(57)【要約】本発明は薬剤として使用するステロイド誘導体に関する。特に、本発明は、良性及び／または悪性の腫瘍の治療のための薬剤であって、Ｇ１相中の細胞周期阻止のようなＷｎｔ−シグナル中での妨害を中断することができ、及び／または、アンジオスタチン性作用を提供する薬剤の製造における、５−アンドロステン−、５−プレグネノロンステロイド誘導体または対応する飽和誘導体（アンドロスタン−あるいはプレグナン−）の使用に関する。そのようなステロイド誘導体の例として、Δ−５−アンドロステン−１７α−オール、アンドロステン−１７α−オール−プレグナン−１７α−オールまたはプレグナン−１７α−オール誘導体がある。更なる観点において、本発明は、５−アンドロスタン−３β，１７α−ジオールあるいはアンドロスタン−３βα−ジオール、酵素及びスルホトランスフェラーゼを接触させることにより、５−アンドロステン−１７α−オール−３β−サルフェートあるいは対応するアンドロスタン誘導体（１７α−ＡＥＤＳまたは１７−ＡＡＤＳ）を提供し；そして、１７α−ＡＥＤＳあるいは１７α−ＡＡＤＳを適当な担体と合わせ；これによりペルオキシゾーム増殖活性化受容体γ（ＰＰＡＲγ）のリガンドとして作用することができる薬剤を製造する工程を含む、良性及び／または悪性腫瘍及び/または炎症性状態の治療のための薬剤の製造方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の一般式（Ｉ）及び（ＩＩ）で定義される化合物の群から選択されるステロイド誘導体（これらの式間の唯一の違いは、炭素原子番号５及び６間の結合の性質である）
2004524325.tif 000010
（式中、Ｒ１Ｏはβ位にあり、Ｒ１は、水素原子；ＮＯ２、ＳＯ３Ｈ、ＯＰ（ＯＨ）３、アシル基、及び無機酸及び有機酸とエステルを形成することのできる他の基；ＣＨ３、ＣＨ２ＯＭｅ、ＣＨ２Ｏ−アルキルのような保護基；直鎖もしくは枝分かれ鎖、飽和もしくは不飽和または環状の他の脂肪族鎖、例えば飽和もしくは芳香族もしくは複素環式基であって、２０個以下の炭素原子を含む混合環状脂肪族基であり、置換基は、例えば、水酸基、ハロゲン、アミノ、アルキルアミノ、カルボキシル酸またはカルボン酸エステル基から選ばれ；
Ｒ２は７位の炭素のβ位のＲ’Ｏまたは式ＩＩの場合は水素原子であり、
Ｒ’はＲ１，Ｒ３またはＲ４で独立して、上記Ｒ１に関して定義した置換基のいずれか一つであり、Ｒ３はα位にあり、水酸基、アシル基またはアルコキシ基Ｒ”Ｏであり、
Ｒ”はＲ１，Ｒ３またはＲ４で独立して、上記Ｒ１に関して定義した置換基のいずれか一つであり、
Ｒ４はβ位にあり、水素原子、アルキル基、アシル基、アルコキシ基Ｒ’’’Ｏであり、
Ｒ’’’はＲ１，Ｒ３またはＲ４で独立して、Ｒ１で定義した任意の基である。）
【請求項２】
Ｒ１、Ｒ’および／またはＲ”が該ステロイドと１またはそれ以上のエーテル及び／またはエステルを形成する請求項１記載のステロイド誘導体。
【請求項３】
Ｒ４が、水素原子もしくはアルコキシ基もしくはアルキル基が該ケト基に結合したアシル基である請求項１または２記載のステロイド誘導体。
【請求項４】
Ｒ４がアセチル（ＣＨ３ＣＯ）であり、２０に番号付けられたこのケトンの炭素が、任意のアルキル基、アルケニル基、アリール基、例えば枝分かれした側鎖もしくは混合した芳香族及び脂肪族側鎖、例えば環式飽和炭化水素、並びに例えばＮ、Ｐ、Ｏ、Ｓｉ、Ｆ、Ｓ、Ｓｅ、ＣＮ、ハロゲンを含み、２０個までの炭素を含んでいる複素環もしくはヘテロ脂肪族鎖を有する前記請求項のいずれか１項に記載のステロイド誘導体。
【請求項５】
前記ステロイドが、５−アンドロステン−３β，７β，１７α−トリオール、５−アンドロステン−３β，１７α−ジオール−７−オン、アンドロスタン−３β，７β，１７α−トリオールおよびアンドロスタン−３β，１７α−ジオール−７−オンからなる群から選択される前記請求項のいずれか１項に記載のステロイド誘導体。
【請求項６】
良性または悪性の腫瘍の治療及び／または予防のための薬剤であって、Ｇ１相中の細胞周期阻止のようなＷｎｔ−シグナル中での妨害を中断することができ、及び／または、アンジオスタチン性作用を提供する薬剤の製造に使用するための、上記式ＩまたはＩＩで表される化合物の群から選択されるステロイド誘導体
（式中、Ｒ２以外の全ての置換基は請求項１で定義したとおりであり、Ｒ２はα位にあり、Ｒ’Ｏ、Ｏ＝またはＳ＝である）。
【請求項７】
良性または悪性の腫瘍の治療及び／または予防のための薬剤であって、Ｇ１相中の細胞周期阻止のようなＷｎｔ−シグナル中での妨害を中断することができ、及び／または、アンジオスタチン性作用を提供する薬剤の製造における、５−アンドロステン−、５−プレグネノロンステロイド誘導体または対応する飽和誘導体（アンドロスタン−あるいはプレグナン−）の使用。
【請求項８】
前記ステロイド誘導体が、下記の一般式（I）または（II）により記載されるステロイド誘導体（これらの式間の唯一の違いは、炭素原子番号５及び６間の結合の性質である）
2004524325.tif 000011
式中、Ｒ１Ｏはβ位にあり、Ｒ１は、水素原子；ＮＯ２、ＳＯ３Ｈ、ＯＰ（ＯＨ）３、アシル基、及び無機酸及び有機酸とエステルを形成することのできる他の基；ＣＨ３、ＣＨ２Ｏメチル、ＣＨ２Ｏ−アルキルのような保護基；直鎖もしくは枝分かれ鎖、飽和もしくは不飽和または環状の他の脂肪族鎖、例えば飽和もしくは芳香族もしくは複素環式基であって、２０個以下の炭素原子を含む混合環状脂肪族基であり、置換基は、例えば、水酸基、ハロゲン、アミノ、アルキルアミノ、カルボキシルまたはカルボン酸エステル基から選ばれ；
Ｒ２は７位の炭素のα位またはβ位のＲ’Ｏまたは、Ｒ２はＯ＝またはＳ＝であり、
Ｒ’はＲ１，Ｒ３またはＲ４で独立して、式（Ｉ）の水酸基のＲ１ exceptの定義において記載した置換基のいずれか一つであるが、式（ＩＩ）においてはＲ２は水素原子であり、Ｒ３はα位にあり、水酸基、アシル基またはアルコキシ基Ｒ”Ｏであり、
Ｒ”は上記Ｒ１に関して定義した置換基のいずれか一つであり、
Ｒ４はβ位にあり、水素原子、アルキル基、アシル基、アルコキシ基Ｒ’’’Ｏであり、
Ｒ’’’はＲ１，Ｒ２またはＲ３で独立して、Ｒ１で定義した任意の基である
である請求項７の使用。
【請求項９】
Ｒ１、Ｒ’および／またはＲ”が該ステロイドと１またはそれ以上のエーテル及び／またはエステルを形成する請求項８記載の使用。
【請求項１０】
Ｒ４が、水素原子もしくはアルコキシ基もしくはアルキル基が該ケト基に結合したアシル基である請求項８または９記載の使用。
【請求項１１】
Ｒ４がアセチル（ＣＨ３ＣＯ）であり、２０位のケトンの炭素が、任意のアルキル基、アルケニル基、アリール基、例えば枝分かれした側鎖もしくは混合した芳香族及び脂肪族側鎖、例えば環式飽和炭化水素、並びに例えばＮ、Ｐ、Ｏ、Ｓｉ、Ｆ、Ｓ、Ｓｅ、ＣＮ、一またはそれ以上のハロゲンを含み、２０個までの炭素から成る複素環もしくはヘテロ脂肪族鎖を有する請求項１０記載の使用。
【請求項１２】
前記ステロイドが、１７−ヒドロキシプレグネノロン（１７α−ＯＨ）、Δ−５−アンドロステン−３β，１７α−ジオール、Δ−５−アンドロステン−３β，７β、１７α−トリオール、５−アンドロスタン−３β，７β，１７α−トリオール、５−アンドロスタン−３β，１７α−ジオール−７−オン、５−アンドロステン−３β，７α，１７α−トリオール、５−アンドロスタン−３β，７α，１７α−トリオールおよび５−アンドロスタン−３β，１７α−ジオールからなる群から選択される請求項７〜１１のいずれか１項に記載のステロイド誘導体。
【請求項１３】
前記ステロイドに対応する１またはそれ以上のプレグナン−及び／またはアンドロスタン誘導体を前記薬剤の製造のために使用する請求項７〜１２のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１４】
前記中断が、サイクリンＤ１及びβ−カテインの過剰発現のダウンレギュレーションにより行われる請求項７〜１３のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１５】
前記効果が、前記腫瘍の細胞に対する直接のアポトーシス効果とは本質的に独立している請求項７〜１４のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１６】
前記薬剤が、直腸癌、Ｗｎｔシグナル経路に属する因子の遺伝子型または発現型の過剰発現を伴う他の悪性腫瘍、例えば肺癌、黒色腫、乳癌、細胞リンパ腫及び他のリンパ腫、並びに前立腺癌の小片、前述の要因のアップレギュレーションによって特徴づけられる扁平上皮細胞起源の頭と首の癌、食道癌、副甲状腺癌また腺腫、あるいはＷｎｔシグナルの妨害により特徴づけられる他の腫瘍；糖尿病網膜症のような病的な血管新生によって支配される症状、滲出型黄斑変性、角膜の血管新生及び血管腫から成る群から選ばれた少なくとも１つ以上の病状の治療及び／または予防のためのものである請求項７〜１５のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１７】
（ａ）５−アンドロステン−３β，１７α−ジオールあるいは対応する飽和ステロイド、５−アンドロスタン−３β，１７α−ジオール、サルフェートドナー、スルホトランスフェラーゼ及びＰＡＰＳを接触させることにより、５’−アンドロステン−１７α−オール−３β−サルフェート（１７α−ＡＥＤＳ）あるいは５−アンドロスタン−１７α−オール−３β−サルフェート（１７α−ＡＡＤＳ）を提供し；そして
（ｂ）これにより生成したサルフェート化１７α−ＡＥＤＳあるいは１７α−ＡＡＤＳを適当な担体と合わせ；これによりペルオキシゾーム増殖活性化受容体γ（ＰＰＡＲγ）のリガンドとして作用することができる薬剤を製造する工程を含む、良性及び悪性腫瘍の治療のための薬剤の製造方法。
【請求項１８】
前記酵素が、ＤＨＥＡ−スルホトランスフェラーゼまたはフェノールスルホトランスフェラーゼである請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
前記薬剤が、尿道癌、胃癌、小腸癌、膵臓癌、腫瘍、内皮細胞に由来する癌、平滑筋肉腫、結腸癌、コリンサルコーマ（ｃｈｏｒｉｏｎｃａｒｃｉｎｏｍａ）、肺の腺腫及び脂肪肉腫、並びに眼組織の病変、例えば黒点及び緑内障の細胞からなる群から選ばれる病状の治療及び／または予防のためのものである請求項１７または１８記載の方法。
【請求項２０】
アンドロゲン、デルタノイド、エストロゲン、レチノイド、ＨＮＦ−４、ＣＯＵＰＴＦ、ＲＸＲ、ＲＡＲ、プロゲスチン、レクシノイドまたはこれらのコファクターまたはＰＰＡＲ−α、δ、γのリガンドの効果を弱めるための薬剤の製造における５−アンドロステン−１７α−オール−３β−サルフェート（１７α−ＡＥＤＳ）または対応するアンドロスタン誘導体１７α−ＡＡＤＳの使用。
【請求項２１】
免疫調節剤、例えば、慢性関節リウマチ、関節あるいは炎症性腸疾病のような炎症性疾病あるいは多発性硬化症またはギランバレー（Ｇｕｉｌｌａｉｎ  Ｂａｒｒｅ）症候群などの病気の治療及び／または予防のための薬剤の製造のための５−アンドロステン−１７α−オール−３β−サルフェート（１７α−ＡＥＤＳ）及び／またはアンドロスタン−１７α−オール−３β−サルフェートの使用。
【請求項２２】
目の炎症症状の治療及び／または予防、またはドライマクラー（ｄｒｙ  ｍａｃｕｌａｒ）に適する請求項１７〜１９のいずれか１項に記載の方法により製造された薬剤。
【請求項２３】
例えばクーメイト（Ｃｏｕｍａｔｅ）（登録商標）のような抑制剤の同時投与によりスルファターゼ活性を抑制することにより持続効果を達成した請求項１７〜１９のいずれか１項に記載の方法により製造された薬剤。
【請求項２４】
５−アンドロステン−１７α−オール−３β−サルフェートまたはアンドロスタン−１７α−オール−３β−サルフェートを合成する請求項１７〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
９−シス形のレチン酸、１またはそれ以上のコルチコステロイド、またはアンドロゲン、デルタノイド、エストロゲン、レチノイド、ＨＮＦ−４、ＣＯＵＰＴＦ、ＲＸＲ、ＲＡＲ、プロゲスチン、レクシノイドのような核受容体またはこれらのコファクターまたはＰＰＡＲ−α、δ、γのリガンドをさらに含み、効果を弱めるため同じ生物学的機能を有する請求項１７〜１９のいずれか１項に記載の方法により製造された医薬組成物。
【請求項２６】
カチオン性デキストランを含む延長された放出性の組成である請求項２５記載の医薬組成物。
【請求項２７】
治療有効量の請求項１〜６及び請求項７〜１６に記載の化合物の悪性及び良性腫瘍を患うヒトの治療方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、薬剤として有用な新規のステロイド誘導体に関する。本発明は、さらに、例えば、良性及び／または悪性の腫瘍のための、薬剤の製造におけるステロイド誘導体の使用、そのような医薬組成物、並びに良性及び悪性腫瘍の治療方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
米国特許第５，９１２，２４０号（ロリア（Ｌｏｒｉａ））には、ステロイドアンドロステン−３β，１７α−ジオール（１７α−ＡＥＤ）及びすべての新生細胞系で成長を抑制し、アポトーシスを引き起こすことによる抗腫瘍作用について記述されている。アポトーシスは、３つの新生物の骨髄性細胞系中で生体外で実証されている。２つの乳癌細胞系では、増殖阻害が実証されている。しかしながら、この２つの乳癌細胞系中でアポトーシスは実証されていない。
【０００３】
核受容体ＰＰＡＲγはステロイドホルモン受容体スーパーファミリーに属する転写因子である。核受容体は細胞外のホルモンシグナルを転写応答につなげる。これは、目標遺伝子のプロモーター領域内にある反応要素への受容体の結合により行われる。このファミリーのいくつかの核受容体はリガンド依存性の効果のみを奏するが、他はリガンドがない状態で機能する。ステロイドホルモン受容体スーパーファミリーのメンバーは、グルココルチコイド受容体、及びエストロゲン、アンドロゲン、プロゲスチン、甲状腺ホルモン、レチン酸、９−シス形のレチン酸、ペルオキシゾーム増殖因子、ビタミンＤ及びエクジソンの受容体を含む。
【０００４】
受容体は６つの領域から成る。Ｎ末端Ａ−Ｆから数えると、リガンド非依存性の機能（ＡＦ−１）は、Ａ／Ｂにあり、リガンド依存性の機能はＡＦ−２はＥに存在する。Ｃ領域はＤＮＡ結合領域（ＤＢＤ）である。
【０００５】
