(57)【要約】本発明は、天然薬（即ち、伝統的な漢方薬）の製剤を製造する方法に関する。特に、本発明は、生体工学の理論を斟酌し、ヒト腸官における微小生態系を模倣する腸内共生生物の発酵培養組織により、任意の植物又は動物由来の天然薬を生体転換又は生体修飾し、それによって、前記天然薬の生物活性を改良し、その毒性を軽減あるいは除去する方法に関する。本発明は更に、天然の漢方製剤の製造における、前記方法の使用にも関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
天然薬製剤を製造するための方法であって、１つ以上の腸内共生生物を前記薬剤の抽出物を含む培養培地に接種すること；及び好適な発酵条件下でこの腸内共生生物を培養することを含んでなる方法。
【請求項２】
１つ以上の腸内共生生物の共発酵培養組織を調製する工程；及び前記培養培地に、１つ以上の天然薬の予め作製された抽出物又は未加工の天然薬の粉末を添加する工程；及び得られた混合物を更に混合及び培養する工程を含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
１つ以上の天然薬の予め作製された抽出物又は未加工の天然薬の粉末を好適な培養培地に添加する工程；及び１つ以上の腸内共生生物を、得られた混合物にバッチに接種し、共発酵によりこの腸内共生生物を培養する工程を含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記共生生物が、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｕｍ、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ及びＢａｃｉｌｌｕｓからなる群種から選択される１つ以上のヒト腸内非病原性共生生物である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記共生生物が、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｂｉｆｉｄｕｍ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｂｒｅｖｅ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｉｎｆａｎｔｉｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｌｏｎｇｕｍ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｃａｓｅｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｐｌａｎｔａｒｕｍ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ　ｆａｅｃａｌｉｓ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ　ｆａｅｃｉｕｍ、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ　ｃｉｔｒｏｖａｒｕｍ、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｓｈｅｒｍａｎｉｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ及びＢａｃｉｌｌｕｓ　ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓからなる群種から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記天然薬製剤が、予防及び／又は治療効果を有し、１つ以上のヒト正常腸内細菌及びその代謝産物により加工又は修飾されうる、１つ以上の任意の植物又は動物由来の薬剤又はその組み合わせを含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記天然薬製剤が、１つ以上の天然薬又はその組み合わせの水抽出物又は有機溶液抽出物、あるいは前記薬剤の未加工の固体粉末である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記有機溶液が、メタノール、エタノール、ｎ−プロパノール、イソプロパノール、メチルエーテル、エチルエーテル、ジメチルエーテル、アセトン、ジクロロメタン、クロロフォルム、アセトニトリル又はそれらの混合物からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記天然薬製剤が、生命ＱＩを支持するために病原性因子を除去する；ＱＩを活性化して止血する；脾臓を活性化し、腎臓を強化する；硬い塊を柔軟化し、血液のうっ血を除去する；粘液分泌過多を解消し、湿気を取り除く；炎症を軽減し、毒素を排出する；ヴァイタルエッセンス及び血液の生成を促進する；利尿を促進し、生命ＱＩを活性化するための薬剤又はそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明は、天然薬（すなわち、伝統的漢方薬）の製剤の製造方法に関する。特に、本発明は、生体工学の観点からヒト腸管での微小生態系を模した腸内共生発酵培養による任意の植物または動物由来の天然薬の生体転換または生体修飾の方法により、上記天然薬の生物活性を改良し、その毒性を減少させまたは除去することに関する。本発明は、天然の漢方製剤の製造における上記方法の使用にも関する。
【０００２】
発明の背景
漢方薬は、東洋、特に中国において数千年にわたり臨床に用いられてきているが、漢方薬の正確な機構、すなわち薬理効果は未だよく知られていない。ヒトの微小生態系に関する研究の発達と共に、ヒト腸内微生物の微小生態は漢方医科学を考慮した「病気」に密接に関係している可能性があると考えられるに至っている。具体的には、漢方薬を用いる調節により、腸管における有用細菌と有害細菌のバランスを改良することができる。一方、腸内の微小生態環境のバランスを取ることによって、天然薬の吸収、転換および輸送が容易になり、これによりその生物学的効果が改良される。
【０００３】
漢方薬の薬効は、それに含まれる化学材料に依存している。漢方薬の意味において煎出液、すなわち水抽出物の形態でヒトに経口投与すると、最終的に様々な輸送経路によって吸収され、（１）原型化合物が循環に吸収され、薬理効果を示し、（２）原型化合物が吸収された後、腸肝循環、組織または血液中での一連の工程を施した後、その薬理効果を発揮し、（３）原型化合物が吸収されず、糞便および尿と共に排泄され、（４）原型化合物は通常の腸内細菌の活性の結果、腸内細菌代謝酵素によって化学的に転換される。
【０００４】
この方法では、上記薬の吸収速度、輸送速度および生物活性は毒性のある副作用の減少と共に改良され、これはその薬理効果を示す上で好ましい。従って、ヒト腸内嫌気性菌による天然薬および実験室並びに臨床的な薬物動態の研究に関するその代謝転換の正確な工程を詳細に検討することは、漢方薬の機能的機構を説明する上で極めて重要である。
【０００５】
１９５０年以来、天然薬またはその活性成分およびその構造的修飾に関する腸内の通常の細菌叢による転換を検討する目的で、様々な動物モデルや方法が用いられてきた。イン・ビボまたはイン・ビトロでの研究によって、天然薬についての吸収、輸送、代謝およびイン・ビボ薬効に重要な役割を果たしている煎出液（すなわち、水抽出物）の形態で投与される天然薬への腸内の通常の細菌叢による生態転換および構造的修飾については複雑な代謝過程があることが明らかにされている。
【０００６】
