(57)【要約】組成物、試薬試験片、分析物検出システムおよびこれらのキット、並びに、サンプル中の分析物の検出におけるこれらの使用方法を提供する。本発明の組成物は正に荷電されている多孔質基材および当該基材の少なくとも１個の表面上における尿素誘導体色素を特徴としており、多くの好ましい実施形態において、上記尿素誘導体色素は負に荷電されている尿素誘導体色素である。また、多くの好ましい実施形態において、本発明の組成物は、例えば、分析物のオキシダーゼおよび／またはペルオキシダーゼのような、過酸化物生成性の信号生成システムにおける少なくとも１種類の付加的な試薬要素をさらに含有している。本発明の組成物、試験片、分析物検出システムおよびキットは、例えば、血液またはそのフラクション等の、生理学的サンプルのようなサンプル中の多様な分析物の検出において有用であることが分かっている。
2004503760.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
物質の組成物において、
正に荷電されている多孔質基材と、
前記基材の少なくとも１個の表面上における一定の尿素誘導体色素を含有している組成物。
【請求項２】
前記正に荷電されている多孔質基材がナイロンにより構成されている請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記尿素誘導体色素が負に荷電されている尿素誘導体色素である請求項１または請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
前記尿素誘導体色素が以下の化学式を有する請求項１，２または請求項３に記載の組成物。
Ｒ１ Ｒ２ ＮＣＯＮＨＲ３
この式において、一体の形態のＲ１ ，Ｒ２ はＮ，Ｎ−二置換型のアミノアリールであり、Ｒ３ はカルボキシアルキル、アルコキシカルボニル、アルキルカルボニル、アリールスルホニル、スルホアリールおよびカルボキシアリールから成る群から選択される。
【請求項５】
前記尿素誘導体色素がフェノチアジン誘導体色素、フェノキサジン誘導体色素およびジフェニルアミン誘導体色素から成る群から選択される請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
前記尿素誘導体色素が前記基材において存在している過酸化物生成性の信号生成システムにおける一定の要素である請求項１乃至請求項５のいずれかに記載の組成物。
【請求項７】
前記組成物がさらに過酸化物生成性の信号生成システムにおける少なくとも１種類の付加的な試薬要素を含有している請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
前記少なくとも１種類の付加的な試薬要素が分析物オキシダーゼである請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
前記少なくとも１種類の付加的な試薬要素がペルオキシダーゼである請求項７に記載の組成物。
【請求項１０】
前記ペルオキシダーゼがホースラディッシュ・ペルオキシダーゼである請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
前記尿素誘導体色素が１０−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−３，７−ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジンまたはその塩である請求項１乃至請求項１０のいずれかに記載の組成物。
【請求項１２】
生理学的サンプル中の分析物の存在の検出または濃度の決定において使用するための試薬試験片において、請求項１乃至請求項１１のいずれかに記載の組成物を含む試薬試験片。
【請求項１３】
分析物の検出または測定のシステムにおいて、
（ａ）請求項１２に記載の試薬試験片と、
（ｂ）一定の自動化計器を備えているシステム。
【請求項１４】
サンプル中の分析物の存在の検出または濃度の決定のための方法において、
（ａ）生理学的サンプルを請求項１２に記載の試薬試験片に供給する工程と、
（ｂ）前記信号生成システムにより生成される信号を検出する工程と、
（ｃ）前記検出した信号を前記生理学的サンプル中の分析物の存在または濃度に関連付ける工程を含む方法。
【請求項１５】
生理学的サンプル中の分析物の濃度の決定において使用するためのキットにおいて、
（ａ）請求項１２に記載の試薬試験片と、
（ｂ）（ｉ）前記生理学的サンプルを入手するための手段、および
（ｉｉ）一定の分析物の標準物、の少なくとも一方を備えているキット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明の分野は分析物の検出であり、特に分析物の検出において使用するための試薬システムである。
【０００２】
発明の背景
