(57)【要約】本発明は、それらが誘導されたアデノウイルスのゲノムに関して異種であるパッケージングに必須な領域を含有するという特徴を有するアデノウイルスベクターに関する。本発明は、また、前記アデノウイルスベクターを含有するウイルス調製物、細胞、それらを含んでなる医薬組成物または物質、およびそれらの療法または予防上の使用に関する。最後に、本発明は、それが誘導されたアデノウイルスのゲノムに関して減衰されたパッケージング性質を有する動物由来のアデノウイルスのゲノムに関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
アデノウイルスのゲノムに関して異種である包膜に必須な領域を含むことを特徴とする、アデノウイルスのゲノムから誘導されたアデノウイルスベクター。
【請求項２】
ヒト由来のアデノウイルスから誘導され、そして包膜に必須な前記異種領域が動物由来のアデノウイルスから誘導されていることを特徴とする、請求項１に記載のアデノウイルスベクター。
【請求項３】
サブグループＣヒトアデノウイルス、特にアデノウイルス２（Ａｄ２）または５（Ａｄ５）から誘導されていることを特徴とする、請求項２に記載のアデノウイルスベクター。
【請求項４】
包膜に必須な前記異種領域がイヌ、トリ、ウシ、ネズミ、ヒツジ、ブタおよびサルのアデノウイルスから選択される動物アデノウイルスから誘導されていることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか一項に記載のアデノウイルスベクター。
【請求項５】
Ａｄ５から誘導され、そして包膜に必須な前記異種領域がウシのアデノウイルスから誘導されていることを特徴とする、請求項３または４に記載のアデノウイルスベクター。
【請求項６】
前記ウシアデノウイルスがＢＡＶ３であることを特徴とする、請求項５に記載のアデノウイルスベクター。
【請求項７】
包膜に必須な前記領域が包膜領域を含むことを特徴とする、請求項１〜６のいずれか一項に記載のアデノウイルスベクター。
【請求項８】
包膜に必須な前記領域が、さらに、５’および３’ＩＴＲを含むことを特徴とする、請求項７に記載のアデノウイルスベクター。
【請求項９】
少なくともＥ１機能について欠陥があることを特徴とする、請求項１〜８のいずれか一項に記載のアデノウイルスベクター。
【請求項１０】
さらに、Ｅ２、Ｅ３、Ｅ４およびＬ１〜Ｌ５機能から選択される機能の少なくとも１つについて欠陥があることを特徴とする、請求項９に記載のアデノウイルスベクター。
【請求項１１】
組換えアデノウイルスベクターの欠陥がある機能のすべてまたは一部分を補足することを可能とするヘルパーベクターであることを特徴とする、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のアデノウイルスベクター。
【請求項１２】
５’および３’ＩＴＲ配列、およびヒトアデノウイルスから誘導されたＥ２、Ｅ４および／またはＬ１〜Ｌ５機能をコードする配列、およびウシアデノウイルスから誘導された異種包膜領域を含むことを特徴とする、請求項１１に記載のヘルパーアデノウイルスベクター。
【請求項１３】
ヒトアデノウイルスから誘導されたＥ２、Ｅ４および／またはＬ１〜Ｌ５機能をコードする配列、および５’および３’ＩＴＲ配列、およびウシアデノウイルスから誘導された異種包膜領域を含むことを特徴とする、請求項１１に記載のヘルパーアデノウイルスベクター。
【請求項１４】
組換え体であり、そして宿主細胞または生物におけるその発現に必要な因子の制御下に配置された問題の少なくとも１つの遺伝子を含むことを特徴とする、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のアデノウイルスベクター。
【請求項１５】
問題の前記遺伝子が、アンチセンスＲＮＡ、サイトカイン、細胞または核のレセプター、リガンド、凝固因子、ＣＦＴＲタンパク質、インスリン、ジストロフィン、成長因子、酵素、酵素インヒビター、抗腫瘍作用をもつポリペプチド、細菌、寄生生物またはウイルスの感染を阻害することができるポリペプチドおよび、特にＨＩＶ、抗体、トキシン、イムノトキシン、血管形成インヒビターおよびマーカーをコードする遺伝子から選択される、請求項１４に記載の組換えアデノウイルスベクター。
【請求項１６】
さらに、それが誘導されたアデノウイルスのゲノムに関してオートローガスである、第２包膜領域を含むことを特徴とする、請求項１４または１５に記載の組換えアデノウイルスベクター。
【請求項１７】
すべてのアデノウイルスの機能について欠陥があり、そして、問題の前記遺伝子に加えて、少なくとも５’および３’ＩＴＲを含み、前記オートロガス包膜領域がヒトアデノウイルスから誘導され、そして前記異種包膜領域がウシアデノウイルスから誘導されていることを特徴とする、請求項１６に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項１８】
異種包膜領域がオートロガス包膜領域の３’の中に挿入されていることを特徴とする、請求項１６または１７に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項１９】
前記ヘルパーおよび組換えベクターが同一の第１アデノウイルス、特にＡｄ５から誘導され、そして前記ヘルパーベクターが担持する包膜に必須な前記異種領域が第１アデノウイルスと異なる第２アデノウイルス、特にＢＡＶ３から誘導されていることを特徴とする、複製欠陥組換えアデノウイルスベクターの欠陥機能のすべてまたは一部分を補足するための、請求項１１〜１３のいずれか一項に記載のヘルパーアデノウイルスベクターの使用。
【請求項２０】
複製欠陥組換えアデノウイルスベクターが請求項１〜１０および１４〜１８のいずれか一項に記載のベクターであり、前記ヘルパーおよび組換えベクターが同一の第１アデノウイルスから誘導され、そして前記ヘルパーベクターが担持する包膜に必須な前記異種領域および前記組換えベクターが第１アデノウイルスと異なる第２アデノウイルスから誘導されていることを特徴とする、請求項１９に記載の使用。
【請求項２１】
下記の因子：
（ａ）請求項１１〜１３のいずれか一項に記載のヘルパーアデノウイルスベクター、
（ｂ）複製欠陥組換えアデノウイルスベクター、および
（ｃ）必要に応じて、ベクター（ａ）が担持する包膜に必須な異種領域と同一由来の動物アデノウイルスから誘導されたアデノウイルスのゲノム、
を含んでなる組成物。
【請求項２２】
前記複製欠陥組換えアデノウイルスベクター（ｂ）が請求項１〜１０および１４〜１８のいずれか一項に記載のアデノウイルスベクターであり、そしてベクター（ａ）および（ｂ）が担持する包膜に必須な異種領域と同一由来の動物アデノウイルスから誘導されたアデノウイルスのゲノムが必要に応じて（ｃ）の中に存在することを特徴とする、請求項２１に記載の組成物。
【請求項２３】
それが誘導されたアデノウイルスと比較して、減衰した包膜能力を有することを特徴とする、動物アデノウイルス、特にウシアデノウイルス、特にＢＡＶ３から誘導されたアデノウイルスのゲノム。
【請求項２４】
（ａ）第１細胞系統の中に、
（ｉ）請求項１１〜１３のいずれか一項に記載のヘルパーアデノウイルスベクター、
（ｉｉ）動物アデノウイルスから誘導されたアデノウイルスのゲノム、および
（ｉｉｉ）上記組換えアデノウイルスベクター、
を導入し、前記アデノウイルスのゲノム（ｉｉ）はベクター（ｉ）が担持する包膜に必須な異種領域と同一由来であり、そして前記アデノウイルスのゲノム（ｉｉ）およびベクター（ｉ）および（ｉｉｉ）は前記第１細胞系統において複製することができ、
（ｂ）ベクター（ｉ）および（ｉｉｉ）およびアデノウイルスのゲノム（ｉｉ）を含むウイルス粒子の産生を可能とする適当な条件下に、前記第１細胞系統を培養し、
（ｃ）工程（ｂ）において得られた前記ウイルス粒子を細胞培養物から回収し  、
（ｄ）第２細胞系統を工程（ｃ）において回収された前記ウイルス粒子で感染させ、前記ヘルパーベクター（ｉ）および前記アデノウイルスのゲノム（ｉｉ）は前記第２細胞系統においてゼロまたは減少した包膜および／または複製の能力を有し、
（ｅ）前記組換えアデノウイルスベクター（ｉｉｉ）の包膜を可能としかつウイルス調製物を産生するために適当な条件下に、前記第２細胞系統を培養し、そして
（ｆ）工程（ｅ）において得られた前記ウイルス調製物を細胞培養物から回収する、
ことによる、複製欠陥組換えアデノウイルスベクターを含むウイルス調製物を製造する方法。
【請求項２５】
前記複製欠陥組換えアデノウイルスベクターが請求項１〜１０および１４〜１８のいずれか１項記載のベクターであり、前記アデノウイルスのゲノム（ｉｉ）がベクター（ｉ）および（ｉｉｉ）およびアデノウイルスゲノム（ｉｉ）により担持された包膜に必須の異種領域と同じ起源のものであり、ベクター（ｉ）および（ｉｉｉ）が前記第１細胞系統で複製可能であることを特徴とする、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記第１細胞系統の中に、
（ｉ）少なくともＥ１機能について欠陥がある請求項１１〜１３のいずれか一項に記載のヘルパーアデノウイルスベクター、
（ｉｉ）ウシアデノウイルス、特にＢＡＶ３から、必要に応じて請求項２３に従い、誘導されたアデノウイルスのゲノム、および
（ｉｉｉ）Ｅ１機能についておよびＥ２、Ｅ４および／またはＬ１〜Ｌ５機能の少なくとも１つについて欠陥がある組換えアデノウイルスベクター、特に請求項１１〜１８のいずれか一項に記載のベクター、
を導入し、前記第１細胞系統がウシ由来である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記アデノウイルスのゲノム（ｉｉ）がＥ１機能について欠陥があり、そして前記第１細胞系統が前記アデノウイルスのゲノム（ｉｉ）のＥ１機能を補足する細胞である、請求項２４〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記第１細胞系統がＭＤＢＫ系統または網膜または胎児腎臓の一次ウシ細胞から誘導され、そしてウシアデノウイルス、特にＢＡＶ３のＥ１領域をコードする配列を含み、前記配列がそれらの発現に必要な因子の制御下に配置されている、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記第２細胞系統がヒトアデノウイルス、特にＡｄ５のＥ１機能を補足する細胞である、請求項２４〜２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
