(57)【要約】実質上純粋なＷＮＶ−１及びＰＡＰ−１／ＷＩＰ−１相互作用阻害剤又はＷＩＰ−１／ＷＮＶ  Ｃｐ相互作用阻害剤を同定するためのアッセイにおけるその使用が開示される。ＷＮＶ−１の発現を妨害するアンチセンス配列を含む組成物及び同組成物を使用して癌を治療する方法が開示される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＷＩＰ−１のアミノ酸配列を有する実質上純粋な蛋白質。
【請求項２】
請求項１記載の蛋白質をコードする核酸配列を含む組換え発現ベクター。
【請求項３】
請求項２記載の組換え発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項４】
ＷＩＰ−１のｃＤＮＡ配列又は少なくとも１０ヌクレオチドを有するその断片からなる単離された核酸分子。
【請求項５】
ＷＩＰ−１のｃＤＮＡ配列の少なくとも１０ヌクレオチドのヌクレオチド配列に相補なヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチド分子。
【請求項６】
ＷＩＰ−１のｃＤＮＡ配列の１０−１５０ヌクレオチドのヌクレオチド配列に相補なヌクレオチド配列からなる、請求項５記載のオリゴヌクレオチド分子。
【請求項７】
ＷＩＰ−１のｃＤＮＡ配列の１８−２８ヌクレオチドのヌクレオチド配列に相補なヌクレオチド配列からなる、請求項６記載のオリゴヌクレオチド分子。
【請求項８】
請求項５記載の核酸分子及び薬学上受容可能な担体を含む薬学組成物。
【請求項９】
ＷＩＰ−１上のエピトープに結合する単離された抗体。
【請求項１０】
モノクローナル抗体である、請求項９記載の抗体。
【請求項１１】
ＷＩＰ−１のアミノ酸配列を有する実質上純粋な蛋白質又はその断片及び薬学上受容可能な担体を含む、薬学組成物。
【請求項１２】
無菌であって発熱物質を含まない、請求項１１記載の薬学組成物。
【請求項１３】
ＷＩＰ−１のアミノ酸配列を有する実質上純粋な蛋白質である、請求項１２記載の薬学組成物。
【請求項１４】
ＷＩＰ−１の断片のアミノ酸配列を有する実質上純粋な蛋白質を含む請求項１２記載の薬学組成物であって、但し当該断片が可溶性であってＷＩＰのＣｐに結合できる、薬学組成物。
【請求項１５】
ＷＩＰ−１の断片のアミノ酸配列を有する実質上純粋な蛋白質を含む請求項１１記載の薬学組成物であって、但し当該断片が可溶性であってＷＮＶのＣｐに結合できる、薬学組成物。
【請求項１６】
試験化合物の存在下でＷＮＶのＣｐとＷＩＰ−１を接触させ、そしてＷＩＰ−１に結合するＷＮＶのＣｐのレベルを当該試験化合物の不在下でのＷＩＰ−１に結合するＷＮＶのＣｐのレベルに対して比較することを含む、ＷＩＰ−１に結合するＷＮＶのＣｐを阻害する化合物を同定する方法。
【請求項１７】
試験化合物の存在下でＰＡＰ−１とＷＩＰ−１を接触させ、そしてＷＩＰ−１に結合するＰＡＰ−１のレベルを当該試験化合物の不在下でのＷＩＰ−１に結合するＰＡＰ−１のレベルに対して比較することを含む、ＷＩＰ−１に結合するＰＡＰ−１を阻害する化合物を同定する方法。
【請求項１８】
ＷＩＰ−１発現又はＷＩＰ−１／ＰＡＰ−１相互作用を妨害する化合物を含む組成物を個体に投与することを含む、腫瘍細胞を有する個体をＷＩＰ−１に付随したＰＡＰ−１で治療するための方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の開示】
【０００１】
発明の分野
発明は、ＷＮＶキャプシッドに結合するヒト蛋白質の同定及びクローン化、その作成及び使用の方法、及びそれらの活性の細胞サイクル中での阻害のための組成物及び方法に関する。
発明の背景
ウエストナイルウイルス（ＷＮＶ）のコア蛋白質はキャプシッド又はＣｐとも呼ばれ、それが存在する細胞の中でアポトーシスを誘導することができるものとして、最近同定された。この観察は、ＰＣＴ／ＵＳ０１／３１３５５及び連続番号６０／２３７，８８５に記載されており、引用により本明細書に編入される。
【０００２】
ＷＮＶの複製を阻害する新規な化合物を同定する要求が存在する。特定すれば、ＷＮＶキャプシッド蛋白質により媒介される特定の分子シグナルを干渉することにより複製を低下させる、安全で有効な化合物が求められる。同様に、細胞サイクルのカスケードの必須成分であるＷＮＶのＣｐが相互作用する共因子を干渉することにより複製を低下させる、安全で有効な化合物が求められる。さらに、共因子を同定して、細胞サイクルを変調させる方法においてそれを標的化する要求が存在する。ＷＮＶのＣｐの活性を阻害する化合物及び方法に関する要求が存在する。
発明の概要
本発明は、実質上純粋なＷＩＰ−１、コードする核酸配列を含む組換え発現ベクター及び当該組換え発現ベクターを含む宿主細胞に関する。
【０００３】
本発明は、ＷＩＰ−１のｃＤＮＡ配列又は少なくとも１０ヌクレオチドを有するその断片、又はＷＩＰ−１のｃＤＮＡ配列の少なくとも１０ヌクレオチドのヌクレオチド配列に相補なヌクレオチド配列からなる、単離された核酸分子に関する。
【０００４】
本発明は、ＷＩＰ−１上のエピトープに結合する単離された抗体に関する。
