(57)【要約】細胞への核酸分子の送達方法および細胞への核酸送達および核酸の発現を測定する方法が提供されている。これらの方法は、細胞への人工染色体を含む大型核酸分子の導入用に設計されており、インビトロおよびインビボで実践される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞への大型核酸分子の導入方法であって、
(ａ)核酸分子を送達因子に暴露し、
(ｂ)細胞を送達因子に暴露し、そして
(ｃ)細胞を核酸分子と接触させることにより、核酸分子を細胞へ送達させる
段階を含み、段階(ａ)〜(ｃ)は順序立てて連続的または同時に行なわれるものとし、ただし、送達因子がエネルギーである場合、それは核酸分子には適用されず、細胞と核酸分子の接触後それは細胞には適用されないものとする方法。
【請求項２】
核酸分子および細胞間の接触を増加させる作用因子に核酸分子を暴露し、そして細胞の透過性を高める作用因子に細胞を暴露する、請求項１記載の方法。
【請求項３】
核酸分子が約０.６メガ塩基よりも大きい、請求項１記載の方法。
【請求項４】
核酸分子が約１メガ塩基よりも大きい、請求項１記載の方法。
【請求項５】
核酸分子が約５メガ塩基よりも大きい、請求項１記載の方法。
【請求項６】
核酸分子が、天然染色体、人工染色体、または約０.６メガ塩基よりも大きい染色体のフラグメントまたは約０.６メガ塩基よりも大きい裸のＤＮＡである、請求項１記載の方法。
【請求項７】
核酸分子が人工染色体である、請求項１記載の方法。
【請求項８】
核酸分子が、人工染色体発現系(ＡＣｅｓ)である、請求項１記載の方法。
【請求項９】
核酸分子を、インビトロ、エクスビボまたはインビボで送達因子に暴露する、請求項１記載の方法。
【請求項１０】
送達因子に暴露された核酸分子と細胞の接触をインビトロ、エクスビボまたはインビボで行なう、請求項１記載の方法。
【請求項１１】
送達因子への核酸の暴露が、核酸を送達因子と混合することにより行なわれ、そして透過性を高める作用因子への細胞の暴露が、細胞への超音波または電気エネルギーの適用を含む、請求項１または２記載の方法。
【請求項１２】
送達因子がカチオン化合物を含む、請求項１記載の方法。
【請求項１３】
カチオン化合物が、カチオン脂質、カチオンポリマー、カチオン脂質混合物、カチオンポリマー混合物、カチオン脂質およびカチオンポリマーの混合物、カチオン脂質および中性脂質の混合物、ポリカチオン脂質、非リポソーム形成脂質、活性化デンドリマー、および塩化ピリジニウム界面活性剤から成る群から選択される、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
送達因子が１種またはそれ以上のカチオン化合物を含む組成物であり、化合物が、Ｎ−[１−(２,３−ジオレイルオキシ)プロピル]−Ｎ,Ｎ,Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド(ＤＯＴＭＡ)、ジオレイルホスファチジルエタノールアミン(ＤＯＰＥ)、２,３−ジオレイルオキシ−Ｎ−[２(スペルミンカルボキサミド)エチル]−Ｎ,Ｎ−ジメチル−１−プロパンアミニウムトリフルオロアセテート(ＤＯＳＰＡ)、Ｃ52Ｈ106Ｎ６Ｏ４・４ＣＦ３ＣＯ２Ｈ、Ｃ88Ｈ178Ｎ８Ｏ４Ｓ２・４ＣＦ３ＣＯ２Ｈ、Ｃ40Ｈ84ＮＯ３Ｐ・ＣＦ３ＣＯ２Ｈ、Ｃ50Ｈ103Ｎ７Ｏ３・４ＣＦ３ＣＯ２Ｈ、Ｃ55Ｈ116Ｎ８Ｏ２・６ＣＦ３ＣＯ２Ｈ、Ｃ49Ｈ102Ｎ６Ｏ3・４ＣＦ３ＣＯ２Ｈ、Ｃ44Ｈ89Ｎ５Ｏ３・２ＣＦ３ＣＯ２Ｈ、Ｃ100Ｈ206Ｎ12Ｏ４Ｓ２・８ＣＦ３ＣＯ２Ｈ、Ｃ41Ｈ78ＮＯ8Ｐ、Ｃ162Ｈ330Ｎ22Ｏ９・１３ＣＦ３ＣＯ２Ｈ、Ｃ43Ｈ88Ｎ４Ｏ２・２ＣＦ３ＣＯ２Ｈ、Ｃ43Ｈ88Ｎ４Ｏ３・２ＣＦ３ＣＯ２Ｈ、および(１−メチル−４−(１−オクタデカ−９−エニル−ノナデカ−１０−エニレニル)ピリジニウムクロリドから成る群から選択される、請求項１２記載の方法。
【請求項１５】
送達因子がエネルギーである、請求項１記載の方法。
【請求項１６】
細胞をエネルギーで処理する、請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
エネルギーが超音波エネルギーである、請求項１５記載の方法。
【請求項１８】
超音波エネルギーを約３０秒間〜約５分間細胞に適用する、請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
超音波エネルギーを一連続パルスとして適用する、請求項１７記載の方法。
【請求項２０】
超音波エネルギーを２またはそれ以上の断続パルスとして適用する、請求項１７記載の方法。
【請求項２１】
超音波エネルギーの断続パルスを、実質的に同じ長さの時間、実質的に同じエネルギーレベルで適用する、請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
断続パルスについて、エネルギーレベル、適用時間の長さ、またはエネルギーレベルおよび適用時間の長さが変化する、請求項２０記載の方法。
【請求項２３】
細胞への超音波エネルギー適用前に、細胞をキャビテーション化合物と接触させる、請求項１１記載の方法。
【請求項２４】
細胞への超音波エネルギー適用前に、細胞をキャビテーション化合物と接触させる、請求項１７記載の方法。
【請求項２５】
透過性を高める作用因子が電気エネルギーの適用を含む、請求項１１記載の方法。
【請求項２６】
(ａ)超音波または電気エネルギーを細胞に適用し、そして
(ｂ)細胞を、超音波または電気エネルギーの適用終結後、核酸分子および送達因子の混合物と接触させることにより、核酸分子を細胞へ送達する
段階を含む、請求項１記載の方法。
【請求項２７】
作用因子がカチオン化合物である、請求項２６記載の方法。
【請求項２８】
エネルギーが超音波である、請求項２５記載の方法。
【請求項２９】
超音波エネルギー適用前に細胞をキャビテーション化合物と接触させる、請求項２８記載の方法。
【請求項３０】
細胞が植物細胞または動物細胞である、請求項１記載の方法。
【請求項３１】
細胞が、核移植供与細胞、幹細胞、一次細胞、不死化セルラインからの細胞および特定器官を発生させ得る細胞から成る群から選択される、請求項１記載の方法。
【請求項３２】
細胞が、一次細胞、不死化細胞、胚細胞、幹細胞、形質転換細胞および腫瘍細胞から成る群から選択される、請求項１記載の方法。
【請求項３３】
細胞が、核移植供与細胞、幹細胞、および特定器官を発生させ得る細胞から成る群から選択される、請求項１記載の方法。
【請求項３４】
(ａ)核酸分子の非存在下で細胞を送達因子と接触させ、そして超音波エネルギーまたは電気エネルギーを細胞に適用し、ただし、接触および適用は連続的または同時に行われるものとし、次いで
(ｂ)細胞を核酸分子と接触させることにより、核酸分子を細胞に送達する
段階を含む、細胞への核酸分子の送達方法。
【請求項３５】
送達因子がカチオン化合物を含む、請求項３４記載の方法。
【請求項３６】
送達因子が１種またはそれ以上のカチオン化合物を含む組成物であり、化合物が、Ｎ−[１−(２,３−ジオレイルオキシ)プロピル]−Ｎ,Ｎ,Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド(ＤＯＴＭＡ)、ジオレイルホスファチジルエタノールアミン(ＤＯＰＥ)、２,３−ジオレイルオキシ−Ｎ−[２(スペルミンカルボキサミド)エチル]−Ｎ,Ｎ−ジメチル−１−プロパンアミニウムトリフルオロアセテート(ＤＯＳＰＡ)、Ｃ52Ｈ106Ｎ６Ｏ４・４ＣＦ３ＣＯ２Ｈ、Ｃ88Ｈ178Ｎ８Ｏ４Ｓ２・４ＣＦ３ＣＯ２Ｈ、Ｃ40Ｈ84ＮＯ３Ｐ・ＣＦ３ＣＯ２Ｈ、Ｃ50Ｈ103Ｎ７Ｏ３・４ＣＦ３ＣＯ２Ｈ、Ｃ55Ｈ116Ｎ８Ｏ２・６ＣＦ３ＣＯ２Ｈ、Ｃ49Ｈ102Ｎ６Ｏ3・４ＣＦ３ＣＯ２Ｈ、Ｃ44Ｈ89Ｎ５Ｏ３・２ＣＦ３ＣＯ２Ｈ、Ｃ100Ｈ206Ｎ12Ｏ４Ｓ２・８ＣＦ３ＣＯ２Ｈ、Ｃ41Ｈ78ＮＯ8Ｐ、Ｃ162Ｈ330Ｎ22Ｏ９・１３ＣＦ３ＣＯ２Ｈ、Ｃ43Ｈ88Ｎ４Ｏ２・２ＣＦ３ＣＯ２Ｈ、Ｃ43Ｈ88Ｎ４Ｏ３・２ＣＦ３ＣＯ２Ｈ、および(１−メチル−４−(１−オクタデカ−９−エニル−ノナデカ−１０−エニレニル)ピリジニウムクロリドから成る群から選択される、請求項３４記載の方法。
【請求項３７】
送達因子が(１−メチル−４−(１−オクタデカ−９−エニル−ノナデカ−１０−エニレニル)ピリジニウムクロリドである、請求項３４記載の方法。
【請求項３８】
核酸分子が約１メガ塩基より大きい、請求項３４記載の方法。
【請求項３９】
核酸分子が、人工染色体、人工染色体発現系(ＡＣｅｓ)および天然染色体または少なくとも約０.６メガ塩基より大きいそのフラグメントから成る群から選択される、請求項３４記載の方法。
【請求項４０】
カチオン化合物が、カチオン脂質、カチオンポリマー、カチオン脂質混合物、カチオンポリマー混合物、カチオン脂質およびカチオンポリマーの混合物、カチオン脂質および中性脂質の混合物、ポリカチオン脂質、非リポソーム形成脂質、活性化デンドリマー、および塩化ピリジニウム界面活性剤から成る群から選択される、請求項３５記載の方法。
【請求項４１】
エネルギーが超音波である、請求項３４記載の方法。
【請求項４２】
超音波エネルギーを、約０.１および１ワット／ｃｍ２の間、約３０秒間〜約５分間細胞に適用する、請求項４１記載の方法。
【請求項４３】
超音波エネルギーを、一連続パルスとしてまたは２またはそれ以上の断続パルスとして適用する、請求項４１記載の方法。
【請求項４４】
パルスが断続パルスであり、そして超音波エネルギーの断続パルスを、実質的に同じ長さの時間、実質的に同じエネルギーレベルで適用する、請求項４３記載の方法。
【請求項４５】
パルスが断続パルスであり、そして断続パルスについて、エネルギーレベル、適用時間の長さ、またはエネルギーレベルおよび適用時間の長さが変化する、請求項４３記載の方法。
【請求項４６】
超音波エネルギー適用前に、細胞をキャビテーション化合物と接触させる、請求項３４記載の方法。
【請求項４７】
細胞が、胚性幹細胞、核移植供与細胞、幹細胞および特定器官を発生させ得る細胞から成る群から選択される、請求項３４記載の方法。
【請求項４８】
対象における細胞への核酸分子の送達方法であって、
(ａ)核酸分子の非存在下で対象に送達因子を投与し、
(ｂ)作用因子投与後、超音波または電気エネルギーを対象に適用し、そして
(ｃ)超音波または電気エネルギーの適用終結後、核酸分子を対象に投与することにより、核酸分子を細胞へ送達する
段階を含む方法。
【請求項４９】
作用因子がカチオン化合物である、請求項４８記載の方法。
【請求項５０】
送達因子および核酸分子の投与およびエネルギーの適用が、細胞が存在する対象の局所領域に直接向けられている、請求項４８記載の方法。
【請求項５１】
送達因子が１種またはそれ以上のカチオン化合物を含む組成物であり、化合物が、Ｎ−[１−(２,３−ジオレイルオキシ)プロピル]−Ｎ,Ｎ,Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド(ＤＯＴＭＡ)、ジオレイルホスファチジルエタノールアミン(ＤＯＰＥ)、２,３−ジオレイルオキシ−Ｎ−[２(スペルミンカルボキサミド)エチル]−Ｎ,Ｎ−ジメチル−１−プロパンアミニウムトリフルオロアセテート(ＤＯＳＰＡ)、Ｃ52Ｈ106Ｎ６Ｏ４・４ＣＦ３ＣＯ２Ｈ、Ｃ88Ｈ178Ｎ８Ｏ４Ｓ２・４ＣＦ３ＣＯ２Ｈ、Ｃ40Ｈ84ＮＯ３Ｐ・ＣＦ３ＣＯ２Ｈ、Ｃ50Ｈ103Ｎ７Ｏ３・４ＣＦ３ＣＯ２Ｈ、Ｃ55Ｈ116Ｎ８Ｏ２・６ＣＦ３ＣＯ２Ｈ、Ｃ49Ｈ102Ｎ６Ｏ3・４ＣＦ３ＣＯ２Ｈ、Ｃ44Ｈ89Ｎ５Ｏ３・２ＣＦ３ＣＯ２Ｈ、Ｃ100Ｈ206Ｎ12Ｏ４Ｓ２・８ＣＦ３ＣＯ２Ｈ、Ｃ41Ｈ78ＮＯ8Ｐ、Ｃ162Ｈ330Ｎ22Ｏ９・１３ＣＦ３ＣＯ２Ｈ、Ｃ43Ｈ88Ｎ４Ｏ２・２ＣＦ３ＣＯ２Ｈ、Ｃ43Ｈ88Ｎ４Ｏ３・２ＣＦ３ＣＯ２Ｈ、および(１−メチル−４−(１−オクタデカ−９−エニル−ノナデカ−１０−エニレニル)ピリジニウムクロリドから成る群から選択される、請求項４８記載の方法。
【請求項５２】
対象の領域が、関節、腫瘍、臓器および組織から成る群から選択される、請求項５０記載の方法。
【請求項５３】
核酸分子が約１メガ塩基より大きい、請求項４８記載の方法。
【請求項５４】
核酸分子が約５メガ塩基より大きい、請求項４８記載の方法。
【請求項５５】
核酸分子が、人工染色体、サテライト人工染色体および天然染色体またはそのフラグメントからなる群から選択される、請求項４８記載の方法。
【請求項５６】
カチオン化合物が、カチオン脂質、カチオンポリマー、カチオン脂質混合物、カチオンポリマー混合物、カチオン脂質およびカチオンポリマーの混合物、カチオン脂質および中性脂質の混合物、ポリカチオン脂質、非リポソーム形成脂質、活性化デンドリマー、および塩化ピリジニウム界面活性剤から成る群から選択される、請求項４９記載の方法。
【請求項５７】
エネルギーが超音波であり、超音波エネルギーを対象に投与する前に、対象にキャビテーション化合物を投与する、請求項４８記載の方法。
【請求項５８】
大型核酸分子を細胞へ送達する方法であって、
(ａ)カチオン脂質を含む組成物と核酸分子を接触させ、次いで、
(ｂ)核酸分子を細胞と接触させ、この場合段階(ａ)および(ｂ)を同時または連続的に行うものとする方法。
【請求項５９】
カチオン脂質組成物が、２,３−ジオレイルオキシ−Ｎ−[２(スペルミンカルボキサミド)エチル]−Ｎ,Ｎ−ジメチル−１−プロパンアミニウムトリフルオロアセテート(ＤＯＳＰＡ)およびジオレイルホスファチジルエタノールアミン(ＤＯＰＥ)を含む、請求項５８記載の方法。
【請求項６０】
核酸分子が０.６メガ塩基対より大きいサイズである、請求項５８記載の方法。
【請求項６１】
核酸分子が、天然染色体、人工染色体、染色体のフラグメント、または裸のＤＮＡである、請求項５８記載の方法。
【請求項６２】
細胞が、植物細胞および動物細胞から成る群から選択される、請求項５８記載の方法。
【請求項６３】
細胞が、一次細胞、不死化細胞、胚細胞、幹細胞、形質転換細胞および腫瘍細胞から成る群から選択される、請求項５８記載の方法。
【請求項６４】
核酸分子をインビトロ、エクスビボまたはインビボで細胞と接触させる、請求項５８記載の方法。
【請求項６５】
対象における細胞への核酸分子の送達方法であって、
(ａ)核酸分子を送達因子と混合し、そして
(ｂ)核酸分子および作用因子の混合物を対象に投与することにより、核酸分子を、作用因子またはエネルギーを単独で使用する場合よりも多大な範囲まで細胞へ送達させる
ことを含む方法。
【請求項６６】
作用因子がカチオン化合物である、請求項６５記載の方法。
【請求項６７】
カチオン化合物および核酸分子混合物を局所適用する、請求項６６記載の方法。
【請求項６８】
混合物を関節、腫瘍、臓器または組織に適用する、請求項６７記載の方法。
【請求項６９】
核酸分子が約１メガ塩基より大きい、請求項６５記載の方法。
【請求項７０】
カチオン化合物が、カチオン脂質、カチオンポリマー、カチオン脂質混合物、カチオンポリマー混合物、カチオン脂質およびカチオンポリマーの混合物、カチオン脂質および中性脂質の混合物、ポリカチオン脂質、非リポソーム形成脂質、活性化デンドリマー、および塩化ピリジニウム界面活性剤から成る群から選択される、請求項６６記載の方法。
【請求項７１】
核酸分子が、人工染色体、人工染色体発現系(ＡＣｅｓ)、天然染色体または少なくとも約０.６メガ塩基よりも大きいそのフラグメントから成る群から選択される、請求項６５記載の方法。
【請求項７２】
核酸分子が、天然染色体、人工染色体、染色体のフラグメントまたは大きさが少なくとも約０.６メガ塩基より大きい裸のＤＮＡである、請求項６５記載の方法。
【請求項７３】
対象において核酸分子を細胞へ送達する方法であって、
(ａ)対象に超音波または電気エネルギーを適用し、そして
(ｂ)超音波または電気エネルギーの適用終結時、対象に核酸分子および送達因子を投与することにより、核酸分子を細胞へ送達する段階を含み、
その場合送達因子および核酸を連続的または単一組成物として投与する方法。
【請求項７４】
超音波または電気エネルギーの適用終結後核酸分子を投与し、送達因子を投与することにより、核酸分子を細胞へ送達する、請求項７３記載の方法。
【請求項７５】
超音波エネルギー適用前に、対象にキャビテーション化合物を投与する、請求項７３記載の方法。
【請求項７６】
エネルギーが超音波であり、超音波エネルギーを適用前に、対象にキャビテーション化合物を投与する、請求項７５記載の方法。
【請求項７７】
作用因子がカチオン化合物である、請求項７３記載の方法。
【請求項７８】
カチオン化合物が、カチオン脂質、カチオンポリマー、カチオン脂質混合物、カチオンポリマー混合物、カチオン脂質およびカチオンポリマーの混合物、カチオン脂質および中性脂質の混合物、ポリカチオン脂質、非リポソーム形成脂質、活性化デンドリマー、および塩化ピリジニウム界面活性剤から成る群から選択される、請求項７７記載の方法。
【請求項７９】
送達因子が１種またはそれ以上のカチオン化合物を含む組成物であり、化合物が、Ｎ−[１−(２,３−ジオレイルオキシ)プロピル]−Ｎ,Ｎ,Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド(ＤＯＴＭＡ)、ジオレイルホスファチジルエタノールアミン(ＤＯＰＥ)、２,３−ジオレイルオキシ−Ｎ−[２(スペルミンカルボキサミド)エチル]−Ｎ,Ｎ−ジメチル−１−プロパンアミニウムトリフルオロアセテート(ＤＯＳＰＡ)、Ｃ52Ｈ106Ｎ６Ｏ４・４ＣＦ３ＣＯ２Ｈ、Ｃ88Ｈ178Ｎ８Ｏ４Ｓ２・４ＣＦ３ＣＯ２Ｈ、Ｃ40Ｈ84ＮＯ３Ｐ・ＣＦ３ＣＯ２Ｈ、Ｃ50Ｈ103Ｎ７Ｏ３・４ＣＦ３ＣＯ２Ｈ、Ｃ55Ｈ116Ｎ８Ｏ２・６ＣＦ３ＣＯ２Ｈ、Ｃ49Ｈ102Ｎ６Ｏ3・４ＣＦ３ＣＯ２Ｈ、Ｃ44Ｈ89Ｎ５Ｏ３・２ＣＦ３ＣＯ２Ｈ、Ｃ100Ｈ206Ｎ12Ｏ４Ｓ２・８ＣＦ３ＣＯ２Ｈ、Ｃ41Ｈ78ＮＯ8Ｐ、Ｃ162Ｈ330Ｎ22Ｏ９・１３ＣＦ３ＣＯ２Ｈ、Ｃ43Ｈ88Ｎ４Ｏ２・２ＣＦ３ＣＯ２Ｈ、Ｃ43Ｈ88Ｎ４Ｏ３・２ＣＦ３ＣＯ２Ｈ、および(１−メチル−４−(１−オクタデカ−９−エニル−ノナデカ−１０−エニレニル)ピリジニウムクロリドから成る群から選択される、請求項７３記載の方法。
【請求項８０】
対象において核酸分子を細胞へ送達する方法であって、
(ａ)対象に超音波または電気エネルギーを適用し、そして
(ｂ)超音波または電気エネルギーの適用終結時、対象に核酸分子を投与することにより、核酸分子を細胞へ送達する
段階を含む方法。
【請求項８１】
エネルギーが超音波であり、超音波エネルギーを適用する前に、対象にキャビテーション化合物を投与する、請求項８０記載の方法。
【請求項８２】
核酸分子が人工染色体発現系(ＡＣｅｓ)である、請求項８０記載の方法。
【請求項８３】
核酸分子が、天然染色体、人工染色体、染色体のフラグメントまたは大きさが少なくとも約０.６メガ塩基より大きい裸のＤＮＡである、請求項８０記載の方法。
【請求項８４】
エクスビボ遺伝子治療方法であって、
(ａ)核酸分子の非存在下における細胞を、核酸分子を細胞へ送達する化合物を含む組成物と接触させることにより核酸分子を細胞へインビトロで送達し、
(ｂ)最初に化合物と接触させた細胞へ超音波または電気エネルギーを適用し、
(ｃ)超音波または電気エネルギーの適用終結時核酸分子と細胞を接触させることにより、核酸分子を細胞へ送達し、そして
(ｄ)対象に細胞を導入する
段階を含む方法。
【請求項８５】
化合物がカチオン化合物である、請求項８４記載の方法。
【請求項８６】
カチオン化合物が、カチオン脂質、カチオンポリマー、カチオン脂質混合物、カチオンポリマー混合物、カチオン脂質およびカチオンポリマーの混合物、カチオン脂質および中性脂質の混合物、ポリカチオン脂質、非リポソーム形成脂質、活性化デンドリマー、および塩化ピリジニウム界面活性剤から成る群から選択される、請求項８５記載の方法。
【請求項８７】
化合物が、Ｎ−[１−(２,３−ジオレイルオキシ)プロピル]−Ｎ,Ｎ,Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド(ＤＯＴＭＡ)、ジオレイルホスファチジルエタノールアミン(ＤＯＰＥ)、２,３−ジオレイルオキシ−Ｎ−[２(スペルミンカルボキサミド)エチル]−Ｎ,Ｎ−ジメチル−１−プロパンアミニウムトリフルオロアセテート(ＤＯＳＰＡ)、Ｃ52Ｈ106Ｎ６Ｏ４・４ＣＦ３ＣＯ２Ｈ、Ｃ88Ｈ178Ｎ８Ｏ４Ｓ２・４ＣＦ３ＣＯ２Ｈ、Ｃ40Ｈ84ＮＯ３Ｐ・ＣＦ３ＣＯ２Ｈ、Ｃ50Ｈ103Ｎ７Ｏ３・４ＣＦ３ＣＯ２Ｈ、Ｃ55Ｈ116Ｎ８Ｏ２・６ＣＦ３ＣＯ２Ｈ、Ｃ49Ｈ102Ｎ６Ｏ3・４ＣＦ３ＣＯ２Ｈ、Ｃ44Ｈ89Ｎ５Ｏ３・２ＣＦ３ＣＯ２Ｈ、Ｃ41Ｈ78ＮＯ8Ｐ、Ｃ100Ｈ206Ｎ12Ｏ４Ｓ２・８ＣＦ３ＣＯ２Ｈ、Ｃ162Ｈ330Ｎ22Ｏ９・１３ＣＦ３ＣＯ２Ｈ、Ｃ43Ｈ88Ｎ４Ｏ２・２ＣＦ３ＣＯ２Ｈ、Ｃ43Ｈ88Ｎ４Ｏ３・２ＣＦ３ＣＯ２Ｈおよび(１−メチル−４−(１−オクタデカ−９−エニル−ノナデカ−１０−エニレニル)ピリジニウムクロリドから成る群から選択される、請求項８５記載の方法。
【請求項８８】
核酸分子が、天然染色体、人工染色体、染色体のフラグメントまたは大きさが少なくとも約０.６メガ塩基より大きい裸のＤＮＡである、請求項８４記載の方法。
【請求項８９】
細胞が植物細胞または動物細胞である、請求項８４記載の方法。
【請求項９０】
細胞が、核移植供与細胞、幹細胞、一次細胞、不死化セルライン、および特定器官を発生させ得る細胞から成る群から選択される、請求項８４記載の方法。
【請求項９１】
細胞が、不死化細胞、胚細胞、幹細胞、形質転換細胞および腫瘍細胞から成る群から選択される、請求項８４記載の方法。
【請求項９２】
エクスビボ遺伝子治療方法であって、
(ａ)核酸分子を細胞へ送達する化合物を含む組成物と混合した核酸分子と細胞を接触させることにより核酸分子を細胞へインビトロで送達し、
(ｂ)核酸分子および化合物と接触させた細胞へ超音波または電気エネルギーを適用することにより、化合物単独の存在下における場合よりも多大な範囲まで核酸分子を細胞へ送達し、
(ｃ)対象に細胞を導入する
段階を含む方法。
【請求項９３】
化合物が、カチオン脂質、カチオンポリマー、カチオン脂質混合物、カチオンポリマー混合物、カチオン脂質およびカチオンポリマーの混合物、カチオン脂質および中性脂質の混合物、ポリカチオン脂質、非リポソーム形成脂質、活性化デンドリマー、および塩化ピリジニウム界面活性剤から成る群から選択される、請求項９２記載の方法。
【請求項９４】
化合物が、Ｎ−[１−(２,３−ジオレイルオキシ)プロピル]−Ｎ,Ｎ,Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド(ＤＯＴＭＡ)、ジオレイルホスファチジルエタノールアミン(ＤＯＰＥ)、２,３−ジオレイルオキシ−Ｎ−[２(スペルミン−カルボキサミド)エチル]−Ｎ,Ｎ−ジメチル−１−プロパンアミニウムトリフルオロアセテート(ＤＯＳＰＡ)、Ｃ52Ｈ106Ｎ６Ｏ４・４ＣＦ３ＣＯ２Ｈ、Ｃ88Ｈ178Ｎ８Ｏ４Ｓ２・４ＣＦ３ＣＯ２Ｈ、Ｃ40Ｈ84ＮＯ３Ｐ・ＣＦ３ＣＯ２Ｈ、Ｃ50Ｈ103Ｎ７Ｏ３・４ＣＦ３ＣＯ２Ｈ、Ｃ55Ｈ116Ｎ８Ｏ２・６ＣＦ３ＣＯ２Ｈ、Ｃ49Ｈ102Ｎ６Ｏ3・４ＣＦ３ＣＯ２Ｈ、Ｃ44Ｈ89Ｎ５Ｏ３・２ＣＦ３ＣＯ２Ｈ、Ｃ41Ｈ78ＮＯ8Ｐ、Ｃ100Ｈ206Ｎ12Ｏ４Ｓ２・８ＣＦ３ＣＯ２Ｈ、Ｃ162Ｈ330Ｎ22Ｏ９・１３ＣＦ３ＣＯ２Ｈ、Ｃ43Ｈ88Ｎ４Ｏ２・２ＣＦ３ＣＯ２Ｈ、Ｃ43Ｈ88Ｎ４Ｏ３・２ＣＦ３ＣＯ２Ｈおよび(１−メチル−４−(１−オクタデカ−９−エニル−ノナデカ−１０−エニレニル)ピリジニウムクロリドから成る群から選択される、請求項９２記載の方法。
【請求項９５】
核酸分子が、天然染色体、人工染色体、染色体のフラグメントまたは大きさが少なくとも約０.６メガ塩基より大きい裸のＤＮＡである、請求項９２記載の方法。
【請求項９６】
細胞が植物細胞または動物細胞である、請求項９２記載の方法。
【請求項９７】
細胞が、核移植供与細胞、幹細胞、一次細胞、不死化細胞、および特定器官を発生させ得る細胞から成る群から選択される、請求項９２記載の方法。
