(57)【要約】グルカンの製造方法。第１の方法は、スクロース、プライマー、無機リン酸またはグルコース−１−リン酸、スクロースホスホリラーゼ、およびグルカンホスホリラーゼを含む反応溶液を反応させて、グルカンを生産する工程を包含し、ここで反応開始時から反応終了時までの間の該反応溶液のスクロース−リン酸比率の最大値は約１７以下である。第２の方法は、スクロース、プライマー、無機リン酸またはグルコース−１−リン酸、スクロースホスホリラーゼ、およびグルカンホスホリラーゼを含む反応溶液を反応させて、グルカンを生産する工程を包含し、ここで該反応は、約４０℃〜約７０℃の温度で行われる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
グルカンの製造方法であって、
スクロース、プライマー、無機リン酸またはグルコース−１−リン酸、スクロースホスホリラーゼ、およびグルカンホスホリラーゼを含む反応溶液を反応させて、グルカンを生産する工程を包含し、ここで反応開始時から反応終了時までの間の該反応溶液のスクロース−リン酸比率の最大値が約１７以下である、方法。
【請求項２】
前記最大値が約０．５以上約１５以下である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記最大値が約１以上約１０以下である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記最大値が約２以上約７以下である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記グルカンが、アミロースである、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記スクロースホスホリラーゼが、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属に属する細菌由来である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記スクロースホスホリラーゼが、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、およびＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｉｔｉｓからなる群より選択されるＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓに属する細菌由来である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記グルカンホスホリラーゼが、植物由来である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記グルカンホスホリラーゼが、藻類由来である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記グルカンホスホリラーゼが、馬鈴薯由来である、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記グルカンホスホリラーゼが、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ由来である、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記グルカンホスホリラーゼが、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来である、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記スクロースホスホリラーゼおよびグルカンホスホリラーゼの両方、もしくは少なくとも一方が、遺伝子組換えされた微生物により生産される、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記スクロースホスホリラーゼおよびグルカンホスホリラーゼの両方、もしくは少なくとも一方が、担体上に固定化されている、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記プライマーが、マルトオリゴ糖、アミロース、アミロペクチン、グリコーゲン、デキストリン、プルラン、カップリングシュガー、澱粉、およびこれらの誘導体からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記マルトオリゴ糖が、マルトオリゴ糖混合物である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記マルトオリゴ糖混合物が、マルトテトラオースの重合度以上の重合度のマルトオリゴ糖に加えて、マルトトリオース、マルトースおよびグルコースのうちの少なくとも１つを含有する、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記澱粉が、可溶性澱粉、ワキシー澱粉、ハイアミロース澱粉、澱粉枝切り酵素分解物、澱粉ホスホリラーゼ分解物、澱粉部分加水分解物、化工澱粉、およびこれらの誘導体からなる群から選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
請求項１に記載の方法であって、生産されたグルカンを、有機溶媒を利用せずに精製する工程をさらに包含する、方法。
【請求項２０】
請求項１に記載の方法であって、前記反応後の反応溶液を冷却することにより前記グルカンを沈澱させる工程、および該沈澱したグルカンを固液分離方法により精製する工程をさらに含む、方法。
【請求項２１】
請求項１に記載の方法であって、さらに
前記グルカン生産反応の間もしくはグルカン生産反応後に前記反応溶液を冷却してグルカンをゲル化する工程、
ゲル化したグルカンを回収する工程、および
該ゲル化したグルカンから、フルクトースを、水による洗浄、凍結融解、ろ過、圧搾、吸引および遠心分離からなる群より選択される操作によって除去する工程を含む、方法。
【請求項２２】
請求項１に記載の方法であって、さらに、前記グルカン生産反応後、水に溶解しているグルカンを沈澱させずに、限外ろ過膜を用いた膜分画もしくはクロマトグラフィーに供してフルクトースを除去する工程を含む、方法。
【請求項２３】
請求項１に記載の方法であって、前記反応溶液中にさらに、枝切り酵素、ブランチングエンザイム、４−α−グルカノトランスフェラーゼおよびグリコーゲンデブランチングエンザイムからなる群より選択される酵素を含む、方法。
【請求項２４】
グルカンの製造方法であって、
スクロース、プライマー、無機リン酸またはグルコース−１−リン酸、スクロースホスホリラーゼ、およびグルカンホスホリラーゼを含む反応溶液を反応させて、グルカンを生産する工程を包含し、ここで該反応が、約４０℃〜約７０℃の温度で行われる、方法。
【請求項２５】
前記反応温度が、約４５℃〜約６５℃である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
反応開始時の前記反応溶液中のスクロースの濃度が約５〜約１００％である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
反応開始時の前記反応溶液中のスクロースの濃度が約８〜約８０％である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
反応開始時の前記反応溶液中のスクロースの濃度が約１５〜約５０％である、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記グルカンが、アミロースである、請求項２４に記載の方法。
【請求項３０】
前記スクロースホスホリラーゼが、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属に属する細菌由来である、請求項２４に記載の方法。
【請求項３１】
前記スクロースホスホリラーゼが、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、およびＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｉｔｉｓからなる群より選択されるＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓに属する細菌由来である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記グルカンホスホリラーゼが、植物由来である、請求項２４に記載の方法。
【請求項３３】
前記グルカンホスホリラーゼが、藻類由来である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記グルカンホスホリラーゼが、馬鈴薯由来である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３５】
前記グルカンホスホリラーゼが、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ由来である、請求項２４に記載の方法。
【請求項３６】
前記グルカンホスホリラーゼが、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来である、請求項２４に記載の方法。
【請求項３７】
前記スクロースホスホリラーゼおよびグルカンホスホリラーゼの両方、もしくは少なくとも一方が、遺伝子組換えされた微生物により生産される、請求項２４に記載の方法。
【請求項３８】
前記スクロースホスホリラーゼおよびグルカンホスホリラーゼの両方、もしくは少なくとも一方が、担体上に固定化されている、請求項２４に記載の方法。
【請求項３９】
前記プライマーが、マルトオリゴ糖、アミロース、アミロペクチン、グリコーゲン、デキストリン、プルラン、カップリングシュガー、澱粉、およびこれらの誘導体からなる群から選択される、請求項２４に記載の方法。
【請求項４０】
前記マルトオリゴ糖が、マルトオリゴ糖混合物である、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記マルトオリゴ糖混合物が、マルトテトラオースの重合度以上の重合度のマルトオリゴ糖に加えて、マルトトリオース、マルトースおよびグルコースのうちの少なくとも１つを含有する、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記澱粉が、可溶性澱粉、ワキシー澱粉、ハイアミロース澱粉、澱粉枝切り酵素分解物、澱粉ホスホリラーゼ分解物、澱粉部分加水分解物、化工澱粉、およびこれらの誘導体からなる群から選択される、請求項３９に記載の方法。
【請求項４３】
請求項２４に記載の方法であって、生産されたグルカンを、有機溶媒を利用せずに精製する工程をさらに包含する、方法。
【請求項４４】
請求項２４に記載の方法であって、前記反応後の反応溶液を冷却することにより前記グルカンを沈澱させる工程、および該沈澱したグルカンを固液分離方法により精製する工程をさらに含む、方法。
【請求項４５】
請求項２４に記載の方法であって、さらに
前記グルカン生産反応の間もしくはグルカン生産反応後に前記反応溶液を冷却してグルカンをゲル化する工程、
ゲル化したグルカンを回収する工程、および
該ゲル化したグルカンから、フルクトースを、水による洗浄、凍結融解、ろ過、圧搾、吸引および遠心分離からなる群より選択される操作によって除去する工程を含む、方法。
【請求項４６】
請求項２４に記載の方法であって、さらに、前記グルカン生産反応後、水に溶解しているグルカンを沈澱させずに、限外ろ過膜を用いた膜分画もしくはクロマトグラフィーに供してフルクトースを除去する工程を含む、方法。
【請求項４７】
請求項２４に記載の方法であって、前記反応溶液中にさらに、枝切り酵素、ブランチングエンザイム、４−α−グルカノトランスフェラーゼおよびグリコーゲンデブランチングエンザイムからなる群より選択される酵素を含む、方法。
【請求項４８】
グルカンの製造方法であって、
スクロース、プライマー、無機リン酸またはグルコース−１−リン酸、スクロースホスホリラーゼ、およびグルカンホスホリラーゼを含む反応溶液を反応させて、グルカンを生産する工程を包含し、ここで反応開始時から反応終了時までの間の該反応溶液のスクロース−リン酸比率の最大値が約１７以下であり、該反応が、約４０℃〜約７０℃の温度で行われる、方法。
【請求項４９】
請求項１に記載の方法で製造される、グルカン。
【請求項５０】
請求項２４に記載の方法で製造される、グルカン。
【請求項５１】
グルカンの製造方法であって、
スクロース、プライマー、無機リン酸またはグルコース−１−リン酸、スクロースホスホリラーゼ、およびグルカンホスホリラーゼを含む反応溶液を反応させて、グルカンを生産する工程を包含し、ここで反応開始時の該反応溶液のスクロース−リン酸比率が約１７以下である、方法。
【請求項５２】
前記反応が、約４０℃〜約７０℃の温度で行われる、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
グルカンの製造方法であって、
スクロース、プライマー、無機リン酸またはグルコース−１−リン酸、スクロースホスホリラーゼ、およびグルカンホスホリラーゼを含む反応溶液で反応を開始させる工程；スクロース、無機リン酸またはグルコース−１−リン酸を該反応溶液に追加する工程；ならびにさらに反応を続けてグルカンを生産する工程を包含し、ここで該追加工程完了時の該反応溶液のスクロース−リン酸比率が約１７以下である、方法。
【請求項５４】
前記反応が、約４０℃〜約７０℃の温度で行われる、請求項５３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、グルカンおよびその誘導体の製造方法に関する。更に詳しくは、α−１，４−グルカン鎖の伸長方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
グルカンは、Ｄ−グルコースのみを構成糖とする多糖の総称である。代表的なグルカンの例としては、澱粉、セルロースなどが挙げられる。澱粉は、構成糖がα−グルコシド結合によって連結されるα−グルカンである。澱粉中には、直鎖状α−１，４−グルカンであるアミロースと、枝分かれ構造を持つアミロペクチンとが存在している。アミロースとアミロペクチンとの存在比は、澱粉を貯蔵する植物体によって異なる。そのため、アミロースとアミロペクチンとを任意の構成比で含む澱粉を得ることは極めて困難である。アミロースを安定的に製造できれば、これを市販の澱粉と混合させることで任意のアミロース含量を持つ澱粉を作り出すことができる。
【０００３】
任意の構造を持つアミロースおよびアミロペクチンを作り出すことは、従来、加水分解酵素、転移酵素などの作用を利用して行なわれている。しかし、α−１，４−グルカン鎖を伸長することによる、澱粉の構造改変についての報告は限られている。α−１，４−グルカン鎖を効率的に伸長する方法を開発することは、アミロースを製造できるだけでなく、澱粉の構造を任意に変えられるという点で有益である。
【０００４】
澱粉含有食品において澱粉中のアミロースの含有量および構造は、食品の物性に大きな影響をもたらすことが知られている。しかし、澱粉中のアミロースの含有量および構造は、原料として利用する澱粉によって決定される。アミロースの含有量、構造を任意に変えることができれば、新しい食感を持つ食品の開発が期待できる。
【０００５】
不溶性のアミロースには、食物繊維と同様の働きが予想され、健康食品への利用も期待できる。さらに、アミロースは、例えばヨウ素、脂肪酸などを分子内に包接し得る特徴を持つことから、医薬品、化粧品、サニタリー製品分野での用途が期待される。アミロースはまた、アミロースと同様の包接能力を持つシクロデキストリンおよびシクロアミロースの製造用原料に利用できる。さらに、アミロースを含有したフィルムは、汎用プラスチックに劣らない引張強度を持ち、生分解性プラスチックの素材として非常に有望である。このようにアミロースには、多くの用途が期待されている。しかし、実質的に純粋なアミロースは得ることが困難であり、非常に高価であるので、試薬レベルで流通しているだけであり、産業用素材としてはほとんど利用されていない。そのため、安定的かつ安価にアミロースを製造する方法が望まれている。
【０００６】
アミロースの製造方法はいくつか公知である。アミロースは、澱粉中におよそ０〜７０％の割合で存在している。Ｔ．Ｊ．Ｓｃｈｏｃｈら、Ｊ．Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ，６４，２９５７（１９４２）の方法により、ブタノールなどの沈澱剤を用いて、天然素材である澱粉中からアミロースを抽出することが可能である。しかし、この抽出操作は煩雑で収率も低い。またこの抽出操作によって、α−１，６−グルコシド結合を全く含まない直鎖状グルカンを得ることは困難である。さらに分子量分布の狭い直鎖状グルカンの抽出は困難である。
【０００７】
酵素的にα−１，４−グルカン鎖を伸長する方法として、糖ヌクレオチドを基質として使用し、グリコーゲンシンターゼ、スターチシンターゼなどにより、糖部分を、プライマーであるマルトテトラオースなどに転移することで合成する方法がある。しかし、この方法は、基質として使用される糖ヌクレオチドは非常に高価であり工業的には利用できないという欠点がある。
【０００８】
馬鈴薯由来のグルカンホスホリラーゼ（Ｇｌｕｃａｎ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｓｅ：ＧＰ）により、α−グルコース−１−リン酸（ａｌｐｈａ−ｇｌｕｃｏｓｅ−１−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）のグルコシル基をプライマーであるマルトヘプタオースなどに転移することでα−１，４−グルカン鎖を合成する方法がある。
【０００９】
他にも、グルコース−１−フルオライドを基質として使用して、プライマーにスクロースホスホリラーゼ（Ｓｕｃｒｏｓｅ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｓｅ：ＳＰ）とグルカンホスホリラーゼとを同時に作用させる方法が公開されている（米国特許第５，４０５，４４９号およびＥＰ０５９０７３６）。
【００１０】
これらの合成方法には、反応開始時の反応溶液中の基質とプライマーとの比を任意に設定することにより、得られる直鎖状グルカンの分子量を制御できるという利点がある。しかし、基質であるα−グルコース−１−リン酸、およびグルコース−１−フルオライドは高価であるので、広範囲の産業で利用し得るような安価な直鎖状α−１，４−グルカンの製造には適切でない。
【００１１】
より安価に直鎖状グルカンを製造する方法としては、スクロースとプライマーにスクロースホスホリラーゼとグルカンホスホリラーゼを同時に作用させる方法（以下、ＳＰ−ＧＰ法という）が公開されている（Ｗａｌｄｍａｎｎ，Ｈ．ら，Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１５７（１９８６）ｃ４−ｃ７）。Ｗａｌｄｍａｎｎらは、ロイコノストック属（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｒｏｉｄｅｓ）由来のスクロースホスホリラーゼと馬鈴薯塊茎由来のグルカンホスホリラーゼを用いてスクロースから高収率で直鎖状グルカンを合成している。ＷａｌｄｍａｎｎらのＳＰ−ＧＰ法は、安価な基質を用いて直鎖状グルカンを製造できるという点で有望であるが、以下に示すように改善すべき問題点がいくつかある。
【００１２】
まず第１に、使用している酵素量が多いので、製造にかかるコストが高くなり安価に製造できないことである。この問題解決のためには、反応条件を工夫することにより、使用酵素量を削減するか、もしくは単位酵素あたりのアミロース生産性を高めることが必要になる。
【００１３】
ＳＰ−ＧＰ法において使用酵素量、もしくは酵素あたりのアミロース生産性を決定する要因の１つとして、反応開始時の溶液中での、ＳＰの基質であるスクロースの濃度に対する無機リン酸（ｉｎｏｒｇａｎｉｃ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）の濃度比が挙げられる。Ｗａｌｄｍａｎｎらの先行技術では反応開始時の溶液中で、スクロース濃度に比較して、かなり低濃度の無機リン酸を用いることにより、高い収率でグルカンを製造している。スクロースをまずグルコース−１−リン酸へと転換し、次いでグルコース−１−リン酸をグルカンへと転換するＳＰ−ＧＰ法では、高濃度の無機リン酸を用いると、中間体であるグルコース−１−リン酸が高濃度で蓄積される。そのため、最終産物であるグルカンの収率が低下すると考えられる。それゆえ、従来のＳＰ−ＧＰ法では、低い無機リン酸濃度が採用されたと考えられる。本発明の前には、反応開始時の溶液中のスクロースと無機リン酸との濃度比を変えることが、使用酵素量、もしくは酵素あたりのアミロース生産性にどのような影響を与えるかについては、開示されておらず、その効果を予測することも出来なかった。
【００１４】
ＳＰ−ＧＰ法と同様に２種類のホスホリラーゼを組み合わせてかつ無機リン酸を媒介として糖質を合成する方法が報告されている。例えば、Ｃｈａｅｎら（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，９２（２００１）１７７−１８２）は、マルトースホスホリラーゼとコージビオースホスホリラーゼとを組み合わせて用いて、マルトースからコージオリゴ糖を合成する方法を開示している。Ｃｈａｅｎらは、反応開始時の溶液中の無機リン酸濃度が低い方が反応産物であるコージオリゴ糖の収率が高いと記載している。このように、従来、２つのホスホリラーゼを組み合わせる反応系では、最終産物の収量を増やすためには反応開始時の溶液中の無機リン酸濃度を低くすることが好ましいと考えられていた。
【００１５】
ＳＰ−ＧＰ法において使用酵素量、もしくは酵素あたりのアミロース生産性を決定する要因の２つ目は、反応温度である。一般的に酵素反応は高温で行うほど、反応速度が上昇するため、高温条件下で行うことが望まれる。しかしながら、酵素タンパク質は加熱に対して不安定であるため、実際の酵素反応は、その酵素タンパク質が熱失活しない温度範囲で行われる。Ｗａｌｄｍａｎｎらの先行技術においては、ロイコノストック属由来のスクロースホスホリラーゼが用いられており、グルカン合成反応はこの酵素の熱安定性を考慮して、３７℃で行われていた。本発明の前には、本反応溶液中のスクロース濃度を変化させることがスクロースホスホリラーゼの安定性にどのような影響を与えるかについては、開示されておらず、その効果を予測することは出来なかった。また、ストレプトコッカス属由来のスクロースホスホリラーゼの熱安定性については何ら開示されておらず、それゆえ、このスクロースホスホリラーゼをグルカン合成に利用することによる効果を予測することは出来なかった。
【００１６】
第二の問題点としては、操作性の問題がある。グルカン、特にアミロースは老化して不溶化し、沈澱またはゲルを形成する。この老化速度は、温度に依存することが周知である。反応温度が低い場合には、製造後のアミロース溶液がゲル化するなど、その後の段階で操作性に問題が生じる。したがって、反応温度は可能な限り高い方が望ましい。しかし、Ｗａｌｄｍａｎｎらの先行技術においてはアミロースを製造する際の反応温度は３７℃と低く問題がある。
【００１７】
