(57)【要約】本発明は、各種の肺疾患を含む炎症性疾患の治療のためのニコチン性受容体アゴニストの使用に関する。このようなアゴニストは、ステロイドのような他の抗炎症剤に比べて副作用が少ない。さらに、これらのアゴニストは、肺疾患の軽減のために単独で、あるいは他の抗炎症剤との組み合わせで使用することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ニコチン性受容体と結合し、その機能を調整する作用物質を動物に投与することを含む、動物の炎症を緩和または予防する方法。
【請求項２】
前記作用物質がニコチン性受容体の機能の上方制御を生じさせる請求項１の方法。
【請求項３】
前記炎症が、肺の炎症性疾患に起因する請求項１または２の方法。
【請求項４】
前記肺の炎症性疾患が、例えば、喘息、慢性閉塞性肺疾患（DOPD）、間質性肺線維症（IPF）、サルコイドーシス、過敏性肺臓炎（HP）、慢性HP、および器質性肺炎を伴う閉塞性細気管支炎（BOOP）から成る群より選択される請求項３の方法。
【請求項５】
前記作用物質が、ジメチルフェニルピペラジニウム（DMPP）である請求項３または４の方法。
【請求項６】
動物の炎症性疾患を緩和または予防するための薬剤の製造における、ニコチン性受容体と結合し、その機能を調整する作用物質の使用。
【請求項７】
前記炎症性疾患が、肺の炎症性疾患である請求項６の使用。
【請求項８】
炎症性疾患を緩和または予防することができる他の作用物質をさらに含む請求項６または７の使用。
【請求項９】
前記薬剤が、経口用、舌下用、腹腔内用、静脈内注入用、吸入用、または鼻用の形態である請求項６〜８のいずれかの使用。
【請求項１０】
前記肺の炎症性疾患が、例えば、喘息、慢性閉塞性肺疾患（DOPD）、間質性肺線維症（IPF）、サルコイドーシス、過敏性肺臓炎（HP）、慢性HP、および器質性肺炎を伴う閉塞性細気管支炎（BOOP）から成る群より選択される請求項７の使用。
【請求項１１】
前記疾患が、喘息である、請求項１０の使用。
【請求項１２】
前記作用物質が、喘息に随伴する炎症、気管支反応亢進あるいは気管支（線維症性）組織修復に関与するニコチン性受容体をターゲットにすることによって、喘息を緩和または予防する請求項１１の使用。
【請求項１３】
前記作用物質が、ジメチルフェニルピペラジニウム（DMPP）である請求項６〜１２のいずれかの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ニコチン性受容体アゴニストの使用または投与による、各種の肺疾患を含む炎症性疾患の治療に関する。
【背景技術】
【０００２】
人間は1時間に1立方メートル以上の空気を呼吸するが、、吸入する空気中に存在する大量の粒子、抗原、感染因子および毒性ガスや煙は通常は肺の防御機構によって処理されている。これらの外来性因子と免疫系および他の肺の防御機構との相互作用の結果、調節的炎症反応が生じるが、これは通常、身を守るのためのもので有益である。一般に、この防御機構は気道およびガス交換が行われる肺胞上皮表面の状態を正常に保つように自己調節されている。しかしながら、炎症反応を調節することができず、組織損傷の可能性が増す場合もある。環境状態、遺伝的素因および様々な不明確な要因によっては、異常に多数の細胞の炎症が呼吸系の様々な部位で漸増し、疾患および疾病が引き起こされる。
【０００３】
吸入された刺激物または内在性の刺激物に対する炎症反応は、血管透過性の非特異的上昇、ヒスタミン、エイコサノイド、プロスタグランジン、サイトカインおよびケモカインを含む炎症誘導因子および化学走化性因子の放出を特徴とする。これらの因子は、白血球−内皮細胞接着分子の発現と結合を調節し、血液中に存在する炎症細胞を漸増させる。
【０００４】
より特異的な炎症反応は、吸入した抗原に対しての強くまた特異的な免疫応答の増加と、抗原認識が関係している。この反応は、喘息、過敏性肺臓炎（HP）の発症に関与する。また、確定的ではないがサルコイドーシス（多臓器肉芽腫性疾患）の発症に関与するものと考えられている。肺損傷後の修復機構の調節異常は、線維症、ならびに喘息、肺線維症、慢性閉塞性肺疾患（COPD）および慢性HPにおける機能喪失の原因となりうる。
【０００５】
HPの発生率は、非喫煙者より現在喫煙者のほうがずっと低いことが、以前、報告された（1-4）。サルコイドーシスも、非喫煙者より喫煙者のほうが頻度が低い（5, 6）。HPおよび他の炎症性疾患の発症に対する喫煙の有益な効果の根底にある機構はまだわかっていないが、ニコチンの免疫調節作用に関連している可能性がある。禁煙後、新規の喘息または喘息の悪化が臨床的に観察されている。この証拠を得ることは難しく、喘息の予防または治療におけるニコチンのどのような保護的効果があったとしても、無数の有害成分を含むタバコを喫煙する悪影響の方がはるかに大きいことには違いない。
【０００６】
喫煙の保護的効果は他の疾病においても報告されており、最も研究されているのは潰瘍性大腸炎、炎症性腸疾患である（7, 8）。ニコチンはこれらの疾病の治療に成功裏に用いられている（9, 10）。他の研究は、アルツハイマー病およびパーキンソン病の治療においてニコチンのなしうる治癒的価値が認められている（11, 12）。
【０００７】
