物を提供することである。同時に消化酵素混合物中に含有されている補充酵素（リパーゼ、プロテアーゼ、アミラーゼ）は、単独でも、相互の混合物としても、ヒトにおける治療のために想定された消化酵素に対して課される全ての要求をできる限り良好に満足すべきである。たとえば補充酵素は、そのつどの生理学的な作用部位で通常支配的なｐＨ範囲で、良好なｐＨ安定性および良好なｐＨ活性を有しているべきである。さらに補充酵素は身体固有の作用物質、たとえば胆汁塩または身体固有のプロテアーゼ、たとえばペプシンもしくは膵臓プロテアーゼと良好に相容性であるべきである。その他の課題は本発明による目的のために、プロセス経過および生成物量に関して簡単に標準化することができる製造法により常に一定の品質および任意の量で得ることができる補充酵素を選択することである。
【００１３】
前記課題は
ａ）リゾープス−デレマの濃縮リパーゼ、
ｂ）アスペルギルス−メレウスの中性プロテアーゼおよび
ｃ）アスペルギルス−オリゼのアミラーゼ
を含有する新規の微生物酵素の混合物を提供することにより解決される。本発明による微生物酵素の混合物は通例の助剤および／または担体材料と共に通常の医薬調製物中に含有されていてもよい。これらの医薬調製物は作用物質としてもっぱら特定の糸状菌の本発明による微生物酵素の混合物を含有しており、かつ哺乳動物およびヒトの身体固有の消化酵素の完全補充のために適切である。本発明による微生物酵素の混合物中に含有されている個々の酵素（リパーゼ、プロテアーゼ、アミラーゼ）に共通していることは、消化官の生理学的ないし病態生理学的ｐＨ範囲（約ｐＨ４〜８）および特に栄養摂取の際もしくはその直後に支配的な条件下で良好なｐＨ安定性および良好なｐＨ活性を有していることである。該医薬調製物はさらに、良好な効果および良好な相容性により優れている。
【００１４】
リゾープス−デレマの濃縮リパーゼは、少なくとも１８０００００ＦＩＰ−Ｕ／ｇ（＝ベルギーの国際薬学連盟（Ｆｅｄｅｒａｔｉｏｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃ）の規定により決定された、国際的に標準化された酵素活性単位）の比活性を有している。菌株リゾープス−デレマは菌株リゾープス−オリゼの亜種であると見なされている。菌株リゾープス−デレマの糸状菌のリパーゼは自体公知であり、かつたとえば相応する菌の培養ブロスから自体公知の方法により得ることができる。糸状菌を発酵させるため、およびこれらの糸状菌から形成された酵素産物を単離するための方法は、たとえばバイオテクノロジーの関連テキストから（たとえばＨ． Ｄｉｅｋｍａｎｎ， Ｈ． Ｍｅｔｚ， ”Ｇｒｕｎｄｌａｇｅ ｕｎｄ Ｐｒａｘｉｓ ｄｅｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅ”、Ｇｕｓｔａｖ Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｖｅｒｌａｇ Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ １９９１を参照のこと）、または関連する専門書から当業者に公知である。引き続き、単離したリパーゼからたとえば自体公知の方法で随伴物質を除去し、かつ本発明により所望される比活性まで富化するか、もしくは濃縮することができる。有利にはリパーゼ（ＥＣ番号３．１．１．