血液または血液誘導型の生成物等の生理学的流体における分析物検出は今日の社会に対してその重要性を常に高めつつある。分析物検出のアッセイは臨床実験室的試験、家庭用試験等を含む種々の用途において有用であることが認識されており、この場合のこのような試験の各結果は種々の病状における診断および管理において傑出した役割を果たしている。関連の分析物はグルコース、アルコール、ホルムアルデヒド、Ｌ−グルタミン酸、グリセロール、ガラクトース、グリケート化タンパク質、クレアチン、ケトン体、アスコルビン酸、乳酸、ロイシン、リンゴ酸、ピルビン酸および尿酸、各種ステロイド等を含む。このように高まりつつある分析物検出の重要性に応じて、臨床用および家庭用の両方における種々の分析物検出のプロトコルおよび装置がこれまでに開発されている。
【０００３】
現在までに開発されている上記のプロトコルおよび装置の多くは血液等の生理学的サンプル中における関連の分析物の存在を確認するための一定の信号生成システムを採用している。種々の異なる分析物の検出において有用であることが知られている信号生成システムの一例はオキシダーゼまたはペルオキシダーゼの酵素が関連の分析物を酸化して過酸化水素を生成するシステムである。その後、この過酸化水素は次の色素基質に対する酵素触媒作用による反応により一定の検出可能な色素形成性の生成物を生成することにより検出される。このような信号生成システムにおいて有用な色素は一般に高い感度を有する可視の色信号を生じる。
【０００４】
種々の高感度の色素は一般的に過酸化物生成性の信号生成システムにおいて用いられている。しかしながら、尿素誘導体色素等の多くの高感度の色素は固相および／または液相中におけるそれぞれの安定性（例えば、酸化、光に対する安定性）による制限がある。
【０００５】
高感度の色素を含有している各種組成物がこれまでに開発されているが、これらの組成物のさらなる開発が要望され続けている。例えば、高感度の尿素誘導体色素を含み、酸化に対する耐性を有している固相の組成物が極めて重要になると考えられる。
【０００６】
関連の文献
関連の文献は特公平１１１８７６８号（ＪＰ １１１８７６８）、特公平９０１９２９６号（ＪＰ ９０１９２９６）、欧州特許第３８２０５号、同第１２４２８７号および同第２５１２９７号を含む。また、ヤギ（Ｙａｇｉ）他，（１９８６年），バイオケム．アイ・エヌ・ティー．（Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｉｎｔ．），１２巻，３６７頁乃至３７１頁も参照されたい。
【０００７】
発明の概要
組成物、試薬試験片、分析物検出システムおよびこれらのキット、並びに、サンプル中の分析物の検出におけるこれらの使用方法を提供する。本発明の組成物は正に荷電されている多孔質基材および当該基材の少なくとも１個の表面における尿素誘導体色素を有することを特徴としており、この場合の多くの好ましい実施形態において、上記尿素誘導体色素は負に荷電されている尿素誘導体色素である。多くの好ましい実施形態において、本発明の組成物はさらに、例えば、分析物のオキシダーゼおよび／またはペルオキシダーゼ等の、信号生成システムを生成するペルオキシダーゼの少なくとも１種類の付加的な試薬要素を含有している。本発明の組成物、試験片、分析物検出システムおよびキットは、例えば、血液または血液のフラクション等の、生理学的サンプルのようなサンプル中における多様な分析物の検出において有用であることが分かっている。
【０００８】
好ましい実施形態の説明
組成物、試薬試験片、分析物検出システムおよびこれらのキット、並びに、サンプル中の分析物の検出におけるこれらの使用方法を提供する。本発明の組成物は正に荷電されている多孔質基材および当該基材の少なくとも１個の表面における尿素誘導体色素を有することを特徴としており、この場合の多くの好ましい実施形態において、上記尿素誘導体色素は負に荷電されている尿素誘導体色素である。多くの好ましい実施形態において、本発明の組成物はさらに、例えば、分析物のオキシダーゼおよび／またはペルオキシダーゼ等の、信号生成システムを生成するペルオキシダーゼの少なくとも１種類の付加的な試薬要素を含有している。本発明の組成物、試験片、分析物検出システムおよびキットは、例えば、血液または血液のフラクション等の、生理学的サンプルのようなサンプル中における多様な分析物の検出において有用であることが分かっている。本発明のさらに詳細な説明において、本発明の組成物を先ず説明し、次に当該組成物が有用であることが分かっている代表的な適用方法を説明し、さらに本発明の組成物を備えているシステムおよびキットを説明する。
【０００９】
本発明をさらに詳細に説明する前に、本発明が以下において説明されている本発明の特定の各実施形態に限定されないこと、すなわち、これら特定の各実施形態の変更例が作成可能であり、本明細書において記載されている特許請求の範囲に依然として含まれることが当然に理解されると考える。また、使用されている技術用語が特定の各実施形態の説明を目的としていて、これらを限定することを目的としていないことも当然に理解されると考える。その代わりに、本発明の範囲は本明細書に記載されている特許請求の範囲により確立される。
【００１０】