ワックスマン(Ｗａｘｍａｎ)（Ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ｉｎ  ｔｈｅ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｄｅｈｙｄｒｏ−ｅｐｉａｎｄｒｏｓｔｅｒｏｎｅ  ａｓ  ａ  ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒｓ，  ＤＪ  Ｗａｘｍａｎ，  Ｊ  ｏｆ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，  ｖｏｌ  １５０，  ｓｕｐｐｌ．  Ｓｅｐｔ  １９９６）は、５−アンドロステン−３β，１７β−ジオールの３β−サルフェートのＰＰＡＲαに対するリガンド活性を間接的に実証した。
【０００６】
発明の要約
本発明の１つの目的は、細胞周期阻止及び／またはアンジオスタチン性効果を抑制することができ、薬剤として有用な新規の化合物を提供することである。本発明のこの目的及び他の目的は、添付の請求の範囲に記載されているように達成される。
【０００７】
より詳しくは、本発明は、サイクリン  Ｄ１あるいはβ−カテニンを、これらの因子が過剰発現し、治療の障害となっている場合にダウンレギュレーションを引き起こすため、細胞周期ブロックを排除するため、あるいは病的血管侵入をダウンレギュレーションするために、そのようなステロイドの治療投与量を投与することに関する。そのような実例の例は、結腸直腸癌である、そのような事例の例としては、多くの場合にＡＰＣ遺伝子内で変異しており、β−カテニンのアップレギュレーションを引き起こす結腸癌、サイクリンＤ１あるいはβ−カテニンの発現の増加を伴う少数の前立腺癌、並びに表現型の理由でβ−カテニンの増加した発現を伴ういくつかの乳癌である。リンパ腫の領域では、特に興味深い亜群であるマントル細胞リンパ腫瘍があり、これは、事実上すべての既知の治療に耐性であることが知られており、サイクリンＤ１の発現によって特徴づけられる。
【０００８】
本発明によって得られる効果は、単独であるいは従来の細胞増殖抑制性の治療あるいは放射腺治療と組み合わせて使用することができる。いくつかの事例では、当該ステロイドの無関係の核受容体への望ましくないアフィニティ（例えばプロゲステロン、アンドロゲンあるいはエストロゲン受容体へのアフィニティ）をブロックするため、または使用されるステロイドと競合するプロセスにより良い基質を供給することにより、競合するプロセスを抑制することによって治療の効能を増加させるために（ＰＰＡＲγとコファクターＡＲＡ７０について成功裏に競合し、望ましくないＰＰＡＲγ活性を抑えるアンドロゲン受容体）、本発明による新規のステロイドを、アンドロゲン、抗アンドロゲン、エストロゲン、抗エストロゲン、レチン酸誘導体、デルタノイド、レバキシン等のような核受容体へのリガンドと組み合わせることが有用、あるいは必要であり得る。
【０００９】
本発明は、さらに新規な３β−ステロイドサルフェートのＰＰＡＲγリガンド及びＰＰＡＲγリガンド活性、そのような活性を促進または遮断する方法及びそれらの有利な用途を取り扱う。本発明は、それら新規なステロイド自体及びその効果を包含する。
【００１０】
発明の詳細な説明
第一の観点において、本発明は、医薬として有用な新規なステロイド誘導体に関する。本発明による誘導体は、下記の一般式（Ｉ）及び（ＩＩ）のいずれかにより記載される。これらの式間の唯一の違いは、炭素原子番号５及び６間の結合の性質であり、式（Ｉ）では、下記に示すように二重結合である。
2004524325.tif 000002
ここで、これらのステロイドは、３β位にＲ１Ｏ置換基を有し、１７α位にＲ３置換基を有し、そして７及び１７β位に所望の置換基を有する。
【００１１】
３位の酸素上のＲ１は、（ｉ）水素原子，（ｉｉ）ＮＯ２、ＳＯ３Ｈ、−ＯＰ（ＯＨ）３、アシル基、及び無機酸及び有機酸とエステルを形成することのできる他の基、（ｉｉｉ）ＣＨ３、ＣＨ２ＯＭｅ、ＣＨ２Ｏ−アルキルのような保護基（ｉｖ）直鎖もしくは枝分かれ鎖、飽和もしくは不飽和、置換もしくは未置換、環状の他の脂肪族鎖、例えば混合環状脂肪族基、飽和もしくは芳香族もしくは複素環式基であって、２０個以下の炭素原子を含むものでありうる。置換基は、例えば、ＯＨ、ハロゲン（Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ）、アミノ、アルキルアミノあるいはジアルキルアミノから選ばれ得る。
【００１２】
さらに、具体的な実施態様においては、Ｒ１は、ステロイドとエーテルあるいはエステルを形成することができ、Ｒ２は式（ＩＩ）において水素であってよく、もしＲ４がＨでなければ、式（Ｉ）において水素であってよく、さもなければ炭素番号７のαまたはβ位のＲ’Ｏであり得る。ここで  Ｒ’は、Ｒ１とは独立にＲ１に認められる置換基でありうる。
Ｒ２は＝Ｏあるいは＝Ｓであってもよい。
Ｒ３は常に１７α位にあり、水酸基、アシル基またはＲ’’Ｏであってもよい。ここでＲ’’は、Ｒ１で記載したエーテルあるいはエステルを形成する他の基、あるいはＲ１とは独立にＲ１について認められる置換基であってもよい。
Ｒ４は、常に１７β−位にあり、水素原子、アルキル基、アシル基、アルコキシ基であってよく、該基は、式：Ｒ’’’Ｏ（式中、Ｒ’’’はエーテル基またはエステル基を形成する任意の基である）、また、Ｒ１とは独立にＲ１について認められる置換基であってもよい。
さらに、Ｒ４は、水素原子もしくはアルコキシ基もしくはアルキル基がケト基に結合しうるアシル基であってもよい。
【００１３】
特定の実施態様では、１７ＯＨプレグネノロン（ここでメチルはケトン基に結合している）でのように、Ｒ４はアセチル（ＣＨ３ＣＯ）であり得る。この２０に番号付けられたこのケトンの炭素は、任意のアルキル基、アルケニル基、アリール基、例えば枝分かれした側鎖もしくは混合した芳香族及び脂肪族側鎖、例えば環式飽和炭化水素、並びに例えばＮ、Ｐ、Ｏ、Ｓｉ、Ｆ、Ｓ、Ｓｅ、ＣＮ、ハロゲンを含み、２０個までの炭素を含んでいる複素環もしくはヘテロ脂肪族鎖を有することができる。
【００１４】
１つの実施態様では、該ステロイドは、１７−ヒドロキシプレグネノロン（１７α−ＯＨ）、Δ−５−アンドロステン−３β，１７α−ジオール、Δ−５−アンドロステン−７−オキソ−３β，１７α−ジオール及び／または５−アンドロステン−３β，７β，１７α−トリオールである。
【００１５】
別の実施態様では、該ステロイドは、対応するプレグナン−及び／またはアンドロスタン誘導体である。
【００１６】
特定の実施態様において、上記の作用は、前述の腫瘍の細胞に対する直接のアポトーシス効果とは独立している。
【００１７】
本発明の新規なステロイドは、薬剤として有用であり、治療を必要とする患者に投与されると、Ｗｎｔシグナルリング経路の妨害により、１つ以上の抗腫瘍作用を提供することができる。そのような薬剤は、この経路を調節する因子中の変異により、この経路からの因子の過剰発現が生じている場合、または表現型の過剰発現が生じている場合、腫瘍が従来の治療のいくつかの形式に耐性であることが示されている場合の、腫瘍の治療には特に有利である。
【００１８】
最も有利な実施態様では、本発明によって１またはそれ以上のステロイドを含む薬剤が遺伝の過剰発現を伴う大腸癌サイクリンＤ１及び／またはβ−カテニン（エストロゲン受容体陰性の乳癌）の発現型のアップレギュレーションによって引き起こされた癌、肺癌、黒色腫、マントル細胞リンパ腫、及びサイクリンD１の過剰発現によって特徴づけらる他のＢ細胞リンパ腫、副甲状腺腫、扁平上皮細胞起源の頭と首の腫瘍、食道癌、及び破壊的な血管新生（糖尿病網膜症）に支配される腫瘍及び他の病状、滲出型黄斑変性、角膜の血管新生、ヘマジオーマ（ｈｅｍａｎｇｉｏｍａｓ）のような血管腫、悪性の血管腫、正中線肉芽腫及びケロイド形成のような傷跡の制御できない成長から成る群から選ばれる病状の治療及び／または予防のためのものである。
【００１９】
第二の観点において、本発明は、良性または悪性の腫瘍の治療及び／または予防のための薬剤であって、Ｇ１相中の細胞周期阻止のようなＷｎｔ−シグナリング中の妨害を中断することができ、及び／またはアンジオスタチン性作用を提供する薬剤の製造における、５−アンドロステン−、５−プレグネノロンまたは対応する飽和誘導体（アンドロスタンあるいはプレグナン）のステロイド誘導体の使用に関する。
【００２０】
特定の実施態様では、該ステロイド誘導体は、上記で示した式（Ｉ）あるいは（ＩＩ）に示される。
【００２１】
上記のように、１つの実施態様において、前記式のＲ１、Ｒ’及び／またはＲ”は、該ステロイドと１またはそれ以上のエーテル及び／またはエステルを形成する。特定の実施態様において、Ｒ４は、水素、またはアルコキシまたはアルキル基がケト基に結合したアシル基であり得る。特定の実施態様において、メチルがケト基に結合する場合、Ｒ４はアセチル（ＣＨ３ＣＯ）である。また、２０位のケト基の炭素は、アルキル基、アルケニル基、アリール基、例えば枝分かれした側鎖あるいは混合芳香族と脂肪族の側鎖、例えば環状炭化水素並びに、Ｎ、Ｐ、０、Ｓｉ、Ｓ、Ｓｅ、ＣＮ、あるいは１つ以上のハロゲンを含み、炭素数が２０以上である複素環またはヘテロ脂肪族鎖を有する。
【００２２】
２．  有利な実施態様では、該ステロイドは、１７ヒドロキシ−プレグネノロン（１７α−ＯＨ）、Δ−５−アンドロステン−３β，１７α−ジオール、Δ−５−アンドロステン−３β，１７α−ジオール−７−オキソ、５−アンドロステン−３β，７β，１７α−トリオール、５−アンドロステン−３β，７β，１７α−トリオール及び５−アンドロステン３β．１７α−ジオール−７−オン、５−アンドロスタン−３β，７β，１７α−トリオール、５−アンドロステン−３β，７α，１７α−トリオール、５−アンドロスタン−３β，７α，１７α−トリオール及び５−アンドロスタン−３β，１７α−ジオールから成る群から選択される。
【００２３】
該ステロイドに対応する１つ以上のプレグナン−及び／またはアンドロスタン誘導体は、本発明による薬剤の製造において使用することができる。
【００２４】
上記で議論された中断は、サイクリンＤ１及びβ−カテニンの過剰発現をダウンレギュレーションすることにより得られる。また、効果は、有利なことに、前述の腫瘍の細胞に対するいかなる直接のアポトーシス効果にも本質的に依存しない。本発明のこの観点によって製造された薬剤は、直腸癌、Ｗｎｔシグナル経路に属する因子の遺伝子型または発現型の過剰発現を伴う他の悪性腫瘍、例えば肺癌、黒色腫、乳癌、細胞リンパ腫及び他のリンパ腫、並びに前立腺癌の小片、前述の要因のアップレギュレーションによって特徴づけられる扁平上皮細胞起源の頭と首の癌、食道癌、副甲状腺癌また腺腫、あるいはＷｎｔシグナルの妨害により特徴づけられる他の腫瘍；糖尿病網膜症のような病的な血管新生によって支配される症状、滲出型黄斑変性、角膜の血管新生及び血管腫から成る群から選ばれた１つ以上の病状の治療及び／または予防のために有用である。
【００２５】
前立腺癌の症状における前記ステロイドの潜在的な有用性に関しては、Ｗｎｔシグナリングのデレギュレーションが前立腺癌の小さなサブフラクションにも存在し、これにより本発明によるステロイドが有用となる。ただし、下記の化合物は、下記の理由により例外となる：
2004524325.tif 000003
【００２６】
アンドロゲン及びエストロゲン受容体（ＡＲ及びＥＲ）を完全に欠くＤｕｎｎｉｎｇ  ＡＴ−１ラット前立腺癌モデルとは反対に、殆どのヒト前立腺癌は、ＡＲを、そして通常はさらにＥＲβをも大量に発現する。アンドロゲン不応性癌においては、ＡＲがさらにアップレギュレーションされる。アップレギュレーションされたβ−カテニンのアンドロゲン受容体（ＡＲ）転写に対する影響は、アンドロゲンからのＡＲ転写活性の増加並びにリガンド特異性の減少を導き、これはこの疾病における１７α−ＡＥＤの有用性を制限する。なぜならこれはエピテストステロンまたはＢ）１７α−ＡＥＤ−３β−サルフェートに容易に代謝されるからである。両方の潜在的なアンドロゲン受容体リガンドは、さらに他の既知のＡＲリガンド（議論における参考文献を参照）に容易に転化される。
【００２７】
アンドロゲン不応性進行では、ＡＲはさらに表皮増殖因子（ＥＧＦ）及びＩＬ−６のようなリガンド非依存性因子によっても活性化される。ＥＧＦ受容体の活性化は、さらにサイクリンＤ１（議論の参考文献を参照）の発現をアップレギュレーションする。上記２つの化合物Ｓ４及びＳ８は、これにより、常軌を逸したＷｎｔシグナリングを発現しているヒト前立腺癌の小さなサブフラクションでのみ有効な値となり、それらの有用性は、それらのアンドロゲン活性及び他のアンドロゲンへの代謝により、さらに制限される。
【００２８】
例証されるような常軌を逸したＷｎｔシグナリングによる細胞周期調節欠陥を伴う癌、あるいは例えば破壊的な血管新生においては、そのようなプロセスは、本発明によるステロイドを用いた治療を、単独で、前手術的または前放射線治療的な治療として、または細胞毒性薬、インターフェロン、サイトカインもしくはステロイドホルモンと組み合わせて行うことにより制限されるかまたは止められるかもしれない。
【００２９】
第三の観点において、本発明は（ａ）５−アンドロステン−３β，１７α−ジオールあるいはアンドロスタン−３β，１７α−ジオール、サルフェートドナー、３’ホスホ−アデノシン−５’−ホスホサルフェート（ＰＡＰＳ）及びスルホトランスフェラーゼを接触させることにより、５’−アンドロステン−１７α−オール−３β−サルフェート（１７α−ＡＥＤＳ）あるいはアンドロスタン−１７α−オール−３β−サルフェート（１７α−ＡＡＤＳ）を提供し；そして（ｂ）これにより生成したサルフェート化１７α−ＡＥＤＳあるいは１７α−ＡＡＤＳを適当な担体と合わせ；これによりペルオキシゾーム増殖活性化受容体γ（ＰＰＡＲγ）のリガンドとして作用することができる薬剤を製造する工程を含む、良性及び悪性腫瘍の治療のための薬剤の製造方法に関する。本発明の内容において、該薬剤の有効成分は、対応するアンドロステン（またはアンドロスタン）誘導体またはそれらの有機酸もしくは無機酸とのエステルであり得る。有機酸の場合は、２５個以下の炭素からなるものであり得る（Ｓ４及びＳ８）。医薬の効果はスルファターゼインヒビター、例えばクーメイト（Ｃｏｕｍａｔｅ）（登録商標）の同時投与により増強または延長され得る。
【００３０】
ｃ）アーノストヴァ，リブース他（Ａｒｎｏｓｔｏｖａ，Ｌｉｂｕｓｅ  ｅｔ  ａｌ）；Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，Ｃｚｅｃｈ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，Ｐｒａｑｕｅ，Ｃｚｅｃｈ．Ｓｙｎｔｈ．Ｃｏｍｍｕｎ．（１９９０），２０（１０），１５２１−９により記載された方法による３β−サルフェートＳ４（Ｒ１＝ＳＯ３Ｈ）及びＳ８（Ｒ１＝ＳＯ３Ｈ）の合成