ニコチン性受容体は、リガンド型イオンチャネルとして作用する５つのポリペプチドサブユニットから成る５量体である。リガンドが受容体に結合すると、このポリペプチドに立体配座の変化が生じ、その結果、中心部のイオンチャンネルが開放されて細胞外液から細胞質へナトリウムイオンが移動可能となる。現在までに、α、β、γおよびδの4種類のサブユニットが特定されており、ニコチン性受容体は、これら4種類のサブユニットのあらゆる組み合わせで構成することが可能である（13）。最近の研究で、肺胞マクロファージ（AM）はそのα-7サブユニットを発現でき（14）、一方、気管支上皮細胞はα-3、α-5およびα-7サブユニットを（15）、ならびにリンパ球はα-2、α-5、α-7、β-2およびβ-4サブユニットを（14）発現できることが明らかにされている。繊維芽細胞（16）および気道平滑筋細胞（17）もこれらの受容体を発現する。従って、定住肺細胞（AM、樹状細胞、上皮細胞、繊維芽細胞など）および炎症性疾患の際に補充されるもの（リンパ球、多核白血球）はニコチン性受容体を発現する。
【０００８】
リンパ球におけるニコチン性受容体の活性化は、細胞を不完全な活性化を誘導する細胞内シグナル機構影響を及ぼす。実際、ニコチンを作用させることによりプロテインキナーゼ（タンパク質リン酸化酵素）の活性は上方制御され、引き続いてホスホリパーゼA2（PLA2）の活性が上方制御される。PLA2は、ホスホイノシトール−2−ホスフェート（PIP2）を、イノシトール−3−ホスフェート（IP3）およびジアシルグリセロール（DAG）へと分解する（18, 19）。細胞中にIP3が継続的に存在することによって、カルシウム貯蔵の減少に結びつくその脱感作が引き起こされると考えられている（19）。この考えは、ニコチンで処理したリンパ球がNFk-Bなどの転写因子を活性化するのに十分な量のカルシウムを細胞質内に放出していないという現象を説明できた（20）。
【０００９】
タバコの煙の主要な薬理学的成分であるニコチンは、最も知られているニコチン性受容体アゴニスト（agonist）の一つである（21）。この天然物質については、抗炎症性および免疫抑制性はよく解析されており（22）、さらに抗線維症性を有することが示唆されている（23）。動物ではニコチン含有量の多いタバコの煙に対する暴露は、低ニコチンタバコの煙に対して暴露より免疫抑制作用が大きい（24）。さらに、ニコチンでラットを処理すると、抗原に対する特異的抗体反応が抑制され、T細胞アネルギーが誘発される（25）。たとえ数が増したとしても、喫煙者由来のAMは、エンドトキシンに呼応した炎症性サイトカインを分泌能力が低下しており（20, 25, 26）、ニコチンはこの抑制反応の要因のひとつと考えられている（26）。ある研究では喫煙者由来の抹消血リンパ球がFASリガンド（FASＬ）を高発現すること、さらにニコチンが非喫煙者由来のリンパ球のFASＬの発現を増長させることが明らかにされ、ニコチンが細胞死に影響している可能性が示唆された（27）。ニコチンが、試験管内でのヒト歯肉繊維芽細胞の増殖および細胞外基質生産に対して阻害効果を持つことも明らかにされている（23）。興味深いことに、ニコチン処理は、ニコチン受容体の発現を上方制御ようである（28）。
【００１０】
ニコチン性アゴニストはT細胞の活性化を下方制御し、実際、ニコチンが共刺激分子CD28およびCTLA4のT細胞における発現に影響することが明らかにされている（29）。
【００１１】
B7/CD28/CTLA4共刺激経路は、T細胞の活性化およびホメオスタシスにおいて重要な調節的役割を果たす（30, 31）。2つのシグナル伝達経路が関与している。正シグナルは、T細胞応答（増殖、活性化、サイトカイン発現、および生存）の増強作用をもたらすT細胞CD28受容体へのB7（CD80/CD86）分子の結合に伴うものである。（32）。負シグナルは、T細胞応答の下方制御をおこす活性化T細胞におけるCTLA4とB7の相互作用に伴って生じるものである（33, 34）。CD28誘導シグナルとCTLA4誘導シグナルの間の均衡は、T細胞活性化の転帰を変化させうる。
【００１２】
HPに関しては、活性HP（35）の患者およびマウスHP（36）において、AMでのB7分子発現の上昇制御が以前に報告されている。マウスにおけるB7−CD28共刺激経路の遮断は、肺の炎症を抑制することも明らかにされた（36）。また、これらの報告では、AMでのB7分子の発現が非喫煙者より喫煙者のほうが低いこと、さらに試験管内でのインフルエンザウイルス感染によって、非喫煙者ではAMにおけるB7発現が上方制御されるのに対し、喫煙者AMでは不能なことが明らかにされている。なお、これがニコチンに起因するのか、タバコの煙の中に存在する他の物質に起因するのかは、不明である（35）。B7分子の上方制御は、喘息（37, 38）およびサルコイドーシス（38）においても報告されている。
【００１３】
エピバチジンは、今までに知られている最も強力なニコチン性アゴニストである（40）。これは、抗炎症性および鎮痛性を有する。実際、その鎮痛能力はモルヒネの200倍である（40）。この分子が試験管内でリンパ球の増殖を抑制することも知られている（41）。エピバチジンのその受容体への結合は、非特異的である（42）。残念ながら、エピバチジンにはほとんどが心臓血管および中枢神経系に対する重大な毒性副作用があり、その結果、肺疾患治療用の抗炎症薬として使用できない（40）。
【００１４】
