(57)【要約】外側壁と、２つの端部壁と、動的液体培地の入口／出口とからなる対称軸線を有するケーシングによって区画された動物細胞の体外培養用培養室。
2004504023.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（ａ）〜（ｄ）を有することを特徴とする、外部側壁と、２つの端部壁と、動的液体培地の入口および出口とから成る対称軸線を有するケーシングによって区画された、動物細胞の体外培養用培養室：
（ａ）　上記対称軸に対して直角に配置された互いにカットオフ限界値が異なる少なくとも２枚の平らな濾過膜（Ｍ１、Ｍ３）、
（ｂ）　培養状態の細胞を接着させるための上記濾膜（Ｍ１、Ｍ３）の間の生物適合性のある培養物支持手段、
（ｃ）　動的液体培地の分配手段を構成する２つの端部壁、
（ｄ）　細胞培養室へ培養物を供給し且つ培養済みの細胞株と、培養で生じた廃棄物と、過剰な栄養源とを選択的に抜き出すための動的液体培地の３つの入口／出口の対（Ｆ１、Ｆ２、Ｆ３）であって、その２つの入口／出口の対の各々は一つの端部壁と一枚の膜との間に接続され、残りの第３の入口／出口対は上記の２枚の平らな濾過膜の間に接続されている入口／出口の対。
【請求項２】
一方の平らな濾過膜のカットオフ限界値が０．０１μｍ〜７μｍの間で、他方の平らな濾過膜のカットオフ限界値が１５キロダルトン（ＫＤａ）以下である請求項１に記載の培養室。
【請求項３】
一方の平らな濾過膜のカットオフ限界値が０．２μｍ〜４μｍの間で、他方の平らな濾過膜のカットオフ限界値が１０〜１２ＫＤａの間にある請求項１または２に記載の培養室。
【請求項４】
カットオフ限界値が異なる２枚の濾過膜がお互いに最大で２５ｍｍ離れており、好ましくは０．２〜２０ｍｍだけ離れている請求項１〜３のいずれか一項に記載の培養室。
【請求項５】
培養状態の細胞を接着させるための生物適合性のある培養物支持手段が生物適合性のあるマイクロサポート（ｍａｃｒｏｓｕｐｐｏｒｔｓ）のベッドである請求項１〜４のいずれか一項に記載の培養室。
【請求項６】
マイクロサポートのベッドの最大厚さが互いに異なるカットオフ限界値を有する２枚の濾過膜の間の距離に等しい請求項５に記載の培養室。
【請求項７】
濾過膜の間に存在するマイクロサポートが円柱形、多面形または球形を有する請求項５または６に記載の培養室。
【請求項８】
マイクロサポートを構成する材料が生物適合性のある無機材料、金属材料およびポリマー材料から成る群の中から選択される請求項５〜７のいずれか一項に記載の培養室。
【請求項９】
マイクロサポートを構成する材料が珊瑚、チタンおよびその合金、ポリアミドおよびフルオロポリマーから成る群の中から選択される請求項８に記載の培養室。
【請求項１０】
培養状態の細胞を接着させるための生物適合性のある培養物支持手段が、互いに異なるカットオフ限界値を有する２枚の濾過膜（Ｍ１、Ｍ３）の間に配置された濾過膜Ｍ２である請求項１〜４のいずれか一項に記載の培養室。
【請求項１１】
濾過膜Ｍ２がカットオフ限界値の最大値が１５Ｋｄａである濾過膜の上に支持されている請求項１０に記載の培養室。
【請求項１２】
濾過膜Ｍ２が細胞の移入または共培養によって変性されている請求項１０または１１に記載の培養室。
【請求項１３】
濾過膜Ｍ２の移入による変性がグリコプロテイン、抗体、蛋白質分子のタイプの粘着分子に対するリガンドの固定によって行われる請求項１２に記載の培養室。
【請求項１４】
細胞の共培養による変性が、付着細胞の第１の培養物を構成する第１のタイプの細胞から基材の培養物を作り、この基材の培養物を洗浄し、第２のタイプの細胞を固定し、共培養条件を最適化して行なわれる請求項１２に記載の培養室。
【請求項１５】
培養物を支持する生物適合性のある濾過膜Ｍ２が０．０１μｍ〜７μｍの範囲のカットオフ限界値を有する請求項１０〜１４のいずれか一項に記載の培養室。
【請求項１６】
互いに異なるカットオフ限界値を有する２枚の濾過膜（Ｍ１、Ｍ３）および培養用濾過膜Ｍ２が支持網で支持されている請求項１〜４および１０〜１５のいずれか一項に記載の培養室。
【請求項１７】
対称軸を有するケーシングの端部壁の内側表面が動的液体培地の分配手段を構成する請求項１〜１６のいずれか一項に記載の培養室。
【請求項１８】
端部壁の内側表面が平滑である請求項１７に記載の培養室。
【請求項１９】
２つの端部壁の内側表面に２つの動的液体培地Ｆ１およびＦ３の分配溝が設けられている請求項１７に記載の培養室。
【請求項２０】
端部壁の分配溝が主ネットワーク（主網構造）から成り、好ましくは動的液体培地が循環する方向に拡大している請求項１９に記載の培養室。
【請求項２１】
端部壁の分配溝が二次溝から成る二次ネットワーク（二次的網構造）につながり、この二次ネットワークの溝は主ネットワークの溝に対して直角である請求項１９〜２０のいずれか一項に記載の培養室。
【請求項２２】
主網状組織と二次的網状組織とが動的液体培地の碁盤の目状ネットワークを構成する請求項１９〜２１のいずれか一項に記載の培養室。
【請求項２３】
端部壁の主網状組織および／または二次的網状組織の溝が異なるカットオフ限界値を有する濾過膜と接触している請求項１９〜２２のいずれか一項に記載の培養室。
【請求項２４】
主網状組織の溝が５ｍｍ以下の深さと、２ｍｍ以下の幅を有し、互いに隣接す２本の溝の間のピッチが２ｍｍ以下である請求項１９〜２２のいずれか一項に記載の培養室。
【請求項２５】
二次的網状組織の溝が２ｍｍ以下の深さと、２ｍｍ以下の幅とを有する請求項１９〜２３のいずれか一項に記載の培養室。
【請求項２６】
動的液体培地の二つの入口／出口対Ｆ１の一つが端部壁と０．０１μｍ〜７μｍのカットオフ限界値を有する濾過膜Ｍ１との間に接続され且つ細胞の培養培地を供給し、成育因子を含む栄養培地が上記の０．０１μｍ〜７μｍのカットオフ限界値を有する濾過膜を通過する請求項１〜２５のいずれか一項に記載の培養室。
【請求項２７】
動的液体培地の入口／出口対Ｆ１が閉ループを形成する請求項２６に記載の培養室。
【請求項２８】
２枚の濾過膜の間に接続された動的液体培地の入口／出口対Ｆ２が、培養される細胞の導入、培養後の細胞の回収、遺伝子の移入、遺伝的に変異した細胞の回収、洗浄用液体の導入および培地での細胞の成長を抑制する分子の除去を行う機能を有する請求項１〜２７のいずれか一項に記載の培養室。
【請求項２９】
動的液体培地の２つの入口／出口対Ｆ３の一対が他方の端部壁の所の開放ループに接続されて、成育因子を含まない栄養培地の細胞培地を１５Ｋｄａ以下のカットオフ限界値を有する平らな濾過膜を通って供給する請求項１〜２８のいずれか一項に記載の培養室。
【請求項３０】
動的液体培地の３つの入口／出口対がケーシングの対称軸線を通る互いに直角な３つの平面内にあり、これらの面は動的液体培地の第１の入口と第２の入口との間で約６０度の角度を成し、第１の入口と第３の入口との間で約１２０度の角度を成し、動的液体培地の各出口は同じ角度を成している請求項１〜２９のいずれか一項に記載の培養室。
【請求項３１】
下記（ａ）〜（ｅ）を有することを特徴とする、外部側壁と、２つの端部壁と、動的液体培地の入口および出口とから成る対称軸線を有するケーシングによって区画された培養室と、この培養室に上記培地を循環させる手段とを有する、動物細胞の体外培養用バイオリアクタ：
（ａ）　上記対称軸に対して直角に配置された互いにカットオフ限界値が異なる少なくとも２枚の平らな濾過膜（Ｍ１、Ｍ３）を有する培養室であって、互いにカットオフ限界値が異なるこれら２枚の平らな濾過膜の間には培養状態の細胞を接着させるための生物適合性のある培養物支持手段が設けられ、この培養室は動的液体培地の分配手段を構成する２つの端部壁と、細胞培養室へ培養物を供給し且つ培養済みの細胞株、培養で生じた廃棄物および過剰な栄養源を選択的に抜き出すための動的液体培地の３つの入口／出口の対（Ｆ１、Ｆ２、Ｆ３）とで構成される対称軸線を有するケーシングで区画され、２つの入口／出口の対の各々は一つの端部壁と一枚の膜との間に接続され、残りの第３の入口／出口対は上記の２枚の平らな濾過膜の間に接続されている培養室、
