(57)【要約】本発明は、遺伝子発現を変更する方法に関し、特に、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を用いて真核細胞における遺伝子発現を制御する方法、並びにこの方法を用いて遺伝子発現が変更された真核細胞系に関する。本発明はまた、遺伝子発現の制御に好適な組成物及びこのような組成物を用いる治療方法に関する。
2004532616.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
二本鎖ＲＮＡ複合体であって、
（ｃ）生理学的条件下で或るｍＲＮＡ分子の少なくとも一部にハイブリダイズ可能な第１のリボ核酸分子と、
（ｄ）生理学的条件下で、少なくとも一部が前記第１の部分にハイブリダイズ可能である第２のリボ核酸分子とを含むことを特徴とする二本鎖ＲＮＡ複合体。
【請求項２】
前記第１の部分及び前記第２の部分が別々のリボ核酸分子であることを特徴とする請求項１に記載のＲＮＡ複合体。
【請求項３】
前記ｍＲＮＡが細胞内の遺伝子によってコードされていることを特徴とする請求項１に記載の二本鎖ＲＮＡ分子。
【請求項４】
ｄｓＲＮＡ複合体を形成可能な線状ＲＮＡ分子であって、
（ｃ）或るｍＲＮＡ分子の少なくとも一部にハイブリダイズ可能な第１の部分と、
（ｄ）少なくとも一部が、前記第１の部分にハイブリダイズしてヘアピンｄｓＲＮＡ複合体を形成可能である第２の部分とを含むことを特徴とする線状ＲＮＡ分子。
【請求項５】
前記ｍＲＮＡが細胞内の遺伝子によってコードされていることを特徴とする請求項４に記載の二本鎖ＲＮＡ分子。
【請求項６】
更に、前記第１の部分と前記第２の部分との間に位置するリボ核酸の第３の部分を含むことを特徴とする請求項４に記載の線状ＲＮＡ分子。
【請求項７】
前記第３の部分が、前記第１の部分と前記第２の部分との間のハイブリダイゼーションを促進することを特徴とする請求項６に記載の線状ＲＮＡ分子。
【請求項８】
更に、リボ核酸の追加ＲＮＡ部分を含み、前記追加ＲＮＡ部分が、前記ｍＲＮＡ分子をコードする遺伝子からの転写を変化させるｄｓＲＮＡの能力を高めることを特徴とする請求項１若しくは請求項４に記載のＲＮＡ分子。
【請求項９】
前記追加ＲＮＡ部分がＲＮＡ分子をコードすることを特徴とする請求項８に記載のＲＮＡ分子。
【請求項１０】
前記追加ＲＮＡ部分がタンパク質をコードすることを特徴とする請求項８に記載のＲＮＡ分子。
【請求項１１】
前記タンパク質がＴａｔであることを特徴とする請求項１０に記載のＲＮＡ。
【請求項１２】
前記リボ核酸の第３の部分が更に、少なくとも１つのリボザイムと、前記リボザイムによって認識されるターゲット配列とを含み、前記ターゲット配列が前記第１の部分及び前記第２の部分に存在しないことを特徴とする請求項６に記載のＲＮＡ。
【請求項１３】
前記第１の部分と前記第２の部分とのハイブリダイゼーションで前記二本鎖ＲＮＡ複合体が形成され、前記ターゲット配列が前記ヘアピンｄｓＲＮＡによって切断されることを特徴とする請求項１２に記載のＲＮＡ。
【請求項１４】
前記リボ核酸の第３の部分が更に、イントロン即ちリンカー配列を含むことを特徴とする請求項６記載のＲＮＡ。
【請求項１５】
ｄｓＲＮＡ複合体を形成可能な線状ＲＮＡ分子であって、
（ｄ）或る遺伝子によってコードされるｍＲＮＡ分子の少なくとも一部に相補的なＲＮＡ領域含む第１の部分と、
（ｅ）前記第１の部分の少なくとも一部にハイブリダイズ可能な第２の部分と、
（ｆ）前記第１の部分と前記第２の部分とが互いにハイブリダイズするのを可能にする前記第１の部分と前記第２の部分との間に位置する第３の部分とを含むことを特徴とする線状ＲＮＡ分子。
【請求項１６】
前記第３の部分が、少なくとも１つのリボザイムと前記リボザイムによって認識されるターゲット配列とを含み、前記ターゲット配列が前記第１の部分及び前記第２の部分に存在しないことを特徴とする請求項１５に記載の線状ＲＮＡ分子。
【請求項１７】
前記第２の配列がポリアデニル化シグナルを含むことを特徴とする請求項１５に記載の線状ＲＮＡ分子。
【請求項１８】
前記第３の部分が、複数のリボザイムと、それらによって切断される複数のターゲット配列とを含むことを特徴とする請求項１５に記載の線状ＲＮＡ分子。
【請求項１９】
ｄｓＲＮＡ複合体を形成可能な線状ＲＮＡ分子であって、
（ｃ）或る遺伝子によってコードされるｍＲＮＡ分子の少なくとも一部にハイブリダイズする第１の部分と、
（ｄ）少なくとも一部が前記第１の部分にハイブリダイズ可能な第２の部分とを含み、
前記第２の部分が、ポリアデニル化シグナルと、前記第１の部分にハイブリダイズ可能な前記第２の部分の前記部分と前記ポリアデニル化シグナルとの間に位置するリボザイムとを含み、前記リボザイムが前記ポリアデニル化シグナルを除去可能であることを特徴とする線状ＲＮＡ分子。
【請求項２０】
前記リボザイムがシス作用性ハンマーヘッド型リボザイムであることを特徴とする請求項１９に記載の線状ＲＮＡ分子。
【請求項２１】
請求項１乃至請求項２０の何れかに記載の前記ＲＮＡ分子をコードする少なくとも１つのＤＮＡ分子。
【請求項２２】
１つのＤＮＡ分子が、請求項１乃至請求項２０の何れかに記載のＲＮＡ分子をコードすることを特徴とする請求項２１に記載のＤＮＡ分子。
【請求項２３】
２つのＤＮＡ分子が請求項１に記載のＲＮＡ分子をコードすることを特徴とする請求項２１に記載のＤＮＡ分子。
【請求項２４】
請求項１乃至請求項２０の何れかに記載のＲＮＡ分子を含む真核細胞。
【請求項２５】
請求項２１乃至請求項２３の何れかに記載のＤＮＡ分子を含む真核細胞。
【請求項２６】
前記真核細胞が哺乳動物細胞であることを特徴とする請求項２４若しくは請求項２５に記載の真核細胞。
【請求項２７】
前記真核細胞がヒト細胞であることを特徴とする請求項２４乃至請求項２６の何れかに記載の真核細胞。
【請求項２８】
前記細胞が更に、ＨＩＶ核酸を含むことを特徴とする請求項２７に記載の細胞。
【請求項２９】
前記細胞が腫瘍細胞であることを特徴とする請求項２４乃至請求項２７の何れかに記載の細胞。
【請求項３０】
請求項１乃至請求項２０の何れかに記載の少なくとも１つのＲＮＡ分子をコードするベクター。
【請求項３１】
請求項２１乃至請求項２３の何れかに記載のＤＮＡを含むベクター。
【請求項３２】
前記ベクターが、プラスミド、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、またはレトロウイルスであることを特徴とする請求項３０若しくは請求項３１に記載のベクター。
【請求項３３】
前記プラスミドがエピソームプラスミドであることを特徴とする請求項３２に記載のベクター。
【請求項３４】
真核細胞においてタンパク質の発現を抑制するための方法であって、
請求項１乃至請求項２０の何れかに記載のＲＮＡ分子、請求項２１乃至請求項２３の何れかに記載のＤＮＡ分子、または請求項３０乃至請求項３２の何れかに記載のベクターを前記真核細胞に導入するステップを含むことを特徴とする方法。
【請求項３５】
前記真核細胞が哺乳動物細胞であることを特徴とする請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記真核細胞が、ヒト細胞、体細胞、未分化細胞、分化細胞、腫瘍細胞、またはキメラ細胞であることを特徴とする請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記ＲＮＡまたは前記ＤＮＡが小胞を用いて前記細胞に導入されるか、或いはマイクロインジェクションにより導入されることを特徴とする請求項３４に記載の方法。
【請求項３８】
前記ｍＲＮＡが、癌関連遺伝子、リュウマチ様関節炎関連遺伝子、及びウイルス遺伝子からなる群から選択されることを特徴とする請求項３４に記載の方法。
【請求項３９】
前記ｍＲＮＡがＨＩＶ由来遺伝子であることを特徴とする請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記遺伝子が、ｔａｔ、ｎｅｆ、ｒｅｖ、ｍａ、ｃａ、ｎｃ、ｐｇ、ｖｐｕ、ｐｒ、ｖｉｆ、ｓｕ、ｔｍ、ｖｐｒ、ｒｔ、及びｉｎからなる群から選択されることを特徴とする請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
細胞内の遺伝子からのタンパク質の発現を抑制するための方法であって、ｄｓＲＮＡ複合体を形成可能な線状ＲＮＡ分子を細胞に導入するステップを含み、前記ＲＮＡ分子が、
（ａ）或る遺伝子によってコードされるｍＲＮＡ分子の少なくとも一部にハイブリダイズする第１の部分と、
（ｂ）少なくとも一部が前記第１の部分にハイブリダイズ可能である第２の部分とを含むことを特徴とする方法。
【請求項４２】
前記第２の部分が、前記線状ＲＮＡ分子の３’末端に位置するポリアデニル化シグナルを含むことを特徴とする請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記第２の部分が更に、前記第１の部分にハイブリダイズ可能な前記第２の部分の前記部分と前記ポリアデニル化シグナルとの間に位置するリボザイムを含み、前記リボザイムが前記ポリアデニル化シグナルを除去可能であることを特徴とする請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記リボザイムがシス作用性ハンマーヘッド型リボザイムであることを特徴とする請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記細胞が哺乳動物細胞であることを特徴とする請求項４１に記載の方法。
【請求項４６】
前記細胞がin vitroにあることを特徴とする請求項４１に記載の方法。
【請求項４７】
前記細胞がin vivoにあることを特徴とする請求項４１に記載の方法。
【請求項４８】
前記導入ステップが、マイクロインジェクションを用いることを特徴とする請求項４１に記載の方法。
【請求項４９】
前記ＲＮＡがＤＮＡ分子によってコードされ、前記ＤＮＡ分子が細胞内で転写されることを特徴とする請求項４１に記載の方法。
【請求項５０】
前記ＲＮＡがベクターとして導入されることを特徴とする請求項４１に記載の方法。
【請求項５１】
前記ベクターがＲＮＡまたはＤＮＡであることを特徴とする請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記ベクターが、プラスミド、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、またはレトロウイルスであることを特徴とする請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記ＲＮＡが細胞外で合成されることを特徴とする請求項４１に記載の方法。
【請求項５４】
前記ＲＮＡが細胞内で合成されることを特徴とする請求項４１に記載の方法。
【請求項５５】
前記ＲＮＡが核内に維持されることを特徴とする請求項４３に記載の方法。
【請求項５６】
ｄｓＲＮＡ分子を細胞の核に局在化させるための方法であって、ｄｓＲＮＡ複合体を形成可能な線状ＲＮＡ分子をコードするＤＮＡ分子を細胞に導入するステップを含み、前記ＤＮＡ分子によってコードされる前記ＲＮＡ分子が、
（ａ）或る遺伝子によってコードされるｍＲＮＡ分子の少なくとも一部にハイブリダイズする第１の部分と、
（ｂ）少なくとも一部が前記第１の部分にハイブリダイズ可能である第２の部分とを含み、
前記第２の分が、ポリアデニル化シグナルと、前記第１の部分にハイブリダイズ可能な前記第２の部分の前記部分と前記ポリアデニル化シグナルとの間に位置するリボザイムとを含み、
前記リボザイムが、前記ポリアデニル化シグナルを除去して前記ＲＮＡを前記核内に維持することを特徴とする方法。
【請求項５７】
前記リボザイムがシス作用性ハンマーヘッド型リボザイムであることを特徴とする請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
細胞における核酸配列の発現を調節するための方法であって、
ｄｓＲＮＡ分子を含む細胞が維持されていた細胞培地に細胞を曝露するステップとを含み、
前記ｄｓＲＮＡが、或る遺伝子によってコードされるｍＲＮＡ分子の少なくとも一部にハイブリダイズする第１の部分と、少なくとも一部が前記第１の部分にハイブリダイズ可能な第２の部分とを有することを特徴とする方法。
【請求項５９】
細胞における遺伝子の機能を同定するための方法であって、
（ａ）細胞内においてｄｓＲＮＡ分をｍＲＮＡ分子に結合させるステップであって、前記ｄｓＲＮＡが、生理学的な条件下で前記ｍＲＮＡ分子の少なくとも一部にハイブリダイズ可能な第１のリボ核酸分子と、生理学的な条件下で少なくとも一部が前記第１の部分にハイブリダイズ可能な第２のリボ核酸分子とを含む、前記ステップと、
（ｂ）前記結合による前記細胞の変化を検出するステップとを含むことを特徴とする方法。
【請求項６０】
細胞内で二本鎖ＲＮＡを形成するための方法であって、請求項１乃至２０の何れかに記載のＲＮＡ分子または請求項２１乃至請求項２３の何れかに記載のＤＮＡ分子を細胞に導入するステップを含むことを特徴とする方法。
【請求項６１】
真核細胞における遺伝子の発現を抑制するための組成物であって、
請求項１若しくは請求項４の何れかに記載のＲＮＡ分子を含み、
前記ＲＮＡ分子が更に、リボ核酸の追加ＲＮＡ部分を含み、前記追加ＲＮＡ部分が、前記ｍＲＮＡ分子をコードする遺伝子からの転写を変化させるｄｓＲＮＡの能力を高めることを特徴とする組成物。
【請求項６２】
更に、前記第１の部分と前記第２の部分との間に位置するリボ核酸の第３の部分を含み、前記第３の部分が前記第１の部分と前記第２の部分との間のハイブリダイゼーションを促進することを特徴とする請求項６１に記載の組成物。
【請求項６３】
細胞内の遺伝子の発現を抑制するために、請求項１乃至請求項２０の何れかに記載のＲＮＡ、請求項２１乃至請求項２３の何れかに記載のＤＮＡ、または請求項３１乃至請求項３３の何れかに記載のベクターの何れかを使用する方法。
【請求項６４】
請求項１乃至請求項２０の何れかに記載のＲＮＡ、請求項２１乃至請求項２３の何れかに記載のＤＮＡ、または請求項３１乃至請求項３３の何れかに記載のベクターを含む医薬組成物。
【請求項６５】
請求項１乃至請求項２０の何れかに記載のＲＮＡ、請求項２１乃至請求項２３の何れかに記載のＤＮＡ、または請求項３１乃至請求項３３の何れかに記載のベクターを含む医薬組成物を有するマイクロインジェクション装置。
【請求項６６】
請求項１乃至請求項２０の何れかに記載のＲＮＡ、請求項２１乃至請求項２３の何れかに記載のＤＮＡ、または請求項３１乃至請求項３３の何れかに記載のベクターを含む脂質小胞。
【請求項６７】
細胞内のゲノム核酸或いはウイルス核酸の機能を決定するために、請求項１乃至請求項２０の何れかに記載のＲＮＡ、請求項２１乃至請求項２３の何れかに記載のＤＮＡ、または請求項３１乃至請求項３３の何れかに記載のベクターの何れかを使用する方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の内容の開示】
【０００１】
発明の分野
本発明は、遺伝子発現を変更する方法に関し、特に、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を用いて真核細胞における遺伝子発現を制御する方法、並びにこの方法を用いて遺伝子発現が変更された真核細胞系に関する。本発明はまた、遺伝子発現の制御に好適な組成物及びこのような組成物を用いる治療方法に関する。
