(57)【要約】本発明は、オルトソマイシン生合成遺伝子クラスターの同定に有用な組成物及び方法を提供するものである。本発明はまた、エベルニノマイシン型オルトソマイシン遺伝子クラスター及びアビラマイシン型オルトソマイシン遺伝子クラスターの識別に有用な組成物及び方法も提供する。オルトソマイシン、エベルニノマイシン型オルトソマイシン及びアビラマイシン型オルトソマイシンを識別する固有の構造的特徴に関与する特定のタンパク質ファミリーに由来するＰＣＲプライマー、ハイブリダイゼーションプローブなど本発明の組成物を用いて、オルトソマイシン遺伝子クラスターを同定してもよい。コンピュータ読み取り可能な媒体に保存された参照配列をコードする配列など本発明の組成物を用いて、オルトソマイシン遺伝子クラスターを同定してもよい。
2004532021.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ゲノムＤＮＡを含む試料を提供し、
ａ．配列番号５１、Genbankアクセッション番号ＡＡＫ８３１９２、配列番号５３、配列番号５５、及び配列番号５１、５３、５５、又はGenbankアクセッション番号ＡＡＫ８３１９２の配列を有するポリペプチドに対して少なくとも６５％の相同性を有するポリペプチド；
ｂ．配列番号５７、Genbankアクセッション番号ＡＡＫ８３１７０、配列番号５９、配列番号６１、及び配列番号５７、５９、６１、又はGenbankアクセッション番号ＡＡＫ８３１７０の配列を有するポリペプチドに対して少なくとも６５％の相同性を有するポリペプチド；
ｃ．配列番号６３、Genbankアクセッション番号ＡＡＫ８３１９３、配列番号６５、配列番号６７、及び配列番号６３、６５、６７、又はGenbankアクセッション番号ＡＡＫ８３１９３の配列を有するポリペプチドに対して少なくとも６５％の相同性を有するポリペプチド；
ｄ．配列番号６９、配列番号７１、配列番号７３、及び配列番号６９、７１、又は７３の配列を有するポリペプチドに対して少なくとも６５％の相同性を有するポリペプチド；
ｅ．配列番号９９、Genbankアクセッション番号ＡＡＫ８３１８４、配列番号１０１、配列番号１０３、及び配列番号９９、１０１、１０３、又はGenbankアクセッション番号ＡＡＫ８３１８４の配列を有するポリペプチドに対して少なくとも６５％の相同性を有するポリペプチド；
ｆ．配列番号１０５、Genbankアクセッション番号ＡＡＫ８３１８６、配列番号１０７、配列番号１０９、及び配列番号１０５、１０７、１０９、又はGenbankアクセッション番号ＡＡＫ８３１８６の配列を有するポリペプチドに対して少なくとも６５％の相同性を有するポリペプチド；
ｇ．配列番号１１１、Genbankアクセッション番号ＡＡＫ８３１８８、配列番号１１３、配列番号１１５、及び配列番号１１１、１１３、１１５、又はGenbankアクセッション番号ＡＡＫ８３１８８の配列を有するポリペプチドに対して少なくとも６５％の相同性を有するポリペプチド；
ｈ．配列番号１２７、Genbankアクセッション番号ＡＡＧ３２０６７、配列番号１２９、配列番号１３１、及び配列番号１２７、１２９、１３１、又はGenbankアクセッション番号ＡＡＧ３２０６７の配列を有するポリペプチドに対して少なくとも６５％の相同性を有するポリペプチド；
ｉ．配列番号１２３、Genbankアクセッション番号ＡＡＧ３２０６６、配列番号１２５、及び配列番号１２３、１２５、又はGenbankアクセッション番号ＡＡＧ３２０６６の配列を有するポリペプチドに対して少なくとも６５％の相同性を有するポリペプチド；
ｊ．配列番号１５３、Genbankアクセッション番号ＡＡＫ８３１８７、配列番号１５５、配列番号１５７、及び配列番号１５３、１５５、１５７、又はGenbankアクセッション番号ＡＡＫ８３１８７の配列を有するポリペプチドに対して少なくとも６５％の相同性を有するポリペプチド；
ｋ．配列番号１５９、配列番号１６１、配列番号１６３、及び配列番号１５９、１６１、又は１６３の配列を有するポリペプチドに対して少なくとも６５％の相同性を有するポリペプチド；
ｌ．配列番号１６７、配列番号１７３、Genbankアクセッション番号ＡＡＫ８３１８１、配列番号１６９、及び配列番号１６７、１６９、１７３、又はGenbankアクセッション番号ＡＡＫ８３１８１の配列を有するポリペプチドに対して少なくとも６５％の相同性を有するポリペプチド；
ｍ．配列番号１７５、配列番号１７７、配列番号１７９、及び配列番号１７５、１７７、又は１７９の配列を有するポリペプチドに対して少なくとも６５％の相同性を有するポリペプチド；
ｎ．配列番号１６５、配列番号１７１、配列番号１６９、及び配列番号１６５、１６９、又は１７１の配列を有するポリペプチドに対して少なくとも６５％の相同性を有するポリペプチド；
ｏ．配列番号１９３、Genbankアクセッション番号ＡＡＫ８３１８９、配列番号１９５、配列番号１９７、及び配列番号１９３、１９５、１９７、又はGenbankアクセッション番号ＡＡＫ８３１８９の配列を有するポリペプチドに対して少なくとも６５％の相同性を有するポリペプチド；
ｐ．配列番号１９９、Genbankアクセッション番号ＡＡＫ８３１７４、配列番号２０１、及び配列番号１９９、２０１、又はGenbankアクセッション番号ＡＡＫ８３１７４の配列を有するポリペプチドに対して少なくとも６５％の相同性を有するポリペプチド；
及び、ｑ．配列番号２０３、配列番号２０５、配列番号２０７、及び配列番号２０３、２０５、又は２０７の配列を有するポリペプチドに対して少なくとも６５％の相同性を有するポリペプチド；
からなる群のうち、少なくとも２つの群に由来するポリペプチドをコードする核酸配列の有無を該試料中で検出することを特徴とするオルトソマイシン生合成遺伝子、遺伝子断片又は遺伝子クラスターの同定方法。
【請求項２】
さらに、
ａ．下記の（ｒ）〜（ｚ）からなる群のうち、少なくとも１つの群に由来するポリペプチドをコードする核酸配列：
ｒ．配列番号２０９、配列番号２１１、及び配列番号２０９、又は配列番号２１１のポリペプチドに対して少なくとも６５％の相同性を有するポリペプチド；
ｓ．配列番号２１３、配列番号２１５、及び配列番号２１３、又は配列番号２１５のポリペプチドに対して少なくとも６５％の相同性を有するポリペプチド；
ｔ．配列番号２１７、配列番号２１９、及び配列番号２１７、又は配列番号２１９のポリペプチドに対して少なくとも６５％の相同性を有するポリペプチド；
ｕ．配列番号２２１、配列番号２２３、及び配列番号２２１、又は配列番号２２３のポリペプチドに対して少なくとも６５％の相同性を有するポリペプチド；
ｖ．配列番号２２５、配列番号２２７、及び配列番号２２５、又は配列番号２２７のポリペプチドに対して少なくとも６５％の相同性を有するポリペプチド；
ｗ．配列番号２２９、配列番号２３１、及び配列番号２２９、又は配列番号２３１のポリペプチドに対して少なくとも６５％の相同性を有するポリペプチド；
ｘ．配列番号２３３、配列番号２３５、及び配列番号２３３、又は配列番号２３５のポリペプチドに対して少なくとも６５％の相同性を有するポリペプチド；
ｙ．配列番号２３７、配列番号２３９、及び配列番号２３７、又は配列番号２３９のポリペプチドに対して少なくとも６５％の相同性を有するポリペプチド；
及び、ｚ．配列番号２４１、配列番号２４３、及び配列番号２４１、又は配列番号２４３のポリペプチドに対して少なくとも６５％の相同性を有するポリペプチド；
又は；
ｂ．下記の（ａａ）〜（ｆｆ）からなる群のうち、少なくとも１つの群に由来するポリペプチドをコードする核酸配列：
ａａ．配列番号２４５、Genbankアクセッション番号ＡＡＧ３２０６８、及び配列番号２４５、又はGenbankアクセッション番号ＡＡＧ３２０６８のポリペプチドに対して少なくとも６５％の相同性を有するポリペプチド；
ｂｂ．配列番号２４７、Genbankアクセッション番号ＡＡＫ８３１８３、及び配列番号２４７、又はGenbankアクセッション番号ＡＡＫ８３１８３のポリペプチドに対して少なくとも６５％の相同性を有するポリペプチド；
ｃｃ．配列番号２４９、Genbankアクセッション番号ＡＡＧ３２０６９、及び配列番号２４９、又はGenbankアクセッション番号ＡＡＧ３２０６９のポリペプチドに対して少なくとも６５％の相同性を有するポリペプチド；
ｄｄ．配列番号２５１、Genbankアクセッション番号ＡＡＫ８３１７２、及び配列番号２５１、又はGenbankアクセッション番号ＡＡＫ８３１７２のポリペプチドに対して少なくとも６５％の相同性を有するポリペプチド；
ｅｅ．配列番号２５３、Genbankアクセッション番号ＡＡＫ８３１７１、及び配列番号２５３、又はGenbankアクセッション番号ＡＡＫ８３１７１のポリペプチドに対して少なくとも６５％の相同性を有するポリペプチド；
及び、ｆｆ．配列番号２５５、Genbankアクセッション番号ＡＡＫ８３１７５、及び配列番号２５５、又はGenbankアクセッション番号ＡＡＫ８３１７５のポリペプチドに対して少なくとも６５％の相同性を有するポリペプチド；
のいずれかの有無を検出し、さらに検出された遺伝子クラスターが、エベルニノマイシン型オルトソマイシン遺伝子クラスターであるか、又はアビラマイシン型オルトソマイシン遺伝子クラスターであるかを測定することを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３】
さらに、検出した核酸配列を用いて、ゲノムＤＮＡを含む試料からオルトソマイシン遺伝子クラスターを単離することを特徴とする請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
さらに、該試料中のゲノムＤＮＡから検出された核酸配列を内包する生物を同定することを特徴とする請求項１、２又は３記載の方法。
【請求項５】
ＤＮＡを含む試料が、環境由来のバイオマスであることを特徴とする請求項１〜４のいずれか記載の方法。
【請求項６】
該バイオマスが微生物混合培養物であることを特徴とする請求項５記載の方法。
【請求項７】
該ゲノムＤＮＡを含む試料が、混合生物群より得られることを特徴とする請求項１〜６のいずれか記載の方法。
【請求項８】
該ゲノムＤＮＡを含む試料が複数のクローンを含むゲノムライブラリーであって、該クローンを作製する該ゲノムＤＮＡが混合生物群より得られることを特徴とする請求項１〜７のいずれか記載の方法。
【請求項９】
該ゲノムＤＮＡを含む試料が、純粋培養物より得られることを特徴とする請求項１〜４のいずれか記載の方法。
【請求項１０】
該ゲノムＤＮＡを含む試料が複数のクローンを含むゲノムライブラリーであって、該クローンを作製する該ＤＮＡが純粋培養物より得られることを特徴とする請求項１〜４のいずれか記載の方法。
【請求項１１】
（ａ）〜（ｑ）群のうち少なくとも４つの群に由来する核酸配列の有無を、該ゲノムＤＮＡ試料において検出することを特徴とする請求項１〜１０のいずれか記載の方法。
【請求項１２】
（ａ）〜（ｑ）群に由来するポリペプチドをコードする核酸配列の有無を検出する際に、
ａ．配列番号５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１５４、１５６、１５８、１６０、１６２、１６４、１６６、１６８、１７０、１７２、１７４、１７６、１７８、１８０、１９４、１９６、１９８、２００、２０２、２０４、２０６、２０８の配列、それらに相補的な配列のいずれかを、又は、配列番号５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１５４、１５６、１５８、１６０、１６２、１６４、１６６、１６８、１７０、１７２、１７４、１７６、１７８、１８０、１９４、１９６、１９８、２００、２０２、２０４、２０６、２０８の配列、若しくはそれらに相補的な配列のいずれかの少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、７５、１００、１５０、２００、３００、４００若しくは５００個の塩基を連続状態で含む断片を含有する、単離、精製又は濃縮を行った核酸；
又は、
ｂ．配列番号５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、９９、１０１、１０３、１０５、１０７、１０９、１１１、１１３、１１５、１２３、１２５、１２７、１２９、１３１、１５３、１５５、１５７、１５９、１６１、１６３、１６５、１６７、１６９、１７１、１７３、１７５、１７７、１７９、１９３、１９５、１９７、１９９、２０１、２０３、２０５、２０７のポリペプチドのいずれかを、又は、配列番号５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、９９、１０１、１０３、１０５、１０７、１０９、１１１、１１３、１１５、１２３、１２５、１２７、１２９、１３１、１５３、１５５、１５７、１５９、１６１、１６３、１６５、１６７、１６９、１７１、１７３、１７５、１７７、１７９、１９３、１９５、１９７、１９９、２０１、２０３、２０５、２０７のポリペプチドのいずれかの少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、７５、１００、若しくは１５０個のアミノ酸を連続状態で含む断片をコードする、単離、精製又は濃縮を行った核酸；
に由来するＰＣＲプライマー又はハイブリダイゼーションプローブを使用することを特徴とする請求項１〜１１のいずれか記載の方法。
【請求項１３】
請求項３記載の方法により得られるオルトソマイシン遺伝子クラスター。
【請求項１４】
ＤＮＡを含む試料を提供し、
ｒ．配列番号２０９、配列番号２１１、及び配列番号２０９、又は配列番号２１１のポリペプチドに対して少なくとも６５％の相同性を有するポリペプチド；
ｓ．配列番号２１３、配列番号２１５、及び配列番号２１３、又は配列番号２１５のポリペプチドに対して少なくとも６５％の相同性を有するポリペプチド；
ｔ．配列番号２１７、配列番号２１９、及び配列番号２１７、又は配列番号２１９のポリペプチドに対して少なくとも６５％の相同性を有するポリペプチド；
ｕ．配列番号２２１、配列番号２２３、及び配列番号２２１、又は配列番号２２３のポリペプチドに対して少なくとも６５％の相同性を有するポリペプチド；
ｖ．配列番号２２５、配列番号２２７、及び配列番号２２５、又は配列番号２２７のポリペプチドに対して少なくとも６５％の相同性を有するポリペプチド；
ｗ．配列番号２２９、配列番号２３１、及び配列番号２２９、又は配列番号２３１のポリペプチドに対して少なくとも６５％の相同性を有するポリペプチド；
ｘ．配列番号２３３、配列番号２３５、及び配列番号２３３、又は配列番号２３５のポリペプチドに対して少なくとも６５％の相同性を有するポリペプチド；
ｙ．配列番号２３７、配列番号２３９、及び配列番号２３７、又は配列番号２３９のポリペプチドに対して少なくとも６５％の相同性を有するポリペプチド；
及び、ｚ．配列番号２４１、配列番号２４３、及び配列番号２４１、又は配列番号２４３のポリペプチドに対して少なくとも６５％の相同性を有するポリペプチド；
からなる群のうち、少なくとも１つの群に由来するポリペプチドをコードする核酸配列の有無を検出することを特徴とする、エベルニノマイシン型オルトソマイシン生合成遺伝子、遺伝子断片又は遺伝子クラスターの同定方法。
【請求項１５】
さらに、請求項１記載の（ａ）〜（ｑ）群のうち少なくとも２つの群に由来するポリペプチドをコードする核酸配列の有無を該試料中で検出することを特徴とする請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
（ｒ）〜（ｇ）群のうち少なくとも２つの群に由来するポリペプチドをコードする核酸配列の有無を検出する際に、
ａ．配列番号２１０、２１２、２１４、２１６、２１８、２２０、２２２、２２４、２２６、２２８、２３０、２３２、２３４、２３６、２３８、２４０、２４２、２４４の配列、それらに相補的な配列のいずれかを、又は、配列番号２１０、２１２、２１４、２１６、２１８、２２０、２２２、２２４、２２６、２２８、２３０、２３２、２３４、２３６、２３８、２４０、２４２、２４４の配列、若しくはそれらに相補的な配列のいずれかの少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、７５、１００、１５０、２００、３００、４００若しくは５００個の塩基を連続状態で含む断片を含有する、単離、精製又は濃縮を行った核酸；
又は、
ｂ．配列番号２０９、２１１、２１３、２１５、２１７、２１９、２２１、２２３、２２５、２２７、２２９、２３１、２３３、２３５、２３７、２３９、２４１、２４３のポリペプチドのいずれかを、又は、配列番号２０９、２１１、２１３、２１５、２１７、２１９、２２１、２２３、２２５、２２７、２２９、２３１、２３３、２３５、２３７、２３９、２４１、２４３のポリペプチドのいずれかの少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、７５、１００、若しくは１５０個のアミノ酸を連続状態で含む断片をコードする、単離、精製又は濃縮を行った核酸；
に由来するＰＣＲプライマー又はハイブリダイゼーションプローブを使用することを特徴とする請求項１４又は１５記載の方法。
【請求項１７】
さらに、検出した核酸配列を用いて、該ゲノムＤＮＡを含む試料からエベルニノマイシン型オルトソマイシン生合成遺伝子クラスターを単離することを特徴とする請求項１４〜１７記載の方法。
【請求項１８】
該試料中のゲノムＤＮＡから検出された核酸配列を内包する生物を同定することを特徴とする請求項１４〜２７のいずれか記載の方法。
【請求項１９】
該ＤＮＡを含む試料が、環境由来のバイオマスであることを特徴とする請求項１４〜１８のいずれか記載の方法。
【請求項２０】
該バイオマスが微生物混合培養物であることを特徴とする請求項１４〜１９のいずれか記載の方法。
【請求項２１】
該ゲノムＤＮＡを含む試料が、混合生物群より得られることを特徴とする請求項１４〜２０のいずれか記載の方法。
【請求項２２】
該ゲノムＤＮＡを含む試料が複数のクローンを含むゲノムライブラリーであって、該クローンを作製する該ゲノムＤＮＡが混合生物群より得られることを特徴とする請求項１４〜２１のいずれか記載の方法。
【請求項２３】
該ゲノムＤＮＡを含む試料が、純粋培養物より得られることを特徴とする請求項１４〜１８のいずれか記載の方法。
【請求項２４】
該ゲノムＤＮＡを含む試料が複数のクローンを含むゲノムライブラリーであって、該クローンを作製する該ＤＮＡが純粋培養物より得られることを特徴とする請求項１４〜１８のいずれか記載の方法。
【請求項２５】
（ｒ）〜（ｚ）群のうち少なくとも２つの群の有無を、該ゲノムＤＮＡ試料において検出することを特徴とする請求項１４〜２４のいずれか記載の方法。
【請求項２６】
請求項１７記載の方法により得られるエベルニノマイシン型オルトソマイシン生合成遺伝子クラスター。
【請求項２７】
ゲノムＤＮＡを含む試料を提供し、
ａａ．配列番号２４５、Genbankアクセッション番号ＡＡＧ３２０６８、及び配列番号２４５、又はGenbankアクセッション番号ＡＡＧ３２０６８のポリペプチドに対して少なくとも６５％の相同性を有するポリペプチド；
ｂｂ．配列番号２４７、Genbankアクセッション番号ＡＡＫ８３１８３、及び配列番号２４７、又はGenbankアクセッション番号ＡＡＫ８３１８３のポリペプチドに対して少なくとも６５％の相同性を有するポリペプチド；
ｃｃ．配列番号２４９、Genbankアクセッション番号ＡＡＧ３２０６９、及び配列番号２４９、又はGenbankアクセッション番号ＡＡＧ３２０６９のポリペプチドに対して少なくとも６５％の相同性を有するポリペプチド；
ｄｄ．配列番号２５１、Genbankアクセッション番号ＡＡＫ８３１７２、及び配列番号２５１、又はGenbankアクセッション番号ＡＡＫ８３１７２のポリペプチドに対して少なくとも６５％の相同性を有するポリペプチド；
ｅｅ．配列番号２５３、Genbankアクセッション番号ＡＡＫ８３１７１、及び配列番号２５３、又はGenbankアクセッション番号ＡＡＫ８３１７１のポリペプチドに対して少なくとも６５％の相同性を有するポリペプチド；
及び、ｆｆ．配列番号２５５、Genbankアクセッション番号ＡＡＫ８３１７５、及び配列番号２５５、又はGenbankアクセッション番号ＡＡＫ８３１７５のポリペプチドに対して少なくとも６５％の相同性を有するポリペプチド；
からなる群のうち、少なくとも１つの群に由来するポリペプチドをコードする核酸配列の有無を該試料中で検出することを特徴とする、アビラマイシン型オルトソマイシン生合成遺伝子、遺伝子断片又は遺伝子クラスターの同定方法。
【請求項２８】
さらに、請求項１記載の（ａ）〜（ｑ）群のうち少なくとも２つの群に由来するポリペプチドをコードする核酸配列の有無を該ＤＮＡ試料中で検出することを特徴とする請求項２７記載の方法。
【請求項２９】
（ａａ）〜（ｆｆ）群のうち少なくとも２つの群に由来するポリペプチドをコードする核酸配列の有無を検出する際に、
ａ．配列番号２４６、２４８、２５０、２５２、２５４、２５６の配列、並びにGenbankアクセッション番号ＡＡＧ３２０６８、ＡＡＫ８３１８３、ＡＡＧ３２０６９、ＡＡＫ８３１７２、ＡＡＫ８３１７１、及びＡＡＫ８３１７５に対応する核酸配列、それらに相補的な配列のいずれかを、又は、配列番号２４６、２４８、２５０、２５２、２５４、２５６の配列、並びにGenbankアクセッション番号ＡＡＧ３２０６８、ＡＡＫ８３１８３、ＡＡＧ３２０６９、ＡＡＫ８３１７２、ＡＡＫ８３１７１、及びＡＡＫ８３１７５に対応する核酸配列、若しくはそれらに相補的な配列のいずれかの少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、７５、１００、１５０、２００、３００、４００若しくは５００個の塩基を連続状態で含む断片を含有する、単離、精製又は濃縮を行った核酸；
又は、
ｂ．配列番号２４５、２４７、２４９、２５１、２５３、若しくはGenbankアクセッション番号ＡＡＧ３２０６８、ＡＡＫ８３１８３、ＡＡＧ３２０６９、ＡＡＫ８３１７２、ＡＡＫ８３１７１、及びＡＡＫ８３１７５のポリペプチドのいずれかを、又は、配列番号２４５、２４７、２４９、２５１、２５３、若しくはGenbankアクセッション番号ＡＡＧ３２０６８、ＡＡＫ８３１８３、ＡＡＧ３２０６９、ＡＡＫ８３１７２、ＡＡＫ８３１７１、及びＡＡＫ８３１７５のポリペプチドのいずれかの少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、７５、１００、若しくは１５０個のアミノ酸を連続状態で含む断片をコードする、単離、精製又は濃縮を行った核酸；
に由来するＰＣＲプライマー又はハイブリダイゼーションプローブを使用することを特徴とする請求項２７又は２８記載の方法。
【請求項３０】
さらに、検出した核酸配列を用いて、該ゲノムＤＮＡを含む試料からアビラマイシン型オルトソマイシン生合成遺伝子クラスターを単離することを特徴とする請求項２７、２８又は２９記載の方法。
【請求項３１】
該試料中のゲノムＤＮＡから検出された核酸配列を内包する生物を同定することを特徴とする請求項２７〜３０のいずれか記載の方法。
【請求項３２】
該ＤＮＡを含む試料が、環境由来のバイオマスであることを特徴とする請求項２７〜３１のいずれか記載の方法。
【請求項３３】
該バイオマスが微生物混合培養物であることを特徴とする請求項２７〜３２のいずれか記載の方法。
【請求項３４】
該ゲノムＤＮＡを含む試料が、混合生物群より得られることを特徴とする請求項２７〜３３のいずれか記載の方法。
【請求項３５】
該ゲノムＤＮＡを含む試料が複数のクローンを含むゲノムライブラリーであって、該クローンを作製する該ゲノムＤＮＡが混合生物群より得られることを特徴とする請求項２７〜３４のいずれか記載の方法。
【請求項３６】
該ゲノムＤＮＡを含む試料が、純粋培養物より得られることを特徴とする請求項２７〜３１のいずれか記載の方法。
【請求項３７】
該ゲノムＤＮＡを含む試料が複数のクローンを含むゲノムライブラリーであって、該クローンを作製する該ＤＮＡが純粋培養物より得られることを特徴とする請求項２７〜３１のいずれか記載の方法。
【請求項３８】
（ａａ）〜（ｚｚ）群のうち少なくとも２つの群の有無を、該ゲノムＤＮＡ試料において検出することを特徴とする請求項２７〜３７のいずれか記載の方法。
【請求項３９】
請求項３０により得られるアビラマイシン型オルトソマイシン生合成遺伝子クラスター。
【請求項４０】
オルトソマイシン遺伝子、オルトソマイシン遺伝子断片、オルトソマイシン遺伝子クラスター、及びオルトソマイシン産生生物の検出に使用する、
ａ．配列番号５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１５４、１５６、１５８、１６０、１６２、１６４、１６６、１６８、１７０、１７２、１７４、１７６、１７８、１８０、１９４、１９６、１９８、２００、２０２、２０４、２０６、２０８；
ｂ．配列番号５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１５４、１５６、１５８、１６０、１６２、１６４、１６６、１６８、１７０、１７２、１７４、１７６、１７８、１８０、１９４、１９６、１９８、２００、２０２、２０４、２０６、２０８の少なくとも１０個のヌクレオチドを連続状態で含む、配列番号５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１５４、１５６、１５８、１６０、１６２、１６４、１６６、１６８、１７０、１７２、１７４、１７６、１７８、１８０、１９４、１９６、１９８、２００、２０２、２０４、２０６、２０８の断片；
ｃ．配列番号５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１５４、１５６、１５８、１６０、１６２、１６４、１６６、１６８、１７０、１７２、１７４、１７６、１７８、１８０、１９４、１９６、１９８、２００、２０２、２０４、２０６、２０８に対して少なくとも７０％の相同性、又は配列番号５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１５４、１５６、１５８、１６０、１６２、１６４、１６６、１６８、１７０、１７２、１７４、１７６、１７８、１８０、１９４、１９６、１９８、２００、２０２、２０４、２０６、２０８の断片に対して少なくとも７０％の相同性を有する配列；
及び、ｄ．該（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）の配列に相補的な配列；
からなる群より選ばれる配列を保存した、コンピュータ読み取り可能な媒体。
【請求項４１】
エベルニノマイシン型オルトソマイシン遺伝子、遺伝子断片、遺伝子クラスター、又はエベルニノマイシン型オルトソマイシン産生生物の同定に使用する、
ａ．配列番号２１０、２１２、２１４、２１６、２１８、２２０、２２２、２２４、２２６、２２８、２３０、２３２、２３４、２３６、２３８、２４０、２４２、２４４；
ｂ．配列番号２１０、２１２、２１４、２１６、２１８、２２０、２２２、２２４、２２６、２２８、２３０、２３２、２３４、２３６、２３８、２４０、２４２、２４４の少なくとも１０個のヌクレオチドを連続状態で含む、配列番号２１０、２１２、２１４、２１６、２１８、２２０、２２２、２２４、２２６、２２８、２３０、２３２、２３４、２３６、２３８、２４０、２４２、２４４の断片；
ｃ．配列番号２１０、２１２、２１４、２１６、２１８、２２０、２２２、２２４、２２６、２２８、２３０、２３２、２３４、２３６、２３８、２４０、２４２、２４４に対して少なくとも７０％の相同性、又は配列番号２１０、２１２、２１４、２１６、２１８、２２０、２２２、２２４、２２６、２２８、２３０、２３２、２３４、２３６、２３８、２４０、２４２、２４４の断片に対して７０％の相同性を有する配列；
及び、ｄ．該（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）の配列に相補的な配列；
からなる群より選ばれる配列を保存した、コンピュータ読み取り可能な媒体。
【請求項４２】
アビラマイシン型オルトソマイシン遺伝子、遺伝子断片、遺伝子クラスター、又はアビラマイシン型オルトソマイシン産生生物の同定に使用する、
ａ．配列番号２４６、２４８、２５０、２５２、２５４、２５６、及びGenbankアクセッション番号ＡＡＧ３２０６８、ＡＡＫ８３１８３、ＡＡＧ３２０６９、ＡＡＫ８３１７２、ＡＡＫ８３１７１、及びＡＡＫ８３１７５に対応する核酸配列；
ｂ．配列番号２４６、２４８、２５０、２５２、２５４、２５６、及びGenbankアクセッション番号ＡＡＧ３２０６８、ＡＡＫ８３１８３、ＡＡＧ３２０６９、ＡＡＫ８３１７２、ＡＡＫ８３１７１、及びＡＡＫ８３１７５に対応する核酸配列の少なくとも１０個のヌクレオチドを連続状態で含む、配列番号２４６、２４８、２５０、２５２、２５４、２５６、及びGenbankアクセッション番号ＡＡＧ３２０６８、ＡＡＫ８３１８３、ＡＡＧ３２０６９、ＡＡＫ８３１７２、ＡＡＫ８３１７１、及びＡＡＫ８３１７５に対応する核酸配列の断片；
ｃ．配列番号２４６、２４８、２５０、２５２、２５４、２５６、若しくはGenbankアクセッション番号ＡＡＧ３２０６８、ＡＡＫ８３１８３、ＡＡＧ３２０６９、ＡＡＫ８３１７２、ＡＡＫ８３１７１、及びＡＡＫ８３１７５に対応する核酸配列に対して７０％の相同性、又は配列番号２４６、２４８、２５０、２５２、２５４、２５６、若しくはGenbankアクセッション番号ＡＡＧ３２０６８、ＡＡＫ８３１８３、ＡＡＧ３２０６９、ＡＡＫ８３１７２、ＡＡＫ８３１７１、及びＡＡＫ８３１７５に対応する核酸配列の断片に対して７０％の相同性を有する配列；
及び、ｄ．該（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）の配列に相補的な配列；
からなる群より選ばれる配列を保存した、コンピュータ読み取り可能な媒体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微生物学分野に関する。より詳しくは、オルトソマイシン産生に関与する遺伝子及び生物に関する。
【背景技術】
【０００２】
オルトソマイシンは、２つのオルトエステル糖結合を含むオリゴ糖分子である。オルトソマイシンの一般的な構造を以下に図示する。上記オルトソマイシンの糖残基は、標識されたＡ−Ｈである。オルトソマイシンの重要な特徴であるオルトエステル結合を以下に示す。
【０００３】
【化１】
2004532021.tif 000003
【０００４】
既知のオルトソマイシン化合物は、（１）オリゴ糖鎖の末端部分にアミノ糖残基又はニトロ糖残基を含む、すなわち、上記分子中のＲがエベルニトロースであるエベルニノマイシン、（２）末端部分にアミノ糖残基又はニトロ糖残基を含まない、すなわち、上記分子中のＲが水素であるアビラマイシン、クラマイシン及びフランバマイシンの２種類に大別することができる。２種類目に分類されるオルトソマイシンのなかで、アビラマイシンとクラマイシンとの相違点は、糖残基Ｇ中のＣ４５ヒドロキシル基とのエステル結合に見られるアシル側鎖の性質のみである。アビラマイシンもクラマイシンも、このヒドロキシル上に単純なメチル基を有していない。エベルニノマイシン類では、このヒドロキシルがＯ−メチル化されているのが一般的である。フランバマイシンとアビラマイシンとの相違点は糖残基ＤのＣ２３位だけであり、アビラマイシンではメチレンカーボンが、フランバマイシンではヒドロキシル基がこの位置に存在している。エベルニノマイシンでは、この位置にヒドロキシルが存在する場合と存在しない場合がある。
【０００５】
既知のオロトソマイシンの多くは、抗生作用を有している。従来の抗生物質に耐性をもつ細菌の出現により、新規抗微生物剤に対する必要性は差し迫ったものとなっている。オリゴ糖類の抗生物質は、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌、バンコマイシン耐性腸球菌、及びペニシリン耐性肺炎球菌などのグラム陽性菌に対して広範囲にわたる抗菌性作用を示す。そのため、新規オルトソマイシン天然産物を同定する方法の開発が求められている。オルトソマイシン産生微生物は、新規抗生物質の重要な供給源である。したがって、オルトソマイシン産生生物を同定する方法及びそうした生物により産生されるオルトソマイシンの種類を識別する方法の開発も求められている。
【０００６】
オルトソマイシン産生微生物を同定するための既存のスクリーニング方法は労力を要するとともに時間がかかるものであり、現在のところ識別も充分とはいえず、オルトソマイシン天然産物を低いレベルで産生する生物の検出には至っていない。オルトソマイシン産生生物を検出するツールの改良が必要とされている。また、従来の培養試験では検出されないレベルでオルトソマイシンを産生する生物を検出することが可能なツールも必要とされている。オルトソマイシンのなかでもアビラマイシンやエベルニノマイシンなど、オルトソマイシン分子の種類を識別するツールも必要とされている。
【発明の開示】
【０００７】
本発明は、オルトソマイシン生合成遺伝子の同定に有用な組成物及び方法を提供するものである。本発明は、エベルニノマイシン型オルトソマイシン遺伝子クラスターとアビラマイシン型オルトソマイシン遺伝子クラスターとの識別に有用な組成物及び方法も提供する。標的のオルトソマイシン遺伝子を一度同定してしまえば、オルトソマイシン化合物の完全長又は部分的生合成遺伝子座が常法により単離される場合がある。
【０００８】
本発明の１つの態様においては、ハイブリダイゼーションプローブやＰＣＲプライマーなどの本発明の組成物を用いてオルトソマイシン遺伝子クラスターを同定している。本発明のハイブリダイゼーションプローブ又はＰＣＲプライマーは、オルトソマイシン、エベルニノマイシン型オルトソマイシン、及びアビラマイシン型オルトソマイシンを識別する固有の構造的特徴に関与するタンパク質ファミリーに由来する。オルトソマイシン遺伝子クラスターを同定する場合は、該ハイブリダイゼーションプローブ又はＰＣＲプライマーは、ＧＦＴＥ、ＧＦＴＧ、ＧＴＦＨ、ＨＯＸＧ、ＭＴＦＤ、ＭＴＦＥ、ＭＴＦＦ、ＭＴＬＡ、ＭＴＩＡ、ＯＸＲＶ、ＯＸＲＷ、ＯＸＲＷ、ＰＨＯＤ、ＵＮＡＪ、ＵＥＶＡ、ＵＥＶＢ、及びＵＮＫＵという１７個のタンパク質ファミリーに対応する核酸配列に由来している。エベルニノマイシン型オルトソマイシン遺伝子クラスターを同定する場合は、該ハイブリダイゼーションプローブ又はＰＣＲプライマーは、ＤＡＣＴ、ＤＥＰＦ、ＥＰＩＭ、ＧＴＦＡ、ＭＴＦＧ、ＭＴＦＶ、ＯＸＢＮ、ＯＸＣＯ及びＵＮＢＢという９個のタンパク質ファミリーに対応する核酸配列に由来している。アビラマイシン型オルトソマイシン遺伝子クラスターを同定する場合は、該ハイブリダイゼーションプローブ又はＰＣＲプライマーは、ＡＢＣＤ、ＤＥＰＮ、ＭＥＭＤ、ＲＥＢＵ、ＵＮＡＩ及びＵＮＢＲという６個のタンパク質ファミリーに対応する核酸配列に由来している。
【０００９】
本発明は、オルトソマイシン生合成遺伝子、オルトソマイシン遺伝子断片、オルトソマイシン遺伝子クラスター又はオルトソマイシン産生生物の同定に使用する組成物を提供するものである。１つの態様においては、本発明は、配列番号５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１５４、１５６、１５８、１６０、１６２、１６４、１６６、１６８、１７０、１７２、１７４、１７６、１７８、１８０、１９４、１９６、１９８、２００、２０２、２０４、２０６、２０８の配列、それらに相補的な配列のいずれかを、又は、配列番号５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１５４、１５６、１５８、１６０、１６２、１６４、１６６、１６８、１７０、１７２、１７４、１７６、１７８、１８０、１９４、１９６、１９８、２００、２０２、２０４、２０６、２０８の配列、若しくはそれらに相補的な配列のいずれかの少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、７５、１００、１５０、２００、３００、４００若しくは５００個の塩基を連続状態で含む断片を含有する、単離、精製又は濃縮を行った核酸を提供するものである。別の態様においては、本発明は、オルトソマイシン生合成遺伝子、オルトソマイシン遺伝子断片、オルトソマイシン遺伝子クラスター又はオルトソマイシン産生生物の同定に使用する上記核酸を提供するものである。該単離、精製又は濃縮を行った核酸は、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、及び合成ＤＮＡなどのＤＮＡを含んでいてもよい。該ＤＮＡは二本鎖でも一本鎖でもよく、一本鎖の場合はコード鎖又は非コード（アンチセンス）鎖でもよい。あるいは、該単離、精製又は濃縮を行った核酸は、ＲＮＡを含んでいてもよい。
【００１０】
