(57)【要約】本発明は、熱ショックタンパク質９０（ＨＳＰ９０）を標的とすることによる、ＨＣＶの複製およびプロセシングを抑制するための方法に関する。ＨＳＰ９０は、ＮＳ２／３自己切断における必須因子であることが判明している細胞シャペロンタンパク質である。ＮＳ２／３切断を促進するＨＳＰ９０の能力を抑制する化合物を使用して、ＨＳＰ９０を標的とすることができる。【選択図】図２
2004504356.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）に感染した細胞においてＨＣＶの複製またはプロセシングを抑制する方法であって、ＨＳＰ９０インヒビターの有効量を該細胞に与える工程を含んでなる方法。
【請求項２】
該ＨＳＰ９０インヒビターがＨＳＰ９０へのＡＴＰの結合を抑制する、請求項１記載の方法。
【請求項３】
該ＨＳＰ９０インヒビターがゲルダナマイシンである、請求項１記載の方法。
【請求項４】
該ＨＳＰ９０インヒビターがハービマイシンＡである、請求項１記載の方法。
【請求項５】
該ＨＳＰ９０インヒビターがラディシコールである、請求項１記載の方法。
【請求項６】
該方法をインビトロで行う、請求項１〜５のいずれか１項記載の方法。
【請求項７】
ＨＣＶのプロセシングを抑制する、請求項１記載の方法。
【請求項８】
ＨＣＶの複製を抑制する、請求項１記載の方法。
【請求項９】
ＮＳ２／３活性を含むポリペプチドにＨＳＰ９０インヒビターの有効量を与える工程を含んでなる、ＮＳ２／３の切断を抑制する方法。
【請求項１０】
該ＨＳＰ９０インヒビターがゲルダナマイシン、ハービマイシンＡまたはラディシコールである、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
該ＨＳＰ９０インヒビターがＨＳＰ９０へのＡＴＰの結合を抑制する、請求項９記載の方法。
【請求項１２】
患者においてＨＣＶの複製を抑制する方法であって、ＨＳＰ９０インヒビターの有効量を該患者に投与する工程を含んでなる方法。
【請求項１３】
該ＨＳＰ９０インヒビターがＨＳＰ９０へのＡＴＰの結合を抑制する、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
該ＨＳＰ９０インヒビターがゲルダナマイシン、ラディシコールまたはハービマイシンＡである、請求項１２記載の方法。
【請求項１５】
ａ）ＮＳ２／３活性を含むポリペプチドへのＨＳＰ９０の会合を化合物が抑制する能力を測定する工程、および
ｂ）ＮＳ２／３の切断を該化合物が抑制する能力を測定する工程を含んでなる、ＮＳ２／３プロセシングのインヒビターを同定する方法。
【請求項１６】
ａ）ＨＳＰ９０活性を化合物が抑制する能力を測定する工程、および
ｂ）ＨＣＶの複製を該化合物が抑制する能力を測定する工程を含んでなる、ＨＣＶ複製のインヒビターを同定する方法。
【請求項１７】
該工程（ａ）が、ＨＳＰ９０がＡＴＰに結合するのを該化合物が抑制する能力を測定する、請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
ａ）ＮＳ２／３活性を含むポリペプチドへのＨＳＰ９０の会合を化合物が抑制する能力を測定する工程、および、
ｂ）ＨＣＶの複製を該化合物が抑制する能力を測定する工程を含んでなる、ＨＣＶ複製のインヒビターを同定する方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の背景）
本明細書中に引用されている参考文献は本発明の先行技術であると認められるものではない。
【０００２】
世界中で推定１億７，０００万人がＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）に感染している。この感染は通常は持続的であり、しばしば何年も続く無症候期の後、多数の患者は、肝硬変および肝細胞癌を含む慢性肝疾患を発症する。
【０００３】
ＨＣＶはプラス鎖ＲＮＡウイルスである（Ｃｈｏｏら，（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ　２４４，３６２−３６４；およびＣｈｏｏら，（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ　２４４，３５９−３６２）。ＨＣＶゲノムは、Ｃ−Ｅ１−Ｅ２−ｐ７−ＮＳ２−ＮＳ３−ＮＳ４Ａ−ＮＳ４Ｂ−ＮＳ５Ａ−ＮＳ５Ｂの順序でウイルスタンパク質を含有する約３０００アミノ酸の単一のポリタンパク質をコードしている。該ＮＳタンパク質は非構造的であると考えられており、該ウイルスポリタンパク質のプロセシングおよびウイルスの複製の酵素機能に関与している。該ポリタンパク質前駆体からの個々のタンパク質の遊離は、細胞およびウイルスの両方のプロテアーゼにより媒介される（Ｃｈｏｏら，（１９９１）Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．ＵＳＡ　８８，２４５１−２４５５；Ｔａｋａｍｉｚａｗａら，（１９９１）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６５，１１０５−１１１３；Ｎｅｄｄｅｒｍａｎｎら，（１９９７）Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．３７８，４６９−４７６；Ｌｏｈｍａｎｎら，（１９９６）Ｊ．Ｈｅｐａｔｏｌ．２４，１１−１９；およびＨｏｕｇｈｔｏｎら，（１９９１）Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ　１４，３８１−３８８）。
【０００４】
成熟ＮＳ４Ａ、ＮＳ４Ｂ、ＮＳ５ＡおよびＮＳ５Ｂのタンパク質分解遊離は、ＮＳ３のＮ末端ドメイン内に含まれているキモトリプシン様セリンプロテアーゼにより触媒され、一方、宿主細胞プロテアーゼがＣ、Ｅ１、Ｅ２およびｐ７を遊離し、アミノ酸８１０にＮＳ２のＮ末端を生成する（Ｍｉｚｕｓｈｉｍａら，（１９９４）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６８，２７３１−２７３４、およびＨｉｊｉｋａｔａら，（１９９３）Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．ＵＳＡ　９０，１０７７３−１０７７７）。
【０００５】
ＮＳ２とＮＳ３との間の切断はＮＳ２／３プロテアーゼにより触媒される。ＮＳ２／３活性はヒトにおけるＨＣＶの複製に必須であるらしい（Ｋｏｌｙｋｈａｌｏｖら，（２０００）Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　ｖｉｒｏｌｏｇｙ　７４，２０４６−５１）。
【０００６】
（発明の概要）
