(57)【要約】ヘルパー依存性アデノウイルスベクター系が提供される。本ヘルパー依存性アデノウイルスベクター系は、以下のものを含む：(1)ベクター上に存在するコード配列のインビボでの長期間、高レベルの発現を提供するシス作用ヒトスタッファーDNAを含む「ガットレス（gutless）」アデノウイルスベクター；(2)リコンビナーゼ認識部位に隣接するアデノウイルスゲノム領域を有することを特徴とするアデノウイルスヘルパーベクターであり、そのヘルパーベクターがアデノウイルスゲノム領域の外側に位置する非哺乳動物のエンドヌクレアーゼ認識部位をさらに含むアデノウイルスヘルパーベクター；および(3)対応するリコンビナーゼおよびエンドヌクレアーゼ、加えてアデノウイルスのプレターミナルタンパク質およびポリメラーゼタンパク質を発現する哺乳動物細胞。また、アデノウイルスのキャプシドに包まれた本ヘルパー依存性アデノウイルスベクターを有するビリオンを作製するために本系を用いる方法も提供される。さらに、本方法の実施において使用されるキットが提供される。
2004532039.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の(a)〜(d)を含むヘルパー依存性アデノウイルスベクター：
(a)少なくとも1つの制限エンドヌクレアーゼ部位；
(b)スタッファー領域；および
(c)パッケージング配列；
(d)構成要素(a)、(b)および(c)がアデノウイルスITR配列に隣接していること。
【請求項２】
スタッファー領域が、ベクター上に存在するコード配列の高レベルおよび長期間のインビボでの発現を提供するヒトゲノム核酸に見出される1つまたは複数のシス作用配列を有する核酸を含む、請求項1記載のヘルパー依存性アデノウイルスベクター。
【請求項３】
少なくとも1つの制限エンドヌクレアーゼ部位が、別個の複数の制限エンドヌクレアーゼ部位を含むマルチクローニング部位の一部である、請求項1記載のヘルパー依存性アデノウイルスベクター。
【請求項４】
ベクターが発現カセットをさらに含む、請求項1記載のヘルパー依存性アデノウイルスベクター。
【請求項５】
発現カセットが、DNA挿入媒介酵素により認識される部位に隣接する該発現カセットを含む組み込みエレメントに存在する、請求項4記載のヘルパー依存性アデノウイルスベクター。
【請求項６】
DNA挿入媒介酵素がトランスポザーゼであり、かつ組み込みエレメントがトランスポゾンである、請求項5記載のヘルパー依存性アデノウイルスベクター。
【請求項７】
DNA挿入媒介酵素がインテグラーゼである、請求項5記載のヘルパー依存性アデノウイルスベクター。
【請求項８】
ベクターがDNA挿入媒介酵素についてのコード配列をさらに含む、請求項5記載のヘルパー依存性アデノウイルスベクター。
【請求項９】
組み込みエレメントが、互いに組換えを行うリコンビナーゼ認識部位に隣接している、請求項5記載のヘルパー依存性アデノウイルスベクター。
【請求項１０】
ベクターが直鎖状核酸である、請求項1記載のヘルパー依存性アデノウイルスベクター。
【請求項１１】
ベクターがアデノウイルスのキャプシドを含むビリオンに存在している、請求項1記載のヘルパー依存性アデノウイルスベクター。
【請求項１２】
ベクターが環状核酸である、請求項1記載のヘルパー依存性アデノウイルスベクター。
【請求項１３】
以下の(a)および(b)を含むアデノウイルスヘルパーベクター：
(a)互いに組換えを行う第一と第二のリコンビナーゼ認識部位の間の第一の領域に位置するアデノウイルスベクターコード配列またはその部分；および
(b)エンドヌクレアーゼ認識部位が該第一の領域以外の領域に位置している、哺乳動物ゲノム配列に見出されない少なくとも1つのエンドヌクレアーゼ認識部位。
【請求項１４】
第一および第二のリコンビナーゼ認識部位がlox部位である、請求項13記載のアデノウイルスヘルパーベクター。
【請求項１５】
エンドヌクレアーゼ認識部位が、約15ヌクレオチドから約25ヌクレオチド長までの範囲であるヌクレオチドの非パリンドローム配列である、請求項13記載のアデノウイルスヘルパーベクター。
【請求項１６】
エンドヌクレアーゼ認識部位が18 bp I-SceI部位である、請求項15記載のアデノウイルスヘルパーベクター。
【請求項１７】
ベクターが直鎖状である、請求項13記載のアデノウイルスヘルパーベクター。
【請求項１８】
ベクターがアデノウイルスのキャプシドを含むビリオンに存在している、請求項17記載のアデノウイルスヘルパーベクター。
【請求項１９】
ベクターが環状である、請求項13記載のアデノウイルスヘルパーベクター。
【請求項２０】
以下の(a)〜(d)を安定的に発現する哺乳動物細胞：
(a)リコンビナーゼ；
(b)哺乳動物細胞に見出されない配列を認識するエンドヌクレアーゼ；
(c)アデノウイルスのプレターミナルタンパク質；および
(d)アデノウイルスのポリメラーゼ。
【請求項２１】
リコンビナーゼがCreリコンビナーゼである、請求項20記載の哺乳動物細胞
【請求項２２】
エンドヌクレアーゼが、約15ヌクレオチドから約25ヌクレオチド長までの範囲であるヌクレオチドの非パリンドローム配列を認識する、請求項20記載の哺乳動物細胞。
【請求項２３】
エンドヌクレアーゼがI-SceIである、請求項20記載の哺乳動物細胞。
【請求項２４】
細胞が改変されたヒト細胞である、請求項20記載の哺乳動物細胞。
【請求項２５】
細胞が不死化された細胞である、請求項24記載の哺乳動物細胞。
【請求項２６】
細胞が改変された293細胞である、請求項25記載の哺乳動物細胞。
【請求項２７】
請求項20記載の哺乳動物細胞の収集物。
【請求項２８】
以下の(a)〜(c)を含む、アデノウイルスベクターの作製において使用される系：
(a) (i)少なくとも1つの制限エンドヌクレアーゼ部位；
(ii)該ベクター上に存在するコード配列の高レベルおよび長期間のインビボでの発現を提供するヒトゲノム核酸に見出される1つまたは複数のシス作用配列を有する核酸を含むスタッファー領域；および
(iii)パッケージング配列
を含み、構成要素(i)、(ii)および(iii)がアデノウイルスのITR配列に隣接している、ヘルパー依存性アデノウイルスベクター；
(b) (i)互いに組換えを行い、かつ第一のリコンビナーゼにより認識される第一と第二のリコンビナーゼ認識部位の間の第一の領域に位置するアデノウイルスベクターコード配列またはその部分；および
(ii)エンドヌクレアーゼ認識部位が該第一の領域以外である領域に位置している、哺乳動物ゲノム配列に見出されない少なくとも1つのエンドヌクレアーゼ認識部位
を含む、アデノウイルスヘルパーベクター；ならびに
(c) (i)該第一のリコンビナーゼ；
(ii)哺乳動物ゲノム配列に見出されない該エンドヌクレアーゼ認識部位を認識するエンドヌクレアーゼ；
(iii)アデノウイルスのプレターミナルタンパク質；および
(iv)アデノウイルスのポリメラーゼ
を安定的に発現する哺乳動物細胞。
【請求項２９】
第一のリコンビナーゼがCreリコンビナーゼであり、かつ第一および第二のリコンビナーゼ認識部位がlox部位である、請求項28記載の系。
【請求項３０】
エンドヌクレアーゼがI-SceIである、請求項28記載の系。
【請求項３１】
哺乳動物細胞が不死化されたヒト細胞である、請求項28記載の系。
【請求項３２】
不死化されたヒト細胞が改変された293細胞である、請求項31記載の系。
【請求項３３】
ヘルパー依存性アデノウイルスベクターが発現カセットを含む、請求項28記載の系。
【請求項３４】
発現カセットが、DNA挿入媒介酵素により認識される部位に隣接する該発現カセットを含む組み込みエレメントに存在している、請求項33記載の系。
【請求項３５】
DNA挿入媒介酵素がトランスポザーゼであり、かつ組み込みエレメントがトランスポゾンである、請求項34記載の系。
【請求項３６】
DNA挿入媒介酵素がインテグラーゼである、請求項35記載の系。
【請求項３７】
組み込みエレメントが、互いに組換えを行い、かつ第二のリコンビナーゼにより認識されるが第一のリコンビナーゼにより認識されない第三および第四のリコンビナーゼ認識部位に隣接している、請求項34記載の系。
【請求項３８】
以下の段階を含む、ビリオンを作製する方法：
(a)請求項20記載の細胞を(i)請求項1記載のヘルパー依存性アデノウイルスベクターおよび(ii)請求項20記載のアデノウイルスヘルパーベクターに接触させる段階であって、該接触段階により、該ヘルパー依存性アデノウイルスベクターおよび該アデノウイルスヘルパーベクターが該細胞へ侵入する段階；および
(b)該ビリオンがアデノウイルスのキャプシドに包まれた該ヘルパー依存性アデノウイルスベクターを含む、該ビリオンを産生するのに十分な条件下で該細胞を維持する段階。
【請求項３９】
細胞が複数のビリオンを産生する、請求項38記載の方法。
【請求項４０】
複数のビリオンが、アデノウイルスのキャプシドに包まれているアデノウイルスヘルパーベクターを含むコンタミネーションビリオンを含むビリオンを実質的に含まない、請求項38記載の方法。
【請求項４１】
キットが以下の(a)〜(c)を含む、アデノウイルスのキャプシドタンパク質に包まれたヘルパー依存性アデノウイルスベクターを含むビリオンの調製において使用されるキット：
(a) (i)少なくとも1つの制限エンドヌクレアーゼ部位；
(ii)該ベクター上に存在するコード配列の高レベルおよび長期間のインビボでの発現を提供するヒトゲノム核酸に見出される1つまたは複数のシス作用配列を有する核酸を含むスタッファー領域；および
(iii)パッケージング配列
を含み、構成要素(i)、(ii)および(iii)がアデノウイルスのITR配列に隣接している、ヘルパー依存性アデノウイルスベクター；
(b) (i)互いに組換えを行い、第一と第二のリコンビナーゼ認識部位の間の第一の領域に位置するアデノウイルスベクターコード配列またはその部分；および
(ii)エンドヌクレアーゼ認識部位が該第一の領域以外である領域に位置している、哺乳動物ゲノム配列に見出されない少なくとも1つのエンドヌクレアーゼ認識部位
を含む、アデノウイルスヘルパーベクター；ならびに
(c) (i)該アデノウイルスヘルパーベクターの該第一および第二のリコンビナーゼ認識部位を認識するリコンビナーゼ；
(ii)哺乳動物細胞に見出されない該エンドヌクレアーゼ認識部位を認識するエンドヌクレアーゼ；
(iii)アデノウイルスのプレターミナルタンパク質；および
(iv)アデノウイルスのポリメラーゼ
を安定的に発現する哺乳動物細胞。
【請求項４２】
リコンビナーゼがCreリコンビナーゼであり、かつ第一および第二のリコンビナーゼ認識部位がlox部位である、請求項41記載のキット。
【請求項４３】
エンドヌクレアーゼがI-SceIである、請求項41記載のキット。
【請求項４４】
哺乳動物細胞が不死化されたヒト細胞である、請求項41記載のキット。
【請求項４５】
不死化されたヒト細胞が改変された293細胞である、請求項44記載のキット。
【請求項４６】
組み込みエレメントを含むアデノウイルスベクター。
【請求項４７】
組み込みエレメントが発現カセットである、請求項46記載のアデノウイルスベクター。
【請求項４８】
標的細胞を請求項1または請求項46記載のアデノウイルスベクターに接触させる段階を含む、核酸を標的細胞へ導入する方法。
【請求項４９】
核酸が発現カセットである、請求項48記載の方法。
【請求項５０】
核酸を標的細胞の染色体へ組み込む方法である、請求項48記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
合衆国法典35巻第119条(e)項により、本出願は、2001年3月26日に出願された米国仮特許出願第60/278,972号および2001年4月16日に出願された米国仮特許出願第60/284,335号の出願日への優先権を主張する；それらの開示は参照として本明細書に組み入れられている。
【０００２】
謝辞
本発明は、国立衛生研究所により授与された助成金番号第NIH DK 49022号における米国政府援助の下で行われた。米国政府は本発明において一定の権利を有する。
【０００３】