本発明は、ＷＩＰ−１に結合するＷＮＶのＣｐを阻害する化合物を同定する方法に関する。
【０００５】
本発明は、ＷＩＰ−１に結合するＰＡＰ−１を阻害する化合物を同定する方法に関する。
本発明は、ＷＩＰ−１に付随したＰＡＰ−１を用いて腫瘍を有する個体を治療する方法に関し、当該個体に、ＷＩＰ−１発現又はＷＩＰ−１／ＰＡＰ−１相互作用を妨害する化合物を含む組成物を投与することを含む。
好ましい態様の詳細な説明
ＷＮＶのＣｐは、ＰＡＰ−１と呼ばれるオンコジーンに関連するＷＮＶキャプシッド蛋白質／コア相互作用蛋白質−１（ＷＩＰ−１）と呼ばれる蛋白質に結合することがわかってきた。ＷＮＶのＣｐはアポトーシスを誘導することが分かってきた。従って、ＷＮＶのＣｐとＷＩＰ−１の間の相互作用の変調はＷＮＶ活性を阻害するかもしれない。さらに、ＷＩＰ−１への結合又はさもなくばそのＰＡＰ−１との対合を阻害することがアポトーシスを誘導するかもしれない。
【０００６】
本明細書にて使用される、ＷＩＰ−１は明細書を通してＰＡＰＡ−１と交換可能に使用され、各標記は他方と同じ遺伝子及び蛋白質を意味する。この出願は、本明細書に引用により編入される、米国仮出願番号６０／２９３，５６９に対する優先権を主張する。
【０００７】
ＷＩＰ−１がアポトーシス誘導蛋白質ＷＮＶのＣｐに結合するという発見は、特異的阻害剤をデザイン及び発見することを意味する。本発明によれば、ＷＩＰ−１は、特異的阻害剤に関して化合物をスクリーニングするために使用してよい。阻害剤は、抗−ＷＮＶ剤として有用である。精製されたＷＩＰ−１、及びＷＩＰ−１を含む複合体は、これらの蛋白質及び複合体が試験化合物の存在下で活性であるか否かを決定するために薬剤スクリーニングにおいて有用かもしれない。複合体を解離させて複合体の形成を阻害する化合物を同定するために、試験化合物をスクリーニングしてよい。
【０００８】
ＷＩＰ−１は、プロトオンコジーンであるＰＩＭ−１のリガンドである、ＰＡＰ−１の相互作用蛋白質である。図１は様々な相互作用を示す。ＷＩＰ−１がアポトーシス誘導性蛋白質ＷＮＶ  Ｃｐに結合するという発見は、ＷＩＰ−１／ＰＡＰ−１の相互作用の特異的阻害剤をデザイン及び発見する手段を提供し、並びに、ＷＩＰ−１／ＰＡＰ−１複合体を有する腫瘍細胞中でアポトーシスを誘導する標的を提供する。阻害剤は、抗癌剤として有用である。精製されたＷＩＰ−１、及びＷＩＰ−１を含む複合体は、これらの蛋白質及び複合体が試験化合物の存在下で活性であるか否かを決定するために薬剤スクリーニングにおいて使用してよい。複合体を解離させて複合体の形成を阻害する化合物を同定するために、試験化合物をスクリーニングしてよい。
【０００９】
ＷＩＰ−１をコードする単離されたｃＤＮＡは、ＷＩＰ−１の組換え生産における出発物質として有用である。当該ｃＤＮＡは、後に蛋白質を組換え発現する宿主細胞内に導入される発現ベクターを含むベクターに取り込まれる。核酸分子及びその断片、特にゲノミック配列は、遺伝子再構成を検出するためのプローブとして使用してよい。プローブは、例えば、制限断片長多型アッセイ及び蛍光インサイチュハイブリダイゼーションアッセイにおいて有用である。ＷＩＰ−１をコードするｃＤＮＡの断片に相補なヌクレオチド配列を含む核酸配列は、アンチセンス分子及びプライマーとして、それぞれ、ｍＲＮＡの翻訳を阻害するため及び遺伝子配列を増幅するために使用してよい。
【００１０】
ＷＩＰ−１は、ＷＩＰ−１のアミノ酸配列も掲載する図２に示されるｃＤＮＡによりコードされて、天然源から単離されるか、組換えＤＮＡ法により生産されるか又は標準蛋白質合成技術により合成され得る。
【００１１】
標準技術及び容易に入手可能な出発物質を用いて、ＷＩＰ−１をコードする核酸分子を、開示されたヌクレオチド配列情報を用いてデザインされたプローブ及びプライマーを用いて、ｃＤＮＡライブラリーから単離してよい。本発明は、ＷＩＰ−１をコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子に関する。本発明は、ＷＩＰ−１又はその断片のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子に関する。幾つかの態様において、上記核酸分子は、ＷＩＰ−１をコードするヌクレオチド配列からなる。幾つかの態様において、上記核酸分子は、ＷＩＰ−１のコーディング配列またはその相補配列からなるヌクレオチド配列を含む。幾つかの態様において、上記核酸分子は、ＷＩＰ−１をコードするヌクレオチド配列セットからなる。発明の単離された核酸分子は、発明の蛋白質を製造するための構築物及び組換え発現系を製造するために有用である。
【００１２】
ｃＤＮＡライブラリーは、よく知られた技術により生成される。本明細書において記載されたヌクレオチド配列の一つを含むｃＤＮＡクローンは、ＷＩＰ−１をコードするヌクレオチド配列の少なくとも一部を含むプローブ又はプライマーを用いて同定してよい。当該プローブ又はプライマーは、少なくとも１６ヌクレオチド、好ましくは少なくとも２４ヌクレオチドを有する。当該プローブ又はプライマーは、標準ハイブリダイゼーション技術を用いてｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするために使用される。あるいは、出発物質として如何なるヒト細胞からのゲノミックＤＮＡを用いて、ゲノミッククローンを単離してもよい。