本明細書および本明細書において記載されている特許請求の範囲において、その内容が特別に明示しない限り、単一的な言及が複数的な言及を含む場合がある。特別に定めない限り、本明細書において用いられている全ての技術的および科学的な用語は本発明が属する技術分野における通常の熟練者において一般的に理解されている意味と同一の意味を有する。
【００１１】
組成物および試薬試験片
上記において概説したように、本発明はサンプル中における多様な分析物の検出において使用するための組成物を提供する。これらの組成物は正に荷電されている多孔質基材および当該基材の少なくとも１個の表面上の尿素誘導体色素を含む。しかしながら、多くの実施形態において、上記組成物はさらに過酸化物生成性の信号生成システムの少なくとも１種類の付加的な試薬要素を含み、さらに一般的に複数の信号生成システムの要素を含む。また、上記試薬組成物は、一般的に試薬試験片において見られるような、乾燥状態の組成物である。特に、本発明は、例えば、グルコース、アルコール、グリケート化タンパク質等の、全血中における特定の分析物についてのアッセイのための試験片を提供する。最も広い意味において、この試薬試験片は正に荷電されている多孔質基材および当該基材上に存在している過酸化物生成性の信号生成システムを備えており、このシステムは一定の尿素誘導体色素を含有している。多くの実施形態において、上記基材上に存在している信号生成システムは分析物酸化性の酵素をさらに含有している。次に、上記の各要素をさらに詳細に説明する。
【００１２】
正に荷電されている多孔質基材
上記本発明の試験片において用いられている基材は不活性な多孔質基材であり、この基材は以下において説明されているような信号生成システムにおける種々の要素のための支持体を提供していて、一定の正電荷を有している。この基材は、例えば、血液等の生理学的サンプルの供給のための場所を提供して、上記信号生成システムの色素により生成される色素形成性の生成物の検出を行なうように構成されている。従って、この基材はその中における水性流体の流れの透過を可能にして上記信号生成システムの化学的反応が生じるために十分な気孔空間を提供する物質である。種々の分析物検出アッセイにおいて使用するために多数の異なる正に荷電されている多孔質基材が開発されており、これらの基材はその材料、気孔の大きさ、各寸法等の点で異なる可能性があり、この場合の代表的な基材は米国特許第５，９３２，４３１号、同第５，８７４，０９９号、同第５，８７１，７６７号、同第５，８６９，０７７号、同第５，８６６，３２２号、同第５，８３４，００１号、同第５，８００，８２９号、同第５，８００，８２８号、同第５，７９８，１１３号、同第５，６７０，３８１号、同第５，６６３，０５４号、同第５，４５９，０８０号、同第５，４５９，０７８号、同第５，４４１，８９４号および同第５，２１２，０６１号において記載されている物を含み、これらの開示は本明細書に参考文献として含まれる。上記試験片の各寸法および多孔質度は大幅に変更可能であり、この場合の基材は、例えば、サンプル供給領域またはその近くにおいて比較的に大きな気孔を有しており、検出領域において比較的に小さな気孔を有しているような、一定の多孔質度の勾配を有していてもいなくてもよい。また、正に荷電している膜はポリアミドのような正に荷電しているポリマーの使用により調製できる。あるいは、このような膜はカチオン性の界面活性剤またはポリマーによる表面被覆処理のような種々の技法により調製することも可能である。この被膜は浸漬塗布、化学的処理、写真技法、プラズマ重合化などにより供給できる。さらに別の実施形態において、上記膜は１種類以上の正に荷電した材料を膜形成性ポリマーと共に混合することにより調製できる。正に荷電したポリマーの例はポリアミド、ポリ（ビニル・ピリジン）、ポリ（ビニル・イミダゾール）、ポリ（アリルアミン）、ポリ（塩化ビニル・ベンジルジメチル・アンモニウム）、ポリリジンである。また、カチオン性の界面活性剤の例は第一級、第二級および第四級のアミノ基を有する界面活性剤を含む。この材料は以下において詳述されている信号生成システムの種々の要素に対して共役的または非共役的な結合を行なうために官能基化されていてもいなくてもよい。
【００１３】
多くの実施形態において、上記基材は膜状の試験パッドとして構成されていて、固形の支持体に固定されており、この場合の支持体はプラスチック（例えば、ポリスチレン、ナイロンまたはポリエステル）または金属シートまたは当業界において知られているその他の任意の適当な材料とすることができる。多くの実施形態において関連していることは米国特許第５，９７２，２９４号、同第５，９６８，８３６号、同第５，９６８，７６０号、同第５，９０２，７３１号、同第５，８４６，４８６号、同第５，８４３，６９２号、同第５，８４３，６９１号、同第５，７８９，２５５号、同第５，７８０，３０４号、同第５，７５３，４５２号、同第５，７５３，４２９号、同第５，７３６，１０３号、同第５，７１９，０３４号、同第５，７１４，１２３号、同第３８３，５５０号、同第３８１，５９１号、同第５，６２０，８６３号、同第５，６０５，８３７号、同第５，５６３，０４２号、同第５，５２６，１２０号、同第５，５１５，１７０号、同第３６７，１０９号、同第５，４５３，３６０号、同第５，４２６，０３２号、同第５，４１８，１４２号、同第５，３０６，６２３号、同第５，３０４，４６８号、同第５，１７９，００５号、同第５，０５９，３９４号、同第５，０４９，４８７号、同第４，９３５，３４６号、同第４，９００，６６６号および同第４，７３４，３６０号において開示されている各試験片の構成であり、これらの開示はそれぞれ本明細書に参考文献として含まれる。