【０００２】
背景
ヒトを含む様々な生物の遺伝子配列の決定により、生体機能が分かっていない多数の新規な遺伝子が同定された。従って、特に哺乳動物細胞培養にいて特定の遺伝子の発現を制御するため、並びにこれらの推定遺伝子の細胞内の役割を研究するために効果的な方法を引き続いて開発していく必要がある（Fields、1997年）。遺伝子破壊に容易に影響されない生物における遺伝子の機能を不活化を、アンチセンスＲＮＡ（van der Krolら、1988年ン）、相同なセンスＲＮＡ（Bunnellら、1990年）、リボザイム（Serverら、1990年）、またはドミナントネガティブポリペプチド（Herskowitz、1988年）をコードする配列を発現する遺伝子作製物を用いて達成することができる。トランス作用性遺伝子インヒビターの形態であるこれら全てに共通する特徴は、ターゲット配列に由来するということである。このような技術は、「病原体由来耐性」に基づいている。この「病原体由来耐性」は、病原体に由来するヌクレオチド配列を用いて宿主の遺伝子を組換えてその病原体に対して耐性を有するようにすることである（Sanford、1988年）。これらの遺伝子特異的抑制の確認には時間がかかり、タンパク質のドメイン構造の幅広い知識や、アンチセンスＲＮＡ、センスＲＮＡ、またはリボザイムをコードする多数の候補遺伝子作製物の時間のかかるスクリーニングが必要である。大抵の場合、ターゲット遺伝子の構造成分及び機能成分の知識が必要である。
【０００３】
近年、遺伝子特異的二本鎖ＲＮＡが、特定の遺伝子の発現を調節するために或る種の真核細胞型に用いられるようになってきた（Fireら、Nature391, 860-811、1998年）。最も一般的な方法では、in vitroで２つの相補的なＲＮＡ鎖を生成して、これらのＲＮＡ鎖をアニーリングし、このように合成したｄｓＲＮＡをターゲット細胞に導入する。初期の研究は、ｄｓＲＮＡが特定の遺伝子の発現を調節し得ることを示している。このようなｄｓＲＮＡ分子が、アンチセンスＲＮＡ或いはセンスＲＮＡを単独で用いるよりも効果的であり、ｄｓＲＮＡの作用機構によりターゲットｍＲＮＡが変性することが実証されている。現在に至るまで、哺乳動物細胞における特定の遺伝子発現を調節するためのｄｓＲＮＡの利用は、合成により得た長い及び短いｄｓＲＮＡの使用に限定されている。
【０００４】
ヒトの細胞における遺伝子抑制に用いるｄｓＲＮＡを生成するための遺伝子発現方法はこれまで成功していない。これは、分化した哺乳動物体細胞が、ｄｓＲＮＡ活性化プロテインキナーゼ（ＰＫＲ）の活性化（Clemens、1997年）を含むインターフェロン応答で外来ｄｓＲＮＡに応答する（Marcus、1983年）という事実による可能性が高い。この酵素ＰＫＲは、翻訳開始因子ｅＩＦ２のαサブユニットをリン酸化して不活化し、これにより翻訳全体が停止し、最終的に細胞が死滅（apoptosis）する。従って、アプリオリな事実は、分化した哺乳動物細胞が、外来ｄｓＲＮＡによる特定の遺伝子の不活化に抵抗することを示唆している。
【０００５】
従って、遺伝子機能を同定するための方法としてだけでなはくタンパク質発現を特異的に抑制するための治療として、効果的かつ予測可能に哺乳動物細胞のターゲット遺伝子の発現を変更する新規な方法が要望されている。
【０００６】
本発明の目的は、従来技術の少なくとも或る種の欠点を改善し、有用な代替法を提供することである。
【０００７】
前述した及び後述する従来技術の説明及び言及は、本発明をその技術的文脈及び重要性においてより理解できるようにするためのものである。しかしながら、これとは反対に明確な記載がない場合は、この説明が、言及したあらゆる従来技術が周知である或いは当分野で一般的な知識の一部をなすという明示的或いは暗示的な容認と解釈されるべきものではない。
【０００８】
本発明の要約
分子内二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）及び／または分子間二本鎖ＲＮＡを形成可能なＲＮＡを用いて、細胞、特に真核細胞におけるターゲット遺伝子の発現を効果的に調節することができることが予期せず偶然に見出された。
【０００９】
第１の実施形態では、本発明は二本鎖ＲＮＡ複合体に関する。この二本鎖ＲＮＡ複合体は、（ａ）生理学的条件下で、ｍＲＮＡ分子の少なくとも一部にハイブリダイズ可能な第１のリボ核酸分子と、（ｂ）生理学的条件下で、少なくとも一部が前記第１の部分にハイブリダイズ可能な第２のリボ核酸分子とを含む。
【００１０】
この実施形態の一態様では、前記第１の部分及び前記第２の部分が別々のリボ核酸分子である。更なる態様では、ｍＲＮＡは細胞内の遺伝子によってコードされる。
【００１１】
本発明は、ｄｓＲＮＡ複合体を形成可能な線状ＲＮＡ分子に関する。このＲＮＡ分子は、（ａ）ｍＲＮＡ分子の少なくとも一部にハイブリダイズする第１の部分と、（ｂ）少なくとも一部が、前記第１の部分にハイブリダイズしてヘアピンｄｓＲＮＡ複合体を形成する第２の部分とを含む。
【００１２】
ｍＲＮＡは、細胞内の遺伝子によってコードされるのが好ましい。この実施形態は更に、第１の部分と第２の部分との間に位置する第３の部分のリボ核酸を含み得る。この第３の部分は、第１の部分と第２の部分との間のハイブリダイゼーションを促進するのに有用であり得る。
【００１３】
これら２つの実施形態の何れにおいても、ｍＲＮＡ分子をコードする遺伝子からの転写を変化させるｄｓＲＮＡの能力を高めることができるリボ核酸の追加ＲＮＡ部分を含み得る。一態様では、この追加ＲＮＡ部分がＲＮＡ分子をコードし、別の態様では、この追加ＲＮＡ部分がタンパク質をコードする。一例では、このタンパク質はＴａｔであり、別の例は後述する。
【００１４】
また、これら２つの実施形態の何れの場合も、リボ核酸の第３の部分は、少なくとも１つのリボザイムと、第１の部分及び第２の部分には存在しない前記リボザイムによって認識されるターゲット配列とを含む。必ずしも必要ではないが、好適な方法では、二本鎖ＲＮＡ複合体が、第１の部分と第２の部分とのハイブリダイゼーションで形成され、ターゲット配列がヘアピンｄｓＲＮＡによって切断される。加えて、リボ核酸の第３の部分は更に、イントロン即ちリンカー配列を含む。
【００１５】
本発明の更なる実施形態では、本発明はｄｓＲＮＡ複合体を形成可能な別の線状ＲＮＡ分子に関する。このＲＮＡ分子は、（ａ）或る遺伝子によってコードされるｍＲＮＡ分子の少なくとも一部に相補的なＲＮＡの領域を含む第１の部分と、（ｂ）第１の部分の少なくとも一部にハイブリダイズ可能な第２の部分と、（ｃ）第１の部分と第２の部分とが互いにハイブリダイズ可能となるようにこれら両部分の間に配置された第３の部分とを含む。
【００１６】
この第３の実施形態の好適な態様では、第３の部分は、少なくとも１つのリボザイムと、第１の部分及び第２の部分には存在しない、このリボザイムによって認識されるターゲット配列とを含む。別の態様では、第２の配列は更に、ポリアデニル化シグナルを含み得る。第３の配列は、１或いは複数のリボザイムと、リボザイムによって切断され得る１或いは複数のターゲット配列とを含み得る。
【００１７】
本発明の別の実施形態では、本発明は、ｄｓＲＮＡ複合体を形成可能な別の線状ＲＮＡ分子に関する。このＲＮＡ分子は、（ａ）或る遺伝子によってコードされるｍＲＮＡ分子の少なくとも一部にハイブリダイズする第１の部分と、（ｂ）少なくとも一部が第１の部分にハイブリダイズ可能な第２の部分とを含み、第２の部分が、ポリアデニル化シグナルと、第１の部分にハイブリダイズ可能な第２の部分の或る部分とそのポリアデニル化シグナルとの間に位置するリボザイムとを含み、このリボザイムがポリアデニル化シグナルを除去可能である。
【００１８】
この実施形態の好適な態様では、リボザイムは、シス作用性ハンマーヘッド型リボザイムである。
【００１９】
これらの実施形態はＤＮＡの形態を取り得る。このＤＮＡは、例えば細胞或いは細胞可溶化物に存在する転写装置を用いて本発明のＲＮＡ分子を生成可能である。このＲＮＡ分子は、１つのＤＮＡ分子或いは２つ以上のＤＮＡ分子として細胞に導入することができる。
【００２０】
更なる実施形態では、別の二本鎖ＲＮＡ複合体が提供される。このＲＮＡは、（Ａ）ハイブリダイゼーション条件下で或る遺伝子によってコードされるｍＲＮＡ分子の少なくとも一部にハイブリダイズする第１の配列と、（Ｂ）ハイブリダイゼーション条件下で、第１の配列にハイブリダイズする第２の配列とを含み、第１の配列及び第２の配列がそれぞれ、別々の線状ＲＮＡ分子の一部である。
【００２１】
別の実施形態では、二本鎖ＲＮＡ複合体を形成する別の線状ＲＮＡ分子が提供される。このＲＮＡは、（Ａ）ハイブリダイゼーション条件下で、或る遺伝子によってコードされるｍＲＮＡ分子の少なくとも一部にハイブリダイズする第１の配列と、（Ｂ）ハイブリダイゼーション条件下で、第１の配列にハイブリダイズする第２の配列とを含み、第１の配列と第２の配列との間の複合体が人工ヘアピンｄｓＲＮＡを形成する。別の態様では、二本鎖ＲＮＡ複合体を形成する別の線状ＲＮＡ分子が提供される。このＲＮＡ分子は、（ａ）ｄｓＲＮＡの特定の活性を高めるＲＮＡまたはタンパク質をコードする部分と、（ｂ）二本鎖ＲＮＡ複合体を形成する部分とを含む。この二本鎖ＲＮＡ複合体を形成する部分は、（ｉ）ハイブリダイゼーション条件下で、遺伝子によってコードされるｍＲＮＡ分子の少なくとも一部にハイブリダイズする第１の配列と、（ｉｉ）ハイブリダイゼーション条件下で、第１の配列にハイブリダイズする第２の配列と、（ｉｉｉ）第１の配列と第２の配列とが互いにハイブリダイズ可能となるように第１の配列と第２の配列との間に位置する第３の配列とをふくみ、ハイブリダイゼーション条件下で、第１の配列と第２の配列との間のハイブリダイゼーションで二本鎖ＲＮＡ複合体を形成する。
【００２２】
好適な実施形態では、ｄｓＲＮＡの特定の活性を高めるタンパク質はＨＩＶ  Ｔａｔタンパク質であり得る。
【００２３】
好適な実施形態では、第３の配列が、（ｉ）リボザイムと、（ｉｉ）第１の配列及び第２の配列には存在しない、このリボザイムによって特異的に認識されるターゲット配列とを含む。複合体形成部分が、第１の配列と第２の配列との間のハイブリダイゼーションで二本鎖ＲＮＡ複合体を形成し、ターゲット配列がリボザイムによって切断される。第３の配列はまた、複数のリボザイム及びリボザイムによって切断される複数のターゲット配列を含み得る。
【００２４】
更なる好適な実施形態では、第３の配列が、第１の配列或いは第２の配列の何れにも含まれないターゲット配列の一部であるイントロン即ちリンカー配列を含む。
【００２５】
別の態様では、本発明は、二本鎖ＲＮＡ複合体を形成する別の線状ＲＮＡ分子を提供する。このＲＮＡ分子は、（ａ）ハイブリダイゼーション条件下で、或る遺伝子によってコードされるｍＲＮＡの少なくとも一部にハイブリダイズする第１の配列と、（ｂ）ハイブリダイゼーション条件下で、第１の配列にハイブリダイズする第２の配列と、（ｃ）第１の配列と第２の配列が互いにハイブリダイズ可能となるように、第１の配列と第２の配列との間に位置する第３の配列とを含み、この第３の配列が、（ｉ）リボザイムと、（ｉｉ）第１の配列及び第２の配列に存在しない、このリボザイムによって特異的に認識されるターゲット配列とを含み、ハイブリダイゼーション条件下での第１の配列と第２の配列との間のハイブリダイゼーションで二本鎖ＲＮＡ複合体を形成し、ターゲット配列がリボザイムによって切断される。
【００２６】
本発明のこの実施形態の第３の配列はまた、複数のリボザイム及びこれらのリボザイムによって切断される複数のターゲット配列を含み得る。
【００２７】
別の態様では、別の二本鎖ＲＮＡ複合体が提供される。このＲＮＡは、（Ｂ）ハイブリダイゼーション条件下で、或る遺伝子によってコードされるｍＲＮＡ分子の少なくとも一部にハイブリダイズする第１の配列と、（Ｃ）ハイブリダイゼーション条件下で、第１の配列にハイブリダイズする第２の配列とを含む。第２の配列は、その３’末端の第１の配列と相補的な領域の終端部とポリアデニル化シグナルとの間に位置するシス作用性ハンマーヘッド型リボザイムを含む。このリボザイムは、この同じ領域内で切断してポリアデニル化シグナルを除去可能である。
【００２８】
本発明のこの実施形態は、リボザイムを用いてＲＮＡ分子のポリアデニル化シグナルを切断して、ＲＮＡ分子及び／またはｄｓＲＮＡを核内に維持する。
【００２９】
このリボザイムは、参考文献に記載されているあらゆるリボザイムとすることができるが、ハンマーヘッド型リボザイムが好ましい。
【００３０】
本発明のＲＮＡは、１つの分子であっても良いし、２つ以上のＲＮＡ分子であっても良い。ＲＮＡが１つの分子である場合、ｄｓＲＮＡは分子内ＲＮＡ結合によって形成され得る。２つ以上のＲＮＡ分子が用いられる実施形態では、ｄｓＲＮＡは分子間ＲＮＡ結合によって形成され得る。
【００３１】
本発明はまた、ｄｓＲＮＡを形成可能なＲＮＡ分子をコードするＤＮＡ分子を提供する。このようなＤＮＡ分子は１つのＤＮＡ分子とすることができ、細胞に導入されると、分子内ｄｓＲＮＡを形成可能な１つのＲＮＡ分子を産生する。しかしながら、後述する説明から、同時或いは連続的に２つ以上のＤＮＡ分子を細胞に導入して、分子間ｄｓＲＮＡを形成可能な２つ以上のＲＮＡ分子を産生させることができることを理解できよう。通常は、分子内或いは分子間ｄｓＲＮＡに何れかを形成可能な２つのＲＮＡ配列は、その少なくとも一部が、発現が抑制されるべき遺伝子即ち核酸配列のセンス配列であり、その少なくとも一部がそのアンチセンス配列である。好適な実施形態では、ｄｓＲＮＡを形成可能なＲＮＡをコードするＤＮＡを含む作製物を用いて細胞内でＲＮＡを生成する。
【００３２】
本発明は、本発明のＲＮＡ分子またはＤＮＡ分子を含むベクター、並びにＲＮＡ分子またはＤＮＡ分子を含む細胞、またはそのような分子を含むベクターを提供する。好ましくは、細胞は哺乳動物細胞であって、更に好ましくはヒト細胞である。当業者であれば、細胞が、体細胞、未分化細胞、脱分化腫瘍細胞、キメラ細胞、または遺伝子組換え動物細胞であることが理解できよう。細胞は、もちろん腫瘍細胞であり得る。
【００３３】
当業者であれば、細胞が、in vitroで培養された細胞であるか、或いはin situで培養された細胞であり、治療方法が、in vivo及びex vivo治療を含むことを理解できよう。
【００３４】
好ましくは、ＲＮＡは遺伝子によってコードされ、この遺伝子がこの細胞内で転写され、更に好ましくはこの遺伝子がベクターによって細胞に導入される。最も好ましくは、このベクターは、プラスミド、アデノウィルス、アデノ関連ウィルス、またはレトロウィルスである。好適な実施形態では、このプラスミドはエピソームプラスミドである。しかしながら、本発明は、これらのタイプのベクターに限定されるものではなく、当業者であればその他の適切なベクターが思い当たるであろう。
【００３５】
当業者であれば前記説明から、二本鎖ＲＮＡを形成可能なＲＮＡを細胞、特に細胞の細胞質或いは核内に導入するためのあらゆる機構が本発明に有用であることが理解できよう。従って、或る場合には、例えばＲＮＡをコードするベクター、マイクロインジェクション、または小胞輸送によってＲＮＡを導入することが有用であると考えられ、このＲＮＡが、細胞に導入時に一本鎖或いは二本鎖の形態とすることができることを理解できよう。従ってこのＲＮＡは、標準的な技術によって細胞外で合成することができる。