序論
発明の分野
本発明の分野は、ベクター、詳しくはウイルスベクター、およびより詳しくはアデノウイルスベクターである。
【背景技術】
【０００４】
発明の背景
すべてのウイルス遺伝子を欠損するアデノウイルスベクターは、インビトロおよびインビボでの安全かつ効率的な遺伝子移入のための有望な道具である(Schiednerら、1998、Nat Genet 18:180-183; Balagueら、2000、Blood 95:820-828)。アデノウイルスは、広い範囲の細胞型の高力価、効率的感染を生じる能力、ならびに分裂細胞および非分裂細胞に感染する能力を含め、他のウイルスに基づく遺伝子治療法を凌ぐいくつかの利点をもつ(Wickhamら、1996、Nat Biotechnol 14:1570-1573)。しかしながら、これらのベクターをより効率的かつ安全なものにするために、アデノウイルスベクターのさらなる開発が必要である。
【０００５】
第一世代E1欠損アデノウイルスは、免疫原性ウイルスタンパク質の産生の毒性作用を示す。それゆえ、Cre-loxP HD系は、すべてのウイルスのコード配列が除去された組換えアデノウイルスを生じるように開発された(Parksら、1996, Proc Natl Acad Sci USA. 93:8027-8034)。この系で使用されるヘルパー-ウイルスは、ガッティド（gutted）アデノウイルスへすべてのアデノウイルス遺伝子をトランスに提供する。これらのヘルパー-ウイルスのパッケージングシグナルは、安定的に発現するCreリコンビナーゼ発現細胞において、ヘルパー-ウイルスゲノムのパッケージングを阻害するためにloxP部位に隣接している。残念なことに、精製をもってしても、ヘルパー-ウイルスのコンタミネーションレベルが約0.1％のままであり、このコンタミネーションは、遺伝子治療法のためのガッティドアデノウイルスをより安全にするために、さらに減少させなければならない。
【０００６】
従って、次世代アデノウイルスベクターの開発に大いに関心が寄せられている。特に関心対象となるのは、さらに低レベルのヘルパーベクターのコンタミネーションレベルで作製されうる、現在有効なガットレス（gutless）アデノウイルスベクターのすべての恩典を享受するアデノウイルスベクターの開発であると考えられる。また関心対象となるのは、標的細胞ゲノムへ組み込むことができるそのようなベクターの開発であると思われる。
【０００７】
関連文献
対象となる米国特許は、第5,919,676号；第6,066,478号；第6,080,569号；および第6,156,497号を含む。対象となる公開されたPCT出願は、国際公開公報第98/13510号；第99/27101号；第00/22106号；第00/49166号；および第00/52187号を含む。対象となる追加の参照文献は以下のものを含む：Balagueら、Blood(2000) 95:820-828; Hartigan-O'Connorら、J Virol. (1999) 73:7835-7841; Lieberら、J Virol. (1996) 70:8944-8960; Morralら、(1999) Proc Natl Acad Sci USA. 96:12816-12821; Parksら、(1996) Proc Natl Acad Sci USA. 93:8027-8034; Parksら、J Virol. (1999) 73:13565-13570; Sandigら、Proc Natl Acad Sci USA (2000) 97:1002-1007; Schiednerら、Nat Genet (1998) 18:180-183;およびZhengら、Nature Biotechnol (2000) 18:176-180。対象となる追加の背景参照文献は、Robbinsら、Tibtech(1998) 16:35-40；およびKayら、Nat. Med. (2001) 33-40を含む。
【発明の開示】
【０００８】
発明の概要
ヘルパー依存性アデノウイルスベクター系が提供される。本ヘルパー依存性アデノウイルスベクター系は以下のものを含む：(1)「ガットレス（gutless）」アデノウイルスベクターであって、ある特定の態様において、ベクター上に存在するコード配列のインビボでの長期間、高レベル発現を提供するシス作用のヒトスタッファーDNAを含み、ある特定の態様において、そのベクターが組み込みドメインを含む；(2)リコンビナーゼ認識部位に隣接するアデノウイルスのゲノム領域を有することを特徴とするアデノウイルスヘルパーベクターであって、そのヘルパーベクターがアデノウイルスのゲノム領域の外側に位置する非哺乳動物のエンドヌクレアーゼ認識部位をさらに含む；および(3)対応するリコンビナーゼおよびエンドヌクレアーゼ、加えてアデノウイルスのプレターミナルタンパク質およびポリメラーゼタンパク質を発現する哺乳動物細胞。また、アデノウイルスのキャプシドに包まれた本ヘルパー依存性アデノウイルスベクターを有するビリオンを作製するために本系を使用する方法が提供される。さらに、本方法の実施において使用されるキットが提供される。
【０００９】
特定の態様の説明
ヘルパー依存性アデノウイルスベクター系が提供される。本ヘルパー依存性アデノウイルスベクター系は以下のものを含む：(1)「ガットレス」アデノウイルスベクターであって、ある特定の態様において、ベクター上に存在するコード配列のインビボでの長期間、高レベル発現を提供するシス作用のヒトスタッファーDNAを含み、ある特定の態様において、そのベクターが組み込み核酸ドメインを含む；(2)リコンビナーゼ認識部位に隣接するアデノウイルスのゲノム領域を有することを特徴とするアデノウイルスヘルパーベクターであって、そのヘルパーベクターがアデノウイルスのゲノム領域の外側に位置する非哺乳動物のエンドヌクレアーゼ認識部位をさらに含む；および(3)対応するリコンビナーゼおよびエンドヌクレアーゼ、加えてアデノウイルスのプレターミナルタンパク質およびポリメラーゼタンパク質を発現する哺乳動物細胞。また、アデノウイルスのキャプシドに包まれた本ヘルパー依存性アデノウイルスベクターを有するビリオンを作製するために本系を使用する方法が提供される。さらに、本方法の実施において使用されるキットが提供される。
【００１０】
本発明をさらに記載する前に、特定の態様の変形が行われてもよく、かつ添付された特許請求の範囲の範囲内にあるように、本発明は下に記載された発明の特定の態様に限定されないことが理解されるべきである。使用される用語は、特定の態様を記載することの目的のためであり、限定的であることを意図するものではないことも理解されるべきである。その代わりとして、本発明の範囲は、添付された特許請求の範囲により確立されるものとする。
【００１１】
本明細書および添付された特許請求の範囲で用いられる場合、単数形「一つの(a)」、「一つの(an)」、および「その(the)」は、その文脈が明らかに別なものとして規定しない限り、複数形の言及を含むことに留意しなければならない。別に定義されない限り、本明細書で用いられるすべての技術的および科学的用語は、本発明が属する技術分野の業者に一般に理解されているのと同じ意味をもつ。
【００１２】
値の範囲が提供される場合には、その文脈が明らかに別なように規定しない限り、その範囲の上限と下限の間で、その下限のユニットの10分の1ごとのそれぞれ間にある値、およびその決められた範囲における任意の他の決められたまたは間にある値は、本発明の範囲内に含まれるものと理解される。その決められた範囲において任意の特定的に除外された限界を条件として、独立的にそのより小さい範囲に含まれうるこれらのより小さい範囲の上限および下限もまた、本発明の範囲内に含まれる。決められた範囲が限界の一つまたは両方を含む場合、それらの含まれる限界の両方のいずれかを除外する範囲もまた、本発明に含まれる。
【００１３】
本明細書に挙げられるすべての刊行物は、以下に記載される発明に関連して使用されうる刊行物に記載される構成要素を記載かつ開示することの目的のために、参照として本明細書に組み入れられている。
【００１４】
本発明のさらなる記載において、第一に、系およびそれらの構成要素がより詳細に記載され、続いて、本系を用いてアデノウイルスのビリオンを作製する方法の概説、加えて本系および本方法が用途を見出す様々な適用の考察および本方法を実施するために使用されうる本キットの簡単な説明がある。
【００１５】
系
上記で要約されているように、本発明は、アデノウイルスベクターの作製において使用される系を提供する。より具体的に言うと、その系は、アデノウイルスベクター粒子またはビリオンを作製するための系であり、ビリオンが、そのビリオンのキャプシドの内部に存在するゲノム核酸(核様体)において、対象となる配列（例えば、治療産物をコードする発現カセット）を有する核酸を含む。本系は、最も広い意味において、以下の構成要素を含む：(a)ヘルパー依存性または「ガットレス」のアデノウイルスベクター；(b)アデノウイルスヘルパーベクター；および(c)パッケージング細胞系。これらの特定のエレメントのそれぞれは、別々に以下により詳細に考察される。
【００１６】
ガットレスヘルパー依存性アデノウイルスベクター
本系のヘルパー依存性アデノウイルスベクターは、すべてのアデノウイルス遺伝子が欠損しているという点において「ガットレス」ベクターであり、そしてアデノウイルスのITR領域およびパッケージング(Ψ)配列のみを含む。従って、ヘルパー依存性アデノウイルスベクターは、アデノウイルスゲノムコード産物についてコードする核酸配列を含まない。従って、本ガットレスヘルパー依存性アデノウイルスベクターは、アデノウイルスのE1A、E1B pIX、IVa2、MLP、L1、L2、L3、L4、L5、E3、E2A、E2B、またはE4遺伝子を含まない。
【００１７】
本系のヘルパー依存性アデノウイルスベクターは、少なくとも1つの制限エンドヌクレアーゼ部位を含む。換言すれば、ベクターは少なくとも1つの制限酵素切断部位を含み、この部位は外因性核酸（例えば、所望の治療タンパク質産物をコードする核酸）の挿入のための部位としての役割を果たす。様々な制限酵素切断部位が当技術分野において公知であり、このベクターに含まれてもよく、そのような部位は以下の制限酵素により認識されるものを含む：HindIII、PstI、SalI、AccI、HincII、XbaI、BamHI、SmaI、XmaI、KpnI、SacI、EcoRIなど。多くの態様において、ベクターは、ポリリンカー、すなわち、上記に列挙されているような複数の異なる制限酵素により認識される部位の接近して配置されたシリーズまたはアレイを含む。
【００１８】
