(57)【要約】スフィンゴシンキナーゼ、又は、その類縁物質、断片、若しくは誘導体をコードするポリヌクレオチドを動物に投与することによって、該動物において血管形成を誘発する方法。該ポリヌクレオチドをは、ウイルスベクターのような適当な発現ベクターに含有され得る。スフィンゴシンキナーゼをコードするポリヌクレオチドは適当な発現ビークル又はウイルスベクターのような発現ベクターに含有することが出来る。スフィンゴシンキナーゼを発現する発現ベクターの投与を介するスフィンゴシンキナーゼの運搬によって、平滑筋細胞又は周皮細胞のような壁細胞に支持され良く組織された構造を含むより大きな血管が形成される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
有効量のスフィンゴシンキナーゼ、又は、その類縁物質、断片、若しくは誘導体を動物に投与することを含む、該動物において血管形成を誘発する方法。
【請求項２】
スフィンゴシンキナーゼ、又は、その類縁物質、断片、若しくは誘導体をコードするポリヌクレオチドを動物に投与することによって、該動物に、スフィンゴシンキナーゼ、又は、その類縁物質、断片、若しくは誘導体が投与される、請求項１記載の方法。
【請求項３】
スフィンゴシンキナーゼ、又は、その類縁物質、断片、若しくは誘導体をコードするポリヌクレオチドを含有する発現ビークルを動物に投与することによって、該動物に、スフィンゴシンキナーゼ、又は、その類縁物質、断片、若しくは誘導体をコードするポリヌクレオチドが投与される、請求項２記載の方法。
【請求項４】
前記発現ビークルが更に、ＶＥＧＦ，ＦＧＦ，ＩＧＦ，アンジオポイエチン，ＰＤ−ＥＧＦ，ＴＧＦ−β，ＨＩＦ１−α，酸化窒素合成酵素，ＭＣＰ−１，インターロイキン−８，エプリン，ＮＡＰ−２，ＥＮＡ−７８，ＧＲＯＷ−α、及びチロシル‐ｔＲＮＡシンセターゼの活性断片から成る群から選択される蛋白質をコードするポリヌクレオチドを含有する、請求項３記載の方法。
【請求項５】
前記発現ビークルがウイルスベクターである請求項３記載の方法。
【請求項６】
前記ウイルスベクターがアデノウイルスベクターである請求項５記載の方法。
【請求項７】
前記ウイルスベクターがレンチウイルスベクターである請求項５記載の方法。
【請求項８】
前記ウイルスベクターがＢＩＶベクターである請求項５記載の方法。
【請求項９】
アデノウイルスベクターが約１０７プラーク形成単位〜約１０１２プラーク形成単位の量で動物に投与される、請求項６記載の方法。
【請求項１０】
アデノウイルスベクターが約５ｘ１０８プラーク形成単位〜約２ｘ１０１１プラーク形成単位の量で動物に投与される、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
レンチウイルスベクターが約５ｘ１０５形質導入単位〜約１０１２形質導入単位の量で動物に投与される、請求項７記載の方法。
【請求項１２】
レンチウイルスベクターが約５ｘ１０５形質導入単位〜約１０１２形質導入単位の量で動物に投与される、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
レンチウイルスベクターが約５ｘ１０５形質導入単位〜約１０１０形質導入単位の量で動物に投与される、請求項８記載の方法。
【請求項１４】
アデノウイルスベクターが約５ｘ１０５形質導入単位〜約１０１０形質導入単位の量で動物に投与される、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
動物が哺乳類である、請求項１記載の方法。
【請求項１６】
哺乳類が霊長類である、請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
霊長類がヒトである、請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
スフィンゴシンキナーゼ、又は、その類縁物質、断片、若しくは誘導体をコードするポリヌクレオチドを含有するウイルスベクター。
【請求項１９】
前記ウイルスベクターが更に、ＶＥＧＦ，ＦＧＦ，ＩＧＦ，アンジオポイエチン，ＰＤ−ＥＧＦ，ＴＧＦ−β，ＨＩＦ１−α，酸化窒素合成酵素，ＭＣＰ−１，インターロイキン−８，エプリン，ＮＡＰ−２，ＥＮＡ−７８，ＧＲＯＷ−α、及びチロシル‐ｔＲＮＡシンセターゼの活性断片から成る群から選択される蛋白質をコードするポリヌクレオチドを含有する請求項１８記載のベクター。
【請求項２０】
前記ベクターがアデノウイルスベクターである、請求項１８記載のベクター。
【請求項２１】
前記ウイルスベクターがレンチウイルスベクターである、請求項１８記載のベクター。
【請求項２２】
前記ウイルスベクターがＢＩＶベクターである、請求項１８記載のベクター。
【請求項２３】
スフィンゴシンキナーゼ、又は、その類縁物質、断片、若しくは誘導体をコードするポルヌクレオチドを動物に投与することを含む、該動物においてスフィンゴシンキナーゼを発現させる方法。
【請求項２４】
スフィンゴシンキナーゼ、又は、その類縁物質、断片、若しくは誘導体をコードするポリヌクレオチドを含有する発現ビークルを動物に投与することによって、該動物に、スフィンゴシンキナーゼ、又は、その類縁物質、断片、若しくは誘導体をコードするポリヌクレオチドが投与される、請求項２３記載の方法。
【請求項２５】
前記発現ビークルがウイルスベクターである、請求項２４記載の方法。
【請求項２６】
前記ウイルスベクターがアデノウイルスベクターである、請求項２５記載の方法。
【請求項２７】
前記ウイルスベクターがレンチウイルスベクターである、請求項２５記載の方法。
【請求項２８】
前記ウイルスベクターがＢＩＶベクターである、請求項２５記載の方法。
【請求項２９】
有効量のスフィンゴシンキナーゼ、又は、その類縁物質、断片、若しくは誘導体を動物に投与することを含む、該動物における鬱血性心不全の予防又は治療方法。
【請求項３０】
有効量のスフィンゴシンキナーゼ、又は、その類縁物質、断片、若しくは誘導体を動物に投与することを含む、該動物における心筋虚血の予防又は治療方法。
【請求項３１】
有効量のスフィンゴシンキナーゼ、又は、その類縁物質、断片、若しくは誘導体を動物に投与することを含む、該動物における虚血再灌流傷害の予防又は治療方法。
【請求項３２】
有効量のスフィンゴシンキナーゼ、又は、その類縁物質、断片、若しくは誘導体を動物に投与することを含む、該動物における末梢動脈疾患の予防又は治療方法。
【請求項３３】
スフィンゴシンキナーゼ、又は、その類縁物質、断片、若しくは誘導体をコードするポリヌクレオチドを動物に投与することによって、該動物に、スフィンゴシンキナーゼ、又は、その類縁物質、断片、若しくは誘導体が投与される、請求項２９，３０，３１又は３２に記載の方法。
【請求項３４】
スフィンゴシンキナーゼ、又は、その類縁物質、断片、若しくは誘導体をコードするポリヌクレオチドを含有する発現ビークルを動物に投与することによって、該動物に、スフィンゴシンキナーゼ、又は、その類縁物質、断片、若しくは誘導体をコードするポリヌクレオチドが投与される、請求項３３記載の方法。
【請求項３５】
前記発現ビークルが更に、ＶＥＧＦ，ＦＧＦ，ＩＧＦ，アンジオポイエチン，ＰＤ−ＥＧＦ，ＴＧＦ−β，ＨＩＦ１−α，酸化窒素合成酵素，ＭＣＰ−１，インターロイキン−８，エプリン，ＮＡＰ−２，ＥＮＡ−７８，ＧＲＯＷ−α、及びチロシル‐ｔＲＮＡシンセターゼの活性断片から成る群から選択される蛋白質をコードするポリヌクレオチドを含有する請求項３４記載の方法。
【請求項３６】
前記発現ビークルがウイルスベクターである、請求項３４記載の方法。
【請求項３７】
前記ウイルスベクターがアデノウイルスベクターである、請求項３６記載の方法。
【請求項３８】
前記ウイルスベクターがレンチウイルスベクターである、請求項３６記載の方法。
【請求項３９】
前記ウイルスベクターがＢＩＶベクターである、請求項３６記載の方法。
【請求項４０】
動物が哺乳類である、請求項２９，３０，３１又は３２に記載の方法。
【請求項４１】
哺乳類が霊長類である、請求項４０記載の方法。
【請求項４２】
霊長類がヒトである、請求項４１記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本出願は、米国特許法第１１９条（ｅ）に基づく以下の米国仮出願： ２０００年１０月５日出願の仮出願番号６０／２３８，２３０ （スフィンゴシンキナーゼをコードするポリヌクレオチドの投与による血管形成の誘発）の利益を主張するものである。これら出願の開示内容の全体が本明細書内に参照として取り込まれる。
【０００２】