本発明は、熱ショックタンパク質９０（ＨＳＰ９０）を標的とすることによる、ＨＣＶの複製およびプロセシングを抑制するための方法に関する。ＨＳＰ９０は、ＮＳ２／３自己切断における必須因子であることが判明している細胞シャペロンタンパク質である。ＮＳ２／３切断を促進するＨＳＰ９０の能力を抑制する化合物を使用して、ＨＳＰ９０を標的とすることができる。
【０００７】
したがって、本発明の第１の態様は、ＨＣＶに感染した細胞においてＨＣＶの複製またはプロセシングを抑制する方法であって、ＨＳＰ９０インヒビターの有効量を該細胞に与える工程を含んでなる方法を記載する。該有効量は、ＨＣＶ複製における検出可能な減少を引き起こすのに十分な量である。好ましくは、複製は、少なくとも約２０％、少なくとも約５０％、少なくとも約７５％、または少なくとも約９０％抑制される。
【０００８】
本発明のもう１つの態様は、ＮＳ２／３活性を含むポリペプチドにおけるＮＳ２／３切断を抑制する方法を記載する。該方法は、該ポリペプチドにＨＳＰ９０インヒビターの有効量を与えることを含む。該有効量は、ＮＳ２／３切断における検出可能な減少を引き起こすのに十分な量である。好ましくは、ＮＳ２／３切断は、少なくとも約２０％、少なくとも約５０％、少なくとも約７５％、または少なくとも約９０％抑制される。
【０００９】
「ＮＳ２／３活性を含む」ポリペプチドは、全体的または部分的に、天然に存在するＮＳ２／３領域に由来しＮＳ２／３自己触媒活性を有するアミノ酸領域から構成される。天然に存在する領域に由来するアミノ酸領域は、天然に存在するＮＳ２／３領域の配列を含有するか、または天然に存在する領域に基づいて設計される。該ＮＳ２／３自己触媒活性は、より長い長さのポリペプチド上に存在しうる。
【００１０】
本発明のもう１つの態様は、ＨＣＶに感染した患者においてＨＣＶの複製を抑制する方法に関する。該方法は、ＨＳＰ９０インヒビターの有効量を該患者に投与する工程を含む。ＨＣＶに感染しうる患者には、ヒトおよびチンパンジーが含まれる。好ましくは、該対象はヒトである。
【００１１】
本発明のもう１つの態様は、（ａ）ＮＳ２／３活性を含むポリペプチドへのＨＳＰ９０の会合を化合物が抑制する能力を測定する工程、および（ｂ）該化合物がＮＳ２／３切断を抑制する能力を測定する工程を含んでなる、ＮＳ２／３プロセシングのインヒビターを同定する方法を記載する。
【００１２】
本発明のもう１つの態様は、（ａ）ＨＳＰ９０活性を化合物が抑制する能力を測定する工程、（ｂ）ＨＣＶの複製を該化合物が抑制する能力を測定する工程を含んでなる、ＨＣＶ複製のインヒビターを同定する方法を記載する。
【００１３】
本発明のもう１つの態様は、（ａ）ＮＳ２／３活性を含むポリペプチドへのＨＳＰ９０の会合を化合物が抑制する能力を測定する工程、および（ｂ）ＨＣＶの複製を該化合物が抑制する能力を測定する工程を含んでなる、ＨＣＶ複製のインヒビターを同定する方法を記載する。
【００１４】
本発明の他の特徴および利点は、種々の実施例を含む本明細書に記載の追加的な説明から明らかである。記載している実施例は、本発明の実施に有用な種々の成分および方法を例示するものである。該実施例は本発明を限定するものではない。本開示に基づき、当業者は、本発明の実施に有用な他の成分および方法を同定し使用することが可能である。
【００１５】
（図面の簡単な記載）
図１．ＨＳＰ９０とのＮＳ２／３の物理的会合。（Ａ）ＨＳＰ９０特異的抗体とのＮＳ２／３の免疫共沈降。網状赤血球ライセート中で合成された［３５Ｓ］メチオニン標識ＮＳ２／３（８１０−１６１５ＢＫ）、Ｕｂｉ−８４９−１２０７Ｊ−ＢＬＡまたはホタルルシフェラーゼは、抗ＨＳＰ９０　ｍＡｂ　３Ｇ３で又は対照ＩｇＭ　ＴＥＰＣ−１８３で免疫沈降した。（Ｂ）ゲルダナマイシンは、ＮＳ２／３とＨＳＰ９０との会合を妨げる。１０μＭ　ゲルダナマイシンの不存在下（レーン１）または存在下（レーン４）で網状赤血球ライセート中で合成された［３５Ｓ］メチオニン標識ＮＳ２／３は、抗ＨＳＰ９０　ｍＡｂ　３Ｇ３（レーン３および６）または対照ＩｇＭ　ＴＥＰＣ−１８３（レーン２および５）で免疫沈降した。
【００１６】
図２．ＨＳＰ９０インヒビターは、細胞に基づくアッセイにおいてＮＳ２／３切断を抑制する。β−ラクタマーゼ活性がＮＳ２／３切断の達成の指標となるＮＳ２／３の融合タンパク質を発現するジャーカット細胞を、ゲルダナマイシンまたはラディシコール（ｒａｄｉｃｉｃｏｌ）で処理した。インヒビター処理は５時間にわたり、ついでシクロヘキシミドを加えてタンパク質合成を停止させ（３０分間）、ついでβ−ラクタマーゼ基質ＣＣＦ２を加えた。２時間後、β−ラクタマーゼ活性を蛍光測定（４６０ｎｍ／５３０ｎｍの比率）により定量した。より低い４６０ｎｍ／５３０ｎｍ比率はＮＳ２／３切断の抑制を示す。ゲルダナマイシン（三角形）のＩＣ５０は４０ｎＭであり、ラディシコール（円形）のＩＣ５０は１３ｎＭである。
【００１７】
（発明の詳細な記載）
ＨＳＰ９０は、ＨＣＶの複製およびプロセシングを抑制するための標的として本発明で同定されたシャペロンタンパク質である。ＨＳＰ９０の標的化は、ＮＳ２／３切断を促進するＨＳＰ９０の能力を抑制する化合物を使用して達成されうる。
【００１８】
シャペロンタンパク質は、非天然タンパク質内および間の誤った相互作用を妨げうる。該タンパク質は、多数の新たに合成されたタンパク質のフォールディング反応の速度ではなく収率を増加させると考えられる（Ｈａｒｔｌ，（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ　３８１，５７１）。また、タンパク質のフォールディングへのその関与に関連したメカニズムにより、シャペロンタンパク質は、種々のシグナリングタンパク質、例えばチロシンキナーゼ、例えばｐ６０ｓｒｃ（Ｗｈｉｔｅｓｅｌｌら，（１９９４）Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．ＵＳＡ　９１，８３２４）、ステロイドホルモン受容体（総説としては、Ｐｒａｔｔら，（１９９７）Ｅｎｄｏｃｒ．Ｒｅｖ．１８，３０６を参照されたい）および一酸化窒素シンターゼ（Ｇａｒｃｉａ−Ｃａｒｄｅｎａら，（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ　３９２，８２１，Ｂｅｎｄｅｒら，（１９９９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４，１４７２）の活性を調節するのを助ける。
【００１９】
