(57)【要約】腫瘍細胞の生存率を減少させ、哺乳動物中の新生物に感染させ、特定の天然に存在しないウイルスを使用する方法が、開示される。ウイルス再集合体（例えば、レオウイルス再集合体）およびＰＫＲ感受性ウイルスを同定するための技術もまた開示される。腫瘍細胞の生存率を減少させる方法であって、該方法は、該腫瘍細胞に、天然に存在しないウイルスを投与する工程を包含する。哺乳動物中の新生物にウイルスを感染させる方法であって、該方法は、天然に存在しないウイルスを該哺乳動物に投与する工程を包含する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
腫瘍細胞の生存率を減少させる方法であって、該方法は、該腫瘍細胞に、天然に存在しないウイルスを投与する工程を包含し、ここで、該ウイルスは、以下：
ａ）レオウイルスであって、該レオウイルスのｍｕ−２タンパク質が、９３位、１５０位、３００位、３０２位、３４７位、３７２位、４３４位、４５８位、６５２位および７２６位において、それぞれ、アミノ酸残基Ａ、Ｒ、Ｍ、Ｆ、Ｌ、Ｍ、Ｉ、Ｑ、ＩおよびＳを有する、レオウイルス；または
ｂ）レオウイルス科から選択されるウイルス種の２以上の親株の再集合体もしくはその子孫；または
ｃ）９３位、１５０位、３００位、３０２位、３４７位、３７２位、４３４位、４５８位、６５２位および７２６位において、それぞれ、アミノ酸残基Ａ、Ｒ、Ｍ、Ｆ、Ｌ、Ｍ、Ｉ、Ｑ、ＩおよびＳを有するレオウイルスｍｕ−２タンパク質を発現し得る、レオウイルス以外のウイルスであって、ここで該レオウイルス以外のウイルスが、Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ、ＲｈａｂｄｏｖｉｒｉｄａｅおよびＰａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅからなる群より選択されるＤＮＡウイルス、ポジティブセンスＲＮＡウイルス、またはネガティブセンスＲＮＡウイルスである、レオウイルス以外のウイルス、
である、方法。
【請求項２】
哺乳動物中の新生物にウイルスを感染させる方法であって、該方法は、天然に存在しないウイルスを該哺乳動物に投与する工程を包含し、ここで、該ウイルスは、以下：
ａ）レオウイルスであって、該レオウイルスのｍｕ−２タンパク質が、９３位、１５０位、３００位、３０２位、３４７位、３７２位、４３４位、４５８位、６５２位および７２６位において、それぞれ、アミノ酸残基Ａ、Ｒ、Ｍ、Ｆ、Ｌ、Ｍ、Ｉ、Ｑ、ＩおよびＳを有する、レオウイルス；または
ｂ）レオウイルス科から選択されるウイルス種の２以上の親株の再集合体もしくはその子孫；または
ｃ）レオウイルス以外のウイルスであって、ここで、該レオウイルス以外のウイルスが、
ｉ）９３位、１５０位、３００位、３０２位、３４７位、３７２位、４３４位、４５８位、６５２位および７２６位において、それぞれ、アミノ酸残基Ａ、Ｒ、Ｍ、Ｆ、Ｌ、Ｍ、Ｉ、Ｑ、ＩおよびＳを有するレオウイルスｍｕ−２タンパク質を発現し得、そして
ｉｉ）Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ、ＲｈａｂｄｏｖｉｒｉｄａｅおよびＰａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅからなる群より選択されるＤＮＡウイルス、ポジティブセンスＲＮＡウイルス、またはネガティブセンスＲＮＡウイルスである、
レオウイルス以外のウイルス、
である、方法。
【請求項３】
哺乳動物中の新生物を処置する方法であって、該方法は、治療有効量の天然に存在しないウイルスを該哺乳動物に投与する工程を包含し、ここで、該ウイルスが、以下：
ａ）レオウイルスであって、該レオウイルスのｍｕ−２タンパク質が、９３位、１５０位、３００位、３０２位、３４７位、３７２位、４３４位、４５８位、６５２位および７２６位において、それぞれ、アミノ酸残基Ａ、Ｒ、Ｍ、Ｆ、Ｌ、Ｍ、Ｉ、Ｑ、ＩおよびＳを有する、レオウイルス；または
ｂ）レオウイルス科から選択されるウイルス種の２以上の親株の再集合体もしくはその子孫；または
ｃ）レオウイルス以外のウイルスであって、ここで、該レオウイルス以外のウイルスが、
ｉ）９３位、１５０位、３００位、３０２位、３４７位、３７２位、４３４位、４５８位、６５２位および７２６位において、それぞれ、アミノ酸残基Ａ、Ｒ、Ｍ、Ｆ、Ｌ、Ｍ、Ｉ、Ｑ、ＩおよびＳを有するレオウイルスｍｕ−２タンパク質を発現し得、そして
ｉｉ）Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ、ＲｈａｂｄｏｖｉｒｉｄａｅおよびＰａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅからなる群より選択されるＤＮＡウイルス、ポジティブセンスＲＮＡウイルス、またはネガティブセンスＲＮＡウイルスである、
レオウイルス以外のウイルス、
である、方法。
【請求項４】
腫瘍細胞の生存率を減少させるため、哺乳動物中の新生物に感染させるため、または哺乳動物中の新生物を処置するための医薬の製造における、天然に存在しないウイルスの使用であって、ここで、該ウイルスは、以下：
ａ）レオウイルスであって、該レオウイルスのｍｕ−２タンパク質が、９３位、１５０位、３００位、３０２位、３４７位、３７２位、４３４位、４５８位、６５２位および７２６位において、それぞれ、アミノ酸残基Ａ、Ｒ、Ｍ、Ｆ、Ｌ、Ｍ、Ｉ、Ｑ、ＩおよびＳを有する、レオウイルス；または
ｂ）レオウイルス科から選択されるウイルス種の２以上の親株の再集合体もしくはその子孫；または
ｃ）レオウイルス以外のウイルスであって、ここで、該レオウイルス以外のウイルスが、
ｉ）９３位、１５０位、３００位、３０２位、３４７位、３７２位、４３４位、４５８位、６５２位および７２６位において、それぞれ、アミノ酸残基Ａ、Ｒ、Ｍ、Ｆ、Ｌ、Ｍ、Ｉ、Ｑ、ＩおよびＳを有するレオウイルスｍｕ−２タンパク質を発現し得、そして
ｉｉ）Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ、ＲｈａｂｄｏｖｉｒｉｄａｅおよびＰａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅからなる群より選択されるＤＮＡウイルス、ポジティブセンスＲＮＡウイルス、またはネガティブセンスＲＮＡウイルスである、
レオウイルス以外のウイルス、