配列番号５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１５４、１５６、１５８、１６０、１６２、１６４、１６６、１６８、１７０、１７２、１７４、１７６、１７８、１８０、１９４、１９６、１９８、２００、２０２、２０４、２０６、２０８のいずれかの、単離、精製又は濃縮を行った核酸を用いて、配列番号５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、９９、１０１、１０３、１０５、１０７、１０９、１１１、１１３、１１５、１２３、１２５、１２７、１２９、１３１、１５３、１５５、１５７、１５９、１６１、１６３、１６５、１６７、１６９、１７１、１７３、１７５、１７７、１７９、１９３、１９５、１９７、１９９、２０１、２０３、２０５、２０７のポリペプチドのいずれかを、又は配列番号５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、９９、１０１、１０３、１０５、１０７、１０９、１１１、１１３、１１５、１２３、１２５、１２７、１２９、１３１、１５３、１５５、１５７、１５９、１６１、１６３、１６５、１６７、１６９、１７１、１７３、１７５、１７７、１７９、１９３、１９５、１９７、１９９、２０１、２０３、２０５、２０７のポリペプチドのいずれかの少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、７５、１００、若しくは１００個のアミノ酸を連続状態で含む断片を調製してもよい。
【００１１】
したがって、本発明は、配列番号５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、９９、１０１、１０３、１０５、１０７、１０９、１１１、１１３、１１５、１２３、１２５、１２７、１２９、１３１、１５３、１５５、１５７、１５９、１６１、１６３、１６５、１６７、１６９、１７１、１７３、１７５、１７７、１７９、１９３、１９５、１９７、１９９、２０１、２０３、２０５、２０７のポリペプチドのいずれかを、又は、配列番号５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、９９、１０１、１０３、１０５、１０７、１０９、１１１、１１３、１１５、１２３、１２５、１２７、１２９、１３１、１５３、１５５、１５７、１５９、１６１、１６３、１６５、１６７、１６９、１７１、１７３、１７５、１７７、１７９、１９３、１９５、１９７、１９９、２０１、２０３、２０５、２０７のポリペプチドのいずれかの少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、７５、１００、若しくは１５０個のアミノ酸を連続状態で含む断片をコードする、単離、精製又は濃縮を行った核酸も提供するものである。別の態様においては、本発明は、オルトソマイシン生合成遺伝子、オルトソマイシン遺伝子断片、オルトソマイシン遺伝子クラスター又はオルトソマイシン産生生物の検出に使用する上記核酸を提供するものである。
【００１２】
これらの核酸のコード配列は、配列番号５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１５４、１５６、１５８、１６０、１６２、１６４、１６６、１６８、１７０、１７２、１７４、１７６、１７８、１８０、１９４、１９６、１９８、２００、２０２、２０４、２０６、２０８の核酸、若しくはその断片のいずれかのコード配列と相同であってもよく、又は、オルトソマイシン生合成遺伝子若しくはオルトソマイシン産生生物の検出に使用する遺伝子情報の冗長性若しくは縮重の結果として、配列番号５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、９９、１０１、１０３、１０５、１０７、１０９、１１１、１１３、１１５、１２３、１２５、１２７、１２９、１３１、１５３、１５５、１５７、１５９、１６１、１６３、１６５、１６７、１６９、１７１、１７３、１７５、１７７、１７９、１９３、１９５、１９７、１９９、２０１、２０３、２０５、２０７のポリペプチドのいずれかを、又は、配列番号５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、９９、１０１、１０３、１０５、１０７、１０９、１１１、１１３、１１５、１２３、１２５、１２７、１２９、１３１、１５３、１５５、１５７、１５９、１６１、１６３、１６５、１６７、１６９、１７１、１７３、１７５、１７７、１７９、１９３、１９５、１９７、１９９、２０１、２０３、２０５、２０７のポリペプチドのいずれかの少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、７５、１００、若しくは１５０個のアミノ酸を連続状態で含む断片をコードする別のコード配列であってもよい。
【００１３】
本発明は、エベルニノマイシン型オルトソマイシン生合成遺伝子、エベルニノマイシン型オルトソマイシン遺伝子断片、エベルニノマイシン型オルトソマイシン遺伝子クラスター、及びエベルニノマイシン及びオルトソマイシン産生生物の同定に使用する組成物を提供するものである。１つの態様においては、本発明は、配列番号２１０、２１２、２１４、２１６、２１８、２２０、２２２、２２４、２２６、２２８、２３０、２３２、２３４、２３６、２３８、２４０、２４２、２４４の配列、それらに相補的な配列のいずれかを、又は、配列番号２１０、２１２、２１４、２１６、２１８、２２０、２２２、２２４、２２６、２２８、２３０、２３２、２３４、２３６、２３８、２４０、２４２、２４４の配列、若しくはそれらに相補的な配列のいずれかの少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、７５、１００、１５０、２００、３００、４００若しくは５００個の塩基を連続状態で含む断片を含有する、単離、精製又は濃縮を行った核酸を提供するものである。別の態様においては、本発明は、エベルニノマイシン型オルトソマイシン遺伝子、エベルニノマイシン型オルトソマイシン遺伝子断片、エベルニノマイシン型オルトソマイシン遺伝子クラスター、並びにエベルニノマイシン様オルトソマイシン産生生物の同定に使用する上記核酸を提供するものである。該単離、精製又は濃縮を行った核酸は、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、及び合成ＤＮＡなどのＤＮＡを含んでいてもよい。該ＤＮＡは二本鎖でも一本鎖でもよく、一本鎖の場合はコード鎖又は非コード（アンチセンス）鎖でもよい。あるいは、該単離、精製又は濃縮を行った核酸は、ＲＮＡを含んでいてもよい。
【００１４】
配列番号２１０、２１２、２１４、２１６、２１８、２２０、２２２、２２４、２２６、２２８、２３０、２３２、２３４、２３６、２３８、２４０、２４２、２４４のいずれかの単離、精製又は濃縮を行った核酸を用いて、配列番号２０９、２１１、２１３、２１５、２１７、２１９、２２１、２２３、２２５、２２７、２２９、２３１、２３３、２３５、２３７、２３９、２４１、２４３のポリペプチドのいずれかを、又は、配列番号２０９、２１１、２１３、２１５、２１７、２１９、２２１、２２３、２２５、２２７、２２９、２３１、２３３、２３５、２３７、２３９、２４１、２４３のポリペプチドのいずれかの少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、７５、１００、若しくは１００個のアミノ酸を連続状態で含む断片を調製してもよい。
【００１５】
したがって、本発明は、配列番号２０９、２１１、２１３、２１５、２１７、２１９、２２１、２２３、２２５、２２７、２２９、２３１、２３３、２３５、２３７、２３９、２４１、２４３のポリペプチドのいずれかを、又は、配列番号２０９、２１１、２１３、２１５、２１７、２１９、２２１、２２３、２２５、２２７、２２９、２３１、２３３、２３５、２３７、２３９、２４１、２４３のポリペプチドのいずれかの少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、７５、１００、若しくは１５０個のアミノ酸を連続状態で含む断片をコードする、単離、精製又は濃縮を行った核酸も提供するものである。別の態様においては、本発明は、エベルニノマイシン型オルトソマイシン遺伝子、エベルニノマイシン型オルトソマイシン遺伝子断片、エベルニノマイシン型オルトソマイシン遺伝子クラスター、並びにエベルニノマイシン型オルトソマイシン産生生物の同定に使用する上記核酸を提供するものである。これらの核酸のコード配列は、配列番号２１０、２１２、２１４、２１６、２１８、２２０、２２２、２２４、２２６、２２８、２３０、２３２、２３４、２３６、２３８、２４０、２４２、２４４の核酸若しくはその断片のいずれかのコード配列と相同であってもよく、又は、遺伝子情報の冗長性若しくは縮重の結果として、配列番号２０９、２１１、２１３、２１５、２１７、２１９、２２１、２２３、２２５、２２７、２２９、２３１、２３３、２３５、２３７、２３９、２４１、２４３のポリペプチドのいずれかを、又は、配列番号２０９、２１１、２１３、２１５、２１７、２１９、２２１、２２３、２２５、２２７、２２９、２３１、２３３、２３５、２３７、２３９、２４１、２４３のポリペプチドのいずれかの少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、７５、１００、若しくは１５０個のアミノ酸を連続状態で含む断片をコードする別のコード配列であってもよい。
【００１６】
本発明は、アビラマイシン型生合成遺伝子、アビラマイシン型オルトソマイシン遺伝子断片、アビラマイシン型オルトソマイシン遺伝子クラスター、並びにアビラマイシン型オルトソマイシン産生生物の同定に使用する組成物を提供するものである。１つの態様においては、本発明は、配列番号２４６、２４８、２５０、２５２、２５４、２５６の配列、並びにGenbankアクセッション番号ＡＡＧ３２０６８、ＡＡＫ８３１８３、ＡＡＧ３２０６９、ＡＡＫ８３１７２、ＡＡＫ８３１７１、及びＡＡＫ８３１７５に対応する核酸配列、それらに相補的な配列のいずれかを、又は、配列番号２４６、２４８、２５０、２５２、２５４、２５６の配列、並びにGenbankアクセッション番号ＡＡＧ３２０６８、ＡＡＫ８３１８３、ＡＡＧ３２０６９、ＡＡＫ８３１７２、ＡＡＫ８３１７１、及びＡＡＫ８３１７５に対応する核酸配列、若しくはそれらに相補的な配列のいずれかの少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、７５、１００、１５０、２００、３００、４００若しくは５００個の塩基を連続状態で含む断片を含有する、単離、精製又は濃縮を行った核酸を提供するものである。別の態様においては、本発明は、アビラマイシン型オルトソマイシン遺伝子、及びアビラマイシン型オルトソマイシン産生生物の同定に使用する上記核酸を提供するものである。該単離、精製又は濃縮を行った核酸は、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、及び合成ＤＮＡなどのＤＮＡを含んでいてもよい。該ＤＮＡは二本鎖でも一本鎖でもよく、一本鎖の場合はコード鎖又は非コード（アンチセンス）鎖でもよい。あるいは、該単離、精製又は濃縮を行った核酸は、ＲＮＡを含んでいてもよい。
【００１７】
配列番号２４６、２４８、２５０、２５２、２５４、２５６のいずれかの、単離、精製又は濃縮を行った核酸を用いて、配列番号２４５、２４７、２４９、２５１、２５３及び２５５のポリペプチドのいずれかを、又は配列番号２４５、２４７、２４９、２５１、２５３ののポリペプチドのいずれかの少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、７５、１００、若しくは１００個のアミノ酸を連続状態で含む断片を調製してもよい。
【００１８】
したがって、本発明は、配列番号２４５、２４７、２４９、２５１、２５３、若しくはGenbankアクセッション番号ＡＡＧ３２０６８、ＡＡＫ８３１８３、ＡＡＧ３２０６９、ＡＡＫ８３１７２、ＡＡＫ８３１７１、及びＡＡＫ８３１７５のポリペプチドのいずれかを、又は、配列番号２４５、２４７、２４９、２５１、２５３、若しくはGenbankアクセッション番号ＡＡＧ３２０６８、ＡＡＫ８３１８３、ＡＡＧ３２０６９、ＡＡＫ８３１７２、ＡＡＫ８３１７１、ＡＡＫ８３１７５のポリペプチドのいずれかの少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、７５、１００、若しくは１５０個のアミノ酸を連続状態で含む断片をコードする、単離、精製又は濃縮を行った核酸も提供するものである。別の態様においては、本発明は、アビラマイシン型オルトソマイシン遺伝子、アビラマイシン型オルトソマイシン遺伝子断片、アビラマイシン型オルトソマイシン遺伝子クラスター、並びにアビラマイシン型オルトソマイシン産生生物の同定に使用する上記核酸を提供するものである。これらの核酸のコード配列は、配列番号２４６、２４８、２５０、２５２、２５４、２５６の核酸若しくはその断片のいずれかのコード配列のいずれかと相同であってもよく、又は、遺伝子情報の冗長性若しくは縮重の結果として、配列番号２４５、２４７、２４９、２５１、２５３、若しくはGenbankアクセッション番号ＡＡＧ３２０６８、ＡＡＫ８３１８３、ＡＡＧ３２０６９、ＡＡＫ８３１７２、ＡＡＫ８３１７１、及びＡＡＫ８３１７５のポリペプチドのいずれかを、又は、配列番号２４５、２４７、２４９、２５１、２５３、若しくはGenbankアクセッション番号ＡＡＧ３２０６８、ＡＡＫ８３１８３、ＡＡＧ３２０６９、ＡＡＫ８３１７２、ＡＡＫ８３１７１、ＡＡＫ８３１７５のポリペプチドのいずれかの少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、７５、１００、若しくは１５０個のアミノ酸を連続状態で含む断片をコードする別のコード配列であってもよい。
【００１９】
配列番号５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１５４、１５６、１５８、１６０、１６２、１６４、１６６、１６８、１７０、１７２、１７４、１７６、１７８、１８０、１９４、１９６、１９８、２００、２０２、２０４、２０６、２０８、２１０、２１２、２１４、２１６、２１８、２２０、２２２、２２４、２２６、２２８、２３０、２３２、２３４、２３６、２３８、２４０、２４２、２４４、２４６、２４８、２５０、２５２、２５４、２５６のポリペプチドのいずれかをコードする、単離、精製又は濃縮を行った核酸としては、（１）配列番号５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１５４、１５６、１５８、１６０、１６２、１６４、１６６、１６８、１７０、１７２、１７４、１７６、１７８、１８０、１９４、１９６、１９８、２００、２０２、２０４、２０６、２０８、２１０、２１２、２１４、２１６、２１８、２２０、２２２、２２４、２２６、２２８、２３０、２３２、２３４、２３６、２３８、２４０、２４２、２４４、２４６、２４８、２５０、２５２、２５４、２５６のいずれかのコード配列のみ；（２）配列番号５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１５４、１５６、１５８、１６０、１６２、１６４、１６６、１６８、１７０、１７２、１７４、１７６、１７８、１８０、１９４、１９６、１９８、２００、２０２、２０４、２０６、２０８、２１０、２１２、２１４、２１６、２１８、２２０、２２２、２２４、２２６、２２８、２３０、２３２、２３４、２３６、２３８、２４０、２４２、２４４、２４６、２４８、２５０、２５２、２５４、２５６のいずれかのコード配列、及びリーダー配列などの付加的なコード配列又はプロタンパク質；又は（３）配列番号のコード配列、及びイントロンなどの非コード配列、又はコード配列の非コード配列５’及び／又は３’が挙げられるが、これらに限定されるものではない。したがって、ここで使用されているように、「ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド」という語は、付加的なコード配列及び／又は非コード配列をも含むポリヌクレオチドに加えて、該ポリペプチド用コード配列だけを含むポリヌクレオチドをも意味するものである。
【００２０】
本発明は、オルトソマイシン生合成遺伝子、オルトソマイシン産生生物の検出に使用するポリヌクレオチドであって、「サイレントな」ポリヌクレオチド変化、たとえば、配列番号５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１５４、１５６、１５８、１６０、１６２、１６４、１６６、１６８、１７０、１７２、１７４、１７６、１７８、１８０、１９４、１９６、１９８、２００、２０２、２０４、２０６、２０８、２１０、２１２、２１４、２１６、２１８、２２０、２２２、２２４、２２６、２２８、２３０、２３２、２３４、２３６、２３８、２４０、２４２、２４４、２４６、２４８、２５０、２５２、２５４、２５６のポリヌクレオチドによりコードされるアミノ酸配列が変わらないような変化を示すポリヌクレオチドに関する。本発明はまた、オルトソマイシン生合成遺伝子及びオルトソマイシン産生生物の同定に使用する、配列番号５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、９９、１０１、１０３、１０５、１０７、１０９、１１１、１１３、１１５、１２３、１２５、１２７、１２９、１３１、１５３、１５５、１５７、１５９、１６１、１６３、１６５、１６７、１６９、１７１、１７３、１７５、１７７、１７９、１９３、１９５、１９７、１９９、２０１、２０３、２０５、２０７、２０９、２１１、２１３、２１５、２１７、２１９、２２１、２２３、２２５、２２７、２２９、２３１、２３３、２３５、２３７、２３９、２４１、２４３、２４５、２４７、２４９、２５１、２５３、２５５のポリペプチドのアミノ酸の置換、付加、欠失、融合及び切断が生じるヌクレオチド変化を示すポリヌクレオチドに関する。
【００２１】
１つの態様においては、本発明の組成物は、オルトソマイシン生合成遺伝子及びオルトソマイシン生合成遺伝子座を含有する試料を同定するプローブとして使用されている。試料は、環境由来バイオマス、純粋又は混合微生物培養物、純粋又は混合微生物培養物より単離したゲノムＤＮＡ、純粋又は混合微生物培養物由来のゲノムＤＮＡライブラリーの形態であってもよい。該組成物は、当業者には周知の核酸ハイブリダイゼーション法及びポリメラーゼ連鎖反応で使用されている。
【００２２】
別の実施形態においては、オルトソマイシンを産生する可能性のある微生物を含有する環境由来試料をＰＣＲ法で同定している。標的のオルトソマイシン生合成遺伝子配列を増幅するために、該環境由来試料に含まれる核酸を本発明のプライマーと接触させる。ＰＣＲにより陽性と考えられる環境由来試料については、標的の遺伝子配列を内包する微生物及びオルトソマイシン遺伝子クラスターの同定及び単離を行う。該環境由来試料に含まれる各種微生物群から代表的なゲノムＤＮＡを集めたゲノムＤＮＡライブラリー（例えば、コスミド、ＢＡＣなど）を構築し、（例えば、ハイブリダイゼーション法又はＰＣＲによって）標的の配列を内包するゲノムＤＮＡクローン、及び重複する可能性のあるクローンの局在を確認し、目的のゲノムＤＮＡクローンの配列を決定し、オルトソマイシン生合成遺伝子座のＯＲＦを推定することにより、オルトソマイシン遺伝子クラスターの同定を行ってもよい。オルトソマイシン生合成遺伝子座を含む微生物の同定及び単離は、例えば、本発明の核酸プローブ又は新しく同定したオルトソマイシン生合成遺伝子座に由来する核酸プローブのいずれかを用いたコロニーハイブリダイゼーションによって行ってもよい。単離したオルトソマイシン生合成遺伝子座を適切な代理宿主に導入して、オルトソマイシン化合物のヘテロローガスな生産（heterologous production）を行ってもよい。あるいは、オルトソマイシン生合成遺伝子座を含む微生物を同定し単離した場合には、発酵させることによりオルトソマイシン化合物を産生してもよい。
【００２３】
本発明の別の実施形態においては、オルトソマイシン遺伝子クラスターを含有する微生物をまず同定し、例えば、本発明の核酸プローブを用いたコロニーハイブリダイゼーションによって、純粋培養物として単離している。純粋培養物を出発点として、この単一の種から代表的なゲノムＤＮＡを集めたゲノムＤＮＡライブラリー（例えば、コスミド、ＢＡＣなど）を調製し、標的の配列を内包するゲノムＤＮＡクローン、及び重複する可能性のあるクローンの局在を、本発明のプローブを用いて（例えば、ハイブリダイゼーション法又はＰＣＲによって）確認し、目的のゲノムＤＮＡクローンの配列を決定し、オルトソマイシン生合成遺伝子座のＯＲＦを推定する。オルトソマイシン生合成遺伝子座を含む微生物を発酵させてオルトソマイシン化合物を産生してもよく、又は、オルトソマイシン生合成遺伝子座を適切な代理宿主に導入して、オルトソマイシン化合物のヘテロローガスな生産を行ってもよい。
【００２４】
本発明の別の態様においては、オルトソマイシン特異的核酸コード配列、エベルニノマイシン特異的核酸コード配列、アビラマイシン特異的核酸コード配列、オルトソマイシン特異的ポリペプチドコード配列、エベルニノマイシン特異的ポリペプチドコード配列、及びアビラマイシン特異的ポリペプチドコード配列から選択した１つ以上の配列を本発明の教示の通りに用いて、オルトソマイシン遺伝子クラスターをコンピュータシミュレーションで同定している。コンピュータ読み取り可能な媒体に保存されている一連のクエリー配列から１つのクエリーを読み出して、本発明の参照配列から選択したサブジェクトと比較する。該サブジェクトとクエリーとの間の類似の程度を測定し、オルトソマイシン遺伝子を表すクエリー配列を同定する。
【００２５】
当然のことながら、オルトソマイシン生合成遺伝子クラスター、エベルニノマイシン型生合成遺伝子クラスター、及びアビラマイシン型生合成遺伝子クラスターを同定する組成物及び方法を提供する本発明は、同定された生合成遺伝子クラスターが産生するオルトソマイシン、エベルニノマイシン型オルトソマイシン、アビラマイシン型オルトソマイシンをも提供するものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２６】
本発明は、オルトソマイシン遺伝子クラスター及びオルトソマイシン産生生物を同定するための組成物及び方法を提供するものである。本発明はまた、エベルニノマイシン型オルトソマイシン遺伝子クラスターとアビラマイシン型オルトソマイシン遺伝子クラスターとを識別するため、及びエベルニノマイシン型オルトソマイシン産生株とアビラマイシン型オルトソマイシン産生株とを識別するための組成物及び方法をも提供するものである。本発明の組成物及び方法を提供するため、該２種類のオルトソマイシン化合物の各メンバーの完全長生合成遺伝子座を同定し、配列を決定し、アノテーションを行った。Micromonospora carbonacea var. aurantiacaにおけるエベルニノマイシンの生合成遺伝子座（ＥＶＥＲ）は、約６０ｋｂに及んでおり、エベルニノマイシンの生合成に関与するタンパク質をコードする４９個のＯＲＦを含んでいる。Streptomyces mobaraensis由来のアビラマイシン様化合物の生合成遺伝子座（ＡＶＩＡ）は、約５０ｋｂに及んでおり、アビラマイシン型化合物の生合成に関与するタンパク質をコードする４２個のＯＲＦを含んでいる。
【００２７】
ＥＶＥＲ及びＡＶＩＡの分析により、すべてのオルトソマイシン分子に共通し、オルトソマイシン生合成遺伝子座を示す構造的特徴に関与する１７個のタンパク質ファミリーが判明した。これら１７個のタンパク質ファミリーの各メンバーは、ＥＶＥＲ、すなわち、ＥＶＥＲ  ＯＲＦ５、８、９、１２、１３、１５、１７〜１９、２４〜２６、３１、３３、３５及び４０（それぞれ、配列番号１１３、６５、２０１、７１、１２５、１０１、１９５、１５５、１０７、５３、２０５、１６１、１６９、１７７、５９及び１２９）において、及びＡＶＩＡ、すなわち、ＯＲＦ１〜３、５、９、１８、１９、２２〜２６、３１〜３４及び３７（それぞれ、配列番号１２３、２０３、１２７、５７、１９９、１６５、１６７、９９、１０５、１５３、１１１、１９３、５１、６３、１５９、１７５及び６９）において認められている。ＥＶＥＲでは、２個のタンパク質ファミリーが融合してＯＲＦ３１（配列番号１６９）を形成している。１７個のタンパク質ファミリーのメンバーは、Micromonospora carbonacea var. africana由来エベルニノマイシンの生合成遺伝子座及びStreptomyces viridochromogenesＴｕ５７由来アビラマイシン化合物の生合成遺伝子座でも認められている。これら１７個のタンパク質ファミリーの配列は、オルトソマイシンの生合成に関与する遺伝子クラスターを同定するための組成物及び方法、並びにオルトソマイシン産生生物を同定するための組成物及び方法の基盤を形成している。
【００２８】
ＥＶＥＲ及びＡＶＩＡの分析により、エベルニノマイシン型オルトソマイシン生合成遺伝子座とアビラマイシン型オルトソマイシン生合成遺伝子座とを識別する９個のタンパク質ファミリーが判明した。これら９個のタンパク質ファミリーの各メンバーは、ＥＶＥＲ、すなわち、ＥＶＥＲ  ＯＲＦ３、４、２１、４２、４３、４４、４５、４６及び４７（それぞれ、配列番号２２５、２３７、２２１、２３３、２０９、２２９、２１７、２１３及び２４１）において認められている。９個のタンパク質ファミリーそれぞれのメンバーは、Micromonospora carbonacea var. africana由来エベルニノマイシンの生合成遺伝子座でも認められている。ＡＶＩＡ、Streptomyces viridochromogenesＴｕ５７由来アビラマイシン化合物の生合成遺伝子座を含め、アビラマイシン型オルトソマイシンの生合成遺伝子座においては、これら９個のタンパク質ファミリーのメンバーはどれ１つとして認められなかった。これら９個のタンパク質ファミリーの配列は、エベルニノマイシン型オルトソマイシンの生合成に関与する遺伝子クラスターを同定するための組成物及び方法、並びにエベルニノマイシン型オルトソマイシン産生生物を同定するための組成物及び方法の基盤を形成している。
【００２９】
ＥＶＥＲ及びＡＶＩＡの分析により、アビラマイシン型オルトソマイシン生合成遺伝子座とエベルニノマイシン型オルトソマイシン生合成遺伝子座とを識別する６個のタンパク質ファミリーが判明した。これら６個のタンパク質ファミリーの各メンバーは、ＡＶＩＡ、すなわち、ＡＶＩＡ  ＯＲＦ６、７、１０、２１、２７及び２８（それぞれ、配列番号２５３、２５１、２５５、２４７、２４５及び２４９）において認められている。６個のタンパク質ファミリーのメンバーは、Streptomyces viridochromogenesＴｕ５７由来アビラマイシン化合物の生合成遺伝子座でも認められている。ＥＶＥＲ及びMicromonospora carbonacea var. africana由来エベルニノマイシンの生合成遺伝子座を含め、エベルニノマイシン型オルトソマイシンの生合成遺伝子座においては、これら６個のタンパク質ファミリーのメンバーはどれ１つとして認められなかった。これら６個のタンパク質ファミリーの配列は、アビラマイシン型オルトソマイシンの生合成に関与する遺伝子クラスターを同定するための組成物及び方法、並びにアビラマイシン型オルトソマイシン産生生物を同定するための組成物及び方法の基盤を形成している。
【００３０】
本発明の組成物及び方法を用いると、オルトソマイシン（エベルニノマイシン型オルトソマイシンとアビラマイシン型オルトソマイシンの両方）を産生するためのＤＮＡを含有する事実上すべての生物を、該生物のオルトソマイシン産生遺伝子の発現レベル又は該生物のオルトソマイシン産生量に関係なく検出することができる。オルトソマイシン産生に関与する核酸配列又はアミノ酸配列を検出すると、通常の実験室条件下又は該生物が自然状態で見られるような典型的な環境条件下では該生物が産生することのない、新規オルトソマイシン天然産物の検出が可能になる。オルトソマイシン産生に関与する核酸配列又はアミノ酸配列を検出すると、培養試験では検出できないほど低いレベルで産生された新規オルトソマイシンの検出が可能になる。オルトソマイシン産生に関与する核酸配列又はアミノ酸配列を検出すると、新規オルトソマイシン天然産物の供給源である新規オルトソマイシン産生株（エベルニノマイシン型オルトソマイシン産生株とアビラマイシン型オルトソマイシン産生株の両方）の検出が可能になる。
【００３１】
オルトソマイシン産生に必要なオープンリーディングフレームの有無を、本発明の組成物及び教示に基づき、ハイブリダイゼーションプローブ又はＰＣＲプライマーで検出することができる。プローブを使用したスクリーニングは、コンピュータシミュレーション又は従来のハイブリダイゼーションスクリーニング法のいずれかで行うことができる。
【００３２】
本明細書及び本件図面において、Micromonospora carbonacea var. aurantiacaＮＲＲＬ２９９７由来エベルニノマイシンの生合成遺伝子座をＥＶＥＲと称し、Micromonospora carbonacea var. africana（ＡＴＣＣ３９１４９、ＳＣＣ１４１３）由来エベルニノマイシンの生合成遺伝子座をＥＶＥＡと称し、Streptomyces mobaraensis由来アビラマイシン様化合物の生合成遺伝子座をＡＶＩＡと称し、Streptomyces viridochromogenesＴｕ５７由来アビラマイシン化合物の生合成遺伝子座をＡＶＩＬと称する場合がある。
【００３３】
ＥＶＥＲ、ＥＶＥＡ、ＡＶＩＡ、及びＡＶＩＬのＯＲＦには、推定される機能が割り当てられ、既知のタンパク質との相同性、又は既知のタンパク質との相同性の欠如に基づいて、ファミリー内でグループ分けが行われている。構造と機能を相関させるため、表Ｉに示したように、該タンパク質ファミリーを４文字で表記し、本明細書及び本図面では一貫してその表記を使用した。
【００３４】
【表Ｉ−１】
2004532021.tif 000004
【表Ｉ−２】
2004532021.tif 000005
【００３５】
「単離された」という語は、物質がその本来の環境、例えばそれが天然物として生じるのであればその自然環境から除去されたことを意味する。例えば、生体内に存在する自然に生じたポリヌクレオチド又はポリペプチドは、単離されてはいないが、その同じポリヌクレオチド又はポリペプチドが、自然界のシステムで共存している物質のすべて又は一部から分離された場合は、単離されたことになる。そうしたポリヌクレオチドをベクターの一部とすることができ、及び／又は、そうしたポリヌクレオチド又はポリペプチドを組成物の一部とすることができる。その場合もやはり単離されたことになる。なぜなら、そうしたポリヌクレオチド又はポリペプチドにとって、該ベクターや組成物は自然環境の一部ではないからである。
【００３６】
「精製された」という語は、１００％の純度を必要とするわけではなく、どちらかといえば、相対的な定義を意図するものである。従来、ライブラリーから得た個々の核酸は、電気泳動上で同質となるまで精製されている。これらのクローンから得た配列を、コスミドライブラリーなどの大型インサートライブラリー又は全生物ＤＮＡから直接得ることは不可能であった。本発明の精製された核酸は、生物のゲノムＤＮＡの残存物から少なくとも１０4〜１０6倍に精製されたものである。しかし、「精製された」という語は、ゲノムＤＮＡの残存物又はライブラリー若しくは他の環境に存在する他の配列から、少なくとも１０1倍、好ましくは１０2倍又は１０3倍、さらに好ましくは１０4倍又は１０5倍に精製された核酸も含むものである。
【００３７】
「組換え体」という語は、核酸が、自然環境では隣接しない「骨格」核酸に隣接していることを意味する。「濃縮」核酸とは、核酸骨格分子群中に数にして５％以上の核酸インサートが存在することを示す。「骨格」分子には、発現ベクター、自己複製核酸、ウィルス、組込み（integrating）核酸などの核酸、及び目的の核酸の維持又は操作に使用する他のベクター又は核酸などがある。該濃縮核酸は、組換え骨格分子群中に存在する核酸インサート数の１５％以上であることが好ましく、５０％以上であることがさらに好ましく、９０％以上であることがもっとも好ましい。
【００３８】
「組換え」ポリペプチド又はタンパク質とは、組換えＤＮＡ技術により作製された、すなわち、目的のポリペプチド又はタンパク質をコードする外部ＤＮＡコンストラクトにより形質転換された細胞から作製されたポリペプチド又はタンパク質を示す。「合成」ポリペプチド又はタンパク質とは、化学合成により調製されたポリペプチド又はタンパク質のことである。
【００３９】
「遺伝子」という語は、ポリペプチド鎖の作製に関与するＤＮＡのセグメントであり、コード領域前後の領域（リーダー及びトレーラー）、及び該当する場合には、個々のコード部分（エキソン）の間にある領域（イントロン）も含むものである。
【００４０】
ある特定のポリペプチド又はタンパク質を「コードするヌクレオチド配列」又はＤＮＡ「コード配列」とは、適切な制御配列の管理下に置かれた際にポリペプチド又はタンパク質に転写及び翻訳されるＤＮＡ配列のことである。
【００４１】
オリゴヌクレオチドとは、遺伝子、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ又はその他目的の核酸をコードするゲノムＤＮＡ分子、ｃＤＮＡ分子、又はｍＲＮＡ分子とハイブリダイズする核酸であって、一般的には１０個以上、好ましくは１５個、さらに好ましくは２０個以上で、好ましくは１００個以下のヌクレオチドを有する核酸のことである。
【００４２】
「オルトソマイシン産生株」又は「オルトソマイシン産生生物」とは、オルトソマイシン化合物を産生するのに必要な遺伝情報をもつ微生物を示し、該生物がオルトソマイシン産物を産生することが周知であるかどうかは、問題としない。自然環境下で存在している生物においてオルトソマイシン化合物を産生する遺伝情報が認められた場合も、組換え技術によって遺伝情報を生物に導入した場合も、この語はすべての生物に同じように適用される。オルトソマイシン産生株としては、Micromonosporaceae科、そのなかでも好ましくはMicromonospora、Actinoplanes及びDactylosporangium属の生物、Streptomycetaceae科、そのなかでも好ましくはStreptomyces及びKitasatospora属の生物、並びにPseudonocardiaceae科、そのなかでも好ましくはAmycolatopsis及びSaccharopolyspora属の生物が挙げられる。
【００４３】
寄託株：Micromonospora carbonacea aurantiaca由来エベルニノマイシン生合成遺伝子座まで及ぶコスミドクローンをそれぞれ有する３つの大腸菌ＤＨ１０Ｂ株を、２００１年１月２４日付で、カナダ国、Ｒ３Ｅ  ３Ｒ２、マニトバ州、ウィニペグ、アーリントンストリート  １０１５のカナダ国際寄託局（ＩＤＡＣ）に寄託した。該寄託株のアクセッション番号は、ＩＤＡＣ２４０１０１−１、ＩＤＡＣ２４０１０１−２、及びＩＤＡＣ２４０１０１−３であった。Streptomyces mobaraensis由来アビラマイシン生合成遺伝子座まで及ぶコスミドクローンをそれぞれ有する２つの大腸菌ＤＨ１０Ｂ株を、２００１年２月２７日付で、カナダ国、Ｒ３Ｅ  ３Ｒ２、マニトバ州、ウィニペグ、アーリントンストリート  １０１５のカナダ国際寄託局（ＩＤＡＣ）に寄託した。該寄託株のアクセッション番号は、ＩＤＡＣ２７０２０１−１、ＩＤＡＣ２７０２０１−２であった。ここでは、該寄託した大腸菌株を「寄託株」と称することとする。
【００４４】
該寄託株はともに、Micromonospora carbonacea var. aurantiaca由来エベルニノマイシン用及びStreptomyces mobaraensis由来アビラマイシン型化合物用の完全な生合成遺伝子座を含んでいる。本明細書中の配列に関する記載との間で齟齬が生じた場合は、寄託株に含まれるポリヌクレオチド配列及びそれらにコードされるあらゆるポリペプチドのアミノ酸配列が優先される（controlling）。
【００４５】
該寄託株の寄託は、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約に基づいて行われた。特許証が発行されると、寄託株は最終的なものとして、無制限又は無条件で公開される。寄託株は当業者の便宜のためだけに提供されるものであり、米国特許法第１１２条で要求されている実施可能要件を満たすために寄託が必要というわけではない。寄託株及びそれに由来する化合物の作製、使用又は販売には許諾が必要となる場合があり、かかる許諾が寄託により与えられることはない。
