(57)【要約】本発明は、免疫療法に使用するための、抗原分子と会合したα（２）マクログロブリンの複合体に関する。本発明は、免疫疾患、増殖性疾患及び感染症の診断及び治療における、かかる組成物の使用方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
感染症若しくは癌の治療又は予防に有効な量の、感染因子の抗原又は癌細胞において同じ細胞型の非癌細胞での発現と比較して過剰発現される抗原の抗原性を示す抗原分子と非共有結合により会合したα（２）マクログロブリンポリペプチドからなる分子複合体、及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
【請求項２】
前記抗原分子が、感染因子の抗原の抗原性を示す抗原分子である、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
前記抗原分子が、癌細胞において同じ細胞型の非癌細胞での発現と比較して過剰発現される抗原の抗原性を示す抗原分子である、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項４】
前記抗原分子が、腫瘍特異的抗原又は腫瘍関連抗原である、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項５】
感染症若しくは癌の治療又は予防に有効な量の、感染因子の抗原又は癌細胞において同じ細胞型の非癌細胞での発現と比較して過剰発現される抗原の抗原性を示す抗原分子とα（２）マクログロブリンポリペプチドとから構成される融合タンパク質、及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
【請求項６】
前記分子複合体が精製されたものである、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項７】
感染因子の抗原分子又は癌細胞において同じ細胞型の非癌細胞での発現と比較して過剰発現される抗原と非共有結合により会合したα（２）マクログロブリンポリペプチドからなる、精製された分子複合体。
【請求項８】
少なくとも６５％の分子複合体が、抗原分子と非共有結合により会合したα（２）マクログロブリンである、分子複合体の精製集団。
【請求項９】
少なくとも６５％の分子複合体が、抗原分子と非共有結合により会合したα（２）マクログロブリンである、組換え細胞から精製された分子複合体の精製集団。
【請求項１０】
病原体に感染しており、さらに、（ｉ） プロモーターに機能しうる形で連結され、且つ（ｉｉ） α（２）マクログロブリンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を有する核酸によって形質転換された組換え細胞であって、α（２）マクログロブリンポリペプチドが、抗原分子が存在する場合にその抗原分子と会合して、十分量存在すれば該抗原分子に対する免疫応答を誘導することができる複合体を形成するものである、前記組換え細胞。
【請求項１１】
（ｉ） プロモーターに機能しうる形で連結され、且つ（ｉｉ） α（２）マクログロブリンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を有する核酸によって形質転換された組換え癌細胞であって、α（２）マクログロブリンポリペプチドが、抗原分子が存在する場合にその抗原分子と会合して、十分量存在すれば該抗原分子に対する免疫応答を誘導することができる複合体を形成するものである、前記組換え癌細胞。
【請求項１２】
（ｉ） 第１のプロモーターに機能しうる形で連結され、且つα（２）マクログロブリンポリペプチドをコードする第１のヌクレオチド配列を有する第１の核酸、及び（ｉｉ） 第２のプロモーターに機能しうる形で連結され、且つ抗原分子をコードする第２のヌクレオチド配列を有する第２の核酸、によって形質転換された組換え細胞であって、該細胞内でα（２）マクログロブリンポリペプチドと抗原分子とが発現されて互いに会合し、十分量存在すれば該抗原分子に対する免疫応答を誘導することができる複合体を形成する、前記組換え細胞。
【請求項１３】
ヒト細胞である、請求項１０〜１２のいずれか１項に記載の組換え細胞。
【請求項１４】
請求項１０〜１２のいずれか１項に記載の組換え細胞と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物。
【請求項１５】
抗原分子と非共有結合により会合したα（２）マクログロブリンポリペプチドの複合体の製造方法であって、下記工程：
（ａ） α（２）マクログロブリンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を有する核酸によって形質転換された細胞を、α（２）マクログロブリンポリペプチドが該細胞により発現されて該細胞の抗原分子と会合するような条件下にて培養する工程、及び
（ｂ） 該抗原分子と非共有結合により会合した該α（２）マクログロブリンポリペプチドの複合体の集団を、該細胞から回収する工程、
を含む、前記方法。
【請求項１６】
感染因子の１以上の抗原に由来する抗原分子と非共有結合により会合したα（２）マクログロブリンポリペプチドの製造方法であって、下記工程：
（ａ） α（２）マクログロブリンポリペプチド又はその断片、類似体若しくは変異体をコードし、且つプロモーターに機能しうる形で連結されたヌクレオチド配列を有する核酸によって形質転換された感染細胞を、α（２）マクログロブリンポリペプチドが該細胞により発現されて該細胞のペプチドと会合するような条件下にて培養する工程、及び
（ｂ） 感染因子に由来するペプチドと非共有結合により会合したα（２）マクログロブリンポリペプチドの複合体の集団を、該細胞から回収する工程、
を含む、前記方法。
【請求項１７】
前記複合体を精製することを更に含む、請求項１５又は１６に記載の方法。
【請求項１８】
アフィニティークロマトグラフィーにより前記複合体を精製することを更に含む、請求項１５又は１６に記載の方法。
【請求項１９】
感染症の感染因子の抗原の抗原性を示す第１の抗原分子と非共有結合により会合したα（２）マクログロブリンポリペプチドからなる精製された複合体を、免疫原性を示す量で個体に投与することを含む、感染症を有する個体において感染症を治療又は予防する方法。
【請求項２０】
前記の免疫原性を示す複合体の投与より前、投与と同時又は投与より後に、感染因子の第２の抗原分子の抗原性を示す第２の抗原分子と非共有結合により会合したα（２）マクログロブリンポリペプチドの第２の複合体を感作量で用いてｉｎ ｖｉｔｒｏで感作した抗原提示細胞を含む組成物を個体に投与することを更に含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
感染症を有する被験体において感染症を治療又は予防する方法であって、下記工程：
（ａ） プロモーターに機能しうる形で連結され、且つα（２）マクログロブリンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を有する核酸によって形質転換された、感染症の感染因子の抗原の抗原性を示す感染細胞を、α（２）マクログロブリンポリペプチドが該感染細胞により発現されて該細胞の抗原分子と会合するような条件下にて培養する工程、
（ｂ） 抗原分子と非共有結合により会合したα（２）マクログロブリンポリペプチドの複合体を該感染細胞から回収する工程、及び
（ｃ） 回収した複合体を、上記感染症を治療又は予防するのに有効な量で被験体に投与する工程、
を含む、前記方法。
【請求項２２】
工程（ａ）の前に、被験体から感染細胞を得て、該感染細胞を前記核酸によって形質転換する工程を更に含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
工程（ａ）の前に、被験体と同じ種類の感染症を有している、その被験体とは別の１以上の個体から感染細胞を得て、該感染細胞を前記核酸によって形質転換する工程を更に含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
感染症を有する被験体において感染症を治療又は予防する方法であって、下記工程：
（ａ） （ｉ） α（２）マクログロブリンポリペプチドをコードする第１の核酸及び（ｉｉ） 感染症の感染因子の抗原の抗原性を示す抗原分子をコードする第２の核酸によって形質転換された組換え細胞を培養する工程、
（ｂ） 該抗原と非共有結合により会合したα（２）マクログロブリンポリペプチドの複合体を回収する工程、並びに
（ｃ） 回収した複合体を、上記感染症を治療又は予防するのに有効な量で被験体に投与する工程、
を含む、前記方法。
【請求項２５】
感染症が、ウイルス、細菌、真菌及び寄生虫からなる群から選択される感染因子により引き起こされる、請求項１９、２１又は２４に記載の方法。
【請求項２６】
ある種類の癌を有しているか又はある種類の癌の予防が望まれる個体において癌を治療又は予防する方法であって、第１の抗原分子と非共有結合により会合したα（２）マクログロブリンポリペプチドからなる精製された複合体を免疫原性を示す量で個体に投与する工程を含み、且つ、
（ａ） 第１の抗原分子が、上記種類の癌又はその転移癌の抗原性を示すものであるか、又は
（ｂ） 該複合体を、α（２）マクログロブリンポリペプチドを組換え的に発現する上記種類の癌細胞又はその転移癌細胞から複合体を回収することによって得る、前記方法。
【請求項２７】
前記の免疫原性を示す複合体の投与より前、投与と同時又は投与より後に、癌細胞において同じ細胞型の非癌細胞での発現と比較して過剰発現される抗原の抗原性を示す第２の抗原分子と非共有結合により会合したα（２）マクログロブリンの第２の複合体を感作量で用いてｉｎ ｖｉｔｒｏで感作した抗原提示細胞を含む組成物を、個体に投与することを更に含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
第１の抗原分子が、癌細胞において同じ細胞型の非癌細胞での発現と比較して過剰発現される抗原である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
抗原分子が腫瘍特異的抗原又は腫瘍関連抗原である、請求項２６に記載の方法。
【請求項３０】
ある種類の癌を有しているか又はある種類の癌の予防が望まれる被験体において癌を治療又は予防する方法であって、下記工程：
（ａ） プロモーターに機能しうる形で連結され、且つα（２）マクログロブリンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を有する核酸によって形質転換された上記種類の癌細胞を、α（２）マクログロブリンポリペプチドが該癌細胞により発現されて該細胞の少なくとも１つの抗原分子と会合するような条件下にて培養する工程、
（ｂ） 少なくとも１つの抗原分子と非共有結合により会合したα（２）マクログロブリンポリペプチドの複合体を該癌細胞から回収する工程、及び
（ｃ） 回収した複合体を、癌を治療又は予防するのに有効な量で被験体に投与する工程、
を含む、前記方法。
【請求項３１】
工程（ａ）の前に、被験体から癌細胞を得て、該癌細胞を前記核酸によって形質転換する工程を更に含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
工程（ａ）の前に、被験体と同じ種類の癌を有している、被験体とは別の１以上の個体から癌細胞を得て、該癌細胞を前記核酸によって形質転換する工程を更に含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
ある種類の癌を有しているか又はある種類の癌の予防が望まれる被験体において癌を治療又は予防する方法であって、下記工程：
（ａ） （ｉ） α（２）マクログロブリンポリペプチドをコードする第１の核酸及び（ｉｉ） 癌細胞の抗原の抗原性を示す抗原分子をコードする第２の核酸によって形質転換された組換え細胞を培養する工程、
（ｂ） 該抗原と非共有結合により会合したα（２）マクログロブリンポリペプチドの複合体を回収する工程、並びに
（ｃ） 回収した複合体を、癌を治療又は予防するのに有効な量で被験体に投与する工程、
を含む、前記方法。
【請求項３４】
癌の種類が、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮腫、骨膜腫、中皮腫、ユーイング肉腫、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、大腸癌、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、脂腺癌、乳頭状癌、乳頭状腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支原生癌、腎細胞癌、ヘパトーム、胆管癌、絨毛癌、セミノーマ、胎生期癌、ウィルムス腫、子宮頸癌、精巣癌、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神経膠腫、星状細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、脳室上衣腫、松果体腫、血管芽腫、聴神経腫、乏突起神経膠腫、髄膜腫、黒色腫、神経芽腫、網膜芽腫、白血病、リンパ腫、多発骨髄腫、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症、及び、Ｈ鎖病からなる群より選択される、請求項２６、３０又は３３に記載の方法。
【請求項３５】
自己免疫疾患の治療が必要な哺乳動物に、α（２）マクログロブリンに特異的な抗体を投与することを含む、自己免疫疾患の治療方法。
【請求項３６】
前記抗体が精製されたものである、請求項３５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、米国国立衛生研究所から与えられた助成金番号ＣＡ６４３９４の下での合衆国政府の支援に基づいて為された。政府は本発明において一定の権利を有する。
【０００２】
１． 序論
本発明は、免疫療法に使用するための、抗原分子と会合したα（２）マクログロブリンの複合体に関する。本発明は、かかる組成物を免疫疾患、増殖性疾患及び感染症の診断及び治療に使用する方法に関する。
【０００３】
２． 本発明の背景
２．１． 熱ショックタンパク質
熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）は、ストレスタンパク質とも呼ばれており、初めは、細胞が熱ショックに応答して合成するタンパク質として同定されたものである。ＨＳＰは分子量に基づいて５つのファミリーに分類されており、Ｈｓｐ１００、Ｈｓｐ９０、Ｈｓｐ７０、Ｈｓｐ６０及びｓｍＨｓｐがある。その後、これらのファミリーの多くのメンバーは、他のストレス刺激、例えば、栄養欠乏、代謝破壊、酸素ラジカル、細胞内病原体による感染などに応答して誘導されることが見出された（Ｗｅｌｃｈ， Ｍａｙ １９９３， Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｍｅｒｉｃａｎ ５６−６４； Ｙｏｕｎｇ， １９９０， Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ８：４０１−４２０； Ｃｒａｉｇ， １９９３， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６０：１９０２−１９０３； Ｇｅｔｈｉｎｇら， １９９２， Ｎａｔｕｒｅ ３５５：３３−４５； 及びＬｉｎｄｑｕｉｓｔら， １９８８， Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ２２：６３１−６７７を参照のこと）。
【０００４】
熱ショックタンパク質は現存するタンパク質のうちで最も高度に保存されたタンパク質に入る。例えば、大腸菌由来のＨｓｐ７０であるＤｎａＫは、擦過傷（ｅｘｃｏｒｉａｔｅｓ）からのＨｓｐ７０タンパク質に対して約５０％のアミノ酸配列同一性を有する（Ｂａｒｄｗｅｌｌら， １９８４， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ８１：８４８−８５２）。Ｈｓｐ６０及びＨｓｐ９０ファミリーも同様に高いレベルのファミリー内保存を示す（Ｈｉｃｋｅｙら， １９８９， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． ９：２６１５−２６２６； Ｊｉｎｄａｌ， １９８９， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． ９：２２７９−２２８３）。さらに、Ｈｓｐ６０、Ｈｓｐ７０及びＨｓｐ９０ファミリーは、配列の点では３５％を超えるアミノ酸同一性を有して、ストレスタンパク質に関係しているが、その発現レベルがストレスによって変化しないタンパク質を含むことが発見されている。
【０００５】
熱ショックや他の生理的ストレスに対する細胞性応答の研究から、ＨＳＰはこうした不利な状態から細胞を保護することに関わっているだけでなく、ストレスを受けていない細胞においても必須の生化学的及び免疫学的プロセスに関係していることが明らかにされた。例えば、Ｈｓｐ７０ファミリーのメンバーは、細胞質、核、ミトコンドリア、又は小胞体に存在し（Ｌｉｎｄｑｕｉｓｔ ら， １９８８， Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ２２：６３１−６７７）、免疫系の細胞への抗原提示に関与しており、さらに、正常細胞においてはタンパク質の輸送、折りたたみ及び組み立てにも関係している。ＨＳＰはタンパク質又はペプチドと結合し、その結合したタンパク質又はペプチドをアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）又は低ｐＨの存在下で放出することができる。
【０００６】
２．２． ＨＳＰ−ペプチド複合体の免疫原性
Ｓｒｉｖａｓｔａｖａらは、メチルコラントレンで誘発させた近交マウスの肉腫に対する免疫応答を実証した（１９８８， Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｔｏｄａｙ ９：７８−８３）。これらの研究において、これらの腫瘍の個々に異なる免疫原性に応答可能な分子は９６ｋＤａの糖タンパク質（ｇｐ９６）と８４〜８６ｋＤａの細胞内タンパク質であることが判った（Ｓｒｉｖａｓｔａｖａら， １９８６， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８３：３４０７−３４１１； Ｕｌｌｒｉｃｈら， １９８６， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８３：３１２１−３１２５）。特定の腫瘍から単離されたｇｐ９６又はｐ８４／８６でマウスを免疫化すると、マウスはその特定の腫瘍に対して免疫されるが、抗原的に区別される腫瘍に対しては免疫されない。ｇｐ９６及びｐ８４／８６をコードする遺伝子を単離して特性決定を行ったところ、それらの間には有意な相同性が見られ、しかもｇｐ９６とｐ８４／８６は同一の熱ショックタンパク質のそれぞれ小胞体と細胞質にある同等物であることが示された（Ｓｒｉｖａｓｔａｖａら， １９８８， Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ ２８：２０５−２０７； Ｓｒｉｖａｓｔａｖａら， １９９１， Ｃｕｒｒ． Ｔｏｐ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １６７：１０９−１２３）。さらに、Ｈｓｐ７０はそれが単離された腫瘍に対する免疫を誘導するが、抗原的に異なった腫瘍に対しては免疫を誘導しないことが示された。しかしながら、ペプチドを枯渇させたＨｓｐ７０はその免疫原活性を失うことが見出された（Ｕｄｏｎｏ及びＳｒｉｖａｓｔａｖａ， １９９３， Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １７８：１３９１−１３９６）。これらの観察から、熱ショックタンパク質はそれ自体に免疫原性があるのではなく、抗原ペプチドと非共有結合による複合体を形成して、その複合体が抗原ペプチドに特異的な免疫を引き出すことができることが示唆された（ Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ， １９９３， Ａｄｖ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ６２：１５３−１７７； Ｕｄｏｎｏら， １９９４， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， １５２：５３９８−５４０３； Ｓｕｔｏら， １９９５， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２６９：１５８５−１５８８）。
【０００７】
ＨＳＰとペプチドとの非共有結合による複合体（癌細胞から精製されたもの）は、癌の治療及び予防に使用することができ、１９９６年４月１１日付けのＰＣＴ国際公開第９６／１０４１１号及び１９９７年３月２０日付けの国際公開第９７／１０００１号（それぞれ、１９９８年４月１２日発行の米国特許第５，７５０，１１９号及び１９９８年１１月１７日発行の米国特許第５，８３７，２５１号；これらの各特許は参照することにより本明細書に組み入れる）に記載されている。ストレスタンパク質−抗原複合体の（例えば、病原体に感染した細胞からの）単離及び精製も記載されており、これらはウイルスのような病原体や細菌、原生動物、真菌、寄生虫などの他の細胞内病原体が引き起こす感染症の治療及び予防に使用されている（例えば、１９９５年９月２１日付けのＰＣＴ国際公開第９５／２４９２３号を参照のこと）。また、免疫原性のあるストレスタンパク質−抗原複合体は、ストレスタンパク質と抗原ペプチドとのｉｎ ｖｉｔｒｏでの複合体化によっても調製することができ、そのような複合体を癌や感染症の治療及び予防に使用することは、１９９７年３月２０日付けのＰＣＴ国際公開第９７／１００００号（２０００年２月２９日発行の米国特許第６，０３０，６１８号）に記載されている。養子免疫療法で使用するために抗原提示細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏで感作するためのストレスタンパク質−抗原複合体の使用は、１９９７年３月２０日付けのＰＣＴ国際公開第９７／１０００２号に記載されている（１９９９年１１月１６日発行の米国特許第５，９８５，２７０号も参照のこと）。
【０００８】
２．３． α（２）マクログロブリン受容体
αマクログロブリンは、補体成分であるＣ３、Ｃ４及びＣ５をも含む構造的に関連したタンパク質のタンパク質スーパーファミリーのメンバーである。ヒト血漿タンパク質α（２）マクログロブリン（α２Ｍ）は、主にプロテイナーゼインヒビター並びに血漿性及び炎症性液性プロテイナーゼスカベンジャー分子として知られている７２０ｋＤａのホモ四量体タンパク質である（総説としては、Ｃｈｕ及びＰｉｚｚｏ， １９９４， Ｌａｂ． Ｉｎｖｅｓｔ． ７１： ７９２を参照されたい）。α（２）マクログロブリンは１４７４アミノ酸前駆体として合成され、そのうちでシグナル配列として機能する最初の２３個が切り離されて１４５１アミノ酸の成熟タンパク質となる（Ｋａｎら， １９８５， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ８２： ２２８２−２２８６）。
【０００９】
α（２）マクログロブリンは求核性アミノ酸側鎖を有するタンパク質及びペプチドに共有結合により無差別に結合し（Ｃｈｕら， １９９４， Ａｎｎ． Ｎ．Ｙ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ７３７： ２９１−３０７）、それらをα２Ｍ受容体（α２ＭＲ）を発現する細胞に標的化する（Ｃｈｕ及びＰｉｚｚｏ， １９９３， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５０： ４８）。α２Ｍのα２Ｍ受容体への結合はα２ＭのＣ末端部分により仲介され（Ｈｏｌｔｅｔら， １９９４， ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ． ３４４： ２４２−２４６）、その重要な残基が特定されている（Ｎｉｅｌｓｅｎら， １９９６， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７１： １２９０９−１２９１２）。
【００１０】
プロテイナーゼ活性の阻害について一般的に知られているように、α２Ｍは複数の結合部位で種々のプロテアーゼに結合する（例えばＨａｌｌら， １９８１， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｍ． １００（１）： ８−１６を参照されたい）。α２Ｍとプロテアーゼが相互作用すると、トランスフォーメーションと呼ばれる複雑な構造的再編成がおこる。これは、プロテイナーゼがチオエステルによって「トラップ」された後に、α２Ｍの「ベイト（ｂａｉｔ； おとり）」領域内において開裂が起こる結果である。当該コンホメーション変化により受容体結合に必要な残基が露出し、α２Ｍプロテイナーゼ複合体がα２ＭＲに結合することが可能になる。メチルアミンは、プロテイナーゼにより誘導されたのと同様のコンホメーション変化と開裂を引き起こすことができる。本受容体に認識されないα２Ｍの未開裂の形態のものは、しばしば「遅延型」形態 （ｓ−α２Ｍ） と称される。開裂した形態は「急速型」形態（ｆ−α２Ｍ）と称される（Ｃｈｕら， １９９４， Ａｎｎ． Ｎ．Ｙ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ７３７： ２９１−３０７に概説されている）。
【００１１】
プロテイナーゼ阻害機能のほかに、α２Ｍは、抗原と複合体を形成したときに、マクロファージのような抗原提示細胞に取り込まれてＴ細胞ハイブリドーマに提示されるその抗原の能力をｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて最大で２桁高め（Ｃｈｕ及びＰｉｚｚｏ， １９９４， Ｌａｂ． Ｉｎｖｅｓｔ． ７１： ７９２）、Ｔ細胞の増殖を誘導することができる（Ｏｓａｄａら， １９８７， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ． １４６： ２６−３１）ことが、研究により明らかになっている。更なる証拠により、α２Ｍと抗原との複合体形成は、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて粗脾臓細胞による抗体産生を高め（Ｏｓａｄａら， １９８８， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ． １５０： ８８３）、実験用ウサギ（Ｃｈｕら， １９９４， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５２： １５３８−１５４５）及びマウス（Ｍｉｔｓｕｄａら， １９９３， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ． １０１： １３２６−１３３１）でのｉｎ ｖｉｖｏにおける抗体反応を誘起することが示唆されている。しかしながらこれらの研究は何れも、α２Ｍ−抗原複合体がｉｎ ｖｉｖｏにおいて細胞傷害性Ｔ細胞の応答を誘導することができるか否かを示すものではない。
【００１２】
２．４． 熱ショック／ストレスタンパク質の免疫原性
Ｓｒｉｖａｓｔａｖａらは、メチルコラントレンで誘発させた近交マウスの肉腫に対する免疫応答を実証した（１９８８， Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｔｏｄａｙ ９：７８−８３）。これらの研究において、これらの腫瘍の個々に異なる免疫原性に応答可能な分子は９６ｋＤａの細胞表面糖タンパク質（ｇｐ９６）と８４〜８６ｋＤａの細胞内タンパク質であることが特定された（Ｓｒｉｖａｓｔａｖａら， １９８６， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８３：３４０７−３４１１； Ｕｌｌｒｉｃｈ， Ｓ．Ｊら， １９８６， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８３：３１２１−３１２５）。特定の腫瘍から単離されたｇｐ９６又はｐ８４／８６でマウスを免疫すると、マウスはその特定の腫瘍に対して免疫されるが、抗原的に区別される腫瘍に対しては免疫されない。ｇｐ９６及びｐ８４／８６をコードする遺伝子を単離して特性分析を行ったところ、それらの間には有意な相同性が見られ、しかもｇｐ９６とｐ８４／８６は同一の熱ショックタンパク質のそれぞれ小胞体と細胞質にある同等物であることが示された（Ｓｒｉｖａｓｔａｖａら， １９８８， Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ ２８：２０５−２０７； Ｓｒｉｖａｓｔａｖａら， １９９１， Ｃｕｒｒ． Ｔｏｐ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １６７：１０９−１２３）。さらに、Ｈｓｐ７０はそれが単離された腫瘍に対する免疫を誘導するが、抗原的に異なった腫瘍に対しては免疫を誘導しないことが示された。しかしながら、ペプチドを枯渇させたＨｓｐ７０はその免疫原活性を失うことが見出された（Ｕｄｏｎｏ及びＳｒｉｖａｓｔａｖａ， １９９３， Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １７８：１３９１−１３９６）。これらの観察から、熱ショックタンパク質はそれ自体に免疫原性があるのではなく、抗原ペプチドと非共有結合による複合体を形成して、その複合体が抗原ペプチドに特異的な免疫を引き出すことができると示唆された（ Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ， １９９３， Ａｄｖ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ６２：１５３−１７７； Ｕｄｏｎｏら， １９９４， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， １５２：５３９８−５４０３； Ｓｕｔｏら， １９９５， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２６９：１５８５−１５８８）。
