(57)【要約】固相支持体を利用した核酸の等温増幅法を開示する。これらの方法は、高処理能力を必要とする用途（特に、核酸配列決定）に有用である。
2004524012.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
最大1000個のヌクレオチドを含む核酸セグメントを少なくとも１つ等温増幅する方法であって、下記の工程：
a）増幅すべき核酸を含む核酸鋳型を少なくとも１つ形成し、ここで該核酸は、5’末端にオリゴヌクレオチド配列Ｙを、3’末端にオリゴヌクレオチド配列Ｚを含み、さらに該核酸は、5’末端に該核酸を固相支持体上へ固定化するための手段を有し、
b）１以上のコロニープライマーＸを形成し、ここで該コロニープライマーは、オリゴヌクレオチド配列Ｚにハイブリダイズ可能であり、かつ、該コロニープライマーを固相支持体へ固定化するための手段を5’末端に有し、
c）該核酸鋳型とコロニープライマーを、固相支持体の存在下で5’末端による固相支持体上への固定化を可能にする溶液と共に混合し、核酸鋳型とコロニープライマー双方の5’末端を該固相支持体へ結合させ、
d）少なくとも核酸ポリメラーゼとヌクレオチド前駆体を含有する増幅溶液を該固相支持体へ適用して、固定化された核酸鋳型の配列と同一または相補的な配列を有する核酸を等温にて生成・固定化する
を含む前記方法。
【請求項２】
２つの異なるコロニープライマーＸ’およびＸ”を核酸鋳型と混合し、コロニープライマーＸ’およびＸ”の配列が、オリゴヌクレオチド配列ＺがコロニープライマーＸ’の一方とハイブリダイズ可能であり、かつ、オリゴヌクレオチド配列ＹがコロニープライマーＸ”の一方と同一となるような配列である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
オリゴヌクレオチド配列Ｚがオリゴヌクレオチド配列Ｙに相補的であり、コロニープライマーＸがオリゴヌクレオチド配列Ｙと同一の配列である、請求項１記載の方法。
【請求項４】
１以上のコロニープライマーＸが縮重プライマー配列を含んでいてもよく、核酸鋳型が増幅すべき核酸を含み、かつ、オリゴヌクレオチド配列ＹまたはＺをそれぞれ5’および3’末端に含まない、請求項１記載の方法。
【請求項５】
前記核酸鋳型が、ゲノムDNA、相補的DNA、組換えDNA、または任意の形態の合成もしくは修飾DNA、RNA、mRNA、または任意の形態の合成もしくは修飾RNAである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
核酸鋳型が68〜605個の塩基を含有する、請求項５記載の方法。
【請求項７】
固定化溶液中の核酸鋳型の濃度が１nM〜0.01nMである、請求項６記載の方法。
【請求項８】
固定化溶液中のコロニープライマーの濃度が1000〜50nMである、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記核酸ポリメラーゼが、DNA依存性DNAポリメラーゼまたはRNA依存性DNAポリメラーゼである、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記核酸ポリメラーゼが、70℃〜85℃で活性なDNAポリメラーゼである、請求項５記載の方法。
【請求項１１】
増幅を77℃〜81℃の温度で行う、請求項６記載の方法。
【請求項１２】
増幅溶液の核酸前駆体が、デオキシリボヌクレオチド三リン酸である、請求項１〜11のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
核酸鋳型とコロニープライマー双方の5’末端を固定化するための手段が、該分子と固相支持体との間に共有結合を形成する化学的に修飾可能な官能基である、請求項１〜12のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
核酸鋳型およびプライマーを5’末端修飾にてチオール基、リン酸基またはアミノ基で修飾し、1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)-カルボジイミド塩酸塩（EDC）を含有する固定化溶液を用いて固定化する、請求項13記載の方法。
【請求項１５】
固相支持体が、一官能性または二官能性架橋試薬を用いた官能化による核酸の共有結合を可能にするものである、請求項13記載の方法。
【請求項１６】
核酸鋳型とコロニープライマー双方の5’末端を固定化するための手段が、固相支持体上に固定化された分子を親和性によって結合する化学基である、請求項１〜12のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
増幅溶液に６％〜14％のDMSOが含まれる、請求項１〜16のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
DNAコロニーを固相支持体上で等温生成するための、請求項１〜17のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
生成される核酸コロニーの密度が1000〜100000個/mm2である、請求項18記載の方法。
【請求項２０】
増幅核酸を可視化する追加工程を含む、請求項18または19記載の方法。
【請求項２１】
二本鎖DNAインターカレート剤、標識ヌクレオチド、または標識オリゴヌクレオチドを使用する、請求項20記載の方法。
【請求項２２】
核酸コロニーの１つ以上に属する１以上の固定化核酸鎖を、化学的、光学的、物理的または酵素的手段によって遊離させる追加工程を含む、請求項18〜21のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
核酸コロニーの１つ以上を配列決定する工程を少なくとも１回行う追加工程を含む、請求項18〜22のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
配列決定を、標識ヌクレオチドを取込ませることで行う、請求項23記載の方法。
【請求項２５】
コロニープライマーを利用して標識ヌクレオチドを取込ませる、請求項24記載の方法。
【請求項２６】
１以上の増幅核酸にハイブリダイズするコロニープライマー以外のプライマーを利用して標識ヌクレオチドを取込ませる、請求項25記載の方法。
【請求項２７】
核酸コロニーの１つ以上に属する核酸鎖の一方もしくは両方の標識オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションの結果、配列決定を行う、請求項23記載の方法。
【請求項２８】
標識が放射性基または蛍光基である、請求項23〜27のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
請求項22記載の核酸鎖の一方または両方の遊離の結果、配列決定を行う、請求項23記載の方法。
【請求項３０】
１つの核酸コロニーに少なくとも存在する増幅核酸鋳型の完全配列または部分配列を決定する、請求項22記載の方法。
【請求項３１】
追加工程を核酸コロニーの１つ以上に同時に行う、請求項19〜29のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
ゲノム学、薬理ゲノム学、薬剤発見、食品の特性決定、遺伝子型決定、診断学、遺伝子発現の監視、遺伝的多様性のプロファイリング、全ゲノム配列決定および多型発見の分野において核酸の配列決定および再配列決定に使用する、または、核酸の増幅を伴う他の任意の用途に使用する核酸分子を提供するための、請求項１〜31のいずれか一項に記載の方法の使用。
【請求項３３】
ゲノム学、薬理ゲノム学、薬剤発見、食品の特性決定、遺伝子型決定、診断学、遺伝子発現の監視、遺伝的多様性のプロファイリング、全ゲノム配列決定および多型発見の分野において核酸の配列決定および再配列決定に使用する、または、核酸の増幅を伴う他の任意の用途に使用する核酸分子を提供するための、請求項１〜31のいずれか一項に記載の方法を含む等温核酸増幅に使用するためのキット。
【発明の詳細な説明】
【発明の開示】
【０００１】
発明の分野
本発明は核酸増幅分野に関する。より詳しくは、本発明は、固相表面を利用した核酸の等温増幅法、並びに、高処理能力を必要とする用途（特に、核酸配列決定）に有用な装置およびキットに関する。
発明の背景
核酸配列分析は、生物学、バイオテクノロジーおよび医学における多くの活動の基礎となっている。ヒトおよび他の高等生物の大型ゲノムの配列決定以外にも、例えば、一塩基多型（SNP）の検出、スクリーニングや遺伝子発現の監視を行うべく努力が始まっていることから、核酸配列を決定し得ることが益々重要になってきている。核酸配列決定によってもたらされる遺伝情報は、例えば、薬物標的の発見や確認、疾患の診断、リスク評価、および生物の同定や特性決定において多くの用途を有している。
【０００２】
生物、疾患、または集団を形成する個体に関する遺伝情報に対して信頼性の高いデータの必要性が急速に増加していることから、スクリーニング法の処理能力を向上させることがより一層重要である。このような用途の基本的な目的は、細胞型、生物または個体集団に属する対象核酸中に含まれる４つの塩基（アデニン（A）、シトシン（C）、グアニン（G）およびチミン（T）またはウラシル（U））の配列を決定することである。核酸配列決定法の大部分（Yan H et al., Science 2000, 289(5486):1890-2に概説）は、（プライマー始動型ヌクレオチド伸長またはハイブリダイゼーション技術を利用して）核酸配列を直接決定することができ、また、（電気泳動および／または切断分析によって）間接的に決定することも可能である。しかしながら、核酸配列分析専用のいずれの用途も、その科学的・経済的価値は方法の実際の処理能力に大きく依存している。
【０００３】
信頼性の高い結果を得るのに許容される量および質にて単離核酸を得るためには労力が必要であり、このことは、配列決定法の処理能力を評価する際に考慮すべき主要な問題の１つをなしている。比較的高品質の出発材料を用意するか、および／または、相当の人手をかけなければ、配列決定すべき核酸を含む原サンプルでは、このような分析を行うのに十分な材料が得られないことが多い。このことは、何百ナノグラムもの単離DNA配列を必要とする配列決定法をナノグラムまたはそれ以下の全ゲノムDNAを出発材料として行わなければならないような、法医学的なDNA標本もしくは保存DNA標本の場合、または、特定の細胞型から採取したmRNAサンプルの場合に特に重要である。
【０００４】
このような問題を解消するのに主に採用される解決策は、目的の核酸断片のみからなるコピーを複数生成させることによりDNA配列を増幅することである。通常、核酸の増幅には以下に示す一連の操作を繰り返す必要がある：
a）目的の配列を含む第１核酸（鋳型）を供給し、
b）第１核酸に含まれ、かつ、目的の配列の3’末端に隣接するかまたは内側の配列に相補的な配列を少なくともその3’末端に含む第２核酸（プライマー）を供給し、
c）鋳型とプライマーの双方を、少なくともこれら２つの核酸の相補領域において一本鎖分子に変化させる条件を整え、
d）鋳型およびプライマーの中に位置する相補配列間でハイブリダイゼーションさせる条件を整え、
e）ハイブリダイズしたプライマーの3’末端から出発して、ワトソン・クリックの塩基対合則（A-TまたはA-UおよびC-G）に従って鋳型領域の相補鎖を合成可能な核酸ポリメラーゼを供給し、
f）得られた二本鎖核酸（一方の鎖は元の鋳型に属し、他方の鎖には、ヌクレオチド伸長が可能であった鋳型の領域に相補的な配列と融合したプライマーが含まれる）を分離させ、その結果、各鎖が新たなハイブリダイゼーションおよび重合用の鋳型となり得る。