【００３１】
対応するアンドロスタン誘導体（Ｓ８，上記式））は、１７α−または１７β−ＡＥＤ（Ｍ＆Ｍに記述されたミツノブ（Ｍｉｔｓｕｎｏｂｕ）反応による１７βから１７αへの変換）から、酢酸塩により水酸基を保護し、その後、二重結合をラネー触媒で還元することにより得られる。
【００３２】
有利な実施態様においては、前述の酵素は、ＤＨＥＡスルホトランスフェラーゼあるいはフェノールスルホトランスフェラーゼである。特定の実施態様においては、本発明の薬剤は、エストロゲン受容体α（ＥＲ−α）遮断効果を増強する薬剤である。
本発明は、さらに、以下に例示されるように、上記方法自体により製造される薬剤を含む。
【００３３】
本発明により製造される薬剤は、尿道癌、胃癌、小腸癌、膵臓癌、腫瘍、内皮細胞に由来する癌、平滑筋肉腫、結腸癌、コリンサルコーマ（ｃｈｏｒｉｏｎｃａｒｃｉｎｏｍａ）、肺の腺腫及び脂肪肉腫、並びに眼組織の病変、例えば黒点及び緑内障の細胞からなる群から選ばれる病状の治療及び／または予防に有用である。
【００３４】
一つの実施態様において、本発明は、また、免疫調節剤、例えば、慢性関節リウマチ、関節あるいは炎症性腸疾病のような炎症性疾病あるいは多発性硬化症かギランバレー（Ｇｕｉｌｌａｉｎ  Ｂａｒｒｅ）症候群のような強調されたまたは持続性のＴ−ヘルパー−１応答により起きる疾病の治療及び／または予防のための薬剤の製造のための５−アンドロステン−１７α−オール−３β−サルフェート（１７α−ＡＥＤＳ）及び／またはアンドロスタン−１７α−オール−３β−サルフェートの使用に関する。本発明はまた、薬剤として使用するための５−アンドロステン−１７α−オール−３β−サルフェート（１７α−ＡＥＤＳ）及び／またはアンドロスタン−１７α−オール−３β−サルフェートに関する。
【００３５】
本発明の薬剤はそのままの形態でまたは加水分解し得るプロドラッグ、即ち選択した環境において加水分解により不活性型の医薬から活性医薬となるもののいずれの形態で投与するのにも適している。そのようなプロドラッグは該医薬のエーテルあるいはエステルであり得る。そのような医薬またはプロドラッグは、局所的な注射により、腫瘍内への注射により、非経口投与により、動脈内投与により、腫瘍あるいは病原性新血管新生物の部分を支持する動脈の選択的なカテーテル法により、薬理学的に許容され得る無菌溶液または懸濁液の形態で適切に投与される。水溶性デンプン粒子（スフェレックス（Ｓｐｈｅｒｅｘ）（登録商標））の同時の注入は、該薬剤の効果を増強または延長するであろう。また、生じる低酸素状態によって生じる腫瘍の血管新生及び再生への刺激をさらに打ち消すであろう。
【００３６】
該薬剤は、薬理学的に許容され得る、例えば目、または口、鼻、膣もしくは直腸の粘膜に塗布可能なシクロデキストリンによる溶液、クリームあるいはゼリーの形態で、局所的に使用することもできる。皮膚においては、例えば過剰な傷跡形成の防止のために、薬剤溶液に浸漬した湿布を使用してもよい。該薬剤は、経口投与で、直腸もしくは膣用の座剤、クリームあるいは浣腸剤として投与することもできる。
【００３７】
Ｓ４（Ｒ１＝ＳＯ３Ｈ）あるいはＳ８（Ｒ１＝ＳＯ３Ｈ）による３β−サルフェートも、胃癌の場合の胃粘膜中の標的に達するために、プロトンポンプ抑制剤（適切なｐＨとするために）と混合して、カプセル剤または錠剤の形態で経口的に投与してもよい。
【００３８】
小腸腫瘍またはクローン病においては、該薬剤はＤＨＥＡ−スルホトランスフェラーゼが小腸内で存在するように、適当なサルフェート型または本来のステロイド（Ｓ４またはＳ８）の形態で、腸溶プセル剤として投与してもよい。
【００３９】
薬剤Ｓ４あるいはＳ８のサルフェートは、上皮膀胱癌の場合は、無菌溶液のデミュア（ｄｅｍｕｒｅ）として、カテーテルによって尿膀胱に投与してもよい。
【００４０】
上記式（Ｉ）及び（ＩＩ）により定義される本発明の化合物は、ドキソルビシン（アドリアマイシン）、ダウノルビシン、エピルビシン、イダルビシンあるいはミトキサントロンのようなアントラサイクリン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシンあるいはビノレルビンのようなビンカアルカロイド類、ドセタキサルあるいはパクリタキセルのようなタキサン類、イホスファミド、シクロホスファミド、ブスルファン、チオテパのようなアルキル化剤、ロムスチン、クロラムブチル、ダカルバジン、シスプラチン、パラプラチンかオキサリプラチンのようなニトロソ尿素、エトポシドまたはテニポシドのようなトポイソメラーゼＩＩ−抑制剤、トポテカンまたはイリノテカンのようなトポイソメラーゼＩ−抑制剤、メトトレキサート、メルカプトプリン、チタラビン、５−フルオロウラシル、ゲムシタビン、ブレオマイシン、マイトマイシン、アムサクリン、アスパラギナーゼ、アルトレタミン、ヒドロキシカルバミド、ミルテフォスチン、エストラムスチン、プロカルバジンあるいはＤＴＩＣのような代謝拮抗剤等の細胞毒性医薬と組み合わせてもよい。
【００４１】
１つの実施態様において、式（Ｉ）及び（ＩＩ）により定義される本発明による新規化合物の効果は、コルチコイド、レチノイド、デルタノイド、甲状腺ホルモン、性ステロイド及び他の核受容体リガンドの使用により弱められ得る。
【００４２】
図面の詳細な記載
【００４３】
図１は、分化していないコントロール及び１７α＋１７β−ＡＥＤで治療された腫瘍の写真である。
【００４４】
図２は表ＩＶに関して議論されているウェスタンブロットを示す。
α＝１７α−ＡＥＤに接触させたラット腫瘍（他の治療と比較した接触時間の差を指摘するためのコントロールの左側に表わされている）。薬剤は、９６時間作用させた。
β＝８倍高い投与量の１７β−ＡＥＤで４５６時間治療した腫瘍。
α＋βは、αで９６時間に続き、βで３６０時間の連続治療を示す。
【００４５】
図３は、α−ＡＥＤ、β−ＡＥＤ、５−アンドロステン３β，７β，１７α−トリオール及び１７αＯＨ−プレグネノロンのＶＥＧＦの発現に対する影響を説明する。
Ａ：未治療のコントロール；左側の染色された部分。続いて同じ腫瘍のネガティブコントロールが示される。
Ｂ：１７α−ＡＥＤ；左側の染色された部分。続いて同じ腫瘍のネガティブコントロールが示される  Ｃ：１７β−ＡＥＤ；
Ｄ：左から右まで、アンドロステン−３β，１７α，７β−トリオールで治療された１−３の腫瘍サンプル；ＶＥＧＦについて染色、４つのネガティブコントロール，同じ治療
【００４６】
図４は、α−ＡＥＤ、１７α−ＯＨ−プレグネノロン及びβ−ＡＥＤで治療されたＤｕｎｎｉｎｇＡＴ−１ラット腫瘍のサンプル、並びに未治療のサンプル（Ｃ１−Ｃ３）のタンパク質ブロットを示す。
β−カテニン、サイクリン  Ｄ１及びＣＯＸ−２の発現に対する治療の影響が、代表的な例によって実証されている。
【００４７】
図５は、未治療の腫瘍（ＣＡ−ＣＤ）と比較した１７α−ＡＥＤ（αＡ−Ｄ）で治療したＤｕｎｎｉｎｇラット前立腺癌の細胞周期に対する影響の代表的な例を示す。未治療の腫瘍は、Ｇ１における大量の細胞によりサイクリンＤ１の強い発現を示す。１７α−ＡＥＤで治療された腫瘍では、Ｇ１における減少とＳ期の細胞の増加、及びサイクリン  Ｄ１の減少が平行した。Ｇ２の細胞の増加がないので、蛋白質ブロッティングの結果と組み合わせたパターンと、アポトーシスの欠如が示されたことは、ＳまたはＧ２におけるアポトーシスではない自然の細胞死を示す。
【００４８】
図６は、リガンド誘導したコアクチベーターアッセーにおいてどのようにα−ＡＥＤ、１７ＯＨ−プレグネノロン及び５−アンドロステン−３β，７β，１７α−トリオール及びそれらの対応する３β−サルフェートに対するＰＰＡＲγリガンド活性を調べたかを説明する。陽性コントロールとしてＳＲＣ−１を使用し、陰性コントロールとして雄ラットからのラット肝臓細胞質ゾルを使用した。
【００４９】
ＰＰＡＲγリガンド活性を示した唯一のサンプルは５−アンドロステン−１７α−オール−３β−サルフェートである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５０】
実施例１：  ３β，７β，１７β−トリヒドロキシアンドロステ−５−エンの合成
本実施例において下記のスキーム１に示されるように、３β，７β，１７β−トリヒドロキシアンドロステ−５−エン（化合物６）が合成された。ここで、（ａ）はＮａＢＨ４，エタノールであり；（ｂ）はＡｃ２Ｏ，ピリジン，ＤＭＡＰであり、（ｃ）はｔ−ＢｕＯＯＨ、Ｃｕ（Ｉ）Ｉ、アセトニトリルであり；（ｄ）はＮａＢＨ４、ＣｅＣ１３＊７Ｈ２０、エタノールであり；そして（ｅ）はＫＯＨ、ＭｅＯＨである。
スキーム１
2004524325.tif 000004
【００５１】
化合物２：３β，１７β−ジヒドロキシ−アンドロステン−５−エンの合成
化合物１（１．００ｇ，３．４６ｍｍｏｌ）を乾燥エタノール（１５ｍｌ）に溶解し、ＮａＢＨ４（１９６ｍｇ、５．２０ｍｍｏｌ）をゆっくり添加した。１時間後、室温で、ＮａＯＨ水溶液（２Ｍ、６ｍｌ）を注意深く添加し、この混合物をジエチルエーテルで３回抽出した。合わせた抽出物を、ＭｇＳＯ４で乾燥し、溶媒を蒸発させた。
収率：９１％
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，４００ＭＨｚ）０．７６（ｓ，１８−Ｈ）、１．０５（ｓ，１９−Ｈ）、３．５２（ｍ，３α−Ｈ）、３．６５（ｔ，１７α−Ｈ）、５．３５（ｄ，６−Ｈ）
【００５２】
化合物３：３β，１７β−ジアセトキシ−アンドロステ−５−エン
化合物２（８８０ｍｇ、２．９３ｍｍｏｌ）、ピリジン（２５ｍｌ）、無水酢酸（２当量）及びＤＭＡＰ（１０ｍｏｌ％、２９ｍｇ）を、１００℃で２時間加熱した。反応混合物を水に注ぎ、固体を濾去し、希塩酸、ＮａＨＣＯ３及び水で洗浄し、最後にエタノールから結晶させた。
収率：８７％。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、４００ＭＨｚ）２．０３（ｓ，１７β−ＯＡｃ）、２．０５（ｓ，３β−ＯＡＣ）、５．３８（ｄ，６−Ｈ）
【００５３】
化合物４：３β，１７β−ジアセトキシ−アンドロステ−５−エン（サルバドール，ジェイ．エイ．アール．（Ｓａｌｖａｄｏｒ，Ｊ．Ａ．Ｒ．）；ｅｌｏ，Ｍ．Ｌ．Ｓ．；Ｎｅｖｅｓ，Ａ．Ｃ．Ｓ．Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．１９９７，１１９−１２２）
アルゴン下、アセトニトリル（１２ｍｌ）中の化合物３（６５０ｍｇ、１．８０  ｍｍｏｌ）の溶液に、ヨウ化銅（Ｉ）  （３．６ｍｇ、０．１８ｍｍｏｌ）及びｔ−ブチル過酸化水素（２．５ｍｌ、１０ｍｍｏｌ）を添加した。マグネティックスターラーで５５℃で２４時間撹拌した後、溶液をＮａ２Ｓ０３溶液（１０％水溶液）に注ぎ、ジエチルエーテルで抽出した。その抽出物をＭｇＳＯ４で乾燥し、ＮａＨＣＯ３の飽和水溶液、塩水及び水で洗浄した。また、溶媒を蒸発させた。
収率：４５％。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、４００ＭＨｚ）５．７２．（ｄ，６−Ｈ）
【００５４】
化合物５：３β，１７β−ジアセトキシ，７β−ヒドロキシ−アンドロステ−５−エン
ルシェ（Ｌｕｃｈｅ）の還元法（Ｌｕｃｈｅ，Ｊ．−Ｌ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９７８、１００，２２２６）を行った。乾燥エタノール（１０ｍｌ）中の化合物４（３３０ｍｇ、０．８６ｍｍｏｌ）の溶液を、攪拌しながら−７８℃に冷却した。ＣｅＣｌ３＊７Ｈ２０（３３５ｍｇ、０．８６ｍｍｏｌ）、続いてＮａＢＨ４（４８ｍｇ、１．２９ｍｍｏｌ）を添加した。
【００５５】
反応混合物を、０℃にゆっくり暖め、３０分間撹拌した。ＮａＯＨ水溶液（２Ｍ、６ｍｌ）を、注意深く添加し、混合物をジエチルエーテルで３回抽出した。合わせた抽出物を、ＭｇＳＯ４で乾燥した。また、溶媒を蒸発させた。このようにして製造された化合物５（１５０ｍｇ、０．４０ｍｍｏｌ）を、メタノール中の５％の水酸化カルシウム中で１時間還流することにより鹸化した。混合物を処理した後、生成物をアセトン／水から再結晶した。収率：８０％。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＭｅＯＨ，４００ＭＨｚ）３．４０（ｍ，３α−Ｈ）、３．５７（ｔ，１７α−Ｈ）、３．８５（ｄ，７α−Ｈ）、５．２１（ｓ，６−Ｈ）
【００５６】
実施例２：３β，７β，１７α−トリヒドロキシアンドロステ−５−エンの合成
本実施例においては、スキーム２で示されるように、３β，７β，１７α−トリヒドロキシアンドロステ−５−エン（化合物１２）を製造した。ここで（ａ）はｔ−ブチルジメチルシリルクロライド、イミダゾール、ＤＭＦであり；（ｂ）はＮａＢＨ４、ＣｅＣ１３＊７Ｈ２Ｏ，ＥｔＯＨであり；（ｃ）はｐ−ニトロ安息香酸、ＰＰｈ３、ＤＥＡＤ、トルエンであり；（ｄ）はｔＢｕＯＯＨ、Ｃｕ（Ｉ）Ｉ、アセトニトリルであり；そして、（ｆ）はｎ−ＢＵ４ＮＦ、ＴＨＦ、ＫＯＨ、ＭｅＯＨである。
【００５７】
スキーム２
2004524325.tif 000005
【００５８】
化合物７：３β−（ジメチルｔ−ブチルシロキシ）アンドロステ−５−エン−７−オンの合成（ミツノブ反応）
乾燥ＤＭＦ（２０ｍｌ）中の、化合物１（２．８８ｇ、１０ｍｍｏｌ）、イミダゾール（１．７ｇ、２５ｍｍｏｌ）及びｔ−ブチルジメチルシリルクロライド（１．８ｇ、１２ｍｍｏｌ）の溶液を、アルゴン下で一晩維持し、その後水に注ぎ、クロロホルムで抽出し、溶媒を蒸発させた。収率：９８％
１ＨＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、４００ＭＨｚ）０．０６（ｓ，Ｍｅ２Ｓｉ、０．８８（ｓ，１８−Ｈ）、０．８９（ｓ，ｔＢｕ）、１．０２（ｓ，１９Ｈ）、２．４１（ｄｄ，１６−Ｈ）、３．５０（ｍ，３α−Ｈ）、５．３７（ｄ、６−Ｈ）
【００５９】
化合物８：３β−（ジメチルｔ−ブチルシロキシ），１７β−ヒドロキシ−アンドロステ−５−エン
収率：９２％。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、４００ＭＨｚ）３．６４（ｔ，１７α−Ｈ）
【００６０】
化合物９：３β（ジメチルｔ−ブチルシロキシ），１７α−ベンゾイルオキシ−アンドロステ−５−エン
