(57)【要約】細胞を単離および分析するためのシステム、装置および方法。細胞は、誘電泳動プレフィルターに導入され、このプレフィルターは、誘電泳動力によって細胞の少なくとも一部を捕捉するように構成された１つ以上の捕捉電極を備える。このプレフィルターから捕捉された細胞は、このプレフィルターに連結されている誘電泳動フィールドフローフラクショネーション分離器に送り込まれる。細胞は、誘電泳動力（および、必要に応じて磁気泳動力）と重力との平衡を保って、細胞を分離器の速度プロフィール内の位置に移動させることによって識別される。細胞の少なくとも一部は、分離器に連結されている２つ以上の螺旋状電極セグメントにより、この分離器からの細胞出現時間の関数として捕捉される。
2004532968.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞を分析するための流体デバイスであって、該デバイスは、以下：
誘電泳動力と重力との平衡を保って、細胞を分離器の速度プロフィール内の位置に移動させることによって、該細胞を識別するように構成された、誘電泳動フィールドフローフラクショネーション分離器；および、
該分離器に連結されており、該分離器から出現する該細胞の少なくとも一部を捕捉するように構成された、複数セグメント電極アレイアイソレーター、
を備える、デバイス。
【請求項２】
請求項１に記載の流体デバイスであって、前記分離器に連結されている誘電泳動プレフィルターをさらに備え、該プレフィルターが、誘電泳動力により該細胞の少なくとも一部を捕捉するように構成された１つ以上の捕捉電極を備える、デバイス。
【請求項３】
前記分離器が、磁気泳動力によって、前記細胞を該分離器の速度プロフィール内の位置に移動させるように構成された磁石をさらに備える、請求項１に記載の流体デバイス。
【請求項４】
前記磁石がＳｎＣｏまたはＮｄＦｅＢを含む、請求項３に記載の流体デバイス。
【請求項５】
前記電極アレイアイソレーターに連結されているプログラム可能な流体プロセッサをさらに備える、請求項１に記載の流体デバイス。
【請求項６】
細胞を分析するための流体デバイスであって、該デバイスは、以下：
誘電泳動力によって細胞の少なくとも一部を捕捉するように構成された１つ以上の捕捉電極を備える、誘電泳動プレフィルター；
該プレフィルターに連結されており、誘電泳動力と重力との平衡を保って、該細胞を分離器の速度プロフィール内の位置に移動させることによって、該細胞を識別するように構成された、誘電泳動フィールドフローフラクショネーション分離器；および、
該分離器に連結されており、該分離器からの細胞の出現時間の関数として該細胞の少なくとも一部を捕捉するように構成された、２つ以上の螺旋状電極セグメント、
を備える、デバイス。
【請求項７】
請求項６に記載の流体デバイスであって、ここで、前記２つ以上の螺旋状電極セグメントの各々は、複数の電極要素を含み、ここで、該複数の電極要素の各々は、単一周波数の信号によって作動するように構成されているが、該信号の位相は、該複数の電極要素の各々について異なる、デバイス。
【請求項８】
４つの電極要素をさらに備え、ここで、前記信号の位相が０°、９０°、１８０°、２７０°である、請求項７に記載の流体デバイス。
【請求項９】
前記螺旋状電極セグメント上で捕捉された前記細胞上への試薬の注入を可能にするように構成された試薬ポートをさらに備える、請求項６に記載の流体デバイス。
【請求項１０】
前記分離器が、磁気泳動力によって、前記細胞を該分離器の速度プロフィール内の位置に移動させるように構成された磁石をさらに備える、請求項６に記載の流体デバイス。
【請求項１１】
前記２つ以上の螺旋状電極セグメントに連結されているグログラム可能な流体プロセッサをさらに備える、請求項１０に記載の流体デバイス。
【請求項１２】
細胞を分析するための流体デバイスであって、該デバイスは、以下：
誘電泳動力と重力との平衡を保って、細胞を分離器の速度プロフィール内の位置に移動させることによって、該細胞を識別するように構成された、誘電泳動フィールドフローフラクショネーション分離器；
該分離器に連結されており、該分離器から出現する該細胞の少なくとも一部を捕捉するように構成された、複数セグメント電極アレイアイソレーター；および、
該電極アレイアイソレーターに連結されている、プログラム可能な流体プロセッサ、
を備える、デバイス。
【請求項１３】
前記分離器に連結されている誘電泳動プレフィルターをさらに備え、該プレフィルターが、誘電泳動力によって、前記細胞の少なくとも一部を捕捉するように構成された１つ以上の捕捉電極を備える、請求項１２に記載の流体デバイス。
【請求項１４】
前記分離器が、磁気泳動力によって、前記細胞を該分離器の速度プロフィール内の位置に移動させるように構成された磁石をさらに備える、請求項１２に記載の流体デバイス。
【請求項１５】
細胞を単離および分析するための方法であって、該方法は、以下：
細胞を誘電泳動フィールドフローフラクショネーション分離器に導入する工程；
該分離器中の細胞を識別する工程であり、該識別工程が、誘電泳動力と重力との平衡を保って、該細胞を該分離器の速度プロフィール内の位置に移動させる工程を包含する、工程；および、
該分離器に連結されている複数セグメント電極アレイアイソレーターにより、該分離器から出現する細胞の少なくとも一部を捕捉する工程、
を包含する、方法。
【請求項１６】
前記細胞の少なくとも一部が、最初は、キャリアビーズの表面に連結されている、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記細胞を識別する工程が、磁気泳動力を用いて該細胞を前記分離器の速度プロフィール内の位置に移動させる工程をさらに包含する、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記細胞が、磁気的に標識された抗体と共にインキュベートされる、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記複数セグメント電極アレイアイソレーターによって捕捉された細胞を溶解する工程をさらに包含する、請求項１５に記載の方法。
【請求項２０】
前記溶解工程が、ＡＣ電場の使用を包含する、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記細胞の少なくとも一部を捕捉するように構成された１つ以上の捕捉電極を備える誘電泳動プレフィルターに、細胞を導入する工程をさらに包含する、請求項１５に記載の方法。
【請求項２２】
前記複数セグメント電極アレイアイソレーターに連結されているプログラム可能な流体プロセッサを使用して、前記細胞を操作する工程をさらに包含する、請求項１５に記載の方法。
【請求項２３】
細胞を単離および分析するための方法であって、該方法は、以下：
誘電泳動力によって、細胞の少なくとも一部を捕捉するように構成された１つ以上の捕捉電極を備える誘電泳動プレフィルターに、該細胞を導入する工程；
該プレフィルターに連結されている誘電泳動フィールドフローフラクショネーション分離器に、該プレフィルターから捕捉された該細胞を送り込む工程；
該細胞を識別する工程であり、該識別工程が、誘電泳動力と重力との平衡を保って、該細胞を該分離器の速度プロフィール内の位置に移動させる工程を包含する、工程；および、
該分離器に連結されている２つ以上の螺旋状電極セグメントにより、該分離器からの細胞の出現時間の関数として該細胞の少なくとも一部を捕捉する工程、
を包含する、方法。
【請求項２４】
前記細胞を識別する工程が、該細胞を前記分離器の速度プロフィール内の位置に移動させるために磁気泳動力を使用する工程をさらに包含する、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記細胞が、磁気的に標識された抗体と共にインキュベートされる、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記細胞が前記分離器から出現した後に、複数の分析ビーズが該細胞と混合される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２７】
前記細胞を前記２つ以上の螺旋状電極セグメント上に濃縮する工程をさらに包含し、該濃縮工程が、多重位相場によって該２つ以上の電極セグメントを作動させる工程を包含する、請求項２３に記載の方法。
【請求項２８】
前記多重位相場が４つの位相を含み、かつ１０ＫＨｚ〜２００ｋＨｚの間の周波数を含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記２つ以上の螺旋状電極セグメントに連結されているプログラム可能な流体プロセッサによって前記細胞を操作する工程をさらに包含する、請求項２３に記載の方法。
【請求項３０】
細胞を単離および分析するための方法であって、該方法は、以下：
細胞を誘電泳動フィールドフローフラクショネーション分離器に導入する工程；
該分離器中の細胞を識別する工程であり、該識別工程が、誘電泳動力と重力との平衡を保って、該細胞を該分離器の速度プロフィール内の位置に移動させる工程を包含する、工程；
該分離器に連結されている複数セグメント電極アレイアイソレーターにより、該分離器から出現した該細胞の少なくとも一部を捕捉する工程；および、
該電極アレイアイソレーターに連結されているプログラム可能な流体プロセッサによって該細胞を操作する工程、
を包含する、方法。
【請求項３１】
前記細胞を識別する工程が、前記細胞を前記分離器の速度プロフィール内の位置に移動させるために、磁気泳動力を用いる工程をさらに包含する、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記細胞の少なくとも一部を捕捉するように構成された１つ以上の捕捉電極を備える誘電泳動プレフィルターに細胞を導入する工程をさらに包含する、請求項３０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（１．発明の分野）
本発明は、一般に、流体処理、そしてより具体的には、一体型流体デバイスに関する方法および装置に関し、このデバイスは、細胞の懸濁液から推定細胞亜集団を富化しかつ単離し、そして症状（例えば、癌）検出および診断の目的のためにマーカータンパク質およびｍＲＮＡに関する亜集団を定量的に分析し得る。
【０００２】
（２．関連技術の記載）
疾患状態に影響を与える増加する数の遺伝子の同定およびポストゲノム段階のアプローチは、分子診断の利益を広げることが可能な、より高速で自動化された技術の必要性を明確にする。十分に小型で自動化された安価なデバイスが、分子スクリーニングのために開発され得る場合、このデバイスは、癌および他の疾患の診断および予後に革命を起こすだけでなく、分子方法が完全に（治療の点でさえ）普及し得る。
【０００３】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の遺伝子チップおよびチップ実施形態のような、いくつかのデバイスは、使用し始められているが、これまで開発された多くの方法は、労働集約的であり、そして自動化された連続的モニタリング、またはハイスループット適用に容易に適合されない。明らかに、広範の実施可能な技術は、臨床サンプルのサンプル調製および分子分析を自動化し得る一体型装置が現実化する前に必要とされる。
【０００４】
（発明の要旨）
本発明の主題である技術は、組み合わされたサンプルの調製および分子マーカーの検出のための、多重用途の診断システムの作製に関連する問題を扱う。完全に自動化されたアッセイを実施し得るシステム、方法、およびデバイスを本発明において開示する。これらのデバイスは、小さなサイズの利点、少ないサンプル容積の必要性、および低コストで大量生産するための可能性を提供する。このような低コストのシステムは、再利用可能または廃棄可能な医用デバイスに適用可能である。
