(57)【要約】本発明は、核磁気共鳴（ＮＭＲ）スペクトル法および磁気共鳴映像法（ＭＲＩ）、特にＮＭＲスペクトル法、に関する。この発明は、生物学的システム中における試験化合物の動態を研究するための従来のＮＭＲを超えた強化検出感度をもたらす過分極化方法を提供する。この方法は、薬剤の代謝および毒性を試験するために特に適している。ここで得られるＮＭＲ感度の増加は、ＮＭＲ検出の二つの重要観点において有利である：対応するＮＭＲスペクトルのシグナル対ノイズ比を増加させるために大規模な平均化を従来使用する場合において、試験化合物を低濃度で検出しそして相当な時間節約を達成することができる。この方法は、従来のＮＭＲを用いては実用的でないか不可能であった試験に用いることができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも一つのＮＭＲ活性核を含む試験化合物の動態を検討する方法であって：
ＮＭＲ活性核を過分極化する；
試験化合物をそこで動態を研究すべき生物学的システムへ投与する；そして
システムまたはシステムから抽出される試料をＮＭＲスペクトル法もしくはＮＭＲ映像法により分析する
ことを含む方法。
【請求項２】
少なくとも一つのＮＭＲ活性核を含む試験化合物の動態を検討する方法であって：
試験化合物をそこで動態を研究すべき生物学的システムへ投与する；
システム中でもしくはシステムから抽出される試料中でＮＭＲ活性核を過分極化する；そして
過分極化したシステムもしくは試料をＮＭＲスペクトル法および／もしくはＮＭＲ映像法により分析する
ことを含む方法。
【請求項３】
試験化合物がＮＭＲ活性核で富化されている、請求項１もしくは請求項２に記載の方法。
【請求項４】
ＮＭＲ活性核が１３Ｃ、１５Ｎ、３１Ｐ、１Ｈおよび１９Ｆから選択される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
過分極化されたシステムもしくは試料が過分極化から分析の期間中で保持磁場に保有される、請求項２〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
ＮＭＲ核が１３Ｃでありそして分析を、ピークが試験化合物中の各々の炭素中心に対して観察できることを特徴とする、ＮＭＲスペクトル法により行う、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
試験化合物の代謝が研究される、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
システムが全体の動物もしくはヒトの体であり、そして試料、例えば血液もしくは尿、をシステムから経時的に抽出し、該試料の各々を過分極化してからＮＭＲスペクトル法により分析する、請求項５に記載の方法。
【請求項９】
システムが全体の動物もしくはヒトの体でありそしてシステムをＮＭＲ映像法により経時的に分析する、試験化合物の吸収を研究するための請求項１および３〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
システムが全体の動物もしくはヒトの体であり、そして試料、例えば血液もしくは尿、をシステムから経時的に抽出し、該試料の各々を過分極化してからＮＭＲスペクトル法により分析する、試験化合物の吸収を研究するための請求項２〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
システムが全体の動物もしくはヒトの体であり、過分極化した試験化合物を吸入法もしくは静脈注射により投与し、そして体内における試験化合物の分布をＮＭＲ映像法により分析する、試料化合物の分布を研究するための請求項１および３〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
システムが全体の動物もしくはヒトの体であり、そして試料、例えば尿の試料を経時的に抽出し、該試料の各々を過分極化してからＮＭＲ映像法により分析する、試験化合物の排泄を研究するための請求項２〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
少なくとも一つのＮＭＲ活性核を含む生物学的システムの状態を検討する方法であって：
システム中でＮＭＲ活性核を過分極化する；そして
システムもしくはシステムから抽出される試料をＮＭＲスペクトル法もしくはＮＭＲ映像法により新ライン分析してシステムに対するＮＭＲパターンを作製することを含む方法。
【請求項１４】
請求項１３に記載の方法であって：
システムをその状態中で変化に付す；
ＮＭＲ核を過分極化させる；
その変化した状態におけるシステムもしくはシステムから抽出される試料をＮＭＲスペクトル法および／もしくはＮＭＲ映像法により分析してその変化した状態におけるシステムに対するＮＭＲパターンを作製する；
システムおよびその変化した状態におけるシステムに対するＮＭＲパターンを比較する；および
ＮＭＲパターンにおける変化を確認する
ことをさらに含む方法。
【請求項１５】
少なくとも一つのＮＭＲ活性核を含む生物学的システムの状態を検討する方法であって：
システムをその状態中で変化に付す；
ＮＭＲ活性核を過分極化する；
システムまたはシステムから抽出される試料をＮＭＲスペクトル法もしくはＮＭＲ映像法により分析してシステムからのＮＭＲパターンを作製する；
このパターンを過分極化および分析に先立ってその状態中で変化に付していない制御システムから得られるパターンと比較する；そして
試験システムからのパターンと制御システムからのパターンとの間のいかなる相違も確認する
ことを含む方法。
【請求項１６】
試験システムが薬剤への露出によりその状態中で変化に付されている、請求項１４もしくは請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
少なくとも一つのＮＭＲ活性核を含む生物学的システムの状態を検討する方法であって：
ＮＭＲ活性核を試験システム中で過分極化する；
試験システムまたは試験システムから抽出される試料をＮＭＲスペクトル法もしくはＮＭＲ映像法により分析して試験システムに対するＮＭＲパターンを作製する；
試験システムに対するＮＭＲパターンをその試験システムと同一タイプの少なくとも一つの他のシステムに対するＮＭＲパターンと比較するが、該他のシステムは既知の状態にある；そして
試験システムの状態を決定する
ことを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
この発明は、核磁気共鳴（ＮＭＲ）スペクトル法および磁気共鳴映像法（ＭＲＩ）、特にＮＭＲスペクトル法、に関する。ＮＭＲ活性核のスペクトルはそれらの環境に依存して変化する。本発明は、ＮＭＲもしくはＭＲＩ分析に先立って、試験化合物のＮＭＲ活性核の核分極を強化すること（以後「過分極化（ｈｙｐｅｒｐｏｌａｒｉｓａｔｉｏｎ）」という）により生物学的システムにおいて、外因性、例えば薬剤、もしくは内因性の天然化合物であってもよい試験化合物の動態に関する情報を得るための方法を提供する。この発明はまた、生物学的システムの状態についての情報を得るためにＮＭＲパターンプロファイリングを行う方法を提供する。
【０００２】
以後用いる用語「試験化合物」は、その中で試験するべき生物学的システムに外因性もしくは内因性であり得てかつ生理的興味のある化合物、例えば潜在的薬剤物質、をいうが、これは、希ガスでもなくまたはいわゆるオーバーハウザーＭＲＩ（ＯＭＲＩ）造影剤もしくは他のＭＲ映像剤でもない。試験化合物は、少なくとも一つのＮＭＲ活性核、即ち非−ゼロ核スピンをもつ核、を含まなければならない。
【０００３】
以後用いる用語「動態」は、試験化合物に適用するときには、生物学的システムにおける代謝、吸収、分布ならびに排泄を包含する。
【０００４】
以後用いる用語「生物学的システム」は、全体の動物、植物、微生物、単離した器官および組織、単離した細胞および培養細胞、単離した亜−細胞の細胞小器官ならびに発現および／もしくは再構成した酵素システムを包含する。全体の動物、植物、単離した器官もしくは組織のような生物学的システムから抽出され得る試料としては、組織もしくは細胞試料、糞便、血液を非限定的に含む体液、リンパ液、尿、精液、母乳、脳脊髄液、汗、涙腺もしくは耳下腺の分泌液または潅注液が挙げられる。
【０００５】
ゲノム革命、コンビナトリアル化学ライブラリーおよび高処理スクリーニングのお陰で、幾何級数的に増加する数の新しい化学エンティティが、新薬としての市販化に先立って必要とされる治検段階に今や入り込みつつあるか既に在る。潜在的に受益的な薬剤のこの急速な発生は、効能および安全性両方の評価プロセスに益々圧力を掛けてきている。そのような評価の効率を最適化し得る新技術を求める徹底的な検索が進行中である。
【０００６】
薬動力学および毒性試験には、親化合物から生成した代謝産物の同定ならびに親化合物およびその代謝産物両方の毒性の評価という、二つの重要な要件がある。薬剤の開発の前臨床試験および臨床試験段階の期間中では、治験薬そのものもしくはそれらの代謝産物がインビトロの試験システム、動物、健康なボランティアもしくは患者において副作用を引き起こすかどうかを検討する（検出／モニタリングにより）ことが不可欠である。潜在的に望ましくなくかつ危険でさえある作用が薬剤または一つもしくはそれ以上の代謝産物の体内における濃度もしくは分布に関係しているかどうかを把握することがまた必要である。加えて、そのような評価は、例えば、一つもしくはそれ以上の薬剤代謝酵素に確認された欠陥を持つ特定の患者群（前臨床および臨床試験の母集団の極少数であろう）が増大する危険度で薬剤の副作用を発現するかどうかを決定するために、選択された患者で実施されるであろう。いかなるそのような検討の重要な態様は、一旦投与されている薬剤物質の動態、即ち、その吸収、組織分布、代謝の速度および部位、代謝産物の構造および相対的存在度の特性化ならびに排泄経路、を決定することである。ここに試験化合物の動態を研究する新しい方法に対する必要性がある。
