(57)【要約】本発明は、新規の治療用および診断用アレイに関する。より具体的には、本発明は疾患の診断および治療（例えば、癌の診断および治療）に使用するための、デンドリマーに基づく多機能組成物、およびシステムに向けられる。組成物およびシステムは、通常、診断用および治療用物質の標的化、画像化、感知、および／またはその放出の誘発、ならびに治療に対する細胞または組織（例えば、腫瘍）の応答のモニタリングに関する、二つまたはそれ以上の異なる成分を含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
デンドリマー複合体を含む組成物であって、デンドリマー複合体が第一および第二のデンドリマーを含み、該第一のデンドリマーが第一の薬剤を含み、該第二のデンドリマーが第二の薬剤を含み、該第一の薬剤が該第二の薬剤とは異なる組成物。
【請求項２】
第一および第二の薬剤を、治療薬、生物学的モニタリング剤、生物学的画像化（ｉｍａｇｉｎｇ）剤、標的化（ｔａｒｇｅｔｉｎｇ）剤、および細胞異常の特異的サイン（ｓｉｇｎａｔｕｒｅ）を同定することが可能な薬剤からなる群より選択する、請求項１記載の組成物。
【請求項３】
第一のデンドリマーが第二のデンドリマーに共有結合で連結した、請求項１記載の組成物。
【請求項４】
第三のデンドリマーをさらに含み、該第三のデンドリマーが、第一および第二のデンドリマーに共有結合で連結した、請求項１記載の組成物。
【請求項５】
第一のデンドリマーが第二のデンドリマーと共有結合で結合していない、請求項４記載の組成物。
【請求項６】
第三のデンドリマーと複合体を形成した（ｃｏｍｐｌｅｘｅｄ）第三の薬剤をさらに含む、請求項４記載の組成物。
【請求項７】
第三の薬剤を含む第四のデンドリマーをさらに含み、該第四のデンドリマーが該第三のデンドリマーに共有結合で連結した、請求項４記載の組成物。
【請求項８】
第四の薬剤を含む第五のデンドリマーをさらに含み、該第五のデンドリマーが第三のデンドリマーと複合体を形成している、請求項７記載の組成物。
【請求項９】
第一の薬剤が治療薬であり、かつ第二の薬剤が生物学的モニタリング剤である、請求項１記載の組成物。
【請求項１０】
治療薬が化学療法剤、癌抑制剤（ａｎｔｉ−ｏｎｃｏｇｅｎｉｃ）、抗血管新生剤、および治療用タンパク質をコードする核酸を含む発現構築物から選択される、請求項９記載の組成物。
【請求項１１】
治療薬が感光性（ｐｈｏｔｏ−ｌａｂｉｌｅ）、非放射線耐性（ｒａｄｉｏ−ｌａｂｉｌｅ）、および非酵素耐性（ｅｎｚｙｍｅ−ｌａｂｉｌｅ）の保護基から選択される保護基で保護されている、請求項９記載の組成物。
【請求項１２】
化学療法剤が、白金複合体、ベラパミル、ポドフィロトキシン、カルボプラチン、プロカルバジン、メクロレタミン、シクロホスファミド、カンプトセシン、イホスファミド、メルファラン、クロランブシル、ビサルファン（ｂｉｓｕｌｆａｎ）、ニトロソウレア、アドリアマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ブレオマイシン、プリコマイシン（ｐｌｉｃｏｍｙｃｉｎ）、マイトマイシン、エトポシド、タモキシフェン、タキソール、トランスプラチナ（ｔｒａｎｓｐｌａｔｉｎｕｍ）、５−フルオロウラシル、ビンクリスチン、ビンブラスチンとメトトレキサートから選択される、請求項１０記載の組成物。
【請求項１３】
癌抑制剤がアンチセンス核酸を含む、請求項１０記載の組成物。
【請求項１４】
アンチセンス核酸が発癌遺伝子のＲＮＡに相補的な配列を含む、請求項１３記載の組成物。
【請求項１５】
発癌遺伝子が、ａｂｌ、Ｂｃｌ−２、Ｂｃｌ−ｘ１、ｅｒｂ、ｆｍｓ、ｇｓｐ、ｈｓｔ、ｊｕｎ、ｍｙｃ、ｎｅｕ、ｒａｆ、ｒａｓ、ｒｅｔ、ｓｒｃ、またはｔｒｋから選択される、請求項１４記載の組成物。
【請求項１６】
核酸が腫瘍サプレッサー、サイトカイン、受容体、アポトーシス誘導物質、または分化作用因子から選択される因子をコードする、請求項１０記載の組成物。
【請求項１７】
腫瘍サプレッサーがＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、Ｃ−ＣＡＭ、ｐｌ６、ｐ２１、ｐ５３、ｐ７３、Ｒｂ、およびｐ２７から選択される、請求項１６記載の組成物。
【請求項１８】
サイトカインがＧＭＣＳＦ、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、β−インターフェロン、γ−インターフェロン、およびＴＮＦから選択される、請求項１６記載の組成物。
【請求項１９】
受容体がＣＦＴＲ、ＥＧＦＲ、エストロゲン受容体、ＩＬ−２受容体、およびＶＥＧＦＲから選択される、請求項１６記載の組成物。
【請求項２０】
アポトーシス誘導物質がＡｄＥｌＢ、Ｂａｄ、Ｂａｋ、Ｂａｘ、Ｂｉｄ、Ｂｉｋ、Ｂｉｍ、Ｈａｒａｋｉｄ、およびＩＣＥ−ＣＥＤ３プロテアーゼから選択される、請求項１６記載の組成物。
【請求項２１】
生物学的モニタリング剤が治療薬の効果を測定する薬剤を含む、請求項２記載の組成物。
【請求項２２】
治療薬が半減期の短い放射性同位元素を含む、請求項２記載の組成物。
【請求項２３】
画像化剤が、１４Ｃ、３６ＣＩ、５７Ｃｏ、５８Ｃｏ、５１Ｃｒ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１１１Ｉｎ、１５２Ｅｕ、５９Ｆｅ、６７Ｇａ、３２Ｐ、１８６Ｒｅ、３５Ｓ、７５Ｓｅ、Ｔｃ−９９ｍ、および１６９Ｙｂから選択される放射性標識を含む、請求項２記載の組成物。
【請求項２４】
モニタリング剤が、治療薬によって引き起こされるアポトーシスの量を測定し得る、請求項２１記載の組成物。
【請求項２５】
標的化剤が、抗体、受容体リガンド、ホルモン、ビタミン、および抗原から選択される、請求項２記載の組成物。
【請求項２６】
抗体が疾患特異的抗原に特異的である、請求項２５記載の組成物。
【請求項２７】
疾患特異的抗原が腫瘍特異的抗原を含む、請求項２６記載の組成物。
【請求項２８】
受容体リガンドが、ＣＦＴＲ、ＥＧＦＲ、エストロゲン受容体、ＦＧＲ２、葉酸受容体、ＩＬ−２受容体、糖タンパク質、およびＶＥＧＦＲに対するリガンドから選択される、請求項２５記載の組成物。
【請求項２９】
第一および第二のデンドリマーがＰＡＭＡＭデンドリマーを含み、かつ第三のデンドリマーがＰＯＰＡＭデンドリマーを含む、請求項４記載の組成物。
【請求項３０】
デンドリマー複合体が、第二のデンドリマーと複合体を形成した第一のデンドリマーからなる、請求項１記載の組成物。
【請求項３１】
以下の段階を含む、細胞を処理する方法：
（ａ）以下を提供する段階：
（ｉ）細胞；および
（ｉｉ）デンドリマー複合体を含む組成物であって、デンドリマー複合体が第一および第二のデンドリマーを含み、該第一のデンドリマーが第一の薬剤を含み、かつ該第二のデンドリマーが第二の薬剤を含み、ここで該第一の薬剤が該第二の薬剤とは異なる組成物；ならびに
（ｂ）該細胞を該組成物に曝露する段階。
【請求項３２】
第一および第二の薬剤が、治療薬、生物学的モニタリング剤、生物学的画像化剤、標的化剤、および細胞異常の特異的サインを同定することが可能な薬剤からなる群より選択される、請求項３１記載の方法。
【請求項３３】
第一のデンドリマーが第二のデンドリマーに共有結合で連結した、請求項３１記載の方法。
【請求項３４】
第三のデンドリマーをさらに含み、第三のデンドリマーが第一および第二のデンドリマーに共有結合で連結している、請求項３１記載の方法。
【請求項３５】
第三のデンドリマーと複合体を形成した第三の薬剤をさらに含む、請求項３４記載の方法。
【請求項３６】
第三の薬剤を含む第四のデンドリマーをさらに含み、第四のデンドリマーが該第三のデンドリマーに共有結合で連結している、請求項３４記載の方法。
【請求項３７】
第四の薬剤含む第五のデンドリマーをさらに含み、第五のデンドリマーが第三のデンドリマーと複合体を形成している、請求項３６記載の方法。
【請求項３８】
第一の薬剤が治療薬であり、かつ第二の薬剤が生物学的モニタリング剤である、請求項３１記載の方法。
【請求項３９】
細胞が対象中に存在する、請求項３１記載の方法。
【請求項４０】
対象が疾患を有する、請求項３９記載の方法。
【請求項４１】
疾患が、癌、心血管疾患、炎症性疾患、およびプリオン型疾患からなる群より選択される、請求項４０記載の方法。
【請求項４２】
治療薬が不活性型であり、対象へ組成物を投与した後に活性になる、請求項３８記載の方法。
【請求項４３】
対象が腫瘍を有する、請求項３９記載の方法。
【請求項４４】
細胞を組成物に曝露する段階が、該組成物を対象に投与する段階を含む、請求項３９記載の方法。
【請求項４５】
投与が、内視鏡的投与、気管内投与、病巣内投与、経皮的投与、静脈内投与、皮下投与および腫瘍内投与から選択される、請求項４４記載の方法。
【請求項４６】
癌が、肺癌、乳癌、黒色腫、大腸癌、腎癌、精巣癌、卵巣癌、肺癌、前立腺癌、肝癌，胚性腫瘍、上皮癌、前立腺癌、頭部および頚部の癌、膵癌、神経膠芽細胞腫、星状細胞腫、乏突起神経膠腫、脳室上衣細胞腫、神経線維肉腫、髄膜腫、肝臓癌、脾臓癌、リンパ節癌、小腸癌、大腸癌、胃癌、甲状腺癌、子宮内膜癌、前立腺癌、皮膚癌、食道癌、ならびに骨髄腫から選択される、請求項４１記載の方法。
【請求項４７】
第一のデンドリマーが第一の核酸リンカーを含み、かつ第二のデンドリマーが第二の核酸リンカーを含み、ここで該第一の核酸リンカーが該第二の核酸リンカーとハイブリダイズする、請求項１または３１記載の組成物。
【請求項４８】
第一のリンカーと第二のリンカーのハイブリダイゼーションにより形成された二重鎖が切断部位を含む、請求項４７記載の組成物。
【請求項４９】
切断部位がヌクレアーゼ認識部位を含む、請求項４８記載の組成物。
【請求項５０】
ヌクレアーゼ認識部位が制限エンドヌクレアーゼ認識部位を含む、請求項４９記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明は、新規の治療用および診断用システムに関する。より具体的には、本発明はデンドリマーに基づく多機能組成物、および疾患の診断および治療（例えば、癌の診断および治療）における用途を目的とするシステムに関する。組成物およびシステムは、通常、診断および治療に関係する物質の標的化、画像化、検出、および／またはその放出の誘導、ならびに治療に対する細胞または組織（例えば、腫瘍）の応答をモニターするための二つまたはそれ以上の異なる成分を含む。
【０００２】
発明の背景
多数の形状の新生物に罹患した患者の生存率は、新規の化学療法剤および放射線療法剤により改善されている。現在、複数の癌で５年生存率は８０％を超える。しかしながら、このような成功にもかかわらず、癌治療に関しては未だに多くの問題が存在する。例えば、大腸癌等の多くの癌は、一般的に利用可能な治療法にあまり反応しない。
【０００３】
既存の方法に反応する種類の腫瘍についても、そのような治療法によく反応するものはごく一部にすぎない。また、多くの癌に対して治療法が改善されていても、現在用いられている治療薬の大部分は、副作用が強い。このような副作用により、化学療法剤の使用が制限され、そのため治療に関する選択肢のない癌患者がかなりいる。遺伝子治療および免疫療法等、別の種類の治療法は、化学療法よりも特異性が高く副作用も少ないことが示されている。これらの方法も臨床試験では改善されつつあるが、現在のところまだ実用には少々問題が残る。
【０００４】
既存の治療法は限られた成功しか収めていないが、新生物細胞の生物学に関する理解は進んだ。悪性形質転換および細胞増殖の変化に関する細胞事象は現在明らかにされ、ヒトの複数種類の腫瘍における癌化に関し、複数の過程についての報告がある（例えば、Ｉｓａａｃｓ、Ｃａｎｃｅｒ ７０：１８１０ ［１９９２］を参照）。無秩序な細胞増殖を引き起こす発癌遺伝子が同定され、その遺伝的起源および機能について特徴付けがなされている。細胞の複製サイクルを制御する特異的経路について詳細な特徴付けがなされ、この制御に関わるタンパク質のクローン化および特徴付けがなされている。また、アポトーシスを媒介し、細胞増殖を負に制御する分子について詳細が明らかにされている（Ｋｅｒｒ、ら、Ｃａｎｃｅｒ ７３：２０１３ ［１９９４］）。これら細胞制御経路を操作することによって、新生物細胞の増殖を止め、アポトーシスの誘導が可能であることが現在示されている（例えば、ＣｏｈｅｎおよびＴｏｈｏｋｕ， Ｅｘｐ． Ｍｅｄ．，１６８：３５１ ［１９９２］ ならびにＦｕｊｉｗａｒａら、Ｊ． Ｎａｔｌ． Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．， ８６：４５８ ［１９９４］）。新生物細胞の細胞増殖および複製を制御する代謝経路は、治療の重要な標的である。
【０００５】
印象的な成果にもかかわらず、これらの治療法が癌細胞のインビボ治療法として利用するには、まだ多くの障害がある。例えばこれらの治療では、個体の特定の腫瘍細胞における、特異的な病態生理学的変化を同定する必要がある。このためには、腫瘍の機械的侵襲（生検）ならびに通常はインビトロでの細胞培養および試験による診断が必要である。次に、治療法の選択と実施の前に、腫瘍の形質を解析しなくてはならない。このような段階は時間がかかり、複雑でかつ費用もかかる。
【０００６】
正常細胞と比較した腫瘍細胞の治療法を選択することが必要となる。現行の治療法は、腫瘍細胞に対して比較的特異的であるにすぎない。腫瘍を標的とする場合には、このような選択性の問題が扱われるが、大部分の腫瘍は固有の抗原を持たないため、これは適切ではない。さらに、治療法は理想的には耐性新生物が選択されることを予防するために、平行して機能する複数の異なる作用機序を必要とし、腫瘍の部位と種類を確認した後、医師によって解除されうるべきである。最終的に、治療は理想的には治療前および直後に、医師が残留しているかまたは最小化した疾患を同定でき、治療に対する反応をモニターできるものでなくてはならない。残留する少数の細胞が再増殖または悪化し、治療に耐性の腫瘍を形成することがあるため、これは重要な要件である。治療の終わりに（すなわち、腫瘍の再増殖後でなく治療実施後）、残りの疾患を同定すれば、残留している数少ない腫瘍細胞の根絶が容易になる。
【０００７】
従って、理想的な治療では、腫瘍を標的とし、腫瘍の程度を画像化し、腫瘍細胞における治療薬の存在を同定できるべきである。理想的には、医師がなぜ細胞が新生物へと形質転換したのかを判定し、腫瘍細胞の病態生理学的異常に基づいて治療薬分子を選択し、異常細胞においてのみ治療薬を活性化させ、治療に対する反応を記録し、疾患の残留を同定することができる。
【０００８】
発明の概要
本発明は、新規の治療用および診断用システムに関する。より具体的には、本発明は、デンドリマーに基づく疾患の診断および治療（例えば、癌の診断および治療）用の、多機能組成物およびシステムに関する。組成物およびシステムは、通常、診断または治療用物質の標的化、画像化、感知、および／またはその放出の誘発、ならびに治療に対する細胞または組織（例えば、腫瘍）の応答のモニタリングに関する、二つまたはそれ以上の異なる成分を含む。
【０００９】
例えば、本発明は、デンドリマー複合体を含む組成物を提供し、該デンドリマー複合体は第一および第二のデンドリマーを含み、第一のデンドリマーは第一の薬剤を含み、かつ第二のデンドリマーは第二の薬剤を含み、ここで第一の薬剤は第二の薬剤とは異なる。好ましい態様においては、第一および第二の薬剤は、治療薬、生物学的モニタリング剤、生物学的画像化剤、標的化剤、および細胞異常の特異的サインを同定することが可能な薬剤からなる群より選択される。ある態様においては、第一のデンドリマーは、第二のデンドリマーと共有結合で結合している。ある態様においては、デンドリマー複合体は、別のデンドリマーを含む。例えば、ある態様においては、複合体は第三のデンドリマーを含む（例えば、第三のデンドリマーは第一および第二のデンドリマーに共有結合で連結している）。さらに別の態様においては、デンドリマー複合体は、第四、第五、または別のデンドリマーを含む。個々のデンドリマーは薬剤を含んでいてもよい。
【００１０】
ある態様においては、本発明は以下を含む組成物を提供する：ここで第一のおよび第二のデンドリマーが、少なくとも１つのデンドリマーと複合体形成（例えば、共有結合により結合）しており、（例えば、それぞれ、共通の第三のデンドリマーと、またはそれぞれ別々に第三および第四のデンドリマーと）、かつ第一の薬剤は第二の薬剤と異なり、かつ第一および第二の薬剤は、治療薬、生物学的モニタリング剤（すなわち、生物学的物質または事象をモニターできる薬剤）、生物学的画像化剤（すなわち、生物学的物質または事象を画像化できる薬剤）、標的化剤（すなわち、生物学的物質を標的化できる薬剤（すなわち、生物学的物質と特異的に相互作用する））、および細胞の同一性の特異的サインを同定できる薬剤（すなわち、他の種類の細胞から該細胞を区別するのに役立つ細胞の特徴を同定できる（例えば、特定の細胞異常に特異的な細胞内タンパク質））からなる群より選択される、第一の薬剤を含む第一のデンドリマー、および第二の薬剤を含む第二のデンドリマー。本発明はデンドリマーの性質によって限定されるものではない。本発明の用途に好ましいデンドリマーには、ポリアミドアミン（ＰＡＭＡＭ）、ポリプロピルアミン（ＰＯＰＡＭ）、ポリエチレンイミン、イプティセン（ｉｐｔｙｃｅｎｅ）、脂肪族ポリエーテル、および／または芳香族ポリエーテルのデンドリマーが含まれるが、これらに限定されない。デンドリマー複合体中の個々のデンドリマーは、他のデンドリマーと化学的性質が類似していても、異なってもよい（例えば、第一のデンドリマーはＰＡＭＡＭデンドリマーを含む一方で、第二のデンドリマーはＰＯＰＡＭデンドリマーを含んでもよい）。ある態様においては、第一または第二のデンドリマーはさらに、別の薬剤を含むことができる。
【００１１】
本発明のある態様においては、デンドリマー複合体はさらに、一つまたは複数の別のデンドリマーを含んでいてもよい。例えば、組成物はさらに、第三のデンドリマーを含みうるが、ここで第三のデンドリマーは、少なくとも一つの他のデンドリマーと複合体形成している。ある態様においては、第三の薬剤は第三のデンドリマーと複合体形成している。ある態様においては、第一および第二のデンドリマーはそれぞれ、第三のデンドリマーと複合体形成している。好ましい態様においては、第一および第二のデンドリマーは、ＰＡＭＡＭデンドリマーを含み、かつ第三のデンドリマーは、ＰＯＰＡＭデンドリマーを含む。ある態様においては、本発明はさらに、薬剤（例えば、第三および第四の薬剤）を含む、第四および／または第五のデンドリマーを含み、ここで第四および／または第五のデンドリマーはまた、第三のデンドリマーと複合体（例えば、共有結合により結合）形成している。本発明は、互いに複合体を形成したデンドリマーの数によって制限されるものではない。
【００１２】
本発明のある態様においては、第一の薬剤は治療薬であり、第二の薬剤は生物学的モニタリング剤である。好ましい態様においては、治療薬は化学療法剤、癌抑制剤、抗血管新生剤、抗微生物剤または抗病原体剤、および治療用タンパク質をコードする核酸を含む発現構築物を含むが、これらに限定されない。ある態様においては、治療薬は、感光性、非放射線耐性、および非酵素耐性の保護基から選択される保護基で保護されている。好ましい態様においては、化学療法剤は、白金複合体、ベラパミル、ポドフィロトキシン、カルボプラチン、プロカルバジン、メクロレタミン、シクロホスファミド、カンプトセシン、イホスファミド、メルファラン、クロランブシル、ビサルファン、ニトロソウレア、アドリアマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ブレオマイシン、プリコマイシン、マイトマイシン、エトポシド、タモキシフェン、タキソール、トランスプラチナ、５−フルオロウラシル、ビンクリスチン、ビンブラスチン、およびメトトレキサートを含むが、これらに限定されない。ある態様においては、癌抑制性の薬剤はアンチセンス核酸を含む。ある態様においては、アンチセンス核酸は、発癌遺伝子のＲＮＡに相補的な配列を含む。好ましい態様においては、発癌遺伝子は、ａｂｌ、Ｂｃｌ−２、Ｂｃｌ−ｘ１、ｅｒｂ、ｆｍｓ、ｇｓｐ、ｈｓｔ、ｊｕｎ、ｍｙｃ、ｎｅｕ、ｒａｆ、ｒａｓ、ｒｅｔ、ｓｒｃ、またはｔｒｋを含むが、これらに限定されない。ある態様においては、治療用タンパク質をコードする核酸は、腫瘍サプレッサー、サイトカイン、受容体、アポトーシス誘導物質、または分化作用因子を含む因子をコードするが、これらに限定されない。好ましい態様においては、腫瘍サプレッサーは、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、Ｃ−ＣＡＭ、ｐ１６、ｐ２１、ｐ５３、ｐ７３、Ｒｂ、およびｐ２７を含むが、これらに限定されない。好ましい態様においては、サイトカインは、ＧＭＣＳＦ、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＥＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＥＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、β−インターフェロン、γ−インターフェロン、およびＴＮＦを含むが、これらに限定されない。好ましい態様においては、受容体は、ＣＦＴＲ、ＥＧＦＲ、エストロゲン受容体、ＩＬ−２受容体およびＶＥＧＦＲを含むが、これらに限定されない。好ましい態様においては、アポトーシス誘導物質は、ＡｄＥｌＢ、Ｂａｄ、Ｂａｋ、Ｂａｘ、Ｂｉｄ、Ｂｉｋ、Ｂｉｍ、Ｈａｒａｋｉｄ、およびＩＣＥ−ＣＥＤ３プロテアーゼを含むが、これらに限定されない。ある態様においては、治療薬は半減期の短い放射性同位元素を含む。
【００１３】
本発明のある態様においては、生物学的モニタリング剤は、治療薬の効果を測定する（例えば、治療薬によって誘導される細胞内因子または反応を直接または間接的に測定する）薬剤を含む。しかしながら、本発明は生物学的モニタリング剤の性質によって限定されるものではない。ある態様においては、モニタリング剤は、治療薬によって引き起こされるアポトーシスの量を測定するか、または検出することが可能である。
【００１４】
本発明のある態様においては、画像化剤には、１４Ｃ、３６ＣＩ、５７Ｃｏ、５８Ｃｏ、５１Ｃｒ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１１１Ｉｎ  １５２Ｅｕ、５９Ｆｅ、６７Ｇａ、３２Ｐ、１８６Ｒｅ、３５Ｓ、７５Ｓｅ、Ｔｃ−９９ｍ、および１６９Ｙｂを含む放射性標識が含まれるが、これらに限定されない。また、本発明は画像化剤の性質によって限定されるものではない。
【００１５】
本発明のある態様においては、標的化剤は、抗体、受容体リガンド、ホルモン、ビタミンおよび抗原を含むが、標的化剤の性質によってこれらに限定されない。また、本発明は標的化剤の性質によって限定されるものではない。ある態様においては、抗体は疾患特異的抗原に特異的である。ある好ましい態様においては、疾患特異的抗原は腫瘍特異的抗原を含む。ある態様においては、受容体リガンドは、ＣＦＴＲ、ＥＧＦＲ、エストロゲン受容体、ＦＧＲ２、葉酸受容体、ＩＬ−２受容体、糖タンパク質、およびＶＥＧＦＲに対するリガンドを含むが、これらに限定されない。
【００１６】
本発明のある態様においては、第一および第二のデンドリマー（および第三の、第四の、等々）は、リンカーにより互いに結合している。ある好ましい態様においては、リンカーは核酸リンカーを含む。例えば、ある態様においては、第一のデンドリマーは第一の核酸リンカーを含み、かつ第二のデンドリマーは第二の核酸リンカーを含み、ここで第一の核酸リンカーは、第二の核酸リンカーとハイブリダイズしている。ある態様においては、第一のリンカーが第二のリンカーにハイブリダイゼーションすることにより形成された二重鎖は、切断部位（例えば、制限エンドヌクレアーゼ部位等のヌクレアーゼ認識部位）を含む。
【００１７】
