(57)【要約】本発明は、皮膚の炎症及び免疫に関連する遺伝的因子を、ヒトゲノムの特定領域に位置決めすることに関する。特に、皮膚の炎症及び免疫を含む疾患状態（とりわけアトピー性皮膚炎であるが、これに限定されない）に対する個々人の遺伝的感受性を決定する方法、皮膚の炎症及び免疫を含む疾患状態に対して感受性を付与する多型対立遺伝子を同定する方法、及び皮膚の炎症及び免疫を含む疾患状態の発現に寄与するか、又はそのような疾患状態を発現させるヒト遺伝子を同定する方法を開示する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
皮膚の炎症及び免疫を含む疾患状態に対する感受性に関連した多型対立遺伝子を同定するための、多型マーカーＤ１Ｓ４９８を含むヒト染色体１ｑ２１の領域の使用。
【請求項２】
多型マーカーＤ１Ｓ４９８を含むヒト染色体１ｑ２１の領域が、多型マーカーＤ１Ｓ２７２６と多型マーカーＤ１Ｓ２８７８との間に配置された領域であるか、又はその部分領域である、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
皮膚の炎症及び免疫を含む疾患状態に対する感受性に関連した多型対立遺伝子を同定するための、多型マーカーＤ１７Ｓ７８４を含むヒト染色体１７ｑ２５の領域の使用。
【請求項４】
多型マーカーＤ１７Ｓ７８４を含むヒト染色体１７ｑ２５の領域が、多型マーカーＤ１７Ｓ７８５とテロメアとの間に配置された領域であるか、又はその部分領域である、請求項３に記載の使用。
【請求項５】
皮膚の炎症及び免疫を含む疾患状態に対する感受性に関連した多型対立遺伝子を同定するための、多型マーカーＤ２０Ｓ１１５を含むヒト染色体２０ｐの領域の使用。
【請求項６】
多型マーカーＤ２０Ｓ１１５を含むヒト染色体２０ｐの領域が、多型マーカーＤ２０Ｓ１１７と多型マーカーＤ２０Ｓ１１２との間に配置された領域であるか、又はその部分領域である、請求項５に記載の使用。
【請求項７】
アトピー性皮膚炎に対する感受性に関連した多型対立遺伝子を同定するための、請求項１乃至６のいずれか一項に記載の使用。
【請求項８】
皮膚の炎症及び免疫を含む疾患状態に対する感受性に関連した、突然変異体又は多型変異体を含む少なくとも１つのヒト遺伝子を同定するための、多型マーカーＤ１Ｓ４９８を含むヒト染色体１ｑ２１の領域の使用。
【請求項９】
多型マーカーＤ１Ｓ４９８を含むヒト染色体１ｑ２１の領域が、多型マーカーＤ１Ｓ２７２６と多型マーカーＤ１Ｓ２８７８との間に配置された領域であるか、又はその部分領域である、請求項８に記載の使用。
【請求項１０】
皮膚の炎症及び免疫を含む疾患状態に対する感受性に関連した、突然変異体又は多型変異体を含む少なくとも１つのヒト遺伝子を同定するための、多型マーカーＤ１７Ｓ７８４を含むヒト染色体１７ｑ２５の領域の使用。
【請求項１１】
多型マーカーＤ１７Ｓ７８４を含むヒト染色体１７ｑ２５の領域が、多型マーカーＤ１７Ｓ７８５とテロメアとの間に配置された領域であるか、又はその部分領域である、請求項１０に記載の使用。
【請求項１２】
皮膚の炎症及び免疫を含む疾患状態に対する感受性に関連した、突然変異体又は多型変異体を含む少なくとも１つのヒト遺伝子を同定するための、多型マーカーＤ２０Ｓ１１５を含むヒト染色体２０ｐの領域の使用。
【請求項１３】
多型マーカーＤ２０Ｓ１１５を含むヒト染色体２０ｐの領域が、多型マーカーＤ２０Ｓ１１７と多型マーカーＤ２０Ｓ１１２との間に配置された領域であるか、又はその部分領域である、請求項１２に記載の使用。
【請求項１４】
アトピー性皮膚炎に対する感受性に関連した、その突然変異体又は多型変異体を含む少なくとも１つのヒト遺伝子を同定するための、請求項８乃至１３のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１５】
皮膚の炎症及び免疫を含む疾患状態を個体が発症する可能性を予測する方法であって、
個体のＤＮＡサンプルを得ること、
多型マーカーＤ１Ｓ４９８を含む染色体１ｑ２１の領域における個体の遺伝子型を決定すること、
個体の遺伝子型を、羅患した個体の遺伝子型と比較すること、
を含む、前記方法。
【請求項１６】
多型マーカーＤ１Ｓ４９８を含むヒト染色体１ｑ２１の領域が、多型マーカーＤ１Ｓ２７２６と多型マーカーＤ１Ｓ２８７８との間に配置された領域であるか、又はその部分領域である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
皮膚の炎症及び免疫を含む疾患状態を個体が発症する可能性を予測する方法であって、
個体のＤＮＡサンプルを得ること、
多型マーカーＤ１７Ｓ７８４を含む染色体１７ｑ２５の領域における個体の遺伝子型を決定すること、