前記第２細胞系統が２９３系統である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
請求項２４〜３０のいずれか一項に記載の方法に従い得られたウイルス調製物。
【請求項３２】
請求項１〜１０および１４〜１８のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルスベクターを含有する感染性ウイルス粒子の少なくとも３０％を含む、請求項３１に記載のウイルス調製物。
【請求項３３】
請求項１〜１８のいずれか一項に記載のアデノウイルスベクターを含むか、あるいは請求項３１または３２に記載のウイルス調製物で感染された宿主細胞。
【請求項３４】
下記の因子：
（ｉ）請求項１１〜１３のいずれか一項に記載のヘルパーアデノウイルスベクター、および
（ｉｉ）動物アデノウイルスから誘導されたアデノウイルスのゲノム、
を含む細胞。
【請求項３５】
さらに、（ｉｉｉ）欠陥組換えアデノウイルスベクター、特に請求項１〜１０および１４〜１８のいずれか一項に記載のベクターを含有する、請求項３４に記載の細胞。
【請求項３６】
治療または予防の因子として、請求項１〜１０および１４〜１８のいずれか一項に記載のアデノウイルスベクター、請求項３１または３２に記載のウイルス調製物、または請求項３３に記載の宿主細胞を含んでなる医薬組成物。
【請求項３７】
宿主細胞または生物における問題の遺伝子の転移または発現のための、請求項１〜１０および１４〜１８のいずれか一項に記載のアデノウイルスベクター、請求項３１または３２に記載のウイルス調製物、または請求項３３に記載の宿主細胞の使用。
【請求項３８】
遺伝子療法または免疫療法による疾患の治療に意図される薬物の製造のための、請求項１〜１０および１４〜１８のいずれか一項に記載のアデノウイルスベクター、請求項３１または３２に記載のウイルス調製物、または請求項３３に記載の宿主細胞の使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、誘導されたアデノウイルスのゲノムに関して異種である包膜（ｅｎｃａｐｓｉｄａｔｉｏｎ）に必須な領域を含有するという特徴を有する新規なアデノウイルスベクターに関する。これらのベクターはヘルパーベクターまたは組換えベクターとして使用することができ、前者は後者の製造を可能とする。本発明の主題は、また、前記アデノウイルスベクターを含有するウイルス調製物、細胞、それらを含んでなる医薬組成物または物質、ならびにそれらの療法または予防の目的のための使用に関する。最後に、本発明は、また、それが誘導された自然のゲノムに関して減衰された包膜能力を有する動物由来のアデノウイルスのゲノムに関する。本発明は、遺伝子療法、特にヒトにおける遺伝子療法の面において特に重要性を有する。
【０００２】
遺伝子療法は、宿主細胞または生物の中への遺伝情報の転移として定義される。ヒトに適用された最初のプロトコールは、米国において１９９０年９月に、アデニンデアミナーゼ（ＡＤＡ）をコードする遺伝子に影響を与える突然変異のために遺伝的に免疫不全であった患者について開始された。この最初の実験は比較的成功を収めたので、遺伝病（欠陥遺伝子の機能障害を補正する目的で）および後天性疾患（癌、感染症、例えば、ＡＩＤＳおよびその他）を包含する種々の疾患のための技術の開発を促進した。現在の戦略の大部分は、治療遺伝子をその細胞のターゲットに運ぶベクターを使用する。ウイルスベクターおよび合成ベクターを包含する多数のベクターは過去数年間に開発され、そして当業者にとってアクセス可能な多数の刊行物の主題であった。
【０００３】
遺伝子療法のベクターとしてのアデノウイルスの重要性は、多数の先行技術の文献において既に記載されてきている。アデノウイルスは多数の細胞の型の、分裂する細胞および休止細胞を感染し、非組込み性であり、高度には病原性ではない。さらに、アデノウイルスは気道に対して自然の向性を有する。これらの特異的性質を有するためには、アデノウイルスベクターは多数の療法、特にワクチンの適用のために選択される。指針として、アデノウイルスのゲノムは、ウイルスのサイクルに関係する約３０の遺伝子を担持する、約３６ｋｂの線状または二本鎖のＤＮＡ分子から成る。初期の遺伝子（Ｅ１〜Ｅ４；初期についてＥ）は、ゲノムにおいて分散した４つの領域に分割される。Ｅ１、Ｅ２およびＥ４領域はウイルスの複製のために必須であるが、Ｅ３領域は必須ではなく、宿主における抗アデノウイルス免疫応答のモジュレーションに関係する。後期の遺伝子（Ｌ１〜Ｌ５；後期についてＬ）は構造的タンパク質を主としてをコードし、初期の転写単位を部分的にカバーする。それらは大部分について主要な後期のプロモーターＭＬＰから転写される。さらに、アデノウイルスのゲノムは、その末端に、シス作用性領域を担持し、シス作用性領域は包膜のために必須であり、５’および３’末端に位置する逆方向末端反復（ＩＴＲ）および５’ＩＴＲに引き続く包膜領域から成る。
【０００４】
現在、遺伝子療法のプロトコールにおいて使用されているアデノウイルスベクターは、環境および宿主生物におけるそれらの汎発性を回避するために、Ｅ１領域の主要な部分を欠如する。Ｅ３領域における追加の欠失は、クローニング能力の増加を可能とする。問題の遺伝子は、ウイルスＤＮＡの中に、欠失された領域の１つまたは他の代わりに導入される。これらのいわゆる第１世代を使用する遺伝子の転移の可能性は現在よく確立されているが、それらの安全性の問題が残る。複製競合粒子の発生の危険に加えて、なお発現されるウイルスタンパク質の潜在的な免疫原性は、ある特定の用途において、形質導入された細胞の持続性およびトランスジーンの安定な発現を妨害する。これらの欠点は新しい世代のベクターの構築を正当化する。それらはシスの領域（ＩＴＲおよび包膜配列）を保存し、これらの領域は包膜のために必須であるが、ウイルス遺伝子の大部分のｉｎ  ｖｉｖｏ発現の抑制を目的とする、追加の遺伝的修飾を含む（例えば、国際出願ＷＯ９４／２８１５２号参照）。これに関して、いわゆる最小ベクターは、すべてのアデノウイルスの機能を欠如し、選択の代替物を表す。
【０００５】
アデノウイルスベクターを製造する技術は文献に広く記載されている。第１の例において、ゲノムは２９３系統（特に、下記の文献を参照のこと：ＧｒａｈａｍおよびＰｒｅｖｅｃｔ、１９９１、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌ．７、Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ；Ｅ．Ｊ．Ｍｕｒｒａｙ編、Ｔｈｅ  Ｈｕｍａｎ  Ｐｒｅｓｓ  ｌｎｃ．、ニュージャージイ州クリントン）または大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）（例えば、国際出願ＷＯ９６／１７０７０号参照）において相同組換えにより製造される。次いで、ベクターを増殖させて、それを含有するウイルス粒子のストックを構築することが必要である。この製造工程は重大であり、そして臨床的バッチを製造を目的とした大規模な開発をもくろむことができる、高い感染粒子の力価を得ることを可能とすべきである。この効果のために、ベクターが欠陥的である発現の発現産物をトランスで提供する相補性系統を使用する。例えば、ヒト胚腎細胞から確立された２９３系統において、Ｅ１について欠失されたウイルスを増殖させる（Ｇｒａｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．、１９７７、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．３６、５９−７２）。第２世代のウイルスに関すると、２つの必須のウイルス機能を補足する系統、例えば、下記の文献に記載されている系統を使用することができる：Ｙｅｈ  ｅｔ  ａｌ．、１９９６、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７０、５５９−５６５；ＫｒｏｕｇｌｉａｋおよびＧｒａｈａｍ、１９９５、Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ６、１５７５−１５８６；Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．、１９９５、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ２、７７５−７８３；Ｌｕｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．、１９９８、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２、２０２２−２０３３；および国際出願ＷＯ９４／２８１５２号およびＷＯ９７／０４１１９号。発現のウイルス産物は潜在的毒性を有するために、工業的方法における使用をもくろむ前に、これらの系統を成長能力および粒子の収率を最適化することが必要である。さらに、最小ウイルスの増殖に適当な、すべてのアデノウイルスの機能を補足する系統は現在まだ入手不可能である。
【０００６】
他の別法は、組換えアデノウイルスベクターの欠陥機能の少なくとも一部分を補足するように、追加のウイルス因子が設計された「ヘルパーウイルス」を使用することに基づく。先行技術のヘルパーウイルスは、組換えベクターが補足を必要としない必須領域を必要に応じて欠失した、アデノウイルスのゲノムから成る。１例として、２９３系統の中へのＥ１−ヘルパーウイルスおよびＥ１−Ｅ４−組換えベクターの共トランスフェクションは、組換えベクターのウイルス粒子の形成に導く。Ｅ１機能は２９３系統により提供され、そしてＥ４機能はヘルパーウイルスにより提供される。
【０００７】