【０００５】
１つの実施形態において、このようなシステムは、以下のサブシステムを含み得る：（１）推定細胞を濃縮するためのプレフィルター段階；（２）細胞亜集団を分別するための高度な識別分離器段階；（３）細胞をバーストさせ、そして分子成分を移動させる段階；および（４）タンパク質およびｍＲＮＡ分子診断マーカーの自動化分析のための段階。
【０００６】
このようなシステムの開発のための重要な技術、および本発明の開示によって明らかにされる他の技術としては、以下が挙げられる：血液または分散されたリンパ節の細胞から、推定癌細胞を捕捉するためのプレフィルター方法論；推定細胞をミクロ流体単離チャンバおよび分析チャンバに分別するために、推定細胞の誘電特性および必要な場合に免疫磁気標識特性を開発する力均衡方法；ならびに特定の構築された分子アッセイ方法と組み合わせた場合に、複数の分子マーカーの並行定量を可能にするキャリアビーズのための、誘電指標方法および誘電操作方法。
【０００７】
本明細書中に開示される特定の技術としては、誘電泳動捕捉、誘電泳動フィールドフローフラクショネーション（ＤＥＰ−ＦＦＦ）、進行波方法、および本発明者によって実施される他の方法が挙げられ、以下は、本明細書中でその全体が参考として特に援用されている：米国特許第５，９９３，６３０号、表題「Ｍｅｔｈｏｄ  ａｎｄ  Ａｐｐａｒａｔｕｓ  ｆｏｒ  Ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ  Ｕｓｉｎｇ  Ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ  Ｄｉｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  ａｎｄ  Ｆｉｅｌｄ  Ｆｌｏｗ  Ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ」；米国特許第５，８５８，１９２号、表題「Ｍｅｔｈｏｄ  ａｎｄ  Ａｐｐａｒａｔｕｓ  ｆｏｒ  Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ  Ｕｓｉｎｇ  Ｓｐｉｒａｌ  Ｅｌｅｃｔｒｏｄｅｓ」；米国特許第５，８８８，３７０号、表題「Ｍｅｔｈｏｄ  ａｎｄ  Ａｐｐａｒａｔｕｓ  ｆｏｒ  Ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ  Ｕｓｉｎｇ  Ｇｅｎｅｒａｌｉｚｅｄ  Ｄｉｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  ａｎｄ  Ｆｉｅｌｄ  Ｆｌｏｗ  Ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ」；米国特許第５，９９３，６３２号、表題「Ｍｅｔｈｏｄ  ａｎｄ  Ａｐｐａｒａｔｕｓ  ｆｏｒ  Ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ  Ｕｓｉｎｇ  Ｇｅｎｅｒａｌｉｚｅｄ  Ｄｉｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  ａｎｄ  Ｆｉｅｌｄ  Ｆｌｏｗ  Ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ」；米国特許出願第０９／２４９，９５５号（１９９９年２月１２日に出願）、表題「Ｍｅｔｈｏｄ  ａｎｄ  Ａｐｐａｒａｔｕｓ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ  Ｆｌｕｉｄｉｃ  Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ」；米国特許出願第０９／３９５，８９０号（１９９９年９月１４日に出願）、表題「Ｍｅｔｈｏｄ  ａｎｄ  Ａｐｐａｒａｔｕｓ  ｆｏｒ  Ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ  Ｕｓｉｎｇ  Ｇｅｎｅｒａｌｉｚｅｄ  Ｄｉｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  ａｎｄ  Ｆｉｅｌｄ  Ｆｌｏｗ  Ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ」；米国仮出願第６０／２１１，７５７号（２０００年６月１４日に出願）、表題「Ｍｅｔｈｏｄ  ａｎｄ  Ａｐｐａｒａｔｕｓ  ｆｏｒ  Ｃｏｍｂｉｎｅｄ  Ｍａｇｎｅｔｏｐｈｏｒｅｔｉｃ  ａｎｄ  Ｄｉｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｉｃ  Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｎａｌｙｔｅ  Ｍｉｘｔｕｒｅｓ」；米国仮出願第６０／２１１，５１５号（２０００年６月１４日に出願）、表題「Ｄｉｅｌｅｃｔｒｉｃａｌｌｙ−Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  Ｍｉｃｒｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ」；米国仮出願第６０／２１１，５１６号（２０００年６月１４日に出願）、表題「Ａｐｐａｒａｔｕｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  Ｆｌｕｉｄ  Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ」。
【０００８】
誘電指標は、並行分子分析スキームにおける個々の分子試験を同定するための新しいアプローチを示し、この分子試験は、キャリアビーズの誘電指標を遺伝子チップに使用される空間的指標に置換する。この新しいアプローチは、異なるビーズの亜集団（各々は、異なる分子マーカーのプローブを運搬する）が、各ビーズ／プローブ型に対して特異的な誘電フィンガープリントを使用するキャリア媒体内で同定および操作されることを可能にする。これによって、要求される場合、例えば、遺伝子チップ技術によって、固定された基板上の密接に特定化されたパターンで異なる分子プローブを固定するための必要性が、排除される。プローブの混合物（各プローブは、別々に指標されたビーズ型で運搬される）は、分子マーカーの任意の所望されるパネルを試験するために、再利用可能なアッセイシステムに注入され、そしてフラッシュされ得る。
【０００９】
指標パラメータとしてのビーズ誘電特性の使用は、誘電泳動力または別の適切な操作力を介して、ビーズを操作する能力を提供するだけではなく、蛍光プローブアッセイにおいて低い光の放射と相互作用し得る、光学的なビーズ指標方法または蛍光ビーズ指標方法に変わる新しい方法を提供する。
【００１０】
本明細書中に開示される技術は、多くの学問分野の局面で構築され、そして合成される。これらの学問分野としては、以下が挙げられる：フィールドフローフラクショネーション（物理化学）、誘電泳動および磁気泳動（物理学）、ミクロ流体（機械工学および流体工学）、ミクロ製造（ｍｉｃｒｏｆａｂｒｉｃａｔｉｏｎ）（フォトリソグラフィー，ＭＥＭおよび磁気材料科学）、制御電子工学（電子工学）、抗体および核酸の結合および連結（免疫学および分子生物学）、細胞生物学（細胞培養および細胞学）、フローサイトメトリー、および腫瘍学。
【００１１】
（例示的な実施形態の説明）
本発明の開示されるシステム、方法および装置は、多くの利点（そのうちの少しが以下にある）を提供する。これらは、末梢血単核細胞（ＰＢＭＮＣ）から腫瘍細胞を分離するために使用され得る、細胞プレフィルタリングを可能にする。これらは、誘電泳動−磁気泳動フィールドフローフラクショネーション（ＤＥＰ−ＭＡＰ−ＦＦＦ）を可能にし、誘電泳動および免疫磁気細胞分離の組み合わせを可能にする。これらは、ビーズの誘電指標付け、ビーズ表面への抗体およびオリゴヌクレオチドプローブの連結を可能にし、そして２つの異なるビーズ／プローブ型の混合物を使用する２つの分子マーカーに対する同時アッセイを可能にする。これらは、インピーダンスセンシング法を使用して誘電測定による、標的とビーズの会合の定量化およびビーズ型の同定を可能にする。これらは、それらの表面レセプター濃度に従う、細胞のＤＥＰ−ＭＡＰ−ＦＦＦ分画を可能にする。これらは、単離された細胞画分を約１０９細胞／ｍｌまで濃縮するために使用され得る螺旋状電極アレイに印加される掃引周波数進行場（ｓｗｅｐｔ  ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ  ｔｒａｖｅｌｉｎｇ  ｆｉｅｌｄｓ）を使用するサンプルのＤＥＰ焦点化を可能にする。これらは、細胞の電気媒介バーストを可能にする。これらはまた、誘電指標付けを用いる平行アッセイを実行するために使用され得る異なるビーズ／プローブの組み合わせの混合物を可能にする。
【００１２】
この技術から利益を得ることができる領域は、以下が挙げられるが、これらに限定されない：血液および尿アッセイ、病原体検出、汚染モニタリング、水モニタリング、肥料分析、化学兵器および生物兵器の検出、食物病原体検出、品質管理および混合、大量並列分子生物学的プロトコル、遺伝子操作、発癌物質検出、ならびに薬学的開発および試験。
【００１３】
本発明の開示が、一部において、別々に議論され得る多くの技術の組み合わせを扱うので、本明細書中に開示される個々の技術のいくつかに関連するいくつかの理論的な基礎および考慮から議論を始めるのが有用である。実施例の節において、本開示の実施形態に従うシステムおよび装置（および関連する方法論）を形成するために、議論を、これらの技術の組み合わせに、より焦点を合わせる。
【００１４】
本開示の特定の技術は、新たなアリコートの感知ビーズが各すべてのアッセイに使用され得るように、ビーズキャリアに取り付けられる分子認識および感知要素を使用する。後にビーズを配置し、各サンプル間に「ブランク」を流し（ｒｕｎｎｉｎｇ）、そしてサイクルを洗浄することによって、較正の問題が解決され得、そしてキャリーオーバーおよび相互汚染の非存在が検証され得る。
【００１５】
ビーズ上に生物学的に活性な成分を配置することはまた、単一の流体デバイスが、異なるビーズ／プローブの組み合わせを使用することによって、幅広い範囲のサンプル調製および分子分析の問題に適用され得ることを意味する。最後に、生物学的な成分が、１つの実施形態のデバイス内の固定された表面に取り付けられる必要がないので、これらの表面は、例えば、ＰＴＦＥコーティングされて、生体分子接着およびキャリーオーバーの問題を減少し得る。従って、単一のデバイスが複数の適用を有し得ることによって、ビーズの使用は、この技術の潜在的な適用可能性を高める。
【００１６】
分子増幅技術が広範な使用を享受しているが、ＰＣＲのような方法は、これらの方法をわずかにしか定量的にし得ない、制御し難い因子に対する感受性を含む欠点を有する。さらに、分子増幅は、検出されるべき高濃度の分子を反応表面に浸す。結果として生じるキャリーオーバーの問題は、非常に重大なので、分子増幅実験における全ての湿潤した表面を、典型的には使い捨て可能にする。これらの理由のために、本開示は、再使用可能なデバイスを設計する際の直接的な分子増幅工程を避け、そして直接ビーズ上に捕捉される少数の分子を検出することに焦点を合わせる。それにもかかわらず、本開示の利益を有するので、当業者は、本明細書に記載されるビーズ−ビーズ指標付け技術がまた、必要とされる場合に、分子増幅プロトコルに適合可能であることを認識する。
【００１７】