化合物８（１．７ｇ，４．１９ｍｍｏｌ）、β−ニトロ安息香酸（１．８ｇ、１１ｍｍｏｌ）及びトリフェニルホスフィン（２．８ｇ、１０．５ｍｍｏｌ）を、アルゴン下でトルエン（２５ｍｌ）に溶解し、３０℃に加熱した。ＤＥＡＤ（１．５３ｍｌ，１０ｍｍｏｌ）をゆっくり添加した。その混合物を２時間還流し、溶媒を蒸発させ、固体残渣をペンタン／ジエチルエーテル＝９５／５によりクロマトグラフィ分離した。
収率：６８％。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、４００ＭＨｚ）５．２（ｄ，１７β−Ｈ），８．２−８．３５（Ａｒ）
【００６１】
化合物１０：３β−（ジメチルｔ−ブチルシロキシ），１７α−ベンゾイルオキシ−アンドロステ−５−エン−７−オン
収率：３６％
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、４００ＭＨｚ）５．６８（ｄ，６Ｈ）
化合物１２：３β，７β，１７α−トリヒドロキシ−アンドロステ−５−エン
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、４００ＭＨｚ）３．５７（ｍ，３α−Ｈ）、３．７５（１７α−Ｈ）、３．８０（ｄ，７α−Ｈ）：
【００６２】
実施例３：作用の評価
材料及び方法
【００６３】
動物１
予めコペンハーゲンフィッシャーラット（Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ−Ｆｉｓｃｈｅｒ  ｒａｔｓ）で成長させ下記のように治療したＤｕｎｎｉｎｇＲ３３２７，ＡＴ−１ラット前立腺癌の生存腫瘍片を試験のために採取した。
【００６４】
群１：Δ５−アンドロステン−３β，１７βジオール（シグマ  ケミカルズ（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ））８０ｍｇの皮下一回投与。
【００６５】
群２及び３：Δ５−アンドロステン−３β，１７α−ジオール（ステロイド社（Ｓｔｅｒａｌｏｉｄ  Ｉｎｃ．））１０ｍｇの一回投与
【００６６】
群４：未治療の腫瘍のコントロールとして用いた。すべての治療において、等量のＰＥＧ４００（シグマケミカルズ）及びエタノール０．５ｍｌをビヒクル（Ｖｅｈｉｃｌｅ）として使用し、腫瘍部位の近くに皮下注射した。
【００６７】
９６時間後、あらかじめ１０ｍｇのΔ５アンドロステン−３β，１７α−ジオールで治療した群３に、群１と同様に８０ｍｇのΔ５−アンドロステン−３β，１７β−ジオールの単回注射を受けさせた。
【００６８】
群２では、二酸化炭素でラットを窒息させることによって、９６時間の後に実験を終了し、残りの群については１９日後に終了した。地方の動物倫理学委員会はこの実験を許可した。この実験のその他の詳細は、Ａｔｉｔｕｍｏｕｒａｌ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  １７α−ＡＥＤ  ａｎｄ  １７−β  ｅｐｉｍｅｒ  ｉｎ  ｖｉｖｏ，  ｉｎ  Ｄｕｎｎｉｎｇ  ＡＴ−１  ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｃａｎｃｅｒ  ｉｎ  ｒａｔ：  Ｈａｇｓｔｏｍ  ｅｔ  ａｌ．  ｕｎｐｕｂｌ．に記載されている。
【００６９】
免疫染色
免疫染色は、ホルマリンに固定されたセクションについて、ＶＥＧＦ、クローンＣ−１、ＩｇＧ２ａ、ｓｃ７２６９、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ．ワーキング（Ｗｏｒｋｉｎｇ）稀釈１：１００で行った。ネガティブコントロール抗体として、マウスＩｇＧ、ＤＡＫ−ＧＯ１，ｋａｐｐａ，ｘ９３１、Ｄａｋｏを１：５０のワーキング稀釈液と共に使用した。
【００７０】
腫瘍は、Ａｐｐｏ−Ｔａｇ  ｉｎ  ｓｉｔｕアポトーシス検知キット（オンコー（Ｏｎｃｏｒ）、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）を用いて、増加したアポトーシスについて調べた。
【００７１】
動物２
上記の動物実験を繰り返した。
群１は、１０ｍｇの１７α−ＡＥＤを腫瘍の近くに単回皮下投与した。
群２は、同じ方法で８０ｍｇの１７β−ＡＥＤを単回投与した。
群３は、同じ方法で２５ｍｇの１７α−ＯＨプレグネノロンを単回投与した。
群４は、７，５ｍｇの５−アンドロステン−３β，７β，１７α−トリオールを単回投与した。
群５は、腫瘍のコントロールである。
【００７２】
細胞系
ヒト前立腺癌細胞系、ＰＣ−３及びＤＵ−１４５を使用した。凍結した細胞系を培地中で確立した。まず、腫瘍部分として見なされたＵ−１４５を、はさみを使用して無菌ペトリ皿中で崩し入れた。崩した腫瘍を、培地を含む７５ｃｍ３の細胞培養フラスコに移した。培地は、ＰＣ−３についてはＨａｍ’ｓＦ１０を、ＤＵ−１４５についてはＲＰＭＩ  １６４０を使用した。
【００７３】
ＦＢＳ１０％，０．２％ＮａＨＣＯ３（７．５％）、２ｍＭのＬ−グルタミン（２００ｍＭ）及び０．００５ｍｇ／ｍｌのゲンタマイシン（５ｍｇ／ｍ）を両方の細胞系用の培養液に添加した。
【００７４】
細胞は７５ｃｍ３細胞培養フラスコ中で殆どコンフルエントになるまで培養した。また、培地は週に二度交換した。培地で希釈された１７α−ＡＥＤ、１７β−ＡＥＤ、並びにその混合物の等量のＤＭＳＯ及びエタノール中の溶液を、培養フラスコ中のＤＭＳＯの濃度が０．１５％を超えないように、それぞれ添加した。
【００７５】
各培養フラスコ中のＡＥＤの濃度は１００ｎＭであった。コントロールは、培地中、同じ濃度ＤＭＳＯ及びエタノールに曝した。
【００７６】
接触は９６時間維持し、その後、培養フラスコ中の細胞は、ＰＣ−３についてはトリプシン（０．２５％）５ｍｌ、ＤＵ−１４５についてはトリプシン及びヴァーシーン（０．２ｍＭ）３ｍｌで治療した。その後、細胞をガラススパーテルを用いて機械的にほぐした。１００μｌのアリコートをトリパンブルー排除試験のために取り出した。２００μｌのアリコートをサイトスピン（ｃｙｔｏｓｐｉｎ）プレパレーションのために取り出した。その後、残る７００μｌのサンプルを、４℃、５１０ｘｇで５分間遠心分離した。上清を除去し、細胞を１ｍｌの昆虫溶菌バッファー（ファーミンゲン（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）  ２１４２５Ａ）中の培地に再懸濁し、氷上で３０分間インキュベートした。その後、細胞溶解液を分析まで−７０℃で保存した。
【００７７】
アポトーシス分析
細胞溶解物の１００μｌのアリコートを、カスパーゼ分析のために取り出した。各部分を、１ｍｌのプロテアーゼ分析バッファー、及び２０μＭの最終濃度のＡｃ−ＤＥＶＤ−ＡＭＣ基質（ファーミンゲン＃６６０８１Ｕ）と混合した。溶液を３７℃で６０分間インキュベ−トした。
【００７８】
バックグラウンド蛍光を調べるために、細胞溶解物を含まず、同量のプロテアーゼアッセーバッファー、細胞溶解バッファー及びＡｃ−ＤＥＶＤ−ＡＭＣ基質を含むコントロールを調製した。
【００７９】
蛍光を、蛍光分光光度計（ＲＦ５４０、島津データ・レコーダーＤＲ３、インストルメンツＡＢ、ラムダ）を使用して、３８０ｎｍの励起波長で、４１５−４５０ｎｍで測定した。
【００８０】
トリパンブルー排除試験
ＰＢＳの中の初期細胞懸濁液のアリコート１００μｌを、トリパンブルー排除分析により集めた細胞の生存率を測定するために使用した。細胞懸濁液１０μｌを、１０μｌのトリパンブルー溶液（シグマ  ケミカル社（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．） ＃Ｔ８１５４）と混合し、３分間静置した。細胞の生存数及び死滅数を血球計数器で数えた。
【００８１】
フォトレジストレーション
生長抑制作用を見るために、１７α−ＡＥＤを含む培養物並びに同数の細胞を含むコントロールを、グリッドを備えたペトリ皿中で成長させ、特定領域の同定を可能にした。細胞を２４時間ごとにコンフルエントになるまで撮影した。
【００８２】
乳癌及び前立腺癌の細胞系におけるＨＥＲ−２及び１７α−ＡＥＤサルフェートの効果
前立腺癌細胞系ＰＣ−３及びＤＵ−１４５及び乳癌細胞系ＭＣＦ−７及びＳＫＢＲ−３の細胞培養物を、２００ｎＭの１７α−ＡＥＤの存在下または不存在下で、前記のようにフラスコ中で成長させた。１７α−ＡＥＤを含有する培養液をさらに細分し、それらの培養物をハーセプチン（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ）(登録商標)，ｈｅｒ−２抗体の存在下または不存在下で、希釈して細胞懸濁液中の濃度を１：１５０とした１ｍｇ／ｍｌ幹溶液を用いて培養した。ｈｅｒ−２抗体には保存料は添加されないので、７２時間のインキュベーションの間２４時間あけて２回添加した（抗体の短い半減期を考慮して）。
【００８３】
ステロイドを含んでいない各細胞系の代表例も上記のようにハーセプチンで治療した。各細胞系及び異なる治療について、３個の異なる培養フラスコを使用した。
さらに、１００μｌのラット肝臓細胞質ゾルと約０．１６ｍｇのＰＡＰＳに対応する２０μｌの３’−ホスホアデノシン−５’ホスホサルフェート（ＰＡＰＳ）の混合物をシェアし、１７α−ＡＥＤを含有する培養液に添加した。
最後に、各細胞系について、３つのサンプルを未治療のコントロールとして保存した。生存細胞の数を評価するために、クロロフルオレセインジアセテートの溶液を培養の最後の日に培養液に添加した。この化学薬品は、細胞に自由に入り込むが、生細胞中で代謝され緑色の蛍光を有する型を形成し、細胞から出ることができない。死んでいる細胞を検知するために、赤い蛍光を与えるプロピジウムヨーダイドを、ファクスキャン（Ｆａｃｓｃａｎ）中でサンプルを分析する１５分前に添加した。ファクスキャンの中の検知器を１００００個の細胞が通過するための時間を、細胞死には至らない可能な成長抑制効果を検出するために評価した。
【００８４】
ＤＵ−１４５及びＰＣ−３細胞培養物におけるエストロゲン受容体遮断、１７α−ＡＥＤ−３β−サルフェート及びＨＥＲ−２抗体の複合的な影響
前の実験に基づいて、細胞培養実験を、二つの前立腺癌細胞系で繰り返した。文献によれば、エストロゲン受容体βは両方の細胞系で発現し、エストロゲン受容体αはＰＣ−３細胞でのみ発現する。エストロゲン受容体を遮断するために、５０ｎｍの濃度でのＩＣＩ１７２，７８０を使用し、３６時間あけて２回添加した。その後、エストロゲン受容体を遮断した培養物を、＋／−ＨＥＲ２抗体及び＋／−１７α−ＡＥＤ−３β−サルフェートで、上記のようにエストロゲン受容体が遮断されていること以外は、ＰＣ−３及びＤＵ１４５の実験に記載された濃度及び方法で治療した。
【００８５】
３Ｔ３−Ｌ１繊維芽細胞の培養
ＡＴＣＣ（胚の筋細胞系）バッチＦ−１２７３２（バッチ日９３０３０１）からの３Ｔ３Ｌ１繊維芽細胞を、５００ｍｌのＤＭＥＭ、５０ｍｌのウシ胎児血清（ＦＢＳ）及び１１ｍｌのＰＥＳＴ中で生長させた。培地は一日おきに交換した。細胞は８０％コンフルエントになるまて経過させた。
【００８６】
識別するために、繊維芽細胞をの区別のために、ＤＭＥＭ＋１０％ＦＣＳ＋５μｇ／ｍｌインシュリン中でインキュベ−トした。０．１ｍＭのＩＢＭＸの及び０．２５μＭのデキサメタゾンを添加した。２日後に、細胞を、ＤＭＥＭ＋１０％ＦＣＳ＋５μｇ／ｍｌインシュリンに移した。その後、培地は一日おきに交換され、ＤＭＥＭ＋１０％ＦＣＳから成る。蒸留水中のエタノールを添加し、エタノール濃度を０．１％未満に維持した。これを識別用陽性コントロールとした。
【００８７】
培養中の１７α−ＡＥＤ濃度を１００あるいは２００ｎＭとして、ＩＢＭＸとデキサメタゾンを、エタノールと水中の１７α−ＡＥＤの溶液に換える以外は同じ溶液を用いて、繊維芽細胞をインキュベ−トした。コンフルエントになるまで、培養物をインキュベーター中で維持した。
【００８８】
タンパク質ブロッティング
両方の上記の実験からの溶かされたラット腫瘍を、氷冷細胞溶解バッファー中でホモジナイズした（１６０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、２ｍＭのＣａＣｌ２、５％のＳＤＳ、０．５％のトリトンＸ−１００、１００μｇ／ｍｌのフェニルメチルスルホニルフルオライド、１μｇ／ｍｌのロイペプチン及び２μｇ／ｍｌのアプロチニン）。氷上に１５分間置き、続いて１３，０００ｇで１０分間遠心分離した。ホモジネートの蛋白含有量をラウリー（Ｌｏｗｒｙ）分析により決定した。
【００８９】
溶解物（９０μｇ）中の蛋白質を、８％のＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて電気泳働により分離し、分離された蛋白質をトランスブロット電気泳動転移細胞（Ｔｒａｎｓ−ｂｌｏｔ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｒｅｔｉｃ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｃｅｌｌ）；バイオ・ラッド・ラボラトリーズ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ−Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）中でニトロセルロース膜（アメーシャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ））上に転写した。
【００９０】
トランスブロット（Ｔｒａｎｓ−ｂｌｏｔ）及びＴＴＢＳ（ｌｘＴＴＢＳ：２０ｍＭのＴｒｉｓ、１５０ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ７．５、０．１％のＴｗｅｅｎ−２０））中の脱脂乳によるブロックの後、ブロットを３％（ｗ／ｖ）の脱脂乾燥乳を含むＴＴＢＳ中１：４００に希釈されたマウスモノクローナルＩｇＧ１  ＰＰＡＲγ抗体（抗ＰＰＡＲγ（Ｅ８）サンタクルーズ・バイオテクノロジー（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ））でプローブした。
【００９１】
ＴＴＢＳ中で洗浄した後、ブロットをワサビペルオキシダーゼと共に１時間再インキュベートし、３％（ｗ／ｖ）脱脂乳を含むＴＴＢＳ中で１：４０００に希釈された第２抗体（抗ヤギ抗体２０２０（サンタクルーズ））に結合させた。ブロットを増強された化学発光システム（ＥＣＬ、アメーシャム）を使用して現像し、ハイパーフィルム（Ｈｙｐｅｒｆｉｌｍ）ＥＣＬ（アメーシャム）に接触させた。光電密度はデンシトメトリーにより測定した。
【００９２】
