(57)【要約】本発明は、腫瘍細胞内で過剰発現されるか、あるいは自己腫瘍細胞または様々な腫瘍細胞株から誘導されたタンパク質および／またはペプチド、あるいは前記タンパク質および／またはペプチドをコードするＲＮＡまたはＤＮＡまたはｃＤＮＡが導入された半同種異系抗原提示細胞に関する。本発明は、半同種異系の抗原提示細胞の製造方法、ならびに腫瘍疾病の治療のためのそれらの用途に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
腫瘍細胞内で過剰発現されるか、もしくは自己腫瘍細胞から誘導されたタンパク質およびペプチドのうち少なくともいずれか、または前記タンパク質およびペプチドのうち少なくともいずれかをコードするＲＮＡもしくはＤＮＡもしくはｃＤＮＡが、腫瘍疾病の治療のために導入されている半同種異系抗原提示細胞の用途。
【請求項２】
前記腫瘍細胞は、好ましくは卵巣、乳房および腎細胞癌腫のような癌腫の細胞、好ましくは白血病およびリンパ腫の細胞のような造血系の腫瘍細胞、好ましくは肉腫のような間葉性腫瘍の細胞、上皮腫瘍の細胞、好ましくは黒色腫のような外胚葉腫瘍の細胞、ならびに好ましくは芽球腫および奇形腫のような未分化組織からの胚芽腫の細胞を含むことを特徴とする請求項１に記載の用途。
【請求項３】
前記半同種異系抗原提示細胞は、好ましくは卵巣、乳房および腎細胞癌腫のような癌腫、好ましくは白血病およびリンパ腫のような造血系の腫瘍、好ましくは肉腫のような間葉性腫瘍、上皮腫瘍、好ましくは黒色腫のような外胚葉腫瘍、ならびに好ましくは芽球腫および奇形腫のような未分化組織からの胚芽腫を含む腫瘍の治療のために用いられることを特徴とする請求項２に記載の用途。
【請求項４】
２つの異なる半同種異系個体の半同種異系抗原提示細胞が用いられることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項または複数項に記載の用途。
【請求項５】
自己腫瘍細胞からｃＤＮＡに逆転写し、該ｃＤＮＡをＰＣＲによって増幅した後に該ｃＤＮＡをＲＮＡに転写して得られたＲＮＡが用いられることを特徴とする請求項４に記載の用途。
【請求項６】
前記半同種異系抗原提示細胞は、静脈内、皮下または筋肉内経路によって投与されることを特徴とする請求項１〜５のいずれか１項または複数項に記載の用途。
【請求項７】
腫瘍細胞内で過剰発現されるか、もしくは自己腫瘍細胞から誘導されたタンパク質およびペプチドのうち少なくともいずれか、または前記タンパク質およびペプチドのうち少なくともいずれかをそれぞれコードするＲＮＡもしくはＤＮＡもしくはｃＤＮＡが、組換え技術により導入されている前記半同種異系抗原提示細胞の用途。
【請求項８】
腫瘍明示化抗原をコードするＲＮＡもしくはＤＮＡもしくはｃＤＮＡが半同種異系抗原提示細胞に導入されていることを特徴とし、該腫瘍明示化抗原は、腫瘍細胞内で過剰発現される抗原であって、好ましくは、腫瘍遺伝子（好ましくはＨＥＲ２／ｎｅｕ）、腫瘍に増殖優位性を与えるか腫瘍の生存を保証するかの少なくともいずれかの作用を有するタンパク質（好ましくはＰＳＭＡ）、細胞周期調節タンパク質、転写因子（好ましくはＷＴ‐１）、ムチン（好ましくはＭＵＣ‐１）、細胞分裂の調節に関与するタンパク質（好ましくはテロメラーゼ）から選択される、請求項１〜７のいずれか１項または複数項に記載の用途。
【請求項９】
前記抗原提示細胞は樹状細胞またはマクロファージであることを特徴とする請求項１〜８のいずれか１項または複数項に記載の用途。
【請求項１０】
いくつかの異なる腫瘍細胞株由来のタンパク質およびペプチドのうち少なくともいずれか、または前記タンパク質およびペプチドのうち少なくともいずれかをコードするＲＮＡもしくはＤＮＡもしくはｃＤＮＡが、腫瘍疾病の治療のために導入されている半同種異系抗原提示細胞の用途。
【請求項１１】
２つまたは３つの異なる腫瘍細胞株からプールされたｃＲＮＡが導入されていることを特徴とする請求項１０に記載の用途。
【請求項１２】
腫瘍疾病の治療のための半同種異系抗原提示細胞の調製方法であって、腫瘍細胞内で過剰発現されるか、もしくは自己腫瘍細胞から誘導されたタンパク質およびペプチドのうち少なくともいずれか、または前記タンパク質およびペプチドのうち少なくともいずれかをコードするＲＮＡもしくはＤＮＡもしくはｃＤＮＡが、半同種異系抗原提示細胞に導入されることを特徴とする方法。
【請求項１３】
腫瘍疾病の治療のための半同種異系抗原提示細胞の調製方法であって、いくつかの異なる腫瘍細胞株由来のタンパク質およびペプチドのうち少なくともいずれか、または前記タンパク質およびペプチドのうち少なくともいずれかをそれぞれコードするＲＮＡもしくはＤＮＡもしくはｃＤＮＡが、半同種異系抗原提示細胞に導入されることを特徴とする方法。
【請求項１４】
最初に腫瘍細胞由来のＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写し、該ｃＤＮＡをＰＣＲによって増幅し、続いて該ｃＤＮＡをＲＮＡに転写することを特徴とする請求項１２または１３に記載の方法。
【請求項１５】
２つの異なる半同種異系個体の抗原提示細胞が用いられることを特徴とする請求項１２〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
請求項１２〜１５に記載の方法によって得ることのできる半同種異系抗原提示細胞。
【請求項１７】
腫瘍細胞内で過剰発現されるか、もしくは自己腫瘍細胞から誘導されたタンパク質およびペプチドのうち少なくともいずれか、または前記タンパク質およびペプチドのうち少なくともいずれかをそれぞれコードするＲＮＡもしくはＤＮＡもしくはｃＤＮＡを含有する半同種異系抗原提示細胞。
【請求項１８】
前記腫瘍細胞内で過剰発現されるか、もしくは自己腫瘍細胞から誘導されたタンパク質およびペプチドのうち少なくともいずれか、または前記タンパク質およびペプチドのうち少なくともいずれかをコードするＲＮＡもしくはＤＮＡもしくはｃＤＮＡは、好ましくは卵巣、乳房および腎細胞癌腫のような癌腫、好ましくは白血病およびリンパ腫の細胞のような造血系の腫瘍、好ましくは肉腫のような間葉性腫瘍の細胞、上皮腫瘍の細胞、好ましくは黒色腫のような外胚葉腫瘍の細胞、ならびに好ましくは芽球腫および奇形腫のような未分化組織からの胚芽腫の細胞から選ばれることを特徴とする請求項１７に記載の半同種異系抗原提示細胞。