例えば、Ｄｏｏｔｈ Ａ．Ｎ． ｅｔ ａｌ． （Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２２３：２５１， １９５６）は、３，４−ジヒドロキシフェニルアセテートのようなＢ環分解生成物が、クエルセチンをマウスに経口投与した後に尿中に検出することができることを報告した。反対に、これらのクエルセチン代謝生成物は、抗生物質（例えば、ネオマイシン）を予め動物に投与すると、尿中に検出することができなかった。実験結果は、これらの代謝生成物が腸内細菌の陥入転換（ｅｍｂｏｌｉｃ ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ）によってもたらされることを示唆している。
【０００７】
Ｄｒａｓａｒ ａｎｄ Ｈｉｌｌ （ヒトの腸内細菌叢（Ｈｕｍａｎ Ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ Ｆｌｏｒａ）， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， １９７４）は、腸内細菌を抑制する目的でラットに抗生物質を腹腔内投与したところ、漢方である毒性の高いアーモンドグリコシドを含むアーモンドを実験ラットに経口投与したとき、ラットではアーモンドグリコシドに対する毒性反応は認めることができないことも明らかにした。更に、アーモンドグリコシドをマウスの単離した腸内細菌と共にインキュベーションすると、上記アーモンドグリコシドはフェニルエタノールニトリルに加水分解することができ、次に、これは更に特別に検出することができる毒性のあるヒドロシアン酸に分解される（Ｓｃｈｅｌｉｎｅ Ｒ．Ｋ．， Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． Ｒｅｖ．， ２５：４５１， １９７３を参照）。
【０００８】
甘草の主成分であるリキルチンは、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ． ＣＬＨによってその生成物であるグルクロニダーゼを用いてエノキソロンに転換することができることも明らかにされている。更に、根粒細菌種からの植物由来のイソフラボン化合物は、ヤギ由来の腸内内容物とインキュベーションすることによって構造を修飾することができることが観察された。特に、７−ヒドロキシ−４−メチルイソフラボンは、色素ゲニテイン（ｇｅｎｉｔｅｉｎ）に転換するバイオカニンＡでダイズグリコシドリガンドとエピュオールに転換される。すなわち、ヤギの内容物中の腸内細菌叢は、イソフラボン化合物を生体転換する能力を有する（Ｎｉｉｓｓｏｕ， Ａ．， ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ， １４８：９２， １９６７を参照）。
【０００９】
上記の総ての実験は、とりわけ消化管を介して体内に摂取されると、既知および／または未知構造を有する天然薬は、吸収前に腸内細菌叢またはその代謝物の作用によってある程度構造が修飾された後、その生物活性の機能が構造的に修飾されねばならない。
【００１０】
しかしながら、先行技術ではこれまでのところ、未知構造を有する天然薬、特に既知の共生を用いることによる天然薬組成物についてのイン・ビトロで操作または処理を行い、その活性成分を活性化し、誘導し、転換し、および／または修飾することによって、経口投与の後に生物学的機能を増強することに関しては報告されていない。更に、製造方法については、共生のバッチに接種して天然薬の生物活性を改良した後、生成物を臨床に良好に応用することによるイン・ビトロでの発酵による上記医薬の製造方法については、全く報告されていない。
【００１１】
本発明者は、腸内共生製剤並びに天然の抗癌薬の開発における長期間の努力に基づいて、様々な腸内共生生物を様々な天然薬組成物の水抽出物と組み合わせて発酵させたのであり、本発明で用いた腸内共生生物は人体に広く分布して、正確な活性を有する。意外なことには、上記の天然薬組成物のイン・ビボでの薬理活性は、腸内共生生物およびその代謝物による発酵処理の後には実質的に増強されていることを見いだした。本発明は、上記の発見に基づいて行われたものである。
【００１２】
発明の概要
本発明の１つの目的は、天然薬調製物を製造するための方法であって、該薬剤の抽出物を含有する培養培地に１つ以上の腸内共生生物をバッチに接種すること、及び、好適な発酵条件下で該腸内共生生物を培養することを含んでなる方法を提供することである。
【００１３】
本発明の好適な実施形態において、該方法は１つ以上の腸内共生生物の共発酵培養組織を調製する工程、その後１つ以上の天然薬の予め作製された抽出物又は未加工の天然薬の粉末を該培養培地に添加する工程、その後得られた混合物をさらに混合及び培養する工程を含む。
【００１４】
本発明の好適な他の実施形態において、該方法は１つ以上の天然薬の予め作製された抽出物又は未加工の天然薬の粉末を好適な培養培地に添加する工程、その後１つ以上の腸内共生生物を生成する混合物にバッチに接種し、共発酵によって該腸内共生生物を培養する工程を含む。
【００１５】
本発明のさらに好適な実施形態において、該共生生物は、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ， Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ， Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ， Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ， Ｐｒｏｐｉｏｎｉｕｍ， Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ　及び　Ｂａｃｉｌｌｕｓからなる群種から選択される、１つ以上のヒト腸内非病原性共生生物である。
【００１６】
本発明のさらに好適な実施形態において、該共生生物は、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｉｆｉｄｕｍ， Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｒｅｖｅ， Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｆａｎｔｉｓ， Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ， Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ， Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ， Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ， Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ， Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ， Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ， Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ， Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ， Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｃｉｔｒｏｖｏｒｕｍ，　Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｈｅｒｍａｎｉｉ， Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｔｌｉｓ及び　Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓからなる群種から選択される。
