(57)【要約】本発明は、出血症状の処置又は予防における第ＶＩＩａ因子及び第ＸＩＩＩ因子の使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
第ＶＩＩａ因子及び第ＸＩＩＩ因子を含んで成る医薬組成物。
【請求項２】
第ＶＩＩａ因子が第ＶＩＩ因子変異体である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
第ＶＩＩａ因子がヒト第ＶＩＩａ因子である、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
第ＶＩＩａ因子及び第ＸＩＩＩ因子が組換えヒト第ＶＩＩａ因子及び組換えヒト第ＸＩＩＩ因子である、請求項１又は３に記載の組成物。
【請求項５】
第ＸＩＩＩ因子が第ＸＩＩＩ因子のａ２−二量体である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項６】
第ＸＩＩＩ因子が活性第ＸＩＩＩ因子である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項７】
更にＴＦＰＩ阻害剤を含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項８】
更に第ＶＩＩＩ因子を含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項９】
出血症状の処置を含むキットであって、
ａ）第一単位剤形中に、有効量の第ＶＩＩａ因子及び医薬として許容される担体；
ｂ）第二単位剤形中に、有効量の第ＸＩＩＩ因子及び医薬として許容される担体；並びに
ｃ）前記の第一及び第二剤形を含むための容器、
を含んで成るキット。
【請求項１０】
ａ）第一単位剤形中に、有効量の第ＶＩＩａ因子及び医薬として許容される担体；
ｂ）第二単位剤形中に、有効量の第ＸＩＩＩ因子及び医薬として許容される担体；
ｃ）第三単位剤形中に、有効量のＴＦＰＩ阻害剤及び医薬として許容される担体；並びに
ｄ）前記の第一、第二及び第三剤形を含むための容器、
を含んで成る、請求項９に記載のキット。
【請求項１１】
出血症状の処置を含むキットであって、
ａ）第一単位剤形中に、有効量の第ＶＩＩａ因子及びＴＦＰＩ阻害剤及び医薬として許容される担体；
ｂ）第二単位剤形中に、有効量の第ＸＩＩＩ因子及び医薬として許容される担体；並びに
ｃ）前記の第一及び第二剤形を含むための容器、
を含んで成る、請求項９に記載のキット。
【請求項１２】
出血症状の処置を含むキットであって、
ａ）第一単位剤形中に、有効量の第ＶＩＩａ因子及び医薬として許容される担体；
ｂ）第二単位剤形中に、有効量の第ＸＩＩＩ因子及びＴＦＰＩ阻害剤及び医薬として許容される担体；並びに
ｃ）前記の第一及び第二剤形を含むための容器、
を含んで成るキット。
【請求項１３】
別々の単位剤形で調製されるか、又は単位剤形中に含まれる第ＶＩＩＩ因子を含み、第ＶＩＩａ因子、第ＸＩＩＩ因子又はＴＦＰＩ阻害剤のリストから選択される１又は複数の化合物を更に含む、請求項９〜１２のいずれか１項に記載のキット。
【請求項１４】
対象者における出血症状を処置するための薬剤の製造のための、第ＸＩＩＩ因子と組み合わせた第ＶＩＩａ因子の使用。
【請求項１５】
対象者における凝血時間を減少させるための薬剤の製造のための、第ＸＩＩＩ因子と組み合わせた第ＶＩＩａ因子の使用。
【請求項１６】
正常な哺乳類の血漿中の血塊の溶解時間を延長するための薬剤の製造のための、第ＸＩＩＩ因子と組み合わせた第ＶＩＩａ因子の使用。
【請求項１７】
正常な哺乳類の血漿中の血塊の強度を増大させるための薬剤の製造のための、第ＸＩＩＩ因子と組み合わせた第ＶＩＩａ因子の使用。
【請求項１８】
正常な哺乳類の血漿中のフィブリン血塊形成を増強するための薬剤の製造のための、第ＸＩＩＩ因子と組み合わせた第ＶＩＩａ因子の使用。
【請求項１９】
対象者におけるフィブリン血塊形成を増強する方法であって、対象者に対し、有効量の第ＶＩＩａ因子を有効量の第ＸＩＩＩ因子と組み合わせて投与することを含んで成る方法。
【請求項２０】
対象者における出血症状を処置するための方法であって、対象者に対し、有効量の第ＶＩＩａ因子を有効量の第ＸＩＩＩ因子と組み合わせて投与することを含んで成る方法。
【請求項２１】
第ＶＩＩａ因子及び第ＸＩＩＩ因子が１つの剤形で投与される、請求項１９又は２０に記載の方法。
【請求項２２】
第ＶＩＩａ因子及び第ＸＩＩＩ因子が順次投与される、請求項１９又は２０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明の分野
本発明は、第ＶＩＩａ因子及び第ＸＩＩＩ因子を含んで成る医薬組成物に関する。本発明はまた、出血症状に苦しむ対象者の処置又はその予防のための薬剤の製造のための、第ＶＩＩａ因子と第ＸＩＩＩ因子の組み合わせの使用に関する。本発明はまた、対象者における出血症状の処置のための方法及び対象者における血塊形成を増強するための方法に関する。本発明はまた、これらの化合物を含んで成るキットに関する。
【０００２】
本発明の背景
止血は、血管壁に対する損傷の後に循環血液に曝露される組織因子（ＴＦ）と、全ＦＶＩＩタンパク質量の約１％に相当する量で循環に存在するＦＶＩＩａとの間の複合体の形成によって開始する。この複合体は、ＴＦ坦持細胞に固着され、そして当該細胞表面上でＦＸをＦＸａへ、そしてＦＩＸをＦＩＸａへと活性化する。ＦＸａはプロトロンビンをトロンビンへと活性化し、これがＦＶＩＩＩ， ＦＶ， ＦＸＩ及びＦＸＩＩＩを活性化する、プロトロンビンをトロンビンに活性化する。更に、止血のこの開始段階で形成される限定された量のトロンビンも、血小板を活性化する。血小板に対するトロンビンの作用の後、これらはこれらは形状を変化させ、そして荷電したリン脂質をそれらの表面に曝露する。この活性化した血小板の表面は、更なるＦＸの活性化及び完全なトロンビンの産生のための鋳型を形成する。活性化した血小板の表面上での更なるＦＸの活性化は、活性化した血小板の表面上でのＦＩＸａ−ＦＶＩＩＩａ複合体を介して起こり、そしてＦＸａは続いて、表面上に残っている間プロトロンビンをトロンビンに変換する。トロンビンは、続いてフィブリノーゲンを、不溶性で、且つ初期の血小板の栓を安定化するフィブリンへと変換する。この過程は、ＴＦの発現又は曝露の部位に区分化、すなわち局在化されており、これにより凝固系の全身的な活性化の危険性を最小化している。前記の栓を形成する不溶性フィブリンは、フィブリン繊維のＦＸＩＩＩ触媒型の架橋によって更に安定化される。
【０００３】
ＦＶＩＩａは一本鎖の酵素前駆体として主に血漿中に存在しており、ＦＸａによって二本鎖の活性型ＦＶＩＩａへと開裂される。組換え活性第ＶＩＩａ因子（ｒＦＶＩＩａ）は、止血剤の前駆物質として開発されてきた。ｒＦＶＩＩａの投与は、抗体形成を原因として凝固因子産物で処置され得ない、出血している血友病の対象者における、迅速で且つ高度に有効な止血前の応答を提供する。また、第ＶＩＩ因子を欠損している、出血している対象者又は正常な凝固系を有しているが、過度の出血を被っている対象者も、ＦＶＩＩａにより首尾よく処置されうる。これらの研究において、ｒＦＶＩＩａの不所望な副作用（特に血栓塞栓症の発生）にも遭遇しなかった。
【０００４】
追加的に外から投与されたＦＶＩＩａは、活性化した血小板の表面上でのトロンビンの形成を増大させる。これは、ＦＩＸ又はＦＶＩＩＩを欠損し、そしてそれ故に完全なトロンビンの形成にとって最も有力な経路を失っている血友病の対象者において起こる。また、より低量の血小板又は欠損した機能を有する血小板の存在下で、追加のＦＶＩＩａはトロンビンの形成を増大させる。
【０００５】
フィブリン安定化因子であるＦＸＩＩＩは、フィブリンモノマーを架橋し、それによってプラスミン及び他のタンパク質分解酵素による溶解に対して耐性が増大したフィブリン構造を提供するトランスグルタミナーゼである。第ＸＩＩＩ因子はまた、「フィブリノリガーゼ」及び「フィブリン安定化因子」としても知られている。活性化した場合、ＦＸＩＩＩａはフィブリン分子の側鎖間、及び他の基質間で分子間ガンマ−グルタミル−イプシロン−リジン架橋を形成することができる。ＦＸＩＩＩは血漿及び血小板中に見られる。当該酵素は、２つのアルファサブユニット及び２つのベータサブユニットから成る四量体の酵素前駆体（ａ２ｂ２と表す）として血漿中に、そして２つのアルファサブユニットから成る酵素前駆体（ａ２二量体）として血小板中に存在する。
【０００６】
両酵素前駆体は、トロンビン及びＣａ２＋によって活性化される。カルシウムは、損傷部位にある凝集している血小板から放出される。トロンビンは、（ａ２二量体の）１−３７のＮ末端アミノ酸残基を開裂する。ａ２ｂ２の酵素前駆体の場合、ベータサブユニットは活性化したアルファサブユニットから解離する。カルシウムは同様に、酵素前駆体及びトロンビンの修飾分子にもよく結合する。トロンビン及びカルシウムの活性化後、アルファ鎖上にある活性中心のシステインが曝露され、そして完全に活性化した酵素が形成される。重度の血小板減少症を有する対象者は、ＦＸＩＩＩの低い血漿レベルを有していることが明らかとなっている。
【０００７】
手術又は大外傷に伴い過剰に出血し、そして輸血を必要としている対象者が、全く出血を経験していない者より合併症を患いやすいことは周知である。しかしながら、また、ヒトの血液又は血液産物（血小板、白血球、凝血欠損症の処置のための血漿由来の濃縮物等）の投与を必要としている中程度の出血も、ヒトのウイルス（肝炎、ＨＩＶ、パラボウイルス、及び他の未知のウイルス）を運ぶ危険性を伴う合併症に至ることがある。大量の輸血を必要としている甚大な出血も、肺及び腎臓の機能を含む、多臓器不全の発病をもたらすことがある。一度対象者がこれらの重度の合併症を発病すると、多数のサイトカインが関与する一連の事象及び炎症反応が開始して、いずれの処置も極端に困難となり、そして不幸にもしばしば失敗する。従って、手術及び大きな組織の損傷の処置における主要な目的は、出血を回避し又は最小化することにある。
【０００８】
その様な出血を回避し、又は最小化するために、フィブリン分解酵素によって容易に溶解しない、安定で且つ固体の止血性の栓の形成を保証することが重要である。更に、その様な栓又は血塊の迅速且つ有効な形成を保証することが重要である。
【０００９】
日本国特許出願第２−１６７２３４Ａ号は、フィブリノーゲン、プロトロンビン、血液凝固因子ＶＩＩ、血液凝固因子ＩＸ、血液凝固因子Ｘ、血液凝固因子ＸＩＩＩ、アンチトロンビン、プロテイナーゼ阻害剤、及びカルシウムイオンを含むことを特徴とする生組織（ｂｉｏ−ｔｉｓｓｕｅ）のための接着剤に関する。
【００１０】
日本国特許出願第５９−１１６２１３Ａ号は、活性成分として血液凝固剤を含む組織用の糊としての使用のためのエアロゾル組成物に関する。血液凝固剤は、血液凝固因子Ｉ， ＩＩ， ＩＩＩ， ＩＶ， Ｖ， ＶＩＩ， ＶＩＩＩ， ＩＸ， Ｘ， ＸＩ， ＸＩＩ， 及びＸＩＩＩ、プレカリクレイン、高分子キニノーゲン及びトロンビンから選択されうる。Ｆ ＸＩＩＩとトロンビンの組み合わせが好ましい。