【０００７】
生物学的システムにおける試験化合物の動態を研究するために使用できる方法の一つは代謝産物の構造を同定することである。代謝産物の構造を同定する現行の技法は、液体クロマトグラフィーと組み合せた質量分析法（ＭＳ）に大いに頼っている。しかしながら、質量分析法は、それ自身では、往々にして代謝産物の構造を完全にかつ明確に特性化することはできない。ＮＭＲスペクトル法から導き出されるデータは、往々にしてＭＳから得られるものと相補的でありそして、組み合せて使用するとき、これらの技法は代謝産物の構造を決定することを可能にする。不幸にも、現在ではＮＭＲは相対的に感度が悪い。多くの場合、ＮＭＲの相対的に低い感度は、望ましいシグナルを捕捉するために必要とするアクイジション時間および特定のシグナル対ノイズ比（例えば３：１）におけるアナライトの検出下限に影響する基本的な問題を提起する。
【０００８】
実際面では、現行のＮＭＲ技法の低感度は、吸収、分布、代謝ならびに排泄（ＡＤＭＥ）の研究におけるそれらの応用を制限する。薬剤開発の初期の間は、候補薬剤、ひいてはその代謝産物の供給は限られていて、ＮＭＲによる分析に使える量は往々にして十分ではない。加えて、インビトロおよびインビボのスクリーンで生成する代謝産物の濃度は低くかつ、往々にしてＮＭＲによる分析に必要なレベルより相当に下である。投与量を増加させることは勧められないが、これは代謝の経路はそのような非−生理条件下では変化するかもしれず、そして形成した代謝産物は標準的な患者の治療体制下に生成するものに非−代表的であろうからである。
【０００９】
現在では、新しい候補薬剤をＮＭＲにより特性化するためには、試験法をスケールアップしかつ多量の生物的液体（例えば、細胞培養の上澄み液、器官潅流液、血漿、胆汁、尿等）から代謝産物を濃縮する必要がある。これは、非常に時間浪費的であり、それで、実用的には、薬剤開発段階の後期まで往々にして実施されない。これは、高出費な後段階の候補薬剤の不合格の多くに至るものである。理想的には、新しい化学エンティティのＡＤＭＥ特性の評価に出来るだけ早くＭＳと共にＮＭＲを日常的な分析ツールとして取り入れる必要がある。しかしながら、これは従来のＮＭＲ技法の感度では実現可能ではない。過分極化したＮＭＲ活性核を用いる本発明は、多くの上述の制限に対処しており、したがって、下記で議論するように、従来のＮＭＲ技法に比較して多くの利点を提供する。
【００１０】
ＡＤＭＥへの応用に加えて、毒性の評価はまた薬剤承認のプロセスに中心的である。毒性試験に関する現行の状況は、ほぼ間違いなくＡＤＭＥよりずっとさらに問題である。多くの候補薬剤は、臨床試験の後期で許容されない毒性を示すと判明し、場合によっては発売を遅らすことになる。現行の前臨床毒性スクリーンが不適切であることは、製薬工業内で広く認められている。現行のインビトロスクリーンはインビボの状況を不十分に予測するにすぎない。したがって、ヒトでの大規模試験の前に二つの動物種で新しい候補薬剤の毒性を徹底的に評価しなければならない。これは費用が掛かり時間の浪費である。さらに、動物試験からの結果は必ずしもヒトでの予測にならない。ここに改良した毒性スクリーニング法に対する緊急的な要請がある。
【００１１】
現行では、効力および安全性を評価する生体分析アプローチには、いわゆるゲノミックおよびプロテオミックな方法をそれぞれ用いて、遺伝的レベルもしくは細胞タンパク質の発現レベルのどちらかで薬剤候補に対する生体システムの応答の測定が挙げられる。しかしながら、両方の方法は全体の細胞、組織もしくは生物の動的代謝状態を無視するので、組み合せてもゲノミックスおよびプロテオミックスは、薬剤候補の動態および毒性的プロフィルを正確に評価するために生体システムにおける統合された細胞機能に関する十分な情報を提供し得ない。高分解能１Ｈ　ＮＭＲに基づくアプローチが示唆されて（Ｘｅｎｏｂｉｏｔｉｃａ， １９９９， ｖｏｌ． ２９， １１８１−１１８９， Ｊ， Ｋ． Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ）、メタボノミックスと名付けられている。メタボノミックスは、病態生理学的刺激もしくは遺伝子的修飾に対する生体システムの動的マルチパラメトリック代謝応答の定量的測定として定義される。そのような分析は、既知の毒素に対する応答で生成した内因性化合物の変形のパターンを際立たせるであろうと期待されている。このことは、新しい候補の毒性を比較により予測することを可能にするに違いない。
【００１２】
過分極化したＮＭＲを用いる本発明による方法は、現在使用している技法に比べて、内因性化合物の分布、代謝ならびに排泄への新しい候補薬剤の作用のメタボノミック分析における改良を可能にするに違いない。過分極化したＮＭＲは、これらの種類の試験に対する１３Ｃ　ＮＭＲの利用を可能にするであろう。現在では、１Ｈ　ＮＭＲに使用のみが実用的であり（従来のＮＭＲ用いる１３Ｃに対する検出の低感度性のために）そして、分析の情報内容は１Ｈの化学シフトの範囲により制限される。比較すると、１３Ｃ　ＮＭＲははるかに幅広い範囲の化学シフトを提供する。本発明の方法により得られる改良は、スピードおよび感度ならびにそれらのいずれかの組み合せの点にあるであろう。
【００１３】
ＮＭＲパターンプロファイリングは、生物学的システムの状態に関する情報を取得するために用いられる技法である（Ｊ Ｐｈａｒｍ ｂｉｏｍｅｄ Ａｎａｌ １９９５ Ｍａｒ； １３（３）： ２０５−１１， Ａｎｔｈｏｎｙ ＭＬ ｅｔ ａｌ； Ｍｏｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ １９９４ Ｊｕｌ； ４６（１）： １９９−２１１， Ａｎｔｈｏｎｙ ＭＬ ｅｔ ａｌ； Ｎａｔｕｒｗｉｓｓｅｎｓｃｈａｆｔｅｎ １９７５ Ｊａｎ； ６２（１）： １０−４， Ｋｏｗａｌｓｋｉ ＢＲ ａｎｄ Ｂｅｎｄｅｒ ＣＦ）。典型的には、その状態である種の摂動に付しているシステムからの、スペクトルもしくは映像であり得るＮＭＲパターンが、平常状態における同一タイプのシステムからのＮＭＲパターンと比較される。それから、パターンの変化をそのシステムの状態の変化と相関させることができる。そのシステムの状態の変化は、例えば、薬剤物質への露出、環境もしくは疾患の変化またはそのシステムの開発期における変化であり得る。プロファイリングを用いて二つのシステムを比較して、それらが同一のもしくは異なる状態にあるかどうかを決定することができる。
【００１４】
種々の状態における一つのタイプのシステムにより表示されるパターンについて一旦情報が得られると、プロファイリングを用いて、試験システムにより表示されるパターンをそのタイプのシステムに対する既知のパターンと比較することによりそのタイプの試験システムの状態を決定することができる。便宜的に情報を電子的に保存しそして、アルゴリズム解析を用いて、試験システムに対するパターンを既知のパターンと比較することができる。アルゴリズム解析はコンピュータおよび適切なソフトウェア−を用いて適宜行う。ＮＭＲパターンプロファイリングは潜在的に、特定のエンティティ、例えば代謝産物、が個々には明確に同定され得ないときでさえ、システムに関する極めて多量の情報を取得するための強力な技法である。しかしながら、その有用性は、ＮＭＲ技法の比較的低い感度のせいで個々のスペクトルにおける相違を検出し分離するための現行技術の無能により制限されている。過分極化したＮＭＲ活性核を用いる本発明はこの制限に対応し、そのため、例えば，システムの健康、機能および代謝状況ならびにシステムの中で起こる機構に関して，従来のＮＭＲ技法を用いて得られるよりはより多くの情報を得るためにＮＭＲパターンプロファイリング用いることを潜在的に可能にする。
【００１５】
本発明は、ＮＭＲ活性核を分極化するために特定の方法に限定するものではない。そのような分極化は，下記で説明するように，多くの異なる方法，例えば、希ガスからの分極移動により，もしくは「蛮力（Ｂｒｕｔｅ ｆｏｒｃｅ）」（ＷＯ ９９／３５５０８， Ｎｙｃｏｍｅｄ Ｉｍａｇｉｎｇ ＡＳ）、ＤＮＰ（ＷＯ ９８／５８２７２， Ｎｙｃｏｍｅｄ Ｉｍａｇｉｎｇ ＡＳ）およびパラ水素（ｐ−Ｈ２）法（ＷＯ ９９／２４０８０， Ｎｙｃｏｍｅｄ Ｉｍａｇｉｎｇ ＡＳ）の一つにより達成され得る。
【００１６】
非−ゼロ核スピンを有する希ガス同位体は過分極化させることが、即ち、例えば円偏光を用いることによりそれらの分極を平衡分極化を介して強化させることができる。過分極化のための好ましい技法としては、光学的に励起したアルカリ金属蒸気との交換および順安定性交換が挙げられる。この技法を応用することができる希ガスとしては３Ｈｅおよび１２９Ｘｅが挙げられる。希ガスの強化核分極は、スピン−スピン相互作用により隣接するもう一つのＮＭＲ活性種に移動させることができる。ＷＯ　９７／３７２３９（Ｌａｗｒｅｎｃｅ Ｂｅｒｋｅｌｅｙ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）には、過分極化した希ガスから目標化合物上の核スピンへ核分極を移動させて、対応するＮＭＲもしくはＭＲＩシグナルの強化をもたらす方法が記載されている。ＷＯ　９８／３０９１８（Ｎｙｃｏｍｅｄ Ｉｍａｇｉｎｇ ＡＳ）はエクス−ビボの動的核分極化（ＤＮＰ）即ち過分極化したガスからＭＲＩ剤への核オーバーハウザー効果（ＮＯＥ）交差−分極化に関するが、そこではガスは体内への投与に先立ってＭＲＩ剤から分離される。
