(57)【要約】【課題】得ることのできる脱ミネラル化骨粒子の質が、ドナーの骨の入手可能性及び骨のサイズの両者により制限されているが、これらの制限事項により課される拘束をうけない脱ミネラル化骨粒子を製造する方法の提供。【解決手段】全骨を脱ミネラル化し、その後脱ミネラル化骨を脱ミネラル化骨粒子に細別する脱ミネラル化骨粒子の製造方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
全骨を脱ミネラル化し、その後脱ミネラル化骨を脱ミネラル化骨粒子に細別することを特徴とする脱ミネラル化骨粒子の製造方法。
【請求項２】
脱ミネラル化骨粒子の収量が、全骨をミネラル化骨粒子に細別しその後ミネラル化骨粒子を脱ミネラル化して脱ミネラル化骨粒子を得ることにより得られるそれより大きい請求項１の方法。
【請求項３】
全骨が、自原、同種または異種の皮質、海綿質または皮質海綿質の骨である請求項１の方法。
【請求項４】
全骨が脱ミネラル化されて、約１０重量％より少ない残存カルシウムを含む請求項１の方法。
【請求項５】
全骨が脱ミネラル化されて、約５重量％より少ない残存カルシウムを含む請求項１の方法。
【請求項６】
全骨が脱ミネラル化されて、約１重量％より少ない残存カルシウムを含む請求項１の方法。
【請求項７】
脱ミネラル化骨の細別が、ミリングにより実施される請求項１の方法。
【請求項８】
ミリングが、衝撃ミル、グレーティングミルまたは切断ミルで実施される請求項７の方法。
【請求項９】
脱ミネラル化骨の細別が、脱ミネラル化骨に機械的圧力を適用することにより実施される請求項１の方法。
【請求項１０】
骨が、拘束されていない間加圧される請求項９の方法。
【請求項１１】
骨が拘束されている間加圧される請求項９の方法。
【請求項１２】
約１０００ｐｓｉから約４００００ｐｓｉの圧の下で実施される請求項９の方法。
【請求項１３】
約５０００ｐｓｉから約２００００ｐｓｉの圧の下で実施される請求項９の方法。
【請求項１４】
加圧の生成物が、拘束されている間追加の加圧をうける請求項１０の方法。
【請求項１５】
加圧の生成物が、追加の細別操作をうける請求項１０の方法。
【請求項１６】
全骨が、約１−約４００ｍｍの中位長さ、約０．５−約２０ｍｍの中位厚さ及び約２−約１０ｍｍの中位幅に及ぶ請求項１の方法。
【請求項１７】
全骨が、約５−約１００ｍｍの中位長さ、約２−約１０ｍｍの中位厚さ及び約２−約１０ｍｍの中位幅に及ぶ請求項１の方法。
【請求項１８】
脱ミネラル化骨粒子が細長い形態のものである請求項１の方法。
【請求項１９】
脱ミネラル化骨粒子が、約２−約３００ｍｍの中位長さ、約０．５−約１５ｍｍの中位厚さ及び／または中位幅、約２−約３５ｍｍの中位幅、並びに約２−約２００の中位長さ：厚さの比及び／または中位長さ：幅の比を有する請求項１８の方法。
【請求項２０】
脱ミネラル化骨粒子が、約５−約５０ｍｍの中位長さ、約１−約５ｍｍの中位厚さ、約２−約２０ｍｍの中位幅、及び／または約１０−約１００の中位長さ：厚さの比及び／または中位長さ：幅の比を有する請求項１８の方法。
【請求項２１】
請求項９の方法により製造されることを特徴とする脱ミネラル化骨繊維。
【請求項２２】
実質的に未処理の天然骨コラーゲン繊維。
【請求項２３】
それから繊維が得られる脱ミネラル化骨に存在するとき、繊維の長さに実質的に等しい長さを有する請求項２２の骨コラーゲン繊維。
【請求項２４】
少なくとも１つの追加の内科的／外科的に有用な物質を含む請求項２１の脱ミネラル化骨繊維。
【請求項２５】
少なくとも１つの追加の内科的／外科的に有用な物質を含む請求項２２の骨コラーゲン繊維。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、種々の整形外科の用途を有するインプラントにおいてまたはインプラントとして有用な脱ミネラル化骨粒子を製造する方法に関する。さらに特に、本発明は、これらの粒子を製造する従来の方法によりもたらさられるそれよりもはるかに多い収量で脱ミネラル化骨粒子を生成する、脱ミネラル化骨から粒子を製造する方法に関する。
