(57)【要約】本発明は、哺乳動物の中枢神経系および末梢神経系における神経再生の阻害を逆行させ得る薬剤として、ホスホジエステラーゼ４型（「ＰＤＥ４」）のインヒビターの新規な同定に関する。本発明は、ＰＤＥ４発現を調節することによって、神経再生の阻害効果を逆行させ得る薬剤を使用する、組成物および方法を提供する。動物に投与された場合、ニューロンにおけるＰＤＥ４活性を阻害するのに有効な量で、少なくとも１つのＰＥＤ４インヒビターを含む組成物が、提供される。神経系において、神経の成長または再生を調節するための方法、神経組織またはニューロンに対する損傷または傷害を処置するための方法、および障害または疾患に関連する神経の変性を処置するための方法であって、ニューロンにおいてホスホジエステラーゼＩＶ活性を阻害する、治療的に有効量の薬剤を含む組成物を動物に投与する工程を包含する方法が、提供される。
2004532809.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
組成物であって、長期間、哺乳動物に皮下投与した場合、ニューロンにおけるホスホジエステラーゼ４型の活性を阻害するのに有効な量のホスホジエステラーゼ４型（ＰＤＥ４）インヒビターを含む、組成物。
【請求項２】
組成物であって、長期間、哺乳動物に皮下投与した場合、ニューロンにおけるｃＡＭＰレベルを増加するのに有効な量のＰＤＥ４インヒビターを含む、組成物。
【請求項３】
組成物であって、長期間、哺乳動物に皮下投与した場合、ＭＡＧまたはミエリンの存在下でニューロンの成長を促進する量のＰＤＥ４インヒビターを含む、組成物。
【請求項４】
前記ＰＤＥ４インヒビターが、ロリプラムである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項５】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の組成物であって、前記ＰＤＥ４インヒビターが、０．１〜１０μｍｏｌ／ｋｇ／時間の用量で投与され、該用量が、少なくとも２４時間の間投与される、組成物。
【請求項６】
前記ＰＤＥ４インヒビターが、０．１〜３μｍｏｌ／ｋｇ／時間の用量で投与される、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
請求項５に記載の組成物であって、前記ＰＤＥ４インヒビターが、４８時間、７２時間、９６時間、１週間、２週間、１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、６ヶ月、および１２ヶ月からなる群から選択される、少なくとも一定期間で投与される、組成物。
【請求項８】
哺乳動物の神経系における神経の成長または再生を調節するための方法であって、該方法は、長期間、該哺乳動物に組成物を投与する工程を包含し、該組成物は、哺乳動物のニューロンにおけるＰＤＥ４活性を阻害する、治療的に有効量の薬剤を含む、方法。
【請求項９】
神経組織またはニューロンに対する傷害または損傷の処置を、該処置を必要とする患者に施す方法であって、該方法は、長期間、該患者に組成物を投与する工程を包含し、該組成物は、ニューロンにおけるＰＤＥ４活性を阻害する、治療的に有効量の薬剤を含む、方法。
【請求項１０】
障害または疾患に関連する神経変性の処置を、該処置を必要とする患者に施す方法であって、該方法は、長期間、該患者に組成物を投与する工程を包含し、該組成物は、ニューロンにおけるＰＤＥ４活性を阻害する、治療的に有効量の薬剤を含む、方法。
【請求項１１】
アポトーシスに関連する疾患、障害または状態の処置を、該処置を必要とする患者に施す方法であって、該方法は、長期間、該患者に組成物を投与する工程を包含し、該組成物は、ニューロンにおけるＰＤＥ４活性を阻害する、治療的に有効量の薬剤を含む、方法。
【請求項１２】
筋萎縮性側索硬化症、アルツハイマー病、パーキンソン病、およびハンティングトン病からなる群から選択される、神経変性疾患の処置を、該処置を必要とする患者に施す方法であって、該方法は、長期間、該患者に組成物を投与する工程を包含し、該組成物は、ニューロンにおけるＰＤＥ４活性を阻害する、治療的に有効量の薬剤を含む、方法。
【請求項１３】
前記ＰＤＥ４インヒビターが、少なくとも２４時間の間、連続的または反復的に投与される、請求項９〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
請求項１３に記載の方法であって、前記ＰＤＥ４インヒビターが、４８時間、７２時間、９６時間、１週間、２週間、１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、６ヶ月、および１２ヶ月からなる群から選択される、少なくとも一定期間、連続的または反復的に投与される、方法。
【請求項１５】
前記ＰＤＥ４インヒビターが、皮下に投与される、請求項８〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
前記ＰＤＥ４インヒビターが、ロリプラムである、請求項８〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記患者が、ヒト被験体である、請求項８〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
前記ＰＤＥ４インヒビターが、０．１〜１０μｍｏｌ／ｋｇ／時間の用量で投与される、請求項８〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
前記ＰＤＥ４インヒビターが、０．１〜３μｍｏｌ／ｋｇ／時間の用量で投与される、請求項１８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本出願は、２０００年１１月２日に出願された米国仮出願６０／２４５，３１９（本明細書中で参考として援用されている）の優先権を主張する。
【０００２】
（発明の技術分野）
本発明は、哺乳動物の中枢神経系および末梢神経系における神経再生の阻害を逆行させ得る薬剤として、ホスホジエステラーゼ４型（「ＰＤＥ４」）のインヒビターの新規な同定に関する。本発明は、ＰＤＥ４発現を調節することによって、神経再生の阻害効果を逆行させ得る薬剤を使用する、組成物および方法を提供する。動物に投与された場合、ニューロンにおけるＰＤＥ４活性を阻害するのに有効な量で、少なくとも１つのＰＥＤ４インヒビターを含む組成物が、提供される。神経系において、神経の成長または再生を調節（例えば、促進）するための方法、神経組織またはニューロンに対する傷害または損傷を処置するための方法、および障害または疾患に関連する神経の変性を処置するための方法であって、ニューロンにおいてホスホジエステラーゼＩＶ活性を阻害する、治療的に有効量の薬剤を含む組成物を動物に投与する工程を包含する方法が、提供される。
【０００３】
（発明の背景）
成体哺乳動物の中枢神経系（ＣＮＳ）の軸索は、軸索（神経）の成長を助長／促進する多くの分子が存在するという事実にもかかわらず、損傷後に再生しない。軸索の再生を妨害する少なくとも３つの因子が存在する：（１）ミエリン中における軸索成長に特異的なインヒビターの存在；（２）グリア瘢痕の形成；および（３）ニューロンの内因性の成長状態。このグリア瘢痕は、損傷後にいつでも形成する。従って、瘢痕が形成する前に、この「適期（ｗｉｎｄｏｗ−ｏｆ−ｏｐｐｏｒｔｕｎｉｔｙ）」において成長を助長することは、有利である。従って、損傷の直後に、ＣＮＳおよび末梢神経系（ＰＮＳ）中にある主な障害は、ミエリン中に存在する、ニューロンの成長および再生のインヒビターである。
【０００４】
損傷後に成体哺乳動物のＣＮＳの軸索は再生し得ないにもかかわらず、ＣＮＳニューロンが培地中に配置される場合、または許容性基質が末梢神経（Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎら、１９８０、ＤａｖｉｄおよびＡｇｕａｙｏ、１９８１）または胎児の脊髄（Ｈｏｗｌａｎｄら、１９９５）中に移植されることによって提供される場合、これらのニューロンは、軸索をこの許容性基質へと、越えることなく伸長させ得る。このことは、損傷した成体ＣＮＳ環境が軸索の再生を阻害することを示唆する。現在までに同定された、成体の損傷したＣＮＳの阻害分子は、ミエリンに関連する糖タンパク質（ＭＡＧ）（ＤｅＢｅｌｌａｒｄら、１９９６；ＭｃＫｅｒｒａｃｈｅｒら、１９９４；Ｍｕｋｈｏｐａｄｈｙａｙら、１９９４）およびＮｏｇｏ（Ｃｈｅｎら、２０００；Ｓｐｉｌｌｍａｎｎら、１９９８）である。軸索再生に対する他の障害は、反応性星状細胞によって分泌されるプロテオグリカンおよびグリア瘢痕の形成である（ＭｃＫｅｏｎら、１９９５）。
【０００５】
ニューロン成長のインヒビターを克服する最近の戦略としては、インヒビターを中和させるか、または軸索の成長能を変化させて、この軸索が、阻害されることによってミエリンに対してもはや応答しなくなるようにすることが挙げられる。このような方法において、これらは、インビボで再生し、そしてインビトロでミエリンによって阻害されない若い軸索に類似している（例えば、米国特許第５，９３２，５４２号および同６，２０３，７９２号を参照のこと（これらの全開示は、本明細書中で参考として援用されている））。
【０００６】
以前の研究は、成体のＣＮＳのニューロンが、その内因性の成長能を変化させ得る、すなわち、そのニューロンがミエリンに関連するインヒビターに対して応答せず、これにより損傷後に再生し得る状態を引き起こし得る、ことを示した（例えば、Ｂｒｅｇｍａｎ，１９９８；ＮｅｕｍａｎｎおよびＷｏｏｌｆ、１９９９を参照のこと）。Ｂｒｅｇｍａｎおよび共同研究者は、一片の胎児脊髄を損傷した成体の脊髄に移植し、そしてニューロトロフィンを移植片にポンピングした。病巣を越える顕著な軸索の成長が、検出された。ＮｅｕｍａｎｎおよびＷｏｏｌｆは、病巣をそれらの末梢枝に馴化させた後に、脊髄神経節（ＤＲＧ）ニューロンの中枢軸索が再生することを報告した。他の研究者は、ジブチリルｃＡＭＰ（ｄｂｃＡＭＰ）を人工的に用いるか、またはニューロトロフィンを用いてニューロンを予め処理（「プライミング」）することによってのいずれかで、より古いニューロン中の環状ＡＭＰ（ｃＡＭＰ）の内因性レベルを高めることにより、それらのレベルが一般的なミエリンインヒビターまたは特定のミエリンインヒビターのいずれかによって阻害されないという結果が得られることを実証した（ＭＡＧ．Ｃａｉら（１９９９）；本明細書中で参考として援用される）。さらに、若いニューロン中のｃＡＭＰの内因性レベルが非常に高いこと、ならびにインビボで再生する能力ならびにＭＡＧおよびミエリンに対して成長する能力がｃＡＭＰ依存性であることが示されている（Ｃａｉら、２００１；（２０００年５月５日に出願された米国仮出願６０／２０２，３０７）およびこの米国仮出願の優先権を主張する２００１年５月４日に出願されたＰＣＴ／ＵＳ０１／１４３６４（これらの出願の全開示は、本明細書中で参考として援用される））。より最近なって、神経成長相反因子（ｎｅｕｒａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｒｅｐｕｌｓｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ）（例えば、ミエリンまたはＭＡＧ）によって媒介される成長相反に供した神経細胞と、サイクリックヌクレオチド依存性タンパク質キナーゼのアクチベーターとを接触させることにより、神経細胞の成長を促進することが実証されている（米国特許第６，２６８，３５２号を参照のこと）。
【０００７】
別の因子（これらのインヒビターの存在に対して応答するニューロンの内因性能力）もまた、いくつかの研究グループが焦点を合わせている。胎児ＣＮＳが再生することは、十分に確立されている（Ｈａｓａｎら、１９９３）。胎児ニューロンが、培地中でミエリンによって阻害されず（Ｓｈｅｗａｎら、１９９５）、そして成体ＣＮＳに移植された場合、長い軸索を伸長し得る（ＬｉおよびＲａｉｓｍａｎ、１９９３）。さらに、新生児のＤＲＧニューロン中のｃＡＭＰのレベルは高く、そして出生後約３日で劇的に減少することが実証されている（Ｃａｉら、２００１）。ほぼ同一の年齢で、ラットの脊髄は、再生の能力を失う（Ｂｒｅｇｍａｎ，１９８７；ＢａｔｅｓおよびＳｔｅｌｚｎｅｒ、１９９３）。従って、現在、損傷ニューロンまたは障害ニューロン中のニューロンの再生を促進する、２、３の効果的な治療剤または方法が存在する。
【０００８】
ニューロンの再生に問題がある、神経系状態、損傷または変性障害または変性疾患を患った患者を処置するために、ニューロンにおいて軸索を再生するインヒビターを調節し得ることが、有用である。特に、哺乳動物の神経系の選択的ｃＡＭＰ活性を、単独または他の処置と組み合わせて誘導するか、またはそうでなければ選択的に成長させて、ミエリンおよびミエリンインヒビター（例えば、ミエリン関連糖タンパク質（ＭＡＧ））による軸索の成長の阻害を軽減し得ることが、有用である。
【０００９】
（発明の要旨）
本研究者はまた、ここで、ミエリンおよびＭＡＧのようなミエリンに関連するインヒビターによって媒介される中枢神経系（ＣＮＳ）および末梢神経系（ＰＮＳ）における、神経の成長および再生の正常な阻害を逆行させる、特定のホスホジエステラーゼ４型（「ＰＤＥ４」）インヒビターの長期の投与を示している。従って、１局面において、本発明は、動物に投与される場合、ニューロンにおけるＰＤＥ４活性を阻害するのに有効な量で、ＰＤＥ４特異的インヒビターを含む薬学的組成物を提供し、これにより、ミエリン媒介成長阻害またはＭＡＧ媒介成長阻害を軽減する。別の局面において、本発明は、患者にＰＤＥ４特異的インヒビターを投与して、ＣＮＳおよびＰＮＳ中の神経成長および神経再生の正常な阻害を逆行または防止させる方法を提供する。従って、本発明は、神経系の神経成長または神経再生を調節および促進（または阻止）するための方法、神経組織またはニューロンに対する損傷または傷害を処置する方法、および損傷、状態、障害または疾患（例えば、脳および脊髄の疾患および損傷）に関連する神経変性を処置するための方法を提供する。本発明の方法を使用することによって、ニューロンの成長および再生のＭＡＧ媒介阻害およびミエリン媒介阻害を軽減することはまた、種々の神経変性疾患および記憶喪失に関連する障害または状態における治療効果のためにも使用され得る。本発明はまた、ニューロンの生存を促進するため、およびグリア瘢痕の形成を防止するために、ＰＤＥ４特異的インヒビターを長期投与する方法を提供する。本発明はまた、ＰＤＥ４発現を調節（増加または減少）させることによる神経の成長および再生において、ミエリン、およびＭＡＧのような関連するインヒビターの阻害効果を調節する組成物および方法を提供する。
【００１０】