【００１３】
癌細胞から精製した、ストレスタンパク質とペプチドとの非共有結合性の複合体の癌の治療及び予防のための使用、並びに、養子免疫療法と組合わせた当該複合体の使用は文献に記載されている（米国特許第５，７５０，１９９号；米国特許第５，８３０，４６４号；１９９６年４月１１日付けの特許協力条約（ＰＣＴ）国際公開第９６／１０４１１号；及び１９９７年３月２０日付けの国際公開第９７／１０００１号を参照されたい。これらの文献はいずれも参照によりその全体が本明細書中に組み込まれるものとする）。ストレスタンパク質−ペプチド複合体の細胞溶解物からの精製は、既に記載されている；ストレスタンパク質−ペプチド複合体は、病原体感染細胞から単離することができ、ウイルス及び他の細胞内病原体（細菌、原生動物、真菌及び寄生虫）のような病原体による感染の治療及び予防のために使用できる（１９９５年９月２１日付けのＰＣＴ国際公開第９５／２４９２３号を参照されたい）。
【００１４】
また、免疫原性のあるストレスタンパク質−ペプチド複合体は、ストレスタンパク質と抗原ペプチドとのｉｎ ｖｉｔｒｏでの複合体化によっても調製することができ、そのような複合体を感染症や癌の治療及び予防に使用することは、１９９７年３月２０日付けのＰＣＴ国際公開第９７／１００００号に記載されている。感染症及び癌の治療のための、所定の抗原と組み合わせた熱ショックタンパク質の使用もまた、１９９７年２月２７日付けのＰＣＴ国際公開第９７／０６８２１号に記載されている。免疫応答を刺激するために、また、感染症及び癌の治療のために、真核生物性の熱ショックタンパク質をコードする発現可能なポリヌクレオチドを哺乳動物細胞に投与することは、共に１９９７年２月２７日付のＰＣＴ国際公開第９７／０６６８５号及び第９７／０６８２８号に記載されている。養子免疫療法で使用するために抗原提示細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏで感作するためのストレスタンパク質−ペプチド複合体の使用は、１９９７年３月２０日付けのＰＣＴ国際公開第９７／１０００２号に記載されている。
【００１５】
２．５ 抗原提示
主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）分子は抗原提示細胞の細胞表面に抗原を提示する。次に細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）がＭＨＣ分子及びその結合ペプチドを認識して標的細胞を殺す。抗原はその起源が細胞内であるか細胞外であるかに応じて２つの異なった抗原プロセッシング経路によりプロセッシングされる。細胞内つまり内因性のタンパク質抗原（すなわち、抗原提示細胞内で合成された抗原）は、ＭＨＣクラスＩ（ＭＨＣＩ）分子によってＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球に提示される。一方、細胞外つまり外因的に合成された抗原決定基は、「特殊化」又は「専門化」されたＡＰＣ（例えば、マクロファージ）の細胞表面上でＭＨＣクラスＩＩ分子によってＣＤ４＋Ｔ細胞に提示される（一般的には、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， Ｗ．Ｅ． Ｐａｕｌ（編）， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ： Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ， １９８４を参照のこと）。この抗原プロセッシング経路の区画分離は、さもなくば近隣細胞のＭＨＣＩ抗原の放出の結果として免疫応答中に起こりうる組織破壊を防止するのに重要である。
【００１６】
熱ショックタンパク質ｇｐ９６は、ｇｐ９６が単離される起源に応じて、広範なアレイのペプチドに対してシャペロンの機能をもつ（Ｓｒｉｖａｓｔａｖａら， １９９８， Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ８：６５７−６６５を参照のこと）。腫瘍由来のｇｐ９６は腫瘍抗原ペプチドを担い（Ｉｓｈｉｉら， １９９９， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １６２：１３０３−１３０９）、ウイルス感染細胞からのｇｐ９６調製物はウイルスのエピトープを有しており（Ｓｕｔｏ及びＳｒｉｖａｓｔａｖａ， １９９５， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６９：１５８５−１５８８； Ｎｉｅｌａｎｄら， １９９８， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９５：１８００−１８０５）、そしてオボアルブミン又はβ−ガラクトシダーゼのようなモデル抗原でトランスフェクトされた細胞からのｇｐ９６調製物は対応するエピトープを伴っている（Ａｒｎｏｌｄら， １９９５， Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １８２：８８５−８８９； Ｂｒｅｌｏｅｒら， １９９８， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２８：１０１６−１０２１）。ｇｐ９６とペプチドとの会合はｉｎ ｖｉｖｏで起こる（Ｍｅｎｏｒｅｔ及びＳｒｉｖａｓｔａｖａ， １９９９， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｕｎ． ２６２：８１３−８１８）。ｇｐ９６−ペプチド複合体は、細胞から単離されたものであれ（Ｔａｍｕｒａら， １９９７， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７８：１１７−１２０）、ｉｎ ｖｉｔｒｏで再構成されたものであれ（Ｂｌａｃｈｅｒｅら， １９９７， Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １８６：１１８３−１４０６）、優れた免疫原であり、ｇｐ９６シャペロン化抗原ペプチドに特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞応答を引き出すために広く使用されている。
【００１７】
ｇｐ９６−ペプチド複合体が免疫応答を引き出す能力は、抗原提示細胞のＭＨＣクラスＩ分子への該ペプチドの移行に依存している（Ｓｕｔｏ及びＳｒｉｖａｓｔａｖａ， １９９５， 前掲）。小胞体［ＥＲ］中のｇｐ９６によりシャペロン化された内因的に合成された抗原は抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞（又はＭＨＣＩ−制限ＣＴＬ）をｉｎ ｖｉｖｏで感作することができ、このＣＤ８＋Ｔ細胞の感作はマクロファージを必要とする。しかし、外因的に導入されたｇｐ９６−ペプチド複合体が抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞応答を引き出すプロセスは完全には理解されていない。なぜならば、細胞外抗原をクラスＩ提示機構へ移行させるための立証された経路が存在しないからである。だが、ＨＳＰと会合された細胞外起源の抗原ペプチドは何らかの形でマクロファージにより救出され、内因経路に向けられ、そしてＣＤ８＋リンパ球により認識されるＭＨＣＩ分子により提示されたＣＤ８＋リンパ球により認識される（Ｓｕｔｏ及びＳｒｉｖａｓｔａｖａ， １９９５， 前掲；Ｂｌａｃｈｅｒｅら， １９９７， Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １８６：１３１５−２２）。
【００１８】
抗原提示のための細胞外ペプチドの送達を説明するために、いくつかのモデルが提唱されてきた。一つの提唱は、「直接移行」モデルとして知られており、ＨＳＰシャペロン化ペプチドがＣＤ８＋Ｔリンパ球への提示のためにマクロファージの細胞表面上でＭＨＣＩ分子に移行されるという提唱である。別の提唱は、可溶性の細胞外タンパク質が骨髄由来のマクロファージ及び樹状細胞における構成的マクロピノサイトーシスにより細胞質ゾルに輸送されるというものである（Ｎｏｒｂｕｒｙら， １９９７， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２７：２８０−２８８）。さらに別の提唱された機構は、ＨＳＰがマクロファージのＭＨＣクラスＩ分子により取り込まれ、このことが適切なＴ細胞を刺激するというものである（Ｓｒｉｖａｓｔａｖａら， １９９４， Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ ３９：９３−９８）。その他の研究者らは、細胞外媒体から小胞体の内腔へのペプチドの移動には新規な細胞内輸送経路が関係している可能性があると提唱している（Ｄａｙら， １９９７， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ９４：８０６４−８０６９； Ｎｉｃｃｈｉｔｔａ， １９９８， Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ． １０：１０３−１０９）。さらなる提唱として、（ａ） タンパク質をファゴソームから細胞質ゾルへ移行させる無規定の経路を保有する食細胞の関与；（ｂ） 摂取した物質をリソソーム中で消化し、ペプチドを表面上にのせるためにクラスＩ分子へ逆流させる食細胞の関与がある（Ｂｅｖａｎ， １９９５， Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １８２：６３９−４１）。
【００１９】
このほかにも、細胞外ペプチドを抗原提示のためにＡＰＳの細胞表面に送達する受容体介在経路が提唱されている。免疫感作に必要とされるｇｐ９６シャペロン化抗原ペプチドの量が極めて少量であること（Ｂｌａｃｈｅｒｅら， １９９７， 前掲）、及びｇｐ９６−ペプチド複合体の免疫原性が機能的な抗原提示細胞（ＡＰＣ）に厳格に依存すること（Ｕｄｏｎｏら， １９９４， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ９１：３０７７−３０８１）を考慮して、ＡＰＣはｇｐ９６の受容体をもつと提唱されたことがあった（Ｓｒｉｖａｓｔａｖａら， １９９４， Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ ３９：９３−９８）。最近になって、そのような受容体と合致する予備的な微視的証拠が得られている（Ｂｉｎｄｅｒら， １９９８， Ｃｅｌｌ Ｓｔｒｅｓｓ ＆ Ｃｈａｐｅｒｏｎｅｓ ３ （Ｓｕｐｐ．１）：２．； Ａｒｎｏｌｄ−Ｓｃｈｉｌｄら， １９９９， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １６２：３７５７−３７６０； 及びＷａｓｓｅｎｂｅｒｇら， １９９９， Ｊ． Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ． １：１２）。一つの仮説は、ｇｐ９６の取り込みのためにマンノース受容体が使用されるというものであるが、Ｈｓｐ７０のような非グリコシル化ＨＳＰのための機構は提唱されていない（Ｃｉｕｐｉｔｕら， １９９８， Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ．， １８７：６８５−６９１）。
【００２０】
ＨＳＰが介在するペプチドの抗原提示に関与する特定の分子を同定し特徴づけることは、ＨＳＰ及びＨＳＰ−ペプチド複合体による特異的免疫を誘起させるための、また、新規な診断及び治療方法を開発するための、有用な試薬及び手法を提供するだろう。
【００２１】
文献の引用又は考察は、それが本発明の先行技術であることを容認するものとして解釈されるべきでない。
【００２２】
３． 発明の概要
本発明は、α（２）マクログロブリン（「α２Ｍ」）を含む複合体及び免疫療法におけるそれらの使用のための方法を提供する。本発明は、α２Ｍが、熱ショックタンパク質ｇｐ９６のα２Ｍ受容体への結合と直接的に競合するという出願人らが得た知見に部分的には基づいたものである。この知見は、α２ＭとＨＳＰが、α（２）マクログロブリン受容体上の共通の認識部位に結合する可能性があることを示している。このように、ＨＳＰとα２Ｍとは多くの共通した機能特性（例えば、ペプチドとの結合能、並びに、α（２）マクログロブリン受容体による認識及び取り込み）を有していることから、本出願人らは、α２Ｍを、癌及び感染症に対する免疫療法のための本明細書中に記載した方法において使用できることを見出した。α−２−マクログロブリンは、抗原と複合体を形成することができ、該複合体は、α（２）マクログロブリン受容体（ＬＤＬ（低密度リポタンパク質）受容体関連タンパク質（「ＬＲＰ」）又はＣＤ９１としても知られている）を介して抗原提示細胞（ＡＰＣ）に取り込まれる。このように本発明は、免疫疾患、増殖性疾患及び感染症に対する免疫応答を標的化するための特定のα２Ｍ−抗原分子複合体を使用する方法及びそのための組成物を提供する。
【００２３】
本発明は、抗原分子と非共有結合により会合したα（２）マクログロブリンの複合体、抗原分子と会合したα２Ｍの複合体を発現する組換え細胞、並びに、α２Ｍ−抗原分子複合体を特異的に認識する抗体及び他の分子を包含する。本発明はまた、これらの組成物を免疫疾患、増殖性疾患及び感染症の診断及び治療に使用する方法を提供する。
【００２４】
本明細書中で用いる場合、抗原分子と会合しているα（２）マクログロブリンは、共有結合により又は非共有結合により、抗原分子に結合している。共有結合とは例えばペプチド結合又はチオエステル結合であってよい。すなわち、α（２）マクログロブリンと抗原分子との融合タンパク質は本発明の範囲に属する。
【００２５】
本発明は、感染症若しくは癌の治療又は予防に有効な量の、感染因子の抗原又は癌細胞において同じ細胞型の非癌細胞での発現と比較して過剰発現される抗原の抗原性を示す抗原分子と非共有結合により会合したα（２）マクログロブリンポリペプチドからなる分子複合体、及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を提供する。本明細書中で用いる場合、癌細胞の細胞型とは、胸部、肺、卵巣などの起源となる組織の細胞の種類を指す。ある実施形態では、抗原分子は、ある感染因子の抗原の抗原性を示すものである。別の実施形態では、抗原分子は、癌細胞において同じ細胞型の非癌細胞での発現と比較して過剰発現される抗原の抗原性を示す。他の実施形態では、抗原分子は腫瘍特異的抗原又は腫瘍関連抗原である。他の実施形態では、抗原分子は、癌細胞において同じ細胞型の非癌細胞での発現と比較して過剰発現される抗原の抗原性を示す。
【００２６】
他の実施形態では、抗原分子と非共有結合により会合したα（２）マクログロブリンポリペプチドからなる、感染症若しくは癌の治療又は予防に有効な分子複合体は、精製されたものである。特に、「精製された」分子複合体という用語は、その少なくとも６５％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％又は１００％がα（２）マクログロブリンポリペプチドと抗原分子との非共有結合性の複合体である、複合体集団を指す。他の実施形態では、感染因子の抗原分子又は癌細胞において同じ細胞型の非癌細胞での発現と比較して過剰発現される抗原と会合したα（２）マクログロブリンポリペプチドからなる精製された分子複合体である。
【００２７】
本発明は更にまた、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％又は１００％の分子複合体が、抗原分子と非共有結合により会合したα（２）マクログロブリンである、分子複合体の精製集団を提供する。本発明はまた、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％又は１００％の分子複合体が、抗原分子と非共有結合により会合したα（２）マクログロブリンである、組換え細胞から精製した分子複合体の精製集団を提供する。
【００２８】
本発明はまた、病原体に感染しており、さらに、（ｉ） プロモーターに機能しうる形で連結され、且つ（ｉｉ） α（２）マクログロブリンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を有する核酸によって形質転換された組換え細胞であって、α（２）マクログロブリンポリペプチドが、抗原分子が存在する場合にその抗原分子と会合して、十分量存在すれば該抗原分子に対する免疫応答を誘導することができる複合体を形成するものである、前記組換え細胞を提供する。本発明は、（ｉ） プロモーターに機能しうる形で連結され、且つ（ｉｉ） α（２）マクログロブリンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を有する核酸によって形質転換された組換え癌細胞であって、α（２）マクログロブリンポリペプチドが、抗原分子が存在する場合にその抗原分子と会合して、十分量存在すれば該抗原分子に対する免疫応答を誘導することができる複合体を形成するものである、前記組換え癌細胞を提供する。他の実施形態では、本発明は、（ｉ） 第１のプロモーターに機能しうる形で連結され、且つα（２）マクログロブリンポリペプチドをコードする第１のヌクレオチド配列を有する第１の核酸、及び（ｉｉ） 第２のプロモーターに機能しうる形で連結され、且つ抗原分子をコードする第２のヌクレオチド配列を有する第２の核酸、によって形質転換された組換え細胞であって、該細胞内でα（２）マクログロブリンポリペプチドと抗原分子とが発現されて互いに会合し、十分量存在すれば該抗原分子に対する免疫応答を誘導することができる複合体を形成する、前記組換え細胞を提供する。種々の実施形態では、組換え細胞はヒト細胞である。種々の実施形態では、医薬組成物は組換え細胞と薬学的に許容される担体とを含む。
【００２９】
ある実施形態では、抗原分子と非共有結合により会合したα（２）マクログロブリンポリペプチドの複合体の製造方法であって、下記工程：
（ａ） α（２）マクログロブリンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を有する核酸によって形質転換された細胞を、α（２）マクログロブリンポリペプチドが該細胞により発現されて該細胞の抗原分子と会合するような条件下にて培養する工程、及び
（ｂ） 該抗原分子と非共有結合により会合した該α（２）マクログロブリンポリペプチドの複合体の集団を、該細胞から回収する工程、
を含む、前記方法が提供される。
【００３０】
本発明は更に、感染因子の１以上の抗原に由来する抗原分子と非共有結合により会合したα（２）マクログロブリンポリペプチドの製造方法であって、下記工程：
（ａ） α（２）マクログロブリンポリペプチド又はその断片、類似体若しくは変異体をコードし、且つプロモーターに機能しうる形で連結されたヌクレオチド配列を有する核酸によって形質転換された感染細胞を、α（２）マクログロブリンポリペプチドが該細胞により発現されて該細胞のペプチドと会合するような条件下にて培養する工程、及び
（ｂ） 感染因子に由来するペプチドと非共有結合により会合したα（２）マクログロブリンポリペプチドの複合体の集団を、該細胞から回収する工程、
を含む、前記方法を提供する。ある実施形態では、上記方法は更に上記複合体を精製することを含む。他の実施形態では、上記方法は更にアフィニティークロマトグラフィーにより上記複合体を精製することを含む。
【００３１】
本発明は更に、感染症の感染因子の抗原の抗原性を示す第１の抗原分子と非共有結合により会合したα（２）マクログロブリンポリペプチドからなる免疫原性を示す複合体の１種以上を、免疫原性を示す量で個体に投与することを含む、感染症を有する個体において感染症を治療又は予防する方法を提供する。他の実施形態では、上記方法は更に、上記の免疫原性を示す複合体の投与より前、投与と同時又は投与より後に、感染因子の第２の抗原分子の抗原性を示す第２の抗原分子と非共有結合により会合したα（２）マクログロブリンポリペプチドの第２の複合体を感作量で用いてｉｎ ｖｉｔｒｏで感作した抗原提示細胞を含む組成物を個体に投与することを含む。
【００３２】
本発明は更に、感染症を有する被験体において感染症を治療又は予防する方法であって、下記工程：
（ａ） プロモーターに機能しうる形で連結され、且つα（２）マクログロブリンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を有する核酸によって形質転換された、感染症の感染因子の抗原の抗原性を示す感染細胞を、α（２）マクログロブリンポリペプチドが該感染細胞により発現されて該細胞の抗原分子と会合するような条件下にて培養する工程、
（ｂ） 抗原分子と非共有結合により会合したα（２）マクログロブリンポリペプチドの複合体を該感染細胞から回収する工程、及び
（ｃ） 回収した複合体を、上記感染症を治療又は予防するのに有効な量で被験体に投与する工程、
を含む、前記方法を提供する。ある実施形態では、上記方法は更に、工程（ａ）の前に、被験体から感染細胞を得て、該感染細胞を前記核酸によって形質転換する工程を含む。他の実施形態では、上記方法は更に、上記工程（ａ）の前に、被験体と同じ種類の感染症を有している、その被験体とは別の１以上の個体から感染細胞を得て、該感染細胞を前記核酸によって形質転換する工程を含む。
【００３３】
本発明は更に、感染症を有する被験体において感染症を治療又は予防する方法であって、下記工程：
（ａ） （ｉ） α（２）マクログロブリンポリペプチドをコードする第１の核酸及び（ｉｉ） 感染症の感染因子の抗原の抗原性を示す抗原分子をコードする第２の核酸によって形質転換された組換え細胞を培養する工程、
（ｂ） 該抗原と非共有結合により会合したα（２）マクログロブリンポリペプチドの複合体を回収する工程、並びに
（ｃ） 回収した複合体を、上記感染症を治療又は予防するのに有効な量で被験体に投与する工程、
を含む、前記方法を提供する。種々の実施形態では、上記感染症は、ウイルス、細菌、真菌及び寄生虫からなる群から選択される感染因子により引き起こされる。
【００３４】
本発明はまた、ある種類の癌を有しているか又はある種類の癌の予防が望まれる個体において癌を治療又は予防する方法であって、第１の抗原分子と非共有結合により会合したα（２）マクログロブリンポリペプチドの免疫原性を示す複合体を個体に投与する工程を含み、且つ、
（ａ） 第１の抗原分子が、上記種類の癌又はその転移癌の抗原性を示すものであるか、又は
（ｂ） 該複合体を、α（２）マクログロブリンポリペプチドを組換え的に発現する上記種類の癌細胞又はその転移癌細胞から複合体を回収することによって得る、前記方法を提供する。ある実施形態では、この方法は更に、上記免疫原性を示す複合体の投与より前、投与と同時又は投与より後に、癌細胞において同じ細胞型の非癌細胞での発現と比較して過剰発現される抗原の抗原性を示す第２の抗原分子と非共有結合により会合したα（２）マクログロブリンの第２の複合体を感作量で用いてｉｎ ｖｉｔｒｏで感作した抗原提示細胞を含む組成物を、個体に投与することを含む。他の実施形態では、上記第１の抗原分子は、癌細胞において同じ細胞型の非癌細胞での発現と比較して過剰発現される抗原である。
【００３５】
ある実施形態では、ある種類の癌を有しているか又はある種類の癌の予防が望まれる被験体において癌を治療又は予防する方法であって、下記工程：
（ａ） プロモーターに機能しうる形で連結され、且つα（２）マクログロブリンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を有する核酸によって形質転換された上記種類の癌細胞を、α（２）マクログロブリンポリペプチドが該癌細胞により発現されて該細胞の少なくとも１つの抗原分子と会合するような条件下にて培養する工程、
（ｂ） 少なくとも１つの抗原分子と非共有結合により会合したα（２）マクログロブリンポリペプチドの複合体を該癌細胞から回収する工程、及び
（ｃ） 回収した複合体を、癌を治療又は予防するのに有効な量で被験体に投与する工程、
を含む、前記方法が提供される。ある実施形態では、上記方法は更に、工程（ａ）の前に、被験体から癌細胞を得て、該癌細胞を前記核酸によって形質転換する工程を含む。他の実施形態では、上記方法はさらに、上記工程（ａ）の前に、被験体と同じ種類の癌を有している、被験体とは別の１以上の個体から癌細胞を得て、該癌細胞を前記核酸によって形質転換する工程を含む。
【００３６】
本発明は更に、ある種類の癌を有しているか又はある種類の癌の予防が望まれる被験体において癌を治療又は予防する方法であって、下記工程：
（ａ） （ｉ） α（２）マクログロブリンポリペプチドをコードする第１の核酸及び（ｉｉ） 癌細胞の抗原の抗原性を示す抗原分子をコードする第２の核酸によって形質転換された組換え細胞を培養する工程、
（ｂ） 該抗原と非共有結合により会合したα（２）マクログロブリンポリペプチドの複合体を回収する工程、並びに
（ｃ） 回収した複合体を、癌を治療又は予防するのに有効な量で被験体に投与する工程、
を含む、前記方法を提供する。
【００３７】
本明細書中で用いる「癌の種類」とは、例えば、黒色腫、乳癌、腎臓癌、又はそれらの転移癌を指す。転移癌とは、起源の細胞と同じ種類の癌を指す。種々の実施形態では、癌は、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮腫、骨膜腫、中皮腫、ユーイング肉腫、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、大腸癌、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、脂腺癌、乳頭状癌、乳頭状腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支原生癌、腎細胞癌、ヘパトーム、胆管癌、絨毛癌、セミノーマ、胎生期癌、ウィルムス腫、子宮頸癌、精巣癌、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神経膠腫、星状細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、脳室上衣腫、松果体腫、血管芽腫、聴神経腫、乏突起神経膠腫、髄膜腫、黒色腫、神経芽腫、網膜芽腫、白血病、リンパ腫、多発骨髄腫、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症、及び、Ｈ鎖病からなる群より選択される。
【００３８】
本発明は更にまた、自己免疫疾患の治療が必要な哺乳動物に、α（２）マクログロブリンに特異的な抗体を投与することを含む、自己免疫疾患の治療方法を包含する。ある実施形態では、上記抗体は精製されたものである。
【００３９】
４． 図面の説明
（図面の説明については下記参照）
５． 発明の詳細な説明
本発明は、免疫療法に使用するためのα（２）マクログロブリン（「α２Ｍ」）ワクチンのための組成物及び方法を提供する。本発明は、α２Ｍが抗原提示細胞による熱ショックタンパク質の取込みをブロックするという出願人らが得た知見に部分的に基づくものである。特に、本発明は、抗原分子と会合したα２Ｍの複合体を提供し、該複合体は抗原提示細胞（「ＡＰＣｓ」）上のα（２）マクログロブリン受容体により認識され、このような細胞により免疫系に提示される。このように本発明は、免疫疾患、増殖性疾患、及び感染症に対する免疫応答を標的とするための特異的α２Ｍ−抗原分子複合体を使用するための方法及び組成物を提供する。
【００４０】
ヒト血漿タンパク質α（２）マクログロブリンは、主にプロテイナーゼインヒビター並びに血漿性及び炎症性液性（ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｆｌｕｉｄ）プロテイナーゼスカベンジャー分子として知られている７２０ｋＤａのホモ四量体プロテイナーゼインヒビターである（概説についてはＣｈｕ及びＰｉｚｚｏ， １９９４， Ｌａｂ． Ｉｎｖｅｓｔ． ７１： ７９２を参照されたい）。α２Ｍのタンパク質分解活性の間に、非タンパク質分解性のリガンドが活性化されたチオエステルに共有結合的及び非共有結合的に取り込まれ得る（Ｏｓａｄａら， １９８７， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍ． １４６： ２６−３１； Ｏｓａｄａら， １９８８， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍ． １５０： ８８３−８８９； Ｃｈｕ及びＰｉｚｚｏ， １９９３， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １５０： ４８−５８； Ｃｈｕら， １９９４． １５２：１５３８−１５４５； Ｍｉｔｓｕｄａら， １９９３， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍ． １９１： １３２６−１３３１を参照されたい）。本明細書に記載するように、α２Ｍと癌細胞抗原又は病原体の抗原性を有する抗原分子との間で、複合体が形成されると、かかるα２Ｍ−抗原分子複合体は、α２Ｍが組み込まれた抗原に対して向けられる細胞傷害性Ｔ細胞の応答を刺激するのに使用できる。かかる複合体を免疫療法剤として使用して癌及び感染症を治療することが可能である。
【００４１】
かかる治療用のα２Ｍ−抗原分子複合体の製造及び送達に使用するための方法及び組成物を以下に詳細に記載する。本発明は、抗原分子と会合したα（２）マクログロブリンの複合体、α２Ｍを発現する抗原性の細胞、並びにα２Ｍ−抗原分子複合体を特異的に認識する抗体及び他の分子を包含する。本発明はまた、免疫疾患、増殖性疾患及び感染症の診断及び治療においてこれら組成物を使用するための方法に関する。
【００４２】
５．１ 本発明の組成物
本発明は、増殖性疾患、感染症及び免疫疾患に対する免疫療法に使用できる組成物を提供する。かかる組成物には、α２Ｍ複合体を特異的に認識する抗体、α２Ｍ複合体を発現する単離された抗原性の細胞、並びに、組換えα２Ｍ及び抗原分子をコードする配列を含む組換え細胞が含まれる。
【００４３】