本発明はまた、細胞およびデンドリマー複合体を含む組成物を提供する段階、ならびに細胞をデンドリマー複合体に曝露する段階を含む、デンドリマー複合体で細胞を処理する方法を提供する。ある態様においては、デンドリマー複合体は、第一の薬剤を含む第一のデンドリマーを含み、かつ第二のデンドリマーは第二の薬剤を含み、ここで第一のおよび第二のデンドリマーは、少なくとも一つのデンドリマーと複合体形成し、かつ第一の薬剤は第二の薬剤と異なり、ここで第一および第二の薬剤は、治療薬、生物学的モニタリング剤、生物学的画像化剤、標的化剤および細胞異常の特異的サインを同定できる薬剤からなる群より選択され、細胞を組成物に曝露させる。本発明は、細胞種の性質または曝露段階に限定されるものではない。例えば、本発明の細胞には、インビトロで存在する細胞（例えば、培養細胞）およびインビボで存在する細胞（例えば、ヒトもしくは対象動物の細胞または病原体細胞）が含まれるが、これらに限定されない。細胞が対象（例えば、ヒトまたは対象動物）中に存在する好ましい態様においては、対象は疾患を有する（例えば、細胞が腫瘍細胞等の疾患細胞である）。ある態様においては、疾患は、癌、心血管疾患、炎症性疾患、およびプリオン型疾患（すなわち、プリオンに関連するか、または起因する疾患）を含むが、これらに限定されない。
【００１８】
本発明のある態様においては、治療薬は不活性型であり、組成物を対象に投与した後に活性になる。例えば薬剤は、光またはｐＨ変化に曝されて（例えば、特定の細胞内環境への曝露により）活性型を呈するよう変化する。これらの態様においては、薬剤は、それを不活性化する保護リンカー（例えば、光開裂可能な、酵素により開裂可能な、ｐＨにより開裂可能なもの）に付加し、適当な活性化作用因子（例えば、紫外線、切断酵素、またはｐＨの変化）への曝露により活性になりうる。
【００１９】
本発明のある態様においては、対象は腫瘍を有するか、または癌の保有が疑われる。ある態様においては、癌には、肺癌、乳癌、黒色腫、大腸癌、腎癌、精巣癌、卵巣癌、肺癌、前立腺癌、肝癌，胚性腫瘍、上皮癌、前立腺癌、頭部および頚部の癌、膵癌、神経膠芽細胞腫、星状細胞腫、乏突起神経膠腫、脳室上衣細胞腫、神経線維肉腫、髄膜腫、肝臓癌、脾臓癌、リンパ節癌、小腸癌、大腸癌、胃癌、甲状腺癌、子宮内膜癌、前立腺癌、皮膚癌、食道癌、ならびに骨髄腫が含まれるが、これらに限定されない。ある態様においては、ナノデバイスを含む組成物、および他の任意の成分（例えば、薬学的に許容される担体、アジュバント、および賦形剤）を、対象に投与する。本発明は、投与経路によって限定されるものではない。このような投与経路には、内視鏡的投与、気管内投与、病巣内投与、経皮的投与、静脈内投与、皮下投与、および腫瘍内投与が含まれるが、これらに限定されない。
【００２０】
発明の概括的な説明
本発明は、新規の治療用および診断用の複合体に関する。より具体的には、本発明は、疾患の診断および治療（例えば、癌の診断および治療）に利用するための、デンドリマーに基づく多機能組成物およびシステムに関する。組成物およびシステムは、通常、診断用および治療用物質の標的化、画像化、感知、および／またはその放出の誘発、ならびに治療に対する細胞または組織（例えば、腫瘍）の応答をモニターするための、二つまたはそれ以上の異なる成分を含む。
【００２１】
例えば、本発明は二つまたはそれ以上のデンドリマーを含むナノデバイスを提供し、ここでそれぞれは、診断用および治療用物質の標的化、画像化、感知、および／またはその放出の誘発、ならびに治療に対する細胞または組織の応答をモニターするための、一つまたは複数の異なる成分と複合体形成している。本発明のある態様においては、ナノデバイスは、上記の機能性を有する他のデンドリマーサブユニットと複合体を形成した、コア・デンドリマー（例えば、共有結合により連結した）を含む。本発明によってこのような組成物には毒性がないことが証明され、様々な生理学的条件を治療、検出、およびモニターする新規の方法が示される。例えば、ある態様においては、ナノデバイスは、ナノデバイスを特定の細胞または組織に向けるデンドリマーサブユニットを含む（例えば、細胞成分を認識し、かつこれに特異的である、結合性薬剤を含む）。他の態様においては、ナノデバイスは、細胞、細胞成分、または細胞反応を画像化するデンドリマーサブユニットを含む（例えば、細胞、成分、または反応への曝露により検出可能なシグナルを提供する）。さらに別の態様においては、ナノデバイスは、サインを同定する薬剤を提供し、直接または間接的に、細胞の存在または細胞状態を同定する、デンドリマーサブユニットを含む（例えば、サインを同定する薬剤と癌特異的因子の相互作用により癌細胞を同定する）。またさらに別の態様においては、ナノデバイスは、細胞または対象への送達または放出のための、治療薬または診断薬を提供するデンドリマーサブユニットを含む。
【００２２】
従って、本発明は、様々な病理または生理学的条件で細胞または対象を治療しかつ特徴付けを行うための、様々な有用な治療用および診断用組成物を提供する。本発明のナノデバイスは、所望の機能性を付与するための任意の量のデンドリマー成分を含む。例えば癌治療では、本発明は、サインを同定する薬剤、画像化剤、治療薬、標的化剤、およびモニタリング剤それぞれを含む、個々のデンドリマー単位に共有結合により結合したコア・デンドリマーを含む、ナノデバイスを提供する。例えば、乳癌では（例えば、乳癌および大腸癌に用いる複合体を示す図３、ならびに上記の図４を参照のこと）、コア・デンドリマーは、ＭＲＩによる組織の画像化のためのガドリニウム・コントラスト化剤を含む第一のデンドリマー、癌治療のための治療薬（例えば、タキソールまたはシスプラチン）を含む第二のデンドリマー、癌細胞を標的化するための葉酸受容体に結合するリガンドを含む第三のデンドリマー、癌のサインの同定するために変異ｐ５３タンパク質を検出する蛍光成分を含む第四のデンドリマー、および治療薬による治療をモニターするための蛍光性アポトーシス・マーカーを含む第五のデンドリマーと複合体形成している。ある態様においては、コア・デンドリマーは所望の成分を含む。さらに別の態様においては、単一デンドリマーに二つまたはそれ以上の機能性を付与する。
【００２３】
本発明の好ましい態様においては、任意の所望のナノデバイス複合体の作製に利用するために、上記の機能性を含む個々のデンドリマーのライブラリーを作製する。例えば、個々のデンドリマーが治療薬のホストの一つを含む、デンドリマーのライブラリーを作製する。同一の方法を標的化剤、画像化剤等に関して実施する。このようなライブラリーにより、所望の用途に最適な治療用または診断用複合体を作製するために、成分を混合および調合することが可能となる。ナノデバイスは、合理的に作製してもよく、または無作為に作製し、所望の活性に関してスクリーニングを実施してもよい。このように、本発明は広範な治療用途および診断用途を有する非毒性システムを提供する。
【００２４】
定義
本発明の理解を容易にするように、用語および表現について以下に定義する。
【００２５】
本明細書に記載の「デンドリマー複合体」という用語は、互いに物理的に結合した二つまたはそれ以上のデンドリマーを含む複合体（例えば、共有または非共有結合により互いに結合したもの）を表す。例えば、共有結合で互いに結合した（例えば、直接または結合性の基によって）２つのデンドリマーは、デンドリマー複合体を提供する。
【００２６】
本明細書に記載の「薬剤」という用語は、生物学的に適切な活性または性質を有する組成物を表す。生物学的に関連のある活性は、生物学的反応もしくは事象に関連した活性、または生物学的反応もしくは事象の検出、モニタリングまたは特徴付けが可能な活性である。生物学的に関連のある活性としては、治療活性（例えば、生物学的な健康を改善する、または望ましくない生物学的状態に関連する持続的な変性を予防する能力）、標的化活性（例えば、生物学的分子または複合体と結合または会合する能力）、モニタリング活性（例えば、生物学的事象の進行をモニターするか、または生物学的組成における変化をモニターする能力）、画像化活性（例えば、生物学的組成物または反応を観察するか、または検出する能力）、およびサインを同定する活性（例えば、特定の細胞の組成または状態を認識し、かつ組成または状態の存在を示す検出可能な反応を呈する能力）が含まれるが、これらに限定されない。本発明の薬剤は、これら特定の例に限定されるものではない。実際、生物学的物質を送達する薬剤、または破壊する薬剤、化粧用薬剤等を含む、任意の有用な薬剤も利用可能である。本発明の好ましい態様においては、薬剤または複数の薬剤は、少なくとも一つのデンドリマー（例えば、デンドリマーに取り込まれたもの、デンドリマー上に表面を露出したもの等）に関連したものである。本発明のある態様においては、二つまたはそれ以上のデンドリマーが、組成物中に存在し、ここで一方のデンドリマーは、他のデンドリマーの薬剤とは「異なる」薬剤を含む。「とは異なる」とは、化学的組成および／または機能性の点で互いに異なる薬剤を表す。
【００２７】
本明細書に記載の「ナノデバイス」という用語は、一つまたは複数の「薬剤」を含むか、またはこれに結合した、小型の（例えば、ヒトが裸眼では見えない程度の）組成物を表す。最も単純な形態としては、ナノデバイスは、生物学的機能性を提供する少なくとも一つの薬剤（例えば、治療薬）と結合した、物理的組成物（例えば、デンドリマー）から成る。しかしながら、ナノデバイスは別の成分（例えば、別のデンドリマーおよび／または薬剤）を含むことができる。本発明の好ましい態様においては、ナノデバイスの物理的組成物は、少なくとも一つのデンドリマーを含み、生物学的機能性はデンドリマーに結合した少なくとも一つの薬剤によって提供される。
【００２８】
本明細書に記載の「生物学的に活性な」という用語は、タンパク質または天然に存在する分子の構造的、調節的、または生化学的機能を有する他の生物学的に活性な分子（例えば、触媒性ＲＮＡ）を表す。
【００２９】
本明細書に記載の「アゴニスト」という用語は、生物学的に活性な分子と相互作用する際に、生物学的に活性な分子を変化（例えば、増強）させ、生物学的に活性な分子の活性を調整する分子を表す。アゴニストは、タンパク質、核酸、炭水化物または生物学的に活性な分子に結合するか、または相互作用する、他の任意の分子を含む。例えばアゴニストは、直接または転写因子を介してＲＮＡポリメラーゼと相互に作用することにより、遺伝子の転写活性を変化させることができる。
【００３０】
本明細書で用いられる「アンタゴニスト」または「阻害剤」という用語は、生物学的に活性な分子と相互作用する際に、生物学的に活性な分子の生物学的活性を阻止または調整する分子を指す。アンタゴニストまたは阻害剤には、タンパク質、核酸、炭水化物、または生物学的に活性な分子に結合または相互作用する他の分子が含まれる。阻害剤およびアンタゴニストは、全ての細胞、器官、または生物の生物学に影響を及ぼしうる（例えば、腫瘍増殖を遅延させる阻害剤）。
【００３１】
本明細書に記載の「調整する」という用語は、生物学的に活性な分子の生物学的活性における変化を表す。調整は、活性の増加もしくは減少、結合性質の変化、または生物学的に活性な分子の生物学的、機能的、もしくは免疫学的性質におけるその他の任意の変化であってもよい。
【００３２】
「遺伝子」という用語は、ポリペプチドまたは前駆物質の産生に必要なコード配列を含む核酸（例えば、ＤＮＡ）配列を表す。完全長のコード配列またはコード配列の断片の所望の活性または機能的性質（例えば、酵素活性、リガンド結合、シグナル伝達等）が保持される限り、ポリペプチドは完全長のコード配列またはコード配列の一部によってコードされ得る。本用語はまた、構造遺伝子のコード領域を含み、５’および３’端の双方でコード領域に隣接して位置し、遺伝子が完全長のｍＲＮＡの長さに対応するように、いずれかの末端において約１ｋｂまたはそれ以上の距離がある配列を含む
。コード領域の５’に位置しｍＲＮＡ上に転写される配列は、５’非翻訳配列と呼ばれる。コード領域の３’に位置しｍＲＮＡ上に転写される配列は、３’非翻訳配列と呼ばれる。「遺伝子」という用語は、遺伝子のｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡの両方を含む。ゲノム遺伝子または遺伝子クローンは、「イントロン」、「介在領域」、または「介在配列」と呼ばれる非コード配列で分断されたコード領域を含む。イントロンは、核内ＲＮＡ（ｈｎＲＮＡ）に転写された遺伝子のセグメントである。イントロンはエンハンサー等の調節要素を含むこともある。イントロンは、核内転写産物または一次転写産物から除かれる、または「スプライス・アウト（ｓｐｌｉｃｅｄ ｏｕｔ）」される。したがって、イントロンは、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）転写産物中には存在しない。ｍＲＮＡは、翻訳過程で初期ポリペプチドのアミノ酸配列またはアミノ酸の順序を特定する機能がある。
【００３３】
本明細書に記載の「コードする核酸分子」、「コードするＤＮＡ配列」および「コードするＤＮＡ」という用語は、デオキシリボ核酸鎖に沿ったデオキシリボヌクレオチドの順序または配列を表している。これらデオキシリボヌクレオチドの順序によって、ポリペプチド（タンパク質）鎖に沿ったアミノ酸の順序が決定される。従って、ＤＮＡ配列はアミノ酸配列をコードする。
【００３４】
本明細書に記載の「相補的」または「相補性」という用語は、塩基対形成の規則に従うポリヌクレオチド（すなわち、ヌクレオチド配列）を表している。例えば、「Ａ−Ｇ−Ｔ」配列は、「Ｔ−Ｃ−Ａ」配列に対して相補的である。相補性は、塩基対形成の規則に従ってごく一部の核酸塩基が調和している「部分的な」もであってもよい。または、核酸間の相補性が「完全」または「全体にわたる」ものであってもよい。核酸鎖間の相補性の程度は、核酸鎖のハイブリダイゼーションの効率と程度に重大な影響を及ぼす。核酸間の結合に基づく検出法および増幅反応の場合には、このことは特に重要である。
【００３５】
本明細書に記載の「ハイブリダイゼーション」という用語は、相補的核酸の対合を表す。ハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーションの強度（すなわち、核酸間の結合の強度）は、核酸間で相補性の程度、ストリンジェンシー条件、形成したハイブリッドのＴｍ、および核酸中のＧ：Ｃ含量等の因子の影響を受ける。
【００３６】
本明細書に記載の「Ｔｍ」という用語は「融解温度」を表す。融解温度は、二本鎖核酸分子の集団の半分が一本鎖に解離する温度である。核酸のＴｍを求めるための式については当技術分野で公知である。標準的な文献に記載されるように、核酸が１ＭのＮａＣｌを含む水溶液中にあるときには、Ｔｍ値を簡単に推定するために、式： Ｔｍ＝８１．５＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）を利用することができる（例えば、ＡｎｄｅｒｓｏｎおよびＹｏｕｎｇ、「核酸ハイブリダイゼーション（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）」中の「定量的ハイブリダイゼーション（Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ Ｆｉｌｔｅｒ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）」［１９８５］を参照のこと）。これ以外の文献では、構造上の性質と同様に配列の性質を考慮に入れてＴｍを計算する、より高度な計算を行っている。
【００３７】
本明細書に記載の「ストリンジェンシー」という用語は、核酸ハイブリダイゼーションが実施される、温度、イオン強度の条件、および有機溶媒等の他の化合物の存在を表す。上記の異なるパラメータを個々にまたは同時に変化させることによって、「ストリンジェンシー」 条件を変化させることを、当業者は認識すると考えられる。「高いストリンジェンシー」の条件であれば、核酸の塩基対形成は塩基配列の相補性が高い核酸断片間でのみ起こる（例えば、「高いストリンジェンシー」の条件では、同一性が約８５％〜１００％、好ましくは同一性が約７０％〜１００％である相同体間でハイブリダイゼーションが起こる）。中程度のストリンジェンシーの条件であれば、核酸の塩基対形成は、塩基配列が中程度の相補性を示す核酸間ハイブリダイゼーションで起こる（例えば、「中程度のストリンジェンシー」の条件では、約５０％〜７０％の同一性を有する相同体間でハイブリダイゼーションが起こる）。従って、相補配列の頻度が通常低い、遺伝的に異なる生物に由来する核酸の場合には、「弱い」または「低い」ストリンジェンシーの条件が必要になることが多い。
【００３８】
核酸ハイブリダイゼーションに関して用いる「高いストリンジェンシーの条件」は、長さ約５００ヌクレオチドのプローブを利用する場合に、５×ＳＳＰＥ（４３．８ｇ／ｌ ＮａＣｌ、６．９ｇ／ｌ ＮａＨ２ＰＯ４・Ｈ２Ｏ、および１．８５ｇ／ｌ ＥＤＴＡ；ＮａＯＨでｐＨ７．４に調整）、０．５％ＳＤＳ、５×デンハルト試薬、ならびに１００μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡからなる水溶液中、４２℃で結合またはハイブリダイゼーションを実施した後、０．１×ＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳを含む溶液中、４２℃で洗浄することに相当する条件を含む。
【００３９】
核酸ハイブリダイゼーションに関して用いる「中程度のストリンジェンシーの条件」は、長さ約５００ヌクレオチドのプローブを利用する場合に、５×ＳＳＰＥ（４３．８ｇ／ｌ ＮａＣｌ、６．９ｇ／ｌ ＮａＨ２ＰＯ４・Ｈ２Ｏ、および１．８５ｇ／ｌ ＥＤＴＡ；ＮａＯＨでｐＨ７．４に調整）、０．５％ＳＤＳ、５×デンハルト試薬、ならびに１００μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡからなる水溶液中、４２℃で結合またはハイブリダイゼーションを実施した後、１．０×ＳＳＰＥ、１．０％ＳＤＳを含む溶液中、４２℃で洗浄することに相当する条件を含む。
【００４０】
「低いストリンジェンシーの条件」は、長さ約５００ヌクレオチドのプローブを利用する場合には、５×ＳＳＰＥ（４３．８ｇ／ｌ ＮａＣｌ、６．９ｇ／ｌ ＮａＨ２ＰＯ４・Ｈ２Ｏ、および、１．８５ｇ／ｌ ＥＤＴＡ；ＮａＯＨでｐＨ７．４に調整）、０．１％ＳＤＳ、５×デンハルト試薬（５０×デンハルト試薬は５００ｍｌ当たり、５ｇのフィコール（タイプ４００、ファルマシア）、５ｇのＢＳＡ（Ｆｒａｃｔｉｏｎ Ｖ；シグマを含む））および１００μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡからなる水溶液中、４２℃で結合またはハイブリダイゼーションを実施した後、５×ＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳを含む溶液中、４２℃で洗浄することに相当する条件を含む。
【００４１】
本明細書に記載の「アンチセンス」という用語は、特定のＤＮＡまたはＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）配列に対して相補的である、ＤＮＡまたはＲＮＡの配列を表す。細菌の遺伝子制御に関するアンチセンスＲＮＡ（「ａｓＲＮＡ」）分子もこの定義の範囲内に含まれる。アンチセンスＲＮＡは、コード鎖を合成可能にするウイルス・プロモーターに対して逆向きで、目的の遺伝子をスプライシングすることによる合成を含む、任意の方法により産生されうる。胚に導入されると、この転写された鎖は胚が産生した天然ｍＲＮＡと共に二重鎖を形成する。この二重鎖は、ｍＲＮＡがさらに転写することを阻害するか、または翻訳を阻害する。このようにして、表現型が変異型となる。「アンチセンス鎖」という用語は、「センス」鎖に対して相補的である核酸鎖を表す。（−）（すなわち、「負」）という名称は、アンチセンス鎖を表すのに用いられることもあり、また（＋）はセンス（すなわち、「正」）鎖を表すのに用いられることもある。
【００４２】
本明細書に記載の「抗原決定基」という用語は、特定の抗体と接触する抗原の一部（すなわち、エピトープ）を表す。あるタンパク質またはタンパク質断片を用いて宿主動物を免疫した場合には、タンパク質の様々な部位がタンパク質の所与の領域または３次構造に特異的に結合する抗体の産生を誘導する。このような領域または構造を抗原決定基と称する。抗体への結合に関して、抗原決定基は、無傷の抗原（すなわち、免疫反応を誘発するために用いた「免疫原」）と競合する。
【００４３】
抗体とタンパク質またはペプチドとの相互作用に関して用いる「特異的結合」または「特異的に結合する」という用語は、相互作用がタンパク質上の特定の構造（すなわち、抗原決定基またはエピトープ）の存在に依存することを意味する。言い換えれば、抗体は一般にタンパク質そのものよりも特異的なタンパク質構造を認識して結合する。例えば、抗体がエピトープ「Ａ」に特異的であれば、標識した「Ａ」と抗体を含む反応における、エピトープＡを含むタンパク質（または遊離した未標識のＡ）の存在は、抗体に結合する標識したＡの量を減少させる。
【００４４】
本明細書に記載の「導入遺伝子」という用語は、例えば新規受精卵または初期胚に外来遺伝子を導入することによる、生物に導入された外来遺伝子を表す。「外来遺伝子」という用語は、導入遺伝子が天然に存在する遺伝子と同一位置に存在しない限り、実験的操作により動物のゲノムに導入した核酸であって、その動物に見いだされる遺伝子配列を含みうる任意の核酸（例えば、遺伝子配列）を表す。
【００４５】
本明細書に記載の「ベクター」という用語は、ＤＮＡセグメントを細胞から別の細胞へと移す核酸分子を表す。「媒体」という用語は「ベクター」と同義に用いられることもある。ベクターは、プラスミド、バクテリオファージ、または植物もしくは動物のウイルスに由来することが多い。
【００４６】
本明細書に記載の「発現ベクター」という用語は、所望のコード配列、および発現可能に連結したコード配列を特定の宿主生物において発現するために必要な、適当な核酸配列を含む、組換えＤＮＡ分子を表す。原核生物における発現に必要な核酸配列は、通常プロモーター、オペレーター（選択的）、およびリボソーム結合部位を含み、さらに別の配列を伴うことも多い。真核細胞は、プロモーター、エンハンサー、ならびに終結シグナルおよびポリアデニル化シグナルを用いることが知られている。
【００４７】
本明細書に記載の「遺伝子導入システム」という用語は、核酸配列を含む組成物を細胞または組織に送達する手段を表す。例えば、遺伝子導入システムには、ベクター（例えば、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、およびその他の核酸による送達システム）、裸の核酸の微量注入、およびポリマーによる送達システム（例えば、リポソームによるシステム、および金属粒子を利用したシステム）が含まれるが、これらに限定されない。本明細書に記載の「ウイルス遺伝子導入システム」という用語は、所望の細胞または組織への試料の送達を促進するためのウイルス要素（例えば、無傷のウイルスおよび改変したウイルス）を含む、遺伝子導入システムを表す。本明細書に記載の「アデノウイルス遺伝子導入システム」という用語は、無傷または改変したアデノウイルス属に属するウイルスを含む、遺伝子導入システムを表す。
【００４８】
本明細書に記載の「トランスフェクション」という用語は、外来性ＤＮＡを真核細胞に導入することを表す。トランスフェクションは、当技術分野で公知の様々な手段により実施し得る。このような手段には、リン酸カルシウム−ＤＮＡ共沈法、ＤＥＡＥデキストラン媒介トランスフェクション、ポリブレン媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、微量注入、リポソーム融合、リポフェクション、プロトプラスト融合、レトロウイル感染および微粒子銃が含まれる。
【００４９】
本明細書に記載の「細胞培養」という用語は、細胞のインビトロ培養を表す。継代細胞株（例えば、不死化表現型を備えているもの）、初代培養細胞、一定期間のみ継代できる細胞株（例えば、非形質転換細胞）、およびインビトロで維持されているその他の細胞群も、この用語の範囲に含まれる。
【００５０】
本明細書に記載の「インビトロ」という用語は、人工環境、および人工環境で起こる過程または反応を表す。インビトロ環境は、試験管および細胞培養からなるが、これらに限定されない。「インビボ」という用語は、天然環境（例えば、動物または細胞）、および天然環境で起こる過程または反応を表す。
【００５１】
「被験化合物」という用語は、疾患、病気、疾病、または身体機能の障害の治療または予防に用いることができる、化学的物質、医薬品、薬剤等を表す。被験化合物は、既知の治療用化合物および潜在的な治療用化合物の両方を含む。被験化合物は、本発明のスクリーニング法を用いたスクリーニングにより、治療薬となり得るか否かが決定される。「既知の治療用化合物」は、（例えば、動物試験により、または人間への投与を行った過去の経験から）このような治療または予防に効果的であることが示されている、治療用化合物を表す。
