(57)【要約】強化母材薄膜は、細胞成長に適しかつ軟骨細胞移植に使用することに適した１またはそれを超える足場成形タンパク質を含有する。その強化母材を製造する方法が開示される。足場は、タンパク質を安定化する溶液、コロイド分散液、または懸濁液中でコラーゲン母材と共に培養される。強化母材は、組織工学、軟骨移植、骨および軟骨移植、関節補修、関節炎異常の予防に用いられる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
コラーゲン基剤強化母材を製造する方法であって、
母材を成形するように足場成形タンパク質でコラーゲンを培養すること、
フリース状材料を成形するように母材を減圧凍結乾燥すること、
母材を成形するように前記フリース状材料をシートに圧縮すること、
からなる、コラーゲン基剤強化母材の製造方法。
【請求項２】
前記コラーゲンはＩＩ型コラーゲンである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記コラーゲンはＩ／ＩＩＩ型コラーゲンである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記足場成形タンパク質は疎水性の非グリコシル化タンパク質である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記足場成形タンパク質はエラスチンである、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記足場成形タンパク質はエラスチン繊維からなる、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記足場成形タンパク質はエラスチン状ペプチドである、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記足場成形タンパク質は可溶性エラスチンである、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
ｐＨ限度／温度／時間制限を持った、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
コラーゲン母材および足場成形タンパク質からなる、コラーゲン基剤強化薄膜。
【請求項１１】
前記コラーゲンはＩＩ型コラーゲンである、請求項１０に記載の薄膜。
【請求項１２】
前記コラーゲンはＩ／ＩＩＩ型コラーゲンである、請求項１０に記載の薄膜。
【請求項１３】
前記コラーゲンは架橋されていない、請求項１０に記載の薄膜。
【請求項１４】
前記コラーゲンは架橋されている、請求項１０に記載の薄膜。
【請求項１５】
前記コラーゲンは天然コラーゲンである、請求項１０に記載の薄膜。
【請求項１６】
前記足場成形タンパク質は疎水性の非グリコシル化タンパク質である、請求項１０に記載の薄膜。
【請求項１７】
前記足場成形タンパク質はエラスチンからなる、請求項１６に記載の薄膜。
【請求項１８】
前記足場成形タンパク質はエラスチン繊維からなる、請求項１０に記載の薄膜。
【請求項１９】
前記足場成形タンパク質はエラスチン状ペプチドである、請求項１０に記載の薄膜。
【請求項２０】
前記足場成形タンパク質は可溶性エラスチンである、請求項１０に記載の薄膜。
【請求項２１】
移植物品として使用に適した、または軟骨細胞とならびにコラーゲン母材および足場成形タンパク質からなるコラーゲン基剤薄膜とからなる関節鏡外科に適した、組成。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、強化母材および母材を安定化しかつ強化する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
膝またはその他の関節の軟骨への傷害は、軟骨母材を変形する異常な機械的荷重からしばしば生じる。関節に加わる荷重は、母材中のコラーゲン網様構造を断裂させ、軟骨母材の強さを減じる。
【０００３】
人間の関節軟骨は一旦損傷されると、それは再生のための限られた適応性を有しているので、軟骨傷害は治療するのに困難である。ＩＩ型コラーゲンは、関節軟骨内の細胞外母材の主構造タンパク質である。ＩＩ型コラーゲンは、他の型のコラーゲンに類似して、三重螺旋形状を成形する３つのコラーゲン・ポリペプチドからなっている。ポリペプチドは互いに撚り合わされ、コラーゲン・ポリペプチド間に架橋を与えるテロペプチド領域を各端に有している。自然状態のコラーゲン母材は、多数の架橋三重螺旋を含有し、個々の分子は約３００，０００ダルトンの分子量を有している。ＩＩ型コラーゲンはほとんど動物コラーゲンだけに見出される。他の型のコラーゲンは動物の皮、薄膜、骨に見出される。
【０００４】
関節の関節表面の外層におけるＩＩ型コラーゲンの過剰崩壊は、変形性関節症によっても生じる。コラーゲン網様構造はしたがって弱められ、次いで線維攣縮を発展させ、それによってプロテオグリカンのような母材物質が喪失され、いつかは完全に移動される。弱められた変形性関節症軟骨のこのような線維攣縮は、石灰化した軟骨に低下し、肋軟骨下の骨になる（Ｋｅｍｐｓｏｎ，  Ｇ．Ｅ等、Ｂｉｏｃｈｉｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ａｃｔａ  １９７６，４２８，７４１；Ｒｏｔｈ，  Ｖ．およびＭｏｗ，  Ｖ．Ｃ．  Ｊ．Ｂｏｎｅ  Ｊｏｉｎｔ  Ｓｕｒｇｅｒｙ，１９８０，６２Ａ，１１０２；Ｗｏｏ，Ｓ．Ｌ．−Ｙ．等、生体工学ハンドブック（Ｒ．ＳｋａｌａｋおよびＳ．Ｃｈｉｅｎ  Ｅｄｓ）ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８７，ｐｐ４．１−４．４４）。