である、使用。
【請求項５】
請求項１、２もしくは３に記載の方法、または請求項４に記載の使用であって、ここで前記ウイルスが、レオウイルスであり、該レオウイルスのｍｕ−２タンパク質が、９３位、１５０位、３００位、３０２位、３４７位、３７２位、４３４位、４５８位、６５２位および７２６位において、それぞれ、アミノ酸残基Ａ、Ｒ、Ｍ、Ｆ、Ｌ、Ｍ、Ｉ、Ｑ、ＩおよびＳを有する、
方法または使用。
【請求項６】
前記ｍｕ−２タンパク質が、レオウイルス株Ｔ３  Ｄｅａｒｉｎｇのｍｕ−２タンパク質のアミノ酸配列を有する、請求項５に記載の方法または使用。
【請求項７】
前記ｍｕ−２タンパク質が、レオウイルス株Ｔ３  ＤｅａｒｉｎｇのＭ１遺伝子の核酸配列を有する遺伝子によって発現される、請求項６に記載の方法または使用。
【請求項８】
前記レオウイルスが、ｅｂ８６、ｅｂ１２９、ｅｂ８８、ｅｂ１３およびｅｂ１４５からなる群より選択されるレオウイルス株と同じ遺伝子型を有する、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記レオウイルスが、Ｌ３遺伝子を有し、該Ｌ３遺伝子の配列が、レオウイルス株Ｔ１  ＬａｎｇのＬ３遺伝子と同じである、請求項７に記載の方法または使用。
【請求項１０】
前記レオウイルスが、ｅｂ２８、ｅｂ３１、ｅｂ９７、ｅｂ１２３およびｇ１６からなる群より選択されるレオウイルス株と同じ遺伝子型を有する、請求項９に記載の方法または使用。
【請求項１１】
前記レオウイルスが、Ｌ１遺伝子およびＳ２遺伝子を有し、該Ｌ１遺伝子およびＳ２遺伝子の配列が、レオウイルス株Ｔ１  Ｌａｎｇの対応する遺伝子と同じである、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記レオウイルスが、ｅｂ１４６およびｅｂ１０８から選択されるレオウイルス株と同じ遺伝子型を有する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記レオウイルスがＳ４遺伝子を有し、該Ｓ４遺伝子の配列が、レオウイルス株Ｔ１  Ｌａｎｇの対応する遺伝子と同じである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記レオウイルスが、レオウイルス株ｅｂ９６と同じ遺伝子型を有する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
請求項１、２もしくは３に記載の方法、または請求項４に記載の使用であって、前記ウイルスが、レオウイルス科から選択されるウイルス種の２以上の親株の再集合体またはその子孫である、方法または使用。
【請求項１６】
前記ウイルス種が、レオウイルスであり、前記親株が、Ｔ３  Ｄｅａｒｉｎｇ、Ｔ１  Ｌａｎｇ、Ｔ３  ＡｂｎｅｙおよびＴ２  Ｊｏｎｅｓからなる群より選択される、請求項１５に記載の方法または使用。
【請求項１７】
前記親株が、Ｔ３  ＤｅａｒｉｎｇおよびＴ１  Ｌａｎｇである、請求項１６に記載の方法または使用。
【請求項１８】
前記ウイルスが、ウイルス株ｅｂ１１８、ｅｂ７３．１、ｈ１７、ｈ１５、ｅｂ３９およびｈ６０からなる群より選択される、請求項１７に記載の方法または使用。
【請求項１９】
請求項１、２もしくは３に記載の方法、または請求項４に記載の使用であって、前記ウイルスが、レオウイルス以外のウイルスであり、ここで、該レオウイルス以外のウイルスが、以下：
ｉ）９３位、１５０位、３００位、３０２位、３４７位、３７２位、４３４位、４５８位、６５２位および７２６位において、それぞれ、アミノ酸残基Ａ、Ｒ、Ｍ、Ｆ、Ｌ、Ｍ、Ｉ、Ｑ、ＩおよびＳを有するレオウイルスｍｕ−２タンパク質を発現し得、そして
ｉｉ）Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ、ＲｈａｂｄｏｖｉｒｉｄａｅおよびＰａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅからなる群より選択されるＤＮＡウイルス、ポジティブセンスＲＮＡウイルス、またはネガティブセンスＲＮＡウイルスである、
レオウイルス以外のウイルス、
である、
方法または使用。
【請求項２０】
請求項１９に記載の方法または使用であって、前記ウイルスが、ヘルペスウイルス、アデノウイルス、パルボウイルス、パポバウイルス、イリドウイルス、ヘパドナウイルス、ポックスウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、ヒトパラインフルエンザウイルス、麻疹ウイルスまたは風疹ウイルスから選択されるＤＮＡウイルスである、方法または使用。
【請求項２１】
前記ウイルスが、トガウイルス、フラビウイルス、ピコルナウイルスまたはコロナウイルスから選択されるポジティブセンスＲＮＡウイルスである、請求項１９に記載の方法または使用。
【請求項２２】
前記ウイルスが、Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ、ＲｈａｂｄｏｖｉｒｉｄａｅおよびＰａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅからなる群より選択されるネガティブセンスＲＮＡウイルスである、請求項１９に記載の方法または使用。
【請求項２３】
前記ウイルスが、インフルエンザウイルスまたは水疱性口内炎ウイルスである、請求項１９に記載の方法または使用。
【請求項２４】
前記ウイルスが、複製能のあるウイルスである、請求項１〜２３のいずれか１項に記載の方法または使用。
【請求項２５】
前記ウイルスが、クローン性ウイルスである、請求項２４に記載の方法または使用。
【請求項２６】
前記ウイルスが、鼻腔内、気管内、静脈内、腹腔内または腫瘍内からなる群より選択される経路によって投与される、請求項１〜２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
前記ウイルスが、ヒトまたは非ヒト哺乳動物に投与される、請求項１〜２６のいずれか１項に記載の方法または使用。
【請求項２８】
前記ウイルスが、３×１０７〜３×１０９ＰＦＵ／ｋｇの用量で投与される、請求項２６または２７に記載の方法または使用。
【発明の詳細な説明】
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００１】