任意のインサイチュハイブリダイゼーションアッセイ（ＤＮＡ、ＲＮＡおよびタンパク質を検出するための方法を含む）が、キャリアビーズの表面上で操作するように適合され得る。本開示において、ハイブリダイゼーションおよび免疫蛍光分子技術の確立された本体は、ビーズキャリアを指標付けするための新たな方法と共に使用され得、その結果、ビーズ型の複雑な混合物中の個々のビーズ型が、同定可能であり、選択的な操作、および所望であれば単離に使用され得る。誘電的に操作されたビーズを使用するアッセイは、最小量のサンプルを必要とする。例えば、約５μｍの直径のビーズは、約７８μｍ２の比較的大きな表面積を有するが、わずか６５ｆＬの容積を占め、これは、代表的な腫瘍細胞の約１／１５の容積である。１００個の腫瘍細胞および１０個の異なるビーズ型から構成される２５０個のビーズは、ＤＥＰ媒介集束を使用して、５０μｍの直径の球形領域にパッケージされ得る。これは、約１０９細胞／ｍｌが、分子プローブを保有する２×１０９ビーズ／ｍｌと接触を維持することと等価である。磁気ビーズ表面上のｃＤＮＡプローブへの標的ｍＲＮＡのハイブリダイゼーションの時間は、濃縮細胞溶解物においてほんの数分であることが示されている；従って、本開示のビーズ−ビーズアプローチは、一体化システムにおける分子マーカーの迅速なアッセイを可能にし得る。
【００１８】
本開示のビーズ−ビーズ誘電指標付け技術は、１０，０００以上の遺伝子の発現の大量並列分析について設計された、大遺伝子−チップアレイ法を置き換えることを意味しない。これらの方法は、最初に、特定の細胞事象の重要なマーカーの同定を可能にする。代わりに、本開示は、減少したパネルの１０ほどの重要な分子マーカーが、特定のサブセットの疑われる疾患状態をスクリーニングするための利用可能なマーカーのライブラリーから選択され得る技術を表す。サンプル調製および分子分析を単一の自動化目的に組み合わせることによって、このシステムは、遺伝子チップから誘導される分子疫学的データの活用を可能にし、そしてそのデータを幅広い集団にアクセス可能にする。
【００１９】
本開示は、混合された細胞懸濁物からの疑われる細胞の単離、および誘電的に指標付けされたビーズの混合物の操作を、すべて一体化デバイスにおいて取り組む。これらの工程を達成することは、最終的に、それを懸濁する溶液に関して物体を動かす方法（誘電泳動または別の適切な操作力が理想的に適合する問題）に依存する。
【００２０】
誘電泳動（ＤＥＰ）は、空間的に不均一な電場によって引き起こされる物質または物体の移動である。周知の電気泳動の現象とは完全に異なり、物体がその周囲に対して、電気的に分極される異なる傾向を有する場合、ＤＥＰのみが生じる。その物体がその周囲よりも分極可能である場合、それは、より高磁場の領域に引っ張られる（「ポジティブＤＥＰ」）；逆に、それがあまり分極されない場合、それは弱い磁場領域に向かって押される（「ネガティブＤＥＰ」）。ポジティブＤＥＰは、荷電したプラスチックの櫛への荷電していない紙切れの引き付けとして大部分の人々に公知である。磁気泳動は、誘電泳動の磁気的類似物（空間的に不均一な磁場における磁気的に分極可能な粒子の収集）である。この力は、磁極の縁部におけるフリンジ場（ｆｒｉｎｇｉｎｇ  ｆｉｅｌｄ）でのよく知られた鉄屑の収集の原因である。静電場に制限されることから離れて、ＤＥＰはまた、光学的周波数においてさえ、交流（ＡＣ）場で生じる。レーザーピンセットを使用して、レーザービームの高磁場勾配集束領域においてその懸濁媒体よりも高い屈折率（大きな電気分極性）を有する細胞を捕捉する場合が、その一例である。（この極度の場合において、第２の光圧の項もまた存在する）。より低い周波数において、ＤＥＰは、それらの低周波数スペクトル特性に依存する細胞に力を課すために使用され得る。これらのスペクトル特性における違いは、細胞混合物における異なる細胞型に、異なるかまたはさらに反対の力を課すために活用され得る。本開示の技術のために、比較的低い周波数（約１０ｋＨｚ〜約１０ＭＨｚ）が使用され得、ここで、細胞膜およびビーズコーティング特性は、粒子の誘電特性を支配する。
【００２１】
ＤＥＰの本質的な特徴は、懸濁媒体に対する物体の移動である。例えば、物体は、ネガティブＤＥＰによって集束点に濃縮し得、そして／またはポジティブＤＥＰによって捕捉され得る。さらに、異なる粒子型が、適切な場の条件下で、３次元で互いに離れるように移動され得る。これらの基本的な操作は、細胞およびビーズを分類し、単離し、そして捕捉するため、およびそれらが懸濁される試薬を変化させるために使用され得る。
【００２２】
正常細胞および癌細胞における広範なＤＥＰ操作が本開示に特に関連し、これらの細胞において、異なる細胞型が、異なる誘電泳動フィンガープリント（ｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔ）を有し、それらを特徴付け、操作し、分画し、単離し、捕捉しそして選択的にバーストするために（本明細書中に開示される実施形態に従って）使用され得ることを本発明者および他者が示した。
【００２３】
要約すると、ＤＥＰは、以下のような力である：
１．キャリア媒体と異なる誘電特性を有する粒子が、空間的に不均一な電場のどこかで、ＤＣから光学的周波数に供される場合、生じる；
２．電気泳動とは全く対照的に、粒子上の任意の正味の電荷を完全に無視する（これは、核酸のような高度に荷電した生体分子でアッセイを行う場合、重要な考慮である）；
３．細胞を捕捉し、集束し、分画し、そして単離するために使用され得る；
４．各細胞型の誘電フィンガープリントに特異的に依存する。原則として、ＤＥＰは、細胞間の任意のスペクトル的違いを活用するために使用され得るが、本開示は、原形質膜の形態学的特徴によって支配される低周波数の差に焦点を集める；
５．細胞単離実験について代表的に１０ｋＨｚと１ＭＨｚとの間の周波数を有するＡＣ電場によって作り出され得る。これらの周波数において電気分解が生じず、制御された細胞バーストを達成するために、高閾値の大きさを越えて故意に電場が上昇されない限り、細胞は損傷を受けない；
６．当該分野で公知の方法に従って、製造するのが安価である微小電極のアレイによって作り出され得る；
７．たとえ、電極がＰＴＦＥまたは他の絶縁体の薄いコーティングを有するとしても、ＡＣ周波数で作り出され得る；
８．電極に印加される信号の周波数および／または電圧によって制御される。エレクトロニクスは、直接的であり、ポケット計算機の大きさの箱に組み込まれ得、安価であり、そして当該分野においてすべて公知であるように別々に保持され得、その結果、ＤＥＰチャンバが使い捨て可能であり得る一方で、エレクトロニクスが保持される；
９．中間および微小流体スケールの適用に理想的である。なぜなら、電極が、流体チャネルおよびチャンバの床および／または壁を整列させるからである；
１０．細胞、ビーズ、または他の標的が、それらのキャリア媒体内で選択的に操作され得るか、または適所に保持されながら、新しいキャリア媒体がそれらを洗浄し得る。
【００２４】
一実施形態において、疑わしい細胞亜集団のサンプル調製物の高度な識別は、高層状（ｈｙｐｅｒｌａｙｅｒ）フィールドフローフラクショネーションと呼ばれる分離技術によって達成される。基礎となる原理は、簡単である：平坦なチャネルを通って流れる流体の速度は、ゼロ（床部および天井部における）から最大（中心部における）まで増加する。異なる細胞型がチャネル床部の上の異なる特徴的な高さに位置決めされる場合、これらの細胞型は、流体によって異なる速度で運ばれ、そしてこの細胞混合物がチャネルを通って移動する場合に分離される。次いで、これらの異なる型は、これらがチャネルの遠位端から出る場合に単離されそして捕捉され得る。分離は、例えば、非特異的結合を減少させる、キャリア流体以外の任意の材料と細胞との相互作用、キャリーオーバー、およびクロマトグラフィー法に固有の混入効果に依存しない。
【００２５】
分離チャネル内に異なる細胞型を特徴的に位置決めするために、細胞にかかる誘電泳動力と重力との釣り合いをとり得る。さらに、磁気泳動力は、所望ならば細胞を位置決めするために同様にしようされ得る。このように、免疫磁気標識は、異なる細胞型を識別するためのさらなる特徴として使用され得る。ＤＥＰ−ＭＡＰ−ＦＦＦ法は同様に、独自の固有の誘電特性を有する細胞、および分子マーカーキャリアとして作用し得るビーズに適用され得る。細胞亜集団が、混合物中の他の細胞型から識別される固有の誘電的な差異を有する場合、磁気標識を使用する必要はなく、そしてこの方法は、ＤＥＰ−ＦＦＦスキームに属し得る。
【００２６】
四重極磁場構成に供された層流プロフィールにおける免疫磁気的に標識された細胞の連続ＭＡＰ選別が示されている。表面レセプター密度に従う細胞の選別が達成されたが、この方法は、ＭＡＰ力が不釣り合いであるという欠点を有する。結果として、分離は、流速依存性である。さらに、重たく標識された細胞は、流動チャンバの側面に衝突して、捕捉され得るかまたは他の細胞型と混ざるにすぎない。しかし、本開示のＤＥＰ−ＭＡＰ−ＦＦＦ設計は、対立するＤＥＰ力とＭＡＰ力の釣り合いをとり、細胞を流動プロフィールにおける平衡位置に配置する。このように、固有に不均質な腫瘍細胞の亜集団を選別する場合にさらに考慮する可能性がある、不釣り合いな力の落とし穴（ｐｉｔｆａｌｌ）が回避され得る。
【００２７】
細胞選別に加えて、ＤＥＰは、多数の細胞が処理される必要がある場合に、細胞を予め濾過するために、細胞がＤＥＰ−ＭＡＰ−ＦＦＦ分離器から出た後に、その細胞を捕捉するために、細胞単離体およびビーズを濃縮するために、細胞を溶解するために、および分子分析プロトコルにおいて試薬が変化している間、ビーズを適所に保持するために、使用され得る。このように、誘電泳動は、サンプルプレフィルター、ＤＥＰ−ＭＡＰ−ＦＦＦ分離器、細胞画分単離および溶解ステージ、ならびに分子分析ステージを一体化する自動化デバイスを具現化する能力を提供する。
【００２８】
（サンプルの予備濃縮）
一実施形態において、ＤＥＰ−ＭＡＰ−ＦＦＦシステムは、高分解能分離を行う場合、最大２×１０５の細胞を含む約２０μＬの細胞懸濁液のサンプルを採り得る。分子分析ステージにおける２０の癌細胞の検出下限は、１０００の正常細胞あたり１以上の癌細胞の発生率を必要とする。この識別のレベルは、推定の腫瘍組織の生検サンプルに適切であるが、骨髄収集物中の転移性細胞またはセンチネルリンパ節中の微小転移巣の、残りの疾患の検出のような他の用途において、その目的は、１０６以上の正常有核細胞あたり１の腫瘍細胞を検出することである。このような用途において、２０の腫瘍細胞に分析を提供するために、ＤＥＰ−ＭＡＰ−ＦＦＦ分離器ステージの容量をはるかに超える数である、２×１０７より多くの正常細胞を選別する必要がある。なぜなら、高度な識別を達成するために、このステージは、細胞−細胞相互作用が無視できる細胞濃度で作動する必要があるからである。
【００２９】
従って、多数の細胞を選別するために、疑わしい癌細胞のＤＥＰ予備濾過工程を実行するステージが必要であり得る。予備濾過は疑わしい細胞の純粋な集団を提供しないが、予備濾過は、デバイスのＤＥＰ−ＭＡＰ−ＦＦＦステージに適切なサンプルを提供する（これは一実施形態において、本開示の実施例の章で説明および例示される）。一実施形態において、プレフィルターは、約２０×１０６の細胞を処理し得、そして疑わしい細胞亜集団中に濃縮された約２×１０５の細胞を抽出し得る。次いで、これらの２×１０５の細胞は、高識別ＤＥＰ−ＭＡＰ−ＦＦＦ分離器ステージに移動され得る。この一体型デバイスの最後のステージにおける分子分析の下限が、２０の癌細胞である場合、この一体型デバイスは、１０６の出発有核細胞あたり１の癌細胞の検出限界を達成し得る。
【００３０】
（誘電泳動）
かけられた電場
【００３１】
【数１】
2004532968.tif 000003
に起因して、粒子に作用するＤＥＰ力は、以下のように記載され得ることが示されている：
【００３２】
【数２】
2004532968.tif 000004
ここで、
【００３３】
【数３】
2004532968.tif 000005
