(57)【要約】野生型ヒトＢｃｌ−２タンパク質から派生した変異タンパク質が開示される。Ｂｃｌ−２のプログラム細胞死阻害能を阻止する物質を同定するためのアッセイも、開示される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
野生型ヒトＢｃｌ−２タンパク質から派生した変異タンパク質であって、該野生型ヒトＢｃｌ−２タンパク質に由来するフレキシブルループを含むアミノ酸残基の配列が、少なくとも２個の酸性アミノ酸を含む交換アミノ酸配列に交換されている、変異タンパク質。
【請求項２】
交換アミノ酸配列が、ヒトＢｃｌ−ｘＬタンパク質に由来するフレキシブルループの少なくとも一部の配列を含む、請求項１に記載の変異タンパク質。
【請求項３】
交換アミノ酸配列が配列番号１の配列を含む、請求項２に記載の変異タンパク質。
【請求項４】
交換アミノ酸配列が、少なくとも４〜約５０アミノ酸残基の配列を含む、請求項１に記載の変異タンパク質。
【請求項５】
該酸性アミノ酸が、グルタミン酸及びアスパラギン酸からなる群より独立に選択される、請求項１に記載の変異タンパク質。
【請求項６】
ヒトＢｃｌ−２タンパク質に由来するフレキシブルループをコードする該アミノ酸残基が、該ヒトＢｃｌ−２タンパク質のアミノ酸３５〜９１を含む、請求項１に記載の変異タンパク質。
【請求項７】
野生型Ｂｃｌ−２より低い等電点を有している、請求項１に記載の変異タンパク質。
【請求項８】
【化１】
2004526673.tif 000011
を含むアミノ酸配列を有している変異タンパク質。
【請求項９】
Ｂｃｌ−２タンパク質と結合する物質を同定するためのアッセイであって、
（ａ）試験すべき候補物質を準備する工程；
（ｂ）請求項１の変異タンパク質と強固に結合することができる標識されたペプチドを準備する工程；
（ｃ）標識されたペプチドと該変異タンパク質との複合体を形成させる工程；
（ｄ）候補物質を、標識されたペプチド／変異タンパク質複合体と接触させることにより、反応混合物を形成させる工程；
（ｅ）候補物質が、反応し、標識されたペプチドを追い出すことを可能にするために十分な条件の下で、反応混合物をインキュベートする工程；及び
（ｆ）該変異タンパク質との結合から追い出された標識されたペプチドの量を決定する工程を含むアッセイ。
【請求項１０】
ペプチドが、放射性同位体、蛍光モエティ、酵素、特異的結合分子又は粒子で標識されている、請求項９に記載のアッセイ。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【技術分野】
本発明は、野生型ヒトＢｃｌ−２から派生した変異Ｂｃｌ−２タンパク質に関する。本発明のタンパク質は、Ｂｃｌ−２のプログラム細胞死阻害能を阻止する物質を同定するための生物学的アッセイにおいて使用されうる。
【０００２】
【背景技術】
アポトーシス又はプログラム細胞死（以後、「ＰＣＤ」と呼ぶ）は、高等生物における発生及びホメオスタシスの高度に保存された不可欠の特徴である。Ｋｅｌｅｋａｒら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，１７（１２）：７０４０−７０４６（１９９７）。アポトーシスは、身体が、旧細胞を新たな健康な細胞に交換するための、又は遺伝学的エラーの子孫への伝達を防止するため細胞が自滅するためのメカニズムである。いくつかの癌においては、例えば、細胞増殖及び／又は細胞死の改変が、これらの過程を制御する「キー」遺伝子の数個の変異の蓄積によることが、一般的に認められている。正常な系は、これらの変異した遺伝子を含有している細胞を排除することができず、その結果、調節されない細胞増殖が起こる。従って、癌及びその他の疾患において観察される細胞増殖又はアポトーシスの異常な性質は、細胞増殖と細胞死との平衡を調節する制御経路の機能不全の結果である。
【０００３】
アポトーシス応答の促進又は抑制に関与している一つの分子グループは、Ｂｃｌ−２タンパク質ファミリーである。Ｂｃｌ−２ファミリーは、細胞死を促進するか又は阻害するタンパク質を含有している。抗アポトーシス性タンパク質と呼ばれることが多い阻害剤のいくつかには、Ｂｃｌ−２、Ｂｃｌ−ｘＬ、Ｍｃｌ−１、アデノウイルスＥ１Ｂ  １９Ｋ、エプスタインバーウイルスＢＨＲＦ１、及びカエノラブディティス・エレガンス（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ）Ｃｅｄ−９が含まれる。アポトーシス促進性タンパク質と呼ばれることが多い細胞死の促進剤には、例えばＢａｘ、Ｂａｋ、Ｂａｄ、Ｂｉｋ、Ｂｉｄ、及びＢｃｌ−ｘＳが含まれる。Ｂｃｌ−２ファミリーの重要な特徴は、そのメンバーが、自己又はファミリーの他のメンバーと相互作用（即ち、二量化）することができるという点である。（Ｋｅｌｅｋａｒ（前記）。Ｏｔｔｉｌｉｅ，Ｓ．ら，Ｊ．ｏｆ  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７２（４９）：３０８６６−３０８７２（１９９７）も参照のこと）。これらのタンパク質−タンパク質相互作用は、細胞の死シグナルに対する応答の決定において、決定的に重要であると考えられている（Ｋｅｌｅｋａｒ（前記）、Ｙａｎｇら，Ｃｅｌｌ，８０：２８５−２９１（１９９５）も参照のこと）。
【０００４】
Ｂｃｌ−２ファミリーメンバーＢｃｌ−ｘＬの三次元構造は、解明されている（Ｍｕｃｈｍｏｒｅら，Ｎａｔｕｒｅ，３８１：３３５−３４１（１９９６））。Ｂｃｌ−ｘＬの構造は、両親媒性ヘリックスによって囲まれた２個の中央の疎水性ヘリックスを含有している。疎水性結合ポケットが、ＢＨ１、ＢＨ２、及びＢＨ３として知られる３個の特定のドメインの空間的近接によって作出され、死促進タンパク質のための結合部位を提供する。Ｓａｔｔｌｅｒ  Ｍ．ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７５：９８３−９８６（１９９７）。死促進タンパク質が、ＢＨ３ドメインを介してこの結合部位と相互作用することも既知である。Ｉｄ。
【０００５】