【０００５】
通常、第２のプライマーも増幅反応へ添加し、同様に目的の配列に隣接するかまたは内側の、新たに合成された鎖の部分にハイブリダイズさせることにより重合を開始する。一方の相補鎖にそれぞれ特異的な２つのプライマーを使用する場合には、これらのサイクルを繰り返すことにより、該プライマーとのハイブリダイゼーションに使用される配列間に含まれる鋳型配列の両鎖のコピーを複数合成できる。あるいは、１つのプライマーのみを供給する場合には、一本鎖のコピーが複数生成する。
【０００６】
重要なのは、元の鎖と新たに合成された鎖とのハイブリダイゼーションを解き、それぞれを遊離のプライマー分子へハイブリダイズさせて重合を再び開始し、所望量の特定の核酸配列を迅速に生成するよう、条件を連続的に回復させることである。プライマー分子は、通常、鋳型分子よりもかなりの高濃度で存在するため、増幅過程の指数関数的な動力学が持続可能である。
【０００７】
一般に、核酸の一本鎖および二本鎖形態間の移行は、増幅工程を行う系の温度を上下させることにより達成される。この範囲では、増幅に必要なエレメント（鋳型、プライマー、核酸ポリメラーゼ、ヌクレオチド、塩）は、外部装置によって発生する一連の加熱相および冷却相へかけられる。
【０００８】
このようなアプローチは通常熱サイクルと呼ばれるが、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR；Mcpherson MJ ら編「PCR: a Practical approach」中のTaylor GR著「Polymerase chain reaction: basic principles and automation」、Oxford Univ. Press 1991）と呼ばれる周知技術に適用されている。PCRでは、下記の工程を厳密に順序を守って既定時間行う：
a）変性（90℃〜95℃で30〜60秒）。外部装置によって、核酸分子の動きを増大させるのに必要なエネルギー（熱の状態）を、二本鎖構造を安定化させている非共有結合性相互作用を破壊するのに十分なレベルで供給する。この工程は、鋳型とプライマーが既に一本鎖形態である場合には第１サイクルにおいて結果的に省略することも可能であるが、後続のサイクル全てにおいては絶対に必要である。
【０００９】
b）ハイブリダイゼーション（35℃〜80℃で30〜90秒）。プライマーと鋳型分子に含まれる相補配列は、温度を下げればハイブリダイズが可能である。この温度は、限られた相同性しか有さない分子のハイブリダイゼーションを回避するよう注意して制御しなければならないが、プライマーおよび鋳型の相補領域をなす核酸配列の長さとC/G含量の双方の関数であるため、各々の場合に応じて算出する。
【００１０】
c）伸長（60℃〜85℃で60〜180秒）。新しい核酸分子を実際に生成する唯一の工程である。伸長を行う温度は選択したポリメラーゼの関数であり、若干の例外を除いて、ハイブリダイゼーション温度には相当しない。通常、新たに合成される鎖の伸長は、増幅すべき核酸の長さに応じて、慣用のポリメラーゼによって１分または数分のうちに完了する。このような伸長鎖が伸長によって生じた二本鎖分子から少なくとも部分的に一本鎖分子として遊離するまで、新たなプライミング事象が発生することはない。
【００１１】
通常、分析を行うのに十分な量の核酸分子を取得するためには、これらの工程を15〜40サイクル繰り返すが、その後、PCR増幅は通常ポリメラーゼを使い果たしてプラトーに達する。
【００１２】
多くの異なる技術、手順および反応条件が基本スキームに基づいて開発されていても、以下に示す一連の特定の要件のため、PCRには厳しい制限がある：
a）加熱・冷却装置、
b）核酸の変性に必要な高温にて多数のサイクルを行った後でも高度の進行性と精度を維持するポリメラーゼ、
c）多数のサイクルへの増幅工程の細分化（そのため、重合は連続的ではなく、熱サイクル工程と同期している。核酸重合反応は、遊離のプライマーと鋳型分子とのハイブリダイゼーションに必要な条件を再設定すべく定期的に中断されるため、連続的に達成されることはなく、工程全体の速度が遅くなる）。
【００１３】
古典的なPCRに伴うこのような制限を解消するため、特に、熱サイクルを用いずに等温条件における鎖の分離とハイブリダイゼーションを可能にする代替アプローチを提供しようと、様々な解決策が先行技術において開示されてきた。
【００１４】
Strand Diplacement Amplification（SDA）は、重合鎖のみを切断するエンドヌクレアーゼをポリメラーゼと併用し、ポリメラーゼがこのような鎖に置き換わりながら新たな合成鎖を生成する等温核酸増幅・検出法である（EP497272；Walker GT, PCR Methods Appl 1993, 3(1):1-6）。この技術は、一本鎖の切断（ニッキング）、伸長および置換の工程を繰り返すものであり、様々に応用されているが（WO96/23904; Westin L et al., Nat Biotechnol 2000, 18(2):199-204）、このようなアプローチは応用範囲が限られる。エンドヌクレアーゼはポリメラーゼと同時に添加しなければならず、従って、工程全体を実施できる許容温度の範囲が両酵素の活性を維持する温度に限定される。エンドヌクレアーゼの場合には、このような範囲（通常25℃〜50℃）は一般に低すぎてプライマーの鋳型への非特異的なハイブリダイゼーションを防ぐことができず、反応のかなりの割合が非生産的になるか、または、望ましくない産物を生成してしまう。さらに、エンドヌクレアーゼ切断による認識部位（endonucleolytic recognition site）が、増幅すべき鋳型領域に存在してはならない一方で、プライマー配列中には常に存在しなければならないことが必須であるため、プライマーおよび／または鋳型として作用する核酸にはさらに改変を加える必要も考えられる。
【００１５】
Rolling Circle Amplification（RCA）は、等温条件下で環状オリゴヌクレオチドプローブを線形または幾何学的動力学にて伸長するDNAポリメラーゼを使用し、DNA分子の直列結合コピーを生成して複雑なパターンの鎖置換事象の結果として増幅を行う技術である（Walter NG and Strunk G, Proc Natl Acad Sci USA 1994, 91(17):7937-41; WO94/03624）。この場合にも、たとえ該技術が様々に応用されてきたとしても（WO97/19193, Isaksson A and Landegren U, Curr Opin Biotechnol 1999, 10(1):11-5）、このような技術にはいくつかの制限があり、例えば、環状分子を使用したり、単一要素としてではなく、原配列を不定コピー数（相互に直列結合）含有する一連の分子群として増幅分子が産生されること、などである。
【００１６】
他の技術は、RNAポリメラーゼ、リボヌクレアーゼおよび逆転写酵素を含有する等温多酵素反応における中間体DNA-RNAハイブリッドによって問題を解決すべく開発されている（WO91/04340, WO92/08800, WO97/04126; Gebinoga M and Oehlenschlager F, Eur J Biochem 1996, 235(1-2):256-61）。これらの方法を用いても、RNAが急速に分解することと、反応において全成分を同時に正しく機能させて増幅工程の特異性と速度を維持する条件を見出すのが煩雑であることの双方に関連するいくつかの問題に遭遇してしまうことは明らかである。
【００１７】
上記の増幅技術が微量の核酸配列を分析する上で助けになったとしても、核酸配列決定法の処理能力は、処理を行って信頼性の高い情報を得るのに十分な量で単離核酸が得られることだけでなく、複数のサンプルを迅速かつ人手をかけずに処理できることにも関係している。遺伝情報の大部分は現在でも依然として、ゲル電気泳動のような扱いが難しく、手間がかかり、自動化が困難で、かつ、比較的大型の装置を必要とする技術を用いて得られている。さらに、このような方法では一般に、配列決定すべき各核酸要素の個々の処理を行っているだけである。従って多くの技術は、複数の異なる核酸の並行分析を可能にする特定の解決策をもたらすべく開発されたのである。
【００１８】
先行技術においては、処理能力を増大させる一般的な方法は、固相支持体を用いて多くのサンプルを並行して処理することである。該固相支持体は「DNAマイクロアレイ」または「DNAチップ」と定義されることが多く、この上に核酸を固定化した後、標識単一ヌクレオチドまたは標識核酸のいずれかを伴う様々なアプローチを利用して分析を行う（Southern E et al., Nat Genet. 1999, 21(1 Suppl):5-9; Lockhart DJ and Winzeler EA, Nature 2000, 405(6788):827-36）。大型の分子（例えば、500ヌクレオチド長を超える分子）並びにそれより小型の分子（オリゴヌクレオチドプライマー等）は、物理的または化学的手段によって、非特異的にまたは特異的な化学基を一端に用いて、効率的に固相支持体へ共有結合させることが可能である（Adessi C et al., Nucleic Acids Res 2000, 28(20):E87; Okamoto T et al., Nat Biotechnol 2000, 18(4):438-41）。適切なロボット工学、マイクロ力学に基づく系と顕微鏡技術とを組み合わせることにより、支持体１cm2当たり何百万もの核酸を整列付着させて分析することが技術的に実現可能である。
【００１９】
同様のアプローチを利用し、プライマーまたは鋳型分子のいずれかを固定化させることによりプライマー伸長反応を行うことが可能である（WO91/13075, WO00/47767）。あるいは、プライマーを表面へグラフト化させて溶液状態の遊離プライマーと併用することで、PCR産物を表面上へ増幅・結合させることができる（Andreadis JD and Chrisey LA, Nucleic Acids Res 2000, 28(2):e5）。また、プライマーをマトリックス上へ固定化し、一本鎖／二本鎖形態間の平衡と一塩基伸長をランダムかつ無制御に行う温度範囲（58℃〜74℃）の液相中に鋳型分子を維持することもできる（Dubiley S et al., Nucleic Acids Res 1999, 27(18):e19）。
【００２０】
これらの技術の主な欠点は、各用途ごとにDNAチップをまず設計・製造しなければならず、操作には依然として長時間を要し、複雑でかつ費用がかかり、従って、同一のチップを非常に多数必要とする場合にしか行えない点である。さらに、チップはハイブリダイゼーションおよび／または一塩基伸長にしか使えない場合が多く、再利用はできず、常に各チップにつき１種類の核酸サンプルしか処理できない（Cheung VG et al., Nat Genet. 1999, 21(1 Suppl):15-9; Bowtell DD, Nat Genet. 1999, 21(1 Suppl):25-32）。
【００２１】
他の技術は、上記２つの工程をより効率的に組み合わせることで、増幅および配列決定処理能力に関連する問題を少なくとも部分的に解決しようとする範囲で近年開発されたものである。
【００２２】