は、Ｃｌａｕｓｉｕｓ−Ｍｏｓｓｏｔｔｉ係数であり、この係数は、それぞれ、粒子およびその懸濁媒体の周波数依存性誘電特性、ε＊ｐ（ω）およびε＊ｍ（ω）を表す。ωは、角周波数であり、そしてＥ（ｒｍｓ）は、印可された電場のｒｍｓ値である。Ｅｉ０およびφｉ（ｉ＝ｘ；ｙ；ｚ）は、それぞれ、主軸方向の場成分の大きさおよび位相である。式（１）は、現在の議論に十分であり、そしてＤＥＰ運動に寄与する２つの独立した力が存在することを示す：
（ｉ）場の不均質性成分：左側の項は、粒子における誘導された双極子モーメントの実数（同相、すなわち容量性（ｃａｐａｃｉｔａｔｉｖｅ））成分、Ｒｅ（ｆＣＭ）、および場の大きさの空間不均一性、
【００３４】
【数４】
2004532968.tif 000006
に依存する。この力は、Ｒｅ（ｆＣＭ）が正か負かに依存して、粒子を強い場領域または弱い場領域に押し出す。これは、細胞を電極の端部に引きつけるかまたはこれから遠ざけ得るＤＥＰ力である。電極アレイが単一または二重の相シグナルによって電圧を与えられる場合に作用し得るのは、ＤＥＰ力成分のみである。
【００３５】
（ｉｉ）進行場成分：右側の項は、誘導された双極子モーメントの虚（違相、すなわち損失性（ｌｏｓｓｙ））成分、Ｉｍ（ｆＣＭ）、および場の相の空間不均一性
【００３６】
【数５】
2004532968.tif 000007
に依存する。この力は、Ｉｍ（ｆＣＭ）のサインに依存して、この場が移動している方向と同じ方向または反対の方向に粒子を押す。これにより細胞は、電極アレイ上を移動する電場に沿って掃引され得る。この力を生じるために、少なくとも３つの励起相が提供されなければならない。
【００３７】
これらの力成分は独立して作用するが、適切な電極アレイ設計によって、この力成分は、電極アレイの上で細胞を移動させつつ、この電極アレイの上に細胞を浮揚させるように同時に付与され得る。
【００３８】
（細胞の誘電特性）
低い周波数において、細胞は負のＤＥＰ（電極の頂部からの反発）を示すが、それらのいわゆるＤＥＰ交差周波数より上の高い周波数において、これらは正のＤＥＰ（電極の頂部に向かう引力）を示す。異なる細胞型は、異なる交差周波数を有する。約１０４Ｈｚと３×１０４Ｈｚとの間の周波数において、乳癌細胞は、正のＤＥＰ捕捉を受け、一方、血液細胞は、負ＤＥＰ反発を受ける。癌細胞型と血液細胞型との間のこれらの誘電的な差異は、細胞の同定、識別および分離のための基礎として使用され得る。細胞サイズ、細胞組成、特に細胞膜の形態学の全ては、細胞間の誘電的差違に寄与する；すなわち、異なる細胞は、異なる誘電的表現型を有する。
【００３９】
本発明者らは、彼らが試験した全ての形質転換された細胞型の誘電的表現型は、より正常な細胞起源の表現型とは有意に異なり、すなわち、誘導された分化後の同じ細胞型とは有意に異なることを見出した。このことは、より多くの細胞表面形態学的複雑性および形質転換された細胞型における対応してより高い膜容量から生じる。さらに、腫瘍細胞は、通常、血液細胞よりはるかに大きい。これらの組み合わせた差異の効果は、形質転換細胞の誘電特性が、正常な血液細胞とは非常に顕著に異なることである。特に本開示に関連して、本発明者らは、５のヒト乳癌細胞株を含む９のヒト癌、乳癌を有する患者から採取した腹水サンプル、および２の結腸癌細胞株のＤＥＰ交差周波数を測定した。１００ｍＳ／ｍの伝導率の溶液中に懸濁したこれらの癌細胞型のＤＥＰ交差周波数を、正常な末梢血単核細胞型のデータと比較して、図１に示す。これらの腫瘍細胞の全ては、はるかに小さい交差周波数を示す。これらの差異を、ＰＢＭＮＣおよびリンパ細胞分散物から疑わしい細胞の集団を単離するために利用し得る。
【００４０】
（細胞のＤＥＰ捕捉による予備濾過）
細胞分離のための誘電的な差異の利用は、いくつかの様式で達成され得る。最も簡単であるが最も新しい選別方法は、正のＤＥＰによって異なる細胞型を引きつけそして捕捉しつつ、負のＤＥＰにより１つ以上の電極から１つの細胞型を離す周波数を適用することである。図２Ａは、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１ヒト乳癌細胞およびヒト末梢血の混合物を示す。より大きな乳癌細胞（直径約１２μｍ）は、容易に同定可能である。図２Ｂにおいて、２．５×１０４ＨｚのＡＣシグナルを隣接する金電極（暗いパターン）の間に適用し、そして流体流動を左から右に開始した。ヒト乳癌細胞は、電極の頂部に引きつけられ、そして捕捉される（図２Ｂおよび２Ｃ）。一方、血液細胞は、これらの電極から離され、そして流体によって運ばれる。これらは、細胞混合物が負荷されていない、癌細胞を含まない下流に現れる（図２Ｄ）。このＤＥＰ捕捉アプローチは、出発混合物中の標的細胞および他の細胞型の誘電特性における大きな差異がある場合に、十分に機能する。例えば、本発明者らは、予備実験において試験した最も希薄な濃度である、１腫瘍細胞／３×１０５ＰＢＭＮＣにおいてでさえ、ＰＢＭＮＣから１００％のヒト乳癌細胞を回収することが可能であることを実証した。
【００４１】
血液細胞を流し出した後、腫瘍細胞を、周波数を１０ｋＨｚより下に下げ、これらの腫瘍細胞を負のＤＥＰによって電極から離し、そしてチャンバから解放させることによって、回収し得る。本発明者らは、いくつかの正常細胞は、捕捉段階の間に腫瘍細胞と会合し得、その結果、回収効率は非常に良好になり得るが、純度はそれほど良くなり得ないことを見出した。より高い付与周波数（２００ｋＨｚ以上）において、全ての生細胞は、型にかかわらず、正のＤＥＰによって捕捉されるようになることが見出されたことに注目すべきである。従って、ＤＥＰは、必要ならば、細胞型と関係なく、試薬のストリーム内に細胞を固定するために、非常に一般的に使用され得る。
【００４２】
稀な癌細胞が関係する適用において、約６０ｃｍ２の表面積を有するプレフィルターシステムが、使用され得、そして有核細胞の懸濁液が、この表面積上を約３．６×１０６細胞／分の速度で通過され得る。これは、腫瘍細胞の存在について、２０×１０６の有核細胞をスクリーニングするために、リンパ節および全血由来の細胞の懸濁液を用いて、約６分間操作され得る。次いで、０．１％より大きい純度で、疑わしい細胞を、一体化デバイスにおけるＤＥＰ−ＭＡＰ−ＦＦＦによる高い識別分離のために通過され得、そして引く続く単離の後、この一体化デバイスにおける下流分子分析のために通過され得る（本開示の実施例の節により詳細に議論される）。
【００４３】
（ＤＥＰ−ＦＦＦ分離）
生検サンプル由来の腫瘍細胞またはＤＥＰトラッピングによって予め濾過されたリンパ節または血球サンプル由来の腫瘍細胞の高い識別分離を可能にするために、フラクショネーション方法（ＤＥＰ−ＭＡＰ−ＦＦＦと呼ばれる）が、使用され得る。このような方法はまた、必要とされる場合、免疫磁気特性を使用し得る。標的細胞をトラップする代わりに、ＤＥＰ−ＦＦＦは、フリンジ場を使用して電極面上に細胞を浮遊させるために、キャストレイテッドエッジを用いることなく、平行電極を使用する。電界の強度および不均一性は、電極面上の高さが増加するにつれて減少し、そして細胞に対するＤＥＰ力は、高さと共に指数関数的に減少する。細胞が、負のＤＥＰを経験する周波数が電極アレイに印加される場合、細胞は、反発的なＤＥＰ力が沈降力と釣り合う高さに浮遊する。密度および／または誘電特性における差を有する細胞は、従って、図３に示されるような特徴的な高さに浮遊される。この平衡高さは、平行電極形状において、以下：
【００４４】
【数６】
2004532968.tif 000008
によって与えられ、ここで、Ｕは電極アレイに印加される電気電位であり、Ａは形状項であり、ｐは、電極分極によって遮蔽されない印加電場の割合であり（５０ｋＨｚより大きい周波数でｐ〜１）、そして（ρｃ−ρｍ）ｇは、沈降力である。
【００４５】
細胞分画についてのこの平衡浮遊効果を利用するために、流体流動が、チャネル内で開始される。流体は、放物型プロフィールでチャネルを、通過して流れる（チャンバ頂部と底部壁において最も遅く、そして中間部において最も速い（１つの実施形態に従って約半分の高さ））。高さｈｅｑでの速度は、以下：
【００４６】
【数７】
2004532968.tif 000009
によって与えられ、ここで、Ｈはチャンバの高さであり、そして＜ν＞は、平均流体速度である。次いで、この流体は、それらの浮遊高さに対応する速度で細胞を運ぶ。長いチャンバの一方の末端で開始する混合細胞型は、従って、それらの誘電特性および密度特性に従って分離される。
【００４７】
分離のための流体力学的流動プロフィールを利用する技術のファミリーは、フィールド−フローフラクショネーション（ＦＦＦ）と呼ばれる。従って、本発明者らは、この方法をＤＥＰ−ＦＦＦと呼ぶ。このＤＥＰ−ＦＦＦの識別能は、細胞誘電泳動力がゼロに近づく周波数範囲（すなわち、図１に示されるクロスオーバー周波数付近）で極端に高い。低い識別能は、より低い周波数を使用することによってまたは中程度の周波数を使用することによって電気的に選択され得る。
【００４８】
本発明者らは、約４５ｃｍ×２ｃｍから顕微鏡スライドのサイズの範囲の幾つかのＤＥＰ−ＦＦＦ分離器を作製した（微細加工に関する以下の節を参考のこと）。本開示の利点において、当業者は、他のサイズが同様に使用され得ることを認識する。ＤＥＰ−ＦＦＦ分離は、通常、完了するのに４〜１５分かかるが、しかしこの時間は、デバイスのサイズおよび他のパラメータ（例えば、サンプルサイズ）に依存して有意に変化し得る。異なる実験パラメータ下での、異なる細胞型に対する異なる分離時間については、図４を参照のこと。
【００４９】
１つの実施形態において、ＤＥＰ−ＦＦＦの改変形態が使用され得、ここで、さらなる垂直方向の力成分が加えられ、この力成分は、細胞の免疫磁気標識に依存する。このことは、いくつかの腫瘍細胞型が、ＤＥＰ−ＦＦＦのみによって正常な細胞からのそれらの分離を可能にする、図１に示されるような固有の誘電特性を有さないかもしれないという潜在的な問題を解決し得る。本発明者らは、細胞特有の特性の利用が、可能である場合、標識工程を必要とすることよりも望ましくあり得ると考える。従って、本発明者は、ＤＥＰ−ＭＡＰ−ＦＦＦ分離器を設計し、その結果、免疫磁気標識化の利用が可能となるが、本質的ではなく、任意である。免疫磁気標識化の非存在において、このデバイスは、誘電特性のみによって細胞を識別し得るＤＥＰ−ＦＦＦ分離器として機能し得る。
【００５０】
（磁気泳動（ＭＡＰ））
不均一な磁場に置かれた体積νおよび透磁率μｐの粒子は、ＭＡＰ力を受け、このＭＡＰ力は、式（１）に与えられるＤＥＰ力の磁気アナログである：
【００５１】
【数８】
2004532968.tif 000010
ここで、μｓおよびμｐは、各々、懸濁媒体および粒子の透磁率であり、Ｒは粒子半径であり、そしてｋｃｍ（μ＊ｓ，μ＊ｐ，ωＨ）は、懸濁媒体に対する粒子の磁気分極率を記載する磁気クラウジウス−モソッティ（Ｍａｇｎｅｔｉｃ  Ｃｌａｕｓｉｕｓ−Ｍｏｓｓｏｔｔｉ）因子である。ＭＡＰ細胞選別のために代表的に使用される静的な場において、ωＨ（適用される磁場の周波数）は、０の値を有し、そしてμｓおよびμｐは、静的透磁率パラメータになる。さらに、免疫磁気標識化実験における水性懸濁液の透磁率は、自由空間の透磁率とほぼ同じであり得、そして標識細胞の正味の分極率は、それに結合したｎ個の同じ標識の組合せ効果から生じると仮定され得る。最後に、固定された形状について、磁場勾配は、形状項ＧＭＡＰ×印加された磁場強度Ｂｏとして書かれ得る。従って、生物学的標識化実験において、本発明者らは、ＭＡＰ力の式を、以下：
【００５２】
【数９】
2004532968.tif 000011
に簡単化し得、ここで、φは、所定の磁気標識型に対する定数である。これは、ＭＡＣＳにおける細胞の磁気的捕捉を決定する基本的な式である。しかし、本開示の目的は、細胞を磁気的に捕獲することではない。ＧＭＡＰに具体化される磁場およびその不均一な特徴を作り出す磁気要素の適切な設計によって、分離チャンバにわたって本質的に一定であり、そしてチャンバフロアに向かうＭＡＰ力が、提供され得る。