本発明は、血管形成の誘発に関する。より具体的には、本発明は、スフィンゴシンキナーゼ、又は、その類縁物質、断片、若しくは誘導体を動物に投与することを含む、該動物において血管形成を誘発する方法に関する。好ましくは、スフィンゴシンキナーゼ、又は、その類縁物質、断片、若しくは誘導体をコードするポリヌクレオチドを動物に投与することによって、該動物に、スフィンゴシンキナーゼ、又は、その類縁物質、断片、若しくは誘導体が投与される。スフィンゴシンキナーゼをコードするポリヌクレオチドは適当な発現ビークル、又はアデノウイルスベクターのような発現ベクターに含有される。
【０００３】
【従来の技術】
血管内皮細胞は血管由来因子に応答して、毛細血管網への形態形成を行う。以前に、スフィンゴシン−１−ホスフェート（ＳＰＰ）、血小板由来生物活性脂質がスフィンゴ脂質由来の哺乳類細胞における重要なセカンドメッセンジャーであり、増殖を促進しアポトーシスを阻害するように働くことが示された（Ｏｌｉｖｅｓａ， ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ， Ｖｏｌ．３６５， ｐｇｓ． ５５７−５６０ （１９９３年１０月７日）； Ｓｐｉｅｇｅｌ， ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｌｅｕｋｏｃ． Ｂｉｏｌ． Ｖｏｌ．６５， Ｎｏ．３， ｐｇｓ．３４１−３４４ （１９９９年３月）。最近になって、ＳＰＰが脈菅形成の新たな調節物質（レギュレーター）として定義された （Ｌｅｅ， ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ， Ｖｏｌ．９９， Ｎｏ．３， ｐｇｓ．３０１−３１２ （１９９９年１０月２９日）。ＳＰＰは内皮細胞上のＧ蛋白質結合受容体の内皮細胞分化遺伝子（ＥＤＧ）ＥＤＧ−１及びＥＤＧ−３サブタイプを活性化する。ＥＤＧ−１及びＥＤＧ−３サブタイプの双方に調節されたシグナル経路が内皮細胞の毛細血管様網への形態形成に必要である。ＳＰＰはＧｉ／マイトージェン活性化プロテインキナーゼ細胞生存経路を誘発し、小ＧＴＰアーゼＲｈｏ 及びＲａｃ 結合のアドヘリン結合集合（ａｄｈｅｒｅｎｓ ｊｕｎｃｔｉｏｎ ａｓｓｅｍｂｌｙ） を増大させる（Ｌｅｅ， １９９９）。ＳＰＰのレベルはスフィンゴシンをＳＰＰにリン酸化する酵素によって調節される可能性がある。最初の哺乳類スフィンゴシンキナーゼ（マウスＳＰＨＫ１α及びＳＰＨＫ１β）のクローニング及びその同定が報告された（Ｋｏｈａｍａ， ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． Ｖｏｌ． ２７３， Ｎｏ．３７， ｐｇｓ．２３７２２−２３７２８ （１９９８年９月１１日））。ヒトスフィンゴシンキナーゼ（ＳＰＨＫ１及びＳＰＨＫ２）も報告されている（Ｎａｖａ， ｅｔ ａｌ．， ＦＥＢＳ， ４７３：８１−８４ （２０００） 及びＬｉｕ， ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２７５：１９５１３−１９５２０ （２０００））。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、スフィンゴシンキナーゼの投与、及び特に、スフィンゴシンキナーゼのベクター媒介による発現が新たな血管の形成を増大させることを発見した。即ち、本発明は、スフィンゴシンキナーゼ、好ましくは、スフィンゴシンキナーゼ、又は、その類縁物質、断片、若しくは誘導体をコードするポリヌクレオチドを動物に投与することにより、血管形成を誘発することに関する。スフィンゴシンキナーゼ、又は、その類縁物質、断片、若しくは誘導体、又は、スフィンゴシンキナーゼ、又は、その類縁物質、断片、若しくは誘導体をコードするポリヌクレオチドは、例えば、ＶＥＧＦ，ＦＧＦ，ＩＧＦ，アンジオポイエチン，ＰＤ−ＥＧＦ，ＴＧＦ−β，ＨＩＦ１−α，酸化窒素合成酵素，ＭＣＰ−１，インターロイキン−８，エプリン（ｅｐｈｒｉｎｓ），ＮＡＰ−２，ＥＮＡ−７８，ＧＲＯＷ−α、及び、米国特許出願６０／１９３，４７１ （２０００年３月３１日出願）及び米国特許出願０９／８１３，７１８（２００１年３月２１日出願）に開示されたチロシル‐ｔＲＮＡシンセターゼの活性断片のような他の脈菅形成（ａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ）蛋白質又は他の脈菅形成蛋白質をコードするポリヌクレオチドと組み合わせて投与することが出来る。スフィンゴシンキナーゼをコードするポリヌクレオチドは適当な発現ビークル又はウイルスベクターのような発現ベクターに含有することが出来る。スフィンゴシンキナーゼをコードするポリヌクレオチドの動物への投与は、局部に高いレベルでＳＰＰを運搬する方法であり、このような方法によって平滑筋細胞又は周皮細胞のような壁細胞に支持され良く組織された（ｗｅｌｌ−ｄｅｆｉｎｅｄ）構造を含むより大きな血管が形成される。
【０００５】
本発明の一態様によれば、動物における血管形成を誘発する方法が提供される。この方法は、有効量のスフィンゴシンキナーゼ、又は、その類縁物質、断片、若しくは誘導体を動物に投与することを含む。
本発明の別の態様によれば、動物における鬱血性心不全の予防又は治療方法が提供される。該方法は、有効量のスフィンゴシンキナーゼ、又は、その類縁物質、断片、若しくは誘導体を動物に投与することを含む。
更に本発明の別の態様によれば、動物における心筋虚血の予防又は治療方法が提供される。該方法は、有効量のスフィンゴシンキナーゼ、又は、その類縁物質、断片、若しくは誘導体を動物に投与することを含む。
更に本発明の別の態様によれば、動物における虚血再灌流傷害の予防又は治療方法が提供される。該方法は、有効量のスフィンゴシンキナーゼ、又は、その類縁物質、断片、若しくは誘導体を動物に投与することを含む。
好適具体例において、スフィンゴシンキナーゼ、又は、その類縁物質、断片、若しくは誘導体をコードするポリヌクレオチドを動物に投与することによって、該動物に、スフィンゴシンキナーゼ、又は、その類縁物質、断片、若しくは誘導体が投与される。スフィンゴシンキナーゼは哺乳動物、好ましくは霊長類、最も好ましくはヒトスフィンゴシンキナーゼである。スフィンゴシンキナーゼのアミノ酸配列及びそれらをコードするポリヌクレオチドの具体例は、ＧｅｎｂａｎｋにおいてヒトＳＰＨＫ１及びＳＰＨＫ２（寄託番号ＡＦ２００３２８及びＡＦ２４５４４７）、マウスＳＰＨＫ１α、ＳＰＨＫ１β、及び、ＳＰＨＫ２（寄託番号ＡＦ０６８７４８， ＡＦ０６８７４９及びＡＦ２４５４４８）、及びラットＳＰＨＫ１ａ，ＳＰＨＫ１ｃ，ＳＰＨＫ１ｄ，ＳＰＨＫ１ｅ及びＳＰＨＫ１ｆ（寄託番号ＡＢ０４９５７１， ＡＢ０４９５７２及びＡＢ０４９５７３， ＡＢ０４９５７４ 及びＡＢ０４９５７５）である。配列番号１及び配列番号２はヒトＳＰＨＫ１のｃＤＮＡ及びアミノ酸配列を示している。配列番号３及び配列番号４はヒトＳＰＨＫ２のｃＤＮＡ及びアミノ酸配列を示している。スフィンゴシンキナーゼの類縁物質（アナログ）の非限定的な例として、スフィンゴシンキナーゼのスプライス変異体、コード領域における欠失、及び多形態（マルチプルフォーム）（Ｔ． Ｋｏｈａｍａ， ｅｔ ａｌ．， ＪＢＣ， ２７３：２３７２２−２３７２８ （１９９８）； Ｈ． Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．， ＪＢＣ， ２７５：１９５１３−１９５２０ （２０００）； Ｙ． Ｂａｎｎｏ， ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ．， ３３５：３０１−３０４ （１９９８））を挙げることが出来る。スフィンゴシンキナーゼの断片とは、血管形成を誘発する活性を維持する蛋白質の部分である。スフィンゴシンキナーゼの誘導体の非限定的な例として、スフィンゴシンキナーゼの調節又は生物活性を変更するような修飾が含まれる。非限定的な例として、シグナル配列を付加し該酵素を分泌させたり、又は、カルシウム、カルモデュリン結合ドメイン、ＡＴＰ結合部位又は膜伸長配列の修飾を挙げることが出来る。ポリヌクレオチドは適当なプロモーターの調節下にある。しかしながら、本発明の範囲は特定のプロモーターに何等限定されるものではない。
【０００６】
