(57)【要約】本発明は、インフルエンザＡウイルスおよび／またはインフルエンザＢウイルスによる感染を検出する方法に関し、該方法は、ｉ） 唾液サンプルを得るステップ、ｉｉ） 検出反応のために唾液サンプルを調製するステップ、およびｉｉｉ） 唾液サンプル中のインフルエンザＡウイルスおよび／またはインフルエンザＢウイルスを検出するステップ、を含んでなる。さらに、本発明は、インフルエンザＡウイルスおよび／またはインフルエンザＢウイルスによる感染を検出するためのテストキットに関し、該キットは、ｉ） 唾液サンプルを採取するための装置、およびｉｉ） インフルエンザＡウイルスおよび／またはインフルエンザＢウイルスの検出のための試薬および／または補助試薬、を含んでなる。さらにまた、本発明は、インフルエンザＡウイルスおよび／またはインフルエンザＢウイルスによる感染を検出するためのサンプル材料としての唾液の使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
インフルエンザＡウイルスおよび／またはインフルエンザＢウイルスによる感染を検出する方法であって、以下のステップ：
ｉ）　　唾液サンプルを得るステップ、
ｉｉ　　検出のために唾液サンプルを調製するステップ、および
ｉｉｉ）　唾液サンプル中のインフルエンザＡウイルスおよび／またはインフルエンザＢウイルスを検出するステップ、
を含む、上記方法。
【請求項２】
ステップｉ）で得られる唾液サンプルが、自然に形成された唾液であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ステップｉ）で得られる唾液サンプルが、ウイルス特異的な富化を行うことなく唾液採取装置で得られることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
ステップｉｉ）において、インフルエンザＡウイルスおよび／またはインフルエンザＢウイルスのＲＮＡを唾液サンプルから単離し、ステップｉｉｉ）においてＲＴ−ＰＣＲによって増幅し検出することを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
ステップｉｉｉ）において、唾液サンプルを、インフルエンザＡウイルスおよび／またはインフルエンザＢウイルスの存在について免疫学的に調べることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
ステップｉｉ）において、唾液サンプルを、インフルエンザＡウイルスおよび／またはインフルエンザＢウイルスのウイルス核タンパク質が放出されるように溶解バッファーで処理し、ステップｉｉｉ）において、この核タンパク質を免疫学的に検出することを特徴とする、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
インフルエンザＡウイルスおよび／またはインフルエンザＢウイルスによる感染を検出するためのテストキットであって、以下のもの：
ｉ）　唾液サンプルを採取するための装置、および
ｉｉ） インフルエンザＡウイルスおよび／またはインフルエンザＢウイルスの検出のための試薬および／または補助試薬、
を含んでなる上記キット。
【請求項８】
インフルエンザＡウイルスおよび／またはインフルエンザＢウイルスによる感染を検出するためのサンプル材料としての唾液の使用。
【請求項９】
唾液が自然に形成されたものであることを特徴とする、請求項８に記載の唾液の使用。
【請求項１０】
唾液サンプルが、ウイルス特異的な富化を行うことなく唾液採取装置で採取されることを特徴とする、請求項８に記載の唾液の使用。
【請求項１１】
インフルエンザＡウイルスおよび／またはインフルエンザＢウイルスによる感染が免疫学的試験によって検出されることを特徴とする、請求項８〜１０のいずれか１項に記載の唾液の使用。
【請求項１２】
インフルエンザＡウイルスおよび／またはインフルエンザＢウイルスによる感染が核酸の検出によって検出されることを特徴とする、請求項８〜１０のいずれか１項に記載の唾液の使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、インフルエンザＡウイルスおよび／またはインフルエンザＢウイルスの検出方法、対応するテストキット、およびインフルエンザＡウイルスおよび／またはインフルエンザＢウイルス検出のためのサンプル材料としての唾液の使用に関する。
【０００２】
インフルエンザは、過小評価されることの多い感染性疾患であるが、特に高齢者とハイリスク患者では高い罹患率と死亡率に至ることがある。インフルエンザＡウイルスおよび／またはインフルエンザＢウイルス（以下、インフルエンザＡ／Ｂウイルスと略記する）は、真性ウイルス性インフルエンザの原因であり、毎年世界中で数億人が罹患する。インフルエンザＡウイルスとインフルエンザＢウイルスは、主に鼻咽頭空洞部と口腔咽頭空洞部に感染し、初期には、感染者に一般的な呼吸器症状を引き起こす。
【０００３】
インフルエンザを患者の臨床症状のみに基づいて高い信頼度で診断することは、経験を積んだ医師ですらできないことである。なぜならば、アデノウイルス、パラインフルエンザウイルスもしくは呼吸合包体ウイルス（ＲＳウイルス）等の鼻腔または咽頭腔に感染する他のウイルスも類似した症状を引き起こすからである。
【０００４】