【０００５】
軟骨の再生治療方法は、関節およびその他の関節状態を治療するのに有用であり、関節損傷の初期の段階で実施され、したがって、人工関節置換外科術のようなより広範囲な処置を必要とする多数の患者を減らしている。このような予防治療法によって、変形性関節症を患っている患者の数が減少する。
【０００６】
軟骨細胞を成長させ、それを用いる方法が、Ｂｒｉｔｔｂｅｒｇ，Ｍ．等（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．１９９４，３３１，８８９）によって記載されている。これらの方法によって成長された軟骨細胞を用いた自系の移植も開示されている。さらに、Ｋｏｌｅｔｔａｓ等は、延長された細胞培養の下でコラーゲンおよびプロテオグリカンのような軟骨特別分子の発現を調べた（Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ１９９５，１０８，１９９１）。彼らは、単層培養における培養中の形体学的変化にかかわらず（Ａｕｌｔｈｏｕｓｅ，Ａ．等  Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  Ｃｅｌｌ  Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．１９８９，２５，６５９；Ａｒｃｈｅｒ，Ｃ．等  Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ．１９９０，９７，３６１；Ｈａｅｎｓｅｌｍａｎｎ，Ｈ．等  Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ．１９９４，１０７，１７；Ｂｏｎａｖｅｎｔｕｒｅ，Ｊ．等  Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．１９９４，２１２，９７）、アガロース・ゲル、アルギン酸塩ビードまたは種々の科学者によって試験されたスピンナ培養（丸い細胞形態構造を保有する）を超えて成長された懸濁培養と比較したとき、このような形態構造は軟骨細胞を変化させない。すなわち、ＩＩ型およびＩＸ型コラーゲンのような発現されたマーカ、大凝集プロテオグリカン、アグリカン、ベルシカン、連鎖タンパク質は変化しない（Ｋｏｌｅｔｔａｓ，Ｅ．等  Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ１９９５，１０８，１９９１）。
【０００７】
さらに、ドナーからの軟骨細胞は、動物に移植された軟骨を成形するように生体外で成長された（Ａｄｋｉｓｓｏｎ等「関節軟骨治療用新規足場独立新細胞移植」ＩＣＲＳ第２回シンポジウム国際軟骨補修協会、Ｎｏｖ．１１−１８，１９９８）。さらに、軟骨細胞は軟骨を再生するために骨端症核の軟骨表面に接種された（Ａｌｂｒｅｃｈｔ等「軟骨細胞の周囲接種：統合軟骨補修の強化に向けて」ＩＣＲＳ第２回シンポジウム国際軟骨補修協会、Ｎｏｖ．１６−１８，１９９８）。膝関節の関節表面は種々の培養された軟骨細胞によって治療された（Ｓｔｏｎｅ等  Ｏｐｅｒａｔｉｖｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｏｒｔｈｏｐａｅｄｉｃｓ７（４）、ｐｐ．３０５−３１１，Ｏｃｔ．１９９７およびＭｉｎａｓ等  Ｏｐｅｒａｔｉｖｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｏｒｔｈｏｐａｅｄｉｃｓ７（４）、ｐｐ．３２３−３３３，Ｏｃｔ．１９９７）。
【０００８】
Ｓｔｏｎｅに付与された米国特許第５，００７，９３４号は、生体適合および生体再吸収性繊維から成形された人工器官再吸収性半月板に向けられている。その繊維は、天然繊維または天然繊維に類似するものを含む。本発明に有用な天然繊維は、コラーゲン、エラスチン、レチクリン、それらの類似体、それらの混合物を含む。その繊維は、円周方向、半径方向、または交互に母材内で向けられ、繊維は不規則な配向を有していてもよい。繊維は架橋され、母材はグリコサミノグリカンを選択的に含んでいてもよい。
【０００９】
Ｇｅｉｓｔｌｉｃｈ等に付与された米国特許第５，８３７，２７８号は、再吸収性があり、誘導された組織再生に用いられるコラーゲン含有薄膜を記載している。薄膜は、細胞成長を許す繊維面と、細胞付着を阻止する滑らかな（繊維面と反対の）面とを有する。薄膜生産物は天然コラーゲン薄膜から（すなわち、子ウシまたは子ブタの皮または腱から）抽出され、また、処理されても、それはその天然の構造特徴を維持するものとして記載されている。コラーゲンは、コラーゲンを脱脂しかつ分解するようにアルカリ剤によって純化され、次いで純化コラーゲンが酸性化され、水洗され、乾燥され、脱脂され、そして選択的に架橋される。脂肪は鹸化される。薄膜は、約９５重量％の天然コラーゲンを含有するものとして記載されている。コラーゲンは、強化タンパク質を含有するようには見えない。
【００１０】