癌細胞及びその他の罹患細胞にしばしば存在するＢｃｌ−２及びＢｃｌ−ｘＬのような抗アポトーシス性タンパク質の過剰発現が、アポトーシスシグナルを阻止し、該細胞の増殖を可能にすることは、当分野において既知である。例えば、高レベルのＢｃｌ−２遺伝子発現が、極めて多様なヒト癌において見い出される。さらに、Ｂｃｌ−２及びＢｃｌ−ｘＬを阻止することにより、罹患細胞においてアポトーシスを誘導することができ、アポトーシス過程の障害によって引き起こされた癌及びその他の疾患のための有効な療法を提供することができると考えられている。そこで、Ｂｃｌ−２ファミリーのタンパク質間の相互作用を阻害することにより、アポトーシスを誘発又は誘導する化合物を同定するために使用されうるアッセイが、当分野においては必要とされている。
【０００６】
天然に存在する又は野生型のＢｃｌ−２が、溶液中に置かれた場合に、十分な挙動を示さず凝集することも、当分野において既知である。そのような凝集のため、Ｂｃｌ−２のプログラム細胞死阻害能を阻止する薬物の設計を補助しうる、Ｘ線結晶学又はＮＭＲのような構造研究において、研究者らがＢｃｌ−２を使用することは困難である。さらに、溶液中のＢｃｌ−２の凝集のため、Ｂｃｌ−２のプログラム細胞死阻害能を阻止する物質を同定するためのアッセイにおいて、天然に存在する又は野生型のＢｃｌ−２タンパク質を使用することも困難である。従って、溶液中で凝集せず、構造研究において使用されうる、改変型又は変異型のＢｃｌ−２を開発する必要が、当分野においては存在している。しかしながら、現在までのところ、そのような改変された又は変異したタンパク質を開発する努力は、成功していない。例えば、アンダーソン（Ａｎｄｅｒｓｏｎ）らは、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，１５：１６２−１７０（１９９９）に、「ｒｈＢｃｌ−２」と呼ばれる組換えヒトＢｃｌ−２のクローニング及び発現を記載している。この変異型Ｂｃｌ−２においては、Ｂｃｌ−２の推定フレキシブルループが短小化され、四（４）個のアラニン残基からなるフレキシブルリンカーに交換されている。さらに、Ｂｃｌ−２の疎水性カルボキシ末端が、六（６）個のヒスチジン残基と交換されている。
具体的には、アンダーソンらのＢｃｌ−２欠失変異体は、以下のように要約されうる：Ｂｃｌ−２（６３２）−ＡＡＡＡ−Ｂｃｌ−２（５６−２０６）−ＨＨＨＨＨＨ。アンダーソンらは、それらの変異体を大腸菌において発現させ、それを精製することに成功したが、彼らは、それらの発現タンパク質の溶解度が、調査された条件の下でのＸ線又はＮＭＲに基づく構造研究のための理想より低いことを認めた。そこで、現在、Ｘ線又はＮＭＲに基づく構造研究において使用されうる改変型又は変異型のＢｃｌ−２が、当分野において必要とされている。Ｂｃｌ−２と結合することができる化合物を同定するためのスクリーニングアッセイも、必要とされている。そのようなスクリーニングアッセイは、水溶性Ｂｃｌ−２変異体を用いて達成されうる。
【０００７】
【発明の開示】
本発明は、野生型ヒトＢｃｌ−２タンパク質から派生した変異タンパク質に関する。より具体的には、本発明の変異タンパク質においては、野生型ヒトＢｃｌ−２タンパク質に由来するフレキシブルループを含むアミノ酸残基の配列が、少なくとも２個の酸性アミノ酸を含む異なる配列（即ち、交換アミノ酸配列）と交換されている。酸性アミノ酸は、グルタミン酸もしくはアスパラギン酸、又は両方の組み合わせであり得る。好ましくは、交換アミノ酸配列は、ヒトＢｃｌ−ｘＬタンパク質に由来するフレキシブルループの少なくとも一部の配列を含む。より好ましくは、交換アミノ酸配列は、配列番号１の配列を含む。特に好ましい変異タンパク質は、配列番号２のアミノ酸配列を有している。
【０００８】
本発明の一つの実施形態において、変異タンパク質の交換アミノ酸配列は、少なくとも４〜約５０アミノ酸残基の配列を含む。より好ましくは、交換アミノ酸配列は、少なくとも１６〜約２５アミノ酸残基の配列を含む。
【０００９】
本発明の変異タンパク質は、野生型Ｂｃｌ−２より低い等電点を有している。好ましくは、等電点は、４．５〜約６．０、より好ましくは５．０〜約５．５である。特に好ましい等電点は、５．０である。
【００１０】
本発明は、Ｂｃｌ−２タンパク質と結合する物質を同定するためのアッセイにも関する。該アッセイは、（ａ）試験すべき候補物質を準備する工程；（ｂ）本発明の変異タンパク質と強固に結合することができる標識されたペプチドを準備する工程；（ｃ）標識されたペプチドと変異タンパク質との複合体を形成させる工程；（ｄ）候補物質を、標識されたペプチド／変異タンパク質複合体と接触させることにより、反応混合物を形成させる工程；（ｅ）候補物質が反応し、標識されたペプチドを追い出すことを可能にするために十分な条件の下で、反応混合物をインキュベートする工程；及び（ｆ）該変異タンパク質との結合から追い出された標識されたペプチドの量を決定する工程を含む。好ましくは、ペプチドは、放射性同位体、蛍光モエティ、酵素、特異的結合分子、又は粒子で標識されている。より好ましくは、ペプチドはフルオレセイン化合物で標識されている。最も好ましくは、ペプチドは、フルオレセインイソチオシアネート又は５−カルボキシ−フルオレセインで標識されている。
【００１１】
【発明を実施するための最良の形態】
１．本発明
本発明は、溶液中で凝集せず、Ｂｃｌ−２タンパク質と結合する物質を同定するためのアッセイにおいて使用されうる変異Ｂｃｌ−２タンパク質に関する。
【００１２】
ＩＩ．配列表
本願は、配列表も含有している。ヌクレオチド配列について、塩基対は、以下の塩基コードによって表される。
【００１３】
2004526673.tif 000002
【００１４】
2004526673.tif 000003
本願において示されるアミノ酸は、Ｌ型であり、以下のアミノ酸３文字略号によって表される。
【００１５】
2004526673.tif 000004
【００１６】
ＩＩＩ．本発明のタンパク質