【００１３】
本発明は、ＷＩＰ−１の断片に対して同一か又は相補なヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子に関し、少なくとも１０ヌクレオチドである。幾つかの態様において、上記単離された核酸分子は、ＷＩＰ−１の断片に対して同一か又は相補なヌクレオチド配列からなり、少なくとも１０ヌクレオチドである。幾つかの態様において、上記単離された核酸分子は、ＷＩＰ−１の断片に対して同一か又は相補なヌクレオチド配列からなり、１５−１５０ヌクレオチドである。幾つかの態様において、上記単離された核酸分子は、配列番号：１の断片に対して同一か又は相補なヌクレオチド配列からなり、１５−３０ヌクレオチドである。少なくとも１０ヌクレオチドの、ＷＩＰ−１の断片に対して同一か又は相補なヌクレオチド配列を含むか又はからなる単離された核酸分子は、ＷＩＰ−１の遺伝子及びｃＤＮＡ配列を同定するためのプローブとして有用である。ＷＩＰ−１遺伝子及びＷＩＰ−１のｃＤＮＡを増幅するためのＰＣＲプライマー、及びＷＩＰ−１遺伝子及びＷＩＰ−１のｃＤＮＡの転写及び翻訳を阻害するためのアンチセンス分子は、それぞれ、ＷＩＰ−１をコードする。ＷＩＰ−１の転写及び翻訳を阻害するためのアンチセンス分子は、癌を治療するために有用な薬学組成物中に取り込まれてよい。
【００１４】
ＷＩＰ−１をコードするｃＤＮＡは、サンプルからのｃＤＮＡが電気泳動ゲル上で分離される電気泳動アッセイにおいて分子マーカーとして使用してよく、ＷＩＰ−１プローブはそのようなプローブにハイブリダイズするバンドを同定するのに使用される。サイズマーカーとして提供された単離された核酸分子は、上記プローブに対してハイブリダイズすることが公知の陽性バンドとして現れ、よって即ちＷＩＰ−１をコードするｃＤＮＡのサイズに対する参照点として使用することができる。そのようなアッセイに有用な電気泳動ゲルは、標準のポリアクリルアミドゲルを含み、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）に記載されており、引用により本明細書に編入される。
【００１５】
ＷＩＰ−１のヌクレオチド配列は、ＷＩＰ−１の唯一のヌクレオチド配列に特異的にハイブリダイズするプローブ、プライマー及び相補分子をデザインするのに使用してよい。ＷＩＰ−１をコードするヌクレオチド配列に特異的にハイブリダイズするプローブ、プライマー及び相補分子は、当業者により日常的にデザインされてよい。
【００１６】
本発明は、ＷＩＰ−１を同定するためのオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション方法を実施するためのプローブとして有用な標識されたオリゴヌクレオチドも含む。従って、本発明は、標識され且つＷＩＰ−１の唯一のヌクレオチド配列にハイブリダイズできるプローブを含む。本発明の標識されたプローブは、放射性標識されたヌクレオチドにより標識されるか又はさもなくば容易に利用可能な非放射性検出系により検出可能である。幾つかの好ましい態様において、プローブは、１０から１００ヌクレオチドの間からなるオリゴヌクレオチドを含む。幾つかの好ましいのは、プローブが１０から５０ヌクレオチドの間からなるオリゴヌクレオチドを含む。幾つかの好ましいのは、プローブが１２から２０ヌクレオチドの間からなるオリゴヌクレオチドを含む。当該プローブは、ＷＩＰ−１の唯一のヌクレオチド配列の断片に同一か又は相補なヌクレオチド配列を含むことが好ましい。幾つかの態様において、標識されたプローブは、ＷＩＰ−１遺伝子が存在する染色体上で測定するために使用される。
【００１７】
ＷＩＰ−１をコードするｃＤＮＡは、核酸配列を増幅するためのＰＣＲプライマーをデザインするのに使用してよい。ＰＣＲ技術は、当業者により日常的に実施されて、その診断における用途はよく知られており受容される。ＰＣＲ技術を実施するための方法は、引用により本明細書に編入される、”ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ”，Ｉｎｎｉｓ，Ｍ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，編纂。Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ（１９９０）に開示されている。ＰＣＲ技術の応用は、引用により本明細書に編入される、”Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ”Ｅｒｌｉｃｈ，Ｈ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，編纂、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８９）に開示されている。幾つかの単純な規則が有効なプライマーのデザインを補助する。典型的なプライマーは、５０％から６０％のｇ＋ｃ組成を有する１８−２８ヌクレオチドの長さである。プライマー全体が、それがハイブリダイズするはずの配列に相補であることが好ましい。好ましくは、プライマーが１００塩基対から２０００塩基対のＰＣＲ産物を生成する。しかしながら、５０塩基対から１０ｋｂ及びそれ以上の産物を生成することができる。
