(57)【要約】本発明は、脊髄幹細胞を、増殖因子ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４の存在下で、および任意選択でさらにインターロイキン受容体ｓＩＬ−４Ｒの存在下で、樹状細胞が生成するまで栄養培地にて増殖させる、樹状細胞の調製方法について説明する。そのように調製された樹状細胞は、好ましくは毒素、サイトカイン、およびサイトカイン受容体の少なくともいずれか一つを装填しており、腫瘍患者の治療に使用される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
インビトロでの樹状細胞の調製方法であって、
脊髄幹細胞を、増殖因子ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４の存在下で、および任意選択でインターロイキン受容体ｓＩＬ−４Ｒの存在下で、樹状細胞が生成するまで栄養培地にて増殖させることを特徴とする方法。
【請求項２】
ヒトの脊髄幹細胞を使用することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
増殖因子およびインターロイキン受容体の添加を、脊髄幹細胞が完全に細胞培養フラスコに広がった後で実行することを特徴とする請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
各増殖因子を８００〜１０００Ｕ／ｍｌの量で添加することを特徴とする請求項１〜３の１または複数項に記載の方法。
【請求項５】
各増殖因子を８６０〜９５０Ｕ／ｍｌの量で添加することを特徴とする請求項４に記載の方法。
【請求項６】
生成する樹状細胞を定期的な間隔で細胞培養フラスコから取り除くことを特徴とする請求項１〜５の１または複数項に記載の方法。
【請求項７】
細胞培養培地として、任意選択で抗生物質、グルタミンおよびＦＣＳを補給したＤＭＥＭ　Ｈａｍ’ｓ　Ｆ−１２およびＲＰＭＩ１２６０を使用する請求項１〜６の１または複数項に記載の方法。
【請求項８】
インターロイキン受容体を５００〜７５０Ｕ／ｍｌの量で添加することを特徴とする請求項１〜７の１または複数項に記載の方法。
【請求項９】
ｓＩＬ−４Ｒを５５０〜７００Ｕ／ｍｌの量で添加することを特徴とする請求項１〜８の１または複数項に記載の方法。
【請求項１０】
増殖因子ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４のの組合せを使用して、任意選択でさらにインターロイキン受容体ｓＩＬ−４Ｒを組み合わせて使用して、脊髄幹細胞から調製された樹状細胞。
【請求項１１】
サイトカイン、サイトカイン受容体、および毒素の少なくともいずれか一つを装填していることを特徴とする請求項１０に記載の樹状細胞。
【請求項１２】
前記毒素として、サソリのＰａｒａｂｕｔｈｕｓ属、ムカデのＳｃｏｌｏｐｅｎｄｒａ属、Ｈｅｍｉｓｃｏｌｏｐｅｎｄｒａ属；ヘビのＢｉｔｉｓ属、Ｎａｊａ属；クモのＬｏｘｏｓｃｅｌｅｓ属、Ｌｙｃｏｓａ属、Ｓｉｃａｒｉｕｓ属およびＰｈｏｌｃｕｓ属；のうちの少なくともいずれか一つに由来の毒からの細胞毒作用壊死作用、およびアポトーシス作用のうちの少なくとも１つを有するペプチド毒素が使用され、
前記サイトカインとして、インターフェロンＩＦＮ−γ／ＩＮＦ−γ；ＩＮＦ−α／ＩＮＦα；およびインターロイキンＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１４、ＩＬ−１７またはそれらの組合せ；のうちの少なくともいずれか一つが使用され、