グルカンのうち、特に分岐構造のない直鎖状アミロースを製造する場合、使用するプライマーには、直鎖マルトオリゴ糖を用いる必要がある。Ｗａｌｄｍａｎｎらの先行技術では、直鎖マルトオリゴ糖として精製マルトヘプタオースが利用されている。しかし、精製マルトヘプタオースは、試薬レベルのものしかなく非常に高価である。安価なプライマーの候補としては、澱粉を適度に加水分解したマルトオリゴ糖混合物がある。しかしながら、多くのグルカンホスホリラーゼは、マルトテトラオースの重合度以上の重合度のマルトオリゴ糖のみをプライマーとして利用することが出来るが、マルトトライオースの重合度以下の重合度のマルトオリゴ糖をプライマーには利用し得ないことが公知である。マルトオリゴ糖混合物には、プライマーとして機能しうるマルトヘキサオースの重合度以上の重合度のマルトオリゴ糖に加えて、プライマーとして機能し得ないマルトトライオース、マルトースおよびグルコースが含まれている。また、マルトオリゴ糖混合物に含まれるグルコースは、スクロースホスホリラーゼの阻害物質であることが公知である。このように、プライマーとして機能し得ないマルトトライオース、マルトースおよびグルコースを含有し、かつスクロースホスホリラーゼの阻害物質であるグルコースを含有するマルトオリゴ糖混合物が、ＳＰ−ＧＰ法において、有効に機能しうるかどうかについては、本発明の前には開示されておらず、その有効性は容易に推測できなかった。
【００１８】
本発明の方法の場合、酵素反応終了時の反応溶液には、グルカンとともに多量のフルクトースが副生する。従って本発明の方法を用いる工業的グルカン製造の場合、グルカン合成反応工程後に効率的にグルカンを精製する工程が必須である。Ｗａｌｄｍａｎｎらの先行技術では、アミロースを精製する際に、ブタノールによるアミロースの選択的沈澱法を利用している。しかしながら、アミロースを工業的に大量生産する際には、有機溶媒を利用する方法は、コスト的にも、人体への安全性でも、環境面でも、優れた方法ではない。有機溶媒を利用しない方法については開示されていない。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１９】
本発明は、上記問題点の解決を意図するものであり、従来法よりも実用的な条件で、安定的かつ安価に、グルカン、特にアミロースを製造する方法を提供することを目的とする。さらに詳しくは、スクロースからアミロースを製造する際に、必要な酵素量を極力抑える方法、より高い温度での反応を実現する方法を提供することを目的とする。
【００２０】
本発明はまた、製造されたアミロース溶液から、アミロースを有機溶媒を使用することなく効率的に精製することも目的とする。
【００２１】
本発明者らは、上記の課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、反応開始時から反応終了までの間の（スクロースのモル濃度）と（無機リン酸のモル濃度およびグルコース−１−リン酸のモル濃度の合計）との比の最大値をある範囲内に設定することで、従来の方法に比べ高い生産性が得られることを最終的に見出し、これに基づいて本発明を完成させた。
【００２２】
本発明者らはまた、ある濃度以上のスクロースの存在下において、スクロースホスホリラーゼの耐熱性が上昇し、反応温度を上昇させることが可能であること、その結果、必要酵素量を減少させることが可能であること、もしくは単位酵素あたりのグルカン生産性を高めることが可能であること、さらに高温で反応を行うためアミロースを老化させることなく生産可能であることを見出し、これに基づいて本発明を完成させた。
【００２３】
本発明者らはまた、ストレプトコッカス属由来のスクロースホスホリラーゼを利用することにより、反応温度を上昇させることが可能であること、その結果、必要酵素量を減少させることが可能であるか、もしくは単位酵素あたりのグルカン生産性を高めることが可能であること、さらに高温で反応が行われるためアミロースを老化させることなく生産可能であることを見出し、これに基づいて本発明を完成させた。
【００２４】
本発明者らはまた、ＳＰ−ＧＰ法に用いるプライマーとして、精製マルトオリゴ糖ではなく、マルトオリゴ糖混合物、特に多くのグルカンホスホリラーゼにおいてプライマーとして機能し得ないマルトトライオース、マルトースおよびグルコースをも含有し、スクロースホスホリラーゼの阻害物質であるグルコースも含有するようなマルトオリゴ糖混合物を用いても、目的とするグルカン、特にアミロースの合成が、問題なく実施できることを見出し、これに基づいて本発明を完成させた。
【００２５】
本発明者らはまた、以下のいずれかの工程によって、反応液中のフルクトースを効率的に除去し、グルカンを製造できることを見出し、これに基づいて本発明を完成させた。
（１）生産されたグルカンを、有機溶媒を利用せずに精製する工程；
（２）上記反応後の反応溶液を冷却することにより上記グルカンを沈澱させる工程、および該沈澱したグルカンを固液分離方法により精製する工程；
（３）上記グルカン生産反応の間もしくはグルカン生産反応後に上記反応溶液を冷却してグルカンをゲル化する工程、ゲル化したグルカンを回収する工程、および該ゲル化したグルカンから、フルクトースを、水による洗浄、凍結融解、ろ過、圧搾、吸引および遠心分離からなる群より選択される操作によって除去する工程；ならびに
（４）上記グルカン生産反応後、水に溶解しているグルカンを沈澱させずに、限外ろ過膜を用いた膜分画もしくはクロマトグラフィーに供してフルクトースを除去する工程。
【００２６】
本発明のグルカンの第１の製造方法は、スクロース、プライマー、無機リン酸またはグルコース−１−リン酸、スクロースホスホリラーゼ、およびグルカンホスホリラーゼを含む反応溶液を反応させて、グルカンを生産する工程を包含し、ここで反応開始時から反応終了時までの間の該反応溶液のスクロース−リン酸比率の最大値が約１７以下である。
【００２７】
１つの実施態様では、上記最大値は、約０．５以上約１５以下であり得、好ましくは約１以上約１０以下であり得、さらに好ましくは約２以上約７以下であり得る。
【００２８】
１つの実施態様では、上記グルカンは、アミロースであり得る。
【００２９】
１つの実施態様では、上記スクロースホスホリラーゼは、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属に属する細菌由来であり得る。好ましくは、上記スクロースホスホリラーゼは、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、およびＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｉｔｉｓからなる群より選択されるＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属に属する細菌由来であり得る。
【００３０】
１つの実施態様では、上記グルカンホスホリラーゼは、植物由来であり得る。より好ましくは、上記グルカンホスホリラーゼは、藻類または馬鈴薯由来であり得る。
【００３１】
１つの実施態様では、上記グルカンホスホリラーゼは、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ由来またはＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来であり得る。
【００３２】
１つの実施態様では、上記スクロースホスホリラーゼおよびグルカンホスホリラーゼの両方、もしくは少なくとも一方は、遺伝子組換えされた微生物により生産され得る。
【００３３】
１つの実施態様では、上記スクロースホスホリラーゼおよびグルカンホスホリラーゼの両方、もしくは少なくとも一方は、担体上に固定化され得る。
【００３４】
１つの実施態様では、上記スクロースは、未精製糖であり得る。
【００３５】
１つの実施態様では、上記プライマーは、マルトオリゴ糖、アミロース、アミロペクチン、グリコーゲン、デキストリン、プルラン、カップリングシュガー、澱粉、およびこれらの誘導体からなる群から選択され得る。
【００３６】
１つの実施態様では、上記マルトオリゴ糖は、マルトオリゴ糖混合物であり得る。
【００３７】
１つの実施態様では、上記マルトオリゴ糖混合物は、マルトテトラオース以上の重合度のマルトオリゴ糖に加えて、マルトトリオース、マルトースおよびグルコースのうちの少なくとも１つを含有し得る。
【００３８】
１つの実施態様では、上記澱粉は、可溶性澱粉、ワキシー澱粉、ハイアミロース澱粉、澱粉枝切り酵素分解物、澱粉ホスホリラーゼ分解物、澱粉部分加水分解物、化工澱粉、およびこれらの誘導体からなる群から選択され得る。
【００３９】
１つの実施態様では、上記方法は、生産されたグルカンを、有機溶媒を利用せずに精製する工程をさらに包含し得る。
【００４０】
１つの実施態様では、上記方法は、上記反応後の反応溶液を冷却することにより上記グルカンを沈澱させる工程、および該沈澱したグルカンを固液分離方法により精製する工程をさらに含み得る。
【００４１】
１つの実施態様では、上記方法は、上記グルカン生産反応の間もしくはグルカン生産反応後に上記反応溶液を冷却してグルカンをゲル化する工程、ゲル化したグルカンを回収する工程、および該ゲル化したグルカンから、フルクトースを、水による洗浄、凍結融解、ろ過、圧搾、吸引および遠心分離からなる群より選択される操作によって除去する工程をさらに含み得る。
【００４２】
１つの実施態様では、上記方法は、さらに、上記グルカン生産反応後、水に溶解しているグルカンを沈澱させずに、限外ろ過膜を用いた膜分画もしくはクロマトグラフィーに供してフルクトースを除去する工程を含み得る。上記限外ろ過膜は、分画分子量サイズ約３０，０００のものであり得る。上記限外ろ過膜はまた、中空糸タイプの限外濾過膜であり得る。上記クロマトグラフィーに使用され得る担体は、ゲル濾過クロマトグラフィー用担体、配位子交換クロマトグラフィー用担体、イオン交換クロマトグラフィー用担体、または疎水クロマトグラフィー用担体であり得る。
【００４３】
１つの実施態様では、上記反応溶液中にさらに、枝切り酵素、ブランチングエンザイム、４−α−グルカノトランスフェラーゼおよびグリコーゲンデブランチングエンザイムからなる群より選択される酵素を含み得る。
【００４４】
本発明のグルカンの第２の製造方法は、スクロース、プライマー、無機リン酸またはグルコース−１−リン酸、スクロースホスホリラーゼ、およびグルカンホスホリラーゼを含む反応溶液を反応させて、グルカンを生産する工程を包含し、ここで該反応が、約４０℃〜約７０℃の温度で行われる。
【００４５】
１つの実施態様では、上記反応温度は、約４５℃〜約６５℃であり得る。
【００４６】
１つの実施態様では、反応開始時の上記反応溶液中のスクロースの濃度は約５％〜約１００％であり得、好ましくは約８％〜約８０％であり得、そしてより好ましくは約１５％〜約５０％であり得る。
【００４７】
１つの実施態様では、上記グルカンは、アミロースであり得る。
【００４８】
１つの実施態様では、上記スクロースホスホリラーゼは、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属に属する細菌由来であり得る。好ましくは、上記スクロースホスホリラーゼは、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、およびＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｉｔｉｓからなる群より選択されるＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属に属する細菌由来であり得る。
【００４９】
１つの実施態様では、上記グルカンホスホリラーゼは、植物由来であり得る。より好ましくは、上記グルカンホスホリラーゼは、藻類または馬鈴薯由来であり得る。
【００５０】
１つの実施態様では、上記グルカンホスホリラーゼは、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ由来またはＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来であり得る。
【００５１】
１つの実施態様では、上記スクロースホスホリラーゼおよびグルカンホスホリラーゼの両方、もしくは少なくとも一方は、遺伝子組換えされた微生物により生産され得る。
【００５２】
１つの実施態様では、上記スクロースホスホリラーゼおよびグルカンホスホリラーゼの両方、もしくは少なくとも一方は、担体上に固定化され得る。
【００５３】
１つの実施態様では、上記スクロースは、未精製糖であり得る。
【００５４】
１つの実施態様では、上記プライマーは、マルトオリゴ糖、アミロース、アミロペクチン、グリコーゲン、デキストリン、プルラン、カップリングシュガー、澱粉、およびこれらの誘導体からなる群から選択され得る。
【００５５】
１つの実施態様では、上記マルトオリゴ糖は、マルトオリゴ糖混合物であり得る。
【００５６】
１つの実施態様では、上記マルトオリゴ糖混合物は、マルトテトラオース以上の重合度のマルトオリゴ糖に加えて、マルトトリオース、マルトースおよびグルコースのうちの少なくとも１つを含有し得る。
【００５７】
１つの実施態様では、上記澱粉は、可溶性澱粉、ワキシー澱粉、ハイアミロース澱粉、澱粉枝切り酵素分解物、澱粉ホスホリラーゼ分解物、澱粉部分加水分解物、化工澱粉、およびこれらの誘導体からなる群から選択され得る。
【００５８】
１つの実施態様では、上記方法は、生産されたグルカンを、有機溶媒を利用せずに精製する工程をさらに包含し得る。
【００５９】
１つの実施態様では、上記方法は、上記反応後の反応溶液を冷却することにより上記グルカンを沈澱させる工程、および該沈澱したグルカンを固液分離方法により精製する工程をさらに含み得る。
【００６０】
１つの実施態様では、上記方法は、上記グルカン生産反応の間もしくはグルカン生産反応後に上記反応溶液を冷却してグルカンをゲル化する工程、ゲル化したグルカンを回収する工程、および該ゲル化したグルカンから、フルクトースを、水による洗浄、凍結融解、ろ過、圧搾、吸引および遠心分離からなる群より選択される操作によって除去する工程をさらに含み得る。
【００６１】
１つの実施態様では、上記方法は、さらに、上記グルカン生産反応後、水に溶解しているグルカンを沈澱させずに、限外ろ過膜を用いた膜分画もしくはクロマトグラフィーに供してフルクトースを除去する工程を含み得る。上記限外ろ過膜は、分画分子量サイズ約３０，０００のものであり得る。上記限外ろ過膜はまた、中空糸タイプの限外濾過膜であり得る。上記クロマトグラフィーに使用され得る担体は、ゲル濾過クロマトグラフィー用担体、配位子交換クロマトグラフィー用担体、イオン交換クロマトグラフィー用担体、または疎水クロマトグラフィー用担体であり得る。
【００６２】
１つの実施態様では、上記反応溶液中にさらに、枝切り酵素、ブランチングエンザイム、４−α−グルカノトランスフェラーゼおよびグリコーゲンデブランチングエンザイムからなる群より選択される酵素を含み得る。
【００６３】
本発明のグルカンの第３の製造方法は、スクロース、プライマー、無機リン酸またはグルコース−１−リン酸、スクロースホスホリラーゼ、およびグルカンホスホリラーゼを含む反応溶液を反応させて、グルカンを生産する工程を包含し、ここで反応開始時から反応終了時までの間の該反応溶液のスクロース−リン酸比率の最大値が約１７以下であり、該反応が、約４０℃〜約７０℃の温度で行われる。
【００６４】
１つの実施態様では、上記最大値は、約０．５以上約１５以下であり得、好ましくは約１以上約１０以下であり得、さらに好ましくは約２以上約７以下であり得る。
【００６５】
１つの実施態様では、上記反応温度は、約４５℃〜約６５℃であり得る。
【００６６】
１つの実施態様では、反応開始時の上記反応溶液中のスクロースの濃度は約５〜約１００％であり得、好ましくは約８〜約８０％であり得、そしてより好ましくは約１５〜約５０％であり得る。
【００６７】
１つの実施態様では、上記グルカンは、アミロースであり得る。
【００６８】
１つの実施態様では、上記スクロースホスホリラーゼは、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属に属する細菌由来であり得る。好ましくは、上記スクロースホスホリラーゼは、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、およびＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｉｔｉｓからなる群より選択されるＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属に属する細菌由来であり得る。
【００６９】
１つの実施態様では、上記グルカンホスホリラーゼは、植物由来であり得る。より好ましくは、上記グルカンホスホリラーゼは、藻類または馬鈴薯由来であり得る。
【００７０】
１つの実施態様では、上記グルカンホスホリラーゼは、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ由来またはＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来であり得る。
【００７１】
１つの実施態様では、上記スクロースホスホリラーゼおよびグルカンホスホリラーゼの両方、もしくは少なくとも一方は、遺伝子組換えされた微生物により生産され得る。
【００７２】
１つの実施態様では、上記スクロースホスホリラーゼおよびグルカンホスホリラーゼの両方、もしくは少なくとも一方は、担体上に固定化され得る。
【００７３】
１つの実施態様では、上記スクロースは、未精製糖であり得る。
【００７４】
１つの実施態様では、上記プライマーは、マルトオリゴ糖、アミロース、アミロペクチン、グリコーゲン、デキストリン、プルラン、カップリングシュガー、澱粉、およびこれらの誘導体からなる群から選択され得る。
【００７５】
１つの実施態様では、上記マルトオリゴ糖は、マルトオリゴ糖混合物であり得る。
【００７６】
１つの実施態様では、上記マルトオリゴ糖混合物は、マルトテトラオース以上の重合度のマルトオリゴ糖に加えて、マルトトリオース、マルトースおよびグルコースのうちの少なくとも１つを含有し得る。
【００７７】
１つの実施態様では、上記澱粉は、可溶性澱粉、ワキシー澱粉、ハイアミロース澱粉、澱粉枝切り酵素分解物、澱粉ホスホリラーゼ分解物、澱粉部分加水分解物、化工澱粉、およびこれらの誘導体からなる群から選択され得る。
【００７８】
１つの実施態様では、上記方法は、生産されたグルカンを、有機溶媒を利用せずに精製する工程をさらに包含し得る。
【００７９】
１つの実施態様では、上記方法は、上記反応後の反応溶液を冷却することにより上記グルカンを沈澱させる工程、および該沈澱したグルカンを固液分離方法により精製する工程をさらに含み得る。
【００８０】
１つの実施態様では、上記方法は、上記グルカン生産反応の間もしくはグルカン生産反応後に上記反応溶液を冷却してグルカンをゲル化する工程、ゲル化したグルカンを回収する工程、および該ゲル化したグルカンから、フルクトースを、水による洗浄、凍結融解、ろ過、圧搾、吸引および遠心分離からなる群より選択される操作によって除去する工程をさらに含み得る。
【００８１】
１つの実施態様では、上記方法は、さらに、上記グルカン生産反応後、水に溶解しているグルカンを沈澱させずに、限外ろ過膜を用いた膜分画もしくはクロマトグラフィーに供してフルクトースを除去する工程を含み得る。上記限外ろ過膜は、分画分子量サイズ約３０，０００のものであり得る。上記限外ろ過膜はまた、中空糸タイプの限外濾過膜であり得る。上記クロマトグラフィーに使用され得る担体は、ゲル濾過クロマトグラフィー用担体、配位子交換クロマトグラフィー用担体、イオン交換クロマトグラフィー用担体、または疎水クロマトグラフィー用担体であり得る。
【００８２】
１つの実施態様では、上記反応溶液中にさらに、枝切り酵素、ブランチングエンザイム、４−α−グルカノトランスフェラーゼおよびグリコーゲンデブランチングエンザイムからなる群より選択される酵素を含み得る。
【００８３】
本発明のグルカンの第４の製造方法は、スクロース、プライマー、無機リン酸またはグルコース−１−リン酸、スクロースホスホリラーゼ、およびグルカンホスホリラーゼを含む反応溶液を反応させて、グルカンを生産する工程を包含し、ここで反応開始時の該反応溶液のスクロース−リン酸比率が約１７以下である。
【００８４】
１つの実施形態では、無機リン酸もグルコース−１−リン酸も、反応開始後に追加されない。
【００８５】
１つの実施形態では、上記反応は、約４０℃〜約７０℃の温度で行われ得る。
【００８６】
本発明のグルカンの第５の製造方法は、スクロース、プライマー、無機リン酸またはグルコース−１−リン酸、スクロースホスホリラーゼ、およびグルカンホスホリラーゼを含む反応溶液で反応を開始させる工程；スクロース、無機リン酸またはグルコース−１−リン酸を該反応溶液に追加する工程；ならびにさらに反応を続けてグルカンを生産する工程を包含し、ここで該追加工程完了時の該反応溶液のスクロース−リン酸比率が約１７以下である。
【００８７】
１つの実施形態では、上記反応は、約４０℃〜約７０℃の温度で行われ得る。
【００８８】
本発明のグルカンは、上記のいずれかの方法で製造される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００８９】
以下に本発明を詳細に説明する。
【００９０】
本発明の方法では、グルカンを製造する。本明細書中では「グルカン」とは、Ｄ−グルコースを構成単位とする、糖であって、α−１，４−グルコシド結合によって連結された糖単位を少なくとも２糖単位以上有する糖をいう。グルカンは、直鎖状、分岐状または環状の分子であり得る。直鎖状グルカンとα−１，４−グルカンとは同義語である。直鎖状グルカンでは、α−１，４−グルコシド結合によってのみ糖単位の間が連結されている。α−１，６−グルコシド結合を１つ以上含むグルカンは、分岐状グルカンである。グルカンは、好ましくは、直鎖状の部分をある程度含む。分岐のない直鎖状グルカンがより好ましい。
【００９１】
グルカンは、場合によっては、分岐の数（すなわち、α−１，６−グルコシド結合の数）が少ないことが好ましい。このような場合、分岐の数は、代表的には０〜１００００個、好ましくは０〜１０００個、より好ましくは０〜５００個、さらに好ましくは０〜１００個、さらに好ましくは０〜５０個、さらに好ましくは０〜２５個、さらに好ましくは０個である。
【００９２】
本発明のグルカンでは、α−１，６−グルコシド結合を１としたときのα−１，６−グルコシド結合の数に対するα−１，４−グルコシド結合の数の比は、好ましくは１〜１００００であり、より好ましくは１０〜５０００であり、さらに好ましくは５０〜１０００であり、さらに好ましくは１００〜５００である。
【００９３】
α−１，６−グルコシド結合は、グルカン中に無秩序に分布していてもよいし、均質に分布していてもよい。グルカン中に糖単位で５個以上の直鎖状部分ができる程度の分布であることが好ましい。
【００９４】
グルカンは、Ｄ−グルコースのみから構成されていてもよいし、グルカンの性質を損なわない程度に修飾された誘導体であってもよい。修飾されていないことが好ましい。
【００９５】
グルカンは、代表的には約８×１０３以上、好ましくは約１×１０４以上、より好ましくは約５×１０４以上、さらに好ましくは約１×１０５以上、さらに好ましくは約６×１０５以上の分子量を有する。グルカンは、代表的には約１×１０８以下、好ましくは約１×１０７以下、さらに好ましくは約５×１０６以下、さらに好ましくは約１×１０６以下の分子量を有する。
【００９６】
当業者は、本発明の製造方法で用いられる基質の量、酵素の量、反応時間などを適宜設定することによって所望の分子量のグルカンが得られることを容易に理解する。
【００９７】
＜グルカンの製造に用いる材料＞