本発明の１実施形態において、ＰＤＥ４特異的インヒビターは、血液脳関門に接近するインヒビターである。なぜなら、神経の損傷または疾患の部位から遠位の部位に投与され得るからである。好ましい実施形態において、このＰＤＥ４インヒビターは、ロリプラム、血液脳環門を通過する低分子を阻害する。より好ましい実施形態において、ロリプラムは、皮下に投与される。別の局面において、本発明は、ＰＤＥ４活性を遺伝的に減少させて、神経成長の阻害および再生を逆行または防止させ、グリア瘢痕の形成を防止させ、そしてニューロンの生存を促進させる方法を提供する。
【００１１】
（発明の詳細な説明）
本明細書に記載される発明が完全に理解され得るために、以下の詳細な説明が、記載される。
【００１２】
（定義および一般的技術）
他に本明細書中で規定されない限り、本発明とともに使用される科学用語および技術用語は、当業者によって一般的に理解される意味を有する。さらに、他に状況によって必要とされない限り、単数形の用語は、複数形を含み、そして複数形の用語は、単数形を含む。一般的に、本明細書中に記載される、細胞および組織培養、分子生物学、免疫学、神経生物学、遺伝学ならびにタンパク質および核酸化学およびハイブリダイゼーションとともに使用される命名法、およびこれらの技術は、当該分野において周知のものであり、一般的に使用される。本発明の方法および技術は、他に示さない限り、当該分野において周知であり、そして本明細書全体を通して引用され、考察される種々の一般的およびより特定の参考文献において記載される従来の方法に従って一般的に実行される。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）；Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｌｙ  Ｍａｎｕａｌ、第３版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ（２００１）；Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ（１９９２、および２００１に対する補遺）；Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｒｏｍ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、第４版、Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（１９９９）；Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ  （１９９０）；Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９９９）；Ｃｒａｗｌｅｙら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ（１９９７および２００１に対する補遺）；ならびＫｌｅｉｔｍａｎら、Ｃｕｌｔｕｒｉｎｇ  Ｎｅｒｖｅ  Ｃｅｌｌｓ、３３７−７８頁、ＭＩＴ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ／Ｌｏｎｄｏｎ，Ｅｎｇｌａｎｄ（Ｇ．ＢａｎｋｅｒおよびＫ．Ｇｏｓｌｉｎ編）（１９９１）（これらのそれぞれは、本明細書中において、その全体が参考として援用される）を参照のこと。
【００１３】
酵素反応および細胞培養および精製技術は、当該分野で一般的になされるような製造業者の仕様書に従って、または本明細書に記載されるように、実施される。本明細書中に記載される、分析化学、合成有機化学、ならびに医学的および薬学的化学と関連して使用される命名法、ならびにこれらの実験手順および技術は、当該分野において周知のものであり、そして一般的に使用されるものである。化学合成、化学分析、薬学的調整、処方、および送達、ならびに患者の処置のために、標準的技術が使用される。
【００１４】
以下の用語は、他に示さない限り、以下の意味を有するように理解される：
用語「ＰＤＥ４」とは、ホスホジエステラーゼの脳濃縮アイソフォームをいい、これは、ｃＡＭＰからＡＭＰへの加水分解的変換を触媒する酵素である。このような変換は、当業者に周知の多くの方法（標識されるかまたはその他で検出可能な基質を使用する酵素アッセイを含む）のいずれかによって評価され得る。本発明は、哺乳動物ＣＮＳまたはＰＮＳにおけるニューロン成長のミエリン媒介阻害またはＭＡＧ媒介阻害を軽減するのに有効な量で、ＰＤＥ４のインヒビターを含む方法および組成物を提供する。好ましくは、本発明に従うＰＤＥ４インヒビターは、哺乳動物被験体に皮下的に投与される。
【００１５】
用語「ＰＤＥ４インヒビター」（また「ＰＤＥ阻害活性」）とは、ＰＤＥ４酵素の活性を測定可能に減少させるインヒビターをいう。用語「ＰＤＥ４特異的インヒビター」とは、別の酵素（特に、別のＰＤＥ酵素）の活性よりも優先的にＰＤＥ４酵素の活性を減少させるインヒビターをいう。好ましい実施形態において、ＰＤＥ４特異的インヒビターは、別のＰＤＥ酵素を阻害する場合よりも、少なくとも５倍大きく、ＰＤＥ４活性を阻害するインヒビターである。より好ましい実施形態において、ＰＤＥ４特異的インヒビターは、このインヒビターが別のＰＤＥ酵素を阻害する場合よりも、少なくとも１０倍大きく、より好ましくは、少なくとも２０倍大きく、なおさらに好ましくは、少なくとも５０倍大きく、ＰＤＥ４活性を阻害するインヒビターである。ＰＤＥ酵素アッセイは、当業者に周知である。好ましくは、本発明のＰＤＥ４インヒビターは、この推定インヒビターの非存在下でのＰＤＥ４と比較して、ニューロンにおける全体的なＰＤＥ４活性を減少させる方向で、ＰＤＥ４活性の１つ以上の特徴（例えば、会合定数、解離定数、触媒速度、および基質ターンオーバー速度）に影響する。
【００１６】
ニューロンにおけるＰＤＥ４「活性」、「生物活性」、または「生物学的活性」を変更または調節する薬剤とは、ニューロンにおいて、ＰＤＥ４酵素活性（ｃＡＭＰをＡＭＰに変換）を、直接的または究極的に、増加（アゴニスト）または減少（アンタゴニスト）し得る薬剤をいう。ＰＤＥ４活性は、ＰＤＥ４発現のレベルを変更することによって（すなわち、ニューロンにおいて、ＰＤＥ４をコードするＤＮＡ、ＲＮＡもしくはタンパク質、またはＰＤＥ４調節薬剤を変更することによって）調節され得る。ＰＤＥ４活性はまた、ＰＤＥ４ポリヌクレオチド分子またはＰＤＥ４ポリペプチド分子を直接的に変異または変更することによって調節され得る。このような変異または変更としては、限定しないが、基質親和性定数または結合速度、基質解離速度、酵素の触媒速度またはターンオーバー速度、および別の相同なまたは異質なサブユニットへのＰＤＥ４サブユニットの結合定数またはＰＤＥ４分子によって触媒作用に影響する（増加または減少する）分子を変化させることが挙げられる。当業者は、当該分野で公知の方法を使用して、化合物がＰＤＥインヒビターであるか否か、特異的なＰＤＥ４インヒビターであるか否かを容易に決定し得る。例えば、ＰＤＥ４のインヒビターを評価するための方法を開示するＡｌｌｅｎら（１９９９）（本明細書中において参考として援用される）を参照のこと。また、Ａｍｅｒｓｈａｍ製のＫｉｔ  Ｎｕｍｂｅｒ  ＴＲＫＱ７０９０（ＰＤＥについてのアッセイを提供する）を参照のこと。
【００１７】
ニューロンにおけるＰＤＥ４活性はまた、別の薬剤または因子（例えば、アゴニストまたはアンタゴニスト）との会合（共有結合的または非共有結合的）によって調節され得る。推定ＰＤＥ４調節因子またはモジュレーターの方向および大きさは、当該分野において周知の方法を使用して、推定モジュレーターの非存在下または存在下で、ＰＤＥ４活性を、好ましくは時間および用量依存性の様式で測定することによって決定され得る。
【００１８】
ＰＤＥ４活性は、ＰＤＥ４特異的酵素アッセイ（上記の通り）によって直接的に、あるいは、細胞中のＰＤＥ４コード核酸レベルをアッセイすること（例えば、ＲＴ−ＰＣＲ、ノーザンブロット分析もしくは定常状態ＲＮＡコードアルギナーゼのレベルを測定するための他の方法による）、または細胞中のＰＤＥ４特異的タンパク質分子をアッセイすること（例えば、ウェスタンブロット技術、ＥＬＩＳＡアッセイなどを含む、種々の免疫親和性手順による）によって間接的に測定され得る（これらのすべてが、当業者に周知であり、本明細書中に記載される技術である）。同様に、発現レベルが細胞においてＰＤＥ４活性と相関する核酸分子またはタンパク質分子が、ＰＤＥ４を間接的に測定するために使用され得る。
【００１９】
ＰＤＥ４インヒビターは、有効用量が、インヒビターの非存在下のＰＤＥ４活性と比較して、少なくとも１０倍、ＰＤＥ４活性を阻害するインヒビターである。好ましい実施形態において、ＰＤＥ４インヒビターは、有効用量が、少なくとも２０倍、より好ましくは、５０倍、またはさらに少なくとも１００倍、ＰＤＥ４活性を阻害するインヒビターである。
【００２０】
用語「軸索成長」または「軸索再生」とは、本明細書中で使用される場合、長さ方向に軸索が伸長する能力、および軸索が発芽する能力の両方をいう。軸索発芽は、既存の軸索または成長している軸索から伸長する新規なプロセスとして規定される（例えば、Ｍａら、Ｎａｔ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，２、２４−３０頁（１９９９）（これは、本明細書中において参考として援用される）を参照のこと）。
【００２１】
用語「ＭＡＧ」とは、ミエリン関連糖タンパク質をいい、これは、細胞型およびニューロンの発生段階に依存して、ＣＮＳおよびＰＮＳにおいてニューロン成長および再生を促進または阻害するミエリン由来の分子である。用語「ＭＡＧ」とはまた、「ＭＡＧ誘導体」をいい、これは、少なくとも１つのＭＡＧ細胞外ドメインを含む分子であり、ここで、このＭＡＧ分子は、変更されている（例えば、ＭＡＧ分子に融合した他の分子に部分を有するキメラを作製するための組換えＤＮＡ技術、または化的改変もしくは酵素的改変による）か、あるいは変異されている（例えば、内部欠失、挿入、再配列および点変異）。ＭＡＧ誘導体は、他に述べない限り、ＭＡＧ活性を保持する。
【００２２】
用語「ニューロトロフィン（ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｎ）」とは、ニューロン生存および成長を助ける栄養性因子をいう。ニューロトロフィンは、ニューロンにおけるサイクリックＡＭＰレベル（ｃＡＭＰ）を上昇させる。
【００２３】
用語「患者」とは、ヒト被験体および獣医学的被験体が挙げられる。
【００２４】
「栄養性因子」は、細胞生存および成長を助け、そしてサイクリックＡＭＰ（ｃＡＭＰ）レベルを上昇させる物質である。
【００２５】
非加水分解性サイクリックＡＭＰ（ｃＡＭＰ）アナログは、ホスホジエステラーゼ耐性結合を有し、従って、非改変ｃＡＭＰ分子よりも大きな生物活性を有するｃＡＭＰである。例として、ジブチリルｃＡＭＰ（ｄｂｃＡＭＰ）（Ｐｏｓｔｅｒｎａｋ  ａｎｄ  Ｗｅｉｍａｎｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，３８，３９９−４０９頁（１９７４）（本明細書中において参考として援用される）；およびＳｐ−ｃＡＭＰ（Ｄｏｓｔｍａｎｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６５，１０４８４−４９１頁（１９９０）（本明細書中において参考として援用される）が挙げられる。
【００２６】
本明細書中で使用される場合、句「治療的有効量」とは、被験体が、選択された投与レジメン（例えば、選択された用量レベルおよび処置時間）下で処置された後に、ニューロン成長または再生において検出可能な改善を示すような、本発明のＰＤＥ４調節薬剤の量を意味する。
【００２７】
用語「処置」とは、症状の発生を妨げるために、症状を制御または除去するために、あるいは、ニューロン死またはニューロン成長の欠乏に関連する状態、疾患または障害に関連する症状を軽減するために、治療的有効量の本発明の化合物を、被験体に投与することとして規定される。
【００２８】
用語「長期」、「長期投与」、または「長期処置」とは、本明細書中で使用される場合、少なくとも１２時間、より好ましくは、２４時間、さらにより好ましくは、４８時間、７２時間または９６時間の、化合物（好ましくは、ＰＤＥ４特異的インヒビター）の投与を意味する。長期処置または投与は、同様により長期であり得、１週間、１０日、２週間、１か月、３か月または６か月までの投与または処置を含む。
【００２９】
用語「被験体」とは、本明細書中で記載される場合、哺乳動物、または培養物中の細胞として規定される。好ましい実施形態において、被験体は、処置の必要な、ヒト患者または他の動物患者である。
【００３０】
「ＢＢＢスコア」は、脊髄損傷後のラットにおける運動機能の回復の程度を測定する、改変２１点オープンフィールド運動スケールとして、Ｂａｓｓｏ、ＢｅａｔｔｉｅおよびＢｒｅｓｎａｈａｎによって開発された試験の結果である。例えば、Ｂａｓｓｏら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｔｒａｕｍａ  １３（７）：３４３−５９（１９９６）；Ｂｅａｔｔｉｅら（１９９７）（本明細書中において、参考として援用される）を参照のこと。
【００３１】
本明細書および特許請求の範囲全体を通して、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」もしくは「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」のような変形は、示された整数または整数の群を含むことを意味するが、任意の他の整数も整数の群も排除することを意味しないことが理解される。
【００３２】
（神経系損傷および疾患を処置する方法）
哺乳動物中枢神経系は、損傷後再生しない。なぜなら、神経を成長するように促進（ｐｒｏｍｏｔｅ）および推進（ｅｎｃｏｕｒａｇｅ）する多くの分子が存在するものの、神経が再生することを活動的に阻害する、成体ＣＮＳに存在する分子も存在するからである。従って、神経系損傷の結果は、麻痺または脳損傷であり得る。さらに、特定の分子が神経再生を妨げるとして同定されたとしても、脊髄損傷後にヒトにおいて処置はほとんど試みられていない。なぜなら、大部分、スペアの軸索の結果として、通常、いくらか部分的な機能が残るからである。従って、外科医は、残りの機能の損失を生じる、さらなる損傷を避けるために、損傷部位における介入を含む任意の処置を試みることを嫌う。
【００３３】
動物において、神経系損傷に関する多数の処置が、いくらか成功しているが、これらは、ヒトにおける使用に適切でないかまたは理想的でないかのいずれかである（Ｂｒｅｇｍａｎら、１９９５；Ｈｕａｎｇら、１９９９；Ｌｅｈｍａｎｎら、１９９９；ＭｃＫｅｒｒａｃｈｅｒ、２００１；ＳｃｈｎｅｌｌおよびＳｃｈｗａｂ、１９９０）。例えば、脊髄が損傷する前にミエリンで免疫したマウスにおいて、かなりの再生および機能回復が存在する（Ｈｕａｎｇら、１９９９）ことが、示された。この処置は、ヒトにとって適切ではない。なぜなら、第１に、この処置は、損傷前に必要であり、いつ損傷が生じるか予測不可能であるからである。第２に、ヒトにおけるミエリンでの免疫は、いくつかのマウス株におけるように、自己免疫疾患である多発性硬化症を誘導する可能性が非常に高い。動物における他の処置は、損傷部位での直接介入を必要とし、このことは、さらなる損傷の危険を冒す。
