(57)【要約】【課題】細胞表面受容体の刺激を特定の標的細胞に限定する多重特異性試薬、それを用いる細胞の処置方法および医薬製剤を提供する。【解決手段】多重特異性試薬（１５）は少なくとも１つの、リガンド多重結合による刺激を必要とする細胞表面受容体（１２）に対する第１の結合部位（１７）を有する。この試薬（１５）は細胞表面受容体（１２）と同一の細胞（１０）で発現される標的抗原（１４）に対する第２の結合部位を有する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つの、リガンド多重結合による刺激を必要とする細胞表面受容体に対する第１の結合部位、および少なくとも１つの、標的抗原に対する第２の結合部位を有する多重特異性試薬であって、前記の細胞表面受容体と標的抗原とが同一の細胞で発現されることを特徴とする多重特異性試薬。
【請求項２】
多重特異性が、二重特異性抗体またはその抗原結合フラグメントＦ（ａｂ）ｘおよび組換えによって作製された受容体リガンドよりなる群から選択される、請求項１に記載の多重特異性試薬。
【請求項３】
標的抗原が、リガンド多重結合による刺激を必要とする細胞表面受容体でもある、請求項１または請求項２に記載の多重特異性試薬。
【請求項４】
細胞表面受容体が、ＡＰＯ−１、ＴＲＡＩＬ−Ｒ１およびＴＲＡＩＬ−Ｒ２で代表される細胞死受容体、ならびに抗原提示細胞を活性化するＣＤ４０で代表される受容体よりなる群から選択される、請求項１ないし３のいずれか一項に記載の多重特異性試薬。
【請求項５】
標的抗原が、腫瘍細胞特異的細胞表面抗原、Ｔ細胞特異的細胞表面抗原、一般にはＣＤマーカー、および細胞特異的マーカーよりなる群から選択される、請求項１ないし４のいずれか一項に記載の多重特異性試薬。
【請求項６】
請求項１ないし５のいずれか一項に記載の試薬を、細胞表面受容体の標的抗原により限定される刺激を誘発するために使用することを特徴とする細胞の処置方法。
【請求項７】
細胞表面受容体が細胞死受容体であって、それにより標的抗原により限定されるアポトーシスを誘導することを特徴とする請求項６に記載の処置方法。
【請求項８】
標的抗原が腫瘍細胞で特異的に発現され、それにより腫瘍細胞を選択的に死滅させることを特徴とする請求項６に記載の処置方法。
【請求項９】
標的抗原がＴ細胞で特異的に発現され、それにより活性化Ｔ細胞を免疫抑制に関連して選択的に死滅させることを特徴とする請求項６に記載の処置方法。
【請求項１０】
標的抗原が抗原提示細胞で特異的に発現され、それによりこれらの細胞を細胞表面受容体ＣＤ４０によって特異的に活性化させることを特徴とする請求項６に記載の処置方法。
【請求項１１】
請求項１ないし５のいずれか一項に記載の試薬と医薬上許容される賦形剤とを含んでなることを特徴とする医薬組成物。
【請求項１２】
細胞表面受容体の標的抗原により限定される刺激を得るための、請求項１ないし５のいずれか一項に記載の多重特異性試薬の使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、一般に、細胞の刺激、特に細胞表面受容体の選択的活性化に関する。
【０００２】
【従来の技術】
細胞外シグナルがリガンドの細胞外結合を細胞内生化学的事象へと変換できる受容体タンパク質によって原形質膜を通して伝達されることは周知である。このように、細胞表面受容体は細胞内シグナル経路を活性化することで細胞内の異なる部位へと導き、これらの部位で特定の事象を誘導している。
細胞表面受容体は全て、細胞内外の連絡を確立する膜貫通タンパク質またはタンパク質複合体である。多くの受容体は、それらの関連リガンドと結合すると決まったタンパク質コンホメーションの変化を受ける。このコンホメーション変化によってイオンチャンネルが開放される受容体種や、またコンホメーション変化によって受容体が細胞内シグナルタンパク質およびシグナル酵素と会合してこれらのタンパク質および酵素を活性化できるようにその細胞質領域が変質する受容体種も存在する。
【０００３】