【００１１】
ＷＯ ９３／１２８１３（ＺｙｍｏＧｅｎｅｔｉｃｓ）は、手術を受ける対象者における、手術前の失血を減少させるためのＦＸＩＩＩの使用に関する。当該発明の組成物はまた、アプロチニンを含んで成ることもある。ＦＸＩＩＩは、大量瞬時投与として、典型的に手術の１日前に対象者に投与される。
【００１２】
欧州特許第２２５．１６０号（Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ）は、ＦＶＩＩａの組成物及び、凝固因子の欠損又は凝固因子の阻害剤が原因ではない出血症状の処置のための方法に関する。
【００１３】
欧州特許第８２．１８２号（Ｂａｘｔｅｒ Ｔｒａｖｅｎｏｌ Ｌａｂ．）は、対象者における血液凝固因子の欠乏又は血液凝固因子に対する阻害剤の効果の相殺における使用のための第ＶＩＩａ因子の組成物に関する。
【００１４】
国際特許公報ＷＯ ９３／０６８５５（Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ）は、ＦＶＩＩａの局所適用に関する。
【００１５】
Ｋｊａｌｋｅ ｅｔ ａｌ． Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ ａｎｄ Ｈａｅｍｏｓｔａｓｉｓ， １９９９（Ｓｕｐｐｌ）， ０９５ １は、追加の外からのＦＶＩＩａの投与及びＡ型及びＢ型血友病の症状を模倣しているモデル系における活性化した血小板の表面上でのトロンビンの形成に対する効果に関する。
【００１６】
対象者、特に、トロンビン生成障害を有する対象者における、凝固を増強し、安定な止血性の栓を迅速に形成し、そして十分な止血を達成する、改良され、信頼性があり、且つ広範に適用可能な方法についての当業界における要求がいまだに存在する。また、十分な止血を達成するために必要なＦＶＩＩａの量が減少される方法についての必要性も存在する。
【００１７】
本発明の要約
本発明の１つの目的として、出血症状及び凝血障害の処置又は予防において有効に使用され得る組成物を提供することがある。
【００１８】
本発明の第二の目的として、出血症状の処置又は予防において又は凝血原として有効に使用され得る、１つの剤形の組成物を提供することがある。
【００１９】
本発明の別の目的として、相乗効果を示す組成物、処置方法又はキットを提供することがある。
【００２０】
本発明の更なる目的として、実質的な副作用、例えば凝固系の高レベルな全身作用を示さない組成物、処置方法又はキットを提供することがある。
【００２１】
本発明の他の目的は、本発明の説明を読むことで明らかとなるだろう。
【００２２】
本発明者は、第ＶＩＩａ因子と第ＸＩＩＩ因子との組み合わせが第ＶＩＩａ因子又は第ＸＩＩＩ因子それぞれが単独であるよりも更に有効に正常なヒトの血漿の凝血時間を減少させることができることを示した。更に、第ＶＩＩａ因子と第ＸＩＩＩ因子との組み合わせが、第ＶＩＩａ因子又は第ＸＩＩＩ因子それぞれが単独であるよりも更に有効に血塊の固さを増大させうることも示した。血塊の固さの更なる増大が観察されない濃度の第ＶＩＩａ因子を、血塊の固さの更なる増大が観察されない濃度の第ＸＩＩＩ因子と組み合わせることによって、予想外にも、凝固の固さの更なる増大が観察された。第ＶＩＩａ因子と第ＸＩＩＩ因子との組み合わせが、第ＶＩＩａ因子又は第ＸＩＩＩ因子の各阻害剤が単独であるよりも更に有効に、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの正常なヒトの血漿における血塊溶解時間を延長し得ることも示された。このように、凝血を増強することによって、対象者における出血の更に有効な処置を得ることができる。更に、患者が、比較的より低い濃度の第ＶＩＩａ因子で処置されることにより、第ＶＩＩａ因子単独による常用の処置と関連する比較的高い費用を低下させることができる。
【００２３】
第一の観点において、本発明は、第ＶＩＩａ因子及び第ＸＩＩＩ因子、そして任意に医薬として許容される担体を含んで成る医薬組成物に関する。
【００２４】
別の観点において、本発明は、単独の活性剤として第ＶＩＩａ因子及び第ＸＩＩＩ因子、そして任意に医薬として許容される担体を含んで成る医薬組成物に関する。
【００２５】
別の観点において、本発明は、第ＶＩＩａ因子及び第ＸＩＩＩ因子、そして任意に医薬として許容される担体を含んで成る、静脈内投与のために調製される医薬組成物に関する。
【００２６】
別の観点において、本発明は、単独の活性剤として第ＶＩＩａ因子及び第ＸＩＩＩ因子、そして任意に医薬として許容される担体を含んで成る、静脈内投与のために調製される医薬組成物に関する。
【００２７】
１つの態様において、第ＶＩＩａ因子は組換え第ＶＩＩａ因子であり、そして第ＸＩＩＩ因子は組換え第ＸＩＩＩ因子である。
【００２８】
本発明の１つの態様において、第ＶＩＩａ因子は組換え第ＶＩＩａ因子である。更なる態様において、第ＶＩＩａ因子は組換えヒト第ＶＩＩａ因子である。更なる態様において、第ＶＩＩａ因子は第ＶＩＩａ因子変異体である。
【００２９】
１つの態様において、第ＶＩＩａ因子変異体は、野生型第ＶＩＩａ因子と比較して、わずかに２０個のアミノ酸が置換され、欠失され、又は挿入されているアミノ酸配列変異体（すなわち、米国特許第４，７８４，９５０号に開示されたアミノ酸配列を有するポリペプチド）である。別の態様において、野生型の第ＶＩＩａ因子と比較して、第ＶＩＩａ因子変異体は、わずかに１０個のアミノ酸が置換され、欠失され、又は挿入され；別の態様において、第ＶＩＩａ因子変異体は、わずかに８個のアミノ酸が置換され、欠失され、又は挿入され；別の態様において、第ＶＩＩａ因子変異体は、わずかに６個のアミノ酸が置換され、欠失され、又は挿入され；別の態様において、第ＶＩＩａ因子変異体は、わずかに５個のアミノ酸が置換され、欠失され、又は挿入され；別の態様において、第ＶＩＩａ因子変異体は、わずかに３個のアミノ酸が置換され、欠失され、又は挿入されている。１つの態様において、第ＶＩＩａ因子変異体は、［Ｌ３０５Ｖ］−ＦＶＩＩａ， ［Ｌ３０５Ｖ／Ｍ３０６Ｄ／Ｄ３０９Ｓ］−ＦＶＩＩａ， ［Ｌ３０５Ｉ］−ＦＶＩＩａ， ［Ｌ３０５Ｔ］−ＦＶＩＩａ， ［Ｆ３７４Ｐ］−ＦＶＩＩａ， ［Ｖ１５８Ｔ／Ｍ２９８Ｑ］−ＦＶＩＩａ， ［Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ］−ＦＶＩＩａ及び［Ｋ３３７Ａ］−ＦＶＩＩａのリストから選択される。
【００３０】
１つの態様において、第ＸＩＩＩ因子はＦＸＩＩＩ ａ２ｂ２である。更なる態様において、第ＸＩＩＩ因子はＦＸＩＩＩ ａ２である。更なる態様において、第ＸＩＩＩ因子は、活性第ＸＩＩＩ因子（ＦＸＩＩＩａ）である。１つの態様において、第ＸＩＩＩ因子は第ＸＩＩＩ因子変異体である。１つの態様において、第ＸＩＩＩ因子はヒト第ＸＩＩＩ因子である。１つの態様において、第ＸＩＩＩ因子は組換え第ＸＩＩＩ因子である。１つの態様において、第ＸＩＩＩ因子は組換えヒト第ＸＩＩＩ因子である。１つの態様において、第ＸＩＩＩ因子はヒトａ２二量体である。
【００３１】
１つの観点において、前記組成物は、更にＴＦＰＩ阻害剤を含む。別の観点において、前記組成物は、更に第ＶＩＩＩ因子を含む。別の観点において、前記組成物は、更に第ＶＩＩＩ因子及びＴＦＰＩ阻害剤を含む。
【００３２】
１つの態様において、前記組成物は、更にフィブリン分解系の阻害剤、例えばアプロチニン、ε−アミノカプロン酸又はトラネキサム酸、を含んで成る。
【００３３】
別の観点において、本発明は、出血症状の処置を含むキットであって、
ａ）第一単位剤形中に、有効量の第ＶＩＩａ因子及び、任意に、医薬として許容される担体；
ｂ）第二単位剤形中に、有効量の第ＸＩＩＩ因子及び、任意に、医薬として許容される担体；並びに
ｃ）前記の第一及び第二剤形を含むための容器、
を含んで成るキット、に関する。
【００３４】
１つの観点において、当該キットは、
ａ）第一単位剤形中に、有効量の第ＶＩＩａ因子及び、任意に、医薬として許容される担体；
ｂ）第二単位剤形中に、有効量の第ＸＩＩＩ因子及び、任意に、医薬として許容される担体；
ｃ）第三単位剤形中に、有効量のＴＦＰＩ阻害剤及び、任意に、医薬として許容される担体；並びに
ｄ）前記の第一、第二及び第三剤形を含むための容器、
を含んで成る。
【００３５】
別の観点において、本発明は、出血症状のための処置を含むキットであって、
ａ）第一単位剤形中に、有効量の第ＶＩＩａ因子及びＴＦＰＩ阻害剤、並びに、任意に、医薬として許容される担体；
ｂ）第二単位剤形中に、有効量の第ＸＩＩＩ因子及び、任意に、医薬として許容される担体；並びに
ｃ）前記の第一及び第二剤形を含むための容器、
を含んで成るキット、に関する。
【００３６】
別の観点において、本発明は、出血症状のための処置を含むキットであって、
ａ）第一単位剤形中に、有効量の第ＶＩＩａ因子及び、任意に、医薬として許容される担体；
ｂ）第二単位剤形中に、有効量の第ＸＩＩＩ因子及びＴＦＰＩ阻害剤並びに、任意に、医薬として許容される担体；並びに
ｃ）前記の第一及び第二剤形を含むための容器、
を含んで成るキット、に関する。
【００３７】
別の観点において、本発明は、出血症状の処置を含むキットであって、
ａ）第一単位剤形中に、有効量の第ＶＩＩａ因子及び第ＸＩＩＩ因子並びに、任意に、医薬として許容される担体；
ｂ）第二単位剤形中に、有効量のＴＦＰＩ阻害剤及び、任意に、医薬として許容される担体；並びに
ｃ）前記の第一及び第二剤形を含むための容器、
を含んで成るキット、に関する。
【００３８】
別の観点において、本発明は、出血症状の処置を含むキットであって、
ａ）第一単位剤形中に、有効量の第ＶＩＩａ因子及び、任意に、医薬として許容される担体；
ｂ）第二単位剤形中に、有効量の第ＸＩＩＩ因子及び、任意に、医薬として許容される担体；
ｃ）第三単位剤形中に、有効量の第ＶＩＩＩ因子及び、任意に、医薬として許容される担体；
ｄ）第四単位剤形中に、有効量のＴＦＰＩ阻害剤及び、任意に、医薬として許容される担体；並びに
ｅ）前記の第一、第二、第三及び第四の剤形を含むための容器、
を含んで成るキットに関する。
【００３９】
別の観点において、当該キットは、
ａ）第一単位剤形中に、有効量の第ＶＩＩａ因子及び第ＸＩＩＩ因子並びに、任意に、医薬として許容される担体；
ｂ）第二単位剤形中に、有効量の第ＸＩＩＩ因子及び、任意に、医薬として許容される担体；
ｃ）第三単位剤形中に、有効量のＴＦＰＩ阻害剤及び、任意に、医薬として許容される担体；並びに
ｄ）前記の第一、第二及び第三剤形を含むための容器、
を含んで成る。
【００４０】
別の観点において、本発明は、出血症状の処置を含むキットであって、
ａ）第一単位剤形中に、有効量の第ＶＩＩａ因子及びＴＦＰＩ阻害剤並びに、任意に、医薬として許容される担体；
