(57)【要約】本発明は、高分子量のＤｅｒｍａｔｏｐｈａｇｏｉｄｅｓタンパク質、このようなタンパク質をコードする核酸分子、およびこのようなタンパク質から誘導される治療薬および診断薬に関する。本発明は、約６０（ｋｄもしくはｋＤ）、７０ｋＤ、または約９８ｋＤ〜約１０９ｋＤの分子量を有する新規のタンパク質に関する。このようなタンパク質は、Ｄｅｒｍａｔｏｐｈａｇｏｉｄｅｓ族のダニのタンパク質アレルゲンの少なくとも１つのエピトープを含み、そして本明細書中で、Ｄｅｒ  ＨＭＷ−ｍａｐタンパク質と命名される。本発明はまた、全長タンパク質もしくは成熟タンパク質のフラグメントまたはペプチドであるタンパク質、ならびにこのようなタンパク質のいずれかの抗体、ミメトープ、またはムテインを提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離された核酸分子であって、以下：
（ａ）少なくとも約１５０ヌクレオチドを含む核酸分子であって、該核酸分子は、１×ＳＳＣおよび０％ホルムアミドを含む溶液中で、約５０℃の温度で、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４５からなる群から選択される核酸配列、および配列番号３３のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする核酸配列およびそれらの相補体を含む核酸分子にハイブリダイズする、少なくとも約１５０ヌクレオチドを含む、核酸分子；ならびに
（ｂ）（ａ）の核酸分子のいずれかのフラグメントを含む核酸分子であって、該フラグメントは、少なくとも約１５ヌクレオチドを含む、核酸分子、
からなる群から選択される、核酸分子。
【請求項２】
請求項１に記載の核酸分子であって、前記核酸分子は、Ｄｅｒ  ＨＭＷ−ｍａｐタンパク質をコードする核酸配列を含む、核酸分子。
【請求項３】
請求項１に記載の核酸分子であって、前記核酸分子は、ｎＤｅｒ９８１７５２、ｎＤｅｒｆ９８１６６５、ｎＤｅｒｆ９８１６０８、ｎＤｅｒｐ９８１６２１、ｎＤｅｒｐ９８１５２７、ｎＤｅｒｐ９８１４７０およびｎＤｅｒｆ６０５１０からなる群から選択される、核酸分子。
【請求項４】
請求項１に記載の核酸分子であって、前記核酸分子は、以下：
（ａ）配列番号１４、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４５からなる群から選択される核酸配列を含む、核酸分子；および
（ｂ）（ａ）の核酸分子の対立遺伝子改変体を含む、核酸分子、
からなる群から選択される、核酸分子。
【請求項５】
請求項１に記載の核酸分子であって、前記核酸分子が、以下：
（ａ）配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１８、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３８、配列番号４１、および配列番号４４からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする核酸配列を含む、核酸分子；ならびに
（ｂ）（ａ）のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする核酸分子の対立遺伝子改変体を含む、核酸分子、
からなる群から選択される、核酸分子。
【請求項６】
請求項１〜５に記載の核酸分子を含む、組換え分子。
【請求項７】
請求項１〜５に記載の核酸分子を含む、組換えウイルス。
【請求項８】
請求項１〜５に記載の核酸分子を含む、組換え細胞。
【請求項９】
単離されたタンパク質であって、該単離されたタンパク質は、以下：
（ａ）少なくとも約１５０ヌクレオチドを含む核酸分子であって、該核酸分子は、１×ＳＳＣおよび０％ホルムアミドを含む溶液中で、約５０℃の温度で、配列番号１６、配列番号１９、配列番号２２、配列番号３６、配列番号３９、配列番号４２、配列番号４５からなる群から選択される核酸配列、および配列番号３３のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする核酸配列の相補体、を含む核酸分子にハイブリダイズする、少なくとも約１５０ヌクレオチドを含む、核酸分子；ならびに
（ｂ）（ａ）の核酸分子のいずれかのフラグメントを含む核酸分子であって、該フラグメントは、少なくとも約１５ヌクレオチドを含む、核酸分子、
からなる群から選択される核酸によってコードされる、単離されたタンパク質。
【請求項１０】
前記タンパク質が、動物に投与される場合、Ｄｅｒ  ＨＭＷ−ｍａｐタンパク質に対して免疫応答を誘発する、請求項９に記載のタンパク質。
【請求項１１】
請求項９に記載のタンパク質であって、前記タンパク質が、以下：
（ａ）配列番号１４、配列番号１７、配列番号２０、配列番号３４、配列番号３７、配列番号４０、配列番号４３からなる群から選択される核酸配列、および配列番号３３のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする核酸配列のコーディング鎖、を有する核酸分子によってコードされるタンパク質；および
（ｂ）（ａ）の核酸分子のいずれかを含む核酸分子の対立遺伝子改変体を含む核酸分子によってコードされるタンパク質、
からなる群から選択される、タンパク質。
【請求項１２】
請求項９に記載のタンパク質であって、前記タンパク質が、以下：
（ａ）配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１８、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３８、配列番号４１、および配列番号４４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、タンパク質；ならびに
（ｂ）（ａ）のアミノ酸配列のいずれかを含むタンパク質をコードする核酸分子の対立改変体によってコードされる、タンパク質、
からなる群から選択される、タンパク質。
【請求項１３】
請求項９に記載のタンパク質に選択的に結合する、単離された抗体。
【請求項１４】
前記タンパク質が、ＩｇＥに選択的に結合する、請求項９に記載のタンパク質。
【請求項１５】
請求項９に記載のタンパク質であって、前記タンパク質が、少なくとも１つの同定される特性を有するエピトープを含み、該特性が、以下：
（ａ）該エピトープが、ペプチドのβ−消失に耐性であり；
（ｂ）該エピトープが、プロテイナーゼ−Ｋ消化に耐性であり；そして
（ｃ）該エピトープが、グリコシル化タンパク質を検出するために設計された試験に対して反応性である、特性からなる群から選択され、ここで、該エピトープが、ＩｇＥに結合し、該ＩｇＥが、ダニに対してアレルギー性のイヌ由来のイヌＩｇＥおよびダニに対してアレルギー性のネコ由来のネコＩｇＥからなる群から選択される、タンパク質。
【請求項１６】
ダニに対するアレルギー反応を処置するための治療組成物であって、該治療組成物が、以下：
（ａ）請求項９〜１２に記載の単離されたタンパク質；
（ｂ）該ダニアレルギー性タンパク質のミメトープ；
（ｃ）該ダニアレルギー性タンパク質のムテイン；
（ｄ）請求項１〜５に記載の単離された核酸分子；
（ｅ）該ダニアレルギー性タンパク質に対する抗体；および
（ｆ）該ダニアレルギー性タンパク質のＩｇＥに対する結合のインヒビター、からなる群から選択される脱感作化合物を含む、治療組成物。
【請求項１７】
請求項１６に記載の組成物であって、前記組成物が、賦形剤、アジュバント、およびキャリアからなる群から選択される成分をさらに含む、組成物。
【請求項１８】
前記脱感作化合物が、裸の核酸分子である、請求項１６に記載の組成物。
【請求項１９】
動物がダニに対して感受性であるか、またはアレルギー反応を有するか否かを試験するためのアッセイキットであって、該キットは、以下：
（ａ）請求項９〜１２に記載の単離されたタンパク質；および
（ｂ）該動物が、感受性であるかまたはアレルギー反応を有するか否かを決定するための手段であって、該手段が、ダニに対して感受性であるか、またはアレルギー反応を有する動物を同定するための該タンパク質の使用を含む、手段、を備える、アッセイキット。
【請求項２０】
ダニに対して感受性であるか、またはアレルギー反応を有する動物を同定するための方法であって、該方法は、以下の工程：
（ａ）請求項９〜１２に記載の単離されたタンパク質と、動物の抗体とを接触させる工程；および
（ｂ）該タンパク質と該抗体との間の免疫複合体形成を決定する工程であって、該免疫複合体の形成は、該動物が、感受性であるかまたは該アレルギー反応を有することを示す、工程、
を含む、方法。
【請求項２１】
ダニに対するアレルギー反応に対して、宿主動物を脱感作するための方法であって、該方法が、請求項１６に記載の治療組成物を前記動物に投与する工程を包含する、方法。
【請求項２２】
請求項２１に記載の方法であって、前記タンパク質が、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１８、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３８、配列番号４１、および配列番号４４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、方法。
【請求項２３】
請求項２１に記載の方法であって、前記治療組成物が、賦形剤、アジュバント、およびキャリアからなる群から選択される成分をさらに含む、方法。
【請求項２４】
ダニアレルギー性タンパク質を産生するための方法であって、該方法は、以下の工程：
少なくとも約１５０ヌクレオチドを含む核酸分子であって、該核酸分子が、１×ＳＳＣおよび０％ホルムアミドを含む溶液中で、約５０℃の温度で、配列番号１６、配列番号１９、配列番号２２、配列番号３６、配列番号３９、配列番号４２、配列番号４５からなる群から選択される核酸配列、および配列番号３３のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする核酸配列の相補体；および該核酸分子のいずれかのフラグメントを含む核酸分子であって、該フラグメントが、少なくとも約１５ヌクレオチドを含む核酸分子にハイブリダイズする、少なくとも約１５０ヌクレオチドを含む、核酸分子からなる群から選択される核酸分子で形質転換された細胞を培養する工程、を包含する、方法。
【請求項２５】
少なくとも１つの同定される特性を有する非タンパク質のエピトープを含む試薬であって、該特性が、以下：
（ａ）該エピトープが、ペプチドのβ−消失に対して耐性であり；
（ｂ）該エピトープが、プロテイナーゼ−Ｋ消化に耐性であり；そして
（ｃ）該エピトープが、グリコシル化タンパク質を検出するために設計された試験に対して反応性である、特性から選択され、ここで、該エピトープが、ＩｇＥに結合し、該ＩｇＥが、ダニに対してアレルギー性のイヌ由来のイヌＩｇＥおよびダニに対してアレルギー性のネコ由来のネコＩｇＥからなる群から選択される、試薬。
【請求項２６】
請求項２５に記載のエピトープに選択的に結合する、単離された抗体。
【請求項２７】
ダニに対するアレルギー反応を処置するための治療組成物であって、該治療組成物が、請求項２５に記載の試薬を含む脱感作化合物を含む、治療組成物。
【請求項２８】
動物が、ダニに対して感受性であるか、またはアレルギー反応を有するか否かを試験するためのアッセイキットであって、該キットは、請求項２５に記載の試薬と、該動物が感受性であるかまたはアレルギー反応を有するか否かを決定するための手段とを備え、該手段が、ダニに対して感受性であるか、またはアレルギー反応を有する動物を同定するための該試薬の使用を含む、アッセイキット。
【請求項２９】
ダニに対して感受性であるか、またはアレルギー反応を有する動物を同定するための方法であって、該方法は、以下：
（ａ）請求項２５の試薬と動物の抗体とを接触させる工程；および
（ｂ）該試薬と該抗体の間の免疫複合体を決定する工程であって、該免疫複合体の形成は、該動物が、感受性であるかまたはアレルギー反応を有することを示す、工程、
を包含する、方法。
【請求項３０】
ダニに対するアレルギー反応に対して宿主動物を脱感作するための方法であって、該方法が、請求項２５の試薬を含む脱感作化合物を含む治療組成物を、該動物に投与する工程、を包含する方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、高分子量のＤｅｒｍａｔｏｐｈａｇｏｉｄｅｓタンパク質、核酸分子、およびこのようなタンパク質に由来する治療薬および診断薬に関する。
【０００２】
（発明の背景）
アレルギー症状を媒介するイムノグロブリンＥ（ＩｇＥ）は、多くの動物を苦しめる。動物におけるＩｇＥ抗体産物は、例えば、アトピー性疾患、喘息および鼻炎を含む、病原性ＩｇＥ応答を誘導し得る。アレルゲンは、感受性のある個体において病原性ＩｇＥ応答を誘導する能力により特徴付けされるタンパク質またはペプチドである。
【０００３】
イエダニ（例えば、Ｄｅｒｍａｔｏｐｈａｇｏｉｄｅｓ  ｆａｒｉｎａｅおよびＤｅｒｍａｔｏｐｈａｇｏｉｄｅｓ  ｐｔｅｒｏｎｙｓｓｉｎｕｓ；それぞれ、Ｄｅｒ  ｆおよびＤｅｒ  ｐ）アレルゲンは、ＩｇＥ媒介の病因に関連した主要な原因物質である。以前の研究者は、ヒトにおけるイエダニアレルギーの２つの大群（第Ｉ群（Ｄｅｒ  ｆＩおよびＤｅｒ  ｐＩ、Ｍｒ２５，０００）ならびに第２群（Ｄｅｒ  ｆＩＩおよびＤｅｒ  ｐＩＩ、Ｍｒ１４，０００）；Ｃｈａｐｍａｎら、Ａｌｌｅｒｇｙ，第５２巻、３７−３７９頁、１９９７年）を同定している。以前の研究者は、以下のものについてのヌクレオチド配列および／またはアミノ酸配列を開示している：Ｄｅｒ  ｆＩ、Ｄｅｒ  ｆＩＩ、Ｄｅｒ  ｐＩ、およびＤｅｒ  ｐＩＩ、米国特許第５，５５２，１４２号（Ｔｈｏｍａｓら、１９９６年９月３日発行）、米国特許第５，４６０，９７７号（Ａｎｄｏら、１９９５年１０月２４日発行）、ＰＣＴ特許出願公開番号ＷＯ９５／２８４２４（Ｃｈｅｎら、１９９５年１０月２６日公開）、米国特許第５，４３３，９４８号（Ｔｈｏｍａｓら、１９９５年７月１８日発行）、ＰＣＴ特許出願公開番号ＷＯ９３／０８２７９号（Ｇａｒｍｅｎら、１９９３年３月４日発行）またはＣｈａｐｍａｎ、前出；Ｄｅｒ  ｐＩＩＩ、ＰＣＴ特許出願公開番号ＷＯ９５／１５９７６（Ｔｈｏｍａｓら、１９９５年６月１５日公開）；Ｄｅｒ  ｐＶＩＩ、ＰＣＴ特許出願公開番号ＷＯ９４／２０６１４（Ｔｈｏｍａｓら、１９９４年９月１５日）；４０キロダルトン（ｋｄ）Ｄｅｒ  ｆアレルゲン、米国特許第５，４０５，７５８号（Ｏｋａら、１９９５年４月１１日）、米国特許第５，３１４，９９１号（Ｏｋａら、１９９４年５月２４日）；熱ショックタンパク質（Ｈｓｐ７０）である７０−ｋｄ  Ｄｅｒ  ｆアレルゲン、Ａｋｉら、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、第１１５巻、４３５−４４０、１９９４；またはＮｏｌｉら、Ｖｅｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈ．，第５２巻、１４７−１５７頁、１９９６；ならびに９８−ｋｄ  Ｄｅｒ  ｆパラミオシン様アレルゲン、Ｔｓａｉら、Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，第１０２巻、２９５−３０３頁、１９９８年。これらの公開された配列は、本発明のダニアレルギー核酸分子もタンパク質も、そしてまたイヌ血清、ネコ血清、またはヒト血清中のＩｇＥ抗体と免疫反応性であるこのようなタンパク質の関連性も、開示も示唆も予想もしていない。
【０００４】
本発明の生成物およびプロセスは、ダニアレルギーの特異的検出および処置を提供する分野において必要とされる。
【０００５】
（発明の要旨）
本発明は、約６０（ｋｄもしくはｋＤ）７０ｋＤまたは約９８ｋＤ〜約１０９ｋＤの分子量を有する新規のタンパク質に関する。このようなタンパク質は、Ｄｅｒｍａｔｏｐｈａｇｏｉｄｅｓ属のダニのタンパク質アレルゲンの少なくとも１つのエピトープを含み、そして本明細書中でＤｅｒ  ＨＭＷ−ｍａｐタンパク質と命名される。好ましいタンパク質は、Ｄｅｒｍａｔｏｐｈａｇｏｉｄｅｓ  ｆａｒｉｎａｅまたはＤｅｒｍａｔｏｐｈａｇｏｉｄｅｓ  ｐｔｅｒｏｎｙｓｓｉｕｓタンパク質である。本発明はまた、全長タンパク質もしくは成熟タンパク質のフラグメントまたはペプチドであるタンパク質、ならびにこのようなタンパク質の任意の抗体、ミメトープ、またはムテインを提供する。本発明はまた、このようなタンパク質のいずれかをコードする核酸分子、ならびにこれらの相補体を提供する。本発明はまた、このようなタンパク質、核酸分子、抗体、ミメトープ、またはムテインを得るための方法、ならびに診断用途または治療用途にこのような化合物を使用するための方法を提供する。本発明はまた、ダニアレルギー性のイヌまたはネコのＩｇＥに結合する非タンパク質様エピトープを含む試薬、ならびにこのようなエピトープに対して惹起された抗体に関する。本発明はまた、このような非タンパク質様エピトープを含む治療組成物またはアッセイキット、ならびにダニに対するアレルギー性応答に感受性の動物を同定および／または脱感作する方法に関し、この方法は、本発明の非タンパク質様エピトープの使用を含む。
【０００６】
本発明の１つの実施形態は、以下の単離された核酸分子の少なくとも１つである：（ａ）少なくとも約１５０ヌクレオチドを含む核酸分子（ここで、このような核酸分子は、１×ＳＳＣおよび０％ホルムアミドを含む溶液中、約５０℃の温度にて、以下の核酸配列の少なくとも１つを含む核酸分子にハイブリダイズする）：配列番号１４、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４５、および配列番号３３のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする核酸配列、ならびにそれらの相補鎖；ならびに（ｂ）（ａ）の核酸分子のいずれかのフラグメントを含む核酸分子（ここで、このフラグメントは、少なくとも約１５ヌクレオチドを含む）。本発明はまた、このような核酸配列を含む組換え分子、組換えウイルスおよび組換え細胞、ならびにこれらを産生する方法を含む。
【０００７】
本発明の別の実施形態は、以下の核酸分子の少なくとも１つによってコードされる単離されたタンパク質である：（ａ）少なくとも約１５０ヌクレオチドを含む核酸分子（ここで、このような核酸分子は、１×ＳＳＣおよび０％ホルムアミドを含む溶液中、約５０℃の温度にて、以下の核酸配列の少なくとも１つを含む核酸分子にハイブリダイズする）：配列番号１６、配列番号１９、配列番号２２、配列番号３６、配列番号３９、配列番号４２、配列番号４５、および配列番号３３のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする核酸配列；ならびに（ｂ）（ａ）の核酸分子のいずれかのフラグメントを含む核酸分子（ここで、このフラグメントは、少なくとも約１５ヌクレオチドを含む）。本発明の単離されたタンパク質はまた、以下のアミノ酸配列の少なくとも１つを有するタンパク質をコードする核酸分子の相補体と、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする核酸分子によりコードされ得る：配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１８、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３８、配列番号４１、および配列番号４４。本発明はまた、本発明のタンパク質に選択的に結合する抗体、ならびにこのようなタンパク質または抗体を産生および使用する方法を含む。
【０００８】
本発明はまた、ダニに対するアレルギー応答を処置するための治療組成物を含む。このような治療組成物は、少なくとも１つの以下の脱感作化合物を含む：（ａ）本発明の単離された核酸分子；（ｂ）本発明の単離されたダニアレルギー性タンパク質；（ｃ）このようなダニアレルギー性タンパク質のミメトープ；このようなダニアレルギー性タンパク質のムテイン；（ｅ）このようなダニアレルギー性タンパク質に対する抗体；および（ｆ）ＩｇＥに対するダニアレルギー性タンパク質の結合のインヒビター。ダニに対するアレルギー性応答に対して、宿主動物を脱感作する方法もまた含まれる。このような方法は、本発明の治療組成物を動物に投与する行程を包含する。
【０００９】
本発明の１つの実施形態は、ある動物が、ダニに対するアレルギー性応答に感受性であるか否か、またはこの応答を有するか否かを試験するアッセイキットである。このようなキットは、本発明の単離されたタンパク質、ならびにこの動物が、このアレルギー性応答に感受性であるか否か、またはこの応答を有するか否かを決定するための手段を含む。このような手段は、ダニに対するアレルギー性応答に感受性であるか、またはこの応答を有する動物を同定するための、このようなタンパク質の使用を含む。本発明はまた、ダニに対するアレルギー性応答に感受性であるか、またはこの応答を有する動物を同定する方法を含む。このような方法は、以下の行程を包含する：（ａ）本発明の単離されたタンパク質を動物の抗体と接触させる行程；および（ｂ）タンパク質と抗体との間の免疫複合体形成を決定する行程（ここで、この免疫複合体の形成は、この動物がダニに対するアレルギー性応答に感受性であるか、またはこの応答を有することを示す）。
【００１０】
本発明は、以下の同定された特性の少なくとも１つを有する非タンパク質様エピトープを含む試薬を含む：（ａ）エピトープが、ペプチドのβ脱離に耐性である；（ｂ）エピトープがプロテインキナーゼＫ消化に耐性である；および（ｃ）エピトープがグリコシル化タンパク質を検出するために設計された試験に反応性である。このようなエピトープは、以下の抗体の少なくとも１つに結合する：ダニに対してアレルギー性のイヌ由来のイヌＩｇＥ、およびダニに対してアレルギー性のネコ由来のネコＩｇＥ。このような非タンパク質様エピトープおよびこのようなエピトープの誘導体を選択的に結合する単離された抗体もまた含まれる。
【００１１】
本発明はまた、本発明の非タンパク質様エピトープを含む治療組成物およびアッセイキット、ならびにダニに対するアレルギー応答に感受性の動物を同定および／または脱感作する方法に関し、この方法は、本発明の非タンパク質様エピトープの使用を包含する。
【００１２】
（発明の詳細な説明）
本発明は、約６０キロダルトン（ｋＤ）〜約１０９キロダルトンの範囲の分子量を有する単離されたタンパク質を提供し、これは、Ｄｅｒｍａｔｏｐｈａｇｏｉｄｅｓ属のダニ（特に、Ｄｅｒｍａｔｏｐｈａｇｏｉｄｅｓ  ｆａｒｉｎａｅ種および／またはＤｅｒｍａｔｏｐｈａｇｏｉｄｅｓ  ｐｔｅｒｏｎｙｓｓｉｕｓ種のダニ）のタンパク質アレルゲンのエピトープの少なくとも１つを含む。このようなタンパク質は、本明細書中でＤｅｒ  ＨＭＷ−ｍａｐタンパク質と呼ばれる。本発明は、さらに、Ｄｅｒ  ＨＭＷ−ｍａｐタンパク質をコードする核酸分子、Ｄｅｒ  ＨＭＷ−ｍａｐタンパク質に対する抗体、およびＤｅｒ  ＨＭＷ−ｍａｐタンパク質活性のインヒビターを、単離および同定する方法を含む。本明細書中で用いられる場合、用語「単離されたＤｅｒ  ＨＭＷ−ｍａｐタンパク質」とは、Ｄｅｒｍａｔｏｐｈａｇｏｉｄｅｓ、さらに好ましくは、Ｄｅｒｍａｔｏｐｈａｇｏｉｄｅｓ  ｆａｒｉｎａｅおよび／またはＤｅｒｍａｔｏｐｈａｇｏｉｄｅｓ  ｐｔｅｒｏｎｙｓｓｉｕｓ（これら自体は、その天然の供給源に由来するか、または、例えば、組換え核酸技術または化学合成を用いて産生される）由来のＤｅｒ  ＨＭＷ−ｍａｐタンパク質をいう。本発明には、Ｄｅｒ  ＨＭＷ−ｍａｐタンパク質に特異的に結合する免疫グロブリンを検出するための方法、ダニアレルゲンに対する病因を処置するための方法、および以下に開示されるような他の適用における、このタンパク質および抗体の使用もまた含まれる。本発明の産物およびプロセスは都合がよい。なぜならば、これらは、動物の体液における抗Ｄｅｒ  ＨＭＷ−ｍａｐ抗体の検出、およびＩｇＥまたは疾患に関与するＤｅｒ  ＨＭＷ−ｍａｐタンパク質活性の阻害を可能にするからである。
【００１３】
本発明の１つの実施形態は、以下を含む単離されたＤｅｒｍａｔｏｐｈａｇｏｉｄｅｓアレルギー性組成物である：（ａ）以下を包含する方法により産生される組成物：（１）ゲルろ過カラムにＤｅｒｍａｔｏｐｈａｇｏｉｄｅｓ抽出物の可溶性タンパク質を適用する行程；（２）ゲルろ過カラムから排除されたタンパク質を収集し、そしてこの排除されたタンパク質をアニオン交換カラムに適用する行程；および（３）約０．３Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）を有するアニオン交換カラムに結合したタンパク質を溶出して、Ｄｅｒｍａｔｏｐｈａｇｏｉｄｅｓアレルギー性組成物を得る行程；および（ｂ）行程（ａ）に関して産生されたタンパク質のペプチドを含む組成物（ここで、このアレルギー性組成物は、ＩｇＥに結合すること、Ｂリンパ球応答を刺激すること、およびＴリンパ球応答を刺激することを含む、生物学的機能を可能にする）。このようなＤｅｒｍａｔｏｐｈａｇｏｉｄｅｓアレルギー性組成物はまた、本明細書中でＤｅｒ  ＨＭＷ−ｍａｐ組成物ともいわれる。適切なゲルろ過カラムとしては、約５０ｋＤと約１５０ｋＤの間の分子量を有するタンパク質を排除し得る任意のゲルろ過カラムが挙げられる。好ましいゲルろ過カラムとしては、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−１００カラムが挙げられるが、これに限定されない。適切なアニオン交換カラムとしては、約ｐＩ６未満のｐＩを有するタンパク質に結合し得る任意のアニオン交換カラムが挙げられる。好ましいアニオン交換カラムとしては、Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムが挙げられるが、これに限定されない。本明細書中で用いられる場合、「Ｂリンパ球応答を刺激する」とは、動物において本発明のＤｅｒ  ＨＭＷ−ｍａｐにより優先的に誘導され、そしてＢリンパ球の活性を伴う、動物における体液性免疫応答の増加をいう。本明細書中で用いられる場合、「Ｔリンパ球応答を刺激する」とは、動物において本発明のＤｅｒ  ＨＭＷ−ｍａｐにより優先的に誘導され、そしてＴリンパ球の活性を伴う、動物における体液性免疫応答の増加をいう。
【００１４】
本発明の１つの実施形態は、Ｄｅｒ  ＨＭＷ−ｍａｐタンパク質を含む単離されたタンパク質である。用語（ある）（「ａ」または「ａｎ」）実体とは、１つ以上の実体をいうことについて特に言及する。例えば、（ある）タンパク質、（ある）核酸分子、（ある）抗体、（ある）インヒビター、（ある）化合物、または（ある）治療組成物とは、それぞれ、「１つ以上」または「少なくとも１つ」のタンパク質、「１つ以上」または「少なくとも１つ」の核酸分子、「１つ以上」または「少なくとも１つ」の抗体、「１つ以上」または「少なくとも１つ」のインヒビター、「１つ以上」または「少なくとも１つ」の化合物、あるいは「１つ以上」または「少なくとも１つ」の治療組成物をいう。それ自体では、用語「ある（「ａ」（または「ａｎ」））」、「１つ以上」、および「少なくとも１つ」とは、本明細書中で交換可能に用いられ得る。用語「含む」、「含有する」、および「有する」とは、交換可能に用いられ得ることについて特に言及する。本発明に従って、単離されたタンパク質、または生物学的に純粋なタンパク質は、その天然の環境から取り出されているタンパク質である。これ自体では、「単離された」および「生物学的に純粋な」とは、タンパク質が精製されている程度を反映する必要はない。本発明の単離されたタンパク質は、その天然の供給源から得られ得るか、組換えＤＮＡ技術を用いて生成され得るか、または化学合成により生成され得る。
【００１５】
本明細書中で用いられる場合、Ｄｅｒ  ＨＭＷ−ｍａｐタンパク質は、全長タンパク質、またはこのようなタンパク質の任意のホモログであり得る。本明細書中で用いられる場合、タンパク質とは、ポリペプチドまたはペプチドであり得る（これらの用語が、当業者に用いられる）。好ましくは、Ｄｅｒ  ＨＭＷ−ｍａｐタンパク質は、Ｄｅｒ  ＨＭＷ−ｍａｐタンパク質に対するＩｇＥ媒介性の病因を示す動物由来の主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）分子の存在下で、ＩｇＥ抗体により認識される（すなわち、本発明のタンパク質がＩｇＥ抗体に結合する）、Ｂリンパ球の表面上の抗体により認識される、そして／あるいはＴ細胞レセプターにより認識されるエピトープの少なくとも１つを含む、Ｄｅｒ  ＨＭＷ−ｍａｐタンパク質の少なくとも一部を含む。
【００１６】
本発明のペプチドは、ＩｇＥに結合し得る、ダニアレルゲンに対して動物を脱感作し得る、Ｂリンパ球応答を刺激し得る、そして／あるいはＴリンパ球応答を刺激し得る、本発明のＤｅｒ  ＨＭＷ−ｍａｐタンパク質を含む。好ましくは、本発明のペプチドは、Ｂリンパ球エピトープ、またはＴリンパ球エピトープを含む。Ｂリンパ球エピトープを有するペプチドは、抗体に結合し得る。Ｔリンパ球エピトープを有するペプチドは、ペプチドがＴ細胞レセプターを介してＴリンパ球を刺激し得るような様式でＭＨＣ分子に結合し得る。本発明に従って、Ｂリンパ球エピトープを含むペプチドは、約４残基〜約５０残基の長さ、好ましくは、約５残基〜約２０残基の長さであり得る。本発明に従って、Ｔリンパ球エピトープを含むペプチドは、約４残基〜約２０残基の長さ、好ましくは、約８残基〜約１６残基の長さであり得る。
【００１７】
本発明のＤｅｒ  ＨＭＷ−ｍａｐタンパク質（ホモログを含む）は、Ｄｅｒ  ＨＭＷ−ｍａｐタンパク質に対するアレルギー性応答を誘導し得るタンパク質の能力により、単純な方法で同定され得る。Ｄｅｒ  ＨＭＷ−ｍａｐタンパク質ホモログの例としては、Ｄｅｒ  ＨＭＷ−ｍａｐタンパク質が挙げられ、ここで、アミノ酸は、欠失（例えば、ペプチドのようなタンパク質の短縮型バージョン）、挿入、転換、置換、および／または誘導体化（例えば、グリコシル化、ホスホリル化、アセチル化、ミリストイル化、プレニル化、パルミトイル化、アミド化、および／またはグリセロホスファチジルイノシトールの付加による）されており、その結果、ホモログは、天然のＤｅｒ  ＨＭＷ−ｍａｐタンパク質に対するアレルギー応答を誘導し得る。
【００１８】
Ｄｅｒ  ＨＭＷ−ｍａｐタンパク質ホモログは、天然の対立遺伝子改変または天然の変異の結果であり得る。本発明のＤｅｒ  ＨＭＷ−ｍａｐタンパク質ホモログはまた、タンパク質に対する直接的改変、あるいは例えば、無作為変異もしくは標的化された変異をもたらす、古典的核酸技術もしくは組換え核酸技術を用いる、タンパク質をコードする遺伝子に対する改変を含むが、これらに限定されない、当該分野で公知の技術を用いて産生され得る。
【００１９】
本発明の１つの実施形態は、Ｄｅｒ  ＨＭＷ−ｍａｐ遺伝子であり、これは、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４３、および配列番号４５の核酸配列、ならびにこれらの核酸配列のいずれかの相補体を含む。これらの核酸配列は、本明細書中でさらに記載される。例えば、核酸配列（配列番号１４）は、Ｄｅｒ  ＨＭＷ−ｍａｐ遺伝子の核酸分子ｎＤｅｒｆ９８１７５２（この生成は実施例に開示される）として、本明細書中で示されるｃＤＮＡ（相補的ＤＮＡ）のコード鎖の縮重配列を示す。核酸分子ｎＤｅｒｆ９８１７５２は、明らかに全長コード領域を含む。配列番号１４の相補体（配列番号１６により本明細書中で示される）は、配列番号１４を有する鎖に相補的な鎖の核酸配列をいい、これは当業者により簡単に決定され得る。同様に、本発明の任意の核酸配列の核酸配列相補体とは、配列が引用される鎖に相補的である（すなわち、この鎖と二重鎖を形成し得る）核酸鎖の核酸配列をいう。核酸配列決定技術は全体として誤りをなくせないので、配列番号１４（ならびに本明細書中で示される他の核酸配列およびタンパク質配列）は、本発明のＤｅｒ  ＨＭＷ−ｍａｐタンパク質をコードする核酸分子の明確な核酸配列を示すことに注目すべきである。
【００２０】
別の実施形態では、Ｄｅｒ  ＨＭＷ−ｍａｐ遺伝子、または核酸分子は、配列番号１４または配列番号１６に類似するが同一ではない対立遺伝子改変体、あるいは本明細書中で引用される任意の他のＤｅｒ  ＨＭＷ−ｍａｐ核酸配列であり得る。例えば、配列番号１４または配列番号１６を含むＤｅｒ  ＨＭＷ−ｍａｐ遺伝子の対立遺伝子改変体は、配列番号１４および配列番号１６を含む遺伝子と、本質的に同じゲノムの遺伝子座（単数および複数）で生じる遺伝子であるが、これらは、例えば、変異または組換えにより生じる天然のバリエーションに起因して、類似するが同一ではない配列を有する。天然の選択は、代表的に、機能に影響する変異に対する選択であるので、対立遺伝子改変体（すなわち、引用される核酸配列に対応するか、または引用される核酸配列の対立遺伝子）は、通常、比較される遺伝子によりコードされるタンパク質の活性に類似する活性を有するタンパク質をコードする。遺伝子または核酸分子の対立遺伝子改変体はまた、（例えば、コントロール領域を調節する際に）遺伝子の５’または３’の非翻訳領域の変化を含み得るか、初期翻訳物の選択的スプライシングを伴って、それにより交互にエキソンを並列にし得る。対立遺伝子改変体は、当業者に周知であり、そして所定のチリダニ（例えば、Ｄｅｒｍａｔｏｐｈａｇｏｉｄｅｓ）内で天然に存在することが予測される。なぜならば、代表的ゲノムは、二倍体であり、そして有性生殖は、対立遺伝子の再分類を生じるからである。
【００２１】