【００４６】
すべてのオルトソマイシンに共通する構造的特徴には、１７個の特定のタンパク質ファミリー、すなわちＧＴＦＥ、ＧＴＦＧ、ＧＴＦＨ、ＨＯＸＧ、ＭＴＦＤ、ＭＴＦＥ、ＭＴＦＦ、ＭＴＬＡ、ＭＴＩＡ、ＯＸＲＶ、ＯＸＲＷ、ＯＸＲＷ、ＰＨＯＤ、ＵＮＡＪ、ＵＥＶＡ、ＵＥＶＢ、及びＵＮＫＵから選択される１つ以上のタンパク質が必要となる。この１７個のタンパク質ファミリーにはＯＸＲＷが２つ含まれているが、ＥＶＥＲにおいては、２つ目のＯＸＲＷファミリーは、ＵＮＡＪファミリー及びＯＸＲＷファミリーに由来するタンパク質の融合物であるため、ＯＸＲＸと命名されている。これら１７個のタンパク質ファミリーのいずれかのメンバーであるポリペプチド、又はこれら１７個のタンパク質ファミリーのいずれかのメンバーであるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、オルトソマイシン遺伝子クラスター及びオルトソマイシン産生生物に特徴的であると考えられている。
【００４７】
オルトソマイシン生合成遺伝子座は、オルトソマイシン生合成遺伝子座に特徴的と考えられる１７個のタンパク質ファミリー１つ１つについて、そのメンバーを含むわけではないと予想されている。例えば、ＵＥＶＢ及びＭＴＩＡタンパク質ファミリーは、ＥＶＥＡ遺伝子座では認められない。しかし、ＡＶＩＡ、ＡＶＩＬ及びＥＶＥＲ遺伝子座ではＵＥＶＢ及びＭＴＩＡタンパク質ファミリーが認められていること、及び、他のホモログが今日まで発見されていないことから、ＵＥＶＢ及びＭＴＩＡタンパク質ファミリーは、オルトソマイシン遺伝子座を示すものであると考えられている。ＧＴＦＥ、ＧＴＦＧ、ＧＴＦＨ、ＨＯＸＧ、ＭＴＦＤ、ＭＴＦＥ、ＭＴＦＦ、ＭＴＬＡ、ＭＴＩＡ、ＯＸＲＶ、ＯＸＲＷ、ＯＸＲＷ、ＰＨＯＤ、ＵＮＡＪ、ＵＥＶＡ、ＵＥＶＢ、及びＵＮＫＵという１７個のタンパク質ファミリーのうち、少なくとも１個、好ましくは２個、さらに好ましくは３個、より好ましくは４個、より好ましくは５個、より好ましくは６個、より好ましくは８個、より好ましくは１０個以上が存在しているということは、オルトソマイシン生合成遺伝子座及びオルトソマイシン産生生物が存在するということである。
【００４８】
ＧＴＦＥタンパク質ファミリーのメンバーには、ＡＶＩＡ  ＯＲＦ３１（配列番号５１）、ＡＶＩＬGenbankアクセッション番号ＡＡＫ８３１９２、ＥＶＥＲ  ＯＲＦ２４（配列番号５３）、ＥＶＥＡ  ＯＲＦ３３（配列番号５５）から選択したポリペプチド、及び、デフォルトパラメータを用いたＢＬＡＳＴＰアルゴリズムで測定した場合に、配列番号５１、５３、５５、又は、ＡＶＩＬGenbankアクセッション番号ＡＡＫ８３１９２の配列を有するポリペプチドに対して、少なくとも９９％、少なくとも９５％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７０％、少なくとも６０％の相同性を有するポリペプチドが含まれる。
【００４９】
ＧＴＦＧタンパク質ファミリーのメンバーには、ＡＶＩＡ  ＯＲＦ５（配列番号５７）、ＡＶＩＬGenbankアクセッション番号ＡＡＫ８３１７０、ＥＶＥＲ  ＯＲＦ３５（配列番号５９）、ＥＶＥＡ  ＯＲＦ２７（配列番号６１）から選択したポリペプチド、及び、デフォルトパラメータを用いたＢＬＡＳＴＰアルゴリズムで測定した場合に、配列番号５７、５９、６１、又は、ＡＶＩＬGenbankアクセッション番号ＡＡＫ８３１７０の配列を有するポリペプチドに対して、少なくとも９９％、少なくとも９５％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７０％、少なくとも６０％の相同性を有するポリペプチドが含まれる。
【００５０】
ＧＴＦＨタンパク質ファミリーのメンバーには、ＡＶＩＡ  ＯＲＦ３２（配列番号６３）、ＡＶＩＬGenbankアクセッション番号ＡＡＫ８３１９３、ＥＶＥＲ  ＯＲＦ８（配列番号６５）、ＥＶＥＡ  ＯＲＦ３１（配列番号６７）から選択したポリペプチド、及び、デフォルトパラメータを用いたＢＬＡＳＴＰアルゴリズムで測定した場合に、配列番号６３、６５、６７、又は、ＡＶＩＬGenbankアクセッション番号ＡＡＫ８３１９３の配列を有するポリペプチドに対して、少なくとも９９％、少なくとも９５％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７０％、少なくとも６０％の相同性を有するポリペプチドが含まれる。
【００５１】
ＨＯＸＧタンパク質ファミリーのメンバーには、ＡＶＩＡ  ＯＲＦ３７（配列番号６９）、ＥＶＥＲ  ＯＲＦ１２（配列番号７１）、ＥＶＥＡ  ＯＲＦ４３（配列番号７３）から選択したポリペプチド、及び、デフォルトパラメータを用いたＢＬＡＳＴＰアルゴリズムで測定した場合に、配列番号６９、７１、又は７３の配列を有するポリペプチドに対して、少なくとも９９％、少なくとも９５％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７０％、少なくとも６０％の相同性を有するポリペプチドが含まれる。
【００５２】
ＭＴＦＤタンパク質ファミリーのメンバーには、ＡＶＩＡ  ＯＲＦ２２（配列番号９９）、ＡＶＩＬGenbankアクセッション番号ＡＡＫ８３１８４、ＥＶＥＲ  ＯＲＦ１５（配列番号１０１）、ＥＶＥＡ  ＯＲＦ８（配列番号１０３）から選択したポリペプチド、及び、デフォルトパラメータを用いたＢＬＡＳＴＰアルゴリズムで測定した場合に、配列番号９９、１０１、１０３、又は、ＡＶＩＬGenbankアクセッション番号ＡＡＫ８３１８４の配列を有するポリペプチドに対して、少なくとも９９％、少なくとも９５％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７０％、少なくとも６０％の相同性を有するポリペプチドが含まれる。
【００５３】
ＭＴＦＥタンパク質ファミリーのメンバーには、ＡＶＩＡ  ＯＲＦ２３（配列番号１０５）、ＡＶＩＬGenbankアクセッション番号ＡＡＫ８３１８６、ＥＶＥＲ  ＯＲＦ１９（配列番号１０７）、ＥＶＥＡ  ＯＲＦ１０（配列番号１０９）から選択したポリペプチド、及び、デフォルトパラメータを用いたＢＬＡＳＴＰアルゴリズムで測定した場合に、配列番号１０５、１０７、１０９、又は、ＡＶＩＬGenbankアクセッション番号ＡＡＫ８３１８６の配列を有するポリペプチドに対して、少なくとも９９％、少なくとも９５％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７０％、少なくとも６０％の相同性を有するポリペプチドが含まれる。
【００５４】
ＭＴＦＦタンパク質ファミリーのメンバーには、ＡＶＩＡ  ＯＲＦ２５（配列番号１１１）、ＡＶＩＬGenbankアクセッション番号ＡＡＫ８３１８８、ＥＶＥＲ  ＯＲＦ５（配列番号１１３）、ＥＶＥＡ  ＯＲＦ１２（配列番号１１５）から選択したポリペプチド、及び、デフォルトパラメータを用いたＢＬＡＳＴＰアルゴリズムで測定した場合に、配列番号１１１、１１３、１１５、又は、ＡＶＩＬGenbankアクセッション番号ＡＡＫ８３１８８の配列を有するポリペプチドに対して、少なくとも９９％、少なくとも９５％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７０％、少なくとも６０％の相同性を有するポリペプチドが含まれる。
【００５５】
ＭＴＬＡタンパク質ファミリーのメンバーには、ＡＶＩＡ  ＯＲＦ３（配列番号１２７）、ＡＶＩＬGenbankアクセッション番号ＡＡＧ３２０６７、ＥＶＥＲ  ＯＲＦ４０（配列番号１２９）、ＥＶＥＡ  ＯＲＦ４５（配列番号１３１）から選択したポリペプチド、及び、デフォルトパラメータを用いたＢＬＡＳＴＰアルゴリズムで測定した場合に、配列番号１２７、１２９、１３１、又は、ＡＶＩＬGenbankアクセッション番号ＡＡＧ３２０６７の配列を有するポリペプチドに対して、少なくとも９９％、少なくとも９５％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７０％、少なくとも６０％の相同性を有するポリペプチドが含まれる。
【００５６】
ＭＴＩＡタンパク質ファミリーのメンバーには、ＡＶＩＡ  ＯＲＦ１（配列番号１２３）、ＡＶＩＬGenbankアクセッション番号ＡＡＧ３２０６６、ＥＶＥＲ  ＯＲＦ１３（配列番号１２５）から選択したポリペプチド、及び、デフォルトパラメータを用いたＢＬＡＳＴＰアルゴリズムで測定した場合に、配列番号１２３、１２５、又は、ＡＶＩＬGenbankアクセッション番号ＡＡＧ３２０６６の配列を有するポリペプチドに対して、少なくとも９９％、少なくとも９５％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７０％、少なくとも６０％の相同性を有するポリペプチドが含まれる。
【００５７】
ＯＸＲＶタンパク質ファミリーのメンバーには、ＡＶＩＡ  ＯＲＦ２４（配列番号１５３）、ＡＶＩＬGenbankアクセッション番号ＡＡＫ８３１８７、ＥＶＥＲ  ＯＲＦ１８（配列番号１５５）、ＥＶＥＡ  ＯＲＦ１１（配列番号１５７）から選択したポリペプチド、及び、デフォルトパラメータを用いたＢＬＡＳＴＰアルゴリズムで測定した場合に、配列番号１５３、１５５、１５７、又は、ＡＶＩＬGenbankアクセッション番号ＡＡＫ８３１８７の配列を有するポリペプチドに対して、少なくとも９９％、少なくとも９５％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７０％、少なくとも６０％の相同性を有するポリペプチドが含まれる。
【００５８】
ＯＸＲＷタンパク質ファミリーのメンバーには、ＡＶＩＡ  ＯＲＦ３３（配列番号１５９）、ＥＶＥＲ  ＯＲＦ２６（配列番号１６１）、ＥＶＥＡ  ＯＲＦ３０（配列番号１６３）から選択したポリペプチド、及び、デフォルトパラメータを用いたＢＬＡＳＴＰアルゴリズムで測定した場合に、配列番号１５９、１６１、又は、１６３の配列を有するポリペプチドに対して、少なくとも９９％、少なくとも９５％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７０％、少なくとも６０％の相同性を有するポリペプチドが含まれる。
【００５９】
ＯＸＲＷタンパク質ファミリーのメンバーには、ＡＶＩＡ  ＯＲＦ１９（配列番号１６７）、ＥＶＥＡ  ＯＲＦ６（配列番号１７３）、ＡＶＩＬGenbankアクセッション番号ＡＡＫ８３１８１、ＥＶＥＲ  ＯＲＦ３１（配列番号１６９）から選択したポリペプチド、及び、デフォルトパラメータを用いたＢＬＡＳＴＰアルゴリズムで測定した場合に、配列番号１６７、１６９、１７３、又は、ＡＶＩＬGenbankアクセッション番号ＡＡＫ８３１８１の配列を有するポリペプチドに対して、少なくとも９９％、少なくとも９５％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７０％、少なくとも６０％の相同性を有するポリペプチドが含まれる。
【００６０】
ＰＨＯＤタンパク質ファミリーのメンバーには、ＡＶＩＡ  ＯＲＦ３４（配列番号１７５）、ＥＶＥＲ  ＯＲＦ３３（配列番号１７７）、ＥＶＥＡ  ＯＲＦ２９（配列番号１７９）から選択したポリペプチド、及び、デフォルトパラメータを用いたＢＬＡＳＴＰアルゴリズムで測定した場合に、配列番号１７５、１７７、又は、１７９の配列を有するポリペプチドに対して、少なくとも９９％、少なくとも９５％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７０％、少なくとも６０％の相同性を有するポリペプチドが含まれる。
【００６１】
ＵＮＡＪタンパク質ファミリーのメンバーには、ＡＶＩＡ  ＯＲＦ１８（配列番号１６５）、ＥＶＥＡ  ＯＲＦ５（配列番号１７１）、ＥＶＥＲ  ＯＲＦ３１（配列番号１６９）から選択したポリペプチド、及び、デフォルトパラメータを用いたＢＬＡＳＴＰアルゴリズムで測定した場合に、配列番号１６５、１６９、又は１７１の配列を有するポリペプチドに対して、少なくとも９９％、少なくとも９５％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７０％、少なくとも６０％の相同性を有するポリペプチドが含まれる。
【００６２】
ＵＥＶＡタンパク質ファミリーのメンバーには、ＡＶＩＡ  ＯＲＦ２６（配列番号１９３）、ＡＶＩＬGenbankアクセッション番号ＡＡＫ８３１８９、ＥＶＥＲ  ＯＲＦ１７（配列番号１９５）、ＥＶＥＡ  ＯＲＦ１４（配列番号１９７）から選択したポリペプチド、及び、デフォルトパラメータを用いたＢＬＡＳＴＰアルゴリズムで測定した場合に、配列番号１９３、１９５、１９７、又は、ＡＶＩＬGenbankアクセッション番号ＡＡＫ８３１８９の配列を有するポリペプチドに対して、少なくとも９９％、少なくとも９５％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７０％、少なくとも６０％の相同性を有するポリペプチドが含まれる。
【００６３】
ＵＥＶＢタンパク質ファミリーのメンバーには、ＡＶＩＡ  ＯＲＦ９（配列番号１９９）、ＡＶＩＬGenbankアクセッション番号ＡＡＫ８３１７４、ＥＶＥＲ  ＯＲＦ９（配列番号２０１）から選択したポリペプチド、及び、デフォルトパラメータを用いたＢＬＡＳＴＰアルゴリズムで測定した場合に、配列番号１９９、２０１、又は、ＡＶＩＬGenbankアクセッション番号ＡＡＫ８３１７４の配列を有するポリペプチドに対して、少なくとも９９％、少なくとも９５％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７０％、少なくとも６０％の相同性を有するポリペプチドが含まれる。
【００６４】
ＵＮＫＵタンパク質ファミリーのメンバーには、ＡＶＩＡ  ＯＲＦ２（配列番号２０３）、ＥＶＥＲ  ＯＲＦ２５（配列番号２０５）、ＥＶＥＡ  ＯＲＦ３２（配列番号２０７）から選択したポリペプチド、及び、デフォルトパラメータを用いたＢＬＡＳＴＰアルゴリズムで測定した場合に、配列番号２０３、２０５、又は、２０７の配列を有するポリペプチドに対して、少なくとも９９％、少なくとも９５％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７０％、少なくとも６０％の相同性を有するポリペプチドが含まれる。
【００６５】
エベルニノマイシン型オルトソマイシンを他のオルトソマイシンから識別する構造的特徴には、９個のタンパク質ファミリー、すなわちＤＡＴＣ、ＤＥＰＦ、ＥＰＩＭ、ＧＴＦＡ、ＭＴＦＧ、ＭＴＦＶ、ＯＸＢＮ、ＯＸＣＯ及びＵＮＢＢから選択される１つ以上のタンパク質が必要となる。これら９個のタンパク質ファミリーのいずれかのメンバーであるポリペプチド、又はこれら９個のタンパク質ファミリーのいずれかのメンバーであるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、エベルニノマイシン型オルトソマイシン遺伝子クラスター及びエベルニノマイシン型オルトソマイシン産生生物に特徴的であると考えられている。好ましい実施形態において、これら９個のタンパク質ファミリー、すなわち、ＤＡＴＣ、ＤＥＰＦ、ＥＰＩＭ、ＧＴＦＡ、ＭＴＦＧ、ＭＴＦＶ、ＯＸＢＮ、ＯＸＣＯ及びＵＮＢＢのいずれかのメンバーであるポリペプチド、又はこれら９個のタンパク質ファミリーのいずれかのメンバーであるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、オルトソマイシン遺伝子クラスターに特徴的な１７個のタンパク質ファミリー、すなわち、ＧＴＦＥ、ＧＴＦＧ、ＧＴＦＨ、ＨＯＸＧ、ＭＴＦＤ、ＭＴＦＥ、ＭＴＦＦ、ＭＴＬＡ、ＭＴＩＡ、ＯＸＲＶ、ＯＸＲＷ、ＯＸＲＷ、ＰＨＯＤ、ＵＮＡＪ、ＵＥＶＡ、ＵＥＶＢ、及びＵＮＫＵのいずれかのメンバーである１つ以上のポリペプチド、又はこれら１７個のタンパク質ファミリーのメンバーであるポリペプチドをコードする１つ以上のポリヌクレオチドとともに検出されている。
【００６６】
エベルニノマイシン型オルトソマイシン生合成遺伝子座は、エベルニノマイシン型オルトソマイシン生合成遺伝子座に特徴的と考えられる９個のタンパク質ファミリー１つ１つについて、そのメンバーを含むわけではないと予想されている。むしろ、ＤＡＴＣ、ＤＥＰＦ、ＥＰＩＭ、ＧＴＦＡ、ＭＴＦＧ、ＭＴＦＶ、ＯＸＢＮ、ＯＸＣＯ及びＵＮＢＢという９個のタンパク質ファミリーのうち、少なくとも１個、好ましくは２個、さらに好ましくは３個、より好ましくは４個、もっとも好ましくは６個以上が存在しているということは、エベルニノマイシン型オルトソマイシン生合成遺伝子座及びエベルニノマイシン型オルトソマイシン産生生物が存在するということである。好ましい実施形態において、オルトソマイシン生合成遺伝子クラスターに特徴的な、ＧＴＦＥ、ＧＴＦＧ、ＧＴＦＨ、ＨＯＸＧ、ＭＴＦＤ、ＭＴＦＥ、ＭＴＦＦ、ＭＴＬＡ、ＭＴＩＡ、ＯＸＲＶ、ＯＸＲＷ、ＯＸＲＷ、ＰＨＯＤ、ＵＮＡＪ、ＵＥＶＡ、ＵＥＶＢ、及びＵＮＫＵという１７個のタンパク質ファミリーのうち、少なくとも１個、好ましくは２個、さらに好ましくは４個、より好ましくは６個、より好ましくは８個、より好ましくは１０個以上の存在とともに、ＤＡＴＣ、ＤＥＰＦ、ＥＰＩＭ、ＧＴＦＡ、ＭＴＦＧ、ＭＴＦＶ、ＯＸＢＮ、ＯＸＣＯ及びＵＮＢＢという９個のタンパク質ファミリーのうち、少なくとも１個、好ましくは２個、さらに好ましくは３個、より好ましくは４個、もっとも好ましくは６個以上の存在が検出されたということは、エベルニノマイシン型オルトソマイシン生合成遺伝子座及びエベルニノマイシン型オルトソマイシン産生生物が存在するということである。
【００６７】
ＤＡＴＣタンパク質ファミリーのメンバーには、ＥＶＥＲ  ＯＲＦ４３（配列番号２０９）、ＥＶＥＡ  ＯＲＦ３７（配列番号２１１）から選択したポリペプチド、及び、デフォルトパラメータを用いたＢＬＡＳＴＰアルゴリズムで測定した場合に、ＥＶＥＲ  ＯＲＦ４３（配列番号２０９）、ＥＶＥＡ  ＯＲＦ３７（配列番号２１１）のポリペプチドに対して、少なくとも９９％、少なくとも９５％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７０％、少なくとも６０％の相同性を有するポリペプチドが含まれる。
【００６８】
ＤＥＰＦタンパク質ファミリーのメンバーには、ＥＶＥＲ  ＯＲＦ４６（配列番号２１３）、ＥＶＥＡ  ＯＲＦ４０（配列番号２１５）から選択したポリペプチド、及び、デフォルトパラメータを用いたＢＬＡＳＴＰアルゴリズムで測定した場合に、ＥＶＥＲ  ＯＲＦ４６（配列番号２１３）、ＥＶＥＡ  ＯＲＦ４０（配列番号２１５）のポリペプチドに対して、少なくとも９９％、少なくとも９５％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７０％、少なくとも６０％の相同性を有するポリペプチドが含まれる。
【００６９】
ＥＰＩＭタンパク質ファミリーのメンバーには、ＥＶＥＲ  ＯＲＦ４５（配列番号２１７）、ＥＶＥＡ  ＯＲＦ３９（配列番号２１９）から選択したポリペプチド、及び、デフォルトパラメータを用いたＢＬＡＳＴＰアルゴリズムで測定した場合に、ＥＶＥＲ  ＯＲＦ４５（配列番号２１７）、ＥＶＥＡ  ＯＲＦ３９（配列番号２１９）のポリペプチドに対して、少なくとも９９％、少なくとも９５％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７０％、少なくとも６０％の相同性を有するポリペプチドが含まれる。
【００７０】
ＧＴＦＡタンパク質ファミリーのメンバーには、ＥＶＥＲ  ＯＲＦ２１（配列番号２２１）、ＥＶＥＡ  ＯＲＦ３５（配列番号２２３）から選択したポリペプチド、及び、デフォルトパラメータを用いたＢＬＡＳＴＰアルゴリズムで測定した場合に、ＥＶＥＲ  ＯＲＦ２１（配列番号２２１）、ＥＶＥＡ  ＯＲＦ３５（配列番号２２３）のポリペプチドに対して、少なくとも９９％、少なくとも９５％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７０％、少なくとも６０％の相同性を有するポリペプチドが含まれる。
【００７１】
ＭＴＦＧタンパク質ファミリーのメンバーには、ＥＶＥＲ  ＯＲＦ３（配列番号２２５）、ＥＶＥＡ  ＯＲＦ１８（配列番号２２７）から選択したポリペプチド、及び、デフォルトパラメータを用いたＢＬＡＳＴＰアルゴリズムで測定した場合に、ＥＶＥＲ  ＯＲＦ３（配列番号２２５）、ＥＶＥＡ  ＯＲＦ１８（配列番号２２７）のポリペプチドに対して、少なくとも９９％、少なくとも９５％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７０％、少なくとも６０％の相同性を有するポリペプチドが含まれる。
【００７２】
ＭＴＦＶタンパク質ファミリーのメンバーには、ＥＶＥＲ  ＯＲＦ４４（配列番号２２９）、ＥＶＥＡ  ＯＲＦ３８（配列番号２３１）から選択したポリペプチド、及び、デフォルトパラメータを用いたＢＬＡＳＴＰアルゴリズムで測定した場合に、ＥＶＥＲ  ＯＲＦ４４（配列番号２２９）、ＥＶＥＡ  ＯＲＦ３８（配列番号２３１）のポリペプチドに対して、少なくとも９９％、少なくとも９５％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７０％、少なくとも６０％の相同性を有するポリペプチドが含まれる。
【００７３】
ＯＸＢＮタンパク質ファミリーのメンバーには、ＥＶＥＲ  ＯＲＦ４２（配列番号２３３）、ＥＶＥＡ  ＯＲＦ３６（配列番号２３５）から選択したポリペプチド、及び、デフォルトパラメータを用いたＢＬＡＳＴＰアルゴリズムで測定した場合に、ＥＶＥＲ  ＯＲＦ４２（配列番号２３３）、ＥＶＥＡ  ＯＲＦ３６（配列番号２３５）のポリペプチドに対して、少なくとも９９％、少なくとも９５％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７０％、少なくとも６０％の相同性を有するポリペプチドが含まれる。
【００７４】
ＯＸＣＯタンパク質ファミリーのメンバーには、ＥＶＥＲ  ＯＲＦ４（配列番号２３７）、ＥＶＥＡ  ＯＲＦ１９（配列番号２３９）から選択したポリペプチド、及び、デフォルトパラメータを用いたＢＬＡＳＴＰアルゴリズムで測定した場合に、ＥＶＥＲ  ＯＲＦ４（配列番号２３７）、ＥＶＥＡ  ＯＲＦ１９（配列番号２３９）のポリペプチドに対して、少なくとも９９％、少なくとも９５％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７０％、少なくとも６０％の相同性を有するポリペプチドが含まれる。
【００７５】
ＵＮＢＢタンパク質ファミリーのメンバーには、ＥＶＥＲ  ＯＲＦ４７（配列番号２４１）、ＥＶＥＡ  ＯＲＦ４１（配列番号２４３）から選択したポリペプチド、及び、デフォルトパラメータを用いたＢＬＡＳＴＰアルゴリズムで測定した場合に、ＥＶＥＲ  ＯＲＦ４７（配列番号２４１）、ＥＶＥＡ  ＯＲＦ４１（配列番号２４３）のポリペプチドに対して、少なくとも９９％、少なくとも９５％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７０％、少なくとも６０％の相同性を有するポリペプチドが含まれる。
【００７６】
アビラマイシン型オルトソマイシンを他のオルトソマイシンから識別する構造的特徴には、６個のタンパク質ファミリー、すなわちＡＢＣＤ、ＤＥＰＮ、ＭＥＭＤ、ＲＥＢＵ、ＵＮＡＩ及びＵＮＢＲから選択される１つ以上のタンパク質が関与している。これら６個のタンパク質ファミリーのいずれかのメンバーであるポリペプチド、又はこれら６個のタンパク質ファミリーのいずれかのメンバーであるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、アビラマイシン型オルトソマイシン遺伝子クラスター及びアビラマイシン型オルトソマイシン産生生物に特徴的であると考えられている。好ましい実施形態において、これら６個のタンパク質ファミリー、すなわち、ＡＢＣＤ、ＤＥＰＮ、ＭＥＭＤ、ＲＥＢＵ、ＵＮＡＩ及びＵＮＢＲのいずれかのメンバーであるポリペプチド、又はこれら６個のタンパク質ファミリーのいずれかのメンバーであるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、オルトソマイシン生合成遺伝子クラスターに特徴的な１７個のタンパク質ファミリー、すなわち、ＧＴＦＥ、ＧＴＦＧ、ＧＴＦＨ、ＨＯＸＧ、ＭＴＦＤ、ＭＴＦＥ、ＭＴＦＦ、ＭＴＬＡ、ＭＴＩＡ、ＯＸＲＶ、ＯＸＲＷ、ＯＸＲＷ、ＰＨＯＤ、ＵＮＡＪ、ＵＥＶＡ、ＵＥＶＢ、及びＵＮＫＵのいずれかのメンバーである１つ以上のポリペプチド、又はこれら１７個のタンパク質ファミリーのメンバーであるポリペプチドをコードする１つ以上のポリヌクレオチドとともに検出されている。
【００７７】
アビラマイシン型オルトソマイシン生合成遺伝子座は、アビラマイシン型オルトソマイシン生合成遺伝子座に特徴的と考えられる６個のタンパク質ファミリー１つ１つについて、そのメンバーを含むわけではないと予想されている。むしろ、ＡＢＣＤ、ＤＥＰＮ、ＭＥＭＤ、ＲＥＢＵ、ＵＮＡＩ及びＵＮＢＲというタンパク質ファミリーのうち、少なくとも１個、好ましくは２個、さらに好ましくは３個、より好ましくは４個、もっとも好ましくは５個又は６個が存在しているということは、アビラマイシン型オルトソマイシン生合成遺伝子座及びアビラマイシン型オルトソマイシン産生生物が存在するということである。好ましい実施形態において、オルトソマイシン生合成遺伝子クラスターに特徴的な、ＧＴＦＥ、ＧＴＦＧ、ＧＴＦＨ、ＨＯＸＧ、ＭＴＦＤ、ＭＴＦＥ、ＭＴＦＦ、ＭＴＬＡ、ＭＴＩＡ、ＯＸＲＶ、ＯＸＲＷ、ＯＸＲＷ、ＰＨＯＤ、ＵＮＡＪ、ＵＥＶＡ、ＵＥＶＢ、及びＵＮＫＵという１７個のタンパク質ファミリーのうち、少なくとも１個、好ましくは２個、さらに好ましくは４個、より好ましくは６個、より好ましくは８個、より好ましくは１０個以上の存在とともに、ＡＢＣＤ、ＤＥＰＮ、ＭＥＭＤ、ＲＥＢＵ、ＵＮＡＩ及びＵＮＢＲというタンパク質ファミリーのうち、少なくとも１個、好ましくは２個、さらに好ましくは３個、より好ましくは４個、もっとも好ましくは５個又は６個の存在が検出されたということは、アビラマイシン型オルトソマイシン生合成遺伝子座及びアビラマイシン型オルトソマイシン産生生物が存在するということである。
【００７８】
ＡＢＣＤタンパク質ファミリーのメンバーには、ＡＶＩＡ  ＯＲＦ２７（配列番号２４５）、ＡＶＩＬGenbankアクセッション番号ＡＡＧ３２０６８から選択したポリペプチド、及び、デフォルトパラメータを用いたＢＬＡＳＴＰアルゴリズムで測定した場合に、ＡＶＩＡ  ＯＲＦ２７（配列番号２４５）、又は、ＡＶＩＬGenbankアクセッション番号ＡＡＧ３２０６８のポリペプチドに対して、少なくとも９９％、少なくとも９５％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７０％、少なくとも６０％の相同性を有するポリペプチドが含まれる。
【００７９】
ＤＥＰＮタンパク質ファミリーのメンバーには、ＡＶＩＡ  ＯＲＦ２１（配列番号２４７）、ＡＶＩＬGenbankアクセッション番号ＡＡＫ８３１８３から選択したポリペプチド、及び、デフォルトパラメータを用いたＢＬＡＳＴＰアルゴリズムで測定した場合に、ＡＶＩＡ  ＯＲＦ２１（配列番号２４７）、又は、ＡＶＩＬGenbankアクセッション番号ＡＡＫ８３１８３のポリペプチドに対して、少なくとも９９％、少なくとも９５％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７０％、少なくとも６０％の相同性を有するポリペプチドが含まれる。
【００８０】
ＭＥＭＤタンパク質ファミリーのメンバーには、ＡＶＩＡ  ＯＲＦ２８（配列番号２４９）、ＡＶＩＬGenbankアクセッション番号ＡＡＧ３２０６９から選択したポリペプチド、及び、デフォルトパラメータを用いたＢＬＡＳＴＰアルゴリズムで測定した場合に、ＡＶＩＡ  ＯＲＦ２８（配列番号２４９）、又は、ＡＶＩＬGenbankアクセッション番号ＡＡＧ３２０６９のポリペプチドに対して、少なくとも９９％、少なくとも９５％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７０％、少なくとも６０％の相同性を有するポリペプチドが含まれる。
【００８１】
ＲＥＢＵタンパク質ファミリーのメンバーには、ＡＶＩＡ  ＯＲＦ７（配列番号２５１）、ＡＶＩＬGenbankアクセッション番号ＡＡＫ８３１７２から選択したポリペプチド、及び、デフォルトパラメータを用いたＢＬＡＳＴＰアルゴリズムで測定した場合に、ＡＶＩＡ  ＯＲＦ７（配列番号２５１）、又は、ＡＶＩＬGenbankアクセッション番号ＡＡＫ８３１７２のポリペプチドに対して、少なくとも９９％、少なくとも９５％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７０％、少なくとも６０％の相同性を有するポリペプチドが含まれる。
【００８２】
ＵＮＡＩタンパク質ファミリーのメンバーには、ＡＶＩＡ  ＯＲＦ６（配列番号２５３）、ＡＶＩＬGenbankアクセッション番号ＡＡＫ８３１７１から選択したポリペプチド、及び、デフォルトパラメータを用いたＢＬＡＳＴＰアルゴリズムで測定した場合に、ＡＶＩＡ  ＯＲＦ６（配列番号２５３）、又は、ＡＶＩＬGenbankアクセッション番号ＡＡＫ８３１７１のポリペプチドに対して、少なくとも９９％、少なくとも９５％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７０％、少なくとも６０％の相同性を有するポリペプチドが含まれる。
【００８３】
ＵＮＢＲタンパク質ファミリーのメンバーには、ＡＶＩＡ  ＯＲＦ１０（配列番号２５５）、ＡＶＩＬGenbankアクセッション番号ＡＡＫ８３１７５から選択したポリペプチド、及び、デフォルトパラメータを用いたＢＬＡＳＴＰアルゴリズムで測定した場合に、ＡＶＩＡ  ＯＲＦ１０（配列番号２５５）、又は、ＡＶＩＬGenbankアクセッション番号ＡＡＫ８３１７５のポリペプチドに対して、少なくとも９９％、少なくとも９５％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７０％、少なくとも６０％の相同性を有するポリペプチドが含まれる。
ハイブリダイゼーションプローブ及びＰＣＲプライマー：
オルトソマイシン産生生物又はオルトソマイシン生合成遺伝子座を同定するため、培養した微生物、又は、例えば土壌など、オルトソマイシン化合物を産生する遺伝的能力をもつ生物を含有する可能性のある環境試料に由来する核酸を、オルトソマイシンに共通する構造的特徴の生合成に関係する１７個のタンパク質ファミリーのメンバーをコードするヌクレオチド配列に基づくプローブと接触させてもよい。次の（１）〜（１７）からなる群から選択される１つの核酸、又は複数の核酸を組み合わせたものに基づいて、有用なプローブを設計してもよい：（１）ＧＴＦＥファミリーのポリペプチドをコードする核酸配列、例えば、配列番号５２、５４、５６（ＡＶＩＡ  ＯＲＦ３１、ＥＶＥＲ  ＯＲＦ２４及びＥＶＥＡ  ＯＲＦ３３にて、ＧＴＦＥタンパク質をそれぞれコードする核酸配列）の核酸、又は、ＡＶＩＬGenbankアクセッション番号ＡＡＫ８３１９２をコードする核酸配列；（２）ＧＴＦＧファミリーのポリペプチドをコードする核酸配列、例えば、配列番号５８、６０、６２（ＡＶＩＡ  ＯＲＦ５、ＥＶＥＲ  ＯＲＦ３５及びＥＶＥＡ  ＯＲＦ２７にて、ＧＴＦＧタンパク質をそれぞれコードする核酸配列）の核酸、又は、ＡＶＩＬGenbankアクセッション番号ＡＡＫ８３１７０をコードする核酸配列；（３）ＧＴＦＨファミリーのポリペプチドをコードする核酸配列、例えば、配列番号６４、６６、６８（ＡＶＩＡ  ＯＲＦ３２、ＥＶＥＲ  ＯＲＦ８及びＥＶＥＡ  ＯＲＦ３１にて、ＧＴＦＨタンパク質をそれぞれコードする核酸配列）の核酸、又は、ＡＶＩＬGenbankアクセッション番号ＡＡＫ８３１９３をコードする核酸配列；（４）ＨＯＸＧファミリーのポリペプチドをコードする核酸配列、例えば、配列番号７０、７２、７４（ＡＶＩＡ  ＯＲＦ３７、ＥＶＥＲ  ＯＲＦ１２及びＥＶＥＡ  ＯＲＦ４３にて、ＨＯＸＧタンパク質をそれぞれコードする核酸配列）の核酸；（５）ＭＴＦＤファミリーのポリペプチドをコードする核酸配列、例えば、配列番号１００、１０２、１０４（ＡＶＩＡ  ＯＲＦ２２、ＥＶＥＲ  ＯＲＦ１５及びＥＶＥＡ  ＯＲＦ８にて、ＭＴＦＤタンパク質をそれぞれコードする核酸配列）の核酸、又は、ＡＶＩＬGenbankアクセッション番号ＡＡＫ８３１８４をコードする核酸配列；（６）ＭＴＦＥファミリーのポリペプチドをコードする核酸配列、例えば、配列番号１０６、１０８、１１０（ＡＶＩＡ  ＯＲＦ２３、ＥＶＥＲ  ＯＲＦ１９及びＥＶＥＡ  ＯＲＦ１０にて、ＭＴＦＥタンパク質をそれぞれコードする核酸配列）の核酸、又は、ＡＶＩＬGenbankアクセッション番号ＡＡＫ８３１８６をコードする核酸配列；（７）ＭＴＦＦファミリーのポリペプチドをコードする核酸配列、例えば、配列番号１１２、１１４、１１６（ＡＶＩＡ  ＯＲＦ２５、ＥＶＥＲ  ＯＲＦ５及びＥＶＥＡ  ＯＲＦ１２にて、ＭＴＦＦタンパク質をそれぞれコードする核酸配列）の核酸、又は、ＡＶＩＬGenbankアクセッション番号ＡＡＫ８３１８８をコードする核酸配列；（８）ＭＴＬＡファミリーのポリペプチドをコードする核酸配列、例えば、配列番号１２８、１３０、１３２（ＡＶＩＡ  ＯＲＦ３、ＥＶＥＲ  ＯＲＦ４０及びＥＶＥＡ  ＯＲＦ４５にて、ＭＴＬＡタンパク質をそれぞれコードする核酸配列）の核酸、又は、ＡＶＩＬGenbankアクセッション番号ＡＡＧ３２０６７をコードする核酸配列；（９）ＭＴＩＡファミリーのポリペプチドをコードする核酸配列、例えば、配列番号１２４、１２６（ＡＶＩＡ  ＯＲＦ１及びＥＶＥＲ  ＯＲＦ１３にて、ＭＴＩＡタンパク質をそれぞれコードする核酸配列）の核酸、又は、ＡＶＩＬGenbankアクセッション番号ＡＡＧ３２０６６をコードする核酸配列；（１０）ＯＸＲＶファミリーのポリペプチドをコードする核酸配列、例えば、配列番号１５４、１５６、１５８（ＡＶＩＡ  ＯＲＦ２４、ＥＶＥＲ  ＯＲＦ１８及びＥＶＥＡ  ＯＲＦ１１にて、ＯＸＲＶタンパク質をそれぞれコードする核酸配列）の核酸、又は、ＡＶＩＬGenbankアクセッション番号ＡＡＫ８３１８７をコードする核酸配列；（１１）ＯＸＲＷファミリーのポリペプチドをコードする核酸配列、例えば、配列番号１６０、１６２及び１６４（ＡＶＩＡ  ＯＲＦ３３、ＥＶＥＲ  ＯＲＦ２６及びＥＶＥＡ  ＯＲＦ３０にて、ＯＸＲＷタンパク質をそれぞれコードする核酸配列）の核酸；（１２）ＯＸＲＷ／ＯＸＲＸファミリーのポリペプチドをコードする核酸配列、例えば、配列番号（配列番号１６７のＡＶＩＡ  ＯＲＦ１９、配列番号１７３のＥＶＥＡ  ＯＲＦ６にて、２つ目のＯＸＲＷタンパク質をそれぞれコードする核酸配列）、配列番号１７０（ＥＶＥＲ  ＯＲＦ３１にて、ＯＸＲＸタンパク質をコードする核酸）の核酸、及び、ＡＶＩＬGenbankアクセッション番号ＡＡＫ８３１８１をコードする核酸配列；（１３）ＰＨＯＤファミリーのポリペプチドをコードする核酸配列、例えば、配列番号１７６、１７８及び１８０（ＡＶＩＡ  ＯＲＦ３４、ＥＶＥＲ  ＯＲＦ３３及びＥＶＥＡ  ＯＲＦ２９にて、ＰＨＯＤタンパク質をそれぞれコードする核酸配列）の核酸；（１４）ＵＮＡＪ／ＯＸＲＸファミリーのポリペプチドをコードする核酸配列、例えば、配列番号（配列番号１６５のＡＶＩＡ  ＯＲＦ１８、配列番号１７１のＥＶＥＡ  ＯＲＦ５にて、ＵＮＡＪタンパク質をそれぞれコードする核酸配列）、配列番号１７０（ＥＶＥＲ  ＯＲＦ３１にて、ＯＸＲＸタンパク質をコードする核酸）の核酸；（１５）ＵＥＶＡファミリーのポリペプチドをコードする核酸配列、例えば、配列番号１９４、１９６及び１９８（ＡＶＩＡ  ＯＲＦ２６、ＥＶＥＲ  ＯＲＦ１７及びＥＶＥＡ  ＯＲＦ１４にて、ＵＥＶＡタンパク質をそれぞれコードする核酸配列）の核酸、又は、ＡＶＩＬGenbankアクセッション番号ＡＡＫ８３１８９をコードする核酸配列；（１６）ＵＥＶＢファミリーのポリペプチドをコードする核酸配列、例えば、配列番号２００及び２０２（ＡＶＩＡ  ＯＲＦ９、及びＥＶＥＲ  ＯＲＦ９にて、ＵＥＶＢタンパク質をそれぞれコードする核酸配列）の核酸、又は、ＡＶＩＬGenbankアクセッション番号ＡＡＫ８３１７４をコードする核酸配列；（１７）ＵＮＫＵファミリーのポリペプチドをコードする核酸配列、例えば、配列番号２０４、２０６、２０８（ＡＶＩＡ  ＯＲＦ２、ＥＶＥＲ  ＯＲＦ２５及びＥＶＥＡ  ＯＲＦ３２にて、ＵＮＫＵタンパク質をそれぞれコードする核酸配列）の核酸。好ましいプローブとしては、単離、精製又は濃縮を行った核酸であって、配列番号５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、���４、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１５４、１５６、１５８、１６０、１６２、１６４、１６６、１６８、１７０、１７２、１７４、１７６、１７８、１８０、１９４、１９６、１９８、２００、２０２、２０４、２０６、２０８、及びそれらに相補的な配列に由来するもの、又は、配列番号５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１５４、１５６、１５８、１６０、１６２、１６４、１６６、１６８、１７０、１７２、１７４、１７６、１７８、１８０、１９４、１９６、１９８、２００、２０２、２０４、２０６、２０８の配列のいずれか、若しくはそれらに相補的な配列の、少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、７５、１００、１５０、２００、３００、４００若しくは５００個の塩基を連続状態で含む断片に由来するものが挙げられる。