ｂ）第二単位剤形中に、有効量の第ＸＩＩＩ因子及び、任意に、医薬として許容される担体；
ｃ）第三単位剤形中に、有効量の第ＶＩＩＩ因子及び、任意に、医薬として許容される担体；並びに
ｄ）前記の第一、第二及び第三剤形を含むための容器、
を含んで成るキットに関する。
【００４１】
別の観点において、本発明は、出血症状の処置を含むキットであって、
ａ）第一単位剤形中に、有効量の第ＶＩＩａ因子及び第ＶＩＩＩ因子並びに、任意に、医薬として許容される担体；
ｂ）第二単位剤形中に、有効量の第ＸＩＩＩ因子及び、任意に、医薬として許容される担体；
ｃ）第三単位剤形中に、有効量のＴＦＰＩ阻害剤及び、任意に、医薬として許容される担体；並びに
ｄ）前記の第一、第二及び第三剤形の含むための容器、
を含んで成るキットに関する。
【００４２】
別の観点において、本発明は、出血症状の処置を含むキットであって、
ａ）第一単位剤形中に、有効量の第ＶＩＩａ因子及び第ＸＩＩＩ因子並びに、任意に、医薬として許容される担体；
ｂ）第二単位剤形中に、有効量の第ＸＩＩＩ因子及びＴＦＰＩ阻害剤並びに、任意に、医薬として許容される担体；並びに
ｃ））前記の第一及び第二剤形を含むための容器、
を含んで成るキットに関する。
【００４３】
別の観点において、本発明は、出血症状の処置を含むキットであって、
ａ）第一単位剤形中に、有効量の第ＶＩＩＩ因子及び第ＸＩＩＩ因子並びに、任意に、医薬として許容される担体；
ｂ）第二単位剤形中に、有効量のＴＦＰＩ阻害剤及び、任意に、医薬として許容される担体；
ｃ）第三単位剤形中に、有効量の第ＶＩＩａ因子及び、任意に、医薬として許容される担体；並びに
ｄ）前記の第一、第二及び第三剤形を含むための容器、
を含んで成るキットに関する。
【００４４】
別の観点において、本発明は、出血症状の処置を含むキットであって、
ａ）第一単位剤形中に、有効量の第ＸＩＩＩ因子及びＴＦＰＩ阻害剤並びに、任意に、医薬として許容される担体；
ｂ）第二単位剤形中に、有効量の第ＶＩＩＩ因子及び、任意に、医薬として許容される担体；
ｅ）第二単位剤形中に、有効量の第ＶＩＩａ因子及び、任意に、医薬として許容される担体；並びに
ｃ）前記の第一、第二及び第三剤形を含むための容器、
を含んで成るキットに関する。
【００４５】
別の観点において、本発明は、出血症状の処置を含むキットであって、
ａ）第一単位剤形中に、有効量のＴＦＰＩ阻害剤及び第ＶＩＩＩ因子並びに、任意に、医薬として許容される担体；
ｂ）第二単位剤形中に、有効量の第ＶＩＩａ因子及び、任意に、医薬として許容される担体；
ｆ）第二単位剤形中に、有効量の第ＸＩＩＩ及び、任意に、医薬として許容される担体；並びに
ｃ）前記の第一、第二及び第三剤形を含むための容器、
を含んで成る。
【００４６】
別の観点において、本発明は、出血症状の処置を含むキットであって、
ａ）第一単位剤形中に、有効量のＴＦＰＩ阻害剤及び第ＸＩＩＩ因子並びに、任意に、医薬として許容される担体；
ｂ）第二単位剤形中に、有効量の第ＶＩＩＩ因子及び第ＶＩＩａ因子並びに、任意に、医薬として許容される担体；
ｃ）前記の第一及び第二剤形を含むための容器、
を含んで成るキットに関する。
【００４７】
別の観点において、本発明は、出血症状の処置を含むキットであって、
ａ）第一単位剤形中に、有効量の第ＶＩＩａ因子及びＴＦＰＩ阻害剤並びに、任意に、医薬として許容される担体；
ｂ）第二単位剤形中に、有効量の第ＶＩＩＩ因子及び第ＸＩＩＩ因子並びに、任意に、医薬として許容される担体；
ｃ）前記の第一及び第二剤形を含むための容器、
を含んで成るキットに関する。
【００４８】
別の観点において、本発明は、出血症状を処置するための薬剤の製造のための、第ＸＩＩＩ因子と組み合わせた第ＶＩＩａ因子の使用、に関する。
【００４９】
別の観点において、本発明は、対象者における凝血時間を減少させるための薬剤の製造のための、第ＸＩＩＩ因子と組み合わせた第ＶＩＩａ因子の使用、に関する。
【００５０】
別の観点において、本発明は、哺乳類の血漿の、血塊の溶解時間を延長するための薬剤の製造のための、第ＸＩＩＩ因子と組み合わせた第ＶＩＩａ因子の使用、に関する。
【００５１】
別の観点において、本発明は、哺乳類の血漿の、血塊の強度を増大させるための薬剤の製造のための、第ＸＩＩＩ因子と組み合わせた第ＶＩＩａ因子の使用、に関する。
【００５２】
別の観点において、本発明は、哺乳類の血漿の、フィブリン血塊形成を増強するための薬剤の製造のための、第ＸＩＩＩ因子と組み合わせた第ＶＩＩａ因子の使用、に関する。
【００５３】
１つの態様において、哺乳類の血漿はヒトの血漿である。別の態様において、哺乳類の血漿は正常な血漿であり；別の態様において、血漿は正常なヒトの血漿であり；１つの態様において、血漿はトロンビン産生障害を有する対象者由来の血漿である。１つの態様において、血漿は低下したフィブリノーゲン濃度を有する対象者に由来する。
【００５４】
１つの態様において、第ＶＩＩａ因子と第ＸＩＩＩ因子は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの、正常なヒトの血漿における血塊溶解時間を延長する。
【００５５】
別の観点において、本発明は、対象者におけるフィブリン血塊形成を増強する方法であって、対象者に対し、有効量の第ＶＩＩａ因子を有効量の第ＸＩＩＩ因子と組み合わせて投与することを含んで成る方法、に関する。
【００５６】
別の観点において、本発明は、対象者における出血症状を処置するための方法であって、対象者に対し、有効量の第ＶＩＩａ因子を有効量の第ＸＩＩＩ因子と組み合わせて投与することを含んで成る方法、に関する。
【００５７】
別の観点において、本発明は、哺乳類の血漿中の凝血時間を低下させるための方法であって、有効量の第ＸＩＩＩ因子と組み合わせた有効量の第ＶＩＩａ因子と血漿を接触させることを含んで成る方法、に関する。１つの態様において、有効量の第ＸＩＩＩ因子と組み合わせた有効量の第ＶＩＩａ因子は、その様な処置を必要とする対象者に投与される。
【００５８】
別の観点において、本発明は、対象者におけるフィブリンの形成を増強するための方法であって、有効量の第ＸＩＩＩ因子と組み合わせた有効量の第ＶＩＩａ因子を対象者に投与することを含んで成る方法、に関する。
【００５９】
本発明の方法の１つの態様において、第ＶＩＩａ因子及び第ＸＩＩＩ因子は、対象者に投与される単独の活性剤である。本発明の別の態様において、前記医薬組成物は、単独の活性剤として第ＶＩＩａ因子及び第ＸＩＩＩ因子を含んで成る。
【００６０】
本発明の態様において、第ＶＩＩａ因子及び第ＸＩＩＩ因子は、同時に且つ１つの剤形で投与される。別の態様において、第ＶＩＩａ因子及び第ＸＩＩＩ因子は、順次投与される。更なる態様において、第ＶＩＩａ因子及び第ＸＩＩＩ因子は、互いに約１〜２時間以内に、例えば互いに３０分以内に、例えば互いに１０分以内に、例えば第一単位剤形中に第ＶＩＩａ因子を、そして第二単位剤形中に第ＸＩＩＩ因子を含んで成るキットの形態で、投与される。
【００６１】
１つの態様において、第ＶＩＩａ因子の有効量は、０．０５ｍｇ／日〜５００ｍｇ／日（７０ｋｇの対象者）である。１つの態様において、第ＸＩＩＩ因子の有効量は、０．０５ｍｇ／日〜５００ｍｇ／日（７０ｋｇの対象者）である。
【００６２】
本発明の１つの態様において、医薬組成物は（一回分の調製物の形態にある場合）、本質的に第ＶＩＩａ因子及び第ＸＩＩＩ因子、並びに、任意に少なくとも１つの医薬として許容される賦形剤又は担体、及び／又は安定化剤、及び／又は界面活性剤、及び／又は中性塩、及び／又は酸化防止剤、及び／又は保存剤、及び／又はプロテアーゼ阻害剤、から成る。
【００６３】
本発明の別の態様において、医薬組成物は（一回分の調製物の形態にある場合）、本質的に第ＶＩＩａ因子及び第ＸＩＩＩ因子、並びに、任意に少なくとも１つの医薬として許容される賦形剤又は担体、及び／又は安定化剤、及び／又は界面活性剤、及び／又は中性塩、及び／又は酸化防止剤、及び／又は保存剤、及び／又はプロテアーゼ阻害剤、及び／又はＴＦＰＩ阻害剤、から成る。
【００６４】
本発明の別の態様において、医薬組成物は（一回分の調製物の形態にある場合）、本質的に第ＶＩＩａ因子及び第ＸＩＩＩ因子、並びに、任意に少なくとも１つの医薬として許容される賦形剤又は担体、及び／又は安定化剤、及び／又は界面活性剤、及び／又は中性塩、及び／又は酸化防止剤、及び／又は保存剤、及び／又はプロテアーゼ阻害剤、及び／又はＴＦＰＩ阻害剤、及び／又は第ＶＩＩＩ因子、から成る。
【００６５】
本発明の別の態様において、医薬組成物は（一回分の調製物の形態にある場合）、本質的に第ＶＩＩａ因子及び、任意に少なくとも１つの医薬として許容される賦形剤又は担体、及び／又は安定化剤、及び／又は界面活性剤、及び／又は中性塩、及び／又は酸化防止剤、及び／又は保存剤、及び／又はプロテアーゼ阻害剤、を含んで成る第一単位剤形；並びに、本質的に第ＸＩＩＩ因子、及び、任意に少なくとも１つの医薬として許容される賦形剤又は担体、及び／又は安定化剤、及び／又は界面活性剤、及び／又は中性塩、及び／又は酸化防止剤、及び／又は保存剤、及び／又はプロテアーゼ阻害剤、を含んで成る第二単位剤形、から成る。
【００６６】
本発明の１つの態様において、医薬組成物は（一回分の調製物の形態にある場合）、本質的に第ＶＩＩａ因子及び、任意に少なくとも１つの医薬として許容される賦形剤又は担体、及び／又は安定化剤、及び／又は界面活性剤、及び／又は中性塩、及び／又は酸化防止剤、及び／又は保存剤、及び／又はプロテアーゼ阻害剤、及び／又はＴＦＰＩ阻害剤、を含んで成る第一単位剤形；並びに、本質的に第ＸＩＩＩ因子、及び、任意に少なくとも１つの医薬として許容される賦形剤又は担体、及び／又は安定化剤、及び／又は界面活性剤、及び／又は中性塩、及び／又は酸化防止剤、及び／又は保存剤、及び／又はプロテアーゼ阻害剤、及び／又はＴＦＰＩ阻害剤、及び／又は第ＶＩＩＩ因子、を含んで成る第二単位剤形、から成る。
【００６７】
更なる態様において、対象者はヒトであり；別の態様において、対象者はトロンビン産生障害を有しており；１つの態様において、対象者はフィブリノーゲンの低下した血漿濃度を有している（例えば、大量に輸血される対象者）。
【００６８】
更なる観点において、前記組成物は、更に第ＶＩＩＩ因子を含む。１つの態様において、第ＶＩＩＩ因子は、活性第ＶＩＩＩ因子（第ＶＩＩＩａ因子）である。更なる態様において、第ＶＩＩＩ因子は、組換え第ＶＩＩＩａ因子である。更なる態様において、第ＶＩＩＩ因子は組換えヒト第ＶＩＩＩａ因子である。
【００６９】
更なる観点において、当該組成物は、更にフィブリン分解系の阻害剤、例えばアプロチニン、ε−アミノカプロン酸又はトラネキサム酸、を含んで成る。
【００７０】
本発明の詳細な説明