インフルエンザ感染症（インフルエンザ）は医学的に非常に重要であるため、世界中のほとんどすべての国が、現在、国家的に組織化されたインフルエンザ監視システムを設けている。この計画では、一般開業医が鼻および／または喉からスワブ（綿棒で採取したサンプル材料）を採取し、それらを各国の照会センターに送付する。通常は、このスワブを溶出し、その後、ＭＤＣＫ細胞（Ｍａｄｉｎｅ−Ｄａｒｂｙ Ｃａｎｉｎｅ Ｋｉｄｎｅｙ細胞）等の哺乳動物細胞上で患者試料を培養することにより、インフルエンザＡ／Ｂウイルスを検出している。
【０００５】
これらの特別な実験室での培養は、１４日間も要することがあり、したがって、個々の患者の診断にすぐには対応できない。むしろ、上記各国照会センターの目的は、培養したウイルスをタイプ（型）およびサブタイプに分類して、その結果を世界保健機関（ＷＨＯ）に報告することである。その後、毎年のＷＨＯの推奨を基礎として、最近流行したウイルス株に翌年のインフルエンザワクチンを適合させることがワクチン製造業者の仕事となる。
【０００６】
遺伝的な、またそれゆえに、免疫学的な可変性が特にインフルエンザＡウイルスで高い理由は、通常の遺伝的浮動（点突然変異）に加えて、まれなケースでは遺伝子転位（ウイルス遺伝子の再編成）も起こりうるためである。このことは、他のウイルスとは対照的に、インフルエンザウイルスのゲノムがセグメント化されており、また、インフルエンザＡウイルスが動物だけでなくヒトの病原体でもあるという事実による。
【０００７】
ウイルス表面に存在する主要抗原は、ヘマグルチニン（赤血球凝集素）（Ｈ）とノイラミニダーゼ（Ｎ）である。現在、インフルエンザＡウイルスについては、ヘマグルチニンの１５のサブタイプ（Ｈ１〜Ｈ１５）とノイラミニダーゼの９つのサブタイプ（Ｎ１〜Ｎ９）が知られている。
【０００８】
例えば宿主（例：ブタ）がヒトに対して病原性であるＡ型インフルエンザウイルスと、トリのインフルエンザＡウイルスに共感染すると、ウイルスゲノムの再編成が起こって、新しいインフルエンザＡウイルスサブタイプが形成される。そしてそれがヒトに逆伝播した時、完全にヒトの免疫系を逃れることになる。そのごく最近の例は、早期の検出と徹底した医療にも関わらず、罹患した患者１８人のうち６人が死亡した、１９９７年５月に香港で発生したいわゆるトリウイルスインフルエンザ（Ａ型／Ｈ５Ｎ１／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／１５６／９７）であった。
【０００９】
しかし、より広範な伝染病もしくは世界的な流行病を引き起こすには、新種のインフルエンザウイルスサブタイプが、直接ヒトからヒトへ伝播されなければならない。最初に１９１８／１９１９年に起きたサブタイプＨ１Ｎ１のケース（スペインかぜ、世界的に約５０００万人が死亡）、１９５７年のケース（サブタイプＨ２Ｎ２、アジアかぜ、約１００万人の犠牲者）、および１９６８年のケース（サブタイプＨ３Ｎ２、香港かぜ、約１００万人の犠牲者）がそうである。
【００１０】
新世代のインフルエンザ治療薬が最近入手できるようになり、そのいわゆるノイラミニダーゼ阻害剤は初めてインフルエンザの原因療法を可能にし、ゆえに専門家達からインフルエンザの治療における真の躍進とみなされている。この新しいクラスの物質を登録するために実施された臨床試験により、治療の成功は、主として、最初の臨床徴候が発生した後で早期に治療を開始することに起因することが示された。それゆえに、この新しい治療薬の選択、早い段階での治療開始の必要性、およびそれほど特異的でない臨床症状を考慮すると、迅速な個別診断が治療決定の基礎として有用であるだろう。
【００１１】
その結果、いくつかの診断薬製造業者は最近、抗原の検出に基づいた迅速な免疫学的インフルエンザ試験を開発したが、これらの迅速試験は、サンプル材料として鼻および／または喉から綿棒で採取したスワブ、あるいは鼻洗浄によって得られる液体を使用するものである。このような迅速インフルエンザ試験の例には、Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ＧｍｂＨ社のインフルエンザＡ／Ｂ迅速試験、Ｑｕｉｄｅｌ社のＱｕｉｃｋ Ｖｕｅ、およびＢｉｏｓｔａｒ社のＡＢ ＦＬＵ ＯＩＡなどがある。
【００１２】
サンプルを集めるうえで特に問題となるのは、鼻や咽頭の空洞の感染部位から、十分な量のインフルエンザＡおよび／またはインフルエンザＢウイルス（以下インフルエンザＡ／Ｂウイルスと略記する）を含むサンプル材料を分離することである。したがって、サンプリングの質が迅速試験の陽性率に直接的な影響を及ぼす。これらの試験は通常約７０パーセントの臨床感度を有し、すなわち、免疫学的な迅速試験もまた、対照法（細胞培養）でインフルエンザ陽性と診断された全サンプルの７０％において陽性である。したがって、診断薬業者は、彼らのインフルエンザ迅速試験に関し、取得したサンプルに実際に十分な量のインフルエンザＡ／Ｂウイルスを確実に含有させるため、サンプルは特別に訓練された医療従事者によってのみ採取されるべきことを、製品説明書中で指摘している。
【００１３】
かかる状況は、綿棒でふきとらねばならない咽頭腔（咽頭壁後方、咽頭、扁桃腺）の部位がウイルス感染の存在場所に応じて実際異なっているため、さらに複雑になる。このことは、例えば、インフルエンザＡ／Ｂウイルスを検出するためではなく、ストレプトコッカス感染を検出するためには、喉の別の部位からスワブを採取しなければならないことを意味する。
【００１４】