しかしながら、この方法の主要なは欠点は、細胞がウイルス粒子の混合集団を産生し、それらのあるものが組換えベクターを含み、他のものがヘルパーベクターを含むことである。実際には、調製物は主としてヘルパーウイルス粒子を含有し、これらは選択的利点を有し、汚染が９０％に到達し、それを超えることさえある。ヘルパーウイルスの存在はヒトに適用される療法の関係において望ましくなく、このために、物理的分離技術、例えば、超遠心分離の使用を必要とする。
【０００８】
本発明は、ヒトおよび動物のアデノウイルスのそれぞれの成長特性を利用することを提案する。今回、ウシＢＡＶ３アデノウイルスをヒト系統において増殖させることができないことが証明されたが、Ａｄ５はウシ細胞において増殖させることができる。ヒト２９３系統におけるＢＡＶ３アデノウイルス単独の感染またはＡｄ５の存在下の感染は、感染性ＢＡＶ３ウイルス粒子の形成に導かない。他方において、Ａｄ５ヴィリオンはウシ系統の感染により得られる。さらに、ヒト細胞においてＢＡＶ３ウイルスタンパク質は発現しない。
【０００９】
これらの観察に基づいて、本発明は、特に、２工程で起こりかつＡｄ５とＢＡＶ３との間のキメラであるアデノウイルスを使用する、包膜系を提供する。今回、下記のベクターが構築された：（ｉ）自然包膜領域がウシＢＡＶ３アデノウイルスのそれで置換されたＡｄ５ゲノムから誘導されたヘルパーウイルスおよび（ｉｉ）Ａｄ５から誘導され、そして２つの包膜領域、すなわち、Ａｄ５由来の第１（オートローガス（ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ））およびＢＡＶ３由来の第２（異種）の領域、を含む組換え欠陥アデノウイルス。ＢＡＶ３アデノウイルスで感染させたウシ細胞系統の中に２つのベクターをトランスフェクトすると、３つのウイルスゲノムが増幅し、そして３つの型のウイルス粒子が産生する。この第１増幅工程の間に、ＢＡＶ３ゲノムはトランス作用性因子を提供し、組換えベクターおよびヘルパーベクターの包膜を可能とし、後者は組換えベクターの欠陥機能を少なくとも部分的に補足する。３つの型のウイルスの混合物をウシ細胞から回収し、ヒト２９３細胞の感染に使用する。ＢＡＶ３ゲノムと、ＢＡＶ３から誘導された唯一の包膜領域を有するヘルパーベクターは、ＢＡＶ３配列を認識する包膜因子が存在しないので、Ａｄ５の存在においてさえ増殖することができず、これは対応するウイルス粒子の形成を排除する。しかしながら、ヘルパーベクターは、Ａｄ５由来の包膜シグナルにより伝達される組換えベクターの包膜に必要な因子をトランスで産生し、そして、２９３細胞に関連して、欠陥のある初期および後期の機能を補足することができ、その目的は組換えベクターを含有するヴィリオンを主として発生させることである。本発明は、ヘルパーベクターによるアデノウイルス調製物の汚染をかなり組換えさせることによって安全性の目的を満足し、こうして変化する効率の時間を要する、費用のかかる分離技術の使用を回避する。
【００１０】
したがって、本発明の主題は、それが誘導されたアデノウイルスのゲノムに関して異種である包膜に必須な領域を含むことを特徴とする、アデノウイルスのゲノムから誘導されたアデノウイルスベクターである。
【００１１】
本発明の目的に対して、アデノウイルスは、そのゲノムが修飾された親アデノウイルスから得られる。最小の修飾は、異なる由来の包膜に必須な領域の挿入である（異種）。もちろん、他の修飾をまた考えることができる。これらは種々の型（１またはそれ以上のヌクレオチドの欠失、付加、置換）であることができ、アデノウイルスのゲノムのコーディング領域またはこれらの外側（ウイルス遺伝子の発現、包膜およびその他に関係する領域）に位置することができ、そして初期および後期の双方の領域において影響を受けることができる。これに関して、本発明に特に適当なアデノウイルスは欠陥的である、すなわち、宿主細胞中で相補性の非存在において自律的に増殖することができない。それは置換に必須な１またはそれ以上のウイルス遺伝子について欠陥的であることができる。これらの遺伝子は欠失されており（全体または一部分として）、非機能的とされている（例えば、突然変異により）か、あるいは他の配列（特にその発現が宿主細胞または生物において探求される遺伝子）により置換されることができる。
【００１２】
本発明のアデノウイルスは、ヒトまたは動物のアデノウイルスから誘導することができ、そして任意の血清型を有する。サブグループＣヒトアデノウイルス、特にアデノウイルス２（Ａｄ２）および５（Ａｄ５）は、本発明を実施するために最も特に適当である。本発明の関係において使用することができる動物アデノウイルスの間で、イヌ、トリ、ウシ、ネズミ、ヒツジ、ブタおよびサルのアデノウイルスおよびその他を述べることができる。手引きとして、下記のアデノウイルスを使用するすることができる：ネズミアデノウイルスＭａｖｉ（Ｂｅａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．、１９９０、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １７５、８１−９０）、イヌアデノウイルスＣＡＶ−１またはＣＡＶ−２（ＳｐｉｂｅｙおよびＣａｖａｎａｇｈ、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．１９８９、７０、１６５−１７２；Ｌｉｎｎｅ、１９９２、Ｖｉｒｕｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２３、１１９−１３３；Ｓｈｉｂａｔａ  ｅｔ  ａｌ．、１９８９、Ｖｉｒｏｌ．１７２、４６０−４６７；Ｊｏｕｖｅｎｎｅ  ｅｔ  ａｌ．、Ｇｅｎｅ、１９８７、６０、２１−２８）、トリアデノウイルスＤＡＶ（Ｚａｋｈａｒｃｈｕｋ  ｅｔ  ａｌ．、Ａｒｃｈ．Ｖｉｒｏｌ．１９９３、１２８、１７１−１７６）またはウシアデノウイルスＢＡＶ３（Ｍｉｔｔａｌ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．１９９５、７６、９３−１０２）。一般に、前述のアデノウイルスは収集所およびＡＴＣＣにおいて入手可能であり、そして先行技術において発表されている多数の研究の主題である。アデノウイルス５（Ａｄ５）に関すると、そのゲノムの完全な配列は遺伝子バンクから受け入れ番号Ｍ７３２６０で入手可能である。この配列は本発明の明細書を参照することによって完全に組込まれる。
【００１３】
本発明の目的に対して、「包膜に必須な領域」は、タンパク質因子、特にウイルスタンパク質因子と共同して、ウイルスキャプシドの中へのウイルスベクターのゲノムの包膜を保証するための、シス作用性領域を意味すると理解される。このような領域は、特に、アデノウイルスのゲノムの場合において、５’および３’ＩＴＲ、および包膜領域から成る。それらの用語はこの分野においてよく知られている。
【００１４】
本発明によるアデノウイルスベクターの特性は、親アデノウイルスに関して、異種である、すなわち、異なる由来である、包膜に必須な領域を担持することである。それは任意のウイルス（レトロウイルス、ポックスウイルスおよびその他）から誘導することができるが、それが親アデノウイルスと異なる属または血清型のアデノウイルスであるかぎり、アデノウイルス由来は好ましい。好ましくは、本発明によれば、包膜に必須な前記異種領域は、包膜配列および必要に応じて５’および３’ＩＴＲ少なくとも１つから成る。
【００１５】
アデノウイルスの由来に依存して、包膜に必須な領域は多少変化させることができる。しかしながら、それらは入手可能な配列のデータに基づいて、あるいはヒトアデノウイルスとの類似性により同定することができる。ＩＴＲはアデノウイルスのゲノムの５’および３’末端に自然に位置し、そして前記ゲノムの複製および包膜の段階に関係づけられる。一般に、ＩＴＲは１００〜２００塩基対を含む。多数のＩＴＲ配列が文献において提案されている；例として、Ａｄ５についてＨｅａｒｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．、１９９７、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６１、２５５５−２５５８またはＢＡＶ３についてＷＯ９５／１６０４８を挙げることができる。包膜領域（Ψと記載する）はアデノウイルスのゲノムの５’ＩＴＲの背後に位置し、そして包膜に参加する反復モチーフを含む。例えば、Ａｄ５の包膜領域はＡＩ〜ＡＶＩと表示する７つのモチーフを含み、それらのモチーフはコンセンサス配列５’Ａ／Ｔ  ＡＮ  Ａ／Ｔ  ＴＴＧ  ３’（ここでＮは任意のヌクレオチドを表す）を有し、そしてウイルスゲノムの位置２４１−２４８、２６２−２６９、３０４−３１１、３１４−３２１および３３９−３４６に存在する（ＧｒａｂｌｅおよびＨｅａｒｉｎｇ、１９９０、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６４、２０４７−２０５６；ＳｃｈｍｉｄおよびＨｅａｒｉｎｇ、１９９８、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２、６３３９−６３４７）。種々のアデノウイルスの包膜領域は文献に記載されている（例えば、下記の文献を参照のこと：Ａｄ１６について、ＨａｍｍａｒｓｋｊｏｌｄおよびＷｉｎｂｅｒｇ、１９８０、Ｃｅｌｌ  ２０、７８７−７９５；Ａｄ５について、Ｈｅａｒｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．、１９８７、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６１、２５５５−２５５８；Ａｄ３について、ＲｏｂｉｎｓｏｎおよびＴｉｂｂｅｔｓ、１９８４、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、１３７、２７６−２８６；ＣＡＶ２について、Ｓｈｉｂａｔａ  ｅｔ  ａｌ．、１９８９、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １７２、４６０−４６７；ＢＡＶ３について、ＷＯ９５／１６０４８号）。純粋に例示のために、Ａｄ５の包膜領域は少なくともヌクレオチド（ｎｔ）２４０から３５０まで延びことを述べるべきである。ＢＡＶ３のそれにについては、それは位置約１８５〜約５１４の間の０．３ｋｂのフラグメントの中に含有される。しかしながら、包膜領域の限界は変化することができ、そしてより短いまたは長い領域もまた適当である。当業者はアデノウイルスのゲノムの５’末端のフラグメントを単離し、それを適当なベクターの中に挿入し、そして、例えば、ウイルスの力価またはリポーター遺伝子の発現を決定することによって、適当な系統においてその包膜能力を確認することができる。