本発明は、第ＶＩＩａ因子及び第ＸＩＩＩ因子の組み合わせを含んで成る組成物を提供する。本発明はまた、単独の活性剤として第ＶＩＩａ因子及び第ＸＩＩＩ因子の組み合わせを含んで成る組成物を提供する。当該組成物は、１つの組成物の形態にあってもよく、又はそれは多成分のキットの形態であってもよい。本発明は治療用及び予防用の凝血原及びフィブリン血塊安定化剤として有用であり、そして霊長類、例えばヒトを含む哺乳類において素速くフィブリン血塊を形成する。
【００７１】
第一又は第二又第三、などの単位剤形が本明細書を通じて言及される場合、このことは好ましい投与順序を示唆しないが、単に便宜的に言及される。
【００７２】
本発明は更に、例えば、外傷又は手術による、ヒトを含む対象者、あるいは欠陥のある血液凝固因子ＦＩＸ若しくはＦＸＩＩＩ又は血小板を有する対象者における出血症状を処置するための方法（予防的に処置すること又は予防することを含む）を提供する。
【００７３】
第ＶＩＩａ因子と第ＸＩＩＩ因子の組み合わせが、固体の安定で且つ迅速な止血性の栓の形成を保証する有利な産物であることが現在明らかとなっている。
【００７４】
十分なトロンビンの産生は、固体の安定な止血性の栓が形成されるのに必要である。その様な栓のフィブリン構造は、形成されるトロンビンの量及び最初のトロンビンの産生速度の両方に依存する。トロンビン産生の障害が起こっている場合、高度に透過性のある多孔性のフィブリンの栓が形成される。通常フィブリン表面上に存在するフィブリン分解酵素は、その様なフィブリンの栓を溶解する。安定なフィブリンの栓の形成はまた、トロンビンによって活性化される第ＸＩＩＩａ因子の存在に依存し、そしてそれ故に十分なトロンビンの産生にも依存する。更に、最近になって説明されたトロンビン活性化線溶抑制因子、ＴＡＦＩは、その活性化のために、むしろ多くのトロンビンの量を必要とする。十分に適当でないトロンビンの形成が起こっている場合、ＴＡＦＩはその結果として活性化されて正常な線溶活性によって通常溶解されるよりも容易に止血性の栓の形成をもたらすことがある。
【００７５】
トロンビンの産生を増大させることによって、第ＶＩＩａ因子は、十分な第ＸＩＩＩ因子の活性化のための基礎を提供し、このことは、十分に安定化した止血性の栓の形成のため、そしてそれによる止血の維持のために最も重要なことである。より少数の血小板を有する状況である、血小板減少症において、より迅速なトロンビンの産生が、外部からの追加の第ＶＩＩａ因子の投与によって開始される。しかしながら、全体的なトロンビンの産生は、高濃度であっても第ＶＩＩａ因子によって正常化されない。
【００７６】
第ＶＩＩａ因子と第ＸＩＩＩ因子、特に第ＸＩＩＩ因子のアルファ鎖（ａ２二量体）を組み合わせることによって、第ＶＩＩａ因子の止血効果を増強する十分な第ＸＩＩＩ因子の活性化が容易となる。
【００７７】
更に、フィブリノーゲンの血漿濃度が低下した対象者（多数の外傷又は広範囲な手術の結果により大量に輸血された対象者）において、完全な第ＸＩＩＩ因子の活性化は起こらない。更に効果的な止血は、第ＶＩＩａ因子と第ＸＩＩＩ因子の組み合わせの投与によって得られる。
【００７８】
フィブリンの止血性の栓の安定性を増大させるための別の方法は、第ＸＩＩＩａ因子（活性第ＸＩＩＩ因子）が十分に存在することを保証することである。
【００７９】
血小板減少症を有する対象者は、トロンビン産生の障害及びフィブリンの栓の安定化の欠損を有しており、これが成熟前に溶解しやすい止血性の栓をもたらす。更に、大外傷及び臓器損傷を受け、且つ、その結果として頻回の輸血を受けた対象者は、しばしば減少した血小板数並びに低下したフィブリノーゲン、第ＶＩＩＩ因子、及び他の凝固タンパク質レベルを有している。これらの対象者は、傷害性の（又は低下した）トロンビン産生を経験する。更に、それらの低下したフィブリノーゲンレベルは、第ＸＩＩＩ因子の活性化をマイナス方向へと妨害する。これらの対象者は、それ故に欠陥性の、又はほとんど効率的でない止血を有しており、これが過剰な外傷及び臓器損傷を特徴とする状況において過剰に放出されるタンパク質分解酵素によって容易に且つ成熟前に溶解されるフィブリンの栓の形成を導く。
【００８０】
対象者において止血を維持する十分な能力を有する十分に安定化した栓の形成を容易にするために、本発明に従う組成物が投与される。この組成物は、減少した数の血小板を有する対象者及び低下した血漿レベルのフィブリノーゲン及び／又は他の凝固タンパク質を有する対象者において特に有益である。
【００８１】
第ＸＩＩＩ因子の存在下において、より低い濃度の第ＶＩＩａ因子は、十分な止血を保証するのに十分であると思われる。
【００８２】
上述したように、第ＸＩＩＩ因子は２つのアルファサブユニット及び２つのベータサブユニットから成る四量体酵素前駆体（ａ２ｂ２と表す）として血漿中に存在するが、ａ２−二量体として他の組織（例えば、血小板）に見られる。これらの酵素前駆体の形態のいずれか、又は活性第ＸＩＩＩ因子（第ＸＩＩＩａ因子）は、本発明において使用されることがあり、それらの特徴である架橋活性を保持する、遺伝子操作された第ＸＩＩＩ因子の変異体も同様である。１つの態様において、第ＸＩＩＩ因子はヒト第ＸＩＩＩ因子であり；別の態様において、第ＸＩＩＩ因子はヒトａ２−二量体であり；更に別の態様において、第ＸＩＩＩ因子は活性化されたヒト第ＸＩＩＩａ因子である。
【００８３】
本発明において使用される第ＸＩＩＩ因子及び第ＶＩＩａ因子は、血液から精製されることもあり、又は組換え的な手段によって産生されうる。このことは、本明細書に記載の方法の実施が、精製された第ＸＩＩＩ因子及び第ＶＩＩａ因子がどのように誘導されるかとは関係なく、そしてそれ故に、本発明が、本明細書での使用に適した任意な第ＸＩＩＩ因子及び第ＶＩＩａ因子の調製物の使用を網羅することを考慮されることを証明するものである。また、特徴的な止血関連活性を保持する第ＶＩＩａ因子及び第ＸＩＩＩ因子の遺伝子操作された変異体も本発明において使用され得る。第ＶＩＩａ因子又は第ＸＩＩＩ因子あるいはそれらの特徴である止血関連活性を保持する第ＶＩＩａ因子又は第ＸＩＩＩ因子変異体のフラグメントも、本発明において使用され得る。第ＶＩＩａ因子の止血関連活性は、例えば、本明細書に記載の第ＶＩＩａ因子活性アッセイを用いて測定されうる。第ＸＩＩＩ因子の止血関連活性は、例えば、本明細書に記載の第ＸＩＩＩ因子活性アッセイを用いて測定されうる。
【００８４】
野生型の第ＶＩＩａ因子と比較して実質的に同一又はより良い生物学的活性を有する第ＶＩＩ因子変異体の限定しない例は、限定しないが、デンマーク国特許出願番号ＰＡ ２０００ ００７３４， ＰＡ２０００ ０１３６０， 及びＰＡ ２００１ ００４７７に記載のものを含む。限定しない例は、［Ｌ３０５Ｖ］−ＦＶＩＩａ， ［Ｌ３０５Ｖ／Ｍ３０６Ｄ／Ｄ３０９Ｓ］−ＦＶＩＩａ， ［Ｌ３０５Ｉ］−ＦＶＩＩａ， ［Ｌ３０５Ｔ］−ＦＶＩＩａ， ［Ｆ３７４Ｐ］−ＦＶＩＩａ， ［Ｖ１５８Ｔ／Ｍ２９８Ｑ］−ＦＶＩＩａ， ［Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ］−ＦＶＩＩａ及び［Ｋ３３７Ａ］−ＦＶＩＩａを含む。
【００８５】
本文において、アミノ酸の三文字又は一文字表記は、表１に示すようにそれらの常用の意味で使用されている。特に断らない限り、本発明で言及したアミノ酸は、Ｌ−アミノ酸である。例えば、Ｋ３３７における最初のアミノ酸が、野生型第ＶＩＩ因子の指定の位置に天然に存在するアミノ酸を表すこと、そして例えば、［Ｋ３３７Ａ］−ＦＶＩＩａが、指定の位置において天然に存在する、一文字暗号Ｋによって表されるアミノ酸が一文字暗号Ａによって表されるアミノ酸によって置換されているＦＶＩＩ−変異体を表すことは理解されるはずである。
【表１】
2004505016.tif 000002
【００８６】
用語「第ＶＩＩａ因子」又は「ＦＶＩＩａ」は、交換可能に使用されうる。第ＶＩＩａ因子の用語は、酵素前駆体である第ＶＩＩ因子（一本鎖の第ＶＩＩ因子）を含む。用語「第ＸＩＩＩ因子」又は「ＦＸＩＩＩ」は交換可能に使用されうる。用語「第ＶＩＩＩ因子」又は「ＦＶＩＩＩ」は交換可能に使用されうる。
【００８７】
当業者にとって、置換が、第ＶＩＩａ因子又は第ＸＩＩＩ因子分子の機能に必須の領域の外側で行われることがあり、そしてなおも活性ポリペプチドをもたらすことは自明だろう。第ＶＩＩａ因子又は第ＸＩＩＩ因子ポリペプチドの活性に必須であり、そしてそれ故に好ましくは置換の対象とならないアミノ酸残基は、当業界で知られている手順、例えば部位指定突然変異誘発又はアラニンスキャニング突然変異誘発、に従い同定されうる（例えば、Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ ａｎｄ Ｗｅｌｌｓ， １９８９， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４： １０８１−１０８５）。後者の技術において、変異は分子の正に荷電した残基毎に導入され、そして生じた変異分子は、当該分子の活性に必須のアミノ酸残基を同定するために、凝固、それぞれの架橋活性について試験される。基質−酵素の相互作用部位も、核磁気共鳴解析、結晶学又は光親和性標識の様な技術による三次元構造の解析によって決定されうる（例えば、ｄｅ Ｖｏｓ ｅｔ ａｌ．， １９９２， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５５：３０６−３１２； Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．， １９９２， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２２４： ８９９−９０４； Ｗｌｏｄａｖｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９９２， ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ ３０９：５９−６４を参照のこと）。
【００８８】
あるヌクレオチドを別のヌクレオチドと交換するための、核酸配列内への変異の導入は、当業界で知られている方法のいずれかを用いる部位指定突然変異誘発によって達成されうる。特に有用なのは、超らせんの、注目のインサートを有する二本鎖ＤＮＡベクター及び所望の変異を含む２つの合成プライマーを利用する手順である。当該ベクターの反対の鎖にそれぞれ相補的なオリゴヌクレオチドプライマーは、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼによって、温度サイクリングの間伸長する。当該プライマーの取り込み時に、ねじれ型のニックを含む変異プラスミドが産生する。温度サイクリングの後、当該産物は、親のＤＮＡ鋳型を消化し、そして変異含有合成ＤＮＡを選択するために、メチル化ＤＮＡ及びヘミメチル化ＤＮＡに特異的なＤｐｎＩで処理される。変異体を生成し、同定し、そして単離するための当業界で知られている他の手順も使用されることがあり、例えば遺伝子シャッフリング又はファージディスプレイ技術である。
【００８９】
