(57)【要約】本発明は、ａ）サンプルを、ルシフェラーゼレポータープラスミド、アンドロゲン受容体のリガンド結合ドメインおよびＧａｌ４ＤＮＡ結合ドメインからなる融合タンパク質であって、該ルシフェラーゼレポータープラスミドにおける結合部位に結合し得る融合タンパク質、アンドロゲン受容体のＮ末端領域およびルシフェラーゼ遺伝子プロモーターに結合できるタンパク質からなる融合タンパク質、およびアンドロゲン受容体相互作用タンパク質３を含有する細胞と接触させ、ｂ）該サンプルを当該細胞とともにインキュベーションし、ｃ）該細胞を溶解し、ｄ）溶解物のルシフェラーゼ活性を測定し、ｅ）測定したルシフェラーゼ活性を、サンプルの代わりにコントロールが加えられる以外は前記ａ）からｄ）の工程を繰り返すことにより得られるルシフェラーゼ活性と比較して、サンプルの相対ルシフェラーゼ活性を与え、そしてｄ）該相対ルシフェラーゼ活性を用いてサンプル中の活性なアンドロゲンを検出または定量することからなる、サンプルのアンドロゲン活性を決定する方法に関する。
2004504856.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプルのアンドロゲン活性を決定する方法であって、
ａ）サンプルを、
ルシフェラーゼレポータープラスミド、
アンドロゲン受容体のリガンド結合ドメインおよびＧａｌ４ＤＮＡ結合ドメインからなる融合タンパク質であって、該ルシフェラーゼレポータープラスミドにおける結合部位に結合可能である融合タンパク質、
アンドロゲン受容体のＮ末端領域およびルシフェラーゼ遺伝子プロモーターに結合し得るタンパク質からなる融合タンパク質、および
アンドロゲン受容体相互作用タンパク質３
を含有する細胞と接触させる工程、
ｂ）該サンプルを該細胞と共にインキュベーションする工程、
ｃ）該細胞を溶解する工程、
ｄ）溶解物のルシフェラーゼ活性を測定する工程、
ｅ）測定したルシフェラーゼ活性と、サンプルの代わりにコントロールを加える以外は前記工程ａ）からｄ）までの工程を繰り返すことにより得られるルシフェラーゼ活性とを比較してサンプルの相対ルシフェラーゼ活性を与える工程、および
ｆ）相対ルシフェラーゼ活性を用いてサンプル中の活性なアンドロゲンを検出または定量する工程
からなる方法。
【請求項２】
サンプルが哺乳動物とくにヒトの血清サンプルである請求項１記載の方法。
【請求項３】
血清サンプルが、サンプルを細胞と接触させる前に結合タンパク質からアンドロゲンを遊離させるように処理されている請求項２記載の方法。
【請求項４】
サンプルがアンドロゲン活性に関して試験されるべき化合物を含有する溶液である請求項１記載の方法。
【請求項５】
化合物の抗アンドロゲン活性を決定する方法であって、
ａ）アンドロゲン活性を有する第一化合物からなる第一サンプルから放出されるルシフェラーゼ活性を請求項４記載の方法にしたがって測定する工程、
ｂ）アンドロゲン活性を有する第一化合物と、Ｉ）抗アンドロゲン活性に関して試験されるべき第二化合物またはＩＩ）哺乳動物血清、とからなる第二サンプルから放出されるルシフェラーゼ活性を前の工程にしたがって測定し、
ｃ）前記ａ）工程とｂ）工程で得られるルシフェラーゼ活性を比較する工程、および
ｄ）該第二サンプルから放出される低下したルシフェラーゼ活性を用いて第二化合物または血清の抗アンドロゲン活性を検出または定量する工程
からなる方法。
【請求項６】
細胞が
ルシフェラーゼレポータープラスミドｐＧ５−ＬＵＣ、
ヒトアンドロゲン受容体のリガンド結合ドメインおよびＧａｌ４ＤＮＡ結合ドメインでクローニングされたベクターからなるプラスミドであって、ｐＭ−ｈＡＲであり、ヒトＡＲのアミノ酸６５７〜９１９からなるプラスミド、
ラットアンドロゲン受容体のＮ末端領域およびルシフェラーゼ遺伝子プロモーターでクローニングされたベクターからなるプラスミドであって、ｐＶＰ１６−ｒＡＲであり、ラットＡＲのアミノ酸５〜５３８からなるプラスミド、および
アンドロゲン受容体相互作用タンパク質３でクローニングされたベクターからなるプラスミドであって、ｐＦＬＡＧ−ＡＲＩＰ３であるプラスミド
でトランスフェクションして調製されている請求項１、２、３、４または５記載の方法。
【請求項７】
細胞が哺乳動物細胞である請求項６記載の方法。
【請求項８】
哺乳動物細胞がＣＯＳ−１である請求項７記載の方法。
【請求項９】
ルシフェラーゼレポータープラスミド、
アンドロゲン受容体のリガンド結合ドメインおよびＧａｌ４ＤＮＡ結合ドメインからなる融合タンパク質であって、該ルシフェラーゼレポータープラスミドにおける結合部位に結合可能である融合タンパク質、
アンドロゲン受容体のＮ末端領域およびルシフェラーゼ遺伝子プロモーターに結合し得るタンパク質からなる融合タンパク質、および
アンドロゲン受容体相互作用タンパク質３
を含有する細胞。
【請求項１０】
細胞が
ルシフェラーゼレポータープラスミドｐＧ５−ＬＵＣ、
ヒトアンドロゲン受容体のリガンド結合ドメインおよびＧａｌ４ＤＮＡ結合ドメインでクローニングされたベクターからなるプラスミドであって、ｐＭ−ｈＡＲであり、ヒトＡＲのアミノ酸６５７〜９１９からなるプラスミド、
ラットアンドロゲン受容体のＮ末端領域およびルシフェラーゼ遺伝子プロモーターでクローニングされたベクターからなるプラスミドであって、ｐＶＰ１６−ｒＡＲであり、ラットＡＲのアミノ酸５〜５３８からなるプラスミド、および