【００１６】
包膜に必須な異種領域を担持する配列は、慣用手段（制限酵素を使用する消化、ＰＣＲおよびその他）によりウイルスゲノムから単離することができるか、あるいは化学的合成により製造することができる。必要に応じて、本発明の関係において、それらは天然の配列と比較して突然変異（１またはそれ以上のヌクレオチドの欠失、置換および／または付加）を含むことができる。また、他の外因的配列（制限部位およびその他）を含むことができる。それらは、本発明に従い、オートロガス領域に加えて、あるいはその置換として、アデノウイルスベクターの中に挿入することができる。挿入は、オートロガス領域の５’または３’において、その場所に、または異なる部位（例えば、３’ＩＴＲの直前の３’末端）で行うことができる。
【００１７】
好都合には、本発明によるアデノウイルスベクターはヒト由来のアデノウイルスから誘導され、そして包膜に必須な異種領域は動物由来のアデノウイルスから誘導される。これに関して、本発明に最も特に適当なベクターは、サブグループＣヒトアデノウイルスから、特にアデノウイルス２（Ａｄ２）または５（Ａｄ５）から誘導される。包膜に必須な異種領域に関すると、それは好ましくは前述のものから選択される動物アデノウイルスから誘導される。
【００１８】
完全に好ましい態様によれば、本発明によるアデノウイルスベクターはＡｄ５から誘導され、そして包膜に必須な異種領域はウシアデノウイルス、特にＢＡＶ３から誘導される。
【００１９】
前述の態様は好ましいが、他の組合わせを本発明の関係において使用することができることを述べるべきである。例えば、Ａｄ５から誘導され、そして異なる血清型の他のヒトアデノウイルス（Ａｄ３、Ａｄ７およびその他）から誘導された包膜に必須な異種領域を含むアデノウイルスを考えることができる。あるいは、アデノウイルスの骨格が動物由来であり、そして包膜に必須な領域をヒトアデノウイルスから誘導することができる。
【００２０】
上に示したように、本発明によるアデノウイルスは好ましくは少なくともＥ１機能について欠陥がある。このような欠陥は、対応する領域の全体または一部分の欠失により得ることができる。多数のＥ１−ベクターは先行技術において記載されており、そして本発明の関係において使用することができる。さらに、それは、特にＥ２、Ｅ４および／またはＬ１〜Ｌ５領域において、１またはそれ以上の他のウイルス遺伝子に影響を与える追加の突然変異／欠失を含むことができる。任意の組合わせを考えることができる（Ｅ１−Ｅ２−、Ｅ１−Ｅ４−、Ｅ１−Ｅ２−Ｅ４−およびその他）。このようなベクターは、特に国際出願ＷＯ９４／２８１  ５２号に記載されている。これらの態様を説明するために、Ｅ２領域のＤＢＰ（ＤＮＡ結合性タンパク質のための）遺伝子に影響を与える熱感受性突然変異を挙げることができる（Ｅｎｓｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、１９７２、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．１０、３２８−３３９）。オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）６および７をコードする配列を除外した、Ｅ４領域の部分的欠失を考えることもできる（Ｋｅｔｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、１９８９、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１７、３０３７−３０４８）。他の可能性は転写単位Ｅ４の完全な欠失である。そのうえ、本発明によるアデノウイルスベクターは、非必須領域Ｅ３のすべてまたは一部分を欠如することができる。この別法によれば、それにもかかわらず、ポリペプチド、特に糖タンパク質ｇｐ１９ｋをコードするＥ３配列を保存し、宿主の免疫系からのエスケープを可能とすることが好都合であることがある（Ｇｏｏｄｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．、１９９０、Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  ｌｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １０、５３−７１）。ある用途（組換えベクター）において、すべてのウイルス遺伝子の非機能性は好ましい。
【００２１】
第１変法によれば、本発明によるアデノウイルスベクターはヘルパーウイルスベクターとして使用して、組換えアデノウイルスベクターの欠陥機能のすべてまたは一部分を補足することができる。好都合な態様によれば、それは少なくともＥ１機能について欠陥がある。必要に応じて、それは追加の機能、例えば、Ｅ２について欠陥的であることができる。当業者は、補足しようとする組換えベクターおよび選択した細胞系統に依存して必要な欠陥を定めるすることができる。Ｅ４機能はＯＲＦ６および７によってのみ提供されることができることを述べるべきである。Ｅ３領域のすべてまたは一部分の存在は任意である。特定の態様によれば、それは５’および３’ＩＴＲ配列と、ヒトアデノウイルス、特にＡｄ５から誘導されたＥ２、Ｅ４および／またはＬ１〜Ｌ５機能をコードする配列と、ウシアデノウイルス、特にＢＡＶ３から誘導された異種包膜領域とを含む。他の態様によれば、ヘルパーウイルスベクターはヒトアデノウイルス、特にＡｄ５から誘導されたＥ２、Ｅ４および／またはＬ１〜Ｌ５機能をコードする配列と、異種５’ＩＴＲ配列、３’ＩＴＲ配列と、ウシアデノウイルス、特にＢＡＶ３から誘導された包膜領域とを含む。
【００２２】
本発明によるヘルパーアデノウイルスベクターは、上記において定義したアデノウイルスのゲノムの中に、少なくとも１つの包膜に必須な異種領域を挿入することによって得られる。好ましいプロセシング方法は、オートロガス包膜に必須な領域を異種領域で置換することである。当業者は、慣用の分子生物学の技術を適用することによって、このような構築物を製造することができる。
【００２３】
第２変法によれば、本発明によるアデノウイルスベクターは組換えベクターであり、そして宿主細胞または生物におけるその発現に必要な因子の制御下に配置された、少なくとも１つの問題の遺伝子を含む。
【００２４】
本発明において使用する問題の遺伝子は、真核生物、原核生物、寄生生物またはアデノウイルス以外のウイルスから誘導することができる。それはこの分野において普通に使用されている任意の技術、例えば、クローニング、ＰＣＲまたは化学的合成により単離することができる。それはゲノム型（全体としてイントロンのすべてまたは一部分を含む）、相補的ＤＮＡ型（ｃＤＮＡ、イントロンを欠如する）または混合型（ミニ遺伝子）であることができる。そのうえ、それはアンチセンスＲＮＡおよび／またはメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）をコードすることができ、次いでこれを問題のポリペプチドに翻訳し、後者は（ｉ）細胞内に存在し、（ｉｉ）宿主細胞の膜の中に組込むか、あるいは（ｉｉｉ）分泌されることができる。それは天然に見出される（天然の）ポリペプチド、その一部分（トランケート）、特に改良されたまたは修飾された生物学的性質を示す突然変異体または種々の由来の配列の融合から得られたキメラポリペプチドであることができる。
【００２５】
本発明の関係において、下記の遺伝子を使用することは好都合することがある：サイトカイン（α、βまたはγインターフェロン、インターロイキン（ＩＬ）、特にＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−１０またはＩＬ−１２、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、およびその他）、細胞レセプター（特にＨＩＶウイルスにより認識される）、レセプターリガンド、凝固因子、成長因子（ＦＧＦ、繊維芽細胞成長因子を表す、ＶＥＧＦ、血管内皮成長因子を表す）、酵素（ウレアーゼ、レニン、トロンビン、金属プロテイナーゼ、ＮＯＳ、酸化窒素シンターゼを表す、ＳＯＤ、カタラーゼ、およびその他）、酵素インヒビター（α１−抗トリプシン、抗トロンビンＩＩＩ、ウイルスプロテアーゼインヒビター、ＰＡＩ−１、プラスミノゲンアクチベーターインヒビターを表す）、クラスＩまたはＩＩの主要な組織適合性複合抗原または対応する遺伝子の発現に対して作用するポリペプチド、ウイルス、細菌または寄生生物の感染または発生を阻害することができるポリペプチド、アポプトーシスに対して積極的または消極的に反応するポリペプチド（Ｂａｘ、Ｂｃ１２、Ｂｃ１Ｘ、およびその他）、細胞増殖抑制因子（ｐ２１、ｐ１６、Ｒｂ）、アポリポタンパク質（ＡｐｏＡＩ、ＡｐｏＡＩＶ、ＡｐｏＥ、およびその他）、血管形成インヒビター（アンギオスタチン、エンドスタチン、およびその他）、マーカー（β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、およびその他）をコードする問題の遺伝子、あるいはターゲッテッドアイルメントに対して療法的効果を有する問題の遺伝子。より正確には、遺伝的機能障害を治療する目的に対して、欠陥遺伝子の機能的コピー、例えば、ＡまたはＢ血友病における因子ＶＩＩＩまたはＩＸ、デュシェーヌまたはベッカーミオパシーにおけるジストロフィン、糖尿病におけるインスリン、および膵嚢胞性繊維症におけるＣＦＴＲ（膜貫通コンダクタンスレギュレーター）タンパク質をコードする遺伝子の機能的コピーが使用されるであろう。