（ｂ）　この培養室に接続された、培地を収容する膨張容器Ｒ１を含む、閉ループ回路の第１の動的液体培地Ｆ１の循環手段、
（ｃ）　上記培養室に接続された、培地を収容するタンクＲ２を含む、培地に応じて閉ループまたは開ループとなる第２の動的液体培地Ｆ２の循環手段、
（ｄ）　上記培養室に接続された、培地を収容するタンクＲ３を含む、開ループの第３の動的液体培地Ｆ３の循環手段、
（ｅ）　調節−制御ユニットに接続した動的液体培地の対照、調節およびコンディショニング手段。
【請求項３２】
液体培地Ｆ１、Ｆ２およびＦ３の循環手段が調節−指令ブロックに接続されたポンプＰ１、Ｐ２およびＰ３をそれぞれ備えている請求項３１に記載のバイオリアクタ。
【請求項３３】
第３の動的液体培地Ｆ３の循環手段が調節−指令ブロックに接続された弁Ｖ３を有する請求項３１に記載のバイオリアクタ。
【請求項３４】
成育因子に豊んだ動的液体培地Ｆ１を収容する膨張容器Ｒ１が０．２２μｍのカットオフ限界値を有する濾過器と調節−指令ブロックによって駆動される電磁弁Ｖ１とを備えている請求項３１に記載のバイオリアクタ。
【請求項３５】
膨張容器Ｒ１が培養室への液体の循環を逆転させるための液体培地の高レベルと低レベルを検知するセンサを備えている請求項３１〜３４のいずれか一項に記載のバイオリアクタ。
【請求項３６】
動的液体培地のコンディショニング手段が培地の酸素、温度およびｐＨの調節手段を有する請求項３１に記載のバイオリアクタ。
【請求項３７】
培地のコンディショニング手段が物質または熱エネルギーの一定値の移動に必要な寸法を有する機能性単位モジュールである請求項３６に記載のバイオリアクタ。
【請求項３８】
上記の機能性単位モジュールが曝気装置、熱交換器、ｐＨ調節器、透析モジュールまたは限外濾過器から成る請求項３７に記載のバイオリアクタ。
【請求項３９】
請求項１〜３０のいずれか一項に記載の培養室を有する請求項３１〜３８のいずれか一項に記載のバイオリアクタ。
【請求項４０】
上側端部壁と、０．０１μｍ〜７μｍのカットオフ限界値を有する平らな濾過膜との間に位置した培養室の帯域Ｃ１が圧力ｐ１である請求項３１〜３９のいずれか一項に記載のバイオリアクタ。
【請求項４１】
互いに異なるカットオフ限界値を有する２枚の平らな濾過膜の間の培養室の帯域Ｃ２が圧力ｐ２である請求項３１〜４０のいずれか一項に記載のバイオリアクタ。
【請求項４２】
カットオフ限界値が１５Ｋｄａ以下である平らな濾過膜と培養室のケーシングの下側端部壁との間の帯域Ｃ３が圧力ｐ３である請求項３１〜４１のいずれか一項に記載のバイオリアクタ。
【請求項４３】
培養室内で圧力ｐ１が圧力ｐ３以上で、圧力ｐ２が圧力ｐ１とｐ３との間にあって、成育因子Ｆ１に豊んだ栄養源培地が培養室の帯域Ｃ１から帯域Ｃ３方へ流れる請求項３１〜４２のいずれか一項に記載のバイオリアクタ。
【請求項４４】
細胞培養室の圧力ｐ３が圧力ｐ１以上で、圧力ｐ２が圧力ｐ１とｐ３との間にあって、成育因子Ｆ３を含まない基礎栄養培地が培養室の帯域Ｃ３から培養室の帯域Ｃ１の方へ流れる請求項３１〜４２のいずれか一項に記載のバイオリアクタ。
【請求項４５】
ポンプＰ１が稼働し、ポンプＰ３が停止して、成育因子に豊んだ栄養源培地Ｆ１が培養室へ流れ、逆止弁Ｖ３が、培養室の帯域Ｃ１内の圧力ｐ１が培養室の帯域Ｃ３の圧力ｐ３以上となるように調整され、ただし、帯域Ｃ２内の圧力ｐ２が圧力ｐ１とｐ３との間である請求項３１〜４３のいずれか一項に記載のバイオリアクタ。
【請求項４６】
調節−指令ブロックが、膨張タンクＲ１が低レベルに達した時にポンプＰ１を止め、ポンプＰ３を稼働させて流れの循環方向を逆にするシーケンスに従ってプログラムされている請求項４５に記載のバイオリアクタ。
【請求項４７】
弁Ｖ３が閉じられる請求項４５に記載のバイオリアクタ。
【請求項４８】
培養室の帯域Ｃ３内の圧力ｐ３が培養室の帯域Ｃ１内の圧力ｐ１以上になった培養室に（ただし、帯域Ｃ２内の圧力ｐ２は圧力ｐ１とｐ３との間にある）、成育因子を含まない基礎栄養培地Ｆ３が再度供給されると請求項４６に記載のバイオリアクタ。
【請求項４９】
液体培地に応じて第２の動的液体培地Ｆ２の入口／出口の構造が閉ループまたは開ループになったときにポンプＰ１およびＰ３が停止する請求項３１〜４８のいずれか一項に記載のバイオリアクタ。
【請求項５０】
動的液体培地Ｆ２が、培養すべき細胞を培養室に導入し、培養後の細胞を回収するために用いられる請求項４９に記載のバイオリアクタ。
【請求項５１】
動的液体培地Ｆ２が、培養細胞を収容した培養室内で遺伝子の移入ベクターを導入し、培養され、遺伝的に変性された細胞株を回収するために用いられる請求項４９に記載のバイオリアクタ。
【請求項５２】
動的液体培地Ｆ２が、培養細胞の成長を抑制する分子の洗浄液の導入と、この分子の除去のために用いられる請求項４９に記載のバイオリアクタ。
【請求項５３】
生物適合性のある隔壁を通って注射器によって細胞培養室の帯域Ｃ２内で培地Ｆ２に植菌するために、電磁弁Ｖ２Ｅ１は開放し、電磁弁Ｖ２Ｅ２、Ｖ２Ｅ３、Ｖ２Ｓ１、Ｖ２Ｓ２およびＶ２Ｓ３を閉じる請求項５０に記載のバイオリアクタ。
【請求項５４】
培養後に培養室内の細胞を回収するために、電磁弁Ｖ２Ｓ１開放し、電磁弁Ｖ２Ｅ２、Ｖ２Ｅ３、Ｖ２Ｓ２およびＶ２Ｓ３を閉じ、ポンプＰ２を稼働して帯域Ｃ２の内容物を細胞回収容器へ送る請求項５０に記載のバイオリアクタ。
【請求項５５】
培地導入時に第２の培地Ｆ２が細胞密封空間の洗浄に必要な要素を含むときに、抑制分子を除去するために電磁弁Ｖ２Ｅ３を開け、電磁弁Ｖ２Ｅ１、Ｖ２Ｅ２を閉じる請求項５２に記載のバイオリアクタ。
【請求項５６】
洗浄用培地Ｆ２が連続的に開ループが流れ、洗浄培地の導入および回収時に電磁弁Ｖ２Ｅ１、Ｖ２Ｅ２、Ｖ２Ｓ１、Ｖ２Ｓ２を閉じ、電磁弁Ｖ２Ｅ３、Ｖ２Ｓ３を開ける請求項５２に記載のバイオリアクタ。
【請求項５７】
細胞培養室の帯域Ｃ２の閉ループを循環する培地Ｆ２に含まれる遺伝子導入ベクターの植菌のために、電磁弁Ｖ２Ｅ２を開け、電磁弁Ｖ２Ｅ１、Ｖ２Ｅ３、Ｖ２Ｓ１およびＶ２Ｓ３を閉じる請求項５１に記載のバイオリアクタ。
【請求項５８】
調節−指令ブロックに対照・調節手段を介して動的液体培地Ｆ１、Ｆ２、Ｆ３に関する情報と、各種容器、タンク、ポンプ、弁および培養室の帯域Ｃ１、Ｃ２およびＣ３内の圧力に関する情報とが送られ、管理され、必要な命令が出される請求項３１〜５７のいずれか一項に記載のバイオリアクタ。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【本発明の分野】
本発明は、動物細胞の体外培養物を収容するための細胞培養室と、バイオリアクタとに関するものである。
本発明は特に、互いに異なるカットオフ限界値を有する少なくとも２枚の平らな濾過膜を有し且つ対称軸線を有するケーシング（ケーシング）によって区画された細胞培養室と、この細胞培養室内で細胞の生育環境を調節、制御しながら動物細胞を培養するためのバイオリアクタとに関するものである。
【０００２】
本発明の動物細胞の体外培養用細胞培養室およびバイオリアクタを用いることによって動物細胞を無菌条件下で培養することができる。
本発明は動物細胞の生産、例えば造血細胞、肝細胞、皮膚細胞（ケラチン合成細胞とよばれる）、膵臓細胞あいは治療目的用の組織構造を有する（または有しない）神経細胞の製造に応用することができる。
【０００３】
【従来の技術】
医学技術の大きな進歩を表す器官、組織または細胞の移入に大きな経済的関心が集まり、治療目的の細胞移入で使用される動物細胞や、欠陥組織の一時的緩和手段として患者に結合される外部デバイスで使用される動物細胞の培養用バイオリアクタが開発されている。
【０００４】