アンドロゲン受容体相互作用タンパク質３でクローニングされたベクターからなるプラスミドであって、ｐＦＬＡＧ−ＡＲＩＰ３であるプラスミド
でトランスフェクションして調製されている請求項９記載の細胞。
【請求項１１】
細胞が哺乳動物細胞である請求項１０記載の細胞。
【請求項１２】
哺乳動物細胞がＣＯＳ−１である請求項１１記載の細胞。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
［発明の分野］
本発明はサンプルのアンドロゲン活性もしくは抗アンドロゲン活性を決定する方法であって、サンプルが哺乳動物の血清または検体化合物溶液である方法に関する。
【０００２】
［発明の背景］
本発明の背景を示すためにここで用いられる刊行物およびそのほかの資料、ならびに、とくに実施に関する追加的詳細を提供する事例は参考文献によって取り入れられる。
【０００３】
アンドロゲンは胎内における男性器の男性化、男子の第二次性徴の発達、および成人生活における男性の性機能の維持に必要である。標的細胞に入った後、アンドロゲンはリガンド依存的転写因子であるアンドロゲン受容体（ＡＲ）に結合する。該ホルモンが結合した後、ＡＲは核内に入り標的遺伝子の調節領域にホモダイマーとして結合する。ＡＲは種々形態のビタミンＤ３、甲状腺ホルモン、レチノイドおよびステロイドホルモンの受容体からなる核内受容体スーパーファミリーに属する（１）。これら受容体は、ＤＮＡ−およびリガンド−結合ドメイン（それぞれＤＢＤおよびＬＢＤ）、および可変ヒンジとＮ末端領域を保存している（１）。ＡＲの場合、Ｎ末端領域は一次転写活性ドメインを包含する。アンドロゲンが結合すると、ＬＢＤおよびＡＲのＮ末端領域は相互作用を示し、このことはＡＲ二量化を容易にすること（２，３）、転写活性を調節すること（４）および低リガンド濃度で受容体を安定化すること（５）を示唆している。
【０００４】
ＡＲ−相互作用タンパク質３（ＡＲＩＰ３）、すなわち精巣で主として発現する５７２アミノ酸核タンパク質は、ＡＲ依存的転写の潜在的なコレギュレーターを意味する（６）。ＡＲＩＰ３の正確な生理的役割は未だ知られていないが、本発明者らはそれがＡＲ　ＬＢＤとＮ末端領域のあいだのアンドロゲン依存的相互作用をかなり促進にすることを観察した。本発明者らはＡＲＩＰ３で促進されたＬＢＤとＡＲのＮ末端領域とのあいだの相互作用に基づくバイオアッセイの開発をここに報告する。このアッセイは小児科の患者における循環アンドロゲン生物活性の定量に有用であると思われる。本発明者らは本アッセイが臨床内分泌学において広範な効果を有することを期待している。
【０００５】
［発明の要旨］
したがって、本発明の一側面によれば、本発明はサンプルのアンドロゲン活性を決定する方法であって、
ａ）サンプルを
ルシフェラーゼレポータープラスミド、
アンドロゲン受容体のリガンド結合ドメインおよびＧａｌ４ＤＮＡ結合ドメインからなる融合タンパク質であって、該ルシフェラーゼレポータープラスミドにおける結合部位に結合可能である融合タンパク質、
アンドロゲン受容体のＮ末端領域およびルシフェラーゼ遺伝子プロモーターに結合し得るタンパク質からなる融合タンパク質、および
アンドロゲン受容体相互作用タンパク質３
を含有する細胞と接触させる工程、
ｂ）該サンプルを該細胞と共にインキュベーションする工程、
ｃ）該細胞を溶解する工程、
ｄ）溶解物のルシフェラーゼ活性を測定する工程、
ｅ）測定したルシフェラーゼ活性と、サンプルの代わりにコントロールを加える以外は前記工程ａ）からｄ）までの工程を繰り返すことにより得られるルシフェラーゼ活性とを比較してサンプルの相対ルシフェラーゼ活性を与える工程、および
ｆ）相対ルシフェラーゼ活性を用いて、サンプル中の活性なアンドロゲンを検出または定量する工程
からなる方法に関する。
【０００６】
ほかの側面によれば、本発明は化合物の抗アンドロゲン活性を決定する方法にであって、
ａ）前述のようなアンドロゲン活性を有する第一化合物からなる第一サンプルから放出されるルシフェラーゼ活性を測定する工程、
ｂ）アンドロゲン活性を有する前記第一化合物と、Ｉ）抗アンドロゲン活性に関して試験されるべき第二化合物またはＩＩ）哺乳動物の血清、とからなる第二サンプルから放出されるルシフェラーゼ活性を前の工程にしたがって測定する工程、
ｃ）前記ａ）工程とｂ）工程で得られるルシフェラーゼ活性を比較する工程、および
ｄ）該第二サンプルから放出される低下したルシフェラーゼ活性を用いて第二化合物または血清の抗アンドロゲン活性を検出または定量する工程
からなる方法に関する。
【０００７】
第三の側面によれば、本発明は
ルシフェラーゼレポータープラスミド、
アンドロゲン受容体のリガンド結合ドメインおよびＧａｌ４ＤＮＡ結合ドメインからなる融合タンパク質であって、該ルシフェラーゼレポータープラスミドにおける結合部位に結合可能である融合タンパク質、
アンドロゲン受容体のＮ末端領域およびルシフェラーゼ遺伝子プロモーターに結合し得るタンパク質からなる融合タンパク質、および
アンドロゲン受容体相互作用タンパク質３
を含有する細胞に関する。
【０００８】
［発明の詳細な説明］
本発明のアッセイはヒト血清や小児科患者における循環中のアンドロゲンの生物活性の定量に有用と思われる。したがって、本発明者らは本アッセイが臨床内分泌学において広範な効果を有することを期待する。