３）は、日本の天野エンザイム株式会社（Ａｍａｎｏ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）のリゾープス−デレマの”Ｌｉｐａｓｅ Ｄ Ａｍａｎｏ ２０００ （Ｒ）（Ｌｉｐａｓｅ Ｄ２ （Ｒ）とも呼ばれる）を使用することができる。これらのリパーゼは、天然の膵臓リパーゼと同様に、脂肪酸グリセリドに対して１，３−位特異性を有する。比活性はバッチに依存して約１８０００００ＦＩＰ−Ｕ／ｇから約２２５００００ＦＩＰ−Ｕ／ｇの間である。”Ｌｉｐａｓｅ Ｄ Ａｍａｎｏ ２０００ （Ｒ）”は、パンクレアチンからの膵臓プロテアーゼに対する高い安定性により優れている。たとえば実験室試験において”Ｌｉｐａｓｅ Ｄ Ａｍａｎｏ ２０００ （Ｒ）”の脂肪分解活性はｐＨ６〜８のｐＨ範囲でパンクレアチンからの膵臓プロテアーゼを２時間作用させた後で、なお初期活性の５５％である。”Ｌｉｐａｓｅ Ｄ Ａｍａｎｏ ２０００ （Ｒ）”のｐＨ安定性は、３７℃、１２０分以上の時間でｐＨ４〜８のｐＨ範囲での実験室試験において初期活性の少なくとも７０％である。
【００１５】
リゾープス−デレマの濃縮リパーゼにとって特徴的なパラメータとしてたとえばそのｐＨプロファイルが適切である。従って”Ｌｉｐａｓｅ Ｄ Ａｍａｎｏ ２０００ （Ｒ）”のｐＨプロファイルは比活性としてｐＨ値に依存して決定した。この場合、個々のｐＨ値での比活性は微生物リパーゼの活性を決定するためのＦＩＰ法の変更により測定された。さらにｐＨプロファイルは胆汁酸塩の可変的な濃度の存在下でも決定された。
【００１６】
ａ）オリーブ油エマルションの製造
アラビアゴム      ４４ｇ、
オリーブ油      １１５ｇおよび
水              ４００ｍｌ
を電動ミキサー中で１５分間均質化する。
【００１７】
ｂ）異なった濃度の胆汁−ディスパート（Ｄｉｓｐｅｒｔ）溶液の製造
胆汁不含：                  水１２０ｍｌ、
胆汁  ０．５ミリモル／ｌ：  水１２０ｍｌ＋ディスパート溶液（ＦＩＰ標準）２００ｍｇ、
胆汁  ５ミリモル／ｌ：      水１２０ｍｌ＋ディスパート溶液２ｇ、
胆汁１０ミリモル／ｌ：      水１２０ｍｌ＋ディスパート溶液４ｇ。
【００１８】
ｃ）基質エマルションの製造
オリーブ油エマルション（ｖｉｄｅ ｓｕｐｒａ）                      ４８０ｍｌ
塩化カルシウム溶液（ＣａＣｌ２×２Ｈ２Ｏ  ２８．３ｇ／ｌ水）１６０ｍｌおよび
所望の濃度の胆汁ディスパート溶液（ｖｉｄｅ ｓｕｐｒａ）                      １２０ｍｌ
を混合した。
【００１９】
ｄ）酵素溶液の製造
”Ｌｉｐａｓｅ Ｄ Ａｍａｎｏ ２０００ （Ｒ）”（２２３００００ＦＩＰ−Ｕ／ｇの比活性を測定）５０ｍｇを１％濃度の塩化ナトリウム溶液１００ｍｌ中に溶解した。このストック溶液（Ｓｔａｍｍｌｏｅｓｕｎｇ）から１ｍｌを採取し、かつ純水を用いて２００ｍｌに希釈した。そのつど、希釈したストック溶液の１ｍｌ（５５７５ＦＩＰ−Ｕに相応）を次の測定の際に使用する。
【００２０】