【００１８】
ＰＣＲ技術は、核酸分子中に存在する配列にハイブリダイズする５’と３’のプライマーを用意し、そしてさらに遊離のヌクレオチド及び当該遊離のヌクレオチドによりプライマー間のヌクレオチド配列に相補塩基を満たす酵素を用意することにより、複数コピーのヌクレオチド配列の迅速な生成を可能にして、ＤＮＡの相補鎖を生成する。上記酵素はプライマーに隣接する相補配列中を満たす。５’プライマーと３’のプライマーの両方が核酸の同じ断片の相補鎖の上のヌクレオチド配列にハイブリダイズして、特定の二本鎖産物の指数的増幅がもたらされる。単一のプライマーが核酸分子にハイブリダイズするのみなら、直線的増幅が、変更可能な長さの一本鎖生成物を生成する。
【００１９】
本発明は、ＷＩＰ−１をコードするヌクレオチド配列を含むベクター又は組換え発現ベクターに関する。本明細書にて使用される、用語「組換え発現ベクター」は、適切な宿主に導入された場合に、必要な遺伝子要素を含むことによりＷＩＰ−１をコードするコーディング配列の直接の発現をするプラスミド、ウイルス粒子又は他のベクターに言及することを意味する。
【００２０】
当業者は、ＷＩＰ−１をコードする核酸分子を単離して、それを、標準技術及び容易に入手可能な出発物質を持いることにより発現ベクター中に挿入することができる。コーディング配列は必要な制御配列に作動可能なように連結される。発現ベクターはよく知られており、容易に入手可能である。発現ベクターの例は、プラスミド、ファージ、ウイルスベクター及び他の核酸分子又は宿主細胞を形質転換してコーディング配列の発現を促進させるのに有用な媒体を含む核酸分子を含む。発明の組換え発現ベクターは、ＷＩＰ−１を発現する宿主を形質転換するのに有用である。
【００２１】
本発明は、ＷＩＰ−１のヌクレオチド配列を含む組換え発現ベクターを含む宿主細胞に関する。蛋白質の生産のためのよく知られた組換え発現ベクターにおける使用のための宿主細胞は、よく知られており、容易に入手可能である。宿主細胞の例は、細菌細胞、例えば大腸菌、酵母細胞、例えば、サッカロミセスセレビシエ、昆虫細胞、例えば、ヨトウガ（Ｓ．ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）、非ヒト哺乳類組織培養細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞及びヒト組織培養細胞、例えばヒーラ細胞を含む。
【００２２】
幾つかの態様において、例えば、当業者は、よく知られた技術を用いて、よく知られた発現系における使用のために市販の発現ベクターのＤＮＡ分子を挿入することができる。例えば、市販のプラスミドｐＳＥ４２０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡ）は、大腸菌におけるＷＩＰ−１の生産のために使用してよい。市販のプラスミドｐＹＥＳ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡ）は、例えば、酵母のサッカロミセスセレビシエ株における生産のために使用してよい。市販のプラスミドＭＡＸＢＡＣTMは完全バキュロウイルス発現系（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡ）を、例えば、昆虫細胞における生産のために使用してよい。市販のプラスミドｐｃＤＮＡ  Ｉ又はｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡ）を、例えば、哺乳類細胞、例えばチャイニーズハムスター卵巣細胞における生産のために使用してよい。当業者は、市販の発現ベクター及び系又はその他を用いることにより、日常的な技術及び容易に入手可能な出発物質によりＷＩＰ−１を生産することができる。（例えば、引用により本明細書に編入される、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）を参照。）即ち、所望の蛋白質を原核系及び真核系の両方において製造することができ、当該蛋白質の加工された形態のスペクトルをもたらす。
【００２３】
当業者は、他の市販の発現ベクター及び系を使用するか又はよく知られた方法及び市販の出発物質を用いてベクターを製造することができる。必要な制御配列、例えばプロモーター及びポリアデニル化シグナル及び好ましくはエンハンサーを含む発現系は、容易に入手可能であって、様々な宿主に関して当業界において知られている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）を参照。
【００２４】