好ましくは、スフィンゴシンキナーゼ、又は、その類縁物質、断片、若しくは誘導体をコードするポリヌクレオチドは適当な発現ビークルに含有される。このような発現ビークルの非限定的な例としては、プラスミド、真核細胞ベクター、原核細胞ベクター（例えば、細菌ベクター）、及びウイルスベクターがある。一具体例では、ベクターはウイルスベクターである。使用可能なウイルスベクターとしては、ＲＮＡウイルスベクター（例えば、レンチウイルスベクターを含むレトロウイルスベクター）、ＤＮＡウイルスベクター（例えば、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター及び天然痘ウイルスベクター）がある。ベクターを構築する際にＤＮＡウイルスベクターを使用する場合には、スフィンゴシンキナーゼコードするポリヌクレオチドはＤＮＡである。ベクターを構築する際にＲＮＡウイルスベクターを使用する場合には、スフィンゴシンキナーゼコードするポリヌクレオチドはＲＮＡである。好適なウイルスベクターは、アデノウイルスベクター（好ましくは、全てのウイルス遺伝子を欠く、即ち、高能力、又は弱い（ｇｕｔｌｅｓｓ））、レンチウイルスベクター（例えば、ＨＩＶ，ＢＩＶ−ベース）、及びアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである。
【０００７】
一具体例では、スフィンゴシンキナーゼ、又は、その類縁物質、断片、若しくは誘導体をコードするポリヌクレオチドを含有するウイルスベクターはアデノウイルスベクターである。
使用することが出来るアデノウイルスベクターの一例として、実質的に完全なアデノウイルスゲノムを有するアデノウイルスベクターを挙げることが出来る（Ｓｈｅｎｋ ｅｔ ａｌ．， Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， １１１（３）： １−３９ （１９８４））。或いは、かかるアデノウイルスベクターとして、アデノウイルスゲノムの少なくとも一部が欠失した修飾アデノウイルスベクターを使用することも可能である。
【０００８】
好適には、 アデノウイルスベクターはアデノウイルス５’ＩＴＲ，アデノウイルス３’ＩＴＲ、アデノウイルスキャプシド化シグナル（ｅｎｃａｐｓｉｄａｔｉｏｎ ｓｉｇｎａｌ）、スフィンゴシンキナーゼ、又は、その類縁物質、断片、若しくは誘導体をコードするＤＮＡ配列、及び、該スフィンゴシンキナーゼ、又は、その類縁物質、断片、若しくは誘導体をコードするＤＮＡ配列を制御するプロモーターを含む。該ベクターは、アデノウイルスＥ１及びＥ３ＤＮＡ配列の少なくとも主要部がないが、アデノウイルスＥ２及びＥ４ＤＮＡ配列の全て、及び、アデノウイルス主要後期プロモーターにより促進されるアデノウイルス蛋白質をコードするＤＮＡ配列を欠くものではない。一具体例では、該ベクターはアデノウイルスＥ２及びＥ４ＤＮＡ配列から成る群から選択された少なくとも一つのＤＮＡ配列の少なくとも一部も欠くものである。
【０００９】
別の一具体例では、該ベクターはアデノウイルスＥ１及びＥ３ＤＮＡ配列の少なくとも主要部がなく、Ｅ２及びＥ４ＤＮＡ配列のいずれかの一部を欠くものである。
【００１０】
更に別の具体例では、７２キロダルトン結合蛋白質をコードするＥ２ａ領域における遺伝子が変異され、ウイルス粒子が生産される温度である３２℃で活性である温度感受性蛋白質を産生する。この温度感受性変異体は、Ｅｎｓｉｎｇｅｒ， ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｖｉｒｏｌｏｇｙ， １０：３２８−３３９ （１９７２）， Ｖａｎ ｄｅｒ Ｖｌｉｅｔ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｖｉｒｏｌｏｇｙ， １５：３４８−３５４ （１９７５） 及びＦｒｉｅｆｅｌｄ ｅｔ ａｌ．， Ｖｉｒｏｌｏｇｙ， １２４：３８０−３８９ （１９８３） に記載されている。
【００１１】
好適具体例においては、このようなベクターはまず、標準手段に従い、５’末端においてアデノウイルス５’ＩＴＲを含む「必須左末端要素」、アデノウイルスキャプシド化シグナル、及びＥ１ａエンハンサー配列；プロモーター（アデノウイルスプロモーター又は外来性プロモーター）；多価クローニング部位（本明細書中で記載されるようなもの）；ポリＡシグナル；並びにアデノウイルスゲノムのセグメントに対応するＤＮＡセグメントを含むシャトルプラスミドを構築することによって調製することが出来る。プロモーターの一具体例としては、例えばグルココルチコイド応答性プロモーター或いはエストロゲン応答性プロモーターのような調節プロモーター、又は、プロモーターは組織特異的プロモーターでも良い。ベクターの別の一具体例として、スフィンゴシンキナーゼ、又は、その類縁物質、断片、若しくは誘導体をコードするＤＮＡ配列の発現を増加及び／又は維持することができるゲノム要素を含むことが出来る。このようなゲノム要素の非限定的な例として、イントロン、エキソン、ポリアデニル化配列、並びに、５’及び３’非翻訳領域がある。このようなゲノム要素の代表的な例が１９９９年８月１０日発行の米国特許第５，９３５，９３５に開示されている。ベクターは更に、３部分から成るリーダー配列を含むことが出来る。アデノウイルスゲノムのセグメントに対応するＤＮＡセグメントはアデノウイルスとの相同組換えの為の基質として機能する。プラスミドは更に、選択マーカー及び複製起点を含むことが出来る。複製起点としては細菌由来の複製起点で良い。このようなシャトルプラスミドの代表的な例としては、１９９４年１０月２７日公開のＰＣＴ出願（公開番号：ＷＯ９４／２３５８２）、１９９５年４月１３日公開のＰＣＴ出願（公開番号：ＷＯ９５／０９６５４）及び米国特許第５，５４３，３２８ 号明細書（１９９６年８月６日発行）に記載されたｐＡｖＳ６を挙げることが出来る。スフィンゴシンキナーゼ、又は、その類縁物質、断片、若しくは誘導体をコードするＤＮＡ配列はこのようなシャトルプラスミドの多価クローニング部位に挿入されてプラスミドベクターが調製される。
【００１２】
この構築物を用いて次にアデノウイルスベクターを生産する。プラスミドベクター及びアデノウイルスをＣａＰＯ４沈殿により２９３細胞のようなヘルパー細胞系にコトランスフェンクションすることによって相同組み換えを起こすことが出来る、このような相同組み換えに際して、組み換えアデノウイルスベクターが形成され、それは、５’ＩＴＲと相同組み換え断片との間におけるシャトルプラスミド由来のＤＮＡ配列、及び、相同組み換え断片と３’ＩＴＲとの間におけるアデノウイルス由来のＤＮＡを含有するものである。
一具体例では、相同組み換え断片はアデノウイルス５（ＡＴＣＣ　ＶＲ−５）ゲノムのヌクレオチド３３２９〜６２４６にオーバーラップするものである。
【００１３】
このような相同組み換えにより、アデノウイルス５’ＩＴＲ、アデノウイルスキャプシド化シグナル、及びＥ１ａエンハンサー配列；プロモーター；スフィンゴシンキナーゼ、又は、その類縁物質、断片、若しくは誘導体をコードするＤＮＡ配列；ポリＡシグナル；アデノウイルスＤＮＡ配列；並びにアデノウイルス３’ＩＴＲを含むベクターが形成される。該ベクターは更に３部分から成る（ｔｒｉｐａｒｔｉｔｅ） リーダー配列を含むことが出来る。このベクターは次に、ウイルス複製に必要なＥ１ａ及びＥ１ｂＤＮＡ配列を含む２９３ヘルパー細胞（ＡＴＣＣ　Ｎｏ．ＣＲＬ１５７３）のようなヘルパー細胞系にトランスフェクションされ、アデノウイルス粒子が生じる。トランスフェクションはエレクトロポーレーション、リン酸カルシウム沈殿、マイクロインジェクション又はプロテオリポソームによって行うことが出来る。
【００１４】
一具体例においては、アデノウイルスベクターは、アデノウイルスＥ１及びＥ４ＤＮＡ配列の全て若しくはそれぞれの一部がないか、又は、アデノウイルスＥ１及びＥ２ＤＮＡ配列の全て若しくはそれぞれの一部がないか、又は、Ｅ１，Ｅ２及びＥ４ＤＮＡ配列の全て若しくはそれぞれの一部を欠いている。
【００１５】
このようなベクターは、修飾若しくは未修飾ウイルスゲノム若しくはプラスミドの一部を含むプラスミド、及び、アデノウイルス５（ＡＴＣＣ　ＶＲ−５）ゲノム又は変異若しくは欠失を有するアデノウイルス５由来のウイルスのような直鎖アデノウイルスゲノムに直接由来する断片の組み合わせをインビトロで直接結合（ライゲーション）させることによって組み立てる（アセンブリ）ことが出来る。
【００１６】
別の方法では、所望の修飾を有するアデノウイルスゲノム（アデノウイルス５ゲノム又はアデノウイルス５Ｅ３変異体Ａｄｄ１３２７（Ｔｈｉｍｍａｐａｙａ， ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ， Ｖｏｌ．３１， ｐｇ，５４３（１９８３））の一部を含むプラスミドクローンと、左アデノウイルスＩＴＲ、Ｅ１領域及び所望の導入遺伝子を含む第二のプラスミド（例えばｐＡｖＳ６）とを真核細胞内で相同組み換えすることによってベクターをアセンブリすることが出来る。あるいは、相同組み換えはプラスミドクローンと直鎖アデノウイルスゲノム（アデノウイルス５、Ａｄｄ１３２７、又は変異若しくは欠失を有するアデノウイルス５由来のウイルス）ゲノムに直接由来する断片との間で実施することが出来る。
【００１７】