特定の胆汁酸塩濃度がその中に存在する前記の基質エマルションからそのつど１９ｍｌの試料を３７℃にサーモスタット処理する。次いで基質エマルションの種々の試料を０．１ＭのＮａＯＨもしくは１ＭのＨＣｌの添加により３、４、５、６、７および８のｐＨ値に調整する。こうして準備した基質エマルションの試料に、引き続きそのつど１ｍｌの前記の酵素溶液を添加する（注釈：最適な滴定速度を決定するために、酵素溶液中に理想的に含有されているリパーゼの適量は基本的に自体公知の方法により希釈列により確認することができる）。添加を行った後、０．１ＭのＮａＯＨを用いてｐＨ−スタット−滴定を１０分間実施する。その後、遊離した脂肪酸を完全に解離するために、３０秒以内にｐＨ９まで終点滴定を実施する。合計して必要とされる０．１ＭのＮａＯＨの消費量をリパーゼの活性単位Ｕに換算する：この場合、リパーゼの活性単位Ｕは毎分１μモルの消費量に相応する。確認されたリパーゼの活性単位はそのつど使用される乾燥酵素のｇで表される量に関連させることによりＵ／ｍｇの単位に換算することができる。ｐＨプロファイルを調整するためにＵ／ｍｇの単位はそれぞれの異なったｐＨ値およびそれぞれの試験した胆汁酸塩濃度に関して第１表にまとめてあり、かつ表の値を第１図ではグラフにプロットする。
【００２１】
前記のｐＨプロファイルから”Ｌｉｐａｓｅ Ｄ Ａｍａｎｏ ２０００ （Ｒ）”に関して、０．５ミリモル／ｌのＦＩＰ−標準胆汁塩濃度でのリパーゼ活性の最大値として至適ｐＨはｐＨ約７に決定することができる。
【００２２】
アスペルギルス−メレウスの中性プロテアーゼは少なくとも７５００ＦＩＰ−Ｕ／ｇの比活性を有する。その至適ｐＨはｐＨ６〜ｐＨ８である。菌株アスペルギルス−メレウスの糸状菌の中性プロテアーゼは自体公知であり、かつたとえば自体公知の方法により相応する菌類の培養ブロスから得ることができる。糸状菌の発酵法およびこれらの糸状菌から形成される酵素産物の単離法は、たとえばバイオテクノロジーの関連テキストから（たとえばＨ． Ｄｉｅｋｍａｎｎ， Ｈ． Ｍｅｔｚ， ”Ｇｒｕｎｄｌａｇｅｎ ｕｎｄ Ｐｒａｘｉｓ ｄｅｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅ”、Ｇｕｓｔａｖ Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｖｅｒｌａｇ Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ １９９１を参照のこと）、または関連する専門書から当業者に公知である。引き続き、単離したプロテアーゼから所望の場合には自体公知の方法で随伴物質を除去し、かつ本発明により所望される比活性まで富化するか、もしくは濃縮することができる。
【００２３】
有利には中性プロテアーゼは、日本の天野エンザイム社のアスペルギルス−メレウスからの”Ｐｒｏｚｙｍｅ （Ｒ）”（場合により”アルカリ性蛋白分解酵素”とも呼ばれる。ＥＣ番号３．４．２１．６３）を使用することができる。この微生物プロテアーゼは多糖類の少なくとも３つの１，４−α−Ｄ−グルコース単位を有する１，４−α−Ｄ−グルコシド結合を加水分解し、比活性約７８００ＦＩＰ−Ｕ／ｇを有する。このプロテアーゼのｐＨ安定性はｐｈ５〜８のｐＨ範囲および３７℃で実験室試験において１２０分以上で初期活性の少なくとも６０％である。
【００２４】
アスペルギルス−メレウスの中性プロテアーゼに関する特徴的なパラメータとしてたとえばそのｐＨプロファイルが適切である。従ってプロテアーゼ”Ｐｒｏｚｙｍｅ ６ （Ｒ）”のｐＨプロファイルは比活性としてｐＨ値に依存して測定された。
【００２５】
このために、膵臓プロテアーゼの活性を測定するためのＦＩＰ法の規定に相応して種々の基質溶液を製造した。ＦＩＰ規定の変更において基質溶液として４％濃度のヘモグロビン溶液をカゼインの代わりに使用する。さらにＦＩＰ規定の変更において種々の基質溶液中で相応する量の１ＭのＮａＯＨもしくは１ＭのＨＣｌを添加することにより、そのつど２、３、４、５、６、７および８の種々のｐＨ値を調整する。基質溶液に”Ｐｒｏｚｙｍｅ ６ （Ｒ）”の試料を添加する。