【００１７】
本発明のＮＭＲスペクトル法もしくは映像法は、従来のＮＭＲもしくはＭＲＩのように試験化合物の動態について同様なタイプの情報を提供するが、潜在的な利点をもたらす。これらの利点の中にあるのは：ａ）分析の増大した感度；およびｂ）ＮＭＲスペクトル（もしくは映像）のアクイジションの増大したスピードである。ＮＭＲ活性核を含む薬剤／代謝産物もしくは生理化合物の分析は、以前では対応する１４Ｃ−標識化合物を試験することによってのみ供給された追加的な情報を、放射性同位体に関連する問題はない一方で、提供し得る
【００１８】
さらに、蛍光剤および関係する標識化技法を用いる試験と比較すると、例えば、現行発明は、検出を可能にするために、レポーター、例えば蛍光体、を含む付加体および試験化合物の合成を必要としない。それ故に、本発明は従来の蛍光に基づく検出システムより優れた以下の利点を提供する：
【００１９】
１．新規薬剤もしくは生理化合物の構造に変化は無い。蛍光法のような技法には、追加的な化学化合物が測定に影響するであろうとする点で常に不利がある。特に、蛍光標識は、試験化合物と比較するとかなりのサイズを持ち、ときには試験化合物と同じかより大きい。したがって、標識した試験化合物の動態は非−標識化合物より全く異なることがある。
【００２０】
２．蛍光測定は、例えば、染料漏れ、染料画分化、シグナル消去および自己蛍光のせいで特異的ではないであろう。
【００２１】
同様に、本発明のＮＭＲパターンプロファイリング法は現在あるＮＭＲパターンプロファイリング法と比較するとき、システムの状態について同様なタイプの情報を提供するが、また潜在的な利点も提供する。それらの可能な利点の中には：ａ）分析の増大した感度；およびｂ）ＮＭＲスペクトル（もしくは映像）のアクイジションの増大したスピードである。パターンプロフィルにおける増えた細目は、従来のＮＭＲ下ではノイズから識別し得ないであろうスペクトル内で特徴が見られるように増大した感度の結果として実現し得る。この感度の増加により、１Ｈ　ＮＭＲプロフィル単独に比して追加的情報を提供するであろう１３Ｃ　ＮＭＲならびに１Ｈ　ＮＭＲの利用が可能となる。従来のＮＭＲ技法を用いて得られるパターンプロフィルでは見られないパターンの変化を、本発明にしたがう方法を用いて観察し得る。これらの小さい変化は、例えば、毒性を試験したり細胞培養について品質保証試験を行うときに特に重要であるであろう。
【００２２】
本発明の一つの態様は、代謝を含めて、試験化合物の動態のいかなる様子もモニターする方法に関するが、その方法は、試験化合物中の一つもしくはそれ以上のＮＭＲ活性核を極性化しそして核のスペクトル中の変化を検出することから成る。試験化合物は薬剤のような外因性化合物もしくは内因性「天然」物質でもよい。これらの変化は、連続的に、もしくは一連の別個の測定としてもしくは単一の測定として検出し得る。例えば、呼気、血液、血漿、尿もしくは他の体液の試料を用いる全ての代謝産物の動的クリアランスパターンには特に、定量および定性測定の両方が含まれる。適切な核は非−ゼロ核スピンを持つものである。好ましいＮＭＲ活性核は１３Ｃ、１５Ｎ、３１Ｐ、１９Ｆおよび／もしくは１Ｈであり、１３Ｃが特に好ましい。
【００２３】
試験化合物が薬剤でありかつ同位体富化が検出を容易にするために適切である場合には、１３Ｃ、１５Ｎのように、薬剤の治療効能に実質的に何の影響もしない安定な、非−放射性同位体を使用することが好ましい。これに代えて、３１Ｐ、１９Ｆおよび／もしくは１Ｈのように高天然存在度にある核種は本発明の方法にしたがって検出することができる。
【００２４】
試験化合物が薬剤のように外因性である場合には、そこでその動態を研究すべきシステムに投与する前に分極化してもよい。これに代えて、内因性および外因性の試験化合物については、システム全体もしくはシステムから抽出される試料を色々な時間に適切な過分極化技法に付してもよい。
【００２５】
かくして、第一の態様において、本発明は、少なくとも一つのＮＭＲ活性核を含む試験化合物の動態を検討する方法を提供し、該方法は：
試験化合物を生物学的システムへ投与する；
システム中でもしくはシステムから抽出される試料中でＮＭＲ活性核を過分極化する；そして
過分極化したシステムまたはシステムから抽出される一つもしくはそれ以上の試料をＮＭＲスペクトル法および／もしくはＮＭＲ映像法により分析する
ことを含む。
ＮＭＲスペクトル法は、特に、システムから抽出される試料を分析する場合には、好ましい分析方法である。
【００２６】
適切には、システムが動物もしくは潅流した器官である場合には、試料（例えば、生検試料、検死体もしくは体液抽出物）を採取してから過分極化してもよい。例えば、血液もしくは尿の試料を採取してもよい。これらの試料をＮＭＲスペクトル法の前に精製してもよいが、これは必ずしも必要ではない。本発明にしたがう方法の重要な利点は、先行技術の方法と異なり、分画、精製もしくは濃縮のステップなしに粗製の生物学的試料で、スペクトル法を直接に行うことができることである。
【００２７】
この方法は動的研究に特に適しているが、これは試料を時間間隔で採取し、過分極化し、それから種々の試料のＮＭＲスペクトルを比較して経時的な変化を示すことができるからである。過分極化は、単一移動、連続移動もしくは間欠移動として分極化剤を使って実施し得る。過分極化のための適切な方法はシステムもしくは試料の性質に依存して選択されるであろう。
試験化合物は好ましくは、そこでその動態を研究すべき生物学的システムに外因的なもの、即ち、薬剤もしくは薬剤候補である。
【００２８】
もう一つの態様において、本発明は、少なくとも一つのＮＭＲ活性核を含む試験化合物の動態を検討する方法を提供し、該方法は：
化合物中でＮＭＲ活性核を過分極化する；
過分極化した化合物を生物学的システムへ投与する；そして
システムまたはシステムから抽出される試料をＮＭＲスペクトル法および／もしくはＮＭＲ映像法により分析する
ことを含む。
過分極化のための適切な方法はシステムもしくは試料の性質に依存して選択され得る。
【００２９】
ＮＭＲスペクトル法は、特に、システムから抽出される試料を分析する場合には、好ましい分析方法である。試験化合物は好ましくは、そこでその動態を研究すべき生物学的システムに外因的なもの、即ち、薬剤もしくは薬剤候補である。ここでも、試料をスペクトル法に先立って分画、精製もしくは濃縮の予備ステップに付してもよいが、このことは必ずしも必要でない事実が本方法の利点である。
【００３０】
第一および第二の態様にしたがう方法用の試験化合物に使用する適切なＮＭＲ活性核としては、１３Ｃ、１５Ｎ、３１Ｐ、１９Ｆおよび／もしくは１Ｈが挙げられ、１５Ｎが特に好ましい。１３Ｃが最も好ましい。
【００３１】
この発明の方法を自然存在度のＮＭＲ活性核を含む試験化合物で使用することは可能であるが、試験化合物が外因性である場合には、好ましくはシステムに投与する前にＮＭＲ活性核で富化する。これは、一つもしくはそれ以上の部位の選択的富化もしくは全ての部位の均一的な富化のどちらかで行い得る。化学合成もしくは生物学的標識化により富化を達成できる。好ましくは、この発明にしたがう方法に使用するための試験化合物は、人工的に富化した存在度の、例えば、１３Ｃ、を広くもしくは少なくとも一つの特定位置において、少なくとも５％、適切には少なくとも１０％、さらに適切には少なくとも５０％、好ましくは少なくとも７５％、さらに好ましくは少なくとも９０％、そして理想的には１００％に近い存在度で含む有機化合物である。
【００３２】
本発明はまた、人工的に富化した存在度の１５Ｎを、少なくとも１％、適切には少なくとも５％、さらに適切には少なくとも１０％、好ましくは少なくとも５０％、さらに好ましくは少なくとも７５％もしくはそれ以上、そして理想的には１００％近くで含む試験化合物の使用をカバーする。
一つ以上の核種、例えば１３Ｃおよび１５Ｎ、の富化は同一の試験化合物で行い得る。
【００３３】
均一的に富化した試験化合物中の異なる１３Ｃ中心は非常に異なる速度で緩和するので、非常に異なるシグナル強度がいずれの作製したＮＭＲスペクトルにおいて見出されるだろうと予期されるかもしれないが、驚くべきことには、あまりにも速く緩和してスペクトルには現れないと予期された１３Ｃ中心に対してさえピークが観察されている。かくして、各々の炭素中心に対するピークをこの発明の好ましい実施態様にしたがって作製したスペクトル中に観察できるが、ここではＮＭＲ核は１３Ｃで、分析はスペクトル法によるものである。
【００３４】
この発明にしたがうＮＭＲ活性核の過分極化の程度は、スペクトロメーターの磁場および温度における熱平衡と比較した強化係数により測定することができる。適切にはこの強化係数は少なくとも１０％、好ましくは少なくとも５０％、そしてさらに好ましくは少なくとも１００％である。しかしながら、より小さい強化性が得られる場合においてさえ、この試験方法は、従来の方法に比して全体の測定に必要な時間が短いためになお有用に行い得る。もし強化性に再現性がありかつ分極化／ＮＭＲ測定を繰り返すことができるならば、ＮＭＲシグナルのシグナル対ノイズ比を改良できる。そのような場合には、必要な最少ＮＭＲ強化係数は：ａ）分極化技術およびｂ）試験化合物の濃度に依存する。強化性は、試験化合物からのＮＭＲシグナルを検出できるように十分大きくなければならない。こういった意味合いで、多回実験で得ることができる１０もしくは１０以下の強化性は、従来のＮＭＲと比較してデータのアクイジションに節約される時間のために非常に有用であろう。