少なくとも1つの制限酵素切断部位に加えて、本ヘルパー依存性アデノウイルスベクターは、核酸、特にDNAから構成されるスタッファー領域をさらに含む。ある特定の態様において、ドメインは、ヒトゲノム核酸において見出される1つまたは複数のシス作用配列を有する領域であり、これらの1つまたは複数のシス作用配列は、ベクター上に存在するコード配列、すなわち、ヘルパー依存性ベクターの発現カセットに存在する治療タンパク質についてのコード配列の高レベルおよび長期間のインビボでの発現を提供する。高レベル発現とは、本ヘルパー依存性ベクター上に存在する遺伝子の発現レベルが、本ヒトスタッファーDNAを含まないが、代わりにスタッファーDNAとして、Parksら、J. Virol. (1999) 73:8027-8034に記載される〜22 kbラムダDNA断片を含む対照ヘルパー依存性ベクターにおいて観察される発現レベルより少なくとも約5倍、通常では少なくとも約10倍、およびより通常では少なくとも約25倍高いことを意味する。本シス作用ヒトスタッファーDNAにより与えられる長期間発現は、上記の対照ヘルパー依存性ベクターにおいて観察されるものより少なくとも約5倍、通常では少なくとも約10倍、およびより通常では少なくとも約25倍長い。ヒトスタッファーDNAの全体のサイズは変化しうるが、典型的には約20 kbから約30 kbまで、通常では約20 kbから約25 kbまでの範囲であり、サイズはしばしば約21 kbから約23 kbまでの範囲、例えば、22 kbである。上記の高レベルおよび長期間の発現を提供する別個のシス作用配列の数は、所望の発現特性が得られる限りは変化しうるが、典型的には、約1個から約6個まで、通常では約1個から約5個まで、およびより通常では約1個から約4個までの範囲であり、多くの態様において、異なるまたは別個のシス作用配列の数は、2個、3個または4個である。対象となる特定のシス作用配列は、限定されるものではないが、以下のものを含む：ヒトアルフォイド反復ドメイン、例えば、17番ヒト染色体由来のアルフォイド反復DNAの16.2断片(Smith JGら、Mol Cell Biol (1995) 15:5165-5172に記載される)；マトリックス付着領域またはMAR、例えば、アデノウイルス5型の左末端を含む4.2 kb断片(ヌクレオチド1位〜440位)、および免疫グロブリンκMAR(Igκ MAR)の2コピー(Betz AGら、Cell (1994) 77:239-248に記載される)；肝実質細胞制御領域(HCR)、例えば、HCRを含む1.2 kb断片(Miaoら、Molecular Therapy, 1:522-532に記載される)；他のマトリックス付着領域、例えば、2.8 kbニワトリリゾチーム5'マトリックス付着領域(Phi-Van Lら、Mol. Cell Biol. (1990) 10:2302-2307に記載される)、ヒトインターフェロンβ遺伝子の5'領域由来のMAR断片(Bode Jら、Science 1992年1月、10:195-197に記載される)、または例えば、他のセントロメアの配列またはテロメアの配列のような他の可能性のある非コードヒト配列など。ある特定の態様において、ヒトスタッファーDNAは、Parksら、J. Virol. (1999) 73:8027-8034に開示されるスタッファーDNA；またはpSTK120に見出されるスタッファーDNAもしくはSandigら、Proc. Nat'l Acad. Sci. USA(2000年2月1日) 97(3):1002-1007に開示される他のスタッファーDNAではない。
【００１９】
上記に挙げられているように、制限酵素切断部位およびスタッファーDNAに加えて、本ヘルパー依存性アデノウイルスベクターはまた、アデノウイルスパッケージング配列および隣接アデノウイルスITRを含み、これらのエレメントについての核酸配列は公知であり、これらのエレメントを含む核酸は当業者に容易に入手可能である。隣接とは、ヘルパー依存性ベクター、または上記のパッケージング配列、制限酵素切断部位およびヒトスタッファー断片を含む少なくともベクターの領域のいずれかの末端に単一のITR配列があることを意味する。
【００２０】
さらに、本ヘルパー依存性アデノウイルスベクターは、典型的には、プロモーター(および、機能的発現カセットを提供するための任意の他の必要とされる配列)に利用可能に連結された対象となる産物をコードする核酸、本明細書では「対象となる遺伝子」とも呼ばれるものであるが、これを含む発現カセットをさらに含む。対象となる特定の産物およびそれらの対応するコード配列は、以下により詳細に記載されている。発現カセットのサイズは変化しうるが、一般的に約1 kbから約14 kbまで、通常では約4 kbから約11 kbまで、およびより通常では約5 kbから約9 kbまでの範囲である。
【００２１】
ある特定の態様において、本ヘルパー依存性ベクターの発現カセットは、組み込みエレメントの一部である。組み込みエレメントとは、DNA組み込み媒介酵素または活性の存在下において、染色体DNAへと組み込むDNAの区分、領域、または一片を意味する。組み込みエレメントは、ランダムなまたは部位特異的な組み込みエレメントでありうる。ランダムな組み込みエレメントは、適当なDNA組み込み媒介酵素または活性の存在下において、ランダムな位置に染色体DNAへと組み込むエレメントである。ランダムな組み込みエレメントの例は、トランスポゾンであり、トランスポザーゼにより認識される配列に隣接する発現カセットを含む。組み込みエレメントは任意の都合の良いトランスポゾンであってもよく、多数のトランスポゾン系(すなわち、トランスポザーゼおよびそれらにより認識される配列)は当技術分野に公知であり、以下のものを含む：スリーピングビューティ(Sleeping Beauty)トランスポゾン、P因子トランスポゾン、およびTc1/マリナー(mariner)スーパーファミリーの他の転移因子など。または、組み込みエレメントは、部位特異的組み込みエレメントでありうる。対象となる部位特異的組み込みエレメントは、インテグラーゼ認識エレメントを含む。多数のインテグラーゼが当技術分野において知られており、代表的インテグラーゼは、限定されるものではないが、以下のものを含む：Grothら、Proc. Nat'l Acad. Sci. USA (2000) 97:5995-6000に記載されるΦc31インテグラーゼ；Sauerら、Curr. Opin. Biotechnol. (1994) 5, 521-527 3に記載されるCreリコンビナーゼおよびDiaz, V.ら、J. Biol. Chem. (1999) 274, 6634-6640に記載されるようなFLPリコンビナーゼなど。国際公開公報第00/11155号および国際公開公報第01/61049号も参照されたい；それらの先行文献の開示は参照として本明細書に組み入れられている。
【００２２】
ある特定の好ましい態様において、組み込みエレメントは、最初の直鎖状ヘルパー依存性核酸物質から環状組み込みエレメントを作製するために適当なリコンビナーゼの存在下において互いに組換えを行う能力があるリコンビナーゼ認識部位に隣接する。対象となるリコンビナーゼ認識部位は、限定されるものではないが、lox部位、att部位、dif部位およびfrt部位を含み、対象となる部位は、限定されるものではないが、loxP、loxP2、loxP511、loxP514、loxB、loxC2、loxL、loxR、loxΔ86、loxΔ117、loxP3、loxP23、att、dif、およびfrtなどを含む。
【００２３】
例えば、環状組み込みエレメントが望ましいという態様において、発現カセット中に存在し、かつ発現カセットに隣接するように選択される特定のリコンビナーゼ部位は、ヘルパーベクターゲノムのリコンビナーゼおよび標的細胞の性質に基づき、さらにヘルパー依存性ベクターと共に投与されると考えられる任意の追加のベクターに基づいて選択される。一般的に、ヘルパー依存性ベクターに存在する組換え認識部位は、ヘルパーベクターに存在するものとは異なる。さらに、隣接部位は、発現カセット中に存在する部位とは異なる。
【００２４】
ヘルパー依存性ベクターが組み込みエレメント、例えば第一のリコンビナーゼ認識部位を含みかつ互いに組換えを行う第二のリコンビナーゼ認識部位に隣接するエレメントを含むという態様において、ヘルパー依存性ベクターは、ヘルパー依存性ベクターに存在する組換え認識部位の1つ、または両方についてのコード配列をさらに含んでもよい。例えば、ヘルパー依存性ベクターがスリーピングビューティリコンビナーゼ認識部位を含む組み込み発現カセットを含み、その発現カセットがFRT部位に隣接している場合、ヘルパー依存性ベクターはスリーピングビューティトランスポザーゼおよび/またはF1pリコンビナーゼについてのコード配列をさらに含んでもよい。存在する場合、これらのコード配列は、典型的には、それらが標的細胞において発現されるように発現カセットの一部として存在する。なおさらに、そのコード配列は、典型的には、リコンビナーゼ認識部位に隣接していないヘルパー依存性ベクターの領域に位置し、例えば、それらは、そのコード配列が最後に標的細胞ゲノムへと組み込まれる切り出された環状エレメントの一部にならないように、上記のようなスタッファーDNAドメイン中に位置してもよい。
【００２５】
ヘルパー依存性ベクターの全体のサイズは変化するものであるが、一般的には約22 kbから約38 kbまで、通常では約25 kbから約36 kbまで、およびより通常では約26 kbから約33 kbまでの範囲である。ヘルパー依存性ベクターは、そのベクターが使用されることになっている特定の系およびプロトコールにより、直鎖状または環状、例えばプラスミドでありうる。ある特定の態様において、ヘルパー依存性ベクターは、アデノウイルスのキャプシドに包まれうる。
【００２６】
本発明による代表的なヘルパー依存性ベクターの記載は、図1に提供される。その発現カセットがリコンビナーゼの存在下において環状核酸を産生するためにベクターから切り出されうるトランスポゾンとして存在している、すなわち、切り出し可能なトランスポゾン中に存在する発現カセットである、ヘルパー依存性ベクターの記載は図8に示されている。
【００２７】
アデノウイルスヘルパーベクター
本系のもう一つの要素はヘルパーベクターであり、ベクターはアデノウイルスヘルパーベクターである。アデノウイルスヘルパーベクターは、上記のガットレスヘルパー依存性アデノウイルスベクターの複製およびパッケージングに必要なアデノウイルスゲノムコード産物の少なくとも一部分を提供するアデノウイルスベクターコード配列を含み、これらの産物はヘルパー依存性ベクターへトランスに提供される。典型的には、ヘルパーベクターのアデノウイルスベクターコード配列は、以下のアデノウイルスゲノムコード産物をトランスに提供する：E2A、E2B、E4領域の遺伝子産物および後期アデノウイルスコード領域L1、L2、L3、L4およびL5の遺伝子産物であり、ヘルパーベクターによりトランスに提供される特定の因子は、必須のアデノウイルスゲノムコード因子の一部分をトランスに提供しうるまたは提供しえない使用されるパッケージング細胞の性質に、少なくとも一部分では依存しうる。従って、本系のヘルパーベクターは、野生型アデノウイルスベクターコード配列のすべてまたは部分を含むアデノウイルスベクターコード配列を含む。典型的には、ヘルパーベクターに存在するアデノウイルスベクターコード配列の部分は、全アデノウイルスゲノムの長さにして約70％から約99％まで、通常では約80％から約95％までの範囲である。このアデノウイルスベクターコードエレメントの長さは、典型的には、約20 kbから約38 kbまで、通常では約25 kbから約32 kbまで、およびより通常では約26 kbから約28 kbまでの範囲である。
【００２８】
上記のアデノウイルスベクターコードエレメントは、互いに組換えを行い、かつ同じリコンビナーゼにより認識される第一と第二のリコンビナーゼ認識部位の間のヘルパーベクターの第一の領域に位置する。対象となるリコンビナーゼ認識部位は、限定されるものではないが、lox部位、att部位、dif部位、およびfrt部位を含み、対象となる特異的配列は、限定されるものではないが、loxP、loxP2、loxP511、loxP514、loxB、loxC2、loxL、loxR、loxΔ86、loxΔ117、loxP3、loxP23、att、dif、およびfrtなどを含む。本ヘルパーベクターが使用される系のガットレスヘルパー依存性ベクターが、上記のように、発現カセットが見出される切り出し可能な組み込みエレメントを含む場合、ヘルパーベクターのリコンビナーゼ認識部位は、ヘルパー依存性ベクターのリコンビナーゼ認識部位のように同じリコンビナーゼにより認識されない。
【００２９】