【０００２】
【従来の方法】
脱ミネラル化骨粒子、並びに脱ミネラル化骨粒子を含む組成物、材料及び装置、並びに骨の欠損の修復及び他の整形外科の応用のそれらの用途は周知である。
【０００３】
皮質骨の微細構造は、長軸に平行して配向されたミネラル化コラーゲンの束または繊維からなる。脱ミネラル化骨粒子を製造する周知の方法は、例えば酸による処理により次に脱ミネラル化される粒子をもたらす、例えば切り刻み、ミリング、削り、機械処理などのような機械的操作によって全骨すなわちミネラル化骨の部分を細別することを含む。得られる脱ミネラル化骨粒子は、骨の修復及び他の整形外科の応用に使用されることを目的とするインプラントとしてまたはインプラントにおいてそれらが有用になる骨誘導性を示す。脱ミネラル化骨粒子を製造する周知の方法の欠点の１つは、骨原料の一部例えば４５−６５重量％のみが脱ミネラル化骨粒子を生成するに過ぎないことである。さらに、骨のミリングの機械の機械的な制限例えば機械のつかみに骨原料を捕まえる必要性のために、かなり実質的なサイズのドナーの骨（例えば未処理の皮質骨体）のみが、脱ミネラル化骨粒子の源として使用されるに過ぎない。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
従来法により得られる脱ミネラル化骨粒子の制限された量は、ドナーの骨の入手可能性が制限されているために、関心事である。現在、規制はドナーの骨材料の貯蔵を許可していない。得ることのできる脱ミネラル化骨粒子の質が、ドナーの骨の入手可能性及び骨のサイズの両者により制限されているため、これらの制限事項により課される拘束をうけない脱ミネラル化骨粒子を製造する方法が必要とされている。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
ドナーの骨を最適に使用する脱ミネラル化骨粒子の製造方法を提供するのが本発明の目的である。
【０００６】
従来法により得られるそれに比べて、所定の量の全骨に対するより多い収量の粒子を生ずる脱ミネラル化骨粒子の製造方法を提供するのが本発明のさらなる目的である。
【０００７】
脱ミネラル化骨原料に機械的な圧力をかけることにより骨コラーゲンの繊維または繊維状束の形で脱ミネラル化骨粒子を提供するのが本発明の他の目的である。
【０００８】
本発明の他の目的は、上記の目的及び前記の記述を考慮して当業者に明らかであろう。
【０００９】
本発明のこれらの目的及び関連する目的のために、全骨を脱ミネラル化し、次に脱ミネラル化骨を細別して脱ミネラル化骨粒子にすることからなる脱ミネラル化骨粒子を製造する方法が提供される。
【００１０】
一般に、本発明の方法により得られる脱ミネラル化骨粒子の収量は、まず全骨をミネラル化した骨粒子に細別しそしてその後になってミネラル化骨粒子を脱ミネラル化して脱ミネラル化骨粒子をもたらすことにより得られるそれよりも、顕著に多く、例えば約５−約２０重量％多い。
【００１１】
用語「粒子」は、本明細書で使用されるとき、比較的小さい骨粒子、例えば繊維、密に接触した繊維の束、撚糸、狭い片、薄いシート、チップ、破片、粉末などを含むことを目的とし、それは規則的、不規則的またはランダムな形状を有しさらに互いに完全に離れているかまたは離れていない。
【００１２】
表現「全骨」は、本明細書で使用するとき、その完全な天然のミネラル含量を含みそして解剖学的に完全な骨及びその部分を含む骨をいう。
【００１３】
用語「脱ミネラル化」は、本明細書で使用するとき、その初めのミネラル含量の約９５％より少なくミネラルを含む骨をいう。表現「完全に脱ミネラル化された」は、本明細書で使用するとき、その初めのミネラル含量の約５％より少なくミネラルを含む骨をいう。