本発明の１つの実施形態では、単離されたＤｅｒ  ＨＭＷ−ｍａｐタンパク質は、Ｄｅｒ  ＨＭＷ−ｍａｐタンパク質をコードする遺伝子にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする核酸分子によりコードされる。本発明のＤｅｒ  ＨＭＷ−ｍａｐタンパク質の最小のサイズは、対応する天然のタンパク質をコードする核酸分子の相補的配列と、安定なハイブリッドを形成し得る（すなわち、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする）核酸分子によりコードされるのに十分なサイズである。このようなタンパク質をコードする核酸分子のサイズは、核酸の組成、およびＤｅｒ  ＨＭＷ−ｍａｐ核酸分子と相補的核酸配列との間の％相同性に依存する。ストリンジェントな条件下で安定なハイブリッドを形成するために必要とされる相同性の範囲は、相同配列が所定の核酸分子の全体を通じて散在するか、または所定の核酸分子の別個の領域にクラスター化する（すなわち、局在化する）かに依存して変化し得ることが容易に理解される。
【００２２】
Ｄｅｒ  ＨＭＷ−ｍａｐタンパク質をコードする遺伝子と安定なハイブリッドを形成し得る核酸分子の最小のサイズは、この核酸分子がＧＣリッチである場合、代表的には、少なくとも約１２ヌクレオチド〜約１５ヌクレオチドの長さであり、そしてこれがＡＴリッチである場合、少なくとも約１５ヌクレオチド〜約１７塩基の長さである。本発明のＤｅｒ  ＨＭＷ−ｍａｐタンパク質ホモログをコードするために用いられる核酸分子の最小のサイズは、約１２ヌクレオチド〜約１８ヌクレオチドの長さ、好ましくは、約１２ヌクレオチドの長さ、約１５ヌクレオチドの長さ、または約１８ヌクレオチドの長さである。従って、本発明のＤｅｒ  ＨＭＷ−ｍａｐタンパク質ホモログの最小の長さは、約４〜約６アミノ酸の長さである。本発明のＤｅｒ  ＨＭＷ−ｍａｐタンパク質をコードする核酸分子の最小サイズに対して、特定の制限以外の制限はない。なぜならば、本発明の核酸分子は、ある遺伝子、遺伝子全体、または複数の遺伝子の一部を含み得るからである。本発明の核酸分子によりコードされるタンパク質の好ましいサイズは、このようなタンパク質の全長タンパク質、融合タンパク質、多価タンパク質、または機能的タンパク質のいずれが所望されるかに依存する。好ましくは、本発明の核酸分子によりコードされるタンパク質の好ましいサイズは、免疫応答を誘導するタンパク質の一部であり、これは、約３０アミノ酸、より好ましくは、約３５アミノ酸、そしてさらにより好ましくは、約４４アミノ酸の長さである。
【００２３】
ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、核酸分子がハイブリダイズし、そして数学的に規定され得る、遺伝子の規定された物理学的特性に基づいて決定される。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、当業者が非相同的な核酸分子間の優位な類似性を同定することを可能にする、実験パラメーターである。これらの条件は、当業者に周知である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  ＬａｂｓＰｒｅｓｓ、およびＭｅｉｎｋｏｔｈら、１９８４，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１３８，２６７−２８４を参照のこと。参考文献に詳細に説明されるように、ハイブリダイゼーション条件の決定は、イオン強度（Ｍ（モル／リットル））、ハイブリダイゼーション温度（℃）、核酸らせん不安定化剤（例えば、ホルムアミド）の濃度、最も短いハイブリッド二重鎖の平均の長さ（ｎ）、および未知の核酸分子がハイブリダイズするフラグメントのＧ＋Ｃ組成のパーセントを含む一組の変数の操作を伴う。少なくとも約１５０ヌクレオチドの核酸分子について、これらの変数は、標準的な数式に代入されて、所定の核酸分子の融解温度（すなわちＴｍ）を計算する。以下の式に規定されるように、Ｔｍは、２つの鎖の間が１００％相補性であるとみなされている、２つの相補的核酸分子鎖が解離する温度である：
Ｔｍ＝８１．５℃＋１６．６ｌｏｇＭ＋０．４１（Ｇ＋Ｃの％）−５００／ｎ−０．６１（ホルムアミドの％）。約５０ヌクレオチドよりも小さい核酸分子について、ハイブリッド安定性は、解離温度（Ｔｄ）（５０％の二重鎖が解離する温度として規定される）により規定される。これらのより小さな分子について、標準的なイオン強度での安定性は、以下の式により定義される：
Ｔｄ＝４（Ｇ＋Ｃ）＋２（Ａ＋Ｔ）。
【００２４】
Ｔｄより５℃低い温度が、完全に一致した分子間のハイブリダイゼーションを決定するために用いられる。
【００２５】
また、どれくらいの塩基対のミスマッチ（すなわち、比較される２つの核酸分子間の差異）が所定の位置の塩基の非相補性を含み、そしてギャップが、比較される核酸分子のいずれかの所定の位置での１つ以上の塩基の挿入または欠失に起因して、異なるサイズの核酸分子に関するＴｍまたはＴｄに影響するかも当業者に周知である。例えば、Ｔｍは、約１５０ｂｐよりも大きいハイブリッドに関して、１％のミスマッチの塩基対の各々について約１℃低下し、そしてＴｄは、約５０ｂｐよりも小さいハイブリッドに関して、ミスマッチの塩基対の各々について約５℃低下する。約５０〜約１５０塩基対の間のハイブリッドの条件は、経験的にかつ過度な実験なしに、当業者に周知の標準的な実験手順を用いて決定され得る。これらの単純な手順は、当業者に、特定の塩基対ミスマッチ％未満を有する核酸ハイブリッドのみがハイブリダイズするような、（例えば、塩濃度、ホルムアミド濃度、または温度を変化させることによる）ハイブリダイゼーション条件の設定を可能にさせる。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、約３０％未満の塩基対ミスマッチ（すなわち、約７０％以上の同一性）を有する分子間のハイブリダイゼーションを可能にさせる実験条件であることが、当業者により一般に理解される。当業者は、試験される所定の核酸分子が、約５０ヌクレオチド未満であるか、または約５０ヌクレオチドを越えるかを容易に決定し得、従って、ハイブリダイゼーション条件を決定するための適切な式を選択し得るので、当業者は、核酸分子が、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で所定の遺伝子とハイブリダイズするか否か、そして、同様に、核酸分子が、所望の量の塩基対ミスマッチを可能にするように設計された条件下でハイブリダイズするか否かを決定し得る。
【００２６】
ハイブリダイゼーション反応はしばしば、ハイブリダイズされるべき核酸分子を、膜のような固体支持体に付着させる工程、次いで、ハイブリダイゼーション溶液中に懸濁された標識核酸分子（代表的に、プローブと称される）とハイブリダイズさせる工程によって実施される。一般的なハイブリダイゼーション反応技術の例としては、周知のサザンブロッティング手順およびノーザンブロッティング手順が挙げられるが、これらに限定されない。代表的には、実際のハイブリダイゼーション反応は、ストリンジェントではない条件（すなわち、より低い温度および／またはより高い塩濃度）でなされ、次いで、高ストリンジェンシーを、所望のストリンジェンシーを達成するためにより高い温度および／またはより低い塩濃度の溶液中でこの膜を洗浄することによって達成する。
【００２７】
例えば、当業者が、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、Ｄｅｒｍａｔｏｐｈａｇｏｉｄｅｓ  ｆａｒｉｎａｅおよび／またはＤｅｒｍａｔｏｐｈａｇｏｉｄｅｓ  ｐｔｅｒｏｎｙｓｓｉｕｓの約１５０ｂｐ長の核酸分子とハイブリダイズする核酸分子を同定することを望む場合、以下の条件が好ましくは使用され得る。Ｄｅｒｍａｔｏｐｈａｇｏｉｄｅｓ  ｆａｒｉｎａｅおよびＤｅｒｍａｔｏｐｈａｇｏｉｄｅｓ  ｐｔｅｒｏｎｙｓｓｉｕｓのＤＮＡの平均Ｇ＋Ｃ含量は、約３９％である。未知の核酸分子が支持体膜に付着され、そしてこの１５０ｂｐのプローブが標識される（例えば、放射性タグを用いて）。ハイブリダイゼーション反応は、２×ＳＳＣおよび０％ホルムアミドを含む溶液中において約３７℃の温度（低ストリンジェンシー条件）で実施され得る。異なる濃度のＳＳＣの溶液は、所望される濃度のＳＳＣを得るように２０×ＳＳＣ（１リットルの水中において、１７５．３ｇのＮａＣｌおよび約８８．２ｇのクエン酸ナトリウム（ｐＨ７））のストック溶液を希釈することによって、当業者により作製され得る。高ストリンジェンシーのハイブリダイゼーションを達成するために、当業者は、３０％までの塩基対ミスマッチを許容するために必要とされる洗浄条件を算出する。例えば、１×ＳＳＣおよび０％ホルムアミドを含む洗浄溶液中において、完全なハイブリッドのＴｍは約８０℃である：
８１．５℃＋１６．６ｌｏｇ（０．１５Ｍ）＋（０．４１×３９）−（５００／１５０）−（０．６１×０）＝８０．４℃。
従って、約３０％の塩基対ミスマッチを有する核酸分子とのハイブリダイゼーションを達成するために、ハイブリダイゼーションの洗浄を、約５０℃の温度で実施する。従って、本明細書中に開示される所望される％塩基対ミスマッチ、式およびＧ／Ｃ含量に基づいて、さらなるハイブリダイゼーション温度を算出することは当業者の技術の範囲内である。例えば、本明細書中において特定される配列を有する本発明の核酸分子に対するハイブリダイゼーションについて試験されるべき核酸分子は１５０ヌクレオチドよりも長いので、３０％までの塩基対ミスマッチを許容するハイブリダイゼーション反応のためのＴｍは、５０℃から有意に変動しないことが当業者に理解される。
【００２８】
さらに、２つの核酸配列間の類似性程度を決定するための市販のコンピュータープログラムが存在することが当該分野で公知である。これらのコンピュータープログラムは、ハイブリッド核酸分子間の％同一性ならびにギャップの数および長さを決定するための種々の公知の方法を含む。アミノ酸配列間およびまた核酸配列間の％同一性を決定するための好ましい方法は、核酸配列またはアミノ酸配列を比較および分析するために設計された市販の１つ以上のコンピュータープログラムを使用する分析を含む。これらのコンピュータープログラムは、以下を含むが、これらに限定されない：ＧＣＧＴＭ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩから入手可能）、ＤＮＡｓｉｓＴＭ（Ｈｉｔａｃｈｉ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｓａｎ  Ｂｒｕｎｏ，ＣＡから入手可能）およびＭａｃＶｅｃｔｏｒＴＭ（Ｅａｓｔｍａｎ  Ｋｏｄａｋ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ  Ｈａｖｅｎ，ＣＴから入手可能）。アミノ酸配列間およびまた核酸配列間の％同一性を決定するための好ましい方法は、プログラムＤＮＡｓｉｓバージョン２．１における最大マッチによる比較機能（Ｃｏｍｐａｒｅ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｂｙ  ｍａｘｉｍｕｍ  ｍａｔｃｈｉｎｇ）をデフォルトパラメーターで用いる使用を含む。
【００２９】
本発明の１つの実施形態は、Ｄｅｒ  ＨＭＷ−ｍａｐタンパク質を含む。１つの実施形態では、本発明のＤｅｒ  ＨＭＷ−ｍａｐタンパク質は、還元型１２％ＴｒｉｓグリシンＳＤＳ−ＰＡＧＥに提示された場合に、図１に示されるように、約９８ｋＤ〜約１０９ｋＤの分子量のバンドとして移動するタンパク質を含む。図１におけるこのバンドは、タンパク質を、実施例１に詳細に記載された方法を使用してＤｅｒｍａｔａｐｈａｇｏｉｄｅｓ  ｆａｒｉｎａｅダニから収集する場合に得られる。好ましくは、本発明のＤｅｒ  ＨＭＷ−ｍａｐタンパク質は、約９０ｋＤ〜約１２０ｋＤ、そしてより好ましくは、約９８ｋＤ〜約１０９ｋＤの範囲の分子量を有するタンパク質を含む。本発明の好ましいＤｅｒ  ＨＭＷ−ｍａｐタンパク質は、ｍａｐＡおよびｍａｐＢを含む。この同定を、実施例の節に記載する。
【００３０】
別の実施形態では、本発明のＤｅｒ  ＨＭＷ−ｍａｐタンパク質は、還元型１４％ＴｒｉｓグリシンＳＤＳ−ＰＡＧＥに提示された場合に、図２に示されるように、約６０ｋＤの分子量のバンドとして移動するタンパク質を含む。図２におけるこのバンドは、タンパク質を、実施例９に詳細に記載された方法を使用してＤｅｒｍａｔａｐｈａｇｏｉｄｅｓ  ｆａｒｉｎａｅダニから収集する場合に得られる。好ましくは、本発明のＤｅｒ  ＨＭＷ−ｍａｐタンパク質は、約６０ｋＤの分子量を有するタンパク質を含む。本発明の好ましいＤｅｒ  ＨＭＷ−ｍａｐタンパク質は、ｍａｐＤを含む。この同定を、実施例の節に記載する。
【００３１】
別の実施形態では、好ましいＤｅｒ  ＨＭＷ−ｍａｐタンパク質は、少なくとも約５０ヌクレオチドであるかまたは約１５０ヌクレオチドであり、かつ、好ましくは約４０％以下の塩基対ミスマッチを許容する条件下、より好ましくは約３５％以下の塩基対ミスマッチを許容する条件下、より好ましくは約３０％以下の塩基対ミスマッチを許容する条件下、より好ましくは約２５％以下の塩基対ミスマッチを許容する条件下、より好ましくは約２０％以下の塩基対ミスマッチを許容する条件下、より好ましくは約１５％以下の塩基対ミスマッチを許容する条件下、より好ましくは約１０％以下の塩基対ミスマッチを許容する条件下、そしてさらにより好ましくは約５％以下の塩基対ミスマッチを許容する条件下において、配列番号１６、配列番号１９、配列番号２２、配列番号３６、配列番号３９、配列番号４２、配列番号４５、および配列番号３３のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする核酸配列、それらの相補体からなる群より選択される核酸分子とハイブリダイズする核酸分子によってコードされるタンパク質を含む。
【００３２】
本発明の別の実施形態は、以下からなる群より選択される核酸分子によってコードされるＤｅｒ  ＨＭＷ−ｍａｐタンパク質を含む：少なくとも約１５０ヌクレオチドを含む核酸分子であって、ここで、少なくとも約１５０ヌクレオチドを含むこの核酸分子は、１×ＳＳＣおよび０％ホルムアミドを含む溶液中において約５０℃の温度で、配列番号１６、配列番号１９、配列番号２２、配列番号３６、配列番号３９、配列番号４２、配列番号４５、および配列番号３３のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする核酸配列の相補体、ならびに少なくとも約１５ヌクレオチドを含む上記の任意の核酸分子のフラグメントを含む核酸分子からなる群より選択される核酸配列に対してハイブリダイズする。
【００３３】
本発明のさらに別の好ましいＤｅｒ  ＨＭＷ−ｍａｐタンパク質は、配列番号１４、配列番号１７、配列番号２０、配列番号３４、配列番号３７、配列番号４０、配列番号４３および／または配列番号３３のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする核酸配列の相補体の核酸配列を有する核酸分子に対して、好ましくは少なくとも約６０％同一、より好ましくは少なくとも約６５％同一、より好ましくは少なくとも約７０％同一、より好ましくは少なくとも約７５％同一、より好ましくは少なくとも約８０％同一、より好ましくは少なくとも約８５％同一、より好ましくは少なくとも約９０％同一、そしてさらにより好ましくは少なくとも約９５％同一である核酸分子によってコードされるタンパク質を含む。このようなタンパク質のフラグメントもまた好ましい。本明細書中で使用される場合の％同一性は、プログラムＤＮＡｓｉｓバージョン２．１における最大マッチによる比較機能（Ｃｏｍｐａｒｅ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｂｙ  ｍａｘｉｍｕｍ  ｍａｔｃｈｉｎｇ）をデフォルトパラメーターで用いて使用することにより決定される。
【００３４】
本発明のさらなる好ましいＤｅｒ  ＨＭＷ−ｍａｐタンパク質としては、以下が挙げられる：配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１８、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３８、配列番号４１、配列番号４４のアミノ酸配列を有するタンパク質、および配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１８、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３８、配列番号４１、配列番号４４のアミノ酸配列を有するタンパク質のホモログを含むタンパク質であって、ここでこのようなホモログは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１８、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３８、配列番号４１、配列番号４４のアミノ酸配列を有するタンパク質に対する免疫応答を誘発する少なくとも１つのエピトープを含む、タンパク質。同様に、配列番号１４、配列番号１７、配列番号２０、配列番号３４、配列番号３７、配列番号４０、配列番号４３の核酸配列および／または配列番号３３のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする核酸配列、あるいはそれらのホモログによってコードされる核酸分子によってコードされるタンパク質もまた好ましい。
【００３５】
本発明の好ましい単離されたタンパク質は、以下の核酸分子のなかの少なくとも１つによりコードされるタンパク質である：ｎＤｅｒｆ９８１７５２、ｎＤｅｒｆ９８１６６５、ｎＤｅｒｆ９８１６０８、ｎＤｅｒｐ９８１６２１、ｎＤｅｒｐ９８１５２７、ｎＤｅｒｐ９８１４７０、ｎＤｅｒｆ６０５１０、またはこれらの任意の核酸分子の対立遺伝子改変体。別の好ましい単離されたタンパク質は、配列番号１４、配列番号１７、配列番号２０、配列番号３４、配列番号３７、配列番号４０、配列番号４３の核酸配列を有する核酸分子によってコードされるか、またはこれらの列挙された任意の核酸分子の対立遺伝子改変体によってコードされるタンパク質である。
【００３６】
配列番号１４（ｎＤｅｒｆ９８１７５２のコード鎖）の翻訳により、本明細書中でＰＤｅｒｆ９８５５５と称される約５５５アミノ酸のタンパク質が生じ、このアミノ酸配列は配列番号１５に提示され、最初のインフレームコドンは、配列番号１４のヌクレオチド１〜ヌクレオチド３にわたると考えられる。配列番号１４の相補鎖を、本明細書中では配列番号１６として提示する。ＰＤｅｒｆ９８５５５のアミノ酸配列は、ｎＤｅｒｆ９８１６６５の核酸分子によってコードされ、この核酸分子は、配列番号１７に示されるコード鎖および配列番号１９に示される相補鎖を有する。配列番号１５の分析は、ほぼアミノ酸１〜ほぼアミノ酸１９に及ぶシグナルペプチドの存在を示唆している。本明細書中でＰＤｅｒｆ９８５３６と称される提案された成熟タンパク質は、約５３６アミノ酸を含む。この配列は、本明細書中で配列番号２１として表され、そして配列番号２０（コード鎖）および配列番号２２（相補鎖）により表される、本明細書中でｎＤｅｒｆ９８１６０８と称される核酸分子によってコードされる。
【００３７】
配列番号３４（ｎＤｅｒｐ９８１６２１のコード鎖）の翻訳により、本明細書中でＰＤｅｒｐ９８５０９と称される約５０９アミノ酸のタンパク質が生じ、このアミノ酸配列は配列番号３５に提示され、最初のインフレームコドンは、配列番号３４のヌクレオチド１４〜ヌクレオチド１６にわたると考えられる。配列番号３４の相補鎖を、本明細書中では配列番号３６として提示する。ＰＤｅｒｐｆ９８５０９のアミノ酸配列は、ｎＤｅｒｐ９８１５２７の核酸分子によってコードされ、この核酸分子は、配列番号３７に示されるコード鎖および配列番号３９に示される相補鎖を有する。配列番号３５の分析は、ほぼアミノ酸１〜ほぼアミノ酸１９に及ぶシグナルペプチドの存在を示唆している。本明細書中でＰＤｅｒｐ９８４９０と称される提案された成熟タンパク質は、約４９０アミノ酸を含む。この配列は、本明細書中で配列番号４１として表され、そして配列番号４０（コード鎖）および配列番号４２（相補鎖）により表される、本明細書中でｎＤｅｒｐ９８１４７０と称される核酸分子によってコードされる。
【００３８】
Ｄ．ｆａｒｉｎａｅ  ６０−ｋＤ抗原タンパク質の部分をコードする核酸分子である、配列番号４３（ｎＤｅｒｆ６０５１０のコード鎖）の翻訳により、本明細書中でＰＤｅｒｆ６０１７０と称される約１７０アミノ酸のタンパク質が生じ、このアミノ酸配列は、配列番号４４として提示され、最初のインフレームコドンは、配列番号４３のヌクレオチド１〜ヌクレオチド３にわたると考えられる。配列番号４３に対する相補配列は、本明細書中で配列番号４５として表される。
【００３９】
本発明の好ましいＤｅｒ  ＨＭＷ−ｍａｐタンパク質は、ＰＤｅｒｆ９８５５５と、少なくとも約４５％、好ましくは少なくとも約５０％、より好ましくは少なくとも約５５％、さらにより好ましくは少なくとも約６０％、さらにより好ましくは少なくとも約６５％、さらにより好ましくは少なくとも約７０％、さらにより好ましくは少なくとも約７５％、さらにより好ましくは少なくとも約８０％、さらにより好ましくは少なくとも約８５％、さらにより好ましくは少なくとも約９０％、そしてさらにより好ましくは約９５％同一であるタンパク質を含む。より好ましいのは、ＰＤｅｒｆ９８５５５、ＰＤｅｒｆ９８５３６、ＰＤｅｒｐ９８５０９、ＰＤｅｒｐ９８４９０、および／またはＰＤｅｒｆ６０１７０を含むＤｅｒ  ＨＭＷ−ｍａｐタンパク質；ならびにＰＤｅｒｆ９８５５５、ＰＤｅｒｆ９８５３６、ＰＤｅｒｐ９８５０９、ＰＤｅｒｐ９８４９０、および／またはＰＤｅｒｆ６０１７０のタンパク質をコードする核酸分子の対立遺伝子改変体によってコードされるタンパク質である。
【００４０】
本発明の他の好ましいＤｅｒ  ＨＭＷ−ｍａｐタンパク質は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１８、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３８、配列番号４１、および／または配列番号４４のアミノ酸配列と、少なくとも約４５％、好ましくは少なくとも約５０％、より好ましくは少なくとも約５５％、さらにより好ましくは少なくとも約６０％、さらにより好ましくは少なくとも約６５％、さらにより好ましくは少なくとも約７０％、さらにより好ましくは少なくとも約７５％、さらにより好ましくは少なくとも約８０％、さらにより好ましくは少なくとも約８５％、さらにより好ましくは少なくとも約９０％、そしてさらにより好ましくは約９５％同一であるアミノ酸配列を含むタンパク質を含む。より好ましいのは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１８、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３８、配列番号４１、および／または配列番号４４のアミノ酸配列を含むＤｅｒ  ＨＭＷ−ｍａｐタンパク質；ならびに配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１８、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３８、配列番号４１、および／または配列番号４４のアミノ酸配列を有するＤｅｒ  ＨＭＷ−ｍａｐタンパク質をコードする核酸分子の対立遺伝子改変体によってコードされるＤｅｒ  ＨＭＷ−ｍａｐタンパク質である。
【００４１】
本発明の１つの実施形態では、Ｄｅｒ  ＨＭＷ−ｍａｐタンパク質は、配列番号１５、配列番号３５、および／または配列番号４４のアミノ酸を含み（配列番号１５、配列番号３５、および／または配列番号４４のアミノ酸配列からなるタンパク質、それらのフラグメント、融合タンパク質、および多価タンパク質を含むが、これらに限定されない）、そして配列番号１５、配列番号３５、および／または配列番号４４のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする核酸分子の対立遺伝子改変体によってコードされるタンパク質を含む。
【００４２】
１つの実施形態では、好ましいＤｅｒ  ＨＭＷ−ｍａｐタンパク質は、少なくとも約３５アミノ酸長、好ましくは少なくとも約５０アミノ酸長、より好ましくは少なくとも約１００アミノ酸長、より好ましくは少なくとも約２００アミノ酸長、さらにより好ましくは少なくとも約２５０アミノ酸長のアミノ酸配列を含む。この実施形態において、本発明の好ましいＤｅｒ  ＨＭＷ−ｍａｐタンパク質は、配列番号１５の少なくとも一部を含むアミノ酸配列を有する。別の実施形態では、好ましいＤｅｒ  ＨＭＷ−ｍａｐタンパク質は、全長タンパク質（すなわち、全長コード領域によってコードされるタンパク質）を含む。
【００４３】
本発明のさらなる好ましいＤｅｒ  ＨＭＷ−ｍａｐタンパク質は、ｎＤｅｒｆ９８１７５２、ｎＤｅｒｆ９８１６６５、ｎＤｅｒｆ９８１６０８、ｎＤｅｒｐ９８１６２１、ｎＤｅｒｐ９８１５２７、ｎＤｅｒｐ９８１４７０、およびｎＤｅｒｆ６０５１０の少なくとも一部を含む核酸分子によってコードされるタンパク質、ならびにこのような核酸分子の対立遺伝子改変体によってコードされるＤｅｒ  ＨＭＷ−ｍａｐタンパク質を含む。
【００４４】
また好ましいのは、配列番号１４、配列番号１７、配列番号２０、配列番号３４、配列番号３７、配列番号４０、配列番号４３および／または配列番号３３のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする核酸配列、ならびにこれらの核酸分子の対立遺伝子改変体の少なくとも一部を含む核酸配列を有する核酸分子によってコードされるＤｅｒ  ＨＭＷ−ｍａｐタンパク質である。
【００４５】
別の実施形態では、本発明の好ましいＤｅｒ  ＨＭＷ−ｍａｐタンパク質は、少なくとも約１２ヌクレオチド、好ましくは、少なくとも約１６ヌクレオチド、より好ましくは、少なくとも約１８ヌクレオチド、より好ましくは、少なくとも約２０ヌクレオチド、より好ましくは、少なくとも約２５ヌクレオチド、より好ましくは、少なくとも約５０ヌクレオチド、より好ましくは、少なくとも約１００ヌクレオチド、より好ましくは、少なくとも約３５０ヌクレオチド、より好ましくは、少なくとも約４５０ヌクレオチド、より好ましくは、少なくとも約５００ヌクレオチド、そしてさらにより好ましくは、少なくとも約８００ヌクレオチドを含む核酸分子によってコードされる。この実施形態に含まれるのは、ｎＤｅｒｆ９８１７５２、ｎＤｅｒｐ９８１６２１、および／またはｎＤｅｒｆ６０５１０の少なくとも部分によってコードされるＤｅｒ  ＨＭＷ−ｍａｐタンパク質であるか、あるいはこれらの核酸分子の対立遺伝子改変体によってコードされるＤｅｒ  ＨＭＷ−ｍａｐタンパク質である。さらに別の実施形態では、本発明の好ましいＤｅｒ  ＨＭＷ−ｍａｐタンパク質は、見かけ上全長のＤｅｒ  ＨＭＷ−ｍａｐコード領域を含む核酸分子（すなわち、見かけ上全長のＤｅｒ  ＨＭＷ−ｍａｐタンパク質をコードする核酸分子）によってコードされる。
【００４６】
本発明のＤｅｒ  ＨＭＷ−ｍａｐタンパク質の１つの実施形態は、１つ以上の融合セグメントに結合されたＤｅｒ  ＨＭＷ−ｍａｐタンパク質含有ドメインを含む融合タンパク質である。本発明での使用に適切な融合セグメントとしては、タンパク質の安定性を増強し得るセグメント；Ｄｅｒ  ＨＭＷ−ｍａｐタンパク質に対する免疫応答を増強するための免疫増強物質として作用し得るセグメント、Ｄｅｒ  ＨＭＷ−ｍａｐタンパク質に対するＩｇＥ応答を減少し得るセグメント；および／またはＤｅｒ  ＨＭＷ−ｍａｐタンパク質の精製（例えば、アフィニティクロマトグラフィーによる）を補助し得るセグメントが挙げられるが、これらに限定されない。適切な融合セグメントは、所望される機能（例えば、増加した安定性の付与、タンパク質に対する増加した免疫原性の付与、ＩｇＥ応答の減少、および／またはタンパク質精製の単純化）を有する任意のサイズのドメインであり得る。融合セグメントは、このタンパク質のＤｅｒ  ＨＭＷ−ｍａｐタンパク質含有ドメインのアミノ末端および／またはカルボキシル末端に結合され得、そしてＤｅｒ  ＨＭＷ−ｍａｐタンパク質の簡単な回収を可能にするために、切断に対して感受性であり得る。融合タンパク質は、好ましくは、Ｄｅｒ  ＨＭＷ−ｍａｐタンパク質含有ドメインのカルボキシル末端および／またはアミノ末端のいずれかに結合された融合セグメントを含むタンパク質をコードする融合核酸分子で形質転換された組換え細胞を培養することによって生成される。好ましい融合セグメントとしては、以下が挙げられる：金属結合ドメイン（例えば、ポリ−ヒスチジンセグメント）；免疫グロブリン結合ドメイン（例えば、プロテインＡ；プロテインＧ；Ｔ細胞；Ｂ細胞；Ｆｃレセプターまたは補体タンパク質の抗体結合ドメイン）；糖結合ドメイン（例えば、マルトース結合ドメイン）；「タグ」ドメイン（例えば、ガラクトシダーゼ、ｓｔｒｅｐタグペプチド、このドメインに結合する化合物を使用して精製され得る他のドメイン（例えば、モノクローナル抗体）の少なくとも一部分）；および／またはリンカーおよび酵素ドメイン（例えば、リンカーによって、Ｄｅｒ  ＨＭＷ−ｍａｐタンパク質に連結されたアルカリホスファターゼドメイン）。より好ましい融合セグメントとしては、以下が挙げられる：金属結合ドメイン（例えば、ポリ−ヒスチジンセグメント）；マルトース結合ドメイン；ｓｔｒｅｐタグペプチド（例えば、Ｂｉｏｍｅｔｒａ、Ｔａｍｐａ，ＦＬから入手され得るペプチド）；ファージＴ７  Ｓ１０ペプチド。
【００４７】
別の実施形態では、本発明のＤｅｒ  ＨＭＷ−ｍａｐタンパク質はまた、１つ以上のアレルゲンから動物を脱感作し得る少なくとも１つのさらなるタンパク質セグメントを含む。このような多価の脱感作タンパク質は、２つ以上の核酸ドメインを含む核酸分子で形質転換された細胞を培養することによって生成され得、この２つ以上の核酸ドメインは、生じる核酸分子が、アレルゲンから動物を脱感作し得る少なくとも２つの脱感作化合物を含む多価の脱感作化合物として発現されるような様式で、共に連結されている。
【００４８】
多価の脱感作化合物の例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：１つ以上のアレルゲン（例えば、植物アレルゲン、動物アレルゲン、寄生生物アレルゲン、または外寄生生物アレルゲン）によって引き起こされるアレルギーに対して脱感作する１つ以上の化合物に対して結合された、本発明のＤｅｒ  ＨＭＷ−ｍａｐタンパク質。アレルゲンとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：イネ科草本、メドーフェスキュー（Ｍｅａｄｏｗ  Ｆｅｓｃｕｅ）、ギシギシ（Ｃｕｒｌｙ  Ｄｏｃｋ）、オオバコ（ｐｌａｎｔａｉｎ）、メキシカンファイアーブッシュ（Ｍｅｘｉｃａｎ  Ｆｉｒｅｂｕｓｈ）、シロザ（Ｌａｍｂ’ｓ  Ｑｕａｒｔｅｒ）、アカザ（ｐｉｇｗｅｅｄ）、ブタクサ（ｒａｇｗｅｅｄ）、セージ（ｓａｇｅ）、ニレ（ｅｌｍ）、オナモミ（ｃｏｃｋｌｅｂｕｒ）、トリネコバカエデ（Ｂｏｘ  Ｅｌｄｅｒ）、クルミ（ｗａｌｎｕｔ）、ハコヤナギ（ｃｏｔｔｏｎｗｏｏｄ）、トネリコ（ａｓｈ）、シラカンバ（ｂｉｒｃｈ）、ヒマラヤスギ（ｃｅｄａｒ）、オーク（ｏａｋ）、クワ（ｍｕｌｂｅｒｒｙ）由来の植物（ｐａｎｔ）アレルゲン、ゴキブリ、Ｄｅｒｍａｔｏｐｈａｇｏｉｄｅｓ、Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ、Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ、Ｈｅｌｍｉｎｔｈｏｓｐｏｒｉｕｍ、Ｍｕｃｏｒ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ、Ｐｕｌｌｕｌａｒｉａ、Ｒｈｉｚｏｐｕｓおよび／またはＴｒｉｃｏｐｈｙｔｏｎ；蠕虫由来の寄生生物アレルゲン；あるいは、クモ形綱、昆虫（ノミ、マダニ、ハエ、カ、スナバエ、ブユ（ｂｌａｃｋ  ｆｌｙ）、ウマバエ、ノサシバエ（ｈｏｒｎ  ｆｌｙ）、アブ、ツェツェバエ、サシバエ（ｓｔａｂｌｅ  ｆｌｙ）、ハエウジ病原因バエ（ｍｙｉａｓｉｓ−ｃａｕｓｉｎｇ  ｆｌｙ）および噛み付きブユ（ｂｉｔｉｎｇ  ｇｎａｔｓ）、アリ、クモ、シラミ；ダニならびに半翅類昆虫を含む）およびヒル型類（ｌｅｅｃｈ）由来の外寄生生物アレルゲン。
【００４９】
