(57)【要約】本発明は、気体及び／又は液体サンプル、並びにエアゾールにおけるジカルボニル合成物の定量法に関する。該方法は、糖尿病患者のいわゆるカルボニル・ストレスの場合に反応性カルボニル合成物の蓄積の判定に使われ得る。【特許請求の範囲】
【請求項１】
気体及び／又は液体サンプルにおけるジカルボニル合成物の定量法であって、
ａ）カルボニル反応基にて誘導される、固体相及び／又は水溶性重合体上のサンプルに含まれるジカルボニル合成物をジカルボニル合成物の少なくとも一つのカルボニル機能及びカルボニル反応基間のカップリング反応を経て強化させる段階と、
ｂ）前記強化段階の際に特定の分析的試薬にて形成されるジカルボニル合成物及び／又は固定された合成物のカップリング反応をさせる段階と、
ｃ）結合された分析的試薬の量の検出によってジカルボニル合成物の定量を判定する段階とを含む定量法。
【請求項２】
前記定量法は、微量滴定プレートによって具現されることを特徴とする請求項１に記載の定量法。
【請求項３】
前記定量法は、流体圧入システムによって具現されることを特徴とする請求項１に記載の定量法。
【請求項４】
前記定量法は、小型化された通過流システムによって具現されることを特徴とする請求項１に記載の定量法。
【請求項５】
段階ａ）において、前記サンプルは、固体相を含むカートリッジによって伝達されることを特徴とする請求項３又は４に記載の定量法。
【請求項６】
段階ａ）において、第１カルボニル機能及びカルボニル反応基間のカップリング反応が具現され、段階ｂ）において、分析的試薬及びジカルボニル合成物の第２カルボニル機能間のカップリング反応が具現されることを特徴とする請求項１乃至５のいずれかに記載の定量法。
【請求項７】
段階ｂ）において、フルオロホア・ヒドラジドが分析的試薬として使われ、前記ヒドラジドが段階ｃ）において螢光測定方式で検出されることを特徴とする請求項６に記載の定量法。
【請求項８】
段階ｂ）において、ビオチン・ヒドラジドを経てジカルボニル合成物の第２のカルボニル機能に結合される、アビディン−酵素複合物が分析的試薬として使われることを特徴とする請求項６に記載の定量法。
【請求項９】
段階ｂ）において、カルボニル反応基によって表面において変形され、測光方式、螢光測定方式、比濁分析方式、濁度測定方式、又は視覚的に検出される、ナノ又はマイクロ粒子が使用されることを特徴とする請求項６に記載の定量法。
【請求項１０】
段階ｂ）において、ヒドラジド基を含む合成物が使われ、前記合成物は、該合成物に特有である抗体と結合されることを特徴とする請求項６に記載の定量法。
【請求項１１】
前記抗体は、分析的試薬、例えば、フルオロホア、金の粒子又はラテックス粒子によって表示されることを特徴とする請求項１０に記載の定量法。
【請求項１２】
前記抗体は、分析的分子としての酵素によって表示されることを特徴とする請求項１０に記載の定量法。
【請求項１３】
段階ｃ）において、検出は、測光方式、螢光測定方式、電気化学方式、光測定方式、直光学方式及び／又はクォーツ・マイクロ・バランス方式によって具現されることを特徴とする請求項８乃至１２のいずれかに記載の定量法。
【請求項１４】
段階ａ）におけるカルボニル反応基は、アミノピラジン、アミノピリジン、アミノピリミジン及びアミノグアニジンの群から選択されることを特徴とする請求項１乃至１３のいずれかに記載の定量法。
【請求項１５】
前記表示された抗体は、固定された合成物に特有である分析的試薬として使われることを特徴とする請求項１４に記載の定量法。
【請求項１６】
前記抗体は、フルオロホア、酵素、金の粒子、表示された抗抗体又はアビディン−ビオチンシステムによって表示されることを特徴とする請求項１５に記載の定量法。
【請求項１７】
段階ｂ）において、カルボニル反応基によって誘導される固体相及び／又は水溶性重合体は、特定の分析的試薬として機能し、その成分が段階ｃ）において測光方式又は螢光測定方式によって検出される芳香性成分は、リング閉鎖反応によって生成されることを特徴とする請求項１乃至５のいずれかに記載の定量法。
【請求項１８】
α−オキソアルデヒドは、ジカルボニル合成物として判定されることを特徴とする請求項１乃至１７のいずれかに記載の定量法。
【請求項１９】