【００１４】
用語「骨形成性」は、本明細書で使用されるとき、物質内部から生細胞の参加により新しい骨形成を誘導する材料または物質の能力をいい、そして「骨形成」は、そのメカニズムまたは結果をいうものと理解すべきである。
【００１５】
用語「骨誘導性」は、本明細書で使用されるとき、骨形成性の可能性を有する宿主から細胞を補充する材料または物資の能力及び異所性の骨を形成する能力をいい、そして「骨誘導」はそのメカニズムまたは結果をいうものと理解すべきである。
【００１６】
用語「骨伝導性」は、本明細書で使用されるとき、新しい宿主骨の成長を受容する表面をもたらす材料または物質の能力をいい、そして「骨伝導」は、そのメカニズムまたは結果をいうものと理解すべきである。
【００１７】
用語「自原」、「同種」及び「異種」は、骨組織の最終の受血者に関して本明細書で使用される。
【００１８】
本発明の脱ミネラル化骨粒子を製造するのに好適な全骨は、任意の源からのドナーの骨である。従って、自原、同種または異種の骨が使用でき、自原及び同種の骨が好ましい。異種の組織の特に有用な源は、ブタ、ウマ科またはウシ科である。骨は、皮質、海綿質または皮質海綿質である。好ましい骨は、皮質同種骨、例えば大腿骨、脛骨、腓骨、橈骨、尺骨などである。
【００１９】
本発明の方法は、種々のサイズの全骨に適用できる。そのため、原料として利用される骨は、比較的小さい片の骨からその解剖学的起源について認識できるような寸法の骨のサイズに及ぶ。一般に、全骨の原料の片または部分は、中位長さ約１−約４００ｍｍそして好ましくは約５−約１００ｍｍ、中位厚さ約０．５−約２０ｍｍそして好ましくは約２−約１０ｍｍ、そして中位幅約１−約２０ｍｍそして好ましくは約２−約１０ｍｍに及ぶ。
【００２０】
骨がドナーから得られた後、それは当業者に周知の方法を使用して処理、例えば清浄、殺菌、脱脂などをされる。骨全体は、次に脱ミネラル化されるか、または所望ならば、骨は脱ミネラル化前に部分に分けられる。骨全体またはその部分の１つ以上は、次に無機含量を低いレベル（例えば、約１０重量％より少ない、好ましくは約５重量％より少ないそしてさらに好ましくは約１重量％より少ない残存カルシウムを含む）に低下させるために、脱ミネラル化にかけられる。
【００２１】
骨の脱ミネラル化は、周知かつ従来の方法に従って達成できる。脱ミネラル化の方法は、酸溶液を使用することにより骨の無機ミネラル成分を除く。これらの方法は、当業者に周知であり、例えば本明細書に参考として引用されるＲｅｄｄｉら、「Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ  ６９」ｐｐ．１６０１−１６０５（１９７２）参照。酸溶液の濃度、骨の形状及びサイズ及び脱ミネラル化方法の時間が、脱ミネラル化の程度を決定するだろう。一般に、小さい粒子に比べて大きな骨の部分は、より長いしかも激しい脱ミネラル化を要するだろう。異なるサイズの骨の脱ミネラル化に関する特定のパラメータのガイダンスは、米国特許５８４６４８４、Ｈａｒａｋａｓ，「Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｏｒｔｈｏｐａｅｄｉｃｓ  ａｎｄ  Ｒｅｌａｔｅｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ」ｐｐ．２３９−２５１（１９８３）及びＬｅｗａｎｄｒｏｗｓｋｉら、「Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ」３１、ｐｐ．３６５−３７２（１９９６）に見いだされ、それらのそれぞれは本明細書で参考として引用される。
【００２２】
