(57)【要約】本発明は、未知の照会ペプチドを既知のペプチドのデータベースにマッチングさせる方法を提供する。本明細書中に記載される方法は、未知の照会ペプチドの迅速で、感度のよい、および選択的な同定を可能にし、これは、ハイスループットのタンパク質同定の開発を可能にする。本明細書中に記載される方法は、さらに、照会ペプチドの質量分析データがその質により分類かつ重み付けされることを可能にする。さらに、本明細書中に記載の方法は、改変照会タンパク質を、改変の予測または改変されたペプチド質量を調整することによって改変された照会タンパク質のロバストな同定を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）インデックステーブルを構成する工程であって、該インデックステーブルは、複数の許容質量値に対応する複数のレコードを含み、該レコードは、ゼロ以上のフィールドを含み、
（ｉ）該複数のデータベースペプチドから第１のペプチドを選択する工程と、
（ｉｉ）該第１のペプチドの複数の関連する質量を計算する工程と、
（ｉｉｉ）該複数の関連する質量から第１の関連する質量を選択する工程と、
（ｉｖ）該複数のレコードから第１のレコードを参照する工程であって、該第１のレコードは該第１の関連する質量に対応する、工程と、
（ｖ）第１のフィールドを該第１のレコードに入力する工程であって、該第１のフィールドは、該第１のペプチドを参照する第１のペプチドインデックスを含む、工程と、
（ｖｉ）該複数の関連する質量から、少なくとも１つの他の関連する質量について、工程（ｉｉｉ）〜（ｖ）を繰返す工程と、
（ｖｉｉ）該複数のデータベースペプチドから、少なくとも１つの他のペプチドについて、工程（ｉ）〜（ｖｉ）を繰返す工程と、
を包含する、構成する工程と、
（ｂ）複数の比較スコアを生成する工程であって、該複数の比較スコアは、該複数のデータベースペプチドに対応し、
（ｉ）該照会ペプチドの複数の照会質量値を生成する工程と、
（ｉｉ）該複数の照会質量値から第１の照会質量値を選択する工程と、
（ｉｉｉ）該複数のレコードから第２のレコードを参照する工程であって、該第２のレコードは、該第１の照会質量値に対応する、工程と、
（ｉｖ）該第２のレコードから第２のフィールドを選択する工程であって、該第２のフィールドは、第２のペプチドインデックスを含む、工程と、
（ｖ）該複数の比較スコアから第１の比較スコアを選択する工程であって、該第１の比較スコアは、該第２のペプチドインデックスに対応する、工程と、
（ｖｉ）該第１の比較スコアをインクリメントする工程と、
（ｖｉｉ）該複数の照会質量値から選択された、少なくとも１つの他の照会質量値について、工程（ｉｉ）〜（ｖｉ）を繰返す工程と、
を包含する、生成する工程と
を包含する、照会ペプチドを複数のデータベースペプチドと比較する方法。
【請求項２】
前記生成する工程（ｂ）（ｉ）は、前記照会ペプチドに関して質量分光分析法を実行する工程を包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記質量分光分析法は、フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴分析法（「ＦＴＩＣＲ」）、四重極質量分析法、イオントラップ質量分析法、および飛行時間型質量分析法からなるセットより選択された方法によって実行される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記計算する工程（ａ）（ｉｉ）は、前記第１のペプチドの複数の関連する質量を計算する工程を包含し、該複数の関連する質量は、複数の１次質量および複数の相補的質量を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記生成する工程（ｂ）は、前記第１の比較スコアを、重み値で乗算する工程をさらに包含し、該重み値は、該質量値のタイプの関数である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記質量値のタイプは、ｙイオン、ｂイオン、ピーク質量、および相補的質量からなる群より選択される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
（ａ）第１のインデックステーブルを構成する工程であって、該第１のインデックステーブルは、複数の許容質量値に対応する第１の複数のレコードを含み、該レコードは、ゼロ以上のフィールドを含む、構成する工程と、
（ｂ）第２のインデックステーブルを構成する工程であって、該第２のインデックステーブルは、該複数の許容質量値に対応する第２の複数のレコードを含み、該レコードは、ゼロ以上のフィールドを含む、構成する工程と、
（ｃ）複数の重み値を計算する工程であって、該重み値は、該第１および該第２のインデックステーブルの予測値により設定される、計算する工程と
を包含する、照会ペプチドを複数のデータベースペプチドと比較する方法。
【請求項８】
（ａ）照会ペプチドの複数の照会質量値を生成する工程と、
（ｂ）該複数の照会質量値から照会質量値のセットを同定する工程であって、該セットは、変更された質量値に対応する、工程と、
（ｃ）該照会ペプチドのスペクトル範囲を決定する工程と、
（ｄ）該スペクトル範囲を複数の等しい区間に細分する工程と、
（ｅ）該複数の等しい区間について複数の検索を実行する工程と
を包含する、改変された照会ペプチドを複数のデータベースペプチドと比較する方法。
【請求項９】