個体の遺伝子型を、羅患した個体の遺伝子型と比較すること、
を含む、前記方法。
【請求項１８】
多型マーカーＤ１７Ｓ７８４を含むヒト染色体１７ｑ２５の領域が、多型マーカーＤ１７Ｓ７８５とテロメアとの間に配置された領域であるか、又はその部分領域である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
皮膚の炎症及び免疫を含む疾患状態を個体が発症する可能性を予測する方法であって、
個体のＤＮＡサンプルを得ること、
多型マーカーＤ２０Ｓ１１５を含む染色体２０ｐの領域における個体の遺伝子型を決定すること、
個体の遺伝子型を、羅患した個体の遺伝子型と比較すること、
を含む、前記方法。
【請求項２０】
多型マーカーＤ２０Ｓ１１５を含むヒト染色体２０ｐの領域が、多型マーカーＤ２０Ｓ１１７と多型マーカーＤ２０Ｓ１１２との間に配置された領域であるか、又はその部分領域である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
疾患状態がアトピー性皮膚炎である、請求項１５乃至２０のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、皮膚の炎症及び免疫に関連する遺伝的因子の決定に関する。詳細には、しかし限定的ではなく、本発明は、皮膚の炎症及び免疫を含む疾患状態（特にアトピー性皮膚炎、しかしこれに限定されない）に対する個体の遺伝的感受性を決定することに関する。本発明はまた、皮膚の炎症及び免疫を含む疾患状態に対しての感受性をもたらす多型対立遺伝子を同定する方法、そして皮膚の炎症及び免疫を含む疾患状態の発現に寄与するか、又はそのような疾患状態を発現させるヒト遺伝子を同定する方法に関する。
【０００２】
アトピー性皮膚炎（ＡＤ、湿疹）は、西洋社会では１０％〜２０％の小児が罹患しており、喘息との強い共有した家族的集積性を示す。ＡＤは、一般には、乳幼児期及び幼少期に始まり、炎症を起こした痒い皮膚を特徴とする。ＡＤを有する乳幼児は、湿潤性の炎症性斑及びかさぶた状のプラークを顔、首、伸筋表面及び鼠蹊部に生じさせやすい。小児及び若年成人は、特に前肘窩及び膝窩における屈曲部皮膚の皮膚炎になりやすい。アトピーはＡＤの顕著な特徴である。アトピー状態は、ヒョウヒダニのタンパク質などのありふれたアレルゲンに対する免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ）の応答を特徴とする。ＡＤ患者の８％が総血清ＩｇＥ濃度の上昇を有し（Ｊｕｈｌｉｎら、１９６９）、重症ＡＤ小児の６０％に喘息が存在する（Ｃｏｘら、１９９８）。その結果、現在では、アトピー機構がＡＤの病因論であるとの理解が主流である（Ｂｏｓ、２０００）。
【０００３】
ＡＤの双子での研究では、一卵性双生児ペアにおいて０．７２〜０．８６の一致率及び二卵性双生児ペアにおいて０．２１〜０．２３の一致率が示された。このことは、強い遺伝的因子が疾患の発症には存在することを示唆する（Ｓｈｕｌｔｚ　Ｌａｒｓｅｎ、１９９３；Ｗｉｌｌｉａｍｓ、１９９４）。従って、本発明者らは、ＡＤ、喘息及び総血清ＩｇＥ濃度に対する連鎖についてゲノム全体でのスクリーニングを行うことによってＡＤに対する遺伝的素因を調査した。重症ＡＤの一人の小児を介して確認された核家族のゲノム全体でのスクリーニングにより、１ｑ２１、１７ｑ２５及び２０ｐの染色体において、ＡＤに対する連鎖又はＡＤと喘息との併合に対する連鎖（ｐ＜０．００１）に関する証拠が明らかにされた。これらの３つの遺伝子座は、知られている乾癬感受性遺伝子座と非常に密接に対応しており、１ｑ２１遺伝子座は、表皮分化を調節する遺伝子のクラスターを含む。ＡＤ遺伝子座及び乾癬遺伝子座が偶然により同時に起こる控えめな確率は２．８×１０−５未満であるとシミュレーションによって見積もられた。これらの結果は、皮膚の炎症及び免疫に対する全般的な作用を有する多型遺伝子座の存在を示唆しており、そしてＡＤが、全身的なアトピー状態を促進する遺伝子に加えて、皮膚の応答を調節する遺伝子によって影響されることを示している。
【０００４】
本発明者らによって同定された連鎖領域は、皮膚の炎症及び免疫に対して全般的な影響をもたらす感受性遺伝子（１つ又は複数）の場所を突き止めるために使用することができ、そして皮膚の炎症及び免疫を含む疾患状態に対する感受性に関連し得る多型の存在についてさらにスクリーニングすることができる。
【０００５】
用語「皮膚の炎症及び免疫を含む疾患状態」には、アトピー性皮膚炎、乾癬及びアレルギー性接触皮膚炎が包含されるが、これらに限定されない。
【０００６】
従って、第１の態様において、本発明は、皮膚の炎症又は免疫を含む疾患状態に対しての感受性に関連する多型対立遺伝子を同定するための、多型マーカーＤ１Ｓ４９８を含むヒト染色体１ｑ２１の領域の使用を含む。
