(57)【要約】本発明は、（ａ）非還元条件下においてドデシル硫酸ナトリウムでのポリアクリルアミドゲル電気泳動で少なくとも１つのバンドを有し、（ｂ）平均分子量５００〜５００，０００ダルトンを有し、（ｃ）タンパク質部分に対して、全窒素０．００５〜０．５質量％およびアミノ窒素０．０００５〜０．０１質量％を有し、（ｄ）水および水性電解質溶液に溶解性であるが、エタノールまたはアセトンに不溶性であり、（ｆ）トリクロロ酢酸またはピクリン酸と共に、水溶液中で沈殿を形成する、抽出溶解性タンパク質画分の、ケラチノサイト分化に特有のタンパク質合成を刺激するため、特にフィラグリン合成を刺激するための使用に関する。本発明はまた、肌の老化、特にシワ形成に対抗するための該タンパク質画分の使用、乾燥肌を処置するためおよび／または肌を乾燥から守るためのその使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）非還元条件下においてドデシル硫酸ナトリウムでのポリアクリルアミドゲル電気泳動で少なくとも１つのバンドを示し、
（ｂ）平均分子量５００〜５００，０００ダルトンを有し、
（ｃ）タンパク質含有率（％）を基準に、０．００５〜０．５質量％の全窒素含有率および０．０００５〜０．０１質量％のアミノ窒素含有率を有し、
（ｄ）水および水性電解質溶液に溶解性であるが、エタノールまたはアセトンに不溶性であり、
（ｅ）トリクロロ酢酸またはピクリン酸と共に、水溶液中で析出物を形成する、
抽出溶解性タンパク質画分の、ケラチノサイト分化に特有のタンパク質合成を刺激するため、とりわけフィラグリン合成を刺激するための使用。
【請求項２】
少なくとも１種のプロテアーゼ阻害因子を含有する画分を、使用することを特徴とする請求項１に記載の使用。
【請求項３】
マメ科の種子を抽出することにより得られる画分を、使用することを特徴とする請求項１または２に記載の使用。
【請求項４】
バンバラナッツ（ボアンドゼイア・スブテラニア（Ｖｏａｎｄｚｅｉａ ｓｕｂｔｅｒｒａｎｅａ））の種子を抽出することにより得られる画分を、使用することを特徴とする請求項３に記載の使用。
【請求項５】
皮膚の老化、とりわけシワに対する、請求項１〜４のいずれかに記載の抽出溶解性タンパク質画分の使用。
【請求項６】
乾燥肌の処置のため、および／または肌の乾燥に対する、請求項１〜４のいずれかに記載の抽出溶解性タンパク質画分の使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（技術分野）
本発明は、一般に化粧品、特にケラチノサイト分化に特有のタンパク質合成を刺激するため、とりわけフィラグリン合成を刺激するために、特別な抽出物を使用することに関する。
【０００２】
（背景技術）
プロフィラグリンは、表皮組織の顆粒層の細胞におけるケラチノサイト顆粒の重要な構成要素である。顆粒層中の合成およびリン酸化されたプロフィラグリンは、約４００ｋＤａの分子量を有するタンパク質であり、フィラグリンの生合成における前駆体として機能し、それは、ケラチノサイトの成熟の際に脱リン酸化およびプロテオリシスによりフィラグリンに転化する。ヒトフィラグリンは、約３７ｋＤａの分子量を有し、カチオン的に変化され、通常、表皮組織の角質層中に見出すことができる（Ｓａｒｒｅｔ ら， Ｐａｔｈ． Ｂｉｏｌ． ３７（４）， ２９７ （１９８９年） 参照）。
【０００３】
