(57)【要約】改善された薬物動態を有する改変キメラポリペプチドを開示する。詳細には、薬物動態プロフィールを改善するよう改変された改変キメラＦｌｔ１レセプターポリペプチドを開示する。この改変ポリペプチドを作製および使用する方法もまた開示する。この方法は、哺乳動物における血漿漏出および／または血管透過を低減または阻害するための改変ポリペプチドの使用を包含するがこれらに限定されない。血漿漏出および／または血管透過が、例えば、炎症性皮膚疾患を引き起こす疾患を処置する方法もまた開示する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物において乾癬を処置する方法であって、該哺乳動物にＶＥＧＦアンタゴニストを投与する工程を包含する、方法。
【請求項２】
ヒトにおいて乾癬を処置する方法であって、該ヒトにＶＥＧＦアンタゴニストを投与する工程を包含する、方法。
【請求項３】
哺乳動物において乾癬を処置する方法であって、該哺乳動物にＶＥＧＦＲ１Ｒ２−ＦｃΔＣ１（ａ）を投与する工程を包含する、方法。
【請求項４】
ヒトにおいて乾癬を処置する方法であって、該ヒトにＶＥＧＦＲ１Ｒ２−ＦｃΔＣ１（ａ）を投与する工程を包含する、方法。
【請求項５】
哺乳動物において乾癬性損傷の重篤度を低減する方法であって、該哺乳動物にＶＥＧＦアンタゴニストを投与する工程を包含する、方法。
【請求項６】
哺乳動物において乾癬性損傷の重篤度を低減する方法であって、該哺乳動物にＶＥＧＦアンタゴニストを投与する工程を包含する、方法。
【請求項７】
ヒトにおいて乾癬性損傷の重篤度を低減する方法であって、該ヒトにＶＥＧＦＲ１Ｒ２−ＦｃΔＣ１（ａ）を投与する工程を包含する、方法。
【請求項８】
ヒトにおいて乾癬性損傷の重篤度を低減する方法であって、該ヒトにＶＥＧＦＲ１Ｒ２−ＦｃΔＣ１（ａ）を投与する工程を包含する、方法。
【請求項９】
ヒトにおいて乾癬と関連するケラチノサイトの過剰増殖の程度を最小限に抑える方法であって、該ヒトにＶＥＧＦアンタゴニストを投与する工程を包含する、方法。
【請求項１０】
ヒトにおいて乾癬と関連するケラチノサイトの過剰増殖の程度を最小限に抑える方法であって、該ヒトにＶＥＧＦＲ１Ｒ２−ＦｃΔＣ１（ａ）を投与する工程を包含する、方法。
【請求項１１】
ヒトにおいて乾癬と関連して過剰増殖したケラチノサイトの程度を低減する方法であって、該ヒトにＶＥＧＦアンタゴニストを投与する工程を包含する、方法。
【請求項１２】
ヒトにおいて乾癬と関連して過剰増殖したケラチノサイトの程度を低減する方法であって、該ヒトにＶＥＧＦＲ１Ｒ２−ＦｃΔＣ１（ａ）を投与する工程を包含する、方法。
【請求項１３】
ヒトにおいて乾癬と関連する表皮過形成の程度を最小限に抑える方法であって、該ヒトにＶＥＧＦアンタゴニストを投与する工程を包含する、方法。
【請求項１４】
ヒトにおいて乾癬と関連する表皮過形成の程度を最小限に抑える方法であって、該ヒトにＶＥＧＦＲ１Ｒ２−ＦｃΔＣ１（ａ）を投与する工程を包含する、方法。
【請求項１５】
ヒトにおいて乾癬と関連する表皮過形成を逆転する方法であって、該ヒトにＶＥＧＦアンタゴニストを投与する工程を包含する、方法。
【請求項１６】
ヒトにおいて乾癬と関連する表皮過形成を逆転する方法であって、該ヒトにＶＥＧＦＲ１Ｒ２−ＦｃΔＣ１（ａ）を投与する工程を包含する、方法。
【請求項１７】
ヒトにおいて乾癬に関連する錯角化を処置する方法であって、該ヒトにＶＥＧＦアンタゴニストを投与する工程を包含する、方法。
【請求項１８】
ヒトにおいて乾癬に関連する錯角化を処置する方法であって、該ヒトにＶＥＧＦＲ１Ｒ２−ＦｃΔＣ１（ａ）を投与する工程を包含する、方法。
【請求項１９】
ヒトにおいて乾癬に関連する微小膿瘍を処置する方法であって、該ヒトにＶＥＧＦアンタゴニストを投与する工程を包含する、方法。
【請求項２０】
ヒトにおいて乾癬に関連する微小膿瘍を処置する方法であって、該ヒトにＶＥＧＦＲ１Ｒ２−ＦｃΔＣ１（ａ）を投与する工程を包含する、方法。
【請求項２１】
ヒトにおいて乾癬に関連する乳頭間隆起を減少させる方法であって、該ヒトにＶＥＧＦアンタゴニストを投与する工程を包含する、方法。
【請求項２２】
ヒトにおいて乾癬に関連する乳頭間隆起を減少させる方法であって、該ヒトにＶＥＧＦＲ１Ｒ２−ＦｃΔＣ１（ａ）を投与する工程を包含する、方法。
【請求項２３】
ヒトにおいて炎症性皮膚疾患を処置する方法であって、該ヒトにＶＥＧＦＲ１Ｒ２−ＦｃΔＣ１（ａ）を投与する工程を包含する、方法。
【請求項２４】
ヒトの真皮から表皮へのリンパ球の浸潤を防止する方法であって、該ヒトにＶＥＧＦＲ１Ｒ２−ＦｃΔＣ１（ａ）を投与する工程を包含する、方法。
【請求項２５】
前記投与が局所投与である、請求項１〜２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
前記投与が皮下投与である、請求項１〜２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
前記投与が、筋肉内投与、鼻腔内投与、髄腔内投与、動脈内投与、静脈内投与、経腟投与、経皮投与、または経鼻投与である、請求項１〜２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
哺乳動物において乾癬を処置するための、ＶＥＧＦアンタゴニストの使用。
【請求項２９】
ヒトにおいて乾癬を処置するための、ＶＥＧＦアンタゴニストの使用。
【請求項３０】
ヒトにおいて乾癬を処置するための、ＶＥＧＦＲ１Ｒ２−ＦｃΔＣ１（ａ）の使用。
【請求項３１】
ヒトにおいて創傷治癒を増強する方法であって、該ヒトにＶＥＧＦアンタゴニストを投与する工程を包含する、方法。
【請求項３２】
ヒトにおいて創傷治癒を増強する方法であって、該ヒトにＶＥＧＦＲ１Ｒ２−ＦｃΔＣ１（ａ）を投与する工程を包含する、方法。
【請求項３３】
前記投与が局所投与である、請求項３１または３２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３４】
前記投与が皮下投与である、請求項３１または３２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３５】
前記投与が、筋肉内投与、鼻腔内投与、髄腔内投与、動脈内投与、静脈内投与、経腟投与、経皮投与、または経鼻投与である、請求項３１または３２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３６】
ヒトにおいて創傷治癒を増強するための、ＶＥＧＦアンタゴニストの使用。
【請求項３７】
ヒトにおいて創傷治癒を増強するための、ＶＥＧＦＲ１Ｒ２−ＦｃΔＣ１（ａ）の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、米国特許出願０９／７７３，８７７（２００１年１月３１日出願）の優先権を主張し、この米国特許出願０９／７７３，８７７は、国際出願ＰＣＴ／ＵＳ００／１４１４２（２０００年５月２３日出願）の優先権を主張し、この国際出願ＰＣＴ／ＵＳ００／１４１４２は、米国仮出願６０／１３８，１３３（１９９９年６月８日出願）の優先権を主張する。本明細書全体にわたって、種々の刊行物が参照される。これらの刊行物の開示は、その全体が本明細書中に参考として援用される。
【０００２】
（導入）
本発明の分野は、改良された薬動力学を有する改変ポリペプチドである。詳細には、本発明の分野は、薬物動態プロフィールを改良するような様式で改変されたＦｌｔ１レセプターポリペプチドに関する。本発明の分野はまた、この改変ポリペプチドを作製し使用する方法に関し、この方法は、この改変ポリペプチドを使用して、哺乳動物における血漿漏出および／または血管透過性を減少するか阻害し、そして血漿漏出および／または血管透過性が生じる種々の疾患（例えば、乾癬を含む、炎症性皮膚疾患）を処置することを含むが、これに限定されない。
【背景技術】
【０００３】
（背景）
細胞に結合しそれにより表現型応答（例えば、細胞増殖、生存、細胞産物分泌、または分化）を引き起こすポリペプチドリガンドの能力は、しばしば、細胞上の膜貫通レセプターを介して媒介される。このようなレセプターの細胞外ドメイン（すなわち、細胞の表面上に示されるレセプターの部分）は、一般に、そのリガンド結合特性を有するタンパク質を提供するため、分子の最も特有の部分である。細胞外ドメインへのリガンドの結合は、一般に、細胞内標的へ生物学的シグナルを伝達するシグナル伝達を生じる。しばしば、このシグナル伝達は、触媒性細胞内ドメインを介して作用する。この触媒性細胞内ドメインの配列モチーフの特定のアレイは、潜在的なキナーゼ基質へのアクセスを決定する（Ｍｏｈａｍｍａｄｉら、１９９０，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１１：５０６８−５０７８；Ｆａｎｔｌら、１９９２，Ｃｅｌｌ  ６９：４１３−４１３）。触媒性細胞内ドメインを介してシグナルを伝達するレセプターの例としては、レセプターチロシンキナーゼ（ＲＴＫ）、例えば、一般に、神経系の細胞に限定されるレセプターのＴｒｋファミリー、トリパルテート（ｔｒｉｐａｒｔａｔｅ）ＣＮＴＦレセプター複合体を含むレセプターのサイトカインファミリー（Ｓｔａｈｌ  ＆  Ｙａｎｃｏｐｏｕｌｏｓ，１９９４，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏ．２５：１４５４−１４６６）（これもまた一般に、神経系の細胞に限定される）、Ｇ−タンパク質結合レセプター（例えば、心筋細胞において見出されるβ２−アドレナリン作動性レセプター）、およびほとんどの部分が、マスト細胞および好塩基球上に位置する多量体ＩｇＥ高親和性レセプターＦｃεＲＩ（Ｓｕｔｔｏｎ  ＆  Ｇｏｕｌｄ，１９９３，Ｎａｔｕｒｅ  ３６６：４２１−４２８）が挙げられる。
【０００４】
現在までに同定された全てのレセプターは、二量化、三量化、またはリガンド結合後のいくぶんかの関連したコンフォメーション変化（Ｓｃｈｌｅｓｓｉｎｇｅｒ，Ｊ．，１９８８，Ｔｒｅｎｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．１３：４４３−４４７；Ｕｌｌｒｉｃｈ  ＆  Ｓｃｈｌｅｓｓｉｎｇｅｒ，１９９０，Ｃｅｌｌ  ６１：２０３−２１２；Ｓｃｈｌｅｎｓｓｉｎｇｅｒ  ＆  Ｕｌｌｒｉｃｈ，１９９２，Ｎｅｕｒｏｎ  ９：３８３−３９１）、および二量化した細胞内ドメインの間の分子相互作用を受けて、触媒機能の活性化を導くようである。いくつかの場合（例えば、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ））において、リガンドは、２つのレセプター分子に結合する二量体であり（Ｈａｒｔら、１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４０：１５２９−１５３１；Ｈｅｌｄｉｎ，１９８９，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：８９０５−８９１２）、一方、例えば、上皮増殖因子（ＥＧＦ）の場合において、リガンドは、単量体である（Ｗｅｂｅｒら、１９８４，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５９：１４６３１−１４６３６）。ＦｃεＲＩレセプターの場合において、リガンドであるＩｇＥは、単量体様式のＦＣεＲＩに結合して存在し、そして抗原が、このＩｇＥ／ＦｃεＲＩ複合体に結合し、そして隣接するＩｇＥ分子と架橋する場合にのみ、活性化される（Ｓｕｔｔｏｎ  ＆  Ｇｏｕｌｄ，１９９３，Ｎａｔｕｒｅ  ３６６：４２１−４２８）。
【０００５】
しばしば、高等生物内の特定のレセプターの組織分布は、レセプターの生物学的機能に関する洞察を提供する。いくつかの増殖因子および分化因子に対するＲＴＫ（例えば、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ））は、広範に発現され、従って、組織の増殖および維持においてある一般的な役割を果たすようである。レセプターのＴｒｋ  ＲＴＫファミリーのメンバー（Ｇｌａｓｓ  ＆  Ｙａｎｃｏｐｏｕｌｏｓ，１９９３，Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．３：２６２−２６８）は、より一般的には、神経系の細胞に限定され、神経増殖因子（ＮＧＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィン−３（ＮＴ−３）およびニューロトロフィン−４／５（ＮＴ−４／５）からなる神経増殖因子ファミリー（これは、Ｔｒｋ  ＲＴＫファミリーレセプターに結合する）は、脳および末梢におけるニューロンの多様な群の分化を促進する（Ｌｉｎｄｓａｙ，Ｒ．Ｍ，１９９３，Ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ  Ｆａｃｔｏｒｓ，Ｓ．Ｅ．Ｌｏｕｇｈｌｉｎ  ＆  Ｊ．Ｈ．Ｆａｌｌｏｎ編、２５７−２８４頁、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  ＰＲＥＳＳ）。ＦｃεＲＩは、非常に限られた数の型の細胞（例えば、マスト細胞および好塩基球）に局在する。マスト細胞は、骨髄多能性造血幹細胞系譜に由来するが、血流からの移動の後に、細胞中で成熟を完了し（Ｊａｎｅｗａｙ  ＆  Ｔｒａｖｅｒｓ，１９９６、Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ，第２版，Ｍ．Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ  ＆  Ｅ．Ｌａｗｒｅｎｃｅ編，１：３−１：４頁，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｌｔｄ．，Ｌｏｎｄｏｎ，ＵＫ，Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒを参照のこと）、そしてアレルギー反応に関与する。
【０００６】
多くの研究は、レセプターの細胞外ドメインは、特異的リガンド結合特性を提供することを証明している。さらに、レセプターが発現される細胞環境は、リガンドがレセプターに結合する際に示される生物学的応答に影響を与え得る。例えば、Ｔｒｋレセプターを発現するニューロン細胞が、このレセプターに結合するニューロトロフィンに曝露される場合、ニューロンの生存および分化が生じる。同じレセプターが線維芽細胞により発現される場合、ニューロトロフィンへの曝露は、線維芽細胞の増殖を生じる（Ｇｌａｓｓら，１９９１，Ｃｅｌｌ  ６６：４０５−４１３）。
【０００７】
血管内皮細胞についての選択性を有する細胞由来二量体マイトジェンのクラスが、同定され、そして血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）と命名された。ＶＥＧＦは、ラット神経膠腫細胞の馴化増殖培地［Ｃｏｎｎら、（１９９０），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８７．２６２８−２６３２頁］；およびウシ下垂体小胞星状細胞の馴化増殖培地［ＦｅｒｒａｒａおよびＨｅｎｚｅｌ，（１９８９），Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．，１６１，８５１−８５８頁；Ｇｏｚｐａｄｏｒｏｗｉｃｚら，（１９８９），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８６，７３１１−７３１５頁］；およびヒトＵ９３７細胞の馴化増殖培地［Ｃｏｎｎｏｌｌｙ，Ｄ．Ｔ．ら（１９８９），Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４６，１３０９−１３１２頁］から精製されている。ＶＥＧＦは、約４６ｋＤａの見かけの分子量を有し、各サブユニットが、約２３ｋＤａの見かけの分子量を有する、二量体である。ＶＥＧＦは、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）に対していくつかの構造的類似性を有し、この血小板由来増殖因子は、結合組織細胞についてのマイトジェンであるが、大血管由来の血管内皮細胞についてのマイトジェンではない。
【０００８】
膜結合チロシンキナーゼレセプター（Ｆｌｔとして公知）は、ＶＥＧＦレセプターであることが示された［ＤｅＶｒｉｅｓ，Ｃ．ら、（１９９２）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５５，９８９−９９１頁］。このＦｌｔレセプターは、有糸分裂誘発を引き起こすＶＥＧＦに特異的に結合する。別の形態のＶＥＧＦレセプター（ＫＤＲと命名される）はまた、ＶＥＧＦに結合し、そして有糸分裂誘発を引き起こすことが知られている。ＫＤＲのｃＤＮＡ部分配列およびほぼ全長のタンパク質配列もまた同様に、公知である［Ｔｅｒｍａｎ，Ｂ．Ｉ．ら（１９９１）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ６，１６７７−１６８３頁；Ｔｅｒｍａｎ，Ｂ．Ｉ．ら（１９９２）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．１８７，１５７９−１５８６頁］。
【０００９】
持続的な新脈管形成は、特定の疾患（例えば、乾癬、慢性関節リウマチ、血管種、血管線維腫、糖尿病性網膜症および血管新生緑内障）を引き起こすかまたは悪化させ得る。ＶＥＧＦ活性のインヒビターは、このような疾患、ならびに他のＶＥＧＦ誘発病理学的新脈管形成および血管透過性状態（例えば、腫瘍血管新生）の処置として有用である。本発明は、ＶＥＧＦレセプターＦｌｔ１に基づくＶＥＧＦインヒビターに関する。
【００１０】
炎症の主要な構成要素である、血漿漏出は、微小血管の異なるサブセットにおいて生じる。特に、ほとんどの器官において、血漿漏出は、細静脈において特異的に生じる。細動脈および毛血管とは異なり、細静脈は、ヒスタミン、ブラディキニンおよびセロトニンを含む多数の炎症メディエーターに応答して、漏出性になる。炎症の１つの特徴は、細静脈の内皮において形成する細胞間間隙から生じる血漿漏出である。炎症のほとんどの実験モデルは、これらの細胞間間隙が、後毛細管の内皮細胞と集合細静脈との間で生じることを示す（Ｂａｌｕｋ，Ｐ．ら、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１９９８  １５２：１４６３−７６）。特定のレクチンが、炎症細静脈の内皮細胞縁における血漿漏出の病巣部位、内皮間隙およびフィンガー様プロセスの特徴を示すために使用され得ることが示されている（Ｔｈｕｒｓｔｏｎ，Ｇ．ら、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ，１９９６，２７１：Ｈ２５４７−６２）。特に、植物レクチンは、例えば、ラット器官の炎症細静脈における内皮細胞縁の形態学的変化を可視化するために使用されている。炎症細静脈の病巣に結合するレクチン（例えば、コンカナバリンＡおよびリシン）は、血漿漏出の部位に対応する間隙により曝露される内皮下血管壁の領域を示す（Ｔｈｕｒｓｔｏｎ，Ｇ．ら、Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ，１９９６，２７１：Ｈ２５４７−６２）。
【００１１】
微小血管の特性は、動的である。例えば、慢性炎症疾患は、新脈管形成および微小血管の拡大を含む、微小血管のリモデリングに関連する。微小血管はまた、異常な表現型特性を取得することによって、リモデリングされ得る。慢性気道炎症のマウスモデルにおいて、気道毛血管は、細静脈の特性（拡大された血管直径、フォン・ビルブラント因子に対する増加された免疫反応性、およびＰ−セレクチンに対する増加した免疫反応性を含む）を得る。さらに、これらのリモデリングされた血管は、炎症メディエーターに応答して漏出し、一方、正常なマウスの気道の同じ位置の血管は、漏出しない。
【００１２】
特定の基質は、血管透過性および／または血漿漏出を減少または阻害することが示された。例えば、ミスチキシン（ｍｙｓｔｉｘｉｎ）は、内皮間隙形成をブロックすることなく、血漿漏出を阻害することが報告された（Ｂａｌｕｋ，Ｐ．ら、Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．，１９９８，２８４：６９３−９）。また、β２−アドレナリン作動性レセプターアゴニストのフォルモテロールは、内皮間隙形成を阻害することによって、微小血管漏出を減少する（Ｂａｌｕｋ，Ｐ．およびＭｃＤｏｎａｌｌｄ，Ｄ．Ｍ．，Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，１９９４，２６６：Ｌ４６１−８）。
【００１３】
アンギオポイエチン（ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ）および血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）ファミリーのメンバーは、血管内皮細胞に対して非常に特異的であると考えられる唯一の増殖因子である。マウスにおける標的遺伝子活性化の研究は、ＶＥＧＦが、血管発生の早期段階に必要であること、およびＡｎｇ−１が、血管リモデリングの後期段階に必要であることを示した。
【００１４】
Ｍｅｔｒｉｓ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  Ｌｉｍｉｔｅｄの名で２０００年１月４日に発行された米国特許第６，０１１，００３号は、ＶＥＧＦに結合し、それによりＶＥＧＦに対する阻害効果を発揮し得る改変された可溶性形態のＦＬＴポリペプチド（５以下の完全免疫グロブリンドメインを含むポリペプチド）を開示する。
【００１５】
１９９８年１月２７日に発行され、Ｍｅｒｃｋ  ＆  Ｃｏ．，に譲渡された米国特許第５，７１２，３８０号は、ＶＥＧＦに対するレセプターのＣ末端膜貫通領域を有するかまたは有さない、天然に存在するかまたは組換え操作された可溶性形態である、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）インヒビターを開示する。
【００１６】
ＰＣＴ公開番号ＷＯ  ９８／１３０７１（１９９８年４月２日公開）（これもまた、Ｍｅｒｃｋ  ＆  Ｃｏ．に譲渡された）は、ＶＥＧＦに結合する可溶性レセプタータンパク質をコードするヌクレオチド配列の遺伝子転位による、一次腫瘍増殖および転位の阻害のための遺伝子治療法を開示する。
【００１７】
Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．の名で１９９７年１１月２７日に公開されたＰＣＴ公開番号ＷＯ  ９７／４４４５３は、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）レセプターＦｌｔ１およびＫＤＲ（ヒトＫＤＲレセプターＦＬＫ１に対するマウスホモログを含む）由来のアミノ酸配列を含む新規のキメラＶＥＧＦレセプタータンパク質を開示し、ここで、このキメラＶＥＧＦレセプタータンパク質は、ＶＥＧＦに結合し、そして内皮細胞増殖およびその血管形成活性を拮抗する。
【００１８】
Ｔｏａ  Ｇｏｓｅｉ  Ｃｏ．，ＬＴＤ．の名で１９９７年４月１７日に公開されたＰＣＴ公開番号ＷＯ  ９７／１３７８７は、新生血管形成に付随して生じる疾患（例えば、固形腫瘍）の処置において有用な、低分子量ＶＥＧＦインヒビターを開示する。ＶＥＧＦレセプターＦＬＴの細胞外領域中に第１の免疫グロブリン様ドメインおよび第２の免疫グロブリン様ドメインを含むが、その第６の免疫グロブリン様ドメインおよび第７の免疫グロブリン様ドメインを含まないポリペプチドは、ＶＥＧＦ阻害活性を示す。
【００１９】
Ｓｈａｒｉｆｉ，Ｊ．ら，１９９８，Ｔｈｅ  Ｑｕａｒｔｅｒｌｙ  Ｊｏｕｒ．ｏｆ  Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．４２：２４２−２４９は、モノクローナル抗体（ＭＡｂ）が塩基性で正に荷電したタンパク質であり、哺乳動物細胞が負に荷電されているため、この両者間の静電相互作用は、正常器官に対する腫瘍の低い比率を生じる高いレベルのバックグラウンド結合を生成し得ることを開示する。この効果を克服するために、本発明者らは、第二因子ならびにＭＡｂそれ自体の化学的改変および電荷の改変のような種々の方法を使用することによって、ＭＡｂクリアランスを改善することを試みた。
【００２０】
Ｊｅｎｓｅｎ−Ｐｉｐｐｏら．，１９９６，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １３：１０２−１０７は、十二指腸内経路によって投与された場合、治療的タンパク質、組換えヒト顆粒球コロニー刺激因子（ＰＥＧ−Ｇ−ＣＳＦ）のｐｅｇｙｌａｔｉｏｎが、インビボ生物活性の安定性および保持の増加をもたらすことを開示する。
【００２１】
Ｔｓｕｔｓｕｍｉら，１９９７，Ｔｈｒｏｍｂ  Ｈａｅｍｏｓｔ．７７：１６８−７３は、ポリエチレングリコール改変インターロイキン−６（ＭＰＥＧ−ＩＬ−６）のインビボ血小板新生活性（ここで、ＩＬ−６の１４リシンアミノ基の５４％が、ＰＥＧと結合される）を、天然ＩＬ−６のそれと比較した実験を開示する。
【００２２】
Ｙａｎｇら，１９９５，Ｃａｎｃｅｒ  ７６：６８７−９４は、組換えヒトインターロイキン−２（ＩＬ−２）へのポリエチレングリコールの結合が、化合物、ポリエチレングリコール−改変ＩＬ−２（ＰＥＧ−ＩＬ−２）を生じることを開示し、この化合物は、ＩＬ−２のインビトロ活性およびインビボ活性を保持するが、顕著に延長した循環半減期を示す。
【００２３】
Ｒ．ＤｕｎｃａｎおよびＦ．Ｓｐｒｅａｆｉｃｏ，Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔ．２７：２９０−３０６，２９６（１９９４）は、ポリエチレングリコールを結合させることによって、アスパラギナーゼの血漿半減期を改善する試みについて検討する。
【００２４】
Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．ａｎｄ  Ｔｈｅ  Ｒｅｇｅｎｔｓ  ｏｆ  Ｔｈｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａの名前で１９９９年１月２８日に公開されたＰＣＴ国際公報第ＷＯ９９／０３９９６は、塩基性アミノ酸の領域の欠失を有する改変ヒトｎｏｇｇｉｎポリペプチドを記載する。この改変ヒトｎｏｇｇｉｎポリペプチドは、非改変ヒトｎｏｇｇｉｎと比較した場合、動物血清においてヘパリンに対する減少した親和性および優れた薬物動態学を有する一方で、生物学的活性を保持すると記載される。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００２５】
（発明の要旨）
本発明は、改善された薬物動態学的特性を有するＶＥＧＦアンタゴニストに関する。好ましい実施形態は、（ｂ）多量体化成分をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結した（ａ）ＶＥＧＦレセプター成分をコードするヌクレオチド配列を含む、ＶＥＧＦポリペプチドを結合し得る融合ポリペプチドをコードする単離された核酸分子であり、ここで、ＶＥＧＦレセプター成分は、融合ポリペプチドの唯一のＶＥＧＦレセプター成分であり、ここで、（ａ）のヌクレオチド配列は、第１のＶＥＧＦレセプターの細胞外ドメインのＩｇドメイン２のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列、および第２のＶＥＧＦレセプターの細胞外ドメインのＩｇドメイン３のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列から本質的になる。
【００２６】
さらなる実施形態において、第１のＶＥＧＦレセプターの単離された核酸は、Ｆｌｔ１である。
【００２７】
さらなる実施形態において、第２のＶＥＧＦレセプターの単離された核酸は、Ｆｌｋ１である。
【００２８】
さらに別の実施形態において、第２のＶＥＧＦレセプターの単離された核酸は、Ｆｌｔ４である。
【００２９】
別の好ましい実施形態において、第１のＶＥＧＦレセプターの細胞外ドメインのＩｇドメイン２をコードするヌクレオチド配列は、第２のＶＥＧＦレセプターの細胞外ドメインのＩｇドメイン３をコードするヌクレオチド配列の上流である。
【００３０】
なお別の好ましい実施形態において、第１のＶＥＧＦレセプターの細胞外ドメインのＩｇドメイン２をコードするヌクレオチド配列は、第２のＶＥＧＦレセプターの細胞外ドメインのＩｇドメイン３をコードするヌクレオチド配列の下流である。
【００３１】
本発明の好ましい実施形態において、多量体化成分は、免疫グロブリンドメインを含む。
【００３２】
別の実施形態において、免疫グロブリンドメインは、ＩｇＧのＦｃドメイン、ＩｇＧの重鎖およびＩｇＧの軽鎖からなる群から選択される。
【００３３】
好ましい実施形態として、改変したＦｌｔ１レセプター融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子を含み、ここで、核酸分子のコード領域は、以下：
（ａ）図１３Ａ〜１３Ｄに記載のヌクレオチド配列；
（ｂ）図１４Ａ〜１４Ｃに記載のヌクレオチド配列；
（ｃ）図１５Ａ〜１５Ｃに記載のヌクレオチド配列；
（ｄ）図１６Ａ〜１６Ｄに記載のヌクレオチド配列；
（ｅ）図２１Ａ〜２１Ｃに記載のヌクレオチド配列；
（ｆ）図２２Ａ〜２２Ｃに記載のヌクレオチド配列；
（ｇ）図２４Ａ〜２４Ｃに記載のヌクレオチド配列；および
（ｈ）遺伝的コードの縮重の結果として、（ａ），（ｂ），（ｃ），（ｄ），（ｅ），（ｆ），または（ｇ）のヌクレオチド配列とは異なり、改変Ｆｌｔ１レセプター融合ポリペプチドの生物学的活性を有する融合ポリペプチド分子をコードするヌクレオチド配列、
からなる群から選択されるヌクレオチド配列からなる。
【００３４】
本発明のさらなる実施形態において、融合ポリペプチドは、上記の単離された核酸分子によってコードされる。
【００３５】
好ましい実施形態は、ＶＥＧＦ分子と結合して、融合ポリペプチドの多量体を含む非機能的複合体を形成し得る組成物である。
【００３６】
多量体がダイマーである組成物もまた、好ましい。
【００３７】
なお別の実施形態において、組成物はキャリア内にある。
【００３８】
別の実施形態は、上記の核酸分子を含むベクターであり、このベクターとして、記載される核酸分子を含む発現ベクターが挙げられ、ここで、この核酸分子は、発現コントロール配列に作動可能に連結される。
【００３９】
他の実施形態として、適切な宿主細胞において発現ベクターを含む、融合ポリペプチドの産生のための宿主−ベクター系；適切な宿主細胞が細菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞、または哺乳動物細胞である宿主−ベクター系；適切な宿主細胞がＥ．Ｃｏｌｉである宿主−ベクター系；適切な宿主細胞がＣＯＳ細胞である宿主−ベクター系；適切な宿主細胞がＣＨＯ細胞である宿主−ベクター系である。
【００４０】
本発明の別の実施形態は、融合ポリペプチドの産生を可能にする条件下で宿主−ベクター系の増殖細胞を含む融合ポリペプチドを産生し、そのように産生された融合ポリペプチドを回収する方法である。
【００４１】
さらなる実施形態として、図１０Ａ〜１０Ｄまたは図２４Ａ〜２４Ｃに記載の核酸配列によってコードされた融合ポリペプチドが挙げられ、この融合ポリペプチドは、アセチル化またはｐｅｇｙｌａｔｉｏｎによって改変され、ここで、このアセチル化は、アセチル化試薬の少なくとも約１００倍モル過剰で達成されるか、またはアセチル化は、少なくとも約１０倍モル過剰〜約１００倍モル過剰の範囲のモル過剰のアセチル化試薬を用いて達成され、ここで、ｐｅｇｙｌａｔｉｏｎは、１０Ｋまたは２０Ｋ  ＰＥＧである。
【００４２】
好ましい実施形態として、上記の融合ポリペプチドを哺乳動物に投与する工程を包含する、哺乳動物における血漿漏洩を低減または阻害する方法が挙げられ、この実施形態として、哺乳動物がヒトであり、融合ポリペプチドがアセチル化されているか、または融合ポリペプチドがｐｅｇｙｌａｔｅされている実施形態が挙げられる。
【００４３】
さらなる実施形態は、ＶＥＧＦレセプターリガンドＶＥＧＦと特異的に結合する融合ポリペプチドである。
【００４４】
本発明の好ましい実施形態は、上記の有効量の融合ポリペプチドを投与する工程を包含する、ヒトにおける血管成長をブロックする方法である。
【００４５】
上記の有効量の融合ポリペプチドを哺乳動物に投与する工程を包含する、哺乳動物におけるＶＥＧＦレセプターリガンド活性を阻害する方法もまた、好ましい。
【００４６】
これらの方法の好ましい実施形態は、哺乳動物がヒトである、実施形態である。
【００４７】
本発明の方法のさらなる実施形態として、ヒトにおける腫瘍増殖の弱毒化または予防；ヒトにおける水腫（特に、ここで、水腫は、脳水腫である）の弱毒化または予防；ヒトにおける腹水形成（特に、腹水は、卵巣癌関連腹水である）の弱毒化または予防が挙げられる。
【００４８】
本発明の好ましい実施形態として、（ｂ）多量体化成分に作動可能に連結された（ａ）ＶＥＧＦレセプター成分を含むＶＥＧＦポリペプチドと結合し得る融合ポリペプチドが挙げられ、ここで、ＶＥＧＦレセプター成分は、融合ポリペプチドにおける唯一のＶＥＧＦレセプター成分であり、第１のＶＥＧＦレセプターの細胞外ドメインのＩｇドメイン２のアミノ酸配列および第２のＶＥＧＦレセプターの細胞外ドメインのＩｇドメイン３のアミノ酸配列から実質的になる。
【００４９】
融合ポリペプチドのさらなる実施形態において、第１のＶＥＧＦレセプターは、Ｆｌｔ１である。
【００５０】
融合ポリペプチドのなおさらなる実施形態において、第２のＶＥＧＦレセプターは、Ｆｌｋ１である。
【００５１】
融合ポリペプチドのさらに別の実施形態は、第２のＶＥＧＦレセプターがＦｌｔ４である融合ポリペプチドである。
【００５２】
好ましい実施形態として、第１のＶＥＧＦレセプターの細胞外ドメインのＩｇドメイン２のアミノ酸配列が、第２のＶＥＧＦレセプターの細胞外ドメインのＩｇドメイン３のアミノ酸配列の上流である融合ポリペプチド、および第１のＶＥＧＦレセプターの細胞外ドメインのＩｇドメイン２のアミノ酸配列が、第２のＶＥＧＦレセプターの細胞外ドメインのＩｇドメイン３のアミノ酸配列の下流である融合ポリペプチドが挙げられる。
【００５３】