【０００９】
ほかの実施態様によれば、本発明者らは本発明のアッセイがアンドロゲン活性に関して試験化合物をスクリーニングするために非常に有用であると信ずる。この場合、血清サンプルに代えて、試験化合物の溶液をトランスフェクションした細胞と接触させる。
【００１０】
さらなる実施態様によれば、本方法は溶液または血清サンプル中の試験化合物の抗アンドロゲン活性を測定するためにも適用可能である。この場合、アンドロゲン活性を有する第一化合物からなる第一サンプルから放出されるルシフェラーゼ活性を測定する。ついで、アンドロゲン活性を有する当該第一化合物と、Ｉ）抗アンドロゲン活性に関して試験されるべき第二化合物またはＩＩ）血清、とからなる第二サンプルから放出されるルシフェラーゼ活性を測定する。２つの測定から得られるルシフェラーゼ活性を比較し、第二サンプルから放出される減少したルシフェラーゼ活性を用いて第二化合物または血清の抗アンドロゲン活性を検出または定量する。
【００１１】
血清サンプルのアンドロゲン活性を検討する場合は、サンプルを細胞と接触させる前に結合タンパク質からアンドロゲンを遊離させるために、サンプルを処理するのが好ましい。かかる処理はたとえばジエチルエーテルによる抽出であり得る。
【００１２】
トランスフェクションされる細胞はアンドロゲン感受性でない細胞である。好ましい細胞は、本発明がそれにより限定されるわけではないが、哺乳動物細胞である。たとえば、この条件を満たす酵母細胞も採用してもよい。好ましい哺乳動物細胞はＣＯＳ−１細胞（ＡＴＣＣ　Ｎｏ．ＣＲＬ−１６５０）である。
【００１３】
好ましい態様によれば、ルシフェラーゼレポータープラスミドはｐＧ５−ＬＵＣであり、ヒトアンドロゲン受容体のリガンド結合ドメインでクローニングしたベクターはアミノ酸６５７〜９１９を含有するｐＭ−ｈＡＲであり、ラットアンドロゲン受容体のＮ末端領域でクローニングしたベクターはアミノ酸５〜５３８を含有するｐＶＰ１６−ｒＡＲであり、アンドロゲン受容体相互作用タンパク質３はｐＦＬＡＧ−ＡＲＩＰ３である。
【００１４】
ＬＢＤとＡＲのＮ末端領域とのあいだのＡＲＩＰ３で促進された相互作用に基づく本発明のバイオアッセイは、既知方法に比べて多くの利点を有する。このアッセイはトランスフェクションされた細胞の利用に基づくので、プローブの調製はその細胞を培養するだけで実施することができる。本アッセイは非常に感度がよくかつ特異的である。本アッセイは広域の動的範囲（ｄｙｎａｍｉｃ ｒａｎｇｅ）をもち、エストラジオールに対する最小の交差反応性を示す。たとえば、男子においては、血清アンドロゲン生物活性レベルとＲＩＡで測定したテストステロン濃度とはよく相関したが、生物活性レベルはより低かった。これは恐らくアンドロゲンのＳＨＢＧへの結合を反映しているものと思われる。
【００１５】
以下に、非限定的な実験の部で本発明を説明する。
【００１６】
実験の部
本発明者らは、少量（１０μｌ）のヒト血清から直接アンドロゲン生物活性を測定し得る哺乳動物細胞（ＣＯＳ−１）バイオアッセイを開発した。組み換え体アッセイ（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｓｓａｙ）はリガンド結合ドメインとアンドロゲン受容体（ＡＲ）のＮ末端領域（これらは、サッカロマイセス　セレビシエのＧａｌ４　ＤＮＡ結合領域および単純ヘルペスＶＰ１６タンパク質の転写活性ドメインとそれぞれ融合した）とのあいだでのアンドロゲン依存的相互作用に基づいている。この相互作用は細胞中のＡＲ−相互作用タンパク質３（ＡＲＩＰ３）を共発現することによって増幅される。レポータープラスミドはルシフェラーゼ遺伝子の上流に５個のＧａｌ４結合部位を含んでいた。細胞溶解物中のルシフェラーゼ活性はヒト血清中のアンドロゲン生物活性から誘導される。ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）中のテストステロンの飽和濃度は相対ルシフェラーゼにおいて、７００倍を超える誘導を引き起こした。感度は、ＦＣＳ中１．０ｎｍｏｌ／Ｌ未満のテストステロンであった。イントラアッセイおよびインターアッセイ変動係数はそれぞれ８．３％と２５％であった。ＡＲ末端間の相互作用は非ステロイド性抗アンドロゲンによって阻害され、そのアッセイはエストラジオールとの最小の交差反応性を示した。血清アンドロゲン生物活性は思春期の体質的遅延を有する男子２３人（ＣＤＰ；年齢１３．９歳から１６．８歳）および潜伏精巣症を有する思春期前の男子９人（年齢：１．０歳から６．４歳）で検討した。アンドロゲン生物活性はＣＤＰを有する男子１５人ならびにｈＣＧ（範囲：１．０〜１４．５テストステロン当量）での治療中の潜伏精巣症を有するすべての男子で検出可能であった。バイオアッセイで測定した血清アンドロゲン生物活性は、血清テストステロン濃度（ｒ＝０．９３、Ｐ＜０．０００１、ｎ＝２２）と強く相関したが、ジヒドロテストステロン、ＤＨＥＡ、またはアンドロステンジオンのレベルとは相関しなかった。
【００１７】
材料および方法
プラスミド：