ブロットを取り、β−カテニン（Ｃ−１８，ｓｃ．１４９６））及びＣＯＸ−２（Ｃ−２０、ｓｃ  １７４５）に対する抗体に再ハイブリダイズさせた。
【００９３】
実験はすべて、各分析で２度繰り返した。
【００９４】
第２の動物実験において、腫瘍をβ−カテニン、ＣＯＸ−２及びサイクリン  Ｄ１（Ａ−１２、ｓｃ、８３９６）の発現について調べた。
蛋白質ブロッティングを、ＤＵ−１４５及びＰＣ−３細胞系について繰り返し、さらに、抗体（Ｈ−７４、ｓｃ７１９７）によりＰＰＡＲγの発現について調べた。
【００９５】
（３５Ｓ）メチオニン標識ＳＲＣ−１の調製
ＡｐｃＤＮＡ３−ＳＲＣ−１構築物を鋳型として使用し、ＴＮＴ（登録商標）結合網状赤血球溶解液システム（Ｃｏｕｐｌｅｄ  Ｒｅｔｉｃｕｌｏｃｙｔｅ  Ｌｙｓａｔｅ  Ｓｙｓｔｅｍ）（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ））を使用するインヴィトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）転写及び翻訳によって（３５Ｓ）メチオニン標識ＳＲＣ−１を調製した。
【００９６】
ＧＳＴ−ＰＰＡＲγとＳＲＣ−１の間のリガンド誘導相互作用：
ＧＳＴ−ＰＰＡＲγ融合蛋白質を生成させるために、マウスＰＰＡＲγｃＤＮＡをｐＧＥＸ−ＫＧのＮｃｏＩ−ＨｉｎｄＩＩＩサイトに挿入し、タンパク質をＥｃｏｌｉ  Ｙ１０９０株で発現させた。該菌を、下記のプロテアーゼ阻害剤を含んでいるＴＥＤＧバッファー（５０ｍＭトリス（ｐＨ  ７．４）、１．５ｍＭのＥＤＴＡ、１０％のグリセリン、０．４ＭのＮａＣｌ、０．１ｍＭのＤＴＴ）中の超音波治療によって溶解した：０．５ｍＭのＰＭＳＦ、１ｍＭのベンズアミジン、１０μｇ／ｍｌロイペプチン、１０μｇ／ｍｌアンチパイン及び１０μｇ／ｍｌアプロチニン。溶菌液をＳＷ４１ローター中、１００，０００ｘｇで６０分間、ベックマン（Ｂｅｃｋｍａｎ）Ｌ８−７０Ｍ超遠心分離機をを用いて遠心分離した。融合蛋白質をＧＳＨセファロースビーズ（ファーマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ））を固定し、その後、１０ｍＭトリス（ｐＨ７．４）、０．１２ＭのＫＣｌ、８％グリセリン、４ｍＭのＤＴＴ、及び０．５％ＣＨＡＰＳ（緩衝液ＡＡ）中、室温で３０分間インキュベートした（図５）。その後、（３５Ｓメチオニン）ＳＲＣ−１（約０．１μＣｉ）を添加し、該ビーズをさらに１時間４℃でインキュベートし、緩衝液Ａで洗浄した。ＳＤＳサンプルバッファーを該ビーズに添加し、７．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥに分離する前にサンプルを煮沸した。放射活性をオートラジオグラフィーで検出した。
【００９７】
リガンド誘導コアクチベーター相互作用分析
α−ＡＥＤ及びβ−ＡＥＤを、上記のＰＰＡＲγリガンド活性についての分析で、エタノール１０％、蒸留水中、の１０及び１００μＭ溶液中で調べた。α−ＡＥＤ溶液またはβ−ＡＥＤ溶液の１０μｌのアリコートを、下記のように調製した雄ラットの肝臓の細胞質ゾル調製物に添加した。
【００９８】
ラット肝臓ホモジネートは、公知のステロイドスルホトランスフェラーゼ活性源であり、フードプロセッサーを使用して調製した。肝臓ホモジネートは、２ｍｍｏｌのＰＭＳＦ、１ｍｍｏｌのＥＤＴＡ及び１０ｍｍｏｌのトリスＨＣｌを添加してｐＨを７．４０とすることによってセリンプロテアーゼから保護した。このホモジネートは４℃で調製し、その後１５０００ｇで１０分間遠心分離し、その後４℃で１０００００ｇで１時間遠心分離を行った。上清を下記のステロイドの一つを含む試験管に分割した：肝臓細胞質ゾル１００μｌと共に５μＭ濃度の１７β−ＡＥＤあるいは１７α−ＡＥＤ。１つの試験管を陽性コントロールとし、ＳＲＣ−１を含有させた。
【００９９】
第二の実験において、下記のステロイドの活性を試験した：１７α−ＡＥＤ、１７ＯＨ−プレグネノロン及び５−アンドロステン−３β、７β、１７α−トリオール、１０μｌの５’−ホスホアデノシン−３’−ホスホサルフェート（ＰＡＰＳ），シグマケミカルズ（０．１ｍｇのＰＡＰＳに相当）を伴うまたは伴わない。１つの試験管を、陽性コントロールとし、ステロイドの代わりにＳＲＣ−１を含有させた。ステロイドスルホトランスフェラーゼを３０分間４５℃に加熱することにより不活性化した場合、１つの試験管は肝臓細胞質ゾルを含有させた。該管を２０℃で１時間撹拌し、その内容物をリガンド活性に対する受容体コアクチベーターアッセーで調べた（図５）。
【０１００】
１７α−ＡＥＤの３βサルフェートの合成、分子構造の同定及びリガンド誘導コアクチベーター相互作用アッセー１における活性の確認
【０１０１】
１７α−ＡＥＤを、アーノストヴァ，リブース  エム．（Ａｒｎｏｓｔｏｖａ，Ｌｉｂｕｓｅ  Ｍ．）；Ｐｏｕｚａｒ，Ｖｌａｄｉｍｉｒ；Ｄｒａｓａｒ，Ｐａｖｅｌ，Ｉｎｓｔ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，Ｃｚｅｃｈ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，Ｐｒａｑｕｅ，Ｃｚｅｃｈ．Ｓｙｎｔｈ．Ｃｏｍｍｕｎ．（１９９０），２０（１０），１５２１−９に記載の方法により処理した。アセテートを保護基として使用し、ピリジン−ＳＯ３−複合体をサルフェート剤として使用した。メタノール−水中の０．８ＭＮａＯＨの過剰量で脱保護し、所望のヒドロキシサルフェートを得た。これを、上記のリガンド活性化コアクチベーター受容体活性におけるＰＰＡＲγ活性について調べた。これにより、１７α−ＡＥＤ−３βサルフェートのＰＰＡＲγ活性が示された。
【０１０２】
結果
形態学
ＤｕｎｎｉｎｇＡＴ−１ラット前立腺癌における最初の１７α−ＡＥＤ及びこれに続く１７β−ＡＥＤによる連続治療により、ラット前立腺癌は、形成手術のパターンから腺の分化を示す腫瘍へ腫瘍外観が変化した。ヒト前立腺癌がＰＰＡＲγを発現し、この受容体の活性化はＰＰＡＲγを発現する他のタイプの組織における分化を導くことができるので、この核受容体の発現のアテニュエーションがこの分化を説明することができるか見るために、ＰＰＡＲγに対する抗体によるタンパク質ブロッティングを行った。
【０１０３】
３Ｔ３−Ｌ１マウス繊維芽細胞
アディポサイトの（ａｄｉｐｏｃｙｔｉｃ）発現型への分化が起こるかどうか確かめるために、３Ｔ３Ｌ１マウス繊維芽細胞のプレコンフルエント培養物を、１００及び２００ｎｍｏｌの１７α−またはβ−ＡＥＤに接触させた。ＩＢＭＸとデキサメタゾンを含む陽性コントロールは、コンフルエントに達した後に予想通りに分化した。
分化はアンドロステンジオールについては見られなかったが、２００ｎＭの１７α−ＡＥＤに接触させた繊維芽細胞培養物において細胞増殖の著しい抑制が見られた。、
【０１０４】
アポトーシス、細胞生存率及び成長抑制
１７α−ＡＥＤで治療されたラット前立腺癌の切片のアポトーシスの増加をＴＵＮＥＬ法により調べたところ、コントロールと比較してプログラムされた細胞死の増加は認められなかった（ハグストロム他（Ｈａｇｓｔｒｏｍ  ｅｔ  ａｌ．）；Ａｎｔｉｔｕｍｏｕｒａｌ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  １７α−ＡＥＤ  ａｎｄ  １７−βｅｐｉｍｅｒｓ  ｉｎ  ｖｉｖｏ，  ｉｎ  Ｄｕｎｎｉｎｇ  Ａｔ−１  ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｃａｎｃｅｒ  ｉｎ  ｒａｔ）。
【０１０５】
カスパーゼ−３及びカスパーゼ−７の変化の測定（ＤＵ−１４５はアポトーシス中カスパーゼ−３活性を欠く。代わりに、カスパーゼ３に比べてアポトーシスを媒介する効果は弱いカスパーゼ−７を有する。しかしながら、両カスパーゼとも同じアミノ酸モチーフを認識し、従って使用した基質はいずれの検出にも適する）は、ＤＵ−１４５が１７α−ＡＥＤの存在下で成長させた場合に、１７β−ＡＥＤあるいはコントロールの成長と比較して、著しい減少を示した。興味深いことに、ＤＵ−１４５細胞の１７α−ＡＥＤ治療後に、細胞総数の著しい減少が見られた。これは、ＤＵ−１４５細胞における両ステロイドの成長抑制効果を示す。蛍光強度の測定は、細胞数の差について補正されたが、１７α−ＡＥＤ治療されたサンプルのコントロール及び他のステロイドと比較した蛍光強度の減少は残った。このことは、ＤＵ−１４５並びにＰＣ−３における１７α−ＡＥＤからのアポトーシスの効果に対する保護効果を示唆する。
【０１０６】
１７α−ＡＥＤで治療されたＰＣ−３細胞におけるカスパーゼ３媒介蛍光は、未治療のコントロールと比較して本質的に変化しない強度を示す。しかしながら、細胞数について強度を補正すると、アポトーシスの減少に応じて、おそらく顕著になる。アポトーシスの増加に応じて１７β−ＡＥＤが約２倍の蛍光強度になるのが見られる。ＰＣ−３培養における細胞総数を見ると、コントロールと比べて、１７α−ＡＥＤで治療された培養物は細胞総数が５９％増加することがわかる。
【０１０７】
１７β−ＡＥＤで治療されたサンプルでは、細胞数の増加は、２９％とより小さかった。
【０１０８】
生存細胞の割合の減少は、１７α−ＡＥＤあるいは１７β−ＡＥＤで治療されたＰＣ−３培養での生存細胞割合の小さな減少を示す。しかしながら、これらの培養中の細胞総数の増加は、これより重要であり、これらの培養中で生存細胞の数が該培養中の細胞の総数と等しくなる。
【０１０９】
従って、この実験は、１７α−ＡＥＤがアンドロゲン不応性ヒト前立腺癌の２つの共通の例；細胞系ＰＣ−３またはＤＵ−１４５でのアポトーシスに対し重要な保護を与えることを実証する。さらに、１７β−ＡＥＤは、ＰＣ−３細胞におけるアポトーシスは増加するが、ＤＵ−１４５においてはしない。
【０１１０】
ロリア（Ｌｏｒｉａ）によるより早い日付の乳癌細胞系中の観察に反して、両ステロイドの組み合わせは、前立腺癌のアポトーシスに顕著な効果を与えることはなかった。１７α−ＡＥＤ及び１７β−ＡＥＤはＰＣ−３細胞の細胞死を増加させるが、生存細胞数も増加させる。
【０１１１】
以下、表Iは、１７α−ＡＥＤ、１７β−ＡＥＤあるいはその両方で治療されたＰＣ−３及びＤＵ−１４５細胞、及び致死及び生存細胞の数を、未治療のコントロールと比較して示す。各群の評価は、３つの異なる培養フラスコからの異なる測定値に基づく。
【表１】
2004524325.tif 000006
【０１１２】
さらに、下記の表IIは、カスパーゼ−３、アポトーシス分析における分光蛍光学で評価されたＤＵ−１４５及びＰＣ−３サンプルの蛍光の平均値を示す。
【表２】
2004524325.tif 000007
【０１１３】
表IIIは、ＤＵ−１４５及びＰＣ−３−アンドロゲン不応性 ヒト前立腺癌細胞系及びヒト乳癌細胞系ＭＣＦ−７（エストロゲン受容体陽性）及びＳＫＢＲ−３（エストロゲン受容体陰性）を発現しているＨＥＲ−２／ｎｅｕにおける生存率及びアポトーシスの評価、並びにＨＥＲ−２／ｎｅｕ抗体ヘルセプチン、１７α−ＡＥＤの３β−サルフェート及びそれらのの組み合わせの影響を示す。
【表３】
2004524325.tif 000008
ファクスキャン中の蛍光細胞の測定は下記のように解釈される。
主な２つの細胞集団が見出された。一つはクロロフルオロセインジアセテート（ＣＦＡ）で強く着色し、プロピジウムヨーダイド（ＰＩ）で非常に弱く着色され、生存しているものと数えられ、もう一つはその逆のパターンで着色され、死んでいるものとして数えられた。
【０１１４】
小さな細胞集団は両方に強く着色され、初期のアポトーシスを含むと考えられる。
これらの結果は、すべての細胞系のコントロールにおいて生存しているか死んでいるものとして評価された細胞間の割合について同様の図を示した。
【０１１５】
１７α−ＡＥＤ−３βサルフェートは、ＰＣ−３及びＳＫＢＲ−３において反対であるが、効果を示した。ＰＣ−３培養物において生存細胞のパーセンテージは増加し、死んでいる細胞は減少した。ＳＫＢＲ−３で、生存細胞の減少及び死んでいる細胞の増加が、１７α−ＡＥＤ−３βサルフェートは培養物で見られた。ＨＥＲ−２抗体による細胞培養物の治療は、生存細胞と死亡細胞の割合に対する著しい影響を示さなかった。ＨＥＲ−２抗体及び１７α−ＡＥＤ−３βサルフェートの組み合わせは、細胞生存率を著しく増加し、ＳＫＢＲ−３細胞を保護すると考えられる。他の細胞についても、弱いが同様の傾向が見られるが、ＤＵ−１４５については、この組み合わせは生存細胞を減少させる。
【０１１６】
従って、この実験は、ＨＥＲ−２発現が、おそらくはＤＵ−１４５を除くこれらの細胞系中で１７α−ＡＥＤ−３βサルフェートがアポトーシス効果を欠くことの理由であるという理論を支持しない。１７α−ＡＥＤ−３βサルフェートで治療したＳＫＢＲ−３において見られる結果は、１７α−ＡＥＤ−３βサルフェートの効果を得るにはエストロゲンを遮断する必要があることを示す。
【０１１７】
ヒトアンドロゲン不応性癌細胞系ＰＣ−３及びＤＵ−１４５におけるエストロゲン受容体の遮断
【０１１８】
ＩＣＩ１７２，７８０のエストロゲン遮断の結果は、ＰＣ−３細胞における、生存細胞の著しい減少と、両方のマーカー、ＤＣＦＡ、及びＰＩ（後者はアポトーシス細胞を示唆する）に弱く染色される細胞の増加を示す。
【０１１９】
ＤＵ−１４５の結果において、死んでいる細胞の数の明白な増加がないことはあまり明らかにはならなかった。ＰＣ−３細胞における１７α−ＡＥＤ−３βサルフェート及びＩＣＩ１７２，４８０の併用治療は、およそ８０％の細胞死に帰着した。細胞死の増加はＤＵ−１４５細胞で見られなかった。ＰＩで強く染色される細胞の数は特に併用治療を施した細胞において減少した。
【０１２０】
従って、この実験は、ＰＣ−３培養物中のエストロゲン受容体の遮断の後に増加する細胞死がどのように観察されるかを説明する。１７α−ＡＥＤ３βサルフェートが添加される場合、相乗効果が観察される。ＤＵ−１４５細胞においては明白な効果は観察されなかった。
【０１２１】
細胞系のウェスタンブロッティング
ノーザンブロッティングと同様に、１７α−ＡＥＤで治療したＰＣ−３及びＤＵ−１４５細胞系及び未治療のコントロール（各々の３つのサンプル）のウェスタンブロッティング、ＰＣ−３中のＣＯＸ−２及びβ−カテニンの弱い発現及びＤＵ−１４５におけるはるかに強い発現を示した。
【０１２２】
ＰＰＡＲγの発現は、ＤＵ−１４５よりＰＣ−３においてはるかに強かった。ＰＰＡＲγは、ＤＵ−１４５で強く発現するが、ＰＣ−３においては弱くしか発現しない。アンドロステンジオールによる単独のまたは併用した治療は、ＰＰＡＲγ、ＰＰＡＲδ、ＣＯＸ−２またはβ−カテニンの発現に対して調節効果を示さなかった。これに対して、ＡＥＤＳは、両方の細胞系においてＰＰＡＲγの発現を著しく増加させたが、ＡＥＤＳはＰＰＡＲδの発現には効果がなかった。