【００８４】
そうした手順においては、培養した微生物、又は、オルトソマイシン化合物を産生する遺伝的能力をもつ生物を含有する可能性のある環境試料から核酸を得る。該核酸と本発明の教示及び組成物に基づいて設計したプローブとを、オルトソマイシン特異的タンパク質ファミリーの存在を示すどのような相補配列とも該プローブが特異的にハイブリダイズできるような条件下で接触させる。１７個のオルトソマイシン特異的タンパク質ファミリーのうち、少なくとも２個、好ましくは３個、さらに好ましくは４個、さらに好ましくは５個、さらに好ましくは６個、さらに好ましくは８個、より好ましくは１０個以上が存在しているということは、オルトソマイシン生合成遺伝子座又はオルトソマイシン産生生物が存在するということである。
【００８５】
オルトソマイシン遺伝子、生合成遺伝子座、及びそうした遺伝子又は遺伝子座を含有する微生物を同定するための特徴的な核酸配列を、環境試料（例えば土壌など）由来の微生物の複雑な混合物に用いてもよい。微生物混合物とは、２つ以上の種又は株からなる異種微生物群を指す。微生物をその生息環境内でしか増幅させない場合には、そうした微生物混合物は培養されたものとはみなされない。必須栄養素を提供する各種成長培地を用いたインビトロ培養によってその生息環境以外で増幅や増殖を行うことにより、培養微生物混合物を得てもよい。しかし、使用する成長培地によっては、そのような増幅は、結果として混合物のサブ群の増幅になる場合が多いため、常に望ましいとは限らない。必要であれば、連続稀釈後に固形培地で増殖させるなど、個々のコロニー形成単位を単離するための確立した微生物学的技術により、培養又は非培養微生物混合物から、単一の種又は株である純粋培養物を得てもよい。
【００８６】
ＰＣＲ、ハイブリダイゼーション、ショットガン配列決定法などの実験法を行い、その後で配列データを生物情報学的に分析することにより、本発明に開示されている特徴的な核酸配列を用いた純粋培養物又は培養若しくは非培養微生物混合物のいずれかから、オルトソマイシン遺伝子及び／又はオルトソマイシン生合成遺伝子座を同定してもよい。単一の生物からなる純粋培養物中のオルトソマイシン遺伝子及び／又はオルトソマイシン生合成遺伝子座を同定することは、その種類のオルトソマイシンに属する１つ又は複数の天然化合物を産生する遺伝的能力を有する生物を直接識別するということである。培養又は非培養微生物混合物中のオルトソマイシン遺伝子及び／又はオルトソマイシン生合成遺伝子座を同定するには、それらを含有する微生物の同定及び単離を行って、その微生物の純粋培養物を得るという別の段階を経る必要がある。培養微生物混合物から、オルトソマイシン遺伝子及び／又はオルトソマイシン生合成遺伝子座を含有する微生物を同定する際に適用してもよい一般的な方法の１つに、そうした混合物を適切な固形培地で増殖させ、結果として生じたコロニー形成単位をナイロン膜などの固形マトリックス上で複製し、該膜を検出可能な特徴的核酸配列と接触させ、陽性のコロニー形成単位を同定し、元の培地上の対応するコロニー形成単位を同定し、精製し、増幅させるコロニーリフト法（Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley 503 Sons, Inc. 1997; Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2d Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989）がある。
【００８７】
オルトソマイシンに特徴的な核酸を用いて、多数の環境試料について、オルトソマイシン化合物を産生する可能性をもつ生物、すなわち、オルトソマイシン遺伝子及び／又はオルトソマイシン生合成遺伝子座を含有する生物の有無を調査してもよい。非培養微生物混合物から単離したＤＮＡ由来のポリペプチドを同定するために調査を利用するプロトコルの１つが、Seow et al. (1997) J. Bacteriol. Vol. 179 pp. 7360-7368に概述されている。
【００８８】
エベルニノマイシン型オルトソマイシン産生株又はエベルニノマイシン型オルトソマイシン生合成遺伝子クラスターを同定するため、例えば、土壌など、エベルニノマイシン型オルトソマイシン化合物を産生する遺伝的能力をもつ生物を含有する可能性のある環境試料に由来する核酸を、エベルニノマイシン型オルトソマイシンに特有の構造的特徴の生合成に関連するタンパク質ファミリーに対応するヌクレオチド配列に基づいて構築したプローブと接触させてもよい。次の（１）〜（９）からなる群から選択される核酸に基づいて、有用なプローブを設計してもよい：（１）ＤＡＴＣファミリーのポリペプチドをコードする核酸配列、例えば、配列番号２１０、２１２（ＥＶＥＲ  ＯＲＦ４３及びＥＶＥＡ  ＯＲＦ３７にて、ＤＡＴＣタンパク質をそれぞれコードする核酸配列）の核酸；（２）ＤＥＰＦファミリーのポリペプチドをコードする核酸配列、例えば、配列番号２１４、２１６（ＥＶＥＲ  ＯＲＦ４６及びＥＶＥＡ  ＯＲＦ４０にて、ＤＥＰＦタンパク質をそれぞれコードする核酸配列）の核酸；（３）ＥＰＩＭファミリーのポリペプチドをコードする核酸配列、例えば、配列番号２１８及び２２０（ＥＶＥＲ  ＯＲＦ４５及びＥＶＥＡ  ＯＲＦ３９にて、ＥＰＩＭタンパク質をそれぞれコードする核酸配列）の核酸；（４）ＧＴＦＡファミリーのポリペプチドをコードする核酸配列、例えば、配列番号２２２及び２２４（ＥＶＥＲ  ＯＲＦ２１及びＥＶＥＡ  ＯＲＦ３５にて、ＧＴＦＡタンパク質をそれぞれコードする核酸配列）の核酸；（５）ＭＴＦＧファミリーのポリペプチドをコードする核酸配列、例えば、配列番号２２６、２２８（ＥＶＥＲ  ＯＲＦ３及びＥＶＥＡ  ＯＲＦ１８にて、ＭＴＦＧタンパク質をそれぞれコードする核酸配列）の核酸；（６）ＭＴＦＶファミリーのポリペプチドをコードする核酸配列、例えば、配列番号２３０、２３２（ＥＶＥＲ  ＯＲＦ４４及びＥＶＥＡ  ＯＲＦ３８にて、ＭＴＦＶタンパク質をそれぞれコードする核酸配列）の核酸；（７）ＯＸＢＮファミリーのポリペプチドをコードする核酸配列、例えば、配列番号２３４及び２３６（ＥＶＥＲ  ＯＲＦ４２及びＥＶＥＡ  ＯＲＦ３６にて、ＯＸＢＮタンパク質をそれぞれコードする核酸配列）の核酸；（８）ＯＸＣＯファミリーのポリペプチドをコードする核酸配列、例えば、配列番号２３８、２４０（ＥＶＥＲ  ＯＲＦ４及びＥＶＥＡ  ＯＲＦ１９にて、ＯＸＣＯタンパク質をそれぞれコードする核酸配列）の核酸；及び（９）ＵＮＢＢファミリーのポリペプチドをコードする核酸配列、例えば、配列番号２４２、２４４（ＥＶＥＲ  ＯＲＦ４７及びＥＶＥＡ  ＯＲＦ４１にて、ＵＮＢＢタンパク質をそれぞれコードする核酸配列）の核酸。好ましいプローブとしては、単離、精製又は濃縮を行った核酸であって、配列番号２１０、２１２、２１４、２１６、２１８、２２０、２２２、２２４、２２６、２２８、２３０、２３２、２３４、２３６、２３８、２４０、２４２、２４４、及びそれらに相補的な配列に由来するもの、又は、配列番号２１０、２１２、２１４、２１６、２１８、２２０、２２２、２２４、２２６、２２８、２３０、２３２、２３４、２３６、２３８、２４０、２４２、２４４の配列、及びそれらに相補的な配列のいずれかの少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、７５、１００、１５０、２００、３００、４００若しくは５００個の塩基を連続状態で含む断片に由来するものが挙げられる。
【００８９】
そうした手順においては、培養した微生物、又は、エベルニノマイシン型オルトソマイシン化合物を産生する遺伝的能力をもつ生物を含有する可能性のある環境試料から核酸を得る。かかる環境試料は、微生物混合物でもよく、単一の微生物からなる純粋培養物でもよい。該核酸と本発明の教示及び組成物に基づいて設計したプローブとを、エベルニノマイシン型オルトソマイシン特異的タンパク質ファミリーの存在を示すどのような相補配列とも該プローブが特異的にハイブリダイズできるような条件下で接触させる。９個のエベルニノマイシン型オルトソマイシン特異的タンパク質ファミリーのうち、少なくとも１個、好ましくは２個、さらに好ましくは４個、より好ましくは６個以上が存在しているということは、エベルニノマイシン型オルトソマイシン生合成遺伝子座及びエベルニノマイシン型オルトソマイシン産生生物が存在するということである。
【００９０】
アビラマイシン型オルトソマイシン産生株又はアビラマイシン型オルトソマイシン生合成遺伝子座を同定するため、培養微生物、又は、例えば土壌など、アビラマイシン型オルトソマイシン化合物を産生する遺伝的能力をもつ生物を含有する可能性のある環境試料由来の核酸を、アビラマイシン型オルトソマイシンに共通の構造的特徴の生合成に関連する６個のタンパク質ファミリーのメンバーに対応するプローブと接触させる。次の（１）〜（６）からなる群から選択される核酸から、有用なプローブを設計してもよい：（１）ＡＢＣＤファミリーのポリペプチドをコードする核酸配列、例えば、配列番号２４６（ＡＶＩＡ  ＯＲＦ２７）、又は、ＡＶＩＬGenbankアクセッション番号ＡＡＧ３２０６８；（２）ＤＥＰＮファミリーのポリペプチドをコードする核酸配列、例えば、配列番号２４８（ＡＶＩＡ  ＯＲＦ２１）、又は、ＡＶＩＬGenbankアクセッション番号ＡＡＫ８３１８３；（３）ＭＥＭＤファミリーのポリペプチドをコードする核酸配列、例えば、配列番号２５０（ＡＶＩＡ  ＯＲＦ２８）、又は、ＡＶＩＬGenbankアクセッション番号ＡＡＧ３２０６９；（４）ＲＥＢＵファミリーのポリペプチドをコードする核酸配列、例えば、配列番号２５２（ＡＶＩＡ  ＯＲＦ７）、又は、ＡＶＩＬGenbankアクセッション番号ＡＡＫ８３１７２；（５）ＵＮＡＩファミリーのポリペプチドをコードする核酸配列、例えば、配列番号２５４（ＡＶＩＡ  ＯＲＦ６）、又は、ＡＶＩＬGenbankアクセッション番号ＡＡＫ８３１７１；及び（６）ＵＮＢＲファミリーのポリペプチドをコードする核酸配列、例えば、配列番号２５６（ＡＶＩＡ  ＯＲＦ１０）、又は、ＡＶＩＬGenbankアクセッション番号ＡＡＫ８３１７５からなる群から選択される核酸。好ましいプローブとしては、単離、精製又は濃縮を行った核酸であって、配列番号２４６、２４８、２５０、２５２、２５４、２５６、及びGenbankアクセッション番号ＡＡＧ３２０６８、ＡＡＫ８３１８３、ＡＡＧ３２０６９、ＡＡＫ８３１７２、ＡＡＫ８３１７１、及びＡＡＫ８３１７５に対応する核酸配列、それらに相補的な配列に由来するもの、又は、配列番号２４６、２４８、２５０、２５２、２５４、２５６の配列及びそれらに相補的な配列のいずれかの少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、７５、１００、１５０、２００、３００、４００若しくは５００個の塩基を連続状態で含む断片に由来するものが挙げられる。
【００９１】
そうした手順においては、培養した微生物、又は、アビラマイシン型オルトソマイシン化合物を産生する遺伝的能力をもつ生物を含有する可能性のある環境試料から核酸を得る。かかる環境試料は、微生物混合物でもよく、単一の微生物からなる純粋培養物でもよい。該核酸と本発明の教示及び組成物に基づいて設計したプローブとを、アビラマイシン型オルトソマイシン特異的タンパク質ファミリーの存在を示すどのような相補配列とも該プローブが特異的にハイブリダイズできるような条件下で接触させる。６個のアビラマイシン型オルトソマイシン特異的タンパク質ファミリーのうち、少なくとも１個、好ましくは２個、さらに好ましくは３個、より好ましくは４個以上が存在しているということは、アビラマイシン型オルトソマイシン生合成遺伝子座及びアビラマイシン型オルトソマイシン産生生物が存在するということである。
【００９２】
必要な場合には、オルトソマイシン産生株から得た相補配列とオルトソマイシン産生株に由来しないコントロール配列の両方に該プローブを接触させることにより、該プローブがオルトソマイシン産生株由来の相補配列と特異的にハイブリダイズできるような条件を決定してもよい。いくつかの分析においては、コントロール配列がオルトソマイシン産生株に関連する生物に由来している場合がある。あるいは、コントロール配列がオルトソマイシン産生株に無関係の場合もある。該プローブがオルトソマイシン産生株由来の核酸と特異的にハイブリダイズできるような条件を確認するために、ハイブリダイゼーション緩衝液の塩濃度、ハイブリダイゼーション緩衝液のホルムアミド濃度、ハイブリダイゼーション温度などのハイブリダイゼーション条件を変えてもよい。
【００９３】
試料中にオルトソマイシン産生株由来の核酸が含まれる場合は、プローブとオルトソマイシン産生株由来の核酸との特異的ハイブリダイゼーションがやがて検出される。放射性同位体、蛍光染料、又は検出可能な産物の形成に触媒作用を及ぼせる酵素などの検出可能な試薬を用いてプローブを標識することにより、ハイブリダイゼーションを検出してもよい。
【００９４】
当業者であれば、標識プローブを用いて試料中のオルトソマイシン産生株由来核酸の有無を検出する多くの方法に精通している。そうした方法としては、サザンブロット法、ノーザンブロット法、コロニーハイブリダイゼーション法、及びドットブロット法が挙げられる。これらの各手法のプロトコルは、Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley 503 Sons, Inc. 1997; Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2d Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989に記載されている。
【００９５】
あるいは、本発明の教示及び組成物に基づいて設計された２つ以上のプローブを増幅反応に用いて、核酸試料がオルトソマイシン産生株由来核酸を含んでいるかどうかを測定してもよい。該プローブはオリゴヌクレオチドを含んでいることが好ましい。１つの実施態様においては、該増幅反応は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を含んでいてもよい。ＰＣＲのプロトコルは、上記Ausubel及びSambrookに記載されている。そうした手順においては、試料中の核酸をプローブと接触させ、増幅反応を行い、あらゆる増幅産物を検出する。反応産物に対してゲル電気泳動を行い、該ゲルを臭化エチジウムなどのインターキュレーター（interculator）で染色することにより、増幅産物を検出してもよい。あるいは、１つ以上のプローブを放射性同位体で標識し、該放射性同位体の有無及び放射性増幅産物の有無を、ゲル電気泳動後にオートラジオグラフィーで検出してもよい。
【００９６】
配列番号５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１５４、１５６、１５８、１６０、１６２、１６４、１６６、１６８、１７０、１７２、１７４、１７６、１７８、１８０、１９４、１９６、１９８、２００、２０２、２０４、２０６、２０８、２１０、２１２、２１４、２１６、２１８、２２０、２２２、２２４、２２６、２２８、２３０、２３２、２３４、２３６、２３８、２４０、２４２、２４４、２４６、２４８、２５０、２５２、２５４、２５６やそれらに相補的な配列の、単離、精製又は濃縮を行った核酸、又は配列番号５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１５４、１５６、１５８、１６０、１６２、１６４、１６６、１６８、１７０、１７２、１７４、１７６、１７８、１８０、１９４、１９６、１９８、２００、２０２、２０４、２０６、２０８、２１０、２１２、２１４、２１６、２１８、２２０、２２２、２２４、２２６、２２８、２３０、２３２、２３４、２３６、２３８、２４０、２４２、２４４、２４６、２４８、２５０、２５２、２５４、２５６の配列のいずれかを、又は、それらに相補的な配列の少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、７５、１００、１５０、２００、３００、４００若しくは５００個の塩基を連続状態で含む断片をプローブとして用いて、配列番号５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、９９、１０１、１０３、１０５、１０７、１０９、１１１、１１３、１１５、１２３、１２５、１２７、１２９、１３１、１５３、１５５、１５７、１５９、１６１、１６３、１６５、１６７、１６９、１７１、１７３、１７５、１７７、１７９、１９３、１９５、１９７、１９９、２０１、２０３、２０５、２０７、２０９、２１１、２１３、２１５、２１７、２１９、２２１、２２３、２２５、２２７、２２９、２３１、２３３、２３５、２３７、２３９、２４１、２４３、２４５、２４７、２４９、２５１、２５３、２５５のポリペプチドをそれぞれコードするＤＮＡの同定及び単離を行ってもよい。そうした手順においては、オルトソマイシン産生株を含む試料からゲノムＤＮＡライブラリーを構築する。次いで、コード配列又はコード配列の断片を含み、配列番号５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、９９、１０１、１０３、１０５、１０７、１０９、１１１、１１３、１１５、１２３、１２５、１２７、１２９、１３１、１５３、１５５、１５７、１５９、１６１、１６３、１６５、１６７、１６９、１７１、１７３、１７５、１７７、１７９、１９３、１９５、１９７、１９９、２０１、２０３、２０５、２０７、２０９、２１１、２１３、２１５、２１７、２１９、２２１、２２３、２２５、２２７、２２９、２３１、２３３、２３５、２３７、２３９、２４１、２４３、２４５、２４７、２４９、２５１、２５３、２５５のポリペプチド又はその断片のいずれかをコードするプローブと該ゲノムＤＮＡライブラリーとを、該プローブがその相補配列と特異的にハイブリダイズできるような条件下で接触させる。好ましい実施形態においては、該プローブは、長さにして約１０〜約３０個のヌクレオチドを有し、配列番号５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１５４、１５６、１５８、１６０、１６２、１６４、１６６、１６８、１７０、１７２、１７４、１７６、１７８、１８０、１９４、１９６、１９８、２００、２０２、２０４、２０６、２０８、２１０、２１２、２１４、２１６、２１８、２２０、２２２、２２４、２２６、２２８、２３０、２３２、２３４、２３６、２３８、２４０、２４２、２４４、２４６、２４８、２５０、２５２、２５４、２５６の核酸に基づいて設計されたオリゴヌクレオチドである。次いで、該プローブとハイブリダイズするゲノムクＤＮＡローンを検出し、単離する。目的のＤＮＡクローンを調製し同定する手順は、Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley 503 Sons, Inc. 1997; Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2d Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989に開示されている。
【００９７】
配列番号５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１５４、１５６、１５８、１６０、１６２、１６４、１６６、１６８、１７０、１７２、１７４、１７６、１７８、１８０、１９４、１９６、１９８、２００、２０２、２０４、２０６、２０８、２１０、２１２、２１４、２１６、２１８、２２０、２２２、２２４、２２６、２２８、２３０、２３２、２３４、２３６、２３８、２４０、２４２、２４４、２４６、２４８、２５０、２５２、２５４、２５６やそれらに相補的な配列の、単離、精製又は濃縮を行った核酸、又は配列番号５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１５４、１５６、１５８、１６０、１６２、１６４、１６６、１６８、１７０、１７２、１７４、１７６、１７８、１８０、１９４、１９６、１９８、２００、２０２、２０４、２０６、２０８、２１０、２１２、２１４、２１６、２１８、２２０、２２２、２２４、２２６、２２８、２３０、２３２、２３４、２３６、２３８、２４０、２４２、２４４、２４６、２４８、２５０、２５２、２５４、２５６の配列のいずれか、若しくはそれらに相補的な配列の少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、７５、１００、１５０、２００、３００、４００若しくは５００個の塩基を連続状態で含む断片をプローブとして用いて、関連する核酸の同定及び単離を行ってもよい。いくつかの実施形態において、該関連する核酸は、潜在的オルトソマイシン産生株由来のゲノムＤＮＡ（又はｃＤＮＡ）であってもよい。そうした手順においては、潜在的オルトソマイシン産生株由来の核酸を含む核酸試料とプローブとを、該プローブが関連配列と特異的にハイブリダイズできるような条件下で接触させる。該核酸試料は、潜在的オルトソマイシン産生株由来のゲノムＤＮＡ（又はｃＤＮＡ）ライブラリーであってもよい。次いで、上記方法のいずれかを用いて、該プローブと核酸とのハイブリダイゼーションを検出する。
【００９８】
ハイブリダイゼーションは、低ストリンジェンシー条件下、中程度のストリンジェンシー条件下、又は高ストリンジェンシー条件下で行ってもよい。核酸ハイブリダイゼーションの一例を挙げる。０．９ＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのＮａＨ2ＰＯ4、ｐＨ７．０、５．０ｍＭのＮａ2ＥＤＴＡ、０．５％のＳＤＳ、１０×Denhardt's、及び０．５ｍｇ／ｍｌのポリリボアデニル酸からなる溶液中で、不動化変性核酸を含むポリマー膜を、まず４５℃で３０分間プレハイブリダイズする。その後、約２×１０7ｃｐｍ（比放射能４〜９×１０8ｃｐｍ／ｕｇ）の32Ｐ末端標識オリゴヌクレオチドプローブを溶液に添加する。１２〜１６時間のインキュベーションを行った後、０．５％のＳＤＳを含む１×ＳＥＴ（１５０ｍＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのＴｒｉｓ塩酸、ｐＨ７．８、１ｍＭのＮａ2ＥＤＴＡ）中で、かかる膜を室温で３０分間洗浄し、新しい１×ＳＥＴ中で、オリゴヌクレオチドプローブ用にＴｍ−１０℃で３０分間洗浄する。ここでＴｍとは融解温度のことである。その後、ハイブリダイゼーションシグナルを検出するため、かかる膜をオートラジオグラフ用フィルムに曝露させる。
【００９９】
検出可能なプローブとハイブリダイズする、ゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡなどの核酸の同定に使用するハイブリダイゼーションストリンジェンシーの条件を変えると、該プローブに対して異なる相同性を有する核酸の同定及び単離が可能になる。該プローブの融解温度よりも低い温度で、いろいろと温度を変えてハイブリダイゼーションを行うことによって、ストリンジェンシーを変えてもよい。該プローブの融解温度は、下記の式を利用して計算してもよい。
【０１００】
長さにして１４〜７０個のヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドの場合、摂氏での融解温度（Ｔｍ）は、下記の式を利用して計算してもよい。
Ｔｍ＝８１．５+１６．６（ｌｏｇ［Ｎａ+］）+０．４１（フラクションＧ+Ｃ）−（６００／Ｎ）、式中、Ｎはオリゴヌクレオチドの長さ
ホルムアミドを含む溶液中でハイブリダイゼーションを行う場合、以下の方程式を用いて融解温度を計算してもよい。
Ｔｍ＝８１．５+１６．６（ｌｏｇ［Ｎａ+］）+０．４１（フラクションＧ+Ｃ）−（０．６３％のホルムアミド）−（６００／Ｎ）、式中、Ｎはプローブの長さ
６×ＳＳＣ、５×Denhardt's試薬、０．５％のＳＤＳ、０．１ｍｇ／ｍｌの変性分画サケ精子ＤＮＡ、又は６×ＳＳＣ、５×Denhardt's試薬、０．５％のＳＤＳ、０．１ｍｇ／ｍｌの変性分画サケ精子ＤＮＡ、５０％のホルムアミド中で、プレハイブリダイゼーションをおこなってもよい。ＳＳＣ及びDenhardt's溶液の組成については、上記Sambrook et al.中に列挙されている。
【０１０１】
上に列挙したハイブリダイゼーション溶液に検出可能なプローブを添加することにより、ハイブリダイゼーションを行う。該プローブが二本鎖ＤＮＡを含む場合には、温度を上げながらインキュベーションを行い、次いで急激に冷却することによりかかるＤＮＡを変性させ、その後でハイブリダイゼーション溶液に添加する。また、二次構造の形成若しくはオリゴマー化を皆無にするため又は減らすために、一本鎖プローブを同様に変性させることが望ましい場合もある。フィルターを充分な時間ハイブリダイゼーション溶液と接触させて、相補配列又は相同配列を内包するｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡと該プローブがハイブリダイズできるようにする。長さにして２００以上のヌクレオチドからなるプローブについては、Ｔｍよりも１５〜２５℃低い温度でハイブリダイゼーションを行ってもよい。オリゴヌクレオチドプローブなど、それよりも短いプローブについては、Ｔｍよりも５〜１０℃低い温度でハイブリダイゼーションを行ってもよい。短いプローブのハイブリダイゼーションは、６×ＳＳＣ中で行うのが好ましい。長いプローブのハイブリダイゼーションは、５０％のホルムアミドを含む溶液中で行うのが好ましい。
【０１０２】
これまで述べたハイブリダイゼーションはすべて、高ストリンジェンシー条件下で行われるハイブリダイゼーションの例と考えられている。
【０１０３】
ハイブリダイゼーションに続いて、２×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳ中で少なくとも１５分間、目的のストリンジェンシーに応じて室温又はそれよりも高い温度で、フィルターを洗浄する。その後フィルターを１×ＳＳＣ、０．５％のＳＤＳで、３０分〜１時間、（再び）室温で洗浄する。
【０１０４】
プローブとハイブリダイズした核酸を、オートラジオグラフィー又は他の従来の方法で同定する。
【０１０５】
プローブ配列との相同性が低下している核酸を同定する際には、上記手順を修正してもよい。例えば、検出可能なプローブとの相同性が低下している核酸を得るためには、低ストリンジェンシー条件を用いてもよい。例えば、Ｎａ+の濃度が約１Ｍのハイブリダイゼーション緩衝液において、ハイブリダイゼーション温度を、６８℃から４２℃まで、５℃ずつ下げていってもよい。ハイブリダイゼーション後、フィルターを２×ＳＳＣ、０．５％のＳＤＳで、ハイブリダイゼーション温度で洗浄してもよい。これらの条件は、５０℃を越える温度では「中程度のストリンジェンシー」条件で、５０℃以下の温度では「低ストリンジェンシー」条件であると考えられている。「中程度のストリンジェンシー」ハイブリダイゼーション条件の具体例として、上記ハイブリダイゼーションを５５℃で行った場合が挙げられる。「低ストリンジェンシー」ハイブリダイゼーション条件の具体例として、上記ハイブリダイゼーションを４５℃で行った場合が挙げられる。
【０１０６】
あるいは、ホルムアミドを含む、例えば６×ＳＳＣなどの緩衝液中で、４２℃でハイブリダイゼーションを行ってもよい。この場合、プローブとの相同性が低下しているクローンを同定するために、ハイブリダイゼーション中のホルムアミドの濃度は、５０％から０％へ、５％ずつ下げてもよい。ハイブリダイゼーション後、フィルターを６×ＳＳＣ、０．５％のＳＤＳで、５０℃で洗浄してもよい。これらの条件は、ホルムアミドが２５％を越える場合には「中程度のストリンジェンシー」条件で、２５％以下の場合には「低ストリンジェンシー」条件であると考えられている。「中程度のストリンジェンシー」ハイブリダイゼーション条件の具体例として、上記ハイブリダイゼーションを３０％のホルムアミドで行った場合が挙げられる。「低ストリンジェンシー」ハイブリダイゼーション条件の具体例として、上記ハイブリダイゼーションを１０％のホルムアミドで行った場合が挙げられる。
【０１０７】
プローブとハイブリダイズした核酸を、オートラジオグラフィー又は他の従来の方法で同定する。
【０１０８】
例えば、配列番号５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１５４、１５６、１５８、１６０、１６２、１６４、１６６、１６８、１７０、１７２、１７４、１７６、１７８、１８０、１９４、１９６、１９８、２００、２０２、２０４、２０６、２０８、２１０、２１２、２１４、２１６、２１８、２２０、２２２、２２４、２２６、２２８、２３０、２３２、２３４、２３６、２３８、２４０、２４２、２４４、２４６、２４８、２５０、２５２、２５４、２５６の配列、上記配列の少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、７５、１００、１５０、２００、３００、４００若しくは５００個の塩基を連続状態で含む断片、及びそれらの相補配列からなる群から選択した核酸配列に対して、少なくとも９７％、少なくとも９５％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７０％の相同性を示す配列を有する核酸を単離するのに、上記方法を用いてもよい。デフォルトパラメータを用いたＢＬＡＳＴＮのバージョン２．０で相同性を測定してもよい。例えば、相同的なポリヌクレオチドは、ここに記載したコード配列のいずれかに対して自然に発生したアレル変異体であるコード配列を有していてもよい。そうしたアレル変異体には、配列番号５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１５４、１５６、１５８、１６０、１６２、１６４、１６６、１６８、１７０、１７２、１７４、１７６、１７８、１８０、１９４、１９６、１９８、２００、２０２、２０４、２０６、２０８、２１０、２１２、２１４、２１６、２１８、２２０、２２２、２２４、２２６、２２８、２３０、２３２、２３４、２３６、２３８、２４０、２４２、２４４、２４６、２４８、２５０、２５２、２５４、２５６、又はその相補配列の核酸と比較して、１つ以上のヌクレオチドの置換、欠失、付加が生じていてもよい。
【０１０９】
また、配列番号５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、９９、１０１、１０３、１０５、１０７、１０９、１１１、１１３、１１５、１２３、１２５、１２７、１２９、１３１、１５３、１５５、１５７、１５９、１６１、１６３、１６５、１６７、１６９、１７１、１７３、１７５、１７７、１７９、１９３、１９５、１９７、１９９、２０１、２０３、２０５、２０７、２０９、２１１、２１３、２１５、２１７、２１９、２２１、２２３、２２５、２２７、２２９、２３１、２３３、２３５、２３７、２３９、２４１、２４３、２４５、２４７、２４９、２５１、２５３、２５５のいずれかの配列を有するポリペプチド、又は、デフォルトパラメータを用いたＢＬＡＳＴＰのバージョン２．２．２アルゴリズムで測定した際に、上記配列の、少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、７５、１００、若しくは１５０個のアミノ酸を連続状態で含む断片を有するポリペプチドに対して、少なくとも９９％、少なくとも９５％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、又は少なくとも７０％の相同性を示すポリペプチドをコードする核酸を単離するのに、上記方法を用いてもよい。
生物情報学：
ここで使用する「オルトソマイシン特異的核酸コード」という語には、配列番号５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１５４、１５６、１５８、１６０、１６２、１６４、１６６、１６８、１７０、１７２、１７４、１７６、１７８、１８０、１９４、１９６、１９８、２００、２０２、２０４、２０６、２０８のヌクレオチド配列、配列番号５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１５４、１５６、１５８、１６０、１６２、１６４、１６６、１６８、１７０、１７２、１７４、１７６、１７８、１８０、１９４、１９６、１９８、２００、２０２、２０４、２０６、２０８の断片、配列番号５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１５４、１５６、１５８、１６０、１６２、１６４、１６６、１６８、１７０、１７２、１７４、１７６、１７８、１８０、１９４、１９６、１９８、２００、２０２、２０４、２０６、２０８に相同的なヌクレオチド配列、又は配列番号５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１５４、１５６、１５８、１６０、１６２、１６４、１６６、１６８、１７０、１７２、１７４、１７６、１７８、１８０、１９４、１９６、１９８、２００、２０２、２０４、２０６、２０８の断片に相同的なヌクレオチド配列、及び前記全配列の相補配列が含まれる。該断片には、配列番号５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１５４、１５６、１５８、１６０、１６２、１６４、１６６、１６８、１７０、１７２、１７４、１７６、１７８、１８０、１９４、１９６、１９８、２００、２０２、２０４、２０６、２０８の、少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、７５、１００、１５０、２００、３００、４００若しくは５００個のヌクレオチドを連続状態で含む、配列番号５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１５４、１５６、１５８、１６０、１６２、１６４、１６６、１６８、１７０、１７２、１７４、１７６、１７８、１８０、１９４、１９６、１９８、２００、２０２、２０４、２０６、２０８の部分が含まれる。該断片は新規断片であることが好ましい。配列番号５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１５４、１５６、１５８、１６０、１６２、１６４、１６６、１６８、１７０、１７２、１７４、１７６、１７８、１８０、１９４、１９６、１９８、２００、２０２、２０４、２０６、２０８の相同配列及び断片とは、これらの配列に対して、少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８０％、７５％、又は７０％の相同性を有する配列のことである。相同性の測定は、デフォルトパラメータを用いたＢＬＡＳＴＮ及びＴＢＬＡＳＴＸをはじめとする、ここに記載したコンピュータプログラム及びパラメータのいずれを用いて行ってもよい。相同配列には、配列番号５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１５４、１５６、１５８、１６０、１６２、１６４、１６６、１６８、１７０、１７２、１７４、１７６、１７８、１８０、１９４、１９６、１９８、２００、２０２、２０４、２０６、２０８の核酸コード中のチミンがウリジンに置換されているＲＮＡ配列も含まれる。相同配列は、ここに記載したどの手順を用いて得てもよく、また、シーケンシングエラー訂正の結果として生じる場合もある。当然のことながら、配列番号５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１５４、１５６、１５８、１６０、１６２、１６４、１６６、１６８、１７０、１７２、１７４、１７６、１７８、１８０、１９４、１９６、１９８、２００、２０２、２０４、２０６、２０８の核酸コードは、Ｇ、Ａ、Ｔ及びＣがデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）配列のグアニン、アデニン、チミン及びシトシン塩基をそれぞれ表し、Ｇ、Ａ、Ｕ及びＣがリボ核酸（ＲＮＡ）配列のグアニン、アデニン、ウラシル及びシトシン塩基をそれぞれ表す、従来の１文字表記形式（Stryer, Biochemistry, 3rd edition, W. H. Freeman & Co., New Yorkの裏表紙の見返し部分を参照のこと）、又は、配列中のヌクレオチドの同一性を記録するあらゆる形式で表すことができる。