【００５２】
本明細書に記載の「試料」という用語は、最も広義のものであり、環境的および生物学的試料を含む。環境的試料は、土壌および水等の環境に由来する物質を含む。生物学的試料は、ヒトを含む動物、体液（例えば、血液、血漿および血清）、固体（例えば、糞便）、組織、液体食品（例えば、乳）、および固形食品（例えば、野菜）であってもよい。
【００５３】
本明細書に記載の「光増感剤」および「光力学的色素」という用語は、光量子（ｈν）への曝露により励起状態に変換された物質を表している。光増感剤および光力学的色素には、フォトフィリン２、ベンゾポルフィリン、ｍ−テトラヒドロキシフェニルクローム、スズエチオパープリン（ｔｉｎ ｅｔｉｏｐｕｒｐｕｒｉｎ）、銅ベンゾクロリン、およびその他のポルフィリンが含まれるが、これらに限定されない。
【００５４】
発明の詳細な説明
本発明は、疾患（例えば、癌）の治療およびモニタリングのための、新規のシステムおよび組成物を提供する。例えば、本発明は、疾患状態に基づく適当な治療薬を提供し、送達した治療薬に対する反応をモニターし、また残留する疾患を同定するための病理生理学的異常を標的とし、画像化し、および検出するシステムおよび組成物を提供する。本発明の好ましい態様においては、組成物は、患者の細胞または対象の細胞に容易に導入可能な程度に小型である。
【００５５】
好ましい態様においては、癌の治療に本発明のシステムおよび組成物を用いて、治療およびモニタリングを行う。しかしながら、本発明のシステムおよび組成物は、様々な疾患状態またはその他の生理学的状態の治療およびモニタリングにも用いることが可能であり、本発明は特定の疾患状態または状況においての用途に限定されるものではない。特定用途で本発明を利用しうる他の疾患状態としては、心血管疾患、炎症性疾患、およびその他の増殖異常が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５６】
好ましい態様においては、本発明は、デンドリマーサブユニットを含むナノデバイスを提供する。好ましい態様においては、ナノデバイスは、細胞内への移行を促進するために直径が数百ナノメーターに限定される。
【００５７】
本発明の好ましい態様においては、二つまたはそれ以上の異なるデンドリマー構造体を含む組成物であって、それぞれが少なくとも一つの機能的成分を含む組成物を提供する。このような成分としては治療薬、生物学的モニタリング成分、生物学的画像化成分、標的化成分、および細胞異常の特異的サインを同定するための成分を含むが、これらに限定されない。これらの成分は最終的に、治療用および／または診断用複合体を形成し、この複合体中で異なる成分のそれぞれが別個のデンドリマー担体中に含まれる。このように、治療用ナノデバイスまたは複合体は、複合体の他のデンドリマー組成物のうち、少なくとも一つと特異的に複合体形成、または共有結合で連結した少なくとも二つの異なるデンドリマー担体からなる。
【００５８】
ナノデバイスの個々の成分および作製法、ならびに本発明のある態様におけるその用途について、以下に説明する。本発明のシステムおよび組成物の設計について例示するために、乳腺癌および大腸の腺癌の治療およびモニタリングにおける組成物の用途に関する、具体的な態様に焦点を当てて説明する。これらの具体的な態様は、本発明の特定の好ましい態様を説明する目的において例示されるものであって、本発明の範囲を限定するものではない。これらの態様においては、本発明のナノデバイスは、新生物細胞の細胞表面を標的とし、受容体を介したエンドサイトーシスで腫瘍細胞内に取り込まれる。デバイスの画像化成分によって、例えば、ＭＲＩを利用して腫瘍を画像化できる。検出用成分を含むこれらのデバイスにおいては、特定の癌のサインの存在によって赤色蛍光を発する（例えば、Ｍｕｃ１、Ｈｅｒ２または変異ｐ５３）。これにより、ナノデバイスの治療薬成分に含まれる治療薬が放出される。例えば、上記のように活性化された蛍光色を呈する細胞（例えば、赤色を呈する細胞）にレーザー光を照射することによって放出される、光非耐性保護基に結合したシスプラチン等の非耐性保護基と結合した治療薬成分が、放出を促進する。また選択的に、治療用デバイスは、腫瘍の治療に対する反応をモニターするための成分を含むこともできる。例えば、薬剤が細胞のアポトーシスを誘導する場合には、緑色蛍光を活性化するために細胞のカスパーゼ活性を利用してもよい。これにより、アポトーシスを起こした細胞はオレンジ色（赤色と緑色の組み合わせ）に変化し、残りの細胞は赤いままである。アポトーシスが誘導され、それに伴う傷害を有する正常細胞は緑色蛍光を発する。
【００５９】
上記の例から明らかなように、本発明の組成物を利用することによって、癌に関する非侵襲的検出、信号化、および介入を容易にする。この技術を用いて癌細胞における分子変化の特異的プロトコールを知ることができるので、樹状分子により非侵襲的検出を達成し、次にこれを様々な腫瘍の表現型に対して自動的に利用することができる。ポリマー・アレイによる方法を利用する場合には、異なる種類の腫瘍または異なる病理生理学的変化を扱うために、標的化用複合体、検出用複合体、および治療用複合体を相互に交換する。従って、アレイによる方法は、あらゆる単一種類の腫瘍または細胞異常を超える、交換可能で共通な治療用プラットフォーム提供する。
【００６０】
Ｉ．デンドリマー
本発明の好ましい態様においては、ナノデバイスはデンドリマーを含む。デンドリマーのポリマーに関しては多くの報告がある（Ｔｏｍａｌｉａ， Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ ６：５２９ ［１９９４］； Ａｎｇｅｗ， Ｃｈｅｍ． Ｉｎｔ． Ｅｄ． Ｅｎｇｌ．， ２９：１３８ ［１９９０］を参照のこと；本文献はその全文が参照として本明細書に組み入れられる）。デンドリマーのポリマーは、通常、直径１〜２０ナノメータの範囲にある球状構造体として合成される。ポリアミドアミン（β−アラニンサブユニット）のデンドリマーについての複数の世代を図１に示す。分子量と末端基の数は、ポリマーの世代（層の数）の指数関数として増加する。異なる種類のデンドリマーは、重合過程を開始するコア構造を基に合成できる。
【００６１】
デンドリマーのコア構造は、全体的形状、密度および表面の機能性等の複数の分子の性質を規定する（Ｔｏｍａｌｉａら、Ｃｈｅｍ． Ｉｎｔ． Ｅｄ． ＥｎｇＬ， ２９：５３０５ ［１９９０］）。球状デンドリマーに関しては、アンモニアが三価イニシエーター・コアとして働くか、またはエチレンジアミン（ＥＤＡ）が四価イニシエーター・コアとして働く。最近報告された棒状形態のデンドリマー（Ｙｉｎら、Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ．， １２０：２６７８ ［１９９８］では、ポリエチレンイミンからなる様々な長さの線状コアを用いる。コアが長くなるにしたがって、棒の長さが長くなる。デンドリマー高分子はキログラム単位で市販されており、現在、生物工学的利用に適した製造段階（ＧＭＰ）で製造されている。
【００６２】
デンドリマーの特徴付けは、エレクトロスプレーイオン化質量分析、１３Ｃ核磁気共鳴分光学、高速液体クロマトグラフィー、多角レーザ光散乱を利用した、サイズ排除クロマトグラフィー、キャピラリー電気泳動法およびゲル電気泳動を含む複数の技術で実施できるが、これらに限定されない。このような試験は、個々のポリマーからなる群の均一性を試験するものであり、ＧＭＰの応用およびインビボでの利用に関するデンドリマー製造の品質管理をモニターする上で重要である。デンドリマーに関しては様々な研究が行われおり、インビボ試験でも静脈内投与した場合に、毒性を示す証拠はない（Ｒｏｂｅｒｔｓら、Ｊ． Ｂｉｏｍｅｄ． Ｍａｔ． Ｒｅｓ．， ３０：５３ ［１９９６］およびＢｏｕｒｎｅら、 Ｊ． Ｍａｇｎ． Ｒｅｓｏｎ． Ｉｍａｇ．， ６：３０５ ［１９９６］）。
【００６３】
デンドリマー産生法と組成物については米国特許に数多くの記載がある。本発明に有用なデンドリマー組成物を説明する目的で、以下にこれら特許のいくつかを例として挙げる。なお、これらは例示的に示す単なる例であって、本発明に用いることのできる類似のデンドリマー組成物も他に数多く存在する。
【００６４】
米国特許第４，５０７，４６６号、米国特許第４，５５８，１２０号、米国特許第４，５６８，７３７号および米国特許第４，５８７，３２９号は、それぞれ従来の星状形態の高分子と比較して、末端の密度が高い高密度の星状形態の高分子を作製する方法について記載している。これらのポリマーは、従来の星状形態の高分子（すなわち、３世代めの高密度の星状形態の高分子）と比較して、反応性がより高く、その均一性も高い。これらの特許はさらに、アミドアミン・デンドリマーの性質およびデンドリマーの３次元的分子直径についても記載している。
【００６５】
米国特許第４，６３１，３３７号は、加水分解的に安定したポリマーに関して記載している。米国特許第４，６９４，０６４号は、棒状形態のデンドリマーに関して記載している。米国特許第４，７１３，９７５号は、高密度の星状形態の高分子およびウイルス、細菌および酵素を含むタンパク質の、表面の特徴付けにおけるその用途に関して記載している。米国特許第４，７３７，５５０号には、高密度の星状形態の架橋型高分子について記載がある。米国特許第４，８５７，５９９号および米国特許第４，８７１，７７９号は、交換樹脂、キレート樹脂として有用な固定化コア上の高密度の星状形態の高分子、およびこのようなポリマーの作製法について記載している。
【００６６】
米国特許第５，３３８，５３２号は、農薬、医薬またはその他の送達物質を少なくとも１単位結合した、デンドリマーの星状（ｓｔａｒｂｕｒｓｔ）結合に関する。本特許には、単位ポリマー当たり高濃度の送達物質を送達する手段、制御送達、標的化された送達の手段、ならびに／または、例えば薬剤、抗生物質、一般的および特異的毒素、金属イオン、放射性核種、シグナル誘導物質、抗体、インターロイキン、ホルモン、インターフェロン、ウイルス、ウイルス断片、農薬および抗微生物剤等の複数種物質を提供する、デンドリマーの用途について記載されている。
【００６７】
他の種類の有用なデンドリマー組成物が、米国特許第５，３８７，６１７号、米国特許第５，３９３，７９７号および米国特許第５，３９３，７９５号に記載されている。ここでは、高密度の星状形態の高分子は、外側の疎水性外皮を提供可能な疎水性キャッピングによって修飾されている。米国特許第５，５２７，５２４号には、抗体と結合したアミノ末端を有するデンドリマーの用途に関して開示されている。
【００６８】
デンドリマーの金属イオン担体としての利用については、米国特許第５，５６０，９２９号に記載がある。くし状（ｃｏｍｂ−ｂｕｒｓｔ）多枝配置を有する、架橋されていない多枝状ポリマーおよびその製造法については、米国特許第５，７７３，５２７号に開示されている。分枝から保護された第一の分枝ポリマーの組を形成させ、コアに埋込み、第一分岐したポリマーの組を脱保護した後、分枝から保護される第二の分枝ポリマーの組を形成させ、第一の分枝ポリマーの組を含むコアに埋込む段階等によって形成する、高分子量の多分枝ポリマーの産生過程については、米国特許第５，６３１，３２９号に記載がある。
【００６９】
米国特許第５，９０２，８６３号には、親油性有機シリコンおよび親水性ポリアニクロアミン（ｐｏｌｙａｎｉｃｌｏａｍｉｎｅ）のナノスコピック・ドメインを含むデンドリマー・ネットワークについて記載がある。ネットワークは、ＰＡＭＡＭ（親水性）内部ポリプロピレンイミンおよび外層有機シリコンを有する、共重合デンドリマー前駆物質から調製される。これらのデンドリマーでは、サイズ、形態および空間的分布が調整可能である。これらは、特殊膜、保護コーティング、有機性の有機金属または無機添加物を含む、複合体、皮膚パッチによる送達、吸収剤、クロマトグラフィー・パーソナルケア製品および農産物に利用可能な有機シリコンを外層に有する、疎水性デンドリマーである。
【００７０】
米国特許第５，７９５，５８２号には、インフルエンザ抗原のアジュバントとして利用するデンドリマーの用途について記載がある。デンドリマーの使用によって、少ない抗原量で高い抗体価の抗体を産生できる。米国特許第５，８９８，００５号および米国特許第５，８６１，３１９号には、分析対象の濃度を決定するための特異的な免疫結合アッセイについて記載がある。米国特許第５，６６１，０２５号は、標的部位へヌクレオチドを送達するためのデンドリマー・ポリカチオンを含む自己会合性ポリヌクレオチド送達システムの詳細について記載がある。本特許は、ポリヌクレオチドおよびポリヌクレオチドと非共有結合で結合したデンドリマー・ポリカチオンを含む組成物と細胞を接触させる段階を含む、ポリヌクレオチドをインビトロで真核細胞に導入する方法を提供する。
【００７１】
インビトロで診断に用いるデンドリマー−抗体複合体については、デンドリマー−キレート物質−抗体の構築物の産生、およびボロン化（ｂｏｒｏｎａｔｅｄ）デンドリマー−抗体複合体の開発（中性子捕捉療法用）に関して既に報告がある（Ｓｉｎｇｈら、Ｃｌｉｎ． Ｃｈｅｍ．， ４０：１８４５ ［１９９４］）。これら後者の化合物はそれぞれ、癌治療薬として用いることができる（Ｗｕら、Ｂｉｏｏｒｇ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． Ｌｅｔｔ．， ４：４４９ ［１９９４］； Ｗｉｅｎｅｒら、Ｍａｇｎ． Ｒｅｓｏｎ． Ｍｅｄ． ３１：１ ［１９９４］； Ｂａｒｔｈら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ． ５：５８ ［１９９４］；および Ｂａｒｔｈ ら）。
【００７２】
これらの複合体には腫瘍の磁気共鳴像を得るために利用されているものもある（Ｗｕら、［１９９４］およびＷｉｅｎｅｒら、［１９９４］、上記）。本研究の成果から、インビボ投与した場合、抗体がデンドリマー結合治療薬を、抗原を有する腫瘍に送達し得ることが分かっている。デンドリマーは特異的に細胞に進入し化学療法剤または遺伝子治療薬を送達することも示されている。特に、他の手段で送達されたシスプラチンと比較して、デンドリマー・ポリマーに封入されたシスプラチンはその効力が増し、毒性は低くなることが、研究によって明らかにされている（ＤｕｎｃａｎおよびＭａｌｉｋ， Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌ． Ｂｉｏａｃｔ． Ｍａｔｅｒ． ２３：１０５ ［１９９６］）。
【００７３】
また、蛍光色素またはサインとなる分子に結合したデンドリマーは、細胞に侵入することがわかっている。この後、生理学的変化を評価する目的で、検出器に適合性のある細胞中で検出する（Ｂａｋｅｒら、Ａｎａｌ． Ｃｈｅｍ． ６９：９９０ ［１９９７］）。最終的には、分子の外側の部分が酵素または光誘導性触媒で切断されるデンドリマーを、特殊化したブロック共重合体として構築する（ＵｒｄｅａおよびＨｏｍ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６１：５３４ ［１９９３］）。これによって、疾患部位に治療薬を放出するためのポリマーの制御性分解が可能となり、治療薬の放出を外部から誘導する機構が提供される。
【００７４】
単一デンドリマーはこれら特定の機能を有することが示されているが、現在のところ、複数を特定の配置で含むデバイスについては何ら報告されていない。本発明は、特異的機能性を有する個々を単一複合体として組み合わせた、二つまたはそれ以上のデンドリマー含むナノデバイスを提供する。例えば、本発明の好ましい複合体は、コア・デンドリマーを取り巻く個々のデンドリマー・モジュールから構築される。これにより、図２のコア−外皮デンドリマーまたはクラスター分子が提供される。マルチデンドリマー複合体の構築前に、異なる活性に関して、異なる複合体、例えば一つのデンドリマーは感知用複合体であり、一つは標的化用であり、かつ別のものは治療薬の担体である複合体を産生する。次に、これらの異なるデンドリマー・モジュールを一緒にクラスター化して共有結合で連結し、単一の治療用デバイスまたは複合体を提供する。
【００７５】
このような方法では、デンドリマーは他の外皮型デンドリマーが共有結合によって結合したコアとして作用する。好ましい態様においては、コア分子はアミン末端を含むデンドリマーである。外皮試薬のデンドリマーは、アミド形成でコアと共有結合を可能とするカルボン酸／エステル基を有する。次に、同一またはより高い世代の異なる官能基を有する、アミノ末端を有するデンドリマーを高濃度で含む混合物をコア・デンドリマーに添加する。これにより、コアのアミン末端基と外側機能性デンドリマーの遊離末端カルボン酸基との間でアミド形成が起こり、クラスターが形成される。コア・デンドリマーと個々の外層のデンドリマー間には、立体的に誘導される化学量論により限られた数の結合が形成され得る。ある態様においては、モル過剰の外層のデンドリマーを用いて反応を促進し、個々の外層コア・デンドリマーを単一コア分子とのみ反応させる。
【００７６】
ＩＩ．治療薬
本発明は様々な治療用薬剤に利用しうる。デンドリマーと結合した治療薬は、本発明の方法、システムおよび組成物を用いて送達できる。治療薬の送達について例示するために、以下の説明では主に、癌治療におけるシスプラチンおよびタキソールの送達に焦点を当てる。また、様々な光力学的治療用の化合物、および様々な抗微生物性化合物について説明する。
【００７７】
（ｉ）シスプラチンおよびタキソール
腫瘍細胞におけるシスプラチンおよびタキソールのアポトーシス誘導作用については、十分明らかにされている（例えば、Ｌａｎｎｉら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．， ９４：９６７９ ［１９９７］； Ｔｏｒｔｏｒａら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５７：５１０７ ［１９９７］； およびＺａｆｆａｒｏｎｉら、Ｂｒｉｔ． Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ ７７：１３７８ ［１９９８］を参照のこと）。しかしながら、これらおよびその他の化学療法剤を利用した治療を、重大な毒性を招かずに達成するのは困難である。現在用いられている薬剤は、一般的に水に難溶性であり、毒性が高く、疾患細胞のみならず正常細胞にも影響を与える用量で投与される。例えば、既知の抗癌剤のうちで最も効果的な化合物であるパクリタキセル（タキソール）は、水に難溶性である。パクリタキセルはＢ１６黒色腫、ＬＩ２１０白血病、ＭＸ−１乳癌、およびＣＳ−１大腸癌の異種移植などの広範な種類の腫瘍モデルに、優れた抗腫瘍活性を示す。しかしながら、パクリタキセルが水に難溶性であることが、ヒトへの投与において問題となる。従って、現在使われているパクリタキセルの処方では、この薬剤を可溶化するためにクリマフォア（ｃｒｅｍａｐｈｏｒ）が必要となる。ヒトにおける臨床的用量範囲は、２００ ｍｇ〜５００ ｍｇである。この用量は、エタノール：クリマフォア の１：１溶液に溶解し、１リッターの溶液に希釈して静脈内投与する。現在使われてクリマフォアは、ポリエトキシル化されたヒマシ油である。これはクリマフォア混合物に溶解し、大量の水溶性担体で希釈して、注射により与えられる。直接投与（例えば、皮下）では、局所的毒性を示し活性レベルは低い。従って、これらの化学療法剤の送達に関しては、より効率的かつ効果的な送達システムが必要である。
【００７８】
特異的薬剤送達の方法と組成物を提供することにより、本発明はこれらの問題を克服する。また、本発明は、相加的効果を生ずる薬剤の組み合わせ（例えば、二つまたはそれ以上の異なる治療薬）を投与することを可能とする。複数の薬剤の利用により、単一薬剤に対する疾患の耐性を阻止する。例えば、単一薬剤（タキソール）に耐性な癌についての報告がある（（Ｙｕら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ． ２：５８１ ［１９９８］）。本発明の開発中に実施した実験によって、デンドリマーに結合したシスプラチンはシスプラチン耐性の癌細胞さえ効率よく死滅させ得ることが明らかとなった（実施例４を参照のこと）。機構に対する理解は、本発明の実施には不要であり、また本発明を限定するものでもないが、デンドリマー複合体は多剤耐性チャネルがシスプラチンを細胞外に排出するのを防ぐことが意図される。
【００７９】
また、本発明によって、シスプラチンおよび／またはタキソールを対象に送達した後、治療の成否をモニターすることができる。例えば、これらの薬剤のアポトーシス誘導能のインビトロ測定が、インビボ効力のマーカーとなることが報告されている（Ｇｉｂｂ、Ｇｙｎｅｃｏｌｏｇｉｃ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ ６５：１３ ［１９９７］）。従って、効果的に抗腫瘍を治療し、かつ毒性を低下させるために、これらの薬剤の一方または両方を送達することに加えて、アポトーシスの誘導をモニターする本発明の技術は治療薬の有用性についての尺度を与えることができる。重要なことは、両治療薬とも、乳癌および大腸癌を含む広範な種類の腫瘍に対する活性を有するが、これらのみに限定されない（Ａｋｕｔｓｕら、Ｅｕｒ． Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ ３１Ａ：２３４１ ［１９９５］）。
【００８０】
上記では特定の２つの薬剤について説明したが、癌治療に通常用いるいかなる薬剤に関しても、本発明を利用することができる。本発明に従い癌治療を実施する場合、ナノデバイスの治療薬成分には、アドリアマイシン、５−フルオロウラシル、エトポシド、カンプトセシン、アクチノマイシン−Ｄ、マイトマイシンＣ、さらに好ましくは、シスプラチン等の化合物を含むが、これらに限定されない。薬剤は、本明細書に記載されているように、免疫療法剤と組み合わせて混合した治療用組成物、またはキットとして調製し利用することができる。
【００８１】
本発明のある態様においては、デンドリマー・システムは、本発明の相乗的な抗新生物剤をもたらす、ＤＮＡ傷害を促進する核酸（例えば、ＤＮＡ）と直接結合した一つまたは複数の薬剤をさらに含む。シスプラチン、およびその他のＤＮＡアルキル化薬剤等の薬剤を利用してもよい。シスプラチンは広く癌治療に利用されており、その効果的な用量は、臨床的に利用する場合、合計３回の投与スケジュールにつき３週毎に５日間で２０ｍｇ／Ｍ２である。ナノデバイスは、適切な任意の方法で送達してもよく、静脈内、皮下、腫瘍内、腹膜内への注射、または局所（例えば、粘膜表面へ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００８２】
ＤＮＡを傷害する薬剤は、ＤＮＡ複製、細胞分裂および染色体の分配を阻害する化合物をも含む。このような化学療法用の化合物としては、アドリアマイシンが挙げられ、また既知のものとして、ドキソルビシン、エトポシド、ベラパミル、ポドフィロトキシン等がある。新生物治療のおける臨床において広範に利用されるこれらの化合物は、大量注射で静脈内に投与する。その用量はアドリアマイシンでは２１日間隔で２５〜７５ｍｇ／Ｍ２、エトポシドの静脈内投与では３５〜５０ｍｇ／Ｍ２の範囲にあり、経口投与では静脈内投与用量の２倍とする。
【００８３】
核酸前駆物質およびサブユニットの合成および正確性を阻害する薬剤はまた、ＤＮＡ傷害をもたらし、本発明の化学療法剤として用いることができる。複数の核酸前駆物質が開発されている。徹底的な試験がなされており、入手も容易な薬剤は特に有用である。このような薬剤としては、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）等が新生物の組織では選択的に利用され、この選択性のために、薬剤は新生物細胞への送達に特に有用である。送達用量は３〜１５ｍｇ／ｋｇ／日の範囲であるが、その他の用量については疾患の段階、治療に対する細胞の感受性、薬剤に対する耐性の程度等を含む、様々な因子に従って大きく変動する。
【００８４】
