(57)【要約】本発明は、インサイチューで天然の有蹄類ＰｒＰＣおよび／または変性した有蹄類ＰｒＰＳｃに高度の結合親和性で特異的に結合するが、インサイチューで天然の有蹄類ＰｒＰＳｃに結合しない抗体を提供する。好ましい抗体は、天然のウシＰｒＰＣおよび処理されたＰｒＰＳｃに結合するが、インサイチューで天然のウシＰｒＰＳｃに結合せず、試料が感染性プリオン（すなわち、病原性ＰｒＰＳｃ）に感染しているかどうかを判定するアッセイ法において使用することができる。
2004509858.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
インサイチューで天然の有蹄類ＰｒＰＣに優先的に結合できる抗体。
【請求項２】
乳牛、シカ、ヒツジ、エルク、ウマ、クーズー、ヤギ、ラクダ、およびブタからなる群より選択される有蹄類の天然ＰｒＰＣに特異的に結合する、請求項１記載の抗体。
【請求項３】
抗体が、変性した有蹄類ＰｒＰＳｃに１０７ ｌ／モル以上の結合親和性Ｋａで結合し、天然の有蹄類ＰｒＰＳｃに対する結合親和性が１０６ ｌ／モル以下のＫａである、請求項１記載の抗体。
【請求項４】
変性した有蹄類ＰｒＰＳｃに１０８ ｌ／モル以上の結合親和性Ｋａで結合し、インサイチューで天然の有蹄類ＰｒＰＳｃには結合しない、請求項３記載の抗体。
【請求項５】
単一の有蹄類種のＰｒＰＣに特異的に結合し、該単一有蹄類種の天然ＰｒＰＳｃにインサイチューで結合しない、請求項１記載の抗体。
【請求項６】
複数の有蹄類種のＰｒＰＣに結合することができ、該複数有蹄類種の天然ＰｒＰＳｃにインサイチューで結合しない、請求項１記載の抗体。
【請求項７】
以下の段階を含む方法によって生産される、天然の有蹄類ＰｒＰＣに特異的に結合する抗体：
ファージ上に抗体ライブラリーを合成する段階；
ファージと、有蹄類ＰｒＰタンパク質を含む組成物を接触させることによって、試料に対してライブラリーをパニングする段階；
天然の有蹄類ＰｒＰＣに結合するファージを単離する段階。
【請求項８】
方法が、単離されたファージを解析してＰｒＰＣが結合するアミノ酸配列をコードする配列を決定する段階をさらに含む、請求項７記載の抗体。
【請求項９】
ファージ上の抗体ライブラリーが以下の段階によって調製される、請求項７記載の抗体：
免疫応答を生じさせるために、宿主哺乳動物をＰｒＰタンパク質で免疫する段階；
抗体産生を担っている細胞を該宿主哺乳動物から抽出する段階；
宿主哺乳動物の該細胞からＲＮＡを単離する段階；
該ＲＮＡを逆転写してｃＤＮＡを生成する段階；
プライマーを用いて該ｃＤＮＡを増幅する段階；
抗体がファージ上で発現するように、該ｃＤＮＡをファージディスプレイベクターに挿入する段階；および
リポソームに分散させた抗原に対する抗体をパニングする段階。
【請求項１０】
リポソームに分散させた抗原が、ＰｒＰＳｃでは入手できないＰｒＰＣエピトープをコードするペプチドである、請求項９記載の抗体。
【請求項１１】
以下の段階を含む、供給源における有蹄類ＰｒＰＳｃを検出する方法：
ＰｒＰＳｃを含むと推測される有蹄類試料を、試料中のＰｒＰＣを除去するために酵素で処理する段階；
試料中の任意のＰｒＰＳｃを変性させるように試料をさらに処理する段階；
ＰｒＰＳｃを含むと推測される試料と、試料中の変性したＰｒＰＳｃに特異的に結合する診断上有効な量の抗体を接触させる段階；および
抗体が試料中の任意の物質に特異的に結合するか否かを判定する段階。
【請求項１２】
有蹄類が乳牛である、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
支持体表面と該支持体表面に結合した抗体とを含むアッセイ法であって、該抗体が１０７ ｌ／モル以上の結合親和性で変性した有蹄類ＰｒＰＳｃに結合できる、アッセイ法。
【請求項１４】
抗体が、流動性を有する液体試料中で、５０％以上の変性した有蹄類ＰｒＰＳｃに結合できる、請求項１３記載のアッセイ法。
【請求項１５】
複数の異なる抗体が支持体表面に結合しており、各抗体が、ＰｒＰＳｃに対して１０７ ｌ／モル以上のＫａを有する、請求項１３記載のアッセイ法。
【請求項１６】
有蹄類におけるプリオンを検出する方法であって、
有蹄類から組織を抽出する段階；
試料を第１の部分と第２の部分とに分割する段階；
第１の部分と、インサイチューで天然の有蹄類ＰｒＰＣに優先的に結合する抗体を接触させて、第１のＰｒＰ濃度を決定する段階；
第２の部分に存在するＰｒＰＳｃを変性させるため第２の部分を処理する段階；および
変性した第２の部分と、インサイチューで天然の有蹄類ＰｒＰＣに優先的に結合する抗体を接触させて、第２のＰｒＰ濃度を決定する段階、を含み、
該試料中のＰｒＰＳｃの存在が第２の濃度から第１の濃度を差し引くことによって検出され、第２のＰｒＰ濃度に及ぼす処理の影響が考慮される、方法。
【請求項１７】
組織が脳組織であり、乳牛から抽出される、請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
以下の段階を含む、有蹄類に由来する試料中のＰｒＰＳｃの存在を判定する方法：
試料の第１の部分と、インサイチューで天然のＰｒＰＣに優先的に結合する抗体を接触させる段階；
抗体に対する任意のＰｒＰＳｃの結合親和性を高めるように試料の第２の部分を処理する段階；
試料の処理された第２の部分と抗体を接触させて、第２の濃度を決定する段階；
第２の濃度を調整して、調整された濃度を得る段階であって、この調整によって、処理の結果として生じた、抗体に対する試料中の任意のＰｒＰＣの増大した親和性が補正される段階；および
第１の濃度と調整された濃度とを比較して、試料中のＰｒＰＳｃの存在を判定する段階。
【請求項１９】
試料が、疾患の症状を示していない動物から得られる、請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
第１の濃度および第２の濃度が、時間分解解離強化蛍光（ｔｉｍｅ−ｒｅｓｏｌｖｅｄ， ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ−ｅｎｈａｎｃｅｄ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）を用いて決定される、請求項１８記載の方法。
【請求項２１】
ＰｒＰＳｃが１×１０３粒子／ｍｌ以下の濃度で試料中に存在する、請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
処理する段階が、試料中の任意のＰｒＰＳｃの少なくとも２％を、抗体に結合する形態に変換するのに十分な、熱、圧力、および化学的変性からなる群より選択される処理に試料を供する段階を含む、請求項１８記載の方法。
【請求項２３】
以下の段階を含む、試料中のＰｒＰＳｃの存在を判定する方法：
試料中の任意のＰｒＰＳｃを、インサイチューで有蹄類ＰｒＰＣに結合する抗体に対する親和性を有する結合構造に変換するように、試料を処理する段階；
処理された試料と抗体を接触させて、濃度を決定する段階；
濃度を調整して、調整された濃度を得る段階であって、この調整によって、処理の結果として生じる抗体に対する試料中のＰｒＰＣの増大した親和性が補正される段階；および
調整された第１の濃度と、対照濃度および予め決められた標準濃度からなる群より選択される既知濃度を比較して、ＰｒＰＳｃの存在を判定する段階。
【請求項２４】
濃度がフローサイトメトリーを用いて決定される、請求項２３記載の方法。
【請求項２５】
調整された濃度が、処理された非感染対照試料から決定された既知濃度と比較される、請求項２３記載の方法。
【請求項２６】
調整された濃度が、非感染集団に由来する処理された試料から予め決定された既知濃度と比較される、請求項２３記載の方法。
【請求項２７】
ＰｒＰＳｃが１×１０３タンパク質分子／ｍｌ以下の濃度で試料中に存在し、ＰｒＰＣが１×１０６タンパク質分子／ｍｌ以上の濃度で試料中に存在する、請求項２３記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明は、抗体、抗体を入手する方法、およびこのような抗体を使用するためのアッセイ法に関する。より具体的には、本発明は、有蹄類ＰｒＰ抗体、有蹄類に由来するＰｒＰの天然に生じる形態に特異的に結合する抗体を入手する方法、および、乳牛などの有蹄類における感染性プリオンの存在を検出するために抗体を使用するアッセイ法に関する。
【０００２】
発明の背景
プリオンは、ヒトおよび動物において中枢神経系海綿状脳症を引き起こす感染性病原体である。プリオンは、細菌、ウイルス、およびウイロイドとは異なる。プリオンタンパク質の感染には核酸成分が必要でなといういことが、現在、最も有力な仮説である。さらに、動物のある種（例えば、ヒト）に感染するプリオンは、別の種（例えば、マウス）に容易に感染しない。
【０００３】
プリオンおよびプリオンが引き起こす疾患の研究における大きな一歩は、プリオンタンパク質（「ＰｒＰ」）と呼ばれるタンパク質の発見および精製であった（ボルトン（Ｂｏｌｔｏｎ）ら（１９８２），Ｓｃｉｅｎｃｅ ２１８：１３０９−１１；プルシナー（Ｐｒｕｓｉｎｅｒ）ら（１９８２），Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２１：６９４２−５０；マッキンレー（ＭｃＫｉｎｌｅｙ）ら（１９８３），Ｃｅｌｌ ３５：５７−６２）。その後、完全なプリオンタンパク質コード遺伝子のクローニング、配列決定、およびトランスジェニック動物における発現がなされた。ＰｒＰＣはシングルコピー宿主遺伝子にコードされ（バスラー（Ｂａｓｌｅｒ）ら（１９８６），Ｃｅｌｌ ４６：４１７−２８）、通常、ニューロンの外表面に見出される。プリオン病は、ＰｒＰＳｃと呼ばれる変形へのＰｒＰＣの変換によって生じることが有力な仮説である。
【０００４】
ＰｒＰＳｃは、動物およびヒトの伝達性神経変性疾患の伝染および発病に必要であるように思われる。プルシナー，Ｓ．Ｂ．（１９９１），Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５２：１５１５−１５２２を参照のこと。最も一般的な動物のプリオン病は、ヒツジおよびヤギのスクレイピーならびにウシのウシ海綿状脳症（ＢＳＥ）である（ウィレスミス（Ｗｉｌｅｓｍｉｔｈ），Ｊ．およびウェルズ（Ｗｅｌｌｓ）（１９９１），Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７２：２１−３８）。４つのヒトプリオン病が特定されている：（１）クールー、（２）クロイツフェルト−ヤコブ病（ＣＪＤ）、（３）ゲルストマン−ストロイスラー−シャインカー病（ＧＳＳ）、および致死性家族性不眠症（ＦＦＩ）（ガジュセック（Ｇａｊｄｕｓｅｋ），Ｄ．Ｃ．，（１９７７）Ｓｃｉｅｎｃｅ １９７：９４３−９６０；メドリ（Ｍｅｄｏｒｉ）ら（１９９２），Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３２６：４４４−４４９）。当初、散発性疾患、遺伝性疾患、および感染性疾患としてのヒトプリオン病の発表が難問を投げかけたが、これは後にＰｒＰの細胞遺伝性起源によって説明された。
【０００５】
ＢＳＥは、特に英国における重大な社会経済学的問題でもある。１７５，０００匹以上のウシ（主に乳牛）が過去数十年にわたりＢＳＥで死んだ。３０ヶ月にわたって殺されたウシに対する英国政府によって実施された試験は、試験された７４９，６３１匹の約０．３％すなわち２２４９匹のウシが、表面的な症状がなくてもＢＳＥにかかっていた可能性があることを示唆している。１９９６年３月２７日、欧州連合（ＥＵ）は、英国産のウシ製品（生きたウシ動物；その精液および胚；英国において解体処理されたウシ動物の肉；動物試料またはヒトの食物連鎖に入る恐れのある、英国において解体処理されたウシ動物から得られた製品；医薬品、化粧品、または薬学的製品に使用する予定になっている材料；ならびに哺乳動物由来の肉および骨粉を含む）の輸出を禁止した。この禁止は、課せられてから英国の農業に１５億ポンドを超える損害を与え、多くの農家を破産させた。禁止は１９９９年８月１日に解かれたが、フランスおよびドイツは依然としてＥＵの決定に反して英国産のウシ製品の輸入を禁止している。
【０００６】
ウシプリオンが変異型クロイツフェルト−ヤコブ病（ｎｖＣＪＤ）を発症した人間に伝染した可能性によって、ＢＳＥを検出する重要性が高まっている（Ｇ．チャゾト（Ｃｈａｚｏｔ）ら（１９９６），Ｌａｎｃｅｔ ３４７：１１８１；Ｒ．Ｇ．ウィル（Ｗｉｌｌ）ら（１９９６），Ｌａｎｃｅｔ ３４７：９２１−９２５）。初期の研究によって、スクレイピー感染性を失うことなくＰｒＰＳｃのＮ末端を切断することができ（Ｓ．Ｂ．プルシナーら（１９８２），Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２１：６９４２−６９５０；Ｓ．Ｂ．プルシナーら（１９８４），Ｃｅｌｌ ３８：１２７−１３４）、相応して、ＰｒＰＳｃのＮ末端が切り取られているものは依然としてＰｒＰＳｃへの変換を可能にすることが明らかになった（Ｍ．ロガース（Ｒｏｇｅｒｓ）ら（１９９３），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：３１８２−３１８６）。ウシからヒトへｎｖＣＪＤが伝染しうることがインビボ試験によって確かめられており、これは、記録に残されている「種の壁」がこの新たな株と関係があるという励ましとなる推測を、米国立科学アカデミー紀要の１２月２０日号が揺るがしていることを示唆している（Ｍ．Ｒ．スコット（Ｓｃｏｔｔ）ら（１９９９），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９６：１５１３７−１５１４２）。
【０００７】
ヒトまたは動物の組織にＰｒＰＳｃが存在することはプリオンに感染したことを示している。ＰｒＰＳｃはプリオン感染の不変成分であり、臨床的に罹患した動物およびヒトの脳におけるイムノアッセイ法によって容易に検出することができる唯一の疾患特異的診断マーカーである（メイヤー（Ｍｅｙｅｒ）ら（１９８６），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８３：３６９３−７；セルバン（Ｓｅｒｂａｎ）ら（１９９０），Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ，４０：１１０−１１７；トラボウロス（Ｔａｒａｂｏｕｌｏｓ）ら（１９９２），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．８９：７６２０−７６２４；グラスホール（Ｇｒａｔｈｗｏｈｌ），Ｋ．Ｕ．Ｄ．，Ｍ．ホリウチ（Ｈｏｒｉｕｃｈｉ）ら（１９９７），Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ６４：２０５−２１６）。残念なことに、ＰｒＰＳｃアッセイ法はプリオン力価が高い時だけしか陽性でなく、その一方で、低濃度のＰｒＰＳｃの検出が問題となっていた。高濃度のＰｒＰＣの存在下で低濃度のＰｒＰＳｃを測定することも難しいことが分かっている。
【０００８】
世界中のウシの集団および英国における罹患したウシの集団に及ぼすＢＳＥの潜在的な影響の巨大さを考えると、ウシの集団を保護するためにＢＳＥに感染した乳牛を評価する方法が大いに必要とされる。ヒトの集団に対する潜在的な健康上のリスクを考えると、ウシプリオンを検出するより感度の高い方法が緊急に必要とされる。
【０００９】
発明の概要
本発明は、高度の親和性および特異性で、天然の有蹄類ＰｒＰＣおよび／または変性した有蹄類ＰｒＰＳｃに特異的に結合する抗体を提供する。この抗体は、天然の有蹄類ＰｒＰＳｃに結合する必要はない。抗体はまた高度に特異的である（すなわち、試料（例えば、ホモジネートされた有蹄類（特に、ウシ）脳組織の天然環境）に存在すると予想される他のタンパク質および／または他の分子に結合しない）。抗体は非常に多くの適用において有用であり、特に、有蹄類におけるプリオン感染の決定に有用である。抗体は、以下の特徴の一つまたは複数を特徴とする：（１）天然のＰｒＰＣおよび変性したＰｒＰＳｃに特異的に結合できること、（２） プリオンタンパク質が処理（例えば、変性）されている場合には、インサイチューで（すなわち細胞培養物中のＰｒＰＳｃにのみ結合する）、またはインビボでＰｒＰＣもしくは変性したＰｒＰＳｃに結合できること。好ましい抗体は、（３）哺乳動物のただ一つの特異的な種のＰｒＰＣタンパク質に結合する（例えば、ウシＰｒＰＣに結合するが他の哺乳動物のＰｒＰＣには結合しない）能力によってさらに特徴付けられる。抗体は、（４）天然のＰｒＰＳｃに結合しないこと、および（５）比較的高度の結合親和性で天然のＰｒＰＣに結合することによりさらに特徴付けられる。
【００１０】
重要な目的は、有蹄類ＰｒＰＣの天然の形態に結合する抗体を提供することがである。
【００１１】
別の目的は、動物のある特異的な種のＰｒＰＣ（例えば、ウシＰｒＰＣ）のエピトープに特異的に結合し、他の動物種のＰｒＰＣ（例えば、マウスＰｒＰＣ）に結合しない抗体を提供することである。
【００１２】
さらに別の目的は、有蹄類の一つまたは複数の種に由来する一つまたは複数のタイプのＰｒＰＣタンパク質に結合できることを特徴とする広範囲の特異的抗体を作成することが可能な特異的な方法を提供することである。
【００１３】
本発明の別の目的は、本発明の抗体を用いて、有蹄類におけるＰｒＰＳｃを検出するためのアッセイ法を提供することである。
【００１４】