前記サイトカイン受容体として、インターロイキン受容体ｓＩＬ−１Ｒ、ｓＩＬ−２Ｒ、ｓＩＬ−３Ｒ、ｓＩＬ−４Ｒ、ｓＩＬ−６Ｒ、ｓＩＬ−１０Ｒ、ｓＩＬ−１４Ｒ、ｓＩＬ−１７Ｒまたはそれらの組合せが使用されることを特徴とする請求項１１に記載の樹状細胞。
【請求項１３】
腫瘍の治療のための請求項１〜１２の１または複数項に記載の樹状細胞の使用方法。
【請求項１４】
皮膚の腫瘍の治療のための請求項１３に記載の使用方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、腫瘍疾病（好ましくは皮膚の腫瘍疾病）の場合の治療的使用のための、増殖因子ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４を、任意選択のインターロイキン受容体ｓＩＬ−４Ｒの存在下で添加することによる、インビトロでの脊髄幹細胞からの樹状細胞の調製に関する。
【０００２】
（先行技術）
用語「樹状細胞」とは、幹細胞から分化し、遺伝的悪性転換または癌化細胞を追跡および破壊する樹状突起を有する免疫系の細胞のことを指す。破壊は例えば、遺伝的悪性転換細胞または癌化細胞を特定した後で、そのような細胞に免疫ペプチド毒素を汲み入れることによって起こり得る。この場合、樹状細胞は輸送細胞として機能する。免疫ペプチド毒素は悪性転換または癌化細胞を溶菌させる。
【０００３】
免疫状態が弱い場合には、免疫系の残りとの共同作用する身体内に存在する樹状細胞の数が、形質転換細胞を有効に制御するには不十分である。
局所に現れた腫瘍、好ましくは皮膚の腫瘍の治療では、インビトロで作成した患者自身の樹状細胞が、患者の腫瘍の中かまたは腫瘍部位の周囲に注入され得る。好ましくは、樹状細胞にはサイトカインおよび免疫毒素のすくなくともいずれか一つが装填されている。しかしながら、血液幹細胞から調製された従来の樹状細胞では、装填能が制限されている。
【０００４】
現在樹状細胞は血液幹細胞から調製されている。個々の増殖因子か増殖因子混合物をそれぞれ添加すると、インビトロで分化が起こる。
この方法の欠点は、分化が不均一であり、一貫しない基底細胞量を生じさせることである。これは、外来種（動物および植物毒素）からの治療上有効な物質の装填をほとんど不可能にする。
【０００５】
Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， 第９３巻， ２５８８−２５９２ ページ， １９９６年から、ＣＤ１４＋血液単球が、機能的な成熟ＣＤ８３＋樹状細胞に分化することがわかる。本発明の基礎となる問題の解決策として示唆された特定の組合せは、該文献より予期されるものではなく、該文献によって自明とはならない。特に、該文献は、使用される増殖因子およびインターロイキン受容体の相補的な添加を組み合わせた脊髄幹細胞からの樹状細胞の調製を予想していない。さらに、Ｄ１に説明された樹状細胞は、本発明に記載の方法により調製される樹状細胞のように、毒性物質で良好に装填する能力を示さない。
【０００６】
したがって、本発明の目的は、腫瘍治療におけるか、（例えば腫瘍疾病の従来の放射線療法に加えた）支持療法としてかの少なくともいずれかで、上述の先行技術の欠点を回避する有用な改良方法を提供することである。
【０００７】
本発明によれば、上記の問題は、出発物質（脊髄幹細胞）の特定の選択を行い、任意選択でさらにインターロイキン受容体ｓＩＬ−４Ｒを組み合わせて増殖因子（ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４）の特定の組合せを使用することにより解決される。
【０００８】