本発明において用いる抗癌治療薬は、デンドリマー構造に組み込み得るものであるか、またはデンドリマー構造に結合したものであり、その場合には、本来の抗癌効果を消失することなく、対象、組織、または細胞に送達し得る。白金複合体、ベラパミル、ポドフィロトキシン、カルボプラチン、プロカルバジン、メクロレタミン、シクロホスファミド、カンプトセシン、イホスファミド、メルファラン、クロランブシル、ビサルファン、ニトロソウレア、アドリアマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ブレオマイシン、プリコマイシン、マイトマイシン、エトポシド（ＶＰ１６）、タモキシフェン、タキソール、トランスプラチナ、５−フルオロウラシル、ビンクリスチン、ビンブラスチンおよびメトトレキサート、ならびにその他の類似する抗癌剤等の、癌治療薬についてのより詳細な説明に関しては、当業者は複数の教示書を参照できる。このような教示書としては、「医師用卓上参考書（ｔｈｅ Ｐｈｙｓｉｃｉａｎ’ｓ Ｄｅｓｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ）」ならびに、Ｇｏｏｄｍａｎ（グッドマン）およびＧｉｌｍａｎ（ギルマン）の「治療薬の薬学的基礎（Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）」（第９版、Ｈａｒｄｍａｎら編、１９９６）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００８５】
好ましい態様においては、薬剤は好ましくは光開裂性リンカーを含む、ナノデバイスに結合している。例えば、本発明に用いることができるヘテロ二機能性の、複数の光開裂性リンカーがＯｔｔｌ（オットル）らによって報告されている（Ｏｔｔｌら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．， ９：１４３ ［１９９８］）。これらのリンカーは、水または有機溶媒のいずれかに可溶性である。これらはアミンまたはアルコールと反応し得る活性化エステル、およびチオール基と反応するエポキシドを含む。二つの基の間にある３，４−ジメトキシ−６−ニトロフェニル光異性化基が、近紫外光（３６５ｎｍ）に曝露された場合には、無傷の形状のアミンまたはアルコールを放出する。従って、治療薬がこのようなリンカーを用いて本発明の組成物と結合している場合、標的部位を近紫外光に曝露することによって生物学的に活性な、または活性化され得る形態で、放出させることができる。
【００８６】
例示的な態様においては、タキソールのアルコール基を、有機溶媒可溶性リンカーの活性化エステルと反応させる。産物を次に、適当なデンドリマーの部分的チオール化表面と反応させる（デンドリマーの一級アミンを、化学量論的な量よりも少ない２−イミノチオランと反応させることによって、部分的にチオールを含む基に変換できる）。シスプラチンの場合、薬物のアミノ基が水溶性リンカーと反応する。アミノ基の反応性が低い場合には、二塩化Ｐｔ（ＩＩ）スルファジアジン等の一級アミノを含む、シスプラチンの活性類似体（Ｐａｓａｎｉら、Ｉｎｏｒｇ． Ｃｈｉｍ． Ａｃｔａ ８０：９９ ［１９８３］およびＡｂｅｌら、Ｅｕｒ． Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ ９：４ ［１９７３］）を用いることができる。このように結合した薬物は不活性であり、正常細胞に害を与えることはない。この複合体が腫瘍細胞内に局在する場合には、適当な近紫外波長のレーザ光に曝露して、活性な薬物を細胞中に放出させる。
【００８７】
本発明の他の態様においても、同様にシスプラチン（またはその類似体）のアミノ基を、２−ニトロベンジルオキシカルボニル基等の高疎水性の光開裂性保護基と結合させる（Ｐｉｌｌａｉ， Ｖ．Ｎ．Ｒ． Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ： １−２６ ［１９８０］）。この疎水基を結合させることにより、薬物がＰＡＭＡＭデンドリマー（例えば、Ｅｓｆａｎｄら、Ｐｈａｒｍ． Ｓｃｉ．， ２：１５７ ［１９９６］を参照のこと）内の疎水性ポケットに充填され、高度に優先的に保持され、水溶性環境から隔離される。近紫外線（約３６５ｎｍ）に曝露された場合には、疎水基が切断され、無傷の薬物が放出される。薬物自体は親水性であるため、薬物はデンドリマーの外に拡散し、腫瘍細胞に入り、そこでアポトーシスを開始させる。
【００８８】
光開裂性リンカーとは別に、酵素開裂可能なリンカーもある。効果的な抗腫瘍性複合体として、複数の光開裂性リンカーが示されており、これらはドキソルビシン等の癌治療薬を、短い適当なペプチドリンカーを含む、水溶性ポリマーと結合させることにより調製可能である（例えば、Ｖａｓｅｙら、Ｃｌｉｎ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．， ５：８３ ［１９９９］を参照のこと）。リンカーは細胞の外部で安定であるが、細胞内ではチオールプロテアーゼで切断される。好ましい態様においては、複合体ＰＫ１を利用する。光開裂性リンカーによる方法とは別に、Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ等の酵素切断性リンカーを用いることもできる。
【００８９】
本発明は、治療技術の性質によって限定されるものではない。例えば、本発明に利用可能な複合体には、ＢＮＣＴに対する結合ホウ素ダスターの利用（Ｃａｐａｌａら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．， ７：７ ［１９９６］）、放射性同位元素の利用、およびリシン等の毒素のナノデバイスへの結合を含むが、これらに限定されない。
【００９０】
（ｉｉ）光力学的治療
光力学的治療薬も、本発明における治療薬として利用することができる。ある態様においては、光力学的化合物を含む本発明のデンドリマー組成物に照射を行い、無繊維性放射状エフェクターから拡散する一重項酸素およびフリーラジカルを生じさせ、生物学的標的（例えば、腫瘍細胞または細菌細胞）に作用させる。好ましい光力学的化合物には、ＩＩ型光化学的反応に関係するものも含まれるが、これらに限定されない。ＩＩ型光化学的反応とは以下の反応である：
ＰＳ ＋ ｈν→  ＰＳ＊（１）
ＰＳ＊（１） →  ＰＳ＊（３）
ＰＳ＊（３）＋  Ｏ２ →  ＰＳ  ＋ ＊Ｏ２
＊Ｏ２ ＋ Ｔ → 細胞毒性
式中、ＰＳ＝光増感剤、ＰＳ＊（１）＝ 励起された一重項状態のＰＳ、ＰＳ＊（３）＝ 励起された３重項状態のＰＳ、ｈν＝ 光量子、＊Ｏ２＝ 励起された一重項酸素、およびＴ＝生物学的標的である。本発明において利用し得る他の光力学的化合物として、一重項酸素の産生とは異なる機構で細胞毒性を引き起こすもの（例えば、参照として本明細書に組み入れられる、銅ベンゾクロリン、Ｓｅｌｍａｎら、Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍ． Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌ．、５７：６８１−８５ ［１９９３］）が挙げられる。本発明において利用しうる光力学的化合物の例としては、フォトフィリン２、フタロシアニン類（例えば、Ｂｒａｓｓｅｕｒら、Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍ． Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌ．， ４７：７０５−１１ ［１９８８］を参照）、ベンゾポルフィリン、テトラヒドロキシフェニルポルフィリン、ナフタロシアニン（例えば、ＦｉｒｅｙおよびＲｏｄｇｅｒｓ， Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍ． Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌ．， ４５：５３５−３８ ［１９８７］を参照）、ｓａｐｐｈｙｒｉｎｓ（Ｓｅｓｓｌｅｒら、Ｐｒｏｃ． ＳＰＩＥ， １４２６：３１８−２９ ［１９９１］）、ポルフィノン（ｐｏｒｐｈｉｎｏｎｅｓ）（Ｃｈａｎｇら、 Ｐｒｏｃ． ＳＰＩＥ， １２０３：２８１−８６ ［１９９０］）、スズエチオパープリン、エーテル置換ポルフィリン（Ｐａｎｄｅｙら、Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍ． Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌ．， ５３：６５−７２ ［１９９１］）、およびフェノキサジン類等の陽イオン性色素（例えば、Ｃｉｎｃｏｔｔａら、ＳＰＩＥ Ｐｒｏｃ．， １２０３：２０２−１０ ［１９９０］ を参照）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００９１】
他の態様においては、直接フリーラジカルを産生する（すなわち、一重項酸素を産生しない）毒性薬剤を、重合中の無繊維性放射状エフェクターに取り込ませる。この方法によって、無繊維性放射状エフェクターがより大型でより寿命の長いものとなり、また局所的酸素供給によって制限されなくなる。このような毒性薬剤には、３６０ ｎｍ〜４００ ｎｍの光照射で水酸基ラジカルを産生する、２−メチル−４−ニトロ−キノリン−Ｎ−オキシド（アルドリッチ社）および４，４−ジニトロ−（２，２）ビピリジニル−Ｎ，Ｎジオキシド（アルドリッチ社）（Ｂｏｔｃｈｗａｙら、Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍ． Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌ． ６７（７）：６３５−４０ ［１９９８］）、６３０ｎｍの光刺激で水酸基ラジカルを産生する、マカライトグリーンおよびイソフランブルー（モレキュラー・プローブ社）（Ｊａｙら、ＰＮＡＳ ９１：２６５９ ［１９９４］； Ｈａｕｇｌａｎｄ、「蛍光プローブおよび化学物質研究の手引き（Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｂｅｓ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）」、 第６版、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、ユージーン、オレゴン ［１９９４］）、細胞に対して毒性を示すＮＯの供給源として用いられる、ニトロシルペンタクロロルテニウム酸カリウム（モレキュラー・プローブ社）（Ａｂｓ＝５１６ｎｍ）、ルッサン（Ｒｏｕｓｓｉｎ’ｓ）ブラック塩およびルッサンレッド塩 （Ａｂｓ＝３１３〜５４６ｎｍ）（Ｍｕｒｐｈｙら、Ｎｅｕｒｏｐｈａｒｍ． ３３：１３７５−８５ ［１９９４］； Ｂｏｕｒａｓｓａら、ＪＡＣＳ １１９：２８５３−６０ ［１９９７］）、およびその他の光分解性一酸化窒素および水酸基供与体（Ｄｅ ＬｅｏおよびＦｏｒｄ， ＪＡＣＳ １２１：１９８０−８１ ［１９９９］）を含むが、これらに限定されない。
【００９２】
（ｉｉｉ）抗微生物性治療薬
抗微生物性の治療薬も、本発明における治療薬として利用できる。微生物の機能を止める、阻害する、または低下させる薬剤が利用できる。また同様の活性を有すると考えられる薬剤も利用し得る。抗微生物剤としては、単独または組み合わせて用いる天然および合成抗生物質、抗体、阻害タンパク質、アンチセンス核酸、膜破壊性薬剤等が挙げられるが、これらに限定されない。実際、抗細菌剤、抗ウイルス剤、抗真菌剤などの任意の種類の抗生物質も利用し得るが、これらに限定されない。
【００９３】
ＩＩＩ．サインを同定する薬剤
ある態様においては、本発明のナノデバイスは、サイン成分（「サイン」）によって活性化されるか、またはこれと相互作用する一つまたは複数のサインを同定する薬剤を含む。好ましい態様においては、サインを同定する薬剤はサイン（例えば、標的とする細胞に特異的な細胞表面の分子）に特異的に結合する抗体であり、好ましくはモノクローナル抗体である。
【００９４】
本発明のある態様においては、腫瘍細胞を同定する。腫瘍細胞は、乳癌におけるＭｕｃ１、Ｈｅｒ２および変異ｐ５３等の癌特異的抗原の顕著な発現を含む、多様なサインを示すものである。これらは、乳癌のうちの３０％（Ｈｅｒ２）から７０％（変異ｐ５３）に存在し、癌の特異的サインとなる。好ましい態様においては、本発明のナノデバイスは、乳癌に局在する変異体ｐ５３に特異的に結合するモノクローナル抗体を含む。
【００９５】
本発明のある態様においては、感受性遺伝子を発現する癌細胞を同定する。例えばある態様においては、以下の二つの乳癌感受性遺伝子を乳癌の特異的サインとして利用する：第１７番染色体上のＢＲＣＡ１および第１３番染色体上のＢＲＣＡ２。個体がＢＲＣＡ１またはＢＲＣＡ２のいずれかに変異を有する場合には、生涯のある時点で乳癌または卵巣癌と診断される危険性が高い。これらの遺伝子は、照射による二本鎖ＤＮＡ切断の修復に関係する。ＢＲＣＡ１またはＢＲＣＡ２に変異が存在する場合には、この機構が働かないためＤＮＡ複製により多くの誤りを生じ、最終的に癌の増殖に至ると考えられる。
【００９６】
さらには、異なる複数の細胞表面受容体の発現をナノデバイスの結合と取り込みの標的として利用することができる。このような受容体としては、ＥＧＦ受容体、葉酸受容体、ＦＧＲ２型受容体等が挙げられるが、これらに限定されない。
【００９７】
本発明のある態様においては、染色体異常に関連する遺伝子発現の変化は、サイン成分である。例えば、バーキットリンパ腫はＭｙｃ遺伝子を伴う染色体転座に起因する。染色体転座は、染色体が破壊されていることを意味し、他の染色体の一部の結合を可能にする。バーキットリンパ腫の古典的染色体転座は、Ｍｙｃ遺伝子の部位として第８番染色体を含む。これによりのＭｙｃの発現パターンが変化し、細胞の成長と増殖の制御に関する正常機能が破壊される。
【００９８】
他の態様においては、大腸癌に関連した遺伝子発現が、サイン成分として同定される。大腸癌に関して以下の２つの重要な遺伝子が公知である：第２番染色体のＭＳＨ２および第３番染色体のＭＬＨ１。通常、これらの遺伝子のタンパク質産物は、ＤＮＡ複製における誤りの修復を助ける。ＭＳＨ２とＭＬＨ１タンパク質が変異した場合、複製の誤りが修復されずに残り、ＤＮＡを傷害して大腸癌に至る。複数の内分泌腺新形成に関係するＭＥＮ１遺伝子は、第１１番染色体上に見出されることが数年前から知られており、さらに最終的には１９９７年により詳細に地図が作製され、このような癌のサインとして利用される。本発明の好ましい態様においては、検出を行う変化したタンパク質に特異的、または発現遺伝子に特異的な抗体を本発明のナノデバイスと複合体形成させる。
【００９９】
さらに別の態様においては、大腸の腺癌では、ＣＥＡおよび変異ｐ５３（両者は十分に証明されている腫瘍のサインである）の発現レベルが高い。このような細胞株おけるｐ５３の変異は、乳癌細胞の一部で見いだされる変異と類似しており、これらの癌それぞれに対する２つのナノデバイス間で、同一のｐ５３検出成分を共有することができる（すなわち、ナノデバイスの作製において、同一のサインを同定する薬剤を含むデンドリマーを各々の種類の癌に利用できる）。大腸および乳癌細胞についてはいずれも、ヌードマウスマウスに腫瘍を形成する細胞株を用いて、信頼性の高い試験を行うことが可能であるため、動物における最適化と特徴付けが可能となる。
【０１００】
上記の説明から、本発明に利用可能な異なる腫瘍のサインは数多く存在し、その一部は特定の種類の癌に特異的であり、他のものは本質的に非特異的であることが明らかである。本発明は特定の腫瘍のサイン、またはその他の任意の疾患特異的サインによって限定を受けるものではない。例えば、本発明におけるサインとして利用できる腫瘍サプレッサーとしては、ｐ５３、Ｍｕｃ１、ＣＥＡ、ｐｌ６、ｐ２１、ｐ２７、ＣＣＡＭ、ＲＢ、ＡＰＣ、ＤＣＣ、ＮＦ−１、ＮＦ−２、ＷＴ−１、ＭＥＮ−Ｉ、ＭＥＮ−ＩＩ、ｐ７３、ＶＨＬ、ＦＣＣおよびＭＣＣが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１０１】
ＩＶ．生物学的画像化成分
本発明のある態様において、ナノデバイスは容易に画像化できる少なくとも一つのデンドリマーに基づくナノスコピックな構成単位を含む。本発明は、用いる画像化成分の性質によって限定されるものではない。本発明のある態様においては、画像化モジュールが、生体分子と結合した硫化亜鉛でキャッピングされたセレン化カドミウム（Ｓｏｏｋｌａｌ， Ａｄｖ． Ｍａｔｅｒ．， １０：１０８３ ［１９９８］）等の量子ドット（例えば、ＣｈａｎおよびＮｉｅ、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８１：２０１６ ［１９９８］を参照）の表面修飾を含む。
【０１０２】
しかしながら、好ましい態様において画像化モジュールは、「ナノ合成物（ｎａｎｏｃｏｍｐｏｓｉｔｅ）」の概念（Ｂａｌｏｇｈら、Ｐｒｏｃ． ｏｆ ＡＣＳ ＰＭＳＥ ７７：１１８ ［１９９７］およびＢａｌｏｇｈおよびＴｏｍａｌｉａ， Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅ． Ｓｏｃ．， １２０：７３５５ ［１９９８］）に従って産生された、デンドリマーを含む。これらの態様においては、反応性封入によってデンドリマーを産生する。この場合、反応物質は鋳型デンドリマーによって予め組織化され、第二の反応物質によってポリマー分子に順次固定化される。このナノ粒子のサイズ、形態、サイズ分布および表面の機能性は、樹状高分子によって決定され、制御される。これらの物質は、ホストの溶解性と適合性を示し、さらにゲスト分子の光学的または生理的性質（すなわち、分子によって画像化が可能となる）を示す。媒体によってデンドリマー・ホストは異なるが、デンドリマー・ホストに様々なゲスト濃度レベルで異なる化合物を充填することもできる。複合体および複合物には、様々な金属または他の無機物を使用してもよい。これらの物質の電子密度が高い場合には、電子顕微鏡および関連した散乱技術による画像化は、かなり単純化される。さらには無機原子の性質によって、阻害性の生物学的物質が共存しても、または共存しなくても画像化できる、測定可能な性質が新たに導入される。本発明のある態様においては、ナノスコピック合成物の標識／トレーサーとして利用するデンドリマーに、金、銀、コバルト、鉄原子／分子および／またはフルオレセイン等の有機色素分子を封入するが、画像化または検出を容易にするあらゆる物質を利用できる。
【０１０３】
本発明のある態様においては、画像化に基礎となるのは、調べる複合体に関し選択した物理的性質の、局所的密度差の受動的または能動的観察である。この差は、形態の違い（例えば、原子力顕微鏡により検出された物質の密度）、組成の変化（例えば、Ｘ線で検出される放射線不透過性）、光励起における相違（例えば、分光測光で検出される蛍光色素）、回折における相違（例えば、ＴＥＭで検出される電子ビーム）、吸収のコントラスト（例えば、光学的方法で検出される光）または特殊な放射発光（例えば、放射性同位体による方法）等によるものである。従って、画像化の質と感度は観察する性質および利用する技術に依存する。癌細胞の画像化技術は、選択した細胞の局所濃度が低いものであっても観察し得る、充分に高レベルの感度を有するものでなくてはならない。できるだけ早期に癌のサインを検出するには、高い選択性（すなわち、適切な標的化による特異性の高い検出）およびできるだけ高い感度が必要となる。
【０１０４】
（Ａ）磁気共鳴による画像化
標的に送達したナノデバイスが腫瘍細胞に結合すれば（または内部へ取り込まれれば）、デバイス上の一つまたは複数のモジュールによって位置を画像化できる。既に、デンドリマーは生物医学的画像化剤として利用されており、おそらく最もよく知られているのは磁気共鳴画像化（ＭＲＩ）用のコントラスト促進剤 （例えば、Ｗｉｅｎｅｒら、Ｍａｇ． Ｒｅｓｏｎ． Ｍｅｄ． ３１：１ ［１９９４］を参照のこと；ＰＡＭＡＭデンドリマーの例示）であろう。通常は、Ｇｄ（ＩＩＩ）−ジエチレントリアミン５酢酸（Ｇｄ（ＩＩＩ）−ＤＴＰＡ）等の錯体形成した常磁性イオンを水溶性デンドリマーに結合させることによって、これらの薬剤を作製する。これに含まれるものの文脈において有用な他の常磁性イオンとしては、ガドリニウム、マンガン、銅、クロム、鉄、コバルト、エルビウム、ニッケル、ユーロピウム、テクネチウム、インジウム、サマリウム、ジスプロシウム、ルテニウム、イッテルビウム、イットリウム、およびホルミウム等のイオン、ならびにその組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。本発明のある態様においては、デンドリマーを上皮成長因子（ＥＧＦ）等の、標的化群に結合させて、複合体を所望の細胞種（例えば、ＥＧＦの場合には、ＥＧＦＲを発現する腫瘍細胞）に特異的に結合させる。本発明の好ましい態様においては、ウィーナー（Ｗｉｅｎｅｒ）の方法（Ｗｉｅｎｅｒら、 Ｍａｇ． Ｒｅｓｏｎ． Ｍｅｄ． ３１：１ ［１９９４］）で、ＤＴＰＡのイソチオシアネートによりＤＴＰＡをデンドリマーに結合させる。
【０１０５】
デンドリマーの多価性、サイズ、および構造により、デンドリマーによるＭＲＩ用薬剤は特に効果的である。これによって、分子のプロトン緩和は大きく促進され、分子緩和能が高まり、かつ標的部位において常磁性イオンが高く効果的な濃度になる。動的ＭＲＩを用いて良性および悪性の乳腺腫瘍を、後者の種類の腫瘍の脈管系がどれほどより高密度の像を作るかに基づいて見分けるのにも、デンドリマーによるガドリニウムによるコントラスト剤が利用されている（Ａｄａｍら、Ｉｖｅｓｔ． Ｒａｄ． ３１：２６ ［１９９６］）。従って、ＭＲＩは特に有用な本発明の画像化システムを提供する。
【０１０６】
（Ｂ）巨視的画像化
癌細胞および組織に関する顕微鏡による静的な構造画像化は、患者の体外で従来から実施されてきた。古典的な組織学による組織生検がよい例である。この方法は、癌の診断および治療における強力な補助資料を提供する。検体を採取後、薄片に切り取り（例えば、４０ミクロン未満）、染色し、固定して、病理学者が検査する。得られる画像は、通常２次元の明視野透化像である。未染色の組織ではほとんど無色であるが、特殊な色素を用いることによって選択的コントラストを付け、異常な細胞内成分の同定を行う。核内倍数性の決定等における、コンピュータ支援による解析を用いた亜細胞性の構造特性の定量化は、検体が薄く３次元全体の情報が欠如しているために組織学的つながりが欠けていることにより、混乱することが多い。このような静的画像化法はその限界にもかかわらず、生検組織における新生物の同定にとって大変重要であった。さらにこの方法は、侵襲性と危険度の高い化学療法、外科的方法、および放射線照射療法の併用（それに伴って、重篤な組織傷害、合併症、および患者の死さえ引き起こすことも多い）の実施に関する重要な決定因子として利用されてきた。
【０１０７】
本発明のナノデバイスによって、腫瘍の微視的機能的画像化が可能となり、画像化の方法が改善され得る。方法は、インビボ、インビトロ、およびエキソビボで用いることができる。例えば、本発明のある態様においては、本発明のデンドリマーは、光に曝されることによって、光またはその他の検出可能なシグナルを発するように設計される。標識したデンドリマーは物理的には、顕微鏡技術の光学的限界解像度よりも小型であるが、励起されたときには自己発光性の物体となり、光学的技術を用いて容易に観察および測定が可能である。本発明のある態様においては、顕微鏡用の蛍光検出バイオセンサーは、調節可能な励起および励起フィルターならびに複数波長の光源の利用を含む（Ｆａｒｋａｓら、ＳＰＥＩ ２６７８：２００ ［１９９７］）。深部組織に画像化剤を含む態様においては、近赤外（ＮＩＲ）域のより長波長を用いる（例えば、Ｌｅｓｔｅｒら、Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ４４：２９ ［１９９８］を参照のこと）。近赤外線領域におけるデンドリマーを用いたバイオセンシングに関しては、デンドリマーのバイオセンシング・アンテナ様構造が示されている（Ｓｈｏｒｔｒｅｅｄら、 Ｊ． Ｐｈｙｓ． Ｃｈｅｍ．， １０１：６３１８ ［１９９７］）。本発明に利用できるバイオセンサーとしては、蛍光性色素および分子標識が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１０８】