該照会質量値のセットを排除する工程をさらに包含する、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記照会質量値のセットを調整する工程をさらに包含する、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
インデックステーブルを構成する工程を包含する、照会ペプチドを複数のデータベースペプチドと比較する方法であって、該インデックステーブルは、複数の許容質量値に対応する複数のレコードを含み、該レコードは、ゼロ以上のフィールドを含み、該構成する工程は、
（ｉ）該複数のデータベースペプチドから第１のペプチドを選択する工程と、
（ｉｉ）該第１のペプチド上の改変部位を同定する工程と、
（ｉｉｉ）該改変部位に改変を適用して、第１の改変ペプチドを生成する、工程と、
（ｉｖ）該第１の改変ペプチドの複数の関連する質量を計算する工程と、
（ｖ）該複数の関連する質量から第１の関連する質量を選択する工程と、
（ｖｉ）該複数のレコードから第１のレコードを参照する工程であって、該第１のレコードは、該第１の関連する質量に対応する、工程と、
（ｖｉｉ）第１のフィールドを該第１のレコードに入力する工程であって、該第１のフィールドは、該第１のペプチドを参照する第１のペプチドインデックスを含む、工程と、
（ｖｉｉｉ）該複数の関連する質量からの、少なくとも１つの他の関連する質量について、工程（ｖ）〜（ｖｉｉ）を繰返す工程と、
（ｉｘ）該複数のデータベースペプチドからの、少なくとも１つの他のペプチドについて、工程（ｉ）〜（ｖｉｉｉ）を繰返す工程と
を包含する、方法。
【請求項１２】
前記同定工程（ｉｉ）は、リン酸化部位、酸化部位、および置換部位からなる群より選択される改変部位を同定する工程を包含する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記リン酸化部位は、セリン、スレオニンおよびチロシンからなる群より選択されるアミノ酸を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記酸化部位は、システインおよびメチオニンからなる群より選択されるアミノ酸を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記置換部位は、グルタミン、グルタメート、アスパラギンおよびアスパルテートからなる群より選択されるアミノ酸を含む、請求項１２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、プロテオミクス解析の分野に関し、特に、質量分析法によって分析されたタンパク質をデータベース内の公知のアミノ酸配列と一致させる方法の提供に関する。
【背景技術】
【０００２】
（関連技術の記載）
タンデム質量分析（「ＭＳ／ＭＳ」）技術は、ペプチドの分析について実証されている。タンデム質量分析法において、ペプチドは、ペプチドの混合物から、特定の質量または分子量の標的ペプチドを選択するために利用される、第１の質量分光計に付与される。標的ペプチドは、その後、インタクトペプチドおよび種々の成分フラグメント、通常、質量が比較的小さいペプチドを含む混合物を生成するために活性化または断片化される。この混合物は、その後、フラグメントスペクトルを生成する第２の質量分光計に付与される。このフラグメントスペクトルは、通常、複数のピークを有する棒グラフの形態で表され、各ピークは、検出されたフラグメントの質量／電荷比を示す。
【０００３】
従って、フラグメントスペクトルは、標的ペプチドを同定するために用いられ得る。前のアプローチは、通常、１つ以上の候補アミノ酸配列を仮定するための基準としてのフラグメントスペクトルの使用を含む。この手順は、通常、熟練の研究者による人的分析を含むが、少なくとも１つのオートメーション化された手順がＪｏｈｎ  Ｙａｔｅｓ，ＩＩＩらによる「Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  Ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ＩＩ」１９９１年、４７７〜４８５ページに記載される（本明細書中に参考のため援用される）。候補配列は、その後、タンパク質配列ライブラリにおける種々のタンパク質の既知のアミノ酸配列と比較され得る。
【０００４】
ゲノムを配列する試みは、膨大な生のＤＮＡ配列情報をもたらし、その後、膨大なタンパク質配列情報をもたらす。タンパク質配列情報の量が増加すると、その推定消化物およびフラグメント生成物に関する情報の量が増加する。
【０００５】
２つの場合は、データベース検索することによって、ペプチドを同定する際の重要な考察を高速化するために、質量分析法フラグメントスペクトルと組み合わされる。
【０００６】
第１の場合は、既知のペプチドのデータベースが急速に増加する場合である。既知のペプチドがこのように増加する１つの原因は、データベース内で分類整理されている既知のタンパク質の数が増加するということである。その結果、その推定消化物生成物の数が対応して増加する。第２の原因は、ヒトのゲノムが配列されており、多くの他のゲノムが現在配列中であるということである。これらのゲノムは、理論的翻訳および消化によって多数のペプチドを同様に示す。
【０００７】
第２の場合が、未知のペプチドから生成されるフラグメントスペクトルがより多い場合である。このような状態において、能力または容量それ自体は、その後、益々要求される。オートメーション化されたフラグメントスペクトルの収集のいくつかの新しい技術は、ペプチドに関するハイスループットの実験の知名度を高めた。
【０００８】