用語「第ＶＩＩＩ因子」又は「ＦＶＩＩＩ」は、活性第ＶＩＩＩ因子（第ＶＩＩＩａ因子と表す）、それらの特徴である凝固活性を保持する第ＶＩＩＩ因子の変異型及び短小型を含む。１つの態様において、第ＶＩＩＩ因子はヒト第ＶＩＩＩ因子である。
【００９０】
用語「ＴＦＰＩ阻害剤」は、ＴＦＰＩ（組織因子系凝固インヒビター）の抗凝固活性を阻害する化合物を意味する。当該用語は、欧州特許第５５８ ５２９号、ＷＯ ９６／２８１５３及びＵＳ ５，６２２，９８８に開示されているもののような化合物を含む。「ＴＦＰＩ」及び「ＥＰＩ」（外因系凝固インヒビター）も交換可能に使用されうる。
【００９１】
本発明において、第ＶＩＩａ因子の「有効量」及び第ＸＩＩＩ因子の「有効量」は、前記疾患及びその合併症を治療し、緩和し、若しくは部分的に抑えるほど、出血又は失血を予防し、又は減少させるのに十分な、第ＶＩＩａ因子及び第ＸＩＩＩ因子の量として定義される。
【００９２】
本発明に従い投与される第ＶＩＩａ因子の量及び第ＸＩＩＩ因子の量は、約１：１００〜約１００：１（第ＶＩＩａ因子（μｇ）：第ＸＩＩＩ因子（μｇ））の比率で変化することがある。
【００９３】
本文において、「トロンビン産生に障害のある対象者」は、活性化した血小板の表面上で十分なトロンビンの群発を生み出すことの出来ない対象者を意味し、そして、正常な量及び機能の凝固因子、血小板及びフィブリノーゲンを含む、十分に機能する正常な止血系を有する対象者を含み、そしてＦＩＸ及び／又はＦＶＩＩＩを欠き（Ａ型及びＢ型血友病）、又は欠陥のあるＦＩＸ及び／又はＦＶＩＩＩを有し、又はＦＩＸ及び／又はＦＶＩＩＩに対する阻害因子を有する対象者；ＦＸＩを欠く対象者；より低下した数の血小板又は欠陥のある機能を有する血小板を有する対象者（例えば、血小板減少症又はグランツマン血小板無力症又は過剰に出血している対象者）；及びより低レベルのプロトロンビン， ＦＸ又はＦＶＩＩを有する対象者、を含む。
【００９４】
フィブリノーゲンの血漿濃度が低下した対象者（例えば、多数の外傷又は広範囲の手術の結果として大量に輸血された対象者）も、容易に溶解しやすい、ゆるくて且つ不安定なフィブリンの栓の形成に苦しんでいる。
【００９５】
用語「十分な止血」は、効果的に出血を停止し、そしてフィブリン分解系によって容易に分解しない、損傷部位にある安定で且つ固体のフィブリン血塊又は血栓の形成を意味する。
【００９６】
用語「第ＶＩＩａ因子の活性」又は「第ＶＩＩａ因子活性」は、トロンビンを産生する能力を意味し；当該用語はまた、組織因子の不在下の、活性化した血小板の表面上でトロンビンを産生する能力も含む。
【００９７】
用語「正常な止血系の増強」は、トロンビンを産生する能力の増強を意味する。
【００９８】
本明細書で使用する場合、用語「出血障害」は、出血において現れる細胞又は分子起源の、先天的な、後天的な、又は誘導された何らかの欠損を意味する。例として、凝固因子の欠損症（例えば、Ａ型及びＢ型血友病又は凝固因子ＸＩ又はＶＩＩの欠損症）、凝固因子の阻害因子、欠陥のある血小板機能、血小板減少症、フォンヴィレブランド病、がある。
【００９９】
用語「出血症状」は、手術と他の組織損傷の形態の両方に関連する主要な問題である、制御されず、且つ過剰な出血を意味する。制御されず、且つ過剰な出血は、基本的に正常な凝固系を有する対象者（これらの対象者は、出血の結果として凝固障害を発生する一方で、出血の希釈効果に起因する凝固タンパク質の希釈、フィブリン分解の増大及び血小板の減少、を伴う）及び凝固又は出血障害を有する対象者において起こることがある。凝固因子欠損症（Ａ型及びＢ型血友病、凝固因子ＸＩ又はＶＩＩの欠損症）又は凝固因子阻害因子も、出血障害の原因となることがある。過剰な出血はまた、正常に機能する血液凝固カスケードを有する対象者（凝固因子の欠損症又は凝固因子のいずれかに対する阻害因子無し）においても起こることがあり、そして欠陥のある血小板機能、血小板減少症又はフォンヴィレブランド病によって起こることもある。その様な場合において、出血が血友病によって生じる出血と関連することがあるのは、止血系が、血友病のような場合に、欠損しているが、又は大出血を引き起こす異常な必須凝固「化合物」（例えば、血小板又はフォンヴィレブランド因子タンパク質）を有しているためである。手術又は大きな外傷に関連する広範な損傷を経験する対象者において、正常な止血機構は、迅速な止血の要求に圧倒されることがあり、そしてそれらは、基本的に（外傷前の）正常な止血機構にも関わらず、出血を引き起こすことがある。満足の行く止血を達成することはまた、出血が、外科的な止血についての可能性に限定される、脳、内耳領域及び眼の様な器官で起こる場合には問題である。同様の問題は、様々な器官（肝臓、肺、腫瘍組織、胃腸管）から生検を得る過程において、並びに腹腔鏡による手術において起こることがある。これら全ての状況にとって共通することは、外科的な技術（縫合、クリップ等）によって止血を提供することが困難であることであり、これは出血が拡散する場合（出血性の胃炎及び大量な子宮での出血）にも同様である。急性で且つ大量の出血は、欠陥のある止血が所定の治療によって導入された、抗凝固治療を受けている対象者においても起こることがある。その様な対象者は、抗凝固効果が素速く無効にされなければならない場合に、手術的な介入を必要とすることがある。恥骨後の前立腺全摘出術は、局部的な前立腺ガンを有する対象者のために一般的に実施されている手順である。当該手術は、重大で且つ時々大量の失血によってしばしば複雑なものとなる。前立腺摘出の間のかなりの失血は、外科的な止血の場合に容易に接近可能でなく、且つ広範な領域から拡散する出血を引き起こしうる、様々な入り組んで血管新生した部位を有する、複雑な解剖の状況と関連する。満足の行かない出血の場合に問題を起こすことがある別の状況は、正常な止血機構を有する対象者が血栓塞栓症を防ぐために抗凝固治療が与えられる場合である。その様な治療は、ヘパリン、他の形態のプロテオグリカン、ワルファリン又は他の形態のビタミンＫアンタゴニスト並びにアスピリン及び他の血小板凝集阻害剤、を含むことがある。
【０１００】
本発明の１つの態様において、出血は血友病と関連する。別の態様において、出血は、後天的な阻害因子による血友病と関連する。別の態様において、出血は血小板減少症と関連する。別の態様において、出血はフォンヴィレブランド病と関連する。別の態様において、出血は重度の組織損傷と関連する。別の態様において、出血は重度の外傷と関連する。別の態様において、出血は手術と関連する。別の態様において、出血は腹腔鏡による手術と関連する。別の態様において、出血は出血性の胃炎と関連する。別の態様において、出血は大量な子宮での出血である。別の態様において、出血は、機械的な止血の可能性に限定される器官で起こる。別の態様において、出血は脳、内耳領域又は眼において生じる。別の態様において、出血は抗凝固治療と関連する。
【０１０１】
本発明に従う組成物は、更にＴＦＰＩ阻害剤を含んで成ることもある。その様な組成物は、好ましくはＡ型又はＢ型血友病を有する対象者に投与されるべきである。
【０１０２】
本発明に従う組成物は、更に第ＶＩＩＩ因子を含んで成ることもある。その様な組成物は、好ましくは第ＶＩＩＩ因子に対する阻害因子を持たない対象者に投与されるべきである。
【０１０３】
本文において、用語「処置」は、出血を阻害し、又は最小化するための、例えば手術において予想される出血の防止、及び例えば血友病又は外傷において既に起きている出血の制御の両方を含むことを意味する。第ＶＩＩａ因子及び第ＸＩＩＩ因子の投与も、従って用語「処置」に含まれる。
【０１０４】
用語「対象者」は、本明細書で使用する場合、任意な動物、特に哺乳類、例えばヒトを意味することを意図し、そして、所望により、用語「患者」と交換可能に使用されうる。
【表２】
2004505016.tif 000003
【０１０５】
化合物の調製
本発明の使用に適したヒト精製第ＶＩＩａ因子は、好ましくはＤＮＡ組換え技術によって、例えばＨａｇｅｎ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８３：２４１２−２４１６， １９８６に記載の様に、又は欧州特許第２００．４２１号（ＺｙｍｏＧｅｎｅｔｉｃｓ， Ｉｎｃ．）に記載の様に生成される。組換え技術によって産生される第ＶＩＩａ因子は、真の第ＶＩＩａ因子又は多少修飾された第ＶＩＩａ因子であってもよく、但し、その様な第ＶＩＩａ因子は、真の第ＶＩＩａ因子（野生型第ＶＩＩａ因子）と実質的に同一の血液凝固についての生物活性を有する。前記の修飾された第ＶＩＩａ因子は、既知の手段による、例えば部位特異的突然変異誘発による、天然第ＶＩＩ因子をコードする核酸における、アミノ酸のコドンの変化又はアミノ酸コドンのいくつかの除去によって、野生型第ＶＩＩ因子をコードする核酸配列を修飾することによって産生されうる。
【０１０６】
第ＶＩＩ因子は更に、Ｂｒｏｚｅ ａｎｄ Ｍａｊｅｒｕｓ， Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２５５ （４）： １２４２−１２４７， １９８０及びＨｅｄｎｅｒ ａｎｄ Ｋｉｓｉｅｌ， Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ． ７１： １８３６−１８４１， １９８３に開示されている方法によっても産生することができる。これらの方法は、検出可能な量の他の血液凝固因子なしに第ＶＩＩ因子を作り出す。また更に精製した第ＶＩＩ因子調製物は、最終的な精製段階として更なるゲルろ過を含めることによって得ることができる。次に、第ＶＩＩ因子は、周知の手段により、例えばいくつかの異なる血漿タンパク質、例えば第ＸＩＩａ因子、第ＩＸ因子又は第Ｘａ因子により活性化されたＦＶＩＩａに変換される。あるいは、Ｂｊｏｅｒｎ ｅｔ ａｌ．（Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｄｉｓｃｌｏｓｕｒｅ， ２６９ Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ １９８６， ｐｐ．５６４−５６５）により記載されるように第ＶＩＩ因子は、それをイオン交換クロマトグラフィーカラム、例えばＭｏｎｏ Ｑ（商標）（Ｐｈａｒｍａｃｉａ ｆｉｎｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）等に通すことにより活性化することができる。
【０１０７】