本発明のある態様においては、機能的画像化技術を用いてインビボ画像化を行う。機能的画像化は相補的なものであり、静的構造画像化に比べて潜在的により強力な技術である。機能的画像化に関しては、巨視的レベルの画像化の利用が最もよく知られている。例えば、機能的磁気共鳴画像化（ｆＭＲＩ）および陽電子放射断層撮影法（ＰＥＴ）が例として挙げられる。しかしながら、微視的な機能的画像化も実施可能であり、インビボおよびエキソビボでの生体組織分析に利用することもできる。微視的な機能的画像化とは、３次元画像化、３次元空間的なマルチスペクトル容量測定、および時間的サンプリングの効率的な組み合わせである。簡単に言い換えると、一種の３次元スペクトルの微視的映像フィルムである。興味深いことに、細胞と組織は自家蛍光性である。複数の波長で励起した場合には、特異的標識を行わなくとも、複数の細胞成分（例えば、核）を特徴付けるために必要な基本３次元構造の大部分が得られる。斜光線も構造に関する情報を得るのに有用であり、通常利用される。構造スペクトル・マイクロ画像化ではなく、機能スペクトル・マイクロ画像化を利用したバイオセンサーを用いて、細胞または組織内の生理学的シグナルの位置を調べることもできる。例えば、本発明のある態様においては、バイオセンサーを含む本発明のデンドリマーを用いて、上方制御された葉酸またはＥＧＦ類等の受容体ファミリーを画像化する。従って、そのような態様においては、機能的バイオセンシングは、早期の段階であっても発癌または悪性度に関連した生理的異常性の検出を伴う。本発明の組成物および方法を用いて、複数の生理学的条件を画像化することができる。このような方法としは、ｐＨ、酸素濃度、Ｃａ２＋濃度、およびその他の生理的に関連のある分析対象に関するナノスコピックなデンドリマー・バイオセンサーの検出を含むが、これらに限定されない。
【０１０９】
Ｖ．生物学的モニタリング成分
本発明のナノデバイスの生物学的モニタリング成分または検出成分は、ある薬剤（例えば、ナノデバイスの治療用成分によって提供される治療薬）によって誘導される、腫瘍細胞の特定の反応をモニターし得る。本発明は、特定のモニタリング・システムに限定されるものではないが、癌治療をモニターする方法と組成物によって本発明を例示する。本発明の好ましい態様においては、薬剤が細胞にアポトーシスを誘導し、モニタリングにはアポトーシスの検出を含む。特定の態様においては、モニタリング成分は、アポトーシスが起こったときに特定波長の蛍光を発する薬剤である。例えば好ましい態様においては、カスパーゼ活性がモニタリング成分中で緑色蛍光を活性化する。赤色標識を有する特定のサインの標的となった結果、赤色に変化した癌細胞は、アポトーシスを起してオレンジ色に変化し、残りの癌細胞は赤いままである。正常な細胞でアポトーシスの誘導を受けたもの（例えば、副次的傷害によって）があれば、それは蛍光緑色となる。
【０１１０】
これらの態様においては、フルオレセイン等の蛍光基をモニタリング成分に用いる。モレキュラー・プローブ社から入手可能なイソチオシアネート誘導体により、フルオレセインをデンドリマー表面に容易に結合できる。これにより、共焦点顕微鏡法でナノデバイスを細胞と共に画像化できる。
【０１１１】
好ましくは蛍光性ペプチドからなる酵素基質を用いて、ナノデバイスの効果的感知を達成する。例えば、治療薬に起因するアポトーシスによって、ペプチダーゼであるカスパーゼ１（ＩＣＥ）が産生される。カルビオケミ社（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）では、この酵素のペプチド基質であって、蛍光性の部分を遊離する複数のペプチド基質を販売している。本発明の用途において、特に有用なペプチドを以下に示す。
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ここでＭＣＡは（７−メトキシクマリン−４−イル）アセチルであり、ＤＮＰは２，４−ジニトロフェニル基である（Ｔａｌａｎｉａｎら、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２７２： ９６７７ ［１９９７］）。このペプチドにおいては、蛍光の発生に関わる共鳴エネルギーのＤＮＰ基への移動（ＦＲＥＴ）により、ＭＣＡ基の蛍光はかなり減弱している。酵素がアスパラギン酸とグリシン残基の間でペプチドを切断すれば、ＭＣＡとＤＮＰが分離し、ＭＣＡ基は強い緑色蛍光を発する（最大励起は３２５ｎｍであり、最大放射は３２９ｎｍである）。
【０１１２】
本発明の好ましい態様においては、ペプチドのリジン端がナノデバイスに連結しており、切断が起こったときに、ＭＣＡ基が細胞質に放出される。ペプチドのリジン端は、例えば、Ｍａｌ−ＰＥＧ−ＯＳｕ等の二機能性リンカーの活性化エステル基と反応し得るので、複合体作製の際の合成において有用となる。従って、これらの方法を用いて作製した標的細胞が緑色蛍光を発すれば、明らかにアポトーシスが開始したことを示す（細胞が既に凝集した量子ドットにより赤色を呈しているのであれば、色の組み合わせとして細胞はオレンジ色に変化する）。
【０１１３】
本発明に利用可能な別の蛍光性色素としては、アポトーシス細胞内のＤＮＡ変化に感受性があることが報告されている、アクリジンオレンジ（Ａｂｒａｍｓら、 Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １１７：２９ ［１９９３］）、およびアポトーシスに伴う脂質過酸化に感受性がある、シスパリナリン酸（Ｈｏｃｋｅｎｂｅｒｙら、 Ｃｅｌｌ ７５：２４１ ［１９９３］）が挙げられるが、これらに限定されない。なお、ペプチドおよび蛍光性色素は単に例示的なものである。アポトーシスによって産生されるカスパーゼの効果的な基質として働くペプチドであれば、いずれのペプチドも本発明に利用できる。
【０１１４】
ＶＩ．標的送達のための成分
上記で説明したように、本発明のもう一つの成分は、ナノデバイス組成物が特異的に特定の種類の細胞（例えば、腫瘍細胞）を標的化できるものである。一般的に、ナノデバイスは細胞の表面部を通じて新生物細胞に送達され、受容体媒介性エンドサイトーシスによって細胞に取り込まれる。
【０１１５】
標的細胞（例えば、腫瘍細胞）の表面に位置することが知られている、任意の成分を本発明に利用できる。例えば、そのような成分に対する抗体は、成分を含む細胞の表面に本発明の組成物を標的化する。または標的成分は、細胞表面の受容体に対するリガンドであってもよく、またはその逆であってもよい。同様に、ビタミンも本発明の治療薬を特定の細胞に標的化する目的で利用できる。
【０１１６】
本発明のある態様においては、標的成分はサイン成分として機能するものであってもよい。例えば、腫瘍特異的抗原を本発明に利用できる。このような腫瘍特異的抗原としては、癌胎児性抗原、前立腺特異的抗原、チロシナーゼ、ｒａｓ、シアリル・ルイス抗原、ｅｒｂ、ＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−３、ＢＡＧＥ、ＭＮ、ｇｐ１００、ｇｐ７５、ｐ９７、プロテアーゼ３、ムチン、ＣＤ８１、ＣＩＤ９、ＣＤ６３；ＣＤ５３、ＣＤ３８、ＣＯ−０２９、ＣＡ１２５、ＧＤ２、ＧＭ２およびＯ−アセチルＧＤ３、Ｍ−ＴＡＡ、Ｍ−ｆｅｔａｌまたはＭ−ｕｒｉｎａｒｙが挙げられるが、これらに限定されない。または、標的成分は、腫瘍サプレッサー、サイトカイン、ケモカイン、腫瘍特異的受容体リガンド、受容体、アポトーシス誘導物質、または分化作用因子であってもよい。
【０１１７】
標的化に利用する腫瘍サプレッサータンパク質としては、ｐｌ６、ｐ２１、ｐ２７、ｐ５３、ｐ７３、Ｒｂ、ウィルムス腫瘍（ＷＴ−１）、ＤＣＣ、１型神経線維腫症（ＮＦ−１）、フォンヒッペル−リンダウ病（ＶＨＬ）の腫瘍サプレッサー、Ｍａｓｐｉｎ、Ｂｒｕｓｈ−１、ＢＲＣＡ−１、ＢＲＣＡ−２、マルチ腫瘍サプレッサー （ＭＴＳ）、ヒト黒色腫のｇｐ９５／ｐ９７抗原、腎細胞癌関連Ｇ２５０抗原、ＫＳ１／４全癌（ｐａｎ−ｃａｒｃｉｎｏｍａ）抗原、卵巣性癌抗原（ＣＡ１２５）、前立腺特異抗原、黒色腫抗原ｇｐ７５、ＣＤ９、ＣＤ６３、ＣＤ５３、ＣＤ３７、Ｒ２、ＣＤ８１、Ｃ００２９、ＴＩ−１、Ｌ６およびＳＡＳが挙げられるが、これらに限定されない。当然のことながら、これらは単に例示的な腫瘍サプレッサーであるが、本発明には腫瘍サプレッサーとして当業者に現在公知である、または将来明らかにされる他の因子を利用することもできる。
【０１１８】
本発明の好ましい態様においては、標的化を発癌遺伝子が発現している因子に向ける。このような因子としては、Ｓｒｃファミリーの構成員等の膜結合性および細胞質性のチロシン・キナーゼ、Ｍｏｓ等のセリン／トレオニン・キナーゼ、血小板由来増殖因子（ＰＤＤＧ）等の増殖因子および受容体、ｒａｓファミリーを含む小型ＧＴＰアーゼ（Ｇタンパク質）、サイクリン依存性タンパク質・キナーゼ（ｃｄｋ）、ｃ−ｍｙｃ、Ｎ−ｍｙｃおよびＬ−ｍｙｃ構成員を含むｍｙｃファミリーの構成員、ならびにｂｃｌ−２とそのファミリー構成員が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１１９】
本発明の標的であるサイトカインとしては、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＥＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬＡ １、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＴＮＦ、ＧＭＣＳＦ、β−インターフェロンおよびγ−インターフェロンが挙げられるが、これらに限定されない。利用できるケモカインとしては、ＭＩＰ１α、ＭＩＰ１βおよびＲＡＮＴＥＳが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１２０】
本発明の標的である酵素としては、シトシン脱アミノ酵素、ヒポキサンチン−グアニン・ホスホリボシル転移酵素、ガラクトース−１−リン酸ウリジルトランスフェラーゼ、フェニルアラニン・ヒドロキシラーゼ、グルコセレブロシダーゼ、スフィンゴミエリナーゼ、α−Ｌ−イズロニダーゼ、グルコース−６−リン酸脱水素酵素、ＨＳＶチミジンキナーゼ、およびヒト・チミジンキナーゼが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１２１】
本発明に利用可能な受容体およびそれに関連したリガンドとしては、葉酸受容体、アドレナリン受容体、成長ホルモン受容体、黄体形成ホルモン受容体、エストロゲン受容体、上皮成長因子受容体、繊維芽細胞成長因子受容体等が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１２２】
本発明の標的化の局面において利用し得るホルモンおよびその受容体としては、成長ホルモン、プロラクチン、胎盤性ラクトゲン、黄体形成ホルモン、卵胞刺激的ホルモン、絨毛性ゴナドトロピン、甲状腺−刺激的ホルモン、レプチン、アドレノコルチコトロピン（ＡＣＴＨ）、アンジオテンシンＩ、アンジオテンシンＩＩ、βエンドルフィン、βメラノサイト刺激的ホルモン（β−ＭＳＨ）、コレシストキニン、エンドセリンＩ、ガラニン、胃抑制ペプチド（ＧＥＰ）、グルカゴン、インスリン、アミリン、リポトロピン、ＧＬＰ−１（７−３７）ニューロフィシンおよびソマトスタチンが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１２３】
さらには、本発明は、ナノデバイスの標的化成分に配置されたビタミン（脂溶性および非脂溶性ビタミンの両方）を利用して、それに対する受容体を有するか、またはこれらのビタミンを取り込む細胞を標的化することを意図する。この局面に関し特に好ましいものとしては、ビタミンＤおよびその類似体、ビタミンＥ、ビタミンＡ等の脂溶性ビタミン、またはビタミンＣ等の水溶性ビタミンが挙げられる。
【０１２４】
本発明のある態様においては、多数の癌細胞標的化群がデンドリマーに結合する。次に、標的化デンドリマーをコア・デンドリマーに結合させる。従って、本発明のナノデバイスは、特異的に癌細胞を標的化するようなものである（すなわち、健康な細胞ではなく癌細胞により結合する可能性が高い）。さらに、デンドリマーが多価であるためにポリエチレングリコール（ＰＥＧ）またはポリエチルオキサゾリン（ＰＥＯＸ）鎖が結合可能となり、血液循環時間が増加し複合体の免疫原性を減少させることができる。
【０１２５】
本発明の好ましい態様においては、短い連結（例えば、直接結合）、中程度の長さの連結（例えば、ピアス・ケミカル社で販売するＳＰＤＰ等の小型分子の二官能性リンカーを用いて）または長い連結（例えば、シェアウォーター・ポリマーズ社で販売するＰＥＧ二官能性リンカー）のいずれかを利用して、標的化群をデンドリマーに結合する。デンドリマーの表面には多数の官能基が存在するので、一つまたは複数の標的化群を個々のデンドリマーに結合することができる。その結果、デンドリマーと標的細胞の間で複数の結合が起こる。このような態様においては、デンドリマーは、この「協同的結合」または多価相互作用効果により、標的細胞に対して非常に高い親和性を示す。
【０１２６】
立体化学的な理由から、リガンドがより小型であれば、デンドリマーの表面により多く結合させることができる。葉酸を結合したデンドリマーが、高親和性葉酸受容体（ｈＦＲ）を発現する腫瘍細胞の表面および細胞内に特異的に蓄積することが、最近ウィーナー（Ｗｉｅｎｅｒ）によって報告された（Ｗｉｅｎｅｒら、 Ｉｎｖｅｓｔ． Ｒａｄｉｏｌ．， ３２：７４８ ［１９９７］）。ｈＦＲ受容体は、乳癌を含む上皮性の腫瘍で発現し、上方制御される。ｈＦＲを欠失した対照の細胞では、葉酸結合性デンドリマーの有意な蓄積は全くみられなかった。カルボジイミド・カップリング反応によって、最も成熟した世代のＰＡＭＡＭデンドリマーに葉酸を結合させることができる。葉酸はサイズも小さく、結合の方法も簡単なので、デンドリマーを標的化するための好ましい候補である。
【０１２７】
より大型ではあるが、相対的にはまだ小型の部類に入るリガンドとして、上皮成長因子（ＥＧＦ）がある。これは５３アミノ酸残基の単一鎖からなるペプチドである。ＳＰＤＰリンカーでＥＧＦに結合したＰＡＭＡＭデンドリマーはヒトのグリオーマ細胞の細胞表面に接着し、エンドサイトーシスで取り込まれ、リソソームに蓄積することが報告されている（Ｃａｓａｌｅら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．， ７：７ ［１９９６］）。正常細胞と比較して脳腫瘍細胞ではＥＧＦ受容体の密度は最高で１００倍高いので、ＥＧＦを用いることによって、この種の腫瘍に対する有用な標的化剤を提供し得る。また、ＥＧＦ受容体は乳癌および大腸癌で過剰発現するので、同様にこれらの細胞の標的化剤としてＥＧＦを利用することができる。同様に、繊維芽細胞成長因子受容体（ＥＧＥＲ）も相対的に小さいポリペプチド（ＦＧＦ）を結合し、多くのものが乳腺腫瘍細胞株で高レベルに発現することが知られている（特に、ＦＧＦ１、２および４）（Ｐｅｎａｕｌｔ−Ｌｌｏｒｃａら、 Ｉｎｔ． Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ ６１：１７０ ［１９９５］）．
【０１２８】
本発明の好ましい態様においては、標的化成分は、抗体または抗体の抗原結合性断片（例えば、Ｆａｂ単位）である。例えば、多くの癌（ＨＥＲ２乳腺腫瘍を含む）の表面に存在し、よく調べられている抗原は、糖タンパク質ｐ１８５である。これは、悪性細胞でのみ発現する（Ｐｒｅｓｓら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ５：９５３ ［１９９０］）。組換えヒト化抗ＨＥＲ２モノクローナル抗体（ｒｈｕＭａｂＨＥＲ２）が、ＨＥＲ２を過剰発現する乳癌細胞の増殖を阻害することが報告されており、また進行性乳癌の治療（通常の化学療法剤と併用で）に関する臨床試験において、現在評価が行われている（Ｐｅｇｒａｒｎら、Ｐｒｏｃ． Ａｍ． Ｓｏｃ． Ｃｌｉｎ． ＯｎｃｏＬ， １４：１０６ ［１９９５］）。パーク（Ｐａｒｋ）およびパパアジョポロス（Ｐａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓ）は、ｒｈｕＭａｂＨＥＲ２のＦａｂ断片を小型単層状のリポソームに結合した。次に、これに化学療法剤であるドキソルビシン（ｄｏｘ）を充填した後、ＨＥＲ２を過剰発現する異種移植腫瘍片へと標的化することが可能である（Ｐａｒｋら、 Ｃａｎｃｅｒ Ｌｅｔｔ．， １１８：１５３ ［１９９７］およびＫｉｒｐｏｔｉｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．， ３６：６６ ［１９９７］）。このｄｏｘを充填した「免疫リポソーム」は、ｄｏｘを含んだ同等のリポソームであって標的化させないもの、または遊離のｄｏｘと比べて、腫瘍に対する細胞毒性が高く、かつ遊離のｄｏｘと比べて全身的な毒性は減少した。
【０１２９】
様々な生物学的標的（例えば、病原体、腫瘍細胞、正常組織）上の、抗原または免疫原（例えば、腫瘍、組織または病原体特異的抗原）を標的化できるように、抗体を作製することができる。このような抗体としては、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、単一鎖抗体、Ｆａｂ断片、およびＦａｂ発現ライブラリーが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１３０】
ある好ましい態様においては、抗体は、腫瘍特異的エピトープ（例えば、ＴＡＧ−７２（Ｋｊｅｌｄｓｅｎら、 Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ４８：２２１４−２２２０ ［１９８８］； 米国特許第５，８９２，０２０号、第５，８９２，０１９号および第５，５１２，４４３号）；ヒト癌抗原（米国特許第５，６９３，７６３号、第５，５４５，５３０号および第５，８０８，００５号）；骨癌細胞由来のＴＰ１およびＴＰ３抗原（米国特許第５，８５５，８６６号）；腺癌細胞由来のトムゼン−フリーデンライヒ（ＴＦ）抗原（米国特許第５，１１０，９１１号）；ヒト前立腺癌由来の「ＫＣ−４抗原」（米国特許第４，７０８，９３０号および第４，７４３，５４３号）；ヒト直腸結腸癌抗原（米国特許第号４，９２１，７８９）；嚢胞腺癌由来のＣＡ１２５抗原（米国特許第４，９２１，７９０号）；ヒト乳癌由来のＤＦ３抗原（米国特許第４，９６３，４８４号および第５，０５３，４８９号）；ヒト乳腺腫瘍抗原（米国特許第４，９３９，２４０号）；ヒトの黒色腫のｐ９７抗原（米国特許第４，９１８，１６４号）；癌またはオロソムコイドに関連した抗原（ＣＯＲＡ）（米国特許第４，９１４，０２１号）；ヒト肺癌の扁平細胞に反応するがヒト肺小細胞癌に反応しない、ヒトの肺癌抗原（米国特許第号４，８９２，９３５号）；ヒト乳癌の糖タンパク質のＴおよびＴｎハプテン（Ｓｐｒｉｎｇｅｒら、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ． Ｒｅｓ． １７８：２７１−２９２ ［１９８８］）、ＭＳＡと呼ばれる乳癌糖タンパク質（Ｔｊａｎｄｒａら、 Ｂｒ． Ｊ． Ｓｕｒｇ． ７５：８１１−８１７ ［１９８８］； ＭＦＧＭ乳癌抗原（Ｉｓｈｉｄａら、 Ｔｕｍｏｒ ＢｉｏＬ １０：１２−２２ ［１９８９］）；ＤＵ−ＰＡＮ−２膵臓癌抗原（Ｌａｎら、 Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ４５：３０５−３１０ ［１９８５］）； ＣＡ１２５卵巣癌抗原（Ｈａｎｉｓｃｈら、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ． Ｒｅｓ． １７８：２９−４７ ［１９８８］）； ＹＨ２０６肺癌抗原（Ｈｉｎｏｄａら、（１９８８） Ｃａｎｃｅｒ Ｊ． ４２：６５３−６５８ ［１９８８］）を認識する。前述の参考文献はいずれも参照として特に本明細書に組み入れられる。
【０１３１】
他の好ましい態様においては、抗体は特異的病原体を認識する。このような病原体としては、例えば、レジオネラ菌（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｅｒｍｏｐｈｉｌｉａ）、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、破傷風菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｅｔａｎｉ）、インフルエンザ菌（Ｈｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）、梅毒トレポネーマ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｐａｌｌｉｄｕｍ）、炭疽菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓ）、コレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ）、ボレリア・ブルグドルフェリ（Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）、ジフテリア菌（Ｃｏｒｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ）、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）、ヒト乳頭腫ウィルス、ヒト免疫不全ウィルス、風疹ウィルス、ポリオウイルス等が挙げられる。
【０１３２】
当技術分野で公知の様々な方法を用いてポリクローナル抗体を産生することができる。抗体の産生に関しては、所望のエピトープに対応するペプチドを注射することによって様々な動物宿主を免役することができる。動物宿主としては、ウサギ、マウス、ラット、ヒツジ、ヤギ等が挙げられるが、これらに限定されない。好ましい態様においては、ペプチドを免疫原性の担体（例えば、ジフテリア毒素、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、またはキーホール・リンペット・ヘモシアニン（ＫＬＨ））に結合する。宿主の種に応じて様々なアジュバントを利用し、免疫学的反応を増強する。このようなアジュバントとしては、フロインド（完全および不完全）、水酸化アルミニウム等の鉱物ゲル、リゾレシチン等の表面活性剤、プルロニック・ポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油性乳剤、キーホール・リンペット・ヘモシアニン、ジニトロフェノール、およびＢＣＧ（カルメット−ゲラン杆菌）ならびにコリネバクテリウム−パルヴム等の潜在的に有用なヒトのアジュバントが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１３３】
モノクローナル抗体の調製に関しては、継代細胞株の培養によって抗体分子を産生する技術を用いることができる（例えば、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、「抗体：実験マニュアル（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」、 Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、コールドスプリングハーバー、ニューヨークを参照のこと）。これらには、ケーラー（Ｋｏｈｌｅｒ）およびミルシテイン（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ）が初めに開発したハイブリドーマ技術（ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ， Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５−４９７ ［１９７５］）、ならびにトリオーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（例えば、Ｋｏｚｂｏｒら Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｔｏｄａｙ ４：７２ ［１９８３］を参照のこと）、ならびにヒトモノクローナル抗体を産生するＥＢＶハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅら、「モノクローナル抗体および癌治療（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ）」中、Ａｌａｎ Ｒ． Ｌｉｓｓ， Ｉｎｃ．， ｐｐ． ７７−９６ ［１９８５］）が含まれるが、これらに限定されない。
【０１３４】
本発明の別の態様においては、最近の技術を利用した無菌動物によってモノクローナル抗体を産生することもできる（例えば、国際特許公開公報ＰＣＴ／ＵＳ９０／０２５４５を参照のこと）。本発明に従って、ヒト抗体を利用してもよく、ｋａｔｕ