なお別の実施形態において、融合ポリペプチド多量体化成分として、免疫グロブリンドメインが、ＩｇＧのＦｃドメイン、ＩｇＧの重鎖、およびＩｇＧの軽鎖からなる群から選択される実施形態を含む免疫グロブリンドメインが挙げられる。
【００５４】
好ましい実施形態として、改変Ｆｌｔ１レセプターのアミノ酸配列を含む融合ポリペプチドが挙げられ、ここで、このアミノ酸配列は、（ａ）図１３Ａ〜１３Ｄに記載のアミノ酸配列；（ｂ）図１４Ａ〜１４Ｃに記載のアミノ酸配列；（ｃ）図１５Ａ〜１５Ｃに記載のアミノ酸配列；（ｄ）図１６Ａ〜１６Ｄに記載のアミノ酸配列；（ｅ）図２１Ａ〜２１Ｃに記載のアミノ酸配列；（ｆ）図２２Ａ〜２２Ｃに記載のアミノ酸配列；および（ｇ）図２４Ａ〜２４Ｃに記載のアミノ酸配列からなる群から選択される。
【００５５】
別の好ましい実施形態は、上記の融合ポリペプチドを哺乳動物に投与する工程を包含する、哺乳動物における血漿漏洩を低減または阻害する方法である。
【００５６】
代替の好ましい実施形態は、哺乳動物におけるＶＥＧＦレセプターリガンド活性を阻害する方法であり、この方法は、上記の有効量の融合ポリペプチドを哺乳動物に投与する工程を包含する。
【００５７】
本発明の１つの実施形態は、哺乳動物における乾癬を処置する方法であり、この方法は、ＶＥＧＦアンタゴニストを哺乳動物に投与する工程、特に、ＶＥＧＦＲ１Ｒ２−ＦｃΔＣ１（ａ）を哺乳動物に投与する工程を包含する。
【００５８】
別の好ましい実施形態は、ヒトにおける乾癬を処置する方法であり、この方法は、ＶＥＧＦアンタゴニストをヒトに投与する工程、特に、ＶＥＧＦＲ１Ｒ２−ＦｃΔＣ１（ａ）をヒトに投与する工程を包含する。
【００５９】
なお別の実施形態は、哺乳動物における乾癬性損傷の重篤度を低減する方法であり、この方法は、ＶＥＧＦアンタゴニストを哺乳動物に投与する工程、特に、ＶＥＧＦＲ１Ｒ２−ＦｃΔＣ１（ａ）を哺乳動物に投与する工程を包含する。
【００６０】
ヒトにおける乾癬性損傷の重篤度を低減する方法もまた、好ましく、この方法は、ＶＥＧＦアンタゴニストをヒトに投与する工程、特に、ＶＥＧＦＲ１Ｒ２−ＦｃΔＣ１（ａ）をヒトに投与する工程を包含する。
【００６１】
なお別の好ましい実施形態は、ヒトにおける乾癬に関連したケラチノサイトの過剰増殖の程度を最小にする方法であり、この方法は、ＶＥＧＦアンタゴニストをヒトに投与する工程、特に、ＶＥＧＦＲ１Ｒ２−ＦｃΔＣ１（ａ）をヒトに投与する工程を包含する。
【００６２】
ヒトにおける乾癬に関連したケラチノサイトの過剰増殖の程度を低減する方法もまた、好ましく、この方法は、ＶＥＧＦアンタゴニストをヒトに投与する工程、特に、ＶＥＧＦＲ１Ｒ２−ＦｃΔＣ１（ａ）をヒトに投与する工程を包含する。
【００６３】
本発明のさらなる好ましい実施形態は、ヒトにおける乾癬に関連した表皮過形成の程度を最小にする方法であり、この方法は、ＶＥＧＦアンタゴニストをヒトに投与する工程、特に、ＶＥＧＦＲ１Ｒ２−ＦｃΔＣ１（ａ）をヒトに投与する工程を包含する。
【００６４】
１つの好ましい実施形態は、ヒトにおける乾癬に関連した表皮過形成の程度を逆転させる方法であり、この方法は、ＶＥＧＦアンタゴニストをヒトに投与する工程、特に、ＶＥＧＦＲ１Ｒ２−ＦｃΔＣ１（ａ）をヒトに投与する工程を包含する。
【００６５】
なお他の好ましい実施形態は、ヒトにおける乾癬に関連した錯角化を処置する方法であって、ＶＥＧＦアンタゴニストをヒトに投与する工程、特に、ＶＥＧＦＲ１Ｒ２−ＦｃΔＣ１（ａ）をヒトに投与する工程を包含する方法、およびヒトにおける乾癬に関連した微小膿瘍（ｍｉｃｒｏａｂｃｅｓｓ）を処置する方法であって、ＶＥＧＦアンタゴニストをヒトに投与する工程、特に、ＶＥＧＦＲ１Ｒ２−ＦｃΔＣ１（ａ）をヒトに投与する工程を包含する方法、を含む。
【００６６】
ヒトにおける乾癬に関連した乳頭間隆起（ｒｅｔｅｒｉｄｇｅ）を低下させる好ましい方法もまた、意図されており、この方法は、ＶＥＧＦアンタゴニストをヒトに投与する工程、特に、ＶＥＧＦＲ１Ｒ２−ＦｃΔＣ１（ａ）をヒトに投与する工程を包含する。
【００６７】
さらなる意図された実施形態は、ヒトにおける炎症性皮膚疾患を処置する方法であり、この方法は、ＶＥＧＦＲ１Ｒ２−ＦｃΔＣ１（ａ）をヒトに投与する工程を包含する。
【００６８】
なおさらなる実施形態は、ヒトの真皮から表皮内へのリンパ球の浸潤を防止する方法であり、この方法は、ＶＥＧＦＲ１Ｒ２−ＦｃΔＣ１（ａ）をヒトに投与する工程を包含する。
【００６９】
本発明の好ましい実施形態において、投与は、局所投与、皮下投与、またはおそらく筋肉内投与、鼻腔内投与、髄腔内投与、動脈内投与、静脈内投与、経腟投与、経皮投与、経鼻投与である。
【００７０】
好ましい実施形態は、哺乳動物における乾癬を処置するための、特に、ヒトにおける乾癬を処置するためのＶＥＧＦアンタゴニストの使用を含む。
【００７１】
さらなる実施形態は、ヒトにおける乾癬を処置するためのＶＥＧＦＲ１Ｒ２−ＦｃΔＣ１（ａ）の使用である。
【００７２】
本発明の１つの実施形態は、哺乳動物における乾癬を処置する方法であり、この方法は、ＶＥＧＦアンタゴニストを哺乳動物に投与する工程、特に、ＶＥＧＦＲ１Ｒ２−ＦｃΔＣ１（ａ）を哺乳動物に投与する工程を包含する。
【００７３】
別の好ましい実施形態は、ヒトにおける乾癬を処置する方法であり、この方法は、ＶＥＧＦアンタゴニストをヒトに投与する工程、特に、ＶＥＧＦＲ１Ｒ２−ＦｃΔＣ１（ａ）をヒトに投与する工程を包含する。
【００７４】
なお別の実施形態は、哺乳動物における乾癬性損傷の重篤度を低減する方法であり、この方法は、ＶＥＧＦアンタゴニストを哺乳動物に投与する工程、特に、ＶＥＧＦＲ１Ｒ２−ＦｃΔＣ１（ａ）を哺乳動物に投与する工程を包含する。
【００７５】
ヒトにおける乾癬性損傷の重篤度を低減する方法もまた、好ましく、この方法は、ＶＥＧＦアンタゴニストをヒトに投与する工程、特に、ＶＥＧＦＲ１Ｒ２−ＦｃΔＣ１（ａ）をヒトに投与する工程を包含する。
【００７６】
なお別の好ましい実施形態は、ヒトにおける乾癬に関連したケラチノサイトの過剰増殖の程度を最小にする方法であり、この方法は、ＶＥＧＦアンタゴニストをヒトに投与する工程、特に、ＶＥＧＦＲ１Ｒ２−ＦｃΔＣ１（ａ）をヒトに投与する工程を包含する。
【００７７】
ヒトにおける乾癬に関連した、過剰増殖したケラチノサイトの程度を低減する方法もまた、好ましく、この方法は、ＶＥＧＦアンタゴニストをヒトに投与する工程、特に、ＶＥＧＦＲ１Ｒ２−ＦｃΔＣ１（ａ）をヒトに投与する工程を包含する。
【００７８】
本発明のさらなる好ましい実施形態は、ヒトにおける乾癬に関連した表皮過形成の程度を最小にする方法であり、この方法は、ＶＥＧＦアンタゴニストをヒトに投与する工程、特に、ＶＥＧＦＲ１Ｒ２−ＦｃΔＣ１（ａ）をヒトに投与する工程を包含する。
【００７９】
１つの好ましい実施形態は、ヒトにおける乾癬に関連した表皮過形成の程度を逆転させる方法であり、この方法は、ＶＥＧＦアンタゴニストをヒトに投与する工程、特に、ＶＥＧＦＲ１Ｒ２−ＦｃΔＣ１（ａ）をヒトに投与する工程を包含する。
【００８０】
なお他の好ましい実施形態は、ヒトにおける乾癬に関連した錯角化を処置する方法であって、ＶＥＧＦアンタゴニストをヒトに投与する工程、特に、ＶＥＧＦＲ１Ｒ２−ＦｃΔＣ１（ａ）をヒトに投与する工程を包含する方法、およびヒトにおける乾癬に関連した微小膿瘍を処置する方法であって、ＶＥＧＦアンタゴニストをヒトに投与する工程、特に、ＶＥＧＦＲ１Ｒ２−ＦｃΔＣ１（ａ）をヒトに投与する工程を包含する方法、を含む。
【００８１】
ヒトにおける乾癬に関連した乳頭間隆起を低下させる好ましい方法もまた、意図されており、この方法は、ＶＥＧＦアンタゴニストをヒトに投与する工程、特に、ＶＥＧＦＲ１Ｒ２−ＦｃΔＣ１（ａ）をヒトに投与する工程を包含する。
【００８２】
さらなる意図された実施形態は、ヒトにおける炎症性皮膚疾患を処置する方法であり、この方法は、ＶＥＧＦＲ１Ｒ２−ＦｃΔＣ１（ａ）をヒトに投与する工程を包含する。
【００８３】
なおさらなる実施形態は、ヒトの真皮から表皮内へのリンパ球の浸潤を防止する方法であり、この方法は、ＶＥＧＦＲ１Ｒ２−ＦｃΔＣ１（ａ）をヒトに投与する工程を包含する。
【００８４】
本発明のさらなる実施形態は、ヒトにおける創傷治癒を増強する方法であり、この方法は、ＶＥＧＦアンタゴニストをヒトに投与する工程を包含する。
【００８５】
別の好ましい実施形態は、ヒトにおける創傷治癒を増強する方法であり、ＶＥＧＦＲ１Ｒ２−ＦｃΔＣ１（ａ）をヒトに投与する工程を包含する。
【００８６】
本発明の好ましい実施形態において、投与は、局所投与、皮下投与、またはおそらく筋肉内投与、鼻腔内投与、髄腔内投与、動脈内投与、静脈内投与、経腟投与、経皮投与、経鼻投与である。
【００８７】
好ましい実施形態は、哺乳動物における乾癬を処置するための、特に、ヒトにおける乾癬を処置するためのＶＥＧＦアンタゴニストの使用を含む。
【００８８】
さらなる実施形態は、ヒトにおける乾癬を処置するためのＶＥＧＦＲ１Ｒ２−ＦｃΔＣ１（ａ）の使用である。
【００８９】
（発明の詳細な説明）
アゴニストを治療剤候補とみなすのに適切な薬物動態プロファイルを有する、レセプターに基づくＶＥＧＦアゴニストを生成することは、当該分野において長年の懸案であった。出願人は、初めて、ＶＥＧＦ活性を拮抗し得るキメラポリペプチド分子を本明細書中で記載し、この分子は、他の既知のレセプターに基づくＶＥＧＦアンタゴニストと比較して改善された薬物動態特性を提示する。従って、本明細書中に記載のキメラポリペプチド分子は、ＶＥＧＦの拮抗が所望の結果である治療における用途に適切な分子を初めて提供する。本発明は、ＩｇＧのＦｃ領域にＦｌｔ１レセプターの改変された細胞外リガンド結合ドメインを融合することによって形成される、新規のキメラポリペプチド分子を提供する。
【００９０】
この細胞外リガンド結合ドメインは、レセプターの部分として定義され、このレセプターは、細胞膜におけるネイティブコンフォメーションにおいて、細胞外に方向付けられており、ここで、これは、同族リガンドと接触し得る。この細胞外リガンド結合ドメインは、レセプターの膜貫通ドメインに関連する疎水性アミノ酸も、レセプターの細胞内ドメインに関連する任意のアミノ酸を含まない。一般的に、レセプターの、細胞内ドメインまたは細胞質ドメインは、通常、正に荷電しているか、または極性であるアミノ酸（すなわち、リジン、アルギニン、ヒスチジン、グルタミン酸、アスパラギン酸）から構成される。先行する１５〜３０の、支配的な、疎水性または非極性のアミノ酸（すなわち、ロイシン、バリン、イソロイシン、およびフェニルアラニン）は、膜貫通ドメインを構成する。この細胞外ドメインは、アミノ酸の疎水性膜貫通ストレッチに先行するアミノ酸から構成される。通常は、この膜貫通ドメインは、正に荷電しているか、または極性である、アミノ酸（例えば、リジンまたはアルギニン）に隣接される。ｖｏｎ  Ｈｅｉｊｎｅは、所定のレセプターのどのアミノ酸が、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、または細胞内ドメインに属するかを決定するときに、当業者によって通常参照される詳細な規則について刊行した（ｖｏｎ  Ｈｅｉｊｎｅ，１９９５，ＢｉｏＥｓｓａｙｓ１７：２５−３０を参照のこと）。あるいは、インターネット上のウェブサイト（例えば、ｈｔｔｐ：／／ｕｌｒｅｃ３．ｕｎｉｌ．ｃｈ／ｓｏｆｔｗａｒｅ／ＴＭＰＲＥＤ＿ｆｏｒｍ．ｈｔｍｌ）が、利用可能となり、タンパク質のドメインについて予測を行うことについてタンパク質化学者に情報を提供するようになった。本発明は、適切な宿主細胞に導入することが可能なキメラポリペプチド分子発現することが可能なベクターに挿入された、キメラポリペプチド分子をコードする核酸分子の構築を提供する。適切な宿主細胞としては、細菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞、および哺乳類細胞が挙げられるが、これらに限定されない。ＤＮＡフラグメントをベクターに挿入するための当業者に公知のいずれかの方法が、転写制御シグナル／翻訳制御シグナルの制御下にこのキメラポリペプチド分子をコードする発現ベクターを構築するために使用され得る。これらの方法は、インビトロ組換えＤＮＡ技術および合成技術ならびにインビボ組換え（遺伝子組換え）を含み得る（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ；Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｅｄｓ．Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ  ａｌ．，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌ．Ａｓｓｏｃ．，Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，ＮＹを参照のこと）。
【００９１】
このキメラポリペプチド分子をコードする核酸分子の発現は、第２の核酸配列によって調節され得、このキメラポリペプチド分子はその結果、この組換えＤＮＡ分子で形質転換した宿主において発現される。例えば、本明細書中に記載のキメラポリペプチド分子の発現は、当該分野で公知の任意のプロモーター／エンハンサーエレメントによって制御され得る。このキメラポリペプチド分子の発現を制御するために使用され得るプロモーターとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：Ｓｑｕｉｎｔｏら（Ｃｅｌｌ（１９９１）６５：１−２０）によって記載された長末端反復；ＳＶ４０初期プロモーター領域（ＢｅｒｎｏｉｓｔおよびＣｈａｍｂｏｎ，１９８１，Ｎａｔｕｒｅ  ２９０：３０４−３１０）、ＣＭＶプロモーター、ラウス肉腫ウイルスの３’長末端反復に含有まれるプロモーターであるＭ−ＭｕＬＶ  ５’末端反復（Ｙａｍａｍｏｔｏら，１９８０，Ｃｅｌｌ  ２２：７８７−７９７）、ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター（Ｗａｇｎｅｒら、１９８１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．  ７８：１４４−１４４５）、メタロチオニン（ｍｅｔａｌｌｏｔｈｉｏｎｉｎｅ）遺伝子の調節配列（Ｂｒｉｎｓｔｅｒら、１９８２，Ｎａｔｕｒｅ  ２９６：３９−４２）；原核生物発現ベクター（例えば、β−ラクタマーゼプロモーター（Ｖｉｌｌａ−Ｋａｍａｒｏｆｆら，１９７８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７５：３７２７−３７３１）、またはｌａｃプロモーター（ＤｅＢｏｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，１９８３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８０：２１−２５、またＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｍｅｒｉｃａｎ，１９８０，２４２  ７４−９４の「Ｕｓｅｆｕｌ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｆｒｏｍ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｂａｃｔｅｒｉａ」もまた参照のこと））；酵母または他の真菌由来のプロモーターエレメント（例えば、Ｇａｌ４プロモーター、ＡＤＨ（アルコールデヒドロゲナーゼ）プロモーター、ＰＧＫ（ホスホグリセロールキナーゼ）プロモーター、アルカリホスファターゼプロモーター、および組織特異性を提示し、そして、トランスジェニック動物において使用されてきた、動物転写制御領域。ここで、この動物転写制御領域は、以下である：膵臓腺房細胞において活性であるエラスターゼＩ遺伝子制御領域（Ｓｗｉｆｔら、１９８４，Ｃｅｌｌ  ３８：６３９−６４６；Ｏｒｎｉｔｚら、１９８６，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．５０：３９９−４０９；ＭａｃＤｏｎａｌｄ，１９８７，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ７：４２５−５１５）；膵臓β細胞において活性であるインシュリン遺伝子制御領域（Ｈａｎａｈａｎ，１９８５，Ｎａｔｕｒｅ  ３１５：１１５−１２２）、リンパ細胞において活性である免疫グロブリン遺伝子制御領域（Ｇｒｏｓｓｃｈｅｄｌら、１９８４，Ｃｅｌｌ  ３８：６４７−６５８；Ａｄａｍｅｓら、１９８５，Ｎａｔｕｒｅ  ３１８：５３３−５３８；Ａｌｅｘａｎｄｅｒら、１９８７，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．７：１４３６１４４４）、精巣細胞、乳房細胞、リンパ細胞および肥満細胞において活性なマウス乳腺腫瘍ウイルス制御領域（Ｌ���ｄｅｒら、１９８６，Ｃｅｌｌ  ４５：４８５−４９５）、肝臓において活性なアルブミン遺伝子制御領域（Ｐｉｎｋｅｒｔら、１９８７，Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌ．１：２６８−２７６）、肝臓において活性なα−フェトプロテイン遺伝子制御領域（Ｋｒｕｍｌａｕｆら、１９８５，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：１６３９−１６４８；Ｈａｍｍｅｒら、１９８７，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３５：５３−５８）；肝臓において活性なα−アンチトリプシン（α−１−ａｎｔｉｔｒｙｐｓｉｎ）遺伝子制御領域（Ｋｅｌｓｅｙら，１９８７，Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌ．１：１６１−１７１）、脊髄細胞において活性なβ−グロビン遺伝子制御領域（Ｍｏｇｒａｍら、１９８５，Ｎａｔｕｒｅ  ３１５：３３８−３４０；Ｋｏｌｌｉａｓら、１９８６，Ｃｅｌｌ  ４６：８９−９４）；脳の稀突起膠細胞において活性であるミエリン基底タンパク質遺伝子制御領域（Ｒｅａｄｈｅａｄら、１９８７，Ｃｅｌｌ  ４８：７０３−７１２）；骨格筋において活性なミオシン軽鎖−２遺伝子制御領域（Ｓｈａｎｉ，１９８５，Ｎａｔｕｒｅ  ３１４：２８３−２８６）、ならびに視床下部において活性な性腺刺激ホルモン放出ホルモン遺伝子制御領域（Ｍａｓｏｎら、１９８６，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３４：１３７２−１３７８）。
【００９２】
よって、本発明に従って、本明細書中に記載されるようなキメラポリペプチド分子をコードする核酸を含む、細菌宿主および真核生物宿主において複製され得る発現ベクターは、その宿主をトランスフェクトするために使用され、これにより、このような核酸分子の発現を指向して、次いで、生物学的に活性な形態において改修され得るこのキメラポリペプチド分子を産生する。本明細書中で使用される場合、生物学的に活性な形態とは、ＶＥＧＦに結合し得る形態を含む。
【００９３】
本明細書中で記載されるキメラ核酸分子を含む発現ベクターは、以下の３つの一般的アプローチによって同定され得る：（ａ）ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーション、（ｂ）「マーカー」遺伝子機能の存在または非存在、および（ｃ）挿入配列の発現。第１のアプローチにおいて、発現ベクター中に挿入された外因性遺伝子の存在は、挿入されたキメラポリペプチド分子配列に相同である配列を含むプローブを使用して、ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーションによって検出され得る。第２のアプローチにおいて、組換えベクター／宿主系は、ベクターへの外因性遺伝子の挿入によって生じる特定の「マーカー」遺伝子機能（例えば、チミジンキナーゼ活性、抗生物質に対する耐性、表現型の形質転換、バキュロウイルスにおけるオクルージョンボディー（ｏｃｃｌｕｓｉｏｎ  ｂｏｄｙ）の形成など）の存在または非存在に基づいて同定および選択され得る。例えば、キメラポリペプチド分子ＤＮＡ配列がベクターのマーカー遺伝子配列内に挿入される場合、挿入物を含む組換え体は、マーカー遺伝子機能の非存在によって同定され得る。第３のアプローチにおいて、組換え体発現ベクターは、組換え体によって発現される外因性遺伝子産物をアッセイすることによって同定され得る。このようなアッセイは、例えば、キメラポリペプチド分子の物理的特性または機能的特性に基づき得る。
【００９４】
本発明の細胞は、一過性にか、好ましくは構成的かつ持続的に、キメラポリペプチド分子を発現し得る。
【００９５】
キメラポリペプチド分子は、安定な、生物学的に活性なキメラポリペプチド分子の引き続く形成を可能にする任意の技術によって精製され得る。例えば（限定の目的ではないが）、これらの因子は、可溶性タンパク質または封入体のいずれかとして、細胞より改修され得、封入体からは、８Ｍ塩酸グアニジンおよび透析（例えば、Ｂｕｉｌｄｅｒら、米国特許第５，６６３，３０４号を参照のこと）によって定量的に抽出され得る。これらの因子のさらなる精製のために、慣用的イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィーまたはゲル濾過が、使用され得る。
【００９６】
本発明の１つの実施形態において、第１の成分をコードするヌクレオチド配列は、第２の成分をコードするヌクレオチド配列の上流にある。本発明の別の実施形態において、第１の成分をコードするヌクレオチド配列は、第２の成分をコードするヌクレオチド配列の下流にある。本発明のさらなる実施形態が調製され得、ここで、第１、第２および第３の融合ポリペプチド成分の順番が再配列される。例えば、第１の成分をコードするヌクレオチド配列が１と称され、第２の成分をコードするヌクレオチド配列が２と称され、そして第３の成分のヌクレオチド配列が３と称される場合、次いで、５’から３’の方向に読まれる場合、本発明の単離された核酸中のこれらの成分の順番は、１，２，３；１，３，２；２，１，３；２，３，１；３，１，２；または３，２，１の６つの組み合わせのいずれかであり得る。
【００９７】
本発明はまた、診断的有用性および治療的有用性を有する。本発明の特定の実施形態において、本明細書中に記載されるキメラポリペプチド分子の機能または発現における異常を検出する方法は、障害の診断に使用され得る。他の実施形態において、キメラポリペプチド分子、またはこのキメラポリペプチド分子を結合するアゴニストもしくはアンタゴニストの操作は、疾患の処置に使用され得る。さらなる実施形態において、そのキメラポリペプチド分子は、結合因子のその標的に対する結合をブロックするための薬剤として利用される。
【００９８】
例示の目的であるが、限定の目的ではなく、本発明の方法は、脈管透過性、水腫または炎症（例えば、傷害、発作または腫瘍に関連する脳水腫；炎症性傷害（例えば、慢性関節リウマチを含む乾癬または関節炎）に関連する水腫；喘息；火傷に関連する一般的水腫；腫瘍、炎症または外傷に関連する腹水および胸水；慢性気道炎症；毛細管漏出症候群；セプシス；タンパク質の漏出増加に関連する腎疾患；および眼障害（例えば、黄斑変性および糖尿病性網膜症に関連する老化）によって特徴付けられる臨床状態を処置する際に有用であり得る。
【００９９】
本発明の方法は、受容可能な薬学的キャリア（以下を参照のこと）中の、治療的有効量のＶＥＧＦアンタゴニスト（好ましくは、ＶＥＧＲ１Ｒ２−ＦｃΔＣ１（ａ））の薬学的組成物を、その必要のある被験体（すなわち、例えば、炎症性皮膚疾患に罹患する被験体）に投与する工程を包含する。いくつかの特定の実施形態において、このＶＥＧＦアンタゴニスト（好ましくは、ＶＥＧＲ１Ｒ２−ＦｃΔＣ１（ａ））は、乾癬を被る患者を処置するために使用される。
【０１００】
ＶＥＧＦアンタゴニスト（好ましくは、ＶＥＧＲ１Ｒ２−ＦｃΔＣ１（ａ））は、それ自体、または薬学的組成物の形態で、被験体に投与され得る。本発明の化合物を含む薬学的組成物は、慣用的混合プロセス、溶解プロセス、顆粒化プロセス、糖衣錠作製プロセス、粉末化プロセス、乳化プロセス、カプセル化プロセス、エントラッピングプロセスまたは凍結乾燥プロセスの手段によって、製造され得る。薬学的組成物は、活性なＶＥＧＦアンタゴニスト（好ましくは、ＶＥＧＲ１Ｒ２−ＦｃΔＣ１（ａ））のプロセス化を容易にする１つ以上の生理学的に受容可能なキャリア、希釈剤、賦形剤または補助剤を、薬学的に使用され得る調製物中に使用して、慣用的様式にて処方され得る。適切な処方物は、選択された投与経路に依存する。
【０１０１】
局所的な投与のために、化合物が、溶液、ゲル、軟膏、クリーム、懸濁物などとして処方され得、これらは、当該分野において周知である。
【０１０２】
全身的処方としては、注入（例えば、皮下注射、眼内注射、静脈内注射、筋肉内注射、硬膜下腔内注射または腹腔内注射）による投与のために設計されたもの、ならびに経皮投与、粘膜内投与、経口投与または肺内投与のために設計されたものが挙げられる。注入について、本発明の化合物は、水溶液（好ましくは、生理学的に適合可能な緩衝液（例えば、ハンクス液、リンガー液または生理学的な生理食塩水）にて処方され得る。これらの溶液は、処方剤（例えば、懸濁剤、安定化剤および／または分散剤）を含み得る。あるいは、化合物は、適切なビヒクル（例えば、発熱物質を含まない滅菌水）と使用前に構成するための粉末形態であり得る。
【０１０３】
粘膜投与について、浸透されるバリアに適切な浸透剤が、処方物中に使用される。このような浸透剤は、一般に当該分野において公知である。
【０１０４】
経口投与について、化合物は、活性なＶＥＧＦアンタゴニスト（好ましくは、ＶＥＧＲ１Ｒ２−ＦｃΔＣ１（ａ））を当該分野において周知の薬学的に受容可能なキャリアと組合わせることによって、容易に処方され得る。このようなキャリアは、本発明の化合物を、処置されるべき患者による経口摂取のための錠剤、丸剤、糖剤、カプセル、液体、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁物などとして処方されることを可能にする。経口固体処方物（例えば、粉末、カプセルおよび錠剤）について、適切な賦形剤としては、フィラー（例えば、糖（例えば、ラクトース、スクロース、マンニトールおよびソルビトール））；セルロース調製物（例えば、ダイズ澱粉、コムギ澱粉、コメ澱粉、ジャガイモ澱粉、ゼラチン、ゴムトラガカント、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、および／またはポリビニルピロリドン（ＰＶＰ））；顆粒剤；ならびに結合剤が挙げられる。所望ならば、崩壊剤（例えば、架橋ポリビニルピロリドン、アガーまたはアルギン酸もしくはこの塩（例えば、アルギン酸ナトリウム））が、添加され得る。所望ならば、固体投薬形態は、標準的技術を使用して糖衣性または腸溶性であり得る。
【０１０５】
経口液体調製物（例えば、懸濁物、エリキシルおよび溶液、適切なキャリア、賦形剤または希釈剤）としては、水、グリコール、油、アルコールなどが挙げられる。さらに、香味料、防腐剤、着色剤などが、添加され得る。
【０１０６】
口内投与について、化合物は、慣用的な様式で処方される錠剤、ロゼンジなどの形態をとり得る。
【０１０７】
吸入による投与について、本発明に従う使用のための化合物は、加圧されたパッキングまたはネブライザーからのエアロゾルスプレーの形態で、適切な推進薬（例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロメタン、二酸化炭素または他の適切な気体）の使用とともに都合よく送達される。加圧されたエアロゾルの場合において、投薬単位は、測定された量送達するための値を提供することによって決定され得る。例えば、吸入器または注入器での使用のためのゼラチンのカプセルおよびカートリッジは、化合物と適切な粉末ベース（例えば、ラクトースまたは澱粉）との粉末混合物を含んで処方され得る。
【０１０８】
化合物はまた、直腸内組成物または膣内組成物（例えば、坐剤または停留浣腸（例えば、慣用的な坐剤ベース（例えば、ココアバターまたは他のグリセリド）を含む））にて処方され得る。
【０１０９】
以前に記載された処方物に加えて、化合物はまた、貯留調製物として処方され得る。このような長期間作用する処方物は、移植（例えば、皮下または筋肉内での）または筋肉内注射によって投与され得る。よって、例えば、化合物は、適切なポリマー性材料もしくは疎水性材料（例えば、受容可能な油中の乳濁液として）またはイオン交換樹脂、あるいは、節約性（ｓｐａｒｉｎｇｌｙ）可溶性誘導体（例えば、節約性可溶性塩）として処方され得る。
【０１１０】
あるいは、他の薬学的送達系が、使用され得る。リポソームおよび乳濁液は、送達ビヒクルの周知の例示であり、これらは、本発明のＶＥＧＦアンタゴニスト（好ましくは、ＶＥＧＲ１Ｒ２−ＦｃΔＣ１（ａ））を送達するために使用され得る。特定の有機溶媒（例えば、ジメチルスルホキシド）はまた、使用され得るが、通常より強い毒性の代償がある。さらに、化合物は、徐放性系（例えば、治療剤を含む固体ポリマーの半透過性マトリクス）を使用して送達され得る。種々の徐放性材料が確立されており、そして当業者によって周知である。徐放性カプセルは、それらの化学的性質に依存して、数週間から１００日より長くまでにわたって化合物を放出する。治療試薬の化学的性質および生物学的安定性に依存して、タンパク質安定化のためにさらなる戦略が利用され得る。
【０１１１】
本発明の化合物が荷電された側鎖または荷電された末端を含む場合、本発明の化合物は、遊離酸または遊離塩基として、あるいは薬学的に受容可能な塩として、上記の処方物のいずれか中に含まれ得る。薬学的に受容可能な塩は、遊離塩基の抗菌活性を実質的に残存し、そして無機酸との反応によって調製される塩である。薬学的な塩は、水性溶媒および他のプロトン性溶媒中で、対応する遊離塩基形態よりもより安定である傾向がある。
【０１１２】
好ましい実施形態において、ＶＥＧＦアンタゴニスト（好ましくは、ＶＥＧＲ１Ｒ２−ＦｃΔＣ１（ａ））は、適切な濃度での注入のために滅菌水を用いて再構成されるべき凍結乾燥粉末として調製される。再構成される溶液は、適切に緩衝化されている。好ましい実施形態において、ＶＥＧＦアンタゴニスト（好ましくは、ＶＥＧＲ１Ｒ２−ＦｃΔＣ１（ａ））は、防腐剤を含まない。
【０１１３】
ＶＥＧＦアンタゴニスト（好ましくは、ＶＥＧＲ１Ｒ２−ＦｃΔＣ１（ａ））は、一般に、意図される目的（すなわち、炎症性皮膚疾患（特に、乾癬）を処置すること）を達成するために効果的な量で使用される。乾癬を処置するための使用のために、ＶＥＧＦアンタゴニスト（好ましくは、ＶＥＧＲ１Ｒ２−ＦｃΔＣ１（ａ））、またはその薬学的組成物が、治療的有効量で投与または適用される。治療的有効量によって、処置される患者の症状を改善または予防するために効果的な量が意味される。治療的有効量の決定は、特に、本明細書中に提供される詳細な開示の観点から、十分に当業者の能力内である。
【０１１４】
全身投与のために、治療的有効用量は、初めにインビトロアッセイから推定され得る。例えば、用量は、動物モデルにおいて、細胞培養物で決定されるようなＩＣ５０を含む循環濃度範囲を達成するように処方され得る。このような情報を使用して、ヒトにおいて有用な用量をより正確に決定し得る。最初の投薬量はまた、当該分野で周知である技術を使用して、インビボデータ（例えば、動物モデル）から推定され得る。当業者は、動物でのデータに基づいて、ヒトへの投与を容易に最適化し得る。
【０１１５】
投薬量および投薬間隔は、治療効果を維持するに十分な血漿レベルの化合物を提供するために、個々に調整され得る。局所的投与または選択的取り込みの場合、化合物の有効な局所的濃度は、血漿濃度とは関連しない場合がある。当業者は、過度な実験を伴わずに、治療的に有効な局所的投薬量を最適化し得る。
【０１１６】
投与される化合物の量は、当然のことながら、処置される被験体、被験体の体重、苦痛の重篤度、投与の様式、および処方する医師の判断に依存する。
【０１１７】
治療は、症状が検出され得る間または症状が検出不可能である場合でさえも、断続的に繰り返され得る。治療は、単独で与えられても、他の薬物と組み合わせて与えられてもよい。
【０１１８】
好ましくは、本明細書中に記載される化合物の治療的有効用量は、実質的な毒性を引き起こさずに、治療効果を与える。
【０１１９】
本明細書中に記載される化合物の毒性は、細胞培養物または実験動物での標準的な薬学的手順によって（例えば、ＬＤ５０（集団の５０％に対して致死的である用量）またはＬＤ１００（集団の１００％に対して致死的である用量）を決定することによって）、決定され得る。毒性作用と治療効果との間の用量比が、治療指数（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｉｎｄｅｘ）である。高い治療指数を示す化合物が、好ましい。これらの細胞培養物アッセイおよび動物実験から得られるデータを、ヒトにおける使用のために非毒性である投薬範囲を処方するにおいて使用し得る。本明細書中に記載された化合物の投薬量は、好ましくは、ほとんどまたは全く毒性を有さない有効用量を含む循環濃度の範囲内である。投薬量は、使用される投薬形態および利用される投与経路に依存して、この範囲内で変動し得る。正確な処方、投与経路および投薬量は、患者の状態に鑑みて、個々の医師によって選択され得る（例えば、Ｆｉｎｇｌら、１９７５：Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、第１章、第１頁を参照のこと）。
【０１２０】
以下の実施例を、限定のためではなく例示のために提供する。
【実施例】
【０１２１】
（実施例）
Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃのアミノ酸配列分析によって、異常に多い数（４６個）の塩基性アミノ酸残基リジンの存在が明らかにされた。Ｆｌｔ１（１−３）−ＦｃのＩＥＦ分析によって、このタンパク質は、９．３よりも高いｐＩを有することが示された。このことは、このタンパク質が非常に塩基性であるという予測を確証付けた。Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃタンパク質の塩基性の性質は、このタンパク質が細胞外マトリクス成分に結合する原因となっており、そしてこの相互作用が、マウスに注射された場合にＦｌｔ１（１−３）−Ｆｃによって示される極めて短期間の検出可能な循環血清半減期の原因であり得るという仮説が立てられた。この仮説を試験するために、Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃタンパク質を、リジン残基でアセチル化して塩基性電荷を減少させた。次いで、アセチル化Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃを、下記のアッセイにおいて試験した。