本発明における使用のための第ＸＩＩＩ因子は、既知の方法、例えば、引用によって組み入れられる、Ｃｏｏｋｅ ａｎｄ Ｈｏｌｂｒｏｏｋ（Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｊ． １４１：７９−８４）及びＣｕｒｔｉｓ ａｎｄ Ｌｏｒａｎｄ（Ｍｅｔｈｏｄ Ｅｎｚｙｍｏｌ． ４５：１７７−１９１， １９７６）によって開示されたもの、に従い、血漿から調製されうる。第ＸＩＩＩ因子のａ２二量体型は、引用によって本明細書に組み入れられる、米国特許第３，９０４，７５１号；第３，９３１，３９９号；第４，５９７，８９９号及び第４，２８５，９３３号に開示されているように胎盤から調製されうる。しかしながら、病気の伝染の危険性がある血液又は組織由来の産物の使用を回避するために、組換え第ＸＩＩＩ因子を使用することが好ましい。組換え第ＸＩＩＩ因子を調製するための方法は、当業界で知られている。例えば、引用によってその全体が本明細書に組み入れられる、Ｄａｖｉｅ ｅｔ ａｌ．， ＥＰ ２６８，７７２； Ｇｒｕｎｄｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．， ＡＵ−Ａ−６９８９６／８７； Ｂｉｓｈｏｐ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９９０， ２９： １８６１−１８６９； Ｂｏａｒｄ ｅｔ ａｌ．， Ｔｈｒｏｍｂ． Ｈａｅｍｏｓｔ． １９９０， ６３： ２３５−２４０； Ｊａｇａｄｅｅｓｗａｒａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅ １９９０ ８６： ２７９−２８３； 及びＢｒｏｋｅｒ ｅｔ ａｌ．， ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ． １９８９， ２４８： １０５−１１０を参照のこと。一つの態様において、第ＸＩＩＩ因子のａ２二量体は、米国特許同時継続出願第０７／７４１，２６３号（引用によってその全体が本明細書に組み入れられる）に開示されているように、酵母サッカロミセス・セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の細胞質から調製される。当該細胞は回収され、そして溶解され、そして透明なライゼートが調製される。当該ライゼートは誘導されたアガロースのカラム、例えばＤＥＡＥ Ｆａｓｔ−Ｆｌｏｗ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）等を用いて、中性からわずかにアルカリ性のｐＨで、陰イオン交換カラムクロマトグラフィーによって分画される。続いて、第ＸＩＩＩ因子が、溶出液を濃縮し、そしてｐＨを５．２〜５．５に調節することによって、例えばコハク酸アンモニウムバッファーに対する透析によって、カラムから沈殿される。続いて、沈殿物は溶解され、そして常用のクロマトグラフィー技術、例えばゲル濾過及び疎水性相互作用クロマトグラフィーを用いて更に精製される。
【０１０８】
当業者に自明なように、免疫応答を誘導する危険性を軽減するために、対象者と同系の第ＸＩＩＩ因子及び第ＶＩＩａ因子を使用することが好ましい。ヒト以外の第ＸＩＩＩ因子の調製及び特徴づけは、Ｎａｋａｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．（Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ７８： １２４７−１２６６， １９７５）によって開示されている。本発明はまた、獣医学的な手順における前記第ＸＩＩＩ因子及び第ＶＩＩａ因子の使用を包含する。
【０１０９】
投与及び医薬組成物
熟慮した上での介入（ｉｎｔｅｒｖｅｎｔｉｏｎ）に関連した処置のために、第ＶＩＩ因子及び第ＸＩＩＩ因子は、典型的に介入を実施する前の約２４時間以内に投与され、そしてその後、７日間ほど又はそれ以上の間投与される。凝固剤としての投与は、本明細書に記載のような様々な経路によって実施されうる。
【０１１０】
第ＶＩＩ因子の投与量は、対象者の体重、症状及び症状の重症度に依存して、７０ｋｇの患者の場合、負荷量及び維持量として、約０．０５ｍｇ〜約５００ｍｇ／日、例えば約１ｍｇ〜約２００ｍｇ／日、例えば約１０ｍｇ〜約１７５ｍｇ／日に及ぶ。
【０１１１】
第ＸＩＩＩ因子の投与量は、対象者の体重症状及び症状の重症度に依存して、７０ｋｇの患者の場合、負荷量及び維持量として、約０．０５ｍｇ〜約５００ｍｇ／日、例えば約１ｍｇ〜約２００ｍｇ／日、例えば約１０ｍｇ〜約１７５ｍｇ／日に及ぶ。
【０１１２】
本発明の組成物及びキットは、ヒト及び獣医学の医薬において有用であり；例えば、出血症状又は凝固障害の苦しむ対象者の処置又は予防において有用である。本発明における使用のために、第ＶＩＩａ因子及び第ＸＩＩＩ因子は、任意に医薬として許容される担体と一緒に、調製される。好ましくは、医薬組成物は非経口的に、すなわち、静脈内、皮下、又は筋肉内から投与され、あるいは、連続的又は拍動的な注入によっても投与されうる。
【０１１３】
製剤は、更に１又は複数の希釈剤、乳化剤、保存剤、緩衝液、賦形剤等を含んでもよく、そして液体、粉末、懸濁液、徐放の形態で提供されることもある。当業者は、本発明の組成物を適切な方法で、且つ許容されている慣習、例えばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ，１６ｔｈ ｅｄ．，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ， １９９０に開示されているものに従い調製しうる。非経口投与のための組成物は、第ＶＩＩ因子及び代ＸＩＩＩ因子を、医薬として許容される担体、好ましくは水性担体と一緒に、好ましくはその中に溶解されて、含んで成る。様々な水性担体が使用されることがあり、例えば水、緩衝化された水、０．４％塩溶液、０．３％グリシン等である。本発明の第ＶＩＩ因子変異体はまた、損傷の部位への送達又は標的化のためにリポソーム調製物中に配合され得る。リポソーム調製物は一般的に、たとえば米国特許第４，８３７，０２８号、第４，５０１，７２８号及び第４，９７５，２８２号に記載される。
【０１１４】
静脈内注入のための典型的な医薬組成物は、２５０ｍｌの無菌リンガー溶液及び１０ｍｇの第ＶＩＩａ因子及び／又は第ＸＩＩＩ因子を含むように製造され得る。非経口投与可能な化合物を調製するための実際の方法は、当業者に知られており、又は明らかであり、そしてたとえば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ，１６ｔｈ ｅｄ．，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ（１９９０）により詳細に記載される。
【０１１５】
要約すると、本発明に従う使用のための医薬組成物は、第ＶＩＩａ因子、又は第ＸＩＩＩ因子、又は第ＸＩＩＩ因子と組み合わせた第ＶＩＩａ因子を、好ましくは精製形態で、適切なアジュバント及び適切な担体又は希釈剤と混合することにより作られる。適切な生理学的に許容される担体又は希釈剤には、滅菌水及び塩類溶液がある。当該組成物は、だいたいの生理学的条件にとって必要とされるような医薬として許容される補助物質、例えばｐＨ調節物質及び緩衝剤、張度調節物質等、例えば酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム等を含むことがある。適切なアジュバントは、カルシウム、タンパク質（例えばアルブミン）、又は精製された第ＶＩＩａ因子及び／又は第ＸＩＩＩ因子を安定化するための他の不活性なペプチド（例えばグリシルグリシン）又はアミノ酸（例えばグリシン又はヒスチジン）がある。他の生理的に許容されるアジュバントは、非還元糖、ポリアルコール（例えばソルビトール、マンニトール又はグリセロール）、多糖、例えば低分子量デキストラン、界面活性剤（例えばポリソルベート）及び酸化防止剤（例えばビスルファイト及びアスコルベート）である。アジュバントは、一般に、０．００１〜４％ｗ／ｖの濃度で存在する。当該医薬組成物は、プロテアーゼ阻害剤、例えばアプロチニン、又はトラネキサム酸、並びに保存剤を含むこともある。更に調製物はＴＦＰＩ阻害剤及び／又は第ＶＩＩＩ因子を含むことがある。
【０１１６】
当該組成物は、常用の、周知の滅菌技術によって滅菌されうる。生じた水溶液は、使用のためにパッケージングされ、又は無菌条件下で濾過され、そして凍結乾燥されることがあり、凍結乾燥した調製物は、投与前に滅菌水溶液と一緒にされることがある。
【０１１７】
これらの製剤中での第ＶＩＩａ因子、第ＸＩＩＩ因子、又は第ＸＩＩＩ因子と組み合わせた第ＶＩＩａ因子の濃度は、非常に広範に、すなわち、重量当たり約０．５％未満、通常重量当たり約１％又はそれ未満から、重量当たり１５〜２０％程度にまで及ぶことがあり、そして選択した特定の投与形態に従い、主に、液体の体積、粘度等によって選択される。
【０１１８】
注射又は注入、特に注射による投与が好ましい。従って、第ＶＩＩａ因子及び第ＸＩＩＩ因子は、静脈内投与に適した形態で調製され、例えば、１つの剤形中に第ＶＩＩａ因子及び第ＸＩＩＩ因子の両方を含む、溶解された凍結乾燥粉末又は液体製剤並びに別の剤形中に第ＸＩＩＩ因子を含む溶解された凍結乾燥粉末又は液体製剤のいずれかの調製物である。
【０１１９】
第ＶＩＩａ因子及び第ＸＩＩＩ因子の局所送達、例えば局所適用は、例えば噴霧、潅流、二重バルーンカテーテル、ステント、血管移植片又はステント中に組込まれるもの、バルーンカテーテルをコーティングするために使用されるヒドロゲル、又は他の十分に確立された方法により実施され得る。毎日の維持レベルを必要とする通院患者のために、第ＶＩＩａ因子及び第ＸＩＩＩ因子は、たとえばポータブルポンプシステムを用いて、連続的注入により投与され得る。いずれにせよ、医薬組成物は、対象者を効果的に処置するのに十分な量の第ＶＩＩａ因子及び第ＸＩＩＩ因子を提供するべきである。
【０１２０】
第ＶＩＩａ因子と第ＸＩＩＩ因子の組み合わせは、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの血塊の固さについてのアッセイ及びフィブリンを分解する時間についてのアッセイにおいて相乗効果を示す。更に、第ＶＩＩａ因子と第ＸＩＩＩ因子の組み合わせは、安定なフィブリン血塊を形成し、血塊を半分に溶解する時間を増大し、血塊の強度を増大し、そしてフィブリン分解に対する耐性を増大することにおいて、相乗効果を示す。
【０１２１】
第ＶＩＩ因子及び第ＸＩＩＩ因子を含む組成物は、予防的及び／又は治療的な処置のために投与されうる。治療的な適用において、組成物は上述のような病気に既に苦しんでいる対象者に対し、当該病気及びその合併症を治療し、緩和し、又は部分的に抑えるのに十分な量で投与される。これを達成するために適した量は、「有効量」又は「治療的有効量」として定義される。当業者に理解されるように、この目的のために有効な量は、病気又は損傷の重症度、及び患者の体重及び全身状態に依存する。本発明の材料が、一般的に、重度の病気又は損傷状態、すなわち生命を脅かされる状況において使用され得ることに留意しなければならない。そのような場合、ヒトにおいての外来性物質の最少化及び第ＶＩＩａ因子及び第ＸＩＩＩ因子の免疫性の一般的な欠失の観点においては、実質的に過剰量のこれらの組成物を投与することが可能であり、そして治療者に望ましく感じられると思われる。