本発明は、天然に存在する又は野生型のヒトＢｃｌ−２タンパク質から派生した変異Ｂｃｌ−２タンパク質に関する。より具体的には、本発明の変異タンパク質は、野生型ヒトＢｃｌ−２タンパク質から派生したアミノ酸残基を含有しているが、野生型タンパク質より低い等電点を示すキメラタンパク質である。従って、天然に存在する又は野生型のヒトＢｃｌ−２タンパク質とは異なり、本発明の変異Ｂｃｌ−２タンパク質は、溶液中で凝集しない。好ましい実施形態において、本発明の変異タンパク質は、天然に存在する又は野生型のヒトＢｃｌ−２タンパク質から派生したアミノ酸残基のみならず、野生型ヒトＢｃｌ−ｘＬタンパク質から派生したアミノ酸残基も含む。本発明の変異Ｂｃｌ−２タンパク質は、溶液中に置かれた場合に凝集しないため、これらのタンパク質は、Ｘ線結晶学及びＮＭＲ構造研究において、そしてＢｃｌ−２のプログラム細胞死阻害能を阻止する候補化合物を同定するためのアッセイにおいて、使用されうる。
【００１７】
本明細書において使用されるように、「等電点」（又は、ｐＩ）という用語は、タンパク質が正味の電荷を保持していないｐＨをさす。Ｂｃｌ−２／ｉｓｏ１、Ｂｃｌ−２／ｉｓｏ２、及びＢｃｌ−２／ｉｓｏ３の等電点は、それぞれ約７．０、７．２、及び７．２である。本発明の変異タンパク質は、野生型Ｂｃｌ−２より低い、好ましくは約４．５〜６．０の範囲の等電点を有している。より好ましくは、本発明の変異タンパク質の等電点は、４．５〜約５．５である。より好ましい等電点は、約５．０〜約５．５である。最も好ましい等電点は、５．０である。タンパク質の等電点を決定するための手段は、当業者に周知である。
【００１８】
本明細書において使用されるように、「天然に存在する」又は「野生型の」Ｂｃｌ−２タンパク質という用語は、ヒトＢｃｌ−２のアイソフォームである３個のタンパク質のうちのいずれかをさす。これらのアイソフォームは、配列番号３、４及び５として示されている。配列番号３に示されたタンパク質は、「アイソフォーム１」（Ｂｃｌ−２／ｉｓｏ１）と呼ばれ、Ｔｓｕｊｉｍｏｔｏ，Ｙ．ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２６：１０９７−１０９９（１９８４）及びＴｓｕｊｉｍｏｔｏ，Ｙ．ら，ＰＮＡＳ，８３：５２１４−５２１８（１９８６）に記載されている。配列番号４に示されたタンパク質は、「アイソフォーム２」（Ｂｃｌ−２／ｉｓｏ２）と呼ばれ、Ｃｌｅａｒｙ，Ｍ．ａｎｄ  Ｓｋｌａｒ．Ｋ．，ＰＮＡＳ，８２：７４３９−７４４３（１９８５）及びＣｌｅａｒｙ，Ｍ．ら，Ｃｅｌｌ，４７：１９−２８（１９８６）に記載されている。配列番号５に示されたタンパク質は、「アイソフォーム３」（Ｂｃｌ−２／ｉｓｏ３）と呼ばれ、Ｂａｋｓｈｉ，Ａ．ら，Ｃｅｌｌ，４１：８９９−９０６（１９８５）及びＳｅｔｏ，Ｍ．ら，ＥＭＢＯ  Ｊ．７：１２３−１３１（１９８８）に記載されている。図１から明らかなように、Ｂｃｌ−２／ｉｓｏ３は、残基４８位においてＢｃｌ−２／ｉｓｏ１及びＢｃｌ−２／ｉｓｏ２と異なっている（Ｉの代わりにＦ）。Ｂｃｌ−２／ｉｓｏ１は、残基９６位及び１１０位において他の２個のアイソフォームと異なっている（それぞれ、Ｔの代わりにＡ、Ｒの代わりにＧ）。
【００１９】
本明細書において使用されるように、「天然に存在する」又は「野生型の」Ｂｃｌ−ｘＬタンパク質という用語は、配列番号６に示されたタンパク質をさし、Ｃｅｌｌ，７４：５９７−６０８（１９９３）に記載されている。
【００２０】
本明細書において使用されるように、「約」という用語は、等電点を修飾するために使用される場合、±５％を意味する。アミノ酸配列の長さを修飾するために使用される場合、「約」は、±２アミノ酸を意味する。
【００２１】
天然に存在する又は野生型のヒトＢｃｌ−ｘＬタンパク質は、溶液中でのタンパク質の完全性を維持するために必要とされない非構造フレキシブルループ（αヘリックス又はβシートのような規則的な二次構造を示さないことを意味する）を含有している（Ｍｕｃｈｍｏｒｅら，Ｎａｔｕｒｅ，３８１：３３５−３４１（１９９６））。このループは、アミノ酸残基３５〜９１（図１及び配列番号６を参照のこと）に見い出される。このループがタンパク質から除去された場合ですら、Ｂｃｌ−ｘＬタンパク質が抗アポトーシス性タンパク質としての機能を保持していることは、当分野において既知である。Ｂｃｌ−ｘＬとＢｃｌ−２との配列相同性に基づき、Ｂｃｌ−２の残基３５〜９１も、非構造であり、タンパク質の完全性の維持にとって不必要であると推測される。これらの非構造ループは、リン酸化のような翻訳後修飾の箇所である。
【００２２】
本発明の変異タンパク質は、ヒトＢｃｌ−２タンパク質から派生したものである。具体的には、本発明の変異ヒトＢｃｌ−２タンパク質は、うち少なくとも２個が酸性アミノ酸、即ちグルタミン酸（Ｇｌｕ）又はアスパラギン酸（Ａｓｐ）である、少なくとも４〜約５０個のアミノ酸残基と交換された、非構造フレキシブルループを形成するアミノ酸残基を有している。酸性アミノ酸は、交換配列内の任意の位置に位置しうる。さらに、交換配列は、一つの型の酸性アミノ酸（即ち、２個以上のＧｌｕ又は２個以上のＡｓｐのいずれか）のみを含んでいてもよいし、又は両方の組み合わせを含んでいてもよい。この記載によって意図されるように、（それが少なくとも２個の酸性アミノ酸を含んでいる限り）、交換配列を構成する酸性アミノ酸の型又は総数に関しては限定されない。
【００２３】
好ましい実施形態において、ヒトＢｃｌ−２タンパク質の非構造フレキシブルループは、残基のうちの少なくとも２個が酸性アミノ酸である、Ｂｃｌ−ｘＬの非構造ループに由来するアミノ酸残基の連続配列に相当する、少なくとも４〜約５０アミノ酸残基の配列に交換される。より好ましくは、Ｂｃｌ−２の非構造フレキシブルループのアミノ酸残基は、ヒトＢｃｌ−ｘＬタンパク質に由来する対応する非構造フレキシブルループに由来する少なくとも１６〜約２５個のアミノ酸残基（うち少なくとも２個は酸性アミノ酸である）に交換される。さらに好ましくは、Ｂｃｌ−２の非構造フレキシブルループの配列全体、アミノ酸残基３５〜９１が、天然に存在する又は野生型のヒトＢｃｌ−ｘＬタンパク質のフレキシブルループの一部をコードする配列ＤＶＥＥＮＲＴＥＡＰＥＧＴＥＳＥ（配列番号１）に交換される。
【００２４】
本発明の変異Ｂｃｌ−２タンパク質は、約１５０〜約１８０個のアミノ酸残基を含有しうる。
【００２５】
好ましい本発明の変異Ｂｃｌ−２タンパク質の例には、これに限定はされないが、
【００２６】
【化２】