【０１１０】
「エベルニノマイシン特異的核酸コード」という語は、配列番号２１０、２１２、２１４、２１６、２１８、２２０、２２２、２２４、２２６、２２８、２３０、２３２、２３４、２３６、２３８、２４０、２４２、２４４のヌクレオチド配列、配列番号２１０、２１２、２１４、２１６、２１８、２２０、２２２、２２４、２２６、２２８、２３０、２３２、２３４、２３６、２３８、２４０、２４２、２４４の断片、配列番号２１０、２１２、２１４、２１６、２１８、２２０、２２２、２２４、２２６、２２８、２３０、２３２、２３４、２３６、２３８、２４０、２４２、２４４に相同的なヌクレオチド配列、又は配列番号２１０、２１２、２１４、２１６、２１８、２２０、２２２、２２４、２２６、２２８、２３０、２３２、２３４、２３６、２３８、２４０、２４２、２４４の断片に相同的なヌクレオチド配列、及び前記全配列の相補配列を含む。該断片には、配列番号２１０、２１２、２１４、２１６、２１８、２２０、２２２、２２４、２２６、２２８、２３０、２３２、２３４、２３６、２３８、２４０、２４２、２４４の、少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、７５、１００、１５０、２００、３００、４００若しくは５００個のヌクレオチドを連続状態で含む、配列番号２１０、２１２、２１４、２１６、２１８、２２０、２２２、２２４、２２６、２２８、２３０、２３２、２３４、２３６、２３８、２４０、２４２、２４４の部分が含まれる。該断片は新規断片であることが好ましい。配列番号２１０、２１２、２１４、２１６、２１８、２２０、２２２、２２４、２２６、２２８、２３０、２３２、２３４、２３６、２３８、２４０、２４２、２４４の相同配列及び断片とは、これらの配列に対して、少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８０％、７５％、又は７０％の相同性を有する配列のことである。相同性の測定は、デフォルトパラメータを用いたＢＬＡＳＴＮ及びＴＢＬＡＳＴＸをはじめとする、ここに記載したコンピュータプログラム及びパラメータのいずれを用いて行ってもよい。相同配列には、配列番号２１０、２１２、２１４、２１６、２１８、２２０、２２２、２２４、２２６、２２８、２３０、２３２、２３４、２３６、２３８、２４０、２４２、２４４の核酸コード中のチミンがウリジンに置換されているＲＮＡ配列も含まれる。相同配列は、ここに記載したどの手順を用いて得てもよく、また、シーケンシングエラー訂正の結果として生じる場合もある。当然のことながら、配列番号２１０、２１２、２１４、２１６、２１８、２２０、２２２、２２４、２２６、２２８、２３０、２３２、２３４、２３６、２３８、２４０、２４２、２４４の核酸コードは、Ｇ、Ａ、Ｔ及びＣがデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）配列のグアニン、アデニン、チミン及びシトシン塩基をそれぞれ表し、Ｇ、Ａ、Ｕ及びＣがリボ核酸（ＲＮＡ）配列のグアニン、アデニン、ウラシル及びシトシン塩基をそれぞれ表す、従来の１文字表記形式（Stryer, Biochemistry, 3rd edition, W. H. Freeman & Co., New Yorkの裏表紙の見返し部分を参照のこと）、又は、配列中のヌクレオチドの同一性を記録するあらゆる形式で表すことができる。
【０１１１】
「アビラマイシン特異的核酸コード」という語は、配列番号２４６、２４８、２５０、２５２、２５４、２５６、並びにGenbankアクセッション番号ＡＡＧ３２０６８、ＡＡＫ８３１８３、ＡＡＧ３２０６９、ＡＡＫ８３１７２、ＡＡＫ８３１７１、及びＡＡＫ８３１７５に対応する核酸配列のヌクレオチド配列；配列番号２４６、２４８、２５０、２５２、２５４、２５６、並びにGenbankアクセッション番号ＡＡＧ３２０６８、ＡＡＫ８３１８３、ＡＡＧ３２０６９、ＡＡＫ８３１７２、ＡＡＫ８３１７１、及びＡＡＫ８３１７５に対応する核酸配列の断片；配列番号２４６、２４８、２５０、２５２、２５４、２５６、並びにGenbankアクセッション番号ＡＡＧ３２０６８、ＡＡＫ８３１８３、ＡＡＧ３２０６９、ＡＡＫ８３１７２、ＡＡＫ８３１７１、及びＡＡＫ８３１７５に対応する核酸配列に相同的なヌクレオチド配列、又は配列番号２４６、２４８、２５０、２５２、２５４、２５６、並びにGenbankアクセッション番号ＡＡＧ３２０６８、ＡＡＫ８３１８３、ＡＡＧ３２０６９、ＡＡＫ８３１７２、ＡＡＫ８３１７１、及びＡＡＫ８３１７５に対応する核酸配列の断片に相同的なヌクレオチド配列、及び前記全配列の相補配列を含む。該断片には、配列番号２４６、２４８、２５０、２５２、２５４、２５６、並びにGenbankアクセッション番号ＡＡＧ３２０６８、ＡＡＫ８３１８３、ＡＡＧ３２０６９、ＡＡＫ８３１７２、ＡＡＫ８３１７１、及びＡＡＫ８３１７５に対応する核酸配列の、少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、７５、１００、１５０、２００、３００、４００若しくは５００個のヌクレオチドを連続状態で含む、配列番号２４６、２４８、２５０、２５２、２５４、２５６、並びにGenbankアクセッション番号ＡＡＧ３２０６８、ＡＡＫ８３１８３、ＡＡＧ３２０６９、ＡＡＫ８３１７２、ＡＡＫ８３１７１、及びＡＡＫ８３１７５に対応する核酸配列の部分が含まれる。該断片は新規断片であることが好ましい。配列番号２４６、２４８、２５０、２５２、２５４、２５６、並びにGenbankアクセッション番号ＡＡＧ３２０６８、ＡＡＫ８３１８３、ＡＡＧ３２０６９、ＡＡＫ８３１７２、ＡＡＫ８３１７１、及びＡＡＫ８３１７５に対応する核酸配列の相同配列及び断片とは、これらの配列に対して、少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８０％、７５％、又は７０％の相同性を有する配列のことである。相同性の測定は、デフォルトパラメータを用いたＢＬＡＳＴＮ及びＴＢＬＡＳＴＸをはじめとする、ここに記載したコンピュータプログラム及びパラメータのいずれを用いて行ってもよい。相同配列には、配列番号２４６、２４８、２５０、２５２、２５４、２５６、及びGenbankアクセッション番号ＡＡＧ３２０６８、ＡＡＫ８３１８３、ＡＡＧ３２０６９、ＡＡＫ８３１７２、ＡＡＫ８３１７１、ＡＡＫ８３１７５に対応する核酸配列の核酸コード中のチミンがウリジンに置換されているＲＮＡ配列も含まれる。相同配列は、ここに記載したどの手順を用いて得てもよく、また、シーケンシングエラー訂正の結果として生じる場合もある。当然のことながら、配列番号２４６、２４８、２５０、２５２、２５４、２５６、及びGenbankアクセッション番号ＡＡＧ３２０６８、ＡＡＫ８３１８３、ＡＡＧ３２０６９、ＡＡＫ８３１７２、ＡＡＫ８３１７１、ＡＡＫ８３１７５に対応する核酸配列の核酸コードは、Ｇ、Ａ、Ｔ及びＣがデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）配列のグアニン、アデニン、チミン及びシトシン塩基をそれぞれ表し、Ｇ、Ａ、Ｕ及びＣがリボ核酸（ＲＮＡ）配列のグアニン、アデニン、ウラシル及びシトシン塩基をそれぞれ表す、従来の１文字表記形式（Stryer, Biochemistry, 3rd edition, W. H. Freeman & Co., New Yorkの裏表紙の見返し部分を参照のこと）、又は、配列中のヌクレオチドの同一性を記録するあらゆる形式で表すことができる。
【０１１２】
「オルトソマイシン特異的ポリペプチドコード」という語には、配列番号５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１５４、１５６、１５８、１６０、１６２、１６４、１６６、１６８、１７０、１７２、１７４、１７６、１７８、１８０、１９４、１９６、１９８、２００、２０２、２０４、２０６、２０８のｃＤＮＡにコードされる配列番号５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、９９、１０１、１０３、１０５、１０７、１０９、１１１、１１３、１１５、１２３、１２５、１２７、１２９、１３１、１５３、１５５、１５７、１５９、１６１、１６３、１６５、１６７、１６９、１７１、１７３、１７５、１７７、１７９、１９３、１９５、１９７、１９９、２０１、２０３、２０５、２０７のポリペプチド配列、配列番号５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、９９、１０１、１０３、１０５、１０７、１０９、１１１、１１３、１１５、１２３、１２５、１２７、１２９、１３１、１５３、１５５、１５７、１５９、１６１、１６３、１６５、１６７、１６９、１７１、１７３、１７５、１７７、１７９、１９３、１９５、１９７、１９９、２０１、２０３、２０５、２０７のポリペプチドに相同性を示すポリペプチド配列、又は前記配列の断片が含まれる。相同ポリペプチド配列とは、配列番号５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、９９、１０１、１０３、１０５、１０７、１０９、１１１、１１３、１１５、１２３、１２５、１２７、１２９、１３１、１５３、１５５、１５７、１５９、１６１、１６３、１６５、１６７、１６９、１７１、１７３、１７５、１７７、１７９、１９３、１９５、１９７、１９９、２０１、２０３、２０５、２０７のポリペプチド配列のいずれかに対して、少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、８０％、７５％、又は７０％の相同性を有するポリペプチド配列のことである。ポリペプチド配列の相同性の測定は、デフォルトパラメータ又はユーザー指定パラメータを用いたＢＬＡＳＴＰバージョン２．２．２をはじめとする、ここに記載したコンピュータプログラム及びパラメータのいずれを用いて行ってもよい。相同配列は、ここに記載したどの手順を用いて得てもよく、また、シーケンシングエラー訂正の結果として生じる場合もある。ポリペプチド断片は、配列番号５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、９９、１０１、１０３、１０５、１０７、１０９、１１１、１１３、１１５、１２３、１２５、１２７、１２９、１３１、１５３、１５５、１５７、１５９、１６１、１６３、１６５、１６７、１６９、１７１、１７３、１７５、１７７、１７９、１９３、１９５、１９７、１９９、２０１、２０３、２０５、２０７のポリペプチドのうち、少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、７５、１００、若しくは１５０個のポリペプチドを連続状態で含んでいる。該断片は新規断片であることが好ましい。当然のことながら、配列番号５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、９９、１０１、１０３、１０５、１０７、１０９、１１１、１１３、１１５、１２３、１２５、１２７、１２９、１３１、１５３、１５５、１５７、１５９、１６１、１６３、１６５、１６７、１６９、１７１、１７３、１７５、１７７、１７９、１９３、１９５、１９７、１９９、２０１、２０３、２０５、２０７のポリペプチドコードは、従来の１文字表記形式又は３文字表記形式（Stryer, Biochemistry, 3rd edition, W. H. Freeman & Co., New Yorkの裏表紙の見返し部分を参照のこと）、又は、配列中のポリペプチドの同一性に関するあらゆる形式で表すことができる。
【０１１３】
「エベルニノマイシン特異的ポリペプチドコード」という語には、配列番号２１０、２１２、２１４、２１６、２１８、２２０、２２２、２２４、２２６、２２８、２３０、２３２、２３４、２３６、２３８、２４０、２４２、２４４及び２４４のｃＤＮＡにコードされる配列番号２０９、２１１、２１３、２１５、２１７、２１９、２２１、２２３、２２５、２２７、２２９、２３１、２３３、２３５、２３７、２３９、２４１及び２４３のポリペプチド配列、配列番号２０９、２１１、２１３、２１５、２１７、２１９、２２１、２２３、２２５、２２７、２２９、２３１、２３３、２３５、２３７、２３９、２４１及び２４３のポリペプチドに相同性を示すポリペプチド配列、又は前記配列の断片が含まれる。相同ポリペプチド配列とは、配列番号２０９、２１１、２１３、２１５、２１７、２１９、２２１、２２３、２２５、２２７、２２９、２３１、２３３、２３５、２３７、２３９、２４１及び２４３のポリペプチド配列のいずれかに対して、少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、８０％、７５％、又は７０％の相同性を有するポリペプチド配列のことである。ポリペプチド配列の相同性は、デフォルトパラメータ又はユーザー指定パラメータを用いたＢＬＡＳＴＰバージョン２．２．２をはじめとする、ここに記載したコンピュータプログラム及びパラメータのいずれを用いて測定してもよい。相同配列は、ここに記載したどの手順を用いて得てもよく、また、シーケンシングエラー訂正の結果として生じる場合もある。ポリペプチド断片は、配列番号２０９、２１１、２１３、２１５、２１７、２１９、２２１、２２３、２２５、２２７、２２９、２３１、２３３、２３５、２３７、２３９、２４１及び２４３のポリペプチドのうち、少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、７５、１００、若しくは１５０個のポリペプチドを連続状態で含んでいる。該断片は新規断片であることが好ましい。当然のことながら、配列番号２０９、２１１、２１３、２１５、２１７、２１９、２２１、２２３、２２５、２２７、２２９、２３１、２３３、２３５、２３７、２３９、２４１及び２４３のポリペプチドコードは、従来の１文字表記形式又は３文字表記形式（Stryer, Biochemistry, 3rd edition, W. H. Freeman & Co., New Yorkの裏表紙の見返し部分を参照のこと）、又は、配列中のポリペプチドの同一性に関するあらゆる形式で表すことができる。
【０１１４】
「アビラマイシン特異的ポリペプチドコード」という語には、（配列番号２４６、２４８、２５０、２５２、２５４、２５６のｃＤＮＡにコードされる）配列番号２４５、２４７、２４９、２５１、２５３、２５５のポリペプチド配列、及びGenbankアクセッション番号ＡＡＧ３２０６８、ＡＡＫ８３１８３、ＡＡＧ３２０６９、ＡＡＫ８３１７２、ＡＡＫ８３１７１及びＡＡＫ８３１７５のポリペプチド配列、配列番号２４５、２４７、２４９、２５１、２５３、２５５、及びGenbankアクセッション番号ＡＡＧ３２０６８、ＡＡＫ８３１８３、ＡＡＧ３２０６９、ＡＡＫ８３１７２、ＡＡＫ８３１７１及びＡＡＫ８３１７５のポリペプチドに相同性を示すポリペプチド配列、又は前記配列の断片が含まれる。相同ポリペプチド配列とは、配列番号２４５、２４７、２４９、２５１、２５３、２５５のポリペプチド配列のいずれか、又はGenbankアクセッション番号ＡＡＧ３２０６８、ＡＡＫ８３１８３、ＡＡＧ３２０６９、ＡＡＫ８３１７２、ＡＡＫ８３１７１及びＡＡＫ８３１７５のポリペプチドに対して、少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、８０％、７５％、又は７０％の相同性を有するポリペプチド配列のことである。ポリペプチド配列の相同性は、デフォルトパラメータ又はユーザー指定パラメータを用いたＢＬＡＳＴＰバージョン２．２．２をはじめとする、ここに記載したコンピュータプログラム及びパラメータのいずれを用いて測定してもよい。相同配列は、ここに記載したどの手順を用いて得てもよく、また、シーケンシングエラー訂正の結果として生じる場合もある。ポリペプチド断片は、配列番号２４５、２４７、２４９、２５１、２５３、２５５のポリペプチド、又はGenbankアクセッション番号ＡＡＧ３２０６８、ＡＡＫ８３１８３、ＡＡＧ３２０６９、ＡＡＫ８３１７２、ＡＡＫ８３１７１及びＡＡＫ８３１７５のポリペプチドのうち、少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、７５、１００、若しくは１５０個のポリペプチドを連続状態で含んでいる。該断片は新規断片であることが好ましい。当然のことながら、配列番号２４５、２４７、２４９、２５１、２５３、２５５、及びGenbankアクセッション番号ＡＡＧ３２０６８、ＡＡＫ８３１８３、ＡＡＧ３２０６９、ＡＡＫ８３１７２、ＡＡＫ８３１７１及びＡＡＫ８３１７５のポリペプチドのポリペプチドコードは、従来の１文字表記形式又は３文字表記形式（Stryer, Biochemistry, 3rd edition, W. H. Freeman & Co., New Yorkの裏表紙の見返し部分を参照のこと）、又は、配列中のポリペプチドの同一性に関するあらゆる形式で表すことができる。
【０１１５】
わかりやすくするために、オルトソマイシン特異的核酸コード、エベルニノマイシン特異的核酸コード、アビラマイシン特異的核酸コード、オルトソマイシン特異的ポリペプチドコード、エベルニノマイシン特異的ポリペプチドコード、アビラマイシン特異的ポリペプチドコード、又はそれらの一部を「参照配列」と総称する場合がある。
【０１１６】
当業者であれば容易にわかることだが、参照配列は、コンピュータによる読み取り及びアクセスが可能ないかなる媒体においても、保存、記録、及び操作が可能である。ここで使用する「記録した」及び「保存した」という語は、コンピュータ媒体に情報を保存する処理のことである。熟練者であれば、現時点で周知の、コンピュータ読み取り可能な媒体への情報の記録方法を容易に適用して、１つ以上のオルトソマイシン特異的核酸コード、エベルニノマイシン特異的核酸コード、アビラマイシン特異的核酸コード、オルトソマイシン特異的ポリペプチドコード、エベルニノマイシン特異的ポリペプチドコード、及びアビラマイシン特異的ポリペプチドコードを含む製品を作製することができる。
【０１１７】
コンピュータ読み取り可能な媒体としては、磁気的に読み取りが可能な媒体、光学的に読み取りが可能な媒体、電子的に読み取りが可能な媒体、及び磁気／光学的媒体が挙げられる。例えば、該コンピュータ読み取り可能な媒体が、ハードディスク、フロッピーディスク、磁気テープ、ＣＤ−ＲＯＭ、デジタル多用途ディスク（ＤＶＤ）、ランダムアクセスメモリ（ＲＡＭ）、又はリードオンリーメモリ（ＲＯＭ）、及び当業者に周知の他の種類の媒体であってもよい。
【０１１８】
さまざまなフォーマットのさまざまなデータプロセッサプログラムにおいて、オルトソマイシン特異的核酸コード、エベルニノマイシン特異的核酸コード、アビラマイシン特異的核酸コード、オルトソマイシン特異的ポリペプチドコード、エベルニノマイシン特異的ポリペプチドコード、アビラマイシン特異的ポリペプチドコードの保存及び操作を行ってもよい。例えば、オルトソマイシン特異的核酸コード、エベルニノマイシン特異的核酸コード、アビラマイシン特異的核酸コード、オルトソマイシン特異的ポリペプチドコード、エベルニノマイシン特異的ポリペプチドコード、アビラマイシン特異的ポリペプチドコード、核酸コードを、ＤＢ２又はORACLEなど当業者が精通している各種データベースプログラム中の、MicrosoftWORD又はWORDPERFECTなどのワードプロセッシングファイルにテキストやＡＳＣＩＩとして保存してもよい。また、配列の比較や同定を行う手段として、又は、オルトソマイシン特異的核酸コード、エベルニノマイシン特異的核酸コード、アビラマイシン特異的核酸コード、オルトソマイシン特異的ポリペプチドコード、エベルニノマイシン特異的ポリペプチドコード、アビラマイシン特異的ポリペプチドコードと比較するためのクエリーヌクレオチド配列又はクエリーポリペプチド配列の供給源として、多くのコンピュータプログラム及びデータベースを用いてもよい。
【０１１９】
下記のリストは、本発明を制限することではなく、本発明のオルトソマイシン特異的核酸コード、エベルニノマイシン特異的核酸コード、アビラマイシン特異的核酸コード、オルトソマイシン特異的ポリペプチドコード、エベルニノマイシン特異的ポリペプチドコード、アビラマイシン特異的ポリペプチドコードに有用なプログラム及びデータベースへの指針を提供することを目的とするものである。使用してもよいプログラム及びデータベースとしては、MacPattern（EMBL社製）、DiscoveryBase（Molecular Applications Group社製）、GeneMine（Molecular Applications Group社製）、Look（Molecular Applications Group社製）、MacLook（Molecular Applications Group社製）、ＢＬＡＳＴ及びＢＬＡＳＴ２（NCBI社製）、ＢＬＡＳＴＮ及びＢＬＡＳＴＸ（Altschul et al., J. Mol. Biol. 215: 403 (1990)）、ＦＡＳＴＡ（Person and Lipman, Proc. Nalt. Acad. Sci. USA, 85: 2444(1998)）、ＦＡＳＴＤＢ（Brutlag et al. Comp. App. Biosci. 6-237-245, 1990）、Catalyst（Molecular Simulations Inc.社製）、Catalyst/SHAPE（Molecular Simulations Inc.社製）、Cerius2. DBAccess（Molecular Simulations Inc.社製）、HypoGen（Molecular Simulations Inc.社製）、Insight II（Molecular Simulations Inc.社製）、Discover（Molecular Simulations Inc.社製）、CHARMm（Molecular Simulations Inc.社製）、Felix（Molecular Simulations Inc.社製）、DelPhi（Molecular Simulations Inc.社製）、QuanteMM（Molecular Simulations Inc.社製）、Homology（Molecular Simulations Inc.社製）、Modeler（Molecular Simulations Inc.社製）、ISIS（Molecular Simulations Inc.社製）、Quanta/Protein Design（Molecular Simulations Inc.社製）、WetLab（Molecular Simulations Inc.社製）、WetLab Diversity Explorer（Molecular Simulations Inc.社製）、Gene Explorer（Molecular Simulations Inc.社製）、SeqFold（Molecular Simulations Inc.社製）、ＭＤＬ利用可能化学品ディレクトリーデータベース、ＭＤＬ薬剤データレポートデータベース、総合的医薬品化学データベース、Derwents'世界薬剤インデックスデータベース、BioByteMasterFileデータベース、Genbankデータベース、Gensyqnデータベースなどが挙げられるが、これらに限定されるものではない。本開示内容を入手した当業者であれば、この他にも多くのプログラム及びデータベースがあることがわかるであろう。
【０１２０】
本発明の実施形態は、システム、特に、ここに記載した配列情報を保存し操作するコンピュータシステムを含むものである。ここで使用する「コンピュータシステム」という語は、ハードウェアコンポーネント、ソフトウェアコンポーネント、及び参照配列の分析に使用するデータ保存コンポーネントを指す。
【０１２１】
かかるコンピュータシステムが、処理装置、データを保存するための１つ以上の内部データ保存コンポーネント、及び該データ保存コンポーネントに保存されたデータを取り出すための１つ以上のデータ取り出し装置を含む多目的システムであることが好ましい。現在利用可能なコンピュータシステムであればすべて好適であることは、熟練者であれば容易にわかることである。
【０１２２】
コンピュータシステムの一例を図４に示す。図４のコンピュータシステムには、中央システムバス１１６に接続された多数のコンポーネントが含まれている。そうしたコンポーネントとしては、内蔵キャッシュメモリ１１８と外部キャッシュメモリ１２０を備えた中央処理装置１１８、システムメモリ１２２、モニター１００に接続したディスプレイアダプタ１０２、ネットワークインターフェイスとも称するネットワークアダプタ１２６、内蔵モデム１２４、サウンドアダプタ１２８、キーボード１４０及びマウス１３８、又はトラックボール若しくはタブレットなど他の適切な入力装置を接続してもよいＩＯコントローラ１３２、及び外部プリンター１３４、及び／又は、かなり多数の外部装置が挙げられる。かかる外部装置には、外部モデム、テープ保存ドライブ、又はディスクドライブなどがあるが、それらに限定されるものではない。図４に示されたすべてのコンポーネントが本発明を実施する際に必要であるわけではないこと、同様に、図４に示されていない他のコンポーネントが、本発明に用いるために考えられたコンピュータシステム中に存在している場合があることは、当業者であれば容易にわかることである。
【０１２３】
１つ以上のホストバスアダプタ１１４を、システムバス１１６に接続してもよい。１つ以上のディスクドライブ１１２（着脱可能式又は固定式）、フロッピードライブ１１０、テープドライブ１０８、デジタル多用途ディスクＤＶＤドライブ１０６、及びコンパクトディスクＣＤ−ＲＯＭドライブ１０４など１つ以上の保存ドライブを、ホストバスアダプタ１１４に任意に接続してもよい。読み取り専用モード、及び／又は読み取り書き込みモードで、かかる保存装置を操作してもよい。ＤＶＤ１０６又はＣＤ−ＲＯＭ１０４など光学的な保存装置は、読み取り専用モードで使用されるのがより一般的であり、固定式ディスクドライブ１１２は、読み取り書き込みモードで操作される傾向にある。個々のディスクドライブ１１２よりも大きな大型データセットを格納しているコンピュータシステムもあり、その場合は専用のソフトウェアを使えば、多数のディスクからデータへのアクセスが可能になる。そのようなソフトウェアの例としては、Sun Microsystems社製のSolstice Disk Suite、又は、Sun Microsystems社製のRAID (redundant array of inexpensive disks) Managerが挙げられるが、これらに限定されるものではない。かかるコンピュータシステムは筐体又はケースに入れられていてもよい。かかるコンピュータシステムは、多数の中央処理装置１１８又は多数のメモリバンク１２２を任意に含んでいてもよい。
【０１２４】
図１の矢印１４２は、コンピュータシステムの内蔵コンポーネントの相互接続を示すものである。かかる矢印は説明のみを目的としており、実際の接続アーキテクチャを特定するものではない。メーカーによっては、１つ以上の中央処理装置をＣＰＵ／メモリボードに接続し、その後それをシステムバスに接続する場合がある。
【０１２５】
参照配列へのアクセス及び処理を行うためのソフトウェア（配列比較ソフトウェア、分析ソフトウェア、及び検索ツール、アノテーションツール、モデリングツールなど）は、実行中は、メインメモリ１２２に存在している。
【０１２６】
好ましい実施形態においては、かかるコンピュータシステムは、コンピュータ読み取り可能な媒体に保存されたクエリー配列の核酸コードと、同じくコンピュータ読み取り可能な媒体に保存された、オルトソマイシン特異的核酸コード、エベルニノマイシン特異的核酸コード、アビラマイシン特異的核酸コードから選択されるサブジェクト配列とを比較する配列比較ソフトウェア、又はコンピュータ読み取り可能な媒体に保存されたクエリー配列のポリペプチドコードと、同じくコンピュータ読み取り可能な媒体に保存された、オルトソマイシン特異的ポリペプチドコード、エベルニノマイシン特異的ポリペプチドコード、アビラマイシン特異的ポリペプチドコードから選択されるサブジェクト配列とを比較する配列比較ソフトウェアをさらに含んでいる。「配列比較ソフトウェア」は、コンピュータシステムに搭載され、ヌクレオチド配列を、データ保存手段内に保存された他のヌクレオチド配列と比較する、１つ以上のプログラムを指す。配列比較ソフトウェアの設計の一例を図２に示す。
【０１２７】
配列比較ソフトウェアは１つ以上の特定のコンパレータアルゴリズムを利用しているのが一般的である。当該分野で周知の各種配列コンパレータアルゴリズムを用いて、タンパク質及び／又は核酸配列類似性を評価してもよい。そうしたアルゴリズム及びプログラムとしては、ＴＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＰ、ＦＡＳＴＡ、ＴＦＡＳＴＡ、ＣＬＵＳＴＡＬ、ＨＭＭＥＲ、ＭＡＳＴ、又は当業者には周知のその他の適切なアルゴリズムが挙げられるが、これらに限定されるものではない（Pearson and Lipman, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 (8): 2444-2448; Altschul et al, 1990, J. Mol. Biol. 215 (3): 403-410; Thompson et al., 1994, Nucleic Acids Res. 22 (2): 4673-4680; Higgins et al., 1996, Methods Enzymol. 266: 383-402; Altschul et al, 1990, J. Mol. Biol. 215 (3): 403-410; Altschul et al., 1993, Nature Genetics 3: 266-272; Eddy S. R., Bioinformatics 14: 755-763, 1998; Bailey TL et al., J Steroid Biochem Mol Biol 1997 May; 62 (1): 29-44）。コンパレータアルゴリズムの一例を図３に示す。本明細書で確認した配列コンパレータアルゴリズムは、本発明のこの態様で使用するために特別に考えられたものである。
【０１２８】
配列比較ソフトウェアは１つ以上の特定のアナライザアルゴリズムを利用しているのが一般的である。アナライザアルゴリズムの一例を図４に示す。適切なアナライザアルゴリズムを用いて、コンパレータアルゴリズムにより測定されたクエリー／サブジェクト対の間の類似性を評価することができる。また、コンテキスト特定ルールに基づいて、サブジェクトのアノテーションをクエリーに割り当ててもよい。熟練者であれば、適切なアナライザアルゴリズム及び適切なコンテキスト依存規則の選択を容易に判断することができる。本明細書中の他の部分で確認したアナライザアルゴリズムは、本発明のこの態様での使用を目的として特別に考えたものである。
【０１２９】
図２は、クエリー配列とサブジェクト配列を比較する配列比較ソフトウェアの一例のフローチャートである。参照配列からサブジェクト配列を選択してもよく、その場合、ヌクレオチド配列、ポリペプチド配列又は他の形で表される１つの遺伝子又は一組の遺伝子と、本発明のオルトソマイシン特異的核酸コード、エベルニノマイシン特異的核酸コード、アビラマイシン特異的核酸コード、オルトソマイシン特異的ポリペプチドコード、エベルニノマイシン特異的ポリペプチドコード、アビラマイシン特異的ポリペプチドコードとの間に有意な類似性があるかどうかを、該ソフトウェアが判断することになる。Ｃ又はＣ++プログラミング言語、Ｊａｖａ、Ｐｅｒｌ又は当業者に周知の他の適切なプログラミング言語で該ソフトウェアを実行してもよい。
【０１３０】
図２に関しては、データベース２０８にアクセスしている又はテキストファイル２０６を開いているユーザーからの入力２１０により、該プログラムによるクエリー配列へのアクセスを行ってもよい。「クエリー開始プロセス」により、クエリー配列へのアクセス及びクエリー配列のコンピュータメモリ１２２への取りこみ、又はディスクドライブ１１２若しくはクエリー配列アレイ２１６の形式の他の保存装置に保存されたプログラムによる管理が可能になる。クエリーアレイ２１６は、１つ以上のクエリーヌクレオチド又はポリペプチド配列であり、適切な識別子を伴うものである。データベース２２６にアクセスしている又はテキストファイル２２４を開いているユーザーからの入力２２８により、プログラムがデータセットにアクセスする。図２の「サブジェクトデータソース初期化プロセス」とは、それによって、オルトソマイシン特異的核酸コード、エベルニノマイシン特異的核酸コード、アビラマイシン特異的核酸コード、オルトソマイシン特異的ポリペプチドコード、エベルニノマイシン特異的ポリペプチドコード、アビラマイシン特異的ポリペプチドコードから選択した１つ以上の配列を含む参照データセットがコンピュータメモリ１２２に取りこまれる方法、又はディスクドライブ１１２若しくはサブジェクトアレイ２３４の形式の他の保存装置に保存されたプログラムの管理下に置かれる方法を示す。サブジェクトアレイ２３４は、１つ以上のサブジェクトヌクレオチド又はポリペプチド配列であり、適切な識別子を伴うものである。
【０１３１】
図２の「比較サブプロセス」とは、クエリー配列アレイ２１６のクエリー要素とサブジェクトアレイ２３４のサブジェクト要素とを２つ一組で比較するソフトウェアによりコンパレータアルゴリズム２３８が呼び出されるプロセスである。図２の「コンパレータアルゴリズム」とは、それぞれのアレイ２１６、２３４からのクエリー及びサブジェクトを２つ一組で比較することである。コンパレータアルゴリズム２３８は、クエリー／サブジェクト対に作用するものであればどのようなアルゴリズムでもよく、ＢＬＡＳＴ、Smith Waterman、Fastaなどの相同アルゴリズム、ＨＭＭＥＲなどのMarkovモデルのような統計的表示／確率的アルゴリズム、又は当業者に周知の他の適切なアルゴリズムが例示できるが、これらに限定されるものではない。適切なアルゴリズムは一般に、クエリー／サブジェクト対の入力を要求し、スコア（クエリーとサブジェクトとの間の類似性表示）を返してくる。通常このプロセスには、ＢＬＡＳＴで使用されるKarlin Altschul統計、Malkovモデルで使用されるForward又はViterbiアルゴリズムなどの適切な統計方法、又は当業者に周知の他の適切な統計が用いられる。
【０１３２】
図２の配列比較ソフトウェアには、コンパレータアルゴリズム２３８により２つ一組で比較した結果を分析する手段も含まれている。図２の「分析サブプロセス」とは、該ソフトウェアによりアナライザアルゴリズム２４４が呼び出されるプロセスである。「アナライザアルゴリズム」とは、コード化されてプログラムとなったコンテキスト依存規則、又は実行時間中に動的にロードされたコンテキスト依存規則にしたがってコンパレータアルゴリズム２３８が測定したクエリー／サブジェクト類似性に基づき、サブジェクトのアノテーションがクエリーに割り当てられるプロセスである。コンテキスト依存規則とは、比較というコンテキストを与えられたクエリーにサブジェクトのアノテーションを割り当てることが可能かどうかを判断するために用いるものである。こうした規則によって該ソフトウェアは、コンパレータアルゴリズム２３８が出した結果の全体的意味を適切なものにすることができる。
【０１３３】