Ｇｅｉｓｔｌｉｃｈ等のＰＣＴ  ＷＯ９６／２５９６１は、選択的に架橋を含むＩＩ型コラーゲンからなる軟骨組織を再構築するための母材を記載している。その母材を製造するさいに、軟骨は動物から採取、冷凍、小寸法化、脱水、脱脂、水洗、アルカリ材料処理をされる。非コラーゲンアルカリ可溶性タンパク質は、変性、破壊、分解、排除される。透析および冷凍乾燥が、可能な処理工程として挙げられている。母材材料は、所望の形状に成形するために打ち抜かれ、次に滅菌される。
【００１１】
Ｗａｌｌａｃｅ等に付与された米国特許第４，４２４，２０８号は、微粒子架橋アテロペプチド・コラーゲンと、水の坦体中に分散された再構築アテロペプチド・コラーゲン繊維とからなる注入可能なコラーゲン移植材料を記載している。コラーゲンのアテロペプチド形体は天然のテロペプチド架橋に欠ける。米国特許第４，４２４，２０８号に記載された方法においては、ウシまたはブタの真皮（上皮下の皮膚層）から得られたコラーゲンは、弱酸内で浸透させることによって軟化され、脱毛され、研磨のような物理的処理によって粉末にされ、酸およびタンパク質分解酵素によって可溶化され、アルカリ溶液によって処理され、酵素から開放される。コラーゲンの架橋ゲル形体は、グルタルアルデヒドの負荷によるような放射誘導架橋または化学誘導架橋によって成形される。コラーゲンの繊維形体は、Ｎａ2ＨＰＯ4のような緩衝剤で溶液を中和させることによってつくられる。注入可能コラーゲン成分は、５−３０％繊維コラーゲンおよびコラーゲンの架橋ゲル形体の７０−９８％からなる。
【００１２】
Ｌｕｃｋ等に付与された米国特許第４，４８８，９１１号は、天然コラーゲンの免疫性テロペチド部分のないコラーゲン繊維の生成を記載している。テロペチド領域は、天然コラーゲン内の架橋の点を与える。架橋されてもよい繊維は、スポンジ、人工器官素子、フィルム、薄膜、縫合糸として使用することを記載している。米国特許第４，４８８，９１１号に記載された方法（非ＩＩ型、Ｉ型、その他）においては、ウシのような動物の腱、皮膚、接続組織から得られたコラーゲンが、酢酸溶液内に分散され、肉細断機を通過され、テロペチドを切り裂きかつコラーゲンを可溶化するようにペプシンによって処理され、凝結され、透析され、ホルムアルデヒドの付加によって架橋され、滅菌され、減圧凍結乾燥される。米国特許第４，４８８，９１１号において開示された方法は、グリコサミノグリカンおよび脂質のような非コラーゲン・タンパク質が無いコラーゲンの形体を得ることをこの特許は指示している。さらに、その特許は、コラーゲンが例えば、薄膜、フィルム、またはスポンジをつくるゲルとして用いられてもよく、また、コラーゲンの架橋の程度は構造特性を変えるように制御されうることを記載している。
【発明の開示】
【００１３】
一実施例においては、本発明は内部足場によって母材を強化する方法を提供する。本発明の一実施例は、コラーゲン−タンパク質懸濁液を成形するように１またはそれを超える足場成形タンパク質によってコラーゲンを培養すること、フリース状材料を成形するように懸濁液を減圧凍結乾燥すること、混合物を成形するようにフリース状材料をシートに圧縮することからなるコラーゲン基剤母材をつくる方法に向けられている。一実施例においては、コラーゲンはＩＩ型またはＩ／ＩＩＩ型コラーゲンである。本発明において使用するコラーゲン母材は、ブタ、ウシ、ニワトリ、ヒツジ、ヤギ、カンガルー、その他の動物資源からつくられたものを含む。一実施例においては、足場成形タンパク質は、エラスチンまたはエラスチン状ペプチドのような非グリコシル化タンパク質である。
【００１４】
別の観点においては、本発明はタンパク質強化母材に接種された軟骨細胞を含む。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
近年入手できる母材および異なる化学成分を有する薄膜は、非常に限られた機械的強度を示す。これらの母材または薄膜の多くは、血球に曝した短時間後に崩壊する。機械的安定性は、組織移植のために細胞負荷母材の操作に不可欠である。一実施例においては、本発明は、骨芽細胞または間充組織茎細胞のような軟骨細胞または他の細胞の関節鏡または他の動物侵襲移植に適した新しい母材を処置されるべき領域に造り出すために母材を強化するのに有効かつ効果的なタンパク質足場を提供する。本発明は、母材を強化するさいに有用なポリ乳酸およびポリグリコール酸強化足場に向けられている。
【００１６】
異なる型のコラーゲン材料の劣化挙動を分析しているときに、特定の母材構造がトリプシンによってではなく、コラゲナーゼによって容易に劣化されたことが驚異的に発見された。他の母材構造は、コラゲナーゼによる処理後ではなく、トリプシンによる処理後に機械的強度の顕著な喪失を現した。いくつかの場合に、コラゲナーゼおよびトリプシンの組合せまたは順次処理は、薄膜の機械的強度にいかなる顕著な効果をも示さなかった。順次組織的分析が、部分的架橋無しでまたはそれのみを持った純粋コラーゲンＩ型、Ｉ／ＩＩＩ型、またはＩＩ型構造からなる天然、合成、または半合成薄膜がコラゲナーゼによる劣化に敏感であったことを示した。
【００１７】
いくつかの市場で入手できる薄膜（スイスのＥｄ  Ｇｅｉｓｔｌｉｃｈ  Ｓｏｎｅから発売されているＣｈｏｎｄｒｏ−Ｇｉｄｅ（登録商標）またはＣｈｏｎｄｒｏ−Ｃｅｌｌ（登録商標））のみならず、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウシ、ニワトリ、カンガルーのような異なる動物からの腹膜または皮膚からとれたいくつかの天然薄膜が、それらがコラーゲンを含有しているとは言っても、コラゲナーゼにまったく耐性があるとわかった。しかし、トリプシン、またはトリプシン／コラゲナーゼによるこれらの薄膜の処理は、材料の起点および厚みに関連して変わる完全な劣化を特定の期間内に示した。これらの知見は、コラゲナーゼによって劣化されずかつ各材料の機械的強度および安定性に著しく貢献する追加のタンパク質足場の存在を示した。