本明細書中で使用する場合、α２Ｍの定義には、α２Ｍと、少なくとも３５％〜５５％、好ましくは５５％〜７５％、最も好ましくは７５％〜８５％のアミノ酸同一性を有する、他のポリペプチド断片、類似体及びα２Ｍの変異体が包含され、それは抗原分子と複合体を形成することが可能であり、該複合体は、抗原提示細胞に取り込まれて、該抗原分子に対する免疫応答を誘導することができることが意図される。２つの配列の間の同一性％の決定はまた、数学的アルゴリズムを用いて行なうことができる。２つの配列の比較に用いるための数学的アルゴリズムの好ましい、非限定的な例は、Ｋａｒｌｉｎ及びＡｌｔｓｃｈｕｌ， １９９３， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９０：５８７３−５８７７のように改変した、Ｋａｒｌｉｎ及びＡｌｔｓｃｈｕｌ， １９９０， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８７：２２６４−２２６８のアルゴリズムである。かかるアルゴリズムを、Ａｌｔｓｃｈｕｌら， １９９０， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２１５：４０３−４１０のＮＢＬＡＳＴ及びＸＢＬＡＳＴプログラムに組み込む。ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索は、本発明の核酸分子と相同のヌクレオチド配列を得るために、ＮＢＬＡＳＴプログラム（スコア（ｓｃｏｒｅ） ＝ １００， ワード長（ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ） ＝ １２）を用いて行なうことができる。ＢＬＡＳＴタンパク質検索は、本発明のタンパク質分子と相同のアミノ酸配列を得るために、ＸＢＬＡＳＴプログラム（スコア ＝ ５０， ワード長 ＝ ３）を用いて行なうことができる。比較のためにギャップ付きアライメントを得るには、Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴをＡｌｔｓｃｈｕｌら， １９９７， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２５：３３８９−３４０２に記載のように使用することができる。あるいは、ＰＳＩ−Ｂｌａｓｔを用いて、分子間の距離関係（ｄｉｓｔａｎｔ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ）を検出する反復検索を行なうこともできる（Ａｌｔｓｃｈｕｌら， １９９７， 前掲）。ＢＬＡＳＴ、Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴ及びＰＳＩ−Ｂｌａｓｔプログラムを利用する場合は、各プログラム（例えばＸＢＬＡＳＴ及びＮＢＬＡＳＴ）のデフォルトパラメーター（ｄｅｆａｕｌｔ ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ）を用いることができる（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）。配列の比較に利用する数学的アルゴリズムの、他の好ましい、非限定的な例は、Ｍｙｅｒｓ及びＭｉｌｌｅｒ， １９８８， ＣＡＢＩＯＳ ４：１１−１７のアルゴリズムである。このようなアルゴリズムは、ＧＣＧ配列アライメントソフトウェアパッケージの一部であるＡＬＩＧＮプログラム（ｖｅｒｓｉｏｎ ２．０）に組み込まれている。アミノ酸配列の比較のためにＡＬＩＧＮプログラムを利用する場合は、ＰＡＭ１２０ウェイトレジデューテーブル（ｗｅｉｇｈｔ ｒｅｓｉｄｕｅ ｔａｂｌｅ）、１２のギャップ長ペナルティ（ｇａｐ ｌｅｎｇｔｈ ｐｅｎａｌｔｙ）及び４のギャップペナルティを用いることができる。
【００４４】
本発明の免疫原性α２Ｍ−抗原分子複合体は、α２Ｍと、哺乳動物において免疫応答を誘導することができる抗原ペプチドとからなる任意の複合体を含みうる。
【００４５】
α２Ｍ及び／又は抗原分子は、天然の起源から精製でき、化学的に合成することもでき、又は組換えにより産生することもできる。
【００４６】
５．１．１ α２Ｍポリペプチド
本発明のα（２）マクログロブリン複合体は、抗原ペプチドと会合したα（２）マクログロブリンポリペプチドから成る。α（２）マクログロブリンポリペプチドは、組換えＤＮＡ技術、合成方法又は天然のα２Ｍポリペプチドの酵素的若しくは化学的な切断により産生してもよい。本明細書には、このようなα２Ｍポリペプチドの産生方法を記載する。
【００４７】
５．１．１．１ α２Ｍ遺伝子配列の単離
様々な態様では、本発明はα２Ｍ、並びにその断片、誘導体、類似体及び変異体のアミノ酸配列を含む組成物に関する。α２Ｍをコードする核酸、並びに、かかる核酸に相補的な核酸及びハイブリダイズ可能な核酸が提供される。
【００４８】
任意の真核細胞が、α２Ｍ遺伝子のコード領域を得るための核酸供給源として利用できる。α２Ｍをコードする核酸配列は、脊椎動物、哺乳動物並びにヒトを含む霊長類から単離できる。
【００４９】
天然のα２Ｍポリペプチドのアミノ酸配列及び核酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋなどの配列データベースにおいて一般的に入手できる。本発明のα２Ｍポリペプチドの調製に使用できるα２Ｍ配列の非限定的な例は、次のようなものである： Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号Ｍ１１３１３、Ｐ０１０２３、ＡＡＡ５１５５１；Ｋａｎら， １９８５， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ８２：２２８２−２２８６。遺伝コードの縮重により、本明細書中において用いる用語「α２Ｍ遺伝子」は、天然のヌクレオチド配列を指すだけでなく、α２Ｍポリペプチドをコードする他の全ての縮重ＤＮＡ配列を包含する。Ｅｎｔｒｅｚなどのコンピュータープログラムを用いてデータベースを閲覧することができ、目的のあらゆるアミノ酸配列データ及び遺伝子配列データを登録番号により検索することができる。これらのデータベースはまた、アライメントスコア及び統計値により類似の配列を分類する、ＦＡＳＴＡ及びＢＬＡＳＴのようなプログラムを用いてクエリー（ｑｕｅｒｙ）配列に対して様々な程度の類似性を有する配列を同定するために検索することもできる。ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索は、本発明の核酸分子と相同のヌクレオチド配列を得るために、ＮＢＬＡＳＴプログラム（スコア ＝ １００， ワード長 ＝ １２）を用いて行なうことができる。ＢＬＡＳＴタンパク質検索は、本発明のタンパク質分子と相同のアミノ酸配列を得るために、ＸＢＬＡＳＴプログラム（スコア ＝ ５０， ワード長 ＝ ３）を用いて行なうことができる。比較のためにギャップ付きアライメントを得るには、Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴをＡｌｔｓｃｈｕｌら， １９９７， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２５：３３８９−３４０２に記載のように使用することができる。あるいは、ＰＳＩ−Ｂｌａｓｔを用いて、分子間の距離関係を検出する反復検索を行なうこともできる（Ａｌｔｓｃｈｕｌら， １９９７， 前掲）。ＢＬＡＳＴ、Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴ及びＰＳＩ−Ｂｌａｓｔプログラムを利用する場合は、各プログラム（例えばＸＢＬＡＳＴ及びＮＢＬＡＳＴ）のデフォルトパラメーターを用いることができる（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖを参照されたい）。
【００５０】
該ＤＮＡは、当該技術分野で既知の標準的な方法を用いてＤＮＡ増幅を行うことによって得ることができ、又はある組織、細胞培養物、若しくはクローニングされたＤＮＡ（例えば、ＤＮＡ「ライブラリー」）から直接的に分子クローニングを行うことによって得ることができる。ゲノムＤＮＡ由来のクローンはコード領域の他に調節領域及びイントロンＤＮＡ領域を含んでいる可能性がある；ｃＤＮＡ由来のクローンはエキソン配列のみを含んでいることとなる。起源がどうであれ、α２Ｍ遺伝子は、遺伝子の増殖のためには適切なベクター中にクローニングされなければならない。
【００５１】
好ましい実施形態では、関連する又は相同なα２Ｍの既知の配列から設計したプライマーを用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によりゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡからＤＮＡを増幅できる。ＰＣＲを用いて、選択の前にＤＮＡクローン又はゲノムＤＮＡ若しくはｃＤＮＡライブラリーにおける所望の配列を増幅する。ＰＣＲは、例えばサーマルサイクラー及びＴａｑポリメラーゼ（商標名ＧＥＮＥ ＡＭＰで市販）を用いて行なうことができる。増幅するＤＮＡには任意の種からのｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡが含まれ得る。関連するＨＳＰの既知の核酸配列を示すオリゴヌクレオチドプライマーがＰＣＲでのプライマーとして使用できる。好ましい態様において、オリゴヌクレオチドプライマーは、異なる種のα２Ｍ遺伝子の間で高度に保存されたα２Ｍ遺伝子の少なくとも一部分を示す。ＰＣＲ反応に使用するために、幾つかの異なる縮重プライマーを合成することを選択してもよい。ＰＣＲ反応を開始するのに用いるハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーを変化させて、既知のα２Ｍヌクレオチド配列と単離した核酸相同体との間のヌクレオチド配列類似性の程度をより高くする又はより低くすることを可能にすることもできる。異種間でのハイブリダイゼーションには、低いストリンジェンシー条件が好ましい。同種間でのハイブリダイゼーションには適度にストリンジェントな条件が好ましい。首尾よく増幅を行なった後に、α２Ｍをコードする配列をクローニングして配列決定することができる。増幅するα２Ｍ遺伝子のコード領域の大きさが単一のＰＣＲで増幅するには大きすぎる場合は、好ましくは重複した領域を伴った、遺伝子全体にわたる複数のＰＣＲを行ない、該ＰＣＲの産物を互いに連結して全体をコードする配列を形成することができる。あるいは、α２Ｍ遺伝子のあるセグメントを増幅する場合には、該セグメントをクローニングして完全なｃＤＮＡ又はゲノムクローンを単離するためのプローブとして利用することができる。
【００５２】
別の実施形態では、ゲノムＤＮＡからのα２Ｍ遺伝子の分子クローニングのために、ＤＮＡ断片を生成してゲノムライブラリーを形成する。関連するα２Ｍをコードする配列のうちの幾つかは入手し精製して標識化することができるので、ゲノムＤＮＡライブラリー中のクローニングされたＤＮＡ断片を、標識化プローブへの核酸ハイブリダイゼーションによりスクリーニングできる（Ｂｅｎｔｏｎ及びＤａｖｉｓ， １９７７， Ｓｃｉｅｎｃｅ １９６：１８０； Ｇｒｕｎｓｔｅｉｎ及びＨｏｇｎｅｓｓ， １９７５， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ７２：３９６１）。該プローブと実質的な相同性を有するこれらのＤＮＡ断片はハイブリダイズすることとなろう。制限酵素消化、及び、既知の制限酵素地図が入手できるのであればそれから予想される断片サイズとの比較により、適当な断片を同定することもまた可能である。
【００５３】
α２ＭゲノムＤＮＡを単離することに替わる方法としては、限定されるものではないが、既知の配列から遺伝子配列自体を化学的に合成すること、又は、α２ＭをコードするｍＲＮＡに対するｃＤＮＡを作製することが挙げられる。例えば、α２Ｍ遺伝子のｃＤＮＡクローニングのためのＲＮＡはα２Ｍを発現する細胞から単離できる。ｃＤＮＡライブラリーを当該技術分野で既知の方法により作製して、ゲノムＤＮＡライブラリーをスクリーニングするために開示されている方法などの方法によりスクリーニングすることができる。α２Ｍに対する抗体が入手できるのであれば、α２Ｍは、α２Ｍ合成クローンである可能性の有るものへの標識化抗体の結合により同定することができる。
【００５４】
α２Ｍをコードするヌクレオチド配列のクローニングのための他の特定の実施形態を以下に示す（これは例であって限定するためのものではない）：
ある特定の実施形態では、あるファミリーに属するα２Ｍタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、低〜中程度のストリンジェンシーの条件下においてα２Ｍをコードするヌクレオチド配列を含むプローブとハイブリダイゼーションすることにより同定し且つ得ることができる。
【００５５】
例示のためであって限定するものではないが、ストリンジェンシーが低い条件を用いる手順は次の通りである（またＳｈｉｌｏ及びＷｅｉｎｂｅｒｇ， １９８１， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７８：６７８９−６７９２を参照されたい）。ＤＮＡを含むフィルターを、３５％ホルムアミド、５Ｘ ＳＳＣ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ （ｐＨ ７．５）、５ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１％ ＰＶＰ、０．１％ Ｆｉｃｏｌｌ、１％ ＢＳＡ、５００μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡを含む溶液中に６時間４０℃にて前処理する。ハイブリダイゼーションを、次の改変を加えた同じ溶液中で行なう：０．０２％ ＰＶＰ、０．０２％ Ｆｉｃｏｌｌ、０．２％ ＢＳＡ、１００μｇ／ｍｌ サケ精子ＤＮＡ、１０％（重量／容積）硫酸デキストラン、及び、５〜２０ Ｘ １０６ ｃｐｍ ３２Ｐ−標識化プローブを用いる。フィルターを１８〜２０時間、４０℃にてハイブリダイゼーション混合物中でインキュベートし、次いで、１．５時間５５℃にて、２Ｘ ＳＳＣ、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ （ｐＨ７．４）、５ｍＭ ＥＤＴＡ及び０．１％ ＳＤＳを含有する溶液中で洗浄する。洗浄液を新鮮な溶液と入れ替え、更に１．５時間６０℃にてインキュベートする。フィルターを水気を取り乾燥させ （ｂｌｏｔｔｅｄ ｄｒｙ）、 オートラジオグラフィーのために露光させた。必要であれば、フィルターを３回目については６５〜６８℃にて洗浄し、フィルムに再露光した。使用しうる、他のストリンジェンシーの低い条件（例えば異種間ハイブリダイゼーションについて使用する場合）が当該技術分野において周知である。
【００５６】
あるα２Ｍ遺伝子断片を適当なクローニングベクターに挿入して宿主細胞に導入し、遺伝子配列の多数のコピーが生成されるようにすることができる。限定されるものではないが、バクテリオファージ（例えばλ誘導体）、又は、プラスミド（例えばｐＢＲ３２２若しくはｐＵＣプラスミド誘導体又はＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））のような当該技術分野において既知の数多くのベクター−宿主系を用いることができる。
【００５７】
発現されるペプチド配列にアミノ酸の置換を引き起こす目的で、又は、以後の操作が容易になるように制限部位を作製／欠失するために、当該技術分野において既知の突然変異誘発のためのあらゆる技術を用いて、ＤＮＡ配列における個々のヌクレオチドを改変することができる。かかる技術には、限定するものではないが、化学的突然変異誘発、ｉｎ ｖｉｔｒｏ部位特異的突然変異誘発（Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎら， １９７８， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ ２５３：６５５１）、オリゴヌクレオチド指向性突然変異誘発（Ｓｍｉｔｈ， １９８５， Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｇｅｎｅｔ． １９：４２３−４６３； Ｈｉｌｌら， １９８７， Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． １５５：５５８−５６８）、ＰＣＲに基づくオーバーラップ伸長（Ｈｏら， １９８９， Ｇｅｎｅ ７７：５１−５９）、ＰＣＲに基づくメガプライマー突然変異誘発（Ｓａｒｋａｒら， １９９０， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ， ８：４０４−４０７）などが含まれる。改変は、二本鎖ジデオキシＤＮＡ配列決定により確認することができる。
【００５８】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、目的の遺伝子又は遺伝子断片を得るために一般に用いられている。例えば、所望する任意の長さのα２Ｍポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を、α２Ｍ又はそのペプチド結合ドメインをコードするヌクレオチド配列に隣接するＰＣＲプライマーを用いて生成することができる。或いは、α２Ｍ遺伝子配列を、そのような部位が利用可能である場合は制限エンドヌクレアーゼを用いて適当な部位で切断して、α２Ｍ又はそのペプチド結合ドメインをコードするＤＮＡの断片を放出することができる。都合のよい制限部位が利用可能でない場合は、当該技術分野において既知の部位特異的突然変異誘発法及び／又はＤＮＡ増幅法により適当な位置にそのような部位を作製することができる（例えば、Ｓｈａｎｋａｒａｐｐａら， １９９２， ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄ Ａｐｐｌ． １：２７７−２７８を参照されたい）。次に、α２Ｍ又はそのペプチド結合ドメインをコードするＤＮＡ断片を単離し、正常な翻訳リーディングフレームが維持されることが確実であることに注意しながら適当な発現ベクターに連結する。
【００５９】
本発明のα（２）マクログロブリンポリペプチドは、発現される細胞からの回収及び精製が容易になるように融合タンパク質として発現させることができる。例えば、α２Ｍポリペプチドが、培養培地中に分泌されるように、それがＥＲ膜を横切って輸送を指令するシグナル配列リーダーペプチドを含んでいてもよい。更には、α２Ｍポリペプチドは、α２Ｍポリペプチドの、抗原ペプチドの結合に関与しない任意の位置（例えば、カルボキシル末端等）に融合されたアフィニティーラベルなどのアフィニティーラベルを含んでいてもよい。アフィニティーラベルを用いて、アフィニティーパートナー分子に結合することによりタンパク質の精製を容易にすることができる。
【００６０】
このような融合タンパク質の種々の産生方法が当該技術分野において周知である。それらの産生をもたらす操作は、遺伝子又はタンパク質のレベルで、好ましくは遺伝子のレベルで行なうことができる。例えば、α２Ｍポリペプチドのクローニングされたコード領域を、当該技術分野において既知の多くの組換えＤＮＡ法のうちのいずれかにより改変することができる（Ｓａｍｂｒｏｏｋら， １９９０， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， 第２版， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ； Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋの第８章の Ａｕｓｕｂｅｌら）。置換、欠失、挿入又はそれらの任意の組合わせを導入又は組合わせてα２Ｍポリペプチドをコードする最終的なヌクレオチド配列を得ることは、以後の議論から明らかであろう。
【００６１】
種々の実施形態では、組換えＤＮＡ技術を用いてα２Ｍポリペプチドを含む融合タンパク質を作製することができる。例えば、α２Ｍポリペプチドがペプチドでタグ付けされた融合タンパク質として発現されるように、アフィニティーラベルの配列を含むベクター内に適切なリーディングフレームでα２Ｍ遺伝子断片を導入することにより、α２Ｍポリペプチドをコードする組換え遺伝子を構築することができる。特定の結合パートナーに認識され得るアフィニティーラベルが、α２Ｍポリペプチドのアフィニティー精製のために使用できる。
【００６２】
好ましい実施形態では、アフィニティーラベルはα２Ｍのアミノ末端〜カルボキシル末端にて融合される。カルボキシル末端において融合が起こる正確な部位は重要ではない。最適な部位は、日常的な実験により決定できる。
【００６３】
当該技術分野において既知の種々のアフィニティーラベルを使用することができ、例えば、限定されるものではないが、免疫ブロブリン定常領域、ポリヒスチジン配列（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌ． ２， Ａｕｓｕｂｅｌら編， Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈ． Ａｓｓｏｃ． ＆ Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ中の、Ｐｅｔｔｙ， １９９６， Ｍｅｔａｌ−ｃｈｅｌａｔｅ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ；Ｓｍｉｔｈ， １９９３， Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏ． ４：２２０−２２９）、大腸菌マルトース結合タンパク質（Ｇｕａｎら， １９８７， Ｇｅｎｅ ６７：２１−３０）、及び種々のセルロース結合ドメイン（米国特許第５，４９６，９３４号；第５，２０２，２４７号；第５，１３７，８１９号；Ｔｏｍｍｅら， １９９４， Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ． ７：１１７−１２３）などが挙げられる。例えば緑色蛍光タンパク質の一部分などの他のアフィニティーラベルにより、α２Ｍポリペプチドに蛍光特性を付与できる。他の可能性のあるアフィニティーラベルは、モノクローナル抗体が利用可能である短いアミノ酸配列であり、例えば限定されるものではないが、以下の周知の例、すなわちＦＬＡＧエピトープ、アミノ酸４０８−４３９でのｍｙｃエピトープ、インフルエンザウイルスヘマグルチニン（ＨＡ）エピトープなどが挙げられる。他のアフィニティーラベルは特異的な結合パートナーにより認識され、従って、固体支持体上に固定化され得る結合パートナーへのアフィニティー結合により単離が容易となる。いくつかのアフィニティーラベルは、α２Ｍポリペプチドに新しい構造上の特性、例えば多量体を形成する能力をもたらすことができる。結合したペプチドによるα２Ｍポリペプチドの二量体化は、抗原提示の過程でα２Ｍポリペプチドとそのパートナーとの間の相互作用の結合力を上昇させることができる。これらのアフィニティーラベルは、一般的には通常はホモポリマーとして存在するタンパク質から導かれる。ＣＤ８の細胞外ドメイン（Ｓｈｉｎｕｅら， １９８８， Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １６８：１９９３−２００５）もしくはＣＤ２８（Ｌｅｅら， １９９０． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １４５：３４４−３５２）、又は鎖間のジスルフィド結合のための部位を含む免疫グロブリン分子の一部分のようなアフィニティーラベルにより、多量体が形成され得る。当業者であれば理解されるように、限定されないが、ＤＮＡクローニング、ＤＮＡ増幅、及び合成方法を含む多くの方法を用いて、上記アフィニティーラベルのコード領域を得ることができる。アフィニティーラベル並びにその検出及び単離のための試薬には市販されているものがある。
【００６４】
好ましいアフィニティーラベルは、免疫グロブリン分子の非可変部分である。典型的には、かかる部分は少なくとも、免疫グロブリン重鎖の定常領域の機能的に働くＣＨ２及びＣＨ３ドメインを含む。融合はまた、定常ドメインのＦｃ部分のカルボキシル末端、又は重鎖若しくは軽鎖のＣ１に対してすぐ接するアミノ末端の領域を用いて行なう。好適な免疫グロブリンに基づくアフィニティーラベルは、ＩｇＧ−１、−２、−３若しくは−４サブタイプ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤ又はＩｇＭから得ることができるが、好ましくはＩｇＧ１からである。α２Ｍポリペプチドをヒトに対してｉｎ ｖｉｖｏで使用することを意図するのであれば、好ましくは、ヒト免疫グロブリンを使用する。免疫グロブリン軽鎖又は重鎖定常領域をコードする多くのＤＮＡが、知られているか、又はｃＤＮＡライブラリーから容易に入手可能である。例えば、Ａｄａｍｓら， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， １９８０， １９：２７１１−２７１９； Ｇｏｕｇｈら， １９８０， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， １９：２７０２−２７１０； Ｄｏｌｂｙら， １９８０， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ．， ７７：６０２７−６０３１； Ｒｉｃｅら， １９８２， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ．， ７９：７８６２−７８６５； Ｆａｌｋｎｅｒら， １９８２， Ｎａｔｕｒｅ， ２９８：２８６−２８８； 及びＭｏｒｒｉｓｏｎら， １９８４， Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ， ２：２３９−２５６を参照されたい。免疫グロブリンの検出に関しては、多くの免疫学的試薬及びラベル系が利用可能であるので、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、免疫沈降、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）等を使用するなど当該技術分野において既知の種々の免疫学的技術により、α２Ｍポリペプチド−Ｉｇ融合タンパク質は容易に検出及び定量することができる。同様に、アフィニティーラベルが容易に入手できる抗体に対するエピトープである場合は、かかる試薬を使用し、上記の技術を用いて、アフィニティーラベルを含むα２Ｍポリペプチドを検出、定量及び単離することができる。多くの例において、α２Ｍポリペプチドに特異的な抗体を作製する必要はない。
【００６５】
特に好ましい実施形態は、α２Ｍポリペプチドの、ヒト免疫グロブリンＧ−１（ＩｇＧ−１；Ｂｏｗｅｎら， １９９６， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５６：４４２−４９を参照されたい）のヒンジ、ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインへの融合体である。このヒンジ領域は、通常はＩｇ分子中の他のシステインとのジスルフィド結合に関与する３つのシステイン残基を含む。当該システインはいずれもペプチドがタグとして機能するためには必要ではないので、これらのシステイン残基のうちの１つ以上が、例えばセリンのような他のアミノ酸残基により任意に置換されていてもよい。
【００６６】
当該技術分野において既知の種々のリーダー配列は、細菌細胞及び哺乳動物細胞からα２Ｍポリペプチドを効率的に分泌させるために使用することができる（ｖｏｎ Ｈｅｉｊｎｅ， １９８５， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １８４：９９−１０５）。リーダーペプチドは、対象とする宿主細胞に基づいて選択され、細菌、酵母、ウイルス、動物及び哺乳動物の配列を含んでいてもよい。例えば、ヘルペスウイルス糖タンパク質Ｄリーダーペプチドが種々の哺乳動物細胞に使用するのに好適である。哺乳動物細胞に使用するための好ましいリーダーペプチドは、マウス免疫グロブリンκ鎖のＶ−Ｊ２−Ｃ領域から得ることができる（Ｂｅｒｎａｒｄら， １９８１， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ７８：５８１２−５８１６）。細菌細胞においてα２Ｍポリペプチド発現を標的化するための好ましいリーダー配列には、大腸菌タンパク質ＯｍｐＡ（Ｈｏｂｏｍら， １９９５， Ｄｅｖ． Ｂｉｏｌ． Ｓｔａｎｄ． ８４：２５５−２６２）、Ｐｈｏ Ａ（Ｏｋａら， １９８５， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ８２：７２１２−１６）、ＯｍｐＴ（Ｊｏｈｎｓｏｎら， １９９６， Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ７：１０４−１１３）、ＬａｍＢ及びＯｍｐＦ（Ｈｏｆｆｍａｎ及びＷｒｉｇｈｔ， １９８５， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８２：５１０７−５１１１）、β−ラクタマーゼ（Ｋａｄｏｎａｇａら， １９８４， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２５９：２１４９−５４）、エンテロトキシン（Ｍｏｒｉｏｋａ−Ｆｕｊｉｍｏｔｏら， １９９１， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６６：１７２８−３２）及びスタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）プロテインＡ（Ａｂｒａｈｍｓｅｎら， １９８６， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １４：７４８７−７５００）及びＢ． サブチリス（Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ）エンドグルカナーゼ（Ｌｏら， Ａｐｐｌ． Ｅｎｖｉｒｏｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ５４：２２８７−２２９２）並びに人工及び合成シグナル配列（ＭａｃＩｎｔｙｒｅら， １９９０， Ｍｏｌ． Ｇｅｎ． Ｇｅｎｅｔ． ２２１：４６６−７４； Ｋａｉｓｅｒら， １９８７， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２３５：３１２−３１７）が含まれるがこれらには限らない。
【００６７】