このようにして調製された樹状細胞は、特にその均一性によって特徴づけられ、量と質の両方に関して優れた様式で、先行技術の血液幹細胞から調製された樹状細胞よりも効率的に治療上有効な物質を装填し得る。該樹状細胞はさらに、任意選択でさらにインターロイキン受容体ｓＩＬ−４Ｒと組み合わせて本明細書に記載した増殖因子の特定の組合せを使用しない脊髄幹細胞から調製された樹状細胞によりも優れた利点を示す。
【０００９】
以下、本発明をまず概略的に説明してから、次に実施例に関して詳細に説明する。しかしながら、本発明は、以下の明細書に説明された特定の実施形態や実施例に制限されない。本発明の精神から逸脱せずに、明細書と請求項の範囲内で本発明の個々の実施形態を改変し得る。
【００１０】
本発明の方法はヒトまたは動物の脊髄幹細胞に基づいているが、ヒトの脊髄幹細胞が好ましいことが理解される。樹状細胞への分化後にドナーに再導入される自己由来の幹細胞が使用されることが好ましい。
【００１１】
脊髄幹細胞はそれ自体公知の方法によって単離された形式の脊髄である。この目的では脊髄穿刺法が広く使用されている。このようにして得られた組織は細胞培養に直接使用することも可能ではあるが、一般に、除去された脊髄は、細胞を長期間の間生存させておくために処理される。この目的で、衝撃凍結による処理が特に有効である。その後、このようにして処理された細胞を次に液体窒素中で保存する。除去と保存は、できるだけ滅菌されていることを保証する様式で行なわなければならない。
【００１２】
脊髄幹細胞を従来の細胞培養フラスコ内の増殖に適した培地に入れる。脊髄幹細胞を培養するために、当業者に知られている代表的な培地を使用することができる。ＤＭＥＭ　Ｈａｍ’ｓ　Ｆ−１２培地をＲＰＭＩと組み合わせたものが、特に有効と判明した。汚染を回避するために、抗生物質、好ましくは複数の抗生物質の混合物が加えられる。使用可能な抗生物質は例えばペニシリンとストレプトマイシンである。さらなる添加物は、アミノ酸（例えばグルタミン）や、ウシ胎児血清またはその代用物である。細胞はインキュベータ内で適温で培養されるが、体温の約３７℃が特に好ましく使用される。
【００１３】
細胞は、増殖因子の特定の組み合わせ（すなわちＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４）と、任意選択でインターロイキン受容体ｓＩＬ−４Ｒとの存在下で培養される。本発明によれば、増殖因子のそのような組み合わせと、任意選択でさらにインターロイキン受容体を加えるだけで、活性物質（例えばサイトカイン、サイトカイン受容体および細胞毒物）を特に有効な様式で装填した均一な樹状細胞が形成されることがわかった。添加される増殖因子と、さらに任意選択で添加されるインターロイキン受容体とは、天然源由来のものであってもよいし、組換えであってもよい。添加される増殖因子の量は、当業者がマニュアル実験によって決定し、最適化することができる。一般に、添加される増殖因子の量は、各増殖因子当たり８００〜１０００Ｕ／ｍｌであり、約８６０〜９５０Ｕ／ｍｌが特に適していることがわかっている。任意選択のインターロイキン受容体ｓＩＬ−４Ｒの補足的添加は、５００〜７５０Ｕ／ｍｌの量で、さらに好ましくは５００〜６００Ｕ／ｍｌの量で、同様に好ましくは５５０〜７００Ｕ／ｍｌの量で行われる。
【００１４】
本発明の特に好ましい実施形態では、脊髄幹細胞からの樹状細胞の調製のためにＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４およびｓＩＬ−４Ｒが使用される。
