(57)【要約】【課題】ＣＤ８−陽性ＣＴＬを認識し、腫瘍または白血病細胞のＣＴＬ誘発細胞溶解および／またはアポトーシスをもたらす使用可能な「ユニバーサル」腫瘍関連ペプチド抗原（ユニバーサルＴＡＡ）を作成すること。【解決手段】（ａ）ｈｄｍ２プロト腫瘍蛋白のアミノ酸位８１〜８８に相当するアミノ酸配列ＬＬＧＤＬＦＧＶ、または、アミノ酸配列ＬＬＧＤＬＦＧＶの機能的等価物であり、そのアミノ酸の1つ以上のアミノ酸置換、欠失、挿入、付加、逆位、および／または化学または物理的修飾により誘導可能なアミノ酸配列を有し、（ｂ）ＣＤ８−陽性ＣＴＬのエピトープであり、そして（ｃ）腫瘍および白血病細胞に対するＣＤ８−陽性ＣＴＬの、分子群「ＭＨＣクラスＩ」、対立遺伝子変異体Ａ２（略してＡ２）のヒト白血球抗原に制限された免疫応答を誘発するのに適するオリゴペプチド。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣＤ−８陽性細胞毒性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）によりペプチド抗原として認識され、腫瘍または白血病細胞のＣＴＬ−誘発溶解および／またはアポトーシスをもたらすユニバーサル腫瘍関連オリゴペプチドであって、該オリゴペプチドは（ａ）ヒトｍｄｍ２（＝ｈｄｍ２）プロト腫瘍蛋白のアミノ酸位８１〜８８に相当するアミノ酸配列ＬＬＧＤＬＦＧＶ、または、アミノ酸配列ＬＬＧＤＬＦＧＶの機能的等価物であり、そのアミノ酸の1つ以上のアミノ酸置換、欠失、挿入、付加、逆位、および／または化学または物理的修飾により誘導可能なアミノ酸配列を有し、（ｂ）ＣＤ８−陽性ＣＴＬのエピトープであり、そして（ｃ）腫瘍および白血病細胞に対する、分子群「ＭＨＣクラスＩ」、対立遺伝子変異体「Ａ２」、特にサブタイプＡ２．１のヒト白血球抗原（ＨＬＡ）へのＣＤ８−陽性ＣＴＬの制限された免疫応答を誘発するのに適することを特徴とする上記オリゴペプチド。
【請求項２】
請求項１記載のオリゴペプチドに相当し、−ＣＯ−ＮＨ−ペプチド結合の代わりに−ＮＨ−ＣＯ−結合または他の非ペプチド結合が形成されていることを特徴とするレトロ逆位ペプチドまたは偽ペプチド。
【請求項３】
請求項１記載のオリゴペプチドを少なくともコードするヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド。
【請求項４】
Ｔ細胞、特にＣＤ８−陽性細胞毒性Ｔリンパ球の検出のため、および／または、それに影響するため、および／または、その発生のため、および／または、その増殖のため、および／またはその活性化および機能状態の制御のための、診断薬、および／または、治療薬、および／または、予防薬の製造のための請求項１記載のオリゴペプチド、および／または、請求項２記載のレトロ逆位ペプチドまたは偽ペプチド、および／または、請求項３記載のポリヌクレオチドの使用。
【請求項５】
Ｔ細胞、特にＣＤ８−陽性細胞毒性Ｔリンパ球のインビボまたはインビトロの活性化のための試薬であって、請求項１記載のオリゴペプチド少なくとも１つ、および／または、請求項２記載のレトロ逆位ペプチドまたは偽ペプチド、および／または、請求項３記載のポリヌクレオチドを用いて調製されることを特徴とする上記試薬。
【請求項６】
請求項３記載のポリヌクレオチド１つ以上を含み、自家、異系、異種または微生物学的起源の細胞において発現可能な組み換えＤＮＡまたはＲＮＡベクター分子。
【請求項７】
請求項３記載のポリヌクレオチドまたは請求項６記載のベクター分子を含む宿主細胞。
【請求項８】
目的のオリゴペプチドに対する、または目的のオリゴペプチドとＨＬＡ−Ａ２の複合体に対する、ポリクローナル、モノクローナルまたは組み換え抗体の調製のための請求項１記載のオリゴペプチド少なくとも１つ、および／または、請求項２記載のレトロ逆位ペプチドまたは偽ペプチドの使用。
【請求項９】
請求項１記載のオリゴペプチド少なくとも１つ、および／または、請求項２記載のレトロ逆位ペプチドまたは偽ペプチドと、または、目的のオリゴペプチドとＨＬＡ−Ａ２の複合体と、特異的に反応する抗体。
【請求項１０】
ＭＨＣクラスＩの４量体または製薬上許容しうる担体または他の構造物との会合複合体中に存在することを特徴とする請求項１記載のオリゴペプチド。
【請求項１１】
ＭＨＣクラスＩの４量体または製薬上許容しうる担体または他の構造物との会合複合体中に存在することを特徴とする請求項２記載のレトロ逆位ペプチドまたは偽ペプチド。
【請求項１２】
目的のオリゴペプチドに対するポリクローナル、またはモノクローナル、または組み換えのＡ２−制限Ｔ細胞受容体またはそれに機能的に等価な分子の調製のための、請求項１記載のオリゴペプチド少なくとも１つ、および／または、請求項２記載のレトロ逆位ペプチドまたは偽ペプチド、または、請求項３記載のポリヌクレオチドの使用。
【請求項１３】
請求項１記載のオリゴペプチド少なくとも１つ、および／または、請求項２記載のレトロ逆位ペプチドまたは偽ペプチドと特異的に反応するＴ細胞受容体またはそれに機能的に等価な分子。
【請求項１４】
請求項１３記載のＴ細胞受容体をコードするポリヌクレオチド。
【請求項１５】
請求項１３記載のＴ細胞受容体を発現する能力を有する発現ベクター。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はＣＤ８−陽性細胞毒性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）によりペプチド抗原として認識され、腫瘍または白血病細胞のＣＴＬ誘発溶解および／またはアポトーシスをもたらすユニバーサル腫瘍関連オリゴペプチドに関する。
【背景技術】
【０００２】
ＣＤ８−陽性ＣＴＬは細胞の免疫系のエフェクター細胞である。その機能は、感染した、または変性した内因性細胞の特異的排除にある。ＣＴＬはとりわけクラスＩの主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）分子に結合し、変性細胞の表面に存在する腫瘍特異的、または腫瘍関連のペプチド抗原を認識する。ＭＨＣクラスＩ分子の範囲におけるペプチド抗原の認識はＣＴＬの特異的膜Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）により行なわれる。認識後、目的の細胞は標的細胞を溶解し、そして／またはこれらの標的細胞のプログラムされた細胞死（アポトーシス）を誘発するか、または、サイトカインを放出するＣＴＬにより破壊される。
【０００３】
ＣＴＬによる標的細胞の認識はＣＴＬ上のＣＤ８共受容体の発現により促進される。ＣＤ８共受容体はＭＨＣクラスＩ分子のα２およびα３ドメインの保存された領域に結合し、これによりＴＣＲ−ペプチド−ＭＨＣ複合体の安定化に寄与している。
【０００４】
ＭＨＣクラスＩ分子の範囲における腫瘍細胞の表面に存在する腫瘍関連ペプチド抗原（ＴＡＡ）の内、「ユニバーサル」ＴＡＡが最も重要である。「ユニバーサル」ＴＡＡは正常細胞で弱く発現され、腫瘍細胞で過剰発現される細胞蛋白から主に誘導される。これらの蛋白には、とりわけ、多くの固形腫瘍のみならず血液学的な新形成（悪性血液系障害）ＡＭＬ、ＡＬＬおよびＣＬＬにおいても過剰発現される、「マウス２重微小２」プロト腫瘍生成物質（ｍｄｍ２）のヒト相同体である「ヒトｍｄｍ２」、或いは略して「ｈｄｍ２」プロト腫瘍蛋白が含まれる。ｈｄｍ２蛋白の細胞プロセシングから形成されるオリゴペプチドは対立遺伝子変異体Ａ２、サブタイプＡ２．１（略してＡ２．１；白人集団における最も頻繁に存在するＭＨＣクラスＩ対立遺伝子）のＭＨＣクラスＩ分子の範囲では細胞表面に存在し、ＣＤ８−陽性ＣＴＬの興味深い標的構造となるはすである。正常組織におけるｈｄｍ２の発現は現在まで十分検討されていない。しかしながらマウスのｍｄｍ２については、精巣においてｍｄｍ２ｍＲＮＡの発現が増大していること、および、胸腺、卵巣および中枢神経系において発現が低いこと、および子宮においてｍｄｍ２蛋白の発現が増大していることがわかっている。
【０００５】
悪性腫瘍の治療のための免疫療法的処置法の開発の条件は免疫原性腫瘍抗原の同定である。このような腫瘍抗原は、一般的にＴ細胞、そして特に腫瘍反応性のＴ細胞の誘導のためのワクチンとして、これらのＴ細胞が特定の腫瘍の退行および消滅をもたらすことを目的として、特定の条件下で用いられている。黒色腫の場合は、このようにして免疫療法のために臨床試験の範囲において使用されている幾つかのペプチド抗原が既に知られている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、ＣＤ８−陽性ＣＴＬを認識し、腫瘍または白血病細胞のＣＴＬ誘発細胞溶解および／またはアポトーシスをもたらす使用可能な「ユニバーサル」腫瘍関連ペプチド抗原（ユニバーサルＴＡＡ）を作成するという目的に基づいている。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
この目的の解決策は（ａ）ｈｄｍ２プロト腫瘍蛋白のアミノ酸位８１〜８８に相当するアミノ酸配列ＬＬＧＤＬＦＧＶ、または、アミノ酸配列ＬＬＧＤＬＦＧＶの機能的等価物であり、そのアミノ酸の1つ以上のアミノ酸置換、欠失、挿入、付加、逆位、および／または化学または物理的修飾により誘導可能なアミノ酸配列を有し、（ｂ）ＣＤ８−陽性ＣＴＬのエピトープであり、そして（ｃ）腫瘍および白血病細胞に対するＣＤ８−陽性ＣＴＬの、分子群「ＭＨＣクラスＩ」、対立遺伝子変異体Ａ２（略してＡ２）のヒト白血球抗原に制限された免疫応答を誘発するのに適するオリゴペプチドを使用可能とすることよりなる。
【０００８】
等しい解決策は、本発明のこのオリゴペプチドに相同なレトロ逆位ペプチドまたは偽ペプチドを使用可能とすることよりなり、これは−ＣＯ−ＮＨペプチド結合の代わりに例えば−ＮＨ−ＣＯ−結合のような非ペプチド結合を有する(Meziere等、1997)。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
オリゴペプチド「ｈｄｍ２  ８１−８８」を用いて、アミノ酸配列がｈｄｍ２腫瘍蛋白を起源とするペプチド抗原が初めて使用可能となった。ｈｄｍ２  ８１−８８オリゴペプチドおよびその誘導体はユビキタスな定量的に腫瘍に関連するＣＴＬエピトープであり、このため、悪性疾患のｈｄｍ２−特異的免疫療法のための分子の基礎となる。
【００１０】
本発明のオリゴペプチド（ｈｄｍ２  ８１−８８およびその誘導体）は悪性の固形腫瘍および／またはリンパ血液新形成を有する患者の能動および受動の免疫化において使用でき、その際、ｈｄｍ２エピトープ８１−８８はＡ２．１の範囲内において存在し、これによりｈｄｍ２  ８１−８８特異的細胞毒性Ｔリンパ球の誘導、発生および増殖がもたらされ、これは、該当患者の腫瘍または白血病細胞を特異的に破壊することができ、これにより治癒がもたらされるのである。
【００１１】
本発明の過程において、意外にも、ｈｄｍ２が多発性骨髄腫（または形質細胞腫）、または組織球性リンパ腫およびＣＭＬ−骨髄芽球の危機以上の形態の悪性血液疾患において過剰発現されるが、末梢血液の静止期のＢ細胞、Ｔ細胞、単核細胞、肺腺維芽細胞および生理学的に活性化された樹状細胞およびＴ細胞では検出されないことがわかった。このことから、オリゴペプチドｈｄｍ２  ８１−８８およびその誘導体については、正常細胞に対する望ましくない攻撃の危険性が無視できるほど低い広範な適応症の範囲という利点が得られるのである。
【００１２】
ｈｄｍ２  ８１−８８オリゴペプチドの誘導体は、オリゴペプチドそのものと比較して潜在的な機能的自己忍容性（ｈｄｍ２  ８１−８８オリゴペプチドと比較して）がＴ細胞レベルで自ら回避できるという利点を有する。ｈｄｍ２  ８１−８８オリゴペプチドは特定の条件下では、一部の正常組織における（低い）発現のために、対象生物（患者身体）における「忍容性原」となり、生物自体の（患者自体の）ＣＴＬに対しては免疫原性とならないが、ｈｄｍ２  ８１−８８オリゴペプチドの誘導体は原則として抗原として認識され、ＣＴＬの活性化と増殖を誘発する。このような誘導体誘発ＣＴＬは原則としてｈｄｍ２  ８１−８８野生型配列と高い交叉反応性を有し、その結果、その表面にｈｄｍ２  ８１−８８（Ａ２の範囲において、特にＡ２．１）を呈する上記（腫瘍）細胞の細胞溶解および／またはアポトーシスを誘発する。ｈｄｍ２  ８１−８８オリゴペプチドの特に好ましい誘導体は他の哺乳類または脊椎動物に天然に存在するもの、例えばマウスのｈｄｍ２  ８１−８８相同体である。ｈｄｍ２（蛋白）相同体およびそれをコードする核酸は、対応する生物から、比較的容易に、即ち直接またはよく知られた単離方法を用いて得ることができる。
【００１３】
オリゴペプチドｈｄｍ２  ８１−８８およびその誘導体は慣用的なペプチド合成方法により調製することができ、そして、これらのオリゴペプチドをコードするヌクレオチド配列は知られた試薬を用いて、または、分子生物学的方法を用いて得ることができる。
【００１４】
本発明のオリゴペプチド（ｈｄｍ２  ８１−８８およびその誘導体）は患者におけるＴリンパ球のインビボの誘導のため、および、適切な反応性を有する患者本来の、または患者にとって外因性のＴリンパ球のインビトロの誘導および増殖のための双方に適している。
【００１５】
患者におけるＴリンパ球のインビボの誘導および増殖のためには、種々の方法が可能であり、例えば（ａ）純粋なペプチドとしての、または、アジュバントと共に、またはサイトカインと共に、または適当な放出系、例えばリポソーム中で、ｈｄｍ２  ８１−８８オリゴペプチドおよび／またはその誘導体の１種以上を注射すること、（ｂ）少なくともｈｄｍ２  ８１−８８オリゴペプチドまたはその誘導体をコードする１つ以上の核酸を、「裸」の状態で、または、複合体形態で、またはウィルスまたは非ウィルスベクターの形態で、またはカチオン系の脂質またはカチオン系の重合体のような放出系と共に注射すること、（ｃ）ｈｄｍ２  ８１−８８オリゴペプチドまたはその誘導体、またはレトロ逆位ペプチドまたはその類縁体である偽ペプチドを自家、異系、異種または微生物学的起源の細胞に負荷すること、（ｄ）ｈｄｍ２蛋白または他の種の相同体を自家、異系、異種または微生物学的起源の細胞に負荷し、これによりｈｄｍ２  ８１−８８オリゴペプチドまたはその誘導体を対応する細胞上に提示すること、または（ｅ）少なくともペプチドまたはその誘導体をコードする核酸と共に（やはり「裸」、または、複合体形態、またはウィルスまたは非ウィルスベクターの形態）自家、異系、異種または微生物学的起源の細胞をトランスフェクトまたは感染させること、が挙げられる。
【００１６】
インビトロの誘導および増殖の場合は、インビトロで得られたＴリンパ球を注入または注射等の方法で患者に投与する。
【００１７】