すべてのプラスミド構築物は以前に報告されており（４、６〜７）、本明細書ではおのおのにつき簡単な記載のみとする。ヒトＡＲのＬＢＤ（アミノ酸６５７〜９１９を含む）（７）およびラットＡＲのＮ末端領域（５〜５３８）（４）はＰＣＲにより作製し、ｐＭおよびＶＰ１６ベクター（クロンテックラボラトリーズ社（ＣＨＬＯＮＴＥＣ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．）、パロ　アルト（Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ）、カナダ）にそれぞれクローニングした。ルシフェラーゼレポーターｐＧ５−ＬＵＣは最小ＴＡＴＡボックスの前に５つのＧａｌ４−結合部位を含む。ｐＦＬＡＧ−ＡＲＩＰ３は記載済みである（６）。
【００１８】
細胞培養およびトランスフェクション：
ＣＯＳ−１細胞（アメリカン　タイプ　カルチャー　コレクション）は、ペニシリン（２５ｕｎｉｔｓ／ｍｌ）、ストレプトマイシン（２５ｕｎｉｔｓ／ｍｌ）および１０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）ウシ胎仔血清（ＦＣＳ；ギブコＢＲＬ社（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）、ペイスレイ（Ｐａｉｓｌｅｙ）、英国）を含有するフェノールレッドなしのダルベッコ最少必須培地（ＤＭＥＭ；ギブコＢＲＬ社（Ｇｉｂｃｏ　ＢＲＬ）、サンタ　クララ（Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ）、カナダ）中で維持した。トランスフェクションの２４時間前に、細胞を９６穴プレート（ヌンク社（ＮＵＮＣ）、ロスキルデ（Ｒｏｓｋｉｌｄｅ）、デンマーク）に１０００細胞／穴の濃度で分配した。プレートを５％ＣＯ２／空気の湿潤雰囲気下、３７℃で一夜インキュベーションした。トランスフェクション３時間前に、細胞培養培地を、８％の炭除去ＦＣＳ（ｃｈａｒｃｏａｌ−ｓｔｒｉｐｐｅｄ ＦＣＳ）を含有するＤＭＥＭで置き換えた。細胞をＦｕＧｅｎｅ試薬（ロッシュ　モレキュラー　バイオケミカルズ社（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）、マンハイム、ドイツ）を用いて製造者が提供している指示書にしたがってトランスフェクションした。各ウェルは全部で４９ｎｇのＤＮＡ（ｐＧ５−ＬＵＣ、１８ｎｇ；ｐＭ−ｈＡＲ（６５７〜９１９）、９ｎｇ；ｐＦＬＡＧ−ＰＡＲＩＰ、９ｎｇ；ｐＶＰ１６−ｒＡＲ（５〜５３８）、９ｎｇおよびｐＣＭＶβ４ｎｇ）を受けた。
【００１９】
トランスフェクション２４時間後、各ウェル中の培地をＦＣＳを含まないフェノールレッドなしのＤＭＥＭ９０μｌで置き換え、ついで１０μｌのテストステロン含有ＦＣＳを３組（標準）に、または１０μｌのヒト血清（未知サンプル）を２組に加えた。５％ＣＯ２／空気の湿潤雰囲気下、３７℃で一夜インキュベーションした後、吸引してウェルを空にし、希釈したレポーターリシスバッファー（プロメガ社（Ｐｒｏｍｅｇａ）、マディソン、ウィスコンシン州）３０μｌ中で細胞を溶解し、細胞溶解物１０μｌをβ−ガラクトシダーゼ活性（８）およびルシフェラーゼ活性（９）を測定するために９６穴プレートに移した。
【００２０】
性ステロイドおよび非ステロイド性抗アンドロゲン：
デヒドロエピアンドロステロン（ＤＨＥＡ；３β−ヒドロキシ−５−アンドロステン−１７−オン）、アンドロステンジオン（４−アンドロステン−３，１７−ジオン）および５α−ジヒドロテストステロン（ＤＨＴ；１７β−ヒドロキシ−５α−アンドロスタン−３−オン）（これら試薬はステラロイド社（Ｓｔｅｒａｌｏｉｄｅ Ｉｎｃ．，）（ウィルトン、ＮＨ）より入手した）をエタノール中に溶解して順次希釈し、ついで炭除去 ＦＣＳに加えて６．１３ｎｍｏｌ／Ｌ、２５ｎｍｏｌ／Ｌおよび１００ｎｍｏｌ／Ｌの濃度のものを得た。ＤＨＴはさらにＦＣＳ中で希釈し０．７８ｎｍｏｌ／Ｌの血清濃度とした。これらのステロイドはテストステロン標準曲線と並行してバイオアッセイで試験した。エストラジオールのトランスアクチベーション能力を検討するために、１７β−エストラジオールを炭除去 ＦＣＳ中に溶解し５００ｎｍｏｌ／Ｌの血清濃度とした。非ステロイド性抗アンドロゲンであるカソデックス（Ｃａｓｏｄｅｘ）（（２ＲＳ）−４′−シアノ−３−（４−フルオロフェニルスルホニル）−２−ヒドロキシ−２−メチル−３′−トリフルオロメチル−プロピオンアニリド）、およびヒドロキシフルタミド（４−ヒドロキシ−α、α、α−トリフルオロ−２−メチル−４′−ニトロ−ｍ−プロピオノトルイジド）をそれぞれゼネカファーマシューティカルズ社（Ｚｅｎｅｃａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）（マックレスフィールド（Ｍａｃｃｌｅｓｆｉｅｌｄ）、英国）およびシェーリング社（Ｓｃｈｅｒｉｎｇ Ｃｏｒｐ．）（ブラッドフェルド（Ｂｌｏｏｍｆｅｌｄ）、ニュージランド）から入手した。これら非ステロイド性抗アンドロゲンをエタノール中に連続的に溶解し、テストステロン１０ｎｍｏｌ／Ｌを含有する炭除去ＦＣＳに加えた。得られたＦＣＳ中の抗アンドロゲンの最高濃度はヒドロキシフルタミドで１μｍｏｌ／Ｌ、およびカソデックスで１μｍｏｌ／Ｌであった。測定は一回のトランスフェクションで４組実施した。
【００２１】
バイオアッセイ用のスタンダードおよび患者血清の調製：