ヒト・ハイブリドーマを用いて（Ｃｏｔｅら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ８０：２０２６−２０３０ ［１９８３］）またはＥＢウイルスを用いたヒトＢ細胞のインビトロ形質転換により（Ｃｏｌｅら、「モノクローナル抗体および癌治療（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ）」中、Ａｌａｎ Ｒ． Ｌｉｓｓ， ｐｐ． ７７−９６ ［１９８５］）、得ることができる。．
【０１３５】
本発明に従って、単一鎖抗体の産生技術（米国特許第４，９４６，７７８号； 参照として本明細書に組み入れられる）を利用して、特異的な単一鎖抗体の産生に用いることができる。本発明の別の態様では、Ｆａｂ発現ライブラリーの構築技術（Ｈｕｓｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４６：１２７５−１２８１ ［１９８９］）を利用して、所望の特異性を有するモノクローナルＦａｂ断片の同定を迅速かつ簡便に行うことができる。
【０１３６】
既知の技術により、抗体分子のイデオタイプ（抗原結合領域）を含む抗体断片を作製することもできる。例えば、そのような断片としては、抗体分子のペプシン消化で調製可能なＦ（ａｂ’）２断片、Ｆ（ａｂ’）２断片のジスルフィド結合を還元して作製できるＦａｂ’断片、およびパパインと還元剤で抗体分子を処理することによって調製可能なＦａｂ断片が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１３７】
抗体の産生においては、当技術分野で公知の技術によって、所望の抗体に関するスクリーニングを行うことができる。公知の技術としては、例えば、放射免疫アッセイ、ＥＬＩＳＡ（酸素結合免疫吸着検査法）、「サンドイッチ」免疫アッセイ、免疫放射定量測定法、ゲル内拡散沈降素反応、免疫拡散法、インサイチュー免疫アッセイ（例えば、金コロイド、酵素または放射性同位元素標識を用いて）、ウエスタンブロット、沈降反応、凝集アッセイ（例えば、ゲル凝集アッセイ、血球凝集アッセイ等）、補体結合アッセイ、免疫蛍光アッセイ、プロテインＡアッセイ、および免疫電気泳動法等）が挙げられる。
【０１３８】
本発明のデンドリマー・システムは、リポソームと比較して安定性が高く、サイズおよび多分散性に関する調整がし易く、かつ一般的に毒性と免疫原性が低い等の、多くの利点を有する（例えば、Ｄｕｎｃａｎら、Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｐｒｅｐｒｉｎｔｓ ３９：１８０ ［１９９８］参照のこと）。従って、本発明のある態様においては、本発明のナノデバイスに関する標的化剤のように、標的化用抗体と同様に、抗ＨＥＲ２抗体断片はデンドリマーに結合する。
【０１３９】
乳癌に関しては、葉酸、ＥＧＦ、ＦＧＦ、および腫瘍関連抗原ＭＵＣ１、ｃＭｅｔ受容体およびＣＤ５６（ＮＣＡＭ）に対する抗体（または抗体断片）を用いて、細胞表面を標的化することができる。細胞内部へ移行すると、ナノデバイスは（結合した抗体によって）ＨＥＲ２、ＭＵＣ１または変異ｐ５３に結合する。
【０１４０】
二官能性リンカーであるＳＰＤＰおよびＳＭＣＣ、ならびにより長いＭａｌ−ＰＥＧ−ＯＳｕリンカーは、抗体とデンドリマーを結合させる目的において特に有用である。さらに多くの腫瘍細胞は、オリゴサッカライドに結合する表面レクチンを含み、その特異的認識は、主にオリゴサッカライドの末端の炭化水素残基によるものである（ＳｈａｒｏｎおよびＬｉｓ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４６：２２７ ［１９８９］）。適当な単糖をＢＳＡ等の非糖鎖付加型タンパク質に結合させることにより、遊離の単糖よりさらに強固に腫瘍レクチンに結合する複合体を作製できる（Ｍｏｎｓｉｇｎｙら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｅ ７０：１６３３ ［１９８８］）。
【０１４１】
マンノシル化ＰＡＭＡＭデンドリマーは単量体マンノシドより最大で４００倍強く、マンノシド結合レクチンに結合する（ＰａｇｅおよびＲｏｙ， Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．， ８：７１４ ［１９９７］）。シアリル化デンドリマーおよびその他の樹状ポリマーは、インビトでもインビボでも様々なシアル酸結合性ウイルスに結合し、これを阻害する。複数の単糖残基（例えば、ガラクトース結合型細胞のαガラクトシド）をデンドリマーに結合させることによって、対応する種類の腫瘍細胞に親和性の高い多価複合体を作製する。末端アミンを市販されているα−ガラクトシジル−フェニルイソチオシアネートと反応させることによって、付加反応を容易に実施できる。炭化水素が小型であれば、デンドリマー表面における濃度を高めることができる。
【０１４２】
適当なペプチド標的化群を同定および選択するための柔軟性の高い方法としては、ファージ・ディスプレイ技術が挙げられる（例えば、Ｃｏｒｔｅｓｅら、 Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｂｉｏｔｅｃｈｏｌ．， ６：７３ ［１９９５］を参照のこと）。これは、市販のキットを用いて簡単に実施することができる。ファージ・ディスプレイ法では、ファージ表面に結合したペプチドの、大規模な多様性な組み合わせライブラリーを作製し
、強固に結合する固定化表面受容体に対してスクリーニングを行う。強固に結合させた後、ウイルス構築物を単離して配列を決定し、ペプチド配列を同定する。そのうちの最良のペプチドを、次回のペプチド・ライブラリーのスクリーニングの出発点として用いてこれを繰り返す。最終的に、親和性の高い好適なペプチドを同定し、次に生体適合性および標的特異性に関するスクリーニングを実施する。このようにして、デンドリマーに結合可能なペプチドを産生することができる。これによって、細胞の受容体（例えば、腫瘍細胞の受容体）またはその他の所望の標的に対して、特異性および親和性の高い多価複合体を作製する。
【０１４３】
上記の標的化法に関連して「プレターゲティング」法がある（例えば、ＧｏｏｄｗｉｎおよびＭｅａｒｅｓ， Ｃａｎｃｅｒ （ｓｕｐｐｌ．） ８０：２６７５ ［１９９７］）を参照のこと）。本法の例としては、腫瘍特異的モノクローナル抗体とストレプトアビジンの複合体による患者の初期治療が挙げられる。ビオチン化した適当な除去剤で残存する可溶性複合体を血流から除く。腫瘍に局在する複合体だけが残れば、つぎに放射性標識したビオチン化薬剤を導入する。これは、特異的で強力なビオチン−ストレプトアビジンの相互作用によって腫瘍部位に局在化する。従って、癌細胞の近くでは放射性線量を最大化し、健康な細胞に有害となるおそれのある体の他の部分では、その線量を最小化する。
【０１４４】
まず、ポリスチレン性のウェルに結合したストレプトアビジン分子をビオチン化デンドリマーで処理し、次に放射性標識ストレプトアビジンを導入し、ポリスチレンに結合したストレプトアビジン一つ当たり、最大４分子の標識ストレプトアビジン分子が結合することが示されている（Ｗｉｌｂｕｒら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．， ９：８１３ ［１９９８］）。従って、本発明の方法において、ビオチン化デンドリマーはインビボにおいて放射性標識多価受容体として作用し、これを用いて結合した抗体複合体当たりの放射線量を増幅させることができる。本発明の好ましい態様においては、クラスターを形成したデンドリマー上の一つまたは複数の多価ビオチン化モジュールは、放射性標識またはボロン化された（Ｂａｒｔｈら、Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ １４：５３４ ［１９９６］））、アビジンまたはストレプトアビジンに対する多価標的となり、これによっても腫瘍細胞の照射線量の増幅が起こる。
【０１４５】
また、デンドリマーおよびクラスター化したデンドリマーを除去剤として用いることもできる。例えば、多価ガラクトースまたはマンノース表面を有するデンドリマーを部分的にビオチン化することによってこれを達成できる。こうして、複合体−除去剤からなる複合体は、対応する肝細胞の受容体に対して強力な親和性を有する。
【０１４６】
本発明の他の態様においては、標的化に、浸透性と保持力を強化する（ＥＰＲ）方法を用いる。浸透性と保持力（ＥＰＲ）の強化の効果は、腫瘍の標的化の「受動的」な方法である（ＤｕｎｃａｎおよびＳａｔ， Ａｎｎ． Ｏｎｃｏｌ．， ９：３９ ［１９９８］を参照のこと）。ＥＰＲ効果は、腫瘍の高浸透性の脈管系および貧弱なリンパ排液による腫瘍微小環境において、高分子および小粒子を選択的に濃縮する。この用途において、本発明のデンドリマー組成物は理想的なポリマーを提供する。つまり、デンドリマー組成物は相対的に堅く、多分散性の幅は狭く、サイズおよび表面の化学的性質が調整可能であり、抗腫瘍剤を輸送しその後放出可能な「積載」空間を内部に有する。実際、ＰＡＭＡＭデンドリマー白金酸塩が、固形腫瘍に蓄積し（シスプラチンの場合に比べて約５０倍高いＰｔレベル）、シスプラチンが効果を示さない固形腫瘍モデルにおいてもインビボ活性を有することが示されている（Ｍａｌｉｋら、Ｐｒｏｃ． Ｉｎｔ’ｌ． Ｓｙｍｐ． Ｃｏｎｔｒｏｌ． Ｒｅｌ． Ｂｉｏａｃｔ． Ｍａｔｅｒ．， ２４：１０７ ［１９９７］およびＤｕｎｃａｎら、Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｐｒｅｐｒｉｎｔｓ ３９：１８０ ［１９９８］）。
【０１４７】
本発明の標的化成分は、生物学的標的の（例えば、病原体の）様々な他のエピトープを認識する。ある態様においては、標的を認識するか、または様々な病原性生物を検出する目的で、分子認識要素を組み込む。このような病原性生物としては、以下のものが挙げられるが、これらに限定されない：ＨＴＶ（Ｗｉｅｓら、 Ｎａｔｕｒｅ ３３３： ４２６ ［１９８８］）、インフルエンザ（Ｗｈｉｔｅら、 Ｃｅｌｌ ５６： ７２５ ［１９８９］）、クラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ）（Ｉｎｆｅｃｔ． Ｉｍｍ． ５７： ２３７８ ［１９８９］）、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、ストレプトコッカス・スイ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｕｉｓ）、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、おたふくかぜウイルス、ニューカッスル病ウイルス、およびレオウィルス、センダイウイルス、およびミクソウイルスを含む様々なウイルスを標的とするシアル酸；ならびにコロナウイルス、脳脊髄炎ウイルスおよびロタウイルスを標的とする９−ＯＡＣシアル酸；サイトメガロウイルス（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １７６： ３３７ ［１９９０］）および麻疹ウイルス（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １７２： ３８６ ［１９８９］）を検出するための非シアル酸糖タンパク質；ＨＩＶを標的としたＣＤ４（Ｋｈａｔｚｍａｎら、Ｎａｔｕｒｅ ３１２： ７６３ ［１９８５］）、血管作用性腸管ペプチド（Ｓａｃｅｒｄｏｔｅら、Ｊ． ｏｆ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １８： １０２ ［１９８７］）およびペプチドＴ（Ｒｕｆｆら、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ ２１１： １７ ［１９８７］）；ワクシニアウイルスを標的とした上皮成長因子（Ｅｐｓｔｅｉｎら、 Ｎａｔｕｒｅ ３１８： ６６３ ［１９８５］）；狂犬病ウイルスを標的とするアセチルコリン受容体（Ｌｅｎｔｚら、 Ｓｃｉｅｎｃｅ ２１５： １８２ ［１９８２］）；エピスタイン−バー・ウイルスを標的とするＣｄ３補体受容体（Ｃａｒｅｌら、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６５： １２２９３ ［１９９０］）；レオウィルスを標的とするβアドレナリン受容体（Ｃｏら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ８２： １４９４ ［１９８５］）；リノウイルスを標的とするＩＣＡＭ−１（Ｍａｒｌｉｎら、 Ｎａｔｕｒｅ ３４４： ７０ ［１９９０］）、Ｎ−ＣＡＭおよびミエリン関連糖タンパク質ＭＡｂ（Ｓｈｅｐｈｅｙら、 Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ８５： ７７４３ ［１９８８］）；ポリオウイルスを標的とするポリオウイルス受容体（Ｍｅｎｄｅｌｓｏｈｎら、 Ｃｅｌｌ ５６： ８５５ ［１９８９］）；ヘルペスウイルスを標的とする繊維芽細胞成長因子受容体（Ｋａｎｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４８： １４１０ ［１９９０］）； 大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）を標的とするオリゴマンノース；髄膜炎菌を標的とするガングリオシドＧＭ１；および様々な病原体を広範に検出する抗体（例えば、淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）、ビブリオ・バルニフィカス（Ｖ． ｖｕｌｎｉｆｉｃｕｓ）、腸炎ビブリオ菌（Ｖ． ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ）、コレラ菌（Ｖ． ｃｈｏｌｅｒａｅ）およびビブリオ・アルギノリチカス（Ｖ． ａｌｇｉｎｏｌｙｔｉｃｕｓ）。
【０１４８】
本発明のある態様においては、標的化成分は、好ましくは核酸（例えば、ＲＮＡまたはＤＮＡ）である。ある態様においては、核酸である標的化成分は、特定の核酸（例えば、染色体ＤＮＡ、ｍＲＮＡ、またはリボゾームＲＮＡ）と塩基対形成することによってハイブリダイズするように設計される。他の態様においては、核酸はリガンドまたは生物学的標的に結合する。以下のタンパク質に結合する核酸が同定されている：逆転写産酵素、ＨＩＶのＲｅｖおよびＴａｔタンパク質（Ｔｕｅｒｋら、 Ｇｅｎｅ １３７（１）：３３−９ ［１９９３］）； ヒト神経増殖因子（Ｂｉｎｋｌｅｙら、 Ｎｕｃ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２３（１６）：３１９８−２０５ ［１９９５］）； および血管内皮増殖因子（Ｊｅｌｌｉｎｅｋら、 Ｂｉｏｃｈｅｍ． ８３（３４）： １０４５０−６ ［１９９４］）である。リガンドに結合する核酸は、好ましくはＳＥＬＥＸ法で同定される（例えば、米国特許第５，４７５，０９６号、第５，２７０，１６３号および第５，４７５，０９６号、ならびにＰＣＴ出願された国際公開公報第９７／３８１３４号、国際公開公報第９８／３３９４１号、および国際公開公報第９９／０７７２４号を参照のこと；これらはいずれも参照として本明細書に組み入れられる）。なお、他にも多くの方法が当技術分野で公知である。
【０１４９】
ＶＩＩ．合成および複合体形成
本節では、ナノデバイス個々の成分（すなわち、上記の成分のうち一つまたは複数を含む個々のデンドリマー）の合成および生成、ならびにそのような成分のナノデバイスへの結合（例えば、そのようなデンドリマーを一つまたは複数、コア・デンドリマーへ結合させる）に関して説明を行う。
【０１５０】
本発明の好ましい態様においては、典型的な分岐合成（イニシエーター・コアから高分子を形成させる）に従いＰＡＭＡＭデンドリマーを調製する。これはメチルアクリレート（ＭＡ）の二重結合にアミノ基を付加するマイケル付加反応から成る２段階逐次成長反応の後に、エチレンジアミン（ＥＤＡ）による末端カルボメトキシ、−（ＣＯ２ＣＨ３）基のアミド化を実施する段階を含む。イニシエーター・コア試薬としてアンモニアを用いた場合には、この合成は図７に示す反応で表される。
【０１５１】
この過程の第一の段階では、４７℃で４８時間、不活性窒素雰囲気下においてアンモニアをＭＡ（モル比＝１：４．２５）と反応させる。得られた化合物を、世代＝０と呼び、これは星状形態で分岐したＰＡＭＡＭトリエステルである。次の段階では、トリエステルと過剰のＥＤＡと反応させ、星状形態で分岐したＰＡＭＡＭトリアミン（Ｇ＝０）を生成させる。この反応をメタノール中不活性雰囲気（窒素）下で実施する。０℃では反応が終結するまで４８時間かかる。このマイケル付加反応および逐次アミド化反応を繰り返して、世代＝１を調製する。
【０１５２】
このトリアミンを調製したところで、分岐型ＰＡＭＡＭデンドリマーの合成の第一サイクルが完全に終了する。この反応を連続的に反復して、より大型の世代（Ｇ＝１〜５）のデンドリマー（すなわち、それぞれエステルおよびアミンで終結した分子）を合成する。例えば、この連続反応を２サイクル目に、世代１が産生され、これはそれぞれヘキサエステルおよびヘキサアミン表面を有する。その後の１〜９世代に関して、同様の方法で同一反応を繰り返し、上記のように分子量と末端基数が正確であり、コア−外皮構造を与える分岐型内部空間の層を形成させる。エステルで終結したＰＡＭＡＭデンドリマーの加水分解、または無水コハク酸をアミンで終結したデンドリマー（例えば、成熟世代のＰＡＭＡＭ、ＰＯＰＡＭまたはＰＯＰＡＭ−ＰＡＭＡＭハイブリッド・デンドリマー）に反応させることによって、カルボン酸の表面を有するデンドリマーを産生させることもできる。
【０１５３】
重合過程を開始するコア構造に基づいて、様々なデンドリマーを合成することができる。これらのコア構造は、デンドリマー分子の、全体的形状、密度および表面の機能性等の、複数の重要な性質を規定する（Ｔｏｍａｌｉａら、Ａｎｇｅｗ． Ｃｈｅｍ． Ｉｎｔ． Ｅｄ． Ｅｎｇｌ．， ２９：５３０５ ［１９９０］）。アンモニアに由来する球状デンドリマーは、三価イニシエーター・コアを有するが、ＥＤＡは四価イニシエーター・コアである。最近、棒状形態のデンドリマーが報告された。これは、様々な長さの線状ポリ（エチレンイミン）コアに基づくものである。コアが長くなるにしたがって、棒の長さも長くなる（Ｙｉｎら、Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ．， １２０：２６７８ ［１９９８］）．
【０１５４】
好適な分析技術を利用して、サイズと均一性についてデンドリマーの特徴付けを行うことができる。分析技術には、原子力顕微鏡（ＡＦＭ）、エレクトロスプレーイオン化質量分析、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析、１３Ｃ核磁気共鳴分光学、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）（多角レーザ光散乱、デュアルＵＶおよび屈折率検出器を装備したもの）、キャピラリー電気泳動法およびゲル電気泳動を含むが、これらに限定されない。これらの分析法は、デンドリマー群の均一性を保証するものであり、インビボでの利用があればデンドリマー産生の品質管理に重要である。最も重要なことは、デンドリマーを利用して大規模な研究が行われ、その結果静脈内投与した場合の毒性を示す証拠はなにもなかったことである（Ｒｏｂｅｒｔｓら、Ｊ． Ｂｉｏｍｅｄ． Ｍａｔｅｒ． Ｒｅｓ．， ３０：５３ ［１９９６］およびＢｏｕｒｎｅら、Ｊ． Ｍａｇｎｅｔｉｃ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ Ｉｍａｇｉｎｇ， ６：３０５ ［１９９６］）。
【０１５５】
能動的検出、標的化、画像化、および治療薬送達に必要な様々な機能的モジュールを有する単一樹状デバイスを作製する目的で、個々が異なる機能を有する複数のＰＡＭＡＭデンドリマー・モジュールを共有結合により結合して単一デバイスを作製した。これは、所望の活性（例えば、あるデンドリマーは検出する目的で結合し、あるものは標的に到達させる目的であり、別のものは治療薬の担体として）に対応する、異なる複合体またはナノ複合物の合成を含む。次に、これらの異なるデンドリマーを自己会合させ、単一の治療用デバイスを生じるように、共有結合で連結する。ある態様においては、あるデンドリマーがコアとなり、そのまわりに他のデンドリマーが共有結合する（すなわち、「クラスター化デンドリマー」）。好ましい態様においては、コア・デンドリマーはＰＯＰＡＭデンドリマーであり、外側のデンドリマーはＰＡＭＡＭデンドリマーである。さらに別の態様においては、デンドリマーは、コア・デンドリマーを含まずに互いに複合体形成している（例えば、線状の鎖として、四つのデンドリマーが共有結合で互いに連結したもの）。
【０１５６】
本発明の好ましい態様においては、クラスター化したデンドリマーの形成は、エステル・アミノ分解技術を用いてコアおよび外側のデンドリマーの間にアミド結合を形成させる。エステル・アミノ分解技術では、メタノール中４０℃で、様々なポリ（アミドアミン）ＰＡＭＡＭデンドリマー・コア試薬を、過剰のエステルで終結したＰＡＭＡＭデンドリマー外皮試薬と反応させる（例えば、Ｕｐｐｕｌｕｒｉら、ＰＭＳＥ ８０：５５ ［１９９９］を参照のこと）。別の態様においては、水を反応媒体として用いる。この方法は、アミンで終結したコア試薬を過剰のカルボン酸エステル外皮試薬と反応させる自己会合反応の後に、コアと外皮成分の間のアミド結合させるためにカップリング薬剤（すなわち、カルボジイミド）を添加する段階を含む。これらの反応は室温で起こる。このような態様は、抗体等の生体分子の存在下で反応を実施することが好ましい。
【０１５７】
これら分子の水溶液中での合成反応では、その第一段階としてコア・デンドリマーの分子のまわりに外皮デンドリマー分子が自己会合することによって、コアのまわりに外皮分子が効率的に（すなわち、最大に）充填する。図５に示す自己会合クラスターは、クラスター化したデンドリマーが共有結合で結合したコア−外皮の調製に用いる代表的な前駆物質である。第二の段階では、図６示すように、カップリング試薬（カルボジイミド試薬であるＥＤＣ等）を用いて、コアおよび外皮の分子を共有結合で結合する。反応の進行をサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）で、またカルボン酸エステルの官能基性の消失を、１Ｈ／１３Ｃ ＮＭＲおよびゲル電気泳動、ならびに赤外線領域（ＦＴＩＲ）等でモニターする。室温の場合には、反応が通常一時間以内に終結する。
【０１５８】
本発明のある態様においては、これら高分子量の生成物のサイズと形態を原子力顕微鏡（ＡＦＭ）およびサイズ排除クロマトグラフィーＳＥＣで測定し、個々のデンドリマーと比較する。これらの技術によって、コア−外皮デンドリマーが実際に産生されたことが分かる。必要に応じて、ゲル電気泳動により別の証拠を得る。反応が完全であれば、この方法によって、より分子量の大きい産物の存在を示すことができる。クラスター化したデンドリマーの絶対分子量は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析、または多角レーザ光散乱検出器（ＭＡＬＬＳ）を装備したＳＥＣによって決定する。
【０１５９】
この方法でクラスター化したデンドリマー分子は、ＳＥＣで観察すると（大型のデンドリマーと同様に）多分散性の幅が狭い。ＰＡＭＡＭデンドリマーを世代６から世代９に変換するには約３〜４週間かかるが、同様のサイズ、許容範囲の分散性および形態を有するクラスター化したデンドリマーを合成には、約１日のみを要する（精製手順を含む）。
【０１６０】
多機能のクラスター化デンドリマーに関しては、外皮デンドリマー・モジュール上の官能基の架橋反応の問題は、反応に関与する側鎖に標準的な保護基を用いることによって克服する。二官能性リンカーを用いる方法では、別の溶液を用いる。例えば、まずアミノ表面化したコア・デンドリマーの表面を２−イミノチオランと反応させ、チオール表面を生成させ、次にこの産物を外皮デンドリマー上のマレイミド・リンカー基と反応させる。
【０１６１】