腫瘍または癌の発症または進行の阻害に関すると、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、細胞障害性産物（単純ヘルペスウイルス１チミジンキナーゼ（ＨＳＶ−１−ＴＫ）、リシン、コレラまたはジフテリアトキシン、ウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼおよびシトシンジアミナーゼをコードするＦＣＹ１およびＦＵＲ１酵母遺伝子の産物、およびその他）、抗体、細胞の分裂または形質導入のシグナルのインヒビター、腫瘍抑制遺伝子の発現産物（ｐ５３、Ｒｂ、ｐ７３、およびその他）、免疫系を刺激するポリペプチド、腫瘍関連抗原（ＭＵＣ−１、ＢＲＣＡ−１、ＨＰＶ乳頭腫ウイルスの初期または後期の抗原（Ｅ６、Ｅ７、Ｌ１、Ｌ２、およびその他）をコードする問題の遺伝子を、適当ならば、サイトカイン遺伝子と組み合わせて、使用することが好ましい。最終、抗ＨＩＶ療法において、免疫保護的ポリペプチド、抗原性エピトープ、抗体（２Ｆ５；Ｂｕｃｈａｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、１９９２、Ｖａｃｃｉｎｅ  ９２、１９１−１９５）、ＣＤ４レセプターの細胞外ドメイン（ｓＣＤ４；Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、１９８８、Ｎａｔｕｒｅ  ３３１、８４−８６）、イムノアドヘシン（例えば��ＣＤ４−ＩｇＧ免疫グロブリンハイブリッド；Ｃａｐｏｎ  ｅｔ  ａｌ．、１９８９、Ｎａｔｕｒｅ  ３３７、５２５−５３１；Ｂｙｒｎ  ｅｔ  ａｌ．、１９９０、Ｎａｔｕｒｅ  ３４４、６６７−６７０）、イムノトキシン（例えば、抗体２Ｆ５の融合物またはアンギオゲニンに対するイムノアドヘシンＣＤ４−２Ｆ５；Ｋｕｒａｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．、１９８５、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２４、５４９４−５４９９）、トランスドミナント（ＥＰ０６１４９８０号、ＷＯ９５／１６７８０号）、細胞障害性産物、例えば、前述のものの１つ、またはαまたはβＩＦＮをコードする問題の遺伝子を使用することができる。
【００２６】
そのうえ、問題の遺伝子の１つは、また、トランスフェクトまたは形質導入された細胞の選択または同定を可能とする、選択可能な遺伝子であることができる。下記の遺伝子を挙げることができる：ｎｅｏ遺伝子（ネオマイシンリン酸転移酵素をコードする）、これは抗生物質Ｇ４１８に対する耐性を与える；ｄｈｆｒ（ジヒドロフォレートレダクターゼ）遺伝子；ＣＡＴ（クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ）遺伝子；ｐａｃ（プロマイシンアセチルトランスフェラーゼ）遺伝子；またはｇｐｔ（サンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ）遺伝子。一般に、選択可能な遺伝子はこの分野において知られている。
【００２７】
句「発現に必要な因子」は、問題の遺伝子のＲＮＡの転写およびｍＲＮＡのポリペプチドへの翻訳を可能とする遺伝的因子を意味する。これらのうちで、プロモーターは特に重要である。プロモーターは真核生物由来またはさらにウイルス由来の遺伝子から単離することができ、そして構成的または調節可能であることができる。あるいは、それは問題の遺伝子の天然のプロモーターであることができる。そのうえ、プロモーターを修飾して、プロモーターの活性を改良し、転写を阻害する領域を抑制し、構成的プロモーターを調節可能するか、あるいは逆もまた同じであり、制限部位を導入するなどをすることができる。例として、下記のプロモーターを挙げることができる：ＰＧＫ（ホスホグリセレートキナーゼ）、ＭＴ（メタロチオネイン；Ｍｃｌｖｏｒ  ｅｔ  ａｌ．、１９８７、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．７、８３８−８４８）、α１−抗トリプシン、ＣＦＴＲ、界面活性剤、免疫グロブリン、β−アクチン（Ｔａｂｉｎ  ｅｔ  ａｌ．、１９８２、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２、４２６−４３６）またはＳＲα（Ｔａｋｅｂｅ  ｅｔ  ａｌ．、１９８８、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．８、４６６−４７２）遺伝子の真核生物のプロモーター、ＳＶ４０ウイルス（サルウイルス）の初期プロモーター、ＣＭＶウイルス（サイトメガロウイルス）の初期プロモーターおよびアデノウイルスのプロモーターＥ１ＡおよびＭＬＰ。それは、また、腫瘍または癌の細胞における発現を刺激するプロモーターであることができる。特に、下記の遺伝子のプロモーターを挙げることができる：乳癌および前立腺癌において過度に発現されるＭＵＣ−１遺伝子（Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．、１９９５、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９６、２７７５−２７８２）、結腸癌において過度に発現されるＣＥＡ（癌腫胚抗原）遺伝子（Ｓｃｈｒｅｗｅ  ｅｔ  ａｌ．、１９９０、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０、２７３８−２７４８）、黒色腫において過度に発現されるチロシナーゼ遺伝子（Ｖｉｌｅ  ｅｔ  ａｌ．、１９９３、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５３、３８６０−３８６４）、乳癌および膵臓癌において過度に発現されるＥＲＢ−２遺伝子（Ｈａｒｒｉｓ  ｅｔ  ａｌ．、１９９４、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １、１７０−１７５）および肝臓癌において過度に発現されるα−フェトタンパク質遺伝子（Ｋａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．、１９９７、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５７、４６１−４６５）。サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）の初期プロモーターは最も特に好ましい。
【００２８】
発現に必要な因子は、さらに、宿主細胞における問題の遺伝子の発現またはその維持を改良する追加の因子を含むことができる。特に、下記の因子を挙げることができる：イントロン配列、分泌のためのシグナル配列、核局在化配列、ＩＲＥＳ型の翻訳再開のための内部の部位、転写停止のためのポリＡ配列、三部分リーダーおよび複製起点。これらの因子はこの分野において知られている。
【００２９】
本発明による組換えアデノウイルスベクターはいくつかの問題の遺伝子を含むとき、これらは同一遺伝的因子（第２シストロンの翻訳再開のためのＩＲＥＳ型の翻訳開始の内部の部位を使用するポリシストロン性カセット）または独立の因子の制御下に配置することができる。
【００３０】
特に好都合な態様は、それが誘導されたアデノウイルスのゲノムに関してオートロガスである包膜に必須な第２領域から成る、組換えアデノウイルスベクターにある。換言すると、この組換えアデノウイルスベクターは、一方がオートロガスでありかつ他方が異種である、２つの包膜領域を担持する。アデノウイルスベクターにおけるそれらの領域の位置は重要ではない。それらは特に前記ベクターの末端の１つに位置するか、あるいは前記末端の各々において分離されていることができる。好都合には、異種領域はオートロガス領域の３’に位置する。
【００３１】
本発明の関係において、本発明による組換えアデノウイルスベクターは、Ｅ１機能について欠陥があり、そしてＥ２、Ｅ３、Ｅ４および／またはＬ１〜Ｌ５の機能の少なくとも１つの欠陥がある。好ましい例は、１またはそれ以上の問題の遺伝子に加えて、少なくとも５’および３’ＩＴＲと、ヒトアデノウイルス、特にＡｄ５から誘導された包膜に必須なオートロガス領域と、ウシアデノウイルス、特にＢＡＶ３から誘導された包膜に必須な異種領域とを含む、すべてのアデノウイルス機能について欠陥があるベクター（最小ベクター）である。
【００３２】
分子生物学的技術により、本発明による組換えアデノウイルスベクターを発生することは、当業者の技量の範囲内である。特定のデータ（ベクターの型、問題の遺伝子およびその他）の関数として、前記技術を適合させる方法は当業者にとって明らかである。
【００３３】
本発明は、また、複製欠陥組換えアデノウイルスベクター、特に本発明による組換えアデノウイルスベクター、の欠陥機能のすべてまたは一部分を補足するための本発明によるヘルパーアデノウイルスベクターの使用に関し、前記ヘルパーおよび組換えベクターの双方は同一のアデノウイルス、特にＡｄ５から誘導され、そしてヘルパーベクターが担持する包膜に必須な前記異種領域および、必要に応じて、組換えベクターが前のアデノウイルスと異なるアデノウイルス、特にＢＡＶ３から誘導されている。
【００３４】
本発明は、また、下記の因子：
（ａ）本発明によるヘルパーアデノウイルスベクター、
（ｂ）複製欠陥組換えアデノウイルスベクター、特に本発明による組換えアデノウイルスベクター、および
（ｃ）必要に応じて、ヘルパーおよび組換えベクター（ａ）および必要に応じて（ｂ）が担持する包膜に必須な異種領域と同一由来の動物アデノウイルスから誘導されたアデノウイルスのゲノム、
を含んでなる組成物に関する。
【００３５】
本発明は、また、それが誘導されたアデノウイルスと比較して、減衰した包膜能力を有することを特徴とする、動物アデノウイルス、特にウシアデノウイルス、特にＢＡＶ３から誘導されたアデノウイルスのゲノムに関する。減衰は、自然領域（本発明によるヘルパーおよび組換えアデノウイルスベクター）を担持するゲノムの利益のために、アデノウイルスのゲノムの増殖を減少させることを意図する。それは包膜領域の部分的欠失によるか、あるいは包膜プロセスをコントロールする１またはそれ以上のモチーフの突然変異により得るすることができる。減衰の例は、国際出願ＷＯ９４／２８１５２号およびＩｍｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、１９９５、Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ６、７１１−７２１に記載されている。例えば、包膜に必須な自然領域を担持する同等のウイルスに関して、ウイルス力価（ＧｒａｈａｍおよびＰｒｅｖｅｃ、１９９１、ｓｕｐｒａ）またはリポーター遺伝子の発現を決定することによって、減衰の確認を可能とする技術は当業者は知っている。減衰された包膜に必須な領域は、２〜１０００倍、好都合には３〜１００倍、好ましくは５〜１０倍だけ減少した包膜効率を示す。