上記のリコンビナーゼ認識部位隣接アデノウイルスベクターコードエレメントに加えて、本系のヘルパーウイルスベクターは、哺乳動物のゲノム配列には見出されない少なくとも1つのエンドヌクレアーゼ認識部位(すなわち、非哺乳動物の制限酵素切断部位)を含み、この非哺乳動物の制限酵素切断部位は、アデノウイルスベクターコードエレメントを含むリコンビナーゼ認識部位に隣接する領域以外であるヘルパー依存性ベクターの領域に位置する。このように、ヘルパーベクターが直鎖状ベクターである場合、この非哺乳動物の制限酵素切断部位は、ベクター上の5'リコンビナーゼ認識部位の左へまたは3'リコンビナーゼ認識部位の右へ位置する。ヘルパーベクターが環状である、例えば、プラスミドである他の態様において、リコンビナーゼ認識部位により分けられる2つの領域を有するものとして見られる場合、アデノウイルスコード配列エレメントおよび非哺乳動物の制限酵素切断部位は、環状ベクターの異なる領域に位置する。非哺乳動物の制限酵素切断部位のサイズは変化しうるが、典型的には、少なくとも約6ヌクレオチド長、通常では少なくとも約12ヌクレオチド長、およびより通常では少なくとも約16ヌクレオチド長であり、その部位の長さは38ヌクレオチドまたはそれ以上である場合もあるが、ある特定の態様において、約30ヌクレオチドを超さず、典型的には約20ヌクレオチドを超さない。任意の都合の良い非哺乳動物の制限酵素切断部位が使用されうるが、対象となる代表的な部位は、限定されるものではないが、26ヌクレオチドI-CeuI、39ヌクレオチドPI-SceI、および18 bp I-SceI部位などを含み、対象となる多くの態様において、部位は、18 bp I-SceI部位である。非哺乳動物制限酵素切断部位の存在が、そのベクターが対応する制限エンドヌクレアーゼ、すなわち、その部位を切断するヌクレアーゼを発現する宿主細胞に存在する場合、そのヘルパーベクターを自己破壊させる。
【００３０】
上記のアデノウイルスベクターコードエレメント、隣接リコンビナーゼ認識部位、および非哺乳動物の制限酵素切断部位に加えて、本系のヘルパーベクターはまた、典型的には、上記のように、パッキング配列および末端隣接ITR配列を含む。
【００３１】
ヘルパー-ウイルスは、典型的には、約30 kbから約38 kbまで、通常では約34 kbから約38 kbまで、およびより通常では約36 kbから約38 kbまでの長さである。ヘルパーウイルスベクターは、直鎖状または環状であってもよく、ヘルパーウイルスベクターがビリオンであるように、キャプシド、例えば、アデノウイルスのキャプシドに包まれる場合もある。
【００３２】
代表的なヘルパー-ウイルス地図は図3に提供されている。
【００３３】
パッケージング細胞
本系の第三の構成要素は、パッケージング細胞である。本発明のパッケージング細胞は、以下のものを安定的に発現する哺乳動物細胞である：(i)ヘルパーベクターのリコンビナーゼ認識部位を認識するリコンビナーゼ；および(ii)ヘルパーベクターの非哺乳動物の制限酵素切断部位を認識する、すなわち、切断するエンドヌクレアーゼ。ある特定の好ましい態様において、このパッケージング細胞または宿主細胞はまた、アデノウイルスのプレターミナルタンパク質およびアデノウイルスのポリメラーゼを発現する。一般的に、哺乳動物細胞は、ヒトの細胞であり、ある特定の好ましい態様において、その細胞は不死化した細胞である。対象となる代表的な細胞は、限定されるものではないが、アデノウイルス5型DNA不死化ヒト胚腎細胞、例えば、HEK293細胞のようなHEK細胞などを含む。
【００３４】
本パッケージング細胞により安定的に発現されるリコンビナーゼは様々でありうる。対象となる代表的なリコンビナーゼは、限定されるものではないが、以下のものを含む：Creリコンビナーゼ(cre遺伝子は、様々な宿主においてクローニングおよび発現されており、その酵素は当技術分野において公知の標準的な技術を用いて均一性に精製されるうる--精製されたCreタンパク質はノバジェン(Novagen)から市販されている)；frt部位を認識するS. セレビシエ(S. cerevisiae)のFLPリコンビナーゼ；att部位を認識するバクテリオファージラムダのIntリコンビナーゼ；dif部位を認識するリコンビナーゼを共に形成する大腸菌(E. coli)のxerCおよびxerDリコンビナーゼ；Hinリコンビナーゼ；Cinリコンビナーゼ；免疫グロブリンリコンビナーゼなど。細胞は望ましいリコンビナーゼを安定的に発現するものであるから、それは、典型的には、例えば、発現カセットを含む導入遺伝子またはその導入遺伝子についてのその必須部分での形質転換により、リコンビナーゼを安定的に発現するように操作された細胞である。
【００３５】
リコンビナーゼに加えて、哺乳動物細胞はまた、上記のように、ヘルパーベクターの非哺乳動物の制限酵素切断部位を認識および切断する非哺乳動物の制限エンドヌクレアーゼを安定的に発現する。この非哺乳動物制限エンドヌクレアーゼは様々でありうるが、代表的なエンドヌクレアーゼは、限定されるものではないが、I-CeuI、PI-SceI、I-SceIなどを含み、多くの態様において、パッケージング細胞はI-SceIを安定的に発現する。リコンビナーゼに関してのように、細胞は、一般的に、例えば、制限エンドヌクレアーゼについての発現カセットを含む導入遺伝子またはその必須部分での形質転換により、その制限エンドヌクレアーゼを発現するように操作される。
【００３６】
ある特定の態様において、パッケージング細胞は、アデノウイルスのプレターミナルタンパク質およびアデノウイルスポリメラーゼを安定的に発現する点においてさらに特徴付けられ、例えば、その細胞はこれらのアデノウイルスの因子を安定的に発現するように形質転換されている。対象となる特定のパッケージング細胞は、293に基づく細胞、294Gであり、以下の実験の節においてより詳細に記載されており、加えて、他の特定のパッケージング細胞も以下の実験の節において記載されている。
【００３７】
上記のパッケージング細胞の収集物または集団、例えば、細胞系も提供される。
【００３８】
パッケージングされたガットレスアデノウイルスベクターを作製する方法
パッケージングされたヘルパー依存性ガットレスアデノウイルスベクター、すなわち、上記のガットレスヘルパー依存性アデノウイルスベクターを含むビリオンを作製するために本系を用いる方法もまた提供される。
【００３９】
一般的に、本方法は、パッケージング細胞、典型的には、上記のような本系のパッケージング細胞の収集物または細胞系(例えば、少なくとも約1 x 106細胞、通常では少なくとも約1 x 106細胞の集団)を、結果としてヘルパー依存性アデノウイルスベクターおよびアデノウイルスヘルパーベクターがそのパッケージング細胞へ侵入する条件下において、本系のヘルパーベクターおよびヘルパー依存性ベクターに接触させることを必要とする。その必須のベクターの侵入が起こる限り、接触は任意の都合の良い様式において生じてもよく、接触は同時または逐次的でありうる。代表的な接触プロトコールは、以下の実験の節において記載されている。上記の接触段階は、トランスフェクションすることとしても知られている。トランスフェクションは任意の都合の良いプロトコールを用いて行われ、適するプロトコールは当業者に知られており、代表的なプロトコールは、以下の実験の節において提供されている。
【００４０】
接触およびベクター侵入の後に生じる細胞は、アデノウイルスのキャプシドに包まれたヘルパー依存性アデノウイルスベクターを含むビリオンまたはウイルス粒子を作製するために十分な条件下で維持される。典型的には、細胞は、約35℃から約39℃まで、通常では約36.5℃から約37.5℃までの範囲の温度で、約1日から約7日まで、通常では約1日から約4日までの範囲の期間、適する増殖培地、例えば、ダルベッコの改変イーグル培地(Dulbecco's Modified Eagle Medium)などにおいて維持される。
【００４１】
従って、トランスフェクション後、トランスフェクションされた宿主細胞は増殖し、そこから本発明による組換えアデノウイルスが収集されるが、当業者に公知の標準的プロトコールを含む任意の都合の良いプロトコールでこれらの段階に使用されうる。例えば、以下の実験の節を参照されたい。
【００４２】
図3は、パッケージングされたヘルパー依存性アデノウイルスベクターを作製する本方法の概要的代表例を提供する。図3に示すように、関連リコンビナーゼタンパク質を発現するパッケージング細胞が存在する場合、リコンビナーゼ認識部位に隣接するヘルパーベクターのアデノウイルスベクターコードエレメントは、ヘルパーベクターの残りから切り出され、その後、その残りは非哺乳動物の制限酵素により切断される。それにもかかわらず、必須のアデノウイルスコード因子は、その切り出されたリコンビナーゼ部位隣接アデノウイルスベクターコードエレメントによりトランスになお提供される。ヘルパー依存性ベクターは、それゆえ、そのトランスに提供された因子ならびに宿主パッケージング細胞により供給される因子、例えば、アデノウイルスのポリメラーゼおよびプレターミナルタンパク質によりウイルス粒子へパッケージングされる。
【００４３】
上記方法は、パッケージングされたヘルパー依存性ベクターの高力価の調製物を、非常に低レベルのヘルパーベクターコンタミネーションレベルで作製する。高力価の調製物とは、少なくとも約5 x 109粒子/ml 、通常では少なくとも約1 x 1010粒子/ml 、およびより通常では少なくとも約5 x 1010粒子/mlの調製物を意味する。本高力価の調製物におけるヘルパー-ウイルスのコンタミネーション量は、約1％を超えず、通常では約0.2％を超えず、およびより通常では約0.1％を超えず、ある特定の態様においては、ヘルパー-ウイルスコンタミネーション量は、より低く、例えば0.05％、0.02％、またはそれ以下である。
【００４４】
組み込みアデノウイルスベクター
組み込み発現カセットを含む上記のヘルパー依存性ベクターに加えて、本発明はまた、組み込みエレメントを含む一般的なアデノウイルスベクターも提供する。最も広い意味において、任意のアデノウイルスベクターを本明細書に記載されるように組み込みエレメントを含むように改変することができ、この組み込みエレメントは、典型的には、第一のリコンビナーゼ認識部位を含む発現カセットを含み、この発現カセットは互いに組換えを行い第二のリコンビナーゼ認識部位に隣接する。本発明に従って組み込みベクターであるように改変することができる代表的なアデノウイルスベクターは、米国特許第5,962,313号；第5,962,311号；第5,952,221号；第5,932,210号；第5,928,944号；第5,922,576号；第5,919,676号；第5,891,690号；第5,885,808号；第5,880,102号；第5,877,011号；第5,871,982号；第5,869,037号；第5,858,351号；第5,851,806号；第5,843,742号；第5,837,484号；第5,820,868号；第5,789,390号；第5,756,283号；第5,747,072号；第5,731,172号；第5,700,470号；第5,670,488号；第5,616,326号；第5,589,377号；第5,585,362号；第5,354,678号に記載されるものを含む；それらの開示は参照として本明細書に組み入れられている。
【００４５】
有用性
上記プロトコールを用いる本系で作製されるヘルパー依存性アデノウイルスベクター、および/または組み込みエレメント（例えば、組み込み発現カセット）を含むアデノウイルスベクターは、幅広く様々な内因性および/または外因性核酸を標的細胞へ安定的に挿入するためのベクターとして使用されうる(外因性とは、標的細胞に存在しない配列を有する核酸を意味し、一方、内因性とは、挿入前に標的細胞にあらかじめ存在する核酸を意味し、例えば、核酸の余分のコピーおよび/または核酸の発現可能なコピーを標的細胞へ挿入したい場合に必要とされる)。多くの態様において、外因性核酸に存在するヌクレオチドの配列は、標的細胞のゲノムに見出されない、すなわち、それは標的細胞に対して異種性のものである。本方法を様々な標的細胞に使用することができる。本ベクターが使用されうる標的細胞は、一般的に、動物細胞である。多くの態様において、特に対象となるのは、脊椎動物細胞、特に、鳥類細胞、例えばニワトリ細胞；マウス、ブタ、ヒツジ、ウマ、ラット、イヌ、ネコ、サルおよびヒトの細胞を含む哺乳動物細胞などを標的化する本ベクターの使用である。
【００４６】
本発明の方法において、アデノウイルスベクターは、アデノウイルスがそのゲノム、すなわち、上記のヘルパー依存性ベクターの核酸を標的細胞へ挿入するのに十分な条件下で、標的細胞と接触させる。任意の都合の良いプロトコールを使用することができ、プロトコールにより、ゲノムを標的細胞へインビトロまたはインビボで導入することができる。例えば、標的細胞が生物から取り出された生物細胞である場合、組換えウイルスを、標的細胞の生存力を許容する細胞培養条件下でその細胞と接触させてもよい。または、標的細胞が多細胞生物の一部である場合、アデノウイルスベクターを、ウイルスが生物へ侵入し、かつその標的細胞へそのゲノムを挿入するような様式において、生物または宿主へ投与することができる。例えば、ウイルスは、生物または宿主へ注射され、宿主の粘膜表面などと接触させてもよい。