【０００７】
本発明はまた、皮膚の炎症又は免疫を含む疾患状態に対しての感受性に関連する多型対立遺伝子を同定するための、多型マーカーＤ１７Ｓ７８４を含むヒト染色体１７ｑ２５の領域の使用を含む。
【０００８】
本発明はなおさらに、皮膚の炎症又は免疫を含む疾患状態に対しての感受性に関連する多型対立遺伝子を同定するための、多型マーカーＤ２０Ｓ１１５を含むヒト染色体２０ｐの領域の使用を含む。
【０００９】
本発明者らは、アトピー性皮膚炎及び乾癬の両方に対して連鎖を示す、皮膚の炎症及び免疫に対しての全般的な感受性に関連するヒトゲノムの３つの領域を同定した。この第１の態様において、本発明は、皮膚の炎症及び免疫を含む疾患状態に対する全般的な感受性に関連する多型変異体を同定することにおけるゲノムのこれら３つの領域（これらは連鎖領域と呼ばれる）の使用を提供する。さらなる実施形態において、本発明ではまた、皮膚の炎症及び免疫を伴う特定の疾患状態（好ましい例はアトピー性皮膚炎である）に対する感受性に関連する多型変異体を同定することにおける、本明細書中に示される連鎖領域の使用が考えられる。
【００１０】
本発明者らによって同定された第１の連鎖領域はヒト染色体１ｑ２１上にあり、マーカーＤ１Ｓ４９８を含む。この第１の連鎖領域は、連鎖のピークで当該マーカーの側面に位置するマーカーによって定義され得る。従って、好ましい実施形態において、本発明は、連鎖群の先端から１４４ｃＭと１７８．４ｃＭの位置で、Ｄ１Ｓ４９８の側面にそれぞれ位置するマーカーＤ１Ｓ２７２６とマーカーＤ１Ｓ２８７８との間に配置されたヒト染色体１ｑ２１の連鎖領域又はこの領域の部分領域の使用を提供する。この部分領域は多型マーカーＤ１Ｓ４９８を含んでもよく、又は含まなくてもよい。
【００１１】
第２の連鎖領域はヒト染色体１７ｑ２５上にあり、マーカーＤ１７Ｓ７８４を含む。この第２の連鎖領域は、連鎖のピークで当該マーカーの側面に位置するマーカーによってさらに定義され得る。従って、好ましい実施形態において、本発明は、（１０３．８ｃＭの距離における）マーカーＤ１７Ｓ７８５とテロメアとの間に配置されたヒト染色体１７ｑ２５の連鎖領域又はこの領域の部分領域の使用を提供する。この部分領域は多型マーカーＤ１８Ｓ７８４を含んでもよく、又は含まなくてもよい。
【００１２】
第３の連鎖領域はヒト染色体２０ｐ上にあり、マーカーＤ２０Ｓ１１５を含む。この第３の連鎖領域は、連鎖のピークで当該マーカーの側面に位置するマーカーによってさらに定義され得る。従って、好ましい実施形態において、本発明は、連鎖群の先端から２．８ｃＭと３９．７ｃＭの位置で、Ｄ２０Ｓ１１５の側面にそれぞれ位置するマーカーＤ２０Ｓ１１７とマーカーＤ２０Ｓ１１２との間に配置されたヒト染色体２０ｐの連鎖領域又はこの領域の部分領域の使用を提供する。この部分領域は多型マーカーＤ２０Ｓ１１５を含んでもよく、又は含まなくてもよい。
【００１３】
Ｄ１Ｓ２７２６、Ｄ１Ｓ２８７８、Ｄ１７Ｓ７８５、Ｄ２０Ｓ１１７及びＤ２０Ｓ１１２のマーカーはすべて公開されており、Ｍａｒｓｈｆｉｅｉｄ地図に示される（Ｂｒｏｍａｎ，Ｋ．Ｗ．ら、１９９８）。
【００１４】
本明細書中に示される連鎖領域は、ヒト遺伝学の分野で十分に知られている技術を使用して、皮膚の炎症及び免疫に関連し得る多型対立遺伝子の存在について探査することができる。好ましい方法は、正常者又は健常者、そしてアトピー性皮膚炎などの、皮膚の炎症及び免疫を含む疾患状態の罹患者を含む多数の個体（患者）において連鎖領域を探査し、従って連鎖領域内における何らかの多型変化を同定することである。用語「多型変化」には、単一ヌクレオチド多型、ならびに短い欠失又は挿入及び多ヌクレオチド変化などの他の「単純」な多型、そしてまた制限断片長多型が含まれるが、これらに必ずしも限定されない。
【００１５】
連鎖領域において同定される何らかの多型変異体について、一般に、又は特定の疾患状態（例えば、アトピー性皮膚炎）に関して皮膚の炎症又は免疫との関連性を、家族を基礎にした群集研究などの、ヒト遺伝学の分野で知られている技術を使用して評価することができる。
【００１６】
皮膚の炎症及び免疫に関連する多型対立遺伝子の同定は、診断試験（例えば、皮膚の炎症及び免疫に関連する状態を発症しやすい個体を同定するための遺伝子スクリーニング）を開発することにおいて重要である。
【００１７】
多型変異体の存在について連鎖領域を探査する実際の工程は、この分野で知られている技術のいずれかを使用して達成することができる（Ｓｃｈａｆｅｒ及びＨａｗｋｉｎｓ、Ｎａｔｕｒｅ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、第１６巻、３３頁〜３９頁（１９９８）による総説を参照のこと）。好ましい技術が下記に列挙されるが、この列挙は、本発明の範囲を限定するものとして決して解釈すべきではない。