本発明の実施に有用な脱ミネラル化の方法では、骨は、酸脱ミネラル化工程を伴う脱脂／殺菌の工程にかけられる。有用な脱脂／殺菌溶液は、エタノールの水溶液であり、エタノールは、脂質に良好な溶媒でありそして水は溶液が骨粒子中にさらに深く浸透できるようにする良好な親水性の担体である。エタノールの水溶液は、また増殖性の微生物及びウイルスを殺すことにより骨を殺菌する。元来、少なくとも約１０−約４０重量％の水（すなわち、約６０−約９０重量％の脱脂剤例えばアルコール）は、脱脂／殺菌溶液に存在して、最短の時間内で最適の脂質除去及び殺菌を生じさせなければならない。脱脂溶液の有用な濃度範囲は、約６０−８５重量％のアルコールまたは約７０重量％のアルコールである。別のまたは補助的な脱脂溶液は、水中０．１−１０％の濃度の界面活性剤例えばＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００から作られる。脱脂後、骨は脱ミネラル化を行う時間酸に浸漬される。この工程で使用できる酸は、無機酸例えば塩酸及び有機酸例えば過酢酸を含む。酸の処理後、脱ミネラル化した骨は、残存量の酸を除きそれによりｐＨを上げるために、注射用の滅菌水で洗浄される。
【００２３】
脱ミネラル化後、骨を所望の形態及びサイズの脱ミネラル化骨粒子に細別する。脱ミネラル化骨の細別に有用なのは、木材、プラスチック、軟らかい金属、セラミックスなどのような固いまたは砕けやすい物質の切り刻み、ミリング、加圧、削り、機械処理、押し出し及び／または切断などの当業者に周知の機械または装置である。特に好ましいのは、衝撃ミル、グレーティングミル、せん断ミル及び切断ミルを含むミルである。脱ミネラル化された骨の細別のための好ましい装置の多くは、下層のコラーゲン繊維に平行な方向に脱ミネラル化物質を切断または分離することにより脱ミネラル化骨を細分化する。
【００２４】
脱ミネラル化骨を細別するのに使用できる木材、プラスチック、軟らかい金属のような固いまたは砕けやすい物質を切り刻み、切断に有用な装置または機械の特に好ましいタイプは、衝撃ミル、グレーティングミル、せん断ミル及び切断ミルを含む。多くの好ましい切断及びミリングの装置及び／または機械は、下層のコラーゲン繊維に平行なまたはほぼ平行な方向に脱ミネラル化物質を切断または分離することにより、脱ミネラル化骨を細分化する。ミル、プレス及び押し出し機は、この点について特に有用である。
【００２５】
衝撃ミルは、高速で動く鈍い歯のロータまたは揺れ動くハンマーを有し、そして骨に衝撃をあたえそしてそれを細分化した粒子に砕くことにより脱ミネラル化骨原料を細分化する。骨は、骨の微細構造を構成している天然のコラーゲンの束の線に沿って粉砕し勝ちである。鋭い切断ロータを有する同様なミルは、衝撃ミルにより得られる繊維状の粒子とは逆に、いくらか対称的な粒子に骨をたたき切り勝ちである。衝撃速度は、結果に影響する因子である。速度があまりに遅いと、骨は、望ましい粒子に粉砕されるよりむしろ可塑的に変形する。脱ミネラル化骨の繊維をもたらす衝撃ミルの特定のタイプまたはモデルの操作に含まれるこの因子及び同様な因子は、通常の実験を用いて最適にすることができる。
【００２６】
せん断ミルは、骨を引き裂くことにより脱ミネラル化骨原料を細分化する。引き裂く作用は、優先して骨の最も弱い点で骨を破壊し勝ちである。脱ミネラル化コラーゲンの束の間の結合は弱い点を示しそして結果は繊維のタイプの粒子の生成である。
【００２７】
旋盤のスピンドル要素は、突き出した切断要素をその円周の表面に付けた回転する粉砕の輪を有するように適合される。骨の原料が回転する輪に対して押されるとき、切断要素は、繊維タイプの粒子を生成する。このタイプの粒子形成操作では、得られる繊維状の粒子は、天然のコラーゲンの束の線に沿って分離しない。
【００２８】