【００４７】
本アデノウイルスベクターを用いる標的細胞のゲノムへの外因性核酸の安定的組み込みにおける本方法は、標的細胞への外因性核酸の安定的組み込みが望ましい様々な適用においての使用が見出される。
【００４８】
アデノウイルスベクターの特有の性質に依存して、外因性核酸は、標的細胞ゲノムに組み込む場合もあるしまたは組み込まない場合もある。従って、ある特定の態様において、挿入されたヘルパー依存性ベクターは、標的細胞にエピソームとして存在する。
【００４９】
さらに他の態様において、挿入されたヘルパー依存性ベクター、またはより具体的にはその一部分が、宿主ゲノムへ組み込まれる。上記のように、ある特定の態様において、外因性核酸（例えば発現カセット）は、ランダムまたは部位特異的のいずれかで、リコンビナーゼによりベクターから切り出し可能または可能ではない組み込みエレメントに存在する。この組み込みの機構は、図8に概略的に示されている。図8において、発現カセットを有するヘルパー依存性アデノウイルスゲノムが適切なリコンビナーゼおよびトランスポザーゼを発現する標的細胞へ挿入される場合、その組み込みエレメントは、ベクターから切り出されて環状中間体を産生し、その後、標的細胞ゲノムへと転移される。このように、標的細胞ゲノムへのベクターの外因性核酸の組み込みが起こる。
【００５０】
本ベクターおよび本方法の使用を見出す適用は、研究適用、ポリペプチド合成適用、および治療上の適用を含む。これらの適用の代表的分類のそれぞれは、より詳細に、別々に下に記載されている。
【００５１】
研究適用
本ベクターの使用を見出す研究適用の例は、特定の遺伝子を特徴付けるために設計される適用を含む。そのような適用において、ベクターは、対象となる遺伝子またはコード配列を標的細胞へ挿入するために使用され、得られた挿入遺伝子の細胞の表現型に対する影響が観察される。このように、その遺伝子の活性およびそれによりコードされた産物の性質についての情報を推定することができる。ベクターはまた、遺伝子発現を、例えば、時間的様式(例えば、ある発生期)または空間的様式(例えば、特定の細胞または組織型)において制御するDNA配列を同定および定義するために使用されうる。そのようなアッセイ法において、本ベクターは、選択的マーカー遺伝子、例えば、抗生物質耐性、LacZなどを標的細胞のゲノムへ安定的に組み込むために使用され、マーカーが内因性プロモーター領域の支配下にない限り、あったとしても有意には発現されないように、ベクターは、マーカー遺伝子についての十分なプロモーターを欠失している。マーカー遺伝子が内因性プロモーター配列と十分に関連して標的細胞ゲノムへ挿入される場合には、それは発現されると思われる。結果として生じるマーカー遺伝子の発現特性から、その後、その発現を媒介している内因性プロモーターを特徴付けることができる。遺伝子発現研究の結果の同定および特徴付けにおいて、本ベクターの使用を見出すさらにもう一つの研究適用が存在する。例えば、対象となる遺伝子が様々な標的細胞のゲノムにおける別個の位置へ挿入されている別個の複数のベクター標的細胞(またはそれらから生じる動物)が調製され、対象となる遺伝子の発現は内因性プロモーターの媒介に依存する、すなわち、対象となる遺伝子はプロモーターを欠失しているか、または弱いプロモーターのみに連結されている。複数とは、少なくとも2個を意味し、その数は、通常では約2個から約5000個まで、より通常では約2個から約200個までの範囲である。この複数のベクター標的細胞は、ベクターを複数の細胞に導入すること、または遺伝子の挿入部位に関して同構造である予め標的化した細胞の収集物、すなわち、単一の標的細胞の子孫を収集し、その後、その収集物の構成メンバーの1つまたは複数であるが、すべてではないものへトランスポザーゼを導入することにより作製することができる。本ベクターはまた、組み込み変異体を研究するために使用可能であり、対象となる遺伝子は、ゲノムへランダムに挿入され、標的細胞の表現型においてランダムな挿入の影響が観察される。対象となる遺伝子の過剰発現および/または発現欠失が細胞において生じているモデルを作製するために、本ベクターを使用することもでき、この変異体発現パターンの影響が観察される。対象となる表現型および/または発現パターンを生じる挿入による突然変異誘発によって宿主細胞へ導入された遺伝子を容易にクローニングするためにも、本ベクターを使用することができる。そのような適用において、本ベクターは、DNAのランダムな組み込みを通して挿入の変異体を生じるために使用される。得られた変異体の表現型および/または発現パターンは、その後、任意の都合の良いプロトコールを用いてアッセイされる。
【００５２】
ポリペプチド合成適用
上記の研究適用に加えて、本ベクターはまた、ポリペプチド、例えば対象となるタンパク質の合成における使用が見出される。そのような適用において、必須のおよび/または望ましい発現調節配列、例えばプロモーターなど(すなわち、発現モジュール)と組み合わせて、対象となるポリペプチドをコードする遺伝子を含むベクターは、ポリペプチドの発現のための発現宿主として作用する標的細胞へ導入される。導入およびその結果起こる標的細胞ゲノムへの安定的組み込みの後、標的宿主細胞は、その後、組み込まれた遺伝子の発現に十分な条件下で維持される。タンパク質を発現する形質転換された宿主が調製されれば、そのタンパク質は、その後、組成物を含む所望のタンパク質を製造するために精製される。任意の都合の良いタンパク質精製法を使用することができ、適するタンパク質精製方法としては、「Guide to Protein Purification」、(Deuthser編)(Academic Press、1990)に記載されている。例えば、タンパク質を発現する発現宿主から、可溶化物を調製し、HPLC、排除クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、アフィニティークロマトグラフィーなどを用いて精製することができる。
【００５３】
治療上の適用
本ベクターはまた、治療上の適用における使用が見出され、ベクターは、治療核酸、例えば、遺伝子またはそのタンパク質/因子コード配列を標的細胞のゲノムへ安定的に組み込むために使用される（すなわち、遺伝子治療適用）。本ベクターを、幅広く様々な治療核酸を送達するために使用することができる。遺伝的欠陥に基づく疾患状態の治療において使用される特定の治療遺伝子は、以下の産物をコードする遺伝子を含む：因子VIII、因子IX、β-グロビン、低密度リポタンパク質受容体、アデノシンデアミナーゼ、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ、スフィンゴミエリナーゼ、グルコセレブロシダーゼ、嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子、α1-アンチトリプシン、CD-18、オルニチントランスカルバミラーゼ、アルギニノコハク酸シンセターゼ、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ、分枝鎖α-ケト酸デヒドロゲナーゼ、フマリルアセト酢酸ヒドロラーゼ、グルコース6-ホスファターゼ、α-L-フコシダーゼ、β-グルクロニダーゼ、α-L-イズロニダーゼ、ガラクトース1-リン酸ウリジルトランスフェラーゼ、インターロイキン、サイトカイン、低分子ペプチドなど。タンパク質の上記リストは、哺乳動物タンパク質、多くの態様においてはヒトタンパク質に属しているものとし、上記タンパク質のヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、一般的に、当業者に知られている。本ベクターにより送達されうる癌治療遺伝子は以下のものを含む：リンパ球の抗腫瘍活性を増強させる遺伝子、発現産物が腫瘍細胞の免疫原性を増強させる遺伝子、腫瘍抑制遺伝子、毒素遺伝子、自殺遺伝子、多剤耐性遺伝子、アンチセンス配列など。
【００５４】
アデノウイルスベクターの使用は、さらに、米国特許第5,962,313号；第5,962,311号；第5,952,221号；第5,932,210号；第5,928,944号；第5,922,576号；第5,919,676号；第5,891,690号；第5,885,808号；第5,880,102号；第5,877,011号；第5,871,982号；第5,869,037号；第5,858,351号；第5,851,806号；第5,843,742号；第5,837,484号；第5,820,868号；第5,789,390号；第5,756,283号；第5,747,072号；第5,731,172号；第5,700,470号；第5,670,488号；第5,616,326号；第5,589,377号；第5,585,362号；第5,354,678号に記載されている；それらの開示は参照として本明細書に組み込まれている。
【００５５】
トランスジェニック細胞および非ヒトトランスジェニック動物
また本発明により、トランスジェニック細胞および非ヒトトランスジェニック動物が提供される。本細胞およびその細胞を含む動物の特徴は、細胞における本組換えアデノウイルスの存在であり、例えば、細胞のベクター上に、または細胞のゲノムに安定的に組み込まれているかのいずれかである。同様に、本発明のトランスジェニック動物は、上記のような少なくとも1つのトランスジェニック細胞を含むことを特徴とする。
【００５６】
キット
また本発明により、上記のように本組換えアデノウイルスベクターを調製するためのキットが提供される。本キットは、上記のような、ヘルパー依存性ベクター、ヘルパーベクター、およびパッケージング細胞の1つまたは複数、通常ではすべてを、少なくとも含む。キットの他の選択的構成要素は、制限酵素；対照プラスミド；緩衝液などを含む。キットの様々な構成要素を、別々の容器に存在させても良いし、または望ましい場合には、ある程度適合性の構成要素を一つの容器へ前もって混合してもよい。
【００５７】
上記に挙げられている構成要素に加えて、本キットは、典型的には、本方法を実施するためにキットの構成要素を使用するための使用説明書をさらに含む。本方法を実施するための使用説明書は、一般的に、適する記録媒体に記録されている。例えば、使用説明書は、紙またはプラスチックなどのような支持体に印刷されてもよい。従って、使用説明書は、包装挿入物としてキットの中、キットまたはその構成要素の容器のラベルにおいて(すなわち、包装またはその中の内部包装に関連して)などに存在しうる。他の態様において、使用説明書は、適したコンピューター読み取り可能記憶媒体、例えば、CD-ROM、ディスケットなどの上に存在する電子記憶データファイルとして存在する。さらに他の態様において、実際の使用説明書はキットに存在しないが、遠隔操作による情報源から、例えば、インターネット経由で、使用説明書を得る手段が提供される。この態様の例は、使用説明書を見ることができるおよび/またはそこから使用説明書をダウンロードすることができるウェブアドレスを含むキットである。使用説明書についてのように、使用説明書を得るためのこの方法は、適する支持体に記録される。
【００５８】
以下の実施例は、例示的なものとして提供され、限定する意図はない。
【００５９】
実験
I. ベクターおよびパッケージング細胞の調製
A. ヘルパー依存性ベクターpAdFTC：
新規なヘルパー依存性ベクターpAdFTCが開発された。このベクターは、スタッファーDNAとして3つのシス作用配列を含む：ヒトのアルフォイド反復DNA(CEN)の断片、マトリックス付着領域(MAR)、および肝実質細胞制御領域(HCR)。AdFTCはまた、対象となる任意の遺伝子を有する欠損アデノウイルスの作製を可能にするマルチクローニング部位も含む。このベクターの地図は、図1に提供されている。
【００６０】