ライブラリーから容易に得ることができる、合成により生産することができる、又は業者から入手することができる所望のアフィニティーラベル又はリーダーペプチドをコードするＤＮＡ配列は、本発明の実施のために好適である。かかる方法は当該技術分野において周知である。
【００６８】
５．１．１．２ 組換え発現
本発明の種々の実施形態では、α２Ｍポリペプチドをコードする配列を、組換え細胞において増殖及び発現するための発現ベクターに挿入する。
【００６９】
発現構築物とは、本明細書中で使用する場合、適切な宿主細胞中でのα２Ｍポリペプチドの発現を可能にする１以上の調節領域と機能的に関連付けられたα２Ｍポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を指す。「機能的に関連付けられた」とは、調節領域と発現されるα２Ｍポリペプチド配列とが、転写及び最終的には翻訳が可能なように連結され且つ位置付けられている関係を指す。
【００７０】
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に基づいたベクターは最も一般的であり、外来性タンパク質の高レベルでの発現に多目的に使用できる系である（Ｍａｋｒｉｄｅｓ， １９９６， Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｒｅｖ．， ６０：５１２−５３８）。大腸菌中での発現に用いることのできる調節領域の非限定的な例としては、ｌａｃ、ｔｒｐ、ｌｐｐ、ｐｈｏＡ、ｒｅｃＡ、ｔａｃ、λＰＬ、並びにファージＴ３及びＴ７プロモーターが挙げられうるが、これらに限定されない（Ｍａｋｒｉｄｅｓ， １９９６， Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｒｅｖ．， ６０：５１２−５３８）。原核生物発現ベクターの非限定的な例としては、λｇｔ１１などのλｇｔベクター系列（Ｈｕｙｎｈら， １９８４， 「ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ」， Ｖｏｌ．Ｉ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ （Ｄ． Ｇｌｏｖｅｒ編）， ｐｐ．４９−７８， ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ， Ｏｘｆｏｒｄ）及びｐＥＴベクター系列（Ｓｔｕｄｉｅｒら， １９９０， Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．， １８５：６０−８９）が挙げられうる。しかし原核生物の宿主−ベクター系の潜在的な欠点は、哺乳動物で行われるような翻訳後プロセシング事象の多くを行うことができないことである。従って、真核生物の宿主−ベクター系が好ましく、哺乳動物の宿主−ベクター系がより好ましく、ヒト宿主−ベクター系が最も好ましい。
【００７１】
α２Ｍポリペプチドの転写に必要な調節領域は、その発現ベクターにより提供することができる。翻訳開始コドン（ＡＴＧ）も、開始コドンを欠いたα２Ｍポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を発現させるために提供することができる。適合しうる宿主−構築物系においては、転写に必要な細胞性タンパク質、例えばＲＮＡポリメラーゼ及び転写因子などは、宿主生物中でα２Ｍポリペプチド配列の転写が行えるように、発現構築物上の調節領域に結合するだろう。遺伝子の発現に必要とされる調節領域の正確な性質は宿主細胞の種類毎に異なりうる。一般的には、ＲＮＡポリメラーゼと結合することのできるプロモーターは、機能的に関連付けられた核酸配列の転写を開始するために必要とされる。そのような調節領域としては、転写及び翻訳の開始に関与する５’非コード配列、例えばＴＡＴＡボックス、キャップ部位、ＣＡＡＴボックス、及び類似のものなどが挙げられうる。コード配列の３’側の非コード配列には転写終結調節配列、例えばターミネーター及びポリアデニル化部位が含まれうる。
【００７２】
α２Ｍポリペプチドの発現には、構成的及び誘導性の双方の調節領域を用いることができる。組換え細胞の増殖に最適な条件とα２Ｍポリペプチドの高レベルでの発現のための条件が異なる場合には誘導性プロモーターを用いることが望ましいであろう。有用な調節領域の例は下記の次の節に示す。
【００７３】
哺乳動物宿主細胞中でのα２Ｍポリペプチドの発現には、種々の調節領域を用いることができ、そのようなものとしては例えば、ＳＶ４０初期及び後期プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）前初期プロモーター、及びラウス肉腫ウイルスの長い末端反復配列（ＲＳＶ−ＬＴＲ）プロモーターが挙げられる。哺乳動物細胞で有用と考えられる誘導性プロモーターとしては、限定はされないが、メタロチオネインＩＩ遺伝子、マウス乳癌ウイルスグルココルチコイド応答性の長い末端反復配列（ＭＭＴＶ−ＬＴＲ）、β−インターフェロン遺伝子、及びα２Ｍ７０遺伝子と結合しているものが挙げられる（Ｗｉｌｌｉａｍｓら， １９８９， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ４９：２７３５−４２； Ｔａｙｌｏｒら， １９９０， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．， １０：１６５−７５）。
【００７４】
下記の動物の調節領域、それらは組織特異性を示しトランスジェニック動物で用いられてきたものであるが、そのような領域も特定の組織タイプの腫瘍細胞中で用いることができる：膵臓の腺房細胞で活性のあるエラスターゼＩ遺伝子制御領域（Ｓｗｉｆｔら， １９８４， Ｃｅｌｌ ３８：６３９−６４６； Ｏｒｎｉｔｚら， １９８６． Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｓｙｍｐ． Ｑｕａｎｔ． Ｂｉｏｌ． ５０：３９９−４０９； ＭａｃＤｏｎａｌｄ， １９８７， Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ７：４２５−５１５）； 膵臓のβ細胞で活性のあるインスリン遺伝子制御領域（Ｈａｎａｈａｎ， １９８５， Ｎａｔｕｒｅ ３１５：１１５−１２２）；リンパ系細胞で活性のある免疫グロブリン遺伝子制御領域（Ｇｒｏｓｓｃｈｅｄｌら， １９８４， Ｃｅｌｌ ３８：６４７−６５８； Ａｄａｍｅｓら， １９８５， Ｎａｔｕｒｅ ３１８：５３３−５３８； Ａｌｅｘａｎｄｅｒら， １９８７， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． ７：１４３６−１４４４）；精巣、乳房、リンパ系及びマスト細胞中で活性のあるマウス乳癌ウイルス制御領域（Ｌｅｄｅｒら， １９８６， Ｃｅｌｌ ４５：４８５−４９５）；肝臓中で活性のあるアルブミン遺伝子制御領域（Ｐｉｎｋｅｒｔら， １９８７， Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌ． １：２６８−２７６）；肝臓中で活性のあるα−フェトプロテイン遺伝子制御領域（Ｋｒｕｍｌａｕｆら， １９８５． Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． ５：１６３９−１６４８； Ｈａｍｍｅｒら， １９８７， Ｓｃｉｅｎｃｃ ２３５：５３−５８）；肝臓中で活性のあるα１−アンチトリプシン遺伝子制御領域（Ｋｅｌｓｅｙら， １９８７， Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌ． １：１６１−１７１）；骨髄細胞中で活性のあるβ−グロビン遺伝子制御領域（Ｍｏｇｒａｍら， １９８５， Ｎａｔｕｒｅ ３１５：３３８−３４０； Ｋｏｌｌｉａｓら， １９８６， Ｃｅｌｌ ４６：８９−９４）；脳の希突起神経膠細胞中で活性のあるミエリン塩基性タンパク質遺伝子制御領域（Ｒｅａｄｈｅａｄら， １９８７， Ｃｅｌｌ ４８：７０３−７１２）；骨格筋中で活性のあるミオシン軽鎖−２遺伝子制御領域（Ｓａｎｉ， １９８５， Ｎａｔｕｒｅ ３１４：２８３−２８６）；及び視床下部で活性のある性腺刺激ホルモン放出ホルモン遺伝子制御領域（Ｍａｓｏｎら， １９８６， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３４：１３７２−１３７８）。
【００７５】
宿主細胞内でのα２Ｍポリペプチドの発現効率は、ＳＶ４０ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、サイトメガロウイルス、免疫グロブリン遺伝子、メタロチオネイン、β−アクチン内に見出されるものなどの適切な転写エンハンサーエレメントを発現ベクター中に含ませることによって増強することができる（Ｂｉｔｔｎｅｒら， １９８７， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ． １５３：５１６−５４４； Ｇｏｒｍａｎ， １９９０， Ｃｕｒｒ． Ｏｐ． ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １：３６−４７を参照されたい）。
【００７６】
発現ベクターはまた、２つ以上のタイプの宿主細胞でのベクターの維持と複製を可能にする、又はそのベクターを宿主の染色体中に組み入れることを可能にする配列をも含むことができる。そのような配列としては、限定はされないが、複製起点、自律複製配列（ＡＲＳ）、セントロメアＤＮＡ、及びテロメアＤＮＡが挙げられうる。また、少なくとも２つのタイプの宿主細胞中で複製し維持されうるシャトルベクターを用いることも有利でありうる。
【００７７】
さらに、発現ベクターは、α２ＭポリペプチドをコードするＤＮＡを含んでいる宿主細胞を最初に単離若しくは同定するための選択可能若しくはスクリーニング可能なマーカー遺伝子を含むことができる。α２Ｍポリペプチド−抗原分子複合体の長期にわたる高収率の産生のためには、哺乳動物細胞における安定した発現が好ましい。哺乳動物細胞では多数の選択系を用いることができ、そのようなものとしては、限定はされないが、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（Ｗｉｇｌｅｒら， １９７７， Ｃｅｌｌ １１：２２３）、ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＳｚｙｂａｌｓｋｉとＳｚｙｂａｌｓｋｉ， １９６２， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ４８：２０２６）、及びアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｌｏｗｙら， １９８０， Ｃｅｌｌ ２２：８１７）の遺伝子をそれぞれｔｋ−、ｈｇｐｒｔ−、若しくはａｐｒｔ−細胞中で用いることができる。また、代謝拮抗物質耐性も次のものの選択の基礎として用いることができる：ジヒドロ葉酸還元酵素（ｄｈｆｒ）、この酵素はメトトレキセートに対する耐性を付与する（Ｗｉｇｌｅｒら， １９８０， Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７７：３５６７； Ｏ’Ｈａｒｅら， １９８１， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７８：１５２７）；ｇｐｔ、これはミコフェノール酸への耐性を付与する（ＭｕｌｌｉｇａｎとＢｅｒｇ， １９８１， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７８：２０７２）；ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｎｅｏ）、これはアミノグリコシドＧ−４１８に対する耐性を付与する（Ｃｏｌｂｅｒｒｅ−Ｇａｒａｐｉｎら， １９８１， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １５０：１）；及びハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｈｙｇ）、これはハイグロマイシンに対する耐性を付与する（Ｓａｎｔｅｒｒｅら， １９８４， Ｇｅｎｅ ３０：１４７）。他の選択マーカー、例えば、限定はされないが、ヒスチジノール及びＺｅｏｃｉｎ（商標名）も用いることができる。
【００７８】
α２ＭポリペプチドＤＮＡ配列をベクターのクローニング部位に挿入するために、調節機能を有するＤＮＡ配列、例えばプロモーターなどを、α２Ｍポリペプチド−結合領域をコードするＤＮＡ配列に結合しなければならない。これを行うためには、当該技術分野で周知の技術を用いて、適切な適合する制限酵素切断部位を提供するリンカー若しくはアダプターを、α２ＭポリペプチドをコードするｃＤＮＡ若しくは合成ＤＮＡの末端に連結することができる（Ｗｕら， １９８７， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ． １５２：３４３−３４９）。制限酵素を用いた切断を行った後、連結前に、一本鎖のＤＮＡ末端を消化するか、又は埋めること（ｆｉｌｌｉｎｇ ｉｎ）することによって平滑末端が作製されるように改変することができる。あるいはまた、所望の制限酵素切断部位は、所望の制限酵素切断部位を含んでいるプライマーを用いたＰＣＲの使用によってそのＤＮＡを増幅させて、ＤＮＡの断片中に導入することができる。
【００７９】
調節領域と機能的に関連付けられたα２Ｍポリペプチド配列を含んでなる発現構築物を、それ以上クローニングすることなく、α２Ｍポリペプチド−抗原分子複合体の発現及び産生のための適切な宿主細胞中に直接的に導入することができる（例えば、米国特許第５，５８０，８５９号を参照）。発現構築物にはまた、α２Ｍポリペプチド配列の宿主細胞ゲノム中への組み込み（例えば相同組換えによる）を容易にするＤＮＡ配列を含ませることができる。この場合には、宿主細胞中でのα２Ｍポリペプチドの増殖と発現のために、適切な宿主細胞に適した複製起点を含む発現ベクターを用いる必要がない。
【００８０】
α２Ｍポリペプチドをコードするクローニングされたヌクレオチド配列を含んでいる発現構築物を、当該技術分野で既知の種々の技術によって宿主細胞内に導入することができ、そのような技術としては、限定されないが、原核細胞には細菌の形質転換（Ｈａｎａｈａｎ， １９８５， ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ， １：１０９−１３６中）、及び真核細胞にはリン酸カルシウム介在トランスフェクション（Ｗｉｇｌｅｒら， １９７７， Ｃｅｌｌ １１：２２３−２３２）、リポソーム介在トランスフェクション（Ｓｃｈａｅｆｅｒ−Ｒｉｄｄｅｒら， １９８２， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２１５：１６６−１６８）、エレクトロポレーション（Ｗｏｌｆｆら， １９８７， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８４：３３４４）、及びマイクロインジェクション（Ｃａｐｐｅｃｈｉ， １９８０， Ｃｅｌｌ ２２：４７９−４８８）が挙げられる。同じ宿主細胞内でのα２Ｍポリペプチドと抗原分子との共発現は実質的に同じ方法により達成できる。
【００８１】
適切にプロセシングされたα２Ｍポリペプチド又はα２Ｍポリペプチド−抗原分子複合体の長期にわたる高収率の産生には、哺乳動物細胞中での安定な発現が好ましい。α２Ｍポリペプチド又はα２Ｍポリペプチド−抗原分子複合体を安定に発現する細胞系は選択マーカーを含有するベクターを用いて操作することができる。限定としてではなく例示としては、発現構築物の導入後、操作された細胞を１〜２日間、富化培地中で増殖させ、次いで選択培地に換える。発現構築物中の選択マーカーは、その選択に対する耐性を付与し、最適な形としては細胞が安定にその発現構築物を染色体中に組み込み、培養下で増殖して細胞系へと拡大することを可能にする。そのような細胞は長期間培養することができ、一方α２Ｍポリペプチドは連続的に発現される。
【００８２】
その組換え細胞は、温度、インキュベーション時間、吸光度、及び培地組成の標準的な条件下で培養することができる。あるいはまた、組換え抗原性細胞は、癌細胞若しくは感染細胞の必要とする栄養素要求性及び生理学的要求性に匹敵する条件下で培養することができる。しかし、組換え細胞の増殖条件はα２Ｍポリペプチド及び抗原タンパク質の発現のための条件とは異なることがある。またα２Ｍ−抗原分子複合体の産生を増強するために、改変された培養条件及び培地を用いてもよい。α２Ｍポリペプチド又はα２Ｍポリペプチド−抗原分子複合体を産生するための最適な条件を確立するために、当該技術分野において既知の任意の技術を適用してもよい。
【００８３】
５．１．１．３ 組換えα２Ｍポリペプチドの精製方法
一般的に本発明のα２Ｍポリペプチドは組換え細胞培養物から、硫酸アンモニウム沈澱、酸抽出、陰イオン又は陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、イムノアフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー及びレクチンクロマトグラフィーを含む既知の方法により回収及び精製することができる。
【００８４】
本発明は、α２Ｍポリペプチド上に存在するアフィニティーラベルの特性に基づいた、アフィニティー精製による組換えα２Ｍポリペプチドの精製のための方法を提供する。１つのアプローチは、あるタグとその結合パートナーとの特異的分子相互作用に基づいている。もう一つのアプローチは、抗体の、タグ上に存在するエピトープへの免疫特異的結合に依存している。当該技術分野において周知のアフィニティークロマトグラフィーの原理は一般的にこれらのアプローチの両方に適用可能である。
【００８５】
以下に記載するのは、あるタグとその結合パートナーとの特異的分子相互作用に基づく幾つかの方法である。
【００８６】
免疫グロブリンの定常領域に融合している組換えα２Ｍを精製するのに一般的に適用できる方法はプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーである。この技術は当該技術分野において周知のものである。スタフィロコッカスプロテインＡは、重鎖免疫グロブリンの第２定常領域と第３定常領域との間に位置する領域に特異的に結合する４２ｋＤのポリペプチドである。ヒトＦｃ領域に対するプロテインＡの親和性は強いが、免疫グロブリンの異なるクラス、サブクラス及び種のＦｃドメインのために、他の種に対しては異なるかもしれない。好ましくないサブクラスとしてはヒトＩｇＧ−３及び大部分のラットサブクラスが挙げられる。特定のサブクラスに対しては、プロテインＧ（ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ）由来）が、プロテインＡの替わりに精製に使用することができる。プロテインＡセファロース（Ｐｈａｒｍａｃｉａ又はＢｉｏｒａｄ）は、一般的に使われる抗体のアフィニティー精製のための固相であり、本質的に同じ方法により、免疫グロブリンＦｃフラグメントに融合したα２Ｍポリペプチドの精製に使用することができる。細胞上清に存在する分泌されたα２Ｍポリペプチドは、固相上のプロテインＡに特異的に結合する。一方で、混入物は洗い流される。結合したα２Ｍポリペプチドは当該技術分野で既知の種々の緩衝液系（ｐＨを徐々に低下する、クエン酸緩衝液、酢酸緩衝液及びグリシン−ＨＣｌ緩衝液の連続を含む）により溶出することができる。この方法は、組換え細胞がα２Ｍポリペプチドともに同時精製される抗体をも産生する場合は、好ましくない。例えば、Ｌａｎｇｏｎｅ， １９８２， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ｍｅｔｈ． ５１：３； Ｗｉｌｃｈｅｋら， １９８２， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｉｎｔｌ． ４：６２９； Ｓｊｏｂｒｉｎｇら， １９９１， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６：３９９； Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｈａｒｌｏｗ及びＬａｎｅ編， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， １９８８中の６１７−６１８ページを参照されたい。
【００８７】
あるいは、ポリヒスチジンタグを使用することもできる。この場合はα２Ｍポリペプチドは金属キレートクロマトグラフィーにより精製できる。通常は６個のヒスチジン配列であるポリヒスチジンタグは、ニトリロトリ酢酸マトリックスのような固相に固定化することができるニッケルイオン（Ｎｉ２＋）などの二価金属イオンに対して高い親和性を有している。ポリヒスチジンはＮｉ２＋−ＮＴＡ−アガロースに対してよく特性付けされている親和性を有しており、２つの温和な処理（イミダゾール（０．１〜０．２Ｍ）が結合部位に対して樹脂と効果的に競合するだろう；又は、ｐＨを６．０のすぐ下に下げることでヒスチジン側鎖がプロトン化され結合が破壊されるだろう）のいずれかにより溶出することが可能である。該精製方法は、Ｎｉ２＋−ＮＴＡ−アガロースカラムに細胞培養物の上清をローディングし、混入物を洗い流し、α２Ｍポリペプチドをイミダゾール又は弱酸を用いて溶出させることを含む。Ｎｉ２＋−ＮＴＡ−アガロースはＳｉｇｍａ （Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ）及びＱｉａｇｅｎのような供給元から入手可能である。ポリヒスチジンタグを認識する抗体もまた入手でき、α２Ｍポリペプチドを検出し定量するために用いることができる。
【００８８】
使用できる他のアフィニティーラベルの例は、元来は寄生虫日本住血吸虫（Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ ｊａｐｏｎｉｃｕｍ）からクローニングされたものであるグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）配列である。一般的に、大腸菌などの原核宿主細胞中で発現されたα２Ｍ−ＧＳＴ融合体は、グルタチオンアガロースビーズにより吸着し、次に中性ｐＨにおいて遊離の還元型グルタチオンの存在下にて溶出させることによって、細胞培養物上清から精製できる。精製中のどの段階においても変性条件は必要でないので、従って固定化α２Ｍポリペプチドを抗原ペプチドとともにローディングするのに使用するためには望ましいだろう。さらにまた、ＧＳＴは特定の条件下において二量体を形成することが知られているので、二量体α２Ｍポリペプチドを得ることができる。Ｓｍｉｔｈ， １９９３， Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏ． ４：２２０−２２９を参照されたい。
【００８９】
使用可能な他の有用なアフィニティーラベルは、ｍａｌＥ遺伝子によりコードされる大腸菌のマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）である。細胞上清中に存在する分泌されたα２Ｍポリペプチド−ＭＢＰはアミロース樹脂に結合する。一方で混入物は洗い流される。結合したα２Ｍポリペプチド−ＭＢＰは、マルトースによりアミロース樹脂から溶出される。例えば、Ｇｕａｎら， １９８７， Ｇｅｎｅ ６７：２１−３０を参照されたい。
【００９０】
α２Ｍポリペプチドを精製する第二のアプローチは、それに対するポリクロナール抗体又はモノクローナル抗体が利用可能なエピトープを含むアフィニティーラベルに対して適用できる。イムノアフィニティークロマトグラフィー及び免疫沈降のような免疫特異的結合による、当該技術分野において知られたタンパク質の精製の種々の方法を使用することができる。例えば、「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」， １９８８， Ｈａｒｌｏｗ及びＬａｎｅ（編）， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｎ．Ｙ．中の第１３章、並びに、「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」， １９９１， Ｃｏｌｉｇａｎら（編）， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ中の第８章、第Ｉ節及び第ＩＩ節を参照されたい。これらの開示内容はともに参照により本明細書に組み入れられる。
【００９１】
上記の実施形態は、本発明のα２Ｍポリペプチドを発現するヒト細胞等の哺乳動物細胞の細胞培養培地から、α２Ｍポリペプチド−抗原分子複合体を回収し精製するために使用することができる。該方法を適合して、α２Ｍポリペプチド及び／又はα２Ｍ−抗原分子複合体の中規模精製及び大規模精製を行うことができる。ｐＨを下げること又は変性条件を必要としない方法は、α２Ｍポリペプチド−抗原分子複合体の精製のためには最も好ましい。該方法を用いて、真核細胞（例えば癌細胞、組織、単離された細胞、又はある細胞内病原体に感染した不死化真核細胞系又は病原体に感染した被験者から得た細胞）からα２Ｍポリペプチドを単離することができる。
【００９２】
５．１．１．４ 宿主−ベクター系
ここでは、α２Ｍポリペプチドの発現のために使用できるベクター及び宿主細胞の系を記載する。プラスミド、コスミド、ファージ、ファージミド又は改変されたウイルスを含むがこれらに限らない種々の発現ベクターを本発明に用いることができる。典型的にはかかる発現ベクターは、適切な宿主細胞内で該ベクターが増殖するための機能的な複製起点、α２Ｍポリペプチド遺伝子配列の挿入のための１以上の制限エンドヌクレアーゼ部位、及び、１以上の選択マーカーを含む。発現ベクターは、細菌、酵母、昆虫、哺乳動物及びヒトを含むがこれらには限らない原核生物又は真核生物に由来する適合する宿主細胞と共に用いなければならない。
【００９３】
発現構築物及びベクターをα２Ｍポリペプチドを産生させる目的で宿主細胞に導入する。ｉｎ ｖｉｔｒｏで培養されたもの又は遺伝的に操作されたものを含む、α２Ｍを産生することができ且つ発現ベクターと適合する任意の細胞型を使用することができる。宿主細胞は、健常なヒト、癌患者及び感染症を有する患者を含む正常な又は罹病した被験者、私的な実験用保管物、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ等の公的な培養物コレクション、又は商業的な供給元から入手することができる。
【００９４】
様々な宿主細胞が、翻訳後プロセシング及びタンパク質の改変のための特徴的で特異的な機構を有する。発現された遺伝子産物を、受容者がα２Ｍをプロセシングするのと類似の特定の様式で改変しかつプロセシングする宿主細胞を選択することができる。大量のα２Ｍを産生するためには、本発明に使用する宿主細胞の種類は異種遺伝子の発現のために使用されており、且つ、合理的に十分に特性付けられており、大規模な生産工程のために開発されたものであることが好ましい。ある特定の実施形態では、宿主細胞は、α２Ｍポリペプチド−抗原分子複合体又はα２Ｍポリペプチド−抗原分子複合体を発現する細胞を投与しようとする同じ患者に由来するものである。あるいは、α２Ｍポリペプチドを発現するのに使用し、続いて被験者に免疫療法を投与するのに使用する細胞は、該被験者にとって自己由来のものである。
【００９５】
好ましい哺乳動物の宿主細胞には、ＳＶ４０により形質転換されたサル腎細胞系（ＣＯＳ−７， ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５１）；ヒト胚腎細胞系（２９３， ２９３−ＥＢＮＡ又は懸濁培地中で増殖のためにサブクローニングした２９３細胞、Ｇｒａｈａｍら， Ｊ． Ｇｅｎ． Ｖｉｒｏｌ．， ３６：５９， １９７７）；ベビーハムスター腎細胞（ＢＨＫ， ＡＴＣＣ ＣＣＬ １０）；チャイニーズハムスター卵巣細胞−ＤＨＦＲ（ＣＨＯ， Ｕｒｌａｕｂ及びＣｈａｓｉｎ． Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ７７；４２１６， １９８０）；マウスセルトリ細胞（Ｍａｔｈｅｒ， Ｂｉｏｌ． Ｒｅｐｒｏｄ． ２３：２４３−２５１， １９８０）；マウス繊維芽細胞（ＮＩＨ−３Ｔ３）、サル腎細胞（ＣＶＩ ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７０）；アフリカミドリザル腎細胞（ＶＥＲＯ−７６， ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１５８７）；ヒト子宮頸癌細胞（ＨＥＬＡ， ＡＴＣＣ ＣＣＬ ２）；イヌ腎細胞（ＭＤＣＫ， ＡＴＣＣ ＣＣＬ ３４）；バッファローラット肝細胞（ＢＲＬ ３Ａ， ＡＴＣＣ ＣＲＬ １４４２）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８， ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７５）；ヒト肝細胞（Ｈｅｐ Ｇ２， ＨＢ ８０６５）；及びマウス乳癌細胞（ＭＭＴ ０６０５６２， ＡＴＣＣ ＣＣＬ ５１）等のヒト、サル及び齧歯類に由来する細胞が含まれるがこれらには限らない（例えば、「Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｆｒｅｅｍａｎ ＆ Ｃｏ． １９９０ 中の Ｋｒｉｅｇｌｅｒ Ｍ． を参照されたい）。（α２Ｍポリペプチド−抗原分子複合体を産生する）組換え細胞の癌ワクチンとしての有用性を示すのに使用される癌細胞型の例としては次のものが挙げられる：マウス繊維芽細胞系、ＮＩＨ３Ｔ３、マウスルイス肺癌細胞系、ＬＬＣ、マウス肥満細胞腫細胞系、Ｐ８１５、マウスリンパ腫細胞系、ＥＬ４及びそのオボアルブミントランスフェクタント、Ｅ．Ｇ７、マウス黒色腫細胞系、Ｂ１６Ｆ１０、マウス線維肉腫細胞系、ＭＣ５７、及びヒト小細胞肺癌細胞系、ＳＣＬＣ＃２並びにＳＣＬＣ＃７。
【００９６】