本発明によって骨粒子をミリングするのに有用な他の装置は、ＩＫＡ（商標）Ｗｏｒｋｓ（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＮＣ）から入手できるミル例えばモデルＡ１０  ＩＫＡ−Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  ＭｉｌｌまたはモデルＭ  ２０  ＩＫＡ−Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｍｉｌｌを含む。これらのミルは冷却接続を有し、そして６−７ｍｍの最大粒サイズを有する固く砕けやすい物質の粉砕に好適である。ステンレス鋼の星型カッターが有用なサイズの粒子をもたらすことが確かめられた。本発明の実施に有用な他のミリング機械は、ドラムカッター骨ミル、例えばＴｒａｃｅｒ  Ｄｅｓｉｇｎ，Ｉｎｃ．（Ｓａｎｔａ  Ｐａｕｌａ，ＣＡ）例えばその骨ミルモデルＢＭ  １０００を含む。
【００２９】
脱ミネラル化骨原料を細分化する特に有効な方法は、骨を加圧することである。最も簡単な加圧技術は、圧力を拘束されていない脱ミネラル化骨に適用することである。その例は、乳鉢及び乳棒を使用して骨を加圧し、例えば回転ピンにより生ずるような回転／加圧の運動を適用するか、または平らなまたは曲線を有する板の間に骨の片を加圧することを含む。これらの平らにする圧力は、骨の繊維を分離する。ミネラル化骨から繊維を製造する従来技術の方法とは異なり、本発明により脱ミネラル化骨を加圧することは、それからそれらが得られる脱ミネラル化骨原料の繊維と同じ長さである未処理の天然の骨コラーゲン繊維（結合した短い繊維の部分から作られる複合繊維ではない）を提供する。
【００３０】
他の加圧技術は、その床または底の板に穴（または少数の穴）を有する密閉した室内に拘束された脱ミネラル化骨を機械的に加圧することを含む。分離された繊維は、穴を通して押し出され、穴の直径は、押し出された繊維の最大の直径を制限する。拘束されない加圧法によるように、この拘束された技術は、殆ど未処理（長さに関する限り）であるが分離された骨コラーゲンの束である繊維をもたらす。
【００３１】
繊維の破壊を最小にすることによりより長い繊維を生ずる非拘束／拘束の組み合わせた加圧技術では、脱ミネラル化骨は、まず拘束されない条件にある間繊維の最初に分離された塊に加圧され、次にこれらの繊維は、加圧が続けられている密封された室内に拘束される。
【００３２】
一般に、脱ミネラル化骨を加圧して脱ミネラル化骨粒子をもたらすことは、約１０００−約４００００ｐｓｉそして好ましくは約５０００−約２００００ｐｓｉで実施できる。
【００３３】
脱ミネラル化骨粒子を生成するのに使用される方法に応じて、少なくとも約８０重量％好ましくは少なくとも約９０重量％そして最も好ましくは少なくとも約９５重量％の粒子は、約２−約３００ｍｍ以上の中位長さ、好ましくは約５−約５０ｍｍの中位長さ、約０．５−約１５ｍｍの中位厚さ、好ましくは約１−約５ｍｍの中位厚さ、約２−約３５ｍｍの中位幅、好ましくは約２−約２０ｍｍの中位幅、そして約２−２００好ましくは約１０−約１００の中位長さ：厚さの比及び／または中位長さ：幅の比を有する。もし所望ならば、骨粒子の塊は、例えばふるい分けにより異なるサイズに分けるかまたは分類される及び／または存在するかも知れない任意のより小さい望ましいサイズの骨粒子は減少または排除できる。
【００３４】
この点で、それらの目的とする最終の使用に応じて、脱ミネラル化した骨粒子は、後で使用されるために、有利には凍結乾燥または冷凍の状態で、滅菌条件下で貯蔵されるか、またはそのまま利用できる。
【００３５】