テストステロン（ステラロイズ社（Ｓｔｅｒａｌｏｉｄｓ Ｉｎｃ．）、 ウィルトン、ＮＨ）をエタノール中に溶解し、順次希釈し、炭除去ウシ胎仔血清（ＦＣＳ；ハイクローン社（ＨｙＣｌｏｎｅ）、ローガン、ユタ州）に加え、アリコートに分割し、これらをバイオアッセイのスタンダードとして後に使用するため−７０℃で保存した。各男子（下記参照）から得た６０マイクロリットルの血清を手短に遠心分離し、０．２２μｍのＳｐｉｎ−Ｘ遠心分離フィルターユニット（コーニングコースターコーポラション）（Ｃｏｒｎｉｎｇ ｃｏｓｔａｒ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、ニューヨーク、ニューヨーク州）でろ過し、使用するまで−７０℃で保存した。
【００２２】
エーテル抽出：
テストステロンを潜伏精巣症（１３）の思春期前の男子１０人（年齢幅：１．０〜８．０歳）のプールしておいた血清に加えた。血清プールをガラスチューブ中３００μｌ アリコートに分割し、ついでジエチルエーテル（メルク社（Ｍｅｒｃｋ）、ダムスタット、ドイツ）３００μｌを加えた。チューブを手短にボルテックスで混合し、４℃で１０分間遠心分離し、ドライアイス−エタノール（−７０℃）浴中に入れて水層を凍結し、そののち有機層は新しいガラスチューブに移した。凍結を一回繰り返し、ジエチルエーテルを留去し、サンプルを３００μｌの炭除去ＦＣＳ（５つのチューブ）中で再構成した。チューブを４℃で一夜穏やかに振とうし、０．２２μｍのＳｐｉｎ−Ｘ遠心分離フィルターユニットでろ過した。各チューブから得た血清３０〜６０μｌをテストステロンＲＩＡ（下記参照）用に取った。男子のプールした血清中（および炭除去ＦＣＳ中）の血清性ホルモン−結合グロブリン（ＳＨＢＧ）レベルを下記のアッセイを用いて測定した。
【００２３】
被験者：
１．０〜１６．８歳の男子３２人を検討した。１３．９〜１６．８歳の男子２３人は思春期の体質的遅延（ＣＤＰ）を有していた。男子１９人における血清ホルモンレベルと共に臨床データが以前に文献発表されている（１０）。男子は初期思春期（男子１８人はタナー段階Ｇ２、５人は段階Ｇ３）であり、思春期遅延と説明できる基礎疾病を有していなかった。６５パーセントが家族に思春期遅延の病歴を有していた。男子を臨床的に検査し、思春期をタナー（１１）にしたがって各付けし、精巣を定規で測定し、精巣体積を式：長さ×幅２×０．５２（１２）により算出し、また一つの血液サンプルを採取した。２２人の男子は１２ヶ月以上追跡し、思春期が各被験者で進行した。別の検討グループは潜伏精巣症（臨床データおよび血清ホルモンレベルは以前に文献発表済み；１３）を有する１．０〜６．４歳の男子９人からなっていた。これら男子はヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ；１５００〜５０００ＩＵｉ．ｍ．，一週間隔で３回）で治療された。血液サンプルは処置直前と最後のｈＣＧ注射の４日後に採取した。この血液サンプルは凝固させ、血清を遠心分離で分離し必要になるまで−７０℃で保存した。検討プロトコールはヘルシンキ大学の子供・青春期人病院（Ｈｏｓｐｉｔａｌ ｆｏｒ Ｃｈｉｌｄｒｅｎ ａｎｄ Ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｓ）の倫理委員会で承認されている。インフォームドコンセントは保護者ならびにＣＤＰをもつ男子から取得した。
【００２４】
イムノアッセイ：
血清テストステロン濃度は市販のＲＩＡキット（オリオン　ダイアグノスティカ社（Ｏｒｉｏｎ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ）、エスポー、フィンランド；１０、１３）を用いて測定した。製造元によれば、アッセイは５α−ジヒドロテストステロンと４．５％の交差反応性を有し、ほかのステロイドホルモンに対しては最小の交差反応を示す。血清ＤＨＴ、アンドロステンジオンおよびＤＨＥＡ濃度はＣＤＰ男子において、文献記載（１４）と同様にＬｉｐｉｄｅｘ−５０００マイクロカラム（パッカード−ベッカー社（Ｐａｃｋａｒｄ−Ｂｅｃｋｅｒ）、グロニンガー（Ｇｌｏｎｉｎｇｅｒ）、オランダ）でステロイド分画を分離後に測定した。ＣＤＰ男子２２人の血清ＳＨＢＧ濃度は時間分解フルオロイムノアッセイ（ワラック　オ社（Ｗａｌｌａｃ Ｏｙ）、ツルク、フィンランド）を用いて測定した。製造元によれば、ＳＨＢＧアッセイの感度は０．５ｎｍｏｌ／Ｌよりよく、インターアッセイとイントラアッセイの変動係数は共に５％未満である。
【００２５】
データ分析：
相対ルシフェラーゼ活性はトランスフェクション効率における差を補正するためにルシフェラーゼ活性をβ−ガラクトシダーゼ活性で割って計算した。バイオアッセイの標準曲線はＡｓｓａｙＺａｐプログラム（ビオソフト社（Ｂｉｏｓｏｆｔ Ｉｎｃ．）、 ケンブリッジ、英国）を用いて４パラメーターの荷重方程式（ａ ４ ｐａｒａｍｅｔｅｒ ｗｅｉｇｈｔｅｄ ｅｑｕａｔｉｏｎ）で合わせた。結果はｎｍｏｌ／Ｌテストステロン当量で表示する。ピアソンの相関係数は変数の関連を検討するため変数間で計算した。異なったパラメーターの平均値は適切な場合は、対応のあるおよび対応のないｔ検定（ｐａｉｒｅｄ ａｎｄ ｕｎｐａｉｒｅｄ ｔ−ｔｅｓｔ）で試験した。すべての平均値は±ＳＤで表示した。統計的な有意性はＰ＜０．０５で受け入れた。
【００２６】
結果：