2004526673.tif 000005
が含まれる。
【００２７】
前述のように、本発明の変異Ｂｃｌ−２タンパク質は、天然に存在する又は野生型のＢｃｌ−２タンパク質とは異なり、溶液中で凝集しない。理論に拘束されることは望まないが、本発明の発明者らは、Ｂｃｌ−２に由来する非構造フレキシブルループ全体の、ヒトＢｃｌ−ｘＬタンパク質に由来する非構造フレキシブルループの一部への置換は、本発明の変異Ｂｃｌ−２タンパク質をより酸性にし、従って変異Ｂｃｌ−２タンパク質の等電点を、天然に存在する又は野生型のＢｃｌ−２タンパク質と比較して低下させると考えている。より具体的には、本発明者らは、Ｂｃｌ−ｘＬの非構造フレキシブルループからアミノ酸残基４９〜９１が除去された場合、この短小化されたタンパク質が溶液中で良好な挙動を示し、凝集しないことを見出した。この短小化されたＢｃｌ−ｘＬタンパク質の等電点は、約４．９であると決定された。次いで、本発明者らは、Ｂｃｌ−２の非構造フレキシブルループから同じアミノ酸残基（４９〜９１）を除去した。驚くべきことに、この短小化されたタンパク質は、溶液中で良好な挙動を示さず、凝集を示した。この短小化されたＢｃｌ−２タンパク質の等電点は、約６．４であると決定された。本発明者らは、Ｂｃｌ−ｘＬタンパク質及びＢｃｌ−２タンパク質の短小化されたループを比較し、Ｂｃｌ−ｘＬに由来する短小化されたループが、Ｂｃｌ−２に由来する短小化されたループより多くの酸性アミノ酸残基を含有しており、従って短小化されたＢｃｌ−ｘＬタンパク質の等電点が、短小化されたＢｃｌ−２タンパク質より低くなっていることを理解した。本発明者らは、等電点の差が、２個のタンパク質の挙動の差を説明すると考えている。
【００２８】
本発明の変異タンパク質は、約６．０未満、好ましくは約５．５未満の等電点を有している。より具体的には、本発明者らは、Ｂｃｌ−２の非構造フレキシブルループの配列全体、アミノ酸残基３５〜９１を、（天然に存在する又は野生型のヒトＢｃｌ−ｘＬタンパク質のフレキシブルループの一部を表す）アミノ酸残基ＤＶＥＥＮＲＴＥＡＰＥＧＴＥＳＥ（配列番号１）に交換した場合に、この変異Ｂｃｌ−２タンパク質の等電点が約５．０となることを見出した。本発明者らは、この野生型と比較した場合の本発明の変異Ｂｃｌ−２タンパク質の等電点の低下が、変異Ｂｃｌ−２タンパク質が溶液中で凝集しない理由であると考えている。
【００２９】
本発明の変異タンパク質は、組換えＤＮＡ技術のような、当分野において既知の技術を使用して調製されうる。例えば、前記のようなＢｃｌ−２変異タンパク質をコードするヌクレオチド配列を、プラスミドのような適当なＤＮＡベクターに挿入することができる。より具体的には、ヌクレオチド配列は、これらに限定はされないが、ライゲーションのための平滑末端化又は付着末端化、適切な末端を提供するための制限酵素消化、適宜の粘着末端の充填、望ましくない接合を回避するためのアルカリホスファターゼ処理、及び適切なリガーゼによるライゲーションを含む、当分野において既知の技術を使用して、適当なＤＮＡベクターに挿入されうる。そのような操作のための技術は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，ら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第２版，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，Ｎ．Ｙ．，（１９８９）に記載されている。調製後、ヌクレオチド配列は、ＤＮＡベクターに挿入され、ベクターが、適当な宿主を形質転換するために使用される。発現によって、組換え変異タンパク質が、宿主において産生される。形質転換される宿主は、原核細胞又は真核細胞のいずれかであり得る。
【００３０】
本発明のタンパク質は、調製された後、イオン交換、アフィニティ、サイズ排除、又は疎水性相互作用を含む、多数のクロマトグラフィー法によって実質的に精製されうる（Ｃｒｉｇｈｔｏｎ，Ｔ．，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ，ＷＨ  Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．（１９８３））。本発明の合成タンパク質の組成は、アミノ酸分析又は（エドマン分解法を使用した）配列決定により確認されうる。本発明の変異タンパク質は、スクリーニングアッセイにおいて使用されうる。より具体的には、本発明の変異タンパク質は、Ｂｃｌ−２のプログラム細胞死阻害能を阻止する低分子を同定するために使用されうる。
【００３１】
ＩＶ．本発明のタンパク質を使用したスクリーニングアッセイ
本発明は、本発明の変異Ｂｃｌ−２タンパク質と結合することができ、従ってプログラム細胞死を阻害する候補化合物を同定するための多様なスクリーニングアッセイに関する。本発明のアッセイは、候補化合物が、本発明の変異Ｂｃｌ−２タンパク質と結合し、ペプチドのような標識されたプローブ分子を追い出すことができるか否かに焦点を当てる。
【００３２】
本発明のスクリーニングアッセイは、Ｂｃｌ−２と結合することができる化合物を同定するため、多数の化合物をスクリーニングするために使用されうる。Ｂｃｌ−２化合物と結合することが同定された化合物は、抗癌剤として臨床的に使用されうる。具体的には、これらの化合物は、ある種の癌の治療において、Ｂｃｌ−２を過剰発現している癌細胞のアポトーシスを促進するために使用されうる。スクリーニングアッセイにおいて活性を有していない化合物は、候補化合物としてのさらなる検討から排除されうる。
【００３３】
スクリーニングすべき候補化合物は、多数の化学クラスを包含しうる。しかしながら、候補化合物は、典型的には、有機分子、好ましくは約１５０〜約８００ダルトンの分子量を有する小さい有機化合物である。そのような候補化合物は、タンパク質との構造的相互作用、特に水素結合に必要な官能基を含有しているべきであり、典型的には少なくとも１個のアミン基、カルボニル基、ヒドロキシル基、又はカルボキシル基を含み、好ましくは官能化学基のうちの少なくとも２個を含む。候補化合物は、しばしば、前記の官能基のうちの１個以上で置換された、環式炭素構造もしくは複素環式構造及び／又は芳香族構造もしくは多環芳香族構造を含有している。候補化合物は、ペプチド、糖類、脂肪酸、ステロイド、プリン、ピリミジン、それらの誘導体、構造類似体、又は組み合わせを含む生体分子の中にも見出されうる。