【請求項９８】
細胞が、胚細胞、幹細胞、形質転換細胞および腫瘍細胞から成る群から選択される、請求項９２記載の方法。
【請求項９９】
エネルギーが超音波であり、細胞へ超音波を適用する前に、細胞をキャビテーション化合物と接触させる、請求項９２記載の方法。
【請求項１００】
エクスビボ遺伝子治療方法であって、
(ａ)核酸分子の非存在下における細胞を、核酸分子を細胞へ送達する化合物を含む組成物とインビトロで接触させ、
(ｂ)先に化合物と接触させた細胞を核酸分子と接触させ、
(ｃ)化合物および核酸分子と接触させた細胞に超音波または電気エネルギーを適用することにより、化合物単独の存在下における場合よりも多大な範囲まで核酸分子を細胞へ送達し、そして
(ｄ)対象に細胞を導入する
段階を含む方法。
【請求項１０１】
化合物が、カチオン脂質、カチオンポリマー、カチオン脂質混合物、カチオンポリマー混合物、カチオン脂質およびカチオンポリマーの混合物、カチオン脂質および中性脂質の混合物、ポリカチオン脂質、非リポソーム形成脂質、活性化デンドリマー、および塩化ピリジニウム界面活性剤から成る群から選択される、請求項１００記載の方法。
【請求項１０２】
化合物が、Ｎ−[１−(２,３−ジオレイルオキシ)プロピル]−Ｎ,Ｎ,Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド(ＤＯＴＭＡ)、ジオレイルホスファチジルエタノールアミン(ＤＯＰＥ)、２,３−ジオレイルオキシ−Ｎ−[２(スペルミン−カルボキサミド)エチル]−Ｎ,Ｎ−ジメチル−１−プロパンアミニウムトリフルオロアセテート(ＤＯＳＰＡ)、Ｃ52Ｈ106Ｎ６Ｏ４・４ＣＦ３ＣＯ２Ｈ、Ｃ88Ｈ178Ｎ８Ｏ４Ｓ２・４ＣＦ３ＣＯ２Ｈ、Ｃ40Ｈ84ＮＯ３Ｐ・ＣＦ３ＣＯ２Ｈ、Ｃ50Ｈ103Ｎ７Ｏ３・４ＣＦ３ＣＯ２Ｈ、Ｃ55Ｈ116Ｎ８Ｏ２・６ＣＦ３ＣＯ２Ｈ、Ｃ49Ｈ102Ｎ６Ｏ3・４ＣＦ３ＣＯ２Ｈ、Ｃ44Ｈ89Ｎ５Ｏ３・２ＣＦ３ＣＯ２Ｈ、Ｃ41Ｈ78ＮＯ8Ｐ、Ｃ100Ｈ206Ｎ12Ｏ４Ｓ２・８ＣＦ３ＣＯ２Ｈ、Ｃ162Ｈ330Ｎ22Ｏ９・１３ＣＦ３ＣＯ２Ｈ、Ｃ43Ｈ88Ｎ４Ｏ２・２ＣＦ３ＣＯ２Ｈ、Ｃ43Ｈ88Ｎ４Ｏ３・２ＣＦ３ＣＯ２Ｈおよび(１−メチル−４−(１−オクタデカ−９−エニル−ノナデカ−１０−エニレニル)ピリジニウムクロリドから成る群から選択される、請求項１００記載の方法。
【請求項１０３】
核酸分子が、天然染色体、人工染色体、染色体のフラグメントまたは大きさが少なくとも約０.６メガ塩基より大きい裸のＤＮＡである、請求項１００記載の方法。
【請求項１０４】
細胞が植物細胞または動物細胞である、請求項１００記載の方法。
【請求項１０５】
細胞が、核移植供与細胞、幹細胞、一次細胞、不死化細胞、および特定器官を発生させ得る細胞から成る群から選択される、請求項１００記載の方法。
【請求項１０６】
細胞が、胚細胞、形質転換細胞および腫瘍細胞から成る群から選択される、請求項１００記載の方法。
【請求項１０７】
エネルギーが超音波であり、細胞へ超音波を適用する前に、細胞をキャビテーション化合物と接触させる、請求項１００記載の方法。
【請求項１０８】
エクスビボ遺伝子治療方法であって、
(ａ)細胞に超音波または電気エネルギーをインビトロで適用し、
(ｂ)超音波またはエネルギーの適用終結時、核酸分子および核酸分子を細胞へ送達する化合物を含む組成物の混合物と細胞を接触させることにより、細胞へ核酸分子を送達し、そして
(ｃ)対象へ細胞を導入する
段階を含む方法。
【請求項１０９】
化合物が、カチオン脂質、カチオンポリマー、カチオン脂質混合物、カチオンポリマー混合物、カチオン脂質およびカチオンポリマーの混合物、カチオン脂質および中性脂質の混合物、ポリカチオン脂質、非リポソーム形成脂質、活性化デンドリマー、および塩化ピリジニウム界面活性剤から成る群から選択される、請求項１０８記載の方法。
【請求項１１０】
化合物が、Ｎ−[１−(２,３−ジオレイルオキシ)プロピル]−Ｎ,Ｎ,Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド(ＤＯＴＭＡ)、ジオレイルホスファチジルエタノールアミン(ＤＯＰＥ)、２,３−ジオレイルオキシ−Ｎ−[２(スペルミン−カルボキサミド)エチル]−Ｎ,Ｎ−ジメチル−１−プロパンアミニウムトリフルオロアセテート(ＤＯＳＰＡ)、Ｃ52Ｈ106Ｎ６Ｏ４・４ＣＦ３ＣＯ２Ｈ、Ｃ88Ｈ178Ｎ８Ｏ４Ｓ２・４ＣＦ３ＣＯ２Ｈ、Ｃ40Ｈ84ＮＯ３Ｐ・ＣＦ３ＣＯ２Ｈ、Ｃ50Ｈ103Ｎ７Ｏ３・４ＣＦ３ＣＯ２Ｈ、Ｃ55Ｈ116Ｎ８Ｏ２・６ＣＦ３ＣＯ２Ｈ、Ｃ49Ｈ102Ｎ６Ｏ3・４ＣＦ３ＣＯ２Ｈ、Ｃ44Ｈ89Ｎ５Ｏ３・２ＣＦ３ＣＯ２Ｈ、Ｃ41Ｈ78ＮＯ8Ｐ、Ｃ100Ｈ206Ｎ12Ｏ４Ｓ２・８ＣＦ３ＣＯ２Ｈ、Ｃ162Ｈ330Ｎ22Ｏ９・１３ＣＦ３ＣＯ２Ｈ、Ｃ43Ｈ88Ｎ４Ｏ２・２ＣＦ３ＣＯ２Ｈ、Ｃ43Ｈ88Ｎ４Ｏ３・２ＣＦ３ＣＯ２Ｈおよび(１−メチル−４−(１−オクタデカ−９−エニル−ノナデカ−１０−エニレニル)ピリジニウムクロリドから成る群から選択される、請求項１０８記載の方法。
【請求項１１１】
核酸分子が、天然染色体、人工染色体、染色体のフラグメントまたは大きさが少なくとも約０.６メガ塩基より大きい裸のＤＮＡである、請求項１０８記載の方法。
【請求項１１２】
細胞が植物細胞または動物細胞である、請求項１０８記載の方法。
【請求項１１３】
細胞が、核移植供与細胞、幹細胞、一次細胞、不死化細胞、および特定器官を発生させ得る細胞から成る群から選択される、請求項１０８記載の方法。
【請求項１１４】
細胞が、胚細胞、形質転換細胞および腫瘍細胞から成る群から選択される、請求項１０８記載の方法。
【請求項１１５】
エネルギーが超音波であり、細胞へ超音波を適用する前に、細胞をキャビテーション化合物と接触させる、請求項１０８記載の方法。
【請求項１１６】
エクスビボ遺伝子治療方法であって、
(ａ)細胞に超音波または電気エネルギーをインビトロで適用し、
(ｂ)超音波または電気エネルギーの適用終結時、細胞へ核酸分子を送達する少なくとも１種の化合物を含む組成物と細胞を接触させ、
(ｃ)先に化合物と接触させた細胞を核酸分子と接触させることにより、核酸分子を細胞へ送達し、そして
(ｄ)細胞を対象に導入する
段階を含む方法。
【請求項１１７】
化合物が、カチオン脂質、カチオンポリマー、カチオン脂質混合物、カチオンポリマー混合物、カチオン脂質およびカチオンポリマーの混合物、カチオン脂質および中性脂質の混合物、ポリカチオン脂質、非リポソーム形成脂質、活性化デンドリマー、および塩化ピリジニウム界面活性剤から成る群から選択される、請求項１１６記載の方法。
【請求項１１８】
化合物が、Ｎ−[１−(２,３−ジオレイルオキシ)プロピル]−Ｎ,Ｎ,Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド(ＤＯＴＭＡ)、ジオレイルホスファチジルエタノールアミン(ＤＯＰＥ)、２,３−ジオレイルオキシ−Ｎ−[２(スペルミン−カルボキサミド)エチル]−Ｎ,Ｎ−ジメチル−１−プロパンアミニウムトリフルオロアセテート(ＤＯＳＰＡ)、Ｃ52Ｈ106Ｎ６Ｏ４・４ＣＦ３ＣＯ２Ｈ、Ｃ88Ｈ178Ｎ８Ｏ４Ｓ２・４ＣＦ３ＣＯ２Ｈ、Ｃ40Ｈ84ＮＯ３Ｐ・ＣＦ３ＣＯ２Ｈ、Ｃ50Ｈ103Ｎ７Ｏ３・４ＣＦ３ＣＯ２Ｈ、Ｃ55Ｈ116Ｎ８Ｏ２・６ＣＦ３ＣＯ２Ｈ、Ｃ49Ｈ102Ｎ６Ｏ3・４ＣＦ３ＣＯ２Ｈ、Ｃ44Ｈ89Ｎ５Ｏ３・２ＣＦ３ＣＯ２Ｈ、Ｃ41Ｈ78ＮＯ8Ｐ、Ｃ100Ｈ206Ｎ12Ｏ４Ｓ２・８ＣＦ３ＣＯ２Ｈ、Ｃ162Ｈ330Ｎ22Ｏ９・１３ＣＦ３ＣＯ２Ｈ、Ｃ43Ｈ88Ｎ４Ｏ２・２ＣＦ３ＣＯ２Ｈ、Ｃ43Ｈ88Ｎ４Ｏ３・２ＣＦ３ＣＯ２Ｈおよび(１−メチル−４−(１−オクタデカ−９−エニル−ノナデカ−１０−エニレニル)ピリジニウムクロリドから成る群から選択される、請求項１１６記載の方法。
【請求項１１９】
核酸分子が、天然染色体、人工染色体、染色体のフラグメントまたは大きさが少なくとも約０.６メガ塩基より大きい裸のＤＮＡである、請求項１１６記載の方法。
【請求項１２０】
細胞が植物細胞または動物細胞である、請求項１１６記載の方法。
【請求項１２１】
細胞が、核移植供与細胞、幹細胞、一次細胞、不死化細胞、および特定器官を発生させ得る細胞から成る群から選択される、請求項１１６記載の方法。
【請求項１２２】
細胞が、胚細胞、形質転換細胞および腫瘍細胞から成る群から選択される、請求項１１６記載の方法。
【請求項１２３】
エネルギーが超音波であり、細胞へ超音波を適用する前に、細胞をキャビテーション化合物と接触させる、請求項１１６記載の方法。
【請求項１２４】
エクスビボ遺伝子治療方法であって、
(ａ)細胞を核酸分子とインビトロで接触させ、
(ｂ)核酸分子と接触させた細胞に超音波または電気エネルギーを適用することにより、核酸分子を細胞へ送達し、そして
(ｃ)細胞を対象へ導入する
段階を含む方法。
【請求項１２５】
エネルギーが超音波であり、超音波エネルギーを適用する前に、細胞をキャビテーション化合物と接触させる、請求項１２４記載の方法。
【請求項１２６】
核酸分子が、天然染色体、人工染色体、染色体のフラグメントまたは大きさが少なくとも約０.６メガ塩基より大きい裸のＤＮＡである、請求項１２４記載の方法。
【請求項１２７】
細胞が植物細胞または動物細胞である、請求項１２４記載の方法。
【請求項１２８】
細胞が、核移植供与細胞、幹細胞、一次細胞、不死化細胞、および特定器官を発生させ得る細胞から成る群から選択される、請求項１２４記載の方法。
【請求項１２９】
細胞が、胚細胞、形質転換細胞および腫瘍細胞から成る群から選択される、請求項１２４記載の方法。
【請求項１３０】
エネルギーが超音波であり、細胞へ超音波を適用する前に、細胞をキャビテーション化合物と接触させる、請求項１２４記載の方法。
【請求項１３１】
エクスビボ遺伝子治療方法であって、
(ａ)細胞に超音波または電気エネルギーをインビトロで適用し、
(ｂ)超音波または電気エネルギーの適用終結時、細胞を核酸分子と接触させることにより、核酸分子を細胞に送達し、
(ｃ)細胞を対象に導入する
段階を含む方法。
【請求項１３２】
核酸分子が、天然染色体、人工染色体、染色体のフラグメントまたは大きさが少なくとも約０.６メガ塩基より大きい裸のＤＮＡである、請求項１３１記載の方法。
【請求項１３３】
細胞が植物細胞または動物細胞である、請求項１３１記載の方法。
【請求項１３４】
細胞が、核移植供与細胞、幹細胞、一次細胞、不死化細胞、および特定器官を発生させ得る細胞から成る群から選択される、請求項１３１記載の方法。
【請求項１３５】
細胞が、胚細胞、形質転換細胞および腫瘍細胞から成る群から選択される、請求項１３１記載の方法。
【請求項１３６】
エネルギーが超音波であり、超音波エネルギーを適用する前に、細胞をキャビテーション化合物と接触させる、請求項１３１記載の方法。
【請求項１３７】
化合物が、カチオン脂質、カチオンポリマー、カチオン脂質混合物、カチオンポリマー混合物、カチオン脂質およびカチオンポリマーの混合物、カチオン脂質および中性脂質の混合物、ポリカチオン脂質、非リポソーム形成脂質、活性化デンドリマー、および塩化ピリジニウム界面活性剤から成る群から選択される、請求項１３１記載の方法。
【請求項１３８】
化合物が、Ｎ−[１−(２,３−ジオレイルオキシ)プロピル]−Ｎ,Ｎ,Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド(ＤＯＴＭＡ)、ジオレイルホスファチジルエタノールアミン(ＤＯＰＥ)、２,３−ジオレイルオキシ−Ｎ−[２(スペルミン−カルボキサミド)エチル]−Ｎ,Ｎ−ジメチル−１−プロパンアミニウムトリフルオロアセテート(ＤＯＳＰＡ)、Ｃ52Ｈ106Ｎ６Ｏ４・４ＣＦ３ＣＯ２Ｈ、Ｃ88Ｈ178Ｎ８Ｏ４Ｓ２・４ＣＦ３ＣＯ２Ｈ、Ｃ40Ｈ84ＮＯ３Ｐ・ＣＦ３ＣＯ２Ｈ、Ｃ50Ｈ103Ｎ７Ｏ３・４ＣＦ３ＣＯ２Ｈ、Ｃ55Ｈ116Ｎ８Ｏ２・６ＣＦ３ＣＯ２Ｈ、Ｃ49Ｈ102Ｎ６Ｏ3・４ＣＦ３ＣＯ２Ｈ、Ｃ44Ｈ89Ｎ５Ｏ３・２ＣＦ３ＣＯ２Ｈ、Ｃ41Ｈ78ＮＯ8Ｐ、Ｃ100Ｈ206Ｎ12Ｏ４Ｓ２・８ＣＦ３ＣＯ２Ｈ、Ｃ162Ｈ330Ｎ22Ｏ９・１３ＣＦ３ＣＯ２Ｈ、Ｃ43Ｈ88Ｎ４Ｏ２・２ＣＦ３ＣＯ２Ｈ、Ｃ43Ｈ88Ｎ４Ｏ３・２ＣＦ３ＣＯ２Ｈおよび(１−メチル−４−(１−オクタデカ−９−エニル−ノナデカ−１０−エニレニル)ピリジニウムクロリドから成る群から選択される、請求項１３１記載の方法。
【請求項１３９】
細胞へ核酸を送達するキットであって、
送達因子を含む組成物を含む送達剤、
音響穿孔法または電気穿孔遂行用試薬、および
細胞への核酸送達についての所望による使用説明書
を含むキット。
【請求項１４０】
さらに人工染色体を含む組成物を含む、請求項１３９記載のキット。
【請求項１４１】
送達因子が、カチオン脂質、カチオンポリマー、カチオン脂質混合物、カチオンポリマー混合物、カチオン脂質およびカチオンポリマーの混合物、カチオン脂質および中性脂質の混合物、ポリカチオン脂質、非リポソーム形成脂質、活性化デンドリマー、および塩化ピリジニウム界面活性剤から成る群から選択される化合物を含む、請求項１４０記載のキット。
【請求項１４２】
化合物が、Ｎ−[１−(２,３−ジオレイルオキシ)プロピル]−Ｎ,Ｎ,Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド(ＤＯＴＭＡ)、ジオレイルホスファチジルエタノールアミン(ＤＯＰＥ)、２,３−ジオレイルオキシ−Ｎ−[２(スペルミン−カルボキサミド)エチル]−Ｎ,Ｎ−ジメチル−１−プロパンアミニウムトリフルオロアセテート(ＤＯＳＰＡ)、Ｃ52Ｈ106Ｎ６Ｏ４・４ＣＦ３ＣＯ２Ｈ、Ｃ88Ｈ178Ｎ８Ｏ４Ｓ２・４ＣＦ３ＣＯ２Ｈ、Ｃ40Ｈ84ＮＯ３Ｐ・ＣＦ３ＣＯ２Ｈ、Ｃ50Ｈ103Ｎ７Ｏ３・４ＣＦ３ＣＯ２Ｈ、Ｃ55Ｈ116Ｎ８Ｏ２・６ＣＦ３ＣＯ２Ｈ、Ｃ49Ｈ102Ｎ６Ｏ3・４ＣＦ３ＣＯ２Ｈ、Ｃ44Ｈ89Ｎ５Ｏ３・２ＣＦ３ＣＯ２Ｈ、Ｃ41Ｈ78ＮＯ8Ｐ、Ｃ100Ｈ206Ｎ12Ｏ４Ｓ２・８ＣＦ３ＣＯ２Ｈ、Ｃ162Ｈ330Ｎ22Ｏ９・１３ＣＦ３ＣＯ２Ｈ、Ｃ43Ｈ88Ｎ４Ｏ２・２ＣＦ３ＣＯ２Ｈ、Ｃ43Ｈ88Ｎ４Ｏ３・２ＣＦ３ＣＯ２Ｈおよび(１−メチル−４−(１−オクタデカ−９−エニル−ノナデカ−１０−エニレニル)ピリジニウムクロリドから成る群から選択される、請求項１４１記載のキット。
【請求項１４３】
細胞へ導入された核酸の送達および発現を検出または測定する方法であって、
リポーター遺伝子をコード化する標識核酸分子を細胞へ導入し、
細胞への核酸送達の指標として標識細胞を検出し、そして
細胞におけるＤＮＡ発現の指標としてリポーター遺伝子産物を測定することにより、細胞における核酸分子の送達および発現を検出または測定する
段階を含む方法。
【請求項１４４】
標識細胞を、フローサイトメトリー、蛍光定量法、細胞イメージングまたは蛍光顕微鏡法により検出する、請求項１４３記載の方法。
【請求項１４５】
標識細胞をフローサイトメトリーにより検出する、請求項１４３記載の方法。
【請求項１４６】
核酸分子がＤＮＡである、請求項１４３記載の方法。
【請求項１４７】
標識が、ヨードデオキシウリジン(ＩｄＵまたはＩｄＵｒｄ)またはブロモデオキシウリジン(ＢｒｄＵ)である、請求項１４３記載の方法。
【請求項１４８】
リポーター遺伝子が、蛍光タンパク質、酵素または抗体をコード化する、請求項１４３記載の方法。
【請求項１４９】
酵素が、ルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼまたはアルカリ性ホスファターゼである、請求項１４８記載の方法。
【請求項１５０】
蛍光タンパク質が、赤色、緑色または青色蛍光タンパク質である、請求項１４８記載の方法。
【請求項１５１】
核酸分子が、天然染色体、人工染色体、染色体のフラグメントまたは大きさが少なくとも約０.６メガ塩基より大きい裸のＤＮＡである、請求項１４３記載の方法。
【請求項１５２】
核酸分子が、人工染色体、プラスミド、染色体フラグメント、裸のＤＮＡまたは天然染色体である、請求項１４３記載の方法。
【請求項１５３】
核酸分子が、人工染色体発現系(ＡＣｅｓ)である、請求項１４３記載の方法。
【請求項１５４】
細胞が真核生物細胞である、請求項１４３記載の方法。
【請求項１５５】
細胞が、一次細胞、セルライン、植物細胞または動物細胞である、請求項１５４記載の方法。
【請求項１５６】
細胞が、幹細胞、核移植供与細胞、腫瘍細胞または形質転換細胞である、請求項１５５記載の方法。
【請求項１５７】
細胞への核酸分子の送達をモニターする方法であって、
(ａ)核酸分子を標識し、
(ｂ)標識核酸分子を細胞へ送達し、そして
(ｃ)細胞への核酸分子送達の指標として、フローサイトメトリー、蛍光定量法、細胞イメージングまたは蛍光顕微鏡法により細胞における標識核酸分子を検出する
段階を含む方法。
【請求項１５８】
核酸分子をチミジン類似体で標識する、請求項１５７記載の方法。
【請求項１５９】
チミジン類似体がヨードデオキシウリジンまたはブロモデオキシウリジンである、請求項１５８記載の方法。
【請求項１６０】
核酸分子を、カチオン化合物を含む送達因子で処理する、請求項１５７記載の方法。
【請求項１６１】
化合物が、Ｎ−[１−(２,３−ジオレイルオキシ)プロピル]−Ｎ,Ｎ,Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド(ＤＯＴＭＡ)、ジオレイルホスファチジルエタノールアミン(ＤＯＰＥ)、２,３−ジオレイルオキシ−Ｎ−[２(スペルミン−カルボキサミド)エチル]−Ｎ,Ｎ−ジメチル−１−プロパンアミニウムトリフルオロアセテート(ＤＯＳＰＡ)、Ｃ52Ｈ106Ｎ６Ｏ４・４ＣＦ３ＣＯ２Ｈ、Ｃ88Ｈ178Ｎ８Ｏ４Ｓ２・４ＣＦ３ＣＯ２Ｈ、Ｃ40Ｈ84ＮＯ３Ｐ・ＣＦ３ＣＯ２Ｈ、Ｃ50Ｈ103Ｎ７Ｏ３・４ＣＦ３ＣＯ２Ｈ、Ｃ55Ｈ116Ｎ８Ｏ２・６ＣＦ３ＣＯ２Ｈ、Ｃ49Ｈ102Ｎ６Ｏ3・４ＣＦ３ＣＯ２Ｈ、Ｃ44Ｈ89Ｎ５Ｏ３・２ＣＦ３ＣＯ２Ｈ、Ｃ41Ｈ78ＮＯ8Ｐ、Ｃ100Ｈ206Ｎ12Ｏ４Ｓ２・８ＣＦ３ＣＯ２Ｈ、Ｃ162Ｈ330Ｎ22Ｏ９・１３ＣＦ３ＣＯ２Ｈ、Ｃ43Ｈ88Ｎ４Ｏ２・２ＣＦ３ＣＯ２Ｈ、Ｃ43Ｈ88Ｎ４Ｏ３・２ＣＦ３ＣＯ２Ｈおよび(１−メチル−４−(１−オクタデカ−９−エニル−ノナデカ−１０−エニレニル)ピリジニウムクロリドから成る群から選択される、請求項１６０記載の方法。
【請求項１６２】
核酸分子が、天然染色体、人工染色体、染色体のフラグメントまたは大きさが少なくとも約０.６メガ塩基より大きい裸のＤＮＡである、請求項１５８記載の方法。
【請求項１６３】
作用因子が核酸分子を細胞へ送達する能力についてのスクリーニング方法であって、
(ａ)作用因子の存在下において標識核酸分子を細胞へ送達し、そして
(ｂ)作用因子が細胞へ核酸分子を送達する能力の指標として、標識を含む細胞の数を測定する
段階を含む方法。
【請求項１６４】
細胞数を、フローサイトメトリー、蛍光定量法、細胞イメージングまたは蛍光顕微鏡法により測定する、請求項１６３記載の方法。
【請求項１６５】
標識がヨードデオキシウリジンまたはブロモデオキシウリジンである、請求項１６３記載の方法。
【請求項１６６】
作用因子がカチオン化合物を含む、請求項１６３記載の方法。
【請求項１６７】
化合物が、Ｎ−[１−(２,３−ジオレイルオキシ)プロピル]−Ｎ,Ｎ,Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド(ＤＯＴＭＡ)、ジオレイルホスファチジルエタノールアミン(ＤＯＰＥ)、２,３−ジオレイルオキシ−Ｎ−[２(スペルミン−カルボキサミド)エチル]−Ｎ,Ｎ−ジメチル−１−プロパンアミニウムトリフルオロアセテート(ＤＯＳＰＡ)、Ｃ52Ｈ106Ｎ６Ｏ４・４ＣＦ３ＣＯ２Ｈ、Ｃ88Ｈ178Ｎ８Ｏ４Ｓ２・４ＣＦ３ＣＯ２Ｈ、Ｃ40Ｈ84ＮＯ３Ｐ・ＣＦ３ＣＯ２Ｈ、Ｃ50Ｈ103Ｎ７Ｏ３・４ＣＦ３ＣＯ２Ｈ、Ｃ55Ｈ116Ｎ８Ｏ２・６ＣＦ３ＣＯ２Ｈ、Ｃ49Ｈ102Ｎ６Ｏ3・４ＣＦ３ＣＯ２Ｈ、Ｃ44Ｈ89Ｎ５Ｏ３・２ＣＦ３ＣＯ２Ｈ、Ｃ41Ｈ78ＮＯ8Ｐ、Ｃ100Ｈ206Ｎ12Ｏ４Ｓ２・８ＣＦ３ＣＯ２Ｈ、Ｃ162Ｈ330Ｎ22Ｏ９・１３ＣＦ３ＣＯ２Ｈ、Ｃ43Ｈ88Ｎ４Ｏ２・２ＣＦ３ＣＯ２Ｈ、Ｃ43Ｈ88Ｎ４Ｏ３・２ＣＦ３ＣＯ２Ｈおよび(１−メチル−４−(１−オクタデカ−９−エニル−ノナデカ−１０−エニレニル)ピリジニウムクロリドから成る群から選択される、請求項１６６記載の方法。
【請求項１６８】
段階(ａ)が、カチオン化合物を含む送達因子と核酸分子を接触させることを含む、請求項１６３記載の方法。
【請求項１６９】
化合物が、Ｎ−[１−(２,３−ジオレイルオキシ)プロピル]−Ｎ,Ｎ,Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド(ＤＯＴＭＡ)、ジオレイルホスファチジルエタノールアミン(ＤＯＰＥ)、２,３−ジオレイルオキシ−Ｎ−[２(スペルミン−カルボキサミド)エチル]−Ｎ,Ｎ−ジメチル−１−プロパンアミニウムトリフルオロアセテート(ＤＯＳＰＡ)、Ｃ52Ｈ106Ｎ６Ｏ４・４ＣＦ３ＣＯ２Ｈ、Ｃ88Ｈ178Ｎ８Ｏ４Ｓ２・４ＣＦ３ＣＯ２Ｈ、Ｃ40Ｈ84ＮＯ３Ｐ・ＣＦ３ＣＯ２Ｈ、Ｃ50Ｈ103Ｎ７Ｏ３・４ＣＦ３ＣＯ２Ｈ、Ｃ55Ｈ116Ｎ８Ｏ２・６ＣＦ３ＣＯ２Ｈ、Ｃ49Ｈ102Ｎ６Ｏ3・４ＣＦ３ＣＯ２Ｈ、Ｃ44Ｈ89Ｎ５Ｏ３・２ＣＦ３ＣＯ２Ｈ、Ｃ41Ｈ78ＮＯ8Ｐ、Ｃ100Ｈ206Ｎ12Ｏ４Ｓ２・８ＣＦ３ＣＯ２Ｈ、Ｃ162Ｈ330Ｎ22Ｏ９・１３ＣＦ３ＣＯ２Ｈ、Ｃ43Ｈ88Ｎ４Ｏ２・２ＣＦ３ＣＯ２Ｈ、Ｃ43Ｈ88Ｎ４Ｏ３・２ＣＦ３ＣＯ２Ｈおよび(１−メチル−４−(１−オクタデカ−９−エニル−ノナデカ−１０−エニレニル)ピリジニウムクロリドから成る群から選択される、請求項１６８記載の方法。
【請求項１７０】
核酸分子が、天然染色体、人工染色体、染色体のフラグメントまたは裸のＤＮＡ、またはプラスミドである、請求項１６３記載の方法。
【請求項１７１】
核酸分子が、天然染色体、人工染色体、染色体のフラグメントまたは大きさが少なくとも約０.６メガ塩基より大きい裸のＤＮＡである、請求項１６３記載の方法。
【請求項１７２】
細胞が、一次細胞、不死化細胞、胚細胞、幹細胞、形質転換細胞および腫瘍細胞から成る群から選択される、請求項１４３記載の方法。
【請求項１７３】
細胞が、一次細胞、不死化細胞、胚細胞、幹細胞、形質転換細胞および腫瘍細胞から成る群から選択される、請求項１５７記載の方法。
【請求項１７４】
細胞が、一次細胞、不死化細胞、胚細胞、幹細胞、形質転換細胞および腫瘍細胞から成る群から選択される、請求項１６３記載の方法。
【請求項１７５】
大型異種核酸を含む滑膜細胞。
【請求項１７６】
異種核酸が少なくとも約０.６メガ塩基を越える大きさである、請求項１７５記載の滑膜細胞。
【請求項１７７】
人工染色体を含む滑膜細胞。
【請求項１７８】
人工染色体がＡＣｅｓである、請求項１７７記載の滑膜細胞。
【請求項１７９】
線維芽細胞様滑膜細胞である、請求項１７５または請求項１７７記載の滑膜細胞。
【請求項１８０】
哺乳類滑膜細胞である、請求項１７５または請求項１７７記載の滑膜細胞。
【請求項１８１】
霊長類滑膜細胞である、請求項１８０記載の滑膜細胞。
【請求項１８２】
げっし動物、ウサギ、サルまたはヒト滑膜細胞である、請求項１８０記載の滑膜細胞。
【請求項１８３】
滑膜細胞への人工染色体の導入を含む、滑膜細胞への異種核酸の導入方法。
【請求項１８４】
人工染色体がＡＣｅｓである、請求項１８３記載の方法。
【請求項１８５】
滑膜細胞が線維芽細胞様滑膜細胞である、請求項１８３記載の方法。
【請求項１８６】
大型核酸分子を滑膜細胞へ導入する方法であって、
核酸分子を送達因子に暴露し、そして
滑膜細胞を核酸分子と接触させる
段階を含む方法。
【請求項１８７】
大型核酸分子が人工染色体である、請求項１８６記載の方法。
【請求項１８８】
人工染色体がＡＣｅｓである、請求項１８７記載の方法。
【請求項１８９】
滑膜細胞が線維芽細胞様滑膜細胞である、請求項１８６記載の方法。
【請求項１９０】
送達因子がカチオン化合物を含む、請求項１８６記載の方法。