【００３６】
好ましくは、ＲＮＡは前記細胞の核内に維持される。一実施形態では、このＲＮＡは、ポリアデニル化シグナルの欠失即ち切断によって前記細胞の核内に維持される。ＲＮＡからポリアデニル化シグナルを切断することは、シス作用性リボザイム或いはその他の好適な手段によって達成することができる。
【００３７】
別の態様では、本発明は、真核細胞において特定の遺伝子即ち特定の核酸配列の発現を抑制するための方法を提供する。この方法は、本発明のＲＮＡ分子またはＤＮＡ分子を細胞に導入するステップを含む。このＲＮＡ分子は、特定の遺伝子即ち特定の核酸配列に対応するセンス配列及びアンチセンス配列のそれぞれに一致する第１の配列及び第２の配列を含む。このＤＮＡ分子は、特定の遺伝子即ち特定の核酸配列に対応するセンス配列及びアンチセンス配列に一致する第１のＲＮＡ分子及び第２のＲＮＡ分子をコードする配列を含む。
【００３８】
別の態様では、本発明は、特定の遺伝子即ち特定の核酸配列が本発明の方法によって抑制される哺乳動物細胞を提供する。
【００３９】
別の態様では、本発明は、哺乳動物細胞において遺伝子即ち核酸配列の発現を調節する方法を提供する。この方法は、前記細胞を本発明の哺乳動物細胞が培養された培地に曝露することを含む。
【００４０】
更に別の態様では、本発明は、遺伝子即ち核酸配列の機能を決定するための方法を提供する。この方法は、本発明の方法によって遺伝子即ち核酸配列の発現を抑制することを含む。
【００４１】
更なる態様では、本発明は、タンパク質の機能を決定する方法を提供する。この方法では、そのタンパク質をコードする遺伝子の発現を、本発明の方法によって抑制することを含む。
【００４２】
別の態様では、本発明は、直接或いは間接的による遺伝子即ち核酸配列の発現に細胞応答を、本発明の方法によってこの遺伝子即ち核酸配列の発現を抑制して、調節する方法を提供する。
【００４３】
別の態様では、本発明は、真核細胞における遺伝子発現の抑制に用いられる組成物を提供する。この組成物は、（ａ）ＨＩＶ Ｔａｔタンパク質をコードするＲＮＡ分子と、（ｂ）二本鎖ＲＮＡ複合体を形成する線状ＲＮＡ分子とを含む。このＲＮＡ分子は、（ｉ）ハイブリダイゼーション条件下で、或る遺伝子によってコードされるｍＲＮＡ分子の少なくとも一部にハイブリダイズする第１の配列と、（ｉｉ）ハイブリダイゼーション条件下で、第１の配列にハイブリダイズする第２の配列と、（ｉｉｉ）第１の配列と第２の配列とが互いにハイブリダイズ可能となるように第１の配列と第２の配列との間に位置する第３の配列とを含む。このＲＮＡ分子は、ハイブリダイゼーション条件下での第１の配列と第２の配列との間のハイブリダイゼーションで二本鎖ＲＮＡ複合体を形成する。
【００４４】
更なる態様では、本発明は、真核細胞における遺伝子発現の抑制に用いられる組成物を提供する。この組成物は、（ａ）ＨＩＶ Ｔａｔタンパク質をコードするＤＮＡ分子と、（ｂ）二本鎖ＲＮＡ複合体を形成する線状ＲＮＡ分子をコードするＤＮＡ分子とを含む。このＲＮＡ分子は、（ｉ）ハイブリダイゼーション条件下で、或る遺伝子によってコードされるｍＲＮＡ分子の少なくとも一部にハイブリダイズする第１の配列と、（ｉｉ）ハイブリダイゼーション条件下で、第１の配列にハイブリダイズする第２の配列と、（ｉｉｉ）第１の配列と第２の配列が互いにハイブリダイズ可能となるように第１の配列と第２の配列との間に位置する第３の配列とを含む。このＲＮＡ分子は、ハイブリダイゼーション条件下での第１の配列と第２の配列との間のハイブリダイゼーションで二本鎖ＲＮＡ複合体を形成する。
【００４５】
更なる態様では、本発明は、遺伝子即ち核酸配列の発現によって直接或いは間接的に引き起こされた障害を治療するための方法を提供する。この方法では、この遺伝子即ち核酸配列の発現が本発明の方法により抑制される。
【００４６】
好適な実施形態の説明
定義
本明細書で用いる核酸分子の「触媒領域」、「触媒核酸分子」、「触媒核酸」、及び「触媒核酸配列」なる用語は同じ意味であり、それぞれは固有の基質を特異的に認識してその基質の化学修飾を触媒する核酸分子を意味する。
【００４７】
本明細書に用いる「二本鎖ＲＮＡ複合体」、「二本鎖ＲＮＡ」、「ｄｓＲＮＡ複合体」、及び「ｄｓＲＮＡ」なる用語は同じ意味であり、それぞれは、（ａ）１つの分子の配列の少なくとも一部が、他のＲＮＡ分子の配列の少なくとも一部に相補的であってハイブリダイズ可能である２つの線状ＲＮＡ分子によって形成される複合体、或いは（ｂ）互いに相補的であってハイブリダイズ可能である、１つの線状ＲＮＡ分子の２つの部分によって形成される複合体の何れかである。ｄｓＲＮＡ形成の或るメカニズムが図７に示されている。
【００４８】
本明細書に用いる用語「ハイブリダイゼーション条件」は、少なくとも７ヌクレオチド長さを有する相補的な２つのＲＮＡ鎖間のハイブリダイゼーションを許容する条件を意味する。ハイブリダイゼーション条件は、当分野で周知であり、限定するものではないが細胞内生理学的条件等の生理学的条件が含まれる。
【００４９】
疾患、症状、或いは障害を「抑制する」或いは「制限する」なる用語は、疾患、症状、或いは障害の発症の可能性を低くすること、そのような発症を予防する或いは遅延させることを意味する。或いは、疾患、症状、または障害の程度即ち重篤度を下げることを意味する。
【００５０】
真核細胞における遺伝子の発現を「抑制する」なる用語は、特定の遺伝子が発現する程度を低くする、好ましくはそのような発現全てを阻止或いは抑制することを指す。
【００５１】
細胞内にｄｓＲＮＡ複合体を「導入する」なる用語は、そのような複合体が細胞内に存在するようにすることを指す。このような細胞内への導入は、細胞外で形成されたｄｓＲＮＡ複合体を細胞内に入れる、或いは細胞に導入されるとｄｓＲＮＡ複合体を産生するＲＮＡ或いはＤＮＡの何れかである１つの核酸分子を細胞内に入れることにより達成することができる。
【００５２】
本明細書に用いる用語「介在配列」或いは「ＩＶＳ（intervening sequence）」は、図９に示されているような斜線が引かれた配列を指す。この配列は、好ましくは第１の配列及び第２の配列に無関係であって、スプライスドナー及びスプライスアクセプターを含むイントロン、或いは複数のリボザイムを含むイントロンとすることができる。
【００５３】
用語「核酸分子」は、限定するものではないがＤＮＡ、ＲＮＡ、及びそれらのハイブリッドを含むあらゆる核酸分子を指す。核酸分子を形成する核酸塩基には、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ、及びＵの塩基、並びにそれらの誘導体を用いることができる。これらの塩基の誘導体は当分野で周知であり、PCR Systems、Reagents、Consumables（米国ニュージャージー州のBranchburgに所在のRoche Molecular Systems社のPerkin Elmer Catalogue 1996年−1997年）に例示されている。
【００５４】
本明細書に用いる用語「リボザイム」は、ＲＮＡである触媒核酸分子や、触媒成分がＲＮＡであるものを指し、ＤＮＡ或いはＲＮＡである固有のターゲット核酸配列（本明細書では「ターゲット」或いは「ターゲット配列」とも呼ぶ）を認識して切断する。リボザイムはそれぞれ、触媒成分（本明細書では「触媒ドメイン」とも呼ぶ）と、その触媒ドメインの両側の２つの結合ドメインからなるターゲット配列結合成分を含む。リボザイムはSunら（2000年）に記載されている。好適な実施形態では、リボザイムはハンマーヘッド型リボザイムである。
【００５５】
本明細書に用いる用語「被験者」は、限定するものではないが霊長類、マウス、ラット、ギニアピッグ、及びウサギを含む動物を指す。好適な実施形態では、被験者はヒトである。
【００５６】
本明細書に用いる「基質」は、触媒核酸分子によって特異的に認識され変化させられる分子を指す。
【００５７】
本明細書に用いる障害を「治療する」なる用語は、障害の進行を減速させる、抑制する、停止する、或いは逆転させるという意味である。好適な実施形態では、障害を「治療する」は、障害の進行を逆転することを指し、理想的には障害自体を取り除くことを指す。本明細書に用いる障害を「改善させる」及び「処置する」という用語は互いに置き換えることができる。この用語はまた、「予防」と「治癒処置」との間をより明確に区別するために、用語「予防の」及び「治療の」と共に用いられる。
【００５８】
用語「ＨＩＶ Ｔａｔタンパク質」、「Ｔａｔタンパク質」、及び「Ｔａｔ」は、本明細書では交換可能に用いられており、（ａ）アミノ酸配列（met-glu-pro-val-asp-pro-arg-leu-glu-pro-trp-lys-his-pro-gly-ser-gln-pro-lys-thr-ala-cys-thr-asn-cys-tyr-cys-lys-lys-cys-cys-phe-his-cys-gln-val-cys-phe-ile-thr-lys-ala-leu-gly-ile-ser-tyr-gly-arg-lys-lys-arg-arg-gln-arg-arg-arg-pro-pro-gln-gly-ser-gln-thr-his-gln-val-ser-leu-ser-lys-gln-pro-thr-ser-gln-ser-arg-gly-asp-pro-thr-gly-pro-lys-glu）を含むＨＩＶタンパク質、（ｂ）アミノ酸配列（tyr-gly-arg-lys-lys-arg-arg-gln-arg-arg-arg）を含むＨＩＶタンパク質、及び（ｃ）タンパク質（ａ）及び（ｂ）の自然に生じる変異体の全てを指す。自然に発生するＨＩＶタンパク質配列の変異体は、特にＧｅｎｂａｎｋデータベース及びＬｏｓ  Ａｌａｍｏｓ  ＨＩＶデータベースで見つけることができる。これらのデータベース及び自然発生の変異体は何れも当分野で周知である。
【００５９】
本発明は、二本鎖ＲＮＡ複合体を形成可能なセンスＲＮＡ配列及びアンチセンスＲＮＡ配列（遺伝子即ち核酸配列に対して）を用いて、真核細胞の既知の遺伝子即ち核酸配列の発現を制御する方法に関する。すなわち、本発明のＲＮＡ分子は、二本鎖ＲＮＡを形成することができると共に、ゲノム、外来ＤＮＡ、またはＲＮＡ分子、好ましくは細胞内のｍＲＮＡの一部に結合することができる。好ましくは、センス及びアンチセンスＲＮＡ配列は、１或いは複数のＤＮＡ分子によってコードされ、このようなＤＮＡ分子の発現により分子内或いは分子間二本鎖ＲＮＡ（「ｄｓＲＮＡ」）を形成できるＲＮＡ配列が生じ、これにより遺伝子即ち核酸分子の発現が抑制される。しかしながら、分子内ｄｓＲＮＡ（１本鎖ＲＮＡを用いて形成されたｄｓＲＮＡ）或いは分子間ｄｓＲＮＡ（二本以上のＲＮＡ鎖を用いて形成されたｄｓＲＮＡ）が細胞内で形成されるように１或いは複数のＲＮＡ分子を細胞に導入したり、或いは予備形成された複合体としてｄｓＲＮＡを細胞に導入することができる。
【００６０】
従って、本発明は、ｄｓＲＮＡを形成するためのＲＮＡ分子、ｄｓＲＮＡを形成するためのＲＮＡ分子をコードするＤＮＡ、そのような分子を含むベクターや細胞、そのような分子及びベクターを含む成分、並びにそのようなＲＮＡ分子、ＤＮＡ分子、及びｄｓＲＮＡを投与するための予防及び治療方法に関する。或る実施形態では、本発明は、リボザイム含有ＲＮＡ分子を用いてｄｓＲＮＡ複合体を形成することで、ｄｓＲＮＡの形成に関連する既知の問題を克服する。別の実施形態では、本発明は、ｄｓＲＮＡの特定の作用を強化するタンパク質或いはＲＮＡをコードするＲＮＡ分子の或る部分の能力に基づいている。一例では、特定の作用を強化するこのＲＮＡ分子の或る部分が、ｄｓＲＮＡ複合体の細胞内破壊を抑制するＨＩＶ Ｔａｔタンパク質をコードする。更に、このような部分は、ＨＩＶ感染等の障害を治療するのにも有用である。更に別の実施形態では、本発明は、リボザイム含有ＲＮＡ分子を用いてポリアデニル化シグナルを除去して、細胞の核からＲＮＡ分子が放出されるのを防止或いは最小化する。本発明の別の実施形態では、コトランスフェクション法を用いて、複数のＲＮＡ或いはＤＮＡ分子を導入して分子間ｄｓＲＮＡを容易に形成し、更に検出可能なマーカーを用いて抑制された遺伝子即ち核酸配列を特定し易くする。
【００６１】
このような分子（ＲＮＡ及びＤＮＡ）、成分、及び方法は、既知の遺伝子の発現を抑制して回復可能な障害を治療するため或いはその発症を抑制するために様々に用いることができる。
【００６２】
或る実施態様では、二本鎖ＲＮＡ複合体が提供される。このＲＮＡは、生理学的条件下でｍＲＮＡ分子の少なくとも一部にハイブリダイズ可能である第１のリボ核酸分子と、生理学的条件下で少なくとも一部が第１のリボ核酸分子にハイブリダイズ可能である第２のリボ核酸分子とを含む。これらの第１の部分及び第２の部分は、別々のリボ核酸分子上に存在するのが好ましい。これらの分子は、細胞内に存在するような生理学的条件下でハイブリダイズ可能であって、ハイブリダイゼーションで第１の部分と第２の部分とで二本鎖ＲＮＡ分子を形成する。
【００６３】
このタイプのＲＮＡ分子は、相補的なＲＮＡをコードする２つの別の発現カセットを有する１つの発現プラスミドを導入して、より好ましくは２つの線状ＲＮＡ分子のそれぞれをコードする２つの発現ベクターを導入して、細胞内で生成することができる。２つの線状ＲＮＡの生成は、２つのＤＮＡ分子を作製することで最も簡単に達成することができる。２つのＤＮＡ分子はそれぞれ、（ａ）細胞内で機能するプロモーターと、（ｂ）目的の核酸のヌクレオチド配列の少なくとも一部と同一の少なくとも２０のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列か、或いはアンチセンス配列かを含み、最終的に分子間ｄｓＲＮＡ構造を形成する、センスヌクレオチド配列を備えた領域とアンチセンスヌクレオチド配列を備えた領域との間の塩基対形成によって二本鎖ＲＮＡを形成可能である、ＲＮＡ分子に転写され得るＤＮＡ領域と、（ｃ）転写終結及びポリアデニル化シグナルをコードするＤＮＡ領域とを含む。アンチセンス領域及びセンス領域の長さや配列等の異なった構造や機能の特徴についての本方法の好適な実施形態は、本明細書の他の部分に記載されている。
【００６４】
別の態様では、第１の部分及び第２の部分を含む二本鎖ＲＮＡ複合体を形成する線状ＲＮＡ分子が提供される。第１の部分は、好ましくは細胞内のｍＲＮＡ分子の少なくとも一部にハイブリダイズ可能であり、第２の部分の少なくとも一部が第１の部分にハイブリダイズしてヘアピンｄｓＲＮＡ複合体を形成可能である。
【００６５】
一実施形態では、これらのＲＮＡ部分は１つの線状ＲＮＡ分子上に存在し、分子内ハイブリダイゼーションによってｄｓＲＮＡが形成される。第１の部分と第２の部分との間の距離は、それらの部分間に１つも配列が存在しないものから、制限酵素認識部位（８塩基対以下）が挿入されているもの、或いはそれよりも大きな領域まで様々である。用語「ヘアピンｄｓＲＮＡ」は、相同領域と相同領域との間に非相同のヘアピン状構造が形成されるように折り返すことができるｄｓＲＮＡ分子を指す。このｄｓＲＮＡ複合体は、発現ベクターからの発現により形成されるのが好ましい。これは、キメラＤＮＡ分子を作製することで最も簡単に達成することができる。このキメラＤＮＡは、（ａ）細胞内で機能するプロモーターと、（ｂ）目的の核酸のヌクレオチド配列の少なくとも一部と同一の少なくとも２０のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列、及びアンチセンス配列を含み、最終的にヘアピンｄｓＲＮＡ構造を形成する、センスヌクレオチド配列を備えた領域とアンチセンスヌクレオチド配列を備えた領域と間の塩基対形成によってｄｓＲＮＡを形成可能である、ＲＮＡ分子に転写され得るＤＮＡ領域と、（ｃ）転写終結及びポリアデニル化シグナルをコードするＤＮＡ領域とを含む。好適な実施形態では、キメラ遺伝子から転写されるＲＮＡ分子は、ヘアピンＲＮＡを必ず含み、センス配列とアンチセンス配列の順序は絶対的ではない。