【００３６】
本発明による動物アデノウイルスのゲノムは、複製コンピテントであることができるか、あるいは１またはそれ以上のウイルス遺伝子に影響を与える修飾、例えば、前述の修飾を含むことができる。特に、前記ゲノムのＥ１領域の全体または一部分の欠失は本発明の関係において好都合である。ゲノムおよび／またはベクターはＤＮＡまたはウイルスの形態であることができることを述べるべきである。
【００３７】
本発明は、また、工程：
（ａ）第１細胞系統の中に、
（ｉ）本発明によるヘルパーアデノウイルスベクター、
（ｉｉ）動物アデノウイルスから誘導されたアデノウイルスのゲノム、および
（ｉｉｉ）複製欠陥組換えアデノウイルスベクター、
を導入し、前記アデノウイルスのゲノム（ｉｉ）はベクター（ｉ）および必要に応じて（ｉｉｉ）が担持する包膜に必須な異種領域と同一由来であり、そして前記アデノウイルスのゲノム（ｉｉ）およびベクター（ｉ）および（ｉｉｉ）は前記第１細胞系統において複製することができ、
（ｂ）ベクター（ｉ）および（ｉｉｉ）およびアデノウイルスのゲノム（ｉｉ）を含むウイルス粒子の産生を可能とする適当な条件下に、前記第１細胞系統を培養し、
（ｃ）工程（ｂ）において得られた前記ウイルス粒子を細胞培養物から回収し、
（ｄ）第２細胞系統を工程（ｃ）において回収された前記ウイルス粒子で感染させ、前記ベクター（ｉ）および前記アデノウイルスのゲノム（ｉｉ）は前記第２細胞系統においてゼロまたは減少した包膜および／または複製の能力を有し、
（ｅ）前記組換えアデノウイルスベクター（ｉｉｉ）の包膜を可能としかつウイルス調製物を産生するために適当な条件下に、前記第２細胞系統を培養し、そして
（ｆ）工程（ｅ）において得られた前記ウイルス調製物を細胞培養物から回収する、
ことによる、複製欠陥組換えアデノウイルスベクター、特に本発明による組換えアデノウイルスベクターを含むウイルス調製物を製造する方法に関する。
【００３８】
本発明の目的に対して、アデノウイルスベクターおよびゲノムは先行技術の手段により、特にトランスフェクションおよび／または感染により、第１細胞系統の中に導入することができる。ベクターを系統の中にトランスフェクトすることができ、この系統は動物アデノウイルスのゲノムの粒子で感染される（トランスフェクションの前、それに引き続いて、またはそれと同時に）。種々の因子（ｉ）、（ｉｉ）または（ｉｉｉ）を含有するウイルスは、先行技術の技術に従い製造することができる。そのうえ、前記複製欠陥組換えアデノウイルスベクターは、ＷＯ９４／２８１５２号、ＷＯ９４／０８０２６号、ＷＯ９３／１９１９１号またはＷＯ９４／１２６４９号に記載されているように、ベクターから成ることができる。
【００３９】
そのうえ、ゲノム（ｉｉ）は野生型であり、本発明に従い（減衰された）および／または１またはそれ以上のウイルス遺伝子の機能に影響を与える１またはそれ以上の修飾を含むことができる。
【００４０】
好都合な態様によれば、第１細胞は、
（ｉ）少なくともＥ１機能について欠陥があり、ヒトアデノウイルス（特にＡｄ５）から誘導され、かつウシアデノウイルス（特にＢＡＶ３）から誘導された包膜に必須な異種領域を担持するヘルパーアデノウイルスベクター、
（ｉｉ）ウシアデノウイルス（特にＢＡＶ３）から、必要に応じて本発明に従い、誘導されたアデノウイルスのゲノム、および
（ｉｉｉ）Ｅ１機能についておよびＥ２、Ｅ４および／またはＬ１〜Ｌ５機能の少なくとも１つについて欠陥があり、かつヒトアデノウイルス（特にＡｄ５）から誘導された、上記において定義した、第２オートロガス包膜領域を担持し、かつウシアデノウイルス（特にＢＡＶ３）から誘導された包膜に必須な異種領域を担持する、組換えアデノウイルスベクター、
を含み、前記第１細胞系統はウシ由来である。
【００４１】
完全に好都合な態様によれば、前述の方法の（ｉ）における問題の欠陥ヘルパーアデノウイルスベクターは、５’および３’ＩＴＲおよび包膜領域を含むウシアデノウイルス（特にＢＡＶ３）から誘導された包膜に必須な異種領域を含む。
【００４２】
あるいは、Ｅ１機能について欠陥があるアデノウイルスのゲノム（ｉｉ）を使用することができる。好ましい変形に関すると、Ｅ１機能について欠陥があるＢＡＶ３ゲノムは、国際出願ＷＯ９５／１６０４８号に記載されている。この場合において、動物由来の前記アデノウイルスのゲノムみらＥ１機能を補足することができる第１細胞系統が使用されるであろう。前記アデノウイルスのゲノム（ｉｉ）として同一動物由来の系統を使用することが好ましい。それは確立された系統または一次系統であることができる。
【００４３】
相補性細胞という用語は、この分野において標準的である。本発明の関係において、それは本発明によるアデノウイルスのベクターまたはゲノムの欠陥因子の少なくとも一部分をトランスで提供することができる。一般に、対応するウイルス遺伝子を適当な細胞系統の中にトランスフェクトすることによって、アデノウイルス機能を補足する細胞を得ることができる。ＤＮＡを細胞の中に導入する、すべての標準的手段を使用することができる（リン酸カルシウムを使用するトランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、リポフェクション、プロトプラストの融合およびその他）。そのうえ、ウイルス遺伝子を慣用のベクター（合成、ウイルスまたはプラスミドのベクターおよびその他）により運搬し、前記相補性細胞における構成的または調節された発現を可能とする因子の制御下に配置する。アデノウイルスベクターに適当な相補性系統この分野において知られている（例えば、下記の文献を参照のこと：国際出願ＷＯ９４／２８１５２号、ＷＯ９７／０４１１９号およびＧｒａｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．１９７７、３６、５９−７２）。
【００４４】
特に適当なウシ系統はＭＤＢＫ系統（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−２２またはＣＲＬ−６０７１）または一次細胞、特に網膜または胎児腎臓の細胞から誘導され、そしてウシアデノウイルス、特にＢＡＶ３のＥ１領域をコードする配列を含み、前記配列は前記系統におけるそれらの発現に必要な因子の制御下に配置される。
【００４５】
好ましい態様によれば、第２細胞系統はヒトアデノウイルス、特にＡｄ５のＥ１機能を補足する細胞である。好ましくは、２９３系統を使用する。しかしながら、他の系統、例えば、国際出願ＷＯ９４／２８１５２号に記載されている系統を使用することもできる。
【００４６】
工程（ｃ）のウイルス粒子およびウイルス調製物を培養上清から回収することができるが、また、細胞から回収することができる。普通に使用される方法の１つは、細胞を連続的凍結／融解サイクルにより溶解して、溶解上清からヴィリオンを回収することから成る。次いで、これらを増幅し、先行技術の技術（クロマトグラフィー、超遠心、特に塩化カルシウム勾配を通す超遠心、およびその他）に従い、精製することができる。
【００４７】
本発明は、また、本発明の方法に従い得られたウイルス調製物に関する。好都合な態様によれば、ウイルス調製物は、本発明による組換えアデノウイルスベクターを含有する感染性ウイルス粒子の少なくとも３０％を含む。好都合には、それは少なくとも５０％、好ましくは少なくとも７０％、最も好ましくは少なくとも８０％のウイルス粒子を含む。
【００４８】
本発明は、また、本発明によるアデノウイルスベクターを含むか、あるいは本発明によるウイルス調製物で感染された宿主細胞に関する。哺乳動物細胞、特にヒト細胞は最も特に適当である。宿主細胞ゲノムまたは他の因子（エピソーム）の中に組込まれたの形態の前記ウイルスを含むことができる。それは造血由来の一次または腫瘍細胞（全能幹細胞、白血球、リンパ球、単球またはマクロファージおよびその他）、筋細胞（サテライト細胞、ミオサイト、筋芽細胞およびその他）、心臓、肺、気管、肝臓、上皮または繊維芽の細胞であることができる。
【００４９】
本発明は、また、記の因子：
（ｉ）本発明によるヘルパーアデノウイルスベクター、
（ｉｉ）動物アデノウイルスから誘導されたアデノウイルスのゲノム、および
（ｉｉ）欠陥組換えアデノウイルスベクター、特に本発明による組換えアデノウイルスベクター、
を含む細胞に関する。
【００５０】
前記細胞は好ましくはアデノウイルス機能、特に動物またはヒトのアデノウイルスのＥ１機能を補足する細胞である。細胞は上記において定義された特性を有する。
【００５１】
本発明は、また、治療または予防の因子として、本発明によるアデノウイルスベクター、ウイルス調製物または宿主細胞と、薬学上許容される担体とを含んでなる医薬組成物に関する。本発明による組成物は、いっそう特に遺伝子療法により疾患の予防的または治療的処置に意図され、そして遺伝病（血友病、糖尿病、嚢胞性線維症、デュシェーヌまたはベッカーミオパシー、自己免疫疾患）および後天性疾患（癌、腫瘍、心臓血管性疾患、感染由来の疾患、例えば、Ｂ型肝炎またはＣ型肝炎、ＡＩＤＳおよびその他）の双方に適用される。
【００５２】