WO96/04404（Mosaic Technologies Inc.）には、サンプル中に含まれている可能性のある標的核酸の検出方法が開示されている。該方法は、標的核酸が試験サンプル中に存在する場合にのみ、標的核酸のPCR増幅を誘導するものである。特異的プライマーを固相支持体へ結合させ、これにより、増幅された標的核酸配列もこのような支持体に結合される。これら２つの特異的プライマーは、慣用のPCRの場合には特別に設計され、増幅すべき標的配列の両側に位置するかまたは内側の配列へハイブリダイズし、標準的な熱サイクル工程を始動させる。
【００２３】
このPCR増幅工程の第１工程は、支持体に結合させた第１特異的プライマー（「プライマー１」）への標的核酸のハイブリダイゼーションである。次いで、標的核酸に相補的な第１伸長産物をプライマー１配列の伸長によって形成する。鎖のハイブリダイゼーションを解くのに必要な高温に支持体をさらすと、標的核酸が外れ、他のプライマー１配列（支持体に結合していてもよい）とのさらなるハイブリダイゼーション反応に参加できるようになる。第１結合伸長産物は次いで、同じく支持体上に結合している第２特異的プライマー（「プライマー２」）とハイブリダイズ可能となり、プライマー２配列を伸長させることにより、第１伸長産物に相補的な第２伸長産物を形成することができ、同様に支持体に結合される。従って、標的核酸と第１および第２伸長産物は、複数のハイブリダイゼーションおよび伸長工程に参加し得る鋳型分子であり、標的核酸の元の存在量と最初に存在したプライマー１およびプライマー２配列の数によってのみ制限される。最終的に、表面に結合した標的配列のコピーが複数得られる。
【００２４】
この文献に開示されている増幅技術は、鋳型が溶液状態である第１サイクル後に、鋳型およびプライマー分子の双方が各々の5’末端を介して支持体上に固定化され、その結果ハイブリダイズした際に典型的なブリッジ様構造を形成することから、通常「Bridge Amplification」と呼ばれる。
【００２５】
この増幅工程では標的核酸のみが固定化されるため、支持体を監視することで、プライマーを設計した際に作業者によって予め規定された特定の標的配列の有無について総合的な品質評価が行える。従って、第１および第２プライマーの様々な組み合わせを固相支持体の異なる領域に配置する場合や、標的配列を一塩基ずつ分析する必要のない場合には、Bridge Amplificationは処理能力の高い配列分析法として利用可能である。さらに、異なる各標的配列に対して特異的なプライマーが公知であって、標的配列を同様の増幅条件で増幅できる場合には、このような技術は、異なる配列および／またはサンプルの連続分析を実質的に改善し得る。
【００２６】
他の技術は、Bridge Amplificationの基礎をなす機構をより効率的に利用しようとするものである。WO98/44151（Glaxo）には、分析すべき核酸鋳型を全て遺伝子操作してその両末端に固定化プライマーに相補的なリンカー配列を付加することにより、溶液状態の各鋳型分子を実際の配列に関係なくランダムに配置・増幅させる方法が開示されている。このように、同一のPCR増幅産物を高密度にて固相支持体の別々の領域に固定化させたものを、プレート上で観察される細菌コロニーに似ていることから「DNAコロニー」と呼ぶ。各DNAコロニーは、例えば、標識参照配列とハイブリダイズさせることにより、または、プライマー伸長を利用したアプローチを用いることにより、個別に可視化および分析が可能である。WO00/18957（Appl. Res. Syst.）には、増幅を実際に開始する前にプライマーおよび鋳型分子の双方を同時に固相支持体上へ固定化させることで、Bridge Amplification技術の効率を向上させる方法が開示されている。
【００２７】
Bridge Amplificationを利用した技術の実質的な制限は、プライマー配列または固定化手順にどんなに特殊なものを選んでも、工程を等温条件にて（即ち、熱サイクル工程を必要とせずに）行う方法について教示がないため、依然としてPCRに伴う同様の制限を受けてしまうことである。分析系および可視化系が高感度であることからサイクル数を減らせたとしても、ハイブリダイゼーションを解く温度によって固相支持体の均一性が左右され、表面と結合する核酸の安定性にも影響が及ぶという別の問題が生じる。しかしながら、先行技術に開示された等温増幅系はいずれも、同時に増幅および分析可能な様々な鋳型分子の密度とBridge Amplification技術の特徴である自給自足性とを同時に達成するものではない。
【００２８】
従って、Bridge Amplificationの原理を応用した、プライマーハイブリダイゼーション、鎖伸長および鎖分離が一定温度で連続的に生じる方法を発明するのが有利であると考えられる。実際のところ、課題を解決するものとしては温度や複雑な特定の技術を用いることしか先行技術には開示されていないため、鎖分離を達成することがより重要である。WO97/47767（Sarnoff Corp）には、化学的または静電的な変性手法を増幅工程に適用したことが示唆されている。しかしながら、このような手法には、電場発生装置のような専用の機器やNaOHのような化学物質が必要であり、通常の増幅手法とは互換性に乏しく、特定の追加工程（即ち、プライマーの改変、伸長再開前の化学物質の洗浄除去）もさらに必要である。
【００２９】
Bridge Amplification技術は、伸長が完了した後にのみ、または、完了していない場合には伸長を実行中の核酸ポリメラーゼを妨害することなく鎖分離が可能となる前提で、等温条件にて鎖分離を簡単に誘導できれば、さらなる利点をもたらすと考えられる。
発明の要旨
今回、核酸の長さに応じて屈曲が制限されれば、両鎖の5’末端によって同一の固相支持体上に固定化された二本鎖核酸の鎖分離が等温条件で容易になされることを見出した。この生物物理的特徴が、Bridge Amplificationを利用したDNAコロニーの等温生成にうまく利用されている。
発明の詳細な説明
高分子の可撓性は従来より持続長、即ち、局所構造を顕著に改変することなく屈曲し得る、高分子が持つべき最小サイズとして測定されている。核酸ポリメラーゼ活性に適合した塩濃度では、このような長さは、一本鎖DNAの場合にはおよそ５nm（即ち15塩基）に相当し、二本鎖DNAの場合にはおよそ50nm（即ち150塩基対）に相当する（Tinland B et al., Macromolecules 1997, 30(19):5763-5765; Williams LD and Maher LJ, Annu Rev Biophys Biomol Struct 2000, 29, 497-521）。換言すれば、二本鎖DNAは、数多くの非共有結合性相互作用によってその構造が安定化されているため、一本鎖DNAよりも剛性が高い。RNAについても、二本鎖RNAの持続長の推定が文献中で35〜72nmとばらついているものの、同様のことが観察された（Zacharias M, Biopolymers 2000, 54(7):547-60; Kebbekus P et al., Biochemistry 1995, 4;34(13):4354-7）。従って、外部条件によって屈曲した場合には、二本鎖分子は一本鎖分子よりも大きな機械的応力を受けることになる。
【００３０】
多くの生物物理学的研究において、二本鎖DNAに見られる非共有結合性相互作用を不安定化する機械的応力より生じたエネルギー（転写、スーパーコイル化、またはコンティグ5’/3’末端の機械的分離の結果発生）を定量および予知する試みがなされた（Strick TR et al., Annu Rev Biophys Biomol Struct. 2000, 29, 523-43に概説）。このような一本鎖／二本鎖核酸間の移行は、二本鎖分子が変性温度付近の温度にさらされた場合には、制御できない自然の現象としても判明している（Dubiley S et al., Nucleic Acids Res. 1999, 27(18):e19）。しかしながら、（部分的または完全な）二本鎖DNA分子の5’末端がいずれも固相支持体上に同時に固定化されていれば、このような現象が誘導可能であり、かつ、有効に利用できることは実証されていない。さらに、これらの文献、並びに、Bridge Amplification関連技術を記載した文献はいずれも、このようなエネルギーが自発的に誘導されてBridge Amplificationを行う際に熱サイクルを回避し得ることを示唆していない。
【００３１】
図１には、本発明の基礎をなす分子機構の概要を示す。
一本鎖プライマーに属する相補配列（a’およびa”）並びに5’末端が固相支持体（c）に固定化されている鋳型（b）はハイブリダイズできる程度に接近しており（１）、各プライマー／鋳型ハイブリダイゼーション産物は、固定化されている5’末端間の距離に応じてある程度強く屈曲している（図1A）。
【００３２】
増幅溶液（d）の存在下では、核酸ポリメラーゼ分子（e）によって、固定化された鋳型のコピーである新規鎖の伸長がハイブリダイズしたプライマーの3’末端側から開始可能である（２）。従って、二本鎖領域が最初のハイブリダイゼーション領域から伸長し、複合体中では、人為的に屈曲させられた二本鎖核酸の量が徐々に増えていく（図1B）。
【００３３】
伸長時には、二本鎖構造の剛性と両鎖の5’末端が固定されたことに起因する屈曲とのコントラストによって誘導される機械的応力の作用の結果、ポリメラーゼから遠位にある二本鎖セグメントが自発的に変性し得る（３）。二本鎖核酸を安定化させている非共有結合性相互作用は、鋳型がこのような剛性構造から屈曲形態へ順応し得るほど長くなければ、一定した機械的応力を生じ得る。分子の二本鎖部分は、分子に存在する非共有結合性相互作用の数が増えるほど屈曲を受け入れられなくなり、二本鎖構造をとろうとする鋳型の部分を減らす以外に機械的応力を取り除くことはできない。この際、会合がさらに弱まった結果このような応力をより容易に吸収するようになる部分は、進行中の核酸ポリメラーゼから遠位にある鋳型分子の3’末端であり、一本鎖となることができる。その結果、屈曲による応力は減少し、応力が吸収しきれないほど再び強まるまでポリメラーゼはさらに前進可能となる。従って、この過程が進行するにつれ、二本鎖核酸分子は徐々に「二本鎖が解けて(unzipped)」3’末端は新たなプライマーとハイブリダイズ可能となり（４）、別のDNAポリメラーゼ分子によって鋳型の２回目のコピーが開始可能となる（５）。この過程は一塩基ずつでも起こり得る。機械的応力によって鋳型の3’末端側で鎖が１〜２塩基分開くのと同時に、新規合成鎖の3’末端側にポリメラーゼによって塩基が１〜２個取込まれる（図1C）。
【００３４】
鋳型の１つ目のコピーが完了または完了間近になると、２つ目のコピーを合成しているDNAポリメラーゼは共有鎖に機械的応力をも誘導できるようになり、共有鎖が１つ目の合成鎖から徐々に分離・置換される（６；図1D）。
【００３５】
次いで反応は完了まで進む。即ち、既述したように、鋳型の２本の鎖がいずれも固定化されて増幅を開始し得るようになる。鋳型の２つ目のコピーが完了または完了間近になると、鋳型の5’一本鎖末端が遊離して（７）近くにある別の固定化プライマーにハイブリダイズすると同時に（８）、別の核酸ポリメラーゼ分子によって合成が再開可能となる（９）。同時に、１つ目の一本鎖コピーは別のプライマーとハイブリダイズして（10）新たなコピー事象が開始可能となる（11）。図1Eに示すこの過程は、機械的応力による鎖の分離と置換によって新規合成コピーを連続的に一本鎖核酸へ変化させ、固定化プライマーとハイブリダイズする任意の固定化鋳型分子によって、サイクル活性を外部で発生させることなく鎖の分離と置換を再現することができる。
【００３６】