受容体と結合するリガンドの重要な作用は、多くの場合、受容体を多重結合または架橋することによって細胞内シグナルカスケードを活性化するというものである。このような表面受容体の架橋は受容体の生理学的リガンドによって達成され、あるいはまた、例えば好適な架橋抗体を用いてｉｎ ｖｉｔｒｏで達成することができる。
例えば、リンパ球の場合、１つの結合部位しか持っていない（ａｂ’）フラグメントと結合することから、特定の抗原受容体を刺激することはできないが、受容体がクラスターを形成すると、（Ｆａｂ’）２抗体フラグメント、すなわち、２つの結合部位を有するフラグメントを結合することから、細胞が活性化されることが示されている。また、リンパ球が免疫グロブリンＦｃ部分に対する受容体を有する細胞と結合する完全抗体によって刺激される場合にはさらに強い反応が得られる。言い換えると、完全抗体の不変領域に対するＦｃ受容体を有する他の細胞によって提供される多くの同一抗体分子と結合させることにより、受容体が効率的に架橋される場合に活性化が起こる。
【０００４】
このように受容体は固定化された抗体によって効率的に架橋される。
また、ｉｎ ｖｉｔｒｏではかかる架橋はプロテインＡによってまたは受容体と結合する抗体の不変領域に特異的に結合するその他の抗体によって架橋される受容体と結合する抗体の不変領域によって達成される。
例えば、ＴＮＦ（腫瘍壊死因子）ファミリーのメンバーが三量体として作用すること、またリガンドによって誘導されるそれらの受容体の三量体化がシグナル伝達開始における重要な事象であることが知られている。
【０００５】
Ｄｈｅｉｎら（非特許文献１参照）では、ＡＰＯ−１細胞表面抗原を効率的に架橋することによってアポトーシスが誘導されることが報告されている。彼らはヒツジ抗マウス抗体によって架橋される抗ＡＰＯ−１ Ｆ（ａｂ’）２フラグメントがＡＰＯ−１受容体と結合するときにＳＫＷ６．４細胞でアポトーシスが誘導されるが、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントが単独で結合する場合には、これを達成するには不十分であることを示している。著者らはこれらの結果から、抗体の二価性、すなわちＡＰＯ−１細胞表面抗原に対して２つの結合部位を有することはアポトーシスの誘導に不十分であり、ＡＰＯ−１細胞表面抗原の効率的な架橋がこれを達成するのに必要であるとの結論を出している。
【０００６】
ＡＰＯ−１抗原の配列、およびＡＰＯ−１抗原に対するモノクローナル抗体が特許文献１に記載されている。この特許文献１では、ＡＰＯ−１抗原を有する腫瘍の治療に抗ＡＰＯ−１抗体が使用でき、さらにこの抗体を用いて異なる種類の細胞でアポトーシスを誘導できることもまた記載されている。
しかし、身体の多くの細胞がＡＰＯ−１細胞表面抗原を有することが知られており、これは抗ＡＰＯ−１抗体を腫瘍患者へ投与することによって腫瘍細胞の攻撃だけではなく、さらに、同様にＡＰＯ−１表面抗原を有するその他の、健康でかつおそらくは必要な細胞の攻撃さえももたらしてしまうことを意味している。
【０００７】
このような背景から、公知の抗ＡＰＯ−１抗体の腫瘍患者の治療に向けた使用は、例えばある特定の環境下でしかふさわしくないものである。
ＴＲＡＩＬ（ＴＮＦ関連アポトーシス誘導リガンド）受容体Ｒ１およびＲ２は、架橋によって活性化される細胞死受容体のもう１つのタイプである（非特許文献２参照）。著者らは、全ての抗ＴＲＡＩＬ−Ｒ２抗体と２種類の抗ＴＲＡＩＬ−Ｒ１抗体では、それらを溶解状態で細胞に加えた場合、ＴＲＡＩＬ感受性黒色腫細胞を全く溶解させることができないか、または最小限の溶解しか生じなかったが、これらの抗体がＴＲＡＩＬ−Ｒ１およびＴＲＡＩＬ−Ｒ２細胞死受容体の架橋を確保できるようにそれらを培養プレートに固定化した場合、それらはそれらの細胞溶解能力の高まりを示したことを報告している。
【０００８】
細胞死受容体ＴＲＡＩＬ−Ｒ１およびＴＲＡＩＬ−Ｒ２に対する抗体はＴＲＡＩＬ感受性細胞において非特異的にも作用するが、これはそれらが単に治療的価値が少ないことを意味しているにすぎない。
これに加え、二重特異性抗体と呼ばれるもの、すなわち腫瘍関連抗原に対する１つの特異性と、マクロファージ、Ｔリンパ球またはナチュラルキラー細胞のようなこの結合によって活性化される免疫系の防御細胞の表面抗原に対する１つの特異性を有する抗体を防御細胞の活性を特定の標的細胞に向ける癌免疫療法に使用できることが分かっている。