メチルグリオキサル、グリオキサル及び／又は３−デオキシグルクロンは、ジカルボニル合成物として判定されることを特徴とする請求項１８に記載の定量法。
【請求項２０】
呼吸空気、呼吸縮合物、ボディ流体及び／又は気管支歯槽洗浄におけるジカルボニル合成物の判定のための、請求項１乃至１９のいずれかによる方法の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、気体及び／又は液体サンプル、並びにエアゾールにおけるジカルボニル合成物の定量法に関する。該方法は、更に、糖尿病患者のいわゆるカルボニル・ストレスの場合に反応性カルボニル合成物の蓄積の判定に使われ得る。
【背景技術】
【０００２】
腎臓損害又は眼レンズの曇りのような長年の糖尿病（インシュリン依存型及び／又はインシュリン非依存型の糖尿病）の結果として発生する合併症は、その検出は難しくかつ遅れがちである。これらの疾患に対応する指標は、現在まで複合血液分析を通じて研究所においてのみ可能であった。コラーゲン、酵素及び他の細胞構成要素と共にグリコール酸塩を形成する反応性代謝生成物は、これらの合併症又は結果として生じる疾患の原因となり、このようなメカニズムによって細胞毒素として作用し得る。これにより、メチルグリオキサル、グリオキサル及び３−デオキシグルクロンのようなα−オキソアルデヒドの役割が特に議論されている。これらの物質は、赤血球において形成され、血漿において非常に低い濃度で出現する。このような方法で、これらの物質は肺を通じて運ばれる。肺においてはその膜透過性により、これらの物質は血液から呼吸空気に肺胞膜を通じて拡散される。従って、血液の代わりにこれらの物質は呼気においても又は呼吸縮合物においても定量され得る。
【０００３】
これによって、α−オキソアルデヒド・メチルグリオキサルが、特に関心の対象である。メチルグリオキサルは、リン酸トリオースから、ケトン体の代謝作用から生成され、更に、トレオニンの代謝作用の場合には、グリオキサラーゼによって分解され得る。その後、メチルグリオキサルは、イミダゾロン誘導剤及びビス−リジル交さ結合を形成することによってタンパク質と反応する。タンパク質のこの交さ結合によりコラーゲンが安定化し、もって膜が厚くなり得る。よって、これらの反応は腎臓損害及びレンズ曇りのような糖尿病性合併症の少なくとも一部を表わしている。
【０００４】
糖尿病において現在まで正常にある血糖量の判定のみでは、血漿又は血清において全血の瞬間的なメチルグリオキサル濃度についての直接的結論を提供することはできない。
現在の技術水準によれば、α−オキソアルデヒドの定量は、例外なく、血漿から明瞭に達成される。インシュリンに依存する糖尿病患者の場合において、非特許文献１によって検出され得る。ここで、健康な比較被実験者と比較してメチルグリオキサル濃度が５乃至６倍以上になると、インシュリンに依存する糖尿病患者の場合には血漿においてメチルグリオキサル濃度がすぐに２乃至３倍以上になる。あるいは、尿におけるα−オキソアルデヒドの定量は可能であるが、尿において予想される生理的に必要とする非常に低い濃度があまりに高い分析的複雑さを要求するので、文献には記載されていない。従って、血漿におけるα−オキソアルデヒドの直接的定量が必要である。
【０００５】
現在の技術水準によるこれらの方法は、結果的に極めて複雑で高価であり、従って現在まで血漿又は血清において全血のα−オキソアルデヒドの内容を判定するための正規のルーチン検査に適していなかった。
【０００６】
現在の技術水準によるこれらの検査方法の結果として、全血、血漿及び血清においてメチルグリオキサルのようなα−オキソアルデヒドの減少された目標の薬を投与する正規の検査及び可能な指向ニーズは、非常に複雑である。
【０００７】
ガス・クロマトグラフィ分析法による定量は特許文献１から公知である。ボディの増加するＡＧＥ化学作用は、しかし、糖尿病のみに制限されなくて、専ら酸化プロセスに基づくのでもない。病気の場合及び同様に年齢とともに、増加する基質剤有効性及び減少する解毒は、反応性のカルボニル合成物（いわゆるカルボニル・ストレス）の蓄積の結果としてなる。網膜症、神経障害及びネフロパシのような多くの糖尿病性合併症の出現に加えて、同様に単球との結合により催炎サイトカインの循環を引き起こす、メチルグリオキサル−変形されたタンパク質による免疫システムへの影響が観察され得る。更に、メチルグリオキサルがアルツハイマーの症候群及び血管病の病因の役割を果たすと思われる。これにより、呼吸空気又は呼吸縮合物診断法のための更なる利用分野が開かれる。