【請求項１９１】
滑膜細胞への大型核酸分子の導入方法であって、
(ａ)核酸分子を送達因子に暴露し、
(ｂ)滑膜細胞を送達因子に暴露し、そして
(ｃ)滑膜細胞を核酸分子と接触させることにより、核酸分子を滑膜細胞へ送達する
段階を含み、段階(ａ)〜(ｃ)を順序立てて連続的にまたは同時に遂行する方法。
【請求項１９２】
滑膜細胞が線維芽細胞様滑膜細胞である、請求項１９１記載の方法。
【請求項１９３】
送達因子がカチオン化合物を含む、請求項１９１記載の方法。
【請求項１９４】
核酸分子が少なくとも約０.６メガ塩基を越える大きさである、請求項１９１記載の方法。
【請求項１９５】
滑膜細胞への核酸分子の送達方法であって、
(ａ)核酸分子の非存在下滑膜細胞を送達因子と接触させ、超音波エネルギーまたは電気エネルギーを滑膜細胞に適用し、ただし、この接触および適用は連続的または同時に行われるものとし、次いで
(ｂ)滑膜細胞を核酸分子と接触させることにより、核酸分子を滑膜細胞へ送達する
段階を含む方法。
【請求項１９６】
滑膜細胞への核酸分子の送達方法であって、
(ａ)核酸分子および送達因子を滑膜細胞と接触させ、超音波エネルギーまたは電気エネルギーを滑膜細胞に適用する段階を含み、接触および適用を連続的または同時に行うことにより、核酸分子を滑膜細胞に送達する方法。
【請求項１９７】
送達因子がカチオン化合物を含む、請求項１９５または請求項１９６記載の方法。
【請求項１９８】
滑膜細胞が線維芽細胞様滑膜細胞である、請求項１９５または請求項１９６記載の方法
【請求項１９９】
エネルギーが超音波である、請求項１９５または請求項１９６記載の方法。
【請求項２００】
対象におけるリウマチ疾患経過の調節方法であって、対象への大型核酸の導入を含み、大型核酸がリウマチ疾患経過を調節する作用因子であるかまたはそれをコード化する核酸を含むものである方法。
【請求項２０１】
核酸を対象における炎症部位に導入する、請求項２００記載の方法。
【請求項２０２】
リウマチ疾患経過が炎症である、請求項２００記載の方法。
【請求項２０３】
リウマチ疾患が慢性関節リウマチである、請求項２００記載の方法。
【請求項２０４】
大型核酸が人工染色体である、請求項２００記載の方法。
【請求項２０５】
人工染色体がＡＣｅｓである、請求項２０４記載の方法。
【請求項２０６】
炎症部位が関節にある、請求項２０１記載の方法。
【請求項２０７】
核酸を細胞へインビトロで導入し、次いで対象へ移し入れる、請求項２００記載の方法。
【請求項２０８】
核酸を細胞へインビボで導入する、請求項２００記載の方法。
【請求項２０９】
核酸を滑膜細胞へ導入する、請求項２０７または請求項２０８記載の方法。
【請求項２１０】
滑膜細胞が線維芽細胞様滑膜細胞である、請求項２０９記載の方法
【請求項２１１】
核酸が、抗炎症性または免疫調節性分子をコード化する核酸を含む、請求項２００記載の方法。
【請求項２１２】
核酸が、インターロイキン−１受容体アンタゴニスト、可溶性インターロイキン−１受容体、可溶性腫瘍壊死因子受容体、インターフェロン−β、インターロイキン−４、インターロイキン−１０、インターロイキン−１３、トランスフォーミング成長因子β、ドミナントネガティブＩカッパＢ−キナーゼ、ＦａｓＬ、Ｆａｓ−会合デスドメインタンパク質またはＣＴＬＡ−４またはそれらの組合わせをコード化する核酸を含む、請求項２００記載の方法。
【請求項２１３】
結合組織疾患処置用候補剤の同定方法であって、
候補剤であるかまたはそれをコード化する核酸を含む大型核酸分子を病気の動物モデルに導入し、そして
候補剤が動物における一つまたはそれ以上の病状を改善するか否かを測定する
ことを含む方法。
【請求項２１４】
病気がリウマチ疾患である、請求項２１３記載の方法。
【請求項２１５】
病気がリウマチ様関節炎である、請求項２１３記載の方法。
【請求項２１６】
動物が哺乳類である、請求項２１３記載の方法。
【請求項２１７】
動物が、げっし動物、ウサギ、イヌ、ウマまたは霊長類である、請求項２１３記載の方法。
【請求項２１８】
大型核酸分子が人工染色体である、請求項２１３記載の方法。
【請求項２１９】
人工染色体がＡＣｅｓである、請求項２１８記載の方法。
【請求項２２０】
核酸分子が滑膜細胞にある、請求項２１３記載の方法。
【請求項２２１】
滑膜細胞が線維芽細胞様滑膜細胞である、請求項２２０記載の方法
【請求項２２２】
核酸を動物の関節へ導入する、請求項２１３記載の方法。
【請求項２２３】
核酸を細胞へインビトロで導入し、次いで動物に移し入れる、請求項２１３記載の方法。
【請求項２２４】
核酸をインビボで細胞へ導入する、請求項２１３記載の方法。
【請求項２２５】
関節の治療的処置用に選択された細胞を含み、それらの細胞が大型異種核酸を含むものである、組成物。
【請求項２２６】
関節の治療的処置用に選択された細胞を含み、それらの細胞が人工染色体を含むものである、組成物。
【請求項２２７】
人工染色体がＡＣｅｓである、請求項２２６記載の組成物。
【請求項２２８】
リウマチ様関節炎の治療的処置用に選択された細胞を含み、それらの細胞が大型異種核酸を含むものである、組成物。
【請求項２２９】
リウマチ様関節炎の治療的処置用に選択された細胞を含み、それらの細胞が人工染色体を含むものである、組成物。
【請求項２３０】
人工染色体がＡＣｅｓである、請求項２２９記載の組成物。
【請求項２３１】
送達因子またはエネルギー単独使用の場合よりも多大な範囲まで核酸分子を細胞へ送達する、請求項４８または請求項７３記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
(関連出願)
２００１年３月２２日付、De Jong et al.による「細胞への核酸分子の送達およびその評価方法」と題する米国特許出願第０９／８１５９７９号、２００１年３月２２日付、De Jong et al.による「細胞への核酸分子の送達およびその評価方法」と題する米国特許出願第０９／８１５９８１号および２００２年２月２８日付、De Jong et al.による「細胞への核酸分子の送達およびその評価方法」と題する米国特許出願第１０／０８６７４５号について優先権を主張する。認められる場合これら出願の各々の対象を出典明示で援用する。
【０００２】
(発明の分野)
本発明は、細胞への核酸分子の送達方法および細胞への核酸送達およびそこにおける核酸発現の測定方法に関するものである。
【０００３】
(発明の背景)
核酸分子、特にプラスミドＤＮＡおよび核酸の他の小フラグメントを細胞へ送達する若干の方法が開発されている。これらの方法は、大型核酸分子の送達については理想的ではない。すなわち、大きさおよび複雑度が増している核酸分子、例えば人工染色体の細胞への送達方法が要望されている。インビトロおよびインビボ手順、例えば遺伝子治療での使用およびトランスジェニック動物および植物の製造についての方法が要求されている。さらに、細胞へのＤＮＡ送達の効率を迅速で簡単に測定および評価できることが要望されている。
【０００４】
したがって、核酸分子、特に大型分子、例えば人工染色体を細胞へ送達する方法の提供が本発明における目的である。また、送達の評価方法も提供される。
【０００５】
(発明の要約)
細胞への大型核酸分子の送達方法が提供される。いかなる大きさの核酸分子であってもその送達に使用され得る方法であれば、細胞への大型核酸分子、例えば天然および人工染色体およびそのフラグメントの送達に適切である。これらの方法は、限定されるわけではないが、細胞に基いたタンパク質製造、トランスジェニックタンパク質製造および遺伝子治療を目的とする細胞への核酸分子の送達を含む適用についての核酸のインビトロ、エクスビボおよびインビボ送達用に設計されている。細胞およびトランスジェニック動物および植物におけるタンパク質の製造方法、核酸を細胞へ導入することによりトランスジェニック動物および植物を製造する方法、およびエクスビボおよびインビボ遺伝子治療法も提供される。
【０００６】
本明細書で提供されている方法は、細胞への大型核酸分子の送達用に設計されているが、小型分子の送達にも使用され得る。これらの方法の中には、核酸分子を第一送達因子、典型的には核酸分子および細胞間の接触を増加させる因子に暴露し、そして細胞を第二の送達因子、すなわち一般的には第一因子とは異なるもので、特に細胞の透過性を高める作用因子、例えばエネルギーに暴露する段階を含むものもある。選択された送達因子およびその組み合わせは、因子の非存在下または一因子単独の存在下における場合よりも多大な範囲まで細胞へ核酸を送達させるものである。一般的に、これらの方法全てにおいて、透過性促進因子がエネルギーである、例えば電気穿孔法または音響穿孔法の場合、核酸分子の非存在下で細胞をそれと接触させる。
【０００７】
また、細胞を脂質剤、特にデンドリマー、例えばＳＡＩＮＴ−２(登録商標)(１−メチル−４−(１−オクタデカ−９−エニル−ノナデカ−１０−エニレニル)ピリジニウムクロリド、また１−メチル−４−(１９−シス,シス−ヘパトリチアコンタ−９,２８−ジエニル)ピリジニウムクロリドとも称される)と、エネルギー適用と同時または連続的に接触させる方法も提供される。核酸については、所望により送達因子で処理してもよく、上記要領で処理した細胞と接触させる。
【０００８】
選択された送達方法は、標的細胞(核酸が送達される細胞)、核酸分子および選択された送達因子(複数も可)のタイプ(複数も可)により変化する。本発明で提供される細胞への大型核酸分子送達方法の例としては、限定されるわけではないが、以下のいずれかを含む方法が挙げられる：
【０００９】
核酸分子を送達因子、例えば核酸の電荷を中和するカチオン脂質と混合し、細胞を核酸および送達因子の混合物と接触させる；
【００１０】
細胞を核酸分子と接触させ、次いで細胞を送達因子と接触させるかまたは細胞を送達因子と接触させ、次いで細胞を核酸分子と接触させる；
【００１１】
核酸分子の非存在下における細胞を送達因子と接触させ、送達因子と接触させた細胞に超音波または電気エネルギーを適用し、そしてエネルギー適用終結時に細胞を核酸分子と接触させる；
【００１２】
細胞に超音波または電気エネルギーを適用し、そしてエネルギー適用終結時、核酸分子および送達因子の混合物と細胞を接触させる；
【００１３】
超音波または電気エネルギーを細胞に適用し、エネルギー適用終結時、細胞を送達因子と接触させ、先に送達因子と接触させた細胞を核酸分子と接触させる；
【００１４】
超音波または電気エネルギーを細胞に適用し、エネルギー適用終結時、細胞を核酸と接触させる；
【００１５】
核酸分子の非存在下における細胞を送達因子と接触させ、送達因子と接触させた細胞に超音波または電気エネルギーを適用し、そしてエネルギー適用終結時、核酸および送達因子の混合物と細胞を接触させる。
【００１６】
また、上記方法の組み合わせを含む方法も提供される。一般に、方法のいずれかまたは方法の組み合わせの場合、細胞へのエネルギーの適用は、核酸分子導入前に行なわれる。しかしながら、場合によっては、例えば、核酸分子の完全さが核酸分子の存在下におけるエネルギーの適用により損なわれない場合には、エネルギーは核酸分子の存在下で適用され得る。
【００１７】
本発明で提供される方法は、多様な目的のための多様な環境における細胞への大型核酸分子の送達を意図したものである。例えば、約０.５、０.６、０.７、０.８、０.９、１、５、１０、３０、５０および１００メガ塩基対より大きい核酸分子が、本発明で提供される方法を用いて細胞へ送達され得る。これらの方法は、インビトロまたはインビボで大型核酸分子を細胞へ送達するのに使用され得る。
【００１８】
送達方法のインビボ適用、例えばインビボ遺伝子治療において、大型核酸分子は、動物対象において直接細胞へ送達され得る。上記動物には、限定されるわけではないが、哺乳類が含まれる。例えば、動物対象は、ヒトまたは他の霊長類、げっし動物、ウサギ、イヌ、ウマまたはサルであり得る。試薬は対象において局所的または全身的(例、血流で)に投与され得る。例えば、核酸および／または送達因子の局所投与は、例えば関節、皮膚、組織、腫瘍および臓器といった領域へ行われ得る。全身的投与の場合、核酸分子は興味の対象である細胞または組織へターゲッティングされ得る。
【００１９】
また、本発明で提供される送達方法を用いることにより、インビトロで大型核酸分子が標的細胞へ送達され得、次いでそれが動物対象、特にヒト対象へ導入され、そのこと自体は例えばエクスビボ遺伝子治療法で行われ得る。すなわち、本発明で提供される細胞への大型核酸分子の送達方法を用いることによるインビボおよびエクスビボ遺伝子治療法が本発明で提供される。
【００２０】
送達因子を使用する方法の特定実施態様では、送達因子はカチオン化合物である。カチオン化合物には、限定されるわけではないが、カチオン脂質、カチオンポリマー、カチオン脂質混合物、カチオンポリマー混合物、カチオン脂質およびカチオンポリマーの混合物、カチオン脂質および中性脂質の混合物、ポリカチオン脂質、非リポソーム形成脂質、活性化デンドリマー、エタノール性カチオン脂質、カチオン両親媒性物質および塩化ピリジニウム界面活性剤がある。
【００２１】
本発明で提供される方法を用いて細胞へ送達され得る核酸分子の中には、人工染色体、サテライトＤＮＡベース人工染色体(ＳＡＴＡＣ、本明細書ではＡＣｅｓとも称す)および天然染色体またはこれらの染色体のいずれかのフラグメントが含まれる。
【００２２】
超音波エネルギーは、一連続パルスまたは２またはそれ以上の断続パルスとして適用され得る。超音波エネルギーの断続パルスは、実質的に同じ長さの時間、実質的に同じエネルギーレベルで適用され得るか、またはエネルギーレベル、適用時間の長さ、またはエネルギーレベルおよび適用時間の長さが変化し得る。超音波エネルギー範囲およびパルス数は、選択された器具により、本発明で提供される方法によって変化し得、経験的に決定され得る。典型的には、超音波は、約３０秒間〜約５分間適用される。使用するパワーは、使用するソノーポレーター(sonorporator)の機能である。
【００２３】
超音波エネルギーの効果は、超音波エネルギー適用前にキャビテーション化合物を細胞(インビトロ)と接触させるかまたは対象(インビボ)に投与することにより高められ得る。すなわち、提供される方法は、上記キャビテーション化合物の使用を含み得る。
【００２４】
電場を本発明で提供される方法において使用するとき、それらを、好ましくは約２０〜５０ｍｓｅｃ(ミリセカンド)間懸濁させた細胞に適用するが、タイミングおよび電圧は使用する器具および特定パラメーターの関数(ファンクション)である。電気エネルギーは、１〜５断続パルスとして適用され得る。示されている通り、電場範囲およびパルス数は、器具仕様により変化し得、経験的に決定され得る。
【００２５】
本発明で提供される送達方法を用いて、大型核酸分子を動物細胞、特に非ヒト動物細胞へ送達し、そしてトランスジェニック動物を生じさせる条件に大型核酸分子が送達された動物細胞を暴露することにより、トランスジェニック動物、特に非ヒトトランスジェニック動物を製造する方法が提供される。
【００２６】
本発明で提供される細胞への大型核酸分子の送達方法はまた、移植可能な臓器および組織の生成方法でも使用され得る。トランスジェニック動物、特に非ヒトトランスジェニック動物、または移植可能臓器の生成方法で使用される細胞の例としては、限定されるわけではないが、胚性幹細胞、核移植供与細胞、幹細胞および特定器官を発生させ得る細胞が挙げられる。本発明で提供される細胞への核酸分子送達方法はまた、細胞タンパク質製造セルラインを生成させる方法で使用され得る。
【００２７】
さらに、細胞への核酸送達をモニターする方法が提供される。これらの方法により、細胞への核酸移動の迅速で正確な測定が可能となるため、インビトロ、エクスビボまたはインビボでいかなる核酸でも任意の細胞型に送達できるように様々な送達因子およびプロトコルの使用がスクリーニングおよび最適化され得る。さらに、細胞における核酸の送達および発現のモニター方法が提供される。
【００２８】
細胞への核酸の送達をモニターする方法の実施態様では、本明細書記載の送達因子(複数も可)を用いるか、または当業者に公知の送達方法を用いて標識核酸分子、例えばＤＮＡを細胞へ送達する。次いで、検出方法、例えばフローサイトメトリーを用いることにより、送達方法が核酸分子の送達を促進または遂行する能力の指標として標識を含む細胞の数を測定する。フローサイトメトリーの代わりに、またはそれに加えて使用され得る他の検出方法には、限定されるわけではないが、蛍光定量法、細胞イメージング、蛍光顕微鏡法並びに上記検出および、必要または所望に応じ、定量についての当業者間では公知である他の方法がある。
【００２９】
細胞への核酸分子、例えばＤＮＡの送達をモニターおよび定量する方法の実施態様の一例において、核酸分子は、ヌクレオシドまたはリボヌクレオシド類似体、特にチミジン類似体、例えばヨードデオキシウリジン(ＩｄＵまたはＩｄＵｒｄ)およびブロモデオキシウリジン(ＢｒｄＵ)で標識した人工染色体であり、送達因子はカチオン化合物であり、単独またはエネルギーと組合わせて使用される。
【００３０】
事象の数を集めるのが容易であるため、本発明で提供されるモニター方法、特にフローサイトメトリー技術に基く方法は、核酸分子移動の先行評価方法よりも統計的に優れた核酸分子送達データの収集方法を提供する。明確な値が器械誘導されるため、判断の誤りを被りにくい。
【００３１】
本発明で提供されるモニター方法により、細胞への少数の核酸分子の送達が迅速、簡単および正確に検出され得る。かかる少数でも、遺伝子導入、遺伝子治療、細胞タンパク質生産目的および遺伝子導入の他の目標にとっては十分であり得る。また上記モニター方法によると、異なる送達方法の送達効率における差異を迅速に定量することが可能となるため、細胞への核酸分子、例えばＤＮＡの送達方法の開発および最適化が容易に行なわれ得る。
【００３２】
また、これらの方法を用いることにより、送達プロトコルが確立されていないかまたはトランスフェクションが容易ではない細胞へのトランスフェクション効率が最適化され得る。これらの方法はまた、細胞へのあらゆる大きさの核酸分子、例えばＤＮＡの送達を促進または可能にする能力についての送達プロトコルおよび作用因子の迅速なスクリーニングを可能にする。
【００３３】
また、核酸分子送達をモニターする方法を、核酸分子発現をモニターする方法と組合わせる方法が提供される。細胞への核酸分子送達効率を評価するだけでなく、同じ細胞集団において送達された核酸分子の後続的発現をモニターすることが可能である。すなわち、これらの方法はまた、マーカー遺伝子、例えば限定されるわけではないが、蛍光タンパク質、例えば赤色、緑色または青色蛍光タンパク質を用いた、核酸分子送達および初期遺伝子発現間における生物学的事象のマッピング方法を提供する。
【００３４】
これらの組み合わせ方法の特定実施態様では、核酸分子の送達および発現、例えば染色体の送達およびそこでコード化される遺伝子の発現を、緑色蛍光タンパク質をコード化する配列を含む核酸分子のＩｄＵ標識法を用いてモニターする。
【００３５】
特定実施態様において、核酸分子の送達および発現をモニターする方法は、リポーター遺伝子をコード化する標識核酸分子を細胞へ導入し、細胞への核酸送達の指標として標識細胞を検出し、そして細胞におけるＤＮＡ発現の指標としてリポーター遺伝子産物を測定することにより、細胞における核酸分子の送達および発現を検出または測定する段階を包含する。標識細胞は、例えばフローサイトメトリー、蛍光定量法、細胞イメージングまたは蛍光顕微鏡法により検出され得る。標識は、例えばヨードデオキシウリジン(ＩｄＵまたはＩｄＵｒｄ)またはブロモデオキシウリジン(ＢｒｄＵ)であり得、リポーター遺伝子は、例えば蛍光タンパク質、酵素、例えばルシフェラーゼ、または抗体をコード化するものであり得る。送達される核酸分子には、限定されるわけではないが、ＲＮＡ、例えばリボザイム、ＤＮＡ、例えば裸のＤＮＡおよび染色体、プラスミド、染色体フラグメント、典型的には少なくとも一遺伝子または少なくとも１Ｋｂを含むもの、裸のＤＮＡまたは天然染色体が含まれる。人工染色体発現系(ＡＣｅｓ)の送達および発現を測定することによる方法が本明細書では例として挙げられている。セルライン、一次細胞、一次セルライン、植物細胞および動物細胞を含む、そして幹細胞、胚細胞、および核酸分子の送達が行なわれ得る他の細胞を含め、真核生物および原核生物といった、いかなるタイプの細胞でも考えられ、本発明で提供される方法で使用され得る。
【００３６】
(発明の詳細な記載)
Ａ．定義
特記しない場合、本明細書で使用されている技術的および科学的用語は全て、この発明が属する業界の者が共通して理解しているのと同じ意味を有する。本明細書で引用されている特許、特許出願および出版物は全て、出典明示で援用する。
【００３７】
本明細書で使用されている「核酸」の語は、少なくとも２個の共有結合したヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体サブユニットを含むポリヌクレオチドをいう。核酸は、デオキシリボ核酸(ＤＮＡ)、リボ核酸(ＲＮＡ)、またはＤＮＡまたはＲＮＡの類似体であり得る。ヌクレオチド類似体は市販されており、上記ヌクレオチド類似体を含むポリヌクレオチドの製造方法は公知である(Lin et al.(１９９４)Nucl.Acids Res.２２：５２２０−５２３４；Jellinek et al.(１９９５)Biochemistry ３４：１１３６３−１１３７２；Pagratis et al.(１９９７)Nature Biotechnol. １５：６８−７３)。核酸は、一本鎖、二本鎖、またはそれらの混合物であり得る。本発明における目的のため、特記しない場合、核酸は二本鎖であるか、または文脈から明白なものである。
【００３８】
「核酸」の語は、一本鎖および／または二本鎖ポリヌクレオチド、例えばデオキシリボ核酸(ＤＮＡ)およびリボ核酸(ＲＮＡ)、並びにＲＮＡまたはＤＮＡの類似体または誘導体をいう。また、「核酸」の語には、核酸の類似体、例えばペプチド核酸(ＰＮＡ)、チオリン酸ＤＮＡ、および他のかかる類似体および誘導体も含まれる。
【００３９】
本明細書で使用されているＤＮＡは、あらゆるタイプおよび大きさのＤＮＡ分子、例えばｃＤＮＡ、プラスミドおよび修飾ヌクレオチドおよびヌクレオチド類似体を含むＤＮＡを包含するものとする。
【００４０】
本明細書で使用されているヌクレオチドは、ヌクレオシドモノ−、ジ−およびトリリン酸を包含する。ヌクレオチドはまた、修飾ヌクレオチド、例えば、限定されるわけではないが、チオリン酸ヌクレオチドおよびデアザプリンヌクレオチドおよび他のヌクレオチド類似体を包含する。
【００４１】
本明細書で使用されている「大型核酸分子」または「大型核酸」の語は、大きさが少なくとも約０.５メガ塩基対(Ｍ塩基)、０.５Ｍ塩基より大きい核酸分子をいい、大きさが少なくとも約０.６、０.７、０.８、０.９、１、５、１０、３０、５０および１００、２００、３００、５００Ｍ塩基の核酸分子を包含する。大型核酸分子は、典型的には約１０〜約４５０またはそれ以上のＭ塩基の範囲であり得、様々な大きさ、例えば約２５０〜約４００Ｍ塩基、約１５０〜約２００Ｍ塩基、約９０〜約１２０Ｍ塩基、約６０〜約１００Ｍ塩基および約１５〜５０Ｍ塩基を有し得る。
【００４２】
大型核酸分子の例には、限定されるわけではないが、天然染色体およびそのフラグメント、特に哺乳類染色体および動原体およびテロメアを保持しているそのフラグメント、人工染色体発現系(ＡＣｅｓ、サテライトＤＮＡベース人工染色体(ＳＡＴＡＣ)とも呼ばれる；米国特許第６０２５１５５および６０７７６９７号参照)、哺乳類人工染色体(ＭＡＣ)、植物人工染色体、昆虫人工染色体、トリ人工染色体およびミニ染色体(例、米国特許第５７１２１３４、５８９１６９１および５２８８６２５号参照)がある。大型核酸分子は、特定ヌクレオチド配列をコード化する所望の核酸フラグメント、例えば興味の対象である遺伝子の単一コピーを含み得るか、またはその多重コピーまたは多重遺伝子または異なる異種ヌクレオチド配列を担い得る。例えば、ＡＣｅｓは、興味の対象である遺伝子の４０またはそれ以上のコピーを担い得る。大型核酸分子は、典型的には遺伝子発現を調節および／または全体的構造の決定に関与すべく機能するタンパク質、例えば染色体タンパク質と会合し得る。