【００１８】
他の不溶性高分子生体分解性タンパク質がどのように働いても、このような足場を成形したあるタンパク質はエラスチンとして識別された。本発明にもとづいて用いられうるエラスチンの一例は、Ｐａｒｔｒｉｄｇｅ等によって記載されたエラスチン分画であり（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．６１：１１−２１，１９５４）、これを参考としてここに組み入れる。特に、エラスチンは家畜の項靱帯から抽出され、純化され、可溶性のほぼ純粋なエラスチン・パウダを生産する。
【００１９】
さらに、ＤｅｂｅｌｌｅおよびＡｌｉｘ（Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ８１：９８１−９９４，１９９９）によって記載されているような異なるエラスチン構造は、本発明にもとづいて用いられうる。これを参考としてここに組み入れる。エラスチンは、相当な量の不規則な変形β−構造を持つ球顆状トロポエラスチン単量体からなる。さらに、エラスチン構造は可動性で、水の存在によって影響を受ける。
【００２０】
異なる動物種からのエラスチンも採用されうる。エラスチンは、人間、ウシ、ブタ、ニワトリ、ヒツジ、ヤギ、カンガルー資源から得られてもよい。
ＤａｖｒｉｌおよびＨａｎによって準備されかつ記載されたもの（ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ４３：３３１−３３６，１９７４）のようなエラスチン状ペプチドが用いられてもよい。これを参考としてここに組み入れる。特に、これらブタのエラスチン状ペプチドは、ゲル濾過、電気泳動および紙クロマトグラフィーによって続くエラスターゼ、熱溶解酵素、タンパク質分解酵素によるブタの大動脈の酵素および化学的消化によってデスモシンまたはイソデスモシンを豊富にされる。
【００２１】
Ｓｍｉｔｈ等（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．８：４２２７−２４３２，１９７２）およびＭａｎｎｉｎｇ等（Ｃｏｎｎｅｃｔｉｖｅ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｒｅｓ．１３：３１３−３２２，１９８５）によって記載されているような塩可溶エラスチンも使用されうる。これらを参考としてここに組み入れる。塩可溶エラスチンは抽出、沈殿、順次遠心分離によってブタの大動脈から、またはデシル−アガロースのカラムで疎水性の相互作用クロマトグラフィーによってヒツジの血管組織から準備され、純化されうる。
【００２２】
エラスターゼの異なる濃度によって分析された薄膜のいくつかの処理が、分析された製品の顕著な劣化を導く。トリプシン、コラゲナーゼ、エラスターゼに耐性のある薄膜が、ポリエチレングリコールまたはポリエチレンオキシド／ポリブチレンテレフタレート共重合体のような完全合成物であるか、または天然の含有追加化学架橋剤であった。
【００２３】
本発明者は、エラスチンのような異なる量の足場成形タンパク質によるコラーゲン母材の培養が、母材の生分解性に影響を及ぼさずに、母材の機械的安定性を著しく増加させたことを実証した。このようにして、ある観点では、本発明は足場成形タンパク質を用いてコラーゲン母材および材料の機械的強度および安定性を増加させる方法を示唆している。これらの強化されたコラーゲン母材は、細胞（例えば、軟骨細胞）培養および移植を含めて様々な目的のために用いられてもよい。
【００２４】
本発明にもとづく適切な母材材料は、軟骨細胞のような細胞の成長および取付けを可能にしかつ軟骨細胞の自然環境に類似したシステムを提供することができる能力を有するものとして特徴付けられる。母材材料は十分な時間にわたって安定であり、完全軟骨修復を許しかつ時間を超えて再吸収または破壊されることを許す。
【００２５】
適切な母材材料は、コラーゲン、ヒアルロン酸およびその派生物、同族体、類似体；ポリ乳酸およびポリグリコール酸；ポリエチレンオキシド；それらの混合物、フィブリン；プロテオグリカン；タンパク質および砂糖を含む。
【００２６】
本発明のための母材材料は、米国特許出願第０９／４６７，５８４号、米国特許第５，２０１，７４５号、米国特許第５，８３７，２７８号、ＰＣＴ  ＷＯ９６／２５９６１号（これらのすべてを参考としてここに組み入れる。）に記載されているもののような広く受け容れられかつ記載されている方法にもとづいて、動物の皮膚、腹膜、動物の軟骨のような天然資源から準備される。
【００２７】
このような一方法においては、動物から得られた軟骨組織は、米国特許出願第０９／４６７，５８４号（これを参考としてここに組み入れる。）に記載された物理的および／または化学的処理によって可溶化される。可溶化工程は、不純物を除去しかつ固相と液相とを分離するように様々な緩衝剤による処理、遠心分離のような固相と液相との分離をする物理的処理、テロペプチド領域内のコラーゲンの架橋をその事実上非架橋アテロコラーゲン三重螺旋形体に破壊するようにタンパク質分解性酵素による処理を含む。
【００２８】
再構築によって、コラーゲンの非架橋アテロコラーゲン形体が、テロペプチド領域内にあるいくつかの残基を含めて、コラーゲン分子にそった可変領域間でその架橋を再確立する。その結果、コラーゲンはその液体またはゲル状粘稠度を喪失し、細胞が成長されるように、高度の構造一体性を持ったより剛性なものになる。