【００１４】
信号生成システム
上記正に荷電されている多孔質基材に加えて、本発明の試験片はさらに一定の信号生成システムにおける１種類以上の要素を含み、この信号生成システムは分析物の存在に応答して一定の検出可能な生成物を生成し、この検出可能な生成物はアッセイ処理されるサンプル中に存在している分析物の量を導出するために使用できる。本発明の試験片において、上記信号生成システムにおける１種類以上の要素は上記正に荷電されている多孔質基材の少なくとも一部分（すなわち、検出領域）、さらに多くの実施形態において、当該正に荷電されている多孔質基材の実質的に全部に付随して、例えば、共役的または非共役的に結合する。
【００１５】
上記信号生成システムは分析物酸化性の信号生成システムである。この分析物酸化性の信号生成システムとは、サンプル中の分析物濃度を導出するための検出可能な信号を発生する場合に、この分析物が適当な酵素により酸化されて当該分析物の酸化された形態が生成されると共にこれに対応または比例する量の過酸化水素が生じることを意味する。その後、この過酸化水素はさらに１種類以上の指示薬化合物から上記検出可能な生成物を生成するために用いられ、この場合の信号生成システムにより生成される検出可能な生成物の量、すなわち、信号がその後において初期のサンプル中の分析物の量に関連付けられる。従って、この分析物酸化性の信号生成システムは過酸化水素に基づく信号生成システムまたは過酸化物生成性の信号生成システムとして公正に特徴付けることもできる。
【００１６】
上記において示したように、上記過酸化水素に基づく信号生成システムは上記分析物を酸化して対応する量の過酸化水素を生成する一定の酵素を含み、この場合の対応する量とは、上記生成される過酸化水素の量がサンプル中に存在している分析物の量に比例することを意味する。この第１の酵素の特異的な性質はアッセイ処理される分析物の性質により必然的に決まるが、一般にオキシダーゼである。従って、この酵素はグルコース・オキシダーゼ（分析物がグルコースの場合）、コレステロール・オキシダーゼ（分析物がコレステロールの場合）、アルコール・オキシダーゼ（分析物がアルコールの場合）、ホルムアルデヒド・デヒドロゲナーゼ（分析物がホルムアルデヒドの場合）、グルタメート・オキシダーゼ（分析物がＬ−グルタミン酸である場合）、グリセロール・オキシダーゼ（分析物がグリセロールである場合）、ガラクトース・オキシダーゼ（分析物がガラクトースである場合）、ケトアミン・オキシダーゼ（分析物がグリケート化タンパク質、例えば、フルクトースアミンである場合）、３−ヒドロキシブチレート・デヒドロゲナーゼ（分析物がケトン体である場合）、Ｌ−アスコルベート・オキシダーゼ（分析物がアスコルビン酸である場合）、ラクテート・オキシダーゼ（分析物が乳酸である場合）、ロイシン・オキシダーゼ（分析物がロイシンである場合）、マレート・オキシダーゼ（分析物がリンゴ酸である場合）、ピルベート・オキシダーゼ（分析物がピルビン酸である場合）、ウレート・オキシダーゼ（分析物が尿酸オキシダーゼである場合）等とすることができる。さらに、上記および上記以外の関連の分析物に対して使用するための別の酸化性酵素が当該技術分野における熟練者において知られており、これらもまた使用可能である。
【００１７】
上記信号生成システムは過酸化水素の存在下における一定の色素基質の一定の検出可能な生成物への変換において触媒作用する一定の酵素を含み、この場合の上記反応により生成される検出可能な生成物の量は存在している過酸化水素の量に比例する。この第２の酵素は一般にペルオキシダーゼであり、この場合の適当なペルオキシダーゼはホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、ソイ・ペルオキシダーゼ、遺伝子組換えにより生成したペルオキシダーゼおよび過酸化物的作用を有する合成類似体等を含む。例えば、サイ（Ｃｉ）他，（１９９０年），アナリティカ・キミカ・アクタ（Ａｎａｌｙｔｉｃａ Ｃｈｉｍｉｃａ Ａｃｔａ），２３３巻、２９９頁乃至３０２頁を参照されたい。
【００１８】
上記色素基質は上記ペルオキシダーゼの存在下において過酸化水素により酸化されて所定の波長領域内の光を吸収する一定の生成物、すなわち、指示薬色素を生成する。好ましくは、この指示薬色素は上記のサンプルまたは試験試薬が強く吸収する波長とは異なる一定の波長において（光を）強く吸収する。この指示薬の酸化された形態は、上記膜の試験側における色の変化を明示する、着色している状態、わずかに着色している状態、または無色の状態の最終生成物のいずれでもよい。すなわち、上記試験試薬は分析物の存在を漂白中の一定の発色領域により、あるいは、発色中の一定の無色領域により示すことができる。