本発明による医薬組成物は、慣用の投与方法において、局所的、非経口的または消化的経路により製造することができる。特に、治療的に有効な量治療または予防因子を薬学上許容される担体と組合わせる。考えられる投与の経路は多数存在する。例えば、胃内、皮下、心臓内、筋肉内、静脈内、動脈内、腹腔内、腫瘍内、鼻内、肺内または気管内の経路を挙げることができる。後者の３つの態様について、エーロゾルまたは点滴注入は好都合である。投与は単一の投与として、か、あるいはある時間間隔後に１回または数回反復される投与として実施することができる。適当な投与経路および投与量は、種々のパラメーター、例えば、治療すべき個体または疾患または１または２以上の転移すべき問題の遺伝子に依存して変化する。本発明によるウイルス調製物は、１０４〜１０１４ｐｆｕ（プラーク形成単位）、好都合には１０５〜１０１３ｐｆｕ、好ましくは１０６〜１０１２ｐｆｕの投与量の形態で処方することができる。本発明による組換えアデノウイルスベクターに関すると、０．０１〜１００ｍｇ、好ましくは０．０５〜１０ｍｇ、最も好ましくは０．５〜５ｍｇのＤＮＡを含んでなる投与量を考えることができる。処方物は、また、薬学上許容される希釈剤、アジュバントまたは賦形剤を含むことができる。処方物は液体または乾燥形態（凍結乾燥物およびその他）で提供することができる。
【００５３】
本発明によるウイルスベクターまたはウイルス調製物は、必要に応じて、トランスフェクションおよび／または安定性を改良する、１またはそれ以上の物質と組み合わせることができる。これらの物質は当業者がアクセス可能な文献に広く記載されている（例えば、下記の文献を参照のこと：Ｆｅｌｇｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、１９８７、Ｐｒｏｃ．Ｗｅｓｔ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｏｃ．３２、１１５−１２１；ＨｏｄｇｓｏｎおよびＳｏｌａｉｍａｎ、１９９６、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４、３３９−３４２；Ｒｅｍｙ  ｅｔ  ａｌ．、１９９４、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ５、６４７−６５４）。非限定的例示として、それらの物質は、ポリマー、脂質、特にカチオン性脂質、リポソーム、核タンパク質または中性リポソームであることができる。これらの物質は単独で、または組合わせで使用することができる。
【００５４】
最後に、本発明は、宿主細胞または生物における問題の遺伝子の転移または発現のための、本発明によるアデノウイルスベクター、ウイルス調製物または宿主細胞の使用に関する。好ましい使用は、遺伝子療法または免疫療法によるヒトまたは動物の体の治療にある。第１の可能性によれば、薬物はｉｎ  ｖｉｖｏで直接的に投与することができる（例えば、アクセス可能な腫瘍の中への静脈内注射、肺の中へのエーロゾルおよびその他）。また、ｅｘ  ｖｉｖｏアプローチを採用することができ、このアプローチは患者から細胞（骨髄幹細胞、末梢血リンパ球、筋細胞およびその他）を収集し、先行技術の技術に従いｉｎ  ｖｉｔｒｏでそれらをトランスフェクトし、そして患者にそれらを再投与することから成る。好ましい使用は、遺伝子療法または免疫療法による疾患の治療に意図される薬物の製造のための使用である。
【００５５】
本発明は、また、治療的に有効な量の本発明による組換えアデノウイルスベクター、ウイルス調製物または宿主細胞を治療を必要とする患者に投与する治療方法に拡張される。
【００５６】
【実施例】
本発明を詳細に説明する。これらの実施例は本発明を限定しない。
【００５７】
後述する構築物は、Ｍａｎｉａｔｉｓ  ｅｔ  ａｌ．、１９８９、Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ、に詳述されている遺伝子工学および分子クローニング技術に従うか、あるいは商業的キットを使用するとき、製造業者のプロトコールに従い、製造される。相同組換え工程は大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＪ５１８３中で実施することが好ましい（Ｈａｎａｈａｎ、１９８３、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１６６、５５７−５８０）。制限部位の修復に関すると、使用する技術は突起する５’末端を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のＤＮＡポリメラーゼｌの大きいフラグメント（Ｋｌｅｎｏｗ）で充填することから成る。そのうえ、後述する種々の構築物において使用するアデノウイルスのゲノムのフラグメントは、遺伝子バンクのデータバンクにおいて、それぞれ、登録番号Ｍ７３２６０およびＡＦＯ３０１５４で開示されているように、Ａｄ５およびＢＡＶ３のゲノムのヌクレオチド配列中のそれらの位置に従い正確に示されている。
【００５８】
細胞生物学に関すると、当業者によく知られている標準的技術に従い、細胞をトランスフェクトまたは形質導入し、培養する。下記の実施例において、細胞系統２９３（Ｇｒａｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．、１９７７、ｓｕｐｒａ；ＡＴＣＣから受け入れ番号ＣＲＬ１５７３で入手可能である）およびＭＤＢＫ（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−６０７１またはＣＣＬ−２２）を使用する。他の細胞系統を使用することができることが理解されるであろう。
【００５９】
実施例１：ヒト系統中のＢＡＶ３ウイルスの増殖の非存在
ヒト系統ＭＤＢＫおよびヒト系統Ａ５４９（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−１８５）、ＨｅＬａ（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−２）および２９３（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５７３）を野生型ＢＡＶ３で異なるＭＯＩ（１、２および１０）において感染させる。細胞を感染後３日に収集し、許容性ＭＤＢＫ細胞について、ウイルス力価を測定する。増殖ファクターはヒト細胞の感染の場合において１より小さいが、それはウシ系統の場合において５０〜１００である。これらの結果が示すように、ＢＡＶ３ベクターはヒト系統中で増殖することができない。
【００６０】
ＢＡＶ３のウイルス遺伝子の発現は、確立されたヒト系統（Ａ５４９、ＨｅＬａ、２９３、ＭＲＣ５、ＲＰＭＩ）または一次ヒト系統（一次筋系統ＰＨＭ）の中にＢＡＶ３ウイルスを感染した後、逆ＰＣＲにより確認される。対照系統はＭＤＢＫ系統から成る。慣用技術に従い、細胞を回収し、ポリＡ＋ＲＮＡを単離する。Ｅ１領域に対して特異的なアンチセンスプライマーを使用して逆転写を実施し、次いで同一プライマーおよびＥ１に対して特異的なセンスプライマーを使用してＰＣＲ増幅を実施する。ＰＣＲ生成物をサザンブロット分析し、Ｅ１に対して特異的なプローブを使用して検出する。このプローブはゲノムＤＮＡに対応する６２６ｂｐおよびポリＡ＋ｍＲＮＡから誘導された５１９ｂｐのバンドの検出を可能とする。ＭＤＢＫ細胞において、感染後１６時間に最大であるウイルスＥ１遺伝子の発現が観測される。Ｅ１は、また、２９３系統において発現される。他方において、Ｅ１ｍＲＮＡの発現は試験したすべての他のヒト系統において検出することができない。
【００６１】
これらの結果が示すように、ヒト細胞はＢＡＶ３ウイルスで感染されるが、ＢＡＶ３ウイルスはその中で複製することができない。
【００６２】
実施例２：キメラアデノウイルスベクターＡｄ５／ＢＡＶ３の構築
構築したすべてのベクターのうちの最初のベクターは、β−ガラクトシダーゼをコードする細菌のＬａｃＺ遺伝子を発現するカセットを含む。これを実施するために、ＬａｃＺコーディング配列を担持するｐＴＧ８５９５（Ｌｕｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．、１９９８、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２、２０２２−２０３３）のＸｈｏｌ−Ｓａｃｌフラグメントを、プラスミドｐＣｌ（Ｐｒｏｍｅｇａ）のＸｈｏｌ部位の中にクローニングする。後者は真核生物発現ベクターであり、ＣＭＶプロモーター、スプライシング配列、多重クローニング部位およびＳＶ４０ポリＡ配列を含む。前述の調節因子によりフランクされた、ＬａｃＺ遺伝子を発現するカセットを、Ｂｇｌｌｌ−ＢａｍＨｌフラグメントの形態で単離し、転移ベクターｐＴＧ８３４３のＢｇｌｌｌ部位の中に導入して、ｐＴＧ６４５２を形成する。手引きとして、転移ベクターは、プラスミドｐｐｏｌｙｌｌ（Ｌａｔｈｅ  ｅｔ  ａｌ．、１９８７、Ｇｅｎｅ  ５７、１９３−２０１）の中に挿入された、Ｅ１配列の大部分（ｎｔ１〜４５８および３３２９〜５７８８）が欠失されたＡｄ５の５’末端を含む。ｐＴＧ６４５２から得られたＰａｃｌ−Ｎｓｉｌフラグメントと、Ｅ３領域が欠失され、酵素Ｃｌａｌにより切断されたＡｄ５ゲノムを担持するベクターｐＴＧ３６５２との間の相同組換えにより、アデノウイルスのゲノムを再構築する。こうして得られたベクター（ｐＴＧ６４８１と呼ぶ）は、Ｅ１領域（ｎｔ４５９〜３３２８）およびＥ３領域（ｎｔ２８２４９〜３０７５８）を欠如するＡｄ５配列、およびＥ１領域の代わりにクローニングされたｐＣＭＶ−ＬａｃＺ−ｐＡＳＶ４０カセットを含有する。包膜領域はＡｄ５由来である。
【００６３】
次の工程は、ＢＡＶ３の包膜領域を先行するベクターの中に挿入することである。２つの挿入部位を試験した：Ａｄ５ゲノムの位置１５１のＡｆｌｌｌｌ部位のレベルにおける、自然包膜領域から上流の第１の挿入部位、およびＳａｃｌ部位（Ａｄ５の位置４５１の）のレベルにおけるその下流の他方の挿入部位。ＰＴＧ６４５２のＡｆｌｌｌｌ消化、クレノーを使用する処理およびＢＡＶ３ゲノムの位置１４１〜９８４における配列をカバーする８４４ｂｐのＨａｅｌｌ−Ｐｖｕｌｌフラグメントの導入により、第１構築物ｐＴＧ６４６６を発生させ、このフラグメントは前以てクレノーの作用に暴露されている。ベクターｐＴＧ６４６７を同一プロトコールに従い発生させるが、ただしｐＴＧ６４５２をＳａｌｌで線状化する。こうして、ベクターｐＴＧ６４６６およびｐＴＧ６４６７は、１つがＡｄ５由来でありかつ他方がＢＡＶ３由来（約０．８５ｋｂ）である、２つの包膜領域を含有する。
【００６４】