【０１２２】
（実施例１：ＣＨＯ  Ｋ１細胞におけるＦｌｔ１（１−３）−Ｆｃタンパク質の発現）
標準的な分子生物学的技術（例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌら編，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌ．Ａｓｓｏｃ．，Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，ＮＹを参照のこと）を使用して、Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃをコードする遺伝子を、発現ベクターｐＥＥ１４．１（Ｌｏｎｚａ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ，ｐｌｃ）中に、ＣＭＶプロモーターの下流のマルチクローニング部位に挿入した。ＣＨＯ  Ｋ１細胞に、リポフェクトアミン（ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を使用して、このｐＥＥ１４．１／Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃ  ＤＮＡ構築物をトランスフェクトした。トランスフェクトされたＣＨＯ  Ｋ１細胞を、２５μＭメチオニンスルホキシム（ＭＳＸ）（Ｓｉｇｍａ  Ｉｎｃ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯから）を含む、グルタミン非含有ＤＭＥＭ（ＪＲＨ，Ｋａｎｓａｓ  Ｃｉｔｙ，ＭＯ）中において増殖させ、そしてヒトＦｃを捕捉および検出する標準的なイムノアッセイを使用して、手で拾い上げられた１００個を超えるコロニー単離株からＣＨＯ  Ｋ１細胞上清をスクリーニングすることによって、高組換えタンパク質発現体（ｅｘｐｒｅｓｓｏｒ）を得た。手で拾い上げられた選択されたクローンを、１００μＭ  ＭＳＸの存在下において増幅し、次いで、この増幅されたクローンの第二回目のスクリーニングを行った。最高の産生クローンは、５５ｐｇ／細胞／日の組換えＦｌｔ１（１−３）−Ｆｃタンパク質の比生産性（ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｖｉｔｙ）を有した。
【０１２３】
選択されたクローンを、上記の細胞培養培地を用いて、２２５ｃｍ２のＴ−フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ａｃｔｏｎ，ＭＡ）中で増殖させ、次いで、８．５Ｌローラーボトル（Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ａｃｔｏｎ，ＭＡ）中に移した。細胞を、標準的なトリプシン処理によってこのローラーボトルから取り出し、そして３．５Ｌの懸濁培地中に配置した。この懸濁培地は、５ＬのＣｅｌｌｉｇｅｎバイオリアクター（Ｎｅｗ  Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｎｅｗ  Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ，ＮＪ）中において、５％胎仔ウシ血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ  Ｌａｂｓ，Ｌｏｇａｎ，ＵＴからのＦＢＳ）、１００μＭのＭＳＸおよびＧＳ補充物（ＪＲＨ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｋａｎｓａｓ  Ｃｉｔｙ，ＭＯ）を含む、グルタミン非含有ＩＳＣＨＯ培地（Ｉｒｖｉｎｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｓａｎｔａ  Ａｎａ，ＣＡ）（０．３×１０６細胞／ｍＬの密度）から構成される。細胞を３．６×１０６／ｍＬの密度に到達させ、そしてそれらを懸濁物に適応させた後、それらの細胞を、５％胎仔ウシ血清を有する２０ＬのＩＳＣＨＯ培地中において０．５×１０６細胞／ｍＬの密度で、６０Ｌのバイオリアクター（ＡＢＥＣ，Ａｌｌｅｎｔｏｗｎ，ＰＡ）に移した。２日後、さらなる２０ＬのＩＳＣＨＯ＋５％胎仔ウシ血清を、このバイオリアクターに添加した。この細胞をさらに２日間増殖させて、３．１×１０６細胞／ｍＬの最終密度に到達させ、そして収集時の最終Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃ濃度は、９５ｍｇ／Ｌであった。収集時には、０．４５μｍ  Ｐｒｏｓｔａｋ  Ｆｉｌｔｅｒｓ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｉｎｃ．，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）を用いて、平行流濾過（ｔａｎｇｅｎｔｉａｌ  ｆｌｏｗ  ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）によって細胞を取り出した。
【０１２４】
（実施例２：ＣＨＯ  Ｋ１細胞から得られたＦｌｔ１（１−３）−Ｆｃタンパク質の精製）
Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃタンパク質を、最初に、アフィニティークロマトグラフィーによって精製した。プロテインＡカラムを使用して、高い特異性で、分子のＦｃ部分を結合させた。次いで、このアフィニティー精製されたタンパク質を濃縮し、そしてＳＥＣカラムを通過させた。次いで、このタンパク質を処方緩衝液中に溶出した。以下に、これらの手順を詳細に記載する。
【０１２５】
（材料および方法）
すべての化学薬品を、ＰＢＳ（これは、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤから、１０倍濃縮物として入手した）を除いて、Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ，Ｐｈｉｌｌｉｐｓｂｕｒｇ，ＮＪから入手した。プロテインＡ  Ｆａｓｔ  ＦｌｏｗおよびＳｕｐｅｒｄｅｘ  ２００の製剤等級の樹脂を、Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ．から入手した。タンパク質濃縮のための装置および膜を、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡから入手した。
【０１２６】
Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃタンパク質を含有する、０．４５μｍで濾過されたＣＨＯ馴化培地（約４０Ｌ）を、ＰＢＳで平衡化された２９０ｍＬのプロテインＡ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗカラム（直径１０ｃｍ）に供した。このカラムを、３５０ｍＭ  ＮａＣｌおよび０．０２％ＣＨＡＰＳを含有するＰＢＳで洗浄し、そして結合したタンパク質を、１０ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４を含有する２０ｍＭクエン酸で溶出した。この溶出における単一ピークを収集し、そしてそのｐＨを、１Ｍ  ＮａＯＨで中性まで上昇させた。溶出画分を、平行流濾過および撹拌細胞濃縮（ｓｔｉｒｒｅｄ  ｃｅｌｌ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ）の両方によって、１０Ｋ再生セルロース膜を使用して約９ｍｇ／ｍＬまで濃縮した。凝集体および他の夾雑物を除去するために、この濃縮したタンパク質を、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００の製剤等級樹脂を充填したカラム（１０ｃｍ×５５ｃｍ）に供し、そして５％グリセロールを含有するＰＢＳ中で流した。主要ピーク画分をプールし、濾過滅菌し、アリコートに等分し、そして−８０℃で保存した。
【０１２７】
（実施例３：Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃタンパク質のアセチル化）
２ｍｇのＦｌｔ１（１−３）−Ｆｃタンパク質を、スルホ−ＮＨＳ−アセテート改変キット（ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−ａｃｅｔａｔｅ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔ）（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ，カタログ番号２６７７７）に提供される取扱説明書に記載されるようにしてアセチル化した。
【０１２８】
（実施例４：アセチル化Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃタンパク質の特徴付け）
（（ａ）ＩＥＦ分析）
Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃおよびアセチル化Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃを、標準的なＩＥＦ分析によって分析した。図１に示されるように、Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃタンパク質は、ゲル中へ移動不可能であり、従って、９．３（標準における最高のｐＩ）よりも高いｐＩを有することはほぼ相違ない。しかし、アセチル化Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃは、ゲル中へ移動可能であり、そして約５．２のｐＩで平衡化され得る。この結果は、アセチル化がこのタンパク質の正味の正電荷を減少させ、従って、そのｐＩをかなり低下させることを実証する。
【０１２９】
（（ｂ）細胞外マトリクス成分への結合）
細胞外マトリクス成分への結合について試験するため、Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃおよびアセチル化Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃを、細胞外マトリクス成分との相互作用を模倣するように設計されたアッセイにおいて試験した。このアッセイにおいて、９６ウェルの組織培養プレートを、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（Ｂｉｏｃｏａｔ  ＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）マトリクス薄層９６ウェルプレート（ｍａｔｒｉｘ  ｔｈｉｎ  ｌａｙｅｒ  ９６  ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅ），カタログ番号４０６０７，Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  Ｌａｂｗａｒｅ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）でコーティングした。このプレートを、ウェルに添加された、種々の濃度のＦｌｔ１（１−３）−Ｆｃ、アセチル化Ｆｌｔ１（１−３）−ＦｃまたはｒＴｉｅ２−Ｆｃ（無関係のコントロール）のタンパク質のいずれかと共にインキュベートした。このプレートを、室温または３７℃のいずれかで１〜２時間インキュベートし、次いで、結合タンパク質の検出を、このウェルにアルカリホスファターゼ結合体化抗ヒトＦｃ二次抗体を添加することによって達成する。最後に、アルカリホスファターゼ基質をこのウェルに添加し、そして光学密度を測定する。図２は、このアッセイの結果を示す。無関係のコントロールタンパク質ｒＴｉｅ２−Ｆｃと同様に、アセチル化Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃは、Ｍａｔｒｉｇｅｌをコーティングされたプレートに対していかなる結合をも示さない。一方、非アセチル化Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃタンパク質は、顕著な結合を示す。この結果は、塩基性アミノ酸残基のアセチル化が、正に荷電されたタンパク質と、それらがインビボで曝露されている負に荷電された細胞外マトリクス成分との間に存在する荷電相互作用を妨げるために有効な方法であることを示す。
【０１３０】
（実施例５：Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃタンパク質のペグ化（ｐｅｇｙｌａｔｉｏｎ））
タンパク質のペグ化（ポリエチレングリコール−ＰＥＧ）は、免疫原性を最小限にしつつ安定性およびバイオアベイラビリティを増強することによって、インビボにおけるその効力を増加させることが示されたが（上記で引用された参考文献を参照のこと）、腎糸球体によって濾過されるには大きすぎるペグ化分子が、その薬物動態学的特性を改善するとは直感では考え難い。理論によって束縛されないが、出願人は、細胞外マトリクスとの相互作用から正電荷を物理的に保護することによってではなく、おそらく正電荷を変化させることによってかまたはＦｌｔ１（１−３）−ＦｃのｐＩを低下させることによって、Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃ分子のペグ化が薬物動態学的特性を改善し得ると仮定した。出願人は、下記のように２０ＫのＰＥＧ鎖を結合させることによって、Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃ分子の薬物動態学的特性を改善することを試みることを決定した。
【０１３１】
（材料および方法）
ＣＨＯ細胞（上記を参照のこと）に由来する精製されたＦｌｔ１（１−３）−Ｆｃを、以下のペグ化実験において使用した。官能化されたＰＥＧを、Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ，Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ，ＡＬから入手し；Ｂｉｃｉｎｅを、Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ，ＭＯから入手し；Ｓｕｐｅｒｏｓｅ６カラムを、Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪから入手し；１０倍濃縮物としてのＰＢＳを、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤから入手し；グリセロールを、Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ，Ｐｈｉｌｌｉｐｓｂｕｒｇ，ＮＪから入手し；そしてビス−Ｔｒｉｓプレキャストゲルを、Ｎｏｖｅｘ，ＣＡから入手した。
【０１３２】
アミン特異的な末端部分で官能化された２０Ｋ  ＰＥＧ鎖を、異なる反応条件（ここでは、ＰＥＧ：タンパク質の化学量論を変動させた）を評価するために設定された小規模での反応研究において使用した。これらの反応および標準的なＳＤＳ−ＰＡＧＥでのサンプルの分析に基づいて、１．５ｍｇ／ｍＬの濃度のＦｌｔ１（１−３）−Ｆｃを、ｐＨ８．１において、１：６のＰＥＧ：Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃモノマーのモル比で、２０Ｋ  ＳＰＡ−ＰＥＧ（ＰＥＧスクシンイミジルプロピオネート）分子と反応させた。この反応を、８℃で一晩進行させた。最初の精製のために、この反応生成物を、５％グリセロールを含むＰＢＳで平衡化された１０ｍｍ×３０ｃｍ  Ｓｕｐｅｒｏｓｅ６カラムに供した。このカラムは、ペグ化の程度に基づいて、ペグ化されたＦｌｔ１（１−３）−Ｆｃ分子を分離するようであった。還元および非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルでのバンド形成パターンによって判断した場合に、主にモノペグ化およびジペグ化されたダイマー性Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃであるように思われたものに対応する画分をプールした。タンパク質濃度を、２８０ｎｍでの吸光度を測定することによって決定した。ペグ化されたＦｌｔ１（１−３）−Ｆｃタンパク質を、濾過滅菌し、アリコートに等分し、そして−４０℃で保存した。
【０１３３】
（実施例６：Ｂｉａｃｏｒｅベースのアッセイにおける、非改変Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃ、アセチル化Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃおよびペグ化Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃの結合）
非改変Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃタンパク質、アセチル化Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃタンパク質およびペグ化Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃタンパク質を、Ｂｉａｃｏｒｅベースのアッセイにおいて試験して、Ｆｌｔ１リガンドであるＶＥＧＦに結合する能力を評価した。このアッセイにおいては、非改変Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃタンパク質を、Ｂｉａｃｏｒｅチップ（標準的な手順に関して、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｉｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  Ｍａｎｕａｌ，Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｉｎｃ．，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪを参照のこと）の表面に固定し、そして０．２μｇ／ｍｌ  ＶＥＧＦと、非改変Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃ、アセチル化Ｆｌｔ１（１−３）Ｆｃまたはペグ化Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃ（各々、２５μｇ／ｍｌ）のいずれかとを含有するサンプルを、Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃでコーティングされたチップに通過させた。非特異的結合の影響を最小にするために、結合したサンプルを、０．５Ｍ  ＮａＣｌ洗浄液で洗浄した。１つのサンプルでは、非改変Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃを、ヘパリンと混合した。ヘパリンは負に荷電した分子であり、そしてＦｌｔ１（１−３）−Ｆｃタンパク質は正に荷電した分子であり、それゆえ、これらの２つの分子が一緒に混合されると、これらは、これらのそれぞれの電荷によって相互作用するはずである。このことは、Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃの固有の正電荷を本質的に中和して、この分子が、あたかも化学的または遺伝的に改変されて、その結果、その電荷および電荷相互作用を介して結合する傾向が減少したかのように挙動するようにする。図３に示すように、アセチル化Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃ（カラム１３〜１６）、ペグ化Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃ（カラム１７〜２０）およびヘパリン処理Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃ（カラム２１〜２４）は各々、Ｂｉａｃｏｒｅチップに結合したＦｌｔ１（１−３）−Ｆｃと、コントロール（カラム１〜４）および無関係のタンパク質（カラム５〜８）と比較して、ＶＥＧＦ結合に関して完全に競合し得る。非改変のＦｌｔ１（１−３）−Ｆｃ（カラム５〜６）は、Ｂｉａｃｏｒｅチップに結合したＦｌｔ１（１−３）−Ｆｃと、ＶＥＧＦ結合に関して部分的にのみ競合するようであった。しかし、結合したサンプルを０．５Ｍ  ＮａＣｌで洗浄することによって（カラム７〜８）、改変形態のＦｌｔ１（１−３）−Ｆｃと類似した結合プロファイルを生じた。このことは、この非改変タンパク質が、塩での洗浄によって除去され得る、チップへの非特異的結合を示したことを示す。
【０１３４】
（実施例７：ＥＬＩＳＡベースのアッセイにおける、非改変Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃ、アセチル化Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃおよびペグ化Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃの結合）
非改変Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃタンパク質、アセチル化Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃタンパク質およびペグ化Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃタンパク質を、標準的なＥＬＩＳＡベースのアッセイにおいて試験して、Ｆｌｔ１レセプターリガンドであるＶＥＧＦに結合する能力を評価した。図４に示すように、ペグ化Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃタンパク質およびアセチル化Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃタンパク質は両方とも、ＶＥＧＦに結合し得る。このことは、これらのタンパク質をペグ化またはアセチル化のいずれかによって改変することは、そのリガンドを結合する能力を破壊しないことを実証する。
【０１３５】
（実施例８：非改変Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃ、アセチル化Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃ、およびペグ化Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃの薬物動態学的分析）
インビボでの実験を設計して、非改変Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃタンパク質、アセチル化Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃタンパク質、およびペグ化Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃタンパク質の薬物動態学的プロファイルを評価した。Ｂａｌｂ／ｃマウス（２３〜２８ｇ；３匹のマウス／群）に、４ｍｇ／ｋｇの非改変Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃ、アセチル化Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃ、またはペグ化Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃを皮下注射した。タンパク質の注射の１時間後、２時間後、４時間後、６時間後、２４時間後、２日後および３日後、マウスの尾から採血した。血清を、Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃタンパク質を検出するように設計した標準的なＥＬＩＳＡベースのアッセイにおいてアッセイした。手短に述べると、このアッセイは、ＥＬＩＳＡプレートをＶＥＧＦでコーティングすること、非改変Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃ、アセチル化Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃまたはペグ化Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃを含有する血清を結合させること、およびアルカリホスファターゼに連結した抗Ｆｃ抗体を用いて報告することを含む。図５に示すように、Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃタンパク質の全てについてのＴｍａｘは、６時間の時点と２４時間の時点との間であった。異なるタンパク質についてのＣｍａｘは、以下の通りであった：非改変：０．０６μ／ｍｌ〜０．１５μｇ／ｍｌ；アセチル化：１．５μｇ／ｍｌ〜４．０μｇ／ｍｌ；そしてペグ化：約５μｇ／ｍｌ。
【０１３６】
（実施例９：Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃの段階的アセチル化）
細胞外マトリクス成分への結合を除去するために必要なアセチル化の最少量を決定するために、漸増量のモル過剰のアセチル化試薬をアセチル化反応混合物中で用いることによってＦｌｔ１（１−３）−Ｆｃタンパク質を段階的な様式でアセチル化する実験を設計した。モル過剰の範囲は以下の通りであった：１モルのＦｌｔ１（１−３）−Ｆｃモノマーあたり０、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、および１００モルのアセチル化試薬。反応を、スルホ−ＮＨＳ−アセテート改変キット（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ，Ｃａｔ．＃２６７７７）と共に提供される指示マニュアルに詳述されるとおりに行った。
【０１３７】
（実施例１０：段階的アセチル化Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃの特徴付け）
（（ａ．）ＩＥＦ分析）非改変のＦｌｔ１（１−３）−Ｆｃタンパク質および段階的アセチル化Ｆｌｔ１（１−３）Ｆｃタンパク質を、標準的なＩＥＦ分析によって分析した。図６Ａ〜図６Ｂに示すように、非改変のＦｌｔ１（１−３）−Ｆｃタンパク質は、その非常に高いｐＩ（９．３よりも大きい）に起因して、ゲル中に移動できなかった。しかし、段階的アセチル化Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃサンプルの大部分（３０〜１００倍モル過剰のサンプル）はゲル中に移動し得、そしてこのタンパク質のアセチル化の程度に依存して、４．５５〜８．４３の範囲にわたるｐＩで平衡化し得た。この結果は、アセチル化が、このタンパク質の正電荷を、用量依存性様式で変更し得ること、およびｐＩの低下が、アセチル化の程度を制御することによって制御され得ることを実証する。
【０１３８】
（（ｂ．）細胞外マトリクス成分に対する段階的アセチル化Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃの結合）
細胞外マトリクス成分への結合について試験するために、Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃおよび段階的アセチル化Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃを、細胞外マトリクス成分との相互作用を模倣するように設計された上記のアッセイにおいて試験した。種々の濃度の非改変Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃタンパク質、段階的アセチル化Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃタンパク質（１０、２０、および３０倍モル過剰のサンプル）またはｒＴｉｅ２−Ｆｃ（無関係なコントロール）タンパク質のいずれかを、ウェルに添加した。プレートを、１〜２時間にわたって、室温または３７℃でインキュベートし、次いで、結合したタンパク質の検出を、アルカリホスファターゼ結合体化抗ヒトＦｃ二次抗体をウェルへ添加することによって達成した。続いて、アルカリホスファターゼ基質をウェルに添加し、そして光学密度を測定した。図７は、このアッセイの結果を示す。無関係なコントロールのタンパク質ｒＴｉｅ２−Ｆｃと同様に、段階的アセチル化Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃ（２０倍および３０倍モル過剰のサンプル）は、Ｍａｔｒｉｇｅｌでコーティングしたプレートに対して何の顕著な結合も示さず、一方、非アセチル化Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃタンパク質は、顕著な結合を示した。この結合は飽和性であり、このことは、Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃタンパク質が、飽和性ではないかもしれない、より一般的な電荷媒介相互作用というよりは、部位特異的に結合し得ることを示す。１０倍モル過剰のサンプルは、減少した結合を示したが、アセチル化の程度は、細胞外マトリクス成分への結合を完全にブロックするには充分ではなかった。２０倍以上にモル過剰のサンプルは、ＩＥＦ分析（図６Ａおよび図６Ｂ）による、より低いモル過剰のサンプルは、大きな正味の正電荷を依然として有したという事実にもかかわらず、検出可能な結合を示さなかった。この結果は、細胞外マトリクス成分への結合を除去するために、利用可能な塩基性アミノ酸の全てを完全にアセチル化する必要はないことを実証する。
【０１３９】
（（ｃ．）Ｂｉａｃｏｒｅベースのアッセイにおける、段階的アセチル化Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃの結合）
非改変Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃタンパク質および段階的アセチル化Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃタンパク質を、Ｂｉａｃｏｒｅベースのアッセイにおいて試験して、Ｆｌｔ１リガンドであるＶＥＧＦへの結合能力を評価した。このアッセイにおいて、非改変Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃタンパク質（０．５μｇ／ｍｌ、１．０μｇ／ｍｌ、または５．０μｇ／ｍｌ）を、Ｂｉａｃｏｒｅチップ（標準的な手順について、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｉｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  Ｍａｎｕａｌ，Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｉｎｃ．，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪを参照のこと）の表面に固定し、そして０．２μｇ／ｍｌ  ＶＥＧＦと、非改変Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃ（０．５μｇ／ｍｌ、１．０μｇ／ｍｌ、または５．０μｇ／ｍｌのいずれか）または１０種の異なる段階的アセチル化Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃサンプル（各々、０．５μｇ／ｍｌ、１．０μｇ／ｍｌ、または５．０μｇ／ｍｌ）のいずれかとを含む溶液を、Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃでコーティングしたチップに通過させた。図８に示すように、半化学量論的比率（０．２μｇ／ｍｌ  ＶＥＧＦに対して、非改変Ｆｌｔ１（１−３）または段階的アセチル化Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃのいずれか０．５μｇ／ｍｌ）では、溶液中には、ＶＥＧＦを完全に結合するに充分なＦｌｔ１（１−３）−Ｆｃ（非改変または段階的アセチル化のいずれか）は存在しない。１：１の化学量論的比率に近似する１．０μｇ／ｍｌでは、非改変Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃおよび段階的アセチル化Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃは両方とも、ＶＥＧＦ結合について、より良好に競合し得るが、利用可能なＶＥＧＦを完全に結合するにはなお不充分なＦｌｔ１（１−３）−Ｆｃタンパク質（非改変または段階的アセチル化のいずれか）が存在する。しかし、１：１の化学量論的比率よりも何倍か大きい５．０μｇ／ｍｌでは、Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃタンパク質および段階的アセチル化Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃタンパク質は両方とも、アセチル化の程度にかかわらず、ＶＥＧＦを結合し得る。このことは、アセチル化が、Ｆｌｔ１（１−３）−ＦｃのＶＥＧＦ結合能を変更しないことを明らかに実証する。
【０１４０】
（（ｄ．）段階的アセチル化Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃの薬物動態学的分析）