【００３４】
本出願人は、神経系の損傷および疾患を処置するためにＰＤＥ４インヒビターを使用する方法を提供することによって、この問題に取り組んだ。本出願人は、ニューロンにおけるＰＤＥ４を阻害することが、ミエリンおよびミエリンインヒビター（例えば、ＭＡＧ）によるニューロン成長の阻害を軽減すること、を決定した。本発明は、神経系の損傷（末梢神経系（ＰＮＳ）損傷および中枢神経系（ＣＮＳ）損傷の両方）（特に、ＣＮＳ損傷）の処置に有用である。本明細書中に記載される方法を使用して、ミエリンおよびＭＡＧの阻害効果が、ニューロンにおけるＰＤＥ４活性を減少または消滅させる因子によって、部分的にかまたは完全に、ブロックされ得るかまたは軽減され得る。これらの因子、またはニューロンにおけるＰＤＥ４の活性を調節し得るこれらの因子もしくは他の因子の改変形態は、直接的もしくは間接的に、単独でかもしくは組み合わせて、損傷神経に投与されて、ミエリンまたはミエリンインヒビター（例えば、ＭＡＧ）の阻害効果をインビボで逆転させ得、そして再生を進行させ得る。
【００３５】
１つの局面において、本発明は、ＰＤＥ４インヒビターを使用して神経系損傷を処置する方法を提供する。神経系損傷としては、脊髄損傷、脳損傷、動脈瘤、発作、およびＰＮＳ損傷が挙げられるが、これらに限定されない。１つの実施形態において、本発明は、ＰＤＥ４に特異的なインヒビターを使用する方法を提供し、このインヒビターは、ＣＮＳにおいて高レベルで発現される。ＰＤＥ４特異的インヒビターを使用する利点は、このＰＤＥ４特異的インヒビターが、神経系にそのインヒビターの作用を標的化するために使用され得ることである。さらに、ＰＤＥ４は、哺乳動物の他の組織および器官においては高レベルで発現されないので、ＰＤＥ４特異的インヒビターを用いる処置は、非特異的ＰＤＥインヒビターを用いる処置よりも少ない副作用しか有さない。
【００３６】
好ましい実施形態において、この方法は、損傷部位に対して遠位に投与され得るＰＤＥ４インヒビターを使用する。なぜなら、神経系損傷を有する患者を処置するための理想的処置は、最も侵襲性が小さい処置であるからである。より好ましい実施形態において、この方法は、皮下投与または静脈内投与され得るＰＤＥ４インヒビターを使用し、このＰＤＥ４インヒビターは、損傷部位で有効でありことができるＰＤＥ４インヒビターである。脳損傷または脊髄損傷の場合、非常に好ましい１つの実施形態は、血液脳関門を通過してＣＮＳ損傷部位に到達する、ＰＤＥ４インヒビターを使用する方法である。好ましい実施形態において、この方法は、ＰＤＥ４インヒビターであるロリプラムを使用する。
【００３７】
本出願人は、ＰＤＥ４インヒビター（特にＰＤＥ４特異的インヒビター）を用いる長期処置が、神経細胞におけるニューロン成長を増加することを、見出した。ＰＤＥ４特異的インヒビターが、ミエリン、ＭＡＧ、および他のニューロン成長インヒビターによるニューロン成長の阻害を軽減するだけではなく、長期処置はまた、ニューロン成長インヒビターの非存在下でニューロン成長を促進する。従って、好ましい実施形態において、この方法は、長期間ＰＤＥ４インヒビターを投与する工程を包含する。１つの実施形態において、この方法は、ＰＤＥ４インヒビターを、少なくとも１２時間、より好ましくは少なくとも２４時間、４８時間、７２時間、または９６時間、なおより好ましくは少なくとも１週間、２週間、１ヶ月間、２ヶ月間、または３ヶ月間投与する工程を包含する。この方法は、ＰＤＥ４インヒビターを、６ヶ月間または１２ヶ月間までの間投与する工程を包含する。本発明の非常に好ましい実施形態において、この方法は、患者の神経系損傷が緩和または処置されるまで、またはＰＤＥ４インヒビターの投与がさらなる有益な効果を有さなくなるまで、ＰＤＥ４インヒビターを投与する工程を包含する。好ましい実施形態において、このＰＤＥ４インヒビターは、３日間〜６ヶ月間、１週間〜３ヶ月間、または２週間〜１ヶ月間、投与される。
【００３８】
長期処置は、神経系の疾患または障害を処置するに十分な有効量のＰＤＥ４インヒビターを、例えば、ミニポンプ、移植可能な徐放形態のこのＰＤＥ４インヒビターまたは静脈内点滴投与を介して、連続投与することによって、達成され得る。あるいは、長期処置は、一定投与レベルおよび投薬間隔で、一定量のこのインヒビターを反復投与して、目的の血清もしくは細胞もしくは組織（例えば、神経系組織もしくは神経系細胞）中のＰＤＥ４インヒビター濃度が、その神経系の疾患または障害を処置するために必要な濃度未満に低下しないようにすることによって、達成され得る。特定の化合物の薬物動態学的プロフィールを決定するための方法は、当該分野で周知であり、そして、その有効濃度を維持するために必要な正確な用量および投薬間隔を決定するために使用され得る。反復投与は、例えば、１０分間毎に１回、３０分間毎に１回、１時間毎に１回、３時間毎に１回、６時間毎に１回、または８時間毎に１回投与することによって、達成され得る。
【００３９】
別の局面において、本発明は、神経系疾患を処置する必要がある患者にＰＤＥ４インヒビターを投与することによって、神経系疾患を処置するための方法を提供する。１つの実施形態において、本発明の方法は、アポトーシス、壊死、または他の形態の細胞死と関係する障害、状態、または疾患と関連する神経変性を処置するために、使用され得る。好ましい実施形態において、この方法は、限定はされないが、筋萎縮性側索硬化症、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、クロイツフェルト−ヤーコプ病、クールー、多発性全身萎縮症、筋萎縮性側索硬化症（ルー・ゲーリグ病）、および進行性核上麻痺を処置するために、使用される。別の実施形態において、本発明は、（例えば、ヘルペスウイルスまたはＨＩＶによる）ウイルス感染、（ウイルス性または非ウイルス性の）脳炎、ミトコンドリア疾患、クールーおよび末梢神経障害に関係するニューロン疾患を処置するための方法を提供する。
【００４０】
記憶獲得の動物モデルである長期強化は、ｃＡＭＰ依存性であり、転写依存性であり、そして軸索の出芽を生じる（例えば、Ｍａら、Ｎａｔ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２、ｐｐ．２４〜３０（１９９９）（本明細書中に参考として援用される）を参照のこと）。さらに、ニューロトロフィンおよびｄｂｃＡＭＰがＭＡＧおよびミエリンによる阻害に克服するｃＡＭＰ依存性能力と、記憶および学習に関係する変化との間に、多くの分子および形態の類似性が存在する（Ｂａｃｈら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９６、ｐｐ．５２８０〜８５（１９９９）；本明細書中に参考として援用される）。従って、別の実施形態において、本発明は、ニューロン死またはニューロン成長の欠如に関連する、記憶および学習の欠損および障害を処置するための方法を提供し、この方法は、この処置を必要とする患者にＰＤＥ４インヒビターを投与することによる。
【００４１】
好ましい実施形態において、神経系疾患を処置する方法は、罹患した神経組織に投与される必要は必ずしもないＰＤＥ４インヒビターを使用する。上記のように、より好ましい実施形態において、この方法は、皮下投与または静脈内投与され得るＰＤＥ４インヒビターを使用し、このＰＤＥ４インヒビターは、罹患した神経組織に到達し得る、ＰＤＥ４インヒビターである。ＣＮＳ疾患およびＰＮＳ疾患の両方について、非常に好ましい１つの実施形態は、ＰＤＥ４インヒビターを使用する方法である。この方法が血液脳関門を通過するＰＤＥ４インヒビターを使用することが、ＣＮＳ疾患にとって特に好ましい。好ましい実施形態において、この方法は、ＰＤＥ４インヒビターであるロリプラムを使用する。
【００４２】
好ましい実施形態において、神経系の疾患または障害を処置するための方法は、長期の間ＰＤＥ４インヒビターを投与する工程を包含する。１つの実施形態において、この方法は、少なくとも１週間、２週間、１ヶ月間、２ヶ月間、または３ヶ月間、ＰＤＥ４インヒビターを投与する工程を包含する。好ましい実施形態において、この方法は、特に慢性神経系疾患の場合、６ヶ月間または１年間以上、ＰＤＥ４インヒビターを投与する工程を包含する。本発明の非常に好ましい実施形態において、この方法は、患者の神経系の疾患または障害が軽減、処置、または安定化されるか、あるいはＰＤＥ４インヒビターの投与がさらなる有益な効果を有さなくなるまで、ＰＤＥ４インヒビターを投与する工程を包含する。
【００４３】
本発明の方法は、外傷性脊髄損傷、外傷性脳損傷、動脈瘤および発作を含む、損傷、疾患、または障害を処置するために使用され得る。このような損傷、疾患、または障害として、ＰＮＳ損傷、ウイルス感染（例えば、ヘルペスウイルスまたはＨＩＶ）、（ウイルス性または非ウイルス性の）脳炎、ミトコンドリア疾患、クロイツフェルト−ヤーコプ病、クールー、多発性全身萎縮、末梢神経障害、糖尿病性ニューロパシー、幼児における早熟と関係する脳室周囲白質軟化症、ギヤン−バレー症候群、ペリツェーウス−メルツバッヒャー病、および進行性核上麻痺もまた、挙げられる。
【００４４】
本発明の方法はまた、以下を含むがこれらに限定されない、神経変性疾患を処置するために使用され得る：筋萎縮性側索硬化症（ルー・ゲーリグ病；「ＡＬＳ」）；パーキンソン病；パーキンソンプラス（Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ  Ｐｌｕｓ）症候群；ＡＬＳ−パーキンソン痴呆複合症；ハンティングトン病；ホジキン病；アルツハイマー病；ピック病；ウィルソン病；肝レンズ核変性症；環境毒素（マンガンおよび一酸化炭素中毒を含む）；遺伝性癲癇；栄養欠乏状態（例えば、ヴェルニッケ−コルサコフ症候群、Ｂ１２欠乏およびペラグラ）；長期の低血糖または低酸素；新生物随伴症候群；重金属曝露（例えば、砒素、ビスマス、金、マンガン、および水銀）；透析痴呆；シルダー病；脂質貯蔵疾患；大脳小脳変性；痙性対麻痺に関連する痴呆；進行性核上麻痺；ビンスヴァンガー病；脳腫瘍もしくはａｂｃｅｓｓ；マルキアファーヴァ−ビニャーミ病；交通性水頭症、正常圧水頭症、もしくは閉塞性水頭症；進行性多病巣性白質脳炎；レーヴィ小体疾患；いくつかのＡＩＤＳ症例；進行性失語症候群；および前頭葉痴呆。Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ（第６版）、Ａｄａｍｓ，Ｒ．Ｄ．、Ｖｉｃｔｏｒ，Ｍ．およびＲｏｐｐｅｒ，Ａ．Ｈ．編、１９９７（ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）（本明細書中に参考として援用される）を参照のこと。
【００４５】
神経膠瘢痕の形成は、ＣＮＳにおける再生の欠如に寄与する別の要因である。神経膠瘢痕の主要な成分は、種々の阻害分子（プロテオグリカン）を沈着するための足場として作用し得る、反応性神経膠星状細胞および結合組織エレメントである。重要なことには、神経膠星状細胞の増殖は、上昇したｃＡＭＰレベルおよび増殖速度に応じてブロックされ（例えば、Ｄｕｇａｎら、１９９９）、そして線維芽細胞を浸潤する細胞外マトリックス生成能力は、上昇したｃＡＭＰレベルにより阻害される（Ｈｅｒｍａｎｎら、２００１）。従って、別の局面において、本発明は、神経系損傷後の神経膠瘢痕の形成を減少または予防する方法を提供し、この方法は、ＰＤＥ４インヒビターを投与することによる。
【００４６】
好ましい実施形態において、神経膠瘢痕形成を予防または減少するための方法は、長期間ＰＤＥ４インヒビターを投与する工程を包含する。１つの実施形態において、この方法は、損傷が生じた後、少なくとも３日間、１週間、２週間、１ヶ月間、２ヶ月間、または３ヶ月間、ＰＤＥ４インヒビターを投与する工程を包含する。好ましい実施形態において、この方法は、神経膠瘢痕形成を予防または減少するために、神経系損傷の後短い時間の間に、ＰＤＥ４インヒビターを投与する工程を包含する。
【００４７】
別の局面において、負の軸索誘導の合図としてのＭＡＧの特性は、再生中の軸索をその正確な標的へと導き、そしてこれらを正しい経路上に維持するために、使用され得る。この目的のために、本発明のＰＤＥ４モジュレーターまたはニューロンにおけるＰＤＥ４のレベルを変化（例えば、減少または増加）させ得るこれらの因子または他の因子の改変形が、正確な経路に沿った成長を促進または含むように、再生中の神経組織のまさにその領域に投与される。
【００４８】
（ＰＤＥ４インヒビター）