また、ＴｈａｌまたはＢｓｔｕｌ消化により先行するものから誘導された減少したＢＡＶ３包膜領域（ＢＡＶ３ゲノムの位置１８５〜５１４）を使用した。前述したように、約０．３ｋｂのＢＡＶ３領域をＡｄ５組換えベクターの中に、Ａｆｌｌｌｌ部位（オートロガスｐｓｉ領域の５’中の）のレベルまたはＳａｌｌ部位（オートロガスｐｓｉ領域の３’中の）のレベルにおいて挿入する。後者の場合において、転移ベクターｐＴＧ６４５８を発生させ、そしてアデノウイルスのゲノムを前述したように相同組換えにより再構築して、ｐＴＧ６４８２を形成する。
【００６５】
次いで、Ａｄ５包膜領域がそのＢＡＶ３相同体に対して交換されている構築物を発生させる。ベクターｐＴＧ６４５２をＡｆｌｌｌｌ（ｎｔ１５１）およびＳａｌｌ（ｎｔ４５１）で消化し、次いでクレノーポリメラーゼで処理する。Ａｄ５包膜領域を担持する３００ｂｐのフラグメントを、ＢＡＶ３から単離されたＨａｅｌｌ−Ｐｖｕｌｌフラグメント（８４４ｂｐ）と置換し、クレノーの作用により平滑とする。ｐＴＧ６４６８が得られ、これはＡｄ５の関係において唯一のＢＡＶ３包膜領域を担持する。同一構築物は、０．３ｋｂのＢＡＶ３包膜領域を使用する。
【００６６】
修飾された領域を、上に示したように、相同組換えによりアデノウイルスのゲノムの中に再導入する。
【００６７】
同一方法において、Ａｄ５ゲノムから誘導され、包膜領域およびＢＡＶ３の５’および３’ＩＴＲを含むヘルパーアデノウイルスベクターを構築する。そのために、Ｅ１およびＥ３領域が欠失されたＡｄ５ゲノムから誘導されたベクターｐＴＧ１３３７３を構築し、これは５’ＩＴＲおよびＢＡＶ３ゲノムの０．３ｋｂの包膜領域を含む。
【００６８】
ｐＴＧ８３４３の中に存在する５’ＩＴＲおよびＡｄ５包膜領域を、ｐＴＧ５４３１の中に存在する５’ＩＴＲおよびＡｄ５包膜領域で置換することによって、ベクターｐＴＧ１３３７３を得る；手引きとして、ｐＴＧ５４３１はＢＡＶ３ゲノムの５’末端（ヌクレオチド１〜８２１７）から成る。これを実施するために、ｐＴＧ８３４３をＢｇｌｌｌで消化し、クレノーの作用に暴露し、次いでＰａｃｌで消化し、そしてｐＴＧ５４３１をＡｃｃｌで消化し、クレノーの作用に暴露し、次いでＰａｃｌで消化する。こうして得られたフラグメントを結合させて、ｐＴＧ１３３７２を形成する。最後に、Ｂｇｌｌで消化したｐＴＧ１３３７２から得られたフラグメントと、Ｐａｃｌで消化したｐＴＧ６４０１から得られたフラグメントとの間の相同組換えにより、ｐＴＧ１３３７３を発生させる。
【００６９】
次いで、下記の方法において、Ｅ１およびＥ３領域を欠失したＡｄ５ゲノムから誘導され、５’および３’ＩＴＲならびにＢＡＶ３包膜領域を含むベクターｐＴＧ１４３１０を発生させる。
【００７０】
ベクターｐＴＧ１３３８４のＡｄ５の３’ＩＴＲ（Ａｄ５ゲノムの３’末端（ヌクレオチド３２８００〜３５９３５）；ヌクレオチド３５８２６〜３５８２７の間に挿入されたクローニングカセットから成る）を、ＢＡＶ３の３’ＩＴＲで置換する。これを実施するために、ｐＴＧ１３３８４をＸｂａｌで消化し、クレノーの作用に暴露し、次いでＰａｃｌで消化する。そのうえ、ｐＴＧ５４３１をＡｐｏｌで消化し、クレノーで処理し、そしてＰａｃｌで消化する。手引きとして、ベクターｐＴＧ５４３１は、ユニークＨｉｎｄｌｌｌ制限部位により分離された、ＢＡＶ３の５’末端（８２９〜１０７７フラグメントが欠失されたヌクレオチド１〜１６５１）および３’末端（ヌクレオチド３３２３２〜３４４４６）を含む。こうして得られたフラグメントを結合して、ｐＴＧ１４２６１を形成する。
【００７１】
そのうえ、ＸｂａｌおよびＢａｍＨｌで消化し、クレノーを作用させた後に、ｐＴＧ１４２６１を再循環させると、ｐＴＧ１４２６１のウシＩＴＲから上流のＨｉｎｄｌｌｌ切断部位の排除が可能となる。こうして、ベクターｐＴＧ１４２６２が得られる。
【００７２】
平行して、ｐＴＧ１３３７３をＨｉｎｄｌｌｌで消化し、再循環させてｐＴＧ１４２６３を形成し、これはＢＡＶ３の５’ＩＴＲおよび０．３ｋｂの包膜配列ならびにＡｄ５の３’ＩＴＲを含有する。
【００７３】
次いでベクターｐＴＧ１４２６３中のＡｄ５の３’ＩＴＲを、ｐＴＧ１４２６２のＢＡＶ３の３’ＩＴＲで置換する。これを実施するために、ｐＴＧ１４２６３およびｐＴＧ１４２６２をＨｉｎｄｌｌｌおよびＰａｃｌで消化する。こうして得られたフラグメントを結合して、ｐＴＧ１４２６６を発生させる。
【００７４】
最後に、Ｈｉｎｄｌｌｌで線状化したｐＴＧ１４２６６と、Ｐａｃｌで消化したｐＴＧ１３３７３との間の相同組換えにより、アデノウイルスのゲノムを再構築する。得られたベクター（ｐＴＧ１４３１０と呼ぶ）は、Ｅ１およびＥ３領域が欠失されたＡｄ５のゲノムから誘導され、そして５’および３’ＩＴＲならびにＢＡＶ３包膜領域を含有する。
【００７５】
ｐＴＧ１４３１０のそれに類似するが、０．８ｋｂのＢＡＶ３包膜領域を含むアデノウイルスのゲノムがまた得られた。そのために、ｐＴＧ８３４３の中に存在するＡｄ５の５’ＩＴＲおよび包膜領域を、ｐＴＧ５４３１の中に存在するＢＡＶ３の５’ＩＴＲおよび０．８ｋｂの包膜領域と置換した。これを実施するために、ｐＴＧ８３４３をＢｇｌｌｌで消化し、クレノーの作用に暴露し、次いでＰａｃｌで消化する。他方において、ｐＴＧ５４３１をＰｖｕｌｌおよびＰａｃｌで消化する。こうして得られたフラグメントを結合して、ｐＴＧ１３３７３を発生させる。
【００７６】
次いで、ｐＴＧ１４２６６の中に存在するＢＡＶ３の５’ＩＴＲおよび０．３ｋｂの包膜領域を、ｐＴＧ１４３１３の中に存在するＢＡＶ３の５’ＩＴＲおよび０．８ｋｂの包膜領域で置換する。これを実施するために、ｐＴＧ１４２６６から得られたＳｓｐｌ／Ｍｆｅｌフラグメントと、ｐＴＧ１４３１３から得られたＳｃａｌ／Ｎｓｉｌフラグメントとの間で、相同組換えを実施する。こうして得られたベクターをｐＴＧ１４３１５と呼ぶ。
【００７７】
最後に、ｐＴＧ１４３１５から得られたＨｉｎｄｌｌｌフラグメントと、ｐＴＧ５４０１から得られたＰａｃｌフラグメントとの間の相同組換えにより、アデノウイルスのゲノムを再構築する。こうして得られたベクター（ｐＴＧ１４３１６と呼ぶ）はＡｄ５のゲノムから誘導され、そして５’および３’ＩＴＲならびにＢＡＶ３の０．８ｋｂの包膜領域を含有する。
【００７８】
本発明によるベクターの追加の実施例は、Ｅ１およびＥ３が欠失されたＡｄ５ゲノムから誘導され、そして５’および３’ＩＴＲならびにＢＡＶ３の０．３ｋｂの包膜領域を含有し、ここで包膜領域は３’ＩＴＲのすぐ上流に挿入されている。
【００７９】
このようなベクターを構築するために、ｐＴＧ１３３７２およびｐＴＧ１４２６６中のＢＡＶ３包膜領域のすべてをまず欠失させる。そのために、ｐＴＧ１３３７２をＡｆｌｌｌｌで消化し、クレノーの作用に暴露し、次いでＰａｃｌで消化し、そしてｐＴＧ１４２６２をＰｖｕｌｌおよびＰａｃｌで消化する。こうして得られたフラグメントを結合して、ｐＴＧ１４３１１を発生させる。
【００８０】
ｐＴＧ１４２６６から得られたＸｍｎｌ／Ｄｒａｌｌｌフラグメントと、ｐＴＧ１４３１１から得られたＰｖｕｌｌ／Ｓｐｈｌフラグメントとの間の相同組換えにより、ｐＴＧ１４２６６のウシ包膜領域を欠失させる。次いで、ｐＴＧ１４３２８が得られる。
【００８１】
次いで、ｐＴＧ１３３８４中のＡｄ５の３’ＩＴＲを、ｐＴＧ５４３１の中に存在するＢＡＶ３の３’ＩＴＲおよび０．３ｋｂの包膜配列で置換する。そのために、ｐＴＧ１３３８４をＢａｍＨｌで消化し、クレノーの作用に暴露し、次いでＰａｃｌで消化する。他方において、ｐＴＧ５４３１をＡｆｌｌｌｌで消化し、クレノーで処理し、そしてＰａｃｌで消化する。こうして得られたフラグメントを結合して、ｐＴＧ１４２７１を発生させる。
【００８２】
ｐＴＧ１４３２８およびｐＴＧ１４２７１から得られたＥｃｏＲｌ／Ｈｉｎｄｌｌｌフラグメントの結合により、３’ＩＴＲのちょうど上流にＢＡＶ３の包膜配列を導入する。こうして得られたベクターをｐＴＧ１４３３０と呼ぶ。
【００８３】
次いで、ｐＴＧ１４３３０のＨｉｎｄｌｌｌフラグメントと、ｐＴＧ６４０１のＰａｃｌフラグメントとの間の相同組換えにより、アデノウイルスのゲノムを再構築する。次いで、Ｅ１およびＥ３領域が欠失されたＡｄ５ゲノムから誘導され、そして５’および３’ＩＴＲならびに３’ＩＴＲのちょうど上流に挿入されたＢＡＶ３の０．３ｋｂの包膜領域を含有する、ベクターｐＴＧｐｒｏｄ１１が得られる。
【００８４】
実施例３：ウイルス粒子の産生
ウイルスゲノムｐＴＧ６４６８（ヘルパー）およびｐＴＧ６４６７またはｐＴＧ６４６６（組換え体）を、ＭＢＤＫ系統のウシ細胞の中にトランスフェクトする。次に、トランスフェクトされた細胞を野生型または減衰ＢＡＶ３ゲノムで感染させる。Ａｄ５はＢＡＶ３ウイルスの存在においてウシ細胞中で増殖することができかつ３つのウイルス因子はＢＡＶ３包膜領域を含有するので、それらをウイルスキャプシドの中にパッケージし、感染性ウイルス粒子を発生させることができる。この混合物を回収し、そしてＭＢＤＫ細胞の感染ので連続的サイクルによる増幅の工程を必要に応じて実施して、３つの型のウイルスのでウイルスのストックを構築する。ウシ細胞についてのこの第１工程の間に、ＢＡＶ３ゲノムはヘルパーベクターの包膜のためのトランス作用性因子を産生し、これは組換えベクターの増殖に必要なウイルス機能を提供する。組換えベクターの包膜は、ＢＡＶ３およびＡｄ５由来のアデノウイルス因子により仲介されることができる。なぜなら、組換えベクターは双方の由来の包膜領域を有し、そしてキャプシドはＢＡＶ３またはＡｄ５の構造タンパク質を含有することができるからである。
【００８５】
ウシ系統において発生したウイルス混合物を使用して、ヒト２９３細胞を感染させる。これらの細胞において、ＢＡＶ３ウイルスはＡｄ５の存在においてさえ増殖することができない。しかしながら、Ａｄ５由来のヘルパーベクターはそのウイルスゲノムを複製し、そしてそれが担持する初期および後期のウイルス遺伝子のすべてを発現することができる。他方において、それは単一のＢＡＶ３包膜領域を有するので、それは包膜されることができない。対照的に、組換えベクターはＡｄ５由来の包膜領域を介して包膜することができ、そして包膜因子はヘルパーベクターにより提供される。発生したウイルス粒子を回収し、そして療法の目的に使用することができる。
【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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