アデノウイルスの作製のためのプラスミドpAdFTCは、17番ヒト染色体由来のアルフォイド反復DNAの16.2 kb断片を含むプラスミドpDYALに基づく(KrysanおよびCalos, Gene 1993年12月22日; 136(1-2):137-143)。アルフォイド反復DNAは、アデノウイルス5型の左端およびIgκ MARの2コピーを含む1.5 kb断片に隣接している。サブクローンpDYAL5'ITRIgκMARは、p72N5'ITR IgκMAR由来のSalI断片をpDYALのSalI部位へクローニングすることにより得られた。肝実質細胞制御領域(HCR)、制限エンドヌクレアーゼPacIおよびPmeIについての認識部位を有するマルチクローニング部位、ならびにアデノウイルス5型の右端を含む、pHM5 3'ITRHCR由来の1.2 kbのSpeI断片は、pDYAL5'ITRIgκMARのSpeI部位へクローニングされ、結果としてpAdFTCを生じた。pBSK/S(ストラタジーン(STRATAGENE))に基づくシャトルプラスミドpBS-P/Pは、PacIとPmeIの認識部位の間の中にマルチクローニング部位を有するように構築された。PacI部位はPacIリンカーライゲーションによりpBSのKpnI部位へクローニングされ、PmeIはリンカーライゲーションによりpBSのSacI部位へクローニングされて、結果としてpBS-P/Pを生じた。
【００６１】
B. パッケージング細胞294G：
新規な293に基づく細胞系、294Gは、効率的なガットレスアデノウイルスの作製のために開発された。294Gは、アデノウイルス遺伝子のプレターミナルタンパク質およびポリメラーゼ、Cre/loxPリコンビナーゼ、ならびに制限酵素エンドヌクレアーゼI-SceIを安定的に発現する。I-SceIは、哺乳動物細胞に存在しない特有の18 bp非パリンドローム配列を認識するイントロンにコードされたエンドヌクレアーゼである。この特徴により、この制限酵素を哺乳動物細胞において安定的に産生することが可能になる。I-SceIを安定的に発現する細胞系294Gの作製のために、I-SceI cDNAをプラスミドpIRESpuroベクター(クロンテック(CLONTECH))へクローニングし、293に基づく細胞へ安定的にトランスフェクションした。
【００６２】
C. ヘルパーベクター
1. ヘルパーベクターAdlucI(lox)2：
新規なヘルパー-ウイルスAdlucI(lox)2は、ガットレスアデノウイルスの作製のために開発された。このヘルパー-ウイルスを、ヘルパー-ウイルスコンタミネーションの問題を回避するためにガットレスアデノウイルス作製の間に破壊することができる。AdlucI(lox)2は、I-SceI認識部位を含み、それゆえ、安定的にI-SceIを発現している細胞において切断および破壊されうる。さらに、AdlucI(lox)2は、全アデノウイルスゲノムに隣接する2つのloxP部位を含む。SV40プロモーターにより誘導されるルシフェラーゼ遺伝子をクローニングすることにより構築されたアデノウイルスベクターは、シャトルベクターpHM5loxへクローニングされ、マルチクローニング部位における1つまたは2つの部位をI-SceIへ変えた。SV40/ルシフェラーゼ発現カセットを含むI-CeuI/PI-SceI断片をpAdHM4loxのI-CeuI/PI-SceI部位へクローニングした。マーカー遺伝子としてlacZまたはGFPを含むベクターも、同様に構築された。第一世代アデノウイルスは、以前に記載されているように、作製および増幅された(MizuguchiおよびKay, Hum Gene Ther.、1998年11月20日；9(17):2577-2583)。
【００６３】
2. ヘルパー-ウイルスAdluc/IsceI(lox)2の産生
ヘルパー-ウイルス[Adluc/IsceI(lox)2]は、I-SceIイントロンにコードされたエンドヌクレアーゼ制限酵素切断部位を含むように構築された(図2)。さらに、遺伝子欠損ベクターを作製するための新規な細胞系が開発された。本発明者らは、Cre-C7細胞を改変し、機能しうるエンドヌクレアーゼを発現するクローンを選択した。予測される産物が新規なヘルパー-ウイルスをC7-Cre/SceI細胞系へ形質導入した後に実際に産生されていることを実証するために、本発明者らは、ベクターおよびヘルパーに感染されたCre/SceI細胞上において予備的なサザン分析(図2)を行い、それらの存在を確認した。重要な点は、アデノウイルスのタンパク質をトランスに発現する能力があるが(そのベクターの複製およびパッケージングを可能にするため)、パッケージングシグナルが欠けている環状アデノウイルスゲノムが産生されていることである。
【００６４】
II. アデノウイルスの調製プロトコール：
上記の構成要素を用いてヘルパー-ウイルスコンタミネーションが減少した量で含まれる高能力アデノウイルスを作製する方法は、以下に記載され、図3に説明されている。上記で言及されているように、ウイルス貯蔵物からのヘルパー-ウイルスの除去は、HDベクター系の継続的な臨床使用における制限因子である。本発明の方法では、そのようなヘルパー-ウイルスコンタミネーションを除去しないにしても、本質的に低下させる。Creリコンビナーゼの存在下において、本発明のヘルパー-ウイルスの全アデノウイルスコード配列を除去し、結果として、不安定なアデノウイルスのミニゲノム(Lieberら、J Virol. (1996) 70:8944-8960)およびパッケージングシグナルを有しない欠損アデノウイルスゲノムの環状形が生じる。本発明者らの新規なヘルパー-ウイルスに存在するI-SceI認識部位は、ウイルスの作製の間に安定的発現のI-SceI細胞系おいて認識され、結果として、切断産物のパッケージングなしにヘルパー-ウイルスゲノムの切断を生じる。作製間におけるCre/lox組換えおよび制限酵素I-SceIによるヘルパー-ウイルスゲノムの切断の組み合わせが、ヘルパー-ウイルスコンタミネーションを有意に減少させる。
【００６５】
新規なヘルパー-ウイルスと共にHD-ベクターを作製するために、Creリコンビナーゼ、I-SceI、アデノウイルスのプレターミナルタンパク質およびポリメラーゼ(HD-ベクターの複製を増加させるため)を発現する293に基づく細胞系、すなわち、294Gが使用される。ヘルパー-ウイルスは、2つのベクター、pAdHM4loxおよびpHM3 loxに基づいており、アデノウイルスコード配列がlox部位に隣接する第一世代を生じる。マーカー遺伝子として、ヘルパー-ウイルスは、SV40プロモーターの制御下でルシフェラーゼ遺伝子を含む。
【００６６】
予備的な第一の実験において、図4に示されるように、高レベルのベクター、および本発明者らの標準的方法により得られるものと比較してより低レベルのヘルパー-ウイルスが、一継代後に得られた。この初期の予備実験において、最大のベクター対ヘルパーの比率は、新規なCre/SceI細胞において〜6のMOIで起こっている。この新規な細胞系を用いてより多くのベクターが作製されるだけでなく、ヘルパーの量もまた大いに低減される。
【００６７】
さらなる実験において、4連続継代段階が、本発明者らの細胞系293G7およびヘルパー-ウイルスAdluc/IsceI(lox)2を用いるHDベクターAdFTC/lacZ/ChMAR(図5)を増幅するために行われた。
【００６８】
III. 予備的研究：
予備的研究において、本発明者らは、ヒト凝固因子IXを発現するためにHDベクター、AdFTCを使用した(AdFTC/hFIX)。hFIXについての発現カセットは、エンハンサーHCRおよびアポリポタンパク質E(ApoE)、ヒトアルファアンチトリプシンプロモーター(hAAT)、ならびにhFIX cDNA(hFIXイントロンAおよびウシポリアデニル化シグナルを含む)を含み、インビボで高レベルの遺伝子発現を生じることが示された(Miaoら、2000、Mol Ther. 1:522-532)。
【００６９】
A. ヒト凝固因子IXについての発現カセットを含む欠損アデノウイルスと第一世代アデノウイルスのインビトロおよびインビボでの発現レベルの比較
インビトロでの研究で、一次肝実質細胞において、同じhFIX発現カセットを含む第一世代アデノウイルス(fgAdhFIX)と比較して、AdFTC/hFIXからのhFIXのより高い発現レベルが実証された。図6Aは、異なるMOIでのAdFTC/hFIXについてのhFIX発現レベルを示す。例えば、AdFTC/hFIXについての100のMOIで、2700 ng/mlに達するhFIX発現レベルを検出することができた。このMOIで、同じ発現カセットを有する第一世代アデノウイルスは、明らかに、より低い発現レベルを示す(図6B)。この発見は、HDベクターAdFTCにおけるシス作用スタッファーDNAによるものと思われる。
【００７０】
インビボでのAdFTC/hFIXおよびfgAdhFIXの発現レベルを研究するために、3匹のC57BL/6マウスの2群に、各ウイルスの2 x 109個の形質導入粒子を尾静脈を通して注入した。ヒトFIX血清レベルを、ELISAにより毎週測定し、ヒトFIXの持続性レベルを検出することができた(注入後8週間、AdFTC/hFIXについて〜41 μg/mlおよびfgAdFIXについて〜11 μg/ml)。結果は、図7にグラフを用いて示されている。この観測から、ADFTCがウイルスに基づく遺伝子治療方法として大いに有望であることが明らかに実証されている。血清アラニンアミノトランフフェラーゼ(ALT)のレベルにより示される毒性は、AdFTC/hFIXおよびfgAdhFIXを注入されたマウスにおいて検出されえなかった(表1)。
【００７１】
【表１】
2004532039.tif 000003
【００７２】
IV. 組み込みガットレスアデノウイルスを作製するための方法
A. 組み込みガットレスアデノウイルスを作製するための方法
ガッティドアデノウイルスの持続性はわかっていないが、明らかに一生ではないようであるため、遺伝的疾患のとって、安全な組み込みアデノウイルスは大きな利点を有すると思われる。それゆえ、第二の方法は、ゲノムへ組み込む能力をもつアデノウイルスベクターを設計し、それによって、一生、治療遺伝子を産生させるために、本発明者らの改良されたより毒性の少ないアデノウイルス系の使用を提案する。これを行うために、本発明者らは、肝臓において非毒性であるトランスポザーゼ遺伝子を一過性に発現させ(Yantら、2000、Nature Genetics 25:35-40)、結果として、アデノウイルスのキャプシドの効率的および臨床的に関連性のある送達特性をもって、配列特異的(非哺乳動物の)逆位反復に隣接するDNA配列の染色体DNAへの安定的組み込みを生じる。環状ゲノムからの転移は、直鎖状DNAからよりも非常に効率的である。それゆえ、本発明者らは、組み込み能力をもつ環状中間体を得るために、直鎖状アデノウイルスゲノムから逆位反復に隣接するトランスポゾンを切り出す。Cre-loxP系はガットレスアデノウイルスの作製の間にすでに用いられているため、代替的な系であるFlp組換え系が環状中間体を作製するために用いられる。それゆえ、トランスポゾンのIRに隣接する治療発現カセットは、Flpリコンビナーゼ認識部位(FRT)間の中にクローニングされる。トランスポザーゼおよびFlpリコンビナーゼが同時発現されて、組み込みが起こる。この方法は、高い組み込み効率をもつ欠損組み込みアデノウイルスを作製する。方法は、図8に示されている。
【００７３】
B. 部位特異的組み込みガットレスアデノウイルスを作製するための方法
AAVまたはレトロウイルスが使用される場合に起こるランダムな組み込み現象による、突然変異誘発において可能性のあるリスクを有意に低下させる部位特異的組み込みは、ストレプトマイセス(Streptomyces)ファージφC31由来の新規な部位特異的インテグラーゼ(Grothら、Proc Natl Acad Sci USA 2000年5月23日；97(11):5995-6000)のようなインテグラーゼを使用することにより提供される。
【００７４】
V. 組み込みトランスポゾンの組換えアデノウイルスへの配置
A.