【特許文献１】
独国特許第１００２８３２６Ａ１明細書
【非特許文献１】
ティージェイ  トーナリー（Ｔ．Ｊ．Ｔｈｏｒｎａｌｌｙ）「Ａｄｖａｎｃｅｄ・Ｇｌｙｃａｔｉｏｎ・ａｎｄ・ｔｈｅ・ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ・ｏｆ・ｄｉａｂｅｔｉｃ・ｃｏｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ／Ｕｎｉｆｙｉｎｇ・ｔｈｅ・ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ・ｏｆ・Ｇｌｕｃｏｓｅ，ｍｅｔｈｙｇｌｙｏｘａｌ・ａｎｄ・ｏｘｉｄａｔｉｖｅ・ｓｔｒｅｓｓ」、エンドクリノォジーおよびメタボリズム、１９９６年３月、１４９−１６６ぺイジ。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
メチルグリオキサルの減少された目標の薬を投与する正規の検査及び可能な指向ニーズは、現在まで非常に複雑であった。糖尿病患者にとって一般的な血糖量判定のみでは、血漿において瞬間的なメチルグリオキサル濃度についての直接的結論は提供できない。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の目的は、気体及び／又は液体サンプルの合成物の定量が単純かつ経済的方法で可能である、ジカルボニル合成物の定量法を提供することである。
【００１０】
この目的は、請求項１の特徴を有する一般的な方法によって達成される。更なる従属請求項は、有利な発展を示す。本方法の使用は請求項１８に記載されている。
【００１１】
本発明によれば、気体及び／又は液体サンプル、並びにエアゾールにおけるジカルボニル合成物の定量法が提供され、該方法は次の段階を含む。
【００１２】
ａ）カルボニル反応基、例えばヒドラジド基にて誘導される、固体相及び／又は適切な水溶性重合体上のサンプルに含まれるジカルボニル合成物を強化させる段階と、その結果は、ジカルボニル合成物の少なくとも一つのカルボニル機能及び誘導された固体相又は適切な水溶性重合体のカルボニル反応基間のカップリング反応であり、
【００１３】
ｂ）前記強化段階の際に特定の分析的試薬にて形成されるジカルボニル合成物及び／又は固定された合成物間のカップリング反応をさせる段階と、
【００１４】
ｃ）現在の技術水準によって通用している方法で結合された分析的試薬の検出によってジカルボニル合成物の定量を判定する段階とである。
【００１５】
好ましい実施例においては、該方法は微量滴定プレートによって具現される。従って、ジカルボニル合成物のカップリングに適している両方の商業的な微量滴定プレートが使われることができ、ジカルボニル合成物を結合するための所望の機能が得られるように微量滴定プレート表面の誘導が達成されることができる。
【００１６】
あるいは、該方法は、流れ注射システム（英語：流れ注射分析、ＦＩＡ）によって具現され得る。サンプル及び更なる試薬は、蠕動運動のポンプによって運ばれるキャリアスチームによって注射される。同様に、他の小型化された通過流システムも、しかし、可能である。
【００１７】
更なる異なる選択肢として、該方法は、カートリッジによって具現されることもできる。サンプルは、固体相を含むカートリッジ、例えば手動ポンプによってこの目的で伝達される。これにより、カートリッジのジカルボニル合成物は、固体相に結合され、内的又は外的に検出され得る。固体相は、従って、多孔性材料として又は粒子形態として現れ得る。
【００１８】
好ましくは、段階ａ）において、第１カルボニル機能及びカルボニル反応基間のカップリング反応が具現され、段階ｂ）において、分析的試薬及びジカルボニル合成物の第２の結合されていないカルボニル機能間のカップリング反応が具現される。段階ｂ）において、よってフルオロホア・ヒドラジドが分析的試薬として使われ、前記ヒドラジドが段階ｃ）において螢光測定方式で検出される。フルオロホア・ヒドラジドとして、例えば、次の合成物が可能である。