１つの実施形態においては、コンパレータアルゴリズム２３８は、オルトソマイシン遺伝子座を代表するものと考えられる一連のクエリー配列について、該一連のクエリー配列が、下記の（１）〜（１７）からなる群のうち、２つの群に由来するポリペプチドの核酸配列コードに対応する参照配列に対して統計的類似性を示すクエリー配列を少なくとも１つ含んでいるかどうかを判断しなくてはならない、とコンテキスト依存規則により指示される場合がある。（１）配列番号５１、Genbankアクセッション番号ＡＡＫ８３１９２、配列番号５３、配列番号５５、及び配列番号５１、５３、５５、又はGenbankアクセッション番号ＡＡＫ８３１９２の配列を有するポリペプチドに対して少なくとも７０％の相同性を有するポリペプチド；（２）配列番号５７、Genbankアクセッション番号ＡＡＫ８３１７０、配列番号５９、配列番号６１、及び配列番号５７、５９、６１、又はGenbankアクセッション番号ＡＡＫ８３１７０の配列を有するポリペプチドに対して少なくとも７０％の相同性を有するポリペプチド；（３）配列番号６３、Genbankアクセッション番号ＡＡＫ８３１９３、配列番号６５、配列番号６７、及び配列番号６３、６５、６７、又はGenbankアクセッション番号ＡＡＫ８３１９３の配列を有するポリペプチドに対して少なくとも７０％の相同性を有するポリペプチド；（４）配列番号６９、配列番号７１、配列番号７３、及び配列番号６９、７１、又は７３の配列を有するポリペプチドに対して少なくとも７０％の相同性を有するポリペプチド；（５）配列番号９９、Genbankアクセッション番号ＡＡＫ８３１８４、配列番号１０１、配列番号１０３、及び配列番号９９、１０１、１０３、又はGenbankアクセッション番号ＡＡＫ８３１８４の配列を有するポリペプチドに対して少なくとも７０％の相同性を有するポリペプチド；（６）配列番号１０５、Genbankアクセッション番号ＡＡＫ８３１８６、配列番号１０７、配列番号１０９、及び配列番号１０５、１０７、１０９、又はGenbankアクセッション番号ＡＡＫ８３１８６の配列を有するポリペプチドに対して少なくとも７０％の相同性を有するポリペプチド；（７）配列番号１１１、Genbankアクセッション番号ＡＡＫ８３１８８、配列番号１１３、配列番号１１５、及び配列番号１１１、１１３、１１５、又はGenbankアクセッション番号ＡＡＫ８３１８８の配列を有するポリペプチドに対して少なくとも７０％の相同性を有するポリペプチド；（８）配列番号１２７、Genbankアクセッション番号ＡＡＧ３２０６７、配列番号１２９、配列番号１３１、及び配列番号１２７、１２９、１３１、又はGenbankアクセッション番号ＡＡＧ３２０６７の配列を有するポリペプチドに対して少なくとも７０％の相同性を有するポリペプチド；（９）配列番号１２３、Genbankアクセッション番号ＡＡＧ３２０６６、配列番号１２５、及び配列番号１２３、１２５、又はGenbankアクセッション番号ＡＡＧ３２０６６の配列を有するポリペプチドに対して少なくとも７０％の相同性を有するポリペプチド；（１０）配列番号１５３、Genbankアクセッション番号ＡＡＫ８３１８７、配列番号１５５、配列番号１５７、及び配列番号１５３、１５５、１５７、又はGenbankアクセッション番号ＡＡＫ８３１８７の配列を有するポリペプチドに対して少なくとも７０％の相同性を有するポリペプチド；（１１）配列番号１５９、配列番号１６１、配列番号１６３、及び配列番号１５９、１６１、又は１６３の配列を有するポリペプチドに対して少なくとも７０％の相同性を有するポリペプチド；（１２）配列番号１６７、配列番号１７３、Genbankアクセッション番号ＡＡＫ８３１８１、配列番号１６９、及び配列番号１６７、１６９、１７３、又はGenbankアクセッション番号ＡＡＫ８３１８１の配列を有するポリペプチドに対して少なくとも７０％の相同性を有するポリペプチド；（１３）配列番号１７５、配列番号１７７、配列番号１７９、及び配列番号１７５、１７７、又は１７９の配列を有するポリペプチドに対して少なくとも７０％の相同性を有するポリペプチド；（１４）配列番号１６５、配列番号１７１、配列番号１６９、及び配列番号１６５、１６９、又は１７１の配列を有するポリペプチドに対して少なくとも７０％の相同性を有するポリペプチド；（１５）配列番号１９３、Genbankアクセッション番号ＡＡＫ８３１８９、配列番号１９５、配列番号１９７、及び配列番号１９３、１９５、１９７、又はGenbankアクセッション番号ＡＡＫ８３１８９の配列を有するポリペプチドに対して少なくとも７０％の相同性を有するポリペプチド；（１６）配列番号１９９、Genbankアクセッション番号ＡＡＫ８３１７４、配列番号２０１、及び配列番号１９９、２０１、又はGenbankアクセッション番号ＡＡＫ８３１７４の配列を有するポリペプチドに対して少なくとも７０％の相同性を有するポリペプチド；及び（１７）配列番号２０３、配列番号２０５、配列番号２０７、及び配列番号２０３、２０５、又は２０７の配列を有するポリペプチドに対して少なくとも７０％の相同性を有するポリペプチド。もちろん、好ましいコンテキスト依存規則が、オルトソマイシン生合成遺伝子又はオルトソマイシン産生生物を同定するための種々さまざまな基準点を、本発明の範囲から逸脱することなく特定する場合もある。好ましい基準点として考えられているものに、一連のクエリー配列のうち少なくとも１つのクエリー配列が、上記オルトソマイシン生合成遺伝子に特徴的な１７群のポリペプチドのうち３、４、５、６、７、８、１０、又はそれ以上のポリペプチドに対応する核酸コードに対して統計的類似性を示す点が挙げられる。他の好ましいコンテキスト依存規則は、各群に必要とされる相同性の程度を、１つ以上の参照配列について、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は９８％に設定する。
【０１３４】
別の実施形態においては、コンパレータアルゴリズム２３８は、エベルニノマイシン型オルトソマイシンを代表するものと考えられる一連のクエリー配列について、そのうちの少なくとも１つが、下記の（１）〜（９）からなる群のうち、１つの群に由来するポリペプチドの核酸配列コードに対応する参照配列に対して統計的類似性を示すクエリー配列であるかどうかを判断しなくてはならない、とコンテキスト依存規則により指示される場合がある。（１）配列番号２０９、配列番号２１１、及び配列番号２０９又は配列番号２１１のポリペプチドに対して少なくとも７０％の相同性を有するポリペプチド；（２）配列番号２１３、配列番号２１５、及び配列番号２１３又は配列番号２１５のポリペプチドに対して少なくとも７０％の相同性を有するポリペプチド；（３）配列番号２１７、配列番号２１９、及び配列番号２１７又は配列番号２１９のポリペプチドに対して少なくとも７０％の相同性を有するポリペプチド；（４）配列番号２２１、配列番号２２３、及び配列番号２２１又は配列番号２２３のポリペプチドに対して少なくとも７０％の相同性を有するポリペプチド；（５）配列番号２２５、配列番号２２７、及び配列番号２２５又は配列番号２２７のポリペプチドに対して少なくとも７０％の相同性を有するポリペプチド；（６）配列番号２２９、配列番号２３１、及び配列番号２２９又は配列番号２３１のポリペプチドに対して少なくとも７０％の相同性を有するポリペプチド；（７）配列番号２３３、配列番号２３５、及び配列番号２３３又は配列番号２３５のポリペプチドに対して少なくとも７０％の相同性を有するポリペプチド；（８）配列番号２３７、配列番号２３９、及び配列番号２３７又は配列番号２３９のポリペプチドに対して少なくとも７０％の相同性を有するポリペプチド；及び（９）配列番号２４１、配列番号２４３、及び配列番号２４１又は配列番号２４３のポリペプチドに対して少なくとも７０％の相同性を有するポリペプチド。もちろん、好ましいコンテキスト依存規則が、エベルニノマイシン型オルトソマイシン生合成遺伝子又はエベルニノマイシン型オルトソマイシン産生生物を同定するための種々さまざまな基準点を、本発明の範囲から逸脱することなく特定する場合もある。好ましい基準点として考えられているものに、一連のクエリー配列のうち少なくとも１つのクエリー配列が、上記エベルニノマイシン型オルトソマイシン生合成遺伝子に特徴的な９群のポリペプチドのうち２、３、４、５、６、７、８、又は９群のポリペプチドに対応する核酸コードに対して統計的類似性を示す点が挙げられる。さらに好ましい実施形態においては、該一連のクエリー配列は、エベルニノマイシン生合成遺伝子クラスターに特徴的な９群のポリペプチドのうち２、３、４、５、６、７、８、又は９群のポリペプチドに対応する核酸コードに対して統計的類似性を示す少なくとも１つのクエリー配列、及び上記オルトソマイシン生合成遺伝子に特徴的な１７群のポリペプチドのうち、３、４、５、６、７、８、１０、又はそれ以上のポリペプチドに対応する核酸コードに対して統計的類似性を示す、一連のクエリー配列中の少なくとも１つのクエリー配列を含んでいてもよい。他の好ましいコンテキスト依存は、各群に必要とされる相同性の程度を、１つ以上の参照配列について、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は９８％に設定する。
【０１３５】
別の実施形態においては、コンパレータアルゴリズム２３８は、アビラマイシン型オルトソマイシン遺伝子座を代表するものと考えられる一連のクエリー配列について、該一連のクエリー配列が、下記の（１）〜（６）からなる群のうち、１つの群に由来するポリペプチドの核酸配列コードに対応する参照配列に対して統計的類似性を示すクエリー配列を少なくとも１つ含んでいるかどうかを判断しなくてはならない、とコンテキスト依存規則により指示される場合がある。（１）配列番号２４５、Genbankアクセッション番号ＡＡＧ３２０６８、及び配列番号２４５又はGenbankアクセッション番号ＡＡＧ３２０６８のポリペプチドに対して少なくとも７０％の相同性を有するポリペプチド；（２）配列番号２４７、Genbankアクセッション番号ＡＡＫ８３１８３、及び配列番号２４７又はGenbankアクセッション番号ＡＡＫ８３１８３のポリペプチドに対して少なくとも７０％の相同性を有するポリペプチド；（３）配列番号２４９、Genbankアクセッション番号ＡＡＧ３２０６９、及び配列番号２４９又はGenbankアクセッション番号ＡＡＧ３２０６９のポリペプチドに対して少なくとも７０％の相同性を有するポリペプチド；（４）配列番号２５１、Genbankアクセッション番号ＡＡＫ８３１７２、及び配列番号２５１又はGenbankアクセッション番号ＡＡＫ８３１７２のポリペプチドに対して少なくとも７０％の相同性を有するポリペプチド；（５）配列番号２５３、Genbankアクセッション番号ＡＡＫ８３１７１、及び配列番号２５３又はGenbankアクセッション番号ＡＡＫ８３１７１のポリペプチドに対して少なくとも７０％の相同性を有するポリペプチド；（６）配列番号２５５、Genbankアクセッション番号ＡＡＫ８３１７５、及び配列番号２５５又はGenbankアクセッション番号ＡＡＫ８３１７５のポリペプチドに対して少なくとも７０％の相同性を有するポリペプチド。もちろん、好ましいコンテキスト依存規則が、アビラマイシン型オルトソマイシン生合成遺伝子又はアビラマイシン型オルトソマイシン産生生物を同定するための種々さまざまな基準点を、本発明の範囲から逸脱することなく特定する場合もある。好ましい基準点として考えられているものに、一連のクエリー配列のうち少なくとも１つのクエリー配列が、上記アビラマイシン型オルトソマイシン生合成遺伝子に特徴的な群のポリペプチドのうち２、３、４、５、又は６群のポリペプチドに対応する核酸コードに対して統計的類似性を示す点が挙げられる。さらに好ましい実施形態においては、該一連のクエリー配列は、アビラマイシン型生合成遺伝子クラスターに特徴的な２、３、４、５、又は６群のポリペプチドに対応する核酸コードに対して統計的類似性を示す少なくとも１つのクエリー配列、及び上記オルトソマイシン生合成遺伝子に特徴的な１７群のポリペプチドのうち、３、４、５、６、７、８、１０、又はそれ以上のポリペプチドに対応する核酸コードに対して統計的類似性を示す、一連のクエリー配列中の少なくとも１つのクエリー配列を含んでいてもよい。他の好ましいコンテキスト依存規則は、各群に必要とされる相同性の程度を、１つ以上の参照配列に対して、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は９８％に設定する。
【０１３６】
このように、分析サブプロセスを、他のどのようなコンテキスト依存規則と併用してもよく、また、別の実施形態に適合させるために採用してもよい。アナライザアルゴリズム２４４の主な機能は、コンテキスト依存規則に基づき、意味又は診断を１つのクエリー又は一連のクエリーに割り当てることである。かかるコンテキスト依存規則はアプリケーション特異的であり、アナライザアルゴリズム２４４の全体的役割を変えずに、コンテキスト依存規則が変更される場合がある。
【０１３７】
最後に、図２の配列比較ソフトウェアには、コンパレータアルゴリズム２３８による比較の結果、及びアナライザアルゴリズム２４４による分析結果を、その比較を要求したユーザー又はプロセスに返す手段が含まれている。図２の「ディスプレイ／レポートサブプロセス」とは、コンパレータアルゴリズム２３８による比較の結果、及びアナライザアルゴリズム２４４による分析結果を、その比較を要求したユーザー又はプロセスに返すプロセスのことである。結果２４０、２４６をファイル２５２に書き込み、コンソール、カスタム・グラフィカル・インターフェース、ウェブ・インターフェース、若しくは他の適切な実装時固有インターフェースなどのユーザー・インターフェースに表示してもよく、又は、リレーショナルデータベース若しくは他の適切な実装時固有データベースなどのデータベースにアップロードしてもよい。
【０１３８】
その比較を要求したユーザー又はプロセスに結果を一旦返してしまうと、かかるプログラムは終了する。
【０１３９】
図２の配列比較ソフトウェアの原理は、クエリーの受領又はロードを行い、参照データセットの受領又はロードを行った後、コンパレータアルゴリズム２３８によって２つ一組での比較を行い、その後アナライザアルゴリズム２４４を用いて結果を評価して、クエリーが参照配列に対して有意な類似性を有しているかどうかの判断に達し、最終的にユーザー又は呼び出しているプログラム若しくはプロセスに結果を返すということである。
【０１４０】
図３は、２つの配列がホモログであるかどうかを判断するコンパレータアルゴリズム２３８のコンピュータ内プロセスの１つの実施形態を示すフローチャートである。かかるコンパレータアルゴリズムは、比較用のクエリー／サブジェクト対を受け取り、適切な比較を行い、相同性の程度を計算して、かかる対とともに返す。
【０１４１】
図３については、シーケンス３０４の冒頭で比較が開始されている。３０６で（ｘ）個の文字の照合を試みているが、この（ｘ）はユーザーが指定した数字である。一致物が見つからない場合は、サブジェクトについてポリペプチド１個分だけクエリー配列を３１６に進ませ、クエリーの最後が３１８に到達しない場合は、３０６で（ｘ）個の文字について別の照合を試みる。一致物がまったく見つからない場合は、クエリー全体を、サブジェクトの開始位置を越えてさらに前進させ、クエリーの最後が３１８に到達すると、サブジェクトポインターがポリペプチド１個分だけ前進し、クエリーポインターが、クエリー３１８の冒頭に設定される。サブジェクトの最後が到達し、それでも一致物が見つからない場合は、ヌル相同性結果スコア（null homology result score）が３２４で割り当てられ、アルゴリズムが、一対の配列をヌルスコアとともに呼び出しプロセス又はプログラムへ返す。その後、アルゴリズムは３２６を終了する。３０８で一致物が見つかった場合、照合した領域の拡大が３１０で試みられ、一致物は３１２で統計的に分析される。かかる拡大は一方向性でも双方向性でもよい。アルゴリズムは閉回路内で照合した領域の拡大と相同性スコアの計算を継続し、ポリペプチド側鎖の化学的特性を考えればすべての不一致物が同じであるとは限らないことを考慮して、不一致物にペナルティーを与える。例えば、ともに塩基性側鎖を有するリジンとアルギニンとの不一致には、酸性側鎖を有するリジンとグルタミン酸との間の不一致よりも少ないペナルティーが与えられる。蓄積したペナルティーが、ユーザーにより指定されたある値を一旦越えた場合、又はいずれかの配列の最後が３１２に一旦到達した場合、拡大閉回路はストップする。最大スコアを３１４で保存し、３１６でサブジェクトについてポリペプチド１個分だけクエリー配列を進ませ、クエリーの最後が３１８に到達しない場合は、３０６で（ｘ）個の文字について別の照合を試みる。クエリーの全長に対する一致物が存在するかどうかをサブジェクトの全長について評価するまで、かかるプロセスは続く。かかるアルゴリズムによって個々のスコア及びアラインメントを３１４で保存し、全体スコアを３２４で計算し、保存する。アルゴリズムは、一対の配列を局所的スコア及び全体的スコアとともに呼び出しプロセス又はプログラムへ返す。その後アルゴリズムは３２６で終了する。
【０１４２】
コンパレータアルゴリズム２３８アルゴリズムは、下記のとおり擬似コードで表してもよい。
【０１４３】
2004532021.tif 000006
【０１４４】
ヌクレオチド配列に使用するために、コンパレータアルゴリズム２３８を書いてもよい。その場合は、スコアを計算し、ヌクレオチドの化学特性に基づいてペナルティーを適用するために、採点計画を実施する。コンパレータアルゴリズム２３８は、ヌクレオチド又はポリペプチド配列の採点方法における格差の存在も考慮している場合がある。
【０１４５】
ＢＬＡＳＴは、コンパレータアルゴリズム２３８の一実施手段である。ＨＭＭＥＲは、Markovモデル分析に基づくコンパレータアルゴリズム２３８の別の実施手段である。ＨＭＭＥＲという実施手段においては、クエリー配列は、配列相同性を利用するのではなく、サブジェクト配列を表す数学モデルと比較される。
【０１４６】
図４はオルトソマイシン生合成遺伝子座、エベルニノマイシン型オルトソマイシン生合成遺伝子座、又はアビラマイシン型オルトソマイシン生合成遺伝子座の有無を検出するアナライザアルゴリズム２４４のプロセスを図示するフローチャートである。図４のアナライザアルゴリズムを、コンパレータアルゴリズム２３８で測定した類似性に基づいて、及び、コード化されてプログラムとなったコンテキスト依存規則、又は実行時間中に動的にロードされたコンテキスト依存規則にしたがって、サブジェクトのアノテーションをクエリーに割り当てるプロセスに用いてもよい。コンテキスト依存規則とは、比較というコンテキストを与えられたクエリーにサブジェクトのアノテーションを割り当てることが可能かどうかを判断するものである。コンテキスト依存規則は、一致した対を評価するプロセスで受け入れられる類似性の程度と質を判断する基準点を設定する。
【０１４７】
アナライザアルゴリズム２４４は、コンパレータアルゴリズム２３８により組み合わされたアレイ状の対をインプットとして受け取る。そうしたアレイは、少なくともクエリー識別子、サブジェクト識別子、及びそれらの類似性測定における関連値で構成されている。一群のクエリー配列がアビラマイシン型オルトソマイシン生合成遺伝子クラスターに特徴的な配列を含んでいるかどうかを判断するため、データソースにアクセスし、アビラマイシン特異的核酸コード及びアビラマイシン特異的ポリペプチドコードに関するアビラマイシン特異的情報を取り出すことにより、参照又は診断アレイ４０６を作製する。診断アレイ４０６は、少なくともサブジェクト識別子及びそれらの関連アノテーションで構成されている。アビラマイシン型生合成遺伝子クラスターに特徴的な９個のタンパク質ファミリー、すなわち、ＡＢＣＤ、ＤＥＰＮ、ＭＥＭＤ、ＲＥＢＵ、ＵＮＡＩ及びＵＮＢＲへの言及が、アノテーションに含まれていてもよい。遺伝子座における特異的構造分類の排他的存在に関する情報、又は、例えば以前コンピュータで算出した、モチーフのデータベースなど他のデータベースとの一致物が、アノテーションに含まれていてもよい。一旦、アルゴリズムによって、２つの必要なアレイ４０２と４０６の構築又は受理が首尾良く行われ、メモリにいずれかのコンテキスト依存規則が保有されると、コンパレータアルゴリズム２３８が判断したように、一致した対のそれぞれに対する評価が可能になる。該アルゴリズムは、一致した対のそれぞれに対して４０８での評価を行い、コンテキスト依存規則に基づいて、４１０で一致物が有効かどうかを確認する、又は確認しない。４１０で一致物の確認がうまくいった場合は、サブジェクトのアノテーションがクエリーに割り当てられる。それぞれの比較の結果は４１２で保存される。閉回路は、クエリー／サブジェクトアレイの最後が到達したときに終了する。アビラマイシン特異的核酸コード及びアビラマイシン特異的ポリペプチドコードについての、すべてのクエリー／サブジェクト対の評価が終わると、ＯＲＦのクエリーのセットがアビラマイシン遺伝子座であるかどうかを４１６で最終的に判断することができる。
【０１４８】
次いで該アルゴリズムは、呼び出し中のプログラム又はプロセスに、全体的な診断及び特徴づけを行ったクエリー／サブジェクト対のアレイを裏付けとなる証拠とともに返し、その後４１８で終了する。
【０１４９】
異なる診断アレイ及びコンテキスト依存規則を動的にロードするように、アナライザアルゴリズム２４４の設定を行ってもよい。例えば、クエリー／サブジェクト対と、エベルニノマイシン特異的核酸コード又はエベルニノマイシン特異的ポリペプチドコードなどの他の生合成経路に特徴的なサブジェクト、又は一連のアノテーション済サブジェクトとの比較に用いてもよい。
【０１５０】
これより本発明を下記の実施例によりさらに詳しく説明するが、本発明がそれら実施例に制限されるものではないことは、承知されてしかるべきである。
【実施例１】
【０１５１】
Micromonospora carbonacea var. aurantiacaにおけるエベルニノマイシン生合成遺伝子座の同定
６１６０４、イリノイ州、ピオリア、ユニヴァーシティーストリート、１８１５Ｎに所在の米国農務省農業研究サービスカルチャーコレクションより、微生物Micromonospora carbonacea var. aurantiacaＮＲＲＬ２９９７を入手した。ＮＲＲＬ２９９７株が産生するエベルニノマイシン化合物は、米国特許第３，４９９，０７８号に記載されている。カナダ国特許出願番号第２，３５２，４５１号に記載の方法にしたがい、エベルニノマイシンの生合成遺伝子座を、ＮＲＲＬ２９９７株から同定した（ＥＶＥＲ）。エベルニノマイシンの生合成遺伝子座まで及ぶオーバーラップゲノムインサートを含むコスミドから得た配列を同定した。コスミドインサートの配列内部で、既知のタンパク質に対して相同性を有するポリペプチドをコードする多数のＯＲＦを同定した。デフォルトパラメータを用いたＢＬＡＳＴＰのバージョン２．２．２というプログラムで相同性を測定した。ＥＶＥＲの隣接ヌクレオチド配列及び推定アミノ酸配列が提供されている。ＥＶＥＲは３つの隣接ＤＮＡ配列（配列番号２８０、２８１、及び２８２）で形成されており、それらの配列はＥＶＥＲ内で見られるように、ＤＮＡcontig１（配列番号２８０）の３’末端がＤＮＡcontig２（配列番号２８１）の５’末端に、ＤＮＡcontig２（配列番号２８１）の５’末端が、ＤＮＡcontig３（配列番号２８２）の５’末端に隣接するように配置されている。ＥＶＥＲに存在するＯＲＦは５０のポリペプチドをコードしており、その配列は、下記のとおり提供されている。ＯＲＦ１のアミノ酸配列（配列番号２６３）は、contig１（配列番号２８０）から引用した配列番号２６４の核酸配列から推定したものである。ＯＲＦ２のアミノ酸配列（配列番号８９）は、contig１（配列番号２８０）から引用した配列番号９０の核酸配列から推定したものである。ＯＲＦ３のアミノ酸配列（配列番号２２５）は、contig１（配列番号２８０）から引用した配列番号２２６の核酸配列から推定したものである。ＯＲＦ４のアミノ酸配列（配列番号２３７）は、contig１（配列番号２８０）から引用した配列番号２３８の核酸配列から推定したものである。ＯＲＦ５のアミノ酸配列（配列番号１１３）は、contig１（配列番号２８０）から引用した配列番号１１４の核酸配列から推定したものである。ＯＲＦ６のアミノ酸配列（配列番号１１９）は、contig１（配列番号２８０）から引用した配列番号１２０の核酸配列から推定したものである。ＯＲＦ７のアミノ酸配列（配列番号４９）は、contig１（配列番号２８０）から引用した配列番号５０の核酸配列から推定したものである。ＯＲＦ８のアミノ酸配列（配列番号６５）は、contig１（配列番号２８０）から引用した配列番号６６の核酸配列から推定したものである。ＯＲＦ９のアミノ酸配列（配列番号２０１）は、contig１（配列番号２８０）から引用した配列番号２０２の核酸配列から推定したものである。ＯＲＦ１０のアミノ酸配列（配列番号１５）は、contig１（配列番号２８０）から引用した配列番号１６の核酸配列から推定したものである。ＯＲＦ１１のアミノ酸配列（配列番号９５）は、contig１（配列番号２８０）から引用した配列番号９６の核酸配列から推定したものである。ＯＲＦ１２のアミノ酸配列（配列番号７１）は、contig１（配列番号２���０）から引用した配列番号７２の核酸配列から推定したものである。ＯＲＦ１３のアミノ酸配列（配列番号１２５）は、contig１（配列番号２８０）から引用した配列番号１２６の核酸配列から推定したものである。ＯＲＦ１４のアミノ酸配列（配列番号８３）は、contig１（配列番号２８０）から引用した配列番号８４の核酸配列から推定したものである。ＯＲＦ１５のアミノ酸配列（配列番号１０１）は、contig１（配列番号２８０）から引用した配列番号１０２の核酸配列から推定したものである。ＯＲＦ１６のアミノ酸配列（配列番号４７）は、contig１（配列番号２８０）から引用した配列番号４８の核酸配列から推定したものである。ＯＲＦ１７のアミノ酸配列（配列番号１９５）は、contig１（配列番号２８０）から引用した配列番号１９６の核酸配列から推定したものである。ＯＲＦ１８のアミノ酸配列（配列番号１５５）は、contig１（配列番号２８０）から引用した配列番号１５６の核酸配列から推定したものである。ＯＲＦ１９のアミノ酸配列（配列番号１０７）は、contig１（配列番号２８０）から引用した配列番号１０８の核酸配列から推定したものである。ＯＲＦ２０のアミノ酸配列（配列番号７７）は、contig１（配列番号２８０）から引用した配列番号７８の核酸配列から推定したものである。ＯＲＦ２１のアミノ酸配列（配列番号２２１）は、contig１（配列番号２８０）から引用した配列番号２２２の核酸配列から推定したものである。ＯＲＦ２２のアミノ酸配列（配列番号１５１）は、contig１（配列番号２８０）から引用した配列番号１５２の核酸配列から推定したものである。ＯＲＦ２３のアミノ酸配列（配列番号１４３）は、contig１（配列番号２８０）から引用した配列番号１４４の核酸配列から推定したものである。ＯＲＦ２４のアミノ酸配列（配列番号５３）は、contig１（配列番号２８０）から引用した配列番号５４の核酸配列から推定したものである。ＯＲＦ２５のアミノ酸配列（配列番号２０５）は、contig１（配列番号２８０）から引用した配列番号２０６の核酸配列から推定したものである。ＯＲＦ２６のアミノ酸配列（配列番号１６１）は、contig１（配列番号２８０）から引用した配列番号１６２の核酸配列から推定したものである。ＯＲＦ２７のアミノ酸配列（配列番号２５７）は、contig１（配列番号２８０）から引用した配列番号２５８の核酸配列から推定したものである。ＯＲＦ２８のアミノ酸配列（配列番号１３５）は、contig１（配列番号２８０）から引用した配列番号１３６の核酸配列から推定したものである。ＯＲＦ２９のアミノ酸配列（配列番号３）は、contig１（配列番号２８０）から引用した配列番号４の核酸配列から推定したものである。ＯＲＦ３０のアミノ酸配列（配列番号３５）は、contig１（配列番号２８０）から引用した配列番号３６の核酸配列から推定したものである。ＯＲＦ３１のアミノ酸配列（配列番号１６９）は、contig１（配列番号２８０）から引用した配列番号１７０の核酸配列から推定したものである。ＯＲＦ３２のアミノ酸配列（配列番号１８３）は、contig１（配列番号２８０）から引用した配列番号１８４の核酸配列から推定したものである。ＯＲＦ３３のアミノ酸配列（配列番号１７７）は、contig１（配列番号２８０）から引用した配列番号１７���の核酸配列から推定したものである。ＯＲＦ３４のアミノ酸配列（配列番号２９）は、contig１（配列番号２８０）から引用した配列番号３０の核酸配列から推定したものである。ＯＲＦ３５のアミノ酸配列（配列番号５９）は、contig１（配列番号２８０）から引用した配列番号６０の核酸配列から推定したものである。ＯＲＦ３６のアミノ酸配列（配列番号１８９）は、contig１（配列番号２８０）から引用した配列番号１９０の核酸配列から推定したものである。ＯＲＦ３７のアミノ酸配列（配列番号１４１）は、contig１（配列番号２８０）から引用した配列番号１４２の核酸配列から推定したものである。ＯＲＦ３８のアミノ酸配列（配列番号４１）は、contig１（配列番号２８０）から引用した配列番号４２の核酸配列から推定したものである。ＯＲＦ３９のアミノ酸配列（配列番号９）は、contig１（配列番号２８０）から引用した配列番号１０の核酸配列から推定したものである。ＯＲＦ４０のアミノ酸配列（配列番号１２９）は、contig１（配列番号２８０）から引用した配列番号１３０の核酸配列から推定したものである。表II−Ｂに示したように、ここに提供されたＯＲＦ４１の配列は、ギャップを含んでいる。ＯＲＦ４１、Ｃ末端のアミノ酸配列（配列番号２３）は、contig１（配列番号２８０）から引用した配列番号２４の核酸配列から推定したものである。ＯＲＦ４１、Ｎ末端のアミノ酸配列（配列番号２１）は、contig２（配列番号２８１）から引用した配列番号２２の核酸配列から推定したものである。ＯＲＦ４２、Ｃ末端のアミノ酸配列（配列番号２３３）は、contig３（配列番号２８２）から引用した配列番号２３４の核酸配列から推定したものである。ＯＲＦ４３のアミノ酸配列（配列番号２０９）は、contig３（配列番号２８２）から引用した配列番号２１０の核酸配列から推定したものである。ＯＲＦ４４のアミノ酸配列（配列番号２２９）は、contig３（配列番号２８２）から引用した配列番号２３０の核酸配列から推定したものである。ＯＲＦ４５のアミノ酸配列（配列番号２１７）は、contig３（配列番号２８２）から引用した配列番号２１８の核酸配列から推定したものである。ＯＲＦ４６のアミノ酸配列（配列番号２１３）は、contig３（配列番号２８２）から引用した配列番号２１４の核酸配列から推定したものである。ＯＲＦ４７のアミノ酸配列（配列番号２４１）は、contig３（配列番号２８２）から引用した配列番号２４２の核酸配列から推定したものである。ＯＲＦ４８（配列番号２５９）のアミノ酸配列は、contig３（配列番号２８２）から引用した配列番号２６０の核酸配列から推定したものである。ＯＲＦ４９（配列番号２６７）のアミノ酸配列は、contig３（配列番号２８２）から引用した配列番号２６８の核酸配列から推定したものである。ＯＲＦ５０（配列番号２６１）のアミノ酸配列は、contig３（配列番号２８２）から引用した配列番号２６２の核酸配列から推定したものである。
【０１５２】
ＥＶＥＲ中のＯＲＦには、表II−Ａに示したように、既知のタンパク質との相同性に基づいて、推定される機能及びタンパク質ファミリー名が割り当てられている。配列番号２８０、２８１、及び２８２における各ＥＶＥＲ  ＯＲＦの位置、長さ、及び配向を、表II−Ｂにて提供している。
【０１５３】
【表ＩＩ−Ａ１】
2004532021.tif 000007
【表ＩＩ−Ａ２】
2004532021.tif 000008
【表ＩＩ−Ａ３】
2004532021.tif 000009
【表ＩＩ−Ａ４】
2004532021.tif 000010
【表ＩＩ−Ａ５】
2004532021.tif 000011
【表ＩＩ−Ａ６】
2004532021.tif 000012
【表ＩＩ−Ａ７】
2004532021.tif 000013
【０１５４】
【表ＩＩ−Ｂ】
2004532021.tif 000014
【実施例２】
【０１５５】
Streptomyces mobaraensis由来アビラマイシン型化合物の生合成遺伝子座の同定
微生物Streptomyces mobaraensisＮＲＲＬ  Ｂ−３７２９株を、米国農務省農業研究サービスカルチャーコレクションより入手した。以前に、Streptomyces mobaraensisがアビラマイシン型化合物又はオルトソマイシン全般を産生すると報告されたことはなかった。カナダ国特許出願番号第２，３５２，４５１号に記載の方法を用いて、Streptomyces mobaraensisにおけるアビラマイシン型化合物の生合成遺伝子座（ＡＶＩＡ）を同定した。エベルニノマイシンの遺伝子座まで及ぶオーバーラップゲノムインサートを含むコスミドから得た配列を同定した。コスミドインサートの配列内部で、既知のタンパク質に対して相同性を有するポリペプチドをコードする多数のＯＲＦを同定した。デフォルトパラメータを用いたＢＬＡＳＴＰのバージョン２．２．２というプログラムで相同性を測定した。ＡＶＩＡにまで及ぶ隣接ヌクレオチド配列及びＡＶＩＡの推定アミノ酸配列は、下記のとおり提供されている。ＯＲＦ１のアミノ酸配列（配列番号１２３）は、contig１（配列番号２７７）から引用した配列番号１２４の核酸配列から推定したものである。ＯＲＦ２のアミノ酸配列（配列番号２０３）は、contig１（配列番号２７７）から引用した配列番号２０４の核酸配列から推定したものである。ＯＲＦ３のアミノ酸配列（配列番号１２７）は、contig１（配列番号２７７）から引用した配列番号１２８の核酸配列から推定したものである。ＯＲＦ４のアミノ酸配列（配列番号１９）は、contig１（配列番号２７７）から引用した配列番号２０の核酸配列から推定したものである。ＯＲＦ５のアミノ酸配列（配列番号５７）は、contig１（配列番号２７７）から引用した配列番号５８の核酸配列から推定したものである。ＯＲＦ６のアミノ酸配列（配列番号２５３）は、contig１（配列番号２７７）から引用した配列番号２５４の核酸配列から推定したものである。ＯＲＦ７のアミノ酸配列（配列番号２５１）は、contig１（配列番号２７７）から引用した配列番号２５２の核酸配列から推定したものである。ＯＲＦ８のアミノ酸配列（配列番号１８７）は、contig１（配列番号２７７）から引用した配列番号１８８の核酸配列から推定したものである。ＯＲＦ９のアミノ酸配列（配列番号１９９）は、contig１（配列番号２７７）から引用した配列番号２００の核酸配列から推定したものである。ＯＲＦ１０のアミノ酸配列（配列番号２５５）は、contig１（配列番号２７７）から引用した配列番号２５６の核酸配列から推定したものである。ＯＲＦ１１のアミノ酸配列（配列番号１１７）は、contig１（配列番号２７７）から引用した配列番号１１８の核酸配列から推定したものである。ＯＲＦ１２のアミノ酸配列（配列番号８７）は、contig１（配列番号２７７）から引用した配列番号８８の核酸配列から推定したものである。ＯＲＦ１３のアミノ酸配列（配列番号８１）は、contig１（配列番号２７７）から引用した配列番号８２の核酸配列から推定したものである。ＯＲＦ１４のアミノ酸配列（配列番号１８１）は、contig１（配列番号２７７）から引用した配列番号１８２の核酸配列から推定したものである。ＯＲＦ１５のアミノ酸配列（配列番号１３３）は、contig１（配列番号２７７）から引用した配列番号１３４の核酸配列から推定したものである。ＯＲＦ１６のアミノ酸配���（配列番号１）は、contig１（配列番号２７７）から引用した配列番号２の核酸配列から推定したものである。ＯＲＦ１７のアミノ酸配列（配列番号３３）は、contig１（配列番号２７７）から引用した配列番号３４の核酸配列から推定したものである。ＯＲＦ１８のアミノ酸配列（配列番号１６５）は、contig１（配列番号２７７）から引用した配列番号１６６の核酸配列から推定したものである。ＯＲＦ１９のアミノ酸配列（配列番号１６７）は、contig１（配列番号２７７）から引用した配列番号１６８の核酸配列から推定したものである。ＯＲＦ２０のアミノ酸配列（配列番号４５）は、contig１（配列番号２７７）から引用した配列番号４６の核酸配列から推定したものである。ＯＲＦ２１のアミノ酸配列（配列番号２４７）は、contig１（配列番号２７７）から引用した配列番号２４８の核酸配列から推定したものである。ＯＲＦ２２のアミノ酸配列（配列番号９９）は、contig１（配列番号２７７）から引用した配列番号１００の核酸配列から推定したものである。ＯＲＦ２３のアミノ酸配列（配列番号１０５）は、contig１（配列番号２７７）から引用した配列番号１０６の核酸配列から推定したものである。ＯＲＦ２４のアミノ酸配列（配列番号１５３）は、contig１（配列番号２７７）から引用した配列番号１５４の核酸配列から推定したものである。ＯＲＦ２５のアミノ酸配列（配列番号１１１）は、contig１（配列番号２７７）から引用した配列番号１１２の核酸配列から推定したものである。ＯＲＦ２６のアミノ酸配列（配列番号１９３）は、contig１（配列番号２７７）から引用した配列番号１９４の核酸配列から推定したものである。ＯＲＦ２７のアミノ酸配列（配列番号２４５）は、contig１（配列番号２７７）から引用した配列番号２４６の核酸配列から推定したものである。ＯＲＦ２８のアミノ酸配列（配列番号２４９）は、contig１（配列番号２７７）から引用した配列番号２５０の核酸配列から推定したものである。ＯＲＦ２９のアミノ酸配列（配列番号１４９）は、contig１（配列番号２７７）から引用した配列番号１５０の核酸配列から推定したものである。ＯＲＦ３０のアミノ酸配列（配列番号１４５）は、contig１（配列番号２７７）から引用した配列番号１４６の核酸配列から推定したものである。ＯＲＦ３１のアミノ酸配列（配列番号５１）は、contig１（配列番号２７７）から引用した配列番号５２の核酸配列から推定したものである。ＯＲＦ３２のアミノ酸配列（配列番号６３）は、contig１（配列番号２７７）から引用した配列番号６４の核酸配列から推定したものである。ＯＲＦ３３のアミノ酸配列（配列番号１５９）は、contig１（配列番号２７７）から引用した配列番号１６０の核酸配列から推定したものである。ＯＲＦ３４のアミノ酸配列（配列番号１７５）は、contig１（配列番号２７７）から引用した配列番号１７６の核酸配列から推定したものである。ＯＲＦ３５のアミノ酸配列（配列番号２７）は、contig１（配列番号２７７）から引用した配列番号２８の核酸配列から推定したものである。ＯＲＦ３６のアミノ酸配列（配列番号７５）は、contig１（配列番号２７７）から引用した配列番号７６の核酸配列から推定したものである。ＯＲＦ３７のアミノ酸配列（配列番号６９）は、contig１（配列���号２７７）から引用した配列番号７０の核酸配列から推定したものである。ＯＲＦ３８のアミノ酸配列（配列番号９３）は、contig１（配列番号２７７）から引用した配列番号９４の核酸配列から推定したものである。ＯＲＦ３９のアミノ酸配列（配列番号７）は、contig１（配列番号２７７）から引用した配列番号８の核酸配列から推定したものである。ＯＲＦ４０のアミノ酸配列（配列番号３９）は、contig１（配列番号２７７）から引用した配列番号４０の核酸配列から推定したものである。ＯＲＦ４１のアミノ酸配列（配列番号１３９）は、contig１（配列番号２７７）から引用した配列番号１４０の核酸配列から推定したものである。ＯＲＦ４２のアミノ酸配列（配列番号１３）は、contig１（配列番号２７７）から引用した配列番号１４の核酸配列から推定したものである。ＡＶＩＡ中のＯＲＦには、表III−Ａに示したように、既知のタンパク質との相同性に基づいて、推定される機能及びタンパク質ファミリー名が割り当てられている。配列番号２７７における各ＡＶＩＡ  ＯＲＦの位置、長さ、及び配向を、表III−Ｂにて提供している。