（発明の要旨）
本発明は、腫瘍細胞の生存率を減少させる方法、哺乳動物中の新生物にウイルスを感染させる方法、または哺乳動物中の新生物を処置する方法を提供し、この方法は、天然に存在しないウイルスを投与する工程を包含し、ここで、このウイルスは、以下：ａ）そのｍｕ−２タンパク質が、９３位、１５０位、３００位、３０２位、３４７位、３７２位、４３４位、４５８位、６５２位および７２６位において、それぞれ、アミノ酸残基Ａ、Ｒ、Ｍ、Ｆ、Ｌ、Ｍ、Ｉ、Ｑ、ＩおよびＳを有するレオウイルス；またはｂ）レオウイルス科から選択されるウイルス種の２以上の親株の再集合体もしくはその子孫；またはｃ）レオウイルス以外のウイルスであって、ここで、このレオウイルス以外のウイルスが、以下：ｉ）９３位、１５０位、３００位、３０２位、３４７位、３７２位、４３４位、４５８位、６５２位および７２６位において、それぞれ、アミノ酸残基Ａ、Ｒ、Ｍ、Ｆ、Ｌ、Ｍ、Ｉ、Ｑ、ＩおよびＳを有するレオウイルスｍｕ−２タンパク質を発現し得、そしてｉｉ）Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ、ＲｈａｂｄｏｖｉｒｉｄａｅおよびＰａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅからなる群より選択されるＤＮＡウイルス、ポジティブセンス（ｐｏｓｉｔｉｖｅ−ｓｅｎｓｅ）ＲＮＡウイルス、またはネガティブセンス（ｎｅｇａｔｉｖｅ−ｓｅｎｓｅ）ＲＮＡウイルスである。本発明はさらに、腫瘍細胞の生存率の減少、哺乳動物中の新生物の感染、または哺乳動物中の新生物の処置のための医薬の製造における、このような天然に存在しないウイルスの使用を提供する。
【０００２】
本発明は、ＰＫＲ感受性ウイルスを同定する方法を提供し、この方法は、以下の工程：ａ）試験されるウイルスサンプルを、第一部分および第二部分に分割する工程；ｂ）ＰＫＲ−／−細胞におけるウイルスの増殖を可能にする条件下で、ＰＫＲ＋／＋細胞をこの第一部分と接触させ、そしてＰＫＲ−／−細胞をこの第二部分と接触させる工程；ｃ）ＰＫＲ＋／＋細胞およびＰＫＲ−／−細胞におけるウイルスの増殖速度を決定する工程；ならびにｄ）工程ｃ）の増殖速度を比較する工程であって、ここで、ＰＫＲ＋／＋細胞における増殖速度よりも高いＰＫＲ−／−細胞における増殖速度が、ウイルスをＰＫＲ感受性として同定する工程、を包含する。本発明に従って同定されたこのようなＰＫＲ感受性ウイルスは、腫瘍細胞の生存率の減少、哺乳動物中の新生物の感染、または哺乳動物中の新生物の処置のために有用である。
【０００３】
（発明の詳細な説明）
本出願を通じて、アミノ酸は、一般に、標準的な１文字の略号を使用して特定されるが、名前または標準的な３文字の略号によってもまた特定され得る。
【０００４】
Ｔ３Ｄ、Ｔ１Ｌ、Ｔ３ＡおよびＴ２Ｊは、それぞれ、レオウイルス株Ｔ３  Ｄｅａｒｉｎｇ、Ｔ１  Ｌａｎｇ、Ｔ３  ＡｂｎｅｙおよびＴ２  Ｊｏｎｅｓの標準的な略号である。上に列挙した株の名前およびそのそれぞれの略号は、交換可能に使用される。
【０００５】
本明細書中で使用される場合、「表現型」とは、ウイルスの発現されたタンパク質の配列をいう。レオウイルスの場合、発現されたタンパク質は、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｍ１、Ｍ２、Ｍ３、Ｓ１、Ｓ２、Ｓ３およびＳ４遺伝子の遺伝子産物である。従って、これら遺伝子の産物のアミノ酸配列が２つの異なるレオウイルス株において同じである場合、これらの株は、同じ表現型を有すると言われる。
【０００６】
本明細書中で使用される場合、「遺伝子型」とは、ウイルスのコード領域のヌクレオチド配列をいう。従って、例えば、２つのレオウイルスのＬ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｍ１、Ｍ２、Ｍ３、Ｓ１、Ｓ２、Ｓ３およびＳ４遺伝子のヌクレオチド配列が２つの異なるレオウイルス株において同じである場合、これらの株は、同じ遺伝子型を有すると言われる。
【０００７】
用語「ＰＦＵ」は、プラーク形成単位を意味し、そして生きたウイルス粒子の定量的測定である。
【０００８】
抗新生物方法および抗腫瘍方法、ならびに上記の本発明の使用の例としては、そのｍｕ−２タンパク質が、９３位、１５０位、３００位、３０２位、３４７位、３７２位、４３４位、４５８位、６５２位および７２６位において、それぞれ、アミノ酸残基Ａ、Ｒ、Ｍ、Ｆ、Ｌ、Ｍ、Ｉ、Ｑ、ＩおよびＳを有するレオウイルスを利用する方法および使用が挙げられる。より特定の実施形態において、このレオウイルスｍｕ−２タンパク質は、例えば、このｍｕ−２タンパク質が、レオウイルス株Ｔ３  ＤｅａｒｉｎｇのＭ１遺伝子の核酸配列を有する遺伝子によって発現される場合、レオウイルス株Ｔ３  Ｄｅａｒｉｎｇのｍｕ−２タンパク質のアミノ酸配列を有する。より特定の実施形態において、このレオウイルスは、ｅｂ８６、ｅｂ１２９、ｅｂ８８、ｅｂ１３およびｅｂ１４５からなる群より選択されるレオウイルス株と同じ遺伝子型を有する。より特定の実施形態において、このレオウイルスは、その配列がレオウイルス株Ｔ３  ＤｅａｒｉｎｇのＭ１遺伝子と同じであるＭ１遺伝子、およびその配列がレオウイルス株Ｔ１  ＬａｎｇのＬ３遺伝子と同じであるＬ３遺伝子を有し、例えば、このウイルスは、ｅｂ２８、ｅｂ３１、ｅｂ９７、ｅｂ１２３およびｇ１６からなる群より選択されるレオウイルス株と同じ遺伝子型を有し得る。なおより特定の実施形態において、このレオウイルスは、その配列がレオウイルス株Ｔ３  ＤｅａｒｉｎｇのＭ１遺伝子と同じであるＭ１遺伝子、ならびにその配列がレオウイルス株Ｔ１  Ｌａｎｇの対応する遺伝子と同じであるＬ３遺伝子、Ｌ１遺伝子およびＳ２遺伝子を有し、例えば、このレオウイルスは、ｅｂ９６、ｅｂ１４６およびｅｂ１０８から選択されるレオウイルス株と同じ遺伝子型を有する。さらにより特定の実施形態において、このレオウイルスは、その配列がレオウイルス株Ｔ３  ＤｅａｒｉｎｇのＭ１遺伝子と同じであるＭ１遺伝子、ならびにその配列がレオウイルス株Ｔ１  Ｌａｎｇの対応する遺伝子と同じであるＬ３遺伝子、Ｌ１遺伝子、Ｓ２遺伝子およびＳ４遺伝子を有し、例えば、このレオウイルスは、レオウイルス株ｅｂ９６と同じ遺伝子型を有する。
【０００９】