【００５３】
本発明者らは、平行電極アレイ上のＤＥＰ力が、以下：
【００５４】
【数１０】
2004532968.tif 000012
のように、高さｈとともに指数関数的に減少することを先に指摘した。電場条件が、ＤＥＲ−ＦＦＦにおける場合と同様に、反発的なＤＥＰを提供するように選択される場合、ＭＡＰ力は、下向きのＭＡＰ力と沈降力との和が浮遊ＤＥＰ力のよって釣り合うまで、電極平面に向かって免疫磁気的に標識された細胞を引く。電極形状項ＧＤＥＰおよび電極アレイに印加された印加ＲＭＳ電圧Ｖ０の観点から電場勾配を書くと、粒子平衡高さを決定する力の釣り合いが、以下の７式によって与えられる：
【００５５】
【数１１】
2004532968.tif 000013
ここで、ｍｌａｂｅｌは、各免疫磁気標識の質量である。磁気標識化が無視できる場合（ｎ→０）、この式は、単純なＤＥＰ−ＦＦＦについて以前に与えられた式に変形される。一方で、磁気標識化が下向きの力を支配する場合、ｈの減少は、細胞に結合した磁気標識の数ｎの対数にほぼ比例する。この状況において、「支配する」とは、小さい細胞の沈降力以上にＭＡＰ力を有意に提供することを意味するので、より小さな磁気力が、ＭＡＣＳにおいて使用されたような流動流に対する磁気的捕捉よりも、ＤＥＰ−ＭＡＰ−ＦＦＦにおいて必要とされることが理解される。
【００５６】
Ｖ０は、いつも、細胞が全ての様式でチャンバフロアに引かれないことを確実にするように選択され得ることをまた注意のこと。１つの実施形態に従って、細胞は、流体流動プロフィールにおけるそれらの特徴的な高さｈに従って、ＦＦＦスキームで分離されるので、免疫磁気標的化の程度に従って、それらを分離し得、そして蛍光細胞分析分離（ＦＡＣＳ）において知られているように、対数関係が、異なるクラスの細胞を分離する場合に良好なダイナミックレンジを確実にするために非常に好都合であり得る。従って、必要とされる場合、ＭＡＰは、例えば、上皮表面マーカーまたはＥＧＦのようなレセプターによって、疑いのある腫瘍細胞亜集団を選別するための識別の理想的なさらなるレベルを提供する。
【００５７】
（ＤＥＰ媒介細胞フォーカシング）
細胞は、ＤＥＰ（これは、細胞を引きつけるかまたは電極縁からそれらを離す）とｔｗＤＥＰ（これは、電極の面に平行にそれらを輸送する）によって同時に操作され得る。空間的な電極配置は、これらの効果を同時に利用して、細胞を濃縮し、そして電気的に刺激された細胞溶解を達成するために使用され得る。１つの実施形態において、この螺旋状アレイは、０°、９０°、１８０°および２７０°の位相以外は同じ周波数の信号によって活性化されて、この螺旋の中心に向かって掃引する同心円状の移動場を形成する４つの平行電極要素を含む。位相０°、２７０°、１８０°および９０°による励起は、この螺旋の周辺に向かって外側に掃引する場を生じる。０°、１８０°、０°および１８０°の位相の信号は、ＤＥＰ捕獲、浮遊、または非常に高い場強度において、細胞バーストのために使用され得る定常場パターンを生成する。
【００５８】
細胞捕獲およびフォーカシングの例が、図５に示され、ここで、ＨＬ−６０ヒト前骨髄球性（ｐｒｏｍｙｅｌｙｔｉｃ）白血病細胞が、散乱状態から螺旋の中心に約１５秒でフォーカシングされる。１つの実施形態において、電極アレイの螺旋状アームは、それらが、螺旋の中心でほとんど接触し、達成されるべき細胞の濃度をかなり増加させるまで延ばされ得る。本発明者らは、マウス赤白血病細胞株およびヒト乳癌細胞株を血流から捕獲およびフォーカシングするためにこの技術を適用し、そして血球から乳房細胞および白血病細胞を分離した。また、本発明者らは、この技術を用いて、それらの未感染の対応物からマラリア因子Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍによって寄生された赤血球を首尾良く分離した。
【００５９】
１つの実施形態において、５個の螺旋状アレイセグメントが、一体化デバイスのＤＥＰ−ＭＡＰ−ＦＦＦ分離器ステージから異なる時間に出現するため、これは、細胞亜集団を捕獲するために使用され得る。それらが分離器から出現し、そしてそれらが捕獲される前に、細胞の流れにアッセイビーズを注入することによって、次いで螺旋状電極に掃引場を印加することによって、細胞およびビーズは、同時に中心にフォーカシングされて、非常に濃縮された混合物を形成し得る。
【００６０】
（（細胞の電気媒介溶解（ｅｌｅｃｔｒｏ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｃｅｌｌｓ））
一旦標的細胞集団が首尾良く単離されると、引く続く分子分析は、通常、細胞が乱されて細胞内のタンパク質、ＲＮＡ、およびＤＮＡを放出することを必要とする。このことに対するアプローチは、界面活性剤または他の溶解剤への曝露を含む。これらの方法は、本明細書中に記載されるシステムおよびデバイスにおいて使用されるが、細胞は大きなＡＣ電場を使用して電気的に溶解され得る。ＤＥＰ操作は、代表的に、１０４Ｖ／ｍ未満の局所電場を含み、そして本発明者らは、細胞が、生存性または活性を失うことなく、このような場への長期（４０分以上）の曝露を持続し得ることを示した。電極形状に依存して、１Ｖ  ＲＭＳのオーダーの電圧が、これを達成するために使用される。
【００６１】
しかし、より高いＡＣ電圧が印加されて、細胞をバーストさせ得る場を発生させ得る。細胞型に依存して、約５×１０４Ｖ／ｍにおいて、一時的な膜エレクトロ透過化が起こり、そしてこれを使用して、試薬を細胞に充填し得る。約２×１０５Ｖ／ｍより高圧において、細胞膜の瞬時的な消滅が起こる。本発明者らは、異なる細胞型が、消滅に対する特徴的に異なる感受性を有することを見出した。図６Ａは、ヒトＴリンパ球の消滅に関する場の強度対周波数依存性を示し、そして図６Ｂは、ヒトＭＤＡ−ＭＢ−４３５乳癌細胞についての結果を示す。明らかに、これらの細胞は特徴的な、そして区別可能な周波数および場の範囲において、バーストする。有用な特徴は、単離電極に捕捉された細胞を可逆的に透過化するか完全に全てを消滅させるかを電気的に選択する能力、あるいは単離電極に捕捉された細胞の亜集団を選択する能力である。
【００６２】
１つの実施形態において、電気によって媒介される細胞溶解は、螺旋状単離セグメントの中心において利用されて、分子種を、これらの細胞と混合され、そして濃縮されたアッセイビーズのすぐ隣接した位置へと、標的細胞から放出し得る。
【００６３】
（微細加工）
例えば本開示の実施形態による分離において使用するための、電極アレイは、当該分野において公知のように、マイクロリソグラフィーによって作製され得る。本発明者らは、約２００μｍ〜４５ｃｍの広範囲のサイズにわたって、１０μＬ〜４ｍＬの容量のＤＥＰチャンバおよび分離器を構築した。一体化される電子部品およびセンサの容量が、他の加工方法では提供され得ないものを要求する場合には、ケイ素およびガラスならびに微小機械加工方法の使用が使用され得る。他の場合においては、平坦なガラスおよび射出成形されたポリマーの組み合わせが使用されて、当該分野において公知の方法によって、本明細書中に開示されるデバイスが加工され得る。小さなデバイスが、ケイ素およびガラスの微細機械加工によって作製され得、そして全ての流体チャネルが透明なポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）頂部に成形された、平坦なガラス基板上の単一層のリソグラフィー（電極用）によって再生され得る。ＰＤＭＳを成形することは、ガラスおよびケイ素を微小機械加工するよりずっと費用効果的なアプローチであると示唆されてきた；このことは、鋳型内に鋳造または射出され得る透明な液体に起因して起こる。本開示のデバイスは、少量（約２０μＬ）のサンプルのみでなく、より大きな容量（約１０ｍＬ以上）をもまた取り扱うよう設計され得る。このことを達成するために、微小流体の前端は、明らかに不適切である。なぜならこれは、多量のサンプルを合理的な割合で処理し得ないからである。１つの実施形態において、サンプルは、このサンプルがこのデバイスを通過するにつれて濃縮され得、そして同時に、その容量を減少させ得る。この様式で、微小流体ステージは、その少量のサンプルの要求および迅速な処理能力の利点を伴って、分子分析を完了するために、顕微鏡の視野（ｗｏｒｌｄ）と継目なしに界面を接し得る。
【００６４】
（磁場の発生）
ＤＥＰ−ＦＦＦに関連して使用されるＭＡＰ力は、かなり独特の特性を有する磁石を必要とする。すなわち、磁場強度とその不均一性との積が、分離器の全長にわたって実際上一定である必要がある。このことを達成するために、磁極を対向させる配向で平行な配置に置かれた、ＳｎＣｏ材料またはＮｄＦｅＢ材料のいくつかの平坦な磁石を使用し得る。図７は、この配置の２つの磁石を示す。磁力線は、対向する磁極間の空間において圧迫を受け、そして比較的均一な分布で出現する。この場における制御された不均一性は、焼結された鉄球で作製された複合材料を場の経路（ｆｉｅｌｄ  ｐａｔｈ）に使用することによって、生じ得る。
【００６５】
場の強度および均一性（焼結した鉄元素の非存在下で）を、２５ｍｍ×２５ｍｍの磁極面および空気中で０．２２Ｔの「自由な場」を有する、６ｍｍ厚の２つのＳｎＣｏ磁石に関して試験した。対向する磁極の配置の場を、指向性Ｈａｌｌプローブを用いて測定した。０．４Ｔ過剰の場の強度が、４ｍｍ以下の磁極間隔に対して測定され（図７）、そして場の水平成分は５％未満であった。小さなＭＡＣＳ分離器において使用される磁場の、本発明者らの測定に基づくと、これらの強度は、ＤＥＰ−ＭＡＰ−ＦＦＦにおいて免疫磁気的に標識された細胞の磁気的位置決めを達成するに十分である。
【００６６】
以下の実施例は、本発明の具体的な実施形態を限定するためではなく、実証するために含まれる。以下の実施例に開示される技術は、本発明の実施において良好に機能することが本発明者らにより発見された技術を代表し、従って本発明の実施のための具体的な様式を構成するとみなされ得ることが、当業者によって理解されるべきである。しかし、当業者は、本開示を考慮して、開示される具体的な実施例において多くの変化がなされ得、そして依然として、本発明の意図および範囲から逸脱することなく、同様かまたは類似の結果を得ることを理解するべきである。
【００６７】
（実施例１−設計における考察）
１つの実施形態において、本開示は、臨床的に関連するサンプルから細胞を選別し得、単離し得、そしてバーストし得、そしてこれらの細胞に対する分子マーカーアッセイを、迅速かつ自動的に実施し得る、一体型の流体デバイスに関する。図８は、完成した一体型デバイスの機能的ブロック図を示し、そして図９は、このシステムに対する設計を示す。
【００６８】
（プレフィルター）
図９は、このデバイスのプレフィルターおよびＤＥＰ−ＭＡＰ−ＦＦＦ細胞分画ステージの設計を示す。このプレフィルターは、本質的に、ＤＥＰ細胞捕捉デバイスの拡大版である。このデバイスの目的は、希少な細胞の検出の適用において、選別される必要のある莫大な数の細胞を取り扱うことである。このことは、残存するいくらかの正常細胞を犠牲にしてさえも、癌であると疑われる全ての細胞を捕捉する際に、目的とされる。この拡大されたプレフィルターは、１つの実施形態において、２×１０７以下の細胞を含む１０ｍｌ未満の容量のサンプルを、１０分以内で、１分間あたり３．６×１０６細胞の最大速度で処理するよう設計される。これは、このサンプルの疑わしい細胞から抽出するよう設計され、この抽出物が、第２の高度識別細胞分画ステージ（以下で議論する）に通過する。
【００６９】