【０００９】
一般に、二重特異性抗体は２つの異なるエピトープと結合可能な抗体であり、かつ各エピトープに対して一価性の抗体である。これらは一価性Ｆ（ａｂ’）フラグメントの酸化によりＦ（ａｂ’）２フラグメントを得ることで、２種類のハイブリドーマ細胞系の融合によりハイブリッドハイブリドーマもしくはグアドローマ細胞を得ることで、あるいは組換えによって作製される。
Ｊｕｎｇら（非特許文献３参照）では、各抗原に対して一価性である二重特異性Ｆ（ａｂ）ハイブリッドフラグメントの調製が記載されている。二重特異性抗体の調製のさらなる参考としては、この刊行物を参照のこと。
【００１０】
著者らは、二重特異性抗体またはフラグメントを使用して、一方で標的細胞の標的抗原と結合し、もう一方でＴ細胞のＣＤ３および／またはＣＤ２８受容体と結合する抗体により標的細胞によって誘導されるＴ細胞の活性化を果たすことができることを示している。
Ｓｅｇａｌら（非特許文献４参照）では、エフェクター細胞をそれが認識しない標的細胞へと向けるための二重特異性抗体の使用についても記載されている。この用途では、二重特異性抗体が標的細胞の表面分子およびエフェクター細胞の表面受容体と結合する。
【００１１】
Ｒｏｏｓｎｅｋら（非特許文献５参照）は、Ｔ細胞で発現されるＭＨＣおよびＣＤ３の両方に対して特異性を有する二重特異性抗体ではＴ細胞の効率的な増殖を誘導できるが、元の抗体２種類の混合物ではこれを行うことができないことを示した。著者らは、この相乗作用が侵害される膜へのＴ細胞受容体／ＣＤ３複合体のアンカーリングによるものという仮説を立てている。これに関して、彼らはＴ細胞受容体が抗原提示細胞（ＡＰＣ）またはそれ自身の膜内にある表面分子にアンカーリングされるかどうかを受容体が識別できないと仮定した上で、ｉｎ ｖｉｖｏで別の細胞の抗原によって引き起こされるＴ細胞受容体／ＣＤ３複合体が膜内のその移動性の変化に反応するものと推測している。
【００１２】
しかしながら、このＴ細胞受容体活性化の機構はあるＴ細胞亜群に限定されるものであり、依然不明である。先行技術ではこれまでこれは、Ｔ細胞受容体とともにＣＤ４またはＣＤ８のような共受容体が刺激され、同時にこの共受容体が刺激に対してシグナルをも発生させるという事実によるものと考えられるＴ細胞受容体特異的な作用であると考えられてきた（非特許文献６参照）。
【００１３】
【特許文献１】
ＵＳ ５，８９１，４３４
【非特許文献１】
Ｄｈｅｉｎら，ＩＮＤＵＣＴＩＯＮ ＯＦ ＡＰＯＰＴＯＳＩＳ ＢＹ ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ ＡＮＴＩＢＯＤＹ ＡＮＴＩ−ＡＰＯ−１ ＣＬＡＳＳ ＳＷＩＴＣＨ ＶＡＲＩＡＮＴＳ ＩＳ ＤＥＰＥＮＤＥＮＴ ＯＮ ＣＲＯＳＳ−ＬＩＮＫＩＮＧ ＯＦ ＡＰＯ−１ ＣＥＬＬ ＳＵＲＦＡＣＥ ＡＮＴＩＧＥＮＳ”， ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， 第１４９巻， １９９２， ３１６６−３１７３頁
【非特許文献２】
Ｇｒｉｆｆｉｔｈら， ”Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ＴＲＡＩＬ Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ｕｓｉｎｇ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ”， ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， 第１６２巻， １９９９， ２５９７−２６０５頁
【非特許文献３】
Ｊｕｎｇら， ”Ｔａｒｇｅｔ ｃｅｌｌ−ｉｎｄｕｃｅｄ Ｔ ｃｅｌｌ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｂｉ− ａｎｄ ｔｒｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ”， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， 第２１巻， １９９１， ２４３１−２４３５頁