鼻／喉からスワブを集めることは、患者にとって不快であり、（小さな）子供の場合には特に問題である。一方、子供は、彼らの社会的接触（幼稚園、学校）によって、また、彼らの免疫系が十分には発達していないという事実によって、インフルエンザ流行の少なくとも初期段階でインフルエンザウイルスの主なキャリアーとなることが多い。
【００１５】
鼻および咽頭から得られたスワブは均質なサンプル材料ではないので、インフルエンザ試験の陽性率は、スワブの質に加えて、正確な溶出、すなわち、スワブ材料の液相（次なる試験に実際のサンプル材料として供される）への移行によっても決定される。
【００１６】
特に新しい治療薬の選択（ノイラミニダーゼ阻害剤）は、訓練された（医療）従事者によるサンプリングを必要とする、従来用いられてきたサンプル材料（スワブ、鼻洗浄液）とは相容れない、一般開業医または患者のためのインフルエンザウイルス（インフルエンザＡ／Ｂウイルス）試験の必要性を将来的に高めるであろう。
【００１７】
本発明の目的は、従来技術の欠点を解決することである。特に本発明の目的は、訓練されていない者もしくは理想的には患者自身が行うことのできる、インフルエンザＡおよび／またはインフルエンザＢウイルス感染の検出方法を提供することである。とりわけ本発明の目的は、インフルエンザＡおよび／またはインフルエンザＢウイルスを確実に検出でき、好ましくは均質であり、訓練されていない者もしくは理想的には患者自身が簡便かつ単純な方法で採取できる、そのようなサンプル材料を見出すことである。
【００１８】
上記目的は、本明細書の独立請求項に特徴付けられる本発明の主題により達成される。本発明の好ましい実施形態は、本明細書の従属請求項に記載する。
【００１９】
本発明は、インフルエンザＡウイルスおよび／またはインフルエンザＢウイルスによる感染を検出する方法であって、以下のステップ：
ｉ）　　唾液サンプルを得るステップ、
ｉｉ　　検出のために唾液サンプルを調製するステップ、および
ｉｉｉ）　唾液サンプル中のインフルエンザＡウイルスおよび／またはインフルエンザＢウイルスを検出するステップ、
を含む、上記方法に関する。
【００２０】
本発明はさらに、インフルエンザＡウイルスおよび／またはインフルエンザＢウイルスによる感染を検出するためのテストキットであって、以下のもの：
ｉ）　唾液サンプルを採取するための装置、および
ｉｉ） インフルエンザＡウイルスおよび／またはインフルエンザＢウイルスの検出のための試薬および／または補助試薬、
を含んでなる上記キットに関する。
【００２１】
さらに本発明は、インフルエンザＡウイルスおよび／またはインフルエンザＢウイルスによる感染を検出するためのサンプル材料としての唾液の使用に関する。
【００２２】
驚くべきことに、確立された診断法を用いて、サンプル材料としての唾液からインフルエンザＡ／Ｂウイルスを確実に検出できることが見出された。
【００２３】
特に、本発明の好ましい実施形態において、サンプル採取の際に唾液サンプル中のウイルスを富化する必要なしに（むしろ、自然に形成された唾液がインフルエンザＡ／Ｂウイルス検出用のサンプル材料として十分である）、唾液からインフルエンザＡ／Ｂウイルスを検出できるということは予想外のことであった。本発明において、自然に形成された唾液とは、インフルエンザＡ／Ｂウイルスを検出することを目的として唾液サンプルを集める時に、サンプル中のインフルエンザＡ／Ｂウイルスが富化されないということを意味すると理解される。自然に口腔内に存在している唾液だけが採取され、例えば唾液採取容器に（例えば唾を吐くことによって）移される。コットンフリース（綿棒）のような吸収性の材料を利用して口腔内の唾液サンプルを集めたり、または、当業界で周知の唾液採取装置（例えば、Ｓａｒｓｔｅｄｔ社製のＳａｌｉｖｅｔｔｅ、もしくはＥｐｉｔｏｐｅ社（Ｂｅａｖｅｒｔｏｎ， ＯＲ ９７００８， ＵＳＡ）製のＯｒａＳｕｒｅ試料採取装置など）を使用して唾液サンプルを集めたりすることも可能である。
【００２４】
当然のことながら、本発明に従って、サンプリング中にもしくはその後の処理段階においてウイルスの富化（濃縮）を行った唾液を、インフルエンザＡ／Ｂウイルス検出用のサンプル材料として使用することも可能である。
【００２５】
インフルエンザ診断において従来知られているサンプル材料（すなわち鼻腔／咽喉からのスワブおよび鼻腔刺激により得られる液体）とは対照的に、本発明の唾液サンプル材料および単純なサンプル採取方法は、訓練されていない者または患者自身による標準化されたサンプル採取を可能にし、これにより、インフルエンザＡ／Ｂウイルス試験の診断信頼度が向上する。さらに、唾液はこれまで使用されてきた材料より均質なサンプル材料であり、このことも診断信頼度の向上に貢献する。
【００２６】
本発明の方法では、まず初めに、唾液サンプルを採取する。例えば、サンプル採取は、上記のように、容器へ唾を吐くか、口腔内を綿棒のような吸収性の材料または同様の材料を用いて唾液サンプルを吸収させるか、あるいは、慣用の唾液採取装置を使用することによって行うことができる。
【００２７】
続いて、採用する検出方法（免疫学的検出または核酸による検出）に従う検出反応のために唾液サンプルを調製する。
【００２８】