本発明はまた、本発明のＤｅｒ  ＨＭＷ−ｍａｐタンパク質のマイムトープ（ｍｉｍｅｔｏｐｅ）を含む。本明細書中で使用される場合、本発明のＤｅｒ  ＨＭＷ−ｍａｐタンパク質のマイムトープとは、このようなＤｅｒ  ＨＭＷ−ｍａｐタンパク質の活性（例えば、Ｄｅｒ  ＨＭＷ−ｍａｐタンパク質に対する免疫応答を誘導するために結合する能力）を模擬し得る任意の化合物をいい、これはしばしば、このマイムトープが、Ｄｅｒ  ＨＭＷ−ｍａｐタンパク質を模擬する構造を有することに起因する。しかし、マイムトープは、そのマイムトープがＤｅｒ  ＨＭＷ−ｍａｐタンパク質を機能的に模擬する限り、Ｄｅｒ  ＨＭＷ−ｍａｐタンパク質に類似した構造を有する必要はないことに留意されるべきである。マイムトープは、以下であり得るが、これらに限定されない：分解に対するその感受性を減少するように改変されたペプチド；抗イディオタイプ抗体および／または触媒性抗体、あるいはそれらのフラグメント；単離されたタンパク質の非タンパク質様免疫原性部分（例えば、糖質構造）；合成または天然の有機分子または無機分子（核酸を含む）；および／または任意の他のペプチド模擬化合物。本発明のマイムトープは、本発明のＤｅｒ  ＨＭＷ−ｍａｐタンパク質に関してコンピューターにより生成される構造を使用して設計され得る。マイムトープはまた、分子（例えば、オリゴヌクレオチド、ペプチドまたは他の有機分子）の無作為サンプルを生成し、そしてこのようなサンプルを、対応する結合パートナー（例えば、抗Ｄｅｒ  ＨＭＷ−ｍａｐタンパク質抗体）を使用してアフィニティクロマトグラフィー技術によりスクリーニングすることによって獲得され得る。マイムトープはまた、例えば、合理的薬物設計によって獲得され得る。合理的薬物設計手順では、本発明の化合物の三次元構造を、例えば、核磁気共鳴（ＮＭＲ）またはＸ線結晶学によって分析し得る。次いで、この三次元構造を使用して、例えば、コンピューターモデリングによって潜在的なマイムトープの構造を予測し得る。次いで、この予測されたマイムトープ構造を、例えば、化学合成、組換えＤＮＡ技術によってか、または天然の供給源からマイムトープを単離することによって、生成し得る。Ｄｅｒ  ＨＭＷ−ｍａｐタンパク質のマイムトープの特定の例としては、抗イディオタイプ抗体、ＳｅｌｅｘＴＭ技術を使用して生成されるオリゴヌクレオチド、ペプチドライブラリーの無作為スクリーニングによって同定されるペプチド、およびファージディスプレイ技術によって同定されるタンパク質が挙げられる。好ましいマイムトープは、本発明のＤｅｒ  ＨＭＷ−ｍａｐタンパク質に対して、特に、免疫応答を誘導するＤｅｒ  ＨＭＷ−ｍａｐタンパク質のエピトープに対して、構造的および／または機能的に類似したペプチド模擬化合物である。
【００５０】
本発明はまた、本発明のＤｅｒ  ＨＭＷ−ｍａｐタンパク質のムテインも包含する。本明細書中で使用される場合、ムテインとは、所望のアミノ酸残基が置換または除去された、Ｄｅｒ  ＨＭＷ−ｍａｐタンパク質の特定のホモログをいう。本発明の好ましいムテインとしては、そのムテインを治療用量で動物に投与した場合に、その動物によるアナフィラキシー反応を減少するようにアミノ酸残基が変化された、Ｄｅｒ  ＨＭＷ−ｍａｐタンパク質ホモログが挙げられる。本発明のより好ましいムテインとしては、Ｄｅｒ  ＨＭＷ−ｍａｐタンパク質の１つ以上のシステイン残基が置換または除去された、Ｄｅｒ  ＨＭＷ−ｍａｐタンパク質ホモログが挙げられる。ムテインを生成するための方法は、当業者に公知であり、そしてそのような方法は、本明細書中に開示されている。好ましくは、ムテインは、組換え技術を使用して生成される。
【００５１】
本発明の別の実施形態は、Ｄｅｒ  ＨＭＷ−ｍａｐ核酸分子を含む、単離された核酸分子である。このような核酸分子の識別的な特徴は、今までに記載されている。本発明の核酸分子は、単離された天然のＤｅｒ  ＨＭＷ−ｍａｐ遺伝子またはそのホモログを包含し得、この後者は、以下により詳細に記載される。本発明の核酸分子は、１つ以上の調節領域、全長コード領域もしくは部分的コード領域、またはこれらの組み合わせを含み得る。本発明の核酸分子の最小サイズは、別の核酸分子の相補配列との安定なハイブリッドの形成（すなわち、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でのハイブリダイゼーション）を可能にするに十分な、サイズである。
【００５２】
本発明に従うと、単離された核酸分子は、その天然環境から取り出された（すなわち、ヒトによる操作を受けた）核酸分子であり、そしてこの単離された核酸分子は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはＤＮＡもしくはＲＮＡのいずれかの誘導体を含み得る。このように、「単離された」とは、その核酸分子が精製された程度を反映しない。本発明の単離されたＤｅｒ  ＨＭＷ−ｍａｐ核酸分子またはそのホモログは、その天然供給源から単離され得るし、あるいは組換えＤＮＡ技術（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅またはクローニング）または化学合成を使用して生成され得る。単離されたＤｅｒ  ＨＭＷ−ｍａｐ核酸分子およびそのホモログとしては、例えば、天然の対立遺伝子改変体、ならびに本発明のＤｅｒ  ＨＭＷ−ｍａｐタンパク質をコードする能力を実質的に妨げないような様式でヌクレオチドの挿入、欠失、置換、および／または逆位によって改変された核酸分子が挙げられ得る。
【００５３】
Ｄｅｒ  ＨＭＷ−ｍａｐ核酸分子ホモログは、当業者に公知の多数の方法（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｓ  Ｐｒｅｓｓ；Ｓａｍｂｒｏｏｋら（同書）を、参照のこと）を使用して、生成され得る。例えば、種々の技術を使用して核酸分子が改変され得、このような種々の技術としては、古典的変異誘発技術および組換えＤＮＡ技術（例えば、部位特異的変異誘発、化学的処理、制限酵素切断、核酸フラグメントの連結、ＰＣＲ増幅、オリゴヌクレオチド混合物の合成、および核酸分子混合物を「構築」するための混合物群の連結、ならびにこれらの組み合わせ）が挙げられるが、これらに限定されない。核酸分子ホモログは、Ｄｅｒ  ＨＭＷ−ｍａｐ核酸分子とのハイブリダイゼーションによってか、またはこの核酸分子によりコードされるタンパク質の機能（例えば、Ｄｅｒ  ＨＭＷ−ｍａｐタンパク質の少なくとも１つのエピトープに対する免疫応答を惹起する能力、またはＤｅｒ  ＨＭＷ−ｍａｐ活性をもたらす能力）をスクリーニングすることによって、選択され得る。
【００５４】
対立遺伝子改変体は、代表的には、その改変体が比較されている遺伝子によりコードされるタンパク質の活性と類似する活性を有する、タンパク質をコードする。対立遺伝子改変体はまた、その遺伝子の５’非翻訳領域または３’非翻訳領域（例えば、調節制御領域）中に変化を含み得る。対立遺伝子改変体は、当業者に周知であり、そして所定のチリダニにおいて見出されると予測される。なぜなら、そのゲノムは、二倍体であり、そして／または２つ以上のチリダニの群の間にあるからである。本発明はまた、実験室での操作に起因する改変体（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応増幅の間に生成される改変体であるが、これに限定されない）も含む。
【００５５】
本発明の単離された核酸分子は、少なくとも１つの本発明のＤｅｒ  ＨＭＷ−ｍａｐタンパク質をコードする、核酸配列を含み得、このようなタンパク質の例は、本明細書中に開示される。句「核酸分子」は、物理的な核酸分子を主に指し、そして句「核酸配列」は、その核酸分子に関するヌクレオチドの配列を主に指すが、この２つの句は、互換可能に使用され得、特に、Ｄｅｒ  ＨＭＷ−ｍａｐタンパク質をコードすることができる核酸分子または核酸配列に関して、互換可能に使用され得る。
【００５６】
本発明の好ましい核酸分子は、動物に投与された場合、Ｄｅｒ  ＨＭＷ−ｍａｐアレルゲンにより引き起こされるアレルギー反応からその動物を脱感作することができる。以下により詳細に開示されるように、このような核酸分子は、アンチセンスＲＮＡ、三重らせんを形成できる分子、リボザイム、または他の核酸ベース薬物化合物であり得るし、またはそれらをコードし得る。さらなる実施形態において、本発明の核酸分子は、脱感作タンパク質（例えば、本発明のＤｅｒ  ＨＭＷ−ｍａｐタンパク質）をコードし得、この核酸分子は、例えば、直接注入によって（すなわち、ＤＮＡ試薬として）か、またはビヒクル（例えば、組換えウイルス試薬または組換え細胞試薬）中で、その動物に送達される。
【００５７】
本発明の１つの実施形態は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でＤｅｒ  ＨＭＷ−ｍａｐ遺伝子にハイブリダイズする、単離された核酸分子である。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件とは、本明細書中に記載される標準的ハイブリダイゼーション条件を指す。本発明の好ましい核酸分子は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１８、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３８、配列番号４１、および／または配列番号４４を含むアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする遺伝子とハイブリダイズする、単離された核酸分子を含む。本発明のより好ましい核酸分子は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１８、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３８、配列番号４１、および／または配列番号４４を含むアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする核酸配列の相補体とハイブリダイズする、単離された核酸分子を含む。
【００５８】
本発明のより好ましい核酸分子は、少なくとも約１５０ヌクレオチドを含む核酸分子からなる群より選択される単離された核酸分子を含み、ここで少なくとも約１５０ヌクレオチドを含むこの核酸分子は、１×ＳＳＣおよび０％ホルムアミドを含む溶液において、温度約５０℃にて、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４５の核酸配列、および／または配列番号３３のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする核酸配列、ならびにそれらの相補体からなる群より選択される核酸配列に、ハイブリダイズする。
【００５９】
本発明はまた、本明細書中に開示される任意の核酸分子のフラグメントをも包含する。本発明に従うと、フラグメントは、そのサイズが、本発明の配列番号により同定される配列より小さい長さと、本明細書中で規定されるようなオリゴヌクレオチドの最小サイズとの間の範囲であり得る、任意の核酸分子または核酸配列を含み得る。例えば、本発明のフラグメントのサイズは、長さが約１７５２ヌクレオチド未満でありかつ１１ヌクレオチドよりは大きい、任意のサイズであり得る。
【００６０】
本発明の１つの実施形態において、好ましいＤｅｒ  ＨＭＷ−ｍａｐ核酸分子は、単離された核酸分子を含み、この単離された核酸分子は、少なくとも約５０ヌクレオチドまたは少なくとも約１５０ヌクレオチドであり、かつこの単離された核酸分子は、約４０％以下の塩基対ミスマッチを好ましくは許容する条件下で、より好ましくは、約３５％以下の塩基対ミスマッチを許容する条件下で、より好ましくは、約３０％以下の塩基対ミスマッチを許容する条件下で、より好ましくは、約２５％以下の塩基対ミスマッチを許容する条件下で、より好ましくは、約２０％以下の塩基対ミスマッチを許容する条件下で、より好ましくは、約１５％以下の塩基対ミスマッチを許容する条件下で、より好ましくは、約１０％以下の塩基対ミスマッチを許容する条件下で、そしてなおより好ましくは、約５％以下の塩基対ミスマッチを許容する条件下で、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３７、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４５の核酸配列、および配列番号３３のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする核酸配列、ならびにそれらの相補体からなる群より選択される核酸配列に、ハイブリダイズする。
【００６１】
本発明の別の実施形態は、少なくとも約１５０塩基対を含む核酸分子を含み、ここでこの核酸分子は、１×ＳＳＣおよび０％ホルムアミドを含む溶液において、温度約５０℃にて、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４５の核酸配列、および／または配列番号３３のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする核酸配列、ならびにそれらの相補体からなる群より選択される核酸配列に、ハイブリダイズする。本発明のさらなる好ましい核酸分子は、少なくとも約１５０塩基対を含む単離された核酸分子のフラグメントを含み、ここでこの核酸分子は、１×ＳＳＣおよび０％ホルムアミドを含む溶液において、温度約５０℃にて、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４５の核酸配列、および配列番号３３のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする核酸配列、ならびにそれらの相補体からなる群より選択される核酸配列に、ハイブリダイズする。
【００６２】
本発明のさらなる好ましいＤｅｒ  ＨＭＷ−ｍａｐ核酸分子は、少なくとも約５０ヌクレオチドまたは少なくとも約１５０ヌクレオチドである単離された核酸分子を含み、この単離された核酸分子は、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４５の核酸配列、および配列番号３３のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする核酸配列、ならびにそれらの相補体からなる群より選択される核酸配列と、好ましくは少なくとも約６０％同一であり、より好ましくは少なくとも約６５％同一であり、より好ましくは少なくとも約７０％同一であり、より好ましくは少なくとも約７５％同一であり、より好ましくは少なくとも約８０％同一であり、より好ましくは少なくとも約８５％同一であり、より好ましくは少なくとも約９０％同一であり、そしてなおより好ましくは少なくとも約９５％同一である、核酸配列を含む。このような核酸分子のいずれかのフラグメントもまた、好ましい。同一性パーセントは、プログラムＤＮＡｓｉｓ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ２．１内において、デフォルトパラメータを使用して最大一致によるＣｏｍｐａｒｅ機能を使用して、決定され得る。
【００６３】
本発明の１つの実施形態は、核酸分子ｎＤｅｒｆ９８１７５２、ｎＤｅｒｆ９８１６６５、およびｎＤｅｒｆ９８１６０８、ｎＤｅｒｐ９８１６２１、ｎＤｅｒｐ９８１５２７、ｎＤｅｒｐ９８１４７０、および／もしくはｎＤｅｒｆ６０５１０、またはこれらの核酸分子の対立遺伝子改変体の、すべてまたは一部を含む、核酸分子である。本発明の別の好ましい核酸分子は、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４５の核酸配列、および／または配列番号３３のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする核酸配列、ならびにこれらの核酸配列を有する核酸分子の対立遺伝子改変体、およびこれらの核酸配列を有する核酸分子のホモログの、少なくとも一部を含み；好ましくは、このようなホモログは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１８、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３８、配列番号４１、および／または配列番号４４のアミノ酸配列を有するタンパク質に対して、免疫応答を惹起する少なくとも１つのエピトープをコードする核酸分子をコードするか、またはその核酸分子と相補的である。このような核酸分子は、上記配列番号に含まれるヌクレオチドに加えて、ヌクレオチドを含み得、そのヌクレオチドは、例えば、全長遺伝子、全長コード領域、融合タンパク質をコードする核酸分子、または多価防御化合物をコードする核酸分子であるが、これらに限定されない。
【００６４】
１つの実施形態において、本発明のＤｅｒ  ＨＭＷ−ｍａｐ核酸分子は、ＰＤｅｒｆ９８５５５、ＰＤｅｒｐ９８５０９、および／またはＰＤｅｒｆ６０１７０と、少なくとも約４５％、好ましくは少なくとも約５０％、より好ましくは少なくとも約５５％、なおより好ましくは少なくとも約６０％、なおより好ましくは少なくとも約６５％、なおより好ましくは少なくとも約７０％、なおより好ましくは少なくとも約７５％、なおより好ましくは少なくとも約８０％、なおより好ましくは少なくとも約８５％、なおより好ましくは少なくとも約９０％、そしてなおより好ましくは少なくとも約９５％同一である、タンパク質をコードする。なおより好ましいのは、ＰＤｅｒｆ９８５５５、ＰＤｅｒｆ９８５３６、ＰＤｅｒｐ９８５０９、ＰＤｅｒｐ９８４９０、および／もしくはＰＤｅｒｆ６０１７０をコードする核酸分子、ならびに／またはこのような核酸分子の対立遺伝子改変体である。
【００６５】
別の実施形態において、本発明のＤｅｒ  ＨＭＷ−ｍａｐ核酸分子は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１８、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３８、配列番号４１、および／または配列番号４４と、少なくとも約４５％、好ましくは少なくとも約５０％、より好ましくは少なくとも約５５％、なおより好ましくは少なくとも約６０％、なおより好ましくは少なくとも約６５％、なおより好ましくは少なくとも約７０％、なおより好ましくは少なくとも約７５％、なおより好ましくは少なくとも約８０％、なおより好ましくは少なくとも約８５％、なおより好ましくは少なくとも約９０％、そしてなおより好ましくは少なくとも約９５％同一である、アミノ酸配列を有するタンパク質をコードする。本発明はまた、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１８、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３８、配列番号４１、および／または配列番号４４の少なくとも一部を有するタンパク質をコードするＤｅｒ  ＨＭＷ−ｍａｐ核酸分子、ならびにこれらの配列を有するタンパク質をコードするＤｅｒ  ＨＭＷ−ｍａｐ核酸分子の対立遺伝子改変体（発現される細胞のコドン使用頻度特性に適合するように改変された、核酸分子を含む）も、包含する。
【００６６】
別の実施形態において、好ましいＤｅｒ  ＨＭＷ−ｍａｐ核酸分子は、少なくとも約３５アミノ酸長、好ましくは少なくとも約５０アミノ酸長、より好ましくは少なくとも約１００アミノ酸長、より好ましくは少なくとも約２００アミノ酸長、なおより好ましくは少なくとも約２５０アミノ酸長を含む、Ｄｅｒ  ＨＭＷ−ｍａｐタンパク質をコードする。
【００６７】
本発明の特定のＤｅｒ  ＨＭＷ−ｍａｐ核酸分子の核酸配列を知ることにより、当業者は、例えば、（ａ）それらの核酸分子のコピーを作製し得、（ｂ）そのような核酸分子の少なくとも一部を含む核酸分子（例えば、全長遺伝子、全長コード領域、調節制御配列、短縮コード領域を含む、核酸分子）を得ることができ、そして（ｃ）他のＤｅｒ  ＨＭＷ−ｍａｐ核酸分子を得ることができる。このような核酸分子は、種々の方法で得ることができ、そのような方法としては、適切な発現ライブラリーを、本発明の抗体を用いてスクリーニングすること；適切なライブラリーをスクリーニングするために本発明のオリゴヌクレオチドプローブを使用する、従来のクローニング技術；および本発明のオリゴヌクレオチドプライマーを使用する、適切なライブラリーもしくはＤＮＡのＰＣＲ増幅が、挙げられる。核酸分子をスクリーニングまたは増幅するための好ましいライブラリーとしては、Ｄｅｒｍａｔｏｐｈａｇｏｉｄｅｓ  ｆａｒｉｎａｅライブラリー、および／またはＤｅｒｍａｔｏｐｈａｇｏｉｄｅｓ  ｐｔｅｒｏｎｙｓｓｉｕｓライブラリー（例えば、本明細書中に実施例にて開示される、ライブラリー）が挙げられる。遺伝子をクローニングおよび増幅するための技術は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（同書）に開示されている。
【００６８】
本発明はまた、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、本発明の他の核酸分子（好ましくは、より長い他の核酸分子）（例えば、Ｄｅｒ  ＨＭＷ−ｍａｐ核酸分子を含む核酸分子、または他のＤｅｒ  ＨＭＷ−ｍａｐ核酸分子を含む核酸分子）の相補的領域とハイブリダイズすることができる、オリゴヌクレオチドである核酸分子を包含する。本発明のオリゴヌクレオチドは、ＲＮＡでも、ＤＮＡでも、またはいずれかの誘導体でも、あり得る。このようなオリゴヌクレオチドの最小サイズは、オリゴヌクレオチドと、本発明の核酸分子上の相補的配列と間での、安定なハイブリッドの形成に必要なサイズである。本発明の好ましいオリゴヌクレオチドは、好ましくは約２００ヌクレオチド、より好ましくは約１５０ヌクレオチド、そしてなおより好ましくは約１００ヌクレオチドの最大サイズを有する。本発明は、例えば、核酸分子を同定するためのプローブとして、使用され得るオリゴヌクレオチドを包含する。
【００６９】
本発明の１つの実施形態は、組換えベクターを包含し、その組換えベクターは、本発明の少なくとも１つの単離された核酸分子を、宿主細胞中にその核酸分子を送達することができる任意のベクター中に挿入された状態で、含む。そのようなベクターは、異種核酸配列を含み、その異種核酸配列は、天然では本発明の核酸分子に近接して見出されず、かつ好ましくは、その本発明の核酸分子が由来する種以外の種に由来する、核酸配列である。そのベクターは、ＲＮＡまたはＤＮＡのいずれかであり得、原核生物性または真核生物性のいずれかであり得、そして代表的には、ウイルスまたはプラスミドである。組換えベクターは、本発明のＤｅｒ  ＨＭＷ−ｍａｐ核酸分子のクローニング、配列決定、および／または他の操作において、使用され得る。
【００７０】
１つの型の組換えベクター（本明細書中において、組換え分子と呼ばれる）は、発現ベクターに作動可能に連結された、本発明の核酸分子を含む。句「作動可能に連結された」とは、宿主細胞中に形質転換された場合に核酸分子が発現されることができる様式で、発現ベクター中にその核酸分子が挿入されていることを指す。本明細書中で使用される場合、発現ベクターは、宿主細胞を形質転換することができ、かつ特定の核酸分子の発現をもたらすことができる、ＤＮＡベクターまたはＲＮＡベクターである。好ましくは、その発現ベクターはまた、その宿主細胞中で複製することもできる。発現ベクターは、原核生物性または真核生物性のいずれかであり得、そして発現ベクターは、代表的には、ウイルスまたはプラスミドである。本発明の発現ベクターとしては、本発明の組換え細胞（細菌細胞、真菌細胞、内寄生生物細胞、昆虫細胞、他の動物細胞、ならびに植物細胞を含む）において機能する（すなわち、遺伝子発現を指向する）、任意のベクターが挙げられる。本発明の好ましい発現ベクターは、細菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞、および哺乳動物細胞において、そしてより好ましくは、本明細書中に開示される細胞型において、遺伝子発現を指向し得る。
【００７１】
特に、本発明の発現ベクターは、調節配列（例えば、転写制御配列、翻訳制御配列、複製起点、および組換え細胞と適合性でありかつ本発明の核酸分子の発現を制御する他の調節配列）を含む。特に、本発明の組換え分子は、転写制御配列を含む。転写制御配列は、転写の開始、伸長、および終結を制御する、配列である。特に重要な転写制御配列は、転写開始を制御する配列（例えば、プロモーター配列、エンハンサー配列、オペレーター配列、およびリプレッサー配列）である。適切な転写制御配列としては、本発明の組換え細胞の少なくとも１つにおいて機能し得る、任意の転写制御配列が挙げられる。種々のこのような転写制御配列が、当業者に公知である。好ましい転写制御配列としては、細菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞、および哺乳動物細胞において機能する配列が挙げられ、例えば、ｔａｃプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｔｒｃプロモーター、ｏｘｙ−ｐｒｏプロモーター、ｏｍｐ／ｌｐｐプロモーター、ｒｒｎＢプロモーター、バクテリオファージλプロモーター（例えば、λＰＬプロモーターおよびλＰＲプロモーター、およびこのようなプロモーターを含む融合物）、バクテリオファージＴ７プロモーター、Ｔ７ｌａｃプロモーター、バクテリオファージＴ３プロモーター、バクテリオファージＳＰ６プロモーター、バクテリオファージＳＰ０１プロモーター、メタロチオネインプロモーター、α接合因子プロモーター、Ｐｉｃｈｉａアルコールオキシダーゼプロモーター、アルファウイルスサブゲノムプロモーター（例えば、シンドビスウイルスサブゲノムプロモーター）、抗生物質耐性遺伝子プロモーター、バキュロウイルスプロモーター、Ｈｅｌｉｏｔｈｉｓ  ｚａｅ昆虫ウイルスプロモーター、ワクシニアウイルスプロモーター、ヘルペスウイルスプロモーター、アライグマポックスウイルスプロモーター、他のポックスウイルスプロモーター、アデノウイルスプロモーター、サイトメガロウイルスプロモーター（例えば、中初期プロモーター）、シミアンウイルス４０プロモーター、レトロウイルスプロモーター、アクチンプロモーター、レトロウイルス長末端反復プロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、熱ショックプロモーター、リン酸および硝酸転写制御配列、ならびに原核生物細胞または真核生物細胞において遺伝子発現を制御することができる他の配列が挙げられるが、これらに限定されない。さらなる適切な転写制御配列としては、組織特異的プロモーターおよび組織特異的エンハンサー、ならびにリンホカイン誘導性プロモーター（例えば、インターフェロンまたはインターロイキンによって誘導される、プロモーター）が、挙げられる。本発明の転写制御配列としてはまた、イヌまたはネコと天然で関連がある、天然に存在する転写制御配列が挙げられ得る。
【００７２】
本発明の組換えベクター中に含むために適切かつ好ましい核酸分子は、本明細書中に開示されるような核酸分子である。組換えベクター中、特に組換え分子中に含むために好ましい核酸分子としては、ｎＤｅｒｆ９８１７５２、ｎＤｅｒｆ９８１６６５、ｎＤｅｒｆ９８１６０８、ｎＤｅｒｐ９８１６２１、ｎＤｅｒｐ９８１５２７、ｎＤｅｒｐ９８１４７０、およびｎＤｅｒｆ６０５１０が、挙げられる。
【００７３】
本発明の組換え分子はまた、（ａ）発現される本発明のＤｅｒ  ＨＭＷ−ｍａｐタンパク質が、そのタンパク質を産生する細胞から分泌されることができるように、分泌シグナル（すなわち、シグナルセグメント核酸配列）を含み得、そして／または（ｂ）融合タンパク質として本発明の核酸分子の発現をもたらす、融合配列を含み得る。適切なシグナルセグメントの例としては、本発明のタンパク質の分泌を指向することができる、任意のシグナルセグメントが挙げられる。好ましいシグナルセグメントとしては、組織プラスミノーゲンアクチベーター（ｔ−ＰＡ）シグナルセグメント、インターフェロンシグナルセグメント、インターロイキンシグナルセグメント、成長ホルモンシグナルセグメント、組織適合性シグナルセグメントおよびウイルスエンベロープ糖タンパク質シグナルセグメント、ならびに天然のシグナルセグメントが、挙げられるが、これらに限定されない。融合セグメント核酸によりコードされる適切な融合セグメントは、本明細書中に開示される。さらに、本発明の核酸分子は、コードされるタンパク質をプロテオソームへと指向する、融合セグメント（例えば、ユビキチン融合セグメント）に、連結され得る。組換え分子はまた、本発明の核酸分子の核酸配列の周囲および／または内部に、介在配列および／または非翻訳配列を含み得る。
【００７４】
本発明の別の実施形態は、本発明の１つ以上の組換え分子で形質転換された宿主細胞を含む、組換え細胞を包含する。細胞中への核酸分子の形質転換は、核酸分子をその細胞中に挿入し得る任意の方法によって、達成され得る。形質転換技術としては、トランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、リポフェクション、吸着、およびプロトプラスト融合が挙げられるが、これらに限定されない。組換え細胞は、単細胞のままであり得るし、または組織、器官、もしくは多細胞生物へと成長し得る。本発明の形質転換された核酸分子は、その核酸分子が発現される能力が維持されるような様式で、形質転換された（すなわち、組換え）細胞の染色体外にあるままであり得るし、またはその細胞の染色体中の１つ以上の部位に組み込み得る。細胞を形質転換するための好ましい核酸分子としては、本明細書中に開示されるＤｅｒ  ＨＭＷ−ｍａｐ核酸分子が挙げられる。細胞を形質転換するための特に好ましい核酸分子としては、ｎＤｅｒｆ９８１７５２、ｎＤｅｒｆ９８１６６５、ｎＤｅｒｆ９８１６０８、ｎＤｅｒｐ９８１６２１、ｎＤｅｒｐ９８１５２７、ｎＤｅｒｐ９８１４７０、およびｎＤｅｒｆ６０５１０が、挙げられる。
【００７５】
形質転換するために適切な宿主細胞としては、本発明の核酸分子で形質転換され得る任意の細胞が挙げられる。宿主細胞は、形質転換されていない細胞であり得るか、または少なくとも１つの核酸分子（例えば、本発明の１以上のタンパク質および／または多価ワクチンの産生に有用な他のタンパク質をコードする核酸分子）で既に形質転換されている細胞であり得るかのいずれかである。本発明の宿主細胞は、本発明のＤｅｒ  ＨＭＷ−ｍａｐタンパク質を内因的（すなわち、天然で）産生し得るか、または本発明の少なくとも１つの核酸分子で形質転換された後にこのようなタンパク質を産生し得るかのいずれかである。本発明の宿主細胞は、本発明の少なくとも１つのタンパク質を産生し得る任意の細胞であり得、そしてこれらには、細菌細胞、真菌細胞（酵母を含む）、他の昆虫細胞、他の動物細胞および植物細胞が挙げられる。好ましい宿主細胞としては、細菌細胞、ミコバクテリア細胞、酵母細胞、寄生生物細胞、昆虫細胞および哺乳動物細胞が挙げられる。より好ましい宿主細胞としては、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ、ＢＨＫ（乳児ハムスター腎臓）細胞、ＭＤＣＫ細胞（イヌヘルペスウイルス培養のための正常なイヌ腎臓細胞株）、ＣＲＦＫ細胞（ネコヘルペスウイルス培養のための正常なネコ腎臓細胞株）、ＣＶ−１細胞（例えば、アライグマポックスウイルスを培養するために使用される、アフリカザル腎臓細胞株）、ＣＯＳ（例えば、ＣＯＳ−７）細胞、およびＶｅｒｏ細胞が挙げられる。特に好ましい宿主細胞としては、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ（Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ−１２誘導株を含む）；Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ；Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ（ＵＫ−１Ｘ３９８７およびＳＲ−１１Ｘ４０７２のような弱毒化株を含む）；Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ；Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉ；ＢＨＫ細胞；ＭＤＣＫ細胞；ＣＲＦＫ細胞；ＣＶ−１細胞；ＣＯＳ細胞；Ｖｅｒｏ細胞および非腫瘍形成性マウス筋芽細胞Ｇ８細胞（例えば、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１２４６）である。さらなる適切な哺乳動物細胞宿主としては、他の腎臓細胞株、他の線維芽細胞株（例えば、ヒト、マウス、またはニワトリの胚線維芽細胞株）、骨髄腫細胞株、チャイニーズハムスター卵巣細胞、マウスＮＩＨ／３Ｔ３細胞、ＬＭＴＫ３１細胞および／またはＨｅＬａ細胞が挙げられる。
【００７６】
組換え細胞は、好ましくは、宿主細胞を１以上の組換え分子で形質転換することによって生成され、各組換え分子は、１以上の転写制御配列を含む発現ベクターに作動可能に連結された、本発明の１以上の核酸分子を含む。句「作動可能に連結される」とは、核酸分子を、その核酸分子が宿主細胞内に形質転換された場合に発現され得るような様式で、発現ベクター内に挿入することをいう。
【００７７】
本発明の組換え分子は、任意の転写制御配列のうちの少なくとも１つに作動可能に連結された、上記の任意の核酸分子うちの少なくとも１つを含み得る分子であり、その転写制御配列は、形質転換される細胞においてその核酸分子の発現を効果的に調節し得る。これらの例を、本明細書中に開示する。
【００７８】
本発明の組換え細胞としては、本発明の任意のＤｅｒ  ＨＭＷ−ｍａｐ核酸分子のうちの少なくとも１つで形質転換された任意の細胞が挙げられる。細胞を形質転換するために適切かつ好ましいＤｅｒ  ＨＭＷ−ｍａｐ核酸分子ならびに適切かつ好ましい組換え分子を、本明細書中に開示する。
【００７９】