本発明はまた、本発明の方法および組成物において使用され得るＰＤＥ４の種々のインヒビターを提供する。ＰＤＥ４に特異的な種々のインヒビターが、記載されている。最近の総説について、Ｖ．Ｄａｌ  ＰｉａｚおよびＭＰ  Ｇｉｏｖａｎｎｏｎｉ、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２０００  Ｍａｙ；３５（５）：４６３〜８０を参照のこと。また、例えば、Ｄｉｎｔｅｒら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ．２０００  Ａｕｇ  １；１０８（１−２）：１３６〜４６（選択的ＰＤＥ４インヒビター「メソプラム」を開示する）；Ｃａｍｐｏｓ−Ｔｏｉｍｉｌら、Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｖａｓｃ．Ｂｉｏｌ．２０００  Ｓｅｐ；２０（９）：Ｅ３４〜４０（ＰＤＥ４インヒビターとしてのＧｉｎｇｋｏ  ｂｉｌｏｂａ抽出物ＥＧｂ  ７６１の効果を開示する）；Ｉｋａｍｕｒａら、Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．２０００  Ａｕｇ；２９４（２）：７０１〜６（ＰＤＥ４特異的インヒビターとしてのロリプラムまたはＲｏ−２０−１７２４を開示する）；Ｌａｌｉｂｅｒｔｅら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２０００  Ｍａｙ  ３０；３９（２１）：６４４９〜５８（ロリプラム）；Ｄ．ＨａｆｆｎｅｒおよびＰＧ  Ｇｅｒｍａｎｎ、Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｒｉｔ．Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ．２０００  Ｍａｙ；１６１（５）：１４９５〜５００（（ＰＤＥ−４）インヒビター「ロフルミラスト」を開示する）；Ｂａｎｎｅｒら、Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ａｌｌｅｒｇｙ  ２０００  Ｍａｙ；３０（５）：７０６〜１２（ＰＤＥ４インヒビターＣＤＰ８４０、ロリプラムおよびＲＯ−２０−１７２４）；Ｅｈｉｎｇｅｒら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２０００  Ｍａｒ  ２４；３９２（１〜２）：９３〜９）ＰＤＥ４インヒビターＲＰＲ  ７３４０１を開示する）；Ｂｏｉｃｈｏｔら、Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．２０００  Ｆｅｂ；２９２（２）：６４７〜５３（選択的ＰＤＥ４インヒビターとしての、９位が置換されたアデニン誘導体を開示する）；Ｓｏｕｎｅｓｓら、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１９９９  Ｓｅｐ  １５；５８（６）：９９１〜９（ロリプラム、ＲＰ  ７３４０１（ピクラミラスト）、および他の構造的に多岐のＰＤＥ４インヒビターを開示する）；Ｈｅら（一連の２，２−二置換インダン−１，３−ジオンベースのＰＤＥ４インヒビター、ならびにＲＰ  ７３４０１  ＰＤＥ４インヒビターおよびＣＤＰ  ８４０  ＰＤＥ４インヒビターを開示する）；ならびにＤａｌ  Ｐｉａｚら（選択的ホスホジエステラーゼＰＤＥ４インヒビターとしての、一連の６−アリール−４，５−複素環式縮合ピリダジノンを開示する）（これらすべてが、本明細書中に参考として援用される）を参照のこと。脳ＰＤＥ４の好ましいインヒビターとしては、ロリプラム（Ｇｅｎａｉｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１９９５  Ａｐｒ  １１；９２（８）：３６０１〜５）；Ｒｏ  ２０−１７２４（Ｆｕｊｉｍａｋｉら、Ｎｅｕｒｏｐｓｙｃｈｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ、２０００  Ｊａｎ；２２（１）：４２〜５１）；およびＢＢＢ０２２Ａ（Ｆａｌｃｉｋら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ．１９９９  Ｊｕｎ  １；９７（１〜２）：１１９〜２８）が、挙げられる。ＰＤＥ４を阻害する上記物質の誘導体およびアナログもまた、挙げられる。
【００４９】
別の局面において、当業者は、本発明の方法および組成物においてＰＤＥ４阻害活性を有する任意の化合物を使用し得る。化合物がＰＤＥ４阻害活性を有するか否かを決定する任意の方法を使用し得る。このような方法は、上記されている。さらに、化合物が、上記のＰＤＥ４特異的インヒビターであるか否かを決定し得る。
【００５０】
（ニューロンＰＤＥ４モジュレーターの薬学的組成物）
本発明のＰＤＥ４調節因子は、薬学的組成物へと処方され得、そして取り組まれる特定の臨床状態を処置するために有効な用量で、インビボで投与される。好ましい実施形態において、このＰＤＥ４調節因子は、ＰＤＥ４インヒビターであり、好ましくは、ＰＤＥ４特異的インヒビターである。より好ましい実施形態において、この薬学的組成物は、静脈内投与または皮下投与に適切な組成物であり、好ましくは、皮下投与に適切な組成物である。なおより好ましい実施形態において、この組成物は、長期投与に適した組成物である。別の好ましい実施形態において、この組成物は、長期投与を可能にするデバイス内に含まれる。このようなデバイスとしては、とりわけ、ミニポンプ、徐放性経口錠剤または徐放性口腔錠剤、経皮パッチ、静脈内点滴バッグ、直腸座剤または膣座剤、移植可能徐放ゲル、錠剤または侵食性生体マトリックスが、挙げられる。本発明に従う薬学的組成物の１つ以上の投与は、神経系における神経の成長または再生を調節するために（例えば、促進または阻害するために）、神経組織またはニューロンに対する損傷または被害を処置するために、ならびに神経系に対する損傷（例えば、外傷）、障害または疾患（アポトーシス、壊死、または他の形態の細胞死に関連するものを含む）に関連する神経変性を処置するために、有用である。
【００５１】
所定の適用のために好ましい薬学的処方物および治療上有効な用量レジメンの決定は、例えば、患者の状態および重量、所望される処置の程度、およびその処置に対する患者の許容性を考慮して、当業者の範囲内である。例えば、Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ａｄｄｉｔｉｖｅｓ：Ａｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｒｅ  ｔｈａｎ  ６０００  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  ｂｙ  Ｔｒａｄｅ  Ｎａｍｅ，Ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｆｕｎｃｔｉｏｎ，ａｎｄ  Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｅｒ、Ａｓｈｇａｔｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．、Ｍ．ＡｓｈおよびＩ．Ａｓｈ編、１９９６；Ｔｈｅ  Ｍｅｒｃｋ  Ｉｎｄｅｘ：Ａｎ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｄｒｕｇｓ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ、Ｓ．Ｂｕｄａｖａｒｉ編、年鑑；Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＯＬＹＡＭＩＮＥ；Ｍａｒｔｉｎｄａｌｅ：Ｔｈｅ  Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ｄｒｕｇ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ、Ｋ．Ｐａｒｆｉｔｔ編、１９９９；ならびにＧｏｏｄｍａｎ  ＆  Ｇｉｌｍａｎ’ｓ  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、Ｐｅｒｇａｍｏｎ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ＮＹ、Ｌ．Ｓ．Ｇｏｏｄｍａｎら編（これらの内容は、本明細書中に参考として援用される）を参照のこと。
【００５２】
本発明のニューロンＰＤＥ４モジュレーター（単離された形態および精製された形態、これらの塩またはその薬学的に受容可能な誘導体を含む）の投与は、損傷または障害（特に、中枢神経系および末梢神経系に関するもの）を処置するために使用される薬剤の、従来認容されている投与様式のいずれかを使用して、達成され得る。
【００５３】
ロリプラムは、血液脳関門を通り得、従って皮下注射により動物に治療有効用量で送達され得る、ＰＤＥ４インヒビターである。この特性は、ロリプラム、および血液脳関門を通り得る他のＰＤＥ４インヒビターを、ニューロンの成長および再生を改善するための治療剤として、非常に魅力的な候補にする。
【００５４】
本発明のＰＤＥ４モジュレーターを含む薬学的組成物は、種々の形態であり得、この形態は、好ましい投与の様式に従って選択され得る。これらとしては、例えば、固体、半固体、および液体の投薬形態（例えば、錠剤、カプセル剤、丸剤、散剤、クリーム、液体の溶液または懸濁液、シロップ、坐剤、注射可能な溶液および注入可能な溶液、エアロゾルなど）が挙げられる。好ましい形態は、意図される投与の様式および治療の適用に依存する。投与の様式としては、経口投与、非経口投与（皮下、静脈内、筋内、関節内、滑液包内、槽、鞘内、肝臓内、病変内および頭蓋内の、注射または注入が挙げられる）、局所投与、直腸投与、経鼻投与、頬投与、膣投与、吸入による投与、または移植されたレザバ、外部ポンプもしくはカテーテルによる投与が挙げられ得るが、これらに限定されない。好ましい実施形態において、本発明のニューロンＰＤＥ４モジュレーターは、例えば、注射によってか、またはミニポンプを介する連続的な送達によって、皮下投与される。
【００５５】
本発明のＰＤＥ４調節因子は、例えば、取り込みまたは安定性を刺激する補因子ありまたはなしで、滅菌等張処方物に入れられ得る。この処方物は、好ましくは液体であるか、または凍結乾燥された粉末であり得る。例えば、本発明の薬剤は、５．０ｍｇ／ｍｌのクエン酸一水和物、２．７ｍｇ／ｍｌのクエン酸三ナトリウム、４１ｍｇ／ｍｌのマンニトール、１ｍｇ／ｍｌのグリシンおよび１ｍｇ／ｍｌのポリソルベート２０を含む処方物緩衝液で希釈され得る。この溶液は、凍結乾燥され得、冷蔵して保存され得、そして投与の前に、滅菌注射用水（ＵＳＰ）で再形成され得る。
【００５６】
この組成物はまた、好ましくは、当該分野において周知の、従来の薬学的に受容可能なキャリアを含む（前出の薬学の参考文献を参照のこと）。このような薬学的に受容可能なキャリアとしては、他の医薬品、キャリア（遺伝的キャリアを含む）、アジュバント、賦形剤など（例えば、ヒト血清アルブミンまたは血漿調製物）が挙げられ得る。この組成物は、好ましくは、単位用量の形態であり、そして通常、１日に１回以上投与される。
【００５７】
本発明の化合物を含む組成物は、約０．１〜約９０重量％の活性化合物、そしてより一般的には、約１０重量％〜約３０重量％の活性化合物を含有する。この組成物は、通常のキャリアおよび賦形剤（例えば、コーンスターチまたはゼラチン、ラクトース、スクロース、微結晶性セルロース、カオリン、マンニトール、リン酸二カルシウム、塩化ナトリウムおよびアルギン酸）を含み得る。この組成物は、クロスカルメロースナトリウム（ｃｒｏｓｃａｒｍｅｌｌｏｓｅ  ｓｏｄｉｕｍ）、微結晶性セルロール、コーンスターチ、デンプングリコール酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ  ｓｔａｒｃｈ  ｇｌｙｃｏｌａｔｅ）、およびアルギン酸を含み得る。
【００５８】
経口投与のためには、薬学的組成物は、例えば、錠剤、カプセル剤、懸濁液または液体の形態である。錠剤およびカプセル剤のような固体処方物が、特に有用である。徐放性調製物または腸溶性調製物もまた、考案され得る。小児および老年者の適用については、懸濁液、シロップおよび噛める錠剤が、特に適切である。薬学的組成物は、好ましくは、治療有効量の活性成分を含む投薬単位の形態で作製される。このような投薬単位の例は、錠剤およびカプセル剤である。
【００５９】
治療の目的で、錠剤およびカプセル剤は、活性成分に加えて従来のキャリアを含み得、このキャリアは例えば、結合剤（例えば、アラビアゴム、ゼラチン、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリビニルピロリドン（ポビドン）、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、スクロース、デンプンおよびエチルセルロースソルビトール、またはトラガカントゴム）；充填剤（例えば、リン酸カルシウム、グリシン、ラクトース、トウモロコシデンプン、ソルビトール、またはスクロース）；滑沢剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、または他の金属ステアリン酸塩、ステアリン酸、ポリエチレングリコール、シリコーン流体、タルク、蝋、油およびシリカ、コロイド状シリカまたはコロイド状タルク）；崩壊剤（例えば、ジャガイモデンプン）、矯味矯臭剤または着色剤、または受容可能な湿潤剤である。
【００６０】
経口液体調製物は、一般に、水性または油性の、溶液、懸濁液、エマルジョン、シロップまたはエリキシルの形態であり、以下のような従来の添加剤を含み得る：懸濁剤、乳化剤、非水性薬剤、防腐剤、着色剤および矯味矯臭剤。経口液体調製物は、リポペプチドミセルまたは単量体形態のリポペプチドを含み得る。液体調製物のための添加剤の例としては、アラビアゴム、扁桃油、エチルアルコール、分別ココナッツ油、ゼラチン、グルコースシロップ、グリセリン、水素化食用脂肪、レシチン、メチルセルロース、パラ−ヒドロキシ安息香酸メチルもしくはパラ−ヒドロキシ安息香酸プロピル、プロピレングリコール、ソルビトール、またはソルビン酸が挙げられる。
【００６１】
静脈内（ＩＶ）使用のためには、ＰＤＥ４モジュレーターの水溶性形態が、通常使用される静脈内流体のいずれかに溶解され得、そして注入によって投与され得る。静脈内処方物は、キャリア、賦形剤または安定剤（カルシウム塩、ヒト血清アルブミン、クエン酸塩、酢酸塩、塩化カルシウム、炭酸塩などの塩が挙げられるが、これらに限定されない）を含み得る。静脈内流体としては、生理食塩水またはリンガー溶液が挙げられるが、これらに限定されない。必要に応じて他のキャリア分子とカップリングされる、ポリアミンモジュレーターおよびアルギナーゼモジュレーターもまた、注射器、カニューレ、カテーテルおよびラインに入れられ得る。
【００６２】
非経口投与のための処方物は、水性または非水性の等張性滅菌注入溶液または懸濁液の形態であり得る。これらの溶液または懸濁液は、経口投与のための処方物における使用に関して言及されたキャリアの１つ以上を有する、滅菌された粉末または顆粒から調製され得る。リポペプチドミセルは、非経口投与のために特に望ましくあり得る。この化合物は、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、エタノール、トウモロコシ油、ベンジルアルコール、塩化ナトリウム、および／または種々の緩衝液に溶解され得る。筋内調製物のためには、ポリアミン調節因子またはアルギナーゼ調節因子、あるいはこの化合物の適切な可溶性の塩形態（例えば、塩酸塩）の滅菌処方物が、薬学的希釈剤（例えば、注射用水（ＷＦＩ）、生理食塩水または５％グルコース）に溶解され得、そして投与され得る。
【００６３】
注射可能な蓄積形態は、生分解性ポリマー（例えば、ポリラクチド−ポリグリコリド）中に微小カプセル化された上記化合物のマトリックスを形成することによって、作製され得る。薬物対ポリマーの比、および使用される特定のポリマーの性質に依存して、薬物放出の速度が制御され得る。他の生分解性ポリマーの例としては、ポリ（オルトエステル）およびポリ（無水物）が挙げられる。蓄積注射可能な処方物はまた、薬物を、身体組織と適合性のミクロエマルジョンにトラップすることによって、調製される。
【００６４】
局所的な使用のために、本発明のＰＤＥ４調節因子はまた、皮膚、または鼻および咽喉の粘膜に適用するために適切な形態で調製され得、そしてクリーム、軟膏、液体スプレーまたは吸入剤、ロゼンジ、または咽喉塗布剤の形態をとり得る。このような局所処方物は、さらに、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）のような化合物を含んで、活性成分の表面浸透を容易にし得る。局所調製物のためには、ＰＤＥ４調節因子またはその適切な塩形態の滅菌処方物が、クリーム、軟膏、スプレーまたは他の局所的包帯として投与され得る。局所調製物はまた、治療組成物を浸透させた帯具の形態であり得る。