ジメチルフェニルピペラジニウム（DMPP）は合成ニコチン性アゴニストであり、非特異的なアゴニストである（13）。受容体に対するその効力は、刺激に関与する細胞の種類に依存するが、ほぼニコチンと同じである（43）。ニコチンおよび他のニコチン性アゴニストを越えるその利点は、その化学的立体構造によって、血液脳関門の通過が妨げられることであり、これにより、依存中毒性や他の中枢神経作用は生じない（13）。DMPPの抗炎症性はあまりよく明らかにはされていない。しかしながら、長期にわたる投薬により体内の白血球の数を減少させ、脾細胞によるサイトカインの生産を低下させ、ナチュラルキラー細胞の活性を低下させることが明らかにされている（44）。気道平滑筋細胞に対するDMPPの効果も試験されている。長期にわたってDMPPを投与すると、この細胞は、最初に短い収縮作用を生じ、その後弛緩作用を生じる（45）。近年、より強力な気管支拡張薬（B2アゴニスト）が市場で入手できるようになり、この気管支拡張作用、それ自体によって、DMPPが喘息の治療に潜在的に有用になることはなかろう。けれども、このニコチン性受容体アゴニストは、抗炎症性を目的として、喘息およびCOPD患者に安全に投与することができることから、その特性は重要である。さらに、DMPPが、心臓、脳、肝臓または肺などの主要臓器に対してなんらかの毒性作用を及ぼすという証拠はない。
【００１５】
肺の炎症性疾患を含む炎症性疾患の治療の進歩にもかかわらず、入手可能な薬剤または作用物質を用いる治療は、多くの場合、望ましくない副作用を生じる。例えば、COPDの炎症は、コルチコステロイドに対して明らかに耐性であり、結果として、この状態を治療するために、新しい抗炎症薬の開発が必要であることは、認識されている（46）。
【００１６】
同様に、コルチコステロイドおよび他の免疫抑制は、肺線維症の治療に日常的に用いられているが、これらは最低限の効能しか実証していない（47）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
このような背景で、肺の炎症性疾患を含む炎症性疾患の治療法、副作用を生じることなくそれらの症状を緩和することが可能なであり、新規で信頼性の高い治療法が求められている。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
本発明に従えば、炎症性疾患を治療するための新規方法が提供される。具体的には、ニコチン性受容体アゴニストの使用または投与によって、肺の炎症性疾患を治療するための新規方法が記載される。
【００１９】
炎症性肺疾患を治療するためにニコチンまたは他のニコチン性受容体アゴニストを使用する考えは新規である。ニコチンおよび他のニコチン性受容体のすばらしい抗炎症性および免疫抑制性にもかかわらず、アレルギー性肺疾患および他の炎症性肺疾患におけるそれらの有用性が以前に開示されたことはない。ニコチンそれ自体はなんらかの長期副作用を及ぼすことはないと考えられている安全な物質である（48, 49）。肺、心臓および動脈の喫煙関連疾患は、ニコチンによってではなく、吸入される煙の中に存在する無数の他の化学物質によって生じる。主な問題は、ニコチンが血液脳関門を通過して、依存中毒性が誘発されることである。これらが、肺疾患の治療においてニコチン性アゴニストがこれまでに関心を持たれなかった主な理由である。喫煙の有害作用は明らかである。ニコチンは喫煙の毒性作用の原因ではない（49）が、関連性は残る。
【００２０】
従って、本発明は、喘息、COPD、間質性肺線維症（IPF）、サルコイドーシス、HP、および器質性肺炎を伴う閉塞性細気管支炎（BOOP）などの炎症性肺疾患を治療するために、DMPPなどのニコチン性受容体アゴニストの使用を提案する。薬剤は、経口投与してもよいし、好ましくは多様かつ適切な薬剤放徐媒体を用いてエアロゾル化して吸入させることで肺へ直接的に薬物を目標送達してもよい（従って、あらゆる全身性作用を最小にする）。
【００２１】
ニコチン性受容体アゴニストは、その抗炎症性および免疫抑制性、ならびに副作用が最小限にあることから、気管支炎または間質炎によって特徴付けられる非常に様々な肺疾患の治療における医学的使用に理想的な薬剤である。これらの疾病には、喘息、COPD、IPF、サルコイドーシス、HPおよびBOOPが挙げられる。
【００２２】
本発明のその他すべての目的、利点および特徴は、その好ましい態様（もっぱら添付の図面を参照した実施例）についての非限定的な以下の記載を読むことによってさらに明瞭化するであろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
炎症細胞および肺細胞におけるニコチン性受容体の存在は、既に述べたとおりである。しかしながら、本発明の新規性は、ニコチン性受容体アゴニストが炎症性肺疾患の治療に有用であるらしいことを見出し、これにより、喘息、HP、サルコイドーシス、BOOP、IPFおよびCOPDなどの炎症性肺疾患の病原機構に対して特異的に影響するニコチン性アゴニストの抗炎症性および免疫抑制性を発見したことである。この一つの例は、B7共刺激分子の発現に対するタバコの煙の効果である。
【００２４】
二つの動物モデル（HPモデルおよび喘息モデル）を用いて、炎症性肺疾患におけるニコチン性拮抗薬の効果を研究した。これらのモデルの両方を用いて、肺の生理機能および炎症に対するニコチン性受容体アゴニスト（選択的アゴニストと非選択的アゴニストの両方）の効果を研究した。ニコチン性アゴニストが炎症を下方制御する機構を理解するための試みにおける試験管内での研究は、動物検体または患者より単離した炎症細胞、ならびに市販の細胞株を用いて行った。