組換えＤＮＡ技術は、例えば、宿主細胞内の核酸分子のコピー数、それらの核酸分子が転写される効率、その得られた転写物が翻訳される効率、および翻訳後修飾の効率を操作することによって、形質転換された核酸分子の発現を改善するために、使用され得る。本発明の核酸分子の発現を増加するために有用な組換え技術としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：高コピー数プラスミドへの核酸分子の作動可能な連結、１以上の宿主細胞染色体内への核酸分子の組み込み、プラスミドへのベクター安定性配列の付加、転写制御シグナル（例えば、プロモーター、オペレーター、エンハンサー）の置換または改変、翻訳制御シグナル（例えば、リボソーム結合部位、シャイン−ダルガノ配列）の置換または改変、宿主細胞のコドン使用頻度に対応させるような本発明の核酸分子の改変、転写物を不安定化させる配列の欠失、および発酵中の組換え酵素産生から組換え細胞増殖を時間的に切り離す制御シグナルの使用。本発明の発現させる組換えタンパク質の活性は、このようなタンパク質をコードする核酸分子のフラグメント化、改変または誘導体化によって改善され得る。
【００８０】
本発明の単離されたＤｅｒ  ＨＭＷ−ｍａｐタンパク質は、種々の様式で産生され得、これらには、天然のタンパク質の産生および回収、組換えタンパク質の産生および回収、およびこれらのタンパク質の化学合成が挙げられる。１つの実施形態において、本発明の単離されたタンパク質は、タンパク質を産生するのに効果的な条件下でそのタンパク質を発現し得る細胞を培養し、そしてそのタンパク質を回収することによって、産生される。培養するために好ましい細胞は、本発明の組換え細胞である。効果的な培養条件としては、タンパク質産生を可能にする、効果的な培地条件、バイオリアクター条件、温度条件、ｐＨ条件および酸素条件が挙げられるが、これらに限定されない。効果的な培地とは、細胞が本発明のＤｅｒ  ＨＭＷ−ｍａｐタンパク質を産生するように培養される、任意の培地をいう。このような培地は、代表的に、同化可能な炭素源、窒素源およびリン酸源、ならびに適切な塩、ミネラル、金属および他の栄養素（例えば、ビタミン）を有する水性培地を含む。本発明の細胞は、従来の発酵バイオリアクター、振盪フラスコ、試験管、マイクロタイターディッシュ、およびペトリプレートにおいて培養され得る。培養は、組換え細胞に適切な温度、ｐＨおよび酸素含量で行われ得る。このような培養条件は、当業者の技術の範囲内である。
【００８１】
産生のために使用されるベクターおよび宿主系に依存して、本発明の得られるタンパク質は、組換え細胞内に残ったままであり得るか；発酵培地中に分泌され得るか；２つの細胞膜間の空間（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉのペリプラズム空間）に分泌され得るか；あるいは細胞またはウイルスの膜の外側表面上に保持され得るかの、いずれかである。句「タンパク質を回収する」、ならびに同様の句は、タンパク質を含む発酵培地全体を回収することをいい、そして分離または精製のさらなる工程を含む必要はない。本発明のタンパク質は、種々の標準的なタンパク質精製技術（例えば、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ろ過、電気泳動、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、コンカナバリンＡクロマトグラフィー、等電点電気泳動および差次的可溶化が挙げられるが、これらに限定されない）を使用して精製され得る。本発明のタンパク質は、好ましくは、「実質的に純粋な」形態で回収され得る。本明細書中で使用される場合、「実質的に純粋（な）」とは、治療組成物または診断剤としてのタンパク質の効果的な使用を可能にする純度をいう。例えば、動物のための治療組成物は、実質的な毒性を示すべきでなく、そして好ましくは、処置される動物を脱感作し得るべきである。
【００８２】
本発明はまた、本発明のＤｅｒ  ＨＭＷ−ｍａｐタンパク質またはそのミメトープ（ｍｉｍｅｔｏｐｅ）に選択的に結合する単離された（すなわち、それらの天然環境から取り出された）抗体（すなわち、抗Ｄｅｒ  ＨＭＷ−ｍａｐタンパク質抗体）を包含する。本明細書中で使用される場合、用語、Ｄｅｒ  ＨＭＷ−ｍａｐに「選択的に結合する」とは、本発明の抗体が、本発明の特定化されたタンパク質またはそのミメトープに優先的に結合する能力をいう。結合は、当該分野で標準的な種々の方法（酵素免疫アッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡ）、イムノブロットアッセイなどを含む；例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、同書、を参照のこと）を使用して測定され得る。抗Ｄｅｒ  ＨＭＷ−ｍａｐタンパク質抗体は、好ましくは、動物において免疫応答を誘導するＤｅｒ  ＨＭＷ−ｍａｐタンパク質の部分に選択的に結合する。
【００８３】
本発明の単離された抗体としては、体液（例えば、血清が挙げられるが、これに限定されない）中の抗体、または種々の程度に精製された抗体が挙げられ得る。本発明の抗体は、ポリクローナルまたはモノクローナルであり得る。このような抗体の機能的等価物（例えば、抗体フラグメントおよび遺伝子操作された抗体（１より多いエピトープに結合し得る、単鎖抗体またはキメラ抗体を含む）もまた、本発明に含まれる。
【００８４】
本発明の抗体を産生するための好ましい方法は、（ａ）本発明のタンパク質、ペプチドまたはそのミメトープの有効量を動物に投与して、抗体を産生する工程；および（ｂ）それらの抗体を回収する工程、を包含する。別の方法において、本発明の抗体は、本発明のＤｅｒ  ＨＭＷ−ｍａｐタンパク質を産生するために先に開示したような技術を使用して、組換え的に産生される。定義されるタンパク質またはミメトープに対して惹起された抗体が有利であり得る。なぜなら、そのような抗体は、治療組成物中で使用する場合に、さもなければ診断アッセイにおける干渉または副作用を生じ得る他の物質に対する抗体が、実質的に混入されていないからである。
【００８５】
本発明の抗体は、本発明の範囲内の種々の潜在的用途を有する。例えば、このような抗体は、（ａ）ダニアレルゲン（特に、Ｄｅｒ  ＨＭＷ−ｍａｐタンパク質）を検出するためのツールとして；（ｂ）発現ライブラリーをスクリーニングするためのツールとして；および／または（ｃ）タンパク質と他の混入物との混合物から本発明の所望のタンパク質を回収するために、使用され得る。本発明の抗体はまた、例えば、Ｄｅｒ  ＨＭＷ−ｍａｐに特異的に結合するＩｇＥへのＤｅｒ  ＨＭＷ−ｍａｐタンパク質の結合を阻害し、免疫複合体形成を妨げ、それによって、ダニアレルゲンに対する過敏性応答を減少するために、使用され得る。
【００８６】
本発明のＤｅｒ  ＨＭＷ−ｍａｐタンパク質は、キメラ分子中に含まれ得、このキメラ分子は、動物において免疫応答を誘導するＤｅｒ  ＨＭＷ−ｍａｐタンパク質の少なくとも一部、および第２の分子を含み、この第２の分子は、基質に結合されていないＤｅｒ  ＨＭＷ−ｍａｐタンパク質と本質的に同じ様式でそのＤｅｒ  ＨＭＷ−ｍａｐタンパク質の部分がＩｇＥに結合し得るような様式で、そのキメラ分子が基質に結合されるのを可能にする。適切な第２の分子の例としては、免疫グロブリン分子の一部、または基質に固定化され得る適切な結合パートナーを有する別のリガンドが挙げられる（例えば、ビオチンおよびアビジン、または金属結合タンパク質および金属（例えば、Ｈｉｓ）、または糖結合タンパク質および糖（例えば、マルトース））。
【００８７】
本発明のＤｅｒ  ＨＭＷ−ｍａｐタンパク質は、処方物中に含まれ得、本明細書中で、Ｄｅｒ  ＨＭＷ−ｍａｐタンパク質処方物と称する。例えば、Ｄｅｒ  ＨＭＷ−ｍａｐタンパク質は、そのＤｅｒ  ＨＭＷ−ｍａｐタンパク質が可溶化される緩衝液、および／またはキャリアと合わせられ得る。適切な緩衝液およびキャリアは、当業者に公知である。適切な緩衝液の例としては、Ｄｅｒ  ＨＭＷ−ｍａｐタンパク質が、Ｄｅｒ  ＨＭＷ−ｍａｐタンパク質に特異的に結合する抗体に選択的に結合するように機能し得る、任意の緩衝液（例えば、リン酸緩衝化生理食塩水、水、生理食塩水、リン酸緩衝液、重炭酸緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液（Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−２−エタンスルホン酸緩衝化生理食塩水）、ＴＥＳ緩衝液（Ｔｒｉｓ−ＥＤＴＡ緩衝化生理食塩水）、Ｔｒｉｓ緩衝液およびＴＡＥ緩衝液（Ｔｒｉｓ−酢酸−ＥＤＴＡ）が挙げられるが、これらに限定されない）が挙げられる。キャリアの例としては、ポリマーマトリクス、トキソイド、および血清アルブミン（例えば、ウシ血清アルブミン）が挙げられるが、これらに限定されない。キャリアは、Ｄｅｒ  ＨＭＷ−ｍａｐタンパク質に特異的に結合する抗体に選択的に結合するＤｅｒ  ＨＭＷ−ｍａｐタンパク質の能力を実質的に干渉しないような様式で、Ｄｅｒ  ＨＭＷ−ｍａｐタンパク質と混合され得るかまたはＤｅｒ  ＨＭＷ−ｍａｐタンパク質に結合体化（すなわち、付着）され得る。
【００８８】
本発明のＤｅｒ  ＨＭＷ−ｍａｐタンパク質は、Ｄｅｒ  ＨＭＷ−ｍａｐタンパク質を含む細胞によって産生され得る。好ましいＤｅｒ  ＨＭＷ−ｍａｐタンパク質保有細胞としては、本発明のＤｅｒ  ＨＭＷ−ｍａｐタンパク質をコードする核酸分子を含む組換え細胞が挙げられる。
【００８９】
さらに、本発明のＤｅｒ  ＨＭＷ−ｍａｐタンパク質処方物は、Ｄｅｒ  ＨＭＷ−ｍａｐタンパク質のみならず、アレルギーに対する動物の脱感作、あるいはダニアレルゲン病原の予防または処置において有用な、１以上のさらなる抗原または抗体を含み得る。本明細書中で使用される場合、抗原とは、抗体によって選択的に結合され得る、任意の分子をいう。本明細書中で使用される場合、アレルゲンとは、動物におけるアレルギー応答に関与する抗体の産生を刺激し得る、任意の抗原をいう。本明細書中で使用される場合、第２の分子への第１の分子の選択的結合とは、第１の分子が第３の分子へ結合する能力と比較して、その第１の分子が第２の分子に優先的に結合（例えば、より高い親和性、より高いアビディティを有する）する能力をいう。この第１の分子は、必ずしも第２の分子の天然のリガンドである必要はない。本発明のアレルゲンは、好ましくは、ダニ由来であり、そしてダニ関連アレルゲン（他の昆虫アレルゲンおよび植物アレルゲンを含むが、これらに限定されない）である。
【００９０】
本発明に従って、実質的に任意の物質が、抗原として作用し得、そして抗体応答を誘発し得る（すなわち、エピトープとして機能し得る）。例えば、抗体は、糖質エピトープ（タンパク質に付加されている、サッカリドおよび／またはポリサッカリド（いわゆる、グリコシル化タンパク質））に応答して惹起され得る。しかし、サッカリドおよび／またはポリサッカリドは、タンパク質が存在することなく、単独で抗原として作用し得る。糖質部分の末端の糖、および内部の糖が、エピトープとして作用し得る。ポリサッカリドは、分枝鎖として存在し得、この場合、エピトープは、順番が連続しないが空間的に隣接する糖を有し得る。哺乳動物タンパク質において通常見られない、非通常の、昆虫特異的な糖は、昆虫の核酸分子由来の糖タンパク質に存在し得、そしてこれらの非通常の糖は、哺乳動物免疫系によって認識されるエピトープを含み得る。
【００９１】
本発明の１つの実施形態は、ダニに対してアレルギー性である動物のＩｇＥに結合し得るか、ダニアレルゲンに対して動物を脱感作し得るか、Ｂリンパ球応答を刺激し得るか、そして／またはＴリンパ球応答を刺激し得る非タンパク質エピトープを含む、試薬である。このようなエピトープ（本明細書中でＤｅｒ  ＮＰエピトープと呼ばれる）は、本発明のＤｅｒ  ＨＭＷ−ｍａｐタンパク質の部分として存在し得るか、または本発明のＤｅｒ  ＨＭＷ−ｍａｐタンパク質から単離され得る。このようなエピトープは、例えば、実施例１に従って産生されたＤ．ｆａｒｉｎａｅ  ＨＭＷ−ｍａｐ組成物中に含まれるタンパク質上に存在する。本発明のＤｅｒ  ＮＰエピトープは、その天然の供給源から単離され得るか、または合成的に産生され得る。このようなエピトープは、キャリアまたは他の分子に連結され得るが、その必ずしもその必要はない。Ｄｅｒ  ＮＰエピトープは、以下の識別される特徴のうちの少なくとも１つを有する：（ａ）そのエピトープは、ペプチドのβ−脱離に対して耐性である；（ｂ）そのエピトープは、プロテイナーゼＫ消化に対して耐性である；および（ｃ）そのエピトープは、グリコシル化されたタンパク質を検出するように設計された試験に対して反応性である。好ましいＤｅｒ  ＮＰエピトープは、このような識別される特徴の全てを有する。Ｄｅｒ  ＮＰエピトープは、ダニに対してアレルギー性のイヌまたはネコのＩｇＥに選択的に結合し得る。理論に束縛されないが、Ｄｅｒ  ＮＰエピトープは、Ｎ結合型グリカンを明らかに含まない糖質部分を含むと考えられている。このようなエピトープの構造的特徴の同定は、当業者によって決定され得る。１つの実施形態において、Ｄｅｒ  ＮＰエピトープに選択的に結合する単離された抗体が提供される。本発明はまた、Ｄｅｒ  ＮＰエピトープの誘導体（すなわち、このようなエピトープの活性を模倣する（例えば、Ｄｅｒ  ＮＰエピトープのミメトープである）、ネイティブ（すなわち、天然で見られる）Ｄｅｒ  Ｎｐエピトープに対して惹起された抗体に結合し得る、化合物）を包含する。
【００９２】
本発明のＤｅｒ  ＮＰエピトープを含む試薬は、本発明に従って種々の様式で使用され得る。このような試薬は、脱感作化合物であり得るか、またはダニアレルギーの感受性または感度について試験するための検出試薬であり得る。１つの実施形態において、本発明の治療組成物は、Ｄｅｒ  ＮＰエピトープを含む試薬を含む。別の実施形態において、本発明のアッセイキットは、Ｄｅｒ  ＮＰエピトープを含む試薬を備える。本発明の１つの実施形態は、ダニに対するアレルギー応答に対して感受性であるかまたはダニに対するアレルギー応答を有する動物を同定する方法である。このような方法は、Ｄｅｒ  ＮＰエピトープを含む試薬を動物の抗体と接触させる工程、およびその試薬と抗体との間の免疫複合体の形成を決定する工程を包含し、この免疫複合体の形成は、その動物が、そのアレルギー応答に感受性であるかまたはそのアレルギー応答を有することを示す。本発明の別の実施形態は、ダニに対するアレルギー応答に対して宿主動物を脱感作するための方法である。このような方法は、その動物に、脱感作化合物としてＤｅｒ  ＮＰエピトープを含む試薬を含む治療組成物を投与する工程を包含する。
【００９３】
本発明の別の実施形態は、Ｄｅｒ  ＮＰエピトープを欠くＤｅｒ  ＨＭＷ−ｍａｐタンパク質である。理論に束縛されないが、このようなタンパク質は、より良好な脱感作化合物である。なぜなら、このようなタンパク質は、ＩｇＥに結合する能力が減少されていることが予測されるからである。このようなタンパク質は、例えば、ネイティブＤｅｒ  ＨＭＷ−ｍａｐタンパク質からＤｅｒ  ＮＰエピトープを除去することによってか、またはこのタンパク質を組換え的に（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて）産生することによって、産生され得る。
【００９４】
本発明の１つの実施形態は、動物がＤｅｒ  ＨＭＷ−ｍａｐタンパク質に対して過敏性であるか否かを検出し得る、インビボ試験である。本発明のインビボ過敏性試験は、ダニアレルゲンに対して感受性であるかまたはダニアレルゲンに対するアレルギーを有する動物を同定するために、特に有用である。本発明の適切なインビボ過敏性試験は、皮膚試験であり得るが、これに限定されず、この皮膚試験は、Ｄｅｒ  ＨＭＷ−ｍａｐタンパク質またはそのミメトープを含む有効量の処方物を投与（例えば、皮内注射または表面スクラッチ）する工程を包含する。本発明の皮膚試験を行うための方法は、当業者に公知であり、そして本明細書中に簡単に開示される。
【００９５】
インビボ皮膚試験において使用するための適切な処方物は、Ｄｅｒ  ＨＭＷ−ｍａｐタンパク質、Ｄｅｒ  ＨＭＷ−ｍａｐタンパク質のホモログおよび／またはＤｅｒ  ＨＭＷ−ｍａｐタンパク質のミメトープを含む。
【００９６】
本発明の皮膚試験における使用のためのＤｅｒ  ＨＭＷ−ｍａｐタンパク質タンパク質処方物の適切な量は、その試験に使用される処方物のアレルゲン性および生成物が送達される部位に依存して、広範に変化し得る。本発明の皮膚試験における使用のためのＤｅｒ  ＨＭＷ−ｍａｐタンパク質処方物の適切な量としては、反応（例えば、その処方物に対するアレルギー反応から生じる検出可能な膨疹または硬化（硬度））を形成し得る量が挙げられる。本発明の皮膚試験における使用のためのＤｅｒ  ＨＭＷ−ｍａｐタンパク質の好ましい量は、約１×１０−８マイクログラム（μｇ）〜約１００μｇ、より好ましくは、約１×１０−７μｇ〜約１０μｇ、そしてさらにより好ましくは、約１×１０−６μｇ〜約１μｇのＤｅｒ  ＨＭＷ−ｍａｐタンパク質の範囲にある。このような量は、投与されるタンパク質のアレルゲン性に依存して変化することが、当業者に理解される。
【００９７】
本発明に従って、本発明のＤｅｒ  ＨＭＷ−ｍａｐタンパク質は、免疫増強物質（例えば、以下に詳細に定義されるような、本発明のキャリアまたはアジュバント）と合わされ得る。しかし、本発明の新しい局面は、本発明のＤｅｒ  ＨＭＷ−ｍａｐタンパク質が、特に、イヌにおいて、免疫増強物質の非存在下で過敏性応答を誘導し得ることである。
【００９８】
本発明の皮膚試験はさらに、コントロール溶液を動物に投与する工程を包含する。コントロール溶液としては、ネガティブコントロール溶液および／またはポジティブコントロール溶液が挙げられ得る。本発明のポジティブコントロール溶液は、動物に投与された場合に過敏性応答を誘導することが公知の少なくとも１つの化合物の有効量を含む。ポジティブコントロール溶液としての使用のための好ましい化合物としては、ヒスタミンが挙げられるが、これに限定されない。本発明のネガティブコントロール溶液は、動物に投与された場合に過敏性応答を誘導しないことが公知の溶液を含み得る。それ自体で、ネガティブコントロール溶液は、過敏性応答を本質的に誘導し得ない化合物を有する溶液を含み得るか、または処方物を調製するために使用される緩衝液（例えば、生理食塩水）を単に有する溶液を含み得る。好ましいネガティブコントロール溶液の例は、フェノレート化リン酸緩衝化生理食塩水（Ｇｒｅｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｌｅｎｏｉｒ、ＮＣから入手可能）である。
【００９９】
本発明の１以上の処方物に対する動物の過敏性は、動物への１以上の実験サンプルおよびコントロールサンプルの投与から生じる反応を測定し（例えば、膨疹、硬化または硬度；当業者に公知の技術を使用して）、そして実験サンプルに対する反応を１以上のコントロール溶液の投与から生じる反応と比較することによって、評価され得る。皮内注射のための好ましいデバイスとしては、個々のシリンジが挙げられる。スクラッチのための好ましいデバイスとしては、一時に多くのサンプルの投与を可能にするデバイスが挙げられる。動物の過敏性は、本発明の処方物の投与から生じる反応が、ネガティブコントロールの投与から生じる反応よりも大きいか否かを決定することによってか、および／またはその処方物の投与から生じる反応が、ポジティブコントロール溶液の投与から生じる反応と少なくともおよそ同じサイズであるか否かを決定することによって、評価され得る。それ自体で、実験サンプルが、動物へのポジティブコントロールサンプルの投与によって生じた膨疹のサイズより大きいかまたはそれに等しい反応を生じる場合、その動物は、その実験サンプルに対して過敏性である。反対に、実験サンプルが、動物へのネガティブコントロールサンプルの投与によって生じた反応に類似する反応を生じる場合、その動物は、その実験サンプルに対して過敏症ではない。
【０１００】
動物の過敏症の評価のための好ましい膨疹サイズは、約１６ｍｍ〜約８ｍｍ、より好ましくは、約１５ｍｍ〜約９ｍｍ、そしてさらにより好ましくは、約１４ｍｍ〜約１０ｍｍの範囲の直径である。
【０１０１】
好ましくは、動物が本発明の処方物に対する即時型過敏性応答を生じる能力またはその過敏性応答を生じる能力がないことは、サンプルの投与後約２分〜約３０分で、より好ましくは、サンプルの投与後約１０分〜約２５分で、そしてさらにより好ましくは、サンプルの投与後約１５分で、膨疹サイズを測定することによって決定される。
【０１０２】
好ましくは、動物が本発明の処方物に対する遅延型過敏性応答を生じる能力およびその過敏性応答を生じる能力がないことは、サンプルの投与後約１８時間〜約３０時間で、より好ましくは、サンプルの投与後約２０時間〜約２８時間で、そしてさらにより好ましくは、サンプルの投与後約２４時間で、硬化および／または紅斑を測定することによって決定される。遅延型過敏性応答はまた、他の技術を使用して（例えば、当業者に公知の技術を使用して、上記に直接規定した期間の間の投与部位での細胞浸潤の程度を決定することによって）測定され得る。
【０１０３】
好ましい実施形態において、本発明の皮膚試験は、Ｄｅｒ  ＨＭＷ−ｍａｐタンパク質を含む有効量の処方物を動物に所定の部位で皮内注射する工程、および有効量のコントロール溶液を同じ動物に異なる部位で皮内注射する工程を包含する。多くの部位で複数のサンプルを同時に送達し得る（好ましくは、多くの処方物の同時の評価を可能にする）デバイスを使用することは、当業者の範囲内である。皮膚試験に使用するための好ましいＤｅｒ  ＨＭＷ−ｍａｐタンパク質は、全長タンパク質を含む。好ましいポジティブコントロールサンプルは、ヒスタミンを含むサンプルであり得る。好ましいネガティブコントロールサンプルは、希釈剤を含むサンプルであり得る。
【０１０４】
本発明の皮膚試験を使用してＤｅｒ  ＨＭＷ−ｍａｐタンパク質に対する過敏性について試験するために適切かつ好ましい動物は、本明細書中に開示される。本発明の皮膚試験で試験するために特に好ましい動物としては、ヒト、イヌ、ネコおよびウマが挙げられ、ヒト、イヌおよびネコが、さらにより好ましい。本明細書中で使用される場合、イヌとは、イヌ科の任意のメンバーをいい、これらには、家庭内のイヌ、野生のイヌおよび動物園のイヌが含まれる。イヌの例としては、家庭内のイヌ、野生のイヌ、キツネ、オオカミ、ジャッカルおよびコヨーテが挙げられるが、これらに限定されない。本明細書中で使用される場合、ネコとは、ネコ科の任意のメンバーをいい、これらには、家庭内のネコ、野生のネコおよび動物園のネコが含まれる。ネコの例としては、家庭内のネコ、ライオン、トラ、ヒョウ（ｌｅｏｐａｒｄ）、ヒョウ（ｐａｎｔｈｅｒ）、ピューマ、ボブキャット、オオヤマネコ、ジャガー、チーターおよびサーバルが挙げられるが、これらに限定されない。本明細書中で使用される場合、ウマとは、ウマ科の任意のメンバーをいい、これらには、ウマ、ロバ、ラバおよびシマウマが挙げられる。
【０１０５】
本発明の１つの実施形態は、Ｄｅｒ  ＨＭＷ−ｍａｐタンパク質に結合する抗体（本明細書中で抗Ｄｅｒ  ＨＭＷ−ｍａｐ抗体といわれる）をインビトロで検出する方法である。この方法は、以下の工程を包含する：（ａ）単離されたＨＭＷ−ｍａｐタンパク質と推定抗Ｄｅｒ  ＨＭＷ−ｍａｐ抗体含有組成物とを、Ｄｅｒ  ＨＭＷ−ｍａｐタンパク質：抗体複合体を形成するに適切な条件下で接触させる工程；および（ｂ）このＤｅｒ  ＨＭＷ−ｍａｐタンパク質：抗体複合体を検出することにより、上記抗体の存在を検出する工程。このようなＤｅｒ  ＨＭＷ−ｍａｐタンパク質：抗体複合体の存在は、動物が、ダニアレルゲンに対する抗体を生成していることを示す。検出するための好ましい抗Ｄｅｒ  ＨＭＷ−ｍａｐ抗体としては、ＩｇＥアイソタイプまたはＩｇＧアイソタイプを有する抗体が挙げられる。検出するための好ましい抗Ｄｅｒ  ＨＭＷ−ｍａｐ抗体としては、ネコ抗体、イヌ抗体、ウマ抗体、およびヒト抗体が挙げられ、ネコ、イヌおよびヒト抗体が特に好ましい。
【０１０６】
本明細書中で用いられる場合、用語「接触する（接触させる）」は、この場合、推定抗体含有組成物とＤｅｒ  ＨＭＷ−ｍａｐタンパク質とを合わせるまたは混合することをいう。Ｄｅｒ  ＨＭＷ−ｍａｐタンパク質と抗体との間の複合体の形成は、測定され得る（すなわち、検出され得る）安定な複合体を形成するために、Ｄｅｒ  ＨＭＷ−ｍａｐタンパク質がこの抗体に選択的に結合する能力をいう。本明細書中で用いられる場合、用語、抗体に選択的に結合するとは、Ｄｅｒ  ＨＭＷ−ｍａｐタンパク質に特異的に結合しない他の抗体に実質的に結合することなく、本発明のＤｅｒ  ＨＭＷ−ｍａｐタンパク質が抗体に優先的に結合する能力をいう。Ｄｅｒ  ＨＭＷ−ｍａｐタンパク質と抗体との間の結合は、複合体を形成するに適切な条件下でもたらされる；このような条件（例えば、適切な濃度、緩衝液、温度、反応時間）ならびにこのような条件を最適化する方法は、当業者に公知であり、例が本明細書中に開示される。複合体形成条件の例はまた、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，（同書）に開示される。
【０１０７】
本明細書中で用いられる場合、用語「複合体形成を検出する」とは、任意の複合体が形成されたか否かを決定すること（すなわち、複合体の存在（すなわち、実在）をアッセイすること）をいう。複合体が形成されると、形成された複合体の量が決定されるが、必ずしも必要ではない。Ｄｅｒ  ＨＭＷ−ｍａｐタンパク質と組成物中の抗体との間の複合体形成、または選択的結合が、当該分野で標準的な種々の方法（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ（同書）を参照のこと）を用いて測定され得る（すなわち、検出、決定され得る）。これらの例は、本明細書中で開示される。
【０１０８】
１つの実施形態において、本発明の方法の推定抗体含有組成物は、動物由来の生物学的サンプルを含む。適切な生物学的サンプルとしては、体液組成物または細胞組成物が挙げられるが、これらに限定されない。体液とは、動物から集められ得る（すなわち、得られ得る）任意の流体をいい、これらの例としては、血液、血清、血漿、尿、涙、水溶性体液（ａｑｕｅｏｕｓ  ｈｕｍｏｒ）、脳脊髄液（ＣＳＦ）、唾液、リンパ、鼻分泌物、乳汁、および糞便が挙げられるが、これらに限定されない。このような本発明の組成物は、体液中に存在する免疫グロブリンの非ＩｇＥまたは非ＩｇＧアイソタイプおよび／または他のタンパク質（例えば、アルブミン）の少なくともいくつかを除去するために予め処理され得るが、必ずしも必要ではない。このような除去としては、体液と、レクチンであるｊａｃａｌｉｎまたはＩｇＡ免疫グロブリンの定常領域に特異的に結合する抗体（すなわち、抗ＩｇＡアイソタイプ抗体）のような物質を接触させて、ＩｇＡ抗体を除去すること、および／あるいはこの体液を、例えば、コンカナバリンＡまたはプロテインＧに、それぞれ曝すことにより、ＩｇＥ抗体またはＩｇＧ抗体を体液の他の成分からアフィニティー精製することが挙げられるが、これらに限定されない。別の実施形態において、組成物は、体液中に含まれる免疫グロブリンを濃縮するために予め処理された、集められた体液を含む。例えば、体液中に含まれる免疫グロブリンは、硫酸アンモニウムを用いて他のタンパク質から沈殿され得る。本発明の好ましい組成物は、血清である。
【０１０９】
別の実施形態において、本発明の方法の抗体含有組成物としては、ＩｇＥもしくはＩｇＧを生成する細胞が挙げられる。このような細胞は、細胞の表面に結合したＩｇＥもしくはＩｇＧを有し得るか、そして／あるいはＩｇＥもしくはＩｇＧを分泌し得る。このような細胞の例としては、骨髄腫細胞が挙げられる。ＩｇＥもしくはＩｇＧは、細胞の膜に直接結合するか、または細胞の表面に結合した分子（例えば、抗原）に結合するかのいずれかで、細胞の表面に結合され得る。
【０１１０】
複合体は、種々の方法において検出され得、これらの方法としては以下の１以上のアッセイの使用が挙げられるが、これらに限定されない：酵素結合イムノアッセイ、ラジオイムノアッセイ、蛍光イムノアッセイ、化学発光アッセイ、側流（ｌａｔｅｒａｌ  ｆｌｏｗ）アッセイ、凝集アッセイ、粒子ベースのアッセイ（例えば、磁性粒子またはプラスチックポリマー（例えば、ラテックスまたはポリスチレンビーズ）のような粒子が挙げられるが、これらに限定されない粒子を用いる）、免疫沈降アッセイ、ＢｉｏＣｏｒｅＴＭアッセイ（例えば、金コロイドを用いる）、および免疫ブロッティングアッセイ（例えば、ウェスタンブロット）。このようなアッセイは、当業者に周知である。アッセイは、結果がどのように用いられ得るかに依存して、定性的結果または定量的結果を与えるために用いられ得る。例えば、凝集、粒子分離、および免疫沈降のようないくつかのアッセイは、検出可能なマーカーを必要とすることなく、視覚的に観察され得る（例えば、肉眼または濃度計または分光光度計のような機械のいずれかにより）。
【０１１１】
他のアッセイにおいて、検出可能なマーカーのＤｅｒ  ＨＭＷ−ｍａｐタンパク質、Ｄｅｒ  ＨＭＷ−ｍａｐタンパク質に結合した抗体、またはＤｅｒ  ＨＭＷ−ｍａｐタンパク質もしくはＤｅｒ  ＨＭＷ−ｍａｐタンパク質に結合した抗体に選択的に結合する試薬（以下により詳細に記載される）への結合体化（すなわち、結合）は、複合体形成の検出を補助する。検出可能なマーカーの例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：放射活性標識、酵素、蛍光標識、化学発光標識、色素生成標識またはリガンド。リガンドとは、別の分子に選択的に結合する分子をいう。好ましい検出可能なマーカーとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：フルオレセイン、放射性同位体、ホスファターゼ（例えば、アルカリホスファターゼ）、ビオチン、アビジン、ペルオキシダーゼ（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ）、およびビオチン関連化合物またはアビジン関連化合物（例えば、ストレプトアビジンまたはＰｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬから市販されるＩｍｍｕｎｏＰｕｒｅ（登録商標）ＮｅｕｔｒＡｖｉｄｉｎ）。
【０１１２】
１つの実施形態において、複合体は、推定抗体含有組成物と、検出可能なマーカーに結合体化されるＤｅｒ  ＨＭＷ−ｍａｐタンパク質とを接触させることにより検出される。Ｄｅｒ  ＨＭＷ−ｍａｐタンパク質に結合体化するための適切な検出マーカーとしては、放射活性標識、蛍光標識、酵素標識、化学発光標識、色素生成標識またはリガンドが挙げられるが、これらに限定されない。検出可能なマーカーは、Ｄｅｒ  ＨＭＷ−ｍａｐタンパク質が検出される抗体に結合する能力をブロックしないように、Ｄｅｒ  ＨＭＷ−ｍａｐタンパク質に結合体化される。
【０１１３】
別の実施形態において、Ｄｅｒ  ＨＭＷ−ｍａｐタンパク質：抗体複合体は、推定抗体含有組成物とＤｅｒ  ＨＭＷ−ｍａｐタンパク質とを接触させ、次いで、この複合体と、指標分子とを接触させることにより検出される。本発明の適切な指標分子としては、Ｄｅｒ  ＨＭＷ−ｍａｐタンパク質またはＤｅｒ  ＨＭＷ−ｍａｐタンパク質に結合した抗体のいずれかに結合し得る分子が挙げられる。このように、指標分子は、Ｄｅｒ  ＨＭＷ−ｍａｐタンパク質：抗体複合体のどの部分が検出されるかに依存して、例えば、抗原および抗体を含み得る。抗体である好ましい指標分子としては、例えば、抗ＩｇＥ抗体、抗ＩｇＧ抗体、およびＤｅｒ  ＨＭＷ−ｍａｐタンパク質に結合するが、Ｄｅｒ  ＨＭＷ−ｍａｐタンパク質上の異なるエピトープに結合することが既知の推定抗体含有組成物中で同定された抗体以外の抗体が挙げられる。好ましいレクチンとしては、高マンノース基に結合するレクチンが挙げられる。指標分子自体は、本発明の検出可能なマーカーに結合され得る。例えば、抗体は、ビオチン、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼまたはフルオレセインに結合体化され得る。
【０１１４】
１つの好ましい実施形態において、Ｄｅｒ  ＨＭＷ−ｍａｐタンパク質：抗体複合体は、この複合体と、ＩｇＥ抗体に選択的に結合する指標分子（本明細書中で抗ＩｇＥ試薬といわれる）またはＩｇＧ抗体に選択的に結合する指標分子（本明細書中で抗ＩｇＧ試薬といわれる）とを接触させることにより検出される。このような抗ＩｇＥまたは抗ＩｇＧ抗体の例としては、抗アイソタイプ抗体である２次抗体（例えば、ＩｇＥもしくはＩｇＧの定常領域に選択的に結合する抗体）、抗体結合細菌表面タンパク質（例えば、プロテインＡまたはプロテインＧ）、抗体結合細胞（例えば、Ｂ細胞、Ｔ細胞、ナチュラルキラー細胞、多形核白血球細胞、単球またはマクロファージ細胞）、抗体結合真核生物細胞表面タンパク質（例えば、Ｆｃレセプター）、および抗体結合補体タンパク質が挙げられるが、これらに限定されない。好ましい指標分子としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：抗ネコＩｇＥ抗体、抗ネコＩｇＧ抗体、抗イヌＩｇＥ抗体、抗イヌＩｇＧ抗体、抗ヒトＩｇＥ抗体、および抗ヒトＩｇＧ抗体。本明細書中で用いられる場合、抗ＩｇＥ抗体または抗ＩｇＧ抗体は、完全な抗体のみならず、ＩｇＥもしくはＩｇＧ重鎖定常領域に選択的に結合し得るその任意のサブユニットもしくは一部もまた含み得る。例えば、抗ＩｇＥ試薬または抗ＩｇＧ試薬としては、ＦａｂフラグメントまたはＦ（ａｂ’）２フラグメントが挙げられ、これらはともに、Ｊａｎｅｗａｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ，ｔｈｅ  Ｉｍｍｕｎｅ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｉｎ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｄｉｓｅａｓｅ，Ｇａｒｌａｎｄ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｉｎｃ．，ＮＹ，１９９６に詳細に記載される。