【００６６】
別の実施形態では、ｄｓＲＮＡの特定の活性を高める（即ち、ｍＲＮＡ分子をコードする遺伝子からの転写を変化させるｄｓＲＮＡの能力を高める）ＲＮＡまたはタンパク質をコードする部分を含む、二本鎖ＲＮＡ複合体を形成する線状ＲＮＡ分子が提供される。この別の例では、二本鎖ＲＮＡ分子が形成され、好ましくはタンパク質である活性要素が、そのＲＮＡ上にコードされているか、或いは別のＲＮＡ配列にコードされていてｄｓＲＮＡのその特定のターゲットへの結合を促す。
【００６７】
好適な実施形態では、ｄｓＲＮＡを用いた特定の遺伝子制御の効率を上げるためにタンパク質をコードし得る部分を含む線状ＲＮＡ分子が提供される。ｄｓＲＮＡはまた、そのｄｓＲＮＡをそのターゲット配列に特異的に結合させ得る部分を含む。このタンパク質成分は、限定するものではないがｄｓＲＮＡに応答する全ての哺乳動物細胞を変化させることができるウイルスタンパク質を含む様々なタンパク質とすることができる。このタンパク質成分はまた、限定するものではないが哺乳動物ウイルスタンパク質（ワクシニアウイルス初期タンパク質Ｅ３Ｌ、レオウイルスｐ３タンパク質、ワクシニアウイルスｐＫ３、ＨＩＶ−１ Ｔａｔ）或いは細胞タンパク質（ＰＫＲドミナントネガティブタンパク質、ｐ５８、及びｖ−ｅｒｂＢ、ｓｏｓ、または活性化されたｒａｓ等の発癌遺伝子）が含まれ得る。更に、このタンパク質成分は、ｄｓＲＮＡに特異的に作用して特定の遺伝子発現の制御におけるそのｄｓＲＮＡの効率を高める宿主タンパク質複合体のあらゆる酵素成分とすることができる。好適な実施形態では、ｄｓＲＮＡの特定の活性を高めるタンパク質はＨＩＶ Ｔａｔタンパク質である。ｄｓＲＮＡによる特定の制御を促進することができるＲＮＡ成分として、限定するものではないが短いウイルス或いは細胞内ｄｓＲＮＡ（例えば、アデノウイルスＶＡＩ、ＨＩＶ−１ ＴＡＲ、ＥＢＥＲ−１、及びＡｌｕ ＲＮＡｓ）が挙げられる。
【００６８】
更に別の好適な実施形態では、線状ＲＮＡ分子上に第３の部分が設けられる。この第３の部分は、（ｉ）リボザイムと、（ｉｉ）第１の配列及び第２の配列には存在しない、そのリボザイムによって特異的に認識されるターゲット配列とを含み、これにより、第１の配列と第２の配列と間のハイブリダイゼーションで複合体形成部分が二本鎖ＲＮＡ複合体を形成し、そのターゲット配列がそのリボザイムによって切断される。第３の配列はまた、複数のリボザイム及びそれらによって切断されるターゲット配列を含み得る。図８に例示されている好適な実施形態では、介在配列にリボザイムが隣接しているため、転写時にそのリボザイムにより介在配列が切断され、ターゲットｍＲＮＡに相同なｄｓＲＮＡが残る。更に好適な実施形態では、第３の配列は、イントロン、配列１または配列２の何れにも含まれていないターゲット配列の一部、またはリンカー配列を含む。
【００６９】
線状ｄｓＲＮＡ複合体は、好ましくはエピソームプラスミドまたはレトロウイルスベクターである発現ベクターからの発現により形成されるのが好ましい。これは、キメラＤＮＡ分子を作製することで最も簡単に達成することができる。このキメラＤＮＡ分子は、（ａ）細胞内で機能するプロモーターと、（ｂ）ｄｓＲＮＡの特定の活性を高めることができるタンパク質をコードするＤＮＡ領域と、（ｃ）目的の核酸のヌクレオチド配列の少なくとも一部と同一の少なくとも２０のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列、及びアンチセンス配列を含み、最終的に分子内ｄｓＲＮＡ構造を形成する、センスヌクレオチド配列を備えた領域とアンチセンスヌクレオチド配列を備えた領域との間の塩基対形成によって二本鎖ＲＮＡを形成可能である、ＲＮＡ分子に転写され得るＤＮＡ領域と、（ｄ）（ｃ）におけるセンス配列とアンチセンス配列との間の第３のＤＮＡ配列と、（ｅ）ポジティブな選択可能なマーカーをコードするＤＮＡ領域と、（ｆ）転写終結及びポリアデニル化シグナルをコードするＤＮＡ領域とを含む。好適な実施形態では、キメラ遺伝子から転写されたＲＮＡ分子は、ｄｓＲＮＡの特定の活性を高めることができるタンパク質をコードする領域と、ターゲット配列に特異的な分子内ｄｓＲＮＡを形成できる部分とを含む。当業者であれば、上記した部分（ａ）は、上記した部分（ｂ）と同じ線状ＲＮＡ内で発現させることもできるし、また、別のキメラＤＮＡ分子から上記（ｂ）部分と同時発現させることもできることが分かるであろう。この別のキメラＤＮＡ分子は、（ａ）細胞内で機能するプロモーターと、（ｂ）ｄｓＲＮＡの特定の活性を高めることができるタンパク質をコードするＤＮＡ領域と、（ｃ）転写終結及びポリアデニル化シグナルをコードするＤＮＡ領域とを含む。一実施形態では、本発明は、二本鎖ＲＮＡ複合体を形成する線状ＲＮＡ分子を提供する。このＲＮＡ分子は、（ａ）ＨＩＶ Ｔａｔタンパク質をコードする部分と、（ｂ）（ｉ）ハイブリダイゼーション条件下で或る遺伝子即ち核酸によってコードされるｍＲＮＡ分子の少なくとも一部にハイブリダイズする第１の配列と（ｉｉ）ハイブリダイゼーション条件下で第１の配列にハイブリダイズする第２の配列と（ｉｉｉ）第１の配列と第２の配列が互いにハイブリダイズできるようにそれらの間に位置する第３の配列とを含む二本鎖ＲＮＡ複合体を形成する部分とを含み、これによりハイブリダイゼーション条件下で、第１の配列と第２の配列とのハイブリダイゼーションで部分（ｂ）が二本鎖ＲＮＡ複合体を形成する。
【００７０】
本発明は更に、二本鎖ＲＮＡ複合体を形成する線状ＲＮＡ分子を提供する。このＲＮＡ分子は、（ａ）ハイブリダイゼーション条件下で或る遺伝子即ち核酸分子によってコードされるｍＲＮＡ分子の少なくとも一部とハイブリダイズする第１の配列と、（ｂ）ハイブリダイゼーション条件下でこの第１の配列とハイブリダイズする第２の配列と、（ｃ）（ｉ）リボザイムと（ｉｉ）第１の配列及び第２の配列に存在しない、そのリボザイムによって特異的に認識されるターゲット配列とを含む、第１の配列と第２の配列が互いにハイブリダイズできるようにそれらの配列間に位置する第３の配列とを含み、これによりハイブリダイゼーション条件下で、第１の配列と第２の配列と間のハイブリダイゼーションで二本鎖ＲＮＡ複合体を形成し、ターゲット配列がリボザイムによって切断される。この線状ＲＮＡ複合体は、好ましくはエピソームプラスミドまたはレトロウイルスベクターである発現ベクターからの発現により形成されるのが好ましい。これは、キメラＤＮＡ分子を作製することで最も簡単に達成することができる。このキメラＤＮＡ分子は、（ａ）細胞内で機能するプロモーターと、（ｂ）目的の核酸のヌクレオチド配列の少なくとも一部と同一の少なくとも２０のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列を含む、ＲＮＡ分子に転写され得るＤＮＡ領域と、（ｃ）（ｉ）リボザイムと（ｉｉ）第１の配列及び第２の配列に存在しない、そのリボザイムによって特異的に認識されるターゲット配列を含むＤＮＡ領域と、（ｄ）アンチセンス配列に転写され得るＤＮＡ領域であって、このＲＮＡ分子が、最終的に分子内ｄｓＲＮＡ構造を形成する、センスヌクレオチド配列を備えた領域とアンチセンスヌクレオチド配列を備えた領域と間の塩基対形成によってｄｓＲＮＡを形成することができる、前記ＤＮＡ領域と、（ｅ）ポジティブな選択可能なマーカーをコードするＤＮＡ領域と、（ｆ）転写終結及びポリアデニル化シグナルをコードするＤＮＡ領域とを含む。
【００７１】
別の態様では、二本鎖ＲＮＡ複合体が提供される。このＲＮＡは、（Ａ）ハイブリダイゼーション条件下で、或る遺伝子によってコードされるｍＲＮＡ分子の少なくとも一部にハイブリダイズする第１の配列と、（Ｂ）ハイブリダイゼーション条件下で第１の配列とハイブリダイズする第２の配列とを含む。第２の配列は、その３’末端の第１の配列と相補的な領域の終端部とポリアデニル化シグナルとの間に位置するシス作用性ハンマーヘッド型リボザイムを含む。このリボザイムは、この同じ領域内で切断してポリアデニル化シグナルを除去可能である。本発明のこの実施形態は、リボザイムを用いてＲＮＡ分子のポリアデニル化シグナルを切断するため、ＲＮＡ分子及び／またはｄｓＲＮＡが核内に維持される。
【００７２】
しかしながら、第１の配列は、或る遺伝子によってコードされるｍＲＮＡ分子の少なくとも一部にハイブリダイズする必要がない。ＲＮＡ分子またはｄｓＲＮＡ複合体が細胞内に存在する場合、ＲＮＡ鎖の一方の鎖が、或る遺伝子即ち核酸配列の少なくとも一部と相補的であれば良い。
【００７３】
本発明はまた、ｄｓＲＮＡ複合体を形成可能な線状ＲＮＡ分子をコードするＤＮＡ分子を提供する。
【００７４】
ＲＮＡ分子及びＤＮＡ分子の両方の場合には、そのような分子を２つ以上細胞に導入する。つまり、分子間ｄｓＲＮＡ複合体を形成できる、或る遺伝子即ち核酸分子に関連するセンス配列及びアンチセンス配列を別々に導入する。ＤＮＡ分子の場合、これらのＤＮＡ分子を異なった各ベクターに導入し、同時に或いは連続して細胞に導入する。しかしながら、ＲＮＡ分子及びＤＮＡ分子、並びにこれらを含むベクターを、マイクロインジェクション、小胞輸送、または当分野で周知の同様の技術を用いて細胞内の核に導入することができることは明らかである。
【００７５】
本線状ＲＮＡ分子の長さは、少なくとも２０ヌクレオチドの長さのｄｓＲＮＡ複合体が形成されるのに十分な長さでなければならない。線状ＲＮＡ分子またはその第１の配列及び第２の配列の長さには上限はないが、一実施形態では、第１の配列及び第２の配列はそれぞれ、約２０ヌクレオチド〜３０００ヌクレオチドの長さの範囲である。別の実施形態では、第１の配列及び第２の配列はそれぞれ、約２０ヌクレオチド〜２５ヌクレオチドの長さの範囲である。更に別の実施形態では、第１の配列及び第２の配列はそれぞれ、約１００ヌクレオチド〜１０００ヌクレオチドの長さの範囲である。更なる実施形態では、約２００ヌクレオチド〜５００ヌクレオチドの長さの範囲であり、好ましくは約３５０ヌクレオチドの長さである。
【００７６】
本ＲＮＡ分子の第３の配列におけるリボザイム及びターゲット配列の数は、１或いは複数とすることができる。本ＲＮＡ分子の好適な実施形態では、第３の配列は、複数のリボザイム、及びそれらのリボザイムによって切断される複数のターゲット配列を含む。このような或る実施形態では、第３の配列は、２つのリボザイムと、それらのリボザイムによって切断される２つのターゲット配列とを含む。
【００７７】
更に、第３の配列内のリボザイムは、あらゆるタイプのリボザイムとすることができる。好適な実施形態では、このようなリボザイムはハンマーヘッド型リボザイムである。本発明のパラメータ内で、リボザイムの結合ドメインの長さ（本明細書では「アーム長さ」とも呼ぶ）は、あらゆる順列にすることができ、同じであっても異なっていても良い。様々な順列、例えば７＋７、８＋８、及び９＋９の塩基対／ヌクレオチドが考えられる。結合ドメインの長さが長くなれば長くなるほど、その相補的なｍＲＮＡ配列により強固に結合することは周知の通りである。従って、好適な実施形態では、それぞれの結合ドメインの長さは、９ヌクレオチドである。好適なリボザイムは、シス作用性ハンマーヘッド型リボザイムである。
【００７８】
本ＲＮＡ分子の第３の配列内のリボザイム及びターゲット配列は、実質的に無限の数の配置方法でターゲットの切断及び第１の配列と第２の配列との間のハイブリダイゼーションを可能にすることができる。しかしながら、リボザイムとそのターゲット配列の両方は、第１の配列と第２の配列との連結部にできる限り近づけるのが好ましい。例えば、一実施形態では、第３の配列は、（ｉ）第１の配列に近接して位置する第１のターゲット（例えば、第１の配列から１０ヌクレオチド以内）、（ｉｉ）その第１のターゲットに近接して位置する第１のリボザイム、（ｉｉｉ）第２のリボザイム、（ｉｖ）第１の配列及び第２のリボザイムの両方に近接して位置する第２のターゲットの順でエレメントが配置される。このような実施形態では、第１のリボザイムが第２のターゲットを切断し、第２のリボザイムが第１のターゲットを切断するため、成分ＲＮＡ鎖内に何れのリボザイムも含まないｄｓＲＮＡ複合体が形成される。この実施形態ではまた、必ずしも必要ではないが、第１のリボザイム及び第２のリボザイムとを同一とし、第１のターゲットと第２のターゲットとを同一とすることができる。
【００７９】
リボザイムを利用した上記ｄｓＲＮＡ複合体のプロセッシングは、第３の配列内にイントロン及び好適なスプライスドナー／アクセプター部位を設けて、転写時に細胞機能によりイントロンがスプライシングされ、ｄｓＲＮＡが残るようにして達成することができる。
【００８０】
リボザイムはまた、先述したように第２の配列内に含めて、この作製物においてポリアデニル化シグナルを切断して、核内にＲＮＡ分子及びｄｓＲＮＡ複合体が保持されるようにすることができる。当業者であれば、上記したシス作用性リボザイム法は、核内にＲＮＡを保持する数ある方法の内の１つであることを理解できるであろう。例えば、核系ＲＮＡ結合タンパク質に対する認識シグナルを含める方法を用いることができる。更に、既知の核内ＲＮＡ局在化配列を含めてＲＮＡを核内に保持することができる。
【００８１】
本ＲＮＡ分子では、第３の配列に、ｄｓＲＮＡの形成を促進し、かつ／またはｄｓＲＮＡ形成をモニタするためにあらゆる追加配列を含めることができる。このような配列には、限定するものではないが、薬剤耐性を付与するような外来遺伝子、または遺伝子抑制の検出や介在配列の喪失の検出を容易にするマーカー（限定するものではないが、例えば単純ヘルペスチミジンキナーゼ、大腸菌シトシンデアミナーゼ等を含むネガティブ選択マーカー）を含めることができる。本発明はまた、真核細胞において或る遺伝子の発現を抑制するために用いられる第１の組成物を提供する。この組成物は、（ａ）ＨＩＶ Ｔａｔタンパク質をコードするＲＮＡ分子と、（ｂ）二本鎖ＲＮＡ複合体を形成する線状ＲＮＡ分子とを含む。この線状ＲＮＡ分子は、（ｉ）ハイブリダイゼーション条件下で、その遺伝子によってコードされるｍＲＮＡ分子の少なくとも一部にハイブリダイズする第１の配列と、（ｉｉ）ハイブリダイゼーション条件下で第１の配列とハイブリダイズする第２の配列と、（ｉｉｉ）第１の配列と第２の配列とが互いにハイブリダイズできるようにそれらの配列間に位置する第３の配列とを含み、これによりハイブリダイゼーション条件下での第１の配列と第２の配列のハイブリダイゼーションで、二本鎖ＲＮＡ複合体を形成する。
【００８２】
本発明は更に、第１の組成物のＲＮＡ分子をコードするＤＮＡ分子を提供する。好適な実施形態では、ＤＮＡ分子は発現ベクター内に機能的に挿入されている。
【００８３】