【００１８】
（ａ）ＤＮＡ配列決定：ヘテロ接合性の変化が、配列内の１つの位置に２塩基として出現する。ホモ接合性変異体が、コントロール（すなわち、野生型）配列との比較によって見出される。
【００１９】
（ｂ）ヘテロ二重鎖分析：この技術は、ヘテロ二重鎖が、ホモ二重鎖と比較して、非変性ポリアクリルアミドゲルにおいて低下した移動度を示すという事実に基づく。試験される領域（好都合には約２００ｂｐ）が増幅され、これを変性して、自身又はコントロールの「野生型」ＤＮＡに再生し、そして二重鎖が非変性ゲルで分離される。ＤＮＡの同じ領域が個体間で比較され、移動度の差により、配列の違いが示される。
【００２０】
（ｃ）一本鎖コンフォメーション多型分析（ＳＳＣＰ又はＳＳＣＡ）：一本鎖ＤＮＡは折り重なり、弱い分子内結合によって安定化される複雑な構造を形成する。非変性ポリアクリルアミドゲルにおけるこれらの構造の電気泳動移動度は、鎖の長さ及びコンフォメーションに依存する。典型的には、試験される領域に由来するＰＣＲ増幅産物が熱変性され、相補鎖の再会合を妨げるために急冷される。その後、生成物が非変性ゲルで分離される。ＤＮＡの同じ領域が個体間で比較され、差のある移動度により、この領域において個体間に存在する配列の違いが示される。
【００２１】
（ｄ）ミスマッチの化学切断（ＣＣＭ）：放射能標識されたプローブを試験ＤＮＡにハイブリダイゼーションさせ、ミスマッチが、一方のＤＮＡ鎖をミスマッチ部位で切断する一連の化学反応によって検出される。この高感度な方法は、キロベース長の断片に対して適用することができる。
【００２２】
（ｅ）ミスマッチの酵素切断：酵素（例えば、Ｔ４エンドヌクレアーゼＶＩＩ）を使用して切断が行われること以外はＣＣＭに類似する技術。
【００２３】
（ｆ）質量分析法：マトリックス支援レーザー脱離／イオン化飛行時間型質量分析法（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ）を、高感度な質量測定によってＤＮＡ断片を比較するために使用することができる。
【００２４】
（ｇ）サザンブロッティング：連鎖領域の断片からなる標識プローブを、種々の制限酵素で消化された正常コントロール及びに由来するゲノムＤＮＡを含有するナイロンメンブランにハイブリダイゼーションさせられる。プローブとハイブリダイゼーションする制限断片のサイズが患者とコントロールとの間で大きく異なることにより、制限フ断片長多型の存在が示され得る。
【００２５】
上記に列挙された技術を用いて、新規な多型変異体を同定するために、連鎖領域を探査することができる。
【００２６】
知られている多型変異体に関するかなりの量の情報を、例えば、Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ、米国）のウエブサイト（ｗｗｗ−ｇｅｎｏｍｅ．ｗｉ．ｍｉｔ．ｅｄｕ／ＳＮＰ／ｈｕｍａｎ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ）からアクセス可能なヒトＳＮＰデータベースなどの公開されているデータベースにおいて見出すことができる。従って、本発明ではまた、皮膚の炎症及び免疫に関連し得る連鎖領域内の多型変異体を同定するためにこれらの情報源を探査／検索することが考えられる。この方法を使用して同定される何らかの知られている多型と、一般に、又はアトピー性皮膚炎などの特定の状態に関する皮膚の炎症及び免疫との関連性を、遺伝学的技術（例えば、家族に基づく連関研究）を使用して再び調べることができる。
【００２７】
第２の態様において、本発明には、皮膚の炎症又は免疫を含む疾患状態に関連する少なくとも１つのヒト遺伝子（その突然変異体又は多型変異体を含む）を同定するための、多型マーカーＤ１Ｓ４９８を含むヒト染色体１ｑ２１の領域の使用が含まれる。
【００２８】
本発明にはまた、皮膚の炎症又は免疫を含む疾患状態に関連する少なくとも１つのヒト遺伝子（その突然変異体又は多型変異体を含む）を同定するための、多型マーカーＤ１７Ｓ７８４を含むヒト染色体１７ｑ２５の領域の使用が含まれる。
【００２９】
本発明にはなおさらに、皮膚の炎症又は免疫を含む疾患状態に関連する少なくとも１つのヒト遺伝子（その突然変異体又は多型変異体を含む）を同定するための、多型マーカーＤ２０Ｓ１１５を含むヒト染色体２０ｐの領域の使用が含まれる。
【００３０】
本発明のこの態様にはまた、連鎖のピークにおけるマーカーに隣接するマーカー（上記参照）に対する参照によって規定される連鎖領域及び同様にその部分領域の使用が包含される。