サンプルの例としては、赤血球が溶解した末梢血液、リンパ節組織の分散物、または分散された生検細胞が挙げられ得る。１０分以内での選別を達成するために、このプレフィルターは、１分間あたり１０００μＬ以下の細胞懸濁物を選別し得る。このことは、２０ｍｍ幅、４００μｍ高さおよび３０ｃｍ長のチャンバの床をライニングするＤＥＰ捕捉アレイによって、達成され得る。これらの寸法は、（１）混合物中の疑われる癌細胞が、チャンバを横切る十分な時間保証されて、印加される５０ｋＨｚの場によって捕捉されるに十分にＤＥＰ電極アレイの近くに沈降し、一方で正常な血液細胞が反発されること；（２）捕捉された細胞が受ける流体力学的力が、電極アレイを破壊しないために十分に弱いままであること；ならびに（３）細胞密度が、疑われる細胞が過剰量の他の細胞との衝突によって電極から突き放されないために十分に低いままであることを確実にする。
【００７０】
出発懸濁物を処理した後に、清澄な溶出物が、約４００μＬ／分でプレフィルターを通過して、捕捉されていない残りの細胞を洗い流し得る。このリンス段階の間に、ＤＥＰプレフィルター捕捉電極は、脱エネルギー化され得、一方で二次捕捉ステージはエネルギー付与されたままである。プレフィルターステージにおける疑われる細胞は、放出され得、そして二次トラップに運ばれ得る。捕捉された細胞のこの圧密は、高濃度の正常細胞がこの系から除去されることによって、可能となる。これらの初期段階の間にわたって、出現する溶出物は、廃棄へと送られ得る。
【００７１】
圧密工程の後に、二次捕捉ステージは、疑われる癌細胞を、いくらかの捕捉された血液細胞と共に含み得る。本発明者らの経験に基づいて、このステージは、合計２×１０５以下の「疑われる」細胞をこのステージに収集すると予測される。これらの疑われる細胞は、制限された数の単球、いくらかのマクロファージ、および他の任意の大きな循環細胞（真の癌細胞の全てを含む）を含み得る。この細胞の数は、ＤＥＰ−ＭＡＰ−ＦＦＦによる高度識別選別のために理想的である。なぜなら、細胞密度は、細胞間相互作用が無視されるように十分に低下しているからである。プレフィルター設計の主要な利点は、このような細胞間相互作用のその相対的許容性である。
【００７２】
（磁性抗体標識化）
ＭＡＰ分離が細胞単離の次の工程において利用される場合には、二次捕捉ステージにおける細胞を、磁気的に標識された抗体とともにインキュベートし得る。また、蛍光抗体（このデバイスのさらにずっと下流での表面マーカー検出に適している）が、この時点で添加され得る。標識を達成するために、抗体は、この目的で提供されたポートに注入され得、同時に細胞は、この実施形態においては約２５０ｋＨｚの場からのＤＥＰ力によって電極上の適所に保持される。一旦、流体流が停止すると、ピーク間約３ＶのＤＥＰ場が、約１０ｋＨｚと約２５０ｋＨｚとの間で、約１０秒間の間隔で交互にされて、細胞を交互に浮揚および捕捉して、これらの細胞を抗体とともに穏やかに攪拌し得る。インキュベーションに続いて、ＤＥＰ場が約２５０ｋＨｚに切り替えられて、細胞を捕捉し得、一方で抗体は洗い流されて、細胞が新しい緩衝液でリンスされる。
【００７３】
（ＤＥＰ−ＭＡＰ−ＦＦＦ注入）
任意の抗体標識工程に続いて、０．５Ｖ、１０ｋＨｚの信号が印加されて、疑われる細胞を、これらを浮揚させることなく二次捕捉電極から解放し得る。流体流動がプレフィルターステージにおいて開始され得、そして細胞が、流体スプリッタを介してＤＥＰ−ＭＡＰ−ＦＦＦステージにフラッシュされ得る。チャンバの寸法およびスプリッタの位置に起因して、疑われる細胞は、２０μＬの溶出液中で、ＤＥＰ−ＭＡＰ−ＦＦＦステージに運び込まれ得る。ＤＥＰ−ＭＡＰ−ＦＦＦステージの端部におけるシリンジポンプを使用して、サンプル流動を制御し得る。
【００７４】
細針吸引生検サンプルの分析のような適用において、出発細胞計数は、約２×１０５細胞以下であり得、そしてプレフィルター工程は、不必要になる。なぜなら、ＤＥＰ−ＭＡＰ−ＦＦＦ分画器は、所望でない細胞間相互作用なしに、このような少量のサンプルを取り扱い得るからである。このようなサンプルは、任意の抗体標識工程のための濃縮器注入ステージにおける予め濃縮されたサンプル充填ポートに、従ってＤＥＰ−ＭＡＰ−ＦＦＦ選別器に直接、注入され得る。
【００７５】
（ＤＥＰ−ＭＡＰ−ＦＦＦ分画）
プレフィルターステージからの細胞サンプルの注入の間および注入後に、ＤＥＰ−ＭＡＰ−ＦＦＦ分離器ステージにおけるＤＥＰ電極アレイが、分離に適切な周波数（代表的には２０〜８０ｋＨｚの範囲）でエネルギー付与され得る。流動を停止させて、細胞が平衡高さ（ここで、これらの細胞に作用する磁力、ＤＥＰ力および重力の場が平衡化される）に達するために十分な時間を与え得る。ＤＥＰ−ＦＦＦ実験に基づいて、このいわゆる緩和時間は、５分を超える必要はない。緩和に続いて、ＤＥＰ−ＭＡＰ−ＦＦＦステージを通って流れる流体が開始され得、そして細胞は、ＤＥＰ力、ＭＡＰ力および重力のバランスによって制御される放物線流動プロフィールにおけるそれらの位置に従って特徴的な速度でチャンバを通して運ばれ得る。ＤＥＰ−ＦＦＦ実験に基づいて、この分離工程にかかる時間は、１つの実施形態において、１２分以下である。
【００７６】
（細胞画分の捕捉）
プレフィルターおよびＤＥＰ−ＭＡＰ−ＦＦＦステージの界面においてと同様に、分離流動が、ＤＥＰ−ＭＡＰ−ＦＦＦステージと、アイソレーターおよび分析ステージとの間で使用され得、その結果、この分離器の底部（ここに細胞が出現し得る）の近くの流動のみが、通過する。残りの溶出物は、上部から抜かれ得、そして廃棄へと送られ得る。流動ストリームがＤＥＰ−ＭＡＰ−ＦＦＦ分離器から出現し、そして単離および分析ステージへと入るにつれて、分析ビーズの制御された流動が、流動ストリームに注入され得る。これにより、分析ビーズが、出現する細胞画分と混合され得る。
【００７７】
細胞単離ステージは、５部の別個の電極アレイセグメントに分割され得、各々のセグメントが、分離器から出現する細胞の別個の画分を捕捉し得、そして濃縮し得る。いずれかの細胞が出現する前に、非進行の１０ｋＨｚの場が、単離ステージの最初の４つのセグメントにエネルギー付与し得る。これにより、細胞とビーズとの両方が、負のＤＥＰによって浮揚し得、そしてこれらの細胞およびビーズがこれらのセグメントに沈降することを防止する。しかし、第５のセグメントは、５００ｋＨｚでエネルギー付与され得る。この周波数において、全ての細胞型およびビーズが捕捉され得る。従って、最初に出現する細胞およびこれらの細胞と混合されるビーズは、最初の４つのセグメントを横切って運ばれ得、そして正のＤＥＰによって第５のセグメントに捕捉され得る。細胞の第１の画分を第５のセグメント上に単離するために適切な時間間隔の後に、トラップの第４のセグメントが５００ｋＨｚでエネルギー付与され得、その結果、引き続いて出現する細胞が、これらの細胞と混合されたビーズと共に、第４のセグメントに捕捉され得る。適切な時間間隔で、第３のトラップ、次いで第２のトラップ、そして最後に第１のトラップが同様に５００ｋＨｚでエネルギー付与され得る。このプロセスの完了後、５種の異なる細胞画分が単離および捕捉され得、各々が、これらの細胞と混合されたビーズと共に、異なる時間制限間にＭＡＧ−ＤＥＰ−ＦＦＦ分離から出現する細胞を含む。ここでは５つのセグメントに関して記載されるが、当業者は、任意の数のセグメントが使用され得ることを認識する。
【００７８】
本発明者らの、ＤＥＰ−ＦＦＦに関する知識およびＭＡＧ−ＤＥＰ−ＦＦＦに関する予測に基づいて、最小のサイズ、最も複雑でない表面形態、および最低濃度の磁気標識された表面マーカーを組み合わせる細胞は、早く出現し得、そしてセグメント５に捕捉され得る。逆に、大きなサイズ、複雑な表面形態、および高濃度の表面マーカーを組み合わせる細胞は、最後に出現し得、そしてセグメント１に捕捉され得る。
【００７９】
（細胞単離物の組織学的分析）
必要に応じて、単離および分析ステージの異なるセグメントに捕捉された細胞は、抗体または染料をこの目的で提供される試薬ポートを通して注入することによって、抗体または染料で処理され得る。組織学的試薬が細胞の生存度に影響を与えない限り、これらの細胞は、注入および処理の間、正のＤＥＰによって適所に保持され得る。いくつかの染色工程が使用され得、そして過剰の試薬または抗体が、必要に応じて洗い流され得る。ガラスおよび／または透明なＰＤＭＡが、分離チャンバを構築するために使用され得る。従って、染色後、５つのセグメントにおいて単離された細胞は、組織学者によって、光学顕微鏡検査および／または蛍光顕微鏡検査によって、インサイチュで比較され得、そして構築され得る。所望であれば、細胞分析の次の工程のためのさらなる試薬が、この時点で添加され得る。
【００８０】
（収束／濃縮）
細胞およびビーズをアイソレーターステージの５つのセグメントにおいて捕捉し、必要に応じて、これらの細胞を、組織学的染色を用いて試験し、そしてこれらを分析における次の工程のために必要とされる試薬で灌流したら、これらの細胞は収束されて、ビーズとの濃厚な混合物を形成し得る。これを達成するために、単離ステージの５つ全てのセグメントにおける螺旋状電極が、１０ｋＨｚから２００ｋＨｚの周波数で掃引される４相場でエネルギー付与されて、５つの螺旋の各々の中心に指向されるｔｗＤＥＰ力を提供し得る。確立された哺乳動物細胞の誘電特性およびあつらえたビーズの誘電特性に起因して、このｔｗＤＥＰ力は、全ての型の細胞およびビーズを、これらが最初に捕捉された螺旋の中心に向けて掃引し得る。このプロセスには１分より長くかからず、そして各螺旋の中心において、細胞およびビーズの濃厚な濃度を生じると考えられる。この様式で、各単離された画分は、収束の前に灌流された試薬混合物中に懸濁した約１０１０ビーズ／ｍｌと共に、約１０９細胞／ｍｌの密度で濃縮され得る。
【００８１】
（細胞のバースト）
一旦、細胞およびビーズが濃縮されると、この細胞の、電気により媒介される溶解が起こり得る。これは、強いＡＣ電圧（例えば、ピーク間１５Ｖ）を螺旋状電極に印加することによって、達成され得る。しかし、当業者は、バーストを引き起こすに適切な他の任意の電圧が使用され得ることを認識する。
【００８２】
（分子分析）
細胞溶解に続く細胞内成分の遊離は、灌流された試薬とのこれらの成分の反応、およびビーズ（存在する場合）の表面とのこれらの成分との相互作用を可能にし得る。濃縮された細胞溶解物における希少なｍＲＮＡの、ビーズに担持されるプローブとのハイブリダイゼーションに関する文献において報告される実験に基づくと、これらの反応は非常に迅速に、代表的には数分以内に起こる。
【００８３】
（検出）
１５分間のインキュベーション時間の後に、標的ｍＲＮＡは、ビーズ上の相補プローブとハイブリダイズしているはずである。螺旋状電極セグメントが、５００ｋＨｚの非進行場でエネルギー付与されて、この時点でビーズを捕捉し得る。細胞の破片は、正のＤＥＰによって引き付けられず、そしてこれらのビーズから洗い流され得る。実際に、比較的強い（ｈａｒｓｈ）試薬が、この時点でのビーズの清澄化のために添加され得、異なるビーズ型に結合したｍＲＮＡを分解せず、ビーズを損傷しないものを提供する。破片のないビーズおよびハイブリダイズしていない分子を洗浄した後に、これらのビーズは、標的ｍＲＮＡの配列決定のために、第２の蛍光プローブで灌流され得る。この様式で、ビーズ表面上の標的配列は、蛍光標識され得る。結合していない第２の標識の除去のための、さらなる洗浄工程に続いて、螺旋状電極は、１０ｋＨｚの信号でエネルギー付与されて、これらのビーズを解放し得る。この時点で、溶出流動が連続して１つの螺旋状セグメントを通して発生し得、そしてこれらのビーズは、これらが近位インピーダンスセンサを通過するにつれて、試験され得る。
【００８４】
同時の蛍光分析を使用して、各ビーズに結合したｍＲＮＡ二次標識の量を定量し得、そしてＡＣインピーダンス特徴を使用して、各ビーズ／プローブの組み合わせを同定（従って、混合アッセイを指標）し得る。このプロセスには、約１５分かかるはずである。
【００８５】
（全分析時間）