本発明では、核酸が一本鎖形態であるか二本鎖形態であるかに応じて可撓性がかなり異なるという核酸の特徴によって鋳型が一本鎖分子として部分的に遊離される一方で、重合が依然として進行することを示す。驚くべきことに、本発明では、本事象がポリメラーゼの活性に影響を与えず、これを利用して鋳型分子の等温増幅を行って固相表面の別々の領域に固定化された新規合成分子が得られることも示す。
【００３７】
本特許出願に開示するBridge Amplification法に加えた改良によって、WO98/44151およびWO00/18957に開示のDNAコロニーと同様に、一本鎖／二本鎖の混合構造を有する相補配列を固相支持体の別々の領域に指数関数的に産生することが可能となるが、等温かつ連続的に産生を行うことができる。同一増幅分子の量が十分であると考えられる場合には、配列決定およびこれら特許出願に開示の他の分析法を、支持体上に等温生成されたDNAコロニーまたは先行技術に開示された方法によってDNAコロニーから溶液中へ遊離させた分子に等しく適用できる。
【００３８】
本発明に開示された増幅工程の連続性は、等温条件と組み合わせることで、ハイスループットスクリーニング法を適用し得る形態および量にて核酸分子を取得するための時間と労力が削減される点で、先行技術に対して明らかに有利である。また、本発明では、固相支持体の使用を、増幅分子の後験的分析（先行技術で周知）を並行して行うツールとしてだけでなく、核酸増幅を連続工程として等温条件で行うための必須の構成要素として開示している点も指摘しなければならない。
【００３９】
二本鎖DNAの持続長が150塩基対に相当するものであっても、本発明の方法は、広範囲のDNAまたはRNA鋳型長（数百ヌクレオチドのオーダー）に対して実行可能であることが判明した。このような範囲は、本特許出願の実施例に68〜605個のヌクレオチドを含むDNA分子について記載したのと同様の経験的な方法によって同定される条件を使用することで、最大1000個のヌクレオチドを含む鋳型までさらに拡大できると推測される。
【００４０】
本発明の主な目的は、最大1000個のヌクレオチドを含む核酸セグメントを少なくとも１つ等温増幅する方法を提供することであり、該方法は下記の工程：
a）増幅すべき核酸を含む核酸鋳型を少なくとも１つ形成し、ここで該核酸は、5’末端にオリゴヌクレオチド配列Ｙを、3’末端にオリゴヌクレオチド配列Ｚを含み、さらに該核酸は、5’末端に該核酸を固相支持体上へ固定化するための手段を有し、
b）１以上のコロニープライマーＸを形成し、ここで該コロニープライマーは、オリゴヌクレオチド配列Ｚまたはオリゴヌクレオチド配列Ｙのいずれかにハイブリダイズ可能であり、かつ、該コロニープライマーを固相支持体へ固定化するための手段を5’末端に有し、
c）該核酸鋳型とコロニープライマーを、固相支持体の存在下で5’末端による固相支持体上への固定化を可能にする溶液と共に混合し、核酸鋳型とコロニープライマー双方の5’末端を該固相支持体へ結合させ、
d）少なくとも核酸ポリメラーゼとヌクレオチド前駆体を含有する増幅溶液を該固相支持体へ適用して、固定化された核酸鋳型の配列と同一または相補的な配列を有する核酸を等温にて生成・固定化する
を含む。
【００４１】
本発明の方法は、68〜605個の塩基を含む一本鎖DNA分子の固相支持体上での等温増幅に成功している。
工程c）における固定化核酸の量は、本発明によって生成可能な表面単位当たりのDNAコロニーの平均数を決定する。固定化すべきDNA分子の好適な濃度範囲は、実施例において、鋳型分子の場合には１nM〜0.01nM、コロニープライマーの場合には50〜1000nMと決定されている。このようなの核酸の濃度では、1000〜100000個/mm2の密度にてDNAコロニーの生成が可能である。
【００４２】
本発明に記載の増幅法に適用される一定温度は、選択した核酸ポリメラーゼが最適な活性を示す温度である。実施例からは、先行技術で公知の核酸増幅系に通常使用される核酸ポリメラーゼも、70℃〜85℃の温度、より好ましくは77℃〜81℃の温度にて本発明の方法に使用できることが明らかである。この範囲は、プライマーと鋳型間の非特異的ハイブリダイゼーション事象が通常これらの温度で減少することから、ハイブリダイゼーションにとっても機能的である。
【００４３】
本明細書中「等温」とは「実質的に同一の温度」に相当し、特定の核酸ポリメラーゼを用いて方法を行うために最初に選択した温度から外れても、そのずれが市販のサーモスタットの振れ幅の範囲内におさまることを意味する。
【００４４】
本明細書中「固相支持体」とは、核酸が結合可能な任意の固相表面を指し、例えば、ラテックスビーズ、デキストランビーズ、ポリスチレン表面、ポリプロピレン表面、ポリアクリルアミドゲル、金表面、ガラス表面およびシリコンウェーハ等である。好ましくは、固相支持体はガラスまたはポリスチレン表面である。
【００４５】
本明細書中「核酸鋳型」とは、増幅すべき核酸（DNAまたはRNA）を含む要素を指し、一本鎖核酸、二本鎖核酸、または一本鎖／二本鎖の混合核酸として反応中に存在する。核酸鋳型を構成するヌクレオチドは、天然または非天然ヌクレオチドのいずれであってもよい。
【００４６】
本明細書中「コロニープライマー」とは、固相表面上へ5’末端を介して固定化可能なオリゴヌクレオチドプライマーを含む要素を指し、3’末端側で相補配列にハイブリダイズし、特異的なポリメラーゼ反応を開始することができる。
【００４７】
本明細書中「縮重プライマー配列」とは、任意の核酸断片とその配列に関係なくハイブリダイズ可能な短鎖オリゴヌクレオチド配列を指す。
本明細書中「核酸を固相支持体へ固定化するための手段」とは、化学的に修飾可能な官能基といった任意の化学的または非化学的結合方法を指す。「結合」は、共有結合または非共有結合のいずれかによる核酸の固相支持体上への固定化と関連する。
【００４８】
本明細書中「化学的に修飾可能な官能基」とは、例えば、リン酸基、カルボン酸もしくはアルデヒド部分、チオール基またはアミノ基等の基を指す。
本明細書中「核酸コロニー」とは、２本の相補的な核酸鎖を複数コピー含む個々の領域をいう。
【００４９】
本明細書中「誘導化（derivatised）表面」とは、アミノ基、チオール基またはアクリレート基等の化学反応性基によって改変された表面を指す。
本明細書中「官能化表面」とは、マレイン酸またはコハク酸官能性部分等の特定の官能基によって改変された誘導化表面を指す。
【００５０】
本発明の方法に従って増幅し得る核酸としては、DNA、例えば、ゲノムDNA、相補的DNA、組換えDNA、または、任意の形態の合成もしくは修飾DNAが挙げられる。その長さは、同一の固相支持体上に同時に固定化される鋳型分子に応じて異なり、既知もしくは未知の配列を有する大型核酸分子の断片、または、それよりも小さな部分であってよい。増幅すべき核酸は任意の供給源から誘導することができる（例えば、一定の制限酵素消化によって得られるゲノムDNA断片）。しかしながら、本発明の方法に用いる前に、WO00/18957に要約されているような通常の遺伝子操作技術を用いてさらに処理を行うことが必要な場合もあり、特に、コロニープライマーとハイブリダイズするのに必要なＹおよびＺ配列を付加する必要がある場合もある。mRNAの場合には、逆転写酵素を用いて単離mRNAをcDNAにすることができ、最終的に二本鎖DNAとしてから本発明の方法に適用する。
【００５１】
また、鋳型が天然、合成または修飾RNA分子のいずれかである場合には、一本鎖RNAから二本鎖RNAを生成し得る当該技術分野で公知の特定の酵素を用いることにより、本発明の方法によって直接増幅できる。
【００５２】
本発明の核酸鋳型は、増幅すべき核酸だけでなく、既知の配列を有する様々な長さのオリゴヌクレオチド配列ＹおよびＺも含む。本発明の方法に用いるオリゴヌクレオチド配列ＹおよびＺは、好ましくは少なくとも５ヌクレオチド長であり、好ましくは５〜100ヌクレオチド長、より好ましくは約20ヌクレオチド長である。
【００５３】
本発明のオリゴヌクレオチド配列ＹおよびＺは、当該技術分野で通常もしくは慣用の技術を用いて調製するか、または、販売元から購入すればよい。増幅すべき核酸配列が複数ある場合には、オリゴヌクレオチドＹおよびＺの付加を同一または異なる反応において行うことができる。
【００５４】
核酸鋳型の5’および3’末端にそれぞれ含まれるオリゴヌクレオチド配列ＹおよびＺは、鋳型の最末端に位置する必要はない。例えば、オリゴヌクレオチド配列ＹおよびＺは、核酸鋳型の5’および3’末端またはその付近にぞれぞれ位置するのが好ましいものの（例えば、5’および3’末端から０〜100ヌクレオチド以内）、1000塩基長以上には増幅されない核酸配列の両側に配列ＹおよびＺが位置する場合には、核酸鋳型の5’および3’末端からさらに離れた位置（例えば、100ヌクレオチドを超える位置）にあってもよい。
【００５５】
核酸鋳型を調製したら、増幅させてから本発明の方法に使用してもよい。このような増幅は、当該技術分野で周知の文献記載の方法を用いて行えばよく、例えば、鋳型核酸を発現ベクターへ挿入し、適切な生物学的宿主中で増幅させるか、または、PCRによって増幅させる。しかしながら、本発明の方法では、核酸鋳型の単一コピーから生成される核酸コロニー内で核酸鋳型を複数コピー製造できるためこの増幅工程は必須ではなく、実施例に示すように、化学的に修飾された5’側固定化基を導入する目的のみに行えばよい。
【００５６】
最終的には、核酸鋳型を二本鎖分子として固相支持体上へ固定化できるが、当該技術分野で周知の文献記載の方法を用いて一本鎖の形態にすることもでき、例えば、約94℃に加熱し、氷上で素早く０℃まで冷却するか、または、0.1〜0.5ＭのNaOH中で洗浄する。
【００５７】
鋳型に含まれるオリゴヌクレオチド配列に相補的なコロニープライマー側の配列は、相補配列とのハイブリダイズ活性が最大となり、かつ、他の任意の配列に対する非特異的なハイブリダイズ活性が非常に低くなるように選択する。コロニープライマーは５〜100塩基長であってよいが、好ましくは15〜25塩基長である。プライマーには天然または非天然ヌクレオチドのいずれが含まれていてもよい。
【００５８】
本発明の方法では、１つまたは２つの異なるコロニープライマーを使用して核酸コロニーを生成してもよい。基本的な実施形態では、２つの異なるコロニープライマーＸ’およびＸ”を工程c）において核酸鋳型と混合し、コロニープライマーＸ’およびＸ”の配列は、オリゴヌクレオチド配列ＺがコロニープライマーＸ’の一方とハイブリダイズ可能であり、かつ、オリゴヌクレオチド配列ＹがコロニープライマーＸ”の一方と同一となるような配列である。あるいは、オリゴヌクレオチド配列Ｚはオリゴヌクレオチド配列Ｙに相補的であり、コロニープライマーＸはオリゴヌクレオチド配列Ｙと同一の配列である。
【００５９】
本発明の核酸鋳型およびプライマーを作製する際には、当該技術分野で周知の文献記載の方法によって所望の追加配列をさらに導入することができる。このような追加配列としては、例えば、制限酵素部位、修飾ヌクレオチド、または、所定の核酸鋳型配列を含有する増幅産物の同定・単離を可能にする他の核酸タグが挙げられる。他の望ましい配列としては、フォールドバックDNA配列（一本鎖になるとヘアピンループまたは他の二次構造を形成）、タンパク質／DNA相互作用を指令する「調節」DNA配列（プロモーター、エンハンサー、複製起点、特定のDNA結合タンパク質によって認識されるオペレーターDNA配列等）が挙げられる。
【００６０】
本発明のコロニープライマーには縮重プライマー配列も含まれる。このような縮重プライマーは従って、鋳型とのハイブリダイゼーションを生じるために核酸鋳型中にオリゴヌクレオチド配列ＹまたはＺを存在させる必要はないが、オリゴヌクレオチド配列ＸまたはＹを含む鋳型とハイブリダイズさせるために縮重プライマーを使用することは除外されない。しかしながら、本発明の増幅法に使用するには、縮重プライマーは、増幅すべき核酸配列の両側に位置する（即ち、フランキング）部位にて鋳型中の核酸配列にハイブリダイズしなければならない。