ヒト血清中のアンドロゲンに対する哺乳動物細胞の応答を定量するバイオアッセイの原理を図１に示す。血清からのアンドロゲンはＣＯＳ−１細胞に入り、ＬＢＤとＡＲのＮ末端領域とのあいだの相互作用を誘導する。この相互作用はＡＲＩＰ３により促進される（６）。複合体はｐＧ５−ＬＵＣに存在するＧａｌ４結合部位に結合し、ＶＰ１６転写活性化ドメインはルシフェラーゼ遺伝子プロモーターに繋がりルシフェラーゼ遺伝子転写の活性化を導く。細胞溶解物中のルシフェラーゼ活性はヒト血清中のアンドロゲン生物活性に相当する。
【００２７】
用量反応：
各種量のテストステロンを炭除去ＦＣＳに加えた。得られた用量反応曲線は図２に示す。値は相対ルシフェラーゼ活性（各ウェルで得られたβガラクトシダーゼ活性で割ったルシフェラーゼ活性）の単位として表示されている。相対ルシフェラーゼ活性の最も急な上昇はＦＣＳ中のテストステロンが１０ｎｍｏｌ／Ｌより低い濃度で起きた。五回の種々アッセイからの最大倍率誘導の平均値（テストステロン無添加の炭除去ＦＣＳにより誘導される活性に対する１００ｎｍｏｌ／Ｌのテストステロンにより誘導される相対ルシフェラーゼ活性の比として計算）は７４５であった。
【００２８】
アンドロゲンおよびエストロゲンの生体能力：
各種の天然アンドロゲンの生体能力を検討するため、ＤＨＴ、アンドロステンジオンおよびＤＨＥＡを炭除去ＦＣＳに加えた。ジヒドロテストステロンが最も活性なアンドロゲンであった。ＤＨＴ０．７８ ｎｍｏｌ／Ｌを含有するＦＣＳは１０．０ｎｍｏｌ／Ｌテストステロン当量に等しい相対ルシフェラーゼ活性を誘導した。アンドロステンジオンの最高濃度（ＦＣＳ中１００ｎｍｏｌ／Ｌ）のみが１．３ｎｍｏｌ／Ｌのテストステロン当量に等しいシグナルを誘導した。ＤＨＥＡはいかなる量でもルシフェラーゼ遺伝子発現を活性化しなかった。高濃度のエストラジオール（５００ｎｍｏｌ／Ｌ）を含有するＦＣＳにより誘導される相対ルシフェラーゼ活性はテストステロン飽和濃度（１００ｎｍｏｌ／Ｌ）を含有するＦＣＳで達せられるそれの０．１％未満であった。
【００２９】
非ステロイド性抗アンドロゲンによる阻害：
ＡＲのフラグメント間の相互作用に対する抗アンドロゲンの効果は、まずテストステロンを炭除去ＦＣＳに加えて亜飽和濃度（１０ｎｍｏｌ／Ｌ）を与えることにより検討した。ついで、増量したヒドロキシフルタミドおよびカソデックスをテストステロン含有ＦＣＳのアリコートに加えた。各希釈液１０μｌをバイオアッセイにおける測定に付した。テストステロンのモル量の１００倍（ヒドロキシフルタミド）または１０００倍（カソデックス）（すなわち、臨床的に得られ得る抗アンドロゲン濃度）量を含有するＦＣＳは、抗アンドロゲンを添加しないテストステロン含有ＦＣＳにより達せられる活性の〜５％に相当するレベルまで相対ルシフェラーゼ活性を抑制した。
【００３０】
感度および精度：
バイオアッセイの感度は、テストステロン無添加の炭除去ＦＣＳで誘導される複数のルシフェラーゼ活性の平均と標準偏差の２倍をもって定義した。その感度はテストステロン１．０ｎｍｏｌ／Ｌ含有ＦＣＳ（０．１ｎｍｏｌ／Ｌのテストステロンを含有する細胞培養培地）で誘導されるシグナル以下であった。イントラアッセイの偏差係数（ＣＶ）は同じヒト血清サンプルの繰り返し測定として定義した。４．９ｎｍｏｌ／Ｌテストステロン当量で、イントラアッセイの偏差係数（ＣＶ）は８．３％であり、インターアッセイのＣＶは２５％（５回のアッセイから決定したとき）であった。
【００３１】
患者データ：
血清アンドロゲン生物活性レベルはＣＤＰ男子１５人およびｈＣＧで治療中の潜伏精巣症を有する思春期前男子９人全員で測定感度以上であった（ｈＣＧ治療前のアンドロゲン生物活性レベルはアッセイの検出限界以下であった）。アッセイ感度以上のアンドロゲン生物活性の平均は４．３±３．２ｎｍｏｌ／Ｌであり、１．０〜１４．５ｎｍｏｌ／Ｌテストステロン当量（ｎ＝２４）におよんだ。これらの値は用量反応曲線の上昇部分にあり、ＲＩＡ（ｒ＝０．９３，Ｐ＜０．０００１，ｎ＝２２，図３）。血清全テストステロンの機能として表現すると、平均の血清アンドロゲン生物活性レベルは、ＣＤＰまたは潜伏精巣症を有する男子でそれぞれ２６±３．７％および３３±９％であった（Ｐ＜０．０５）。ＣＤＰを有する男子では、このパーセンテージおよび精巣容積ははっきりと相関した（ｒ＝０．４９、ｎ＝１３、Ｐ＝０．０９）。
【００３２】
ＣＤＰを有する男子において、血清アンドロゲン生物活性レベルは血清ＤＨＥＡ（範囲、４．７〜２１．１ｎｍｏｌ／Ｌ）、ＤＨＴ（０．３〜３．４ｎｍｏｌ／Ｌ）またはアンドロステンジオン（０．９〜４．４ｎｍｏｌ／Ｌ）濃度には相関しなかった。生物活性とＳＨＢＧとの関連性を検討するとき、バイオアッセイの感度以下の相対ルシフェラーゼ活性はバイオアッセイの検出限界に等しいところに設定した。一人の男子はＣＤＰを有するほかの男子（範囲：３６〜１２５ｎｍｏｌ／Ｌ）よりも明らかに高い血清ＳＨＢＧレベル（２５０ｎｍｏｌ／Ｌ）であり、この値はすべて相関関係分析から除外した。アンドロゲン生物活性レベルは血清ＳＨＢＧ濃度と負に相関し（ｒ＝−０．４４、Ｐ＜０．０５、ｎ＝２１）、精巣容量に正に相関した（ｒ＝０．７７、Ｐ＜０．０００１、ｎ＝２３）。
【００３３】
ヒト血清のエーテル抽出：