【００２９】
本発明の別の実施例においては、コラーゲン母材は、タンパク質構造を破壊しない条件の下でタンパク質の懸濁液によって母材を培養することによって準備される。母材は、周囲温度から８０℃までの範囲内の温度条件下で、４−９の範囲内のｐＨ条件下で準備される。
【００３０】
別の実施例においては、母材組成は新組合せによってつくられたＩＩ型コラーゲンから成形される。実質的に純粋な新組合せによりつくられたＩＩ型コラーゲンは、架橋されていない。しかし、それはテロペプチド領域を有することができる。一実施例においては、それは可溶性であり、フリース状構造に成形されうる。
【００３１】
本発明で使用する母材は市場から入手できる。適切であると認識されている一材料は、Ｃｈｏｎｄｒｏ−Ｃｅｌｌ（登録商標、スイスのＧｅｉｓｔｌｉｃｈ  ｕｎｔ  Ｓｏｅｈｎｅから販売されたＩＩ型コラーゲン母材パッド）である。本発明において使用されてもよい別の材料は、Ｃｈｏｎｄｒｏ−Ｇｉｄｅ（登録商標、スイスのＧｅｉｓｔｌｉｃｈ  ｕｎｔ  Ｓｏｅｈｎｅから販売されたＩ型コラーゲン母材パッド）である。本発明において使用する追加の母材は、ウシのコラーゲンＩ／ＩＩＩ母材（Ｉｍｍｅｄｅｘ，フランス）であり、組織科学研究所（ＵＫ）から入手できるＰｅｒｍａｃｏｌ（登録商標）および種々の非架橋または架橋変種のようなその他の母材、Ｏｐｏｃｒｉｎ  Ｓ．ｐ．Ａ．（イタリー）および種々の大学および研究所から入手できるＡｎｔｅｍａ（登録商標）である。一実施例においては、母材は２つの滑らかな表面、または一方が滑らかな表面で他方が粗い表面を有する。母材の滑らかな表面は組織の成長を阻止し、他方、粗い表面は細胞の内部成長を一般に促す。母材の表面特性は、米国特許出願第０９／４６７，５８４号に記載されているような減圧凍結乾燥混合物内のエタノール（１０−３０％溶液）のようなアルコールを徐々にくわえることによって変えられてもよい。
【００３２】
別の実施例においては、母材の粘稠度はフリース状であり、１またはそれを超える架橋剤によって母材を処理することによって成形される。架橋は、組成物を加熱または放射に曝すことによって達成される。母材の合成特性は変わるが、母材は好ましくは０．１−２０ｋｐの範囲、最も好ましくは１．５−５ｋｐの範囲の強度を有する。
【００３３】
一実施例においては、架橋はアルデヒド基生体適合架橋剤またはグルタルアルデヒドのような他価のアルデヒドである。また、架橋剤は支持母材およびその成分と反応する２つの成分を持った二機能剤でもある。その成分の例は、アルデヒド；ケトン；アセタール、半アセタール；フェノール樹脂系のような酸化性の結合のために入手できる成分；フラボイドのようなキノン；カルボキシル系；活性カルボキシル酸である。また、エチル−ジメチル−アミノプロピルカルボジミド（ＥＣＤ）が架橋剤として使用されてもよい。好適架橋剤は、ビオフラボノイドまたはシアンイダノールのような２つのアルデヒド系を含有する化合物（ＩＩ型コラーゲン上のリシン残基を結合することによって架橋を促進する。）である。使用されるべき架橋剤の型は、母材の粘稠度および物理的特性に関する効果ならびに母材と細胞とが移植されるべき身体の領域との生理学的な相溶性を評価することによって決定される。
【００３４】
用語「タンパク質足場」によって、それは構造タンパク質からなる三次元孔質構造のような内部結合繊維組織支持構造を意味する。本発明のための許容できる足場成形タンパク質の例は、可溶性または非可溶性の形体にあるエラスチンまたはエラスチン状ペプチドのような疎水性の非グリコシル化タンパク質を含む。エラスチン状ペプチドは、膵臓の痰（ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｓｐｕｔｕｍ）のような異なる型のエラスターゼによってエラスチンまたは可溶性エラスチンの部分的消耗加水分解によって絶縁されたペプチドを含む。本発明の一実施例においては、本発明にもとづくタンパク質強化母材は、軟骨損傷のような傷害または欠陥の修復のために動物に移植する移植可能物品を成形するように成長された細胞（軟骨細胞）を有する。
【００３５】
自系または同族でもよい軟骨細胞は、関節の軟骨欠陥の治療に使用するためにタンパク質強化母材に培養されおよび／または保持される。軟骨細胞は、標準の皿内で支持母材に直接に成長されるか、および／または使用前に母材に装填される。使用のさいには、軟骨細胞装填タンパク質強化母材、すなわち本発明にもとづく移植可能な物品は、関節鏡をかいしてまたは最小限の侵襲もしくは切開関節外科技術によって関節内に誘導されるのが好ましい。本発明の移植方法は、軟骨欠陥の修復のために適切な他生の外因性軟骨細胞の使用を意図している。
【００３６】
細胞装填強化母材は、移植のための様々な設置および固定素子を用いて、身体欠陥または損傷の作用もしくは刺激修復のための様々なその他の技術に組み入れられる。これらの技術および素子のあるものは、Ｂｅｈｒｅｎｓ等による１９９９年８月１３日出願の米国特許出願第０９／３７３，９５２号、発明の名称「軟骨細胞移植のための方法、器具、および材料」、１９９８年８月１４日出願の米国特許仮出願第６０／０９６，５９７号、１９９９年８月２日出願の米国特許仮出願第６０／１４６，６８３号に示されている。これらのすべての記載が参考としてここに組み入れられる。
【００３７】