多くのウイルスに基づく発現系もまた、α２Ｍポリペプチドを産生するために、哺乳動物細胞と共に利用できる。ＤＮＡウイルスのバックボーンを利用するベクターは、シミアンウイルス４０ （ＳＶ４０）（Ｈａｍｅｒら， １９７９， Ｃｅｌｌ １７：７２５）、アデノウイルス（Ｖａｎ Ｄｏｒｅｎら， １９８４， Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ４：１６５３）、アデノ随伴ウイルス（ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎら， １９８８， Ｊ Ｖｉｒｏｌ ６２：１９６３）、及びウシパピローマウイルス（Ｚｉｎｎら， １９８２， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ７９：４８９７）に由来する。アデノウイルスが発現ベクターとして利用される場合は、供与ＤＮＡ配列をアデノウイルス転写／翻訳制御領域（例えば後期プロモーター及び３つに別れた（ｔｒｉｐａｒｔｉｔｅ）リーダー配列）に連結することができる。次にこのキメラ遺伝子をｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎ ｖｉｖｏ組換えによりアデノウイルスゲノム中に挿入することができる。ウイルスゲノムの非必須領域（例えば、領域Ｅ１又はＥ３）へ挿入すればその結果として、感染宿主内で生存することができ且つ異種産物を発現することができる組換えウイルスが得られるだろう（例えばＬｏｇａｎ及びＳｈｅｎｋ， １９８４， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． （ＵＳＡ） ８１：３６５５−３６５９を参照されたい）。
【００９７】
ウシパピローマウイルス（ＢＰＶ）は、ヒトを含む多くの高等脊椎動物に感染することができ、そしてそのＤＮＡはエピソームとして複製する。安定で、多コピー型の（２０〜３００コピー／細胞）染色体外エレメントとして哺乳動物細胞中に存在する多くのシャトルベクターが、組換え遺伝子発現のために開発されている。典型的には、これらのベクターは、ＢＰＶ ＤＮＡ（全ゲノム又は６９％形質転換断片）のあるセグメント、広範な宿主範囲を有するプロモーター、ポリアデニル化シグナル、スプライスシグナル、選択マーカー、及び該ベクターが大腸菌内で増殖することを可能にする「無毒の」プラスミド配列を含む。細菌内での構築及び増殖の後に、該発現遺伝子構築物を、例えばリン酸カルシウム共沈又はエレクトロポレーションの技術により、培養した哺乳動物細胞内へトランスフェクトする。形質転換された表現型を表さないこれらの宿主細胞については、形質転換体の選択はヒスチジノール及びＧ４１８耐性のような優性選択マーカーを用いて行われる。例えばｐＢＣＭＧＳＮｅｏ及びｐＢＣＭＧＨｉｓのようなＢＰＶベクターを用いて、α２Ｍポリペプチド配列を発現することができる（Ｋａｒａｓｕｙａｍａら， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １８：９７−１０４； Ｏｈｅら， Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ， ６：３２５−３３）。該ベクターは続いてα２Ｍポリペプチドの発現のために広範な細胞型内にトランスフェクトすることができる。
【００９８】
あるいは、ワクシニア７．５Ｋプロモーターを使用することもできる（例えば、Ｍａｃｋｅｔｔら， １９８２， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． （ＵＳＡ） ７９：７４１５−７４１９； Ｍａｃｋｅｔｔら， １９８４， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ４９：８５７−８６４； Ｐａｎｉｃａｌｉら， １９８２， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． （ＵＳＡ） ７９：４９２７−４９３１を参照されたい）。ヒト宿主細胞を使用する場合は、エプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）起点（ＯｒｉＰ）及びＥＢＶ核抗原１（ＥＢＮＡ−１；トランス作用複製因子）に基づくベクターを使用することができる。かかるベクターは広範なヒト宿主細胞に使用できる（例えば、ＥＢＯ−ｐＣＤ （Ｓｐｉｃｋｏｆｓｋｙら， １９９０， ＤＮＡ Ｐｒｏｔ Ｅｎｇ Ｔｅｃｈ ２：１４−１８）、ｐＤＲ２及びλＤＲ２（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから入手可能））。
【００９９】
α２Ｍポリペプチドはまた、レトロウイルスに基づく発現系を用いて作製することもできる。トランスフェクションとは対照的に、レトロウイルスは、例えば主な造血細胞を含む広範な細胞型に効率的に感染して遺伝子を導入することができる。モロニーマウス白血病ウイルスのようなレトロウイルスでは、ウイルス遺伝子配列の大部分を取り除き、α２Ｍをコードする核酸配列で置換することができる。この際、失われたウイルスの機能はトランスにより （ｉｎ ｔｒａｎｓ） 供給することができる。レトロウイルスベクターで感染する宿主の範囲はまた、ベクターパッケージングに用いるエンベロープの選択により操作することができる。
【０１００】
例えば、あるレトロウイルスベクターは、５’ 長い末端反復配列（ＬＴＲ）、３’ ＬＴＲ、パッケージングシグナル、細菌の複製起点及び選択マーカーを含むことができる。α２ＭポリペプチドＤＮＡは５’ ＬＴＲと３’ ＬＴＲとの間の位置に挿入されて、５’ ＬＴＲプロモーターからの転写によりクローニングされたＤＮＡが転写されるようになる。５’ ＬＴＲは、ＬＴＲプロモーターを含むがこれには限らないプロモーター、Ｒ領域、Ｕ５領域及びプライマー結合部位をこの順で含む。これらのＬＴＲエレメントのヌクレオチド配列は当該技術分野において周知である。また異種プロモーター並びに複数の薬剤選択マーカーを、感染細胞の選択を容易にするために発現ベクターに含めることもできる（ＭｃＬａｕｃｈｌｉｎら， １９９０， Ｐｒｏｇ． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ． 及び Ｍｏｌｅｃ． Ｂｉｏｌ． ３８：９１−１３５；Ｍｏｒｇｅｎｓｔｅｒｎら， １９９０， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ． １８：３５８７−３５９６；Ｃｈｏｕｌｉｋａら， １９９６， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ ７０：１７９２−１７９８；Ｂｏｅｓｅｎら， １９９４， Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ ６：２９１−３０２；Ｓａｌｍｏｎｓ及びＧｕｎｚｂｅｒｇ， １９９３， Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ４：１２９−１４１；及びＧｒｏｓｓｍａｎ及びＷｉｌｓｏｎ， １９９３， Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌ． ３：１１０−１１４を参照のこと）。
【０１０１】
他の有用な真核宿主−ベクター系には酵母及び昆虫系が含まれ得る。酵母では、構成的又は誘導性プロモーターを含む多くのベクターを、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）（パン酵母）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）（分裂酵母）、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）、及びハンゼヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）（メチロトローフ酵母（ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｉｃ ｙｅａｓｔｓ））とともに使用することができる。概説としては、「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」， Ｖｏｌ． ２， １９８８， Ａｕｓｕｂｅｌら（編）， Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈ． Ａｓｓｏｃ． ＆ Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ， 第１３章； 「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ」， Ｗｕ及びＧｒｏｓｓｍａｎ（編）， Ａｃａｄ． Ｐｒｅｓｓ， Ｎ．Ｙ．， Ｖｏｌ． １５３， ｐｐ． ５１６−５４４中のＧｒａｎｔら， １９８７， Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｙｅａｓｔ， １９８７；Ｇｌｏｖｅｒ， １９８６， ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ｖｏｌ． ＩＩ， ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ， Ｗａｓｈ．， Ｄ．Ｃ．， 第３章；及び「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ」， Ｂｅｒｇｅｒ及びＫｉｍｍｅｌ（編）， Ａｃａｄ． Ｐｒｅｓｓ， Ｎ．Ｙ．， Ｖｏｌ． １５２， ｐｐ． ６７３−６８４中のＢｉｔｔｅｒ， １９８７， Ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ Ｙｅａｓｔ；及び「Ｔｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｙｅａｓｔ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ」， １９８２， Ｓｔｒａｔｈｅｒｎら（編）， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ， Ｖｏｌ． Ｉ及びＩＩを参照されたい。
【０１０２】
昆虫系においては、バキュロウイルスであるオートグラファ・カルフォルニカ（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）核多角体病ウイルス（ＡｃＮＰＶ）をベクターとして用いてヨトウガ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）細胞中でα２Ｍポリペプチドを発現させることができる。α２ＭポリペプチドＤＮＡは該ウイルスの非必須領域（例えばポリヘドリン遺伝子）内にクローニングして、ＡｃＮＰＶプロモーター（例えばポリヘドリンプロモーター）の制御下に配置してもよい。続いてこれらの組換えウイルスを用いて挿入されたＤＮＡが発現される宿主細胞を感染させる（例えば、Ｓｍｉｔｈら， １９８３， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ４６：５８４；Ｓｍｉｔｈ， 米国特許第４，２１５，０５１号を参照されたい）。
【０１０３】
本明細書中に記載するクローニングベクター及び発現ベクターのいずれも、当該技術分野で周知の技術により既知のＤＮＡ配列から合成し組み立てることができる。調節領域及びエンハンサーエレメントは、天然及び合成のどちらであってもよい種々の起源のものとすることができる。ベクター及び宿主細胞には市販されているものもある。有用なベクターの非限定的な例は、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， １９８８， Ａｕｓｕｂｅｌら編， Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈ． Ａｓｓｏｃ． ＆ Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅの補遺５（これは参照により本明細書中に組み入れる）；並びにＣｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｉｎｃ．， 及びＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｉｎｃのような業者のカタログに記載されている。
【０１０４】
５．１．１．５ 合成による生産
α２Ｍを生産するための、組換え技術に代わる方法にはペプチド合成がある。例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏにてペプチドと結合する基質−結合ドメインを含むα２Ｍの一部分に対応するペプチドは、ペプチド合成機を用いて合成することができる。従来のペプチド合成法又は当該技術分野にて周知のその他の合成プロトコールを用いることができる。
【０１０５】
さらに、α２Ｍポリペプチドの類似体及び誘導体は化学的に合成することができる。さらに、所望により、非古典的アミノ酸若しくは化学的アミノ酸類似体をα２Ｍ配列中に置換若しくは付加するものとして導入することができる。非古典的アミノ酸としては、限定はされないが、通常のアミノ酸のＤ−異性体、α−アミノイソ酪酸、４−アミノ酪酸、Ａｂｕ、２−アミノ酪酸、γ−Ａｂｕ、ε−Ａｈｘ、６−アミノヘキサン酸、Ａｉｂ、２−アミノイソ酪酸、３−アミノプロピオン酸、オルニチン、ノルロイシン、ノルバリン、ヒドロキシプロリン、サルコシン、シトルリン、システイン酸、ｔ−ブチルグリシン、ｔ−ブチルアラニン、フェニルグリシン、シクロヘキシルアラニン、β−アラニン、フルオロ−アミノ酸、デザイナー（ｄｅｓｉｇｎｅｒ）アミノ酸、例えばβ−メチルアミノ酸、Ｃα−メチルアミノ酸、Ｎα−メチルアミノ酸、及び一般にアミノ酸類似体とされるものが挙げられる。
【０１０６】
α２Ｍアミノ酸配列を有するペプチド、又はその断片、類似体、突然変異体、若しくは誘導体は、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ， １９６３， Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ．， ８５：２１４９に述べられている方法と類似の方法を用いて固相ペプチド合成で合成することができる。合成の際に、保護された側鎖を有するＮ−α−保護アミノ酸を、Ｃ末端で不溶性のポリマー支持体（例えばポリスチレンビーズ）に連結された、伸長しつつあるポリペプチド鎖に段階的に添加する。ペプチドは、Ｎ−α−脱保護アミノ酸のアミノ基を、Ｎ−α−保護アミノ酸をジシクロヘキシルカルボジイミドなどの試薬と反応させて活性化させたそのα−カルボキシル基と連結させることによって合成される。活性化されたカルボキシル基へ遊離アミノ基が結合することによってペプチド結合が形成される。最も一般的に用いられるＮ−α−保護基には、酸に対して不安定なＢｏｃ、及び塩基に対して不安定なＦｍｏｃが含まれる。適切な化学反応法、樹脂、保護基、保護アミノ酸、及び試薬についての詳細は当該技術分野において周知であり、本明細書中では詳述しない（Ａｔｈｅｒｔｏｎら、１９８９， Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ， ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ、及びＢｏｄａｎｓｚｋｙ， １９９３， Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｔｅｘｔｂｏｏｋ， 第２版， Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇを参照）。
【０１０７】
この結果得られたα２Ｍポリペプチドの精製は、従来法、例えばゲル浸透、分配及び／若しくはイオン交換クロマトグラフィーを用いた分取ＨＰＬＣなどを用いて行われる。適切なマトリックス及びバッファーの選択は当該技術分野で周知であり、本明細書では詳述しない。
【０１０８】
５．２ α２Ｍポリペプチドを含む抗原複合体
５．２．１ α２Ｍポリペプチドと抗原分子との細胞内複合体の単離
ここでは、本発明のα２Ｍポリペプチド又はα２Ｍポリペプチド−抗原分子複合体を組換え細胞から精製するための方法、及び、当該技術分野において既知の僅かな改変を有する、細胞培養物からのα２Ｍポリペプチド又はα２Ｍ−抗原分子複合体の精製方法を記載する。組換え細胞には、例えば、抗原分子を発現する細胞及びα２Ｍポリペプチドを組換えにより発現する細胞が含まれる。かかる細胞は、感染因子（ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ａｇｅｎｔ）に感染した細胞及び癌細胞を含むがこれらに限られない種々の起源に由来するものであってよい。
【０１０９】
本発明は、α２Ｍポリペプチド上に存在するアフィニティーラベルの特性に基づくアフィニティー精製による組換えα２Ｍポリペプチド−抗原分子複合体の精製方法を提供する。１つのアプローチはタグとその結合パートナーとの間の特異的分子相互作用に基づいている。もう一つのアプローチは、抗体の、タグ上に存在するエピトープへの免疫特異的結合に依存している。当該技術分野において周知のアフィニティークロマトグラフィーの原理は一般的にこれらのアプローチの両方に適用可能である。
【０１１０】
α２Ｍポリペプチド−抗原分子複合体を産生するために、α２Ｍポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を細胞内に導入することができる。ある抗原分子が細胞内に存在する場合は、α２Ｍポリペプチドは細胞内で該抗原分子と会合し、α２Ｍポリペプチドと抗原分子との間の共有結合による又は非共有結合による複合体を形成することができる。α２Ｍポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を導入することができる細胞としては、上皮細胞、内皮細胞、ケラチノサイト、線維芽細胞、筋細胞、肝細胞；Ｔリンパ球、Ｂリンパ球、単球、マクロファージ、好中球、好酸球、巨核球、顆粒球等の血液細胞；種々の幹細胞又は前駆細胞、特に、例えば骨髄、臍帯血、末梢血、胎児肝等から得た造血幹細胞又は前駆細胞が挙げられるがこれらには限らない。細胞型の選択は、治療又は予防する腫瘍又は感染症の種類に依存し、当業者により決定され得る。ある特定の実施形態では、α２Ｍポリペプチドをコードする核酸配列を含む発現構築物を抗原性の細胞に導入する。本明細書中で用いる場合、抗原性の細胞には、感染因子又は病原体に感染した細胞、非感染性の形態又は非病原性の形態の感染因子又は病原体に（例えばヘルパー感染因子の使用により）感染した細胞、弱毒化された形態の感染因子又は病原体の非病原性の変異体若しくは複製ができない変異体に感染した細胞又はそれらを発現するように操作された細胞、癌の原因となる感染因子（例えばウイルス）に感染しているものの未だ新生物性ではない前新生物性細胞；あるいは、突然変異原若しくは癌原因物質（例えばＤＮＡ損傷性物質、放射線など）に曝された抗原性の細胞が含まれうる。使用できる他の細胞は前新生物性細胞であって、形態、生理学的機能又は生化学的機能によって特性付けられるような正常の形態から新生物性の形態への移行の途上にあるものである。好ましくは本発明の方法に使用する癌細胞及び前新生物性細胞は哺乳動物起源のものである。本発明のこの態様から考えられる哺乳動物には、ヒト、伴侶動物（例えばイヌ及びネコ）、家畜動物（例えばヒツジ、ウシ、ヤギ、ブタ及びウマ）、実験動物（例えばマウス、ラット及びウサギ）、及び捕獲した又は自由な野生動物が含まれる。
【０１１１】
種々の実施形態では、任意の癌細胞、好ましくはヒト癌細胞を、α２Ｍポリペプチド−抗原分子複合体を産生するための本発明の方法に使用することができる。癌細胞は、発現されたα２Ｍポリペプチドと共有結合により又は非共有結合により会合する抗原ペプチドを提供する。次に、α２Ｍポリペプチド−抗原分子複合体を該細胞から精製してかかる癌を治療するために使用する。本発明の方法で調製される免疫原性組成物により治療又は予防しうる癌には、肉腫及び癌腫のような腫瘍が含まれるがこれらには限らない。本発明の方法により影響を受ける癌の例を第５．６節に列記する。このように、前新生物性の病変、癌（複数の離れた部位に転移した癌を含む）から単離した任意の組織又は細胞は本発明の方法に使用することができる。例えば、充実性組織のみならず、異常に増殖している組織に見られる細胞、循環する白血病細胞、転移性の病変を使用することができる。
【０１１２】
他の実施形態では、前新生物性病変、癌組織又は癌細胞に由来する細胞系もまた、該細胞系の細胞が標的癌細胞上の抗原と共通する少なくとも１以上の抗原決定基を有している限り、使用することができる。癌組織、癌細胞、癌原因物質に感染した細胞、他の前新生物性細胞、及びヒト起源の細胞系が好ましい。
【０１１３】
癌細胞及び前新生物性細胞は当該技術分野において既知の任意の方法により同定できる。例えば、癌細胞は、形態、酵素アッセイ、増殖アッセイ、細胞質遺伝学的特性付け、ＤＮＡマッピング、ＤＮＡ配列決定、癌原因ウイルスの存在、又は突然変異原若しくは癌原因物質への曝露の履歴、イメージングなどにより同定できる。癌細胞はまた、外科的技術、内視鏡検査技術又は他の生検技術により得ることもできる。癌細胞のある特徴的な特性が知られている場合は、アフィニティークロマトグラフィー及び蛍光活性化細胞選別（例えば、癌細胞が発現する抗体に対する、蛍光によりタグ付けした抗体を用いる）のような、しかしながらこれらには限らない、当該技術分野で既知の任意の生化学的方法及び免疫学的方法により癌細胞を得る又は精製することもできる。
【０１１４】
癌組織、癌細胞又は細胞系統は単一の個体から得てもよいし、又は複数の個体からプールしてもよい。クローンの、同種の、又は精製された癌細胞の集団を使用することは必須ではない。また、標的癌細胞上の少なくとも１以上の抗原決定基がα２Ｍポリペプチドを発現するために使用する細胞に存在している限りは、ｉｎ ｖｉｖｏでの最終的な標的の細胞（例えば対象の受容者の腫瘍からの細胞）を使用する必要もない。加えて、離れた転移癌に由来する細胞を用いて原発癌に対する免疫原性組成物を調製することもできる。細胞の混合物は、該混合物中の細胞のうちの相当数が癌細胞であり且つ標的癌細胞と少なくとも１つの抗原決定基が共通しているのであれば、使用することができる。ある特定の実施形態では、α２Ｍポリペプチドを発現するのに使用する癌細胞は精製されている。
【０１１５】
５．２．２ ｉｎ ｖｉｔｒｏ 複合体化
別の実施形態では、α２Ｍポリペプチドと抗原分子との複合体はｉｎ ｖｉｔｒｏにて産生される。免疫原性α２Ｍポリペプチド−抗原分子複合体を、ｉｎ ｖｉｔｒｏにてα２Ｍポリペプチド−抗原分子複合体を形成するための当該技術分野において既知の任意の方法により生成することができる。ここでは、α２Ｍ−抗原分子複合体を形成する手順及び抗原ペプチドを単離する方法を詳細に記載する。
【０１１６】
非共有結合による免疫原性複合体をｉｎ ｖｉｔｒｏにて形成する方法は当該技術分野において周知である。例えば、かかる複合体を、ＨＳＰと抗原分子との非共有結合によるカップリングのために既に記載されている方法を用いてα２Ｍポリペプチドと抗原分子とを非共有結合により複合体化することにより、ｉｎ ｖｉｔｒｏにて生成することができる（例えばＢｌａｃｈｅｒｅら， １９９７， 前掲；１９９７年３月２０日付けのＰＣＴ国際公開第９７／１００００号を参照されたい）。好ましくは、免疫原性分子複合体は、プロテアーゼによる処理により製造されたものでも、又は、アンモニア若しくはメチルアミンのような活性化剤による処理により製造されたものでもない。他の好ましい実施形態では、免疫原性分子複合体のα２Ｍ分子は「ベイト（ｂａｉｔ）」領域内において切断されたものではない。更に他の実施形態では、α２Ｍポリペプチドはチオエステル結合を介して抗原分子と共有結合的に会合していない。
【０１１７】
共有結合によるカップリングの方法もまた当該技術分野において周知である（例えばＯｓａｄａら， １９８７， 前掲； Ｏｓａｄａら， １９８８， 前掲； Ｃｈｕ及びＰｉｚｚｏ， １９９３， 前掲； Ｃｈｕら， １９９４， 前掲； Ｍｉｔｓｕｄａら， １９９３， 前掲を参照されたい）。ある実施形態では、例えばα２Ｍポリペプチドをプロテアーゼと混合した場合に、α２Ｍのタンパク質分解活性化の間に非タンパク質分解性のリガンドは活性化されたチオエステルに共有結合することができる。非タンパク質分解性のリガンドはまた、熱を消費しながら求核活性化の逆転の際に、アンモニア又はメチルアミンにより活性化されたα２Ｍ分子中に取り込まれることができる（Ｇｒｏｎ及びＰｉｚｚｏ， １９９８， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ３７： ６００９−６０１４）。このような、α２Ｍによるペプチドの偶然の捕捉を可能にする条件を用いて本発明のα２Ｍポリペプチド−抗原分子複合体を製造する。
【０１１８】
例えば本発明の種々の実施態様では、α２Ｍポリペプチドを、プロテアーゼ、アンモニア又はメチルアミン及びエチルアミンのような小さなアミン求核分子の存在下にて抗原分子と混合してもよい。使用することのできるプロテアーゼの非限定的な例としては、トリプシン、ブタ膵臓エラスターゼ（ＰＥＰ）、ヒト好中球エラスターゼ、カテプシンＧ、Ｓ． アウレウス（Ｓ． ａｕｒｅｕｓ）Ｖ−８プロテイナーゼトリプシン、ａ−キモトリプシン、Ｖ８プロテアーゼ、パパイン及びプロテイナーゼＫが挙げられる（「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」， Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １７．４．６−１７．４．８中の Ａｕｓｕｂｅｌら（編）を参照されたい）。
【０１１９】
共有結合によるα２Ｍポリペプチド−抗原分子複合体を製造するための他の実施形態では、α２Ｍポリペプチドと抗原分子とを調製し、次いで例えば化学的架橋を用いて共有結合によりカップリングする。化学的架橋方法は当該技術分野において周知である。例えば好ましい実施形態では、グルタルアルデヒド架橋を使用することができる。グルタルアルデヒド架橋はペプチドとｈｓｐｓとの共有結合による複合体を形成するために使用されている（Ｂａｒｒｉｏｓら， １９９２， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２２： １３６５−１３７２を参照されたい）。一実施形態では、次のプロトコールを使用する。随意に、α２Ｍポリペプチドを、α２Ｍポリペプチドと会合し得る任意のペプチドを除去することを目的として、複合体化する前にＡＴＰ又は低いｐＨで前処理してもよい。好ましくは、１ｍｇのα２Ｍポリペプチドを１ｍｇのペプチドと０．００２％のグルタルアルデヒドの存在下にて２時間架橋させる。グルタルアルデヒドはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に対する終夜にわたる透析により除去される（Ｌｕｓｓｏｗら， １９９１， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２１：２２９７−２３０２）。
【０１２０】
化学的架橋のための他の方法もまた使用してよく、さらに光架橋等のタンパク質を共有結合により結合させるための他の方法もまた使用してよい（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ａｕｓｕｂｅｌら（編）， Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを参照されたい）。
【０１２１】
共有結合による又は非共有結合によるα２Ｍポリペプチド−抗原分子複合体のための抗原分子は種々の起源から単離してよく、化学的に合成してよく、又は、組換えにより産生してよい。このような方法は、本発明の免疫療法用ワクチン又は予防用ワクチンの中規模又は大規模生産のために容易に適合させることができる。
【０１２２】
複合体化の後に、免疫原性α２Ｍ−抗原分子複合体を随意に精製することができる。好ましい実施形態では、かかる複合体は、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％又は１００％のα２Ｍと抗原分子との非共有結合による複合体である。かかる複合体は、例えば下記の混合リンパ球標的細胞アッセイ（ＭＬＴＣ）を用いてｉｎ ｖｉｔｒｏでアッセイすることができる。免疫原性複合体を単離した後には、それらを、随意に以下に検討する好ましい投与プロトコール及び賦形剤を用いて動物モデルにおいて更に特性付けることができる。
【０１２３】
５．２．３ α２Ｍ−抗原分子融合タンパク質
他の実施形態では、抗原分子配列に連結されたα２Ｍ配列からなる組換え融合タンパク質を免疫療法に使用することができる。かかる組換え融合タンパク質を産生するために、抗原分子をコードする配列に融合したα２Ｍをコードする核酸配列を用い、上記第５．１．１．１節及び第５．１．１．２節に記載するような当該技術分野において既知の組換え方法を用いて、発現ベクターを構築する（Ｓｕｚｕｅら， １９９７， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ９４： １３１４６−５１を参照されたい）。次に、α２Ｍ−抗原ペプチド融合体を発現させて単離する。該分子の抗原ペプチド部分を特定して設計することにより、かかる融合タンパク質は免疫応答を誘導するために使用することができ、また標的とする癌及び感染症に対する免疫療法に使用することができる。
【０１２４】
５．２．４ 抗原分子の起源
１以上の種類の癌又は感染細胞に特異的な、抗原分子又はその抗原性のある部分は、当該技術分野において既知のものから選択できる。あるいは、かかる抗原分子を、イムノアッセイ又は免疫応答を生じさせる能力により測定したそれらの抗原性又はそれらの免疫原性に関して選択することができる。
【０１２５】
５．２．４．１ 外因性抗原分子