【０１２２】
予防的適用において、第ＶＩＩａ因子及び第ＸＩＩＩ因子を含む組成物は、患者自身の凝固能力を増強するために、病状又は損傷に影響を受けやすく、あるいはその危険性のある対象者に投与される。そのような量は、「予防的有効用量」であると定義される。
【０１２３】
当該組成物の一回及び複数回の投与は、処置する医師によって選択される投与量のレベル及びパターンで実施されうる。当該組成物は、一日又は一週間当たり１又は複数回投与されうる。その様な医薬組成物の有効量は、出血症状に対して臨床的に有意な効果を提供する量である。その様な量は、部分的に、対象者の処置される症状、年齢、体重、及び全身の健康、並びに当業者にとって自明な他の要因、に依存する。
【０１２４】
当該組成物は、予想される出血の前に、又は出血の開始時に、一回の単回投与量で通常投与される。しかしながら、複数回投与量で、好ましくは与えられる投与量及び対象者の症状に依存して２−４−６−１２時間の間隔で、与えられることもある。
【０１２５】
当該組成物は、第ＶＩＩａ因子及び第ＸＩＩＩ因子の両方を適当な濃度で含んで成る単一の調製物の形態であってもよい。当該組成物は、第ＶＩＩａ因子を含んで成る第一単位剤形及び第ＸＩＩＩ因子を含んで成る第二単位剤形並びに、任意に第ＶＩＩＩ因子及び／又はＴＦＰＩ阻害剤を含んで成る１又は複数の更なる単位剤形、から成るキットの形態であってもよい。この場合、第ＶＩＩａ因子及び第ＸＩＩＩ因子は、順次、好ましくは互いに約１〜２時間以内に、例えば互いに３０分以内に、好ましくは互いに１０分以内、更に好ましくは５分以内に投与されるべきである。２つの単位剤形のうちいずれかが最初に投与されることがある。
【０１２６】
本発明は、別々に投与されうる活性成分と組み合わせた処置による出血症状又は処置あるいは凝固処置に関するものなので、本発明はまた、キットの形態で異なる医薬組成物を組み合わせることに関する。当該キットは、少なくとも２つの別々の医薬組成物を含む。当該キットは、別々の組成物を含むための容器、例えば分けられたボトル又は分けられたホイルパケットを含む。典型的に、当該キットは、異なる成分の投与のための説明書を含む。当該キットの形態は、異なる成分が好ましくは異なる剤形で投与され、そして異なる投与間隔で投与される場合に、あるいは前記組み合わせのうちの個々の成分の力価が処方する医師によって所望とされる場合に、特に有利である。
【０１２７】
アッセイ
第ＶＩＩａ因子活性についての試験
第ＶＩＩａ因子活性について試験し、そしてそれによって適当な第ＶＩＩａ因子変異体を選択するのに適したアッセイは、単純な予備的ｉｎ ｖｉｔｒｏ試験として実施されうる。
【０１２８】
ｉｎ ｖｉｔｒｏでの加水分解アッセイ
天然（野生型）の第ＶＩＩａ因子及び第ＶＩＩａ因子変異体（以後ともに「第ＶＩＩａ因子」と言及する）は、比活性についてアッセイされうる。それらはまた、アッセイされ、同時に直接的にそれらの比活性について比較されることがある。当該アッセイは、マイクロタイタープレート（ＭａｘｉＳｏｒｐ， Ｎｕｎｃ， Ｄｅｎｍａｒｋ）内で実施される。色素原性の基質Ｄ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−ｐ−ニトロアニリド（Ｓ−２２８８， Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｘ， Ｓｗｅｄｅｎ）は、終濃度１ｍＭで、０．１Ｍ ＮａＣｌ， ５ｍＭ ＣａＣｌ２及び１ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミンを含む、５０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ， ｐＨ７．４中の第ＶＩＩａ因子（終濃度１００ｎＭ）に加えられる。４０５ｎｍの吸光度が、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ（商標）３４０プレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ， ＵＳＡ）内で連続的に測定される。２０分のインキュベーションの間に現れた吸光度は、酵素を含まない空のウェルの吸光度を引いた後に、変異体と野生型の第ＶＩＩａ因子の活性間の比率を計算するために使用される。
比率＝（第ＶＩＩａ因子変異体のＡ４０５ｎｍ）／（第ＶＩＩａ因子の野生型のＡ４０５ｎｍ）
【０１２９】
それらに基づいて、天然の第ＶＩＩａ因子に匹敵する、又はそれよりも高い活性を有する第ＶＩＩａ因子変異体が同定されることがあり、例えば図１に示した変異体の活性と天然の第ＶＩＩａ因子の活性の比率が約１．０超の比率である変異体などである。
【０１３０】
第ＶＩＩａ因子又は第ＶＩＩａ因子変異体の活性はまた、生理学的な基質、例えば第Ｘ因子を用いて、適当には１００〜１０００ｎＭの濃度で測定されることがあり、ここで、産生する第Ｘａ因子は、適当な色素原性の基質（例えば、Ｓ−２７６５）の添加の後に測定される。尚、当該活性アッセイは、生理学的な温度で実施されうる。
【０１３１】
第ＶＩＩａ因子又は第ＶＩＩａ因子変異体のトロンビンを産生する能力も、生理学的な濃度の全ての関連する凝固因子及び阻害因子（Ａ型血友病の症状を模倣する場合には第ＶＩＩＩ因子を除く）並びに活性化された血小板（引用として本明細書に組み入れられる、Ｍｏｎｒｏｅ ｅｔ ａｌ．（１９９７） Ｂｒｉｔ． Ｊ． Ｈａｅｍａｔｏｌ． ９９， ５４２−５４７のｐ．５４３に記載のもの）を含んで成るアッセイにおいて測定されうる。
【０１３２】
第ＸＩＩＩ因子の活性についての試験
第ＸＩＩＩ因子のトランスグルタミナーゼ活性について試験し、そしてそれによって適当な第ＸＩＩＩ因子を選択するのに適したアッセイは、例えば、Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌ． ４５（１９７６） Ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ Ｅｎｚｙｍｅｓ， Ｐａｒｔ Ｂ， ｐａｇｅｓ １７７−１９１（Ｅｄ． Ｌｏｒａｎｄ， Ｌ．）に記載のような単純なｉｎ ｖｉｔｒｏ試験として実施される。
【０１３３】
本発明は、以下の例によって更に例示されるが、これらは保護範囲を限定するものとしてみなされるべきではない。前述の説明及び後述の例に開示される構成は、別々に且つそれらの任意な組み合わせで、それらの異なる形態で本発明を実現するための材料であってもよい。
【０１３４】
例
例１
第ＸＩＩＩ因子は第ＶＩＩａ因子誘導型のフィブリン血塊形成を増強する。
正常なヒト血漿のクエン酸塩（ＮＨＰ）は、マイクロタイター（全量２５０μｌ）内で、２０ｎＭ ＨＥＰＥＳ， １５０ｍＭ ＮａＣｌ， ５ｍＭ ＣａＣｌ２， ｐＨ７．４を含む緩衝液中で１／１０に希釈され、そしてフィブリン血塊形成は、Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ（商標）３４０（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ， Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ ＣＡ）内で６００ｎｍでの光学密度の増大によってモニタリングされた。
【０１３５】
自発的な血塊形成は、約２５００〜３０００秒で得られた。図１は、１０ｎＭの組換え第ＶＩＩａ因子（ｒＦＶＩＩａ）（Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ Ａ／Ｓ Ｂａｇｓｖａｅｒｄ， Ｄｅｎｍａｒｋ）が、凝固時間を１６００秒に短縮したことを示した（ｎ＝２）。凝固時間の更なる短縮は、３０ｎＭの第ＸＩＩＩ因子（ＦＸＩＩＩ）（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ ｉｎｃ， Ｇｒｅｅｎｗｉｃｈ， ＣＴ）が１０ｎＭのｒＦＶＩＩａと一緒に加えられた場合に得られた（ｎ＝３）。ＦＸＩＩＩの存在下で形成した血塊は、その不在下の場合よりも更に透明であり（最大のＯＤがより低い）、これは、ＦＸＩＩＩの添加がより細い線維を有する更に細かい網状のフィブリンゲルをもたらしたことを示している。
【０１３６】
例２
第ＶＩＩａ因子誘導型の血塊形成の間の補助的な第ＸＩＩＩ因子の存在はフィブリン分解的な減成に対する耐性の増大をもたらす。
細い線維から成るフィブリン血塊は、太い線維又はほとんど架橋されていない線維として配向された同量のフィブリンを含む血塊より、機械的に強く、そして減成するのが困難である。図２に示す実験は、補助的なＦＸＩＩＩ（３０ｎＭ）が、ｒＦＶＩＩａ及び組織プラスミノーゲン活性因子（ｔ−ＰＡ， Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ）の存在下で形成した血塊のフィブリン血塊溶解時間を延長することを例示する。血塊形成は、２５μｌのＮＨＰを、５０ｎＭ ｒＦＶＩＩａ及び０．５ｎＭ組換えｔ−ＰＡを含む２２５μｌの２０ｎＭ ＨＥＰＥＳ， １５０ｎＭ ＮａＣｌ， ５ｍＭ ＣａＣｌ２， ｐＨ７．４に添加することによって、３０ｎＭのＦＸＩＩＩの有無に関わらず誘導された。ｔ−ＰＡが媒介するプラスミノーゲン活性化によって誘導される血塊形成及びそれに続く血塊溶解は、Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ（商標）３４０によって、６００ｎｍでＯＤ６００ｎｍの増大として測定され、続いて基底レベルまで痕跡を変換した。図２は、これらの条件下での血塊溶解時間がＦＸＩＩＩの存在によって有意に延長されたことを示す。
【０１３７】
例３
第ＸＩＩＩ因子と組み合わせた第ＶＩＩａ因子は、最大の血塊の固さを増大させ、そしてフィブリン分解に対する血塊の耐性を増大させる。
トロンボエラストグラフの測定は、６ｎＭの組換え組織型プラスミノーゲン活性因子（ｔ−ＰＡ， Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ）を添加した正常なヒト血漿のクエン酸塩で実施され、そして１ｎＭのｒＦＶＩＩａ（Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ Ａ／Ｓ， Ｂａｇｓｖａｅｒｄ， Ｄｅｍａｒｋ）のみ又は様々な濃度の第ＸＩＩＩ因子（ＦＸＩＩＩ， Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， ＨＣＸＩＩＩ−０１６０， Ｌｏｔ Ｎ１２１２）と組み合わせたものの添加の効果はが解析された。凝固は、インノビン（ｉｎｎｏｖｉｎ）（終濃度は、２０００倍希釈されたもの、Ｄａｄｅ Ｂｅｈｒｉｎｇ ＃５２６９４５）及びカルシウム（終濃度１５ｍＭ）の添加によって開始された。
【０１３８】