ＷＩＰ−１をコードするＤＮＡを含む発現ベクターを用いて、外来ＤＮＡの発現が生じる条件下で後に培養及び保持される適合可能な宿主を形質転換する。そうして生産される本発明の蛋白質は、細胞を溶解することによるか又は培養培地からの何れかにより、当業界において適切且つ公知のとおりに、培養物から回収される。当業者は、よく知られた技術を用いて、そのような発現単離物を用いて生産されるＷＩＰ−１を単離することができる。上記のとおりＷＩＰ−１に特異的に結合する抗体を用いて天然源からＷＩＰ−１を精製する方法は、組換えＤＮＡ技術により生産されるＷＩＰ−１を精製するのに等しく適用してよい。
【００２５】
遺伝子構築物の例は、当該構築物がトランスフェクトされる細胞系において機能するプロモーターに作動可能に連結されたＷＩＰ−１コーディング配列を含む。構成的プロモーターの例は、サイトメガロウイルス又はＳＶ４０由来のプロモーターを含む。誘導可能なプロモーターの例は、マウス乳腺白血病ウイルス又はメタロチオネインプロモーターを含む。当業者は、容易に入手可能な出発物質からＷＩＰ−１をコードするＤＮＡを細胞にトランスフェクトするのに有用な遺伝子構築物を容易に生産することができる。そのような遺伝子構築物は、ＷＩＰ−１の生産に有用である。
【００２６】
組換え技術によりＷＩＰ−１を生産することに加えて、自動化されたペプチド合成機も、ＷＩＰ−を生産するのに使用してよい。そのような技術は、当業者によく知られており、ＤＮＡによりコードされた蛋白質の生産に関しては提供されない置換を有する誘導体には有用である。
【００２７】
ＷＩＰ−１を生産することに加えて、ＰＡＰ−１，ＷＮＶ  Ｃｐ及びＰＩＭ−１を同様に生産して、単離することにより試薬として使用してよい。受け入れ番号及び文献により同定される以下の配列は、引用により本明細書に編入される。
2004529652.tif 000002
ＷＩＰ−１をコードする核酸分子は、様々な送達成分、例えば組換えウイルス発現ベクター又は他の適切な送達手段の何れか一つを用いて送達して、それにより適合可能な細胞中でそれらの誘導及び発現を作用させてよい。通常、ウイルスベクターはＤＮＡウイルス、例えば組換えアデノウイルス及び組換えワクシニアウイルス又はＲＮＡ、例えば組換えレトロウイルスであってよい。他の組換えベクターは、細胞に感染して組換え遺伝子を発現できる組換え原核生物を含む。組換えベクターに加えて、他の送達成分も意図され、例えば、リポソームへの封入、トランスフェリン媒介性トランスフェクション及び他の受容体媒介性手段である。発明は、均等な機能を有し、且つその後当業界において公知になる、そのような他の形態の発現ベクター及び他の適切な送達手段を含むことを意図する。
【００２８】
本発明は、ＷＩＰ−１核酸分子に相補なオリゴヌクレオチドにより、ＷＩＰ−１の発現を阻害する方法にも向けられる。オリゴヌクレオチドは、特定の核酸分子との特異的ハイブリダイゼーションを作用させるのに、同一性及び数の点で十分なヌクレオチド配列を含んでよい。そのようなオリゴヌクレオチドは、「ｍＲＮＡに相補な」として記載されることと共通である。オリゴヌクレオチドは、ゲノムの範囲のヌクレオチド配列に向けられてもよい。オリゴヌクレオチドは、動物及びヒトにおける疾患の状態の治療において治療モイエティとして用いられた。
【００２９】
本発明によれば、アンチセンスオリゴヌクレオチドのための好ましい遺伝子内の部位は、当該遺伝子のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の翻訳開始又は停止コドンを包含する領域である。他の標的領域は、５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）及び３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）を含む。ｍＲＮＡのスプライスの部位は好ましくは標的領域であってもよい。標的部位が同定されたなら、オリゴヌクレオチドは、標的に対して十分相補な、即ち所望の効果を提供するために十分うまく且つ十分な特異性をもってハイブリダイズするように、選択される。
【００３０】
本発明によれば、「オリゴヌクレオチド」は、リボ核酸又はデオキシリボ核酸のオリゴマー又はポリマーを意味する。この用語は、天然に生じる核酸塩基（nucleobases）、糖及び共有結合内部糖（バックボーン）結合からなるオリゴヌクレオチド並びに同様に機能する非天然に生じる部分を有するオリゴヌクレオチドを含む。修飾されたか又は置換されたオリゴヌクレオチドはしばしば好ましいが、所望の特性、例えば、増強された細胞取り込み、増強された核酸標的親和性及びヌクレアーゼ存在下の増加した安定性のためである。
【００３１】
好ましいオリゴヌクレオチドは、例えば、ホスホロチオエート、ホスホロトリエステル、及びメチルホスホネートを含む。オリゴヌクレオチドは、限定ではないが、２’−ＯＨ，ハロゲン、及びアルキルを含む一つ又は複数の置換された糖モイエティを含んでもよい。発明のオリゴヌクレオチドは、核酸塩基の修飾及び置換を含んでもよい。本明細書にて使用される、「未修飾」又は「天然」核酸塩基は、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）及びウラシル（Ｕ）を含む。修飾された核酸塩基は、例えば、ヒポキサンチン、６−メチルアデニン、５−ｍｅピリミジン、２−アミノアデニン等を含む。