フィラグリンは、下方角質層中のケラチン凝集において重要な役割を果たすことが知られている。フィラグリンの分解生成物、即ち遊離アミノ酸およびその誘導体は、角質層から水が失われることを妨げる。従ってフィラグリンは、自然保湿因子（ＮＭＦ）のための必須のリザーバーである。特に老化により引き起こされ得るフィラグリン濃度の減少は、乾燥肌（Ｔ． Ｔｅｚｕｋａ ら， Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ， １９９４年， １８８， 第２１〜２４頁参照）およびシワ（Ｊ．Ｉ． Ｃｏｎｔｅｔ−Ａｕｄｏｎｎｅａｕ ら， Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｊ． Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ， １９９９年， １４０， 第１０３８〜１０４７頁参照）の発生を伴うことが示されている。
【０００４】
（発明の開示）
（発明が解決しようとする技術的課題）
従って本発明が取り組む課題は、ケラチノサイト分化に特有のタンパク質合成、とりわけフィラグリン合成を刺激することができ、特に肌の老化および肌の乾燥を打ち消すための新規活性物質を見出すことであった。
【０００５】
（その解決方法）
本発明は、
（ａ）非還元条件下においてドデシル硫酸ナトリウムでのポリアクリルアミドゲル電気泳動で少なくとも１つのバンドを示し、
（ｂ）平均分子量５００〜５００，０００ダルトン、好ましくは５，０００〜１００，０００ダルトンを有し、
（ｃ）タンパク質含有率（％）を基準に、０．００５〜０．５質量％の全窒素含有率および０．０００５〜０．０１質量％のアミノ窒素含有率を有し、
（ｄ）水および水性電解質溶液に溶解性であるが、エタノールまたはアセトンに不溶性であり、
（ｅ）トリクロロ酢酸またはピクリン酸と共に、水溶液中で析出物を形成する、
抽出溶解性タンパク質画分の、ケラチノサイト分化に特有のタンパク質合成を刺激するため、とりわけフィラグリン合成を刺激するための使用に関する。
驚くべきことに、上記条件を満たし、特にバンバラナッツの種子から得られるタンパク質画分の投与は、フィラグリンの合成を刺激し、それにより乾燥およびシワの影響を打ち消すことを見出した。
【０００６】
（発明を実施するための形態）
溶解性タンパク質抽出物
本発明により、マメ科の種子の抽出、とりわけバンバラナッツ種子の抽出により得られる画分を、好ましくは使用する。バンバラナッツ（ボアンドゼイア・スブテラニア （Ｌ） トアール （Ｖｏａｎｄｚｅｉａ ｓｕｂｔｅｒｒａｎｅａ （Ｌ） Ｔｈｏｕａｒｓ））は、食物として局所的に食されているアフリカ起源の種子である。それは、農家により「飢饉穀物」として主として栽培されるアフリカ原産の植物である。その最も重要な特徴は、旱魃および貧弱な土壌に対する耐性、落花生に対して適さない条件下で生育する能力である。完全食品であるバンバラナッツ種子は、タンパク質、炭水化物および脂質を含有し、様々な熟成段階で食すことができる。その化学組成（ｇ／１００ｇ穀紛または１００ｇ乾燥種子）は、次のとおりである：
・タンパク質：１６〜２１質量％、
・デンプン：３９〜４９．５質量％
・タンニン（タンニン酸として表される）：０．３６〜０．９４質量％、
・脂質：５〜７．３質量％、
・灰分：３．６５質量％。
【０００７】
ボアンドゼイア・スブテラニアの種子は、プロテアーゼ阻害因子を含有し、いわゆる Ｋａｋａｄｅ 技術により評価されるそのトリプシン阻害活性は、（文献によれば）、６．７〜１５．４ＴＩＵ／ｍｇ穀紛であることが知られており、この種子のタンパク質分離物の機能性は、食品目的のために調査されている。これに関連して、国際出願 ＷＯ ９８／４２３０５ が参照される。該文献から、化粧品中のバンバラナッツの使用が知られている。該文献は、抽出物の製造についてのさらなる情報も包含する。さらに、少なくとも１種のプロテアーゼ阻害因子を含有する画分を使用することが有利である。