抗新生物方法および抗腫瘍方法、ならびに上記の本発明の使用の他の例としては、レオウイルス科から選択されるウイルス種の２以上の親株の再集合体もしくはその子孫であるウイルスを利用する方法および使用が挙げられる。例えば、再集合体は、レオウイルス株Ｔ３  Ｄｅａｒｉｎｇ、Ｔ１  Ｌａｎｇ、Ｔ３  ＡｂｎｅｙおよびＴ２  Ｊｏｎｅｓのうち２種、３種または４種から作製され得る。より特定の実施形態において、この再集合体は、親株Ｔ３  ＤｅａｒｉｎｇおよびＴ１  Ｌａｎｇから生成される。このような株の例としては、ｅｂ１１８、ｅｂ７３．１、ｈ１７、ｈ１５、ｅｂ３９およびｈ６０、ならびに表１および２に示される他の株が挙げられる。
【００１０】
抗新生物方法および抗腫瘍方法、ならびに上記の本発明の使用の他の例としては、レオウイルス以外のウイルスを利用する方法および使用が挙げられ、このレオウイルス以外のウイルスは、ｉ）９３位、１５０位、３００位、３０２位、３４７位、３７２位、４３４位、４５８位、６５２位および７２６位において、それぞれ、アミノ酸残基Ａ、Ｒ、Ｍ、Ｆ、Ｌ、Ｍ、Ｉ、Ｑ、ＩおよびＳを有するレオウイルスｍｕ−２タンパク質を発現し得、そしてｉｉ）Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ科、Ｒｈａｂｄｏｖｉｒｉｄａｅ科およびＰａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ科からなる群より選択されるＤＮＡウイルス、ポジティブセンスＲＮＡウイルス、またはネガティブセンスＲＮＡウイルスである。適切なＤＮＡウイルスの例としては、ヘルペスウイルス、アデノウイルス、パルボウイルス、パポバウイルス、イリドウイルス、ヘパドナウイルス、ポックスウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、ヒトパラインフルエンザウイルス、麻疹ウイルスまたは風疹ウイルスが挙げられる。適切なポジティブセンスＲＮＡウイルスの例としては、トガウイルス、フラビウイルス、ピコルナウイルスまたはコロナウイルスが挙げられる。Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ、ＲｈａｂｄｏｖｉｒｉｄａｅおよびＰａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅからなる群より選択される適切なネガティブセンスＲＮＡウイルスの例としては、インフルエンザウイルスまたは水疱性口内炎ウイルスが挙げられる。
【００１１】
上記のような本発明のＰＫＲ感受性ウイルスを同定する方法に従って、任意のＰＫＲ＋／＋細胞およびＰＫＲ−／−細胞が使用され得、そしてウイルスの増殖速度は、ウイルス粒子の数を直接的に測定するか、またはウイルスタンパク質の量を測定する技術を含む、ウイルス増殖をモニタリングする任意の標準的な技術によって決定される。特定の実施形態において、このＰＫＲ細胞は、マウス胚線維芽細胞である。別の特定の実施形態において、ウイルスの増殖速度は、プラーク力価アッセイ、抗体アッセイおよびウエスタンブロットからなる群より選択される技術によって決定される。これら技術の各々は、以下に例示される。好ましくは、ＰＫＲ−／−細胞におけるウイルスの増殖速度は、ＰＫＲ＋／＋細胞における増殖速度よりも少なくとも１０倍速い。
【００１２】
抗新生物方法および抗腫瘍方法、ならびに上記の本発明の使用の全てにおいて、このウイルスは、複製能のあるウイルスおよび／またはクローン性ウイルスであり得る。ウイルスは、鼻腔内、気管内、静脈内、腹腔内または腫瘍内が挙げられるがこれらに限定されない任意の従来の経路によって投与され得る。上記の腫瘍細胞の生存率を減少させる方法または使用に従って、このウイルスは、インビボまたはエキソビボのいずれかで、腫瘍細胞に投与され得る。ウイルスが哺乳動物に投与される場合、この哺乳動物は、ヒトまたは非ヒト哺乳動物（例えば、マウス、ヒツジ、ウシ、ブタ、イヌまたはウサギ）のいずれかであり得る。最適な量は、患者によっていくらか異なると予測されるが、熟練の臨床医によって容易に決定され得、３×１０７〜３×１０９ＰＦＵ／ｋｇの投薬量が代表的である。
【００１３】
本発明に従って利用されるウイルスは、任意の従来の手段（２以上の親ウイルス株間での再集合体化または標準的な組換え遺伝子技術の使用を含む）によって生成され得る。一旦生成されると、このようなウイルスは、子孫を生成するために細胞中で培養することによって、再産生され得る。ウイルスの再集合体の構築は、周知であり、例えば、Ｂｒｏｗｎら、「Ｔｈｅ  Ｌ２  Ｇｅｎｅ  ｏｆ  Ｒｅｏｖｉｒｕｓ  Ｓｅｒｏｔｙｐｅ  ３  Ｃｏｎｔｒｏｌｓ  ｔｈｅ  Ｃａｐａｃｉｔｙ  ｔｏ  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｅ，Ａｃｃｕｍｕｌａｔｅ  Ｄｅｌｅｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  Ｅｓｔａｂｌｉｓｈ  Ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｔ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ」、Ｄｏｕｂｌｅ−Ｓｔｒａｎｄｅｄ  ＲＮＡ  Ｖｉｒｕｓｅｓ、Ｃｏｍｐａｎｓら、編、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ（１９８３）に記載される。例えば、再集合体は、レオウイルス株Ｔ３  Ｄｅａｒｉｎｇ、Ｔ１  Ｌａｎｇ、Ｔ３  ＡｂｎｅｙおよびＴ２  Ｊｏｎｅｓのうちの２種、３種または４種から作製され得る。Ｔ３  ＤｅａｒｉｎｇとＴ１  Ｌａｎｇとの再集合体は、実施例２に記載される。好ましくは、このウイルスは、複製能のあるウイルスおよび／またはクローン性ウイルスである。
【００１４】
本発明は、以下の実施例を参照することによって、より良く理解される。これらの実施例は、本明細書中に記載される発明を例示するが、限定することを意図しない。
【００１５】
（実験）
（実験１：ＰＫＲノックアウト線維芽細胞および野生型繊維芽細胞におけるレオウイルス株Ｔ１ＬおよびＴ３Ｄの増殖）
（ウイルス増殖）