真核生物の細胞培養に使われる現在のバイオリアクタの主たる欠点、課題は物質移動すなわち栄養物および溶存酸素を真核生物の細胞まで運ぶ物質移動にある。すなわち、真核生物の細胞は壊れ易く、曝気のために培地を攪拌することによって生じる機械的なストレスで破壊されてしまう。
【０００５】
【特許文献１】米国特許第６，０４８，７２１号明細書
上記文献には哺乳動物の細胞を成長および維持させるためのバイオリアクタが記載されている。このバイオリアクタの円形培養室は細胞の平らなベッドと気体は透過するが液体は通さない膜で区画されている。このバイオリアクタの下側チャンバーに予め注入された栄養培地は放射状に拡散し、空気が上側チャンバーに吹き込まれる。このバイオリアクタの運転方法では、細胞培養で生じた廃棄物を含む培地は廃棄される。培養後の細胞の回収は酵素処理で行われる。この形式のデバイスでは酸素圧の勾配を生じさせるだけの培養室の厚さが必要であるが、そうした厚さは細胞の生育には適していない。
【０００６】
すなわち、真核細胞位置の培養に用いられる従来公知のバイオリアクタの欠点は、培養室に連続的に栄養培地が流され（灌水され）、回収されずに直接廃棄されるため、培養コストが高くなる点にある。
事実、動物細胞、例えば造血細胞や肝細胞の培養では、細胞の増殖および分化を行わせるには成育因子に富んだ栄養素の流れが必須である。しかし、この成育因子は極めて高価であるため、この成長因子が再循環されないバイオリアクタは経済的に大きな負担となり、臨床での開発には適していない。
本発明によって上記の欠点は全て解決することができる。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、培養細胞株を取囲む培地のホメオスタシー（安定性、ｈｏｍｅｏｓｔａｓｙ）が維持でき、従って、可能な最高の条件下で増殖を行うことが可能な、動物細胞の体外培養用の培養室およびバイオリアクタを提供することにある。この目的を達成するために本発明は以下で説明する装置を開発した。
本発明の他の目的は、上記培養室およびバイオリアクタ内に優れた細胞生育環境を維持し、十分な量の栄養物に富んだ培地を細胞に供給するとともに、生じる廃棄物および抑制要素を排出して菌体群の成長を許すことにある。
本発明のさらに他の目的は、培地の成育因子を再循環可能にし、細胞廃棄物を培地から十分に排出させて、細胞培養の経済性を最適化することにある。
【０００８】
本発明のさらに他の目的は、培養細胞株へ目標の遺伝子を移入できるようにすることにある。
本発明のさらに他の目的は、細胞の発育に起因する撹乱要因があっても細胞の培地の生理−化学的性質を維持できるうようにすることにある。
本発明のさらに他の目的は、細胞培養の全プロセスを通じて培養室およびバイオリアクタの無菌性および防腐性を保証することにある。
本発明のさらに他の目的は、本発明の培養室およびバイオリアクタで細胞を回収することにある。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明は、培養した細胞の細胞生育力を維持すると同時に、培地の成育因子を再循環することができる動物細胞の体外培養用培養室およびバイオリアクタを用いることによって上記の欠点が解決でき、細胞増殖の良いレベルを確保できるという知見に基づいている。
【００１０】
本発明の対象は、下記（ａ）〜（ｄ）を有することを特徴とする、外部側壁と、２つの端部壁と、動的液体培地の入口および出口とから成る対称軸線を有するケーシング（ｅｎｖｅｌｏｐｐｅ）によって区画された、動物細胞の体外培養用培養室にある：
（ａ）　上記対称軸に対して直角に配置された互いにカットオフ限界値（ｓｅｕｉｌ ｄｅ ｃｏｕｐｒｅ）が異なる少なくとも２枚の平らな濾過膜（ｍｅｍｂｒａｎｃｅｓ ｐｌａｎｅｓ ｆｉｌｔｒａｎｔｅｓ）、
（ｂ）　培養状態の細胞を接着させるための上記濾膜の間の生物適合性のある培養物の支持手段、
（ｃ）　動的液体培地の分配手段を構成する２つの端部壁（ｐａｒｏｉｓ ｄｅｘｔｒｅｍｉｔｅｓ）、
（ｄ）　細胞培養室へ培養物を供給し且つ培養済みの細胞株と、培養で生じた廃棄物と、過剰な栄養源とを選択的に抜き出すための動的液体培地（ｍｉｌｉｅｕｘ ｌｉｑｕｉｄｓ ｄｙｎａｍｉｑｕｅｓ）（Ｆ１、Ｆ２、Ｆ３）の３つの入口／出口対であって、その２つの入口／出口対の各々は一つの端部壁と一枚の膜との間に接続され、残りの第３の入口／出口対は上記の２枚の平らな濾過膜の間に接続されている入口／出口の対。
【００１１】
本発明の他の対象は、下記（ａ）〜（ｅ）を有することを特徴とする、外部側壁と、２つの端部壁と、動的液体培地の入口および出口とから成る対称軸線を有するケーシングによって区画された培養室と、この培養室に上記培地を循環させる手段とを有する、動物細胞の体外培養用バイオリアクタにある：
（ａ）　上記対称軸に対して直角に配置された互いにカットオフ限界値が異なる少なくとも２枚の平らな濾過膜（Ｍ１、Ｍ３）を有する培養室であって、互いにカットオフ限界値が異なるこれら２枚の平らな濾過膜の間には培養状態の細胞を接着させるための生物適合性のある培養物支持手段が設けられ、この培養室は動的液体培地の分配手段を構成する２つの端部壁と、細胞培養室へ培養物を供給し且つ培養済みの細胞株、培養で生じた廃棄物および過剰な栄養源を選択的に抜き出すための動的液体培地の３つの入口／出口の対（Ｆ１、Ｆ２、Ｆ３）とで構成される対称軸線を有するケーシングで区画され、２つの入口／出口の対の各々は一つの端部壁と一枚の膜との間に接続され、残りの第３の入口／出口対は上記の２枚の平らな濾過膜の間に接続されている培養室、
（ｂ）　この培養室に接続された、培地を収容する膨張容器Ｒ１を含む、閉ループ回路の第１の動的液体培地Ｆ１の循環手段、
（ｃ）　上記培養室に接続された、培地を収容するタンクＲ２を含む、培地に応じて閉ループまたは開ループとなる第２の動的液体培地Ｆ２の循環手段、
（ｄ）　上記培養室に接続された、培地を収容するタンクＲ３を含む、開ループの第３の動的液体培地Ｆ３の循環手段、
（ｅ）　調節−制御ユニットに接続した動的液体培地の対照、調節およびコンディショニング手段。
【００１２】
【実施例】
本発明は、図面を参照した培養室およびこの培養室を含むバイオリアクタに関する以下の非限定的な実施例の説明からよく良く理解できよう。
本発明は、互いにカットオフ限界値が異なる少なくとも２枚の平らな濾過膜と、この互いにカットオフ限界値が異なる少なくとも２枚の平らな濾過膜の間に配置された生物適合性のある培養物支持手段とを有する、細胞および培地の両方を収容可能な、対称軸線を有する細胞培養室に関するものである。この培養室は外部側壁と２つの端部壁とから成る対称軸線を有するケーシングによって区画されている。
「供給膜」とよばれる第１の膜はカットオフ限界値が０．０１μｍ〜７μｍの範囲に選択され、この膜は栄養培地の分子、例えば蛋白質類および巨大分子の通過を許すことによって培養室内への生化学的交換を許すとともに、培養細胞株がホメオスタシー（安定性、ｈｏｍｅｏｓｔａｓｙ）から外れるのを防ぎ且つ汚染菌粒子が通過するのを防いで細胞を封じ込め、培養室を汚染する危険のあるバクテリアに対するバリアの役目をする。
「透析膜」とよばれる他方の濾過膜は、１５キロダルトン（ＫＤａ）以下のカットオフ限界値を有し、分子量が１５Ｋｄａ以上の全ての分子を封じ込める。培養室内にこの濾過膜を存在させることによって、第１の膜によって培養細胞を封じ込める空間を規定することができる。すなわち、カットオフ限界値が１５Ｋｄａ以下である平らな濾過膜によって培養細胞と成育因子および巨大たんぱく質は培養室内に閉じ込められる。
【００１３】
本発明の一つの特徴から、濾過膜の少なくとも一方が０，２μｍ〜４μｍの間のカットオフ限界値を有し、他方が１０〜１２ ＫＤａの間のカッティング限界値を有するのが好ましい。