ＨＳＰ９０は、種々のタンパク質の活性の調節に関与するシャペロンタンパク質である（Ｓｃｈｅｉｂｅｌら，（１９９８）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ　５６，６７５−６８２．）。少なくともいくつかの場合には、ＨＳＰ９０は、細胞性タンパク質フォールディングを補助する、パートナータンパク質が関わり不可逆的副反応を妨げるシャペロン複合体の一部として機能する（Ｓｃｈｅｉｂｅｌら，（１９９８）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ　５６，６７５−６８２）。
【００２０】
ＨＳＰ９０インヒビター
ＨＳＰ９０インヒビターは、ＨＳＰ９０と物理的に会合し、ＮＳ２／３切断および／またはＨＣＶ複製を抑制する。ＨＳＰ９０との間の会合は直接的な会合であるか、またはパートナータンパク質のような他の因子により媒介されうる。好ましいＨＳＰ９０インヒビターは、少なくとも約２０％、少なくとも約５０％、少なくとも約７５％、または少なくとも約９０％の抑制レベルを達成する。
【００２１】
ＨＳＰ９０の活性は、当技術分野でよく知られた種々の化合物を使用して抑制することができる。そのような化合物は、ＮＳ２／３切断および／またはＨＣＶ複製を抑制するための方法において使用することができる。
【００２２】
後記の実施例は、ゲルダナマイシンおよびラディシコールのような当技術分野でよく知られた化合物がＮＳ２／３切断を抑制する能力を例示する。ゲルダナマイシンおよびラディシコールは、ＨＳＰ９０活性のインヒビターとして記載されている化合物である（Ｒｏｅら，（１９９９）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４２，２６０−２６６；およびＳｃｈｅｉｂｅｌら，（１９９８）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ　５６，６７５−６８２）。ゲルダナマイシンおよびラディシコールの多種多様な誘導体が当技術分野でよく知られている。そのような誘導体がＮＳ２／３切断およびＨＣＶ複製を抑制する能力は、標準的な技術を用いて測定することができる。
【００２３】
ゲルダナマイシンは、抗腫瘍活性を有するアンサマイシン抗生物質である（Ｒｏｅら，（１９９９）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４２，２６０−２６６；およびＳｃｈｅｉｂｅｌら，（１９９８）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ　５６，６７５−６８２）。ゲルダナマイシンは、ＨＳＰ９０のＮ末端ドメインに存在するＡＴＰ結合部位に結合することにより抗腫瘍薬効果を発揮すると種々の参考文献に記載されている（Ｒｏｅら，（１９９９）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４２，２６０−２６６；およびＳｃｈｅｉｂｅｌら，（１９９８）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ　５６，６７５−６８２，１９９８）。
【００２４】
抗腫瘍活性を有することが示されたゲルダナマイシンの誘導体は種々の参考文献に記載されている（例えば、共に参照により本明細書に組み入れる米国特許第４，２６１，９８９号および米国特許第５，９３２，５６６号を参照されたい）。これらの誘導体は、ＮＳ２／３切断および／またはＨＣＶ複製の抑制における活性を有すると予想されるメンバーを含有する化合物のクラスを与える。個々の化合物がＮＳ２／３切断またはＨＣＶ複製を抑制する能力は、当技術分野でよく知られた技術を用いて測定することができる。
【００２５】
ラディシコールも、Ｎ末端ドメインＡＴＰ結合部位においてＨＳＰ９０に結合することにより抗腫瘍薬効果を発揮する（Ｒｏｅら，（１９９９）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４２，２６０−２６６）。抗腫瘍活性を有することが示されたラディシコールの誘導体は種々の参考文献に記載されている（例えば、共に参照により本明細書に組み入れる米国特許第５，５９７，８４６号および米国特許第５，９７７，１６５号を参照されたい）。これらの誘導体は、ＮＳ２／３切断および／またはＨＣＶ複製の抑制における活性を有すると予想されるメンバーを含有する化合物のクラスを与える。個々の化合物がＮＳ２／３切断またはＨＣＶ複製を抑制する能力は、当技術分野でよく知られた技術を用いて測定することができる。
【００２６】
ＮＳ２／３切断
ＮＳ２／３切断は、活性ＮＳ３プロテアーゼの産生につながるＨＣＶポリタンパク質プロセシングの一部である。天然に存在するＨＣＶポリペプチドにおいては、ＮＳ２をＮＳ３から分離するアミノ酸１０２６と１０２７との間の切断は、該切断部位に隣接するＮＳ２およびＮＳ３の両方のタンパク質領域に左右されることが判明している（Ｇｒａｋｏｕｉら，（１９９３）Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．９０，１０５８３−１０５８７；およびＫｏｍｏｄａら，（１９９４）Ｇｅｎｅ　１４５，２２１−２２６）。突然変異研究により示されているとおり、該切断はＮＳ３プロテアーゼの触媒活性には左右されない（Ｇｒａｋｏｕｉら，（１９９３）Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．９０，１０５８３−１０５８７；およびＨｉｊｉｋａｔａら，（１９９３）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６７，４６６５−４６７５）。
【００２７】
ＮＳ２／３切断は、ＮＳ２／３触媒活性を含むポリペプチドを使用して種々の系において測定することができる。そのようなポリペプチドの具体例には、切断に十分な量のＮＳ２／３を有する天然に存在するＮＳ２／３領域およびその誘導体が含まれる。該ＮＳ２／３切断領域は、他のポリペプチド領域（ＨＣＶポリペプチド中に存在するもの又はＨＣＶポリペプチド中には存在しないもの）と共に存在しうる。ＮＳ２／３活性を得るために、また、例えば、ＮＳ２／３活性に関するアッセイを補助するマーカーを付与するために、ＮＳ２／３切断領域を含有する融合タンパク質を使用することができる。
【００２８】