インビボ実験を設計して、非改変Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃおよび段階的アセチル化Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃタンパク質の薬物動態学的プロファイルを評価した。Ｂａｌｂ／ｃマウス（２３〜２８ｇ）に、４ｍｇ／ｋｇの非改変サンプル、または１０倍、２０倍、４０倍、６０倍および１００倍モル過剰の段階的アセチル化Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃのサンプル（非改変サンプル、１０倍、２０倍および４０倍モル過剰のサンプルについては３匹のマウス、そして６０倍および１００倍モル過剰のサンプルについては２匹のマウス）を皮下注射した。注射の１時間後、２時間後、４時間後、６時間後、２４時間後、２日後および３日後、マウスの尾から採血した。血清を、Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃを検出するように設計されたＥＬＩＳＡベースのアッセイ（上記）においてアッセイした。図９は、この研究の結果を詳述する。試験したＦｌｔ１（１−３）−Ｆｃタンパク質の全てについてのＴｍａｘは６時間の時点であり、そしてＣｍａｘは以下の通りであった：非改変Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃ：０．０６μｇ／ｍｌ；１０倍モル過剰のサンプル：−０．７μｇ／ｍｌ、２０倍モル過剰のサンプル  −２μｇ／ｍｌ、４０倍モル過剰のサンプル  −４μｇ／ｍｌ、６０倍モル過剰のサンプル  −２μｇ／ｍｌ、１００倍モル過剰のサンプル  −１μｇ／ｍｌ。この結果は、Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃのアセチル化またはペグ化が、その薬物動態学的プロファイルを有意に改善することを実証する。
【０１４１】
（実施例１１：Ｍｕｔ１：Ｆｌｔ１（１−３ΔＢ）−Ｆｃと命名されたＦｌｔ１（１−３）−Ｆｃ塩基性領域欠失変異体の構築）
６未満のｐＩを有するアセチル化Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃが、非常に陽性の非改変Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃ（ｐＩ＞９．３）よりもずっと良好な薬物動態を有するという観察に基づいて、薬物動態の差異が、負に荷電した細胞外マトリクス成分に粘着させるこのタンパク質の正味の電荷に寄与し得るか否か、またはおそらく、細胞外マトリクス成分への特異的結合部位を構成するＦｌｔ１（１−３）−Ｆｃタンパク質の表面に特異的位置が存在するか否かを問うた。例えば、多くのタンパク質は、しばしば塩基性残基のクラスターからなる、ヘパリン結合部位を有することが公知である。時々、これらの残基は、このタンパク質の一次配列においてクラスター状に見出される；いくつかの文献は、このようなヘパリン結合部位について「コンセンサス配列」を同定している（例えば、Ｈｉｌｅｍａｎら，１９９８，Ｂｉｏｅｓｓａｙｓ  ２０（２）：１５６−６７を参照のこと）。他の場合では、タンパク質の既知の結晶構造は、タンパク質の表面における、正に荷電した残基のクラスターを明らかにするが、これらの残基は、一次配列の異なる領域に由来しており、そしてこのタンパク質がその三次構造に折り畳まれた場合にのみ一緒になる。従って、単離されたアミノ酸残基が、そのタンパク質の表面で塩基性残基のクラスターの一部を形成するか否かを推定することは困難である。しかし、正に荷電したアミノ酸残基のクラスターが一次配列に存在する場合、これらの残基が互いに空間的に近接しており、それゆえ、細胞外マトリクス成分結合部位の一部であり得ると推定することは不合理ではない。Ｆｌｔ１レセプターは、充分に研究されており、そして種々のドメインが記載されている（例えば、Ｔａｎａｋａら，１９９７，Ｊｐｎ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ８８：８６７−８７６を参照のこと）。本願の図１０Ａ〜図１０Ｄに示す核酸配列およびアミノ酸配列を参照すれば、この配列の開始部に位置して、ヌクレオチド７６〜７８によってコードされるグリシンまで延びる、分泌に関するシグナル配列を同定し得る。この成熟タンパク質は、Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓで始まり、核酸配列のヌクレオチド７９で始まる。Ｆｌｔ１  Ｉｇのドメイン１は、ヌクレオチド７９〜３９３にまたがり、アミノ酸Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｔｈｒで終わる。Ｆｌｔ１  Ｉｇのドメイン２は、ヌクレオチド３９４〜６８７（Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ＰｒｏからＡｓｎ−Ｔｈｒ−Ｉｌｅをコードする）にまたがり、そしてＦｌｔ１  Ｉｇのドメイン３は、ヌクレオチド６８８〜９９６（Ｉｌｅ−Ａｓｐ−ＶａｌからＡｓｐ−Ｌｙｓ−Ａｌａをコードする）にまたがる。ヌクレオチド９９７〜１００５によってコードされる架橋アミノ酸配列Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ、続いてヒトＦｃをコードするヌクレオチド配列（ヌクレオチド１００６〜１７０１またはアミノ酸Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−ＬｙｓからＰｒｏ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−停止）が存在する。
【０１４２】
Ｆｌｔ１アミノ酸配列のより詳細な分析は、クラスター、すなわち、図１０Ａ〜１０Ｄのアミノ酸残基２７２〜２８１（ＫＮＫＲＡＳＶＲＲ）（これらの１０アミノ酸残基のうちの６アミノ酸残基は塩基性である）が存在することを示す。この配列は、レセプターのＦｌｔ１  Ｉｇドメイン３に配置され（図１１を参照のこと）、ＶＥＧＦリガンドの結合にとってそれ自体は必須ではないが、リガンドへのより高い親和性結合を与える。Ｉｇドメイン３の配列とＩｇドメイン２の配列とのアライメントは、この領域において、これら２つのＩｇドメイン間のアライメントが非常に乏しいこと、およびＩｇドメイン３において約１０のさらなるアミノ酸が存在することを示す。これら２つのドメインの親水性プロフィールの分析（ＭａｃＶｅｃｔｏｒコンピューターソフトフェア）は、タンパク質における親水性領域の存在を明らかに示す（図１２Ａ〜１２Ｂ）。これらの観察は、Ｆｌｔ１  Ｉｇドメイン３の実際の３次元コンフォメーションが、Ｆｌｔ１  Ｉｇドメイン２では生じない、いくつかの型を突出（ｐｒｏｔｒｕｓｉｏｎ）させるという可能性を生じる。この仮説を試験するために、さらなる１０のアミノ酸を欠失させ、そして得られたタンパク質を、この欠失がＶＥＧＦに対するレセプターの親和性をひどく損なうことなく、好都合な薬物動態をもたらすか否かを調べるために試験した。このＤＮＡ構築物を、標準的な分子生物学的技術（例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ），Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌ．Ａｓｓｏｃ．，Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，ＮＹ）ｉｎ  ｔｈｅ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｖｅｃｔｏｒ  ｐＭＴ２１（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｉｎｃ．，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）を参照のこと）を用いて構築し、このＤＮＡ構築物をＭｕｔ１：Ｆｌｔ１（１−３ΔＢ）−Ｆｃと呼ぶ。Ｍｕｔ１：Ｆｉｔ１（１−３ΔＢ）−Ｆｃ構築物を、ヌクレオチド８１４〜８４３（図１０Ａ〜１０Ｄに記載する）の欠失によりＦｌｔ１（１−３）−Ｆｃから誘導した。これは、Ｆｌｔ１  Ｉｇドメイン３由来の高塩基性の１０アミノ酸残基の配列Ｌｙｓ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇを欠失する。
【０１４３】
最終のＤＮＡ構築物を、ＡＢＩ  ３７３Ａ  ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｒおよびＴａｑ  Ｄｉｄｅｏｘｙ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を用いて配列決定検証（ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｖｅｒｉｆｉｅｄ）した。Ｍｕｔ１：Ｆｌｔ（１−３ΔＢ）−Ｆｃの配列を図１３Ａ〜１３Ｄに記載する。
【０１４４】
（実施例１２：Ｍｕｔ２：Ｆｌｔ１（２−３ΔＢ）−Ｆｃと名付けたＦｌｔ（１−３）−Ｆｃ塩基性領域欠失変異体の構築）
Ｍｕｔ２：Ｆｌｔ１（２−３ΔＢ）−Ｆｃと名付けた第２の欠失変異体構築物を、ヌクレオチド７９〜３９３によりコードされるＦｌｔ１  Ｉｇドメイン１（図１０Ａ〜１０Ｄを参照のこと）の欠失によって、Ｍｕｔ１：Ｆｌｔ１（１−３ΔＢ）−Ｆｃ構築物から誘導した；便宜上、ヌクレオチド７３〜７８（ＴＣＡ  ＧＧＴ）をＴＣＣ  ＧＧＡに変更した。これは、関連するアミノ酸配列（Ｓｅｒ−Ｇｌｙ）を変更することなく、制限部位（ＢｓｐＥ１）を導入する。このＤＮＡ構築物を、標準的な分子生物学的技術（例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ），Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌ．Ａｓｓｏｃ．，Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，ＮＹ）ｉｎ  ｔｈｅ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｖｅｃｔｏｒ  ｐＭＴ２１（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｉｎｃ．，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）を参照のこと）を用いて構築し、このＤＮＡ構築物をまた、ＡＢＩ  ３７３Ａ  ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｒおよびＴａｑ  Ｄｉｄｅｏｘｙ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を用いて配列決定検証した。Ｍｕｔ２：Ｆｌｔ１（２−３ΔＢ）−Ｆｃの配列を、図１４Ａ〜１４Ｃに記載する。
【０１４５】
（実施例１３：Ｍｕｔ３：Ｆｌｔ１（２−３）−Ｆｃと名付けたＦｌｔ（１−３）−Ｆｃ欠失変異体の構築）
Ｍｕｔ３：Ｆｌｔ１（２−３）−Ｆｃと名付けた第３の欠失変異構築物を、Ｆｌｔ  Ｉｇドメイン３はインタクトなままなこと（塩基性領域のアミノ酸を欠失しない）を除いて、Ｍｕｔ２：Ｆｌｔ１（２−３ΔＢ）−Ｆｃ構築物と同じ方法で構築した。この構築物を、上記のように標準的な分子生物学的技術を用いて構築し、そして最終構築物を配列決定検証した。Ｍｕｔ３：Ｆｌｔ１（２−３）−Ｆｃの配列を、図１５Ａ〜１５Ｃに記載する。
【０１４６】
（実施例１４：Ｍｕｔ４：Ｆｌｔ１（１−３Ｒ−＞Ｎ）−Ｆｃと名付けたＦｌｔ（１−３）−Ｆｃ塩基性領域Ｎ−グルコシル化変異体の構築）
最終構築物を、Ｆｌｔ１  Ｉｇドメイン３の塩基性領域の中央にＮ−グルコシル化部位を導入して作製した。この構築物を、Ｍｕｔ４：Ｆｌｔ１（１−３Ｒ−＞Ｎ）−Ｆｃと名付け、そしてヌクレオチド８２４〜８２５をＧＡからＡＣに変更し、その結果コードしたＡｒｇ残基（ＡＧＡ）をＡｓｎ残基（ＡＡＣ）に変更することによって作製した（図１０Ａ〜１０Ｄを参照のこと）。従って、得られたアミノ酸配列は、Ａｒｇ−Ａｌａ−ＳｅｒからＡｓｎ−Ａｌａ−Ｓｅｒに変更され、これは、Ａｓｎ残基でのＮ−グリコシル化部位の添加について標準的なシグナル（Ａｓｎ−Ｘｘｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ）と一致する。Ｍｕｔ４：Ｆｌｔ（１−３Ｒ−＞Ｎ）−Ｆｃの配列を、図１６Ａ〜１６Ｄに記載する。
【０１４７】
（実施例１５：アセチル化Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃ変異体、Ｍｕｔ１：Ｆｌｔ１（１−３ΔＢ）−Ｆｃ変異体およびＭｕｔ４：Ｆｌｔ１（１−３Ｒ−＞Ｎ）−Ｆｃ変異体の特徴づけ）
（ａ）細胞外マトリックス成分への結合
３つの改変タンパク質が、改善された薬物動態学的特性を幾分有するか否かを決定するために、Ｍａｔｒｉｇｅｌコートした９６ウェルディッシュ（上記のように）を、種々の濃度の変異体タンパク質を用いてインキュベートし、そして抗ヒトＦｃ／アルカリホスファターゼ結合抗体を用いて検出した。図１８に示すように、この実験は、未改変Ｆｌｔ１（１−３）Ｆｃタンパク質がこれらのウェルに強く結合するが、Ｍｕｔ３：Ｆｌｔ（２−３）−Ｆｃタンパク質はいくらか弱く結合し、Ｍｕｔ１：Ｆｌｔ１（１−３ΔＢ）−Ｆｃタンパク質はなおより弱く結合し、そしてＭｕｔ２：Ｆｌｔ１（２−３ΔＢ）−Ｆｃタンパク質は、他の任意の変異体タンパク質よりもより弱く結合するという最良のプロフィールを示すことを示した。Ｍｕｔ４：Ｆｌｔ１（１−３Ｒ−＞Ｎ）−Ｆｃグリコシル化変異体タンパク質は、Ｍａｔｒｉｇｅｌアッセイに関してわずかな有効性のみを示した。これらの結果は、正のアミノ酸の線状配列が最初の配列から欠失され得、細胞外マトリックス成分との電荷相互作用における低減を生じるという仮説を確認する。
【０１４８】
（ｂ）ＢｉａｃｏｒｅベースのアッセイにおけるＭｕｔ１：Ｆｌｔ１（１−３ΔＢ）−ＦｃおよびＭｕｔ４：Ｆｌｔ１（１−３Ｒ−＞Ｎ）−Ｆｃの結合
未改変Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃタンパク質およびアセチル化Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃタンパク質ならびに遺伝的に改変したＭｕｔ１：Ｆｌｔ１（１−３ΔＢ）−Ｆｃタンパク質およびＭｕｔ４：Ｆｌｔ１（１−３Ｒ−＞Ｎ）−Ｆｃタンパク質を、Ｂｉａｃｏｒｅベースのアッセイにおいて試験し、Ｆｌｔ１リガンドのＶＥＧＦに結合するそれらの能力を評価した。このアッセイにおいて、未改変Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃタンパク質（０．２５、０．５、または１．０μｇ／ｍｌ）を、Ｂｉａｃｏｒｅチップ（Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｉｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  Ｍａｎｕａｌ，Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｉｎｃ．，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ，ｆｏｒ  ｓｔａｎｄａｒｄ  ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓを参照のこと）の表面に固定し、０．１μｇ／ｍｌのＶＥＧＦを含む溶液および精製したかもしくは未改変Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃ（約０．２５、０．５または１．０μｇ／ｍｌ）を含むＣＯＳ細胞の上清、精製したアセチル化Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃ（０．２５、０．５、または１．０μｇ／ｍｌ）、Ｍｕｔ１：Ｆｌｔ１（１−３ΔＢ）−Ｆｃ（約０．２５、０．５、または１．０μｇ／ｍｌ）を含むＣＯＳ細胞上清あるいはＭｕｔ４：Ｆｌｔ１（１−３Ｒ−＞Ｎ）−Ｆｃ（約０．２５、０．５または１．０μｇ／ｍｌ）のいずれかを含むＣＯＳ細胞上清を、Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃでコートしたチップ上に通した。図１７に示すように、準化学量論的（ｓｕｂ−ｓｔｏｉｃｈｉｏｍｅｔｒｉｃ）比率（未改変サンプル、アセチル化サンプル、または遺伝的に改変したサンプルの０．２５μｇ／ｍｌ  Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃ  対  ０１．μｇ／ｍｌ  ＶＥＧＦ）では、Ｂｉａｃｏｒｅチップ上に固定されたＦｌｔ１（１−３）−ＦｃへのＶＥＧＦの結合をブロックするのにＦｌｔ１（１−３）−Ｆｃタンパク質は不十分である。０．５μｇ／ｍｌの未改変、アセチル化または遺伝的に改変したＦｌｔ１（１−３）−Ｆｃタンパク質で、化学量論的比率は１：１に見積もられ、Ｂｉａｃｏｒｅチップに結合するＶＥＧＦをブロックする増大した能力が存在する。１．０μｇ／ｍｌの未改変、アセチル化または遺伝的に改変されたＦｌｔ１（１−３）−Ｆｃタンパク質（化学量論的比率は約１０：１である）では、Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃタンパク質がＢｉａｃｏｒｅチップへのＶＥＧＦの結合をブロックし得るが、これらは等価ではない。未改変Ｆｌｔ１（１−３ΔＢ）−Ｆｃ、アセチル化Ｆｌｔ１（１−３ΔＢ）−ＦｃおよびＭｕｔ１：Ｆｌｔ１（１−３ΔＢ）−Ｆｃは、ＶＥＧＦ結合をブロックするそれらの能力は本質的に等しいが、Ｍｕｔ４：Ｆｌｔ１（１−３Ｒ−＞Ｎ）−Ｆｃは結合ブロックの際に幾分効果は少ない。これらの結果は、負に荷電した大部分のアミノ酸の線状配列を遺伝的に除去することによって、正に荷電した分子の非特異的結合を減少させる可能性があるという仮説を確認する。
【０１４９】
（ｃ）ＥＬＩＳＡベースのアッセイにおけるＭｕｔ１：Ｆｌｔ１（１−３ΔＢ）−Ｆｃ、Ｍｕｔ２：Ｆｌｔ１（２−３ΔＢ）−ＦｃおよびＭｕｔ３：Ｆｌｔ１（２−３）−ＦＣの結合
３つの変異体タンパク質がＦｌｔ１リガンドＶＥＧＦに結合するか否かを決定するために、結合実験を行った。この実験では、ＶＥＧＦでコートした９６ウェルプレートを、種々の濃度の、それぞれの変異体タンパク質とともにインキュベートし、そして洗浄した後、結合した量を、アルカリホスファターゼ結合抗ヒトＦｃ抗体と共にインキュベートすることによって検出し、そして適切なアルカリホスファターゼ基質の添加により比色定量的に見積もった。図１９に示すように、この実験は、試験した濃度において、全ての変異体タンパク質が同様にＶＥＧＦに結合することを示した。
【０１５０】
（実施例１６：アセチル化Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃ、Ｍｕｔ１：Ｆｌｔ１（１−３ΔＢ）−Ｆｃおよび未改変Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃの薬物動態学的分析）
インビボでの実験を、未改変Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃ、Ｍｕｔ１：Ｆｌｔ１（１−３ΔＢ）−Ｆｃおよび４０倍過剰なモル濃度のアセチル化Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃタンパク質の薬物動態学的プロフィールを評価するために設計した。Ｂａｌｂ／ｃマウス（２５〜３０ｇ）に、４ｍｇ／ｋｇの未改変Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃ、４０倍過剰なモル濃度のアセチル化Ｆｌｔ１（１−３）−ＦｃおよびＭｕｔ１：Ｆｌｔ１（１−３ΔＢ）−Ｆｃタンパク質を皮下注射した（各４匹のマウス）。これらのマウスを、注射の１時間後、２時間後、４時間後、６時間後、２４時間後、２日後、３日後および５日後に、尾部から採血した。これらの血清をＦｌｔ１（１−３）−Ｆｃタンパク質を検出するように設計したＥＬＩＳＡにおいて評価した。これは、ＶＥＧＦでＥＬＩＳＡプレートをコーティングする工程、Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃを結合させる工程、そしてアルカリホスファターゼに結合した抗Ｆｃ抗体を用いてレポートする工程を包含する。図２０に示すように、これらの試薬についてのＣｍａｘは以下のとおりである：未改変Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃ−０．１５μｇ／ｍｌ；４０倍過剰なモル濃度のアセチル化Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃ−１．５μｇ／ｍｌ；およびＭｕｔ１：Ｆｌｔ１（１−３ΔＢ）−Ｆｃ−０．７μｇ／ｍｌ。
【０１５１】
（実施例１７：改変Ｆｌｔ１レセプターベクター構築物）
Ｆｌｔ１＿レセプター（ＶＥＧＦＲ１としても公知）の改変したバージョンを構築するための理論的説明は、Ｆｌｔ１のタンパク質配列が高度に塩基性であり、従って、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）に接着しやすいという観察に基づいた。Ｆｌｔ１の高度に塩基性な性質は、なぜ、未改変Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃ（上記）が乏しい薬物動態（治療剤として使用の難しくさせる）を有するのかをおそらく説明する。上記のように、４０倍過剰なモル濃度のアセチル化Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃの化学的に改変した形態（これ以降、Ａ４０と称す）は、アセチル化していないＦｌｔ１（１−３）−Ｆｃ以上に非常に改善された薬物動態（ＰＫ）プロフィールを示した。従って、この試みは、Ｆｌｔ１レセプター分子の改変形態（Ａ４０により示される改善されたＰＫプロフィールを有し、そしてＶＥＧＦにしっかりと結合する能力を未だ維持する）を組換え的に発現させるためにＤＮＡ分子を操作した。
【０１５２】
Ｆｌｔ１の第１のＩｇドメイン（中性のｐＨで＋５の正味の電荷を有する）は、ＶＥＧＦへのしっかりとした結合に必須ではないことが文献において知られているので、このドメインを欠失させた。第３のＩｇドメイン（＋１１の正味の電荷を有する）は、結合に必須ではないが、第２のＩｇドメインよりもＶＥＧＦに高い親和性を与えるので、それを完全に欠失させる代わりに、Ｆｌｔ１レセプター相対物Ｆｌｋ１（ＶＥＧＦＲ２としても公知）およびＦｌｔ４（ＶＥＧＦＲ３としても公知）の等価なドメインで置換した。これらのキメラ分子（Ｒ１Ｒ２（Ｆｌｔ１．Ｄ２．Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）およびＶＥＧＦＲ１Ｒ２−ＦｃΔＣ１（ａ）ならびにＲ１Ｒ３（Ｆｌｔ１Ｄ２．ＶＥＧＦＲ３Ｄ３−ＦｃΔＣ１（ａ）およびＶＥＧＦＲ１Ｒ３−ＦｃΔＣ１（ａ）をそれぞれ示し、ここで、Ｒ１およびＦｌｔ１Ｄ２は、Ｆｌｔ１（ＶＥＧＦＲ１）のＩｇドメイン２であり；Ｒ２およびＦｌｋ１Ｄ３は、Ｆｌｋ１（ＶＥＧＦＲ２）のＩｇドメイン３であり；そしてＲ３およびＶＥＧＦＲ３Ｄ３は、Ｆｌｔ４（ＶＥＧＦＲ３）のＩｇドメイン３である）は、以下に記載するようなインビトロでのＥＣＭ結合アッセイによって判定した場合、ＥＣＭへの粘着性がより少なく、下記のような非常に改善されたＰＫを有した。さらに、これらの分子は、下記のようにＶＥＧＦにしっかりと結合し得、下記のように、内皮細胞において発現されたネイティブなＦｌｋ１レセプターのリン酸化をブロックし得る。
【０１５３】
（ａ）発現プラスミドｐＦｌｔ１Ｄ２．Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）の構築
発現プラスミドｐＭＴ２１．Ｆｌｔ１（１−３）．Ｆｃ（６５１９ｂｐ）およびｐＭＴ２１．Ｆｌｋ−１（１−３）．Ｆｃ（５２３０ｂｐ）は、アンピシリン耐性ならびに、それぞれ、ヒトＦｌｔ１およびヒトＦｌｋ１のＩｇドメイン１〜３のＦｃ−タグ化バージョンをコードするプラスミドである。これらのプラスミドを、Ｆｌｔ１のＩｇドメイン２とＦｌｋ１のＩｇドメイン３との融合物からなるＤＮＡフラグメントを構築するために使用し、それぞれのＩｇドメインのＰＣＲ増幅を使用し、その後さらなるＰＣＲのラウンドでシグナルフラグメント中への２つのドメインの融合を達成した。Ｆｌｔ１のＩｇドメイン２について、５’側および３’側の増幅プライマーは以下のとおりである：
５’：ｂｓｐ／ｆｌｔ１Ｄ２（５’−ＧＡＣＴＡＧＣＡＧＴＣＣＧＧＡＧＧＴＡＧＡＣＣＴＴＴＣＧＴＡＧＡＧＡＴＧ−３’）
３’：Ｆｌｔ１Ｄ２−Ｆｌｋ１Ｄ３．ａｓ（５’−ＣＧＧＡＣＴＣＡＧＡＡＣＣＡＣＡＴＣＴＡＴＧＡＴＴＧＴＡＴＴＧＧＴ−３’）
５’増幅プライマーは、アミノ酸配列ＧＲＰＦＶＥＭ（図２１Ａ〜２１Ｃのアミノ酸２７〜３３に対応する）によって規定される、Ｆｌｔ１のＩｇドメイン２の上流の、ＢｓｐＥ１制限酵素部位をコードする。３’プライマーは、Ｆｌｋ１  Ｉｇドメイン３の５’の開始部に直接融合した、Ｆｌｔ１  Ｉｇドメイン２の３’末端の逆向き相補体をコードする。この融合点は、Ｆｌｔ１のＴＩＩＤ（図２１Ａ〜２１Ｃのアミノ酸１２３〜１２６に対応する）と規定され、そしてＦｌｋ１のＶＶＬＳ（図２１Ａ〜２１Ｃのアミノ酸１２７〜１３０に対応する）に続く。
【０１５４】
Ｆｌｋ１のＩｇドメイン３について、５’増幅プライマーおよび３’増幅プライマーは、以下の通りであった：
【０１５５】
【化１】
2004523533.tif 000002
５’増幅プライマーは、上記のような、Ｆｌｋ１  Ｉｇドメイン３の開始部に直接融合した、Ｆｌｔ１  Ｉｇドメイン２の末端をコードする。３’増幅プライマーは、アミノ酸ＶＲＶＨＥＫ（図２１Ａ〜２１Ｃのアミノ酸２２３〜２２８に対応する）によって規定される、Ｆｌｋ１  Ｉｇドメイン３の末端、続いて架橋配列をコードし、この架橋配列は、制限酵素Ｓｒｆ１に対する認識配列を含み、そしてアミノ酸ＧＰＧをコードする。この架橋配列は、図２１Ａ〜２１Ｃのアミノ酸２２９〜２３１に対応する。
【０１５６】
個々のドメインを産生する１回のＰＣＲ増幅の後に、この産物をチューブ内で合わせ、そしてプライマーｂｓｐ／ｆｌｔ１Ｄ２およびＦｌｋ１Ｄ３／ａｐａ／ｓｒｆ．ａｓ（上記）を用いるさらなる回のＰＣＲに供して、融合産物を産生した。このＰＣＲ産物を、引き続いて、制限酵素ＢｓｐＥＩおよびＳｍａＩで消化し、そして得られた６１４ｂｐのフラグメントを、ベクターｐＭＴ２１／ΔＢ２．ＦｃのＢｓｐＥＩからＳｒｆＩの制限部位にサブクローニングして、プラスミドｐＭＴ２１／Ｆｌｔ１Ｄ２．Ｆｌｋ１Ｄ３．Ｆｃを生じた。Ｆｌｔ１Ｄ２−Ｆｌｋ１Ｄ３遺伝子融合インサートのヌクレオチド配列を、標準的な配列分析によって確認した。次いで、このプラスミドを、制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＳｒｆＩで消化し、そして得られた７０２ｂｐのフラグメントを、プラスミドｐＦｌｔ１（１−３）Ｂ２−ＦｃΔＣ１（ａ）のＥｃｏＲＩからＳｒｆＩの制限部位に移入して、プラスミドｐＦｌｔ１Ｄ２．Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）を生じた。Ｆｌｔ１Ｄ２．Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）キメラ分子の完全ＤＮＡ配列および推定アミノ酸配列を、図２１Ａ〜２１Ｃに示す。
【０１５７】
（（ｂ）発現プラスミドｐＦｌｔ１Ｄ２ＶＥＧＦＲ３Ｄ３ＦｃΔＣ１（ａ）の構築）
発現プラスミドｐＭＴ２１．Ｆｌｔ１（１−３）．Ｆｃ（６５１９ｂｐ）は、アンピシリン耐性およびＦｃタグ化バージョンのヒトＦｌｔ１レセプターのＩｇドメイン１〜３をコードする。このプラスミドを使用して、ＰＣＲによって、Ｆｌｔ１のＩｇドメイン２を含むＤＮＡフラグメントを産生した。細胞株ＨＥＬ９２１．７由来のＲＮＡを使用し、標準的なＲＴ−ＰＣＲ方法論を使用して、Ｆｌｋ１のＩｇドメイン３を産生した。さらなる回のＰＣＲ増幅を使用して、これら２つのＩｇドメインの、単一の融合フラグメントへの融合を達成した。Ｆｌｔ１のＩｇドメイン２について、５’増幅プライマーおよび３’増幅プライマーは、以下の通りであった：
【０１５８】
【化２】
2004523533.tif 000003
５’増幅プライマーは、アミノ酸配列ＧＲＰＦＶＥＭ（図２２Ａ〜２２Ｃのアミノ酸２７〜３３に対応する）によって規定される、Ｆｌｔ１のＩｇドメイン２の上流の、ＢｓｐＥ１制限部位をコードする。３’増幅プライマーは、ＶＥＧＦＲ３  Ｉｇドメイン３の開始部に直接融合し、そしてＶＥＧＦＲ３のＩＱＬＬ（図２２Ａ〜２２Ｃのアミノ酸１２７〜１３０に対応する）に続く、Ｆｌｔ１  Ｉｇドメイン２の末端の逆向き相補体をコードする。この融合点は、Ｆｌｔ１のＴＩＩＤ（図２２Ａ〜２２Ｃのアミノ酸１２３〜１２６に対応する）と規定される。
【０１５９】
ＶＥＧＦＲ３のＩｇドメイン３について、ＲＴ−ＰＣＲのために使用した５’プライマーおよび３’プライマーは、以下の通りであった：
【０１６０】
【化３】
2004523533.tif 000004
５’増幅プライマーと３’増幅プライマーとの両方が、ＶＥＧＦＲ３の配列に一致する。このＲＴ−ＰＣＲ反応の２９６ｂｐ増幅産物を、標準的な技術によって単離し、そして第２回目のＰＣＲに供して、適切な配列を付加し、Ｆｌｔ１Ｄ２ドメインとＦｌｋ１Ｄ３ドメインとの融合、およびＧＰＧ架橋を介するＦｌｋ１Ｄ３ドメインとＦｃドメインとの融合を可能にした（以下を参照のこと）。増幅プライマーは、以下の通りであった：
【０１６１】
【化４】
2004523533.tif 000005
５’増幅プライマーは、上記のように、ＶＥＧＦＲ３  Ｉｇドメイン３の開始部（５’末端）に直接融合した、Ｆｌｔ１  Ｉｇドメイン２の３’末端をコードする。３’増幅プライマーは、アミノ酸ＶＩＶＨＥＮ（図２２Ａ〜２２Ｃのアミノ酸２２１〜２２６に対応する）によって規定される、ＶＥＧＦＲ３  Ｉｇドメイン３の３’末端、続いて架橋配列をコードする。この架橋配列は、Ｓｒｆ１に対する認識配列を含み、そしてアミノ酸ＧＰＧをコードする。この架橋配列は、図２２Ａ〜２２Ｃのアミノ酸２２７〜２２９に対応する。
【０１６２】
個々のＩｇドメインを産生するための、１回（Ｆｌｔ１  Ｉｇドメイン２について）または２回（Ｆｌｔ４  Ｉｇドメイン３について）のＰＣＲの後に、ＰＣＲ産物をチューブ内で合わせ、そして上記の増幅プライマーｂｓｐ／ｆｌｔ１Ｄ２およびＶＥＧＦＲ３Ｄ３／ｓｒｆ．ａｓを用いる、さらなる回のＰＣＲ増幅に供し、融合産物を産生した。このＰＣＲ産物を、引き続いて、制限酵素ＢｓｐＥＩおよびＳｍａＩで消化し、そして得られた６２５ｂｐのフラグメントを、ベクターｐＭＴ２１／Ｆｌｔ１ΔＢ２．Ｆｃ（上記）のＢｓｐＥＩからＳｒｆＩへの制限部位にサブクローニングして、プラスミドｐＭＴ２１／Ｆｌｔ１Ｄ２．ＶＥＧＦＲ３Ｄ３．Ｆｃを生じた。Ｆｌｔ１Ｄ２−ＶＥＧＦＲ３Ｄ３遺伝子融合インサートの配列を、標準的な配列分析によって確認した。次いで、このプラスミドを、制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＳｒｆＩで消化し、そして得られた６９３ｂｐのフラグメントを、プラスミドｐＦｌｔ１（１−３）ΔＢ２−ＦｃΔＣ１（ａ）のＥｃｏＲＩからＳｒｆＩへの制限部位にサブクローニングして、ｐＦｌｔ１Ｄ２．ＶＥＧＦＲ３Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）と命名されたプラスミドを産生した。Ｆｌｔ１Ｄ２．ＶＥＧＦＲ３Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）キメラ分子の完全ＤＮＡおよび推定アミノ酸配列を、図２２Ａ〜２２Ｃに示す。
【０１６３】
（実施例１８：細胞外マトリックス結合（ＥＣＭ）結合アッセイ）
ＥＣＭでコーティングしたプレート（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎカタログ＃３５−４６０７）を、グルタミン（２ｍＭ）、１００Ｕペニシリン、１００Ｕストレプトマイシン、および１０％  ＢＣＳを補充した温ＤＭＥで、少なくとも１時間、サンプルの添加前に再水和した。次いで、このプレートを、Ｆｌｔ１Ｄ２．Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）およびＦｌｔ１Ｄ２．ＶＥＧＦＲ３Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）の濃度を１０ｎＭから開始して、１０％ＢＣＳを含むＰＢＳ中で２倍に連続希釈して変化させながら、室温で１時間インキュベートした。次いで、このプレートを、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘを含むＰＢＳで３回洗浄し、そしてアルカリホスファターゼと結合体化した抗ヒトＦｃ抗体（Ｐｒｏｍｅｇａ，１：４０００（１０％ＢＣＳを含むＰＢＳ中））と共に、室温で１時間インキュベートした。次いで、このプレートを、ＰＢＳ  ０．１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘで４回洗浄し、そして発色のために、アルカリホスファターゼ緩衝液／ｐＮＰＰ溶液（Ｓｉｇｍａ）を添加した。プレートを、ｌ＝４０５〜５７０ｎｍで読み取った。この実験の結果を図２３に示し、Ｆｌｔ１Ｄ２．Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）タンパク質およびＦｌｔ１Ｄ２．ＶＥＧＦＲ３Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）タンパク質が、Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃタンパク質と比較して、ＥＣＭに対する付着性がかなり低いことを実証する。
【０１６４】
（実施例１９：ＣＨＯ−Ｋ１（Ｅ１Ａ）細胞におけるｐＦｌｔ１Ｄ２．Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）の一時的発現）