本発明は更に、真核細胞において或る遺伝子の発現を抑制するために用いられる第２の組成物を提供する。この組成物は、（ａ）或る遺伝子によってコードされるｍＲＮＡ分子の転写を変化させるｄｓＲＮＡの能力を高めるＲＮＡ部分をコードするＤＮＡ分子と、（ｂ）二本鎖ＲＮＡ複合体を形成する線状ＲＮＡ分子をコードするＤＮＡ分子とを含む。この線状ＲＮＡ分子は、（ｉ）ハイブリダイゼーション条件下で、その遺伝子によってコードされるｍＲＮＡ分子の少なくとも一部にハイブリダイズする第１の配列と、（ｉｉ）ハイブリダイゼーション条件下でその第１の配列にハイブリダイズする第２の配列と、（ｉｉｉ）第１の配列と第２の配列が互いにハイブリダイズできるようにそれらの配列間に位置する第３の配列とを含み、これによりハイブリダイゼーション条件下での第１の配列と第２の配列のハイブリダイゼーションで、二本鎖ＲＮＡ複合体を形成する。
【００８４】
好適な実施形態では、それぞれのＤＮＡ分子は発現ベクター内に機能的に導入されている。
【００８５】
上記した組成物の一実施形態では、線状ＲＮＡ分子の第３の配列が、（ｉ）リボザイムと、（ｉｉ）第１の配列及び第２の配列には存在しない、そのリボザイムによって特異的に認識されるターゲット配列とを含み、これにより複合体形成部分が、第１の配列と第２の配列と間のハイブリダイゼーションで二本鎖ＲＮＡ複合体を形成し、そのリボザイムによってターゲット配列が切断される。
【００８６】
上記した組成物はまた、ｄｓＲＮＡを形成可能なＲＮＡ分子をコードする１或いは複数のＤＮＡ分子を用いることができる。
【００８７】
本発明は更に、（ｉ）本ＲＮＡ分子を含む発現ベクターと、（ｉｉ）このＲＮＡ分子をコードするＤＮＡ分子と、（ｉｉｉ）このＤＮＡ分子を含む発現ベクターとを提供する。ｄｓＲＮＡ複合体の形成に１或いは複数のＲＮＡ分子及びＤＮＡ分子を用いることができ、このような分子はそれぞれ、別々のベクター内に含まれ得る。ＲＮＡ分子、ＤＮＡ分子、及びそれらを含むベクターを、同時に或いは連続して細胞に導入することができる。発現ベクター（例えば、ＬＮＬ６等のレトロウイルス発現ベクター、及びアデノウイルス発現ベクター）及びその使用法は当分野で周知であり（Sambrookら、1989年）、これらのベクターは組み込み型ベクターであっても非組み込み型ベクターであっても良い。
【００８８】
本発明は更に、本ＲＮＡ分子及び／またはこれをコードするＤＮＡ分子を含む細胞、並びに本ＲＮＡ分子及び／またはこれをコードするＤＮＡ分子を含む本発現ベクターを含む細胞を提供する。好適な実施形態では、この細胞は真核細胞である。限定するものではないが、真核細胞には、Ｈｅｌａ細胞、線維芽細胞、星状細胞、ニューロン、ＮＢ４１細胞
、Ｔリンパ球、単球、ＣＤ３４+幹細胞、及びＳｕｐＴ−１細胞が含まれる。真核細胞にはまた、分化した体細胞、分化していない体細胞、及び腫瘍細胞が含まれる。
【００８９】
本発明は、細胞内で二本鎖ＲＮＡ複合体を形成するための方法を提供する。この方法は、細胞内に本ＲＮＡ分子を導入して、この分子が二本鎖ＲＮＡ複合体を形成するようにするステップを含む。本発明はまた、この方法によって形成されるｄｓＲＮＡ複合体を提供する。本ＲＮＡ分子は、細胞に直接導入することもできるし、本ＲＮＡ分子をコードするＤＮＡ分子を導入することができる。本ＲＮＡ分子やＤＮＡ分子は何れも、ベクターを用いて導入することができる。
【００９０】
本発明は更に、真核細胞において特定の遺伝子即ち特定の核酸配列の発現を抑制する方法を提供する。この方法は、真核細胞内に１或いは複数のＲＮＡ分子や、１或いは複数のＲＮＡ分子をコードする１或いは複数のＤＮＡ分子を導入するステップを含む。前記１或いは複数のＲＮＡ分子は、前記特定の遺伝子即ち特定の核酸配列のセンサ配列及びアンチセンス配列に対応する第１の配列及び第２の配列を含む。前記ＤＮＡ分子は、前記特定の遺伝子即ち特定の核酸配列のセンサ配列及びアンチセンス配列に対応する第１のＲＮＡ分子及び第２のＲＮＡ分子をコードする配列を含む。
【００９１】
一実施形態では、この方法は、（ａ）少なくとも１つの鎖が、ハイブリダイゼーション条件下で特定の遺伝子によってコードされるｍＲＮＡの少なくとも一部にハイブリダイズする二本鎖ＲＮＡ複合体、及び（ｂ）ＨＩＶ Ｔａｔタンパク質を細胞に導入するステップを含む。別の実施形態では、この方法は細胞内に本ＤＮＡ発現ベクターを導入するステップを含む。更に別の実施形態では、この方法は、本ＤＮＡ発現ベクターを含む組成物を細胞に導入するステップを含む。更なる実施形態では、この方法は、それぞれがｄｓＲＮＡ複合体の１つの鎖をコードする一対のＤＮＡ分子を細胞に導入するステップを含む。それぞれのＤＮＡ分子は、別々のベクターによって導入される。
【００９２】
発現がこの方法によって抑制され得る遺伝子には、限定するものではないが、癌、リュウマチ様関節炎、及びウイルスに関連する遺伝子が含まれる。癌関連遺伝子には、腫瘍遺伝子（例えば、Ｋ−ｒａｓ、ｃ−ｍｙｃ、ｂｃｒ／ａｂｌ、ｃ−ｍｙｂ、ｃ−ｆｍｓ、ｃ−ｆｏｓ、及びｃｅｒｂ−Ｂ）、成長因子遺伝子（例えば、上皮成長因子及びその受容体、並びに線維芽細胞成長因子結合タンパク質をコードする遺伝子）、基質メタロプロテイナーゼ遺伝子（例えば、ＭＭＰ−９をコードする遺伝子）、接着分子遺伝子（例えば、ＶＬＡ−６インテグリンをコードする遺伝子）、腫瘍抑制遺伝子（例えば、ｂｃｌ−２及びｂｃｌ−Ｘｌ）、アンギオテンシン遺伝子、及び転移遺伝子が含まれる。リュウマチ様関節炎関連遺伝子には、例えば、ストロメライシン及び腫瘍壊死因子をコードする遺伝子が含まれる。ウイルス遺伝子には、ヒト乳頭腫ウイルス遺伝子（例えば、子宮頚癌に関連する）、Ｂ型肝炎遺伝子、Ｃ型肝炎遺伝子、及びサイトメガロウイルス遺伝子（例えば、網膜炎に関連する）が含まれる。
【００９３】
この方法の一実施形態では、細胞がＨＩＶ感染しており、遺伝子がＨＩＶ遺伝子である。ＨＩＶ遺伝子には、限定するものではないが、ｔａｔ、ｎｅｆ、ｒｅｖ、ｍａ（基質）、ｃａ（カプシド）、ｎｃ（ヌクレオカプシド）、ｐ６、ｖｐｕ、ｐｒ（プロテアーゼ）、ｖｉｆ、ｓｕ（ｇｐｌ２０）、ｔｍ（ｇｐ４１）、ｖｐｒ、ｒｔ（逆転写酵素）、及びｉｎ（インテグラーゼ）が含まれる。好適な実施形態では、ＨＩＶ遺伝子はｔａｔである。
【００９４】
本発明は更に、ＨＩＶ感染真核細胞におけるＨＩＶ遺伝子の発現を抑制する方法を提供する。この方法は、発現が抑制されるべきＨＩＶ遺伝子によってコードされるｍＲＮＡの少なくとも一部にハイブリダイズするＲＮＡ配列を含む二本鎖ＲＮＡ複合体をそのような細胞に導入することを含む。ＨＩＶ遺伝子には、限定するものではないが、ｔａｔ、ｎｅｆ、ｒｅｖ、ｍａ、ｃａ、ｎｃ、ｐ６、ｖｐｕ、ｐｒ、ｖｉｆ、ｓｕ、ｔｍ、ｖｐｒ、ｒｔ、及びｉｎ（インテグラーゼ）が含まれる。好適な実施形態では、ＨＩＶ遺伝子はｔａｔである。
【００９５】
本発明の別の方法は、細胞の核内にｄｓＲＮＡ分子を局在化させる方法に関する。この方法は、細胞内でｄｓＲＮＡ複合体が形成されるように、１或いは複数のＲＮＡ分子、または１或いは複数のＲＮＡ分子をコードするＤＮＡを細胞に導入するステップを含む。このＲＮＡ分子は、或る遺伝子によってコードされるｍＲＮＡ分子の少なくとも一部にハイブリダイズする第１の部分と、少なくとも一部がこの第１の部分にハイブリダイズ可能な第２の部分とを含む。この第２の部分は、ポリアデニル化シグナル、並びに第１の部分にハイブリダイズ可能な第２の部分の領域とこのポリアデニル化シグナルとの間に位置するリボザイムを含む。このリボザイムは、ポリアデニル化シグナルを除去して、ＲＮＡを核内に保持させることができる。
【００９６】
本発明は更に、目的の細胞内での遺伝子発現を抑制する医薬組成物を提供する。このような或る組成物は、（ａ）ハイブリダイゼーション条件下で、少なくとも一方の鎖が、或る遺伝子によってコードされるｍＲＮＡ分子の少なくとも一部にハイブリダイズ可能な二本鎖ＲＮＡ複合体と、（ｂ）ＨＩＶ Ｔａｔタンパク質と、（ｃ）医薬的に許容される担体とを含む。別の組成物は、（ａ）本ＤＮＡ発現ベクターと、（ｂ）薬学的に許容される担体とを含む。更に別の組成物は、（ａ）本ＤＮＡ発現ベクターを含む組成物と、（ｂ）薬学的に許容される担体とを含む。更なる組成物は、ｄｓＲＮＡ複合体を形成し得る一対のＲＮＡ分子またはＤＮＡ分子、このようなＲＮＡ分子及びＤＮＡ分子を含むベクター、このｄｓＲＮＡ複合体、並びに薬学的に許容される担体を含む。
【００９７】
本発明はまた、患者の細胞内での既知の遺伝子の発現の抑制により障害を改善できる患者の治療方法を提供する。この方法は、ハイブリダイゼーション条件下で発現が抑制されるべき遺伝子によってコードされるｍＲＮＡの少なくとも一部に第１の配列がハイブリダイズする本医薬組成物を薬学的に効果的な量投与することを含む。
【００９８】
本発明はまた、患者の細胞内での既知の遺伝子の発現の抑制により緩和できる障害の発症を抑制できる患者を治療する方法を提供する。この方法は、ハイブリダイゼーション条件下で、発現が抑制されるべき遺伝子によってコードされるｍＲＮＡの少なくとも一部に第１の配列がハイブリダイズする本医薬組成物を予防的に効果的な量投与することを含む。
【００９９】
この方法により発現を抑制できる既知の遺伝には、限定するものではないが、癌、リュウマチ様関節炎、及びウイルスに関連する遺伝子が含まれる。癌関連遺伝子には、腫瘍遺伝子（例えば、Ｋ−ｒａｓ、ｃ−ｍｙｃ、ｂｃｒ／ａｂｌ、ｃ−ｍｙｂ、ｃ−ｆｍｓ、ｃ−ｆｏｓ、及びｃｅｒｂ−Ｂ）、成長因子遺伝子（例えば、上皮成長因子及びその受容体、並びに線維芽細胞成長因子結合タンパク質をコードする遺伝子）、基質メタロプロテイナーゼ遺伝子（例えば、ＭＭＰ−９をコードする遺伝子）、接着分子遺伝子（例えば、ＶＬＡ−６インテグリンをコードする遺伝子）、及び腫瘍抑制遺伝子（例えば、ｂｃｌ−２及びｂｃｌ−Ｘｌ）が含まれる。リュウマチ様関節炎関連遺伝子には、例えば、ストロメライシン及び腫瘍壊死因子をコードする遺伝子が含まれる。ウイルス遺伝子には、ヒト乳頭腫ウイルス遺伝子（例えば、子宮頚癌に関連する）、Ｂ型肝炎遺伝子、Ｃ型肝炎遺伝子、及びサイトメガロウイルス遺伝子（例えば、網膜炎に関連する）が含まれる。この方法の一実施形態では、細胞がＨＩＶ感染しており、遺伝子はＨＩＶ遺伝子である。ＨＩＶ遺伝子には、限定するものではないが、ｔａｔ、ｎｅｆ、ｒｅｖ、ｍａ、ｃａ、ｎｃ、ｐ６、ｖｐｕ、ｐｒ、ｖｉｆ、ｓｕ、ｔｍ、ｖｐｒ、ｒｔ、及びｉｎが含まれる。好適な実施形態では、ＨＩＶ遺伝子はｔａｔである。
【０１００】
本発明は更に、細胞内での核酸配列の発現を変更する（好ましくは、遺伝子の発現を抑制或いは阻止する）ための方法を提供する。この方法は、細胞が培地で成長してその細胞が取り出されたｄｓＲＮＡ複合体を含む培地に細胞を曝露することを含む。このｄｓＲＮＡ複合体は、或る遺伝子によってコードされるｍＲＮＡ分子の少なくとも一部にハイブリダイズする第１の部分と、少なくとも一部がこの第１の部分にハイブリダイズ可能な第２の部分とを含む。この実施形態は、図４を参照して後述する。
【０１０１】
本医薬組成物の治療的に或いは予防的に効果的な量は、通常の算定方法を用いて動物データを基に決定する。一実施形態では、治療的に或いは予防的に効果的な量は、約０．１ｍｇ〜約１ｇの本核酸分子を含む。別の実施形態では、このような効果的な量は、約１ｍｇ〜約１００ｍｇの本核酸分子を含む。更に別の実施形態では、このような効果的な量は、約１０ｍｇ〜約５０ｍｇの核酸分子を含み、好ましくは約２５ｍｇの核酸分子を含む。
【０１０２】
本発明では、本医薬組成物の投与は、当業者に周知の様々な方法及び送達系を用いて行うことができる。投与の方法には、例えば静脈投与、経口投与、インプラントを用いる投与、経粘膜投与、経皮投与、筋内投与、及び皮下投与がある。更に、本医薬組成物は、日常的に用いられる１或いは複数の薬学的に許容される担体を含むのが理想的である。このような担体は、当業者には周知である。以下に記載する、日常的に用いられる複数の担体を利用する送達系は、本医薬組成物を投与するために考えられる数ある実施形態の内の代表的なものである。
【０１０３】
注射用薬物送達系には、溶液、懸濁液、ゲル、微粒子、及びポリマー注射液が含まれる。この薬物送達系は、溶解度変更剤（例えば、エタノール、ポリプロピレングリコール、及びスクロース）、及びポリマー（例えば、polycaprylactones及びＰＬＧＡ）等の賦形剤を含み得る。インプラント系には、ロッドやディスクが含まれる。このインプラント系は、ＰＬＧＡやpolycaprylactone等の賦形剤を含み得る。
【０１０４】
経口送達系には、タブレット及びカプセルが含まれる。この経口送達系は、結合剤（例えば、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、polyvinyl pyrilodone、他のセルロース材料、及びデンプン）、希釈剤（例えば、ラクトース及び他の糖、デンプン、リン酸二カルシウム、及びセルロース材料）、崩壊剤（例えば、starch polymer、及びセルロース材料）、及び潤滑剤（例えば、ステアリン酸塩、及びタルク）を含み得る。
【０１０５】
経粘膜送達系には、パッチ、タブレット、座薬、ペッサリー、ゲル、およびクリームが含まれる。この経粘膜的送達系は、安定剤及び相乗剤（例えば、プロピレングリコール、胆汁酸塩、及びアミノ酸）等の賦形剤、及び他の賦形剤（例えば、ポリエチレングリコール、脂肪酸エステル及びその誘導体、並びにヒドロキシプロピルメチルセルロース及びヒアルロン酸等の親水性ポリマー）を含み得る。
【０１０６】
経皮送達系には、例えば、水溶性及び非水溶性ゲル、クリーム、多層乳剤、マイクロエマルジョン、リポソーム、軟骨剤、水溶液及び非水溶液、ローション、噴霧剤、炭化水素系、及びパウダーが含まれる。この経皮送達系は、安定剤、浸透相乗剤（例えば、脂肪酸、脂肪酸エステル、脂肪アルコール、及びアミノ酸）、及び親水性ポリマー（例えば、ポリカルボフィル及びpolyvinylpyrilodone）を含み得る。一実施形態では、薬学的に許容される担体は、リポソームまたは経皮相乗剤である。本発明に用いることができるリポソームの例として、（１）セルフェクチン（CellFectin）、即ちカチオン性脂質（N, N1, N2, N3-tetramethyl-N, N1, N2, N3-tetrapalmityl-spermine）：dioleoyl phosphatidylethanolamine（DOPE）（GIBCO BRL）が１：１．５（モル比）のリポソーム剤、（２）Cytofectin GSV、即ちカチオン性脂質：ＤＯＰＥ（Glen Research）が２：１（モル比）のリポソーム剤、（３）ＤＯＴＡＰ(N-[1-(2,3-dioleoyloxy)-N, N, N-trimethyl-ammoniummethylsulfate) (Boehringer Manheim)、及び（４）リポフェクタミン（Lipofectamine）、即ちポリカチオン性脂質ＤＯＳＰＡ：中性脂肪ＤＯＰＥ(GIBCO BRL)が３：１（モル比）のリポソーム剤が挙げられる。
【０１０７】
再構成可能な送達系に用いる溶液、懸濁液、及びパウダーには、懸濁剤（例えば、ガム質、zanthans、セルロース系材料、及び糖）、湿潤剤（例えば、ソルビトール）、可溶化剤（例えば、エタノール、水、ＰＥＧ、及びポリエチレングリコール）、界面活性剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウム、Ｓｐａｎｓ、Ｔｗｅｅｎｓ、及びcetyl pyridine）、保存剤及び酸化防止剤（例えば、パラオキシ安息香酸エステル類、ビタミンＥ及びＣ、及びアスコルビン酸）、固化防止剤、コーティング剤、及びキレート化剤（例えば、ＥＤＴＡ）等の賦形剤が含まれる。