ウイルスベクターから取り除かれた必須の遺伝子の機能を補う（代償する）ことの出来る細胞系に該ベクターをトランスフェクションさせ、感染性ウイルス粒子を生じさせる。該細胞系は一般的に、インフェクション可能で、アデノウイルス又はアデノウイルスベクターの増殖を支持し、継続的なウイルス生産を提供するような細胞系である。細胞系は必須のアデノウイルス遺伝子でトランスフェクションされており、感染性のウイルス粒子を生成させるために使用することが出来る。このような細胞の非限定的例としては、Ａ５４９、ＫＢ、及びＨｅｐ−２細胞系を挙げることが出来る。
【００１８】
いくつかのウイルス遺伝子の発現は細胞にとって毒性（有害）であるので、Ｅ１領域、Ｅ２ｂ領域、及び／又はＥ４領域は誘導性プロモーターの制御下におくことが出来る。このような誘導性プロモーターの非限定的な例としてはマウス乳がんウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター（Ａｒｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｖｏｌ． ２５５， ｐｇｓ．１５７３−１５７６ （Ｍａｒｃｈ ２０， １９９２））；合成最小グルココルチノイド応答性要素プロモーターＧＲＥ５（Ｍａｄｄｅｒ， ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．， Ｖｏｌ．９０， ｐｇｓ．５６０３−５６０７ （Ｊｕｎｅ １９９３））；又は、テトラサイクリン応答性プロモーター（Ｇｏｓｓｅｎ， ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．， Ｖｏｌ．８９， ｐｇｓ．５５４７−５５５１ （Ｊｕｎｅ １９９２））を挙げることが出来る。別の具体例では、Ｅ１領域が誘導性プロモーターの制御下にあり、Ｅ２ａ、Ｅ２ｂ及び／又はＥ４領域がそれらの本来のプロモーターの制御下にある。このような例では、本来のプロモーターはＥ１領域の発現によってトランスに活性化される（ｔｒａｎｓａｃｔｉｖａｔｅｄ）。
【００１９】
一具体例における細胞系は、転写調節のためにホルモン誘導性プロモーターであるマウス乳がんウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター又はグルココルチノイド応答性要素（ＧＲＥ）のような調節可能又は誘導性のプロモーターの制御下に置かれたＥ１ａ領域又は完全なＥ１領域（Ｅ１ａ及びＥ１ｂ領域を含む）、及び、完全なアデノウイルスＥ４領域及びその本来のプロモーターを含む。別の例では、Ｅ４ＤＮＡ配列もＭＭＴＶプロモーターにような調節可能なプロモーターから発現される。Ｅ１及びＥ４ＤＮＡ配列は一つの発現ビークルに含有されているか、又は、別のベクターに含まれていてもよい。好適な発現ビークルは、細胞系のゲノムに組み込まれるプラスミドベクターである。
【００２０】
アデノウイルスＥ１及びＥ４ＤＮＡ配列のそれぞれの全て又はその一部がないか、又は、アデノウイルスＥ１及びＥ２ＤＮＡ配列のそれぞれの全て又はその一部がないか、又は、アデノウイルスＥ１、Ｅ２及びＥ４ＤＮＡ配列のそれぞれの全て又はその一部がないようなベクター、及び上記の代償細胞系もＰＣＴ出願Ｎｏ．ＷＯ９６／１８４１８ （１９９６年６月２０日公開）に記載されており、その内容は本明細書に参考として取り込まれる。
【００２１】
更に別の具体例では、アデノウイルスベクターはアデノウイルスコード領域の全てを欠いている。このような能力のない（ガットレス：ｇｕｔｌｅｓｓ）アデノウイルスベクターには、５’ＩＴＲ、アデノウイルスパッケージングシグナル、スフィンゴシンキナーゼ、又は、その類縁物質、断片、若しくは誘導体をコードするＤＮＡ配列、及びアデノウイルス３’ＩＴＲが含まれる。該ベクターは、約２６ｋｂ〜約３８ｋｂ、好ましくは、２８ｋｂ〜３２ｋｂを含み、更に一つ又はそれ以上のゲノム要素を含む。
【００２２】
各種のアデノウイルスベクターは、スフィンゴキナーゼプロモーター以外の、組織特異的プロモーターのようなプロモーターを含むことが出来る。該ベクターは、スフィンゴシンキナーゼ、又は、その類縁物質、断片、若しくは誘導体をコードするＤＮＡ配列に加えて、例えば、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦｓ）、繊維芽増殖因子（ＦＧＦｓ）、ＩＧＦｓ、アンジオポエチン１及びアンジオポエチン２を含むアンジオポエチン、ＴＧＦ−β、ＨＩＦ−αのようなハイポキシア誘起性因子（ＨＩＦｓ）、ＭＣＰ−１のような単球化学付着蛋白質（ｍｏｎｏｃｙｔｅ ｃｈｅｍｏａｔｔａｃｈｅｍｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎｓ： ＭＣＰｓ）、酸化窒素合成酵素、エピリン２のようなエピリン（ｅｐｈｒｉｎ） 、及び、その他の脈管形成遺伝子をコードするＤＮＡ配列、血小板由来内皮細胞増殖因子、及びインターロイキン８のような、新たな血管の生成を促進する付加的な蛋白質をコードするＤＮＡ配列を含むことが出来る。
【００２３】
本発明のアデノウイルスベクターは動物宿主における血管形成を促進するに有効な量でインビボで該宿主に投与することが出来る。該宿主はヒト及びヒト以外の霊長類を含む哺乳類である。
【００２４】
一具体例では、本発明のアデノウイルスベクターは、約１０７プラーク形成単位〜約１０１２プラーク形成単位、好ましくは、約５ｘ１０８プラーク形成単位〜約２ｘ１０１１プラーク形成単位の量で投与され得る。或いは、該アデノウイルスベクターで形質導入された約１０３〜１０８個の量の細胞を投与することも出来る。
【００２５】
一般的に、本アデノウイルスベクターは虚血部位又は治療的な脈管形成が必要な箇所に投与される。例えば、アデノウイルスベクター又は該アデノウイルスベクターで形質導入された細胞の直接の注射、ガイドされるカテーテル又はＮＯＧＡのようなコンピューターによってガイドされる経動脈運搬、又はエレクトロポレーション等の様々な手段により運搬（デリバリー）を行うことが出来る。
【００２６】
又は、アデノウイルスベクターは、それが特定の細胞に標的化されるように修飾ファイバー蛋白質を有することも出来る。このようなアデノウイルスベクターの代表的な例としては、米国特許第５，５４３，３２８号明細書を挙げることが出来る。このようなベクターは、例えば、静脈内投与（例えば、門脈注射または末梢血管注射など）、又は、肝臓動脈投与を含む経動脈投与により全身に投与することが出来る。
【００２７】
アデノウイルスベクターは、患者への投与に適した薬学上許容可能な担体を組み合わせて投与することが出来る。この担体は液体担体（例えば、食塩水）、又は、例えば、マイクロキャリアビーズ又はカルシトニンゲルにような局所化剤のような固形担体、ヒアルロナン溶液、又は、トロンビンによるフィブリノーゲン活性化に由来する繊維素プラグ（米国特許第６，１１７，４２５号）であり得る。
【００２８】
一具体例ではウイルスベクターはレトロウイルスベクターである。レンチウイルスベクターを含むレトロウイルスベクターは約８ｋｂのコード可能領域を有しており、該ウイルスゲノムは宿主細胞の染色体に組み込まれることが可能であるので、導入遺伝子の長期に亘る発現が可能である。使用可能なレトロウイルスベクターの非限定的な例として、モロニーマウス白血病ウイルス、脾臓壊死ウイルス、及び、レトロウイルスである、ラウス肉腫ウイルス、ハーベー肉腫ウイルス、鳥類白血病ウイルス、脊髄増殖性肉腫ウイルス、及び乳がんウイルス、その他に、レンチウイルスベクターをあげることが出来る。
【００２９】
一具体例では、レトロウイルスベクターは、モロニーマウス白血病ウイルスに由来し、Ｂｅｎｄｅｒ， ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．， Ｖｏｌ． ６１， ｐｇｓ．１６３９￣１６４９ （１９８７）及びＭｉｌｌｅｒ， ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ， Ｖｏｌ．７， ｐｇｓ． ９８０−９９０（１９８９） に記載されたＬＮシリーズベクターである、レトロウイルスプラスミドベクターから生成される。このようなベクターはマウス肉腫ウイルス由来のパッケージングシグナルの一部、変異ｇａｇ 開始コドンを有する。本明細書において「変異」という用語は、ｇａｇ蛋白質又はその断片又はその切断（トランケーション）が発現されないように、ｇａｇ開始コドンが欠失、又は変更されていることを意味する。
【００３０】
別の一具体例では、レトロウイルスプラスミドベクターは少なくとも一つのクローニング部位又は制限酵素認識部位を有し、該部位は真核細胞遺伝子における平均発現頻度が１０，０００塩基対に一回よりも少なく、すなわち、制限酵素産物が少なくとも１０，０００塩基対の平均ＤＮＡサイズを有していることである。好適なクローニング部位は、ＮｏｔＩ， ＳｎａＢＩ， ＳａｌＩ　及び ＸｈｏＩ からなる群から選択される。好適例では、レトロウイルスプラスミドベクターにはこれらの各部位が含まれている。このようなベクターは米国特許第５，６７２，５１０号明細書に記載されている。