本発明の脱ミネラル化骨粒子は、種々の整形外科の方法（それらが、１つ以上のメカニズム例えば骨形成、骨誘導及び骨伝導によって骨の治癒／修復の方法に参加する）に、インプラントとしてまたはインプラント中に使用される。脱ミネラル化骨粒子は、そのままで使用できるか、または種々の製品のタイプ例えばゲル、パテまたはシートに形成できる。脱ミネラル化骨粒子は、任意に、１つ以上の物質例えば接着剤、充填剤、可塑剤、可撓化剤、静菌／殺菌剤、表面活性剤、結合剤などと、望ましい形態に粒子を成形する前、その間またはその後に混合してもよい。好適な接着剤、結合剤は、アクリル樹脂、繊維素、生再吸収可能なポリマー例えばポリエステル、ポリカーボネート、ポリアクリレート及びポリホマレートを含む。特に、チルシン（ｔｙｒｓｉｎｅ）、ポリカーボネート、チロシン（ｔｙｒｏｓｉｎｅ）、ポリアクリレート、ポリグリコリド、ポリラクチド、グリコリド−ラクチドコポリマーなど。好適な充填剤は、骨粉末、脱ミネラル化骨粉末、ヒドロキシアパタイトなどを含む。好適な可塑剤及び可撓化剤は、液体ポリヒドロキシ化合物例えばグリセロール、モナセチン、ジアセチンなどを含む。好適な静菌／殺菌剤は、抗生物質、プロビドン、糖などを含む。好適な界面活性剤は、生体適合性の非イオン性、カチオン性、アニオン性及び両性の界面活性剤を含む。
【００３６】
所望ならば、脱ミネラル化骨粒子は、１つ以上の方法で変性でき、例えばそれらの蛋白含量は、米国特許４７４３２５９及び４９０２２９６（それらの内容は本明細書で参考として引用される）に記載されたように増加または変性できる。任意の種々の内科的及び／または外科的に有用な物質が、それらの形成の前、その間またはその後の何れかで、骨粒子に配合または結合できる。従って、例えば１つ以上のこれらの物質は、例えば所望の物質の１つ以上の溶液または分散物中で浸漬または吸収することにより、脱ミネラル化骨粒子中に導入できる。
【００３７】
本発明の脱ミネラル化骨粒子と容易に組み合わすことができる内科的／外科的に有用な物質は、例えばコラーゲン、不溶性コラーゲン誘導体など、並びにそのなかに溶解した可溶性の固体及び／または液体、例えば抗ウイルス剤、特にＨＩＶ及び肝炎に対して有効なもの；抗微生物剤及び／または抗生物質例えばエリスロマイシン、バシトラシン、ネオマイシン、ペニシリン、ポリミキシンＢ、テトラサイクリン、バイオマイシン、クロロマイセチン及びストレプトマイシン、セファゾリン、アンピシリン、アザクタム、トブラマイシン、クリンダマイシン及びゲンタマイシンなど；殺生物／静生物糖例えばデキストロース、グルコースなど；アミノ酸、ペプチド、ビタミン、無機元素、蛋白合成用の共因子；ホルモン；内因性組織または組織フラグメント；合成剤；酵素例えばコラーゲナーゼ、ペプチダーゼなど；フラグメントとのポリマー細胞骨格；合成剤；酵素例えばコラーゲナーゼ、ペプチダーゼ、オキシダーゼなど；実質性細胞とのポリマー細胞骨格；血管原性医薬及びこれらの医薬を含むポリマー性担体；コラーゲンラチス；抗原性剤；細胞骨格剤；軟骨フラグメント；生細胞例えば軟骨細胞、骨髄細胞、間葉幹細胞、天然抽出物、組織移植物、骨、脱ミネラル化骨粉末、自原性組織例えば血液、血清、軟組織、骨髄など；生接着剤、骨形態発生蛋白（ＢＭＰ）、トランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ−ベータ）、インスリン様成長因子（ＩＧＦ−１）（ＩＧＦ−２）；血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）；成長ホルモン例えばソマトトロピン；骨消化物；抗腫瘍剤；免疫抑制剤；浸透増加剤例えば脂肪酸エステル例えばポリエチレングリコールのラウレート、ミリステート及びステアレートモノエステル、エナミン誘導体、アルファ−ケトアルデヒドなど；及び核酸を含む。これらの任意に添加できる物質の量は、広く変化でき、最適のレベルは、通常の実験により特定の場合について容易に決定される。
【００３８】
本発明の方法は、実施例によりより良く理解されるだろう。本明細書を通した場合、すべての部は、他に特定されていない限り、重量による。実施例は、本発明を説明するための手段として提供され、そして本発明を決して制限するものではない。