【請求項１９】
いくつかの異なる腫瘍細胞株由来のタンパク質およびペプチドのうち少なくともいずれか、または前記タンパク質およびペプチドのうち少なくともいずれかをコードするＲＮＡもしくはＤＮＡもしくはｃＤＮＡを含有する半同種異系抗原提示細胞。
【請求項２０】
前記抗原提示細胞は、樹状細胞またはマクロファージであることを特徴とする請求項１６〜１９に記載の半同種異系抗原提示細胞。
【請求項２１】
請求項１６〜２０のいずれか１項に記載の半同種異系抗原提示細胞を含有する医薬組成物。
【請求項２２】
ワクチンであることを特徴とする請求項２１に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、腫瘍細胞内で過剰発現され、もしくは腫瘍細胞から誘導されたタンパク質およびペプチドの少なくともいずれか、または前記タンパク質およびペプチドの少なくともいずれかをコードするＲＮＡもしくはＤＮＡもしくはｃＤＮＡが導入された半同種異系（Semi-allogene ）抗原提示細胞に関する。さらに、本発明は、上記半同種異系抗原提示細胞を製造するための方法、ならびに腫瘍疾病の治療におけるそれらの用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞性免疫反応が、例えば転移性腎細胞癌（ｍＲＣＣ）などの腫瘍疾病の場合に、腫瘍負荷を顕著に減少させ、患者の生存を顕著に延ばすことがあることが、最近の３つの開発から示唆されている。臨床データは、すでにｍＲＣＣの場合での成功を実証しているが、同様の原理を他の腫瘍に転用することも検討されている。以下、本発明の手法の基礎をなす３つの開発について説明する。
Ｉ．転移性腎細胞癌の治療に対する同種異系骨髄移植
同種異系骨髄移植を受けた転移性腎細胞癌患者は、全ケースの５３％において完全または部分的に寛解を達成しうる（１）。平均余命は数ヶ月から数年へと顕著に増加しうる。重大な腫瘍負荷を取り除くことができる一方で、患者の５３％は対宿主性移植片病（ＧＶＤＨ）を発症し、ＧＶＤＨに関係する死亡率は５％である。
【０００３】
腫瘍退縮のメカニズムは、おそらく、同種異系の骨髄移植（ＢＭＴ）後の血液悪性腫瘍の除去に伴うメカニズムと類似している（２）。活性化されたＴリンパ球は、腫瘍細胞内で発現されるタンパク質から誘導されたペプチドと、ＭＨＣ分子（クラスＩとクラスＩＩ型の両方）とで構成されるリガンドを認識する。ＭＨＣタンパク質は３つの群に分類されるが、そのうちの２群、すなわちＭＨＣクラスＩおよびクラスＩＩタンパク質が本発明において特に重要である。ヒトにおいて、ＭＨＣクラスＩタンパク質はＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃと呼ばれている。これらは殆ど全ての体細胞の表面上に発現され、高度な多型性を示す強力な移植抗原を提示する。ヒトにおけるＭＨＣクラスＩＩタンパク質は、ＨＬＡ−ＤＰ、ＨＬＡ−ＤＱ、ＨＬＡ−ＤＲであり、例えば樹状細胞や刺激されたマクロファージ上で発現され、高度に多型の移植抗原を同様に提示する。
【０００４】
リガンド認識によって、様々なＴ細胞においてエフェクタ機能（例えば、サイトカイン分泌および細胞毒性）が活性化され、これにより腫瘍細胞の破壊が行われる。ＭＨＣと非腫瘍関連ペプチドとで構成されるリガンドを認識するＴ細胞の平行活性化（すなわち、アロ反応）が、それ自体が抗腫瘍反応を促進する炎症性サイトカインの分泌により、最適な免疫反応の一助となっているかもしれない。しかしながら、これらの細胞の反応もまたＧＶＨＤにおいて役割を果たす。
ＩＩ．自己腫瘍細胞と同種異系樹状細胞（ＤＣ）とを用いたハイブリッドワクチン
クグラー（Ｋｕｇｌｅｒ）ら（３，４）は、ｍＲＣＣ患者に対して、同種異系樹状細胞と非血縁者の自己腫瘍細胞とを融合して構成されるハイブリッドワクチンによる「ワクチン接種」ができることを示した。「ワクチン接種」後、患者は顕著な腫瘍負荷の減少を見せている。完全寛解を達成した患者は手法Ｉと比較して少なく、今のところ寿命の延長は認められていない。しかしながら、手法Ｉにおける処置とは対照的に、ハイブリッドワクチンの手法は全く毒性を示さないか、僅かな毒性しか示さない。ワクチン接種の終了後、何人かの腫瘍患者は、おそらくは長期間Ｔ細胞反応を持続できないために再発を起こす。連続ワクチン接種によってこの問題を克服することができるかもしれないが、ワクチン接種は同種異系樹状細胞との融合相手となる腫瘍細胞しか利用できないために限界がある。したがって、腫瘍細胞が衰退中であればこの処置を続けることができる。
ＩＩＩ．自己ＤＣに基づくワクチン製造のための腫瘍細胞から得たＲＮＡ
ギルボア（Ｇｉｌｂｏａ）とその共同研究者（５〜８）は、自己ＭＨＣクラスＩおよびクラスＩＩ分子とともに提示するために、ＤＣによって取り込まれ、タンパク質に翻訳可能で、ペプチドにプロセッシング可能な、腫瘍細胞から調製した自己ＲＮＡによって、自己ＤＣをプライミングする戦略を開発している。ＤＣパルスのための無限の材料供給源を提供するために、腫瘍細胞由来のＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写する。このｃＤＮＡは、さらなるＲＮＡを得るためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写のための鋳型として機能する。ＰＣＲ増幅により、無限量の材料を製造することが可能である。腫瘍細胞から得たＲＮＡを自己ＤＣ内で発現させることにより、腫瘍細胞表面上に発現したものに対応するＭＨＣ‐ペプチドリガンドをＤＣの表面上に発現させることができる。ＤＣとそれが生産するサイトカインの同時刺激性分子は、最適なＴ細胞反応の刺激を可能にする。これらのワクチンは僅かな毒性しか示さないものの、ＩおよびＩＩに匹敵するような寛解は現在のところ報告されていない。これは、自己系内では活性化されないアロ反応性Ｔ細胞が欠如していることに起因するかもしれない。
【０００５】
すなわち、従来の治療手法は、長期治療の成功を妨げるか、重大な望ましくない影響を伴うといった実質的な欠点を有していると結論づけてよいだろう。