免疫学的検出の場合には、インフルエンザＡ／Ｂウイルスのウイルス核タンパク質を、例えば溶解試薬によって唾液サンプルから放出させる。かかる試薬は、当業者には公知であり、溶解のための活性成分として例えば塩類または界面活性剤を含むことができる。インフルエンザウイルス検出用の溶解試薬は、界面活性剤（例えば、好適であることが証明されているＴｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ１００、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０またはβ−オクチルグリコピラノシド）、弱い還元剤（例えば、Ｎ−アセチルＬ−システインまたはＤＴＴ（ジチオトレイトール））、生理食塩水（すなわち、０．９重量％のＮａＣｌを含む２０〜５０ｍＭリン酸バッファー）、保存剤（例えば０．０９重量％のＮａＮ３）、および、必要に応じて、非特異的結合を低減させるタンパク質（例えば、ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）またはＢＰＬＡ（ウシ血漿アルブミン））を含んでいるのが好ましい。ウイルス核タンパク質に加えて、免疫学的試験で、例えば、ウイルスマトリックスタンパク質またはウイルスポリメラーゼを検出することもできる。さらに、インフルエンザＡ／Ｂウイルスのヘマグルチニンまたはノイラミニダーゼを検出することも可能であり、この場合には、これらのウイルス成分がウイルス表面上に存在することから溶解を必要としない。
【００２９】
ウイルス検出が核酸に基づく場合は、例えば、ウイルス核酸（ＲＮＡ）を単離し、精製し、そして検出に必要なプライマーの存在下で適切に増幅する。好ましくは逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）によって増幅する。これらのステップは当業者に公知であり、先に増幅を行わない核酸試験も同様である。
【００３０】
インフルエンザＡ／Ｂウイルスは、公知の方法により唾液サンプル中で検出される。
【００３１】
例えばウイルス核タンパク質の免疫学的検出の場合には、適切な標識抗体を用いてサンドイッチ型複合体を形成させ、それを検出することができる。当然、競合試験フォーマットも可能である。検出は、迅速な試験として目視により評価できる免疫学的クロマトグラフィーテストストリップを用いて行うのが好ましいが、あらゆる慣例的な免疫学的方法（例えば、ＥＬＩＳＡ、凝集試験、濁度試験等）により行うことができる。
【００３２】
インフルエンザＡ／ＢウイルスをＲＮＡのような核酸により検出する場合は、ＲＴ−ＰＣＲ産物を標識プライマーで標識して、プライマー上の標識（例えば、酵素標識または蛍光標識）を標識の種類に応じて検出することが好ましい。
【００３３】
本発明の方法を実施するためのテストキットも本発明の主題である。テストキットは、重要な構成要素として、第一に、唾を吐き入れるための容器のような唾液サンプル採取装置、１つ以上の吸収性綿棒、または、従来の唾液採取装置（例えば、Ｓａｒｓｔｅｄｔ社製のＳａｌｉｖｅｔｔｅまたはＥｐｉｔｏｐｅ社製のＯｒａＳｕｒｅ試料採取装置）を含む。さらに、テストキットは、唾液サンプル中のインフルエンザＡ／Ｂウイルスを検出するために必要な試薬および補助試薬をすべて含む。免疫学的検出の場合には、これらは、例えば、ウイルス核タンパク質を放出させるための溶解バッファー、必要に応じて標識された抗体、および場合により、免疫学的検出を行うための反応媒体（テストストリップ、マイクロタイタープレート、試験管）である。対応する試薬および補助試薬は多数の実施形態において当業者に公知である。同じものが核酸試験にも適用される。この場合、キットは、例えば、必要なＰＣＲ試薬と反応容器を含む。
【００３４】
以下の実施例により本発明をさらに説明する。
【００３５】
実施例
１．　サンプル材料としての唾液からのインフルエンザウイルス感染の検出
インフルエンザウイルスを検出するためのサンプル材料としての唾液の適合性を証明するために、インフルエンザ感染の疑いがある１０名と感染の疑いがない４名から、咽喉スワブ２つと唾液サンプル１つを採取した。咽喉スワブから得られたサンプル材料は比較目的のために採取し、インフルエンザＡ／Ｂウイルス感染について調べた。これらの検査の結果を、サンプル材料として唾液を用いて得られた結果と比較した。表１（実施例の実験部の最後に示す）は、上記比較結果の概要を示す。
【００３６】
１．１　サンプル採取
１．１．１．　咽喉スワブ
咽喉スワブは、Ｃｏｐａｎ Ｉｔａｌｉａ社製の滅菌済使い捨て綿棒（Ｉ−２５１２５ Ｂｒｅｓｃｉａ； 注文番号 １６７ＣＳ０１）を使用して、当業者によく知られている方法で採取した。各患者から採取した咽喉スワブ２つは、互いに直接隣接して配置した２つの綿パッドを有する綿棒で喉を一回こすって採取した。こうして、２つのスワブが実質的に比較可能となるようにした。
【００３７】
１．１．２．　唾液サンプル
唾液サンプルは、スクリューキャップ付きの小さな使い捨てプラスチックチューブ（Ｓａｒｓｔｅｄｔ社製、注文番号 ６２．５５９．００１）中に約０．５ｍｌの自然に形成された唾液を採取することによって、患者自身が集めた。当業者には公知である唾液採取方法および唾液採取装置（例えば、Ｓａｒｓｔｅｄｔ社製のＳａｌｉｖｅｔｔｅまたはＥｐｉｔｏｐｅ社（Ｂｅａｖｅｒｔｏｎ， ＯＲ ９７００８， ＵＳＡ）製のＯｒａＳｕｒｅ試料採取装置）は意図的に使用しなかった。それは、予備的な濃縮または唾液の処理をすることなくインフルエンザウイルスを検出することが可能であることを示すためであった。もちろん、本発明に従って、上記唾液採取方法および唾液採取装置を使用することは同様に可能である。
【００３８】