従って本発明は、Ｔ細胞、特にＣＤ８−陽性ＣＴＬの検出のため、および／または、それに影響するため、および／または、その発生のため、および／または、その増殖のため、および／またはその活性化および機能状態の制御のための、診断薬、特にＭＨＣ４量体または本発明の少なくとも１つのｈｄｍ２  ８１−８８オリゴペプチドおよび／またはレトロ逆位ペプチドまたは偽ペプチドが会合する他の構造物、および／または、治療薬、および／または、予防薬（特にワクチン）の製造のための該オリゴペプチド、および／または、その誘導体、および／またはそれの類縁体であるレトロ逆位ペプチドまたは偽ペプチド、および／または、オリゴペプチドまたはその誘導体を少なくともコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドの使用に関する。
【００１８】
可能な治療薬および／または予防薬は特にワクチンまたは注射または注入用の溶液であり、これらは、活性化合物として（ａ）ｈｄｍ２  ８１−８８オリゴペプチドおよび／または少なくとも１つのその誘導体および／またはこのオリゴペプチドまたはその誘導体と類縁の少なくとも１つのレトロ逆位ペプチドまたは偽ペプチド、を含み、（ｂ）少なくともｈｄｍ２  ８１−８８オリゴペプチドまたは少なくともその誘導体をコードする核酸を含み、そして／または（ｃ）ｈｄｍ２  ８１−８８オリゴペプチドおよび／またはその誘導体に対して、および／または、このオリゴペプチドまたはその誘導体と類縁のレトロ逆位ペプチドまたは偽ペプチドに対して、特異的に指向されたインビトロで生産されたＴリンパ球を含む。
【００１９】
診断薬または治療薬または予防薬の調製のためには、少なくともｈｄｍ２  ８１−８８オリゴペプチドおよび／または少なくとも１つのその誘導体をコードする、そして、自家、異系、異種または微生物学的起源の細胞中で転写可能または発現可能である、ポリヌクレオチド１種以上を含有する組み換えＤＮＡまたはＲＮＡベクター分子も特に適している。従って本発明はこのような組み換えＤＮＡまたはＲＮＡベクター分子およびこれらのベクター分子を含む宿主細胞も包含する。
【００２０】
診断薬または治療薬または予防薬として、または、一般的に、本発明のｈｄｍ２過剰発現細胞の検出および／または操作のためには、ｈｄｍ２  ８１−８８オリゴペプチドに対して、および／またはその誘導体に対して、および／または、このオリゴペプチドまたはその誘導体と類縁のレトロ逆位ペプチドまたは偽ペプチドを指向するか、または目的のオリゴペプチドまたはその誘導体またはそれに対してレトロ逆位のペプチドまたは偽ペプチドとＨＬＡ−Ａ２との複合体と反応するようなポリクローナル、モノクローナルまたは組み換えの抗体も使用することができる。ｈｄｍ２  ８１−８８オリゴペプチドおよび／またはその誘導体および／またはオリゴペプチドまたはその誘導体の１つに類縁のレトロ逆位ペプチドまたは偽ペプチドを、本発明のこのようなオリゴペプチドまたはレトロ逆位ペプチドまたは偽ペプチドに対するポリクローナル、モノクローナルまたは組み換えの抗体およびそれ自体が目的である抗体の調製のために使用することは、従って、同様に、本発明の部分を構成する。
【００２１】
診断薬または治療薬または予防薬として、または、一般的に、本発明のｈｄｍ２過剰発現細胞の検出および／または操作のためには、ｈｄｍ２  ８１−８８オリゴペプチド、および／またはその誘導体に対して、および／または、これらに類縁のレトロ逆位ペプチドまたは偽ペプチドに対して特異的なポリクローナル、モノクローナルまたは組み換えのＡ２−制限Ｔ細胞受容体またはそれに機能的に等価な分子も使用できる。Ｔ細胞受容体またはそれに機能的に等価な分子は、自家、異系、異種の起源であることができる。
【００２２】
本発明の要件は従って主に以下のもの、即ち：
・このような本発明のオリゴペプチドまたはレトロ逆位ペプチドまたは偽ペプチドに対する特異性を有するポリクローナル、モノクローナルまたは組み換えのＡ２−制限Ｔ細胞受容体またはそれに機能的に等価な分子の製造のためのｈｄｍ２  ８１−８８オリゴペプチドおよび／またはその誘導体および／またはそれらに類縁のレトロ逆位ペプチドまたは偽ペプチドの使用、または、ｈｄｍ２  ８１−８８オリゴペプチドおよび／またはその誘導体を少なくともコードするヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドの使用、
・  それ自体が目的のＴ細胞およびそれに機能的に等価な分子、
・  このようなＴ細胞受容体およびそれに機能的に等価な分子をコードするポリヌクレオチド、
・  このようなＴ細胞受容体およびそれに機能的に等価な分子の発現のための能力を有する発現ベクターを包含する。
【００２３】
本発明は更に、Ｔ細胞、特にＣＤ８−陽性ＣＴＬのインビボまたはインビトロの活性化のための試薬を含み、その特徴は、それらが、ｈｄｍ２  ８１−８８オリゴペプチドおよび／または少なくとも１つのその誘導体および／またはそれらに類縁の少なくとも１つのレトロ逆位ペプチドまたは偽ペプチドを使用して、そして／または、オリゴペプチドまたはその誘導体を少なくともコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドを使用して、そして／または、ｈｄｍ２蛋白またはその他の種の相同体を用いて調製されることである。これらの試薬は特に治療薬、とりわけワクチンであることができる。
【００２４】
本発明を調製および使用の実施例と共に下記の図面を用いて詳細に説明する。使用する略記法は以下の通りである。
Ａ２：分子群「ＭＨＣクラスＩ」、対立遺伝子変異体「Ａ２」のヒト白血球抗原
Ａ２．１：分子群「ＭＨＣクラスＩ」、対立遺伝子変異体「Ａ２」、サブタイプ「Ａ２．１」のヒト白血球抗原
Ａ２Ｋｂ：Ａ２.１／Ｋｂ＝Ａ２のα１およびα２ドメイン並びにＫｂのα３ドメイン由来のＭＨＣクラスＩ分子
ＡＬＬ：急性リンパ性白血病
ＡＭＬ：急性骨髄性白血病
ＡＰＳ：過硫酸アンモニウム
ＡＰＣ：抗原提示細胞
ＡＴＣＣ：アメリカンタイプカルチャーコレクション
ＡＴＰ：アデノシン−５’−トリホスフェエート
Ｂ−ＡＬＬ：Ｂ細胞ＡＬＬ
ｂｋｇｄ：非特異的蛍光強度
ｂｐ：塩基対
ＢＳＡ：ウシ血清アルブミン
Ｃ末端：カルボキシ末端
ＣＤ：分化クラスター
ＣＤ８：ヒトＣＤ８α／β共受容体
ＣＤＲ：相補性決定領域
ＣＬＬ：慢性リンパ性白血病
ＣＭＬ：慢性骨髄性白血病
ＣＭＶ：サイトメガロウィルス
ＣｏｎＡ：コンカナバリンＡ
ＤＭＳＯ：ジメチルスルホキシド
ＤＮＡ：デオキシリボ核酸
ＤＳＭＺ：ドイツ微生物及び培養細胞のコレクション
ＤＴＴ：ジチオスレイトール
ＤＣ：樹状細胞
Ｅ：Ｔ：エフェクターｖｓ標的細胞の比
ＥＢＶ：エプスタイン・バーウィルス
ＥＤＴＡ：エチレンジアミン４酢酸塩
ＥＲ：小胞体
ＦＡＣＳ：蛍光活性化細胞分類機
ＦＣＳ：ウシ胎児血清
ＦＩＴＣ：フルオレセインイソチオシアネート
Ｆｌｕ  Ｍ１：Ａ／ＰＲ／８／３４インフルエンザウィルスマトリックス蛋白Ｍ１
ｇ−４１８：ゲネチシン（ネオマイシン抗生物質）
ＧＭ−ＣＳＦ：顆粒球ーマクロファージコロニー刺激因子
ＨＶＢ  ｐｏｌ：Ｂ型肝炎ウィルスポリメラーゼ
ｈｄｍ２：ｍｄｍ２のヒト相同体
ＨＥＰＥＳ：Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）ピペリザン−Ｎ'−エタンスルホン酸
ＨＬＡ：ヒト白血球抗原
ＨＬＡ−Ａ２．１：分子群「ＭＨＣクラスＩ］、対立遺伝子変異体「Ａ２］サブタイプ「Ａ２．１」のヒト白血球抗原
ＨＰＬＣ：高圧液体クロマトグラフィー
ＩＦＡ：不完全フロイントアジュバント
ＩＦＮ：インターフェロン
Ｉｇ：免疫グロブリン
ＩＬ：インターロイキン：
ｋｂ：キロ塩基対
Ｋｂ：Ｈ−２Ｋｂ
ｋＤａ：キロダルトン
ＬＢ：Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ
ＬＣＬ：リンパ芽球様細胞系統
ＬＭＰ：低分子質量ポリペプチド
ＬＰＳ：リポ多糖類
ｍｄｍ２：マウス２重微小２
ＭＨＣ：主要組織適合性複合体
Ｍｉｏ：百万
ｍｕｔ：突然変異
Ｎ−末端；アミノ末端
ＯＤ：光学密度
ＰＢＭＣ：末梢血液の単核細胞
ＰＢＳ：リン酸塩緩衝食塩溶液
ＰＧ−Ｅ２：プロスタグランジンＥ２
ＰＨＡ：フィトヘマグルチニン
ＰＭＳＦ：フェニルメチルスルホニルフロリド
ＰＶＤＦ：ポリフッ化ビニリデン
Ｒａｄ：放射線吸収線量
ＲＰ：逆相
ＳＤＳ：ドデシル硫酸ナトリウム
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ：ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動
ＳＬ：特異的細胞溶解
ＳＶ−４０：シミアンウィルス４０
ＴＡＡ：腫瘍関連抗原
ＴＡＰ：抗原プロセシングに関連するトランスポーター
ＴＢＥ：トリスホウ酸ＥＤＴＡ
ＴＥ：トリスＥＤＴＡ
ＴＥＭＥＤ：Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルエチレンジアミン
ＴＦＡ：トリフルオロ酢酸
ＴＩＬ：腫瘍浸潤リンパ球
ＴＮＦ−α：腫瘍壊死因子α
Ｔｒｉｓ：トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン
ＴＣＲ：Ｔ細胞受容体
ｕ：国際単位
ｒｐｍ：回転／分
ＶＳＶ−Ｎ：水疱性口内炎ウィルス核蛋白
ｖ／ｖ：体積／体積
ｗｔ：野生型
ｗ／ｖ：質量／体積
ＣＴＬ：細胞毒性Ｔリンパ球
アミノ酸の略記法：
Ａ：アラニン
Ｃ：システイン
Ｄ：アスパルテート
Ｅ：グルタメート：
Ｆ：フェニルアラニン
Ｇ：グリシン
Ｈ：ヒスチジン
Ｉ：イソロイシン
Ｋ：リジン
Ｌ：ロイシン
Ｍ：メチオニン
Ｎ：アスパラギン
Ｐ：プロリン
Ｑ：グルタミン
Ｒ：アルギニン
Ｓ：セリン
Ｔ：スレオニン
Ｖ：バリン
Ｗ：トリプトファン
Ｙ：チロシン
Ａ）実施例において記載した材料
（１）マウス
ヒトＭＨＣクラスＩトランスジーンＨＬＡ−Ａ２．１（Ａ２．１）を発現するトランスジェニックマウスを技術的に慣用されている方法を用いてＣ５７ＢＬ／６バックグラウンドに交叉させた（Ｉｒｗｉｎ等、１９８９）。これには以下の系統を用いた。
１）Ａ２．１／Ｋｂ（Ａ２Ｋｂ）トランスジェニックマウス  −  これらはＡ２．１のヒトα１およびα２ドメインおよびマウスのＨ−２Ｋｂのα３ドメインよりなるキメラＭＨＣクラスＩトランスジーンに対して、そして、やはりＨ−２ｂ遺伝子に対してホモ接合である。
２）ｈｕＣＤ８α／β（ＣＤ８）トランスジェニックマウス  −  これらはヒトＣＤ８共受容体のαおよびβ鎖に対してホモ接合である。
３）［ｈｕＣＤ８α／β  ｘ  Ａ２．１／Ｋｂ］Ｆ１（ＣＤ８ｘＡ２Ｋｂ）トランスジェニックマウス  −  これらはキメラＡ２Ｋｂ分子、および、更にはヒトＣＤ８のαおよびβ鎖をヘテロ接合発現する。これらは更にＨ−２ｂに対してホモ接合である。
４）Ａ２．１トランスジェニックマウス（（［Ａ２．１  ｘＣ５７ＢＬ／６］ｘＣ５７ＢＬ／６）Ｆ１トランスジェニック）  −  これらはヒトＡ２．１分子のα１、α２およびα３ドメインをヘテロ接合発現し、Ｈ−２ｂに対してホモ接合である。
５）Ｃ５７ＢＬ／６マウス  −  これらはＨ−２ｂ表現型を有する。
【００２５】
（２）合成ペプチド
合成ペプチドはＳｃｒｉｐｐｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ＩｎｓｔｉｔｕｔｅおよびＳＮＰＥ（Ｎｅｏｓｙｓｔｅｍ  ｌａｂｏｒａｔｏｉｒｅ，  Ｓｔｒａｓｂｏｕｒｇ，  Ｆｒａｎｃｅ）より入手した。自動ペプチド合成装置４３０Ａ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，  ＣＡ）を用いてＳｃｒｉｐｐｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅにより合成されたペプチドの純度は少なくとも７０％であり、ＳＮＰＥにより合成されたペプチドの純度は少なくとも７５％であった。全てのペプチドの純度および正確なアミノ酸組成はＨＰＬＣ分析および質量スペクトルにより確認した。Ｓｃｒｉｐｐｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅより入手した凍結乾燥脱ミネラル化されたペプチドは、ペプチド配列の関数としての定量的管理に従って、ＤＭＳＯ、水、ＤＭＳＯと水の混合物中、または、０．１％濃度のＮａＯＨ中、１０ｍｇ／ｍｌとなるように溶解した。脱ミネラル化されていないＳＮＰＥペプチドは基本的にはＤＭＳＯ中１０ｍｇ／ｍｌに溶解した。保存は−２０〜−８０℃で少量に分けて行った。表１に示すペプチドに加えて、Ｂ型肝炎ウィルスコア蛋白の残基１２８〜１４０を形成するペプチドを合成した（ＴＰＰＡＹＲＰＰＮＡＰＩＬ）。
【００２６】
（３）抗体
Ａ２．１のブロックのためには、ハイブリドーマ細胞系統ＰＡ２．１（ＡＴＣＣ  ＨＢ−１１７）により生産されるモノクローナル抗体を用いた。
【００２７】
腫瘍細胞系統およびＡ２−トランスジェニックマウスのＨＬＡタイピングのためには、マウスハイブリドーマ系統ＢＢ７．２（ＡＴＣＣ  ＨＢ−８２）により生産されるモノクローナル抗体を用いた。
【００２８】
細胞のｈｄｍ２発現の分析のためには、市販の抗ｈｄｍ２モノクローナル抗体ＩＦ２（マウスＩｇＧ２ｂ）（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，  Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，  ＭＡ）を用いた。
【００２９】
フローサイトメトリーでのマウスのモノクローナル抗体の検出のためには、ＦＩＴＣコンジュゲートポリクローナル２次抗体（ヤギ抗マウスＩｇＧＦ（ａｂ）２フラグメント；１：３０希釈；Ｊａｃｋｓｏｎ［Ｄｉａｎｏｖａ］，Ｈａｍｂｕｒｇ）を用いた。モノクローナル抗体ＩＦ２の検出はパーオキシダーゼ（セイヨウワサビパーオキシダーゼ）コンジュゲート２次抗体（ヤギ抗マウスＩｇＧ；Ｐｉｅｒｃｅ，  ＩＬ）を用いて行なった。
【００３０】
（４）細胞、細胞系統およびトランスフェクト体
全ての細胞および細胞系統は、ＲＰＭＩ１６４０（Ｂｉｏｗｈｉｔｔａｋｅｒ，Ｖｅｒｖｉｅｒｓ,  Ｂｅｌｇｉｕｍ）中、１０％の熱不活性化（３０分、５６℃）ＦＣＳ（ＰＡＡ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｌｉｎｚ，Ａｕｓｔｒｉａ）、１％の０．２Ｍ  Ｌ−グルタミン（Ｂｉｏｗｈｉｔｔａｋｅｒ）および５０μｇ／ｍｌのゲンタマイシン（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ，Ｅｇｇｅｎｓｔｅｉｎ）の存在下で培養した。マウス由来の細胞およびＣＴＬ系統の増殖のために、β−メルカプトエタノールを５ｘ１０−５Ｍの終濃度で培地中に更に添加した。ネオマイシントランスフェクト細胞の培養のために、ゲネチシン（Ｇ−４１８）（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）を２８０〜５６０μｇ／ｍｌの有効濃度で培地中に添加した。細胞は全て、細胞培養ビンまたは２４穴プレート（ＣＴＬ）（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｃｏｓｔａｒ，Ｂｏｄｅｎｈｅｉｍ）中、水蒸気飽和雰囲気下、３７℃５％ＣＯ２で培養した。