アデノウイルスベクターは直鎖状DNA分子であるため、DNAの分子構造(例えば、直鎖状および環状)が転移に影響するかどうかを測定するために実験が行われた。研究の結果は驚くべきことであり、図9に要約されている。環状または直鎖状DNAと野生型または変異体トランスポザーゼとの様々な組み合わせが、HeLa細胞へとトランスフェクションされた。パネルCでは、機能しうるトランスポザーゼを構成的に発現する細胞系において、トランスポゾンITRを有するまたは有しない直鎖状ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ発現カセット由来の安定的G418耐性コロニーにおいて増加はなかった。このように、DNA転移に基づく組み込みアデノウイルス系を開発するためには、分子は環状中間体を通して動かなければならない可能性が高いものと思われる。
【００７５】
本発明者らは、hFIX発現レベルにおいてゆるやかな減少を観察した。注入の1年後に、血清hFIX濃度が最初のレベルと比較して95％に減少した。それゆえ、本発明者らは、発現カセットを染色体DNAへに組み込むことができるアデノウイルスを作製するためのトランスポゾンに基づく遺伝子送達系を提案した。当研究の間に、本発明者らは、直鎖状DNAが効率的に転移しないことが判明した。従って、本発明者らは、導入遺伝子発現カセットを環状にさせるための方法を計画し、それにより基質トランスポザーゼを形成することが可能になった。本発明者らの予備データは、アデノウイルス内のトランスポゾンが、インビボでHeLa細胞へ形質導入された場合、実際に環状化しうることが示されている。これは、細胞を図5に記載されるベクターで形質導入し、続いてサザンブロット分析を行うことにより実証された(図10)。
【００７６】
多くの態様において、Flpリコンビナーゼ(一過性発現させるためにスタッファーDNAの領域へクローニングされる)も発現するような単一のベクターが最適であるが、2つのベクターの系もまた使用されうる。2ベクター方法において使用されている遺伝子欠損ベクターのゲノムは、図11に概略が示されている。トランスポザーゼは、誘導性プロモーターから誘導されることになる。Flpリコンビナーゼの発現は、構成的かつ遍在性のEF1-アルファプロモーターに由来する。
【００７７】
本発明者らは、トランスポザーゼおよびFlpリコンビナーゼを同時発現するアデノウイルスベクターならびにカナマイシン耐性SBトランスポゾン(図11)を含むベクターをC57Bl/6マウスの尾静脈へ共投与し、最近記載された回復方法(Yantら、Nature Genetics、2000)を用いて依存性転移現象を同定した。組み込みおよび治療可能性を数量化する方法は図12に示されている。導入遺伝子発現は、発現カセットが分裂されているため、親アデノウイルスベクターから生じることができない。これを確証するために、FLP/トランスポザーゼを含まないベクターがマウスへ注入される。しかしながら、DNAが環状化される場合、無傷の発現カセットが回復されて、遺伝子発現が生じうる。X-gal染色(形質導入細胞の頻度)、β-ガラクトシダーゼ酵素アッセイ法、または因子IXの血漿レベルにより、遺伝子発現の定量が行われる。その結果により、環状形および組み込まれた形の両方に由来の遺伝子発現の全量が提供さえっる。組み込まれた形に由来する遺伝子発現の量を確立するために、2/3部分肝切除が、ベクター投与後1週間目に行われる。取り除かれた肝臓組織は、β-ガラクトシダーゼ酵素活性およびX-gal染色(lacZベクターの場合)、ならびにサザン分析について検査される。ベクターを切断しないか、ベクターを1度または2度切断するような様々な酵素を用いることにより、環状ゲノムの数が推定される。肝臓は再生するため、各肝実質細胞は、部分肝切除後、1度または2度分裂し、示されるように、非組み込みプラスミドの約95％が失われる。2週間内に、最初の肝臓塊は回復され、遺伝子発現量が測定される(例えば、β-ガラクトシダーゼまたは血清因子IX)。hFIXの利点は、期間中にわたり個々の動物において連続的に測定可能なことである。遺伝子発現の残存レベルは、導入遺伝子の組み込まれたコピーに起因するものと思われる。部分肝切除の前および後に遺伝子発現の相対的量を測定することにより、組み込まれたゲノムからの相対的な遺伝子発現が割り当てられることになる。
【００７８】
B.
1. 導入
遺伝した疾患についてのアデノウイルス媒介型遺伝子治療の主な制限は、期間中にわたって、少なくとも一部分、直鎖状の染色体外のベクターゲノムの損失から生じる、インビボでの導入遺伝子発現の不安定性である。本明細書に、本発明者らは、宿主細胞染色体への組み込みを通して、インビボでウイルス-コード導入遺伝子を安定的に維持する新規な低免疫原性アデノウイルス遺伝子送達系の作製を記載する。この系は、Flpおよびスリーピングビューティ(SB)リコンビナーゼをコードするヘルパー-ウイルスと共に細胞へ共送達される場合、Flp媒介性組換えおよびその治療有効搭載量の切り出しを受ける供与体トランスポゾンベクターを利用する。これにより、アデノウイルスゲノム内に未だ含まれている直鎖状DNAエレメントと顕著な対照をなして、トランスポザーゼの存在下において容易に転移を受けることが可能なトランスポゾン環をインサイチューで効率的に生じさせる。この系の全身性インビボ送達により、転移およびマウス肝実質細胞の安定的組み込みが生じた。重要なことに、この転移レベルは、広範な肝臓増殖を受けるマウスにおいて治療レベル(正常の3％)でヒト凝固因子IXの発現をインビボで安定化させるために十分であった。同時に、これらの研究は、スリーピングビューティトランスポザーゼ/トランスポゾン系の組み込み能力をもつアデノウイルスベクターの形質導入の効率性および多用性を合わせもつ可能性を実証している。
【００７９】
2. 直鎖状核酸の組み込み効率
図13：直鎖状DNAゲノムは転移を支持しない。A、スリーピングビューティトランスポザーゼ/トランスポゾン系のインビボでの送達のためのE1/E3欠損転移ベクターAd-SBおよびAd-ThAATの構造。5'ITRおよび3'ITR、それぞれ、アデノウイルス5型の左端および右端；RSV、ラウス肉腫ウイルス末端反復配列プロモーター；SB、スリーピングビューティトランスポザーゼ；pA、ポリアデニル化シグナル；E1/E3、それぞれ、アデノウイルス5型初期領域1および3；IR、スリーピングビューティ逆位反復配列；hAAT、ヒトα1-アンチトリプシンcDNA。B、トランスポザーゼの存在下および非存在下におけるマウスでの長期間のアデノウイルスに基づくトランスポゾン発現。C57Bl/6マウス(群あたりn=5マウス)に、AdSB(黒丸)または対照としてのAdnull(黒三角)のいずれかの6 x 109 p.f.u.と共に、2 x 109 p.f.u. AdThAATを尾静脈を通して注入した。C、培養哺乳動物細胞における環状および直鎖状の転移因子からの転移効率。左、HeLa細胞におけるスーパーコイル状のneoマーカーのトランスポゾンの転移；中、HeLa細胞における直鎖状のneoマーカーのエレメントの転移頻度；右、構成的にSBトランスポザーゼを発現するHeLa-SB細胞における隣接逆位反復を含む(+IR)および含まない(-IR)直鎖状neoマーカーのトランスポゾンの転移。3つの独立したトランスフェクション後に得られるG418-耐性(G418R)コロニーの数の平均値±標準偏差が各パネルに示されている。SV40、サルウイルスプロモーター；neo、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子。
【００８０】
3. ヘルパー依存性アデノウイルスベクターからの転移を促進する方法の概要
図14：トランスポザーゼは直鎖状DNA構造に効率的に作用することができないため、スリーピングビューティトランスポゾンを含むアデノウイルスベクターは、SB発現細胞の染色体外に残存している。トランスポゾンが一対のFlp認識標的(FRT)配列に隣接している場合、アデノウイルスベクターは、Flpリコンビナーゼを同時発現する細胞において条件的再編成を受ける。この再編成は、結果として、アデノウイルスゲノムからのトランスポゾンの切り出しおよびFlp媒介性組換えによるその環状化を生じる。それらの直鎖状の対応物と対照的に、これらの環状エレメントは、DNA媒介性転移を活発に受け、結果として、宿主細胞染色体へのトランスポゾンの安定的挿入を生じる。
【００８１】
4. ヘルパー依存性転移ベクターの構造
図15：本発明者らは、インビボでガットレスアデノウイルスベクターからの転移を分析するために2ベクター方法を用いた。この方法は、供与体トランスポゾンを含む第二のウイルスベクター(C〜G)に作用するFlpおよびSBリコンビナーゼを提供する1つのベクター(AおよびB)の使用を用いる。(A)HD-SB-Flpおよび(B)HD-mSB-Flpの両方とも条件的ベクター再編成に必要な増強されたFlpリコンビナーゼ(Flpe)をコードしているが、HD-mSB-Flpは、トランスポザーゼ遺伝子へ導入された不活化突然変異のために転移を支持することができない。供与体ベクター、(C)HD-FRT-Tnori、(D)HD-Tnori、(E)HD-FRT-TlacZ、(F)HD-TlacZ、および(G)HD-FRT-ThFIXは、カナマイシン(CおよびD)、β-ガラクトシダーゼ(E、F)、またはヒト因子IX(G)をコードする供与体トランスポゾンを含む。(E〜G)におけるイントロン含有導入遺伝子は、最初に分裂され、従って、Flp媒介性環状化が正しい読み枠を回復するまで不活性のままである。(D)および(F)に示されるベクターは、一対の隣接FRT部位を欠損し、従って、環形成およびSB媒介性転移の両方に必要なFlp媒介性組換えを受けることができない対照ベクターである。IgκMAR、2コピーの免疫グロブリンκマトリックス付着領域；スタッファーDNA、17番ヒト染色体由来のアルフォイド反復DNAの16.2 kb断片；MTH、金属結合性タンパク質I遺伝子プロモーター；EF1α、ヒト伸長因子1α遺伝子エンハンサー-プロモーター；Tn5、細菌のプロモーター；kan、カナマイシン耐性遺伝子；ori、p15A細菌の複製開始点；Cm、クロラムフェニコール耐性遺伝子；LacZ、LacZコード配列のヌクレオチド1,761位と1,762位の間に挿入されたヒト絨毛性ゴナドトロピン(hCG)6遺伝子のイントロン1を含む組換え分裂β-ガラクトシダーゼ遺伝子；ApoE/HCR、アポリポタンパク質E(ApoE)遺伝子由来の肝実質細胞制御領域(HCR)を含む1.2 kb断片；hAATp、ヒトα1-アンチトリプシン遺伝子プロモーター；hFIX、hFIX遺伝子由来の1.4 kbの切断イントロンAを含む分裂ヒト因子IX(hFIX)cDNA