【００３４】
候補化合物は、合成又は天然の化合物のライブラリーのような極めて多様な起源から入手されうる。例えば、ランダム化されたオリゴヌクレオチド及びオリゴペプチドの発現を含む、極めて多様な有機化合物及び生体分子のランダム合成及び指向的合成のための多数の手段が利用可能である。別法として、細菌、真菌、植物、及び動物の抽出物の形態の天然化合物のライブラリーが、入手可能であるか、又は容易に作製される。さらに、天然の、又は合成的に作製されたライブラリー及び化合物を、従来の化学的、物理的、及び生化学的な手段によって容易に修飾することができ、コンビナトリアルライブラリーを作製するために使用することができる。既知の薬理学的薬剤に、アシル化、アルキル化、エステル化、アミド化等のような、指向的又はランダムな化学修飾を施し、構造類似体を作製することも可能である。
【００３５】
競合結合アッセイにおいて、候補化合物は、固体表面と結合した結合剤の部位との特異的結合に関して、標識された分析物と競合することができる。そのようなアッセイにおいて、標識された分析物は、標識されたペプチドであってよく、結合剤は、固相と結合した本発明の変異Ｂｃｌ−２タンパク質であってよい。結合アッセイにおいて、結合剤と結合した標識された分析物の濃度は、候補化合物の競合能と反比例する。候補化合物による標識された分析物の阻害の量は、結合アッセイの条件、並びに使用される結合剤、標識された分析物、及び候補化合物の濃度に依存する。競合結合アッセイにおいて、一定のアッセイ条件の下で、標識された分析物の結合剤との結合の量が、１０パーセント（１０％）以上減少する場合、候補化合物は、本発明の変異Ｂｃｌ−２タンパク質と結合することができると見なされる。直接結合アッセイにおいては、測定されたシグナルが、バックグラウンドレベルの２倍以上である場合に、候補化合物は、本発明の変異Ｂｃｌ−２タンパク質と結合する。
【００３６】
競合結合アッセイにおいて、候補化合物は、標識された分析物と、本発明の変異Ｂｃｌ−２タンパク質との結合に関して競合する。本明細書に記載されるように、未結合の標識された分析物から、結合した標識された分析物を分離するため、結合剤を固体表面と結合させることができる。別法として、競合結合は、液相で実施されてもよく、当分野において既知の多様な技術が、結合した標識された分析物の放出を検出するため、又は未結合の標識された分析物から、結合した標識された分析物を分離するため、使用されうる。分離後、結合した標識された分析物の量が決定される。試料中に存在するタンパク質の量は、結合した標識された分析物の量と反比例する。
【００３７】
別法として、分離工程が必要とされない均一結合アッセイが実施されうる。これらの型のアッセイにおいては、候補化合物の変異Ｂｃｌ−２タンパク質との結合によって、標識された分析物が追い出され、その後、分析物によって放射されるシグナルが変化する。
【００３８】
本発明の変異Ｂｃｌ−２タンパク質と結合することができる候補化合物を検出するための競合結合アッセイの例は、本明細書の実施例２に記載される。
【００３９】
前述のように、本明細書に記載されたスクリーニングアッセイは、１個以上の標識された分子を利用する。本発明のアッセイにおいて使用される標識は、直接的又は間接的に検出可能なシグナルを提供するものであり得る。使用されうる様々な標識には、放射性同位体、蛍光化合物、化学発光化合物、生物発光化合物、酵素、特異的結合分子、粒子、例えば磁気粒子等が含まれる。特異的結合分子には、ビオチンとストレプトアビジン、ジゴキシンとアンチジゴキシン（ａｎｔｉｄｉｇｏｘｉｎ）等のような対が含まれる。特異的結合メンバーについては、通常、相補メンバーが、既知の手法に従い、検出を提供する分子で標識される。さらに、これらの標識の本発明の変異タンパク質との結合は、当分野において既知の標準的な技術を使用して達成される。
【００４０】
その他の多様な試薬が、スクリーニングアッセイに含まれうる。これらには、最適なタンパク質−タンパク質結合を助長するため、かつ／又は非特異的な、もしくはバックグラウンドの相互作用を低下させるために使用される、塩、中性タンパク質、例えばアルブミン、界面活性剤等のような試薬が含まれる。プロテアーゼ阻害剤、ヌクレアーゼ阻害剤、抗微生物剤等のようなアッセイの効率を改良する試薬も、使用されうる。成分の混合物は、必要な結合を提供する任意の順序で添加される。インキュベーションは、任意の適当な温度、典型的には約０℃から約４０℃で実施されうる。インキュベーション時間は、最適な活性のため選択される。典型的には、約０．０５時間から１０時間のインキュベーションが、十分である。
【００４１】
以下、制限ではなく例示のため、本発明の実施例を示す。
【００４２】
実施例１
変異Ｂｃｌ−２タンパク質の調製
プラスミドの構築：ＮＭＲ構造研究のための適性に関して後に評価される変異Ｂｃｌ−２タンパク質の作製のための核酸構築物を調製した。これらの構築物の生成において使用された試薬は、全て、商業的に利用可能な供給元より得た。一般的に、核酸断片は、標準的なＰＣＲ技術によって調製し、当分野において周知の手段によって商業的ベクターへとクローニングした。配列は、全て、ＡＢＩプリズム（Ｐｒｉｓｍ）３７７ＤＮＡシーケンサー（ＰＥ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）上での分析によって確認した。ＰＣＲ断片を増幅するために使用した順方向プライマー及び逆方向プライマーを、以下の表Ｉに示す。
【００４３】
【表１】
2004526673.tif 000006
【００４４】