【０１１５】
別の好ましい実施形態において、Ｄｅｒ  ＨＭＷ−ｍａｐタンパク質：抗体複合体は、この複合体と、推定抗体含有組成物中の抗体がＤｅｒ  ＨＭＷ−ｍａｐタンパク質に結合するエピトープ以外の異なるエピトープで、Ｄｅｒ  ＨＭＷ−ｍａｐタンパク質に選択的に結合する指標分子とを接触させることにより検出される。
【０１１６】
１つの実施形態において、複合体は、溶液中で形成され、検出され得る。別の実施形態において、複合体が形成され、ここで、この複合体の１以上のメンバーが基材に固定化（例えば、基材上にコーティング）される。固定化技術は、当業者に公知である。適切な基材材料としては、プラスチック、硝子、ゲル、セルロイド、紙、ＰＶＤＦ（ポリ−ビニリデン−フルオリド）、ナイロン、ニトロセルロース、および粒子物質（例えば、ラテックス、ポリスチレン、ナイロン、ニトロセルロース、アガロースおよび磁性樹脂）が挙げられるが、これらに限定されない。基材材料の適切な形状としては、ウェル（例えば、マイクロタイターディッシュウェル）、プレート、ディップスティック、ビーズ、側流装置、膜、フィルター、管、ディッシュ、セルロイド型マトリックス、磁性粒子、および他の粒子物質が挙げられるが、これらに限定されない。特に好ましい基材は、ＥＬＩＳＡプレート、ディップスティック、ラジオイムノアッセイプレート、アガロースビーズ、プラスチックビーズ、ラテックスビーズ、イムノブロット膜およびイムノブロットペーパーを含む。１つの実施形態において、基材（例えば、粒子物質）としては、検出可能なマーカーを含み得る。
【０１１７】
Ｄｅｒ  ＨＭＷ−ｍａｐタンパク質に結合する抗体を検出するための好ましい方法は、免疫吸着アッセイである。本発明の免疫吸着アッセイは、捕捉分子および指標分子を含む。本発明の捕捉分子は、ＩｇＥもしくはＩｇＧが基材に固定化される様式で、ＩｇＥもしくはＩｇＧに結合する。このように、捕捉分子は、好ましくは、本発明の基材に固定化され、その後、推定ＩｇＥ含有組成物または推定ＩｇＧ含有組成物に捕捉分子が曝される。本発明の指標分子は、捕捉分子に結合したＩｇＥもしくはＩｇＧの存在を検出する。このように、指標分子は、好ましくは、推定ＩｇＥ含有組成物または推定ＩｇＧ含有組成物に捕捉分子を曝す前に、捕捉分子と同じ基材に固定化されない。
【０１１８】
好ましい免疫吸着アッセイ法は、以下のいずれかの工程を包含する：（ａ）Ｄｅｒ  ＨＭＷ−ｍａｐタンパク質を基材上に固定化した後に、Ｄｅｒ  ＨＭＷ−ｍａｐタンパク質と、推定ＩｇＥ含有組成物もしくは推定ＩｇＧ含有組成物とを接触させて、Ｄｅｒ  ＨＭＷ−ｍａｐタンパク質−固定化基材を形成する工程；および（ｂ）Ｄｅｒ  ＨＭＷ−ｍａｐタンパク質と、推定ＩｇＥ含有組成物または推定ＩｇＧ含有組成物を接触させて、推定ＩｇＥ含有組成物結合基材または推定ＩｇＧ含有組成物結合基材を形成する前に、推定ＩｇＥ含有組成物または推定ＩｇＧ含有組成物を基材に結合させる工程。好ましくは、基材としては、コーティングしていない基材、Ｄｅｒ  ＨＭＷ−ｍａｐタンパク質固定化基材、抗ＩｇＥ抗体固定化基材、抗ＩｇＧ抗体固定化基材が挙げられる。
【０１１９】
本発明の捕捉分子および指標分子はともに、ＩｇＥ、ＩｇＧまたたはＤｅｒ  ＨＭＷ−ｍａｐタンパク質に結合し得る。好ましくは、捕捉分子は、指標分子と異なるＩｇＥ、ＩｇＧまたはＤｅｒ  ＨＭＷ−ｍａｐタンパク質の領域に結合し、それにより、捕捉分子が、指標分子と同時にＩｇＥ、ＩｇＧまたはＤｅｒ  ＨＭＷ−ｍａｐタンパク質に同時に結合することを可能にする。捕捉分子または指標分子としての試薬の使用は、この分子がＩｇＥ、ＩｇＧまたはＤｅｒ  ＨＭＷ−ｍａｐタンパク質に曝された場合に、基材に固定化されているか否かに依存する。例えば、本発明のＤｅｒ  ＨＭＷ−ｍａｐタンパク質は、Ｄｅｒ  ＨＭＷ−ｍａｐタンパク質が基材に結合している場合に捕捉分子として用いられる。あるいは、Ｄｅｒ  ＨＭＷ−ｍａｐタンパク質は、Ｄｅｒ  ＨＭＷ−ｍａｐタンパク質が基材に結合していない場合に指標分子として用いられる。捕捉分子または指標分子としての使用に適切な分子としては、本発明のＤｅｒ  ＨＭＷ−ｍａｐタンパク質、本発明の抗ＩｇＥ抗体試薬または抗ＩｇＧ抗体試薬が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１２０】
本発明の免疫吸着アッセイは、１以上の層および／または型の指標分子の存在を検出し得る第２の分子または他の結合分子を含み得る。例えば、指標分子に選択的に結合する、タグ化されていない（すなわち、検出可能なマーカーに結合体化されていない）二次抗体は、この二次抗体に選択的に結合する、タグ化された（すなわち、検出可能なマーカーに結合体化されている）三次抗体に結合され得る。適切な二次抗体、三次抗体および他の二次分子または三次分子は、当業者により選択され得る。本発明の好ましい二次分子としては、抗原、抗ＩｇＥイディオタイプ抗体（すなわち、抗ＩｇＥ抗体に独特のエピトープに結合する抗体）、抗ＩｇＥアイソタイプ抗体、抗ＩｇＧイディオタイプ抗体（すなわち、抗ＩｇＧ抗体に独特のエピトープに結合する抗体）、および抗ＩｇＧアイソタイプ抗体が挙げられる。好ましい三次分子は、この二次分子の特徴に基づいて当業者により選択され得る。同じストラテジーが引き続く階層に適用される。
【０１２１】
１つの実施形態において、Ｄｅｒ  ＨＭＷ−ｍａｐタンパク質は、基材（例えば、マイクロタイターディッシュウェルまたはディップスティック）に固定化されることにより捕捉分子として用いられる。動物から集められる生物学的サンプルは、基材に適用され、そして基材に結合されるＤｅｒ  ＨＭＷ−ｍａｐタンパク質：抗体複合体形成を可能にする（すなわち、サンプル中のＩｇＥもしくはＩｇＧが、基材上に固定化されたＤｅｒ  ＨＭＷ−ｍａｐタンパク質に結合する）に適切な（すなわち、十分な）条件下でインキュベートされる。過剰な非結合物質（すなわち、Ｄｅｒ  ＨＭＷ−ｍａｐタンパク質に結合していない生物学的サンプル由来の物質）は、存在するならば、基材に結合している抗原：抗体複合体を保持する条件下で基材から除去される。好ましい条件は、一般に、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（同書）に開示される。抗原に結合したＩｇＥもしくはＩｇＧに選択的に結合し得る指標分子が基材に添加され、この指標分子とＤｅｒ  ＨＭＷ−ｍａｐタンパク質：抗体複合体との間で複合体を形成するようにインキュベートされる。過剰な指標分子は除去され、発色剤が必要ならば添加され、基材は、分析のために検出デバイスに供される。この実施形態に好ましい指標分子は、Ｄｅｒ  ＨＭＷ−ｍａｐタンパク質に結合したＩｇＧ抗体を検出するための抗ＩｇＧ抗体、またはＤｅｒ  ＨＭＷ−ｍａｐタンパク質に結合したＩｇＥ抗体を検出するための抗ＩｇＥ抗体である。好ましくは、この抗ＩｇＧ抗体または抗ＩｇＥ抗体は、ビオチン、蛍光標識または酵素標識に結合体化される。
【０１２２】
１つの実施形態において、この抗ＩｇＥ抗体または抗ＩｇＧ抗体（すなわち、アイソタイプ特異的抗体またはイディオタイプ特異的抗体）は、基材（例えば、マイクロタイターディッシュウェルまたはディップスティック）上に固定化されることにより捕捉分子として用いられる。動物から集められた生物学的サンプルは、この基材に適用され、この基材に結合した、抗ＩｇＥ抗体：ＩｇＥ複合体または抗ＩｇＧ抗体：ＩｇＧ複合体それぞれの形成を可能にするに適切な条件下でインキュベートされる。過剰な非結合物質は、存在するならば、基材に結合している抗ＩｇＥ抗体：ＩｇＥ複合体または抗ＩｇＧ抗体：ＩｇＧ複合体を保持する条件下で基材から除去される。Ｄｅｒ  ＨＭＷ−ｍａｐタンパク質がこの基材に添加され、Ｄｅｒ  ＨＭＷ−ｍａｐタンパク質と抗ＩｇＥ抗体：ＩｇＥ複合体または抗ＩｇＧ抗体：ＩｇＧ複合体との間で複合体の形成を可能にするようにインキュベートされる。好ましくは、Ｄｅｒ  ＨＭＷ−ｍａｐタンパク質は、検出可能なマーカー（好ましくは、ビオチン、酵素標識または蛍光標識）に結合体化される。過剰なＤｅｒ  ＨＭＷ−ｍａｐタンパク質は除去され、発色剤が必要ならば添加され、この基材は、分析のために検出デバイスに供される。
【０１２３】
１つの実施形態において、本発明の免疫吸着アッセイは、捕捉分子を利用しない。この実施形態において、動物から集められた生物学的サンプルは、基材（例えば、マイクロタイターディッシュウェルまたはディップスティック）に適用され、基材へのＩｇＥもしくはＩｇＧの結合を可能にするに適切な条件下でインキュベートされる。体液中に存在する任意のＩｇＥもしくはＩｇＧは、基材に固定化される。過剰な非結合物質は、存在するならば、基材へのＩｇＥもしくはＩｇＧの結合を保持する条件下で基材から除去される。Ｄｅｒ  ＨＭＷ−ｍａｐタンパク質がこの基材に添加され、Ｄｅｒ  ＨＭＷ−ｍａｐタンパク質とＩｇＥもしくはＩｇＧとの間の複合体の形成を可能にするようにインキュベートされる。好ましくは、Ｄｅｒ  ＨＭＷ−ｍａｐタンパク質は、検出可能なマーカー（好ましくは、ビオチン、酵素標識または蛍光標識）に結合体化される。過剰なＤｅｒ  ＨＭＷ−ｍａｐタンパク質は除去され、発色剤が必要ならば添加され、この基材は、分析のために検出デバイスに供される。
【０１２４】
ＩｇＥもしくはＩｇＧを検出するための別の好ましい方法は、側流アッセイであり、この例は、Ｐｒｏｎｏｖｏｓｔ  ｅｔ  ａｌによる米国特許第５，４２４，１９３号（１９９５年６月１３日発行）；Ｉｍｒｉｃｈ  ｅｔ  ａｌによる米国特許第５，４１５，９９４号（１９９５年５月１６日発行）；Ｍｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌによるＷＯ９４／２９６９６（１９９４年１２月２２日公開）；およびＰａｗｌａｋ  ｅｔ  ａｌによるＷＯ９４／０１７７５（１９９４年１月２０日公開）に開示される。１つの実施形態において、生物学的サンプルは、以下の構成要素を備える側流装置に配置される：（ａ）流路を規定する支持体構造；（ｂ）Ｄｅｒ  ＨＭＷ−ｍａｐタンパク質に結合体化したビーズを含む標識試薬（この標識試薬は、標識ゾーンにおける支持体構造内に注入される）；および（ｃ）ＩｇＥ結合組成物またはＩｇＧ結合組成物を含む捕捉試薬。この捕捉試薬は、標識試薬が、標識ゾーンから捕捉ゾーンへ流れ得る様式で、標識ゾーンに流体接続された捕捉ゾーン内で標識試薬の下流に配置される。この支持体構造は、標識ゾーンから捕捉ゾーンへビーズの流れを妨害しない物質を含む。支持体構造として使用するに適切な材料としては、イオン性（すなわち、陰イオン性または陽イオン性）物質が挙げられる。このような材料の例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ニトロセルロース（ＮＣ）、ＰＶＤＦ、カルボキシメチルセルロース（ＣＭ）。この支持体構造は、流路を規定し、この流路は、側方にあり、ゾーン（すなわち、標識ゾーンおよび捕捉ゾーン）に分けられる。この装置は、流路に沿って位置した、より好ましくは標識試薬の上流に位置したサンプル受容ゾーンをさらに備え得る。この支持体構造中の流路は、捕捉ゾーンの下流、好ましくは流路の端部の支持体構造の一部と、標識ゾーンおよび捕捉ゾーンからの過剰な試薬を吸着し得る吸着剤とを接触させることにより作製される。
【０１２５】
この実施形態において、生物学的サンプルは、支持体構造の一部を備えるサンプル受容ゾーンに適用される。この標識ゾーンは、サンプルを、流路により下流に方向付けられたサンプル受容ゾーンから受容する。標識ゾーンは、ＩｇＥもしくはＩｇＧ、またはその両方に結合する標識試薬を含む。好ましい標識試薬は、直接またはリンカーを介してかのいずれかでプラスチックビーズ基材（例えば、ラテックスビーズ）に結合体化されたＤｅｒ  ＨＭＷ−ｍａｐタンパク質である。この基材はまた、検出可能なマーカー（好ましくは、色素生成マーカー）を含む。代表的には、標識試薬は、乾燥または凍結乾燥することにより支持体構造に注入される。サンプル構造はまた、標識ゾーンの下流にある捕捉ゾーンを備える。この捕捉ゾーンは、流路により下流に方向付けられた標識ゾーンから標識試薬を受容する。この捕捉ゾーンは、捕捉ゾーンにおいてＤｅｒ  ＨＭＷ−ｍａｐタンパク質に複合体化されたＩｇＥおよび／もしくはＩｇＧを固定化する捕捉試薬（この場合、上記の抗ＩｇＥ抗体または抗ＩｇＧ抗体、またはその両方）を含む。この捕捉試薬は、好ましくは、乾燥または凍結乾燥することにより支持体構造に固定される。この標識試薬は、捕捉ゾーンに蓄積し、この蓄積は、肉眼でまたは光学検出デバイスにより評価される。
【０１２６】
別の実施形態において、ＩｇＥもしくはＩｇＧを検出するために用いられる側流装置は、以下を備える：（ａ）流路を規定する支持体構造；（ｂ）上記の抗ＩｇＥ抗体もしくは抗ＩｇＧ抗体、またはその両方を含む標識試薬（この標識試薬は、標識ゾーンにおける支持体構造内に注入される）；および（ｃ）Ｄｅｒ  ＨＭＷ−ｍａｐタンパク質を含む捕捉試薬（この捕捉試薬は、標識試薬が、標識ゾーンから捕捉ゾーンへ流れ得る様式で、標識ゾーンに流体接続された捕捉ゾーン内で標識試薬の下流に位置している）。この装置はまた、好ましくは、流路に沿って位置した、好ましくは、標識試薬の上流に位置したサンプル受容ゾーンを備える。この装置はまた、好ましくは、流路の端部に位置した吸着剤を含む。
【０１２７】
Ｄｅｒ  ＨＭＷ−ｍａｐタンパク質に過剰に感受性の動物は、体液のサンプルを用いた免疫複合体形成のレベルと、コントロールサンプルを用いた免疫複合体形成のレベルとを比較することにより同定される。免疫複合体とは、抗体およびＤｅｒ  ＨＭＷ−ｍａｐタンパク質を含む複合体（すなわち、Ｄｅｒ  ＨＭＷ−ｍａｐタンパク質：抗体複合体）をいう。このように、陽性コントロールサンプルを用いると、免疫複合体が形成され、陰性コントロールサンプルを用いると形成されない。このように、体液サンプルが陽性コントロールサンプルを用いた免疫複合体形成以上の免疫複合体形成を生じる場合、この体液が採取された動物は、基材に結合したＤｅｒ  ＨＭＷ−ｍａｐタンパク質に過剰に感受性である。逆に、体液サンプルが陰性コントロールサンプルを用いた免疫複合体形成に類似の免疫複合体形成を生じる場合、この体液が採取された動物は、基材に結合したＤｅｒ  ＨＭＷ−ｍａｐタンパク質に過剰に感受性ではない。
【０１２８】
２以上の異なる皮膚試験および／またはインビトロ試験が、診断目的で用いられ得ることは、本発明の範囲内である。例えば、動物がＤｅｒ  ＨＭＷ−ｍａｐタンパク質に対して直ぐに過剰反応することは、動物の体液中のＤｅｒ  ＨＭＷ−ｍａｐタンパク質に特異的なＩｇＥ抗体を検出し得るインビトロ免疫吸着アッセイを用いて試験され得る。Ｄｅｒ  ＨＭＷ−ｍａｐタンパク質に対する遅延型過敏症を示す大部分の動物はまた、アレルゲンに対する即時型過敏症を示す一方、アレルゲンに対して遅延型過敏症を示す少数の動物は、このアレルゲンに対する即時型過敏症を示さない。このような場合、ＩｇＥ特異的インビトロ試験からのネガティブな結果に従って、動物のＤｅｒ  ＨＭＷ−ｍａｐタンパク質に対する遅延型過敏症は、本発明の皮膚試験を用いて試験され得る。
【０１２９】
本発明はまた、開示された検出方法の各々に基づいて、Ｄｅｒ  ＨＭＷ−ｍａｐタンパク質に特異的に結合する抗体を検出するためのキットを含む。１つの実施形態は、Ｄｅｒ  ＨＭＷ−ｍａｐタンパク質特異的抗体を検出するためのキットであり、このキットは、Ｄｅｒ  ＨＭＷ−ｍａｐタンパク質およびＩｇＥおよび／もしくはＩｇＧを検出するための手段を含む。検出の適切な手段は、Ｄｅｒ  ＨＭＷ−ｍａｐタンパク質またはＩｇＥおよび／もしくはＩｇＧのいずれかに結合する、本明細書中に開示された化合物を含む。本発明の好ましいキットは、本明細書中に開示されたＩｇＥもしくはＩｇＧに選択的に結合し得る抗体および／またはＤｅｒ  ＨＭＷ−ｍａｐタンパク質に結合体化した検出可能なマーカーに結合し得る化合物（例えば、検出可能なマーカーがビオチンの場合に、アビジン、ストレプトアビジンおよびＩｍｍｕｎｏＰｕｒｅ（登録商標）ＮｅｕｔｒＡｖｉｄｉｎ）を含む検出手段を含む。
【０１３０】
本発明の別の好ましいキットは、アレルゲンキットであり、このキットは、Ｄｅｒ  ＨＭＷ−ｍａｐタンパク質、およびダニアレルゲンと同じ環境中で一般に検出されるアレルゲンを含む。本発明のキットとともに使用するための適切かつ好ましいダニ関連アレルゲンは、本明細書中に開示されるダニ関連アレルゲンが挙げられる。
【０１３１】
本発明の好ましいキットは、Ｄｅｒ  ＨＭＷ−ｍａｐタンパク質が基材に固定化されたキットを含む。キットがＤｅｒ  ＨＭＷ−ｍａｐタンパク質および別のアレルゲンを含む場合、このキットは、１以上の組成物を含み、各組成物は、１つのアレルゲンを含む。このように、各アレルゲンは、別々に試験され得る。キットはまた、ＩｇＥもしくはＩｇＧのための２以上の診断試薬、または本明細書中に開示される他の化合物を含み得る。側流アッセイ形式に用いられるキットが特に好ましい。側流アッセイキットが１以上の側流アッセイ装置を備え得ることは、本発明の範囲内である。複数の側流装置は、各々の装置の一方の端部で互いに結合され得、それにより、扇様構造が生じ得る。
【０１３２】
本発明の別の局面としては、ダニアレルギーに罹りやすいかまたはダニアレルギーを有する動物を、本発明のＤｅｒ  ＨＭＷ−ｍａｐタンパク質処方物で処置する工程を包含する。本発明に従って、用語処置とは、ダニアレルゲンに対する、動物による過敏応答の調節をいい得る。調節は例えば、動物の過敏応答に関与する細胞の免疫調節を含み得る。免疫調節は、免疫応答に代表的に関与する分子（例えば、抗体、抗原、主要組織適合遺伝子分子（ＭＨＣ）およびＭＨＣ分子と同時に反応する分子）の活性を調節することを含み得る。特に、免疫調節とは、過敏応答に関与する細胞の炎症応答、免疫抑制および免疫寛容化をもたらす、抗原：抗体相互作用の調節をいう。免疫抑制とは、例えば、免疫応答に関与する特定の細胞を殺傷することによって、免疫応答を阻害することをいう。免疫寛容化とは、免疫応答に関与する特定の細胞をアネルギー化（ａｎｅｒｇｉｚｉｎｇ）する（すなわち、抗原に対するＴ細胞の反応性を減少させる）ことによって、免疫応答を阻害することをいう。
【０１３３】
本発明の１つの実施形態は、本発明のＤｅｒ  ＨＭＷ−ｍａｐタンパク質に対する免疫応答を阻害し得る脱感作化合物を含む治療組成物である。このような脱感作化合物としては、ブロッキング化合物、寛容原（ｔｏｌｅｒａｇｅｎ）および／またはサプレッサー化合物が挙げられる。ブロッキング化合物としては、炎症応答をもたらし得る抗原：抗体相互作用を調節し得る化合物が挙げられ、寛容原は、動物を免疫寛容化し得る化合物であり、そしてサプレッサー化合物は、動物を免疫抑制し得る。本発明の脱感作化合物は、可溶性または膜結合性であり得る。膜結合性脱感作化合物は、生体膜（細胞、リポソーム、平面膜またはミセルを含む）と会合し得る。本発明の可溶性脱感作化合物は、以下の目的に有用である：（１）ＩｇＥ：抗原媒介性の肥満細胞の脱顆粒をブロックすることによってＩ型過敏性反応を阻害すること；（２）細胞の補体破壊に至るＩｇＧ：抗原複合体形成をブロックすることによってＩＩＩ型過敏性反応を阻害すること；および（３）マクロファージによるサイトカイン分泌のＴヘルパー細胞刺激をブロックすることによってＩＶ型過敏性反応を阻害すること。本発明の膜結合性脱感作化合物は、以下の目的に有用である：（１）細胞の補体破壊に至る、細胞表面でのＩｇＧ：抗原複合体形成をブロックすることによってＩＩ型過敏性反応を阻害すること；（２）免疫細胞におけるＩｇＧによって調節されるシグナル伝達をブロックすることによってＩＩ型過敏性反応を阻害すること；および（３）抗原保有細胞のＴ細胞傷害性細胞殺傷をブロックすることによってＩＶ型過敏性反応を阻害すること。脱感作化合物の例としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：本発明のムテイン、ミメトープ（ｍｉｍｅｔｏｐｅ）および抗体、ならびに本発明のタンパク質とＩｇＥとの間の結合を阻害する、本発明の他のインヒビター。
【０１３４】
本発明の脱感作化合物はまた、脱感作化合物を、Ｄｅｒ  ＨＭＷ−ｍａｐタンパク質に対する過敏応答に関与する特定の細胞へと標的化し得るリガンド分子に共有結合によって連結され得る。脱感作化合物を連結するために用いられる適切なリガンドとしては、例えば、免疫グロブリン分子、サイトカイン、レクチン、異種アレルゲン、ＣＤ８分子または主要組織適合遺伝子分子（例えば、ＭＨＣクラスＩまたはＭＨＣクラスＩＩ分子）の、少なくとも一部が挙げられる。脱感作化合物に連結するための、免疫グロブリン分子の好ましい部分としては、免疫細胞特異的表面分子に結合し得る可変領域、および免疫細胞上のＦｃレセプターに結合し得る定常領域（特に、ＩｇＥの定常領域）が挙げられる。好ましいＣＤ８分子としては、ＣＤ８のα鎖の少なくとも細胞外機能ドメインが挙げられる。免疫細胞とは、免疫応答に関与する細胞（特に、ＭＨＣクラスＩ分子またはＭＨＣクラスＩＩ分子を有する細胞）をいう。好ましい免疫細胞としては、抗原提示細胞、Ｔ細胞およびＢ細胞が挙げられる。
【０１３５】
１つの実施形態では、本発明の治療組成物は、本発明のＤｅｒ  ＨＭＷ−ｍａｐタンパク質、そのミメトープもしくはムテイン、または本発明のＤｅｒ  ＨＭＷ−ｍａｐ核酸分子を含む。ダニアレルギーを処置するための本発明の適切な治療組成物は、Ｄｅｒ  ＨＭＷ−ｍａｐタンパク質、そのミメトープもしくはムテイン、または本発明のＤｅｒ  ＨＭＷ−ｍａｐ核酸分子を含む。好ましい治療組成物は、以下を含む：ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１８、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２４、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３８、配列番号４１および配列番号４４からなる群より選択されるアミノ酸配列をコードする核酸分子の相補体とハイブリダイズする、単離されたダニアレルゲン性タンパク質をコードする核酸分子；ダニアレルゲン性タンパク質のミメトープ；ダニアレルゲン性タンパク質のムテイン；ならびに以下からなる群より選択される単離された核酸分子：少なくとも約１５０ヌクレオチドを含む核酸分子であって、ここで、少なくとも約１５０ヌクレオチドを含む核酸分子は、１×ＳＳＣおよび０％ホルムアミドを含む溶液中で、約５０℃の温度で、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４５からなる群より選択される核酸配列、ならびに配列番号３３のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする核酸配列およびその相補体に対してハイブリダイズする、核酸分子；ならびに少なくとも約１５０ヌクレオチドを含む、上記の核酸分子のいずれかのフラグメントを含む核酸分子。好ましいＤｅｒ  ＨＭＷ−ｍａｐムテインは、Ｄｅｒ  ＨＭＷ−ｍａｐタンパク質の少なくとも一部を含み、ここで、適切な数のシステイン残基は、除去されているかまたは非システイン残基で置換されており、その結果、変更されたＤｅｒ  ＨＭＷ−ｍａｐタンパク質は、動物に対して毒性ではない（例えば、アナフィラキシーを引き起こさない）。
【０１３６】
別の実施形態では、本発明の治療組成物は、動物中で、Ｄｅｒ  ＨＭＷ−ｍａｐタンパク質へのその核酸分子の発現を可能にする様式でその動物に投与され得る、Ｄｅｒ  ＨＭＷ−ｍａｐタンパク質をコードする核酸分子を含む。核酸分子は、以下を含むがそれらに限定されない種々の方法で、動物へと送達され得る：（ａ）裸の（すなわち、ウイルスのコートにも細胞膜にもパッケージングされていない）核酸分子（例えば、例えば、Ｗｏｌｆら、１９９０，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４７，１４６５−１４６８に教示されるように、裸のＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子として）を投与すること、または（ｂ）組換えウイルスまたは組換え細胞としてパッケージングされた核酸分子を投与すること（すなわち、核酸分子は、ウイルスビヒクルまたは細胞ビヒクルによって送達される）。
【０１３７】
本発明の裸の核酸分子としては、本発明の核酸分子が挙げられ、そして好ましくは、好ましくは複製能力、さもなければ増幅能力のある、本発明の組換え分子が挙げられる。本発明の裸の核酸は、例えば、二シストロン性組換え分子の形態の、例えば、１以上の内部リボゾーム侵入部位を有する、本発明の１以上の核酸分子を含み得る。好ましい裸の核酸分子は、ウイルスゲノムの少なくとも一部（すなわち、ウイルスベクター）を含む。好ましいウイルスベクターとしては、アルファウイルス、ポックスウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、ピコルナウイルスおよびレトロウイルスに基づくウイルスベクターが挙げられ、アルファウイルス（例えば、シンドビスウイルスまたはセムリキウイルス）、種特異的ヘルペスウイルスおよび種特異的ポックスウイルスに基づくウイルスベクターが特に好ましい。タンパク質産生に適切であると開示されている転写制御配列を含め、任意の適切な転写制御配列が用いられ得る。特に好ましい転写制御配列としては、サイトメガロウイルスの前初期（好ましくは、イントロン−Ａに関連して）、ラウス肉腫ウイルスの長末端反復、および組織特異的転写制御配列、ならびにウイルスベクターを用いる場合は、ウイルスベクターに対して内因性である転写制御配列が挙げられる。「強力な」ポリ（Ａ）配列の取り込みもまた好ましい。
【０１３８】
本発明の裸の核酸分子は、種々の方法によって投与され得る。適切な送達方法としては、例えば、筋肉内注射、皮下注射、皮内注射、皮内乱切、パーティクルボンバードメント、経口適用および鼻適用が挙げられ、筋肉内注射、皮内注射、皮内乱切およびパーティクルボンバードメントが好ましく、そして筋肉内注射がさらにより好ましい。好ましい単一用量の裸のＤＮＡ分子は、当業者によって決定され得るように、投与経路および／または送達方法に依存して、約１ナノグラム（ｎｇ）〜約１ミリグラム（ｍｇ）の範囲にわたる。投与方法の例は、例えば、米国特許第５，２０４，２５３号（Ｂｒｕｎｅｒらによる、１９９３年４月２０日発行）、ＰＣＴ公開番号ＷＯ  ９５／１９７９９（１９９５年７月２７日公開、ＭｃＣａｂｅによる）およびＰＣＴ公開番号ＷＯ  ９５／０５８５３（１９９５年３月２日公開、Ｃａｒｓｏｎらによる）に開示される。本発明の裸のＤＮＡ分子は、水性賦形剤（例えば、リン酸緩衝化生理食塩水）中に、および／もしくはキャリア（例えば、脂質に基づくビヒクル）を伴って含まれ得るか、または微粒子（例えば、金粒子）に結合され得る。
【０１３９】
本発明の組換えウイルスは、ウイルスコート中にパッケージングされ、かつ投与後に動物中で発現され得る、本発明の組換え分子を含む。好ましくは、この組換え分子は、パッケージングが欠損しているか、そして／または弱毒化ウイルスをコードする。アルファウイルス、ポックスウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、ピコルナウイルスおよびレトロウイルスに基づくウイルスを含むがこれらに限定されない、多数の組換えウイルスが用いられ得る。好ましい組換えウイルスは、アルファウイルス（例えば、シンドビスウイルス）、ラクーンポックスウイルス、種特異的ヘルペスウイルスおよび種特異的ポックスウイルスに基づくウイルスである。アルファウイルス組換えウイルスを産生しそして使用するための方法の一例は、ＰＣＴ公開番号ＷＯ  ９４／１７８１３号（Ｘｉｏｎｇらによる、１９９４年８月１８日公開）に開示される。
【０１４０】
動物に投与される場合、本発明の組換えウイルスは、レシピエント動物内で細胞に感染し、そしてＤｅｒ  ＨＭＷ−ｍａｐタンパク質媒介生物学的応答をその動物内で減少させ得る、タンパク質またはＲＮＡ核酸分子の産生を指向する。例えば、本発明のＤｅｒ  ＨＭＷ−ｍａｐ核酸分子を含む組換えウイルスは、その動物内で、Ｄｅｒ  ＨＭＷ−ｍａｐタンパク質媒介生物学的応答を減少させるに充分な量のタンパク質またはＲＮＡの産生をもたらすプロトコルに従って投与される。好ましい単回用量の本発明の組換えウイルスは、その動物の体重１キログラムあたり約１×１０４〜約１×１０７ウイルスプラーク形成単位（ｐｆｕ）である。投与プロトコルは、タンパク質に基づく組成物について本明細書中に記載された投与プロトコルと類似し、皮下投与経路、筋肉内投与経路、鼻腔内投与経路および経口投与経路が好ましい。
【０１４１】
本発明の組換え細胞ワクチンは、本発明の少なくとも１つのタンパク質を発現する、本発明の組換え細胞を含む。この実施形態のために好ましい組換え細胞としては、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｓ．ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ、酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅおよびＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓを含む）、ＢＨＫ、ＣＶ−１、筋芽細胞Ｇ８、ＣＯＳ（例えば、ＣＯＳ−７）、Ｖｅｒｏ、ＭＤＣＫおよびＣＲＦＫ組換え細胞が挙げられる。本発明の組換え細胞ワクチンは、種々の方法で投与され得るが、これらは、経口的に（好ましくは、体重１キログラムあたり約１０８細胞〜約１０１２細胞の範囲にわたる用量で）投与され得るという利点を有し得る。投与プロトコルは、タンパク質に基づくワクチンについて本明細書中に記載された投与プロトコルと類似する。組換え細胞ワクチンは、細胞全体、細胞壁が剥がれた細胞または細胞溶解産物を含み得る。
【０１４２】
本発明の治療組成物が、ダニアレルギーに対して動物を脱感作する効力（有効性）を、本明細書に記載されるインビボ皮膚試験方法、処置される動物における細胞免疫活性の検出、または、本発明のＤｅｒ  ＨＭＷ−ｍａｐタンパク質に対して特異的に結合するＩｇＥのレベルの決定を用いるがこれに限定されない種々の方法で試験し得る。動物における細胞免疫活性およびＩｇＥレベルを決定する方法は、当業者に公知である。１つの実施形態において治療組成物は、イヌ、ネコ、ウサギ、およびマウスのような動物モデルにおいて試験され得、そしてまたヒトにおいて試験され得る。このような技術は、当業者に公知である。
【０１４３】
本発明の治療組成物とともに使用するための好ましい核酸分子としては、本明細書に開示される任意のＤｅｒ  ＨＭＷ−ｍａｐ核酸分子、詳細には、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４５、および／またはアミノ酸配列である配列番号３３を含むタンパク質をコードする核酸配列、ならびにそれらの相補体が挙げられる。
【０１４４】
本発明の治療組成物において有用な組み換え細胞としては、本発明のＤｅｒ  ＨＭＷ−ｍａｐタンパク質を含む、本発明の組み換え細胞が挙げられる。本実施形態に好ましい組み換え細胞としては、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ，Ｅ．ｃｏｌｉ，Ｌｉｓｔｅｒｉａ，Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ，Ｓ．ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ、酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅを含む）、ＢＨＫ、ＣＶ−１、筋芽細胞Ｇ８、ＣＯＳ（例えば、ＣＯＳ−７）、Ｖｅｒｏ、ＭＤＣＫ、およびＣＲＦＫの組み換え細胞が挙げられる。本発明の組み換え細胞は、種々の方法で投与され得るが、好ましくは体重１ｋｇあたり約１０８〜約１０１２細胞の範囲の用量で、経口的に投与され得るという利点を有する。投与プロトコールは、タンパク質組成物について本明細書において記載されたプロトコールと同様である。組み換え細胞とは、細胞全体、細胞壁を剥がした細胞、または細胞溶解物を含み得る。
【０１４５】
本発明の１つの実施形態は、免疫療法の方法であり、この方法は、本発明のＤｅｒ  ＨＭＷ−ｍａｐタンパク質を含む治療組成物の有効量を動物に投与する工程を包含する。適切な治療組成物および投与方法が本明細書において開示されている。本発明によれば、本発明の治療組成物および方法を用いて、ダニアレルゲン病因に関連する症状を予防または緩和し得る。
【０１４６】
本発明の治療組成物がＤｅｒ  ＨＭＷ−ｍａｐタンパク質に対するアレルギー反応をもたらす効力（有効性）を、Ｄｅｒ  ＨＭＷ−ｍａｐタンパク質媒介免疫を決定するための標準的方法（即時型過敏、遅延型過敏、抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）、免疫複合体活性、分裂促進活性、ヒスタミン放出アッセイ、およびＪａｎｅｗａｙら（同書）に記載の方法のような他の方法が挙げられるがこれらに限定されない）を用いて試験し得る。
【０１４７】
本発明はまた、本発明の１つ以上の治療用化合物を含む治療組成物を包含する。このような治療用化合物の例としては、例えば、本明細書に開示された他のアレルゲンが挙げられる。
【０１４８】