【００３１】
皮膚の炎症及び免疫を含む疾患状態に関連する遺伝子（１つ又は複数）を、本明細書中に規定される連鎖領域において同定することができる多くの技術がこの分野では知られている（Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら、Ｃｕｒｒｅｎｔ．Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ（第Ｉ巻、１９８９、Ｇｒｅｅｎ　Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ）、２．１０．３を参照のこと）。好ましい技術の非限定的な列挙が下記に示される：
（ａ）エキソントラッピング：これは人工的なＲＮＡスプライシングアッセイである。一般には、この技術は、複製起点及び強力なプロモーター配列を含有するウイルスゲノム（例えば、ＳＶ４０）のセグメント、多重クローニング部位を含むイントロンによって分離された２つのスプライシング可能なエキソン、ならびにポリアデニル化部位からなる人工ミニ遺伝子を含有するエキソントラップコスミドベクターを使用して行われる。連鎖領域に由来するＤＮＡがエキソントラップベクターにクローン化され、そして組換えＤＮＡが哺乳動物宿主細胞に移される。ウイルスプロモーターからの転写により、ミニ遺伝子の２つのエキソンを含むように通常的にスプライシングされるＲＮＡ転写物がもたらされる。連鎖領域のクローン化された断片自身が機能的なエキソンを含む場合、そのエキソンは、スプライシングされた転写物に取り込まれる。連鎖領域の断片を含むスプライシングされた転写物は、逆転写ＰＣＲを使用して同定することができる。従って、エキソントラップ法は、連鎖領域のクローン化された断片におけるコード領域を同定するために使用することができる。コード領域を含有する断片は、その後、標準的な分子生物学的技術を使用して遺伝子の残り部分を同定する際のプローブとして使用することができる。
【００３２】
（ｂ）ｃＤＮＡの選択又は捕捉（これはまた、直接的な選択及びｃＤＮＡ選択として知られている）：この方法は、連鎖領域の断片をｃＤＮＡの複雑な混合物（ｃＤＮＡライブラリーにおけるすべてのｃＤＮＡクローンの挿入物など）にハイブリダイゼーションさせることによってゲノムＤＮＡ／ｃＤＮＡのヘテロ二重鎖を形成させることを伴う。関連する配列がハイブリダイゼーションし、そして例えば、ＰＣＲを使用して、その後の工程で濃縮され得る。
【００３３】
（ｃ）ｍＲＮＡ／ｃＤＮＡへのハイブリダイゼーション：連鎖領域のゲノム断片を、種々の細胞株のパネルに由来するｍＲＮＡのノーザンブロットに対して、又は適切なｃＤＮＡライブラリーに対してハイブリダイゼーションさせることことができる。陽性のハイブリダイゼーションシグナルにより、断片内における遺伝子の存在が示される。
【００３４】
（ｄ）ＣｐＧアイランドの同定：ＣｐＧアイランド又はＨＴＦアイランドは、遺伝子の５’末端において見出されることが多い短い（約１ｋｂの）低メチル化ＧＣ高頻度（＞６０％）配列である。ＣｐＧアイランドは、いくつかのレアカッター制限酵素の制限部位を含むことが多い。レアカッター制限部位のクラスター化により、ＣｐＧアイランド、従って、可能な遺伝子が示される。ＣｐＧアイランドは、ＤＮＡクローンを、レアカッター酵素で消化されたゲノムＤＮＡのサザンブロットにハイブリダイゼーションすることによって、又はアイランド回収ＰＣＲによって検出することができる。
【００３５】
（ｅ）ズーブロッティング：連鎖領域の断片を、様々な動物種に由来するゲノムＤＮＡサンプルのサザンブロットに対して、低下したストリンジェンシーでハイブリダイゼーションすること。ハイブリダイゼーションシグナルの検出により、保存された領域が示唆され得る。これにより、可能な遺伝子が示される。
【００３６】
上記に記載された技術に加えて、公開されているデータベースにおいてヒトゲノム配列を得ることができることは、例えば、相同性検索及びエキソン予測などのインシリコ技術を使用して、連鎖領域におけるコード配列について検索することが可能であり得ることを意味している。ヒトの第１染色体、第１７染色体及び第２０染色体は、ヒトゲノム配列決定プロジェクトの一部として完全に配列決定されており、様々な配列を、第１染色体及び第２０染色体についてはＳａｎｇｅｒ　Ｃｅｎｔｒｅ（Ｈｉｎｘｔｏｎ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、英国）（ｗｗｗ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ）から、そして第１７染色体についてはＷｈｉｔｅｈｅａｄ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ、米国）から公開されている。従って、皮膚の炎症又は免疫に関連する遺伝子（１つ又は複数）を同定する際において特定の連鎖領域の「使用」には、前記領域の「インシリコ」使用もまた包含されることを理解しなければならない。