【００６１】
上記のようにして調製した核酸鋳型およびプライマーの5’末端を改変し、核酸鋳型とコロニープライマー双方の5’末端を固定化する手段を備える。5’末端を用いて核酸を固定化することにより、鋳型およびプライマーの3’領域がハイブリダイズして新たな鎖の合成を行えるように3’末端を支持体から遠く離した状態にする。
【００６２】
固定化のプロトコールは、等温増幅時に鋳型およびプライマーが固相表面から遊離するのを防ぐものでなければならない。従って固定化の手段は、該分子と誘導化表面を有する固相支持体（後に二官能性架橋基によって修飾され、官能化表面となる）との間に共有結合を形成する化学的に修飾可能な官能基であるのが好ましい。あるいは、不可逆的な受動吸着によって、または、特定の分子間の親和性を利用して固定化を行うこともできる（例えば、ビオチン化分子によるアビジン被覆表面上での固定化）。
【００６３】
固定化すべき核酸の5’末端に付加する化学的に修飾可能な官能基の例は、チオール基、ヒドロキシル基、ジメトキシルトリチル（dimethoxyltrityl；DMT）基、アミノ基またはリン酸基、並びに、カルボン酸またはアルデヒド部分である。固相支持体を誘導化するのに有用な架橋剤の例は、1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)-カルボジイミド塩酸塩（EDC）、無水コハク酸、フェニルジイソチオシアネートもしくは無水マレイン酸、または、m-マレイミドベンゾイル-N-ヒドロキシスクシンイミドエステル（MBS）、N-スクシンイミジル[4-ヨードアセチル]アミノベンゾエート（SIAB）、スクシンイミジル4-[N-マレイミドメチル]シクロヘキサン-l-カルボキシレート（SMCC）、N-y-マレイミドブチリルオキシ-スクシンイミドエステル（GMBS）、スクシンイミジル-4-[p-マレイミドフェニル]ブチレート（SMPB）および対応のスルホ化合物（水溶性）等のヘテロ二官能性架橋剤である。最も好ましくは、核酸鋳型およびプライマーを5’末端修飾にてチオール基、リン酸基またはアミノ基で修飾し、1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)-カルボジイミド塩酸塩（EDC）を架橋剤として含有する固定化溶液を用いて固定化する。
【００６４】
固相支持体は、核酸が固定化できればどのような固相表面であってもよいが、例えば、ラテックスもしくはデキストランビーズ、ポリスチレン表面、ポリプロピレン表面、ポリアクリルアミドゲル、金表面、ガラス表面およびシリコンウェーハ等であり、好ましくは固相支持体は、伸長時に加わる力の影響を受けない程度に硬質であって、WO00/18967およびそれ以前にも記載されているように、一官能性または二官能性架橋試薬を用いた官能化による核酸の共有結合を可能にするものである。本発明の核酸鋳型およびコロニープライマーの双方を合成またはサンプルから精製し、前述のように修飾したら、本特許出願に示すデータ並びに所望のDNAコロニー密度を考慮して算出した濃度にて混合し得る。好ましくは、鋳型の濃度はnM以下であり、コロニープライマーは50〜100000倍高濃度である。
【００６５】
コロニープライマーと核酸鋳型を固相支持体上に固定化したら、次いで、図１に示すように等温増幅反応を行って本発明のDNAコロニーを生成させることができ、各コロニーには元の固定化核酸鋳型とその相補配列が複数コピー含まれる。形成された核酸コロニーの境界は、元の鋳型核酸が固定化された領域に対して比較的局所に限られる。明らかなように、本発明の増幅法を行うことで鋳型分子とその相補分子のコピーがより多く合成されれば、生成する核酸コロニーの境界はさらに拡張し得るものの、形成されたコロニーの境界は依然として核酸が固定化された固相支持体上のわずかな部分に限られる。
【００６６】
DNAコロニーのサイズおよび数は、固相支持体を等温増幅にかける時間を調節することで制御が可能である。従って、固相支持体の表面上に形成される核酸コロニーの数は、鋳型分子とハイブリダイゼーション可能な距離に十分な数の固定化コロニープライマーが存在するのであれば、最初に支持体に固定化させる核酸鋳型の数に依存する。核酸鋳型とプライマーの初期密度を制御することにより、分析や十分な数の増幅配列を含有するのに十分なサイズの固相支持体上に高密度の個々の核酸コロニーを等温産生し得る最適な状態を達成できる。
【００６７】
本特許出願に開示の等温増幅は、DNA依存性またはRNA依存性DNAポリメラーゼを用い、さらに、ヌクレオシド三リン酸分子または他の任意のヌクレオチド前駆体（例えば、修飾ヌクレオシド三リン酸分子）を供給することで実施できる。
【００６８】
本発明に使用可能な核酸ポリメラーゼの例は、DNAポリメラーゼ（クレノウ断片、T4DNAポリメラーゼ）、様々な耐熱菌で同定およびクローニングされた耐熱性DNAポリメラーゼ（Perler F.B. et al., Adv. Protein Chem. 1996, 48:377-435）（例えば、Taq、VENT、Pfu、Tfl DNAポリメラーゼ）並びにその遺伝子操作誘導体（TaqGold、VENTexo、Pfu exo）である。コロニープライマーの伸長に使用する核酸ポリメラーゼは、プライマーと鋳型とのハイブリダイゼーションが鋳型の不完全増幅または偽増幅を回避できる程度に十分特異的となる温度下で安定であるのが好ましい。
【００６９】
増幅溶液には、好ましくは、ヌクレオチド前駆体として、天然もしくは非天然（例えば、蛍光基もしくは放射性基で修飾）のデオキシリボヌクレオチド三リン酸（例えば、dATP、dTTP、dCTP、dGTP）が含有される。核酸の検出能および／または官能基の多様性を増加させる目的で、化学的および生物学的方法用に様々な合成修飾核酸が開発されている。近年概説されているように（Thum O et al., Angew. Chem. Int. Ed. 2001, 40(21):3990-3993）、これらの官能化／修飾分子は天然の重合酵素に十分に適合可能であり、対応の天然分子の塩基対合特性と複製特性とが維持される。
【００７０】
鋳型がRNAまたはDNA分子のいずれかであり、増幅産物を二本鎖RNAの形態で得るのが望ましい場合には、核酸ポリメラーゼはRNA依存性またはDNA依存性RNAポリメラーゼであってよく、例えば、ウイルスRNAレプリカーゼまたはリボザイム（Johnston WK et al., Science 2001, 292(5520):1319-25; Tayon R Jr et al., Nucleic Acids Res 2001, 29(17):3576-82）である。増幅溶液には従って、ヌクレオチド前駆体としてリボヌクレオチド三リン酸が含有されることになる。
【００７１】
増幅溶液の他の成分は核酸ポリメラーゼの選択に応じて添加され、本質的には、各ポリメラーゼの活性を支えるのに有効であることが当該技術分野で知られている化合物に該当する。ジメチルスルホキシド（DMSO）、ウシ血清アルブミン（BSA）、Triton X-100またはMgCl2のような化合物の濃度は、最適な増幅を行う上で重要であることが先行技術において周知であり、従って、以下に示す実施例に基づいて本発明の方法に対してこのような濃度を容易に調節することができる。
【００７２】
コロニーを構成する核酸鎖は、通常、複数のコピーが固相支持体上に固定化され、該コピーは一本鎖、二本鎖、または一本鎖／二本鎖の混合構造であってよく、これら全てが単一のDNAコロニーに属する増幅分子集団中に同時に現れてもよい。従って、分析および／または配列決定すべき全ての核酸分子が（完全に、または、目的のセグメントにおいて）特定の構造であることが方法にとって必要であれば、等温増幅産物にさらに処理を行って、これらの全て（または、少なくとも大部分）がこのような状態になるようにすることもできる。例えば、温度、化学物質または電荷による変性を利用して、全増幅産物を一本鎖DNAへ変えることができる。このような分子は今や、一方の増幅鎖の内部配列に相補的な配列を有し、液相に添加または支持体上に結合されたプライマーと、より効率的にハイブリダイズすることができる。配列決定法にもよるが、この「ヘルパー」オリゴヌクレオチドによって様々な方法で配列検出が可能となる。該オリゴヌクレオチドは標識可能であり、また、標識／修飾ヌクレオチドを使用した伸長を開始させることもできる。あるいは、ハイブリダイゼーション工程または伸長工程の後に形成される特定の配列または構造を認識するエンドヌクレアーゼ切断性酵素（endonucleolytic enzyme）の使用を可能にする。
【００７３】
本発明の核酸コロニーは、使用する条件に応じて様々なサイズおよび密度で生成可能である。コロニーのサイズは、好ましくは0.2μm〜６μmである。本発明の方法に使用する核酸コロニーの密度は、典型的には1000個/mm2〜100000個/mm2である。より高い密度（例えば、100000個/mm2〜10000000個/mm2）でも本発明の方法で同様に達成し得る。現在利用可能な画像解析技術（顕微鏡、CCDカメラ、ソフトウェア）だけでは、このような密度で単一DNAコロニーの鮮明な解像度を達成するには限界があるが、将来的にはおそらく解消されるであろう。
【００７４】
核酸コロニーを等温生成させたら、各種技術を利用してDNAコロニーの１つ以上を同時に可視化および／または特性決定し、例えば、等温生成DNAコロニーの密度および寸法が予測通りであるか確認することができる。特定の技術にもよるが、等温増幅を行った固相支持体またはこのような支持体から液相中に遊離した物質を監視することにより、分析法の結果を得ることができる。場合によっては、等温増幅に使用した核酸分子とは別個の核酸分子を特定の分析法に使用し、先行技術で周知の方法を用いて各核酸配列について経験的に容易に決定可能な最適なハイブリダイゼーション条件に従って、増幅産物とハイブリダイズさせて液相中に遊離させることもできる。
【００７５】
DNAコロニーに使用可能なコロニーの可視化法または配列決定法はWO00/18957に記載されている。全てを網羅するものではないが、このような方法の一覧には、標識オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーション、標識ヌクレオチドの組込み、特定のプローブを用いた再増幅、DNA結合性色素の使用、配列または構造特異的エンドヌクレアーゼによる消化、並びに、他のDNA修飾酵素（例えば、リガーゼ、メチラーゼ、エキソヌクレアーゼ）および他のDNA結合タンパク質の使用が含まれる。
【００７６】
等温生成核酸コロニーの密度および寸法は、当業者に周知の蛍光検出法を用いることで配列分析に先だって計算できる。例えば、臭化エチジウムもしくはPicoGreenTM（Molecular Probes, Eugene, OR）等のインターカレート色素、または、UlisysTM（Molecular Probes）のような他の化学的DNA染色法を使用して、表面上に固定化された等温増幅二本鎖分子を染色し、図３に示すように落射蛍光顕微鏡（epifluorescence microscope）で染色の結果を観察すればよい。WO00/18957に要約されているように、適切な標識（例えば、蛍光または放射活性）を検出・定量可能な装置はいずれも配列決定に使用することができる。顕微鏡の代わりは当業者には周知であり、例えば走査装置等である。
【００７７】