【００２６】
引き続き異なったｐＨ値の基質溶液中で”Ｐｒｏｚｙｍｅ ６ （Ｒ）”試料のプロテアーゼ活性を前記のＦＩＰの規定に従って決定する。個々の試料中で検出される酵素活性をこの測定列中で検出される最大値（＝１００％）へと標準化する。”Ｐｒｏｚｙｍｅ ６ （Ｒ）”に関して検出されるｐＨプロファイルのための測定値は第２表に記載されており、かつ第２図でグラフにプロットされている。したがって”Ｐｒｏｚｙｍｅ ６ （Ｒ）”は生理学的なｐＨ範囲で最適に作用する。
【００２７】
前記のｐＨプロファイルから”Ｐｒｏｚｙｍｅ ６ （Ｒ）”に関してプロテアーゼ活性の最大値として至適ｐＨはｐＨ約８に決定することができる。
【００２８】
本発明により使用されるアスペルギルス−オリゼのアミラーゼ（ＥＣ番号３．２１．１．１）はα−アミラーゼであり、かつ少なくとも４００００ＦＩＰ−Ｕ／ｇ（ｐＨ５．８で測定）の比活性を有する。至適ｐＨはｐＨ４〜６．５のｐＨ範囲である。菌株アスペルギルス−オリゼの糸状菌のアミラーゼは自体公知であり、かつたとえば自体公知の方法により相応する菌の培養ブロスから得られる。糸状菌の発酵のため、およびこの糸状菌から形成される酵素生成物の単離の方法は、、たとえばバイオテクノロジーの関連テキストから（たとえばＨ． Ｄｉｅｋｍａｎｎ， Ｈ． Ｍｅｔｚ， ”Ｇｒｕｎｄｌａｇｅｎ ｕｎｄ Ｐｒａｘｉｓ ｄｅｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅ”、Ｇｕｓｔａｖ Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｖｅｒｌａｇ Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ １９９１を参照のこと）、または関連する専門書から当業者に公知である。引き続き単離したアミラーゼから所望の場合には自体公知の方法で随伴物質を除去し、かつ本発明により所望される比活性まで富化するか、もしくは濃縮することができる。有利にはアミラーゼは天野エンザイム社（日本）のアスペルギルス−メレウスの”Ａｍｙｌａｓｅ Ａ１ （Ｒ）”およびＥｘｔｒａｋｔ−Ｃｈｅｍｉｅ社（ドイツ）の”Ａｍｙｌａｓｅ ＥＣ （Ｒ）”を使用することができる。”Ａｍｙｌａｓｅ Ａ１ （Ｒ）”が有利である。
【００２９】
微生物アミラーゼである”Ａｍｙｌａｓｅ Ａ１ （Ｒ）”は約５２０００ＦＩＰ−Ｕ／ｇ（ｐＨ５．８で測定）の比活性を有する。”Ａｍｙｌａｓｅ Ａ１ （Ｒ）”のｐＨ安定性はｐＨ５〜８のｐＨ範囲で３７℃、１２０分以上での実験室試験で初期活性（Ａｎｆａｎｇｓａｋｔｉｖｉｔａｅｔ）の少なくとも８５％である。さらなる実験室試験でパンクレアチンからの膵臓プロテアーゼ（ｐＨ６〜８のｐＨ範囲で測定）、”Ｐｒｏｚｙｍｅ ６ （Ｒ）”（ｐＨ４〜８のｐＨ範囲で測定）ならびにペプシンと比較して、”Ａｍｙｌａｓｅ Ａ１ （Ｒ）”の良好な安定性が確認された。
【００３０】
アスペルギルス−オリゼのアミラーゼに関する特徴的なパラメータとしてたとえばそのｐＨプロファイルが適切である。従って”Ａｍｙｌａｓｅ Ａ１ （Ｒ）”のｐＨプロファイルを比活性としてｐＨ値に依存して測定した。
【００３１】