【００３５】
上述の方法の分析ステップは、連続的モニターまたは単一の別個測定もしくは適当な間隔で経時的に行い得る一連の別個測定により行い得る。かくして、スペクトルもしくは映像の変化を経時的にモニターして、動的な結果と相関させることができる。そのような動的なイベントについては、試験化合物について代謝的イベント、分布の変化、吸収の経過および排泄の進行が挙げられる。上述の方法を使用して、例えば血液、尿もしくはその他の体液を用い、いかなる試験化合物の動的動態ならびに内因性代謝産物もしくは外因性試験化合物の代謝産物の動的動態をモニターし得る。
【００３６】
研究すべき動態が代謝に関する時には、ＭＲＩよりむしろＮＭＲスペクトル法を分析方法として用いるべきである。分析を経時的に行うことにより、代謝における多くのそして好ましくは全ての既知の変化もしくは試験化合物の個々の代謝産物の出現を確認することが可能であろう。スペクトル中の特定のピークを既知の代謝産物に帰属させることが可能であるに違いない。この技法の増大した感度は、以前は未確認の少量の代謝産物に由来する追加的なピーク（従来のＮＭＲを用いて得られるスペクトルと比較して）をスペクトル中に現れるようにするであろう。これは、有毒の代謝産物はたとえ微量でも薬剤候補を駄目にするような副作用を示す原因となり得るので、重要である。かくして、この方法は、薬剤もしくは他の物質についての代謝／毒性パターンと評価するためのならびに機構的な情報を生み出すための非常に有用なツールであり得る。
【００３７】
代謝研究は、全体の動物、潅流された器官、組織もしくは細胞培養液の中においてまたは試験管システム中で、例えば、ミクロソームの標本もしくはＳ９ミックス（第一相および第二相両方の二つの代謝酵素を含む）のような他の亜−細胞の画分を用いて行うことができる。全体の動物もしくは器官を用いるときには、この発明の第一態様にしたがう方法を使用しそして動物もしくは器官から抽出される試料を過分極化することが好ましい。血液および尿の試料は特に適切である。尿の試料を試験することは蓄積作用を観察させ得る利点を有する。
【００３８】
代謝産物の幾らかが以前には知られていないときには、この方法は特に有用である。分極化したＮＭＲ活性核からの化学シフトは新しい代謝産物の性質を確認する助けになるであろう。
【００３９】
加えて、この方法はまた、異なる代謝産物を明確に同定することが可能でなくても、有用であり得るが、それは、ある状況においては、未知の代謝産物からの動的なクリアランスパターンがまた有意義な価値を持ち得るからである。
【００４０】
試験化合物の研究すべき動態が吸収であるときには、システムは便宜的に全体の動物、潅流された器官、組織もしくは細胞システムである。全体の動物および潅流された器官、特に全体の動物、は特に適している。典型的には、試料は、システム中の異なる位置から抽出されそしてＮＭＲスペクトル法により分析される。これに代えて、全体のシステムをＮＭＲ映像法により分析することができる。一つの実施態様においては、試験化合物を過分極化してから吸入法によりヒトもしくは動物の体に投与する。肺を経由する試験化合物の吸収をＮＭＲ映像法によりモニターする。もう一つの実施態様においては、試験化合物を過分極化してから静脈注射によりヒトもしくは動物の体に投与し、そして血液流からの吸収をＮＭＲ映像法により観察する。
【００４１】
試験化合物の分布を検討することが望まれるならば、試験化合物を過分極化してから全体の動物もしくはヒトの体に投与することが好ましい。化合物は吸入法により投与してもよいが、これに代えて静脈に投与することができる。好ましくは、ＮＭＲ映像法を使用して試験化合物の分布をモニターする。適切には、映像法を連続的に行うことができる。これに代えて、一連の個別の映像を経時的に作製することができる。ＮＭＲ映像法は全体のヒトもしくは動物の体について行うことができる。これに代えて、試験化合物の投与から既知の時間間隔で殺されている動物から固体切片を取りそしてこれらの切片を映像化することができる。この場合には、固体切片は映像化の前に過分極化される。
【００４２】
試験化合物の検討される動態が排泄であるならば、試験化合物を全体の動物に投与してから、例えば、胆汁、唾液、糞便、尿もしくは呼気の試料を抽出することが好ましい。これらの試料はＮＭＲ分析に先立って過分極化される。このタイプの試験にはＮＭＲスペクトル法を使用すべきである。
【００４３】
第三の態様において、本発明は少なくとも一つのＮＭＲ活性核を含む生物学的システムの状態を検討する方法を提供し、その方法は：
ＮＭＲ活性核を過分極化する；そして
システムまたはシステムから抽出される試料をＮＭＲスペクトル法および／もしくはＮＭＲ映像法により分析してシステムのＮＭＲパターンを作製する
ことを含む。
過分極化のステップは全体のシステムもしくはシステムから抽出される試料について行い得る。
【００４４】
一つの好ましい実施態様において、以下の追加的なステップが行われるがそれらは：
システムをその状態中で変化に付す；
ＮＭＲ核を過分極化させる；
その変化した状態におけるシステムもしくはシステムから抽出される試料をＮＭＲスペクトル法および／もしくはＮＭＲ映像法により分析してその変化した状態におけるシステムのＮＭＲパターンを作製する；
システムおよびその変化した状態におけるシステムのＮＭＲパターンを比較する；および
ＮＭＲパターンにおける変化を確認する
ことである。
最終ステップで確認されるＮＭＲパターンにおける変化はシステムの状態における変化と相関させることができる。
【００４５】
これに代えて、同一タイプの二つもしくはそれ以上のシステムを試験してもよい。第一の、もしくは試験の、システムをその状態中で変化に付す一方で、第二の、もしくは制御の、システムはそうしない。過分極化および分析ステップを各々のシステムについて行い、ＮＭＲパターンを比較し、そして試験システムと制御システムとの間のいかなる相違も確認する。
【００４６】
かくして、第四の態様において、本発明は少なくとも一つのＮＭＲ活性核を含む生物学的システムの状態を検討する方法を提供し、その方法は：
システムをその状態中で変化に付す；
ＮＭＲ活性核を過分極化する；
システムまたはシステムから抽出される試料をＮＭＲスペクトル法および／もしくはＮＭＲ映像法により分析して試験システムのＮＭＲパターンを作製する；
このパターンを過分極化および分析に先立ってその状態中で変化に付していない制御システムから得られるパターンと比較する；そして
試験システムからのパターンと制御システムからのパターンとの間のいかなる相違も確認する
ことを含む。
幾らかの試験システムを状態における同一もしくは異なる変化に付すことができ、かつそれらのＮＭＲパターンを単一の制御ムシステムからのパターンと比較することができる。
【００４７】
システムの状態を外的もしくは内的な影響力により変化させてもよい。外的な影響力の例としては、薬剤もしくは他のタイプの試験化合物のような外因性物質への露出、または、例えば、温度もしくはｐＨの変化のようなシステムの環境における変化が挙げられる。内的な影響力の例は、システムの経時的な発達、例えば、細胞の成長および分化である。
【００４８】
適切には、ＮＭＲパターンは、例えばデータベースに、電子的に保存される。アルゴリズム解析を便宜的に用いて、典型的には適切なソフトウェア−のついたコンピュータを使用することにより、比較ステップを行う。
【００４９】
ＮＭＲスペクトル法は分析の好ましい方法である。ＮＭＲ活性核は適切には非−ゼロ核スピンを持つ核である。好ましいＮＭＲ活性核は１３Ｃ、１５Ｎ、３１Ｐ、１９Ｆおよび／もしくは１Ｈである、１３Ｃが特に好ましい。
【００５０】
これらの方法を繰り返して、数多くの異なる状態におけるシステムに対するＮＭＲパターンを取得することができる。この情報は、例えばデータベースに、電子的に保存される。一つもしくはそれ以上のＮＭＲパターンが一つもしくは複数の既知の状態におけるシステムに対して入手可能であるときには、これらを、未知の状態における同一タイプのシステムに対するＮＭＲパターンと比較し得る。もしもＮＭＲパターンが、既知の状態におけるシステムおよび未知の状態におけるシステムに対して実質的に類似するか同一あるならば、未知の状態は既知の状態と同一もしくは類似であるであろう。普通、種々の状態において特定のタイプのシステムに対してＮＭＲパターンがより多く入手可能であるほど、より有望に、未知の状態におけるそのタイプの試験システムに対するパターンと類似もしくは同一のパターンが見出される。
【００５１】
かくして、第五の態様において、本発明は少なくとも一つのＮＭＲ活性核を含む生物学的システムの状態を検討する方法を提供し、その方法は：
ＮＭＲ活性核を過分極化する；
試験システムまたは試験システムから抽出される試料をＮＭＲスペクトル法および／もしくはＮＭＲ映像法により分析して試験システムに対するＮＭＲパターンを作製する；
試験システムに対するＮＭＲパターンをその試験システムと同一タイプの少なくとも一つの他のシステム対するＮＭＲパターンと比較するが、該他のシステムはそのパターンが作製された時に既知の状態にある；そして
試験システムの状態を決定する
ことを含む。
過分極化ステップはシステム上でもしくはシステムから抽出した試料の上で行ってもよい。
【００５２】
便宜的には、比較ステップを、例えば適切なソフトウェア−のついたコンピュータを使用することにより、アルゴリズム解析を用いて行う。適切には、試験システムに対するＮＭＲパターンを、幾らかな他のＮＭＲパターンとそして好ましくは、例えばデータベースに、電子的に保存された相当な数の他のＮＭＲパターンと比較する。