【００３７】
皮膚の炎症及び免疫を含む疾患状態に対する感受性に関連する連鎖領域をさらに明らかにするために、そして感受性遺伝子の同定を助けるために、さらなる精密なマッピングを、連鎖領域におけるさらなるマーカーを使用して行うことができる。新しく同定されたマーカーは、例えば、Ｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｅ　Ｈｕｍａｎ　Ｌｉｎｋａｇｅ　Ｃｅｎｔｅｒ（ＣＨＬＣ）の公開データベース、Ｕｔａｈ　Ｃｅｎｔｅｒ　ｆｏｒ　Ｇｅｎｏｍｅ　Ｒｅｓｅａｒｃｈの公開データベース、及びヒトゲノム配列決定コンソーシアムを形成する機関により維持されるデータベースなどの様々な公開されている情報源において定期的に入手可能になっている。連鎖領域における多型は、Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ、米国）を介してアクセス可能なヒトＳＮＰデータベースなどの公開されているＳＮＰデータベースを検索することによって同定することができる。さらに、連鎖領域の探査によって同定された何らかの新規な多型変異体もまた、精密なマッピングのためのさらなるマーカーとして使用することができる。
【００３８】
精密なマッピングは、罹患家族においてさらなるマーカーのタイプを決定し、連鎖不平衡又は関連性を同定し、それにより領域の連鎖不平衡マップを組み立てることによって行うことができる。
【００３９】
皮膚の炎症及び免疫を含む疾患状態に対する感受性遺伝子の同定を助けるために、連鎖領域を含むヒトゲノムＤＮＡのクローンを組み立てることができる。
【００４０】
第３の態様において、本発明により、皮膚の炎症又は免疫を含む疾患状態を発症する個体の可能性を予測する方法で、
個体のＤＮＡサンプルを得ること、
多型マーカーＤ１Ｓ４９８を含む染色体１ｑ２１の領域における個体の遺伝子型を決定すること、及び
個体の遺伝子型を罹患被験者の遺伝子型と比較すること
を含む方法が提供される。
【００４１】
本発明により、さらに、皮膚の炎症又は免疫を含む疾患状態を発症する個体の可能性を予測する方法で、
個体のＤＮＡサンプルを得ること、
多型マーカーＤ１７Ｓ７８４を含む染色体１７ｑ２５の領域における個体の遺伝子型を決定すること、及び
個体の遺伝子型を罹患被験者の遺伝子型と比較すること
を含む方法が提供される。
【００４２】
本発明により、なおさらに、皮膚の炎症又は免疫を含む疾患状態を発症する個体の可能性を予測する方法で、
個体のＤＮＡサンプルを得ること、
多型マーカーＤ２０Ｓ１１５を含む染色体２０ｐの領域における個体の遺伝子型を決定すること、及び
個体の遺伝子型を罹患被験者の遺伝子型と比較すること
を含む方法が提供される。
【００４３】
本発明のこの態様にはまた、連鎖のピークにおけるマーカー（上記参照）に隣接するマーカーに対する参照によって規定される連鎖領域及び同様にその部分領域の使用に基づく方法が包含される。
【００４４】
本発明のこの態様による方法は、皮膚の炎症及び免疫を含む疾患状態を発症することに対する個体の一般的な感受性を予測するために使用することができる。好ましい実施形態において、本発明の方法は、アトピー性皮膚炎を発症する個体の可能性を明らかにするために使用することができる。
【００４５】
一般的な意味で、本発明の方法は、皮膚の炎症及び免疫を伴う疾患に対する一般的な感受性に関連するとして本発明者らによって同定された染色体領域の１つにおける個体の遺伝子型を決定すること、及び個体の遺伝子型を罹患被験者の遺伝子型と比較することにある。「罹患被験者」は、皮膚の炎症及び免疫を含む疾患状態（例えば、アトピー性皮膚炎）であると、（アトピー性皮膚炎について下記において議論される）臨床的に受け入れられている診断基準を使用して診断されている個体として本明細書中では定義される。
【００４６】
罹患者の遺伝子型に関するデータは、染色体の関連する領域の直接的な配列決定によって得ることができ、又は上記に記載される技術のいずれかを使用して多型変異体の存在について関連する領域を探査することによって得ることができる。好ましくは、遺伝子型データは、非常に多くの罹患被験者から集められる。このデータは、その後、試験個体から得られた遺伝子型データと比較するために使用することができる。試験個体と罹患被験者との間における遺伝子型の一致度が、その後、感受性を示すものとして使用される。
【００４７】