オートメーション化されたフラグメントスペクトルを収集するための新しい技術は、ＬＣカラムからの連続的入力により、フラグメントの候補ペプチドをオートメーション化して選択するための新しいＭＳ機器の能力を含む。別の新しい技術は、表された遺伝子から数千のペプチドを収集するためのＩＣＡＴプロトコルである。これらの２つの技術を組み合わせることによって、ほぼ１千個のフラグメントスペクトルが３時間以内の機械の運転で生成され得る。ＭＡＬＤＩ技術は、さらに、ハイスループットのために適切である。
【０００９】
候補アミノ酸配列を生成するためのフラグメントスペクトルの解釈には時間がかかり、多くの場合、不正確であり、非常に専門的であり、一般に、タンデム質量分析法での広範囲に及ぶ実験を行ういくつかの研究所によってのみ実行され得る。人的解釈への依存は、多くの場合、分析が、比較的ゆっくりとしており、かつ客観性を欠くことを意味する。ペプチド質量マッピングに基づくアプローチは、特定かつ既知のタンパク質分解分割により生成されるインタクト均質なタンパク質から導き出されるペプチド質量に制限され、従って、一般的に、タンパク質の混合物には適用され得ない。
【００１０】
質量分析法によるハイスループットタンパク質同定についての１つの障害は、質量に影響を及ぼすタンパク質に対する改変の存在であり、照会質量比の浪費、かつ、意図されないヒットをもたらす。この問題に対処するための従来技術における方法は、改変がイオン中にある場合、改変は相補体中にはないので、ｂイオンに対して相補的ｙイオンを採用し、改変がイオン中にない場合、改変は相補体中にはないので、ｂイオンに対して相補的ｙイオンを採用しない。この方法の１つの残念な副作用は、照会質量比の数を２倍にすることによって、ノイズレベルもまた２倍にされることである。Ｃｌａｕｓｅｒ  ＫＲ、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ９２：５０７２−６（１９９５年）を参照されたい。
【００１１】
ペプチドの同定において、感度および選択性が改善されるように速度および柔軟性が向上される必要がある。これは、ハイスループットペプチド同定プロジェクトを容易にし得る。これらのプロジェクトは、次に、新しい有益な薬剤の発見、生物学的プロセスのより良好な理解、従って、より良好な製品、ならびに、健康の維持かつ農業のためになる方法をもたらす。
【００１２】
さらに、ペプチドのハイスループット同定における感度および選択性を向上させる必要がある。
【００１３】
さらに、ペプチドのハイスループット同定におけるペプチド改変の影響を最小化する必要がある。
【００１４】
さらに、改変の質量が既知の場合、改変された照会ペプチドの同定のロバストネスを強化するために、この質量情報を採用する必要がある。
【００１５】
最後に、最も一般的なタイプの改変を含む照会タンパク質を同定する場合、速度およびロバストネスを強化する必要がある。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１６】
（発明の簡単な要旨）
これらの要素の各々および方法の実施の詳細な記載が以下に提供される。本明細書中で引用されるすべての参考資料は、参考のため、その全体が援用される。
【００１７】
１局面において、本方法は、照会ペプチドを、照会ペプチドおよび予備計算されたペプチドインデックスからの質量分析データを用いる複数のデータベースペプチドと比較する方法に関する。
【００１８】
別の局面において、本発明は、種々のカテゴリのヒットを同定することによって、および、これらのカテゴリに割り当てられた重みのセットを最適化することによって、質量分析法フラグメントスペクトルからペプチドを同定する際の感度および選択性を向上させる方法に関する。
【００１９】
別の局面において、本発明は、改変された照会ペプチドを複数のデータベースペプチドと比較する場合、照会ペプチドの改変の有害な影響を最小化する方法に関する。
【００２０】
別の局面において、本発明は、同定のロバストネスを強化するために照会ペプチドの既知の改変の質量情報を採用する方法に関する。
【００２１】
別の局面において、本発明は、改変された照会ペプチドを複数の改変されたデータベースペプチドによって補強された複数のデータベースペプチドと比較することによって改変された照会ペプチドの同定の速度を高める方法に関する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
（発明の詳細な説明）
（定義）
本発明の目的で、「ペプチド」は、アミノ酸の配列のことである。「ペプチドデータベース」は、ペプチドのリストのことである。「ペプチドインデックス」は、ペプチドデータベースにおける特定のペプチドを配置するための同定情報のことである。１実施形態において、ペプチドインデックスは、データベースの先頭からのオフセット値のことである。
【００２３】
本発明の目的で、ペプチドの「最初のストリング」は、ペプチドの最初のアミノ酸にて開始するペプチドの部分列のことである。同様に、ペプチドの「末端ストリング」は、ペプチドの最後のアミノ酸にて終端するペプチドの部分列のことである。最初のストリングおよび末端ストリングの両方は、ペプチド全体のことであり得る。
【００２４】
本発明の目的で、ペプチドが断片化され、電荷がＮ末端分割フラグメントにて保持される場合、生じたイオンは、「ｂイオン」と標識付けされる。同様に、電荷がＣ末端分割フラグメントにて保持される場合、生じたイオンは、「ｙイオン」と標識付けされる。ｂイオンの質量は、アミノ酸質量を合計し、かつプロトンの質量を加算することによって計算される。ｙイオンの質量は、Ｃ末端から、アミノ酸の質量を合計し、かつ水およびプロトンの質量を加算することによって計算される。
【００２５】