【００６５】
眼、鼻または耳への適用のためには、本発明のＰＤＥ４調節化合物は、液体形態また半液体形態で調製され得、必要に応じて、疎水性ベースまたは親水性ベース中で、軟膏、クリーム、ローション、塗布剤または散剤として処方される。直腸投与または膣投与のためには、本発明の化合物は、従来のキャリア（例えば、ココアバター、蝋または他のグリセリド）と混合された坐剤の形態で投与され得る。エアロゾル調製物のためには、ペプチドまたはリポペプチド、あるいはこの化合物の塩形態の滅菌処方物が、吸入器（例えば、計量された用量の吸入器）、および噴霧器において、使用され得る。
【００６６】
あるいは、本発明のＰＤＥ４調節因子は、送達時の適切な薬学的に受容可能なキャリア中での再構成のために、粉末形態であり得る。１つの実施形態において、この化合物の単位投薬形態は、滅菌された気密アンプル内の、化合物またはその塩の、適切な希釈剤中の溶液であり得る。単位投薬量中のこの化合物の濃度は、使用される化合物およびその溶解度、ならびに医師により所望される用量に依存して、例えば、約１％から約５０％まで変動し得る。この組成物が投薬単位を含む場合、各投薬単位は、好ましくは、０．１〜１０μｍｏｌ／ｋｇ／時間の活性物質を含む。成人の処置のためには、使用される投薬量は、好ましくは、投与の経路および頻度に依存して、０．１〜３．０μｍｏｌ／ｋｇ／時間の範囲である。皮下投与のためには、より好ましい用量は、０．１５〜１．５μｍｏｌ／ｋｇ／時間である。投与用量は、少なくとも２４時間、好ましくは４８時間、より好ましくは３日間、より好ましくは１週間、より好ましくは２週間、より好ましくは３週間、１ヶ月間、２ヶ月間、またはそれより長く、投与される。投与量は、３ヶ月まで、６ヶ月、または１２ヶ月、あるいはそれより長い期間にわたって、投与され得る。
【００６７】
本発明の薬学的組成物はまた、罹患した組織、血流、脳脊髄液、または神経系における罹患位置へのその薬剤の標的化を可能にする他の位置（筋肉を含む）に配置されるか、その近くに配置されるか、またはその場所と連絡して配置される、ミクロスフェア、リポソーム、他の微粒子送達系、または制御放出処方物もしくは徐放処方物を使用して、投与され得る。本発明の組成物は、制御放出送達系（例えば、カプセル剤）または徐放送達系（例えば、生体侵食性マトリックス）を使用して、送達され得る。本発明の組成物の投与に適した、薬物送達のための例示的な遅延放出送達系は、米国特許第４，４５２，７７５号（Ｋｅｎｔに対して発行された）、同第５，２３９，６６０号（Ｌｅｏｎａｒｄに対して発行された）、同第３，８５４，４８０号（Ｚａｆｆａｒｏｎｉに対して発行された）に記載されている。
【００６８】
徐放キャリアの適切な例としては、形成された物品の形態の、半透過性ポリマーマトリックス（例えば、坐剤またはマイクロカプセル）が挙げられる。移植可能徐放マトリックスまたはマイクロカプセル徐放マトリックスとしては、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，３１９号；ＥＰ  ５８，４８１）、Ｌ−グルタミン酸とγエチル−Ｌ−グルタメートとのコポリマー（Ｓｉｄｍａｎら、Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ，２２，５４７−５６頁（１９８５））；ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）またはエチレン酢酸ビニル（Ｌａｎｇｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．，１５、１６７−２７７頁（１９８１）；Ｌａｎｇｅｒ，Ｃｈｅｍ．Ｔｅｃｈ．，１２，９８−１０５頁（１９８２））が挙げられる。
【００６９】
ＰＤＥ４調節因子を含むリポソームは、周知の方法によって調製され得る（例えば、ＤＥ  ３，２１８，１２１；Ｅｐｓｔｅｉｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８２、３６８８−９２頁（１９８５）；Ｈｗａｎｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，７７、４０３０−３４頁（１９８０）；米国特許第４，４８５，０４５号および同第４，５４４，５４５号を参照のこと）。通常、リポソームは、小さな（約２００〜８００Åの）単層型であり、ここで、脂質含有量は、約３０ｍｏｌ％コレステロールより高い。コレステロールの割合は、最適な薬剤放出速度を制御するように選択される。
【００７０】
本発明のＰＤＥ４調節因子はまた、リポソームに付着され得、このリポソームは必要に応じて、所望の処置部位へのこの組成物の標的化または投与を補助するために、他の薬剤を含み得る。リポソームへのこのような薬剤の付着は、任意の公知の架橋剤（例えば、標的化送達のために、毒素または化学療法剤を抗体にカップリングするために広く使用されてきた、ヘテロ二官能性架橋剤）によって達成され得る。リポソームへの結合体化はまた、炭水化物特異的架橋剤である４−（４−マレイミドフェニル）酪酸ヒドラジン（ＭＰＢＨ）を使用して、達成され得る（Ｄｕｚｇｕｎｅｓら、Ｊ．Ｃｅｌｌ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ａｂｓｔ．Ｓｕｐｐｌ．１６Ｅ  ７７（１９９２））。
【００７１】
（投与経路）
本発明の１つの実施形態において、１種以上の本発明のＰＤＥ４調節因子を発現するよう操作された細胞が、治療的な処置レジメンにおいて使用され得る。このような操作された細胞を使用して、治療剤を合成し得、この治療剤は次いで、独立して宿主に投与され得る。あるいは、本発明のＰＤＥ４調節因子の発現を活性化する（このＰＤＥ４調節因子は、操作された細胞から分泌または放出される）、ＤＮＡまたはＲＮＡのような外因性核酸で形質転換されたか、トランスフェクトされたか、または感染された細胞は、例えば、このような操作された細胞を、宿主に、処置の必要のある標的化組織または細胞と連絡する領域に移植することによって、治療剤として直接使用され得る。例えば、細胞は、神経系の細胞または組織においてＰＤＥ４転写物をコードするｍＲＮＡを特異的に標的化する、アンチセンスＤＮＡ、リボザイム、またはＲＮＡｉを発現するように、操作され得る。
【００７２】
細胞へのウイルス遺伝子または非ウイルス遺伝子の送達（次いでこれらの細胞は、本発明によるＰＤＥ４調節因子を過剰（または過少）発現する）は、当業者に周知の多数の技術のいずれかによって、インビトロまたはインビボで実施され得る。多数のこのような送達方法が、ニューロンに作用することが示された。例えば、Ｃｈｅｒｋｓｅｙら、米国特許第６，２１０，６６４号（Ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｃｅｎｔｒａｌ  ｎｅｒｖｏｕｓ  ｓｙｓｔｅｍ  ｉｎｖｏｌｖｉｎｇ  ａ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｖｅｃｔｏｒ）；Ｋａｐｌｉｔｔら、米国特許第６，１８０，６１３号（ＡＡＶ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｔｏ  ｃｅｌｌｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｎｅｒｖｏｕｓ  ｓｙｓｔｅｍ）；Ｈａｙｅｓら、米国特許第６，０９６，７１６号（Ｌｉｐｏｓｏｍｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｅｎｔｒａｌ  ｎｅｒｖｏｕｓ  ｓｙｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ）；Ｋｏｃｈａｎｅｋら、米国特許第５，９８１，２２５号（Ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｖｅｃｔｏｒ，ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｓａｍｅ，ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ  ｔｈｅ  ｓａｍｅ  ａｎｄ  ｍｅｔｈｏｄ  ｏｆ  ｕｓｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｓａｍｅ）；Ｇａｇｅら、米国特許第５，７６２，９２６号（Ｍｅｔｈｏｄ  ｏｆ  ｇｒａｆｔｉｎｇ  ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｃｅｌｌｓ  ｔｏ  ｔｒｅａｔ  ｄｅｆｅｃｔｓ，ｄｉｓｅａｓｅ  ｏｒ  ｄａｍａｇｅ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｃｅｎｔｒａｌ  ｎｅｒｖｏｕｓ  ｓｙｓｔｅｍ）；ＷＯ／００８１９２（Ｈｅｒｐｅｓ  ｖｉｒａｌ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ）；およびＣＡ２２４７９１２（Ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ｐｒｉｍａｒｙ  ｏｌｉｇｏｄｅｎｄｒｏｃｙｔｅｓ  ｆｏｒ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｇｅｎｅ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｃｅｎｔｒａｌ  ｎｅｒｖｏｕｓ  ｓｙｓｔｅｍ）（これらの全開示は、本明細書中に参考として援用される）を参照のこと。
【００７３】
例えば、ニューロン細胞は、感染した宿主細胞にＰＤＥ４調節因子を高レベルで発現させる、ウイルスに感染し得る。ＰＤＥ４調節因子が通常は分泌タンパク質ではない場合、このＰＤＥ４調節因子は、宿主細胞からのタンパク質の分泌のために必要とされるシグナルペプチドを有するように、操作され得る。このようなシグナルペプチドは、その長さ（約１６〜３０アミノ酸）および疎水性によって特徴付けられ、そしてこれらは、アミノ酸配列レベルで、高度には保存されていない（例えば、Ｌｏｄｉｓｈら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，第３版、Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｂｏｏｋｓ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９５，第１６章を参照のこと）。真核生物細胞における分泌のためのシグナル配列として機能するアミノ酸残基は、当業者に周知の多数の慣用的な遺伝子操作方法のいずれかによって、異種タンパク質のＮ末端に操作され得る。例えば、Ｆａｒｒｅｌｌら、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，４１，１４４−５３頁（２０００）（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｈｅａｌｔｈｔｅｃｈ．ｃｏｍ／２００１／ｐｅｘもまた参照のこと）；Ｂｏｒｎｇｒａｂｅｒら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．，１４，２３７−４６頁（１９９８）；Ｃｏｌｌｉｎｓ−Ｒａｃｉｅら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１３，９８２−９８７頁（１９９５）；米国特許第５，７４７，６６２号；ＷＯ００／５０６１６；ＷＯ９９／５３０５９；およびＷＯ９６／２７０１６を参照のこと；これらの各々は、その全体が本明細書中に参考として援用される。本発明のＰＤＥ４調節因子の分泌形態を発現する宿主細胞は、神経系を浸漬する脳脊髄液（ＣＳＦ）におけるｃＡＭＰのレベルを上昇させると予測される。あるいは、ＰＤＥ４調節因子を、例えば注射によって、ＣＳＦに直接提供することが可能である。他の形態のＰＤＥ４調節因子を分泌する、トランスフェクトされた細胞は、類似の様式で、ニューロンの損傷または変性の部位に投与され得る。
【００７４】
さらに、内因性遺伝子を、相同組換え技術によって、直接標的化することが可能である。このような技術は、当業者が、哺乳動物細胞において、内因性遺伝子を置換または改変することを可能にする。これは、遺伝子のコード配列（細胞内標的化配列を含む）および非コード（調節）配列（例えば、転写制御配列１およびプトレシン活性、ポリアミン活性またはアルギナーゼ活性を調節する選択された遺伝子の発現レベルを制御する他の調節配列）の活性化、不活化または変更のためである。相同組換え技術に関しては、例えば、米国特許第６，２１４，６２２号および同第６，０５４，２８８号（これらは、本明細書中に参考として援用される）を参照のこと。ポリアミン調節配列に関しては、例えば、Ｖｅｒｅｓｓら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，３４６，１８５−１９１頁（２０００）；ＳｈａｎｔｚおよびＰｅｇｇ；Ｉｎｔ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，３１，１０７−１２２頁（１９９９）；Ｓｃｈａｎｔｚら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，５６，３２６５−３２６９頁（１９９６ａ）ならびにＣａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，５６，５１３６−５１７０頁（１９９６ｂ）を参照のこと。
【００７５】
本発明に従うＰＤＥ４調節因子はまた、本発明に従うＰＤＥ４調節因子を放出または分泌するように操作された細胞または他の生体適合性物質の脊椎移植（例えば、脳脊髄液への）によって送達され得る。この因子の細胞分泌速度または物質放出速度は、インビトロ（例えば、適用可能な場合、細胞培養物において）で測定され、次いで、相対容量、インビボの半減期、および当業者により理解される他のパラメーターに基づいて推定される。
【００７６】
必要に応じて、本発明に従うＰＤＥ４調節因子を放出するトランスフェクトされた細胞または生体適合性の送達物質は、当業者に公知の利用可能な方法を使用して、免疫組織学的カプセルまたはチャンバ内にカプセル化され、そして脳または脊髄領域に移植され得る。例えば、米国特許第６，１７９，８２６号、同第６，０８３，５２３号、同第５，６７６，９４３号、同第５，６５３，９７５号および同第５，４８７，７３９号；ならびにＷＯ８９／０４６５５、ＷＯ９２／１９１９５、ＷＯ９３／００１２７、ＥＰ１２７，９８９（これら全ては本明細書中で参考として援用される）を参照のこと。
【００７７】