レオウイルス感染に対するＰＫＲの影響を、ＰＫＲノックアウト（ＰＫＲ−／−）マウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ）を使用して試験した。レオウイルスＴ１ＬおよびＴ３Ｄの両方は、プラークアッセイによって測定されるように、ＰＫＲ＋／＋ＭＥＦと比較して、ＰＫＲ−／−ＭＥＦにおいて、数倍高い力価まで増殖した（図１）。このことは、以下に記載される蛍光抗体染色によって検出される抗原陽性細胞のより高い割合に関連した。このことと一致して、ＰＫＲ−／−ＭＥＦの感染は、以下に記載されるウエスタンブロットによってアッセイされるような、数倍高いウイルスタンパク質の量を生じた。Ｔ１ＬおよびＴ３Ｄの両方は、ＰＫＲ遺伝子を欠く細胞においてより高い力価まで増殖したが、Ｔ１Ｌウイルスは、ＰＫＲ−／−細胞においてもＰＫＲ＋／＋細胞においても、Ｔ３Ｄよりも高い力価まで増殖した（図１）。
【００１６】
（間接的免疫染色）
細胞を、直径３５ｍｍのディッシュ中のカバーガラス上で増殖させ、そして１０の感染効率（ｍｏｉ）でレオウイルスＴ１ＬまたはＴ３Ｄに感染させた。４８時間のインキュベーション後、細胞をＰＢＳ中でリンスし、そして予め冷却したアセトン中で５分間固定した。ＰＢＳ中でのリンス（３×５分間）後、型特異的ウサギ抗ウイルス抗血清の適切な希釈物１００μｌを適用し、室温で３０分間インキュベートした。次いで、カバーガラスをＰＢＳ中でリンスし（３×５分間）、そして二次抗体としてＣｙ３結合体化ロバ抗ウサギ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ）の適切な希釈物を用いて処理した。室温でもう３０分間インキュベートした後、このカバーガラスをＰＢＳ中でリンスし（３×５分間）、そしてスライドグラスをＧｅｌ／Ｍｏｕｎｔ（Ｂｉｏｍｅｄａ  Ｃｏｒｐ）に載せた。全ての抗体希釈を、ＰＢＳ／３％ＢＳＡで行った。
【００１７】
サンプルを、エピ蛍光および４０×１．４０ＮＡ  ＰｌａｎＡｐｏ対物レンズを備えるＺｅｉｓｓ顕微鏡を用いて試験した。画像を、Ｉｍａｇｅ  Ｏｎｅ  ＭｅｔａｍｏｒｐｈソフトウェアおよびＨａｍａｍａｔｓｕ冷却電荷結合デジタルカメラ（モデルＣ５９８５）を使用して収集した。デジタル画像の構成を、Ｃｏｒｅｌ  Ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎｓソフトウェアを使用して行った。
【００１８】
（イムノブロッティング）
ＭＥＦの単層培養物に、ｍｏｉ＝１０のＴ１ＬウイルスまたはＴ３Ｄウイルスを上記のように感染させた。種々の時点で、培養培地を取り出して、細胞をＰＢＳでリンスし、その後１ｍｌのサンプル緩衝液（６２．５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．８）、１０％グリセロール、２％ＳＤＳ、０．０５％ブロモフェノールブルーおよび５％  ２−メルカプトエタノール）（Ｌａｅｍｍｌｉ）中に可溶化した。２５μｌ容量のアリコートを、ＳＤＳ  ＰＡＧＥに供し、そしてＩｍｍｏｂｉｌｏｎ  Ｐメンブレン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）上に、２５Ｖにて４℃で一晩トランスブロットした。乾燥したメンブレンを、ＰＢＳ中５％（ｗ／ｖ）のスキムミルク粉末を用いて、室温で１時間ブロッキングした。その後、これに、新たなブロッキング溶液中の型特異的ウサギ抗レオウイルス免疫血清を一次抗体として添加し、そして４℃で２時間インキュベートした。次いで、このメンブレンを、ＰＢＳ中で３回洗浄し、そしてＴＢＳ（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、０．９％  ＮａＣｌ）中で１回洗浄して、リン酸塩を除去し、そしてアルカリホスファターゼ（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｏａｋｖｉｌｌｅ、Ｏｎｔ）製）と結合体化した１μｇ／ｍｌのプロテインＡを含有する、ＴＢＳ中の５％ミルク中でインキュベートした。最後に、メンブレンを、ＴＢＳ中で４回洗浄し、その後、アルカリホスファターゼ緩衝液（１００ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２および１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．５））中で、発色基質（ニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）（３３μｇ／ｍｌ）および５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスフェート（ＢＩＣＰ）（３．３μｌ／ｍｌ））と反応させた。この反応を、２０ｍＭ  ＥＤＴＡを含有するＰＢＳで停止させた。
【００１９】
（実験２：レオウイルスＴ１Ｌ株とＴ３Ｄ株との間の再集合体）
（レオウイルス血清型１Ｌａｎｇ株と血清型３Ｄｅａｒｉｎｇ株との間の遺伝的再集合体の生成）
マウスＬ９２９細胞に、各々５の感染効率でレオウイルス血清型１Ｌａｎｇ株（Ｔ１Ｌ）および血清型３Ｄｅａｒｉｎｇ株（Ｔ３Ｄ）を共感染させた。感染２４時間後に、３サイクルの凍結および解凍によってウイルスを収集し、その後、Ｌ９２９単層における２サイクルのプラーク単離によって子孫ウイルスを単離した。Ｔ１ＬおよびＴ３Ｄの対応するゲノムセグメントの各々は、電気泳動の移動度により識別可能であるので、セグメント化した二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）ゲノムのポリアクリルアミドゲル電気泳動により各セグメントの移動度を親株と比較し、各ウイルスの遺伝子組成を決定した。Ｌａｅｍｍｌｉにより記載されたように調製したゲルは、１０％のポリアクリルアミドおよび０．２７％のメチレンビス−アクリルアミドを含んだ。二本鎖ＲＮＡを、３日間感染させたＬ９２９細胞から獲得し、ドデシル硫酸ナトリウムを含有する緩衝液に溶解し、そして以前（Ｚｏｕ  Ｓ．およびＥ．Ｇ．Ｂｒｏｗｎ（１９９２）Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｅｌｅｍｅｎｔｓ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｓｉｇｎａｌｓ  ｆｏｒ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｅｎｃａｐｓｉｄａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｒｅｏｖｉｒｕｓ  Ｍ１  ｇｅｎｏｍｅ  ｓｅｇｍｅｎｔ、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １８６：３７７−８８）に記載されたようにエチジウムブロマイドで染色したゲルにおいて検出した。