【０１５６】
【表ＩＩＩ−Ａ−１】
2004532021.tif 000015
【表ＩＩＩ−Ａ−２】
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【表ＩＩＩ−Ａ−３】
2004532021.tif 000017
【表ＩＩＩ−Ａ−４】
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【表ＩＩＩ−Ａ−５】
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【表ＩＩＩ−Ａ−６】
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【０１５７】
【表ＩＩＩ−Ｂ】
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ＡＶＩＡを、Streptomyces viridochromogenesＴｕ５７のアビラマイシンＡ遺伝子座（ここではＡＶＩＬと称する）、GenbankヌクレオチドアクセッションＡＦ３３３０３８と比較した（Weitnauer et al. 2001 Chemistry and Biology Vol. 8, pp. 569-581）。図５は、ＡＶＩＡ及びＡＶＩＬにおける相同的なＯＲＦの存在及び配向を示すものである。図１の上部にあるスケールの単位は、キロ塩基対である。黒い矢印は、ＡＶＩＡ及びＡＶＩＬにおける個々のＯＲＦの相対的な位置を表し、矢頭は各ＯＲＦの配向を示し、対応する４文字のファミリー名が各ＯＲＦの右側に示されている。２つの遺伝子座の間にある白い矢印は、相対的順序及び配向が２つの遺伝子座間で同一のＯＲＦを多数含むセグメントを明示するためのものである。ＡＶＩＡ中のＯＲＦの順序及び配向は、オキシドレダクターゼのＯＸＲＦファミリーメンバーと命名された、ＡＶＩＬ遺伝子座の中央部分にある１個のＯＲＦを除いて、ＡＶＩＬ中のものと全く同一である。ＡＶＩＬ中でＯＸＲＦと命名されたＯＲＦに対応するものは、（「Ｘ」と示されているように）ＡＶＩＡ遺伝子座中には存在しない。ＡＶＩＬ中のＯＲＦで、４文字表記法による名称に下線が引かれたものは、GenbankヌクレオチドアクセッションＡＦ３３３０３８のStreptomyces viridochromogenesＴｕ５７アビラマイシンＡ生合成遺伝子クラスターでは開示されていない。本発明の組成物及び方法を用いて、本発明者らは、ＡＶＩＬ遺伝子座の３’末端の付加的なＯＲＦを同定した。ＨＯＸＧ及びＵＮＫＵと命名されたと考えられるタンパク質に対応するＡＶＩＬ中のＯＲＦの配列は、フレームシフトにより崩壊したと思われる。これらのフレームシフトが、ＯＲＦの実際の混乱（失活すること）を反映しているのか、又は配列決定におけるエラーによるものなのかは、明らかではない。本発明者らは、以前に３個の小型ＯＲＦ（ＵＮＩＱと命名された）が報告されていた領域において、ＡＶＩＬのＵＮＫＵ  ＯＲＦの部分を検出した。ＡＶＩＬのＵＮＫＵ  ＯＲＦに相当する領域に多数のフレームシフトが存在することが、結果的に、違う鎖に基づく、３個のＵＮＩＱ  ＯＲＦに関する以前の報告をもたらしたと思われる。
【実施例３】
【０１５８】
オルトソマイシン生合成遺伝子座を示す遺伝子
オルトソマイシン遺伝子座のある種の遺伝子は、オルトソマイシンオリゴ糖のすべての種類に共通で、かつ、オルトソマイシン生合成遺伝子座を示す構造的特徴と関連している。表IVは、４つのオルトソマイシン遺伝子座、すなわち、ＥＶＥＲ（実施例１に記載）、ＡＶＩＡ（実施例２に記載）、ＥＶＥＡ（実施例１０に記載）、及びＡＶＩＬ（Weitnauer et al. 2001 Chemistry and Biology Vol. 8, pp. 569-581に記載）における、タンパク質ファミリーとそれぞれのＯＲＦ番号を列挙したものである。表IVの各列は、１つのタンパク質ファミリーに関するものであり、それぞれの遺伝子座で、そのタンパク質ファミリーのメンバーと思われるＯＲＦを同定している。タンパク質ファミリーの同定は、４文字表記法で行われている（表Ｉ参照）。このように、ある特定のタンパク質ファミリーのメンバーが、ＥＶＥＡ、ＥＶＥＲ、ＡＶＩＡ及びＡＶＩＬのうちの１つ以上で見つかった場合、それらのメンバーは同じ列に列挙されている。遺伝子座ＡＶＩＬにおける、＃＃、＃＃＃というシンボル、及び小文字でのファミリー名は、GenbankヌクレオチドアクセッションＡＦ３３３０３８のStreptomyces viridochromogenesＴｕ５７アビラマイシンＡ遺伝子座では開示されていないものの、本発明の組成物及び方法を用いて、現在同定されているこれらのＯＲＦを特定するものである。ＥＶＥＲ及びＥＶＥＡは、エベルニノマイシン型オルトソマイシンの例であり、一方、ＡＶＩＡ及びＡＶＩＬは、アビラマイシン型オルトソマイシンの例である。
【０１５９】
これら４つのオルトソマイシン生合成遺伝子座のタンパク質ファミリーを、その分布に基づいて５つのグループに分類することができる。ｉ）オルトソマイシン遺伝子座に共通して認められるが、非オルトソマイシン遺伝子座でも認められ、そのためオルトソマイシン特異的ではないと思われる１７個のファミリー、ii）大半のオルトソマイシン遺伝子座に共通して認められ、これより詳述するように、オルトソマイシンに特徴的と思われる１７個のファミリー、iii）実施例５に詳述するように、特にグループ（ii）のタンパク質ファミリーメンバーとともに認められる場合に、アビラマイシン型オルトソマイシン遺伝子座に特徴的な６個のファミリー、iv）実施例４に詳述するように、特にグループ（ii）のタンパク質ファミリーメンバーとともに認められる場合に、エベルニノマイシン型オルトソマイシン遺伝子座に特徴的と思われる９個のファミリー、及びv）４つのオルトソマイシン遺伝子座のすべてに存在しているわけではなく、及び／又は、オルトソマイシン遺伝子座に固有ではない１２個の種々雑多なファミリー（ＡＶＩＬ遺伝子座において「ＵＮＩＱ」と命名されているものを除く）のグループである。本発明の組成物及び方法を使用すると、Weitnauer et al. 2001 Chemistry and Biology Vol. 8, pp. 569-581に開示されている、鎖の、ＡＶＩＬ  ＯＲＦ２、３及び４の反対側の領域が、ＵＮＫＵタンパク質ファミリーのＡＶＩＡメンバーに相同性を示す。したがって、Weitnauer et al.に開示されているＡＶＩＬ  ＯＲＦ２、３及び４は、正確さに欠ける概念的翻訳と思われ、表IVではＵＮＩＱと命名されている。
【０１６０】
【表ＩＶ−１】
2004532021.tif 000022
【表ＩＶ−２】
2004532021.tif 000023
【０１６１】
表IVのグループ（ii）は、オルトソマイシン遺伝子座に特徴的と思われる１７個のタンパク質ファミリー、すなわち、ＧＴＦＥ、ＧＴＦＧ、ＧＴＦＨ、ＨＯＸＧ、ＭＴＦＤ、ＭＴＦＥ、ＭＴＦＦ、ＭＴＬＡ、ＯＸＲＶ、ＯＸＲＷ、ＯＸＲＷ、ＵＮＡＪ、ＰＨＯＤ、ＵＥＶＡ、ＵＮＫＵ、ＵＥＶＢ、及びＭＴＩＡである。かかる１７個のタンパク質ファミリーにはＯＸＲＷと命名された２個のファミリーが含まれているが、ＥＶＥＲにおいては、ＯＸＲＷタンパク質のうちの１個がＵＮＡＪタンパク質ファミリーメンバーと融合しているため、ＯＸＲＸと命名されている。そのため、ＥＶＥＲにはＯＸＲＷの独立したメンバーが１つ含まれており、ＵＮＡＪの独立したメンバーは含まれていない。ＵＥＶＢ及びＭＴＩＡファミリーは、ＥＶＥＡ遺伝子座には存在していないが、その他の３つのオルトソマイシン遺伝子座において認められること、及び、これまでに既知のホモログが記載されていないことから、オルトソマイシン遺伝子座に特徴的と思われている。オルトソマイシン遺伝子座に特徴的と思われる１７個のタンパク質ファミリーとは、オルトソマイシン以外の化合物の生合成に当然関与しているホモログが存在しない、及び／又は、オルトソマイシン生合成遺伝子座以外の状況でホモログが存在しないファミリーのことである。しかし、オルトソマイシン生合成遺伝子座は、オルトソマイシン遺伝子座に特徴的と思われる１７個のタンパク質ファミリーの各メンバーをかならずしも含むわけではないと予想されている。
【０１６２】
次に述べる、オルトソマイシン生合成遺伝子座に特徴的と思われる１７個のタンパク質ファミリーの各メンバーは、ＥＶＥＡ、ＥＶＥＲ、ＡＶＩＡ及びＡＶＩＬにて同定されている。ＧＴＦＥ（ＡＶＩＡ  ＯＲＦ３１、配列番号５１、ＡＶＩＬアクセッション番号ＡＡＫ８３１９２、ＥＶＥＲ  ＯＲＦ２４、配列番号５３、ＥＶＥＡ  ＯＲＦ３３、配列番号５５）、ＧＴＦＧ（ＡＶＩＡ  ＯＲＦ５、配列番号５７、ＡＶＩＬアクセッション番号ＡＡＫ８３１７０、ＥＶＥＲ  ＯＲＦ３５、配列番号５９、ＥＶＥＡ  ＯＲＦ２７、配列番号６１）、ＧＴＦＨ（ＡＶＩＡ  ＯＲＦ３２、配列番号６３、ＡＶＩＬアクセッション番号ＡＡＫ８３１９３、ＥＶＥＲ  ＯＲＦ８、配列番号６５、ＥＶＥＡ  ＯＲＦ３１、配列番号６７）、ＨＯＸＧ（ＡＶＩＡ  ＯＲＦ３７、配列番号６９、ＥＶＥＲ  ＯＲＦ１２、配列番号７１、ＥＶＥＡ  ＯＲＦ４３、配列番号７３）、ＭＴＦＤ（ＡＶＩＡ  ＯＲＦ２２、配列番号９９、ＡＶＩＬアクセッション番号ＡＡＫ８３１８４、ＥＶＥＲ  ＯＲＦ１５、配列番号１０１、ＥＶＥＡ  ＯＲＦ８、配列番号１０３）、ＭＴＦＥ（ＡＶＩＡ  ＯＲＦ２３、配列番号１０５、ＡＶＩＬアクセッション番号ＡＡＫ８３１８６、ＥＶＥＲ  ＯＲＦ１９、配列番号１０７、ＥＶＥＡ  ＯＲＦ１０、配列番号１０９）、ＭＴＦＦ（ＡＶＩＡ  ＯＲＦ２５、配列番号１１１、ＡＶＩＬアクセッション番号ＡＡＫ８３１８８、ＥＶＥＲ  ＯＲＦ５、配列番号１１３、ＥＶＥＡ  ＯＲＦ１２、配列番号１１５）、ＭＴＬＡ（ＡＶＩＡ  ＯＲＦ３、配列番号１２７、ＡＶＩＬアクセッション番号ＡＡＧ３２０６７、ＥＶＥＲ  ＯＲＦ４０、配列番号１２９、ＥＶＥＡ  ＯＲＦ４５、配列番号１３１）、ＭＴＩＡ（ＡＶＩＡ  ＯＲＦ１、配列番号１２３、ＡＶＩＬアクセッション番号ＡＡＧ３２０６６、ＥＶＥＲ  ＯＲＦ１３、配列番号１２５）、ＯＸＲＶ（ＡＶＩＡ  ＯＲＦ２４、配列番号１５３、ＡＶＩＬアクセッション番号ＡＡＫ８３１８７、ＥＶＥＲ  ＯＲＦ１８、配列番号１５５、ＥＶＥＡ  ＯＲＦ１１、配列番号１５７）、ＯＸＲＷ（ＡＶＩＡ  ＯＲＦ３３、配列番号１５９、ＥＶＥＲ  ＯＲＦ２６、配列番号１６１、ＥＶＥＡ  ＯＲＦ３０、配列番号１６３）、ＯＸＲＷ（ＡＶＩＡ  ＯＲＦ１９、配列番号１６７、ＥＶＥＡ  ＯＲＦ６、配列番号１７３、ＡＶＩＬアクセッション番号ＡＡＫ８３１８１）、ＥＶＥＲにおいては、ＯＸＲＷファミリーの２番目のメンバーはＵＮＡＪファミリー由来のタンパク質と融合しており、その結合ポリペプチドは、ＯＸＲＸ（ＥＶＥＲ  ＯＲＦ３１、配列番号１６９）、ＰＨＯＤ（ＡＶＩＡ  ＯＲＦ３４、配列番号１７５、ＥＶＥＲ  ＯＲＦ３３、配列番号１７７、ＥＶＥＡ  ＯＲＦ２９、配列番号１７９）、ＵＮＡＪ（ＡＶＩＡ  ＯＲＦ１８、配列番号１６５、ＥＶＥＡ  ＯＲＦ５、配列番号１７１）と命名されている。ＥＶＥＲにおいては、ＵＮＡＪタンパク質はＯＸＲＷファミリーの二番目のメンバーと融合しており、その結合ポリペプチドは、ＯＸＲＸ（ＥＶＥＲ  ＯＲＦ３１、配列番号１６９）、ＵＥＶＡ（ＡＶＩＡ  ＯＲＦ２６、配列番号１９３、ＡＶＩＬアクセッション番号ＡＡＫ８３１８９、ＥＶＥＲ  ＯＲＦ１７、配列番号１９５、ＥＶＥＡ  ＯＲＦ１４、配列番号１９７）、ＵＥＶＢ（Ａ��ＩＡ  ＯＲＦ９、配列番号１９９、ＡＶＩＬアクセッション番号ＡＡＫ８３１７４、ＥＶＥＲ  ＯＲＦ９、配列番号２０１）、及びＵＮＫＵ（ＡＶＩＡ  ＯＲＦ２、配列番号２０３、ＥＶＥＲ  ＯＲＦ２５、配列番号２０５、ＥＶＥＡ  ＯＲＦ３２、配列番号２０７）と命名されている。
【０１６３】
オルトソマイシン遺伝子座に特徴的な１７個のファミリーのそれぞれに属する４個のオルトソマイシン遺伝子座由来のホモログを、ＢＬＡＳＴで比較した。アミノ酸配列の相同性及び類似性のパーセントを、表Ｖから表XXまでの１６の表に示す。表Ｖから表XXにおける値は、２つ一組のブラスト２配列についての％相同性（％類似性）として表されている。ｎ／ａとは、ＵＮＡＪ及びＯＸＲＷが非相同ＯＲＦであるため比較不可能であったことを示す。ＸＸＸとは、ファミリーのホモログがその遺伝子座に存在しないことを示す。アスタリスクつきのＡＶＩＬ  ＯＲＦは、（図１０に示すように）公的に利用可能なアビラマイシン遺伝子座のヌクレオチド配列に存在しているが、Genbankタンパク質データベースに提出されていないものである。そのようなＯＲＦについて列挙されている相同性の値は、デフォルト設定及びクエリーとして対応するＡＶＩＡホモログを使用したｔｂｌａｓｔｎにより、入手したものである。「図を参照」とは、おそらくは公的に利用可能な配列内のフレームシフトによって分割されたアビラマイシンＯＲＦを指す。下記の対応するＴＢＬＡＳＴＮアラインメントを参照のこと。
【０１６４】
【表Ｖ】
2004532021.tif 000024
【０１６５】
【表ＶＩ】
2004532021.tif 000025
【０１６６】
【表ＶＩＩ】
2004532021.tif 000026
【０１６７】
【表ＶＩＩＩ】
2004532021.tif 000027
【０１６８】
【表ＩＸ】
2004532021.tif 000028
【０１６９】
【表Ｘ】
2004532021.tif 000029
【０１７０】
【表ＸＩ】
2004532021.tif 000030
【０１７１】
【表ＸＩＩ】
2004532021.tif 000031
【０１７２】
【表ＸＩＩＩ】
2004532021.tif 000032
【０１７３】
【表ＸＩＶ】
2004532021.tif 000033
【０１７４】
【表ＸＶ】
2004532021.tif 000034
【０１７５】
【表ＸＶＩ】
2004532021.tif 000035
【０１７６】
【表ＸＶＩＩ】
2004532021.tif 000036
【０１７７】
【表ＸＶＩＩＩ】
2004532021.tif 000037
【０１７８】
【表ＸＩＸ】
2004532021.tif 000038
【０１７９】
【表ＸＸ】
2004532021.tif 000039
すべてのオルトソマイシン生合成遺伝子座に認められるタンパク質ファミリーの存在により、オルトソマイシン化合物を定義する構造要素の形成については、特定の作用機構又は生合成図式に限定されることなく説明することができる。図２は、アセチルＣｏＡ由来ジクロロイソエベルニン酸の生合成の一図式を示す。図２の図式において、ＫＡＳＡ酵素（推定ケトアシルシンターゼ）は、アセチルＣｏＡをＰＫＳＯ（推定オルセリン酸シンターゼ）上にロードするプライミング酵素である。ＭＦＴＡ（芳香族Ｏ−メチルトランスフェラーゼに類似）はオルセリン酸をメチル化し、ＨＯＸＭ（非ヘムヒドロキシラーゼ／ハロゲナーゼに類似）はイソエベルニン酸を塩素化する。すべてのオルトソマイシン遺伝子座に存在する他のタンパク質ファミリーのメンバーも、オルトソマイシンのジクロロイソエベルニン酸部分の生合成に関与している場合がある。
【０１８０】
図７は、いずれも鉄アルファケトグルタル酸依存性酵素に対して配列類似性を有している２つのＯＸＲＷ及び１つのＯＸＲＶによるオルトエステル形成についての２つの図式（Ａ及びＢ）を示している。図式Ａは、酸化的Ｃ−Ｏカップリング反応に先だつグリコシルトランスフェラーゼ酵素の作用の関与がない点で、図式Ｂと異なっている。同様の酸化的Ｃ−Ｏカップリング反応は、クラバミン酸（clavaminic acid）シンターゼなどの他の鉄アルファケトグルタル酸依存性酵素において観察されている（Salowe SP, Marsh EN, Townsend, CA, Biochemistry 29 (27): 6499-6508）。すべてのオルトソマイシン遺伝子座に存在する他のタンパク質ファミリーのメンバーも、オルトソマイシンのオルトエステル結合の形成に関与している場合がある。
【実施例４】
【０１８１】
エベルニノマイシン型オルトソマイシン生合成遺伝子座に特異的な遺伝子
ＤＡＴＣ、ＤＥＰＦ、ＥＰＩＭ、ＧＴＦＡ、ＭＴＦＧ、ＭＴＦＶ、ＯＸＢＮ、ＯＸＣＯ及びＵＮＢＢタンパク質ファミリー（表IVのグループ（iv））は、特に、９個のタンパク質ファミリーのうち、少なくとも１個、好ましくは２個、さらに好ましくは３個、より好ましくは４個、より好ましくは５個、もっとも好ましくは６個以上のメンバーが、表IVのグループ（ii）に列挙された１７個のオルトソマイシン特異的タンパク質ファミリーのうち、１個、好ましくは２個、さらに好ましくは３個、より好ましくは４個、より好ましくは６個、もっとも好ましくは８個以上のメンバーとともに見つかる場合には、エベルニノマイシン型オルトソマイシン生合成遺伝子座及びエベルニノマイシン型オルトソマイシン産生株に特徴的であると考えられる。ＤＡＴＣ、ＤＥＰＦ、ＥＰＩＭ、ＧＴＦＡ、ＭＴＦＶ、ＯＸＢＮ、及びＯＸＣＯは、密接な関係にある物質がオルトソマイシン生合成とは無関係の二次代謝に関わっているため、エベルニノマイシン型オルトソマイシン生合成遺伝子座に固有であるとはいえない。ＭＴＦＧ及びＵＮＢＢとは、エベルニノマイシン型オルトソマイシン以外の化合物の生合成に当然関与しているホモログが存在しない、及び／又は、エベルニノマイシン型オルトソマイシン生合成遺伝子座以外の状況でホモログが存在しないため、エベルニノマイシン型オルトソマイシン遺伝子座に固有と考えられている２個のファミリーのことである。エベルニノマイシン型オルトソマイシン生合成遺伝子座は、エベルニノマイシン型オルトソマイシン遺伝子座に特徴的と思われる９個のタンパク質ファミリーのメンバーをかならずしも含むわけではないと予想されている。
【０１８２】
エベルニノマイシン型オルトソマイシン遺伝子座に特徴的で、ＥＶＥＲ及びＥＶＥＡに存在する９個のタンパク質ファミリーのホモログを、デフォルトパラメータを用いたＢｌａｓｔ分析で比較した。アミノ酸配列の相同性及び類似性のパーセントを、表XXIに示す。
【０１８３】
【表ＸＸＩ】
2004532021.tif 000040
エベルニノマイシン型オルトソマイシン生合成遺伝子座に特徴的なタンパク質ファミリーの存在により、エベルニノマイシン化合物を特徴づける構造要素の形成については、特定の機構又は生合成図式に限定されることなく説明することができる。図８は、エベルニノマイシンのニトロ糖残基形成の一経路を示す。図８において、アミン酸化反応は、フラビン依存性モノオキシゲナーゼに対して配列類似性を有するＯＸＢＮにより、連続的な触媒作用を受けている。
【実施例５】
【０１８４】
アビラマイシン型オルトソマイシン生合成遺伝子座に特異的な遺伝子
ＡＢＣＤ、ＤＥＰＮ、ＭＥＭＤ、ＲＥＢＵ、ＵＮＡＩ及びＵＮＢＲタンパク質ファミリー（表IVのグループ（iii））は、特に、アビラマイシン型オルトソマイシン生合成遺伝子座に特徴的な６個のタンパク質ファミリーのうち、１個、好ましくは２個、さらに好ましくは３個、より好ましくは４個以上のメンバーが、表IVのグループ（ii）に列挙された１７個のオルトソマイシン特異的タンパク質ファミリーのうち、１個、好ましくは２個、さらに好ましくは４個、より好ましくは６個、より好ましくは８個、もっとも好ましくは１０個以上のメンバーとともに見つかる場合には、アビラマイシン型オルトソマイシンに特徴的であると考えられる。
【０１８５】
アビラマイシン型オルトソマイシン生合成に特徴的であると考えられる６個のタンパク質ファミリーとは、ＡＢＣＤ（ＡＶＩＡ  ＯＲＦ２７、配列番号２４５、ＡＶＩＬアクセッション番号ＡＡＧ３２０６８）、ＤＥＰＮ（ＡＶＩＡ  ＯＲＦ２１、配列番号２４７、ＡＶＩＬアクセッション番号ＡＡＫ８３１８３）、ＭＥＭＤ（ＡＶＩＡ  ＯＲＦ２８、配列番号２４９、ＡＶＩＬアクセッション番号ＡＡＧ３２０６９）、ＲＥＢＵ（ＡＶＩＡ  ＯＲＦ７、配列番号２５１、ＡＶＩＬアクセッション番号ＡＡＫ８３１７２）、ＵＮＡＩ（ＡＶＩＡ  ＯＲＦ６、配列番号２５３、ＡＶＩＬアクセッション番号ＡＡＫ８３１７１）及びＵＮＢＲ（ＡＶＩＡ  ＯＲＦ１０、配列番号２５５、ＡＶＩＬアクセッション番号ＡＡＫ８３１７５）のことである。ＡＢＣＤ、ＤＥＰＮ、ＭＥＭＤ及びＵＮＡＩは、それらのタンパク質ファミリーと密接な関係にある物質がオルトソマイシン生合成とは無関係の二次代謝中に存在しているため、アビラマイシン型オルトソマイシン遺伝子座に固有であるとはいえない。ＲＥＢＵ及びＵＮＢＲメンバーとは、アビラマイシン型オルトソマイシン以外の化合物の生合成に当然関与しているホモログが存在しない、及び／又は、アビラマイシン型オルトソマイシン生合成遺伝子座以外の状況でホモログが存在しないため、アビラマイシン型オルトソマイシン遺伝子座に固有と考えられている２個のファミリーのことである。アビラマイシン型オルトソマイシンは、オルトソマイシン遺伝子座に特徴的と思われる６個のタンパク質ファミリーの各メンバーをかならずしも含むわけではないと予想されている。
【０１８６】
アビラマイシン型オルトソマイシン遺伝子座に特徴的で、ＡＶＩＡ及びＡＶＩＬに存在する６個のファミリーのホモログを、Ｂｌａｓｔ分析で比較した。アミノ酸配列の相同性及び類似性のパーセントを、表XXIIに示す。
【０１８７】
【表ＸＸＩＩ】
2004532021.tif 000041
ＡＶＩＡ及びＡＶＩＬはいずれも、エベルニノマイシン型遺伝子座では見られない二成分輸送系を含んでいる。ＡＶＩＡ中のＡＢＣＤ及びＭＥＭＤタンパク質は、それぞれＡＴＰ結合性トランスポーター（ＡｖｉＡＢＣＩ）及び膜貫通型トランスポーター（ＡｖｉＡＢＣII）として記載されている。また、アビラマイシンＡに対する耐性をS. viridochromogenesが有しているのは、このタンパク質の関与によるものである（Weitnauer et al., 2001, Antimicrob. Agents Chemother., Vol. 45, pp. 690-695）。高い配列相同性に基づき、ＡＶＩＡにおける対応物であるＯＲＦ２７（配列番号２４５）及びＯＲＦ２８（配列番号２４９）は、類似した機能を発揮すると考えられている。これらのタンパク質は、S. peucetiusのＤｒｒＡ及びＤｒｒＢタンパク質にも類似している。S. peucetiusがダウノルビシン及びドキソルビシンに対する耐性を有しているのは、ＤｒｒＡ及びＤｒｒＢタンパク質の関与によるものである。ＡＢＣＤタンパク質、ＡｖｉＡＢＣＩタンパク質及びＤｒｒＡタンパク質は、哺乳類腫瘍細胞のｍｄｒ遺伝子によりコードされるタンパク質に類似している。構造的には無関係の多くの化学療法剤に対してこれらの細胞が耐性を有しているのは、このタンパク質の関与によるものである。ＡＢＣＤとＭＥＭＤは協調して作用を及ぼし、増幅又は過剰発現したｍｄｒ遺伝子を含有する哺乳類腫瘍細胞のために作り上げた交互輸送機構に似た機構により、アビラマイシン型オルトソマイシンオリゴ糖類に対する耐性を与える（Guilfoile et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 88, pp. 8553-8557）。ＡＶＩＡ及びＡＶＩＬはいずれも、エベルニノマイシン型オルトソマイシン遺伝子座中のデヒドラターゼ／エピメラーゼ酵素とは異なる、「ＤＥＰＮ」と命名されたデヒドラターゼ／エピメラーゼを含んでいる。ＡＶＩＡ及びＡＶＩＬはいずれも、未知の機能を有する「ＵＮＡＩ」と命名されたＯＲＦを含んでいる。これに対するホモログは、少なくとも１個存在しているが、エベルニノマイシン型オルトソマイシン遺伝子座には存在しない。その１個とはStreptomyces coelicolorＡ３（２）の仮説上のタンパク質ＳＣＦ５５．２８ｃである。
【実施例６】
【０１８８】
ハイブリダイゼーション又はＰＣＲ増幅によるオルトソマイシン遺伝子同定のための診断用核酸配列の設計
オルトソマイシンオリゴ糖生合成遺伝子座に共通する１７個のタンパク質ファミリーのうちの３個を使用して、他の生物中のオルトソマイシン生合成遺伝子座の同定を目的としたハイブリダイゼーションプローブ又はＰＣＲプライマーとして用いてもよいオリゴヌクレオチドを設計した。本実施例で使用した３個のタンパク質ファミリーとは、ＵＥＶＡ、ＵＥＶＢ及びＨＯＸＧである。ＵＥＶＡ、ＵＥＶＢ及びＨＯＸＧタンパク質ファミリーのヌクレオチド配列でＥＶＥＲ由来のもの、すなわちＥＶＥＲ  ＯＲＦ１７、９、及び１２（それぞれ配列番号１９５、２０１及び７１）、並びにＡＶＩＡ由来のもの、すなわちＡＶＩＡ  ＯＲＦ２６、９及び３７（それぞれ配列番号１９３、１９９及び６９）を、ＢＬＡＳＴを基盤とした、２個のタンパク質又はヌクレオチド配列を整列させるためのツールである「ＢＬＡＳＴ２配列」を用いた２つ一組の比較により整列させた（Tatiana et al. 1999 FEMS Microbiol Lett. 174:247-250）。フィルタリング（組成の複雑度（compositional complexity）が低いクエリー配列のセグメントのマスキング）を適用しなかったことを除いて、パラメータはすべてデフォルト設定であった。
【０１８９】
ＵＥＶＡ、ＵＥＶＢ及びＨＯＸＧタンパク質のＥＶＥＲ及びＡＶＩＬ配列のアラインメントを下記の表XXIII、XXIV、及びXXVにぞれぞれ示す。表XXIIIはＵＥＶＡタンパク質ファミリーの核酸アラインメントであり、ＡＶＩＡ  ＯＲＦ２６（配列番号１９３）及びＥＶＥＲ  ＯＲＦ１７（配列番号１９５）を比較している。表XXIVはＵＥＶＢタンパク質ファミリーの核酸アラインメントであり、ＡＶＩＡ  ＯＲＦ９（配列番号１９９）及びＥＶＥＲ  ＯＲＦ９（配列番号２０１）を比較している。表XXVはＨＯＸＧタンパク質ファミリーの核酸アラインメントであり、ＡＶＩＡ  ＯＲＦ３７（配列番号６９）及びＥＶＥＲ  ＯＲＦ１２（配列番号７１）を比較している。診断用オリゴヌクレオチドを設計する際の基盤として機能するアラインメントのよく保存されたいくつかの領域を強調して表示している（「センス」方向に配置されたオリゴヌクレオチドを示すのに「＞」を用い、「アンチセンス」方向に配置されたオリゴヌクレオチドを示すのに「＜」を用いている。「∧」は、同一の配列を一本鎖として有するものの極性が逆転しているため一方の鎖とハイブリダイズできないことからネガティブコントロールとして機能するコントロールオリゴヌクレオチドを示す）。
【０１９０】
【表ＸＸＩＩＩ−１】
2004532021.tif 000042
【表ＸＸＩＩＩ−２】
2004532021.tif 000043
【０１９１】
【表ＸＸＩＶ−１】
2004532021.tif 000044
【表ＸＸＩＶ−２】
2004532021.tif 000045
【０１９２】
【表ＸＸＶ−１】
2004532021.tif 000046
【表ＸＸＶ−２】
2004532021.tif 000047
下記の表XXVIに列挙したオリゴヌクレオチド配列は、InvitrogenTM社より供給されたものである。必要に応じて、変性オリゴヌクレオチドを設計した。かかる変性オリゴヌクレオチド中、「Ｓ」はＧとＣをほぼ等モル混合してなるオリゴヌクレオチド中の塩基を示し、「Ｒ」はＧとＡをほぼ等モル混合してなるオリゴヌクレオチド中の塩基を示す。実施例７において詳述するように、オルトソマイシン遺伝子を同定するために、かかるオリゴヌクレオチドをハイブリダイゼーションプローブとして用いてもよい。実施例８に記載のとおり、（純粋培養物、混合培養物若しくは環境試料から）単離したＤＮＡに由来するオルトソマイシン遺伝子又は粗細胞集団若しくは環境試料から直接由来するオルトソマイシン遺伝子の部分を増幅するために、かかるオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとして用いてもよい。本出願に開示されている各遺伝子ファミリー他のメンバーが同定されているため、当業者であれば、例えば、多数の配列アラインメントを実行することができるClustalなどの適切なツールを使用して、オルトソマイシン遺伝子を同定し単離する診断用オリゴヌクレオチドを改良し改善することは可能であろう（Higgins and Sharp (1988) Gene Vol. 73 pp. 237-244）。
【０１９３】
【表ＸＸＶＩ】
2004532021.tif 000048
【実施例７】
【０１９４】
ハイブリダイゼーションによりオルトソマイシン遺伝子を同定する際の診断用核酸配列の使用
微生物Micromonospora carbonacea var. africanaＮＲＲＬ１５０９９を米国農務省農業研究サービスカルチャーコレクションより入手した。Ｎ−Ｚアミン寒天培地（水１リットルあたり：１０．０ｇのグルコース、２０ｇの可溶性デンプン、５．０ｇの酵母エキス、５．０ｇのＮ−ＺアミンＡ型（Sigma社製Ｃ０６２６）、１．０ｇの試薬用ＣａＣＯ3、１５．０ｇの寒天）中でこの生物を数日間２８℃で増殖させた。高分子量のゲノムＤＮＡを単離するため、増殖させたばかりの、ほぼ密集状態になっている３つの１００ｍｍペトリ皿の細胞集団を使用した。かかる細胞集団をプラスチック製のスパチュラでそっとすくい取った。ＳＴＥ緩衝液（７５ｍＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、２５ｍＭのＥＤＴＡ）で繰返し洗浄し、残った寒天培地を除去した。確立したプロトコル（Kieser et al., Practical Streptomyces Genetics, The John Innes Foundation, 2000）により、高分子量のＤＮＡを単離し、FIGE MAPPERTM power supply（BIORAD社製）の事前設定プログラムＮｏ．６を用いたフィールドインバージョンゲル電気泳動（ＦＩＧＥ）により、その完全性を実証した。
【０１９５】
SuperCos-1コスミドベクター（StratageneTM社製）を用いて、Micromonospora carbonacea var. africanaゲノムＤＮＡコスミドライブラリーを調製した。製造者の指示にしたがい、コスミドアームを調製した。製造者から供給された緩衝液中で、ＤＮＡ１００μｇあたり約１単位のＳａｕ３ＡＩ制限酵素（New England Biolabs社製）を使用して、高分子量ＤＮＡを３７℃で部分的に分解した。さまざまな時点で、分解物の部分標本を新しい微量遠心チューブに移し、最終濃度で１０ｍＭのＥＤＴＡ及び０．１％のＳＤＳを添加してかかる酵素を失活させた。目的とするサイズ範囲（３０〜５０ｋｂ）の重要なＤＮＡ断片を含むことがＦＩＧＥ分析によって判明した部分標本をプールし、フェノール／クロロホルム（１：１  ｖｏｌ：ｖｏｌ）で抽出し、エタノール沈殿によりペレット化した。製造者の説明書にしたがってアルカリホスファターゼ（Roche社製）を用いて、Ｓａｕ３ＡＩ  ＤＮＡ断片の５’末端を３７℃で３０分間脱リン酸化した。かかるホスファターゼを７０℃で１０分間熱失活させ、フェノール／クロロホルム（１：１  ｖｏｌ：ｖｏｌ）でＤＮＡを抽出し、エタノール沈殿によりペレット化し、滅菌水に再懸濁した。脱リン酸化したＳａｕ３ＡＩ  ＤＮＡ断片を、モルにして約４倍を越えるSuperCos-1コスミドアームを含む反応において、室温で一晩SuperCos-1コスミドアームに結合させた。GigapackR III XL パッケージング抽出物（StratageneTM社製）を製造者の説明書にしたがって使用し、結合産物のパッケージングを行った。８６４個の単離したコスミドクローンからなるライブラリーを選び、ＬＢ培養液（水１リットルあたり：１０．０ｇのＮａＣｌ、１０．０ｇのトリプトン、５．０ｇの酵母エキス）を入れた９枚の９６ウェルマイクロタイタープレートに移し、一晩増殖させた後、最終濃度で２５％のグリセロールを含むように調節した。これらのマイクロタイタープレートを−８０℃で保管し、グリセロールの備蓄品とした。二つ組のマイクロタイタープレートをナイロン膜上に下記のように並べた。マイクロタイター上で増殖した培養物を、ペレット化及び少量のＬＢ培養液での再懸濁によって濃縮した。１グリッドあたり９６ピンの３×３グリッドをナイロン膜に置いた。完全なコスミドライブラリーであるこれらの膜を、その後ＬＢ寒天上で層状とし、３７℃で一晩インキュベーションし、コロニーが育つようにした。ＤＮＡを変性させるため、事前に０．５ＮのＮａＯＨ／１．５ＭのＮａＣｌに１０分間浸しておいた濾紙上で、かかる膜を層状とし、その後、事前に０．５ＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８）／１．５ＭのＮａＣｌに１０分間浸しておいた濾紙上に移して中和した。細胞の残骸をプラスチック製のスパチュラでそっとすくい取り、GS GENE LINKERTM UV Chamber（BIORAD社製）を使用したＵＶ照射により、ＤＮＡを膜上に交差結合させた。
【０１９６】
製造者により供給されたキナーゼ反応緩衝液中に５ピコモルのオリゴヌクレオチドと６．６ピコモルの［γ−Ｐ32］ＡＴＰを含む１５μｌの反応液において、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（New England Biolabs社製）を使用し、オルトソマイシン特異的ハイブリダイゼーションオリゴヌクレオチドプローブをＰ32で放射能標識した。最終濃度が５ｍＭになるようにＥＤＴＡを添加することにより、１時間後に３７℃でキナーゼ反応を終了させた。積分器の機能を内蔵したモデル３ガイガーカウンター（テキサス州、スイートウォーター、Ludlum Measurements Inc.社製）を用いて、放射能標識したオリゴヌクレオチドプローブの特異的作用を評価した。８５℃で１０分間のインキュベーションに続いて氷中での急速冷却を行うことにより、放射能標識したオリゴヌクレオチドプローブを使用の直前に熱変性させた。
【０１９７】