好ましくは、癌の治療又は予防を望む場合は、既知の腫瘍特異的抗原分子又はその断片若しくは誘導体を使用する。例えば、このような腫瘍特異的抗原分子又は腫瘍関連抗原分子には、ＫＳ １／４ 全癌抗原（ｐａｎｃａｒｃｉｎｏｍａ ａｎｔｉｇｅｎ）（Ｐｅｒｅｚ及びＷａｌｋｅｒ， １９９０， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １４２：３６６２−３６６７； Ｂｕｍａｌ， １９８８， Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ ７（４）：４０７−４１５）； 卵巣癌抗原（ＣＡ１２５）（Ｙｕら， １９９１， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５１（２）： ４６８−４７５）； 前立腺性酸フォスファタ−ゼ（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）（Ｔａｉｌｅｒら， １９９０， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １８（１６）：４９２８）； 前立腺特異的抗原（Ｈｅｎｔｔｕ及びＶｉｈｋｏ， １９８９， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍ． １６０（２）：９０３−９１０； Ｉｓｒａｅｌｉら， １９９３， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５３：２２７−２３０）； 黒色腫−関連抗原ｐ９７（Ｅｓｔｉｎら， １９８９， Ｊ． Ｎａｔｌ． Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ． ８１（６）：４４５−４４６）； 黒色腫抗原ｇｐ７５（Ｖｉｊａｙａｓａｒｄａｈｌら， １９９０， Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １７１（４）：１３７５−１３８０）： 高分子量黒色腫抗原（Ｎａｔａｌｉら， １９８７， Ｃａｎｃｅｒ ５９：５５−６３）及び前立腺特異的膜抗原が含まれるがこれらに限らない。
【０１２６】
ある特定の実施形態では、ある特定の腫瘍に特異的な抗原分子又はその断片若しくは誘導体を、α２Ｍポリペプチドと複合体化し、続いて該腫瘍を有する患者に投与するために選択する。
【０１２７】
好ましい実施形態では、ウイルス性疾患の治療又は予防を望む場合には、既知のウイルスのエピトープを含む分子を使用する。例えばかかる抗原エピトープは、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、インフルエンザ、水痘、アデノウイルス、単純ヘルペスウイルスＩ型（ＨＳＶ−Ｉ）、単純ヘルペスウイルスＩＩ型（ＨＳＶ−ＩＩ）、牛疫、ライノウイルス、エコーウイルス、ロタウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、パピローマウイルス、パポーバウイルス、サイトメガロウイルス、エキノウイルス（ｅｃｈｉｎｏｖｉｒｕｓ）、アルボウイルス、ハンタウイルス、コクスサッキーウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、麻疹ウイルス、風疹ウイルス、ポリオウイルス、ヒト免疫不全ウイルスＩ型（ＨＩＶ−Ｉ）、及びヒト免疫不全ウイルスＩＩ型（ＨＩＶ−ＩＩ）を含むがこれらに限らないウイルスから調製することができる。
【０１２８】
他の好ましい実施形態では、細菌感染症の治療又は予防を望む場合には、既知の細菌のエピトープを含む分子を使用する。例えば、かかる抗原エピトープはマイコバクテリア（ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ）、リケッチア（ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ）、マイコプラズマ（ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）、ナイセリア（ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）及びレジオネラ（ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ）を含むがこれらに限らない細菌から調製することができる。
【０１２９】
他の好ましい実施形態では、原生動物感染症の治療又は予防を望む場合には、既知の原生動物のエピトープを含む分子を使用する。例えばかかる抗原エピトープは、リーシュマニア（ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ）、コクジジオア（ｋｏｋｚｉｄｉｏａ）、及びトリパノゾーマ（ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ）を含むがこれらに限らない原生動物から調製することができる。
【０１３０】
更に他の好ましい実施形態では、寄生虫感染症の治療又は予防を望む場合には、既知の寄生虫のエピトープを含む分子を使用する。例えば、かかる抗原エピトープは、クラミジア（ｃｈｌａｍｙｄｉａ）及びリケッチアを含むがこれらに限らない寄生虫から調製することができる。
【０１３１】
抗原と考えられるものの免疫原性及び抗原性を抗体への結合を検出することにより測定するために、ラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ（酵素免疫測定法）、「サンドイッチ」イムノアッセイ、免疫放射定量アッセイ、ゲル拡散沈降素反応、免疫拡散アッセイ、ｉｎ ｖｉｖｏ イムノアッセイ（例えばコロイド金標識、酵素標識、又はラジオアイソトープ標識を用いる）、ウエスタンブロット、免疫沈降反応、凝集アッセイ（例えばゲル凝集アッセイ、血球凝集アッセイ）、補体結合アッセイ、免疫蛍光アッセイ、プロテインＡアッセイ、免疫電気泳動アッセイ等の技術を用いる競合アッセイ系及び非競合アッセイ系を含むがこれらに限らない当該技術分野において既知の種々のイムノアッセイを使用することができる。一態様では、抗体結合は一次抗体上のラベルを検出することにより検出する。他の態様では、一次抗体を、二次抗体又は一次抗体への試薬の結合を検出することにより検出する。更なる態様では、二次抗体を標識化する。イムノアッセイで結合を検出するための多くの方法が当該技術分野において既知であり、それらを使用することが考えられる。免疫原性を検出するための一実施形態では、Ｔ細胞が介在する応答を標準的な方法により、例えばｉｎ ｖｉｔｒｏでの細胞傷害性アッセイ又はｉｎ ｖｉｖｏでの遅延型過敏反応アッセイにより、アッセイすることができる。
【０１３２】
潜在的に有用な抗原分子又はその誘導体は種々の基準、例えば、（ある病原体による感染の治療又は予防を望む場合には）病原体の感染性の中和における抗原の関与（Ｖａｃｃｉｎｅｓ ８５， Ｌｅｒｎｅｒら（編）， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ｐｐ． ３８８−３８９中のＮｏｒｒｂｙ， １９８５， Ｓｕｍｍａｒｙ）、基特異性の種類、患者の抗血清又は免疫細胞による認識、及び／又は抗原に特異的な抗血清又は免疫細胞による防御効果の証明により同定することができる。加えて、病原体が原因である疾患の治療又は予防を望む場合には、抗原にコードされているエピトープは、好ましくは時間的な、又は同じ病原体の異なる単離株間での抗原性の変動が小さいか又は全くない程度を示すべきである。
【０１３３】
５．２．４．２ α２Ｍ複合体からの抗原分子
ｉｎ ｖｉｔｒｏで本発明のα２Ｍポリペプチドと複合体化するための抗原ペプチドはまた、ペプチドとα２Ｍとの内因性の複合体から得ることもできる。二つの方法を用いてα２Ｍ−抗原分子複合体からペプチドを溶出させることができる。１つのアプローチは、α２Ｍ−抗原分子複合体をＡＴＰの存在下にてインキュベートすることを含む。もう１つのアプローチは該複合体を低いｐＨバッファーにおいてインキュベートすることを含む。
【０１３４】
簡潔に言えば、対象とする複合体をＣｅｎｔｒｉｃｏｎ １０ ａｓｓｅｍｂｌｙ （Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を通して遠心分離し、該複合体と弱く会合した低分子量物質を取り出す。高分子量の画分を取り出し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析することができる。一方で、低分子量のものは下記のようにＨＰＬＣにより分析できる。ＡＴＰとインキュベートするプロトコールでは、高分子量画分中のα２Ｍ−抗原分子複合体を１０ｍＭ ＡＴＰとともに３０分間室温にてインキュベートする。低いｐＨのプロトコールでは、酢酸又はトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）をα２Ｍ−抗原分子複合体に添加して最終濃度が１０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）になるようにし、そして該混合物を室温にて、又は沸騰水浴中で、又はその間の任意の温度にて１０分間インキュベートする。
【０１３５】
得られたサンプルを先に記載したようにＣｅｎｔｒｉｃｏｎ １０ ａｓｓｅｍｂｌｙを通して遠心分離する。高分子量画分及び低分子量画分を回収する。残りの高分子量のα２Ｍ−抗原分子複合体はＡＴＰ又は低いｐＨとともに再度インキュベートして残存するペプチドを取り出すこともできる。
【０１３６】
得られた低分子量画分をプールし、蒸発により濃縮し、そして０．１％ＴＦＡ中に溶解する。次に溶解した物質を逆相高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により、例えば０．１％ＴＦＡにより平衡化したＶＹＤＡＣ Ｃ１８逆相カラムを用いて分画する。次に、結合した物質を、約０．８ ｍｌ／分の流速にて、０．１％ＴＦＡ中０から８０％へのアセトニトリルの直線的な勾配をかけてカラムを展開することにより溶出させる。ペプチドの溶出はＯＤ２１０によりモニターでき、ペプチドを含む画分を集めることができる。
【０１３７】
５．２．４．３ ＭＨＣ複合体からのペプチド抗原
ｉｎ ｖｉｖｏにてＭＨＣ分子に結合したペプチドもまた、本発明のα２Ｍポリペプチドと複合体を形成するためにｉｎ ｖｉｔｒｏにて使用できる。潜在的に免疫原性を有するペプチドのＭＨＣ分子からの単離は当該技術分野において周知であるので、本明細書では詳しくは記載しない（Ｆａｌｋら， １９９０， Ｎａｔｕｒｅ ３４８：２４８−２５１； Ｒｏｔｚｓｃｈｅら， １９９０， Ｎａｔｕｒｅ ３４８：２５２−２５４； Ｅｌｌｉｏｔｔら， １９９０， Ｎａｔｕｒｅ ３４８：１９１−１９７； Ｆａｌｋら， １９９１， Ｎａｔｕｒｅ ３５１：２９０−２９６； Ｄｅｍｏｔｚら， １９８９， Ｎａｔｕｒｅ ３４３：６８２−６８４； Ｒｏｔｚｓｃｈｅら， １９９０， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：２８３−２８７を参照されたい。なおこれらの開示内容は参照により本明細書に組み入れる）。
【０１３８】
簡潔に言えば、ＭＨＣ−抗原分子複合体は通常のイムノアフィニティーの手順により単離できる。ペプチドは、次に、アセトニトリル中、約０．１％ ＴＦＡの存在下にて該複合体をインキュベートすることによりＭＨＣ−抗原分子複合体から溶出させることができる。溶出したペプチドは上記のように逆相ＨＰＬＣにより分画し精製することができる。
【０１３９】
５．２．４．４ 合成抗原分子
ＭＨＣ分子から溶出したペプチド又はα２Ｍのアミノ酸配列は、当該技術分野において周知である手動の又は自動化されたアミノ酸配列決定技術の何れかにより決定することができる。潜在的に保護するペプチドのアミノ酸配列がひとたび決定されれば、該ペプチドは、通常のペプチド合成又はその他の当該技術分野において周知のプロトコールを用いて合成できる。
【０１４０】
上記で単離したアミノ酸配列と同じアミノ酸配列を有するペプチドは、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ， １９６３， Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ．， ８５：２１４９に述べられている手順と類似の手順を用いて固相ペプチド合成によって合成することができる。合成の際に、保護された側鎖を有するＮ−α−保護アミノ酸を、そのＣ末端で不溶性のポリマー支持体、例えばポリスチレンビーズに連結された伸長しつつあるポリペプチド鎖に段階的に添加する。ペプチドは、Ｎ−α−脱保護アミノ酸のアミノ基を、Ｎ−α−保護アミノ酸（このアミノ酸はジシクロヘキシルカルボジイミドなどの試薬と反応させることによって活性化させている）のα−カルボキシル基と連結させることによって合成される。活性化されたカルボキシルに遊離のアミノ基が結合することによってペプチド結合が形成される。最も一般的に用いられるＮ−α−保護基としては、酸に対して不安定なＢｏｃ、及び塩基に対して不安定なＦｍｏｃが挙げられる。適切な化学反応、樹脂、保護基、保護アミノ酸、及び試薬についての詳細は当該技術分野で周知であり、本明細書中では詳述しない（Ａｔｈｅｒｔｏｎら， １９８９， Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ， ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ、及びＢｏｄａｎｓｚｋｙ， １９９３， Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｔｅｘｔｂｏｏｋ， 第２版， Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇを参照せよ）。
【０１４１】
得られた断片の精製は、従来の手順、例えばゲル浸透、分配及び／若しくはイオン交換クロマトグラフィーを用いた分取ＨＰＬＣなどを用いて達成される。適切なマトリックス及びバッファーの選択については当該技術分野で周知であり、本明細書では詳述しない。
【０１４２】
５．２．４．５ 組換えにより産生された抗原分子
本発明の特定の実施形態では、タンパク質抗原分子又はその一部分をコードするヌクレオチド配列を、該抗原分子を産生させるために宿主細胞に導入することができる。任意の抗原タンパク質をコードするヌクレオチド配列を得ることができ、そして、α２Ｍポリペプチドをコードするヌクレオチド配列をクローニングし発現させるための先に記載した方法と本質的に同じ方法により、発現のために発現ベクター中にクローニングすることができる。その技術は第５．１．１．１節及び第５．１．１．２節に記載されており、且つ、当該技術分野において周知である。組換え抗原タンパク質又はその一部は、そのタンパク質にとって適切な任意の方法により精製することができ、次いでそれを使用して第５．２．２節に記載したようにｉｎ ｖｉｔｒｏにてα２Ｍポリペプチドと複合体を形成することができる。感染症又は癌を治療又は予防することを目的として、かかるα２Ｍポリペプチド−抗原分子複合体をワクチンとして使用して、ある被験者において抗原タンパク質に対する免疫応答を刺激することができる。
【０１４３】
５．３ α２Ｍ複合体の治療での応用
本発明は、α２Ｍポリペプチドの、感染症及び癌の治療及び予防のための方法における使用を包含する。本明細書において詳細に記載する種々の実施形態では、有効量の、共有結合により又は非共有結合により抗原分子と複合体を形成しているα２Ｍポリペプチドを治療の目的で患者に投与する。
【０１４４】
５．３．１ 感染症の予防及び治療
感染症の治療及び予防のために、α２Ｍ−抗原分子複合体を、感染因子又は病原体の抗原の抗原性を示す細胞から調製し、該感染症に対するワクチンとして使用する。当業者に理解されるように、本明細書に記載するプロトコールを使用して、α２Ｍポリペプチド−抗原分子複合体を、感染因子の抗原の抗原性を示す任意の細胞から単離することもできる。例えば、細胞を感染因子そのものに感染させてよい。あるいはまた、細胞を、弱毒化された形態の感染因子又は病原体の非病原性の変異体若しくは複製ができない変異体に感染させてもよく、あるいはそれらを発現するように操作されていてもよい。一実施形態では、α２Ｍ−抗原分子複合体は、非感染性の形態又は非病原性の形態の感染因子に（例えばヘルパー感染因子の使用により）感染した細胞から調製することができる。他の実施形態では、本発明のα２Ｍ−抗原分子複合体は細胞内病原体に感染した細胞から調製してもよい。他の実施形態では、α２Ｍポリペプチド−複合体は、細胞内病原体により形質転換されている細胞から調製することができる。例えば、免疫原性のα２Ｍポリペプチド−抗原分子複合体は、ＳＶ４０などの形質転換ウイルスにより形質転換された真核細胞から単離することができる。
【０１４５】
感染症の治療又は予防のための好ましい方法は、感染因子の抗原性を示す細胞中に、発現可能なα２Ｍポリペプチド遺伝子配列を、好ましくは発現遺伝子構築物として導入することを含む。α２Ｍポリペプチド遺伝子配列は、上記第５．１．１．１節及び第５．１．１．２節に記載するような組換え方法により操作して、α２Ｍポリペプチド遺伝子配列が、染色体外に位置する又は染色体内に組み込まれた発現構築物の形態で、α２Ｍポリペプチドが組換え細胞内で発現するのに好適になるようにする。該発現遺伝子構築物を含む組換え細胞を発現遺伝子構築物によりコードされるα２Ｍポリペプチドが発現される条件下で培養する。感染因子の抗原分子と共有結合により又は非共有結合により会合したα２Ｍポリペプチドの複合体は、第５．２．１節に記載の方法により細胞培養物又は培養培地から精製される。
【０１４６】
種々の実施形態では、α２Ｍ−抗原分子複合体を、α２Ｍポリペプチドを発現するように遺伝子操作された細胞、例えばある細胞内病原体に感染した組織、単離された細胞、又は不死化真核細胞系から調製される。不死化した動物細胞系をα２Ｍポリペプチド−抗原分子複合体の起源として使用する場合は、対象とする病原体により感染されうる細胞系を使用することが重要である。加えて、ワクチンを接種しようとする受容者と同じ種に由来する細胞を使用することが好ましい。α２Ｍポリペプチド遺伝子配列の発現可能な形態をこれらの細胞系に導入するための技術は上記第５．１．１．２節に記載される。病原体が宿主細胞の溶解を引き起こすと予想されるのであれば、細胞に病原体が感染する前に、発現可能なα２Ｍポリペプチド遺伝子配列を宿主細胞に導入することが好ましい。例えばヒトに投与するための、ＨＩＶ−１に対して有効であり得るα２Ｍポリペプチド−抗原分子複合体を調製するためには、ウイルスを、ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞、ＨｅｐＧ２細胞、及びＵ９３７前単球細胞を含むがこれらには限らない、発現可能なα２Ｍポリペプチド配列により既にトランスフェクトされているヒト細胞中で増殖させることができる。同様に、インフルエンザウイルスを、例えばトランスフェクトされたヒト線維芽細胞系及びＭＤＣＫ細胞中で増殖させてよく、また、マイコバクテリアを、例えばトランスフェクトされたヒトシュワン細胞中で培養してよい。α２Ｍ−抗原分子複合体を含む細胞上清は、宿主細胞の溶解の直前に集めることができる。
【０１４７】
本発明の好ましい態様では、精製したα２Ｍ−抗原分子複合体ワクチンは細胞内病原体により生じるヒトの疾患の治療において特に有用でありうる。しかしながら本明細書において記載する原理を用いて開発されたワクチンは、他の哺乳動物、例えばウシ；ウマ；ヒツジ；ヤギ；及びブタを含む家畜、並びにネコ；及びイヌを含む家庭のペットの、同様に細胞内病原体により生じる疾患を治療するのに有用であろうと考えられる。
【０１４８】
本明細書に記載する方法により、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、インフルエンザ、水痘、アデノウイルス、ＨＳＶ−Ｉ、ＨＳＶ−ＩＩ、牛疫、ライノウイルス、エコーウイルス、ロタウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、パピローマウイルス、パポーバウイルス、サイトメガロウイルス、エキノウイルス、アルボウイルス、ハンタウイルス、コクスサッキーウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、麻疹ウイルス、風疹ウイルス、ポリオウイルス、ＨＩＶ−Ｉ、及びＨＩＶ−ＩＩを含むがこれらに限らないウイルスに感染した細胞に対して、免疫応答、特に細胞障害性Ｔ細胞の応答を刺激するワクチンを調製することができる。同様にまた、マイコバクテリア、リケッチア、マイコプラズマ、ナイセリア及びレジオネラを含むがこれらに限らない細胞内細菌に感染した細胞に対して細胞障害性Ｔ細胞の応答を刺激するワクチンを調製することもできる。加えて、またリーシュマニア、コクジジオア、及びトリパノゾーマを含むがこれらに限らない細胞内原生動物に感染した細胞に対して細胞障害性Ｔ細胞の応答を刺激するワクチンを調製することもできる。さらまた、クラミジア及びリケッチアを含むがこれらに限らない細胞内寄生虫に感染した細胞に対して細胞傷害性Ｔ細胞の応答を刺激するワクチンを調製することができる。
【０１４９】
改変されたα２Ｍポリペプチド−抗原分子複合体による免疫療法の、感染症の進行に対する効果は当業者にとって既知の任意の方法によりモニターすることができる。
【０１５０】
５．３．２ 癌の予防及び治療
本発明により製造される、共有結合性又は非共有結合性のα２Ｍポリペプチド−抗原分子複合体、又はα２Ｍポリペプチドを発現する組換え細胞により提供される免疫療法を癌患者において使用することが望ましいのには多くの理由がある。第一には、癌患者が免疫抑制状態である場合には麻酔を用いた手術及びその後の化学療法は免疫抑制を悪化させることがあり、その場合に適切な免疫療法を手術前の期間に行えばこの免疫抑制が予防されたり回復したりする可能性がある。このことは、感染の合併症が少なくなること及び創傷の治癒の加速につながり得る。第二には、腫瘍の大きさは手術後において最も小さく、免疫療法はこの状況で効果的である可能性が高い。第三の理由は、腫瘍細胞は手術の際に循環系に流出するので有効な免疫療法をこの時点で適用すればこれらの細胞を除くことができる可能性があることである。
【０１５１】
ある特定の実施形態では、本発明の予防及び治療における使用は、癌患者の免疫能を手術の前、手術時、又は手術後に高めること、及び、腫瘍特異的免疫を癌細胞に誘導することを意図するものであり、その目的は癌の阻害であり、また、最終的な臨床上の目的は癌の完全な治癒及びその撲滅である。
【０１５２】
本発明によれば、癌の治療又は予防の好ましい方法は、１以上の個体、好ましくは治療を必要とする個体から癌細胞を単離すること、及びかかる細胞に発現可能なα２Ｍポリペプチド遺伝子配列を好ましくは発現遺伝子構築物として導入することを含む。α２Ｍポリペプチド遺伝子配列を５．１．１．１節及び５．１．１．２節において先に記載した方法により操作して発現構築物の形態であるか染色体内に組み込んだα２Ｍポリペプチド遺伝子配列が、組換え細胞でのα２Ｍポリペプチドの発現に好適である。発現遺伝子構築物を含む組換え細胞は、該発現遺伝子構築物によりコードされるα２Ｍポリペプチドが該組換え宿主細胞によって発現されるような条件下で培養する。癌細胞の抗原分子と共有結合により又は非共有結合により会合したα２Ｍポリペプチドの複合体は、５．２．１節に記載の方法により細胞培養物又は培養培地から精製する。投与経路に応じてα２Ｍポリペプチド−抗原分子複合体を５．７節の記載に従って製剤化し、それを個体に（例えば原発性癌又はその転移癌を治療するために）自家投与し、又は類似した組織種の癌の治療が必要な他の個体に投与し、又は家系若しくは環境危険因子により癌の危険性が高い個体に投与する。
【０１５３】
例えば、上記のように製造したα２Ｍポリペプチド−抗原分子複合体による治療は、手術後の任意の時点で開始してよい。しかしながら患者が化学療法を受けた場合は、α２Ｍ−抗原分子複合体は通常、免疫系を回復させるために４週間以上の間隔の後に投与する。その治療計画として、生理食塩水又は他の生理学的に適合性の溶液中に溶解させたα２Ｍポリペプチド−抗原分子複合体を毎週注射することを含んでもよい。注入経路及び部位は毎回異なる。例えば、１回目の注射は左腕の皮下に行い、２回目の注射は右腕に行い、３回目の注射は左腹部に行い、４回目の注射は右腹部に行い、５回目の注射は左大腿部に行い、６回目の注射は右大腿部に行う、などである。同じ部位は１回以上の注射の間隔を空けて繰り返す。さらに、注射を分けて、用量の半分をそれぞれ異なる部位に同日に投与する。全体としては、最初の４〜６回の注射は１週間の間隔で行う。次に、２回の注射を２週間の間隔で行い、その後の注射計画は１ヶ月の間隔で行う。
【０１５４】
あるいは、α２Ｍ−抗原分子複合体を発現する組換え腫瘍細胞は、腫瘍細胞又は腫瘍抗原を有する細胞に対する免疫応答を刺激するための、患者に投与するためのワクチンとして使用することができる。α２Ｍポリペプチド−抗原分子複合体を安定的に発現する自己由来の組換え腫瘍細胞が好ましい。適切な用量を決定するために、組換え細胞により産生されるα２Ｍポリペプチド−抗原分子複合体の量を定量し、それに応じてワクチン接種に使用する組換え細胞の数を調節してｉｎ ｖｉｖｏでの発現を一定の水準で確保する。好ましい用量は、２４時間で１００ ｎｇのα２Ｍポリペプチドを産生できる組換え細胞数である。患者の安全のために、組換え腫瘍細胞を、患者に投与する直前に放射線照射（１２０００ ｒａｄ）することもできる。照射された細胞は増殖しないが、α２Ｍポリペプチド−抗原分子複合体を約７−１０日間発現し続けることができ、これは免疫応答を誘導するのに十分である。
【０１５５】
本発明の方法により調製される、共有結合による又は共有結合によらないα２Ｍ−抗原分子複合体を用いて治療又は予防することができる癌には、肉腫及び癌腫、例えば、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮腫、骨膜腫、中皮腫、ユーイング肉腫、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、大腸癌、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、脂腺癌、乳頭状癌、乳頭状腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支原生癌、腎細胞癌、ヘパトーム、胆管癌、絨毛癌、セミノーマ、胎生期癌、ウィルムス腫、子宮頸癌、精巣癌、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神経膠腫、星状細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、脳室上衣腫、松果体腫、血管芽腫、聴神経腫、乏突起神経膠腫、髄膜腫、黒色腫、神経芽腫、網膜芽腫、白血病（例えば急性リンパ性及び急性骨髄性白血病（骨髄芽球性白血病、前骨髄球性白血病、骨髄単球性白血病、単球性白血病、及び赤白血病）；慢性白血病（慢性骨髄性（顆粒球性）白血病及び慢性リンパ性白血病））；及び真性赤血球増加症、リンパ腫（ホジキン病及び非ホジキン病）、多発骨髄腫、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症、及び、Ｈ鎖病が含まれるがこれらに限らない。
【０１５６】
ある特定の実施形態では癌は転移性である。他の特定の実施形態では、癌を有する患者は、本発明のα２Ｍ−抗原分子複合体を投与する前に抗癌治療（例えば化学療法、放射線）を受けたために免疫抑制されている。他の特定の実施形態では癌は腫瘍である。
【０１５７】
α２Ｍポリペプチド−抗原分子複合体を用いる免疫療法の、新生物性疾患の進行に対する効果を、当業者にとって公知の任意の方法によりモニターすることができる。そのような方法としては、ａ） 細胞性免疫の評価としての遅延型過敏性の測定； ｂ） 細胞傷害性Ｔリンパ球のｉｎ ｖｉｔｒｏでの活性の測定； ｃ） 腫瘍特異的抗原（例えば癌胎児抗原（ＣＥＡ））のレベルの測定； ｄ） コンピューター断層撮影（ＣＴ）スキャン等の技術を用いた腫瘍の形態の変化の測定； ｅ） 危険度の高い個体における、特定の癌についての危険度の推定バイオマーカーのレベルの変化の測定、及びｆ） ソノグラムを用いた腫瘍の形態の変化の測定、が含まれるがこれらに限定されない。使用し得る他の技法にはシンチグラフィー及び内視鏡検査が含まれる。
【０１５８】
α２Ｍポリペプチド−抗原分子複合体を用いる免疫療法の予防効果はまた、特定の癌についての危険度に対する推定上のバイオマーカーのレベルを測定することにより推定することもできる。例えば、前立腺癌の危険性が高い個体において、血清前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）をＢｒａｗｅｒら， １９９２， Ｊ． Ｕｒｏｌ． １４７：８４１−８４５及びＣａｔａｌｏｎａら， １９９３， ＪＡＭＡ ２７０：９４８−９５８に記載の手順により測定する。あるいは、結腸直腸癌の危険性がある個体において、ＣＥＡを当該技術分野において既知の方法により測定する。さらに、乳癌の危険性が高い個体において、エストラジオールの１６−α−ヒドロキシル化を、Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒら， １９８２， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７９：３０４７−３０５１に記載の手順により測定する。ここで引用する参照文献は引用によりその全体を本明細書中に組み入れる。
【０１５９】
５．３．３ 養子免疫療法との組み合わせ
養子免疫療法とは、感染症又は癌を治療するための治療上のアプローチであって、免疫細胞が感染細胞又は腫瘍細胞及び／又は抗原成分に特異的な免疫を直接的又は間接的に媒介することにより、各場合において感染症を治療するか又は腫瘍を退縮させることを目的として、免疫細胞を宿主に投与するものである（１９９５年９月１３日に出願された米国特許出願連続番号第０８／５２７，５４６号を参照されたい；この文献はその全体を参照により本明細書に組み入れるものとする）。養子免疫療法のために、α２Ｍポリペプチドを、抗原（又は免疫原）分子との共有結合性又は非共有結合性の複合体として用いて、抗原提示細胞（ＡＰＣ）を感作してもよい。
【０１６０】
本発明に従って、任意の所望の投与経路を用いてα２Ｍポリペプチド−抗原分子複合体を投与することによる治療法を、α２Ｍポリペプチド−抗原分子複合体によって感作されたＡＰＣを用いる養子免疫療法と組合せる。α２Ｍポリペプチド−抗原分子複合体で感作されたＡＰＣは、α２Ｍポリペプチド−抗原分子複合体と同時に投与するか、又はα２Ｍポリペプチド−抗原分子複合体を投与する前若しくは後に投与することができる。更には、投与の様式を変えることができ、例えば皮下投与、静脈内投与、腹腔内投与、筋肉内投与、皮内投与又は粘膜投与が挙げられるがこれらに限定されない。
【０１６１】
５．３．３．１ α２Ｍ複合体による抗原提示細胞の感作
抗原提示細胞（マクロファージ、樹状細胞及びＢ−細胞を含むがこれらに限定されない）は、好ましくは、Ｉｎａｂａら， １９９２， Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １７６：１６９３−１７０２に記載のようにヒトの末梢血又は骨髄からの幹細胞及び前駆細胞からｉｎ ｖｉｔｒｏで調製することにより得る。ＡＰＣは当該技術分野において既知の種々の任意の方法により得ることができる。ある好ましい態様では、用いるヒトマクロファージをヒト血球から得る。