【０１０８】
当分野で一般的な技術である様々な実験方法を本発明または本発明に導く実験に用いることができる。これらの方法には、例えばフェノール／クロロホルム抽出、迅速な溶解、及びカラムでのトラップを含む核酸を単離する方法（Kramvisら（1996年）、Sambrookら（1989年）、米国特許第5,582,988号、及びYongら(1995年)を参照）、核酸分子の検出及び定量方法、触媒核酸活性を検出及び定量する方法、ＰＣＲ、ＳＤＡ、及びＴＭＡ（ＳＳＲとしても知られる）を含む核酸配列を増幅する方法（Chehabら（1987年）、Fahyら（1991年）、Jonas, V.ら（1993年）、Saikiら（1985年）、米国特許第4,683,202号、米国特許第4,683,195号、米国特許第4,000,159号、米国特許第4,965,188号、米国特許第5,176,995号;、Walderら（1993年）、Walkerら（1992年））、並びにポラクリルアミドゲル電気泳動法及び蛍光共鳴エネルギー移動法（ＦＲＥＴ）等を含む、触媒核酸分子が増幅された核酸セグメントを切断したかを判定する方法（Cuenoud及びSzostak（1995年）、ＰＣＴ国際出願番号第 WO 94/29481号）が含まれる。
【０１０９】
二本鎖ＲＮＡのex vivoでの治療への適用を概略すると、遺伝子治療をコードする作製物が、増殖能のないレトロウイルス系ウイルスに含まれる。当分野で周知の方法により、この治療をex vivoで幹細胞に適用する。幹細胞は、当分野で周知の方法により患者から単離することができる。次に、遺伝子改変した幹細胞を患者に注入して戻す。二本鎖ＲＮＡを発現する遺伝子改変細胞が疾患に影響を及ぼす。
【０１１０】
ＨＩＶ治療の特定の例では、遺伝子移入作製物には、増殖能のないMoloney Murine Leukemia Virus（ＭｏＭＬＶ）系レトロウイルスベクター（ＬＮＬ６）が含まれる。このレトロウイルスは、転写時にＨＩＶゲノム（ＨＸＢ２）の５３０番目〜１０８９番目のヌクレオチドに相同なｄｓＲＮＡ分子を生成するＡＳＨ５配列及びＨ５配列を含む。図９に示されている例には、使用することができるベクターの様々な組成が示されている。治療には、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）により骨髄から造血前駆細胞（ＣＤ３４＋細胞）を流動させ、アフェレーシスによって収集することが含まれる。ＣＤ３４＋細胞を、当分野で周知の方法でex vivoで濃縮し、培養することができる。このＣＤ３４＋細胞を、患者に戻す前に、ｄｓＲＮＡをコードする増殖能のないレトロウイルスで形質転換する。次に、ｄｓＲＮＡを含むＣＤ３４＋細胞を骨髄に移入すると、やがて抹消リンパ球集団が生成される。このｄｓＲＮＡにより、ＨＩＶ感染から保護され、感染した細胞内でのウイルス増殖が低減する。
【０１１１】
本発明はまた、遺伝子即ち核酸の発現を抑制して遺伝子即ち核酸の機能を決定する方法及びタンパク質の機能を決定する方法を提供する。
【０１１２】
本発明の別の態様では、哺乳動物細胞内での遺伝子即ち核酸配列の発現を変化させる方法が提供される。この方法は、この細胞を、本発明の哺乳動物細胞が成長した培地に曝露することを含む。この実施形態では、本発明で説明したｄｓＲＮＡ複合体をコードするキメラＲＮＡ分子を発現する哺乳動物細胞に曝露された培地を用いて、キメラＤＮＡ分子を含まない哺乳動物細胞内での特定のターゲット遺伝子の発現を変化させることができる。当業者には、この培地が、例３で説明する培地を用いて移送することができる特定のサイレンシングシグナルを含むことが明らかであろう。このシグナルは、例３に示されているように得ることもできるし、また、この分泌性サイレンシングシグナルを生成し得る別の細胞型（ショウジョウバエや植物細胞等）から得ることもできる。
【０１１３】
本発明は、後述の実験の詳細を参照することでより明確になるであろう。また当業者であれば、このような実験の詳細が単に例示目的であって、添付の特許請求の範囲内であることを理解できよう。更に、本明細書中において、様々な刊行物を引用する。本発明の属する最新の技術分野を十分に理解して頂くべく、これらの刊行物に言及することを以って、それらの開示を本明細書の一部とする。
【０１１４】
例１（本発明を例示するための物質及び方法）
エピソーム発現ベクターの作製
標準的な遺伝子クローニング法を用いて、この実験に用いられる発現プラスミドを作製する（Sambrookら、1989年）。コトランスフェクション実験に用いられるこのプラスミドは、コアエピソームプラスミドｐＲＥＰ７（Invitrogen）またはｐＥＡＫ１０（Edge Biosystems）に基づいている。これらのプラスミドは核内に保持され、通常はゲノムＤＮＡに組み込まれない。エピソームプラスミドの維持に必要な配列は、当分野で周知であるＥＢウイルスＯｒｉＰ及びＥＢＮＡ１領域である。センス及びアンチセンスｄＥＧＦＰを発現するプラスミドをｐＲＥＰ７で作製するために用いられるｄＥＧＦＰターゲット遺伝子の部分は、ｐｄ４ＥＧＦＰ−Ｎ１（Clontech）の配列マップの６６６番目〜１７４９番目である。この領域を、ｐｄ４ＥＧＦＰ−Ｎ１を鋳型、配列番号１及び配列番号２をプライマーとして用いてＰＣＲ増幅した（配列番号１の５’から２３番目のＣは、ＡＴＧ開始コドンを除去してｄＥＧＰ ＲＮＡが翻訳されないようにするために導入した）。１０８０ｂｐのＰＣＲ産物をＢａｍＨＩで消化して、これを、センス方向及びアンチセンス方向に、ＲＳＶ ＬＴＲプロモーターの下流のｐＲＥＰ７の固有のＢａｍＨＩ部位にサブクローニングして、ｐＲ７ｃｔｇＥＳ及びｐＲ７ｃｔｇＥａＳをそれぞれ生成した。５８３番目〜１７４９番目（ｐｄ４ＥＧＦＰ−Ｎ１の配列マップにおける）のｄＥＧＦＰ遺伝子の全転写ユニットを、配列番号３及び配列番号４のＰＣＲプライマーを用いてＰＣＲ増幅して、プラスミドｐＪＥＡへのｄＥＧＦＰインサートを得た。このフラグメントを、配列番号５及び配列番号６の一本鎖オリゴヌクレオチドをアニーリングして形成したＢａｍＨＩアダプターに繋いだ。次に、アダプター結合フラグメントをＢａｍＨＩで消化して、これを、哺乳動物タンパク質伸長因子１αプロモーターに対してアンチセンス方向に、ｐＥＡＫ１０（ＪＪＲ）の固有のＢｇｌＩＩ部位に繋いでｐＪＥＡを生成した。プラスミドｐＪｃｔｇＥＳを作製するために、配列番号７を順方向のプライアー、配列番号８を逆のプライマーとして用いて、６６６番目〜１７４９番目（ｐｄ４ＥＧＦＰ−Ｎ１マップ）のｄＥＧＦＰ遺伝子の領域をＰＣＲ増幅した。ＢｇｌＩＩ−ＥｃｏＲＩで消化したＰＣＲ産物を、ｐＥＡＫ１０（ＪＪＲ）の伸長因子１αプロモーターの下流にセンス方向に指向的にクローニングしてｐＪｃｔｇＥＳを生成した。センス及びアンチセンスｄＥＧＦＰ遺伝子を含むｐＲ７ｃｔｇＥＳ、ｐＲ７ｃｔｇＥａＳ、ｐＪＥＡｓ、及びｐＪｃｔｇＥＳが図１Ａに示されている。
【０１１５】
発現カセットが逆方向に反復したプラスミドが図５Ａに示されている。コアプラスミドは、ｐＥＡＫ１０（Edge Biosystems）に基づいている。ｐＥＡＫ１０（ＪＪＲ）上の伸長因子１αプロモーターを、熱ショック最小プロモーター（エクジソン／糖質コルチコイド応答エレメントを含む）で置換する。この熱ショック最小プロモーターは、アナログポナステロンＡの添加でＥｃＲ２９３細胞系に条件的に誘導される。これは、ｐＩＮＤ（Invitrogen）を鋳型、配列番号９を正のプライマー、配列番号１０を逆のプライマーとして用いて、この熱ショックプロモーター領域をＰＣＲ増幅して達成できる。このＰＣＲ産物をＳｐｅＩ及びＨｎｄＩＩＩで消化して、これを、伸長因子１αプロモーターの代わりにｐＥＡＫ１０（ＪＪＲ）の中に指向的にサブクローニングしてプラスミドｐＥＡＫ１０（ＪＪＲ）ＩＮＤを作製した。このベクターを更に、ｐＤｓＲｅｄｌ−Ｎｌ（Clontech）に由来するＲＦＰ遺伝子を導入して改変した。これには、複数のクローニング部位を除去するために、ＮｈｅＩ及びＡｇｅＩによるｐＤｓＲｅｄｌ−Ｎｌの消化、末端の平滑化、及び自己連結が含まれる。次にＲＦＰカセットを、配列番号１１及び配列番号１２をＰＣＲプライマーとして用いて改変ｐＤｓＲｅｄｌ−ＮｌからＰＣＲ増幅した。ＳｐｅＩで消化した作製物をＳｐｅＩで線状にしたｐＥＡＫ１０（ＪＪＲ）ＩＮＤにクローニングして、ｐＥＡＫ１０（ＪＪＲ）ＩＮＤＲＦＰを作製した。
【０１１６】
プラスミドｐＥＡＫ１０（ＪＪＲ）ＩＮＤＲＦＰＰＡＮに含めるキメラ遺伝子を作製するために、配列番号１３を正のプライマー、配列番号１４を逆のプライマーとして用いて、６６６番目〜１５２７番目（ｐｄ４ＥＧＦＰ−Ｎｌマップ）のｄＥＧＦＰ遺伝子の領域をｐＪｃｔｇＥＳからＰＣＲ増幅した。この８６２ｂｐのフラグメントをＢｇｌＩＩ及びＥｃｏＲＩで消化し、これを、ｐＥＡＫ１０（ＪＪＲ）ＩＮＤＲＦＰの条件熱ショックプロモーターの下流にセンス方向に指向的にクローニングした。ｐＥＡＫ１０（ＪＪＲ）ＩＮＤＲＦＰＰＡＮのキメラ遺伝子を完成させるために、ｄＥＧＦＰの５’末端から３５０ｂｐの領域（ｐｄ４ＥＧＦＰ−Ｎｌベクターの６６６番目〜１０２０番目に対応する）を、配列番号１５及び配列番号１６をプライマーとして用いてＰＣＲ増幅し、８６２ｂｐのｄＥＧＦＰフラグメントの下流にアンチセンス方向にＥｃｏＲＩフラグメントとしてクローニングして逆方向反復カセットを形成した。
【０１１７】
ｐＩＲ（intron）Ａ及びｐＩＲ（intron）Ｂに含めるイントロン含有キメラ遺伝子を作製するために、３ステップのクローニングプロトコルを実施した。第１のステップでは、配列番号１７を正のプライマー、配列番号１８を逆のプライマーとして用いて、６６６番目〜１５２７番目（ｐｄ４ＥＧＦＰ−Ｎｌマップ）のｄＥＧＦＰ遺伝子の８６２ｂｐの領域をｐＪｃｔｇＥＳからＰＣＲ増幅して、ＢｇｌＩＩフラグメントとしてｐＥＡＫ１０（ＪＪＲ）ＩＮＤＲＦＰの条件熱ショックプロモーターの下流に両方向にクローニングした。第２のステップでは、ベクターｐＩＲＥＳ−Ｎｅｏ（Clontech）の９７４番目〜１２６９番目の２９６ｂｐの合成介在配列を、配列番号１９及び配列番号２０をプライマーとして用いてＰＣＲ増幅し、ＫｐｎＩフラグメントとして、第１のステップでクローニングしたｄＥＧＦＰフラグメントの下流にセンス方向にクローニングした。作製プロセスの最後のステップでは、６６６番目〜１５２７番目（ｐｄ４ＥＧＦＰ−Ｎｌマップ）のｄＥＧＦＰ遺伝子の８６２ｂｐの領域を、増幅したフラグメントにＸｂａＩ及びＥｃｏＲＩ部位を導入するＰＣＲプライマーを用いてｐＪｃｔｇＥＳからＰＣＲ増幅した。これらのフラグメントを、イントロン配列の下流に指向的にクローニングし、図５Ａに示されているようにプラスミドｐＩＲ（intron）Ａ及びｐＩＲ（intron）Ｂに逆方向反復遺伝子を導入した。
【０１１８】
核から細胞質へのＲＮＡの移動の制限における作用性ハンマーヘッド型リボザイムの有用性を検査するためのプラスミドを作製するために、まず、配列番号２１を５’プライマーとして、配列番号２２を３’プライマーとして用いて、ｐＧＲＥＥＮＬＡＮＴＥＲＮ（Life Technologies）からヒト化ＧＦＰのオープンリーディングフレームをＰＣＲ増幅した。シス作用性リボザイムは当分野で周知であり、Ecknerら（EMBO 10 (11) : 3513-3522,1991年）、及びLiuら（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 4258-4262, 1994年）に記載されている。次に、このＤＮＡを、ｐＥＡＫ１０（ＪＪＲ）の伸長因子１αプロモーターの制御下で、センス方向にＨｉｎｄＩＩＩフラグメントとしてクローニングしてｐＥＡＫ１０ｇｆｐｓを作製した。シス作用性リボザイムをコードするＤＮＡは、互いに相補的なオリゴヌクレオチドである配列番号２３と配列番号２４を合成してアニーリングして得た。このＤＮＡをＥｃｏＲＩで消化し、ＥｃｏＲＩ及びＥｃｏＲＶで消化した後のプラスミドｐＥＡＫ１０ｇｆｐｓに指向的に繋いだ。最終的なプラスミドｐＥＡＫ１０ｇｆｐｓ＋ＲＢＺが得られた。プラスミドｐＥＡＫ１０ｇｆｐｓ及びｐＥＡＫ１０ｇｆｐｓ＋ＲＢＺのそれぞれに対して、プラスミドｐＥＡＫ１０ｇｆｐｓのＧＦＰ ＯＲＦの下流のＳＶ４０ポリアデニル化シグナルが除去された誘導体、及びプラスミドｐＥＡＫ１０ｇｆｐｓ＋ＲＢＺのシス作用性リボザイム配列が除去された誘導体をそれぞれ作製した。このようにして、プラスミドｐＥＡＫ１０ｇｆｐｓ−ｐＡ及びプラスミドｐＥＡＫ１０ｇｆｐｓ＋ＲＢＺ−ｐＡのそれぞれを得た。
【０１１９】
ｄＥＧＦＰを発現する細胞系の作製
ｄＥＧＦＰターゲット遺伝子を発現する細胞系を、ＡｆｌＩＩで線状化したプラスミドｐｄ４ＥＧＦＰ−Ｎ１（Clontech）を用いてEcR２９３細胞（Invitrogen）を電気穿孔して作製した。トランスフェクトされた細胞集団を、ＮｅｏＲクローンの利用により、５００μｇ／ｍｌのＧ４１８の存在下で選択し、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）分析でｄＥＧＦＰ発現についてスクリーニングした。ＣＭＶ最初期プロモーターの制御下でｄＥＧＦＰを発現する細胞系は、１コピーのｄＥＧＦＰ発現カセットを含むことを示している。
【０１２０】
細胞培養及びその方法
ヒト胚腎細胞Ｅｃｒ２９３（Invitrogen）及びそれらの誘導体を、ＤＭＥＭを含む１０％のウシ胎児血清に維持し、グルタミン、ストレプトマイシン、及びペニシリンを追加した。この細胞系は、エクジソンの類似対であるポナステロンＡの存在下でハイブリッドエクジソン応答エレメントに結合するレチノイドＸ受容体（ＲＸＲ）とエクジソン受容体（ＶｇＥｃＲ）とのヘテロダイマーを発現する（Noら、1996年、Saezら、2000年）。ＧＦＰ或いはＲＦＰの発現についてのＦＡＣＳ分析を、Becton Dickinson ＦＡＣＳＯＲＴにおいて実施した。製造者の説明書に従ってＴＲＩＺｏｌ試薬（Life Technologies社）を用いて細胞から全ＲＮＡを抽出した。Sambrookら（1989年）に従ってノーザンハイブリダイゼーション法でターゲットｍＲＮＡの検出を行った。
【０１２１】
２つの異なったエピソームプラスミドでコトランスフェクトされた細胞を選択するために、これらのプラスミドを各２．５μｇ用いて合計で２．５×１０６個のｄＥＧＦＰ発現細胞を電気穿孔した。トランスフェクトしてから４８時間後に、細胞を０．７μｇ／ｍｌのピューロマイシン（ｐＥＡＫ１０系プラスミドを選択するため）及び１００μｇ／ｍｌのハイグロマイシン（ｐＲＥＰ７系プラスミドを選択するために）に曝露した。この２種類の選択から２８日後に、５００μｇ／ｍｌのＧ４１８を添加して第３の選択を行った。電気穿孔してから５週間後に、選択された集団のそれぞれを、ｄＥＧＦＰ仲介細胞蛍光、ｄＥＧＦＰタンパク質レベル、及びｄＥＧＦＰ ｍＲＮＡの定常状態レベルについて特徴付けを行った。
【０１２２】
一過性アッセイで逆方向に反復したプラスミドを検査するために、合計５μｇの各プラスミド及びコントロールベクターを、１×１０６個のｄＥＧＦＰ発現細胞内に個々に電気穿孔した。トランスフェクトから４８時間後に、それぞれの細胞集団を１０μｌのポナステロンＡ（誘導条件）或いは担体のみ（非誘導条件）の何れかで処理した。この処理から２４時間後に、細胞を回収してｄＥＧＦＰ仲介細胞蛍光について分析した。これには、ＲＦＰポジティブ細胞（トランスフェクトされた細胞のみ）のゲーティング（gating）及びこの亜集団内のｄＥＧＦＰ蛍光プロフィールの決定が含まれる。