本発明では、培養室に存在する濾過膜の数は２以上である。この場合、追加の膜は上記の２枚の濾過膜と同じカットオフ限界値を有することができる。
本発明では、互いに異なるカットオフ限界値を有する２枚の平らな濾過膜が培養室の対称軸線に対して直角に配置される。
本発明では、互いに異なるカットオフ限界値を有する２枚の平らな濾過膜は無機または有機の膜にすることができる。例えば、生物適合性のある有機ポリマー、繊維またはポリスルホンにすることができる。
さらに、これらの２枚の濾過膜は互いに約２５ｍｍ以下、好ましくは２０ｍｍ以下だけ離れているのが好ましい。この距離は、細胞が栄養源および酸素源と常に接触できるので、細胞の成長に好都合である。
【００１４】
互いに異なるカットオフ限界値を有する２枚の平らな濾過膜の間には、培養状態にある細胞の接着を許す生物適合性のある培養物支持体となる手段が配置される。
本発明で生物適合性のある培養物の支持体となる手段の一つのは生物適合性のあるマイクロサポート（ｍｉｃｒｏｓｕｐｐｏｒｔ）のベッドである。このマイクロサポートは種々の寸法の粒子からなり、顆粒状要素を焼結して得られる連続ブロックにすることもてきる。このベッドの最大厚さは互いに異なるカットオフ限界値を有する２枚の濾過膜の間の距離に等しい厚さである。マイクロサポートのベッドは培養状態にある細胞を支持する役目と、互いに異なるカットオフ限界値を有する２枚の濾過膜の間に形成される細胞封じ込めに必要な空間を維持する機械的支持体の役目とを有する。生物適合性のあるマイクロサポートのタイプは本発明の培養室内で培養される細胞のタイプに応じて適切な寸法のものが選択される。
培養室の２枚の濾過膜の間に収容されるマイクロサポートは円柱形、球形、多面形、例えば機械加工されたブロックにすることができる。
【００１５】
本発明ではマイクロサポートは無機材料（例えば珊瑚）または金属材料（例えばチタンとその合金）または生物適合性のあるポリマーで作ることができる。
例えば、骨髄移植の用途のための骨の再建を目的とする骨芽細胞の培養の場合および造血細胞の培養の場合のマイクロサポートは珊瑚のミクロビーズにすることができる。所望の粒度を有する珊瑚ビーズは造血性原体により移植される特殊な能力のため、上記用途に適したマイクロサポートであると思われる。骨前駆体の場合には、珊瑚ビーズはさらに代謝ができ、それによって外科的な再建で使用することができる。
例えば、肝細胞の体外バイオマスによる肝機能不全患者のエクスビボ血液解毒のための肝細胞の培養に最も適したマイクロサポートはポリアミドの粒子、例えばナイロン（登録商標）、フッ素ポリマービーズ、例えばテフロン（登録商標）ビーズである。
すなわち、膜の間にマイクロサポートを存在させ且つカットオフ限界値が１５Ｋｄａ以下の濾過膜を用いることで、培養細胞および成長因子の通過が阻止され、培養細胞を封じ込めることができ、これらは互いに異なるカットオフ限界値を有する２枚の膜の間に位置した細胞封じ込め空間内で生物適合性のあるマイクロサポートに固着する。
【００１６】
本発明の生物適合性のある培養物支持体を構成する他の手段はいわゆる「培養膜」Ｍ２とよばれる濾過膜にすることもできる。この濾過膜は前記の他の膜と異なる特性、すなわちカットオフ限界値が０．０１μｍ〜７μｍの範囲内にあるいわゆる供給膜およびカットオフ限界値が１５Ｋｄａ以下のいわゆる透析膜とは異なる特性を有している。
この培養膜は上記２枚の膜の間に配置され、カットオフ限界値が１５Ｋｄａ以下のいわゆる透析膜の上に乗せることができる。
この培養膜は無機または有機の材料にすることができ、その組成は培養物のタイプと培養条件に応じて変えることができる。
【００１７】
細胞がその上で増殖するこのいわゆる培養膜は、基質の移入または細胞の共培養によって変性させることもできる。この変性の非限定的な例としては以下のものを挙げられることができる：
１）グリコプロテインタイプの粘着分子用リガンドの固定、
２）抗体の固定、
３）第１培養物を構成する付着細胞の第１タイプの細胞から他のバイオリアクタで従来の培養法で基礎培地を作り、この基礎培地を培養室に入れ、第２タイプの細胞を入れ、共培養条件を最適化する。この基礎培地の作成を本発明の培養室で第１タイプの細胞から作り、基礎培地を洗浄し、第２タイプの細胞を入れ、共培養条件を最適化することもできる。
４）蛋白質分子の固定。
【００１８】
この培養膜としてカットオフ限界値が０．０１μｍ〜７μｍの範囲の濾過膜を選択することもできる。
カットオフ限界値が０．０１μｍ〜７μｍの範囲内にあるいわゆる供給膜とカットオフ限界値が１５Ｋｄａ以下のいわゆる透析膜との間に配置される本発明の生物適合性のある培養物支持体を構成する手段を用いる場合には、供給膜および透析膜を網構造の支持体で支持することができる。この場合、網構造の支持体は細胞培養室中に供給すべき動的液体培地Ｆ１、Ｆ２およびＦ３を通過させ且つ培養済みの細胞株と、培養で生じた廃棄物と、過剰な栄養源とを選択的に抜き出す役目をする。
上記の膜を支持する上記網構造の支持体は、必要に応じて、上記の膜の片側または両側と接触するように配置するか、培養膜の片側および／または両側と接触させることができる。
【００１９】
細胞培養室は、既に述べたように、１つの外部側壁と２つの端部壁とからなる対称軸線を有するケーシング（エンベロープ）を有している。２つの端部壁の平らな底面は外部側壁の各端縁と一体にすることができる。
対称軸線を有するこのケーシングは例えば生物適合性のあるポリマー材料またはステンレスで作ることができる。生物適合性のあるポリマー材料の例としてはポリオレフィン、ポリアミド、ポリエステルまたはフッ素ポリマー、その他を挙げることができる。
動的液体培地は培養室中へ均一な分配ができるように、培養室に正しく配置された培地の入力／出口を用いて、ケーシングの端部壁の内側表面および培地の分配器を介して供給される。
【００２０】
本発明の２つの端部壁の内側表面は動的液体培地の分配手段を構成する。
その第１のタイプでは、対称軸線を有するケーシングの二つの端部壁の内側表面は平滑であり、従って、供給膜および透析膜と接触する培養室へ供給された動的液体培地は力を受けずに均一に分配できる。
その第２のタイプでは、供給された液体培地が供給膜および透析膜と接触するように培養室へ供給される。すなわち、３つの動的液体培地の中の２つを培養室へ供給するために対称軸線を有するケーシングの２つの端部壁の内側表面に分配溝を形成する。この分配溝は主溝構造（ｓｔｒｒｉｅｓ ｐｒｉｎｃｉｐａｌ）とよばれる主網状組織（ネットワーク）を構成する。この主網状組織は２つの端部壁の各内側表面に細胞培養空間に向かって形成され、各内壁に形成れた入口から拡大するように形成することができる。
本発明では上記の主溝構造とよばれる主網状組織（分配ネットワーク）によって２つの動的液体培地は均一に分配され、端部が端部壁に接続している生物適合性のある通路を介して培養室へ送られる。２つの端部壁の細胞培養空間と対向した表面に形成される分配溝の数は細胞培養室へ動的液体培地が正しく分散するように定められ、対称軸線を有するケーシングの形に応じて決定される。
【００２１】
上記の主網状組織には二次的な網状組織いわゆる二次溝が接続している。この二次溝は主網状組織より浅く、それに対して直角に形成されていて、主網状組織によって規定されると区画の間への循環を良くする役目をする。従って、二次溝は主網状組織に対して直角に形成される。二次的溝の空間は、培地の排出および抜き出しが容易になるように培地の入力の反対側で互いに接近し且つ数を多くなるように変えることができる。
２本の互いに隣接した主網状組織の溝は分配帯域（ゾーン）を構成し、互いに隣接する２本の二次的網状組織が交差した２本の互いに隣接した主網状組織の溝は分配細胞を構成する。
主網状組織および二次性網状組織は動的液体培地を拡散させる細かな「グリッド（格子）状」網状組織を形成する。これらの二つの網状組織によって例えば蜂の巣状の網状組織（ｒｅｓａｕｅ ｍａｉｌｌｅ）が形成できる。