上記で説明したように、本発明のある態様においては、コア−外皮構造を利用して、樹状ポリマー成分から単一分子複合体を形成させる（例えば、図１０を参照のこと）。これによって、ナノデバイスの個々の成分を異なるポリマーに配置して、単一の超分子構造物を形成させることができる。本技術に固有の局面は、構造形成がコア−外皮配置によって特定化され規定されることである。コアがより大型になれば、外皮分子は小型化し、コアと結合可能な外皮デンドリマーの数が多くなる。例えば、クラスターのコアは、アミン化表面を有するＰＡＭＡＭデンドリマーの世代７であってもよい。これは、おおよその分子量が１１０ｋＤａで、直径７ｎｍで表面に５１２個の一級アミンを有する（Ｔｏｍａｌｉａら、Ａｎｇｅｗ． Ｃｈｅｍ． Ｉｎｔ． Ｅｄ．， ２９：１３８ ［１９９０］）。外皮は世代５のカルボキシル化表面ＰＡＭＡＭデンドリマーからなり、そのおおよその分子量は２７ｋＤａで、直径５ｎｍおよび表面のカルボキシル基は１２８個である。これによって、（過剰のＥ５中で実施した場合）Ｅ７コアを平均１２個のＥ５分子が取り巻く上記分子複合体が自己会合する。図１０は、立体障害によって、コアに結合する会合外皮ポリマーの数が制限されることを示している。
【０１６２】
共有結合で結合したＰＡＭＡＭデンドリマーを用いた多官能基による方法では、デンドリマーに基づくナノデバイスを会合させる際に問題が生じることがある。例えば、ある態様においては、これらの成分の自己会合にはコアと表面ポリマー上に異なる電荷が存在することが必要となる。この場合、過剰電荷が外皮ポリマー上に残る。これによって、特に細胞に送達および取り込みを行わせる場合には、デバイスの機能を阻害することもあり得る。また、ポリマーが自己会合した後、ある態様においては、それらが共有結合で結合することも重要である。このような段階に関係する化学的性質は、ナノデバイスの機能的サブユニットに影響を与え、ときには破壊することもある。従って、別の技術を利用して、超分子複合体の構築を行う必要がある。
【０１６３】
本発明のある態様においては、多機能クラスターを形成するデンドリマーの個々のデンドリマー成分を、リンカーの利用によって会合させる。例えば、ある態様においては、共有または非共有相互作用を利用したリンカーにより外皮デンドリマーをコア・デンドリマーに結合させる。このような結合の例としては、複数の利点を提供する核酸リンカーの利用が挙げられる。
【０１６４】
分子を所望の構造的配置で会合させるためには、オリゴヌクレオチドは強力な手段である。これによって簡単に他の物質に結合させることができ、相補的塩基の特異性を有する他のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズさせることができ、配列の設計が容易で、かつ得られる二重鎖構造は強固なものである。本発明の開発中に、この概念を利用して、デンドリマーと相補的オリゴヌクレオチドを用いた超分子コア−外皮構造を構築した。会合技術以前に産生されたものと比較して、これらの構造には、複数の利点がある。例えば、高反応性の化学物質を利用することなく低い温度で自己会合を起こし；異なるオリゴヌクレオチド相補性に基づいて異なるサブユニットを結合させることができ；かつ「生分解性の」複合体を作製するために、オリゴヌクレオチド結合剤にヌクレアーゼ消化部位またはその他の開裂可能な部位を設計でき、これによってサブユニットが腎臓を通して排出され得る（例えば、標的部位に到達したときに分離し、より小型の断片となって腎臓を通して排出されるように設計する）。図１１には、核酸リンカーを用いて会合させたデンドリマー複合体の模式図を示す。複合体を調製する方法を実施例５に示す。
【０１６５】
本発明は、リンカーとして利用する核酸の性質によって限定されるものではない。ある好ましい態様においては、デンドリマーに付加する核酸はその鎖内部に二次構造を含まない。しかしながらある態様においては、二次構造を利用して、所望の機能または性質（例えば、安定性、切断認識部位等）を提供する。核酸リンカーの長さを選択して、コア・デンドリマーと外皮デンドリマーの間を所望の距離に設定することができる。本発明のある態様においては、核酸を修飾して、安定性（例えば、血流中における）を高め、および／または細胞への移入を促進する。このような修飾を施す方法は、当技術分野で公知である。ある態様においては、核酸分子を標識して、会合体の検出または位置決定を可能にする。
【０１６６】
核酸リンカーをデンドリマーに付加すると、デンドリマー複合体を会合させて解析することができる（例えば、構造体が適当な構造をとるかを確認するため）。これらの物質はサイズが小型であるため、会合させた複合体を特徴付ける好ましい方法は、原子力顕微鏡である。原子力顕微鏡の利用によって、３つおよび４つの規則的なモジュールの組み合わせ（すなわち、一つのコアと複数の外皮デンドリマーからなる）である、デンドリマー超分子会合体の存在を明確に証明した。単一クラスターの分析によって、二つの成分の間隔は２１ｎｍであることが示された。これは、オリゴヌクレオチド・ハイブリッドの長さから予測される理論的距離とほとんど一致した。次にこの分析を利用して、一群の分子を調べたところ、いずれも成分間の距離が約２０ｎｍであることが分かった。このことは、開発した超分子構造体が均一であることを示している。これらの超分子会合体は一貫した様式で成分を結合できることから、ワクチン成分から薬剤、画像化剤に至るまで、ほとんどあらゆる種類の物質送達の組み合わせに用いることができる。
【０１６７】
ＶＩＩＩ．ナノデバイスの抗腫瘍効果と毒性に関する評価
様々な治療薬の癌細胞株および初代培養細胞に対する抗腫瘍効果を、本発明のナノデバイスを用いて評価できる。例えば好ましい態様においては、樹立腫瘍細胞株によるモデルまたは初代培養細胞を用いて、インビトロでアッセイを実施する。毒性試験および効力の確認には、新鮮な腫瘍細胞（培養株ではなく）を利用することが好ましい。なぜなら、組織培養による人為要素（例えば、腫瘍細胞の選択等）を避けて、より適切な決定が下せるためである。
【０１６８】
（Ａ）インビトロにおけるヒト腫瘍細胞のアポトーシス誘導の定量化
本発明の例示的な態様においては、本発明のナノデバイスを用いて、インビトロにおけるヒト腫瘍細胞のアポトーシスをアッセイする。細胞におけるアポトーシスの試験によって、治療薬の効力を決定する。アポトーシスの複数の局面を測定可能であり、また測定する必要がある。これらの局面として、上記のものと同様に以下の局面も含むが、これらに限定されない。すなわち、ホスファチジルセリン（ＰＳ）の原形質膜の内膜から外膜への移動の測定、ＤＮＡ断片化の測定、アポトーシス関連タンパク質の検出、およびカスパーゼ３活性の測定が挙げられる。
【０１６９】
（Ｂ）インビトロ毒性学
本発明のある態様においては、毒性試験を実施して、特定のナノデバイスのプラットフォームまたはそのシステムの構成要素の安全性に対する、一般的な見通しを得る。毒性学的情報は、非常に多くの供給源に由来するものである。このような供給源としては、蓄積されたデータベース、インビトロ試験、およびインビボ動物試験が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１７０】
インビトロの毒性学的方法は、近年になって盛んに利用されるようになった。これは、動物実験に代わる代替法の必要性が増しており、倫理的、商業的、および化学的潜在価値に対する理解が高まったためである。インビトロ毒性試験のシステムは、効率の改善、コスト削減、および実験間での変動が少ない等、非常に利点が多い。これらのシステムにより、利用する動物の数も減り、混乱をもたらす全身性効果（例えば、免疫性）を排除でき、かつ環境的条件を制御できる。
【０１７１】
本発明では任意のインビトロ試験システムも利用可能であるが、インビトロ試験に利用する最も一般的なアプローチは、培養細胞モデルの利用である。これらのシステムは、新規に単離した細胞、初代細胞、または形質転換培養細胞を含む。インビトロ毒性学の試験を実施する主たる手段としての細胞培養は、複数の培養物を迅速スクリーニングできる、細胞レベル、細胞内微小器官のレベル、または分子レベルでの毒性効果を同定および評価可能である等の利点を有する。インビトロ細胞培養法では一般に、膜の完全性、代謝活性、および細胞内の乱れを測定することによって、基本的な細胞毒性を明らかにする。膜の完全性に関して通常利用する指標としては、細胞生存率（細胞数）、クローン増殖試験、トリパンブルー排除試験、細胞内酵素放出（例えば、乳酸脱水素酵素）、小イオンの膜浸透性（Ｋ＋、Ｃａ２＋）、および小型分子の細胞内蓄積（例えば、５１Ｃｒ、コハク酸）が挙げられる。細胞内の混乱には、例えばＭＴＴ試験によるミトコンドリア酵素活性レベルのモニタリング、細胞内アデノシン３リン酸（ＡＴＰ）レベルの決定、リソソームへのニュートラルレッドの取り込み、および全タンパク質合成の定量が含まれる。代謝活性の指標には、グルタチオン含有量、脂質過酸化、および乳酸／ピルビン酸比が含まれる。
【０１７２】
（Ｃ）ＭＴＴアッセイ
ＭＴＴアッセイは、細胞生存率を測定する迅速、正確かつ信頼性の高い方法である。ＭＴＴアッセイは、モスマン（Ｍｏｓｍａｎｎ）によって最初に開発された（Ｍｏｓｍａｎｎ， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈ．， ６５：５５ ［１９８３］）。これは、多くの研究室が毒性データを得る目的で利用する非常に簡便な比色アッセイである（例えば、Ｋｕｈｌｍａｎｎら、 Ａｒｃｈ． ＴｏｘｉｃｏＬ， ７２：５３６ ［１９９８］を参照のこと）。簡単に説明すると、ミトコンドリアはＡＴＰを産生して細胞に充分なエネルギーを提供する。これを達成するために、ミトコンドリアはピルビン酸を代謝して、アセチルＣｏＡを産生する。ミトコンドリアの中で、アセチルＣｏＡは、トリカルボン酸サイクルの様々な酵素と反応する。その結果、ＡＴＰが産生される。ＭＴＴアッセイに特に有用な酵素の一つがコハク酸脱水素酵素である。ＭＴＴ（３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２−ジフェニル臭化テトラゾリウム）は、コハク酸脱水素酵素で切断される黄色の基質であり、紫色のホルマザン生成物を生じる。色の変化によって、ミトコンドリア機能における変化を判別する。死細胞であれば、ホルマザンを産生することができない。従って、産生量は直接、生細胞の数に相関する。５４０ｎｍでの吸光度を用いてホルマザン生成物の量を測定する。
【０１７３】
生きた動物の条件に基づいて推定するため、インビトロ試験の結果をインビボ毒性試験と比較することができる。通常、物質の単回投与による急性毒性を評価する。毒性サインについて（体温上昇、呼吸困難、死亡等）動物を１４日間モニターする。通常、急性毒性の標準は半数致死用量（ＬＤ５０）であり、処理集団の半数が死滅すると予測される用量である。この用量の決定は、制御条件下で試験動物を幾何級数的な一連の用量に曝露することによって行う。他の試験としては、１４日間以内の期間でナノデバイスの反復投与に対する動物の反応を測定する、亜急性毒性試験がある。亜慢性毒性試験としては、９０日間反復投与する試験が挙げられる。慢性毒性試験は、亜慢性毒性試験に類似するが、９０日間を超えて試験を続ける。インビボ試験を実施して、特定の組織に関する毒性を調べることもできる。例えば、本発明のある態様においては、腫瘍毒性（すなわち、本発明の組成物が腫瘍組織の生存に及ぼす効果）を調べる（例えば、腫瘍組織サイズおよび／または増殖における変化を検出することによって）。
【０１７４】
ＩＸ．遺伝子治療用ベクター
本発明の特定の態様においては、ナノデバイス組成物は、インビトロ、エキソビボ、またはインビボにおける標的細胞または組織に対する導入遺伝子の送達および発現を含む。このような態様においては、実際のタンパク質を含むのではなく、デンドリマー複合体は、例えば、目的の遺伝子をコードする異種ＤＮＡ、および標的細胞において特定の目的タンパク質の産生を促進する、様々な調節要素を含む発現ベクター構築物を含む。
【０１７５】
ある態様においては、遺伝子は例えば、癌の治療、検出遺伝子の置換に用いる治療遺伝子、または選択もしくはモニタリングの目的で利用するマーカー、またはレポーター遺伝子である。遺伝子療法ベクターとしては、遺伝子は、異種性ＤＮＡの一部である。異種ＤＮＡは、一つまたは複数の供給源に由来するものであってもよい（すなわち、複数遺伝子からなる構築物または融合タンパク質）。さらに異種ＤＮＡは、ある供給源に由来する調節配列および異なる供給源に由来する遺伝子を含むことができる。
【０１７６】
非標的組織に対する潜在的毒性または好ましくない効果を低減する目的で、特異的組織または細胞における転写に効果的である組織特異的プロモーターを利用することもできる。例えば、ＰＳＡ、プロバシン（ｐｒｏｂａｓｉｎ）、前立腺酸性ホスファターゼ、または前立腺特異的腺カリクレイン（ｈＫ２）等のプロモーターを利用して、前立腺で標的遺伝子を発現させることもできる。同様に、他の組織における標的遺伝子の発現にプロモーターを利用することができる（例えば、インスリン、エラスチン、アミラーゼ、ｐｄｒ−１、ｐｄｘ−１およびグルコキナーゼのプロモーターは膵臓を標的とし；アルブミン、ＰＥＰＣＫ、ＨＢＶエンハンサー、αフェトタンパク質、アポリポタンパク質Ｃ、α−１アンチトリプシン、ビテロジェニン、ＮＦ−ＡＢおよびトランスサイレチンのプロモーターは肝臓を標的とし；ミオシンＨ鎖、筋クレアチン・キナーゼ、ジストロフィン、カルパインｐ９４、骨格αアクチン、速白筋トロポニンＩのプロモーターは、骨格筋を標的とし；ケラチンのプロモーターは皮膚を標的とし；ｓｍ２２α；ＳＭ−α−アクチンのプロモーターは平滑筋を標的とし；ＣＦＴＲ；ヒトのサイトケラチン１８（Ｋ１８）；肺サーファクタントタンパク質Ａ、ＢおよびＱＣＣ−１０；Ｐ１プロモーターは肺組織を標的とし；エンドセリン１；Ｅ−セレクチン；フォンビルブランド因子；ＫＤＲ／ｆｌｋ−１は内皮を標的とし；チロシナーゼはメラノサイトを標的とする）。
【０１７７】
核酸はｃＤＮＡでもゲノムＤＮＡでもよい。核酸は好適な治療薬タンパク質をコードすることができる。好ましくは核酸は、腫瘍サプレッサー、サイトカイン、受容体、アポトーシス誘導物質、または分化作用因子をコードする。核酸はアンチセンス核酸であってもよい。このような態様においては、アンチセンス核酸を発現ベクターの外側につないで本発明のナノデバイスに組み込む。
【０１７８】
好ましい態様においては、核酸は腫瘍サプレッサー、サイトカイン、受容体またはアポトーシスの誘導因子をコードする。好適な腫瘍サプレッサーとしては、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、Ｃ−ＣＡＭ、ｐｌ６、ｐ２１１、ｐ５３、ｐ７３またはＲｂが挙げられる。好適なサイトカインとしては、ＧＭＣＳＦ、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、β−インターフェロン、γ−インターフェロン、またはＴＮＦが挙げられる。好適な受容体としては、ＣＦＴＲ、ＥＧＦＲ、エストロゲン受容体、ＩＬ−２受容体、またはＶＥＧＦＲが挙げられる。好適なアポトーシス誘導因子としては、ＡｄＥｌＢ、Ｂａｄ、Ｂａｋ、Ｂａｘ、Ｂｉｄ、Ｂｉｋ、Ｂｉｍ、ＨａｒａｋｉｒｉまたはＩＣＥ−ＣＥＤ３プロテアーゼが挙げられる。
【０１７９】
Ｘ．併用療法
ＤＮＡ傷害性薬剤に耐性な腫瘍細胞は、臨床的腫瘍学の重要な問題である。本発明のナノデバイスは、併用療法を効果的に管理することによってこの問題を改善する手段を提供する。しかしながら、本発明のナノデバイスと組み合わせて従来の併用療法を利用することもできる。例えば、本発明のある態様においては、従来の治療法の実施の前後、または従来の治療法と組み合わせて、ナノデバイスを用いることができる。
【０１８０】
本発明の方法と組成物を用いた併用治療で、細胞を死滅させるか、細胞の増殖もしくは転移、または血管形成を阻害するか、あるいは悪性形質の腫瘍細胞を復帰させるかもしくは減少させるために、「標的」細胞を本明細書に記載のナノデバイス組成物および少なくとも一つの他の薬剤に接触させる。細胞の死滅、または増殖の阻害に効果的な組み合わせの量で、これらの組成物を提供する。この過程は、細胞を同時に免疫療法剤および薬剤または因子に接触させる段階を含むことができる。細胞を単一組成物または両方の薬剤を含む薬理学的製剤と接触させるか、または細胞を同時に二つの別々の組成物もしくは一方の組成物が、例えば発現構築物を含み、他方が治療薬を含む製剤と、接触させる段階によって、これを達成することができる。
【０１８１】
または、分から週の範囲の時間間隔で、ナノデバイスによる治療を他の薬剤による治療より先に、または後に実施することができる。他の薬剤と免疫療法を別々に細胞に適用する態様においては、薬剤およびナノデバイスの併用の好ましい効果が細胞に持続するように、一般的には各送達の時間間隔をあまり長くとらないようにする。そのような場合には、細胞を２つの薬剤と接触させるときのそれぞれの間隔が約１２〜２４時間、より好ましくは、それぞれの間隔が約６〜１２時間であり、遅延時間は約１２時間のみが最も好ましいと考えられる。治療間隔をかなり延長することが好ましい場合もあるが、各投与間の経過は、数日（２日〜７日）から数週間（１週間〜８週間）である。
【０１８２】
ある態様においては、本発明の免疫療法用組成物または他方の薬剤を複数回投与する。ナノデバイスが「Ａ」でかつ他方の薬剤が「Ｂ」である場合には、下記に例示するように、様々な組み合わせで用いることができる：
Ａ／Ｂ／Ａ、Ｂ／Ａ／Ｂ、Ｂ／Ｂ／Ａ、Ａ／Ａ／Ｂ、Ｂ／Ａ／Ａ、Ａ／Ｂ／Ｂ、Ｂ／Ｂ／Ｂ／Ａ、Ｂ／Ｂ／Ａ／Ｂ、Ａ／Ａ／Ｂ／Ｂ、Ａ／Ｂ／Ａ／Ｂ、Ａ／Ｂ／Ｂ／Ａ、Ｂ／Ｂ／Ａ／Ａ、Ｂ／Ａ／Ｂ／Ａ、Ｂ／Ａ／Ａ／Ｂ、Ｂ／Ｂ／Ｂ／Ａ、Ａ／Ａ／Ａ／Ｂ、Ｂ／Ａ／Ａ／Ａ、Ａ／Ｂ／Ａ／Ａ、Ａ／Ａ／Ｂ／Ａ、Ａ／Ｂ／Ｂ／Ｂ、Ｂ／Ａ／Ｂ／Ｂ、Ｂ／Ｂ／Ａ／Ｂ
他の組み合わせも可能である。また、細胞を死滅させるために、細胞の死滅または傷害に効果的な併用量で、双方の薬剤を細胞に送達する。
【０１８３】
本発明のナノデバイスと共に併用療法で用いることのできる他の因子としては、γ線、Ｘ線等のＤＮＡを傷害する作用因子、および／または腫瘍細胞へ放射性同位元素を直接送達する因子が挙げられるが、これらに限定されない。ＤＮＡを傷害する因子の他の形態としてはマイクロ波照射およびＵＶ照射等が挙げられる。Ｘ線の線量範囲は、一定期間にわって適用するものとして（３週〜４週）、日線量５０〜２００レントゲンであり、単回照射の場合では２０００〜６０００レントゲンである。放射性同位元素の線量範囲は、放射性同位元素の半減期、照射の強度および種類、ならびに新生物細胞の取り込みに応じて大きく変わる。当業者には「レミントンの薬科学（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）」第１５版、第３３章、特に６２４〜６５２頁が参考となる。治療対象の状態に応じて、用量を変える必要性が生ずる場合もある。いずれの場合にも、投与の責任者が個々の対象に適当な用量を決定する。さらにヒトへの投与では、調製は米国食品医薬品局生物事務局の基準に要求されるような、無菌性、発熱性、一般的安全性および純度の基準を満たすべきである。
【０１８４】
本発明の好ましい態様においては、癌に罹患した患者へのナノデバイスの局所送達を利用して、送達すべき薬剤の治療効果を最大限にする。同様に、化学療法または放射線治療を、対象の身体における特定患部領域に限定させることも可能である。または、ある状況下では、例えば広範囲に転移が起きている場合には、免疫療法用の組成物および／または薬剤の全身性送達が適当である場合もある。
【０１８５】
ナノデバイスを化学療法および放射線療法と組み合わせることに加えて、従来の遺伝子治療法を利用することも可能である。例えば、ナノデバイス治療と併用して、ｐ５３またはｐ１６変異体を標的化ことにより抗癌治療が改善される。本発明では、同時に他の腫瘍関連遺伝子を用いた治療も可能である。このような腫瘍関連遺伝子としては、ｐ２１、Ｒｂ、ＡＰＣ、ＤＣＣ、ＮＦ−Ｉ、ＮＦ−２、ＢＣＲＡ２、ｐｌ６、ＦＨＩＴ、ＷＴ−Ｉ、ＭＥＮ−Ｉ、ＭＥＮ−ＩＩ、ＢＲＣＡ１、ＶＨＬ、ＦＣＣ、ＭＣＣ、ｒａｓ、ｍｙｃ、ｎｅｕ、ｒａｆ、ｅｒｂ、ｓｒｃ、ｆｉｎｓ、ｊｕｎ、ｔｒｋ、ｒｅｔ、ｇｓｐ、ｈｓｔ、ｂｃｌ、およびａｂｌが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１８６】
インビボでおよびエキソビボ治療は、特定の対象に対する特定の構築物の遺伝子送達に適した方法を用いて実施する。例えば、ウイルスベクターに関しては、通常１×１０４、１×１０５、１×１０６、１×１０７、１×１０８、１×１０９、１×１０１０、１×１０１１または１×１０１２の感染性粒子を患者に送達する。リポゾームまたはその他の非ウイルス製剤についても、相対的な取り込み効率を比較して、比例計算を適用することができる。
【０１８７】
本発明の利点は、医学的デバイスによって治療用組成物を患者の局所的部位に送達できることである。本発明の用途に好適な医学的デバイスは、治療薬の局所的送達を目的とした既知のデバイスを含む。このようなデバイスとしては、例えば、治療薬をコーティングした、またはそれにより薬剤を投与する注射用カテーテル、バルーンカテーテル、二重バルーンカテーテル、微孔性バルーンカテーテル、チャネル・バルーンカテーテル、注入カテーテル、潅流カテーテル等のカテーテル；皮下注射針およびニードル注入カテーテル等のニードル型注入デバイス；ジェット式注射器等の非ニードル型注入デバイス；コーティングしたステント、分岐状ステント、人工血管、ステント移植皮弁等；およびコーティングしたワイヤーコイル等の血管閉塞性デバイスが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１８８】
代表的なデバイスに関しては、米国特許第５，９３５，１１４号、第５，９０８，４１３号、第５，７９２，１０５号、第５，６９３，０１４号、第５，６７４，１９２号、第５，８７６，４４５号；第５，９１３，８９４号、第５，８６８，７１９号、第５，８５１，２２８号、第５，８４３，０８９号、第５，８００，５１９号、第５，８００，５０８号、第５，８００，３９１号、第５，３５４，３０８号、第５，７５５，７２２号、第５，７３３，３０３号、第５，８６６，５６１号、第５，８５７，９９８号、第５，８４３，００３号および第５，９３３，１４５号に記載がある；これらのいずれの内容も参照として本明細書に組み入れられる。市販されており、本用途に利用可能なステントの例としては、ラディアス（ＲＡＤＩＵＳ）（Ｓｃｉｍｅｄ Ｌｉｆｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｉｎｃ．）、シンフォニー（ＳＹＭＰＨＯＮＹ）（Ｂｏｓｔｏｎ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、ウォルステント（Ｗａｌｌｓｔｅｎｔ）（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ Ｉｎｃ．）、プレセデント ＩＩ（ＰＲＥＣＥＤＥＮＴ ＩＩ）（Ｂｏｓｔｏｎ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）およびＮＩＲ（Ｍｅｄｉｎｏｌ Ｉｎｃ．）が挙げられる。このようなデバイスを、既知の技術によって身体内の標的位置に送達する、および／または埋込む。
【０１８９】
ＸＩ．光力学的治療
ある態様においては、本発明の治療用複合体は光力学的化合物および患者に投与する標的化薬剤を含む。ある態様においては、次に標的化薬剤を「標的」細胞に一定期間結合させ（例えば、約１分から２４時間）、標的細胞−標的薬剤の複合体を形成させる。ある態様においては、次に標的化薬剤と光力学的化合物を含む治療用複合体を光線（例えば、赤色レーザ、白熱電球、Ｘ線またはフィルターを通した日光）で照射する。ある態様においては、頚静脈または他の浅層の血管またはリンパ管に光を当てる。ある態様においては、一重項酸素およびフリーラジカルが光力学的化合物から標的細胞（例えば、癌細胞または病原体）に拡散し、これらを破壊する。
【０１９０】
ＸＩＩ．医薬製剤
臨床的用途の場合、本発明のある態様においては、目的の用途に適した形態で医薬組成物としてナノデバイスを調製する。このような場合、一般的に発熱物質ならびに人間または動物に有害なその他の不純物を本質的に含まない、組成物を調製する必要がある。しかしながら、本発明のある態様においては、デンドリマー製剤をそのまま、本明細書に記載の一つまたは複数の経路を用いて投与することができる。