１．２．　咽喉スワブからのインフルエンザＡ／Ｂウイルスの検出（比較目的のため）
１．２．１．　細胞培養による咽喉スワブからの検出
各々のケースにおいて、１番目の咽喉スワブは、Ｖｉｒｏｔｅｓｔ社のインフルエンザウイルス輸送培地（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇｓｔｒ． ８５， Ｄ−７０１９３ Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ， カタログ番号０５００３００）を１．５ｍｌ含むチューブ中へサンプル採取後に直ちに移し、そしてＭＤＣＫ細胞（Ｍａｄｉｎｅ−Ｄａｒｂｙイヌ腎細胞）上で培養した。サンプルは、文献に記載されている方法（“Ｍｉｋｒｏｂｉｏｌｏｇｉｓｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｋ”， Ｇｅｏｒｇ Ｔｈｉｅｍｅ編， Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９９２， 出版者Ｆｒｉｅｄｒｉｃｈ Ｂｕｒｋｈａｒｄ， ３７１頁）に従って培養した。上記結果を表１に示すが、ここで「＋」は陽性の結果を、「−」は陰性の結果を表す。
【００３９】
１．２．２．　免疫学的迅速試験による咽喉スワブからの検出
各々のケースにおいて、２番目のスワブは、患者の喉からサンプルを取り出した後すぐに、インフルエンザウイルスの存在についての免疫学的抗原迅速試験（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ＧｍｂＨ， Ｍａｎｎｈｅｉｍ， ＧｅｒｍａｎｙのインフルエンザＡ／Ｂ迅速試験、カタログ番号 ２ １５８ ６６３）によって調べた。本ケースで使用した迅速試験は、本質的にＥＰ−Ａ ０ ９２６ ４９８の実施例２に記載された免疫学的迅速試験に相当する。この文献は参照により本明細書に組み入れるものとする。
【００４０】
テストストリップの目視による評価に加えて、クロマトグラフィー完了後の検出線の強度を、反射率（ｒｅｍｉｓｓｉｏｎ）光度測定装置（波長５５５ ｎｍの２４の緑色ＬＥＤを用いたリング型照明とレンズ付ＣＣＤカメラを装備）によって定量的に測定した。検出線のシグナル強度は、反射率パーセンテージ（％ｒｅｍ；１００％の反射率とされたテストストリップの「白色」面に対して）として調べた： ９８．５％を越える反射率値は、ユーザーによって陰性シグナルとして検出され； ９６％〜９８．５％の反射率値は、弱い陽性シグナルとして検出され； ９６％より低い反射率値は、明らかな陽性シグナルとして検出される。上記結果を表１に示すが、ここで「＋」は陽性シグナルを、「（＋）」は弱い陽性シグナルを、そして「−」は陰性シグナルを表す。
【００４１】
１．３．　唾液からのインフルエンザＡ／Ｂウイルスの検出
１．３．１．　ＲＴ−ＰＣＲによる唾液中のウイルス核酸の検出
唾液サンプルは、インフルエンザウイルス核酸（この場合リボ核酸、ＲＮＡ）の存在についてＲＴ−ＰＣＲ（逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応）を用いて調べた。分析方法は、サンプルの調製（阻害物質を分離するため）、核酸の増幅、核酸の検出からなる、核酸診断における慣例的な３つの部分ステップを含む（以下の１．３．１．ａ〜１．３．１．ｃを参照されたい）。手順は以下の通りであった。
【００４２】
１．３．１．ａ　サンプルの調製
Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ社（Ｓａｎｄｈｏｆｅｒ Ｓｔｒａｓｓｅ １１６， Ｄ−６８３０５， Ｍａｎｎｈｅｉｍ， Ｇｅｒｍａｎｙ）から市販されているＨｉｇｈ ＰｕｒｅウイルスＲＮＡキット（注文番号 １ ８５８ ８８２）を、インフルエンザウイルスＲＮＡを単離するために使用した。手順は、製品説明書に記載されている標準的プロトコールに従うもので、初めに反応容器（フィルターチューブ）当たり２００μｌの唾液を、結合バッファーの存在下で、フィルターチューブのガラスフリースに結合させ、存在する可能性のある阻害物質を２回の洗浄ステップで除去し、２００μｌの溶出バッファー中へウイルス核酸を溶出させた。この方法では、サンプル量がサンプル調製の前（唾液）と後（溶出物）とで同一になるように注意した。その結果、インフルエンザウイルスの濃縮は全く起こらなかった。当然、唾液の量より少ない量の溶出バッファーで溶出ステップを実施し、溶出液中にインフルエンザウイルスを濃縮または富化することも本発明に従って可能である。
【００４３】
１．３．１．ｂ　ＲＴ−ＰＣＲ
特別に記載しないかぎり、試薬は、すべてＲｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ社（上記参照）から入手した。
【００４４】
ＰＣＲ反応容器あたりの反応容量は５０ μｌとした。これは、１０ μｌのサンプル量（サンプル調製からの溶出物）および１０ μｌのＢｉｃｉｎｅバッファー（５ ｘ ＲＴ−ＰＣＲ バッファー）を含んでいた。マスター混合物の他の成分は以下の最終濃度で存在した：２．５ ｍｍｏｌ／ｌの酢酸マンガン、０．２ ｍｍｏｌ／ｌずつの次のｄＡＴＰ（２’−デオキシアデノシン−５’三リン酸）、ｄＣＴＰ （２’デオキシシチジン−５’三リン酸）、ｄＧＴＰ （２’−デオキシグアノシン−５’三リン酸）およびｄＵＴＰ （２’−デオキシウリジン−５’三リン酸）、ならびに０．０５ ｍｍｏｌ／ｌのｄＴＴＰ （２’−デオキシチミジン−５’三リン酸）； ０．０１Ｕ／μｌのＵＮＧ （ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ）； ０．２Ｕ／μｌのＴｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＨＢ８由来のＴｔｈ ポリメラーゼ； ０．８Ｕ／μｌのＲＮａｓｅ阻害剤；および１．０μｍｏｌ／ｌのフォワードプライマーとリバースプライマー。