血清アンドロゲン生物活性とテストステロンレベルとのあいだの関係をさらに検討するために、潜伏精巣症を有する思春期前の男子１０人のプールした血清にテストステロンを加えて２１ｎｍｏｌ／Ｌの血清濃度とした。このプールにおいて、ＲＩＡで測定した血清テストステロン濃度は２０．６±０．９ｎｍｏｌ／Ｌであり、バイオアッセイで測定したアンドロゲン生物活性レベルは５．７±０．６ｎｍｏｌ／Ｌテストステロン当量であった（図４）。この血清プール中のＳＨＢＧ濃度は１３５ｎｍｏｌ／Ｌであった。本発明者らはプールした血清を、結合タンパク質からステロイドホルモンを遊離させるジエチルエーテルで抽出した。ステロイド含有層は炭除去ＦＣＳ（測定可能なＳＨＢＧはない）中で再構成した。これにより、遊離アンドロゲンおよび最初にタンパク質に結合していたアンドロゲンが、バイオアッセイの細胞に適用可能となる。実際、処置後、プール中の血清アンドロゲン生物活性は５．７±０．６ｎｍｏｌ／Ｌから１３．０±１．６ｎｍｏｌ／Ｌのテストステロン当量に上がった（図４；Ｐ＜０．００５）。すべてのテストステロンがＲＩＡによってすら回収されたわけではないので、血清アンドロゲン生物活性の実際の増加はおそらくもっと高かったであろう。再構成後に測定した平均のテストステロンレベルは１４．１±１．３ｎｍｏｌ／Ｌであった（平均回収率６９％、図４）。
【００３４】
議論：
アンドロゲン性化合物の生物活性を測定する初期のアッセイは、去勢鶏鶏冠成長または雄性ラットの副次的生殖器官（ａｃｃｅｓｏｒｙ ｓｅｘ ｏｒｇａｎｓ）成長のような、生物体のアンドロゲン依存的応答に基づいていた（１５）。細胞培養や組換えＤＮＡ技術の発達は、生細胞の性ステロイド類に対する生物学的応答を評価するより、感度がよくかつ精密なアッセイを可能にした。それにもかかわらず、ヒト血清中の性ステロイド生物活性を測定する従来の唯一のアッセイは、酵母細胞を用いる組替え超感度バイオアッセイのみであった（１６）。酵母細胞は本発明のバイオアッセイには好ましくなかった。なぜなら、おそらく細胞壁の透過特性のため、非ステロイド性抗アンドロゲンは酵母細胞では抗アンドロゲン活性を示さなかったからである。本発明者らの知る限り、ＡＲＩＰ３で促進されるＡＲフラグメント間の相互作用に基づいた本発明の哺乳動物細胞アッセイが、ヒト血清中のアンドロゲン生物活性を測定する最初のものである。
【００３５】
このアッセイの感度は、細胞培養培地におけるテストステロン０．１ｎｍｏｌ／Ｌに相当する、１０μｌＦＣＳアリコート中のテストステロン１．０ｎｍｏｌ／Ｌによって誘導されるシグナルよりも優れていた。これはテストステロンに対するＡＲのＫＤと同程度の強さであり（１７、１８）、このことはサンプルの追加操作なしでアッセイ感度を顕著に高める可能性について疑問を投げかけるものである。エーテル抽出やそののちのＦＣＳ中のサンプル濃縮はバイオアッセイの相対的な感度を高めるが、抽出操作のないアッセイはヒト血清中のアンドロゲン生物活性を直接測定できるという利点を有している。
【００３６】
男子において、血清アンドロゲン生物活性とテストステロン濃度とは強く相関した。血清中のテストステロンはＳＨＢＧに対しては高い親和性をもって結合し、アルブミンに対しては低い親和性をもって結合する。全テストステロンの２未満〜３％しか遊離していない（１８、１９）。生物学的に活性なテストステロンの量は遊離のテストステロンの機能であると示唆されていた（２０）。しかしながら、本発明者らが見出したアンドロゲン生物活性レベルは遊離のテストステロン分画を単に表わすだけであれば明らかに高すぎた（２１）。事実、アッセイの過程で、血清は細胞培養培地に対して、最も弱いタンパク質−ステロイド複合体の解離に導くべき１対１０の比で希釈された。そののち、遊離のテストステロンと当初アルブミンと結合しているテストステロンとの血清中での分画は、一緒にしてしばしば生理的利用可能なテストステロンと言われるのであるが（２０，２３〜２５）、バイオアッセイの細胞に対して利用可能であるはずである。
【００３７】
他方、ＦＣＳ中のＤＨＴの高いアンドロゲン性能力のために、ＣＤＰを有する男子における血清アンドロゲン生物活性とＤＨＴレベルのあいだには正の相関性を見出すことが期待されるであろう。しかしながら、これら変数間の相関関係の欠如は、ＤＨＴのＳＨＢＧに対する親和性がテストステロンの親和性に比べて３倍であるという事実（２６）を反映しており、このことが男子における少量の循環性ＤＨＴを生物学的に不活性にしているのかもしれない。さらに、思春期前男子のＳＨＢＧ含有血清プールにテストステロンを添加すると、ＲＩＡで測定したテストステロンレベルの約４分の１のアンドロゲン生物活性となった。同じように、ヒト血清のジエチルエーテルによる抽出およびそののちの炭除去ウシ胎仔血清へのサンプル再構成は生物活性レベルを増大した。性ステロイドの標的細胞内への流入や細胞内での作用を阻害する未同定ファクターのヒト血清における存在を排除できないけれども、これら知見はＳＨＢＧ結合ステロイド類がバイオアッセイのＣＯＳ−１には利用できないことを示唆している。
【００３８】
血清アンドロゲン生物活性レベルと精巣体積とは強く相関しており、このことは恐らく成人に向けての増大した精巣テストステロン生成を反映しているのであろう。血清アンドロゲン生物活性のテストステロンに対する比も、青年期における血清テストステロンおよびＳＨＢＧレベルの相互変化（２７、２８）のために、予想されることではあるが、思春期の機能として増大する傾向にあった。他方、この比は、ＣＤＰを有する年齢が高い男子に比べて、ｈＣＧ治療中の潜伏精巣症を有する思春期前男子の方が高かった。このことは、思春期前の被験者が初期思春期の男子よりも高い血清ＳＨＢＧレベル（２７）を有しているので、予期できなかった。