本発明の製造方法では、例えば、スクロース、プライマー、無機リン酸またはグルコース−１−リン酸、緩衝剤、スクロースホスホリラーゼ、グルカンホスホリラーゼおよびそれを溶かしている溶媒を主な材料として用いる。これらの材料は通常、反応開始時に全て添加されるが、反応の途中でこれらのうちの任意の材料を追加して添加してもよい。本発明の製造方法では、必要に応じて、枝切り酵素、ブランチングエンザイム、４−α−グルカノトランスフェラーゼおよびグリコーゲンデブランチングエンザイムからなる群より選択される酵素を用いることができる。枝切り酵素、ブランチングエンザイム、４−α−グルカノトランスフェラーゼおよびグリコーゲンデブランチングエンザイムからなる群より選択される酵素は、目的とするグルカンの構造に応じて、本発明の製造方法の最初から反応溶液中に添加してもよく、途中から反応溶液中に添加してもよい。
【００９８】
（１）スクロース：
スクロースは、Ｃ１２Ｈ２２Ｏ１１で示される、分子量約３４２の二糖である。スクロースは、光合成能を有するあらゆる植物中に存在する。スクロースは、植物から単離されてもよいし、化学的に合成されてもよい。コストの面からみて、スクロースを植物から単離することが好ましい。スクロースを多量に含む植物の例としては、サトウキビ、サトウダイコンなどが挙げられる。サトウキビは、汁液中に約２０％のスクロースを含む。サトウダイコンは、汁液中に約１０〜１５％のスクロースを含む。スクロースは、スクロースを含む植物の汁液から精製糖に至るいずれの精製段階のものとして提供されてもよい。
【００９９】
本発明の方法で使用されるスクロースは、純粋なものであることが好ましい。しかし、本発明のスクロースの効果を阻害しない限り、任意の他の夾雑物を含んでいてもよい。
【０１００】
溶液中に含まれるスクロースの濃度は、代表的には約５〜１００％、好ましくは約８〜８０％、より好ましくは約８〜５０％である。なお、本明細書中でスクロースの濃度は、Ｗｅｉｇｈｔ／Ｖｏｌｕｍｅで、すなわち、
（スクロースの重量）×１００／（溶液の容量）
で計算する。スクロースの重量が多すぎると、反応中に未反応のスクロースが析出する場合がある。スクロースの使用量が少なすぎると、高温での反応において収率が低下する場合がある。
【０１０１】
なお、上述した第１の方法の場合、すなわち、反応開始時から反応終了時までの間の該反応溶液のスクロース−リン酸比率の最大値が約１７以下の場合は、スクロース濃度は上記の範囲に必ずしも限定されない。上述した第４の方法の場合、すなわち、反応開始時の反応溶液のスクロース−リン酸比率が約１７以下の場合、および上述した第５の方法の場合、すなわち、スクロース、無機リン酸またはグルコース−１−リン酸を反応溶液に追加する工程を包含する場合も、スクロース濃度は上記の範囲に必ずしも限定されない。本明細書中では、反応溶液中のスクロースモル濃度を、反応溶液中の無機リン酸のモル濃度とグルコース−１−リン酸のモル濃度との合計によって除算することによって得られる比率を、スクロース−リン酸比率という。すなわち、以下の通りである：
【０１０２】
【化１】
2004526463.tif 000002
全反応材料を投入して反応を始めて、反応中に材料の追加をしないのであれば、スクロース−リン酸比率は反応開始時が最大である。
【０１０３】
（２）プライマー：
本発明の方法で用いられるプライマーは、グルカンの合成において出発物質として作用する分子をいう。プライマーは、α−１，４−グルコシド結合で糖単位が結合できる遊離部分を１個以上有すれば、他の部分は糖以外の部分によって形成されていてもよい。本発明の方法では、プライマーに対して糖単位がα−１，４−グルコシド結合で順次結合されて、グルカンが合成される。プライマーとしては、グルカンホスホリラーゼによって糖単位が付加され得る任意の糖が挙げられる。
【０１０４】
プライマーは、本発明の反応の出発物質であればよく、例えば、本発明の方法によって合成されたグルカンをプライマーとして用いて、本発明の方法によってα−１，４−グルコシド鎖を再度伸長することも可能である。
【０１０５】
プライマーは、α−１，４−グルコシド結合のみを含むα−１，４−グルカンであっても、α−１，６−グルコシド結合を部分的に有してもよい。当業者は、所望のグルカンに応じて、適切なプライマーを容易に選択し得る。直鎖状のアミロースを合成する場合には、α−１，４−グルコシド結合のみを含むα−１，４−グルカンをプライマーとして用いれば、枝切り酵素などを用いずに直鎖状アミロースを合成できるので好ましい。
【０１０６】
プライマーの例としては、マルトオリゴ糖、アミロース、アミロペクチン、グリコーゲン、デキストリン、プルラン、カップリングシュガー、澱粉およびこれらの誘導体が挙げられる。
【０１０７】
マルトオリゴ糖は、本明細書中では、２〜１０個のグルコースが脱水縮合して生じた物質であって、α−１，４結合によって連結された物質をいう。マルトオリゴ糖は、好ましくは４〜１０個の糖単位、より好ましくは５〜１０個の糖単位、さらに好ましくは７〜１０個の糖単位を有する。マルトオリゴ糖の例としては、マルトース、マルトトリオース、マルトテトラオース、マルトペンタオース、マルトヘキサオース、マルトヘプタオース、マルトオクタオース、マルトノナオース、マルトデカオースなどのマルトオリゴ糖が挙げられる。マルトオリゴ糖は、好ましくはマルトテトラオース、マルトペンタオース、マルトヘキサオースまたはマルトヘプタオースである。マルトオリゴ糖は、単品であってもよいし、複数のマルトオリゴ糖の混合物であってもよい。コストが低いため、マルトオリゴ糖の混合物が好ましい。１つの実施態様では、マルトオリゴ糖の混合物は、マルトテトラオースの重合度以上の重合度のマルトオリゴ糖に加えて、マルトトリオース、マルトースおよびグルコースのうちの少なくとも１つを含有する。ここで、「マルトテトラオースの重合度以上の重合度のマルトオリゴ糖」とは、重合度４以上のマルトオリゴ糖をいう。オリゴ糖は、直鎖状のオリゴ糖であってもよいし、分枝状のオリゴ糖であってもよい。オリゴ糖は、その分子内に、環状部分を有し得る。本発明では、直鎖状のオリゴ糖が好ましい。
【０１０８】
アミロースとは、α−１，４結合によって連結されたグルコース単位から構成される直鎖分子である。アミロースは、天然の澱粉中に含まれる。
【０１０９】
アミロペクチンとは、α−１，４結合によって連結されたグルコース単位に、α１，６結合でグルコース単位が連結された、分枝状分子である。アミロペクチンは天然の澱粉中に含まれる。アミロペクチンとしては、例えば、アミロペクチン１００％からなるワキシーコーンスターチが用いられ得る。例えば、重合度が約１×１０５程度以上のアミロペクチンが原料として用いられ得る。
【０１１０】
グリコーゲンは、グルコースから構成されるグルカンの一種であり、高頻度の枝分かれを有するグルカンである。グリコーゲンは、動植物の貯蔵多糖としてほとんどあらゆる細胞に顆粒状態で広く分布している。グリコーゲンは、植物中では、例えば、トウモロコシの種子などに存在する。グリコーゲンは、代表的には、グルコースのα−１，４−結合の糖鎖に対して、グルコースおよそ３単位おきに１本程度の割合で、平均重合度１２〜１８のグルコースのα−１，４−結合の糖鎖がα−１，６−結合で結合している。また、α−１，６−結合で結合している分枝にも同様にグルコースのα−１，４−結合の糖鎖がα−１，６−結合で結合している。そのため、グリコーゲンは網状構造を形成する。
【０１１１】
グリコーゲンの分子量は代表的には約１×１０５〜約１×１０８であり、好ましくは約１×１０６〜約１×１０７である。
【０１１２】
プルランは、マルトトリオースが規則正しく、階段状にα−１，６−結合した、分子量約１０万〜約３０万（例えば、約２０万）のグルカンである。プルランは、例えば、澱粉を原料として黒酵母Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ  ｐｕｌｌｕｌａｎｓを培養することにより製造される。プルランは、例えば、林原商事から入手され得る。
【０１１３】
カップリングシュガーは、ショ糖、グルコシルスクロース、マルトシルスクロースを主成分とする混合物である。カップリングシュガーは、例えば、ショ糖と澱粉との混合溶液にＢａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍなどが産生するサイクロデキストリングルカノトランスフェラーゼを作用させることにより製造される。カップリングシュガーは、例えば、林原商事から入手され得る。
【０１１４】
澱粉は、アミロースとアミロペクチンとの混合物である。澱粉としては、通常市販されている澱粉であればどのような澱粉でも用いられ得る。澱粉に含まれるアミロースとアミロペクチンとの比率は、澱粉を産生する植物の種類によって異なる。モチゴメ、モチトウモロコシなどの有する澱粉のほとんどはアミロペクチンである。他方、アミロースのみからなり、かつアミロペクチンを含まない澱粉は、通常の植物からは得られない。
【０１１５】
澱粉は、天然の澱粉、澱粉分解物および化工澱粉に区分される。
【０１１６】
天然の澱粉は、原料により、いも類澱粉および穀類澱粉に分けられる。いも類澱粉の例としては、馬鈴薯澱粉、タピオカ澱粉、甘藷澱粉、くず澱粉、およびわらび澱粉などが挙げられる。穀類澱粉の例としては、コーンスターチ、小麦澱粉、および米澱粉などが挙げられる。天然の澱粉の例は、澱粉を生産する植物の品種改良の結果、アミロースの含量を５０％〜７０％まで高めたハイアミロース澱粉（例えば、ハイアミロースコーンスターチ）である。天然の澱粉の別の例は、澱粉を生産する植物の品種改良の結果、アミロースを含まないワキシー澱粉である。
【０１１７】
可溶性澱粉は、天然の澱粉に種々の処理を施すことにより得られる、水溶性の澱粉をいう。
【０１１８】
化工澱粉は、天然の澱粉に加水分解、エステル化、またはα化などの処理を施して、より利用しやすい性質を持たせた澱粉である。糊化開始温度、糊の粘度、糊の透明度、老化安定性などを様々な組み合わせで有する幅広い種類の化工澱粉が入手可能である。化工澱粉の種類には種々ある。このような澱粉の例は、澱粉の糊化温度以下において澱粉粒子を酸に浸漬することにより、澱粉分子は切断するが、澱粉粒子は破壊していない澱粉である。
【０１１９】
澱粉分解物は、澱粉に酵素処理または加水分解などの処理を施して得られる、処理前よりも分子量が小さいオリゴ糖もしくは多糖である。澱粉分解物の例としては、澱粉枝切り酵素分解物、澱粉ホスホリラーゼ分解物および澱粉部分加水分解物が挙げられる。
【０１２０】
澱粉枝切り酵素分解物は、澱粉に枝切り酵素を作用させることによって得られる。枝切り酵素の作用時間を種々に変更することによって、任意の程度に分岐部分（すなわち、α−１，６−グルコシド結合）が切断された澱粉枝切り酵素分解物が得られる。枝切り酵素分解物の例としては、糖単位数４〜１００００のうちα−１，６−グルコシド結合を１個〜２０個有する分解物、糖単位数３〜５００のα−１，６−グルコシド結合を全く有さない分解物、マルトオリゴ糖およびアミロースが挙げられる。澱粉枝切り酵素分解物の場合、分解された澱粉の種類によって得られる分解物の分子量の分布が異なり得る。澱粉枝切り酵素分解物は、種々の長さの糖鎖の混合物であり得る。
【０１２１】
澱粉ホスホリラーゼ分解物は、澱粉にグルカンホスホリラーゼ（ホスホリラーゼともいう）を作用させることによって得られる。グルカンホスホリラーゼは、澱粉の非還元性末端からグルコース残基を１糖単位ずつ他の基質へと転移させる。グルカンホスホリラーゼは、α−１，６−グルコシド結合を切断することができないので、グルカンホスホリラーゼを澱粉に充分に長時間作用させると、α−１，６−グルコシド結合の部分で切断が終わった分解物が得られる。本発明では、澱粉ホスホリラーゼ分解物の有する糖単位数は、好ましくは約１０〜約１００，０００、より好ましくは約５０〜約５０，０００、さらにより好ましくは約１００〜約１０，０００である。澱粉ホスホリラーゼ分解物は、分解された澱粉の種類によって得られる分解産物の分子量の分布が異なり得る。澱粉ホスホリラーゼ分解物は、種々の長さの糖鎖の混合物であり得る。
【０１２２】
デキストリンおよび澱粉部分加水分解物は、澱粉を、酸、アルカリ、酵素などの作用によって部分的に分解して得られる分解物をいう。本発明では、デキストリンおよび澱粉部分加水分解物の有する糖単位数は、好ましくは約１０〜約１００，０００、より好ましくは約５０〜約５０，０００、さらにより好ましくは約１００〜約１０，０００である。デキストリンおよび澱粉部分加水分解物の場合、分解された澱粉の種類によって得られる分解産物の分子量の分布が異なり得る。デキストリンおよび澱粉部分加水分解物は、種々の長さを持つ糖鎖の混合物であり得る。
【０１２３】
澱粉は、可溶性澱粉、ワキシー澱粉、ハイアミロース澱粉、澱粉枝切り酵素分解物、澱粉ホスホリラーゼ分解物、澱粉部分加水分解物、化工澱粉、およびこれらの誘導体からなる群から選択されることが好ましい。
【０１２４】
本発明の方法では、上記各種糖の誘導体は、プライマーとして用いられ得る。例えば、上記糖のアルコール性水酸基の少なくとも１つが、ヒドロキシアルキル化、アルキル化、アセチル化、カルボキシメチル化、硫酸化、あるいはリン酸化された誘導体などが用いられ得る。さらに、これらの２種以上の誘導体の混合物が原料として用いられ得る。
【０１２５】
（３）無機リン酸またはグルコース−１−リン酸：
本明細書中において、無機リン酸とは、ＳＰの反応においてリン酸基質を供与し得る物質をいう。ここでリン酸基質とは、グルコース−１−リン酸のリン酸部分（ｍｏｉｅｔｙ）の原料となる物質をいう。スクロースホスホリラーゼによって触媒されるスクロース加リン酸分解において、無機リン酸はリン酸イオンの形態で基質として作用していると考えられる。当該分野ではこの基質を慣習的に無機リン酸というので、本明細書中でも、この基質を無機リン酸という。無機リン酸には、リン酸およびリン酸の無機塩が含まれる。通常、無機リン酸は、アルカリ金属イオンなどの陽イオンを含む水中で使用される。この場合、リン酸とリン酸塩とリン酸イオンとは平衡状態になるので、リン酸とリン酸塩とは区別をしにくい。従って、便宜上、リン酸とリン酸塩とを合わせて無機リン酸という。本発明において、無機リン酸は好ましくは、リン酸の任意の金属塩であり、より好ましくはリン酸のアルカリ金属塩である。無機リン酸の好ましい具体例としては、リン酸二水素ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、リン酸三ナトリウム、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウム、リン酸三カリウム、リン酸（Ｈ３ＰＯ４）、リン酸二水素アンモニウム、リン酸水素二アンモニウムなどが挙げられる。
【０１２６】
無機リン酸は、反応開始時のＳＰ−ＧＰ反応系において、１種類のみ含有されてもよく、複数種類含有されてもよい。
【０１２７】
無機リン酸は、例えば、ポリリン酸（例えば、ピロリン酸、三リン酸および四リン酸）のようなリン酸縮合体またはその塩を、物理的、化学的または酵素反応などによって分解したものを反応溶液に添加することによって提供され得る。
【０１２８】
本明細書において、グルコース−１−リン酸とは、グルコース−１−リン酸（Ｃ６Ｈ１３Ｏ９Ｐ）およびその塩をいう。グルコース−１−リン酸は好ましくは、狭義のグルコース−１−リン酸（Ｃ６Ｈ１３Ｏ９Ｐ）の任意の金属塩であり、より好ましくはグルコース−１−リン酸（Ｃ６Ｈ１３Ｏ９Ｐ）の任意のアルカリ金属塩である。グルコース−１−リン酸の好ましい具体例としては、グルコース−１−リン酸二ナトリウム、グルコース−１−リン酸二カリウム、グルコース−１−リン酸（Ｃ６Ｈ１３Ｏ９Ｐ）、などが挙げられる。本明細書において、括弧書きで化学式を書いていないグルコース−１−リン酸は、広義のグルコース−１−リン酸、すなわち狭義のグルコース−１−リン酸（Ｃ６Ｈ１３Ｏ９Ｐ）およびその塩を示す。
【０１２９】
グルコース−１−リン酸は反応開始時のＳＰ−ＧＰ反応系において、１種類のみ含有されてもよく、複数種類含有されていてもよい。
【０１３０】
本発明の方法において、反応開始時の反応溶液中のリン酸とグルコース−１−リン酸との間の比率は、任意の比率であり得る。
【０１３１】
反応溶液中に含まれる無機リン酸のモル濃度とグルコース−１−リン酸のモル濃度との合計は、代表的には約１ｍＭ〜約１０００ｍＭ、好ましくは約１０ｍＭ〜約５００ｍＭ、より好ましくは約２０ｍＭ〜約２５０ｍＭである。無機リン酸のモル濃度およびグルコース−１−リン酸のモル濃度は、それぞれ、反応開始時から反応終了時までの間の反応溶液中のスクロース−リン酸比率の最大値が代表的には約１７以下、好ましくは約０．５以上約１５以下、より好ましくは約１以上約１０以下、そしてさらに好ましくは約２以上約７以下になるように調整される。上述した本発明の第４の方法では、無機リン酸のモル濃度およびグルコース−１−リン酸のモル濃度は、反応開始時の反応溶液のスクロース−リン酸比率が上記範囲内になるように調整される。上述した本発明の第５の方法では、無機リン酸のモル濃度およびグルコース−１−リン酸のモル濃度は、スクロース、無機リン酸またはグルコース−１−リン酸を反応溶液に追加する工程の終了時の反応溶液のスクロース−リン酸比率が上記範囲内になるように調整される。無機リン酸およびグルコース−１−リン酸の量が多すぎると、グルカンの収率が低下する場合がある。使用量が少なすぎると、グルカンの合成に時間がかかる場合がある。
【０１３２】
ＳＰ−ＧＰ反応系中の無機リン酸の含有量は、下記の１．４に記載の方法によって定量され得る。ＳＰ−ＧＰ反応系中のグルコース−１−リン酸の含有量は、下記の１．３に記載の方法によって定量され得る。反応に関与しないリン含有物質を使わない場合、そのような場合は原子吸光法によって無機リン酸およびグルコース−１−リン酸の合計含有量を測定してもよい。
【０１３３】
なお、上述した第２の方法の場合、すなわち、反応温度が約４０℃〜約７０℃で反応が行われる場合、上記の最大値は必ずしも約１７以下である必要はない。
【０１３４】
（４）スクロースホスホリラーゼ（ＥＣ．２．４．１．７）：
本明細書中では、「スクロースホスホリラーゼ」とは、スクロースのα−グリコシル基をリン酸基に転移して加リン酸分解を行う任意の酵素をいう。スクロースホスホリラーゼによって触媒される反応は、次式により示される：
【０１３５】
【化２】
2004526463.tif 000003
スクロースホスホリラーゼは、自然界では種々の生物に含まれる。スクロースホスホリラーゼを産生する生物の例としては、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属に属する細菌（例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、およびＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｉｔｉｓ）、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｐ．、Ｐｕｌｌｕｌａｒｉａ  ｐｕｌｌｕｌａｎｓ、Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｘｙｌｉｎｕｍ、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．、Ｓｙｎｅｃｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ、Ｍｏｎｉｌｉａ  ｓｉｔｏｐｈｉｌａ、Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｅａ  ｅｓｃｅｒｏｔｉｏｒｕｍ、およびＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．が挙げられるがこれらに限定されない。
【０１３６】
スクロースホスホリラーゼは、スクロースホスホリラーゼを産生する任意の生物由来であり得る。スクロースホスホリラーゼは、ある程度の耐熱性を有することが好ましい。スクロースホスホリラーゼは、単独で存在する場合の耐熱性が高ければ高いほど好ましい。例えば、スクロースホスホリラーゼを４％のスクロース存在下で５５℃にて３０分間加熱した場合に加熱前のスクロースホスホリラーゼの活性の５０％以上の活性を保持するものであることが好ましい。スクロースホスホリラーゼは、好ましくはＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属の細菌由来であり、さらに好ましくはＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅまたはＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｉｔｉｓ由来である。
【０１３７】
本明細書中では、酵素がある生物に「由来する」とは、その生物から直接単離したことのみを意味するのではなく、その生物を何らかの形で利用することによりその酵素が得られることをいう。例えば、その生物から入手したその酵素をコードする遺伝子を大腸菌に導入して、その大腸菌から酵素を単離する場合も、その酵素はその生物に「由来する」という。
【０１３８】
本発明で用いられるスクロースホスホリラーゼは、上記のような自然界に存在する、スクロースホスホリラーゼを産生する生物から直接単離され得る。本発明で用いられるスクロースホスホリラーゼは、上記の生物から単離したスクロースホスホリラーゼをコードする遺伝子を用いて遺伝子組換えされた微生物（例えば、細菌、真菌など）から単離してもよい。
【０１３９】
本発明の方法で用いられるスクロースホスホリラーゼは、例えば、以下のようにして調製され得る。まず、スクロースホスホリラーゼを産生する微生物（例えば、細菌、真菌など）を培養する。この微生物は、スクロースホスホリラーゼを直接生産する微生物であってもよい。また、スクロースホスホリラーゼをコードする遺伝子をクローン化し、得られた遺伝子でスクロースホスホリラーゼ発現に有利な微生物（例えば、細菌、真菌など）を遺伝子組換えして組換えされた微生物を得、得られた微生物からスクロースホスホリラーゼを得てもよい。
【０１４０】
スクロースホスホリラーゼ遺伝子での遺伝子組換えに用いられる微生物は、スクロースホスホリラーゼの発現の容易さ、培養の容易さ、増殖の速さ、安全性などの種々の条件を考慮して容易に選択され得る。スクロースホスホリラーゼは、夾雑物としてアミラーゼを含まないことが好ましいので、アミラーゼを産生しないかまたは低レベルでしか発現しない微生物（例えば、細菌、真菌など）を遺伝子組換えに用いることが好ましい。スクロースホスホリラーゼの遺伝子組換えのためには、大腸菌または枯草菌のような中温菌を用いることが好ましい。アミラーゼを産生しないかまたは低レベルでしか発現しない微生物（例えば、細菌、真菌など）を用いて産生されるスクロースホスホリラーゼは、アミラーゼを実質的に含まないため、本発明の方法での使用に好ましい。
【０１４１】
クローン化した遺伝子での微生物（例えば、細菌、真菌など）の遺伝子組換えは、当業者に周知の方法に従って行われ得る。クローン化した遺伝子を用いる場合、この遺伝子を、構成性プロモーターまたは誘導性プロモーターに作動可能に連結することが好ましい。「作動可能に連結する」とは、プロモーターと遺伝子とが、そのプロモーターによって遺伝子の発現が調節されるように連結されることをいう。誘導性プロモーターを用いる場合、培養を、誘導条件下で行うことが好ましい。種々の誘導性プロモーターは当業者に公知である。
【０１４２】
クローン化した遺伝子について、生産されるスクロースホスホリラーゼが菌体外に分泌されるように、シグナルペプチドをコードする塩基配列をこの遺伝子に連結し得る。シグナルペプチドをコードする塩基配列は当業者に公知である。
【０１４３】
当業者は、スクロースホスホリラーゼを生産するために、微生物（例えば、細菌、真菌など）の培養の条件を適切に設定し得る。微生物の培養に適切な培地、各誘導性プロモーターに適切な誘導条件などは当業者に公知である。
【０１４４】
適切な時間の培養後、スクロースホスホリラーゼを培養物から回収する。生産されたスクロースホスホリラーゼが菌体外へ分泌される場合、遠心分離によって菌体を除去すれば、上清中にスクロースホスホリラーゼが得られる。菌体内で生産されたスクロースホスホリラーゼが菌体外へ分泌されない場合、超音波処理、機械的破砕、化学的破砕などの処理によって微生物を破砕し、菌体破砕液を得る。