本発明の利点は、有蹄類試料におけるＰｒＰＳｃの存在を検出するための、迅速で効率的かつ費用対効果が大きいアッセイ法を提供することである。
【００１５】
特異的な利点は、前記のアッセイ法が、製品（例えば、（天然供給源由来の）医薬品、食品、化粧品、またはこのようなプリオンを含む可能性のある任意の材料）にプリオン（すなわち、ＰｒＰＳｃ）が存在するかどうかのスクリーニングとして使用することができ、それによって、このような製品の安全性に関するさらなる保障が得られることである。
【００１６】
別の利点は、前記の抗体がＰｒＰＳｃを変性する化合物と共に使用することができ、それによって、試料中のＰｒＰＣ濃度とＰｒＰＣ＋ＰｒＰＳｃ濃度を区別する手段が得られることである。
【００１７】
本発明の特徴は、好ましくは、抗体の作成においてファージディスプレイライブラリーを使用することである。
【００１８】
本発明の別の特徴は、ファージが、その表面上に抗体の特異的結合タンパク質を発現するように遺伝子操作されていることである。
【００１９】
本発明の一局面は、有蹄類および特に乳牛におけるプリオン病を予防および治療する治療用抗体を提供することである。
【００２０】
本発明の別の局面は、ある特定の製品がプリオンを含まないと証明する手段を提供することである。
【００２１】
以下にさらに詳細に説明されるキメラ遺伝子、アッセイ法、およびトランスジェニックマウスの詳しい内容を読むことにより、本発明のこれらのおよび他の局面、目的、利点、および特徴は当業者に明らかになると思われる。
【００２２】
好ましい態様の詳細な説明
本発明の抗体、このような抗体を生成および使用するためのアッセイ法および方法が開示および説明される前に、本発明は、特定の抗体、アッセイ法、または方法それ自体に限定されず、もちろん変更してもよいことが理解されるべきである。本明細書で用いられる用語は特定の態様だけを説明する目的で用いられ、本発明の範囲は添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるので、本発明を限定することを意図するものではないことも理解されるべきである。
【００２３】
特に指示のない限り、本明細書で用いられる技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者に一般的に理解されているものと同じ意味を有する。本発明の実施または試験において、本明細書で説明されるものと同様のまたは等価な任意の方法および材料を使用することができるが、好ましい方法および材料について今から説明する。方法および／または材料を開示および説明するために、本明細書に記載の全ての刊行物が参照として本明細書に組み入れられ、方法および／または材料に関連して刊行物が引用されている
【００２４】
定義
「ＰｒＰタンパク質」、「ＰｒＰ」などの用語は本明細書で同義に用いられ、ヒトおよび動物において疾患（海綿状脳症）を引き起こすことが知られている感染粒子形態のＰｒＰＳｃと、適切な条件下でＰｒＰＳｃ感染形態に変換される非感染形態のＰｒＰＣの両方を意味するものとする。
【００２５】
「プリオン」、「プリオンタンパク質」、および「ＰｒＰＳｃタンパク質」などの用語は、ＰｒＰタンパク質の感染性ＰｒＰＳｃ形態を指すために本明細書で同義に用いられ、「タンパク質（ｐｒｏｔｅｉｎ）」と「感染（ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）」という言葉の短縮形であり、この粒子は、限定しないが主として、ＰｒＰ遺伝子によりコードされるＰｒＰＳｃ分子からなる。プリオンは、細菌、ウイルス、およびウイロイドとは異なる。既知のプリオンとして、動物に感染してヒツジおよびヤギの神経系伝達性変性疾患であるスクレイピー、ウシ海綿状脳症（ＢＳＥ）すなわち狂牛病、ならびにシカおよびエルクの慢性消耗病（ＣＷＤ）を引き起こすものが挙げられる。ヒトに罹患することが知られている４つのプリオン病は、（１）クールー、（２）クロイツフェルト−ヤコブ病（ＣＪＤ）、（３）ゲルストマン−ストロイスラー−シャインカー病（ＧＳＳ）、および（４）致死性家族性不眠症（ＦＦＩ）である。本明細書で使用する「プリオン」は、使用される任意の動物、特にヒトおよび家畜において、これらの疾患または他の疾患の全てまたはいずれかを引き起こす全形態のプリオンを含む。
【００２６】
「ＰｒＰ遺伝子」という用語は、副題「病原性変異および多型（Ｐｈａｔｈｏｇｅｎｉｃ Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ａｎｄ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ）」で本明細書に列挙されるものなどの多型および変異を有するタンパク質を含むＰｒＰＣタンパク質を発現する遺伝物質を述べるために本明細書で用いられる。「ＰｒＰ遺伝子」という用語は、一般的に、任意の形態のプリオンタンパク質をコードする任意の種の任意の遺伝子を意味する。一般に知られているいくつかのＰｒＰ配列が、このような配列を開示および説明するために参照として本明細書に組み入れられる、ガブリエル（Ｇａｂｒｉｅｌ）ら（１９９２），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：９０９７−９１０１に記載されている。ＰｒＰ遺伝子は、本明細書で述べられる「宿主」および「試験」動物を含む任意の動物ならびにその任意および全ての多型および変異に由来してよく、この用語は、まだ発見されていない他のＰｒＰ遺伝子を含むことが理解される。このような遺伝子により発現されるタンパク質は、ＰｒＰＣ（非疾患）形態またはＰｒＰＳｃ（疾患）形態のいずれをもとることができる。
【００２７】
「標準化プリオン調製物」、「プリオン調製物」、「調製物」などの用語は、プリオン（ＰｒＰＳｃ）を含む組成物を述べるために本明細書で同義に用いられる。この組成物は、プリオンに関連する実質的に同じ遺伝物質を含む哺乳動物の脳組織（例えば、プリオン病の徴候を示す一組の哺乳動物からの脳組織）から得られる。この哺乳動物は、（１）本明細書に記載のトランスジーンを含むか、（２）切除された内因性プリオンタンパク質遺伝子を有するか、（３）遺伝的に異なる種に由来する高コピー数のプリオンタンパク質遺伝子を有するか、または（４）切除された内因性プリオンタンパク質遺伝子と、遺伝的に異なる種に由来するプリオンタンパク質遺伝子とのハイブリッドである。標準化プリオン調製物が得られる哺乳動物は、プリオン接種の結果として、および／または遺伝子組換えされた構造（例えば、高コピー数のプリオンタンパク質遺伝子）による疾患を発症したために、ＣＮＳ機能障害の臨床徴候を示す。
【００２８】
「人工ＰｒＰ遺伝子」という用語は、用語「キメラＰｒＰ遺伝子」、ならびに宿主動物（例えば、マウス）ゲノムに組み込まれた時に、遺伝的に異なる試験哺乳動物（例えば、ヒト、ウシ、またはヒツジ）にしか天然では感染しないプリオンに哺乳動物を感染しやすくする他の組換えによって構築された遺伝子を含むために本明細書で用いられる。一般的に、人工遺伝子は、天然配列の一つまたは複数の（全てとは限らないが、一般的に４０未満の）コドンが遺伝的に変化し、異なるコドン（好ましくは、遺伝的に異なる哺乳動物（例えば、乳牛）の対応するコドン）で置換されている哺乳動物ＰｒＰ遺伝子のコドン配列を含む。遺伝的に変化した哺乳動物は、試料を、遺伝的に異なる哺乳動物にしか感染しないプリオンについてアッセイするのに使用することができる。人工遺伝子の例は、同じ関連位置で、マウスコドンが、乳牛、ヒツジなどに由来する一つまたは複数の異なる置換コドンで置換されているマウスＰｒＰ遺伝子である（但し、全てのマウスコドンが、異なるヒト、乳牛、またはヒツジのコドンで置換されているとは限らない）。人工ＰｒＰ遺伝子は遺伝的に異なる動物のコドンを含むだけでなく、どの天然のＰｒＰ遺伝子とも関連しないが、動物に挿入された時に、動物を、通常、遺伝的に異なる動物にしか感染しないプリオンに感染しやすくする、コドンおよびコドン配列を含んでもよい。
【００２９】
「キメラ遺伝子」、「キメラＰｒＰ遺伝子」、「キメラプリオンタンパク質遺伝子」などの用語は、宿主動物（例えば、マウス）のコドン（このコドンの一つまたは複数が遺伝的に異なる試験動物（例えば、乳牛またはヒツジ）に由来する対応するコドンで置換されている）を含む人工的に構築された遺伝子を表すために本明細書で同義に用いられる。１つの特定の例において、キメラ遺伝子は、ある宿主哺乳動物種（例えば、マウス）のＰｒＰ遺伝子の開始配列および終結配列（すなわち、Ｎ末端コドンおよびＣ末端コドン）からなり、第２の種の試験哺乳動物（例えば、乳牛）のＰｒＰ遺伝子の対応する部分のヌクレオチド配列も含む。キメラ遺伝子は、宿主哺乳動物種のゲノムに挿入された時に、その哺乳動物を、通常、第２の種の哺乳動物にしか感染しないプリオンに感染しやすくする。本明細書で開示される好ましいキメラ遺伝子は、マウスＰｒＰ遺伝子の開始配列および終結配列ならびに対応するウシ配列で置換された非末端配列領域を含むＭＢｏ２Ｍである。ウシ配列は、発現されるタンパク質が９つの残基で異なる点でマウスＰｒＰ遺伝子とは異なる（図２を参照のこと）。ＭＢｏ２Ｍ ＰｒＰは、同様のキメラＰｒＰトランスジーンについて以前に述べられたように構築され（スコット（Ｓｃｏｔｔ），Ｍ．，Ｄ．グロス（Ｇｒｏｔｈ）ら（１９９３），Ｃｅｌｌ ７３：９７９−９８８）、ＭｏＰｒＰに８個のウシ置換：９７、１０９、１３８、１４３、１４５、１５５、１８４、および１８６がなされた（位置番号はＨｕＰｒＰ配列に対応する）。
【００３０】
「プリオン関連遺伝物質」という用語は、動物がプリオン感染性になる能力をもたらす任意の遺伝物質をカバーすることが意図される。従って、この用語は、本明細書で定義される任意の「ＰｒＰ遺伝子」、「人工ＰｒＰ遺伝子」、「キメラＰｒＰ遺伝子」または「切除されたＰｒＰ遺伝子」、ならびに動物がプリオン感染性になる能力をもたらす、これらの遺伝子が改変されたものを含む。標準化プリオン調製物は複数の動物を用いて生成され、これらの動物は全て、動物の全てが同じタイプのプリオンに感染し、ほぼ同時に感染の兆候を示すように、実質的に同じプリオン関連遺伝物質を有する。
【００３１】
「宿主動物」および「宿主哺乳動物」という用語は、天然には動物に存在しない遺伝物質を含むように遺伝的および人工的に操作されたゲノムを有する動物を述べるために用いられる。例えば、宿主動物として、ＰｒＰ遺伝子が切除された（すなわち、機能しなくなった）マウス、ハムスター、およびラットが挙げられる。抗体を産生するために宿主にプリオンタンパク質が接種され、抗体を産生する細胞は、ファージライブラリーを作成するための遺伝物質供給源になり得る。他の宿主動物は天然の（ＰｒＰ）遺伝子を有してもよく、人工遺伝子の挿入または遺伝的に異なる試験動物の天然のＰｒＰ遺伝子の挿入によって変えられた遺伝子を有してもよい。
【００３２】
「試験動物」および「試験哺乳動物」という用語は、宿主動物のＰｒＰ遺伝子と試験動物のＰｒＰ遺伝子とが異なる点で宿主動物とは遺伝的に異なる動物を述べるために用いられる。試験動物は、ある特定の試料が、試験動物に感染する能力を有するプリオンを含むかどうかを確かめるためにアッセイ法試験の実施が望まれる任意の動物でよい。例えば、試験動物は、様々な有蹄類プリオンに感染する任意の有蹄類でも哺乳動物（ヒト、乳牛、ヒツジ、ブタ、ウマ、ネコ、イヌ、またはニワトリを含む）でもよく、ある特定の試料が、通常、試験動物にしか感染しないプリオンを含むかどうかの確認が望まれる。
【００３３】
「遺伝的に異なる動物」および「遺伝的に異なる哺乳動物」という用語は、１７個以上のコドン、好ましくは２０個以上のコドン、最も好ましくは２８〜４０個のコドンで、遺伝的に異なる試験動物と異なる宿主動物の天然のＰｒＰコドン配列を含む動物を述べるために本明細書で用いられる。従って、マウスＰｒＰ遺伝子は、乳牛またはヒツジのＰｒＰ遺伝子に関して遺伝的に異なるが、ハムスターのＰｒＰ遺伝子に関して遺伝的に異ならない。
【００３４】
「切除されたＰｒＰタンパク質遺伝子」、「破壊されたＰｒＰ遺伝子」などの用語は、遺伝子が機能しなくなるように変化した（例えば、ヌクレオチドが付加および／または除去された）内因性ＰｒＰ遺伝子を表すために本明細書で同義に用いられる。非機能ＰｒＰ遺伝子の例およびこのような遺伝子を作成する方法は、ブエラー（Ｂｕｅｌｅｒ），Ｈ．，ら（１９９２），Ｎａｔｕｒｅ ３５６，５７７−５８２およびワイズマン（Ｗｅｉｓｓｍａｎ）（国際公開公報第９３／１０２２７号）に開示される。遺伝子を切除する方法はチャペチ（Ｃａｐｅｃｃｈｉ）（１９８７），Ｃｅｌｌ ５１：５０３−５１２に開示される。これらの全てが参照として本明細書に組み入れられる。好ましくは、遺伝子の両対立遺伝子が破壊される。
【００３５】
「ハイブリッド動物」、「トランスジェニックハイブリッド動物」などの用語は、切除された内因性プリオンタンパク質遺伝子を有する第１の動物と、（１）キメラ遺伝子もしくは人工ＰｒＰ遺伝子または（２）遺伝的に異なる動物のＰｒＰ遺伝子のいずれかを含む第２の動物を交雑することによって得られた動物を表すために本明細書で同義に用いられる。例えば、ハイブリッドマウスは、切除されたマウス遺伝子を有するマウスと、（１）ウシもしくは他の有蹄類ＰｒＰ遺伝子（高コピー数で存在してもよい）または（２）キメラマウス／有蹄類ＰｒＰ遺伝子を含むマウスを交雑することによって得られる。用語「ハイブリッド」は、ハイブリッドの任意の子孫（結果として生じる子孫が、通常、遺伝的に異なる種にしか感染しないプリオンに感染しやすくなれば、２匹のハイブリッドの同系交配子孫を含む）を含む。ハイブリッド動物にプリオンを接種し、この動物を、本発明のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを作成するための細胞供給源にすることができる。
【００３６】
「感染しやすい」および「プリオンに感染しやすい」などの用語は、通常、遺伝的に異なる試験動物にしか感染しないプリオンを接種した場合に、疾患を発症するトランスジェニックまたはハイブリッド試験動物を述べるために本明細書で同義に用いられる。この用語は、キメラＰｒＰ遺伝子がなければウシプリオンに感染しないが、キメラ遺伝子があるとウシプリオンに感染しやすいトランスジェニックまたはハイブリッド動物（例えば、トランスジェニックマウスＴｇ（ＭＢｏ２Ｍ））を述べるために用いられる。
【００３７】
本明細書で使用する「有蹄類」という用語は、ひづめのある任意の哺乳動物を意味する。有蹄類として、乳牛、シカ、エルク、ヒツジ、およびヤギが挙げられるが、これに限定されない。本発明に好ましい有蹄類は乳牛である。
【００３８】
「抗体」とは、抗原に結合することができる免疫グロブリンタンパク質を意味する。本明細書で使用する抗体は、抗体全体ならびに関心対象のエピトープ、抗原、または抗原断片に結合することができる任意の抗体断片（例えば、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｖ）を含むことが意図される。
【００３９】
本発明の抗体は、有蹄類ＰｒＰＣタンパク質に対して免疫反応性または免疫特異的であり、従って、有蹄類ＰｒＰＣタンパク質に特異的かつ選択的に結合する。天然または天然のＰｒＰＣに対して免疫反応性または免疫特異的な抗体が好ましい。ＰｒＰＣに対する抗体は、好ましくは免疫特異的である（すなわち、関連物質と実質的に交差反応しない）。用語「抗体」は全てのタイプの抗体（例えば、モノクローナル）を含むが、本発明の抗体は、好ましくは、本明細書に記載のファージディスプレイ法を用いて生成される。
【００４０】
「精製された抗体」は、天然で結合している他のタンパク質、炭水化物、および脂質を十分に含まない抗体を意味する。このような抗体は、天然のＰｒＰＣタンパク質、変性したＰｒＰＳｃ、またはそれぞれの抗原断片に「優先的に結合」する（すなわち、他の抗原的に関連しない分子（天然のＰｒＰＳｃを含む）を実質的に認識せず、結合しない）。本発明の精製された抗体は、好ましくは、特定の種のＰｒＰＣタンパク質に対して免疫反応性かつ免疫特異的であり、より好ましくは、天然のウシＰｒＰに対して免疫特異的である。
【００４１】
ＰｒＰタンパク質の「抗原断片」は、本発明の抗体に結合することができる、このようなタンパク質の一部を意味する。
【００４２】
「特異的に結合する」は、ＰｒＰタンパク質の特定のポリペプチド（すなわち、エピトープ）に対する抗体の高アビディティおよび／または高親和性結合を意味する。好ましくは、この特定のポリペプチド上のエピトープへの抗体の結合は、他の任意のエピトープ（特に、関心対象の特定のポリペプチドと同じ試料に結合する分子または同じ試料中の分子に存在し得るエピトープ）への同じ抗体の結合より強い（例えば、他のタンパク質（乳牛の天然のＰｒＰＳｃ、または哺乳動物（例えば、ヒト、イヌ、ネコなど）に由来するＰｒＰＳｃもしくはＰｒＰＣを含む）より強く有蹄類ＰｒＰＣに結合する）。関心対象のポリペプチドに特異的に結合する抗体は、弱いが検出可能なレベル（例えば、関心対象のポリペプチドに対して示される結合の１０％以下）で他のポリペプチドに結合できてもよい。このような弱い結合またはバックグラウンド結合は、例えば、適切な対照を使用することによって、関心対象の化合物またはポリペプチドに対する特異的抗体結合と容易に区別することができる。一般的に、１０７モル／ｌ以上、好ましくは、１０８モル／リットル以上の結合親和性で有蹄類ＰｒＰＣに結合する本発明の抗体が、ＰｒＰＣに特異的に結合すると言われる。一般的に、１０６モル／リットル以下の結合親和性を有する抗体は、現在用いられている従来法を用いて、検出可能なレベルで抗原に結合しないので有用でない。本発明の好ましい抗体は、天然のウシＰｒＰＳｃと比較して、ウシＰｒＰＣに対して４倍以上、好ましくは１０倍以上の結合親和性を有する。より好ましくは、本発明の抗体は、天然のウシＰｒＰＳｃと比較して、ウシＰｒＰＣに対して１００倍以上または１，０００倍以上の結合親和性を有する。