【００４３】
本明細書で使用されている人工染色体は、細胞において内在性染色体と一緒に安定して複製および分離し得る核酸分子である。それは、そこに含まれる外来遺伝子を適応させ発現することにより遺伝子送達ビークルとして作用する受容力を有する。哺乳類人工染色体(ＭＡＣ)は、活性哺乳類動原体(複数も可)を有する染色体をいう。植物人工染色体、昆虫人工染色体およびトリ人工染色体は、それぞれ植物、昆虫およびトリ動原体を含む染色体をいう。ヒト人工染色体(ＨＡＣ)は、ヒト動原体を含む染色体をいう。人工染色体の例については、例えば米国特許第６０２５１５５、６０７７６９７、５２８８６２５、５７１２１３４、５６９５９６７、５８６９２９４、５８９１６９１および５７２１１１８号および公開国際ＰＣＴ出願第ＷＯ９７／４０１８３およびＷＯ９８／０８９６４号参照。
【００４４】
本明細書で使用されている「サテライトＤＮＡベース人工染色体(ＳＡＴＡＣ)」の語は、「人工染色体発現系(ＡＣｅｓ)」の語と互換性を有する。これらの人工染色体は、実質的に全ての中性非コーディング配列(ヘテロクロマチン)であるが、例外は外来異種の、典型的には遺伝子エンコーディング核酸であり、ヘテロクロマチン内に散在しており、そこで発現される(米国特許第６０２５１５５および６０７７６９７号および国際ＰＣＴ出願第ＷＯ９７／４０１８３号参照)。これらの人工染色体発現系に含まれる外来遺伝子は、限定されるわけではないが、追跡可能なマーカータンパク質(リポーター遺伝子)、例えば蛍光タンパク質、例えば緑色、青色または赤色蛍光タンパク質(それぞれＧＦＰ、ＢＦＰおよびＲＦＰ)、または他のリポーター遺伝子、例えばβ−ガラクトシダーゼおよび薬剤耐性を付与するタンパク質、例えばハイグロマイシン耐性をコード化する遺伝子をコード化する核酸を含み得る。異種ＤＮＡの他の例には、限定されるわけではないが、治療有効物質、例えば抗癌剤、酵素およびホルモンをコード化するＤＮＡ、および他のタイプのタンパク質、例えば抗体をコード化するＤＮＡがある。
【００４５】
本明細書で使用されている核酸、例えばＤＮＡおよびＲＮＡについての「異種」および「外来」の語は、互換的に使用され、それが存在するかまたはそれが本来存在する位置(複数も可)および／または量とは異なるゲノムまたは細胞での位置(複数も可)および／または量で見出されるゲノムまたは細胞の一部としては自然には存しない核酸をいう。それは、細胞にとって内在性ではなく、細胞へ外部から導入された核酸であり得る。異種ＤＮＡの例には、限定されるわけではないが、例えば遺伝子治療、トランスジェニック動物の製造またはコード化タンパク質の製造を目的として、細胞へ導入された興味の対象である一遺伝子産物または複数遺伝子産物をコード化するＤＮＡが含まれる。異種ＤＮＡの他の例は、限定されるわけではないが、追跡可能なマーカータンパク質、例えば薬剤耐性を付与するタンパク質をコード化するＤＮＡ、治療有効物質、例えば抗癌剤、酵素およびホルモンをコード化するＤＮＡ、および他のタイプのタンパク質、例えば抗体をコード化するＤＮＡを包含する。
【００４６】
本明細書で使用されている「送達」は、「トランスフェクション」と互換的に使用されるもので、外在性核酸分子が細胞の内側に位置するようにそれらを細胞へ導入するプロセスをいう。核酸の送達は、核酸の発現とは区別されるプロセスである。
【００４７】
本明細書で使用されている「発現」は、核酸がペプチドに翻訳されるかまたはＲＮＡへ転写されるプロセスをいい、核酸は例えばペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質へ翻訳され得る。核酸がゲノムＤＮＡから誘導される場合、発現は、適切な真核生物宿主細胞または生物が選択された場合、ｍＲＮＡのスプライシングを含み得る。宿主細胞で発現される異種核酸の場合、それは最初に細胞へ送達され、次いで一旦細胞に入ると、最終的には核に存在しなければならない。
【００４８】
本明細書で使用されている細胞収率は、特定された時間枠の後、本発明における目的の場合は２４時間後、およびクローンフラクション(分数、割合、fraction)の計算に関して使用される時の「全細胞収率」をいう。
【００４９】
本明細書で使用されている細胞回復(リカバリー)時間は、細胞が新しい条件に対し平衡に達するための時間枠をいう。
【００５０】
本明細書で使用されている細胞生存は、細胞傷害性事象、例えば送達手順後の細胞生存能をいう。
【００５１】
本明細書で使用されている対照平板効率(ＣＰＥ)は、平板手順にもかかわらず生残っている、特定細胞についての標準最適成長条件下における未処理細胞のフラクション(割合)をいう。平板効率は、平板培養手順にもかかわらず生残っている処理細胞のフラクションをいう。
【００５２】
本明細書で使用されているクローンフラクションは、細胞への外在性核酸送達後の細胞収率および細胞の平板効率の尺度である。
【００５３】
本明細書で使用されている導入効率は、核酸が送達され、送達された核酸を含む細胞の総数のパーセントである。
【００５４】
本明細書で使用されているトランスフェクション効率は、選択可能なマーカーを含む核酸が送達され、選別にもかかわらず生残っている細胞の総数のパーセントである。
【００５５】
本明細書で使用されている潜在的トランスフェクション効率指数は、例えば特定濃度または量の特定送達因子といった、特定条件下における特定細胞型についての理論的最大トランスフェクション効率を意味する。
【００５６】
本明細書で使用されている「細胞」の語は、動物および植物を含む、真核生物および原核生物の全タイプの細胞を包含するものとする。
【００５７】
本明細書で使用されている「送達因子」は、細胞および／または核酸を、細胞への核酸導入プロセスで暴露することにより、細胞への核酸送達を容易にし得る組成物、条件または物理的処理をいう。送達因子には、細胞と核酸の接触を促進および／または核酸に対する細胞の透過性を増大させる組成物、条件および物理的処理がある。一般に、核酸は、エネルギー、例えば音響穿孔法により直接処理されることは無い。
【００５８】
本明細書で使用されているカチオン化合物は、生理学的ｐＨまたはその前後で正に荷電している極性基を有する化合物である。これらの化合物は、細胞への核酸分子の送達を容易にする。これは、それらが核酸の電荷を中和する能力を発揮することにより達成されると考えられている。カチオン化合物の例としては、限定されるわけではないが、カチオン脂質またはカチオンポリマーまたはそれらの混合物、それに中性脂質を伴うものまたは伴わないもの、ポリカチオン脂質、非リポソーム形成脂質、エタノール性カチオン脂質およびカチオン両親媒性物質がある。また、予期されるカチオン化合物には、活性化デンドリマー、すなわち中心コアから枝分かれし、核酸の負に荷電したリン酸基と相互作用し得る荷電アミノ基の明確な球状構造をもつ球状カチオン性ポリアミドアミンポリマーがある(例、スターバーストデンドリマー)。
【００５９】
また、送達因子として使用されるカチオン化合物には、ペプチドおよびタンパク質フラグメントを含むカチオン化合物の混合物もある。追加的成分は、カチオン化合物に非共有結合または共有結合しているかまたは他の場合カチオン化合物と会合し得る。
【００６０】
本明細書で使用されている超音波エネルギーは、音波(外部適用の場合)および砕石器発生衝撃波(内部適用の場合)を包含するものとする。
【００６１】
本明細書で使用されている電気エネルギーは、細胞へ電場を適用することによって、細胞へ分子を送達するために膜に穿孔すること、例えば電気穿孔技術を含むものとする。
【００６２】
本明細書で使用されているキャビテーション化合物は、一般的に超音波画像装置で使用される造影剤を含むものとし、気体封入および非気体性剤を含む。これらのキャビテーション化合物は、音響または衝撃波のエネルギー送達効率を高める。
【００６３】
本明細書で使用されている「医薬上許容される」は、過剰な毒性、刺激、アレルギー応答または他の望ましくない合併症を誘発することの無い、対象への投与に適した化合物、組成物および用量形態についていう。
【００６４】
本明細書で使用されている胚性幹細胞は、幹細胞にとっての前駆体である原始的未成熟細胞である。
【００６５】
本明細書で使用されている幹細胞は、成熟組織特異的細胞にとっての前駆体である原始的未成熟細胞である。
【００６６】
本明細書で使用されている核移植供与細胞は、核移植プロセス中に除核卵母細胞に導入される核の供給源である細胞である。
【００６７】
本明細書で使用されている「対象」の語は、大型ＤＮＡ分子が導入され得る動物、植物、昆虫および鳥類をいう。高等生物体、例えば哺乳類および鳥類、例えばヒト、霊長類、げっし動物、ウシ、ブタ、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、マウス、ラット、モルモット、ネコ、イヌ、ウマ、ニワトリなどが含まれる。
【００６８】
本明細書で使用されている「対象に投与する」は、１種またはそれ以上の送達因子および／または大型核酸分子を、一緒にまたは別々に対象へ導入または適用する手順であり、対象に存在する標的細胞を上記因子および／または大型核酸分子と最終的に接触させることを目的とする。
【００６９】
本明細書で使用されている「対象に適用する」は、対象に存在する標的細胞を、エネルギー、例えば超音波または電気エネルギーと最終的に接触させる手順である。適用は、エネルギーが適用され得る方法により行われる。
【００７０】
本明細書で使用されている遺伝子治療では、標的細胞とも称されるある種の細胞へ核酸分子および特に大型核酸分子を導入または挿入することにより、病気または障害を矯正または調節するのに必要とされる特異的遺伝子産物を生産させる。核酸が発現され、それによりコード化される生成物が製造されるように、核酸を選択された標的細胞へ導入する。別法として、核酸は、治療的生成物をコード化するＤＮＡの発現を何らかの形で伝達し得る。この生成物は治療的化合物であり得、治療有効量または治療上有用な時点で製造される。またそれは、何らかの形で直接的または間接的に治療的生成物の発現を伝達する生成物、例えばペプチドまたはＲＮＡをコード化し得る。病気または障害に冒された生物体内で標的細胞により核酸を発現させることにより、病気または障害を調節する手段が提供される。治療的生成物をコード化する核酸を、罹患宿主の細胞への導入前に修飾することにより、生成物またはその発現を向上または他の形で改変することができる。
【００７１】
遺伝子治療で使用する場合、細胞をインビトロでトランスフェクション後、トランスフェクション細胞を対象の体に導入し得る。これはエクスビボ遺伝子治療と称されることが多い。別法として、細胞は、対象の体内で直接インビボトランスフェクションされ得る。
【００７２】
本明細書で使用されているフローサイトメトリーは、大きさおよび蛍光に基いて細胞および／または染色体を分析および選別し得るレーザーに基いた器械を用いる方法をいう。
【００７３】
本明細書で使用されているリポーター遺伝子の語は、ＲＮＡまたはタンパク質であり得る検出可能な遺伝子産物を発現する遺伝子を全て包含する。好ましいリポーター遺伝子は、容易に検出され得るものである。リポーター遺伝子の例としては、限定されるわけではないが、蛍光タンパク質、ＣＡＴ(クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ)(AltonおよびVapnek(１９７９)、Nature ２８２：８６４−８６９)ルシフェラーゼ、および他の酵素検出系、例えばベータ‐ガラクトシダーゼ、ホタルルシフェラーゼ(deWet et al.(１９８７)、Mol.Cell.Biol.７：７２５−７３７)、細菌性ルシフェラーゼ(EngebrechtおよびSilverman(１９８４)、PNAS １：４１５４−４１５８；Baldwin et al.(１９８４)、Biochemistry ２３：３６６３−３６６７)、およびアルカリ性ホスファターゼ(Toh et al.(１９８９)Eur.J.Biochem. １８２：２３１−２３８、Hall et al.(１９８３)J.Mol.Appl.Gen.２：１０１)をコード化する核酸がある。
【００７４】
本明細書で使用されているリポーター遺伝子構築物は、転写制御配列に機能し得るように結合されているリポーター遺伝子を含むＤＮＡ分子である。転写制御配列は、プロモーターおよび他の所望による調節領域、例えばプロモーターの活性を調節するエンハンサー配列、またはプロモーターを認識するＲＮＡポリメラーゼの活性または有効性を調節する制御配列、またはエフェクター分子により認識される制御配列、例えば細胞表面タンパク質と細胞外シグナルの相互作用により特異的に誘導されるものを含む。例えば、プロモーターの活性の調節は、プロモーター領域に結合しているＲＮＡポリメラーゼを改変することにより、または別法としてｍＲＮＡの転写開始または伸長を妨害することにより行われ得る。上記配列は、本明細書では集合的に転写制御エレメントまたは配列と称する。さらに、構築物は、生成したｍＲＮＡの翻訳を改変することにより、リポーター遺伝子産物の量を改変するヌクレオチドの配列を含み得る。
【００７５】
本明細書で使用されているプロモーターは、転写開始部位の転写方向に関して上流であるＤＮＡの領域をいう。それは、ＲＮＡポリメラーゼ結合および転写開始部位および他の領域、例えば、限定されるわけではないが、リプレッサーまたはアクチベータータンパク質結合部位、カルシウムまたはｃＡＭＰ応答部位、および直接的または間接的に、プロモーターからの転写の量を改変することが当業者に知られている上記ヌクレオチド配列を含む。
【００７６】
本明細書で使用されている、細胞表面タンパク質の活性により調節または伝達されるプロモーターは、活性が細胞外タンパク質に影響される細胞表面タンパク質の存在により細胞が特定細胞外シグナルに暴露されたとき活性が変化するプロモーターである。
【００７７】
Ｂ．細胞へのＤＮＡの送達方法
核酸、特に大型核酸分子、例えば人工染色体、例えばＡＣｅｓ(先にＳＡＴＡＣと称されている)の様々な送達方法が提供されている。これらの方法では、一般的に、核酸分子および細胞間の接触を増す因子に核酸分子を暴露し、そして細胞を透過性増強剤に暴露する。本発明で提供される方法は各々、これら因子の一方または両方の使用を必要とし、これらは異なる順序で適用される。一般に、細胞の透過性を増加させる因子、例えばエネルギーは、細胞を核酸と接触させる前に適用される。
【００７８】
本発明で提供される方法では、大型核酸分子は、限定されるわけではないが、核酸分子および細胞間の接触を増加させる送達因子を含む因子および／または細胞透過性を増加させる因子および処理を用いて送達される。一般的に、核酸分子は、核酸分子の電荷を中和することにより核酸および細胞間の接触を増やす因子を用い、また細胞の透過性を高めるためのエネルギーを用いることにより送達される。これらの因子は、個々におよび様々な組み合わせおよび適用順序で使用され得る。一般に、エネルギー、例えば音響穿孔法および電気穿孔法は、核酸分子をそれに適用する前に細胞に適用されることは無い。
【００７９】
特定核酸分子、例えばＤＮＡを標的細胞へ送達するために選択される方法は、導入されている特定核酸分子および特定受容細胞により異なり得る。特定核酸分子、例えばＤＮＡおよび受容細胞にとって好ましい方法は、細胞生存に許容される程度で細胞核へ導入される核酸分子、例えばＤＮＡの最大量をもたらすものである。核酸分子、例えばＤＮＡの特定対合および受容細胞にとって適切な送達方法は、本発明で提供される核酸分子、例えばＤＮＡ送達のモニター方法および因子および条件のスクリーニング方法を用いて決定され得るか、または当業者に公知の方法を用いて経験的に決定され得る。
【００８０】
選択される方法は、下記で詳細に検討している若干のパラメーターの考察を必要とする。送達された核酸の検出方法が提供される。この方法は、任意の核酸分子の送達の評価に使用され得るもので、核酸、例えば染色体導入条件を最適化するための迅速なスクリーニング手段として使用され得る。
【００８１】
特に、送達方法は、まず細胞へ核酸分子、例えばＤＮＡを導入する能力、および送達された核酸分子、例えばＤＮＡを発現する十分な数の生存し得る細胞を提供する方法を識別する能力について評価され得る。一旦上記方法が識別されると、それらは本発明で提供される送達モニタリング方法を用いて最適化され、次いで送達された核酸分子の発現をもたらす能力について評価され得る。
【００８２】
送達因子
送達因子には、核酸分子、例えばＤＮＡと細胞の接触を向上および／または核酸分子、例えばＤＮＡに対する細胞の透過性を増加させる組成物、条件および物理的処理がある。上記因子には、限定されるわけではないが、カチオン化合物、ペプチド、タンパク質、エネルギー、例えば超音波エネルギーおよび電場、キャビテーション化合物がある。
【００８３】
本発明で提供される方法で使用される送達因子には、細胞への核酸分子、例えばＤＮＡ送達を容易にするために、細胞および／または核酸分子、例えばＤＮＡが細胞への核酸分子、例えばＤＮＡの導入プロセスにおいて暴露され得る組成物、条件または物理的処理がある。例えば、化合物および化学組成物、例えば、限定されるわけではないが、燐酸カルシウム、ＤＭＳＯ、グリセリン、クロロキン、酪酸ナトリウム、ポリブレンおよびＤＥＡＥデキストラン、ペプチド、タンパク質、温度、光、ｐＨ、放射線および圧力は全て、可能な送達因子である。
【００８４】
カチオン化合物
本発明で提供される方法で使用されるカチオン化合物は、市販されているかまたは当業者であれば合成できるものである。カチオン化合物は、提供された方法を用いた特定細胞型への核酸分子、例えばＤＮＡの送達に使用され得る。当業者であれば、提供されたスクリーニング手順を用いることにより、どのカチオン化合物が特異的標的細胞型への特異的核酸分子、例えばＤＮＡの送達に最も適しているかを容易に決定できるはずである。
【００８５】
(ａ)カチオン脂質
カチオン脂質試薬は、脂質頭部基における正電荷の数に基いた２つの一般的範ちゅう：単一正電荷類または通常は５個以下である、多正電荷類に分類され得る。カチオン脂質は、送達因子として使用される前に中性脂質と混合されることが多い。中性脂質には、レシチン類、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルエタノールアミン類、例えばＤＯＰＥ(ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン)、ＤＰＰＥ(ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン)、ＰＯＰＥ(パルミトイルオレオイルホスファチジルエタノールアミン)およびジステアロイルホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルコリン、ホスファチジルコリン類、例えばＤＯＰＣ(ジオレオイルホスファチジルコリン)、ＤＰＰＣ(ジパルミトイルホスファチジルコリン)、ＰＯＰＣ(パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン)およびジステアロイルホスファチジルコリン、脂肪酸エステル類、グリセリンエステル類、スフィンゴ脂質類、カルジオリピン、セレブロシド類、およびセラミド類、およびそれらの混合物があるが、これらに限定されるわけではない。中性脂質はまた、コレステロールおよび他の３βＯＨ−ステロール類を包含する。
【００８６】
本発明で考えられる他の脂質には、ホスファチジルグリセリン、ホスファチジルグリセリン類、例えばＤＯＰＧ(ジオレオイルホスファチジルグリセリン)、ＤＰＰＧ(ジパルミトイルホスファチジルグリセリン)、およびジステアロイルホスファチジルグリセリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルセリン類、例えばジオレオイル−またはジパルミトイルホスファチジルセリンおよびジホスファチジルグリセリン類がある。
【００８７】
カチオン脂質化合物の例には、リポフェクチン(ライフ・テクノロジーズ、インコーポレイテッド、バーリントン、オンタリオ)(カチオン脂質Ｎ−[１−(２,３−ジオレイルオキシ)プロピル]−Ｎ,Ｎ,Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド(ＤＯＴＭＡ)およびジオレオイルホスファチジルエタノールアミン(ＤＯＰＥ)の１：１(ｗ／ｗ)処方物)、リポフェクタミン(ライフ・テクノロジーズ、インコーポレイテッド、バーリントン、オンタリオ、米国特許第５３３４７６１号参照)(ポリカチオン脂質２,３−ジオレイルオキシ−Ｎ−[２(スペルミン−カルボキサミド)エチル]−Ｎ,Ｎ−ジメチル−１−プロパンアミニウムトリフルオロアセテート(ＤＯＳＰＡ)およびジオレオイルホスファチジルエタノールアミン(ＤＯＰＥ)の３：１(ｗ／ｗ)処方物)、リポフェクタミンプラス(ライフ・テクノロジーズ、バーリントン、オンタリオ、米国特許第５３３４７６１および５７３６３９２号参照、また米国特許第６０５１４２９号も参照)(リポフェクタミンおよびプラス試薬)、リポフェクタミン２０００(ライフ・テクノロジーズ、バーリントン、オンタリオ、国際ＰＣＴ出願第ＷＯ００／２７７９５号参照)(カチオン脂質)、エフェクテン(キアゲン、インコーポレイテッド、ミッシサウガ、オンタリオ)(非リポソーム脂質処方物)、メタフェクテン(ビオンテックス、ムーニッヒ、ドイツ国)(ポリカチオン脂質)、Ｅｕフェクチン類(プロメガ・バイオサイエンシーズ、インコーポレイテッド、サンルイスオビスポ、カリフォルニア)(エタノール性カチオン脂質１から１２番：Ｃ52Ｈ106Ｎ６Ｏ４・４ＣＦ３ＣＯ２Ｈ、Ｃ88Ｈ178Ｎ８Ｏ４Ｓ２・４ＣＦ３ＣＯ２Ｈ、Ｃ40Ｈ84ＮＯ３Ｐ・ＣＦ３ＣＯ２Ｈ、Ｃ50Ｈ103Ｎ７Ｏ３・４ＣＦ３ＣＯ２Ｈ、Ｃ55Ｈ116Ｎ８Ｏ２・６ＣＦ３ＣＯ２Ｈ、Ｃ49Ｈ102Ｎ６Ｏ3・４ＣＦ３ＣＯ２Ｈ、Ｃ44Ｈ89Ｎ５Ｏ３・２ＣＦ３ＣＯ２Ｈ、Ｃ100Ｈ206Ｎ12Ｏ４Ｓ２・８ＣＦ３ＣＯ２Ｈ、Ｃ162Ｈ330Ｎ22Ｏ９・１３ＣＦ３ＣＯ２Ｈ、Ｃ43Ｈ88Ｎ４Ｏ２・２ＣＦ３ＣＯ２Ｈ、Ｃ43Ｈ88Ｎ４Ｏ３・２ＣＦ３ＣＯ２Ｈ、Ｃ41Ｈ78ＮＯ8Ｐ)、シトフェクテン(バイオ‐ラッド、ハークルズ、カリフォルニア)(カチオン脂質および中性脂質の混合物)、ジーンポーター(ジーン・セラピー・システムズ・インコーポレイテッド、サンディエゴ、カリフォルニア)(中性脂質(Ｄｏｐｅ)およびカチオン脂質の処方物)およびＦｕジーン６(ロシュ・モレキュラー・バイオケミカルズ、インディアナポリス、インディアナ)(非リポソーム試薬に基く多成分脂質)があるが、これらに限定はされない。
【００８８】
(ｂ)非脂質カチオン化合物
非脂質カチオン試薬には、スーパーフェクト(ＳＵＰＥＲＦＥＣＴ、登録商標)(キアゲン、インコーポレイテッド、ミッシサウガ、オンタリオ)(活性化デンドリマー(カチオンポリマー：荷電アミノ基)およびクロンフェクチン(ＣＬＯＮｆｅｃｔｉｎ、登録商標)(カチオン両親媒性物質Ｎ−ｔ−ブチル−Ｎ'−テトラデシル−３−テトラデシル−アミノプロピオンアミジン)(クロンテック、パロアルト、カリフォルニア)があるが、これらに限定されるわけではない。
【００８９】
ピリジニウム両親媒性物質は、二本鎖ピリジニウム化合物であり、細胞に対し本質的には非毒性であり、細胞をトランスフェクションする能力について細胞の選り好みをほとんど示さない。ピリジニウム両親媒性物質の例としては、ピリジニウムクロリド界面活性剤、例えばＳＡＩＮＴ−２(１−メチル−４−(１−オクタデカ−９−エニル−ノナデカ−１０−エニレニル)ピリジニウムクロリド)がある(例えば、van der Woude et al.(１９９７)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. ９４：１１６０参照)。ピリジニウムクロリド界面活性剤は、典型的には中性ヘルパー脂質化合物、例えばジオレオイルホスファチジルエタノールアミン(ＤＯＰＥ)と１：１モル比で混合される。鎖長、飽和状態および頭部基が異なる他のセイント誘導体は、当業者により製造され得、本発明方法の範囲内に含まれ得る。