【０１２３】
ＲＮＡの核内への保持についてのシス作用性ハンマーヘッド型リボザイムの効果を検査するために、図６Ａに示されているそれぞれの作製物を電気穿孔法によりｄＥＧＦＰ発現細胞に導入した。トランスフェクトから４８時間後に、エピソームプラスミドを含む細胞を１ｍｇ／ｍｌのピューロマイシンを添加して選択した。選択の３週間後に、ピューロマイシン耐性細胞を回収して、ｄＥＧＦＰ仲介細胞蛍光についてアッセイした。
【０１２４】
ウェスタンブロット法
細胞可溶化物を、プロテアーゼ阻害剤aprotonin（１μｇ／ｍｌ）、ロイペプチン（１０μｇ／ｍｌ）、及びＤＭＳＦ（１００μｇ／ｍｌ）を添加したＲＩＰＡバッファーを用いて準備した。合計６０μｇの全タンパク質を、投入前の１０％アガロースＴｒｉｓ−ＨＣＬゲル（BioRad）に導入する。２００Ｖで１時間電気泳動してタンパク質を分離し、８０Ｖで６０分間〜９０分間かけてＰＶＤＦメンブレン（Millipore）に移す。このメンブレンを、ＧＦＰマウスポリクローナル抗体（Clontech）、ＰＫＲウサギポリクローナル抗体（SantaCruz）、或いβアクチンマウスモノクローナル抗体（SantaCruz）に接触させる。ヤギ抗マウス（西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合）またはヤギ抗ウサギＨＲＰ（SantaCruz）を用いて二次抗体検出を行い、ルミノール／エンハンサー化学発光基板（Amersham）を用いて視覚化した。
【０１２５】
培地移送実験
ｄＥＧＦＰ仲介細胞発光における培養培地の効果を検査するために、コントロール細胞と、アンチセンス及びセンスｄＥＧＦＰ ＲＮＡを同時発現する細胞とをそれぞれ、コントロール細胞条件培地、センス／アンチセンス細胞条件培地、及びＤＭＥＭ培地の３つのタイプの培地に播種した。２日〜５日後に、それぞれの培地で、コントロール細胞とアンチセンス及びセンスｄＥＧＦＰ ＲＮＡを同時発現する細胞との両方を、ＦＡＣＳで細胞蛍光についてアッセイした。
【０１２６】
逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）
アンチセンス及びセンスｄＥＧＦＰ ＲＮＡの発現を検出するために、標準的なＲＴ−ＰＣＲ反応を実施した。反応条件には、５００ｎｇの全ＲＮＡ、２５ｎＭ 逆のプライマー、５ｎＭ 正のプライマー、６単位のMoloney Murine Leukemia Virus（Ｍ−ＭｕＬＶ）ＲＴ（米国、New England BioLabs）、１×ＰＣＲ Ｇｏｌｄバッファー（１５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．０、５０ｍＭ ＫＣｌ；米国、Perkin Elmer）、４ｍＭ ＭｇＣｌ２、１．８単位のＴａｑ Ｇｏｌｄ（米国、Perkin Elmer）、１０ｍＭ ｄＮＴＰ、及び１０単位のＲＮａｓｉｎ（米国、Promega）が含まれる。センスｄＥＧＦＰ ＲＮＡの場合、配列番号２５の正のプライマー及び配列番号２６の逆のプライマーを用いる。アンチｄＥＧＦＰ ＲＮＡの場合、配列番号２７の正のプライマー及び配列番号２８の逆のプライマーを用いる。何れの場合も、２つのステップでサイクルグ条件を用いた。逆転写ステップでは、反応物を５０℃で６０分間インキュベートし、次に９５℃で１０分間インキュベートしてＴａｑ抗体を不活化した。ＰＣＲステップでは、サイクル条件は、９４℃で３分間、次に９４℃で１分間、６５℃で１分間、７２℃で２分間を３０サイクルである。最後に、全反応物を７２℃で１０分間インキュベートした。これらの反応条件を用いて、センスｄＥＧＦＰ ＲＮＡ及びアンチセンスｄＥＧＦＰ ＲＮＡがそれぞれ、２６０ｂｐ及び６８０ｂｐのＲＴ−ＰＣＲ産物として検出された。これらのバンドは何れも、Ｍ−ＭｕＬＶ ＲＴの非存在下では観察されなかった。これらのＲＴ−ＰＣＲ産物のＤＮＡ配列は、それぞれが対応するｄＥＧＦＰ ＲＮＡに由来することを示した。
【０１２７】
Ｄｉｃｅｒのヒト相同体の発現を検出するために、上記したＲＴ−ＰＣＲ条件を、Ｄｉｃｅｒ特異的な配列番号２９の正のプライマー及びＤｉｃｅｒ特異的な配列番号３０の逆のプライマーと共に用いた。全ＲＮＡからの増幅で、予期していた５７９塩基対のＲＴ−ＰＣＲ産物が生成された。
【０１２８】
例２（ｄＥＧＦＰ遺伝子発現におけるセンスＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、並びにセンス及びアンチセンスＲＮＡの同時発現の影響）
サイトメガロウイルス最初期プロモーターの制御下で安定的にｄＥＧＦＰ遺伝子を発現する（そして、結合したＮＥＯＲ遺伝子の存在によりＧ４１８耐性である）ヒト胚腎細胞系を、ＨｙｇＲ遺伝子（ハイグロマイシン耐性を付与）或いはＰｕｒＲ遺伝子（ピューロマイシン耐性を付与）の何れかとセンス及びアンチセンス発現カセットを含むエピソームプラスミドでトランスフェクトした。ターゲットｍＲＮＡに相補的なアンチセンスＲＮＡやターゲットｍＲＮＡに相同なセンスＲＮＡを発現させるために用いるカセットの構造が図１Ａに示されている。センス遺伝子におけるＡＴＧ開始コドンは、コードされたセンスＲＮＡがｄＥＧＦＰタンパク質に翻訳されないように改変されている。センスプラスミド及びアンチセンスプラスミドでコトランスフェクトした後、エピソーム及びターゲット遺伝子の両方を含む細胞をピューロマイシン、ハイグロマイシン、及びＧ４１８を用いて選択した。コントロール細胞は、アンチセンス遺伝子やセンス遺伝子を含まない２つのベースベクターを含むが、一方のアンチセンスプラスミドやセンスプラスミドを含む細胞は、第２の選択マーカーを含む適切なベースベクターでコトランスフェクトされている。従って、選択された全ての細胞は、ピューロマイシン、ハイグロマイシン、及びＧ４１８に対して耐性を有している。選択の後、全てのコトランスフェクタントを継代培養して異なったレベルの集密に成長させ、細胞の蛍光プロフィールについてＦＡＣＳで分析した。これらの結果の概要が図１Ｂに示されている。
【０１２９】
図１Ｂの結果は、ベクターのみを含む細胞、アンチセンスプラスミドのみを含む細胞、またはセンスプラスミドのみを含む細胞が、ｄＥＧＦＰ仲介細胞蛍光の低下を示さなかったことを示している。この結果は、哺乳動物構成ＥＦ１αプロモーター或いはラウス肉腫ウイルスＬＴＲの何れかによって制御されたアンチセンス遺伝子或いはセンス遺伝子を用いて観察した。これとは対照的に、アンチセンスプラスミド及びセンスプラスミドの両方を含む細胞は、ｄＥＧＦＰターゲット遺伝子によって制御された細胞蛍光が約４０％〜６０％低下したことが観察された。同じ傾向が、集密度の異なる３つの培養細胞でも観察された。これらのデータは、ターゲットｍＲＮＡの存在下でのアンチセンスＲＮＡ及びセンスＲＮＡの同時発現が、アンチセンスプラスミド或いはセンスプラスミドを単独で用いるよりも、ヒト細胞におけるターゲット遺伝子の発現に関連した細胞表現型の抑制に効果的であることを示している。従って、分子間ｄｓＲＮＡを形成し得る２つの相補的なＲＮＡをヒト体細胞に導入することにより、哺乳動物培養細胞における特定の遺伝子の発現を制御することができる。
【０１３０】
更に、ｄＥＧＦＰターゲットｍＲＮＡ及びタンパク質の定常状態レベルにおけるセンス及びアンチセンスｄＥＧＦＰ ＲＮＡ同時発現の影響について、上記したトランスフェクタントの特徴を明らかにした。コントロール細胞、アンチセンス細胞、センス細胞、並びにセンス及びアンチセンスＲＮＡを同時発現する細胞から単離した全ＲＮＡのノーザン分析により、これら全てのタイプの細胞が、同じ定常状態レベルのｄＥＧＦＰターゲットｍＲＮＡを示すことが分かった（図２）。従って、これらの条件下でのアンチセンス及びセンスＲＮＡ同時発現細胞におけるｄＥＧＦＰ仲介細胞蛍光の低下は、ターゲットｍＲＮＡの代謝回転の上昇によるものであるとは考えられない。ｄＥＧＦＰタンパク質のレベルにおけるこれらの相補的なＲＮＡの同時発現の影響を検査するために、上記した細胞から全タンパク質を抽出し、ｄＥＧＦＰ特異抗体及びβアクチン特異抗体を用いて分析した（図３）。これらのタンパク質のブロットの分析により、ｄＥＧＦＰタンパク質のレベルがアンチセンス及びセンスＲＮＡ同時発現する細胞で、他のタイプの細胞に比べて５０％低下したことが示された（図３Ｂ）。この結果により、アンチセンス及びセンス同時発現細胞における細胞蛍光の表現型の変化が、定常状態レベルのｄＥＧＦＰタンパク質の低下によるものであることが分かった。更に、この抑制効果が、ｄＥＧＦＰタンパク質に特異的であって、ｐ５３やβアクチンの定常状態レベルを変化させない。更に、ｐ５３タンパク質は活性化されない。なぜなら、ｐ２１タンパク質のレベルが、対応するコントロールベクターを含む細胞と比べて、アンチセンス及びセンス同時発現細胞において変化しないためである。
【０１３１】
ｄＥＧＦＰターゲット遺伝子発現における観察された抑制効果に相補的なＲＮＡの同時発現が必要であることを実証するために、コードされたＲＮＡの存在について選択した細胞を検査した。ＲＴ−ＰＣＲ分析により、アンチセンスＲＮＡ特異的産物及びセンスＲＮＡ特異的産物の両方の存在が示された。更に、これらのＲＴ−ＰＣＲ産物のクローニング及びシークエンシングにより、これらの産物が常在エピソームプラスミドに由来し、これらの転写物がアデノシンデアミナーゼ活性によって修飾されていないことが分かった。従って、これらの結果は、アンチセンス及びセンスエピソームプラスミドを含む細胞がこれらの相補的なｄＥＧＦＰ ＲＮＡを発現し、これらのＲＮＡがターゲットｄＥＧＦＰ ｍＲＮＡに対して準化学量論的（substochiometric）な定常状態レベルで存在する。
【０１３２】
二本鎖ＲＮＡによって遺伝子妨害するこの方法は、酵素Ｄｉｃｅｒによってコードされる活性の存在を必要とする小さなｄｓＲＮＡ（ｓｉＲＮＡと呼ぶ）または小さな一本鎖ＲＮＡ（ｓｔＲＮＡと呼ぶ）の生成を提案する。Ｄｉｃｅｒのヒト相同体が、センス及びアンチセンスｄＥＧＦＰ ＲＮＡを同時発現するように選択されたヒト胚腎細胞で発現するかどうかを判定するために、全ＲＮＡに対してＲＴ−ＰＣＲを実施した。例１に記載した方法を用いて、５７９塩基対のＲＴ−ＰＣＲ産物を、これら２つの相補的なＲＮＡを同時発現する細胞で検出した。これは、これらの細胞が、他の形態のｄｓＲＮＡ仲介遺伝子制御に関与すると推定される、宿主によってコードされるタンパク質の１つの発現を保持することを示す。
【０１３３】
ｄｓＲＮＡの取り込みに対する哺乳動物体細胞の一般的な応答は、ＰＫＲのリン酸化、翻訳全体の停止、及び最終的にアポトーシスを引き起こすＰＫＲ応答の活性化である。ｄｓＲＮＡを形成する能力を持つセンス及びアンチセンスｄＥＧＦＰ ＲＮＡの同時発現がＰＫＲのレベルに影響を与えるかどうかを検査するために、コントロール細胞、アンチセンス細胞、センス細胞、並びにセンス及びアンチセンスＲＮＡを同時発現刷る細胞におけるこのタンパク質の定常状態レベルを検査した。検査した全ての細胞のタイプで、ＰＫＲタンパク質のレベルは一定であり、ＰＫＲのリン酸化が認められなかった。従って、同じ細胞へのセンス及びアンチセンスｄＥＧＦＰプラスミドの導入は、ｄＥＧＦＰの発現に明らかな抑制効果があるが、驚くべきことに、従来技術から予想されるようなｄｓＲＮＡの存在による一般的な細胞応答が起きない。
【０１３４】
例３（ターゲット遺伝子のみを発現する様々な細胞集団に対するｄｓＲＮＡ仲介抑制効果の伝達性）
非哺乳動物細胞における遺伝子の不活化のメディエーターとしてｄｓＲＮＡを用いた過去の研究から、in vivo（Bosher及びLabousesse、2000年）或いは培養（Caplenら、2000年）において抑制効果の一部を他の細胞に伝達できることが分かっている。ｄＥＧＦＰに特異的なｄｓＲＮＡ仲介抑制効果の伝達性を調べるために、培地交換実験を行った（図４Ａ）。コントロール細胞、及びアンチセンス及びセンスｄＥＧＦＰ ＲＮＡを同時発現する細胞から条件培地を単離して、これらの培地を用いてコントロール細胞、及びアンチセンス及びセンスｄＥＧＦＰ ＲＮＡを同時発現する細胞をそれぞれ培養した。このコントロール培地をアンチセンス及びセンスｄＥＧＦＰ ＲＮＡを同時発現する細胞に加えても、細胞蛍光の発現レベルは変化しなかった（図４Ｂ）。これとは対照的に、アンチセンス及びセンスｄＥＧＦＰ ＲＮＡを同時発現する細胞から単離した条件培地で培養したコントロール細胞では、ｄＥＧＦＰ仲介細胞蛍光の低下が見られた。レシピエントコントロール細胞からの全タンパク質のウェスタンブロット分析により、アンチセンス及びセンスｄＥＧＦＰ ＲＮＡを同時発現する細胞から得た培地に曝露された細胞のみで、ｄＥＧＦＰレベルが５０％低下したことが分かった（図４Ｃ）。これらの条件下で、レシピエントコントロール細胞では、ｐ５３或いはβアクチンの何れの定常状態レベルにも低下が見られなかった。従って、センス及びアンチセンスｄＥＧＦＰ ＲＮＡの同時発現によりヒト細胞内で生じる抑制効果を、センスＲＮＡ或いはアンチセンスＲＮＡの何れにも曝露されていない細胞に伝達することができる。
【０１３５】
例４（ｄＥＧＦＰターゲット遺伝子の表現型発現におけるｄＥＧＦＰに特異的な分子内ｄｓＲＮＡを発現する遺伝子作製物の影響）
遺伝子特異的ｄｓＲＮＡは、二本の相補的なＲＮＡ鎖の同時発現（先述）によって、或いは分子内ｄｓＲＮＡを形成可能な、内部相補性（逆方向反復プラスミドと呼ぶ）を有するＲＮＡを発現するカセットを用いて生成することができる。ｄＥＧＦＰ特異的な一連の逆方向反復プラスミドを作製した（図５Ａ）。これらのプラスミドはそれぞれ、ｄＥＧＦＰ発現ヒト細胞に個別に電気穿孔し、トランスフェクト細胞を、逆方向反復プラスミドに含まれるＲＦＰマーカーによって特定した。次にこの集団を、ｄＥＧＦＰ仲介細胞蛍光において逆方向反復ｄｓＲＮＡの発現を誘導する効果について評価した（図５Ｂ）。この分析により、電気穿孔の４８時間後（そして逆方向反復ｄｓＲＮＡの発現を誘導するためにポナステロンＡを添加して２４時間後）に、内部にイントロンを含む分子内ｄｓＲＮＡの発現で、ｄＥＧＦＰ仲介細胞蛍光が最大３０％〜５０％低下したことが分かった。この抑制効果は、逆方向反復カセットを制御する条件プロモーターの発現誘導時に一層顕著であった。必要とされる逆方向反復の適切な長さは、単純な実験で決定することができる。
【０１３６】
これらの結果は、逆方向反復ｄｓＲＮＡの発現により、ヒト培養細胞における特定の遺伝子の表現型の発現を抑制できることを示している。
【０１３７】
例５（シス作用性リボザイムを用いてｄｓＲＮＡの発現を核に制限する）
全応答機構の存在下で、ｄｓＲＮＡを用いた哺乳動物細胞の遺伝子発現の制御に対する提案された制限の１つは、ＰＫＲ誘導を最小にすることを含む（Sharp、1999年）。これらの活性を高めると、細胞の成長及びアポトーシスが抑制される。この全応答は、細胞質に制限されると提案されている。ここに記載する実験では、センス／アンチセンスｄｓＲＮＡの中には、核から細胞質に移送されるものがあると考えられる。従って、ｄｓＲＮＡに誘導される全応答を回避するための方法をデザインした。この方法は、核内でのｄｓＲＮＡの発現を含む。最後に、シス作用性ハンマーヘッド型リボザイムをコードするＤＮＡ配列を、ｐＥＡＫ（ＪＪＲ）ｇｆｐｓ内のＧＦＰ ＯＲＦとポリ（Ａ）シグナルとの間に導入した。シス作用性リボザイムはポリアデニル化を防止し、コードされた転写物（ｄｓＲＮＡ）が細胞質へ移動するのをブロックする（Liuら、1994年）。これを考査するために、２９３細胞を、このようなリボザイムを含むまたは含まないｐＥＡＫ１０（ＪＪＲ）ｇｆｐｓでトランスフェクトして、その４８時間後及び３週間後に蛍光を測定した。