本発明の治療組成物は、処置されるべき動物が耐性であり得る賦形剤中に処方され得る。このような賦形剤の例としては、水、生理食塩水、リンゲル液、デキストラン溶液、ハンクス溶液、および他の生理学的に平衡な塩の水溶液が挙げられる。非水性ビヒクル（例えば、不揮発性油、ゴマ油、オレイン酸エチル、またはトリグリセリド）もまた用いられ得る。他の有用な処方物は、増粘剤（例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、またはデキストラン）を含む懸濁液を含む。賦形剤はまた、少量の添加物（例えば、等張性および化学的安定性を増強する物質）を含み得る。緩衝液の例としては、リン酸緩衝液、重炭酸緩衝液、およびＴｒｉｓ緩衝液が挙げられるが、保存剤（防腐剤）の例としては、チメロサール、ｏ−クレゾール、ホルマリン、およびベンジルアルコールが挙げられる。標準的な処方物は、注射可能な液体か、または注射のための懸濁液もしくは溶液として適切な液体に取り込まれ得る固体のいずれかであり得る。従って、非液体処方物において、賦形剤は、デキストロース、ヒト血清アルブミン、保存剤（防腐剤）などを含み得、投与前に無菌の水または生理食塩水がこれに添加され得る。
【０１４９】
本発明の１つの実施形態において、治療組成物は、アジュバントを含み得る。アジュバントは、特異的な抗原に対する動物の免疫応答を増強し得る薬剤である。適切なアジュバントとしては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：サイトカイン、ケモカイン、ならびにサイトカインおよびケモカインの生成を誘導する化合物（例えば、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、Ｆｌｔ−３リガンド、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、インターロイキン２（ＩＬ−２）、インターロイキン−３（ＩＬ−３）、インターロイキン４（ＩＬ−４）、インターロイキン５（ＩＬ−５）、インターロイキン６（ＩＬ−６）、インターロイキン７（ＩＬ−７）、インターロイキン８（ＩＬ−８）、インターロイキン１０（ＩＬ−１０）、インターロイキン１２（ＩＬ−１２）、インターフェロンγ、インターフェロンγ誘導性因子Ｉ（ＩＧＩＦ）、トランスフォーミング成長因子β、ＲＡＮＴＥＳ（ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｕｐｏｎ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ、ｎｏｒｍａｌ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ａｎｄ  ｐｒｅｓｕｍａｂｌｙ  ｓｅｃｒｅｔｅｄ（活性化の際に調節された、正常なＴ細胞が発現し、そしておそらく分泌した））、マクロファージ炎症性タンパク質（例えば、ＭＩＰ−１α、およびＭＩＰ−１β）、およびリーシュマニア伸長開始因子（ＬＥＩＦ）；細菌成分（例えば、エンドトキシン、詳細には、スーパー抗原、外毒素および細胞壁成分）；アルミニウムベースの塩；カルシウムベースの塩；シリカ；ポリヌクレオチド；トキソイド；血清タンパク質、ウイルスコート（外殻）タンパク質；ブロックコポリマーアジュバント（例えば、ＨｕｎｔｅｒのＴｉｔｅｒｍａｘＴＭアジュバント（ＶａｘｃｅｌＴＭ，Ｉｎｃ．Ｎｏｒｃｒｏｓｓ，ＧＡ）、Ｒｉｂｉアジュバント（Ｒｉｂｉ  ＩｍｍｕｎｏＣｈｅｍ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｉｎｃ．，Ｈａｍｉｌｔｏｎ，ＭＴ）；ならびにサポニンおよびそれらの誘導体（例えば、Ｑｕｉｌ  Ａ（Ｓｕｐｅｒｆｏｓ  Ｂｉｏｓｅｃｔｏｒ  Ａ／Ｓ，Ｄｅｎｍａｒｋ）。本発明のタンパク質アジュバントは、本明細書に記載の方法を用いて、タンパク質自体の形態で、またはこのようなタンパク質をコードする核酸分子の形態で送達され得る。
【０１５０】
本発明の１つの実施形態において、治療組成物は、キャリアを含み得る。キャリアとしては、処置された動物における治療組成物の半減期を延長する化合物が挙げられる。適切なキャリアとしては、ポリマー性徐放性ビヒクル、生分解性インプラント、リポソーム、細菌、ウイルス、他の細胞、オイル（油）、エステル、およびグリコールが挙げられるがこれらに限定されない。
【０１５１】
本発明の１つの実施形態は、本発明の組成物を動物に緩徐に放出し得る徐放性処方物である。本明細書において用いる場合、徐放性処方物は、徐放性ビヒクル中に本発明の組成物を含む。適切な徐放性ビヒクルとしては、生体適合性ポリマー、他のポリマー性基質、カプセル、マイクロカプセル、微小粒子、ボーラス調製物、浸透性ポンプ、拡散デバイス、リポソーム、リポスフェア（ｌｉｐｏｓｐｈｅｒｅ）、および経皮送達システムが挙げられるがこれらに限定されない。本発明の他の徐放性処方物としては、動物への投与の際に、その場で（インサイチュで）固体またはゲルを形成する液体が挙げられる。好ましい徐放性処方物は、生分解性（すなわち、生体腐食性）である。
【０１５２】
本発明の好ましい徐放性処方物は、動物におけるダニアレルギーを減弱するための組成物の治療用量レベルを達成するのに十分な一定速度で、動物の血中に本発明の治療組成物を放出し得る。本明細書において用いる場合、ダニアレルギーとは、ダニアレルゲンが動物と接触するときに生じる細胞応答をいう。例えば、ダニアレルゲンに特異的に結合するＩｇＥは、Ｆｃεレセプターに結合するようになり、これが、アレルギーの臨床症状を誘引し得る生物学的メディエーター（例えば、ヒスタミン、プロスタグランジン、および／またはプロテアーゼ）の放出を含む、Ｆｃεレセプター媒介性の生物学的応答を生じる。この治療組成物は、好ましくは、約１〜約１２ヶ月におよぶ時間間隔にわたって放出される。本発明の好ましい徐放性処方物は、好ましくは少なくとも約１ヶ月間、より好ましくは少なくとも３ヶ月間、なおより好ましくは少なくとも６ヶ月間、なおより好ましくは少なくとも約９ヶ月間、そしてなおより好ましくは少なくとも約１２ヶ月間、処置を及ぼし得る。
【０１５３】
本発明の治療組成物は、タンパク質分解を生じない従来方法（例えば、濾過）によって滅菌され得るか、そして／または凍結乾燥され得る。
【０１５４】
本発明の治療組成物は、本明細書において記載されるように、ダニアレルギーに対して感受性の任意の動物に対して投与され得る。有効な様式で本発明の治療組成物を投与する受容可能なプロトコールは、個々の用量サイズ、用量の回数、用量投与の頻度、および投与の様式によって変化し得る。このようなプロトコールの決定は、当業者によって達成され得る。有効な用量とは、ダニアレルゲンに対する過敏性に対して動物を処置し得る用量をいう。有効用量は、例えば、用いられる治療組成物、ならびにレシピエント動物のサイズおよびタイプに依存して変化し得る。ダニアレルゲンに対して動物を免疫調節する有効用量は、ダニアレルゲンに対する動物による過敏性応答を緩和し得る時間を超えて投与された用量を含む。例えば、第一の寛容化用量は、過敏性の動物に投与されたときに生じる過敏性応答が最小である、本発明の治療組成物の量を含み得る。第二の寛容化用量は、同じ治療組成物の第一の用量よりも多い量を含み得る。有効な寛容化用量は、動物がダニアレルゲンに対する曝露に対する過敏性応答を有さないように、この動物を寛容化するのに必要な治療組成物の漸増する濃度を含み得る。動物を脱感作するために有効な用量は、その動物の環境に存在するダニアレルゲンに対する曝露に対して過敏性応答を有することから動物をブロックするのに十分な、本発明の治療組成物の濃度を含み得る。有効な脱感作用量は、過敏性動物に投与されたときに生じる過敏性応答が最小である、治療組成物の濃度を有する反復用量を含み得る。
【０１５５】
適切な単一用量は、適切な時間間隔を超えて、１回以上投与された場合、ダニアレルゲンに対する過敏性に対して動物を処置し得る用量である。例えば、ダニアレルゲン、またはミメトープ（ｍｉｍｅｔｏｐｅ）治療組成物の好ましい単回用量は、動物の体重１キログラムあたり、この治療組成物の約０．５ｎｇ〜約１ｇである。治療組成物でのさらなる処置は、もとの投与の後、約１日〜１年で投与され得る。治療組成物でのさらなる処置は好ましくは、この動物がダニアレルゲンに対する過敏性応答からもはや防御されていない場合、投与される。特定の投与用量およびスケジュールは、上記に考察されたパラメーターに基づいて、当業者によって開発され得る。投与の様式としては、皮下経路、皮内経路、静脈内経路、経鼻経路、経口経路、経皮経路、および筋肉内経路が挙げられ得るがこれらに限定されない。
【０１５６】
本発明の治療組成物は、ダニアレルゲンに対する動物の過敏性を改変し得る他の化合物と組み合わせて用いられ得る。例えば、動物は、全身剤または抗炎症性剤（例えば、抗ヒスタミン、抗ステロイド試薬、抗炎症性試薬、およびＩｇＥからＩｇＧへの免疫グロブリン重鎖クラスの切り替えを駆動する試薬）などによって、過敏性応答に関与する細胞の機能を改変し得る化合物（この化合物はアレルギー反応を減弱する）を用いて処置され得る。過敏性応答に関与する細胞の機能を改変するために有用な適切な化合物としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：抗ヒスタミン、クロモリンナトリウム、テオフィリン、サイクロスポリンＡ、アドレナリン、コルチゾン、細胞シグナル伝達を調節し得る化合物、アデノシン３’，５’−サイクリックホスフェート（ｃＡＭＰ）活性を調節し得る化合物、およびＩｇＥ活性をブロックする化合物（例えば、ＩｇＥ由来のペプチドもしくはＩｇＥ特異的Ｆｃレセプター、ＩｇＥ由来のペプチドもしくはＩｇＥ特異的Ｆｃレセプターに特異的な抗体、またはＦｃレセプターに対するＩｇＥの結合をブロックし得る抗体）。
【０１５７】
本発明の組成物は、ダニアレルゲン過敏性を有するかまたは、それに対して過敏な任意の動物に対して投与され得る。処置するのが好ましい動物としては、哺乳動物および鳥類（ネコ、イヌ、ウマ、ヒト、および他のペット、労役動物、および／または経済的食用動物を含む）が挙げられる。防御するのに特に好ましい動物は、ネコおよびイヌである。
【０１５８】
本発明の別の局面は、本発明の処方物を用いて、ダニアレルゲンに対する過敏症を受け易いか、もしくはダニアレルゲンに対する過敏症を有する動物のための処置を処方するための方法を含む。ダニアレルゲン過敏症に対する処置を処方するための好ましい方法は、例えば、（１）本発明のダニアレルゲンまたはそのミメトープ（ｍｉｍｅｔｏｐｅ）を含む有効量の処方物（適切かつ好ましい処方物が、本明細書中に開示される）を動物の１つ目の部位に皮内注射する工程；（２）有効量のコントロール溶液をこの動物の第２の部位に皮内注射する工程；（３）この処方物の注射から生じる膨疹サイズとコントロール溶液の注射から生じる膨疹サイズとを測定して、比較することによって、この動物がダニアレルゲン過敏症を有するか否かを評価する工程；ならびに（４）ダニアレルゲン過敏症に対する処置を処方する工程、を包含する。
【０１５９】
ダニアレルゲン過敏症に対する処置を処方するための代替的な好ましい方法は、（１）試験される動物から得られた体液サンプルの第１の部分を、ダニアレルゲンまたはそのミメトープを含む有効量の処方物（適切かつ好ましい処方物が、本明細書中に開示される）と接触させ、第１の免疫複合体溶液を形成する工程；（２）陽性コントロール抗体と接触させて、第２の免疫複合体溶液を形成する工程；（３）第１の免疫複合体溶液および第２の免疫複合体溶液の中の免疫複合体形成の量を測定および比較することによって、この動物がダニアレルゲン過敏症を有するか否かを評価する工程；ならびに（４）ダニアレルゲン過敏症に対する処置を処方する工程を包含する。本明細書中に開示されるダニアレルゲン処方物を用いて、アレルギーに対する処置を処方するために類似の方法が使用され得ることに、注意すべきである。
【０１６０】
本発明の別の局面は、本発明の処方物を用いて、ダニアレルゲン過敏症を受け易いか、もしくはダニアレルゲンに対する過敏症を有する動物をモニタリングするための方法を含む。本発明のインビボ試験およびインビトロ試験は、ダニアレルゲン過敏症に対する任意の処置の前および後に、ダニアレルゲン過敏症について動物を試験するために使用され得る。ダニアレルゲン過敏症の処置をモニターするための好ましい方法（これはまた、他のアレルギーの処置をモニターするためにも適用され得る）は、（１）ダニアレルゲンまたはそのミメトープを含む有効量の処方物（適切かつ好ましい処方物は、本明細書中に開示される）を動物の１つ目の部位に皮内注射する工程；（２）有効量のコントロール溶液をこの動物の第２の部位に皮内注射する工程；ならびに（３）この処方物の注射から生じる膨疹サイズとコントロール溶液の注射から生じる膨疹サイズとを測定および比較することによって、この動物がダニアレルゲンに対して脱感作されるか否かを決定する工程を包含する。
【０１６１】
ダニアレルゲン過敏症に対する処置をモニターするための代替的な好ましい方法（これはまた、他のアレルギーの処置をモニターするためにも適用され得る）は、（１）試験される動物から得られた体液サンプルの第１の部分を、ダニアレルゲンまたはそのミメトープを含む有効量の処方物（適切かつ好ましい処方物が、本明細書中に開示される）と接触させ、第１の免疫複合体溶液を形成する工程；（２）陽性コントロール抗体と接触させて、第２の免疫複合体溶液を形成する工程；ならびに（３）第１の免疫複合体溶液および第２の免疫複合体溶液の中の免疫複合体形成の量を測定および比較することによって、この動物がダニアレルゲンに対して脱感作されるか否かを決定する工程を包含する。
【０１６２】
本発明はまた、ダニアレルゲンまたはそのミメトープに選択的に結合し得る抗体を含む。このような抗体は、本明細書において、抗ダニアレルゲン抗体と称される。本明細書中に使用される場合、用語「選択的に結合する」とは、このような抗体がダニアレルゲンまたはそのミメトープに優先的に結合する能力をいう。特に、本発明は、Ｄｅｒ  ＨＭＷ−ｍａｐタンパク質に選択的に結合し得る抗体を含む。結合は、免疫ブロットアッセイ、免疫沈降アッセイ、酵素免疫アッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ、免疫蛍光抗体アッセイおよび免疫電子顕微鏡を含む当業者に公知の種々の方法を用いて、測定され得る；例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（同書）を参照のこと。
【０１６３】
本発明の抗体は、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体のいずれかであり得る。本発明の抗体は、機能的等価物（例えば、抗体を得るために使用されるタンパク質またはミメトープの少なくとも１つのエピトープに選択的に結合し得る、抗体フラグメントおよび遺伝子操作された抗体（単鎖抗体を含む））を含む。好ましい抗体は、Ｄｅｒ  ＨＭＷ−ｍａｐタンパク質またはそのミメトープに応答して惹起される。抗体が惹起されるより好ましいＤｅｒ  ＨＭＷ−ｍａｐタンパク質は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１８、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２４、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３８、配列番号４１、および／もしくは配列番号４４のアミノ酸配列、またはこれらのホモログを有するタンパク質の少なくとも一部を含む。好ましくは、本発明の抗体は、本発明のＤｅｒ  ＨＭＷ−ｍａｐタンパク質に対して約１０３Ｍ−１〜約１０１２Ｍ−１の単一部位結合親和性を有する。
【０１６４】
本発明の抗体を産生するための好ましい方法は、Ｄｅｒ  ＨＭＷ−ｍａｐタンパク質またはそのミメトープの有効量を動物に投与して、抗体を生成する工程、およびその抗体を回収する工程を包含する。規定された生成物またはミメトープに対して惹起された抗体は、利点を有し得る。なぜなら、このような抗体は、さもなければ診断アッセイにおける妨害、または治療組成物中で使用された場合の副作用を生じ得る、他の物質に対する抗体を、実質的に混入していないからである。
【０１６５】
本発明の抗体は、種々の潜在的な用途（これらは、本発明の範囲内である）を有する。例えば、このような抗体は、（ａ）ワクチンとして使用されて、動物を受動的に免疫して、その動物をダニアレルゲン過敏症から保護し得、（ｂ）試験キットにおける陽性コントロールとして使用され得、そして／または（ｃ）タンパク質および他の夾雑物の混合物から所望のダニアレルゲンを回収するための手段として使用され得る。
【０１６６】
以下の実施例は、例示目的のために提供され、そして本発明の範囲を限定することを意図しない。
【０１６７】
（実施例）
本実施例は、当業者に公知であると考えられる、多数の分子生物学的技術、微生物学的技術、免疫学的技術および生化学的技術を含むことに、注意すべきである。このような技術の開示は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（同書）および関連する参考文献中に見出され得る。
【０１６８】
（実施例１）
本実施例は、ダニアレルゲンに対してアレルギー性であることが既知であるイヌ由来のＩｇＥに結合する、高分子量タンパク質の同定を記載する。
【０１６９】
約５．５グラム（ｇ）の凍結湿潤Ｄｅｒｍａｔａｐｈａｇｏｉｄｅｓ  ｆａｒｉｎａｅ（Ｄｅｒ  ｆ）ダニ（Ｂａｙｅｒ  Ａｌｌｅｒｇｙ，Ｓｐｏｋａｎｅ，ＷＡから入手可能である）を、３０ｍｌのリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）または０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）（各々、完全なプロテアーゼインヒビター（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮから入手可能である）を含む）のいずれかの中で、丸底ガラスホモジナイザーでホモジナイズし、Ｄｅｒ  ｆ粗抽出物を得た。得られる上清を収集し、そして各々を１６，０００×ｇで約３０分間の遠心分離によって、Ｃｅｎｔｒｉｐｒｅｐ  ３０濃縮器（Ａｍｉｃｏｎ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡから入手可能である）中で濃縮した。濃縮した上清を、それぞれ、ＰＢＳまたは０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）中、分離Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−１００カラム（２．７×７０ｃｍ；Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪから入手可能である）に適用した。各カラムから排除された画分をプールした。ＰＢＳを用いた場合、画分を１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣ（ｐＨ  ８）に対して透析した。画分を、分離Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム（２．５×５ｃｍ；Ｐｈａｒｍａｃｉａから入手可能である）に適用した。０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）を含む画分を使用した場合、Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムを１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）中で予備平衡させた。各カラムを、約４５ｍｌの１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）、次いで０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）、次いで０．２Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）、次いで０．３Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）、次いで０．４Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）、そして次いで、０．５Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）を用いて連続的に溶出した。画分を、各溶出工程から収集した。各画分を、ダニアレルゲンに対するアレルギー性が既知であるイヌから単離したイヌ血清（本明細書中、ダニアレルギー性イヌの抗血清またはダニアレルギー性抗血清と称する）中に存在するＩｇＥ抗体に結合するタンパク質の存在について、ウエスタンブロットによって分析した。詳細には、画分中に含まれるタンパク質を、１２％  Ｔｒｉｓ−グリシン  ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分解し、次いで、ニトロセルロース上にブロットした。このブロットを、標準的な緩衝液を用いて１：２０で希釈した、ダニアレルゲンに対してアレルギー性であることが公知のイヌから得られた血清プールと共にインキュベートした。このブロットを、インキュベートし、次いで、標準的な手順を用いて洗浄した。次いで、このブロットを、マウスモノクローナル抗イヌＩｇＥ抗体ＤＥＩ３８（１ｍｇ／ｍｌ；１：１０００希釈）と共にインキュベートした。このブロットをインキュベートし、次いで標準的な手順を用いて洗浄した。次いで、このブロットを、西洋ワサビベルオキシダーゼに結合体化したロバ抗マウスＩｇＧ抗体（１：１０００希釈；Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｓ，Ｍａｉｎｅから入手可能である）と共にインキュベートした。このブロットに結合したＨＲＰ結合体化抗体の存在を、標準的な技術を用いて検出した。約７０ｋＤのタンパク質を、０．２Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣ��（ｐＨ８）画分中で同定し、約９８ｋＤのタンパク質および約１０９ｋＤのタンパク質を、０．３Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）画分中で同定した。
【０１７０】
０．３Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）を用いて溶出した上記の画分を、Ｃｅｎｔｒｉｐｒｅｐ  ３０濃縮器中で濃縮し、次いで、２０ｍＭ  Ｎａ−Ａｃ（ｐＨ５．６）中で希釈した。次いで、溶出した画分を、ＰｏｌｙＣａｔ  Ａ  ＨＰＬＣ陽イオン交換カラム（ＰｏｌｙＬＣ，Ｃｏｌｕｍｂｉａ，ＭＤから入手可能である）に適用した。このカラムを、約１０ｍｌの２０ｍＭ  Ｎａ−Ａｃ（ｐＨ５．６）を用いて溶出し、次いで、２０ｍＭ  Ｎａ−Ａｃ（ｐＨ５．６）緩衝液中の０〜０．５Ｍ  直線勾配のＮａＣｌの約４５ｍｌを流速約１ｍｌ／分で用いて溶出した。画分を、溶出手順から収集し、そして上記のダニアレルギー性抗血清およびウエスタンブロットプロトコルを用いて高分子量タンパク質の存在についてアッセイした。高分子量タンパク質を含む画分をプールした。トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を、約０．０５％の濃度に添加した。この溶液を、８０％  溶媒Ａおよび２０％  溶媒Ｂで予備平衡させたＴＳＫ−Ｇｅｌ  ＴＭＳ−２５０  Ｃｌ逆相カラム（ＴｏｓｏＨａａｓ，Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙｖｉｌｌｅ，ＰＡから市販）に適用した。溶媒Ａは、水中に約０．０５％  ＴＦＡを含み、そして溶媒Ｂは、水中の９０％アセトニトリル中に約０．０５％  ＴＦＡを含む。このカラムを、約５ｍｌの２０％  溶媒Ｂを用いて溶出し、次いで、約２０％〜約７０％  直線勾配の溶媒Ｂ  ３６ｍｌを０．６ｍｌ／分の流速にて用いて溶出した。このカラムから溶出されたタンパク質を、１２％  Ｔｒｉｓ−グリシンＰＡＧＥによって分解した。このゲルを、クマシーブルーを用いて染色した。染色したゲルを、図１に示す。レーン１は、Ｍａｒｋ−１２タンパク質分子量マーカー（Ｎｏｖｅｘ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡから入手可能である）を含み、レーン２は、逆相カラムから溶出されたタンパク質を含み、そしてレーン３は、ＳｅｅＢｌｕｅＴＭタンパク質分子量マーカー（Ｎｏｖｅｘから入手可能である）を含む。２つの主要なタンパク質を、溶出物中で同定した。このタンパク質の分子量を、ＢｉｏＲａｄＴＭ  Ｍｕｌｔｉ−ＡｎａｌｙｓｔＴＭ／ＰＣ  Ｉｍａｇｅ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＢｉｏＲａｄ  Ｃｏｒｐ．から入手可能である）を用いて決定した。図１のレーン２の中のより高い分子量のタンパク質を、約１０９ｋＤであると決定し、本明細書中においてダニアレルゲンタンパク質Ａ（ｍａｐＡ）と称する。図１のレーン２の中のより低い分子量のタンパク質を、約９８ｋＤであると決定し、本明細書中においてダニアレルゲンタンパク質Ｂ（ｍａｐＢ）と称する。合わせたタンパク質の純度は、８５％純度よりも高く、すなわち、１５％未満の不純物であった。この精製された溶出物を、本明細書中においてＤ．ｆａｒｉｎａｅ高分子量ｍａｐ（ＨＭＷ−ｍａｐ）組成物と称する。
【０１７１】
（実施例２）
本実施例は、Ｄ．ｆａｒｉｎａｅ  ＨＭＷ−ｍａｐ組成物中のタンパク質のＮ末端配列決定を記載する。
【０１７２】
実施例１において上記のようにして得た０．３Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）画分中に含まれるタンパク質を、１２％  Ｔｒｉｓ−グリシンポリアクリルアミド−ＳＤＳゲルを用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、続いてクマシー染色をした。タンパク質を、ＰＶＤＦ上にブロットさせ、クマシーＲ−２５０で染色し、標準的な手順を用いて脱色した。約９８ｋＤのバンドおよび約１０９ｋＤのバンドに対応するタンパク質を切り出し、そして当業者に公知の技術を用いて別々にＮ末端アミノ酸配列決定に供した。約１４アミノ酸の部分的なＮ末端アミノ酸配列を、両方のタンパク質について推定し、そしてこれらの配列が同一であると決定した。Ｎ末端アミノ酸配列を、アミノ酸配列：Ｓｅｒ  Ｉｌｅ  Ｌｙｓ  Ａｒｇ  Ａｓｐ  Ｈｉｓ  Ａｓｎ  Ａｓｐ  Ｔｙｒ  Ｓｅｒ  Ｌｙｓ  Ａｓｎ  Ｐｒｏ  Ｍｅｔを有する配列番号１として本明細書中に示す。
【０１７３】
Ｄ．ｆａｒｉｎａｅ  ＨＭＷ−ｍａｐ組成物中のタンパク質をまた、タンパク質分解性切断に供して、内部アミノ酸配列データを得た。詳細には、このＤ．ｆａｒｉｎａｅ  ＨＭＷ−ｍａｐ組成物を、当該分野で標準的な方法を使用して、エンドプロテイナーゼＡｓｐ−Ｎ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮから入手可能である）を用いて切断した。次いで、消化したタンパク質を、Ｓｔｏｎｅら、Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  Ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｎｄ  ＨＰＬＣ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ（Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｎｄ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｍｉｃｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ，ＰＴ  Ｍａｔｓｕｄａｉｒａ編，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ．）によって記載される方法を用いて、ＨＰＬＣによって分離した。１２個のタンパク質分解性フラグメントを単離し、これらを、本明細書中においてｍａｐ（１）、ｍａｐ（２）、ｍａｐ（３）、ｍａｐ（４）、ｍａｐ（５）、ｍａｐ（６）、ｍａｐ（７）、ｍａｐ（８）、ｍａｐ（９）、ｍａｐ（１０）、ｍａｐ（１１）およびｍａｐ（１２）と称する。
【０１７４】
ｍａｐ（１）のＮ末端部分アミノ酸配列を、Ａｓｐ  Ｔｙｒ  Ｇｌｕ  Ｔｙｒ  Ｐｒｏ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ａｒｇ  Ｌｅｕ  Ｇｌｙ  Ａｓｎ  Ｐｒｏ  Ｌｙｓ  Ａｌａ  Ｐｒｏ  Ｌｅｕ  Ｔｙｒ  Ｌｙｓ  Ａｒｇ  Ｐｒｏであると決定し、配列番号２とも称する。ｍａｐ（２）のＮ末端部分アミノ酸配列を、Ａｓｐ  Ｉｌｅ  Ｐｒｏ  Ｈｉｓ  Ｐｒｏ  Ｔｈｒ  Ａｓｎ  Ｉｌｅ  Ｈｉｓ  Ｌｙｓ  Ｔｙｒ  Ｌｅｕ  Ｖａｌ  Ｃｙｓ  Ｇｌｕ  Ｓｅｒ  Ｖａｌ  Ａｓｎ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙであると決定し、配列番号３とも称する。ｍａｐ（３）のＮ末端部分アミノ酸配列を、Ａｓｐ  Ｐｒｏ  Ａｌａ  Ｌｙｓ  Ｇｌｙ  Ｍｅｔ  Ｓｅｒ  Ｐｒｏ  Ｐｒｏ  Ｇｌｙ  Ｐｈｅ  Ｉｌｅ  Ｖａｌ  Ｇｌｙ  Ｇｌｕ  Ｇｌｕ  Ｇｌｙ  Ｖａｌ  Ｌｅｕ  Ｓｅｒであると決定し、配列番号４とも称する。ｍａｐ（４）のＮ末端部分アミノ酸配列を、Ａｓｐ  Ｇｌｕ  Ｌｙｓ  Ａｓｎ  Ｓｅｒ  Ｐｈｅ  Ｇｌｕ  Ｃｙｓ  Ｉｌｅ  Ｌｅｕ  Ｇｌｙ  Ｐｒｏであると決定し、配列番号５とも称する。ｍａｐ（５）のＮ末端部分アミノ酸配列を、Ａｓｐ  Ａｌａ  Ｐｈｅ  Ｇｌｕ  Ｐｒｏ  Ｈｉｓ  Ｇｌｙ  Ｔｙｒ  Ｌｅｕ  Ｌｅｕ  Ｔｈｒ  Ａｌａ  Ａｌａ  Ｖａｌ  Ｓｅｒ  Ｐｒｏ  Ｇｌｙ  Ｌｙｓであると決定し、配列番号６とも称する。ｍａｐ（６）のＮ末端部分アミノ酸配列を、Ａｓｐ  Ｌｙｓ  Ｇｌｎ  Ａｓｎ  Ｔｙｒ  Ｌｅｕ  Ａｌａ  Ｌｅｕ  Ｖａｌ  Ａｒｇ  Ｇｌｕ  Ｌｅｕ  Ｌｙｓであると決定し、配列番号７とも称する。ｍａｐ（７）のＮ末端部分アミノ酸配列を、Ａｓｐ  Ｍｅｔ  Ａｌａ  Ｇｌｎ  Ａｓｎ  Ｔｙｒ  Ｌｙｓ  Ｔｙｒ  Ａｒｇ  Ｇｌｎ  Ｇｌｎ  Ｐｈｅ  Ｉｌｅ  Ｇｌｎ  Ｓｅｒ  Ｖａｌ  Ｌｅｕ  Ａｓｎ  Ａｓｎ  Ｇｌｙ  Ａｌａ  Ｔｈｒ  Ａｒｇ  Ｇｌｎであると決定し、配列番号８とも称する。ｍａｐ（８）のＮ末端部分アミノ酸配列を、Ａｓｐ  Ｇｌｕ  Ｘａａ  Ａｓｎ  Ｖａｌ  Ｍｅｔ  Ｘａａ  Ｔｙｒ  Ｖａｌ  Ｌｅｕ  Ｔｙｒ  Ｔｈｒ  Ｍｅｔ  Ｈｉｓ  Ｔｙｒ  Ｔｙｒ  Ｌｅｕ  Ａｓｎ  Ａｓｎ  Ｇｌｙ  Ａｌａ  Ｔｈｒ  Ａｒｇであると決定し、配列番号９とも称する（ここで、Ｘａａは、任意のアミノ酸を示す）。ｍａｐ（９）のＮ末端部分アミノ酸配列を、Ａｓｐ  Ｌｙｓ  Ｌｅｕ  Ｖａｌ  Ｍｅｔ  Ｇｌｙ  Ｖａｌ  Ｐｒｏ  Ｐｈｅ  Ｔｙｒ  Ｇｌｙ  Ａｒｇ  Ａｌａ  Ｘａａ  Ｓｅｒ  Ｉｌｅ  Ｇｌｕであると決定し、配列番号１０とも称する（ここで、Ｘａａは、任意のアミノ酸を示す）。ｍａｐ（１０）のＮ末端部分アミノ酸配列を、Ａｓｐ  Ｉｌｅ  Ｐｒｏ  Ｈｉｓ  Ｐｒｏ  Ｔｈｒ  Ａｓｎ  Ｉｌｅ  Ｈｉｓ  Ｌｙｓ  Ｔｙｒ  Ｌｅｕ  Ｖａｌ  Ｃｙｓ  Ｇｌｕ  Ｓｅｒ  Ｖａｌ  Ａｓｎ  Ｇｌｙであると決定し、配列番号１１とも称する。ｍａｐ（１１）のＮ末端部分アミノ酸配列を、Ａｓｐ  Ｔｙｒ  Ａｌａ  Ｌｙｓ  Ａｓｎ  Ｐｒｏ  Ｌｙｓ  Ａｒｇ  Ｉｌｅ  Ｖａｌ  Ｃｙｓ  Ｉｌｅ  Ｖａｌ  Ｇｌｙ  Ｔｈｒ  Ｇｌｕ  Ｇｌｙ  Ｖａｌ  Ｌｅｕ  Ｓｅｒであると決定し、配列番号１２とも称する。ｍａｐ（１２）のＮ末端部分アミノ酸配列を、Ａｓｐ  Ｐｒｏ  Ａｌａ  Ｌｙｓ  Ｇｌｙ  Ｍｅｔ  Ｓｅｒ  Ｐｒｏ  Ｐｒｏ  Ｇｌｙ  Ｈｅ  Ｉｌｅ  Ｖａｌ  Ｇｌｙ  Ｇｌｕ  Ｇｌｕ  Ｇｌｙ  Ｖａｌ  Ｌｅｕ  Ｓｅｒであると決定し、配列番号１３とも称する。ｍａｐ（１）、ｍａｐ（２）、ｍａｐ（３）、ｍａｐ（４）、���ａｐ（５）、ｍａｐ（６）、ｍａｐ（７）、ｍａｐ（８）、ｍａｐ（９）、ｍａｐ（１０）、ｍａｐ（１１）、ｍａｐ（１２）およびｍａｐ（１３）についてのアミノ酸配列は、ｍａｐＡタンパク質およびｍａｐＢタンパク質の混合物から生成されたので、これらの配列は、シグナルタンパク質の部分的な配列を必ずしも表さない。
【０１７５】
（実施例３）
本実施例は、ダニアレルゲンに対するアレルギー性が既知であるイヌ由来のＩｇＥに結合する７０ｋＤタンパク質の精製を記載する。
【０１７６】