【００３９】
実施例  １
ヒトのドナーの起源の右骨幹（９９ｇ）を４つの部分に長さ方向に分割した。すべての部分の全重量は９４ｇであった。骨の部分を、１４１０ｍＬの０．６Ｎ  ＨＣｌ溶液とともに２Ｌ容の容器に入れた。約６時間後、溶液を除き、他の１４１０ｍＬ部分の酸溶液を再注入した。骨の部分及び酸溶液の第二の部分を、２日間磁気撹拌器により緩やかな撹拌をした。骨の部分を、実質的な脱ミネラル化を示すそれらがすべての肉眼で見えるミネラル化領域なしに完全に透明になるまで、脱ミネラル化した。脱ミネラル化骨の部分を次に洗浄した水のｐＨが４．０以上になるまで水により洗浄した。脱ミネラル化骨の部分を次に１時間７０％エタノール中で浸漬した。脱ミネラル化骨の部分をはさみにより切断して、モデルＭ  ２０  ＩＫＡ−Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｍｉｌｌ中に適合させそしてミル中で３０秒間処理して繊維の形の脱ミネラル化骨粒子を生成した（収量１７．９ｇ、１１０ｃｃ）。繊維を次に約１２−１５時間冷凍し凍結乾燥した。
【００４０】
比較例
１１９ｇのミネラル化ヒドドナーの骨を米国特許５６０７２６９に記載されたミリング機械で粉砕して繊維の形のミネラル化骨粒子を得た。ミネラル化繊維を次に下記の脱ミネラル化工程にかけた。同種皮質骨を反応器に入れる。骨１ｇあたり１５ｍＬでＨＣｌの０．６Ｎ溶液を反応器に導入し、脱ミネラル化反応を１−２時間行う。ＨＣｌを除いた後、骨を０．６Ｎ  ＨＣｌ／２０ｐｐｍ−２０００ｐｐｍ非イオン性界面活性剤の溶液で２４−４８時間カバーする。ＨＣｌ／界面活性剤の溶液を除いた後、骨１ｇあたり１５ｍＬで０．６Ｎ  ＨＣｌを反応器に導入し、脱ミネラル化反応をさらに４０−５０分間続け、原料皮質骨の実質的に完全な脱ミネラル化を行う。ふるいを通して脱液した後、脱ミネラル化骨を、１５分間の間隔で置かれた注射用水により骨重量１ｇあたり１５ｍＬで注射用水で３回洗う。注射用水の脱水後、脱ミネラル化骨をアルコールで覆い、少なくとも３０分間浸漬させる。アルコールを次に除き、そして骨を注射用水で洗う。脱ミネラル化骨を次に米国特許５６０７２６９の骨ミリング装置で細分化して、繊維の形態の脱ミネラル化骨粒子の塊を得る。脱ミネラル化骨要素を次に脱水し、そして凍結乾燥のトレイに移しそして少なくとも６時間−７０℃で冷凍する。脱ミネラル化骨粒子を次に２４−４８時間標準の方法に従って凍結乾燥する。乾燥後、脱ミネラル化骨粒子をサイズについて分類する。乾燥前に測定した、この方法に従って製造された実質的に完全に脱ミネラル化した骨粒子の収量は、１５．２７ｇ、７５ｃｃであった。
【００４１】
以下の表は、本発明を表す実施例１の方法と比較例で表された従来の方法との間の収量を比較する。
【００４２】
2004515318.tif 000002
【００４３】
これらのデータが示すように、本発明の方法（全骨の脱ミネラル化が脱ミネラル化骨粒子へのその細分化を行う（実施例１））は、従来技術の方法（脱ミネラル化が全骨がミネラル化骨粒子へ細分化された後にのみ行われる（比較例））から生ずるそれより殆ど５０重量％さらに有用な製品を生成した。
【００４４】
実施例  ２
長さ約２５ｍｍの実質的に完全に脱ミネラル化した腓骨の断面の部分を、最初に５００ｐｓｉから約２００００ｐｓｉに及ぶ圧力でＣａｒｖｅｒプレスの２枚の平らな板の間で加圧した。この初めの加圧操作は、骨の部分を平らにし、そしてそれらのコラーゲンの束を繊維に分離し始めた。この材料を次に「けば立たせ」、そして前記と同様な圧力を使用して再び加圧した。加圧操作を再び繰り返して、互いに完全に分離しない繊維の粗い束の塊を得た。繊維の収率は、原料脱ミネラル化骨の部分の体積に基づいて約５０重量％であり、繊維の多くは、骨原料の天然の繊維と殆ど同じ長さを有した。繊維は、１０−１５ｍｍの長さを有し、いくらかの繊維は２０−２５ｍｍの範囲にあり、そして約２ｍｍの直径を有した。繊維の形ではない物質が、束の繊維の塊に残った。