【００１９】
ａ）５−（（（２−カルボヒドラジノ）メチル）チオ）アセチル）アミノフルオレセイン、
【００２０】
ｂ）フルオレセイン−５−チオセミカルビジド、
【００２１】
ｃ）４，４−ジフルオロ５，７ジメチル１−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−３−プロピオン酸−ヒドラジド、
【００２２】
ｄ）Ｔｅｘａｓｒｅｄ（登録商標）３５０；−４８８；−５６８；−５９４；−６３３。
【００２３】
あるいは、段階ｂ）において、ヒドラジド基を含む合成物が使われ、該合成物は、該合成物に特有である抗体と結合され得る。この抗体は、分析的試薬、例えば、フルオロホア、金又はラテックス粒子をもって表示され得るのが望ましい。
【００２４】
他の変更例として、該抗体は、分析的分子のような酵素をもって表示され得る。
【００２５】
更なる変更例として、分析的試薬のようなアビディン酵素複合体の使用は、段階ｂ）に示される。このような変更使用において、ビオチン・ヒドラジドは、ジカルボニル合成物の第２のカルボニル機能に結合され、酵素はビオチン・アビディン相互作用を経て連結され得る。アビディンを用いることにより、信号の拡大はジビオチンによるアビディン−酵素結合体の交さ結合、それによる４共有原子価のために可能である。この交さ結合は、前もってすでに遂行されることができる。
【００２６】
酵素のカップリングの場合、同じものの検出は、段階ｃ）において測光方式、螢光測定方式、電気化学方式及び／又は光測定方式で達成されることが望ましい。
【００２７】
検出のための更なる変更例は、ジカルボニル合成物に結合している高分子の合成物に存在し、後者は質量の増加によって検出される。このために、例えば、表面プラスモン共振（英語：ｓｕｒｆａｃｅ  ｐｌａｓｍｏｎ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ、ＳＰＲ）のようなクォーツ微量天秤又は直光学方式が可能である。
【００２８】
しかし、同様に、現在の技術水準から公知の全ての検出方法が使われることもできる。
【００２９】
検出のための更なる変更例は、段階ｂ）において光学の分析に適していて、その表面上にカルボニル反応基を担持するナノ−又はマイクロ粒子に存在する。これらの基は、ジカルボニル合成物の第２のカルボニル機能と反応する。検出は、測光方式、螢光測定方式、比濁分析方式、濁度測定方式、又は視覚的に行われる。
【００３０】
更なる変更例において、強化の際に形成される固定された合成物及び特定の分析的試薬間のカップリング反応は、段階ｂ）において達成され得る。好ましくは、アミノピラジン、アミノピリジン、アミノピリミジン及びアミノグアニジンの群からの合成物は、カルボニル反応基として選択される。これらの合成物は、２つのカルボニル基を経てメチルグリオキサル又はグリオキサルのようなカルボニル合成物と共有結合することが可能である。従ってこのような変更例の場合、これらの合成物はジカルボニル合成物のための収集成分として用いられるように固体相に固定される。ジカルボニル合成物及び上記これらの合成物間の反応によって形成された成分は、この成分に特有である抗体によって検出され得る。しかし、この抗体は自由ジカルボニル合成物又は収集成分と反応しない。該抗体は、例えば、フルオロホア、酵素、ラテックス又は金の粒子として可能な分析的分子によって表示され得る。同様に、抗体が抗抗体によって又はアビディン−ビオチンシステムを経て検出されるのも可能である。
【００３１】
更なる選択は、段階ｂ）において、カルボニル反応基によって誘導される固体相又は水溶性重合体は、特定の分析的試薬として機能し、芳香性合成物は、リング閉鎖反応によって生成されるのを提供する。これらは、順に段階ｃ）において測光方式又は螢光測定方式によって検出され得る。検出可能な生成物は、追加的な分析的試薬のカップリング無く、２つの段階のカップリング反応により独立的にこの変更例において生成される。
【００３２】