【００４５】
プライマーの配列は文献から入手した（Ｊａｍｅｓ Ｃ． Ｄｏｎｏｆｒｉｏ ｅｔ ａｌ．， Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ａ ａｎｄ Ｂ ｉｎ Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ Ｓｅｃｒｅｔｉｏｎｓ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ＰＣＲ， １９９２， ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ １， ２６３−２６８頁）。プライマーは、インフルエンザＡに対してタイプ特異的であり、長さが２１２塩基対のマトリックス遺伝子の高度に保存された遺伝子セグメント（１０１〜３１２位）を有している。リバースプライマーは、次のマイクロタイタープレートでの増幅産物の検出のため、ビオチンで５’末端を標識した。インフルエンザＢに対するタイプ特異的プライマーも文献から公知である（Ｊａｍｅｓ Ｃ． Ｄｏｎｏｆｒｉｏ ｅｔ ａｌ．， Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ａ ａｎｄ Ｂ ｉｎ Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ Ｓｅｃｒｅｔｉｏｎｓ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ＰＣＲ， １９９２， ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ １， ２６３−２６８頁）。
【００４６】
マスター混合物を、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ ９６００ サーモサイクラーで以下の温度プロフィールを用いて増幅した： ＵＮＧの添加後、室温で２０分 ＋ ６０℃で４５分 ＋ ９４℃で２分 ＋ １０サイクル（９４℃で３０秒 ＋ ５０℃で６０秒 ＋ ６８℃で９０秒） ＋ ３５サイクル（９４℃で３０秒 ＋ ６０℃で６０秒 ＋ ６８℃で９０秒） ＋ ６８℃で７分。
【００４７】
１．３．１ｃ　ハイブリダイゼーションおよび検出
ＲＴ−ＰＣＲによって増幅された核酸は、Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ社カタログ番号１ ６３６ １１１のＰＣＲ ＥＬＩＳＡ （ＤＩＧ検出）を使用して検出した。ピペット容量をのぞいて、すべてのステップを使用説明書にしたがって実施した。
【００４８】
増幅産物１０μｌを、１．５ｍｌの反応容器中で変性溶液 ２０μｌと混合し、室温で１０分間インキュベートした。その後、２５０μｌのジゴキシゲニン標識したハイブリダイゼーションプローブを添加した。ハイブリダイゼーションプローブの濃度は７０ｎｇ／ｍｌであった。
【００４９】
ハイブリダイゼーションプローブの配列は文献から入手した（Ｊａｍｅｓ Ｃ． Ｄｏｎｏｆｒｉｏ ｅｔ ａｌ．， Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ａ ａｎｄ Ｂ ｉｎ Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ Ｓｅｃｒｅｔｉｏｎｓ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ＰＣＲ， １９９２， ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ １， ２６３−２６８頁）。プローブは、インフルエンザＡのマトリックス遺伝子の１７７〜２０５位（セグメント７）に対するものである。インフルエンザＢの相当するプローブも、文献から公知である（Ｊａｍｅｓ Ｃ． Ｄｏｎｏｆｒｉｏ ｅｔ ａｌ．， Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ａ ａｎｄ Ｂ ｉｎ Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ Ｓｅｃｒｅｔｉｏｎｓ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ＰＣＲ， １９９２， ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ １， ２６３−２６８頁）。
【００５０】