【００４３】
「検出可能に標識された抗体」、「検出可能に標識された抗ＰｒＰ」、または「検出可能に標識された抗ＰｒＰ断片」は、取り付けられた検出可能な標識を有する抗体（または結合特異性を保持している抗体断片）を意味する。検出可能な標識は、通常、化学結合によって取り付けられるが、標識がポリペプチドの場合、もう一つの選択肢として遺伝子工学的技法によって取り付けることができる。検出可能に標識されたタンパク質を作成する方法は当技術分野において周知である。検出可能な標識は、当技術分野において周知の様々な標識から選択することができるが、通常、放射性同位体、蛍光体、常磁性標識、酵素（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ）、または検出可能なシグナル（例えば、放射能、蛍光、色）を発するか、もしくは標識を基質に暴露した後に検出可能なシグナルを発する他の部分もしくは化合物である。様々な検出可能な標識／基質対（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ／ジアミノベンジジン、アビジン／ストレプトアビジン、ルシフェラーゼ／ルシフェリン））、抗体を標識する方法、および標識抗体を使用する方法が当技術分野において周知である（例えば、ハーロー（Ｈａｒｌｏｗ）およびレーン（Ｌａｎｅ）編（抗体：実験マニュアル（Ａｎｔｉｂｏｄｙ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）（１９８８）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ）を参照のこと）。
【００４４】
「治療」、「治療する」などの用語は、一般的に、望ましい薬理学的効果および／または生理学的効果を得ることを表すために本明細書で用いられる。効果は、疾患もしくはその症状の完全もしくは部分的な予防の点から見た予防的効果でもよく、ならびに／または疾患および／もしくは疾患に起因する副作用の部分的もしくは完全な治癒の点から見た治療的効果でもよい。本明細書で使用する「治療」は、哺乳動物（特に、有蹄類）における疾患の任意の治療をカバーし、
（ａ）疾患にかかる素因があるが、疾患にかかっているとまだ診断されていない被験者において疾患が起こらないようにすること；
（ｂ）疾患を抑止する、すなわち、疾患の発症をくいとめること；または
（ｃ）疾患を緩和する、すなわち、疾患を後退させること、を含む。
【００４５】
本明細書で用いられる略語として以下が挙げられる。
ＣＮＳ：中枢神経系；
ＢＳＥ：ウシ海綿状脳症；
ＣＷＤ：シカまたはエルクの慢性消耗病；
ＣＪＤ：クロイツフェルト−ヤコブ病；
ＦＦＩ：致死性家族性不眠症；
ＧＳＳ：ゲルストマン−ストロイスラー−シャインカー病；
Ｈｕ：ヒト；
ＨｕＰｒＰ：ヒトプリオンタンパク質；
Ｍｏ：マウス；
ＭｏＰｒＰ：マウスプリオンタンパク質；
ＳＨａ：シリアンハムスター；
ＳＨａＰｒＰ：シリアンハムスタープリオンタンパク質；
Ｂｏｖ：乳牛；
ＢｏｖＰｒＰ：乳牛プリオンタンパク質；
Ｔｇ：トランスジェニック；
Ｔｇ（ＳＨａＰｒＰ）：シリアンハムスターのＰｒＰ遺伝子を含むトランスジェニックマウス；
Ｔｇ（ＨｕＰｒＰ）：完全なヒトＰｒＰ遺伝子を含むトランスジェニックマウス；
Ｔｇ（ＳｈｅＰｒＰ）：完全なヒツジＰｒＰ遺伝子を含むトランスジェニックマウス；
Ｔｇ（ＢｏｖＰｒＰ）：完全な乳牛ＰｒＰ遺伝子を含むトランスジェニックマウス；
ＰｒＰＳｃ：プリオンタンパク質のスクレイピーアイソフォーム；
ＰｒＰＣ：プリオンタンパク質の細胞に含まれる一般的な正常アイソフォーム；
ＭｏＰｒＰＳｃ：マウスプリオンタンパク質のスクレイピーアイソフォーム；
ＭＨｕ２Ｍ：マウスＰｒＰ遺伝子の領域が、９個のコドンでマウスＰｒＰと異なる対応するヒト配列で置換されている、キメラマウス／ヒトＰｒＰ遺伝子；
Ｔｇ（ＭＨｕ２Ｍ）マウスは、キメラＭＨｕ２Ｍ遺伝子を含む本発明のトランスジェニックマウスである；
ＭＢｏ２Ｍ：マウスＰｒＰ遺伝子の領域が、９個のコドンでマウスＰｒＰと異なる対応するウシ配列で置換されている、キメラマウス／ヒトＰｒＰ遺伝子；
Ｔｇ（ＭＢｏ２Ｍ）マウスは、キメラＭＢｏ２Ｍ遺伝子を含む本発明のトランスジェニックマウスである；
ＭＢｏ２Ｍ ＰｒＰＣ：キメラウシ／マウスＰｒＰ遺伝子のスクレイピーアイソフォーム；
ＰｒＰＣＪＤ：ＰｒＰ遺伝子のＣＪＤアイソフォーム；
Ｐｒｎｐ０／０：内因性プリオンタンパク質遺伝子（例えば、ＭｏＰｒＰ遺伝子）の両対立遺伝子が切除されているもの；
Ｔｇ（ＳＨａＰｒＰ＋／０）８１／Ｐｒｎｐ０／０：ＳＨａＰｒＰを発現する特定のトランスジェニックマウス系統（８１）、＋／０はヘテロ接合体を示す；
Ｔｇ（ＢｏｖＰｒＰ）／Ｐｒｎｐ０／０：ウシプリオンタンパク質遺伝子（ＢｏｖＰｒＰ）を有するマウスと、内因性プリオンタンパク質遺伝子の両対立遺伝子が破壊されたマウスを交雑させることによって得られたハイブリッドマウス；
Ｔｇ（ＭＢｏ２Ｍ）／Ｐｒｎｐ０／０：キメラプリオンタンパク質遺伝子（ＭＨｕ２Ｍ）を有するマウスと、内因性プリオンタンパク質遺伝子の両対立遺伝子が破壊されたマウスを交雑させることによって得られたハイブリッドマウス；
ＦＶＢ：ＦＶＢマウスの卵は比較的大きく、外因性ＤＮＡのマイクロインジェクションを比較的よく受け入れるために、トランスジェニックマウスの作成によく用いられる標準的な近交系マウス。
【００４６】
本発明の一般的な局面
本発明は、有蹄類（例えば、乳牛、ヒツジ、またはシカ）ＰｒＰＣまたは変性した有蹄類ＰｒＰＳｃに特異的に結合する抗体を提供する。この抗体はまた、天然の有蹄類ＰｒＰＳｃに結合しないことを特徴とし得る。さらに詳細に述べると、本発明の方法は、プリオンタンパク質（特に、有蹄類（例えば、乳牛、ヒツジ、およびシカ）に由来するプリオンタンパク質）の異常配座異性体において入手できないエピトープを認識することができる抗体の開発をもたらす。本発明の抗体および検出法は、プリオンタンパク質の異常アイソフォームの感染状態と非感染状態を、ならびにプリオンタンパク質の異常アイソフォームと正常アイソフォームを定量的に区別することができる。好ましくは、抗体は、単一の種に対して１０７モル／リットル以上、好ましくは１０８モル／リットル以上の親和性で、単一の種のインサイチューで変性した有蹄類ＰｒＰＳｃタンパク質に結合する。本発明の抗体は、複数種（例えば、複数種の有蹄類）に対して親和性を有してもよく、単一の種（例えば、乳牛）に特異的でもよい。抗体は、ＰｒＰＳｃの天然の形態では入手できないＰｒＰＣまたは変性したＰｒＰＣのエピトープを、恐らく、ＰｒＰＣとＰｒＰＳｃとの構造の違いによって認識する。有蹄類ＰｒＰタンパク質遺伝子の異なる変異および／または多型によってコードされる全てのタンパク質に結合できる抗体を、本発明のプロトコールを用いて単離することができる。または、一組の抗体（２つ以上の異なる抗体）を提供することができ、この組の各抗体は、有蹄類ＰｒＰ遺伝子の異なる変異または多型によってコードされるタンパク質に特異的に結合する。従って、抗体を支持体表面に結合させ、有蹄類ＰｒＰＣの特定の対立遺伝子が存在するかどうかインビトロで試料をアッセイするのに使用することができる。
【００４７】
本発明の抗体は、部分的に、ファージディスプレイライブラリーを用いた単離によって特徴付けられる。抗体（特に、抗体のＦａｂ部分）発現用のファージディスプレイライブラリーの構築は当技術分野において周知である。好ましくは、抗体を発現するファージディスプレイ抗体ライブラリーは、１９９３年６月２９日に発行された米国特許第５，２２３，４０９号および１９９８年１２月８日に発行された米国特許第５，８４６，５３３号（両方とも参照として本明細書に組み入れられる）に記載の方法に従って調製される。一般的な方法の手順を、本発明の開示を用いて、本発明の抗体を産生するように合わせることができる。
【００４８】
本発明は、ＢｏＰｒＰＳｃの隠れたエピトープ（特に、エピトープＩと呼ばれる残基９０−１２０）に対応する短い合成ペプチドに対して、開発された抗体をパニングおよびスクリーニングする方法を含む。
【００４９】
本発明の抗体は、インビトロ方法を用いてプリオンを検出するのに特に有用である。この方法において、ヒトまたは動物の組織にＰｒＰＳｃが存在することはプリオンに感染したことを示している。構造依存性イムノアッセイ法（ＣＤＩ）は、本発明の抗体を使用して有蹄類ＰｒＰＳｃを検出するための、迅速かつ特異的かつ非常に感度の高い方法を提供する。このアッセイ法は、名前が示すように構造感受性であり、ＰｒＰＣが１００倍過剰に存在する脳ホモジネートにおいて比較的低い濃度のＰｒＰＳｃを検出することができる。本発明の前に、乳牛の様々な組織においてＢＳＥプリオンを早期検出するためのＣＤＩの迅速な利用は、変性したウシＰｒＰの残基９０−１２０（エピトープＩ）と反応する高親和性抗体が無かったために複雑であった。本発明の前に作成されたモノクローナル抗体または組換え抗体は全てウシＰｒＰに対して低い親和性を有するか、エピトープＩから離れたエピトープを認識する。このエピトープはウシＰｒＰの確実な検出に重要なだけでなく、ＣＤＩの構造感度にも重要である。ＣＤＩの構造感度は、アッセイ法の特異性およびＰｒＰＳｃとＰｒＰＣを区別する能力に重要である。本発明の方法は、特に、構造依存性イムノアッセイ法（ＣＤＩ）（例えば、野生型および新規（ｄｅ ｎｏｖｏ）ウシ、ヒツジ、およびシカプリオンに対するアッセイ法）において使用することができる高親和性の抗ＰｒＰＣ有蹄類抗体の合理的な開発および特異的な選択をもたらす。
【００５０】
ＣＤＩアッセイ法は、１９９９年４月６日に発行された米国特許第５，８９１，６４１号に記載されている。２００１年４月１０日に発行された米国特許第６，２１４，５６５号および１９９９年８月２８日に公開された国際公開公報第９９／４２８２９号も参照のこと。これらの全てがその全体が参照として本明細書に組み入れられる。ＣＤＩアッセイ法の基本的な段階を図１の流れ図に示す。試料１（好ましくは、ウシ脳試料）を２つの部分３および４に分割する２。第１の部分３と、本発明の抗体（好ましくは、検出可能な標識に取り付けられた抗体）を接触させる５。次いで、ウシＰｒＰＣに対する結合レベル６を決定する。次いで、抗体が結合するエピトープを暴露するように、試料の第２の部分４を処理する（すなわち、試料中のタンパク質を変性する）７。この処理によってＰｒＰＳｃ上にエピトープが暴露し、処理されたＰｒＰＳｃに抗体８が結合できるようになる。従って、試料中にＰｒＰＳｃが存在すれば、処理されていない第１の部分に対する結合レベルと比較して、処理された第２の部分に対する結合レベル９は大きい。処理によってＰｒＰＣに対する結合レベルが増加することがある。従って、第２の部分にＰｒＰＳｃが存在しない時でさえ、いくらかの増加が予想される。このために、処理された第２の部分４に対する結合レベルを基準量の分だけ下方修正することが必要になる。下方修正した後、このレベルと第１の部分３で得られたレベル６を比較し１０、ＰｒＰＳｃが試料１に存在するかどうかについて判断を下す。
【００５１】
定量計算
前記の方法を使用して、処理されていない試料から得られたシグナル量と処理された試料を用いて得られたシグナル量との差を計算することが可能である。この差は、（非疾患構造に及ぼす処理の影響に合わせて調整した後に）元々の試料に存在する疾患構造のタンパク質の量に相当する。差が得られた後に、以下に示した式を用いて、体積単位当たりの、元々の試料に存在する疾患構造のタンパク質の量を計算することができる。
ａ）Ｆｎ＝Ｆｎα＋Ｆｎβ→Ｆｎα＝Ｆｎ−Ｆｎβ，Ｆｎβ〜バックグラウンド
ｂ）Ｆｄ＝Ｆｄα＋Ｆｄβ
ΔＦｎ→ｄ＝ΔＦαｎｖｄ＋ΔＦβｎ→ｄ
ΔＦβｎ→ｄ＝Ｆｄ−Ｆｎ−ΔＦαｎ→ｄ
［ＰｒＰβ］または［ＤＲＣ］〜ΔＦβｎ→ｄ＝Ｆｄ−（Ｆｎ＊ｆαｎ→ｄ）
【００５２】
前記の各変数の定義を以下に示す。
Ｆ−　蛍光シグナル（任意の検出可能なシグナルを使用できることに留意のこと）；
Ｆｎ−　天然の構造の蛍光シグナル；
ＦｎαおよびＦｎβ−　それぞれ、天然のαヘリックス構造およびβシート構造の蛍光シグナル；
Ｆｄ−　処理された、すなわち変性した状態のＰｒＰの蛍光シグナル；
ＦｄαおよびＦｄβ−　変性したαヘリックス状態またはβシート状態のＰｒＰのシグナル；
ΔＦｎ→ｄ−　天然の状態から変性した状態に移行した際の蛍光シグナルの増加；
ΔＦαｎ→ｄ−　天然の状態から変性した状態に移行した際のαヘリックス構造の蛍光シグナルの増加；
ΔＦβｎ→ｄ−　天然の状態から変性した状態に移行した際のβシート構造のシグナルの増加；
ｆαｎ→ｄ−　αヘリックスＰｒＰが天然の状態から変性した状態に移行するための相関係数；
［ＰｒＰβ］−　βシート構造のプリオンタンパク質の濃度；
［ＤＲＣ］−　疾患関連構造の任意のタンパク質の濃度。
【００５３】
前記の式は、特に、βシート構造のプリオンタンパク質の濃度を計算するのに用いられる。しかしながら、任意のタンパク質の濃度（すなわち、任意の疾患構造のタンパク質（例えば、［βＡ４β］）の濃度）を計算するのに同じ式を使用することができる。さらに詳細に述べると、［ＤＲＣ］は、疾患関連構造のタンパク質の濃度を示す。
【００５４】
具体的な例を示すために、特に、ＰｒＰタンパク質（このタンパク質は、αヘリックス立体配置を含む少なくとも１つの非疾患構造（ＰｒＰＣ）とβシート立体配置を含む少なくとも１つの疾患関連構造（ＰｒＰＳｃ）を含む）に関して、前記の定義がなされた。この式は、試料に存在する疾患関連構造のタンパク質の濃度を計算するのに用いられる。前記で示された特定の式および定義によれば、この式は、βシート立体配置を含むプリオンタンパク質の濃度を計算するのに用いられる（実施例８を参照のこと）。
【００５５】
前記の式の計算において用いられるシグナルは蛍光シグナルである。しかしながら、任意の検出可能なシグナルを使用することができる。全シグナルは、疾患関連構造および非疾患関連構造から受け取ったシグナルの組み合わせであるＦｎによって表される。これは、前記のアッセイ法に従って処理されていない部分番号１から計算されたシグナルである。変数Ｆｄは、試料の部分番号２を処理することによって得られたシグナルである。このシグナルは、処理された非疾患構造のタンパク質と処理された疾患構造のタンパク質から受け取ったシグナルの組み合わせである。
【００５６】
疾患関連構造のタンパク質を含まない試料を処理することによって得られるシグナルに差があることが認められている。正確な測定値を得るために、この差を計上すべきである。天然の試料と処理された試料との得られたシグナルの差は、もちろん、疾患関連構造および非疾患構造を処理することによって得られたシグナルの差の組み合わせである。疾患構造を処理することによって得られたシグナルの増加（すなわち、処理されていない疾患構造のシグナルと処理された疾患構造から受け取ったシグナルの差）は、処理されていない非疾患構造および処理された非疾患構造から得られたシグナルの増加の計算から受け取ったシグナルから、全試料を処理することから受け取ったシグナルを差し引くことによって計算することができる。これらの式を用いて、元々の試料に存在する疾患構造のタンパク質の濃度を得る最終的な式を作成することが可能である（実施例８を参照のこと）。
【００５７】
作成された抗体断片
本発明の方法を用いて、ＣＤＩフォーマットのＥＬＩＳＡにおいて、変性したＢｏＰｒＰＳｃにきつく結合するが、天然の構造の同じタンパク質には結合しない３つの組換え抗体断片（Ｆａｂ）が単離された。３つ全てのＦａｂが、ウシプリオンタンパク質の９６−１０５領域に対して作成された。クローン「Ｏ」および「Ｓ」はウシＰｒＰのみを認識したのに対して、「Ｐ」は、ＳＨａ、Ｍｏ、Ｏｖ、およびＨｕ、ならびにウシＰｒＰＳｃに結合した。「Ｏ」および「Ｐ」組換え抗体断片（Ｆａｂ）はマウスｃＤＮＡから単離され、大腸菌においてヒト−マウス（ＨｕＭ）キメラＦａｂを発現するベクターにクローニングされた。次いで、精製されたＦａｂはユーロピウムで標識され、ウシ、ヒツジ、およびシカＰｒＰＳｃを測定するために構造依存性イムノアッセイ法（ＣＤＩ）で用いられた。感染単位に関してＣＤＩの感度を校正するために、ウシＰｒＰＳｃを発現するトランスジェニックマウスが将来、用いられるだろう。
【００５８】
抗体および結果として生じるアッセイ法の選択は、試料中で直接、またはプリオン含有試料が接種された動物の脳において間接的に行うことができる。
【００５９】
任意の所与の抗原から抗体を産生するために既知の手段があるが、ある特定のタンパク質（例えば、ＰｒＰＣ）に結合する抗体を産生することが特に難しいことは経験から分かっている。ＰｒＰＣに対する抗体（およびＰｒＰＳｃに対する抗体）を得ることが難しいことは、部分的に、その構造上の特性に関連している。本明細書に記載の手順に従うことで、有蹄類ＰｒＰＣに結合する抗体が得られた。他の人は、抗体を作成するのが難しいＰｒＰＣおよび他のタンパク質（例えば、他種のＰｒＰＣタンパク質）に対する他の抗体を得るために本明細書に記載の手順をまねすることができる。
【００６０】