この再集合体のパネルの使用は、Ｅ．Ｇ．Ｂｒｏｗｎ、Ｍ．Ｌ．Ｎｉｂｅｒｔ、およびＢ．Ｎ．Ｆｉｅｌｄｓ（１９８３）Ｔｈｅ  Ｌ２  ｇｅｎｅ  ｏｆ  ｒｅｏｖｉｒｕｓ  ｓｅｒｏｔｙｐｅ  ３  ｃｏｎｔｒｏｌｓ  ｔｈｅ  ｃａｐａｃｉｔｙ  ｔｏ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅ，ａｃｃｕｍｕｌａｔｅ  ｄｅｌｅｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  ｅｓｔａｂｌｉｓｈ  ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｔ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ、Ｄｏｕｂｌｅ−Ｓｔｒａｎｄｅｄ  ＲＮＡ  Ｖｉｒｕｓｅｓ、Ｒ．Ｗ．ＣｏｍｐａｎｓおよびＤ．Ｈ．Ｌ．Ｂｉｓｈｏｐ編、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．によって、最初に記載された。
【００２０】
（レオウイルスの増殖）
Ｔ１Ｌ、Ｔ３Ｄ、および上記の再集合手順由来のウイルスストックを、細胞変性効果が完全になるまで５％ウシ胎仔血清ならびにペニシリン（１００ユニット／ｍｌまで）およびストレプトマイシン（１００ｕｇ／ｍｌまで）を補充したＥａｒｌ最小必須培地（ＭＥＭ）にて増殖させたＬ９２９細胞中で調製した。細胞および培養上清を、プラークアッセイにより滴定する前に、３サイクルの凍結および解凍に供した。
【００２１】
（マウス胚線維芽細胞における収率）
野生型ＰＫＲ＋／＋細胞を、Ｂａｌｂ−Ｃマウスから獲得し、ＰＫＲ−／−細胞を、ＰＫＲノックアウトマウスから獲得した。細胞培養物を、細断処理（ｍｉｎｃｉｎｇ）およびトリプシン処理により分解した１５〜１７日の胚を用いて生成した。細胞単層を、３７℃、５％  ＣＯ２環境で、１０％ＦＢＳおよびＰ／Ｓを補充したＭＥＭ中の３５ｍｍプラスチック皿にて増殖させた。１５分間隔で攪拌しながら０．５時間ストックウイルスを吸着させることにより、１０の感染効率（ｍｏｉ）で滴定したＴ１Ｌ、Ｔ３Ｄ、または再集合レオウイルスを細胞に感染させた。吸着しなかったウイルスを、２ｍｌの温めたＰＢＳで３回洗浄することにより除去し、その後、５％のウシ胎仔血清ならびにペニシリン（１００ユニット／ｍｌまで）およびストレプトマイシン（１００ｕｇ／ｍｌまで）を補充した３ｍｌのＭＥＭを添加した。Ｔ１ＬおよびＴ３Ｄの収率を、４日間にわたる時点でアッセイし、これを図１に示す。再集合レオウイルスを感染させたＭＥＦ細胞からのウイルスの収率の比較を、二連の培養物のプラークアッセイにより３日間インキュベーションした後に実施した。これらの結果を、以下の表１（ＰＫＲ−／−）および表２（ＰＫＲ＋／＋）に示す。
【００２２】
（Ｌ９２９細胞におけるレオウイルスのプラークアッセイ）
Ｌ９２９細胞の単層培養物を培地からデカントし、ＰＢＳ中で、０．１ｍｌ容量の連続希釈したウイルスに感染させた（二連）。ウイルスを０．５時間吸着させ、その後、１％寒天、５％ＦＢＳ、およびＰ／Ｓを補充した３ｍｌのＭＥＭを適用した。培養物を３７℃にてインキュベートし、同一培地の２ｍｌアリコートの補助的な上乗せを、感染３日後および６日後に添加した。感染８日後、この単層を、プラークを観察するために、ニュートラルレッドを補充した（０．０１％重量／容量）２ｍｌの同一の上乗せ溶液で２４時間染色した。
【００２３】
（議論）
各細胞型におけるＴ１Ｌの増強した増殖能の遺伝的な基礎を、Ｔ１Ｌ×Ｔ３Ｄ再集合体を用いて決定した。野生型ＭＥＦ（ＰＫＲ＋／＋）における収率の差は、主にＭ１遺伝子と関連しなかったが、ＰＫＲ−／−ＭＥＦにおける収率の差は、Ｌ１、Ｌ３、Ｍ３、およびＳ２遺伝子と関連し、Ｍ１遺伝子と関連しなかった。ＰＫＲ−／−ＭＥＦ細胞における複製に対するＰＫＲ＋／＋細胞における複製に関する遺伝的基礎の比較は、レオウイルス感染を阻害するＰＫＲ遺伝子の能力が、Ｍ１遺伝子の特性に依存することを示す。さらに、複製の程度（つまり、ＰＫＲ−／−細胞の搾取（ｅｘｐｌｏｉｔａｔｉｏｎ））は、Ｌ１、Ｌ３、Ｍ３、およびＳ２遺伝子の性質に依存する。従って、ＰＫＲ−／−細胞においてＰＫＲ＋／＋細胞よりも最も大きな複製能の差を有する再集合ウイルスは、Ｔ３Ｄ  Ｍ１遺伝子を有し、ＰＫＲ−／−細胞（多くの腫瘍細胞の特徴）における最も大きな複製能を有するウイルスは、Ｔ１ＬのＬ１、Ｌ３、Ｍ３、およびＳ２遺伝子を有する。このようなウイルスは、ＰＫＲ＋／＋細胞の複製において制限されるが、ＰＫＲ−／−細胞においてＴ１ＬまたはＴ３Ｄのいずれよりも大きな程度で複製し、再集合体ｅｂ９６およびｅｂ１０８の特性を具体化する。実験結果の統計的分析を、表１、２、および３に示す
Ｔ１Ｌ  ｍｕ２タンパク質およびＴ３Ｄ  ｍｕ２タンパク質のアミノ酸配列を表４に示す。各タンパク質は７３６アミノ酸長であり、１０アミノ酸位で異なる。ＰＫＲ−／−ＭＥＦ細胞に対するＰＫＲ＋／＋細胞における複製能として見られるＰＫＲに対する感受性の観察される差は、これらのタンパク質間のアミノ酸配列の差に起因し、従って、これらの位置でこれらのアミノ酸変化または他の置換を有するレオウイルスのＭ１タンパク質を、本明細書中に記載する。ｍｕ２タンパク質は、Ｍ１遺伝子によりコードされる。Ｔ１Ｌ  Ｍ１遺伝子およびＴ３Ｄ  Ｍ１遺伝子のヌクレオチド配列を、表５に示す。各ゲノムセグメントは２３０４ヌクレオチド長であり、５１ヌクレオチド位で異なる。
（表１：ＰＫＲ−／−）
【００２４】
【表１】
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（表２：ＰＫＲ＋／＋（野生型））
【００２５】
【表２】
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表１および表２において、ゲノムセグメントの親起源を、Ｌ（Ｔ１Ｌ）またはＤ（Ｔ３Ｄ）により示す。統計的な有意性を、ｔ−試験およびＭａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ（ＭＷ）試験を用いて決定した。