この発明によるオリゴヌクレオチドは、約８から約１５０のヌクレオチドを含んでよい。より好ましくは、当該オリゴヌクレオチドは、約８から約１００ヌクレオチドを含むのが好ましい。より好ましくは、当該オリゴヌクレオチドは、約８から約５０ヌクレオチドを含むのが好ましい。より好ましくは、当該オリゴヌクレオチドは、約８から約３０ヌクレオチドを含むのが好ましい。より好ましくは、そのようなオリゴヌクレオチドは、約１２から２５のヌクレオチドを含む。
【００３２】
本発明のオリゴヌクレオチドは、診断剤、治療剤及び研究試薬等及びキットとして利用することができる。治療剤に関しては、ＷＩＰ−１の発現を変調することにより治療され得る疾患又は異常を有する疑いのある動物、好ましくはヒトを、この発明によるオリゴヌクレオチドを投与することにより治療する。発明のオリゴヌクレオチドは、有効な量のオリゴヌクレオチドを適切な薬学上受容可能な希釈剤又は担体に添加することにより、薬学組成物中で利用できる。上記オリゴヌクレオチドの用途及び発明の方法は、予防上も有用かもしれない。
【００３３】
本発明のオリゴヌクレオチドは、細胞又は組織サンプルにおいてＷＩＰ−１特異的核酸の存在に関しての診断剤として使用することができる。例えば、ポリヌクレオチドキナーゼを用いて５’末端において32Ｐ標識することにより、放射性標識されたオリゴヌクレオチドを製造することができる。Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９，第２巻、１０５９頁を参照。放射性標識されたオリゴヌクレオチドは、次に、ＷＩＰ−１のｍＲＮＡを含む疑いのある細胞サンプル又は組織サンプルに接触させ、そしてサンプルを洗浄することにより、未結合のオリゴヌクレオチドを除去する。サンプル中に残る放射活性は結合したオリゴヌクレオチドの存在を示し、今度は上記オリゴヌクレオチドに相補な核酸の存在を示し、シンチレーションカウンター又は他の日常的な手段を用いて定量することができる。これらの蛋白質をコードする核酸の発現が、即ち検出される。
【００３４】
本発明の放射性標識されたオリゴヌクレオチドは、研究、診断又は治療の目的のために、ＷＩＰ−１の局在、分配及び定量を決定するため、組織のオートラジオグラフを実施するために使用することもできる。そのような研究においては、組織切片を放射性標識されたオリゴヌクレオチドにより処理して上記のとおりに洗浄し、そして次に、日常のオートラジオグラフの手法に従い写真のエマルジョンに暴露される。エマルジョンは、現像された場合に、ＷＩＰ−１遺伝子を発現する領域にわたって銀粒子のイメージを生じる。銀粒子の定量は、ＷＩＰ−１蛋白質をコードするｍＲＮＡ分子の発現の検出を可能にし、そしてこれらのエリアに対するオリゴヌクレオチドの標的化を可能にする。
【００３５】
オリゴヌクレオチド又はそれを生産するベクターは、薬学組成物中に製剤化することができる。発明による薬学組成物は、薬学上受容可能な担体又は媒体、例えば塩水をさらに含む核酸分子と化合した送達成分を含む。核酸の首尾良い送達を可能にさせる如何なる媒体も使用してよい。当業者は、本発明において使用してよい薬学上受容可能な多数の媒体を容易に理解するはずである。適切な薬学上の担体は、引用により本明細書に編入される、この分野の標準の参照用テキストである、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ａ．Ｏｓｏｌに記載される。
【００３６】
幾つかの態様において、薬学組成物は、Ｗｉｐ−１又はその断片を含む。好ましい態様においては、上記断片がＷＮＶ  Ｃｐに結合する。好ましい態様において、断片は可溶性であり、即ち、それらは可溶性成分として体液、特に血液中に注射してよい。断片は、少なくとも８、好ましくは１０を超えるＷｉｐ−１由来のアミノ酸を含み、そして非−Ｗｉｐ−１配列を含んでよい。幾つかの態様において、断片は、少なくとも１５、好ましくは２０を超え、より好ましくは２５又はそれ以上、より好ましくは３０又はそれ以上、より好ましくは４０又はそれ以上、より好ましくは５０、より好ましくは６０又はそれ以上、より好ましくは７０又はそれ以上、より好ましくは８０又はそれ以上、より好ましくは９０又はそれ以上、より好ましくは１００又はそれ以上、より好ましくは１０５又はそれ以上、より好ましくは１１０又はそれ以上、より好ましくは１２０又はそれ以上、より好ましくは１３０又はそれ以上、より好ましくは１４０又はそれ以上、より好ましくは１５０又はそれ以上、より好ましくは１６０又はそれ以上、より好ましくは１７０又はそれ以上、より好ましくは１８０又はそれ以上、より好ましくは１９０又はそれ以上、より好ましくは２００又はそれ以上、より好ましくは２１０又はそれ以上、より好ましくは２２０又はそれ以上、より好ましくは２３０又はそれ以上、より好ましくは２４０又はそれ以上、より好ましくは２５０又はそれ以上、より好ましくは２６０又はそれ以上、より好ましくは２７０又はそれ以上、より好ましくは２８０又はそれ以上、より好ましくは２９０又はそれ以上、より好ましくは３００又はそれ以上、より好ましくは３２０又はそれ以上、より好ましくは３３０である。断片は、Ｗｉｐ−１からのアミノ酸を含んでよく、そして非Ｗｉｐ−１配列を含んでよい。薬学組成物は、無菌であって発熱物質を含まない注射可能な組成物であることが好ましい。