【００３１】
（４．１）細胞：末梢血液の単核細胞（ＰＢＭＣ）を得るためには、健常者のＡ２陽性ドナーの血液を１：３の比でＰＢＳ（Ｂｉｏｗｈｉｔｔａｋｅｒ，Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＡ）中に希釈し、同じ容量のＦｉｃｏｌｌ（Ｓｅｒｏｍｅｄ  Ｂｉｏｃｈｒｏｍ，Ｂｅｒｌｉｎ）に重績させた。遠心分離後（１５００ｒｐｍ、５℃、７分）、ＰＢＭＣを相界面から単離し、洗浄した。
【００３２】
Ｃｏｎ  Ａ−およびＰＨＡ−活性化リンパ芽球は、ＣｏｎＡ（１０μｇ／ｍｌ）およびＰＨＡ（１．５％ｗ／ｖ）（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ，  Ｅｇｇｅｎｓｔｅｉｎ）でＡ２陽性ＰＢＭＣを３日間刺激することにより、技術的に慣用されている方法（Ｔｈｅｏｂａｌｄ  ｅｔ  ａｌ，１９９５参照）を用いて発生させた。
【００３３】
静止期のＴおよびＢ細胞の取得は抗体コーティングビーズ（Ｄｙｎａｌ，Ｈａｍｂｕｒｇ）を用いてＡ２陽性ＰＢＭＣの陰性選択により行なった。Ｔ細胞の単離のためには、抗ＣＤ２および抗ＣＤ１４ビーズを用いたＢ細胞の単離に関する製造元の指示書に従って抗ＣＤ１９および抗ＣＤ１４ビーズと共にＰＢＭＣをインキュベートした。
【００３４】
樹状細胞（ＤＣ）は技術的に慣用されている方法を用いてＡ２陽性のドナーのＰＢＭＣから発生させた。ペトリ皿中３７℃で４５分間ＰＢＭＣをインキュベートした後、非付着細胞を洗浄除去し、付着ＰＢＭＣを、１．５％自家熱不活性化血漿、１０００Ｕ／ｍｌのＩＬ−４（ＰＢＨ  Ｓｔｒａｔｈｍａｎｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，  Ｈａｎｏｖｅｒ）および８００Ｕ／ｍｌＧＭ−ＣＳＦ（”Ｌｅｕｃｏｍａｘ”，  Ｓａｎｄｏｚ，  Ｎｕｒｅｍｂｅｒｇ）を添加したＸ−Ｖｉｖｏ１５（Ｂｉｏｗｈｉｔｔａｋｅｒ，Ｖｅｒｖｉｅｒｓ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）中に回収した（Ｊｏｎｕｌｅｉｔ等、１９９７）。第３および５日に、１０００Ｕ／ｍｌのＩＬ−４および１６００Ｕ／ｍｌのＧＭ−ＣＳＦは添加するが自家血漿は添加しないことにより部分的な培地の交換を行った。付着ＰＢＭＣは分化し、非付着の樹状ファージを形成していた。第７日にこれらの未成熟のＤＣを１．５％の自家血漿を含有するＸ−Ｖｉｖｏ１５中に接種し、５００Ｕ／ｍｌのＩＬ−４、８００Ｕ／ｍｌのＧＭ−ＣＳＦ、１０ｎｇ／ｍｌのＴＮＦ−α（Ｇｅｎｚｙｍｅ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ），１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１β（ＰＢＨ  Ｓｔｒａｔｈｍａｎｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）、１０００Ｕ／ｍｌのＩＬ−６（ＰＢＨ  Ｓｔｒａｔｈｍａｎｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）および１μｇ／ｍｌのＰＧ−Ｅ２（”Ｍｉｎｐｒｏｓｔｉｎ  Ｅ２”；Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，  Ｆｒｅｉｂｕｒｇ）を投与した（Ｊｏｎｕｌｅｉｔ等、１９９７）。成熟したＤＣはＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ５８、ＣＤ８０、ＣＤ８３およびＣＤ８６を第９日および１０日に発現した。
【００３５】
チロシナーゼペプチド３６９〜３７７に対する特異性を有するＡ２．１陽性ＣＴＬクローン「ＩＶＳＢ」を作成し、技術的に慣用されている方法を用いて使用可能とした。
【００３６】
記載した全ての細胞は細胞毒性試験（「ＣＴＬ認識」）において標的細胞として使用した。
（４．２）細胞系統およびトランスフェクト体：（４．１）に従って調製した、または、従来より知られており常時入手可能である以下に列挙した細胞系統およびトランスフェクト体を本明細書に記載した試験のために使用した。
−  ヒトＡ２．１陽性Ｔ２細胞系統は融合相手である７２１．１４７およびＣＥＭのＢ／Ｔ細胞ハイブリドーマである（Ｓａｌｔｅｒ  ａｎｄ  Ｃｒｅｓｓｗｅｌｌ，１９８６）、
−Ｔｈｅｏｂａｌｄ等，１９９５に従ってＡ２Ｋｂ遺伝子でトランスフェクトしたＴ２細胞（Ｔ２Ａ２Ｋｂ）、
−Ｃ５７ＢＬ／６マウス由来の胸腺腫細胞系統ＥＬ４（Ｔｈｅｏｂａｌｄ等，１９９５）、
−  Ａ２／１でトランスフェクトされたＥＬ４細胞（ＥＡ２）（Ｔｈｅｏｂａｌｄ等，１９９５）、
−ヒトＴ細胞白血病系統Ｊｕｒｋａｔ（Ｔｈｅｏｂａｌｄ等，１９９５）、
−Ａ２．１でトランスフェクトされたＪｕｒｋａｔ細胞（ＪＡ２）（Ｔｈｅｏｂａｌｄ等，１９９５）、
−構成的にＡ２．１陽性でありｐ５３欠損である突然変異骨肉腫細胞系統Ｓａｏｓ−２（Ｄｉｔｔｍｅｒ等、１９９３）、
−残基１４３に突然変異（Ｖ→Ａ）を有するヒトｐ５３遺伝子でトランスフェクトされたＳａｏｓ−２細胞（Ｄｉｔｔｍｅｒ等、１９９３）、
−ヒトｈｄｍ２過剰発現白血病系統ＥＵ−３（Ｐｒｅ−Ｂ−ＡＬＬ、Ａ２陽性）（Ｚｈｏｕ等、１９９５）、
−ヒトｈｄｍ２過剰発現白血病系統ＵｏＣ−Ｂ１１（Ｐｒｅ−Ｂ−ＡＬＬ、Ａ２陽性）（Ｚｈｏｕ等、１９９５）、
−ヒトｈｄｍ２過剰発現白血病系統ＥＵ−１（Ｐｒｅ−Ｂ−ＡＬＬ、Ａ２陰性）（Ｚｈｏｕ等、１９９５）、
−ヒトｈｄｍ２過剰発現白血病系統ＵｏＣ−Ｂ４（Ｐｒｅ−Ｂ−ＡＬＬ、Ａ２陰性）（Ｚｈｏｕ等、１９９５）、
−ヒトｈｄｍ２過剰発現白血病系統ＳＵＰ−Ｂ１５（Ｐｒｅ−Ｂ−ＡＬＬ、Ａ２陰性）（Ｚｈｏｕ等、１９９５）、
−Ａ２陽性細胞系統Ｐｒｅ−Ｂ−ＡＬＬ  ＢＶ１７３（ＤＳＭ  ＡＣＣ２０；ＤＳＭＺ，Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、
−Ａ２陽性組織球性リンパ腫細胞系統Ｕ−９３７（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５９３；Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＡ，ＵＳＡ）、
−Ａ２陽性細胞系統形質細胞腫ＯＰＭ−２（ＤＳＭ  ＡＣＣ５０；ＤＳＭＺ，Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、
−ＥＢＶ形質転換リンパ芽球様およびＡ２陽性細胞系統ＬＧ−２、
−ヒトＡ２陽性結腸癌腫細胞系統ＳＷ４８０（ＤＫＦＺ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，ＦＲＧ）。
【００３７】
記載した全ての細胞は細胞毒性試験において標的細胞として使用した。Ｓａｏｓ−２およびＳａｏｓ−２／１４３標的細胞は２０ｎｇ／ｍｌの濃度で組み換えＩＦＮ−γ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）を用いて細胞毒性試験のために２０時間前処理した。
Ｂ）実施例で使用した方法
（１）トランスフェクション
（１．１）分子生物学的方法
ｈｄｍ２またはＡ２．１遺伝子で哺乳類細胞を安定してトランスフェクトするために、ｈｄｍ２をコードする図２６のプラスミドｐＣＨＤＭＩＡ（Ｗｕ等、１９９３参照）およびＡ２．１をコードする図２７のプラスミドｐＳＶ２−Ａ２．１（Ｉｒｗｉｎ等、１９８９参照）を用いた。ｐＣＨＤＭＩＡプラスミドはさらにネオマイシンおよびアンピシリン耐性をコードしており、ｐＳＶ２−Ａ２．１プラスミドは更にアンピシリン耐性をコードしている。ｈｄｍ２ｃＤＮＡはＣＭＶプロモーターの制御下にあり、Ａ２．１ｃＤＮＡはＳＶ−４０プロモーターの制御下にある。
【００３８】
プラスミドＤＮＡでＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉを形質転換するために、Ｅ．ｃｏｌｉ株ＤＨ５αのコンピテントな細胞を当該分野でよく知られた方法を用いて調製した。ＤＮＡをコンピテントな細菌細胞に添加し、氷上で１５分間インキュベートした後、細胞を４２℃で２分間熱ショックに曝露した。ＬＢ培地（トリプトファン１０ｇ、酵母エキス５ｇ、ＮａＣｌ１０ｇ、水〜１０００ｍｌ、ｐＨ７．５）を添加した後、バッチを２０分間３７℃でインキュベートし、最後に１００μｇ／ｍｌアンピシリン（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ，  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）の存在下、ＬＢ寒天平板培地（１．５ｗ／ｖ  Ｊａｐａｎ  ａｇａｒ；Ｍｅｒｃｋ，Ｄａｒｍｓｔａｄｔ）上にプレーティングし、３７℃でインキュベートした。単集落を釣り、アンピシリン含有ＬＢ培地上に接種し、振とう（２２０ｒｐｍ）させながら３７℃でインキュベートした（予備培養）。次に細胞を回収し、プラスミド調製に付した。調製は「ＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ」を用いて製造元（Ｑｉａｇｅｎ，Ｈｉｌｄｅｎ）の取扱説明書に従って行った。プラスミド担持形質転換体を適当な制限エンドヌクレアーゼを用いた制限酵素分析、および、その後のアガロースゲル電気泳動により同定した。使用したゲル材料は０．６〜１．５％の強度のアガロース（ｗ／ｖ）であり、これはＴＢＥ緩衝液（５０ｍＭホウ酸トリス、２．５ｍＭＮａ２−ＥＤＴＡ、ｐＨ８．５）中に調製した。次に陽性形質転換体をアンピシリン含有ＬＢ培地中、より大きい規模（主培養）で、３７℃で一夜培養した。細胞回収後、プラスミドを製造元（Ｑｉａｇｅｎ）の取扱説明書に従って「ＱＩＡＧＥＮ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍａｘｉ  Ｋｉｔ」を用いて調製した。得られたＤＮＡ溶液の濃度および純度は石英キュベット中で２６０ｎｍおよび２８０ｎｍの波長における吸光度（ＯＤ）を測定することにより光度測定的に確認した。新しい制限酵素分析とゲル電気泳動の後、ＤＮＡをリポフェクション用ではなくエレクトロポレーション用に線状化した。プラスミドｐＣＨＤＭＩＡはＢＳＡ（０．２ｍｇ／ｍｌ）を添加しながら制限エンドヌクレアーゼＰｖｕＩ（ＭＢＩ  Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ，Ｓｔ．Ｌｅｏｎ  Ｒｏｔ）を用いて切断し、ｐＳＶ２−Ａ２．１プラスミドはＥｃｏＲＩ（ＭＢＩ  Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）を用いて切断した。制限酵素切断を確認するために試料をゲル電気泳動で分析した。ＤＮＡ溶液から制限エンドヌクレアーゼを排除するために、抽出を行なった。このため、試料を１容量のフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール（２４：２４：１、ｖ／ｖ／ｖ；Ｒｏｔｈ，Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ）で処理し、十分混合した後に遠心分離した（１４０００ｒｐｍ、４分、室温）。ＤＮＡ含有水性上層を単離し、新しく抽出した。ＤＮＡの沈殿のために、ＤＮＡ溶液に１／１０容量の酢酸ナトリウム（３Ｍ）が投与され、そして混合後、２容量のエタノール（９６％、ｖ／ｖ、−２０℃）で処理した。−２０℃で１時間インキュベートした後、試料を４℃で２０分間遠心分離し、約２容量のエタノール（７０％、ｖ／ｖ、−２０℃）で短時間洗浄した。ＤＮＡペレットを風乾した後、ＤＮＡをＴＥ緩衝液（１０ｍＭトリス、１ｍ���Ｎａ２−ＥＤＴＡ、ｐＨ８）に溶解し、−２０℃で保存した。
【００３９】
（１．２）トランスフェクション法
哺乳類細胞の安定したトランスフェクションのため、ＯＤ指数２６０／２８０ｎｍが少なくとも１．８である高純度のＤＮＡを用いた。
ａ）リポフェクション：付着Ｓａｏｓ−２およびＳＷ４８０細胞をペトリ皿（Ｇｒｅｉｎｅｒ，Ｆｒｉｃｋｅｎｈａｕｓｅｎ）中で培養し、トランスフェクションの日に３０〜５０％コンフルエントとなった（約１５Ｍｉｏ個の細胞／７８ｃｍ２皿）。操作は、製造元の取扱説明書に従って変更を加えた市販のリポフェクションキット（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ，Ｅｇｇｅｎｓｔｅｉｎ）を用いて行なった。１２ｍｌのスナップ蓋付きのポリスチレン管（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｃｏｓｔａｒ，Ｂｏｄｅｎｈｅｉｍ）中で、ＤＮＡ３０μｇをＯｐｔｉ−Ｍｅｍ  Ｉ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）１．５ｍｌ（バッチＡ）またはＯｐｔｉ−Ｍｅｍ  Ｉ０．３ｍｌを含有するリポフェクチン（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）６０μｌ（バッチＢ）と混合し、１時間室温でインキュベートした。バッチＡおよびＢを混合し（Ａ／Ｂ）、更に１０〜１５分間インキュベートした。次にＲＰＭＩ１６４０（１％グルタミン）（Ｂｉｏｗｈｉｔｔａｋｅｒ，Ｖｅｒｖｉｅｒｓ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）を合計終容量２〜６ｍｌとなるようにバッチＡ／Ｂに添加した。このＤＮＡ−およびリポフェクチン−含有溶液を細胞上に分布させ、混合後、ＲＰＭＩ１６４０（１％グルタミン）で中間洗浄した。水蒸気飽和条件下３７℃５％ＣＯ２で少なくとも５時間インキュベートした後、ＤＮＡ含有培地を取り出し、細胞を細胞培養用培地１０ｍｌに重積させた（２．４参照）。約２４時間更にインキュベートした後、トランスフェクトされた細胞を選択培地（ｇ−４１８．０．５６ｍｇ／ｍｌを含有する細胞培養用培地［Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ］）中１：２で選択した。選択培地の交換は１週間に２回行った。３〜４週間後、ＰＢＳ（Ｂｉｏｗｈｉｔｔａｋｅｒ，Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＡ）でペトリ皿を反復洗浄した後、ネオマイシン耐性クローンを単離し、４８穴プレートに移した。トランスフェクト体は最終的に細胞培養ビンに移し、そのｈｄｍ２およびＡ２．１の発現を調べた。