【００１９】
本発明において有用である色素基質は尿素誘導体色素を含む。このような尿素誘導体色素は特公平１１１８７６８号（ＪＰ １１１８７６８）、特公平９０１９２９６号（ＪＰ ９０１９２９６）、欧州特許第３８２０５号、同第１２４２８７号および同第２５１２９７号において開示されている物質の少なくとも一部を含み、これらの開示はそれぞれ本明細書に参考文献として含まれる。この色素基質は一般に、一定の負の電荷を有している、尿素誘導体であり、この場合の適当な負に荷電されている尿素誘導体は一定のカルボキシレート基または一定のスルホネート基を有している化合物を含む。関連の尿素誘導体色素は以下の化学式により示すことができる。
Ｒ１ Ｒ２ ＮＣＯＮＨＲ３
この式において、
一体の形態のＲ１ ，Ｒ２ はＮ，Ｎ−二置換型のアミノアリールであり、
Ｒ３ はカルボキシアルキル、アルコキシカルボニル、アルキルカルボニル、アリールスルホニル、スルホアリールおよびカルボキシアリールから成る群から選択される。
【００２０】
上記Ｒ１ およびＲ２ における各アリール基はイオウ原子（Ｓ）を介して結合してフェノチアジン誘導体系の色素を形成することができ、この色素は以下の化学式により示される。
【化１】
2004503760.tif 000003
この式において、Ｒ４ およびＲ５ はそれぞれ独立してＮＲ２ およびＯＲから選択され、この場合のＲは水素、（Ｃ１ −Ｃ６ ）−アルキル、（Ｃ１ −Ｃ６ ）−アルケニル、アリール、置換アリール、アリールアルキル、置換アリールアルキルであり、Ｒ３ は上記において定められており、さらにＲ６ およびＲ７ はそれぞれ独立して水素、（Ｃ１ −Ｃ６ ）−アルキル、（Ｃ１ −Ｃ６ ）−アルケニル、アシル、カルボキシル、スルホニル、ニトロ、ハロゲン、ヒドロキシル、（Ｃ１ −Ｃ６ ）−アルコキシルまたはヒドロキシル−（Ｃ１ −Ｃ６ ）−アルキルから選択される。
【００２１】
あるいは、上記Ｒ１ およびＲ２ における各アリール基は酸素原子（Ｏ）を介して結合してフェノキサジン誘導体系の色素を形成することができ、この色素は以下の化学式により示すことができる。
【化２】
2004503760.tif 000004
【００２２】
さらに、別の実施形態において、上記Ｒ１ およびＲ２ における各アリール基は結合しておらず、この化合物は以下のジフェニルアミンの化学式により示される。
【化３】
2004503760.tif 000005
【００２３】
例示的な尿素誘導体色素は１０−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−３，７−ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジン（ロイコ・メチレン・ブルー）、１０−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−４，４’−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミン、１０−プロピオン酸フェノチアジン、およびこれらの塩を含む。好ましい実施形態において、上記尿素誘導体色素は１０−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−３，７−ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジンおよびそのナトリウム塩である。
【００２４】
上記組成物の性質により、当該組成物の尿素誘導体色素成分は安定であり、その溶液の状態、とりわけ、水性溶液の状態に比較した場合に、酸化による分解に対して耐性を有している。従って、本発明の組成物は見てわかる色の変化を生じることなく種々の温度および湿度の条件下において保管することができるので、本発明の組成物は保管において安定である。本発明の組成物および試薬試験片が保管において安定である代表的な条件は以下に述べる実験の部分における条件を含む。これらの知見に基づいて、本発明の組成物は、少なくとも約６ヶ月乃至１年半、通常的に約９ヶ月乃至１年の範囲の期間にわたり、少なくとも約−８０℃乃至６０℃、通常的に約−２０℃乃至５６℃の温度範囲および少なくとも約０％乃至８０％、通常的に約５％乃至２０％の湿度範囲において安定である。本発明の組成物は、例えば、親水性のポリスルホン膜またはセルロース・フィルター紙等の中性または負に荷電されている多孔質基材を含む組成物よりもさらに安定であり、この場合に高められる安定性の程度は少なくとも１００倍である。
【００２５】