微生物アミラーゼの活性を測定するためのＦＩＰ法の規定に相応して種々の基質溶液を製造する。ＦＩＰ規定の変更において種々の基質溶液中で相応する量の５ＭのＮａＯＨもしくは５ＭのＨＣｌをＦＩＰ法により使用されるアセテート緩衝液に予め添加することにより、そのつど３．２５；４；５；６；６．８および７．４の種々のｐＨ値を調整する。基質溶液に”Ａｍｙｌａｓｅ Ａ１ （Ｒ）”の試料を添加する。
【００３２】
引き続き異なったｐＨ値の基質溶液中で”Ａｍｙｌａｓｅ Ａ１ （Ｒ）”試料のアミラーゼ活性を前記のＦＩＰの規定に従って決定する。個々の試料中で検出される酵素活性をこの測定列中で検出される最大値（＝１００％）へと標準化する。”Ａｍｙｌａｓｅ Ａ１ （Ｒ）”に関して検出されるｐＨプロファイルのための測定は第３表に記載されており、かつ第３図でグラフにプロットされている。
【００３３】
前記のｐＨプロファイルから”Ａｍｙｌａｓｅ Ａ１ （Ｒ）”に関してアミラーゼ活性の最大値としてｐＨ約５までの至適ｐＨを決定することができる。
【００３４】
微生物アミラーゼである”Ａｍｙｌａｓｅ ＥＣ （Ｒ）”は、約４２５００ＦＩＰ−Ｕ／ｇ（ｐＨ５．８で測定）の比活性を有する。さらになお少量のβ−アミラーゼが検出可能である。至適ｐＨ（前記の”Ａｍｙｌａｓｅ Ａ１ （Ｒ）”のために記載した方法により測定）はｐＨ約５である。ｐＨ６〜８のｐＨ範囲で３７℃、１２０分以上で実験室試験での”Ａｍｙｌａｓｅ ＥＣ （Ｒ）”のｐＨ安定性は初期活性の少なくとも８０％である。さらなる実験室試験で、パンクレアチンからの膵臓プロテアーゼ（ｐＨ６〜８のｐＨ範囲で測定）、”Ｐｒｏｚｙｍｅ ６ （Ｒ）”（ｐＨ４〜８のｐＨ範囲で測定）ならびにペプシンと比較して、”Ａｍｙｌａｓｅ ＥＣ （Ｒ）”の良好な安定性が確認された。
【００３５】
本発明による医薬調製物のために有利には固体の経口投与可能な投与形、たとえば粉末、ペレットまたはマイクロスフェアを選択することができる、これらを所望の場合にはカプセルまたはサッシェに充填するか、または圧縮成形して錠剤にすることができる。液状の医薬調製物、たとえば懸濁剤または液剤もまた場合により考えられる。この場合、個々の酵素リパーゼ、プロテアーゼおよびアミラーゼは一緒に、または空間的に相互に分離して存在していてもよい。個々の酵素が相互に空間的に分離されて存在していない場合には、乾燥した加工および／または貯蔵が有利である。医薬調製物はさらに通例の助剤および／または担体材料を含有していてもよい。助剤および／または担体材料としてたとえば微結晶性セルロース、ポリエチレングリコール、たとえばＰＥＧ４０００または低級アルコール、特に直鎖状もしくは分枝鎖状のＣ１〜Ｃ４−アルコール、たとえば２−プロパノールならびに水が考えられる。
【００３６】
本発明により使用される微生物補充酵素は広いｐＨ範囲にわたる良好な安定性により優れており、かつ従ってそれ以上の処理（たとえばフィルム被覆）を行わなくても直接、経口投与すべき医薬調製物の製造のために使用することができる。この目的のために個々の補充酵素（リパーゼ、プロテアーゼおよびアミラーゼ）は一緒に、または空間的に相互に分離してペレット化することができる。所望の場合には個々の補充酵素を自体公知の適切な胃液耐性の層によりフィルム被覆することもできる。全ての補充酵素を胃液耐性にフィルム被覆すべきではない場合、補充酵素のそれぞれの種類を相互に別々にペレット化し、かつ１種類の酵素のペレットをそのつど別々にフィルム被覆することが有利である。プロテアーゼおよび／またはリパーゼをそのつど単独でペレット化し、かつ胃液耐性にフィルム被覆することが特に有利でありうる。所望の場合には酵素混合物中に存在する酵素の３種類全てを一緒に胃液耐性にフィルム被覆するか、または１種類の酵素をフィルム被覆せず、２種類の酵素を胃液耐性にフィルム被覆することができる。