ｂ）エレクトロポレーション：ｐＣＨＤＭＩＡおよびｐＳＶ２−Ａ２．１で懸濁液細胞系統ＥＬ４を同時トランスフェクトするために、１０Ｍｉｏ個のＥＬ４細胞を洗浄し、０．５ｍｌのＲＰＭＩ１６４０（Ｂｉｏｗｈｉｔｔａｋｅｒ，Ｖｅｒｖｉｅｒｓ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）および１％ＦＣＳ（ＰＡＡ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  Ｌｉｎｚ，  Ａｕｓｔｒｉａ）中に再懸濁し、４ｍｍのキュベット（ＢｉｏＲａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  Ｍｕｎｉｃｈ）中にピペッティングした。ｐＳＶ２−Ａ２．１プラスミドの線状化ＤＮＡ２０μｇおよびｐＣＨＤＭＩＡプラスミドの線状化ＤＮＡ４．５μｇを混合し、次に細胞に添加した。細胞を「Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ」（Ｆｉｓｃｈｅｒ，  Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ）中２ｍｓの間１２００μＦａｒａｄおよび３００ボルトでエレクトロポレーションに付した。次に細胞を９６穴プレート中細胞培養用培地（２．４参照）で連続希釈し、水蒸気飽和条件下３７℃５％ＣＯ２で２４時間培養した。Ｇ−４１８（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ，  Ｅｇｇｅｎｓｔｅｉｎ）の添加は５６０μｇ／ｍｌの有効終濃度で行なった。選択培地の交換は毎週行なった。約２〜３週後、ネオマイシン耐性トランスフェクト体クローンを先ず２４穴プレートに移し、その後、最終的にｈｄｍ２およびＡ２．１の発現を確認するまでは、細胞培養ビンに移した。
【００４０】
（２）フローサイトメトリー
細胞、細胞系統およびトランスフェクト体のＡ２．１発現は蛍光活性化細胞分類機（ＦＡＣＳ）（Ｂｅｃｋｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，  Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，  ＣＡ）において測定した。各々の場合、０．５Ｍｉｏ個の細胞を遠心分離し、５０μｌの容量中、抗Ａ２．１モノクローナル抗体ＢＢ７．２（またはＲＰＭＩ１６４０、１０％ＦＣＳ，２．４参照）で標識した（Ｌｕｓｔｇａｒｔｅｎ等、１９９７）。氷上で１時間インキュベートした後、バッチを２回ＰＢＳ（Ｂｉｏｗｈｉｔｔａｋｅｒ，Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，  ＭＡ）で洗浄し、次に細胞をＦＩＴＣコンジュゲート２次抗体（ヤギ抗マウスＩｇＧＦａｂフラグメント；ＰＢＳ中１：３０希釈したものを５０μｌ）で逆染色した。２５分間氷上でインキュベートした後、試料をＰＢＳで２回洗浄し、最後にＰＢＳおよび１％ホルマリン中に固定した。前方散乱光中で選択した細胞集団の蛍光活性をＦＡＣＳで測定した。
【００４１】
（３）ウエスタンブロット
ａ）核蛋白抽出：全ての作業工程は４℃において行なった。細胞をＰＢＳ（Ｂｉｏｗｈｉｔｔａｋｅｒ，Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，  ＭＡ）で２回洗浄（１５００ｒｐｍ、５℃、７分）し、次にプロテアーゼ阻害剤（後述）の存在下緩衝液Ａ（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．９、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ  ＫＣｌ）中に再懸濁した。細胞膜を溶解するために、緩衝液Ａ２μｌ／細胞Ｍｉｏ個懸濁液または緩衝液Ａ４μｌ／付着細胞Ｍｉｏ個懸濁液を用いた。１０分間インキュベートした後氷上で溶液を遠心分離した（１４０００ｒｐｍ、４℃、１０ｓ）。再度溶解し、インキュベートし、遠心分離した後、細胞の核をプロテアーゼ阻害剤存在下、緩衝液Ｃ（２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．９、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．４２Ｍ  ＮａＣｌ、０．２ｍＭ  ＥＤＴＡおよび２５％グリセロール）中に再懸濁した。氷上で３０分間インキュベートした後、溶液を３０分間遠心分離した。上澄みは核蛋白を含有しており、これを液体窒素中にショック凍結した後、−８０℃で保存した。
【００４２】
−２０℃で保存した以下のプロテアーゼ阻害剤、即ち１．５μｌ／ｍｌペプスタチンＡ（９６％エタノール中１ｍｇ／ｍｌ）、１μｌ／ｍｌアプロチニン（水中１０ｍｇ／ｍｌ）、１μｌ／ｍｌロイペプチン（メタノール中１０ｍｇ／ｍｌ）、１μｌ／ｍｌＤＴＴ（水中１Ｍ）、１０μｌ／ｍｌＰＭＳＦ（イソプロパノール中１７．４ｍｇ／ｍｌ）を緩衝液ＡおよびＣに添加した。
ｂ）蛋白の測定：蛋白の測定は当業者の知る方法で行なった（Ｂｒａｄｆｏｒｄ，  １９７６参照）。核抽出液の蛋白濃度は５９５ｎｍの波長における消衰として光化学的に測定した。試料１μｌを水８００μｌおよび「ＢｉｏＲａｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ」（ＢｉｏＲａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  Ｍｕｎｉｃｈ）２００μｌと共に、プロテアーゼ阻害剤の存在下に混合し、室温で５分間インキュベートした。ＢＳＡ（１ｍｇ／ｍｌ）を用いて記録した検量線を用いることにより、蛋白含量を測定することが可能であった。
ｃ）ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）：ＳＤＳ−ＰＡＧＥは当業者の知る方法に従って実施した。以下の溶液および緩衝液をゲルの調製に使用した。
１）分離ゲル（８％）：水８．９７ｍｌ、分離ゲル緩衝液（１．５Ｍトリス塩酸、ｐＨ８．８、０．４％ＳＤＳ）４．８ｍｌ、３０％アクリルアミド／ビスアクリルアミド５ｍｌ、ＡＰＳ１１２．５μｌ、ＴＥＭＥＤ２２．５μｌ。
２）収集ゲル（４％）：水３．７ｍｌ、収集ゲル緩衝液（０．５Ｍトリス塩酸、ｐＨ６．８、０．４％ＳＤＳ）１．５ｍｌ、３０％アクリルアミド／ビスアクリルアミド０．８ｍｌ、ＡＰＳ７０μｌ、ＴＥＭＥＤ７μｌ。
【００４３】
各々の場合、蛋白試料５０μｇを緩衝液Ｃで１：２に、次に「ローディング希釈」緩衝液（１Ｍ、ｐＨ６．８のトリス塩酸６．２５ｍｌ、ＳＤＳ２ｇ、グリセロール２０ｍｌ。ブロモフェノールブルー１スパーテル、水５０ｍｌとなる量）および１０％１Ｍβ−メルカプトエタノールで１：２に希釈した。９５℃で５分間変性した後、試料および「レインボー」分子量標準物質（Ａｍｅｒｓｈａｍ，
Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ）を適用した。泳動緩衝液の組成はトリス塩基７．５６ｇ、グリシン３６ｇ、およびＳＤＳ２．５ｇを水で２．５ｌとしたものであった。
ｄ）膜への蛋白の移行：ＳＤＳゲルの蛋白は約１２時間ＰＶＤＦ膜（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ，  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）に電場（１００ｍＡ）を適用することにより移行させた。移行緩衝液として、２０％の終濃度でメタノールを含有するｃ）の泳動緩衝液を用いた。
ｅ）抗体標識：移行した蛋白を有する膜はＰＢＳ（Ｂｉｏｗｈｉｔｔａｋｅｒ）で１０分間２回洗浄した後、製造元の取扱説明書に従って「ブロッキング溶液」（１：１０）（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）とともに１時間インキュベートした。次に膜を１次抗体（抗ｈｄｍ２モノクローナル抗体ＩＦ２、マウスＩｇＧ２ｂ）３μｇ／ｍｌと共に２時間インキュベートした。ＰＢＳ、０．１％ポリオキシエチレンソルビタンモノルレート（ツイーン２０）で２回洗浄した後、膜を希釈した「ブロッキング溶液」（１：２０）で２回洗浄した。その後２時間パーオキシダーゼコンジュゲート２次抗体（ヤギ抗マウスＩｇＧ、１：１００００）と共にインキュベートした。膜を３回１５分間ＰＢＳ、０．１％ツイーン２０、最後にＰＢＳで１回洗浄した。
ｆ）現像：抗体標識膜の現像は製造元の取扱説明書に従って１分間「溶液Ａ」、１％「溶液Ｂ」 （Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）中で行なった。オートラジオグラフィーのために、Ｘ線フィルムを膜の上に置き、標識された蛋白をその化学ルミネセンスにより検出した。
【００４４】
（４）ＨＬＡ−Ａ２．１に対するペプチドの結合親和性の測定
ｈｄｍ２ペプチドのＡ２．１への結合を調べるために競合試験を用いた。ＥＡ２細胞にＡ２．１結合ペプチドｐ５３２６４−２７２（Ｔｈｅｏｂａｌｄ等、１９９５）０．０１μｇおよびｈｄｍ２ペプチド３または１０μｇを担持させた。Ａ２．１結合ペプチドチロシナーゼ３６９−３７７（Ｗｏｌｆｅｌ等、１９９４）およびＡ／ＰＲ／８／３４インフルエンザウィルスマトリックス蛋白Ｍ１のペプチド５８−６６（Ｆｌｕ  Ｍ１  ５８−６６）（Ｔｈｅｏｂａｌｄ等、１９９５）を陽性対照として用い、水疱性口内炎ウィルス核蛋白のＨ−２Ｋｂ結合ペプチド５２−５９（ＶＳＶ−Ｎ  ５２−５９）（Ｔｈｅｏｂａｌｄ等、１９９５）を陰性対照として用いた。Ａ２．１制限ｐ５３  ２６４−２７２特異的ＣＴＬ（ＣＤ８ｘ）Ａ２  ２６４は４時間細胞毒性試験（Ｂ８章参照）（Ｔｈｅｏｂａｌｄ等、１９９５）においてペプチド担持および未担持のＥＡ２標的細胞に対するその細胞溶解活性を種々のエフェクター：標的細胞（Ｅ：Ｔ）比において調べた。被験ペプチドによるｐ５３  ２６４−２７２担持ＥＡ２細胞のＣＴＬ（ＣＤ８ｘ）Ａ２  ２６４媒介特異的細胞溶解（ＳＬ）の％抑制は以下の式に従ってＥ：Ｔ比１：１（ｈｄｍ２  ３１４−３２４、３６５−３７５、４０２−４１１および４１９−４２６の場合は０．３：１）で計算した。
【００４５】
【数１】
2004535779.tif 000002
（５）Ａ２．１トランスジェニックマウスの免疫化およびペプチド特異的アロ反応性ＣＴＬの誘導
Ａ２．１制限ペプチド特異的ＣＴＬの発生のために、８〜１２週齢のＡ２．１トランスジェニックマウスの尾部の基部皮下に、（５０−）１００μｇの各々被験ペプチド、および、１２０μｇのＨＢＶ  コア１２８−１４０（Ｉ−Ａｂ結合合成Ｔヘルパーペプチド）（Ｔｈｅｏｂａｌｄ等、１９９５）をフロインドの負完全アジュバント（ＩＦＡ；Ｄｉｆｃｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  Ｄｅｔｒｏｉｔ，  ＵＳＡ）１００μｌ中に乳化したものを注射した（Ｔｈｅｏｂａｌｄ等、１９９５）。約１０日後、脾臓を摘出し、粉砕し、脾細胞懸濁液を２回洗浄した（１５００ｒｐｍ、５℃、７分間）。脾細胞を２４穴プレート中７Ｍｉｏ／ｍｌ／ウェルとなるように接種した。スティミュレーター細胞として、３０００Ｒａｄ（１３２セシウム）を照射され、各々の被験ペプチド５μｇ／ｍｌおよびヒトβ２−マイクログロブリン１０μｇ／ｍｌを担持したＬＰＳ活性化Ｂ細胞芽球を、２回洗浄後に３Ｍｉｏ／ｍｌ／ウェルとなるようにそこに添加した（Ｔｈｅｏｂａｌｄ等、１９９５）。ＬＰＳ芽球はＬＰＳ２５μｇ／ｍｌ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｏｓａ）およびデキストランスルフェート（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｆｒｅｉｂｕｒｇ）７μｇ／ｍｌを用いてＡ２．１トランスジェニックマウス由来の脾細胞（１Ｍｉｏ／ｍｌ）を３日間刺激することにより得た。エフェクターおよびスティミュレーター細胞のバッチは６日間インキュベートし（Ｉ０培養物）、細胞毒性試験に付した。
【００４６】
アロＡ２．１反応性Ｉ０ＣＴＬは６日間６Ｍｉｏ／ｍｌ／ウェルとしたＡ２．１トランスジェニックマウス由来の照射脾細胞（スティミュレーター細胞）と共に７Ｍｉｏ／ｍｌ／ウェルとしたＣＤ８トランスジェニックマウス由来の脾細胞（エフェクター細胞）をインキュベートすることにより発生させた。
【００４７】
（６）ＣＴＬ系統の樹立
ｈｄｍ２  ８１−８８に対して（ＣＴＬ  Ａ２  ８１およびＣＤ８ｘＡ２Ｋｂ８１）、そしてＦｌｕ  Ｍ１  ５８−６６に対して（ＣＴＬ  ＣＤ８ｘＡ２ＫｂＦｌｕ  Ｍ１）特異性を有するポリクローナルペプチド特異的ＣＴＬ系統はペプチド担持スティミュレーター細胞でエフェクター細胞を毎週反復刺激することにより樹立した。使用したスティミュレーター細胞はＪＡ２細胞であり、これは２００００Ｒａｄを先ず照射し、次に、約４０分間、各々の被験ペプチド５μｇ／ｍｌおよびヒトβ２−マイクログロブリン１０μｇ／ｍｌをＲＰＭＩ１６４０（Ｂｉｏｗｈｉｔｔａｋｅｒ，Ｖｅｒｖｉｅｒｓ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）中で担持させ、最後に２回洗浄した。エフェクター細胞は３０００Ｒａｄ照射された０．５ＭｉｏのＪＡ２細胞および６ＭｉｏのＣ５７ＢＬ／６脾細胞と共に２４穴プレート中総容量２ｍｌ／ウェルとなるように接種した。Ｌｅｗｉｓラット由来のＣｏｎＡ活性化脾細胞（ＴＣＧＦ）の培養液の２％（ｖ／ｖ）上澄みをバッチに添加した（Ｔｈｅｏｂａｌｄ等、１９９５）。
【００４８】
アロＡ２．１反応性ＣＴＬ系統はＪＡ２細胞２０Ｍｉｏ／マウスでＣＤ８トランスジェニックマウスを腹腔内免疫化することにより誘導した。３週間後、脾細胞を単離し、照射されたＪＡ２細胞（０．５Ｍｉｏ／ｍｌ／ウェル）またはＡ２．１トランスジェニックマウスの脾細胞（６Ｍｉｏ／ｍｌ／ウェル）でインビトロ刺激した（７Ｍｉｏ／ｍｌ／ウェル）。照射Ｃ５７ＢＬ／６脾細胞（６Ｍｉｏ／ｍｌ／ウェル）および２〜５％ＴＣＧＦの存在下、ＪＡ２細胞でインビトロ再刺激を毎週反復することにより、アロＡ２．１反応性ＣＴＬ系統を最終的に発生させた。
【００４９】
（７）天然ペプチドの抽出とＨＰＬＣ分画およびＣＴＬ認識の回復
ａ）ＭＨＣクラスＩ分子からの天然ペプチドの抽出：付着Ｓａｏｓ−２／ｃｌ６細胞を約５ｘ１０７個／ビンの密度にまで生育させた。細胞をＨＢＳＳ（Ｂｉｏｗｈｉｔｔａｋｅｒ，Ｖｅｒｖｉｅｒｓ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）で２回洗浄し、抽出緩衝液（０．１３Ｍクエン酸、０．０６１ＭＮａ２ＨＰＯ４、ｐＨ３．０）５ｍｌで１分間細胞を処理することによりＭＨＣクラスＩ結合ペプチドを抽出した（Ｔｈｅｏｂａｌｄ等、１９９８）。ＲＰＭＩ１６４０（Ｂｉｏｗｈｉｔｔａｋｅｒ，Ｖｅｒｖｉｅｒｓ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）で２回洗浄した後、細胞を更に細胞培養用培地（２．４参照）中で培養した。抽出液を遠心分離し、ペプチド含有上澄みを凍結した。この操作を１０日間２日おきに繰り返すことにより、約２ｘ１０９個のＳａｏｓ−２／ｃｌ６細胞の相当分からペプチド抽出液を収集することができた。抽出液を解凍し、合わせ、メタノール４ｍｌおよび水４ｍｌで予め洗浄しておいたＣ１８「スパイスカートリッジ」（Ａｎａｌｔｅｃｈ  Ｉｎｃ．，  Ｎｅｗａｒｋ，  ＤＥ）上に担持させた。「カートリッジ」は水１０ｍｌで再度洗浄し、ペプチドをアセトニトリル４ｍｌ（０．１％ＴＦＡ含有）を用いて溶離した。ペプチド含有溶出液を真空乾燥し、水に再懸濁し、遠心分離により残渣を除去した。上澄みをＣｅｎｔｒｉｃｏｎ−１０カラム（Ａｍｉｃｏｎ，  Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）を通して濾過し、得られたペプチド抽出液を再度真空乾燥した（Ｔｈｅｏｂａｌｄ等、１９９８）。