本発明の目的で、ペプチドの質量は、その構成要素であるアミノ酸の質量の合計である。ペプチドの「最初の質量」のセットは、すべての可能な最初のストリングの質量からなる。同様に、ペプチドの「末端質量」のセットは、すべての可能な末端ストリングの質量からなる。ペプチドの「関連する質量」のセットは、最初の質量のセットおよび末端質量のセットの結合（ｕｎｉｏｎ）からなる。他に明示なき場合、「質量」、「質量比」「質量／電荷比」という用語は、本発明の目的で、交換可能に用いられる。
【００２６】
ペプチドの「予測質量比」のセットは、ペプチドのサンプルについての質量分析計測を実行することから生じることが期待される質量／電荷値のセットである。
【００２７】
本発明の目的で、「インデックステーブル」は、個別の質量値をによってレコードに索引付けされ、かつ、フィールドがこれらの値をもたらす関連ペプチドについてのリファレンスを含むデータ構造のことである。インデックステーブルの「許容値」は、テーブルのインデックスの許容可能な値の範囲のことである。インデックステーブルの「ロー」はレコードのことであり、「カラム」はフィールドのことである。
【００２８】
本発明の目的で、「照会ペプチド」は、ペプチドデータベースと比較されるべきペプチドのことである。「照会スペクトル」は、複数の質量／電荷値を比較する照会ペプチドのサンプルの質量分析フラグメンテーションスペクトルである。本発明の目的で、照会スペクトルは、質量分析データからの任意の強度値を含まない。「照会質量」および「照会質量比」のセットは、照会スペクトルから導き出された質量のセットのことである。「１次照会質量」および「１次照会質量比」のサブセットは、フラグメンテーションスペクトルにおけるピークから直接的に導き出されたものである。「相補的照会質量」および「相補的照会質量比」のサブセットは、全照会ペプチドの質量から１次照会質量を減算することによって計算されたものである。
【００２９】
本発明の目的で、「ヒット」は、ペプチドインデックスがインデックステーブルの質量値に位置付けられたことを表し、質量値と照会質量との間の絶対差は、所定の許容値よりも小さい。
【００３０】
本発明の目的で、「ピーク質量比」は、推定同位元素パターンおよび／または電荷の測定された質量／電荷比を調整することによって導き出される照会質量比である。
【００３１】
本発明の目的で、「改変」は、ペプチドの質量比の変化であり、そのペプチドのアミノ酸の１つが変更されるか、または、そのペプチドのＮ末端またはＣ末端基が変更されることのどちらかによって起こる。アミノ酸は、リン酸化、グリコシル化または異なったアミノ酸と置換されることによって改変され得る。改変の「場所」は、改変されたアミノ酸の場所である。本発明の目的で、ペプチドの「スペクトル範囲」は、ゼロから、無改変ペプチドの分子量におよぶ。
【００３２】
本発明の目的で、改変された照会ペプチドの「差質量」は、改変された照会ペプチドの分子量と、無改変の照会ペプチドの分子量との間の差のことである。例えば、改変がリン酸化である場合、差質量は、差質量は、ホスホリル基の質量である。「改変質量比」は、改変されたペプチドの第１の改変されたｂイオンの質量／電荷比のことである。
【００３３】
（予備計算されたインデックステーブルを用いる基本検索方法）
本発明の検索方法は、インデックステーブルの予備計算を必要とする。インデックステーブルは、許容値の範囲内の個別のインクリメントにおける質量によって索引付けされる。例えば、インデックステーブルは、０．０１〜３０，０００ダルトンの値を含み得、０．０１ダルトン刻みで増えて３，０００，０００ローのテーブルになる。
【００３４】
図１を参照して、インデックステーブルの生成は、ペプチドデータベースからペプチドを選択する工程（工程１００）、ペプチドの関連する質量のセットを計算する工程（工程１１０）、および各関連する質量について、ペプチドインデックスをその質量に対応するインデックステーブル内のローの中に配置する工程（工程１２０）を包含する。工程１００〜１２０は、その後、ペプチドデータベース内の各ペプチドについて繰返される（工程１３０）。
【００３５】
図２を参照して、検索は、ペプチドデータベース内のすべてのペプチドについて、すべての関連する質量のセットに対して参照質量のセットを比較する工程を包含する。１実施形態において、検索は、参照ペプチドから質量分析データを生成する工程（工程２００）、スペクトルからピークを同定し、その質量を決定する工程（工程２１０）、その質量に対応するインデックステーブルへの入力をルックアップする工程（工程２２０）、同じ関連する質量を有するデータベースにおける全てのペプチドのスコアをインクリメントする工程（工程２３０）を包含する。工程２００〜２３０は、その後、スペクトルにおける各ピークについて、繰返される（工程２４０）。最後に、ヒットの最大数を有するこれらのペプチドが同定される。
【００３６】
メモリおよび速度の両方に関して効率的であるインデックステーブルを生成することが可能である。１実施形態において、インデックステーブルは、２段階で計算される。第１の段階において、ローごとの入力の数が計算される。ローごとの入力の数に基づいて、そのローの適切な量のメモリが割り当てられる。第２の段階において、ローは、各ローに対応する関連する質量の原因であるペプチドを参照するペプチドインデックスで占められる。
【００３７】
１実施形態において、検索が以下のように実行される。スコア値がペプチドデータベース内のペプチドごとに割り当てられ、かつ初期化される。各照会質量について、インデックステーブルにおける対応するローが参照され、ローにおけるペプチドインデックスの全てがルックアップされ、かつこれらのペプチドインデックスと関連するすべてのスコア値がインクリメントされる。