ＮＳ２／３切断反応は、細菌細胞、哺乳類細胞および昆虫細胞ならびに以下の該タンパク質のインビトロ翻訳において研究されている（Ｇｒａｋｏｕｉら，（１９９３）Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．９０，１０５８３−１０５８７；Ｓｅｌｂｙら，（１９９３）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７４，１１０３−１１１３；Ｈｉｊｉｋａｔａら，（１９９３）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６７，４６６５−４６７５；Ｓａｎｔｏｌｉｎｉら，（１９９５）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６９，７４６１−７４７１；Ｄ’Ｓｏｕｚａら，（１９９４）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７５，３４６９−３４７６；およびＰｉｅｒｏｎｉら，（１９９７）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１，６３７３−６３８０）。ＮＳ２／３切断活性に必須のタンパク質領域は、ＨＣＶオプンリーディングフレームのアミノ酸８９３−１２０７にほぼ位置づけされている（Ｇｒａｋｏｕｉら，（１９９３）Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．９０，１０５８３−１０５８７；Ｈｉｊｉｋａｔａら，（１９９３）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６７，４６６５−４６７５；およびＳａｎｔｏｌｉｎｉら，（１９９５）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６９，７４６１−７４７１）。
【００２９】
ＮＳ２／３切断の触媒メカニズムは未知であるが、メタロプロテアーゼまたはシステインプロテアーゼであると推測されており（Ｗｕら，（１９９８）Ｔｒｅｎｄｓ　Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．２３，９２−９４；およびＧｏｒｂａｌｅｎｙａら，（１９９６）Ｐｅｒｓｐｅｃｔ．Ｄｒｕｇ　Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ　Ｄｅｓｉｇｎ，６４−８６）、ＮＳ２のＮ末端は膜貫通ポリペプチドであると考えられている（Ｓａｎｔｏｌｉｎｉら，（１９９５）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６９，７４６１）。インビトロ翻訳されたＮＳ２／３の切断活性はＥＤＴＡにより抑制され、この活性は金属イオンの再添加により回復する（Ｈｉｊｉｋａｔａら，（１９９３）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６７，４６６５−４６７５；およびＰｉｅｒｏｎｉら，（１９９７）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１，６３７３−６３８０）。
【００３０】
ＮＳ２／３プロセシングおよびＨＣＶ複製のインヒビターの特定
ＮＳ２／３プロセシングまたはＨＣＶ複製を抑制するＨＳＰ９０標的化化合物を特定するためには、種々のアッセイ形態を用いることができる。一般的なアッセイ形態の一例は、まず、ＨＳＰ９０と相互作用する化合物を特定し、ついで、そのような化合物がＮＳ２／３切断またはＨＣＶ複製をも抑制するか否かを判定することを含む。
【００３１】
ＨＳＰ９０と相互作用する化合物は、ＨＳＰ９０に直接的に結合するか、またはＨＳＰ９０のパートナータンパク質（例えば、シャペロン複合体中に存在するもの）と相互作用しうる。化合物がＨＳＰ９０と相互作用する能力は、結合アッセイおよび物理的会合アッセイの実施のような種々の方法で測定することができる。
【００３２】
結合アッセイは、ＨＳＰ９０またはＨＳＰ９０シャペロン複合体への化合物の結合能を測定するものである。ＨＳＰ９０またはＨＳＰ９０シャペロン複合体への化合物の結合能を測定するためには、種々の結合アッセイ形態を実施することができる。種々のアッセイ形態の具体例には、競合的および非競合的なものが含まれる。結合アッセイのための好ましい標的はＡＴＰ結合部位である。
【００３３】
ＨＳＰ９０またはＨＳＰ９０シャペロン複合体に結合すると特定された化合物を、検出可能部分で標識し、ＨＳＰ９０またはＨＳＰ９０シャペロン複合体への他の化合物の結合能の評価に使用することができる。適当な検出可能部分には、放射性同位体および蛍光団が含まれる。好ましくは、個々の検出可能部分は、該部分がＨＳＰ９０またはＨＳＰ９０シャペロン複合体への結合に実質的に影響を及ぼさないように選択され化合物上に配置される。
【００３４】
物理的会合アッセイは、ＨＳＰ９０またはＨＳＰ９０シャペロン複合体が作用するＮＳ２／３断片を含むポリペプチドに対するＨＳＰ９０の会合を測定するものである。ＨＳＰ９０とＮＳ２／３との会合を測定するための技術には、ＨＳＰ９０またはＮＳ２／３に特異的な結合剤を使用するものが含まれる。そのような結合剤は、例えば、ゲルまたはカラム画分中のＨＳＰ９０およびＮＳ２／３の存在を示すために使用することができる。
【００３５】
特異的結合剤の一例として、抗体が挙げられる。ＨＳＰ９０およびＮＳ２／３に特異的な抗体は、標準的な免疫学的技術を用いて産生させることができる。抗体を産生させ使用するための一般的技術は、Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ，１９８７−１９９８、およびＨａｒｌｏｗら，Ａｎｉｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８に記載されている。
【００３６】
ＨＳＰ９０またはＨＳＰ９０シャペロン複合体と相互作用すると確認された化合物を更に、ＮＳ２／３プロセシングまたはＨＣＶ複製に対する効果に関して試験することができる。ＮＳ２／３プロセシングの抑制は、ＮＳ２／３自己切断を測定することによりアッセイすることができる。ＨＣＶ複製の抑制は、ＨＣＶに感染した対象におけるＨＣＶレベルの変化を測定することによりアッセイすることができる。ＨＣＶ感染に感受性の対象には、チンパンジーが含まれる（Ｍａｊｏｒら，（１９９９）Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　７３，３３１７−３３２５）。
【００３７】
ＮＳ２／３プロセシングまたはＨＣＶ複製を抑制するための好ましい標的は、ＨＳＰ９０　ＡＴＰ結合部位である。他の部位、例えば、ＨＳＰ９０の三次構造または他のＨＳＰ９０活性に影響を及ぼす部位に結合する化合物を標的化し、それがＮＳ２／３プロセシングまたはＨＣＶ複製を抑制する能力を試験することができる。
【００３８】
アッセイは、個々の化合物を使用して又は種々の化合物を含有する調製物を使用して行うことができる。ＨＳＰ９０との相互作用、ＮＳ２／３切断の抑制またはＨＣＶ複製の抑制のような所望の効果を１以上の化合物が達成する種々の化合物を含有する調製物を、より小さなグループに分けて、所望の効果を有する特定の化合物を特定することができる。本発明の実施形態の１つにおいては、試験調製物は、ＨＳＰ９０との相互作用、ＮＳ２／３切断の抑制またはＨＣＶ複製の抑制を測定するアッセイにおいて、少なくとも１０個の異なる化合物を含有する。