【０００８】
本発明の抽出溶解性タンパク質画分を、好ましくは、
・肌の老化、特にシワに対して、
・乾燥肌の処置のために、および／または
・肌の乾燥に対して
使用する。
【０００９】
本発明の抽出溶解性タンパク質画分は、肌の老化に対し、とりわけあらゆるスジおよびシワの形成に対して活性である。この種のケア調剤の別名は、老化防止調剤である。その使用は、肌の老化プロセスの遅延化を含む。本発明のタンパク質画分は、肌の乾燥に対しても活性である。なぜならケラチノサイト分化のためのタンパク質合成を刺激することにより、とりわけフィラグリン合成を刺激することにより、角質層のケラチノサイト中におけるこれらタンパク質の割合が増加するからである。それらの分解生成物、遊離アミノ酸およびそれらの誘導体は、肌を乾燥から守る。特にフィラグリンは、自然保湿因子（ＮＭＦ）の必須のリザーバーである。肌を乾燥から守ることの他に、本発明のタンパク質画分を、乾燥肌を処置するため、および少なくとも自然の含水率に戻すためにも使用し得る。
【００１０】
（実施例）
実施例１（製造）
粉砕ボアンドゼイア・スブテラニア種子２５０ｇを、蒸留水２．５Ｌに分散させた。１５分間の攪拌後、ｐＨを、水酸化ナトリウムを添加することにより７．５に調節し、抽出を室温で１時間行った。遠心分離（１０分、５，０００Ｇ）後、上方の油相を排出し、黄色水相を、水での限外濾過（１５，０００Ｄａで保持、濃縮係数２〜１０）または透析濾過により精製した。このようにして得られた画分は、乾燥残分１〜３質量％およびタンパク質濃度０．３〜１５ｇ／Ｌ（ビウレット測定）を有した。次いで画分を凍結乾燥により乾燥した。乾燥生成物の抗トリプシン活性は、５０〜２００ＴＵＩ／ｍｇ（Ｋａｋａｄｅ 法により測定）、または溶液の乾燥残分に対して８００〜２，５００ＴＵＩ／ｍｌに達した。
【００１１】
実施例２（製造）
粉砕ボアンドゼイア・スブテラニア種子４００ｇを、蒸留水４Ｌに分散させ、実施例１に記載するように抽出した。乾燥残分３質量％およびタンパク質濃度０．３〜１５ｇ／Ｌを有する実質的に無色の溶液３．２Ｌが得られた。溶液のｐＨを、硫酸を添加することにより４．５に調節し、次いで３０分間攪拌した。遠心分離（１５分、５，０００Ｇ）後、上方の油相を排出し、黄色水相を、水での限外濾過（１５，０００Ｄａで保持、濃縮係数２〜１０）または透析濾過により精製した。このようにして得られた画分は、乾燥残分１〜３質量％およびタンパク質濃度０．３〜１５ｇ／Ｌ（ビウレット測定）を有した。次いで画分を凍結乾燥により乾燥した。乾燥生成物の抗トリプシン活性は、５０〜２００ＴＵＩ／ｍｇ（Ｋａｋａｄｅ 法により測定）、または溶液の乾燥残分に対して８００〜２，５００ＴＵＩ／ｍｌに達した。
【００１２】
実施例３（製造）
実施例１に従い得られた抽出物を、Ｓｕｐｅｒｏｓｅ １２ ＨＲ ＦＰＬＣ カラム （製造業者：Ｐｈａｒｍａｃｉａ） におけるゲル浸透に付した。５つの画分が得られた：
画分１：分子量＞５００，０００Ｄａ
画分２：分子量１００，０００〜５００，０００Ｄａ
画分３：分子量３０，０００〜１００，０００Ｄａ
画分４：分子量５，０００〜３０，０００Ｄａ
画分５：分子量＜５，０００Ｄａ
【００１３】
細胞成長試験
以下の活性試験を、一方で実施例２の抽出物を使用し、他方で市販配合物 Ｆｉｌｌａｄｙｎ（商標） （Ｌａｂｏｒａｔｏｉｒｅｓ Ｓｅｒｏｂｉｏｌｏｇｉｑｕｅｓ Ｓ．Ａ．） を使用して行った。これは、６０％の実施例２の抽出物、さらにポリオール、キサンタンガムおよび緩衝塩を含有した。