【０１６２】
例えばマクロファージを次のように得ることができるがこれに限定されない：すなわち、単核細胞を患者（好ましくは治療する患者）の末梢血から、フィコール−ハイパーク勾配遠心分離法により単離し、患者自身の血清又は他のＡＢ＋ヒト血清によりプレコートした組織培養ディッシュ上に播種した。該細胞を３７℃にて１時間インキュベートし、次いで付着しない細胞をピペッティングにより除いた。該ディッシュに残された付着細胞に冷たい（４℃）リン酸緩衝化生理食塩水中の１ｍＭ ＥＤＴＡを添加し、室温にて１５分間静置した。細胞を集め、ＲＰＭＩ緩衝液で洗浄し、ＲＰＭＩ緩衝液中に懸濁させた。増加させたマクロファージは、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）と共に３７℃にてインキュベートすることにより得ることができる。増加させた樹状細胞は、Ｉｎａｂａ， Ｋら， １９９２， Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １７６：１６９３−１７０２に詳細に記載されているように顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）と共にインキュベートすることにより得ることができる。
【０１６３】
ＡＰＣを、共有結合により又は非共有結合により抗原分子と結合したα２Ｍポリペプチドにより、該細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏにて該複合体とインキュベートすることにより感作させる。ＡＰＣを、α２Ｍポリペプチドと抗原分子との複合体により、好ましくはｉｎ ｖｉｔｒｏにてα２Ｍポリペプチド−複合体と共に３７℃にて１５分間〜２４時間インキュベートすることにより、感作させる。限定するものではないが例えば、４ ｘ １０７個のマクロファージを、１ｍｌあたり１０マイクログラムのα２Ｍ−抗原分子複合体と共に、又は、１ｍｌあたり１００マイクログラムのα２Ｍ−抗原分子複合体と共に、３７℃にて１５分間〜２４時間、１ｍｌの無添加ＲＰＭＩ培地中でインキュベートすることができる。細胞を３回洗浄し、患者に注射するのに適切な濃度（例えば１ ｘ １０７／ｍｌ）で好ましくは無菌の生理学的媒体中に再懸濁する。好ましい実施形態では、抗原提示細胞は患者にとって自己由来のものである。すなわち、感作されたＡＰＣを注入する患者は、もともとＡＰＣを単離された患者である。
【０１６４】
場合により、感作されたＡＰＣについての、例えば抗原特異的な、クラスＩ拘束性細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）を刺激する能力を、それがＣＴＬを刺激して腫瘍壊死因子を放出させる能力によりモニターすることができ、また、それがかかるＣＴＬの標的としてはたらく能力によりモニターすることができる。
【０１６５】
５．３．３．２ 感作されたＡＰＣの再注入
α２Ｍポリペプチド−抗原で感作したＡＰＣを、通常の臨床的な手順により、好ましくは静脈内投与により、患者に全身的に再注入する。これらの活性化された細胞を、好ましくは、自家性の患者に全身的に投与することにより、再注入する。患者は患者の病的状態に応じて一般的に約１０６〜約１０１２個の感作されたマクロファージを投与される。ある治療計画では、場合により、患者は好適な用量の生物反応改変物質（サイトカインＩＦＮ−α、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＴＮＦ又は他のサイトカイン成長因子が含まれるがこれらに限らない）を更に投与される。
【０１６６】
５．３．４． α２Ｍ−抗原分子複合体の免疫原性の測定
任意の手順では、精製したα２Ｍポリペプチド−抗原分子複合体を、当該技術分野で周知の混合リンパ球標的培養アッセイ（ＭＬＴＣ）を用いて、免疫原性についてアッセイすることができる。
【０１６７】
例えば次の手順を用いることができるがこれに限らない。簡潔にいえば、候補となるα２Ｍポリペプチド−抗原分子複合体をマウスに皮下注射する。陽性対照として、もう１つのマウスの群を、α２Ｍポリペプチドを得た種類の癌細胞の細胞全体を用いて免疫化する。陰性対照として、通常の組換えされていない細胞から単離したα２Ｍ−抗原分子複合体又は全体細胞から単離したα２Ｍ−抗原分子複合体のいずれかをマウスに注射する（すなわち、α２Ｍポリペプチドを得た細胞の種類とは抗原性が異なる）。マウスには７〜１０日間隔で二度注射する。最後の免疫化の１０日後に、脾臓を取り出してリンパ球を放出させる。次に、放出させたリンパ球を、目的の複合体を発現していた死細胞を添加することによりｉｎ ｖｉｔｒｏにて再刺激することもできる。
【０１６８】
例えば、８ ｘ １０６個の免疫脾細胞を、１０％ウシ胎仔血清を含む３ｍｌのＲＰＭＩ培地中の、マイトマイシンＣで処理した若しくはγ線照射（５〜１０，０００ ｒａｄ）した４ ｘ １０４個の病原体感染細胞（又は場合によっては感染因子の抗原をコードする遺伝子でトランスフェクトした細胞）又は腫瘍細胞により刺激することができる。ある場合では、３３％の第２の混合リンパ球培養物の上清すなわちインターロイキン２（ＩＬ−２）を、Ｔ細胞増殖因子の供給源として培養培地中に含めてよい（Ｇｌａｓｅｂｒｏｏｋら， １９８０， Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １５１：８７６）。免疫化後の細胞傷害性Ｔ細胞の一次応答を試験するために、脾細胞を刺激しないで培養してよい。実験によっては、免疫化マウスの脾臓細胞を抗原性の異なる細胞により再刺激して細胞傷害性Ｔ細胞の応答の特異性を測定することもできる。
【０１６９】
６日後に、培養物について、４時間５１Ｃｒ−放出アッセイにより細胞傷害性を試験する（Ｐａｌｌａｄｉｎｏら， １９８７， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ４７：５０７４−５０７９及びＢｌａｃｈｅｒｅら， １９９３， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ １４：３５２−３５６を参照されたい）。このアッセイでは、混合リンパ球混合物を標的細胞の懸濁液に添加して、様々なエフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）比（通常は１：１〜４０：１）となるようにする。標的細胞を、１ ｘ １０６個の標的細胞を２００ｍＣｉ５１Ｃｒ／ｍｌを含む培養培地中で１時間３７℃にてインキュベートすることにより事前に標識化しておく。標識化の後で細胞を３回洗浄する。各アッセイ点（Ｅ：Ｔ比）では三回反復してアッセイし、そして、自然な５１Ｃｒの放出（アッセイにリンパ球を加えない）及び１００％の放出（界面活性剤による細胞の溶解）を測定して適当な対照として用いた。細胞混合物を４時間インキュベートした後、細胞を２００ｇにて５分間遠心分離してペレット化する。上清に放出された５１Ｃｒの量をガンマカウンターにより測定した。細胞傷害性％は、試験サンプルのｃｐｍから自然な放出のｃｐｍを引いたものを、界面活性剤による全放出のｃｐｍから自然な放出のｃｐｍを引いたもので割ることにより評価する。
【０１７０】
ＭＨＣクラスＩカスケードをブロックする目的で、Ｋ−４４ハイブリドーマ細胞（抗ＭＨＣクラスＩハイブリドーマ）から得た濃縮されたハイブリドーマの上清を、最終濃度が１２．５％になるまで試験サンプルに添加する（Ｈｅｉｋｅら， １９９４， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ １５：１６５−１７４）。
【０１７１】
クロム放出アッセイの代わりとしては、特異的抗原で刺激した後のｉｎ ｖｉｔｒｏでの細胞傷害性Ｔ細胞によるサイトカイン放出を測定するＥＬＩＳＰＯＴアッセイである。サイトカイン放出を特定のサイトカイン（インターロイキン−２、腫瘍壊死因子α又はインターフェロン−γなど）に特異的な抗体により検出する（例えばＳｃｈｅｉｂｅｎｂｏｇｅｎら， １９９７， Ｉｎｔ． Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ， ７１：９３２−９３６を参照されたい）。このアッセイは、Ｔ細胞により分泌される目的のサイトカインを捕捉する該サイトカインに特異的な抗体によりプレコートされたマイクロタイタープレートにおいて行う。コートしたウェルにおいて２４〜４８時間Ｔ細胞をインキュベートしたのち、細胞傷害性Ｔ細胞を除き、サイトカイン上の異なるエピトープを認識する第二の標識化抗体で置き換えた。結合していない抗体を除くためによく洗浄した後、有色の反応生成物を生じる酵素基質をプレートに添加する。サイトカイン産生細胞の数を顕微鏡下にて数える。この方法は、アッセイ時間の短さ及び大量の細胞傷害性Ｔ細胞を必要としない感度の高さという利点を有している。
【０１７２】
５．３．５ 免疫療法の際の効果のモニタリング
α２Ｍポリペプチド−抗原分子複合体による免疫療法の効果は当業者にとって既知の任意の方法によりモニターすることができる。その方法には、ａ） 細胞性免疫の評価としての遅延型過敏性の測定； ｂ） 細胞傷害性Ｔリンパ球のｉｎ ｖｉｔｒｏでの活性の測定； ｃ） 感染因子抗原又は腫瘍特異的抗原（例えば癌胎児抗原（ＣＥＡ））のレベルの測定が含まれるがこれらに限らない。α２Ｍ−抗原分子複合体を癌の予防及び治療のために使用する場合には、効果は更に、ｄ） コンピューター断層撮影（ＣＴ）スキャン等の技法を用いた腫瘍の形態の変化； 及び、ｅ） 危険度の高い個体における、特定の癌についての危険度の推定上のバイオマーカーのレベルの変化、及びｆ） ソノグラムを用いた腫瘍の形態の変化によってもモニターすることができる。
【０１７３】
５．３．５．１ 遅延型過敏性に基づく皮膚試験
遅延型過敏性に基づく皮膚試験は、ある抗原に対する全般的な免疫能及び細胞性免疫において非常に有用である。一連の共通皮膚抗原に対する反応ができなくなることはアネルギーと称される（Ｓａｔｏら， １９９５， Ｃｌｉｎ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｐａｔｈｏｌ． ７４：３５−４３）。
【０１７４】
皮膚試験の正しい技法では、抗原を４℃にて無菌状態で保存し、光から保護し、そして使用直前に再構成することが必要である。Ａ２５−又は２７−ゲージ針により、抗原の皮下投与ではなく皮内投与を確実に行える。抗原の皮内投与の２４時間後及び４８時間後に、紅斑及び硬結の両者の最大寸法を物差しで測定する。所定の抗原又は抗原の群に対する活性低下を、より高い濃度の抗原を用いた試験、又は、あいまいな状況での中間的な試験により、反復的な試験によって確認する。
【０１７５】
５．３．５．２ 細胞傷害性Ｔ細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏでの活性化
細胞傷害性Ｔ細胞の活性はｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて次の方法を用いて評価することができる。フィコール−ハイパーク勾配遠心分離法により単離した８ ｘ １０６個の末梢血由来Ｔリンパ球を、１０％ウシ胎仔血清を含む３ｍｌのＲＰＭＩ培地中にて、４ ｘ １０４個のマイトマイシンＣ処理した腫瘍細胞により再刺激する。ある場合では、３３％の第２の混合リンパ球培養物の上清すなわちＩＬ−２を、Ｔ細胞増殖因子の供給源として培養培地中に含ませる。
【０１７６】
免疫化後の細胞傷害性Ｔ細胞の一次応答を試験するために、刺激用の腫瘍細胞を用いずにＴ細胞を培養する。他の実験では、Ｔ細胞を抗原性の異なる細胞により再刺激する。６日後に、培養物について４時間５１Ｃｒ−放出アッセイにより細胞傷害性を試験する。標的物の自然な５１Ｃｒの放出は２０％未満のレベルのはずである。抗−ＭＨＣクラスＩブロッキング活性のため、Ｗ６／３２ハイブリドーマの１０倍濃縮液を最終濃度が１２．５％になるまで試験系に添加する（Ｈｅｉｋｅ Ｍ．ら， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ １５：１６５−１７４）。
【０１７７】
５．３．５．３ 腫瘍特異的抗原のレベル
全ての腫瘍上に特有の腫瘍抗原を検出するのは不可能かもしれないが、多くの腫瘍が正常細胞とは異なる抗原を示す。モノクローナル抗体試薬は抗原の単離や生化学的分析を可能にするとともに、形質転換された細胞と形質転換されていない細胞との区別のため、及び形質転換された細胞の細胞系統を確定するために、診断上非常に有益である。最も解明が進んでいるヒト腫瘍関連抗原は腫瘍胎児抗原である。かかる抗原は胚形成の際に発現されるが、正常な成人の組織には存在しないか又は検出することが非常に難しい。この標準的な抗原が癌胎児抗原（ＣＥＡ）である。それは胎児の腸及びヒトの大腸癌に見られる糖タンパク質であるが正常な成人の大腸細胞には見られない。ＣＥＡは大腸癌細胞から流出して血清中に見られるので、元々は、血清でのこの抗原の存在は大腸癌の患者をスクリーニングするために用いることができると考えられていた。しかしながら、他の腫瘍（脾臓癌及び乳癌など）を有する患者も高い血清レベルのＣＥＡを有する。従って、治療を受ける癌患者においてＣＥＡレベルの下降及び上昇をモニターすることは腫瘍の進行及び治療への応答を予測するのに有用であることが分かっている。
【０１７８】
幾つかの他の腫瘍胎児性抗原がヒトの腫瘍を診断したりモニターするために有用である。例えば、通常は胎児の肝臓及び卵黄嚢細胞により分泌されるα−グロブリンであるα−フェトプロテインは肝臓腫瘍及び胚細胞腫瘍を有する患者の血清に見いだされ、疾患状態のマーカーとして用いることができる。
【０１７９】
５．３．５．４ コンピューター断層撮影（ＣＴ）スキャン
癌の正確なステージ分類のための技術の選択肢としてＣＴがある。ＣＴは転移癌を検出するための他のいかなるイメージング技法よりもより高感度かつ特異的であることが判っている。癌の正確なステージ分類のための技術の他に採り得る選択肢としてソノグラムがある。
【０１８０】
５．３．５．５ 推定上のバイオマーカーの測定
特定の癌についての危険度の推定上のバイオマーカーのレベルを、抗原分子複合体と共有結合により又は非共有結合により結合したα２Ｍの効果をモニターするために測定する。例えば、前立腺癌の危険性が高い個体において、血清前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）をＢｒａｗｅｒら， １９９２， Ｊ． Ｕｒｏｌ． １４７：８４１−８４５及びＣａｔａｌｏｎａら， １９９３， ＪＡＭＡ ２７０：９４８−９５８に記載の手順により測定する。さらに、乳癌の危険性が高い個体において、エストラジオールの１６−α−ヒドロキシル化を、Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒら， １９８２， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７９：３０４７−３０５１に記載の手順により測定する。
【０１８１】
５．４ 標的自己免疫疾患
本発明の方法によって治療することができる自己免疫疾患には、インシュリン依存型真性糖尿病（すなわちＩＤＤＭ又は自己免疫性糖尿病）、多発性硬化症、全身性紅斑性狼瘡、シェーグレン症候群、硬皮症、多発性筋炎、慢性活動性肝炎、混合結合組織病、原発性胆汁性肝硬変、悪性貧血、自己免疫性甲状腺炎、特発性アディソン病、白斑、グルテン過敏性腸疾患、グレーヴズ病、重症筋無力症、自己免液性好中球減少症、特発性血小板減少性紫斑病、慢性関節リウマチ、肝硬変、尋常性天疱瘡、自己免疫性不妊症、グッドパスチャー病、水疱性類天疱瘡、円板状狼瘡、潰瘍性大腸炎、及び密沈積症（ｄｅｎｓｅ ｄｅｐｏｓｉｔ ｄｉｓｅａｓｅ）が含まれるがこれらに限定されない。本明細書中で記載されるとおり、上記疾患には、このような疾患の動物モデル（例えばＩＤＤＭの非肥満型糖尿病（ＮＯＤ）マウス、及び多発性硬化症の実験用自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）マウスなど）により示されるものが含まれる。
【０１８２】
本発明の方法を用いて、患者自身の（自己の）組織への免疫反応を低下させる又は取り除くことにより、あるいは自己免疫反応によりダメージを受けた自己の組織若しくは器官の代わりに移植された組織若しくは器官に対する既存の自己免疫反応を低下させる又は取り除くことにより、このような自己免疫疾患を治療することができる。
【０１８３】
５．５ 標的となる感染症
本発明の方法及び組成物を用いて治療又は予防することができる感染症には、ウイルス、細菌、原生動物及び細胞内寄生虫などの細胞内病原体によって引き起こされるものが挙げられる。ウイルスには、ウイルス疾患が含まれ、例えばＢ型肝炎ウイルス、パルボウイルス（アデノ随伴ウイルスやサイトメガロウイルスなど）、パポバウイルス（パピローマウイルス、ポリオーマウイルス、及びＳＶ４０）、アデノウイルス、ヘルペスウイルス（単純ヘルペスウイルスＩ型（ＨＳＶ−Ｉ）、単純ヘルペスウイルスＩＩ型（ＨＳＶ−ＩＩ）及びエプスタイン−バーウイルスなど）、ポックスウイルス（天然痘（痘瘡）及びワクシニアウイルスなど）、ＲＮＡウイルス（ヒト免疫不全ウイルスＩ型（ＨＩＶ−Ｉ）、ヒト免疫不全ウイルスＩＩ型（ＨＩＶ−ＩＩ）、ヒトＴリンパ球好性ウイルスＩ型（ＨＴＬＶ−Ｉ）及びヒトＴリンパ球好性ウイルスＩＩ型（ＨＴＬＶ−ＩＩ）を含むがこれらに限定されない）、インフルエンザウイルス、はしかウイルス、狂犬病ウイルス、センダイウイルス、ピコルナウイルス（ポリオウイルス、コクサッキーウイルス、ライノウイルスなど）、レオウイルス、トガウイルス（風疹ウイルス及びセムリキ森林熱ウイルスなど）、アルボウイルス、並びにＡ型肝炎ウイルス等により引き起こされるものが挙げられるがこれらに限定されない。
【０１８４】
他の実施形態において、以下に挙げる病原性細菌（ただしこれらに限定されない）により引き起こされる疾患等（ただしこれらに限定されない）の細菌感染を治療又は予防することができる：化膿連鎖球菌、肺炎連鎖球菌、淋菌、髄膜炎菌、ジフテリア菌、ボツリヌス菌、ウェルチ菌、破傷風菌、インフルエンザ菌、肺炎桿菌、臭鼻菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｏｚａｅｎａｅ）、鼻硬腫菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｒｈｉｎｏｓｃｌｅｒｏｍｏｔｉｓ）、黄色ブドウ球菌、コレラ菌、大腸菌、緑膿菌、牛カンピロバクター症菌（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ （Ｖｉｂｒｉｏ） ｆｅｔｕｓ）、カンピロバクター・ジェジュニ、アエロモナス・ヒドロフィラ、バシラス・セレウス、エドワードシエラ・タルダ（Ｅｄｗａｒｄｓｉｅｌｌａ ｔａｒｄａ）、エルシニア・エンテロコリチカ、ペスト菌、偽結核エルジニア菌、志賀赤痢菌、フレクスナー赤痢菌、ソンネ赤痢菌、ネズミチフス菌、腸チフス菌、梅毒トレポネーマ、フランベジアトレポネーマ、ピンタ・トレポネーマ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｃａｒａｔｅｒｕｍ）、ヴァンサンボレリア（Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｖｉｎｃｅｎｔｉｉ）、ライム病ボレリア（Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）、黄疸出血症レプトスピラ、ヒト型結核菌、トキソプラスマ（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ ｇｏｎｄｉｉ）、ニューモシスティス・カリニ、野兎病菌、ウシ流産菌、ブタ流産菌、マルタ熱菌、マイコプラスマ属に属する種、発疹チフスリケッチア、ツツガムシ病リケッチア、クラミジア属に属する種、及びヘリコバクター・ピロリ。
【０１８５】
他の好適な実施形態において、これらの方法は、以下に挙げる病原性原生動物（ただしこれらに限定されない）により引き起こされる感染症を治療又は予防するために使用することができる：赤痢アメーバ（Ｅｎｔｏｍｏｅｂａ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ）、口腔トリコモナス（Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ ｔｅｎａｓ）、腸トリコモナス、腟トリコモナス、ガンビアトリパノソーマ、ローデシアトリパノソーマ、クルーズトリパノソーマ、ドノバンリーシュマニア、熱帯リーシュマニア、ブラジルリーシュマニア、肺炎ニューモシスティス（Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）、三日熱マラリア原虫、熱帯熱マラリア原虫、及び四日熱マラリア原虫。
【０１８６】
５．６ 標的となる増殖性細胞疾患
α２Ｍ−α２Ｍ活性に関係する特定の増殖性及び腫瘍性疾患に関して、本発明の方法によって治療又は予防することができる疾患には以下のものが含まれるが、これらに限定されない：ヒト肉腫及び癌腫（例えば線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮腫、骨膜腫、中皮腫、ユーイング肉腫、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、大腸癌、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、脂腺癌、乳頭状癌、乳頭状腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支原生癌、腎細胞癌、ヘパトーム、胆管癌、絨毛癌、セミノーマ、胎生期癌、ウィルムス腫、子宮頸癌、精巣癌、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神経膠腫、星状細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、脳室上衣腫、松果体腫、血管芽腫、聴神経腫、乏突起神経膠腫、髄膜腫、黒色腫、神経芽腫、網膜芽腫など）；急性リンパ性白血病及び急性骨髄性白血病などの白血病（例えば骨髄芽球性白血病、前骨髄球性白血病、骨髄単球性白血病、単球性白血病、及び赤白血病）；慢性白血病（慢性骨髄性（顆粒球性）白血病及び慢性リンパ性白血病）；並びに真性赤血球増加症、リンパ腫（ホジキン病及び非ホジキン病）、多発性骨髄腫、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症、及びＨ鎖病。
【０１８７】
細胞増殖に欠陥のある、又は治療若しくは予防のために細胞増殖が望まれる疾患及び障害であって、例えば創傷の治癒を促進するため、又は変性した、損傷した、若しくは負傷した組織等の再生を促進するために、α２Ｍの機能を阻害することにより治療若しくは予防することができる疾患及び障害には、以下のものが含まれるがこれらに限定されない：変性疾患、成長不良、低増殖性障害（ｈｙｐｏｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ ｄｉｓｏｒｄｅｒ）、物理的外傷、損傷、及び創傷。
【０１８８】
５．７ 投薬計画及び製剤化
本発明のα２Ｍポリペプチドと抗原分子との共有結合性又は非共有結合性の複合体は、免疫療法のために治療上有効な用量で、感染症若しくは癌の治療又は予防のために哺乳動物に投与するための医薬製剤として製剤化することができる。
【０１８９】
好ましい有効用量の選択は、当業者にとって公知の幾つかの要因を考慮して当業者により判断されるであろう。そのような要因としては、α２Ｍの特定の形態及びその薬物動態学的パラメーター（バイオアベイラビリティー、代謝、半減期など）が挙げられる。これらはある医薬化合物について規制当局の認可を受ける際に典型的に用いられる通常の開発過程を通じて確定されるであろう。用量を考慮する上での更なる要因としては、治療しようとする症状及び疾患、又は正常個体で達成される利益、患者の体重、投与経路、該投与が急性的であるのか慢性的であるのか、併用薬、及び、投与される医薬物質の効き目に影響を及ぼすことが周知である他の要因が挙げられる。このように、正確な用量は担当医の判断及び各患者の事情により、例えば個々の患者の症状及び免疫状態に基づいて、標準的な臨床手法によって決定されるべきである。
【０１９０】
本発明のα２Ｍポリペプチドと抗原分子との共有結合性又は非共有結合の複合体は、感染症若しくは癌の治療又は予防のために哺乳動物に投与するための医薬製剤として製剤化することができる。薬物の溶解性及び吸収部位は治療用薬剤の投与経路を選択するときに考慮するべき要因である。
【０１９１】
本発明のα２Ｍポリペプチド−抗原分子複合体は、場合により、免疫学的応答を高める目的で１以上のアジュバントとともに投与することができる。例えば、宿主の種に応じて、使用し得るアジュバントとしては、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム及びリン酸カルシウムのような鉱物塩又は鉱物ゲル；リゾレシチン、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油乳濁液、キーホールリンペットヘモシアニン及びジニトロフェノールのような界面活性化物質；サイトカイン、サポニン、ムラミールジペプチド及びトリペプチド誘導体、ＣｐＧジヌクレオチド、ＣｐＧオリゴヌクレオチド、モノホスホリル脂質Ａ、ポリホスファゼンのような免疫刺激分子；エマルジョン、リポソーム、ウイロソーム、コクリート（ｃｏｃｈｌｅａｔｅｓ）のような粒子状及び微粒子状アジュバント；免疫刺激性複合体の粘膜アジュバント、フロイントアジュバント（完全及び不完全、並びに、ＢＣＧ（パルメット・ゲラン菌）及びコリネバクテリウム・パルバムのような潜在的に有用なヒトアジュバント）が挙げられるがこれらに限らない。
【０１９２】
本発明のα２Ｍポリペプチド−抗原分子複合体は、例えば皮下投与、静脈内投与又は筋肉内投与を含むがこれらに限らない任意の所望の投与経路を用いて投与することができる。なお皮内投与又は粘膜投与が好ましい。皮内投与又は粘膜投与の長所には、それぞれ、より少ない用量の使用又は迅速な吸収が含まれる。投与の粘膜経路には、経口投与、直腸投与及び鼻内投与が含まれるがこれらに限らない。粘膜投与のための調製物は下記の種々の製剤化において好適である。投与経路は治療の間に変更することができる。
【０１９３】
以上で挙げた服用を好ましくは約４〜６週間、毎週１回行う。そして好ましくは投与の様式及び部位を投与のたびに変える。好ましい実施形態では、皮下投与を行い、各回の投与部位を順次変える。すなわち、限定するものではないが、例えば、１回目の注射は左腕の皮下に行い、２回目の注射は右腕に行い、３回目の注射は左腹部に行い、４回目の注射は右腹部に行い、５回目の注射は左大腿部に行い、６回目の注射は右大腿部に行う、などである。同じ部位は１回以上の注射の間隔を空けて繰り返す。また、注射を分けて投与することもできる。すなわち、例えば用量の半分をある部位に与え、残りの半分を同日に他の部位に与える。
【０１９４】
あるいは、投与の様式を順次に変えて行く。例えば毎週の注射を皮下、筋肉内、静脈内又は腹腔内に順次に行う。
【０１９５】
４〜６週間後は、更なる注射を好ましくは２週間の間隔で１ヶ月にわたり行う。その後の注射は１ヶ月の間隔で行えばよい。後の注射のペースは、患者の臨床上の進行と免疫療法に対する応答性に応じて変えることができる。
【０１９６】
適合性の医薬用担体中に製剤化された共有結合性又は非共有結合性の複合体を含む組成物を、対象とする感染症又は腫瘍の治療のために調製し、包装し、そしてラベル付けすることができる。好ましい形態では、約２〜１５０μｇ、好ましくは２〜５０μｇ、最も好ましくは約２５μｇの範囲の量のα２Ｍポリペプチド−抗原分子複合体を、ヒトに対して、約４〜６週間にわたり週に１回、投与部位を順次変えて皮内投与する。
【０１９７】
該複合体が水溶性であれば、適切な緩衝液（例えばリン酸緩衝化生理食塩水又は他の生理学的に適合性の溶液）中に製剤化することができる。あるいは、得られる複合体が水溶液中で溶解性が低い場合は、Ｔｗｅｅｎ又はポリエチレングリコールのような非イオン性界面活性剤とともに製剤化することができる。このように、共有結合性又は非共有結合性の複合体及びその生理学的に許容される溶媒和物を、吸入法又は吹入法（口又は鼻による）による投与、又は経口投与、バッカル投与、非経口投与、直腸投与のために製剤化することができ、又は、腫瘍の場合は充実性腫瘍への直接的注入のために製剤化することができる。
【０１９８】
経口投与のためには、医薬調製物は、液体状（例えば溶液、シロップ又は懸濁液）であってよく、使用直前に水若しくは他の好適なビヒクルにより再構成するための薬剤として提供してもよい。かかる液体製剤は、懸濁剤（例えばソルビトールシロップ、セルロース誘導体又は食用硬化油脂）；乳化剤（例えばレシチン又はアカシア）；非水性ビヒクル（例えばアーモンド油、油性エステル又は精製植物油）；保存剤（例えばメチル−若しくはプロピル−ｐ−ヒドロキシ安息香酸エステル、又はソルビン酸）などの薬学的に許容される添加物とともに通常の方法により調製することができる。医薬組成物は例えば、結合剤（例えばα化トウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドン又はヒドロキシプロピルメチルセルロース）；充填剤（例えばラクトース、微結晶セルロース又はリン酸水素カルシウム）；滑沢剤（例えばステアリン酸マグネシウム、タルク又はシリカ）；崩壊剤（例えばジャガイモスターチ又はデンプングリコール酸ナトリウム）；又は湿潤剤（例えばラウリル硫酸ナトリウム）などの薬学的に許容される賦形剤とともに通常の方法により調製した錠剤又はカプセルの形態をとりうる。錠剤は当該技術分野において周知の方法によりコーティングしてもよい。
【０１９９】
経口投与のための製剤は、本発明の複合体の制御放出が為されるように好適に製剤化され得る。かかる組成物は通常の方法で製剤化された錠剤又はロゼンジの形態をとり得る。
【０２００】
吸入法により投入する場合、本発明の複合体は、適切な噴射剤（例えばジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素又は他の好適な気体）を用いて、圧力パック又はネブライザーからエアロゾルスプレーとして都合よく送達される。加圧エアロゾルの場合、服用量単位は、一定量を送達するためのバルブを備えることにより決定することができる。吸入器又は吹入器で用いる例えばゼラチン製等のカプセル及び薬包は、ラクトースやデンプンなどの好適な粉末基剤と本発明の複合体との混合粉末を含んで製剤化することができる。