反応混合物２００μｌを、ストレプトアビジンでコーティングしたマイクロタイタープレートのウェルに移し、３７℃で１時間振盪機上にてインキュベートした。ハイブリダイゼーション産物をマイクロタイタープレート壁のストレプトアビジンに結合させた後、ウェルの内容物を吸引し、毎回３００μｌの洗浄溶液で３回洗浄した。その後、抗ジゴキシゲニン−ペルオキシダーゼ基質（抗ＤＩＧ−ＰＯＤコンジュゲート）２００μｌを上記ウェルに添加し、この溶液を振盪機上３７℃で３０分間インキュベートした。ＰＯＤコンジュゲートを結合させた後、ウェルの内容物を吸引し、３００μｌの洗浄溶液で３回洗浄し、次に、２００μｌの２，２’−アジノ−ジ−［３−エチルベンズチアゾリンスルホネート（６）］ジアンモニウム塩基質（ＡＢＴＳ基質）を添加した。３７℃で３０分間最終的にインキュベートした後、４０５ ｎｍでの発色をマイクロタイタープレートリーダーで測定した。
【００５１】
唾液サンプルの各ＰＣＲ測定について、汚染による疑陽性結果を排除するために複数の陰性対照（ＤＥＭＣ水（製品番号 １６−００１Ｙ “Ａｃｃｕ Ｇｅｎｅ Ｗａｔｅｒ， 分子生物学グレード， オートクレーブ済”， Ｂｉｏ Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ Ｅｏｒｏｐｅ Ｓ．ｐ．ｒ．１ （Ｐａｒｃ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｌ ｄｅ Ｐｅｔｉｔ−Ｒｅｃｈａｉｎ， Ｂ−４８００ Ｖｅｒｖｉｅｒｓ， Ｂｅｌｇｉｕｍ）製）を平行して実施した。また、複数の陽性対照（インフルエンザウイルスを含有するＭＤＣＫ培養上清の連続希釈物）をサンプル調製およびＲＴ−ＰＣＲによって平行して測定した。さらに、マイクロタイタープレート上で検出試薬を調べるためにキットの内部陽性対照も実施した。
【００５２】
マイクロタイタープレートで平行して行った陰性対照の吸光度値は、通常１００〜１５０ｍＡであった。平行して実施されたキットの内部陽性対照の値は、通常１０００〜１５００ｍＡであった。
【００５３】
ブランク値またはゼロ値の２倍を超えたシグナルに相当する３００ｍＡ以上の吸光度値を患者サンプルの陽性シグナルとして定義した。上記結果を表１に示すが、ここで「＋」は陽性結果を、「−」は陰性結果を表す。
【００５４】
１．３．２．　免疫学的迅速試験による唾液中のウイルス抗原の検出
Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ＧｍｂＨのインフルエンザＡ／Ｂウイルス迅速試験、カタログ番号２ １５８ ６６３を用いて、唾液中のインフルエンザＡ／Ｂウイルスを検出した。使用した迅速試験は、本質的にＥＰ−Ａ ０ ９２６ ４９８の実施例２に記載された免疫学的迅速試験に相当する。この文献は参照により本明細書に組み入れるものとする。
【００５５】
通常、この試験を使用して、免疫学的クロマトグラフィーテストストリップにより咽喉スワブ中のウイルス核タンパク質をタイプ特異的に検出した。この試験は、インフルエンザＡウイルスとインフルエンザＢウイルスとを識別するものではない。
【００５６】
サンプル材料として唾液を使用してテストストリップの良好なクロマトグラフィーを確実なものとするために、テストキットの構成要素ではない特定の溶解／溶出バッファーを使用した。この特定の溶解／溶出バッファーは、以下の組成を有する：
０．９重量％のＮａＣｌ、２ｍＭのＫＨ２ＰＯ４、１０ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４、０．０９５重量％のＮａＮ３、１０ｍＭのＥＤＴＡ、１．５重量％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、１．５重量％のＴｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００。
【００５７】
試験は以下の通りに実施した：
製品説明書に記載されているように、最初に、テストキット中に含まれている３部（＝８００μｌ）の溶解／溶出バッファーで患者サンプルとしての咽喉スワブを溶出するかわりに、３００μｌの唾液と５００μｌの特定の溶解／溶出バッファーを反応容器に添加して混合した。
【００５８】
残りの試験手順は、製品説明書に記載されている方法に従って行った。これは、最初に抗体溶液１（核タンパク質Ａと核タンパク質Ｂに対するビオチン化モノクローナル抗体を含有）を２滴添加し、抗体溶液２（核タンパク質Ａと核タンパク質Ｂに対するジゴキシゲニン化モノクローナル抗体を含有）を２滴添加し、次に、テストストリップ上でこの反応混合物のクロマトグラフィーを行うことを含んでなる。
【００５９】
ＥＰ−Ａ ０ ９２６ ４９８から公知であるように、テストストリップは、サンプル液中で離脱されうる金コンジュゲートを可逆的に含浸させたコンジュゲートフリースを含んでいる。
【００６０】
検出線としてのポリストレプトアビジンおよび対照線としてのポリクローナル抗体ＰＡＢ＜マウスＦｃγ＞Ｓ−ＩｇＧが非可逆的に含浸されているニトロセルロース膜が、クロマトグラフィー方向下流のテストストリップの別の領域に配置される。
【００６１】
被験体の存在下で反応容器中で形成された、ビオチン化抗体／核タンパク質／ジゴキシゲニン化抗体からなるサンドイッチ型複合体は、テストストリップに沿ってクロマトグラフ展開され、サンドイッチ型複合体のジゴキシゲニン標識抗インフルエンザ抗体に対する抗ジゴキシゲニン抗体によって可溶化された後、金コンジュゲートと結合し、次いで、サンドイッチ型複合体のビオチン標識した抗インフルエンザ抗体によってニトロセルロース膜上のポリストレプトアビジン線に捕捉される。その結果、ニトロセルロース膜上に赤色の線が見えるようになり、これが試験における陽性シグナルを表す。
【００６２】