【００４５】
繊維は、３０秒間衝撃ミルでさらに細分化されて、繊維及び繊維の束の多くの直径を減少させるが、しかし、それらの長さを顕著に減少させなかった。それゆえ、繊維は、前記の範囲の長さ内に入り続けたが、それらの直径は約０．５−約２ｍｍの範囲内にあるようになった。
【００４６】
実施例  ３
長さ約２５ｍｍの脱ミネラル化腓骨断面の部分を、それぞれ１、２及び３ｍｍの直径を有する単一のオリフィスをそれらの底に有する直径２９ｍｍの一連のプレスセルに入れた。５０００−１００００ｐｓｉの圧力の下、脱ミネラル化骨の部分を、オリフィスを通して押し出される繊維に細分化した。脱ミネラル化繊維の収率は、殆どのすべての場合に殆ど１００重量％のオーダーであり、セル中に殆どまたは全く残存しなかった。
【００４７】
実施例  ４
実施例４のそれに類似のセル加圧方法を、直径０．７５ｍｍの単一のオリフィスを有する直径２９ｍｍのプレスセル中で長さ４−８ｍｍの脱ミネラル化骨の部分で実施した。５０００−１００００ｐｓｉのプレス負荷で、骨部分は、それらから繊維が得られる骨部分の長さの２５−５０％の長さに及ぶ繊維に細分化された。繊維の収率は、約５０重量％であった。繊維の長さは約１−５ｍｍに及び、そして約０．５ｍｍの直径を有した。
【００４８】
実施例  ５
長さ約２５ｍｍの実質的に完全に脱ミネラル化した腓骨の断面の部分を、実施例４に記載したプレスセルで加圧した。５０００−１００００ｐｓｉに及ぶ圧力で、骨の部分は、以下の表に示される直径を有する繊維に細分化された。
【００４９】
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【００５０】
実施例  ６
実施例５に記載された加圧操作を実質的に繰り返したが、１５０００ｐｓｉでＣａｒｖｅｒプレスで実施された予備的加圧を先に行った。得られる脱ミネラル化骨繊維は、より小さい直径を有し、そのため、実施例５で得られる繊維よりもより大きい長さ：直径の比を有した。
【００５１】
実施例  ７
実質的に完全に脱ミネラル化した全腓骨の骨幹を、Ｔｒａｃｅｒ（回転グレーター）ミルを使用して繊維状粒子に細分化した。繊維の長さは約５ｍｍであり、直径は約０．５ｍｍであり、そして繊維の収率は約７０重量％であった。
【００５２】
実施例  ８
実施例７を繰り返したが、但し長さ４−８ｍｍの腓骨の部分を使用した。繊維の長さは約３−５ｍｍであり、直径は約０．５ｍｍでありそして繊維の収率は約５０重量％であった。
【００５３】
実施例  ９
モデルＭ５Ａ  Ｆｉｔｚｐａｔｒｉｃｋ  Ｍｉｌｌを使用して、４−１０ｍｍの実質的に完全に脱ミネラル化したウシの骨のチップを、約１−２ｍｍの長さ及び約０．２−０．７ｍｍの直径を有する繊維状粒子に約７０重量％の収率で細分化した。
【００５４】
実施例  １０
実施例９を繰り返したが、但しモデルＭ  ２０  ＩＫＡ−Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｍｉｌｌを使用して、脱ミネラル化ウシチップを細分化した。ミルにより生成した繊維フラクションの繊維は、約１−２ｍｍの長さ、約０．５−１ｍｍの直径を有し、そして繊維の収率は約１０％であった。
【００５５】
実施例  １１
実施例９を繰り返したが、但しＭｅｇａｔｒｏｎホモゲナイザー（Ｇｌｅｎ  Ｍｉｌｌｓ  Ｉｎｃ．，Ｍａｙｗｏｏｄ，ＮＪ）を使用した。得られた繊維は、約７０重量％の収率であり、約１−３ｍｍの長さ及び約０．２−０．５ｍｍの直径を有した。
【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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