【００１７】
本発明の好適な実施形態において、該天然薬調製物は、予防及び／または治療効果を有し、１つ以上のヒト正常腸内細菌及び代謝産物によって加工または修飾されうる、１つ以上の任意の植物又は動物由来の薬剤または組み合わせを含む。
【００１８】
本発明の好適な実施形態において、該天然薬調製物は、１つ以上の天然薬又はその組み合わせの水抽出物又は有機溶液抽出物、あるいは該薬剤の未加工の固体粉末である。
【００１９】
本発明の好適な実施形態において、該有機溶液は、メタノール、エタノール、ｎ−プロパノール、イソプロパノール、メチルエーテル、エチルエーテル、ジメチルエーテル、アセトン、ジクロロメタン、クロロフォルム、アセトニトリル又はそれらの混合物からなる群から選択される。
【００２０】
本発明の好適な実施形態において、該天然薬調製物は、生命ＱＩを支える病原性の因子を除去し、ＱＩを活性化させることにより止血し、脾臓を活性化し腎臓を強化し、硬い塊を柔軟化し血液のうっ血を解消し、粘液分泌過多を解消し湿気を取り除き、炎症を和らげ毒素を排出し、ヴァイタルエッセンス及び血液の生成を促進し、排尿を促進し生命ＱＩを活性化するための薬剤、及びその混合物からなる群から選択される。本発明で用いる「ＱＩ」という語は、生体エネルギー又は脾臓、腎臓などの人体の機能的な活性を意味し、中国伝統の医科学の全概念であり、当該分野の当業者には明らかである。
【００２１】
発明の詳細な説明
本発明の１つの目的は、天然薬の組成物を製造する方法に関する。特に、本発明は生体工学の理論を斟酌し、ヒト腸管の微小生態系を模倣する腸内共生生物の共発酵培養組織により任意の植物又は動物由来の天然薬を生体転換化又は生体修飾し、それにより該天然薬の生物学的活性を向上させ、毒性を軽減あるいは除去する方法に関する。本発明はさらに、天然薬調製物の製造における該方法の使用に関する。
【００２２】
中国伝統の漢方を水煎出することは、長い歴史をもつ中国伝統の薬剤の加工の際に未加工の薬を加工する広く使用されている方法であることはよく知られている。しかしながら、水抽出方法（すなわち、中国伝統の薬剤の抽出方法）は、簡単だが、欠点も伴う。特に、薬剤における水に可溶性の成分は十分に溶出せず、一方、含まれる脂溶性の成分のほとんどは、そのような過程の間になくなる。ここ数十年に、西洋医学の現代の製薬技術、たとえば、エタノールや他の有機溶液抽出技術が導入されてきており、伝統的な水抽出と併用されている。遺憾ながら、これらの方法を用いる時、有機溶液の残留、薬の吸収不足や活性化不足ような問題が生じる。
【００２３】
１９９０年代、経口投与薬の胃腸運搬方法の模倣を意図した、いわゆる「準生体工学的抽出」を用いて中国伝統の薬剤を製造することが提案され、そこでは漢方の活性成分は酸性水性溶液及び基本的な水性溶液でそれぞれ抽出され、小腸での吸収を促進する。しかしながら、ヒト胃腸の内部環境は不適当に簡潔化され、中国の薬草自体の成分の複合性が考慮されていない。
【００２４】
実際、ヒト胃腸は、ヒト細胞すべての数の倍以上の数の約百種の有益又は有害な細菌を含む微小生態系である。さらに、中国漢方薬の全ての製法は化学的合成薬の製法のように１つの化合物ではなく、様々な異種の化学物質を含むほとんど複合性の「貯蔵庫」である。したがって、酸及び／または胃腸の基本条件を単に模倣することより中国伝統の薬剤を加工しても、加工した中国伝統の薬剤に期待する効果を得ることはほとんどできない。
【００２５】
本発明者は、発展した微小生態学的製剤と中国漢方製剤において、長い歴史ある実践に基き、該天然薬調製物に関する本願の方法は実質的に期待する薬学的活性イン・ビボを向上させ，非特定の肉体の毒素をある程度減少させることを見出した。該方法は腸内の共生生物培養組織を選択することにより、様々な天然薬を操作し、３種類の共生生物を中国漢方薬の予め作製された水煎出調製物に添加し、その後得られた混合物を共培養する方法を含む。
【００２６】
本発明の１つの目的は、生体工学の理論を斟酌し、ヒト腸管の微小生態系を模倣する腸内共生生物の共発酵培養組織により任意の植物又は動物由来の天然薬を生体転換又は生体修飾し、それにより該天然薬の生物学的活性を向上させ、毒性を軽減あるいは除去する方法を提供することである。該方法は、以下の工程、
（１）従来の方法にしたがって、植物又は動物由来の天然薬のそれぞれの抽出物を調製し、その生成物を混合する前に圧力を下げて凝縮する工程、
（２）選択した共生生物を順次， 工程（１）の天然薬の抽出物を含む発酵槽にバッチに接種し、生成した混合物を好適な発酵条件下で培養する工程
（３）発酵の終了時、必要に応じて、培養組織を収集する前にその中の共生生物を殺すために発酵培養組織を加熱又は加熱しない工程を含む。
【００２７】
本発明による該共生生物はヒト腸内に一つ以上の任意の本来備わっている有益な、非毒素の細菌であってもよく、 Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ， Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ， Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ， Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ， Ｐｒｏｐｉｏｎｉｕｍ， Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ　及び　Ｂａｃｉｌｌｕｓからなる群から選択することができる。
【００２８】
例として、好ましい菌株としてはＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｉｆｉｄｕｍ， Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｒｅｖｅ， Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｆａｎｔｉｓ， Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ， Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ， Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ， Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ， Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ， Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ， Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ， Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ， Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ， Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ， Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｃｉｔｒｏｖｏｒｕｍ，　Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｈｅｒｍａｎｉｉ， Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｔｌｉｓ及び　Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓからなる群種が挙げられるが、これらに限らない。本発明の目的には、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｉｆｉｄｕｍ， Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｒｅｖｅ， Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｆａｎｔｉｓ， Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓを含むＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ及びＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓが好ましい。