【０１２３】
１７α−ＡＥＤＳで治療された細胞系のウェスタンブロッティング
上記と同じ細胞系で実験を繰り返した。１７α−ＡＥＤＳの１００ｎＭ溶液を１７α−ＡＥＤの代わりに使用した。ＰＣ−３細胞では、ＰＰＡＲγ発現が増加した。ＤＵ−１４５でＰＰＡＲγの発現の増加が見られた。
【０１２４】
動物Ｉのウェスタンブロッティング
ウェスタンブロッティングを、１７α−ＡＥＤ、１７β−ＡＥＤ及び両者による連続的治療により治療された３つの異なる腫瘍からのサンプルを使用して実行した。ＰＰＡＲγ、ＣＯＸ−２及びβ−カテニンに対する抗体を使用した。この実験を異なるコントロール腫瘍を用いて繰り返し、同じ結果を得た。
コントロールの数の値は１００にセットした。平均値、範囲及びｐ値を下記の表IVに示す。
【表４】
2004524325.tif 000009
【０１２５】
ＰＰＡＲγの発現が２倍になりβ−カテニンの発現が著しく減少し、同時に、α−ＡＥＤで治療された腫瘍中のＣＯＸ−２が２倍になるという予期しなかった発見は、ＰＰＡＲγリガンドから予測されるもの（α及びβ−ＡＥＤの組み合わせとは明らかに反対の効果）と矛盾する。
薬への接触の時間は治療アーム（ａｒｍ）間で非常に異なるので、異なる治療間ではデータの比較を非常に用心深く行わなければならない。
【０１２６】
動物ＩＩのウェスタンブロッティング
コントロールは、β−カテニン、サイクリンＤ１及びＣＯＸ−２の高い発現を示した。
α−ＡＥＤで治療したサンプルにおいて、β−カテニン及びサイクリン  Ｄ１の発現の著しい減少が見られた。
【０１２７】
同じパターンであるが、さらに著しい結果が、１７ＯＨプレグネノロンで治療された腫瘍で見られた。
【０１２８】
β−ＡＥＤは、β−カテニンあるいはサイクリンＤ１の発現を減少しなかった。
ステロイドはすべて同様にＣＯＸ−２を増加させた。
【０１２９】
ステロイドへの接触は全てのアームで８０時間とした（腫瘍を９６時間（α−ＡＥＤ）あるいは４５６時間（β−ＡＥＤ及びα＋β−ＡＥＤ）接触させた前の実験に反して）。
【０１３０】
腫瘍成長に対するα−ＡＥＤ、β−ＡＥＤ及び１７α−ＯＨ−プレグネノロンの効果
上記セクション「材料及び方法」に記述した腫瘍の近傍への皮下注射の効果の評価は、β−ＡＥＤで治療したラットの腫瘍体積及び未治療のコントロール中の腫瘍体積が約２倍になったこと（２００％）及びα−ＡＥＤで治療したラットでは約５０％増加し（１５０％）、１７α−ＯＨ−プレグネノロンで治療した動物では約半分になったこと（−５０％）を示す。
【０１３１】
α−ＡＥＤ、β−ＡＥＤ、１７α−ＯＨ−プレグレノロン及び５−アンドロステン−３β，７β，１７α−トリオールのＶＥＧＦに対する効果
【０１３２】
α−ＡＥＤで治療された腫瘍の形態学的調査は、顕微鏡により継ぎはぎの外観を呈し、限定されたエリアで活力を奪われた腫瘍組織を示した。抗腫瘍効果は即時に開始した。β−ＡＥＤで治療した腫瘍における作用の遅れた開始、及びヒト前立腺癌細胞系でインヴィトロでトログリタゾンを用いると作用の開始が非常に遅いと報告されていることを考慮すると、ＰＰＡＲγの活性化によるアポトーシスの増加とは異なるメカニズムが予測されるであろう。
【０１３３】
上記の「材料及び方法」のセクションに記述されるような免疫染色をコントロール腫瘍及び１７α−ＡＥＤで治療した腫瘍に行った。血管内皮生長因子（ＶＥＧＦ）の強い発現はコントロール（４／４）で示され、非常に弱い発現が１７α−ＡＥＤで治療したサンプル（３／４）で示された。
【０１３４】
免疫染色を「動物II」からの腫瘍に繰り返した。ＶＥＧＦのための強い着色がコントロール（４／４）及び１７β−ＡＥＤ（３／４）に示された。ＶＥＧＦについてのほとんど完全な消失が、（４／４）及び１７α−ＯＨ−プレグネノロン（３／３）で示された。５−アンドロステン−３β，７β，１７α−トリオール（ββα−トリオール）で治療された腫瘍において、２つのケースでの腫瘍の検知できるＶＥＧＦのほとんど完全な消失があり、一のケースでは中程度のダウンレギュレーション、一のケースでは不変の外観であった。
【０１３５】
結果を、図３に示す。全腫瘍の５μ切片である。Ａは未治療のコントロールからの腫瘍切片であり、各秒のサンプルはネガティブコントロールである。Ｂは１７α−ＡＥＤで治療した腫瘍であり、各秒のサンプルはネガティブコントロールである。Ｃは１７β−ＡＥＤで治療した腫瘍であり、各秒のサンプルはネガティブコントロールである。
【０１３６】
Ｄは５−アンドロステン−３β，７β，１７α−トリオールで治療された三つのサンプルであり、左側にネガティブコントロールが示されている。右側の三つのサンプルは１７ＯＨ−プレグネノロンで治療したものであり、これにネガティブコントロールが続く。
【０１３７】
１７ＯＨプレグネノロンで治療された腫瘍の優れた増殖抑制は注目すべきである。また、１７ＯＨ−プレグネノロンで治療された腫瘍中のアンジオスタチン性効果の欠如は注目すべきである。
【０１３８】
未治療のコントロールと１７α−ＡＥＤ−治療された後のサンプルにおける、Ｇ１、Ｓ期の中の細胞比率の比較
【０１３９】
未治療のＤｕｎｎｉｎｇＡＴ−１サンプルにおけるＳ期は、平均Ｓ期２５．５％（２４、２４、２４、３０）を示したのに対し、１７α−ＡＥＤ−で治療されたサンプルの平均Ｓ期は４５．３％であった（４５、３８、５３、）。
【０１４０】
Ｇ１の細胞の比率は治療されたコントロールの腫瘍において５９％（５５、５２、６５、６７）であり、治療したものでは３５％（３０、４１、４３）であった。Ｇ２期の細胞の比較は、値が広く分散しているため算定が困難であった。
【０１４１】
図４は、１７α−ＡＥＤで治療した四つの異なる腫瘍を未治療のコントロールの四つの異なる腫瘍と比較した細胞周期分析を示す。細胞周期分析は、Ｇ２期ではかなりの部分の細胞が壊死し、細胞の解釈に妨害をもたらすので、複雑になる。
【０１４２】
ＰＰＡＲγリガンド活性分析
α−及びβ−アンドロステンジオールを、リガンド誘導コアクチベーターアッセーにおけるＰＰＡＲγ−リガンド活性について調べた。調べられたアンドロステンジオールそれ自体におけるリガンド活性を示す転写の兆候は見られなかった。
【０１４３】
αまたはβ−ＡＥＤで２時間インキュベートされた肝臓細胞質ゾルを、リガンドに誘導されたコアクチベーターアッセーで調べた。陽性コントロールに対応する位置の弱いバンドが肝臓細胞質ゾルの中に存在した。同じ結果は、１７β−ＡＥＤを肝臓細胞質ゾルに添加した場合に見られた。
【０１４４】
１７α−ＡＥＤ及び肝臓細胞質ゾルを含んでいるサンプルでは、バンドが消えた。
【０１４５】
実験を、１７α−ＡＥＤ、３β，７β，１７α−アンドロステントリオール及び１７α−ＯＨプレグネノロンプラス／マイナスＰＡＰＳ及びプラス肝臓細胞質ゾルで繰り返した。これも、ＰＡＰＳ及び１７α−ＡＥＤと一緒に熱不活性化され試験された。結果は１７α−ＡＥＤ＋ＰＡＰＳ及び活発な肝臓細胞質ゾルを含んでいるサンプル中でのみリガンド活性が示された（図５）。
【０１４６】
実験を、ＤＨＥＡスルホトランスフェラーゼを不活性化するために４５℃で１５分間肝臓細胞質ゾルを加熱することにより、α−ＡＥＤ及び１７β−ＡＥＤ＋／−ＰＡＰＳ及び肝臓細胞質ゾル＋／−について繰り返した。
【０１４７】
陽性コントロールとして、ＳＲＣを使用した。１７α−ＡＥＤ＋ＰＡＰＳ及び活性肝臓細胞質ゾルを含んでいるサンプル以外では活性は示されなかった。
【０１４８】
図５は、左に向かって、陽性コントロール（ＳＲＣ−１）、陰性コントロール及び従来のステロイド１７α−ＡＥＤ、１７ＯＨ−プレグネノロン及び３β，７β，１７α−アンドロステントリオール＋肝臓細胞質ゾル、これに続いてステロイド＋肝臓細胞質ゾル＋ＰＡＰＳを示す。シグナルの顕著な差が、１７α−ＡＥＤ＋肝臓細胞質ゾル＋ＰＡＰＳの組み合わせで見い出された。他のすべての組み合わせ、陽性コントロール以外は顕著な応答を示さなかった。
【０１４９】
α−ＡＥＤ及びβ−ＡＥＤのいずれも本来人体の中に存在する。ヒト成人で１：２、ヒト胎児で１０：１の割合である。ラットの実験では、１：８の比率を使用した。
【０１５０】
上記のように、米国特許第５，９１２２４０、ロリアには、「エストロゲンあるいはアンドロゲン受容体とは独立した」単球の腫瘍細胞系中のアポトーシス及び増殖阻害及び乳癌細胞系の増殖阻害について記載されている。しかしながら、メカニズムに関する示唆はなく、したがって、ロリアの前述の教示の実際的な適用可能性は制限されている。
【０１５１】
さらに、上記米国特許第５，９１２  ２４０号には、任意のタイプの悪性細胞において、抗腫瘍効果がプログラムされた細胞死（アポトーシス）の増加に依存することが示唆される。しかしながら、本発明の発明者は、ラット前立腺癌ＡＴ−１におけるα−ＡＥＤの効果がインヴィヴォでアポトーシスに依存することを確認することができない。同様に、本発明の発明者によって、５０−２００ｎＭの濃度の１７α−ＡＥＤの濃度に接触させた、ヒトアンドロゲン不応性前立腺癌細胞系ＤＵ−１４５あるいはＰＣ−３において、アポトーシスの増加を示すことができないことを示すことができた。まったく反対に、これらの細胞系中でアポトーシス抑制効果を実証することができた。ＰＰＡＲγ活性と純粋な１７α−ＡＥＤ間にはなんのつながりもないので、本発明の発明者は１７α−ＡＥＤ−３βサルフェートに依存したＰＰＡＲγ活性を予測した。実験をこの化合物で繰り返したが、効果はなかった。
【０１５２】
本出願において、エストロゲンまたはアンドロゲン受容体の依存について議論する場合、ＰＣ−３及びＤＵ−１４５の両方で機能しない腫瘍細胞が議論される。一方では、エストロゲン受容体β（ＥＲβ）は、両方の細胞系で発現する。エストロゲン受容体α（ＥＲα）はＰＣ−３でのみ発現する。両方の細胞系を、両方の受容体を遮断するＩＣＩ１７２，７８０で治療すると、ＰＣ−３細胞においてかなりの増殖抑制と細胞死自体が得られる。
【０１５３】
この効果は、１７α−ＡＥＤ−３０サルフェートの添加により、かなり増強される。
【０１５４】
ＤＵ−１４５では、明白な効果は認められなかった。この理由は、この細胞系に存在するＰ５３変異による機能しないＥＲβシグナル経路、遅れたまたは抑制された腫瘍細胞死、またはＤＵ−１４５がＰＰＡＲγの非常に弱い発現を有するという事実であり得る。その代わりに、それはＰＰＡＲδを発現し、これはＰＰＡＲγリガンド１７α−ＡＥＤ−３βサルフェートによって調節されない。
【０１５５】
他のものが、チアゾリジンジオンで治療された同じ細胞系の増殖阻害に関する同様の結果をもたらし、本発明の発明者が完全なＥＲ遮断にもかかわらず、エストロゲン受容体を遮断する治療に感受性のＰＣ−３中のＰＰＡＲγ発現に対する本発明のリガンドの調整効果を実証することができず、ＤＵ−１４５中のＰＰＡＲγとδの発現に対する我々のリガンドの調整効果を完全に欠くという事実は、以下の議論を支持する。
【０１５６】
２つの乳癌細胞系、ＥＲ陽性ＭＣＦ−７、ｐ５３野生型と、ＡＲ陽性且つＥＲ陰性、ｐ５３変異ＳＫＢＲ−３（後者はｃ−ｅｒｂＢ２を強く発現する）を、１７α−ＡＥＤ−３βサルフェート＋／−ＨＥＲ２抗体で治療した。
【０１５７】
前立腺癌細胞系の中で使用したのと同じ濃度でＳＫＢＲ−３を治療すると、細胞死の中程度の増加に帰着した。しかしながら、米国特許５，９１２，２４０号に行われた濃度の４倍の濃度を用いたにもかかわらずＥＲ＋ＭＣＦでは効果が見られなかった。いずれの、乳癌においても、抗体によるｃ−ｅｒｂＢ２−受容体の遮断からの相加効果は見られなかった。ＳＫＢＲ−３にあるＰ５３変異は１７α−ＡＥＤ−３βサルフェートの増殖抑制作用を妨げなかった。ＥＲ陽性であるが、野生型のＰ５３を含んでいるＭＣＦ−７は、１７α−ＡＥＤ−３βサルフェートによる治療にもかかわらず増殖し続けた。ＰＣ−３及びＤＵ−１４５の実験の結果と共に、これは、１７α−ＡＥＤ−３βサルフェートがエストロゲン受容体と相互作用すること、そしてエストロゲン受容体を発現する組織での使用を考慮する場合エストロゲン受容体とのこの相互作用をブロックすることが必要であることを強く示唆する。
【０１５８】
抗腫瘍効果は、Ｄｕｎｎｉｎｇラット前立腺腫瘍において生体内で実証された。この効果は、Ｔ細胞またはマクロファージのような免疫系のエフェクター細胞とは無関係に、またアポトーシスと無関係に、開始が早い。抗腫瘍効果には、継ぎはぎパターンでの失活及び腫瘍組織中のＶＥＧＦ発現の著しい変化が伴う。これはアンジオスタチン性なメカニズムを強く示唆する。このことは腫瘍の微視的なセクションでも実証された。より進んだ調査により、さらにサイクリン  Ｄ１及びβ−カテニンのダウンレギュレーションが示された。この効果は１７α−ＡＥＤに排他的でなく、また代謝物質（１７α−アンドロステンジオール−３β−サルフェート）に結び付けられるＰＰＡＲγ活性に依存もしないことは、同じラット腫瘍が１７α−ＯＨ−プレグネノロンで治療された場合、さらに強い抗腫瘍効果が見られたという発見に支持される。この物質はＰＰＡＲγ活性を有さず、また、その３β−サルフェートもそうである。この調査を拡張するために、新しいステロイドを促進する、５−アンドロステン３β，７β，１７α−トリオールが構築された。このステロイドには例証可能なＰＰＡＲγ活性はなく、その３β−サルフェートにもなかった。しかしながら、ＶＥＧＦ、β−カテニン及びサイクリンＤ１に対するダウンレギュレーション効果は実証された。プラスミノーゲン活性化因子を阻害するプラスミノーゲンアクチベーター因子抑制剤に対するアップレギュレーション効果（ＰＡＩ−１）が、アンジオスタチン性ステロイド（アンジオスタチン性ステロイドの効果のメカニズムとして提案されている（Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｏｆ  ａｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎｇｉｏｓｔａｔｉｃ  ｓｔｅｒｏｉｄｓ：ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｖｉａ  ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ｂｌｅｉ  Ｆ  ｅｔ  ａｌ：Ｊ  Ｃｅｌｌ  ｐｈｙｓｉｏｌ  １９９３  Ｊｕｎ；１５５（３）：５６８−７８）。
【０１５９】