【００３９】
投与
ＨＳＰ９０を標的化する化合物は、当技術分野でよく知られた技術と共に本明細書に記載の指針を用いて製剤化し患者に投与することができる。好ましい投与経路は、化合物の有効量が標的に到達することを保証する。一般的な医薬投与のための指針は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ　第１８版，Ｇｅｎｎａｒｏ編，Ｍａｃｋ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，１９９０、およびＭｏｄｅｒｎ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ　第２版，ＢａｎｋｅｒおよびＲｈｏｄｅｓ編，Ｍａｒｃｅｌ　Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，１９９０（それらの両方を参照により本明細書に組み入れることとする）に記載されている。
【００４０】
適当な官能基を有する化合物は、酸性または塩基性塩として製造することができる。医薬上許容される塩（水溶性、油溶性または分散性産物の形態）には、例えば無機または有機性の酸または塩基から形成される通常の無毒性塩または第四級アンモニウム塩が含まれる。そのような塩の具体例には、酢酸塩、アジピン酸塩、アルギン酸塩、アスパラギン酸塩、安息香酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、重硫酸塩、酪酸塩、クエン酸塩、ショウノウ酸塩、ショウノウスルホン酸塩、シクロペンタンプロピオン酸塩、ジグルコン酸塩、ドデシル硫酸塩、エタンスルホン酸塩、フマル酸塩、グルコヘプタン酸塩、グリセロリン酸塩、ヘミスルファート、ヘプタン酸塩、ヘキサン酸塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、２−ヒドロキシエタンスルホン酸塩、乳酸塩、マレイン酸塩、メタンスルホン酸塩、２−ナフタレンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、シュウ酸塩、パモ酸塩（ｐａｍｏａｔｅ）、ペクチン酸塩、過硫酸塩、３−フェニルプロピオン酸塩、ピクリン酸塩、ピバル酸塩、プロピオン酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、チオシアン酸塩、トシル酸塩およびウンデカン酸塩のような酸付加塩；およびアンモニウム塩、アルカリ金属塩（例えばナトリウムおよびカリウム塩）、アルカリ土類金属塩（例えばカルシウムおよびマグネシウム塩）、ジシクロヘキシルアミン塩、Ｎ−メチル−Ｄ−グルカミンのような有機塩基との塩およびアミノ酸（例えばアルギニンおよびリシン）との塩のような塩基塩が含まれる。
【００４１】
化合物は、経口、鼻腔内、注射、経皮および経粘膜経路を含む種々の経路により投与することができる。懸濁剤として経口投与する有効成分は、医薬製剤の分野でよく知られた技術に従い製造することが可能であり、かさ高さを付与するための微晶質セルロース、懸濁化剤としてのアルギン酸またはアルギン酸ナトリウム、増粘剤としてのメチルセルロース、および甘味剤／香味剤を含有しうる。即時放出錠剤としては、これらの組成物は、微晶質セルロース、リン酸二カルシウム、デンプン、ステアリン酸マグネシウムおよびラクトース、および／または他の賦形剤、結合剤、増量剤、崩壊剤、希釈剤および滑沢剤を含有しうる。
【００４２】
鼻腔内エアゾールまたは吸入により投与する場合、組成物は、医薬製剤の分野でよく知られた技術に従い製造することができる。そのような組成物は、例えば、生理食塩水中の溶液として、ベンジルアルコールまたは他の適当な保存剤、バイオアベイラビリティを増強するための吸収促進剤を使用して、フルオロカーボンを使用して、および／または他の可溶化剤または分散剤を使用して製造することができる。
【００４３】
また、該化合物は、静脈内（ボーラスおよび注入の両方）、腹腔内、皮下、局所（閉鎖（ｏｃｃｌｕｓｉｏｎ）の存在下または不存在下）または筋肉内形態で投与することが可能であり、すべて、製薬分野の当業者によく知られた形態を用いることができる。注射により投与する場合には、注射溶液または懸濁剤は、適当な無毒性の非経口的に許容される希釈剤または溶剤、例えばリンゲル液または等張塩化ナトリウム溶液、あるいは適当な分散または湿潤および懸濁化剤、例えば無菌無刺激性不揮発性油、例えば合成モノまたはジグリセリド、および脂肪酸、例えばオレイン酸を使用して製剤化することができる。
【００４４】
坐剤の形態で直腸内に投与する場合、これらの製剤は、該薬物を、常温では固体であるが直腸腔内では液化および／または溶解して該薬物を放出する適当な無刺激性賦形剤（例えば、ココア脂、合成グリセリドエステルまたはポリエチレングリコール）と混合することにより製造することができる。
【００４５】
本発明の治療用途のための適当な投与計画は、患者の年齢、体重、性別および医学的状態；治療する状態の重傷度；患者の腎および肝機能；および使用する個々の化合物を含む当技術分野でよく知られた因子を考慮して選択される。
【００４６】
毒性を伴うことなく効力を与える範囲内の薬物濃度を最適に正確に得るためには、標的部位に対する薬物のアベイラビリティーの速度論に基づく計画が必要である。これは、薬物の分布、平衡および消失の考慮を含む。患者に対する１日量は、０．０１〜１，０００ｍｇ／成人患者／日と予想される。
【００４７】
（実施例）
本発明の種々の特徴を更に例示するために、以下に実施例を記載する。該実施例は、本発明を実施するための有用な方法をも例示する。これらの実施例は本発明を限定するものではない。
【００４８】
実施例１：ＮＳ２／３の製造
ＮＳ２の全て及びＮＳ３のほとんどを含むＢＫ株のＨＣＶ残基８１０−１６１５（８１０−１６１５ＢＫと称される）はプラスミドｐＣＩＴＥ８１０−１６１５ＢＫ（Ｎｉｃｏｌａ　Ｌａ　Ｍｏｎｉｃａ博士から贈られた）から製造され、Ｐｉｅｒｏｎｉら，（１９９７）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１，６３７３に既に記載されている。ＢＬＰ１でのプラスミドの線状化の後、ＲＮＡをＴ７　ＲＮＡポリメラーゼで転写し、精製した。タンパク質の翻訳は、標識として［３５Ｓ］−メチオニンを使用してウサギ網状赤血球ライセート中、３０℃で４０分間にわたり行った。ついで、シクロヘキシミド（最終的には２５０μＭ）の添加により翻訳を阻止し、該サンプルを直ちにドライアイス上で凍結した。
【００４９】