本発明のこの態様ではまた、皮膚の炎症又は免疫を含む疾患状態を発症する個体の可能性を予測する方法で、皮膚の炎症又は免疫を含む疾患状態に対する感受性に関連する特定の多型遺伝子座における個体の遺伝子型を明らかにすることを伴う方法が考えられる。
【００４８】
本発明は、下記の実施例を参照することによってさらに理解される。
【００４９】
実施例１
（ａ）家族データ
６７９人を含む１４８家族が、活動性のＡＤを有する小児を介してグレート・オルモンド・ストリート小児病院における皮膚科学診療所から集められた。これらの診療所は三次紹介患者を対象としているので、発端者は、症状範囲の重症側のＡＤを有することが予想された。家族には、２１３組の兄弟姉妹が含まれた。
【００５０】
医師により行われたアンケートが各人について完了した。アンケートには、英国特別調査委員会により定義されたアトピー性皮膚炎に対するＨａｎｉｆｉｎ及びＲａｊｋａの修正診断基準（Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｈ．Ｃ．ら、１９９４ａ及び１９９９ｂ）、及び呼吸疾患に対するアメリカ胸部学会のアンケートに基づく質問（Ｍｉｌｌ，Ｍ．Ｒ．ら、１９９５）が含まれた。それぞれの家族は、医師によってアトピー性皮膚炎の症候について調べられた。ＡＤの重篤度は、関与する表面積、疾患の継続及び夜間のかゆみに基づいて、軽度（３．０〜４．０）、中程度（４．５〜７．５）又は重度（８．０〜９．０）の疾患に患者を分類するＲａｊｋａ及びＬａｎｇｅｌａｎｄのスコア化システム（Ｒａｊｋａ及びＬａｎｇｅｌａｎｄ、１９８９）を使用して評価された。喘息は、以前の記載（Ｃｏｘ　Ｈ．Ｃ．ら、１９９８）のようにアンケート及び以前の医師の診断に基づいて定義された。総血清ＩｇＥ濃度は蛍光酵素免疫アッセイ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　ＣＡＰシステム、Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｕｐｐｓａｌａ、スウェーデン）によって測定された。
【００５１】
この研究での全小児の平均年齢は６．９歳（標準偏差±３．９）であった。１７２人が男児であり、１６６人が女児であった。２５４人の小児がＡＤを有し、１５３人が喘息を有し、１３９人が両方を有した。ＡＤ小児の平均年齢は６．９±４．４歳であり、１２４人が男児で、１３０人が女児であった。疾患発症の相乗平均年齢は１．５歳であり、小児の９０％が２歳未満の発症年齢を有した。平均重篤度スコアは６．２±１．９であった。５１．５％の小児が中程度の疾患であり、２８．６％が重度の疾患であった。血清ＩｇＥ濃度は、ＡＤ及び喘息をともに有する小児（相乗平均、８８０ＩＵ／ｌ；９５％の信頼性区間、６３７〜１２３０ＩＵ／ｌ）が、喘息のみを有する小児（相乗平均、９１；９５％ＣＩ、２３〜３６１ＩＵ／ｌ）又はＡＤのみを有する小児（相乗平均、１７１；９５％ＣＩ、１０６〜２７７ＩＵ／ｌ）よりも高かった。
【００５２】
（ｂ）家族メンバーの遺伝子型
ＡＢＩ　ＬＭＳ２パネルに由来する３８５個の蛍光標識されたマイクロサテライトマーカーを以前の記載（Ｄａｎｉｅｌｓ，Ｓ．Ｅ．ら、１９９６）のようにタイプ決定し、合計で２１０，１６１個の遺伝子型を得た。平均マーカー間隔は約８．９ｃＭであり、ゲノム全体での平均情報含有量は６５％を越えていた。マーカーの順序はＭａｒｓｈｆｉｅｌｄマップ（Ｂｒｏｍａｎ　Ｋ．Ｗ．ら、１９９８）及びＷｈｉｔｅｈｅａｄ物理的地図（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ−ｇｅｎｏｍｅ．ｗｉ．ｍｉｔ．ｅｄｕ／）から採用した。メンデル誤差は連鎖分析の前に除かれた。
【００５３】
（ｃ）統計学的分析
４つの表現型モデルを、ノンパラメトリック罹患同胞対法によってマーカー組に対する連鎖について試験した。これらは、ＡＤａｏ（罹患被験者のみ）、ＡＤａｕ（等しい加重が与えられた罹患被験者及び非罹患被験者）、喘息ａｕ（等しい加重が与えられた罹患被験者及び非罹患被験者）であり、総血清ＩｇＥは量的形質として分析された。喘息被験者は、罹患した同胞対のみによって喘息を分析するためには十分ではなかった。
【００５４】
すべての可能な遺伝ベクトルの確率を、Ｌａｎｄｅｒ−Ｇｒｅｅｎアルゴリズム（Ｌａｎｄｅｒ，Ｅ．Ｓ．及びＧｒｅｅｎ，Ｐ．、１９８７）を使用して、それぞれのマーカーにおいて、そしてマーカー間の４つの位置において計算した。それぞれの家族ｉについて、ノンパラメトリック連鎖統計量を下記のように定義した：Ｚｉ＝（Ｓｉ−μｉ）／σｉ（式中、Ｓｉ＝Ｅ（Ｓ｜家族ｉに対するマーカーデータ）、μｉ＝（Ｓ｜Ｈｏ）、及びσｉ＝Ｖａｒ（Ｓ｜Ｈｏ））。それぞれの遺伝ベクトルについて、連鎖スコアを、