０．２Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）を用いて溶出した実施例１に記載の上記画分を、Ｃｅｎｔｒｉｐｒｅｐ  ３０濃縮器中で濃縮し、次いで、２０ｍＭ  Ｎａ−Ａｃ（ｐＨ５．６）で溶出した。次いで、希釈したタンパク質を、ＰｏｌｙＣａｔ  Ａ  ＨＰＬＣ陽イオン交換カラムに適用した。このカラムを、約１０ｍｌの２０ｍＭ  Ｎａ−Ａｃ（ｐＨ５．６）を用いて溶出し、次いで、２０ｍＭ  Ｎａ−Ａｃ（ｐＨ５．６）緩衝液中の０〜０．５Ｍの直線勾配のＮａＣｌの約４５ｍｌを流速約１ｍｌ／分で用いて溶出した。画分を、溶出手順から収集し、そして上記のダニアレルギー性抗血清およびウエスタンブロットプロトコルを用いて７０ｋＤタンパク質の存在についてアッセイした。この７０ｋＤタンパク質を含む画分をプールした。トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を、約０．０５％の濃度に添加した。この溶液を、８０％  溶媒Ａおよび２０％  溶媒Ｂで予備平衡させたＴＳＫ−Ｇｅｌ  ＴＭＳ−２５０  Ｃｌ逆相カラムに適用した。溶媒Ａは、水中に約０．０５％  ＴＦＡを含み、そして溶媒Ｂは、水中の９０％アセトニトリル中に約０．０５％  ＴＦＡを含む。このカラムを、約３ｍｌの２０％  溶媒Ｂを用いて溶出し、次いで、約２０％〜約７０％の直線勾配の溶媒Ｂ  ３６ｍｌを０．６ｍｌ／分の流速にて用いて溶出した。９０％より高い純度の約７０ｋＤタンパク質を得た。この約７０ｋＤタンパク質を、本明細書中においてｍａｐＣと称する。
【０１７７】
この７０ｋＤタンパク質（ｍａｐＣ）に対応するＳＤＳ−ＰＡＧＥ上の領域のＮ末端配列を、実施例２に記載されるように得た。約２１アミノ酸のＮ末端アミノ酸配列を、８０％  信頼水準で推定し、そしてこれは本明細書中において配列番号３３として表され、これは、以下：Ｇｌｎ  Ｓｅｒ  Ａｒｇ  Ａｓｐ  Ａｒｇ  Ａｓｎ  Ａｓｐ  Ｌｙｓ  Ｐｒｏ  Ｔｙｒ  Ｘａａ  Ｉｌｅ  Ｖａｌ  Ｌｙｓ  Ｌｙｓ  Ｌｙｓ  Ｌｙｓ  Ｌｙｓ  Ａｌａ  Ｌｅｕ  Ａｓｐのアミノ酸配列を有する。
【０１７８】
（実施例４）
本実施例は、ダニアレルゲンに対するアレルギー性が既知であるイヌから単離されたイヌ血清中のイヌＩｇＥに対する、Ｄ．ｆａｒｉｎａｅ  ＨＭＷ−ｍａｐ組成物（すなわち、ｍａｐＡおよびｍａｐＢを含む）の結合を記載する。
【０１７９】
Ｉｍｍｕｌｏｎ  ＩＩマイクロタイタープレートの複数ウェルを、ＣＢＣ緩衝液中で希釈した約１００ナノグラム／ウェル（ｎｇ／ウェル）のＤ．ｆａｒｉｎａｅ  ＨＭＷ−ｍａｐ組成物（これは、実施例１の上記の方法に従って単離した）を用いてコーティングした。このプレートを、４℃で一晩インキュベートした。インキュベーション後、このＤ．ｆａｒｉｎａｅ  ＨＭＷ−ｍａｐ組成物含有溶液を、プレートから除去し、そしてこのプレートをブロット乾燥させた（ｂｌｏｔｔｅｄ  ｄｒｙ）。次いで、このプレートを、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ−２０を有するリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）中に含まれる４．０％  胎仔ウシ血清（ＰＢＳＴＦＣＳ）を約２００μｌ／ウェルで用いて、室温で約１時間ブロックした。次いで、このプレートを、自動洗浄器（Ｄｙｎａｔｅｃｈ，Ｃｈａｎｔｉｌｌｙ，ＶＡから入手可能である）を使用して、ＰＢＳ中の０．０５％  Ｔｗｅｅｎ−２０（ＰＢＳＴ）を用いて４回洗浄した。皮内の皮膚試験においてダニアレルゲンに対する感受性が既知である異なるイヌから単離した血清サンプルの、ＰＢＳＴＦＣＳ中１：１０希釈の約１００μｌ（１ウェル当たり）を、このプレートに添加した。血清のネガティブコントロール群もまた、遮断設備にて惹起された６匹のイヌ由来の血清（Ｈａｒｌａｎ  Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮから入手可能である）の組合わせを含むプレートに、添加した。いくつかのウェルは、イヌ血清を受けず、故に、バックグラウンドの結合レベルが、決定され得た。このプレートを室温で約１時間インキュベートし、ついで、ＰＢＳＴを用いて４回洗浄した。ＰＢＳＴＦＣＳ中に含まれる４０μｇ／ｍｌ  ビオチン化ヒトＦｃεＲα鎖タンパク質（Ｆｒａｎｋら、ＷＯ  ９８／２３９６４（１９９７年１１月２４日公開）に記載されるように生成される）の１：４０００希釈の約１００μｌ（１ウェル当たり）を、添加した。このプレートを室温にて約１時間インキュベートし、次いで、ＰＢＳＴを用いて４回洗浄した。西洋ワサビペルオキシダーゼに結合体化した約０．２５μｇ／ｍｌ  ストレプトアビジン（ＫｉｒｋｅｇａａｒｄおよびＰｅｒｒｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（ＫＰＬ）、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤから入手可能；ＰＢＳＴ中で希釈）の約１００μｌを、実験サンプルまたはコントロールサンプルを受けた各ウェルに添加した。次いで、このプレートを室温にて１時間インキュベートし、ＰＢＳＴを用いて４回洗浄した。室温に予め温めておいた約１００μｌのＴＭＢ基質（ＫＰＬから入手可能である）を各ウェルに添加した。次いで、このプレートを、室温にて約１０分間インキュベートし、次いで、約１００μｌ／ウェルの停止溶液（ＫＰＬから入手可能である）を添加した。ウェルの光学密度（Ｏ．Ｄ．）を、停止溶液を添加した１０分以内に、Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ  Ｍｉｃｒｏｔｉｔｅｒ  Ｐｌａｔｅ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  Ｉｎｃ．から入手可能である）読み取り機で４５０ｎｍにて読み取った。
【０１８０】
ネガティブコントロールサンプルのウェルおよびバックグラウンドのウェルを用いて得たＯ．Ｄ．読み取りは、０Ｏ．Ｄ．であった。２６匹のダニアレルゲン感受性のイヌのうち５匹由来の血清は、約２，０００Ｏ．Ｄ．と約３，２００Ｏ．Ｄ．との間のＯ．Ｄ．読み取りを生成した。他３匹のダニアレルゲン感受性のイヌ由来の血清は、約１，０００Ｏ．Ｄ．と２，０００Ｏ．Ｄ．との間のＯ．Ｄ．読み取りを生成した。他３匹のダニアレルゲン感受性のイヌ由来の血清は、約５００Ｏ．Ｄ．と１，０００Ｏ．Ｄ．との間のＯ．Ｄ．読み取りを生じた。他７匹のダニアレルゲン感受性のイヌ由来の血清は、約２００Ｏ．Ｄ．と５００Ｏ．Ｄ．との間のＯ．Ｄ．読み取りを生じた。他６匹のダニアレルゲン感受性のイヌ由来の活性は、５０Ｏ．Ｄ．未満のＯ．Ｄ．読み取りを生成した。従って、これらの結果は、ダニアレルゲンに対して感受性であることが既知のイヌ由来の血清が、本発明のｍａｐＡタンパク質およびｍａｐＢタンパク質に特異的に結合するＩｇＥ抗体を含むことを示す。
【０１８１】
（実施例５）
本実施例は、ダニアレルゲンに対するアレルギー性が既知のイヌから単離されたイヌ血清中のイヌＩｇＥに対する、７０ｋＤ  Ｄ．ｆａｒｉｎａｅタンパク質の結合を記載する。
【０１８２】
Ｉｍｍｕｌｏｎ  ＩＩマイクロタイタープレートの複数ウェルを、ＣＢＣ緩衝液中で希釈した約１００ｎｇ／ウェルの７０ｋＤ  Ｄ．ｆａｒｉｎａｅタンパク質（本明細書中においてｍａｐＣと称する）（このタンパク質は、実施例１および３の上記のような方法に従った単離した）を用いてコーティングした。このプレートを、４℃で一晩インキュベートした。このプレートを、実施例４に記載される方法を用いてブロックおよび洗浄した。皮内の皮膚試験においてダニアレルゲンに対する感受性が既知である異なるイヌから単離した血清サンプルの、ＰＢＳＴＦＣＳ中１：１０希釈の約１００μｌ（１ウェル当たり）を、このプレートに添加した。ネガティブコントロールサンプルもまた、ＳＰＦ血清サンプル（遮断設備にて維持され、ゆえにダニアレルゲンに決して曝されなかったイヌ由来の血清）を含むプレートに添加した。いくつかのウェルは、イヌ血清を受けず、ゆえに、バックグラウンドの結合レベルが、決定され得た。このプレートを室温で約１時間インキュベートし、次いで、ＰＢＳＴを用いて４回洗浄した。次いで、ビオチン化ヒトＦｃεＲα鎖タンパク質を添加し、そして実施例４に記載される方法を用いてプレートに結合したＩｇＥの存在を検出した。
【０１８３】
ネガティブコントロールサンプルのウェルおよびバックグラウンドのウェルを用いて得たＯ．Ｄ．読み取りは、０Ｏ．Ｄ．であった。２６匹のダニアレルゲン感受性のイヌのうち３匹由来の血清は、約１，５００Ｏ．Ｄ．と約２，７００Ｏ．Ｄ．との間のＯ．Ｄ．読み取りを生成した。他５匹のダニアレルゲン感受性のイヌ由来の血清は、約８００Ｏ．Ｄ．と約１，５００Ｏ．Ｄ．との間のＯ．Ｄ．読み取りを生成した。他４匹のダニアレルゲン感受性のイヌ由来の血清は、約５００Ｏ．Ｄ．と約８００Ｏ．Ｄ．との間のＯ．Ｄ．読み取りを生じた。他６匹のダニアレルゲン感受性のイヌ由来の血清は、約２００Ｏ．Ｄ．と約５００Ｏ．Ｄ．との間のＯ．Ｄ．読み取りを生じた。他８匹のダニアレルゲン感受性のイヌ由来の活性は、５０Ｏ．Ｄ．未満のＯ．Ｄ．読み取りを生成した。従って、これらの結果は、ダニアレルゲンに対して感受性であることが既知のイヌ由来の血清が、本発明のｍａｐＣタンパク質に特異的に結合するＩｇＥ抗体を含むことを示す。
【０１８４】
（実施例６）
本実施例は、ダニアレルゲンに対して過敏であることをインビトロで試験することによって示される、ネコから単離されたネコ血清中のネコＩｇＥに対する、ｍａｐＡタンパク質、ｍａｐＢタンパク質、またはｍａｐＣタンパク質の結合を記載する。
【０１８５】
Ｉｍｍｕｌｏｎ  ＩＩマイクロタイタープレートの複数ウェルを、約１００ｎｇ／ウェルのＤ．ｆａｒｉｎａｅ  ＨＭＷ−ｍａｐ組成物（実施例１の上記の方法に従って単離した）および７０ｋＤ  Ｄ．ｆａｒｉｎａｅタンパク質（実施例３の上記の方法に従って単離した）を用いてコーティングした。このプレートの他のウェルを、４００ｎｇ／ウェルの全Ｄｅｒｍａｔｏｐｈａｇｏｉｄｅｓ  ｐｔｅｒｏｎｙｓｓｉｕｓ抽出物（Ｇｒｅｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｌｅｎｏｉｒ，ＮＣから入手可能；使用前に８倍に濃縮する）または全Ｄ．ｆａｒｉｎａｅ抽出物（Ｍｉｌｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｅｌｋｈａｒｔ，ＩＮから入手可能である）を用いてコーティングした。全サンプルを、ＣＢＣ緩衝液で希釈した。このプレートを、４℃で一晩インキュベートした。このプレートを、実施例４に記載の方法を用いてブロックおよび洗浄した。インビトロアレルゲン試験においてダニアレルゲンに対して感受性であることが既知である異なるネコから単離した血清サンプルの、ＰＢＳＴＦＣＳ中１：１０希釈の約１００μｌ（１ウェルあたり）を、このプレートに添加した。７匹のコントロールネコ（＃１５、＃１６、＃１７、＃１８、＃１９、＃２０、および＃２１）（これらは、インビトロ試験によってダニアレルゲン粉末（ｄｕｓｔ）に対して感受性でないことが示されている）由来の血清もまた、試験した。いくつかのウェルは、ネコ血清を受けず、従って、バックグラウンドの結合レベルが、決定され得る。このプレートを室温にて約１時間インキュベートし、ついで、ＰＢＳＴを用いて４回洗浄した。次いで、ビオチン化ヒトＦｃεＲα鎖タンパク質を添加し、そして実施例４に記載される方法を用いてプレートに結合したＩｇＥの存在を検出した。
【０１８６】
結果を、以下の表１に示す。全ての値は、Ｏ．Ｄ．値の１，０００倍を示す。ＨＤＭは、（血清学的試験（すなわち、全てのＤ．ｆａｒｉｎａｅ抽出物に対するＥＬＩＳＡ）によって）粉末（ｄｕｓｔ）家ダニのアレルゲンに感受性なネコをいう。
（表１）
【０１８７】
【表１】
2004529605.tif 000002
これらの結果は、ダニアレルゲンに感受性であることが既知のネコの数匹からの血清が、本発明のｍａｐＡタンパク質、ｍａｐＢタンパク質またはｍａｐＣタンパク質に特異的に結合するＩｇＥ抗体を含むことを示す。さらに、ｍａｐＡタンパク質、ｍａｐＢタンパク質またはｍａｐＣタンパク質に結合するＩｇＥを含むいくつかの血清はまた、全てのＤ．ｐｔｅｒｏｎｙｓｓｉｕｓ抽出物に結合するＩｇＥ抗体を含む。コントロール血清は、本発明のｍａｐＡタンパク質、ｍａｐＢタンパク質またはｍａｐＣタンパク質のいずれかに結合するＩｇＥ抗体を含まなかった。
【０１８８】
（実施例７）
本実施例は、イヌにおいて高感受性応答を誘導するＤ．ｆａｒｉｎａｅ  ＨＭＷ−ｍａｐ組成物の能力を例証する。
【０１８９】
実施例１に記載されるＤ．ｆａｒｉｎａｅ  ＨＭＷ−ｍａｐ組成物が粉末ダニアレルギー応答に感受性である動物においてアレルギー応答を誘導し得るか否かを決定するために、粉末ダニアレルギーに対する臨床的兆候を活性に示すイヌ（本明細書中、アトピー性イヌという）に対して、皮膚試験を実施した。正常なイヌは、ダニアレルギーの症状を示さないがダニアレルギー応答に感受性であり得るイヌを含む。各イヌ（すなわち、４匹の正常イヌおよび４匹のアトピー性イヌ）を、外側胸部／腹部領域で剃毛し、その領域中の異なる部位に、実施例１に記載される方法によって分離された約１：５０，０００希釈のＤ．ｆａｒｉｎａｅ粗抽出物を用いて約２μｇの精製したＤ．ｆａｒｉｎａｅ  ＨＭＷ−ｍａｐ組成物および／またはコントロール溶液（すなわち、ネガティブコントロールとしての生理食塩水、およびポジティブコントロールとしての１：１０００希釈のヒスタミン）とともに皮内注射した。４匹の正常イヌ全ておよび４匹のアトピー性イヌ全てが、Ｄ．ｆａｒｉｎａｅ全抽出物を受けた。正常イヌの３匹およびアトピー性イヌの２匹は、Ｄ．ｆａｒｉｎａｅ  ＨＭＷ−ｍａｐ組成物を受けた。８匹のイヌ全てが、ネガティブコントロールサンプルおよびポジティブコントロールサンプルの両方を受けた。注射当たりの総容量は、５０マイクロリットル（μｌ）であり、生理食塩水中に希釈された組成物およびコントロールを有した。これらの注射を、単回の注射として投与した。
【０１９０】
全ての注射部位を、１５分時のミリメートル（ｍｍ）で客観的に測定し、そしてコントロールサンプルと比較した場合に（＋）または（−）のいずれかでスコア付けした。客観的スコア付けを、Ｏｈｉｏ  Ｓｔａｔｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｃｏｌｕｍｂｕｓ，ＯＨのＡｎｄｒｅｗ  Ｈｉｌｌｉｅｒ，Ｄ．Ｖ．Ｍ．によって実施した。結果を、表２に示す。
（表２）
【０１９１】
【表２】
2004529605.tif 000003
これらの結果は、Ｄ．ｆａｒｉｎａｅ  ＨＭＷ−ｍａｐ組成物がアトピー性イヌを含むイヌにおいて即時高感受性応答を誘導し得たことを示す。従って、ＨＭＷ−ｍａｐ組成物は、アトピー性イヌを含むイヌにおいて高感受性応答を誘導するために十分アレルギー性である。
【０１９２】
表３は、以下の実験の結果を記載する。ＨＭＷ−ｍａｐ組成物に対するＩｇＥを、以下の３群のイヌの血清においてＥＬＩＳＡを使用して測定した：Ｄ．ｆａｒｉｎａｅアレルギー性のイヌ（ＨＤＭ−ＡＤ）、（他のアレルゲンに対して）アトピー性であるがＨＤＭアレルギー性ではないイヌ（ＡＤ）、およびナイーブなイヌ。３群のイヌをまた、Ｄ．ｆａｒｉｎａｅ全抽出物およびＨＭＷ−ｍａｐ組成物に対する皮内皮膚試験によって試験した。
【０１９３】
（表３．Ｄ．ｆａｒｉｎａｅアレルギー性のイヌ、アトピー性であるがＨＤＭ−アレルギー性ではないイヌおよびナイーブなイヌにおける、Ｄ．ｆａｒｉｎａｅ全抽出物およびＨＭＷ−ｍａｐ組成物についての皮膚試験およびＥＬＩＳＡデータ）
【０１９４】
【表３Ａ】
2004529605.tif 000004
【０１９５】
【表３Ｂ】
2004529605.tif 000005
Ｄ．ｆａｒｉｎａｅ全抽出物に対してＥＬＩＳＡによってポジティブであった全てのイヌはまた、ＨＭＷ−ｍａｐ組成物アレルゲンに対してもポジティブであった。Ｄ．ｆａｒｉｎａｅ全抽出物に対してＥＬＩＳＡによってネガティブであった８匹のイヌについて、８匹中７匹がまた、ＨＭＷ−ｍａｐ組成物に対してもネガティブであった。
【０１９６】
（実施例８）
本実施例は、本発明のＤｅｒ  ＨＭＷ−ｍａｐ組成物をコードする核酸分子の単離を記載する。
【０１９７】
Ｄｅｒ  ＨＭＷ−ｍａｐ組成物核酸分子を、以下のように同定しそして単離した。
【０１９８】
（Ａ．Ｄｅｒｍａｔｏｐｈａｇｏｉｄｅｓ  ｆａｒｉｎａｅ  ｃＤＮＡライブラリーの調製）
Ｄｅｒｍａｔｏｐｈａｇｏｉｄｅｓ  ｆａｒｉｎａｅ  ｃＤＮＡライブラリーを、以下のように調製した。総ＲＮＡを、約２ｇの瞬間凍結しかつ破砕した粉末家ダニから、Ｃｈｏｍｚｙｎｓｋｉら、１９８７、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１６２，１５６−１５９によって記載されるものと類似の酸−グアニジウム−フェノール−クロロホルム法を使用して抽出した。ポリＡ＋選択されたＲＮＡを、製造業者によって推奨される方法に従って、ｍＲＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｎｅｗａｒｋ，ＮＪから入手可能）を使用するオリゴ−ｄＴセルロースクロマトグラフィーによって総ＲＮＡ調製物から分離した。ｃＤＮＡライブラリーを、ＳｔｒａｔａｇｅｎｅのＺＡＰ−ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔプロトコルを使用して、λ−Ｕｎｉ−ＺＡＰＴＭＸＲベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅから入手可能）中に構築した。約５μｇのポリＡ＋ＲＮＡを使用して、Ｄｅｒｍａｔｏｐｈａｇｏｉｄｅｓ  ｆａｒｉｎａｅ  ｃＤＮＡライブラリーを生成した。
【０１９９】
（Ｂ．ＰＣＲプライマーの調製）
さらなるＮ末端アミノ酸配列分析を、実施例２に上記した方法に従って実施した。３４アミノ酸のＮ末端アミノ酸部分配列を推測し、そして以下のアミノ酸配列を有する配列番号２４によって示す：
【０２００】
【化１】
2004529605.tif 000006
（ここで、「Ｘａａ」は、任意のアミノ酸残基を示す）。配列番号４のアミノ酸配列（実施例２に上記した）および配列番号２４を使用して、合成オリゴヌクレオチドプライマーを設計した。以下のヌクレオチド配列：
【０２０１】
【化２】
2004529605.tif 000007
を有する配列番号２４由来のセンスプライマーＤｅｒｆ１（配列番号２５と称する）（ここで、ＹはＣまたはＴを示し、ＲはＡまたはＧを示し、そしてＮはＡ、Ｃ、ＴまたはＧを示す）、または以下のヌクレオチド配列：
【０２０２】
【化３】
2004529605.tif 000008
を有する配列番号４由来のセンスプライマーＤｅｒｆ２（配列番号２６と称する）を、以下のヌクレオチド配列：
【０２０３】
【化４】
2004529605.tif 000009
を有する配列番号４由来のアンチセンスプライマーＤｅｒｆ３（配列番号２７と称する）、または以下のヌクレオチド配列：
【０２０４】
【化５】
2004529605.tif 000010
を有する配列番号２４由来のアンチセンスプライマーＤｅｒｆ４（配列番号２８と称する）と組合わせて使用した。
【０２０５】
次いで、前述のプライマーを使用して、Ｄｅｒｆ  ｃＤＮＡライブラリーを、標準的ポリメラーゼ連鎖反応増幅（ＰＣＲ）技術を用いてスクリーニングした。これらのプライマーにハイブリダイズするｃＤＮＡを同定する試み全てが、失敗した。
【０２０６】
（Ｃ．抗Ｄｅｒ  ＨＭＷ−ｍａｐ組成物抗体を使用するＤ．ｆａｒｉｎａｅ  ｃＤＮＡライブラリーの免疫スクリーニング）
ＰＣＲ法を使用したｃＤＮＡクローン単離の試みが失敗したので、本発明者らは、以下のように生成した抗血清を使用してＤ．ｆａｒｉｎａｅ  ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングした。実施例１に上記した方法に従って単離したタンパク質を抗原の供給源として使用して、本明細書中で抗Ｄｅｒ  ＨＭＷ−ｍａｐ組成物抗体といわれるウサギポリクローナル抗体を生成した。ウサギポリクローナル抗体の調製を、標準的技術を使用して実施した。
【０２０７】
約７．５ｍｌのＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ（ＸＬ１  Ｂｌｕｅ、Ｏ．Ｄ．６００＝０．５）を、Ｄｅｒｍａｔｏｐｈａｇｏｉｄｅｓ  ｆａｒｉｎａｅ  ＺＡＰ−ｃＤＮＡライブラリー（１．８×１０９ｐｆｕ／ｍｌ）からの３．０×１０４ｐｆｕのファージとともに３７℃で１５分間インキュベートし、３０ｍｌのＬｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）培地アガープレート（１５０ｍｍ）にプレートした。このプレートを、３７℃で一晩インキュベートした。次いで、各プレートを、ＩＰＴＧ（１０ｍＭ）処理したニトロセルロースフィルターで３７℃で約４時間オーバーレイした。次いで、このフィルターを取り外し、０．１％  Ｔｗｅｅｎを含むＴｒｉｓ緩衝化生理食塩水（ｐＨ７．５）（ＴＢＳＴ）で５分間洗浄した。このフィルターを、ＴＢＳＴ中に１％脱脂粉乳、１％ＢＳＡ、２％ヤギ血清および０．１５％ゼラチンを調製した溶液で、室温にて２時間ブロックした。次いで、フィルターを、１：１０００希釈の抗Ｄｅｒ  ＨＭＷ−ｍａｐ組成物抗体を含む上記のブロッキング溶液とともに４℃で一晩インキュベートした。次いで、この混合物を、西洋ワサビペルオキシダーゼに結合体化したロバ抗ウサギＩｇＧ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ，Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ，ＰＮより入手可能）とともに、室温で２時間インキュベートした。全てのフィルターを、各インキュベーションの間に、ＴＢＳＴ中に含まれたブロッキング溶液で洗浄（１洗浄あたり３×１５分）した。次いで、全てのフィルターを、Ｔｒｉｓ緩衝化生理食塩水（ｐＨ７．５）で室温にて５分間の最後の洗浄に付した。免疫複合体化プラークを、顕色化溶液（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ＆Ｐｅｒｒｙ  ＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓからのＴＭＢ  Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ／ＴＭＢ  Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ／ＴＭＢ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｅｎｈａｎｃｅｒを１／１／０．１の容量比で）にこのフィルターを浸して着色反応を生成することによって同定した。１２３プラークを同定し、５０プラークをさらに、上記と同様な免疫スクリーニング条件下で２回以上精製した。
【０２０８】
（Ｄ．精製したファージプラグのＰＣＲスクリーニング）
次いで、前出の免疫スクリーニング研究において同定したファージプラグをさらに、８Ｂ項で上記したプライマーを使用するＰＣＲ増幅によって分析した。配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７および配列番号２８によって同定された４つのプライマーの混合物を使用して、５０プラークからのＤＮＡを増幅した。ＰＣＲ増幅を、標準的技術を使用して行った。得られたＰＣＲ増幅産物の１つは、約７００ヌクレオチドのフラグメントを構成した。このＰＣＲ産物を、ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃｏｒｐ．，ＴＡＴＭクローニングベクター（Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃｏｒｐ．によって提供される手順）にクローニングし、標準的技術を使用するＤＮＡ配列分析に供した。７００ｂｐのＰＣＲ産物中にコードされる配列を含むことを決定された、精製したファージ由来のファージミドを回収し、標準的技術を使用するＤＮＡ配列分析に供した。
【０２０９】
約１７５２ヌクレオチド挿入物を含むクローンを単離し、本明細書中でｎＤｅｒｆ９８１７５２と呼ぶ。核酸配列を、標準的技術を使用してｎＤｅｒｆ９８１７５２から得て、核酸配列配列番号１４を有するコード鎖および核酸配列配列番号１６を有する相補鎖から構成されるｎＤｅｒｆ９８１７５２と呼ばれるＤｅｒｍａｔｏｐｈａｇｏｉｄｅｓ  ｆａｒｉｎａｅ核酸分子を得た。配列番号１４の翻訳は、ｎＤｅｒｆ９８１７５２核酸分子がアミノ酸配列配列番号１５を有する全長ｆｌｅａタンパク質の約５５５アミノ酸（本明細書中でＰＤｅｒｆ９８５５５と呼ぶ）をコードすることを示唆する。ここで、開始コドンは、配列番号１４のヌクレオチド１〜ヌクレオチド３にわたり、終止コドンは、配列番号１４のヌクレオチド１６６６〜ヌクレオチド１６６８にわたるオープンリーディングフレームが予想される。ＰＤｅｒｆ９８５５５のアミノ酸配列は、核酸配列配列番号１７を有するコード鎖および核酸配列配列番号１９を有する相補鎖を有する核酸分子ｎＤｅｒｆ９８１６６５によってコードされる。配列番号１８としても示されるＰＤｅｒｆ９８５５５は、推定分子量約６３．２ｋＤおよび推定ｐＩ約５．３３を有する。配列番号１５の分析は、およそのアミノ酸１〜およそのアミノ酸１９にわたるシグナルペプチドの存在を示唆する。ＰＤｅｒｆ９８５３６と本明細書中で示される、提唱した成熟タンパク質は、約５３６アミノ酸を含み、この配列は、配列番号２１として本明細書中に示され、そして、配列番号２０（コード鎖）および配列番号２２（相補鎖）によって示される、ｎＤｅｒｆ９８１６０８と本明細書中で示される核酸分子によってコードされる。ｆｌｅａ  ＰＤｅｒｆ９８５３６のアミノ酸配列（すなわち、配列番号２１）は、ＰＤｅｒｆ９８５３６が推定分子量６１．２ｋＤおよび推定ｐＩ約５．２６を有することを予測する。
【０２１０】
アミノ酸配列配列番号１５とＧｅｎＢａｎｋに報告されたアミノ酸配列との比較は、配列番号１５がＡｎｏｐｈｅｌｅｓ  ｇａｍｂｉａｅ由来のキチナーゼタンパク質（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号２６５４６０２）に最大の相同性（すなわち、約４２％の同一性）を示したことを示す。核酸配列配列番号１７とＧｅｎＢａｎｋに報告された核酸配列との比較は、配列番号１７が、配列番号１７とＣｈｅｌｏｎｕｓ  ｓｐ．ｖｅｎｏｍキチナーゼｍＲＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｕ１０４２２）との間で最大の相同性（すなわち、約５８％の同一性）を示したことを示す。
【０２１１】
（実施例９）
本実施例は、ダニアレルゲンに対してアレルギー性であることが既知のイヌ由来のＩｇＥに結合する６０ｋＤタンパク質の精製、およびこの６０ｋＤタンパク質由来の部分アミノ酸配列を記載する。
【０２１２】
（Ａ．６０ｋＤタンパク質の精製）
Ｄ．ｆａｒｉｎａｅ抽出物を調製し、実施例１に上記された方法に従ってＳｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−１００カラムで分画した。排除ピーク（画分２９〜３５）後の画分を、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−１００カラムから回収し、そしてプールした。次いで、プールした画分を、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）で１：１に希釈し、Ｑ−ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムに適用して実施例１で上記した方法を使用して画分を得た。０．４Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌで溶出した画分を濃縮し、実施例１で上記した方法を使用してＴＭＳ２５０逆相ＨＰＬＣカラムによってさらに精製した。この各文中のタンパク質を、実施例１において１２％ゲルでのタンパク質分離について記載した同様の方法を使用して、１４％Ｔｒｉｓ−グリシンＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離した。染色したゲルを、図２に示す。約５０％  Ｂ（９０％アセトニトリル中０．０５％ＴＡ）で溶出した、約９０％の純度の約６０ｋＤの分子量を有するタンパク質を同定した（図２、レーン４）。示した６０ｋｄタンパク質の分子量を、ＢｉｏＲａｄ  Ｍｕｌｔｉ−Ａｎａｌｙｓｔ／ＰＣ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  １．１プログラムおよびＭａｒｋ−１２タンパク質分子量マーカーを使用して、５６．１１ｋｄであると見積もった。約６０ｋｄタンパク質は、本明細書中でｍａｐＤタンパク質という。
【０２１３】
（Ｂ．６０ｋｄタンパク質より得たＮ末端部分配列および内部配列）
上記のパートＡから溶出したタンパク質を、ＰＶＤＦ上にブロットし、これを、Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ  Ｒ−２５０で染色し、標準的手順を使用して脱色した。約６０ｋｄのバンドに対応するタンパク質を抽出し、当業者に公知の技術を使用するＮ末端アミノ酸配列決定に供した。約２５アミノ酸のＮ末端アミノ酸部分配列を、このタンパク質について推定し、配列番号２３として本明細書中で示されるアミノ酸配列を、以下：
【０２１４】
【化６】
2004529605.tif 000011
であると推定した（ここで、Ｘａａは任意のアミノ酸をいう）。
【０２１５】
この６０ｋｄの領域に対応するタンパク質をまた、内部アミノ酸配列データを得るために、蛋白質分解切断に供した。６０ｋｄタンパク質の消化および逆相クロマトグラフィーを、実施例１に記載したように実施した。４つの蛋白質分解フラグメントを、単離および配列決定し、これらを、本明細書中でｍａｐ（１３）、ｍａｐ（１４）、ｍａｐ（１５）およびｍａｐ（１６）という。
【０２１６】
ｍａｐ（１３）のＮ末端部分アミノ酸配列を、以下：
【０２１７】
【化７】
2004529605.tif 000012
として決定し、これをまた、配列番号２９と示した。ｍａｐ（１４）のＮ末端部分アミノ酸配列を、以下：
【０２１８】
【化８】
2004529605.tif 000013
として決定し、これをまた、配列番号３０と示した。ｍａｐ（１５）のＮ末端部分アミノ酸配列を、以下：
【０２１９】
【化９】
2004529605.tif 000014
として決定し、これをまた、配列番号３１と示した。ｍａｐ（１６）のＮ末端部分アミノ酸配列を、以下：
【０２２０】
【化１０】
2004529605.tif 000015
として決定し、これをまた、配列番号３２と示した。
【０２２１】
（実施例１０）
本実施例は、Ｄ．ｆａｒｉｎａｅ  ６０ｋＤ（ｍａｐＤ）アレルゲンの一部をコードする核酸分子の単離および配列決定を記載する。
【０２２２】
実施例８で先に記載したように、Ｄ．ｆａｒｉｎａｅライブラリーを調製した。Ｄ．ｆａｒｉｎａｅ  ６０ｋＤタンパク質（配列番号２３）について推定されるＮ末端アミノ酸配列より、縮重合成オリゴヌクレオチドプライマーを設計した：配列番号２３の約３〜約１１のアミノ酸残基に対応するセンスプライマーであるプライマー１は、配列番号４６としても識別される配列：
【０２２３】
【化１１】
2004529605.tif 000016
を有し、ここで、Ｈは、ＡまたはＣまたはＴを示し、Ｎは、ＡまたはＣまたはＧまたはＴを示し、そしてＹは、ＣまたはＴを示す。Ｄ．ｆａｒｉｎａｅライブラリー由来のフラグメントのＰＣＲ増幅を、標準的技術を使用して行った。配列番号４６（プライマー１）、および配列番号４７として示されるＭ１３順方向ユニバーサルプライマー：
【０２２４】
【化１２】
2004529605.tif 000017
の組合わせを使用して、ＰＣＲ増幅産物を生成した。
【０２２５】
第二の入れ子（ｎｅｓｔｅｄ）ＰＣＲ反応を、第一のＰＣＲ反応の産物に対して行った。６０ｋＤタンパク質内部アミノ酸配列（配列番号３１）のおよそのアミノ酸残基１〜アミノ酸残基１０にわたる領域に対応する、合成オリゴヌクレオチドを合成した。このプライマー（プライマー２）は、配列番号４８として示される以下の核酸配列：
【０２２６】
【化１３】
2004529605.tif 000018
を有し、ここで、Ｒは、ＡまたはＧを示す。プライマー２（配列番号４８）、および配列番号４９として示されるＴ７標準プライマー：
【０２２７】
【化１４】
2004529605.tif 000019
の組合わせを使用して、ＰＣＲ増幅産物を生成した。生じたＰＣＲ産物を、標準的技術を使用するＤＮＡ配列分析に供した。
【０２２８】
このＰＣＲ産物を配列決定し、５１０ヌクレオチドを含むことを見出し、これは、ｎＤｅｒ６０５１０として識別される。ｎＤｅｒｆ６０５１０のコード鎖のヌクレオチド配列を、本明細書中で配列番号４３として示し、そしてその相補体を、配列番号４５として示す。配列番号４３の翻訳は、ｎＤｅｒｆ６０５１０が、配列番号４４に示されるアミノ酸配列を有する約１７０アミノ酸の部分Ｄ．ｆａｒｉｎａｅ  ６０ｋＤタンパク質（本明細書中でＰＤｅｒｆ６０１７０と呼ぶ）をコードすることを示唆する。ここで、開始コドンは配列番号４３のおよそのヌクレオチド１〜およそのヌクレオチド３にわたり、終止コドンは、配列番号４３のおよそのヌクレオチド５０８〜およそのヌクレオチド５１０にわたるオープンリーディングフレームを推定する。ＰＤｅｒｆ６０１７０は、推定分子量約１９．２ｋＤおよび推定ｐＩ約６．５１を有する。
【０２２９】