【００３７】
本発明により使用される補充酵素の高い比活性は、比較的小さいにも関わらず、高い効果をもたらす投与形を可能にする。たとえば１つの実施態様では医薬調製物は、経口投与可能な、サイズ０のカプセルとして存在していてもよい。このような投与形中にリパーゼ約１００００〜５００００ＦＩＰ−Ｕ、アミラーゼ８０００ＦＩＰ−Ｕおよびプロテアーゼ２００ＦＩＰ−Ｕが存在していてもよい。有利には補充酵素リパーゼ、アミラーゼおよびプロテアーゼは約５０〜５００ＦＩＰ−Ｕ：４０〜１２０ＦＩＰ−Ｕ：１ＦＩＰ−Ｕの比で存在する。
【００３８】
本発明による医薬調製物の、哺乳動物およびヒトにおける消化不良の治療および／または予防のための適性を、以下に記載する、脂肪の消化を測定するためのインビトロ試験モデルにより証明することができる。
【００３９】
１．ブタ用飼料試験栄養における脂肪の消化の検出
その他の栄養成分も含有するブタ用飼料の試験栄養中での脂肪の分解に対する、本発明により使用可能な微生物酵素の混合物の影響を調査する。この場合、塩化カルシウム溶液の添加は遊離する脂肪酸をカルシウムけん化物として沈澱させることに役立つ。
【００４０】
Ａ）ブタ用飼料の試験栄養の製造
以下に記載する成分：
”Ａｌｔｒｏｍｉｎ ９０２１ （Ｒ）”−完成栄養（Ａｌｔｒｏｍｉｎ ＧｍｂＨ社、ドイツ、脂肪含有率約２〜３％、実質的に挽き割り小麦からなる）                ６４．８ｇ
”Ｓｏｊａｍｉｎ （Ｒ）”タンパク質混合物（Ｌｕｋａｓ Ｍｅｙｅｒ社、ドイツ） ３．８５ｇ
アラビアゴム（Ｍｅｒｃｋ ＫＧａＡ社、ドイツ）                    ２４．５ｇ
大豆油（Ｒｏｔｈ社、ドイツ；主な脂肪成分；平均分子量＝９３２ｇ／モル）
２６．７ｇ
を純水２６５ｍｌと混合し、かつ引き続き家庭用ミキサー中で１５分間均質化した。得られるホモジネートに体積が４５０ｍｌになるまで純水を満たした。
【００４１】
Ｂ）胆汁−ディスパート溶液の製造
胆汁−ディスパート溶液１．３５ｇ（ＦＩＰ−標準；リパーゼ活性化混合物）を純水５０ｍｌ中に溶解した。
【００４２】
Ｃ）酵素溶液の製造
１．リパーゼ溶液
天野エンザイム社（日本）の”Ｌｉｐａｓｅ Ｄ Ａｍａｎｏ ２０００ （Ｒ）”（ｐＨ７での比活性は１８８８１３７ＦＩＰ−Ｕ／ｇが測定された）６３．１ｍｇを純水１０ｍｌ中に溶解した。このストック溶液から次の測定のために２５０μｌを使用した。
【００４３】
２．プロテアーゼ溶液
天野エンザイム社（日本）の”Ｐｒｏｚｙｍｅ ６ （Ｒ）”（ｐＨ７．５での比活性は７８１２ＦＩＰ−Ｕ／ｇが測定された）３１９ｍｇを純水１０ｍｌ中に溶解した。このストック溶液から次の測定のために２５０μｌを使用した。
【００４４】
３．アミラーゼ溶液
Ｅｘｔｒａｋｔ−Ｃｈｅｍｉｅ社（ドイツ）の”Ａｍｙｌａｓｅ ＥＣ （Ｒ）”（ｐＨ５．８での比活性は１３４６６ＦＩＰ−Ｕ／ｇが測定された）５９５ｍｇを純水１０ｍｌ中に溶解した。このストック溶液から次の測定のために１０００μｌを使用した。
【００４５】
Ｄ）測定溶液の準備
前記のブタ用飼料の試験栄養１５．５ｍｌに、前記の胆汁ディスパート溶液２ｍｌならびに前記の３つの酵素溶液Ｃ）１．〜Ｃ）３．を順次添加し、かつ純水２９ｍｌで満たした。
【００４６】
Ｅ）測定の実施