【００３７】
局所投与のための製剤は、経皮パッチ、軟膏、ローション、クリーム、ゲル、ドロップ、座剤、スプレー、液体及び粉末を含んでよい。慣用の薬学上の担体、水、粉末、又は油性塩基濃縮剤等が必要又は所望かもしれない。経口投与のための組成物は、粉末又は顆粒、懸濁液又は水溶液又は非水性媒体、カプセル、香粉（sachets）、タブレットを含む。濃縮剤、芳香剤、希釈剤、乳化剤、分散補助剤又は結合剤が望まれるかもしれない。非経口、静脈内、鞘内（intrathecal）又は心室内投与のための組成物は、滅菌水溶液を含んでよく、バッファー、希釈剤及び他の適切な付加物を含んでもよく、好ましくは無菌であって発熱物質を含まない。本発明による静脈内投与に適した薬学組成物は、無菌であって発熱物質を含まない。
【００３８】
本発明の薬学組成物は、動物の体内において剤の活性部位を活性剤に到達させることを可能にする如何なる手段によって投与されてもよい。本発明の薬学組成物は、局所治療が望まれるか又は全身治療が望まれるかに依存し、そして治療されるエリアに依存して、多数の方法により投与してよい。投与は、局所（眼内、膣内、直腸内、鼻内、経皮を含む）、経口又は非経口であってよい。非経口投与は、静脈内ドリップ、皮下、腹膜内又は筋肉内注射、肺投与を含み、例えば、吸入（inhalation）又は吸入（insufflation）、又は鞘内（intrathecal）又は心室内投与による。
【００３９】
用量は、公知の因子、例えば特定の剤の薬力学上の特性、及びその様式及び投与経路；レシピエントの年齢、健康状態及び体重；兆候の性質及び範囲、併用する治療法の種類、治療の頻度、及び所望の効果に依存して、変動する。治療用組成物の製剤及びその後のそれらの投与は、当業者の範囲内と信じられる。
【００４０】
ＷＩＰ−１に結合する抗体を生産するハイブリドーマ、及び抗体それら自身は、ＷＩＰ−１及びＷＩＰ−１を含む蛋白質の複合体の単離及び精製に有用である。さらに、抗体は、ＷＩＰ−１の活性の特異的阻害剤である。ＷＩＰ−１に特異的に結合する抗体は、よく知られた技術及び容易に入手可能な出発物質を用いて、天然源から蛋白質を精製するのに使用してよい。そのような抗体は、組換えＤＮＡ方法論により蛋白質を生産する場合に、存在する物質から蛋白質を精製するのにも使用してよい。
【００４１】
本明細書にて使用される、用語「抗体」は、完全な（complete）、手を付けていない（intact）抗体、及びそのＦａｂ断片及びＦ（ａｂ）2断片を指すことを意味する。完全な、手を付けていない抗体は、モノクローナル抗体、例えば、マウスモノクローナル抗体、キメラ抗体及びヒト化抗体を含む。幾つかの態様において、抗体は、ＷＩＰ−１のエピトープに特異的に結合する。エピトープに結合する抗体は、よく知られた技術、例えば親和性クロマトグラフィーを用いて天然源又は組換え発現系からその蛋白質を単離及び精製するのに使用される。そのような抗体は、細胞が蛋白質を発現しているなら、サンプル中でそのような蛋白質を検出するのに有用である。
【００４２】
抗体の生産及び完全な、手を付けていない抗体、及びそのＦａｂ断片及びＦ（ａｂ）2断片の蛋白質の構造及びそのような分子をコードする遺伝子配列の構成は、よく知られており、そして例えば、Ｈａｒｌｏｗ，Ｅ．ａｎｄ  Ｄ．Ｌａｎｅ（１９８８）ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹに記載されており、引用により本明細書に編入される。簡単に言えば、例えば、ＷＩＰ−１又はその免役原性断片をマウスに注射する。マウスの脾臓を取り出して、脾臓細胞を単離して、不死のマウス細胞と融合させる。ハイブリッド細胞、又はハイブリドーマを培養し、そして抗体を分泌する細胞を選択する。抗体を分析し、そしてＷＩＰ−１に特異的に結合することがわかったら、それらを生産するハイブリドーマを培養することにより、抗体の連続した供給を生じさせる。
【００４３】
本発明の別の側面は、抗−ＷＮＶ化合物を同定する方法に関する。この側面によれば、ＷＩＰ−１又はＣｐに相互作用することが知られているＷＩＰ−１の断片を、Ｃｐ又はＷＩＰ−１に相互作用するＣｐの断片と接触させて、試験化合物の存在下でＧ２／Ｍの移行を妨害又は阻害する。ＷＩＰ−１又はＣｐに相互作用することが公知のＷＩＰ−１の断片の、Ｃｐ又はその断片に対する親和性を測定し、そして試験化合物不在下での、ＷＩＰ−１又はＣｐに相互作用することが公知のＷＩＰ−１の断片の、Ｃｐ又はその断片に対する親和性と比較する。ＣｐのＰＡＰ１への結合を破壊することができる化合物は、抗−ＷＮＶ化合物として有用かもしれない。この薬剤スクリーニングアッセイにおける陽性対照の例は、Ｃｐに関してＷＩＰ−１と競合的に結合する抗−ＷＩＰ−１抗体のはずである。この薬剤スクリーニングアッセイにおける陽性対照の別の例は、ＷＩＰ−１に関してＣｐと競合的に結合する抗−Ｃｐ抗体のはずである。そのような抗体は、Ｃｐ／ＷＩＰ−１相互作用を破壊する公知の化合物として有用である。公知の量のＣｐ及びＷＩＰ−１を、結合に関して適した条件下で化合してよい。発明の幾つかの態様において、試験化合物の好ましい濃度は、１μＭから５００μＭの間である。好ましい濃度は１０μＭと１００μＭの間である。幾つかの好ましい態様においては、試験化合物の連続希釈を使用することが望まれる。