【００２５】
最初、実験は、非特異的アゴニスト、すなわち、どのニコチン性受容体サブユニットにも結合するアゴニスト（ニコチン、ジメチルフェニルピペラジニウム（DMPP）およびエピバチジン）を用いて行った（13, 42）。β4サブユニット特異的アゴニスト、シチジン（42）も試験して、特異的刺激が抗炎症作用を生じるかどうかを見た。
【００２６】
本出願において「動物」という言葉は、人間、霊長類、家畜（ウマ、ウシ、ブタ、ヤギ、ヒツジ、ネコ、イヌ、モルモット、マウスなど）および他の哺乳類を意味する。一般に、この用語は、非常に発達した脈管系を有する生物を示すために用いられる。
【００２７】
本発明において「アゴニスト」または「作用物質」は、ニコチン性受容体に結合し、ニコチン性受容体の機能を修飾する分子または成分である。好ましい作用物質はたとえばDMPPであり、受容体特異的で、血液脳関門を通過しないものである。有用な作用物質は、非常に多数の化学物質類の中で見出すことができるが、典型的には有機化合物、好ましくは低分子量の有機化合物である。低分子量有機化合物の分子量は150より大きいが、約4500未満、好ましくは約150０未満、さらに好ましくは約500未満である。具体例としての種類には、ペプチド、糖類（サッカライド）、ステロイド、複素環式化合物、多環式化合物、置換芳香族化合物などが挙げられる。
【００２８】
選択した作用物質を変性して、有効度、安定性、医薬適合性などを強化することができる。作用物質の構造同定を利用して、さらなる作用物質を同定、生成またはスクリーニングすることができる。例えば、ペプチドからなる作用物質を同定した場合、それらの蛋白質分解安定性を強化するために、上記のような様々な方法でそれらを変性することができる。安定化の他の方法には、カプセル化、例えば、リポソーム内へのカプセル化を挙げることができる。作用物質を保持する担体は、公知のあらゆる利用しやすい方法で調製される。
【００２９】
治療的使用のために、ニコチン性受容体機能に影響を及ぼす作用物質は、あらゆる都合の良い方法によって投与することができる。低分子有機化合物は、好ましくは経口投与され、他の配合薬および作用物質は、好ましくは薬学的もしくは生理学的に許容される担体（例えば、リン酸緩衝生理食塩水など）により利用しやすい形で、また非経口的に、投与される。典型的には、それらの配合薬は、血液または滑液などの体液中に加える。
【００３０】
例として、多くのこうした治療薬は、注射または点滴による直接投与、局所投与、気管内／鼻内への吸入（例えば、エアロゾルによって）、点眼、または薬理活性のあるペプチドを表面に固定もしくは内部に包含したインプラント材料（例えば、コラーゲン、浸透圧性ポンプ、適当な形質転換細胞によって構成される移植片など）による。一般的に投薬量は、経験的に決められるが、典型的には受容者の体重1ｋｇあたり約10-1000μgの範囲であろう。ペプチド作用物質についての濃度は、一般には投与される用量中約50-500μg/mLの範囲であろう。安定剤、殺菌剤などの他の添加剤を含めてもよく、これらの添加剤は公知の容量を添加できる。。
【００３１】
ニコチン性アゴニストが、現在用いられている炎症性肺疾患およびそれに伴う気道閉塞の治療薬すべてに対して、取って代わることはありえないだろう。気管支拡張薬は、気管支痙攣の即時鎮静に引き続き有用である。しかしながら、気管支拡張薬は根本的な原因あるいは炎症に対して薬効がない。
【００３２】
コルチコステロイドは強力な抗炎症薬である。これらは非局所的な（全身への）投与は重大な副作用を引き起こし、可能ならば行うべき長期的な投薬ができない。吸入による投与では吸収率の悪いステロイドは、気道の炎症を治療するために有用である。低用量ではこれらの薬物は、ほとんどまたはまったく副作用を生じない。しかしながら、用量が高くなると、口腔カンジダ症、声帯麻痺、白内障および骨粗しょう症の危険性が増大する。吸入ステロイドは、肺間質に対して効き目がなく、また抗線維症性を有さない（57）。
【００３３】
抗ロイコトリエンなどのさらに最近の薬物は、一部の喘息患者には有用である（58）が、COPDおよび他の肺疾患には効果がない。これらの薬物は、ロイコトリエンによって生じた炎症に対してのみ有効な成分に限定される抗炎症性を有する（59）。IPF、サルコイドーシス、HPおよびBOOPなどの間質性肺疾患の治療は、基本的に全身性コルチコステロイドの使用に頼っている。この治療法は、ある種の炎症を抑制するには有効であるが、残念ながら深刻な副作用をともない、また根本にある線維症の進行を食い止め、改善の方向へ導くことができない。。シクロホスホアミドおよびアザチオプリンなどの免疫抑制剤は、重度のIPFに時として試みられるが、それらの投薬効果は証明されておらず、何らかの効果があったとしても非常に限られたものである（60）。本質的に、肺線維症はほとんどの場合、進行性で治療不可能である。同時に、ほとんどのIPF患者はこのような状況で死に至っている。（61）。
【００３４】