このようにして、本発明は、関節軟骨および骨の欠陥、ならびに靱帯、半月板、脊椎骨円板の欠陥の有効な修復または治療のための方法およびシステムを教示する。これらの方法およびシステムは、軟骨細胞のような細胞と共に、本発明のタンパク質強化母材からなる移植可能物品の使用を含む。
【００３８】
これらの目的のために、本発明の強化母材は、それが長期間意図した目的のために操作されるために安定した形体を保持するように、十分な物理的一体性を有している。この強度は、移植前後に強化母材上に細胞を成長させ、細胞成長分化を最適にするように細胞の自然環境に類似したシステムを提供する。時間経過、多分２、３箇月以内に、強化母材はいかなる顕著な痕も残さず、有害な劣化物をも生成せずに、移植を受ける患者の身体に再吸収されることを期待される。「再吸収」という用語は、強化母材が天然生体過程によって破壊される過程を含み、その破壊された強化母材および劣化物は、例えば、リンパ系または血管をかいして排出される。
【００３９】
［一般実施例］
一実施例においては、本発明の強化母材が下記の方法によって準備される。コラーゲン薄膜の約１ｃｍ2の各細片６つが、リン酸緩衝液のような適切な緩衝剤中に０．１ｍｇ／１００ｍｌから１００ｇ／１００ｍｌまでの範囲にあるタンパク質懸濁液で培養される。薄膜中のタンパク質の最終濃度は、０．１ｍｇ／１００ｇと５０ｇ／１００ｇとの間にある。本発明で使用するタンパク質は、ＥＰＣ，Ｉｎｃ．（ＵＳＡ）から入手できる。特に下記の製品番号で販売されている。それらは、Ｅ６０、ＥＳ６０、Ｆ６５、Ｅ６１、ＥＳ６１、Ｅ７０、ＥＳ７０、ＳＢ７７、ＳＢ８７、ＳＰ４６、ＳＣ５５、ＭＴ６５、ＭＥ１５、ＬＫ２１５、ＫＥ５７、Ｋ２６７、ＥＳ１２、ＴＢ８７２、ＡＥ１７、ＢＥ７３、ＲＡ５０、ＭＴ６０、ＳＨ４７６、ＨＡ５８７、ＨＳ３９５、ＨＬ４５７、ＨＴ７５４である。好適実施例においては、リン酸緩衝液はＫＨ2ＰＯ4である。混合のための許容ｐＨの範囲は、約４．０と９．０との間である。
【００４０】
エラスチンのような足場タンパク質の懸濁液、コロイド状分散液または溶液によって、異なる緩衝剤（例えば、０．１％ＮａＮ3による０．２ｍトリスｐＨ８．８または０．０２Ｍ  ＫＨ2ＰＯ4、ｐＨ７．４）において、０．５ｍｇ／ｍｌと１００ｍｇ／ｍｌとの間のタンパク質濃度、１℃と１０２℃との間の温度で、培養が実施される。
【００４１】
上記の混合物は、０．０５−８０時間、好ましくは約２−８時間、浸透のようなコアセルベートにするか、培養するか、混合することを許される。
懸濁液は、固体を得るために減圧凍結乾燥される。減圧凍結乾燥の許容温度範囲は、約２０℃と約６０℃との間、好ましくは約２５℃で、約０．０１−１０ｍｂａｒの圧力である。減圧凍結乾燥は、１０−２０ｍｌの蒸留水のような水溶液に製品を浸透させた後に、繰り返されてもよい。使用される水の量は、減圧凍結乾燥コラーゲン・ペレットのサイズによって決まる。
【００４２】
減圧凍結乾燥はフリース状母材を生産し、それが移植物品として細胞と共に使用するためのシートに機械的に圧縮される。フリース状材料は、１分から４８時間の期間、５００−１０００グラムの圧力で、好ましくは７５０グラムの圧力で圧縮される。母材のための適切な圧縮機械は、移植された結合材料と共に２つの非粗面ステンレス鋼片を含む。材料は、取扱のさいに裂け難いシート状材料が得られるまで、圧縮される。
【００４３】
図１、２は、２つの部品の形体になった乳鉢１０と乳棒１２とに類似した例示圧縮装置を示す。この実施例においては、圧縮装置は、ステンレス鋼乳棒状スタンプが正確に嵌合する直径約２．５ｃｍの乳鉢状容器を持つステンレス鋼容器である。母材は、乳鉢状部品に入れられ、乳棒状スタンプが開口１４に挿入されて機械的圧力を母材に与える。圧縮装置は、母材に連続的に圧力を与えるのに十分な重量を持った適切な装置である。圧縮装置は、好ましくはステンレス鋼からつくられる。しかし、金属およびその他の材料（例えば、プラスチック、ガラス、セラミック）が用いられてもよい。
【００４４】
成長した軟骨細胞のような細胞を選択的に持った本発明にもとづく強化母材の機械的強度は、強化材料と接触したときの軟骨細胞の挙動を研究するために生体外システムを用いることによって試験される。軟骨細胞接種強化母材の強度は、軟骨細胞接種市販母材に対抗して試験された。特に、図３に示す装置は、接種軟骨細胞母材の機械的強度を測定するのに好適な方法である。使用にさいしては、本発明にもとづいて製造された強化母材２６は、２つの滑らかなクランプ１６、１８に取り付けられる。クランプ１８は不動面２０に取り付けられる。目定めされたキャリパ２２（Ｅｒｉｃｓｅｎ、モデル番号３９１−１００ＩＩ）がクランプ１６に取り付けられる。キャリパ２２は、少なくとも０−１０ｋｐの範囲において機械的抵抗の測定を表示する表示ダイアル２４を含む。本発明にもとづく強化母材２６の機械的強度は、キャリパ２２に引張り力を加え、引裂きまたは破壊する前に維持している強化母材の機械的抵抗のレベルを観測することによって得られる。この生体外方法は、母材の機械的破壊点を試験し、関節鏡手続に機械的に耐える特定材料の能力を示す。
【００４５】
好適実施例においては、軟骨細胞は１またはそれを超える適切な緩衝剤を含有しかつ３７℃の培養器において約５−７．５％自系血清の培養媒体で成長される。適当な時間経過後（例えば、１−１４日）、細胞は培養から取り出され、強化母材の上面に細胞を直接置く前に生活能力について評価され、細胞培養トレイの表面に分散される。強化母材は、上述したような強度特性を試験される。
【００４６】