【０１９１】
好ましい態様においては、安定な組成物の送達と標的細胞による取り込みを可能にするため、ナノデバイスを適当な塩および緩衝液とともに用いる。ナノデバイスを患者に導入する時にも緩衝液を用いる。水溶性の組成物は、細胞に対して効果的な量のナノデバイスを、薬学的に許容される担体または水溶性媒体に分散させたものから成る。そのような組成物を、接種物と称することもある。「薬学的にまたは薬理学的に許容される」という表現は、動物またはヒトに投与した場合に、有害な、アレルギー性の、またはその他の不適当な反応を生じない分子および組成物を表している。本明細書に記載の「薬学的に許容される担体」は、溶媒、分散媒、コーティング剤、抗細菌剤および抗真菌剤、等張化剤および吸収遅延剤等のいずれかまたはすべてを含む。従来の媒体または薬剤が、本発明のベクターまたは細胞に不適合なものでなければ、治療用組成物に利用できる。組成物はその他の有効成分を含むこともできる。
【０１９２】
本発明のある態様においては、活性組成物は古典的医薬製剤を含む。本発明のこのような組成物の投与は、標的組織に到達可能であれば通常の経路で送達する。このようなものとしては、経口、経鼻、口腔内、直腸内、膣内または局所投与が挙げられる。または、投与は、正所、経皮、皮下、筋肉内、腹腔内または静脈内投与であってもよい。
【０１９３】
活性ナノデバイスは、非経口または腹膜内または腫瘍内投与することもできる。活性化合物の溶液は、好適にはヒドロキシプロピルセルローズ等の界面活性剤と混合した、水に溶けた遊離の塩基または薬学的に許容される塩として調製する。分散液は、グリセロール、液体ポリエチレングリコールおよびその混合液、ならびに油に分散したものとして調製することもできる。通常の保存および使用条件下では、これらの製剤は微生物の増殖を予防する保存剤を含む。
【０１９４】
注射可能な用途に好適な製剤形態としては、滅菌水溶液または分散液および滅菌された注射可能な溶液または分散液の即時調製用の滅菌粉末が挙げられる。担体としては、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコールおよび液状ポリエチレングリコール等）、その好適な混合物、および植物油を含む溶媒または分散媒が挙げられる。例えば、レクチン等のコーティング剤を用いることによって、分散液の場合には所望の粒子サイズを維持することによって、および界面活性剤を用いることによって、適当な液状性を維持することができる。微生物作用は、様々な抗細菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサール等によって予防できる。多くの場合、等張化剤、例えば、糖類または塩化ナトリウム等を含むことが好ましい。注射可能な組成物の吸収は、組成物中に吸収遅延剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを用いることによって持続させることができる。
【０１９５】
滅菌済み注射可能溶液は、必要な量の活性化合物を、必要に応じて上記の様々な他の成分を含む適当な溶媒に混ぜ、濾過滅菌することによって作製する。一般的に分散液は、様々な滅菌活性成分を、上記のうちの必要な他の成分と基礎分散媒を含む滅菌済み担体に混合することによって調製する。滅菌済み注射可能溶液の調製用滅菌粉末の場合には、好ましい調製法は、あらかじめ滅菌濾過したその溶液から有効成分と別の所望の成分を含む粉末を得る、真空乾燥および凍結乾燥技術である。
【０１９６】
処方に従い、剤型に適合した方法により、治療効果を与える量のデンドリマー組成物を投与する。製剤は、注射可能溶液、薬剤放出性カプセル等の様々な剤型で容易に投与される。水溶液として非経口投与する場合には、例えば必要に応じて、好ましくは溶液を緩衝化する。最初に液体希釈剤を充分な量の食塩水またはグルコースで等張化させておく。このような水溶液は、静脈内筋肉内、皮下および腹腔内投与に特に好適である。例えば、１用量を１ｍｌの等張ＮａＣｌ溶液に溶解して、１０００ｍｌの皮下注入液に添加するか、または意図する注入部位に注射することができる（例えば、「レミントンの薬科学（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）」第１５版、第３３章、特に１０３５〜１０３８頁および１５７０〜１５８０頁を参照のこと）。本発明のある態様においては、活性粒子または薬剤を、１用量あたり約０．０００１ミリグラムから１．０ミリグラム、または約０．００１ミリグラムから０．１ミリグラム、または約０．１ミリグラムから１．０ミリグラム、またはさらに約１０ミリグラム等と含む、治療用混合物として調製する。複数回の投与も可能である。
【０１９７】
他の投与法に好適な別の製剤としては、腟坐薬および膣坐剤が挙げられる。直腸膣坐剤または坐剤も用いられる。坐剤は様々な重量および形態の固形剤であり、通常直腸、膣または尿道に挿入して用いる。挿入後、坐剤は溶けるか、または体腔内体液に溶解することが多い。一般的に坐剤の場合には、従来の結合剤および担体は、例えばポリアルキレングリコールまたはトリグリセリド類を含み、そのような坐剤は、０．５％から１０％、好ましくは１％〜２％の範囲の有効成分を含む、混合物から調製することができる。膣坐剤または膣坐剤は、通常球形または卵形でその重量はそれぞれ約５ｇである。膣内投与は、坐剤の古典的概念から離れた、例えばクリーム、ゲルまたは液体等の様々な物理的形態でもよい。さらに、坐剤は大腸癌に関しても利用できる。ナノデバイスは、肺癌等の治療に治療する吸入剤としても処方できる。
【０１９８】
ＸＩＩＩ．癌および病原性疾患の治療および予防法
本発明の特定の態様においては、方法および組成物は、癌治療における腫瘍の治療の目的で提供される。特異的サインが同定された癌、または標的となり得る癌であれば、本治療法が利用可能であると考えられる。本発明の方法で治療できる細胞増殖性疾患または癌はヒトの肉腫および癌を含む。このような肉腫および癌としては、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮腫、リンパ管肉腫、ユーイング肉腫、リンパ内皮腫、滑膜腫、中皮腫、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、大腸癌、膵癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、脂腺癌、乳頭癌、乳頭腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支癌、腎細胞癌、肝細胞癌、胆道癌、絨毛上皮腫、精上皮腫、胎児性癌、ウィルムス腫瘍、子宮頚癌、精巣腫瘍、肺癌、肺の小細胞癌、膀胱癌、上皮癌、神経膠腫、星状細胞腫、髄芽細胞腫、頭蓋咽頭腫、脳室上衣細胞腫、松果体腫、血管芽腫、聴神経腫、乏突起神経膠腫、髄膜腫、黒色腫、神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫；白血病、急性リンパ球性白血病および急性骨髄性白血病（骨髄芽球性、前骨髄球性、骨髄単球性、単球性および赤白血病）；慢性白血病（慢性骨髄性（顆粒球性）白血病および慢性リンパ球性白血病）；および真性多血症、リンパ腫（ホジキン病および非ホジキン病）、多発性骨髄腫、ワルデンストローム大グロブリン血症および重鎖病が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１９９】
本治療法は、特異的サインが同定された病原性疾患、または与えられた病原体を標的とする病原性疾患の治療に利用可能であると考えられる。本発明の方法で処理できる可能性のある病原体の例としては、レジオネラ菌、結核菌、破傷風菌、インフルエンザ菌、淋菌、梅毒トレポネーマ、炭疽菌、コレラ菌、ボレリア・ブルグドルフェリ、ジフテリア菌、黄色ブドウ球菌、ヒト乳頭腫ウィルス、ヒト免疫不全ウィルス、風疹ウィルス、ポリオウイルス等が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２００】
実施例
本発明の好ましい態様をさらに例示する目的で、以下に実施例を示すが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。
【０２０１】
実施例１
生体適合性／細胞毒性に関する定量的ＭＴＴアッセイ
本実施例には、様々な個々のデンドリマーおよびコア−外皮デンドリマー分子の細胞毒性の測定を目的とした、マウスおよびラットの初代繊維芽細胞を用いた生体適合性／細胞毒性に関する定量的ＭＴＴアッセイについて説明する。特に、ＰＡＭＡＭデンドリマー（Ｇ５およびＧ７世代）、ＰＯＰＡＭデンドリマー（世代２、３および４）およびコア−外皮デンドリマー分子（すなわち、共有結合で２つまたは３つのＰＡＭＡＭ「外皮」デンドリマーに結合したＰＯＰＡＭ「コア」デンドリマー分子）の細胞毒性を、標準的な定量的ＭＴＴアッセイ（Ｋｕｈｌｍａｎｎら、１９９８；Ｓｌａｄｏｗｓｋｉら、１９９３；Ｗａｎｇら、１９９６；Ｗａｔａｎａｂｅら、１９９４を参照のこと）を用いて解析した。
【０２０２】
簡単に説明すると、ＭＴＴ（３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２−ジフェニル臭化テトラゾリウム）、いずれかＰＡＭＡＭデンドリマー、ＰＯＭＡＭデンドリマーおよびコア−外皮デンドリマー分子とともに、マウスおよびラットの初代繊維芽細胞をそれぞれ２４時間培養した。次に、５４０ｎｍの吸光度で細胞生存率を測定して、生細胞のみに存在するＭＴＴ（黄色）が切断されて生じるホルマザン生成物（紫色）を検出する。
【０２０３】
このアッセイの結果、ＰＯＰＡＭデンドリマーとＰＡＭＡＭデンドリマーおよび本発明のコア−外皮デンドリマーの間では、細胞毒性が非常に異なることが分かった。具体的には、測定したＰＡＭＡＭデンドリマー（Ｇ５およびＧ７世代）では、最大で４０μｇ／ｍｌの濃度で、有意なインビトロ細胞毒性を全く与えなかった。対照的に、３つのＰＯＰＡＭデンドリマー（世代２、３および４）は、マウス繊維芽細胞ではＣＬ５０濃度がそれぞれ４０μｇ／ｍｌ、１２μｇ／ｍｌ、および１２μｇ／ｍｌ、およびラット繊維芽細胞ではＣＬ５０濃度がそれぞれ３０μｇ／ｍｌ、９μｇ／ｍｌおよび９μｇ／ｍｌの濃度依存性の細胞毒性効果を示した。興味深いことに、コア−外皮デンドリマー分子は、ＰＯＰＡＭデンドリマーと異なり細胞毒性の問題を生じなかった。毒性が検出可能であったのはコア−外皮デンドリマーの濃度が３０μｇ／ｍｌより高い場合だけであった。この場合、４０μｇ／ｍｌに曝露して２４時間後に、細胞の５％〜１０％のみが死滅した。これらの結果は、本発明のコア−外皮デンドリマー分子が好ましい生体適合性の性質を有していることを示す。
【０２０４】
実施例２
多機能デンドリマー分子の構築
本実施例には、標的化単位およびシグナル伝達単位の両方を有する多機能デンドリマー分子の構築について説明する。特に本実施例では、デンドリマー表面の残存アミノ基が無水酢酸またはグリシドールで「キャップ」されている、葉酸およびフルオレセインを結合した世代５（Ｇ５）ＰＡＭＡＭデンドリマーの構築について説明する。
【０２０５】
デンドリマー生成に関する模式図を図８に示す。Ｇ５ＰＡＭＡＭをフルオレセイン・イソチオシアネートおよびＮ（Ｅｔ）３と反応させることによって、Ｇ５ＰＡＭＡＭデンドリマーの結合を行った。次に、このフルオレセイン構築物を、葉酸およびＥＤＣと反応した。産物表面の残存アミノ基を無水酢酸またはグリシドールのいずれかと反応させて、それぞれアセトアミドまたはビス（２，３−ヒドロキシプロピル）アミノ基に変換する。これらの生物学的に中性でかつ電荷も中性である「キャッピング」基は、葉酸／フルオレセイン生成物を与え、またこれにより水溶性が高まる。ＤＭＳＯ：水＝１：１中で中性ｐＨに調整したものを限外濾過して、Ｇ５ＰＡＭＡＭデンドリマーを精製した。
【０２０６】
実施例３
インビトロでのスクリーニング・アッセイ
本発明のナノデバイスの毒性および効力はインビトロで測定できる。好ましい態様においては、細胞培養モデルにおいてナノデバイスを試験する。例えば、乳癌を診断、モニタリング、および治療するためのナノデバイスの効力を、乳癌細胞株を用いてアッセイすることができる。特定の乳癌細胞株が過剰発現する受容体を特異的に認識するリガンドまたは抗体と結合させることによって、乳癌細胞株を標的とするデンドリマーを調製する。例えば、ＳＵＭ−５２細胞株はＦＧＦＲ−２、ｃ−ＭＥＴおよびＮＣＡＭ−１遺伝子が増幅しており、これらを過剰発現する。これらの遺伝子の産物はいずれも、高いレベルでＳＵＭ−５２細胞の表面に発現するが、正常細胞や他の乳癌細胞では検知できるレベルでは発現していない。これらの表面に露出している因子に対する結合パートナーの候補を含むデンドリマーのライブラリーを細胞と接触させ、特異的で高い結合親和性を有する候補を同定する。画像化成分、治療用成分等を用いて同様のアッセイを実施することもできる。例えば、異なる治療薬を含むデンドリマーのライブラリーを細胞株と接触させる。正常細胞には有害ではないが、細胞増殖を変化させるか、または細胞を死滅させる薬剤の効力について、スクリーニングを実施する。理想的には、マルチウェル・プレートを用いてこのようなアッセイを実施することにより、候補について同時に、または短期間に大規模スクリーニングすることができる。好ましい態様においては、スクリーニング・アッセイを自動化する。例えば、アポトーシスによって誘起される呈色変化を検出するシステムを用いて、アポトーシスを誘導する抗癌化合物のスクリーニングを自動化することができる（例えば上記のような、本発明の画像化成分に起因する呈色変化）。
【０２０７】
スクリーニング・アッセイには多数の細胞株を用いうる。例えば乳癌では、細胞株ＳＵＭ−１９０およびＳＵＭ−２２５においてはＨＥＲ２が増幅しており、この遺伝子が過剰に発現している。従って、ヒト化した４Ｄ５（ハーセプチン）等の抗体を用いて、デンドリマーをこれらの細胞に特異的に送達することができる。ＳＵＭ−１４９、ＳＵＭ−１５９、およびＳＵＭ−２２９は全てＥＧＦＲを過剰に発現している。従って、ＥＧＲ、ＴＧＦ−αまたはアンフィレギュリン（ａｍｐｈｉｒｅｇｕｌｉｎ）を用いてデンドリマーをこれらの細胞に送達することができる。ＳＵＭ−４４細胞はＨＥＲ−４を発現し、ヘレグリン−デンドリマー複合体を用いて標的化される。ＢＴ２０、ＭＣＦ７、ＵＡＣＣ−８９３、およびＵＡＣＣ８１２を含む対照として、ＡＴＣＣから入手可能な様々なヒト乳腺細胞株を用いた。これらの細胞はＨＥＲ２およびＭＵＣ１の発現に関して異なる。単離した細胞集団および混合細胞集団についてスクリーニング・アッセイを実施することができる。
【０２０８】
実施例４
薬剤耐性細胞の殺滅
本実施例には、シスプラチン結合デンドリマーを用いたシスプラチン耐性細胞の殺滅について説明する。この実験では、テトラゾリウムによる比色ＭＴＴアッセイを用いて細胞生存率を評価した（以下でさらに詳細に説明する）（Ｍｏｓｍａｎｎ， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈ．， ６５：５５ ［１９８３］）。５％ＢＳＡ、インスリンおよびヒドロコルチゾンを添加した無血清ハムＦ−１２培地で、ヒトの細胞株１６Ｎ２を増殖させた。細胞を１×１０４個／ウェルで９６穴マイクロタイタープレートに蒔いた。２４時間後、培地を交換し、シスプラチン（Ｓｔｅｍ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）またはデンドリマー／プラチン複合体をウェルに添加した。７２時間後、細胞生存率をＭＴＴアッセイで評価した。結果を図９に示す。図９においては、薬剤濃度を白金当量で表す。結果は、薬剤非存在下で増殖させた対照細胞に対する、死細胞の割合（％）で表す。データを平均値±ＳＥＭ（ｎ＝４）で表す。ポリマー１およびポリマー２の試料は、いずれも異なる含有量の白金と結合した世代３．５のＰＡＭＡＭデンドリマーである（それぞれ１９．２５％および２０．２６％のＰｔを有する、Ｅ３．５−ＣＯＯＮａ：Ｐｔ）。ハイドロゲル化合物はＰｔを結合した世代４のＰＡＭＡＭデンドリマーである（６．２５％Ｐｔを含む、Ｅ４ＮＨ２：Ｐｔゲル）。
【０２０９】
実施例５
オリゴヌクレオチド／デンドリマー超分子構築物を調製する方法
デンドリマーの表面の一級アミノ基に結合したオリゴヌクレオチドを制御するために、まず無水酢酸でアミンの部分修飾および完全修飾を行った。結合前後のアミノ基の数を、１Ｈ−ＮＭＲおよび電位差滴定で決定した。
【０２１０】
（１）Ｎ−アセチル化によるＧ７およびＧ５ＰＡＭＡＭの完全アセトアミド・キャッピング
乾燥窒素を吹き込んだ２５ｍｌの丸底フラスコにデンドリマーの保存溶液（メタノール中１０重量％；０．０５ｇ、０．４３μｍｏｌ）を入れ、４倍モル過剰の無水酢酸を４℃で滴下した。室温で２４時間緩やかに撹拌しながら、トリエチルアミン塩基（アルドリッチ）（０．２３ｇ；２．３ｍｍｏｌ）を反応混合物に添加した後、１ｍｌのメタノール（アルドリッチ、９９．８％）を添加して混合物を希釈した。次に、この溶液を室温で２４時間反応させた。この産物の溶液をロータリーエバポレータで処理してメタノールを除去し、３．５Ｋ ＭＷＣＯ透析チューブ（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ）に移した。次に、二回蒸留水（１８．２ＭΩ、ＭｉｌｉＱ）に対し３日間透析し、この間、透析外液を５回交換した。透析後、試料を−５２℃で２４時間かけて凍結乾燥を行い、白色粉末（５７ｍｇ、９４％）を得た。この産物を１Ｈ−ＮＭＲで解析した。
【０２１１】
（２）Ｇ７およびＧ５の末端アミノ基の実際数の決定
コーニング・ガラス複合電極を装着したコーニング４２０ ｐＨメーターを用いて２０℃で、無傷のＧ７およびＧ５のデンドリマー水溶液の電位差滴定を行った。簡単に述べると、アミノ基の強い陽性電荷に起因するデンドリマー内の静電相互作用を阻止するために、凍結乾燥したＧ７およびＧ５のデンドリマーをそれぞれ１０ｍｌの０．１Ｎ  ＮａＣｌ溶液に溶解した（例えば、Ｋａｂａｎｏｖら、Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ３２：１９０４ ［１９９９］を参照のこと）。０．１ＮのＨＣｌ標準的溶液（アルドリッチ）を添加することによって、デンドリマーを完全に水素化した後、０．１Ｎ  ＮａＯＨ標準的溶液を用いて、ｐＨを安定化させるため３分間隔で滴定しｐＨの値を測定した。
【０２１２】
（３）化学量論的Ｎ−アセチル化によるＰＡＭＡＭのＧ７およびＧ５の部分的アセトアミド・キャッピング
デンドリマーの表面に実際に存在する一級ＮＨ２基の数を利用して、無水酢酸のアミノ基に対するモル比を決定し、上記と同様の方法で反応した。モル比でアミノ基に対して８９％の無水酢酸を添加することにより、コアと外皮のデンドリマーは、それぞれ８９％および９０％がアセトアミド・キャッピングを有すると期待された。表１にＧ７およびＧ５のＰＡＭＡＭデンドリマーの、部分的アセチル化に関する化学量論をまとめた。
【０２１３】
【表１】
2004515457.tif 000003
【０２１４】
（４）配列設計
５０塩基からなるオリゴマーの最初の１６ヌクレオチドはスペーサーであり、最後の３４ヌクレオチドは相補的標的配列の認識要素として働く。ハイブリダイゼーションの際に結合の認識セグメントが、コア・デンドリマーと外皮デンドリマー強固に結合しうるような配列を選択した。さらに、認識セグメントがＳｆｉＩ制限酵素で切断されることによって、このテクトデンドリマーの断片化パターンがインビボ用途でも観察できるように設計した。コアおよび外皮オリゴヌクレオチドの配列分析を以下に示し、これはベクターＮＴＩシステムのデータに由来する。
コア一本鎖ＤＮＡ（５０ｍｅｒ）
2004515457.tif 000004
分子量      ５，５３５．１
％Ｇ＋Ｃ      ８．０
Ｔｍ         ０．７
％ＧＣＴｍ    ６６．１
ΔＧ   −１０４．２
３’ΔＧ −１６．７
ΔＨ   −４４７．０
ΔＳ   −１１４３．９
外皮一本鎖ＤＮＡ  （５０ｍｅｒ）
2004515457.tif 000005
分子量        ５，６７９．３
％Ｇ＋Ｃ            ８．０
Ｔｍ        １．１
％ＧＣＴｍ    ６．１
ΔＧ   −１０４．４
３’ΔＧ −１７．１
ΔＨ   −４４６．１
ΔＳ   −１１４０．１
【０２１５】
この構築物はいずれのオリゴヌクレオチドにおいても実質的にヘアピンを形成せず、コア／コアおよび外皮／外皮ハイブリダイゼーション能が劇的に低下している。また、コア／外皮ハイブリッド対コア／コアまたは外皮／外皮ハイブリッドのＴｍの差を利用して、コア／外皮ハイブリダイゼーションのより正確な制御が可能である。これによって、好ましくない架橋形成（ゲル形成）をさらに減少させる。さらに３’端における、および制限酵素部位間における、余分なヌクレオチドの付加によって、インビボのリンカーの接近／分解性試験において、ＳｆｉＩが二本鎖ＤＮＡ認識部位を認識しかつ切断する能力を改善することができる。従って、コア／外皮二量体形成の理論は以下のようになる。
2004515457.tif 000006
【０２１６】
本明細書の上記の公表文献および特許はいずれも参照として本明細書に組み入れられる。当業者には、記載の本発明の方法およびシステムに関する様々な改変および変更は、発明の範囲と趣旨を逸脱するものではないことは明らかである。上記では、特定の好ましい態様を示しながら本発明を説明したが、主張される本発明をそのような特定の態様に不当に限定すべきでないことが、理解されるべきである。実際、記載した本発明を実施する方法についての様々な改変に関しては、生化学、免疫学、化学、分子生物学、医学的分野または関連分野の専門家にとっては自明であり、特許請求の範囲に含まれることが意図される。
【図面の簡単な説明】
以下の図は本明細書の一部であり、本発明の局面をさらに説明するために含まれる。本明細書中に示す特定の態様の詳細な説明と組み合わせて、これらの図の一つまたは複数を参照することにより、本発明をよりよく理解することができる。
【図１】球状、樹状ポリマーの複数世代を示し、各世代でサイズ、分子量、およびポリマー表面の一級アミン基の数が増加している。
【図２】デンドリマーに基づくナノデバイスの設計に関する複数の選択肢を示す。
【図３】本発明のある態様における乳癌および大腸癌に関するナノデバイスの構成を示す。
【図４Ａ−Ｄ】本発明のある態様における治療用ナノデバイスの機能を示す。Ａは、「標的化および画像化」への適用を示し、ここでナノデバイスは、細胞表面部分を通じて新生物細胞を標的とし、かつ受容体媒介性エンドサイトーシスによって細胞に取り込まれる。腫瘍００は、ＭＲＩにより画像化される。Ｂは、「癌のサインの感知」への適用を示し、ここで癌のサインにより赤色蛍光が活性化される（量子ドット様の凝集または１消失による、Ｍｕｃ１、Ｈｅｒ２、または変異ｐ５３）。Ｃは「治療薬（Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ）の放出誘発」への適用を示す。ここでレーザ光は、赤色に発光している細胞を標的とし、感光性保護基を薬剤から切り離す（例えば、デンドリマーマトリックスからこれを遊離させる白金またはタキソール）。Ｄは、「治療に対する反応のモニタリング」への適用を示し、ここで薬剤は、細胞内アポトーシスを誘導し、かつカスパーゼ活性は緑色蛍光を活性化する。アポトーシスを起こした癌細胞はオレンジ色に変化し、残りの癌細胞は赤いままである。緑色蛍光を発する場合には、正常な細胞がアポトーシス（副次的傷害）に誘導されている。
【図５】本発明の大型（世代９分子量  ８００ｋＤＡ）ＰＡＭＡＭ樹状ポリマーの原子力顕微鏡（ＡＦＭ）像の写真を示す。サイズおよび形態は均一である。本図では、より大型で非共有結合により結合した３つのデンドリマークラスターを示す。
【図６】本発明のある態様における、クラスター化デンドリマーの水溶液中での合成を示す。
【図７】本発明のある態様における、デンドリマー合成手順を示す。
【図８】本発明のある態様における、デンドリマー合成手順を示す。
【図９】治療薬を含む特定のデンドリマーの、毒性レベルを示すグラフを示す。
【図１０】本発明のある態様における、コア−外皮構造を示す。
【図１１】本発明のある態様における、核酸リンカーを含むコア（Ｇｘ）−外皮構造を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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