ニコチン性アゴニストは、ステロイドの予備薬または置換薬として有用と思われる。肺貪食細胞への目標捕捉的送達によって、ニコチン性アゴニストは気道炎症と間質炎症の双方の抑制に有用性を示すであろう。コルチコステロイドに勝るニコチン性アゴニストの一つの重大な利点は、副作用が少ないことに加えて、このアゴニストが線維芽細胞に直接的に作用し、くわえてこの作用により、気道および肺の線維症、コルチコステロイドで対処不可能な何某かを予防もしくは進行を食い止めて改善させることができることである。HPおよびサルコイドーシスの主な後続症であるIPF、ならびに気道線維症が、慢性喘息における一般所見で認められる場合、間質性繊維症はその特徴とされる。（57）。
【００３５】
炎症性肺疾患に可能性を有する新規治療法として、他の物質も活発に研究されている。多くのサイトカイン（例えば、IL-5、IL-13、IL-16など）が特に標的となっている（62）。炎症に関与する経路が複雑なため、いかなる特異的サイトカインまたは他の炎症鎮静剤が、これらの肺疾患の治療に有意な影響を及ぼす可能性は低いと考えられる。ニコチン性受容体アゴニストは、コルチコステロイドと同様に広範な炎症性反応に効能をもつという利点がある。炎症性肺疾患の治療におけるそれらの可能性は、その点にある。
【実施例】
【００３６】
I−過敏症様の炎症
マウスの長期誘発過敏性肺臓炎（HP）に対するニコチン性アゴニストの効果
実施例１：生体内でのHP研究
ニコチンによるニコチン性受容体の刺激が、炎症性サイトカインの抑制および特異抗原による細胞活性化の阻害反応により、HP抗原に対する免疫応答を下方制御しているのではないかという仮説を立てた。
【００３７】
前に述べたように、HPの発生率が非喫煙者より喫煙者のほうが低いこと（50）、およびこのモデルが、よく研究されていることから、このモデルを選択した。HPの一種である農夫肺（51）の原因物質であるSaccharopolyspora rectivirgula（SR）抗原の投与によってHPを誘発した。マウスに1日2回、035-2.0 mg/kgの範囲の容量のニコチンを同時に腹腔内（IP）投与した。ニコチンの投与は、これらのマウスの気管支肺胞洗浄（BAL）において見出せる総細胞数をかなり減少させた。ニコチン治療によって最も影響を受けた集団は、リンパ球であった（図１）。肺のマクロファージおよびリンパ球を単離し、抗CD3＋組換IL-2で刺激した。これらの細胞によるIFN-γを測定した。IFN-γはmRNAの生産、HPおよび他の肺炎症性疾患の発症に関与することが知られているサイトカイン（52）である。ニコチン治療した動物からの細胞は、治療していない動物からの細胞より有意に低いIFN-γ mRNAの発現を示した（図２）。
実施例２:サイトカイン発現に対するニコチン性アゴニストの効果を示す試験管内での研究
試験管内モデルにおけるニコチンの抑制作用に関与する機構をさらに明らかにするために、肺胞マクロファージ細胞株を用いた。
【００３８】
AMJ2-C11細胞におけるニコチンまたはDMPP処理の効果を、RT-PCRによるTNF-α、IL-10 mRNA発現解析によって分析した。これらのサイトカインは、HP、喘息およびサルコイドーシスなどの肺の炎症性疾患の発症に関与する（52-55）。ニコチンおよびDMPP処理は、用量依存性はなく、TNF mRNA発現の大幅な減少（LPS刺激および40μMニコチン処理により、98％まで発現抑制）を示した（図３）。SRで刺激した細胞でも同様の結果を得た（図４）。この非用量依存性応答は、培地中の大量のアゴニストに起因するニコチン性受容体の脱感作によって説明することができる。IL-10 mRNA発現も、ニコチンおよびDMPP処理によって減少した。もっとも強い下方制御は、ニコチン用量40μM（LPS刺激；mRNA発現88％減少；図５）、およびDMPP用量80μM（SR刺激；mRNA発現87％減少；図６）で発生した。繰り返し述べるがその（ニコチン性アゴニストによる抑制）効果には用量依存性はなかった。
【００３９】
AMJ2-C11細胞においてIFN-γ mRNAの発現が確認されなかった（データ表示なし）ため、別のマクロファージ細胞株（RAW 264.7,ATCC）を用いて、INF-γの発現に対するDMPPの効果をRT-PCRによって分析した。細胞を50μM/mLのSR抗原で刺激し、40から160μMの範囲で用量を変えたDMPPとともにインキュベートした。DMPP処理を行ったところこれらの細胞でINF-γの発現が、40μM DMPP で75％まで減少した（図７）。この効果は用量依存性ではないと再度推測された。
実施例３：共刺激分子の発現に対するニコチン性アゴニストの試験管内での効果
B7（CD80）分子の発現に対するニコチンおよびDMPPの効果を試験管内で分析した。AMJ2-C11細胞（マウス肺胞マクロファージ、ATCCより）を40μMのニコチンまたはDMPPとともにインキュベートし、LPS（0.1μg/mL）またはSR抗原（50μg/mL）で48時間刺激した。処理を行った細胞におけるCD80の発現率は、未処理細胞（LPSもしくはSRで刺激し、ニコチンやDMPPなしでインキュベート）で見られる発現のほぼ半分であった（図８（ａ）および（ｂ））。
実施例４：ヒトBAL細胞（AMおよびリンパ球）に対する研究
一つの目的は、DMPPまたは類似薬で患者を治療することだったので、HP患者由来のリンパ球に対するこの薬物の効果を検証した。HP患者に対してBAL（気管支肺胞洗浄）行った。他のBAL細胞からリンパ球を単離し、PHAで刺激して、DMPPとともにインキュベートした。DMPPの用量応答を、IFN-γに対するサイトカインのmRNA発現量を（RT-PCRにより）分析した（図９）。