プロセシング実験の前に、翻訳されたＮＳ２／３のアリコートを氷上で融解した。Ｐｉｅｒｏｎｉら，（１９９７）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１，６３７３に記載のとおり、１％のＴｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００を含有する室温の溶液への添加により、８１０−１６１５ＢＫのプロセシングを開始した。乾燥ゲル上の［３５Ｓ］標識タンパク質の分布をホスホルイメージャー（Ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｍａｇｅｒ）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｄｙｎａｍｉｃｓ）で測定した。産物のバンドを定量し、該ゲルレーン中の全シグナルに対する比率として表して、ゲルレーンのローディングにおけるばらつきが正規化されるようにした。インヒビターのＩＣ５０の計算のために示されるデータを得るためには、８１０−１６１５ＢＫからの産物ＮＳ２を使用した。なぜなら、そのゲル上の移動は、より高い分子量のＮＳ３断片より小さなバックグラウンドを有する領域におけるものであったからである。
【００５０】
実施例２：ＮＳ２／３融合タンパク質の発現
ｐＣＤＮＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に由来するプラスミドｐＭ３Ａは、Ｕｂｉ−８４９−１２０７Ｊ−ＢＬＡと称される融合タンパク質をコードしており、該融合タンパク質は、ユビキチンをそのＮ末端に含有し、それに続いて、細菌性ＴＥＭ−１　β−ラクタマーゼにＣ末端で連結したＮＳ２／３残基８４９−１２０７（Ｊ株）を含有する。この構築物中のＮＳ３プロテアーゼドメインは不活性化性突然変異Ｓ１１６５Ａを有し、これはＮＳ２／３プロセシング活性には影響を及ぼさない。この構築物のＲＮＡ合成はＴ７プロモーターにより駆動される。実施例１に記載のとおり、翻訳するために、ＲＮＡを別に調製した。ウサギ網状赤血球ライセート中での翻訳に際して、該ユビキチンは細胞性ユビキチンヒドロラーゼにより該タンパク質から直ちに切断される（Ｈｏｃｈｓｔｒａｓｓｅｒ，（１９９６）Ａｎｎｕａｌ　Ｒｅｖｉｅｗ　ｏｆ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　３０，４０５）。
【００５１】
切断可能な連結（配列番号１）が、ユビキチン↓ＡｒｇＨｉｓＧｌｙＳｅｒＧｌｕＰｈｅ−ＮＳ２／３として存在する。この構築物の翻訳は、いくつかのプロセシングされたＮＳ２およびＮＳ３産物を不可避的に産生した。なぜなら、Ｊ株のＮＳ２／３プロセシングは、ＢＫ株からのＮＳ２／３のようには界面活性剤も膜も必要としないからである。そのため、翻訳は３０分間に限定された。室温でのプロセシングの定量は、シクロヘキシミドの添加の直後に調製したサンプルと、より後の時点のサンプルとの比較によるものであった。
【００５２】
実施例３：再構成実験
実施例１に記載のとおりに、ウサギ網状赤血球ライセート中、［３５Ｓ］−Ｍｅｔ標識を行いながらＮＳ２／３（８１０−１６１５ＢＫ）を合成した。翻訳された［３５Ｓ］−メチオニン標識ＮＳ２／３　８１０−１６１５ＢＫを含有するライセートを、２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ７．５）中で平衡化されたＰ−６ポリアクリルアミドゲル（Ｂｉｏ−Ｒａｄ；排除限界６０００Ｄａ）を含有する遠心カラムを介して遠心分離した。ウサギ網状赤血球ライセート（Ｐｒｏｍｅｇａ）をＡｍｉｃｏｎ　Ｍｉｃｒｏｃｏｎ−１０ユニットで濾過して、１０ｋＤａの濾液を得た。
【００５３】
１０，０００Ｄａ未満の溶質を含有するウサギ網状赤血球ライセート濾液（１０ｋＤａ濾液）中への該標識ライセート画分の１０倍希釈は、既に記載されている未希釈ライセート中で観察されたもの（Ｄａｒｋｅら，（１９９９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４，３４５１１）に類似した度合のＮＳ２／３切断を支持した。水またはバッファー中に希釈された同じ物質はＮＳ２／３をプロセシングしなかった。
【００５４】
細胞成分に加えて、市販のウサギ網状赤血球ライセートは、ＤＴＴ、ＫＯＡｃ、ＧＴＰおよびクレアチンリン酸で補足される。該濾過ライセートを、該カラムバッファー中に、または１ｍＭ　ＡＴＰ、１．５ｍＭ　Ｍｇ（ＯＡｃ）２、２ｍＭ　ＤＴＴおよび７９ｍＭ　ＫＯＡｃの組合せを含有するバッファー中に、１０倍希釈した。いくつかのサンプルにおいては、ＫＯＡｃの量が様々であり（２０ｍＭ〜２３７ｍＭ）、あるいはＡＴＰの代わりにＡＴＰγＳが使用された。プロセシングを、１％までのＴｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００の添加により開始し、等容積のＳＤＳサンプルバッファーで３０分後に停止した。結果を表１に示す。表１においては、活性は、該１０ｋＤａ濾液対照の存在下で達成されたプロセシングの量に対する割合（％）として表されている。
【００５５】
【表１】
2004504356.tif 000003
【００５６】
プロセシングを支持する該１０ｋＤａ濾液の成分は熱またはトリプシンでの処理に対して安定であり（熱処理は１００℃で３分間であり、トリプシン処理は０．１ｍｇ／ｍｌで２時間、ついで２倍過剰の膵トリプシンインヒビターで処理した）、このことは非タンパク質性を示唆している。ウサギ網状赤血球ライセート中に存在することが知られている低分子量化合物を、個々に又は組合せて、それらがプロセシングを支持する能力に関して調べた。
【００５７】
単独で又はペアではプロセシングを完全に支持した成分はなかったが、表１に示すとおり、ＡＴＰと塩の組合せとを含有する溶液は、該１０ｋＤａ濾液で達成されたものと比較しうるレベルでプロセシングを可能にした。この組合せにおいてＡＴＰの代わりにＡＴＰγＳを使用すると、プロセシングの喪失が生じた。このことは、該ＡＴＰ寄与がＡＤＰへの加水分解を要することを示唆している。
【００５８】
実施例４：ＡＴＰの枯渇またはＡＴＰ類似体の使用によるＮＳ２／３プロセシングの抑制
ＮＳ２／３プロセシングにおけるＡＴＰの役割を示す再構成実験を補足するために、１％までのＴｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００の添加によりプロセシングを開始する前にグルコース＋ヘキソキナーゼで処理することにより、翻訳された［３５Ｓ］標識ＮＳ２／３（８１０−１６１５ＢＫ）を含有するウサギ網状赤血球ライセートからＡＴＰを枯渇させた。グルコースもヘキソキナーゼも単独では有意な影響を及ぼさなかったが、グルコースのリン酸化においてＡＴＰを消費するそれらの２つの組合せは、プロセシングを６０％抑制した。結果を表２に示す。