まず、ベーリンガー・マンハイム社（ＢＯＥＨＲＩＮＧＥＲ−ＭＡＮＮＨＥＩＭ  Ｃｏｒｐ．）（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）のＲＴ−ＰＣＲキットを使用して、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）により、Ｂｃｌ−２のアミノ酸１〜２１８をコードする断片を調製した。その断片は、製造業者によって提案された条件の下で、プライマー配列、配列番号７及び配列番号８、並びに鋳型としてのダウディ（Ｄａｕｄｉ）ｍＲＮＡ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）を使用して生成させた。まず、その断片を、発現のため、プラスミドｐＥＴ３０ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）のＮｄｅＩ／Ｘｈｏｌ部位へとクローニングした。得られたプラスミドを、プラスミドＡと名付けた。
【００４５】
次いで、配列番号３のアミノ酸１〜３４（Ｂｃｌ−２／ｉｓｏ１）、配列番号６のアミノ酸２９〜４４（Ｂｃｌ−ｘＬループ）、及び配列番号３のアミノ酸９２〜２１８（Ｂｃｌ−２／ｉｓｏ１）をコードする断片を含有している第二のプラスミド（プラスミドＢ）を生成させた。その断片は、プライマーとしての配列番号９及び１０、テンプレートとしてのプラスミドＡ、並びに以下のサイクル条件：９４℃４分１サイクル、９４℃４０秒１サイクル、５５℃４５秒；６８℃６分１５サイクル、及び７２℃１０分１サイクルを使用して、エクスパンドロング（ＥｘｐａｎｄＬｏｎｇ）ＰＣＲキット（ＢＯＥＨＲＩＮＧＥＲ−ＭＡＮＮＨＥＩＭ  Ｃｏｒｐ．，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）を用いて生成させた。プライマー配列は、（１）（配列番号３のアミノ酸３５〜９１をコードするヌクレオチドを含有している）プラスミドＡの介在配列を削除するために「逆」方向で増幅し、かつ（２）Ｂｃｌ−ｘＬループ（配列番号６のアミノ酸２９〜４４）をコードするヌクレオチドを含有するよう、設計された。その後の増幅された断片のライゲーションによって、プラスミドＢが生じた。
【００４６】
配列番号３のアミノ酸１〜３４（Ｂｃｌ−２／ｉｓｏ１）、配列番号６のアミノ酸２９〜４４（Ｂｃｌ−ｘＬループ）、及び配列番号３のアミノ酸９２〜２０７（Ｂｃｌ−２／ｉｓｏ１）をコードする断片を含有している第三のプラスミド（プラスミドＣ）を構築した。断片は、標準的なＰＣＲ試薬、Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ、並びにプライマーとしての配列番号１１及び１２を使用して、以下のサイクル条件：９４℃４分１サイクル、９４℃３０秒；５５℃４５秒；７２℃２分３０サイクル、７２℃１０分１サイクルを用いて、（テンプレートとしての）プラスミドＢから生成させた。得られた断片を、ｐＥＴ２８ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）のＮｄｅＩ／ＸｈｏＩ部位へとクローニングし、プラスミドＣを形成させた。
【００４７】
Ｂｃｌ−２／ｉｓｏ２に関するプラスミド（プラスミドＤ）の構築のため、プラスミドＣをＤＮＡテンプレートとして使用した。アラニン９６及びグリシン１１０を、２セットのプライマー：配列番号１３及び１４（Ａｌａ９６からＴｈｒ９６への変異のため）、並びに配列番号１５及び１６（Ｇｌｙ１１０からＡｒｇ１１０への変異のため）を使用して、それぞれトレオニン９６及びアルギニン１１０へと変化させた。変異した配列は、製造業者の指示に従い、ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）（登録商標）クイックチェンジ（Ｑｕｉｃｋ  Ｃｈａｎｇｅ）キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（登録商標），Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を使用して得た。
【００４８】
Ｂｃｌ−２ミューテイン（ｍｕｔｅｉｎ）の発現及び精製：１５ＮＨ４Ｃｌ、１５ＮＨ４Ｃｌ＋［Ｕ−１３Ｃ］グルコース、又は１５ＮＨ４Ｃｌ、［Ｕ−１３Ｃ］グルコース、及び７５％２Ｈ２Ｏを含有しているＭ９培地で増殖させた大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞において、Ｂｃｌ−２ミューテインを発現させた。対数増殖期（ｍｉｄ−ｌｏｇ  ｐｈａｓｅ）に、１ｍＭイソプロピル−Ｄ−チオガラクトピラノシドで、３０℃で３時間、細胞を誘導した。細胞を、２０ｍＭトリス−Ｃｌ（ｐＨ７．８）、１．５Ｍ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ２−メルカプトエタノールに再懸濁させ、次いで、フレンチプレスによって溶解させた。可溶性画分を、Ｎｉ２＋−アガロースカラムに担荷させ、同じカラム緩衝液で洗浄し、次いで２０ｍＭイミダゾール、２０ｍＭトリス−Ｃｌ（ｐＨ７．８）、１．５Ｍ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ２−メルカプトエタノールで洗浄し、最後に５００ｍＭイミダゾール、２０ｍＭトリス−Ｃｌ（ｐＨ７．８）、５ｍＭ  ２−メルカプトエタノールで溶出させた。溶出したＢｃｌ−２画分を、製造業者（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）の提案するプロトコルに従い、ビオチン化トロンビンで処理した。ビオチン化トロンビン（０．５単位）を使用して、室温で１６時間、タンパク質１ｍｇを分解した。ストレプトアビジンアガロース（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を添加することにより分解反応を停止させ、２０ｍＭトリス−Ｃｌ（ｐＨ７．５）で３倍に希釈し、もう一つの予め平衡化しておいたＮｉ２＋カラムへと通した。ｈｉｓタグを含まない素通りＢｃｌ−２画分を収集した。精製されたＢｃｌ−２ミューテインを濃縮し、４℃で保存した。精製されたＢｃｌ−２ミューテインのＮ末端タンパク質配列決定を、４７７Ａプロテインシーケンサー（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ）（ＰＥ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ，Ｆｏｒｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，Ｃａ）上で実施した。タンパク質濃度は、ピアース（Ｐｉｅｒｃｅ）（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）のクーマシータンパク質アッセイキット及びＵＶを使用して決定した。