【０１３８】
ＧＦＰ遺伝子の３’ＵＴＲにシス作用性リボザイムを付加することにより、蛍光が１５％低下した。この作製物からポリアデニル化（ポリ（Ａ））モジュールを除去すると、蛍光が８２％低下した。ＧＦＰ遺伝子の発現低下の考えられる理由の１つは、ポリ（Ａ）尾部の喪失による転写物の不安定化であると思われる。しかしながら、このようなシスリボザイム及びポリ（Ａ）配列の両方を含まないプラスミドでは、９８％の細胞蛍光を発現した。ポリ（Ａ）シグナルの非存在下でのシス作用性リボザイム配列から得た結果は、この作製物が、コードされたＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を核内に保持するのにより効果的である可能性を示している。当業者には、この方法及び上記した発現ベクターを用いて、真核細胞の核内に２つの相補的なＲＮＡ及び逆方向反復ｄｓＲＮＡを保持して、ＰＫＲ応答の誘導リスクを低減できることが明らかであろう。
【０１３９】
理論に制限されることなく、本発明の作用機構はｄｓＲＮＡの実際の形成に依存し得ると提案される。ｄｓＲＮＡは一旦形成されると、小さなフラグメントに分解され、これらのフラグメントがターゲット遺伝子即ち核酸配列のｍＲＮＡからの翻訳を妨害し得ると提案される。しかしながら、本作用機構を、これらの点を含む或いは含まない他の方法によって達成することができる。
【０１４０】
例６（哺乳動物細胞におけるＨＩＶ−１特異的ｄｓＲＮＡ作製物の検査）
ｄｓＲＮＡ仲介遺伝子抑制の可能な作用機構の１つが図７に示されている。この図は、タンパク質がｄｓＲＮＡに結合して切断を開始してｄｓＲＮＡが最終的に２１個〜２３個に分割される、ｄｓＲＮＡ仲介遺伝子抑制の提案された機構が示されている。次にタンパク質結合フラグメントが増幅ステップ（通常は、関係するＲＮＡポリメラーゼを用いて）を経て、ターゲットｍＲＮＡにハイブリダイズする。物理的なアンチセンスブロックが転写を阻止するか、或いはより可能性が高くは、タンパク質が隔離されてターゲットｍＲＮＡが切断される。
【０１４１】
特定の遺伝子抑制のためにｄｓＲＮＡを形成する様々な方法が図８Ａ乃至図８Ｃに例示されている。第１の機構（図８Ａ）は、転写時に相補的な配列が結合してループを形成する介在配列のクローニングを含む。第２の機構（図８Ｂ）は、スプライスドナー（ＳＤ）／スプライスアクセプター（ＳＡ）部位を備えたイントロンを含み、転写時に細胞機構がイントロンをスプライシングし、ターゲット配列に相同なヘアピンＲＮＡ分子が残る。本発明の好適な実施形態である第３の機構（図８Ｃ）では、リボザイムに隣接した介在配列を含むため、転写時にリボザイムが介在配列を切断し、ターゲットｍＲＮＡに相同なｄｓＲＮＡが残る。
【０１４２】
ＨＩＶ−１ウイルスＲＮＡの領域に特異的なｄｓＲＮＡによってＨＩＶ−１の複製がヒト細胞内でブロックされたかを検査するために、図９に概略を示す遺伝子作製物を作製する。これら全ての作製物は、Ｍｏｌｏｎｅｙ Ｍｕｒｉｎｅ Ｌｅｕｋｅｍｉａ Ｖｉｒｕｓ （ＭｏＭＬＶ）系の増殖能のないレトロウイルスベクター（ＬＮＬ６）に含まれている。第１の作製物（図９のＡ）では次のステップを実施した。（ａ）ヌクレオチドの５３０番目〜１０８９番目（ＨＸＢ２配列の）を含むＨＩＶ−１ゲノムの領域を５’ＬＴＲに対してセンス方向にＮｅｏＲマーカーの下流のＬＮＬ６にクローニングする。この配列はＨ５と呼び、この領域の上側の鎖の配列は配列表の配列番号３１の通りである。（ｂ）次に、シス作用性リボザイムに隣接した介在配列をコードする領域をＨ５の下流にクローニングする。このフラグメントは、配列表の配列番号３２の通りであり、ＩＶＳリボザイムと呼ぶ。（ｃ）ヌクレオチドの５３０番目〜１０８９番目（ＨＸＢ２配列の）を含むＨＩＶ−１ゲノムの領域を５’ＬＴＲに対してアンチセンス方向にＩＶＳリボザイムの下流にクローニングする。この配列をＡＳＨ５と呼び、この領域の上側の鎖の配列は配列表の配列番号３３の通りである。
【０１４３】
第２の作製物（図９のＢ）では、Ｔａｔが転写を促進することができるように、ＨＩＶ−１の６１塩基対のＴＡＲ配列（ＨＩＶ Ｒ領域）を前記第１の作製物の５’ＬＴＲのＵ５領域内にクローニングする。ＨＩＶ Ｒ領域の配列の上側の鎖の配列は、配列表の配列番号３４（GenBank受入れ番号K03455）の通りである。
【０１４４】
第３の作製物（図９のＣ）では、第１の作製物のＮｅｏＲマーカーの代わりにＴａｔタンパク質をコードするヌクレオチド配列をクローニングし、ｐＬＸＳＮ（米国のClontech社）からのＳＶ４０ドライブＮｅｏＲマーカーを、ＡＳＨ５配列の下流にサブクローニングする。Ｔａｔタンパク質のアミノ酸配列は配列表の配列番号３５の通りである。
【０１４５】
これら３つの作製物のそれぞれを、図９に示された作製物を含むレトロウイルスで感染させてＣＥＭ−Ｔ４細胞に導入する。Ｇ４１８での選択の後、これらの細胞をＨＴＬＶ−ＩＩＩＢに曝露し、感染してから５日、６日、及び／または７日経過したら、細胞上清をｐ２４抗原についてアッセイし（ベルギー国のInnunogenetics社のInnotestを用いて）、ＨＩＶ複製における影響を評価する。
【０１４６】
例７（ｄｓＲＮＡをコードするレトロウイルス作製物を用いたＨＩＶ患者の治療）
治療には、骨髄に由来しアフェレーシスによって収集された顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ‐ＣＳＦ）による造血前駆細胞（ＣＤ３４＋細胞）の可動化を含む。ＣＤ３４＋細胞は、当分野で周知の方法によりex vivoで強化及び培養する。ＣＤ３４＋細胞は、患者に再び注入する前に、例６で説明した作製物を含みｄｓＲＮＡをコードする増殖能のないレトロウイルスで形質導入する。次に、ｄｓＲＮＡを含むＣＤ３４＋細胞を骨髄に導入すると、やがて抹消リンパ球集団が生成される。このｄｓＲＮＡにより、ＨＩＶ感染から保護され、感染した細胞内でのウイルス増殖が低減する。
【０１４７】
本発明は、特定の例を用いて説明してきたが、当業者であれば本発明が様々な形態で実施可能であることを理解できよう。
【０１４８】
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【図面の簡単な説明】
【０１４９】
【図１Ａ】センス及びアンチセンスｄＥＧＦＰ ＲＮＡを同時発現するヒト胚腎細胞における不安定化緑色タンパク質（ｄＥＧＦＰ）仲介細胞蛍光の低減。例２に用いられたｄＥＧＦＰターゲット遺伝子、センス遺伝子、及びアンチセンス遺伝子の模式的な例を示す図である。ｄＥＧＦＰ発現細胞系に組み込まれたｄＥＧＦＰターゲット遺伝子の構造が図の一番上に示されている。ｄＥＧＦＰのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）が、ＣＭＶ最初期プロモーター及びＳＶ４０ｐＡポリアデニル化シグナルの制御下にある。センス及びアンチセンスｄＥＧＦＰ遺伝子を含むエピソームプラスミドは、左端に示されているそれぞれの発現プラスミドの呼称で示されている。下向きの矢印は、ｄＥＧＦＰ ＯＲＦにおけるＡＴＧ開始コドンをＣＴＧに置換した１つの塩基交換を示す。水平方向の矢印は、自然の転写方向を示す。ＥＦ−１αは、伸長因子１αの省略形であり、ＰｕｒＲはピューロマイシン−Ｎ‐アセチルトランスフェラーゼの省略形であり、ＲＳＶはラウス肉腫ウイルス末端反復の省略形であり、ＨｙｇＲはハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼの省略形であり、ｄＥＧＦＰ ＯＲＦはｄＥＧＦＰのオープンリーディングフレームの省略形である。センス及びアンチセンス遺伝子のそれぞれは、図示されているようにエピソーム上の選択マーカーに連結されている。
【図１Ｂ】ｄＥＧＦＰ仲介細胞蛍光におけるセンス及びアンチセンスｄＥＧＦＰの同時発現の効果を例示する図である。示されたコトランスフェクトプラスミドの２〜３の独立したプール集団を、３つの異なった段階の集密に成長した後、ｄＥＧＦＰ仲介細胞蛍光についてアッセイした。ヒストグラムは算術幾何平均を表し、エラーバーは標準偏差を表す。各コトランスフェクト集団は以下の通りである。左端の白いボックスはｐＲＥＰ７＋ｐＥＡＫ１０（ＪＪＲ）であり、次の黒く塗られたボックスはｐＲ７ｃｔｇＥＳ＋ｐＪＥａｓであり、次の多数のドットで示されるボックスはｐＲＥＰ７＋ｐＪＥａｓであり、次の斜線で示されるボックスはｐＪｃｔｇＥＳ＋ｐＲ７ｃｔｇＥａｓであり、次の菱形で示されるボックスはｐＪｃｔｇＥＳ＋ｐＲＥＰ７であり、次のレンガで示されるボックスはｐＥＡＫ１０（ＪＪＲ）＋ｐＲ７ｃｔｇＥａｓである。この省略形が図１Ａに用いられている。
【図２】センス及びアンチセンスｄＥＧＦＰ ＲＮＡを同時発現するヒト胚腎細胞におけるｄＥＧＦＰ ｍＲＮＡの定常状態レベルを示す図である。１８Ｓ ｒＲＮＡのレベルに対するｄＥＧＦＰ ｍＲＮＡのレベルの定量分析を例示する。図示されているようにコトランスフェクト集団のそれぞれにおいて、定常状態レベルのｄＥＧＦＰターゲットｍＲＮＡが１８Ｓ ｒＲＮＡのレベルに対して発現している。
【図３】センス及びアンチセンスｄＥＧＦＰ ＲＮＡを同時発現するヒト胚腎細胞におけるｄＥＧＦＰタンパク質レベルを示す図である。βアクチンに対するｄＥＧＦＰタンパク質のレベルの定量分析を示す。それぞれのヒストグラムは、ウェスタンブロット分析で決定されたβアクチンタンパク質に対するｄＥＧＦＰタンパク質の割合を示す。
【図４Ａ】ｄｓＲＮＡ条件培地によるｄＥＧＦＰ仲介細胞蛍光の抑制を示す図である。本発明に従った培地交換実験の概略図である。
【図４Ｂ】図４Ａに従った実験結果を示す図である。センス及びアンチセンスｄＥＧＦＰ ＲＮＡを同時発現する細胞から得たｄｓＲＮＡ条件培地によるｄＥＧＦＰ仲介細胞蛍光の抑制が実証されている。それぞれのヒストグラムのコードが、ダイアグラムの下に示されている。
【図４Ｃ】コントロール細胞から得た培地、ＤＭＥＭ培地、またはセンス及びアンチセンスｄＥＧＦＰ ＲＮＡを同時発現する細胞から得た培地に曝露したコントロール細胞におけるβアクチンタンパク質レベルに対するｄＥＧＦＰ及びｐ５３タンパク質レベルの定量分析を示す図である。
【図５Ａ】逆方向反復プラスミドからのｄｓＲＮＡの発現によるｄＥＧＦＰ仲介細胞蛍光の抑制を示す図である。例４に用いられた逆方向反復プラスミドに含まれる発現カセットの模式的な例を示す。ｄＥＧＦＰ特異的ｄｓＲＮＡを生成するために用いられた３つのカセットそれぞれを示す。これらの逆方向反復遺伝子の全てが、条件エクジソン誘導プロモーター（ＨＳＰとして示されている）の制御下にある。合成介在配列（ＩＶＳ）が初めの２つのカセットに示されている。矢印は転写の正常な方向を示している。これらの発現カセットのそれぞれが、ＲＦＰ遺伝子を含むエピソームプラスミドに存在する。
【図５Ｂ】ｄＥＧＦＰ仲介細胞蛍光におけるｄＥＧＦＰ特異的逆方向反復ｄｓＲＮＡの発現の効果を例示する図である。電気穿孔から４８時間後及びポナステロンＡ（１０μＭ）の添加から２４時間後の、プラスミドトランスフェクト集団（ＲＦＰ＋）におけるコントロールベクターに対するｄＥＧＦＰ仲介細胞蛍光のレベル。白色のヒストグラムによって示される「溶媒」はエタノールのみであり、黒色のヒストグラムは誘導物質ポナステロンＡの添加を意味する。
【図６Ａ】センスＲＮＡの核局在化におけるシス作用性リボザイムの効果を示す図である。例６に用いられた発現カセットを模式的に例示する。レポーターカセットのそれぞれを用いて、核内へのセンスＧＦＰ ＲＮＡの局在化におけるシス作用性ハンマーヘッド型リボザイムの効果を検査した。ＧＦＰ及びＲＦＺ以外の省略形は、既に図１Ａの説明で記載した。ＧＦＰは緑色蛍光タンパク質であり、ＲＢＺはハンマーヘッド型リボザイムをコードする配列を表す。
【図６Ｂ】図６Ａの作製物を用いてＧＦＰ仲介細胞蛍光のレベルを測定し、センスＲＮＡの核局在化におけるシス作用性リボザイムの効果を決定するための実験結果を例示する図である。全ての値はコントロール細胞のパーセンテージとして表されている。
【図７】ｄｓＲＮＡ仲介遺伝子抑制の提案されたメカニズム。ｄｓＲＮＡ仲介遺伝子抑制の提案されたメカニズムを例示する図である。まず、タンパク質がｄｓＲＮＡに結合して切断が開始され、ｄｓＲＮＡが最終的に２１個〜２３個に分割される。次に、タンパク質結合フラグメントが増幅され（関係するＮＲＡポリメラーゼを用いて）、ターゲットｍＲＮＡにハイブリダイズする。物理的なアンチセンスブロックが転写を阻止するか、或いはより可能性が高くは、タンパク質が隔離されてターゲットｍＲＮＡが切断される。
【図８Ａ】ｄｓＲＮＡ形成の別のメカニズムを示す図である。本発明の好適な一実施形態に従ったｄｓＲＮＡ形成を例示する。転写時に相補的な配列の結合部としてループを形成する介在配列のクローニングを伴う第１のメカニズム。
【図８Ｂ】転写時に細胞機構がイントロンをスプライシングして、ターゲット配列に相同なヘアピンＲＮＡ分子が残るように、スプライスドナー／スプライスアクセプター部位を備えたイントロンを含む第２のメカニズムを例示する図である。
【図８Ｃ】本発明の目的である第３のメカニズムを例示する図である。このメカニズムは、リボザイムに隣接した介在配列を含み、これにより転写時にリボザイムが介在配列を切断してターゲットｍＲＮＡに相同なｄｓＲＮＡが残る。
【図９】ＨＩＶ特異的ｄｓＲＮＡをコードする例示的なレトロウイルス作製物を示す図である。例Ａは、レトロウイルスＬＴＲ、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ等の薬剤耐性遺伝子、Ｈ５等の第１の配列、介在配列等のオプションの第３の配列、ＡＳＨ５等の第２の配列、及び第２のＬＴＲを含むレトロウイルスベクターを例示している。例Ｂは、Ｔａｔに結合して転写を促進するＨＩＶ ＴＡＲ配列等の宿主、化学物質、またはウイルス因子に応答する誘導性エレメントを備えたレトロウイルスＬＴＲを含むレトロウイルスベクターを例示している。このベクターは更に、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ等の薬剤耐性遺伝子、Ｈ５等の第１の配列、第３の配列、ＡＳＨ５等の第２の配列、及び第２のＬＴＲを含む。この作製物では、５’ＬＴＲの××の部分は、Ｔａｔに応答するエレメントを表す。例Ｃは、レトロウイルスＬＴＲ、Ｔａｔタンパク質等のｄｓＲＮＡの活性を高めるタンパク質をコードする配列、Ｈ５等の第１の配列、第３の配列、ＡＳＨ５等の第２の配列、ＳＶ４０初期／後期プロモーター等の内部プロモーター、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ等の薬剤耐性遺伝子、及び第２のＬＴＲを含む。３つ全ての作製物における斜線部分は、例６の第３の配列を表す。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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