【００５３】
この方法の真度は、他の要素の中で、ＮＭＲパターンが入手可能である同一タイプのシステムと試験システムの類似性に依存するであろう。かくして、そこで細胞がパターンの既知である組織培養液と同一の細胞系列、組織または種から導き出される場合の単離された試験細胞の状態に関して、試験細胞が異なる細胞系列、組織もしくは種から導き出される場合より、さらに正確な結果が得られるであろう。この方法は、同一であると意図されているシステム、例えば組織培養液、の品質保証試験に特に有用であるが、そこでは小さいが生理的には有意な相違を検出することができる。
【００５４】
第三、第四および第五の態様は、比較的殆んど知られていないような化合物、例えば薬剤、に対する生物学的システムの応答を検討するのに有用である。化合物の作用についての有用なデータを、種々な量でそれに露出したシステムのＮＭＲパターンを他の化合物に露出したときのシステムに対するＮＭＲパターンと比較することにより得ることができる。例えば、試験化合物に露出した時のヒトの肝臓から導き出された細胞について観察したパターンは、肝臓への作用が既知である物質に露出したときの同一の細胞に対するＮＭＲパターンと比較することができる。もしも試験化合物に露出した時のパターンが肝臓毒性を持つと知られている化合物に露出した細胞に対するパターンに類似するならば、おそらく試験化合物も肝臓毒性を示すであろう。これは、試験方法前後のベースラインを同一のシステムを用いて確立し得るときに特に有用である。ＮＭＲプロファイリングはまた未知化合物について重要な構造情報を提供することができる。
第三、第四および第五の態様のプロファイリング方法は植物の試験に特に適している。
【００５５】
分極化した希ガス、好ましくは３Ｈｅもしくは１２９Ｘｅ、またはそのようなガスの混合物、を本発明にしたがって用いて、少なくとも一つのＮＭＲ活性核を含む試験化合物もしくはシステムの核分極化をもたらし得る。過分極化はまた、人工的に富化した過分極化した希ガス、好ましくは３Ｈｅもしくは１２９Ｘｅ、を用いて達成し得る。過分極化したガスは、ガス相にあってもよく、液体中に溶解させていてもよく、もしくは液化した過分極化ガス自身が溶媒として働いてもよい。これに代えて、ガスを冷却した固体表面上に凝縮させてこの形態で用いるか、もしくは昇華させてもよい。これらの方法のどれかが、分極化したガスと標的との必要な緊密混合が起こるのを可能にする。ある場合には、リポソームもしくは微小泡が過分極化した希ガスをカプセル化してもよい。
【００５６】
さらなる実施態様において、本発明は、分極を非常に低い温度および高い磁場において熱力学的平衡により試験化合物もしくはシステム（例えば、１３Ｃ、１５Ｎ、３１Ｐ、２９Ｓｉ、１９Ｆおよび１Ｈ）中の重要な原子に付与し得る、方法を提供する。ＮＭＲスペクトロメーターの操作磁場および温度と比較した過分極化は、非常に高い磁場および非常に低い温度（蛮力）の使用によりもたらされる。使用する電磁場の強度は、可能な限り高く、適切には１Ｔより高く、好ましくは５Ｔより高く、さらに好ましくは１５Ｔもしくはそれ以上、そして特に好ましくは２０Ｔもしくはそれ以上でなければならない。温度は非常に低く、例えば、４．２Ｋもしくはそれ以下、好ましくは１．５Ｋもしくはそれ以下、さらに好ましくは１．０Ｋもしくはそれ以下、そして特に好ましくは１００ｍＫもしくはそれ以下でなければならない。この実施態様は、そこではそのシステムは全体の動物、分離された器官もしくは組織または培養細胞である、生育可能な生物学的システムを分極化するには適していないことが認識されるであろう。
【００５７】
さらなる実施態様において、本発明は、少なくとも一つのＮＭＲ活性核を含む試験化合物もしくはシステムの核分極化をもたらすために、ＤＮＰ剤によりもたらされるＤＮＰ方法を用いる分極移動のための方法を提供する。ＤＮＰ機構はオーバーハウザー効果、いわゆる固体効果および熱的混合効果を含む。
【００５８】
例えば、クロム（Ｖ）イオン、マグネシウム（ＩＩ）イオンのような遷移金属、ニトロキシドラジカルおよびトリチルラジカル（ＷＯ　９８／５８２７２）のような有機フリーラジカルもしくは関連する自由電子を持つ他の粒子のような、大抵の既知常磁性化合物はこの発明のこの実施態様において“ＤＮＰ剤”として使用し得る。ＤＮＰ剤が常磁性ラジカルである場合には、このラジカルは、分極化の直前でラジカル−発生ステップにより、もしくはこれに代えてイオン化放射線の使用により安定なラジカル前駆体よりインシツに便宜的に調整される。ＤＮＰプロセスの間、エネルギーが、通常はマイクロウェーブ放射線の形態で、供給されて、それは常磁性種を先ず励起する。基底状態へ減衰するときに、標的物質のＮＭＲ活性核への分極移動がある。この方法は、例えば、ＤＮＰプロセスを液体ヘリウム中でかつ約１Ｔもしくはそれ以上の磁場で行うことにより、中程度もしくは高度の磁場および非常に低い温度を利用し得る。これに代えて、十分なＮＭＲ強化が達成されて望ましい試験を行い得る中程度の磁場およびいかなる温度を使用してもよい。この方法は、分極化磁場を提供する第一磁石およびＭＲスペクトル法／映像法のために一次場を提供する第二磁石を用いて行ってもよい。上述の蛮力法におけるように、もし高磁場と低温が用いられるならば、この実施態様は、そこではそのシステムは全体の動物、分離された器官もしくは組織または培養細胞である、生育可能な生物学的システムを分極化するには適していないことが認識されるであろう。
【００５９】
常磁性ラジカルの存在は試料を分析する際に作られるＮＭＲスペクトルにおいてスペクトル線幅拡大および感受性シフトを引き起こすかも知れないことが予期される。喜ばしいことに、これは現在まで行われた実験では起こっていない。この良結果は、用いたラジカルの低い緩和性および最終試料中でのその低濃度により説明し得る。それ故に、そこではＤＮＰラジカルを必要とする、この発明のこれらの実施態様においては低緩和性を持つＤＮＰラジカルを用いることが好ましい。
【００６０】
さらなる実施態様において、本発明はパラ水素誘導分極化法を提供する。水素分子は二つの異なる形態で存在するが、これらは、そこでは核スピンが逆平衡でかつ位相外れ（一重項状態）にある、パラ水素（ｐ−Ｈ２）およびそこでは核スピンが平衡もしくは逆平衡でかつ位相内（三重項状態）にある、オルト水素（ｏ−Ｈ２）である。室温においては、この二つの形態は１：３のパラ：オルト水素比での平衡で存在する。しかしながら、パラ水素が富化した水素の調製は、触媒の存在下で、１６０Ｋもしくはそれ以下の低温で行うことができる。形成したパラ水素は、好ましくは低温、例えば、１８〜２０Ｋ、において、長期間保存し得る。これに代えて、それを、非−磁性でかつ非−常磁性である内部表面を持つ容器の中で圧縮ガスの形態で保存してもよい。
【００６１】
パラ水素−含有種の調製は、適切な触媒の存在下でパラ水素−富化水素ガスに化合物の不飽和前駆体（ＮＭＲ活性核を含有する）を露出させることにより達成される。この富化した水素は還元により前駆体と反応して、標的分子に非−熱力学的スピン構造を付与する。かくして、使用に適した化合物は、水素化により還元できてかつそれ故に、例えば、炭素−炭素の二重もしくは三重結合のような不飽和結合の一つもしくはそれ以上を典型的に所有するところの前駆体から調製される。
【００６２】
ｐ−Ｈ２分子を化合物の前駆体へ移動する（例えば（ＰＰｈ２）３ＲｈＣｌでの接触水素化により）ときには、プロトンのスピンは逆平衡のままであって、化合物中で定常定数Ｔ１の水素との熱的平衡へ緩和を始める。しかしながら、緩和の間に、分極の幾らかがパルス配列（Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｉｎ Ｎｕｃｌｅａｒ Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ， ３１，（１９９７）， ２９３−３１５）、低磁場サイクルもしくは他のタイプの結合により近接する核ヘ移動するであろう。適切な置換パターンを持つ、例えば１３Ｃ（および１５Ｎ等）のようなＮＭＲ活性核が緩和している水素に近く存在することは、ゆっくりと緩和している１３Ｃ（および１５Ｎ等）中に分極が捕捉されることにつながり、結果として高い強化係数を与える。
【００６３】
この実施態様は、試験化合物中のＮＭＲ活性核がそこでその動態を研究すべきシステムへの投与に先立って過分極化される、本発明の態様に適している。
【００６４】
この発明のさらなる過分極移動の実施態様はスピン冷凍法である。この方法は、スピン冷凍分極化による固体の化合物もしくはシステムのスピン分極化をカバーする。このシステムは、三次もしくはそれ以上の対称軸を持つ結晶形において、Ｎｉ２＋、ランタニドおよびアクチニドイオンのような適切な常磁性物質とドーピングされるかもしくは密接に混合される。均一な磁場は必要としないで共鳴励起磁場を何ら加えないので、この計装化はＤＮＰに必要とするものより簡単である。このプロセスは、磁場の方向に直角な軸の周りで試料を物理的に回転させることにより行われる。この方法についての前提条件は、常磁性種が高度に異方性のｇ−係数を持つことである。試料回転の結果として、電子常磁性共鳴が核スピンと接触して、核スピン温度の減少に至るであろう。核スピン分極が新しい平衡に達するまで、試料回転を行う。ここでも、この実施態様は、そこではそのシステムは全体の動物、分離された器官もしくは組織または培養細胞である、生物学的システムを分極化するには適していないことが認識されるであろう。
【００６５】