【００２９】
通常、共生生物の種、菌株の選択には特に限定はない。生体工学的及び生態的バランスを考慮に入れると、は二つ以上（上限９種まで）が選択され、ヒト腸内の異なる場所にコロニー形成し、互いに機能上補い合うことが好ましい。一例では、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ、及びｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｉｆｉｄｕｍ， Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｒｅｖｅ を含むＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、及びＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ を含む３種類の共生生物の群が本発明で用いられる。
【００３０】
Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ （Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｉｆｉｄｕｍ， Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｒｅｖｅ を含む）及びＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ　は全て正常の腸の微生物叢に属していることがよく知られている。これらは、腸の異なる部位に位置し、小腸と結腸それぞれの特定の部位にて優先的な機能を持つ。特に、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓは、腸内でビタミンを合成し、食物消化を助け、ホストの新陳代謝を促進し、ホストの乳糖耐性を高める回腸に優先的に位置する。Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍについては、主に結腸にコロニー形成し、最も重要な生理学的な細菌として、ホスト内の栄養分吸収、成長及び発達、生理的嫌悪感及び免疫機能を促進する。Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍについては顕著に盲腸に見受けられ、血清においてコレステロールを潜在的に減少させる際の機能を示す。すなわち、本発明のこれら３つの好ましい共生生物は人体に広く分散され、実質的な生理学的活性を有する。上記３つの共生生物の選択が本発明の基礎となる生体工学の理論により完全に明らかにされることは本発明者により支持されている。
【００３１】
また、該共生生物の生存を促進するため、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｈｅｒｍａｎｉｉ及びＬｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｃｉｔｒｏｖｏｒｕｍを含む３つの共生生物を用いてもよい。特に、
（１）腸内のＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓにより製造された過度の乳酸塩はＰｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍによりプロパン酸及び二酸化炭素に変換され、それにより、糸状菌及び酵母菌を抑制する。
（２）アセトアルデヒドを加水分解するアルコール・デヒドロゲナーゼ、消化管内の酵母菌の成長により引き起こされる有害な代謝産物は、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｈｅｒｍａｎｉｉにより合成されることができる。
（３）Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｃｉｔｒｏｖｏｒｕｍは単一な糖及びクエン酸塩を消化し、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ及びＰｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｈｅｒｍａｎｉｉの成長に有益な二酸化炭素を生成することができる。
【００３２】
本発明で用いる中国伝統の漢方組成物とは、１つ以上の植物又は動物由来の中国漢方を用いた医薬を指し、中国漢方は不変性の基本組織構造をもつ未加工の薬剤、又はそれらの水抽出溶液又は有機溶液抽出物であってもよい。本発明で用いる有機溶液は、メタノール、エタノール、ｎ−プロパノール、イソプロパノール、ｎ−ブタノールなどのアルコール類、メチルエーテル、エチルエーテル、ジメチルエーテルなどのエーテル類、アセトン、ジクロロメタン、クロロフォルム、アセトニトリル、ぎ酸エチル、エチルアセテート又はそれらの混合物を含むが、これらに限定されない。該中国漢方は、環境の安全性及び発酵操作の点から、天然薬の水抽出物であることが好ましい。
【００３３】
薬理効果の点において、本発明によるインビトロでの発酵により処理されうる前記天然薬組成物は、生命ＱＩを支持するために病原性因子を除去する；ＱＩを活性化して止血する；脾臓を活性化し、腎臓を強化する；硬い塊を柔軟化し、血液のうっ血を除去する；粘液分泌過多を解消し、湿気を取り除く；炎症を軽減し、毒素を排出する；ヴァイタルエッセンス及び血液の生成を促進する；利尿を促進し、生命ＱＩを活性化するための薬剤又はそれらの混合物を含むが、それらに限定されない。
【００３４】
本共生生物の培養及び増殖に有用な培養培地は、炭素源、窒素源及び必須ビタミン並びに細菌増殖に必要なミネラルを含む、任意の既知の通常の培養培地でありうる。大規模な工業的製造コストを最小限にするため、製造方法を簡略化し、ダイズイソフラボン、可溶性食事性繊維及びダイズオリゴ糖、例えばスタキオースやラフィノース、等で、培養培地を更に補充する。発芽豆煎汁、酵素タンパク質分解性ビーフブロス、酵母抽出物、炭水化物及びミネラルからなる培養培地が、本発明においては好ましい。本発明で使用する培養培地は、他の基本成分、例えば炭素源（グルコース及びスクロース）、窒素源（酵素分解性ブロス及び酵母抽出物）及びミネラルに加えて、汁培地において約２５％ｖ／ｖであるマメ新芽煎汁を含むことを特徴とする。本発明の典型的な培養培地は、２．５％の酵素分解性ビーフブロス、１．３％の酵母抽出物、２５％のダイズ煎汁、１．３％のグルコース、１．３％のスクロース、０．０５％のＭｇＳＯ４、０．０５％のＣａＣＯ３、０．０３％のＫ２ＨＰＯ４、０．０３％ＫＨ２ＰＯ４、０．０３％のＮａＣｌ（重量による、ｗ／ｗ）からなる。
【００３５】