【００３８】
さらなる実施形態は、照会質量を、ペプチドデータベース内のペプチドと関連する質量とマッチングさせるための許容誤差を採用する。照会質量と、関連する最初のストリングの期待されるＮ末端質量との間の差が最初の質量の許容誤差内である場合、照会質量は、最初の質量をヒットし得る。同様に、照会質量と、関連する末端ストリングの期待されるＣ末端質量との間の差が末端質量の許容誤差内にある場合、照会質量は、末端質量をヒットし得る。本実施形態において、検索は以下のように実行される。前述の例のように、スコア値は、ペプチドデータベース内のペプチドごとに割り当てられ、かつ初期化される。しかしながら、照会質量に対応するローを参照することに加えて、特定の許容誤差内の隣接し合うすべてのローもまた参照される。前述の例と同様の態様で、参照されたローのすべてにおけるペプチドインデックスのすべてがルックアップされ、これらのペプチドインデックスと関連するすべてのスコア値がインクリメントされる。
【００３９】
（重み付き検索方法：ヒットのカテゴリ）
１実施形態において、実験データは、ピークのいくつかのカテゴリが他よりも多くの予測ヒットをもたらし得ることを示すので、検索方法は、重み付けファクタのセットを照会スペクトルにおけるピークの種々のカテゴリに対して採用する。照会スペクトルにおけるピークは、いくつかの基準によって分類され得る。１つのこのような基準は、ｙイオン、ｂイオン、ａイオンまたはインモニウムイオンといったピークを生成したイオンのタイプである。別の基準は、ピークが１次ピークであるか相補的ピークであるかということである。
【００４０】
質量分析法において、ペプチドのサンプルは、複数のサブフラグメントイオンに断片化され、これらのイオンの質量／電荷比が決定される。ｙイオン、ｂイオン、ａイオンおよびインモニウムイオンを含むサブフラグメントイオンのカテゴリは、当該分野にて周知である。例えば、ｙイオンは、一般的な機器におけるいくつかの一般的な設定のｂイオンの、約２倍一般的であることが観察されている。従って、予測されるｙイオンに関するヒットの数は、予測されるｂイオンに関するヒットの数よりも予測的であるべきである。従って、より予測的なカテゴリからのヒットがより重く重み付けされた場合、次の照会ペプチドの同定は、真実である傾向が強くなり得る。
【００４１】
本実施形態において、イオンタイプのセットが選択される。好適な実施形態において、単一荷電ｙイオンおよびｂイオンのセットが選択される。その後、すべての可能なサブフラグメントイオンのセットがペプチドデータベース内のペプチドごとに計算され、予測される質量／電荷比がサブフラグメントイオンごとに計算され、ペプチドインデックスは、上記の節に記載されたように、予測される質量／電荷比のセットに従って占められる。
【００４２】
本実施形態において、照会スペクトルは、選択されたセットのイオンタイプのイオンに対応するピークについて検査される。照会質量のセットは、選択されたセットのイオンタイプに対応すると考えられるこれらのピークを選択することによって決定される。
【００４３】
このピークに属する同位元素パターンが、ピークが単一電荷を有することを示す場合のように、時に、ピークそれ自体の質量比が照会質量比である。同位元素パターンが、ピークを引き起こすイオンが２の電荷を有することを示す場合、そのピークの質量比は２で乗算され、水素の質量が減算されて、照会質量比として用いられ得る。同様に、同位元素パターンが他の電荷を示す場合、ピークの質量比は、これが照会質量比として用いられる前に、等価の単一荷電、単一同位元素質量比に適合される。
【００４４】
照会質量比のセットは、１次照会質量比および相補的照会質量比に分割され得る。照会スペクトルから直接的に導き出されたセットは、１次照会質量比のセットと呼ばれる。１実施形態において、相補的照会質量比Ｃは、以下の式
Ｃ＝Ｑ＋２Ｈ−Ｐ
によって計算され、ここで、Ｑは、照会ペプチドの分子量、Ｈは、水素の質量、およびＰは、１次照会質量比である。照会質量比のセットは、１次質量比および相補的質量比のセットの結合を含む。
【００４５】
（重みの最適セットの決定）
フラグメンテーションスペクトルにおけるデータの質は、ピークによって異なり得るので、フラグメンテーションスペクトルから導き出されるデータを有するペプチドデータベースの検索は、多くの場合、十分な特異性および感度でマッチングを生成することに失敗する。１実施形態において、本方法は、ピークの感知された質に従って、フラグメンテーションスペクトルからピークを分類し、より高い質のピークに、より多くの重みを割り当てる。例えば、ピークの質は、ピークがｙイオンを表すか、ｂイオンを表すかによって異なり得る。特に、ｙイオンが、一般的な設定の一般的な機器におけるｂイオンの２倍一般的である傾向があるため、ｙイオンに関するヒットの数が、ｂイオンのヒットの数の約２倍予測的であるということになる。別の例において、ピークの質は、さらに、その強度と比例して変化し得る。
【００４６】
１実施形態において、ピークの各カテゴリに割り当てられる重みは、学習例の使用によって計算される。学習例は、正確なペプチドが知られる照会スペクトルを含む。カテゴリに割り当てられた重みは、学習例に適合かつ調節されるので、データベースペプチド内の既知の回答は、他の可能性に比べて最も際立っている。
【００４７】
図式的例において、ペプチドデータベース内にｎ個のピプチドがあり、ｍ個のカテゴリのヒットがあり、Ｈｉｊはペプチドｉのカテゴリｊにおけるヒットの数であり、Ｗｊは、カテゴリｊの重み値であると仮定されたい。この例において、Ｘｉは、ペプチドｉのスコアであり、以下のように
【００４８】
【数１】