脊髄幹細胞の培養の初めに増殖因子と受容体を直接加えることは可能である。しかしながら、本発明の好ましい実施形態では、少なくとも１つの細胞層、好ましくは数枚の細胞層が細胞培養フラスコの底に完全に広がるまで、樹状細胞は培養される。この時点で、増殖因子の混合物と、任意選択のｓＩＬ−４Ｒとが加えられる。細胞の増殖を定期的な間隔でモニタしなければならず、培地を交換しなければならないことは勿論である。この目的に必要な技術は長い間知られており、当業者にとって利用可能である。
【００１５】
数時間後、一般に少なくとも２４時間後、微視的モニタリングにより、脊髄幹細胞の樹状細胞への分化が観察され得る。その後、移動性で、かつ脊髄幹細胞とは対照的に細胞培養フラスコの底に詰まった接続を有しない分化樹状細胞が、収集され、新しい細胞培養フラスコに入れられる。分化プロセスを継続するために、古い細胞培養フラスコを新しい培地で充填する。新しい脊髄幹細胞がもはや形成されないか、十分な量の形成がもはや生じなければ、すぐに培養物を捨てる。一般に、分化された樹状細胞は、少なくともさらに３週間新しい細胞培養フラスコで培養可能であり、治療目的に利用可能である。しかしながら、本発明に従って調製された樹状細胞を直接治療に使用するのではなく、最初に急速冷凍し、装填のためにそれらを使用する直前にのみ他の治療上有効な物質（例えば毒素）と接触させることも可能である。
【００１６】
本発明の方法によって得られる樹状細胞は、有利な均一性を有しており、特に有利な様式で外来物質を装填することができる。そのような外来物質には、例えばサイトカイン、毒素およびサイトカイン受容体が含まれる。
【００１７】
本発明による有用なサイトカインの例は、インターフェロンＩＦＮ−γ／ＩＮＦ−γ；ＩＮＦ−α／ＩＮＦα；およびインターロイキンＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１４、ＩＬ−１７またはそれらの組合せ；のうちの少なくともいずれか一つである。
【００１８】
更に、本発明によって調製された脊髄幹細胞は、サイトカイン受容体を好ましく装填することが判明した。好ましくはインターロイキン受容体が使用される。現在まで未知のメカニズムにより、サイトカイン受容体、好ましくはインターロイキン受容体は、該受容体での装填が特に合理的となるように、インターロイキンの形成を開始する。サイトカイン受容体の例はインターロイキン受容体であり、好ましくはインターロイキン受容体ｓＩＬ−１Ｒ、ｓＩＬ−２Ｒ、ｓＩＬ−３Ｒ、ｓＩＬ−４Ｒ、ｓＩＬ−６Ｒ、ｓＩＬ−１０Ｒ、ｓＩＬ−１４Ｒ、ｓＩＬ−１７Ｒである。特に好ましいのは、インターロイキン受容体ｓＩＬ−４ＲおよびｓＩＬ−６Ｒの少なくとも一方で樹状細胞を装填することである。
【００１９】
樹状細胞の装填（例えば毒素による）は、それ自体公知である。装填には、細胞に単に物質を付着させるだけでなく、樹状細胞内に物質をとり込ませることも含む。考えられる１つのタイプの装填はリポフェクションである。元々この技術は外来ＤＮＡまたはＲＮＡで細胞を形質転換するのに使用されていた。装填効率の増大は、リポソームへの抗体、タンパク質、糖脂質などの結合により達成され、それにより狙ったやり方でリポソームと細胞表面との間の相互作用に影響が及ぶ。このように、毒素（好ましくはペプチド毒素）、サイトカインまたはサイトカイン受容体を、「細胞に属する」と認めることができ、「正常な」代謝機能中に樹状細胞へ導入することができる。他の装填方法は、細胞への注入か、物質を含む培地での細胞のインキュベーションである。これについては例えばＨｅｒｄｅｒ （１９９５）， Ｌｅｘｉｋｏｎ ｄｅｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｅ ｕｎｄ Ｍｏｌｅｋｕｌａｒｂｉｏｌｏｇｉｅ， 第２ 巻， Ｓｐｅｋｔｒｕｍ Ａｋａｄｅｍｉｓｃｈｅｒ Ｖｅｒｌａｇ， Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇを参照されたい。