【非特許文献４】
Ｓｅｇａｌら， ”Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｉｎ ｃａｎｃｅｒ ｔｈｅｒａｐｙ”， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， 第１１巻， １９９９， ５５８−５６２頁
【非特許文献５】
Ｒｏｏｓｎｅｋら， ”Ｔ ｃｅｌｌ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｂｙ ａ ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉ−ＣＤ３／ａｎｔｉ−ｍａｊｏｒ ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ ｃｏｍｐｌｅｘ ｃｌａｓｓ Ｉ ａｎｔｉｂｏｄｙ”， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， 第２０巻， １９９０， １３９３−１３９６頁
【非特許文献６】
Ｅｍｍｒｉｃｈら， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， １８， ６４５ （１９８８）
【００１４】
【発明が解決しようとする課題】
上記のことを踏まえ、本願の目的は、一般に、細胞表面受容体の刺激を特定の標的細胞に限定する試薬を提供することである。
【００１５】
【課題を解決するための手段および発明の効果】
本発明によれば、この目的は少なくとも１つの、リガンド多重結合による刺激を必要とする細胞表面受容体に対する第１の結合部位、および少なくとも１つの標的抗原に対する第２の結合部位を有する試薬であって、細胞表面受容体と標的抗原とが同一の細胞で発現される、多重特異性試薬によって達成される。
本発明の目的は、このようにして十分に達成される。
【００１６】
このように本願発明者は、多重結合による刺激を必要とする細胞表面受容体を固定化抗体または、例えばプロテインＡによって結合する、もしくはその他の抗体と結合する抗体によって強制的に架橋する必要がなく、その代わりとして、例えば、二重特異性抗体によって一般的には細胞表面受容体の標的抗原により限定される刺激が誘導できることを見出した。
このように、標的抗原を使用して特定の細胞型を選択し、さらにこの細胞型の関連細胞表面受容体を活性化することが可能である。ゆえに、試薬が有する２つの結合部位のうち、一方は機能的役割を担う、すなわち細胞表面受容体に対応するもの、もう一方が特異性を示しうる、すなわち標的抗原限定に対応するものである。本発明者の発見によれば、細胞表面受容体はさらに、また特に、２つの抗原が同じ細胞で発現されるときに効率的に架橋される。どのようにすれば、２つの受容体が同一の細胞で発現される場合であっても、二重特異性抗体によって機能性受容体と機能性受容体を誘発するのに十分な標的受容体との架橋が確保できるのか先行技術では明らかでなかったことから、この結果は驚くべきことである。
【００１７】
【発明の実施の形態】
本願発明者は独自の種々の試験から、この二重特異性による方法により、シグナル作用を有する必要はないが、有していてもよい種々の標的抗原を使用して、例えば、ＣＤ４０ （ＴＮＦ受容体ファミリーの別のメンバー）を刺激することによって細胞死受容体ＡＰＯ−１または抗原提示細胞（ＡＰＣ）を刺激することが可能であることを導き出した。これはＲｏｏｓｎｅｋら、上記、およびＥｍｍｒｉｃｈら、上記、によって行われた研究からは考えられなかったことであり、包括的な試験的立証が必要であった。
【００１８】
上記のことから、本発明はさらにまた、新規試薬が、細胞表面受容体の標的抗原により限定される刺激を誘発するために使用される、細胞処置法に関する。
この方法を用いて、例えば、癌細胞を選択的に死滅させるように、または免疫抑制に関連して、細胞死受容体を発現している活性化Ｔ細胞のアポトーシス死を誘導するように特定の標的細胞の細胞死受容体を刺激することが可能である。