【００９０】
エネルギー
送達因子はまた、エネルギー、例えば音波および電気エネルギー供給源に対する細胞および／または核酸分子、ただし一般的には細胞の処理または暴露を含む。
【００９１】
超音波
インビトロおよびインビボトランスフェクションの場合、超音波供給源は、トランスフェクションの促進に適切な周波数およびエネルギー出力を提供し得るべきである。例えば、出力装置は、２０ｋＨｚ〜約１ＭＨｚの周波数範囲で超音波エネルギーを発生し得る。超音波エネルギーの仕事率は、例えば約０.０５ｗ／ｃｍ２〜２ｗ／ｃｍ２、または約０.１ｗ／ｃｍ２〜約１ｗ／ｃｍ２の範囲であり得る。超音波は、一連続パルスで投与され得るかまたは２またはそれ以上の断続パルスとして投与され得、それらは同一であり得るかまたは時間および強度が変化し得る。
【００９２】
超音波エネルギーは体へ局所適用され得るか、または超音波ベースの体外衝撃波砕石術が「広範囲にわたる」適用に使用され得る。超音波エネルギーは、様々な超音波装置を用いて対象の体に適用され得る。一般に、超音波は、標準または特別製の超音波イメージングプローブまたは超音波針を、他の医療装置、例えばスコープ類、カテーテルおよび外科用器具の使用を伴うかまたは伴わずに用いる直接接触により、または組織または臓器を部分的または完全に流動媒質で包囲する超音波浴を通して投与され得る。超音波の供給源は、対象の体にとって外面的、例えば対象の体内へ超音波を投入する、対象の皮膚に適用される超音波プローブ、または内蔵的、例えば対象の体内に設置される超音波トランスデューサーを有するカテーテルであり得る。適切な超音波システムは公知である(例、国際ＰＣＴ出願第ＷＯ９９／２１５８４号および米国特許第５６７６１５１号参照)。
【００９３】
カチオン化合物および核酸分子、例えばＤＮＡを全身投与するとき、超音波を一つまたは幾つかの臓器または組織へ同時適用することにより、対象の体の多領域への核酸分子送達が促進され得る。別法として、超音波を特異的領域または組織へ選択的に適用することにより、核酸分子、例えばＤＮＡの選択的取込みが促進され得る。
【００９４】
超音波のトランスフェクション効率はまた、人工キャビテーション核としての役割を果たす造影剤、例えばアルブネックス(モレキュラー・バイオシステムズ、サンディエゴ、カリフォルニア)、イメージェント(アライアンス・ファーマシューティカル、サンディエゴ、カリフォルニア)、レヴォヴィスト−ＳＨＵ(シェリングＡＧ、ベルリン、ドイツ国)、デフィニティー(Ｅ.Ｉ.デュポン・ド・ヌムール、ウィルミントン、デラウエア)、ＳＴＵＣ(ワシントン・ユニバーシティー、セントルイス、ミズーリ)の使用および気体マイクロバブルの導入により高められ得る。造影剤は、局所的、例えば関節に導入、全身的に導入され得、特定領域で砕石器衝撃波を集中させることによりキャビテーション効率を高め得るか、または特定部位に造影剤をターゲッティングし、次いで砕石器衝撃波を集中させることによりキャビテーション効率を高め得る。
【００９５】
電気穿孔法
電気穿孔法は、パルス回転電場の使用により一時的に細胞の外膜に孔を開ける。インビトロおよびインビボでの電気穿孔に使用される方法および装置は公知である(例、米国特許第６０２７４８８、５９９３４３４、５９４４７１０、５５０７７２４、５５０１６６２、５３８９０６９、５３１８５１５号参照)。標準プロトコルが使用され得る。
【００９６】
Ｃ．細胞のターゲッティングおよびそこへの送達
本発明で提供される方法は、細胞、例えば、限定されるわけではないが、真核生物および原核生物細胞への核酸の送達に使用され得る。これらの方法で使用され得る細胞の例には、限定されるわけではないが、幹細胞および胚細胞を含む、セルライン、一次細胞、一次セルライン、植物細胞および動物細胞がある。例えば、線維芽細胞、例えば肺および皮膚線維芽細胞、線維芽細胞様細胞、滑膜細胞、線維芽細胞様滑膜細胞、幹細胞、例えば胚性および成体幹細胞、例えば間葉幹細胞、筋芽細胞、リンパ芽球、癌腫およびヘパトーム細胞は、本発明で提供される方法を用いて核酸および特に大型核酸および人工染色体が送達およびモニターされ得る多くの細胞の中に含まれる。特定細胞には、哺乳類細胞、例えば、Ａ９細胞(マウス線維芽細胞、ＨＰＲＴ、ＡＴＣＣ受託番号ＣＣＬ−１.４)、ＣＨＯ−Ｓ細胞およびＤＧ４４細胞(チャイニーズハムスター卵巣細胞)、Ｖ７９細胞(チャイニーズハムスター肺線維芽細胞、ＡＴＣＣ受託番号ＣＣＬ−３９)、ＬＭＴＫ細胞(マウス線維芽細胞、ＡＴＣＣ受託番号ＣＣＬ−１.３)、皮膚線維芽細胞、Ｌ８細胞(ラット筋芽細胞、ＡＴＣＣ受託番号ＣＲＬ−１７６９)、ＣＣＤ１０４３ ＳＫ細胞(ヒト線維芽細胞、ＡＴＣＣ受託番号ＣＲＬ−２０５６)、成体由来の間葉幹細胞(例、ヒト骨髄由来、キャンブレックス・バイオサイエンシーズ、イースト・ラザフォード、ニュージャージー)、滑膜細胞(ラットおよびヒト)、デトロイト５５１細胞(ヒト胚性皮膚線維芽細胞、ＡＴＣＣ受託番号ＣＣＬ−１１０)、ＮＳ０(ネズミ骨髄腫、ＥＣＡＣＣ受託番号８５１１０５０３)、２９３細胞(５型(Ａｄ５)ＤＮＡ(ＡＴＣＣ受託番号ＣＲＬ−１５７３)により形質転換されたヒト胚性腎細胞)、Ｐ４６−Ｆｌ(ウシリンパ球様セルライン)、ＤＴ４０(ニワトリリンパ芽球)、ＥＪ３０細胞(ヒト膀胱癌)、ＨｅｐＧ２細胞(ヒトヘパトーム)およびネズミおよびウシ胚がある。
【００９７】
特定実施態様において、本発明で提供される細胞への核酸の送達方法は、例えば遺伝子治療適用で、疾患または障害を処置するために細胞へ核酸を送達するのに使用され得る。遺伝子治療適用では、細胞へ送達される核酸は、治療的分子、例えばタンパク質をコード化し得る。多くの場合、有効な遺伝子治療適用は、大型核酸を細胞へ送達する必要があることにより複雑になっている。また、一つまたはそれ以上の治療的分子をコード化する核酸のコピーを多数提供するのが望ましいことであり得る。遺伝子治療法における難しさをより大きくしているのは、遺伝子治療適用での使用に好ましい細胞が容易にはトランスフェクションされ得ないことが多いという難題である。本発明で提供される方法は、治療適用で使用され得るように細胞への、人工染色体またはそのフラグメント形態であり得る大型核酸の送達に特に適している。
【００９８】
インビトロ送達
カチオン化合物および核酸分子、例えばＤＮＡは、別々にまたは一緒に混合してインビトロで細胞に加えられ得、その場合超音波または電気エネルギーの適用を伴う場合も伴わない場合もあり得る。一般に、エネルギーを適用する場合、核酸分子と細胞を接触させる前にそれを適用する。
【００９９】
一般に、カチオン脂質／化合物と混合される核酸分子、例えばＤＮＡは、「実施例」で記載されている要領で細胞に加えられ得る。標的細胞への核酸分子、例えばＤＮＡの送達の最適化に重要なパラメーターは、当業者にとっては容易に理解できるものである。これらのパラメーターには、例えば、カチオン化合物、カチオン化合物濃度、核酸分子、例えばＤＮＡ、核酸分子濃度、細胞成長培地、細胞培養条件、細胞がカチオン化合物に暴露される時間の長さ、標的細胞型に対するカチオン化合物の傷害性、および超音波または電気穿孔法の使用量および時間が特に含まれる。種々の核酸分子、例えばＤＮＡおよび標的細胞型についてこれらのパラメーターを最適化するのが必要であり得る。上記最適化は、本発明で提供されるガイダンスを用いて常用手順により行なわれる。さらに、迅速なスクリーニング方法により、何のパラメーターが送達を最適化すべく調節される必要があるかという方向性が提供され得る(「実施例」参照)。カチオン化合物および標的細胞型の異なる組み合わせで使用するため、および送達を最適にするための培養条件、時間、試薬濃度および他のパラメーターの改変は、経験的に決定され得る。トランスフェクション効率を高めるのに超音波エネルギーを使用する必要がある場合、それは、下記および「実施例」で記載されている要領で適用され得る。電気穿孔法は、下記要領にしたがい、または当業者に公知の適切なプロトコルにより遂行され得る。
【０１００】
別々の異なる段階における、カチオン化合物および核酸分子、例えばＤＮＡと細胞の接触は、一般的に「実施例」記載の要領で実施され得る。当業者であれば、本明細書の開示に基いて標的細胞への成分適用の順序を容易に変え得るはずである。
【０１０１】
エクスビボ遺伝子治療
核酸分子、例えばＤＮＡの送達は、インビトロ送達における上記要領にしたがい実施される。選択完了後、核酸分子、例えばＤＮＡを含む細胞は、注射、例えば皮下、筋肉内、腹腔内、脈管内およびリンパ管内および関節内注射を含む様々な手段により対象標的へ導入される。細胞は、医療装置、例えば関節鏡、他のスコープ類または様々な型のカテーテルの助けを借りて、または借りずに投与され得る。
【０１０２】
インビボ遺伝子治療
インビボで対象の体内における標的細胞へ核酸分子、例えばＤＮＡを送達する一方法では、カチオン化合物をまず標的領域(例、組織、臓器、腫瘍または関節)へ送達する。適量の時間をおいた後、標的領域を、装置、組織型および体における標的領域の深度により異なる適切な時間適切なエネルギーレベルの超音波周波数にかける。別法として、電気エネルギーを標的領域に送達する。次いで核酸分子、例えばＤＮＡを同じ領域に送達する。所望により、この手順を反復することにより、核酸分子、例えばＤＮＡが時間経過に伴う多重注射または多重投与により同時に異なる領域で送達され得る。
【０１０３】
カチオン化合物は、核酸分子、例えばＤＮＡと一緒に混合され、標的領域へ送達され得る。次いで、標的領域は適切な時間適切なエネルギーレベルの超音波周波数にかけられ得る。核酸分子、例えばＤＮＡ、生体内での位置、使用されるカチオン化合物および他の可変因子によっては、標的領域における細胞への適切な導入効率を達成するのに超音波または電気穿孔を使用する必要が無い場合もあり得る。超音波適用前、造影剤を標的領域に送達することにより、核酸分子、例えばＤＮＡの導入が促進され得る。
【０１０４】
核酸分子、例えばＤＮＡは、体の臓器または組織、例えば皮膚、筋肉、胃、腸、肺、膀胱、卵巣、子宮、肝臓、腎臓、膵臓、脳、心臓、脾臓、前立腺および関節(例えば膝、肘、肩、手首、股関節部、指、足首など)へ送達され得る。分子は、例えば一次細胞およびセルライン、例えば線維芽細胞、筋肉、胃、腸、肺、膀胱、卵巣、子宮、肝臓、腎臓、膵臓、脳、心臓、脾臓、前立腺へ送達され、インビボ系を模倣し得る。
【０１０５】
カチオン化合物および核酸分子、例えばＤＮＡは、別々にまたは一緒に、注射(例えば、皮下、筋肉内、腹腔内、脈管内、関節内およびリンパ管内注射)、点滴注入、カニューレ挿入、低速輸液、局所適用および他の投与方法を含む様々な手段により体の標的領域へ送達され得る。それらは、全身的(例えば静脈内注射により)、例えば特異標的領域(組織または領域)への送達により局所的に、例えばカテーテルを用いて、または直接注射により適切な方式により投与され得る。それらは、医療器具、例えば関節鏡、他のスコープ類または様々なタイプのカテーテルの助けを借りて、または借りずに投与され得る。
【０１０６】
カチオン化合物は、医療装置、例えばカテーテル、例えば血管形成バルーンカテーテルをカチオン化合物処方物でコーティングすることによっても投与され得る。コーティングは、例えば医療装置をカチオン脂質処方物またはカチオン化合物処方物および適切な溶媒、例えば水性緩衝液、水性溶媒、エタノール、メチレンクロリド、クロロホルムおよび他の適切な溶媒の混合物に浸すことにより達成され得る。一定量の処方物は、装置の表面に自然に付着し、それに続いて適宜対象に投与される。別法として、カチオン脂質処方物の凍結乾燥混合物は、装置表面へ特異的に結合され得る。上記結合技術は公知である(例、Ishihara et al.(１９９３)Journal of Biomedical Materials Research ２７：１３０９−１３１４参照)。
【０１０７】
カチオン化合物および核酸分子、例えばＤＮＡは、インビボ送達用に、医薬上許容される担体、例えば食塩水または他の医薬上許容される溶液中で処方され得る。核酸分子、例えばＤＮＡおよびカチオン化合物は、投与経路とは関係無く、当業者に公知の標準的方法により医薬上許容される用量形態に処方される。
【０１０８】
遺伝子治療の場合、核酸分子、例えばＤＮＡの用量レベルは、特定対象についての最適治療応答を達成すべく変えられ得る。これは、様々な因子、例えば投与方式、核酸分子、例えばＤＮＡの活性、製造されるタンパク質の特性、標的細胞のトランスフェクション効率(核酸分子、例えばＤＮＡを取込む能力)、投与経路、標的細胞の位置および他の因子により異なる。
【０１０９】
当業者であれば容易に理解できるように、投与される用量および特定投与方式は、年齢、体重および処置される特定動物およびその領域、特定核酸分子および使用されるカチオン化合物、予期される治療または診断用途、および処方物の形態、例えば懸濁液、エマルジョンまたはリポソームといった因子により変化する。典型的には、用量は低レベルで投与され、所望の治療効果が達成されるまで増やされる。投与されるカチオン化合物の量は、変化し、一般的には投与されている核酸分子、例えばＤＮＡの量に左右される。例えば、カチオン化合物対核酸分子の重量比は、約１：１〜約１５：１、例えば約５：１〜約１：１の重量比であり得る。一般的に、投与されるカチオン化合物の量は、約０.１ミリグラム(ｍｇ)〜約１グラム(ｇ)の範囲で変化する。一般的ガイダンスによると、典型的には体重７０ｋｇおよび１ｍｌ当たり約１〜１０００万の染色体を伴う組成物の場合、１〜２０ｍｌの範囲の単一用量が単一または反復用量として投与される。
【０１１０】
病気の局所処置の場合、慢性関節リウマチ、乾癬および糖尿病における罹患関節への投与は、当然血友病または他の遺伝疾患といった病気の処置における筋肉への注射と同様に可能である。局所処置以外については、ターゲッティングされた送達段階が必要とされる。
【０１１１】
病気の処置を行うための細胞も提供される。例えば、関節または慢性関節リウマチの治療的処置用に選択された細胞を含む組成物が提供され、その場合細胞は大型異種核酸分子を含有する。例えば、上記組成物の細胞は、人工染色体を含み得る。上記組成物の特定実施態様では、細胞はＡＣｅｓを含み得る。
【０１１２】
結合組織およびリウマチ性疾患における遺伝子治療
慢性関節リウマチ(ＲＡ)は、関節の炎症および進行性の軟骨および(硬)骨破壊を特徴とする慢性炎症疾患である。関節における抗リウマチ薬剤の治療レベルを達成するためには比較的高い全身用量が必要であるため、ＲＡの処置は現行の戦略では問題が多い。さらに、利用可能な処置は、著しい厄介な副作用を伴う。すなわち遺伝子治療は、結合組織疾患、リウマチ性疾患および慢性糜爛性関節疾患、例えばＲＡ、変形性関節症、強直性脊椎炎および若年性慢性関節炎の処置における炎症部位への治療分子の送達についてのより有効なシステムである。
【０１１３】
滑膜性の連結において、平滑な連結は、骨端を覆う関節軟骨の巨大分子構造により確実なものとなる。隣接する骨の位置に見られる腔所または連結空間は、滑膜と称される組織により内側が覆われている。滑膜は、マクロファージ様Ａ型細胞(マクロファージ／単核球前駆体に由来すると思われ、食作用を呈する)および線維芽細胞様Ｂ型細胞(外見上はより線維芽細胞的であり、ヒアルロン酸および関節液の他成分の製造に伴う)を含む。滑膜の下にあるのは、性質的に線維質で脂肪または輪紋状であり得る散在する細胞下部滑膜(subsynovium)である。線維芽細胞様滑膜細胞(ＦＬＳ)は、異なる遺伝子発現パターンにより内膜下滑膜における正常な線維芽細胞とは区別され得る。ＦＬＳは、高レベルのウリジンジホスホグルコースデヒドロゲナーゼ(ＵＤＰＧＤ)、高レベルの血管細胞接着分子−１(ＶＣＡＭ−１)、細胞間接着分子−１(ＩＣＡＭ−１)およびＣＤ４４(ヒアルロン酸受容体)、フィブロネクチン受容体およびβ３インテグリン類を発現することが示された。亜系(サブライン)線維芽細胞または他の供給源からの線維芽細胞は、これらのマーカーを発現しないか、または低レベルで発現するに過ぎない(例、Edwards(１９９５)Ann.Rheum.Dis.５４：３９５−３９７、Firestein(１９９６)Arthritis Rheum.３９：１７８１−１７９０、Edwards(２０００)Arthritis Res.２：３４４−３４７参照)。
【０１１４】
ＲＡにおける病状の進行は、線維芽細胞様滑膜細胞(ＦＬＳ)の増殖および炎症細胞(例、リンパ球、マクロファージおよびマスト細胞)の浸潤故に滑膜内層の肥厚を必然的に伴う。滑膜細胞の正常な生態もまた、関節の軟骨および硬骨の侵襲および破壊を含むＲＡの病理学的プロセスで改変される。エラスターゼおよびコラゲナーゼの生成に加えて、滑膜細胞は、滑膜内におけるリンパ球およびマクロファージの漸増および活性化に関与する細胞表面タンパク質の発現によりＲＡの病態生理学的プロセスを仲介する。滑膜細胞の増殖により、軟骨を浸潤し、異常増殖するパンヌス組織が誘導され、骨破壊および関節構造および機能の破壊に至る。炎症(誘発)性サイトカイン類、例えば、腫瘍壊死因子−α(ＴＮＦ−α)およびインターロイキン−１(ＩＬ−１)は、ＲＡに伴う炎症および関節損傷において重要な役割を演じる。これらのサイトカイン類により誘発される病理学的作用には、滑膜過形成に至る白血球浸潤、細胞活性化、軟骨破損および軟骨マトリックス合成の阻害が含まれる。
【０１１５】
リウマチ様滑膜組織への核酸導入により、炎症または過形成を阻止するかまたは病的滑膜を特異的に破壊する傷害性物質を提供するメディエーターが製造され得る。エクスビボでのインターロイキン−１受容体アンタゴニスト(ＩＬ１−ＲＡ)をコード化する核酸のレトロウイルス送達および滑膜細胞の形質導入は、ヒトＲＡの遺伝子治療において炎症阻止に使用されている(例、Evans(１９９６)Human Gen.Ther. ７：１２６１−１２８０およびDel Vecchio et al.(２００１)Arthritis Res.３：２５９−２６３参照)。アデノウイルスベクターは、インビボ形質導入法における滑膜細胞へのＩＬ−１受容体アンタゴニストをコード化する核酸の送達について提案されている[例、米国特許第５７４７０７２号およびＰＣＴ出願公開第ＷＯ００／５２１８６号参照]。
【０１１６】
人工染色体は、遺伝子治療についてウイルスに基くシステムを凌ぐ利点を提供する。例えば、人工染色体発現系(ＡＣｅｓ)、および米国特許第６０２５１５５および６０７７６９７号およびＰＣＴ出願第ＷＯ９７／４０１８３号で報告されている他の人工染色体は、インビトロおよびインビボの両方で、大型核酸および／または特定ヌクレオチド配列の多数コピーの細胞、例えば滑膜細胞への送達について大きな受容力をもつ非組込み的非ウイルス性ベクターとしての役割を果たす。上記人工染色体系は、それらが長期間にわたって単一または多数のタンパク質を製造する遺伝子の安定した予測可能な発現を可能にするという点でさらなる利点を提供する。
【０１１７】
本発明で提供される方法は、大型核酸、例えば人工染色体を一次細胞、例えば滑膜細胞(例、線維芽細胞様滑膜細胞)および皮膚線維芽細胞、および骨格筋線維芽細胞セルラインへ導入するのに使用され得る。すなわち、滑膜細胞へ染色体、例えば人工染色体を導入することにより異種核酸を滑膜細胞へ導入する方法も本発明で提供される方法の中に含まれる。上記の一実施態様において、人工染色体はＡＣｅｓである。滑膜細胞は、例えば線維芽細胞様滑膜細胞であり得る。
【０１１８】
大型核酸分子の滑膜細胞への導入について本発明で提供される特定方法は、核酸分子を送達因子に暴露し、滑膜細胞を核酸分子と接触させる段階を含む。この方法の特定実施態様では、送達因子はエネルギーではない。一実施態様において、大型核酸分子は染色体である。例えば、核酸は人工染色体、例えばＡＣｅｓであり得る。特定実施態様において、滑膜細胞は線維芽細胞様滑膜細胞である。任意の送達因子、例えば本明細書に記載されているものは、上記方法で使用され得る。例えば、送達因子は、カチオン化合物を含むものであり得る。
【０１１９】
また、核酸分子を送達因子に暴露し、滑膜細胞を送達因子に暴露し、そして滑膜細胞を核酸分子と接触させる段階を含むことにより、核酸分子を滑膜細胞へ送達する、滑膜細胞への核酸分子導入方法も提供されており、この場合、上記段階は何らかの順序で連続的または同時に遂行される。本方法の実施態様の中には、送達因子がエネルギーである場合、それを核酸分子には適用せず、核酸分子と滑膜細胞の接触後にそれを滑膜細胞には適用しないものもある。核酸はいずれの核酸でもよい。特定実施態様では、核酸は大型核酸、染色体、人工染色体またはＡＣｅｓである。さらに別の実施態様において、滑膜細胞は線維芽細胞様滑膜細胞である。送達因子、例えば本明細書記載のものは、上記方法で使用され得る。例えば、送達因子は、カチオン化合物を含むものであり得る。
【０１２０】
本明細書で提供される滑膜細胞への核酸分子の別の送達方法は、核酸分子の存在または非存在下における滑膜細胞を送達因子と接触させ、超音波エネルギーまたは電気エネルギーを滑膜細胞に適用し、ただしここで接触および適用は連続的または同時に行うものとし、次いで滑膜細胞を核酸分子と接触させることにより、核酸分子を滑膜細胞へ送達する段階を含む。核酸はいずれの核酸でもよい。特定実施態様では、核酸は、大型核酸、染色体、人工染色体またはＡＣｅｓである。さらに別の態様において、滑膜細胞は線維芽細胞様滑膜細胞である。多数の送達因子、例えば本明細書記載の因子は上記方法で使用され得る。例えば、送達因子は、カチオン化合物を含むものであり得る。一実施態様において、エネルギーは超音波である。
【０１２１】
すなわち、本明細書では、滑膜細胞および線維芽細胞を含む一次細胞への核酸、特に大型核酸、例えば人工染色体を含む染色体、例えばＡＣｅｓの送達方法が提供されている。これらの方法はインビトロおよびインビボで使用され得る。
【０１２２】
また本明細書では、大型異種核酸、異種染色体またはその一部分、または人工染色体を含む滑膜細胞が提供される。一実施態様において、人工染色体はＡＣｅｓである。上記滑膜細胞には線維芽細胞様滑膜細胞が含まれる。滑膜細胞はいかなる種に由来するものでもよく、例えば哺乳類が含まれ得るが、限定されるわけではない。例えば、大型核酸、例えば人工染色体(例、ＡＣｅｓ)を含む滑膜細胞には、霊長類滑膜細胞、並びにげっし動物、ウサギ、サル、イヌ、ウマおよびヒト滑膜細胞がある。
【０１２３】
上記細胞への大型核酸の送達を達成する能力は、上記方法が、遺伝子治療適用および遺伝子治療法で使用され得る治療分子に関する罹患動物モデルでの試験において有用であることを立証する。すなわち、本明細書では、病気を処置するかまたは病状を調節する方法であって、罹患対象へ大型核酸分子、染色体またはその一部分、または人工染色体を導入する段階を含む方法が提供される。
【０１２４】
本明細書では対象におけるリウマチ疾患の病状を処置または調節する方法が提供される。一実施態様において、本方法は大型核酸を対象に導入する段階を含み、その場合大型核酸はリウマチ疾患の病状を調節する因子であるかまたはそれをコード化する核酸を含む。例えば、核酸は、抗リウマチ効果を有する分子であり得るかまたはそれをコード化し得る。リウマチ疾患に伴う病状は当業界では公知であり、本明細書に記載されている。例えば、上記の一病状は、細胞活性化、浸潤、増殖および漸増の過程を含む炎症過程である。この方法の特定実施態様では、疾患は慢性関節リウマチである。核酸は、例えば染色体またはその一部分または人工染色体、例えばＡＣｅｓであり得る。特定実施態様において、大型核酸は対象における炎症部位へ導入される。可能性のある一炎症部位は関節である。
【０１２５】
また、大型核酸を対象に導入する対象におけるリウマチ疾患の処置方法も提供され、その場合大型核酸は、治療剤であるかまたはそれをコード化する核酸を含む。例えば、核酸は、抗リウマチ効果を有する分子であり得るかまたはそれをコード化し得る。この方法の特定実施態様において、疾患は慢性関節リウマチである。核酸は、例えば染色体またはその一部分または人工染色体、例えばＡＣｅｓであり得る。この方法の実施態様において、大型核酸は対象における炎症部位へ導入される。可能性のある一炎症部位は関節である。