【００２０】
別の装填方法はレーザマイクロインジェクションである。この方法では、毒性物質を含む培地に存在する樹状細胞を高度に集束させたレーザー光線で短期間処理し、周囲の培地を細胞に入れる細胞膜の孔を生成する。この方法の基礎となる細胞または細胞凝集物の顕微操作の技術については例えばＳｃｈｕｅｔｚｅ Ｋ． ｅｔ ａｌ．； Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， １６， ８： ７３７−７４２ （１９９８）， Ｓｃｈｕｅｔｚｅ Ｋ． ｅｔ ａｌ．； Ｊ． Ｃｅｌｌ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， ４４， ５： ７３５−７４６ （１９９８）， Ｂｏｅｈｍ Ｍ． ｅｔ ａｌ．； Ａｍｅｒｉｃ． Ｊ． Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ； １５１， １： ６３−６７， Ｐｏｎｔｅｎ Ｆ． ｅｔ ａｌ．： Ｍｕｔａｔｉｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ， ３８２： ４５−５５ （１９９７）， Ｂｅｒｎｓｅｎ Ｍ． ｅｔ ａｌ．； Ｌａｂ． Ｉｎｖｅｓｔ． ７８： １２６７−１２７３ （１９９８） ｏｒ Ｆｉｎｋ Ｌ． ｅｔ ａｌ．； Ｎａｔ． Ｍｅｄｉｃｉｎｅ． ４， １１： １３２９−１３３３ （１９９８）に記載されている。
【００２１】
樹状細胞を装填する別の方法は以下のとおりである。
毒素で飽和させた培養液（５ｍｌの細胞培地当たり約２ｍｇの毒素画分）を、本発明による脊髄幹細胞から調製された均一な樹状細胞の予め分化させておいた細胞培養物に定期的に加える。２日ごとに培地を交換してこれを繰り返すと、樹状細胞の毒素受け取りが起こり、これに続いて細胞に毒素がとり込まれる。それらの樹状細胞を制御された程度で形質転換細胞に接触させると、外来物質を装填した樹状細胞によって引き起こされる腫瘍細胞に対する迅速に開始する作用を観察することができる。この方法により、樹状細胞は非常に高い装填能を生じる。
【００２２】
本発明の好ましい実施形態では、毒性物質として、細胞毒性作用、壊死作用、およびアポトーシス作用の少なくとも一つを有する毒性物質が使用される。この目的に使用するのに特に好ましい物質は、ムカデ、ヘビ、サソリおよびクモの毒に由来する。本発明の方法に従って調製されたそのように装填された樹状細胞は、皮膚の癌腫、例えば黒色腫の治療に特に役立つ。好ましくは、それらは以下の動物のペプチド毒素である：ムカデ種のＳｃｏｌｏｐｅｎｄｒａ　ｍｏｒｓｉｔａｎｓ、Ｓ．ｇｉｇａｎｔｅａおよびＨｅｍｉｓｃｏｌｏｐｅｎｄｒａ種；ヘビ種のＢｉｔｉｓ　ａｒｉｅｔａｎｓ（パフアダー）、Ｂｉｔｉｓ　ｇａｂｏｎｉｃａ（ガボンクサリヘビ）、Ｂｉｔｉｓ　ｎａｓｉｃｏｒｎｉｓ（ツノクサリヘビ）；より小さなＢｉｔｉｓ種のＢ．ａｔｒｏｐｏｓ、Ｂ．ｃａｕｄａｌｉｓ、Ｂ．ｐｅｒｉｎｇｕｅｙｉ；ドクハキコブラ種のＮａｊａ　ｍｅｌａｎｏｌｅｕｃａおよびＮａｊａ　ｐａｌｌｉｄａ；クモ亜綱ドクイトグモ種のＬｏｘｏｓｃｅｌｅｓ　ｌａｅｔａ、Ｌ．ｓｐｉｎｉｃｅｐｓ、Ｌ．ｂｅｒｇｅｒｉ、Ｌ．ｐａｒａｍｉ、Ｌ．ｒｕｆｅｓｃｅｎｓ、Ｌ．ｒｅｃｌｕｓａ、Ｌ．