過剰な金コンジュゲートは、下流にクロマトグラフ展開され、ＰＡＢ＜マウスＦｃγ＞Ｓ−ＩｇＧによって別の赤色の線としてニトロセルロース膜の対照線上に捕捉される。
【００６３】
テストストリップの目視による評価に加えて、クロマトグラフィー完了後の検出線の強度を、反射率光度測定装置（波長５５５ ｎｍの２４の緑色ＬＥＤを用いたリング型照明とレンズ付ＣＣＤカメラを装備）によって定量的に測定した。検出線シグナルの強度は、反射率パーセンテージ（％ｒｅｍ： １００％の反射率とされたテストストリップの「白色」面に対して）として調べた： ９８．５％を越える反射率値は、ユーザーによって陰性シグナルとして検出され； ９６％〜９８．５％の反射率値は、弱い陽性シグナルとして検出され； ９６％より低い反射率値は、明らかな陽性シグナルとして検出される。上記結果を表１に示すが、ここで「＋」は陽性シグナルを、「（＋）」は弱い陽性シグナルを、そして「−」は陰性シグナルを表す。
【００６４】
１．４．　結果
患者サンプルから得られたいくつかの結果を、一例として下記に示す（表１）。
【００６５】
これらの結果はもっぱらインフルエンザＡウイルスの検出に関係する。というのは、サンプル採取時にインフルエンザＡのみが優勢で、インフルエンザＢに感染した患者は全く存在しなかったからである。専門家であれば、インフルエンザＡとは対照的に、インフルエンザＢは毎冬流行するものではなく、たとえ両方のインフルエンザＡ／Ｂウイルスが冬期に存在したとしても、インフルエンザＢは常に流行がずっと少ないことを理解している。
【００６６】
さらに、人工的に調製したインフルエンザＢ陽性唾液サンプル（インフルエンザＢウイルスの培養上清を添加した唾液サンプルのプール）が、核酸試験ならびに免疫学的試験において唾液中のインフルエンザウイルスを検出するのに好適であったことは特筆すべきである。したがって、示した結果は、唾液からのインフルエンザＡウイルスに加えて、インフルエンザＢウイルスを別々にもしくは一緒に検出することに関して、本発明の範囲を限定するものではない。むしろ、唾液は、インフルエンザＡ／Ｂウイルス検出用のサンプル材料として好適である。
【００６７】
【表１】
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Ａ：被験者番号１〜１０の被験者はインフルエンザ様症状を示した。被験者番号１１〜１４の被験者は、急性呼吸器症状を示さなかった。
Ｂ：ＭＤＣＫ細胞上で培養（上記１．２．１．参照）；「＋」陽性、「−」陰性。
Ｃ：１．２．２および１．３．２で記載した迅速試験手順（上記参照）；
「＋」陽性、「（＋）」弱陽性、「−」陰性。
Ｄ：反射率光度測定装置による検出線強度の定量的測定（上記１．２．２および１．３．２参照）；本明細書に示したスケールに従う相対的結果（「＋」陽性、「（＋）」弱陽性、「−」陰性）のみを示す。
Ｅ：マイクロタイタープレートの吸光度値を４０５ｎｍで測定した（上記１．３．１参照）；本明細書に示したスケールに従う相対的結果（「＋」陽性、「−」陰性）のみを示す。
【００６８】
下記は、表１で示された結果から明らかである：
・　臨床的症状にしたがってインフルエンザ患者として分類された被験者（番号１〜１０）のすべてが、実際にインフルエンザ陽性というわけではなかった。被験者９および１０は、咽喉スワブの培養、唾液サンプルのＰＣＲ、ならびに唾液および咽喉スワブの迅速試験において陰性であった。このことは、臨床的症状のみを基礎としてインフルエンザの決定的診断を下すことは不可能であるという、冒頭部に記載した、また専門家の間でも知られている説を強調するものである。
【００６９】
・　無症候性の被験者（番号１１〜１４）の咽喉スワブサンプルおよび唾液サンプルは先に挙げたすべての試験方法で陰性であり、このことは、これらの方法の臨床的特異性を実証するものである。
【００７０】
・　咽喉スワブの細胞培養によってインフルエンザＡ陽性であることが判明している８名の被験者（番号１〜８、いわゆる培養陽性被験者）のうち、６名の被験者が咽喉スワブを使用する免疫学的迅速試験によっても陽性と診断された。このことは、サンプル材料としてスワブを使用する従来の迅速試験の臨床的感度が、ゴールドスタンダードとして現在認められている細胞培養法における感度よりも低いことを示すものである（各製造業者の製品説明書に従う種々の免疫学的迅速試験の臨床的感度：Ｑｕｉｄｅｌ 鼻腔スワブについて７３％、Ｒｏｃｈｅ 咽喉スワブについて７０％、Ｂｉｏｓｔａｒ 咽喉スワブについて６０％および鼻咽頭スワブについて８３％）。
【００７１】
・　対照的に、８名すべての培養陽性被験者から採取した対応する唾液サンプルは免疫学的迅速試験で陽性であることが判明した。
【００７２】
・　さらに、唾液サンプルを用いる免疫学的迅速試験のテストストリップ上の検出線の強度は、咽喉スワブを使用した場合の対応する検出線強度よりも幾分強いことが、反射率の値（表には示してない）の比較により示される。
【００７３】
・　したがって、唾液による迅速試験の結果は、対応する唾液からのＰＣＲ結果と一致しており、これらの結果は、サンプル採取時に予め富化しなくても、サンプル材料としての唾液中にインフルエンザＡ／Ｂウイルスを確実に検出し得ることを示すものである。
【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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