【００４４】
本発明の別の側面は、ＷＩＰ−１／ＰＡＰ−１相互作用を阻害し、よってそのような分子複合体を有する細胞内でアポトーシスを誘導する化合物を同定する方法に関する。この側面によれば、ＷＩＰ−１又はＰＡＰ−１に相互作用することが知られているＷＩＰ−１の断片を、ＰＡＰー１又はＷＩＰ−１に相互作用することが知られているＰＡＰ−１断片に接触させる。ＷＩＰ−１又はその断片のＰＡＰ−１又はその断片に対する親和性を測定し、そして試験化合物不在下での、ＷＩＰ−１又はその断片の、ＰＡＰ−１又はその断片に対する親和性と比較する。ＰＡＰ−１のＷＩＰ−１への結合を破壊することができる化合物は、抗−癌化合物として有用かもしれない。この薬剤スクリーニングアッセイにおける陽性対照の例は、ＰＡＰ−１に関してＷＩＰ−１と競合的に結合する抗−ＷＩＰ−１抗体のはずである。この薬剤スクリーニングアッセイにおける陽性対照の別の例は、ＷＩＰ−１に関してＰＡＰ−１と競合的に結合する抗−ＰＡＰ−１抗体のはずである。そのような抗体は、ＰＡＰ−１／ＷＩＰ−１相互作用を破壊する公知の化合物として有用である。公知の量のＰＡＰ−１及びＷＩＰ−１を、結合に関して適した条件下で化合してよい。発明の幾つかの態様において、試験化合物の好ましい濃度は、１μＭから５００μＭの間である。好ましい濃度は１０μＭと１００μＭの間である。幾つかの好ましい態様においては、試験化合物の連続希釈を使用することが望まれる。本発明は、さらに以下の実施例において例示されるが、いかなる意味においても限定することを意図しない。
実施例
ウエストナイルウイルスは、約１１ｋｂのプラスの極性のＲＮＡゲノムの一本鎖ＲＮＡウイルスである。直径約３０ｎｍのヌクレオキャプシッドは、キャプシッドとゲノミックＲＮＡからなる。ＷＮＶのキャプシッド（Ｃｐ）をコードするｃＤＮＡのクローン化及び発現、及びＷＮＶ／ＣＰ−ＤＮＡの免役源としてのマウスにおける使用は、報告されている。ＷＮＶのＣｐの特性決定は、それが病原性蛋白質であって、インビボ及びインビトロにおいてミトコンドリア媒介経路を通してアポトーシスを誘導することを明らかにした。酵母の２−ハイブリッド系を用いてこのキャプシッド蛋白質に関しての可能性のある細胞内受容体として作用するかもしれない細胞蛋白質の検索において、Ｃｐにより相互作用される、我々が仮にＷＩＰ−１（ウエストナイルキャプシッド相互作用蛋白質（West Nile capsid interacting protein））と命名した新規な３４３ａａの蛋白質をコードするヒトｃＤＮＡが同定された。免役ブロッティングの目的のため、ＨＡエピトープをインフレームにて、この蛋白質のアミノ末端エンドに融合させた。ｐｃＷｉｐから調製されたインビトロ翻訳された蛋白質の産物は、約３８ｋＤの質量の蛋白質の合成を明らかにした。ＷＮＶのＣｐとそのリガンドの間の物理的相互作用は、35Ｓ−標識されたインビトロ翻訳蛋白質を用いることにより確認した。この発現プラスミドをトランスフェクトされて、35Ｓ−標識されたメチオニンを用いた細胞の簡単な代謝標識をされた細胞から調製された溶解物のＳＤＳ分析は、インビトロ翻訳された生成物の分子質量に相当する蛋白質の移動度を示した。一過性の発現の研究は、この蛋白質が核周囲の領域において局在する典型的なドーナッツ構造をもって、細胞質領域中に明確に局在することを示す。Ｃｐとそのリガンドを共に発現する細胞のほとんどにおいて、ＷＩＰは核領域においてＣｐと共に局在する。これは、細胞内部でのこれらの細胞間の明確な相互作用を示す。Ｃｐとそのリガンドの幾つかの欠失変異体並びに部位特異的変異体は、オーダーマップ中において、それらの相互作用ドメインを構成した。これらの部位特異的変異体のいくつかは、全体的に変更された局在パターンを呈した。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１】図１は、ＷＩＰ−１，ＰＡＰ−１，ＷＮＶ  Ｃｐ及びＰＭ−１の様々な相互作用を示す。
【図２】図２は、ＨＡ融合蛋白質を含むＷＩＰ−１のｃＤＮＡ配列及びアミノ酸配列（配列番号：１及び配列番号：２）を示す。
【図３】図３は、ＷＩＰ−１のｃＤＮＡ配列及びアミノ酸配列（配列番号：１及び配列番号：２）を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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2004529652.tif 000035
2004529652.tif 000036
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