したがって、すでに述べたように、手法I は、全体の５３％で発生し、場合によっては致命的結果を伴うＧＶＨＤ発症のリスクを背負っている。
【０００６】
ＩＩに記載の手法（クグラー（Ｋｕｇｌｅｒ）ら）は、ＭＨＣ‐ペプチドリガンドを提供するために患者の生きた腫瘍細胞を必要とするという欠点があるため、この手法の適用期間は大きく限定される。
【０００７】
ギルボア（Ｇｉｌｂｏａ）と共同研究者による治療は、僅かな毒性しか示さなかったものの、現在のところ顕著な腫瘍寛解は全く報告されていない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
したがって、本発明の目的は、上記欠点を回避する抗原提示細胞であって、従って腫瘍疾病の治療に有用な抗原提示細胞を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記目的は独立請求項に記載の特徴によって達成されている。好ましい実施形態は従属請求項に記載されている。
それぞれ腫瘍細胞中で過剰発現されるか、あるいは自己腫瘍細胞またはいくつかの異なる腫瘍細胞株から誘導されたタンパク質および／またはペプチド、あるいは前記タンパク質および／またはペプチドをコードするＲＮＡまたはＤＮＡまたはｃＤＮＡが導入された半同種異系抗原提示細胞を用いることにより、腫瘍疾病の治療に有益な免疫反応を達成することができる。
【００１０】
クグラー（Ｋｕｇｌｅｒ）らの手法とは異なり、これらの半同種異系抗原提示細胞の製造のための本発明の方法は、電気融合が必要でないという利点を有している。したがって、抗原提示細胞の機能が電気融合によって損なわれることがない。例えばＲＮＡを用いたトランスフェクションは、抗原提示細胞の当該分子を取込む天然の能力を利用しているために、電気融合を行わずにすむ。
【００１１】
本発明に従う戦略、すなわち半同種異系ワクチンを使用することにより、ＭＨＣと腫瘍関連ペプチドとで構成されるリガンドを、より効率よく提示する能力が与えられる。クグラー（Ｋｕｇｌｅｒ）らの手法ではわずか約１０％のハイブリッド細胞しか生産されなかったのに対し、本発明によるとペプチドリガンドを発現した抗原提示細胞を明らかに高率で生産することができた。
【００１２】
この点に関して、例えば、自己腫瘍細胞由来のＲＮＡを逆転写し、ｃＤＮＡをＰＣＲによって増幅し、続いてｃＤＮＡをＲＮＡに転写することによる、腫瘍関連ＲＮＡを（無限に）生産するための好ましい実施形態に従って用いられる手法は、特に有益である。
【００１３】
本発明に従う上記手法は、すでに腫瘍細胞が少量になっていても、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＲＮＡ転写のための無限のｃＤＮＡ供給源を形成するのに十分なＲＮＡを提供できるという利点を有している。ＲＮＡに基づいてパルスすることにより、腫瘍細胞の量が限られている場合に伴う欠点を回避することができる。ワクチン接種を長期間実施することができるために、例えばクグラー（Ｋｕｇｌｅｒ）らによる手法と比べて、反応速度が向上し、長期の実施が可能となる。
【００１４】
患者のＭＨＣ分子に対応しない半同種異系抗原提示細胞ＭＨＣ分子は、アロ反応に対する刺激を与える。したがって、半同種異系抗原提示細胞を用いることにより、自己細胞を用いた場合に比べて、免疫反応が強く誘発される。それにもかかわらず、本発明のワクチンの毒性は、これまでに記載された手法のものと比較してはるかに低い。
【００１５】
このように、本発明に従う半同種異系樹状細胞の使用は、ギルボア（Ｇｉｌｂｏａ）らの手法によって必要なＭＨＣマッチングを与えながらも、癌患者の進行した疾病によく見られる自己樹状細胞の機能が弱いという、自己樹状細胞の使用に伴う欠点を回避している。
【００１６】
本発明によれば、患者に対して半同種異系の個人から抗原提示細胞を調製する。これは、例えば父、母、兄弟、姉妹、または子孫などの血縁ドナーの抗原提示細胞のＭＨＣ分子が、患者のＭＨＣ分子と５０％の同一性を有している場合である。このことは以下のように模式的に示すことができる。もし患者のＨＬＡが対立遺伝子ａ＋ｃを有しているならば、ドナーとなりうる近親者は以下の対立遺伝子異型を有していなければならない。
両親：       ＨＬＡ  ａｂまたはｃｄ
兄弟および姉妹：   ＨＬＡ  ａｄまたはｂｃ
子孫：       ＨＬＡ  ａｅ，ａｆ，ｃｅ，ｃｆ
（母＝ＨＬＡ  ｅｆ）
上記の半同種異系抗原提示細胞は、患者の抗原提示細胞とＨＬＡハプロタイプが一致するので、ＨＬＡハプロタイプ一致抗原提示細胞と呼ぶこともできる。
【００１７】
ＨＬＡハプロタイプ一致抗原提示細胞は、１つの染色体のＨＬＡ−Ａ，ＨＬＡ−ＢおよびＨＬＡ−Ｃ対立遺伝子によってコードされる、患者と共通のクラスＩ（ＨＬＡ−Ａ，ＨＬＡ−ＢおよびＨＬＡ−Ｃ）分子を有するとともに、同じ染色体の対立遺伝子によってコードされる患者と共通のクラスＩＩ分子（ＨＬＡ−ＤＲ，ＨＬＡ−ＤＱおよびＨＬＡ−ＤＰ）も有している。
【００１８】
半同種異系抗原提示細胞の単離に続いて、自己腫瘍細胞から誘導されたタンパク質および／またはペプチド、あるいはそれぞれ前記タンパク質および／またはペプチドをコードするＲＮＡまたはＤＮＡまたはｃＤＮＡまたはｃＲＮＡを上記細胞に導入する。別の実施形態においては、腫瘍細胞中で過剰発現されるタンパク質および／またはペプチド、あるいは前記タンパク質および／ペプチドをコードするＲＮＡ、ＤＮＡ、ｃＤＮＡまたはｃＲＮＡを導入する。これらは腫瘍明示化抗原（tumordefinierte Antigene）、すなわち腫瘍細胞に特異的な抗原であり、正常細胞よりも腫瘍細胞において、それぞれ高い発現または極めて高い発現を示す。好ましくは、このような腫瘍明示化抗原は、腫瘍遺伝子、例えばＨＥＲ２／ｎｅｕ、腫瘍に増殖優位性を与えるか腫瘍の生存を保証するかの少なくともいずれかの作用を有するタンパク質、例えばＰＳＭＡ、細胞周期調節タンパク質、転写因子、例えばＷＴ−１、ムチン、好ましくはＭＵＣ−１、細胞分裂の調節に関与するタンパク質、好ましくはテロメラーゼから選択される。当然のことながら、本明細書中で用いるタンパク質、ペプチド、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ｃＤＮＡおよびｃＲＮＡは、組換え技術によって調製および使用することもできる。