【０２０１】
本発明の複合体は、注射による（例えばボーラス注射又は連続注入などによる）非経口投与用に製剤化することができる。注射用製剤は、用量単位の剤形として、例えばアンプル又は複数投薬容器の中に保存剤を加えた形で提供されてもよい。本発明の組成物は、油性若しくは水性ビヒクル中の懸濁液、溶液又は乳剤などの形態であっても良く、懸濁剤、安定化剤及び／又は分散剤等の製剤化剤を含み得る。あるいは、有効成分は、使用する前に好適なビヒクル（例えば発熱物質を含まない無菌水）で構成するための粉末状のものであってもよい。
【０２０２】
また本発明の複合体は、例えばカカオバター又は他のグリセリド等の従来の坐剤基剤を含む坐剤又は貯留浣腸等の直腸用組成物として製剤化してもよい。
【０２０３】
先に記載した製剤のほかに、本発明の化合物は、デポ製剤として製剤化されてもよい。このような長時間作用する製剤は、体内移植（例えば皮下又は筋肉内）により、又は筋肉内注射により、投与することができる。したがって、例えば本発明の化合物は好適なポリマー材料若しくは疎水性材料と一緒に（例えば許容可能な油中の乳剤として）、又はイオン交換樹脂と一緒に、あるいは例えば難溶性塩等の難溶性誘導体として、製剤化することができる。リポソーム及びエマルジョンは、親水性の薬物の送達ビヒクル又は担体として周知の例である。
【０２０４】
望ましい場合、本発明の複合体は、共有結合による又は非共有結合による複合体を含む単位剤形を１つ以上含むパック又はディスペンサーに入れて提供してもよい。パックは例えば金属箔又はプラスチック箔製のもの（ブリスターパック等）であってもよい。パック又はディスペンサーに、投与方法説明書を添付してもよい。
【０２０５】
本発明はまた本発明の治療計画を行うためのキットをも提供する。かかるキットは、１以上の容器内に、治療上又は予防上有効な量の共有結合性又は非共有結合性のα２Ｍポリペプチド−抗原分子複合体を薬学的に許容し得る形態で含んでいる。本発明のキットのバイアル瓶内のα２Ｍポリペプチド−抗原分子複合体は薬学的に許容し得る溶液の形態であり得る。例えば、無菌の生理的食塩水、デキストロース溶液、若しくは緩衝化した溶液、又は薬学的に許容され得る無菌の溶液と組合わせられている。あるいは、該複合体は凍結乾燥されているか又は乾燥されていてよい。この場合は、該キットは更に、場合により、注射する目的で該複合体を溶液として再構成するために、容器中に、好ましくは無菌の、薬学的に許容され得る溶液（例えば生理的食塩水、デキストロース溶液等）を含む。
【０２０６】
他の実施形態では、本発明のキットは更に、複合体を注射するための、好ましくは無菌の形態で包装された針又はシリンジ、及び／又は包装されたアルコールパッドを含んでいる。場合により、臨床医又は患者がα２Ｍポリペプチド−抗原分子複合体を投与するための説明書を含む。
【０２０７】
６． 実施例： α２Ｍは、α２Ｍ受容体を介するＨＳＰ−媒介抗原提示と拮抗する
６．１ 序論
ここで示す実施例では、ｇｐ９６と、マクロファージ及び樹状細胞上に存在するα２Ｍ受容体との間のｉｎ ｖｉｖｏでの相互作用の同定が成功裡に行われたこと、並びに、この相互作用がα２Ｍにより阻害されることを記載する。ここに示す実験は、免疫疾患、増殖性疾患及び感染症の治療のための免疫療法薬剤としてのα２Ｍポリペプチド−抗原分子複合体の使用に関する本発明の組成物及び治療方法についての基盤となるものである。
【０２０８】
本発明者は、ある観察結果が、ＨＳＰシャペロン化ペプチド抗原（ＨＳＰ−ｃｈａｐｅｒｏｎｅｄｐｅｐｔｉｄｅ ａｎｔｉｇｅｎ）の提示の「直接輸送」モデルと一致しないことに気付いた。まず、ＨＳＰ調製物の免疫原性は、Ｂ細胞や他の非プロフェッショナル抗原提示細胞ではなく機能的な食細胞の存在に依存するが（Ｕｄｏｎｏ及びＳｒｉｖａｓｔａｖａ， １９９３（前掲）； Ｓｕｔｏ及びＳｒｉｖａｓｔａｖａ， １９９５（前掲））、遊離ペプチドは全ての細胞型を感作することができる。第２に、極端に少量のＨＳＰ−ペプチド複合体は、特異的な免疫を誘発するのに効果的であった。すなわち、ＣＴＬ認識のためにマクロファージを感作する上で、ｇｐ９６シャペロン化ペプチドは、遊離ペプチドに比べて数百倍効果がある。このことは、特異的な取込みメカニズムが存在する可能性を示唆している。第３に、ｇｐ９６シャペロン化ペプチドは、ＭＨＣ Ｉ反応を誘発し、この反応はペプチドの大きさによって制限されなかった。最後に、マクロファージ中でのｇｐ９６−ペプチド複合体のプロセッシングは、ブレフェルジンＡ（ＢＦＡ）（ゴルジ体を経由する輸送を遮断する）に対して感受性であることが分かった。このことは、細胞内のメカニズムを介してプロセッシングが起こったことを示す。これらの観察結果により、ＨＳＰシャペロン化ペプチドは、内部でプロセシングされ、マクロファージの細胞表面上のＭＨＣクラスＩ分子によって提示される、という仮説が導き出された（Ｓｕｔｏ及びＳｒｉｖａｓｔａｖａ， １９９５（前掲））。また、マンノース受容体がｇｐ９６の取込みに使用されるという仮説もあるが、ＨＳＰ７０などの非グリコシル化ＨＳＰについてのメカニズムは提唱されていない（Ｃｉｕｐｉｔｕら， １９９８， Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ．， １８７： ６８５−６９１）。他の観察結果は、新規な細胞内の輸送経路が、細胞外の媒質からＥＲのルーメンへのペプチドの輸送に関係していることを示した（Ｄａｙら， １９９７， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ９４：８０６５−８０６９； Ｎｉｃｃｈｉｔｔａ， １９９８， Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ． １０：１０３−１０９）。さらに、（ａ） 食胞から細胞質ゾルにタンパク質を短絡させて通常のクラスＩ経路に入れる未だ不明確な経路を有する食細胞及び（ｂ）リソソーム中に摂取された物質を消化してペプチドを表面のクラスＩ分子に負荷させるように戻す食細胞、の関与が示唆されている（Ｂｅｖａｎ， １９９５， Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １９２：６３９−４１）。本明細書中に開示された熱ショックタンパク質に対する受容体の発見は、ＨＳＰと複合体を形成した細胞外抗原性ペプチドがＭＨＣクラスＩ分子により抗原提示細胞上にどのように提示され得るのかというパラドックスを解明する手掛りとなる。
【０２０９】
６．２ 材料及び方法
アフィニティークロマトグラフィー
容量２ｍｌのタンパク質（１ｍｇ）を、還元剤（ＮａＣＮＢＨ３）を加えた平衡化したＡｍｉｎｏＬｉｎｋビーズ含有ＰＢＳ（２ｍｌ）と一緒に、１時間インキュベートした。カラムを徹底的に洗浄することにより、結合しなかったタンパク質を除去し、未反応基をクエンチングさせた。固定化の収率は、一般には、タンパク質の最初の量の９２％を超えていた。カラムは使用するまで４℃で保存した。このようなカラムを、ｇｐ９６（Ｓｒｉｖａｓｔａｖａら， １９８６， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．， Ｕ．Ｓ．Ａ． ８３：３４０７−３４１１に記載されたように精製した）及びアルブミンを用いて作成した。膜を精製するために、ダウンスホモジェナイズによりＰＭＳＦを含む低張緩衝液中に細胞を溶解した。１０００ｇにて５分間遠心分離することにより、溶解しなかった細胞及び核を取り除いた。核を取り除いた上清を１００，０００ｇにて９０分間遠心分離した。ペレットは全ての膜を含んでおり、デキストラン／ポリエチレングリコールの二重相で、水性二相分画により分画した。簡潔にいえば、膜をＰＥＧ（０．２２Ｍリン酸ナトリウム緩衝液中、３３重量％；ｐＨ６．５）中に再懸濁し、デキストラン（０．２２Ｍリン酸ナトリウム緩衝液中、２０重量％；ｐＨ６．５）の上に穏やかに重層した。これら２つの相をゆっくりかき混ぜ、２０００ｇにて１５分間遠心分離した。これらの境界相にある白い物質は原形質膜を豊富に含んでおり、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ８、０．０８％オクチルグルコシドを含む）中で４℃にて２時間インキュベートすることにより、これらのタンパク質を抽出した。
【０２１０】
推定上の受容体へのｇｐ９６の光架橋
架橋剤ＳＡＳＤ（Ｐｉｅｒｃｅ）を、ヨードビーズ（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いてＩ１２５で標識した。放射性標識したＳＡＳＤを、室温にて１時間インキュベートすることによって、共有結合によりｇｐ９６に結合させた。遊離ＳＡＳＤ及びＩ１２５をサイズ排除カラム（ＫｗｉｋＳｅｐカラム， Ｐｉｅｒｃｅ）により除去した。架橋研究のために、Ｉ１２５−ＳＡＳＤ−ｇｐ９６（５０μｇ ｇｐ９６）を精製ＣＤ１１ｂ＋細胞と一緒にインキュベートした。結合していないタンパク質を洗浄して除去した。この点について、全ての手順は、非常に微かな光の中で行った。紫外線でタンパク質を架橋させた。溶解バッファー（０．５％ＮＰ４Ｏ， １０ｍＭ Ｔｒｉｓ， １ｍＭＥＤＴＡ， １５０ｍＭ ＮａＣｌ）で細胞を溶解し、１００ｍＭ ２−メルカプトエタノールで処理して架橋を切断した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びオートラジオグラフィーにより、細胞溶解液を分析した。
【０２１１】
提示アッセイ
Ｓｕｔｏ及びＳｒｉｖａｓｔａｖａ， １９９５， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６９：１５８５−１５８８に記載されたように、提示アッセイを行った。抗原提示細胞（ＲＡＷ２６４．７マクロファージ細胞系）を、完全ＲＰＭＩ中でＡＨＩ−特異的Ｔ細胞と一緒に１：１の比率でプレーティングした。各タイプにつき約１０，０００個の細胞を用いた。ＡＨ１−２０量体ペプチド（ＲＶＴＹＨＳＰＳＹＶＹＨＱＦＥＲＲＡＫ）をシャペロン化するｇｐ９６（１０μｇ／ｍｌ）を細胞に加え、全培養物を２０時間インキュベートした。ＥＬＩＳＡ（Ｅｎｄｏｇｅｎ）により上清中に放出されたＩＦＮ−γの量を定量することにより、Ｔ細胞の刺激を測定した。
【０２１２】
タンパク質のマイクロ配列決定法
アフィニティークロマトグラフィーにより同定されたタンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析し、さらにクーマシーブルーで染色するか、又はＰＶＤＦ膜に移してクーマシーブルーで染色した（全てケラチンを含まない条件下で行った）。かみそりでゲル又は膜からタンパク質バンドを切り出した。８０ｋＤａのかすかなクーマシーバンドからトリプシンペプチドを、５０％アセトニトリル、５％蟻酸で抽出し、乾燥し、７５ｍ １０ｃｍの逆相Ｃ１８マイクロキャピラリーカラム（体積３μｌ）上に載せ、オンラインマイクロキャピラリー液体クロマトグラフィー−タンデム型質量分析法によりトリプシンペプチドを分離した後、先に記載されたように、ＳＥＱＵＥＳＴプログラムを用いてデータベース検索を行った（Ｇａｔｌｉｎら， ２０００， Ａｎａｌ． Ｃｈｅｍ． ７２：７５７−６３； Ｌｉｎｋら， １９９９， Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １７：６７６−８２）。Ｆｉｎｎｉｇａｎ ＬＣＱイオントラップ質量分析計を用いて、データ依存型自動ＭＳ／ＭＳ様式で、分析を行った。
【０２１３】
６．３　結果
潜在的ｇｐ９６受容体としての８０ｋＤａタンパク質の同定
ｇｐ９６の均質な調製物をＦＩＴＣに結合させ、ｇｐ９６−ＦＩＴＣを用いてＲＡＷ２６４．７細胞を染色したところ、ｇｐ９６によりシャペロン化されたペプチドを提示することができる機能があることが分かった。ｇｐ９６−ＦＩＴＣはＲＡＷ２６４．７細胞の細胞表面を染色したが、対照アルブミンＦＩＴＣ調製物は染色しなかった（図１Ａ）。細胞表面ビオチン化ＲＡＷ２６４．７細胞の原形質膜調製物を、０．０８％オクチル−グルコシド中に可溶化し、可溶性抽出物をｇｐ９６−セファロースカラムに加えた。結合したタンパク質を３Ｍの塩化ナトリウムで溶出した。溶出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を行ったところ、およそ７５〜８０ｋＤａのサイズの２つの大きなバンドが得られた（図１Ｂ、左上）。このゲルをアビジン−ペルオキシダーゼを用いてブロットしたところ、いずれのバンドもビオチン化されていることが分かった。これは、これらが表面に局在していることを示す（図１Ｂ、左下）。対照血清アルブミンアフィニティーカラム上でのＲＡＷ２６４．７細胞の膜抽出物のアフィニティー精製では、いずれのタンパク質も単離されず、このようなゲルのイムノブロットをアビジンペルオキシダーゼでプローブしても、アルブミン結合性表面タンパク質は検出されなかった（図１Ｂ、一番上及び一番下の中央のライン）。ｇｐ９６アフィニティーカラム上で、追加的な対照として、ｇｐ９６−ＦＩＴＣに結合せず、かつｇｐ９６によりシャペロン化されたペプチドを提示しないＰ８１５細胞の膜抽出物のクロマトグラフィーを行ったが、ｇｐ９６−結合タンパク質は溶出されなかった（図１Ｂ、一番上及び一番下の右側のライン）。
【０２１４】
並行実験で、ｇｐ９６分子を、光架橋可能基を含む放射性ヨウ素化リンカーであるスルホスクシンイミジル（４−アジドサリチルアミド）ヘキサノエート（ＳＡＳＤ）に結合させた。ｇｐ９６−ＳＡＳＤ−Ｉ１２５を、ｇｐ９６によりシャペロン化されたペプチドを提示することが先に証明されている腹腔マクロファージ（Ｓｕｔｏ及びＳｒｉｖａｓｔａｖａ， １９９５， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６９：１５８５−１５８８）上にパルスした。細胞の洗浄を何度も行って過剰なｇｐ９６−ＳＡＳＤを除去し、紫外線を細胞に１０分間照射することにより、光活性化を行った。推定上のｇｐ９６リガンドにＩ１２５基を転移させるために、細胞溶解液を還元し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの後にオートラジオグラフィーを行って分析した。ｇｐ９６分子は、提示不能Ｐ８１５細胞中ではなく提示可能（ｒｅ−ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ−ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ）マクロファージ中に特異的に存在するおよそ８０ｋＤａのバンドに架橋することが観察された（図１Ｃ）。このバンドは、ｇｐ９６アフィニティーカラムの溶出物中に見られる２つのバンドのうち大きな方にサイズが対応するようである（図１Ｂ）。その調製物の下方のバンドに対応するバンドは、光架橋調製物中には見られない。ｇｐ９６が、提示不能細胞系の中ではなく２つの異なる提示可能細胞型の中の８０ｋＤａタンパク質に特異的に結合するという観察結果、並びに２つの独立したアッセイによる観察結果は、この８０ｋＤａ分子がｇｐ９６受容体の候補であることを支持していた。
【０２１５】
８０ｋＤａタンパク質に対する抗血清は、ｇｐ９６によりシャペロン化された抗原性ペプチドの提示を阻害する
７５〜８０ｋＤタンパク質を含む溶出物を用いて、ニュージーランド白ウサギを免疫し、免疫前及び免疫後の血清を用いて、提示可能ＲＡＷ２６４．７、一次腹腔マクロファージ及び提示不能Ｐ８１５細胞の原形質膜抽出物のブロットをプローブした。免疫後の血清は、Ｐ８１５細胞ではなく一次マクロファージ及びＲＡＷ２６４．７膜の原形質膜抽出物中の８０ｋＤａバンド（及びこれより低いかすかな７５ｋＤａバンド）を検出したが、免疫前の血清は検出しなかった（図２Ａ）。免疫前及び免疫後の血清を、ｇｐ９６によりシャペロン化されたペプチドの提示を妨げる能力についての機能アッセイにおいてテストした。ネズミ大腸癌ＣＴ２６のｇｐ７０抗原に由来するＬｄ−制限エピトープＡＨ１（Ｈｕａｎｇら， １９９６， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ９３： ９７３０−９７３５）をモデル系として用いた。ＡＨ１前駆体（直接的な提示を阻害するために使用される）とｇｐ９６との複合体を、ＲＡＷ２６４．７細胞上にパルスし、これらを用いてＬｄ／ＡＨ１特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞クローンを刺激した。クローンによるインターフェロン−γの放出を、それらの活性化をマーカーとして測定した。ＲＡＷ２６４．７細胞は、このアッセイにおいてｇｐ９６によりシャペロン化されたＡＨ１前駆体を効率良く提示することができた。最も高い濃度で、免疫後血清は、提示を完全に阻害したことが観察された（図２Ｂ）。免疫前の血清は、免疫後血清に比べて提示の阻害における効力が低かったが、高い濃度では提示をかなり阻害した。この観察結果の重大性は、後に本発明者らがｇｐ９６受容体の正体を決定したときに明らかとなった。アフィニティー精製したｇｐ９６結合タンパク質で繰返し免疫しても、それに応じて抗体力価が上昇することはなかった。
【０２１６】
α２Ｍ受容体の重鎖のアミノ末端フラグメントとしての８０ｋＤａタンパク質の同定
ｇｐ９６アフィニティーカラムから溶出した８０ｋＤａタンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、クーマシーブリリアントブルーで染色することにより可視化した。タンパク質のバンドをゲル中でトリプシン消化し、第６．２節の「方法」に記載されたように質量分析法をベースとするタンパク質のマイクロ配列決定にかけた。α２−マクログロブリン（α２Ｍ）受容体のＮ末端領域に対応する独立した４つのトリプシンペプチド（免疫学者によりＣＤ９１と呼ばれる）が同定された（図３Ｃ）。
【０２１７】
α２Ｍはｇｐ９６によりシャペロン化された抗原性ペプチドのＲＡＷ２６４．７による提示を阻害する
α２Ｍ受容体は、α２Ｍ受容体の既知の天然リガンドのうちの１つである。ｇｐ９６によりシャペロン化された抗原性ペプチドＡＨ１の提示を阻害するその能力を、図２に記載したアッセイでテストした。α２Ｍは提示を完全に且つ滴定可能に（ｔｉｔｒａｔａｂｌｙ）阻害するが、対照タンパク質であるセレクチン（ＣＤ６２）や血清アルブミンはこれを阻害しないことが観察された（図４）。この観察結果は、免疫前の血清はＲＡＷ２６４．７細胞の原形質膜中の８０ｋＤａバンドを検出しなかったが、高い濃度では提示をある程度阻害した、という図２の結果とも一致していた。このように、構造的基準及び機能的基準により、α２Ｍ受容体は、ｇｐ９６の受容体としての必須基準を満たすと判断された。
【０２１８】
６．４ 考察
α２Ｍ受容体（ＣＤ９１とも呼ばれる）は、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）受容体関連タンパク質（ＬＲＰ）に関係するタンパク質として最初に同定された（Ｓｔｒｉｃｋｌａｎｄら， １９９０， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６５：１７４０１−１７４０４； Ｋｒｉｓｔｅｎｓｅｎら， １９９０， ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ． ２７６：１５１−１５５）。このタンパク質は、およそ４２０ｋＤａのαサブユニット、８５ｋＤａのβサブユニット及び３９ｋＤａがしっかり会合した分子（ＲＡＰ）からなる。α及びβサブユニットは、サイズがおよそ１５Ｋｂである単一の転写産物によってコードされる（Ｖａｎ Ｌｅｕｖｅｎら， １９９３， Ｂｉｏｃｈｉｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ． １１７３：７１−７４）。この受容体は、単球系列の細胞の中、並びに肝細胞、線維芽細胞及びケラチノサイトの中に存在することが証明された。ＣＤ９１は活性化状態の血漿糖蛋白α２Ｍ（これは種々のエンドプロテイナーゼに結合して阻害する）に結合することが既に証明されている。またα２Ｍ受容体はトランスフォーミング増殖因子β（Ｏ Ｃｏｎｎｏｒ−ＭｃＣｏｕｒｔら， １９８７， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６２：１４０９０−１４０９９）、血小板由来増殖因子（Ｈｕａｎｇら， １９８４， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ８１：３４２−３４６）、及び線維芽細胞増殖因子（Ｄｅｎｎｉｓら， １９８９， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６４：７２１０−７２１６）等の他のリガンドにも結合する。したがって、α２Ｍは、その様々なリガンドの活性を調節し、そして特異的に消失させると考えられる。これらの様々なリガンドと複合体を形成すると、α２Ｍは細胞表面上のα２Ｍ受容体に結合し、受容体により媒介されるエンドサイトーシスにより細胞内に取り込まれる。α２Ｍと複合体形成したリガンドの取込みは、α２Ｍ受容体の主な機能であるとこれまで考えられていたが、脂質代謝におけるα２Ｍ受容体の役割も考えられる。α２Ｍ以外のα２Ｍ受容体リガンド（例えば組織特異的プラスミノーゲンアクチベーター＝インヒビター複合体（Ｏｒｔｈら， １９９２， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ８９：７４２２−７４２６）及びウロキナーゼ−ＰＡＩ１複合体（Ｎｙｋｊａｅｒら， １９９２， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６７： １４５４３−１４５４６））が同定された。これらのリガンドは、ある範囲の細胞外血漿産物の浄化におけるα２Ｍ受容体の役割も立証する。
【０２１９】
本明細書で報告された研究は、熱ショックタンパク質ｇｐ９６がα２Ｍ受容体の更なるリガンドであることを示している。ヒトｇｐ９６コード遺伝子は、既に本発明者らにより１２番染色体（ｑ２４．２→ｑ２４．３）にマッピングされている（Ｍａｋｉら， １９９３， Ｓｏｍａｔｉｃ Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ． Ｇｅｎ． １９：７３−８１）。この点において、α２Ｍ受容体遺伝子が同染色体のそう遠くない位置（ｑ１３→ｑ１４）にマッピングされていることは興味深いことである（Ｈｉｌｌｉｋｅｒら， Ｇｅｎｏｍｉｃｓ １３：４７２−４７４）。ｇｐ９６は、α２Ｍなどの他のリガンドを介さずにα２Ｍ受容体に直接結合する。溶液中の又は固相基質に架橋されたｇｐ９６の均質な調製物は、α２Ｍ受容体に結合する。確かに、α２Ｍ受容体の主なリガンドであるα２Ｍは実際に、ｇｐ９６とα２Ｍ受容体との相互作用を促進するのではなく阻害する。これは、ｇｐ９６がα２Ｍ受容体の直接的なリガンドであるという証拠である。ｇｐ９６に結合することが証明された８０ｋＤａタンパク質が、α２Ｍ受容体のαサブユニットのアミノ末端分解産物であることは明らかである。このサイズ範囲のα２Ｍ受容体の分解産物は、過去の研究においても観察されており（Ｊｅｎｓｅｎら， １９８９， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ａｒｃｈ． ５：１７１−１７６）、蛋白加水分解による切断に特に感受性のある独立した外部ドメインがα２Ｍ受容体の中に存在することを示している。
【０２２０】
本明細書中に記載されるように、ｇｐ−９６とα２Ｍ受容体との相互作用は、α２Ｍ受容体の新しいタイプの機能、つまりセンサーとしての機能（以前に知られているその血漿ベースのリガンドを含む細胞外環境のセンサーとしてだけでなく細胞内環境のセンサーとしての機能）を提供する。ｇｐ９６等のＨＳＰは必須の細胞内分子であり、（アポトーシス性ではなく）壊死性の細胞死の条件下においてのみ、細胞外環境の中に放出される。このように、α２Ｍ受容体は、スカベンジャー受容体ＣＤ３６と同じように、壊死性細胞死のセンサーとして機能し得る（図５を参照されたい）。また、近年同定されたホスファチジルセリン結合タンパク質は、アポトーシス性細胞死のセンサー及びアポトーシス細胞の受容体として機能する（Ｓａｖｉｌｌら， １９９２， Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． ９０：１５１３−１５２２； Ｆａｄｏｋら， ２０００， Ｎａｔｕｒｅ ４０５：８５−９０）。アポトーシス細胞とマクロファージとの相互作用は、ＴＮＦなどの炎症性サイトカインのダウンレギュレーションをもたらし（Ｆａｄｏｋら， ２０００（前掲））、ｇｐ９６−ＡＰＣ間の相互作用は、ＡＰＣのＭＨＣ Ｉ分子によるｇｐ９６シャペロン化ペプチドの提示をもたらし、その後、抗原特異的Ｔ細胞の刺激（Ｓｕｔｏ及びＳｒｉｖａｓｔａｖａ， １９９５（前掲））及びさらにＴＮＦ、ＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ−１２などの前炎症性サイトカインの分泌をもたらす。興味深いことに、α２Ｍ（α２Ｍ受容体の独立したリガンド）は、ｇｐ９６シャペロン化ペプチドのマクロファージによる提示を阻害する。この観察結果は、ｇｐ９６シャペロン化ペプチドの提示が、血液中では生理学的に発生し得ず、局在化した壊死性細胞死の結果として組織内においてのみ発生し得ることを示す。これは、テストした全ての条件下で血液中にｇｐ９６又は他のＨＳＰが全く存在しなかったことと一致する。まとめると、これらの観察結果は、組織のひどい損傷及び細胞溶解の結果、血液中にＨＳＰが放出されても、全身性の致命的な前炎症性サイトカインのカスケードには至らないようにするメカニズムの可能性を示唆している。
【０２２１】
したがって、α２Ｍ受容体が、ＡＰＣが（ｉ）α２Ｍ及び他の血漿リガンドを介して血液の細胞外環境を、並びに（ｉｉ）ＨＳＰ（特にｇｐ９６ファミリーのＨＳＰ）を介して組織の細胞内環境を、サンプリングすることができるようにするという可能性がある。前者は、ＡＰＣがその原始的な食細胞機能を実行することができるようにし、後者はＡＰＣがその先天性及び適応性の免疫学的機能を実行することができるようにする。他の観点から見て、ＣＤ３６又はホスファチジルセリンを介したＡＰＣによるアポトーシス細胞の認識は、抗炎症性シグナルをもたらすが、α２Ｍ受容体を介する壊死性細胞とＡＰＣとの相互作用は、炎症前の先天性及び適応性の免疫反応をもたらす（Ｓｒｉｖａｓｔａｖａら， １９９８，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ８：６５７−６６５を参照されたい）。
【０２２２】
本発明は、本発明の個々の態様を１つずつ例示した記載された具体的な実施形態によってその範囲を限定されるものではなく、機能的に同等な方法及び構成要素は、本発明の範囲内に含まれる。実際に、本明細書中に示され記載されたもの以外にも、これまでの説明及び添付した図面を見れば、当業者には本発明の様々な改変が自明となろう。このような改変は、本発明の特許請求の範囲内に含まれるものとする。
【０２２３】
本明細書中に引用された全ての参考文献（特許出願、特許及び他の出版物を含む）は、あらゆる目的のために、本明細書中に参照によりその全体が組み込まれる。
【図面の簡単な説明】
【図１】
推定上のｇｐ９６受容体としての８０ｋＤａ ポリペプチドの同定。Ａ：ｇｐ９６−ＦＩＴＣで染色した提示能のあるＲＡＷ２６４．７細胞の共焦点顕微鏡検査、及びＢ．アルブミン−ＦＩＴＣで染色した提示能のあるＲＡＷ２６４．７細胞の共焦点顕微鏡検査。Ｃ：ｇｐ９６又はアルブミン−セファロース（ＳＡ）カラムから溶出し、銀染色（上）又はアビジン−ペルオキシダーゼ（下）で染色した表面ビオチン化ＲＡＷ２６４．７細胞（提示能あり）又はＰ８１５細胞（提示能なし）からの原形質膜の界面活性剤抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析。Ｄ：ｇｐ９６−ＳＡＳＤ−Ｉ１２５を生存している腹腔マクロファージ（ＭＯ）又はＰ８１５細胞に架橋結合させ、細胞溶解物をＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びオートラジオグラフィーで試験した。示されるように、対照として各種の成分を省いた。
【図２】
抗ｐ８０抗血清は８０ｋＤａ分子を検出し、マクロファージによるｇｐ９６シャペロン化ＡＨ１ペプチドの提示を阻害する。Ａ：免疫前及び免疫後血清を用いて、ＲＡＷ２６４．７細胞、腹腔マクロファージ（両細胞タイプとも提示能あり）又はＰ８１５細胞の原形質膜抽出物のブロットをつり上げた。Ｂ：ｇｐ９６シャペロン化ＡＨ１ペプチドの提示。示した最終希釈で血清を添加した。黒抜きの十字は、ＡＰＣを直接ＡＨ１ペプチドでパルスしたときのＴ細胞刺激のレベルを示す。白抜きの十字は、パルスしなかったＡＰＣについての対応する値を示す。
【図３】
８０ｋＤａ タンパク質のタンパク質マイクロ配列決定。Ａ：タンデム質量分析による単一のトリプシン（ＧＡＬＨＩＹＨＱＲ）ペプチドの分析。確認されたｂ−イオン系列（赤）及びｙ−イオン系列（青）と共に全ての可能なｂ−及びｙ−イオン系列を示す。Ｂ：このペプチドの衝突誘導解離（ＣＩＤ）スペクトルを示す。Ｃ：α２Ｍ受容体からの４つの同定されたペプチド、ペプチド質量、及び配列を示す。
【図４】
α２−マクログロブリンはマクロファージによるｇｐ９６シャペロン化ＡＨ１ペプチドの提示を阻害する。黒抜きの十字は、ＡＰＣを直接ＡＨ１ペプチドでパルスしたときのＴ細胞刺激のレベルを示す。白抜きの十字は、パルスしなかったＡＰＣについての対応する値を示す。
【図５】
α２Ｍ受容体は細胞外ｇｐ９６を検出するその能力ゆえに壊死性細胞死のセンサーとなる。反対に、ホスファチジルセリン（ｐｓ）の受容体（ｐｓＲ）はアポトーシス性細胞死を検出する。
【図６】
Ａ：マウスα２Ｍ受容体ｃＤＮＡ（配列番号１）及びマウスα２Ｍ受容体タンパク質の推定上のオープンリーディングフレーム（Ｇｅｎｂａｎｋ アクセッション番号ＣＡＡ４７８１７）。Ｂ：マウスα２Ｍタンパク質（配列番号２）、ここで、この受容体の８０ｋＤａのｇｐ９６相互作用性断片のマイクロ配列決定により同定された残基は太字で強調してある。
【図７】
Ａ．α２Ｍのアミノ酸配列（配列番号３）。Ｂ．α２Ｍのヌクレオチド配列（配列番号４）。α２Ｍ由来の受容体結合ドメインの１３８アミノ酸配列（配列番号５）には下線を引いた。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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