実施例１７（ａ）において上に記載した、ｐＦｌｔ１Ｄ２．Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）プラスミドを保有するＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ１０Ｂ細胞の大規模（２Ｌ）培養物を、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＴｅｒｒｉｆｉｃ  Ｂｒｏｔｈ（ＴＢ）中で一晩増殖させた。翌日、このプラスミドＤＮＡを、ＱＩＡｇｅｎ  Ｅｎｄｏｆｒｅｅ  Ｍｅｇａｐｒｅｐキットを使用して、製造業者のプロトコルに従って、抽出した。精製したプラスミドＤＮＡの濃度を、ＵＶ分光計および蛍光計を使用する標準的な技術によって決定した。このプラスミドＤＮＡを、制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＮｏｔＩならびにＡｓｅＩを使用して、アリコートの標準的な制限酵素消化によって確認した。１％アガロースゲルで分析した場合、全ての制限酵素消化フラグメントが、予測した大きさに対応した。
【０１６５】
４０個の１５ｃｍペトリプレートに、ＣＨＯ−Ｋ１／Ｅ１Ａ細胞を、４×１０６細胞／プレートの密度で播種した。プレート培地は、１０％  Ｈｙｃｌｏｎｅウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、１００Ｕペニシリン／１００Ｕストレプトマイシンおよびグルタミン（２ｍＭ）を補充したＧｉｂｃｏ  ＨａｍのＦ−１２であった。翌日、各プレートの細胞を、６μｇのｐＦｌｔ１Ｄ２．Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）プラスミドＤＮＡで、Ｇｉｂｃｏ  ＯｐｔｉｍｅｍおよびＧｉｂｃｏ  Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅを１２ｍｌの容量で使用して、製造業者のプロトコルに従って、トランスフェクトした。細胞にトランスフェクション混合物を添加した４時間後、１０％ＦＢＳを補充した１２ｍｌ／プレートのＯｐｔｉｍｅｍを添加した。プレートを、５％ＣＯ２インキュベーター中で一晩、３７℃でインキュベートした。翌日、培地を各プレートから除去し、そして２５ｍｌの発現培地（グルタミン（２ｍＭ）および１ｍＭ酪酸ナトリウムを補充したＧｉｂｃｏ  ＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭ  ＩＩ）を添加した。このプレートを、３７℃で３日間インキュベートした。３日間のインキュベーション後、培地を各プレートから吸引し、そしてスイングバケットローターで４００ｒｐｍで遠心分離して、細胞をペレット化した。上清を滅菌した１Ｌの瓶に廃棄し、そして発現したタンパク質の精製を、以下に記載されるように実施した。
【０１６６】
（実施例２０：構築  ｐＶＥＧＦＲ１Ｒ２−ＦｃΔＣ１（ａ）発現ベクター）
ｐＶＥＧＦＲ１Ｒ２．ＦｃΔＣ１（ａ）発現プラスミドを、図２１Ａ〜２１ＣのＦｌｔ１ｄ２−Ｆｌｋ１ｄ３−ＦｃΔＣ１（ａ）のアミノ酸２６と２７（ＧＧ）との間のアミノ酸ＳＤＴ（図２４Ａ〜２４Ｃのアミノ酸２７〜２９に対応する）をコードするＤＮＡの挿入、および図のアミノ酸２２９〜２３１に対応するアミノ酸ＧＰＧをコードするＤＮＡの除去によって、構築した。ＳＤＴアミノ酸配列は、Ｆｌｔ１レセプターに対してネイティブであり、そして異種Ｎ末端プロセシングの確率を低下させるために、付加して戻された。Ｆｌｔ１のＩｇドメインとＦｌｋ１のＩｇドメインとが互いに直接融合するように、ＧＰＧ（架橋配列）を除去した。ｐＶＥＧＦＲ１Ｒ２．ＦｃΔＣ１（ａ）キメラ分子の完全ＤＮＡ配列および推定アミノ酸配列を、図２４Ａ〜２４Ｃに示す。
【０１６７】
（実施例２１：改変されたＦｌｔ１レセプターを産生するために使用される細胞培養プロセス）
（（ａ）Ｆｌｔ１Ｄ２．Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）を産生するために使用される細胞培養プロセス）
実施例１において上に記載した発現プラスミドｐＦｌｔ１Ｄ２．Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）を使用して、Ｆｌｔ１Ｄ２．Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）タンパク質を産生するためのプロセスは、このタンパク質産物を構成的に発現する組換えチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ  Ｋ１／Ｅ１Ａ）細胞の懸濁培養を包含する。これらの細胞をバイオリアクター内で増殖させ、そしてタンパク質産物を単離し、そしてアフィニティークロマトグラフィーおよびサイズ排除クロマトグラフィーによって精製する。このプロセスを、以下にさらに詳細に提供する。
【０１６８】
（細胞増殖）
Ｆｌｔ１Ｄ２．ＦＬｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）発現細胞株を含む２つの集密なＴ−２２５ｃｍ２フラスコを、細胞を培地（ＧＭＥＭ＋１０％血清、ＧＩＢＣＯ）中８つのＴ−２５５ｃｍ２フラスコ中に入れ、そして３７℃および５％ＣＯ２でインキュベートすることにより拡張した。これらのフラスコが集密に接近したとき（約３〜４日）、トリプシンを用いて細胞を脱着させた。新鮮培地を添加し、細胞がトリプシンにさらに晒されることを防いだ。細胞を遠心分離し、そして新鮮培地に再懸濁し、次いで、８つの８５０ｃｍ２ローラーボトルに移し、そして集密まで３７℃および５％ＣＯ２でインキュベートした。
【０１６９】
（バイオリアクター中の懸濁培養）
ローラーボトル中で生育した細胞をトリプシン処理し、それらを表面から脱着し、そして懸濁培養培地で洗浄した。これらの細胞を、５Ｌバイオリアクター（Ｎｅｗ  Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ  Ｃｅｌｌｉｇｅｎ  Ｐｌｕｓ）に無菌的に移し、そこで、細胞を３．５Ｌの懸濁培養で増殖させる。この懸濁培養培地は、ＩＳ−ＣＨＯ（Ｉｒｖｉｎｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）のグルタミンフリーの低グルコース改変であり、それには、５％ウシ胎児血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、ＧＳ補填物（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）および２５μＭメチオニンスルホキシイミン（シグマ）を添加した。ｐＨは、入口ガスへの二酸化炭素の添加によるか、またはバイオリアクターへの炭酸ナトリウムの液体溶液の添加により７．２に制御した。溶解酸素レベルは、入口ガスへの酸素または窒素の添加により、３０％の飽和で維持し、そして温度は３７℃で制御した。４×１０６細胞／ｍＬの密度に到達したとき、細胞を、同じ培地およびバイオリアクターを制御するための設定値を含む、４０Ｌのバイオリアクターに移した。温度設定値を、３４℃に減少させ、細胞増殖を遅延させ、そしてタンパク質発現の相対割合を増加させた。
【０１７０】
（（ｂ）Ｆｌｔ１Ｄ２．ＶＥＧＦＲ３Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）を産生するために用いられる細胞培養プロセス）
Ｆｌｔ１Ｄ２．Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）について上述したのと同じ方法を、Ｆｌｔ１Ｄ２．ＶＥＧＦＲ３Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）を産生するために用いた。
【０１７１】
（実施例２２：改変Ｆｌｔ１レセプターの回収および精製）
（（ａ）Ｆｌｔ１Ｄ２．Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）の回収および精製）
産物タンパク質を、バイオリアクターから、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｐｒｏｓｔａｋ  接線方向流れ濾過モジュールおよび低せん断力ポンプ（Ｆｒｉｓｔａｍ）を用いて細胞を保持しながら無菌的に回収した。新鮮培地をバイオリアクターに入れ、回収濾過の間に取り出された分を補充した。次いで、約４０Ｌの回収濾液を、ＰｒｏｔｅｉｎＡ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ樹脂（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を含む４００ｍＬのカラム上にロードした。樹脂にロードした後、１０ｍＭリン酸ナトリウム、５００ｍＭ塩化ナトリウムを含む、ｐＨ７．２の緩衝液で洗浄し、任意の非結合汚染タンパク質を除去した。Ｆｌｔ１Ｄ２．Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）タンパク質を、ｐＨ３．０のクエン酸緩衝液で溶出した。溶出したタンパク質を、Ｔｒｉｓベースの添加により中和し、そして−２０℃で凍結した。
【０１７２】
上記ＰｒｏｔｅｉｎＡ工程からのＦｌｔ１Ｄ２．Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）タンパク質のいくつかの凍結ロットを融解し、プールし、そしてＭｉｌｌｉｐｏｒｅの３０ｋＤ公称分子量カットオフ（ＮＭＷＣＯ）接線方向流れ濾過メンブレンを用いて濃縮した。このタンパク質を攪拌細胞濃縮器（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に移し、そして３０ｋＤ  ＮＭＷＣＯメンブレンを用いて３０ｍｇ／ｍＬまでさらに濃縮した。この濃縮されたタンパク質を、リン酸緩衝化生理食塩水＋５％グリセロールで平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ２００樹脂（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ）でパックされたサイズ排除カラム上にロードした。同じ緩衝液を用いてカラムを運転した。Ｆｌｔ１Ｄ２．Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）ダイマーに相当するフラクションをプールし、０．２２ミクロンフィルターを通じて滅菌濾過し、アリコートにし、そして凍結した。
【０１７３】
（（ｂ）Ｆｌｔ１Ｄ２．ＶＥＧＦＲ３Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）の回収と精製）
Ｆｌｔ１Ｄ２．Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）について上述したのと同じ方法を用いて、Ｆｌｔ１Ｄ２．ＶＥＧＦＲ３Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）を回収および精製した。
【０１７４】
（実施例２３：一時的に発現されたＶＥＧＦＲ２のリン酸化アッセイ）
初代ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）、４〜６継代、を、無血清ＤＭＥ高グルコース培地中で２時間枯渇させた。ＶＥＧＦレセプターＦｌｔ１、Ｆｌｋ１およびＦｌｔ４（ＶＥＧＦＲ３）に対するリガンドである、ヒトＶＥＧＦ１６５を４０ｎｇ／ｍｌ（１ｎＭ）を含むサンプルを調製し、そして０．１％ＢＳＡを含む無血清ＤＭＥ高グルコース培地中の変化する量の改変Ｆｌｔ１レセプターＦｌｔ１（１−３）−Ｆｃ、Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃ（Ａ４０）、Ｆｌｔ１Ｄ２Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）およびＦｌｔ１Ｄ２ＶＥＧＦＲ３Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）と、室温で１時間プレインキュベートした。細胞に、５分間、上記の調製されたサンプル＋／−ＶＥＧＦ１６５を負荷し、次いで、完全溶解緩衝液を用いて細胞全体を溶解した。細胞溶解物を、ＶＥＧＦＲ２レセプターのＣ末端に対して惹起された抗体で免疫沈降させた。免疫沈降させた溶解物を、４−１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ  Ｎｏｖｅｘゲル上にロードし、次いで標準的なトランスファー方法を用いてＰＶＤＦメンブレンに移した。リン酸化ＶＥＧＦＲ２の検出は、４Ｇ１０（ＵＢＩ）と呼ばれる抗ホスホチロシンｍＡｂでイムノブロットし、そしてＥＣＬ−試薬（Ａｍｅｒｓｈａｍ）で発色することにより行った。図２５Ａ−２５Ｃおよび２６Ａ−２６Ｂは、この実験の結果を示す。図２５Ａ−２５Ｃは、ＶＥＧＦ１６５リガンド刺激によるチロシンリン酸化ＶＥＧＦＲ２（Ｆｌｋ１）のウェスタンブロットによる検出が、細胞表面レセプターが種々のレベルにリン酸化され、それに依存して、改変Ｆｌｔ１レセプターが、ＶＥＧＦとのプレインキュベーションの間に用いられていることを示すことを明らかにする。図２５Ａに見られるように、Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃ、Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃ（Ａ４０）または一時的Ｆｌｔ１Ｄ２Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）いずれかの１．５モル過剰で、コントロール媒体負荷と比べたとき、これら３つの改変Ｆｌｔ１レセプターにより、レセプター刺激の完全な遮断が存在する。対照的に、一時的Ｆｌｔ１Ｄ２ＶＥＧＦＲ３Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）は、ＶＥＧＦポジティブコントロール負荷と比較したとき、このモル過剰では、顕著な遮断を示していない。同様の結果が、図２５Ｂで観察され、ここでは、改変ＦｌｔレセプターがＶＥＧＦ１６５リガンドに対して３倍モル過剰で存在する。図２５Ｃでは、改変Ｆｌｔ１レセプターがＶＥＧＦ１６５リガンドに対して６倍モル過剰で存在し、一時的Ｆｌｔ１Ｄ２ＶＥＧＦＲ３Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）が、ここで、細胞表面レセプターのＶＥＧＦ１６５誘導刺激を部分的に遮断することが示され得る。
【０１７５】
図２６Ａ−２６Ｂでは、ＶＥＧＦ１６５リガンド刺激によるチロシンリン酸化ＶＥＧＦＲ２（Ｆｌｋ１）のウェスタンブロットによる検出は、細胞表面レセプターが、一時的Ｆｌｔ１Ｄ２Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）、安定Ｆｌｔ１Ｄ２Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）、または一時的ＶＥＧＦＲ１Ｒ２−ＦｃΔＣ１（ａ）いずれかの１および２倍モル過剰（図２６Ａ）または３倍および４倍モル過剰（図２６Ｂ）とプレインキュベートしたＶＥＧＦ１６５を有する負荷サンプルによりリン酸化されないことを示す。試験されたすべての改変Ｆｌｔ１レセプター濃度で、プレインキュベーションの間にＶＥＧＦ１６５リガンドの完全な結合があり、コントロール媒体負荷と比較したとき、非結合ＶＥＧＦ１６５による細胞表面レセプターの検出可能な刺激はなかった。
【０１７６】
（実施例２４：細胞増殖バイオアッセイ）
試験細胞集団は、ＭＧ８７細胞であり、これは、ＴγκＢ細胞内キナーゼドメインに融合したＶＥＧＦＲ２（Ｆｌｋ１）細胞外ドメインをコードし、それ故キメラ分子を産生するＤＮＡ挿入片を含む発現プラスミドで安定にトランスフェクトされている。ネイティブなＶＥＧＦＲ２（Ｆｌｋ１）細胞内キナーゼドメインよりもむしろＴγκＢ細胞内キナーゼドメインを用いる理由は、ＶＥＧＦＲ２（Ｆｌｋ１）の細胞内キナーゼドメインは、これら細胞においてＶＥＧＦ１６５により刺激されたとき、強い増殖応答を引き起こさないことである。完全長ＴγκＢレセプターを含むＭＧ８７細胞は、ＢＤＮＦで刺激されたとき、強い増殖応答を与えることが知られ、そこで、このＴγκＢ細胞内キナーゼドメインは、この増殖応答能力を利用するためにＶＥＧＦＲ２（Ｆｌｋ１）の細胞内キナーゼドメインを置き換えるように操作された。
【０１７７】
５×１０３細胞／ウェルを、９６ウェルプレート中に入れ、そして２時間３７℃で沈降させた。以下の改変ＦｌｔレセプターＦｌｔ１（１−３）−Ｆｃ、Ｆｌｔ１Ｄ２．Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）およびＦｌｔ１Ｄ２．ＶＥＧＦＲ３Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）、およびネガティブコントロールとして、Ｔｉｅ２−Ｆｃと称される無関係のレセプターを、４０ｎＭ〜２０ｐＭまで滴定し、そして細胞上で１時間、３７℃でインキュベートした。次いで、規定培地中のヒト組換えＶＥＧＦ１６５を１．５６ｎＭの濃度ですべてのウェルに添加した。これらのプレートを、３７℃で７２時間インキュベートし、そして次いでＭＴＳ（Ｏｗｅｎ試薬、Ｐｒｏｍｅｇａ）を添加し、そしてプレートを、さらに４時間インキュベートした。最後に、プレートを４５０／５７０ｎｍでスペクトル分析器上で読み取った。この実験の結果を図２７に示す。コントロールレセプターＴｉｅ２−Ｆｃは、任意の濃度でＶＥＧＦ１６５誘導細胞増殖をブロックせず、その一方、Ｆｌｔ１Ｄ２．Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）は、１．５６ｎＭのＶＥＧＦ１６５を、０．８ｎＭの最大半分用量でブロックする。Ｆｌｔ（１−３）−ＦｃおよびＦｌｔ１Ｄ２．ＶＥＧＦＲ３Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）は、このアッセイにおいてＶＥＧＦ１６５をブロックすることにおいてより有効ではなく、約２ｎＭの最大半分用量である。ＶＥＧＦ１６５単独は、１．２吸光度単位の読み取り値を与え、そしてバックグラウンドは０．３８吸光度単位である。
【０１７８】
（実施例２５：改変ＦｌｔレセプターのＶＥＧＦ１６５への結合化学量論）
（（ａ）ＢＩＡｃｏｒｅ分析）
Ｆｌｔ１Ｄ２Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）およびＶＥＧＦＲ１Ｒ２−ＦｃΔＣ１（ａ）のヒトＶＥＧＦ１６５との相互作用の化学量論を、Ｆｌｔ１Ｄ２ＦＩｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）またはＶＥＧＦＲ１Ｒ２−ＦｃΔＣ１（ａ）表面へのＶＥＧＦ飽和結合のレベルを測定すること、またはＶＥＧＦ  ＢＩＡｃｏｒｅチップ表面へのＦｌｔ１Ｄ２ＦＩｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）またはＶＥＧＦＲ１Ｒ２−ＦｃΔＣ１（ａ）の結合を完全に阻害するために必要なＶＥＧＦ１６５濃度を測定することにより決定した。
【０１７９】
改変ＦｌｔレセプターＦｌｔ１Ｄ２ＦＩｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）およびＶＥＧＦＲ１Ｒ２−ＦｃΔＣ１（ａ）を、アミン−カップリング化学を用いてＢｉａｃｏｒｅチップ（ＢＩＡＣＯＲＥ）上に最初固定化された抗−Ｆｃ特異的抗体で捕捉した。ブランク抗体表面をネガティブコントロールとして用いた。ＶＥＧＦ１６５を、１ｎＭ、１０ｎＭ、および５０ｎＭの濃度で、Ｆｌｔ１Ｄ２ＦＩｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）およびＶＥＧＦＲ１Ｒ２−ＦｃΔＣ１（ａ）表面上に１０μｌ／分で１時間注入した。リアルタイム結合シグナルを記録し、そして飽和結合を各注入の終わりで達成した。結合化学量論は、１ｎｇ／ｍｌに等価な１０００ＲＵの変換係数を用い、固定化されたＦｌｔ１Ｄ２ＦＩｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）またはＶＥＧＦＲ１Ｒ２−ＦｃΔＣ１（ａ）に対する結合ＶＥＧＦ１６５のモル比として算出した。結果は、１つのＦｌｔ１Ｄ２ＦＩｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）分子またはＶＥＧＦＲ１Ｒ２−ＦｃΔＣ１（ａ）分子あたり、１つのＶＥＧＦ１６５ダイマー分子の結合化学量論を示した（図２８）。
【０１８０】
溶液中では、１ｎＭ濃度のＦｌｔ１Ｄ２ＦＩｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）またはＶＥＧＦＲ１Ｒ２−ＦｃΔＣ１（ａ）（Ｆｌｔ１Ｄ２ＦＩｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）またはＶＥＧＦＲ１Ｒ２−ＦｃΔＣ１（ａ）／ＶＥＧＦ１６５相互作用のＫＤより１０００倍高いと推定される）を、種々の濃度のＶＥＧＦ１６５と混合した。１時間のインキュベーションの後、溶液中の遊離のＦｌｔ１Ｄ２ＦＩｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）の濃度を、アミン−カップルしたＶＥＧＦ１６５表面への結合シグナルとして測定した。較正曲線を用いて、Ｆｌｔ１Ｄ２ＦＩｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）ＢＩＡｃｏｒｅ結合シグナルをそのモル濃度に変換した。データは、Ｆｌｔ１Ｄ２ＦＩｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）溶液中への１ｎＭのＶＥＧＦ１６５の添加が、ＶＥＧＦ１６５表面へのＦｌｔ１Ｄ２ＦＩｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）結合を完全にブロックしたことを示した。この結果は、１つのＦｌｔ１Ｄ２ＦＩｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）分子あたり、１つのＶＥＧＦ１６５分子の結合化学量論を示唆した（図２９および図３０）。Ｆｌｔ１Ｄ２ＦＩｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）の濃度を、ＶＥＦＧ１６５の添加された濃度の関数としてプロットしたとき、直線部分の傾きは、Ｆｌｔ１Ｄ２ＦＩｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）について−１．０６、そしてＶＥＧＦＲ１Ｒ２−ＦｃΔＣ１（ａ）について−１．０７であった。傾きの大きさは、ネガティブなものに非常に緊密であり、ＶＥＧＦ１６５の１分子が、Ｆｌｔ１Ｄ２ＦＩｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）またはＶＥＧＦＲ１Ｒ２−ＦｃΔＣ１（ａ）のいずれかの１分子に結合したことを示した。
【０１８１】
（（ｂ）サイズ排除クロマトグラフィー）
Ｆｌｔ１Ｄ２Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）を、３倍を越えるＶＥＧＦ１６５で混合し、そしてレセプター−リガンド複合体を、Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｓｕｐｅｒｏｓｅ６サイズ排除クロマトグラフィーカラムを使用して精製した。次いで、このレセプター−リガンド複合体を、６Ｍのグアニジンヒドロクロリドを含む緩衝液中でインキュベートして、この複合体をその成分タンパク質を解離した。Ｆｌｔ１Ｄ２Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）を、６Ｍのグアニジンヒドロクロリドで実施するＳｕｐｅｒｏｓｅ６サイズ排除クロマトグラフィーを使用して、ＶＥＧＦ１６５から分離した。複合体の化学量論を決定するために、Ｆｌｔ１Ｄ２Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）およびＶＥＧＦ１６５のいくつかの注入液を作製し、そしてピークの高さまたはピークの積分強度を、注入されたタンパク質の濃度の関数としてプロットした。較正を、Ｆｌｔ１Ｄ２Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）／ＶＥＧＦ複合体の分離成分で使用した条件と同一の条件下で実施した。Ｆｌｔ１Ｄ２Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）／ＶＥＧＦ複合体組成物の定量化は、較正曲線を基礎とした。この実験の結果を図２８に記載した。これは、複合体におけるＶＥＧＦ１６５：Ｆｌｔ１Ｄ２Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）の比が、１：１であることを示した。
【０１８２】
（実施例２６：サイズ排除クロマトグラフィーによる、Ｆｌｔ１Ｄ２Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）／ＶＥＧＦ１６５複合体の結合化学量論の決定）
（Ｆｌｔ１Ｄ２Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）／ＶＥＧＦ１６５複合体の調製）
ＶＥＧＦ１６５（濃度＝３．６１ｍｇ／ｍｌ）を、ＣＨＯ細胞で過渡的に発現されたＦｌｔ１Ｄ２Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）（濃度＝０．９ｍｇ／ｍｌ）と、３：１（ＶＥＧＦ１６５：Ｆｌｔ１Ｄ２Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ））のモル比で混合し、そして４℃で一晩インキュベートした。
【０１８３】
（（ａ）ネイティブ条件下でのサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ））
この複合体を過剰の未結合ＶＥＧＦ１６５から分離するために、５０μｌの複合体を、ＰＢＳ緩衝液で平衡化されたＰｈａｒｍａｃｉａ  Ｓｕｐｅｒｏｓｅ  １２  ＰＣ  ３．２／３０に充填した。このサンプルを、流速４０μｌ／分（室温）で同一の緩衝液を用いて溶出した。このＳＥＣの結果を、図３１に示す。ピーク＃１は、この複合体を表し、そしてピーク＃２は、未結合ＶＥＧＦ１６５を表す。１．１ｍｌと１．２ｍｌとの間で溶出するフラクションを合わせて、そしてグアニジニウムヒドロクロリド（ＧｕＨＣｌ）を、この複合体を溶解するために、最終濃度４．５Ｍになるまで添加した。
【０１８４】
（（ｂ）解離条件下でのサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ））
レセプター−リガンド複合体の成分を分離するため、そしてそれらのモル比を決定するために、上記のような５０μｌの解離された複合体を、６Ｍ  ＧｕＨＣｌで平衡化されたＳｕｐｅｒｏｓｅ  １２  ＰＣ  ３．２／３０に充填し、そして流速４０μｌ／分（室温）で同一の溶液を用いて溶出した。このＳＥＣの結果を、図３２に示す。ピーク＃１は、Ｆｌｔ１Ｄ２Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）を示し、そしてピーク＃２は、ＶＥＧＦ１６５を示す。
【０１８５】
（（ｃ）Ｆｌｔ１Ｄ２Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）：ＶＥＧＦ１６５複合体の化学量論の算出）
レセプター−リガンド複合体の化学量論を、この成分のピークの面積またはピークの高さから決定した。それぞれのピークの高さおよびピークの面積に対応する、ＶＥＧＦ１６５およびＦｌｔ１Ｄ２Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）の濃度は、ＶＥＧＦ１６５およびＦｌｔ１Ｄ２Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）に関する標準曲線から得られた。この標準曲線を得るために、いずれかの成分の４種の異なる濃度（０．０４ｍｇ／ｍｌ〜０．３ｍｇ／ｍｌ）を、６Ｍグアニジニウムクロリドで平衡化されたＰｈａｒｍａｃｉａ  Ｓｕｐｅｒｏｓｅ  １２  ＰＣ  ３．２／３０カラムに注入し、そして流速４０μｌ／分（室温）で同一の溶液を用いて溶出した。この標準曲線を、ピークの面積またはピークの高さ  対  タンパク質の濃度をプロットすることによって得た。この成分のピークの面積から決定された、ＶＥＧＦ１６５：Ｆｌｔ１Ｄ２Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）のモル比は、１．１６であった。この成分のピークの高さから決定された、ＶＥＧＦ１６５：Ｆｌｔ１Ｄ２Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）のモル比は、１．１０であった。
【０１８６】
（実施例２７：オンライン光散乱を用いるサイズ排除クロマトグラフィーによる、Ｆｌｔ１Ｄ２Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）／ＶＥＧＦ１６５複合体の化学量論の決定）
（複合体の調整）
ＶＥＧＦ１６５を、ＣＨＯ細胞で過渡的に発現されたＦｌｔ１Ｄ２．Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）タンパク質と、３：１（ＶＥＧＦ１６５：Ｆｌｔ１Ｄ２Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ））のモル比で混合し、そして４℃で一晩インキュベートした。
【０１８７】
（（ａ）オンライン光散乱を用いるサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ））
ＭｉｎｉＤａｗｎオンライン光散乱検出器（Ｗｙａｔｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓａｎｔａ  Ｂａｒｂａｒａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）および屈折率（ＲＩ）検出器（Ｓｈｉｍａｄｚｕ，Ｋｙｏｔｏ，Ｊａｐａｎ）を備えたサイズ排除クロマトグラフィーカラムを使用して、レセプター−リガンド複合体の分子量（ＭＷ）を決定した。サンプルを、ＰＢＳ緩衝液で平衡化されたＳｕｐｅｒｏｓｅ  １２  ＨＲ  １０／３０カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に充填し、そして流速０．５ｍｌ／分（室温）で同一の緩衝液で溶出した。図３３に示されるように、この溶出プロフィールは、２本のピークを示す。ピーク＃１は、レセプター−リガンド複合体を示し、そしてピーク＃２は、未結合ＶＥＧＦ１６５を示す。ＭＷを、ＬＳシグナルおよびＲＩシグナルから計算した。同一の手順を使用して、レセプター−リガンド複合体の個々の成分のＭＷを決定した。これらの決定の結果は、以下のとおりである：ピーク位置におけるＦｌｔ１Ｄ２Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）／ＶＥＧＦ１６５複合体のＭＷは、１５７  ３００であり（図３３）、ピーク位置でのＶＥＧＦ１６５のＭＷは、４４  ３９０であり（図３４）、そしてこのピークにおけるＲ１Ｒ２のＭＷは、１１３  ３００である（図３５）。
【０１８８】
これらのデータは、Ｆｌｔ１Ｄ２Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）／ＶＥＧＦ複合体の化学量論は、Ｆｌｔ１Ｄ２Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）およびＶＥＧＦ１６５に関する分子量の合計に対応する場合、１：１であることを示した。重要なことには、この方法は、結論的に、Ｆｌｔ１Ｄ２Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）／ＶＥＧＦ１６５複合体が１分子のみのＶＥＧＦ１６５リガンドおよび１分子のみのＦｌｔ１Ｄ２Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）から本当に構成されるということを証明した。
【０１８９】
（実施例２８：Ｆｌｔ１Ｄ２．Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）のペプチドマッピング）
Ｆｌｔ１Ｄ２．Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）中のジスルフィド構造およびグリコシル化部位を、ペプチドマッピング方法によって決定した。この方法において、タンパク質を、トリプシンを用いて最初に切断した。トリプシンのフラグメントを、マススペクトロメトリーと連結したＨＰＬＣ、さらにＮ末端配列決定技術によって分析および同定した。このトリプシン消化による細分化を使用して、ジスルフィド−結合−含有フラグメントを同定するのを助けた。ＰＮＧａｓｅ  Ｆ（Ｇｌｙｋｏ，Ｎｏｖａｔｏ，ＣＡ）を用いたトリプシン消化処理を使用して、Ｎ連結グリコシル化部位を有するフラグメントを同定するのを助けた。この結果は、添付の図３６に要約した。
【０１９０】
Ｆｌｔ１Ｄ２．Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）中に全部で１０種のシステインが存在し、これらの６種は、Ｆｃ領域に属する。Ｃｙｓ２７は、Ｃｙｓ７６にジスルフィド結合することが確認された。Ｃｙｓ１２１は、Ｃｙｓ１８２にジスルフィド結合することが確認された。Ｆｃ領域の最初の２個のシステイン（Ｃｙｓ２１１およびＣｙｓ２１４）は、別のＦｃ鎖中の２つの同一のシステインと分子間ジスルフィド結合を形成する。しかし、これらの２個のシステインは互いに酵素により分離され得ないので、同一のシステイン間（例えば、Ｃｙｓ２１１とＣｙｓ２１１との間）、またはＣｙｓ２１１とＣｙｓ２１４との間で生じるかどうかは、決定され得ない。Ｃｙｓ２１６は、Ｃｙｓ３０６にジスルフィド結合することが確認された。Ｃｙｓ３５２は、Ｃｙｓ４１０にジスルフィド結合することが確認された。