【００１９】
この結果、抗原提示細胞は、ＭＨＣと腫瘍関連ペプチドとによって構成されるリガンドを提示し、該リガンドはＴ細胞によって認識されて、自己腫瘍に対する免疫反応を誘導する。
【００２０】
好ましい実施形態に従えば、半同種異系ＤＣによって提示されるＭＨＣが患者のすべての潜在的ＭＨＣクラスＩおよびクラスＩＩ分子を含むように、２つの異なる半同種異系ドナー（すなわち、例えば母と父）の抗原提示細胞を使用することが提供される。各ドナーの第２の染色体は、アロ反応を誘導しうる同種異系ＭＨＣ分子もさらにコードしている。
【００２１】
患者の腫瘍細胞のリガンドに相当するＭＨＣクラスＩおよびクラスＩＩペプチドリガンドを提供するために、ギルボア（Ｇｉｌｂｏａ）と共同研究者による既知の戦略を用いて、抗原提示細胞のパルスのための腫瘍由来ＲＮＡの無限供給源を提供する。同等の可能性としては、半同種異系抗原提示細胞を、ペプチドやタンパク質などの他の抗原供給源でパルスすることがある（９）。
【００２２】
本発明の１つの実施形態に従えば、腫瘍細胞中で過剰発現されるか、自己腫瘍細胞から誘導されるタンパク質および／またはペプチド、あるいは、それぞれ前記タンパク質および／ペプチドをコードするＲＮＡ、ＤＮＡ、ｃＤＮＡまたはｃＲＮＡを、それぞれ、腫瘍細胞、好ましくは自己腫瘍細胞から誘導するか、あるいは前記腫瘍細胞中で発現させ、前記腫瘍細胞としては、間葉性腫瘍の細胞、例えば肉腫、癌腫（好ましくは卵巣、乳房および腎細胞癌腫）の細胞、造血系の腫瘍細胞、好ましくは白血病およびリンパ腫の細胞、上皮腫瘍の細胞、外胚葉腫瘍（例えば黒色腫）細胞、および未分化組織からの胚芽腫（好ましくは芽球腫および奇形腫）の細胞が含まれる。本明細書中でさらに詳細に検討する腎細胞癌腫に対する具体例は、転移性腎細胞癌腫である。本発明の半同種異系抗原提示細胞は、腫瘍の治療において用いることができる。
【００２３】
すでに述べたように、抗原提示細胞へ取り込まれることを意図して自己腫瘍細胞より誘導されたＲＮＡを、無限の増幅のためにｃＤＮＡに逆転写してもよく、ｃＤＮＡをＰＣＲによって増幅してもよく、その後ｃＤＮＡをＲＮＡに転写してもよい。
【００２４】
本発明に従う抗原提示細胞の投与は、静脈内、皮下または筋肉内経路によって実施することができるが、皮下注射が好ましい。
本発明における用途のために、すべてのタイプの抗原提示細胞を用いることができる。これらには、特に単球／マクロファージおよび樹状細胞が含まれるが、後者の方が好ましい。
【００２５】
本発明の他の態様は、半同種異系抗原提示細胞に導入されるものとして、自己腫瘍細胞の成分の代わりに、いくつかの異なる腫瘍細胞株の成分のプールが使用される。これらは、腫瘍治療におけるワクチンとして用いることができる。このような「包括的（generische）」ワクチンを生産するために、例えば、すべての患者に使用することのできる３〜５種の異なるＲＣＣからなる上述のｃＤＮＡのプールを調製すると有益である。すなわち、このようなプールでパルスされた抗原提示細胞に対してプライミングされた腫瘍特異的Ｔ細胞の殆どは、自己腫瘍細胞を認識することができると考えられる。というのも、これらの腫瘍特異的Ｔ細胞は、共通のペプチド‐ＭＨＣリガンドを有しているからである。これにより、ＧＭＰ（適正製造基準）条件下において、１つの製品（すなわち包括的ｃＤＮＡおよびｉｎ  ｖｉｔｒｏで転写された対応するｃＲＮＡ）を生産するだけですむ。その後、ワクチン治療の対象となる個々の患者に対して、本発明に従ってＧＭＰ条件下で、半同種異系樹状細胞だけを調製すればよい。
【００２６】
最終的に、本発明は、上述の半同種異系抗原提示細胞を含有する医薬組成物を含み、前記組成物は好ましくはワクチンの形態である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２７】
以下、樹状細胞を例にとって、本発明の基本的原理を説明のための試験モデルとともにより詳細に説明する。
本手法の原理を確立するために２つのモデル系を用いる。第１の系では、黒色腫モデルからのよく特性が解析された試薬セットを使用し、第２の系では、腎細胞癌腫モデルからの試薬セットを使用する。黒色腫モデルは、試験クローン（ＴｙｒＦ８）のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）によって認識されるエピトープ（ＭＨＣ‐ペプチドリガンド）が明らかにされているという利点があり、これにより、樹状細胞などの抗原提示細胞による抗原提示の効率をより定量的に分析できるようになる。１つの腎細胞癌腫特異的Ｔ細胞クローン（ＴＩＬ‐２６）に対するエピトープはまだ同定されていないが、これらの細胞毒性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）は高度に特徴的なＴＣＲを利用し、該ＴＣＲは、ＴＣＲのＣＤＲ３領域の分子配列に基づいたリアルタイムＲＴ‐ＰＣＲの方法を用いてｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて同定および定量することができる。Ｔ細胞を上記特徴的ＴＣＲ配列によって同定することにより、樹状細胞の機能的プライミング能力を調べることができる。上記２つのモデルを組み合わせて用いることにより、ＤＣの表面において腫瘍関連ペプチドを提示し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける特異的Ｔ細胞反応を活性化するためのこの系の特異性および効率を実証できる。本実験は、第１相／第２相臨床試験の開発に先立って原理を立証するために不可欠である。
（黒色腫系）