１以上の核酸の完全配列または部分配列は、２以上のDNAコロニーに存在する増幅核酸鋳型の完全配列または部分配列を決定することで決定できる。このような追加工程は、増幅核酸を固相支持体上に置いたままでも、DNAクローンの１つ以上に属する核酸鎖の一方もしくは両方を遊離させてからでも行うことができる。好ましくは、複数の配列を同時に決定する。
【００７８】
特に、増幅産物の直接標識または増幅産物の配列決定が望ましい場合には、標識ヌクレオチドを増幅溶液へ導入し、その後、単離DNAコロニーが検出できる程度まで反応を進める。標識基はTexas Redのように放射性または蛍光性であってよく、最終的には、鋳型分子の増幅に使用するのとは異なるプライマーと共に適切な濃度（典型的には、非標識dATPの濃度の1/10〜1/1000）で増幅溶液に添加できる。しかしながら、高濃度の標識ヌクレオチドは増幅過程を阻害する可能性があり、この現象は液相PCR等の他の増幅技術の場合には当業者に周知である。
【００７９】
従って、本発明の方法は、等温増幅DNAコロニーの１つ以上を配列決定する工程を少なくとも１回行う追加工程を含む。配列決定は標識ヌクレオチドの取込みの結果行うことができ、コロニープライマーまたは他のプライマー（固相支持体上に固定化または液相中に存在）を使用する。あるいは配列決定は、標識オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーション、または、核酸コロニーの１つ以上に属する核酸鎖の一方もしくは両方の遊離の結果行うこともできる。
【００８０】
本発明のさらなる態様では、本発明の方法は、等温生成したDNAコロニーの１つ以上に属する核酸鎖の一方もしくは両方を遊離させる追加工程を含み、これらの鎖を溶液状態で回収してさらに使用できるようにする。このような核酸の遊離は、プライマーと表面との結合または増幅核酸中に含まれる特定の配列、構造もしくはヌクレオチドを切断する化学的、光学的、物理的または酵素的手段によって達成可能である。例えば、WO00/58329（Goldsborough A）では、非慣用のヌクレオチドを選択的に切断することにより、核酸分子を固相支持体から解離させる方法が提供されている。あるいは、固定化DNAコロニーに含まれる配列を、PCRのような既知の増幅法のいずれかを用いて、コロニーを浸漬する液相中で再増幅することもできる。
【００８１】
各コロニーに取込まれたヌクレオチドの数および特性を、例えば、プライマー伸長の各工程の直後に、または、記録データを利用して後から決定するためには、いずれのDNAコロニー検出系も分析系と併用するのが好ましく、これにより所定のコロニーに含まれる核酸鋳型の配列決定が可能となる。
【００８２】
本発明の方法を使用して等温条件にて核酸コロニーを生成できる。本発明の核酸コロニーは、本発明の単一の固定化核酸鋳型より生成し得る。本発明の方法は、各々異なる固定化配列を含む可能性のある複数の核酸コロニーの同時産生を可能にする。
【００８３】
本出願では、固相支持体上における核酸の等温増幅に必要な手順を著しく簡略化する手段を提供することにより、核酸増幅および配列決定の高速化の問題に対して別の解決法も提供する。本発明は、長さの限られた核酸配列（最大1000塩基）に適用しても、処理能力の高い方法に対して益々増加している要求の多くを満たすことができる。
【００８４】
多くの場合、ゲノム学およびその関連研究（薬理ゲノム学、薬剤発見、食品の特性決定、遺伝子型決定、診断学、遺伝子発現の監視、遺伝的多様性のプロファイリング、全ゲノム配列決定および多型発見）の分野では、決定・比較すべき核酸配列は数百の異なるゲノム、組換え、または逆転写（retrotranscribed）DNA断片に関連しており、これらはいずれも1000塩基を超えない長さである。従って本発明の方法は、多くの個体（例えば500）に由来する多くの遺伝子もしくはmRNA（例えば500）を同時に配列決定しなければならない場合におけるDNA配列の同定、多数（例えば数百万）の多型の同時評価、または、多数の遺伝子発現（例えば100,000）の同時監視において特に有用であるが、これらに限定されない。
【００８５】
例えば、総合的な遺伝子発現分析の各種方法では、細胞サブ集団または微細解剖構造に特有の遺伝子発現を特性決定することが可能である。これらの高感度技術は、多くの場合、単一mRNA種を同定するのに十分な塩基数である10〜20塩基対の短いセグメント（「タグ」）に断片化された相補的DNAを利用しており、その結果、タンパク質をコードするmRNAに関連するサンプル中に存在する「タグ」の数を計数することで、タンパク質をコードしているmRNAの量を大まかに計算したり、サンプル間で比較することができる。これらのセグメントは、SAGE（Serial Analysis of Gene Expression; Velculescu VE et al., Trends Genet 2000; 16(10):423-5）またはII型制限エンドヌクレアーゼを使用するタグの生成に常時基づく他の系（WO00/53806）の場合と同様、配列決定を行うために通常直列にライゲートされている。本発明の方法は、番号タグの同定および計数を容易にすることができる。適切なリンカー配列を各タグへライゲートして固相表面上で固定化および等温増幅を行った後、所定のタグに対応する単一DNAコロニーを可視化し、直接もしくは間接的に配列決定し、画像解析ソフトウェアを使用して評価することができる。このように、プラスミドにクローニングすべきコンカテマーにタグを全てライゲートしなくても、cDNA集団中の各タグの頻度を計算できる。
【００８６】
疾患または他の表現型に関連するハプロタイプ（即ち、特定のSNP）を同定する目的で、類似のアプローチをESTまたはゲノムDNAに応用することもできる。その理由は、この場合にも、何千もの単一核酸短鎖セグメントの配列を迅速に同定することが重要であるためである。
【００８７】
従って、本発明のさらなる態様は、ゲノム学、薬理ゲノム学、薬剤発見、食品の特性決定、遺伝子型決定、診断学、遺伝子発現の監視、遺伝的多様性のプロファイリング、全ゲノム配列決定および多型発見の分野において核酸の配列決定および再配列決定に使用する、または、核酸の増幅を伴う他の任意の用途に使用する核酸分子を提供するために、固相支持体上における等温核酸増幅法を使用することである。
【００８８】
本発明のさらに別の態様では、ゲノム学、薬理ゲノム学、薬剤発見、食品の特性決定、遺伝子型決定、診断学、遺伝子発現の監視、遺伝的多様性のプロファイリング、全ゲノム配列決定および多型発見の分野において核酸の配列決定および再配列決定に使用する、または、核酸の増幅を伴う他の任意の用途に使用する核酸分子を提供するために、固相支持体上における等温核酸増幅用のキットを提供する。
【００８９】
本発明の方法によって得られた増幅産物を標識ヌクレオチドを利用して同定および特性決定する手順の一例は下記の通りである：
1a）本特許出願にて前述した方法を用いて増幅核酸を固相表面上で生成および可視化し、その結果を記録し、
1b）増幅核酸を処理して可視化に使用したインターカレート色素を除去するなどし、
1c）増幅核酸を少なくとも部分的に一本鎖分子へ変え、
1d）液相または固相中にオリゴヌクレオチドを供給し、ここで、該相および／または該オリゴヌクレオチドは等温増幅に使用したものと同一でも異なっていてもよく、該オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの増幅産物中に存在する配列とハイブリダイズ可能な3’末端配列を含んでいなければならず、
1e）該オリゴヌクレオチドと増幅分子とのハイブリダイゼーション条件を整え、
1f）核酸ポリメラーゼおよび少なくとも１種の標識ヌクレオチドを適切な緩衝液と共に、プライマー伸長を可能にする条件にて液相中へ供給し、
1g）標識ヌクレオチドを取込んだ増幅核酸を、このような標識によって、または、この標識と増幅産物との相互作用によって検出し、その結果を記録し、
1h）場合によっては、液相を除去し、先の伸長に使用した標識とは異なる標識を有するヌクレオチドを使用して工程1f）および1g）を繰り返し、その結果を記録し、
1i）場合によっては、オリゴヌクレオチドおよび／または先の伸長に使用した標識ヌクレオチドとは異なる標識ヌクレオチドを使用して工程1c）〜1f）を繰り返し、その結果を記録する。
【００９０】
上記の手順は、本発明の増幅産物を一塩基ずつ配列決定するのに特に有用であり、その際には、WO00/18957に記載されているように、結果の相対変化をシグナルへ変換して比較し、標識ヌクレオチドの取込みを明確にする。
【００９１】
本発明の方法によって得られた増幅産物を標識オリゴヌクレオチドを利用して同定および特性決定する手順の一例は下記の通りである：
2a）本特許出願にて前述した方法を用いて増幅核酸を固相表面上で生成および可視化し、その結果を記録し、
2b）増幅核酸を処理して可視化に使用したインターカレート色素を除去するなどし、
2c）増幅核酸を少なくとも部分的に一本鎖分子へ変え、
2d）液相または固相中にオリゴヌクレオチドを供給し、ここで、該相および／または該オリゴヌクレオチドは等温増幅に使用したものと同一でも異なっていてもよく、該オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの増幅産物中に存在する配列とハイブリダイズ可能な3’末端配列を含んでいなければならず、
2e）該オリゴヌクレオチドと増幅分子とのハイブリダイゼーション条件を整え、
2f）標識オリゴヌクレオチドとハイブリダイズした増幅核酸を、このような標識によって、または、この標識と増幅産物との相互作用によって検出し、その結果を記録し、
2g）場合によっては、異なる配列および／または異なる標識を含有するオリゴヌクレオチドを使用して工程2c）〜2f）または2e）〜2f)を繰り返し、その結果を記録する。
【００９２】
本発明の方法によって得られた増幅産物を制限酵素を利用して同定および特性決定する手順の一例は下記の通りである：
3a）本特許出願にて前述した方法を用いて増幅核酸を固相表面上で生成および可視化し、その結果を記録し、
3b）増幅核酸を処理して可視化に使用したインターカレート色素を除去するなどし、
3c）本発明のおよび／または工程b)の後に得られる少なくとも１つの増幅産物に存在する二本鎖核酸分子を切断する可能性のある少なくとも１種の制限エンドヌクレアーゼを含有する溶液で、適切な緩衝液と共に、このような酵素活性を可能にする条件にて増幅核酸を処理し、
3d）遊離した核酸を回収し
3e）工程3a）を繰り返してその結果を記録し、可視化の結果を消化の前後で比較し、
3f）場合によっては、異なる制限エンドヌクレアーゼで工程3b）〜3e）を繰り返し、その結果を記録する。
【００９３】
本出願に開示する増幅方法および増幅産物の特徴を理解すれば、先行技術、並びに、本発明の基本的な詳細や用途を記述した後述の非限定的な図面および実施例を参照することにより、このような分析特異的な追加工程の必要性と種類を容易に推測することができる。
実施例
実施例１：固相表面上に固定化された鋳型DNAの等温増幅
方法
DNA配列
プライマーP1（24量体；配列番号１）、P2（24量体；配列番号２）およびP3（40量体；配列番号３）は、C6アミノ結合基を5’末端に有する合成オリゴヌクレオチドである。この化学基を用いてプライマーと鋳型を固相表面上に固定化しておき、本発明の方法を適用する。
【００９４】
鋳型T3（配列番号９）およびT4（配列番号10）（双方とも、P1に相当する配列を5’末端に有し、P2に相補的な配列を3’末端に有する68量体）、並びに、T90（P1に相当する配列を5’末端に有し、P2に相補的な配列を3’末端に有する90量体；配列番号11）は、C6アミノ結合基（T90）またはリン酸基（T3およびT4）を5’末端に有する合成オリゴヌクレオチドである。