トロンボエラストグラフの測定は、最大の血塊の固さ（Ｍａｘｉｍａｌ Ｃｌｏｔ Ｆｉｒｍｎｅｓｓ（ＭＣＦ））及びｔ−ＰＡが媒介する溶解に対する血塊の耐性へのｒＦＶＩＩａ及びＦＸＩＩＩの効果を解析するために利用される。ｒＦＶＩＩａ及び／又はＦＸＩＩＩの添加の前に、得られたＭＣＦは２５ｎｍであり、そして血塊が半分に溶解されるのに必要な時間は１２．３分であった（図３）。濃度を増大させていくＦＸＩＩＩの添加（０−４０ｎＭ）は、ＭＣＦを変化させなかったが、血塊を半分に溶解する時間の量依存的な延長が、最適には３０ｎＭのＦＸＩＩＩで観察された（血塊を半分に溶解する時間：１４．３分、図３）。同様に、ｒＦＶＩＩａ（１ｎＭ）の添加は、ＭＣＦになんら作用することなく、ｔ−ＰＡが媒介するフィブリン分解からの血塊の保護をもたらした（血塊を半分に溶解する時間；１６．４分）（図３）。しかしながら、ｒＦＶＩＩａ（１ｎＭ）とＦＸＩＩＩ（３０ｎＭ）の添加により、ＭＣＦの増大（２９ｍｍ）、及びフィブリン分解からの深遠な保護（血塊を半分に溶解する時間；２．７分）が観察された（図３）。これらのことを一緒に考えると、これらの結果は、結晶に対するｒＦＶＩＩａ及びＦＸＩＩＩの添加は、相乗的に血塊の機械的強度及びｔ−ＰＡが媒介するフィブリン分解に対する耐性を向上させることを示す。
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は、マイクロタイター（全量２５０μｌ）内で、２０ｎＭ ＨＥＰＥＳ， １５０ｍＭ ＮａＣｌ， ５ｍＭ ＣａＣｌ２， ｐＨ７．４を含む緩衝液中で１／１０に希釈された正常なヒト血漿のクエン酸塩（ＮＨＰ）の自発的な血塊の形成が約２５００〜３０００秒で得られたことを示す。フィブリン血塊形成は、Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ（商標）３４０（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ， Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ ＣＡ）内で６００ｎｍでの光学密度の増大によってモニタリングされた。図１は、１０ｎＭの組換え第ＶＩＩａ因子（ｒＦＶＩＩａ）（Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ Ａ／Ｓ Ｂａｇｓｖａｅｒｄ， Ｄｅｎｍａｒｋ）が、凝固時間を１６００秒に短縮したことを示した（ｎ＝２）。凝固時間の更なる短縮は、３０ｎＭの第ＸＩＩＩ因子（ＦＸＩＩＩ）（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ ｉｎｃ， Ｇｒｅｅｎｗｉｃｈ， ＣＴ）が１０ｎＭのｒＦＶＩＩａと一緒に加えられた場合に得られた（ｎ＝３）。ＦＸＩＩＩの存在下で形成した血塊は、その不在下の場合よりも更に透明であり（最大のＯＤがより低い）、これは、ＦＸＩＩＩの添加がより細い線維を有する更に細かい網状のフィブリンゲルをもたらしたことを示している。
【図２】
図２は、補助的なＦＸＩＩＩ（３０ｎＭ）が、ｒＦＶＩＩａ及び組織プラスミノーゲン活性因子（ｔ−ＰＡ， Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ）の存在下で形成した血塊のフィブリン血塊溶解時間を延長することを例示する。血塊形成は、２５μｌのＮＨＰを、５０ｎＭ ｒＦＶＩＩａ及び０．５ｎＭ組換えｔ−ＰＡを含む２２５μｌの２０ｎＭ ＨＥＰＥＳ， １５０ｎＭ ＮａＣｌ， ５ｍＭ ＣａＣｌ２， ｐＨ７．４に添加することによって、３０ｎＭのＦＸＩＩＩの有無に関わらず誘導された。ｔ−ＰＡが媒介するプラスミノーゲン活性化によって誘導される血塊形成及びそれに続く血塊溶解は、Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ（商標）３４０によって、６００ｎｍでＯＤ６００ｎｍの増大として測定され、続いて基底レベルまで痕跡を変換した。図２は、これらの条件下での血塊溶解時間がＦＸＩＩＩの存在によって有意に延長されたことを示す。
【図３】
図３は、最大の血塊の固さ（Ｍａｘｉｍａｌ Ｃｌｏｔ Ｆｉｒｍｎｅｓｓ（ＭＣＦ））及びｔ−ＰＡが媒介する溶解に対する血塊の耐性へのｒＦＶＩＩａ及びＦＸＩＩＩの効果を示す。ｒＦＶＩＩａ及び／又はＦＸＩＩＩの添加の前に、得られたＭＣＦは２５ｎｍであり、そして血塊が半分に溶解されるのに必要な時間は１２．３分であった（図３）。濃度を増大させていくＦＸＩＩＩの添加（０−４０ｎＭ）は、ＭＣＦを変化させなかったが、血塊を半分に溶解する時間の量依存的な延長が、最適には３０ｎＭのＦＸＩＩＩで観察された（血塊を半分に溶解する時間：１４．３分、図３）。同様に、ｒＦＶＩＩａ（１ｎＭ）の添加は、ＭＣＦになんら作用することなく、ｔ−ＰＡが媒介するフィブリン分解からの血塊の保護をもたらした（血塊を半分に溶解する時間；１６．４分）（図３）。しかしながら、ｒＦＶＩＩａ（１ｎＭ）とＦＸＩＩＩ（３０ｎＭ）の添加により、ＭＣＦの増大（２９ｍｍ）、及びフィブリン分解からの深遠な保護（血塊を半分に溶解する時間；２．７分）が観察された（図３）。これらのことを一緒に考えると、これらの結果は、結晶に対するｒＦＶＩＩａ及びＦＸＩＩＩの添加は、相乗的に血塊の機械的強度及びｔ−ＰＡが媒介するフィブリン分解に対する耐性を向上させることを示す。
【図１】
2004505016.tif 000004
【図２】
2004505016.tif 000005
【図３】
2004505016.tif 000006
【国際公開パンフレット】
2004505016.tif 000007
2004505016.tif 000008
2004505016.tif 000009
2004505016.tif 000010
2004505016.tif 000011
2004505016.tif 000012
2004505016.tif 000013
2004505016.tif 000014
2004505016.tif 000015
2004505016.tif 000016
2004505016.tif 000017
2004505016.tif 000018
2004505016.tif 000019
2004505016.tif 000020
2004505016.tif 000021
2004505016.tif 000022
2004505016.tif 000023
2004505016.tif 000024
2004505016.tif 000025
2004505016.tif 000026
2004505016.tif 000027
2004505016.tif 000028
2004505016.tif 000029
2004505016.tif 000030
2004505016.tif 000031
2004505016.tif 000032
2004505016.tif 000033
2004505016.tif 000034
2004505016.tif 000035
2004505016.tif 000036
【手続補正書】
【提出日】平成14年6月21日(2002.6.21)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
第ＶＩＩａ因子及び第ＸＩＩＩ因子を含んで成る、静脈内投与のための医薬組成物。
【請求項２】
第ＶＩＩａ因子が第ＶＩＩ因子変異体である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
第ＶＩＩａ因子がヒト第ＶＩＩａ因子である、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
第ＶＩＩａ因子及び第ＸＩＩＩ因子が組換えヒト第ＶＩＩａ因子及び組換えヒト第ＸＩＩＩ因子である、請求項１又は３に記載の組成物。
【請求項５】
第ＸＩＩＩ因子が第ＸＩＩＩ因子のａ２−二量体である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項６】
第ＸＩＩＩ因子が活性第ＸＩＩＩ因子である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項７】
更にＴＦＰＩ阻害剤を含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項８】
更に第ＶＩＩＩ因子を含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項９】
出血症状の処置を含むキットであって、
ａ）第一単位剤形中に、有効量の第ＶＩＩａ因子及び医薬として許容される担体；
ｂ）第二単位剤形中に、有効量の第ＸＩＩＩ因子及び医薬として許容される担体；並びに
ｃ）前記の第一及び第二剤形を含むための容器、
を含んで成るキット。
【請求項１０】
第三単位剤形中に、有効量のＴＦＰＩ阻害剤及び医薬として許容される担体を更に含んでなる、請求項９に記載のキット。
【請求項１１】
第一単位剤形又は第二単位剤形が更にＴＦＰＩ阻害剤を含んでなる、請求項９に記載のキット。
【請求項１２】
別々の単位剤形中で調製されるか、又は単位剤形中に含まれる、第ＶＩＩＩ因子を更に含み、また、第ＶＩＩａ因子、第ＸＩＩＩ因子又はＴＦＰＩ阻害剤のリストから選択される１又は複数の化合物を更に含む、請求項９〜１１のいずれか１項に記載のキット。
【請求項１３】
対象者における出血症状を処置するための薬剤であって、静脈内投与のための薬剤の製造のための、第ＸＩＩＩ因子と組み合わせた第ＶＩＩａ因子の使用。
【請求項１４】
対象者における凝血時間を減少させるための薬剤の製造のための、請求項１３に記載の使用。
【請求項１５】
正常な哺乳類の血漿の、血塊の溶解時間を延長するための薬剤の製造のための、請求項１３に記載の使用。
【請求項１６】
正常な哺乳類の血漿の、血塊の強度を増大させるための薬剤の製造のための、請求項１３に記載の使用。
【請求項１７】
正常な哺乳類の血漿中のフィブリン血塊形成を増強するための薬剤の製造のための、請求項１３に記載の使用。
【請求項１８】
対象者におけるフィブリン血塊形成を増強する方法であって、対象者に対し、有効量の第ＶＩＩａ因子を有効量の第ＸＩＩＩ因子と組み合わせて投与することを含んで成る方法。
【請求項１９】
対象者における出血症状を処置するための方法であって、対象者に対し、有効量の第ＶＩＩａ因子を有効量の第ＸＩＩＩ因子と組み合わせて投与することを含んで成る方法。
【請求項２０】
第ＶＩＩａ因子及び第ＸＩＩＩ因子が１つの剤形で投与される、請求項１８又は１９に記載の方法。
【請求項２１】
第ＶＩＩａ因子及び第ＸＩＩＩ因子が順次投与される、請求項１８又は１９に記載の方法。
【国際調査報告】
2004505016.tif 000037
2004505016.tif 000038
2004505016.tif 000039
2004505016.tif 000040
2004505016.tif 000041