本発明の特定の観点は、下記の実施例によって示されるように、より良く理解されるであろう。その実施例は例示であって、制限するものではない。
【実施例１】
【００４７】
軟骨細胞がＨＡＭＦ１２、１５ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ緩衝剤および３７℃のＣＯ2培養器内の５−７．５％自系血清を含有する最少必須媒体中で成長され、コペンハーゲンＤＫのＶｅｒｉｇｅｎ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅ  ＡｐＳにおいてクラス１００研究所で取り扱われた。培養媒体の他の組成が、軟骨細胞を培養するために用いられてもよい。
【００４８】
細胞は、５−１０分間トリプシンＥＤＴＡを用いて消化され、Ｂｕｅｒｋｅｒ−Ｔｕｅｒｋチャンバにおいて染色するＴｒｙｐａｎ  Ｂｌｕｅ生存能力を用いて計数された。細胞数は、７．５×１０5細胞毎ｍｌに調節された。１つのＮＵＮＣＬＯＮ（登録商標）板が、クラス１００研究所において剥がされた。
【００４９】
市場で入手できるコラーゲンＩ／ＩＩＩフリース（Ｃｈｏｎｄｒｏ−Ｇｉｄｅ（登録商標）、Ｇｅｉｓｔｌｉｃｈ、ＣＨ）の各１ｃｍ2サイズの６つの試片が、無菌状態の下で、ＮＵＮＣＬＯＮ（登録商標）細胞培養トレイの水溜めの底に置かれた。
【００５０】
５ｍｌの培養媒体にある約５×１０6の軟骨細胞が坦体材料の上面に直接置かれ、その表面上に分散された。板がＣＯ2培養器内に３７℃で３日間培養された。この期間経過後に、軟骨細胞が房状に配置され、坦体上で成長を開始した。軟骨細胞は、坦体を媒体で洗浄することによって、または緩い圧力を母材に機械的に発生させることによってさえも、坦体から取り除かれることはできなかった。培養期間の終了時に、媒体は傾瀉された。
【００５１】
接種された薄膜の機械的耐性が、フリースの機械的破壊点を試験するために、図３に示すような目定めされたキャリパを用いて、標準条件の下で手動試験をされた。この実施例では、薄膜の破壊は、５．４ｋｐの平均牽引力で起きた。
【００５２】
残りの試片は、ジメチルアルシン酸の０．１Ｍナブタラムを含有する低温冷凍された２．５％グルタルアルデヒドによって培養された。母材は組織構造学的評価のためにＳａｆｒａｎｉｎ  Ｏによって染色された。
【００５３】
この実験において測定された破壊牽引力は、後述するその他の実験との比較のための基礎線として考慮された。
【実施例２】
【００５４】
軟骨細胞がＨＡＭＦ１２、１５ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ緩衝剤および３７℃のＣＯ2培養器内の５−７．５％自系血清を含有する最少必須媒体中で成長され、コペンハーゲンＤＫのＶｅｒｉｇｅｎ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅ  ＡｐＳにおいてクラス１００研究所で取り扱われた。培養媒体の他の組成が、軟骨細胞を培養するために用いられてもよい。
【００５５】
細胞は、５−１０分間トリプシンＥＤＴＡを用いて消化され、Ｂｕｅｒｋｅｒ−Ｔｕｅｒｋチャンバにおいて染色するＴｒｙｐａｎ  Ｂｌｕｅ生存能力を用いて計数された。細胞数は、７．５×１０5細胞毎ｍｌに調節された。１つのＮＵＮＣＬＯＮ（登録商標）板が、クラス１００研究所において剥がされた。
【００５６】
コラーゲンＩ／ＩＩＩ母材（Ｉｍｍｅｄｅｘ、フランス）の各１ｃｍ2サイズの６つの試片が、ＮＵＮＣＬＯＮ（登録商標）細胞培養トレイの水溜めの底に嵌合するのに適したサイズに切断され、無菌状態の下で水溜めの底に置かれた。
【００５７】
５ｍｌの培養媒体にある約５×１０5の軟骨細胞が坦体材料の上面に直接置かれ、その表面上に分散された。板がＣＯ2培養器内に３７℃で３日間培養された。培養期間の終了時に、媒体は傾瀉された。
【００５８】
接種された薄膜の機械的耐性が、フリースの機械的破壊点を試験するために、図３に示すような目定めされたキャリパを用いて、標準条件の下で手動試験をされた。この実施例では、薄膜の破壊は、０．３ｋｐの平均牽引力で起きた。機械的耐性は、関節鏡外科目的に適していないこの材料をつくるＣｈｏｎｄｒｏ−Ｇｉｄｅ（登録商標）に比較して非常に低かった。
【００５９】
残りの試片は、固定液として加えられたジメチルアルシン酸の０．１Ｍナブタラムを含有する低温冷凍された２．５％グルタルアルデヒドによって培養された。母材は組織構造学的評価のためにＳａｆｒａｎｉｎ  Ｏによって染色された。
【実施例３】
【００６０】
実施例２におけるコラーゲンＩ／ＩＩＩ母材の各１ｃｍ2サイズである６つの試片がリン酸塩緩衝剤（０．０２Ｍ  ＫＨ2ＰＯ4  ｐＨ７．４）のような適切な緩衝剤中の可溶性エラスチン溶液（ＥＰＣ  Ｉｎｃ．  ＵＳＡ）によって緩やかな攪拌の下で２時間、温度５０℃で培養された。ｐＨは、緩やかな攪拌の下で無菌酸を加えることによって５．０まで落とされた。コアセルベーション反応は、５時間起こることを許された。
【００６１】
懸濁液は、２５℃の温度、０．０５ｍｂａｒの圧力で減圧凍結乾燥された。
減圧凍結乾燥は、図１、２に示す装置を用いて移植物品として細胞と共に使用するシート状に機械的に圧縮されたフリース状材料を生産した。取扱中に引裂きし難いシート状材料が得られるまで、材料は２４時間圧縮された。
【００６２】
フリース母材の各１ｃｍ2サイズの６試片が、ＮＵＮＣＬＯＮ（登録商標）細胞培養トレイの水溜めの底に嵌合するのに適したサイズに切断され、無菌状態の下で水溜めの底に置かれた。