【００９５】
鋳型T155（155量体；配列番号12）、T203（203量体；配列番号13）、T386（386量体；配列番号14）およびT605（605量体；配列番号15）は、P3に相当する配列を5’末端に有し、P2に相補的な配列を3’末端に有する。これらの鋳型は、図２に示すように、T1（配列番号８；pBSk-プラスミド（Stratagene）に含まれる823塩基対配列）のネステッド断片を増幅することにより構築しておく。直接的なプライマーP3（P1に相当する配列を5’末端に有し、16ヌクレオチド長のT1配列に相補的な配列を3’末端に有する40量体；配列番号３）は、5’アミノ結合基を有する。逆方向プライマーP155r（配列番号４）、P203r（配列番号５）、P386r（配列番号６）およびP605r（配列番号７）は、P2に相当する配列を5’末端に有し、16ヌクレオチド長の異なるT1配列に相補的な配列を有する44量体合成オリゴヌクレオチドである。これらの鋳型を、Taqポリメラーゼ（Perkin-Elmer）を５単位、１×Taq緩衝液（Perkin-Elmer）、dNTP（dATP、dGTP、dCTP、dTTP；Pharmacia）を200μM、pBSk-プラスミドを５ng/μl、プライマーP3を１μMおよび対応の逆方向プライマーを１μM含有する溶液100μlを用いて増幅した。PCRサイクル（94℃で30秒、62℃で30秒、72℃60秒）を20サイクル行い、得られた産物を、製造業者の指示に従ってQiaQuickキット（Qiagen）を使用して精製した。精製核酸の回収に使用する溶液には、ホウ酸ナトリウム10mM（pH7.5）を含有させた。
【００９６】
合成オリゴヌクレオチドは全てMicrosynth（スイス）より入手した。
プライマーおよび鋳型核酸を固相表面に固定化するためのプロトコール
本発明の方法の実現可能性を実証するのに使用する固相表面は、NucleolinkTM（Nunc, デンマーク）と呼ばれる官能化合成材料より作製した平底ウェルの内側面とし、96ウェルPCR機に適合する全体形状をしたプレートに仕立てた。実施例で使用する容量（15〜20μl）の固定化および増幅溶液で満たす場合、実際にこれらの溶液と接触する各ウェルの表面はおよそ30mm2に相当する。
【００９７】
プライマーおよび鋳型をNucleolinkTMプレートに結合させた。その際、氷上に維持しながらイミダゾール10nMおよび1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)-カルボジイミド塩酸塩(EDC)10mMを含有する固定化溶液で該核酸を希釈し、ウェルへ添加した。全てのウェルを満たしたら、プレートを10分間50℃でインキュベートした。次いでウェルを室温にてNaOHを0.4ＭおよびTween-20を0.1％含有する溶液で２回洗浄し、最後にTNT（Tris-HClを100mM（pH7.5）、NaClを150mM、Tween-20を0.1％含有する溶液）で３回洗浄してから等温増幅にかけた。
増幅核酸を可視化するためのプロトコール
等温増幅後に、ウェルを20mMのTris-HCl（pH7.5）で３回洗浄し、次いでウェルをPicoGreenTM（Molecular Probes；二本鎖DNAに結合すると蛍光を発する分子、通常20mMのTris-HCl（pH7.5）で2000倍に希釈）と共にインキュベートすることによりDNAコロニーを可視化した。各ウェルを50μlのPicoGreenTM希釈液で10分間室温にてインキュベートした。
【００９８】
ウェルの底部に固定化されたDNAコロニーを、冷却型CCDカメラ（Micomax 512x768, Princeton instruments, Trenton, NJ；Winviewソフトウェア（Princeton instruments, Trenton, NJ）で制御）を搭載した落射蛍光顕微鏡（Axiovert 100TV, Zeiss, ドイツ）で観察した。２秒間露光した後画像を取得し、analySISソフトウェア（Soft Imaging System GmBH, ドイツ）または他の同様のソフトウェアを用いて分析した。
結果
プライマーP1およびP2並びに核酸鋳型T90およびT386を、前述の通りNucleolinkTMウェルへ結合させた。該鋳型には、本発明の方法を適用し得る鋳型長の範囲を確認するために、持続長の約0.6および2.5倍のヌクレオチドが含まれている。
【００９９】
プライマーP1およびP2（各250nM）を含有する固定化溶液20μlでウェルを満たし、表１に示すようにウェルごとに鋳型の種類と濃度を変えた。
【０１００】
【表１】
2004524012.tif 000003
【０１０１】
ウェルを１時間78℃にて、Pfu ポリメラーゼ（Stratagene）を１単位、ジメチルスルホキシド（DMSO）を10％、dNTP（dATP、dGTP、dCTP、dTTP；Pharmacia）を80μM、Tris-HCl（pH8.8）を200mM、KClを10mM、(NH4)2SO4を10mM、MgSO4を２mM、Triton X-100を0.1％およびBSAを0.1mg/ml含有する増幅溶液15μlと共にインキュベートすることにより、等温増幅を行った。等温増幅は、加熱した蓋を用いて78℃一定に設定した標準的な96ウェルPCR機（MJ-Research PTC-200）を使用して行った。
【０１０２】
得られた画像を図３に示す。使用したDNA染色手法のため、シグナルは、NucleolinkTMウェルの底部で増幅・固定化されてコロニーを形成した二本鎖DNA（少なくとも部分的に二本鎖のDNA）の存在による。印刷出力を良くするため画像は反転させてある。130AU（任意単位、CCDカメラを制御するソフトウェアによって計算）以下のシグナルは白色となり、350AU以上のシグナルは黒色となる。
【０１０３】
図３からは、プライマーのみを結合させた場合（H1およびH2）には画像が全体的に白色となり、自発的な増幅が検出されないことが明らかである。一方、鋳型を最高濃度とした場合には（A1/2、B1/2）、増幅産物が全表面を覆い、画像が飽和してしまっているが、両鋳型の濃度がnM以下であるC1/2、D1/2およびE1/2のウェルでは、識別可能なDNAコロニーが得られている。このような「スポット」（各々１〜５μm2の領域を占有）の数は、結合工程時に使用する鋳型の濃度に伴ってほぼ直線的に増加する。増幅は、２種類の異なる長さを有する鋳型を用い、固定化の際に鋳型／プライマー比を様々に変えて行った。
【０１０４】
DNAコロニーの数について等温増幅の有効性をより定量的に分析したものを図４に示す。試験を行った実験条件（イミダゾール／EDC核酸固定化溶液、NucleolinkTMウェル、10分間50℃にてインキュベート、各々250mMの２種類のプライマー）では、90〜386ヌクレオチドの範囲の鋳型を固定化溶液にnM以下の濃度で添加した場合には、DNAコロニーとして固相表面上で等温増幅可能であり、１mm2当たり数万のDNAコロニーが得られる。
【０１０５】
他の鋳型長および異なるプライマー濃度に対しても、同様に等温増幅手順を適用した。１列８個のNucleolinkTMウェルを、１種類の鋳型をnM以下の一定濃度（Ａ列ではT155を0.14nM、Ｂ列ではT203を0.2nM、Ｃ列ではＴ386を0.08nM、Ｄ列ではT606を0.04nM）で含有する固定化溶液20μlで満たした。これらの濃度は、各鋳型について取得した曲線に基づいて決定したものである（そのうちの２つを図４に示す）。
【０１０６】
８個のウェルにP1およびP2を表２に示す濃度で含有させた。
【０１０７】
【表２】
2004524012.tif 000004
【０１０８】
前述の通り等温増幅を行った後、本発明の方法の有効性を、鋳型長に対して正規化した蛍光シグナルから異なるプライマー濃度にて測定した（図５）。長い鋳型ほど多くのDNA染色化合物を取込むことから正規化は必要であり、そのため、バックグラウンドを差し引いた生の蛍光シグナルを鋳型の長さ（キロベースで表示）で除算した。
【０１０９】
この実験からは、先に設定した固定化および増幅条件にて本発明の方法に従って検出可能なレベルの増幅を得るのに必要なプライマーP1およびP2の量が、鋳型長に一部依存することが明らかである。持続長付近の長さを有する短い鋳型（T90およびT155、各々持続長の0.6倍および１倍）の場合には、全プライマー濃度が100nM未満であってもシグナルは十分に強いものの、長い鋳型（T386およびT605、各々持続長の2.5倍および４倍）では依然として増幅されるが、全プライマー濃度が100nMを上回る必要がある。これらの結果からは固定化核酸が長いほど誘導される機械的応力が小さくなることが示唆され、等温における鎖の分離および置換を行うのに必要な機械的応力の何分の１かを吸収すると思われる別の三次元構造を想定することができる。
【０１１０】
プライマーおよび鋳型を固相表面上へ適切に固定化することにより増幅産物が実際に得られることを確認するため、以下の対照実験を行った。
第１の実験では、前述の等温増幅および可視化プロトコールを、固定化プライマー（P1およびP2、各250mM）の存在下または不在下にて、固定化または溶液状態のいずれかの鋳型（T386、0.08nM）を用いて行った。図６に示すように、鋳型を溶液状態で用いるか、または、用いない場合はいずれも、プライマーを多量に固定化させても総蛍光は非常に微弱である。このようなシグナルは、おそらく、わずかな自己増幅に起因するものである。いずれにしても、プライマーと鋳型の双方を固定化しただけで、DNAコロニーの形態で二本鎖DNAの等温増幅が可能となることは明らかである。
【０１１１】
第２の対照実験では、先の実験に使用したのと同一の核酸を液相中にて使用し、PCR条件または固相表面に適用したのと同一の等温条件を使用した。
増幅実験に使用した増幅溶液には、Pfuポリメラーゼ（Stratagene）を0.05単位/μl、dNTP（dATP、dGTP、dCTP、dTTP；Pharmacia）を80μM、Tris-HCl（pH8.8）を200mM、KClを10mM、(NH4)2SO4を10mM、MgSO4を２mM、Triton X-100を0.1％、BSAを0.1mg/ml、プライマーP1を１μM、プライマーP2を１μM含有させ、鋳型（T386を0.13nMまたはT90を0.33nM）は添加または無添加とした。増幅溶液を３つに分け、各々を以下の異なる増幅条件にかけた：熱サイクルPCR（94℃で30秒、60℃で30秒、72℃で１分）を20サイクル、72℃で１時間、または、78℃で１時間。増幅産物をQiaquickカラム（Qiagen）で精製し、２％アガロースゲルにロードした。
【０１１２】
図７に示すように、熱サイクル条件を適用すればプライマーが同じ鋳型を液体状態で増幅できても、等温条件では増幅産物は得られなかった。
本発明の方法に適用するため、放射性ヌクレオチドの取込みを測定することにより、様々な市販のDNAポリメラーゼの効率を試験した。P1およびP2をプライマーとして用い（各250nM）、T3およびT4（非常に短い鋳型（68量体）を大過剰に添加（各５nM））の存在下または不在下にて等温増幅を行った。DNAポリメラーゼを0.5単位、DMSOを５％、dNTP（dATP、dGTP、dCTP、dTTP；Pharmacia）を80μM、Tris-HCl（pH8.8）を200mM、KClを10mM、(NH4)2SO4を10mM、MgSO4を２mM、Triton X-100を0.1％、BSAを0.1mg/mlおよびα32P-dCTPを0.128μM含有する増幅溶液20μlを用いて80℃で90分間等温増幅を行った。使用したDNAポリメラーゼは、DynazymeTM（Finzyme, フィンランド）、Pfuポリメラーゼ（Promega）、Taqポリメラーゼ（Perkin Elmer）およびVentTMポリメラーゼ（New England Biolabs）である。