α−オキソアルデヒドは、この方法によって好適なジカルボニル合成物として判定される。メチルグリオキサル、グリオキサル及び／又は３−デオキシグルクロンが、特に優先的に本願明細書に含まれている。
【００３３】
該方法は、気体及び液体サンプルにおいて具現され、例えば、呼吸空気、呼吸縮合物、痰、気管支肺胞洗浄、血液、血漿、血清、尿、組織液及び涙液として言及されなければならない。
【００３４】
本発明における方法は、添付の２つの図面を参照してより詳細に説明される事を意図しており、前記方法はこれに限定されるものでは無い。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３５】
本発明による方法は、次の２つの図面によってより詳細に説明されるが、これにより、上記方法が制限されるのではない。
【００３６】
図１は、本発明による方法の模式的なコースの２つの実施例を示す。先ず、ジカルボニル合成物、即ちメチルグリオキサル（１）とヒドラジド基で誘導される固体相とのカプリングが達成される。
【００３７】
同様に、モノカルボニル合成物としてのアセトン（２）は、固体相と結合されるが、分析的試薬のカプリングのための更なる自由カルボニル機能を有しない。その結果としてモノカルボニル合成物が共同で検出されなくて、後者によって干渉が回避される。その次の酵素のカプリングは、２つの変更例を経て達成される。第１の変更例において、ジカルボニル合成物は第２の自由カルボニル機能を経てヒドラジドに結合されるビオチン（５）と反応する。更なる段階において、ビオチン（５）は、順番に酵素（４）が結合される、アビディン分子と（３）連結する。
【００３８】
対照的に、更なる変更例においては、ヒドラジド基によって変型される酵素（４）の直接的な結合が達成される。
【００３９】
図２は、同じ原理によって実行される試験、次の吸収測定値を有するビオチン・ヒドラジド及びアビディン・ペルオキシダーゼによる検出の結果を示す。
【００４０】
図３は、特定の抗体をもって、ジカルボニル合成物及びカルボニル−反応収集成分間の反応によって形成された成分の検出の原理を示す。
【００４１】
メチルグリオキサル（１）は、ラベル（６）を備える特定の抗体（５）によって検出される成分（４）を形成するように、固体相（３）に固定される収集成分（２）と反応する。
【産業上の利用可能性】
【００４２】
本発明によれば、気体及び／又は液体サンプルの合成物の定量が単純かつ経済的方法で可能である、ジカルボニル合成物の定量法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１】本発明による方法の模式的なコースの２つの実施例を示す図である。
【図２】図２は、同じ原理によって実行される試験、次の吸収測定値を有するビオチン・ヒドラジド及びアビディン・ペルオキシダーゼによる検出の結果を示す図である。
【図３】特定の抗体をもって、ジカルボニル合成物及びカルボニル−反応収集成分間の反応によって形成された成分の検出の原理を示す図である。
【符号の説明】
【００４４】
１…メチルグリオキサル、２…アセトン、３…アビディン分子、４…酵素、５…ビオチン、６…ラベル
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際公開パンフレット】
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2004535583.tif 000013
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2004535583.tif 000017
2004535583.tif 000018
2004535583.tif 000019
2004535583.tif 000020
2004535583.tif 000021
2004535583.tif 000022
2004535583.tif 000023
【国際調査報告】
2004535583.tif 000024
2004535583.tif 000025
2004535583.tif 000026
2004535583.tif 000027
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