本発明によれば、標的細胞による限定によって細胞死受容体に対して向けられた抗体を使用するときに特に問題となる特異性の欠如が回避されるため、新規試薬は医薬上許容される賦形剤とともに医薬組成物として使用することもできる。
【００１９】
医薬上許容される賦形剤、製剤、その他の選択に使用できる方法は、例えば、最初に記載し、かつその開示を参照により本明細書に組み入れる米国特許第５，８９１，４３４号に記載されている。
一般に、多重特異性、好ましくは二重特異性抗体またはそれらの抗原結合フラグメントＦ（ａｂ’）ｘ、および好ましくは組換えによって作製される受容体リガンドの群から選択される新規試薬が好ましい。
【００２０】
新規多重特異性試薬が満たすべき必要条件は、２つの結合部位、すなわち、細胞表面受容体に対するものと標的抗原に対するもう１つのものとを提供し、受容体と抗原とが同じ細胞で発現されることである。これについては、二重特異性抗体、三重特異性抗体もしくはその他の多重特異性抗体、またはそれらの抗原結合フラグメントを使用して、そうでなければ、好ましくは組換えによって作製される好適な受容体リガンドを使用して達成することができる。
【００２１】
組換えＤＮＡ技術により異なる二重特異性抗体、すなわちタンデム抗体およびダイアボディーを合成することが可能である。タンデム抗体の場合、２つのＳｃＦｖ（単鎖抗原結合タンパク質）の遺伝子断片をリンカー配列によって連結し、１つのペプチドとして合成する。ダイアボディーの場合には、２つのＳｃＦｖが、一方のＬ鎖可変領域が「その」Ｈ鎖可変領域と結合しないでもう一方のＳｃＦｖ分子のものと結合するように、その領域が共有結合されることなく二量体化する傾向が多々あり、この２つのＳｃＦｖは１つの細胞で発現される。このように、二重特異性ダイアボディーを作製することは可能であり、組み合わされる２つのＳｃＦｖ分子のＬ鎖可変領域のＤＮＡ配列は発現ベクターで交換される。それらを合成すると、抗原特異的Ｌ鎖およびＨ鎖の可変領域は互いに結合し、２つの異なる特異性を有する組換え抗体分子が形成する。
【００２２】
ＳｃＦｖの異なる結合ドメインを融合することによって二重特異性抗体を作製する２つのＳｃＦｖの組み合わせに広範なスペクトルの可能性を生みだすことになる。
しかしながら、一般には、ある細胞のいくつかの細胞表面受容体と選択的に結合するいずれもの物質を試薬として使用できるということであり、本発明が二重特異性抗体および二重特異性受容体リガンドに限定されるものではないことを示している。
【００２３】
これに関し、標的抗原は、リガンド多重結合による刺激を必要とする細胞表面受容体でもまたある標的抗原が好ましい。
これに関し、標的抗原は、２つの細胞表面受容体が活性化されると同時に限定されるようにそれ自体が活性化可能な細胞表面受容体である場合が有利である。このように、例えば、２つの細胞表面受容体の同時刺激の結果として、このように選択された細胞に相乗効果を誘導することが可能である。
【００２４】
ＡＰＯ−１、ＴＲＡＩＬ−Ｒ１およびＴＲＡＩＬ−Ｒ２のような細胞死受容体、ならびに抗原提示細胞（ＡＰＣｓ）を活性化するＣＤ４０のような受容体の群から選択される細胞表面受容体がさらに好ましい。
この列挙は細胞表面受容体の例示にすぎず、本発明は多重結合による刺激によって標的細胞で選択された作用を誘導するその他の機能的受容体もまた包含する。
【００２５】
腫瘍細胞特異的細胞表面抗原、Ｔ細胞特異的細胞表面抗原、一般にはＣＤマーカー、および細胞特異的マーカーの群から選択される標的抗原がさらに好ましい。
この列挙もまた例示にすぎず、本発明は特定の標的細胞に特異的ないずれの標的抗原による多重特異性試薬の限定もまた包含する。
この目的には白血球の異なる亜群、例えば、またはそれらの異なる発生もしくは分化段階を同定するＣＤマーカーが特に好適である。また、増え続けているＣＤ抗原のリストは他の細胞型、例えば内皮細胞、神経細胞または繊維芽細胞で見られるような分子もまた包含する； これについては、Ｌｅｘｉｋｏｎ ｄｅｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｅ ［Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｙ］， Ｓｐｅｋｔｒｕｍ Ａｋａｄｅｍｉｓｃｈｅｒ Ｖｅｒｌａｇ ＧｍｂＨ， Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ， １９９９， 第ＩＩＩ巻， ３２３−３２９頁を参照のこと。