（表３：ＰＫＲに対する感受性は、Ｍ１遺伝子と関連しない）
【００２６】
【表３】
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（表４：Ｔ１Ｌ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＣＡＡ４２５７０．１）ｍｕ２タンパク質とＴ３Ｄ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＡＡ４７２５６．１）ｍｕ２タンパク質とのアラインメント。これらのアミノ酸配列を、ｃＤＮＡから推定した。各タンパク質は７３６ヌクレオチド長であり、１０アミノ酸位で異なる。）
【００２７】
【表４】
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（表５：ｍｕ−２タンパク質をコードするＴ１Ｌ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｘ５９９４５．１）およびＴ３Ｄ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｍ２７２６１．１）Ｍ１  ｃＤＮＡのヌクレオチド配列のアラインメント。完全なコード配列を示す。レオウイルスは、二本鎖ＲＮＡウイルスなので、レオウイルスゲノムは「ｔ」の代わりに「ｕ」を含む。以下に示す各ゲノムセグメントは２３０４ヌクレオチド長であり、５１ヌクレオチド位で異なる。）
【００２８】
【表５】
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（実験３：ＰＫＲ−／−マウス対ＰＫＲ＋／＋マウスにおける致死感染の評価）
成体Ｂａｌｂ−Ｃ  ＰＫＲ＋／＋マウスまたはＰＫＲ−／−マウスに、種々の用量の感染性レオウイルスＴ１ＬまたはＴ３Ｄを、腹腔内（ＩＰ）経路または鼻腔内（ＩＮ）経路を通じて感染させた。ＩＰ注入は、０．１ｍｌのストックウイルスまたはＰＢＳで希釈したウイルスの投与を含んだ。ＩＮ感染は、ハロタン（酸素中３％で投与した）で麻酔したマウスの鼻パッドに対する、０．０５ｍｌのストックウイルスまたはＰＢＳで希釈したウイルスの適用を含んだ。成体マウスの生存率を、３０日間にわたりモニターした。成体ＰＫＲ＋／＋マウスおよびＰＫＲ−／−マウスは、５ｅ６感染性Ｔ３Ｄウイルスの感染に抵抗性であったのに対し、Ｔ１Ｌウイルスは、この用量でＰＫＲ−／−マウスを殺傷したが、ＰＫＲ＋／＋マウスは殺傷しなかった。このことは、ＰＫＲ−／−マウスの組織へのＴ１Ｌの感染能が増強されたことを実証する（表５）。
【００２９】
２日齢の離乳前のＢａｌｂ−Ｃ  ＰＫＲ＋／＋マウスまたはＰＫＲ−／−マウスに、種々の用量の感染性レオウイルスＴ１ＬまたはＴ３Ｄを、ＩＮ経路を通じて感染させた。ＩＮ感染は、ハロタン（酸素中３％で投与した）で麻酔したマウスの鼻パッドに対する、０．０１ｍｌ容量のストックウイルスまたはＰＢＳで希釈したウイルスの適用を含んだ。離乳前のマウスの生存率を、１８日間にわたりモニターした。離乳前のＰＫＲ＋／＋マウスまたはＰＫＲ−／−マウスは両方とも、類似用量のＴ１Ｌに対して感受性であったのに対し、Ｔ３Ｄウイルスは、ＰＫＲ＋／＋マウスよりもずっと効果的に（野生型の離乳前のマウスを殺傷するのに必要とされる用量よりも１００倍以上少ない用量で）ＰＫＲ−／−マウスを殺傷した。このことは、離乳前のマウスのＰＫＲ−／−組織に対するＴ３Ｄの感染能が増強されたことを実証し、このことは、両方のウイルスは異なる年齢（成体  対  離乳前）のＰＫＲ＋／＋マウスの複製においてより制限されたが、ＰＫＲ＋／＋マウス対ＰＫＲ−／−マウスにおける示差的な複製に関するＴ１Ｌ株とＴ３Ｄ株との特性の差を示す（表５）。
【００３０】
（表５）
【００３１】
【表６】
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（実験４：レオウイルスＴ３Ｄは、Ｔ１Ｌよりも強力なＰＫＲ  ＭＥＦのインデューサーである）
ＰＫＲ＋／＋ＭＥＦの感染により、リン酸化形態のＰＫＲがより多く発現する（図２）。ＰＫＲ＋／＋ＭＥＦに、１０のｍｏｉで感染させ、そしてイムノブロット分析のために、ＰＫＲの最初の１００アミノ酸と反応するウサギ抗ＰＫＲ血清を用いて、４８時間インキュベートした。タンパク質を、１０％ポリアクリルアミドゲル上で分離し、ＩＭＭＯＢＩＬＯＮメンブレン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｉｎｃ．）に移した後、カゼインの存在下で１／１００希釈した一次抗体と共にインキュベートした。繰り返し洗浄した後、このブロットを、アルカリホスファターゼ（１／３０，０００希釈）（Ｓｉｇｍａ  Ｉｎｃ）に結合したヤギ抗ウサギ抗体と共に、１時間インキュベートし、その後、繰り返し洗浄し、図２に示すリン光検出のためにＡｔｔｏｐｈｏｓ基質と反応させた。ＰＫＲの活性化は、わずかに遅い移動度の電気泳動形態を生じる（ＰＫＲ−Ｐとして示す）。Ｔ３Ｄによる感染は、Ｔ１Ｌによる感染よりも多く、この形態を生じる。このことは、ＰＫＲ発現が、Ｔ３Ｄ感染細胞において増強されることを実証し、このことが、ＰＫＲ遺伝子に対するこの遺伝子のより大きな感受性に起因し得ることを示す。
【００３２】
（実験５：レオウイルスＴ１Ｌ×Ｔ３Ｄ再集合体の改善された腫瘍溶解の原理の解明：Ｔ３ＤのＭ１遺伝子ならびにＴ１ＬおよびＴ３Ｄからの残りの遺伝子を有するレオウイルス再集合体は、優れた腫瘍溶解特性を有することの実証）
３つの再集合体を、それらの親ウイルスに関する腫瘍溶解特性の試験のために選択した。再集合体、ＥＢ９６、ＥＢ１０８、およびＥＢ１４６の各々は、Ｔ３ＤのＭ１遺伝子を有し、それらの感染応答において損傷を受けた細胞において優先的に複製することが期待された。これらの再集合体はまた、最適な複製能を提供することが予測されるＴ１ＬのＬ１、Ｌ３、およびＳ２遺伝子を有した。
【００３３】
腫瘍溶解試験を、Ｂａｌｂ−Ｃ起源のＣＴ２６結腸腫瘍細胞株由来の肺腫瘍を有するマウスへの、１０７ｐｆｕの各ウイルスの鼻腔内感染により実施した。実験０日目に、３×１０５のＣＴ２６を、成体雌ＢＬＡＢ−Ｃマウス（４〜６週齢）の尾静脈に注入した。７日目に、３匹のマウスからなる群を麻酔し、０．０５０容量の培養培地中で１０７ｐｆｕのウイルスで感染させた。マウスを、さらに６日間飼育した後、９０％  ＣＯ２／１０％  Ｏ２で安楽死させた。肺を取り出し、重量を測定し、ホルマリン中で固定し、そして写真を撮影した。１つのセットの肺を、パラフィンで包埋し、薄切した後に、ヘマトキシリンおよびエオシン染色により組織学的に試験した。