【００２２】
細胞培養空間と対向する側面に位置した主網状組織は一定の高さと一定の幅を有することができ、これらの値は全体が確実に接着するように網状溝組織が平らな濾過膜と接触するという観点から当業者が適宜求めることができる。すなわち、溝の網状組織と膜との一体構造物の容積が液体を分配する碁盤目を形成し、膜表面の約５０％を占めるようにする。
例えば、網状組織の主溝の深さは５ｍｍ以下、幅は２ｍｍ以下、網状組織の２ｍｍ以下にすることができる。同様に、二次的網状組織の二次溝の深さは２ｍｍ以下、幅は２ｍｍ以下にし、互いに隣接する２つの二次溝の間のピッチは培地流の入口からその出口へ向かって徐々に減少させることができる。従って、末端（すなわち培地出口）の二次網状組織のピッチは２ｍｍ以下になる。
端部壁はワッフル（蜂の巣）形のパターンを有し、その上にカットオフ限界値が異なる膜が支持され、ポリマー接着剤等の生物適合性のある接着剤によって接着される。
【００２３】
対称軸線を有するケーシングは外部側壁と２つの端部壁とからなる。外部側壁は適切な高を有する同じ断面形状の少なくとも３つの部分（互いに同一でよい）から作ることができる。これらの少なくとも３つの壁部分は互いに積層された少なくとも３つのモジュール（Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３）で構成することができる。培養室の対称軸線を有するケーシングの端部壁を構成する２つのモジュール（Ｃ１、Ｃ３）の間に残りの第３のモジュール（Ｃ２）が挿入され、この第３のモジュール（Ｃ２）の各端部面にはカットオフ限界値が０．０１μｍ〜７μｍの範囲の供給膜とよばれる平らな濾過膜（Ｍ１）と、カットオフ限界値が１５Ｋｄａ以下の透析膜とよばれる平らな濾過膜（Ｍ３）とがそれぞれ配置される。
少なくとも３つのモジュールは互いに積層され、例えば適当な固定手段、例えば接着剤、ネジによる機械的固定手段、その他によって互いに密封接続される。
本発明の細胞培養室の対称軸線を有するケーシングは複数の細胞培養室が支持体上に容易に積み重ねできるような適切な形状になっている。当業者は使用目的に従って培養室の対称軸線を有するケーシングの形を選択することができ、対称軸線を有するケーシングを例えば円形、多角形断面にすることができる。
【００２４】
当業者は培養室用の上記モジュールの積層モジュールが適当な支持上に安定に積み重ねできるような同じ形を選択する必要がある。
複数のモジュールを積み重ね培養室の実施例では、例えば６本の柱を有する基台の上に各モジュールを連続して容易に積み重ねることができるることができる例えば六角形にすることができる。この場合、モジュールの積層体を支持する基台の６本の柱を例えば動的液体培地の供給管および排出管として使うこともできる。
本発明の培養室への動的液体培地の供給は３つの動的液体培地の供給システム（各培地用の別々の３つの流れシステム）によって実行される（図１〜８）。
対称軸線を有するケーシングの端部壁の一つ（例えば上側端部壁）の近くに接続された、モジュール（Ｃ１）の外部側壁に接続された生物適合性のある管路を介して流入・排出される第１の動的液体培地（Ｆ１）は栄養培地（栄養に豊んだ培地）を供給する。この培地は成育因子に豊んでいる。この第１の動的液体培地は細胞培養に必要な要素、例えば蛋白質類、欠乏元素、グルコース、水および成育因子からなり、培地へフレッシュな栄養培地を供給する。
培養室の対称軸線を有するケーシングの一部を形成するモジュール（Ｃ２）の外部側壁に接続した生物適合性のある管路を介して流入・排出される第二の動的液体培地（Ｆ２）は用途に応じた三つの別々の役目をする。
【００２５】
モジュール（Ｃ２）の培養室の側壁に接続した生物適合性のある管路を介して入る第２の動的液体培地Ｆ２の第１の役目は、培養すべき細胞を培養室中へ導入し且つ培養後に培養後の細胞（例えば造血細胞、肝細胞）を培養室のモジュールから回収することにある。
この第２の動的液体培地の第２の役目は遺伝子を移入させることにある。すなわち、第２の動的液体培地を通じて培養室のモジュール（Ｃ２）へ懸濁液の培養細胞を導入することでこの液体培地に含まれるウイルス粒子を膜の所で懸濁液中の細胞に固定して、所望の遺伝子を移入させる。この第２の培地流から所望の培養細胞、一般には遺伝的に変性された培養細胞を得ることができる。すなわち、この培地は遺伝子的に導入すべきベクターを輸送し、細胞と接触して、ターゲット細胞と遺伝子的に導入すべきベクターの間で膜の合着を起こさせることができる。遺伝子導入するベクターは任意の種類のものにすることができ、例えば、アデノウィルス、レトロウィルス等のウィルス、リポソーム、プラスミド複合体を挙げることができる。
【００２６】
人体の外で行う細胞のマーキング（遺伝子導入ベクターの注入）によって遺伝的に変性すべき組織を正確にマーキングすることができる。さらに、例えば治療上に問題となる細胞個体群で導入遺伝子をマーキングするだけに使用する合成ウィルスを使うこともできる。エンベロップをコードする遺伝子といわゆる遺伝情報を運ぶ遺伝子とが分けられることを特徴とするこのウィルスは、細胞内部へ所望の遺伝情報を移入した後は再生できない。従って、使用した合成ウィルスからの組換えウィルスと患者中に存在する野生のウィルスとのリスクは制限される。
第２の動的液体培地（Ｆ２）の第３の役目は、細胞封じ込め空間内に存在する大きな抑制分子を洗浄する流体としての役目である。すなわち、培養細胞にはその回収前、植菌前、処理中または培養室中での植菌中にストレスが加わる。このストレスによって増殖を抑制する蛋白質類が（細胞によって）生産され、静止状態とよばれる休止状態になってしまう。この状態下では細胞は成育因子によって行われる刺激作用に応答する生理学的な状態にはならず、増殖しない。
【００２７】
造血細胞の場合にはイオン性放射線の照射（意図的な放射線療法または事故による）に起因するいわゆる「放射線起因性」のストレスが生じる。このタイプのストレスによってインヒビター（例えば「Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ−ｂｅｔａ」または「Ｔｕｍｏｒ Ｎｅｃｒｏｓｉｓ Ｆａｃｔｏｒ−ａｌｐＨａ」）が生じる。これらの抑制分子は成育因子と同様に造血細胞の培養で生じるサイトカインであり、培養室の互いに異なるカットオフ限界値を有する膜によって閉じ込められる。
従って、正しい細胞培養を実行するためには、これらの抑制分子を培地、従って培養室から除去する必要がある。すなわち、上記の第３の役目によって、第２の動的液体培地を細胞封じ込め帯域の洗浄用に用いて抑制分子を除去することができる。
【００２８】
第３の動的液体培地（Ｆ３）は、対称軸線を有するケーシングの他方の端部壁（例えば下側端部壁）に近いモジュール（Ｃ３）の外部側壁に接続された生物適合性を有する管路を介して流入、排出される。この第３の動的液体培地（Ｆ３）は基礎栄養培地（ｍｉｌｉｅｕ ｎｕｔｒｉｔｉｖｅ ｄｅ ｂａｓｅ）（基礎的再生栄養培地（ｍｉｌｉｅｕ ｎｕｔｒｉｔｉｖｅ ｄｅ ｂａｓｅ−ｒｅｇｅｎｅｒａｎｔ）ともよばれる）を供給する。この基礎栄養培地は成育因子を含まない完全栄養培地である。すなわち、この基礎栄養培地はグルコース、水、欠乏元素、例えばビタミンおよびミネラル、培地のｐＨを評価するための色素および上記のアルブミンタイプの蛋白質類からなる。
本発明の３つの別々の動的液体培地（Ｆ１、Ｆ２、Ｆ３）（３重流ともよばれる）が供給される培養室は、これら培地を流入、排出させる３対の入口／出口対で特徴付けられる。その２つの対（Ｆ１、Ｆ３）はモジュール（Ｃ１）および（Ｃ３）に供給するための端部壁の近くに接続されて、互いに異なるカットオフ限界値を有する平らな濾過膜と接触するように培地を分配する。第３の入口／出口対（Ｆ２）は互いに異なるカットオフ限界値を有する２枚の平らな濾過膜の間に位置した外部側壁に接続している（すなわちモジュール（Ｃ２）に接続している）。