【０１４５】
本発明の方法では、菌体破砕液を精製せずに用いてもよい。次いで、菌体破砕液を遠心分離して菌体の破片を除去し、上清を入手し得る。得られたこれらの上清から、本発明の酵素を、硫酸アンモニウム沈澱またはエタノール沈澱、酸抽出、陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィーおよびレクチンクロマトグラフィーを含む周知の方法によって回収し得る。回収された生成物は、必要に応じて精製され得る。
【０１４６】
好ましい実施態様では、スクロースホスホリラーゼは、精製段階の任意の段階でスクロース（代表的には約４％〜約３０％、好ましくは約８％〜約３０％、より好ましくは約８％〜約２５％）の存在下で加熱され得る。この加熱工程における溶液の温度は、この溶液を３０分間加熱した場合に、加熱前のこの溶液に含まれるスクロースホスホリラーゼの活性の５０％以上、より好ましくは８０％以上の活性が残る温度であることが好ましい。この温度は好ましくは約５０℃〜約８０℃であり、より好ましくは約５５℃〜約７０℃である。例えば、Ｓ．ｍｕｔａｎｓ由来スクロースホスホリラーゼの場合、この温度は約５０℃〜約６０℃であることが好ましい。加熱が行われる場合、加熱時間は、反応温度を考慮して、スクロースホスホリラーゼの活性を大きく損なうことがない限り、任意の時間で設定され得る。加熱時間は、代表的には約１０分間〜約９０分間、より好ましくは約３０分間〜約６０分間である。
【０１４７】
反応開始時の溶液中に含まれるスクロースホスホリラーゼの量は、反応開始時の溶液中のスクロースに対して、代表的には約０．０５〜１，０００Ｕ／ｇスクロース、好ましくは約０．１〜５００Ｕ／ｇスクロース、より好ましくは約０．５〜１００Ｕ／ｇスクロースである。スクロースホスホリラーゼの重量が多すぎると、反応中に変性した酵素が凝集しやすくなる場合がある。使用量が少なすぎると、グルカンの収率が低下する場合がある。
【０１４８】
スクロースホスホリラーゼは、精製されていても未精製であってもよい。スクロースホスホリラーゼは、固定化されていても固定化されていなくともよい。スクロースホスホリラーゼは、固定化されることが好ましい。固定化の方法としては、担体結合法（たとえば、共有結合法、イオン結合法、または物理的吸着法）、架橋法または包括法（格子型またはマイクロカプセル型）など、当業者に周知の方法が使用され得る。スクロースホスホリラーゼは、担体上に固定化されていることが好ましい。
【０１４９】
（５）グルカンホスホリラーゼ（ＥＣ．２．４．１．１）：
グルカンホスホリラーゼとは、α−１，４−グルカンの加リン酸分解を触媒する酵素の総称であり、ホスホリラーゼ、スターチホスホリラーゼ、グリコーゲンホスホリラーゼ、マルトデキストリンホスホリラーゼなどと呼ばれる場合もある。グルカンホスホリラーゼは、加リン酸分解の逆反応であるα−１，４−グルカン合成反応をも触媒し得る。反応がどちらの方向に進むかは、基質の量に依存する。生体内では、無機リン酸の量が多いので、グルカンホスホリラーゼは加リン酸分解の方向に反応が進む。本発明の方法では、無機リン酸は、スクロースの加リン酸分解に使われ、反応溶液中に含まれる無機リン酸の量が少ないので、α−１，４−グルカンの合成の方向に反応が進む。
【０１５０】
グルカンホスホリラーゼは、デンプンまたはグリコーゲンを貯蔵し得る種々の植物、動物および微生物中に普遍的に存在すると考えられる。
【０１５１】
グルカンホスホリラーゼを産生する植物の例としては、藻類、ジャガイモ（馬鈴薯ともいう）、サツマイモ（甘藷ともいう）、ヤマイモ、サトイモ、キャッサバなどの芋類、キャベツ、ホウレンソウなどの野菜類、トウモロコシ、イネ、コムギ、オオムギ、ライムギ、アワなどの穀類、えんどう豆、大豆、小豆、うずら豆などの豆類などが挙げられる。
【０１５２】
グルカンホスホリラーゼを産生する動物の例としては、ヒト、ウサギ、ラット、ブタなどの哺乳類などが挙げられる。
【０１５３】
グルカンホスホリラーゼを産生する微生物の例としては、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｒａｄｉｏｄｕｒａｎｓ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｉｔｏｒａｌｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｏｒｉｋｏｓｈｉ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ、Ａｑｕｉｆｅｘ  ａｅｏｌｉｃｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  Ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｍ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｓｙｎｅｃｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ  ｓｐ．、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．などが挙げられる。グルカンホスホリラーゼを産生する生物はこれらに限定されない。
【０１５４】
本発明で用いられるグルカンホスホリラーゼは、ジャガイモ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓに由来することが好ましく、ジャガイモに由来することがより好ましい。本発明で用いられるグルカンホスホリラーゼは、反応至適温度が高いことが好ましい。反応至適温度が高いグルカンホスホリラーゼは、例えば、高度好熱細菌に由来し得る。
【０１５５】
本発明で用いられるグルカンホスホリラーゼは、上記のような自然界に存在する、グルカンホスホリラーゼを産生する動物、植物、および微生物から直接単離され得る。
【０１５６】
本発明で用いられるグルカンホスホリラーゼは、これらの動物、植物または微生物から単離したグルカンホスホリラーゼをコードする遺伝子を用いて遺伝子組換えされた微生物（例えば、細菌、真菌など）から単離してもよい。
【０１５７】
グルカンホスホリラーゼは、上記のスクロースホスホリラーゼと同様に、遺伝子組換えされた微生物から得られ得る。
【０１５８】
遺伝子組換えに用いる微生物（例えば、細菌、真菌など）は、上記のスクロースホスホリラーゼと同様に、グルカンホスホリラーゼの発現の容易さ、培養の容易さ、増殖の速さ、安全性などの種々の条件を考慮して容易に選択され得る。グルカンホスホリラーゼは、夾雑物としてアミラーゼを含まないことが好ましいので、アミラーゼを産生しないかまたは低レベルでしか発現しない微生物（例えば、細菌、真菌など）を遺伝子組換えに用いることが好ましい。グルカンホスホリラーゼの遺伝子組換えのためには、大腸菌または枯草菌のような中温菌を用いることが好ましい。アミラーゼを産生しないかまたは低レベルでしか発現しない微生物（例えば、細菌、真菌など）を用いて産生されるグルカンホスホリラーゼは、アミラーゼを実質的に含まないため、本発明の方法での使用に好ましい。
【０１５９】
遺伝子組換えによって得られたグルカンホスホリラーゼの生産および精製は、上記のスクロースホスホリラーゼと同様に行われ得る。
【０１６０】
反応開始時の溶液中に含まれるグルカンホスホリラーゼの量は、反応開始時の溶液中のスクロースに対して、代表的には約０．０５〜１，０００Ｕ／ｇスクロース、好ましくは約０．１〜５００Ｕ／ｇスクロース、より好ましくは約０．５〜１００Ｕ／ｇスクロースである。グルカンホスホリラーゼの重量が多すぎると、反応中に変性した酵素が凝集しやすくなる場合がある。使用量が少なすぎると、グルカンの収率が低下する場合がある。
【０１６１】
グルカンホスホリラーゼは、精製されていても未精製であってもよい。グルカンホスホリラーゼは、固定化されていても固定化されていなくともよい。グルカンホスホリラーゼは、固定化されることが好ましい。固定化の方法としては、担体結合法（たとえば、共有結合法、イオン結合法、または物理的吸着法）、架橋法または包括法（格子型またはマイクロカプセル型）など、当業者に周知の方法が使用され得る。グルカンホスホリラーゼは、担体上に固定化されていることが好ましい。グルカンホスホリラーゼはまた、スクロースホスホリラーゼと同じ担体上に固定化されていてもよいし、別の担体上に固定化されていてもよい。同じ担体上に固定化されていることが好ましい。
【０１６２】
（６）枝切り酵素：
本発明の方法において、α−１，６−グルコシド結合を含有する出発材料を用いる場合などの、生成物に分岐が生じる場合には、必要に応じて、枝切り酵素を用いることができる。
【０１６３】
本発明で用いられ得る枝切り酵素は、α−１，６−グルコシド結合を切断し得る酵素である。枝切り酵素は、アミロペクチンおよびグリコーゲンにともによく作用するイソアミラーゼ（ＥＣ  ３．２．１．６８）と、アミロペクチン、グリコーゲンおよびプルランに作用するα−デキストリンエンド−１，６−α−グルコシダーゼ（プルラナーゼともいう）（ＥＣ  ３．２．１．４１）との２つに分類される。
【０１６４】
枝切り酵素は、微生物、細菌、および植物に存在する。枝切り酵素を産生する微生物の例としては、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．が挙げられる。枝切り酵素を産生する細菌の例としては、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｕｌｌｕｌｙｔｉｃｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍａｃｅｒａｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｉｒｃｕｌａｎｓ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｔｈｅｒｍｏａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ  ｔｈａｌｐｏｐｈｉｌｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｅｔｈａｎｏｌｉｃｕｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｍｙｌｏｄｅｒａｍｏｓａなどが挙げられる。枝切り酵素を産生する植物の例としては、ジャガイモ、サツマイモ、トウモロコシ、イネ、コムギ、オオムギ、オートムギ、サトウダイコンなどが挙げられる。枝切り酵素を産生する生物はこれらに限定されない。
【０１６５】
本発明で用いられ得る枝切り酵素は、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｕｌｌｕｌｙｔｉｃｕｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｍｙｌｏｄｅｒａｍｏｓａに由来することが好ましく、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｍｙｌｏｄｅｒａｍｏｓａに由来することがより好ましい。本発明で用いられる枝切り酵素は、反応至適温度が高いことが好ましい。反応至適温度が高い枝切り酵素は、例えば、高度好熱細菌に由来し得る。
【０１６６】
本発明で用いられ得る枝切り酵素は、上記のような自然界に存在する、枝切り酵素を産生する微生物、細菌、および植物から直接単離され得る。
【０１６７】
本発明で用いられ得る枝切り酵素は、これらの微生物、細菌、および植物から単離した枝切り酵素をコードする遺伝子を用いて遺伝子組換えされた微生物（例えば、細菌、真菌など）から単離してもよい。
【０１６８】
枝切り酵素は、上記のスクロースホスホリラーゼと同様に、遺伝子組換えされた微生物から得られ得る。
【０１６９】
遺伝子組換えに用いる微生物（例えば、細菌、真菌など）は、上記のスクロースホスホリラーゼと同様に、枝切り酵素の発現の容易さ、培養の容易さ、増殖の速さ、安全性などの種々の条件を考慮して容易に選択され得る。枝切り酵素は、夾雑物としてアミラーゼを含まないことが好ましいので、アミラーゼを産生しないかまたは低レベルでしか発現しない微生物（例えば、細菌、真菌など）を遺伝子組換えに用いることが好ましい。枝切り酵素の遺伝子組換えのためには、大腸菌または枯草菌のような中温菌を用いることが好ましい。アミラーゼを産生しないかまたは低レベルでしか発現しない微生物（例えば、細菌、真菌など）を用いて産生される枝切り酵素は、アミラーゼを実質的に含まないため、本発明の方法での使用に好ましい。
【０１７０】
遺伝子組換えによる枝切り酵素の生産および精製は、上記のスクロースホスホリラーゼと同様に行われ得る。
【０１７１】
反応開始時の溶液中に含まれる枝切り酵素の量は、反応開始時の溶液中のスクロースに対して、代表的には約０．０５〜１，０００Ｕ／ｇスクロース、好ましくは約０．１〜５００Ｕ／ｇスクロース、より好ましくは約０．５〜１００Ｕ／ｇスクロースである。枝切り酵素の重量が多すぎると、反応中に変性した酵素が凝集しやすくなる場合がある。使用量が少なすぎると、グルカンの収率が低下する場合がある。
【０１７２】
枝切り酵素は、精製されていても未精製であってもよい。枝切り酵素は、固定化されていても固定化されていなくともよい。枝切り酵素は、固定化されることが好ましい。固定化の方法としては、担体結合法（たとえば、共有結合法、イオン結合法、または物理的吸着法）、架橋法または包括法（格子型またはマイクロカプセル型）など、当業者に周知の方法が使用され得る。枝切り酵素は、担体上に固定化されていることが好ましい。枝切り酵素はまた、スクロースホスホリラーゼおよびグルカンホスホリラーゼの少なくとも一方と同じ担体上に固定化されていてもよいし、別の担体上に固定化されていてもよい。スクロースホスホリラーゼおよびグルカンホスホリラーゼの両方と同じ担体上に固定化されていることが好ましい。
【０１７３】
（７）ブランチングエンザイム（ＥＣ．２．４．１．１８）：
本発明の方法において、生成物に分岐を生じさせることが所望される場合には、必要に応じて、ブランチングエンザイムを用いることができる。
【０１７４】
本発明で用いられ得るブランチングエンザイムは、α−１，４−グルカン鎖の一部をこのα−１，４−グルカン鎖のうちのあるグルコース残基の６位に転移して分枝を作り得る酵素である。ブランチングエンザイムは、１，４−α−グルカン分枝酵素、枝つくり酵素またはＱ酵素とも呼ばれる。
【０１７５】
ブランチングエンザイムは、微生物、動物、および植物に存在する。ブランチングエンザイムを産生する微生物の例としては、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｌｄｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏａｇｕｌａｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｌｄｏｖｅｌｏｘ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｃａｔｅｎｕｌａｔｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｍｉｔｈｉｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ、Ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｌｉｃ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ、Ａｑｕｉｆｅｘ  ａｅｏｌｉｃｕｓ、Ｓｙｎｅｃｈｏｓｙｓｔｉｓ  ｓｐ．、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｉｒｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ、Ｒｈｏｄｏｔｈｅｒｍｕｓ  ｏｂａｍｅｎｓｉｓ、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ、酵母などが挙げられる。ブランチングエンザイムを産生する動物の例としてはヒト、ウサギ、ラット、ブタなどの哺乳類が挙げられる。ブランチングエンザイムを産生する植物の例としては、藻類、ジャガイモ、サツマイモ、ヤマイモ、キャッサバなどの芋類、ホウレンソウなどの野菜類、トウモロコシ、イネ、コムギ、オオムギ、ライムギ、アワなどの穀類、えんどう豆、大豆、小豆、うずら豆などの豆類などが挙げられる。ブランチングエンザイムを産生する生物はこれらに限定されない。
【０１７６】
本発明で用いられ得るブランチングエンザイムは、ジャガイモ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ａｑｕｉｆｅｘ  ａｅｏｌｉｃｕｓに由来することが好ましく、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ａｑｕｉｆｅｘ  ａｅｏｌｉｃｕｓに由来することがより好ましい。本発明で用いられるブランチングエンザイムは、反応至適温度が高いことが好ましい。反応至適温度が高いブランチングエンザイムは、例えば、高度好熱細菌に由来し得る。
【０１７７】
本発明で用いられ得るブランチングエンザイムは、上記のような自然界に存在する、ブランチングエンザイムを産生する微生物、動物、および植物から直接単離され得る。
【０１７８】
本発明で用いられ得るブランチングエンザイムは、これらの微生物、動物、および植物から単離したブランチングエンザイムをコードする遺伝子を用いて遺伝子組換えされた微生物（例えば、細菌、真菌など）から単離してもよい。
【０１７９】
ブランチングエンザイムは、上記のスクロースホスホリラーゼと同様に、遺伝子組換えされた微生物から得られ得る。
【０１８０】
遺伝子組換えに用いる微生物（例えば、細菌、真菌など）は、上記のスクロースホスホリラーゼと同様に、ブランチングエンザイムの発現の容易さ、培養の容易さ、増殖の速さ、安全性などの種々の条件を考慮して容易に選択され得る。ブランチングエンザイムは、夾雑物としてアミラーゼを含まないことが好ましいので、アミラーゼを産生しないかまたは低レベルでしか発現しない微生物（例えば、細菌、真菌など）を遺伝子組換えに用いることが好ましい。ブランチングエンザイムの遺伝子組換えのためには、大腸菌または枯草菌のような中温菌を用いることが好ましい。アミラーゼを産生しないかまたは低レベルでしか発現しない微生物（例えば、細菌、真菌など）を用いて産生されるブランチングエンザイムは、アミラーゼを実質的に含まないため、本発明の方法での使用に好ましい。
【０１８１】
遺伝子組換えによるブランチングエンザイムの生産および精製は、上記のスクロースホスホリラーゼと同様に行われ得る。
【０１８２】
反応開始時の溶液中に含まれるブランチングエンザイムの量は、反応開始時の溶液中のスクロースに対して、代表的には約１０〜１００，０００Ｕ／ｇスクロース、好ましくは約１００〜５０，０００Ｕ／ｇスクロース、より好ましくは約１，０００〜１０，０００Ｕ／ｇスクロースである。ブランチングエンザイムの重量が多すぎると、反応中に変性した酵素が凝集しやすくなる場合がある。使用量が少なすぎると、グルカンの収率が低下する場合がある。
【０１８３】
ブランチングエンザイムは、精製されていても未精製であってもよい。ブランチングエンザイムは、固定化されていても固定化されていなくともよい。ブランチングエンザイムは、固定化されることが好ましい。固定化の方法としては、担体結合法（たとえば、共有結合法、イオン結合法、または物理的吸着法）、架橋法または包括法（格子型またはマイクロカプセル型）など、当業者に周知の方法が使用され得る。ブランチングエンザイムは、担体上に固定化されていることが好ましい。ブランチングエンザイムはまた、スクロースホスホリラーゼおよびグルカンホスホリラーゼの少なくとも一方と同じ担体上に固定化されていてもよいし、別の担体上に固定化されていてもよい。スクロースホスホリラーゼおよびグルカンホスホリラーゼの両方と同じ担体上に固定化されていることが好ましい。
【０１８４】
（８）４−α−グルカノトランスフェラーゼ（ＥＣ．２．４．１．２５）
本発明の方法において、生成物に環状構造を生じさせる場合には、必要に応じて、４−α−グルカノトランスフェラーゼを用いることができる。
【０１８５】
本発明で用いられ得る４−α−グルカノトランスフェラーゼは、ディスプロポーショネーティングエンザイム、Ｄ−酵素、アミロマルターゼ、不均化酵素などとも呼ばれ、マルトオリゴ糖の糖転移反応（不均一化反応）を触媒し得る酵素である。４−α−グルカノトランスフェラーゼは、供与体分子の非還元末端からグルコシル基あるいは、マルトシルもしくはマルトオリゴシルユニットを受容体分子の非還元末端に転移する酵素である。従って、酵素反応は、最初に与えられたマルトオリゴ糖の重合度の不均一化をもたらす。供与体分子と受容体分子とが同一の場合は、分子内転移が生じ、その結果、環状構造をもつ生成物が得られる。
【０１８６】
４−α−グルカノトランスフェラーゼは、微生物および植物に存在する。４−α−グルカノトランスフェラーゼを産生する微生物の例としては、Ａｑｕｉｆｅｘ  ａｅｏｌｉｃｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｕｔｙｌｉｃｕｍ、Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｒａｄｉｏｄｕｒａｎｓ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｉｔｒａｌｉｓ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｐｓｉｔｔａｃｉ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．、Ｄｉｃｔｙｏｇｌｏｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍ、Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ、Ｓｙｎｅｃｈｏｓｙｓｔｉｓ  ｓｐ．、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓなどが挙げられる。４−α−グルカノトランスフェラーゼを産生する植物の例としては、ジャガイモ、サツマイモ、ヤマイモ、キャッサバなどの芋類、トウモロコシ、イネ、コムギ、などの穀類、えんどう豆、大豆、などの豆類などが挙げられる。４−α−グルカノトランスフェラーゼを産生する生物はこれらに限定されない。
【０１８７】
本発明で用いられ得る４−α−グルカノトランスフェラーゼは、ジャガイモ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｉｔｒａｌｉｓに由来することが好ましく、ジャガイモ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓに由来することがより好ましい。本発明で用いられる４−α−グルカノトランスフェラーゼは、反応至適温度が高いことが好ましい。反応至適温度が高い４−α−グルカノトランスフェラーゼは、例えば、高度好熱細菌に由来し得る。
【０１８８】
本発明で用いられ得る４−α−グルカノトランスフェラーゼは、上記のような自然界に存在する、４−α−グルカノトランスフェラーゼを産生する微生物および植物から直接単離され得る。
【０１８９】