【００５９】
【表２】
2004504356.tif 000004
【００６０】
別法として、ＡＴＰγＳまたはＡＭＰ−ＰＮＰ（ＡＴＰの非加水分解性類似体である）の添加で、抑制が観察された（表２）。該抑制の力価測定は、ＡＴＰγＳまたはＡＭＰ−ＰＮＰに関してそれぞれ２ｍＭおよび４ｍＭのＩＣ５０値を与え、試験した最大濃度（５ｍＭ）における抑制はそれぞれ７７％および６０％であった（これらの反応内には残留ＡＴＰも約１ｍＭの濃度で存在するため、完全な抑制は予想されない）。ＡＴＰγＳによる抑制は、ユビキチン−ＮＳ２／３−βラクタマーゼよりなる融合タンパク質（Ｕｂｉ−８４９−１２０７Ｊ−ＢＬＡ）として発現されるＨＣＶのＪ株由来のＮＳ２／３でも観察された。
【００６１】
実施例５：ＮＳ２／３活性の抑制
ＡＴＰの関与は、該プロセシングの段階におけるＡＴＰ依存性細胞シャペロンの関与と符合する。２つの関連ベンゾキノンアンサマイシンであるゲルダナマイシンおよびハービマイシンＡ、ならびに大環状抗生物質であるラディシコールは、ＡＴＰ部位での結合によりＨＳＰ９０を特異的に抑制する化合物の具体例である（Ｒｏｅら，（１９９９）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４２，２６０）。
【００６２】
インビトロ合成前駆体８１０−１６１５ＢＫに添加したゲルダナマイシン、ハービマイシンＡおよびラディシコールで、ＮＳ２／３プロセシングの抑制が観察された（５０％まで）。該実験の合成期中に及びＮＳ２／３プロセシングにおいて化合物を含有させた場合には、いくらか大きなプロセシング抑制が用量依存的に観察された（表３）。該化合物はタンパク質合成の全体的な効率には何ら影響を及ぼさず、ＮＳ２／３融合タンパク質Ｕｂｉ−８４９−１２０７Ｊ−ＢＬＡを使用して同様の抑制効力が観察された。
【００６３】
【表３】
2004504356.tif 000005
【００６４】
ＮＳ２／３プロセシング反応を８１０−１６１５ＢＫで行った。ゲルダナマイシンおよびラディシコールの抑制効果を、ペプチド抑制滴定に関して既に記載されている技術（Ｄａｒｋｅら，（１９９９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４，３４５１１）を用いて滴定した。インヒビターをＤＭＳＯに溶解し、光から防護した。ＤＭＳＯの最終濃度がインビトロ実験では２％、細胞に基づくアッセイでは１％となるよう、ＤＭＳＯ中で希釈を行った。ゲルダナマイシンおよびラディシコールの滴定は、ＨＳＰ９０が作用する他のタンパク質の類似インビトロ研究（Ｈｕら，（１９９６）Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．ＵＳＡ９３，１０６０；Ｔｈｕｌａｓｉｒａｍａｎら，（１９９６）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　３５，１３４４３（１９９６），Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒら，（１９９６）Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．ＵＳＡ　９３，１４５３６）で観察されているのと同様の低いマイクロモル範囲のＥＣ５０を与えた（表４）。
【００６５】
【表４】
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【００６６】
実施例６：ＮＳ２／３とＨＳＰ９０との間の物理的会合
インビトロ翻訳されたＮＳ２／３とＨＳＰ９０との物理的会合に関する証拠を免疫沈降により得た。モノクローナルＩｇＭ抗体３Ｇ３（抗ＨＳＰ９０、Ａｆｆｉｎｉｔｙ　Ｂｉｏｒｅａｇｅｎｔｓ）およびＴＥＰＣ−１８３（対照、Ｓｉｇｍａ）は、ＨＳＰ９０の免疫沈降における使用に関して既に記載されている（ＭｃＧｕｉｒｅら，（１９９４）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ａｎｄ　Ｃｅｌｌｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　１４，２４３８）。ルシフェラーゼＲＮＡをＰｒｏｍｅｇａから入手した。架橋抗体により該一次抗体を固体支持体に結合させることにより、イムノアフィニティービーズを調製した。
【００６７】
プロテインＧ−アガロース（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）を使用して、ヤギ抗マウス免疫グロブリンＭ（ＩｇＭ）（５ｍｇ／ｍｌゲル）を４℃で一晩固定化した。ついで該モノクローナル抗ＨＳＰ９０抗体３Ｇ３または等濃度の対照マウスＩｇＭ抗体ＴＥＰＣ−１８３を該固定化抗マウスＩｇＭと一緒にした。ＨＳＰ９０およびいずれかの会合タンパク質を免疫沈降させるために、翻訳された［３５Ｓ］標識ＮＳ２／３を含有するライセートを、実質的には文献記載（ＭｃＧｕｉｒｅら，（１９９４）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ａｎｄ　Ｃｅｌｌｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　１４，２４３８）のとおりに、該ビーズと共にインキュベートした。４℃で２時間の結合の後、該ビーズを洗浄し、ＳＤＳサンプルバッファーに懸濁させ、９５℃に加熱した。免疫沈降物をＳＤＳ／１４％　ポリアクリルアミドゲル上で分離した。
【００６８】
図１に示すとおり、モノクローナルＩｇＭ抗体でのＨＳＰ９０の免疫沈降は、ＢＫまたはＪ株に由来するＮＳ２／３（８１０−１６１５ＢＫおよびＵｂｉ−８４９−１２０７Ｊ−ＢＬＡ）を免疫共沈降させた。対照ＩｇＭ抗体ＴＥＰＣ−１８３は、関心のあるタンパク質の最小量を免疫沈降させたに過ぎなかった。一方、対照タンパク質である翻訳されたホタルルシフェラーゼでは、ＨＳＰ９０との会合は観察されなかった（図１）。この結果は、ｄｅ　ｎｏｖｏ合成されたＮＳ２／３が溶液中でＨＳＰ９０と安定な複合体を形成することを示している。
【００６９】
実施例７：ＮＳ２／３とＨＳＰ９０との会合の抑制
ＮＳ２／３でのＨＳＰ９０の免疫沈降をゲルダナマイシンが妨げる能力を調べた。［３５Ｓ］標識ＮＳ２／３を、網状赤血球ライセート中、１０μＭ　ゲルダナマイシンの不存在下または存在下で合成した。ゲルダナマイシンの存在下では、該抗ＨＳＰ９０　ｍＡｂと共に免疫共沈降するＮＳ２／３の量は６０％減少した（図１Ｂ）。したがって、ゲルダナマイシンによるＮＳ２／３プロセシングのいくらかの抑制は、翻訳中または翻訳直後のＮＳ２／３とのＨＳＰ９０の会合の妨害に帰されうる。