培地中のダイズ新芽煎汁が、窒素及び／又は炭素源としてではなく、ダイズイソフラボン、可溶性繊維及びダイズオリゴ糖（例えばスタキオースやラフィノース）の補充剤として役立つことに留意されたい。ダイジン（ｄａｉｚｉｎ）、染色ゲニテイン（ｇｅｎｉｔｅｉｎ）及びダイドゼイン（ｄａｉｄｚｅｉｎ）を含む植物由来エストロゲンとしてのダイズイソフラボンが、抗遊離基効果、血液脂質レベルの低下、心血管疾患の危険性の低下、内分泌障害によって引き起こる閉経期の女性における骨粗しょう症の予防等の、いくつかの有利な作用を有することは既知である。前記ダイズ新芽煎汁に含まれる可溶性繊維は、内臓における中性脂肪及びコレステロールの吸収を妨げ、胃腸官蠕動を促進し、便秘を予防し、炭水化物の吸収を遅延又は抑制することができる。加えて、そこに含まれるダイズオリゴ糖は、内臓の有害細菌によってではほとんどなく、腸内Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓのみによって使用されうるので、前記ダイズ煎汁によって腸内細菌叢間のバランスを回復することが好適である。
【００３６】
要するに、本発明の１つの特徴は、共生生物の培養培地における主要成分の１つとしてダイズ煎汁を使用することである。本発明による共生生物の培養培地におけるダイズイソフラボン及び可溶性繊維の含有量は、約２０〜４０μｇ／ｍｌ及び３０〜１００μｇ／ｍｌの範囲内であると限定される。
【００３７】
本発明の培養培地における主要成分のひとつであるダイズ煎汁を調製するために、新鮮で成熟したダイズを、２容量の温水で約５〜６時間洗い、ダイズの組織を拡張する。新芽の長さが約３〜８ｃｍになるまで、前記ダイズを更に、約２５〜２７℃の温度で約６０〜７２時間保つ。発芽し、拡張した結果のダイズを集め、発芽ダイズ１リットルあたり３リットルの水の比で、水道水に加える。次いで混合物をオートクレーブで３０分間、約１０５〜１２１℃で加熱する。その後、２層濾布を用いて更に濾過することにより、ダイズ新芽煎汁を得る。
【００３８】
本発明による培養培地のもう１つの主要成分は、プロテアーゼ処理された新鮮なビーフ及びウシ肝臓組織の加水分解物である。本ブロスは、ビーフだけでなく様々な酵素に富むウシ肝臓組織をも使用するという点で、従来のブロスと異なる。加えて、ブタ又はウシ膵臓から得られる生のトリプシン製剤も、本ブロスの製造プロセスにおいて使用される。酵素分解性ビーフブロスを調製するために、選択したビーフ及び肝臓組織を、５：２の比（重量による）で混合し、十分に切り刻む。その後、切り刻んだ混合物に、１〜１．５容量の水を添加し、よく混ぜ、更に約６０分間、約１００℃に加熱する。前記混合物の温度を３８〜４１℃に冷却し、後述する方法により製造された粗トリプシン製剤を添加する。得られたものを約１時間、ｐＨ７〜９で更に消化する。加水分解後、２０００ｒｐｍでの遠心分離後の上澄みを集めることによってタンパク質分解性ビーフブロスを得る。
【００３９】
粗トリプシン製剤を、以下の工程に従って、ビーフ及びウシ肝臓組織から製造する。第１に、動物、例えばウシ、ウマ、ヤギ又はブタからの膵臓をホモジェネートし、次いで無水エタノール及び沸騰水と、１：１：３の比で混合し、更に７２時間攪拌しつづける。５００ｒｐｍで１０分間遠心分離した後、上澄みを集め、得られた上澄みのｐＨを濃縮ＨＣｌで約５．５に調節する。このようにして、所望の粗トリプシン製剤を得る。
【００４０】
通常の技術により得られる天然薬組成物の水又は有機溶液抽出物を上記のようにして得られたマトリクスとしての培養培地に添加し、完全に混合する。前記マトリクス汁及び天然薬の抽出物を含んでなる、結果として得られた混合物を約１０分間加熱して沸騰させ、次いで約３７℃に冷却する。この温度で、前記混合物に、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｕｍ、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ及びＢａｃｉｌｌｕｓからなる群から選択されるヒト正常腸内細菌の１つ以上の共生生物を接種する。次いで、得られたものを更に、約３７℃、ｐＨ６．２で約１８〜２４時間発酵させる。発酵が終了したら、培養系を室温まで冷却し、濾過した後、共生生物発酵により処理される汁（即ち濾過物）形態の天然薬を得る。
【００４１】
代替的には、本出願と同日出願された同時継続出願の記載によれば、天然源からの１つ以上の薬剤又はそれらの混合物を適切な時に全細菌培養組織へ組み込む。上述のプロセスにおいて、前記薬剤を培養組織中の細菌又はその代謝産物により転換又は修飾する。前記処理に好適な時間とは、共生生物共発酵の終了時から２４時間及び全発酵系を過熱することによりその中の細菌が死滅する前の間である。その後、得られた混合物を、更に約１８時間、心理的条件、即ち３７℃でｐＨ６．２という条件を模倣する発酵条件下で発酵させる。
【００４２】
発酵の間、天然薬の抽出物における１つ以上の成分は、嫌気性共生生物又はその代謝産物により、構造的に修飾あるいは代謝的に転換されるであろう。このようにして、天然薬の不活性化化合物は、活性化化合物に転換され、あまり活性化されていない分子は、高い生物活性を有する分子又はその集積物に修飾され、更には高い毒性副作用を有するいくつかの化合物（特に、動物由来の天然化合物）でさえ、低毒性又は無毒性化合物又はその集積物に転換されるであろう。
【００４３】
Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｂｉｆｉｄｕｍ及びＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ　ｆｅａｃｉｕｍを天然抗癌薬剤の転換における共生生物として適用することは、上記に記載されており、他の培養培地及び他の成分を使用するが、やはり腸内環境を模倣する発酵プロトコルは、例えば、選択された共生生物及び発酵プロトコルに依存する特定の環境下で、ある天然薬を転換するのにも有用である。
【００４４】
本発明の１実施形態において、Ｃｏｌｌａ　ｃｏｒｉｉ　ａｉｓｎｉ及びＲａｄｉｘ　ａｓｔｒａｇａｌ、調製Ｒａｄｉｘ　ｒｅｆｍａｎｎｉａｅ、Ｒａｄｉｘ　ｃｏｄｏｎｏｐｓｉｓ、Ｇａｎｏｄｅｒｍａ　ｌｕｃｉｄｕｍ、Ｒａｂｄｏｓｉａ　ｓｅｒｒａ、Ｒａｄｉｘ　ｓｃｕｔｅｌｌａｒｉａｅ、蜂蜜フライドＦｏｌｉｕｍ　ｅｒｉａｂｏｔｒｙａｅ、Ｒｈｉｚｏｍａ　ｐｈｒａｇｍｉｔｉｓ、Ｐａｒｉｓ　ｐｏｌｙｐｈｙｌｌａ等を含む植物由来成分及びトアドスキン（ｔｏａｄｓｋｉｎ）、Ｂｏｍｂｙｘ　ｂａｔｒｙｔｉｃａｔｕｓ、Ｏｓ　ｅｕｌｏｔａｅ（巻貝）、Ｓｃｏｒｐｉｏ、Ｓｃｏｌｏｐｅｎｄｒａ（ムカデ類）、ヤモリ等を含む動物由来成分の抽出物からなる抗癌天然薬としての医薬組成物が好ましい。前記組成物の製剤を、実施例２でより詳細に説明する。
【００４５】
驚くべきことに、本発明による共生生物で更に発酵しない前述の抗癌天然薬を実験用Ｓ１８０肉腫モデル動物又はＨ２２悪性肝癌モデル動物に直接投与する三重実験（ここで、抑制率は３０％未満と算出される）において、癌の増殖抑制の実質的な効果を見ることはできない。同様に、上述の発酵培養組織をそのまま投与する際、前記培養組織が、前述の方法に従って調製される前記３つの共生生物並びにダイズイソフラボン及び可溶性繊維からなる場合でさえ、癌の増殖抑制に対する検出可能な効果を観察することはできない。別の場合、前述の植物及び動物由来薬剤の水抽出物を前記発酵培養組織に１：１の比で添加し、次いで得られた混合物を嫌気条件下、３９℃±１℃で約１８〜２５時間発酵させる。驚くべきことに、このように調製された全天然薬抽出物の共生生物発酵生成物は、癌の増殖に対して実質的な抑制活性を呈することを見出した（実施例３及び４参照）。
【００４６】