準備した測定溶液を３７℃に温度調節し、かつ終点滴定により１ＭのＮａＯＨを用いてｐＨ７に調整した。３つの酵素溶液を添加した直後に、２０分間のｐＨスタット滴定を開始し、かつ１ＭのＮａＯＨの消費を１０秒ごとに記録した。滴定の間、４Ｍの塩化カルシウム溶液１ｍｌを５０μｌの段階で、最大の反応速度が達成されるように手動で計量供給した。
【００４７】
Ｆ）結果
ブタ用飼料−試験栄養中に含有されている脂肪（＝脂肪酸トリグリセリド）は、２０分間の反応時間後に約６７％まで加水分解されていた。これは生理学的な加水分解産物２−脂肪酸モノグリセリドに対して１００％を越える分解に相応する（１００％を越える値は、２−脂肪酸モノグリセリドの１−もしくは３−脂肪酸モノグリセリドへの、およびその後の脂肪分解による分解への自発貯蔵（ｓｐｏｎｔａｎｅ Ｕｍｌａｇｅｒｕｎｇ）に起因する）。
【００４８】
本発明により使用可能な酵素を含有する消化酵素混合物の良好な脂肪の消化能はインビトロでもオリーブ油の試験栄養により証明することができる。
【００４９】
哺乳動物およびヒトにおける消化不良、特に膵機能不全に起因する消化不良の治療および／または予防のために本発明による医薬調製物の特に良好な適性は、インビトロの動物モデルに基づいて、たとえば膵機能不全のブタを用いて証明することもできる：
２．インビトロでの膵機能不全によるブタにおける本発明による酵素混合物の効果
９匹のエレガード（Ｅｌｌｅｇａａｒｄ）系統のメスのゲッティンゲン成ミニブタ（体重３３〜４０ｋｇ）を用いて試験を実施し、その際、該ミニブタには回盲部シャント（Ｕｍｌｅｉｔｕｎｇｓｋａｎｕｅｌｅ）を使用した。シャントは試験動物のキームスの回収のために使用した。これらの動物の６匹はさらに膵路を結紮した（＝試験動物）。残りの３匹の動物は無損傷の膵路を維持しており、かつ試験結果のコントロールに使用した（＝対照動物）。試験は合計して異なった３つの投与量の本発明による酵素混合物を用いて実施した。以下の酵素用量を投与した：
2004524838.tif 000003
投与量に応じて全ての動物に２２日間にわたって毎日２回、ミニブタ用の飼育飼料（Ａｌｔｒｏｍｉｎ （Ｒ）、Ｌｕｋａｓ Ｍｅｙｅｒ社；実質的に二回挽き割りにした小麦）１７０ｇ、タンパク質コンセントレート（Ｓｏｊａｍｉｎ ９０ （Ｒ）、Ｌｕｋａｓ Ｍｅｙｅｒ社）１０ｇ、大豆油（Ｒｏｔｈ社）７０ｇおよびＣｒ２Ｏ３（非吸収性のマーカーとして、ｒｏｔｈ社）０．６２５ｇと、水１ｌとを混合して含有している脂肪分の多い試験飼料をそのつど２５０ｇ与えた。試験動物のみの飼料に付加的に本発明による酵素混合物の個々の酵素を相応する量で食餌の少し前に混合した。さらに試験動物の５匹で、その試験飼料が酵素混合物を添加されていない試験列を実施した。この試験列で得られた結果を以下では「ゼロ値」として記載する。そのつど試験期間の２０日〜２２日目に試験動物から１２時間にわたってシャントからキームスを採取し、かつ該キームスの粗脂肪、粗蛋白およびデンプンの含有率を調査した。食餌試験およびその評価は自体公知の方法で実施した（Ｐ． Ｃ． Ｇｒｅｇｏｒｙ、Ｒ． Ｔａｂｅｌｉｎｇ、Ｊ． Ｋａｍｐｈｕｅｓ、”Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｐａｎｃｒｅａｓ ｉｎ Ｇｒｏｗｉｎｇ Ａｎｉｍａｌｓ”；Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ ｉｎ Ａｎｉｍａｌ ａｎｄ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ２８（１９９９）、第３８１〜３９４頁、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、アムステルダム；Ｓ． Ｇ． ＰｉｅｒｚｙｎｏｗｓｋｉおよびＲ． Ｚａｂｉｅｌｓｋｉ編）。