【００８２】
5. インビボにおいて、組換えヘルパー依存性アデノウイルスベクターからの転移は、トランスポゾンDNAのマウス肝臓染色体への安定的挿入を生じる。
図16：A、マウス染色体由来のトランスポゾンを回収するために用いられる遺伝的方法の概要。C57Bl/6-scidマウス(群あたりn=2マウス)に、各ウイルスの1 x 109形質導入ユニット(T.U.)を尾静脈へ注射した。本発明者らは、ベクター投与直後の5週間の間、動物の飲料水へZnSO4の濃度を増加させて添加していくことにより、段階的様式でトランスポザーゼ発現を誘導した。1群〜3群には、アデノウイルスベクターからのトランスポゾン組み込みが環形成およびトランスポザーゼ活性の両方を必要とすることを示すための対照として含まれた。B、推定切り出し環状エピソームの構造。数はkbでのHindIII断片サイズを表し、矢印はトランスポザーゼ切断部位を指す。H、HindIII。C、HindIII消化および臭化エチジウムゲル電気泳動によるトランスポゾンDNA分析。レーン：1〜8、4群(HD-FRT-Tnori + HD-SB-Flp)マウスの肝臓DNAから回収された8個の独立したkanR/camSクローン由来のDNA。矢印は、内部のトランスポゾン特異的断片(2.4 kbおよび0.4 kb)を指す。サイズマーカーはkbである。D、トランスポゾン挿入部位配列。標的部位重複は太字の大文字で示され、新規の隣接配列は小文字で、トランスポゾン配列は中央の斜線付き四角で表示されている。トランスポゾン隣接配列の起源および同定は、左に示されているが、マウスゲノムデータベース相同性検索により同定された。
【００８３】
6. アデノウイルス/トランスポゾン系による活発に分裂しているマウス肝臓におけるインビボでのFIX持続性
図17：C57Bl/6マウス(群あたりn=5マウス)に、HD-SB-Flp(黒丸)または対照としてのHD-mSB-Flp(白三角)のいずれかの5 x 108と共に、HD-FRT-ThFIXの5 x 108 T.U.を尾静脈へ注射した。トランスポザーゼ発現は、ベクター投与後すぐの最初の3週間の間、25 mM ZnSO4(最終濃度)を含む飲料水の添加により、処理された動物において誘導された。3週間後、Znは水から除去され、肝細胞の再生およびエピソームのベクターの減少を促進するために外科的2/3部分肝切除(PH)が行われた。アステリスク(*)付きの矢印は、動物が、肝細胞の細胞周期をさらに促進するためにベクター投与後6週間、8週間、10週間、12週間および14週間に四塩化炭素(CCl4)の腹腔内(i.p.)注射を受けた時を図示している。
【００８４】
VI. 遺伝子治療への適用
一般的に、本発明者らの新規なHD依存性ベクターAdFTCおよびAdFTCに基づく2つの提案された組み込みベクターは、遺伝子治療法のための効率的遺伝子移入媒体として使用されうる。例えば、表現型の補正研究に関して、血友病の動物モデルにおいて治療レベルの凝固因子を産生するための肝臓に対する遺伝子移入が研究されうる。
【００８５】
VII. 肝炎感染症への適用
肝臓がヒトFVIIIおよびFIX産生の本来の器官であるという理由により、血友病への遺伝子治療は、ほとんど肝臓へ標的化されてきたが、血友病がしばしば肝炎感染症と関連していることから、これがまた問題をもたらしている。将来的に肝炎問題に取り組む一つの方法は、HCV RNAを特異的に標的化してそれを切断させるリボザイムについて肝臓への送達系としてこの新規なHD系を使用することである。HCV特異的リボザイムを発現する第一世代アデノウイルスを用いる当研究室からの以前の結果に基づくと、HCV特異的リボザイムを送達するためにHD系を用いる将来的研究は、肝臓においてHCV複製を制御する方法として大いに有望である。
【００８６】
本発明がアデノウイルスベクターを作製するための重要な新しい方法を提供していることは、上記の結果および考察から明らかである。本発明の利点は、ヘルパーベクターのコンタミネーションがほとんどないまたは全くない、ガットレスアデノウイルスベクターの高力価の調製を生み出す能力を含む。さらに、ベクターにより運ばれた外因性核酸が標的細胞ゲノムへ組み込まれるようなアデノウイルスベクターが提供され、外因性核酸の長期間発現が望ましい場合の適用において一定の利点が提供される。従って、本発明は、当技術分野に重要な貢献を示している。
【００８７】
本明細書に引用されるすべての刊行物および特許出願は、各個々の刊行物または特許出願が具体的かつ個別に示されて参照として組み入れられているかのように、参照として本明細書に組み入れられる。いずれの刊行物の引用も、出願日前のその開示としてであって、本発明が先行発明によりそのような刊行物に先立つ権利がないことの承認として解釈されるべきではない。
【００８８】
理解を明確にすることを目的として、図解および実施例により本発明をかなり詳細に記載してきたが、添付された特許請求の範囲の意図または範囲から逸脱することなく一定の変化および改変がそれに対してなされうることは、本発明の開示を鑑みて当業者にとって容易に明らかであると思われる。
【図面の簡単な説明】
【００８９】
【図１】本発明のヘルパー依存性ベクターである、pAdFTCの地図を提供する。
【図２】新規なヘルパー-ウイルスAdluc/IsceI(lox)2の構造。C7-Cre/SceI細胞の感染後のヘルパー-ウイルスIsceI切断およびCre-組換え産物の形成は、サザンブロット法により実証されている。
【図３】本発明のベクター作製系の概略地図を提供する。
【図４】C7Cre細胞およびC7Cre/ISceI細胞を使用する力価およびヘルパー-ウイルスの比較。AdFTC/lacZ/ChMAR DNAを、2つの異なるクローンのC7Cre/ISceI細胞または本発明者らの標準的C7-Cre細胞へ、様々なヘルパーのMOIと共に、トランスフェクションした。第一継代後、パッケージングベクター(上図)およびヘルパー(下図)の量が測定された。ベクターは形質導入細胞において希釈およびβ-gal分析により力価測定され、ヘルパー-ウイルスはリアルタイムPCR法により測定された。
【図５】β-ガラクトシダーゼをコードするHDベクターのトランスフェクション後の連続継代。増幅は293G7細胞において行われ、各サイクル後に1 mlあたりの青色形成ユニット(bfu's)が計数された。
【図６】HDベクターAdFTC/hFIXおよび第一世代アデノウイルスfgAdhFIXについての一次マウス肝実質細胞におけるインビトロでの導入遺伝子発現。(A)1のMOI(黒丸/白丸)、10のMOI(黒逆三角/白三角)および100のMOI(黒四角/白四角)での一次肝実質細胞におけるAdFTC/hFIXの発現レベル。(B)AdFTC/hFIX(黒逆三角/白三角)およびfgAdhFIX(黒丸/白丸)についての導入遺伝子発現レベルの比較。
【図７】HDベクターAdFTC/hFIX(黒丸)および第一世代アデノウイルスfgAdhFIX(白四角)についてのC57BL/6マウスにおけるインビボでの導入遺伝子発現レベル。群あたり3個体に2 x 109感染性粒子を注入し、hFIXレベルをELISAにより測定した。+/-SDはエラーバーにより示される。
【図８】切り出し可能なトランスポゾンに発現カセットを含む本発明のヘルパー依存性ベクターの地図を提供する。
【図９】転移は直鎖状DNAでは起こらない。(a)および(b)HeLa細胞は、変異体または野生型のトランスポザーゼおよび環状または直鎖状のプラスミドの1つでトランスフェクションされた。(c)トランスポゾンIR含有および欠損の直鎖状DNAが機能しうるトランスポザーゼを安定的に発現するHeLa細胞へトランスフェクションされた。組み込み現象の数は、G418耐性コロニーの数を測定することにより決定された。
【図１０】HeLa細胞における遺伝子欠損アデノウイルスベクターに由来する環状トランスポゾンベクター産生の記載。このベクターで形質導入され、FlpリコンビナーゼでトランスフェクションされたHeLa細胞を、サザンブロット法により分析した。
【図１１】組み込み遺伝欠損のベクター系に基づくトランスポゾンを確立するための2ベクター方法の概略を示す。Enh hAAT = エンハンサーおよびAATプロモーター、MTH = (金属誘導性プロモーター)、kan = 原核生物kan耐性遺伝子、ori = 細菌の複製開始点、Cm = 原核生物クロラムフェニコール耐性遺伝子。EF1-EF1アルファプロモーター-エンハンサー。
【図１２】アデノウイルス-トランスポゾンベクターの組み込みを定量する方法。
【図１３】直鎖状DNAゲノムは転移を支持しない。
【図１４】ヘルパー依存性アデノウイルスベクターからの転移を促進するための方法の概要。
【図１５】ヘルパー依存性転移ベクターの構造。
【図１６】インビボにおいて、組換えヘルパー依存性アデノウイルスベクターからの転移により、トランスポゾンDNAのマウス肝臓染色体への安定的挿入が生じる。
【図１７】インビボにおける、アデノウイルス/トランスポゾン系による活発に分裂しているマウス肝臓でのFIX持続性。
【図１８】本発明のベクターのゲノムへの組み込みの追加の図を提供する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１６Ｃ】
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【図１６Ｄ】
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【図１７】
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【図１８】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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