いかなる確立した理論によっても制限されることを望まないが、上記結果は更に、天然薬、特に既知又は未知の構造を有するいくつかの天然植物及び動物由来薬剤は、インビボ又はインビトロでの通常の腸内細菌叢による、ある化学的修飾あるいは生体転換後、その宿主のみによって吸収されることが可能であり、それにより、その生物活性が作用しうるということを示す。
【００４７】
例として、後述の実施例２及び３は、１３種の植物由来成分及び６種の動物由来成分の抽出物からなる医薬組成物を、好適な栄養培養培地における３つの共生生物を用いて発酵することにより処理する方法をより詳細に説明する。
【００４８】
加えて、前記抗癌医薬組成物の活性は、そのように処理されていない同医薬組成物と比べて、本発明の腸内共生生物で発酵された後に著しく向上するということを示すために、生きた担癌モデル動物も使用される。
【００４９】
得られた本発明の医薬組成物は、通常の化学的治療及び放射線療法を含む従来の抗癌治療に対する潜在的な助剤として有用であり、ある程度まで化学的治療及び／又は放射線療法を受けた患者の副作用を減少あるいは除去するのにも有用である（実施例４及び５参照）。
【００５０】
癌寄生マウスに関する別の研究において、本発明による共生生物での共発酵に供した後、抗癌天然薬は、癌に罹ったマウスの免疫学的機能を増大する能力を有することが更に証明される。特に、（１）癌に罹ったマウスにおけるマクロファージ細胞の食作用的活性が著しく向上し、（２）Ｔ細胞、コンカナバリンＡの有糸分裂因子によって引き起こされるリンパ細胞の転換も改善される（データは示さず）。
【００５１】
従って、確立された理論に制限されないが、本発明者は、驚くべきことに、様々な悪性増殖性疾患の予防及び治療に加え、本発明の伝統的な漢方薬が、哺乳類、好ましくはヒトの造血幹細胞の増殖及び発達を促進する能力を有することを見出した。
【００５２】
細胞レベルに関する並びに動物における主要な実験結果は、本発明の製剤を投与することによって、化学的治療及び／又は放射線療法を受ける患者の抹消血液における好中球及び赤血球レベルを効果的に回復及び維持することができるということを示す。更に、我々の主要な実験結果によれば、本製剤は、化学的治療及び／又は放射線療法によって引き起こされる骨髄幹細胞の増殖及び分化に対する抑制の緩和において有用であることに加え、様々な白血病及び貧血症の治療にも有用であることが示唆される。
【００５３】
本発明は、以下の実施例及び添付のクレームと組み合わせて十分に説明されており、添付のクレームの精神及び範囲を逸脱することなく、多くの変更及び修正を行うことができるということは、当業者にとって明らかであろう。
【００５４】
実施例
実施例１　腸内共生生物の同時発酵培養物の調製
例として本実施例はＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｉｆｉｆｕｍ、およびＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍのバッチ接種、および同時発酵により、同じ培地中で同時発酵培養物を調製する方法を提供する。
【００５５】
１．共生生物系統の選抜
Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍは哺乳類、特にヒトにおいて最も重要な生理学的細菌の一つであり、主として小腸下部および結腸に分布している。Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｒｅｖｅはヒトの栄養、成長、発達および免疫機能に極めて重要であることが知られている。胃腸管では、該細菌の大部分が回腸に存在している。Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓに関しては、ビタミン、特にビタミンＢの生合成に関与し、食物の消化を助け、栄養代謝を促進し、ならびに宿主のラクトース耐性を高める。Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓは主として盲腸に存在し、コレステロールの代謝を助け、従って血中のコレステロールレベルを低下させる。
【００５６】
このように、本発明の３つの共生生物、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｒｅｖｅ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓおよびＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓの選抜は、それらが総てヒトの腸に広く分布していて、互いにその生物学的活性を相補し合っているということに基づいている。
【００５７】
本発明の３つの共生生物、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｒｅｖｅ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓおよびＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓは総てＣｈｉｎａ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＣＣＴＣＣ）， Ｗｕｈａｎ， Ｃｈｉｎａから入手できる。これらの細菌はまた常法により健常者の大便または腸粘膜から単離することもできる。
【００５８】
２．培地の組成およびその調製
培地はタンパク質分解ビーフエキス２５ｍｌ、酵母抽出物１５ｇ、ダイズ新芽煎じ汁２５０ｍｌ、グルコース１２ｇ、スクロース１３ｇ、ＭｇＳＯ４ ５ｇ、ＣａＣＯ３ ３ｇ、ＮａＣｌ３ｇ、Ｋ２ＨＰＯ４ ３ｇ、およびＫＨ２ＰＯ４ ３ｇ（１リットル当たり）からなる。
【００５９】
本発明の培地に用いるタンパク質分解ビーフエキスおよびダイズ新芽煎じ汁は上記発明の詳細な記載の方法に従って調製する。該培地の成分を十分混合した後に１２１℃で３０分間オートクレーブにかけて用いる。
【００６０】
３．バッチ培養による同時発酵法
上記に従ってオートクレーブにかけた培地１００ｍｌを約４０℃に加熱した後、１０００ｇ（湿重）の活性Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｒｅｖｅを、バイオマスの湿重を基に算出した総培養物重の０．８重量％の割合でイノキュレートした。得られた混合物の発酵は嫌気条件下、３９℃で７．５時間行う。培地のｐＨ値が５．０まで下がった時、攪拌しながらそこへ０．５Ｎ　ＮａＯＨ溶液適量を加えることで約６．２に調節し、さらに攪拌しながら活性Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓとともに２０分間イノキュレートする。該Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓの量はバイオマスに対して算出して約９５０ｇ（湿重）である。この培地を同じ温度でさらに６時間発酵させる。該培養物のｐＨが再び約５．５まで下がった時、０．５Ｎ　ＮａＯＨ溶液を加えてｐＨの値を６．２に調節し、その後バイオマスで算出して約８５０（湿重）の量のＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓをそこへイノキュレートし、同じ温度で発酵を維持する。タンク中の全細菌内容物６．５×１０８／ｍｌを超えるまでになったら（この時、ｐＨの値は約３．５〜３．８に達している）、循環水の温度を調節することで培養混合物の温度を約３２℃まで下げ、発酵産物の生体転換が完了するように約２時間維持した。
【００６１】
適用者の特定の目的にもよるが、発酵が完了したところで、上記のように得られた共生生物の同時発酵培養物を、（１）生きている同時発酵共生生物を遠心分離で回収した後、さらに凍結乾燥することで、凍結乾燥細菌粉末を含有する固形薬剤または栄養補助剤が得られ、（２）転換する天然薬抽出物へ加えると、期待される生物学的活性および機能を有する本発明の製剤が得られ、あるいは（３）約３９℃に加熱してそこで増殖中の細菌を死滅させ、所望により遠心分離で上清を回収することで、共生生物同時発酵産物および／または細胞残渣を含有する本発明の栄養補助剤が得られる。