本発明の試薬試験片は任意の好都合なプロトコルにより製造できる。好都合なプロトコルの一例は上記尿素誘導体色素を除く最終的な試薬試験片における試験パッドに付随する試薬組成物の要素の全てを含有している水性溶液に対して試験片の少なくとも試験パッドの部分を先ず接触させることである。都合の良いことに、この試験パッドは上記水性溶液中に浸漬して、一定の十分な時間にわたりその中に維持した後に乾燥することができる。次に、この試験パッドを上記尿素誘導体色素を含有している、例えば、７０％のメタノール溶液等の有機溶液中に浸漬して、一定の十分な時間にわたりその中に維持した後に乾燥させることにより、組成物を伴う試薬試験片の試験パッドが製造できる。
【００２６】
上述したように、上記水性溶液が上記尿素誘導体色素を除く試薬試験片の試験パッドに付随する組成物の種々の要素を含有しており、上記有機溶液が上記尿素誘導体色素の要素を含有していて、これら全ての要素が上記試験片において作成される試薬組成物における各所望の量を有するために十分な量でそれぞれ存在している。従って、上記分析物オキシダーゼの濃度は一般的に約５×１０−３ｍＭ乃至０．２５ｍＭ、通常的に約０．０５ｍＭ乃至０．１０ｍＭの範囲である。同様に、上記ペルオキシダーゼは、存在している場合に、約５×１０−４ｍＭ乃至０．１２５ｍＭ、通常的に約０．００５ｍＭ乃至０．０５ｍＭの範囲である。また、上記尿素誘導体色素の濃度は一般的に約０．５ｍＭ乃至２ｍＭ、通常的に約０．８ｍＭ乃至１．２ｍＭの範囲である。さらに、上記試薬試験片を調製するために用いられる上記水性溶液中に存在できる別の成分は塩化ナトリウム、塩化マグネシウム、トリス（Ｔｒｉｓ）ＰＳＳＡ、テトロニック（Ｔｅｔｒｏｎｉｃ）１３０７、クロテイン、スクロース、オキサミド酸のナトリウム塩、ＥＤＴＡ、マンニトール、ＰＶＰおよびＰＶＢＴＡ等のポリマー等を含む。本発明の試薬試験片を調製するための代表的な方法については以下の各実施例の部分を参照されたい。
【００２７】
分析物検出の方法
上記の組成物、試薬試験片および信号生成システムはサンプル中における分析物の存在、および多くの場合においてその量を検出する方法において有用であることが分かっている。種々の異なる分析物が本発明の方法により検出可能であり、この場合の代表的な分析物は、例えば、グルコース、アルコール、ホルムアルデヒド、Ｌ−グルタミン酸、グリセロール、ガラクトース、グリケート化タンパク質、クレアチニン、ケトン体、アスコルビン酸、乳酸、ロイシン、リンゴ酸、ピルビン酸、尿酸、およびステロイド類等の上述した物質を含む。原理的には、本発明の方法は尿、涙、唾液等の種々の異なる生理学的サンプルの中の分析物の存在、および多くの場合にその濃度を決定するために使用できるが、これらの方法は、血液または血液フラクション、例えば、血液から誘導されるサンプル、とりわけ、全血の中の分析物の濃度の決定における使用に特に適している。
【００２８】
本発明の方法の重要な特徴は一定の尿素誘導体色素を含む本発明の信号生成システムの使用により過酸化水素の高感度な検出が行なえることである。従って、本発明の安定な乾燥状態の試薬形態、例えば、試験片により過酸化水素がサブミリモルの濃度において検出可能であり、この場合のサブミリモルの濃度は一般的に０．０１０ｍＭ乃至１ｍＭ、通常的に約０．０５０ｍＭ乃至０．８ｍＭの範囲の濃度を意味する。一定の尿素誘導体色素を含む本発明の信号生成システムの使用は、尿素誘導体色素以外の色素基質、例えば、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３−メチルアニリンの４−アミノアンチピリン（図３を参照されたい）を含む信号生成システムに比較した場合に、さらに感度の高い過酸化水素の検出を提供する。
【００２９】
本発明の方法において、上記サンプルおよび上記一定の尿素誘導体色素を含む信号生成システムが、例えば、当該サンプルを上記試験片に供給することにより、混合されて反応混合物になり、この反応が上記サンプル中の分析物の存在（および多くの場合にその量）を示す信号を発生するための十分な時間にわたり自然に進行して、この結果として生じる信号が決定されて上記サンプル中の分析物の存在（および多くの場合にその量）に関連付けられる。次に、試験片を用いる方法について本発明の方法をさらに説明する。
【００３０】
本発明の実施において、その第１の工程は一定量の生理学的サンプルを試験片に供給することであり、この場合の試験片は上記において説明されている。また、この試験片に供給される生理学的サンプル、例えば、血液の量は変更可能であるが、一般に約２μＬ乃至４０μＬ、通常的に約５μＬ乃至２０μＬの範囲である。本発明の試験片の性質により、上記試験片に供給される血液サンプルの量は比較的に少なく、約２μＬ乃至４０μＬ、通常的に約５μＬ乃至２０μＬの範囲である。血液が上記生理学的サンプルの場合に、種々の異なるヘマトクリット値の血液サンプルが本発明の方法によりアッセイ可能であり、この場合のヘマトクリット値は約２０％乃至６５％、通常的に約２５％乃至６０％の範囲にできる。
【００３１】
上記サンプルの試験片への供給に続いて、このサンプルは上記信号生成システムにおける各要素と自然に反応して当該サンプル中に存在している関連の分析物の初期的な量に比例する一定の量で存在する検出可能な生成物を生成する。その後、この検出可能な生成物の量、すなわち、上記信号生成システムにより生成される信号が決定されて初期的なサンプル中の分析物の量に関連付けられる。