【０１２６】
リウマチ疾患の病状を調節するかまたはリウマチ疾患を処置する方法において、本方法はエクスビボおよびインビボフォーマットを含むいずれのフォーマットでも実践され得る。すなわち、例えば、核酸はインビトロで細胞へ導入され、次いで対象へ導入され得る。別法として、核酸はインビボで細胞へ導入され得る。特定実施態様では、核酸は、例えば線維芽細胞様滑膜細胞であり得る滑膜細胞へ導入される。導入される核酸は、対象において抗リウマチ効果を有する分子であるかまたはそれをコード化する核酸を含み得る。例えば、この分子は病状を改変、打ち消しまたは縮小し得る。上記分子は病気の徴候を改善し得る。ＲＡを患う対象において抗リウマチ効果を有する分子は当業界では公知である[例、VervoordeldonkおよびTak(２００１)Best Prac.Res.Clin.Rheumatol.１５：７７１−７８８およびＷＯ００／５２１８６参照]。上記分子には、抗炎症性または免疫調節性分子がある。例えば、インターロイキン−１受容体アンタゴニスト、可溶性インターロイキン−１受容体、可溶性腫瘍壊死因子受容体、インターフェロン−β、インターロイキン−４、インターロイキン−１０、インターロイキン−１３、トランスフォーミング成長因子β、ドミナントネガティブＩカッパＢ−キナーゼ、ＦａｓＬ、Ｆａｓ会合デスドメインタンパク質またはＣＴＬＡ−４は、抗リウマチ効果を有し得る分子に含まれる。
【０１２７】
また、結合組織またはリウマチ疾患動物モデルへの大型核酸分子導入による結合組織またはリウマチ疾患の処置における潜在的治療剤として核酸を同定、評価または試験する方法も提供される。核酸分子は、候補治療剤であるかまたはそれをコード化する核酸を含むものであり得る。この方法は、核酸分子が動物に対して何らかの効果、特に抗リウマチ効果を有するか否かを測定する段階を含み得る。例えば、核酸分子が動物に対して何らかの効果を有するか否かを測定するとき、一つまたはそれ以上の病状が影響されたか、例えば反対条件での改善または低減化が評価され得る。特定実施態様において、疾患はリウマチ疾患、例えば慢性関節リウマチである。動物は疾患がモデル化され得るものであればどの動物でもよい。例えば、動物は哺乳類であり得る。特定実施態様において、動物は、サル、げっし動物、ウサギ、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ブタまたは霊長類である。大型核酸は、例えば染色体またはその一部分または人工染色体、例えばＡＣｅｓであり得る。特定実施態様において、核酸分子は、滑膜細胞、例えば線維芽細胞様滑膜細胞にある。さらに別の態様において、核酸は動物の関節へ導入される。核酸分子は、インビトロまたはインビボフォーマットを用いて動物へ導入され得る。例えば、核酸は、インビトロで細胞へ導入され、次いで動物へ導入され得る。別の実施態様において、核酸はインビボで細胞に導入される。
【０１２８】
動物モデルには、例えばＲＡの動物モデルが含まれる。ＲＡの幾つかの動物モデル、および上記モデルの製造方法は、当業界では公知である。上記モデルは、アジュバント誘導関節炎(ＡＡ)[例、Kong et al.(１９９９)Nature ４０２３：３０４−３０９参照]およびコラーゲンII型誘導関節炎[例、Tak et al.(１９９９)Rheumatology ３８：３６２−３６９、Han et al.(１９９８)Autoimmunity ２８：１９７−２０８、Gerlag et al.(２０００)J.Immunology １６５：１６５２−１６５８参照]を含む。例えば、ルイスラットにおけるアジュバント誘導関節炎の実験的誘導は、徹底した局所的硬骨および軟骨破壊、骨密度の喪失および肢体不自由を伴う骨髄および関節周囲の軟組織に重度の炎症をもたらす[例、Bendele et al.(１９９９)Arthritis Rheum.４２：４９８−５０６参照]。
【０１２９】
Ｄ.細胞への核酸送達の評価
安定した核酸分子送達の評価に使用され得る顕微鏡およびコロニー形成分析法は、送達とは別個のプロセスである、核酸分子(例、選択可能なマーカー遺伝子)発現の手動的視覚化または測定に頼るものである。上記方法は、送達方法の評価を得るのに時間の遅延を伴う。ブロモデオキシウリジン(ＢｒｄＵ)を用いて染色体またはプラスミド導入を視覚化する顕微鏡技術(例、Pittman et al. J Immunol Methods １０３：８７−９２(１９８７)参照)は時間がかかり、低レベルの移動の検出でも要求される大型試料サイズについての限界があり、手作業で評点する必要性により制限されている。コロニー形成トランスフェクション分析は、マーカー発現性トランスフェクションコロニーを生成および評価するのに４〜６週間を要し得る。
【０１３０】
反対に、本発明で提供される方法は、迅速で自動化された、高感度で正確な分析手法、例えばフローサイトメトリーに基づいているため、時間の浪費、多大な労力およびエラーを生じやすい段階、例えば顕微鏡技術による個々のトランスフェクション細胞の手作業的検出を全く要しない。上記方法は、トランスフェクション後４８時間以内における核酸分子送達データの分析を可能にする。また、フローサイトメトリー分析法により集められたデータは、例えば核酸分子導入といった多数の事象が容易に集められるため統計的に優れている。これらの方法で得られる明確なデータは、器具誘導であるため、判定の誤りを受けにくい。すなわち、これらの方法は、核酸分子送達の評価における精度を高めるものである。反対に、顕微鏡分析法は、明確な事象の評点に要する時間により制限されており、試料のサイズも限界がある。
【０１３１】
核酸分子送達をモニターする方法は、リポーター遺伝子発現産物ではなく、核酸分子、例えばＤＮＡを検出するため、細胞自己蛍光および低レベルのリポーター遺伝子産物を発現する細胞からの野生型細胞分化の問題により妨害されることなく、２４時間以内に導入された核酸分子の絶対値を測定することが可能である(例えば、Ropp et al.(１９９５)Cytometry ２１：３０９−３１７参照)。
【０１３２】
１．核酸送達に取組む際に考慮すべき因子
細胞への核酸、例えばＤＮＡの送達は、核酸が細胞の内部に導入される過程である。核酸の送達方法は、以下のものを含む様々な方法で評価され得る。
【０１３３】
ａ．導入効率
送達方法は、ＤＮＡを含む核酸が存在する受容細胞のパーセント(すなわち導入効率)を測定することにより評価され得る。しかしながら、導入された核酸を発現する細胞を製造するという最終目標についての送達方法を評価するとき、考慮されるべき受容細胞における核酸の単なる存在より重要な追加的因子がある。これらの追加的因子には細胞生存能が含まれる。増殖中の細胞集団を評価する場合に、クロノジェニシティーは生存能の優れた測定方法である。標的細胞集団が非分裂中または増殖が緩慢なとき、代謝完全性がモニターされ得る。
【０１３４】
ｂ．クロノジェニシティー(クローン原性、clonogenicity)
クロノジェニシティーは、送達手順、成長条件および細胞操作(例、平板培養)に関する細胞の生存能力の尺度を表す。送達手順が、導入された核酸を含む細胞の所望の数を達成するのに十分な数の生存し得る細胞をもたらすか否かを決定するためにクロノジェニシティーを評価することは重要である。
【０１３５】
クロノジェニシティーは、クローンフラクションとして表され得る。クローンフラクションは、２つの別々の分数を掛け合わせ、対照平板効率補正係数(ＣＰＥ)に対して正規化することにより計算される指数である。この計算で掛け合わされる２つの別々の分数は、送達手順後に生残っていた細胞の分数(集団細胞収率)および平板培養に際し生残っている細胞の分数である。すなわち、計算は以下の要領で行われる：
クローンフラクション＝(平板培養後の生存し得るコロニー数／平板培養細胞数)×{トランスフェクション後の細胞数／(トランスフェクションされた細胞数×ＣＰＥ)}
【０１３６】
トランスフェクション後(すなわち、送達後)の細胞数および平板培養後のコロニー数についてこの計算で使用される値は、この過程でのある時点における細胞またはコロニー数に基いている。例えば、トランスフェクション後の細胞数についての値は、送達プロセスを完了させるのに十分である核酸送達後のある時点における細胞数を表す。この時間は経験的に決定され得る。典型的には、この時間は４〜４８時間の範囲であり、一般的にはトランスフェクション後約１日である。同様に、平板培養後の生存し得るコロニー数の値は、生存し得ない細胞が排除され、生存し得る細胞がコロニーとして確立されるのに十分な長さをおいた核酸送達後のある時点におけるコロニーの数を表す。この時間は経験的に決定され得る。典型的には、この時間は、最低でも平均コロニーが約５０細胞により構成される時点であり、または一般的には５細胞周期が過ぎる時点である。
【０１３７】
補正係数は、数えられたコロニー数を最初の平板培養細胞数(典型的には６００〜１０００細胞)で割ることにより決定される比率である、対照ウェルの平板効率を考慮に入れるために含まれる。ＬＭ(ｔｋ−)およびＶ７９−４細胞の場合、補正係数の値は、典型的には約０.７〜約１.２の範囲であり、例えば０.９であり得る。
【０１３８】
平板培養細胞数は、デュプリケイト実施により１０００(簡易化平板効率検定法)で一定しているべきであるが、例外として、ＣＰＥが０.３未満である場合は、播種細胞数を５０００〜５００００の範囲まで増やすべきである。ＣＰＥが０.１未満〜０.２である場合、生存可能フラクション分析を考えるべきである。
【０１３９】
ｃ．生存可能フラクション
標的細胞集団が分裂中ではないか、または分裂が緩慢な場合、複製またはクロノジェニシティー検定法は直接的には関連性が無い。細胞致死を測定するためには、複製受容力の喪失ではなく代謝死をモニターするあまり直接的ではない細胞生存能測定法を使用しなければならない。これらの手順には、例えば(１)染料排除により測定される膜完全性、(２)核酸前駆体の組込みにより測定される核酸合成の阻害、(３)放射性クロム放出、および(４)ＭＴＴアッセイ(３−[４,５−ジメチルチアゾール−２−イル]−２,５−ジフェニル−テトラゾリウムブロミド)が含まれる。これらの方法は代謝における即時変化のみを反映するため、それらは複製受容力喪失の測定とは異なっており、逆転または遅延され得るため、細胞生存能の評価に誤りをもたらし得る。これらの誤りを最小限にするため、デュプリケイト手順の相関関係が示唆されている。
【０１４０】
ｄ．潜在的トランスフェクション効率(ＰＴＥ)およびクロモス指数(ＣＩ)の測定
核酸、例えばＤＮＡの細胞における発現を目標とし、核酸を細胞へ導入するのに使用される送達方法を評価する場合、生存可能であり、核酸が送達された細胞総数の中からの核酸を含む細胞の理論的最大パーセントの指標を得ることが望ましい。これは、潜在的トランスフェクション効率と称され、既存または歴史的実験データセットから計算され得、以下の要領で決定される：
潜在的トランスフェクション効率(ＰＴＥ)＝導入効率×(クローンフラクションまたは生存可能フラクション)×補正係数(ＣＦ)
【０１４１】
クロモス指数(Ｃ.Ｉ.)は、導入効率を測定するための標識核酸、例えばＡＣｅｓ送達％および簡易化クロノジェニシティー検定法を用いて測定されたクローンフラクションの実験値を用いることによる増殖中集団の潜在的トランスフェクション効率の有効かつ迅速な決定方法である。
クロモス指数(ＣＩ)＝標識ＡＣｅｓ送達％ × 評価されたクローンフラクション×ＣＦ
【０１４２】
導入効率およびクローンフラクションおよび生存可能フラクションの値は、上記要領で計算される。補正係数(ＣＦ)は、試料の大きさ、試料採取時間および対照平板効率を考慮に入れる。これらの全因子が各変数、すなわち試料採取時間および大きさについて一定している場合、補正係数はＣ.Ｐ.Ｅ.に関する値の逆数に近づき、すなわちＣＦが低くてもクローンフラクションまたは導入効率は依然として１００％に近づき得る形であり、または言い換えれば、送達および生存能が１００％である場合、最大潜在的トランスフェクション効率は対照細胞の平板効率と等しくなる。Ｃ.Ｉ.の計算により、パラメーター、例えば導入効率、クローンフラクションおよびＣＦが１(または１００％)に近づくことを目標として、各変数の最適化が決定される。試料の大きさまたは採取時間がクローンフラクションまたは導入効率のいずれかについて変化する場合、ＣＦは傾きまたは変化速度に基く外挿値を表す。この評価法の適用は「実施例」で提供されている。
【０１４３】
約１％の安定したトランスフェクション効率は、標的細胞への大型核酸分子の導入に有用であると考えられる範囲(１〜１００％)に存する。本明細書で提供される方法を用いると、選択条件下での長期に及ぶトランスフェクション体の培養および選択マーカー発現に際し生残っている細胞数の測定を必要とせずに所望のトランスフェクション効率を達成するためにはどの送達方法を選択しなければならないかを予測することが可能である。この分析は、「生物学的」値(クローンフラクション)を染色体「取込み」または導入効率(送達されたＡＣｅｓを含む細胞のパーセント)の測定結果と統合するクロモス指数(ＣＩ)の計算を伴う。
【０１４４】
２．導入についての核酸分子の標識
本明細書で提供される核酸分子送達のモニター方法では、送達すべき核酸分子、例えばＤＮＡを標識することにより、細胞への導入後における受容細胞からの核酸分子の検出が可能となる。核酸分子は、ヌクレオチド類似体の組込みにより標識され得る。細胞で検出され得るものであればいずれの核酸分子類似体でもこれらの方法では使用され得る。類似体は、例えば放射能により直接検出可能なものであるか、または類似体を特異認識し、受容細胞内における内在性核酸分子、例えばＤＮＡを構成するヌクレオチドとそれを区別させる類似体への検出可能分子結合時に検出され得る。直接検出可能である類似体は、標準的分析法を用いてそれらを検出させ得る固有の特性を有する。類似体はまた、検出可能分子、例えば類似体に特異結合する標識抗体への結合時に検出可能であり得る。抗体における標識は、標準分析法を用いて検出され得るものである。例えば、抗体は、蛍光であり、フローサイトメトリーまたは顕微鏡により検出され得る。
【０１４５】
これらの方法の特定実施態様では、送達すべき核酸分子、例えばＤＮＡを、チミジン類似体、例えばヨードデオキシウリジン(ＩｄＵｒｄ)またはブロモデオキシウリジン(ＢｒｄＵ)で標識する。好ましい態様では、ＩｄＵｒｄを用いて、送達すべき核酸分子、例えばＤＮＡを標識する。導入されたＩｄＵｒｄ−標識核酸分子、例えばＤＮＡを、ＦＩＴＣコンジュゲート抗ＢｒｄＵ／ＩｄＵｒｄ抗体を用いて免疫学的に標識し、フローサイトメトリーにより定量し得る。すなわち、受容細胞への標識核酸分子、例えばＤＮＡの導入は、トランスフェクション後数時間内に検出され得る。
【０１４６】
Ｅ．送達される核酸分子の安定性
また、選択された送達条件下で核酸分子、例えばＤＮＡの安定性を評価することは興味深いことである。送達条件および因子の中には、核酸分子構造に対し有害な作用を有するものもあり得る。さらに、核酸分子、例えばＤＮＡ送達のある種のモニター方法で使用される標識技術もまた、核酸分子、例えばＤＮＡの構造および機能に衝撃を与え得る。
【０１４７】
核酸分子に関する送達条件の影響は、顕微鏡分析を含む様々な方法で評価され得る。人工染色体、例えばＡＣｅｓの安定性に関する特定分析法の一例では、染色体を興味の対象である条件、例えばＩｄＵ標識処理に暴露し、ヌクレオチド類似体の組込み後に無傷および凝縮されたままである能力について蛍光顕微鏡下で分析する。
【０１４８】
核酸分子送達および発現をモニターする方法
また、本明細書で提供される核酸分子送達法の送達をモニターする方法を、受容細胞における核酸分子、例えばＤＮＡ発現の評価と組み合わすことにより、発現目的のための核酸分子導入の全体的過程に関するさらなる情報が提供され得る。
【０１４９】
例えば、核酸分子、例えばＤＮＡ発現の分析を容易にするために、導入された核酸分子、例えばＤＮＡに、容易に検出される生成物をコード化するリポーター遺伝子を含ませることが望ましい。直接的検出についての上記リポーター遺伝子産物には、緑色蛍光タンパク質(ＧＦＰ)、赤色蛍光タンパク質(ＲＦＰ)、ルシフェラーゼ類、およびＣＡＴがあるが、これらに限定はされない。間接的検出についてのリポーター遺伝子産物には、β−ガラクトシダーゼおよび細胞表面マーカーがあるが、これらに限定はされない。
【０１５０】
例えば、ＤＮＡ類似体、例えばＩｄＵによるＡＣｅｓの標識と組合わせてＧＦＰリポーター遺伝子、例えば、限定されるわけではないが、ＧＦＰコーディング配列を含む人工染色体、例えばＡＣｅｓを用いることにより、送達および発現が迅速で正確にモニターされ得る。例えば、報告された方法のいずれかによる標的細胞へのＩｄＵ標識ＧＦＰ遺伝子含有ＡＣｅｓの送達後、ＡＣｅｓ含有細胞を２つの集団に分ける。一方の集団を固定し、ＩｄＵについて染色し、フローサイトメトリーで分析することにより、送達パーセントを測定する。他方の集団については４〜５細胞分裂(約７２時間)を経験させ、ＧＦＰ蛍光を発現の指標として測定する。
【０１５１】
上記試験は、類似体標識の組込みがＧＦＰタンパク質発現に影響しないことを示していることから、これらの方法を組合わせてＡＣｅｓの送達および初期発現をモニターし得ることにより、送達方法の有効性を迅速に評価するためにさらなる情報が提供され得ることを示している。また、これらの方法を組合わせて用いることにより、初期送達段階および初期遺伝子発現間における生物学的事象がマッピングされ得る。
【０１５２】
以下に記載の実施例は、説明を目的としているに過ぎず、本発明の範囲を制限する意図はないものとする。
【実施例】
【０１５３】
実施例１
人工染色体の製造
Ａ．Ａ９セルラインに含まれるＧＦＰ染色体
プラスミド
プラスミドｐＩＲＥＳ−ＥＧＦＰ(配列番号１３参照、クロンテック(カリフォルニア)から入手される公知プラスミド、例えば米国特許第６０３４２２８、６０３７１３３、５９８５５７７、５９７６８４９、５９６５３９６、５９７６７９６、５８４３８８４、５９６２２６５、５９６５３９６号参照、また米国特許第４９３７１９０号も参照)。このプラスミドは、ＭＣＳおよび強化緑色蛍光タンパク質(ＥＧＦＰ)コーディング領域間に脳心筋炎ウイルス(ＥＣＭＶ)の内部リボソームエントリー部位(ＩＲＥＳ；Jackson(１９９０)Trends Biochem.１５：４７７−４８３；Jang et al.(１９８８)J.Virol.６２：２６３６−２６４３)を含む。これは、興味の対象である遺伝子(ＭＣＳへクローン化)およびＥＧＦＰ遺伝子を単一の二シストロンｍＲＮＡ転写物から翻訳させ得る。プラスミドｐＩＲＥＳ２−ＥＧＦＰは、フローサイトメトリーおよび他の方法による、ＥＧＦＰおよび興味の対象であるタンパク質を発現する一時的トランスフェクション哺乳類細胞の選別用に設計されている。このベクターはまた、ＥＧＦＰを単独で発現させるかまたは薬剤およびクローン選択を伴わない安定したトランスフェクションセルラインを得るのに使用され得る。
【０１５４】
強化ＧＦＰ(ＥＧＦＰ)は、蛍光が３５倍増加したＧＦＰの突然変異体である。この変異型は、アミノ酸６５位におけるＳｅｒからＴｈｒおよび６４位におけるＰｈｅからＬｅｕへの突然変異を有し、最適化されたヒトコドンを伴う遺伝子によりコード化される(例えば、米国特許第６０５４３１２号参照)。ＥＧＦＰは、哺乳類細胞におけるより明るい蛍光および高い発現性について最適化された野生型ＧＦＰの赤色シフト変異体(Yang et al.(１９９６)Nucl.Acids Res.２４：４５９２−４５９３；Haas et al.(１９９６)Curr.Biol.６：３１５−３２４；Jackson et al.(１９９０)Trends Biochem.１５：４７７−４８３)である(最大励起＝４８８ｎｍ；最大放射＝５０７ｎｍ)。ＥＧＦＰは、Ｐｈｅ−６４からＬｅｕおよびＳｅｒ−６５からＴｈｒへの二重アミノ酸置換を含むＧＦＰｍｕｔ１変異体(Jackson(１９９０)Trends Biochem.１５：４７７−４８３)をコード化する。ＥＧＦＰ遺伝子のコーディング配列は、ヒトコドン使用選択性に対応する１９０を越えるサイレント塩基変化を含む(Jang et al.(１９８８)J.Virol.６２：２６３６−２６４３)。ＥＧＦＰの両側に隣接する配列がＫｏｚａｋ共通翻訳開始部位(Huang et al.(１９９０)Nucleic Acids Res.１８：９３７−９４７)に変換されたことにより、真核生物細胞における翻訳効率がさらに高くなった。
【０１５５】
プラスミドｐＩＲＥＳ−ＥＧＦＰは、ＩＲＥＳ配列下流のｎｅｏ遺伝子をＥＧＦＰコーディング領域と置き換えることにより、ＰＩＲＥＳｎｅｏ(本来はｐＣＩＮ４と呼ばれている)から誘導された。ＩＲＥＳ配列は、一ｍＲＮＡ転写物からの２つの読み枠の翻訳を可能にする。ｐＩＲＥＳ−ＥＧＦＰの発現カセットは、ヒトサイトメガロウイルス(ＣＭＶ)主要前初期プロモーター／エンハンサー、次いで多重クローニング部位(ＭＣＳ)、合成イントロン(ＩＶＳ；Huang et al.(１９９０)Nucleic Acids Res．１８：９３７−９４７)、ＥＭＣＶ ＩＲＥＳの後、ＥＧＦＰコーディング領域およびウシ成長ホルモンのポリアデニル化シグナルを含む。
【０１５６】
主要成分の位置(配列番号１３に関する)：
ヒトサイトメガロウイルス(ＣＭＶ)前初期プロモーター：２３２−８２０；
ＭＣＳ ９０９−９７４；
ＩＶＳ ９７４−１２６９；
ＥＣＭＶのＩＲＥＳ １２９９−１８８４；
強化緑色蛍光タンパク質(ＥＧＦＰ)遺伝子 １９０５−２６２１；
ウシポリＡシグナルを含むフラグメント ２６３６−２９１３；
Ｃｏｌ Ｅ１複製起点 ３３４３−４０１６、および
アンピシリン耐性遺伝子５０２６−４１６８
【０１５７】
エシェリキア・コリ(E.coli)における増殖
適切な宿主株：ＤＨ５a、ＨＢ１０１、および他の多目的株。一本鎖ＤＮＡ製造は、Ｆプラスミド、例えばＪＭ１０１またはＸＬ１−Ｂｌｕｅを含む宿主を必要とする。
選択マーカー：プラスミドは、エシェリキア・コリ(E.coli)宿主にカナマイシン(３０μｇ／ｍｌ)に対する耐性を付与する。
エシェリキア・コリ(E.coli)複製起点：ｐＵＣ
コピー数：〜５００
プラスミド不適合性群：ｐＭＢ１／ＣｏｌＥ１
【０１５８】
ｐＣＨＥＧＦＰ２
プラスミドｐＣＨＥＧＦＰ２は、ｐＩＲＥＳ−ＥＧＦＰからのＮｓｉ１／ＳｍａＩフラグメントの欠失により構築された。プラスミドｐＩＲＥＳ−ＥＧＦＰは、ＣＭＶプロモーター、合成イントロン、ＥＧＦＰコーディング配列およびウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナルを含むｐＣＨＥＧＦＰ２の２.１ｋＢ Ｎｒｕ１／Ｘｈｏフラグメントについてのコーディング配列を含む。Ｎｒｕ１およびＳｍａ１によるｐＩＲＥＳ−ＥＧＦＰの消化により、２.１ｋｂフラグメントが生じた。消化されたＤＮＡをアガロースゲル電気泳動により分画し、分離したバンドを切除し、次いでＱｉａｅｘ１１ゲル精製システム(キアゲン、ミッシサウガ、オンタリオ)を用いてゲルから溶離した。
【０１５９】
ｐＦＫ１６１