【００４０】
正常な患者に対してBALを行い、肺胞マクロファージを単離した。細胞をSRで刺激し、ニコチンまたはDMPPで処理したところ、こちらでも同様に未処理の細胞と比較してCD86の発現がほぼ半分にであった（図１０）。
実施例５：他のニコチン性アゴニストの短期SR誘発急性炎症に対する効果の調査
Saccharopolyspora rectivirgula（SR）抗原（農夫肺の原因物質）をマウスの鼻腔内に滴下すると、肺において顕著な炎症反応が誘発される。好中球は、炎症部位において漸加するまずはじめの炎症細胞である。DMPP（0.5 mg/kg）、ニコチン（0.5 mg/kg）およびエピバチジン（2μg/kg）でマウスを治療したところ、SR誘発炎症に対して著しい抑制効果が現れた（図１１）。ニコチン性アゴニストを6時間おきに50μL量で鼻腔内投与し、SRを点滴し24時間後にマウスを屠殺にした。
【００４１】
有意な抑制効果は、ニコチンおよびエピバチジンで認められたが、DMPPで認められなかった。しかしながら、DMPP投与または非投与のマウスの数が15に達すると、非投与グループと比較して有意な抑制が認められた（図１２）。
【００４２】
TNF（炎症誘発性サイトカイン）のレベルは、DMPP投与マウスのBALでのほうが低く（図１３）、このことは、炎症の下方制御が、より低いTNF濃度に起因して生じることを示唆している。
II−喘息様の炎症
実施例６：生体内喘息モデル
類似の実験を、オバルビミン感作マウスにおいて行った。DMPPは吸入したアレルゲンおよびメタコリンに対する炎症反応と反応亢進の両方を抑制すると言われている。
【００４３】
水酸化アルミニウム2 mgを含むPBS溶液に乳化させた20μgのOVA蛋白質（鶏卵アルブミン；Sigma-Aldrich）を腹腔内注射して、Balb/cマウスのグループを感作した。4週間後、刺激（喘息の）誘発用量1.5％／50μLのOVAを鼻腔内投与した。この刺激誘発を3日連続で毎日行って、最後のエアロゾル暴露から24時間後に、マウスの肺のアレルギー性炎症を評価した。刺激誘発期間中、マウスのグループに様々な濃度のDMPPを投与した。気管支肺胞洗浄（BAL）を行い、400 gで遠心分離して、液体と細胞を分離した（図１４、１５、１６および１７）。
【００４４】
上清より肺IL-5レベルを測定した。BAL細胞の総数および細胞種ごとの細胞数を評価した（図１８）。
【００４５】
最適なDMPP用量で実験を繰り返して、気道応答性を評価した。
AHRの測定
麻酔し、気管切開を行い、コンピュータ制御人口呼吸器（FlexiVENT）を用いて換気したマウスにおいて、メタコリンに応じた気道反応亢進（AHR）を測定した。
【００４６】
漸増量のメタコリン（0 mg/kg−32.5 mg/kg）を、頚動脈を通して投与した（図１９、２０）。
実施例７：IL-4 mRNA発現に対するアゴニスト処理の効果
IL-4は喘息の発症に関与することがよく知られているサイトカインであり、IL-4 mRNA発現に対するアゴニスト処理の効果も分析した（53）。ニコチンは用量40μMにおいてIL-4のmRNA発現を92％まで減少した（図２１）。以前に実証されたように、細胞をSR抗原で刺激した際はIL-4mRNAは全く発現しなかった（データ表示なし）。
実施例８：好酸球遊出に対する様々なアゴニストの作用
喘息における炎症の下方制御に対するニコチン性アゴニストの効果をさらに調査するために、好酸球遊出に対する様々なアゴニストの作用を分析した。
【００４７】
肺組織への好酸球および他の炎症細胞の浸潤は、喘息の重要な特徴であり、気道の炎症および反応亢進の原因である。血液循環系から肺への炎症細胞の移動には、脈管内皮、基底膜および細胞外基質成分を通した移行が必要である。炎症細胞は、タンパク質分解酵素（プロテイナーゼ）を生産して、基底膜を横断する。これらの試験管内での予備実験において、本発明者らは、人口基底膜（Matrigel（登録商標）被覆細胞遊走チャンバ）を通した精製好酸球の移行に対する様々なニコチン性アゴニストの効果を調査した。DMPPは、好酸球遊出の用量依存的抑制を誘導し（図２２）、一方、この効果は、拮抗薬メカミラミン（MEC）によって打ち消される（図２３）。この抑制効果を、ニコチン、エピバチジンおよびシトシンを含む他のニコチン性アゴニストでさらに確認する（図２４）。結果は、アゴニストを伴わない対照条件と比較した（アゴニスト処理細胞の）抑制率として表す。
【００４８】
これらの結果より、ニコチン性アゴニストが、基底膜成分を分解するプロテイナーゼの合成または活性化を下方制御し、それによって肺粘膜内への好酸球の移行が抑制されることを示唆している。
実施例９：コラーゲンの生産に対するニコチン性アゴニストの効果
喘息は、その慢性化の原因となりうる上皮下コラーゲン沈着を含む気道構造変化を特徴とする。コラーゲンの合成と、繊維芽細胞によるその分解のバランスが崩れることが、気道構造変化のプロセスに関与するようである（56）。予備実験において、本発明者らは、一次正常繊維芽細胞がもたらすコラーゲンA1合成に対するニコチン性アゴニストの効果を調査した。コラーゲンＡ１遺伝子発現は、RT-PCRによって評価した。
【００４９】
結果は、未処理細胞と比較したアゴニスト処理細胞における遺伝子発現率を表す。
【００５０】