血管形成に対するＰＰＡＲγ活性の見解は異なる。ある証拠によれば、アンジオスタチン性よりもむしろ血管形成について言えば、ＰＡＩ−１はダウンレギュレーションされ、従ってＰＡはアップレギュレーションされる。（Ｔｈｉａｚｏｌｉｄｉｎｅｄｉｏｎｅｓ  ｄｏｗｎ−ｒｅｇｕｒａｔｅ  ＰＡＩ−１  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ＨＵＶＥＣ：  Ａ  ｐｏｓｓｉｂｌｅ  ｒｏｌｅ  ｆｏｒ  ＰＰＡＲγ  ｉｎ  ｅｎｄｔｈｅｌｉａｌ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ：Ｋａｔｏ  Ｋ  ｅｔ  ａｌ：  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｒｅｓ．  Ｃｏｍｍｕｎ．１９９９，Ｍａｙ  １０；  ２５８（２）：４３１−５）。
【０１６０】
β−カテニンはＷｎｔシグナル経路の一部であり、細胞周期レギュレーション及びエントリーに影響を及ぼすことが示されている。（Ｗｎｔ−５ａ  ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｍａｍｍａｒｙ  ｃｅｌｌｓ：  Ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｄｅｖｅｌｏｐｅｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ：  Ｍａｒｚｉｅｈ  Ｊｏｎｓｓｏｎ．  Ｄｏｃｔｏｒａｌ  ｄｉｓｓｅｒｔａｉｏｎ，  Ｌｕｎｄ，  Ｓｅｐｔ．  ２０００）
【０１６１】
抗腫瘍効果とβ−カテニンの低下との間の一致は、サイクリンＤ１，ｃ−ｍｙｃ及びｃ−ｍｅｔのようなこの経路に沿った成長調節遺伝子に対する影響を暗示する。
【０１６２】
ＣＯＸ−２の重要性は、例えば結腸癌だけでなく、前立腺癌においても指摘された。本発明の結果は、一方ではＣＯＸ−２、他方ではサイクリンＤ１、β−カテニン及びＶＥＧＦの可能なコレギュレーションに関する矛盾がある。言及されたステロイドで治療された腫瘍においては、サイクリンＤ１、β−カテニン及びＶＥＧＦに対する同時のダウンレギュレーションの影響で、ＣＯＸ−２は同時にアップレギュレーションされ、腫瘍の明らかな増殖阻害が観察される。ＰＧＥＪとＰＧＥ２の綿密な関係及び増加した血管形成が存在する。
（Ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎｓ  ｕｐ−ｒｅｇｕｌａｔｅ  ＶＥＧＦ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｄｉｓｔｉｎｃｔ  ｐａｔｈｗａｙｓ  ｉｎ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ  Ｕ９３７  ｃｅｌｌｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｒｅｓ．  Ｃｏｍｍｕｎ．  ２０００  Ｊｕｌ５，  ２７３（２）；  ４８５−９１）
【０１６３】
したがって、本発明によって実証されたＶＥＧＦ及びＣＯＸ−２の分岐する調節は、非常に驚くべきことであり、予測できないものである。
【０１６４】
１７β−ＡＥＤで治療された腫瘍において、腫瘍中のこの化合物の増殖刺激的な効果を、これが免疫学的抗腫瘍反応によって中断される前に１週間以上観察した。この効果はエストロゲン受容体及びアンドロゲン受容体の活性化には依存しない。使用されたＡＴ−１腫瘍は完全にそのような受容体を欠くからである。１７β−ＡＥＤで治療された腫瘍中のβ−カテニン及びＣＯＸ−２発現の最初の調査は、それらが１９日間の治療の後の腫瘍調査に基づくものであり、１７α−ＡＥＤで治療した腫瘍は９６時間だけ治療されたものであるため、完全に信頼できるものではなかったので、この実験を、１７α−ＡＥＤ、１７β−ＡＥＤについて繰り返した。
【０１６５】
１７ＯＨプレグネノロン及び５−アンドロステン−３β，７β，１７α−トリオール。この実験では、ラットが犠牲にされる前に、腫瘍はすべて８０時間ステロイドに接触させた。ウェスタンブロッティングは、１７β−ＡＥＤで治療されたβ−カテニン、ＶＥＧＦ及びサイクリンD１の腫瘍中の高い発現にもかかわらずＣＯＸ−２のダウンレギュレーションを示さなかった。
【０１６６】
したがって、これらの三つのアンジオスタチン性ステロイドによる一方では、β−カテニン、ＶＥＧＦ及びサイクリンＤ１、他方ではＣＯＸ−２の逆の調節にもかかわらず、１７β−ＡＥＤで治療された腫瘍におけるＣＯＸ−２の反対の調節は見出されなかった。四つのステロイドのアップレギュレーションは全て、未治療のコントロール腫瘍と比較して、ＣＯＸ２の発現をアップレギュレーションする。
【０１６７】
通常はアンドロゲン非依存性の進行を示す癌の場合である機能性ＡＲシグナルを伴うヒトあるいは他の起源の前立腺癌におけるステロイドＳ４及びＳ８の有用性は、１７α−ＡＥＤあるいは１７α−ＡＡＤ自体の使用を考慮する場合にはおそらく非常に限定される。それらは潜在的なＡＲリガンドであり、容易に他の有力なＡＲリガンドへ変換するからである。
【０１６８】
例えば１７α−ＡＥＤは、エピテストステロン、デヒドロエピアンドロステロン、アンドロステンジオンあるいはエストラジオールに変換される。
Ａ）  エピテストステロンは疾病進行に伴い、ＡＲ内の転写活性を刺激するであろう。
Ｂ）  アップレギュレーションされた場合、β−カテニンは、ＡＲに対する潜在的なリガンドの効果を増強するであろう。アンドロステンジオン、アンドロステンジオール、デヒドロ−エピアンドロステロン、また、エストラジオール（全て１７α−ＡＥＤの可能な代謝物質）、及び一般的なアンドロゲン受容体ブロッカー、例えばビカルタミドは、ＡＲにおける転写活性を増加することが示され、これにより病態は進行する（β−カテニンはアンドロゲン受容体活性及びリガンド特異性に影響する：トルシア  シイアイ他（Ｔｒｕｉｃａ  ＣＩ  ｅｔ  ａｌ）;Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ６０（１７）：  ４７０９−１３，２０００  Ｓｅｐ１．）。
Ｃ）有機体が、アンドロゲン受容体転写の他の潜在的な刺激因子を奪われた場合、１７α−ＡＥＤ−３β−サルフェートの効率が増加するであろう。言及されたＡＲリガンドは、受容体活性化に必要なコファクター用のＰＰＡＲγリガンドであるサルフェート、特にＳＲＣ−１及びＡＲＡ−７０と競合するであろう。サイクリンＤ１の過剰発現は１つの出所による前立腺癌の４．２％と算定されるが、おそらくはそれ以上に一般的であり、疾病進行に一般的なメカニズムであるＥＧＦ受容体刺激によるアンドロゲン非依存性の進行として、サイクリンＤ１のアップレギュレーションを引き起こす。（サイクリンＤ１の過剰発現はヒト前立腺の癌においてまれである：ガンビナー他（Gｕｍｂｉｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ）；Ｐｒｏｓｔａｔｅ．３８（１）：４０−５，Ｊａｎ１．）（表皮増殖因子はヒト前立腺癌細胞系でサイクリンＤ１を誘導する：ペリー他（Ｐｅｒｒｙ  ｅｔ  ａｌ）；Ｐｒｏｓｔａｔｅ．３５（２）：１１７−２４，１９９８  Ｍａｙ）。
【０１６９】
ワックスマン他による上記の実験（Ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ｉｎ  ｔｈｅ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｄｅｈｙｄｒｏ−ｅｐｉａｎｄｒｏｓｔｅｒｏｎｅ  ａｓ  ａ  ｐｅｒｏｘｉｓｏｒｎｅ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ．Ｊ． ｏｆ  Ｅｍｄｐｃｒｏｍｐ；ｐｇｕ  ｖｏｌ１５０，  ｓｕｐｐｌ，  Ｓｅｐｔ  １９９６）内分泌学ｖｏＩ１５０の、ｓｕｐｐｌ、１９９６年９月、）において、ＰＰＡＲα活性の間接的な証拠は、１７β−ＡＥＤについて生体内で実証されたが生体外ではされていない。また、１７β−ＡＥＤあるいはＤＨＥＡの３β−サルフェートがＰＰＡＲαに連結された遺伝子の活性化において対応する在来のステロイドより効率的だったことがさらに実証された。アンドロステンジオールが密接に化学的に関連づけられるとともに、それらが代謝経路に対応しているようである。また、ＰＰＡＲγリガンド活性が１７α−ＡＥＤの３βサルフェートに依存するという仮説は、本発明の発明者によって示唆された。この仮説はリガンド活性がサルフェートドナー、ＰＡＰＳに依存し、ステロイドスルホトランスフェラーゼの主要な源である肝臓細胞質ゾルが存在する必要があるという発見により支持される。ＤＨＥＡスルホトランスフェラーゼは、特に３β−ＯＨステロイド中の３β−位置へのサルフェートのトランスファーに触媒作用を及ぼす。
【０１７０】
カスパーゼ３または７の発現により細胞を調べたにもかかわらず、細胞系ＤＵ−１４５あるいはＰＣ３をインヴィトロで１００あるいは２００のｎＭ濃度１７α−アンドロステンジオールに接触した場合に、アポトーシスか壊死である細胞死の増加は見られなかった。生存細胞及び死んでいる細胞を区別するためのエバンスブルーによる染色も、治療したサンプルにおける細胞死亡率の増加を示さなかった。規則的な時間間隔で未治療のコントロールと１７α−ＡＥＤで治療された培養フラスコ中の菌体数を比較したが、１７α−ＡＥＤで治療された培養中で菌体数の減少は見られず、これらの細胞系においては１７α−ＡＥＤの増殖抑制効果に反すると言える。
【０１７１】
トリパンブルー排除試験における活力を奪われた細胞の数の増加を示さなかったことも、これらの発見を支持する。
【０１７２】
ヒト前立腺癌細胞系ＰＣ−３、ＬＮＣａＰ及びＤＵ−１４５におけるＴＺＤによるインヴィトロでの実験は、ＰＣ−３中で明白な抗腫瘍効果を示し、ＬＮＣａＰ中で中間の効果を示し、及びＤＵ−１４５（ＰＰＡＲγのリガンド（Ｔｒｏｇｌｉｔａｚｏｎｅ））中で効果を示さず、生体外と生体内とでヒト前立腺癌に有力な抗腫瘍作用を有する：（クボタ他（Ｋｕｂｏｔａ  ｅｔ  ａｌ）：  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５８，  ３３４４−３３５２，  Ａｙｇ  １，  １９９８）。しかしながら、この結果はかなりの時間を要した。本実験において、ＤＵ−１４５中で抗腫瘍効果が見られなかったことは、上記で引用したＴＺＤの実験に従うものである。この効果の欠如はＤＵ−１４５細胞のＰＰＡＲγの非常に弱い発現についての本発明の発見により説明される。しかし、ＰＰＡＲδは強く発現する。１７α−ＡＥＤで治療された培養物中ではＰＰＡＲγまたはＰＰＡＲδの発現の変化は観察されなかった。
【０１７３】
ＰＰＡＲγリガンド及び同じヒト前立腺癌細胞系を用いる他の実験においては、増加した細胞死が電子顕微鏡検査法を用いることにより実証された。この細胞死は、非アポトーシス現象であった（ＰＰＡＲγリガンド１５−デオキシ−Δ１２，１４−プロスタグランジンJ２による前立腺癌細胞のＳ期の停止に関連したアポトーシスでない細胞死：場とラー他（Ｂｕｔｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ）：  Ｃｅｌｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  ＆  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ，  Ｖｏｌ．１１，  ４９−６１，  Ｊａｎ  ２０００）。受容体アッセイにおいて、単一の物質として１７α−あるいは１７β−ＡＥＤを使用すると、リガンド活性化は見られなかった。予測できないことではないが、弱いＰＰＡＲγリガンド活性は肝臓細胞質ゾルに存在し、この活性は１７β−ＡＥＤを添加しても変化しなかったが１７α−ＡＥＤを１７β−エピマーと交換すると顕著になった。それと共に、このことは、両エピマーがＰＰＡＲγアゴニスト性を欠き、１７α−ＡＥＤがＰＰＡＲγアンタゴニスト機能を有する可能性を示唆する。
【０１７４】
１７α−ＡＥＤで治療されたＤｕｎｎｉｎｇＡＴ−１ラット前立腺癌におけるインヴィヴォでのＰＰＡＲγのアップレギュレーション、接触を延長した場合に見られる分化並びにＣＯＸ−２のダウンレギュレーション、ＰＰＡＲγリガンドから期待される効果は、ＰＰＡＲγ活性化能力が、１７α−ＡＥＤ自体に依存するよりは、むしろ代謝物質、サルフェート型に結び付けられることを示唆する。
【０１７５】
ウェスタンブロッティングで見られた予期しない結果、すなわち１７α−ＡＥＤがＰＰＡＲγ活性のアップレギュレーションに帰し、同時にＣＯＸ−２がアップレギュレーションされ、同時にβカテニンが１７α−ＡＥＤ及び１７β−ＡＥＤによりダウンレギュレーションされることは、次の方法で説明されるかもしれない：インヴィヴォでのスルホトランスフェラーゼ活性の結果、生体内で、１７α−ＡＥＤは硫酸塩となり、これによりＰＰＡＲのアップレギュレーションが説明される。１７β−ＡＥＤは同じ方法で硫酸塩となる。１７β−ＡＥＤのサルフェート型はＰＰＡＲα活性化化合物であり、βカテニン並びに、ｃ−ｍｙｃ、ｃ−ｍｅｔ、また、サイクリンＤ１の増加が期待される。（Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｃ−ｍｅｔ，  ｃ−ｍｉｃ  ａｎｄ  ＰＰＡＲ−ａｌｐｈａ  ｉｎ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒｓ  ＷＹ−１４，  ６４３（ミラー  アールティー他（Ｍｉｌｌｅｒ  ＲＴ  ｅｔ  ａｌ．），  Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ  １９９６  Ｊｕｎ；  １７（６）：１３３７−４１）。この期待に従って、９６時間１７β−ＡＥＤに接触させたＤｕｎｎｉｎｇＡＴ−１腫瘍に実際に見られる増殖速度の増加が予期される。これが動物実験を繰り返し、８０時間のステロイドへの一定の接触時間がすべての腫瘍について選ばれた理由の１つである。
【０１７６】
本発明の理論に従い、これらの腫瘍のウェスタンブロッティングが、１７β−ＡＥＤへの接触がβ−カテニン及びサイクリンＤ１のダウンレギュレーションに帰着しないことが示された。１７α−ＡＥＤ、１７ヒドロキシ−プレグネノロン、５−アンドロステン−３β，７β，１７α−トリオールへの接触で見られたダウンレギュレーション（後者は７位の置換基のため、容易に１７α−ＡＥＤに転化せず、従ってその３β−サルフェートへも転化しない）は、後者の二つの物質は硫酸化したときに、ＰＰＡＲγ−リガンドに転化しないので、ＰＰＡＲγ非依存性であることを示す。１７β−ＡＥＤへの延長された接触を行った後に見られる腫瘍の減少は、主としてストロマ細胞（それらは微視的に見ることでそうであるように見えた）を含む失活した腫瘍、従ってより少ないβ−カテニンを反映する。