【００３２】
分析物検出システム
本発明の方法の実施において有用な分析物検出システムは試薬試験片および自動化器具を備えている。このようなシステムにおいて、一定の生理学的サンプルが上述した試験片に供給され、上記信号生成システムにより生成された信号が検出されて上記自動化器具によりサンプル中の分析物の存在（および多くの場合にその量）に関連付けられる。上記の反応、検出および関連付けの各工程、並びにこれらを実行するための各器具が米国特許第４，７３４，３６０号、同第４，９００，６６６号、同第４，９３５，３４６号、同第５，０５９，３９４号、同第５，３０４，４６８号、同第５，３０６，６２３号、同第５，４１８，１４２号、同第５，４２６，０３２号、同第５，５１５，１７０号、同第５，５２６，１２０号、同第５，５６３，０４２号、同第５，６２０，８６３号、同第５，７５３，４２９号、同第５，５７３，４５２号、同第５，７８０，３０４号、同第５，７８９，２５５号、同第５，８４３，６９１号、同第５，８４６，４８６号、同第５，９０２，７３１号、同第５，９６８，８３６号および同第５，９７２，２９４号においてさらに詳しく説明されており、これらの開示はそれぞれ本明細書に参考文献として含まれる。なお、上記関連付けの工程において、導出される分析物濃度は、例えば、器具を追随的に較正する等により、観察される信号に対する競合反応の定常的な寄与を考慮に入れている。
【００３３】
本発明の分析物検出システムは分析物決定のための酵素免疫アッセイシステムを含み、この場合のシステムは試験片プレートを形成している多数個の試験片を備えており、この試験片プレートは正に荷電されている多孔質基材および当該基材の少なくとも１個の表面上における一定の尿素誘導体色素を有しており、さらに、上記分析物決定は、例えば、酵素連結型イムノソルベント・アッセイ（ＥＬＩＳＡ）であり、この場合の酵素はペルオキシダーゼであり、上記試験片プレートはさらに上記基材の少なくとも１個の表面上に一定の分析物特異性の抗体を有している。
【００３４】
キット
本発明により、上記本発明の方法の実施において使用するためのキットも提供される。この本発明のキットは上述したような過酸化物生成性の信号生成システムを有する試薬試験片、および、例えば、指を突刺すためのランス、ランス作動手段等の生理学的サンプルを入手するための手段の少なくとも１個、および、例えば、一定の標準化された濃度の分析物を含有している分析物対照溶液のような分析物の標準物を備えている。特定の実施形態において、上記キットはさらに、上述したような、サンプル供給に続いて試験片において生成された生成物の量を検出してこの検出した生成物をサンプル中の分析物の存在（および多くの場合にその量）に関連付けするための自動化器具も備えている。さらに、上記キットは生理学的サンプル中の分析物濃度の決定において本発明のキットの各構成要素を使用するための指示書または説明書を備えている。これらの指示書または説明書はパッケージ、ラベル・インサート、各キット内に存在している各容器等の１個以上において存在させることができる。
【００３５】
以下の各実施例は例示を目的として説明されていて、限定を目的としていない。
【００３６】
実施例
実施例１．市販の色素基質のスクリーニング
以下において記載されている種々の色素の各原液を水または水／０．２Ｍクエン酸塩または水／０．２Ｍクエン酸塩／エタノールの混合液のいずれかにおいて調製した。この色素原液の各濃度は８ｍＭ乃至５０ｍＭの範囲であった。また、１０ｍｇ／ｍｌのＨＲＰの原液も０．０２ＭのＰＢＳのｐＨ７．４の溶液中において調製した。その後、色素／ＨＲＰの各溶液を適当量の色素原液、１０ｍｇ／ｍｌのＨＲＰ原液および０．０２ＭのＰＢＳ緩衝液を最終濃度が［ＨＲＰ］＝１ｍｇ／ｍｌおよび［色素］＝１ｍＭとなるように混合して調整した。その後、このようにして調製した色素／ＨＲＰの各２００μｌをマイクロタイター・プレートの各井戸（ウェル）に加えてから、２０μｌの５００ｍＭのＨ２ Ｏ２ 溶液を加えた。発色が安定状態に到達した後に（２分以内）マイクロタイター・プレート読取装置により各溶液の吸光度を測定した。
【表１】
2004503760.tif 000006
【００３７】
実施例２．ＤＡ−６７を含有している過酸化物生成性の信号生成システムを塗布した試験片の調製