2004526958.tif 000002
計算される。
平均スコア
【００４９】
【数２】
2004526958.tif 000003
は以下のように
【００５０】
【数３】
2004526958.tif 000004
計算される。
【００５１】
【数４】
2004526958.tif 000005
の母分散σ２が以下のように
【００５２】
【数５】
2004526958.tif 000006
計算される。
【００５３】
学習サンプルにおいて、照会ペプチドは既知であり、かつペプチドデータベース内の位置ｑにて存在する。スコアがＸｑであるとすると、照会ペプチドについて計算される。標準偏差Ｄを以下のように
【００５４】
【数６】
2004526958.tif 000007
定義されたい。
【００５５】
重みの所望のセットは、正確なマッチングのためのスコア（この場合、Ｘｐ）をすべての他のスコアから区別するものである。従って、この例においては、最大化する重みＤを設定することが望ましい。
【００５６】
最適な重みを決定する１方法において、共分散値Ｃａｂが用いられる。値Ｃａｂは、カテゴリａとカテゴリｂとの間の共分散を表し、以下のように
【００５７】
【数７】
2004526958.tif 000008
計算される。
【００５８】
次に、上述の分散の計算は、重みおよび共分散に関してもまた表され得る。
【００５９】
【数８】
2004526958.tif 000009
特定の重み値Ｗｋに対して導関数を用いると、
【００６０】
【数９】
2004526958.tif 000010
になる。同様に、特定の重み値Ｗｋに対するＮ２の部分導関数が
【００６１】
【数１０】
2004526958.tif 000011
のように表され得る。
【００６２】
これをゼロに設定し、
【００６３】
【数１１】
2004526958.tif 000012
を想定することによって単純化すると、
【００６４】
【数１２】
2004526958.tif 000013
が得られる。
これは、
【００６５】
【数１３】
2004526958.tif 000014
と書き直され得る。ベクトルおよびマトリックス表記を用いて、かつベクトルｄを、
【００６６】
【数１４】
2004526958.tif 000015
になるように定義する。
従って、
【００６７】
【数１５】
2004526958.tif 000016
および、従って、
【００６８】
【数１６】
2004526958.tif 000017
である。
【００６９】
この等式は、学習例ｑの重みの最適セットをもたらすように解かれ得る。
【００７０】
本発明は、次の未知のペプチドのために用いる重みのセットを決定するために
学習例のセットを用いる。学習例ごとに、最適な重みのセットが計算かつ正規化され、従って、これらの平方の合計は１である。その後、これらの正規化された重みの各々の学習例のセットの平均が、新しい未知のペプチドに関して検索する際に用いられる。重みの所望のセットは、標準偏差を最大化するものである。
【００７１】
一旦重みのセットが決定されると、重みは、未知の照会スペクトルをアッセイする際に用いられ、これらの重みが未知の照会ペプチドの同定を改善するという理にかなった期待がなされる。１実施形態において、異なったイオンタイプの予測される質量比のために、別個のインデックステーブルが生成される。代替的実施形態において、１次質量比および相補的質量比に対して別個のインデックステーブルが生成される。これらの実施形態において、各インデックステーブルは、これと関連する重みを有する。検索の間、スコア値がインクリメントされる。従って、インデックステーブルごとのスコア値は、その重みで乗算される。最後に、ペプチドデータベース内のペプチドごとのスコア値が、インデックステーブルにわたって合計される。
【００７２】
さらなる実施形態において、別個の直交基準の別個のインデックステーブルが生成される。例えば、別個のインデックステーブルは、照会質量比がｂイオンを表すか、ｙイオンを表すかによって、および紹介質量比がピーク質量比を表すか、または相補的質量比を表すかによって生成され得る。この例において、４つの別個のインデックステーブルが生成される。１つはｂイオンのインデックステーブル、１つはｙイオンのインデックステーブル、１つはピーク質量比のインデックステーブル、および１つは、相補的質量比のインデックステーブルである。照会ペプチドをこれらのテーブルと比較すると、４つの別個のカウントをもたらす。各カウントは、その後、テーブルの対応する重みで乗算され、すべての重み付けされたカウントが合計されて、照会タンパク質の重み付きスコアが生成される。
【００７３】
（ペプチド改変の効果の最小化）
多くのペプチドは、リン酸化およびグリコシル化を含む翻訳後改変といった改変を含む。他の改変は、アミノ酸の置換およびＮ末端またはＣ末端基の変化を含む。このような改変は、ペプチドの質量を変更し、ペプチドが質量分析法によって同定されることを困難にする。特に、このような改変の結果、照会ペプチドのイオンのいくつかが、無改変ペプチドの対応するイオンとは化学的に異なる。従って、照会質量比のいくつかは、それらの予測された質量比とはマッチングしない。改変の場所が未知である場合、改変によって影響が及ぼされたイオン、およびそれらのイオンの測定された質量／電荷比がどれであるのかもまた未知である。実験的証拠は、未知の照会ペプチドの改変があった場合、照会ペプチドの質量比の約半分が、正確なペプチドの予測された質量比に対応しないことが観察されることを示す。すなわち、改変された照会ペプチドの照会質量の約半分は、正確なペプチドを他のペプチドから区別することが期待されない。すなわち、これらの改変された照会質量は、正確なデータベースペプチドのスコアに寄与しないという点で廃棄されるだけでなく、不正確なデータベースペプチドのスコアを増加させるという点で、実際、有害である。１実施形態において、本発明は、改変された照会質量を同定する。