このモデル系に対する試薬は、ライデン大学のＰｅｔｅｒ  Ｓｃｈｒｉｅｒ教授より得た。ＨＬＡ‐Ａ＊０２０１拘束性ＣＴＬクローン（ＴｙｒＦ８）を、進行した黒色腫を有した患者より単離した。同患者からの自己黒色腫瘍細胞株も確立した。特異的リガンド、すなわち腫瘍関連タンパク質から誘導されるペプチドは既知のものであり、該ペプチドは、健常なメラニン細胞中では正常なレベルで発現されるが黒色腫中では過剰発現される酵素であるチロシナーゼから誘導される。ＭＨＣ提示分子は、ＨＬＡ‐Ａ＊０２０１対立遺伝子によってコードされていることを確かめた。チロシナーゼに対するｃＤＮＡは入手可能であり、ＨＬＡ‐Ａ２分子のペプチド収容溝内に提示されるチロシナーゼタンパク質由来の正確な９アミノ酸ペプチドは既知であり、ＴｙｒＦ８Ｔ細胞クローンは入手可能である（１０）。
【００２８】
実験の一般的概要としては、まず黒色腫細胞株からＲＮＡを調製し、次に逆転写によってｃＤＮＡを調製する。次にこのｃＤＮＡを増幅して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写ＲＮＡ（ｃＲＮＡ）を調製するための鋳型として用いる。このｃＲＮＡを用いてＨＬＡ‐Ａ２陽性樹状細胞をパルスする（１１，１２）。これらの樹状細胞はｃＲＮＡを取り込んでタンパク質に翻訳するが、該タンパク質の１つはチロシナーゼ酵素でなければならない。チロシンタンパク質は樹状細胞において細胞内プロセッシングを受けてペプチド断片となり、特異的な９アミノ酸のエピトープが、樹状細胞の小胞体内で新しく合成されたＨＬＡ‐Ａ２分子上に搭載される。これらのＭＨＣ‐ペプチド複合体は樹状細胞の細胞質膜に輸送され、ここでＴ細胞による認識が可能となる。ＤＣ表面上の適切なＭＨＣ‐ペプチド複合体を認識するＴｙｒＦ８細胞は、インターフェロンγを分泌して、細胞溶解機構を活性化することにより、これらが樹状細胞を殺傷可能となるように応答する。この活性化は、ＴｙｒＦ８クローンによるインターフェロンγ分泌のＥＬＩＳＡ検出によって、あるいは標準的なクロム放出検定を用い、樹状細胞を標的細胞として標識し、ＴｙｒＦ８細胞存在下におけるそれらの溶解を測定することにより評価することができる。ＴｙｒＦ８細胞の活性化は非常に特異的であるので、チロシナーゼ以外のタンパク質から誘導されたペプチドを保持したＭＨＣ分子は、ＴｙｒＦ８細胞を活性化することができず、ＴｙｒＦ８細胞の活性を最適に刺激するためには、一定の閾値の上記特異的ＭＨＣチロシナーゼペプチド複合体がＤＣによって提示されなければならない。
【００２９】
樹状細胞に上記すべての工程を遂行させることのできる必要な出発物質を、元々のｃＲＮＡが提供できるのかどうか判定するために、ｃＲＮＡでパルスした樹状細胞を、ＴｙｒＦ８細胞を活性化するための刺激側細胞として用いる。黒色腫瘍細胞は様々な異なるＲＮＡを産生するので、チロシナーゼに対する転写物は、さらに大きなプールの中の１成分を表すにすぎない。この混合ｃＲＮＡプールが、チロシナーゼエピトープを与える能力は、単離チロシナーゼｃＤＮＡから作成したｃＲＮＡと同等であろう（すなわち、１つのＲＮＡ種のみ）。ＨＬＡ−Ａ２−チロシナーゼ−ペプチド複合体のレベルの相対評価は、樹状細胞を変化量の試験ｃＲＮＡでパルスし、該樹状細胞のもつ刺激能力を、チロシナーゼの９アミノ酸エピトープを提示する、既知変化量の合成ペプチドでパルスした樹状細胞と比較することによって決定することができる。ＴｙｒＦ８細胞がＭＨＣ‐ペプチド複合体を正確に検出できなくなる閾値レベルは、特異的ＥＬＩＳＡ検定を用いてＴｙｒＦ８細胞によって放出されるインターフェロンγの量を評価することによって決定することができる。
（腎細胞癌腫系）
これらの試薬は発明者によって確立されている。我々は腎細胞癌腫に対して特異的なＣＴＬ細胞株を腎細胞癌腫患者から単離し、このＴ細胞株からＴ細胞クローンを確立した（ＴＩＬ‐２６）。同じ患者から自己腫瘍細胞も得た（ＲＣＣ‐２６）。ＲＣＣ‐２６細胞によって示される腫瘍関連ペプチドを提示するＭＨＣ拘束分子は、ＨＬＡ‐Ａ＊０２０１によってコードされる分子であると同定されている。ＴＩＬ‐２６細胞を自己ＲＣＣ‐２６腫瘍細胞に暴露すると、該ＴＩＬ‐２６細胞は活性化されてインターフェロンγを分泌するとともに、自己ＲＣＣ‐２６腫瘍細胞を溶解できるようになった（１３）。
【００３０】
実験の一般的概要は、黒色腫系について記載したものと同様である。第１の段階では、ＲＣＣ‐２６細胞よりＲＮＡを作成し、逆転写によってｃＤＮＡを調製する。このｃＤＮＡはｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写によってｃＲＮＡを生成するための鋳型として働く。ｃＲＮＡを用いて樹状細胞をパルスし、これらの樹状細胞について、ＴＩＬ‐２６細胞を活性化してインターフェロンγを分泌させる能力を調べる。樹状細胞はＲＣＣ‐２６細胞由来のｃＲＮＡでパルスした後に、活性化ＴＩＬ‐２６細胞を用いた細胞毒性アッセイにおける標的細胞として評価される。樹状細胞の刺激の効率は、ＴＩＬ‐２６細胞によるインターフェロンγ分泌を測定するアッセイにおいて、ならびに、細胞毒性アッセイにおける標的細胞として、ＲＣＣ‐２６細胞の場合の効率と比較することもできる。
【００３１】
これらの２組の実験から、ｃＲＮＡでパルスした同種異系（ＨＬＡ‐Ａ＊０２０１）樹状細胞を用いてＭＨＣ‐ペプチド複合体を製造する方法は機能的であることが明確に実証された。
（ｃＲＮＡでパルスした同種異系樹状細胞によるＴ細胞反応の誘導）
ｃＲＮＡでパルスした樹状細胞がｉｎ  ｖｉｔｒｏで同種異系Ｔ細胞をプライミングする能力を評価するために、２つの実験をｉｎ  ｖｉｔｒｏで実施する。最初に、ドナーＤＳ（ＤＳ＝匿名ドナー）から得たナイーブＴ細胞を、ＴＩＬ‐２６によって認識されるものと明らかに同一のエピトープを認識できるように、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいてＲＣＣ‐２６腫瘍細胞でプライミングできることを証明した（１４）。ＴＩＬ‐２６細胞と同様に、ドナーＤＳ由来のＴ細胞は、ＴＩＬ‐２６細胞によって発現されるＴＣＲα鎖と高い相同性を有するＴＣＲα鎖を発現する（１５）。これらのＴ細胞のＴＣＲ配列は、ＲＮＡを試験試料から単離し、ＴＣＲ特異的プライマーを用いて、リアルタイムＲＴ‐ＰＣＲの方法を用いて試料中の転写物の量を分析することによって定量化することができる（１４）。まず、ドナーＤＳの末梢血リンパ球（ＰＢＬ）を反応側細胞として用いた混合リンパ球培養物中で、ｃＲＮＡ（ＲＣＣ‐２６由来）でパルスした同種異系ＨＬＡ‐Ａ＊０２０１陽性樹状細胞を刺激側細胞として用いる。ＴＩＬ‐２６細胞によって認識される同一のエピトープを認識するマーカー（Ｖａ２０）Ｔ細胞の出現を、特徴的Ｖａ２０配列を有する転写物の増加を調べることによりモニターする。定量的評価は、未刺激ＰＢＬにおける上記転写物の頻度を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにてｃＲＮＡパルス樹状細胞で様々な回数再刺激した後のものと比較するリアルタイムＲＴ‐ＰＣＲを用いて行うことができる。ｃＲＮＡ（ＲＣＣ‐２６由来）でパルスしたドナーＤＳ由来の自己樹状細胞を標的細胞として用い、ｃＲＮＡパルス樹状細胞でプライミングしたＰＢＬ、無傷のＲＣＣ‐２６腫瘍細胞でプライミングしたＰＢＬを細胞毒性エフェクタ細胞として用いて、ＲＣＣ‐２６腫瘍細胞と直接比較する。