【００３１】
このようなクローニング部位を有するレトロウイルスプラスミドベクターを使用するときには、レトロウイルスプラスミドベクターに位置するＮｏｔＩ， ＳｎａＢＩ， ＳａｌＩ　及び ＸｈｏＩ からなる群から選択され少なくとも２つのクローニング部位に適合する少なくとも２つのクローニング部位を有するシャトルクローニングベクターも提供される。このシャトルクローニングベクターも又、該シャトルクローニングベクターからレトロウイルスプラスミドベクターへの移転が可能な、スフィンゴシンキナーゼ、又は、その類縁物質、断片、若しくは誘導体をコードするポリヌクレオチドを有している。
【００３２】
一具体例では、ウイルスベクターは、ＢＩＶに由来するようなレンチウイルスベクターである。一般的に、レンチウイルスベクターは、主要なウイルス遺伝子が欠失し目的とする遺伝子と置換されているように構築されている。最も頻繁には、該目的遺伝子は長い末端反復（ＬＴＲ）内のウイルス調節配列のコントロール下で転写される。或いは、目的遺伝子は内部プロモーターによる調節下で発現される。該ベクターから除去されている遺伝子は一般的には、パッケージング細胞系における一つ又はそれ以上のヘルパー又はパッケージング構築物により提供される（Ｂｅｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６１：１６３９−１６４９ （１９８７） 及びＭｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ， ７：９８０−９９０ （１９８９））。更に、ヘルパー構築物の相補的部分が２つの別の構築物に分割されている、Ｍａｒｋｏｗｉｔｚ ｗｔ ａｌ．， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６２：１１２０−１１２４ （１９８８） も参照されたし。パーッケージング細胞系はレトロウイルスベクターと共にトランスフェクションされ、それによってウイルス粒子にパッケージされるベクターＲＮＡが生産される。これらの放出されるウイルス粒子は複製不能であり、目的の遺伝子を有するレトロウイルスベクターを標的細胞に運搬するために使用することが出来る。
【００３３】
組み換えベクターシステムの安全性、効率及び正確性を増大するために、各種の改良型組み換えシステムが構築されてきた。改良の一つの型としては、３’長末端反復（ＬＴＲ）における欠失によってより安全なパッケージング細胞系にすることである。別の改良には、一つののウイルスｅｎｖ　遺伝子を別のウイルスのｅｎｖ　遺伝子と置換することによって、偽型ヘルパーウイルスを生成するハイブリッドプロデューサー系を作成し、宿主範囲を増大することである。より具体的には、関連しないウイルスであるＶＳＶ及びＨＳＶで偽型化することにより、ＨＩＶの宿主範囲が拡大された（Ｚｈｕ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ａｉｄｓ， ３：２１５−２１９ （１９９０）及びＮａｌｄｉｎｉ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２７２：２６３−２６７（１９９６））。更なる改良は、ベクターにおける最小ウイルスコード領域を使用することによってなされた。レンチウイルスは非分裂細胞にも感染することが可能であり、この性質はインビボでの遺伝子治療において特に有用である。更に、現在使用されているほとんどのパッケージング細胞系は、それぞれが必須のコード配列のひとつを有する別個のプラスミドでトランスフェクションされており、複製能力のあるウイルスが生産されるには多数の組み換え事象が必要になる。米国特許第５，６６５，５７７号明細書、米国特許第５，９９４，１３６号明細書、及び米国特許第６，０１３，５１６号明細書にはレンチウイルスベクターシステムの例が記載されている。米国特許出願第０９／７３４，８３６号及びＰＣＴ特許出願公開ＷＯ０１／４４４５８にはＢＩＶ由来のレンチウイルスベクターシステムの例が記載されている。
【００３４】
一具体例において、レンチウイルスベクターは、約５ｘ１０５形質導入単位〜約１０１２形質導入単位の有効量で動物に投与される。好適例では、動物に投与される有効量は、約５ｘ１０５形質導入単位〜約１０１０形質導入単位である。
【００３５】
一具体例において、レトロウイルスプラスミドベクターは、スフィンゴシンキナーゼ、又は、その類縁物質、断片、若しくは誘導体をコードするポリヌクレオチドに加えて、例えば、インシュリン様増殖因子（ＩＧＦ）、アンジオポエチン１及びアンジオポエチン２を含むアンジオポエチン、繊維芽増殖因子（ＦＧＦｓ）、酸化窒素合成酵素、インターロイキン８お呼びＴＧＦ−βのような、新たな血管の生成を促進する付加的な蛋白質をコードするポリヌクレオチドを含むことが出来る。
【００３６】
基本となる骨格（バックボーン）ベクター又は断片に、クローニング部位又は制限酵素認識部位を含む一つ又はそれ以上のリンカーを結合することによって、シャトルクローニングベクターを構築することが出来る。本明細書にこれまで記載した適合する又は相補的なクローニング部位が該クローニング部位に含まれる。スフィンゴシンキナーゼ、又は、その類縁物質、断片、若しくは誘導体をコードするポリヌクレオチド、及び／又は、シャトルベクターの制限酵素部位に対応する末端を有するプロモーターが当業者に公知の方法でシャトルベクターに結合される。
【００３７】
シャトルクローニングベクターは原核細胞系においてＤＮＡ配列を増幅するために使用することが出来る。該シャトルクローニングベクターは原核細胞系、特に細菌において一般的に使用されているプラスミドから調製することが出来る。即ち、例えば、シャトルクローニングベクターはｐＢＲ３２２及びｐＵＣ１８等のようなプラスミドに由来する。
【００３８】
レトロウイルスプラスミドベクターは、スフィンゴシンキナーゼ、又は、その類縁物質、断片、若しくは誘導体をコードするポリヌクレオチドを発現させるためのプロモーターを含むことが出来る。使用可能な適当なプロモーターの非限定的な例として、レトロウイルスＬＴＲ，ＳＶ４０プロモーター、Ｍｉｌｌｅｒ， ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ， Ｖｏｌ．７， Ｎｏ．９， ９８０−９９０ （１９８９） に記載のヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、又はその他のプロモーター（例えば、ヒストン、ｐｏｌＩＩＩ、サイクリンＧ１、及びβ―アクチンプロモーター等の真核細胞性プロモーターのような細胞性プロモーター）を挙げることが出来る。その他の使用可能なプロモーターの非限定的な例としては、アデノウイルスプロモーター、ＴＫプロモーター、Ｂ１９パルボウイルスプロモーターである。本明細書に含まれる技術事項から、当業者であれば適当なプロモーターを選択できることは明らかである。
【００３９】
スフィンゴシンキナーゼ、又は、その類縁物質、断片、若しくは誘導体をコードするポリヌクレオチドを含有するレトロウイルスプラスミドベクターは、ｇａｇ， ｐｏｌ， 及びｅｎｖレトロウイルス蛋白質をコードする核酸配列を含むパッケージング細胞系に形質導入される。このような パッケージング細胞系の非限定的な例としては、ＰＥ５０１、ＰＡ３１７（ＡＴＣＣＮｏ．ＣＲＬ９０７８）、Ψ−２、Ψ−ＡＭ、ＰＡ１２，Ｔ１９−１４Ｘ、ＶＴ−１９−１７−Ｈ２、ΨＣＲＥ、ΨＣＲＩＰ、ＧＰ＋Ｅ−８６、ＧＰ＋ｅｎｖＡｍ１２、Ｍｉｌｌｅｒ， Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ， Ｖｏｌ．１， ｐｇｓ．５−１４ （１９９０） （この全内容は本明細書に参照して含まれる）に記載のＤＡＮ細胞系、及び、２９３Ｔ細胞（米国特許第５，９５２，２２５明細書）を挙げることが出来る。このベクターは当業者に公知の任意の手段によってパッケージング細胞系に形質導入される。このような手段の非限定的例として、エレクトロポレーション、リポソームの使用、ＣａＰＯ４沈殿を挙げることが出来る。このようなプロデューサー細胞が、スフィンゴシンキナーゼ、又は、その類縁物質、断片、若しくは誘導体をコードするポリヌクレオチドを含有する感染性レトロウイルス粒子を生産する。
【００４０】