本発明の抗体を産生するために、宿主哺乳動物に、望ましい有蹄類ＰｒＰＣからの接種物を接種することから始めることが好ましい。宿主哺乳動物は任意の哺乳動物でよく、好ましくは、本明細書で定義されたタイプの宿主哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、またはハムスター）であり、最も好ましくは、マウスである。宿主動物には、有蹄類の種に内因性のプリオンタンパク質が接種される。例えば、マウスにウシＰｒＰＣペプチドが接種される。このように正常な宿主哺乳動物を用いて、抗体の発生を誘発することが可能である。しかしながら、宿主動物はプリオンタンパク質遺伝子を含んでおり、遺伝的に異なる種のＰｒＰＣが接種されるので、抗体は、あったとしても、宿主動物のプリオンタンパク質のエピトープと遺伝的に異なる種に由来するＰｒＰＣのエピトープとで異なるエピトープに対してしか作成されない。これは、作成され得る抗体の量を実質的に制限し、有蹄類ＰｒＰＣに選択的に結合する抗体を発見する能力を低下させる。従って、異なる種のプリオンタンパク質を区別する抗体を作成する試みでは、インタクトな内因性ＰｒＰ遺伝子を有する哺乳動物を用いて抗体産生プロセスを開始することが好ましい。
【００６１】
抗体はまた、切除されたプリオンタンパク質遺伝子、すなわち、ヌルＰｒＰ遺伝子（Ｐｒｎｐ０／０と略す）を有する動物において作成することができる。これは、宿主動物ＰｒＰ遺伝子と有蹄類ＰｒＰ遺伝子の間で保存されている有蹄類ＰｒＰＣ領域に対して抗体を作成するのを可能にする。従って、本発明はまた、このような「ヌル」哺乳動物の使用に関して説明され、さらに詳細に述べると「ヌルマウス」に関して説明される。
【００６２】
ヌルマウスは、あるＤＮＡセグメントを正常マウスＰｒＰ遺伝子に挿入および／またはＰｒＰ遺伝子の一部を除去して破壊されたＰｒＰ遺伝子を生じさせることによって作成することができる。破壊された遺伝子はマウス胚に注入され、相同組換えによって内因性ＰｒＰ遺伝子と入れ替わる。
【００６３】
ヌルマウスには、抗体形成を刺激するために有蹄類ＰｒＰペプチドが注射される。抗体作成を最大限にするために、ペプチドと共にアジュバント注射を使用することができる。次いで、マウスは屠殺され、骨髄細胞および脾臓細胞が取り出される。細胞が溶解され、ＲＮＡが抽出され、ｃＤＮＡに逆転写される。次いで、抗体重鎖および軽鎖（またはその一部）がＰＣＲによって増幅される。増幅されたｃＤＮＡライブラリーはそのまま使用してもよく、広範囲のバリアントを作成し、それによってライブラリーサイズを大きくするためにさらに操作してもよい。
【００６４】
ＩｇＧ抗体ファージディスプレイライブラリーは、１つのベクターがベクターの第１の発現カセットに重鎖断片をコードするｃＤＮＡインサートを含み、ベクターの第２の発現カセットに軽鎖断片をコードするｃＤＮＡインサートを含むように、ＩｇＧ重鎖をコードする増幅ｃＤＮＡおよび軽鎖をコードする増幅ｃＤＮＡをファージディスプレイベクター（例えば、ｐＣｏｍｂ３ベクター）に挿入することによって構築される。
【００６５】
連結されたベクターは、当技術分野において周知の方法を用いて、ファージディスプレイベクター（例えば、繊維状ファージＭ１３）によってパッケージングされる。パッケージングされたライブラリーは、ファージ粒子数を増幅するために大腸菌培養物に感染するのに用いられる。ファージが細胞から押し出された後、ファージ粒子が単離され、パニング法に用いられる。作成されたライブラリーは、適切なプリオンを含む組成物に対してパニングされる。次いで、ＰｒＰＳｃ（例えば、ウシＰｒＰＳｃ）に選択的に結合する抗体断片が単離される。
【００６６】
抗体の入手−一般的な手順
本発明の抗体は様々な技法によって入手することができる。１つの特定の態様は、ファージ表面上のタンパク質（すなわち、抗体またはその一部）ライブラリーを用いて抗体を作成する方法を提供する。このライブラリーは、ＰｒＰタンパク質を含む組成物（特に、天然に生じるＰｒＰＣ含有組成物）と接触される。ＰｒＰＣに結合するファージが同定され、ＰｒＰＣタンパク質に結合する抗体またはその一部が単離される。抗体またはその一部をコードする遺伝物質の配列を決定することが望ましい。さらに、さらなる抗体を産生するために、それだけでまたは他の遺伝物質と共に配列を増幅し、適切なベクターおよび細胞系に挿入することができる。例えば、ＰｒＰＳｃでは隠されているＰｒＰＣエピトープに結合する可変領域をコードする配列を、抗体の有蹄類（例えば、ウシ）定常領域をコードする配列と融合して、定常／可変構築物を作成することができる。この構築物を増幅し、適切なベクターに挿入し、抗体産生に適した細胞系にトランスフェクトすることができる。このような手順は、このような手順を開示および説明するために参照として本明細書に組み入れられる、１９８９年３月２８日に発行されたキャビリー（Ｃａｂｉｌｌｙ）らへの米国特許第４，８１６，５６７号に記載されている。さらに、ボブルゼクカ（Ｂｏｂｒｚｅｃｋａ）ら（１９８０）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ，２，１５１−１５５頁およびコニエクズニー（Ｋｏｎｉｅｃｚｎｙ）ら（１９８１）Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉａ １４（１），８５−９１頁（これらも参照として本明細書に組み入れられる）を参照のこと。
【００６７】
ＰｒＰＣタンパク質に結合する抗体またはその一部をコードする遺伝物質が単離されると、結合ＰｒＰＣタンパク質に対してより大きな親和性を有する他の抗体またはその一部を産生するために、その遺伝物質を使用することが可能である。これは、部位特異的変異誘発技術またはランダム変異誘発および選択によって行われる。詳細に述べると、配列内の個々のコドンまたはコドン群を除去するか、異なるアミノ酸をコードするコドンで置換することができる。さらなるファージの表面上に抗体またはその一部の変形を発現させるために、多数の異なる配列を作成、増幅、および使用することができる。次いで、これらのファージは、ＰｒＰタンパク質に対する抗体の結合親和性について試験するのに使用することができる。
【００６８】
ファージライブラリーは様々な異なるやり方で作成することができる。ある手順によれば、マウスまたはラットなどの宿主動物がＰｒＰＣタンパク質で免疫化される。免疫化は、より多量かつより多くのタイプの抗体に合わせて最適化するためにアジュバントと共に行ってもよい。抗体作成に十分な時間をとった後に、抗体産生を担う細胞が、接種された宿主哺乳動物から取り出される。ｃＤＮＡライブラリーを作成するために、ＲＮＡが、取り出された細胞から単離され、逆転写にかけられる。抽出されたｃＤＮＡがプライマーを用いて増幅され、適切なファージディスプレイベクターに挿入される。このベクターは、ファージ表面上での抗体またはその一部の発現を可能にする。ディスプレイベクターに挿入する前に、ｃＤＮＡを部位特異的変異誘発にかけることも可能である。詳細に述べると、より大きなライブラリー（すなわち、多くのバリアントからなるライブラリー）を作成するために、コドンを除去するか、異なるアミノ酸をコードするコドンで置換することができ、次いで、ライブラリーをファージ表面上に発現させる。その後、前記のように、ファージと試料を接触させ、ＰｒＰタンパク質に結合するファージが単離される。
【００６９】
プリオン特異的抗体をコードするＲＮＡの単離
コンビナトリアル抗体ライブラリー技術（例えば、Ｍ１３繊維状ファージ表面上に発現する抗体ライブラリーからの、抗原に基づく選択）はモノクローナル抗体作成の新たなアプローチを提供し、本発明に特に関係するハイブリドーマ法と比較して多数の利点を有する（ヒューズ（Ｈｕｓｅ），Ｗ．Ｄ．，Ｌ．サストリー（Ｓａｓｔｒｙ）ら（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４６：１２７５−１２８１．；バルバス（Ｂａｒｂａｓ），Ｃ．Ｆ．，ＩＩＩ，Ａ．Ｓ．ファン（Ｆａｎｇ），ら（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：７９７８−７９８２．；ブルトン（Ｂｕｒｔｏｎ），Ｄ．Ｒ．およびＣ．Ｆ．バルバス，ＩＩＩ（１９９４）Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．５７：１９１−２８０）。
【００７０】
本発明は、ＢｏｖＰｒＰ免疫化Ｐｒｎｐ０／０マウスから調製されたファージ抗体ライブラリーからＰｒＰ特異的モノクローナル抗体を得るための、このような技術を利用した方法を提供する。本発明は、インサイチューでＢｏｖＰｒＰを認識する最初のモノクローナル抗体を提供し、ヌルマウスから特異的抗体をクローニングするためのコンビナトリアルライブラリーの応用を証明する。本発明は寛容の問題を回避し、部分的にヌルマウスを用いて、ＢｏｖＰｒＰおよび他のＰｒＰ上の様々なエピトープを認識することができるモノクローナル抗体パネルをより効率的に作成する。Ｐｒｎｐ０／０マウスは、Ｍｏ、Ｂｏｖ、およびヒトＰｒＰに対するＩｇＧ血清力価を、アジュバントに溶解した比較的少量の各々の精製ＰｒＰ２７−３０を用いた免疫化後に発生する。抗体作成に十分な時間をかけた後に、従来のやり方でハイブリドーマを作成するために免疫化Ｐｒｎｐ０／０マウスを屠殺する。これらのマウスから得られた融合細胞はＰｒＰＣ特異的抗体を分泌する。ファージディスプレイ技術を用いた大きなコンビナトリアルライブラリーの作成に関与する一般的な方法は、１９９３年６月２９日に発行された米国特許第５，２２３，４０９号に説明および開示されている。この特許は、ファージディスプレイ技術を開示および説明するために参照として本明細書に組み入れられる。
【００７１】
一般的に、ファージディスプレイ抗ＰｒＰ抗体ライブラリーは、まず最初に、抗ＰｒＰ抗体をコードするＲＮＡを含むＲＮＡプールを単離することによって調製される。これを達成するために、動物（例えば、マウス、ラット、またはハムスター）を、関心対象のタンパク質またはペプチドで免疫化する。しかしながら、正常な動物は、検出可能なまたは十分に高いレベルでプリオンに対する抗体を産生しない。この問題は、（ＰｒＰ）遺伝子が両対立遺伝子で切除されている動物を免疫化することによって避けられる。このようなマウスはＰｒｎｐ０／０と呼ばれ、このようなマウスを作成する方法は、ブエラー（Ｂｕｅｌｅｒ）ら（１９９２）Ｎａｔｕｒｅ ３５６：５７７−５８２および１９９３年５月２７日に公開されたワイズマン（Ｗｅｉｓｍａｎｎ）国際公開公報第９３／１０２２７号に開示されている。ヌル動物にＰｒＰＣまたはＰｒＰＣペプチドを接種すると、プリオンに対するＩｇＧ血清力価が生じる（プルシナーら，ＰＮＡＳ，１９９３）。１つの好ましい態様において、免疫化のために選択される動物は、ブエラーおよびワイズマンによって述べられたＰｒｎｐ０／０マウスである。一般的に、「ヌル」動物において血清抗体反応を誘発するのに必要なタンパク質量は約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約５００ｍｇ／ｋｇである。
【００７２】
一般的に、ＰｒＰタンパク質は、注射、好ましくは静脈内注射、より好ましくは腹腔内注射によって動物に投与される。動物に１回注射し、一般的に、その後、１〜４回追加免疫注射し、好ましくは、少なくとも３回追加免疫注射する。免疫化後、動物の抗血清とプリオンとの反応性を、標準的な免疫学的アッセイ法（例えば、ＥＬＩＳＡまたはウエスタンブロット）を用いて当技術分野において周知の方法に従って試験することができる（例えば、ハーローおよびレーン，１９８８，抗体：実験マニュアル，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹを参照のこと）。プリオンに結合する抗血清を有する動物を、ＰｒＰＣのさらなる注射によって追加免疫刺激してもよい。
【００７３】
血清抗体レベルは、抗体分泌、従って、リンパ球（特に、プラズマ細胞）における特異的ｍＲＮＡのレベルを予測するものである。従って、血清抗体（特に、比較的高レベルの血清抗体）の検出は、高レベルの、血清抗体をコードするｍＲＮＡを産生するリンパ球（例えば、プラズマ細胞）と相関している。従って、特に、最後の追加免疫注射後、短時間（例えば、約２〜５日、好ましくは３日）でプラズマ細胞をマウスから単離した時に、ＰｒＰＣ免疫化マウスから単離されたプラズマ細胞は、高い割合の、プリオン特異的抗体を産生するリンパ球（例えば、プラズマ細胞）を含んでいる。従って、マウスの免疫化およびその後の追加免疫注射は、マウスプラズマ細胞の全集団に存在する抗ＰｒＰＣ抗体産生プラズマ細胞の総パーセントを高めるのに役立つ。さらに、抗ＰｒＰＣ抗体はピーク血清レベルまたはピーク血清レベル付近で産生されているので、抗ＰｒＰ抗体産生プラズマ細胞は、ピークレベルまたはピークレベル付近で、抗ＰｒＰＣ抗体、従って、これらの抗体をコードするｍＲＮＡを産生している。
【００７４】
抗原特異的抗体の血清レベルと、抗原特異的抗体を産生するリンパ球の数と、抗原特異的抗体をコードする総ｍＲＮＡの量との前記の相関関係は、関心対象の抗原特異的抗体をコードするｍＲＮＡが濃縮されたｍＲＮＡプールを単離する手段をもたらす。プラズマ細胞を含むリンパ球は、当技術分野において周知の方法に従って、プリオン免疫化動物に由来する脾臓および／または骨髄から単離される（例えば、フューズＷ．Ｄ．，Ｌ．サストリーら（１９８９）（補足説明を参照のこと）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４６：１２７５−１２８１を参照のこと）。好ましくは、リンパ球は、最後の追加免疫注射の約２〜５日後、好ましくは約３日後に単離される。これらの細胞から総ＲＮＡが抽出される。哺乳動物細胞からＲＮＡを単離する方法は当技術分野において周知である（例えば、サンブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら，１９８９，分子クローニング：実験マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ），第２版，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹを参照のこと）。
【００７５】
リンパ球ｍＲＮＡからの抗体をコードするｃＤＮＡの作成
ｃＤＮＡは、当技術分野において周知の方法に従って逆転写酵素を用いて単離ＲＮＡから作成することができる（例えば、サンブルックら，前記を参照のこと）。抗体の重鎖または軽鎖をコードするｃＤＮＡは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて増幅することができる。重鎖または軽鎖をコードするｃＤＮＡを増幅するのに用いられる３’プライマーは、特定の抗体サブクラスの重鎖または軽鎖抗体に共通する既知のヌクレオチド配列に基づいている。例えば、ＩｇＧ１重鎖定常領域をコードする遺伝子に基づく一組のプライマーが、ＩｇＧ１サブクラスの重鎖を増幅するのに使用することができ、その一方で、軽鎖定常部分をコードする遺伝子に基づくもう一組のプライマーが、軽鎖レパートリーを増幅するのに用いられる。５’プライマーは、データベースにおける多数の可変配列の調査に基づいたコンセンサス配列である。このように、増幅されたＤＮＡによるコードされる抗体の抗原特異性に関係なく、特定の抗体クラスまたはサブクラスの全ての抗体をコードするＤＮＡを増幅することができる。重鎖または軽鎖をコードする遺伝子全体を増幅することができる。または、重鎖または軽鎖をコードする遺伝子の一部のみを増幅することができる。但し、ＰＣＲ増幅産物は、対応する重鎖または軽鎖と結合することができ、抗原結合において機能する（すなわち、プリオンタンパク質に選択的に結合する）重鎖または軽鎖遺伝子産物をコードする。好ましくは、ファージディスプレイ産物は、ＦａｂまたはＦｖ抗体断片である。
【００７６】
増幅のために選択される抗体コードｃＤＮＡは任意のアイソタイプをコードしてもよく、好ましくは、ＩｇＧサブクラスをコードする。例示的なマウスＩｇＧサブクラスとして、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、およびＩｇＧ３が挙げられる。増幅のための特定の抗体サブクラスをコードするｃＤＮＡの選択は、様々な要因（例えば、抗原に対する動物の血清抗体反応を含む）によって異なる。好ましくは、ＰＣＲ増幅のために選択される抗体サブクラスをコードするｃＤＮＡは、動物が最も高い抗体力価を生じる抗体サブクラスである。例えば、血清ＩｇＧ１の力価が、血清抗体反応において検出された他のどのＩｇＧサブクラスよりも高い場合、ＩｇＧ１をコードするｃＤＮＡがｃＤＮＡプールから増幅される。
【００７７】
好ましくは、２つの別個の増幅ｃＤＮＡプール：１）重鎖ｃＤＮＡアンプライマー産物を含むｃＤＮＡプール（この場合、重鎖は特定の抗体サブクラスの重鎖である）および２）軽鎖ｃＤＮＡアンプライマー産物を含むｃＤＮＡプールを生じるように、重鎖および軽鎖がプラズマ細胞ｃＤＮＡから増幅される。
【００７８】
トランスジェニック動物からの抗体