【００３９】
ＡＲのフラグメント間のアンドロゲン依存性相関関係はエストラジオールに対して最小の交差反応性を示す（３、５）。このことは本研究でも観察された。さらに、非ステロイド性抗アンドロゲンであるカソデックスおよびヒドロキシフルタミドは相対ルシフェラーゼ活性を抑制した。このことは本アッセイがアンドロゲン活性および抗アンドロゲン活性の両者に関して、化合物を迅速にスクリーニングするのに適用できることを示唆している。しかしながら、ＡＲフラグメントまたは全長ＡＲを採用するアッセイにおいて、ある種の合成化合物は異なった働きをするので（５）、これら結果を解釈するに際しては注意が必要である。それにもかかわらず、本発明者らの未発表結果は本アッセイで測定した男子のアンドロゲン生物活性レベルが全長ＡＲの使用に基づくアッセイにより測定したレベルと強く相関することを示している。
【００４０】
本発明の方法は種々の実施態様の形式で組み入れることができ、それらのほんの一部が本明細書に開示されているに過ぎないと理解されるであろう。ほかの実施態様が存在しかつそれが本発明の精神から逸脱しないことは当該技術分野の当業者にとっては明白であろう。したがって、記載された実施態様は例示でありかつ制限的に解釈されるべきでない。
【００４１】
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２８． Ｄｕｃｈａｒｍｅ ＪＲ， Ｆｏｒｅｓｔ ＭＧ． Ｎｏｒｍａｌ ｐｕｂｅｒｔａｌ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ． Ｉｎ； Ｂｅｒｔｒａｎｄ Ｊ， Ｒａｐｐａｐｏｒｔ Ｒ， Ｓｉｚｏｎｅｎｋｏ ＰＣ （ｅｄｓ） Ｐｅｄｉａｔｒｉｃ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ． Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ， Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ； ３７３−３８６．
【図面の簡単な説明】
【図１Ａ】
図１Ａはヒト血清中のアンドロゲン生物活性を定量する哺乳動物細胞バイオアッセイの原理を示す。リガンド結合ドメイン（ＬＢＤ）およびアンドロゲン受容体（ＡＲ）のＮ末端領域は、サッカロマイセス　セレビシエのＧａｌ４ＤＮＡ結合ドメインおよび単純ヘルペスウイルスの転写活性化ドメインタンパク質ＶＰ１６にそれぞれに融合した。ＣＯＳ−１細胞は後者の融合タンパク質、ＡＲ相互作用タンパク質３（ＡＲＩＰ３），およびルシフェラーゼ（ｐＧ５−ＬＵＣ）をコードするプラスミドでコトランスフェクションされた（図１Ａ）。
【図１Ｂ】
図１Ｂはヒト血清中のアンドロゲン生物活性を定量する哺乳動物細胞バイオアッセイの原理を示す。アンドロゲン結合（図１Ｂ）はＬＢＤとＡＲのＮ末端領域とのあいだで相互作用を引き起こし、それはＡＲＩＰ３により促進される。ＶＰ１６活性化ドメインはルシフェラーゼ遺伝子の調節領域に結合して、ルシフェラーゼ遺伝子転写を活性化する。
【図２】
図２Ａおよび図２Ｂは用量反応曲線を表わす。テストステロンは炭除去ウシ胎仔血清に加えられた（図２Ａ）。１０μｌの血清は９０μｌの細胞培養培地に加えられた。生じた細胞培養培地中のテストステロン濃度［Ｔ］は図２Ｂに示されている。生じた相対ルシフェラーゼ活性は両図のｙ軸上に示されている。相対ルシフェラーゼ活性はβ−ガラクトシダーゼ活性で割り算したルシフェラーゼ活性である（β−ガラクトシダーゼはトランスフェクション効率用に内部コントロールとして用いた）。曲線は５つの独立したトランスフェクションからのものであり、各点は３回繰り返しの平均を示す。
【図３】
図３は哺乳動物細胞バイオアッセイによるｎｍｏｌ／Ｌテストステロン当量における血清アンドロゲン生物活性（ｙ軸）に対するＲＩＡによる血清テストステロン濃度（ｘ軸）を示す。白丸は思春期の体質遅延を有する男子（ｎ＝１３）を、黒丸はｈＣＧ処置中の潜伏精巣症を有する思春期前の男子（ｎ＝９）である。
【図４】
図４はテストステロン添加後のヒト血清プール中のテストステロンおよびアンドロゲンの生物活性レベルを表わす。潜伏精巣症を有する思春期前の男子１０人の血清をプールし、テストステロンを加えて２１ｎｍｏｌ／Ｌの濃度とし、テストステロン生物活性レベル（ＲＩＡ，線影を付した棒）およびアンドロゲン生物活性レベル（哺乳動物細胞バイオアッセイ、白棒）を測定した。結合タンパク質からテストステロンを遊離させるために、血清をジエチルエーテルで抽出し、ステロイド含有層を炭除去ＦＣＳ中で再構成し、測定を繰り返した。星印は抽出再構成手順前の平均アンドロゲン生物活性レベルに対して有意差あり（ｐ＜０．００５）。各棒は５回の測定における平均＋ＳＤを表わす。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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