【００２９】
培養室を区画するケーシングへの培地の入口／出口対を互いにズラす（［図１］を参照）ことによって培養室への液体培地の分配を均一化させることができる。
本発明の上記特徴から、３重流システムの入口／出口管路は培養室の対称軸線を有するケーシングに適当に分配される。
［図１］では、生物適合性のある第１流のための管路（ＥＦ１）が培養室のケーシングの上側端部壁の近くに接続され、この第１流の出口管（ＳＦ１）は同じ端部壁の入口管路とは反対側に接続されている。
生物適合性のある第３流の入口管路（ＥＦ３）はケーシングの下側端部壁に接続している。この管路は培養室内げの培地の分配を良くするために成育因子に豊んだ第１の栄養源流の入口管（ＥＦ１）に対して約１２０度の角度を成して接続されている。さらに、生物適合性のあるこの第３流の出口管路（ＳＦ３）は上記流れの入口管（ＥＦ３）の反対側で同じ端部壁に接続している。
【００３０】
［図１］から分かるように、生物適合性のある第２の動的な流れの入口管（ＥＦ２）はそれぞれ０．２２μｍおよび１０ＫＤａのカットオフ限界値を有する２枚の平らな濾過膜（Ｍ１）と（Ｍ３）との間のケーシングの外部側壁の所で第１流の入口管（ＥＦ１）に対して約６０度の角度を成して接続されている。生物適合性のある出口管（ＳＦ２）は入口管の反対側で外部側壁に接続されている。
従って、動的液体培地の３つの入口／出口対はケーシングの対称軸線を通る３つの垂直面内にあり、これらの面は第１の入口と第２の入口との間で互いに約６０度の角度だけ離れ、動的液体培地の第１の入口と第３の入口との間で約１２０度の角度だけ離れ、液体培地の各出口は同じ角度を成している。
【００３１】
本発明はさらに、上記細胞培養室を有するバイオリアクタに関するものである。培養室が動的液体培地の上記３つの入口／出口対を介して接続導管によって供給タンクおよび／または排水タンクに接続されている。本発明のバイオリアクタはさらに、バイオリアクタの調節−指令ブロックに接続された培養条件の調節手段と、動的液体培地の物質移動の制御手段とを有している。
すなわち、本発明のバイオリアクタは培養室の他に、ｐＨ、培地の酸素濃度および温度を調節、制御するための「調節ユニット、指令ユニット」を有している。この「調節−指令ブロック」によってバイオリアクタを完全自動運転にすることができる。この形式の調節方法はデジタルＰ．Ｉ．Ｄ（Ｐｒｏｐｏｒｔｉｏｎｎｅｌｌｅ Ｉｎｔｅｇｒａｌｅ ｅｔ Ｄｅｒｉｖｅｅ）とよばれ、各センサから送られたデータをコンピュータに記録し、データ処理する。
【００３２】
既に述べたように、本発明のバイオリアクタは培養室を含み、一定値の物質またはエネルギー移動に必要な寸法の交換機能単位モジュール（例えば曝気モジュール、熱交換モジュール）で構成され、同じ機能単位の直列および／または並列に配置して全体を寸法を変えることが可能なモジュール式ユニットに構成し、それにプログラム可能な調節−指令ブロックが付けられる。
調節−指令ブロックは調節−制御ユニットから動的液体培地Ｆ１、Ｆ２、Ｆ３に関する全ての情報を受け、各タンク、ポンプ、弁および培養室の帯域−モジュールＣ１、Ｃ２、Ｃ３中の圧力に関する情報を受けて、必要な指令を作り、発信する。
従って、培養室内の特性を必要に応じて変更でき、培養細胞のタイプに応じた培地の安定性に関係する調節パラメータおよびプログラムを変更することができる。
調節ユニットはスペクトル分析によって培地中の水溶液濃度を測定するために赤外線スペクトル計測用のセルを有することができる。また、グルコースおよび乳酸の濃度を「オンライン」または「実時間」で測定することもできる。
培地の温度は３０〜３８℃の間の設定点に固定できる。細胞増殖中の培地のｐＨは６．５〜７．７の間の設定点に固定できる。調節−指令ブロックは通気量とＣＯ２の比率とを調節し、ＣＯ２の溶解で両向性のＨＣＯ３−を生じさせて培地を緩衝し、ｐＨを安定化させる。
【００３３】
本発明のバイオリアクタの一つの特徴から、第１の動的液体培地Ｆ１の（培養室の）入口／出口管は閉ループ回路を介して成育因子に富んだ栄養培地の容器（タンク）Ｒ１に接続導管を介して接続されて、培養細胞の成長に必要な成育因子が再循環できるようになっている。この容器Ｒ１は膨張容器の役割をすることができる。
本発明のバイオリアクタの一つの特徴によって、培養室の第１の栄養培地Ｆ１の入口管と上記の培地の容器Ｒ１との間の接続導管にポンプＰ１を設けて、閉ループを介して培養室中を循環する培地Ｆ１の体積および流量とを調節、制御する。
栄養に富んだ流れＦ１を運ぶ閉ループには膨張容器Ｒ１の位置に空気パージを備えている。この空気パージには培地の呼吸を保証する０．２２μｍのカットオフ限界値を有するフィルターが付けられている。同様に、この閉ループには必要に応じて大気圧との間の圧力差を調節するためのプログラム可能な調節−指令ブロックによって指令される電磁弁Ｖ１が備えられている。膨張容器Ｒ１にはさらに、循環流の方向を逆転させる際に用いられる液体培地の水位（高レベルおよび低レベル）の検出センサを備えている。
【００３４】
本発明のバイオリアクタの他の特徴によって、培養室の第３の基礎栄養培地（ＥＦ３）の入口管は接続導管を介して培地の容器Ｒ３に接続され、その出口管（ＳＦ３）は接続導管を介して廃棄管（廃棄物回収容器）に接続されている。
本発明では、第３の動的液体培地ＥＦ３の入口管に接続した接続導管がポンプＰ３を備え、この流れの出口管に接続した導管は弁Ｖ３を備え（この弁は必要に応じて調節−指令ブロックによって管理される）、この全体で培養室の開回路を循環する第３培地Ｆ３の流量および容積を調節、制御することができる。
本発明では、細胞培養室中を循環する動的液体培地Ｆ１、Ｆ３とタンクＲ１、Ｒ３との間の２つの閉回路および開ループのそれぞれに栄養に富んだ培地Ｆ１の通気装置と基礎栄養培地Ｆ３の通気装置とを設けることができる。
【００３５】
本発明では、栄養に富んだ培地Ｆ１の熱熱交換器と基礎栄養培地Ｆ３の熱熱交換器を細胞培養室への動的液体培地Ｆ１、Ｆ３の２つの回路の入口に設けられることができる。
これらの熱熱交換器は培地の流れを予めコンディショニングすることによって培養室の安定性（ｈｏｍｅｏｓｔａｓｙ）を維持して、培地の物理化学パラメータを外乱させる要素が培養室に入らないようにする。
本発明のバイオリアクタの他の特徴によって、ケーシングの側壁に位置した培養室の第２の動的液体培地ＥＦ２の入口管が接続導管を介してタンクＲ２に接続されている。このタンクＲ２は機能に応じて選択される第２の動的液体培地を収容する。すなわち、培養すべき細胞を培養室へ供給するか、培養後に培養室を排出るか、遺伝子を導入するか、培養細胞に対する抑制分子を培養室から出すために培養室を洗浄するために第２の動的液体培地が収容される。
【００３６】
培養室内での第２の動的液体培地の機能に応じて、入口管ＥＦ２とは反対側に設けられた出口管ＳＦ２には以下のものが接続される：
１）　培養後の細胞を回収する回収タンク（いわゆる回収容器）への接続導管または開回路の場合の下水路（抑制分子の廃棄容器）、または、
２）　閉ループ回路の場合の遺伝子導入用に適したベクターを含む培地を収容したタンクへの接続導管。
【００３７】
本発明のバイオリアクタの他の特徴から、培養室の出口で栄養培地Ｆ１を精製するための培地交換機能モジュール（透析または限外濾過ユニットとよばれる）を追加することができる。これらの培地交換機能モジュールを、成育因子を含む第１の栄養培地Ｆ１の閉ループ回路の出口への接続導管上に、培養室の外部に位置させて、開ループの基礎栄養培地Ｆ３とは逆方向に流すことができる。