【００７４】
改変された照会ペプチドの分子量と無改変の照会ペプチドの分子量との間の差は、「差質量」と呼ばれる。差質量が既知でない場合、照会スペクトルにおける改変された質量比は、比較から排除されるべきである。差質量が既知である場合、その情報は、照会質量比を調整するために用いられ、従って、検索の選択性および感度を向上させるべきである。１実施形態において、照会質量比は、それらから異なった差質量を減算することによって調整される。
【００７５】
１実施形態において、検索方法は、照会ペプチドのスペクトル範囲を区間に分割し、および区間ごとに別個の検索を実行することによって改変された照会タンパク質の改変された照会質量を同定する。さらなる実施形態において、これらの改変された照会質量は、ペプチドインデックスとの比較から排除される。代替的実施形態において、これらの改変された照会質量は、ペプチドインデックスとの比較のために用いられる前に調整される。
【００７６】
ゼロから無改変の照会ペプチドの質量の範囲は、スペクトル範囲と呼ばれる。照会ペプチドの質量を仮定すると、予測された質量よりも高いすべての照会質量比は改変に起因し得る。１実施形態において、スペクトル範囲は、区間に分割され、各区間にわたって別個の検索が実行される。
【００７７】
１実施形態において、照会ペプチドのスペクトル範囲は、ｍ個の等しい区間に分割される。質量ｊから質量ｋのこのような区間の１つを考慮に入れ、かつ改変質量比が［ｊ，ｋ］区間に位置することを想定されたい。改変が、［ｊ，ｋ］区間に位置すると想定することによって、改変された照会質量比のセットが同定され得る。差質量が未知である場合、これらの同定された質量比は、その後、比較から外れ得、あるいは、差質量が既知である場合、調整され得る。質量比の異なったセットが同定され得、例えば、あるセットは、予測されたｂイオン質量比と比較することによって同定され得、別のセットは、予測されたｙイオン質量比と比較することによって同定され得る。特に、ｋよりも大きいすべての照会質量比は外されるか、または、予測されたｂイオン質量比に対するヒットを捜す場合、調整される。分子量よりも大きいすべての照会質量比（２Ｈ−ｊ）が外されるか、または、予測されたｙイオン質量比に対するヒットを捜す場合、調整される。
【００７８】
本実施形態において、照会ペプチドのスペクトル範囲がｍ個の区間に分割された後、各区間について別個の検索が実行され、各検索は、照会ペプチドの改変がその検索の区間に位置することを想定する。別個の検索を実行した後、各検索からのスコアは、合計され、検索のすべてにわたって最も高いスコアを有するペプチドは、照会ペプチドとの最良のマッチングであることが決定される。
【００７９】
本実施形態の方法は、検索プロセスにおけるヒットの分布を変更することによって、改変された照会タンパク質の感度および特異性を向上させる。検索プロセスにおける改変された照会質量比を同定するという期待される利点を理解するために、最初に、１つの区間が改変された照会ペプチド全体を扱う通常の検索における予測されるヒットの分布を検査することが必要である。
【００８０】
照会ペプチドがｋ個のペプチドからなるペプチドデータベースと比較されると仮定されたい。ヒストグラムＦが構成され得、ここで、Ｆｂは、ｂ個のヒットを受け取るデータベースペプチドの数を表す。従って、ｂ個のヒットを受け取るデータベースにおけるペプチドのフラクションＤｂは、
Ｄｂ＝Ｆｂ／ｋ
と計算され得る。検索がトライアルの数と定義された場合（ここで、各照会質量はトライアルを表す）、および成功がペプチドインデックスにおけるペプチドをヒットする照会質量と定義される場合、Ｄ（およびＦ）は、２項分布に続くと見なされ得る。２項分布の分散は、トライアルの数と比例する。特に、２項分布（ｎ，ｐ）の分散（ここで、ｎはトライアルの数であり、ｐはトライアルごとの成功の確率である）は、ｎｐ（１−ｐ）である。換言すると、Ｄ（およびＦ）の分散は、検索において用いられる照会質量比の数と比例する。真のヒットとノイズとの間が著しい対照をなす場合、Ｄ（およびＦ）の所望の確率密度は、ヒットの高い数を受け取る小さい数の配列を表す。２項分布は、ｎの低い値、特にｐの小さい値の理想に近づく。検索を短い区間に制限することは、照会質量比の数、またはｎ個の数を低減し、これは、次に、Ｄ（およびＦ）のより有用な確率密度関数をもたらす。
【００８１】
図式的例において、２つの検索が実行され、その結果は、ヒストグラムベクトルＨ１およびＨ２を計算するために用いられる。この例において、Ｈ１およびＨ２が相関しないと想定すると、次に、Ｈ１およびＨ２は、上述のＦおよびＤと同じ密度の関数を有する確率変数になる。ここで、第１の検索は、ｎ個の照会質量からなり、第２の検索は、２ｎの照会質量からなると想定されたい。次に、Ｈ２の分散は、Ｈ１の分散の２倍になる。従って、より小さい区間にわたる検索は、照会質量の数を低減するので、区間検索は、ペプチド全体にわたる検索よりも小さい分散を有する。
【００８２】