【００２６】
本発明の多重特異性試薬は、このように標的抗原により限定される細胞表面受容体の、第１の結合部位により刺激される機能により普遍的に使用できる。細胞を処置する方法において細胞表面受容体が細胞死受容体である場合には、標的抗原により限定されるアポトーシスが誘導できる。この方法は、例えば、癌の免疫療法に使用できる。
よって、この新規な方法の標的抗原を腫瘍細胞で特異的に発現させる場合、選択的に死滅させるのは腫瘍細胞だけであり、活性化可能な細胞表面受容体もまた含む体のその他の細胞は標的抗原がないために損傷を受けない。
【００２７】
また、標的抗原をＴ細胞で特異的に発現させる場合、細胞死受容体を発現しているＴ細胞を選択的に破壊することができる。このことは、例えば、臓器移植に関連する免疫抑制において有利である。
標的抗原を抗原提示細胞で特異的に発現させる場合、多重特異性試薬が標的抗原に対する結合部位に加え、ＣＤ４０に対する１つの結合部位を少なくとも有するならば、これらのＡＰＣを選択的に刺激することができる。
【００２８】
要約すれば、本発明の結果として、少なくとも２つの結合部位、すなわち、刺激を受けるであろう細胞表面受容体に対するものと同じ細胞の標的抗原に対するもう１つのものとを有し、この標的抗原によって標的細胞が特定される試薬を用いることにより、特定の細胞表面受容体の活性化を特定の標的細胞に限定することが初めてできるようになったといえる。
その他の利点については記載および添付の図面より明らかである。
【００２９】
上記の態様、および以下でさらに説明する態様が、本発明の範囲を外れることなく、各々の場合で具体的に示した組み合わせだけでなく、その他の組み合わせでも、または単独でも使用されうるのは、もちろん明らかである。
以下、本発明の実施形態を図面で示し、次の説明でさらに詳細に記載する。
【００３０】
【実施例】
実施例１： 二重特異性抗体の標的細胞への結合
図１は各表面１１上で細胞表面受容体１２と標的抗原１４が発現される標的細胞１０を示している。
そのＦａｂフラグメント１６が標的抗原１４に対する１つの結合部位を有し、かつそのＦａｂフラグメント１７が細胞表面受容体１２に対する１つの結合部位を有する二重特異性抗体１５は標的細胞１０と結合する。Ｆｃフラグメントが結合または架橋のいずれとも関係がないことから、以下で記載する試験でＦｃ部分のない抗体フラグメントを使用することができた。２つの抗原１２および１４を認識する二重特異性抗体１５は同じ細胞にある両方の抗原と結合する。
【００３１】
標的細胞１０の細胞表面受容体１２はＦａｂフラグメント１６が標的抗原１４と結合すると同時に刺激を受けているにすぎない。
また、図１Ａで示されるように、二重特異性抗体１５が２つの標的細胞１０を二細胞性様式で互いに連結する可能性を除外することができない。これは、各細胞１０が２つの抗原１２および１４を有するある細胞型では、二重特異性抗体１５が図１Ｂの場合のように単細胞、または図１Ａの場合のように二細胞のいずれかと結合する可能性があるが、いずれの場合においてもこの抗体によって標的抗原１４と同じ細胞に存在する細胞表面受容体１２の標的抗原により限定される刺激が誘導されることを意味している。
【００３２】
ＡＰＯ−１、ＴＲＡＩＬ−Ｒ１またはＴＲＡＩＬ−Ｒ２のような種々の細胞死受容体が細胞表面受容体１２として機能を果たしうるが、細胞表面受容体１２の限定された刺激を誘導するのに使用できるいずれの細胞表面抗原も標的抗原１４として使用できる。
言い換えれば、細胞表面受容体１２は標的抗原１４を有するかまたは二細胞性結合の場合にはかかる標的細胞１０のすぐ近くに存在する標的細胞１０で刺激を受けているにすぎない。
【００３３】
この一般原理については、細胞死受容体ＡＰＯ−１の標的抗原により限定される刺激を例として用いて、以下で説明する。