試験化合物、システムもしくはシステムからの試料を過分極化しているときには、ＮＭＲ分析に先立って可能な限り多くの分極を保持することが望ましい。上述の過分極化技法の幾らかは固体状態で分極を移動させるときに効果的であるに過ぎない。しかしながら、スペクトルの分解能および感度を改良するためには、液体状態で化合物試料もしくはシステムのＮＭＲスペクトルを検討することがしばしば望まれる。これに代えて、マジック角回転（ＭＡＳ）のようなスペクトル線幅−尖鋭化技法を使用して固体状態でのＮＭＲのスペクトル分解能を増加しそして低温ＮＭＲ分析を可能にすることができる。
【００６６】
もしも化合物、試料もしくはシステムが固体でないならば、それを、固体状態で行うのが必要な方法の一つによる分極移動に先立って、適当な溶媒混合物中で便宜的に冷凍させてもよい。特にミックスが非晶形のガラスを形成するならば、溶媒混合物が特に適していると見出されている。非晶形のマトリックスを使用して、試料をＤＮＰ分極化に付している間に固体中におけるラジカルと標的との均一的で密接な混合を確実にする。
【００６７】
もしも液体状態ＮＭＲ技法を使用すべきであるならば、一旦化合物、試料もしくはシステムが過分極化されてしまうと、それを分極化チャンバーから直ぐに取り出してから適切な溶媒中に溶解することができる。分析ステップで作られる、映像もしくは、さらに一般的には、スペクトルを妨害しないであろう溶媒を用いることが有利である。Ｄ２Ｏのような重水素化溶媒は特に適している。攪拌、バブリング、超音波分散もしくは他の既知技法を用いて溶解のスピードを改良できる。適切には、溶液の温度およびｐＨを最適な溶解および長い核緩和時間を可能にするように維持する。
【００６８】
好ましくは、化合物、試料もしくはシステムならびにそれらの溶液は、緩和を防止するために、分極化と分析の間の期間を通して保持磁場に保たれる。保持磁場は地磁気より高くそして適切には１０ｍＴより高い磁場を提供する。適切にはそれは試料の領域内では均一である。保持磁場は全ての試験化合物に対して必要ではないが、そのような磁場が用いられかつどの化合物がそのような保持磁場を必要とするだろうかが前もって予測し難いときには、特に化合物の構造がアプイオリに既知でないならば、はるかに良い結果が幾らかな試験化合物について得られる。それ故に、システムもしくは試料を分極化してから分析に移すときはいつでも、保持磁場を用いることが好ましい。最適条件は化合物、試料もしくはシステムの性質に依存する。引き続いて溶液を標準的な溶液相ＮＭＲ分析による検査に移送する。この移送プロセスは好ましくは自動化される。これに代えて、分極移動および溶解ステップは単一の自動化ユニット中に適切に統合される。もう一つの適切な実施態様において、分極移動および溶解ステップは自動化され、そしてＮＭＲ検出ハードウェアは同じ単一の完全統合ユニット内にまた収納される。そのような完全統合システムには保持磁場は必要でないであろう。
【００６９】
異なる１３Ｃ中心は非常に異なる速度で緩和する。したがって、もし核緩和が過分極化ユニットからＮＭＲスペクトロメーターへの移動の間に起こるならば、得られたＮＭＲスペクトル中に非常に異なるシグナル強度が現れることが予期されるであろう。驚くべきことには、均一に１３Ｃで富化した分子内では異なる中心からのピークの高さは同一のオーダーにあると観察せれている。可能な説明は、この効果が、ある炭素中心における交差緩和による強化分極の最分布のためであろうとすることである。これは、それがさもなければ予期されているであろうよりも多くの情報を得ることを可能にするので、有用である。与えられた試験化合物内にあるいかなる炭素中心も同様な感度で検出されるであろうことを推定することは非合理的ではない。
【００７０】
これに代えて、固体状態のＮＭＲ技法を使用すべき場合には、固体状態の化合物、試料もしくはシステムを、例えばＤＮＰ、蛮力、スピン冷凍移動もしくは低温において固体状態中で作用するであろういずれかの他の方法により、過分極化してもよい。引き続いて、過分極化した試料を固体状態のＭＡＳ　ＮＭＲプローブ中に移送させるであろう。この移送は適切に迅速でありかつ便宜的に持ち上げもしくは突き出しにより行われる。ＮＭＲプローブ中の試料をそれから回転させて、高分解能の固体状態ＮＭＲスペクトル法を行うことができるようにする。全体のプロセスは自動化できるしかつ統合ユニット中で好ましく行われるであろう。
【００７１】
この発明を以下の非−限定的な実施例を参照してこれから説明する。
【００７２】
実施例
トリチルラジカル
安定なトリチルメチル試薬はＤＮＰの強化に特に適している。以下の実施例で用いられるラジカルは、トリス（８−カルボキシル−２，２，６，６−テトラ−（２（１−ヒドロキシエチル））ベンゾ［１，２−ｄ：４，５−ｄ’］ビス（１，３）ジチオール−４−イル）メチル　ナトリウム塩（以下トリチルラジカルと呼称する）である。これはＷＯ９８／３９２７７に記載された方法に従って作成する。
トリチルラジカルの保存溶液は、重水素化グリセリン中にてそれぞれの実施例に対し調製する。
【００７３】
グリセリン−Ｄ８（２００μｌ）にトリチルラジカル（６．２８ｍｇ）を加える。穏やかな加熱下に攪拌しそして超音波を軽くかけてラジカルを溶解し、必要時まで密閉バイアル中で保存する。これは安息香酸の試験（実施例１）において用いられる２２ｍＭの保存溶液を与える；ＤＮＰステップで用いられるトリチルラジカルの最終濃度は１３．２ｍＭであった。トリチルラジカル溶液の試料を引き続く分注を促進するために穏やかに温める。同様にしてトリチルラジカルの保存溶液を２２．２５ｍＭで調製し、これを尿試料（実施例４）中の馬尿酸に対してＤＮＰステップでの最終ラジカル濃度の１４．９ｍＭにて使用した。これに加えて、保存溶液を２５ｍＭで調製し、これを残りの試験（実施例２、３、５および６）に対しＤＮＰステップでの最終ラジカルの濃度１５ｍＭにて使用した。
【００７４】
４０％ｗ／ｖ重水素化水酸化ナトリウムは、ＳＩＧＭＡ／ＡＬＤＲＩＣＨ化学会社から購入してＤ２Ｏ中で１００倍に希釈して、実施例１、２および３で使用する０．４％ｗ／ｖ保存溶液を調整した。
グリセリン−Ｄ８、Ｄ２ＯおよびＤＭＳＯ−Ｄ６試薬は、ＳＩＧＭＡ／ＡＬＤＲＩＣＨから購入した。
【００７５】
実施例１：ラット尿から単離された（１３Ｃ−カルボキシル）安息香酸の試験
（１３Ｃ−カルボキシル）安息香酸は、ＳＩＧＭＡ／ＡＬＤＲＩＣＨ化学会社から購入した。ラット尿に試料を約５ｍｇ／ｍｌで加えてから固相抽出（ＳＰＥ）ならびにギ酸−水およびギ酸−メタノールによる濃度勾配溶出を用いる逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰｈｐｌｃ、Ｃ１８Ｋｒｏｍａｓｉｌ、２５Ｘ１ｃｍ、５μｍ）により単離した。それから単離された物質を乾燥し、アリコートをＲＰｈｐｌｃにより再分析すると、オンラインＵＶ検出（２５４ｎｍ）によるモニターで、純度９４％を示し、主成分は担体物質と共溶出し、そしてオンライン電子スプレイイオン化質量分析法（ＥＩ−ＭＳ）にて質量単位１２２に予期された（Ｍ−Ｈ）−イオンを与えた。
【００７６】
上記のように得られた（１３Ｃ−カルボキシル）安息香酸（８９μｇ、０．７２μｍｏｌ）の試料を、重水素化水酸化ナトリウム−Ｄ２Ｏ（０．４％ｗ／ｖ、７．５μｌ、約１．５当量）およびＤ２Ｏ（７．５μｌ）中に溶解させた。グリセリン−Ｄ８（１２４μｌ、２２ｍＭ）中に溶解させたトリチルラジカルを安息香酸溶液に加え、続いてできたカクテルを使い捨てプラスチック製ピペットで均一に混合した。この試料を微小なプラスチック製ピペットを通して液体窒素浴中へしたたらせて、小さな滴粒として急速凍結させた。凍結した試料の滴粒を小さなピンセットを用いて収集して、液体窒素で冷却されたＫｅｌ−Ｆカップに置き、そしてこれを試料分極化のために移送した。試料を３．３５４Ｔの磁場および９３．９２５ＧＨｚのマイクロ波周波数にて終夜分極させた。マイクロ波出力は１００ｍＷであり、試料温度は分極の間１．２５Ｋに保持された。
【００７７】
試験試料をインシツで熱いＤ２Ｏ（約５ｍｌ）中に溶解させ、一部分（５ｍｍのＮＭＲチューブ中で約１ｍｌ、推定試料温度は３３３Ｋである）を液体状態のＮＭＲスペクトル測定のためにＩＮＯＶＡ４００ＭＨｚスペクトロメーターに速やかに移送した。試料はスペクトロメーターに移送させる間（約２０秒の移送時間）地磁気に露出した。１７６．０ｐｐｍで観測される（１３Ｃ−カルボキシル）安息香酸のカルボキシル炭素のピークに対して評価されたシグナル対ノイズは、約４４０である。ＮＭＲスペクトルは、単一アクイジションで得られた（６マイクロ秒間のＲＦパルスに引き続いて、アクイジション時間は１．２秒であり、掃引幅は２５ｋＨｚであり、ＷＡＬＴＺプロトンデカップリングをパルスおよびアクイジションの間適用した；１Ｈｚのスペクトル線幅拡大を適用し、そしてシグナル対ノイズをＶａｒｉａｎ　Ｖｎｍｒソフトウェアによって測定した）。同じ試料を、引き続き同じスペクトロメーター中でプロトンデカップリングをした非強化ＮＭＲにより分析した。カルボニル炭素に対する熱平衡シグナルを約８のシグナル対ノイズで得た。この対照スペクトルは、３７時間で得られた（０．８秒のスキャン反復速度および１１．２度のフリップ角度をもって、即ちＥｒｎｓｔの角度条件下での１６８０００スキャンを平均）。
【００７８】
ＮＭＲ分析で使用された試料を保有し、引き続きギ酸−水およびギ酸−アセトニトリルでの濃度勾配溶出によるＲＰｈｐｌｃ（Ｃ１８Ｋｒｏｍａｓｉｌ、２５Ｘ１ｃｍ、５μｍ）ならびにＥＩ−ＭＳにより再分析した。
再分析は圧倒的に（１３Ｃ）安息香酸を示し、この物質はＭＳ分析によって予期された分子イオンを与えた。