ｂ）天然ペプチド抽出液のＨＰＬＣ分画およびＣＴＬ認識の回復：０．０５％ＴＦＡ中に再懸濁した天然ペプチド抽出液０．９ｍｌおよび、各々の場合、合成ペプチドｈｄｍ２  ８１−８８またはｈｄｍ２  ８０−８８  １ｍｌ（＝１００ｎｇ）をμＲＰＣ  Ｃ２／Ｃ１８ＳＣ２．１／１０カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，  Ｕｐｐｓａｌａ，  Ｓｗｅｄｅｎ）を装着したＲＰ−ＨＰＬＣ  ＳＭＡＲＴシステム上で分離し、溶離液Ａ（０．０５％ＴＦＡ）中２０〜９５％溶離液Ｂ（０．０５％ＴＦＡ中７０％アセトニトリル）の勾配を用いて、３６分間流量５０μｌ／分で２分画分づつ溶離し１００μｌ（天然ペプチド抽出液およびｈｄｍ２  ８１−８８）を得るか、または、流量２５μｌ／分で５０μｌ（ｈｄｍ２  ８０−８８）を得た（Ｔｈｅｏｂａｌｄ等、１９９８）。ＨＰＬＣ画分は３０〜７０分の範囲で収集した。５１Ｃｒ標識Ｔ２標的細胞を６０分間、天然ペプチド抽出液の個々のＨＰＬＣ画分５０μｌとともに、そして、合成ペプチドの個々のＨＰＬＣ画分０．０３μｌ（ｈｄｍ２  ８１−８８）または２．５μｌ（ｈｄｍ２  ８０−８８）とともに、血清非含有ＲＰＭＩ１６４０（Ｂｉｏｗｈｉｔｔａｋｅｒ）、５％ＢＳＡおよび１０μｇ／ｍｌβ２−マイクログロブリンに担持させ、６時間細胞毒性試験に付した（Ｔｈｅｏｂａｌｄ等、１９９８）。Ｅ：Ｔ比２０：１でエフェクター細胞としてＣＴＬ  ＣＤ８ｘＡ２Ｋｂ８１を用いた。
【００５０】
（８）細胞毒性試験
種々の標的細胞に対するエフェクター細胞の細胞溶解反応性を５１Ｃｒ放出試験において確認した（Ｔｈｅｏｂａｌｄ等、１９９５）。Ｔ２  およびＴ２Ａ２Ｋｂ細胞をペプチド力価検定試験の標的細胞として使用した。１〜５Ｍｉｏの標的細胞を１５０μＣｉのＮａ（５１Ｃｒ）Ｏ４（１ｍＣｉ／ｍｌ）（ＮＥＮ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  Ｂｅｌｇｉｕｍ）で６０〜９０分標識した。この標識の前に、種々の濃度のペプチド溶液２μｌおよびＦＣＳ（ＰＡＡ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｌｉｎｚ，Ａｕｓｔｒｉａ）１５μｌ、或いは、ペプチドを用いずにＦＣＳのみをペプチド力価検定試験の細胞に添加した。標識された標的細胞を４回洗浄し、細胞数を０．１Ｍｉｏ／ｍｌに合わせた。エフェクター細胞を細胞培養用培地で１：３で連続希釈し、９６穴プレート中０．１ｍｌ／ウェルトとなるように接種した。同時に５種類のＥ：Ｔ比を試験した。次に標的細胞懸濁液０．１ｍｌ／ウェルをエフェクター細胞に添加し、バッチを４〜６時間インキュベートした。次に細胞を遠心分離（１３００ｒｐｍ、５℃、９分）して除去し、上澄み（０．１ｍｌ／ウェル）をとりだし、ガンマカウンター（Ｃａｎｂｅｒｒａ  Ｐａｃｋａｒｄ，  Ｄｒｅｉｅｉｃｈ）を用いて５１Ｃｒの放出を測定した。％特異的細胞溶解（ＳＬ）を以下の式に従って計算した。
【００５１】
【数２】
2004535779.tif 000003
最大５１Ｃｒ放出は標的細胞による総５１Ｃｒ取りこみに相当し、自発５１Ｃｒ放出はエフェクター細胞非存在下の標的細胞の細胞溶解に相当し、原則として最大５１Ｃｒ放出の１０％より低値であった。自発および最大細胞溶解の数値は各々４バッチの平均とし、実験細胞溶解の数値は２バッチの平均とした。
【実施例１】
【００５２】
Ｃ）実施例
実施例１：オリゴペプチドｈｄｍ２  ８１−８８の実験的取得
（１．１）潜在的なＡ２．１結合性のｈｄｍ２ペプチドの選択
ｈｄｍ２腫瘍蛋白の既知のアミノ酸配列により、このｈｄｍ２ポリペプチドのサブ配列であり下記の基準を満たす８量体、９量体、１０量体および１１量体を調べた。
１．）それらが、ＭＨＣクラスＩ分子の結合ポケットの残基と相互作用するペプチド内のアミノ酸であり、そして、内因的にプロセシングされた、そして、ＭＨＣクラスＩ分子の範囲では提示されたペプチドの場合には、２位およびエピトープのＣ末端に位置する「１次アンカーアミノ酸」として、２位では古典的にはアミノ酸Ｌ、Ｍ、Ｉ、ＶまたはＴ、および非古典的にはアミノ酸Ａ、ＱまたはＫ、そして、Ｃ末端には古典的にはアミノ酸Ｖ、ＬまたはＩおよび非古典的にはアミノ酸Ａ、ＭまたはＴを有する（Ｔｈｅｏｂａｌｄ等、１９９５）。
２．）ｈｄｍ２ペプチドは可能であればマウスの相当するｍｄｍ２ペプチドと相同であってはならない。
３．）９量体は合成ペプチドの結合データに基づいて可能な限り高い「スコア」を有さなければならない（Ｐａｒｋｅｒ等、１９９４）。
結果的に５１個のｈｄｍ２ペプチドを選択した（図１参照）。
【００５３】
（１．２）選択されたｈｄｍ２ペプチドのＡ２．１への結合
理論的結合力により（１．１）に従って選択されたｈｄｍ２ペプチドのＡ２．１に対する実際の結合親和性を調べた。このためには、Ｔｈｅｏｂａｌｄ等（１９９５）の報告において詳細に述べられている競合的結合試験において、競合する合成ペプチドｐ５３  ２６４−２７２のＡ２．１結合を抑制するｈｄｍ２ペプチドの能力を機能的に試験した。この抑制はＡ２．１制限ｐ５３  ２６４−２７２特異的ＣＴＬ系統により媒介される、ｐ５３  ２６４−２７２ペプチドおよび個々のｈｄｍ２試験ペプチドを担持させられたＥＡ２細胞の細胞溶解の低下により測定した。結合結果は図１中、総括された形態で示す。陽性対照として使用したペプチドチロシナーゼ３６９−３７７は最も強い抑制、即ちＡ２．１への結合を示し（Ｗｏｌｆｅｌ等、１９９４参照）、そして３および１０μｇの両方で１００％抑制を達成したのに対し、陰性対照であるＨ−２Ｋｂ結合ペプチドＶＳＶ−Ｎ５２−５９（Ｔｈｅｏｂａｌｄ等、１９９５）はＡ２．１結合活性を全く示さなかった。ｈｄｍ２ペプチドをその結合強度に従って４群に分けた。試験した５１個のペプチド全ての内、１２個が高い結合活性を有しており（被験ペプチド１０μｇで少なくとも８５％抑制）、１６個が中等度の活性（５０〜８４％抑制）、１３個が弱い活性（１０〜４９％）そして１０個が結合活性を有していなかった（＜１０％または抑制の用量依存性が低い）。最も強く結合したｈｄｍ２ペプチドは８０−８８、８１−８８、４８−５７および３３−４１であり、１０μｇで各々、競合ペプチドｐ５３  ２６４−２７２の結合を１００％抑制した。結合の抑制は用量依存的であったが、その理由は全てのＡ２．１結合ペプチドについて１０μｇにおける抑制値が３μｇの場合よりも顕著に高値であったためである。同時に選択された全てのペプチドの５５％は強力または中等度なＡ２．１結合を示した。２０％のみＡ２．１に結合することができなかった。
【実施例２】
【００５４】
実施例２：特異的ＣＴＬ媒介免疫原性の発生のためのｈｄｍ２  ８１−８８オリゴペプチドの適性の実験的説明
（２．１）Ａ２．１トランスジェニックマウスにおけるＡ２．１結合合成ｈｄｍ２ペプチドの免疫原性
マウスＴ細胞によるヒトＭＨＣクラスＩ分子の認識における障害は、Ａ２．１のようなＨＬＡ分子に対してマウスＣＤ８が相互作用を示すことができない点である。この障害を回避ないしは排除するために、２つの方法を用いた。１つの方法は、ＣＤ８との相互作用に必須である、Ａ２．１のヒトα１およびα２ドメインおよびマウスＫｂのα３ドメインよりなるキメラ分子Ａ２．１／Ｋｂ（Ａ２Ｋｂ）の構築である。Ａ２ＫｂトランスジェニックマウスにおいてＡ２Ｋｂトランスジーンの制限により誘発されるＣＴＬはＡ２．１陽性ヒトにおいてやはり免疫原性である同じペプチド抗原を認識する。
【００５５】
Ａ２．１制限応答を増幅するもう１つの方法は、ｈｕＣＤ８α／βトランスジェニックマウスとのＡ２Ｋｂトランスジェニックマウスの交叉により２重トランスジェニックマウス「ＣＤ８ｘＡ２．１／Ｋｂ」を作成することよりなる。ｈｕＣＤ８分子のαおよびβ鎖の発現により、発生したＣＴＬはヒト細胞のＡ２．１分子のα３ドメインと相互作用ができるようになる。
【００５６】
Ａ２Ｋｂ−およびＣＤ８ｘＡ２Ｋｂ−トランスジェニックマウスを実施例１（図１参照）により得られた強力または中等度に結合するペプチドで免疫化する事によりｈｄｍ２ペプチド反応性ＣＴＬを得た。免疫化後９〜１１日に、該当するマウスの脾細胞をペプチド担持同系ＬＰＳ芽球でインビトロ刺激し、その６日後に、Ａ２．１制限ペプチド特異的ＣＴＬ応答について細胞毒性試験において調べた。結果は図２に総括した。陽性対照Ｆｌｕ  Ｍ１  ５８−６６については、Ａ２．１制限ＣＴＬの誘導は既に知られていた（Ｔｈｅｏｂａｌｄ等、１９９５）。Ａ２．１制限ペプチド特異的ＣＴＬ応答は強力結合ペプチドのｈｄｍ２  ８１−８８、３３−４１および８０−８８、および、中等度の結合ペプチドｈｄｍ２１０１−１１０において観察された。細胞溶解の程度はＥ：Ｔ比に依存していた。ＣＴＬは、相当するペプチドを担持した細胞を溶解するが、無関連のＡ２．１結合ペプチドを担持した細胞は溶解しないことから、ペプチド特異的であった（データ示さず）。
【００５７】
ｈｄｍ２  ８０−８８の免疫原性は、独立して行なったｈｄｍ２  ８０−８８による免疫化の後にＣＴＬの認識はペプチドの純度が上昇するに従って低下したことから、恐らくはｈｄｍ２  ８１−８８の混入によるものと考えられた。混入はまた質量スペクトルによっても示されている（データ示さず）。ｈｄｍ２  ８１−８８により誘発されたＣＴＬは、相当するペプチドを担持したマウスのＡ２．１陰性ＥＬ４細胞（Ｈ−２ｂ）が認識されなかったことから、Ａ２．１制限的であった（図３）。
【００５８】
（２．２）ｈｄｍ２  ８１−８８特異的ＣＴＬ：Ａ２．１制限、ペプチド特異性およびペプチド認識の効率
Ａ２．１制限ｈｄｍ２  ８１−８８特異的なＣＴＬを以下のとおりより詳細に調べた。この時点までは、試験において、Ａ２Ｋｂトランスジェニックマウスから発生させたｈｄｍ２  ８１−８８特異的ＣＴＬ系統のみが存在していたため、より高いアビディティーを有するＣＴＬを得ることを意図して、Ａ２．１およびＣＤ８ｘＡ２Ｋｂトランスジェニックマウスをｈｄｍ２  ８１−８８で免疫化した。
【００５９】
Ａ２．１およびＣＤ８ｘＡ２Ｋｂトランスジェニックマウスをｈｄｍ２  ８１−８８で免疫化した後、脾細胞をＡ２．１トランスジェニックマウス由来のペプチド担持ＬＰＳ芽球で刺激し（Ｉ０培養）、６日後、合成ペプチドｈｄｍ２  ８１−８８の種々の濃度でインキュベートされたＴ２標的細胞に対する細胞毒性試験において調べた（図４Ａ）。Ｉ０ＣＴＬ培養のＡ２．１（Ａ２）およびＣＤ８ｘＡ２Ｋｂ８１はそのペプチド認識効率において、ファクター５で相違していた。Ｉ０ＣＴＬ  Ａ２  ８１による標的細胞の半最大細胞溶解はペプチド濃度０．９５ｎＭで観察されたのに対し、Ｉ０ＣＴＬ  ＣＤ８ｘＡ２Ｋｂ８１では０．２ｎＭであった。ペプチド認識効率の相違から、Ｉ０ＣＴＬ  ＣＤ８ｘＡ２Ｋｂ８１はＩ０ＣＴＬ  Ａ２  ８１よりも高いアビディティーを有することが推察される。１００％のＩ０ＣＴＬ  ＣＤ８ｘＡ２Ｋｂ８１の場合の絶対最大細胞溶解もまた６２％のＩ０ＣＴＬ  Ａ２  ８１の場合よりも有意に高値であった。ｈｄｍ２反応性Ｔ細胞のアビディティーにおけるこのような相違もまた内因性に存在するｈｄｍ２  ８１−８８ペプチドの認識を反映している（図４ＢおよびＣ）。Ｉ０ＣＴＬ  ＣＤ８ｘＡ２Ｋｂ８１は４２％まで３０：１のＥ：Ｔ比においてｈｄｍ２過剰発現Ａ２．１陽性トランスフェクト体Ｓａｏｓ−２／ｃｌ６を溶解したが、Ｉ０ＣＴＬによるＡ２  ８１  Ｓａｏｓ−２／ｃｌ６の認識は僅か２３％までであった。検出可能なｈｄｍ２蛋白を発現せず、従って陰性対照として使用されている骨肉腫細胞系統Ｓａｏｓ−２はＩ０ＣＴＬにより認識されなかった（これに関しては図６も参照）。
【００６０】
これらの結果によればＡ２．１−およびＣＤ８ｘＡ２Ｋｂトランスジェニックマウスの単回免疫化およびｈｄｍ２  ８１−８８ペプチドによる単回インビトロ刺激の後、内因性に存在するペプチドを認識する高いアビディティーのＣＴＬが誘導されることを示している。ｈｄｍ２トランスフェクト体の認識については実施例４に記載する。
【００６１】
Ａ２．１−およびＣＤ８ｘＡ２Ｋｂトランスジェニックマウス由来のＩ０ＣＴＬをペプチド担持スティミュレーター細胞で反復して再刺激することにより、ｈｄｍ２  ８１−８８に対する特異性を有する安定なＣＴＬ系統を発生させた。図５Ａは１０：１のＥ：Ｔ比における両方のＣＴＬ系統による合成ｈｄｍ２  ８１−８８の認識の効率を示している。Ｉ０ＣＴＬに対するＣＴＬ系統Ａ２  ８１のアビディティーは、標的細胞の半最大細胞溶解が０．０６９ｎＭのペプチド濃度で達成されたことから、１対数の段階を越えて増大していた。ＣＴＬ  ＣＤ８ｘＡ２Ｋ６８１の細胞溶解活性は０．０３６ｎＭでは半最大値であり、これはファクター５の感受性増大に相当していた。ＣＴＬ系統のアビディティーの観察された増大は高度なアビディティーを有するｈｄｍ２反応性ＣＴＬの発現に起因している。両方のＣＴＬ系統とも、ｈｄｍ２  ８１−８８を担持したＴ２細胞が効率的に溶解されたことからペプチド特異的であったのに対し、未担持または無関連ペプチドＦｌｕ  Ｍ１  ５８−６６を担持したＴ２標的細胞は認識されなかった（図５ＢおよびＣ）。しかしながら、Ｆｌｕ  Ｍ１  ５８−６６提示Ｔ２細胞はＦｌｕ  Ｍ１  ５８−６６に対する特異性を有するＣＤ８ｘＡ２ＫｂＴ細胞集団により溶解された（図示せず）。更にまた、マウスのＡ２．１陰性ｈｄｍ２  ８１−８８担持ＥＬ４細胞（Ｈ−２ｂ）では細胞溶解活性は全く観察されなかったことから、ｈｄｍ２  ８１−８８反応性ＣＴＬ系統はＡ２．１制限性であった。
【００６２】
最終結果において、ｈｄｍ２  ８１−８８に対して特異的な高度なアビディティーを有するＡ２．１制限ＣＴＬ集団が発生された。
【実施例３】
【００６３】
実施例３：ｈｄｍ２トランスフェクト細胞系統の特性化
ペプチドｈｄｍ２  ８１−８８が実際に内因性にプロセシングされｈｄｍ２過剰発現腫瘍細胞のＡ２．１分子の範囲において提示されたかどうかを調べるために、種々のｈｄｍ２陰性（Ｓａｏｓ−２、ＥＬ４）またはｈｄｍ２低発現（ＳＷ４８０）腫瘍細胞系統をｈｄｍ２遺伝子でトランスフェクトした（Ｏｌｉｎｅｒ等、１９９２）。得られたｈｄｍ２過剰発現トランスフェクト体のｈｄｍ２  ８１−８８特異的ＣＴＬによる認識はペプチドｈｄｍ２  ８１−８８の内因性生産の指標である。