【０１９１】
Ｆｌｔ１Ｄ２．Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）中に５つの可能なＮ−連結グリコシル化部位が存在する。これらの５つの全てが、変化する程度にグリコシル化されることが見出された。完全なグルコシル化は、Ａｓｎ３３（アミノ酸配列ＮＩＴ）、Ａｓｎ１９３（アミノ酸配列ＮＳＴ）、およびＡｓｎ２８２（アミノ酸配列ＮＳＴ）において観察された。さらに、部分的なグリコシル化が、Ａｓｎ６５およびＡｓｎ１２０において観察された。グリコシル化の部位は、図３６において下線によって強調表示されている。
【０１９２】
（実施例２９：改変されたＦｌｔレセプターの薬物動態学的分析）
（（ａ）Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃ（Ａ４０）、Ｆｌｔ１Ｄ２．Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）およびＶＥＧＦＲ１Ｒ２−ＦｃΔＣ１（ａ）の薬物動態学的分析）
Ｂａｌｂ／ｃマウス（２５〜３０ｇ）に、４ｍｇ／ｋｇのＦｌｔ１（１−３）−Ｆｃ（Ａ４０）、ＣＨＯで過渡的に発現されたＦｌｔ１Ｄ２．Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）、ＣＨＯで安定的に発現されたＦｌｔ１Ｄ２．Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）、およびＣＨＯで過渡的に発現されたＶＥＧＦＲ１Ｒ２−ＦｃΔＣ１（ａ）を皮下注入した。このマウスを、注射の１時間、２時間、４時間、６時間、２４時間、２日、３日、および６日後に尾部から採血した。この血清を、Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃ（Ａ４０）、Ｆｌｔ１Ｄ２．Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）、またはＶＥＧＦＲ１Ｒ２−ＦｃΔＣ１（ａ）を検出するために設計されたＥＬＩＳＡ中でアッセイした。このＥＬＩＳＡは、ＥＬＩＳＡプレートをＶＥＧＦ１６５でコーティングする工程、検出されたＦｌｔ１（１−３）−Ｆｃ（Ａ４０）、Ｆｌｔ１Ｄ２．Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）、またはＶＥＧＦＲ１Ｒ２−ＦｃΔＣ１（ａ）と結合させる工程、および西洋ワサビペルオキシダーゼに連結した抗Ｆｃ抗体をレポートする工程を包含する。この実験の結果は、図３７に示される。Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃ（Ａ４０）に関するＴｍａｘは、６時間であるが、過渡的および安定的なＦｌｔ１Ｄ２．Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）、ならびに過渡的なＶＥＧＦＲ１Ｒ２−ＦｃΔＣ１（ａ）に関するＴｍａｘは、２４時間であった。Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃ（Ａ４０）に関するＣｍａｘは、８μｌ／ｍｌであった。両方が過渡的な（Ｆｌｔ１Ｄ２．Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）およびＶＥＧＦＲ１Ｒ２−ＦｃΔＣ１（ａ））に関するＣｍａｘは、１８μｇ／ｍｌであり、そして安定なＶＥＧＦＲ１Ｒ２−ＦｃΔＣ１（ａ）に関するＣｍａｘは、３０μｇ／ｍｌであった。
【０１９３】
（（ｂ）Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃ（Ａ４０）、Ｆｌｔ１Ｄ２．Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）およびＦｌｔ１Ｄ２．ＶＥＧＦＲ３Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）の薬物動態学的分析）
Ｂａｌｂ／ｃマウス（２５〜３０ｇ）に、４ｍｇ／ｋｇのＦｌｔ１（１−３）−Ｆｃ（Ａ４０）、ＣＨＯで過渡的に発現されたＦｌｔ１Ｄ２．Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）およびＣＨＯで過渡的に発現されたＦｌｔ１Ｄ２．ＶＥＧＦＲ３Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）を皮下注入した。このマウスを、注射の１日、２日、５日、６日、７日、８日、１２日、１５日、および２０日後に尾部から採血した。この血清を、Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃ、Ｆｌｔ１Ｄ２．Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）、およびＦｌｔ１Ｄ２．ＶＥＧＦＲ３Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）を検出するために設計されたＥＬＩＳＡ中でアッセイした。このＥＬＩＳＡは、ＥＬＩＳＡプレートを１６５でコーティングする工程、Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃ、Ｆｌｔ１Ｄ２．Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）、またはＦｌｔ１Ｄ２．ＶＥＧＦＲ３Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）と結合させる工程、および西洋ワサビペルオキシダーゼに連結した抗Ｆｃ抗体をレポートする工程を包含する。Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃ（Ａ４０）は、５日後の血清中においてもはや検出され得ないが、Ｆｌｔ１Ｄ２．Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）、またはＦｌｔ１Ｄ２．ＶＥＧＦＲ３Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）は、１５日以上にわたって検出可能であった。この実験の結果を、図３８に示す。
【０１９４】
（実施例３０：インビボでの腫瘍の増殖を阻害するための、Ｆｌｔ１Ｄ２．Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）の能力の評価）
インビボでの腫瘍増殖を阻害するための、Ｆｌｔ１Ｄ２．Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）の能力を評価するために、腫瘍細胞懸濁物がいくつかの組み合わされた雄の免疫不全（ＳＣＩＤ）マウスの右側に皮下移植されるモデルを、使用した。２匹の細胞株（ヒトＨＴ−１０８０線維肉腫細胞株（ＡＴＣＣ寄託番号ＣＣＬ−１２１）およびラットＣ６神経膠腫細胞株（ＡＴＣＣ寄託番号ＣＣＬ−１０７））（これらの各々は、明確に異なる形態学および増殖特性を示す）を、このアッセイにおいて使用した。Ｆｌｔ１Ｄ２．Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）の第１の用量（２５ｍｇ／Ｋｇ、または図３９および４０に示されるような用量）を、腫瘍移植の日に与えた。続いて、２週間にわたって１日おきに（ＥＯＤ）もしくは１週間に２回（２×ｗｋ）のいずれかで、Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃ（Ａ４０）、Ｆｌｔ１Ｄ２．Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）またはビヒクルを動物に皮下注射した。２週間後、動物を固定液で灌流し、腫瘍を除去し、そしてサンプルを失明させた。腫瘍の体積を、可視の皮下腫瘍の長さおよび幅を測定することによって決定した。Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃ（Ａ４０）およびＦｌｔ１Ｄ２．Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）の両方は、ＨＴ−１０８０細胞およびＣ６細胞によって形成される腫瘍の増殖を有意に減少させた。これらの実験の結果を、図３９および図４０に示す。
【０１９５】
（実施例３１：雌生殖系におけるＶＥＧＦ１６５および改変型Ｆｌｔレセプターの効果）
生殖周期の過程にわたって子宮および卵巣において生じる血管再構築のステレオタイプのパターンは、十分に特徴付けられており、これらの組織を作製することは、特に、新脈管形成、血管再構築、および血管退行を調節する機構の研究に十分に適している。実際、生殖組織におけるインサイチュハイブリダイゼーション研究は、ＶＥＧＦが、成熟げっ歯類動物、ならびにヒトおよび非ヒト霊長類における生理学的新脈管形成の媒介因子として作用するという初めての明白な証拠を提供した（Ｐｈｉｌｌｉｐｓら、１９９０；Ｒａｖｉｎｄｒａｎａｔｈら、１９９２；Ｓｈｗｅｉｋｉら、１９９３；Ｋａｍａｔら、１９９５）。周期的な新脈管形成および血管再構築は、正常な卵巣および子宮の顕著な特徴であるので、異常な血管成長および／または血管不全が、これらの組織に影響する多くの病理学的状態を特徴付けることが見出されていることは驚くべきことではない。さらに、これらの病原性血管異常は、１つ以上の新脈管形成因子（最も著名なものは、ＶＥＧＦである）または抗新脈管形成因子の調節されていない発現により、引き起こされるか、または持続されると考えられている。
【０１９６】
例えば、異常な新脈管形成は、多嚢胞性卵巣疾患、子宮内膜症、および子宮内膜癌の特徴であり、そして各々の症例において、ＶＥＧＦが、罹患した組織内で過剰発現される（Ｋａｍａｔら、１９９５；Ｓｈｉｆｒｅｎら、１９９６；Ｇｕｉｄｉら、１９９６；Ｄｏｎｎｅｚら、１９９８）。ＶＥＧＦの過剰発現はまた、卵巣過剰刺激症候群（ＭｃＣｌｕｒｅら、１９９４；Ｌｅｖｉｎら、１９９８）および子癇前症（Ｂａｋｅｒら、１９９５；Ｓｈａｒｋｅｙら、１９９６）における、全身性の血管透過性亢進の確立において病原性の役割を果たすと考えられてる。さらに、ＶＥＧＦは、卵巣癌および他の腫瘍に関係する腹水の産生を担う透過性因子として関係している（Ｓｅｎｇｅｒら、１９８３；Ｂｏｏｃｏｃｋら、１９９５）。ＶＥＧＦの生物学的作用を効果的に中和する薬剤は、上記の状態および関連する状態において、治療的利点のあるものであると合理的に予想され得る。
【０１９７】
新脈管形成および血管再構築はまた、胚盤胞着床および胎盤発達の顕著な特徴である（Ｆｉｎｄｌａｙ，１９８６）。ＶＥＧＦは、母性脱落膜および胚性栄養膜の両方において、強力に発現される。ここで、周囲への着床（ｐｅｒｉ−ｉｍｐｌａｎｔａｔｉｏｎ）の間に、初めに、子宮血管系の拡大および透過性亢進を刺激し、そして、引き続いて、胎盤血管系の母性構成要素および胚性構成要素の両方の形成を媒介すると考えられている（Ｓｈｗｅｉｋｉら、１９９３；Ｃｕｌｌｉｎａｎ−ＢｏｖｅおよびＫｏｏｓ、１９９３；Ｃｈａｋｒａｂｏｒｔｙら、１９９５；Ｄａｓら、１９９７）。ＶＥＧＦはまた、子宮に着床の準備をさせるために必要な、黄体新脈管形成および関連するプロゲステロン分泌に必要とされる（Ｆｅｒｒａｒａら、１９９８）。従って、ＶＥＧＦの生化学的作用を阻害する薬剤は、（着床を防止することによる）避妊薬としてか、または妊娠の初期段階における妊娠中絶剤として、有用であることを示し得る。後者の適用は、異所性妊娠の停止のためにの非外科的介入として、特定の使用を見出し得る。
【０１９８】
ＶＥＧＦレセプターの発現は、正常な生殖組織における血管内皮に大部分が閉じ込められており、一方で、Ｆｌｔ１はまた、ヒトおよび動物の両方における胎盤で栄養膜により発現される（Ｃｌａｒｋら、１９９６；Ｈｅら、１９９９）。ここで、Ｆｌｔ１は、栄養膜侵襲において役割を果たすと提唱されている。興味深いことに、Ｆｌｔ１およびＫＤＲ（Ｆｌｋ１）の両方は、絨毛癌細胞株ＢｅＷｏにより発現され（Ｃｈａｒｎｏｃｋ−Ｊｏｎｅｓら、１９９４）、そしてＶＥＧＦは、これらの細胞における、ＤＮＡ合成およびＭＡＰキナーゼのチロシンリン酸化を促進することが示されている。さらに、原発性卵巣癌および転移性卵巣癌は、高いレベルのＶＥＧＦを発現するのみならず、血管内皮に加えて、腫瘍細胞自体が、ＫＤＲおよび／またはＦｌｔ１を発現する（Ｂｏｏｃｏｃｋら、１９９５）。これらの知見は、ＶＥＧＦが腫瘍血管系の生成および維持に決定的に関与し得るのみならず、生殖系起源の少なくともいくつかの腫瘍において、ＶＥＧＦが、腫瘍細胞の生存および増殖を直接支持する自己分泌の役割を補助することを示唆する。従って、ＶＥＧＦの作用をブロックする薬剤は、生殖系起源の腫瘍の処置に、特に有益な適用を有し得る。
【０１９９】
（方法および結果）
（（ａ）ＶＥＧＦ誘発性子宮透過性亢進の評価）
思春期前の雌性ラットにおいて、妊馬血清ゴナドトロピン（ＰＭＳＧ）を、皮下注射（５  ＩＵ）して、排卵を誘発した。これは、２日後にエストラジオールの上昇を生じ、次いで、子宮におけるＶＥＧＦの誘導を引き起こす。この誘導は、６時間後に、子宮の透過性亢進および子宮の湿重量の増加を生じ、従って、改変型Ｆｌｔレセプターである、Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃ（Ａ４０）、Ｆｌｔ１Ｄ２．Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）およびＦｌｔ１Ｄ２．ＶＥＧＦＲ３Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）によって、潜在的にブロックされ得ることが報告されている。このインビボモデルにおいて、正常な重量のラットの子宮は、約５０ｍｇであり、そしてこれは、ＰＭＳＧによって３００〜３５０ｍｇまで誘導され得る。組織の乾燥は、これが全て水の重量であることを示す。ＰＭＳＧ注射の１時間後に２５ｍｇ／ｋｇの、Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃ（Ａ４０）、Ｆｌｔ１Ｄ２．Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）およびＦｌｔ１Ｄ２．ＶＥＧＦＲ３Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）の皮下注射は、子宮湿重量の増加の約５０％の阻害を生じる。改変型Ｆｌｔレセプターの用量の増加は、湿重量の増加を、さらに減少させない。このことは、このモデルに対するＶＥＧＦ非依存成分があることを示唆する。この実験の結果を図４１に示す。
【０２００】
（（ａ）読み出し値として、プロゲステロンを用いる黄体新脈管形成の評価）
思春期前の雌性ラットにおいて、妊馬血清ゴナドトロピン（ＰＭＳＧ）を、皮下注射（５  ＩＵ）して、排卵を誘発した。これは、４日後に、子宮に着床するための準備をさせるための、血流へのプロゲステロンの分泌を可能にする、血管の密なネットワークを含む、完全に機能する黄体を生じる。黄体における新脈管形成の誘導は、ＶＥＧＦを必要とする；従って、ＶＥＧＦをブロックすることは、新規の血管の欠失を生じ、これにより、血流へと分泌されるプロゲステロンを欠失する。このインビボモデルにおいて、プロゲステロンの休止期レベル（ｒｅｓｔｉｎｇ  ｌｅｖｅｌ）は、約５ｎｇ／ｍｌであり、そしてこれを、ＰＭＳＧ後に２５〜４０ｎｇ／ｍｌのレベルまで誘導し得る。ＰＭＳＧ注射の１時間後に２５ｍｇ／ｋｇまたは５ｍｇ／ｋｇの、Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃ（Ａ４０）またはＦｌｔ１Ｄ２．Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）の皮下注射は、４日目のプロゲステロン誘導の完全な阻害を生じる。この実験の結果を、図４２Ａ〜４２Ｂに示す。
【０２０１】
（実施例３３：Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃ（Ａ４０）およびポリエチレングリコール付加（Ｐｅｇｙｌａｔｅｄ）Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃの薬物動態的分析）
Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃを、１０ｋＤ  ＰＥＧまたは２０ｋＤ  ＰＥＧのいずれかを用いて、ポリエチレングリコール付加（ＰＥＧｙｌａｔｅｄ）し、そして、ｂａｌｂ／ｃマウスにおいて、これらの薬物動態的プロフィールについて試験した。Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃの両方のポリエチレングリコール付加形態は、Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃ（Ａ４０）よりも良好なＰＫプロフィールを有することを見出した（ポリエチレングリコール付加分子について、Ｔｍａｘは２４時間で生じ、対照的に、Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃ（Ａ４０）について、Ｔｍａｘは６時間で生じる）。
【０２０２】
（実施例３４：改変型Ｆｌｔ１レセプター改変体のアフィニティーを試験するためのＶＥＧＦ１６５ＥＬＩＳＡ）
１０ｐＭのＶＥＧＦ１６５を、１６０ｐＭ〜０．１ｐＭの範囲の改変型Ｆｌｔ１レセプター改変体と共に室温で一晩インキュベートした。この実験で用いた改変型Ｆｌｔ１レセプター改変体は、Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃ、Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃ（Ａ４０）、一過性発現したＦｌｔ１Ｄ２Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）、一過性発現したＦｌｔ１Ｄ２ＶＥＦＧＦＲ３Ｄ３−ＦｃΔＣ１（ａ）、Ｆｌｔ１−（１−３ＮＡＳ）−Ｆｃ、Ｆｌｔ１（１−３Ｒ−＞Ｃ）−ＦｃおよびＴｉｅ２−Ｆｃであった。Ｆｌｔ１（１−３ＮＡＳ）−Ｆｃは、Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃの改変バージョンであり、ここで、非常に塩基性のアミノ酸配列であるＫＮＫＲＡＳＶＲＲＲが、ＮＡＳＶＮＧＳＲにより置換されて、２つの新規のグリコシル化部位の組込み、および５つの正電荷の正味の減少（両方とも、ＰＫに対するこの配列の不利な効果を減少する目的を有する）を生じる。Ｆｌｔ１（１−３Ｒ−＞Ｃ）−Ｆｃは、同じ塩基性アミノ酸配列内の単一のアルギニン残基（Ｒ）を、システイン（Ｃ）に変化させ（ＫＮＫＲＡＳＶＲＲＲ−＞ＫＮＫＣＡＳＶＲＲＲ）、この残基でのポリエチレングリコール付加を可能にし、次いで、ＰＫに対する不利な効果を発揮することから、塩基性領域を守り得る、改変である。インキュベーションの後、溶液を、ＶＥＧＦ１６５に対する捕捉抗体（Ｒ＆Ｄ）を含むプレートに移した。次いで、遊離のＶＥＧＦ１６５の量を、遊離のＶＥＧＦ１６５を報告するための抗体を用いて測定した。これは、ＶＥＧＦ１６５に対して最も高いアフィニティーを有する改変型Ｆｌｔ１レセプター改変体（遊離のＶＥＧＦ１６５の最も少ない量として測定される）が、Ｆｌｔ１Ｄ２Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）、次いで、Ｆｌｔ１（１−３）−ＦｃおよびＦｌｔ１（１−３）−Ｆｃ（Ａ４０）、次いで、Ｆｌｔ１（１−３Ｒ−＞Ｃ）−Ｆｃ、Ｆｌｔ１（１−３ＮＡＳ）−ＦｃおよびＦｌｔ１Ｄ２ＶＥＦＧＦＲ３Ｄ３−ＦｃΔＣ１（ａ）であったことを示した。Ｔｉｅ２Ｆｃは、ＶＥＧＦ１６５に対するアフィニティーを有していなかった。
【０２０３】
（実施例３５：乾癬の新規の動物モデルにおけるＶＥＧＦＲ１Ｒ２−ＦｃΔＣ１（ａ）の効果）
（導入）
乾癬は、白い板状鱗屑で覆われ、そして程度が変化する不快感を頻繁に伴う、赤斑により特徴付けられる慢性皮膚疾患である。この疾患は、伝染性ではない；しかし、その原因および機構は、まだ決定されていない。見苦しい皮膚病変および皮疹の形成に起因して、乾癬は、頻繁に、その患者に対するネガティブな心理的影響を有する。西欧諸国の国民の、総人口の２〜３％が、この疾患に罹患している。種々の分類が、乾癬について提唱されているが、これは、一般に、尋常性乾癬、膿疱性乾癬、乾癬性関節炎、滴状乾癬などに分類される。これらのうち、尋常性乾癬が、主要な型であり、そして疾患の全ての症例の８０〜９０％の原因である。
【０２０４】
乾癬は、損傷、感染、薬物、食物、気候、およびストレスのような種々の非遺伝的因子の作用により、頻繁に、誘発される、複数の原因による遺伝的疾患であると考えられている。さらに、乾癬は、特定の組織適合抗原（ＨＬＡ）に関連することが公知である。事実、研究は、特定の型の乾癬を特定のＨＬＡに結び付けている。例えば、Ｔｉｉｌｉｋａｉｎｅｎ，Ａ．ら（Ｂｒ  Ｊ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ，１９８０  １０２：１７９−８４）は、組織適合抗原であるＨＬＡ−Ｃｗ６の罹患率が、滴状形態の乾癬を有する２２人の患者の７２．７％、および尋常性形態の乾癬を有する３７人の患者の４５．９％であることを報告している。従って、乾癬は、明らかに、その原因において遺伝的根拠を有する疾患である。
【０２０５】
以下を含む乾癬の、２つの特徴的な症状が存在する：１）他の表層性皮膚疾患により引き起こされる応答に共通する炎症性応答、および２）皮膚のキューティクルの異常な増殖の傾向。炎症性応答は、血管透過性、Ｔリンパ球移動亢進、およびＴヘルパー１型（ＴＨ１）サイトカインの表皮への放出によって特徴付けられる（Ｎｉｃｋｏｌｏｆｆ，ＢＪ，１９９９，Ａｒｃｈ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ  Ｓｅｐ；１３５（９）：１１０４−１０）。異常なキューティクル増殖は、上皮アカントシスおよび、より成熟した乾癬では乳頭間隆起形成により特徴付けられる。より進行した乾癬病巣において、角質層中に核を含む、異常に分化したケラチノサイトを有する融合性錯角化症（ｃｏｎｆｌｕｅｎｔ  ｐａｒａｋｅｒａｔｏｓｉｓ）、および融合性錯角化層（ｃｏｎｆｌｕｅｎｔ  ｐａｒａｋｅｒａｔｏｔｉｃ  ｃｏｒｎｉｆｉｅｄ  ｌａｙｅｒ）（Ａｌｔｍａｎ  ＥおよびＫａｍｉｎｏ  Ｈ．、１９９９、Ｓｅｍｉｎａｒｓ  ｉｎ  Ｃｕｔａｎｅｏｕｓ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ａｎｄ  Ｓｕｒｇｅｒｙ  １８：２５−３５）内の層に配置された好中球を有する微小膿瘍が、頻繁に発症する。乾癬の臨床診断について重要な特色が存在する。
【０２０６】
乾癬を処置するために現在利用可能な治療法としては、表皮細胞の過剰増殖の制御；炎症応答の制御；免疫調節の促進；ならびに細菌および真菌による感染の回避が挙げられる。以下の（１）〜（７）は、一般的に使用される治療法の要点である：（１）副腎皮質ホルモンの外部使用および内部使用−ステロイドの外部使用または局所使用は、乾癬の症状の減少（特に、発疹の減少）という即時効果を有する。しかし、長期にわたる副腎皮質ホルモンの投与は、抵抗性および耐性強化を増加させ、その結果、受容可能な治療効果を得るために、用量が増加されなければならないか、またはより強力な薬物が使用されなければならなくなる。さらに、乾癬性病変が比較的広い領域にわたって生じた場合、この方法のみによって完全に治癒させることはできず、従って、他の治療法と組み合わせなければならない−；（２）光化学療法−この方法は、外部調製物または内部調製物の形態でソラレンを投与する工程および罹患領域に長波紫外線を適用する工程からなる。不幸なことに、すべての型の乾癬をこの方法により処置できるわけではない−；（３）光線両方（ＵＶ照射）−この処置方法はしばしば有効であるが、経時的に、皮膚の加齢の加速を引き起こすという望ましくない副作用を有する。さらに、発癌を誘導する危険が存在する−；（４）コールタールの外部使用−コールタールは、乾癬性病変が短期間の間に減少するように細胞の増殖を抑制し、比較的長期の寛解が達成され得る。しかし、時々、他の皮膚障害（例えば、刺激薬皮膚炎および毛包炎（タール挫瘡））を生じ得る−；（５）メトトレキサートの投与−メトトレキサートは、葉酸に対するアンタゴニストであり、細胞増殖を阻害する際に活性である。メトトレキサートの使用は、膿疱性乾癬を処置するために有効である。不幸なことに、長期にわたるメトトレキサートにしようは、有害な効果（例えば、肝機能の障害、骨髄増殖の抑制、および生殖機能の喪失）を引き起こす−；（６）レチノイドの投与−レチノイドは、表皮の異常な角質化および白血球移動の増加を制御し得るという点で、免疫調節効果を有すると考えられている。レチノイドベースの治療剤の内部投与は、膿疱性乾癬および乾癬性紅皮症を処置するために特に有効である。しかし、レチノイドは、有害な効果（例えば、皮膚の厚さの減少および可視粘膜の減少）を示し得る。さらに、血清リポタンパク質の異常なレベルが、時々観察される。重要なことには、レチノイドは催奇性であり、長期の間身体の内部の蓄積し残留する可能性があるので、小児期のヒトへのレチノイドの投与は回避され、従って、小児期を過ぎたヒトまたは難治性乾癬に罹患しているヒトに、患者集団が制限される−；ならびに（７）シクロスポリンＡ−乾癬を処置するために医師によりしばしば使用される免疫抑制剤。乾癬処置剤としてのシクロスポリンＡの主要な不利点は、全身免疫抑制剤であり、従って、患者を、感染または他の細菌疾患もしくはウイルス疾患に対してより脆弱にすることである。
【０２０７】
最近の研究は、増殖因子ＶＥＧＦが、乾癬性病変にてアップレギュレートされること（Ｄｅｔｍａｒ  Ｍら、１９９４、Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １；１８０（３）：１１４１〜６）を示している。しかし、現在まで、ＶＥＧＦの過剰発現がが、乾癬の発達または乾癬の進行のいずれかにおいて何らかの役割を有し得ることを示すデータは存在しない。ＶＥＧＦは、血管透過性、微小血管密度の増加、および白血球の回転および接着を引き起こすことが、公知である（Ｄｅｔｍａｒ  Ｍら、１９９８、Ｊ  Ｉｎｖｅｓｔ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ  １９９８  Ｊｕｌ；１１１（１）：１〜６）。ＶＥＧＦの発現の増加はまた、慢性炎症皮膚病（水疱性類天疱瘡、疱疹状皮膚炎、および多形性紅斑を含む）と関連付けられており、これらの皮膚病すべては、透過性亢進皮膚微小血管および顕著な乳頭状皮膚水腫により特徴付けられている（Ｂｒｏｗｎ  ＬＦら、１９９５、Ｊ  Ｉｎｖｅｓｔ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ  １０４（５）：７４４〜９）。
【０２０８】
乾癬を処置するために利用可能な治療法が存在するが、利用可能なこれらの治療法のほとんどが、その副作用の重篤性、最終的な抵抗性の発生、および／または適切な患者集団に対する制限が原因で、理想的なものには及ばず、従って、乾癬についての新しい安全かつ有効な治療の必要性が明確である。この必要性を満たすために、本出願人らは、感染を処置する新しく新規な方法を開発した。このような方法は、処置経過の間に明白な副作用を伴わず、比較的短期間にて乾癬用病変を反転することができる、新規なタンパク質分子を利用する。
【０２０９】
本出願人はまた、臨床的乾癬についての新しく新規かつ信頼できる動物モデルを開発した。このモデルにより、この疾患の基礎となる機構を研究および理解することが容易になり、新しい治療法を探索することが補助される。
【０２１０】
（方法および材料）
（Ａ．Ｋ１４ＶＥＧＦトランスジェニックマウス）
ケラチン−１４（Ｋ１４）ベースの発現ベクターと、ＶＵＧＦ１６４をコードするｃＤＮＡを含むマウスｃＤＮＡとを使用して、Ｋ１４−Ａｎｇ１マウス（Ｓｕｒｉ  Ｃら、１９９８、Ｓｃｉｅｎｃｅ  １６；２８２（５３８８）：４６８〜７１）を作製するために使用したアプローチと同一のアプローチによって、Ｋ１４ＶＥＧＦトランスジェニックマウスを作製した。Ｋ１４プロモーターは、表皮（毛髪の内側の細胞を含む）の基底層へＶＥＧＦの発現を方向付ける（Ｓｕｒｉ  Ｃら、１９９８、Ｓｃｉｅｎｃｅ  １６：２８２（５３８８）：４６８〜７１）。このＫ１４ＶＥＧＦトランスジェニックホモ接合マウスを、本明細書中に記載される研究全体にわたって使用した。
【０２１１】
（Ｂ．組織処理および免疫染色）
免疫組織化学のために、野生型マウスおよびＫ１４ＶＥＧＦトランスジェニックマウスの両方から得た耳の皮膚の１０μｍ凍結切片を、抗マウス血小板内皮細胞接着分子１（ＰＥＣＡＭ−１、ＣＤ３１、ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）、抗マウスＣＤ４（ＢＤ  ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）、ＣＤ８（ＢＤ  ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）、抗マウスＦ４／８０（Ｓｅｒｏｔｅｃ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ）または抗マウスＶＥＧＦ（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）で染色した。ＰＥＣＡＭ−１およびＶＥＧＦでの染色のために、組織切片を、４％パラホルムアルデヒド中に予め固定し、その後、当該分野で公知の標準的手順に従って染色した。ＣＤ４抗体、ＣＤ８抗体、またはＦ４／８０抗体での染色のために、当該分野で精通された標準的技術により調製されたアセトン固定組織切片を使用した。
【０２１２】
（Ｃ．組織学）
ヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色を、当業者に精通された標準的プロトコルに従って実施した。
【０２１３】
（Ｄ．ＶＥＧＦＲ１Ｒ２−ＦｃΔＣ１（ａ）注入）
このＫ１４ＶＥＧＦホモ接合トランスジェニックマウスを、頸部皮膚への皮下注入によって、ＶＥＧＦＲ１Ｒ２−ＦｃΔＣ１（ａ）で処理した。このマウスを、２５ｍｇ／ｋｇ  ＶＥＧＦＲ１Ｒ２−ＦｃΔＣ１（ａ）またはコントロールとしての１２．５ｍｇ／ｋｇヒトＦｃのいずれかを用いて、動物１匹あたり合計４回の注入スケジュールを生じる３日ごとに１０日間の注入スケジュールを使用して、処理した。マウスの写真を、各注入の直前に撮影した。マウスの耳組織を、その後の組織学的分析のために１２日目に採取した。
【０２１４】
（結果）
（Ａ．Ｋ１４ＶＥＧＦトランスジェニックマウスの表現型）
以前に報告されたように、Ｋ１４ＶＥＧＦトランスジェニックマウスは、妊娠可能であり、明らかに健常である（Ｓｕｒｉ  Ｃら、１９９８、Ｓｃｉｅｎｃｅ  １６：２８２（５３８８）：４６８〜７１；Ｄｅｔｍａｒ  Ｍら、１９９８、Ｊ  Ｉｎｖｅｓｔ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ  １９９８  Ｊｕｌ；１１１（１）：１〜６）。しかし、このＫ１４ＶＥＧＦトランスジェニックマウスの耳の皮膚は、野生型ＦＶＢ同腹仔の耳の皮膚よりも明白に赤い。乾癬性病変と類似するように見える限局性病変は、この耳の皮膚にて発生し始め、より弱い程度で、弱齢Ｋ１４ＶＥＧＦトランスジェニックマウスの背面および側面の皮膚にて発生し始めた。この状態は、年齢とともに悪化した。大量の皮膚病変が、これらのマウスの耳において、５ヶ月齢以上まで観察された。図４３は、約６ヶ月齢にてこのような大量の病変を示すマウスの写真である。
【０２１５】
（Ｂ．Ｋ１４ＶＥＧＦトランスジェニックマウスの皮膚におけるＶＥＧＦの発現）
ＶＥＧＦトランスジーンの発現が、マウスＶＥＧＦに特異的な抗体を用いる免疫染色により検出された。強力なタンパク質発現が、基底ケラチノサイト中および乳頭状真皮中の微小血管において、観察された。
【０２１６】
（Ｃ．Ｋ１４ＶＥＧＦトランスジェニックマウスにおける乾癬性病変の組織学的分析）
乾癬性病変を示すＫ１４ＶＥＧＦトランスジェニックマウスの耳の組織学的分析により、特徴的乾癬性皮膚表現型が明らかになった。標準的なヘマトリキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色によって、弱齢Ｋ１４ＶＥＧＦトランスジェニックマウスの表皮が、コントロールマウスと比較して、中程度の表皮肥厚（すなわち、表皮過形成）および限局性錯角化（すなわち、皮膚層中のケラチノサイトが、核を保持する）を示すことが、明らかになった（図４４Ａおよび４４Ｂを参照のこと）。皮膚区画において、組織厚が約５倍増加した真皮が、観察され、同様に、炎症性細胞浸潤も、観察された。この状態は、加齢とともに進行した。６ヶ月齢を越えたＫ１４ＶＥＧＦトランスジェニックは、乾癬状果形成に特有の明白な乳頭間隆起を発生し、そして皮膚が、より厚くなった（図４５を参照のこと）。角のケラチンが沈着したよりコンフルエントな角質増殖症および好中球を含む膿疱を伴う錯角化症が、皮膚層に存在した（図４４Ｃ）。角質層の錯角化領域内に局在化したマンロー微小膿瘍（図４６Ａ）（Ａｌｔｍａｎ，Ｅ．およびＫａｍｉｎｏ，Ｈ．１９９９、Ｓｅｍｉｎａｒｓ  ｉｎ  Ｃｕｔａｎｅｏｕｓ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ａｎｄ  Ｓｕｒｇｅｒｙ  １８：２５〜３５）および錯角化角質層のすぐ下に局在化したコゴイ（Ａｌｔｍａｎ，Ｅ．およびＫａｍｉｎｏ，Ｈ．１９９９、Ｓｅｍｉｎａｒｓ  ｉｎ  Ｃｕｔａｎｅｏｕｓ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ａｎｄ  Ｓｕｒｇｅｒｙ  １８：２５〜３５）微小膿瘍（図４６Ｂ）が、より加齢したＫ１４ＶＥＧＦトランスジェニックの病変において同定された。微小膿瘍の存在は、臨床的乾癬診断における重要な特徴である（Ａｌｔｍａｎ，Ｅ．およびＫａｍｉｎｏ，Ｈ．１９９９、Ｓｅｍｉｎａｒｓ  ｉｎ  Ｃｕｔａｎｅｏｕｓ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ａｎｄ  Ｓｕｒｇｅｒｙ  １８：２５〜３５）。
【０２１７】