【００７９】
結果
図１のスペクトルが得られた。安息香酸の標識された１３ＣＯＯＨ部位からの著明なピークが、１７６．０ｐｐｍにおいて明白に見える。７１．９ｐｐｍ付近および６２．３ｐｐｍ付近の著明なピークはグリセリンからの溶媒ピークと同定される。このスペクトルに対するアクイジション時間は、従来のＮＭＲで必要とされるような何日かと比べて、何秒という問題であった。そのスペクトルは例外的なシグナル対ノイズ比を示している。
【００８０】
結論
強化ＮＭＲスペクトルの観測されたシグナル対ノイズ比は、同試料の従来のＮＭＲスペクトルのシグナル対ノイズ比と比較すると、この発明による方法が実質的な改良をもたらすことを立証している。強化は、二、三千倍のオーダーであると評価される。同様に、注目すべき短いデータアクイジション時間は、この発明の方法が従来のＮＭＲでは単に時間を浪費し過ぎて実際上実施しえないであろう試験を行うために使用できることを立証している。
【００８１】
このスペクトルの線は極めて細く、かつスペクトル中では予期された位置にある。それ故に、ＤＮＰラジカルはＮＭＲスペクトルの質に影響を与えないと推論できる。このことは、この発明の過分極法を用いて得られるシグナル強化が、得られた強化スペクトル中のアーティファクトによって損なわれないことを示すので重要である。
【００８２】
実施例２：（１３Ｃ−カルボキシル）安息香酸のｉｖ投与後にラット尿から単離された（１３Ｃ−カルボキシル）馬尿酸 （安息香酸一次代謝物）の試験
保持磁場電磁石なしの実施態様
（１３Ｃ−カルボキシル）安息香酸を静脈内注射により１０ｍｇ／ｋｇ（０および２時間にて）にて４匹の麻酔ラットに投与した；カニューレを挿入した尿道から尿を採集した。主代謝物の（１３Ｃ−カルボキシル）馬尿酸をＳＰＥおよびＲＰ−ｈｐｌｃで単離した。それから単離された物質を乾燥し、アリコートをＲＰｈｐｌｃにより再分析すると、オンラインＵＶ検出（２５４ｎｍ）によるモニターで、純度９９％を示し、主成分は標品の担体物質と共溶出し、そしてオンライン電子スプレイイオン化質量分析法（ＥＩ−ＭＳ）にて質量単位１７９に予期された（Ｍ−Ｈ）−イオンを与えた。
【００８３】
上記のように得られた（１３Ｃ−カルボキシル）馬尿酸（４６３μｇ、２．５７μｍｏｌ）の試料を、重水素化水酸化ナトリウム−Ｄ２Ｏ（０．４％ｗ／ｖ、１７．５μｌ、約０．９７当量）中に溶解させた。グリセリン−Ｄ８（２６μｌ、２５ｍＭ）中に溶解したトリチルラジカルを馬尿酸溶液に加え、続いてできたカクテルを使い捨てプラスチック製ピペットで均一に混合した。この試料を微小なプラスチック製ピペットを通して液体窒素浴中へしたたらせて、小さな滴粒として急速凍結させた。凍結した試料の滴粒を小さなピンセットを用いて収集して、液体窒素で冷却されたＫｅｌ−Ｆカップに置き、そしてこれを試料分極化のために移送した。試料を３．３５４Ｔの磁場および９３．９２５ＧＨｚのマイクロ波周波数にて４時間分極させた。マイクロ波出力は１００ｍＷであり、試料温度は分極の間１．２５Ｋに保持された。試験試料をインシツで熱いＤ２Ｏ（約２〜３ｍｌ）中に溶解させ、一部分（５ｍｍのＮＭＲチューブ中で約１ｍｌ、推定試料温度は３３３Ｋである）を液体状態のＮＭＲスペクトル測定のためにＩＮＯＶＡ４００ＭＨｚスペクトロメーターに速やかに移送した。
【００８４】
結果
ＮＭＲスペクトルは単一アクイジションで得られた（６マイクロ秒間のＲＦパルスに引き続いて、アクイジション時間は１．２秒であり、掃引幅は２５ｋＨｚであった；１Ｈデカップリングを上のように使用した；１Ｈｚのスペクトル線幅拡大を適用し、そしてシグナル対ノイズをＶａｒｉａｎ　Ｖｎｍｒソフトウェアによって測定した）。馬尿酸からの極めてノイズの多いＮＭＲスペクトルが得られた。（１３Ｃ−カルボキシル）馬尿酸の約１７０ｐｐｍに観測されるカルボキシル炭素ピークに対して評価されたシグナル対ノイズは、４以下である。強いグリセリンのシグナルが観測された。
【００８５】
結果
【００８６】
実施例３：（１３Ｃ−カルボキシル）安息香酸のｉｖ投与後にラット尿から単離した（１３Ｃ−カルボキシル）馬尿酸（安息香酸一次代謝物）の試験
保持電磁石を使用する実施態様
上記のように得られた（１３Ｃ−カルボキシル）馬尿酸（４６３μｇ、２．５７μｍｏｌ）の試料を、重水素化水酸化ナトリウム−Ｄ２Ｏ（０．４％ｗ／ｖ、１７．５μｌ、約０．９７当量）中に溶解させた。グリセリン−Ｄ８（２６μｌ、２５ｍＭ）に溶解させたトリチルラジカルを馬尿酸溶液中に加え、続いてできたカクテルを使い捨てプラスチック製ピペットで均一に混合した。この試料を微小なプラスチック製ピペットを通して液体窒素浴中へしたたらせて、小さな滴粒として急速凍結させた。凍結した試料の滴粒を小さなピンセットを用いて収集して、液体窒素で冷却されたＫｅｌ−Ｆカップに置き、そしてこれを試料分極化のために移送した。試料を３．３５４Ｔの磁場および９３．９２５ＧＨｚのマイクロ波周波数にて４時間分極させた。マイクロ波出力は１００ｍＷであり、試料温度は分極の間１．２５Ｋに保持された。試験試料をインシツで熱いＤ２Ｏ（約２〜３ｍｌ）中に溶解させ、一部分（５ｍｍのＮＭＲチューブ中で約１ｍｌ、推定試料温度は３３３Ｋである）を液体状態の１３Ｃ　ＮＭＲスペクトル測定のためにＩＮＯＶＡ４００ＭＨｚスペクトロメーターに速やかに移送した。試料はスペクトロメーターに移送させる間（約２０秒の移送時間）１０ｍＴの保持磁場中で維持した。（１３Ｃ−カルボキシル）馬尿酸の約１７１．２ｐｐｍに観測されるカルボキシル炭素ピークに対して評価されたシグナル対ノイズは、約１５００である。ＮＭＲスペクトルは、単一アクイジションで得られた（６マイクロ秒間のＲＦパルスに引き続いて、アクイジション時間は１．２秒であり、掃引幅は２５ｋＨｚであった；１Ｈデカップリングを上のように用い、１Ｈｚのスペクトル線幅拡大を適用し、そしてシグナル対ノイズをＶａｒｉａｎ　Ｖｎｍｒソフトウェアによって測定した）。
【００８７】
ＮＭＲ分析で使用した試料を保有し、引き続きギ酸−水およびギ酸−アセトニトリルでの濃度勾配溶出によるＲＰｈｐｌｃ（Ｃ１８Ｋｒｏｍａｓｉｌ、２５Ｘ０．４６ｃｍ、５μｍ）ならびにＥＩ−ＭＳにより再分析した。再分析は圧倒的に（１３Ｃ）馬尿酸を示し、この物質はＭＳ分析によって予期された分子イオンを与えた。
【００８８】
結果
図２に強化ＮＭＲスペクトルを示す。保持磁場を用いるこの実施例では、保持磁場を用いない実施例２におけるよりも馬尿酸ＮＭＲシグナルに対するはるかに高いシグナル対ノイズ比が得られた。
喜ばしいことに、標識に対して予期されるものに付加的なピ−クが観測された。
【００８９】
安息香酸標識からのそれと比較すると馬尿酸標識からのＮＭＲシグナルの化学シフト差は、従来のＮＭＲ試験から予期されるものであった。
【００９０】
結論
試料をある場所で分極しそしてＮＭＲ分析を別の場所で行うところの技法によって幾つかの化合物を分析するとき、保持磁場を用いることは有益である。どの化合物がこのような保持磁場を用いることによって利益を得るかを予め予測することは常には可能でないので、エクスシツ過分極化技法を用いるときには日常的に用いるべきである。
【００９１】
強化ＮＭＲスペクトルにおいて馬尿酸からの付加的ピークが存在することは、この発明の方法が従来のＮＭＲを用いてできるであろうよりもより低投与量での試料化合物を試験するのに適していることを示す。幾つかの代謝物が極めて低濃度でのみ存在し得る場合には、薬剤もしくは薬剤候補の毒性および／もしくは代謝を研究するためには、これは潜在的に有意義である。
【００９２】
さらに、この発明の方法はＮＭＲ活性核がより低度の強化度もしくは自然存在比でさえ存在するところの試験化合物について用いるのに好適であり得ることが、付加的ピークの存在から推論される。
【００９３】
予期された化学シフトの位置でＮＭＲシグナルを観測することは、この方法がアーティファクトを導入しないでかつ試験化合物の動態を研究するために使用し得ることを立証している。
【００９４】
実施例４：（１３Ｃ−カルボキシル）馬尿酸（ラット尿中へのスパイク後で直接に分析）
（１３Ｃ−カルボキシル）馬尿酸は、（１３Ｃ−カルボキシル）安息香酸およびグリシンから社内で合成された。
【００９５】
上記の安息香酸の代謝研究において尿（０〜２時間採集）中で測定されたレベルであるところの約５ｍｇ／ｍｌにて、試料をラット尿に加えた。合成した（１３Ｃ−カルボキシル）馬尿酸９５μｇを含有する試料を、ラット尿２０μｌ中に溶解した。グリセリン−Ｄ８（３０μｌ、２２．２５ｍＭ）中に溶解したトリチルラジカルを馬尿酸溶液に加え、そして続いてできたカクテルを使い捨てプラスチック製ピペットで均一に混合した。この試料を微小なプラスチック製ピペットを通して液体窒素浴中へしたたらせて、小さな滴粒として急速凍結させた。凍結した試料の滴粒を小さなピンセットを用いて収集して、液体窒素で冷却されたＫｅｌ−Ｆカップに置き、そしてこれを試料分極化のために移送した。試料を３．３５４Ｔの磁場および９３．９２５ＧＨｚのマイクロ波周波数にて４時間分極させた。マイクロ波出力は１００ｍＷであり、試料温度は分極の間１．２５Ｋに保持された。試験試料をインシツで熱いＤ２Ｏ（約２〜３ｍｌ）中に溶解させ、一部分（５ｍｍのＮＭＲチューブ中で約１ｍｌ、推定試料温度は３３３Ｋである）を液体状態の１３Ｃ　ＮＭＲスペクトル測定のためにＩＮＯＶＡ４００ＭＨｚスペクトロメーターに速やかに移送した。試料はスペクトロメーターに移送させる間（約２０秒の移送時間）１０ｍＴの保持磁場中で維持した。
【００９６】