上記の全ての工程が実施される場合には、開始から終了までの分析全体には、約２時間かかり得る。これは、１０６個の正常細胞あたり１個の癌細胞に接近するべき検出限界で、出発混合物から細胞をプレフィルターする工程；腫瘍細胞を、それらの誘電特性、および必要に応じて、表面免疫磁気マーカーに基づいて単離する工程；他の単離物との比較における、これらの細胞の組織学的分析；ならびに１０までの異なるｍＲＮＡの分子分析を包含する。
【００８６】
あるいは、免疫磁気マーカーおよび組織学的工程が省略される場合には、細胞の選別、単離、および分子分析には、開始から終了まで約４５分かかる。
【００８７】
（実施例２−加工に関する考察）
（電極の加工）
電極アレイは、標準的なマイクロフォトリソグラフィー技術を使用して加工され得る。簡単に言えば、７０Åのチタンおよび１０００Åの金でコーティングされた透明なガラス基板を使用して、開始し得る。ＮＮＮ−Ｓ−４５０仕様でのコーティングは、Ｔｈｉｎ  Ｆｉｌｍ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．によって商業的になされ得、そして均一な沈着、ピンホールのない品質、および１０，０００ｐｓｉの揚力に耐え得ることを保証するか、またはスパッタリングが使用され得るかのいずれかによって、なされ得る。得られる金のブランク（１２５ｍｍ×１２５ｍｍのサイズまで）を、Ｓｈｉｐｌｅｙフォトレジストでスピンコーティングし得、これを、マスク整列器（ＡＢ  Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ）を使用してマスクを通して、ＵＶ光に露出する。得られるパターンを現像し、そして検査し、次いで金およびチタンの層を、それぞれＫＩ／Ｉ２および熱ＨＣｌを用いる２工程でエッチングする。マスクを、ＩＣ  ＣＡＤレイアウトパッケージ（Ｄｅｓｉｇｎ  Ｗｏｒｋｓｈｏｐ）によって設計する。マスクは、Ｅビーム法によって商業的に（６インチ×６インチまでのマスク、および１μｍ未満までのフィーチャー）、または例えば、Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ  ＤｅｓｉｇｎＪｅｔ  ２５００ＣＰプリンターで６００ｄｐｉで印刷された、１０倍版のマスクをフォトグラフ的に還元することによって製造された他のもの（４．８インチ×４．８インチまでの最終マスクサイズ、および４μｍ未満までのフィーチャー）のいずれかによって作製される。
【００８８】
細胞の粘着を防止するために、電極は、疎水性コーティングを生じるようにシラン化され得るか、またはＴＥＦＬＯＮ（登録商標）で他のようにコーティングされ得る。シラン化は、ＳｉｇｍａＣｏｔｅを用いて慣用的に達成される。ＴＥＦＬＯＮ（登録商標）コーティングは、シラン化電極へのフルオロカーボンキャリアからの溶媒沈着、および引き続く焼付けによって、またはスパッタリング（Ｓｔａｎｆｏｌｄ  Ｍｉｃｒｏｆａｂｒｉｃａｔｉｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙとの共同研究において）によって、達成される。
【００８９】
（デバイス構造の製作）
電極アレイのガラス基板は、デバイスの下部壁を構成する。デバイス頂部を構築するために２つのアプローチがとられ得る。１つ目のアプローチにおいて、頂部壁は、４ｍｍのガラスからなり、このガラスには、トリプルチップのダイアモンドドリルを使用して、入口ポートおよび出口ポートの接続のために穴が開けられる。ＰＥＥＫチューブまたはＴＥＦＬＯＮ（登録商標）チューブは、これらの穴に接着され、そしてデバイスの内面となり得る表面上のフラッシュを阻止して（ｃｕｔ  ｏｆｆ  ｆｌｕｓｈ）相互接続を形成し得る。デバイスの２つの対面した壁は、ＵＶ硬化エポキシ接着剤でその長縁に沿ってシールされるか、複数の小さなプラスチッククランプで適所に保持されるか、または目的のために機械加工された単独の金属フレームでクランプされる。デバイスの内側の流体流路は、この構築方法において、５０μｍと４００μｍとの間の厚さのガスケット（必要な場合、流体流動が所望される任意の場所にスロットカットを有する）により規定される。本発明者らは、ＰＴＦＥポリマー、Ｇｏｒｅ−Ｔｅｘポリマー、ＲＴＶポリマーおよびＰＤＭＳポリマーのガスケットを首尾よく使用した。この方法は、単純な流路には適しているが、多重セグメント螺旋状（ｍｕｌｔｉｐｌｅ−ｓｅｇｍｅｎｔ  ｓｐｉｒａｌ）単離（ｉｓｏｌａｔｉｏｎ）およびインピーダンス検知段階に必要な一体化ミクロ流体構成要素におけるより複雑な流路には、射出成形シールを使用する方法が使用され得る。シールは、この目的のために個々の型で作製され得、次いで上記のような単純な頂部と底部の間に挟まれるか、またはデバイスの頂部を、Ｌｕｃｉｔｅ（登録商標）から機械加工してシールを直接射出成形し得る。この場合、シールは、所望のチャネル厚さに等しい距離だけ頂部プレートの表面上に伸長するように作製される。デバイスの頂部プレートをデバイスの底部に向かって単に押圧することにより、必要な流路が形成され、これにより、ガスケットを損傷することなしに容易に分解および洗浄することが可能になる。シールを形成するために使用される成型材料は、弾力性ポリマーであるＰＤＭＳであり、これは、耐久性があり、生物学的に不活性で、限られた圧縮力でも流体に対する良好なシールを形成するために十分圧縮可能であり、かつ透明である。複雑なシールパターンを実現するために、本発明者らは、Ｓｈｅｒｌｉｎｅ  ＣＮＣ微小ミリング機を使用する。このミリング機は、ＣＡＤレイアウトから直接作動する。このようにして、数学的に規定された流路が、コンピュータ制御下でデバイス頂部ブランクに直接切削され得る。これにより、十分に精密な、滑らかな流体通路を、迅速に製造しかつ容易に再生することが可能になる。
【００９０】
（流体流動制御）
流体流動は、デジタルシリンジポンプ（ＫＤ  ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｂｏｓｔｏｎ、Ｍａｓｓ）により制御され得、各シリンジポンプは、異なるバレルサイズの２つのシリンジを保持し得る。本発明者らは、これらのポンプからの有用な流量（すなわち、この流量には、ステッパーモーター動作に起因する拍動がない）は、０．０１μｌ／分〜７０．５７ｍｌ／分で７０に及ぶ。４台ものポンプの完全に一体化されたシステムは、ＤＥＰプレフィルター、ＤＥＰ−ＭＡＰ−ＦＦＦ段階および分離器における自動化サンプル制御を可能にするために必要とされ得る。ポンプは、コンピュータまたは手動制御による簡便な逐次制御のためにデイジーチェーンされ得る。流動弁いくつかの廃棄出口ラインを制御するために必要とされ得る。これらは、流体デバイスと離して取付けられ得る。Ｌｅｅからの低死容積（ｄｅａｄ  ｖｏｌｕｍｅ）弁は、これらの流体制御要求のために使用され得る。
【００９１】
（伝導率測定）
懸濁媒体溶液の伝導率測定は、白金黒で被覆した白金電極を備えたフロースルー電極セルまたは浸漬電極セルを使用して、Ｃｏｌｅ−Ｐａｒｍｅｒ  １９１０１−００電気伝導率計で行われ得る。
【００９２】
（顕微鏡検査法）
検査中のデバイスは、ビデオ録画および画像分析の能力を備えたＺｅｉｓｓ  Ａｘｉｏｖｅｒｔ  Ｓ−１００倒立顕微鏡（倍率×５〜×６００）の載物台上に載せられ得る。これにより、透明な壁のデバイスの任意の区画の直接的な観察が可能になり、そして細胞の手動または自動の可視化が可能になる。この顕微鏡は、エピ蛍光（ｅｐｉｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）、および蛍光顕微鏡検査法に使用される高感度三色ＣＣＤカメラを備える。ソフトウエアを用いてシグナルを定量することにより、分子プローブの蛍光は、達成され得る。分子プローブ蛍光シグナルの検出のために、本発明者らは、Ｏｒｉｅｌ  ＭＳ２５７高感度光ファイバーチューナブル色素レーザー分光計システム、およびＰｈｏｔｏｍｅｔｒｉｃｓ  ＣＨ２１０液体窒素冷却光子計数カメラを備えたＺｅｉｓ  Ａｘｉｏｖｅｒｔ  ４０５Ｍ倒立顕微鏡を入手する。
【００９３】
（電気信号）
ＤＥＰ／ＦＦＦおよびＤＥＰ捕捉のための電場は、ＦＭおよびＡＭ掃引能を備えた２Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ３３１２０信号発生器（１５Ｖ（ピーク−ピーク）まで、５０ＭＨｚまでの周波数）から生成され得る。螺旋状電極に集中したｔｗＤＥＰのために、矩象の（ｉｎ  ｑｕａｄｒａｔｕｒｅ）４つの正弦信号が必要であり、そして矩象数値制御発振器チップに基づくデジタル合成ソースが使用され得る。これは、インターフェースでコンピュータと連結されて、ソフトウエア制御され得る変調特性を有する１２ＭＨｚまでおよび１２Ｖ（ピーク−ピーク）までの矩象信号を発生する。信号は、Ｔｅｋｔｒｏｎｉｘ  ２００ＭＨｚデジタルオシロスコープでモニタリングされ得る。
【００９４】
（磁場）
ＤＥＰ−ＭＡＰ−ＦＦＦ法を開発する際に重要な作業は、分離チャンバ全体を通して
【００９５】
【数１２】
2004532968.tif 000014
の適切な分布を達成する磁場分布を提供する磁気構成要素を設計することである。磁気システムについての設計は、図１０および１１に示される。磁極片の配置は、磁場が、原寸サイズのＤＥＰ−ＭＡＰ−ＦＦＦ分離器に必要な広い面積にわたって生成されることを可能にし得る。平行なＳｍＣｏまたはＮｄＦＢ永久磁石（例えば、０．５テスラ）を使用して、１テスラに近い磁場を生成し得る。磁場増強は、鉄表面における
【００９６】
【数１３】
2004532968.tif 000015
に対する境界条件を利用することにより達成され得る。この増強は、Ｆｅ構成要素の形状により、特に、有効極面の大きさにより制御される。磁場不均一性は、ＤＥＰ−ＭＡＰ−ＦＦＦ分離チャネルの下部にある焼成された鉄粒子により制御され得る。実際、ＤＥＰ−ＭＡＰ−ＦＦＦ分離器においてＭＡＰ力を生成するために使用される原理は、現存のＭＡＣＳ分離器において使用される原理と同じである。しかし、鉄の磁場増強剤および磁場シェーパー（ｓｈａｐｅｒ）は、今日のＭＡＣＳ分離器において使用される無作為なジオメトリーではなく明確な微小ジオメトリーに依存する。流動ストリーム中の細胞の高さを制御するために必要なＭＡＰ力は、流体力学的力に反してカラム中に細胞を捕捉するために必要な力より小さいオーダーであることに、留意するべきである。この理由のために、本発明者らは、ＳｍＣｏまたはＮｄＦＢ磁石が適切であり得ると考える。
【００９７】
磁石が作製され、そして磁場強度および空間的不均一特性を確認するために指向性Ｈａｌｌプローブを使用して試験される間、磁気的シミュレーションが行われ得る。このようにして、設計、シミュレーション、構築、試験および改良の工程が、協調して進行し、このプロジェクトのＭＡＰ要件に適する磁石を生成する。
【００９８】
（コンピュータシミュレーション）
チャンバ壁の間の流体内の電場および磁場の分布は、細胞が経験するＤＥＰ力およびＭＡＰ力を決定する。本発明者らの初期の電場計算は、ＦＯＲＴＲＡＮにより実行される電荷密度法により行われたが、より最近では、本発明者らは、ＡＮＳＹＳ多重物性（ｍｕｌｔｉｐｈｙｓｉｃｓ）有限要素分析パッケージを使用して場分布を計算し、そしてＭＡＴＬＡＢの処理後能力を使用して対応するＤＥＰ力分布を誘導した。
【００９９】
当該分野で公知のＤＥＰ電極ジオメトリーを使用し得る。しかし、ＤＥＰ−ＭＡＰ力バランスに最適な
【０１００】
【数１４】
2004532968.tif 000016
分布を達成するために、磁石、鉄界磁コンセントレータ、および焼成鉄成分の大きさ、形状、および配置の関数としてシミュレーションを行うためにＡＮＳＹＳパッケージを使用する必要があり得る。ＡＭＳＹＳパッケージは、同時の電気的計算および磁気的計算を可能にし、その結果、種々のジオメトリーのＤＥＰ−ＭＡＰ力バランス特性の挙動が、モデリングのために理想的である。