ワン・タッチ（Ｏｎｅ Ｔｏｕｃｈ）（登録商標）ナイロン膜を１／４インチ（０．６３５ｃｍ）の幅および１２インチ（３０．４８ｃｍ）の長さの部材片に切断して、この膜片をＡ浸漬溶液により最初に塗布した後にＢ浸漬溶液により塗布した（成分および濃度は以下の表中に特定されている）。それぞれの塗布処理の後に、上記膜を５５℃において１０分間にわたり熱空気炉内で乾燥した。この塗布処理した膜を２インチ×１２インチ（５．０８ｃｍ×３０．４８ｃｍ）のメリネックス（Ｍｅｌｉｎｅｘ）支持体に貼り付けた。この支持体は色の測定のためにその長さに沿って１／４インチ（０．６３５ｃｍ）ごとに５ｍｍの直径の開口穴を有している。また、このメリネックス支持体はそれぞれの穴の上部および下部に印刷されている２本の縞状の３／８インチ（０．９５３ｃｍ）幅の接着剤も有している。その後、上記膜をメリネックス支持体の各穴を完全に被覆するように貼り合わせた。さらに、メリネックス支持体に印刷されている接着剤によりサンプル分散性のポーレックス（Ｐｏｒｅｘ）（１インチ×１２インチ（２．５４ｃｍ×３０．４８ｃｍ））の層を上記膜の上部に張り合わせた。その後、この組立体の全体を１／４インチ（０．６３５ｃｍ）の幅の各部材片に切断した。
【表２】
2004503760.tif 000007
【００３８】
実施例３．過酸化水素の検出
安定化したＤＡ−６７色素により塗布されている各試験片の顕色の可能性を示すために、ワン・タッチ（Ｏｎｅ Ｔｏｕｃｈ）（登録商標）ナイロン膜を０．５Ｍ、ｐＨ８．０のリン酸塩緩衝液中に２．５ｍＭのＤＡ−６７、１ｍｇ／ｍｌのＨＲＰおよび１％ＰＶＰ（分子量＝３６０Ｋ）を含有している溶液により塗布した。その後、この膜をメリネックス支持体に貼り付けて、ポーレックスにより被覆して、実施例２において説明したように各試験片に切断した。各１０μＬの量の種々の濃度のＨ２ Ｏ２ 溶液を各試験片にそれぞれ滴下して、その色形成をマクベス（Ｍａｃｂｅｔｈ）反射計によりモニターした。ＤＡ−６７色素の検出感度をＨ２ Ｏ２ 、ＴＯＯＳ−４ＡＰに対して最も一般的に使用されている色素の感度に対して比較するために、ワン・タッチ（Ｏｎｅ Ｔｏｕｃｈ）（登録商標）ナイロン膜を０．０２Ｍ、ｐＨ７．４のＰＢＳ中に５ｍＭのＴＯＯＳ、５ｍＭの４ＡＰ、１ｍｇ／ｍｌのＨＲＰおよび１％ＰＶＰ（分子量＝３６０Ｋ）を含有している溶液により塗布した。その後、この膜を用いて実施例２において説明したように各試験片を調整して、上記ＤＡ−６７を塗布した各試験片を試験した方法によりＨ２ Ｏ２ により試験した。これらの結果が図３においてプロットされている。
【００３９】
上記の各結果および説明により、本発明が分析物検出において有用な過酸化水素に基づく信号生成システムの高感度な尿素誘導体色素の要素の有意義な安定化を行なうことが明らかである。従って、本発明は、例えば、尿素誘導体色素以外の色素基質に依存している組成物および方法のような特定の従来技術の組成物および方法に比べた場合に、さらに感度の高い分析物検出を行ない、当該技術分野に対して有意義な貢献を提供する。
【００４０】
本明細書において引用した各公告および特許は、それぞれの公告または特許が特別に且つ個別に本明細書に参考文献として含まれることが示されているように、本明細書に参考文献として含まれる。これらのあらゆる公告の引用はその出願日よりも前におけるそれぞれの開示について引用されているのみであり、（この引用を）本発明が先の発明の効力により当該公告よりも先行する権利がないという承認として解釈すべきでない。
【００４１】
以上において、本発明をその理解の明瞭化のために図示および実施例により幾分詳細に説明したが、当該技術分野における通常の熟練者においては、本発明のこれらの教示に鑑みて、特定の変形および変更が本明細書に記載されている特許請求の範囲から逸脱することなく上記各実施形態に対して行なえることが容易に明らかである。
【図面の簡単な説明】
【図１】
ｐＨ７．４のＰＢＳ緩衝液（０．０２Ｍ）中におけるホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ（１ｍｇ／ｍＬ，５４９単位（Ｕ）／ｍｇ）および過酸化水素（５０μＭ）に対する反応後における種々の市販の色素基質（１ｍＭ）のＵＶ吸光度のグラフ的表現を示している図である。
【図２】
ｐＨ７．４のＰＢＳ緩衝液（０．０２Ｍ）中におけるホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ（１ｍｇ／ｍＬ，５４９単位（Ｕ）／ｍｇ）および過酸化水素（５０μＭ）に対する反応後における種々の市販の色素基質（１ｍＭ）のＵＶ吸光度のグラフ的表現を示している図である。
【図３】
ＤＡ−６７およびＴＯＯＳ−４ＡＰを被覆したワン−タッチ（Ｏｎｅ−Ｔｏｕｃｈ）（登録商標）ナイロン膜における過酸化水素濃度の各作用のグラフ的表現を示している。各ＴＯＯＳ−４ＡＰの試験片は５ｍＭのＴＯＯＳおよび４ＡＰをそれぞれ含有している０．０２Ｍ・ＰＢＳのｐＨ７．４の溶液、１ｍｇ／ｍｌのＨＲＰおよび１％ＰＶＰ（３６０Ｋ）により塗布されている。また、各ＤＡ−６７の試験片は０．５ＭのｐＨ８．０のリン酸塩緩衝液中における２．５ｍＭのＤＡ−６７、１ｍｇ／ｍｌのＨＲＰ、１％ＰＶＰ（３６０Ｋ）により塗布されている。
【図１】
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【図２】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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