【００７０】
実施例８：ＮＳ２／３切断の細胞に基づく抑制
生きた細胞においてＨＳＰ９０がＮＳ２／３プロセシングに必須であるという概念の証明が、ＮＳ２／３を発現する細胞をＨＳＰ９０インヒビターで処理することにより得られた。ネオマイシンで選択可能なトランスフェクションベクターの使用により、ジャーカット細胞におけるＮＳ２／３の安定発現が得られた。ネオマイシン（Ｇ４１８）耐性を付与するプラスミドｐＵｂＢｌａ３Ｘ−ＮＳ２／３−３Ａは、Ｎ末端に結合した３つのユビキチンドメインおよびＣ末端におけるβ−ラクタマーゼとＮＳ２／３タンパク質との融合体を発現する。その完全な未切断タンパク質は、５〜１０分と推定されるインビボ半減期を有する。
【００７１】
プラスミドｐＵｂＢｌａ３Ｘ　ＮＳ２／３−３Ａをジャーカット細胞内にトランスフェクトした。該プラスミドのＣＭＶプロモーター駆動性ＯＲＦは、９１ｋＤａのタンパク質、ユビキチン−ユビキチン−ユビキチン−ＮＳ２／３−β−ラクタマーゼをコードしており、その３つのユビキチンドメインのＣ末端はユビキチンＣ末端ヒドロラーゼに対して非切断性となっている（ユビキチンＣ末端配列ＡｒｇＬｅｕＡｒｇＧｌｙＶａｌ、配列番号２）。該ＮＳ２／３領域はＨＣＶ残基８４９−１２０７を含む。該β−ラクタマーゼドメインは大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）由来のＴＥＭ−１である。該β−ラクタマーゼ部分の発現は、発蛍光性で細胞透過性の基質であるＣＣＦ２で容易に検出される（Ｚｌｏｋａｒｎｉｋら，（１９９８）Ｓｃｉｅｎｃｅ　２７９，８４）。
【００７２】
β−ラクタマーゼの発現を示すために、ＣＣＦ２での処理により、トランスフェクタントをＦＡＣＳにより選別し（Ｚｌｏｋａｒｎｉｋら，（１９９８）Ｓｃｉｅｎｃｅ　２７９，８４）、個々のクローンをＧ４１８選択下で増殖させた。発現された完全な融合タンパク質は、そのユビキチンＮ末端タグのため、ユビキチン指向性プロテオソーム分解に非常に不安定であり、一方、ＮＳ２／３切断のＣ末端産物であるＮＳ３−β−ラクタマーゼは数時間にわたり安定である。したがって、ＣＣＦ２加水分解（高い４６０ｎｍ／５３０ｎｍ比率）により示されるβ−ラクタマーゼ活性の細胞内での増加はＮＳ２／３切断の達成を示し、β−ラクタマーゼ活性の抑制はＮＳ２／３抑制を示す。
【００７３】
これに関連して、プロセシングをなし得ないＮＳ２／３突然変異体Ｃ９９３Ａは、該細胞のβ−ラクタマーゼ活性を約８倍減少させる。ＮＳ２／３切断活性に必須のタンパク質領域は、ＨＣＶオープンリーディングフレームのアミノ酸９８９−１２０７にほぼ位置づけされている。保存された切断部位配列はＡｒｇＬｅｕＬｅｕ↓ＡｌａＰｒｏＩｌｅ（配列番号３）である。Ｃｙｓ９９３およびＨｉｓ９５２は必須残基とされている（Ｇｒａｋｏｕｉら，（１９９３）Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．ＵＳＡ　９０，１０５８３，Ｓｅｌｂｙら，（１９９３）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７４，１１０３，Ｈｉｊｉｋａｔａら，（１９９３）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６７，４６６５，Ｓａｎｔｏｌｉｎｉら，（１９９５）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６９，７４６１，Ｄ’Ｓｏｕｚａら，（１９９４）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７５，３４６９およびＰｉｅｒｏｎｉら，（１９９７）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１，６３７３を参照されたい）。
【００７４】
ＮＳ２／３自己切断は、Ｎ末端における不安定化性ユビキチン分解シグナルをＮＳ３−β−ラクタマーゼＣ末端産物から分離して、細胞内のβ−ラクタマーゼ活性を安定化する。この系を用いて、図２に示すとおり、哺乳類細胞内でのＮＳ２／３プロセシングに対するＨＳＰ９０インヒビターの抑制効力を測定した。ゲルダナマイシンおよびラディシコールは、この関連におけるＮＳ２／３切断の強力なインヒビターであり、それぞれ４０ｎＭおよび１３ｎＭのＩＣ５０値を有する。また、抑制は、試験した最高濃度においてはほぼ完全である（図２）。この結果は、細胞内のＨＳＰ９０活性を抑制するのに要するゲルダナマイシンの濃度が、インビトロで要するものより遥かに低い点で、他のＨＳＰ９０活性に関して他の研究者が見出しているもの（Ｈｕら，（１９９６）Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．ＵＳＡ　９３，１０６０，Ｈｏｌｔら，（１９９９）Ｇｅｎｅｓ　Ｄｅｖ．１３，８１７）と比較しうるものである。
【００７５】
アフィニティー標識（Ｃｈａｖａｎｙら，（１９９６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１，４９７４）およびアフィニティークロマトグラフィー（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒら，（１９９６）Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．ＵＳＡ　９３，１４５３６，Ｗｈｉｔｅｓｅｌｌら，（１９９４）Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．ＵＳＡ　９１，８３２４，およびＳｃｈｕｌｔｅら，（１９９８），Ｃｅｌｌ　Ｓｔｒｅｓｓ　ａｎｄ　Ｃｈａｐｅｒｏｎｅｓ　３，１００）により示されるとおり、ゲルダナマイシンは細胞内でＨＳＰ９０と特異的に相互作用する。したがって、ＮＳ２／３切断に関する観察された抑制はＨＳＰ９０により媒介されるものである。
【００７６】
他の実施形態も特許請求の範囲内に含まれる。いくつかの実施形態を示し説明してきたが、本発明の精神および範囲から逸脱することなく種々の修飾を施すことが可能である。
【図面の簡単な説明】
【図１】ＨＳＰ９０とのＮＳ２／３の物理的会合を示す図である。
【図２】ＨＳＰ９０インヒビターが、細胞に基づくアッセイにおいてＮＳ２／３切断を抑制することを示す図である。
【図１】
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【図２】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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