【数１】
2004509644.tif 000002
（ｆは、家系における始祖対立遺伝子を示す）
として定義した。表現型は、罹患者のみの分析の場合、１（罹患）及び０（非罹患）としてスコア化された。罹患者及び非罹患者を含む分析の場合、非罹患者の表現型は−１としてスコア化された。年齢及び性別に対する調節を行った後の残りが、以前の記載（Ｄｉｚｉｅｒ，Ｍ．Ｈ．ら、１９９５）のように、総血清ＩｇＥ濃度のために使用された。データの尤度、及びＺｉに基づく連鎖に対する１−パラメーター試験が、Ｋｏｎｇ及びＣｏｘ（１９９７）によって記載されるように構築された。すべての家族には、等しい加重が割り当てられた。
【００５５】
ゲノム全体での有意性レベルを計算するために、１０，０００個のシミュレーションされたゲノム探査を、無連鎖の帰無仮説のもとではあるが、最初のゲノム探査において観測された喪失データとマーカー間隔とのパターンを保持して作製した。最初のスクリーニングから得られた４つの表現型をそれぞれのシミュレーションで分析した。これらの表現型の１つ以上に対する連鎖を認める確率Ｐｃを、それぞれの染色体について、Ｐｃ＝（染色体ｃにおいてχ２閾値を有する複製体の数）／１０，０００として計算した。従って、ｎ個の連鎖ピークを認める確率は、
【数２】
2004509644.tif 000003
（式中、ｘは、１に設定されたｎ個の数字及び０に設定された２２−ｎ個の数字を有する長さ２２（染色体の数）のベクトルである）
である。以前に報告された乾癬遺伝子座の±２５ｃＭ以内で連鎖を認める確率を類似する方法で計算した。
【００５６】
（ｄ）結果
ＡＤに対する連鎖に関する証拠が染色体１ｑ２１（ｐ＝０．０００５）及び染色体１７ｑ２５（ｐ＝０．０００４）において同定された（表１）。喘息は染色体２０ｐと連鎖していた（ｐ＝０．０００５）。ＡＤ及び喘息の両方を有する小児に対するこの遺伝子座の連鎖は、喘息単独に対する連鎖と大きく異なっていなかった（χ２＝１０．９、ｐ＝０．０００５）。このことは、ＡＤと喘息との組合せが両疾患の遺伝的サブタイプに対応しているかもしれないことを示唆している。総血清ＩｇＥ濃度は染色体１６ｑと連鎖した（ｐ＝０．０００４）。
【００５７】
その後、モンテカルロシミュレーションを、推定された連鎖について真のゲノム全体での有意性レベルを見積もるために行った。１０，０００個のシミュレーションされたゲノム探査を、同じ４つの表現型、及び最初のゲノム探査において観測されたデータとマーカー間隔とのパターンを使用して作製した。結果は、０．８６の連鎖が偶然により予想されることを示し、そして４つの連鎖のすべてが誤っている確率は１％未満であることを示した（表２）。
【００５８】
本研究において同定された、染色体１ｑ２１、染色体１７ｑ２５及び染色体２０ｐの推定的な遺伝子座は、乾癬感受性遺伝子を含有することが知られている領域と非常に一致している（Ｃａｐｏｎら、１９９９；Ｔｏｍｆｏｈｒｄｅら、１９９４；Ｔｒｅｍｂａｔｈら、１９９７）（表３）。染色体１７ｑ２５及び染色体２０ｐの遺伝子座は、何ら詳細に特徴づけられていないが、染色体１ｑ２１の遺伝子座における遺伝子クラスターは上皮の分化調節に関与することが知られている（Ｗｊｓｔら、１９９９）。
【００５９】
６つの主要な乾癬遺伝子座が認められている（Ｃａｐｏｎら、１９９９；Ｔｏｍｆｏｈｒｄｅら、１９９４；Ｔｒｅｍｂａｔｈら、１９９７；Ｅｎｌｕｎｄら、１９９９ａ；Ｍａｔｔｈｅｗｓら、１９９６；Ｎａｉｒら、１９９７；Ｅｎｌｕｎｄら、１９９９ｂ）。従って、推定されるＡＤ遺伝子座がこれらの６つの領域と一致する有意性が、さらなるモンテカルロシミュレーションによって見積もられた。
【００６０】
これらの結果は、知られている乾癬遺伝子座の±２５ｃＭ以内で一致する、本スクリーニングから得られる３つの遺伝子座の確率が２．８×１０−５であることを示した（表４）。本スクリーニングに由来する３つの連鎖ピークは、実際には、乾癬遺伝子座に対するピークを有するマーカー（Ｄ１Ｓ４９８、Ｄ１７Ｓ７８４及びＤ２０Ｓ１８６）（表１及び表３）をともに有するので、同時局在化に対する±２５ｃＭの間隔は保存的である。
【００６１】
【表１】
2004509644.tif 000004
【００６２】
【表２】
2004509644.tif 000005
【００６３】
【表３】
2004509644.tif 000006
【００６４】
【表４】
2004509644.tif 000007
【００６５】
（参照文献）
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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