あるいは、ポンプ（例えば、皮下投与のために設計されたポンプ）、および／またはカテーテル様デバイスは、本発明のＰＤＥ４調節因子を、時期を得た基準でかつ所望の濃度（これは当業者によって選択され、そして経験的に変更され得る）で投与するために、損傷部位に移植または挿入され得る。このような医薬送達システムは、当業者に周知である。例えば、米国特許第４，５７８，０５７号およびその中で引用される参考文献を参照のこと；移植可能ポンプについては、例えば、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｅｄｔｒｏｎｉｃ．ｃｏｍ／を参照のこと（これらの各々は本明細書中で参考として援用される）。上記のように、好ましくは、本発明のＰＤＥ４調節因子は、血液脳関門を通過し得る。このような場合において、ポンプおよびカテーテル様デバイスは、本発明のＰＤＥ４調節因子を、時期を得た基準でかつ所望の濃度（これは当業者によって選択され、そして経験的に変更され得る）で（例えば、皮下に）投与するために、損傷部位から離れた位置に移植または挿入され得る。別の局面において、本発明は、調節因子を含むポンプを提供する。
【００７８】
さらなる局面において、本発明は、哺乳動物（ヒトおよび他の動物を含む）におけるニューロン変性またはニューロン増殖の欠如に関連する状態、疾患または障害を処置するための方法を提供する。用語「処置する」とは、ニューロン死の予防、ならびに軸索成長、軸索発芽、および宿主動物が罹患した後のニューロン前駆細胞の増殖の制御の両方を示すために使用される。確立された状態、疾患または障害は、急性または慢性のものであり得る。この方法は、ヒトまたは他の動物に、本発明の有効用量のＰＤＥ４調節因子を投与する工程を包含する。例えば、ロリプラムの有効用量は、一般に、約０．１〜１０μｍｏｌ／ｋｇ／時間のロリプラムまたはロリプラム関連アナログもしくは誘導体、あるいはそれらの薬学的に受容可能な塩である。約７０ｋｇの成人ヒト患者について、ロリプラムは、７．０〜７００μｍｏｌのロリプラム／時間の用量（これは１６８〜１６，８００μｍｏｌ用量／日である）を与える。好ましい実施形態において、ＰＤＥ４インヒビター、特に、ＰＤＥ４特異的インヒビターの有効用量は、処置されている神経系組織または器官において少なくとも４０％、より好ましくは５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または９５％だけＰＤＥ４活性を阻害する用量である。
【００７９】
本発明のＰＤＥ４調節因子は、単独でかまたは併用治療の一部として投与され得る。好ましい用量は、約０．１〜１０μｍｏｌ／ｋｇ／時間（２．４〜２４０μｍｏｌ／ｋｇ／日）のロリプラム、ロリプラム関連アナログもしくは誘導体、またはそれらの薬学的に受容可能な塩である。より好ましい用量は、約０．１〜３．０μｍｏｌ／ｋｇ／時間（２．４〜４８μｍｏｌ／ｋｇ／日）のロリプラム、ロリプラム関連アナログもしくは誘導体、またはそれらの薬学的に受容可能な塩である。これらのロリプラムの投薬量は、他のＰＤＥ４インヒビターおよび本発明のＰＤＥ４インヒビターの有効投薬量を決定および最適化するために、当業者によって開始点として使用され得る。
【００８０】
一実施形態において、本発明は、治療的有効量の本発明のＰＤＥ４調節因子を使用して、被験体におけるニューロン変性またはニューロン増殖の欠如に関連する状態、疾患または障害を処置するための方法を提供する。因子を神経系に送達するための代表的な手順は、例えば、Ｃｈｅｒｓｋｅｙら、米国特許第６，２１０，６６４号；Ｋａｐｌｉｔｔら、米国特許第６，１８０，６１３号；Ｈａｙｅｓら、米国特許第６，０９６，７１６号；Ｋｏｃｈａｎｅｋら、米国特許第５，９８１，２２５号；Ｇａｇｅら、米国特許第５，７６２，９２６号；およびカナダ特許２２４７９１２号（これらの内容全体は、その全体が本明細書中で参考として援用される）に記載される。
【００８１】
本明細書中で使用する場合、成句「治療的有効量」とは、被験体が、選択された投与レジメン（例えば、選択された投薬レベルおよび処置回数）の下で処置された後に、ニューロン増殖または再生における検出可能な改善を示すような、本発明のＰＤＥ４調節因子の量を意味する。用語「処置する」は、被験体に、治療的有効量の本発明の化合物を投与して、ニューロン死またはニューロン増殖の欠如に関連する状態、疾患または障害に関連する症状の発生を予防するか、あるいはこのような症状を制御または排除するとして、定義される。用語「被験体」とは、本明細書中で記載される場合、哺乳動物または培養物中の細胞として定義される。好ましい実施形態において、被験体は、処置の必要なヒトまたは他の動物患者である。
【００８２】
本発明の化合物は、単独で、または他の化合物（例えば、「カクテル」）（本発明の他の化合物が挙げられるが、これに限定されない）と組み合わせて投与され得る。本発明の化合物は、一回の一日用量または一日あたり複数回の投薬として投与され得る。好ましくは、処置レジメンは、長期間（例えば、数日または２〜４週間）にわたってＰＤＥ４調節因子を投与する工程を包含する。投与される用量あたりの量または投与される全量は、症状の特徴および重篤度、患者の年齢および一般的な健康状態、処置プログラムに対する患者の耐性、経験的に決定され得る因子のような因子に依存する。
【００８３】
（ホスホジエステラーゼ）
ｃＡＭＰは、同定された第１の細胞内第二メッセンジャー（Ｓｕｔｈｅｒｌａｎｄ、１９７０）であったが、ｃＡＭＰを生成、調節、検出および破壊する酵素の複雑な系の理解は、完成にはほど遠い。
【００８４】
哺乳動物細胞は、アデニリルシクラーゼ（ｃＡＭＰを合成する酵素）の９個のアイソフォームを合成し得る。哺乳動物細胞において、ｃＡＭＰは、ホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ）と呼ばれる酵素のファミリーによって、分解（加水分解）される。アイソフォーム４（「ＰＤＥ４」または４型）を含むＰＤＥの多くのアイソフォームが存在する。例えば、Ｔａｋａｈａｓｈｉら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，１９９９  Ｊａｎ  １５；１９（２）：６１０−８；Ｄｕｐｌａｎｔｉｅｒら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．１９９６．Ｊａｎ  ５；３９（１）：１２０−５を参照のこと。ＰＤＥは、多様な群の酵素を構築する。ＰＤＥの複雑性のレベルは一致し、そしておそらく、アデニリルシクラーゼの複雑性のレベルに勝る。なぜなら、ＰＤＥは、異なるｃＡＭＰ依存性シグナル伝達経路間で連絡するさらなる機会を細胞に提供するからである。
【００８５】
第１のｃＡＭＰホスホジエステラーゼ遺伝子は、ショウジョウバエ、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａにおいて、記憶欠損に影響する遺伝子についてのスクリーニングにおいて同定された（Ｄｕｄａｉら、１９７６）。１９８１年に、「ダンス」と呼ばれるこの遺伝子は、ｃＡＭＰホスホジエステラーゼにおいて変異を有することが生化学的に証明された（Ｂｙｅｒｓら、１９８１）。このＤｒｏｓｏｐｈｉｌａダンス遺伝子は、クローニングされ（ＤａｖｉｓおよびＤａｖｉｄｓｏｎ、１９８６）、続いて、このダンス遺伝子の哺乳動物ホモログがクローニングされ、そして特徴付けされた（Ｄａｖｉｓら、１９８９）。これらは後に、ＰＤＥ４ファミリーの酵素のメンバーであることが示された。
【００８６】
（ホスホジエステラーゼ４型（ＰＤＥ４））
ＰＤＥ４ファミリーの酵素は、４つの酵素（ＰＤＥ  Ａ〜Ｄ）からなり、このうちの３つ（ＰＤＥ４Ａ、ＰＤＥ４ＢおよびＰＤＥ４Ｄ）は、神経系において発現される（Ｐｅｒｅｚ−Ｔｏｒｒｅｓら、２０００）。ＰＤＥ４ファミリーの酵素の全ては、ｃＡＭＰ特異的であり、そしてこれらはロリプラムによって阻害される。ＰＤＥ４の転写およびスプライシングのパターンは、発達と共に変化する（Ｄａｖｉｅｓら、１９８９）。２つの特徴は、かなり例外的である。第１の特徴は、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｃＤＮＡに対する類似性の程度（７５％同一性）であり、このことは、ＰＤＥ４遺伝子が高度に保存された遺伝子であることを示している。第２の特徴は、ラットＰＤＥ４遺伝子の複雑性である。例えば、ＰＤＥ４Ａ遺伝子は、４９ｋｂ長であり、１６エキソンを有する。各遺伝子は、６個までのスプライス改変体をコードし得る。
【００８７】
全てのＰＤＥ４タンパク質は、類似の基本構造を有し、この構造は、ＣＯＯＨ末端に保存された触媒ドメイン、およびこのタンパク質のアミノ末端に２つの上流の保存された領域の選択を含む（Ｂｏｌｇｅｒら、１９９７）。これらの上流の保存された領域、および各タンパク質に固有の極度のアミノ末端領域の組み合わせは、それらの意図される細胞の目的に対してそれらの酵素を標的化し、さらにこれらのＰＤＥ４酵素にそれらの異なる調節特性を与える。これらのスプライス改変体における最も明確な差異の１つは、それらの細胞成分分布である。上流の保存領域、ｕｃｒ１およびｕｃｒ２の両方を有する長いアイソフォームは、膜と結合し、そして短い形態は、通常は細胞質ゾルである。神経系は、主として、これらの酵素の長いアイソフォームを発現する（Ｂｏｌｇｅｒら、１９９７）。
【００８８】
ＰＤＥ４遺伝子の分子クローニングは、ＰＤＥの他のファミリーのクローニングのための出発点であった。今日、哺乳動物ホスホジエステラーゼのリストは、１０の異なるＰＤＥファミリーに細分化されている１９の遺伝子を含む（例えば、Ｓｏｄｅｒｌｉｎｇら（２０００），Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１２：１７４−９（本明細書中で参考として援用される）を参照のこと）。これらのＰＤＥのほとんど全ては、神経系において種々のレベルで発現される。しかし、ＰＤＥ４の活性は、脳におけるｃＡＭＰ  ＰＤＥ活性全体の少なくとも７０％を担う（Ｊｉｎら、１９９９）。異なる組織におけるＰＤＥのインヒビターを用いる実験は、ｃＡＭＰレベルは、ＰＤＥ４特異的インヒビターの適用後に、ニューロンにおいてのみ、有意に上昇することを示した。他の組織において、異なるＰＤＥファミリーのインヒビターの組み合わせが必要とされる（Ｓｈｉｒｏｔａｎｉら、１９９１）。このことは、他の組織において、ＰＤＥ４の相対的な寄与は神経系においてほど高くないという概念を支持する。
【００８９】
（ロリプラム）
ロリプラムは、ＰＤＥ４の特異的インヒビターである。ロリプラムは、抗鬱薬、抗炎症薬、記憶改善薬および鎮静薬として臨床試験の目的であった。記憶改善薬としてのロリプラムの研究において、非常に低い濃度のこの薬物が使用された（０．１〜３．０μｍｏｌ／ｋｇ）（Ｂａｒａｄら、１９９８）。０．１μｍｏｌ／ｋｇの用量で皮下注射された場合、ロリプラムは、海馬依存性記憶作業におけるマウスの能力を改善した。０．３μｍｏｌ／ｋｇまでの濃度において、ロリプラムは、インビトロにおける海馬切片におけるｃＡＭＰの基底レベルを上昇しなかった。ｃＡＭＰの基底レベルの上昇は、１．０〜３．０μｍｏｌ／ｋｇの用量において検出され得た。興味深いことに、ｃＡＭＰの基底レベルの増加を生じたより高いロリプラムの用量（３．０μｍｏｌ／ｋｇ）は、記憶改善効果を有さなかった。ロリプラムの副作用は、これらの濃度において報告されていない（Ｂａｒａｄら、１９９８）。
【００９０】
ロリプラムはまた、高濃度で抗炎症効果および鎮静効果を有することが報告されている。ロリプラムの鎮静効果は、５〜１０μｍｏｌ／ｋｇの濃度でラットにおいて証明された（Ｓｉｌｖｅｓｔｒｅら、１９９９）。関節炎のラットモデルにおける抗炎症薬としてのロリプラムの研究は、２０μｍｏｌ／ｋｇのロリプラムを使用した（Ｆｒａｎｃｉｓｃｈｉら、２０００；Ｈｏｇａｎら、２００１）。これらのより高い濃度において、副作用は報告されなかった。ロリプラムの抗炎症効果はまた、多発性硬化症（これは自己免疫炎症疾患である）についての動物モデルにおいて証明された（Ｇｅｎａｉｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，９２：３６０１−３６０５（１９９５））。
【００９１】
本明細書中で引用される全ての参考文献は、本明細書中で参考として援用される。
【００９２】
本発明をよりよく理解し得るために、以下の実施例は、神経突起増殖に対するミエリンおよびＭＡＧの発生的に調節された効果を阻害するＰＤＥ調節因子を同定するために使用される本発明の方法、このような因子を含む本発明の組成物、およびこれらの組成物を投与する工程を包含する方法を例示するために記載される。これらの実施例は、例示のみの目的のためであり、いずれの様式においても本発明の範囲を限定すると解釈されるべきではない。
【００９３】
（実施例）
以下の実施例は、ＰＤＥ４特異的インヒビターであるロリプラムを使用して哺乳動物ニューロンにおけるｃＡＭＰレベルを上昇することにより、成人の軸索がミエリンインヒビターの存在下で増殖し得ることを示す。これらの実験は、以下のことを示す：ａ）培養された小脳ニューロンの培地に直接添加されたロリプラムは、阻害性ＭＡＧの存在下でこれらのニューロンの神経突起増殖を改善する；ｂ）ロリプラムを用いるプライミングにより、小脳ニューロンは、阻害性ＭＡＧおよびミエリンの存在下において増殖し得る；ｃ）動物に注射されたかまたはミニポンプにより動物に直接皮下送達されたロリプラムは、出生後１２日（Ｐ１２）および１４日（Ｐ１４）のラット由来の単離された小脳（ＣＮＳ）ニューロン、ならびにＰ３０ラット由来のＤＲＧニューロン（ＰＮＳ）のＭＡＧによる軸索増殖の阻害をブロックし、この阻害のブロックは、時間と共に増加する；およびｄ）ミニポンプによって動物に皮下送達されたロリプラムは、脊髄切開後のインビボにおける運動ニューロンの回復を促進する。
【００９４】
（実施例１：ｄｂｃＡＭＰまたはロリプラムを用いる小脳ニューロンの直接処置）
軸索増殖のインヒビター（例えば、ＭＡＧ、ミエリン）に対するニューロンの応答は、ｃＡＭＰの細胞内レベルに依存する。従って、本発明者らは、ＰＤＥ４の特異的インヒビターであるロリプラムの追加が、ＭＡＧの存在下でニューロンを増殖させ得るか否かを観察することを望んだ。
【００９５】