閉ループＦ１に特別な直列に接続された２つの機能モジュールを使用する場合には、２つの異なるカットオフ限界値、例えば１０Ｋｄａと６３０ＫＤａのカットオフ値を使用することができる。すなわち、１０Ｋｄａのモジュールからの流れを３０ＫＤａのモジュールに注入し、浸透物すなわち３０Ｋｄａのカットオフ限界値を通過した液体の画分を回収し、ループＦ１に再注入することで成育因子の寸法に対応した１０〜３０ＫＤａの間の培地の蛋白のソート（ｆｅｎｅｔｒａｇｅ）を行う。
【００３８】
この追加の機能性モジュールは例えば成育因子を追加の第１培養室中に支持した細胞で生産する場合や、主培養室に存在する治療に有用な細胞を刺激するためにループＦ１で再利用するために培地を条件付ける場合（すなわち支持体の細胞によって生じた細胞の廃棄物を回収せずに、生産された成育因子を回収する場合）に有能である。
造血細胞および／または血液細胞を培養するのに使われる方法を用いて基質細胞（ｓｔｒｏｍａｌｅｓ）とよばれる支持細胞で使用することができる。この基質細胞は例えば発現レベルでヒトサイトカインを生産するように遺伝的に変更して必要に応じて培養のサイトカインの発生を助けることができる。
さらに、本発明の対称軸線を有するケーシングは最適分散状態で栄養物を均一に分配することができ、細胞および培地と接触するバイオリアクタの全ての要素を殺菌することができるという利点がある。すなわち、バイオリアクタの殺菌は、全ての器具および貯蔵タンクを１２１℃度で２０分間、オートクレーブで行うことができる。接続導管、容器、タンク、その他の密封要素は、実験室で使用する場合、殺菌を数１０回行っても損傷しない生体適合材料で作られる。これに対して、培養室、接続導管、培地容器等の組立体はヒトの一回のみの臨床で使われる一回だて使用する培養キットを構成する。
【００３９】
また、実験室で使用する場合には、一回の細胞培養後のバイオリアクタの再条件化をモル塩酸溶液を用いたタンパク消化作用と、それに続く超純粋洗浄および再殺菌で行う。
［図２］および［図７］に示す本発明のバイオリアクタの運転方法では、栄養に富んだ培地Ｆ１がケーシングの上側端部壁の所から０．０１μｍ〜７μｍのカットオフ限界値を有する平らな濾過膜と上側端部壁との間の培養室の帯域（Ｃ１）（モジュールまたは区画Ｃ１）にポンプＰ１によって導入される。このポンプＰ１は培地Ｆ１を収容した容器Ｒ１と培養室とを接続する接続導管上に配置されており、他方のポンプＰ３は止まっている。このポンプＰ３は基礎栄養培地Ｆ３を収容したタンクＲ３と培養室とを接続する接続導管上に配置されている。１５Ｋｄａ以下のカットオフ限界値を有する平らな濾過膜と下側端部壁との間の培養室の帯域（Ｃ３）（モジュールまたは区画Ｃ３）の圧力ｐ３は逆止弁Ｖ３によって調節される。この逆止弁Ｖ３は培養室と排水路とを接続していて、培養室の上記帯域Ｃ１内の圧力ｐ１は圧力ｐ３以上と成り、帯域Ｃ２（モジュールまたは区画Ｃ２）内の圧力ｐ２は圧力勾配によってｐ１〜ｐ３の間と成る。
【００４０】
ポンプＰ１が稼動して、第１の動的液体培地Ｆ１が培養室内に導入される間、栄養培地の成育因子は帯域Ｃ１中に入り、培養室の０．０１μｍ〜７μｍのカットオフ限界値を有する前記膜を通過するが、１５Ｋｄａ以下のカットオフ限界値を有する平らな濾過膜で保持される。この膜は成育因子および巨大たんぱくの通過に対するバリヤの役目をする。
従って、成育因子はカットオフ限界値が０．０１μｍ〜７μｍの平らな濾過膜を片側から反対側へ通過しする。この濾過膜は成長を刺激し、および／または、培養室の上記帯域Ｃ２（モジュールまたは区画Ｃ２）を規定する培養室の２枚の平らな膜の間に閉じ込められた培養状態の細胞の分化を制御する。
［図４］では、１５Ｋｄａ以下のカットオフ限界値を有する平らな濾過膜Ｍ３が培養室の帯域Ｃ１およびＣ２内にフレッシュな栄養培地Ｆ１の成育因子と巨大たんぱく質とを閉じ込める。一方、この栄養培地Ｆ１の欠失元素と培養室の帯域Ｃ２に閉じ込められた細胞の培養で生じる小寸法の廃棄物（例えばＮＯ、ＮＨ４＋、乳酸塩、その他）は帯域Ｃ３の方へ抜き出される。従って、膜を通る全ての流れは帯域Ｃ３から培養室の帯域Ｃ１へ向けられる（［図２］と［図７］を参照）。
【００４１】
本発明のバイオリアクタが「下降相れとよばれる運転モードにあるときには、水溶液が帯域Ｃ３の方向、特に排水出口の方へ排液されるので、閉ループ中を循環するフレッシュな栄養培地Ｆ１の体積が減る。従って、容器Ｒ１中の栄養培地Ｆ１の体積が減少する。このフレッシュな栄養培地Ｆ１の成育因子と巨大たんぱく質は帯域Ｃ１およびＣ２内に閉じ込められ、廃棄物は培養室のこれら帯域から帯域Ｃ３の方へ排出され、開いた弁Ｖ３を介して排水出口へ流出する。
容器Ｒ１すなわちフレッシュな栄養培地Ｆ１を運ぶ閉ループの膨張容器が一定の低レベルになると、本発明のバイオリアクタの調節−指令ブロックは循環流を逆にするようにプログラムされている。従って、稼動していたポンプＰ１が停止し、停止していたポンプＰ３が稼動する。開いていた弁Ｖ３は閉じる。
従って、細胞培養室の帯域Ｃ１内の圧力ｐ１は圧力ｐ３以下になり、上記の運転モードに対して逆の圧力勾配によって、帯域Ｃ２中の圧力ｐ２がｐ１とｐ３との間になる。従って、膜を通る全体の流れは帯域Ｃ３から細胞培養室の帯域Ｃ２へ流れる（［図３］および［図８］を参照）。［図３］、［図８］および［図５］に示す本発明バイオリアクタの運転モードは「上昇相」とよばれ、細胞培養内の流れの逆転によって培養室内を循環しているフレッシュな栄養培地Ｆ１には第３の動的液体培地Ｆ３から来るフレッシュな栄養素が再供給され、「下降相」で失われた損失、特に水を補償される。すなわち、基礎培地（再生剤）Ｆ３は細胞培養室中にグルコース、水、欠失元素を再補給する。
【００４２】
容器Ｒ１すなわちフレッシュな栄養培地Ｆ１を運んでいる閉ループ回路の膨張容器の体積が一定の高レベルに達すると、本発明バイオリアクタの制御システムは循環流を再び逆にするようにプログラムされている。
従って、第１の動的液体培地の一部をなす栄養培地Ｆ１が閉ループ中を循環して与えられる成育因子は閉ループ内および区画Ｃ１およびＣ２内に閉じ込められ、その濃度はＣ０〜Ｃ０＋／−ΔＣの間で変動する。従って、本発明の培養室およびバイオリアクタをもちいることによって、栄養培地は再循環され、成育因子は最適状態で使用される。
培養室内への流れを逆流することによって培養された細胞を脆化させるだけの小さな流体力学的応力が生じさせる流れが膜の前後に生じる。従って、ゆッくりとした「層状」の流れが得られる。また、この逆流によって、膜の前後で生じる圧損（膜の透過性を表す指数）を各動的液体培地の流れ中に配置された電子的圧力計によって実時間で制御して、濾過膜の閉塞を警告することができる。
本発明のバイオリアクタの運転モードでは、外部側壁の所から培養室の２枚の平らな濾過膜の間に流入／流出する第２の動的液体培地（Ｆ２）は必要なき能に応じて閉ループまたは開ループ回路で室内を循環し、ポンプＰ１およびＰ３が閉じられ、その入口および出口構造は必要な機能に応じて決められる。
【００４３】
バイオリアクタの運転モードでは、動的な第２の液体培地Ｆ２の主たる機能が培養室内で培養細胞に植菌をし、培養後にそれを放出させることにある場合、抑制分子を除去するために室を洗浄する第３の機能で使われるのと同じ開ループで作動する。この逆に、動的液体培地Ｆ２が遺伝子移入の役割を有する場合には、植菌時および培養相の間、閉ループで作動する。
［図６］のバイオリアクタの運転モードに従った第１の機能では、培養細胞を含む第２の動的液体培地Ｆ２が注射器によって（外部側壁の）入口管ＥＦ２の３つのセグメントの一つのに配置される生物適合性のある隔壁を介して培養室の帯域Ｃ２に植菌される。入口管ＥＦ２の電磁弁Ｖ２Ｅ１は開いており、電磁弁Ｖ２Ｅ２およびＶ２Ｅ３は閉じている。培地の植菌時には、入口管ＥＦ２とは反対側に設けられた出口管ＳＦ２の３つの枝部に設けられた３つの電磁弁Ｖ２Ｓ１、Ｖ２Ｓ２およびＶ２Ｓ３は閉じられる。
【００４４】