【００３２】
第２の試験系として、ＨＬＡ‐Ａ＊０２０１ドナー由来のＴ細胞を、リンパ球と樹状細胞との混合培養物中で、ｃＲＮＡ（黒色腫由来）でパルスしたＨＬＡ‐Ａ＊０２０１を発現しているドナー由来の樹状細胞で刺激する。チロシン特異的リガンドを認識するＴ細胞の発生を、ＨＬＡ‐Ａ２‐チロシナーゼペプチド特異的４量体を用いた標準的なフローサイトメトリーによって評価する（７）。
（混合ｃＲＮＡ試料による樹状細胞のパルス）
現時点では、複数のエピトープに対して生み出される免疫反応が、腫瘍細胞を排除し、腫瘍の再発から保護するための最良の可能性を与えると考えられている。このことは、個々のＭＨＣ‐ペプチドリガンドに対してｉｎ  ｖｉｖｏにおいてプライミングされたＣＴＬがＭＨＣ‐ペプチドリガンド特異的ＣＴＬの発生をもたらし、場合によっては、腫瘍の寛解をもたらすという知見に基づいている。けれども、ＭＨＣ分子をもはや発現しないか、あるいは、当該特異的ペプチドの誘導元のタンパク質をもはや発現しない腫瘍の変異体が出現することもある。多くの異なるＭＨＣ‐ペプチドリガンド特異性を有するＣＴＬを製造すれば、腫瘍変異体が出現する可能性が低くなると考えられる。というのも、多くの異なる特異性を有するＣＴＬによって検出されることを免れるためには、個々の腫瘍細胞が全てのＭＨＣ分子およびペプチド提供タンパク質において異なる変異体を発現する必要があると考えられるからである。
【００３３】
したがって、免疫攻撃のための多くの異なる腫瘍関連ペプチドを提供するために、いくつかの腫瘍細胞株由来のｃＲＮＡをプールすることが最適である。同様に、反応側Ｔ細胞と刺激側樹状細胞とによって共用されるいくつかの異なるＭＨＣ分子を有することがより好ましい。このことは、本明細書に記載の戦略に従って、以下に記載するように、Ｔ細胞のドナーの家族由来のＨＬＡハプロタイプ一致樹状細胞を用いることによって達成される。とはいえ、異なる腫瘍からのｃＲＮＡをプールした場合でも、１つの腫瘍細胞株の特異的エピトープに特徴的なＭＨＣ‐ペプチドリガンドに対する要求密度は維持されていなければならない。このことは、黒色腫細胞株からのｃＲＮＡを、ＲＣＣ‐２６細胞株からのｃＲＮＡと組み合わせることにより、実験的に取り組むことができる。このプールされたｃＲＮＡを用いて同種異系（ＨＬＡ‐Ａ＊０２０１陽性）樹状細胞をパルスして、これらの樹状細胞が、まだ黒色腫特異的ＣＴＬクローン、すなわちＴｙｒＦ８と、ＲＣＣ特異的クローン、すなわちＴＩＬ‐２６との両方を活性化することができるかどうかを調べる。プールされたｃＲＮＡ（２種の腫瘍ｃＲＮＡから１：１で混合）が、両方のＴ細胞クローンを活性化するように機能することがこの実験により証明されれば、２種のｃＲＮＡの様々な比率を用いて、単独のｃＲＮＡ試料をどの程度まで希釈可能か、ＤＣプロセッシングおよび提示における機能までも判定することができる。いくつかの異なる腫瘍細胞株（例えば、３つのＲＣＣ細胞株）からプールされたｃＲＮＡに基づいてワクチンを製造し、特異的ＣＴＬの潜在的標的分子である様々な腎細胞癌腫において発現される既知の遺伝子由来のｃＲＮＡをさらに添加する。ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＭＵＣ１、ＰＳＭＡ、ＷＴ‐１、テロメラーゼおよびいくつかの他の候補を含みうる（９）。これらの個々のｃＲＮＡ種の添加の影響は、当該ｃＲＮＡをＲＣＣ‐２６のｃＲＮＡに添加して、パルスされた樹状細胞のＴＩＬ‐２６細胞活性化能力を調べることによって評価することができる。
（抗原提示細胞としての、自己樹状細胞とＨＬＡハプロタイプ一致樹状細胞との比較）
上記の実験は、ＨＬＡ‐Ａ＊０２０１によってコードされる分子だけを反応側Ｔ細胞と共用する、非血縁ドナーから得たｃＲＮＡパルス同種異系樹状細胞の使用を確立するために計画された。次の段階では、ＨＬＡハプロタイプ一致樹状細胞が、ｃＲＮＡによって樹状細胞に転移された腫瘍関連エピトープに対してＴ細胞をプライミングできることを実証する。ＨＬＡハプロタイプ一致ＤＣが、３つのクラスＩ対立遺伝子（ＨＬＡ‐Ａ，ＨＬＡ‐ＢおよびＨＬＡ‐Ｃ）および３つのクラスＩＩ対立遺伝子（ＨＬＡ‐ＤＲ，ＨＬＡ‐ＤＱおよびＨＬＡ‐ＤＰ）をＴ細胞と共用しているという理由からこの戦略を選ぶ。異なるクラスＩ分子は、それぞれ唯一のペプチド組と結合し、異なるＣＤ８＋ＣＴＬをプライミングし、３つのクラスＩＩによってコードされる分子もまたそれぞれ、クラスＩ分子のものとは明確に区別される異なるペプチド組に結合する。これらのクラスＩＩ‐ペプチドリガンドは、免疫反応の最適な進展を補助するか、もしくはエフェクタ細胞として直接機能するサイトカインを提供することのできる別のタイプのＴリンパ球であるＣＤ４細胞を活性化する（１１）。
【００３４】