【００６４】
ｈｄｍ２遺伝子によるトランスフェクションのために、腫瘍細胞系統Ｓａｏｓ−２、ＳＷ４８０およびＥＬ４（Ｈ−２ｂ）を選択した。Ｓａｏｓ−２はｐ５３欠損Ａ２．１陽性骨肉腫系統であり、ｐ５３がｈｄｍ２遺伝子の転写活性化物質であるためｈｄｍ２の有意な内因性発現はＳａｏｓ−２内では予測されないことから、ｈｄｍ２トランスフェクションに特に適している。ＳＷ４８０はＡ２．１陽性結腸癌腫系統であり少量のｈｄｍ２蛋白を発現する。ＥＬ４はｈｄｍ２発現の欠損したマウスのＡ２．１陰性の胸腺腫系統である。
【００６５】
ｈｄｍ２蛋白およびネオマイシン耐性をコードするプラスミドｐＣＨＤＭＩＡで細胞系統Ｓａｏｓ−２をリポフェクションすることにより（図２６）、ＣＭＶプロモーターの制御下で構成的にｈｄｍ２を過剰発現するトランスフェクト体を発生させた。ｈｄｍ２は主に核に存在することから、核抽出液を細胞から調製した。抽出液をゲル電気泳動により分離し、膜に移し、抗ｈｄｍ２抗体で標識し、最後に化学ルミネセンスにより可視化した。図６に示すウエスタンブロットはｈｄｍ２トランスフェクト体Ｓａｏｓ−２／ｃｌ５およびＳａｏｓ−２／ｃｌ６のｈｄｍ２蛋白発現を示している。９０ｋＤａでは明らかな、そして、７５ｋＤａでは弱い蛋白のバンドが認められるが（矢印）、親のＳａｏｓ−２細胞は予測された通りｈｄｍ２蛋白は発現しなかった。９０ｋＤａの蛋白は４９１アミノ酸の完全長ｈｄｍ２産物である（Ｏｌｉｎｅｒ等、１９９２参照）が、７５ｋＤａの産物は塩基１５８−６６７の欠失を有するｈｄｍ２−ｍＲＮＡ「スプライス」変異体から翻訳された（Ｓｉｇａｌａｓ等、１９９６）。陽性対照として使用したｐｒｅ−Ｂ  ＡＬＬ細胞系統ＥＵ−３（Ｚｈｏｕ等、１９９５）は９０ｋＤａおよび７５ｋＤａの蛋白の両方の極めて強い発現を示した。
【００６６】
ｈｄｍ２ペプチドの効果的提示のためには、とりわけ十分なＡ２の発現が必須となる。ｈｄｍ２トランスフェクト体のフローサイトメトリー分析では親のＳａｏｓ−２細胞と比較して有意ではない程度にのみ、より強力であるＳａｏｓ−２／ｃｌ５および６の同等のＡ２発現が認められた（図７）。
【００６７】
マウスのＥＬ４細胞をエレクトロポレーションにより、Ａ２．１分子をコードするプラスミドｐＳＶ２Ａ２（図２７）（Ｔｈｅｏｂａｌｄ等、１９９５）、および、ｐＣＨＤＭＩＡで同時トランスフェクトした。図６はｈｄｍ２陰性ＥＡ２細胞とは対照的にＡ２．１陽性トランスフェクト体ＥＡ２／ｃｌ１３による９０ｋＤａの完全長ｈｄｍ２蛋白の有意な発現を示している。両トランスフェクト体とも、そのＡ２．１発現に関しては同等であった（データ示さず）。更にまた、ウエスタンブロットにおいて当初は生成クローンＳＷ４８０／ｃｌ２および親細胞のｈｄｍ２発現に有意差が認められなかったものの僅かにのみｈｄｍ２を発現したｐＣＨＤＭＩＡで結腸癌腫系統ＳＷ４８０をリポフェクションした（データ示さず）。
【実施例４】
【００６８】
実施例４：ｈｄｍ２  ８１−８８特異的ＣＴＬによるｈｄｍ２トランスフェクト体の認識
ペプチドｈｄｍ２  ８１−８８の天然のプロセシングおよびＡ２．１提示を確認するために、ｈｄｍ２トランスフェクト体のＡ２．１制限ｈｄｍ２  ８１−８８特異的ＣＴＬによるその認識について試験した。Ｓａｏｓ−２トランスフェクト体Ｓａｏｓ−２／ｃｌ５および６はｈｄｍ２反応性ＣＴＬ  Ａ２およびＣＤ８ｘＡ２Ｋｂ８１により効率的に細胞溶解されたのに対し、親株Ｓａｏｓ−２系統は認識されず、そして、その結果溶解されなかった（図８）。トランスフェクト体の細胞溶解は抗Ａ２．１モノクローナル抗体ＰＡ２．１により抑制することが可能であり、これは、ｈｄｍ２反応性ＣＴＬのＡ２．１制限を更に裏付けるものである。既に説明した通り、ＣＴＬ  ＣＤ８ｘＡ２Ｋｂ８１はやはり内因性認識においてＣＴＬ  Ａ２  ８１よりも高い標的細胞溶解を示し、これは恐らくはＣＤ８媒介のアビディティー増大によるものと考えられた。ＣＴＬ細胞系統ＣＤ８アロＡ２を陽性対照として用いた。ｈｄｍ２トランスフェクト体と親細胞は双方ともアロＡ２．１反応性エフェクター細胞により溶解された（図８）。これらのアロ反応性ＣＴＬはペプチド特異的、即ち、（プロセシングされた）自己ペプチド（ただしシグナルペプチドではない）の範囲においてのみＡ２．１分子を認識したため（結果は示さず）、ここでは例えば検討した細胞の輸送システムにおける何らかの欠損はある程度は除外できる。試験した細胞系統の何れも溶解しなかったＡ２．１制限ＣＴＬ系統ＣＤ８ｘＡ２Ｋｂ  Ｆｌｕ  Ｍ１は陰性対照として機能した（図８）。
【００６９】
ｈｄｍ２トランスフェクト体ＥＡ２／ｃｌ１３およびＳＷ４８０／ｃｌ２の認識を図９および１０に示す。ｈｄｍ２  ８１−８８特異的ＣＴＬによるこれらの標的細胞の溶解は、Ｓａｏｓ−２／ｃｌ５および６と比較して低効率であったものの、ブロック可能であった。親細胞系統は、予測された通り、ｈｄｍ２反応性ＣＴＬにより認識されなかった（図９および１０）。アロＡ２．１反応性ＣＴＬは供試された標的細胞の全てを溶解したが、Ｆｌｕ  Ｍ１特異的ＣＴＬは何れも溶解しなかった（図９および１０）。ＳＷ４８０／ｃｌ２の場合はウエスタンブロットにおけるｈｄｍ２の過剰発現はＳＷ４８０と比較して検出不可能であったが、ＳＷ４８０／ｃｌ２はＣＴＬ  ＣＤ８ｘＡ２Ｋｂ８１により有意に溶解され、このことは細胞毒性試験の比較的高い感受性と合致していた。更にまた、ＳＷ４８０／ｃｌ２細胞の特異的ペプチドＭＨＣ複合体の数がＳＷ４８０の細胞の物より大きいことが解かるが、これは、ＳＷ４８０／ｃｌ２が親細胞系統よりもアロＡ２．１反応性Ｔ細胞に対してより高感受性であったためである（図１０）。
【００７０】
これらの実験で使用した全てのｈｄｍ２トランスフェクト体をｐＣＨＤＭＩＡ発現プラスミドでトランスフェクトした（図２６）。これはｈｄｍ２蛋白、更には選択マーカーとして機能するネオマイシン耐性をコードしている。ペプチドｈｄｍ２  ８１−８８は内因性にプロセシングされ、Ａ２．１の範囲内に提示され、即ち、ｈｄｍ２反応性ＣＴＬのエピトープを提示したことが明らかに推察できた。しかしながらこれらのＣＴＬは集団であるため、ネオマイシン耐性からプロセシングされるペプチドに対する特異性を有するＴ細胞のサブ集団の存在が、特に、ＣＴＬの再刺激がネオマイシン耐性トランスフェクト体で起こったことからも、排除できなかった。しかしながら、ｈｄｍ２トランスフェクト体と同様、やはりネオマイシン耐性を発現するＥＡ２およびＥＡ２Ｋｂ対照に認識が見られなかったことは、ネオマイシン耐性に対する特異性を有する潜在的サブ集団によるｈｄｍ２トランスフェクト体の細胞溶解に反論するものである。更にまた、例えばＣＴＬ集団ＣＤ８ｘＡ２Ｋｂ８１から単離されているＣＴＬクローン３を用いた場合、標的細胞としてのｈｄｍ２トランスフェクト体で同等の細胞毒性データが得られた（データ示さず）。一般的にＣＴＬクローンは厳密にペプチド特異的であるため、ｈｄｍ２トランスフェクト体で観察された細胞溶解はｈｄｍ２  ８１−８８特異的認識に起因するものである。
【００７１】
Ｔ細胞エピトープとしてのｈｄｍ２  ８１−８８の更に明確な指標は種々のｈｄｍ２過剰発現腫瘍細胞の細胞溶解（実施例６参照）であるが、それとは対照的に、Ｓａｏｓ−２細胞は検出可能なｈｄｍ２発現を示して折らず、認識されていない。従って、ｈｄｍ２  ８１−８８オリゴペプチドもまた他のプロセシングされた自己蛋白のエピトープではない。
【００７２】
ここで明らかにされた結果は、ｈｄｍ２  ８１−８８ペプチドが実際に内因性にプロセシングされ、そして、Ａ２．１の範囲内に提示されるという事実を裏付けている。
【実施例５】
【００７３】
実施例５：天然のＡ２．１提示ｈｄｍ２ＣＴＬエピトープとの合成ペプチドｈｄｍ２  ８１−８８の同一性の説明
天然のＡ２．１提示ＣＴＬエピトープがｈｄｍ２  ８１−８８特異的ＣＴＬおよび合成ペプチドｈｄｍ２  ８１−８８に対して同一であることを説明するために、天然のペプチドを酸処理によりＭＨＣクラスＩ分子より抽出した（Ｌｕｓｔｇａｒｔｅｎ等、１９９７）。次に濃縮され精製されたペプチド抽出液および合成のｈｄｍ２  ８１−８８ペプチドを更にＨＰＬＣで精製した。得られた個々の天然または合成のＨＰＬＣ画分をＴ２細胞に担持させ、その認識をｈｄｍ２  ８１−８８特異的ＣＴＬにより試験した（Ｌｕｓｔｇａｒｔｅｎ等、１９９７）。図１１はＣＴＬ  ＣＤ８ｘＡ２Ｋｂ８１を用いた、保持時間の関数としての、Ｓａｏｓ−２／ｃｌ６の天然のペプチド抽出液のそれぞれのＨＰＬＣ画分の認識を示している。
【００７４】
ＣＴＬ細胞溶解は天然ペプチド抽出液のＨＰＬＣ画分２１から回復させた。同等の結果がＣＴＬ  Ａ２  ８１とＣＴＬクローン３  ＣＤ８ｘＡ２Ｋｂ８１で得られた。ＨＰＬＣ分画合成ペプチドｈｄｍ２  ８１−８８のＣＴＬ細胞溶解は、天然ペプチド抽出液の抗原画分２１と比較して同一の保持時間を有していた画分２１により回復した（図１１）。ＨＰＬＣのプロファイルにおいて、合成ペプチドはやはり画分２１に溶出しており、このことは観察された細胞溶解活性はｈｄｍ２  ８１−８８単独の特異的認識に起因するものであることを証明している。
【００７５】
認識されたＴ細胞エピトープがペプチドｈｄｍ２  ８０−８８により提示されること、および、認識が交差反応性に基づいているものであることを排除するために、合成および９０％までの純度のペプチドｈｄｍ２  ８０−８８を更にＨＰＬＣにより精製した。得られたＨＰＬＣ画分のＴ細胞認識は２つの「ピーク」を示し、第１のものはｈｄｍ２  ８１−８８と比較して実質的に同一の保持時間を有する画分２１にあり、第２のものは画分２３にあった（データ示さず）。第１の「ピーク」は、質量スペクトル分析によれば合成の分解生成物ｈｄｍ２  ８１−８８によるｈｄｍ２  ８０−８８の汚染に基づくものであり、第２の「ピーク」はｈｄｍ２  ８１−８８特異的ＣＴＬとｈｄｍ２  ８０−８８との交差反応性に起因するものであった。しかしながら天然のペプチド抽出液のＨＰＬＣ画分においては、細胞溶解は画分２１にのみ起こり、これは合成ペプチドｈｄｍ２  ８１−８８の認識画分と同じ保持時間を有していた。画分２３には細胞溶解は検出されなかった。しかしながら交叉反応性のために、ｈｄｍ２  ８０−８８が天然に存在する場合は、やはり画分２３において細胞溶解が起こっていたはずである。
【００７６】
これらの結果は天然にプロセシングされたＡ２．１提示ＣＴＬエピトープは実際にはペプチドｈｄｍ２  ８１−８８であるという事実を裏付けている。
【実施例６】
【００７７】
実施例６：ヒト腫瘍細胞の特異的認識および細胞溶解のためのｈｄｍ２  ８１−８８特異的ＣＴＬの使用
（６．１）ヒト腫瘍細胞系統のｈｄｍ２蛋白発現
ｈｄｍ２  ８１−８８特異的ＣＴＬがｈｄｍ２トランスフェクト体のみならず、非トランスフェクトＡ２陽性腫瘍細胞系統も効率的に溶解することを説明するために、ｈｄｍ２蛋白ではなくｈｄｍ２−ｍＲＮＡの過剰発現が知られているＡＬＬの細胞系統を用いた（Ｚｈｏｕ等、１９９５参照）。ｈｄｍ２蛋白の過剰発現に加えて、Ａ２の存在はＣＴＬ認識に必須であるため、これらの細胞系統を先ずフローサイトメトリーで分析した。１３種の検討したＡＬＬ細胞系統の内、２種がＡ２陽性であり、１種がＡ２．２４陽性であった（データ示さず）。これらの２種のＡＬＬ系統および３種の別のＡ２陽性ＡＬＬ、リンパ腫および形質細胞腫の系統のうち、ウエスタンブロットを行なったが、その理由は、ペプチド提示のためには、最終分析において、とりわけ、ｈｄｍ２−ｍＲＮＡではなくｈｄｍ２蛋白の過剰発現が重要であるためである。図１２において、種々のＡ２陽性ヒト腫瘍細胞系統のｈｄｍ２蛋白の発現を示す。全ての検査した白血病系統および１種のリンパ腫および１種の形質細胞腫系統が９０ｋＤａの完全長ｈｄｍ２産物を過剰発現した。ｈｄｍ２の７５ｋＤａの「スプライス」変異体も同様にこれらの細胞系統により認識可能な量で生産された。
【００７８】
３種のＡ２陰性ＡＬＬ細胞系統のｈｄｍ２蛋白発現を図１３に示す。ここでもまた蛋白発現のデータは、ここで調べた全てのＡＬＬ細胞系統の場合、転写後の機序は明らかにｈｄｍ２過剰発現の基礎を構成していないという点において、ｍＲＮＡ発現のデータと合致している（Ｚｈｏｕ等、１９９５参照）。例外はｈｄｍ２−ｍＲＮＡの発現が弱いかまったくないことが報告されているｐｒｅ−Ｂ  ＡＬＬ細胞系統ＥＵ−６およびＥＵ−８である（Ｚｈｏｕ等、１９９５参照）。しかしながらこれらの細胞系統はウエスタンブロットでは強い、あるいは中等度のｈｄｍ２蛋白発現を示す（データ示さず）。
【００７９】
（６．２）ｈｄｍ２  ８１−８８特異的ＣＴＬによるｈｄｍ２過剰発現Ａ２陽性腫瘍細胞系統の認識
図１２のｈｄｍ２蛋白過剰発現Ａ２陽性の腫瘍細胞系統を以下においてｈｄｍ２  ８１−８８特異的ＣＴＬの標的細胞として用いる事により、ｈｄｍ２トランスフェクトのみならず非トランスフェクトの腫瘍細胞も効率的に溶解されることを明らかにした。
【００８０】
ｈｄｍ２ではなく突然変異ｐ５３によりトランスフェクトされたＳａｏｓ−２／１４３細胞（Ｔｈｅｏｂａｌｄ等、１９９５）はＣＴＬ  ＣＤ８ｘＡ２Ｋｂ８１の親Ｓａｏｓ−２細胞とは対照的に認識された（図１４）。ＩＦＮ−γ（２０ｎｇ／ｍｌ）を標的細胞に２０時間予備投与することにより細胞溶解を増進すること、および、ＰＡ２．１を添加することによりこれを抑制することが可能であった。陽性対照として使用したアロＡ２反応性ＣＴＬによる未投与Ｓａｏｓ−２およびＳａｏｓ−２／１４３細胞の認識は同等であり、ＩＦＮ−γ投与Ｓａｏｓ−２／１４３細胞の認識は未投与のものより良好であった（図１４）。ＩＦＮ−γ投与細胞で細胞溶解が改善されていた理由は、とりわけ、ＭＨＣペプチド複合体および付着分子の発現の増大であった。しかしながら、Ｆｌｕ  Ｍ１  ５８−６６特異的陰性対照ＣＴＬＣＤ８ｘＡ２ＫｂＦｌｕ  Ｍ１では細胞溶解は観察されなかった。
【００８１】
ｈｄｍ２反応性ＣＴＬによるｈｄｍ２過剰発現Ａ２陽性Ｂ−ＡＬＬ細胞系統の認識を以下の通り検討した。細胞系統ＥＵ−３はＣＴＬ  Ａ２およびＣＤ８ｘＡ２Ｋｂ８１、ＣＴＬ  ＣＤ８ｘＡ２Ｋｂ８１により認識され、３０：１のＥ：Ｔ比において１００％細胞溶解が達成された（図１５）。両方のＣＬＴ系統による細胞溶解はＰＡ２．１により完全にブロックされた。これらの実験において、主にインビトロで発生され、従ってＣＴＬ系統ＣＤ８アロＡ２よりも低い効率の認識を示したアロＡ２．１反応性Ｔ細胞は、陽性対照として機能した。ＥＵ−３とは異なり、ＣＴＬ系統ＣＤ８ｘＡ２Ｋｂ  Ｆｌｕ  Ｍ１の部分においては細胞溶解活性は観察されなかった。ＣＴＬ  ＣＤ８ｘＡ２Ｋｂ８１の標的細胞としてのｐｒｅ−Ｂ−ＡＬＬ細胞系統ＵｏＣ−Ｂ１１およびＢＶ１７３では同等の結果が得られた（図１６）。僅か０．３：１のＥ：Ｔ比において、両方の細胞系統は５０％より高度に溶解された。ここでもまたＰＡ２．１を用いて認識の完全な抑制を達成することができた。アロ反応性ＣＴＬによるＵｏＣ−Ｂ１１の細胞溶解はＢＶ１７３の場合の少なくとも２倍であったが、これは、同等のｈｄｍ２発現の場合においては（図１２参照）、ｈｄｍ２特異的認識の水準に対して作用を有さなかった（図１６）。明らかに、ＣＴＬ  ＣＤ８ｘＡ２Ｋｂ８１に関しては、ペプチド：ＭＨＣクラスＩ複合体の量は限定要因ではなかった。これらの細胞系統はＦｌｕ  Ｍ１特異的Ｔ細胞に感受性ではなかった。細胞系統ＯＰＭ−２（形質細胞腫）およびＵ−９３７（組織球性リンパ腫）は同様に選択的に溶解された（図１７）。