核酸分子ｎＤｅｒｆ６０５１０をプローブとして使用して、全長Ｄ．ｆａｒｉｎａｅ  ６０ｋＤタンパク質またはより大きな部分のＤ．ｆａｒｉｎａｅ  ６０ｋＤタンパク質に対応するタンパク質をコードする核酸分子を単離した。実施例８の上記に示した手順を使用して、標準的技術を使用して３２Ｐで放射標識した核酸配列番号４３を用いて、全Ｄ．ｆａｒｉｎａｅライブラリーをスクリーニングした。６×ＳＳＣ、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液、０．５％  ＳＤＳ、１００ｍｇ／ｍｌ  ｓｓＤＮＡ中で５５℃にて約３６時間、ハイブリダイゼーションを行った。フィルターを、２×ＳＳＣ、０．２％  ＳＤＳ中で５５℃にて１洗浄あたり３０分間３回洗浄した後、０．２×ＳＳＣ、０．２％  ＳＤＳ中で約３０分間最終洗浄した。
【０２３０】
ＰＣＲ増幅を、最初のファージプラグに対して行った。配列番号４６として示されるプライマー１、および配列番号４９として示されるＴ７標準プライマーをプライマーとして使用して、ＰＣＲ産物を生成した。この１．６キロベースのＰＣＲ産物を予備的配列分析することによって、これがＰＤｅｒｆ６０全長タンパク質をコードする完全配列を含む核酸配列を示すことが示された。
【０２３１】
配列番号４４のアミノ酸配列ＰＤｅｒｆ６０１７０とＧｅｎＢａｎｋに報告されたアミノ酸配列との比較は、ＰＤｅｒｆ６０１７０がＡｐｈａｎｏｄｉｄｉｕｍ  ａｌｂｕｍ．由来のキチナーゼタンパク質前駆体（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｐ３２４７０）と最も高い相同性（すなわち約３９％の同一性）を示したことを示す。核酸配列配列番号４３は、ＧｅｎＢａｎｋに提出された配列のいずれにも顕著な相同性を示さなかった。
【０２３２】
（実施例１１）
本実施例は、Ｄｅｒｍａｔｏｐｈａｇｏｉｄｅｓ  ｐｔｅｒｏｎｙｓｓｉｕｓ  ９８ｋＤアレルゲンタンパク質をコードする核酸分子の単離を記載する。
【０２３３】
Ｄ．ｆａｒｉｎａｅ  ＨＭＷ−ｍａｐ組成物をコードする３２−Ｐ標識したｃＤＮＡを用いるハイブリダイゼーションによって、Ｄ．ｆａｒｉｎａｅ  ９８ｋＤアレルゲン（ｍａｐＢ）に高い相同性を有する核酸分子を、Ｄ．ｐｔｅｒｏｎｙｓｓｉｕｓ  ｃＤＮＡライブラリーより単離した。
【０２３４】
Ｄ．ｐｔｅｒｏｎｙｓｓｉｕｓ  ｃＤＮＡライブラリーを、以下のように調製した。総ＲＮＡを、約２ｇのＤ．ｐｔｅｒｏｎｙｓｓｉｕｓダニから、Ｃｈｏｍｚｙｎｓｋｉら、１９８７、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１６２：ｐｐ１５６−１５９によって記載される酸−グアニジウム−フェノール−クロロホルム法を使用して抽出した。ポリＡ＋選択されたＲＮＡを、製造業者によって推奨される方法に従って、ｍＲＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｎｅｗａｒｋ，ＮＪから入手可能）を使用するオリゴ−ｄＴセルロースクロマトグラフィーによって、総ＲＮＡ調製物から分離した。全Ｄ．ｐｔｅｒｏｎｙｓｓｉｕｓ  ｃＤＮＡライブラリーを、ＳｔｒａｔａｇｅｎｅのＺＡＰ−ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔプロトコルを使用して、λ−Ｕｎｉ−ＺＡＰＴＭＸＲベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡから入手可能）中に構築した。約５ミリグラム（ｍｇ）のポリＡ＋ＲＮＡを使用して、Ｄ．ｐｔｅｒｏｎｙｓｓｉｕｓ  ｃＤＮＡライブラリーを生成した。
【０２３５】
ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅより入手可能）に記載されるプロトコルの改変を使用して、３２Ｐ−標識した、Ｄ．ｆａｒｉｎａｅ  ９７ｋＤ  ＭａｐＢアレルゲン（すなわち、配列番号１７）をコードするｃＤＮＡで、全Ｄ．ｐｔｅｒｏｎｙｓｓｉｕｓ  ｃＤＮＡライブラリーを二連のプラークリフト（ｐｌａｑｕｅ  ｌｉｆｔ）を使用してスクリーニングした。ハイブリダイゼーションを、６×ＳＳＣ（処方について、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、同書を参照のこと）、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液（処方について、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、同書を参照のこと）、０．５％  ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）（Ｓｉｇｍａより入手可能）、および１００ｍｇ／ｍｌの一本鎖ＤＮＡ（Ｓｉｇｍａより入手可能）中で、５５℃にて約３６時間行った。２×ＳＳＣ、０．２％  ＳＤＳ中で５５℃にてフィルターを３回洗浄し（１洗浄あたり約３０分間）、続いて、０．２×ＳＳＣ、０．２％  ＳＤＳ中で５５℃にて約３０分間フィルターを最終洗浄した。Ｄ．ｐｔｅｒｏｎｙｓｓｉｕｓ  ９７ｋＤアレルゲン（ｍａｐＢ）をコードする、Ｄ．ｐｔｅｒｏｎｙｓｓｉｕｓ核酸分子のプラーク精製したクローンを、ＺＡＰ−ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅより入手可能）に記載されるインビボ切除プロトコルに従って、ＥｘＡｓｓｉｓｔＴＭヘルパーファージおよびＳＯＬＲＴＭ  Ｅ．ｃｏｌｉを用いて二本鎖組換え分子に変換した。Ｄ．ｐｔｅｒｏｎｙｓｓｉｕｓクローンを含むプラスミドを、標準的技術を使用するＤＮＡ配列分析に供した。ＤＮＡ配列分析（分子量および等電点（ｐＩ）の決定を含む）を、ＧＣＧＴＭプログラムを使用して行った。
【０２３６】
約１６２１ヌクレオチド挿入物を含むクローンを単離した。これは、本明細書中でｎＤｅｒｐ９８１６２１と呼ぶ、配列番号３４として示されるコード鎖および配列番号３６として示される相補鎖を有する全長コード領域を含む。明白な開始コドンおよび終止コドンは、それぞれ配列番号３４のヌクレオチド１４〜ヌクレオチド１６、およびヌクレオチド１５４１〜ヌクレオチド１５４３にわたる。推定のポリアデニル化シグナル（５’ＡＡＴＡＡＡ３’）は、配列番号３４のヌクレオチド１５８４〜ヌクレオチド１５８９にわたる領域に位置する。
【０２３７】
配列番号３４の翻訳は、配列番号３５として示されるアミノ酸配列であり、ＰＤｅｒｐ９８５０９として示される、約５０９アミノ酸のタンパク質を生じる。ＰＤｅｒｐ９８５０９をコードするコード領域からなる核酸分子は、本明細書中でｎＤｅｒｐ９８１５２７として呼ばれ、その核酸配列は、配列番号３７（コード鎖）および配列番号３９（相補鎖）として示される。本明細書中で配列番号３８としても示されるＰＤｅｒｐ９８５０９のアミノ酸配列は、推定分子量約５８．９ｋＤおよび推定ｐＩ約５．６１を有する。ＰＤｅｒｐ９８５０９の分析は、およそのアミノ酸１〜およそのアミノ酸１９にわたるシグナルペプチドの存在を示唆する。提唱した成熟タンパク質（本明細書中でＰＤｅｒｐ９８４９０として示される）は、約４９０アミノ酸を含み、そして本明細書中で配列番号４１として示される。ＰＤｅｒｐ９８４９０のアミノ酸配列によって、このタンパク質が、推定分子量約５６．８ｋＤおよび推定ｐＩ約５．４９、ならびに２つのアスパラギン連結グリコシル化部位（それぞれ、およそのアミノ酸１１５〜およそのアミノ酸１１７、およびおよそのアミノ酸２４０〜アミノ酸２４２に伸展する）を有することを予想する。ＰＤｅｒｐ９８４９０をコードする核酸分子は、配列番号４０によって示されるコード鎖および配列番号４２によって示される相補鎖を有するｎＤｅｒｐ９８１４７０として公知である。
【０２３８】
ＢＬＡＳＴ検索を、以前に記載されるように実施した。ＰＤｅｒｐ９８５０９（配列番号３５）は、Ｍａｎｄｕｃａ  ｓｅｘｔａキチナーゼ（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ登録番号ｐ３６３６２）とアミノ酸レベルで最も高い相同性を示し、約３４％の同一性を有した。ｎＤｅｒｐ９８１６２１（配列番号３４）は、Ｃｈｅｌｏｎｕｓ  ｓｐ．キチナーゼ（登録番号Ｕ１０４２２）に核酸レベルで最も高い相同性を示し、約４９％の同一性を有した。Ｄ．ｆａｒｉｎａｅの９８ｋＤのアレルゲンタンパク質についてのコード領域に対応するｃＤＮＡ領域と、Ｄ．ｐｔｅｒｏｎｙｓｓｉｕｓの９８ｋＤのアレルゲンタンパク質についてのコード領域に対応するｃＤＮＡ領域との比較は、約８４％の同一性を示す。
【０２３９】
（実施例１４）
本実施例は、Ｄ．ｆａｒｉｎａｅ  ＨＭＷ−ｍａｐ組成物の、ダニアレルゲンに対してアレルギー性であることが公知の、ヒトから単離されたヒト血清中のヒトＩｇＥへの結合を示す。
【０２４０】
ＲＡＳＴすなわちラスト法（ｒａｄｉｏ−ａｌｌｅｒｇｏ−ａｂｓｏｒｂｅｎｔ  ｔｅｓｔ）と呼ばれる技術を使用した。なぜなら、ヒト血清中に存在するヒトＩｇＥの量が非常に低いためである。ＲＡＳＴを、本質的に、Ａａｌｂｅｒｓｅ，ＲＣら（１９８１）Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎ．６８：３５６〜３６４頁において記載されるように実施した。単位ＩＵ／ｍｌを計算するために、標準曲線を、Ｄｅｒｐ２に対する十分に特徴付けられたキメラヒト／マウスＩｇＥモノクローナル抗体（ヒトＩｇＥ／モノクローナル抗Ｄｅｒｐ２、Ｓｃｈｕｕｒｍａｎら（１９９７）Ｊ  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．９９：５４５〜５５０頁の手順に従う）のいくつかの希釈物を用いてＲＡＳＴを行なうことによって導き出した。
【０２４１】
手短に言うと、５０μｇのＨＭＷ−ｍａｐ組成物（実施例１に記載されるように精製した）を、製造業者のプロトコルに従って、５０ｍｇのＣＮＢｒ活性型Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪより入手可能）に結合させた。ヒト血清を、全ダニＤ．ｆａｒｉｎａｅ抽出物についてポジティブなＲＡＳＴに基づいて選択し（全部で１７個の異なるサンプル）、ポジティブなＲＡＳＴ数は、１ＩＵ／ｍｌより大きい。２つのネガティブ（０．３ＩＵ未満）コントロール血清もまた含んだ。
【０２４２】
各々の個体の血清サンプルを試験するために、０．５ｍｇのＤ．ｆａｒｉｎａｅ  ＨＭＷ−ｍａｐ組成物結合Ｓｅｐｈａｒｏｓｅを、総容量３００μｌのＰＢＳ−Ｔ（０．１％容量／容量Ｔｗｅｅｎ−２０（Ｓｉｇｍａより入手可能）を添加したリン酸緩衝化生理食塩水）中５０μｌの血清と共にインキュベートした。インキュベーションは、振盪しながら２７℃で一晩行なった。インキュベーション後、結合したＳｅｐｈａｒｏｓｅをＰＢＳ−Ｔで５回洗浄した。総容量７５０μｌ中（４．５％（ｖ／ｖ）ウシ血清および０．５％（ｖ／ｖ）ヒツジ血清を含むＰＢＳ−Ｔ中で希釈した）放射性標識した（１２５−ヨウ素）ヒツジ抗ヒトＩｇＥ（標準的な放射ヨウ素化標識プロトコルによって作製された）を添加し、そして２７℃で一晩インキュベートした。インキュベーション後、結合したＳｅｐｈａｒｏｓｅを、ＰＢＳ−Ｔで４回洗浄し、そしてγカウンターでカウントしてＨＭＷ−ｍａｐ組成物結合Ｓｅｐｈａｒｏｓｅに結合した放射性標識したヒツジ抗ヒトＩｇＥの量を決定した。結果を表４に示す。
【０２４３】
（表４．Ｄ．ｆａｒｉｎａｅ由来のＨＭＷ−ｍａｐ組成物へのヒトＩｇＥの結合）
【０２４４】
【表４】
2004529605.tif 000020
Ｄ．ｆａｒｉｎａｅ全ダニ抽出物に対して感受性を示した患者の約７５％（１５人中１１人）は、ＨＭＷ−ｍａｐ組成物抗原に対して感受性であり、このことは、ＨＭＷ−ｍａｐ組成物抗原が、Ｄ．ｆａｒｉｎａｅ感受性ヒトに対する主要な抗原であることを示す。ＨＭＷ−ｍａｐ組成物に対する感受性は、０．５ＩＵ以上のＲＡＳＴとして規定された。
【０２４５】
（実施例１５）
本実施例は、実施例１に記載されるＤ．ｆａｒｉｎａｅ  ＨＭＷ−ｍａｐ組成物が糖タンパク質を含むことを実証する。
【０２４６】
実施例１に従って調製された約５．４μｇのＤ．ｆａｒｉｎａｅ  ＨＭＷ−ｍａｐ組成物を、ＳＤＳ  ＰＡＧＥに適用し、そして電気泳動を標準的な技術に従って行なった。このタンパク質を、標準的な技術に従ってニトロセルロース膜にブロットし、そして糖タンパク質を、製造業者のプロトコルを使用して、ＤＩＧＴＭグリシン検出キット（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮより入手可能）を使用して検出した。ＨＭＷ−ｍａｐ領域に対応する領域は、キットを用いて陽性反応を示し、このことは、ＨＭＷ−ｍａｐ組成物が糖タンパク質を含むことを示す。
【０２４７】
（実施例１６）
本実施例は、Ｄ．ｆａｒｉｎａｅ  ＨＭＷ−ｍａｐ組成物が、化学的手段および酵素的手段の両方によって、アミノ酸残基が取り除かれる場合でさえ、アレルゲンとしてのその特徴を保持することを示す。この結果は、主なエピトープが、ＨＭＷ−ｍａｐ組成物上のＮ連結グリコシル化部位またはＯ連結グリコシル化部位に結合した多糖を含む、炭水化物エピトープであり得ることを示唆する。
【０２４８】
（Ａ．化学的手段によるタンパク質除去（タンパク質のβ除去））
１２μｇ（マイクログラム）のＨＭＷ−ｍａｐ組成物（実施例１に記載されるように精製された）を、１００μｌ（マイクロリットル）の蒸留した脱イオン水中に溶解した。この混合物に、５μｌの１０Ｍ（モーラー）ＮａＯＨおよび３．８ｍｇ（ミリグラム）ＮａＢＨ４（Ｓｉｇｍａより入手可能）を添加して、０．５Ｍ  ＮａＯＨおよび１Ｍ  ＮａＢＨ４の最終濃度を得た。この反応混合物を、５０℃で３０分間加熱し、次いで冷却し、そして１００μｌのアセトンを添加した。この混合物に、十分な量（すなわち、約１５０μｌ）のＤｏｗｅｘ５０（Ｈ＋）（Ｐｈａｒｍａｃｉａより入手可能）を添加して、わずかに酸性の溶液を作製した。Ｄｏｗｅｘ５０は、タンパク質を吸収および除去し、上清に任意の糖部分を残す。この混合物を、マイクロ遠心分離機で遠心分離し、そして１００μｌの水で３回洗浄した。遠心分離からの上清を合わせて、乾燥するまで蒸発させて、メタノール：ＨＣｌ溶液（１０００：１  ｖ／ｖ）で５回洗浄し、各洗浄後、乾燥するまで蒸発させて塩を取り除く。この混合物を、１００μｌの水に溶解し、そして一部（２０μｌ）を標準的な技術を使用するＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析し、そしてクマシーブルー染色および銀染色の両方を使用して、化学的に処理されたサンプル中のタンパク質の量を決定した。クマシーブルー染色および銀染色のいずれによってもタンパク質は検出されず、このことは、タンパク質の除去を示す。タンパク質上の任意の糖部分は、これらの条件によって影響されなかった。
【０２４９】
各サンプルからの残渣の残りを、実施例４に記載されるように、ＥＬＩＳＡ分析に供した。手短に言うと、１００ｎｇのＨＭＷ−ｍａｐ組成物のβ除去サンプルまたは非β除去サンプルのいずれかをＩｍｍｕｌｏｎプレートにコーティングし、そしてＤ．ｆａｒｉｎａｅ感受性イヌ血清プール、Ｄ．ｆａｒｉｎａｅ感受性ネコ血清プール、および（ＥＬＩＳＡによって測定される場合）Ｄ．ｆａｒｉｎａｅ感受性または非感受性のいずれかである種々の別々のイヌ血清を用いて、ＥＬＩＳＡを、実施例４に記載されるように実行した。結果を表５に示す。
【０２５０】
（表５．ＨＭＷ−ｍａｐ組成物およびβ除去ＨＭＷ−ｍａｐ組成物（これは、炭水化物のみである）に対するイヌ血清およびネコ血清の反応性）
【０２５１】
【表５】
2004529605.tif 000021
表５からの結果は、β除去ＨＭＷ−ｍａｐ組成物サンプルが、Ｄ．ｆａｒｉｎａｅ  ＨＭＷ−ｍａｐ組成物に感受性であるイヌ血清およびネコ血清由来のＩｇＥを結合する能力をまだ保持することを示し、このことは、タンパク質に結合したグリカンが、ＨＭＷ−ｍａｐ組成物アレルゲンタンパク質の主要なエピトープを構成することを示す。
【０２５２】
（Ｂ．酵素的手段によるタンパク質除去）
１４μｇのＨＭＷ−ｍａｐ組成物（実施例１に記載されるように精製した）を、１μｇ  エンドプロテイナーゼＫ（Ｓｉｇｍａより入手可能）で消化して、分子のタンパク質部分を除去する。消化反応を、５６℃で２４時間行ない、その後、反応物中のエンドプロテイナーゼを、煮沸水中で１０分間熱変性させた。
【０２５３】
この反応物の一部を、標準的な技術を使用するＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析し、そしてクマシーブルー染色および銀染色の両方を使用して、酵素的に消化したサンプル中のタンパク質の存在を検出した。ＨＭＷ−ｍａｐ組成物は、クマシーブルー染色および銀染色のいずれによっても検出されず、このことは、ＨＭＷ−ｍａｐ組成物の除去を示す。タンパク質上のグリコシル化部位を介して結合したグリカンはいずれも、これらの条件によって影響されなかった。
【０２５４】
酵素的に消化した反応物の残りを、実施例４に記載される様式で、ＥＬＩＳＡによって試験した。手短に言うと、１００ｎｇのＨＭＷ−ｍａｐ組成物のプロテイナーゼＫ消化サンプルまたはプロテイナーゼＫ未消化サンプルのいずれかをＩｍｍｕｌｏｎプレートにコーティングし、そしてＥＬＩＳＡを、（ＥＬＩＳＡによって測定される場合）Ｄ．ｆａｒｉｎａｅ感受性または非感受性のいずれかである種々の別々のイヌ血清を用いて、実施例４に記載されるように実行した。結果を表６に示す。
【０２５５】
（表６．ＨＭＷ−ｍａｐ組成物およびエンドプロテイナーゼＫ消化ＨＭＷ−ｍａｐ組成物に対するイヌ血清の反応性）
【０２５６】
【表６】
2004529605.tif 000022
表６からの結果は、プロテイナーゼＫ消化ＨＭＷ−ｍａｐ組成物サンプルが、Ｄ．ｆａｒｉｎａｅ  ＨＭＷ−ｍａｐ組成物に感受性であるイヌ血清およびネコ血清由来のＩｇＥを結合する能力をまだ保持することを示し、このことは、タンパク質に結合したグリカンが、ＨＭＷ−ｍａｐ組成物上の主要なエピトープを構成することを示唆する。
【０２５７】
（実施例１７）
本実施例は、ＨＭＷ−ｍａｐ組成物からＮ連結グリカンを除去する試みを記載する。
【０２５８】
ＨＭＷ−ｍａｐ組成物（２μｇ）（実施例１におけるように精製された）を、製造業者の指示に従って、Ｎ−グリコシダーゼＦ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍより入手可能）を用いて消化した。消化物を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析し、そして標準的なプロトコルに従って染色した。２μｇ  Ｆｅｔｕｉｎ（Ｓｉｇｍａより入手可能）を、ポジティブなＮ連結グリコシル化タンパク質コントロールとして使用した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥの分析は、インタクトなｍａｐ  Ｂタンパク質および消化したｍａｐ  Ｂタンパク質の分子量の間に見かけの差異は存在しないことを示した。ポジティブコントロールのｆｅｔｕｉｎは、Ｎ−グリコシダーゼＦでの消化後に分子量の減少を示さなかった。この結果は、ＨＭＷ−ｍａｐ組成物上にＮ連結グリカンが存在しないこと、またはＨＭＷ−ｍａｐ組成物上に小さいサイズのＮグリカンのみが存在することを示す。
【０２５９】
（実施例１８）
本実施例は、全長Ｄｅｒｍａｔｏｐｈａｇｏｉｄｅｓ  ｆａｒｉｎａｅの６０ｋＤアレルゲンをコードする核酸分子の単離および配列決定を記載する。
【０２６０】
この核酸分子を、実施例１０に記載されるＤｅｒｍａｔｏｐｈａｇｏｉｄｅｓ  ｆａｒｉｎａｅの６０ｋＤアレルゲンの一部をコードする３２Ｐ−標識されたｃＤＮＡとハイブリダイズする能力によって、Ｄｅｒｍａｔｏｐｈａｇｏｉｄｅｓ  ｆａｒｉｎａｅのｃＤＮＡライブラリーから単離した。
【０２６１】
Ｄｅｒｍａｔｏｐｈａｇｏｉｄｅｓ  ｆａｒｉｎａｅ  ｃＤＮＡ  ライブラリーを、以下のように調製した。全ＲＮＡを、Ｃｈｏｍｚｙｎｓｋｉら、１９８７、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１６２，１５６〜１５９によって記載される方法に類似の、酸グアニジニウム−フェノール−クロロホルム法を用いて、約２グラムのＤ．ｆａｒｉｎａｅダニから抽出した。ポリＡ＋選択したＲＮＡを、製造者によって推奨される方法に従って、ｍＲＮＡ精製キット（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｎｅｗａｒｋ，ＮＪから入手可能）を用いて、オリゴｄＴセルロースクロマトグラフィーによって、全ＲＮＡ調製物から分離した。全ダニｃＤＮＡライブラリーを、ＳｔｒａｔａｇｅｎｅのＺＡＰ−ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔプロトコルを用いて、ｌａｍｂｄａ−Ｕｎｉ−ＺＡＰＴＭ  ＸＲベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅから入手可能）中に構築した。約５μｇのポリＡ＋ＲＮＡを使用して、Ｄ．ｆａｒｉｎａｅ  ｃＤＮＡライブラリーを生成した。
【０２６２】
ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ中に記載されるプロトコルの改変を用いて、３２Ｐ−標識されたｃＤＮＡ  ｎＤｅｒｆ６０５１０を有する複数のプラークリフトを用いて、全ダニｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングした。ハイブリダイゼーションを、６×ＳＳＣ、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液、０．５％ＳＤＳ、１００ｍｇ／ｍｌのｓｓＤＮＡで、５２℃で１８時間行った。フィルターを、各洗浄あたり、２×ＳＳＣ、０．２％のＳＤＳ中、５５℃で３０分で、２回洗浄した後、約０．２×ＳＳＣを用いる以外は同じ緩衝液中で、３０分間最終の洗浄を行った。Ｄ．ｆａｒｉｎａｅの６０ｋＤアレルゲンをコードする核酸分子のプラーク精製クローンを、ＺＡＰ−ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅから入手可能）中に記載されるインビボでの切り出しプロトコルに従って、ＥｘＡｓｓｉｓｔＴＭヘルパーファージおよびＳＯＬＲＴＭ  Ｅ．ｃｏｌｉを用いて、二本鎖組換え分子へと変換し、これを本明細書中において、ｎＤｅｒｆ６０１４５５として示す。二本鎖プラスミドＤＮＡを、アルカリ溶解プロトコル（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出に記載される）を用いて調製した。
【０２６３】
（実施例１９）
本実施例は、本発明のＤ．ｆａｒｉｎａｅ核酸分子の配列決定を記載する。
【０２６４】
ｎＤｅｒｆ６０１４５５を含むプラスミドを、Ｓａｎｇｅｒジデオキシ鎖停止法によって、Ａｍｐｌｉ  Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、ＦＳ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴから入手可能）を用いたＰＲＩＳＭＴＭ  Ｒｅａｄｙ  Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔを用いて、配列決定した。ＰＣＲ伸長を、ＧｅｎｅＡｍｐＴＭ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ  ９６００（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒから入手可能）中で行った。過剰の色素ターミネーターを、製造者の標準的なプロトコルに従って、ＣｅｎｔｒｉｆｌｅｘＴＭ  Ｇｅｌ  Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ  Ｃａｒｔｒｉｄｇｅ  （Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤから入手可能）を用いて、伸長産物から除去した。サンプルを、ＡＢＩプロトコルに従って再懸濁し、そして、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭＴＭ  ３７７  Ａｕｔｏｍａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒにかけた。配列の編集およびオープンリーディングフレームの決定を含むＤＮＡ配列分析を、ＧＣＧＴＭプログラム（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩから入手可能）を用いて行った。分子量および当電点（ｐＩ）の決定を含むタンパク質配列分析を、ＧＣＧＴＭプログラムを用いて行った。
【０２６５】
完全なｎＤｅｒｆ６０１４５５核酸分子の約１４５５ヌクレオチドコンセンサス配列を決定した；２つの相補鎖の配列が、配列番号５０（コード鎖）および配列番号５２（相補鎖）として存在する。この２つの相補的な鎖の配列を、配列番号５０（コード鎖）および配列番号５２（相補鎖）として示す。ｎＤｅｒｆ６０１４５５配列は、全長のコード領域を含む。明らかな開始コドンおよび停止コドン範囲は、それぞれ、配列番号５０の１４〜１６および１４００〜１４０２のヌクレオチドにわたる。推定ポリアデニル化シグナル（５’ＡＡＴＡＡＡ３’）は、配列番号５０のヌクレオチド約１４０８〜１４１３にわたる領域内に配置される。
【０２６６】
配列番号５０の翻訳は、ＰＤｅｒｆ６０４６２と示される、４６２アミノ酸のタンパク質を生じ、このアミノ酸配列は、配列番号５１に示される。ＰＤｅｒｆ６０４６２をコードするコード領域からなる核酸分子は、本明細書中で、ｎＤｅｒｆ６０１３８６といい、この核酸配列は、配列番号５３（コード鎖）および配列番号５４（相補鎖）に示される。ＰＤｅｒｆ６０４６２のアミノ酸配列（すなわち、配列番号５１）は、ＰＤｅｒｆ６０４６２が、約５２．１ｋＤの推定分子量を有し、約５．７３の推定ＰＩを有することを予測する。配列番号５１の分析は、アミノ酸１〜アミノ酸２５にわたるアミノ酸の範囲によってコードされるシグナルペプチドの存在を示唆する。提唱された成熟タンパク質は、本明細書中でＰＤｅｒｆ６０４３７と示され、このタンパク質は、本明細書中で配列番号５６と示される約４３７アミノ酸を含む。ＰＤｅｒｆ６０４３７のアミノ酸配列（すなわち、配列番号５６）は、ＰＤｅｒｆ６０４６２が、約５０．０ｋＤの推定分子量を有し、約５．６１の推定ＰＩ、およびアミノ酸３１３〜アミノ酸３１５にわたる１つの推定アスパラギン連結グリコシル化部位を有することを予測する。この成熟タンパク質をコードする核酸分子を、配列番号５５と示し、その逆位相補体を、配列番号５７と示す。
【０２６７】
ＢＬＡＳＴｐ検索を、以下に従って行った：Ａｌｔｓｃｈｕｌら，（１９９０），Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３〜４１０；およびＡｌｔｓｃｈｕｌら，（１９９７），Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２５：  ３３８９−３４０２。タンパク質検索を、配列番号５１を用いて行い、この配列番号５１は、キチナーゼ分子に対して有意な相同性を示した。アミノ酸レベルでの相同性検索のスコア一致が最も高いのは、ＰＩＲ受託番号Ａ５３９１８：Ｃｈｅｌｏｎｕｓ  ｓｐキチナーゼ前駆体であり、これは、配列番号５１と約３２％同一であった。ヌクレオチドレベルで、この検索を、配列番号５３を用いて行い、この配列番号５３は、データベース中の任意の配列と有意な類似性を示さなかった。配列分析を、上述のようにＧＣＧ  ＧＡＰプログラムを用いて行った。
【０２６８】
（実施例２０）
本実施例は、Ｄ．ｆａｒｉｎａｅ  ＨＭＷ−ｍａｐ組成物（これは、Ｄｅｒ  ｆ  １５ともいわれる）の特徴付けをさらに記載する。
【０２６９】
実施例８の核酸分子ｎＤｅｒｆ９８１７５２を、適切な発現ベクターに挿入し、Ｅ．ｃｏｌｉおよびＰ．ｐａｓｔｏｒｓ中で発現させた。得られたタンパク質（ＰＤｅｒｆ９８５５５）が、Ｅ．ｃｏｌｉまたはＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ中で発現される場合、実施例４に記載されるように産生した、感作されたイヌ血清は、組換えタンパク質を認識できなかった。このことは、実施例１のネイティブなＤ．ｆａｒｉｎａｅ  ＨＭＷ−ｍａｐ組成物（これはまた、ネイティブなＤｅｒｆ１５ともいう）が使用される場合に得られる陽性の結果と対照的である；実施例４を参照のこと。
【０２７０】
Ｅ．ｃｏｌｉ中で発現されるタンパク質の非反応性は、実施例１６に示される結果と一致し、この結果は、ネイティブなＨＭＷアレルゲンが、アミノ酸が除去された後でさえ、アレルゲンとしての特性を保持していることを示した。
【０２７１】
これらの結果を全て合わせると、主要なエピトープは、分子または他の二次的改変のいくつかの炭化水素領域であることが示唆される。
【０２７２】
ネイティブなＤｅｒｆ１５タンパク質の抗原性は、過ヨウ素酸処理の後に失われず；一般的に、炭化水素エピトープは、さらなる基でさらに置換されたエピトープ、またはジェミナルでないヒドロキシル基を有する珍しい糖を有するエピトープを除いて、過ヨウ素酸塩によって破壊される。
【０２７３】
ネイティブなＤｅｒｆ１５抗原を、炭化水素含量に関して分析した。炭化水素の実質的な量が見い出された（約３０重量％）。特に、約２．８重量％の抗原から構成されるマンノース；ガラクトース約２３．２％；グルコース約４．３％（グリコシル残基の存在は、グルコースがしばしば糖タンパク質を含むため、仮の値であるとみなされなければならない）；そして検出可能なレベルでのＨｅｘＮＡｃ；さらなる観察により、ＨｅｘＮＡｃがＧｌｃＮＡｃおよびＧａｌＮＡｃであることが明らかとなった。
【０２７４】
ネイティブなＤｅｒｆ１５タンパク質を、ＮａＢＨ４存在下にて塩基で処理して、Ｐ−４サイズ排除クロマトグラフィーによって分析した。Ｄｅｒｆ１５中に存在するＯ−連結オリゴ糖によって、このカラムが役に立たないことを見い出した。この結果は、非常に大きなＯ−連結オリゴ糖、またはオリゴ糖上のサルフェートのような酸性基の存在のいずれかと一致する。サルフェートの存在または非存在をより直接的に決定するための試みは、あいまいな結果を与えた。
【０２７５】
Ｄｅｒｆ１５を、ｐＨ４、ｐＨ５、およびｐＨ７で、３７℃にて一晩処理した。次いで、得られたサンプルを、このタンパク質に対する抗体またはＤｅｒｆ１５と反応性であることが公知のイヌ血清でプローブした。ｐＨ５およびｐＨ７で処理したサンプルにおいて、イヌ抗血清エピトープの全てが破壊されたが、ｐＨ４で処理されたサンプルにおいて、いくらか活性が残った。抗Ｄｅｒｆ１５抗体は、脱グリコシル化が起こったかのように、全てのｐＨで、Ｄｅｒｆ１５の分子量が減少したことを示し、ｐＨ４では元の物質がいくらか残っている。この変化が、Ｄｅｒｆ１５タンパク質による自己触媒であったかまたは化学的に生じたか否かは、知られていない；理論に縛られないが、エピトープの喪失がこのような温和な条件下で生じるため、自己触媒作用が起こったと考えられる。
【０２７６】
（実施例２１）
本実施例は、ネコ血清中のネコＩｇＥに対する、いくつかのイエダニ（ＨＤＭ）アレルゲンの結合を記載する。
【０２７７】
イエダニに対するネコのＩｇＥ応答のアレルゲンプロフィールは、イヌのものとは異なっているようである。Ｈｅｓｋａ’ｓ  Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（ＶＤＬ）に２０００年１月に提出されたネコ血清に対するＩｇＥ試験の結果の検査は、全てのアレルゲン特異的なＩｇＥ陽性のネコの４０％が、抗ＨＤＭ  ＩｇＥを有したことを示した。これらのネコの全ては、Ｄ．ｆａｒｉｎａｅおよびＤ．ｐｔｅｒｏｎｙｓｓｉｎｕｓの両方に対して陽性であった。Ｄ．ｆａｒｉｎａｅに関して陽性であることが公知の８８の血清を、Ｄｅｒｆ１、Ｄｅｒｆ２、Ｄｅｒｆ１５、および６０ｋＤアレルゲンの高度に精製された調製物に対して、ＥＬＩＳＡによってアッセイした。このアッセイにおいて、３２％のネコが、Ｄｅｒｆ１について陽性であり、４２％が、Ｄｅｒｆ２について陽性であり、６８％がＤｅｒｆ１５について陽性であり、そして８６％が、６０ｋＤアレルゲンについて陽性であった。
【０２７８】
本発明の種々の実施形態が詳細に記載されているが、これらの実施形態の改変および適応が、当業者に思い浮かぶことは、明らかである。しかし、このような改変および適応が、添付の特許請求の範囲に記載されるような、本発明の範囲内であることが明らかに理解されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は、１２％Ｔｒｉｓ−グリシンＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離された高分子量のＤｅｒ  ｆタンパク質を示す。
【図２】
図２は、１４％Ｔｒｉｓ−グリシンＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離された約６０ｋＤのＤｅｒ  ｆタンパク質を示す。
【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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2004529605.tif 000186
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