Ｐ５ラット由来の小脳ニューロンを、以前に記載されるようにして単離した（Ｃａｉら、１９９９）。簡潔には、小脳を、０．０２５％のトリプシンで処理し、粉砕し、そして３７℃で１０分間インキュベートした。１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を含有する等量のＤＭＥＭを添加することによって、トリプシン処理を止めた。細胞を、８００ｒｐｍで５分間遠心分離した。この細胞を、２ｍｌのＳＡＴＯ中の単一細胞の懸濁液に再懸濁した（Ｃａｉら、１９９９を参照のこと、本明細書中で参考として援用される）。細胞の濃度は、６×１０４細胞／ｍｌに調整した。ＳＡＴＯ培地中の細胞を、ＭＡＧ発現チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞の単層またはコントロールＣＨＯ細胞（すなわち、ＭＡＧを発現しない）の単層のいずれかにプレートし、そして培養した（米国特許第５，９３２，５４２号もまた参照のこと）。記載されるように、ｄｂｃＡＭＰ（１ｍＭ）またはロリプラム（０．１μＭ、０．２５μＭ、０．５μＭまたは１．０μＭ）をこの培地に添加した。１８時間の培養の後、ニューロンを固定し、そしてグリア酸性タンパク質４３（ＧＡＰ４３）に対するウサギポリクローナル抗体で免疫染色して、神経突起を可視化した。初めの２００のＧＡＰ４３陽性ニューロンの最長の神経突起の長さを、Ｓｉｍｐｌｅ  ３２ＴＭソフトウェアを使用して決定した（Ｃａｉら、１９９９を参照のこと）。神経突起の平均長さを決定し、そして平均長さ＋／−ＳＥＭ（マイクロメートル（μｍ））として表した。結果は、ｄｂｃＡＭＰもロリプラムも存在しない場合に増殖したニューロンの神経突起の長さに対する割合として表す。
【００９６】
図１に示すように、０．２５μＭ〜１．０μＭの濃度範囲のロリプラムは、ＭＡＧによる軸索増殖の阻害を部分的にブロックする。０．５μＭの濃度において、ロリプラムは、ジブチリル−ｃＡＭＰ（ｄｂ−ｃＡＭＰ）と比較して８０％の効率で、ＭＡＧによる軸索増殖の阻害をブロックした（図３）。ロリプラムの効果は、用量依存性である。
【００９７】
（実施例２：ＢＤＮＦまたはロリプラムを用いる小脳ニューロンのプライミング）
本発明者らは、軸索成長のインヒビター（ＭＧＡおよびミエリン）と遭遇する前に、ニュートロフィン（脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ））および神経成長因子（ＮＧＦ）を用いて、６〜１８時間、ニューロンを処理すること（「プライミング」と呼ばれる）は、ニューロンに、インビトロでＭＡＧおよびミエリンの存在下で成長する能力（Ｃａｉら、１９９９）、ならびにインビボで再生する能力（Ｂｒｅｇｍａｎ、１９９８）を与ることを以前に示した。ニューロンにおけるｃＡＭＰのレベルは、ニュートロフィンを用いるプライミングの後、増加された。従って、本発明者らは、軸索成長のミエリンおよびＭＧＡ媒介阻害を防止する際に、ロリプラムを用いるプライミングは、ＢＤＮＦを用いるプライミングと同じくらい有効であるか否か決定することを探求した。
【００９８】
ＳＡＴＯ培地（実施例１において調製される）中の単離した小脳ニューロンを、１×１０６細胞／ディッシュで、ポリ−Ｌ−リジンをコートしたディッシュ上にプレートした。示される場合、２００ｎｇ／ｍｌの濃度のＢＤＮＦ、または０．１μＭもしくは０．２５μＭの濃度のロリプラム（全てＳｉｇｍａ製）のいずれかを添加した。１８時間の培養（プライミングと呼ばれる）の後、ニューロンを、０．１％トリプシンを用いて取り出した。トリプシン処理を、１０％ＦＣＳを含む５ｍｌのＤＭＥＭを添加することにより、停止した。プライムしたニューロンを、８００ｒｐｍで６分遠心分離し、そしてＳＡＴＯ培地に再懸濁した。細胞の濃度を、６×１０４細胞／ｍｌに調整した。ニューロンを、ＭＡＧ発現ＣＨＯ細胞、もしくはコントロールＣＨＯ細胞（これはＭＡＧを発現しない）、または精製し、固定化したミエリンのいずれかの上に、迅速にプレートした。ミエリンを、ラットＣＮＳ白質から、以前に記載されるように、調製した（Ｃａｉら、１９９９）。ニューロンを、一晩培養した後、固定し、そしてＧＡＰ４３に対して免疫染色して、軸索（神経突起）を染色した。１８０〜２００ニューロンの、１ニューロンあたり最も長い軸索の長さを測定した。結果を、平均長さ＋／−ＳＥＭ（マイクロメートル（μｍ））として表した（例えば、米国特許第５，９３２，５４２号および同第６，２０３，７９２号を参照のこと）。
【００９９】
図２に示されるように、ＭＡＧによる軸索成長の阻害を防止する際に、０．２５μＭの濃度のロリプラムを用いる小脳ニューロンのプライミングは、ＢＮＤＦを用いる小脳ニューロンのプライミングとほぼ同じくらい有効であった。ロリプラムを用いる処置の後の、ＭＡＧを発現するＣＨＯ細胞の単層上の軸索の長さは、ＢＮＤＦを用いて処理したニューロンのニューロン長さの９５％であった。これらの結果は、ロリプラム（ＰＤＥ４特異的インヒビター）は、用量依存様式で、培養したニューロンにおけるニューロン成長のＭＡＧおよびミエリン媒介阻害を逆転し得る因子であることを実証する。
【０１００】
（実施例３：注射またはミニポンプによるラットへのロリプラムの皮下送達；神経成長および再生に対する効果）
（Ａ．ロリプラム皮下注射）
ＰＤＥ４特異的インヒビターを用いて、インビボでニューロンをプライミングし得、そしてミエリンおよびＭＡＧによる軸索成長の阻害を防止し得るか否かを決定するために、ロリプラムを、２４時間の間３時間毎に、Ｐ１２ラットおよびＰ３０ラットへと皮下注射した。全ての実験について、ロリプラムを、ＤＭＳＯに溶解して、そして滅菌生理食塩水を添加して濃度を調整した。このロリプラム溶液の最終容量は、各注射について０．２ｍｌであった。各時間点で、（一回の）ロリプラム注射を行った。ロリプラムを、（全ての実験について）ラットの頸部の皮膚の下に、および（Ｐ１２ラットを用いる第１の実験についてのみ）種々の他の部位に、インスリンシリンジ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  １ｃｃＵ−１００インスリンシリンジ）を用いて、皮下注射した。コントロール動物に、同じスケジュールに従って、ロリプラムを含まない、ＤＭＳＯおよび滅菌生理食塩水の混合物（０．２ｍｌ）を注射した。
【０１０１】
ロリプラムを、２４時間の間３時間毎に、０ｎｍｏｌ／ｋｇ、７．５ｎｍｏｌ／ｋｇ、２０ｎｍｏｌ／ｋｇ、２５ｎｍｏｌ／ｋｇ、または４０ｎｍｏｌ／ｋｇの濃度で、Ｐ１２ラットに皮下注射した後、屠殺した。小脳ニューロンおよびＤＲＧニューロンを、コントロール動物および処置動物から単離し、そして単層のＭＡＧ発現ＣＨＯ細胞または単層のコントロールＣＨＯ細胞（これはＭＡＧを発現しない）上にプレートした。小脳ニューロンを、実施例１に記載したように単離した。脊髄神経節（ＤＲＧ）ニューロンを、以前に記載されるように単離した（Ｄｅ  Ｂｅｌｌａｒｄら、１９９６）。簡単には、神経節を、動物から取り出し、そして５ｍｌのＳＡＴＯ培地（０．０２５％のトリプシンおよび０．１５％のＩ型コラゲナーゼを含む）（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ）中で、３７℃にて１時間インキュベートした。神経節を摩砕し、そしてトリプシン処理を、１０％ＦＣＳを含むＤＭＥＭ（５ｍｌ）を添加することによって停止させた。神経節を、８００ｒｐｍで６分間遠心分離し、そしてＳＡＴＯ中に再懸濁した。ニューロンを、実施例１に記載したように、ＣＨＯ単層上で一晩培養した後、実施例１に記載したように、固定しそしてＧＡＰ４３に対して免疫染色して、軸索を可視化した。ポジティブコントロールとして、コントロール動物由来のいくつかのニューロンもまた、１ｍＭのｄｂｃＡＭＰの存在下で、一晩培養した。１８０〜２００ニューロンの、１ニューロンあたりの最も長い軸索の長さを測定し、そして結果は、平均長さ＋／−ＳＥＭである。結果を、コントロール動物から単離され、生理食塩水／ＤＭＳＯ注射により処置し、そしてｄｂｃＡＭＰ処置もロリプラム処置もなしで、コントロールＣＨＯ細胞上にプレートしたニューロンの成長の割合として表す。図３Ａおよび３Ｂを参照のこと。
【０１０２】
この実験の結果は、７．５ｎｍｏｌ／ｋｇの用量で、ロリプラムが、ＭＡＧによるニューロン成長の引き続いての阻害を、有効に防止することを示す。２５ｎｍｏｌ／ｋｇの用量では、ＭＡＧによるニューロン成長の阻害は、本質的に完全に防止される。重要なことに、これらの結果は、ＰＤＥ４インヒビターであるロリプラムの動物への皮下注射が、ＭＡＧによる通常の成長阻害を克服するのに十分なレベルまで、インビボでのニューロンにおけるｃＡＭＰの内因的レベルを上昇させ得ることを実証する。本発明者らは、単離したニューロンが、ニューロン成長インヒビターとしてのＭＧＡよりむしろ精製したミエリンに対して培養される場合に、同様の結果を認めた。さらに、２４時間のロリプラムの注射は、コントロール細胞に関する軸索の長さに影響しない。例えば、図３Ａおよび３Ｂを参照のこと。
【０１０３】
これらの結果は、特異的インヒビターであるロリプラムを用いる酵素ＰＤＥ４の阻害が、ＭＡＧおよびミエリンによる哺乳動物軸索成長の阻害を克服し得ることを初めて実証する。重要なことに、図３Ａおよび３Ｂにおける結果が、生きている動物に皮下投与される場合、ロリプラムが、ニューロンの２つの異なる集団（ＣＮＳにおける小脳ニューロンおよびＰＮＳにおけるＤＲＧニューロン）に対する類似の効果を有することを示す。この効果を有するために、ロリプラムは、これらのニューロンに到達し、そして血液脳関門を横切らなければならない。従って、成熟ニューロンの成長状態は、血液脳関門を横切るＰＤＥ４インヒビター（例えば、ロリプラム）を用いる皮下注射によって変化され得、そして、神経成長および再生の阻害は、脊髄損傷または他のＣＮＳ（またはＰＮＳ）損傷の後にインビボで克服される。
【０１０４】
実験の第２のシリーズでは、本発明者らは、より高齢の動物（出生後３０日；Ｐ３０）へ、２４時間の間３時間毎に、漸増濃度のロリプラムの皮下注射をし、そして、上記のように、ＭＡＧの存在下または非存在下で、単離したＤＲＧニューロンの軸索成長を研究した。
【０１０５】
ＤＲＧニューロンを、コントロールＰ３０動物および処置Ｐ３０動物から単離し、そして単層のＭＡＧ発現ＣＨＯ細胞、または単層のコントロールＣＨＯ細胞上にプレートした。ニューロンを、実施例１に記載したように、一晩培養した後、固定し、そしてＧＡＰ４３に対して免疫染色して、軸索を可視化した。１８０〜２００のニューロンの、１ニューロンあたりの最も長い軸索の長さを測定した。結果をコントロール動物から単離したニューロンの成長の割合として表し、そしてコントロール細胞に対する成長の割合として表した平均長さ＋／−ＳＥＭとして示す。図４を参照のこと。
【０１０６】
より高齢の動物において、ＭＡＧによる軸索成長の阻害はまた、用量依存様式でロリプラムにより防止（すなわち、軽減）された（図４）。Ｐ３０ラットにおいて皮下注射した場合に最も有効であったロリプラムの用量は、０．５μｍｏｌ／ｋｇ（本発明者らがＰ１２ラットについて観察したロリプラムの最も有効な皮下用量（２０ｎｍｏｌ／ｋｇ）よりも、有意に高い）であった。従って、ミエリンまたはＭＡＧニューロン成長阻害を軽減するための、（皮下注射による）ロリプラムの最も有効な用量は、動物被験体の年齢および体重の両方に依存すると考えられる。
【０１０７】
次いで、本発明者らは、ロリプラムの効果が、時間依存性であるか否かを決定した。ロリプラム（０．５μｍｏｌ／ｋｇ）を、漸増する時間について、Ｐ３０ラットに対する、繰り返しの皮下注射により投与した。ＤＲＧニューロンを、コントロール動物および処置動物から単離し、そして単層のＭＡＧ発現ＣＨＯ細胞または単層のコントロールＣＨＯ細胞上にプレートした。ニューロンを、一晩培養した後、固定し、そしてＧＡＰ４３に対して免疫染色して、軸索を可視化した。１８０〜２００ニューロンの、１ニューロンあたりの最も長い軸索の長さを測定した。結果をコントロール動物から単離したニューロンの成長の割合として表し、そしてコントロール細胞に対する成長の割合として表した平均長さ＋／−ＳＥＭとして示す。
【０１０８】
図５は、処置されたＰ３０ラットから単離されたＤＲＧニューロンがＭＡＧの存在下または非存在下で成長する能力に対する、繰り返し皮下ロリプラム（０．５μｍｏｌ／ｋｇ）注射の効果の時間経過の結果を示す。ロリプラムの効果は、時間依存性であった。２４時間、ロリプラムを用いて処置したＰ３０動物から単離されたＤＲＧニューロンの軸索の長さは、６時間処置したニューロンの長さと比べて増加した。しかし、間欠皮下投与により投与した場合、軸索の長さについて、ロリプラムを用いて処置した１日目の効果と、２日目の効果と、３日目の効果との間に有意な差異はなかった。
【０１０９】
（Ｂ．ミニポンプにより連続ロリプラム皮下送達）
本発明者らは、Ｐ３０動物にロリプラムを連続的に皮下送達するためにミニポンプを用いて、上記で議論した時間経過実験を繰り返した。ミニポンプによるロリプラムの連続送達は、被験体の身体内で薬物の安定な濃度を提供する。
【０１１０】
ロリプラムを、ＡＬＺＥＴ  ２００１ミニポンプを用いて皮下送達した。ミニポンプを、動物の背中の皮膚の下に、皮下挿入した。２つのミニポンプを、各々の動物に用いた；合わせた流速は、２μｌ／時間であった。ロリプラムを、ＤＭＳＯ中に溶解し、そして滅菌生理食塩水を添加して、毎時にミニポンプから放出されるロリプラムの用量を調整した。処置の２４時間後、ＤＲＧニューロンを、コントロール動物および処置動物から単離し、そして単層のＭＡＧ発現ＣＨＯ細胞または単層のコントロールＣＨＯ細胞上にプレートした。ニューロンを、一晩培養した後、固定し、そしてＧＡＰ４３に対して免疫染色して、軸索を可視化した。１８０〜２００ニューロンの、１ニューロンあたりの最も長い軸索の長さを測定した。結果をコントロール動物から単離したニューロンの成長の割合として表し、そしてコントロール細胞に対する成長の割合として表した平均長さ＋／−ＳＥＭとして示す。図６を参照のこと。
【０１１１】
処置の２４時間後、連続処置した動物から単離されたＤＲＧニューロンは、ＭＡＧにより、もはや阻害されなかった。本発明者らは、Ｐ３０ラットに対して皮下送達したロリプラムの０．４μｍｏｌ／ｋｇ／時間の連続用量が、引き続いての神経成長および再生に最適であったことを見出した。
【０１１２】
ＰＤＥ４インヒビターを用いるより長い連続処置が、ミエリンまたはＭＡＧによる軸索成長の阻害の軽減を増大させるか否かを決定するために、ロリプラムを、ミニポンプにより皮下投与（０．４μｍｏｌ／ｋｇ／時間）した。連続ロリプラム処置の１日後、２日後、または３日後、ＤＲＧニューロンをコントロール動物および処置動物から単離して、そして単層のＭＡＧ発現ＣＨＯ細胞または単層のコントロールＣＨＯ細胞上にプレートした。ニューロンを、一晩培養した後、固定し、そしてＧＡＰ４３に対して免疫染色して、軸索を可視化した。１８０〜２００ニューロンの、１ニューロンあたりの最も長い軸索の長さを測定した。結果をコントロール動物から単離したニューロンの成長の割合として表し、そしてコントロール細胞に対する成長の割合として表した平均長さ＋／−ＳＥＭとして示す。図７を参照のこと。
【０１１３】
処置の２４時間後、連続処置した動物から単離されたＤＲＧニューロンは、ＭＡＧにより、もはや阻害されなかった。連続ロリプラム処置の２日後、軸索成長は、ＭＡＧの存在下およびコントロールＣＨＯ細胞においての両方で、有意に促進された。軸索成長は、連続ロリプラム処置の３日後に、なおさらに促進された。このことは、長期のＰＤＥ４特異的インヒビターの連続投与が、軸索成長に対するＭＡＧおよびミエリンの阻害を克服するのみならず、驚くべきことに、ＰＤＥ４特異的インヒビターの非存在下でのニューロンと比べて、軸索成長を促進するのに非常に効果的でもあることを示唆する。