実施例２： 使用する細胞系
使用した細胞系はＳＫＷ６．４細胞およびＪｕｒｋａｔ細胞である。ＳＫＷ６．４細胞（ＡＴＣＣ： ＴＩＢ ２１５）はＢリンパ球由来であり、ＣＤ９５（ＡＰＯ−１）を発現し、かつアポトーシス感受性である。
【００３４】
Ｊｕｒｋａｔ細胞（ＡＴＣＣ： ＴＩＢ １５２）はＴリンパ球由来であり、これもまたＣＤ９５を発現し、かつアポトーシス感受性である。
両方の細胞系を１０ｍＭグルタメート、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンおよび１０％熱失活ウシ胎児血清（Ｓｉｇｍａ， Ｄｅｉｓｅｎｈｏｆｅｎ， Ｇｅｒｍａｎｙ）を添加したＲＰＭＩ１６４０培地でインキュベートする。
両方の細胞系で発現されるＡＰＯ−１受容体（ＣＤ９５）を細胞表面受容体として選択し、ＣＤマーカー ＣＤ２、ＣＤ５、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２８およびＣＤ４０を標的抗原として選択した。
【００３５】
ＣＤ９５抗体はＳａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ， Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａから購入した。６種類の使用標的抗原に対して向けられるモノクローナル抗体は、例えば、Ｂｉｏｔｒｅｎｄ Ｃｈｅｍｉｋａｌｉｅｎ ＧｍｂＨ， Ｅｎｐｅｎｅｒ Ｓｔｒａβｅ １５７， Ｃｏｌｏｇｎｅから入手できる。
ＡＰＯ−１および６種類の標的抗原の発現を調べるため、ＳＫＷ６．４細胞およびＪｕｒｋａｔ細胞を対応する抗体（１０μｇ／ｍｌ）とともにインキュベートした後、マウスＩｇＧに対して向けられたＦＩＴＣ標識抗体（Ｄａｋｏ， Ｈａｍｂｕｒｇ， Ｇｅｒｍａｎｙ）とともにインキュベートした。ＦＡＣＳ ＣａｌｉｂｕｒおよびＣｅｌＱｕｅｓｔ ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ， Ｓａｎ Ｊｏｓｅ， Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を用いてＦＡＣＳ解析を行った。
【００３６】
ＡＰＯ−１が両方の細胞系で発現され、ＣＤ２０とＣＤ４０、幾分弱いがＣＤ１９がＳＫＷ６．４細胞で発現され、ＣＤ２８と、幾分弱いがＣＤ２とＣＤ５とがＪｕｒｋａｔ細胞で発現されることが分かった。
実施例３： 二重特異性抗体フラグメントの調製
二重特異性抗体フラグメントは連結部のジスルフィド結合を選択的に還元して再び酸化することによりを調製した（例えば、Ｊｕｎｇら、上記参照）。使用した反応条件は、ホモ二量体の形成を妨ぎ、かつ改変された元のＦａｂフラグメントとほぼ完全にハイブリダイズできるように選択した。
【００３７】
次の試験では、ＡＰＯ−１抗体のＩｇＧ２ａ変異体をＳＫＷ６．４細胞では抗原ＣＤ１９、ＣＤ２０およびＣＤ４０に対する抗体と、Ｊｕｒｋａｔ細胞では抗原ＣＤ２、ＣＤ５およびＣＤ２８に対する抗体とハイブリダイズさせた。
図面では、このように調製した二重特異性抗体フラグメントをそれらの２つの特異性により（各々を×で分けて示している）識別している。
実施例４： 標的抗原により限定されるアポトーシス誘導の確認
実施した試験の目的は、二重特異性抗体フラグメントが、これもまた１つの結合部位を有する二重特異性抗体に対応する関連標的抗原も発現している標的細胞のＡＰＯ−１受容体を刺激することしかできないかどうかを調べることであった。
【００３８】
この作用を標的細胞の破壊速度によって確認するため、標的細胞（ＳＫＷ６．４およびＪｕｒｋａｔ）を１μｇの関連抗体構築物／ｍｌを加えて９６ウェルプレート（１×１０５／ウェル）で３反復でインキュベートした。
インキュベーション１６時間後、ミトコンドリア酵素によって別の物質に変えられ、進行中に濃紅色ホルマザンを形成するテトラゾリウム塩ＷＳＴ−１（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ， Ｍａｎｎｈｅｉｍ， Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて残存する細胞の生存力を測定した。