【００４９】
実施例２
ペプチドのＢｃｌ−２／ｉｓｏ１に対する親和性を測定するための競合結合アッセイ
競合蛍光偏光アッセイを使用して、様々なペプチドのＢｃｌ−２／ｉｓｏ１（表２参照）又はＢｃｌ−２／ｉｓｏ２（表３参照）に対する親和性を測定した。競合アッセイは、プローブとして以下の３個のフルオレセイン標識ペプチドのうちの１個を使用して実施した：
【００５０】
【化３】
2004526673.tif 000007
（Ｓｙｎｐｅｐ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｄｕｂｌｉｎ，ＣＡより入手）
【００５１】
【化４】
2004526673.tif 000008
これらのフルオレセイン化ペプチドのＢｃｌ２／ｉｓｏ１からの解離定数は、それぞれ、およそ２０ｎＭ、およそ５０ｎＭ、およそ１００ｎＭである。
【００５２】
全ての滴定を、滴定を実施するための特別プロトコルで修飾されたアボット（Ａｂｂｏｔｔ）臨床診断装置（ＩＭｘ、ＦＰＩＡモード）によって自動化した。適切な一部分を最初の７本のチューブへ移し、中間の希釈されたストックからの一部分を次の７本へ移し、もう一つの中間希釈物を最後の６本へ移すことにより、２０個の別々の２ｍＬ試料から構成された完全な２倍希釈系列を得た。全てのストック及び試料のための希釈緩衝液は、０．０１％ウシガンマグロブリン及び０．１％アジ化ナトリウムを含む１２０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．５５）であった。ペプチドのＤＭＳＯストック溶液の濃度は、Ｔｒｐ吸光度（Ｏ．Ｄ．２８０ｎｍ）、Ｔｙｒ吸光度（Ｏ．Ｄ．２９３）、又はアミノ酸分析によって決定されたように１ｍＭから４ｍＭであった。全ての試料について、最終ＤＭＳＯ濃度は、１％を超えていなかった。フルオレセイン化ペプチドを含まない２０個の１．８ｕＬ試料を調製し、ブランクとして読み取った。各チューブに、Ｂｃｌ−２、フルオレセイン化ペプチド混合物０．２ｕＬを添加し；チューブを３５℃で５分間インキュベートし、次いで全ての強度及び偏光を読み取った。フルオレセイン化ペプチドの遊離型及び結合型の値は、ある範囲±５ｍＰ以内で一定であった。最終Ｂｃｌ−２濃度は３４０ｎＭであった。他の比較的低いＢｃｌ−２濃度との比較を、野生型Ｂｃｌ−２ペプチドについて行った。ＢＧＧを欠く緩衝液を使用した付加的な対照は、ＢＧＧとの非特異的結合が無視しうる程度であることを示した。
【００５３】
定常状態偏光データは、それぞれの分別強度（ｆｒａｃｔｉｏｎａｌ  ｉｎｔｅｎｓｉｔｉｅｓ）を加重した異方性値の直線的相加性のため、蛍光リガンドの結合型及び遊離型の画分を抽出するために、分析されうる（Ｌａｋｏｗｉｃｚ，ＪＲ．Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ：Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ（１９８３））。フルオレセイン化ペプチドのＢｃｌ−２との単純平衡結合のモデルへの、滴定データの非線形最小二乗法による曲線あてはめは、結合型の異方性値、遊離型の異方性値、及び観察された異方性値に関して解かれた標準的な結合方程式を、モデルデベロップメントプログラムＭＩＮＳＱ（Ｖ．４．０３、Ｍｉｃｒｏｍａｔｈ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ）へとプログラミングすることにより達成した。非蛍光ペプチドの親和性の決定には、やはり滴定曲線のあてはめにＭＩＮＳＱを利用して、ダンドリカー（Ｄａｎｄｌｉｋｅｒ）らによって得られた平衡競合結合のための分析アプローチを使用した（Ｄａｎｄｌｉｋｅｒら，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ７４：３−２８（１９８１））。これらの実験及びあてはめの手法の有効性の確認は、異なる固定されたＢｃｌ−２又はフルオレセイン化ペプチドの濃度において、フルオレセイン化ペプチド結合及び競合結合滴定を実施した後に結果を比較することにより得られた。
【００５４】
【表２】
2004526673.tif 000009
【００５５】
【表３】
2004526673.tif 000010
表２及び３が示すように、本発明の変異タンパク質は、Ｂｃｌ−２ファミリーメンバーと強固に結合する化合物を同定するために使用されうる。
【００５６】
実施例３
ＮＭＲによるＢｃｌ−２／ｉｓｏ１及びＢｃｌ−２／ｉｓｏ２の構造決定
ＮＭＲ分光法：可溶性のＢｃｌ−２／ｉｓｏ１及びＢｃｌ−２／ｉｓｏ２の構造を、ＮＭＲ分光法によって決定した（図３参照）。ＮＭＲ実験は、全て、ブルカー（Ｂｒｕｋｅｒ）ＤＲＸ５００、ＤＲＸ６００、又はＤＲＸ８００  ＮＭＲ分光計で、２９８Ｋで取得した。骨格の１Ｈ、１３Ｃ、及び１５Ｎ共鳴の帰属は、重水素デカップリング（ｄｅｕｔｅｒｉｕｍ−ｄｅｃｏｕｐｌｅｄ）三重共鳴実験（ＨＮＣＡ、ＨＮ（ＣＯ）ＣＡ、ＨＮ（ＣＡ）ＣＢ、ＨＮ（ＣＯＣＡ）ＣＢ、ＨＮＣＯ、及びＨＮ（ＣＡ）ＣＯ）一式を使用して、［１５Ｎ、１３Ｃ、（７５％）２Ｈ］Ｂｃｌ−２を用いて達成した（Ｙａｍａｚａｋｉ，Ｔ．，Ｌｅｅ，Ｗ．，Ａｒｒｏｗｓｍｉｔｈ，Ｃ．Ｈ．，Ｍｕｈａｎｄｉｒａｍ，Ｄ．Ｒ．＆  Ｋａｙ，Ｌ．Ｅ．（１９９４）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１６，１１６５５−１１６６６）。側鎖の１Ｈ及び１３Ｃ  ＮＭＲシグナルは、ＨＣＣＨ−ＴＯＣＳＹ実験より帰属させ（Ｃｌｏｒｅ，Ｇ．Ｍ．＆Ｇｒｏｎｅｎｂｏｒｎ，Ａ．Ｍ．