【０１１４】
（実施例４：脊髄損傷後のラットに対するロリプラムの連続皮下送達：運動回復（ｍｏｔｏｒ  ｒｅｃｏｖｅｒｙ）に対する効果）
脊髄損傷後の軸索再生を促進するために続行した１つのストラテジーは、軸索成長を支持するための、脊髄損傷の部位へのシュワン細胞の移植である。（例えば、Ｘｕら、１９９９；Ｒａｍｏｎ−Ｃｕｅｔｏら、１９９８；Ｇｕｅｓｔ，Ｊ．Ｄ．ら、１９９７；Ｘｕら、１９９７を参照のこと）。成体ラットの脊髄を、穏やかな挫傷または完全な離断のいずれかに供し、そしてシュワン細胞移植片を、損傷の部位へと導入した。シュワン細胞移植片と組み合わせた神経栄養因子は、最近、損傷後の軸索伸長を改善することが示された。（Ｊｏｎｅｓ  Ｌ．Ｌ．ら、２００１；Ｍｅｎｅｉ  Ｐ．ら、１９９８）。本発明者らは、このモデル系を用いて、脊髄損傷を有するラットの運動機能を回復する能力に対する、ロリプラム送達の効果を研究した。
【０１１５】
（Ａ．脊髄の完全な離断）
成体ラットの脊髄をＴ８脊髄索レベル（ｃｏｒｄ  ｌｅｖｅｌ）で、完全に離断し、そして隣の仙骨部分を取り出した（Ｘｕら、（１９９７）（本明細書中で参考として援用される））。シュワン細胞を、成体ラット坐骨神経から培養物中で精製し、Ｍａｔｒｉｇｅｌ：ＤＭＥＭ（３０：７０）に懸濁し、そして１２０×１０６細胞／ｍｌの密度で、８ｍｍの長さのポリマー製誘導チャネル（８ｍｍ  ｌｏｎｇ  ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ  ｇｕｉｄａｎｃｅ  ｃｈａｎｎｅｌｓ）に引き入れた。Ｘｕら（１９９７）。各切断断片を、チャネルに１ｍｍ挿入した。離断時に、シュワン細胞ブリッジを、損傷部位に移植し、そしてロリプラムを、実施例３Ｂに記載されるように、２週間、０．０７μｍｏｌ／ｋｇ／時間で、ミニポンプを介して皮下送達した。ネガティブコントロールとして、動物に生理食塩水のみを送達した。ポジティブコントロールとして、５μｌの１０ｍＭ  ｄｂｃＡＭＰを、動物の病巣の近位断片および遠位断片に注入した。動物を、ＢＢＢ試験を使用して、後肢の移動運動（これは、運動回復の指標である）について毎週評価した。図８を参照のこと。
【０１１６】
図８に示した結果は、ロリプラムの投与が、脊髄の完全な離断を有する動物についてのＢＢＢスコア（すなわち、運動回復）を有意に増加したことを実証し、さらに、ロリプラムが、ｄｂｃＡＭＰの投与と本質的に同じ結果を有することを示す。
【０１１７】
（Ｂ．脊髄に対する穏やかな挫傷）
成体ラット脊髄を露出し、加重（ｗｅｉｇｈｔ  ｄｒｏｐ）デバイス（ＮＹＵ）を用いて損傷させた。Ｂｅａｔｔｉｅら（１９９７）およびＢａｓｓｏら（１９９６）を参照のこと。この損傷を加えると同時に、ロリプラムを、０．０７ｎｍｏｌ／ｋｇ／時間で２週間の間、ミニポンプを介して皮下送達した。損傷の１週間後、シュワン細胞（培養物中で増殖および精製している）を、４つの注入物（各々０．２μｌの１ｍＭ  ｄｂｃＡＭＰ）と共に、病巣部位に注入した。ネガティブコントロールとして、動物にシュワン細胞単独を注射した。他の動物に、ｄｂｃＡＭＰおよびシュワン細胞を投与した。動物の１群に、損傷の１週間後に４つの注入物（各々０．２μｌの１ｍＭ  ｄｂｃＡＭＰ）を投与した。別の群に、損傷の１週間後に４つの注入物（各々０．２μｌの５０ｍＭ  ｄｂｃＡＭＰ）を投与した。別の群に、損傷の１日後に４つの注入物（各々０．２μｌの５０ｍＭ  ｄｂｃＡＭＰ）を投与した。ＢＢＢ試験を用いて、後肢の歩行運動について、動物を毎週評価した。
【０１１８】
図９に示されるように、対応するコントロールと比較して、シュワン細胞移植の前および後の連続ロリプラム送達は、ＢＢＢスコアにより測定した場合、損傷後、早くも２週間で、損傷後７週間まで改善する効果を伴って、脊椎損傷したラットにおける運動神経回復を有意に改善した。重要なことは、１５を超えるＢＢＢスコアは、完全な回復として記録され、このスコアは、脊髄損傷後に連続ロリプラム処置を受けたラットの群においてのみ達成された。
【０１１９】
（実施例５：ラットに対するロリプラムの連続皮下送達は、脊髄損傷後のグリア瘢痕の形成を減少する）
Ｐ３０ラットの脊髄を、実施例４Ａに記載されるように完全に離断する。離断と同時に、ロリプラムを、実施例３に記載されるように、１日間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、および７日間、連続送達する。コントロール動物に生理食塩水のみを投与する。さらに３週間後、動物を屠殺し、そして脊髄を取り出す。病巣部位の周りの部分（１０〜２０ｍｍの近位部および遠位部から構成される）を固定し、切片化し、そしてグリア原繊維酸性タンパク質（ｇｌｉａｌ  ｆｉｂｒｉｌｌａｒｙ  ａｃｉｄｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ）（ＧＦＡＰ）またはコンドロイチン硫酸プロテオグリカン（ＣＳＰＳ）に対して、免疫染色する。さらに、ロリプラム処置した動物およびコントロール動物の別々の群において、脊髄の類似の切片（病巣の周囲）を、電子顕微鏡法のために固定する。ＧＦＡＰおよびＣＳＰＧに対する免疫染色、およびＥＭレベルでの形態学を、ロリプラム処置動物とコントロール動物とで比較する。
【０１２０】
（参考文献）
以下の参考文献は、本明細書中で参考として援用される。
【０１２１】
【表１】
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【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は、ロリプラム処置が、ＭＡＧによる神経突起成長の阻害をインビトロで部分的に遮断することを示す。実施例１を参照のこと。黒棒は、ＭＡＧ発現チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞における神経突起の成長を表し、そして、縞模様の棒は、コントロールＣＨＯ細胞（ＭＡＧを発現しない）の単層における成長を表す。レーン１：コントロール（ｄｂｃＡＭＰ、ロリプラムの添加なし）；レーン２：１ｍＭ  ｄｂｃＡＭＰ；レーン３：０．１μＭ  ロリプラム；レーン４：０．２５μＭ  ロリプラム；レーン５：０．５μＭ  ロリプラム；およびレーン６：１．０μＭ  ロリプラム。
【図２Ａ】
図２Ａおよび２Ｂは、インビトロでのロリプラムを用いたプライミングが、ＭＡＧ（図２Ａ）による軸索成長の阻害またはミエリン（図２Ｂ）による軸索成長の阻害を克服することを示す。実施例２を参照のこと。図２Ａにおいて、黒棒は、ＭＡＧ発現チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞における神経突起の成長を表し、そして、縞模様の棒は、コントロールＣＨＯ細胞の単層における成長を表す。図２Ａ：レーン１：コントロール；レーン２：２００ｎｇ／ｍｌ  ＢＤＮＦ；レーン３：０．１μＭ  ロリプラム；レーン４：０．２５μＭ  ロリプラム。図２Ｂ：レーン１：コントロール；レーン２：２００ｎｇ／ｍｌ  ＢＤＮＦ；レーン３：０．２５μＭ  ロリプラム。
【図２Ｂ】
図２Ａおよび２Ｂは、インビトロでのロリプラムを用いたプライミングが、ＭＡＧ（図２Ａ）による軸索成長の阻害またはミエリン（図２Ｂ）による軸索成長の阻害を克服することを示す。実施例２を参照のこと。図２Ａにおいて、黒棒は、ＭＡＧ発現チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞における神経突起の成長を表し、そして、縞模様の棒は、コントロールＣＨＯ細胞の単層における成長を表す。図２Ａ：レーン１：コントロール；レーン２：２００ｎｇ／ｍｌ  ＢＤＮＦ；レーン３：０．１μＭ  ロリプラム；レーン４：０．２５μＭ  ロリプラム。図２Ｂ：レーン１：コントロール；レーン２：２００ｎｇ／ｍｌ  ＢＤＮＦ；レーン３：０．２５μＭ  ロリプラム。
【図３Ａ】
図３Ａおよび３Ｂは、ロリプラムを用いた出産１２日後（Ｐ１２）ラットの皮下注射が、小脳ニューロン（図３Ａ）および脊髄神経節（図３Ｂ）に対するインビトロでのＭＡＧによる軸索成長の阻害を克服することを示す。実施例３Ａを参照のこと。黒棒は、ＭＡＧ発現チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞における神経突起の成長を表し、そして、縞模様の棒は、コントロールＣＨＯ細胞の単層における成長を表す。図３Ａ：レーン１：コントロール；レーン２：１ｍＭ  ｄｂｃＡＭＰ；レーン３：７．５ｎｍｏｌ／ｋｇ  ロリプラム；レーン４：２５ｎｏｌ／ｋｇ  ロリプラム；レーン５：４０ｎｍｏｌ／ｋｇ  ロリプラム；レーン６：７５ｎｍｏｌ／ｋｇ  ロリプラム。図３Ｂ：レーン１：コントロール；レーン２：１ｍＭ  ｄｂｃＡＭＰ；レーン３：４０ｎｍｏｌ／ｋｇ  ロリプラム；レーン４：７５ｎｍｏｌ／ｋｇ  ロリプラム。
【図３Ｂ】
図３Ａおよび３Ｂは、ロリプラムを用いた出産１２日後（Ｐ１２）ラットの皮下注射が、小脳ニューロン（図３Ａ）および脊髄神経節（図３Ｂ）に対するインビトロでのＭＡＧによる軸索成長の阻害を克服することを示す。実施例３Ａを参照のこと。黒棒は、ＭＡＧ発現チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞における神経突起の成長を表し、そして、縞模様の棒は、コントロールＣＨＯ細胞の単層における成長を表す。図３Ａ：レーン１：コントロール；レーン２：１ｍＭ  ｄｂｃＡＭＰ；レーン３：７．５ｎｍｏｌ／ｋｇ  ロリプラム；レーン４：２５ｎｏｌ／ｋｇ  ロリプラム；レーン５：４０ｎｍｏｌ／ｋｇ  ロリプラム；レーン６：７５ｎｍｏｌ／ｋｇ  ロリプラム。図３Ｂ：レーン１：コントロール；レーン２：１ｍＭ  ｄｂｃＡＭＰ；レーン３：４０ｎｍｏｌ／ｋｇ  ロリプラム；レーン４：７５ｎｍｏｌ／ｋｇ  ロリプラム。
【図４】
図４は、ロリプラムを用いた出産３０日後（Ｐ３０）ラットの皮下注射が、インビトロでのＭＡＧによる軸索成長の阻害を克服することを示す。実施例３Ａを参照のこと。黒棒は、ＭＡＧ発現チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞における神経突起の成長を表し、そして、縞模様の棒は、コントロールＣＨＯ細胞の単層における成長を表す。レーン１：コントロール；レーン２：０．１μｍｏｌ／ｋｇ  ロリプラム；レーン３：０．２μｍｏｌ／ｋｇ  ロリプラム；レーン４：０．５μｍｏｌ／ｋｇ  ロリプラム；レーン５：１．０μｍｏｌ／ｋｇ  ロリプラム；レーン６：２．０μｍｏｌ／ｋｇ  ロリプラム。
【図５】
図５は、ロリプラムを用いたＰ３０ラットの反復皮下注射が、ＭＡＧによる神経突起成長の阻害を遮断することを示す。実施例３Ａを参照のこと。黒棒は、ＭＡＧ発現チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞におけるＤＲＧニューロン神経突起の成長を表し、そして、縞模様の棒は、コントロールＣＨＯ細胞の単層における成長を表す。レーン１：コントロール；レーン２：３時間毎のロリプラムの３回の注射、最後の注射の２０時間後に、ニューロンを単離した；レーン３：３時間毎のロリプラムの２回の注射、最後の注射の３時間後に、ニューロンを単離した；レーン４：１日の間の３時間毎の注射、ニューロンを１日目に単離した；レーン５：２日間の間の３時間毎の注射、２日目の最後にニューロンを単離した；レーン６：３日間の３時間毎の注射、ニューロンを３日目の最後に単離した。
【図６】
図６は、ミニポンプによって皮下に送達されるロリプラムが、インビトロでのＭＡＧによるニューロン成長の阻害を遮断することを示す。実施例３Ｂを参照のこと。黒棒は、ＭＡＧ発現チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞における神経突起の成長を表し、そして、縞模様の棒は、コントロールＣＨＯ細胞の単層における成長を表す。レーン１：コントロール；レーン２：０．４μｍｏｌ／ｋｇ／時間  ロリプラム；レーン３：０．５μｍｏｌ／ｋｇ／時間  ロリプラム；レーン４：０．７μｍｏｌ／ｋｇ／時間  ロリプラム。
【図７】
図７は、ミニポンプによって皮下に送達されるロリプラムが、インビトロでのＭＡＧによるニューロン成長の阻害を時間の経過とともに、進行的に遮断することを示す。実施例３Ｂを参照のこと。黒棒は、ＭＡＧ発現チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞における神経突起の成長を表し、そして、縞模様の棒は、コントロールＣＨＯ細胞の単層における成長を表す。レーン１：コントロール；レーン２：ロリプラム処置の１日目；レーン３：ロリプラム処置の２日目；レーン４：ロリプラム処置の３日目。
【図８】
図８は、ミニポンプによって皮下に送達されるロリプラムが、完全な脊髄横切後に、ラットにおいてインビボで、Ｓｃｈｗａｎｎ細胞架橋の存在下で運動ニューロン回復を促進することを示す。実施例４Ａを参照のこと。四角：０．０７μｍｏｌ／ｋｇ／時間  ロリプラム；菱形：１０ｍＭ  ｄｂｃＡＭＰ；三角；生理食塩水コントロール。
【図９】
図９は、ミニポンプによって皮下に送達されるロリプラムが、中程度の脊髄挫傷後に、ラットにおいてインビボで運動回復を促進することを示す。実施例４Ｂを参照のこと。×：０．０７μｍｏｌ／ｋｇ／時間  ロリプラムおよびＳｃｈｗａｎｎ細胞移植ならびに４回注射（損傷の１週間後に、それぞれ、０．２μｌの１ｍＭ  ｄｂｃＡＭＰ）；四角：４回注射（損傷の１週間後に、それぞれ、０．２μｌの１ｍＭ  ｄｂｃＡＭＰ）；三角：４回注射（損傷の１週間後に、それぞれ、０．２μｌの５０ｍＭ  ｄｂｃＡＭＰ）；丸：４回注射（損傷の１日後に、それぞれ、０．２μｌの１ｍＭ  ｄｂｃＡＭＰ）；菱形：損傷の１週間後に、Ｓｃｈｗａｎｎ細胞移植。
【図１】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際公開パンフレット】
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2004532809.tif 000079
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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2004532809.tif 000081
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004532809.tif 000082
2004532809.tif 000083
【国際調査報告】
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