ＨＬＡハプロタイプ一致樹状細胞の役割を解析する実験は、正常な対照ドナー（ドナー＃１）から調製した自己樹状細胞と、選択されたＨＬＡ型の家族（ドナー＃２）（すなわち、一方のＨＬＡハプロタイプがドナー１と共通で、第２のＨＬＡハプロタイプが一致しない親または兄弟姉妹を選択：図２を参照）から調製したＨＬＡハプロタイプ一致樹状細胞とを比較することにより実施する。いずれのドナーから調製したＤＣもＲＣＣ‐２６または黒色腫細胞株のｃＲＮＡでパルスする。得られたＤＣについて、まず上述のようにして、ＴｙｒＦ８およびＴＩＬ‐２６細胞からのインターフェロンγ分泌を刺激する能力について調べる。次の段階では、ドナー＃１由来のＰＢＬを、ｃＲＮＡでパルスした自己樹状細胞またはドナー２のＨＬＡハプロタイプ一致樹状細胞によってｉｎ  ｖｉｔｒｏで刺激する。２回以上刺激した後、異なるＭＨＣ分子（クラスＩおよびクラスＩＩの両方）によって提示されるエピトープを認識するＴ細胞が存在するかどうかを評価する。この評価は、特異的モノクローナル抗体の存在または非存在下、ｃＲＮＡでパルスした自己樹状細胞による刺激を行った後に、該Ｔ細胞のインターフェロンγ分泌を測定することにより実施する。ＭＨＣクラスＩ特異的モノクローナル抗体（Ｗ６／３２）は、ＣＤ８＋ＣＴＬと樹状細胞との間の相互作用を阻止する。ＨＬＡ‐Ａ、ＨＬＡ‐ＢまたはＨＬＡ‐Ｃ分子に特異的なモノクローナル抗体の存在下でのインターフェロンγ分泌の減少は、異なるクラスＩ分子と共同してそれらのペプチドを認識するＣＴＬがどの程度存在するかを証明するものである。クラスＩＩ拘束性ＣＤ４＋細胞の存在は、ＨＬＡ‐ＤＲ，ＨＬＡ‐ＤＱおよびＨＬＡ‐ＤＰ分子と反応するクラスＩＩ特異的モノクローナル抗体を用いることを除いては同様の手法で解明することができる（１７）。
【００３５】
本発明に従うｃＲＮＡの製造を、以下のフローチャートによって説明する。
（ｃＲＮＡ調製のためのフローチャート）
１）腫瘍細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養（例えば、黒色腫細胞株９３０４．Ａ１２および腎細胞癌腫細胞株、ＲＣＣ−２６）
２）腫瘍細胞株からＲＮＡを抽出（例えば、キアゲン（Ｑｕｉｇｅｎ）社の「ＲＮＡＥａｓｙ」キット＃７５４１２を用いて）
３）第１のｃＤＮＡ鎖の合成を実施（例えば、クロンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）社の「Ｓｍａｒｔ  ＰＣＲ」ｃＤＮＡ合成キット＃Ｋ１０５２を用いて）
４）ｃＤＮＡ増幅を実施（例えば、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社の“Ｓｍａｒｔ  ＰＣＲ”ｃＤＮＡ合成キット＃Ｋ１０５２を用いて）
５）ｃＤＮＡのｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写を実施（例えば、アンビオン（Ａｍｂｉｏｎ）社の「ｍＭｅｓｓａｇｅ−ｍＭａｃｈｉｎｅ」キット＃１３４４を用いて）
６）ｃＲＮＡを精製（例えば、Ｑｕｉｇｅｎ社の「ＲＮＡＥａｓｙ」キット＃７５１４２を用いて）
７）ｃＲＮＡの完全性を試験（例えば、パーキンエルマー（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）社の「Ｏｎｅ  ＳｔｅｐＲＴ／ＰＣＲ」キット＃Ｐ／Ｎ４３０８２０６を用いて）
【００３６】
【表１】
2004526731.tif 000002
【００３７】
【表２】
2004526731.tif 000003
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】自己腫瘍細胞と非血縁者の同種異系樹状細胞とが融合された、クグラー（Ｋｕｇｌｅｒ）らによる同種異系腫瘍ワクチンの生産の原理を示す図。
【図２】ＨＬＡハプロタイプ一致抗原提示細胞を用いることによって半同種異系ワクチンを生産する本発明の手法を示す図。
【００３９】
ハプロタイプ特異的ワクチンは以下の特徴を示す。
−ＭＨＣとＴＡＡ（腫瘍関連抗原）ペプチドとで構成される、患者の対立遺伝子の半分に対するリガンド。
−２つのハプロタイプ一致ＤＣ調製物により、すべての対立遺伝子を一致させてもよい。
−アロ反応およびヘルパーＴ細胞刺激のためのＨＬＡ不一致ＭＨＣ‐ペプチドリガンド。
−免疫反応の最適な促進のための、ＤＣから誘導された同時刺激分子とサイトカイン（図中では「Ｙ字形」で示す）。
【図１】
2004526731.tif 000004
【図２】
2004526731.tif 000005
【国際公開パンフレット】
2004526731.tif 000006
2004526731.tif 000007
2004526731.tif 000008
2004526731.tif 000009
2004526731.tif 000010
2004526731.tif 000011
2004526731.tif 000012
2004526731.tif 000013
2004526731.tif 000014
2004526731.tif 000015
2004526731.tif 000016
2004526731.tif 000017
2004526731.tif 000018
2004526731.tif 000019
2004526731.tif 000020
2004526731.tif 000021
2004526731.tif 000022
2004526731.tif 000023
2004526731.tif 000024
2004526731.tif 000025
2004526731.tif 000026
2004526731.tif 000027
2004526731.tif 000028
2004526731.tif 000029
2004526731.tif 000030
2004526731.tif 000031
【手続補正書】
【提出日】平成15年3月5日(2003.3.5)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者における腫瘍疾病の治療のためのＨＬＡハプロタイプ一致抗原提示細胞の製造方法であって、
ドナーから、患者の抗原提示細胞に対してＨＬＡハプロタイプが一致する抗原提示細胞を提供する工程と、
腫瘍細胞内で過剰発現されるか、もしくは自己腫瘍細胞から誘導されたタンパク質およびペプチドのうち少なくともいずれか、または前記タンパク質およびペプチドのうち少なくともいずれかをコードするＲＮＡもしくはＤＮＡもしくはｃＤＮＡを、ＨＬＡハプロタイプ一致抗原提示細胞に導入する工程とを含む方法。
【請求項２】
いくつかの異なる腫瘍細胞株由来のタンパク質およびペプチドのうち少なくともいずれか、または前記タンパク質およびペプチドのうち少なくともいずれかをそれぞれコードするＲＮＡもしくはＤＮＡもしくはｃＤＮＡが、ＨＬＡハプロタイプ一致抗原提示細胞に導入されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