【００３９】
光学濃度はＥＬＩＳＡレーザー（ＳｐｅｋｔｒａＭａｘ ３４０， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ， Ｓｕｎｎｙｖｉｌｌｅ， Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を使用して測定し、死滅した細胞の割合％（その状態での光学濃度をＯＤｘとする）を以下の式：
（１−ＯＤｘ／ＯＤｍａｘ）×１００
（式中、ＯＤｍａｘは抗体不在下で腫瘍細胞によって得られる光学濃度である）
に従い算出した。
【００４０】
いくつかの試験では、その割合をクロム放出試験を用いて測定した。このため、標的細胞を５１Ｃｒ標識クロム酸ナトリウム（８０μＣｉ／ｍｌ、１時間）とともにインキュベートし、次いで完全洗浄し、９６ウェルプレートに３反復で播種した。抗体とともに１６時間インキュベートした後、示された放射能を計数し、死滅細胞の割合％を以下：
ｃｐｍ／ｃｐｍｍａｘ×１００
（式中、ｃｐｍｍａｘは界面活性剤で処理した標的細胞によって放出された放射能である）
のように算出した。
【００４１】
２種類の異なる方法を用いて測定した死滅標的細胞の割合％はかなりの程度で一致していた。
実施例５： 結果
図２は、ＡＰＯ−１およびＣＤ２０に対する特異性を有する二重特異性抗体フラグメント（ＡＰＯ−１−２ａ×ＣＤ２０）ではＣＤ２０陽性ＳＫＷ６．４細胞を効率的に死滅させることができたが、ＣＤ２０陰性のＪｕｒｋａｔ細胞は死滅させなかったことを示している。この両方の細胞系は、アポトーシスを誘導するアゴニスト作用ＩｇＭ抗体（Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈ， Ｍａｒｓｅｉｌｌｅｓ， Ｆｒａｎｃｅ）である抗体７Ｃ１１によってそれら両方ともが死滅するという事実から、ＡＰＯ−１が介在する細胞死に対して感受性であるということになる。
【００４２】
完全抗体またはＦａｂフラグメントのいずれかとして使用した元の抗体２種類の混合物ではＳＫＷ６．４細胞のアポトーシスは全く誘導できなかった。
また、二重特異性抗体フラグメントＡＰＯ−１−２ａ×ＣＤ２０とＡＰＯ−１−２ａ抗体とを同時インキュベートすることで、遮断された二重特異性抗体フラグメントが媒介する細胞溶解がもたらされた。
図３（右側のＦＡＣＳ数値が関連標的抗原の細胞での発現について示している）から、標的細胞で発現される標的抗原量が標的細胞の破壊程度を左右する実質的な要因になっていることが分かる。
【００４３】
Ｊｕｒｋａｔ細胞の有意な溶解はＡＰＯ−１−２ａ×ＣＤ２８構築物によってのみ達成された。
Ｊｕｒｋａｔ細胞の限界破壊を誘導したのはＡＰＯ−１−２ａ×ＣＤ２だけであり、実際に、ＡＰＯ−１−２ａ×ＣＤ５はこれらの細胞に対して全く効果がなかった。一方、ＡＰＯ−１−２ａ×ＣＤ２０およびＡＰＯ−１−２ａ×ＣＤ４０では非常に効果があり、事実上、ＳＫＷ６．４細胞の１００％破壊を誘導した。
ＡＰＯ−１−２ａ×ＣＤ１９およびＡＰＯ−１−２ａ×ＣＤ２８ではＳＫＷ６．４細胞およびＪｕｒｋａｔ細胞各々への効果は小さかった。
【００４４】
これらの結果から、アポトーシスはＡＰＯ−１受容体とともに好適な標的抗原を発現する細胞でしか誘導されないといえる。
【図面の簡単な説明】
【図１】二重特異性抗体と同じ細胞にある２つの異なる抗原との結合の図解
Ａ）二細胞性様式またはＢ）単細胞性様式。
【図２】ＣＤ２０およびＡＰＯ−１に対する特異性を有する二重特異性抗体フラグメントとともに１６時間インキュベートした後のＳＫＷ６．４細胞の選択的死滅（Ｊｕｒｋａｔ細胞は死滅せず）。
【図３】ＡＰＯ−１および異なる標的抗原に対する特異性を有する二重特異性抗体によるＳＫＷ６．４細胞およびＪｕｒｋａｔ細胞の選択的死滅。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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