動物に抗原を感染させ、その後に、抗体産生を担う細胞（およびそのＤＮＡ）を取り出すことによって、抗体をコードする遺伝物質を得ることに加えて、抗体産生用のトランスジェニック動物を作成することによって遺伝物質を得ることが可能である。説明された技術およびトランスジェニック動物技術は、例えば、キメラマウス／ウシ抗体または完全にウシの抗体を産生するのに使用することができる。キメラまたは完全に外来の免疫グロブリンを産生する技術は、所望の抗原に結合する免疫グロブリンの全てまたは一部をコードする遺伝物質が生殖系列細胞に挿入されているトランスジェニック動物の細胞を得ることを必要とする。ウシ抗体をコードする遺伝物質がゲノムに挿入されているトランスジェニックマウスから、完全にウシの抗体を産生することができる。トランスジェニック動物からこのような抗体を産生する同様の技術が、１９９０年４月１９日に公開された国際公開公報第９０／０４０３６号に記載されている。さらに、グッドハルト（Ｇｏｏｄｈａｒｄｔ）ら（１９８７年６月）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８４：４２２９−４２３３およびブクシン（Ｂｕｃｃｈｉｎｅ）ら（１９８７年３月２６日）Ｎａｔｕｒｅ ３２６：４０９−４１１を参照のこと。トランスジェニック動物から抗体を産生する方法を開示および説明するために、これらの全てが参照として本明細書に組み入れられる。
【００７９】
本発明は、主として、ヌルマウス（すなわち、ＰｒＰ遺伝子の両対立遺伝子が切除されたＦＶＢマウス）に関して本明細書で説明される。しかしながら、他の宿主動物を使用することができ、好ましい宿主動物はマウスおよびハムスターであり、マウスは、トランスジェニック動物の作成についてかなりの情報がある点で最も好ましい。可能な宿主動物として、ハツカネズミ属（Ｍｕｓ）（例えば、マウス）、クマネズミ属（Ｒａｔｔｕｓ）（例えば、ラット）、アナウサギ属（Ｏｒｙｃｔｏｌａｇｕｓ）（例えば、ウサギ）、メソクリセタス属（Ｍｅｓｏｃｒｉｃｅｔｕｓ）（例えば、ハムスター）、およびテンジクネズミ属（Ｃａｖｉａ）（例えば、モルモット）から選択される属に属する宿主動物が挙げられる。一般的に、繁殖および管理しやすい、正常な完全に成長した成獣体重が１ｋｇ未満の哺乳動物を使用することができる。
【００８０】
ファージディスプレイ抗体ライブラリーと共に使用するベクター
次いで、重鎖をコードするｃＤＮＡおよび軽鎖をコードするｃＤＮＡが、好ましくは、適切なベクターの別々の発現カセットに挿入される。好ましくは、ベクターは、融合ポリペプチドをコードし、発現することができるヌクレオチド配列を含む。この融合ポリペプチドは、アミノ末端からカルボキシ末端に向かって、１）原核生物分泌シグナルドメイン、２）異種ポリペプチドをコードするＤＮＡ（例えば、重鎖をコードするｃＤＮＡまたは軽鎖をコードするｃＤＮＡ）の挿入部位、および３） 重鎖ｃＤＮＡ用の発現カセットでは繊維状ファージ膜アンカードメインを含む。
【００８１】
ベクターは、融合ポリペプチドを発現するための原核生物または哺乳動物ＤＮＡ発現制御配列（好ましくは、原核生物制御配列）を含む。ＤＮＡ発現制御配列は、構造遺伝子産物を発現するための任意の発現シグナルを含んでもよく、異種ポリペプチドを発現するために発現カセットに作動可能に連結される５’および３’エレメントを含んでもよい。５’制御配列は、転写開始のためのプロモーター、および上流翻訳配列の５’末端に作動可能に連結されるリボソーム結合部位を規定する。ベクターは、さらに、原核細胞（好ましくは、大腸菌などのグラム陰性細胞）における維持および複製のための複製起点を含む。ベクターはまた、発現によって、選択に有利な点（例えば、薬物耐性）がベクターで形質転換される原核細胞または真核細胞に付与される遺伝子を含んでもよい。
【００８２】
繊維状ファージ膜アンカーは、好ましくは、繊維状ファージ粒子のマトリックスに結合し、それによって融合ポリペプチドをファージ表面上に組み込むことが可能なｃｐＩＩＩまたはｃｐＶＩＩＩコートタンパク質のドメインである。分泌シグナルは、あるタンパク質のリーダーペプチドドメインであり、これによってタンパク質はグラム陰性細菌のペリプラズム膜に向けられる。グラム陰性細菌（例えば、大腸菌）のこのようなリーダー配列は当技術分野において周知である（例えば、オリバー（Ｏｌｉｖｅｒ），ナイドハルド（Ｎｅｉｄｈａｒｄ）Ｆ．Ｃ．（編）（１９８７）大腸菌およびネズミチフス菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ａｎｄ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ），Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．，１：５６−６９を参照のこと）。
【００８３】
ファージディスプレイベクターにおいて使用する繊維状ファージ膜アンカー
ベクターに好ましい膜アンカーは、繊維状ファージＭ１３、ｆ１、ｆｄ、および同等の繊維状ファージから得ることができる。好ましい膜アンカードメインは、遺伝子ＩＩＩおよび遺伝子ＶＩＩＩによってコードされるコートタンパク質に見出される。繊維状ファージコートタンパク質の膜アンカードメインはコートタンパク質のカルボキシ末端領域の一部であり、脂質二重膜にまたがる疎水性アミノ酸残基の領域および通常、膜の細胞質側に見出され、膜から延びている荷電アミノ酸残基の領域を含む。ファージｆ１において、遺伝子ＶＩＩＩコートタンパク質の膜にまたがる領域は、４１〜５２のカルボキシ末端１１残基を含んでいる（オオカワ（Ｏｈｋａｗａ）ら（１９８１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５６：９９５１−９９５８）。例示的な膜アンカーはｃｐＶＩＩＩの残基２６〜４０からなる。従って、好ましい膜アンカードメインのアミノ酸残基配列は、Ｍ１３繊維状ファージ遺伝子ＶＩＩＩコートタンパク質（ｃｐＶＩＩＩまたはＣＰ８とも呼ばれる）から得られる。遺伝子ＶＩＩＩコートタンパク質は、一般的に約２５００〜３０００コピーのコートタンパク質を有するファージ粒子の大部分にわたって成熟繊維状ファージに存在する。
【００８４】
別の好ましい膜アンカードメインのアミノ酸残基配列は、Ｍ１３繊維状ファージ遺伝子ＩＩＩコートタンパク質（ｃｐＩＩＩとも呼ばれる）から得られる。遺伝子ＩＩＩコートタンパク質は、一般的に約４〜６コピーのコートタンパク質を有するファージ粒子の一端に、成熟繊維状ファージに存在する。繊維状ファージ粒子の構造、そのコートタンパク質、および粒子集合の詳細な説明は、ラシェド（Ｒａｃｈｅｄ）ら（１９８６）Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ，５０：４０１−４２７による概説およびモデル（Ｍｏｄｅｌ）ら（１９８８）バクテリオファージ（Ｔｈｅ Ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅｓ）：第２巻，Ｒ．カレンダー（Ｃａｌｅｎｄａｒ）編，Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，３７５−４５６頁に見られる。
【００８５】
好ましくは、ファージ膜アンカーをコードするＤＮＡが容易に切り出され、ベクターの発現カセットの残りが破壊されることなくベクターが再連結されるように、繊維状ファージ膜アンカーをコードするＤＮＡはライブラリーベクターにおいてｃＤＮＡインサートの３’側に導入される。ベクターからファージ膜アンカーをコードするＤＮＡを除去し、このベクターを適切な宿主細胞において発現すると、可溶性抗体（Ｆａｂ）断片が産生される。可溶性のＦａｂ断片はファージ結合Ｆａｂの抗原結合性を保持しており、従って、（断片化していない）抗体全体を使用するようにアッセイ法および治療に使用することができる。
【００８６】
本発明と共に使用するベクターは、ヘテロ２量体型受容体（例えば、抗体または抗体Ｆａｂ）を発現することができなければならない。すなわち、ベクターは、２つの別個のｃＤＮＡインサート（例えば、重鎖ｃＤＮＡおよび軽鎖ｃＤＮＡ）を独立して含有し、発現することができなければならない。繊維状ファージ膜アンカーをコードするＤＮＡが重鎖ｃＤＮＡ用発現カセットにのみ存在することを除いて、それぞれの発現カセットは前記のエレメントを含んでもよい。従って、抗体またはＦａｂがファージ表面上に発現されると、重鎖ポリペプチドだけがファージ表面に固定される。軽鎖はファージ表面に直接結合しないが、重鎖ポリペプチドの遊離部分（すなわち、ファージ表面に結合していない重鎖部分）との結合を介してファージに間接的に結合する。
【００８７】
好ましくは、ベクターは、定方向連結を可能にするヌクレオチド配列（すなわち、ポリリンカー）を含む。ポリリンカーは、複製および輸送のために上流および下流の翻訳可能なＤＮＡ配列を作動可能に連結し、ベクターへのＤＮＡ配列の定方向連結のための部位または手段を提供するＤＮＡ発現ベクターの領域である。一般的に、定方向ポリリンカーは、２つ以上の制限エンドヌクレアーゼ認識配列を規定するヌクレオチド配列である。制限酵素で切断すると、２つの部位が付着末端を生じ、この付着末端で、翻訳可能なＤＮＡ配列をＤＮＡ発現ベクターに連結することができる。好ましくは、２つの付着末端は相補せず、そのために、カセットへのｃＤＮＡの定方向挿入が可能になる。ポリリンカーは１つまたは複数の定方向クローニング部位をもたらすことができ、挿入されたｃＤＮＡの発現中に翻訳されてもよく、翻訳されなくてもよい。
【００８８】
特定の態様において、発現ベクターは、繊維状ファージ粒子の形で操作することができる。このようなＤＮＡ発現ベクターは、適切な遺伝的に必要な全てのもの（ｇｅｎｅｔｉｃ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）が提示されるとベクターが一本鎖複製型の繊維状ファージとして複製することができ、繊維状ファージ粒子にパッケージングできるように、繊維状ファージ複製起点を規定するヌクレオチド配列をさらに含む。この特徴は、（例えば、単離された細菌コロニーの感染および単離された細菌コロニーにおける複製によって）個々のファージ粒子を後で単離するためにＤＮＡ発現ベクターがファージ粒子にパッケージングされるのを可能にする。
【００８９】
繊維状ファージ複製起点は、複製によって産生される複製型の複製開始、複製終結、およびパッケージングのための部位を規定するファージゲノムの領域である（例えば、ラシェド（Ｒａｓｃｈｅｄ）ら（１９８６）Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．５０：４０１−４２７；ホリウチ（Ｈｏｒｉｕｃｈｉ）（１９８６）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１８８：２１５−２２３を参照のこと）。本発明での使用に好ましい繊維状ファージ複製起点は、Ｍ１３、ｆ１、またはｆｄファージ複製起点である（ショート（Ｓｈｏｒｔ）ら（１９８８）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１６：７５８３−７６００）。好ましいＤＮＡ発現ベクターは、発現ベクターｐＣＯＭＢ８、ｐＣＫＡＢ８、ｐＣＯＭＢ２−８、ｐＣＯＭＢ３、ｐＣＫＡＢ３、ｐＣＯＭＢ２−３、ｐＣＯＭＢ２−３’、およびｐＣＯＭＢ３Ｈである。
【００９０】
ｐＣｏｍｂ３Ｈベクターは、（ｉ）重鎖および軽鎖が個々のプロモーターではなく単一のＬａｃプロモーターから発現され、（ｉｉ）重鎖および軽鎖が同じリーダー配列（ｐＨＢ）ではなく２つの異なるリーダー配列（ｐｇ１ＢおよびｏｍｐＡ）を有する、ｐＣｏｍｂ３の改変型である。ｐＣｏｍｂ３Ｈについては、ヤング（Ｙａｎｇ）ら（１９９５）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２５４：３９２−４０３を参照のこと。ｐＣｏｍｂ３Ｈの原理は基本的にｐＣｏｍｂ３と同じである。
【００９１】
ファージディスプレイ抗体ライブラリーの作成
重鎖および軽鎖ｃＤＮＡが発現ベクターにクローニングされた後、適切な繊維状ファージを用いてライブラリー全体をパッケージングする。次いで、このファージを用いて、ファージ感受性の細菌培養物（例えば、大腸菌株）に感染させる。ファージは複製し、細胞を溶解し、溶解産物が細菌細胞破片から単離される。ファージ溶解産物は繊維状ファージを含み、この繊維状ファージは、免疫化動物から単離されたクローニングされた重鎖および軽鎖を表面上に発現している。一般的に、重鎖および軽鎖はＦａｂ抗体断片としてファージ表面上に存在し、Ｆａｂの重鎖は、融合ポリペプチドの繊維状ファージ膜アンカー部分を介してファージ表面に固定されている。軽鎖は、抗原結合部位を形成するように重鎖に結合している。キメラ抗体を作成する方法は、このような手順を開示および説明するために参照として本明細書に組み入れられる、１９８９年３月２８日に発行されたキャビリィ（Ｃａｂｉｌｌｙ）らへの米国特許第４，８１６，５６７号に記載されている。さらに、ボブルゼカ（Ｂｏｂｒｚｅｃｋａ）ら（１９８０）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ，２，１５１−１５５頁およびコンイエンジ（Ｋｏｎｉｅｃｚｎｙ）ら（１９８１）Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉａ １４（１）８５−９１頁を参照のこと。これらも参照として本明細書に組み入れられる。
【００９２】
ファージディスプレイ抗体ライブラリーからのＰｒＰＣ抗原特異的Ｆａｂの選択
ＰｒＰＳｃでは入手できないＰｒＰＣエピトープに特異的に結合する抗体またはＦａｂを発現するファージは、モノクローナル抗体および／またはポリクローナル抗体を同定および単離するための任意の様々なプロトコールを用いて単離することができる。このような方法として、イムノアフィニティ精製（例えば、抗原が結合しているカラムにファージを結合させる）および抗体パニング法（例えば、抗原に対して高結合親和性のファージを選択するために、固体支持体に結合した抗原にファージを繰り返し結合させる）が挙げられる。好ましくは、ファージは、当技術分野において周知の技法を用いてパニングによって選択される。
【００９３】
例示的なパニングプロトコールは２回繰り返して行われる。第１回のパニングは、ウシ残基９０−１４５に対応するＣ末端ビオチン化合成ペプチドに対して行われる。ペプチドは、全ての抗体の単離を容易にするために支持層に固定化される（例えば、ストレプトアビジンで高密度に予めコーティングされているＥＬＩＳＡプレートに取り付けられる）。ペプチドを結合させ、結合クローンを単離した後、選択されたファージがＰｒＰＣタンパク質（例えば、天然の有蹄類ＰｒＰＣまたはキメラマウス／有蹄類ＰｒＰＣ）に対してパニングされる。記載のように（ウィリアムソン（Ｗｉｌｌｉａｍｓｏｎ），Ｒ．Ａ．，Ｄ．ペレズ（Ｐｅｒｅｔｚ）ら（１９９６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９３：７２７９−７２８２；ペレズ，Ｄ．，Ｒ．Ａ．ウィリアムソンら（１９９７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７３：６１４−６２２）、選択されたＦａｂは大腸菌において発現され、精製される。
【００９４】
抗ＰｒＰＣ抗体を発現するファージを同定および単離した後、このファージを用いて細菌培養物に感染させ、１個のファージ単離物を同定することができる。前記の方法の一つまたは複数を用いて、別個の各ファージ単離物を再スクリーニングすることができる。抗原に対するファージの親和性をさらに確認し、および／または抗原に対するファージの相対的な親和性を決定するために、抗体またはＦａｂをコードするＤＮＡをファージから単離し、当技術分野において周知の方法を用いて、ベクターに含まれる重鎖および軽鎖のヌクレオチド配列を決定することができる（例えば、サンブルックら，前記を参照のこと）。
【００９５】
ファージディスプレイ抗体ライブラリーから選択されたファージからの可溶性Ｆａｂの単離
可溶性抗体またはＦａｂは、抗体重鎖用の発現カセットに結合している繊維状ファージアンカー膜タンパク質をコードするＤＮＡを切り出すことによって改変ディスプレイから生成することができる。好ましくは、アンカー膜をコードするＤＮＡには、重鎖発現カセットの残りを破壊することも発現ベクターの他のどの部分も破壊することなくアンカー膜配列の切り出しを可能にする便利な制限部位が隣接している。そのため、アンカー膜配列のない改変ベクターは、改変ベクターを用いた細菌細胞のパッケージングおよび感染後に可溶性重鎖ならびに可溶性軽鎖の生成を可能にする。
【００９６】
または、ベクターが適切な哺乳動物発現配列を含む場合、Ｆａｂ発現のために真核細胞（例えば、哺乳動物細胞または酵母細胞、好ましくは、哺乳動物細胞（例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞））を形質転換するのに、この改変ベクターを使用することができる。改変ベクターが真核細胞発現をもたらさない場合、ベクターは、好ましくは、適切なベクターにサブクローニングするために重鎖発現カセットおよび軽鎖発現カセットを両方とも１個のＤＮＡ断片として切り出すことができる。原核細胞および／または真核細胞においてタンパク質を発現させるための非常に多くのベクターが市販されており、および／または当技術分野において周知である（例えば、サンブルックら，前記を参照のこと）。
【００９７】
ＰｒＰ遺伝子およびＰｒＰタンパク質の詳細