Ｋ１４ＶＥＧＦトランスジェニックマウスを、可視的な皮膚の赤さおよび血管新生によって特徴付ける。ＰＥＣＡＭ−１（内皮細胞上に位置する膜内在性タンパク質）（ＤｅＬｉｓｓｅｒ，ＨＭ．ら、１９９４、Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｔｏｄａｙ  Ｏｃｔ；１５（１０）：４９０〜５）についての免疫組織学的染色により、Ｋ１４ＶＥＧＦトランスジェニック皮膚内の皮膚微小血管の数の増加が明らかになった。表皮の底面付近で螺旋状である、乳頭状真皮中で、拡張し蛇行した毛細血管もまた、観察された。Ｋ１４ＶＥＧＦトランスジェニックマウスは、ヒト乾癬性皮膚において観察されるのと同様に、真皮乳頭において拡張し蛇行した毛細血管を示したので、本出願人らは、これらの過形成血管もまた、ヒト感染において観察される血管炎症の特徴を示すか否かを検査した。具体的には、特定の内皮細胞接着分子の誘導が、ヒト乾癬性皮膚病変において観察されるか形成血管および炎症血管の特徴であり、これには、Ｅ−セレクチン（ＣＤ６２Ｅ）の誘導（Ｇｒｏｖｅｓ，Ｒ．Ｗ．，Ａｌｌｅｎ，Ｍ．Ｈ．，Ｂａｒｋｅｒ，Ｊ．Ｎ．，Ｈａｓｋａｒｄ，Ｄ．Ｏ．およびＭａｃＤｏｎａｌｄ，Ｄ．Ｍ．，Ｂｒ  Ｊ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ  １２４，１１７−２３（１９９１）；ＶＣＡＭ−１（ＣＤ１０６）の誘導（Ｇｒｏｖｅｓ，Ｒ．Ｗ．，Ｒｏｓｓ，Ｅ．Ｌ．，Ｂａｒｋｅｒ，Ｊ．Ｂ．およびＭａｃＤｏｎａｌｄ，Ｄ．Ｍ．，Ｊ  Ａｍ  Ａｃａｄ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ  ２９，６７−７２（１９９３））；ならびにＩＣＡＭ−１（ＣＤ５４）の誘導（Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ，Ｃ．Ｅ．、Ｖｏｏｒｈｅｅｓ，Ｊ．Ｊ．およびＮｉｃｋｏｌｏｆｆ，Ｂ．Ｊ．，Ｊ  Ａｍ  Ａｃａｄ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ  ２０，６１７〜２９（１９８９））が、挙げられる。さらに、ＩＣＡＭ−１発現は、乾癬性皮膚における基底表皮ケラチノサイト上で検出可能であるが、正常なヒト表皮のケラチノサイトは、ＩＣＡＭ−１を発現しない（Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ，Ｃ．Ｅ．、Ｖｏｏｒｈｅｅｓ，Ｊ．Ｊ．およびＮｉｃｋｏｌｏｆｆ，Ｂ．Ｊ．，Ｊ  Ａｍ  Ａｃａｄ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ  ２０，６１７〜２９（１９８９）；Ｓｉｎｇｅｒ，Ｋ．Ｈ．，Ｔｕｃｋ，Ｄ．Ｔ．，Ｓａｍｐｓｏｎ，Ｈ．Ａ．およびＨａｌｌ，Ｒ．Ｐ．，Ｊ  Ｉｎｖｅｓｔ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ  ９２，７４６−５０（１９８９））。ヒト感染における知見と類似して、これらの細胞接着分子の発現が、Ｋ１４ＶＥＧＦトランスジェニックマウスの乾癬状皮膚において誘導された。Ｅ−セレクチンは、野生型マウス皮膚において検出可能でなかった（図４８Ｄ）が、本出願人らは、Ｋ１４ＶＥＧＦトランスジェニックマウスにおける乾癬状皮膚病変における血管上で、強力なＥ−セレクチン発現を見出した（図４８Ｅ、矢印）。ＶＣＡＭ−１の発現もまた、野生型皮膚における低レベル発現（図４８Ｆ）と比較して、Ｋ１４ＶＥＧＦトランスジェニックマウスにおける乾癬状病変における血管上で、強力に誘導された（図４８Ｇ、矢印）。同様に、ＩＣＡＭ−１発現は、野生型皮膚（図４８Ｈ）と比較して、Ｋ１４ＶＥＧＦトランスジェニックマウスの過形成皮膚病変における血管上でアップレギュレートされた（図４８Ｉ、矢印）。重要なことには、本出願人らは、Ｋ１４ＶＥＧＦトランスジェニックマウスの��癬状皮膚病変の基底表皮ケラチノサイトにおいて、ヒト乾癬において以前に記載された（Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ，Ｃ．Ｅ．，Ｖｏｏｒｔｈｅｅｓ，Ｊ．Ｊ．およびＮｉｃｋｏｌｏｆｆ，Ｂ．Ｊ．，Ｊ  Ａｍ  Ａｃａｄ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ  ２０，６１７−２９（１９８９）；Ｓｉｎｇｅｒ，Ｋ．Ｈ．，Ｔｕｃｋ，Ｄ．Ｔ．，Ｓａｍｐｓｏｎ，Ｈ．Ａ．およびＨａｌｌ，Ｒ．Ｐ．，Ｊ  Ｉｎｖｅｓｔ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ  ９２，７４６−５０（１９８９）；Ｎｉｃｋｏｌｏｆｆ，Ｂ．Ｊ．，Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ，Ｃ．Ｅ．およびＢａｒｋｅｒ，Ｊ．Ｎ．，Ｊ  Ｉｎｖｅｓｔ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ  ９４，１５１Ｓ−１５７Ｓ（１９９０））と類似するパターンで、ＩＣＡＭ−１の発現を見出した（図４８Ｉ、矢印）。
【０２１８】
乾癬についての病理学的基礎は、公知ではない。１つの問題は、この障害が、表皮のケラチノサイトの異常を反映するのかまたは骨髄由来の免疫細胞の異常を反映するのかということである。乾癬患者由来の症状の無い皮膚を移植した重篤複合免疫不全（ＳＣＩＤ）マウスを使用する最近の研究は、活性化ＣＤ４＋が乾癬表現型の形成を誘発し得るが、ＣＤ８＋  Ｔリンパ球が誘発し得なかったという直接的なインビボの証拠を提供した（Ｗｒｏｎｅ−Ｓｍｉｔｈ，Ｔ，Ｎｉｃｋｏｌｏｆｆ，ＢＪ，１９９６，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  １９９６  Ｏｃｔ  １５；９８（８）：１８７８−８７；Ｎｉｃｋｏｌｏｆｆ，ＢＪ，Ｗｒｏｎｅ−Ｓｍｉｔｈ，Ｔ．，１９９９，Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ  １９９９  Ｊｕｌ；１５５（１）：１４５−５８）。本明細書中に記載されるＫ１４ＶＥＧＦトランスジェニックマウス乾癬モデルにおいて炎症応答を媒介する免疫学的基礎を分析するために、ＣＤ４＋免疫細胞およびＣＤ８＋免疫細胞について免疫染色を行った。その結果は、より歳を取ったＫ１４ＶＥＧＦトランスジェニックマウスから単離した、初期の乾癬損傷およびより成熟した乾癬損傷の両方の真皮において主に局在化するＣＤ４＋Ｔリンパ球の大きな浸潤を明らかにした。損傷皮膚に浸潤されたＣＤ８＋  Ｔリンパ球の全体のレベルは、ＣＤ４＋  Ｔリンパ球のレベルよりも有意に低かった。若いＫ１４ＶＥＧＦトランスジェニック損傷において、ＣＤ８＋  Ｔリンパ球は、真皮および表皮の両方で検出された。興味深いことに、ＣＤ８＋  Ｔリンパ球は、乾癬損傷の成熟とともに、主に表皮に局在化する。Ｋ１４ＶＥＧＦトランスジェニックマウス由来の皮膚の凍結切片がマウスマクロファージマーカーＦ４／８０抗原を認識する抗体を用いて染色された場合、コントロールと比較して、マクロファージの数における有意な増加が観測された。この増加したマクロファージ浸潤は、より歳を取ったＫ１４ＶＥＧＦトランスジェニックマウスにおいて、乾癬損傷の発達とともに、さらにより劇的になった。これは、活性化ＣＤ８＋リンパ球によって分泌されたサイトカインまたは成長因子が、マクロファージ増殖をさらに刺激し、乾癬表現型の悪化を導くことを示唆する。
【０２１９】
（Ｇ．乾癬の動物モデルにおける、ＶＥＧＦＲ１Ｒ２−ＦｃΔＣ１（ａ）の効果）
Ｇ１．本明細書中に記載される乾癬の新規な動物モデルは、乾癬表現型が、マウス表皮におけるＶＥＧＦの過剰発現によって主に誘導され得ることを実証する。乾癬損傷の形成におけるＶＥＧＦの原因となる役割を確認するために、ＶＥＧＦＲ１Ｒ２−ＦｃΔＣ１（ａ）を、マウス首皮膚に皮下的に注射した。ＶＥＧＦＲ１Ｒ２−ＦｃΔＣ１（ａ）は、ＶＥＧＦとの複合体を形成することによって、ＶＥＧＦの結合について、内因性マウスＶＥＧＦレセプターと競合し、このようにして、このＶＥＧＦが、そのレセプターに結合し、そしてシグナルを伝達することを妨げる。５匹の明らかに乾癬損傷を有するＫ１４ＶＥＧＦトランスジェニックマウスを、０日目、３日目、５日目、７日目、および１０日目に、２５ｍｇ／ｋｇの用量でＶＥＧＦＲ１Ｒ２−ＦｃΔＣ１（ａ）を用いて、処置した。３匹の処置されたマウスは、ＶＥＧＦＲ１Ｒ２−ＦｃΔＣ１（ａ）の最初の注射後の３日目までに皮膚損傷の有意な改善を示した。残りの２匹の動物は、３日目までにその損傷における穏やかな改善を示した。ＶＥＧＦＲ１Ｒ２−ＦｃΔＣ１（ａ）の引き続く注射によって、７日目までに、全てのマウスにおいて皮膚損傷のさらなる改善が示された。しかし、１０日目までに、２匹のマウスが、おそらくＶＥＧＦＲ１Ｒ２−ＦｃΔＣ１（ａ）中和抗体の形成に起因して、小さな病巣の損傷を発達させ始めた（図４７）。さらなるセットの動物（２つの実験、２つのコントロール）を用いる引き続く研究は、同じ結果を生じ、従って、乾癬のこの動物モデルにおける乾癬損傷を緩和するＶＥＧＦＲ１Ｒ２−ＦｃΔＣ１（ａ）の能力をさらに実証する。
【０２２０】
（Ｇ２．ＶＥＧＦＲ１Ｒ２−ＦｃΔＣ１（ａ）を用いて処置されたＫ１４ＶＥＧＦマウスの組織学的評価）
（材料および方法）
これらの研究において使用されたＫ１４ＶＥＧＦトランスジェニックマウスおよび野生型同腹仔マウス由来の組織を、性別、年齢、および創傷部位に従って、一致させた。固定した切片を、以前に記載される（Ｈｏｌａｓｈ，Ｊ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８４，１９９４−８．（１９９９））ように、抗マウス血小板−内皮細胞接着分子−１（ＰＥＣＡＭ−１，ＣＤ３１，ＢＤ  ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）、抗マウスＣＤ４（ＢＤ  ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）、ＣＤ８（ＢＤ  ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）、抗マウスＦ４／８０（Ｓｅｒｏｔｅｃ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ）、または抗マウスＶＥＧＦ（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）を用いて免疫染色した。ケラチノサイト増殖および分化マーカーまたは白血球接着分子の染色は、以前に記載（Ｓｔｒｅｉｔ，Ｍ．ら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９６，１４８８８−９３．（１９９９））のように、マウスケラチン６（Ｋ６）およびロリクリンン（ｌｏｒｉｃｒｉｎ）に対するウサギポリクローナル抗体（Ｂａｂｃｏ，Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）、ならびにマウスＥ選択（ＣＤ６２Ｅ）、ＩＣＡＭ−１（ＣＤ５４）、およびＶＣＡＭ−１（ＣＤ１０６；ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）に対するウサギモノクローナル抗体を使用し、Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ  ＡＢＣキット（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）を使用して、行った。
【０２２１】
（結果）
ＶＥＧＦＲ１Ｒ２−ＦｃΔＣ１（ａ）を用いて処置された６匹全てのＫ１４ＶＥＧＦトランスジェニックマウスの組織学的評価は、乳頭間隆起構造のほぼ完全な消散（図４９Ａおよび４９Ｂ）、表皮構造の正規化および錯角化の減少（図４９Ｃおよび４９Ｄ）、ならびに脈管過形成の減少（図４９Ｅおよび４９Ｆ）を明らかにした。さらに、異常な表皮分化のＫ６マーカーは、ＶＥＧＦＲ１Ｒ２−ＦｃΔＣ１（ａ）処置によって正規化（図４９ＧおよびＨ）され、これは、脈管炎症（Ｅ選択およびＩＣＡＭ−１、図４９Ｉ〜４９Ｌ）のマーカーであり、そしてＣＤ８＋Ｔ  リンパ球分布（図４９Ｍおよび４９Ｎ）のマーカーであった。従って、ＶＥＧＦは、より歳を取ったＫ１４ＶＥＧＦトランスジェニックマウスにおいて乾癬状損傷を維持するのに連続的に必要とされ、そしてさらに長く持続する疾患は、ＶＥＧＦ遮断に続いて、劇的に逆転され得る。
【０２２２】
（考察）
乾癬の原因である、もとにある病原性の機構および鍵分子は、まだ同定されていない。原因の因子についての最近の研究は、炎症またはケラチノサイト増殖の分子メディエーターに焦点を当てている。しかし、マウスにおいてこのようなメディエーターをトランスジェニックにより過剰に発現することによってヒト乾癬を模倣する試みは、全てのその病理学的局面においてヒト疾患を反復していない。出願人の知見は、脈管変化がヒト乾癬状態の最も初期のマーカーであり得るというより初期の示唆に対する信用を与える。さらに、ＶＥＧＦ（乾癬皮膚において劇的に上昇することが以前に示されている）が、この疾患において見られる脈管変化においてだけでなく、表皮および炎症変化においても同様に原因となる役割を果たし得る。この線に沿って、出願人は、皮膚における過剰なＶＥＧＦが乾癬表現型の素因を作り出すのに十分であり、そしてこのような過剰発現が、結果的に、その特徴（過形成および炎症性脈管変化だけでなく、全ての特徴的な表皮変化および組織炎症細胞浸潤も含む）のほとんど全てにおいてヒト乾癬を反復するマウスの乾癬状状態の自発的な発生を導く。
【０２２３】
出願人のモデルにおいて、過剰のＶＥＧＦが直ちに本格的な疾患を引き起こさないことが明らかである。なぜなら、明白な自発的な疾患の発生には６ケ月かかるからである。ＶＥＧＦは、最初に、過形成性、漏出性、そして炎症性の皮膚脈管系を作り出し、これは、経時に、より拡散した皮膚炎症性状態を導く。炎症性の脈管系（ＩＣＡＭ−１およびＶＣＡＭ−１のような脈管接着分子における上昇を含む）は、おそらく、皮膚への炎症性細胞の管外遊出を促進し、これは、そのプロセスにそれら自身のサイトカインおよびケモカインメディエーターを与える。漏出性の脈管によって促進されるこの炎症性浸潤および組織浮腫は、皮膚の正常な障壁機能を十分に損ない得、内因性抗原の侵入および免疫状態のさらなる悪化を可能にする。結局、次いで、多様な炎症性環境の創出が、二次的に、表皮変化を導き得、これは、出願人のモデルにおける最初の脈管および炎症変化に続いて生じるようである。興味深いことに、出願人のモデルにおける慢性的に上昇したＶＥＧＦが素因を作り出し、この素因が次いで、おそらく、ある分類の炎症および増殖因子メディエーターが関与する非常に複雑なセットの病理学を生じるように進化するものの、この異常な状態の維持は、ＶＥＧＦに依存したままである。なぜなら、出願人は、この過程における後期のＶＥＧＦ遮断が、観測される病理学のほとんど全てを効果的に逆転させ得ることを示すからである。
【０２２４】
ＶＥＧＦのトラスジェニックによる過剰発現が、結果的に、どのようにマウスにおいて乾癬状状態を導くかについての詳細はまだ理解されていないものの、出願人のモデルがどれだけ正確にヒト乾癬を最終的に模倣するかが顕著である。従って、ヒト疾患の発生の理解に対する潜在的なアプローチとしてこのモデルにおける事象の進行を研究し続けることは非常に価値があるようであり、そしてＶＥＧＦがヒト乾癬において鍵となる原因となる役割を果たし得るという暗示を無視することは不可能であるようである。出願人の知見は、ＶＥＧＦが乾癬表現型の進化において鍵の成分であり、そしてＶＥＧＦの抑制および随伴する炎症が、ヒトにおける乾癬の処置において意味を有し得ることを示唆する。炎症応答および引き続く表皮過剰増殖を制御することを試みる従来の処置は、免疫抑制および抗増殖に頼り、そしてしばしば、完全な消散なしに、かなりの毒性を含む。過形成脈管表現型の排除およびヒト乾癬における関連する炎症状態を抑制するための、特定のＶＥＧＦアンタゴニスト（例えば、新規なＶＥＧＦＲ１Ｒ２−ＦｃΔＣ１（ａ）分子）の使用は、最小の有害な副作用での新規な治療戦略を提供する。
【０２２５】
乾癬の最初の代表的なトランスジェニックモデルを作製し、そしてこの疾患に対する新規な病因および処置アプローチを提案することに加えて、出願人の知見は、前脈管形成（ｐｒｏ−ａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ）の目的（特に、その深在性の前炎症（ｐｒｏ−ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ）能力に関して）のためにＶＥＧＦを治療的に送達する試みと関連し得る有害な影響についての関心を上昇させ続ける。
【０２２６】
（実施例３６：創傷治癒についての新規な動物モデルにおけるＶＥＧＦＲ１Ｒ２−ＦｃΔＣ１（ａ）の効果）
（序論）
初期段階の創傷治癒の間、新規な顆粒組織は、損傷の約４日後に形成し始める。線維芽細胞および細胞外マトリクスタンパク質に沿った多くの新たな毛細管が、創傷空間内に移動する（Ｈｕｎｔ  ＴＫ，１９８０，Ｗｏｒｌｄ  Ｊ  Ｓｕｒｇ  ４（３）：２７１−７）。新生血管形成は、細胞代謝を維持するために必要な酸素および栄養を提供する。実際、適切な新規な血管形成は、創傷治癒の正常な過程に重要であるようである。しかし、創傷治癒に関連する脈管形成を刺激する増殖因子ならびにその役におけるもとにある分子機構は、つかみ所がないままである。
【０２２７】
ＶＥＧＦ（潜在的な血管形成因子）は、強力な血管透過性（ｖａｓｏｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ）活性を有し（Ｄｖｏｒａｋ  ＨＦら、１９９５，Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ  １４６（５）：１０２９−３９）、そして創傷治癒の間、表皮によって大量に産生される（Ｂｒｏｗｎ  ＬＦら、１９９２，Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ１；１７６（５）：１３７５−９）。従って、出願人は、出願人の新規なマウス切除創傷治癒モデルを使用して、創傷治癒におけるＶＥＧＦの潜在的な役割を研究することを決定した。
【０２２８】
（方法）
（Ａ．マウス切除創傷治癒モデル）
新規の創傷治癒モデルを、マウスの耳の背面の皮膚に切除創傷を導入することにより作製した。約２５〜３０ｇの体重の雌ＦＶＢマウス（Ｔａｃｏｎｉｃ、ＮＹ）を、この実験に使用した。動物を、標準的な条件下で収容し、そして食料および水を無制限に与えた。術後に、動物を、標準的な条件下にて個々のゲージに収容し、そして治癒の徴候を毎日チェックした。腹腔内注射を通じてケタミン（２００ｍｇ／ｋｇ）およびキシラジン（１０ｍｇ／ｋｇ）を用いてマウスを麻酔した。電気バリカンを用いて、マウスの耳の皮膚の毛髪を、やさしく剃った。標準的な脱毛剤を適用し、残りの毛髪を除去し、そしてＰＢＳおよびベタジンを用いて、曝された皮膚を洗浄した。１つの十分な厚みの環状の創傷を、各々の耳に作製した。裸の軟骨まで延びる切除を、４ｍｍの生検パンチ（Ｃｌａｒｋ、ＮＹ）により行い、その後、マイクロナイフ（Ｒｏｂｏｚ、ＭＤ）を用いて解剖した。ニックを、耳の軟骨上に作製し、創傷源に印しをつけた。全ての創傷を、収集するまで閉塞用ポリウレタン包帯（Ｔｅｇａｄｅｒｍ、３Ｍ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）で覆った。収集の際に、動物を、ケタミンおよびキシラジンの致死量の腹腔内注射により安楽死させた。創傷を二等分し、そして組織学的に分析した。下層の軟骨により固定されたこれらの創傷を最小限に。全ての年齢および性別の一致した創傷における再上皮化率、十分な再上皮化の割合、および新規の肉芽形成組織の形成を、コンピューター支援画像分析プログラムＯｓｔｅｏｍｅａｓｕｒｅ（Ｏｓｔｅｏｍｅｔｒｉｃｓ，Ｉｎｃ．Ａｔｌａｎｔａ、ＧＡ）により測定した。
【０２２９】
（Ｂ）
組織調製、組織学、およびＶＥＧＦＲ１Ｒ２−ＦｃΔＣ１（ａ）注射を、上記の実施例３５と同様に実施した。
【０２３０】
（結果）
（Ａ．Ｋ１４ＶＥＧＦトランスジェニックマウスにおける創傷治癒）
１つの創傷を、ホモ接合性のＫ１４ＶＥＧＦトランスジェニックマウスの各々の耳に導入した。創傷を、術後３日目、７日目、および１０日目に収集した。凍結切片を、形態分析のために、Ｈ＆Ｅで染色した。創傷組織を、コンピューター支援画像化プログラムＯｓｔｅｏｍｅａｓｕｒｅ（Ｏｓｔｅｏｍｅｔｒｉｃｓ，Ｉｎｃ．Ａｔｌａｎｔａ、ＧＡ）を用いて肉芽形成組織形成および新生上皮形成について定量した。３月齢のＫ１４ＶＥＧＦトランスジェニックマウスにおいて、肉芽形成組織形成は、年齢の一致する野生型同腹仔コントロールマウスと比較して、ＰＯＤ３において３７．８％（Ｐ＜０．０５）損なわれた。
【０２３１】
（Ｂ．正常マウスにおける創傷治癒に対するＶＥＧＦＲ１Ｒ２−ＦｃΔＣ１（ａ）の効果）
上記のように、マウス皮膚におけるＶＥＧＦの過剰発現は、恐らく、過剰な炎症応答および水腫に起因して、創傷治癒を遅らせる。しかし、この実験において、２５ｍｇ／ｋｇのＶＥＧＦＲ１Ｒ２−ＦｃΔＣ１（ａ）を投与することによる、正常ＦＶＢマウス創傷における内因性ＶＥＧＦの遮断は、有意な様式で創傷治癒に影響を及ぼさない。このことは、効果的に治癒しない傾向のある慢性的な創傷におけるＶＥＧＦの高レベルの発現と比較して、「正常」な創傷における相対的に低レベルの発現に起因し得る。これらの観察に基づき、本出願人らは、ＶＥＧＦＲ１Ｒ２−ＦｃΔＣ１（ａ）が、炎症および水腫のダウンレギュレーションによりＶＥＧＦが過剰発現されている臨床状況において創傷治癒を改善および増強する上で有用であることを主張する。
【図面の簡単な説明】
【０２３２】
【図１】図１は、未改変Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃタンパク質およびアセチル化Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃタンパク質のＩＥＦゲル分析を示す。未改変Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃタンパク質は、ｐｌが９．３よりも高いので、このゲルに侵入することができないが、アセチル化Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃは、ｐｌが５．２で平衡化するので、このゲルに侵入することができる。
【図２】図２は、未改変Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃタンパク質およびアセチル化Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃタンパク質の、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）でコーティングされたプレートへの結合を示す。未改変Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃタンパク質は、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）中の細胞外マトリクスに広範囲で結合するが、アセチル化Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃタンパク質は、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）中の細胞外マトリクスに結合しない。
【図３】図３は、Ｂｉａｃｏｒｅベースのアッセイにおける、未改変Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃ、アセチル化Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃタンパク質、およびペグ化Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃの結合を示す。アセチル化Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃ（欄１３〜１６）、ペグ化Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃ（欄１７〜２０）、およびヘパリン処理されたＦｌｔ１（１−３）−Ｆｃ（欄２１〜２４）は各々、コントロール（欄１〜４）および関連性なし（欄５〜８）と比較した場合、ＶＥＧＦ結合について、Ｂｉａｃｏｒｅチップ結合（Ｂｉａｃｏｒｅ  ｃｈｉｐ−ｂｏｕｎｄ）Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃと完全に競合し得る。未改変Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃ（欄５〜６）は、ＶＥＧＦ結合について、Ｂｉａｃｏｒｅチップ結合Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃと部分的にのみ競合するようである。しかしながら、この結合サンプルを０．５ＭのＭａＣｌ（欄７〜８）で洗浄することにより、改変形態のＦｌｔ１（１−３）−Ｆｃと類似の結合プロフィールが得られる。このことは、未改変タンパク質が、塩で洗浄によって除去され得るチップへの非特異的な結合を示すことを示している。
【図４】図４は、ＥＬＩＳＡベースのアッセイにおける、未改変Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃ、アセチル化Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃ、およびペグ化Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃの、ＶＥＧＦへの結合を示す。ペグ化Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃタンパク質とアセチル化Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃタンパク質の両方が、未改変Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃの親和性に近い親和性を伴って、ＶＥＧＦに結合する。
【図５】図５は、未改変Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃ、アセチル化Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃ、およびペグ化Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃの薬物動態学的プロフィールを示す。Ｂａｌｂ／ｃマウス（２３〜２８ｇ）に、４ｍｇ／ｋｇの、未改変Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃ、アセチル化Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃ、またはペグ化Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃを皮下注射した。タンパク質の注射から１時間後、２時間後、４時間後、６時間後、２４時間後、２日後、および３日後に、これらのマウスの尾から血を採取し、この血清を、Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃタンパク質を検出するように設計した標準的なＥＬＩＳＡベースのアッセイにおいてアッセイした。全てのＦｌｔ１（１−３）−Ｆｃタンパク質についてのＴｍａｘ値は、６時間と２４時間との間の時間点であった。異なるタンパク質についてのＣｍａｘ値は、以下の通りであった：未改変：０．０６μｇ／ｍｌ〜０．１５μｇ／ｍｌ；アセチル化：１．５μｇ／ｍｌ〜４．０μｇ／ｍｌ；およびペグ化：およそ５μｇ／ｍｌ。
【図６】図６Ａ〜６Ｂは、未改変Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃタンパク質および段階的なアセチル化Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃタンパク質のＩＥＦゲル分析を示す。未改変Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃタンパク質は、ｐｌが９．３よりも高いので、このゲルに侵入することができないが、段階的なアセチル化Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃサンプルのほとんど（３０〜１００倍の過剰サンプル）は、ｐｌの範囲が４．５５〜８．４３で平衡化するので（アセチル化の程度に依存する）、このゲル内に移動することができた。
【図７】図７は、未改変Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃタンパク質および段階的なアセチル化Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃの、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）でコーティングされたプレートへの結合を示す。関連性の内コントロールタンパク質を有する場合、ｒＴｉｅ２−Ｆｃ、段階的なアセチル化Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃタンパク質（２０および３０倍の過剰サンプル）は、このＭａｔｒｉｇｅｌでコーティングされたプレートへの結合を全く示さないが、非アセチル化Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃタンパク質は、有意な結合を示す。１０倍の過剰サンプルが、結合の低下を示すが、このアセチル化の程度は、細胞外マトリクス成分への結合を完全にブロックするには十分でない。
【図８】Ｂｉａｃｏｒｅベースのアッセイにおける、未改変Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃおよび段階的アセチル化Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃの結合。化学量論未満の比率（未改変Ｆｌｔ１（１−３）または段階的アセチル化Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃのいずれか０．５μｇ／ｍｌ  対  ０．２μｇ／ｍｌのＶＥＧＦ）では、溶液中には、ＶＥＧＦと完全に結合するに十分なＦｌｔ１（１−３）−Ｆｃ（未改変または段階的アセチル化の両方）は存在しない。１．０μｇ／ｍｌ（約１：１の化学量論比率）では、未改変Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃおよび段階的アセチル化Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃの両方が、ＶＥＧＦ結合についてより競合できるが、利用可能なＶＥＧＦを完全に飽和するには、Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃタンパク質（未改変または段階的アセチル化の両方）は、なお不十分である。しかし、５．０μｇ／ｍｌ（１：１より数倍大きい化学量論比率）では、Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃタンパク質および段階的アセチル化Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃタンパク質の両方が、アセチル化の程度に関わらず、ＶＥＧＦを飽和できる。
【図９】未改変Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃおよび段階的アセチル化Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃの薬物動態プロフィール。Ｂａｌｂ／ｃマウス（２３〜２８ｇ）に、４ｍｇ／ｋｇの未改変Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃ、または１０、２０、４０、６０および１００倍過剰な段階的アセチル化Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃで皮下注射した（未改変、１０、２０および４０倍過剰なサンプルについて３匹のマウス、ならびに６０および１００倍過剰なサンプルについて２匹のマウス）。これらのマウスを、注射の１、２、４、６、２４時間後、２日および３日後に、尾部で採血した。血清を、Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃを検出するために設計されたＥＬＩＳＡベースのアッセイにおいてアッセイした。試験した全てのＦｌｔ１（１−３）−Ｆｃタンパク質についてのＴｍａｘは、６時間目の時点であったが、Ｃｍａｘは、以下の通りであった：未改変Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃ：０．０６μｇ／ｍｌ；１０倍過剰なサンプル：０．７μｇ／ｍｌ；２０倍過剰なサンプル：２μｇ／ｍｌ；４０倍過剰なサンプル：４μｇ／ｍｌ；６０倍過剰なサンプル：２μｇ／ｍｌ；１００倍過剰なサンプル：１μｇ／ｍｌ。
【図１０】Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃの核酸配列および推定アミノ酸配列。
【図１１】Ｆｌｔ１の構造の模式図。
【図１２】Ｆｌｔ１のＩｇドメイン２およびＩｇドメイン３のアミノ酸配列の親水性分析。
【図１３】Ｍｕｔ１：Ｆｌｔ１（１−３ΔＢ）−Ｆｃの核酸配列および推定アミノ酸配列。
【図１４】Ｍｕｔ２：Ｆｌｔ１（２−３ΔＢ）−Ｆｃの核酸配列および推定アミノ酸配列。
【図１５】Ｍｕｔ３：Ｆｌｔ１（２−３）−Ｆｃの核酸配列および推定アミノ酸配列。
【図１６】Ｍｕｔ４：Ｆｌｔ１（１−３Ｒ−＞Ｎ）−Ｆｃの核酸配列および推定アミノ酸配列。