ｄｅｓｅｒｔａ；ユーレイクモ種のＰｈｏｌｃｕｓ　ｐｈａｌａｎｇｉｏｉｄｅｓ、Ｐｈｏｌｃｕｓ　ｏｐｉｌｉｏｎｉｄｅｓ、Ｐｈｏｌｃｕｓ種（南アフリカ共和国）、Ｐｈｏｌｃｕｓ種（キューバ）、Ｓｉｃａｒｉｕｓ　ａｌｂｏｓｐｉｎｏｓｕｓ、Ｓ．ｈａｈｎｉ、Ｓ．ｏｗｅｎｉ、Ｓ．ｔｅｓｔａｃｅｕｓ、Ｓ．ｓｐｐ（南アメリカ）種；ファットテールサソリ種のＰａｒａｂｕｔｈｕｓ　ｔｒａｎｓｖａｌｌｉｃｕｓ種、Ｐ．ｇｒａｎｕｌｏｓｕｓ種、Ｐ．ｖｉｌｌｏｓｕｓ種。この目的で、毒素が純粋な形式で存在する必要はない。さらには、例えばカラムクロマトグラフィ法により毒を分別し、例えば細胞毒性を示す分画の成分で樹状細胞を装填することも可能である。
【００２３】
以下、本発明を実施例に関してより詳細に説明する。
（調整方法）
好ましくはヒト脊髄幹細胞を１ｍｌの容量を有するＥｐｐｅｎｄｏｒｆサンプルバイアル（Ｅカップ）に入れて急速凍結する。好ましくはそれは飽和した幹細胞溶液（食塩水または血漿、多くて５０μｌ）である。
【００２４】
さらに処理するために、５００ｍｌ　ＤＭＥＭ　Ｈａｍ’ｓ　Ｆ−１２、５０ｍｌ　ＲＰＭＩ　１２６０、１０ｍｌ　ペニシリン／ストレプトマイシン、５ｍｌ　グルタミンおよび５０ｍｌ　ＦＣＳから成る好ましくは７５０μｌの培地（３７℃）を加える。
【００２５】
その後、このように希釈された懸濁液を、泡を形成せずにボルテックスにて最低設定で１０〜１５秒間振動させて、均一な混合を行う。
その直後、懸濁液を７５ｃｍ２細胞培養フラスコに入れ、２０ｍｌの同じ培地（３７℃）を上に載せる。
【００２６】
細胞培養フラスコ中の懸濁液中に存在する脊髄幹細胞の最適な分布を達成するために、手動で２，３回注意深く揺り動かした。
その後、この細胞培養フラスコを３７℃に設定したインキュベータ内に置いた。
【００２７】
調製された細胞培養物は、インキュベータ内で、一定の温度（摂氏３７度）にて５日間放置しておくことが好ましい。
これは、フラスコの底への脊髄幹細胞の付着を可能にする。
インキュベータに細胞培養フラスコを置いた５日後に、脊髄幹細胞がフラスコの底に付着したどうかに関する、倒立顕微鏡による最初の視覚的モニタを好ましくは実行する。
【００２８】
細胞培養の調製の５日後に無菌条件下で最初の培地交換を以下のように実行することが好ましい。
培地フラスコは、フラスコ内に含まれるできるだけ多くの培地が、既に付着した細胞を同時に流出させることなく除去されるように保持される。任意選択で、ボトルネックをパッド上で穏やかにタッピングすることで、残っている培地が除去される。
【００２９】
このようにして集めた培地を捨てる。
続いて、２０ｍｌの新たな培地を、細胞培養フラスコの底から付着された細胞を解放させずに、注意深く細胞培養フラスコに入れる。
数枚の細胞層が互いの上に増殖し、最初の細胞が表面の培地から脱離し始めるまで上述した培地交換を３日か４日ごとに実行する。
【００３０】
各培地交換の前に、倒立顕微鏡により、細胞培養物の増殖をモニタする。
細胞培養フラスコの底で数枚の細胞層がフラスコに広がっている場合、約２０ｍｌの上清はすべて４個の小さな２５ｃｍ２フラスコに入れて等量で継代培養し、その後３７℃に温めた培地を上に載せる。
【００３１】
それらの継代培養物をさらに処理することなく、インキュベータ内で３７℃にて５日間放置する。
５日目から、上述の培地交換を３日または４日ごとに行い、いずれの場合も５ｍｌの培地は永久的な微視的制御下にある。
【００３２】
細胞層が細胞培養フラスコの底に完全に広がった場合、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４（例えばＢｉｏｃｈｒｏｍ社より入手）のそれぞれが９００Ｕ／ｍｌの濃度を達成するように、増殖因子の添加を行う。添加中は３７℃の温度が好まれる。滅菌２ｍｌピペットを使用して、増殖因子混合物と７００Ｕ／ｍｌ　ｓＩＬ−４Ｒの添加を行う。