本発明のレトロベクター粒子又はレトロウイルスベクターで形質導入された細胞は血管形成を促進するに有効な量でインビボで動物に投与することが出来る。レトロウイルスベクター粒子は、例えば、該ベクター又は該ベクターで形質導入された細胞の直接の注射、ガイドされるカテーテル又はＮＯＧＡのようなコンピューターによってガイドされる経動脈運搬、又はエレクトロポレーション等の様々な手段により局所投与することが出来る。一般的に、本発明のレトロウイルスベクターは、少なくとも約１０４ ｃｆｕ／ｍｌで、一般的に約１０９ ｃｆｕ／ｍｌ未満の量で投与される。正確な投与量は処置対象である動物又は患者の年齢、体重、性別、並びに治療対象の疾患又は病気を含む様々な因子により決まる。
【００４１】
レトロウイルスベクターは、例えば、食塩水、硫酸プロタミン（Ｅｌｋｉｎｓ−Ｓｉｎｎ， Ｉｎｃ．， Ｃｈｅｒｒｙ Ｈｉｌ， Ｎ．Ｊ．） 、水、リン酸緩衝液又はトリス緩衝液のような水溶性緩衝液、及び、ポリブレン（Ｓｉｇａｍ Ｃｈｅｍｉｃａｌ， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ）等の薬学上許容可能な担体、又は、カルシトニンゲル、ヒアルノナン水溶液、又は、トロンビンによるフィブリノーゲン活性化に由来する繊維素プラグ（米国特許第６，１１７，４２５号）のような局所化剤と組み合わせて投与することが出来る。当業者には適当な薬学上許容可能な担体を選択することは本明細書の教示から明らかである。
【００４２】
別の態様では、本明細書に記載のレトロウイルスベクター、又は、スフィンゴシンキナーゼ、又は、その類縁物質、断片、若しくは誘導体をコードするポリヌクレオチドをリポソーム内にカプセル化することが出来る。該レトロウイルスベクター、又は、スフィンゴシンキナーゼ、又は、その類縁物質、断片、若しくは誘導体をコードするポリヌクレオチドをカプセル化するリポソームは上記の薬学上許容可能な担体と組み合わせて宿主に投与することが出来る。
【００４３】
別の態様では、上記のパッケージング細胞系から得られ、スフィンゴシンキナーゼ、又は、その類縁物質、断片、若しくは誘導体をコードするポリヌクレオチドを含有するレトロウイルスプロデューサー細胞を動物に投与することが出来る。一具体例においては、このようなプロデューサー細胞は全身投与（例えば、静脈内、経動脈）することが出来る。該プロデューサー細胞は、スフィンゴシンキナーゼ、又は、その類縁物質、断片、若しくは誘導体をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドを有するレトロウイルスベクターを生産する。
【００４４】
別の具体例では、誘導性プロモーター（ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｐｒｏｍｏｔｅｒ） の制御下でのスフィンゴシンキナーゼの発現がなされる。誘導性遺伝子発現システムによって可逆的様式でスフィンゴシンキナーゼの調節が可能となる。いくつかの誘導性システムが現在利用することが出来る。制御下でのプロモーターシステムの一例としてＴｅｔ−ＯｎＴＭ 及び Ｔｅｔ−ＯｆｆＴＭがあり、クローンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ， Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ， ＣＡ）から市販されている。Ｔｅｔ−ＯｆｆＴＭシステムは、テトラサイクリン制御下でのトランスアクチベーター（ｔＴＡ）を使用するものであり、ｔｅｔ リプレッサー蛋白質（ＴｅｔＲ）及びＶＰ１６活性化ドメインから構成されている。ｔＴＡはテトラサイクリンが存在しないときに転写を活性化する。Ｔｅｔ−ＯｎＴＭシステムは、逆テトラサイクリン制御下でのトランスアクチベーター（ｒｔＴＡ）を使用するものであり、テトラサイクリンが存在するときに転写を活性化する。これら両方のシステムは、ｔｅｔ オペレーター配列の７回繰り返しを含むテトラサイクリン応答性要素（ＴＲＥ）、及びスフィンゴシンキナーゼのような標的遺伝子を使用する。このプロモーターシステムでは、テトラサイクリン又はドキシサイクリンのようなテトラサイクリン誘導体の制御下で導入遺伝子の調節された発現が可能となる。このシステムは本発明におけるスフィンゴシンキナーゼの発現を制御する為に使用することが出来る。
【００４５】
ほかの調節可能なプロモーターシステムは米国特許出願第０９／５８６，６２５及び２０００年７月１８日出願され、２００１年７月１８日に出願変更申請のなされた米国仮出願第Ｎｏ．０９／６１９，０６３ （単鎖、単量体、リガンド非依存性ポリペプチドスイッチを使用する遺伝子発現の調節）に記載されている。
【００４６】
アデノウイルスベクター若しくはレトロウイルスベクター（レンチウイルスベクターを含む）のような発現ビークル、又はこのような発現ビークルで形質導入された細胞は様々な疾患の治療に使用することが出来る。このような疾患の非限定的な例としては、冠状動脈疾患、抹消血管疾患、創傷治癒、及び骨折治療、再建外科治療、すい臓移植のような移植、腱治療／運動障害、潰瘍治療、閉塞性血栓血管炎（Ｂｕｅｒｇｅｒ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）、歯周組織再生、及び放射線治療誘発食道炎を挙げることが出来る。
【００４７】
心臓における収縮機能の喪失は世界で１５００万人の患者がいる主要な疾患であり、１年に約５０万人が鬱血性心不全と診断されている（Ｍａｓｓｉｅ， Ｂ． Ｓｈａｈ， Ｎ． Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｈｅａｒｔ Ｊｏｕｒｎａｌ， １９９７； １３３：７０３−７１２）。鬱血性心不全は心筋性虚血により引き起こされ、脈管形成治療により治療可能なものである。脈管形成治療は、経皮的な冠状動脈介入及び冠動脈バイパス手術を含む、心筋性虚血の治療のための今日の外科的介入にとって替わり得るものである。更に、１年に１００万人当たり５００−１，０００人に発生する危険な四肢虚血はしばしば外科手術又は経皮的な血管再生に適していなく、その結果、四肢を失う結果となる。この場合にも、脈管形成治療はこの疾患の治療に使用することが出来る。この疾患の特定の型が閉塞性血栓血管炎（Ｂｕｅｒｇｅｒ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）であり、予備的な臨床研究によれば、脈管形成的方法がこの疾患の患者にとって新たな治療を提供することが出来る。スフィンゴシンキナーゼが媒介する脈管形成は、肉芽組織における強力な脈管形成応答を必要とする、やけどのような障害の後の創傷治癒を促進し、及び、骨折、骨の移植の為の良好な治療修復の為の脈菅形成を刺激し、又、腱治癒においても使用することが出来る。本発明の治療は、他に、潰瘍治癒、歯周組織再生、及び放射線治療誘発食道炎等において使用することが出来る。カプセル化されたすい臓ランゲルハンス島の移植は、Ｉ型糖尿病の有望な治療法であり、血管新生を増大するためにスフィンゴシンキナーゼを使用することにより多大な効能を享受することが出来る（ｄｅ Ｖｏｓ， ｅｔ ａｌ．， １９９７）。
【００４８】
鬱血性心不全、心筋性虚血、虚血性再灌流障害又は抹消動脈疾患の治療には、レンチウイルスベクターを、約５ｘ１０５形質導入単位〜約１０１２形質導入単位の有効量で動物に投与する。好適例では、動物に投与される有効量は、約５ｘ１０５形質導入単位〜約１０１０形質導入単位である。
【００４９】
鬱血性心不全、心筋性虚血、虚血性再灌流障害又は抹消動脈疾患の治療には、アデノウイルスベクターを、約１０７プラーク形成単位〜約１０１２プラーク形成単位、好ましくは、約５ｘ１０８プラーク形成単位〜約２ｘ１０１１プラーク形成単位の量で投与され得る。或いは、該アデノウイルスベクターで形質導入された約１０３〜１０８個の量の細胞を投与することも出来る。
【００５０】
本発明を以下の実施例により説明する。しかしながら、本発明の範囲はそれらによって限定されるものではない。
【００５１】
【実施例１】
スフィンゴシンキナーゼクローニング及びサザーン分析
ｐＣＲ３．１（インビトロジェン）由来であり、マウススフィンゴシンキナーゼαｃＤＮＡを含むプラスミドｐＣＲ３．１ｓｐｈＫ１αをトーマス・バウムルーカー（Ｎｏｖａｒｔｉｓ， Ｖｉｅｎｎａ， Ａｕｓｔｒｉａ）から入手した。ｐＣＲ３．１ｓｐｈＫ１ｘをＨｉｎｄＩＩＩ及び ＮｏｔＩで消化し、ｓｐｈＫ１αをコードする配列を含む１，５３１ｂｐ挿入物を単離した。断片を平滑末端処理し、ｌｏｘ 組み換え部位を含むアデノウイルスシャトルプラスミドであるｐＡＶＳ６ａｌｘのＥｃｏＲＶ部位にクローニングし、ｐＡＶ１ｘｓｐｈ Ｋ１αを構築した（図１）。ｐＡＶＳ６ａｌｘはｌｏｘ部位をｐＡＶＳ６ａ（米国特許第５，５４３，３２８号明細書）に付加することにより調製した。ＳＶ４０のポリＡシグナル及びｌｏｘ部位を含む、ｐＡＶＨ８−１０１１ｘ由来のＣｌａＩ／ＮｃｏＩ （５３５ｂｐ） 断片をＣｌａＩ及びＮｃｏＩで消化し直線化したｐＡＶＳ６ａ（４，７４５ｂｐ）に挿入した。ｓｐｈ Ｋ１αｃＤＮＡはＲＳＶプロモーター及びアデノウイルスの３部からなる（ｔｒｉｐｒａｔｉｔｅ）リーダー配列の下流にクローン化され、これは、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル及び相同組み換え領域を有していた。アルカリ溶解方法を使用して大規模なプラスミド調製を行い、標準プロトコールに従いＣｓＴＦＡ勾配を利用して精製した。その後、ｃＤＮＡを配列決定した。ｓｐｈ Ｋ１αコード配列は１，１４９ｂｐ（配列番号５）であり、３８２個のアミノ酸からなる蛋白質（配列番号６）をコードしていた。これらのｃＤＮＡ配列及びアミノ酸配列は図２に示した。