多くの異なる動物種についてＰｒＰ遺伝子を構成する遺伝物質が知られている（ガブリエル（Ｇａｂｒｉｅｌ）ら（１９９２），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：９０９７−９１０１を参照のこと）。さらに、異なる哺乳動物のＰｒＰ遺伝子の間にはかなりの相同性がある。ＰｒＰ遺伝子についてかなりの遺伝的相同性があるが、場合によっては差が顕著である。さらに詳細に述べると、異なる哺乳動物のＰｒＰ遺伝子によりコードされるタンパク質にわずかな差があるために、ある哺乳動物（例えば、ヒト）に感染するプリオンは、通常、別の哺乳動物（例えば、マウス）に感染しない。この「種の壁」のために、一般的に、特定の試料が、通常、異なる種の動物（例えば、ヒト）に感染するプリオンを含むかどうかを確かめるために、マウスなどの正常な動物（すなわち、操作されたＰｒＰタンパク質に関連する遺伝物質を有さない動物）を使用することは不可能である。本発明は、有蹄類に由来する試料中のプリオンを検出するために、有蹄類ＰｒＰ遺伝子またはキメラ有蹄類ＰｒＰ遺伝子を有する組換えトランスジェニック動物を使用する方法を提供する。本発明の抗体は、これらの有蹄類プリオンをアッセイ法において検出することができる手段を提供する。
【００９８】
精製された感染性プリオンの主成分（ＰｒＰ２７−３０と呼ばれる）は、遍在性細胞タンパク質ＰｒＰＣの疾患を引き起こす形態である大きな天然タンパク質ＰｒＰＳｃのプロテイナーゼＫ耐性コアである。ＰｒＰＳｃはスクレイピーに感染した細胞にしか見られないが、ＰｒＰＣは感染細胞および非感染細胞の両方に存在し、このために、ＰｒＰＳｃは、感染性プリオン粒子の唯一ではないが主要な成分とみなされる。ＰｒＰＣおよびＰｒＰＳｃは両方とも同じシングルコピー遺伝子によってコードされるので、多大な労力が、ＰｒＰＣからＰｒＰＳｃが生じる機構の解明に向けられてきた。この目標の中心をなすのは、これらの２つの分子間の物理的および化学的な差の特徴付けであった。ＰｒＰＳｃとＰｒＰＣを区別する特性として、低い溶解度（メヤー（Ｍｅｙｅｒ）ら（１９８６），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８３：３６９３−７）、不十分な抗原性（カスクサク（Ｋａｓｃｓａｋ）ら（１９８７）「スクレイピー関連線維タンパク質に対するマウスポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体（Ｍｏｕｓｅ Ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ ａｎｄ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ ｔｏ Ｓｃｒａｐｉｅ−Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｆｉｂｒｉｌ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ）」Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６１（１２）：３６８８−３６９３；セルバン（Ｓｅｒｂａｎ）ら（１９９０），Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ４０：１１０−１１７）、プロテアーゼ耐性（オエシュ（Ｏｅｓｃｈ）ら（１９８５），Ｃｅｌｌ ４０：７３５−７４６）、ならびにスクレイピーに罹患した脳で見られるＰｒＰアミロイド斑に超微細構造および組織化学レベルで非常によく似た棒状凝集体へのＰｒＰ２７−３０の重合（プルシナーら（１９８３）Ｃｅｌｌ）が挙げられる。プロテイナーゼＫを用いることで、ＰｒＰＣを変性することができるが、ＰｒＰＳｃを変性することはできない。現在、ＰｒＰＳｃへの変換につながる、ＰｒＰＣでの移行後化学修飾を特定しようとする試みは無駄なことが判明している（スタール（Ｓｔａｈｌ）ら（１９９３）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）。その結果として、ＰｒＰＣおよびＰｒＰＳｃが実際に同じ分子の配座異性体であることが提唱されている。
【００９９】
従来の技法を用いたＰｒＰの構造を図示することは、溶解度および十分な量の純粋なタンパク質を生成することの難しさの問題によって妨げられてきた。しかしながら、ＰｒＰＣおよびＰｒＰＳｃは構造が異なる。いくつかの種に由来するＰｒＰｓのアミノ酸配列に基づく理論計算から、分子内に４つの推定らせんモチーフがあることが予測された。実験によって得た分光分析データから、ＰｒＰＣでは、これらの領域はαヘリックス配置をとり、実質的にβシートがないことが分かった（パン（Ｐａｎ），Ｋ．Ｍ．ら（１９９３）ＰＮＡＳ ９０：１０９６２：６）。非常に対照的に、同じ研究において、ＰｒＰＳｃおよびＰｒＰ２７−３０はかなりのβシート含有量を有することが見出され、これはアミロイドタンパク質に特有のものである。さらに、ＰｒＰアミノ酸残基９０−１４５に対応する、伸長された合成ペプチドを用いた研究から、これらの短縮された分子は、溶液条件を変えることでαヘリックス構造またはβシート構造のどちらにも変換できることが証明された。ＰｒＰＣからＰｒＰＳｃへの移行には、以前にはαヘリックスであった領域がβシート構造をとることが必要である。
【０１００】
前記で引用された刊行物に記載のタイプの抗体がＰｒＰＣに結合するが、ＰｒＰＳｃには結合しない理由は完全に分かっていない。どの特定の理論にも拘束されるつもりはないが、タンパク質がＰｒＰＣ構造にある時に暴露されているエピトープが、タンパク質が比較的不溶性であり、密に折り畳まれているＰｒＰＳｃ立体配置では変化し、暴露されず、または部分的に隠されているために、このようなことが起こり得ることが示唆される。ＰｒＰＳｃへのわずかな結合が起こる可能性があるので、抗体がＰｒＰｃに結合するがＰｒＰＳｃには結合しないと述べるのは絶対という点から見ると間違っていると指摘される（しかし、一般に受け入れられている点から見ると正しい）。本発明のために、結合が起こらないことを示すのは、平衡定数すなわち親和定数Ｋａが１０６ｌ／モル以下であることを意味する。さらに、結合は、Ｋａが１０７ｌ／モル以上、好ましくは１０８ｌ／モル以上である時に存在すると認められる。１０７ｌ／モル以上の結合親和性は、（１）単一のモノクローナル抗体（すなわち、多数の１種類の抗体）、（２）複数の異なるモノクローナル抗体（例えば、多数の、５種類の異なる各モノクローナル抗体）、または（３）多数のポリクローナル抗体に起因するかもしれない。（１）〜（３）の組み合わせを用いることも可能である。
【０１０１】
抗体／抗原結合力
抗原および抗体を結合させる力は、本質的に、任意の２つの非関連タンパク質（すなわち、ヒト血清アルブミンおよびヒトトランスフェリンなどの他の巨大分子）間で生じる非特異的な相互作用となんら違いはない。これらの分子間力は、４つの一般的な分野（１）静電気力；（２）水素結合力；（３）疎水力；および（４）ファンデルワールス力に分類することができる。静電気力は、２つのタンパク質側鎖にある反対に荷電したイオン基間の引力によるものである。引力（Ｆ）の力は、電荷間の距離（ｄ）の二乗に反比例する。水素結合力は、−ＯＨ、−ＮＨ２、および−ＣＯＯＨなどの親水基間の可逆的な水素結合の形成によって生じる。これらの力は、これらの基を有する２つの分子の密接した位置に大きく依存している。疎水力は、水中の油滴が合体して１個の大きな小滴を形成するのと同じ方法で作用する。従って、バリン、ロイシン、およびフェニルアラニンにある側鎖などの非極性疎水基は水性環境において会合する傾向がある。最後に、ファンデルワールス力は、外側電子雲間の相互作用に依存する分子間で生じる力である。
【０１０２】
異なるタイプの力のそれぞれに関するさらなる情報は、「必須免疫学（Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）」Ｉ．Ｍ．ロイティ（Ｒｏｉｔｔｉ）編（第６版）Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，１９８８から得ることができる。本発明に関して、有用な抗体はこれらの力を全て示す。これらの力が多量に累積したものを得ることで、ＰｒＰタンパク質に対して高度の親和性または結合強度を有する抗体、特に、有蹄類ＰｒＰＣに対して高度の結合強度を有する抗体を得ることが可能である。
【０１０３】
抗体／抗原結合強度の測定
抗体と抗原との結合親和性を測定することができる。結合親和性の測定値は、前記の全ての力の測定値を累積したものである。このような測定を行うための標準的な手順が存在し、有蹄類ＰｒＰＣを含むＰｒＰタンパク質に対する本発明の抗体の親和性を測定するのに直接適用することができる。
【０１０４】
抗体／抗原結合親和性を測定する１つの標準的な方法は透析袋を用いた方法である。透析袋は、抗原は透過するが抗体は透過しない材料からなる容器である。抗体に完全または部分的に結合した抗原を、水などの溶媒に入れた透析袋に入れる。次いで、この袋を、抗体または抗原を含まないが水などの溶媒だけを含む大きな容器に入れる。抗原だけが透析膜を通って拡散できるので、透析袋の中の抗原の濃度および外側の大きな容器の中の抗原の濃度は平衡に達しようとする。透析袋を大きな容器に入れ、平衡に達する時間をとった後、透析袋および周囲容器の中の抗原の濃度を測定し、次いで、濃度の差を求めることが可能である。これによって、透析袋の中の、抗体に結合したままの抗原の量、および抗体から解離し、周囲容器に拡散した量を計算することが可能になる。周囲容器に拡散した抗原を除去するように周囲容器の中の溶媒（例えば、水）を絶えず交換することで、透析袋の中で抗原から抗体を完全に解離させることが可能である。周囲の溶媒を交換しなければ、この系は平衡に達し、反応（すなわち、抗体と抗原との会合および解離）の平衡定数（Ｋ）を計算することが可能である。平衡定数（Ｋ）は、透析袋の中の抗原に結合した抗体の濃度／遊離の抗体結合部位の濃度×遊離の抗原の濃度に等しい量として計算される。平衡定数すなわち「Ｋ」値は、一般的にリットル／モルで測定される。Ｋ値は、抗原および抗体の複合体化形態と比較した遊離状態の抗原と抗体との自由エネルギー（ｄｅｔａ ｇ）の差の尺度である。以下で説明するファージディスプレイ法を用いた時に、得られる抗体の親和性すなわちＫ値は１０７モル／リットル以上である。
【０１０５】
抗体アビディティ
前記に示したように、「親和性」という用語は、単一の抗原決定基（ａｎｔｉｇｅｎ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｅ）に対する抗体の結合を表す。しかしながら、最も現実的な状況では、抗体を多価抗原との相互作用に関心が持たれる。「アビディティ」という用語は、この結合を表すために用いられる。アビディティに寄与する要因は複雑であり、ある特定の血清に含まれる、抗原上の各決定基に対する抗体の不均一性、および決定基それ自体の不均一性を含む。ほとんどの抗原の多価性が、興味深い「ボーナス」効果につながる。ボーナス効果では、抗体による２つの抗原分子の結合が、個々の抗体結合の算術和より常に大きく、通常何倍も大きい。従って、抗血清と多価抗原との間で測定されたアビディティは、１個の抗体と単一の抗原決定基との間の親和性よりいくらか大きいと理解することができる。
【０１０６】
構造依存性アッセイ法（ＣＤＩ）
構造依存性アッセイ法すなわち「ＣＤＩ」は、ＰｒＰＣを排除するためにプロテイナーゼＫで前消化することなく、脳ホモジネート中のＰｒＰＳｃ量を直接測定することができる。このアッセイ法は構造感受性であり、ＰｒＰＣが１００倍過剰に存在する脳ホモジネート中で比較的低い濃度のＰｒＰＳｃを検出することができる。ディファレンシャルイムノアッセイ法の前にＰｒＰＳｃを選択的に沈殿させることで、３，０００倍過剰のＰｒＰＣの存在下でＰｒＰＳｃを測定することができる。現在、このアッセイ法は、５桁のダイナミックレンジで、脳ホモジネート中の１ｎｇ／ｍｌ未満のＰｒＰＳｃを定量することができる（サファー（Ｓａｆａｒ），Ｊ．，Ｈ．ウィル（Ｗｉｌｌｅ）ら（１９９８），Ｎａｔ．Ｍｅｄ，４（１０）：１１５７−１１６５）。臨床的に罹患しているＣＪＤ患者の脳ホモジネート中のプリオン力価は、１０６ ＩＤ５０単位／ｍｌの５％脳ホモジネートに等しいか、またはそれより小さいので（未発表データ）、ディファレンシャルイムノアッセイ法は、１ ＩＤ５０単位／ｍｌと小さなプリオン力価を検出することができる。
【０１０７】
ＣＤＩを用いると、限定されたプロテイナーゼＫ消化の前後にＰｒＰＳｃ濃度の関数として変性したＰｒＰ／天然のＰｒＰの比をプロットすることで複数のプリオン株を区別することができる。対照的に、限定されたタンパク質分解の後のウエスタンブロッティングでは、１つの株（ＤＹ）（ベッセン（Ｂｅｓｓｅｎ），Ｒ．Ａ．およびＲ．Ｆ．マーシュ（Ｍａｒｓｈ）（１９９４），Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６８：７８５９−７８６８）しか他の７つの株と区別することができなかった。さらに、ＤＹプリオンにおけるＰｒＰＳｃの比較的増大したプロテアーゼ感受性は、イムノブロッティングによるその濃度の過小評価につながる可能性がある（スコット（Ｓｃｏｔｔ），Ｍ．Ｒ．，Ｄ．グロス（Ｇｒｏｔｈ）ら（１９９７），Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１：９０３２−９０４４）。
【０１０８】
詳細に述べると、有蹄類残基９０−１２０（エピトープＩ）に対する抗体は、ＣＤＩが乳牛、シカ、エルク、ヒツジ、および他の有蹄類におけるプリオンを検出するのを可能にする。この高親和性抗体は変性したウシＰｒＰのエピトープＩと相互作用し、ＣＤＩアッセイ法が、例えば、試験試料中のウシプリオンの存在を検出するのを可能にする。このエピトープは、ＣＤＩの絶対的な感度だけでなく、構造感度にも重要である。ＣＤＩの構造感度は、アッセイ法の特異性およびＰｒＰＳｃとＰｒＰＣを区別する能力に重要である。
【０１０９】
病原性変異および多型
ヒトＰｒＰ遺伝子には多くの既知の病原性変異がある。さらに、ヒト、ヒツジ、およびウシＰｒＰ遺伝子には既知の多型がある。本発明の抗体は、ＰｒＰ遺伝子の特定の対立遺伝子を認識することに照準を合わすことができる。または、ある種（例えば、ヒト）において病原性であることが知られている多型または変異を、有蹄類ＰｒＰからのペプチドに付加することができる。以下は、このような変異および多型のリストである。
【０１１０】
【表１】
2004509858.tif 000003
【０１１１】
ヒツジおよび乳牛ＰｒＰ遺伝子のＤＮＡ配列は決定されており、このため、どちらの場合でも、各ＰｒＰタンパク質の完全なアミノ酸配列を推定することができる。大部分の個体において生じる正常なアミノ酸配列は野生型ＰｒＰ配列と呼ばれる。この野生型配列は、ある特徴的な多型変化を受けやすい。ヒツジＰｒＰの場合、遺伝子は残基１７１および１３６で２つのアミノ酸多型を示すのに対して、ウシＰｒＰは、成熟プリオンタンパクのアミノ末端領域において８アミノ酸モチーフ配列の５回または６回の反復を有する。これらの多型はどれもそれ自体では病原性でないが、プリオン病に影響を及ぼすように見える。野生型ＰｒＰタンパク質のこれらの正常変化とは異なり、ＰｒＰの特定のアミノ酸残基またはオクタリピートの数を変える、ヒトＰｒＰ遺伝子のある特定の変異が同定されており、この変異は遺伝性ヒトプリオン病と共に分離する。
【０１１２】
変異および多型を証明する前記の表にさらなる意味を与えるために、公表されたＰｒＰ遺伝子配列について言及することができる。例えば、ニワトリ、ウシ、ヒツジ、ラット、およびマウスＰｒＰ遺伝子が、ガブリエル（Ｇａｂｒｉｅｌ）ら（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：９０９７−９１０１に開示および公表されている。シリアンハムスターの配列は、バスラー（Ｂａｓｌｅｒ）ら（１９８６）Ｃｅｌｌ ４６：４１７−４２８において公表されている。ヒツジＰｒＰ遺伝子は、ゴールドマン（Ｇｏｌｄｍａｎｎ）ら（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：２４７６−２４８０によって公表されている。ウシＰｒＰ遺伝子配列は、ゴールドマン（１９９１）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７２：２０１−２０４において公表されている。ニワトリＰｒＰ遺伝子配列は、ハリス（Ｈａｒｒｉｓ）ら（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：７６６４−７６６８において公表されている。ミンクＰｒＰ遺伝子配列は、クレズシュマー（Ｋｒｅｔｚｓｃｈｍａｒ）ら（１９９２）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７３：２７５７−２７６１において公表されている。ヒトＰｒＰ遺伝子配列は、クレズシュマーら（１９８６）ＤＮＡ ５：３１５−３２４において公表されている。マウスＰｒＰ遺伝子配列は、ロシュト（Ｌｏｃｈｔ）ら（１９８６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８３：６３７２−６３７６において公表されている。ヒツジＰｒＰ遺伝子配列は、ウェスタウエイ（Ｗｅｓｔａｗａｙ）ら（１９９４）Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．８：９５９−９６９において公表されている。これらの刊行物は全て、ＰｒＰ遺伝子およびＰｒＰアミノ酸配列を開示および説明するために参照として本明細書に組み入れられる。
【０１１３】
標準化プリオン調製物