【００１４】
細胞の再生能力を試験するために用いるヒト繊維芽細胞に対する調剤の影響を、以下のように調べた：
１０％のウシ胎児血清（ＦＣＳ）を含有する標準細胞培地（ＤＭＥＭ）に、ヒト繊維芽細胞を接種した。３７℃／５％ＣＯ２濃度で１日間インキュベーションした後、成長培地を、ＦＣＳを含有せず、試験調剤を０．０３〜０．６体積％の濃度で含有するものと取り替えた。３日間のインキュベーション後、細胞成長を、細胞タンパク質含有量（ブラッドフォード法）およびプロフィラグリンのリン酸化のために必須のＡＴＰ（Ｖａｓｓｅｕｒ 法）の測定により調べた。結果を、表 Ｉ に示す。表中は、試験物質を添加していない標準（１００％）に対する相対含有率（％）で表す。
【００１５】
【表１】
2004503579.tif 000002
【００１６】
フィラグリン合成の刺激（インビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ））
１０％のウシ胎児血清（ＦＣＳ）を含有する標準細胞培地（ＤＭＥＭ）に、ヒトケラチノサイトを接種した。３７℃／５％ＣＯ２濃度で４日間インキュベーションした後、成長培地を、ＦＣＳを含有せず、試験調剤を０．０２５〜２体積％の濃度で含有するものと取り替えた。６〜７日間のインキュベーション後、プロフィラグリン／フィラグリン合成を、免疫組織化学的に、即ちプロフィラグリンまたはフィラグリンを認識するモノクロナール抗体を使用して測定した。結果を、表 ＩＩ に示す。
【００１７】
プロフィラグリン／フィラグリン合成の刺激（エクスビボ（ｅｘ ｖｉｖｏ））
形成外科からのヒト生検材料を消毒し、培養物を調製した（ＤＭＥＭ、３７℃）。ヒドロゲル中に組み込んだ試験物質（バンバラナッツ抽出物０．３質量％および Ｆｉｌｌａｄｙｎ（商標） ５質量％）を、局所適用した（３日で５つの処置）。３日後、狭生検材料を調製し、液体窒素で凍結した。次いでプロフィラグリン／フィラグリン形成を、再び免疫組織化学法により調べた。結果を、表 ＩＩＩ に示す。
【００１８】
プロフィラグリン／フィラグリンを、共焦点レーザー走査顕微鏡により微視的に測定した。マイクログラフを、Ｌｅｉｃａ の Ｑｕａｎｔｉｍｅｔ Ｑ５００ＩＷ ソフトウェアを使用して数値に転換し、分析した。結果を、組織断面中でプロフィラグリン／フィラグリンにより覆われている表面積割合（％）として表す。
【００１９】
【表２】
2004503579.tif 000003
【００２０】
【表３】
2004503579.tif 000004
【００２１】
いくつかの配合物例を、以下の表 ＩＶ に示す。
【表４】
2004503579.tif 000005
【００２２】
【表５】
2004503579.tif 000006
表 ＩＶ に示される登録商標および銘柄は、コグニスグループの製品のものである。
【国際公開パンフレット】
2004503579.tif 000007
2004503579.tif 000008
2004503579.tif 000009
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2004503579.tif 000013
2004503579.tif 000014
2004503579.tif 000015
【国際調査報告】
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2004503579.tif 000018
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