【００５２】
組み換えアデノウイルスベクターの生成
ｓｐｈ Ｋ１αｃＤＮＡをアデノウイルスベクター内にｌｏｘ 組み換え３プラスミドトランスフェクションシステムを用いて組み込んだ。Ｓ８細胞としても知られている、ＡＥ１−２ａ細胞（Ｇｏｒｚｉｇｌｉａ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．， Ｖｏｌ． ７０， Ｎｏ．６， ｐｇｓ． ４１７３−４１７８ （１９９６））を５％熱不活性化処理したウシ胎児血清（ＦＢＳ）含有リヒター培地で培養した。ＡＥ１−２ａ細胞の一過性トランスフェクションを、Ｌｉｐｏｆｅｃｔ ＡＭＩＮＥ−Ｐｌｕｓ 試薬システム（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ， ＭＤ）を用いて０．５μｇのＮｏｔＩ 消化ｐＡｖ１ｘｓｐｈ Ｋ１α、０．５μｇのｐＣｃｒｅ及び１μｇのＣｌａＩ 消化ｐＳＱ３ＤＮＡで実施した。プラスミドｐＳＱ３は、Ｅ１，Ｅ２ａ及びＥ３配列を欠く、アデノウイルス構造遺伝子を含む３１，５７４ｂｐプラスミドである。
Ｓ８細胞をリポフェクタミン試薬／ＤＮＡ沈殿と共に３７℃で１６時間インキュベートした。沈殿を除去し、単層をＰＢＳで洗浄した。５％ＦＢＳ及び０．３μＭデキサメタゾンを含有するリヒター培地を細胞に添加した。細胞を３７℃で約５〜７日インキュベートした。その後、馴らし培地及び細胞を回収し、凍結及び融解を３回繰り返し、細胞デブリスをペレット化した。馴らし培地をデキサメｔａｚｏン誘導Ｓ８細胞の新鮮なプレートの感染に使用した。細胞変性効果がトランスフェクションの約１２〜１５日後に観察された。ウイルスをデキサメタゾン誘導Ｓ８細胞の１５ｃｍ皿で増幅させた。組み換えＡｖ３ｓｐｈ Ｋ１αベクター（図３）を精製し、大規模な調製シードロットを作成した。
【００５３】
サザーンブロット分析
Ａｖ３ｓｐｈ Ｋ１αのゲノム組織及び精製度は、制限エンドヌクレアーゼ消化し、３２Ｐ標識ｓｐｈ Ｋ１αｃＤＮＡプローブを用いた標準プロトコールに従いサザーンブロット分析によって、単離したウイルスＤＮＡをＤＮＡ分析することによって確認した。公開ＰＣＴ出願番号ＷＯ９６／１８４１８ に記載のように、ＤＮＡをＡｖ３ｎＢｇ及びＡＶ３ｓｐｈ Ｋ１αから単離し、それぞれ１μｇをＫｐｎＩ 及びＳａｌＩ で消化し、０．８％アガロース／ＴＡＥゲルにかけた。レーン１〜５は、ＤＮＡ分子量マーカー（レーン１）、ＫｐｎＩで消化したＡｖ３ｎＢｇ及びＡＶ３ｓｐｈ Ｋ１α（レーン２及び３）、及び、ＳａｌＩ で消化したＡｖ３ｎＢｇ及びＡＶ３ｓｐｈ Ｋ１α（レーン４及び５）である。ＤＮＡ断片をナイロン膜に移し、０．５Ｍ　ＮａＰＯ４、１ｍＭ　ＥＤＴＡ、０．５％　ＢＳＡ、７％　ＳＤＳにおいて、６５℃で２時間プレハイブリダイズした。標準プロトコールに従い、膜をシャトルベクターへのクローニングに使用したＨｉｎｄＩＩＩ／ＮｏｔＩ 消化断片（１５３１ｂｐ）と６５℃で一晩インキュベーションし、ＳＳＣ／ＳＤＳ含有緩衝液中で６５℃で洗浄した。膜を室温で２０分間フィルムに露光した。Ａｖ３ｓｐｈ Ｋ１αに由来する期待された断片がサザーンブロット分析によって得られた（データ示さず）。
【００５４】
【実施例２】
スフィンゴシンキナーゼ活性
まず、スフィンゴシンキナーゼアデノウイルスベクターをインビトロでキャラクタライゼーションした。この蛋白質に対する免疫学的試薬が現時点では利用することができないので、Ａｖ３ｓｐｈ Ｋ１αで形質導入された細胞のスフィンゴシンをＳＰＰへ変換する能力を試験した。
【００５５】
Ｓ８細胞、Ａ５４９細胞（ＡＴＣＣ　Ｎｏ．ＣＣＬ−１８５）、冠動脈平滑筋細胞（ＣＡＳＭＣ）、又はヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を、ＡＶ３ｓｐｈ Ｋ１α或いはＡＶ３Ｎｕｌｌで多重感染度（ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ ｏｆ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ：ＭＯＩ）１００にて形質導入し、又は、モック（偽り）形質導入した。
【００５６】
形質導入の２日後、細胞を収穫し、反応溶液中での凍結―融解にて溶解した。細胞溶解物を遠心分離（１００，０００ｘｇ， ６０分、４℃）で細胞質及び膜画分に分別した。スフィンゴシンキナーゼ活性を５０μＭスフィンゴシン（５％トライトンＸ−１００中に溶解）及びＭｇＣｌ２（２００ｍＭ）含有Ｐ３２ＡＴＰの存在下で測定し、３７℃で１５分間インキュベートした。
【００５７】
２０μｌの１Ｎ　ＨＣｌ、０．８ｍｌのクロロホルム／メタノール／ＨＣｌ（１００：２００：１、ｖ／ｖ）、及び２４０μｌの２Ｍ　ＫＣｌを添加して反応を停止した。遠心分離で相を分離した。有機相中の標識ＳＰＰをシリカゲルＧ６０上の薄層クロマトグラフィで、１−ブタノール／エタノール／酢酸／水（８０：２０：１０：２０， ｖ／ｖ） で分離し、オートラジオグラフィで視覚化した。
【００５８】
モック形質導入されたＳ８，Ａ５４９，ＣＡＳＭＣ，及びＨＵＶＥＣのスフィンゴシンキナーゼ酵素活性は非常に低いレベルであった。Ａｖ３Ｎｕｌｌで形質導入されたＳ８，Ａ５４９，及びＣＡＳＭＣはスフィンゴシンキナーゼ酵素活性の量に実質的な変化を示さなかった。対照的に、アデノウイルスで形質導入したＨＵＶＥＣでは明らかに内在性のスフィンゴシンキナーゼ活性が増大した。Ａｖ３ｓｐｈ Ｋ１αで形質導入された全ての細胞において、実質的に高いスフィンゴシンキナーゼ活性が見られた。これらのデータから、スフィンゴシンキナーゼをコードするアデノウイルスベクターによって、高レベルのＳＰＰを生成する細胞の能力が特異的に増大したことがわかる。これらの結果から、該ベクターがＳＰＰの細胞レベルを増大させることの出来る機能的なスフィンゴシンキナーゼ酵素を発現することが示された。
【００５９】
【実施例３】
マトリゲルインプラントアッセイを用いるインビボ分析
試験物質を予め混合した液体マトリゲル（Ｍａｔｒｉｇｅｌ）（基底膜蛋白質の滅菌抽出物）を含む試料を予め調製して、１．０ｍｌチューバールーリン（ｔｕｂｅｒｕｌｉｎ）シリンジにＧ２７針でプレロードした。動物を麻酔し、２５０ｎｇ／ｍｌ 又は１．２μｇ／ｍｌ のＦＧＦ、アデノウイルスベクター又は該アデノウイルスベクターで形質導入された細胞をを含む０．５ｍｌの未希釈マトリゲルを、Ｇ２７針を使用して、中線の尾部分内に各動物当り１回皮下注射した。マトリゲルは迅速に固形ゲルを形成し、これは７日以上持続する。７日目に動物をＣＯ２で安楽死させ、マトリゲルプラグを組織分析及びヘモグロビン測定の為に回収した。該組織を内皮細胞特異的マーカーＣＤ３１、及び平滑筋細胞マーカーα平滑筋アクチンで染色した。
【００６０】
Ａｖ３ｓｐｈ Ｋ１αがインビボにおける脈菅形成を誘導するか否かを測定するために、胸腺欠損マウスにおけるマトリゲルインプラントモデルを使用した（Ｐａｓｓａｎｉｔｉ， ｅｔ ａｌ．， Ｌａｂ． Ｉｎｖｅｓｔ．， Ｖｏ．６７， Ｎｏ．４， ｐｇｓ．５１９−５２８， １９９２）。細胞当たり１００粒子のＡｖ３ｓｐｈ Ｋ１αで形質導入したＳ８細胞を０．５マトリゲルと混合して、皮下に７日間埋め込んだ。組織学的分析によれば、Ａｖ３ｓｐｈ Ｋ１αは明らかにｂＦＧＦ誘導の脈菅形成を増大させた（データ示さず）。Ａｖ３ｓｐｈ Ｋ１α形質導入細胞の存在下では、より大きく、成熟し、且つ、数の増えたＣＤ−３１陽性血管構造の出現が明らかであった。対照的に、コントロールであるＡｖ３ｎｕｌｌベクターは脈菅形成を促進しなかった。次に、Ａｖ３ｓｐｈ Ｋ１αベクターのマトリゲルへの直接の取り込みによってｂＦＧＦ誘導脈菅形成が増大するか否か検討した。全部で１ｘ１０９個の粒子を２５０ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦと混合してインプラントアッセイで試験した。図４に示されるように、マトリゲルにおけるヘモグロビン濃度の測定から分かるように、ベクターの直接の取り込みによって、脈菅形成応答の増大を促進した。増加した脈菅形成応答はＡＶ３ｓｐｈ Ｋ１α形質導入細胞により生じたものに類似していた。従って、我々は、アデノウイルスベクターを介するスフィンゴシンキナーゼの過剰発現によって血管形成が実質的にインビボで増大し、最も顕著には、新たな血管のサイズ及び数の増加を促進したものと結論する。