【０１１３】
等温増幅後、NucleolinkTMウェルを20mMのTris-HCl（pH7.5）で５回洗浄し、シンチレーション液（Ultima gold；Packard）に移し、Beckmanシンチレーションカウンターにて計数して取込まれた標識ヌクレオチドの量を算出した。
【０１１４】
図８に示すように、試験を行った全てのポリメラーゼで、本発明の方法による等温増幅が可能であるが、収量およびバックグラウンド増幅レベルは異なっている。PfuおよびVentTMポリメラーゼでは、特異的／非特異的シグナルの比率が最も良好である。
【０１１５】
本発明の等温増幅を適用するための他の代替条件を、温度およびDMSO濃度について試験し、長さの異なる鋳型を用いて得られた結果を比較した。
各鋳型（T155を0.14nM、T203を0.2nM、T386を0.08nM、T606を0.04nM）をNucleolinkTMウェルの個々の列にプライマーP1およびP2（各250nM）と共に固定化した。次いで、ウェル列に沿って温度勾配を発生させるPCR機中で10％DMSOを使用して、または、78℃にて様々なDMSO量の存在下にて等温増幅を行った。
【０１１６】
等温増幅、洗浄および可視化を行った後、画像上に存在する全スポットの強度を定量する画像解析ソフトウェアを用いてDNAコロニーの総蛍光量を測定した。図9Aおよび9Bに示すように、増幅産物の量は適用した増幅条件に大きく依存する可能性がある。等温増幅は特に、全ての鋳型に対して77℃〜81℃の温度および８％〜14％のDMSO濃度において有効である。
実施例２：増幅核酸の分析
DNAコロニーを等温にて取得したら、さらに実験を行って増幅核酸の特徴をいくつか評価した。
【０１１７】
各スポットに存在する核酸鎖の平均量を、DNA染色および放射性ヌクレオチドの双方を利用して推定した。その際、Pfuポリメラーゼ、並びに、図８に示した実験に使用した条件（固定化、増幅、可視化および計数条件）を使用した。
【０１１８】
鋳型T386をウェル列へ異なる濃度にて添加した（１nM、0.31nM、または無添加）。増幅溶液の容量で覆われるウェルの表面（容量が15μlであり、ウェルの直径が４mmである場合には約27.56mm2）、分析の対象となる各画像のサイズ（約0.08mm2）並びに標識の比活性を考慮に入れて、計数値をDNAコロニー当たりの分子数へ換算した。結果を表３にまとめる。
【０１１９】
【表３】
2004524012.tif 000005
【０１２０】
この実験では、本発明の方法によって１つの鋳型分子を別々の領域に固定化された数千の鎖へ等温増幅し得ることが明らかである。さらに、DNAコロニーの数は鋳型の濃度に明らかに依存する一方、本発明の方法の効率は、DNAコロニー当たりの増幅鎖数として測定した場合、操作条件（即ち、nMのレンジ）では鋳型の濃度とは無関係である。
【０１２１】
また、等温増幅の産物を表面から回収することも可能である。前述の固定化プロトコールを４個のウェルへ適用し、ウェルの全てにP1およびP2を使用し、そのうちの２個にはT386を単独で使用するが、２個のウェル（T386を固定化したものとしないもの）のみ前述の通り等温増幅プロトコールへかけた。次いで全てのウェルを、Pfuポリメラーゼ（Stratagene）を５単位、DMSOを10％、dNTP（dATP、dGTP、dCTP、dTTP；Pharmacia）を100μM、Tris-HCl（pH8.8）を200mM、KClを10mM、(NH4)2SO4を10mM、MgSO4を２mM、Triton X-100を0.1％、BSAを0.1mg/ml、並びにプライマーP3およびP386r（各１μM）を含有するPCR溶液60μlで満たした。PCRをウェル内で１サイクル行った後（94℃で30秒、60℃で30秒、72℃で60秒）、該PCR溶液の30μlをPCRチューブへ移した。対照として、0.1ngのT386を添加した同一のPCR溶液30μlを新たなPCRチューブに満たした。次いで、PCRサイクル（94℃で30秒、60℃で30秒、72℃で60秒）を10サイクル行い、各サンプルを４μlずつ２％アガロースゲルへロードした。結果を図10に示す。等温増幅産物からは、T386を溶液状態で存在させた場合に得られるPCR産物に匹敵するPCR産物が得られ、一方、等温増幅を行わなかったDNAをチューブに添加した場合には該産物はほとんど観察されない。対照からは、プライマー二量体といったアーティファクトが等温増幅時にもPCR増幅時にも生じないことが明らかである。
【図面の簡単な説明】
【０１２２】
【図１】図１は、固相支持体上での等温増幅の基礎をなす機構の概略図である。文字および数字は、発明の説明中で規定する操作および構成要素を示す。
【図２】図２は、鋳型T1プラスミドインサートの配列である。様々なプライマーとのハイブリダイゼーションや実施例で試験される特定の鋳型の増幅に使用される配列を下線で示す。プライマーの名前および伸長の方向を配列の上に示す。
【図３】図３は、蛍光染色した固相支持体等温増幅核酸のデジタル倒立像のスクリーンコピーである（CCDカメラを搭載した落射蛍光顕微鏡（epifluorescence microscope）で観察）。画像のスケールを図の左上に示す。
【図４】図４は、様々な濃度の鋳型を固定化した際に、等温増幅後にPicoGreenTM染色ウェルの底部で観察されたDNAコロニーの密度のlog-logプロットである。各点とも３回の観察の平均である。線の傾きは１である。
【図５】図５は、長さの異なる鋳型を等温増幅した際に得られる総蛍光量の変化ある。曲線全てに対して同一の任意単位を使用。
【図６】図６は、鋳型T386をウェルへ固定化もしくは溶液状態とした場合、または、鋳型T386を増幅工程から除いた場合に得られる総蛍光量を比較したものである。
【図７】図７は、PCRまたは液相等温増幅によって得られた増幅産物をロードした２％アガロースゲルのデジタル化画像である（電場10V/cmにて30分間泳動したもの）。レーン１、５、９、13：分子量マーカー2.5μl（Superladder low、100塩基対ラダー；Gensura）、該当塩基数を左側に示す。レーン２、３および４：熱サイクルPCR（レーン２）、または、72℃（レーン３）および78℃（レーン４）の等温条件で生成した増幅・精製鋳型T90 ６μl。レーン６、７および８：熱サイクルPCR（レーン６）、または、72℃（レーン７）および78℃（レーン８）の等温条件で生成した増幅・精製鋳型T386 2.5μl。レーン10、11および12：熱サイクルPCR（レーン10）、または、72℃（レーン11）および78℃（レーン12）の等温条件で生成した増幅・精製陰性対照（プライマー単独）2.5μl。ゲルはSybrGreenTM（Molecular Probes, Eugene OR）で染色した。
【図８】図８は、Dynazyme（Dyn.）、Pfuポリメラーゼ（Pfu）、Taqポリメラーゼ（Taq）、VentTM（Vent）の異なる酵素を用いた等温増幅により取込まれた32P-dCTPの量を示す計数実験（２回）の平均である。
【図９】図９は、様々な長さの鋳型を用い、温度（A）またはDMSOの割合（B）を変えて等温増幅を行うことにより得られた蛍光量の変化である。各曲線とも各々の最高値に対して正規化。
【図１０】図10は、異なる出発材料を使用して得たPCR産物をロードしたアガロースゲルのデジタル化画像である（電場10V/cmにて30分間泳動したもの）。レーン１および８は、100bp DNAラダー（Superladder low, Gensura）であり、該当塩基数を左側に示す。PCRの出発材料は、T386を0.1ng（レーン２）、出発材料なし（レーン３）、T386を固定化（レーン４および６）または固定化せず（レーン５および７）、かつ、等温増幅を予め行った（レーン４および５）または行わなかった（レーン６および７）ウェルの一定量とした。ゲルはSybrGreenTM（Molecular Probes, Eugene OR）で染色した。ゲル底部の薄いバンドは、PCR増幅に使用したプライマーである。
【図３】
2004524012.tif 000006
【図４】
2004524012.tif 000007
【図５】
2004524012.tif 000008
【図６】
2004524012.tif 000009
【図８】
2004524012.tif 000010
【図９】
2004524012.tif 000011
【国際公開パンフレット】
2004524012.tif 000012
2004524012.tif 000013
2004524012.tif 000014
2004524012.tif 000015
2004524012.tif 000016
2004524012.tif 000017
2004524012.tif 000018
2004524012.tif 000019
2004524012.tif 000020
2004524012.tif 000021
2004524012.tif 000022
2004524012.tif 000023
2004524012.tif 000024
2004524012.tif 000025
2004524012.tif 000026
2004524012.tif 000027
2004524012.tif 000028
2004524012.tif 000029
2004524012.tif 000030
2004524012.tif 000031
2004524012.tif 000032
2004524012.tif 000033
2004524012.tif 000034
2004524012.tif 000035
2004524012.tif 000036
2004524012.tif 000037
2004524012.tif 000038
2004524012.tif 000039
2004524012.tif 000040
2004524012.tif 000041
2004524012.tif 000042
2004524012.tif 000043
2004524012.tif 000044
2004524012.tif 000045
2004524012.tif 000046
2004524012.tif 000047
2004524012.tif 000048
2004524012.tif 000049
2004524012.tif 000050
2004524012.tif 000051
2004524012.tif 000052
2004524012.tif 000053
2004524012.tif 000054
2004524012.tif 000055
2004524012.tif 000056
2004524012.tif 000057
2004524012.tif 000058
2004524012.tif 000059
2004524012.tif 000060
2004524012.tif 000061
2004524012.tif 000062
2004524012.tif 000063
2004524012.tif 000064
2004524012.tif 000065
2004524012.tif 000066
2004524012.tif 000067
2004524012.tif 000068
2004524012.tif 000069
【国際調査報告】
2004524012.tif 000070
2004524012.tif 000071
2004524012.tif 000072