本発明のアッセイ法を試験し、それによってアッセイ法の信頼性を改善するために、標準化プリオン調製物を生成することができる。この調製物は任意の動物から得ることができるが、好ましくは、試験動物のプリオンを含む脳材料を有する宿主動物から得られる。例えば、ウシプリオンタンパク質遺伝子を含むトランスジェニックマウスはウシプリオンを産生することができ、このようなマウスの脳は標準化ウシプリオン調製物を生成するのに使用することができる。さらに、この調製物は「標準」になるので、好ましくは、一組（例えば、１００匹、１，０００匹、またはより多くの動物）の実質的に同一の動物から得られる。例えば、１００匹のマウス（全て、非常に多くのコピー数のウシＰｒＰ遺伝子（全ての多型および変異）を含んでいる）は疾患を自発的に発症し、有用な標準化プリオン調製物を作成するために、各マウスからの脳組織を一つにすることができる。標準化プリオン調製物は、１９９９年６月１日に発行された米国特許第５，９０８，９６９号および２０００年２月１日に発行された米国特許第６，０２０，５３７号に説明および開示される。両方ともその全体が本明細書に組み入れられる。
【０１１４】
標準化プリオン調製物は、前記のタイプの組換え宿主哺乳動物のどれを用いても生成することができる。例えば、標準化プリオン調製物は、プリオンに感染しやすいように遺伝子組換えされたマウス、ラット、ウサギ、ハムスター、またはモルモットを用いて生成することができる。このプリオンは、一般的に、乳牛、ヒツジ、シカ、またはウマなどの遺伝的に異なる種にしか感染せず、組換え宿主哺乳動物は、プリオン接種後３５０日以内またはそれより短い期間内でＣＮＳ機能不全の臨床兆候を発症する。一つには、使用するのにマウスが安価であり、トランスジェニックマウスの作成に関する経験が他のタイプの宿主動物の作成に関する経験より多く得られているという理由で、最も好ましい宿主哺乳動物はマウスである。標準化プリオン調製物の作成に関する詳細は米国特許第６，００８，４３５号および同第６，０２０，５３７号に記載されている。両方とも参照として本明細書に組み入れられる。
【０１１５】
一旦、適切なタイプの宿主（例えば、マウス）が選択されると、次の段階は、標準化プリオン処方物を生成するために用いられる適切なタイプの遺伝子操作を選択することである。例えば、マウスは、本発明のキメラ遺伝子の挿入によって遺伝子組換えされたマウスでもよい。このグループ内で、マウスは、高コピー数のキメラ遺伝子の組み込みによって、および／またはキメラ遺伝子の発現レベルを高めるために複数のプロモーターの組み込みによって組換えされてもよい。または、本発明のハイブリッドマウスを使用することができ、ここで、内因性ＰｒＰ遺伝子が切除されたマウスと、ゲノムにウシＰｒＰ遺伝子が挿入されたマウスを交雑させる。もちろん、このようなハイブリッドマウスの様々な下位区分がある。例えば、ウシＰｒＰ遺伝子を高コピー数で挿入してもよく、および／または発現を増強するために複数のプロモーターと共に使用してもよい。さらに別の選択肢では、様々な異なるプリオンに感染しやすい（すなわち、一般的に、２つ以上のタイプの試験動物に感染する）マウスを作成するために複数の異なるＰｒＰ遺伝子をゲノムに挿入することによって、マウスを作成することができる。例えば、乳牛配列の一部を含むキメラ遺伝子、シカ配列の一部を含む別のキメラ遺伝子、およびヒツジ配列の一部を含むさらに別のキメラ遺伝子を含むマウスを作成することができる。３つの異なるタイプのキメラ遺伝子が全てマウスゲノムに挿入されれば、マウスは、一般的に、乳牛、シカ、およびヒツジにしか感染しないプリオンに感染しやすくなるだろう。
【０１１６】
適切な哺乳動物（例えば、マウス）および適切な遺伝子組換え法（例えば、ＭＢｏ２ＭなどのキメラＰｒＰ遺伝子の挿入）を選択した後、次の段階は、プリオン関連遺伝物質の点で実質的に同一である多数のこのような哺乳動物を作成することである。さらに詳しく述べると、作成された各マウスは、実質に同じコピー数でゲノムに存在する同一のキメラ遺伝子を含む。これらのマウスは、マウスの９５％以上が、接種後３５０日以内またはそれより短い期間内でＣＮＳ機能不全の臨床兆候を発症し、マウスの全てが、ほぼ同時に（例えば、３０日以内に）このようなＣＮＳ機能不全を発症するように、プリオン関連遺伝物質の点で遺伝的に十分に同一であるべきである。
【０１１７】
一度に、このようなマウスの大きなグループ、例えば５０匹以上、より好ましくは１００匹以上、さらにより好ましくは５００匹以上が作成される。次の段階は、マウスに、一般的に、遺伝的に異なる哺乳動物にしか感染しないプリオン（例えば、ヒツジ、乳牛、シカ、またはウマなどの有蹄類に由来するプリオン）を接種することである。異なる哺乳動物グループに与える量は異なってもよい。哺乳動物にプリオンを接種した後に、哺乳動物がプリオン感染の症状（例えば、ＣＮＳ機能不全の臨床兆候）を示すまで観察を行う。プリオン感染の症状を示した後、各哺乳動物の脳または脳組織の少なくとも一部が取り出される。取り出された脳組織はホモジナイズされ、標準化プリオン調製物が得られる。
【０１１８】
トランスジェニックマウスグループに、遺伝的に異なる動物に由来するプリオンを接種する代わりとして、プリオン関連疾患を自発的に発症するマウスを作成することが可能である。これは、例えば、極端に多いコピー数の乳牛ＰｒＰ遺伝子をマウスゲノムに組み込ませることによって行うことができる。コピー数を、例えば、１００コピー以上まで増やすと、マウスはＣＮＳ機能不全の臨床兆候を自発的に発症し、脳組織内にはヒトに感染することが可能なプリオンを有する。標準化プリオン調製物を生成するために、これらの動物の脳またはこれらの動物の脳組織の一部を取り出し、ホモジナイズすることができる。
【０１１９】
標準化プリオン調製物は直接使用してもよく、様々な異なる陽性対照を得るように希釈および力価測定してもよい。さらに詳しく述べると、第１の組のトランスジェニック対照マウスに接種するために、様々な既知量のこのような標準化調製物を使用することができる。第２の組の実質的に同一のマウスには、試験しようとする材料（すなわち、プリオンを含む可能性のある材料）が接種される。第３のグループの実質的に同一のマウスにはどの材料も注射しない。次いで、３つのグループを観察する。もちろん、第３のグループは、どの材料も注射しなかったので発症しないはずである。このようなマウスが発症すれば、アッセイ法は不正確である（恐らく、疾患を自発的に発症するマウスを作成した結果が原因である）。標準化調製物を注射した第１のグループが発症しなければ、このアッセイ法も不正確である。なぜなら、一般的に遺伝的に異なる哺乳動物にしか感染しないプリオンを接種した時に発症するように、マウスが正しく作成されなかったためである。しかしながら、第１のグループが発症し、第３のグループが発症しなければ、アッセイ法は正確であるとみなされる。従って、第２のグループが発症しなければ、試験材料はプリオンを含まず、第２のグループが発症すれば、試験材料はプリオンを含んでいる。
【０１２０】
本発明の標準化プリオン調製物を使用することによって、極端に希釈したプリオン含有組成物を作成することが可能である。例えば、１ｐｐｍ以下、さらに１ｐｐｂ以下のプリオンを含む組成物を作成することができる。このような組成物は、プリオンの存在の検出における本発明の抗体、アッセイ法、および方法の感度を試験するのに使用することができる。
【０１２１】
プリオン調製物は、一定量のプリオンを含み、同質遺伝子背景から抽出される点で望ましい。従って、調製物中の汚染物質は一定であり、制御することができる。標準化プリオン調製物は、有蹄類を使用することによって製造された様々な医薬品、製品（食品、化粧品などを含む）にプリオンがもしあれば、その存在を確かめるためにバイオアッセイ法を実施する際に有用である。
【０１２２】
有用な適用
前記で示され、以下で詳細な実施例においてさらに説明されるように、広範囲の異なる抗体（すなわち、異なる特異性を有する抗体）を作成するために本発明の方法を使用することが可能である。例えば、単一の有蹄類種に天然に生じるＰｒＰＣタンパク質にのみ結合し、他の種に天然に生じるＰｒＰＣタンパク質には結合しない抗体を作成することができる。さらに、有蹄類プリオンタンパク質の非感染形態（例えば、ＰｒＰＣ）にのみ結合し、感染形態（例えば、ＰｒＰＳｃ）には結合しないように抗体を設計することができる。次いで、アッセイ法装置を作成するために、単一の抗体または一組の異なる抗体を使用することができる。このようなアッセイ法装置は、当業者に周知の従来の技術を用いて作成することができる。抗体を、周知の技法を用いて精製および単離し、周知の手順を用いて支持体表面に結合させることができる。結果として生じる抗体が結合した表面は、試料が一つまたは複数のタイプの抗体を含むかどうかを確かめるために、試料をインビトロでアッセイするのに使用することができる。
【０１２３】
抗体は、米国特許第５，８９１，６４１号に記載のタイプのＣＤＩアッセイ法を実施する際に最も有用である。さらに、抗体は、治療の際に、ＰｒＰＣに結合させ、それによってＰｒＰＣがＰｒＰＳｃに変換するのを妨げることによって使用することができる。
【０１２４】
商業用アッセイ法
本発明の一態様は、１）効果的にＰｒＰＣを分解し、ＰｒＰＳｃを変性する酵素で試料を消化するか、またはＰｒＰＣを分解するがＰｒＰＳｃを分解しない酵素、次いで、ＰｒＰＳｃを変性する酵素を用いて連続的に処理し、２）本発明の抗体を用いて変性したＰｒＰＳｃを検出することによって、有蹄類試料中のＰｒＰＳｃの検出を可能にする商業用アッセイ法を特徴とする。例えば、ウシＰｒＰタンパク質（すなわち、ＰｒＰＣおよびＰｒＰＳｃ）を含む試料を、プロテイナーゼＫ（ＰＫ）消化を用いて変性することができる。このような酵素の使用はＰｒＰＣを消化するが、ＰｒＰＳｃを消化しない。プロテイナーゼＫ消化後、試料を、ＰｒＰＳｃを変性するようにさらに処理し、適切な結合条件下で本発明の抗体と接触させる。好ましくは、抗体を支持層に結合させ、試料と、抗体が結合した支持層材料が容易に接触できるように配置することができる。材料が支持層上の抗体に結合すれば、感染性ＰｒＰＳｃの存在が確かめられる。
【０１２５】
別の態様において、試験しようとする試料を２つの部分に分割し、一方を、試料中のＰｒＰＣを破壊することなく試料中のＰｒＰＳｃを変性するように消化する。両部分を本発明の抗体と接触させる。抗体は、処理されていない部分のＰｒＰＣならびに処理された部分のＰｒＰＣおよびＰｒＰＳｃの両方に結合する。ＰｒＰＣまたはＰｒＰＣ＋ＰｒＰＳｃの濃度が検出され、試料中のＰｒＰＳｃ量が、２つの試料間の検出可能なシグナルの差から明らかになる。
【０１２６】
本発明の商業的な態様において、サンドイッチ型アッセイ法において本発明の抗体を使用することが望ましい場合もある。さらに詳細に述べると、本発明の抗体を支持層の支持体表面に結合させることができる。試験しようとする変性した試料と支持体表面を結合が可能な条件下で接触させる。その後、未反応部位をブロックし、表面と、表面上のタンパク質に結合する汎用抗体（ｇｅｎｅｒａｌｉｚｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ）を接触させる。汎用抗体は検出可能な標識と結合している。検出可能な標識を有する汎用抗体は、支持体表面上の抗体に結合した変性したＰｒＰＳｃに結合する。結合が起これば、例えば、発色させることで標識は検出可能になり、それにより、試料中のＰｒＰＳｃの存在を間接的に示す標識の存在が分かる。このアッセイ法は、１ｐｐｍ以下、さらに１ｐｐｂ以下の量で存在する変性したＰｒＰＳｃを検出することができる。ＰｒＰＳｃは、（ａ）動物供給源から抽出された治療有効成分を含む薬学的処方物、（ｂ）食品、（ｃ）ヒト供給源から取り出された器官、組織、体液、または細胞、（ｄ）注射可能物質、経口薬、クリーム、座薬、および肺内送達処方物などの動物性製品、（ｅ）化粧品、ならびに（ｆ）哺乳動物細胞培養物から抽出された薬学的に有効な化合物からなる群より選択される供給源に存在してもよい。
【０１２７】
実施例
以下の実施例は、当業者に、本発明を製造および使用する方法の完全な開示および説明を提供するために示され、本発明とみなされるものの範囲を限定することが意図されない。使用された数字（例えば、量、温度、濃度など）を確実なものにするために努力が払われたが、ある程度の実験誤差および偏差を見込んでおくべきである。特に指示のない限り、部は重量部であり、分子量は平均分子量であり、温度は摂氏度であり、圧力は雰囲気圧であるか、または雰囲気圧に近い。
【０１２８】
実施例１：抗ウシ抗体の同定および単離
Ｐｒｎｐ０／０マウスを用いて、ウシＰｒＰＣまたは変性したＰｒＰＳｃを認識する抗体を作成した。マウスを、ＫＬＨに結合した合成ウシＰｒＰＣペプチド（ウシＰｒＰの残基９６−１１５に対応する）で免疫化した。ファージディスプレイライブラリーを、同一抗原に対して高力価の血清を示すマウスに由来する脾臓および骨髄から構築した。その後、本発明者らは、様々な長さの合成ＰｒＰペプチドおよび組換えＰｒＰ抗原に対してライブラリーをパニングし、３２個の異なる陽性クローンを選択した。選択されたクローンをＣＤＩフォーマットのＥＬＩＳＡによってスクリーニングし、脳ホモジネートのウエスタンブロットによって詳細に評価した。抗体形成を刺激するためにマウスにウシペプチドを注射した。次いで、マウスを屠殺し、骨髄細胞および脾臓細胞を取り出した。細胞を溶解し、ＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡに逆転写した。次いで、抗体重鎖および軽鎖（またはその一部）をＰＣＲで増幅した。同定された軽鎖配列を、以下のように単離した。
クローンＰ
2004509858.tif 000004
【０１２９】
単離された重鎖は以下の通りであった。
2004509858.tif 000005
【０１３０】
ＩｇＧファージディスプレイライブラリーは、１つのベクターがベクターの第１の発現カセットに重鎖断片をコードするｃＤＮＡインサートを含み、ベクターの第２の発現カセットに軽鎖断片をコードするｃＤＮＡインサートを含むように、ＩｇＧ重鎖断片をコードする増幅ｃＤＮＡおよび軽鎖をコードする増幅ｃＤＮＡをファージディスプレイベクター（例えば、ｐＣｏｍｂ３ベクター）に挿入することによって構築された。連結されたベクターを、当技術分野において周知の方法を用いて繊維状ファージＭ１３によってパッケージングし、ファージ粒子数を増幅させるために大腸菌培養物に感染するのに使用した。細菌細胞の溶解後、ファージ粒子を単離し、パニング手順に使用した。作成されたライブラリーをウシプリオン含有組成物に対してパニングした。次いで、ウシＰｒＰＣに選択的に結合する抗体断片を単離した（バルバス（Ｂａｒｂａｓ），Ｃ．Ｆ．，ＩＩＩおよびＤ．Ｒ．ブルトン（Ｂｕｒｔｏｎ）（１９９６）Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１４：２３０−２３４；ウィリアムスン（Ｗｉｌｌｉａｍｓｏｎ），Ｒ．Ａ．，Ｄ．プレツ（Ｐｅｒｅｔｚ）ら（１９９６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９３：７２７９−７２８２．；ウィリアムスン，Ｒ．Ａ．，Ｄ．プレツら（１９９８）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：９４１３−９４１８）。組換えマウスＦａｂのＯ、Ｐ、およびＳのエピトープは、ＢｏＰｒＰ（９０−１４５）配列に対応し３残基重複する合成デカペプチドライブラリーを用いてマッピングされた。３つ全てのＦａｂが、ウシＰｒＰの残基９６−１０５の単一線状エピトープのみと反応した。しかしながら、Ｐ抗体は他の種における類似配列に対して広範囲の特異性を示し、共通のエピトープモチーフは、ＨＧ（Ｓ，Ｎ）ＱＷＮＫＰＳＫＰＫＴＮ（配列番号：８および９）とまとめることができる。このエピトープは、ウシ、ミュールジカ、オジロジカ（ｗｈｉｔｅ−ｔａｉｌ ｄｅｅｒ）、ロッドデアー（ｒｏｄ ｄｅｅｒ）、エルク、ラクダ、クーズー、ヤギ、ヒツジ、およびブタを含む全ての有蹄類ＰｒＰ配列に存在する。さらに、このエピトープは、フェレット、ネコ、ミンク、チンパンジー、ゴリラ、オランウータン、プレスビティス（ｐｒｅｓｂｉｔｉｓ）、ウサギ、マウス、ラット、ハムスター、マカク、クモザル、リスザル、ヒヒ、およびマーモセットなどの他の種に由来するＰｒＰ配列にも存在する。従って、Ｐクローンは、前記で列挙された全てのＰｒＰを等しく認識すると予想される。クローンＰを用いた抗体をＥｕ−（ＨｕＭ）Ｆａｂ Ｐとして単離し、クローンＳを用いた抗体をＥｕ−（ＨｕＭ）Ｆａｂ Ｓとして単離した。
【０１３１】
実施例２：マウス脳ホモジネートにおけるキメラウシＰｒＰの検出