【００６１】
図５では、スフィンゴシンキナーゼのを発現するアデノウイルスベクターの添加によって、インビボでのマトリゲルシステムにおいて形成される新生血管の性質が著しく変化することが示されている。図５Ａは、スフィンゴシンキナーゼをコードするアデノウイルスベクターで形質導入したＳ８細胞で処理したマトリゲルのヘマトキシン及びエオシン染色の断片を示している。これには、互いに並行して伸びる小動脈及び小静脈を含む血管ネットワーク及び毛細血管のネットワークがはっきりと見られる。更に、これら血管内の赤血球細胞の存在から、パテント（ｐａｔｅｎｔ） 血管が存在することが明らかである。図５Ｂはα平滑筋（α―ＳＭ）アクチン染色の同じ断面である。この断面によれば、内皮細胞を取り囲む少なくとも一層のアクチン陽性細胞の存在が示されている。対照的に、図５Ｃによれば、ＦＧＦで処理したマトリゲルプラグは毛細血管を生成したが、最小量のアクチン陽性細胞しかなかった。スフィンゴシンキナーゼベクター又は該ベクターで形質導入した細胞で処理したマトリゲルにおいて、常に、より大きく且つ一定したα―ＳＭアクチン染色が観察された。ＦＧＦ誘導血管ではα―ＳＭアクチン陽性細胞の量が様々であった。
【００６２】
【実施例４】
スフィンゴシンキナーゼが媒介する心筋細胞の保護
細胞系及び培養条件：ヒト胎児心筋細胞（ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅ）（クローンテック社、４〜７継代）を７５ｃｍ２組織培養フラスコ（ファルコンプリマリア）で、５％ウシ胎児血清、０．５μｇ／ｍｌヒト組換え上皮増殖因子、５ｍｇ／ｍｌインシュリン、１μｇ／ｍｌヒト組換え繊維芽細胞増殖因子、５０ｍｇ／ｍｌゲンタマイシン及び５０μｇ／ｍｌアンフォテリシン−Ｂを添加した平滑筋培養培地−２（クローンテック社）中、３７℃、９５％空気／５％ＣＯ２加湿度雰囲気で培養した。培地を吸引し、０．５ｍＭＥＤＴＡ／０．２５ｍｇ／ｍｌトリプシン溶液で３０秒間すすぎ、細胞をサブカルチュアした。
【００６３】
アポトーシスアッセイ：　血清及びグルコース無添加のダルベッコ変性培地（ライフテクノロジー社）を添加し、予め９５％窒素／５％ＣＯ２で灌流したインキュベーター中で細胞を培養することによって心筋細胞培養物における虚血を誘導した。所定時間後に、細胞を低酸素のインキュベーターから取り出し、血清及びグルコースを含む完全培地において再酸化し、３７、９５％空気／５％ＣＯ２加湿度雰囲気に置いた。心筋細胞を温度制御の水浴（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｃｈｉｃａｇｏ， ＩＬ）に４２℃で３０分間に浸して熱ショックを与えた。熱ショックへの暴露に続いて、細胞を３７℃のＣＯ２インキュベーター内で６時間インキュベートし、アポトーシス誘導に関して分析した。アポトーシス評価に先立ち、細胞を無血清培地中にて１０μＭのＣ６−セラマイド（Ｎ−ヘキサノイルスフィンゴシン）で一晩処理した（Ｂｉｏｍｏｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｐｌｙｍｏｕｔｈ Ｍｅｅｔｉｎｇ， ＰＡ）。文献（Ｈｒｅｎｉｕｋ， Ｄ．， Ｇａｒａｙ， Ｍ， Ｇａａｒｄｅ， Ｗ．， Ｍｏｎｉａ， Ｂ．Ｐ．， ＭｃＫａｙ， Ｒ．Ａ． 及びＣｉｏｆｆｉ， Ｃ．Ｌ． ＭｏｌＰｈａｒｍａｃｏｌ． ５９：８６７−８７４， ２００１）に記載のように、アクリジンオレンジ及びエチジウムブロマイドを使用して蛍光顕微鏡により、アポトーシスの形態学的特徴（クロマチン凝縮及び断片化）について心筋細胞を検査した。簡単に述べると、アクリジンオレンジ及びエチジウムブロマイド（シグマ）保存溶液（１：１）５０μｌを３５ｃｍ培養皿内で増殖している細胞上の培地（１ｍｌ）に添加して、アポトーシスを評価した。カバースリップを装着し、ＦＩＴＣフィルター装備の顕微鏡を用いる蛍光顕微鏡（ｘ６００）にてアポトーシスの形態学的特徴をモニターした。ランダムに選んだ視野からの少なくとも２００個の細胞を計数し、以下の式に従って定量化した。
％アポトーシス細胞＝（アポトーシス細胞数／計数した全細胞数）ｘ１００
【００６４】
心筋細胞のアデノウイルスによる形質導入：　ヒト心筋細胞のアデノウイルスベクターによる形質導入をマーカー遺伝子であるβガラクトシダーゼをコードするアデノウイルスベクター（Ａｖ３ｎｇ）を用いて最適化した。簡潔に述べると、３５ｃｍプリマリア（Ｐｒｉｍａｒｉａ）組織培養皿内で増殖している心筋細胞を、フージェン（Ｆｕｇｅｎｅ）−６の１：１０００μｌ希釈の存在下で、０．５ｍｌ無血清培地中で細胞当たり１０−５００個の粒子のアデノウイルスベクターで６時間、３７℃で感染させて、その後、１ｍｌの完全培地を加えて一晩インキュベートした。９６穴プリマリア培養プレート内で増殖した心筋細胞を、１００μｌ無血清培地中でＡｖ３ｎＢｇで６時間、３７℃で感染させて、その後、１００μｌの完全培地を加えて一晩インキュベートした。
【００６５】
スフィンゴシンキナーゼの過剰発現による心筋細胞のアポトーシス（Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）からの保護：　セラミド（Ｃｅｒａｍｉｄｅ）（ｎ＝３）、熱ショック（Ｈｅａｔ Ｓｈｏｃｋ）（ｎ＝３）、及び虚血／再酸素化 （Ｉｓｃｈｅｍｉａ／Ｒｅｏｘｙ）（ｎ＝２）により誘導されるヒト心筋細胞におけるアポトーシスを阻止する可能性について、ＡＶ３ＳＫベクター及びその酵素産物、スフィンゴシン１−ホスフェート（Ｓ−１−Ｐ）双方について評価した。ベクターが媒介する試験については、ベクター処理の３日後に実験をおこなった。図６に示されたデータによれば、Ｓ−１−Ｐはヒト心筋細胞死の有効な阻害剤である。Ａｖ３ＳＫ形質導入細胞も又、熱ショック及び虚血／再酸素化により誘導されるアポトーシスに対して殆ど完全に抵抗することが出来た。しかしながら、Ａｖ３ＳＫベクターはセラミドにより誘導されるアポトーシスは部分的に阻止することができたのみであった。心筋細胞におけるこのデータから、スフィンゴシンキナーゼ及びＳ１Ｐの心筋保護の役割が支持される。スフィンゴシンキナーゼを発現するベクターを使用する遺伝子治療は、心筋細胞の損傷からの長期にわたる保護、及び鬱血性心不全に対する保護に対する治療様相を表すものである。
【００６６】
本明細書に引用される特許、特許出願、刊行物（公開特許明細書を含む）、寄託番号、及びデータベース番号は、参照されることで、恰も、特許、特許出願、刊行物（公開特許明細書を含む）、寄託番号、及びデータベース番号の夫々が具体的に個別に取り込まれるのと同じ程度に、その全ての開示内容が本明細書内に取り込まれるものである。
【００６７】
以上これまで一般的に記載された本発明は、以下の実施例に則してより容易に理解されるように説明される。これらの実施例は本発明の或る具体例を記載する目的のみで含まれるものであって、本発明をいかなる意味でも限定するものではない。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１はプラスミドｐＡｖ１ｘｓｐｈ Ｋ１αの図である。
【図２】図２はマウススフィンゴシンキナーゼ１αのｃＤＮＡ及びアミノ酸配列を示す。
【図３】図３はアデノウイルスベクターＡｖ３ｓｐｈ Ｋ１αの模式図である。
【図４】図４はヘモグロビンアッセイである。マトリゲルをドライアイスで瞬間凍結し、一晩乾燥させる。乾燥重量を記録し、０．５ｍｌの０．５％Ｔｗｅｅｎ及び水でプラグを再度水和する。ホモゲナイゼーションした後、プラグを遠心分離（１４，０００ ｒｐｍ， ３０分間）する。上清を回収し、その吸光度を４０５ｎｍで測定し、ヘモグロビン標準で得られた標準曲線を用いて、マトリゲル（ｍｇｅ）１ｍｇあたりのヘモグロビン（μｇ）に換算する。
【図５】図５は、スフィンゴシンキナーゼをコードするアデノウイルスベクターの添加がインビボのマトリゲルシステムにおいて形成される新生血管の性質に及ぼす顕著な差異を示す。図５Ａは、スフィンゴシンキナーゼをコードするアデノウイルスベクターで形質導入したＳ８細胞で処理したマトリゲルのヘマトキシン及びエオシン染色の断片を示している。図５Ｂはα平滑筋（α―ＳＭ）アクチン染色の同じ断面である。図５Ｃは毛細血管を生じたＦＧＦで処理したマトリゲルプラグである。
【図６】図６はスフィンゴシンキナーゼが媒介する心筋細胞の保護を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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