本発明で用いられ得る４−α−グルカノトランスフェラーゼは、これらの微生物および植物から単離した４−α−グルカノトランスフェラーゼをコードする遺伝子を用いて遺伝子組換えされた微生物（例えば、細菌、真菌など）から単離してもよい。
【０１９０】
４−α−グルカノトランスフェラーゼは、上記のスクロースホスホリラーゼと同様に、遺伝子組換えされた微生物から得られ得る。
【０１９１】
遺伝子組換えに用いる微生物（例えば、細菌、真菌など）は、上記のスクロースホスホリラーゼと同様に、４−α−グルカノトランスフェラーゼの発現の容易さ、培養の容易さ、増殖の速さ、安全性などの種々の条件を考慮して容易に選択され得る。４−α−グルカノトランスフェラーゼは、夾雑物としてアミラーゼを含まないことが好ましいので、アミラーゼを産生しないかまたは低レベルでしか発現しない微生物（例えば、細菌、真菌など）を遺伝子組換えに用いることが好ましい。４−α−グルカノトランスフェラーゼの遺伝子組換えのためには、大腸菌または枯草菌のような中温菌を用いることが好ましい。アミラーゼを産生しないかまたは低レベルでしか発現しない微生物（例えば、細菌、真菌など）を用いて産生される４−α−グルカノトランスフェラーゼは、アミラーゼを実質的に含まないため、本発明の方法での使用に好ましい。
【０１９２】
遺伝子組換えによる４−α−グルカノトランスフェラーゼの生産および精製は、上記のスクロースホスホリラーゼと同様に行われ得る。
【０１９３】
反応開始時の溶液中に含まれる４−α−グルカノトランスフェラーゼの量は、反応開始時の溶液中のスクロースに対して、代表的には約０．０５〜１，０００Ｕ／ｇスクロース、好ましくは約０．１〜５００Ｕ／ｇスクロース、より好ましくは約０．５〜１００Ｕ／ｇスクロースである。４−α−グルカノトランスフェラーゼの重量が多すぎると、反応中に変性した酵素が凝集しやすくなる場合がある。使用量が少なすぎると、グルカンの収率が低下する場合がある。
【０１９４】
４−α−グルカノトランスフェラーゼは、精製されていても未精製であってもよい。４−α−グルカノトランスフェラーゼは、固定化されていても固定化されていなくともよい。４−α−グルカノトランスフェラーゼは、固定化されることが好ましい。固定化の方法としては、担体結合法（たとえば、共有結合法、イオン結合法、または物理的吸着法）、架橋法または包括法（格子型またはマイクロカプセル型）など、当業者に周知の方法が使用され得る。４−α−グルカノトランスフェラーゼは、担体上に固定化されていることが好ましい。４−α−グルカノトランスフェラーゼはまた、スクロースホスホリラーゼおよびグルカンホスホリラーゼの少なくとも一方と同じ担体上に固定化されていてもよいし、別の担体上に固定化されていてもよい。スクロースホスホリラーゼおよびグルカンホスホリラーゼの両方と同じ担体上に固定化されていることが好ましい。
【０１９５】
（９）グリコーゲンデブランチングエンザイム（ＥＣ．２．４．１．２５／ＥＣ．３．２．１．３３）
本発明の方法において、生成物に環状構造を生じさせる場合には、必要に応じて、グリコーゲンデブランチングエンザイムを用いることができる。
【０１９６】
本発明で用いられ得るグリコーゲンデブランチングエンザイムは、α−１，６−グルコシダーゼ活性と、４−α−グルカノトランスフェラーゼ活性との２種類の活性をもつ酵素である。グリコーゲンデブランチングエンザイムが持つ、４−α−グルカノトランスフェラーゼ活性により、環状構造を持つ生成物が得られる。
【０１９７】
グリコーゲンデブランチングエンザイムは、微生物および動物に存在する。グリコーゲンデブランチングエンザイムを産生する微生物の例としては、酵母などが挙げられる。グリコーゲンデブランチングエンザイムを産生する動物の例としては、ヒト、ウサギ、ラット、ブタなどの哺乳類が挙げられる。グリコーゲンデブランチングエンザイムを産生する生物はこれらに限定されない。
【０１９８】
本発明で用いられ得るグリコーゲンデブランチングエンザイムは、酵母に由来することが好ましい。本発明で用いられるグリコーゲンデブランチングエンザイムは、反応至適温度が高いことが好ましい。反応至適温度が高いグリコーゲンデブランチングエンザイムは、例えば、タンパク質工学的手法により、中温で作用し得る酵素に改変を加えることで得られる。
【０１９９】
本発明で用いられ得るグリコーゲンデブランチングエンザイムは、上記のような自然界に存在する、グリコーゲンデブランチングエンザイムを産生する微生物および動物から直接単離され得る。
【０２００】
本発明で用いられ得るグリコーゲンデブランチングエンザイムは、これらの微生物および動物から単離したグリコーゲンデブランチングエンザイムをコードする遺伝子を用いて遺伝子組換えされた微生物（例えば、細菌、真菌など）から単離してもよい。
【０２０１】
グリコーゲンデブランチングエンザイムは、上記のスクロースホスホリラーゼと同様に、遺伝子組換えされた微生物から得られ得る。
【０２０２】
遺伝子組換えに用いる微生物（例えば、細菌、真菌など）は、上記のスクロースホスホリラーゼと同様に、グリコーゲンデブランチングエンザイムの発現の容易さ、培養の容易さ、増殖の速さ、安全性などの種々の条件を考慮して容易に選択され得る。グリコーゲンデブランチングエンザイムは、夾雑物としてアミラーゼを含まないことが好ましいので、アミラーゼを産生しないかまたは低レベルでしか発現しない微生物（例えば、細菌、真菌など）を遺伝子組換えに用いることが好ましい。グリコーゲンデブランチングエンザイムの遺伝子組換えのためには、大腸菌または枯草菌のような中温菌を用いることが好ましい。アミラーゼを産生しないかまたは低レベルでしか発現しない微生物（例えば、細菌、真菌など）を用いて産生されるグリコーゲンデブランチングエンザイムは、アミラーゼを実質的に含まないため、本発明の方法での使用に好ましい。
【０２０３】
遺伝子組換えによるグリコーゲンデブランチングエンザイムの生産および精製は、上記のスクロースホスホリラーゼと同様に行われ得る。
【０２０４】
反応開始時の溶液中に含まれるグリコーゲンデブランチングエンザイムの量は、反応開始時の溶液中のスクロースに対して、代表的には約０．０１〜５，０００Ｕ／ｇスクロース、好ましくは約０．１〜１，０００Ｕ／ｇスクロース、より好ましくは約１〜５００Ｕ／ｇスクロースである。グリコーゲンデブランチングエンザイムの重量が多すぎると、反応中に変性した酵素が凝集しやすくなる場合がある。使用量が少なすぎると、グルカンの収率が低下する場合がある。
【０２０５】
グリコーゲンデブランチングエンザイムは、精製されていても未精製であってもよい。グリコーゲンデブランチングエンザイムは、固定化されていても固定化されていなくともよい。グリコーゲンデブランチングエンザイムは、固定化されることが好ましい。固定化の方法としては、担体結合法（たとえば、共有結合法、イオン結合法、または物理的吸着法）、架橋法または包括法（格子型またはマイクロカプセル型）など、当業者に周知の方法が使用され得る。グリコーゲンデブランチングエンザイムは、担体上に固定化されていることが好ましい。グリコーゲンデブランチングエンザイムはまた、スクロースホスホリラーゼおよびグルカンホスホリラーゼの少なくとも一方と同じ担体上に固定化されていてもよいし、別の担体上に固定化されていてもよい。スクロースホスホリラーゼおよびグルカンホスホリラーゼの両方と同じ担体上に固定化されていることが好ましい。
【０２０６】
（１０）溶媒：
本発明の方法に用いる溶媒は、スクロースホスホリラーゼおよびグルカンホスホリラーゼの酵素活性を損なわない溶媒であれば任意の溶媒であり得る。
【０２０７】
なお、グルカンを生成する反応が進行し得る限り、溶媒が本発明の方法に用いる材料を完全に溶解する必要はない。例えば、酵素が固体の担体上に担持されている場合には、酵素が溶媒中に溶解する必要はない。さらに、スクロースなどの反応材料も全てが溶解している必要はなく、反応が進行し得る程度の材料の一部が溶解していればよい。
【０２０８】
代表的な溶媒は、水である。溶媒は、上記スクロースホスホリラーゼまたはグルカンホスホリラーゼを調製する際にスクロースホスホリラーゼまたはグルカンホスホリラーゼに付随して得られる細胞破砕液のうちの水分であってもよい。
【０２０９】
水は、軟水、中間水および硬水のいずれであってもよい。軟水とは、硬度２０°以上の水をいい、中間水とは、硬度１０°以上２０°未満の水をいい、硬水とは、硬度１０°未満の水をいう。水は、好ましくは軟水または中間水であり、より好ましくは軟水である。
【０２１０】
（１１）他の成分：
スクロース、プライマー、無機リン酸またはグルコース−１−リン酸、スクロースホスホリラーゼおよびグルカンホスホリラーゼを含む溶液中には、スクロースホスホリラーゼとスクロースとの間の相互作用およびグルカンホスホリラーゼとプライマーとの間の相互作用を妨害しない限り、任意の他の物質を含み得る。このような物質の例としては、緩衝剤、スクロースホスホリラーゼを産生する微生物（例えば、細菌、真菌など）の成分、グルカンホスホリラーゼを産生する微生物（例えば、細菌、真菌など）の成分、塩類、培地成分などが挙げられる。
【０２１１】
＜グルカンの製造＞
本発明のグルカンは、スクロース、プライマー、無機リン酸またはグルコース−１−リン酸、スクロースホスホリラーゼ、およびグルカンホスホリラーゼを含む反応溶液を反応させる工程により製造される。
【０２１２】
図１に、本願発明で用いるスクロースからのグルカン合成の概略を示す。スクロースと無機リン酸からスクロースホスホリラーゼを用いて、グルコース−１−リン酸が生成される。生成されたグルコース−１−リン酸および反応溶液に加えたグルコース−１−リン酸は、直ちにグルカンホスホリラーゼにより適切なプライマーに転移され、α−１，４−グルカン鎖が伸長される。また、その際に生成される無機リン酸は、再度スクロースホスホリラーゼの反応にリサイクルされる仕組みになっている。
【０２１３】
まず、反応溶液を調製する。反応溶液は、例えば、適切な溶媒に、固体状のスクロース、プライマー、無機リン酸またはグルコース−１−リン酸、スクロースホスホリラーゼ、およびグルカンホスホリラーゼを添加することにより調製され得る。あるいは、反応溶液は、スクロース、プライマー、無機リン酸またはグルコース−１−リン酸、スクロースホスホリラーゼ、またはグルカンホスホリラーゼをそれぞれ含む溶液を混合することによって調製してもよい。あるいは、反応溶液は、スクロース、プライマー、無機リン酸またはグルコース−１−リン酸、スクロースホスホリラーゼ、およびグルカンホスホリラーゼのうちのいくつかの成分を含む溶液に固体状の他の成分を混合することによって調製してもよい。この反応溶液には、酵素反応を阻害しない限り、必要に応じて、ｐＨを調整する目的で任意の緩衝剤を加えてもよい。この反応溶液には、必要に応じて枝切り酵素、ブランチングエンザイム、４−α−グルカノトランスフェラーゼおよびグリコーゲンデブランチングエンザイムからなる群より選択される酵素を添加してもよい。
【０２１４】
次いで、反応溶液を、当該分野で公知の方法によって必要に応じて加熱することにより、反応させる。反応温度は、本発明の効果が得られる限り、任意の温度であり得る。反応開始時の反応溶液中のスクロース濃度が約５〜約１００％である場合には、反応温度は代表的には、約４０℃〜約７０℃の温度であり得る。この反応工程における溶液の温度は、所定の反応時間後に反応前のこの溶液に含まれるスクロースホスホリラーゼおよびグルカンホスホリラーゼの少なくとも一方、好ましくは両方の活性の約５０％以上、より好ましくは約８０％以上の活性が残る温度であることが好ましい。この温度は好ましくは約４０℃〜約７０℃であり、より好ましくは約４５℃〜約７０℃、さらにより好ましくは約４５℃〜約６５℃である。
【０２１５】
なお、上述した第１の方法の場合、すなわち、反応開始時から反応終了時までの間の反応溶液のスクロース−リン酸比率の最大値が約１７以下の場合、反応温度は、上述した範囲よりも低くてもよい。上述した第４の方法の場合、すなわち、反応開始時の反応溶液のスクロース−リン酸比率が約１７以下の場合、および上述した第５の方法の場合、すなわち、スクロース、無機リン酸またはグルコース−１−リン酸を反応溶液に追加する工程を包含する場合も、反応温度は、上述した範囲よりも低くてもよい。例えば、加熱を行わずに室温で反応させてもよい。
【０２１６】
反応時間は、反応温度、反応により生産されるグルカンの分子量および酵素の残存活性を考慮して、任意の時間で設定され得る。反応時間は、代表的には約１時間〜約１００時間、より好ましくは約１時間〜約７２時間、さらにより好ましくは約２時間〜約３６時間、最も好ましくは約２時間〜約２４時間である。
【０２１７】
加熱は、どのような手段を用いて行ってもよいが、溶液全体に均質に熱が伝わるように、攪拌を行いながら加熱することが好ましい。溶液は、例えば、温水ジャケットと攪拌装置を備えたステンレス製反応タンクの中に入れられて攪拌される。
【０２１８】
本発明の方法ではまた、反応がある程度進んだ段階で、スクロース、スクロースホスホリラーゼおよびグルカンホスホリラーゼの少なくとも１つを反応溶液に追加してもよい。
【０２１９】
このようにして、グルカンを含有する溶液が生産される。
【０２２０】
反応終了後、反応溶液は、必要に応じて例えば、１００℃にて１０分間加熱することによって反応溶液中の酵素を失活させ得る。あるいは、酵素を失活させる処理を行うことなく後の工程を行ってもよい。反応溶液は、そのまま保存されてもよいし、生産されたグルカンを単離するために処理されてもよい。
【０２２１】
＜精製方法＞
生産されたグルカンは、必要に応じて精製され得る。精製することにより除去される不純物の例は、フルクトースである。グルカンの精製法の例としては、有機溶媒を用いる方法（Ｔ．Ｊ．Ｓｃｈｏｃｈら、Ｊ．Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ，６４，２９５７（１９４２））および有機溶媒を用いない方法がある。
【０２２２】
有機溶媒を用いる精製に使用され得る有機溶媒の例としては、アセトン、ｎ−アミルアルコール、ペンタゾール、ｎ−プロピルアルコール、ｎ−ヘキシルアルコール、２−エチル−１−ブタノール、２−エチル−１−ヘキサノール、ラウリルアルコール、シクロヘキサノール、ｎ−ブチルアルコール、３−ペンタノール、４−メチル−２−ペンタノール、ｄ，ｌ−ボルネオール、α−テルピネオール、イソブチルアルコール、ｓｅｃ−ブチルアルコール、２−メチル−１−ブタノール、イソアミルアルコール、ｔｅｒｔ−アミルアルコール、メントール、メタノール、エタノールおよびエーテルが挙げられる。
【０２２３】
有機溶媒を用いない精製方法の例を、以下に示す。
【０２２４】
（１）グルカン生産反応後、反応溶液を冷却することによりグルカンを沈澱させ、そして沈澱したグルカンを、膜分画、濾過、遠心分離などの一般的な固液分離方法により精製する方法；
（２）グルカン生産反応の間もしくはグルカン生産反応後に反応溶液を冷却してグルカンをゲル化し、ゲル化したグルカンを回収し、そしてゲル化したグルカンから、フルクトースを、水による洗浄、凍結融解、ろ過などの操作によって除去する方法；ならびに
（３）グルカン生産反応後、水に溶解しているグルカンを沈澱させずに、限外ろ過膜を用いた膜分画もしくはクロマトグラフィーに供してフルクトースを除去する方法。
【０２２５】
精製に使用され得る限外濾過膜の例としては、分画分子量約１，０００〜約１００，０００、好ましくは約５，０００〜約５０，０００、より好ましくは約１０，０００〜約３０，０００の限外濾過膜（ダイセル製ＵＦ膜ユニット）が挙げられる。
【０２２６】
クロマトグラフィーに使用され得る担体の例としては、ゲル濾過クロマトグラフィー用担体、配位子交換クロマトグラフィー用担体、イオン交換クロマトグラフィー用担体および疎水クロマトグラフィー用担体が挙げられる。
【実施例】
【０２２７】
以下の実施例により本発明をさらに詳細に説明する。本発明は以下の実施例のみに限定されない。
【０２２８】
（１．測定方法および計算方法）
本発明における各種物質は、以下の測定方法によって測定した。
【０２２９】
（１．１  グルコースの定量）
グルコースを、市販されている測定キットを用いて定量した。グルコースＡＲ−ＩＩ発色試薬（和光純薬社製）を用いて測定する。
【０２３０】
（１．２  フルクトースの定量）
フルクトースを、市販されている測定キットを用いて定量した。Ｆ−キット  Ｄ−グルコース／Ｄ−フルクトース（ロシュ社製）を用いて測定する。
【０２３１】
（１．３  グルコース−１−リン酸の定量）
グルコース−１−リン酸を、以下の方法により定量した。３００μｌの測定試薬（２００ｍＭ  Ｔｒｉｓ‐ＨＣｌ（ｐＨ７．０）、３ｍＭ  ＮＡＤＰ、１５ｍＭ  塩化マグネシウム、３ｍＭ  ＥＤＴＡ、１５μＭグルコース−１，６−二リン酸、６μｇ／ｍｌ  ホスホグルコムターゼ、６μｇ／ｍｌ  グルコース−６−リン酸脱水素酵素）に、適切に希釈したグルコース−１−リン酸を含む溶液６００μｌを加えて攪拌し、反応系を得る。この反応系を、３０℃で３０分間保持した後、分光光度計を用いて３４０ｎｍでの吸光度を測定する。濃度既知のグルコース−１−リン酸ナトリウムを用いて同様に吸光度を測定し、標準曲線を作成する。この標準曲線に試料で得られた吸光度を当てはめ、試料中のグルコース−１−リン酸濃度を求める。通常は、１分間に１μｍｏｌのグルコース−１−リン酸を生成する活性を１単位とする。この定量法では、グルコース−１−リン酸のみが定量され、無機リン酸の量は定量されない。
【０２３２】
（１．４  無機リン酸の定量）
無機リン酸を、リン酸イオンとして以下の方法により求めた。無機リン酸を含む溶液（２００μｌ）に対し、８００μｌのモリブデン試薬（１５ｍＭ  モリブデン酸アンモニウム、１００ｍＭ  酢酸亜鉛）を混合し、続いて２００μｌの５６８ｍＭアスコルビン酸（ｐＨ５．０）を加えて攪拌し、反応系を得る。この反応系を、３０℃で２０分間保持した後、分光光度計を用いて８５０ｎｍでの吸光度を測定する。濃度既知の無機リン酸を用いて同様に吸光度を測定し、標準曲線を作成する。この標準曲線に試料で得られた吸光度を当てはめ、試料中の無機リン酸を求める。この定量法では、無機リン酸の量が定量され、グルコース−１−リン酸の量は定量されない。
【０２３３】
（１．５  グルカンの収量の計算方法）
出発物質として無機リン酸を用いて製造したグルカンの収量は、反応終了後の溶液中の、グルコース、フルクトース、およびグルコース−１−リン酸の量から、以下の式により求められる。
【０２３４】
【化３】
2004526463.tif 000004
この式は、以下の原理に基づく。
【０２３５】
本発明の方法では、まず、以下の式の反応（Ａ）が起き得る。
【０２３６】
【化４】
2004526463.tif 000005
この反応は、スクロースホスホリラーゼにより触媒される。この反応では、スクロースと無機リン酸とが反応して、同じモル量のグルコース−１−リン酸とフルクトースとが生じる。生じたフルクトースはそれ以上他の物質と反応しないので、フルクトースのモル量を測定することによって生じたグルコース−１−リン酸のモル量がわかる。
【０２３７】
スクロースホスホリラーゼは、上記の反応（Ａ）の他に、以下の反応（Ｂ）のスクロースの加水分解も副反応として触媒し得る。
【０２３８】
【化５】
2004526463.tif 000006
グルカンに取り込まれたグルコース量は以下によって計算される。
【０２３９】
【化６】
2004526463.tif 000007
反応（Ｂ）で生成するフルクトースを考慮すると、反応Ａにより生成されたフルクトースの量は、以下によって算出される：
【０２４０】
【化７】
2004526463.tif 000008
したがって、グルカンの収量は、以下の式により求められる。
【０２４１】
【化８】
2004526463.tif 000009
出発物質として、グルコース−１−リン酸を用いて製造したグルカンの収量は、初発のグルコース−１−リン酸の量、ならびに反応終了後の溶液中のグルコース、フルクトースおよびグルコース−１−リン酸の量から、以下の式により求められる。
【０２４２】
【化９】
2004526463.tif 000010
この式は以下の原理に基づく。
【０２４３】
反応溶液中では、初発のグルコース−１−リン酸に加えて、反応Ａによって、グルコース−１−リン酸が生成される。つまり、初発のグルコース−１−リン酸と生成されたグルコース−１−リン酸とが、グルカンの合成に使われ得る。グルカンの合成に使われ得るグルコース−１−リン酸の量から、反応終了後に反応溶液に残存するグルコース−１−リン酸の量を差し引くことによって、反応に使用されたグルコース−１−リン酸の量、すなわち、グルカンに取り込まれたグルコースの量を算出できる。したがって、グルカンに取り込まれたグルコースの量を上記に示す式により求められる。なお、この式は、ＳＰ−ＧＰ反応系において出発材料として無機リン酸とグルコース−１−リン酸とを併用した場合にも適用できる。
【０２４４】
（１．６  グルカンの収率）
出発物質として無機リン酸を用いて製造した場合のグルカンの収率は、以下の式によって求められる。
【０２４５】
【化１０】
2004526463.tif 000011
出発物質としてグルコース−１−リン酸を用いて製造した場合のグルカンの収率は、以下の式によって求められる。
【０２４６】
【化１１】
2004526463.tif 000012
なお、この式は、ＳＰ−ＧＰ反応系において出発材料として無機リン酸とグルコース−１−リン酸とを併用した場合にも適用できる。
【０２４７】
（１．７  グルカンホスホリラーゼの活性測定）
グルカンホスホリラーゼの活性単位を、以下の方法により測定した。
【０２４８】
５０μｌの４％クラスターデキストリン水溶液と５０μｌの５０ｍＭグルコース−１−リン酸ナトリウム水溶液とを混合し、さらに適切に希釈した酵素液１００μｌを加えて反応を開始させる。混合物を３７℃で１５分間反応させた後、２０％ＳＤＳを１０μｌ加え、反応を停止する。その後、反応溶液中の無機リン酸の量を上記１．４に記載の方法により定量する。この方法により、１分間に１μｍｏｌの無機リン酸を生成する活性を１単位とする。ただし、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ  グルカンホスホリラーゼは３７℃の代わりに５０℃で反応させて活性を測定する。
【０２４９】
（１．８  スクロースホスホリラーゼの活性測定）
スクロースホスホリラーゼの活性単位を、以下の方法により求めた。
【０２５０】
２５μｌの１０％スクロースと２０μｌの５００ｍＭ  リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）とを混合する。この混合液に、不溶性タンパク質を除去した適切に希釈した酵素液を５μｌ加えて攪拌し、反応系を得る。この反応系を３７℃で２０分間反応させた後、１００℃で５分間加熱し反応を停止させる。その後、反応後の溶液中のグルコース−１−リン酸を定量する。通常は、１分間に１μｍｏｌのグルコース−１−リン酸を生成する活性を１単位とする。
【０２５１】
（２．酵素の調製）
本発明の実施例で用いた各種酵素は、以下の方法によって調製した。
【０２５２】
（２．１  馬鈴薯塊茎由来グルカンホスホリラーゼの調製方法）
市販されている馬鈴薯塊茎１．４ｋｇの皮をむく。皮をむいた塊茎をジューサーですりつぶしてすりつぶし液を得る。次いで、このすりつぶし液をガーゼで濾過して濾液を得る。濾液に、Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．０）を最終濃度１００ｍＭになるように加えて、酵素液を得る。この酵素液を、５５℃の水浴中で、液温が５０℃に達してからさらに１０分間加熱する。加熱後、この酵素液を、遠心機（ベックマン社製、ＡＶＡＮＴＩ  Ｊ−２５Ｉ）を用いて、８，５００ｒｐｍにて、２０分間遠心分離し、不溶性のタンパク質などを除去し、上清を得る。
【０２５３】