より大きいペプチドデータベースについて、すなわち、ｋの増加する値について、差は、なおさら目立つようになる。この根底にある密度Ｄは、一定の状態で保持されるが、ヒストグラムＦにおける生の値は、ｋと比例して大きくなり、その結果、所望の２項分布にさらに近接する。ペプチドをｍ個の区間に分割、そしてｍ回の検索を実行することによって、ペプチドデータベースの大きさは、ｍのファクタだけ有効に増加される。従って、本明細書中に記載される方法は、その結果のための所望の確率密度関数を設計し、かつその結果を所望の関数とより近く相関させるという２つの目的を実行する。しかしながら、ｍ回の検索を実行し、かつペプチドデータベース内のペプチドの数をｍのファクタだけ有効に大きくするために予測される不利な点は、このアプローチが、さらに、Ｆをｍのファクタだけ大きくし、分布のテールを上昇させて、その低下の速度を遅くすることである。
【００８３】
区間の数が小さい場合、改変された照会質量が区間の数が大きい場合ほど外されない。しかしながら、より多く検索すると、上述の不利な点が増加する。実験的証拠は、６が、使用する区間のほぼ最適な数であることを示す。正確なペプチドに関するヒットの数のテールにおける位置、およびテールの減衰の態様は、推定されている。実験的証拠は、ｍ〜６について、改変された照会質量を除去するという予測される利点は、予測される不利な点を３０のファクタ上回ることを示す。実験的証拠は、さらに、ｍ〜６について、改変された照会質量を調整するという予測される利点は、予測される不利な点を５０００のファクタ上回ることを示す。
【００８４】
１実施形態において、区間における照会質量の数は、改変された照会質量を同定および除去することによってさらに低減される。例えば、上述のように、照会質量の半分が除去された場合、生じる分布の分散が半分になる。
【００８５】
代替的実施形態において、改変された照会質量が同定され、その後、調整される。さらなる実施形態において、改変された照会質量は、既知の差質量を減算することによって調整される。調整された改変照会質量は、比較から排除されないが、ペプチドデータベースへのこれらの質量のヒットが、無調整の状態で残される場合よりも正確である傾向が強い。この実施形態の方法は、改変された照会タンパク質に対して正確なヒットの数を２倍にする方法と見なされ得る。
【００８６】
本明細書中の実施例は、単一改変タンパク質の分析を記載するが、当業者は、記載された方法が２つ以上の改変を含むタンパク質を分析するためにどのように容易に拡張されるかを容易に理解し得る。
【００８７】
（ペプチドデータベースへの改変されたペプチドの付加）
１実施形態において、この発明は、インデックステーブルの構成についての処理の前に、改変されたペプチドをペプチドデータベースに適切に付加することによって、未知の改変された照会ペプチドが正確に同定される確率を高くする方法を提供する。
【００８８】
ペプチドへの最も一般的な改変は、特定のアミノ酸のみに適用することが当該技術においてよく確立されている。例えば、セリン、スレオニン、およびチロシンは、リン酸化に対する受容性がある。同様に、システインおよびメチオニンのみが、一般に、酸化される。アミノ酸の点突然変異は、他のものよりも一般的であることがまた当該分野においてよく確立されている。例えば、グルタメートは、多くの場合、グルタミンで置換され、アスパルテートはアスパラギンで置換されると見なされる。従って、一般的改変の小さいセットが考慮に入れられる場合、ペプチドデータベース内の所与のペプチドの可能な改変の数は、比較的小さい。例えば、６００〜２０００ダルトンの間の分子量を有する平均的ペプチドは、２つのリン酸化部位を有する。この計算によって、ペプチドデータベースへの、単一リン酸化ペプチドの分散の付加は、大きさを３のファクタだけ増加させる。
【００８９】
実験的証拠は、３つの特定の改変が、タンデム質量分析計において測定された改変ペプチドの大部分の原因であることを示す。３つの特定の改変は、メチオニンの酸化、グルタミンからグルタメートへの突然変異、およびアスパラギンからアスパレートへの突然変異である。１つのペプチドデータベースについて、これらの３つのクラスの改変を組み入れる異形ペプチドを付加することによって、データベースの大きさが４０％〜１５０％増すことが計算される。インデックステーブルの大きさが、これを生成するために用いられるペプチドデータベースの大きさに対して、大抵、不変であり、すなわち、より大きいペプチドデータベースは、著しく大きいインデックステーブルをもたらさない。検索の速度もまた、より過密なインデックステーブルによって著しい影響は受けない。従って、インデックステーブルの計算時間の適度な増加は、検索速度に顕著な影響を及ぼすことなく、検索の感度および選択性を改善し得る。
【００９０】
（等価物）
本発明は、発明の主旨または本質的な特性から逸脱することなく、他の特定の形態にて実施されてもよい。従って、上述の実施形態は、本明細書中に記載された発明のすべてが限定的ではなく例示的であると考えられるべきである。従って、本発明の範囲は、上述の記載によってではなく、上掲の請求項によって示され、従って、請求項の等価性の意味および範囲内に入るすべての変形が、その中に含まれることが意図される。
【図面の簡単な説明】
【００９１】
【図１】図１は、本発明の１実施形態におけるインデックステーブルの準備を図示するフローチャートを示す。
【図２】図２は、本発明の１実施形態におけるインデックステーブルの検索を図示するフローチャートを示す。
【図１】
2004526958.tif 000018
【図２】
2004526958.tif 000019
【国際公開パンフレット】
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2004526958.tif 000021
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004526958.tif 000042
【国際調査報告】
2004526958.tif 000043
2004526958.tif 000044