【００８２】
上記所見によれば、内因性にｈｄｍ２を過剰発現したｈｄｍ２  ８１−８８Ａ２陽性腫瘍細胞に対する特異性を有するＣＴＬは、特異的に、Ａ２制限的に、そして、効率的に認識し細胞溶解した。
【００８３】
（６．３）Ａ２陰性ｈｄｍ２過剰発現腫瘍細胞系統はＡ２制限ｈｄｍ２反応性ＣＴＬにより溶解されない。
【００８４】
ｈｄｍ２  ８１−８８特異的ＣＴＬによるＡ２陽性腫瘍細胞系統の認識を確認するために、ｈｄｍ２を過剰発現することが解かっている細胞系統を用いたが（図１３参照）、フローサイトメトリー分析においてＡ２表現型は観察されなかった（データ示さず）。ｐｒｅ−Ｂ  ＡＬＬ細胞系統ＵｏＣ−Ｂ４、ＥＵ−１およびＳＵＰ−Ｂ１５はＣＴＬ  ＣＤ８ｘＡ２Ｋｂ８１およびアロＡ２．１反応性ＣＴＬにより溶解されなかった（図１８）。Ａ２陽性ＥＵ−３細胞はこれらのＣＴＬ系統の部分で効率的に認識された。しかしながらＦｌｕ  Ｍ１特異的ＣＴＬでは細胞溶解は観察されなかった。
【００８５】
これらの実験およびその結果は、ｈｄｍ２過剰発現腫瘍細胞の認識はＡ２制限的に起こり、Ａ２陽性腫瘍細胞の観察された溶解は天然またはリンホカイン活性化キラー細胞により媒介されるということは排除できることを示している。
【実施例７】
【００８６】
実施例７：ヒト腫瘍細胞の選択的認識および溶解のためのｈｄｍ２  ８１−８８特異的ＣＴＬの使用
（７．１）リンパ造血起源の形質転換、活性化または静止期細胞のｈｄｍ２蛋白発現
潜在的なｈｄｍ２特異的ＣＴＬ媒介の免疫療法のためには、正常細胞が溶解されないことが望ましい。ｈｄｍ２腫瘍蛋白は悪性の血液学的疾患において過剰発現され（実施例６（６．１）参照）、そして、知られているとおり、一部の正常細胞によっても発現され、そのうちにはリンパ造血細胞も含まれる。
【００８７】
図１９において種々の形質転換および活性化状態のリンパ造血細胞のｈｄｍ２蛋白発現を示す。ＥＢＶ形質転換リンパ芽球様細胞系統（ＬＣＬ）ＬＧ−２は極めて強いｈｄｍ２蛋白発現を示した。ＰＨＡ−およびＣｏｎＡ−形質転換芽球は有意に低値であるがなおかなりの量のｈｄｍ２蛋白を発現した。比較のために、非形質転換の正常細胞のｈｄｍ２蛋白の発現をこれらの形質転換されたＢ−およびＴ細胞の芽球に並列させた。抗原活性化チロシナーゼ３６９−３７７特異的Ｔ細胞クローンＩＶＳＢの場合（Ｗｏｌｆｅｌ等、１９９４）、ウエスタンブロットではｈｄｍ２蛋白は検出されなかった（図１９）。更にまた、静止期のＴ細胞、Ｂ細胞およびＰＢＭＣのｈｄｍ２蛋白発現も調べた。これらの細胞においても、ｈｄｍ２蛋白は検出されなかった。
【００８８】
（７．２）リンパ造血起源の形質転換、活性化または静止期細胞に対するｈｄｍ２  ８１−８８特異的ＣＴＬの細胞溶解反応性
形質転換された、および、非形質転換のリンパ造血細胞を以下において、ｈｄｍ２  ８１−８８に対する特異性を有するＡ２制限ＣＴＬの標的細胞として使用した。Ａ２陽性ＥＢＶ形質転換ＬＣＬ  ＬＧ−２およびＡ２陽性ＰＨＡ−およびＣｏｎＡ−形質転換芽球はＣＴＬ  ＣＤ８ｘＡ２Ｋｂ８１により効率的に溶解された（図２０）。これらの細胞毒性データはｈｄｍ２蛋白発現のデータと合致していた（図１９参照）。細胞溶解は、それが抗Ａ２．１モノクローナル抗体ＰＡ２．１でほぼ完全にブロックすることが可能であったことから、Ａ２制限的であった。陽性対照として使用したアロＡ２．１反応性ＣＴＬは全ての３細胞型を認識したが、陰性対照として機能したＦｌｕ  Ｍ１特異的ＣＴＬでは細胞溶解は観察されなかった。
【００８９】
完全に発達した樹状細胞（ＤＣ）はＭＨＣクラスＩおよびＩＩ、同時刺激性および付着性の分子を発現し、従って、ＣＴＬのための抗原提示細胞として特に適している。これらの成熟したＤＣはＣＴＬ  Ａ２およびＣＤ８ｘＡ２Ｋｂ８１により十分に認識されない（図２１）。外因性ペプチドｈｄｍ２  ８１−８８をＤＣに担持させた後、ＣＴＬ細胞溶解が回復された。更にアロＡ２．１反応性ＣＴＬの部分に対する細胞溶解活性が見られたため、Ａ２発現における潜在的な欠損の可能性は排除できた。Ｆｌｕ  Ｍ１特異的ＣＴＬによる認識は無かった。
【００９０】
結果は成熟したＤＣが検出可能なｈｄｍ２蛋白を発現しないという事実を裏付けている。
【００９１】
形質転換されたＥＢＶ−ＬＣＬ、ＰＨＡ−およびＣｏｎＡ−芽球とは対照的に成熟したＤＣおよび抗原活性化Ｔ細胞は形質転換されないが、特異的に活性化される。抗原活性化ＣＴＬの例として、チロシナーゼ特異的Ａ２．１陽性クローンＩＶＳＢ（Ｗｏｌｆｅｌ等、１９９４）をｈｄｍ２  ８１−８８に対する特異性を有するＣＴＬのための標的細胞として使用した（図２２）。ＤＣの場合と同様、十分な細胞溶解は認められず、外因性ペプチドｈｄｍ２  ８１−８８を用いてＣＴＬ細胞溶解を再構成することが可能であった。アロＡ２．１反応性ペプチド特異的ＣＴＬ  ＣＤ８アロＡ２は、ＩＶＳＢの細胞溶解とともに、標的細胞の十分なＡ２発現のみならず、その厳密なペプチド依存性のために（データ示さず）、機能的抗原のプロセシングおよび提示も示した。実際、ＣＴＬ  ＣＤ８アロＡ２はＡ２分子自体は認識しなかったが、外因的にプロセシングされた細胞内自己ペプチドの状態のみを認識した。
【００９２】
単離方法によりリンパ造血起源の静止細胞が活性化されることを排除するために、静止期のＴおよびＢ細胞のｈｄｍ２反応性ＣＴＬに対する感受性を調べた。Ｔ細胞（図２３）およびＢ細胞（図２４）の何れも、ｈｄｍ２反応性ＣＴＬにより認識されなかった。同様に、静止期のＰＢＭＣに対する細胞溶解活性も観察されなかった（図２５）。全ての３細胞型の場合、十分なＡ２発現を確認する外因性ペプチドｈｄｍ２  ８１−８８によるＣＴＬ認識の回復が可能であった。標的細胞が外因性自己ペプチドをプロセシングし、提示する能力は、ペプチド依存性ＣＴＬ  ＣＤ８アロＡ２によるその細胞溶解を用いて確認した。ＣＴＬ  ＣＤ８ｘＡ２Ｋｂ  Ｆｌｕ  Ｍ１の部分に対しては溶解活性は観察されなかった。
【実施例８】
【００９３】
実施例８：本発明のオリゴペプチドｈｄｍ２  ８１−８８に対して特異的なＡ２．１制限Ｔ細胞受容体の調製
Ａ２．１トランスジェニックマウスを本発明のオリゴペプチドｈｄｍ２  ８１−８８で免疫化する。１０日後、脾臓を摘出する。脾細胞を、本発明のオリゴペプチドを担持させた予め調製したＡ２．１陽性抗原提示細胞を用いてインビトロ刺激する。これらの２．１陽性抗原提示細胞の調製は当該分野でよく知られており当業者のよく知る技術を用いて行う。何週間か培養した後、Ｔ細胞のペプチドと腫瘍の認識、ペプチド特異性およびＡ２．１制限について調べる。試験が良好に行なえたら、Ｔ細胞をクローニングする。得られたＴ細胞のクローンを再度、ペプチドおよび腫瘍の認識、ペプチド特異性およびＡ２．１制限について試験する。
【００９４】
陽性試験結果を有するＴ細胞クローンの全ｍＲＮＡを調製する。ＲＴ−ＰＣＲによりＴ細胞受容体αおよびβ鎖を増幅する。それぞれの鎖をまず細菌プラスミドにクローニングし、配列決定する。相同ヒト領域により定常マウス領域を置きかえることにより鎖を部分的にヒト化する。次に得られたコンストラクトの適当なレトロウィルスベクターへのクローニングを行なう。
【００９５】
腫瘍または白血病細胞がｈｄｍ２蛋白を過剰発現しているＡ２．１陽性癌患者の末梢血液リンパ球を採取し、Ｔ細胞受容体のαおよびβ鎖のベクターを用いてインビトロで形質導入し、遺伝子の発現を蛋白レベルで調べる。Ｔ細胞受容体発現Ｔリンパ球の腫瘍細胞溶解能力を分析する。試験が良好に行なえた後、遺伝子修飾リンパ球を患者に移入し、変性した細胞の破壊をもたらし、回復させる。
【００９６】
Bradford M. M. (1976).  A rapid and sensitive method for the quantitation ofmicrogram quantities of protein utilizing the principal of protein-dye binding.  Anal. Biochem. 72, 248-254.
Dittmer D., Pati S., Zambetti G., Chu S., Teresky A. K., Moore M., Finlay C., Levine A. J. (1993). Gain of functions mutations in p53. Nat. Genet. 4, 42-46.
Irwin M. J., Heath W. R,, Sherman L. A. (1989). Species-restricted interactions between CD8 and the a3 domain of class I influence the magnitude of the xenogeneic response. J. Exp. Med.179, 1091-1101.
Jonuleit H., Kuhn U., Muller G., Steinbrink K., Paragnik L., Schnitt E., Knop J., Enk A.H. (1997).  Pro-inflammatory cytokines and prostaglandins induce maturation of potent immunostimulatory dendritic cells under fetal calf serum-free conditions. Eur. J. Immunol. 27, 3135-3142.
Lustgarten J., Theobald M., Labadie C., LaFace D., Peterson P., Disis M. L., Cheever M. A., Sherman L. A. (1997).  Identification of Her-2/neu CTL epitopes using double transgenic mice expressing HLA-A2.1 and human CD8.  Human Immunol. 52, 109-118.
Meziere, C., Viguier M., Dumortier H., Lo-Man R., Leclerc C., Guillet J. G., Briand J. P., Muller S. (1997), In vivo T helper cell response to retro-inverso peptidomimetics. J. Immunol. 159 (7), 3230-3237.
Oliner J. D., Kinzler K. W., Meltzer P. S., George D. L., Vogelstein B. (1992).  Amplification of a gene encoding a p53-associated protein in human sarcomas.  Nature 358, 80-83.
Parker K. C., Bednarek M. A., Coligan J. E. (1994).  Scheme for ranking potential HLA-A2 binding peptides based on independent binding of individual peptide side-chains. J. Immunol. 152, 163-175.
Salter R. D., Cresswell P. (1986).  Impaired assembly and transport of HLA-A and -B antigens in a mutant TxB cell hybrid EMBO J. 5, 943-949.
Sigalas I., Calvert H. A., Anderson J. J., Neal D. E., Lunec J. (1996).
Alternatively spliced mdm2 transcripts with loss of p53 binding domain sequences: Transforming ability and frequent detection in human cancers.
Nat. Med. 2, 912-917.
Theobald M., Biggs J., Dittmer D., Levine A. J., Sherman L.A. (1995).
Targeting p53 as a general tumor antigen. Proc. Natl. Acad. Sci USA 92, 11993-11997.
Theobald M., Ruppert T., Kuckelkorn U., Hernandez J., Haubler A., Antunes Ferreira E., Liewer U., Biggs J., Levine A. J., Huber C., Koszinowski U. H., Kloetzel P. -M., Sherman L. A (1998).  The sequence alternation associated with a mutational hotspot in p53 protects cells from lysis by cytotoxic T lymphocytes specific for a flanking peptide epitope. J. Exp. Med. 188, 1017-1028.
Wolfel T., Van Pel A., Brichard V., Schneider J., Seliger B., Meyer zum Buschenfelde K. H., Boon T. (1994).  Two tyrosinase nonapeptides recognized on HLA-A2 melanomas by autologous cytolytic T lymphocytes.  Eur. J. Immunol. 24, 759-764.
Wu X., Bayle H., Olson D., Levine A. J. (1993).  The p53-mdm-2 autoregulatory feedback loop.  Genes and Dev. 7, 1126-1132.
Zhou M., Yeager A.M., Smith S.D., Findley H.W. (1995).  Overexpression of the MDM2 gene by childhood acute lymphoblastic leukemia cells expressing the wild-type p53 gene.  Blood 85, 1608-1614.