ハイブリダイゼーションオーブンを低速振盪で使用し、プレハイブリダイゼーション溶液（６×ＳＳＣ、２０ｍＭのＮａＨ2ＰＯ4、５×Denhardt's、０．４％のＳＤＳ、超音波処理及び変性処理済の０．１ｍｇ／ｍｌのシャケ精子ＤＮＡ）において、４２℃で少なくとも２時間のインキュベーションを行うことにより、コスミドライブラリー膜を調製した。その後、１×１０6ｃｐｍ／ｍｌの放射能標識オリゴヌクレオチドプローブを含むハイブリダイゼーション溶液（６×ＳＳＣ、２０ｍＭのＮａＨ2ＰＯ4、０．４％のＳＤＳ、超音波処理及び変性処理済の０．１ｍｇ／ｍｌのシャケ精子ＤＮＡ）にかかる膜を入れ、ハイブリダイゼーションオーブンを低速振盪で使用し、４２℃で一晩のインキュベーションを行った。翌日、ハイブリダイゼーションオーブンを低速振盪で使用して、洗浄緩衝液（６×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳ）でかかる膜を４６℃、４８℃及び５０℃で、４５分間ずつ洗浄した。その後、かかる膜をＸ線フィルムに曝露し、陽性のコスミドクローンの視覚化及び同定を行った。４個の代表的なオルトソマイシン特異的オリゴヌクレオチドプローブを用いて得た結果を表XXVIIに示す。ハイブリダイゼーション実験において陽性であったコスミドクローンを「＋」で示している。これらのコスミドにおけるインサートの末端について、Ｔ７及びＴ１３ユニバーサルプライマーで配列決定を行ったところ、予想どおり、ＥＶＥＲ遺伝子座の配列と相同的な配列を含んでいることがわかった（データは図示せず）。ＥＶＥＲ遺伝子座のＯＸＣＯ遺伝子ファミリーに由来するものも含め、大半のオルトソマイシン特異的オリゴヌクレオチドプローブで検出されている（データは図示せず）ことからコスミドクローンＩＨ０１を選び、その配列をさらに分析した。ショットガン法により、このコスミドクローンの完全な配列決定を行った。コスミドクローンＦＢ０３及びＤＨ０１がＩＨ０１配列にオーバーラップし、ＩＨ０１配列を５’及び３’方向へそれぞれ伸長させていることが判明したため、これら２つのクローンの配列決定も行った。オーバーラップコスミドクローンＩＨ０１、ＦＢ０３及びＤＨ０１（ここでは、それぞれ０５０ＣＢ、０５０ＣＡ、及び０５０ＣＧと称する）の大きさは８５キロ塩基対を越え、そのなかにはMicromonospora carbonacea var. africanaのエベルニノマイシン生合成遺伝子座（ＥＶＥＡ）が含まれている。ＥＶＥＡについては、実施例１０でさらに詳しく述べる。
【０１９８】
【表ＸＸＶＩＩ】
2004532021.tif 000049
本発明の診断用プローブの特異性を実証するため、オルトソマイシン生合成遺伝子座を含むことが知られている３つの微生物に由来するコスミドＤＮＡの部分標本５０ｎｇをナイロン膜に置き、変性させ、交差結合させ、上記のとおり検査した。１５ｍｌの培養物から、アルカリ溶解法（Sambrook et al. 1989 Molecular cloning: a laboratory manual, 2nd edition.  Cold Spring Harbour Laboratory, Cold Spring Harbour, NY）にしたがって、コスミドＤＮＡを単離した。この実験に使用したコスミドとしては、Micromonospora carbonacea var. africana由来エベルニノマイシン遺伝子座（ＥＶＥＡ）の０５０ＣＡ、０５０ＣＢ、及び０５０ＣＧ、Micromonospora carbonacea var. aurantiaca由来エベルニノマイシン遺伝子座（ＥＶＥＲ）の０１０ＣＡ、０１０ＣＢ、及び０１０ＣＧ、Streptomyces mobaraensis由来アビラマイシン型遺伝子座（ＡＶＩＡ）の０１７ＣＨ、０１７ＣＰ、及び０１７ＣＰが挙げられる。その他、ネガティブコントロールとして機能するオルトソマイシン遺伝子座とは無関係の、Micromonospora carbonacea var. aurantiacaゲノムＤＮＡコスミドクローンの０５０ＣＣも挙げられる。８個のオルトソマイシン特異的オリゴヌクレオチドプローブを用いて得た結果を表XXVIIIに示す。ハイブリダイゼーション実験において陽性であったコスミドクローンを「＋」で示し、ハイブリダイゼーション実験において陰性であったコスミドクローンを「−」で示している。
【０１９９】
表XXVIIIにまとめた実験結果は、ＥＶＥＲ、ＥＶＥＡ及びＡＶＩＡについて入手可能な配列情報と矛盾するものではない。ＥＶＥＲにおけるＵＥＶＡ、ＨＯＸＧ及びＵＥＶＢタンパク質ファミリーのメンバーは、すべて０１０ＣＡコスミドの内部に含まれている。他の２個の遺伝子座には同じことが当てはまらない。すなわち、ＥＶＥＡ及びＡＶＩＡにおけるＵＥＶＡ、ＨＯＸＧ及びＵＥＶＢタンパク質ファミリーのメンバー間の距離は、もっと離れている。４個のＵＥＶＡプローブはすべて、ＥＶＥＲ、ＥＶＥＡ及びＡＶＩＡ中の同一のコスミドを常に検出したが、ＵＥＶＡ−Ｓ２プローブはＥＶＥＡに弱いシグナルを送っていた（表XXVIIIにて括弧で示す）。ＥＶＥＡにはＵＥＶＢホモログが含まれていないため、ＵＥＶＢ−Ｓ１プローブは、ＥＶＥＡコスミドとハイブリダイズしなかった（実施例１０参照）。ネガティブコントロールのコスミドＤＮＡ、０５０ＣＣとハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブは、皆無であった。ネガティブコントロールのオリゴヌクレオチドプローブＵＥＶＢ−ＣＴＬ１は、どのコスミドＤＮＡともハイブリダイズしなかった。
【０２００】
【表ＸＸＶＩＩＩ】
2004532021.tif 000050
【実施例８】
【０２０１】
ＰＣＲ増幅によりオルトソマイシン遺伝子を同定する際の診断用核酸配列の使用
オルトソマイシン遺伝子及び生合成遺伝子座、及び／又はオルトソマイシン産生生物を同定するため、実施例６に記載のオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとして使用してもよい。実施例７に記載したように、Micromonospora carbonacea var. africana及びMicromonospora carbonacea var. aurantiacaからゲノムＤＮＡを調製した。アルカリ溶解法（Sambrook et al. 1989 Molecular cloning: a laboratory manual, 2nd edition.  Cold Spring Harbour Laboratory, Cold Spring Harbour, NY）により、０１０ＣＡコスミドＤＮＡを調製した。ゲノムＤＮＡ及びコスミドＤＮＡの部分標本を、１）ＵＥＶＡ−Ｓ２及びＵＥＶＡ−ＡＳ１、２）ＵＥＶＡ−Ｓ１及びＵＥＶＡ−ＡＳ１、３）ＵＥＶＡ−Ｓ２及びＵＥＶＡ−ＡＳ２、及び４）ＵＥＶＡ−Ｓ１及びＵＥＶＡ−ＡＳ２という４つのＰＣＲプライマー対を用いたＰＣＲ反応における鋳型ＤＮＡとして使用した。
【０２０２】
それぞれのＰＣＲ増幅は、製造者より酵素とともに供給された反応緩衝液に、５０〜１００ナノグラムの鋳型ＤＮＡ、３７．５ピコモルの各プライマー、最終濃度が各０．２ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ及びｄＴＴＰ、最終濃度が１０％のジメチルスルホキシド、及び２単位のＰｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ（StratageneTM社製）を含む５０μｌの反応液を入れた中で行った。ＰＣＲ条件は、最初に９６℃で２分間変性させた後、９６℃で３０秒間の変性、４５℃で３０秒間のアニーリング、７２℃で２．５分間の伸長という増幅サイクルを３０サイクル行うというものであった。
【０２０３】
使用した４つのプライマー対は、オルトソマイシン特異的ＵＥＶＡ遺伝子の部分を増幅すると予想されており、増幅産物の予想サイズが小さい順に列挙されている。これらのオリゴヌクレオチドの相対的な位置は、下記及び図９に示すように、ＵＥＶＡ整列ヌクレオチド配列に記されている。
【０２０４】
図９は、臭化エチジウムで染色した１％アガロースゲルの図であり、かかるゲルには、ＰＣＲ反応液の部分標本５μｌが電気泳動により溶解している。図の上部に、プライマー対を示してある。数字は、ＰＣＲ反応においてどの鋳型ＤＮＡが使用されたかを示すものである。すなわち、「１」はMicromonospora carbonacea var. africanaゲノムＤＮＡを表し、「２」はMicromonospora carbonacea var. aurantiacaゲノムＤＮＡを表し、「３」はＥＶＥＲ遺伝子座のコスミド０１０ＣＡを表す。左端のレーンは、1Kb Plus DNA ladder（InvitrogenTM社製）分子量標準物質を含み、標準物質のなかには、塩基対（ｂｐ）単位で左方向に標識されているものもある。図９の下部の概略図は、ＥＶＥＲ遺伝子座由来ＵＥＶＡ遺伝子の既知のヌクレオチド配列（実施例１に記載）に基づくプライマー対の相対的な位置及びＰＣＲ産物の予想サイズ（塩基対単位）を示している。
【０２０５】
図９については、ゲノムＤＮＡを鋳型として使用したＰＣＲ反応により、テストした４個すべてのプライマー対にスメアが生じている。これに対して、精製した０１０ＣＡコスミドＤＮＡを鋳型として使用したＰＣＲ反応では、予想サイズと一致する明確なバンドが出現している。この結果は、使用したＰＣＲ条件が、ゲノムＤＮＡからの増幅には最適ではないものの、あまり複雑ではない（less complex）サブクローン化ＤＮＡ断片には充分であることを示唆している。ゲノムＤＮＡ鋳型使用時に生じるスメアは、サーマルサイクルにおけるアニーリング温度が最適ではないこと、高いＧ／Ｃ含有量及びゲノムＤＮＡの複雑さ、標的配列の存在量が比較的少ないこと、及びオリゴヌクレオチドＰＣＲプライマー中の変性した部分が存在することが重なって生じたミスプライミング（すなわち、伸長前のＰＣＲプライマーの不正確なアニーリング）によるものと思われる。
【０２０６】
（図９のいくつかのレーンで見られるように）正確なプライミングイベントからある割合の増幅産物が生じるという仮定に基づき、ＵＥＶＡ−Ｓ２及びＵＥＶＡ−ＡＳ１プライマー対を用いた２回目のＰＣＲ反応では、ＵＥＶＡ配列を特異的に増幅するために、ＵＥＶＡ−Ｓ１及びＵＥＶＡ−ＡＳ２プライマー対を用いて得た産物の部分標本を鋳型ＤＮＡとして使用した。これは実質的に、第一ラウンドの増幅が、一対の「外側」ＵＥＶＡ由来プライマーを用いたＵＥＶＡ配列の濃縮という役割をはたし、第二ラウンドの増幅は、該「外側」のプライマーが規定する領域に含まれるプライマーを用いて行われる、二段階ネスティッドＰＣＲということになる。Micromonospora carbonacea var. africanaゲノムＤＮＡとMicromonospora carbonacea var. aurantiacaゲノムＤＮＡの両方にこの二段階ネスティッドＰＣＲ法を使用したところ、ＵＥＶＡ−Ｓ２及びＵＥＶＡ−ＡＳ１プライマー対を用いたコスミド０１０ＣＡで得たものと類似したサイズの明確なバンドを得た（データは図示せず）。かかるバンドをアガロースゲルに溶解し、グラスウールプラグでの遠心分離により精製し、フェノール／クロロホルム（１：１  ｖｏｌ：ｖｏｌ）で抽出し、エタノール沈殿によりペレット化した。その後、ＵＥＶＡ−Ｓ２及びＵＥＶＡ−ＡＳ１プライマーを用いて、精製したＤＮＡの配列決定を行った。
【０２０７】
M. carbonacea var. africanaＰＣＲ産物の配列決定により、ＥＶＥＡ中のＵＥＶＡタンパク質の６９〜１６８位のアミノ酸をコードする領域と完全に一致する、質の高い配列情報を有する３０２個のヌクレオチドを得た（実施例１０に記載）。
〔配列〕
2004532021.tif 000051
【０２０８】
M. carbonacea var. aurantiacaＰＣＲ産物の配列決定により、ＥＶＥＲ遺伝子座中のＵＥＶＡタンパク質の７２〜１８５位のアミノ酸をコードする領域と完全に一致する、質の高い配列情報を有する３４３個のヌクレオチドを得た（実施例１に記載）。
〔配列〕
2004532021.tif 000052
2004532021.tif 000053
【０２０９】
【実施例９】
【０２１０】
コンピュータシミュレーションによるオルトソマイシン生合成遺伝子の同定
本発明で教示されているポリペプチド及びポリヌクレオチドの配列情報により、どの生物試料についてもコンピュータシミュレーションによるオルトソマイシン生合成遺伝子座の同定が可能になる。生物試料は、環境試料（すなわち土壌）、環境試料又は培養した微生物由来の遺伝子原料及び精製した遺伝子原料（ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ）であってもよい。
【０２１１】
培養したMicromonospora carbonacea var. africanaＮＲＲＬ１５００９のゲノムＤＮＡを抽出してカナダ国特許出願番号第２，３５２，４５１号に記載のとおりに抽出し、分析した。すなわち、抽出したゲノムＤＮＡをランダムに断片化し、サイズ断片化し（size-fractionated）、小型のＤＮＡ断片を構築し、適切なプラスミドベクターにクローンして、ゲノムサンプルライブラリー（ＧＳＬ）を構築した。ＧＳＬは、Micromonospora carbonacea var. africanaＮＲＲＬ１５００９の全ゲノムをカバーする小型ランダムゲノムＤＮＡ断片のライブラリーである。
【０２１２】
クローン処理したゲノムＤＮＡインサートの配列決定により、ＧＳＬライブラリーを分析した。それぞれフォワード（Ｆ）プライマー、リバース（Ｒ）プライマーと称されるユニバーサルプライマーのＫＳ及び／又はＳＫを使用して標識ＤＮＡの重合を開始した。3700 ABI capillary electrophoresis DNA sequencer（Applied Biosystems社製）を用いて、生じたゲノム配列タグ（ＧＳＴ）の配列分析を行った。各種タンパク質配列データベースとの配列相同性を比較することにより、さらにＧＳＴを分析した。得られたＧＳＴのＤＮＡ配列をアミノ酸配列に翻訳し、文献（Altschul et al. J. Mol. Biol., October 5; 215 (3) 403-10）記載のアルゴリズムを用いて、National Center for Biotechnology Information（ＮＣＢＩ）の非冗長タンパク質データベース及びＤＥＣＩＰＨＥＲTM（カナダ国、ケベック州、サンローラン、Ecopia BioScience社製）と比較した。データベース中の機能が判明している既知のタンパク質に対する配列類似性により、翻訳されたＧＳＴにコードされるポリペプチドから、本発明のタンパク質ファミリーを容易に認識できるようになる。
【０２１３】
Micromonospora carbonacea var. africanaＧＳＬライブラリーの４００個のＧＳＴを分析し、上記タンパク質データベースと比較した。分析した４００個のＧＳＴのなかで、３個のＧＳＴ（ＲＡＡ１２、ＲＡＣ９２、ＦＡＥ３８）が、本発明によりオルトソマイシン生合成遺伝子座に特徴的と教示されたタンパク質（それぞれ、ＨＯＸＧ、ＯＸＲＷ、ＭＴＦＤ）に対してかなりの配列類似性を有することが判明した。これら３個のＧＳＴがオルトソマイシン特異的遺伝子座の相同タンパク質に対して示す類似性は、非オルトソマイシンコーディング遺伝子座の関連タンパク質に対するものよりも、はるかに高い。翻訳ＧＳＴ産物と、ＥＶＥＲ、ＡＶＩＡ及びＡＶＩＬオルトソマイシン遺伝子座におけるそのホモログとの間の相同性の程度を、表XXIXに示す。３個のＧＳＴはすべて、オルトソマイシン化合物の生合成に固有のタンパク質ファミリーメンバーをコードする。ＨＯＸＧ、ＯＸＲＷ、及びＭＴＦＤは、オルトソマイシンコーディング遺伝子座でのみ認められ、それらがMicromonospora carbonacea var. africanaのゲノムサンプリングから検出されたということは、オルトソマイシン特異的遺伝子座がかかる微生物のゲノム内部に存在することをはっきりと示している。コンピュータシミュレーションによるオルトソマイシン遺伝子座の配列決定に使用したＧＳＴは、ＥＶＥＡ遺伝子座の完全な配列決定で確認されたとおり、ＥＶＥＡに属することがその後で判明した（実施例１０を参照のこと）。
【０２１４】
エベルニノマイシン又はアビラマイシンに特徴的なタンパク質ファミリーを含有しているＧＳＴが検出されていれば、予想されるオルトソマイシン化合物の種類をさらに決定することができただろう。オルトソマイシン特異的遺伝子座の存在は、かかる遺伝子座の検出及び完全な配列決定により確認された（実施例１０を参照のこと）。
【０２１５】
同様の方法を用いて、オルトソマイシン化合物をコードするStreptomyces sp.（コレクションＡＴＣＣ３９３６５）の能力を評価した。７００個のＧＳＴを分析し、タンパク質データベースと比較した。そのうち２個のＧＳＴ（ＦＡＦ６３、ＦＡＡ４７）が、オルトソマイシン遺伝子座で見られるＨＯＸＧ及びＰＫＳＯタンパク質ファミリーに対してかなりの配列相同性を有することが判明した（表XXIX参照）。ＨＯＸＧは、オルトソマイシン生合成遺伝子座でしか見られないため、オルトソマイシンに特徴的なタンパク質ファミリーである。一方、ＰＫＳＯは、オルトソマイシン遺伝子座で見られるタンパク質ファミリーではあるが、オルトソマイシン生合成以外の二次代謝にも関与していると思われる。本発明の組成物及び方法をStreptomyces sp.（コレクションＡＴＣＣ３９３６５）に対して用いることにより、出現した代謝物の測定をこれまでまったく行っていなかった微生物又はバイオマスにおけるオルトソマイシン遺伝子座の発見に関する本発明の予測能力が実証される。
【０２１６】
表XXIXは、Micromonospora carbonacea var. africanaとStreptomyces sp.の翻訳されたＧＳＴと、オルトソマイシン遺伝子座由来のそれらのホモログとの比較を示したものである。Ｂｌａｓｔｘアルゴリズムを用いて、Ｂｌａｓｔ分析を行った（Altschul et al. J. Mol. Biol., October 5; 215 (3) 403-10）。それぞれの比較結果中、１行目は２つのタンパク質セグメント間における同一アミノ酸の数及び同一性の程度を、２行目は類似したアミノ酸の数及び類似性の程度を示している。
【０２１７】
【表ＸＸＩＸ−１】
2004532021.tif 000054
【表ＸＸＩＸ−２】
2004532021.tif 000055
【実施例１０】
【０２１８】
Micromonospora carbonacea var. africanaにおけるエベルニノマイシン生合成遺伝子座
６１６０４、イリノイ州、ピオリア、ユニヴァーシティーストリート、１８１５Ｎに所在の米国農務省農業研究サービスカルチャーコレクションより、微生物Micromonospora carbonacea var. africanaＮＲＲＬ１５０９９を入手した。ＮＲＲＬ１５０９９株が産生したエベルニノマイシン化合物は、米国特許第４，５９７，９６８号に記載されている。カナダ国特許出願番号第２，３５２，４５１号に記載の方法により、ＮＲＲＬ１５０９９株由来エベルニノマイシンの生合成遺伝子座（ＥＶＥＡ）を同定した。ＥＶＥＡまで及ぶオーバーラップゲノムインサートを含むコスミドから得た配列を同定した。コスミドインサートの配列内部で、既知のタンパク質に相同性を有するポリペプチドをコードする多数のＯＲＦを同定した。ＥＶＥＡの隣接ヌクレオチド配列及び推定アミノ酸配列は、下記のとおり提供されている。ＯＲＦ１のアミノ酸配列（配列番号２７１）は、contig１（配列番号２７８）から引用した配列番号２７２の核酸配列から推定したものである。ＯＲＦ２のアミノ酸配列（配列番号１３７）は、contig１（配列番号２７８）から引用した配列番号１３８の核酸配列から推定したものである。ＯＲＦ３のアミノ酸配列（配列番号５）は、contig１（配列番号２７８）から引用した配列番号６の核酸配列から推定したものである。ＯＲＦ４のアミノ酸配列（配列番号３７）は、contig１（配列番号２７８）から引用した配列番号３８の核酸配列から推定したものである。ＯＲＦ５のアミノ酸配列（配列番号１７１）は、contig１（配列番号２７８）から引用した配列番号１７２の核酸配列から推定したものである。ＯＲＦ６のアミノ酸配列（配列番号１７３）は、contig１（配列番号２７８）から引用した配列番号１７４の核酸配列から推定したものである。ＯＲＦ７のアミノ酸配列（配列番号４９）は、contig１（配列番号２７８）から引用した配列番号５０の核酸配列から推定したものである。ＯＲＦ８のアミノ酸配列（配列番号１０３）は、contig１（配列番号２７８）から引用した配列番号１０４の核酸配列から推定したものである。ＯＲＦ９のアミノ酸配列（配列番号２６９）は、contig１（配列番号２７８）から引用した配列番号２７０の核酸配列から推定したものである。ＯＲＦ１０のアミノ酸配列（配列番号１０９）は、contig１（配列番号２７８）から引用した配列番号１１０の核酸配列から推定したものである。ＯＲＦ１１のアミノ酸配列（配列番号１５７）は、contig１（配列番号２７８）から引用した配列番号１５８の核酸配列から推定したものである。ＯＲＦ１２のアミノ酸配列（配列番号１１５）は、contig１（配列番号２７８）から引用した配列番号１１６の核酸配列から推定したものである。ＯＲＦ１３のアミノ酸配列（配列番号１２１）は、contig１（配列番号２７８）から引用した配列番号１２２の核酸配列から推定したものである。ＯＲＦ１４のアミノ酸配列（配列番号１９７）は、contig１（配列番号２７８）から引用した配列番号１９８の核酸配列から推定したものである。ＯＲＦ１５のアミノ酸配列（配列番号９１）は、contig１（配列番号２７８）から引用した配列番号９２の核酸配列から推定したものである。ＯＲＦ１６のアミノ酸配列（配列番号１８５）は、contig２（配列番号２７９）から引用した配列番号１８６の核酸配列から推定したものである。ＯＲＦ１７のアミノ酸配列（配列番号８５）は、contig２（配列番号２７９）から引用した配列番号８６の核酸配列から推定したものである。ＯＲＦ１８のアミノ酸配列（配列番号２２７）は、contig２（配列番号２７９）から引用した配列番号２２８の核酸配列から推定したものである。ＯＲＦ１９のアミノ酸配列（配列番号２３９）は、contig２（配列番号２７９）から引用した配列番号２４０の核酸配列から推定したものである。ＯＲＦ２０のアミノ酸配列（配列番号７９）は、contig２（配列番号２７９）から引用した配列番号８０の核酸配列から推定したものである。ＯＲＦ２１のアミノ酸配列（配列番号２７５）は、contig２（配列番号２７９）から引用した配列番号２７６の核酸配列から推定したものである。ＯＲＦ２２のアミノ酸配列（配列番号１１）は、contig２（配列番号２７９）から引用した配列番号１２の核酸配列から推定したものである。ＯＲＦ２３のアミノ酸配列（配列番号４３）は、contig２（配列番号２７９）から引用した配列番号４４の核酸配列から推定したものである。ＯＲＦ２４のアミノ酸配列（配列番号１４３）は、contig２（配列番号２７９）から引用した配列番号１４４の核酸配列から推定したものである。ＯＲＦ２５のアミノ酸配列（配列番号１７）は、contig２（配列番号２７９）から引用した配列番号１８の核酸配列から推定したものである。ＯＲＦ２６のアミノ酸配列（配列番号１９１）は、contig２（配列番号２７９）から引用した配列番号１９２の核酸配列から推定したものである。ＯＲＦ２７のアミノ酸配列（配列番号６１）は、contig２（配列番号２７９）から引用した配列番号６２の核酸配列から推定したものである。ＯＲＦ２８のアミノ酸配列（配列番号３１）は、contig２（配列番号２７９）から引用した配列番号３２の核酸配列から推定したものである。ＯＲＦ２９のアミノ酸配列（配列番号１７９）は、contig２（配列番号２７９）から引用した配列番号１８０の核酸配列から推定したものである。ＯＲＦ３０のアミノ酸配列（配列番号１６３）は、contig２（配列番号２７９）から引用した配列番号１６４の核酸配列から推定したものである。ＯＲＦ３１のアミノ酸配列（配列番号６７）は、contig２（配列番号２７９）から引用した配列番号６８の核酸配列から推定したものである。ＯＲＦ３２のアミノ酸配列（配列番号２０７）は、contig２（配列番号２７９）から引用した配列番号２０８の核酸配列から推定したものである。ＯＲＦ３３のアミノ酸配列（配列番号５５）は、contig２（配列番号２７９）から引用した配列番号５６の核酸配列から推定したものである。ＯＲＦ３４のアミノ酸配列（配列番号２５）は、contig２（配列番号２７９）から引用した配列番号２６の核酸配列から推定したものである。ＯＲＦ３５のアミノ酸配列（配列番号２２３）は、contig２（配列番号２７９）から引用した配列番号２２４の核酸配列から推定したものである。ＯＲＦ３６のアミノ酸配列（配列番号２３５）は、contig２（配列番号２７９）から引用した配列番号２３６の核酸配列から推定したものである。ＯＲＦ３７のアミノ酸配列（配列番号２１１）は、contig２（配列番号２７９）から引用した配列番号２１２の核酸配列から推定したものである。ＯＲＦ３８のアミノ酸配列（配列番号２３１）は、contig２（配列番号２７９）から引用した配列番号２３２の核酸配列から推定したものである。ＯＲＦ３９のアミノ酸配列（配列番号２１９）は、contig２（配列番号２７９）から引用した配列番号２２０の核酸配列から推定したものである。ＯＲＦ４０のアミノ酸配列（配列番号２１５）は、contig２（配列番号２７９）から引用した配列番号２１６の核酸配列から推定したものである。ＯＲＦ４１のアミノ酸配列（配列番号２４３）は、contig２（配列番号２７９）から引用した配列番号２４４の核酸配列から推定したものである。ＯＲＦ４２のアミノ酸配列（配列番号２７３）は、contig２（配列番号２７９）から引用した配列番号２７４の核酸配列から推定したものである。ＯＲＦ４３のアミノ酸配列（配列番号７３）は、contig２（配列番号２７９）から引用した配列番号７４の核酸配列から推定したものである。ＯＲＦ４４のアミノ酸配列（配列番号９７）は、contig２（配列番号２７９）から引用した配列番号９８の核酸配列から推定したものである。ＯＲＦ４５のアミノ酸配列（配列番号１３１）は、contig２（配列番号２７９）から引用した配列番号１３２の核酸配列から推定したものである。デフォルトパラメータを用いたＢＬＡＳＴＰのバージョン２．２．２アルゴリズムで相同性を測定した。表XXX-Aは、相同性分析の結果を表す。表XXX-Bは、配列番号２７８及び２７９の各ＥＶＥＡ  ＯＲＦの位置、長さ、及び配置を示すものである。
【０２１９】
【表ＸＸＸ−Ａ−１】
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【表ＸＸＸ−Ａ−２】
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【表ＸＸＸ−Ａ−３】
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【表ＸＸＸ−Ａ−４】
2004532021.tif 000059
【表ＸＸＸ−Ａ−５】
2004532021.tif 000060
【表ＸＸＸ−Ａ−６】
2004532021.tif 000061
【０２２０】
【表ＸＸＸ−Ｂ】
2004532021.tif 000062
図１０は、Micromonospora carbonacea var. aurantiaca由来エベルニノマイシン生合成遺伝子座（ＥＶＥＲ）とMicromonospora carbonacea var. africana由来エベルニノマイシン生合成遺伝子座（ＥＶＥＡ）とを比較し、その概略を表したものである。図の上部にあるスケールバーの単位は、キロ塩基対である。黒の矢印は、ＥＶＥＲ及びＥＶＥＡにおける個々のＯＲＦの相対的位置を示し、矢頭は、各ＯＲＦの配向を示す。各ＯＲＦの右に、対応するタンパク質ファミリーを四文字表記で示している。２個の遺伝子座間の白い矢印は、相対的順序と配向が２個の遺伝子座間で同一である多数のＯＲＦを含むセグメントを明示したものである。白い矢印の配向は、各セグメントにおけるＯＲＦの相対的順序を示している。ＥＶＥＲ遺伝子座中のセグメントには、すべて、「左から右」の配向が任意に割り当てられている。セグメントは、その相対的順序及び配向が、比較対象の遺伝子座間で同一である２個以上の隣接したＯＲＦとして定義されている。２個の遺伝子座間の実線は、一方の遺伝子座の各セグメントと他方の遺伝子座の対応するセグメントとを結んだものである。２個の遺伝子座間の点線は、セグメントを形成しない相同的なＯＲＦの個々の対を結んだものである。
【０２２１】
各遺伝子座のＯＲＦで、他の遺伝子座に対応物をもたないものを、「Ｘ」で示している。ＥＶＥＲ中のＯＲＦで、ＥＶＥＡ中に対応物をもたないものは１０個あり、ＭＴＢＡ、ＭＴＦＨ、ＵＥＶＢ、ＭＴＩＡ、ＯＸＲＵ、ＯＸＲＴ、ＤＥＰＤ、ＥＮＧＡ、ＲＥＧＬ及びＫＩＮＢタンパク質ファミリーメンバーと命名されている。ＥＶＥＡ中のＯＲＦで、ＥＶＥＲ中に対応物をもたないものは４個あり、ＨＹＤＨ、ＯＸＲＦ、ＥＦＦＡ及びＯＸＲＦタンパク質ファミリーメンバーと命名されている。ＭＴＢＡ、ＭＴＦＨ、ＵＥＶＢ、ＭＴＩＡ、ＯＸＲＵ、ＯＸＲＴ、ＤＥＰＤ、ＥＮＧＡ、ＲＥＧＬ、ＫＩＮＢ、ＨＹＤＨ、ＯＸＲＦ、ＥＦＦＡ及びＯＸＲＦタンパク質ファミリーのＯＲＦが、エベルニノマイシン型オルトソマイシンのコア構造の組み立てに関与している可能性は低い。むしろ、それらは、メチル化（ＭＴＢＡ及びＭＴＦＨ）、酸化／還元（ＯＸＲＵ、ＯＸＲＴ、ＯＸＲＦ）をはじめとするコア構造の各種修飾、又は耐性機構（ＭＴＩＡ、ＥＦＦＡ）に関与していると思われる。
【０２２２】
Reverse Position Specific BLASTを用いてＮＢＣＩのConserved Domain Databaseを調査したところ（Altschul et al., (1997) Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402）、炭水化物結合及び別のコンテキストでのタンパク質−タンパク質相互作用に関与している二本鎖ベータヘリックスドメインに対して、ＵＥＶＢファミリーが構造的相同性を示すことが判明した。したがって、ＵＥＶＢファミリーは、オルトソマイシンのあるサブ構造を特異的に認識する小型の炭水化物結合タンパク質であるのかもしれない。さらなる修飾を防ぐために、ＵＥＶＢタンパク質が糖残基Ｈを認識し、結合するという興味深い可能性が１つある。この仮説は、Micromonospora carbonacea var. africana由来のエベルニノマイシン遺伝子座にはＵＥＶＢホモログが含まれないという事実、及び、この生物が、オルセリン酸部分とのエステル結合を含めたさまざまな置換を糖残基Ｈ上で行ってエベルニノマイシンを産生するという事実に基づいている。したがって、この仮説に基づくと、ＡＶＩＡ、ＡＶＩＬ若しくはＥＶＥＲ遺伝子座、又はそうしたＯＲＦを含む可能性のあるその他のオルトソマイシン遺伝子座におけるＵＥＶＢ  ＯＲＦが崩壊した結果、糖残基Ｈにさらに置換が生じている新規オルトソマイシンが産生される場合があることが予測されるだろう。
【０２２３】
ＥＶＥＲ及びＥＶＥＡ遺伝子座がともに関連化合物を産生し、これらの遺伝子座をそれぞれ含む生物がともにMicromonospora carbonaceaに分類されるため、ＥＶＥＲ及びＥＶＥＡ遺伝子座のＯＲＦがある程度までシャッフルされ、各遺伝子座に対応物をもたないＯＲＦが存在するという事実は、予想を越えるものであった。
【０２２４】
ここに記載した実施形態は例示のみを目的とするものであること、及び、これらの実施形態を踏まえた各種修正や変更は、当業者であれば思いつくことであって、本出願の範囲及び後述のクレームの範囲に含まれるべきであることは理解されてしかるべきである。ここで触れたあらゆる刊行物、特許、特許出願は、あらゆる目的に使用できるように完全な形でここに参照として組み込んでいる。
【図面の簡単な説明】
【０２２５】
【図１】本発明の参照配列から選択したサブジェクトとクエリーとの比較を目的としたソフトウェアツールを実行するコンピュータシステムのブロック図である。
【図２】図２Ａ、２Ｂ、２Ｃ及び２Ｄは、本発明の参照配列から選択したサブジェクトとクエリーとを比較する際に使用可能な配列比較ソフトウェアのフローチャートであり、図２Ａは配列比較ソフトウェアのクエリー初期化サブプロセス、図２Ｂは配列比較ソフトウェアのサブジェクトデータソース初期化サブプロセスであり、図２Ｃは配列比較ソフトウェアの比較サブプロセス及び分析サブプロセスを示し、図２Ｄは配列比較ソフトウェアのディスプレイ／レポートサブプロセスである。
【図３】クエリー／サブジェクト対の間の類似性を１対単位で測定する際に使用可能なコンパレータアルゴリズムの１つの実施形態である図２Ｃのコンパレータアルゴリズム（２３８）のフローチャートである。
【図４】本発明の参照配列であるサブジェクト配列との類似性に基づいてクエリー配列に同一性を割り当てる際に使用可能なアナライザアルゴリズムの１つの実施形態である図２Ｃのアナライザアルゴリズム（２４４）のフローチャートである。
【図５】Streptomyces mobaraensis由来のアビラマイシン型生合成遺伝子座（ＡＶＩＡ）とStreptomyces viridochromogenesＴｕ５７由来のアビラマイシンＡ生合成遺伝子座（ＡＶＩＬ）とを比較した概略図であり、タンパク質ファミリーの４文字表記で遺伝子座中のＯＲＦを同定している。
【図６】生合成の図式を示しており、図中、オルトソマイシン生合成遺伝子座によく見られるタンパク質ファミリーメンバー、すなわち、ＫＡＳＡ（ＥＶＥＡ  ＯＲＦ１７、配列番号８４；ＥＶＥＲ  ＯＲＦ１４、配列番号８３；ＡＶＩＡ  ＯＲＦ１３、配列番号８１；及びＡＶＩＬ  ＯＲＦ１５、Genbankアクセッション番号ＡＡＫ８３１７８）、ＰＫＳＯ（ＥＶＥＡ  ＯＲＦ１６、配列番号１８５；ＥＶＥＲ  ＯＲＦ３２、配列番号１８３；ＡＶＩＡ  ＯＲＦ１４、配列番号１８１；及びＡＶＩＬ  ＯＲＦ１６、Genbankアクセッション番号ＡＡＫ８３１９４）、ＭＴＦＡ（ＥＶＥＡ  ＯＲＦ４４、配列番号９７；ＥＶＥＲ  ＯＲＦ１１、配列番号９５；ＡＶＩＡ  ＯＲＦ３８、配列番号９３）、及びＨＯＭＸ（ＥＶＥＡ  ＯＲＦ２０、配列番号７９；ＥＶＥＲ  ＯＲＦ２０、配列番号７７；ＡＶＩＡ  ＯＲＦ３６、配列番号７５）が、オルトソマイシンオリゴ糖中の糖残基Ｂとのエステル結合に見られる、ジクロロイソエベルニン分子種を形成している。
【図７】２つの代替的生合成経路を図示しており、図中、オルトソマイシン生合成遺伝子座に特徴的なタンパク質ファミリーメンバー、すなわち、ＯＸＲＷ（ＡＶＩＡ  ＯＲＦ２４及び３３（配列番号１５３及び１５９）；ＡＶＩＬGenbankアクセッション番号ＡＡＫ８３１８７；ＥＶＥＲ  ＯＲＦ１８及び２６（配列番号１５５及び１６１）；ＥＶＥＡ  ＯＲＦ１１及び３０（配列番号１５７及び１６３））並びにＯＸＲＶ（ＡＶＩＡ  ＯＲＦ１９（配列番号１６７）；ＥＶＥＡ  ＯＲＦ６（配列番号１７３）；ＡＶＩＬGenbankアクセッション番号ＡＡＫ８３１８１；ＥＶＥＲ  ＯＲＦ３１（配列番号１６９））が、オルトソマイシンオリゴ糖の残基ＣとＤとを結ぶオルトエステル結合を形成している。
【図８】生合成の図式を示しており、図中、ＤＡＴＣ（ＥＶＥＲ  ＯＲＦ４３（配列番号２０９）；ＥＶＥＡ  ＯＲＦ３７（配列番号２１１））；ＭＴＦＶ（ＥＶＥＲ  ＯＲＦ４４（配列番号２２９）；ＥＶＥＡ  ＯＲＦ３８（配列番号２３１））；ＥＰＩＭ（ＥＶＥＲ  ＯＲＦ４５（配列番号２１７）；ＥＶＥＡ  ＯＲＦ３９（配列番号２１９））；ＤＥＰＦ（ＥＶＥＲ  ＯＲＦ４６（配列番号２１３）；ＥＶＥＡ  ＯＲＦ４０（配列番号２１５））；及びＯＸＢＮ（ＥＶＥＲ  ＯＲＦ４２（配列番号２３３）；ＥＶＥＡ３６（配列番号２３５））などのエベルニノマイシン型オルトソマイシン遺伝子クラスター及びエベルニノマイシン型オルトソマイシン産生株に特徴的なタンパク質ファミリーメンバーが、エベルニノマイシン型オルトソマイシンの特徴であるアミノ糖残基及びニトロ糖残基を形成している。
【図９】実施例８に記載のＰＣＲ増幅実験で作製した、臭化エチジウムで染色した１％アガロースゲルを示す図である。
【図１０】Micromonospora carbonacea var. aurantiaca由来のエベルニノマイシン型生合成遺伝子座（ＥＶＥＲ）とMicromonospora carbonacea var. africana由来のエベルニノマイシン型生合成遺伝子座（ＥＶＥＡ）とを比較した概略図であり、タンパク質ファミリーの４文字表記で遺伝子座中のＯＲＦを同定している。
【図１】
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【図２−Ａ】
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【図２−Ｂ】
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【図２−Ｃ】
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【図２−Ｄ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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