【０１７７】
１７β−ＡＥＤ及び１７α−ＡＥＤが組み合わせられた場合に見られるＣＯＸ−２のダウンレギュレーションは、結合したＰＰＡＲα及びγ活性化の組み合わせの結果またはＰＰＡＲγ活性化の結果であり得る。
【０１７８】
既知の血管形成特性を有するＣＯＸ−２が２倍になったにもかかわらず、ＶＥＧＦのダウンレギュレーション及び抗腫瘍効果が１７α−ＡＥＤに接触された腫瘍中で観察された。ＰＰＡＲγの発現が抗腫瘍効果に本質的に結びつかないことが、３β−サルフェートのＰＣ−３細胞系における抗腫瘍効果の不足によって実証された。エストロゲン受容体が遮断される場合に限り、増殖阻害及び細胞死が生じるので、効力の不足はエストロゲン受容体への１７α−ＡＥＤの結合を示唆する。
【０１７９】
アンドロゲン受容体（ＡＲ）でトランスフェクトしたサッカロミケス種の実験では、１７β−ＡＥＤがこの受容体に結合して、それを活性化した場合に、コファクターＡＲＡ−７０が本質的な役割を果たすことが示された。ＡＲＡ−７０は、さらにＰＰＡＲγにおいてもコファクターの役割を果たし、受容体リガンド反応を増幅した。また、それ自体も受容体を活性化することができた。ＡＲの同時の存在は、活性化されたＰＰＡＲγ―リガンド複合体を消し、コファクターへの競合を示唆する。
【０１８０】
ＥＲ中のＡＲＡ−７０の影響は無視できる程度である。（Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＡＲＡ７０  ａｓ  ａ  ｌｉｇａｎｄ−ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｃｏａｃｔｉｖａｔｏｒ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ＰＰＡＲγ：  ヘインレイン  シンシア他（Ｈｅｉｎｌｅｉｎ  Ｃｙｎｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ）：Ｊ．ｏｆ  Ｂｉｏl.  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ｖｏｌ２７４，Ｎｏ．２３，Ｊｕｌ４，１６１４７−１６１５２，１９９９）。これは、摂護腺のようなアンドロゲンに支配されたシステムでのいくつかの予測可能な結果を指摘する。
【０１８１】
１．テストステロン、ジヒドロテストステロン及び１７β−ＡＥＤ及び恐らく１７α−ＡＥＤに対する他のリガンド、または少なくともその代謝物質、エピテストステロンは、ＰＰＡＲγ―リガンドの効果を打ち消すであろう。アンドロゲンの特性が、アップレギュレーションされたβ−カテニンの場合と同様にＡＲＡ−７０がある状態でこれらの物質中で活性化されるので、ＡＲ活性化を阻む手段としてのフルタミド及びビカルタミドは疑わしいか、あるいは少なくとも不完全である。
【０１８２】
アンドロゲン受容体は多くの器官で発現している。この受容体のダウンレギュレーションについて知られていることは、ダウンレギュレーション効果を有するＥＲαにより部分的に影響を受けるということである。それは、もちろん、テストステロンまたはジヒドロテストステロンのようなリガンドへのアクセスの減少により影響を受ける。さらに、それは、レスヴェラトロールによって、及び芳香族炭化水素の受容体の活性化によってダウンレギュレーションを受ける。
【０１８３】
アンドロゲン受容体を活性化する他の影響は、ＥＧＦまたはＨＥＲ−２の受容体並びにインターロイキン−６（ＩＬ−６）によるシグナリングである。しかしながら、ＩＬ−６によるシグナリングはＰＰＡＲγによって阻害される。
他の因子は、抗体によって、あるいはヒドロキシリノレン酸のようなＥＧＦ−Ｒリガンドの生産を止めるメラトニンの使用によって阻害することができた。
【０１８４】
２．この受容体の活性化がＴ−ヘルパー２タイプの応答に帰着するサイトカイン、ＩＬ−４を特徴づける多くの効果を与えるので、１７β−ＡＥＤの抗腫瘍効果をもたらす免疫強調作用は、ＰＰＡＲγ―リガンドによって打ち消される。このことは、腫瘍免疫療法に有用であることとまさに反対である。まず１７α−ＡＥＤ、続いて１７β−ＡＥＤによる連続的治療を使用する概念は、抗腫瘍効果を達成するにはまったく有用でない。オリジナルの実験で実証されたように、この組み合わせには抗腫瘍効果がなく、逆に腫瘍の増殖を刺激さえした。
【０１８５】
３．ＥＲαとＥＲβの存在は有効な受容体遮断を要する。タモキシフェンまたはラロキシフェンをこの目的のために使用することができる。今日、ＥＲβの機能の制御に関して知られていることから、これはそのリガンド３β，１７β−アンドロスタンジオールによってＥＲα活性を抑える受容体であるので、この受容体の活性を制御する必要はない。腫瘍系では、細胞シグナリングが欠陥かもしれないので、これは必ずしも該当しない。
【０１８６】
ＰＰＡＲγを発現すると知られている内皮細胞からのｃ−ｆｏｓに対する効果により付与されたＰＤＧＦ−ＢＢによるＶＥＧＦのアップレギュレーションが記載されている（ＰＰＡＲγ  ａｇｏｎｉｓｔｓ  ｉｎｃｒｅａｓｅ  ＶＥＧＦ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｓｍｏｏｔｈ  ｍｕｓｃｌｅ  ｃｅｌｌｓ：ヤマカワ  ケイ  他（Ｙａｍａｋａｗａ  Ｋ  ｅｔ  ａｌ），  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｒｅｓ．  Ｃｏｍｍｕｎ．  ２０００  Ｍａｙ  １９，  ２７１（３）：５７１−４)。ＭＭＰ−９の減少も、ＰＰＡＲγリガンドによる治療の後に観察した。出版物は、主としてＰＰＡＲγによるＶＥＧＦのアップレギュレーションを報告している。ｐ５３変異腫瘍中のＶＥＧＦの強いアップレギュレーションも報告されている。
【０１８７】
要約すると、本発明は、いくつかの新生細胞系で観察された増殖阻害、及びＤｕｎｎｉｎｇＡＴ−１ラット前立腺癌に生体内で見られた抗腫瘍効果を裏付ける異なるメカニズムの証拠を提供する。
【０１８８】
まず第１にスルホトランスフェラーゼの作用による１７α−ＡＥＤのサルフェート型への転化は、細胞成長の抑制、アポトーシスあるいは細胞周期阻止の原因である。これはＰＰＡＲγの作用により提供される。
【０１８９】
この型の効果は、主にスルホトランスフェラーゼ活性に、好ましくは肝臓、副腎、睾丸及び小腸に存在するＤＨＥＡスルホトランスフェラーゼに依存する。胎盤中の存在はまだ証明されていないが、関連するプレグネノロンスルホトランスフェラーゼは存在する。はるかに低い基質特異性を備えたスルホトラスファーがさらに、特にプレグネノロンスルホトランスフェラーゼ及びエストロゲンスルホトランスフェラーゼ（後者は多くの組織の中にある）により、どこか他のところで起きている可能性が高い。１７α−ＡＥＤＳのＰＰＡＲγの活性化効果を維持するために、治療すべき器官のスルファターゼ活性を縮小することは重要である。そうでなければこのプロセスは１７α−ＡＥＤＳを非活性化する。これは、スルファターゼの非エストロゲン抑制剤である適量のクーメイト（Ｃｏｕｍａｔｅ）（登録商標）の投与により回避することができる。
【０１９０】
本発明の発明者は、１７α−ＡＥＤ−３β−サルフェートで治療された３Ｔ３Ｌ１繊維芽細胞中の、及びＥＲ陰性乳癌細胞系ＳＫＢＲ−３中の増殖阻害を実証した。
【０１９１】
ヒトアンドロゲン不応性前立腺癌細胞系ＰＣ−３及びＤＵ−１４５で、エストロゲン受容体が遮断された時、ＰＣ−３細胞でかなりの細胞死が見られた。しかしながら、そのような効果はＤＵ−１４５では見られなかった。後者は恐らくこの細胞系でＰＰＡＲγの非常に低い発現に依存しており、代わりにＰＰＡＲδの強い発現によって支配されている。
【０１９２】
ＰＰＡＲγを発現すると知られている、従って１７αＡＥＤの３β−サルフェートに反応すると予想されている他の腫瘍は、尿道癌である、胃癌、内皮細胞、平滑筋細胞に由来する悪性腫瘍、結腸癌、コリンカルシノーマ、肺の腺癌、胃癌及び脂肪肉腫、並びに黒点及び緑内障の細胞のようなＰＰＡＲγリガンドによる治療によって影響を受ける眼組織の病理のいくつかの様相である。
【０１９３】
単球とリンパ細胞はプロ炎症性サイトカイン（ＩＬ−１、ＴＮＦａ、またＩＬ−６）並びにＴ細胞の中のＴ−ヘルパー  １(Ｔ-ｈｅｌｐｅｒ１)プロフィールのサイトカイン（ＩＦＮ−ｙ、ＴＮＦＰ及びＩＬ−２）の生産でダウンレギュレーションを受ける。代わりに、ＩＬ−４効果はＴ−ヘルパー  ２（Ｔ−ｈｅｌｐｅｒ２）−プロフィールの刺激と一致して促進される。これは、さらにクローン病のような炎症性腸疾病、胎盤の組織の疾病、慢性関節リウマチのような自己免疫性の炎症性疾病、多発性硬化症のような神経組織変成の疾病及びギランバレー症候群の疾病及びその他多くのものを含む。
【０１９４】
第２の作用機構は、１７α−ＡＥＤよりも強い１７ＯＨプレグネノロンの抗腫瘍効果によって実証されるように、細胞周期調節および血管形成阻害であり、ＰＰＡＲγによって媒介されない。
【０１９５】
ラット前立腺癌の中のにおいて１７β−ＡＥＤなしに１７α−ＡＥＤで治療した後のβ−カテニンのダウンレギュレーションについての本発明の観察は、２つのアンドロステンジオールエピマーがこの点における調節対かもしれないことを示唆する。
【０１９６】
１７α−ＡＥＤにおけるこの効果が、さらに１７αＯＨ−プレグネノロン、５−アンドロステン−３β，７β，１７α−トリオールにも存在することは、後者の物質のサルフェートはＰＰＡＲγリガンド活性を欠くので、これらの物質の抗腫瘍効果がＰＰＡＲγに依存しないことを示唆する。３つの物質すべては、腫瘍増殖に重要な要因であるβ−カテニンを著しくダウンレギュレーションする。β−カテニンの増加した発現は、１７β−ＡＥＤにインヴィヴォで接触させたラット前立腺癌で最初に見られる増殖刺激について説明するかもしれない。エストロゲンまたはアンドロゲン受容体による効果は、ＤｕｎｎｉｎｇＡＴ−１ラット前立腺癌はこれらの三つの受容体を測定可能な量で有しないので、説明として不十分である。
【０１９７】
細胞周期エントリー及び血管形成に対する影響による他の腫瘍中の効果も、本発明に含まれる。
【０１９８】
従って、増殖の抑制及びアンジオスタチン効果が望ましい場合は、１７ＯＨプレグネノロンあるいはサルフェートへの転化により直接ＰＰＡＲγを刺激しない他のステロイドが選択される。アンドロゲン環境の完全な動物の使用により、ＰＰＡＲγ活性の危険は共同因子の競合（ｑｕｅｎｃｈｉｎｇ）によりさらに縮小される。アンドロゲンはさらにスルホトランスフェラーゼ活性を遮断する。
【０１９９】
他方では、ＰＰＡＲγ活性化が望まれる場合、アンドロゲンは最小限にし、クーメイト（Ｃｏｕｍａｔｅ）（登録商標）のような抑制剤によってスルファターゼ活性を低くしておき、β−カテニンまたはサイクリンの増加した発現による腫瘍を回避すべきである。後者の可能なサインは、ＥＧＦ−Ｒシグナリングを増加させる。
【０２００】
本発明のデータは、良性および悪性の腫瘍の治療に用いた場合、本発明の化合物が治療上有効であることを示す。
【０２０１】
本発明は、さらに本発明の化合物のプロドラッグも含む。そのようなプロドラッグは、エステルその他、水酸基が保護されたプロドラッグである。それらの保護基は新陳代謝中にはずされる。
【０２０２】
本発明の化合物は、治療上有効な量で、好ましくは血清濃度が５０〜５００ｎＭに達するような量の中で投与される。本発明の医薬組成物は、有効成分を治療上不活性な補形薬と共に含む顆粒剤、錠剤または注射用溶液の形態で調製される。
【０２０３】
該組成物は、活性医薬を０．５〜９９．５重量％を含み得る。
【０２０４】
化合物の延長された放出を得るために、カチオン性デキストランと組み合わせて投与してもよく、炭素番号７，１１および１６の１またはそれ以上が置換されたアミノ置換化合物の形態で投与することもできる。
【図面の簡単な説明】
【０２０５】
【図１】は未分化のコントロール及び１７α＋１７β−ＡＥＤで治療された腫瘍の写真である。
【図２】は表ＩＶに関して議論されるウェスタンブロットを示す。
【図３】は、１７α−ＡＥＤ、１７β−ＡＥＤ、１７αＯＨ−プレグネノロン及び５−アンドロステン−３β，７β，１７α−トリオールのＶＥＧＦに対する作用を説明する。
【図４】は、１７α−ＡＥＤ、１７α−ＯＨプレグネノロン及び１７β−ＡＥＤのＤｕｎｎｉｎｇＡＴ−１（ラット前立腺腫瘍）におけるβ−カテニン、サイクリン  Ｄ１及びＣＯＸ−２の発現に対する効果を説明するウェスタンブロットを示す。
【図５】は、代表的な例によって説明された、未治療のコントロール中のＧ１，Ｓ期の中の細胞（ＣＡＣＤ）と１７α−ＡＥＤ（ａｌｆａＡ−Ｄ）で治療した後の細胞の比率の比較を示す。
【図６】は、リガンド誘導コアクチベーター分析において、ＰＰＡＲγリガンド活性について、どのように１７α−ＡＥＤ、１７０Ｈプレグネノロン、５−アンドロステン−３β，７β，１７α及びそれぞれの３β−サルフェートを調べたかを説明する。
【図１】
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【図２】
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【図４】
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【図５（１）】
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【図５（２）】
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【図５（３）】
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【図５（４）】
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【図５（５）】
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【図５（６）】
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【図５（７）】
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【図５（８）】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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