（１９９４）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ  ２３９，３４９−６３）、バリン及びロイシンのメチル基の立体特異的帰属は、生合成的に指図された断片的に１３Ｃ標識されたＢｃｌ−２について観察された１３Ｃ−１３Ｃカップリングパターンの分析から得た（Ｎｅｒｉ，Ｄ．，Ｓｚｙｐｅｒｓｋｉ，Ｔ．，Ｏｔｔｉｎｇ，Ｇ．，Ｓｅｎｎ，Ｈ．＆  Ｗｕｔｈｒｉｃｈ，Ｋ．（１９８９）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２８，７５１０−７５１６）。ＮＯＥ距離制限は、８０ｍｓの混合時間で取得された三次元の１５Ｎ及び１３Ｃで編集されたＮＯＥＳＹスペクトルから得た（Ｆｅｓｉｋ，Ｓ．Ｗ．＆Ｚｕｉｄｅｒｗｅｇ，Ｅ．Ｒ．Ｐ．（１９８８）Ｊ．Ｍａｇｎ．Ｒｅｓｏｎ．７８，５８８−５９３，Ｍａｒｉｏｎ，Ｄ．，Ｄｒｉｓｃｏｌｌ，Ｐ．Ｃ．，Ｋａｙ，Ｌ．Ｅ．，Ｗｉｎｇｆｉｅｌｄ，Ｐ．Ｔ．，Ｂａｘ，Ａ．，Ｇｒｏｎｅｎｂｏｒｎ，Ａ．Ｍ．＆Ｃｌｏｒｅ，Ｇ．Ｍ．（１９８９）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２９，６１５０−６１５６）。低速交換アミドプロトンは、Ｄ２Ｏを用いて調製された緩衝液へとタンパク質を交換した直後に記録された１５Ｎ−ＨＳＱＣスペクトルにおいて同定した。残りの双極子カップリング（ＨＮ−Ｎ及びＣ’−Ｃα）は、１７ｍｇ  ｍＬ−１のＰｆ１ファージの存在下で、［１５Ｎ、１３Ｃ、（７５％）２Ｈ］Ｂｃｌ−２に対する非デカップリングバージョンのＨＮＣＯ実験を使用して測定した（Ｔｊａｎｄｒａ，Ｎ．（１９９９）Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ７，Ｒ２０５−Ｒ２１１，Ｈａｎｓｅｎ，Ｍ．Ｒ．，Ｍｕｅｌｌｅｒ，Ｌ．＆  Ｐａｒｄｉ，Ａ．（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ  Ｓｔｒｕｃ．Ｂｉｏｌ．５，１０６５−１０７４，Ｃｌｏｒｅ，Ｇ．Ｍ．，Ｓｔａｒｉｃｈ，Ｍ．Ｒ．＆Ｇｒｏｎｅｎｂｏｒｎ，Ａ．Ｍ．（１９９８）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２０，１−５７１−１０５７２）。
【００５７】
構造計算：プログラムＣＮＸ（ＭＳＩ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ）を用いて、焼きなましプロトコル（Ｂｒｕｎｇｅｒ，Ａ．Ｔ．（１９９２）Ｘ−ＰＬＯＲ  Ｖｅｒｓｉｏｎ３．１．（Ｙａｌｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｈａｖｅｎ  ａｎｄ  Ｌｏｎｄｏｎ）を使用して、Ｂｃｌ−２構造を計算した。スクエアウェルポテンシャル（ｓｑｕａｒｅ−ｗｅｌｌ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ）（ＦＮＯＥ＝５０ｋｃａｌ  ｍｏｌ−１）を利用して、ＮＯＥから得られた距離を制限した。クロスピーク強度に基づき、ＮＯＥから得られた距離制限には、３．０、４．０、５．０、又は６．０Åの上限が与えられた。二面角制限φ、ψは、ＴＡＬＯＳプログラムを使用して、Ｎ、Ｃ’、Ｃα、及びＨαの化学シフトの分析から生成させた（Ｃｏｒｎｉｌｅｓｃｕ，Ｇ．，Ｄｅｌａｇｌｉｏ，Ｆ．＆Ｂａｘ，Ａ．（１９９９）Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌ．ＮＭＲ１３，２８９−３０２）。２００ｋｃａｌ  ｍｏｌ−１  ｒａｄ−２という力の定数を、全ての二面角制限に適用した。低速交換アミドプロトンを有することが観察された残基についてのみ、明確な水素結合をαヘリックスに含めた。プログラムＰＲＯＣＨＥＣＫを利用して、全体における計算された構造の幾何学的な品質を分析した（Ｌａｓｋｏｗｓｋｉ，Ｒ．Ａ．，ＭａｃＡｒｔｈｕｒ，Ｍ．Ｗ．，Ｍｏｓｓ，Ｄ．Ｓ．＆Ｔｈｏｒｎｔｏｎ，Ｊ．Ｍ．（１９９３）Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｃｒｙｓｔ．２６，２８３−２９１）。
【００５８】
本発明は、上記の記載及び実施例によって例示される。上記の記載を参照することにより、多くの変形が、当業者には明らかとなるであろうため、上記の記載は、非限定的な例示であるものとする。添付の特許請求の範囲及び本旨に含まれるそのような変形は、全て、本発明に包含されるものとする。
【００５９】
以下の特許請求の範囲において定義されるような本発明の概念及び範囲から逸脱することなく、本明細書に記載された本発明の方法の組成、実施、及び配置を変化させることが可能である。
【００６０】
本明細書において引用された参照は、いずれも、参照により組み込まれる。
【図面の簡単な説明】
【図１】
Ｂｃｌ−２アイソフォーム１、２、及び３（以後、それぞれＢｃｌ−２／ｉｓｏ１、Ｂｃｌ−２／ｉｓｏ２、及びＢｃｌ−２／ｉｓｏ３と呼ぶ）の野生型アミノ酸配列、及びヒトＢｃｌ−ｘＬタンパク質の野生型配列を示す図である。Ｂｃｌ−２／ｉｓｏ１とＢｃｌ−２／ｉｓｏ２とＢｃｌ−２／ｉｓｏ３との間の違いは、太字で強調されている。推定非構造ループ（アミノ酸残基３５〜９１）には下線が施されている。
【図２】
野生型ヒトＢｃｌ−ｘＬのリボン表示を示す図である。非構造ループは、図中の左側に突出している非らせん状リボンとして示されている。
【図３】
（Ａ）Ｂｃｌ−２／ｉｓｏ１及び（Ｂ）Ｂｃｌ−２／ｉｓｏ２のＮＭＲにより得られた構造のリボン表示を示す図である。
【図１】
2004526673.tif 000012
【図２】
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【図３】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004526673.tif 000051
【国際調査報告】
2004526673.tif 000052
2004526673.tif 000053
2004526673.tif 000054
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