【００５０】
前記のインビトロ試験において確認された、試験動物における粗脂肪、粗蛋白およびデンプンの前盲腸の見かけの消化率を以下の表Ａにそのつど本来与えられた脂肪、タンパク質もしくはデンプンの絶対量に対するパーセント値で記載する。「前盲腸の消化率」として記載される値は「前盲腸の見かけの消化率」に相応し、これは実際の前盲腸の消化率とは異なって、試験物質の内因性の成分、たとえば内因性タンパク質をなおわずかな量で含有している可能性がある。前盲腸の消化率は試験動物のキームスからマーカー法により以下に記載する式に基づいて決定することができる：
【００５１】
【数１】
2004524838.tif 000004
【００５２】
表Ａ：
試験動物の粗脂肪、粗蛋白およびデンプンの前盲腸消化率のインビボ測定
【００５３】
【表１】
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【００５４】
全ての値は標準偏差を有する平均値として記載されている。
【００５５】
記載の試験結果から、本発明による酵素混合物の投与により膵機能不全のブタにおいて脂肪、タンパク質および炭水化物の消化率の著しい改善が達成され、かつこの改善は投与量に依存していることが明らかである。
【００５６】
例Ｉ：
”Ｌｉｐａｓｅ Ｄ Ａｍａｎｏ ２０００ （Ｒ）”４００ｇ、ＰＥＧ  ４０００  ４００ｇおよび”Ｖｉｖａｐｕｒ （Ｒ）”（＝微結晶性セルロース）１２００ｇから、少量の２−プロパノールおよび水の添加下に自体公知の方法で直径０．７〜１．４ｍｍのペレットを製造した。
【００５７】
”Ａｍｙｌａｓｅ Ａ１ （Ｒ）”７０００ｇ、ＰＥＧ  ４０００  ２０００ｇおよび”Ｖｉｖａｐｕｒ （Ｒ）”（＝微結晶性セルロース）１０００ｇから、少量の２−プロパノールおよび水の添加下に自体公知の方法で直径０．７〜１．７ｍｍのペレットを製造した。
【００５８】
”Ｐｒｏｚｙｍｅ ６ （Ｒ）”１７５０ｇ、ＰＥＧ  ４０００  ５００ｇおよび”Ｖｉｖａｐｕｒ （Ｒ）”２５０ｇから、少量の２−プロパノールおよび水の添加下に自体公知の方法で直径０．７〜１．７ｍｍのペレットを製造した。
【００５９】
前記で製造したペレットからそのつどリパーゼペレット３２ｍｇ、アミラーゼペレット３２５ｍｇおよびプロテアーゼペレット４０ｍｇをサイズ０のゼラチンカプセルに充填した。１カプセルあたり、次の活性を有する投与形が得られた：
リパーゼ      約１００００ＦＩＰ−Ｕ、
プロテアーゼ  約２００ＦＩＰ−Ｕ、
アミラーゼ    約８０００ＦＩＰ−Ｕ。
【図面の簡単な説明】
【図１】
Ｌｉｐａｓｅ Ｄ Ａｍａｎｏ ２０００ （Ｒ）のｐＨプロファイルの表およびグラフを示す。
【図２】
Ｐｒｏｚｙｍｅ ６ （Ｒ）のｐＨプロファイルの表およびグラフを示す。
【図３】
Ａｍｙｌａｓｅ Ａ１ （Ｒ）のｐＨプロファイルの表およびグラフを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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