【００６２】
このようにして得られた同時発酵培養上清に対する生化学分析の結果は、培養上清中のアミノ酸加水分解物の含量が２３．３２２ｍｇ／ｍｌに達し、ＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍおよびＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓの増殖に必要なシステインを含むジスルフィド結合はそれぞれ１．８ｍｇ／ｍｌ（加水分解物）と０．３３ｍｇ／ｍｌ（遊離型）であることを示した。同時発酵培養上清中の総炭水化物含量は約０．０４ｍｇ／ｍｌであり、還元糖の他、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍなどの共生生物に必須のオリゴ糖や食物繊維が提供される。後者は腸管において血糖レベルを抑制し、中性脂質やコレステロールの吸収を妨げ、また便秘を軽減する働きを持つ。
【００６３】
さらに、酢酸エチル抽出およびＨＰＬＣ分析の結果によれば、該培養上清中のダイズイソフラボン類の細菌転換産物、すなわちダイジンは８０ｍｇ／ｍｌに達する。また、種々のビタミン（大部分はビタミンＢ、約４０ｍｇ／ｌ）および一定量のミネラル（Ｐ、Ｆｅ、Ｚｎ、Ｍｇ、ＫおよびＮａ、それぞれ５．０４、５．３６。８．２９、８８．８３、７８３、２８３ｍｇ／ｍｌを含む）も該培養上清中に認められる。
【００６４】
上記の結果はさらに、同時発酵培養上清が細菌の増殖に必要な総ての栄養素を供給する培地としても有用であり得ることを示している。細菌の増殖に伴って細菌の代謝によってもたらされる酸性産物の蓄積の結果、培養系のｐＨの値が４．０より低くなるまでは細菌は成長および／または増殖を止めない。
【００６５】
実施例２：伝統的な抗癌性漢方抽出物の調製
例として本実施例は植物および動物由来薬剤それぞれの水抽出物の調製方法をその薬剤の供給源に従って記載する。
【００６６】
１．植物由来薬剤抽出物の調製
以下に挙げ、従来中国伝統薬科学の分野で扱われてきた１３種の成分を５リットル容の容器で混合する：Ｒａｄｉｘ ａｓｔｒａｇａｌｉ１２ｇ、Ｒａｄｉｘ ｒｅｈｍａｎｎｉａｅ調製物２０ｇ、Ｒａｄｉｘ ｃｏｄｏｎｏｐｓｉｓ１２ｇ、Ｇａｎｏｄｅｒｍａ ｌｕｃｉｄｕｍ８ｇ、Ｒａｄｉｘ ｔｒｉｃｈｏｓａｎｔｈｉｓ１２ｇ、Ｒａｄｉｏｘ ｇｌｙｃｙｒｒｈｉｚａｅ５ｇ、Ｒａｂｄｏｓｉａ ｓｅｒｒａ４０ｇ、Ｒａｄｉｘ ｓｃｕｔｅｌｌａｒｉａｅ１２ｇ、蜂蜜漬けのＦｏｌｉｕｍ ｅｒｉａｂｏｔｒｙａｅ１２ｇ、Ｐｈｉｚｏｍａ ｐｈｒａｇｍｉｔｉｓ１２ｇ、Ｐａｒｉｓ ｐｏｌｙｐｈｙｌｌａ１２ｇ、Ｓｅｍｅｎ ｊｕｇｌａｎｄｉｓ２０ｇ、Ｈｅｒｂａｈｅｄｙｏｔｉｓ ｄｉｆｆｕｓａｅ１２ｇ。得られた混合物（全１８９ｇ）に水１６００ｍｌを加える。得られた混合物を約１．５時間煎じた後、最初の水抽出画分（約５０ｍｌ）をデカンテーションによって得る。次ぎに上記煎じ汁の残りを含む同じ容器にさらに水１２００ｍｌを加える。水および煎じ汁の残りの混合物をさらに約１．０時間煎じた後、同様にして第２の水抽出物画分（４００ｍｌ）を得る。最後に同じ容器に水１２００ｍｌを再び加え、残りのものとともに約０．５時間煎じた後、第３の水抽出画分を得る。この３つの水抽出画分をプールし、総量約３００ｍｌまで減圧濃縮する。
【００６７】
２．動物由来薬剤抽出物の調製
ヒキガエルの皮２０ｇ、カイコ（Ｂｏｍｂｙｘ ｂａｔｒｙｔｉｃａｔｕｓ）８ｇ、マキガイ（Ｏｓ ｅｕｌｏｔａｅ）６ｇ、サソリ（Ｓｃｏｒｐｉｏ）４ｇ、ムカデ（Ｓｃｏｌｏｐｅｎｄｒａ）４ｇ、ヤモリ４ｇ（中国伝統薬の分野で公知の方法により処理）を含む６種の天然動物由来薬を２リットル容の容器に加え、混合する。次ぎにそこへ水３５０ｍｌを加え、混合物を室温で約１２時間浸漬する。組織摩砕器１０００ｒｐｍで約２分間粉砕した後、粉砕混合物を約１５時間煎じる。水抽出物をデカントする。そこへさらに水２５ｍｌを加え、約１時間煎じて第２の水抽出物画分を得る。この２つの抽出物をプールし、さらに４重の濾過クロスで濾過する。室温まで冷却した後、得られた濾液にＣｏｌｌａ ｃｏｒｉ ａｓｉｎｉ３０ｇを加え、加えたＣｏｌｌａ ｃｏｒｉ ａｓｉｎｉが溶けるまで約８０℃に５分間加熱し、その後減圧濃縮して総量２００ｍｌとする。
【００６８】
実施例３　腸内共生生物による天然抗癌薬抽出物の生体転換
例として本実施例は腸内共生生物による２つの手法（以下に詳細に記載）での天然薬抽出物の生体転換法を記載する。
【００６９】
１．Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、ＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓおよびＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓの同時発酵培養物を実施例１に記載の方法に従って調製する。培養物中の全細菌量が７．０×１０８／ｍｌを超えるまでになったら、該天然薬の生体転換を実質的に完了させるために３２℃で約２時間、培養物を生菌とともに維持する。次ぎに反応系としての全培養混合物を約３９℃に加熱し、約６時間維持してその中の細菌を不活性化する。所望により死細菌および大きな細胞残渣を遠心分離（１０００×ｇ、２０分）によって除去する。得られた培養物中に上記の方法に従って調製した天然植物由来薬および動物由来薬を加える。なおここで、植物および動物由来薬および培養物の比率は約５：３：２である。得られた混合物を３８〜４０℃に再び加熱し、嫌気条件下で約１８時間発酵を維持する。発酵が完了したら、培地を回収し、遠心分離で上清を分離する。このようにして本発明の共生生物によって転換された抗癌薬を得る。
【００７０】
２．新しく作製した培地（２５ｍｌタンパク質分解ビーフエキス２５ｍ、酵母抽出物１５ｇ、ダイズ新芽煎じ汁２５０ｍｌ、グルコース１２ｇ、スクロース１３ｇ、ＭｇＳＯ４ ５ｇ、ＣａＣＯ３ ３ｇ、ＮａＣｌ３ｇ、Ｋ２ＨＰＯ４ ３ｇ、およびＫＨ２ＰＯ４ ３ｇ（発明の詳細な説明に記載のように調製）に、上記の天然植物および動物由来薬抽出物を無菌的に加える。なおここで、植物および動物由来薬および培養物の比率は約５：３：２である。抽出物および培地を十分混合したところでＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、ＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓおよびＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓをバッチイノキュレート、すなわち実施例１に記載のものと同様の方法および量でイノキュウレートする。得られた混合物を３８〜４０℃で約２０時間嫌気発酵させる。発酵が完了したら、培地を回収し、遠心分離により上清を分離する。このようにして本発明の共生生物によって転換された抗癌薬を得る。
【００７１】
実施例４　腸内共生生物の発酵転換による抗癌薬抽出物の生物学的活性への作用　本実施例はインビトロで腸内共生生物によって転換された後の天然抗癌薬抽出物の生物学的活性に改良に関するものである。
【００７２】
癌担持モデルマウスとしてＳ１８０肉腫またはＨ２２肝癌腫を皮下移植したクンミン種マウスを用い、高用量または低用量の上記腸管共生生物によって転換された、または転換されていない天然抗癌薬抽出物について癌の増殖に対する阻害活性を調べる。
【００７３】