【図面の簡単な説明】
【００９７】
図面は以下の通りである。
【図１】選択された合成ｈｄｍ２ペプチドの結合。相対的Ａ２．１結合親和性（％抑制として表示）はペプチドｐ５３  ２６４−２７２のＡ２．１結合を抑制する対応ペプチドの能力により求めた。これは種々の濃度のｈｄｍ２ペプチドによるｐ５３  ２６４−２７２担持ＥＡ２標的細胞のｐ５３特異的ＣＴＬ細胞溶解の抑制により測定した。ペプチドＦｌｕ  Ｍ１  ５８−６６およびＶＳＶ−Ｎ  ５２−５９に対する抑制値を７つの独立した実験から平均した。
【図２】Ａ２Ｋｂ−またはＣＤ８ｘＡ２Ｋｂ−トランスジェニックマウスにおける合成ｈｄｍ２ペプチドのＡ２．１制限免疫原性。免疫原性は４時間細胞毒性試験においてペプチド免疫化によりこれらのマウスにおいて誘発されたＣＴＬの細胞溶解活性により確認した。標的細胞として２μｇペプチド担持または未担持のＴ２Ａ２Ｋｂ細胞を用いた。平均４匹の免疫化されたマウスより得られた個々のＣＴＬ培養の代表的な特異的細胞溶解を示す。
【図３】Ａ２Ｋｂ−またはＣＤ８ｘＡ２Ｋｂ−トランスジェニックマウスにおける合成ｈｄｍ２ペプチドのＨ２ｂ−制限免疫原性。免疫原性は４時間細胞毒性試験においてペプチド免疫化によりこれらのマウスにおいて誘発されたＣＴＬの細胞溶解活性により確認した。標的細胞として２μｇペプチド担持または未担持のＥＬ４細胞を用いた。データは図２において選択されたＣＴＬ培養の特異的細胞溶解を示す。
【図４】Ａ２．１−およびＣＤ８ｘＡ２Ｋｂ−トランスジェニックマウスにおける合成ペプチドｈｄｍ２  ８１−８８の免疫原性。ｈｄｍ２  ８１−８８により免疫化されたこれらのマウスにおいて誘発されたＩ０  ＣＴＬ  Ａ２  ８１（●）およびＣＤ８ｘＡ２Ｋｂ８１（○）の細胞溶解活性を６時間細胞毒性試験において測定した。標的細胞は記載したペプチド濃度においてインキュベートされたＴ２細胞（Ａ）、Ｓａｏｓ−２細胞（▲）およびｈｄｍ２−トランスフェクトＳａｏｓ−２／ｃｌ  ６（△）である（Ｂ，Ｃ）。
【図５】ｈｄｍ２  ８１−８８特異的ＣＴＬ系統：ペプチド認識の効率、ペプチド特異性およびＡ２制限。Ａ２．１およびＣＤ８ｘＡ２Ｋｂ−トランスジェニックマウス由来のｈｄｍ２反応性ＣＴＬ系統Ａ２  ８１（●）およびＣＤ８ｘＡ２Ｋｂ８１（○）をｈｄｍ２  ８１−８８ペプチドで反復してインビトロ刺激することにより樹立し、４時間細胞毒性試験において調べた。標的細胞は記載したペプチド濃度においてインキュベートされたＴ２細胞（Ａ）、ｈｄｍ２  ８１−８８ペプチド担持（○）、Ｆｌｕ  Ｍ１  ５８−６６担持（■）および未担持（●）のＴ２標的細胞およびｈｄｍ２  ８１−８８担持（△）および未担持（▲）のＥＬ４細胞である（Ｂ，Ｃ）。
【図６】ｈｄｍ２トランスフェクト体のｈｄｍ２蛋白発現。ｈｄｍ２トランスフェクト体Ｓａｏｓ−２／ｃｌ５および６およびＥＡ２／ｃｌ  １３はＳａｏｓ−２およびＥＬ４細胞のトランスフェクションにより発生させた。これらの細胞の核抽出液を電気泳動により分離し、膜に移し、抗ｈｄｍ２抗体と共にインキュベートし、光化学的に可視化した。ＥＵ−３は陽性対照として機能した。矢印は９０ｋＤａの完全長ｈｄｍ２蛋白および７５ｋＤａのｈｄｍ２「スプライス」変異体である。
【図７】Ｓａｏｓ−２ｈｄｍ２トランスフェクト体、Ｓａｏｓ−２細胞およびｈｄｍ２トランスフェクトＳａｏｓ−２／ｃｌ５およびＳａｏｓ−２／ｃｌ６細胞のＡ２．１発現を抗体標識後のそのＡ２．１発現に関してＦＡＣＳにおいて分析した。抗Ａ２．１モノクローナル抗体ＢＢ７．２（Ａ２．１）または血清（ｂｋｇｄ）およびＦＩＴＣコンジュゲート２次抗体で染色した細胞の蛍光強度を示す。蛍光強度はＡ２．１発現として示される。
【図８】Ｓａｏｓ−２ｈｄｍ２トランスフェクト体のＣＴＬ認識。Ａ２．１制限およびｈｄｍ２  ８１−８８特異的なＣＴＬ  Ａ２およびＣＤ８ｘＡ２Ｋｂ８１およびアロＡ２．１反応性ＣＴＬ  ＣＤ８アロＡ２およびＦｌｕ  Ｍ１  ５８−６６特異的ＣＴＬ  ＣＤ８ｘＡ２Ｋｂ  Ｆｌｕ  Ｍ１を以下の標的細胞、即ち、Ｓａｏｓ−２（●）、ｈｄｍ２トランスフェクトＳａｏｓ−２／ｃｌ５（▲）およびＳａｏｓ−２／ｃｌ６（■）に対して６時間細胞毒性試験において記載したＥ：Ｔ比のもと、エフェクター細胞として試験した。全ての標的細胞には示されるとおり抗Ａ２．１モノクローナル抗体ＰＡ２．１を投与した（○、△、□）。
【図９】ＥＡ２  ｈｄｍ２  トランスフェクト体のＣＴＬ認識。ＣＴＬ  Ａ２  ８１、ＣＴＬ  ＣＤ８ｘＡ２Ｋｂ８１、ＣＴＬ  ＣＤ８  アロＡ２およびＣＴＬ  ＣＤ８ｘＡ２Ｋｂ  Ｆｌｕ  Ｍ１を以下の標的細胞、即ち、Ａ２．１トランスフェクトしたＥＬ４細胞（ＥＡ２）（●）および更にｈｄｍ２遺伝子で同時トランスフェクトしたＥＡ２細胞（ＥＡ２／ｃｌ  １３）（▲）に対して６時間細胞毒性試験において記載したＥ：Ｔ比のもと、エフェクター細胞として試験した。標的細胞には示されるとおり抗Ａ２．１モノクローナル抗体ＰＡ２．１を投与した（○、△）。
【図１０】ＳＷ４８０  ｈｄｍ２トランスフェクト体のＣＴＬ認識。ＣＴＬ  ＣＤ８ｘＡ２Ｋｂ８１、ＣＴＬ  ＣＤ８  アロＡ２およびＣＴＬ  ＣＤ８ｘＡ２Ｋｂ  Ｆｌｕ  Ｍ１を以下の標的細胞、即ち、ＳＷ４８Ｏ細胞（ＳＷ４８Ｏ）（●）およびｈｄｍ２トランスフェクトＳＷ４８Ｏ細胞（ＳＷ４８Ｏ／ｃｌ２）（▲）に対して６時間細胞毒性試験において記載したＥ：Ｔ比のもと、エフェクター細胞として試験した。標的細胞には示されるとおり抗Ａ２．１モノクローナル抗体ＰＡ２．１を投与した（○、△）。
【図１１】ペプチドｈｄｍ２  ８１−８８はｈｄｍ２反応性ＣＴＬの天然のＡ２．１提示エピトープである。Ｓａｏｓ−２／ｃｌ６のＭＨＣクラスＩ分子由来の天然のペプチド抽出液および合成のｈｄｍ２  ８１−８８ペプチドをＨＰＬＣ分画し、個々のＨＰＬＣ画分を５１Ｃｒ標識Ｔ２標的細胞と共に４５分間無血清条件下でインキュベートした。担持Ｔ２細胞を２０：１のＥ：Ｔ比においてＣＴＬＣＤ８ｘＡ２Ｋｂ８１を用いた６時間の細胞毒性試験に付した。ＨＰＬＣの特徴（２１４ｎｍにおける吸光度）および個々のＨＰＬＣ画分を担持したＴ２標的細胞の特異的細胞溶解（棒グラフ）を保持時間の関数として示す。
【図１２】ヒトＡ２陽性腫瘍細胞系統のｈｄｍ２蛋白発現。ＥＵ−３、ＵｏＣ−Ｂ１１およびＢＶ１７３（ｐｒｅ−Ｂ−ＡＬＬ）およびＵ−９３７（組織球性リンパ腫）およびＯＰＭ−２（形質細胞腫）の核抽出液を調製し、ゲル電気泳動で分離し、膜に移し、抗ｈｄｍ２抗体と共にインキュベートし、光化学的に可視化した。矢印は９０ｋＤａの完全長ｈｄｍ２蛋白および７５ｋＤａのｈｄｍ２「スプライス」変異体である。
【図１３】ヒトＡ２陰性腫瘍細胞系統のｈｄｍ２蛋白発現。Ｂ−ＡＬＬ系統のＵｏＣ−Ｂ４、ＳＵＰ−Ｂ１５およびＥＵ−１の核抽出液を調製し、ゲル電気泳動で分離し、膜に移し、抗ｈｄｍ２抗体と共にインキュベートし、光化学的に可視化した。ＥＵ−３は陽性対照として機能し、Ｓａｏｓ−２を陰性対照とした。矢印は９０ｋＤａの完全長ｈｄｍ２蛋白および７５ｋＤａのｈｄｍ２「スプライス」変異体である。
【図１４】ｐ５３／１４３トランスフェクトＳａｏｓ−２細胞のＣＴＬ認識。Ａ２．１制限およびｈｄｍ２  ８１−８８特異的なＣＴＬ  ＣＤ８ｘＡ２Ｋｂ８１およびアロＡ２．１反応性ＣＴＬ  ＣＤ８アロＡ２およびＦｌｕ  Ｍ１  ５８−６６特異的ＣＴＬ  ＣＤ８ｘＡ２Ｋｂ  Ｆｌｕ  Ｍ１を以下の標的細胞、即ち、ＩＦＮ−γの投与（２０ｎｇ／ｍｌ、２０時間）を行なったＳａｏｓ−２（○）および行なわないもの（●）およびＩＦＮ−γの投与を行なったｐ５３／１４３トランスフェクトＳａｏｓ−２細胞（Ｓａｏｓ−２／１４３）（■）または行なわないもの（▲）に対する６時間細胞毒性試験において記載したＥ：Ｔ比のもと、エフェクター細胞として試験した。Ｓａｏｓ−２／１４３細胞には示されるとおり抗Ａ２．１モノクローナル抗体ＰＡ２．１を投与した（△、□）。
【図１５】ｈｄｍ２過剰発現Ａ２陽性腫瘍細胞系統ＥＵ−３のＣＴＬ認識。ＣＴＬ  Ａ２  ８１、ＣＴＬ  ＣＤ８ｘＡ２Ｋｂ８１、Ｉ０  ＣＴＬ  ＣＤ８  アロＡ２およびＣＴＬ  ＣＤ８ｘＡ２Ｋｂ  Ｆｌｕ  Ｍ１をＰＡ２．１の存在下（○）および非存在下（●）にｐｒｅ−Ｂ  ＡＬＬ細胞系統ＥＵ−３に対する６時間細胞毒性試験において記載したＥ：Ｔ比のもと、エフェクター細胞として試験した。
【図１６】ｈｄｍ２過剰発現Ａ２陽性白血病細胞系統のＣＴＬ認識。ＣＴＬ  ＣＤ８ｘＡ２Ｋｂ８１、Ｉ０  ＣＴＬ  ＣＤ８  アロＡ２およびＣＴＬ  ＣＤ８ｘＡ２Ｋｂ  Ｆｌｕ  Ｍ１を標的細胞ＵｏＣ−Ｂ１１（●）およびＢＶ１７３（▲）（ｐｒｅ−Ｂ−Ａｌｌ）に対して６時間細胞毒性試験において記載したＥ：Ｔ比のもと、エフェクター細胞として試験した。全ての標的細胞には示されるとおり抗Ａ２．１モノクローナル抗体ＰＡ２．１を投与した（○、△）。
【図１７】ｈｄｍ２過剰発現Ａ２陽性リンパ腫および形質細胞腫細胞系統のＣＴＬ認識。ＣＴＬ  ＣＤ８ｘＡ２Ｋｂ８１、ＣＴＬ  ＣＤ８  アロＡ２  ＮおよびＣＴＬ  ＣＤ８ｘＡ２Ｋｂ  Ｆｌｕ  Ｍ１を標的細胞ＯＰＭ−２（●）（形質細胞腫）およびＵ−９３７（▲）（組織球性リンパ腫）に対して６時間細胞毒性試験において記載したＥ：Ｔ比のもと、エフェクター細胞として試験した。全ての標的細胞には示されるとおり抗Ａ２．１モノクローナル抗体ＰＡ２．１を投与した（○、△）。
【図１８】Ａ２陰性ｈｄｍ２過剰発現白血病細胞系統は認識されない。ＣＴＬ  ＣＤ８ｘＡ２Ｋｂ８１、アロＡ２．１反応性ＣＴＬおよびＣＴＬ  ＣＤ８ｘＡ２Ｋｂ  Ｆｌｕ  Ｍ１をｐｒｅ−Ｂ−ＡＬＬ細胞系統ＵｏＣ−Ｂ４（●）、ＥＵ−１（▲）およびＳＵＰ−Ｂ１５（○）に対して６時間細胞毒性試験において記載したＥ：Ｔ比のもと、エフェクター細胞として試験した。Ａ２陽性ｐｒｅ−Ｂ  ＡＬＬ系統ＥＵ−３（△）は陽性対照として機能した。
【図１９】リンパ造血細胞のｈｄｍ２蛋白発現。以下の細胞、即ちＥＢＶ−ＬＣＬ  ＬＧ−２、ＰＨＡおよびＣｏｎＡ芽球、チロシナーゼ特異的ＣＴＬクローンＩＶＳＢ、静止期ＴおよびＢ細胞、静止期ＰＢＭＣを調べた。核抽出液を調製し、ゲル電気泳動で分離し、膜に移し、抗ｈｄｍ２抗体で標識し、光化学的に可視化した。ＥＵ−３は陽性対照として機能し、Ｓａｏｓ−２を陰性対照とした。矢印は９０ｋＤａの完全長ｈｄｍ２蛋白および７５ｋＤａのｈｄｍ２「スプライス」変異体である。
【図２０】形質転換されたリンパ造血細胞のＣＴＬ認識。ＣＴＬ  ＣＤ８ｘＡ２Ｋｂ８１、アロＡ２．１反応性ＣＴＬおよびＣＴＬ  ＣＤ８ｘＡ２Ｋｂ  Ｆｌｕ  Ｍ１を以下の標的細胞、即ちＥＢＶ−ＬＣＬ  ＬＧ−２（●）、ＰＨＡ芽球（▲）およびＣｏｎＡ芽球（■）対して６時間細胞毒性試験において記載したＥ：Ｔ比のもと、エフェクター細胞として試験した。全ての標的細胞には示されるとおり抗Ａ２．１モノクローナル抗体ＰＡ２．１を投与した（○、△、□）。
【図２１】活性化成熟樹状細胞（ＤＣ）の実質的認識の欠如。ＣＴＬ  Ａ２  ８１、ＣＴＬ  ＣＤ８ｘＡ２Ｋｂ８１、アロＡ２．１反応性ＣＴＬおよびＣＴＬ  ＣＤ８ｘＡ２Ｋｂ  Ｆｌｕ  Ｍ１を活性化成熟ＤＣ（●）およびｈｄｍ２  ８１−８８ペプチド（１０μＭ）を担持した同細胞（▲）に対して６時間細胞毒性試験において記載したＥ：Ｔ比のもと、エフェクター細胞として試験した。標的細胞には示されるとおり抗Ａ２．１モノクローナル抗体ＰＡ２．１を投与した（○）。
【図２２】抗原活性化Ｔ細胞の実質的認識の欠如。ＣＴＬ  Ａ２  ８１、ＣＴＬ  ＣＤ８ｘＡ２Ｋｂ８１、アロＡ２．１反応性ＣＴＬおよびＣＴＬ  ＣＤ８ｘＡ２Ｋｂ  Ｆｌｕ  Ｍ１をチロシナーゼ特異的ＣＴＬクローンＩＶＳＢ（●）およびｈｄｍ２  ８１−８８ペプチド（１０μＭ）を担持した同細胞（▲）に対して６時間細胞毒性試験において記載したＥ：Ｔ比のもと、エフェクター細胞として試験した。標的細胞には示されるとおり抗Ａ２．１モノクローナル抗体ＰＡ２．１を投与した（○）。
【図２３】静止期のリンパ造血細胞は認識されなかった。ＣＴＬ  Ａ２  ８１、ＣＴＬ  ＣＤ８ｘＡ２Ｋｂ８１、ＣＴＬ  ＣＤ８  アロＡ２およびＣＴＬ  ＣＤ８ｘＡ２Ｋｂ  Ｆｌｕ  Ｍ１を静止期Ｔ細胞（●）およびｈｄｍ２  ８１−８８ペプチド（１０μＭ）を担持した同細胞（▲）に対して６時間細胞毒性試験において記載したＥ：Ｔ比のもと、エフェクター細胞として試験した。標的細胞には示されるとおり抗Ａ２．１モノクローナル抗体ＰＡ２．１を投与した（○）。
【図２４】静止期のリンパ造血細胞は認識されなかった。ＣＴＬ  Ａ２  ８１、ＣＴＬ  ＣＤ８ｘＡ２Ｋｂ８１、ＣＴＬ  ＣＤ８  アロＡ２およびＣＴＬ  ＣＤ８ｘＡ２Ｋｂ  Ｆｌｕ  Ｍ１を静止期Ｂ細胞（●）およびｈｄｍ２  ８１−８８ペプチド（１０μＭ）を担持した同細胞（▲）に対する６時間細胞毒性試験において記載したＥ：Ｔ比のもと、エフェクター細胞として試験した。標的細胞には示されるとおり抗Ａ２．１モノクローナル抗体ＰＡ２．１を投与した（○）。
【図２５】静止期のリンパ造血細胞は認識されなかった。ＣＴＬ  Ａ２  ８１、ＣＴＬ  ＣＤ８ｘＡ２Ｋｂ８１、ＣＴＬ  ＣＤ８  アロＡ２およびＣＴＬ  ＣＤ８ｘＡ２Ｋｂ  Ｆｌｕ  Ｍ１をＰＢＭＣ（●）およびｈｄｍ２  ８１−８８ペプチド（１０μＭ）を担持した同細胞（▲）に対して６時間細胞毒性試験において記載したＥ：Ｔ比のもと、エフェクター細胞として試験した。標的細胞には示されるとおり抗Ａ２．１モノクローナル抗体ＰＡ２．１を投与した（○）。
【図２６】ｈｄｍ２蛋白２をコードするプラスミドｐＣＨＤＭＩＡ。
【図２７】Ａ２．１をコードするプラスミドｐＳＶ２−Ａ２．１。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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