DMPPは、用量依存的に、コラーゲンA1遺伝子発現を抑制する（図２５）。ニコチンは、1および10μMでわずかに抑制効果を生じる。ところが、より高い濃度では、効果を生じなかった（図２６）。これは、おそらくそれらの受容体が脱感作したためであろう。より低い用量が抑制効果をもっとも高く発揮するために必要であり、分析されるであろう。。抑制効果は、エピバチジンででも認められる（図２７）。
【００５１】
以上本発明の好ましい実施形態によって上記の通り本発明を説明したが、本願の特許請求の範囲において述べられている本発明の精神および本質から逸脱しなければ、本発明を変更することができる。
【図面の簡単な説明】
【００５２】
【図１】BAL細胞における総細胞数および細胞種ごとの細胞数。主にリンパ球数の減少より、ニコチン投与マウスの総細胞数に顕著な減少がみられた。
【図２】単離した肺単核細胞におけるIFN-γ mRNA発現。IFN-γ mRNAの有意な抑制が認められた。
【図３】24時間のLPS刺激によってTNF-α mRNA発現を誘導した。結果は、LPS刺激だけを行った対照系を100％とし、それに対する発現量を％で表示した。バンドの強度は、TNF-αの強度をβ-アクチンの強度で割ることによって得た。刺激細胞を異なる用量（40-60μＭのニコチンおよびDMPP）で処理することによって、TNF-α mRNA発現の減少が誘導された。40μMのニコチン濃度で最大の効果が得られた（98％発現減少）一方で、すべての用量のDMPPが、発現を60-50％減少させた。
【図４】24時間のSR刺激によってTNF-α mRNA発現を誘導した。結果を図５に示す。刺激細胞を異なる用量（80および160μＭのニコチン、ならびに40-160μMのDMPP）で処理することによって、TNF-α mRNA発現の下方制御が誘導された。ニコチンは用量160μＭのみがmRNA発現に対して（抑制）効果を示した。一方、DMPPは用量40μＭおよび80μMでTNF-α mRNA発現を60％まで減少させた。
【図５】24時間のLPS刺激によってIL-10 mRNA発現を誘導した。結果を図５に示す。刺激細胞を異なる用量（40-160μMのニコチンおよび40-160μMのDMPP）で処理することによって、IL-10 mRNA発現の下方制御が誘導された。最も強い発現抑制（87％減少）は40μMのニコチンの場合あった。DMPPは、3通りの用量すべてについて、55-40％の発現減少を誘導した。
【図６】24時間のSR刺激によってIL-10 mRNA発現を誘導した。刺激細胞を異なる用量（80μＭおよび160μＭのニコチン、ならびに40-80μMのDMPP）で処理することによって、IL-10 mRNAの下方制御が誘導された。ニコチン処理でのmRNAの最も強い発現抑制は160μMで生じ（60％発現低下）、DMPP処理では80μMで認められた（90％発現低下）。
【図７】24時間のLPS刺激によって、RAW 264.7細胞にIFN-γ mRNA発現を誘導した。結果を図５に示す。刺激細胞を異なる用量のDMPPで処理することによって、IFN-γ mRNA発現減少が誘導された。最も強い発現抑制（80％抑制）は、40μMのDMPPで生じた。
【図８】ａ）LPSまたはSR抗原のいずれかでCD80の発現を誘導したところ、それぞれ38％および35％（の発現陽性細胞）が認められた。ニコチン処理（40μM、48時間）により、LPS刺激細胞で20％に、SR刺激細胞では26％に発現が抑制された。ｂ）LPSまたはSR抗原のいずれかでCD80の発現を誘導したところ、それぞれ38％および35％（の発現陽性細胞）が認められた。DMPP処理（40μM、48時間）により、LPS刺激細胞で17％に、SR刺激細胞では20％に発現が抑制された。
【図９】HP患者で行ったBALより単離したTリンパ球におけるIFN-γ mRNA発現。DMPP処理は、これらの細胞におけるIFN-γの発現を減少させた。
【図１０】正常な患者で行ったBALより得た全細胞でのCD86発現。DMPPで処理した細胞は、未処理の細胞よりCD86の発現が50％低下した。
【図１１】DMPP、ニコチンおよびエピバチジンを投与したマウスからのBAL細胞。ニコチンおよびエピバチジンの投与は、24時間後にSR誘発炎症に対して有意な抑制効果を生じた。
【図１２】検体数を増やしたところ、肺炎に対するDMPPの有意な抑制効果が認められた。
【図１３】DMP投与マウスからのBAL採取液中のTNFレベル。DMPPは、BALＦ TNFレベルを有意に低下させた。
【図１４】喘息マウスのBALにおける全細胞蓄積量に対する、漸増DMPP用量での腹腔内投与の効果。細胞数はOVAで刺激誘発した未治療のマウスにおいて、非常に上昇した。DMPP投与は、用量0.5および2.0ｍｇ／ｋｇで、細胞数を有意に減少させた。
【図１５】用量応答についての細胞種ごとの細胞数。OVA刺激誘発マウス（OVA OVA）は、対照グループ（sal sal）と比較して、BAL中により多くの好酸球およびリンパ球が認められた。DMPP投与はどの用量においてもBAL中の好酸球とリンパ球の双方の存在量が有意に減少させた（n=8;p<0.05）。
【図１６】喘息マウスのBALにおける全細胞蓄積量に対するDMPP腹腔内投与の効果の二次用量応答。細胞数は、OVAで刺激誘発した（DMPP）未投与のマウスにおいて高く上昇した。DMPP投与用量0.1と0.5ｍｇ／ｋｇにおいて、全細胞数の有意な減少が認められた。