【００６３】
５ｍｌの培養媒体にある約５×１０5の軟骨細胞が坦体材料の上面に直接置かれ、その表面上に分散された。板がＣＯ2培養器内に３７℃で３日間培養された。培養期間の終了時に、媒体は傾瀉された。
【００６４】
接種された薄膜の機械的耐性が、フリースの強度を試験するために、図３に示すような目定めされたキャリパを用いて、標準条件の下で手動試験をされた。この実施例では、薄膜の破壊は、４．８ｋｐの平均牽引力で起きた。機械的耐性は、関節鏡外科目的に適しているこの材料をつくるＣｈｏｎｄｒｏ−Ｇｉｄｅ（登録商標）に匹敵できた。
【００６５】
残りの試片は、固定液として加えられたジメチルアルシン酸の０．１Ｍナブタラムを含有する低温冷凍された２．５％グルタルアルデヒドによって培養された。母材は組織構造学的評価のためにＳａｆｒａｎｉｎ  Ｏによって染色された。
【実施例４】
【００６６】
コラーゲンＩＩ薄膜（米国特許出願第０９／４６７，５８４号にもとづいてつくられた）の各１ｃｍ2サイズの６試片が、リン酸塩緩衝剤（０．０２Ｍ  ＫＨ2ＰＯ4  ｐＨ７．４）のような適切な緩衝剤中の０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘおよび０．０１％ＮａＮ3によって２０ｍｇ／ｍｌの超微粉砕された可溶性エラスチンの懸濁液を処理することによって、可溶性エラスチン（ＥＰＣ  Ｉｎｃ．  ＵＳＡ）水懸濁液によって緩い攪拌を伴って５０℃で培養された。ｐＨは、緩やかな攪拌の下で無菌酸を加えることによって５．０まで落とされた。コアセルベーション反応は、５時間起こることを許された。
【００６７】
懸濁液は減圧凍結乾燥された。減圧凍結乾燥は、約２０℃と６０℃との間、好ましくは約２５℃の温度、約０．０５ｍｂａｒの圧力で、１０−２０ｍｌの蒸留水（減圧凍結乾燥されたコラーゲン・ペレットのサイズによって決まる）のような水溶液によって再浸透させた後に繰り返された。減圧凍結乾燥は、図１に示す装置を用いて、移植物品として細胞と共に使用するためにシート状に機械的に圧縮されたフリース状材料をつくった。追加の作業工程は、実施例２において上述したように、同様に行われた。
【００６８】
接種された薄膜の機械的耐性が、フリースの機械的破壊点を試験するために、図３に示すような目定めされたキャリパを用いて、標準条件の下で手動試験をされた。この実施例では、薄膜の破壊は、４．１ｋｐの平均牽引力で起きた。機械的耐性は、Ｃｈｏｎｄｒｏ−Ｇｉｄｅ（登録商標）に匹敵し、したがって、関節鏡外科目的に適しているこの材料をつくる。
【００６９】
残りの試片は、固定液として加えられたジメチルアルシン酸の０．１Ｍナブタラムを含有する低温冷凍された２．５％グルタルアルデヒドによって培養された。母材は組織構造学的評価のためにＳａｆｒａｎｉｎ  Ｏによって染色された。
【実施例５】
【００７０】
実施例２の同じ材料の各１ｃｍ2サイズの６試片が、リン酸塩緩衝剤（０．０２Ｍ  ＫＨ2ＰＯ4  ｐＨ７．４）のような適切な緩衝剤中の可溶性エラスチン（ＥＰＣ  Ｉｎｃ．  ＵＳＡ）から１−２００ｍｇ／ｍｌの濃度で可溶性エラスチン状ペプチド（例えば、エラスチン・ペプチドＣＢ５７３、ＱＰ４５、ＲＹ５３）の水溶液によって培養され、緩やかな攪拌の下で４時間、５０℃まで加熱された。懸濁液は４０℃から０℃まで冷却され、減圧凍結乾燥された。減圧凍結乾燥は、約２０℃と約６０℃との間、好ましくは約２５℃の温度、約０．０５ｍｂａｒの圧力で、１０−２０ｍｌの蒸留水（減圧凍結乾燥されたコラーゲン・ペレットのサイズによって決まる）のような水溶液によって再浸透させた後に繰り返された。減圧凍結乾燥は、移植物品として細胞と共に使用するためにシート状に機械的に圧縮されたフリース状材料をつくった。
【００７１】
製造された材料のシートは、図３に示すような目定めされたキャリパによって引裂き抵抗を試験された。薄膜が、その一方の面に取り付けられた目定めされたキャリパによってフレームに固定された。張力が、キャリパを引っ張ることによって薄膜に加えられた。張力は、認定されたゲージによって連続的に記録された。引裂きが起こった張力が記録された。その張力は、減圧凍結乾燥条件、加えられたエラスチンまたはエラスチン状ペプチドの量および特性にもとづいて、３ｋｐと１２ｋｐとの間にあるように検出された。市場で入手できるコラーゲンＩ／ＩＩＩ薄膜（Ｇｅｉｓｔｌｉｃｈ  ＣＨまたはＴｉｓｓｕｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  ＵＫ）が１ｋｐと６ｋｐとの間で引き裂かれた。
【００７２】
要約すれば、表１に示すように、実施例３、４、５のタンパク質強化母材は、Ｃｈｏｎｄｒｏ−Ｇｉｄｅ（登録商標）に匹敵する機械的耐性を示し、タンパク質で強化されていない実施例２の母材よりも高い機械的耐性を示した。
【００７３】
【表１】
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【図面の簡単な説明】
【００７４】
【図１】強化母材をシート状形体に成形する本発明にもとづく代表的圧縮装置を示す。
【図２】図１に示す代表的圧縮装置の２つの構成要素を示す。
【図３】本発明にもとづく強化母材の機械的強度を測定する装置を示す。
【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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