得られた遠心上清に、硫酸アンモニウムを１００ｇ／Ｌになるように加えてから、４℃にて２時間放置し、タンパク質を沈澱させる。次いで、遠心機（ベックマン社製、ＡＶＡＮＴＩ  Ｊ−２５Ｉ）を用いて、８，５００ｒｐｍにて２０分間遠心分離し、不溶性のタンパク質などを除去し、上清を得る。さらに、得られた上清に硫酸アンモニウムを最終濃度２５０ｇ／Ｌになるように加えてから、４℃にて２時間放置し、タンパク質を沈澱させる。次いで、遠心機（ベックマン社製、ＡＶＡＮＴＩ  Ｊ−２５Ｉ）を用いて、８，５００ｒｐｍ、２０分間遠心分離し、不溶性のタンパク質を回収する。
【０２５４】
回収された不溶性のタンパク質を２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．０）１５０ｍｌで懸濁する。懸濁した酵素液を同じ緩衝液に対して一晩透析する。透析後のサンプルを、あらかじめ平衡化しておいた陰イオン交換樹脂Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（ファルマシア社製）に吸着させ、２００ｍＭ塩化ナトリウムを含む緩衝液で洗浄する。続いて、４００ｍＭ塩化ナトリウムを含む緩衝液で溶出させ、溶出液を回収し、部分精製馬鈴薯塊茎由来グルカンホスホリラーゼ含有溶液とする。
【０２５５】
購入した馬鈴薯によっては、この段階で本発明に使用し得るグルカンホスホリラーゼ含有溶液になるが、さらなる精製を必要とすることが多い。必要に応じて、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−２００ＨＲ（ファルマシア社製）などを用いたゲルフィルトレーションクロマトグラフィーによる分画、Ｐｈｅｎｙｌ−ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ  ６５０Ｍ（東ソー社製）などを用いた疎水クロマトグラフィーによる分画を組み合わせることにより、精製馬鈴薯グルカンホスホリラーゼ含有溶液を得ることができる。
【０２５６】
（２．２  組換え馬鈴薯グルカンホスホリラーゼの調製方法）
馬鈴薯グルカンホスホリラーゼ遺伝子（Ｎａｋａｎｏら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ｔｏｋｙｏ）１０６（１９８９）６９１）を選択マーカー遺伝子Ａｍｐｒとともに発現ベクターｐＥＴ３４（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）に組み込み、プラスミドｐＥＴ−ＰＧＰ１１３を得た。このプラスミドでは、グルカンホスホリラーゼ遺伝子を、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）誘導性プロモーターの制御下に作動可能に連結した。このプラスミドを、大腸菌ＴＧ−１（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）に、コンピテントセル法により導入した。この大腸菌を、抗生物質アンピシリンを含むＬＢ培地（１％トリプトン、０．５％酵母エキス（ともにＤｉｆｃｏ社製）、１％塩化ナトリウム、１．５％寒天））を含むプレートにプレーティングして、３７℃で一晩培養した。このプレート上で増殖した大腸菌を選択することにより、馬鈴薯由来グルカンホスホリラーゼ遺伝子が導入された大腸菌を得た。得られた大腸菌がグルカンホスホリラーゼ遺伝子を含むことを、導入された遺伝子の配列を解析することによって確認した。また、得られた大腸菌がグルカンホスホリラーゼを発現していることを、活性測定によって確認した。
【０２５７】
この大腸菌を、抗生物質アンピシリンを含むＬＢ培地（１％トリプトン、０．５％酵母エキス（ともにＤｉｆｃｏ社製）、１％塩化ナトリウム）１リットルに接種し、１２０ｒｐｍで振盪させながら３７℃で３時間振盪培養した。その後、ＩＰＴＧを０．１ｍＭ、ピリドキシンを１ｍＭになるようにそれぞれこの培地に添加し、２２℃でさらに２０時間振盪培養した。次いで、この培養液を５，０００ｒｐｍにて５分間遠心分離して、大腸菌の菌体を収集した。得られた菌体を、５０ｍｌの０．０５％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含む２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）中に懸濁し、次いで超音波処理により破砕し、菌体破砕液５０ｍｌを得た。この破砕液中には、４．７Ｕ／ｍｇのグルカンホスホリラーゼが含まれていた。
【０２５８】
この菌体破砕液を、５５℃で３０分間加熱する。加熱後、８，５００ｒｐｍにて２０分間遠心分離し、不溶性のタンパク質などを除去して上清を得る。得られた上清を、あらかじめ平衡化しておいた陰イオン交換樹脂Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅに流してグルカンホスホリラーゼを樹脂に吸着させた。樹脂を、２００ｍＭ塩化ナトリウムを含む緩衝液で洗浄して不純物を除去した。続いて、タンパク質を３００ｍＭ塩化ナトリウムを含む緩衝液で溶出させ、組換えグルカンホスホリラーゼ酵素溶液とした。
【０２５９】
（２．３  Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓグルカンホスホリラーゼの調製方法）
鷹羽ら（Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｇｌｙｃｏｓｃｉ．，４８（１）（２００１）７１）の方法により調製した酵素をＴｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓグルカンホスホリラーゼとする。
【０２６０】
（２．４  組換えＴｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓグルカンホスホリラーゼの調製方法）
Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓグルカンホスホリラーゼ遺伝子（Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｇｌｙｃｏｓｃｉ．，４８（１）（２００１）７１）を、選択マーカー遺伝子ＡｍｐｒおよびＴｅｔｒとともにｐＫＫ３８８−１（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社製）に組み込み、プラスミドｐＫＫ３８８−ＧＰを得た。このプラスミドでは、グルカンスホリラーゼ遺伝子を、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）誘導性プロモーターの制御下に作動可能に連結した。このプラスミドを、大腸菌ＭＣ１０６１（ファルマシア社製）に、コンピテントセル法により導入した。この大腸菌を、抗生物質アンピシリンおよびＩＰＴＧを含むＬＢ培地を含むプレートにプレーティングして、３７℃で一晩培養した。このプレート上で増殖した大腸菌を選択することにより、グルカンホスホリラーゼ遺伝子が導入された大腸菌を得た。得られた大腸菌がグルカンホスホリラーゼ遺伝子を含むことを、導入された遺伝子の配列を解析することによって確認した。また、得られた大腸菌がグルカンホスホリラーゼを発現していることを、活性測定によって確認した。
【０２６１】
この大腸菌を、抗生物質アンピシリンを含むＬＢ培地１リットルに接種し、１２０ｒｐｍで振盪させながら３７℃で４〜５時間振盪培養した。その後、ＩＰＴＧを０．０１ｍＭになるようにこの培地に添加し、３７℃でさらに２０時間振盪培養した。次いで、この培養液を５，０００ｒｐｍにて５分間遠心分離して、大腸菌の菌体を収集した。
【０２６２】
得られた菌体を、５０ｍｌの２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）中に懸濁し、次いで超音波処理により破砕し、菌体破砕液５０ｍｌを得た。この破砕液中には、４．２Ｕ／ｍｇのグルカンホスホリラーゼが含まれていた。
【０２６３】
次いで、菌体破砕液を７０℃で３０分間加熱した。加熱後、この菌体破砕液を、遠心機（ベックマン社製、ＡＶＡＮＴＩ  Ｊ−２５Ｉ）を用いて８，５００ｒｐｍ、２０分間遠心分離し、不溶性のタンパク質などを除去し、上清を得た。得られた上清を、組換えＴｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓグルカンホスホリラーゼ溶液とした。
【０２６４】
（２．５  組換えＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ由来スクロースホスホリラーゼの調製方法）
Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ由来スクロースホスホリラーゼ遺伝子（Ｆｅｒｒｅｔｔｉ，Ｊ．Ｊら、Ｉｎｇｂｒｉｔｔ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．５６：１５８５−８８）を、選択マーカー遺伝子ＡｍｐｒおよびＴｅｔｒとともにｐＫＫ３８８−１に組み込み、プラスミドｐＫＫ３８８−ＳＭＳＰを得た。このプラスミドでは、スクロースホスホリラーゼ遺伝子を、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）誘導性プロモーターの制御下に作動可能に連結した。このプラスミドを、大腸菌ＴＧ−１（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）に、コンピテントセル法により導入した。この大腸菌を、抗生物質アンピシリンおよびＩＰＴＧを含むＬＢ培地を含むプレートにプレーティングして、３７℃で一晩培養した。このプレート上で増殖した大腸菌を選択することにより、スクロースホスホリラーゼ遺伝子が導入された大腸菌を得た。得られた大腸菌がスクロースホスホリラーゼ遺伝子を含むことを、導入された遺伝子の配列を解析することによって確認した。また、得られた大腸菌がスクロースホスホリラーゼを発現していることを、活性測定によって確認した。
【０２６５】
この大腸菌を、抗生物質アンピシリンおよびテトラサイクリンを含むＬＢ培地１リットルに接種し、１２０ｒｐｍで振盪させながら３７℃で６〜７時間振盪培養した。その後、ＩＰＴＧを０．０４ｍＭになるようにこの培地に添加し、３０℃でさらに１８時間振盪培養した。次いで、この培養液を５，０００ｒｐｍにて５分間遠心分離して、大腸菌の菌体を収集した。得られた菌体を、５０ｍｌの２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）中に懸濁し、次いで超音波処理により破砕し、菌体破砕液５０ｍｌを得た。この破砕液中には、１０Ｕ／ｍｇのスクロースホスホリラーゼが含まれていた。
【０２６６】
次いで、菌体破砕液にスクロースを加えて、１０％スクロースを含む菌体破砕液を得た。この菌体破砕液を、５５℃の水浴中で３０分間加熱した。加熱後、この菌体破砕液を、遠心機（ベックマン社製、ＡＶＡＮＴＩ  Ｊ−２５Ｉ）を用いて８，５００ｒｐｍにて２０分間遠心分離し、不溶性のタンパク質などを除去し、上清を得た。得られた上清を、あらかじめ平衡化しておいた陰イオン交換樹脂Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅに流してスクロースホスホリラーゼを樹脂に吸着させた。樹脂を、１００ｍＭ塩化ナトリウムを含む緩衝液で洗浄して不純物を除去した。続いて、３００ｍＭ塩化ナトリウムを含む緩衝液でスクロースホスホリラーゼを溶出させ、組換えＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ由来スクロースホスホリラーゼ酵素液とした。
【０２６７】
（２．６  組換えＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  グルカンホスホリラーゼの調製）
高田ら（Ｊ．Ｆｅｒｍｅｎｔ．Ｂｉｏｅｎｇ．，８５（２），１５６（１９９８）の方法により調製した酵素を、組換えＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  グルカンホスホリラーゼとする。
【０２６８】
（３．グルカンの分子量の測定）
本発明で合成したグルカンの分子量を以下の方法により測定した。
【０２６９】
本発明で合成したグルカンを１Ｎ水酸化ナトリウムで完全に溶解し、適当量の塩酸で中和した後、グルカン約３００μｇ分を、示差屈折計と多角度光散乱検出器を併用したゲル濾過クロマトグラフィーに供することにより平均分子量を求めた。
【０２７０】
詳しくは、カラムとしてＳｈｏｄｅｘ  ＳＢ８０６Ｍ−ＨＱ（昭和電工製）を用い、検出器としては多角度光散乱検出器（ＤＡＷＮ−ＤＳＰ、Ｗｙａｔｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）および示差屈折計（Ｓｈｏｄｅｘ  ＲＩ−７１、昭和電工製）をこの順序で連結して用いた。カラムを４０℃に保ち、溶離液としては０．１Ｍ硝酸ナトリウム溶液を流速１ｍＬ／分で用いた。得られたシグナルを、データ解析ソフトウェア（商品名ＡＳＴＲＡ、Ｗｙａｔｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）を用いて収集し、同ソフトを用いて解析することにより、重量平均分子量を求めた。
【０２７１】
（比較例０−１および０−２：３７℃の反応温度と４５℃の反応温度とでの収率の比較）
比較例０−１および０−２で用いた反応溶液の反応開始時の組成を以下の表１に示す。
【０２７２】
【表１】
2004526463.tif 000013
詳細には、スクロース、無機リン酸、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ  スクロースホスホリラーゼ（オリエンタル酵母社製）、上記２．１で調製した馬鈴薯塊茎由来グルカンホスホリラーゼ、およびマルトヘプタオースを、１００ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ７．０）中に溶解して、４％スクロース、２０ｍＭ無機リン酸、１０Ｕ／ｇ  スクロースのＬｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ  スクロースホスホリラーゼ、１０Ｕ／ｇ  スクロースの馬鈴薯塊茎由来グルカンホスホリラーゼおよび２ｍＭマルトヘプタオースの溶液を得た。この溶液を、３７℃（比較例０−１）または４５℃（比較例０−２）で１８時間反応させて、アミロースを合成した。反応液量は１ｍｌであった。
【０２７３】
反応後、合成されたアミロースの収率を上記１．６に従って決定した。結果を図２に示す。
【０２７４】
本明細書では、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ  スクロースホスホリラーゼ（オリエンタル酵母社より購入）、馬鈴薯塊茎由来のグルカンホスホリラーゼ、４％スクロースを用いて３７℃でアミロースを製造する方法を、従来法という。
【０２７５】
図２に示すように、３７℃で反応させた場合のアミロースの収率は７９％であったのに対し、４５℃で反応させた場合、アミロースの収率は３３．８％と低かった。
【０２７６】
このように、従来法の基質濃度のままでは高温でのアミロース製造は工業的に不利であった。使用したＬｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ由来スクロースホスホリラーゼの至適温度は３７℃付近である。それゆえ、この酵素は耐熱性が低いと考えられる。高温でのアミロースの収率が低い原因は、酵素の耐熱性が低いことであると考えられる。
【０２７７】
（実施例１−１〜１−５および比較例１−１：種々のスクロース濃度および高反応温度でのアミロース合成）
以下の表２に示す組成（反応開始時）の反応混合物を用いてアミロース合成を行った。
【０２７８】
【表２】
2004526463.tif 000014
反応後、合成されたアミロースの収率を上記１．６に従って決定した。結果を図３に示す。
【０２７９】
スクロース濃度を従来法の４％（比較例１−１）から８％以上（実施例１−１〜１−５）に引き上げることによって４５℃での反応が可能になり、アミロースの収率が増加した。
【０２８０】
詳しくは、上述の条件で、基質間の割合（すなわち、スクロースとマルトヘプタオースと無機リン酸との割合）および酵素量を変えずに、スクロース濃度を８％〜２５％まで増やすことにより、アミロースの収率が増加した。図３に示すように、スクロース濃度８％にて４５℃での収率は７６．４％となった。これはスクロース濃度４％、４５℃での収率の２倍以上であり、従来法とほぼ同等の収率が得られた。スクロース濃度を１５％以上にするとほぼ１００％のアミロースの収率が得られた。このように、４５℃でのスクロースからのアミロース合成は、スクロース濃度が低いと収率が低く、効率も悪いが、スクロース濃度を高くすることにより、４５℃での工業的な製造が可能になった。
【０２８１】
（実施例２−１〜２−５および比較例２−１〜２−７：低酵素量でのアミロース合成）
以下の表３に示す組成（反応開始時）の反応混合物を用いてアミロース合成を行った。
【０２８２】
【表３】
2004526463.tif 000015
詳しくは、実施例２−１〜２−５および比較例２−１〜２−７では、酵素量を比較例１−１および実施例１−１〜１−５の半分にし、３７℃と４５℃とで反応を行った以外は、それぞれ比較例１−１および実施例１−１〜１−５と同様にアミロースの合成を行なった。
【０２８３】
反応後、合成されたアミロースの収率を上記１．６に従って決定した。結果を図４に示す。
【０２８４】
スクロース濃度１５％以上において、４５℃での反応におけるアミロースの収率は、３７℃での反応に比べて同等以上であった。
【０２８５】
図４に示すように、この条件において従来法では、６０％程度のアミロース収率だったのに対し、スクロース濃度４％にて４５℃での反応では、２２．１％と低い収率であった。しかし、基質間の割合（すなわち、スクロースとマルトヘプタオースと無機リン酸との割合）および酵素量を変えずに、スクロース濃度を８％〜２５％まで増やすことにより、４５℃の反応におけるアミロースの収率が増加した。スクロース濃度１５％以上にて４５℃での反応では、３７℃での反応より高いアミロース収率が得られた。このように、１５％以上のスクロース濃度で反応させることで、４５℃で反応できるだけでなく、３７℃での反応に比べて、高い生産性が実現されるようになった。
【０２８６】
（実施例３−１−１〜３−２−５ならびに比較例３−１−１および３−２−１：耐熱性スクロースホスホリラーゼを用いたアミロースの合成）
以下の表４に示す組成の反応混合物（反応開始時）を用いてアミロース合成を行った。
【０２８７】
【表４】
2004526463.tif 000016
詳しくは、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ由来のスクロースホスホリラーゼの代わりに上記２．５で得られたＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ由来のスクロースホスホリラーゼを１０Ｕ／ｇスクロースの活性単位で用い、グルカンホスホリラーゼを１０Ｕ／ｇスクロースの活性単位で用い、酵素反応を４５℃または５０℃で行った以外は、比較例２−１および実施例２−１〜２−５と同様に比較例３−１−１および３−２−１、ならびに実施例３−１−１〜３−２−５のアミロースの合成を行なった。
【０２８８】
反応後、合成されたアミロースの収率を上記１．６に従って決定した。結果を図５に示す。
【０２８９】
スクロースホスホリラーゼを、従来法で用いられるＬｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ由来のスクロースホスホリラーゼから、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ由来のスクロースホスホリラーゼに変更した場合も、４５℃の反応温度でアミロースを製造できた。
【０２９０】
さらに、スクロースホスホリラーゼを従来法のＬｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ由来のものから、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ由来のものに変更し、かつスクロース濃度を４％から８％以上に引き上げることで５０℃での効率の高い反応が可能になり、アミロースの収率が増加した。
【０２９１】
反応温度を４５℃に設定したところ、図５に示すように、スクロース濃度４％では、アミロースの収率は９７．４％であった。さらに、基質間の割合および酵素量を変えずに、スクロース濃度を８％〜２５％まで増やしても、アミロースの収率は高いレベルで一定であった。このようにスクロースホスホリラーゼをＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ  由来のスクロースホスホリラーゼにすることにより、４５℃でのアミロースの効率の高い製造が可能になった。
【０２９２】
また、反応温度を５０℃に設定したところ、図５に示すように、スクロース濃度４％では、アミロースの収率は２１．８％と低かった。しかし、基質間の割合および酵素量を変えずに、スクロース濃度を８％〜２５％まで増やすことにより、アミロースの収率が増加した。スクロース濃度８％での収率は５５．４％とスクロース濃度４％での収率の２倍以上になり、スクロース濃度１５％以上にするとほぼ１００％のアミロースの収率が得られた。このように、４％スクロースでの５０℃でのアミロース合成は、収率が低く、効率も悪かったが、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ由来スクロースホスホリラーゼを使用し、スクロース濃度を高くすることにより、５０℃でのアミロースの効率の高い製造が可能になった。
【０２９３】
（実施例４−１−１〜４−２−５、ならびに比較例４−１−１および４−２−１：低酵素量で耐熱性スクロースホスホリラーゼを用いたアミロースの合成）
以下の表５に示す組成（反応開始時）の反応混合物を用いてアミロース合成を行った。
【０２９４】
【表５】
2004526463.tif 000017
詳しくは、酵素量を比較例３−１−１、３−２−１、および実施例３−１−１〜３−２−５の半分にした以外は、比較例３−１−１、３−２−１、および実施例３−１−１〜３−２−５と同様にアミロースの合成を行なった。
【０２９５】
反応後、合成されたアミロースの収率を上記１．６に従って決定した。結果を図６に示す。
【０２９６】
スクロースホスホリラーゼを従来法のＬｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ由来のスクロースホスホリラーゼから、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ由来のスクロースホスホリラーゼに変更し、酵素量を従来法の半分にした場合、スクロース濃度が１５％以上での反応において、５０℃での反応におけるアミロースの収率は、４５℃での反応に比べて同等以上であった。
【０２９７】
図６に示すように、スクロース濃度４％にて４５℃での反応では、５０％程度のアミロース収率だったのに対し、スクロース濃度４％にて５０℃での反応では、９．２％と低い収率であった。しかし、基質間の割合および酵素量を変えずに、スクロース濃度を８％〜２５％まで増やすことにより、５０℃の反応におけるアミロースの収率が増加した。スクロース濃度１５％以上にて５０℃での反応では、４５℃での反応より高いアミロース収率が得られた。このように、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ由来スクロースホスホリラーゼを使用し、スクロース濃度を１５％以上で反応させることで、５０℃で反応できるだけでなく４５℃での反応に比べて、高い生産性が実現されるようになった。