【図１７】二次用量応答による細胞種ごとの細胞数。DMPP投与は、用量0.1および0.5ｍｇ／ｋｇにおいて、好酸球数およびリンパ球数を有意に減少させ、なかでも0.5ｍｇ／ｋｇではDMPPの抗炎症作用が最も高かった。
【図１８】対照マウス、喘息マウスおよび薬物投与マウスからのBAL IL-5レベル。OVA刺激誘発は、BALにおけるIL-5レベルを上昇させ、一方、DMPP投与により、投与用量0.5ｍｇ／ｋｇのマウスグループに対してIL-5レベルの有意な抑制効果が認められた。
【図１９】正常なマウス、喘息マウス、および0.5ｍｇ／ｋｇDMPPで鼻腔内投与した喘息マウスからの、メタコリン刺激誘発後の肺抵抗。DMPPは、喘息マウスと比較して、肺抵抗増加割合を抑制するように思われる。
【図２０】200％の肺抵抗増加（PC200）の誘発刺激用量を計算した。DMPPを投与したマウスは喘息マウスと比較して、DMPP投与によってPC200を有意に低減したと思われる（P=0.04;N=6）。
【図２１】24時間LPS刺激によってIL-4 mRNA発現を誘導した。結果を図５に記載のとおり表す。細胞を異なる用量（40-160μMニコチンおよび40-160μM DMPP）で処理した。ニコチン処理によって、IL-4 mRNA発現の低下（40μMニコチンにおいて90％にいたる発現抑制）が誘導された。DMPP処理では、すべての用量においてLPS刺激細胞におけるIL-4 mRNA発現が完全に阻害された。
【図２２】好酸球遊走に対するDMPPの効果。DMPPは、人工基底膜を横断する好酸球のDMPP用量依存的な抑制を誘導する。
【図２３】DMPPの好酸球遊走抑制効果に対する、メカミルアミン（ニコチン性アゴニスト）の効果。メカミルアミンは、DMPPの効果を無効化する。このことから、DMPP抑制効果を発揮する際にニコチン性受容体の活性化が必須であることが示唆された。
【図２４】好酸球の遊走に対する他のニコチン性薬剤の効果。ニコチン、エピバチジンおよびシトシンは、すべて、好酸球の遊走を抑制する。
【図２５】正常なヒト肺繊維芽細胞のコラーゲン1A mRNA発現に対するDMPPの効果。DMPPは、用量依存的にコラーゲン1A mRNA発現を抑制する。
【図２６】ヒト肺繊維芽細胞のコラーゲン1A mRNA発現に対するニコチンの効果。ニコチンは、1および10μＭでコラーゲン1A mRNA発現を抑制するが、これより高い用量では抑制効果はない。
【図２７】ヒト肺繊維芽細胞のコラーゲン1A mRNA発現に対するエピバチジン（別のニコチン性アゴニスト）の効果。エピバチジンもコラーゲン1A mRNA発現に対して抑制効果を生じる。
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【図１】
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【図２】
2004523588.tif 000003
【図３】
2004523588.tif 000004
【図４】
2004523588.tif 000005
【図５】
2004523588.tif 000006
【図６】
2004523588.tif 000007
【図７】
2004523588.tif 000008
【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【手続補正書】
【提出日】平成15年11月13日(2003.11.13)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ニコチン性受容体と結合し、その機能を調整する作用物質を動物に投与することを含む、動物の肺炎症を緩和または予防する方法。
【請求項２】
前記作用物質がニコチン性受容体の機能の上方制御を生じさせる請求項１の方法。
【請求項３】
前記肺炎症が、喘息、慢性閉塞性肺疾患（DOPD）、間質性肺線維症（IPF）、サルコイドーシス、過敏性肺臓炎（HP）、慢性HP、および器質性肺炎を伴う閉塞性細気管支炎（BOOP）から成る群より選択される請求項１の方法。
【請求項４】
前記作用物質が、ジメチルフェニルピペラジニウム（DMPP）である請求項１の方法。
【請求項５】
動物の肺炎症を緩和または予防するための薬剤の製造における、ニコチン性受容体と結合し、その機能を調整する作用物質の使用。
【請求項６】
炎症性疾患を緩和または予防することができる他の作用物質をさらに含む請求項５の使用。
【請求項７】
前記薬剤が、経口用、舌下用、腹腔内用、静脈内注入用、吸入用、または鼻用の形態である請求項５の使用。
【請求項８】
前記肺炎症が、喘息、慢性閉塞性肺疾患（DOPD）、間質性肺線維症（IPF）、サルコイドーシス、過敏性肺臓炎（HP）、慢性HP、および器質性肺炎を伴う閉塞性細気管支炎（BOOP）から成る群より選択される請求項５の使用。
【請求項９】
前記肺炎症が、喘息である請求項１０の使用。
【請求項１０】
前記作用物質が、喘息に随伴する炎症、気管支反応亢進あるいは気管支（線維症性）組織修復に関与するニコチン性受容体をターゲットにすることによって、喘息を緩和または予防する請求項５の使用。
【請求項１１】
前記作用物質が、ジメチルフェニルピペラジニウム（DMPP）である請求項５の使用。
【国際調査報告】
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