最初に腫瘍細胞由来のＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写し、該ｃＤＮＡをＰＣＲによって増幅し、続いて該ｃＤＮＡをＲＮＡに転写することを特徴とする請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
２人の異なるＨＬＡハプロタイプ一致個体の抗原提示細胞が用いられることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
請求項１〜４に記載の方法によって得ることのできるＨＬＡハプロタイプ一致抗原提示細胞。
【請求項６】
前記腫瘍細胞内で過剰発現されるか、もしくは自己腫瘍細胞から誘導されたタンパク質およびペプチドのうち少なくともいずれか、または前記タンパク質およびペプチドのうち少なくともいずれかをコードするＲＮＡもしくはＤＮＡもしくはｃＤＮＡは、以下の腫瘍
細胞、すなわち、好ましくは卵巣、乳房および腎細胞癌腫のような癌腫、好ましくは白血病およびリンパ腫の細胞のような造血系の腫瘍細胞、好ましくは肉腫のような間葉性腫瘍の細胞、上皮腫瘍の細胞、好ましくは黒色腫のような外胚葉腫瘍の細胞、ならびに好ましくは芽球腫および奇形腫のような未分化組織からの胚芽腫の細胞から選ばれることを特徴とする請求項５に記載のＨＬＡハプロタイプ一致抗原提示細胞。
【請求項７】
いくつかの異なる腫瘍細胞株由来のタンパク質およびペプチドのうち少なくともいずれか、または前記タンパク質およびペプチドのうち少なくともいずれかをコードするＲＮＡもしくはＤＮＡもしくはｃＤＮＡを含有する請求項５または６に記載のＨＬＡハプロタイプ一致抗原提示細胞。
【請求項８】
前記抗原提示細胞は、樹状細胞またはマクロファージであることを特徴とする請求項５〜７に記載のＨＬＡハプロタイプ一致抗原提示細胞。
【請求項９】
請求項５〜８のいずれか１項に記載のＨＬＡハプロタイプ一致抗原提示細胞を含有する医薬組成物。
【請求項１０】
ワクチンであることを特徴とする請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
患者における腫瘍疾病の治療のための、請求項５〜８のいずれか１項に記載のＨＬＡハプロタイプ一致抗原提示細胞の用途。
【請求項１２】
前記腫瘍細胞は、好ましくは卵巣、乳房および腎細胞癌腫のような癌腫の細胞、好ましくは白血病およびリンパ腫の細胞のような造血系の腫瘍細胞、好ましくは肉腫のような間葉性腫瘍の細胞、上皮腫瘍の細胞、好ましくは黒色腫のような外胚葉腫瘍の細胞、ならびに好ましくは芽球腫および奇形腫のような未分化組織からの胚芽腫の細胞を含むことを特徴とする請求項１１に記載の用途。
【請求項１３】
前記ＨＬＡハプロタイプ一致抗原提示細胞は、好ましくは卵巣、乳房および腎細胞癌腫のような癌腫、好ましくは白血病およびリンパ腫のような造血系の腫瘍、好ましくは肉腫のような間葉性腫瘍、上皮腫瘍、好ましくは黒色腫のような外胚葉腫瘍、ならびに好ましくは芽球腫および奇形腫のような未分化組織からの胚芽腫を含む腫瘍の治療のために用いられることを特徴とする請求項１２に記載の用途。
【請求項１４】
２人の異なるＨＬＡハプロタイプ一致個体のＨＬＡハプロタイプ一致抗原提示細胞が用いられることを特徴とする請求項１１〜１３のいずれか１項または複数項に記載の用途。
【請求項１５】
自己腫瘍細胞からｃＤＮＡに逆転写し、該ｃＤＮＡをＰＣＲによって増幅した後に該ｃＤＮＡをＲＮＡに転写して得られたＲＮＡが用いられることを特徴とする請求項１４に記載の用途。
【請求項１６】
前記ＨＬＡハプロタイプ一致抗原提示細胞は、静脈内、皮下または筋肉内経路によって投与されることを特徴とする請求項１１〜１５のいずれか１項または複数項に記載の用途。
【請求項１７】
腫瘍細胞内で過剰発現されるか、あるいは自己腫瘍細胞から誘導されたタンパク質およびペプチドのうち少なくともいずれか、または前記タンパク質およびペプチドのうち少なくともいずれかをそれぞれコードするＲＮＡもしくはＤＮＡもしくはｃＤＮＡが、組換え技術により導入されている請求項１１〜１６のいずれか１項に記載のＨＬＡハプロタイプ一致抗原提示細胞の用途。
【請求項１８】
腫瘍明示化抗原をコードするＲＮＡもしくはＤＮＡもしくはｃＤＮＡがＨＬＡハプロタイプ一致抗原提示細胞に導入されていることを特徴とし、該腫瘍明示化抗原は、腫瘍細胞内で過剰発現される抗原であって、好ましくは、腫瘍遺伝子（好ましくはＨＥＲ２／ｎｅｕ）、腫瘍に増殖優位性を与えるか腫瘍の生存を保証するかの少なくともいずれかの作用を有するタンパク質（好ましくはＰＳＭＡ）、細胞周期調節タンパク質、転写因子（好ましくはＷＴ‐１）、ムチン（好ましくはＭＵＣ‐１）、細胞分裂の調節に関与するタンパク質（好ましくはテロメラーゼ）から選択される、請求項１１〜１７のいずれか１項または複数項に記載の用途。
【請求項１９】
前記抗原提示細胞は樹状細胞またはマクロファージであることを特徴とする請求項１１〜１８のいずれか１項または複数項に記載の用途。
【請求項２０】
いくつかの異なる腫瘍細胞株由来のタンパク質およびペプチドのうち少なくともいずれか、または前記タンパク質およびペプチドのうち少なくともいずれかをコードするＲＮＡもしくはＤＮＡもしくはｃＤＮＡが、患者における腫瘍疾病の治療のために導入されている請求項１１〜１９のいずれか１項または複数項に記載のＨＬＡハプロタイプ一致抗原提示細胞の用途。
【請求項２１】
２つまたは３つの異なる腫瘍細胞株からプールされたｃＲＮＡが導入されていることを特徴とする請求項２０に記載の用途。
【国際調査報告】
2004526731.tif 000032
2004526731.tif 000033
2004526731.tif 000034
2004526731.tif 000035
2004526731.tif 000036
2004526731.tif 000037
2004526731.tif 000038
2004526731.tif 000039
2004526731.tif 000040