構造依存性イムノアッセイ法（ＣＤＩ）を用いて、単離された抗体Ｅｕ−（ＨｕＭ）Ｆａｂ ＰおよびＥｕ−（ＨｕＭ）Ｆａｂ Ｓを、キメラＭＢｏ２Ｍ ＰｒＰを検出する感度について試験した。キメラ組換えタンパク質ｒＰｒＰ（ＭＢｏ２Ｍ）を５％ＰｒＰ０／０マウス脳ホモジネートで希釈し、２種類のウシ抗ＰｒＰＣ抗体を、天然のＰｒＰＣ形態のタンパク質を検出する能力についてについて試験した。簡単に述べると、ＰｒＰタンパク質を発現しないＰｒｎｐ０／０マウスの脳を、氷上で、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中でＰｏｗｅｒＧｅｎホモジナイザー（フィッシャーサイエンティフィク（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ），Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ）に３×３０秒押し付けることでホモジネートした。結果として生じた１０％（ｗ／ｖ）ホモジネートを卓上遠心分離器で５００ｇで５分間回転させた。上清を、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）に溶解した４％サルコシルと１：１で混合した。精製組換えＰｒＰ（ＭＢｏ２Ｍ）をホモジネートで希釈し、各試料を２つのアリコート：（１）処理されないアリコート（天然のアリコートと呼ぶ）；（２）最終４Ｍ Ｇｄｎ ＨＣＩと混合し、８０〜１００℃で５分間加熱したアリコート（変性したアリコートと呼ぶ）に分けた。両試料をＨ２Ｏで２０倍に希釈し、ＰＢＳに溶解した０．２％グルタルアルデヒドで１時間活性化したポリスチレンプレートの上にアリコートを置いた。５℃で一晩インキュベートしたプレートを、０．５％ＢＳＡ（ｗ／ｖ）および６％ソルビトール（ｗ／ｖ）を含むＴＢＳ（ｐＨ７．８）でブロックした。
【０１３２】
試料を、０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ ２０を含むＴＢＳ（ｐＨ７．８）で３回洗浄し、ユーロピウム標識キメラ組換えＦａｂ ＰおよびＳと２時間インキュベートした。ユーロピウム標識供給業者（ワラック（Ｗａｌｌａｃ Ｉｎｃ．），Ｔｕｒｋｕ，Ｆｉｎｌａｎｄ）により供給された強化液（ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）でさらに洗浄した後にプレートを発色させ、Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（パッカード（Ｐａｃｋａｒｄ Ｉｎｃ．））時間分解蛍光分光計を用いてシグナルを評価した。記載のように（サファー（Ｓａｆａｒ），Ｊ．，Ｈ．ウィリー（Ｗｉｌｌｉｅ）ら（１９９８）Ｎａｔ．Ｍｅｄ，４（１０）：１１５７−１１６５）、ＰｒＰ濃度を計算し、様々な抗体濃度に対してプロットした（図３）。データ点およびバーは平均濃度を表す。ＳＥＭは、抗体濃度１μｇ／ｍｌでの３回の独立した実験から得た。両組換え抗体におけるユーロピウム密度は４．３Ｅｕ／Ｆａｂである。
【０１３３】
実施例３：マウス脳ホモジネートにおけるウシＰｒＰＳｃの検出感度
Ｅｕ−（ＨｕＭ）Ｆａｂ Ｐを用いて、ＢＳＥ感染Ｔｇ（ＢｏＰｒＰ）マウス脳ホモジネート中のウシＰｒＰＳｃを検出した。実施例２に記載のように調製した、２％サルコシル（ｗ／ｖ）に溶解したＢＳＥ感染５％（ｗ／ｖ）脳ホモジネートの連続希釈を含む試料を、ＣＤＩの前に、５μｇ／ｍｌプロテイナーゼＫで処理し、０．３％（ｗ／ｖ）ＮａＰＴＡおよび１．７ｍＭ ＭｇＣＬ２で濃縮した。ＰＴＡ沈殿の後、各試料を２つのアリコート：（１）処理されないアリコート（天然のアリコートと呼ぶ）；（２）４Ｍ Ｇｄｎ ＨＣｔと混合し、８０〜１００℃で５分間加熱したアリコート（変性したアリコートと呼ぶ）に分けた。両試料をＨ２Ｏで２０倍に希釈し、ＰＢＳに溶解した０．２％グルタルアルデヒドで１時間活性化したポリスチレンプレートの上にアリコートを置いた。５℃で一晩インキュベートしたプレートを、０．５％ＢＳＡ（ｗ／ｖ）および６％ソルビトール（ｗ／ｖ）を含むＴＢＳ（ｐＨ７．８）でブロックした。次いで、試料を、０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ ２０を含むＴＢＳ（ｐＨ７．８）で３回洗浄し、ユーロピウム標識キメラ組換えＦａｂ ＰおよびＳと２時間インキュベートした。ユーロピウム標識供給業者（ワラック，Ｔｕｒｋｕ，Ｆｉｎｌａｎｄ）により供給された強化液によるさらに７回の洗浄段階後に、プレートを発色させた。Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（パッカード）時間分解蛍光分光計を用いてシグナルを評価し、記載のように（サファー，Ｊ．，Ｈ．ウィリーら（１９９８）Ｎａｔ．Ｍｅｄ，４（１０）：１１５７−１１６５）、ＰｒＰ濃度を計算した。各試料からの天然のアリコートおよび変性したアリコートをグルタルアルデヒド活性化ＥＬＩＳＡプレートに架橋させ、両アリコートをユーロピウム標識（ＨｕＭ）Ｆａｂ Ｐ抗体とインキュベートした。洗浄後、Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（パッカード）時間分解蛍光分光計を用いてシグナルを評価した。結果は、各試料の変性した（ＴＲＦＤ）アリコートおよび天然の（ＴＲＦＮ）アリコートからのシグナルの比（図４）または差（図５）として表す。ＢｏＰｒＰｓｃの検出のダイナミックレンジは１００，０００倍であることが分かった。
【０１３４】
実施例４：乳牛脳ホモジネートにおけるウシＰｒＰＳｃの検出感度
Ｅｕ−（ＨｕＭ）Ｆａｂ Ｐを用いて、ＢＳＥ感染乳牛のホモジネート中のウシＰｒＰＳｃも検出した。ＢＳＥ感染乳牛および正常な乳牛の脳を、氷上で、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中でＰｏｗｅｒＧｅｎホモジナイザー（フィッシャーサイエンティフィク，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ）に３×３０秒押し付けることでホモジネートした。結果として生じた１０％（ｗ／ｖ）ホモジネートを卓上遠心分離器で５００ｇで５分間回転させた。上清を、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）に溶解した４％サルコシルと１：１で混合した。６つのＢＳＥ感染脳ホモジネートを正常乳牛脳ホモジネートで連続希釈し、各アリコートを、まず最初に、５μｇ／ｍｌプロテイナーゼＫで３７℃で１時間処理した。０．５ｍＭ ＰＭＳＦおよびアプロチニンおよびロイペプチン（各２μｇ／ｍｌ）で反応物をブロックした後、記載のように（サファー，Ｊ．，Ｈ．ウィリーら（１９９８）Ｎａｔ．Ｍｅｄ，４（１０）：１１５７−１１６５）、試料をＮａＰＴＡおよびＭｇＣｌ２で沈殿させ、各試料を２つのアリコート：（１）処理されないアリコート（天然のアリコートと呼ぶ）；（２）４Ｍ Ｇｄｎ ＨＣＩと混合し、８０〜１００℃で５分間加熱したアリコート（変性したアリコートと呼ぶ）に分けた。両試料をＨ２Ｏで２０倍に希釈し、ＰＢＳに溶解した０．２％グルタルアルデヒドで１時間活性化したポリスチレンプレートの上にアリコートを置いた。５℃で一晩インキュベートしたプレートを、０．５％ＢＳＡ（ｗ／ｖ）および６％ソルビトール（ｗ／ｖ）を含むＴＢＳ（ｐＨ７．８）でブロックした。
【０１３５】
試料を、０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ ２０を含むＴＢＳ（ｐＨ７．８）で３回洗浄し、ユーロピウム標識キメラ組換えＦａｂ Ｐと２時間インキュベートした。ユーロピウム標識供給業者（ワラック，Ｔｕｒｋｕ，Ｆｉｎｌａｎｄ）により供給された強化液によるさらなる洗浄段階後に、プレートを発色させた。Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（パッカード）時間分解蛍光分光計を用いてシグナルを評価し、記載のように（サファー，Ｊ．，Ｈ．ウィリーら（１９９８）Ｎａｔ．Ｍｅｄ，４（１０）：１１５７−１１６５）、ＰｒＰ濃度を計算した。Ｅｕ−（ＨｕＭ）Ｆａｂ Ｐを用いて、ウシＰｒＰＳｃ がＢＳＥ感染英国産乳牛の脳ホモジネート中に検出された。ＢｏＰｒＰＳｃの検出のダイナミックレンジは、２％サルコシル（ｗ／ｖ）に溶解したＢＳＥ感染５％（ｗ／ｖ）脳ホモジネートの連続希釈を含む試料中で１００，０００倍である。この試料は、ＣＤＩの前に、５μｇ／ｍｌプロテイナーゼＫで処理され、０．３％（ｗ／ｖ）ＮａＰＴＡおよび１．７ｍＭ ＭｇＣＬ２で濃縮された。各試料の天然のアリコートおよび変性したアリコートをインキュベートし、各試料からの変性した（ＴＲＦＤ）アリコートおよび天然の（ＴＲＦＮ）アリコートからのＤｉｓｃｏｖｅｒｙ（パッカード）時間分解蛍光分光計を用いて評価した。結果は、各試料の変性した（ＴＲＦＤ）アリコートおよび天然の（ＴＲＦＮ）アリコートからのシグナルの比（図６）または差（図７）として表す。
【０１３６】
実施例５：感染乳牛脳ホモジネートにおけるウシＰｒＰＳｃに対する抗体の株感度
ＢＳＥ株の特徴の差によるＥｕ−（ＨｕＭ）Ｆａｂ Ｐ検出の差を、３２匹の異なるＢＳＥ感染英国産乳牛からのホモジネートを用いて確かめた。３２匹のＢＳＥ感染乳牛および７匹の正常な米国産乳牛の脳を、氷上で、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中でＰｏｗｅｒＧｅｎホモジナイザー（フィッシャーサイエンティフィク，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ）に３×３０秒押し付けることでホモジネートした。結果として生じた１０％（ｗ／ｖ）ホモジネートを卓上遠心分離器で５００ｇで５分間回転させた。上清を、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）に溶解した４％サルコシルと１：１で混合した。ＢＳＥ感染脳ホモジネートを非接種Ｔｇ（Ｂｏ）マウスホモジネートで連続希釈し、各アリコートを、まず最初に、５μｇ／ｍｌプロテイナーゼＫで３７℃で１時間処理した。０．５ｍＭ ＰＭＳＦおよびアプロチニンおよびロイペプチン（各２μｇ／ｍｌ）で反応物をブロックした後、記載のように（サファー，Ｊ．，Ｈ．ウィリーら（１９９８）Ｎａｔ．Ｍｅｄ，４（１０）：１１５７−１１６５）、試料をＮａＰＴＡおよびＭｇＣｌ２で沈殿させ、各試料を２つのアリコート：（１）処理されないアリコート（天然のアリコートと呼ぶ）；（２）４Ｍ Ｇｄｎ ＨＣＩと混合し、８０〜１００℃で５分間加熱したアリコート（変性したアリコートと呼ぶ）に分けた。両試料をＨ２Ｏで２０倍に希釈し、ＰＢＳに溶解した０．２％グルタルアルデヒドで１時間活性化したポリスチレンプレートの上にアリコートを置いた。５℃で一晩インキュベートしたプレートを、０．５％ＢＳＡ（ｗ／ｖ）および６％ソルビトール（ｗ／ｖ）を含むＴＢＳ（ｐＨ７．８）でブロックした。
【０１３７】
次いで、試料を、０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ ２０を含むＴＢＳ（ｐＨ７．８）で３回洗浄し、ユーロピウム標識キメラ組換えＦａｂ Ｐと２時間インキュベートした。ユーロピウム標識供給業者（ワラック，Ｔｕｒｋｕ，Ｆｉｎｌａｎｄ）により供給された強化液によるさらなる洗浄段階後に、プレートを発色させた。Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（パッカード）時間分解蛍光分光計を用いてシグナルを評価し、記載のように（サファー，Ｊ．，Ｈ．ウィリーら（１９９８）Ｎａｔ．Ｍｅｄ，４（１０）：１１５７−１１６５）、ＰｒＰ濃度を計算した。ＰｒＰ２７−３０濃度を、３２匹のＢＳＥ感染英国産乳牛および１２匹の米国産対照でのＣＤＩによって求められた変性／天然の比に対してプロットした（図８）。このデータは平均±ＳＥＭとして表す。以前に記載されたように（サファー，Ｊ．，Ｈ．ウィリーら（１９９８）Ｎａｔ．Ｍｅｄ，４（１０）：１１５７−１１６５）、ＰｒＰ２７−３０濃度を計算した。
【０１３８】
実施例６：Ｅｕ−（ＨｕＭ）Ｆａｂ Ｐの異種間感度
次いで、ミュールジカ、エルク、およびオジロジカを含む様々な有蹄類種においてプリオンを検出する能力について、Ｅｕ−（ＨｕＭ）Ｆａｂ Ｐ抗体を試験した。慢性消耗病（ＣＷＤ）に感染したミュールジカ、エルク、オジロジカ、および正常対照の脳ホモジネートを、これらの異なる種においてＥｕ−（ＨｕＭ）Ｆａｂ Ｐ抗体がプリオンを認識する能力を確かめるために実施例４と同様に処理した。ＰｒＰＳｃに対するＣＤＩ試験の結果を図９および１０に示す。結果は、各試料の変性した（ＴＲＦＤ）アリコートおよび天然の（ＴＲＦＮ）アリコートからの時間分解蛍光（ＴＲＦ）シグナルの比（図９）または差（図１０）として表す。
【０１３９】
実施例７：ＣＷＤに感染したシカにおけるプリオンの検出
Ｅｕ（ＨｕＭ）Ｆａｂ Ｐを用いて、ＣＷＤに感染したシカのホモジネートにおいてシカＰｒＰＳｃを検出した。２％サルコシル（ｗ／ｖ）に溶解したＣＷＤ感染５％（ｗ／ｖ）脳ホモジネートの連続希釈を含む試料を、ＣＤＩの前に、５μｇ／ｍｌプロテイナーゼＫで処理し、０．３％（ｗ／ｖ）ＮａＰＴＡおよび１．７ｍＭ ＭｇＣＬ２で濃縮した。各試料からの天然のアリコートおよび変性したアリコートをグルタルアルデヒド活性化ＥＬＩＳＡプレートに架橋させ、両アリコートをユーロピウム標識（ＨｕＭ）Ｆａｂ Ｐ抗体とインキュベートした。７回の洗浄段階後、Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（パッカード）時間分解蛍光分光計を用いてシグナルを評価した。結果は、各試料の変性した（ＴＲＦＤ）アリコートおよび天然の（ＴＲＦＮ）アリコートからのシグナルの比（図１１）または差（図１２）として表す。
【０１４０】
実施例８
スクレイピー感染シリアンハムスターの脳ホモジネートを用いた以下の実施例においてアッセイ法が証明される。これは、乳牛または有蹄類の脳に適用された方法と同様に行った。ホモジネートをＰｒｎＰ０／０マウス脳ホモジネートで４倍に希釈する。
【０１４１】
ａ）各プレートを、変性したＳＨａＰｒＰ９０−２３１の５つの希釈点からなる内部標準で校正する。総ＰｒＰの時間分解蛍光（ＴＲＦ）をＥｕ標識３Ｆ４ ＩｇＧで発色させ、時間分解蛍光値をＰｒＰ濃度の関数としてプロットする。データを、最小２乗法を用いて一次方程式または多項方程式にフィットさせ、変性したＰｒＰの計算のために最も良い関数を選択する。
2004509858.tif 000006
【０１４２】
ｂ）残りのプレートにおいて、スクレイピー感染シリアンハムスター脳ホモジネートの天然のアリコートおよび変性したアリコートを４倍に希釈し、プラスチック支持体に架橋させ、Ｅｕ標識３Ｆ４ ＩｇＧとインキュベートした。前記の式に従って、総ＰｒＰ含有量を、変性した試料の蛍光シグナルから計算した。
【０１４３】
【表２】
2004509858.tif 000007
【０１４４】
ｃ）変性した試料と天然の試料との蛍光シグナルの比を計算する。
【表３】
2004509858.tif 000008
【０１４５】
正常ハムスター脳ホモジネートから求められたＰｒＰＣの正常値は２．２である。２．２を超える値は異常とみなされ、ＰｒＰＳｃの存在を示す。
【０１４６】
ｄ）天然の状態から変性した状態に移行した際の、αヘリックスＰｒＰついて予想される蛍光シグナルを超える過剰な蛍光シグナルはＰｒＰＳｃの量の尺度であり、示された式に従って計算される。
ΔＦβｎ→ｄ＝Ｆｄ−（Ｆｎ＊ｆαｎ→ｄ）　　　　（２）
式中、ｆは、ＰｒＰＣが天然の状態から変性した状態に移行した際の蛍光シグナルの要因の最大値である。Ｆｄは変性した試料の蛍光であり、Ｆｎは天然の試料の蛍光である。次いで、ＰｒＰＳｃ量が、ΔＦβｎ→ｄおよび式（１）から計算される。
【０１４７】
【表４】
2004509858.tif 000009
【０１４８】
βシート形態のプリオンタンパク質に対して計算された正の値は、ＰｒＰＳｃの存在を示す。
【０１４９】
本発明は、本発明の特定の態様を参照して説明したが、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、様々な変更が可能であり、等価物で置換できることが当業者に理解されるはずである。さらに、特定の状況、材料、物質の組成物、プロセス、一つまたは複数のプロセス段階を本発明の目的、精神、および範囲に合うように、多くの変更を加えることができる。全てのこのような変更は、添付の特許請求の範囲内にあることが意図される。
【図面の簡単な説明】
【図１】本明細書で説明および開示される抗ウシ抗体を用いた、構造依存性イムノアッセイ法（ＣＤＩ）の工程の流れ図である。
【図２】マウスＰｒＰのアミノ酸配列を示し、マウスＰｒＰとウシＰｒＰとの差を具体的に示す。
【図３】Ｅｕ−（ＨｕＭ）Ｆａｂ ＰおよびＥｕ−（ＨｕＭ）Ｆａｂ ＳによるキメラＭＢｏ２Ｍ ＰｒＰの検出における構造依存性イムノアッセイ法（ＣＤＩ）の感度を示す。
【図４および５】Ｅｕ−（ＨｕＭ）Ｆａｂ Ｐを用いてＢＳＥ感染Ｔｇ（ＢｏＰｒＰ）マウスの脳ホモジネート中にウシＰｒＰｓｃを検出するためのＣＤＩの感度を示す。
【図６および７】Ｅｕ−（ＨｕＭ）Ｆａｂ Ｐを用いてＢＳＥ感染英国産乳牛の脳ホモジネート中にウシＰｒＰＳｃを検出するためのＣＤＩの感度を示す。
【図８】３２匹のＢＳＥ感染英国産乳牛および１２匹の非感染米国産対照におけるＣＤＩによって確かめられた、変性／天然比に対してプロットされたＰｒＰ２７−３０の濃度を示す。
【図９および１０】慢性消耗病（ＣＷＤ）に感染したミュールジカ、エルク、オジロジカ、および正常対照におけるＰｒＰＳｃについてのＣＤＩ試験の結果を示す。
び正常対照におけるＰｒＰＳｃについてのＣＤＩ試験の結果を示す。
【図１１および１２】Ｅｕ−（ＨｕＭ）Ｆａｂ Ｐを用いてＣＷＤ感染シカの前頭皮質におけるシカＰｒＰＳｃを検出するためのＣＤＩの感度を示す。シカＰｒＰＳｃ検出のダイナミックレンジは１００，０００倍である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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