【０２９８】
（実施例５−１〜５−５および比較例５−１：Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ由来のスクロースホスホリラーゼおよび高度好熱細菌由来のグルカンホスホリラーゼを用いたアミロースの合成）
以下の表６に示す組成（反応開始時）の反応混合物を用いてアミロース合成を行った。
【０２９９】
【表６】
2004526463.tif 000018
詳しくは、馬鈴薯由来グルカンホスホリラーゼの代わりに、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ由来グルカンホスホリラーゼを用いた以外は、比較例１−１、および実施例１−１〜１−５と同様にアミロースの合成を行なった。
【０３００】
反応後、合成されたアミロースの収率を上記１．６に従って決定した。結果を図７に示す。
【０３０１】
Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ由来のグルカンホスホリラーゼを用い、スクロース濃度を従来法の４％から８％以上に引き上げることによって４５℃での反応が可能になり、アミロースの収率が増加した。
【０３０２】
詳しくは、上述の条件で、基質間の割合および酵素量を変えずに、スクロース濃度を８％〜２５％まで増やすことにより、アミロースの収率が増加した。図７に示すように、スクロース濃度４％、４５℃での収率は２８．０％であったのに対し、スクロース濃度８％にて４５℃での収率は６９．０％であった。さらに、スクロース濃度を１５％以上にするとほぼ１００％のアミロースの収率が得られた。このように、馬鈴薯由来のグルカンホスホリラーゼの代わりに、高度好熱細菌Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ由来グルカンホスホリラーゼを用いることで、４５℃でのアミロースの製造が可能であることを確認した。
【０３０３】
（実施例６−１〜６−５および比較例６−１〜６−７：Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ由来のスクロースホスホリラーゼおよび高度好熱細菌由来のグルカンホスホリラーゼを用いた低酵素量でのアミロース合成）
以下の表７に示す組成（反応開始時）の反応混合物を用いてアミロース合成を行った。
【０３０４】
【表７】
2004526463.tif 000019
詳しくは、実施例６−１〜６−５および比較例６−１〜６−７では、酵素量を実施例５−１〜５−５および比較例５−１の半分にし、３７℃と４５℃とで反応を行った以外は、実施例５−１〜５−５および比較例５−１と同様にアミロースの合成を行なった。
【０３０５】
反応後、合成されたアミロースの収率を上記１．６に従って決定した。結果を図８に示す。
【０３０６】
Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ由来グルカンホスホリラーゼを用いた場合、スクロース濃度１５％以上において、４５℃での反応におけるアミロースの収率は、３７℃での反応に比べて優れていた。
【０３０７】
図８に示すように、この条件において従来法では、３４．２％のアミロース収率だったのに対し、スクロース濃度４％にて４５℃での反応では、１５．６％と低い収率であった。しかし、基質間の割合および酵素量を変えずに、スクロース濃度を８％〜２５％まで増やすことにより、４５℃の反応におけるアミロースの収率が増加した。スクロース濃度１５％以上にて４５℃での反応では、３７℃での反応より高いアミロース収率が得られた。このように、馬鈴薯由来のグルカンホスホリラーゼの代わりに、高度好熱細菌Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ由来グルカンホスホリラーゼを用い、１５％以上のスクロース濃度で反応させることで、４５℃で反応できるだけでなく、３７℃での反応に比べて、高い生産性が実現されるようになった。
【０３０８】
（実施例７−１〜７−５ならびに比較例７−１：Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ由来のスクロースホスホリラーゼおよび高度好熱細菌由来のグルカンホスホリラーゼを用いたアミロースの合成）
以下の表８に示す組成（反応開始時）の反応混合物を用いてアミロース合成を行った。
【０３０９】
【表８】
2004526463.tif 000020
詳しくは、馬鈴薯由来のグルカンホスホリラーゼの代わりに上記２．４で得られたＴｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ由来のグルカンホスホリラーゼを用いた以外は、比較例３−２−１および実施例３−２−１〜３−２−５と同様に比較例７−１および実施例７−１〜７−５のアミロースの合成を行なった。
【０３１０】
反応後、合成されたアミロースの収率を上記１．６に従って決定した。結果を図９に示す。
【０３１１】
スクロースホスホリラーゼを、従来法で用いられるＬｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ由来のスクロースホスホリラーゼから、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ由来のスクロースホスホリラーゼに、馬鈴薯由来グルカンホスホリラーゼをＴｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ由来グルカンホスホリラーゼにそれぞれ変更し、かつスクロース濃度を４％から８％以上に引き上げることで５０℃での反応が可能になり、アミロースの収率が増加した。
【０３１２】
詳しくは、上述の条件で、基質間の割合および酵素量を変えずに、スクロース濃度を８％〜２５％に増やすことにより、アミロースの収率は増加した。図９に示すように、スクロース濃度４％、５０℃での収率は５６．２％であったがスクロース濃度８％、５０℃での収率は７８．４％であり、スクロース濃度を１５％にするとほぼ１００％のアミロースの収率が得られた。このようにスクロースホスホリラーゼをＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ由来のスクロースホスホリラーゼに、グルカンホスホリラーゼをＴｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ由来のグルカンホスホリラーゼにすることにより、５０℃でのアミロースの製造が可能になった。
【０３１３】
（実施例８−１−１〜８−２−５、ならびに比較例８−１−１および８−２−１：Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ由来のスクロースホスホリラーゼおよび高度好熱細菌由来のグルカンホスホリラーゼを用いた低酵素量でのアミロースの合成）
以下の表９に示す組成（反応開始時）の反応混合物を用いてアミロース合成を行った。
【０３１４】
【表９】
2004526463.tif 000021
詳しくは、酵素量を比較例７−１、および実施例７−１〜７−５の半分にし、反応温度を４５℃と５０℃にした以外は、比較例７−１、および実施例７−１〜７−５と同様にアミロースの合成を行なった。
【０３１５】
反応後、合成されたアミロースの収率を上記１．６に従って決定した。結果を図１０に示す。
【０３１６】
スクロースホスホリラーゼを、従来法で用いられるＬｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ由来のスクロースホスホリラーゼから、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ由来のスクロースホスホリラーゼに、馬鈴薯由来グルカンホスホリラーゼをＴｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ由来グルカンホスホリラーゼにそれぞれ変更し、酵素量を従来法の半分にした場合、スクロース濃度を１５％以上での反応において、５０℃での反応におけるアミロースの収率は、４５℃での反応に比べて優れていた。
【０３１７】
図１０に示すように、スクロース濃度４％にて４５℃での反応では、４８．９％のアミロース収率だったのに対し、スクロース濃度４％にて５０℃での反応では、２１．５％と低い収率であった。しかし、基質間の割合および酵素量を変えずに、スクロース濃度を８％〜２５％まで増やすことにより、５０℃の反応におけるアミロースの収率が増加した。スクロース濃度１５％以上にて５０℃での反応では、４５℃での反応より高いアミロース収率が得られた。このように、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ由来スクロースホスホリラーゼおよびＴｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ由来グルカンホスホリラーゼを使用し、スクロース濃度を１５％以上で反応させることで、５０℃で反応できるだけでなく４５℃での反応に比べて、高い生産性が実現されるようになった。
【０３１８】
（実施例９−１〜９−５および比較例９−１：Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ由来のスクロースホスホリラーゼおよびＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来のグルカンホスホリラーゼを用いたアミロースの合成）
以下の表１０に示す組成（反応開始時）の反応混合物を用いてアミロース合成を行った。
【０３１９】
【表１０】
2004526463.tif 000022
詳しくは、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ由来グルカンホスホリラーゼの代わりにＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来グルカンホスホリラーゼを用いた以外は、比較例５−１および実施例５−１〜５−５と同様にアミロースの合成を行なった。
【０３２０】
反応後、合成されたアミロースの収率を上記１．６に従って決定した。結果を図１１に示す。
【０３２１】
Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来のグルカンホスホリラーゼを用い、スクロース濃度を従来法の４％から８％以上に引き上げることによって４５℃での反応が可能になり、アミロースの収率が増加した。
【０３２２】
詳しくは、上述の条件で、基質間の割合および酵素量を変えずに、スクロース濃度を８％〜２５％まで増やすことにより、アミロースの収率が増加した。図１１に示すように、スクロース濃度４％、４５℃での収率は４０．７％であったのに対し、スクロース濃度８％にて４５℃での収率は７０．６％であった。さらに、スクロース濃度を１５％以上にすると約９０％のアミロースの収率が得られた。このように、馬鈴薯由来のグルカンホスホリラーゼの代わりに、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来のグルカンホスホリラーゼを用いることで、４５℃でのアミロース合成が可能であることを確認した。
【０３２３】
（実施例１０−１〜１０−５および比較例１０−１〜１０−７：Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ由来のスクロースホスホリラーゼおよびＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来のグルカンホスホリラーゼを用いた低酵素量でのアミロース合成）
以下の表１１に示す組成（反応開始時）の反応混合物を用いてアミロース合成を行った。
【０３２４】
【表１１】
2004526463.tif 000023
詳しくは、実施例１０−１〜１０−５および比較例１０−１〜１０−７では、酵素量を比較例９−１および実施例９−１〜９−５の半分にし、３７℃と４５℃とで反応を行った以外は、それぞれ比較例９−１および実施例９−１〜９−５と同様にアミロースの合成を行なった。
【０３２５】
反応後、合成されたアミロースの収率を上記１．６に従って決定した。結果を図１２に示す。
【０３２６】
Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来のグルカンホスホリラーゼを用いた場合、スクロース濃度１５％以上において、４５℃での反応におけるアミロースの収率は、３７℃での反応に比べて同等以上であった。
【０３２７】
図１２に示すように、この条件において従来法では、６０．２％のアミロース収率だったのに対し、スクロース濃度４％にて４５℃での反応では、２２．１％と低い収率であった。しかし、基質間の割合および酵素量を変えずに、スクロース濃度を８％〜２５％まで増やすことにより、４５℃の反応におけるアミロースの収率が増加した。スクロース濃度１５％以上にて４５℃での反応では、３７℃での反応より高いアミロース収率が得られた。このように、馬鈴薯由来のグルカンホスホリラーゼの代わりに、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来のグルカンホスホリラーゼを用い、１５％以上のスクロース濃度で反応させることで、４５℃で反応できるだけでなく、３７℃での反応に比べて、高い生産性が実現されるようになった。
【０３２８】
（実施例１１−１〜１１−５ならびに比較例１１−１：Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ由来のスクロースホスホリラーゼおよびＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来のグルカンホスホリラーゼを用いたアミロースの合成）
以下の表１２に示す組成（反応開始時）の反応混合物を用いてアミロース合成を行った。
【０３２９】
【表１２】
2004526463.tif 000024
詳しくは、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ由来のスクロースホスホリラーゼの代わりに、上記２．５で得られたＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ由来のスクロースホスホリラーゼを用い、酵素反応を５０℃で行った以外は、比較例９−１および実施例９−１〜９−５と同様に比較例１１−１および実施例１１−１〜１１−５のアミロースの合成を行なった。
【０３３０】
反応後、合成されたアミロースの収率を上記１．６に従って決定した。結果を図１３に示す。
【０３３１】
スクロースホスホリラーゼを、従来法で用いられるＬｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ由来のスクロースホスホリラーゼから、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ由来のスクロースホスホリラーゼに、馬鈴薯由来グルカンホスホリラーゼをＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来のグルカンホスホリラーゼにそれぞれ変更し、かつスクロース濃度を４％から８％以上に引き上げることで、５０℃での反応が可能になり、アミロースの収率が増加した。
【０３３２】
詳しくは、上述の条件で、基質間の割合および酵素量を変えずに、スクロース濃度を８％〜２５％に増やすことにより、アミロースの収率は増加した。図１３に示すように、スクロース濃度４％、５０℃での収率は３９．１％であったがスクロース濃度８％、５０℃での収率は７０．４％であり、スクロース濃度を１５％にすると９０％以上のアミロースの収率が得られた。このようにスクロースホスホリラーゼをＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ  由来のスクロースホスホリラーゼに、グルカンホスホリラーゼをＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来のグルカンホスホリラーゼにすることにより、５０℃でのアミロースの製造が可能になった。
【０３３３】
（実施例１２−１−１〜１２−２−５、ならびに比較例１２−１−１および１２−２−１：Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ由来のスクロースホスホリラーゼおよびＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来のグルカンホスホリラーゼを用いた低酵素量でのアミロースの合成）
以下の表１３に示す組成（反応開始時）の反応混合物を用いてアミロース合成を行った。
【０３３４】
【表１３】
2004526463.tif 000025
詳しくは、酵素量を比較例１１−１および実施例１１−１〜１１−５の半分にし、反応温度を４５℃と５０℃にした以外は、比較例１１−１および実施例１１−１〜１１−５と同様にアミロースの合成を行なった。
【０３３５】
反応後、合成されたアミロースの収率を上記１．６に従って決定した。結果を図１４に示す。
【０３３６】
スクロースホスホリラーゼを、従来法で用いられるＬｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ由来のスクロースホスホリラーゼから、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ由来のスクロースホスホリラーゼに、馬鈴薯由来グルカンホスホリラーゼをＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来のグルカンホスホリラーゼにそれぞれ変更し、酵素量を従来法の半分にした場合、スクロース濃度を１５％以上での反応において、５０℃での反応におけるアミロースの収率は、４５℃での反応に比べて優れていた。
【０３３７】
図１４に示すように、スクロース濃度４％にて４５℃での反応では、３２．９％のアミロース収率だったのに対し、スクロース濃度４％にて５０℃での反応では、１９．６％と低い収率であった。しかし、基質間の割合および酵素量を変えずに、スクロース濃度を８％〜２５％まで増やすことにより、５０℃の反応におけるアミロースの収率が増加した。スクロース濃度１５％以上にて５０℃での反応では、４５℃での反応より高いアミロース収率が得られた。このように、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ由来スクロースホスホリラーゼおよび、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来のグルカンホスホリラーゼを使用し、１５％以上のスクロース濃度で反応させることで、５０℃で反応できるだけでなく４５℃での反応に比べて、高い生産性が実現されるようになった。
【０３３８】
（実施例１３：高温度条件下でのアミロース合成）
以下の表１４に示す組成（反応開始時）の反応混合物を用いてアミロースの合成を行なった。
【０３３９】
【表１４】
2004526463.tif 000026
詳しくは、酵素量を比較例３−１−１の５倍にし、反応温度を６５℃で行なった以外は比較例３−１−１と同様に比較例１３−１のアミロースの合成を行なった。比較例３−１−１の基質間の割合と酵素量を変えずに、スクロース濃度を５０％に増やすことにより、実施例１３−１のアミロースの合成を行なった。さらに、比較例１３−１および実施例１３−１の馬鈴薯由来グルカンホスホリラーゼの代わりに上記２．４で調製したＴｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ由来グルカンホスホリラーゼを用いて、比較例１３−２および実施例１３−２のアミロースの合成を行なった。
【０３４０】
反応後、合成されたアミロースの収率を上記１．６に従って決定した。結果を図１５に示す。
【０３４１】
従来法では、いずれのグルカンホスホリラーゼを用いた場合でも、６５℃の反応では全くアミロースは合成されなかった。スクロース濃度をあげることにより６５℃でのアミロースの製造が可能になった。
【０３４２】
（実施例１４：マルトテトラオースをプライマーとしたアミロースの製造）
上記実施例では、アミロース製造のプライマーにはマルトヘプタオースを利用している。しかし、純度の高いマルトオリゴ糖は高価であり、産業利用できるほど流通していない。安価なマルトオリゴ糖として、マルトテトラオース含有シラップがある。しかし、このシラップには、プライマーとして機能し得ないと考えられている、グルコース、マルトース、およびマルトトリオースなどが含まれている。さらに、マルトテトラオースは、マルトヘプタオースに比べ、グルカンホスホリラーゼに対する親和性が低い。このようなシラップを用いてグルカンの合成反応ができるかどうかは不明であり、このような研究も報告されていない。そこで、本発明者らは、マルトヘプタオースの代わりにマルトテトラオース含有シラップを用いてもアミロースを合成できるか検討した。
【０３４３】
詳しくは、マルトテトラオース含有量が７０％以上である、テトラップＨ（林原商事）を用いた以外は実施例７−２と同様にして、アミロースを合成した。その結果、テトラップＨを用いても高分子量アミロースが製造されることが確認された。
【０３４４】
（実施例１５：膜ろ過を用いたアミロースの精製）
２％スクロース、１０ｍＭ無機リン酸、５０Ｕ／ｇスクロースのＬｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓスクロースホスホリラーゼ（オリエンタル酵母社製）、５０Ｕ／ｇスクロースの上記２．２で調製した組換え馬鈴薯塊茎由来グルカンホスホリラーゼ、およびプライマーとしてマルトヘプタオースを用いて、３７℃にて１８時間、アミロースを合成した。反応液量は２０００ｍｌとした。
【０３４５】
反応後のアミロース溶液２０００ｍｌを、分画分子量３０，０００の限外濾過膜（ダイセル製ＵＦ膜ユニット）を用いて、１２００ｍｌまで濃縮した。その後、１０Ｌの蒸留水に対してダイアフィルトレーションを行った後、蒸留水を加えて２０００ｍｌとした。膜濾過の前後における、フルクトースの含有量およびアミロースの重量平均分子量を測定した。結果を表１５に示す。
【０３４６】
【表１５】
2004526463.tif 000027
表１５に示すように、限外濾過膜を用いてアミロースを精製することで、反応溶液中に大量に存在するフルクトースを除去できることが確認された。膜濾過の前後で、アミロースの重量平均分子量が大きくは変わらないことが確認された。
【０３４７】
このように、限外濾過膜を利用してアミロースを精製することによって、従来アミロースの精製に使用されていた多くの有機溶媒、例えば、ブタノール、メタノール、エタノール、エーテルなどを使用することなくアミロースの精製を行うことが可能になった。
【０３４８】
（実施例１６−１〜１６−７および比較例１６−１：Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ由来のスクロースホスホリラーゼおよび馬鈴薯由来のグルカンホスホリラーゼを用い、スクロース濃度と無機リン酸濃度との比を変えた場合のアミロースの合成）
以下の表１６に示す組成（反応開始時）の反応混合物を用いてアミロース合成を行った。
【０３４９】
【表１６】
2004526463.tif 000028