コスミドｐＦＫ１６１は、ドクターGyula Hadlaczkyから入手されたもので、ネズミｒＤＮＡ反復から誘導された９ｋｂ ＮｏｔＩ挿入体を含む(このコスミドの報告についてはHadlaczky et al.によるＰＣＴ出願公開第ＷＯ９７／４０１８３号に記載されたクローン１６１参照)。このコスミドは、クローン１６１と称され、配列番号１６におけるヌクレオチド１０２３２−１５０００に対応する配列を含む。それは、以下の要領で巨大染色体のフラグメント(米国特許第６０７７６９７号および国際ＰＣＴ出願第ＷＯ９７／４０１８３号参照、例えばＨ１Ｄ３は、受託番号第９６０４０９２９号としてヨーロピアン・コレクション・オブ・アニマル・セル・カルチャー(ＥＣＡＣＣ)に寄託されたもので、この巨大染色体をもつマウス−ハムスターハイブリッドセルラインである)を、プラスミドｐＷＥ１５(ストラタジーン、ラジョラ、カリフォルニア)に挿入することにより調製された。単離ＳＡＴＡＣを含む１００μｌの低融点アガロースブロック(巨大プラグ)の半分を、３７℃でＮｏｔＩにより一晩消化した。プラスミドｐＷＥ１５も同様にＮｏｔＩで一晩消化した。次いで、巨大プラグを溶かし、消化されたプラスミド、ライゲーション緩衝液およびＴ４リガーゼと混合した。ライゲーションを１６℃で一晩実施した。細菌性ＤＨ５α細胞をライゲーション生成物により形質転換し、形質転換細胞をＬＢ／Ａｍｐプレートで平板培養した。合計１８９のコロニーについて１５〜２０個のコロニーを各プレートで培養した。ＬＢ／Ａｍｐ培地での培養に関して生残ったコロニーからプラスミドＤＮＡを単離し、ｐＵＣ１９プローブとハイブリダイズするＤＮＡの存在についてサザーンブロットハイブリダイゼーションにより分析した。このスクリーニング方法は、全クローン、挿入体を欠いてはいるがｐＷＥ１５プラスミドを含むクローンまでも、検出されることを確実にした。
【０１６０】
全１８９形質転換体の液体培養物を用いることにより、挿入体ＤＮＡ内における制限部位分析用にコスミドミニプレップを調製した。当初の１８９コスミドクローンのうち６個が挿入体を含んでいた。これらのクローンを以下の通り命名した：２８(〜９ｋｂ挿入体)、３０(〜９ｋｂ挿入体)、６０(〜４ｋｂ挿入体)、１１３(〜９ｋｂ挿入体)、１５７(〜９ｋｂ挿入体)および１６１(〜９ｋｂ挿入体)。制限酵素分析は、クローンのうち３個(１１３、１５７および１６１)が同じ挿入体を含むことを示した。
【０１６１】
配列分析するため、コスミドクローン１６１番の挿入体を以下の要領でサブクローニングした。クローン１６１番の挿入体の末端フラグメントを得るため、クローンをＮｏｔＩおよびＢａｍＨＩで消化し、ＮｏｔＩ／ＢａｍＨＩ消化ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＫＳ(ストラタジーン、ラジョラ、カリフォルニア)とライゲーションした。クローン１６１番の挿入体の２フラグメント：０.２ｋｂおよび０.７ｋｂ挿入体フラグメントが得られた。クローン１６１番の挿入体の内部フラグメントをサブクローニングするため、同じ消化物をＢａｍＨＩ消化ｐＵＣ１９とライゲーションした。クローン１６１番の挿入体の３フラグメント：０.６ｋｂ、１.８ｋｂおよび４.８ｋｂ挿入体フラグメントが得られた。
【０１６２】
挿入体は、配列番号５として提供されている、ジェンバンク受託番号第Ｘ８２５６４号に示された７５５１−１５６７０位間におけるマウスリボソームＲＮＡ遺伝子(ｒＤＮＡ)反復単位の内側部分に対応する。クローン１６１番の挿入体について得られた配列データを配列番号６〜１２に示す。具体的には、個々のサブクローンは、ジェンバンク受託番号第Ｘ８２５６４号(すなわち、配列番号５)および配列番号６〜１２における以下の位置に対応していた。
【０１６３】
【表１】
2004532205.tif 000002
【０１６４】
配列番号６〜１２に示された配列は、ジェンバンク受託番号第Ｘ８２５６４号の７５５１−１５６７０位に提示された配列とは幾つかの位置が異なっている。上記ダイバージェンスは、ｒＤＮＡの反復単位間におけるランダム突然変異に帰因し得る。
【０１６５】
ここで使用するため、クローンからのｒＤＮＡ挿入体を、コスミドをＮｏｔＩおよびＢｇｌIIで消化することにより調製し、上記要領で精製した。標準的公知方法(例、Sambrook et al.(１９８９)Molecular Cloning: A Laboratory Manual、第２版、コールドスプリングハーバー・ラボラトリー・プレス、参照)を用いて、細菌ストックの培養および維持およびプラスミドの精製を遂行し、そしてミディ‐およびマキシ‐プレップスキット(キアゲン、ミッシサウガ、オンタリオ)を用いてプラスミドを細菌培養物から精製した。
【０１６６】
Ｂ.ＧＦＰ、ネズミＡ９セルラインの調製
細胞培養およびトランスフェクション
ネズミＡ９セルラインをＡＴＣＣから入手し、下記要領で細胞を解凍および維持した。簡単に述べると、細胞を、９０％ＤＭＥＭ(キャナディアン・ライフ・テクノロジーズ・バーリントン、オンタリオ)および１０％ＦＢＳ(キャン・セラ、レキサデール、オンタリオ)を含む成長培地中１５ｃｍ組織培養皿(ファルコン、ベクトン・ディッキンソン・ラブウェア、フランクリンレイクス、ニュージャージー)１枚につき２×１０６細胞の密度で平板培養し、３７℃、５％ＣＯ２で維持した。細胞が培養飽和密度の７０〜８０％に達したとき、培養物を常用手順で継代した。継代培養を以下の要領で実施した。培地を吸引除去した。１０ｍｌの１×トリプシン−ＥＤＴＡ(キャナディアン・ライフ・テクノロジーズ・バーリントン、オンタリオ)を細胞単層に分配し、皿を静かに回転させてトリプシン−ＥＤＴＡを分布させた。最後に、トリプシン−ＥＤＴＡの塊を吸引除去し、皿を３７℃で５分間置いた。トリプシン−ＥＤＴＡをクエンチングするため、１０ｍｌの成長培地を皿に加え、単一細胞懸濁液を５０ｍｌ円錐管に移した。細胞計数装置(ベックマン‐コールター、ハイアレア、フロリダ)を用いて細胞計数を実施した。細胞を希釈し、上記要領で再培養した。低温貯蔵のため、トリプシン−ＥＤＴＡ処理により培養物を採取し、計数し、次いで細胞懸濁液を、スイングバケット遠心器中で５分間５００×ｇの遠心分離にかけた。細胞ペレットを、１×１０７細胞／ｍｌの密度で９０％ＤＭＥＭ、２０％ＦＢＳおよび１０％ＤＭＳＯ(シグマ‐アルドリッチ、オークビル、オンタリオ)を含む凍結培地に再懸濁した。次いで、１ｍｌアリコートの細胞懸濁液を、クライオバイアル(ヌンク、ロチェスター、ニューヨーク)に分配し、イソプロパノール充填容器(ヌンク、ロチェスター、ニューヨーク)中で一晩冷凍し、−７０℃で置き、次いで長期貯蔵のため液体窒素冷凍庫のガス相へ移した。
【０１６７】
Ｃａ２ＰＯ４共沈澱法(例、Graham et al.(１９７８)Virology ５２：４５６−４５７；Wigler et al.(１９７９)Proc.Natl.Acad.Sci. U.S.A.７６：１３７３−１３７６；および(１９９０)Current Protocols in Molecular Biology、第１巻、ウィリー・インター‐サイエンス、補遺１４、ユニット９.１.１−９.１.９参照)を用いてＡ９細胞をトランスフェクションした。トランスフェクションの一日前、Ａ９細胞を１０ｃｍ皿１枚当たり２×１０６細胞の密度で平板培養し、トランスフェクションの３時間前に培地を新鮮な成長培地と取り換えた。１４０μｇの９ｋｂ ｒＤＮＡ、ＮｏｔＩおよび５μｇの２.１ｋＢ ＣＭＶ−ＥＧＦＰ ＸｈｏＩ／ＮｒｕＩフラグメントを混合し、共沈澱させ、それらを用いてＣａ２ＰＯ４共沈澱物(リン酸カルシウムトランスフェクションシステム、キャナディアン・ライフ・テクノロジーズ・バーリントン、オンタリオ)を調製し、それをサブコンフルエント(subconfluent)Ａ９細胞の１０ｃｍ皿２枚に分配した。ＤＮＡ−Ｃａ２ＰＯ４複合体を１８時間細胞上で放置した後、沈澱物を吸引除去し、細胞を１.５分間グリセリンショックにかけた。グリセリンショック後、細胞単層を２×１０ｍｌのｄＰＢＳ(キャナディアン・ライフ・テクノロジーズ・バーリントン、オンタリオ)で静かに洗浄した後１０ｍｌの予温成長培地を加えた。最後に皿をインキュベーターに戻し、３７℃、５％ＣＯ２で維持した。３時間回復後、各皿を３×１５ｃｍ組織培養皿で継代した。
【０１６８】
落射蛍光(epifluorescence)照明を備えた倒立顕微鏡(Ａｘｉｏｖｅｒｔ２５、ツァイス、(ノースヨーク、オンタリオ)および＃４１０１７Ｅｎｄｏｗ ＧＦＰフィルターセット(クロマ・テクノロジーズ、ブラットルボロ、バーモント))を用いて、培養物のＧＦＰ蛍光を培養中視覚的にモニターした。ＧＦＰ発現性集団の濃厚化を下記要領で実施した。
【０１６９】
蛍光活性化細胞選別法によるＧＦＰ発現性細胞集団の濃厚化
ターボ‐ソートオプションおよび２つのイノーヴァ３０６レーザー(コヒーレント、パロアルト、カリフォルニア)を備えたＦＡＣＳヴァンテージフローサイトメーター(ベクトン・ディッキンソン・イムノサイトメトリー・システムズ、サンホセ、カリフォルニア)を用いて細胞選別を実施した。細胞選別のため、７０μｍノズルを使用した。シース緩衝液をＰＢＳに変えた(２０ｐｓｉで維持)。ＧＦＰを４８８ｎｍレーザービームで励起させ、５００ＥＦＬＰフィルターを用いてＦＬ１で励起を検出した。前方および側方への散乱を、生存可能細胞について選別すべく調節した。次いで、生存可能細胞のみ、ＧＦＰ蛍光について分析した。陰性対照として野生型Ａ９細胞および陽性対照としてＧＦＰ ＣＨＯ細胞を用いて、ゲーティングパラメーターを調節した。
【０１７０】
選別の第１ラウンドについては、Ａ９細胞をトランスフェクション４日後に採取し、１０ｍｌの成長培地に再懸濁し、上記パラメーターを用いてＧＦＰ発現性集団について選別した。ＧＦＰ陽性細胞については、１×ペニシリン／ストレプトマイシンを補った５×１０ｍｌ量の成長培地(キャナディアン・ライフ・テクノロジーズ・バーリントン、オンタリオ)中に分配し、非発現性細胞については廃棄の指示をした。同じ培地を用いてさらに発現性細胞を５０ｍｌに希釈し、２×１５ｃｍ皿へ平板培養し、前項の記載と同様に培養した。選別された集団が密集成長に達したとき、ＧＦＰ発現性細胞について濃厚化するためそれらを再選別した。合計４連続選別を実施することにより、最終選別後には８９％ものＧＦＰ発現性細胞の高い濃厚化を達成した。最終ＧＦＰ発現性集団を低温保存および蛍光in situハイブリダイゼーションスクリーニング(下記参照)用に拡大させた。フローサイトメーターを用いてＧＦＰ発現性単細胞を９６ウェルプレートの個々のウェルへ指向させることにより、単細胞クローンを興味の対象である集団から確立した。これらを上記要領で培養した。
【０１７１】
蛍光In−Situハイブリダイゼーション
蛍光Ｉｎ−Ｓituハイブリダイゼーション(ＦＩＳＨ)スクリーニングを、ＧＦＰ濃厚化集団および単細胞クローンについて実施することにより、増幅および／または人工染色体形成を検出した。中期拡散物の調製およびハイブリダイゼーションを遂行した(Telenius et al.(１９９９)Chromosome Res ７：３−７参照)。使用されるプローブには、マウス主要反復を認識するｐＳＡＴ １(例、Wong et al.(１９８８)Nucl.Acids Res.１６：１１６４５−１１６６１)、マウスｒＤＮＡ含有領域とハイブリダイズするｐＦＫ１６１およびマウス小反復に対するＰＣＲ生成プローブが含まれる。
【０１７２】
すなわち、人工染色体、例えばＡＣｅｓの生成について本明細書で提供される一方法では、選択マーカー、例えば蛍光タンパク質またはフローサイトメトリーに基く方法または他の方法、例えば蛍光定量法、細胞イメージングまたは蛍光顕微鏡を用いて容易に検出され得る他のタンパク質をコード化する異種核酸を、細胞へ導入する。例えば、ｒＤＮＡおよび強化緑色蛍光タンパク質(ＥＧＦＰ)をコード化するＤＮＡは、細胞、例えばＡ９細胞へ導入され得る。トランスフェクションされた細胞は、フローサイトメトリーに基く方法または他の方法、例えば蛍光定量法、細胞イメージングまたは蛍光顕微鏡により検出され得る特性、例えば蛍光特性に基いて選別され得る。例えば、蛍光タンパク質を含む細胞は、蛍光活性化細胞選別装置(ＦＡＣＳ)を用いて非トランスフェクション細胞から単離され得る。人工染色体の存在についての細胞の染色体分析前に選別を実施する場合、人工染色体について濃厚化され得るトランスフェクション細胞の集団が提供されるため、後続の細胞染色体分析および人工染色体、例えばＡＣｅｓを含む細胞の同定および選択が容易になる。例えば、細胞は、染色体セグメントの増幅の指標、増幅および新たな人工染色体形成に関連して生じ得る構造の存在および／または人工染色体、例えばＡＣｅｓの存在について分析され得る。細胞分析は、典型的には本明細書記載および／または当業者公知の技術を用いた染色体構造の視覚化方法、例えば、限定されるわけではないが、Ｇ−およびＣ−バンド法およびＦＩＳＨ分析を含む。上記分析は、増幅が行われ得る、特定核酸、例えばサテライトＤＮＡ配列、ヘテロクロマチン、ｒＤＮＡ配列および異種核酸配列の特異的標識を使用し得る。トランスフェクション細胞の分析中における、染色体数の変化および／または、例えば反復単位の増幅から生じる分割増加による特有の染色体構造の様相は、人工染色体含有細胞の同定を助けるものである。
【０１７３】
Ｃ．フローサイトメトリーによる人工染色体の精製およびフロー選別染色体からのＤＮＡの調製
人工染色体を、フローサイトメトリーにより宿主細胞から精製した(de Jong(１９９９)Cytometry ３５：１２９−１３３参照)。簡単に述べると、ターボ‐ソート・オプションおよび２つのイノーヴァ３０６レーザー(コヒーレント、パロアルト、カリフォルニア)を備えたＦＡＣＳヴァンテージフローサイトメーター(ベクトン・ディッキンソン・イムノサイトメトリー・システムズ、サンホセ、カリフォルニア)で精製を行った。ターボ‐ソート・オプション調節は、２０ ｌｂ／ｉｎ２から６０ ｌｂ／ｉｎ２への最大システム圧の増加、５００００滴／秒から９９０００滴／秒の最大値までの落下駆動頻度および最大６０００Ｖ〜８０００Ｖまでの偏向面電圧の増加を含む。他の調節は、より高圧に適応させるよう器具に加えられる。ヘキスト３５２５８を第一ＵＶレーザービームで励起させ、４２０ｎｍハンドパスフィルターを用いることによりＦＬＩで励起を検出した。クロモマイシンＡ３を４５８ｎｍにセットした第２レーザーにより励起させ、４７５ｎｍロングパスフィルターを用いることにより蛍光をＦＬで検出した。両レーザーとも、出力は２００ｍＷであった。２変量分布(１０２４×１０２４チャンネル)を各選別中に累積した。全染色体選別については、シース圧を３０ ｌｂ／ｉｎ２に設定し、５０μｍ直径ノズルを取り付けた。落下遅延プロファイルを毎朝実施し、主たるプラグ後に反復した。３.０μｍ直径スフェロレインボービーズ(スフェロテク、リバティービル、イリノイ)を用いることにより、器具のアラインメントを毎日行った。２.０％またはそれより少ないＣＶがＦＬ１およびＦＬ４について達成されたときアラインメントは最適化されたと見なした。
【０１７４】
凝縮剤(へキシレングリコール、スペルミンおよびスペルミジン)を、シース緩衝液に加えることにより、選別後の凝縮染色体を維持した。シース緩衝液は、１５ｎｍのトリスＨＣｌ、０.１ｍＭのＥＤＴＡ、２０ｍＭのＮａＣｌ、１％のへキシレングリコール、１００ｍＭのグリシン、２０μＭのスペルミンおよび５０μＭのスペルミジンを含む。選別された染色体を、４℃、約１×１０６染色体／ｍｌの濃度で１.５ｍｌネジ蓋式エッペンドルフ管に集め、次いでそれらを４℃で貯蔵した。
【０１７５】
精製ゲノムＤＮＡの調製については、選別された染色体試料を０.５％ＳＤＳ、５０ｍＭのＥＤＴＡおよび１００μｇ／ｍｌプロテイナーゼＫに移し入れ、次いで５０℃で１８時間インキュベーションした。１μｇの２０ｍｇ／ｍｌグリコーゲン溶液(ベーリンガー・マンハイム)を各試料に加えた後、等量のフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール(２５：２４：１)で抽出した。１０分間２１０００×ｇで遠心分離後、水相を新しい微細遠心管に移し、上記と同様に再抽出した。０.２体積の１０Ｍ ＮＨ４ＯＡＣ、１μｌの２０ｍｇ／ｍｌグリコーゲンおよび１体積のイソプロパノールを、２回抽出水相に加え、次いで渦状に混ぜ、１５分間３００００×ｇ(室温)で遠心分離した。ペレットを２００μｌの７０％エタノールで洗浄し、上記と同様再遠心分離にかけた。洗浄したペレットを風乾し、次に０.５〜２×１０６染色体等量／μｌで５ｍＭのトリス−Ｃｌ、ｐＨ８.０に再懸濁した。
【０１７６】
本質的には上記と同じ要領(Co et al.(２０００)Chromosome Research ８：１８３−１９１参照)で、ＥＧＦＰおよびＲＡＰＳＹＮに特異的なプライマーセットを用いて選別された染色体試料から調製したＤＮＡにおいてＰＣＲを実施した。簡単に述べると、１０ｍＭのトリス−Ｃｌ、ｐＨ８.３、５０ｍＭのＫＣｌ、２００μＭのｄＮＴＰ、５００ｎＭの前進および逆プライマー、１.５ｍＭのＭｇＣｌ２、１.２５単位のＴａｑポリメラーゼ(アンプリ‐Ｔａｑ、パーキン‐エルマー・シータス、カリフォルニア)を含む溶液中１００００または１０００染色体に等しいゲノムＤＮＡにおいて、５０μｌのＰＣＲ反応を実施した。各プライマーセットについて別々の反応を実施した。反応条件は以下の通りであった：９５℃で１０分を１サイクル、次いで９４℃で１分、５５℃で１分、７２℃で１分を３５サイクル、および最後に７２℃で１０分を１サイクル。完了後、下記プライマー(各々配列番号１〜４)を用いるアガロースゲル電気泳動による分析まで試料を４℃に保った：
ＥＧＦＰ前進プライマー  ５'−cgtccaggagcgcaccatcttctt−３'
ＥＧＦＰ逆プライマー  ３'−atcgcgcttctcgttggggtcttt−３'
ＲＡＰＳＹＮ前進プライマー  ５'−aggactgggtggcttccaactcccagacac−３'、および
ＲＡＰＳＹＮ逆プライマー  ５'−agcttctcattgctgcgcgccaggttcagg−３'。
プライマーは全て、キャナディアン・ライフ・テクノロジーズ(バーリントン、オンタリオ)から入手した。
【０１７７】
実施例２
カチオン小胞の調製
以下の要領に従い７００ナノモル／ｍｌ脂質の脂質濃度(カチオン脂質／ＤＯＰＥ１：１)で小胞を調製した。ガラス管(１０ｍｌ)中で、３５０ｎｍｏｌのカチオン脂質(ＳＡＩＮＴ−２)を、３５０ｎｍｏｌジオレオイルホスファチジルエタノールアミン(ＤＯＰＥ)と混合し、両方を有機溶媒(クロロホルム、メタノールまたはクロロホルム／メタノール１：１、ｖ／ｖ)中で可溶化した。ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン(ＤＯＰＥ；アヴァンティ極性脂質、アラバスター、アラバマ)は、膜に逆六辺形相を形成し、膜を弱める。使用され得る他のエフェクターは、シス不飽和ホスファチジルエタノールアミン、シス不飽和脂肪酸およびコレステロールである。シス不飽和ホスファチジルコリンは有効性が劣る。
【０１７８】
溶媒を窒素気流下で蒸発させた(室温で１５分／２５０μｌ溶媒)。真空ポンプからの高度真空下デシケーター中で１５分間脂質を乾燥することにより、残存する溶媒を完全除去した。乾燥混合物に、１ｍｌの超高純度水を加えた。これを約５分間激しく渦状に攪拌した。生成した溶液を、澄明溶液が得られるまで超音波浴(ラボラトリー・サプライズ、インコーポレイテッド、ニューヨーク)中で音波処理にかけた。生成した懸濁液は、サイズ分布が５０〜１００ｎｍの間である単ラメラ小胞の集団を含んでいた。
【０１７９】
実施例３
アルコール注入によるカチオン小胞の調製
ガラス管(１０ｍｌ)中、３５０ｎｍカチオン脂質(セイント−２)を、３５０ｎｍｏｌのＤＯＰＥと混合し、両方を有機溶媒(クロロホルム、メタノールまたはクロロホルム／メタノール１／１)中で可溶化した。溶媒を窒素気流下で蒸発させた(室温で１５分／２５０μｌ溶媒)。高度真空下で１５分間脂質を乾燥することにより、残存する溶媒を完全除去した。次いで、これを１００μｌ純エタノール中で再構成した。
【０１８０】
実施例４
Ｖ７９−４セルラインへのベータＡＣｅｓのトランスフェクション
様々なトランスフェクション剤についてのトランスフェクション手順
全化合物をチャイニーズハムスター肺線維芽細胞ライン(Ｖ７９−４、ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ−３９)で試験した。トランスフェクションの約１７時間前(２細胞倍加)、指数的成長中の細胞をトリプシン処理し、ダルベッコ修飾イーグル培地(ライフ・テクノロジーズ、バーリントン、オンタリオ)を含み、１０％ＦＢＳ(キャン・セラ、レキサデール、オンタリオ)を補った６ウェルペトリ皿に１ウェル当たり２５００００細胞で平板培養した。トランスフェクション時点で、１ウェル当たりの細胞数を評価したところ約１００万であった。トランスフェクションするため、裸のＤＮＡへの複合体形成に関する個々の製造業者の各プロトコルに従ったが、例外として使用するトランスフェクション剤の量を変えることにより、存在するＤＮＡの異なる量およびタイプ、並びに複合体形成の異なるイオン強度を反映させた。典型的には１００万のＡＣｅｓ(８００μｌの体積で)を、広範な濃度(製造業者が示唆した最低濃度の５倍および１００倍の間)でのトランスフェクション剤と合わせた。ＡＣｅｓ／トランスフェクション混合物を、製造業者が推奨する時間、０.８ｍｌ〜１.９ｍｌの範囲の容量で複合させた。複合体形成反応に培地を加えることを推奨する製造業者もある。次いで、複合混合物を受容細胞に適用し、製造業者のプロトコルにしたがってトランスフェクションを続行させた。異なる薬剤で使用される様々な条件に関する詳細は、表１に示されている。
【０１８１】
スーパーフェクト剤についてのトランスフェクション手順
スーパーフェクトを、チャイニーズハムスター肺線維芽細胞ライン(Ｖ７９−４、ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ−３９)で試験した。トランスフェクションの約１７時間前(２細胞倍加)、指数的成長中の細胞をトリプシン処理し、ダルベッコ修飾イーグル培地(ライフ・テクノロジーズ、バーリントン、オンタリオ)を含み、１０％ＦＢＳ(キャン・セラ、レキサデール、オンタリオ)を補った６ウェルペトリ皿に１ウェル当たり２５００００細胞で平板培養した。選別バファー８００μｌ中１００万のＡＣｅｓが１０μｌのスーパーフェクト試薬と複合体形成した。複合体を室温で１０分間インキュベーションした。トランスフェクション時点で、１ウェル当たりの細胞数を評価したところ約１００万であった。培地をウェルから除去し、６００μｌのＤＭＥＭおよび１０％ＦＢＳを加えた。スーパーフェクト：ＡＣｅｓ複合体をウェルへ滴下し、３７℃で３時間インキュベーションした。インキュベーション後、トランスフェクション細胞をトリプシン処理し、２５ｍｌのＤＭＥＭおよび１０％ＦＢＳを含む１５ｃｍ皿に移し、２４時間結合させた。２４時間後、０.７ｍｇ／ｍｌのハイグロマイシンＢを含む選択培地を各ウェルに加えた。選択培地を２〜３日ごとに変えた。１０〜１２日後、コロニーを、無傷の染色体検出のためにベータ‐ガラクトシダーゼ発現および／またはＦＩＳＨについてのスクリーニングにかけた。
【０１８２】
クロモス指数の測定の適用例
約１×１０６のＶ７９−４細胞を、送達因子(すなわち、リポフェクタミン・プラスおよびリポフェクタミンまたはスーパーフェクト)と複合した１×１０６のＩｄＵｒｄ標識ＡＣｅｓによりトランスフェクションした。次いで、トランスフェクション細胞をエタノールに固定した。固定された細胞を変性させ、ＢｒｄＵ／ＩｄＵｒｄ標識核酸に特異的に結合するＦＩＴＣコンジュゲート抗体に暴露した。
【０１８３】
ＩｄＵｒｄ標識ＡＣｅｓを含むトランスフェクション細胞のパーセントを、フローサイトメトリーを用い、ＦＩＴＣ蛍光を集めて測定した。データを蓄積すると、前方散乱対緑色蛍光(ＩｄＵｒｄ−ＦＩＴＣ)を示す２変量チャンネル分布が形成された。１％が陽性領域に現れるように陰性細胞についてのゲートを設定した形で、陰性対照細胞のヒストグラムの視覚的検査により、細胞が陽性であると測定された蛍光レベルを確立した。
【０１８４】
トランスフェクションの２４時間後に回収された細胞数を、コールターカウンターを用いてアリコートを計数することにより測定した。受容セルラインの対照平板効率を測定するため、未処理細胞を、成長培地中１０ｃｍペトリ皿１枚につき６００〜１０００細胞で平板培養し、５細胞周期間または５０細胞から成る平均コロニーが形成されるまで３７℃で、５％ＣＯ２インキュベーター中で静置した。この時点で、生存し得るコロニーの数を測定した。ＣＰＥが０.１〜０.２を越える場合、処理細胞を１０００細胞で播種した。ＣＰＥが低い場合、播種密度を皿１枚当たり５０００〜５００００細胞に増加させた。