培養後に細胞を回収する際には、入口管ＥＦ２の２つの電磁弁Ｖ２Ｅ２およびＶ２Ｅ３が閉じられ、培養細胞の回収タンクに接続している接続導管の出口管ＳＦ２の３つの枝の一つに配置された電磁弁Ｖ２Ｓ１が開けられ、出口管ＳＦ２の他の２つの枝の電磁弁Ｖ２Ｓ２とＶ２Ｓ３は閉じられる。従って、再生された基礎培地はポンプＰ２でタンクＲ２から送られ、回収容器の区画Ｃ２（カットオフ限界値が互いに異なる２枚の膜の間の区画）の内容物を押し出す役目をする。トリプシンおよび／またはコラゲナーゼおよび／またはＤＮＡタイプの酵素処理を使用して培養中に細胞が生産した細胞間マトリックスを壊して、固着を容易にする。
珊瑚タイプのマクロサポート上での造血細胞の培養では培地をｐＨ＝６．０またはｐＨ＝６．５のわずかな酸性化にすることで珊瑚を溶かし、洗浄後に造血細胞を回収することができる。
【００４５】
本発明バイオリアクタの運転モードに従う第３の機能では、細胞封じ込め空間の洗浄に必要な要素を含む第２の動的液体培地Ｆ２は上記と同じ電磁弁の開閉原理で開閉する開ループで機能するが、この場合には入口管が生物適合性のある隔壁を備えておらず、接続導管を介して選択された培地Ｆ２を収容したタンクＲ２に接続されている点が相違する。
電磁弁Ｖ２Ｅ３が開いた入口管ＥＦ２（外部側壁）の３つの枝の一つの所で培養室の帯域Ｃ２へ洗浄培地Ｆ２を導入するときには、電磁弁Ｖ２Ｅ１とＶ２Ｅ２は閉じている。洗浄培地の導入および回収時には出口管ＳＦ２の２つの枝に位置した２つの電磁弁Ｖ２Ｓ１、Ｖ２Ｓ２は閉じ、出口管ＳＦ２の他の枝に接続した電磁弁Ｖ２Ｓ３）は開いていて、洗浄流は開ループを連続的に循環する。電磁弁Ｖ２Ｓ３の出口は下水道に接続することができる。この下水道はバイオリアクタの全ての管、タンク、機能モジュールおよび培養室と同時に殺菌された培地のタンクを構成し、それによって流れ無菌性が保証される。下水道には０．２２μｍの２枚のフイルターを取り付けて、安全性を増し、特に、「熱い」倍地がオーバーフローしたときの無菌を保証する。
【００４６】
［図６］のバイオリアクタの運転モードに従った第２の機能では、入口管ＥＦ２の３つの枝の一つのに設けられた電磁弁Ｖ２Ｅ２を開けて、遺伝子導入ベクターを含んだ第２の動的液体培地Ｆ２が培養室の帯域Ｃ２に導入される。電磁弁Ｖ２Ｅ１およびＶ２Ｅ３は閉じる。この培地の導入時には出口管ＳＦ２の２つの枝に置かれた２つの電磁弁Ｖ２Ｓ１、Ｖ２Ｓ３は閉じる。遺伝子導入ベクターを含んだこの培地Ｆ２は植菌と培養に必要な時間の間、閉ループを循環する。遺伝子移入が終ったときにはループＦ２が上記の洗浄モードに再び変り、残っているベクターが洗浄される。洗浄後、培養物は「上昇相」および「下降相」のＦ１およびＦ３の流れで交互に流れる。
下降相から上昇相へ逆流する際の望ましくない副作用の一つは帯域Ｃ２およびＣ３から来る廃棄物によって培地Ｆ１がわずかに汚染される危険性があるという点である。しかし、希釈現象によって汚染のこの危険性は無視できるものになる。さらに、基礎培地Ｆ３の貯槽と培養室とを接続している接続導管の入口にはフレッシュな培地が前記タンクから供給され、培養室を下水道に接続している導管の先端すなわち弁Ｖ３の近くだけに廃液が来るだけである。
本発明の培養室およびバイオリアクタは動物細胞の体外培養で使用できのという点で本発明は医療分野に関するものである。本発明の培養室およびバイオリアクタは例えば造血細胞または肝細胞の生産で使用できる。
本発明はさらに、骨髄の細胞の体外培養でも使用できる。造血は、全てのタイプの細胞を生産可能な多能性初期細胞（原細胞ともよばれる）の増殖および分化によって血液の全て要素（寿命が限られた成熟した血液細胞）を再生（更新）する生理学的処理である。この血液細胞は血液の概観要素（ｅｌｅｍｅｎｔｓ ｆｉｇｕｒｅｓ ｄｕ ｓａｎｇ）ともよばれる。このプロセスは造血成長因子の管理下にあるので、サイトカインともよばれる。
偶発的無形成症患者または抗癌治療に起因する無形成症の患者での未熟な造血細胞（造血原体ともよばれる）の移入は傷ついた骨髄を再活性させて造血プロセスを開始させるための手段である。
この処理では、原体（発達初期の細胞）をシタフェラーゼ（ｃｙｔａｐｈｅｒｅｓｉｓ）により患者から採取するか、骨髄の穿刺により直接骨採取し、培養後に再注射して、これらの細胞が血液システムおよび患者の免疫を再構成する（完全無形成症の場合）か、一過性はん血球減少症の病的期間（好中球減少症、リンパ球減少症および血小板減少症期）を補償して無形成症患者の内因性血液を再構築できるようにする（放射線照射事故）。
同様に、生命を著しく短くする急性肝不全の場合、体外での血液解毒処理によって患者の欠陥のある肝機能を補償する必要があるが、必要な代謝機能を実行するには多数の肝細胞が必要になる。上記の培養室およびバイオリアクタを用いることによって充分な数の肝細胞を生産ることができ、患者の血液を体外循環するという血液動態上の制約を補う効果的な治療と迅速な解毒を行うことができる。
例として、５０〜１００ｍｌの有効容積を有するバイオリアクタを用いることによって、約１０日間で動物細胞を体外培養して、移入および／または不足時の一時的手段として細胞のバイオマス生産を利用できる。構成・階層化された組織モデルの再構築の分野では、バイオリアクタでの培養時間は数ヵ月にすることができる。
骨髄タイプの細胞（造血細胞）の移入の場合には、培養物から１０６〜１０７ ＣＦＵ／Ｋｇ（早熟細胞のタイプ）の量が必要になる。移入を成功させる条件であるこの臨床的限界値から移入に必要な造血性培養物から得られる細胞の数を１０１０と見積もることができ、この用途で必要な上記培養室およびバイオリアクタの大きさを見積もることができる。
上記の細胞培養でのｐＨ、温度、酸素分圧条件はｐＨが７．４で、温度が３７．５℃で、酸素分圧（飽和％）は１５％である。栄養培地は極めて精製されたまたは合成の蛋白質類と、欠失元素（例えば鉄、セレニウム、トランスフェエリンンリ、ビタミン、その他）と、生色素とから成る合成培地である。この栄養培地はサイトカインである成育因子に富み、この成育因子の濃度は１０〜１００ｎｇ／ｍｌで変えることができる。このサイトカインはヘパリンの存在下で生物学的状態で安定化できる。栄養培地（再生剤）はＭＥＭ−αまたはＲＰＭＩ１６４０またはＩＭＤＭの商品名で市販されている。
【図面の簡単な説明】
【図１】対称軸線を有する六角形のケーシングで区画された細胞培養室の概念図。
【図２】本発明のバイオリアクタの培養室内での液体培地Ｆ１、Ｆ３の圧力勾配がｐ１＞ｐ３である「下降期」での動的循環状態を示す概念図で、異なるカットオフ限界値を有する２枚の濾過膜の間に配置された生物適合性のある培養物支持体はマイクロサポート（ｍａｃｒｏｓｕｐｐｏｒｔｓ）のベッドである。
【図３】本発明のバイオリアクタの培養室内での液体培地Ｆ１、Ｆ３の圧力勾配がｐ３＞ｐ１である「上昇期」での動的循環状態を示す概念図で、異なるカットオフ限界値を有する２枚の濾過膜の間に配置された生物適合性のある培養物支持体はマイクロサポート（ｍａｃｒｏｓｕｐｐｏｒｔｓ）のベッドである。
【図４】本発明のバイオリアクタの培養室内で圧力勾配がｐ１＞ｐ３である「下降期」での概念図。
【図５】本発明のバイオリアクタの培養室内で圧力勾配がｐ３＞ｐ１である「上昇期」での概念図。
【図６】バイオリアクタの配列を示す概念図で、調節−指令ブロックは示していない。
【図７】本発明のバイオリアクタの培養室内での液体培地Ｆ１、Ｆ３の圧力勾配がｐ１＞ｐ３である「下降期」での動的循環状態を示す概念図で、生物適合性のある培養物支持体を構成する手段は濾過膜、いわゆる培地である。
【図８】本発明のバイオリアクタの培養室内での液体培地Ｆ１、Ｆ３の圧力勾配がｐ３＞ｐ１である「上昇期」での動的循環状態を示す概念図で、生物適合性のある培養物支持体を構成する手段は濾過膜、いわゆる培地である。
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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