詳しくは、スクロース、無機リン酸、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓスクロースホスホリラーゼ、上記２．１で調製した馬鈴薯塊茎由来グルカンホスホリラーゼおよびマルトヘプタオースを、１００ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ７．０）中に溶解して、１２５ｍＭスクロース、２０Ｕ／ｇ  スクロースのＬｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓスクロースホスホリラーゼ、２０Ｕ／ｇスクロースの馬鈴薯塊茎由来グルカンホスホリラーゼ、０．３５ｍＭマルトヘプタオース、７．２ｍＭ無機リン酸（比較例１６−１）、または１０〜１２５ｍＭ無機リン酸（実施例１６−１〜１６−７）の溶液を得た。この溶液を３７℃で４時間反応させてアミロースを合成した。反応液量は１ｍｌであった。
【０３５０】
反応後、合成されたアミロースの収率を上記１．６に従って決定した。結果を図１６に示す。
【０３５１】
図１６に示すように、１２５ｍＭスクロースに対して無機リン酸を７．２ｍＭ加えて反応させた場合、アミロースの収率は２０．１％と低かったが、１２５ｍＭスクロースに対して無機リン酸を１０ｍＭ以上加えて反応させた場合、収率を高めることでき、さらに、１２５ｍＭスクロースに対して無機リン酸を２０〜７５ｍＭ加えた場合、４０％以上の収率が得られた。
【０３５２】
（実施例１７−１〜１７−７および比較例１７−１：Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ由来のスクロースホスホリラーゼおよび馬鈴薯由来のグルカンホスホリラーゼを用い、スクロース濃度と無機リン酸濃度との比を変えた場合のアミロースの合成）
以下の表１７に示す組成（反応開始時）の反応混合物を用いてアミロース合成を行った。
【０３５３】
【表１７】
2004526463.tif 000029
詳しくは、実施例１７−１〜１７−７および比較例１７−１は、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ由来スクロースホスホリラーゼの代わりにＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ由来スクロースホスホリラーゼを用い、反応温度を４５℃とした以外は、実施例１６−１〜１６−７および比較例１７−１と同様にしてアミロースを合成した。
【０３５４】
反応後、合成されたアミロースの収率を上記１．６に従って決定した。結果を図１７に示す。
【０３５５】
図１７に示すように、１２５ｍＭスクロースに対して無機リン酸を７．２ｍＭ加えて反応させた場合、アミロースの収率は２６．７％と低かったが、１２５ｍＭスクロースに対して無機リン酸を１０ｍＭ以上加えて反応させた場合、収率を高めることでき、さらに、１２５ｍＭスクロースに対して無機リン酸を２０〜７５ｍＭ加えて反応させた場合、５０〜６０％以上の収率が得られた。
【０３５６】
このように、従来法のスクロース−リン酸比率のままでは、生産性が高くなく工業的生産において不利であったが、スクロース−リン酸比率を一定範囲内にすることで、２倍近い生産性の向上が実現できるようになった。
【０３５７】
（実施例１８  スクロース存在下でのＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ由来スクロースホスホリラーゼの耐熱性）
上記２．５に記載のスクロースホスホリラーゼ産生大腸菌の破砕液を用いて、スクロースを加えて溶解し、スクロースの最終濃度がそれぞれ、溶解後の溶液を基準として４％、８％、１２％、１６％、２０％、２５％または３０％の溶液を得た。スクロースを加えないスクロースホスホリラーゼ酵素液をコントロール（０％スクロース）とした。これらの溶液を、５５℃の水浴中で加熱した。加熱開始時（０分）、加熱開始後３０分、６０分および９０分の時点でサンプリングし、スクロースホスホリラーゼの活性を本明細書中に記載の方法に従って測定した。
【０３５８】
測定された活性に基づいて、残存活性を算出した。
【０３５９】
残存活性を、以下の通りに算出した：
【０３６０】
【数１】
2004526463.tif 000030
残存活性についての結果を図１８に示す。この結果、以下のことがわかった。スクロースを含まない場合（０％）は、５５℃にて３０分の加熱後、活性は１０％程度にまで低下した。
【０３６１】
４％以上のスクロースを含む場合には、３０分の加熱後も５０％以上の活性が残存していた。特に８％以上のスクロースを含む場合には、３０分の加熱後も８０％以上の活性が残存していた。
【０３６２】
（実施例１９  スクロース存在下でのＬｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ由来スクロースホスホリラーゼの耐熱性）
Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓスクロースホスホリラーゼ（オリエンタル酵母社より購入）を含む酵素液に、スクロースを加えて溶解し、スクロースの最終濃度がそれぞれ、溶解後の溶液を基準として１２％、１６％、２０％、２５％または３０％の溶液を得た。スクロースを加えないスクロースホスホリラーゼ酵素液をコントロール（０％スクロース）として用いた。これらの溶液を、５０℃の水浴中で加熱した。加熱開始時（０分）、加熱開始後３０分、６０分および９０分の時点でサンプリングし、スクロースホスホリラーゼの活性を本明細書中に記載の方法に従って測定した。
【０３６３】
測定された活性に基づき、上記の式に従って残存活性を算出した。
【０３６４】
残存活性についての結果を図１９に示す。この結果、以下のことがわかった。スクロースを含まない場合（０％）は、５０℃にて３０分の加熱後、活性は１０％程度にまで低下した。
【０３６５】
１２％以上のスクロースを含む場合には、３０分の加熱後も５０％以上の活性が残存していた。特に２０％以上のスクロースを含む場合には、３０分の加熱後も８０％以上の活性が残存していた。
【０３６６】
（比較例２０：スクロースホスホリラーゼの安定性に対するフルクトースの効果）
スクロースホスホリラーゼの基質には、スクロース以外にフルクトース、無機リン酸、およびグルコース−１−リン酸がある。フルクトースのスクロースホスホリラーゼ安定性への効果を以下のように調べた。
【０３６７】
上記（２．５）で調製したＳ．ｍｕｔａｎｓ由来スクロースホスホリラーゼを含むスクロースホスホリラーゼ酵素液に、最終濃度がそれぞれ、溶解後の溶液を基準として５％または１０％になるようにフルクトースを加えて溶解し、溶液を得た。フルクトースを加えないスクロースホスホリラーゼ酵素液をコントロール（０％スクロース）とした。対照として、同濃度のスクロースを添加した場合についても同時に調べた。これらの溶液を、５５℃の水浴中で加熱した。加熱開始時（０分）、加熱開始後３０分、６０分および９０分の時点で溶液をサンプリングし、スクロースホスホリラーゼの活性を本明細書中に記載の方法に従って測定した。
【０３６８】
測定された活性に基づいて、残存活性を算出した。
【０３６９】
残存活性についての結果を図２０に示す。この結果、フルクトースにはスクロースの場合のようなスクロースホスホリラーゼ安定化効果は認められないことがわかった。
【０３７０】
（比較例２１：スクロースホスホリラーゼの安定性に対する無機リン酸の効果）
無機リン酸のスクロースホスホリラーゼ安定性への効果を以下のように調べた。
【０３７１】
上記（２．５）で調製したＳ．ｍｕｔａｎｓ由来スクロースホスホリラーゼを含むスクロースホスホリラーゼ酵素液に、最終濃度がそれぞれ、溶解後の溶液を基準として４０ｍＭ、１００ｍＭおよび４００ｍＭになるようにリン酸ナトリウムを加えて溶解し、溶液を得た。リン酸ナトリウムを加えないスクロースホスホリラーゼ酵素液をコントロール（添加なし）とした。対照として、１０％の濃度のスクロースを添加した場合についても同時に調べた。これらの溶液を、５５℃の水浴中で加熱した。加熱開始時（０分）、加熱開始後３０分、６０分および９０分の時点で溶液をサンプリングし、スクロースホスホリラーゼの活性を本明細書中に記載の方法に従って測定した。
【０３７２】
測定された活性に基づいて、残存活性を算出した。
【０３７３】
残存活性についての結果を図２１に示す。この結果、無機リン酸にはスクロースの場合のようなスクロースホスホリラーゼ安定化効果は認められないことがわかった。
【０３７４】
（実施例２２−１〜２２−５および比較例２２−１：プルランをプライマーとして用いたグルカンの合成）
以下の表１８に示す組成（反応開始時）の反応混合物を用いてグルカン合成を行なった。
【０３７５】
【表１８】
2004526463.tif 000031
詳しくは、マルトヘプタオースの代わりにプルランＰ−５（平均分子量約５，０００、昭光通商社より購入）を０．２〜１．２５％で用い、スクロースホスホリラーゼを２０Ｕ／ｇスクロースの活性単位で用い、グルカンホスホリラーゼを２０Ｕ／ｇスクロースの活性単位で用いた以外は、比較例３−２−１および実施例３−２−１〜３−２−５と同様に比較例２２−１および実施例２２−１〜実施例２２−５のグルカンの合成を行なった。
【０３７６】
反応後、合成されたグルカンの収率を上記１．６に従って決定した。結果を図２２に示す。
【０３７７】
マルトヘプタオースのかわりに、プルランを用いた場合でも、スクロース濃度を４％から８％以上に引き上げることで５０℃での効率の高い反応が可能になり、グルカンの収率が増加した。
【０３７８】
反応温度を５０℃に設定したところ、図２２に示すように、スクロース濃度４％では、グルカンの収率は９．８％と低かった。しかし、基質間の割合および酵素量を変えずに、スクロース濃度を８％〜２５％まで増やすことにより、グルカンの収率が増加した。スクロース濃度８％での収率は３２．０％とスクロース濃度４％での収率の３倍以上になり、スクロース濃度を１５％以上にすると８０％程度のグルカンの収率が得られた。このように、マルトオリゴ糖の代わりにプルランを用いた場合でも、マルトオリゴ糖を用いた場合と同等の効果が得られた。
【０３７９】
（実施例２３−１〜２３−７および比較例２３−１：プルランをプライマーとして用いたグルカンの合成）
以下の表１９に示す組成（反応開始時）の反応混合物を用いてグルカン合成を行なった。
【０３８０】
【表１９】
2004526463.tif 000032
詳しくは、マルトヘプタオースの代わりにプルランＰ−５（平均分子量約５，０００、昭光通商社より購入）を０．２％で用いた以外は、比較例１７−１および実施例１７−１〜１７−７と同様にして比較例２３−１および実施例２３−１〜２３−７のグルカンの合成を行なった。
【０３８１】
反応後、合成されたグルカンの収率を上記１．６に従って決定した。結果を図２３に示す。
【０３８２】
図２３に示すように、１２５ｍＭスクロースに対して、無機リン酸を７．２ｍＭ加えて反応させた場合、グルカンの収率は、５．３％と低かったが、１２５ｍＭスクロースに対して無機リン酸を１０ｍＭ加えて反応させた場合、１１．７％と２倍以上の収率を得ることができた。さらに、１２５ｍＭスクロースに対して無機リン酸を２０〜７５ｍＭ加えて反応させた場合、２０〜２５％以上の収率を得ることができた。
【０３８３】
このように、マルトオリゴ糖の代わりにプルランを用いた場合でも、マルトオリゴ糖を用いた場合と同等の効果が得られた。
【０３８４】
（実施例２４−１〜２４−７および比較例２４−１：Ｇ−１−Ｐを用いたグルカン合成）
以下の表２０に示す組成（反応開始時）の反応混合物を用いてグルカン合成を行なった。
【０３８５】
【表２０】
2004526463.tif 000033
詳しくは、無機リン酸のかわりにグルコース−１−リン酸を用い、酢酸緩衝液を用いて反応液をｐＨ７．０に調整した以外は、比較例１７−１および実施例１７−１〜１７−７と同様にして比較例２４−１および実施例２４−１〜２４−７のグルカンの合成を行なった。
【０３８６】
反応後、合成されたグルカンの収率を上記１．６に従って決定した。結果を図２４に示す。
【０３８７】
図２４に示すように、１２５ｍＭスクロースに対して、グルコース−１−リン酸を７．２ｍＭ加えて反応させた場合、グルカンの収率は、１６．４％と低かったが、１２５ｍＭスクロースに対してグルコース−１−リン酸を１０ｍＭ加えて反応させた場合、３５．３％と２倍以上の収率を得ることができた。さらに、１２５ｍＭスクロースに対してグルコース−１−リン酸を２０〜７５ｍＭ加えて反応させた場合、４０〜６０％の収率を得ることができた。
【０３８８】
このように、無機リン酸のかわりにグルコース−１−リン酸を用いてグルカンを合成する場合も、従来法のスクロース−リン酸比率の最大値のままでは生産性が低いが、スクロース−リン酸比率の最大値を一定範囲内にすることで２倍以上の生産性が得られるようになった。
【０３８９】
（実施例２５−１〜２５−５：ブランチングエンザイムを含むＳＰ−ＧＰ反応系でのグルカンの合成）
以下の表２１に示す組成の反応混合物を用いてグルカン合成を行った。なお、用いたブランチングエンザイムを、日本国特許公開２０００−３１６５８１（特願平１１−１３０８３３）に開示された方法にしたがって調製した。
【０３９０】
【表２１】
2004526463.tif 000034
この溶液を４５℃で１８時間反応させてグルカンを合成した。反応液量は１ｍｌであった。
【０３９１】
反応後、合成されたグルカンの収率を上記１．６にしたがって決定した。また、合成されたグルカンの平均単位鎖長をＴａｋａｔａらの文献（Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．２９５巻  ９１頁〜１０１頁（１９９６）に示された方法で測定した。結果を下の表２２に示す。
【０３９２】
【表２２】
2004526463.tif 000035
これらの条件において、高収率で、高度に分岐したグルカンを合成できることがわかった。
【産業上の利用可能性】
【０３９３】
本発明により、グルカンが生成される。反応開始時から反応終了までの間の（スクロースのモル濃度）と（無機リン酸のモル濃度およびグルコース−１−リン酸のモル濃度の合計）との比の最大値をある範囲内に設定することで、従来の方法に比べ高い生産性でグルカンを製造することができる。本発明者らは、スクロースホスホリラーゼの熱安定性を向上させる条件で反応させること、もしくは、より耐熱性の高いスクロースホスホリラーゼを開発して使用することにより、高温でのグルカン（好ましくは、アミロース）の製造を実現することができた。
【０３９４】
このようなグルカンは、澱粉加工工業用の原料、飲食用組成物、食品添加物用組成物、接着剤組成物、包接物および吸着物、医薬品および化粧品組成物、フィルム状製品組成物、生物崩壊性プラスチック用の澱粉の代替物質として有用である。
【図面の簡単な説明】
【０３９５】
【図１】図１は、スクロースからのグルカン合成の模式図である。
【図２】図２は、４％の初発スクロース、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ由来スクロースホスホリラーゼおよび馬鈴薯由来グルカンホスホリラーゼを用いて３７℃および４５℃で反応を行った場合のアミロースの収率を示すグラフである。
【図３】図３は、種々の初発スクロース濃度にて４５℃にて反応を行った場合のアミロースの収率を示すグラフである。
【図４】図４は、種々の初発スクロース濃度にて３７℃および４５℃にて反応を行った場合のアミロースの収率を示すグラフである。
【図５】図５は、耐熱性細菌であるＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ由来スクロースホスホリラーゼおよび馬鈴薯由来グルカンホスホリラーゼを用いて種々の初発スクロース濃度にて４５℃および５０℃にて反応を行った場合のアミロースの収率を示すグラフである。
【図６】図６は、図５で用いた酵素活性の半分の量のＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ由来スクロースホスホリラーゼおよび馬鈴薯由来グルカンホスホリラーゼを用いて種々の初発スクロース濃度にて４５℃および５０℃にて反応を行った場合のアミロースの収率を示すグラフである。
【図７】図７は、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ由来スクロースホスホリラーゼおよびＴｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ由来グルカンホスホリラーゼを用いて種々の初発スクロース濃度にて４５℃にて反応を行った場合のアミロースの収率を示すグラフである。
【図８】図８は、図７で用いた酵素活性の半分の量のＬｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ由来スクロースホスホリラーゼおよびＴｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ由来グルカンホスホリラーゼを用いて種々の初発スクロース濃度にて４５℃にて反応を行った場合のアミロースの収率を示すグラフである。
【図９】図９は、耐熱性細菌であるＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ由来スクロースホスホリラーゼおよびＴｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ由来グルカンホスホリラーゼを用いて種々の初発スクロース濃度にて５０℃にて反応を行った場合のアミロースの収率を示すグラフである。
【図１０】図１０は、図９で用いた酵素活性の半分の量のＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ由来スクロースホスホリラーゼおよびＴｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ由来グルカンホスホリラーゼを用いて種々の初発スクロース濃度にて５０℃にて反応を行った場合のアミロースの収率を示すグラフである。
【図１１】図１１は、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ由来スクロースホスホリラーゼおよびＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来グルカンホスホリラーゼを用いて種々の初発スクロース濃度にて４５℃にて反応を行った場合のアミロースの収率を示すグラフである。
【図１２】図１２は、図１１で用いた酵素活性の半分の量のＬｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ由来スクロースホスホリラーゼおよびＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来グルカンホスホリラーゼを用いて種々の初発スクロース濃度にて３７℃および４５℃にて反応を行った場合のアミロースの収率を示すグラフである。
【図１３】図１３は、耐熱性細菌であるＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ由来スクロースホスホリラーゼおよびＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来グルカンホスホリラーゼを用いて種々の初発スクロース濃度にて５０℃にて反応を行った場合のアミロースの収率を示すグラフである。
【図１４】図１４は、図１３で用いた酵素活性の半分の量のＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ由来スクロースホスホリラーゼおよびＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来グルカンホスホリラーゼを用いて種々の初発スクロース濃度にて４５℃および５０℃にて反応を行った場合のアミロースの収率を示すグラフである。
【図１５】図１５は、耐熱性細菌であるＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ由来スクロースホスホリラーゼと、馬鈴薯由来グルカンホスホリラーゼまたはＴｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ由来グルカンホスホリラーゼとを用いて５０％の初発スクロース濃度にて６５℃にて反応を行った場合のアミロースの収率を示すグラフである。
【図１６】図１６は、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ由来スクロースホスホリラーゼおよび馬鈴薯由来グルカンホスホリラーゼを用いて、種々の初発無機リン酸濃度にて３７℃にて反応を行った場合のアミロースの収率を示すグラフである。
【図１７】図１７は、耐熱性細菌であるＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ由来スクロースホスホリラーゼおよび馬鈴薯由来グルカンホスホリラーゼを用いて、種々の初発無機リン酸濃度にて４５℃にて反応を行った場合のアミロースの収率を示すグラフである。
【図１８】図１８は、組換えＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ由来スクロースホスホリラーゼを、種々の濃度のスクロース溶液中で５５℃で加熱した場合の残存活性を示すグラフである。
【図１９】図１９は、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ由来スクロースホスホリラーゼを、種々の濃度のスクロース溶液中で５５℃で加熱した場合の残存活性を示すグラフである。
【図２０】図２０は、スクロースホスホリラーゼ安定性へのスクロースまたはフルクトースの効果を示すグラフである。
【図２１】図２１は、スクロースホスホリラーゼ安定性への無機リン酸の効果を示すグラフである。
【図２２】図２２は、プライマーとしてプルランを用い、種々の初発スクロース濃度にて５０℃にて反応を行った場合の、グルカンの収率を示すグラフである。
【図２３】図２３は、プライマーとしてプルランを用い、種々の初発無機リン酸濃度にて５０℃にて反応を行った場合の、グルカンの収率を示すグラフである。
【図２４】図２４は、基質としてグルコース−１−リン酸を用いた場合の、グルカンの収率を示すグラフである。
【図１】
2004526463.tif 000036
【図２】
2004526463.tif 000037
【図３】
2004526463.tif 000038
【図４】
2004526463.tif 000039
【図５】
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【図６】
2004526463.tif 000041
【図７】
2004526463.tif 000042
【図８】
2004526463.tif 000043
【図９】
2004526463.tif 000044
【図１０】
2004526463.tif 000045
【図１１】
2004526463.tif 000046
【図１２】
2004526463.tif 000047
【図１３】
2004526463.tif 000048
【図１４】
2004526463.tif 000049
【図１５】
2004526463.tif 000050
【図１６】
2004526463.tif 000051
【図１７】
2004526463.tif 000052
【図１８】
2004526463.tif 000053
【図１９】
2004526463.tif 000054
【図２０】
2004526463.tif 000055
【図２１】
2004526463.tif 000056
【図２２】
2004526463.tif 000057
【図２３】
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【図２４】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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