このため、体重約１８〜２５ｇのマウス１２０匹の右腋窩に１×１０７細胞／ｍｌのＳ１８０肉腫またはＨ２２肝癌腫（０．２ｍｌ／マウス）を皮下移植して固形癌モデル動物を得る。得られたモデル動物を無作為に１２群に分ける。処理群の動物それぞれに、天然薬抽出物の発酵させていないもの（１：１希釈）か発酵させたもの（１：４希釈）を毎日経口投与する。
【００７４】
陰性対照群の動物には同量の水道水を、陽性対照群には化学合成抗癌剤シクロホスファミド（ＣＴＸ）を皮下投与する。
【００７５】
天然薬抽出物の投与は癌細胞を移植した日から４日目、すなわち固形腫瘍が手で触れる頃に開始する。１０日間にわたって継続投与した後、動物の体重および固形腫瘍重をそれぞれ測定すれば、癌の阻害率がしかるべく算出できる。２種の癌についての処理試験は３反復で行う。Ｓ１８０肉腫を担持する動物モデルまたはＨ２２肝癌腫を担持する動物モデルについての試験結果はそれぞれ表１および表２に示されている。
【００７６】
【表１】
2004505625.tif 000002
【００７７】
【表２】
2004505625.tif 000003
【００７８】
この処理試験では、試験サンプルの阻害率が３０％よりも高ければ、そのサンプルは抗癌（または癌阻害）活性を有し、そうでなければそのサンプルは抗癌（または癌阻害）活性を持たないとみなされる。表１および２に示されたデータによれば、腸内常在細菌叢またはその代謝産物による生体転換を受けなければ、植物および動物由来薬抽出物は統計学的に有意な抗癌（癌阻害）活性を示さず、その阻害率は１０．５〜２９．５％の範囲でしかない。驚くことに本発明の腸内共生生物との同時発酵の後には、共生生物およびその代謝産物による生化学構造の改変および酵素的転換のために本発明の抽出物の生物学的活性が実質的に向上し、すなわち阻害率は４０％より高くなる。
【００７９】
実施例５　腸内共生生物およびその代謝産物によって転換および改変される天然抗癌薬製剤の癌に対する従来の化学療法および放射線療法に対する作用
本実施例では、上記の癌担持マウスモデルを用いることで以下の結果が得られる。
【００８０】
（１）本製剤を従来の化学療法および放射線療法と併用した場合、癌に対する従来の化学療法および放射線療法に対する発酵天然薬製剤の共同作用が見られる。
【００８１】
（２）また、従来の化学療法および放射線療法によって引き起こされる有毒作用または副作用を防ぐまたは軽減するという点での本製剤の能力も確認される。
【００８２】
１．上記目的のため、体重約１８〜２２ｇのマウス８０匹の右腋窩にＨ２２肝癌腫の生理食塩水懸濁液（１：３希釈、１×１０７細胞／ｍｌ、０．２ｍｌ／マウス）を皮下移植して固形癌モデルマウスを得る。得られたモデルマウスを無作為に８群に分ける。
【００８３】
抗癌化学剤フリオロウラシル（５−Ｆｕ、１５ｍｇ／ｋｇ）の効力に対する本天然薬製剤の作用を調べるため、最初の４群のマウスそれぞれに処理し、残りの４群のマウスは癌に対する放射線療法（６０Ｃｏ全身照射、４．５Ｇ線／日／動物）の効力に対する本組成物の作用に関して処理する。
【００８４】
両動物群に対する組合せ療法（各群中の４つの部分群）は腫瘍細胞を移植した翌日から開始し、７日間継続する。特に部分群２の動物には本製剤を投与し、部部群４の動物は抗癌化学剤または６０Ｃｏ照射とともに本製剤で処理し（処理群）、部分群３に動物には抗癌化学剤を皮下注射するか、または６０Ｃｏ照射を施し、部分群１の動物には同量の水を注射するか、または穏和な６０Ｃｏ全照射を施す（陰性対照群）。
【００８５】
７日間にわたって継続投与した後、動物の体重および固形腫瘍重をそれぞれ測定すれば、癌の阻害率がしかるべく算出できる。癌に対する化学療法または放射線療法に対する本組成物の共同作用は以下のバーギーの補正式：
Ｑ＝Ｅ（Ａ＋Ｂ）／ＥＡ＋ＥＢ−ＥＡ×ＥＢ
｛式中、Ｅ（Ａ＋Ｂ）は組合せ療法の癌阻害率であり、ＥＡおよびＥＢは本組成物投与または化学療法（もしくは放射線療法）単独の癌阻害率である｝
に従う阻害率によって算出する。
【００８６】
結果：（１）算出したＱが０．８５よりも小さければ、組み合わせた療法間の拮抗作用とみなされ、（２）Ｑが０．８５と１．１５の間であれば、相加作用と見なされ、（３）Ｑが１．１５よりも大きければ、組み合わせた療法間の共同作用と考えられる。特定の結果はそれぞれ表３および表４に示されている。
【００８７】
【表３】
2004505625.tif 000004
【００８８】
【表４】
2004505625.tif 000005
【００８９】
表３および４に示されたデータから結論づければ、本抗癌製剤と癌に対する従来の化学療法または放射線療法の組合せの作用は癌阻害率の点で単独療法の場合よりも非常に優れている。さらに、かかる組合せ療法は０．８５と１．９５の間の範囲であるそのＱ値から推定される相加作用を有する。
【００９０】
２．一方、体重約１８〜２２ｇのマウス８０匹（半分は雄、半分は雌）を無作為に２群、各群４つの部分群に分ける。
【００９１】
処理群（部分３および４）の動物には、連続７日間、毎日、中用量または低用量の本発明の抗癌製剤を胃管栄養で与え、（１）同時に１日目に被験動物に抗癌化学薬シクロホスファミド（ＣＴＸ）を１回（６０ｍｇ／ｋｇ）投与するか（表５参照）、あるいは（２）連続７日間、毎日６０Ｃｏ照射（４．５Ｇ線）を行うかする。
【００９２】
陰性対照群（部分群１）の動物には等量の水を与え、陽性群（部分群２）には等量の化学薬または放射線療法単独を施す。７日後、尾部静脈から末梢血をサンプリングした後、ヘモグロビン含量、白血球（ＷＢＣ）総数、赤血球（ＲＢＣ）総数、および血小板（ＢＰＣ）総数を測定する。結果は表５および６に示されている。
【００９３】
【表５】
2004505625.tif 000006
【００９４】
【表６】
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【００９５】
化学薬ＣＴＸおよび６０Ｃｏ照射はいずれも被験動物の造血系に損傷を与え、ＷＢＣ、ＲＢＣ、ＨｂおよびＢＰＣに損傷を与えるが、ＷＢＣ数およびＨｂ含量放射線療法によって著しく影響を受ける。表５および６に示される結果により、放射線療法または化学療法によって引き起こされる損傷は本発明の共生生物の発酵によって処理された本製剤によって効果的に消失または軽減することができる。
【００９６】
実施例６　ヒト骨髄細胞の増殖に対する本製剤の作用
例として本実施例はヒト骨髄細胞の増殖に対する本製剤の作用を記載するが、ここでこの組成物は腸内共生生物およびその代謝産物によって転換または改変されたものである。
【００９７】
Ｔ細胞が枯渇した非接着性ヒト骨髄細胞の細胞培養物を、１５％ヒト血清アルブミンを添加した寒天プレートに４０，０００細胞／プレートの量でプレーティングした後、本製剤０．５ｍｌを加える。このプレートを５％ＣＯ２、５％Ｏ２雰囲気下で１０日間インキュベートする。インキュベーションが終了したら、倒立顕微鏡を用いて細胞コロニー数を数え、コロニー形成単位で、顆粒球、赤血球、単球およびマクロファージコロニーについてはＣＦＵ−ＧＥＭＭとして、顆粒球−マクロファージコロニーについてはＣＦＵ−ＧＭとして、また、赤血球コロニーについてはＣＲＵ−Ｅとして表す。
【００９８】
本発明の天然薬組成物またはサイトカイン（顆粒球コロニー刺激因子、Ｇ−ＣＳＦ）を添加しない各プレートのバックグラウンドは、そこへ１単位のエポエチンを加えた後に赤血球のコロニー単位を数えることで求める。陽性対照としては市販のＧ−ＣＳＦ（１０００ｐｇ／ｍｌ）およびＧＭ−ＧＳＦ（１２００ｐｇ／ｍｌ）を、陰性対照としてはＰＢＳバッファー（１ｍｌ）を用いる。結果は表７に示されている。
【００９９】
【表７】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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