【００３４】
処理後の肺の全体的な外観は、未処理のコントロール肺が、継続的な腫瘍小節に起因する石目模様の表面外観を有する重度の腫瘍を有した（図３）。これらの動物は癌の最終段階にあった。なぜならば、１匹の動物はこの時点で死亡し、他の動物は呼吸窮迫症であったからである。これらの肺は、未感染のｂａｌｂ−ｃ肺よりも３倍重度であり、このことは、増加した腫瘍質量が肺組織の質量の２倍と該算されることを示す（図４）。組織学的に、これらの肺は、腫瘍小節の連続層で覆われており、内部腫瘍塊は、細胞のエオシン好性の成長として観察された（図４および５）。Ｔ１Ｌウイルスによる感染は、全体的な検査で観察可能な表面腫瘍の成長の部分的な休止（ｆｒｅｅｉｎｇ）を引き起こし、これはまた、未処理コントロールに対する、内部および表面の小節の減少ならびに肺重量の２０％の減少と関連した（図３、４、および５）。Ｔ３Ｄ処理は、Ｔ１Ｌ処理ほど効果的ではなく、肺は、大きさがわずかな減少（８％）によってのみ未処理コントロールから識別可能であるが、腫瘍の全体的外観および顕微的外観は類似した（図３、４、および５）。
【００３５】
非常に対照的に、ＥＢ９６再集合ウイルスは、処置によって肺の全体の腫瘍塊を浄化した（図３）。この肺は、腫瘍塊を含まないほぼ正常な重量を有した（図４）。組織学的検査により検出されたように、少数の残留性の腫瘍細胞がこの時点で残留していた（図５）。この肺は、正常の大きさおよび外観（いくつかの環状のパターンおよび肺表面のへこみ（以前の腫瘍小節の位置を示すと思われる）を除く）であった。ＦＢ１４６ウイルスは、Ｔ３Ｄ親ウイルスよりも腫瘍溶解においてより効果的でなかった（図３、４、および５）。再集合体ＥＢ１０８は、腫瘍溶解に部分的に効果的であり、Ｔ１Ｌ親株よりもわずかに良好であるが類似する結果をもたらした。再集合体の遺伝子型の比較において、３つの再集合体が、７つのゲノムセグメントを共通して有し、従って、それらのＬ２、Ｓ３、およびＳ４ゲノムセグメントにおいて異なることが観察され得、このことは、遺伝子の後者の群が、腫瘍溶解の重要なモジュレーターを含むことを示す。ＥＢ９６再集合体は、Ｓ４遺伝子の性質に起因してＥＢ１０８単独よりも効果的である。なぜならば、これらのウイルスは、この遺伝子の親起源においてのみ異なるからである。このことは、Ｔ１Ｌ  Ｓ４遺伝子が、Ｔ３Ｄ  Ｓ４遺伝子よりも増強された腫瘍溶解特性を与えることを示す。Ｓ４遺伝子は、ＰＫＲの活性化をブロックするｄｓＲＮＡ結合タンパク質をコードするので、Ｔ１Ｌ  Ｓ４遺伝子は、この能力において異なり、従って、Ｔ１ＬおよびＴ３Ｄゲノムセグメントの他の組み合わせと強調して、腫瘍溶解能力を制御し得る。結論として、親Ｔ１ＬおよびＴ３Ｄウイルスと比較しての、腫瘍溶解におけるＥＢ９６再集合体の効果の劇的な増大は、特定の遺伝子型を有するレオウイルスの再集合体が、活性な免疫応答を有する宿主の転移性腫瘍における、増強された、効果的な腫瘍溶解能力を有するという原理の証明を実証する（表６）。
【００３６】
（表６：レオウイルス再集合体が、ｃｔ２６肺腫瘍を溶解する能力のランク付け。未処置のコントロール腫瘍保有肺に対する、ｃｔ２６腫瘍保有肺の相対的重量を示す。ゲノムセグメントの親の起源を、Ｔ１ＬについてはＬで、そしてＴ３ＤについてはＤで示す。）
【００３７】
【表７】
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（実験６：Ｔ１Ｌ×Ｔ３Ｄ再集合体が、インビトロで腫瘍を溶解する能力）
ＮＣＩ腫瘍パネル（ＳＦ５３９、ｃｎｓ；ＳＫＭＥＬ２８、黒色腫；ＨＴ２９；ＮＣＩ  Ｈ２３、ｎｓｃ−肺；ＳＷ６２０、結腸；ＤＵ１４５、前立腺）から得た腫瘍細胞株のパネルに、１０の感染効率で、Ｔ１Ｌ、Ｔ３Ｄまたはその再集合体、ＥＢ９６、ＥＢ１０８およびＥＢ１４６を感染させ、細胞病理学的効果について、５日間にわたって観察した。腫瘍細胞を溶解する能力を、−〜＋＋＋の段階で視覚的にスコアした。−は、モック感染細胞との差異が存在しないことを示し、そして＋、＋＋および＋＋＋は、それぞれ、３３％の細胞破壊、６６％の細胞破壊および完全な溶解を示す。異なる腫瘍細胞型は、異なるレオウイルス親株または再集合体による溶解に対する感受性が異なったが、再集合体ウイルスは、全て、インビトロの腫瘍細胞溶解においてＴ３Ｄ親ウイルス同様に有効か、またはＴ３Ｄ親ウイルスよりも有効であった（表７）。
【００３８】
（表７：異なる腫瘍細胞株における、レオウイルスＴ１ＬおよびＴ３Ｄならびに再集合体の細胞病理学）
【００３９】
【表８】
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【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１】ＰＫＲ−／−  対  ＰＫＲ＋／＋のマウス胚線維芽細胞における、レオウイルス株Ｔ１ＬおよびＴ３Ｄのウイルス収率。
【図２】Ｒｅｏ  Ｔ１ＬおよびＴ３Ｄを感染させたＭＥＦにおけるＰＫＲのイムノブロット。
【図３】レオウイルス株での処理後の、ｃｔ２６腫瘍を有するマウスの肺。Ｔ１Ｌ、Ｔ３Ｄ、ＥＢ９６、ＥＢ１０８およびＥＢ１４６を、未処理のコントロール肺と比較する。２匹のマウス由来の肺を、各処理について示す。
【図４】ＢＡＬＢ−Ｃマウス肺の重量を、ＣＴ２６腫瘍およびレオウイルス処理の存在と比較する。
【図５】レオウイルス株処理後の、ｃｔ２６腫瘍を有するマウスの肺葉を示す、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色した組織学的切片。Ｔ１Ｌ、Ｔ３Ｄ、ＥＢ９６、ＥＢ１０８およびＥＢ１４６を、未処理のコントロール肺と比較する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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2004519431.tif 000073
2004519431.tif 000074
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