【００３３】
細胞を底から脱離せずに、細胞培養フラスコを手で注意深く揺り動かす。
細胞培養フラスコを少なくとも２４時間インキュベータ内で３７℃にて保存する。
２４時間の経過前に、倒立顕微鏡を使用して樹状細胞が既に分化しているかどうかについて最初の視覚的制御を行う。その後、細胞を高度に滅菌した条件下でガラスパスツールピペットを使用して、３７℃に予め温めて置いた培地（２ｍｌ）を含む新しいフラスコ（２５ｃｍ２）に、新しい樹状細胞が元のフラスコ内に生成しなくなるまでできるだけ少ない培地の量で毎日移す。
【００３４】
新しい細胞培養フラスコに集められた樹状細胞のための培地交換は、同時に樹状細胞を吸引することなく古い培地のわずか１ｍｌが残るまでパスツールピペットで吸引し、次に３７℃に予め温めて置いた４ｍｌの新しい培地の４ｍｌで充填されるように、実行する。
【００３５】
その後、上述したように、３日か４日ごとに、この培地交換を行う。
そのようにして得られた少なくとも３週間生存する樹状細胞により、十分な数の治療目的が提供される。
【００３６】
（ペプチド毒素による樹状細胞の装填）
本発明で上述した方法によって調製された樹状細胞（２５０〜１５００万個の樹状細胞／５ｍｌ）の３〜５ｍｌの培養物を、０．５〜２．５ｍｌの皮膚癌細胞溶液（約２５０，０００個の皮膚癌細胞／ｍｌ細胞培地を含む新鮮に生成した純粋なヒト皮膚癌細胞培養フラスコの上清、培地：５００ｍｌ　ＤＭＥＭ　Ｈａｍ’ｓ　Ｆ−１２、１０ｍｌ　ペニシリン／ストレプトマイシン、５ｍｌ　グルタミンおよび５０ｍｌ　ＦＢＳ）と接触させた。その後、Ｌｏｘｏｓｃｅｌｅｓ　ｓｐｉｎｉｃｅｐｓに由来する画分３の約１５０μｇ／ｍｌのペプチド毒素を含む１〜２ｍｌの溶液を加えた。室温で２４時間インキュベーションを行った。予めオートクレーブしておいたパスツールピペットを使用して、約４ｍｌの培地上清（可能ならば樹状細胞を含まない）を無菌作業台の下で除去して捨てた。続いて１〜２ｍｌのペプチド毒素Ｌｏｘ．ｔｏｘ．３（最初の添加と同じ濃度）をさらに添加し、ペプチド毒素の最終濃度を約１００μｇ／ｍｌとする。このように装填された樹状細胞を、使用するまで、インキュベータ内で３７°Ｃにてインキュベートした。
【００３７】
そのように調製された樹状細胞、特に、例えば皮膚壊死作用、細胞毒作用、およびアポトーシス作用の少なくともいずれかを有する物質で装填された樹状細胞は、患者に、好ましくは脊髄幹細胞を得た患者に、医薬製剤の形で投与される。外来物質を装填した樹状細胞の投与は、それ自体公知の方法、例えば注入または点滴により実行され得る。さらには、活性物質を装填した樹状細胞が周囲の腫瘍組織に連続的に送達されるように、樹状細胞を腫瘍組織に沈着物の形で移植することも可能である。
【国際公開パンフレット】
2004510405.tif 000002
2004510405.tif 000003
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2004510405.tif 000018
2004510405.tif 000019
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004510405.tif 000020
【国際調査報告】
2004510405.tif 000021
2004510405.tif 000022
2004510405.tif 000023
2004510405.tif 000024