【図１７】Ｂｉａｃｏｒｅベースのアッセイにおける、未改変Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃタンパク質、塩基性領域欠失変異体Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃタンパク質およびＦｌｔ１（１−３）Ｒ−＞Ｎ変異体タンパク質の結合。化学量論未満の比率（未改変、アセチル化または遺伝的改変サンプルの、０．２５μｇ／ｍｌのＦｌｔ１（１−３）−Ｆｃ  対  ０．１μｇ／ｍｌのＶＥＧＦ）では、Ｂｉａｃｏｒｅチップ上に固定されたＦｌｔ１（１−３）−Ｆｃに対するＶＥＧＦの結合をブロックするに十分なＦｌｔ１（１−３）−Ｆｃタンパク質は存在しない。０．５μｇ／ｍｌの未改変、アセチル化または遺伝的改変Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃタンパク質では、化学量論比率は約１：１であり、Ｂｉａｃｏｒｅチップに対するＶＥＧＦの結合をブロックする増大した能力が存在する。１．０μｇ／ｍｌの未改変、アセチル化または遺伝的改変Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃタンパク質（約１０：１の化学量論比率）では、Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃタンパク質は、Ｂｉａｃｏｒｅチップに対するＶＥＧＦの結合をブロックことができるが、これらは、等価ではない。未改変、アセチル化およびＭｕｔ１：Ｆｌｔ１（１−３ΔＢ）−Ｆｃは、そのＶＥＧＦ結合をブロックする能力が実質的に等しいが、Ｍｕｔ４：Ｆｌｔ１（１−３Ｒ−＞Ｎ）−Ｆｃは、結合のブロックにおいて、いくらか有効性が低い。
【図１８】未改変Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃ、Ｍｕｔ１：Ｆｌｔ１（１−３ΔＢ）−Ｆｃ、Ｍｕｔ２：Ｆｌｔ１（２−３ΔＢ）−ＦｃおよびＦｌｔ１（２−３）変異体タンパク質の、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）コーティングプレートへの結合。未改変Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃタンパク質は、これらのウェルに強力に結合し、Ｍｕｔ３：Ｆｌｔ１（２−３）−Ｆｃタンパク質は、いくらかより弱く結合し、Ｍｕｔ１：Ｆｌｔ１（１−３ΔＢ）−Ｆｃタンパク質は、さらにより弱く結合し、Ｍｕｔ２：Ｆｌｔ１（２−３ΔＢ）−Ｆｃタンパク質は、最良のプロフィールを示し、他の変異体タンパク質のいずれよりも、より弱い結合を示す。Ｍｕｔ４：Ｆｌｔ１（１−３Ｒ−＞Ｎ）−Ｆｃグリコシル化変異体タンパク質は、Ｍａｔｒｉｇｅｌアッセイに対して、僅かな利点のみを示す。
【図１９】未改変Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃ、Ｍｕｔ１：Ｆｌｔ１（１−３ΔＢ）−Ｆｃ、Ｍｕｔ２：Ｆｌｔ１（２−３ΔＢ）−ＦｃおよびＦｌｔ１（２−３）変異体タンパク質の、ＥＬＩＳＡベースのアッセイにおける結合。試験した濃度で、未改変Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃ、Ｍｕｔ１：Ｆｌｔ１（１−３ΔＢ）−Ｆｃ、Ｍｕｔ２：Ｆｌｔ１（２−３ΔＢ）−ＦｃおよびＦｌｔ１（２−３）変異体タンパク質は、ＶＥＧＦに対して同様に結合する。
【図２０】未改変Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃ、Ｍｕｔ１：Ｆｌｔ１（１−３ΔＢ）−Ｆｃ、Ｍｕｔ２：Ｆｌｔ１（２−３ΔＢ）−ＦｃおよびＦｌｔ１（２−３）変異体タンパク質の薬物動態プロフィール。これらの試薬についてのＣｍａｘは、以下の通りであった：未改変Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃ：０．１５μｇ／ｍｌ；４０倍のモル濃度過剰のアセチル化Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃ：１．５μｇ／ｍｌ；およびＭｕｔ１：Ｆｌｔ１（１−３ΔＢ）−Ｆｃ：０．７μｇ／ｍｌ。
【図２１Ａ】Ｆｌｔ１Ｄ２．Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）と称される改変Ｆｌｔ１レセプターのヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列。
【図２１Ｂ】Ｆｌｔ１Ｄ２．Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）と称される改変Ｆｌｔ１レセプターのヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列。
【図２１Ｃ】Ｆｌｔ１Ｄ２．Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）と称される改変Ｆｌｔ１レセプターのヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列。
【図２２Ａ】Ｆｌｔ１Ｄ２．ＶＥＧＦＲ３Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）と称される改変Ｆｌｔ１レセプターのヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列。
【図２２Ｂ】Ｆｌｔ１Ｄ２．ＶＥＧＦＲ３Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）と称される改変Ｆｌｔ１レセプターのヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列。
【図２２Ｃ】Ｆｌｔ１Ｄ２．ＶＥＧＦＲ３Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）と称される改変Ｆｌｔ１レセプターのヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列。
【図２３】細胞外マトリックス（ＥＣＭ）アッセイ。このアッセイの結果は、Ｆｌｔ１Ｄ２．Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）タンパク質およびＦｌｔ１Ｄ２．ＶＥＧＦＲ３Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）タンパク質が、Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃタンパク質と比較して、ＥＭＣに対してかなり粘着性が低いことを実証する。
【図２４Ａ】ＶＥＧＦＲ１Ｒ２−ＦｃΔＣ１（ａ）と称される改変Ｆｌｔ１レセプターのヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列。
【図２４Ｂ】ＶＥＧＦＲ１Ｒ２−ＦｃΔＣ１（ａ）と称される改変Ｆｌｔ１レセプターのヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列。
【図２５Ａ】リン酸化アッセイ。Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃ、Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃ（Ａ４０）または一過性Ｆｌｔ１Ｄ２Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）のいずれかの、１．５モル濃度過剰では、コントロールの培地チャレンジと比較して、これら３つの改変Ｆｌｔ１レセプターによるレセプター刺激の完全なブロックが存在する。対照的に、一過性Ｆｌｔ１Ｄ２ＶＥＧＦＲ３Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）は、ＶＥＧＦポジティブのコントロールチャレンジと比較して、このモル濃度過剰では、有意なブロックを示さない。
【図２５Ｂ】類似の結果が、図２５Ｂにおいて見られ、ここで、改変Ｆｌｔレセプターは、ＶＥＧＦ１６５リガンドに対して３倍のモル濃度過剰で存在する。
【図２５Ｃ】改変Ｆｌｔ１レセプターがＶＥＧＦ１６５リガンドに対して６倍のモル濃度過剰で存在する、図２５Ｃにおいて、一過性Ｆｌｔ１Ｄ２ＶＥＧＦＲ３Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）は、ここで、細胞表面レセプターのＶＥＧＦ１６５誘導性刺激を部分的にブロックすることが示され得る。
【図２６】リン酸化アッセイ。ＶＥＧＦ１６５リガンド刺激によるチロシンリン酸化ＶＥＧＦＲ２（Ｆｌｋ１）の、ウェスタンブロットによる検出は、細胞表面レセプターが、一過性Ｆｌｔ１Ｄ２Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）、安定なＦｌｔ１Ｄ２Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）または一過性ＶＥＧＦＲ１Ｒ２−ＦｃΔＣ１（ａ）のいずれかの、１および２倍のモル濃度過剰（図２６Ａ）または３および４倍のモル濃度過剰（図２６Ｂ）と共にＶＥＧＦ１６５をプレインキュベートしたチャレンジサンプルによって、リン酸化されないことを示す。試験した全ての改変Ｆｌｔ１レセプター濃度で、プレインキュベーションの間にＶＥＧＦ１６５リガンドの完全な結合が存在し、コントロールの培地チャレンジと比較して、未結合ＶＥＧＦ１６５による細胞表面レセプターの検出可能な刺激を生じない。
【図２７】ＭＧ／Ｒ２細胞増殖アッセイ。以下の改変Ｆｌｔレセプター（Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃ、Ｆｌｔ１Ｄ２．Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）およびＦｌｔ１Ｄ２．ＶＥＧＦＲ３Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ））ならびにネガティブコントロールとしてのＴｉｅ２−Ｆｃと称される不適切なレセプターを、４０ｎＭ〜２０ｐＭまで滴定し、そして細胞上で３７℃にて１時間インキュベートした。次いで、規定された培地中のヒト組換えＶＥＧＦ１６５を、１．５６ｎＭの濃度で、全てのウェルに添加した。ネガティブコントロールレセプターＴｉｅ２−Ｆｃは、いずれの濃度でも、ＶＥＧＦ１６５誘導性の細胞増殖をブロックしないが、Ｆｌｔ１Ｄ２．Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）は、０．８ｎＭの半最大用量で、１．５６ｎＭ  ＶＥＧＦ１６５をブロックする。Ｆｌｔ１（１−３）−ＦｃおよびＦｌｔ１Ｄ２．ＶＥＧＦＲ３Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）は、約２ｎＭの半最大用量で、このアッセイにおいてＶＥＧＦ１６５をブロックするにあまり有効ではない。ＶＥＧＦ１６５単独は、１．２の吸光度単位の読み取りを与え、そのバックグラウンドは、０．３８吸光度単位である。
【図２８】結合化学量論のＢｉａｃｏｒｅ分析。１ｎｇ／ｍｌと等価な１０００ＲＵの変換計数を使用して、結合化学量論を、固定したＦｌｔ１Ｄ２Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）またはＶＥＧＦＲ１Ｒ２−ＦｃΔＣ１（ａ）に結合したＶＥＧＦ１６５のモル濃度比として算定した。これらの結果は、Ｆｌｔ１Ｄ２Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）分子またはＶＥＧＦＲ１Ｒ２−ＦｃΔＣ１（ａ）分子１つ当たり、１つのＶＥＧＦ１６５二量体分子の結合化学量論を示した。
【図２９】サイズ排除クロマトグラフィー化学量論。１ｎＭの濃度のＦｌｔ１Ｄ２Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）またはＶＥＧＦＲ１Ｒ２−ＦｃΔＣ１（ａ）（Ｆｌｔ１Ｄ２Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）またはＶＥＧＦＲ１Ｒ２−ＦｃΔＣ１（ａ）／ＶＥＧＦ１６５相互作用のＫＤよりも１０００倍高いと見積もられる）を、種々の濃度のＶＥＧＦ１６５と混合した。インキュベーション後、溶液中の遊離Ｆｌｔ１Ｄ２Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）の濃度を測定した。このデータは、Ｆｌｔ１Ｄ２Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）溶液中への１ｎＭ  ＶＥＧＦ１６５の添加が、ＶＥＧＦ１６５表面に対するＦｌｔ１Ｄ２Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）の結合を完全にブロックすることを示す。この結果は、１つのＦｌｔ１Ｄ２Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）分子当たり、１つのＶＥＧＦ１６５分子の結合化学量論を示唆した。
【図３０】サイズ排除クロマトグラフィー化学量論。１ｎＭの濃度のＦｌｔ１Ｄ２Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）またはＶＥＧＦＲ１Ｒ２−ＦｃΔＣ１（ａ）（Ｆｌｔ１Ｄ２Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）またはＶＥＧＦＲ１Ｒ２−ＦｃΔＣ１（ａ）／ＶＥＧＦ１６５相互作用のＫＤよりも１０００倍高いと見積もられる）を、種々の濃度のＶＥＧＦ１６５と混合した。インキュベーション後、溶液中の遊離Ｆｌｔ１Ｄ２Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）の濃度を測定した。このデータは、Ｆｌｔ１Ｄ２Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）溶液中への１ｎＭ  ＶＥＧＦ１６５の添加が、ＶＥＧＦ１６５表面に対するＦｌｔ１Ｄ２Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）の結合を完全にブロックすることを示す。この結果は、１つのＦｌｔ１Ｄ２Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）分子当たり、１つのＶＥＧＦ１６５分子の結合化学量論を示唆した。
【図３１】ネイティブ条件下でのサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）。ピーク＃１は、Ｆｌｔ１Ｄ２Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）／ＶＥＧＦ１６５複合体を示し、そしてピーク＃２は、未結合のＶＥＧＦ１６５を示す。１．１ｍｌと１．２ｍｌとの間で溶出された画分を合わせ、そして塩酸グアニジニウム（ＧｕＨＣｌ）を、最終濃度４．５Ｍまで添加して、この複合体を解離させた。
【図３２】解離条件下でのサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）。レセプター−リガンド複合体の成分を分離し、そしてそれらのモル濃度比を決定するために、５０μｌの解離した複合体を、６Ｍ  ＧｕＨＣｌ中で平衡化したＳｕｐｅｒｏｓｅ  １２  ＰＣ  ３．２／３０上にロードし、そして溶出した。ピーク＃１は、Ｆｌｔ１Ｄ２Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）を示し、そしてピーク＃２は、ＶＥＧＦ１６５を示す。
【図３３】オンライン光散乱を用いる、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）。サイズ排除クロマトグラフィーカラムを、ＭｉｎｉＤａｗｎオンライン光散乱検出器（Ｗｙａｔｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｓａｎｔａ  Ｂａｒｂａｒａ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）および屈折率（ＲＩ）検出器（Ｓｈｉｍａｄｚｕ、Ｋｙｏｔｏ、Ｊａｐａｎ）と共に使用して、レセプター−リガンド複合体の分子量（ＭＷ）を決定した。図３３に示されるように、溶出プロフィールは、２つのピークを示す。ピーク＃１は、レセプター−リガンド複合体を示し、そしてピーク＃２は、未結合のＶＥＧＦ１６５を示す。ＭＷを、ＬＳおよびＲＩシグナルを用いて算定した。同じ手順を使用して、レセプター−リガンド複合体の個々の成分のＷＭを決定した。これらの決定の結果は、以下の通りである：ピーク位置でのＦｌｔ１Ｄ２Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）／ＶＥＧＦ１６５複合体のＭＷは、１５７  ３００である。
【図３４】オンライン光散乱を用いる、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）。サイズ排除クロマトグラフィーカラムを、ＭｉｎｉＤａｗｎオンライン光散乱検出器（Ｗｙａｔｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｓａｎｔａ  Ｂａｒｂａｒａ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）および屈折率（ＲＩ）検出器（Ｓｈｉｍａｄｚｕ、Ｋｙｏｔｏ、Ｊａｐａｎ）と共に使用して、レセプター−リガンド複合体の分子量（ＭＷ）を決定した。図３３に示されるように、溶出プロフィールは、２つのピークを示す。ピーク＃１は、レセプター−リガンド複合体を示し、そしてピーク＃２は、未結合のＶＥＧＦ１６５を示す。ＭＷを、ＬＳおよびＲＩシグナルを用いて算定した。同じ手順を使用して、レセプター−リガンド複合体の個々の成分のＷＭを決定した。これらの決定の結果は、以下の通りである：ピーク位置でのＶＥＧＦ１６５のＭＷは、４４  ３９０である。
【図３５】オンライン光散乱を用いる、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）。サイズ排除クロマトグラフィーカラムを、ＭｉｎｉＤａｗｎオンライン光散乱検出器（Ｗｙａｔｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｓａｎｔａ  Ｂａｒｂａｒａ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）および屈折率（ＲＩ）検出器（Ｓｈｉｍａｄｚｕ、Ｋｙｏｔｏ、Ｊａｐａｎ）と共に使用して、レセプター−リガンド複合体の分子量（ＭＷ）を決定した。図３３に示されるように、溶出プロフィールは、２つのピークを示す。ピーク＃１は、レセプター−リガンド複合体を示し、そしてピーク＃２は、未結合のＶＥＧＦ１６５を示す。ＭＷを、ＬＳおよびＲＩシグナルを用いて算定した。同じ手順を使用して、レセプター−リガンド複合体の個々の成分のＷＭを決定した。これらの決定の結果は、以下の通りである：ピークでのＲ１Ｒ２のＭＷは、１１３  ３００である。
【図３６】ペプチドマッピングおよびグリコシル化分析。Ｆｌｔ１Ｄ２．Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）中のジスルフィド構造およびグリコシル化部位を、ペプチドマッピング法によって決定した。Ｆｌｔ１Ｄ２．Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）中には、全部て１０個のシステインが存在する；これらのうち６個は、Ｆｃ領域に属する。Ｃｙｓ２７は、Ｃｙｓ７６とジスルフィド結合する。Ｃｙｓ１２１は、Ｃｙａ１８２とジスルフィド結合する。Ｆｃ領域中の最初の２つのシステイン（Ｃｙｓ２１１およびＣｙｓ２１４）は、別のＦｃ鎖中の同じ２つのシステインと、分子間ジスルフィド結合を形成する。しかし、同じシステイン（例えば、Ｃｙｓ２１１とＣｙｓ２１１）間、またはＣｙａ２１１とＣｙｓ２１４との間にジスルフィド結合が存在するかは、決定できない。Ｃｙｓ２１６は、Ｃｙｓ３０６とジスルフィド結合する。Ｃｙｓ３５２は、Ｃｙｓ４１０とジスルフィド結合する。Ｆｌｔ１Ｄ２．Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）中には、５つの潜在的なＮ連結グリコシル化部位が存在し、種々の程度までグリコシル化されることが見出されている。完全なグリコシル化は、Ａｓｎ３３、Ａｓｎ１９３およびＡｓｎ２８２上で観察される。部分的なグリコシル化は、Ａｓｎ６５およびＡｓｎ１２０上で観察される。グリコシル化部位は、図中で下線によって強調される。
【図３７】Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃ（Ａ４０）、Ｆｌｔ１Ｄ２．Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）およびＶＥＧＦＲ１Ｒ２−ＦｃΔＣ１（ａ）の薬物動態。Ｂａｌｂ／ｃマウスに、４ｍｇ／ｋｇの、Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃ（Ａ４０）、ＣＨＯ一過性発現Ｆｌｔ１Ｄ２．Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）、ＣＨＯ安定発現Ｆｌｔ１Ｄ２．Ｆｌｋ１  Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）、およびＣＨＯ一過性発現ＶＥＧＦＲ１Ｒ２−ＦｃΔＣ１（ａ）が、皮下に注射した。このマウスを、注射の１時間後、２時間後、４時間後、６時間後、２４時間後、２日後、３日後および６日後において尾部から採血した。この血清を、Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃ（Ａ４０），Ｆｌｔ１Ｄ２．Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）または  ＶＥＧＦＲ１Ｒ２−ＦｃΔＣ１（ａ）を検出するために設計されたＥＬＩＳＡにおいてアッセイした。Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃ（Ａ４０）についてのＴｍａｘは、６時間であったが、一過性および安定性のＦｌｔ１Ｄ２．Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）ならびに一過性のＶＥＧＦＲ１Ｒ２−ＦｃΔＣ１（ａ）についてのＴｍａｘは、２４時間であった。Ｆｉｔ１（１−３）−Ｆｃ（Ａ４０）についてのＣｍａｘは、８μｇ／ｍｌであり、両方の一過性（Ｆｌｔ１Ｄ２．Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）およびＶＥＧＦＲ１Ｒ２−ＦｃΔＣ１（ａ））について、このＣｍａｘは、１８μｇ／ｍｌであり、安定性ＶＥＧＦＲ１Ｒ２−ＦｃΔＣ１（ａ）についてのＣｍａｘは、３０μｇ／ｍｌであった。
【図３８】Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃ（Ａ４０）、Ｆｌｔ１Ｄ２．Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）およびＦｌｔ１Ｄ２．ＶＥＧＦＲ３Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）の薬物動態。Ｂａｌｂ／ｃマウスに、４ｍｇ／ｋｇの、Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃ（Ａ４０）、ＣＨＯ一過性発現Ｆｌｔ１Ｄ２．Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）およびＣＨＯ一過性発現Ｆｌｔ１  Ｄ２．ＶＥＧＦＲ３Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）を皮下注射した。このマウスは、注射の、１日後、２日後、５日後、６日後、７日後、８日後、１２日後、１５日後、および２０日後において尾部から採血した。この血清が、Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃ、Ｆｌｔ１Ｄ２．Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）およびＦｌｔ１Ｄ２．ＶＥＧＦＲ３Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）を検出するために設計されたＥＬＩＳＡにおいてアッセイされた。Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃ（Ａ４０）は、もはや、第５日目後の血清において検出されなかったが、Ｆｌｔ１Ｄ２．Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）およびＦｌｔ１Ｄ２．ＶＥＧＦＲ３Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）は、１５日間以上にわたって検出可能であった。
【図３９】図３９は、Ｆｌｔ１Ｄ２．Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）がＨＴ−１０８０線維肉腫の腫瘍増殖をインビボで阻害する能力を示す。隔日または１週間に２回で、２５ｍｇ／Ｋｇにて、Ｆｌｔ１Ｄ２．Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）を用いたＳＣＩＤマウスの処置により、皮下のＨＴ−１０８０線維肉腫の腫瘍増殖が低減される。
【図４０】図４０は、Ｃ６神経膠腫の腫瘍増殖をインビボで有意に阻害するＦｌｔ１Ｄ２．Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）の能力を示す。隔日または１週間に２回の、Ｆｌｔ１Ｄ２．Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）を用いたＳＣＩＤマウスの処置によって、２．５ｍｇ／Ｋｇほどの低用量で、皮下のＣ６神経膠腫の腫瘍増殖が有意に減少した。
【図４１】図４１は、ＶＥＧＦ誘導性子宮過透過性（Ｈｙｐｅｒｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ）を示す。春機発動期前の雌性ラットにおいて排卵を誘導するために皮下に注射されたＰＭＳＧ（５ＩＵ）によって、２日後に、順次、子宮内でのＶＥＧＦの誘導を生じるエストラジオールのサージを生じる。この誘導によって、この子宮の過透過性が生じ、そして、子宮湿性（ｕｔｅｒｉｎｅ  ｗｅｔ）における増加が生じる。ＰＭＳＧ注射の１時間後での、２５ｍｇ／ｋｇで、Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃ（Ａ４０）、Ｆｌｔ１Ｄ２．Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）およびＦｌｔ１Ｄ２．ＶＥＧＦＲ３Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）の皮下注射によって、子宮湿性の重量の増加における約５０％の阻害が生じる。
【図４２】図４２Ａおよび図４２Ｂは、読み出し（Ｒｅａｄｏｕｔ）としてプロゲステロンを使用する黄体新脈管形成の評価を示す。ＰＭＳＧを、春機発動期前の雌性ラットにおいて排卵を誘導するために皮下注射（５ＩＵ）して、血流中へとプロゲステロンを分泌して、着床のために子宮を準備する血管の緊密なネットワークを含む完全に機能する黄体を生じた。この黄体中の新脈管形成の誘導は、ＶＥＧＦを必要とする。静止レベルのプロゲステロンは、約５ｎｇ／ｍｌであり、そして、このプロスゲステロンは、ＰＭＳＧ後に２５〜４０ｎｇ／ｍｌまで誘導され得る。ＰＭＳＧの１時間後に、２５ｍｇ／ｋｇまたは５ｍｇ／ｋｇでの、Ｆｌｔ１（１−３）Ｆｃ（Ａ４０）またはＦｌｔ１Ｄ２．Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）の皮下注射によって、第４日目におけるプロゲステロン誘導の完全な阻害を生じた。
【図４３】図４３は、Ｋ１４ＶＥＧＦトランスジェニックマウスの巨視的表現型を示す。誕生から６ヶ月で、このマウスは、外耳および頭皮において重大な皮膚損傷を顕出した。この皮膚は、発赤、浮腫、および落屑を呈するまでの顕著な板状鱗屑（錯角化症および過角化症）になる。
【図４４Ａ】図４４Ａは、Ｋ１４ＶＥＧＦトランスジェニックマウス由来の外耳皮の組織構造を示す。ヘマトキシリンおよびエオシンで染色した切片。コントロール、非トランスジェニック。
【図４４Ｂ】図４４Ｂは、Ｋ１４ＶＥＧＦトランスジェニックマウス由来の外耳皮の組織構造を示す。ヘマトキシリンおよびエオシンで染色した切片。３月齢のＫ１４ＶＥＧＦトランスジェニックマウス。
【図４４Ｃ】図４４Ｃは、Ｋ１４ＶＥＧＦトランスジェニックマウス由来の外耳皮の組織構造を示す。ヘマトキシリンおよびエオシンで染色した切片。６月齢のＫ１４ＶＥＧＦトランスジェニックマウス。過角化症および錯角化症の増進を伴う表皮の厚化に留意のこと（４０倍）。
【図４５】図４５は、比較的化膿している損傷における網様稜（Ｒｅｔｅｒｉｄｇｅ）形成を示す。マッソントリクロール染色。６月齢のＫ１４ＶＥＧＦトランスジェニックマウスは、劇的な網様稜を発達させ、その構造のうちのいくつかは、その基底部分と癒着してた。
【図４６Ａ】図４６Ａは、比較的化膿している損傷における微小膿瘍の形成を示す。６月齢のＫ１４ＶＥＧＦトランスジェニックマウス由来の皮膚切片のヘマトキシリンおよびエオシンの染色。モンロー微小膿瘍。
【図４６Ｂ】図４６Ｂは、比較的に化膿している損傷における、微小膿瘍の形成を示す。６月齢のＫ１４ＶＥＧＦトランスジェニックマウス由来の皮膚切片のヘマトキシリンおよびエオシンで染色。コゴイ微小膿瘍。
【図４７】図４７は、乾癬の動物モデルにおけるＶＥＧＦＲ１Ｒ２−ＦｃΔＣ１（ａ）の効果を示す。重篤な皮膚損傷を有するＫ１４ＶＥＧＦトランスジェニックマウスに、第０日目、第３日目、第７日目、および第１０日目において、ＶＥＧＦＲ１Ｒ２−ＦｃΔＣ１（ａ）（２５ｍｇ／ｋｇ）が注射され、そして、各注射後に写真が取られた。
【図４８】図４８Ａ〜図４８Ｉは、Ｋ１４ＶＥＧＦトランスジェニックマウスにおける過形成性血管および炎症した皮膚の血管を示す。野生型同腹子（図４８Ａ、図４８Ｄ、図４８Ｆおよび図４８Ｈ）の冷切片（ｃｒｙｏｓｅｃｔｉｏｎ）およびトランスジェニックマウス外耳皮（図４８Ｂ、図４８Ｃ、図４８Ｅ、図４８Ｇおよび図４８Ｉ）における免疫染色が実施された。ＰＥＣＡＭ染色によって、３月齢Ｋ１４ＶＥＧＦマウスの創傷誘導性乾癬での乳頭真皮において主に増大した血管密度が示された（図４８Ｂ）。６月齢のＫ１４ＶＥＧＦマウスの拡張した血管によって、表皮性網様稜を吻合することにより密閉されている血管が示された（図４８Ｃ）。Ｅ−セレクチン（図４８Ｄおよび図４８Ｅ）、ＶＣＡＭ−１（図４８Ｆおよび図４８Ｇ）およびＩＣＡＭ−１（図４８Ｈおよび図４８Ｉ）の免疫染色によって、皮膚の微細血管における陽性シグナルが示された（矢頭）。基底のケラチノサイトはまた、ＩＣＡＭ−１染色について陽性であった（矢印）。
【図４９】ＶＥＧＦＲ１Ｒ２−ＦｃΔＣ１（ａ）は、Ｋ１４ＶＥＧＦトランスジェニックマウスにおいて乾癬表現型を正常化する。重篤な皮膚の損傷を有するトランスジェニックマウスに、第０日目、第３日目、第７日目および第１０日目に、ＶＥＧＦＲ１Ｒ２−ＦｃΔＣ１（ａ）（２５ｍｇ／ｋｇ）を注射した。組織を、組織学的分析のために第１４日目において回収した。ＶＥＧＦＲ１Ｒ２−ＦｃΔＣ１（ａ）−処置したマウス外耳皮のＨ＆Ｅ染色によって、網様稜の明らかな分解（図４９Ａと４９Ｂとを比較）および減少した錯角化／過角化症（図４９Ｃおよび図４９Ｄを比較のこと）が示された。ＰＥＣＡＭを用いた免疫染色によって、乳頭真皮における微細血管の欠落（ｄｒｏｐ−ｏｆｆ）（図４９Ｅおよび図４９Ｆを比較のこと）が示された。ケラチンＫ６，Ｅ−セレクチンおよびＩＣＡＭ−１で免疫染色し、各々は、真皮（図４９Ｇおよび４９Ｆを比較のこと）、表皮の毛細血管（図４９Ｉおよび図４９Ｊを比較のこと）および基底ケラチノサイト（図４９Ｋおよび図４９Ｌを参照のこと）におけるシグナルの顕著なダウンレギュレーションを、それぞれ示した。ＣＤ８＋  Ｔ−リンパ球は、処置動物において、表皮から真皮へと局在をシフトした（図４９Ｍおよび図４９Ｎを比較のこと）。
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１Ａ】
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【図２１Ｂ】
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【図２１Ｃ】
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【図２２Ａ】
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【図２２Ｂ】
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【図２２Ｃ】
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【図２３】
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【図２４Ａ】
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【図２４Ｂ】
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【図２５Ａ】
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【図２５Ｂ】
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【図２５Ｃ】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４８】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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2004523533.tif 000224