【０１８５】
実施例５
リポフェクタミンによるＬＭＴＫ(−)細胞の超音波伝達トランスフェクション
ＬＭ(ｔｋ−)細胞を、４５００ｍｇ／ＬのＤ−グルコース、Ｌ−グルタミン、ピリドキシン塩酸塩および１０％胎児ウシ血清を含むＤＭＥＭ中、３７℃、５％ＣＯ２で培養した。使用２４時間前１２ウェル皿のコーナーウェルに皿１枚当たり２０００００細胞を播種した(これは、他のウェルからの超音波からの干渉が無いことを確実にするためである)。
【０１８６】
ＧＦＰ染色体を計数することにより、１ｍｌにつき約１×１０６のＡＣｅｓが実証された。染色体を迅速に動かすことにより管中で再懸濁した。１０μｌの染色体懸濁液を除去し、等量の３０ｍｇ／ｍｌＰＩ(よう化プロピジウム)染料と混合した。染色された染色体８μｌをペトロフ・ハウサー計数チャンバーへローディングし、染色体を計数した。
【０１８７】
培地を細胞から除去し、細胞を３７℃に温めておいたＨＢＳＳ(フェノールレッド不含有、ギブコＢＲＬ)で２回洗浄した。温めておいたＨＢＳＳ５００μｌを細胞(１μｌ)の各ウェルに加え、リポフェクタミン(ギブコＢＲＬ)を各ウェルに加えた。次いで、プレートをパラフィルムテープで密閉し、室温で３０分間、２０ｒｐｍで静かに振とうした(スタッガープレート−操作の容易さのため１０分)。
【０１８８】
インキュベーション後、ウルトラサウンドゲル(アザー‐ソニック・ジェネリック超音波透過ゲル、ファーマシューティカル・イノヴェーションズ、インコーポレイテッド、ニューアーク、ニュージャージー)を、２.５ｃｍソノポレーター(sonoporator)ヘッドに適用した。超音波を、プレートの底部を通して、６０秒間、ＩｍａＲＸソノポレーター１００により２.０ワット／ｃｍ２の出力エネルギーで細胞に適用した。ウェルの超音波適用後、播種細胞(２×１０５)当たり一染色体またはシース緩衝液(１５ｎＭのトリスＨＣｌ、０.１ｍＭのＥＤＴＡ、２０ｍＭのＮａＣｌ、１％へキシレングリコール、１００ｍＭのグリシン、２０μＭのスペルミンおよび５０μＭのスペルミジン)中の２００μｌのＧＦＰ ＡＣｅｓを直ちにウェルに加えた。(超音波を必要とするプレート上の試料が全て処理されるまで反復)。次いで、プレートをパラフィルムテープで再度密閉し、室温で１時間静かに(２０ｒｐｍ)振とうした。
【０１８９】
インキュベーション後、１ｍｌ(ＤＭＥＭ、４５００ｍｇ／ＬのＤ−グルコース、Ｌ−グルタミンおよびピリドキシン塩酸塩、１０％胎児ウシ血清、および１００００単位／ｍｌのペニシリンおよび１００００ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシンからのペニシリンおよびストレプトマイシンの１×溶液、１００×ストック溶液含有)を各ウェルに加え、細胞を３７℃で１８〜２４時間インキュベーションした。
【０１９０】
次いで、プレート中の細胞を抗生物質含有培地で洗浄し、２ｍｌの培地を各ウェルに入れた。細胞をトランスフェクション／音響穿孔の４８時間後まで５％ＣＯ２、３７℃でインキュベーションし続けた。次いで、細胞をトリプシン処理し、ＤＭＥＭ中１×１０６の濃度で再懸濁し、フローサイトメトリーにより分析した。
【０１９１】
結果：ターボ‐ソートオプションおよび２つのイノーヴァ３０５レーザー(コヒーレント、パロアルト、カリフォルニア)を備えたＦＡＣＳヴァンテージ(ＢＤＩＳ、サンホセ、カリフォルニア)においてフロー分析を遂行した。ＧＦＰシグナル励起は４８８ｎｍであり、５００ｎｍロングパスフィルターを用いてＦＬ１で放射を検出した。トランスフェクション細胞の分析により、１３〜２７％の範囲に及ぶＧＦＰ陽性細胞の集団が生成された。非音響穿孔対照値は５％であった。
【０１９２】
実施例６
セイント−２による超音波伝達トランスフェクション
Ａ．セイント−２によるＣＨＯ−ＫＩ細胞の超音波伝達トランスフェクション
ＣＨＯ−ＫＩ細胞を、ＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭ２培地(ギブコＢＲＬ、ペーズリー、イギリス国)中、３７℃、５％ＣＯ２で培養した。２×１０５および５×１０５間の細胞を、使用の２４時間前１２ウェルプレートにおいて滅菌ガラススライドへ平板培養した。
【０１９３】
細胞のトランスフェクションを以下の要領で遂行した。培地を細胞から除去し、細胞を３７℃のＨＢＳＳ(フェノールレッド不含有ハンクス平衡塩溶液(ギブコＢＲＬ、イギリス国))により２回洗浄した。次いで、１ウェルにつき３７℃の５００μｌのＨＢＳＳを加えた後、１０μｌの新たに調製した小胞溶液(実施例２で調製)を加え、２３.３ｎｍｏｌ／ｍｌの最終濃度とした。
【０１９４】
別法として、培地を細胞から除去し、細胞をＨＢＳＳで２回洗浄した。３７℃のＨＢＳＳ／脂質溶液５００μｌを各ウェルに加えた。１μｌのエタノール性脂質溶液(上記要領で調製)を５００μｌのＨＢＳＳに激しく渦状に攪拌しながら加えることにより、ＨＢＳＳ／脂質溶液を調製した。次いで、プレートをパラフィルムテープで密閉し、室温で３０分間静かに振とうした。インキュベーション後、超音波を０.５ワット／ｃｍ２の出力エネルギーで６０秒間プレート底部を通して細胞に適用した。超音波は、変換器およびプレート間において超音波ゲル(アクアソニック１００、パーカー、ニュージャージー)により伝達された。超音波をＩｍａＲＸソノポレーター１００で適用した。超音波適用直後、播種細胞(２×１０５〜５×１０５)(実施例１で調製)につき一ＧＦＰ染色体を加えた。次いでプレートを再度密閉し、室温で１時間静かに振とうした。インキュベーション後、１ｍｌの培地(ＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭ２、１０％胎児ウシ血清、１００００μｇ／ｍｌペニシリンおよび１００００μｇ／ｍｌストレプトマイシン含有(ギブコＢＲＬ、ペーズリー、イギリス国))を各ウェルに加え、細胞を３７℃で２４時間インキュベーションした。次いで、細胞を培地で洗浄し、１ｍｌの培地を加え、細胞をさらに２４時間３７℃でインキュベーションした。次いで、発現された遺伝子の検出を顕微鏡により評価するかまたは導入された染色体の検出をＦＩＳＨ分析法により評価した。陰性対照試験は、染色体を細胞に加えないこと以外、同じ方法で遂行した。
【０１９５】
結果
トランスフェクション後、視覚的検査を用いると、細胞の３０％がガラススライドに残存し、そのうち１０％が４８時間後に緑色蛍光タンパク質発現について陽性であった(最初の集団の３％)。２週間培養後、ＦＩＳＨを細胞において遂行したところ、細胞の１.４％が無傷の人工染色体を含んでいた。
【０１９６】
Ｂ．セイント−２によるＨｅｐ−Ｇ２細胞の超音波伝達トランスフェクション
Ｈｅｐ−Ｇ２細胞を、４５００ｍｇ／ｌのグルコース、ピリドキシン／ＨＣｌ、１０％胎児ウシ血清、１００００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンおよび１０００μｇ／ｍｌのペニシリンを加えたＤＭＥＭ中において、３７℃、５％ＣＯ２で培養した。２×１０５および５×１０５間の細胞を、使用の２４時間前１２ウェルプレートにおいて滅菌ガラススライドへ平板培養した。
【０１９７】
ＣＨＯ−ＫＩ培地をＨｅｐ−Ｇ２培地と置き換えること以外は実施例６Ａの手順を用いて細胞をＧＦＰ染色体でトランスフェクションした。
【０１９８】
結果
トランスフェクション後、細胞の３０％がガラススライド上に残存していた。これらの細胞の８０％は、緑色蛍光タンパク質発現について陽性であった。
【０１９９】
Ｃ．セイント−２によるＡ９細胞の超音波伝達トランスフェクション
Ａ９細胞を、４５００ｍｇ／ｌのグルコース、ピリドキシン／ＨＣｌ、１０％胎児ウシ血清、１００００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンおよび１００００μｇ／ｍｌのペニシリンを加えたＤＭＥＭ(ギブコＢＲＬ、ペーズリー、イギリス国)中において、３７℃、５％ＣＯ２で培養した。２×１０５および５×１０５間の細胞を、使用の２４時間前１２ウェルプレートにおいて滅菌ガラススライドへ平板培養した。
【０２００】
ＣＨＯ−ＫＩ培地をＡ９培地と置き換えること以外は実施例６Ａの手順を用いて細胞をＧＦＰ染色体でトランスフェクションした。
【０２０１】
結果
トランスフェクション後、細胞の３０％がガラススライド上に残存しており、そのうち５０％は、緑色蛍光タンパク質発現について陽性であった。
【０２０２】
実施例７
滑膜細胞、骨格筋線維芽細胞および皮膚線維芽細胞へのＡＣｅｓの送達
米国特許第６０２５１５５および６０７７６９７号およびＰＣＴ出願公開第ＷＯ／９７４０１８３号の記載にしたがって調製された、一次ネズミ中心周囲ヘテロクロマチンを含み、リポーター遺伝子(ｌａｃＺ)およびハイグロマイシンＢ選択可能マーカー遺伝子を含む哺乳類(ネズミ)ＡＣｅｓ人工染色体(〜６０Ｍｂ)を、一次ラット線維芽細胞様滑膜細胞、ラット皮膚線維芽細胞およびラット骨格筋線維芽細胞ライン(Ｌ８細胞；ＡＴＣＣ受託番号ＣＲＬ−１７６９)へ送達した。送達前、本明細書記載の要領でＡＣｅｓをヨードデオキシウリジン(ＩｄＵｒｄ)により標識した。
【０２０３】
細胞の調製
一次線維芽細胞様滑膜細胞およびラット皮膚線維芽細胞を、標準的方法を用いてラットから入手した[例、Aupperle et al.(１９９９)J.Immunol. １６３：４２７−４３３およびAlvaro-Garcia et al.(１９９０)J.Clin.Invest.８６：１７９０]。上記方法には、げっし動物の膝から一般的には皮膚および筋肉を除去後次いで膝関節組織を細かく刻むことによる滑膜細胞の単離が含まれる。次いで、細かく刻んだ組織をコラゲナーゼとインキュベーションし、ナイロンメッシュにより濾過し、十分に洗浄する。細胞は一晩培養され得、その後の時点で、非接着細胞を除去する。接着細胞は、培養され、培養物が密集成長に達したときに一定希釈度で再平板培養することにより継代され得る。低グルコースＤＭＥＭ、１−グルタミン、ペニシリン／ストレプトマイシンおよび２０％ＦＢＳを含む培地中６ウェル皿１枚につき５００００〜７５０００細胞の割合で細胞を平板培養する。約８０％密集成長または１ウェル当たり５０００００細胞になるまで、細胞を３〜５日間３７℃の５％ＣＯ２インキュベーター中で培養した。
【０２０４】
ＡＣｅｓによる細胞のトランスフェクション
１００万のＩｄＵｒｄ標識ＡＣｅｓを、以下の要領で２、５または１０μｌのスーパーフェクト(キアゲン)またはリポフェクタミン・プラス(ライフ・テクノロジーズ；ギブコ)と複合体形成させた。スーパーフェクトとの複合体形成を室温で１０分間実施した。リポフェクタミン・プラスとの複合体形成については、指示量のプラス試薬を１００万のＡＣｅｓに加え、室温で１５分間複合体形成させた。次に、指示量のリポフェクタミンを２００μｌの低グルコースＤＭＥＭ(ＦＢＳ不含有)に加え、室温で１５分間ＡＣｅｓ／プラス試薬複合体と合わせた。次いで、複合体化ＡＣｅｓを、６００μｌの培地中の細胞に滴下した(約１.４ｍｌの最終容量)。５％ＣＯ２インキュベーター中３７℃で３時間後、総量３ｍｌの培養培地(低グルコースＤＭＥＭ、ｌ−グルタミン、ペニシリン／ストレプトマイシンおよび２０％ＦＢＳ)を加えた。２４〜４８時間後、細胞をトリプシン処理して単細胞懸濁液を形成し、遠心分離にかけることにより、上清を除去し、次いで最小限１時間冷７０％エタノールに固定した。固定細胞のアリコートを顕微鏡分析用に取っておいた。
【０２０５】
ＡＣｅｓのＦＩＴＣ−コンジュゲート抗体標識
トランスフェクション後、ＡＣｅｓを、ＢｒｄＵ−またはＩｄＵｒｄ−標識核酸に特異結合するＦＩＴＣコンジュゲート抗体で標識し、細胞をＦＩＴＣ蛍光および顕微鏡染色についてＦＡＣｓにより分析した。固定細胞を室温で３０分間２ＮのＨＣｌおよび０.５％トリトン−Ｘ中で変性させた。変性誘発後、細胞を４℃での一連の洗浄工程により中和した。バックグラウンド染色を最小にするため、試料を、最小限１５分間ＰＢＳおよび４％ＦＢＳまたはＢＳＡおよび０.１％トリトン−Ｘ(遮断緩衝液)に再懸濁した。次いで、細胞を沈澱させ、室温で２時間ＦＩＴＣコンジュゲート抗体に暴露した。細胞を遮断緩衝液で洗浄後、試料をフローサイトメトリー分析用に準備した。顕微鏡分析用試料をスライド上で乾燥し、上記染色プロトコルに従ったが、例外としてＢｒｄＵ／ＩｄＵｒｄ抗体を１／５希釈し、２４時間細胞に暴露した。
【０２０６】
結果
無傷ＡＣｅｓの送達を、トランスフェクション後２４〜４８時間以内に検出した。トランスフェクション２４時間後に回収された細胞数を、コールターカウンターを用いてアリコートを計数することにより測定した。受容セルラインの対照平板効率またはトランスフェクション細胞の平板効率を測定するため、細胞を成長培地中１０ｃｍペトリ皿１枚につき１０００〜１００００細胞の割合で平板培養し、１０日間３７℃の５％ＣＯ２インキュベーター中で静置した。その時点で、生存し得るコロニーの数を測定した。正規化平板効率を本明細書の記載にしたがって計算した。
【０２０７】
スーパーフェクトを送達因子として使用したとき、フローサイトメトリーにより測定された線維芽細胞様滑膜細胞への送達パーセントは、〜２４％から〜６６.３％の範囲であった。２μｌのスーパーフェクトを使用したとき正規化平板効率％は〜３６％であり、５μｌのスーパーフェクトを使用したとき〜１６％であった。高用量のスーパーフェクトは、低用量の場合と比べて毒性および１細胞につき多数のＡＣｅｓを伴う。リポフェクタミン・プラスを送達因子として使用したとき、フローサイトメトリーにより測定された線維芽細胞様滑膜細胞への送達パーセントは、〜１１％から〜２７％の範囲であり、因子の用量を増やすと送達パーセントは増加した。
【０２０８】
ＡＣｅｓでトランスフェクションされたＬ８およびラット皮膚線維芽細胞(ＲＳＦ)を、ハイグロマイシンＢ選択下で培養し、ｌａｃＺ発現について分析した。この実施例では、ハイグロマイシン選択遺伝子がＡＣｅｓに含まれていたが、多様な他の選択マーカー遺伝子もあり、それらは、上記遺伝子を含むことが望ましい場合に細胞への異種核酸導入に関連して使用され得る。上記選択系は、当業者には公知である。選択マーカー遺伝子の選択は、例えば、トランスフェクションについての宿主細胞に対する選択剤の毒性レベルを考慮し得る。適切な選択マーカー遺伝子の同定は、本明細書で適用されているガイダンスを用いて常用手順で行われる。
【０２０９】
ｌａｃＺを発現するＬ８細胞およびＲＳＦ細胞のクローンを同定した。これらの結果は、ＩｄＵｒｄ−標識ＡＣｅｓが一次細胞およびセルラインへ有効に送達され得ること、およびＡＣｅｓに含まれる導入遺伝子がトランスフェクションされた細胞で発現されることを立証している。
【０２１０】
実施例８
ラット関節へのリポーター遺伝子のエクスビボ導入
インビボ環境への異種遺伝子の導入および遺伝子のインビボ発現を調べるため、上記のＡＣｅｓでトランスフェクションしたＬ８細胞を、アジュバント誘発関節炎を患うラットの足関節に注射した。０日目、関節炎のアジュバント誘発をルイスラットにおいて行った。動物モデルにおけるアジュバント誘発方法は、当業界では公知である[例、Kong et al.(１９９９)Nature ４０２３：３０４−３０９]。関節炎のアジュバント誘発についてのプロトコルの一例では、ルイスラットを、０日目に０.１ｍｌ鉱油中の１ｍｇのマイコバクテリウム・ツベルクロシス(Mycobacterium tuberculosis)Ｈ３７ＲＡ(ディフコ、デトロイト、ミシガン)により尾の付け根で免疫化する。前足腫脹は、典型的には１０日目前後に始まる。
【０２１１】
１２日目、右足関節へのトランスフェクションＬ８細胞(〜０.７×１０６細胞)または非トランスフェクション対照細胞の関節内注射を実施した。１４日目、移植されたトランスフェクションＬ８細胞の存在について関節を分析するためラットを殺した。
【０２１２】
殺したラットの異なる組織を、ｌａｃＺｍＲＮＡの存在についてＲＴ−ＰＣＲ分析により調べた。全ｍＲＮＡを組織から抽出し、ｌａｃＺ遺伝子に特異的なプライマーを用いてＲＴ−ＰＣＲを遂行した。増幅産物は、他の組織(肝臓、腎臓、心臓、脾臓および肺)ではなく滑膜からのみ検出された。また、殺したラットからの滑膜を、in situ酵素的染色法、β−ｇａｌ活性に関するＸ−ｇａｌ染色法により分析した。滑膜の急速冷凍後、８μｍおよび２０μｍ断片を切断し、メイヤーのヘマトキシリンで対比染色し、細胞の青色染色について分析した。染色は、非トランスフェクション細胞を注射した滑膜ではなく、ＡＣｅｓによりトランスフェクションされたＬ８細胞を注射した滑膜から検出された。これらの結果は、マーカー遺伝子含有ＡＣｅｓを用いたラットアジュバント関節炎モデルにおける有効なエクスビボ遺伝子導入、すなわち遺伝子治療用の非ウイルスベクターとしてＡＣｅｓを用いた関節炎および他の結合組織疾患処置の可能性を立証している。
【０２１３】
実施例９
人工染色体の送達測定についてのフローサイトメトリー技術
生産セルライン(実施例１参照)を、０.１６８μｇ／ｍｌのハイグロマイシンＢ(カルビオケム、サンディエゴ、カリフォルニア)と共に１０％胎児ウシ血清(キャン・セラ、レキサデール、オンタリオ)を含むＭＥＭ培地(ギブコＢＲＬ)中で培養した。ヨードデオキシウリジンまたはブロモデオキシウリジンを、指数的成長相における生産セルライン(ＣＨＯ Ｅ４２０１９)の培養培地に直接加えた。ストックのヨードデオキシウリジンをトリス基剤ｐＨ１０中で調製し、ブロモデオキシウリジンストックをＰＢＳ中で調製した。１５分パルスで５〜５０μＭの２０〜２４時間の連続標識用に０.０５〜１μＭの最終濃度とした。２４時間後、指数的成長中の細胞を、採取前の７時間コルチシン(１.０μｇ／ｍｌ)により有糸分裂で遮断した。次いで、染色体を単離し、ヘキスト３３２５８(２.５μｇ／ｍｌ)およびクロモマイシンＡ３(５０μｇ／ｍｌ)で染色した。ＦＡＣＳヴァンテージフローサイトメーター(ベクトン・ディッキンソン・イムノサイトメトリーシステム、サンホセ、カリフォルニア)を用いて人工染色体の精製を行った。クロモマイシンＡ３を４５７ｎｍにセットした第一レーザーで励起し、４７５ｎｍロングパスフィルターを用いて放射を検出した。ヘキストを第二のＵＶレーザーにより励起し、４２０／４４ｎｍバンドパスフィルターを用いて放射を検出した。両レーザー共、出力は１５０ｍＷであった。細胞核型を示す２変量分布を各ソートから蓄積した。ＡＣｅｓを他の染色体からゲートし、選別した。凝縮剤(へキシレングリコール、スペルミンおよびスペルミジン)をシース緩衝液に加えて、選別後の凝縮した無傷染色体を維持した。選別された染色体のＩｄＵ標識指数を顕微鏡により測定した。選別した染色体のアリコート(２〜１０μｌ)を５分間０.２％ホルムアルデヒド溶液に固定した後、汚染されていない顕微鏡スライド上で乾燥した。顕微鏡試料を７０％エタノールにより固定した。風乾したスライドを室温で３０分間２ＮのＨＣｌによりコプリンジャー中で変性させ、２〜３回ＰＢＳで洗浄した。非特異的結合を、ＰＢＳおよび４％ＢＳＡまたは血清で最小限の１０分間遮断した。最終体積が６０〜１００μｌのＦＩＴＣコンジュゲートＩｄＵ／ＢｒｄＵ抗体(ベクトン・ディッキンソン)の１／５希釈物を、スライドに適用した。プラスチックストリップ、Durraシール(ダイヴァーシファイド・バイオテック、ボストン、マサチューセッツ)をスライドにかぶせ、そしてスライドを８〜２４時間加湿遮蔽箱中で４％Ｃの暗所に保った。ベクターシールド中のＤＡＰＩ(シグマ)１μｇ／ｍｌを対比染色として用いた。落射蛍光用に備えられたツァイスのアクシオプラン２顕微鏡を用いて蛍光を検出した。最小限の１００染色体を、標識％を測定するため評点した。非標識染色体を陰性対照として使用した。
【０２１４】
トランスフェクション前日、Ｖ７９−４(チャイニーズハムスター肺線維芽細胞)細胞をトリプシン処理し、４ｍｌのＤＭＥＭ(ダルベッコ修飾イーグル培地、ライフ・テクノロジーズ)および１０％ＦＢＳ(キャン・セラ、レキサデール、オンタリオ)中で６ウェルペトリ皿に２５００００個の割合で平板培養した。５０００００細胞を平板培養することにより、ＬＭ(ｔｋ−)セルラインで使用するためプロトコルを修正した。〜８００μｌの選別緩衝液中で選別された１×１０６ＡＣｅｓに、脂質またはデンドリマー試薬を加えた。プロトコル変形の例を表１に示す。染色体およびトランスフェクション剤を静かに混合した。複合体を細胞に滴下し、プレートを渦状に混合した。プレートを定められたトランスフェクションの期間５％ＣＯ２インキュベーター中で３７℃に保った。次いで、ウェル中の容量をＤＭＥＭおよび１０％ＦＢＳにより４〜５ｍｌとした。受容細胞を５％ＣＯ２インキュベーター中３７℃で２４時間放置した。トランスフェクション細胞をトリプシン化した。ＩｄＵ標識染色体送達について分析すべき試料を、冷７０％エタノール中に固定し、−２０℃で貯蔵し、ＩｄＵ抗体染色に備えた。コロニー選択用に培養する試料を計数し、次にデュプリケイトで１００００および１０００００細胞の密度で１０ｃｍ皿に導入し、残りの細胞は１５ｃｍ皿に入れた。２４時間後、０.７％ｍｇ／ｍｌハイグロマイシンＢ、＃４０００５１(カルビオケム、サンディエゴ、カリフォルニア)と共にＤＭＥＭおよび１０％ＦＢＳを含む選択培地を加える。選択培地を２〜３日ごとに取り換える。このハイグロマイシンＢ濃度は、７日間選択後に野生型細胞を殺す。１０〜１４日目に、コロニーを拡大させ、次いで、ＦＩＳＨにより無傷染色体導入についてスクリーニングし、ベータガラクトシダーゼ発現について検定した。
【０２１５】
表１：送達トランスフェクションプロトコル
【表２】
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【０２１６】
ＩｄＵ抗体標識
中和段階における何らかの修飾、変性中におけるデタージェントの存在および遮断緩衝液の組成以外は、標準ＢｒｄＵ染色フローサイトメトリープロトコル(Gratzer et al.Cytometry(１９８１)；６：３８５−３９３)を使用した。各段階間に試料を７〜１０分間３００ｇの遠心分離にかけ、上清を除去する。１００万〜２００万細胞の試料を冷７０％エタノールに固定する。次いで、細胞を室温で３０分間２ＮのＨＣＬ＋０.５％トリトンＸ１〜２ｍｌ中で変性させる。指示薬が中性になるまで試料を３〜４回冷ＤＭＥＭで洗浄する。冷ＤＭＥＭ＋５％ＦＢＳで最終洗浄する。ＰＢＳ、０.１％トリトンＸおよび４％ＦＢＳを含む遮断／透過化緩衝液を１０〜１５分間加えた後、遠心分離により試料を沈降させる。２０μｌのＩｄＵ／ＢｒｄＵ ＦＩＴＣコンジュゲートＢ４４クローン抗体(ベクトン・ディッキンソン・イムノサイトメトリー・システムズ、サンホセ、カリフォルニア)をペレットに加え、３０分ごとに攪拌しながら暗所中室温で２時間放置する。細胞を遮断／透過化緩衝液で洗浄し、フロー分析用にＰＢＳに再懸濁する。
【０２１７】
蛍光ＩｄＵｒｄ標識ＡＣｅｓのフローサイトメトリー検出
ＩｄＵ標識ＡＣｅｓを含むトランスフェクション細胞のパーセントを、アルゴンレーザーを４００ｍＷで４８８ｎｍに変えたフローサイトメトリーを用いて測定した。標準ＦＩＴＣ５３０／３０ｎｍバンドパスフィルターを通してＦＩＴＣ蛍光を集めた。細胞集団を側方散乱対前行散乱に基いてゲートすることにより、屑および二重線を排除した。データを蓄積することにより(１５０００事象)形成された２変量チャンネル分布は、前方散乱対緑色蛍光を示した(ＩｄＵ−ＦＩＴＣ)。細胞が陽性であると測定された蛍光レベルを、約１％が陽性領域に現れるように、陰性対照細胞のヒストグラムの視覚的検査により確立した。
【０２１８】
結果：
ＩｄＵ標識ＡＣｅｓのトランスフェクション送達結果を表２に示す。
表２
【表３】
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【０２１９】
修飾は当業者には容易に理解できるものであるため、この発明は添付の請求の範囲によってのみ限定されるものとする。
【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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