（１３Ｃ−カルボキシル）馬尿酸の約１７１．２ｐｐｍに観測されるカルボキシル炭素ピークに対して評価されたシグナル対ノイズは、約５３４である。ＮＭＲスペクトルは、単一アクイジションで得られた（６マイクロ秒間のＲＦパルスに引き続いて、アクイジション時間は１．２秒であり、掃引幅は２５ｋＨｚであった；１Ｈデカップリングを上のように用いた；１Ｈｚのスペクトル線幅拡大を適用し、そしてシグナル対ノイズをＶａｒｉａｎ　Ｖｎｍｒソフトウェアによって測定した）。
【００９７】
ＮＭＲ分析で使用された試料を保有し、引き続きギ酸−水およびギ酸−アセトニトリルでの濃度勾配溶出によるＲＰｈｐｌｃ（Ｃ１８Ｋｒｏｍａｓｉｌ、２５Ｘ０．４６ｃｍ、５μｍ）ならびにＥＩ−ＭＳにより再分析した。再分析は圧倒的に（１３Ｃ）馬尿酸を示し、この物質はＭＳ分析によって予期された分子イオンを与えた。
【００９８】
結果
二つのＮＭＲシグナルが観測され、一つは１７０．７ｐｐｍにおける馬尿酸から生じるもので、そして１６３．１ｐｐｍにおけるもう一つの一本のシングレットＮＭＲシグナルは、化学シフトがＡＣＤ　Ｌａｂｓソフトウェアを用いて予測されるシフトと一致しかつこの物質が尿の主成分であることが公知であるとの理由から、暫定的に尿素に帰属できるところのものである。
【００９９】
結論
この場合、試験化合物は生体マトリックス、即ちラット尿中で直接に分析された。明白なシグナルが得られたという事実は大きな励ましであり、かつ経時的に採集された試料が分析でき、したがって動的研究を可能にすることを立証する。もう一つの結論としては、試料をＮＭＲ分析に先立って分別しなくてもよいということである。
【０１００】
安息香酸がまたその試料中に存在していたならば、それもまた検出されたであろうと推論することは不合理ではない。したがって、この発明の方法を用いて薬物動態学的研究を実施することができる。
【０１０１】
実施例５：ラット尿から単離された（Ｕ−１３Ｃ）パラセタモール
（Ｕ−１３Ｃ）パラセタモールを合成した。この物質をラット尿に約５ｍｇ／ｍｌで加え、それから固相抽出（ＳＰＥ）ならびにギ酸−水およびギ酸−メタノールによる濃度勾配溶出を用いる逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰｈｐｌｃ、Ｃ１８Ｋｒｏｍａｓｉｌ、２５Ｘ１ｃｍ、５μｍ）により単離した。
それから単離された物質を乾燥し、アリコートをＲＰｈｐｌｃにより再分析すると、オンラインＵＶ検出（２５４ｎｍ）によるモニターで、純度９４％を示し、主成分は担体物質と共溶出し、そしてオンライン電子スプレイイオン化質量分析法（ＥＩ−ＭＳ）にて質量単位１６０に予期された（Ｍ＋Ｈ）＋イオンを与えた。
【０１０２】
上記のように得られた （Ｕ−１３Ｃ）パラセタモール（３１２μｇ、１．９６μｍｏｌ）の試料を、ＤＭＳＯ−Ｄ６（１０μｌ）およびＤ２Ｏ（１４μｌ）中に溶解させた。グリセリン−Ｄ８（３６μｌ、２５ｍＭ）中に溶解させたトリチルラジカルを（Ｕ−１３Ｃ）パラセタモール溶液に加え、そして続いてできたカクテルを使い捨てプラスチック製ピペットで均一に混合した。この試料を微小なプラスチック製ピペットを通して液体窒素浴中へしたたらせて、小さな滴粒として急速凍結させた。凍結した試料の滴粒を小さなピンセットを用いて収集して、液体窒素で冷却されたＫｅｌ−Ｆカップに置き、そしてこれを試料分極化のために移送した。試料を３．３５４Ｔの磁場および９３．９２５ＧＨｚのマイクロ波周波数にて４時間分極させた。マイクロ波出力は１００ｍＷであり、試料温度は分極の間１．２５Ｋに保持された。試験試料をインシツで熱いＤ２Ｏ（約２〜３ｍｌ）中に溶解させ、一部分（５ｍｍのＮＭＲチューブ中で約１ｍｌ、推定試料温度は３３３Ｋである）を液体状態の１３Ｃ　ＮＭＲスペクトル測定のためにＩＮＯＶＡ４００ＭＨｚスペクトロメーターに速やかに移送した。試料はスペクトロメーターに移送させる間（約２０秒の移送時間）１０ｍＴの保持磁場中で維持した。ＮＭＲスペクトルは、単一アクイジションで得られた（６マイクロ秒間のＲＦパルスに引き続けて、アクイジション時間は１．２秒であり、掃引幅は２５ｋＨｚであった）。
【０１０３】
ＮＭＲ分析で使用された試料を保有し、引き続きギ酸−水およびギ酸−アセトニトリルでの濃度勾配溶出によるＲＰｈｐｌｃ（Ｃ１８Ｋｒｏｍａｓｉｌ、２５Ｘ０．４６ｃｍ、５μｍ）ならびにＥＩ−ＭＳにより再分析した。再分析は圧倒的に（１３Ｃ）パラセタモールを示し、この物質はＭＳ分析によって予期された分子イオンを与えた。
【０１０４】
結果
強化は、予測と一致した位置に存在するすべてのピークで観測された。
【０１０５】
実施例６：（Ｕ−１３Ｃ）パラセタモールのｉｖ投与後にラット胆汁から単離された（Ｕ−１３Ｃ）パラセタモール−硫酸エステルの試験
（Ｕ−１３Ｃ）パラセタモールを２０ｍｇ／ｋｇ（０および３時間にて）で静脈内注射により４匹の麻酔ラットに投与し、カニューレを挿入した尿道から尿を採集し、そしてカニューレを挿入した輸胆管（２匹のラットのみ）から０〜３および３〜６時間にて胆汁を採取した。胆汁（３〜６時間）をジクロロメタンで抽出しそしてそれからギ酸−水およびギ酸−メタノールによる濃度勾配溶出を用いるＲＰｈｐｌｃ（Ｃ１８Ｋｒｏｍａｓｉｌ、２５Ｘ１ｃｍ、５μｍ）により分別した。
【０１０６】
幾らかな代謝物が採取された。パラセタモール硫酸エステルはオンラインＥＩ−ＭＳにて質量単位２４０における（Ｍ＋Ｈ）＋イオンから同定された。それから単離された物質を乾燥し、アリコートをＲＰｈｐｌｃにより再分析すると、オンラインＵＶ検出（２５４ｎｍ）によるモニターで、ピーク純度９６．７％を示し、そしてオンライン電子スプレイイオン化質量分析法（ＥＩ−ＭＳ）にて質量単位２４０に予期された（Ｍ＋Ｈ）＋イオンを与えた。
【０１０７】
上記のように得られた（Ｕ−１３Ｃ）パラセタモール硫酸エステル（１００μｇ、０．４２μｍｏｌ）の試料をＤ２Ｏ（２４μｌ）中に溶解させた。グリセリン−Ｄ８（３６μｌ、２５ｍＭ）中に溶解させたトリチルラジカルを（Ｕ−１３Ｃ）パラセタモール溶液に加えそして続いてできたカクテルを使い捨てプラスチック製ピペットで均一に混合した。この試料を微小なプラスチック製ピペットを通して液体窒素浴中へしたたらせて、小さな滴粒として急速凍結させた。凍結した試料の滴粒を小さなピンセットを用いて収集して、液体窒素で冷却されたＫｅｌ−Ｆカップに置き、そしてこれを試料分極化のために移送した。試料を３．３５４Ｔの磁場および９３．９２５ＧＨｚのマイクロ波周波数にて４時間分極させた。マイクロ波出力は１００ｍＷであり、試料温度は分極の間１．２５Ｋに保持された。試験試料をインシツで熱いＤ２Ｏ（約２〜３ｍｌ）中に溶解させ、一部分（５ｍｍのＮＭＲチューブ中で約１ｍｌ、推定試料温度は３３３Ｋである）を液体状態の１３Ｃ　ＮＭＲスペクトル測定のためにＩＮＯＶＡ４００ＭＨｚスペクトロメーターに速やかに移送した。試料はスペクトロメーターに移送させる間（約２０秒の移送時間）１０ｍＴの保持磁場中で維持した。ＮＭＲスペクトルは、単一アクイジションで得られた（６マイクロ秒間のＲＦパルスに引き続いて、アクイジション時間は１．２秒であり、掃引幅は２５ｋＨｚであった；１Ｈデカップリングを上のように適用した）。
【０１０８】
ＮＭＲに使用した試料を保有し、引き続きギ酸−水およびギ酸−アセトニトリルでの濃度勾配溶出によるＲＰｈｐｌｃ（Ｃ１８Ｋｒｏｍａｓｉｌ、２５Ｘ０．４６ｃｍ、５μｍ）ならびにＥＩ−ＭＳにより再分析した。再分析は圧倒的に先の分析からのパラセタモール硫酸エステルと一致する保持時間を持つ主成分を示し、この物質はＭＳ分析によって予期された分子イオンを与えた。
【０１０９】
結果
図３に強化ＮＭＲスペクトルを示す。パラセタモールと比較したパラセタモール硫酸エステルのスペクトルで差が観測された。特に、芳香族部位から生じる１３ＣＮＭＲシグナルに対する化学シフトの位置が有意に異なる。
炭素中心のピークの高さは同一のオーダーであった。
【０１１０】
結論
パラセタモール硫酸エステルはラットにおいて代謝により生成していて、そして胆汁から採集された。胆汁は、尿（そこから馬尿酸および安息香酸を採集した）とは異なる生体マトリックスである。この結果は、ＮＭＲ強化は試験化合物がそこから導き出される生体マトリックスとは無関係に観測され得ることを示す。パラセタモールと比べて異なるスペクトルが得られたという事実は、両者間の構造的差異が僅かな場合でも、混合物中での親化合物とそれらの代謝物からのピークを区別し得ることが可能であることを立証する。
他のすべての実施例におけるように、ラジカルから生じるシグナルが観測されなかったことは喜ばしい所見であった。
【０１１１】
炭素中心のピークの高さが同一のオーダーであったことが見出されたことは驚きである。異なる炭素中心は非常に異なる速度で減衰するから、炭素中心に対するシグナル強度は非常に異なると予想された。実際、複数のメチルピークを本当に観測できることは期待されなかった。したがって、この実験からは予期以上に多くの情報が得られた。与えられた試験化合物内のいかなる炭素中心も、この発明の方法によって同様な感度で検出できると推定することは不合理ではない。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１はスペクトルを示す。
【図２】図２は強化ＮＭＲスペクトルを示す。
【図３】図３は強化ＮＭＲスペクトルを示す。
【図１】
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【図２】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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