【０１０１】
最後に、ＡＮＳＹＳパッケージはまた、流動チャネルの流体力学特性のモデリングを可能にし、そして本発明者らは、流体および細胞が、一体化デバイス（特に、流体入口および出口領域）を通過するときの流体および細胞の挙動をモデリングすることを可能にする。このことは、この設計が、細胞が沈降し得る「デッド」スペースのない有効なサンプルの輸送を可能にすることを保証するために、システムのステージ間のインターフェース領域において重要であり得る。
【０１０２】
（ＤＥＰ捕捉）
必要な場合、５Ｖｐ−ｐにおける５００ｋＨｚの場を使用して、ＤＥＰにより細胞を補足し得る。この周波数は、損傷を生じないで有効に細胞膜に浸透するのに十分高く、そして細胞に対して強いＤＥＰ体積力を誘導し、流体流動に反して有効に細胞を捕捉する。ＤＥＰ捕捉は、一体化システムにおいて４つの方法で使用され得る：（１）正常細胞の溶出後にプレフィルターの第２セグメントにおいて濃縮される細胞用、およびＤＥＰ−ＭＡＰ−ＦＦＦステージの前に直接注入される小さなサンプル用；（２）ＤＥＰ−ＭＡＰ−ＦＦＦステージからの溶出後の螺旋状電極セグメントにおいて単離される細胞亜集団用；および、（３）処理のいくつかの段階における試薬灌流の間に細胞を適所に保持するため；（４）細胞溶解およびハイブリダイゼーション段階後の試薬灌流のためにビーズを適所に保持するため。
【０１０３】
（ＤＥＰ−ＭＡＰ−ＦＦＦ分離）
本発明者らのＤＥＰ−ＦＦＦの経験に基づいて、２×１０５個までの細胞を、本明細書において選択されるＤＥＰ−ＭＡＰ−ＦＦＦ分画器のサイズにおいて、細胞間相互作用に摂動を生じるほど大きな細胞濃度を用いないで分析し得る。高濃度の疑わしい細胞（例えば、疑わしい腫瘍の生検または微小針吸引生検由来の分散した細胞）を有すると予測されるサンプルについては、２×１０５個の細胞は、腫瘍細胞（存在する場合）が分子分析に十分であり得ることを保証するのに十分である。このような場合、２０μＬまでの細胞懸濁液は、予め濃縮されたサンプルのローディングポートを介して注入され得る。疑わしい細胞の濃度が低くて十分な疑わしい細胞が２×１０５個の細胞サンプル中になさそうなサンプルについては、プレフィルタリングが必要であり得る。末梢血単核細胞または分散したリンパ節細胞集団のようなサンプルは、この範疇に入る。
【０１０４】
適切な場合、２０μＬのサンプルの注入またはプレフィルタリングの後、二次捕捉電極は、２５０ｋＨｚの周波数および５Ｖｐ−ｐで作動され得る。全ての細胞型は、ＤＥＰ−ＭＡＰ−ＦＦＦ分離器ステージの入口領域において電極上でＤＥＰにより流動ストリームから捕捉され得る。ＤＥＰ−ＭＡＰ−ＦＦＦステージへのサンプル注入は、印加される適切なＤＥＰ浮揚信号と共にこの時点で起こり得る。ＤＥＰ、ＭＡＰおよび重力の影響下で細胞が所定時間平衡高さに達した（２〜５分間）後、キャリア媒体流動は、デジタルシリンジポンプ（ＫＤ  ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｂｏｓｔｏｎ、Ｍａｓｓ）から開始され得る。第１の細胞亜集団は、流体流動の開始後約２〜５分でＤＥＰ−ＦＦＦ分画器から出現し始める。１０ｋＨｚ〜５００ｋＨｚの周波数、０．５Ｖｐ−ｐ〜３Ｖｐ−ｐの電圧、および５〜１０００ｍＳ／ｍのキャリア流体伝導率が使用され得る。
【０１０５】
（細胞追跡）
細胞分画、単離、濃縮およびバーストは、一体化デバイスにより調査され得る。培養された乳房腫瘍細胞は、ＰＢＭＣと混合されて、一体化されたシステムの構成要素部分についての性能および最適な操作条件を調べるための、十分に特徴付けされた再現可能なモデルシステムを提供し得る。細胞亜集団を追跡する際に補助するために、追跡が容易になるようにその乳癌細胞を最初に予め標識し得る。これは、２つの方法で行われ得る。最初に、細胞を、２５μｇ／ｍｌのＢＣＥＣＦ−ＡＭ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）中で１０分間インキュベートし得る。このＢＣＥＣＦ−ＡＭは、不特定のエステラーゼの作用により細胞に不可逆的に蓄積されるフルオレセインプローブである。ＢＣＥＣＦは、生存細胞により蓄積されるのみであり、同時に生存能力の指標として作用する。実験では、このような標識化は、腫瘍細胞の都合の良い追跡を可能にし、腫瘍細胞は、非標識細胞の暗い場に対して明るい球体として現われ、非常に大きな非標識集団（＞１０５個の細胞）内の単一の腫瘍細胞でさえ即座に同定されることを可能にする。この追跡技術を使用して、デバイスにおける分離および操作を受けながら、蛍光顕微鏡検査法により細胞を研究し得る。
【０１０６】
第２に、ＦＩＴＣ結合体化ヒト上皮抗原（ＨＥＡ）抗体を使用して、ＰＢＭＮＣ混合物に添加する前に乳癌細胞を予め標識し得る。この標識手順の蛍光は、ＢＣＥＣＦよりもはるかに弱いが、分離器ステージから現れる細胞は、直接フローサイトメーターに通され得、そしてこの方法により上皮起源であると明確に同定され得る。
【０１０７】
（細胞および細胞培養）
モデル研究には、元々Ｃａｉｌｌｅａｕらにより樹立されたＭＤＡ−ＭＢ−４３５、ＭＤＡ−ＭＢ−４５３、ＭＤＡ−ＭＢ−２３６、およびＭＤＡ−ＭＢ−４６８ヒト乳癌細胞株、ならびに元々Ｍｉｃｈｉｇａｎ  Ｃａｎｃｅｒ  ＦｏｕｎｄａｔｉｏｎからのＭＣＦ−７を使用し得る。腫瘍形成（ｔｕｍｏｒｏｇｅｎｅｓｉｓ）および転移の多くの局面に調査の基礎を築き、十分に特徴付けされており、そしてＡＴＣＣからその他の研究者へ追跡調査のために入手可能である。ＭＤＡ−ＭＢ−４５３は、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１と比較してＨＥＲ２／ｎｅｕのｍＲＮＡレベルにおいて６４倍の増大および対応するタンパク質の細胞表面濃度において匹敵する増加を示す。従って、ＭＤＡ−ＭＢ−４５３は、免疫学的アッセイおよびｍＲＮＡアッセイの両方に適切である。腫瘍細胞は、２５ｃｍ２の排気培養フラスコ（Ｃｏｓｔａｒ）中、１０％ウシ胎児血清、１ｍＭグルタミンおよび２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液を補充したＲＰＭＩ１６４０培地中で３７℃にて５％ＣＯ２／９５％空気雰囲気下培養する。培養物は、マイコプラスマを含まず、そして放射性核酸ハイブリダイゼーションアッセイ（Ｇｅｎ−Ｐｒｏｂｅ，Ｉｎｃ）により周期的にチェックされる。細胞を０．２５％トリプシン−０．０２％ＥＤＴＡ溶液への短時間の露出により５０〜７０％のコンフルエントな培養物から採取する。生存能力をトリパンブルー色素排除により決定する。
【０１０８】
ＤＥＰ分画および操作用のサンプルを、細胞をショ糖／デキストロース溶液に懸濁することにより調製し、１０と１０００ｍＳ／ｍとの間の特定の伝導率および生理学的浸透圧（３００ｍＯｓ／ｋｇ）を有する懸濁液を得ることができる。必要な場合、伝導率を、さらなる培養培地で調整する。
【０１０９】
（免疫学的検出）
細胞サンプルを、分離ステージにロードする前、プレフィルターステージとＤＥＰ−ＭＡＰ−ＦＦＦ分画器ステージとの間のインターフェースにある間、および濃縮前の螺旋状電極アイソレーターステージでの捕捉後に、マーカーのための抗体と共にインキュベートし得る。一連のＤＥＰ浮揚／捕捉サイクルは、これらの工程の各々における抗体／細胞混合物を「攪拌する」ために適用され得る。標識化の後、細胞は、正のＤＥＰにより捕捉され得、そして必要な回数リンス剤で灌流することにより洗浄されて抗体を含まなくなる。蛍光標識、磁気標識または酵素標識された抗体を使用し得る。蛍光顕微鏡検査法を使用して、抗体の蛍光またはその触媒量の副生成物の蛍光を検出し得る。免疫磁気標識は、その表面マーカー濃度によって細胞型のＤＥＰ−ＭＡＰ−ＦＦＦ特性を改変し得る。ヒト上皮抗原（ＨＥＡ）に抗体を使用し得る。なぜならば、これは、血液分散およびリンパ節細胞分散中の上皮細胞を同定するために有用なマーカーであるからである。ＥＧＦレセプター抗体は、乳癌の比較予後マーカーであるので、使用され得る。明らかに、これらの実施例は、技術のより一般的な適用の単なる例示であり、そして任意の異なる適用に関する表面マーカーが、代わりに使用され得る。
【０１１０】
（ｔｗＤＥＰ集中／細胞の濃縮）
血液および培養された乳癌細胞株のｔｗＤＥＰ特性は、当該分野で公知である。細胞亜集団を浮揚させかつ平行移動させる周波数で螺旋状電極アレイに印加される進行波場は、細胞亜集団を螺旋の中心に集中させ得る。各螺旋状単離セグメント上の全ての細胞型およびビーズの種類が、中心に流されて高度に濃縮された混合物を形成し得ることを確実にするために、掃引周波数が適用され得る。１０ｋＨｚ〜５００ｋＨｚの周波数範囲、０．５Ｖｐ−ｐ〜５Ｖｐ−ｐの電圧、および５〜１０００ｍＳ／ｍのキャリア流体伝導率の進行波が使用され得る。
【０１１１】
（コンピュータ制御）
１つの実施形態において、システムを作動させるために使用されるポンプおよび信号発生器は、全てコンピュータ制御可能である。画像処理は、二重Ｐｅｎｔｉｕｍ（登録商標）ＩＩＰＣＩ／ＥＩＳＡマザーボードを使用し得る。画像グラッバーは、実時間画像プロセッサ（ボード上の４ＭＢメモリを備えたＩｍａｇｅ  Ｓｅｒｉｅｓ  ６４０＋Ｎｅｉｇｈｂｏｒｈｏｏｄ  Ｐｒｏｃｅｓｓｏｒ，Ｍａｔｒｏｘ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｌｔｄ．，Ｄｏｒｖａｌ，Ｃａｎａｄａ）を含み得、これは画像を得るため、および画像操作を加速するために使用される。当該分野で公知の適切なソフトウエアは、システムを操作するために使用されるシリアルデバイスおよびＨＰＩＢデバイス（ポンプ、バルブ、信号源、デジタルカメラ）の実時間プロセス制御を実行する。Ｌａｂｖｉｅｗソフトウエアと組み合わせて使用される実時間画像化ライブラリー（ＭＩＬ−３２  ３．１０，Ｍａｔｒｏｘ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｌｔｄ．，Ｄｏｒｖａｌ，Ｃａｎａｄａ）は、システム制御および蛍光検出のために利用され得る。
【０１１２】
（細胞のバースト）
螺旋状電極セグメント上の細胞分画の捕捉およびｔｗＤＥＰによるその濃縮後に、螺旋状電極に印加される電圧および周波数は、標的細胞をバーストするように変更され得る。さらなるレベルの細胞識別は、この段階で可能である。なぜならば、標的化されたバーストが、所望の場合に細胞混合物上で行われ得るからである。乳癌細胞は、代表的には直径１０〜１２μｍの範囲であり、そして約２０ｍＦ／ｍ２の特定の膜キャパシタンスを有する。懸濁媒体伝導率と組み合わせたこれらのパラメータは、最適なバースト条件を規定する。これらは、５〜１０００ｍＳ／ｍのキャリア流体伝導率で、標的培養乳癌細胞およびヒト生検細胞について試験され得る。螺旋状電極上に全ての細胞を迅速にバーストするために最適な場条件もまた、決定され得る。１０Ｖ（ピーク−ピーク）〜２０Ｖ（ピーク−ピーク）の電圧および１０ｋＨｚ〜１００ｋＨｚの周波数を使用し得る（掃引周波数を含む）。
【０１１３】
本開示は、種々の改変および代替の形態に適合可能であり得るが、本明細書中に、特定の実施形態が例として示され、そして記載された。しかし、本開示は、開示される特定の形態に限定されるとは意図されないことを理解すべきである。むしろ、添付の特許請求の範囲により規定される、本開示の精神および範囲内の全ての改変物、等価物、および代替物を網羅する。さらに、開示される装置および方法の異なる局面は、種々組合せて、かつ／または独立して利用され得る。従って、本発明は、本明細書中に示される組合せに制限されないだけでなく、他の組み合わせを含み得る。
【０１１４】
（実施例３−プログラム可能な流体プロセッサ）
本発明の１つの実施形態において、プログラム可能な流体プロセッサ（ＰＦＰ）は、アレイアイソレーターと接続され得、このアレイアイソレーターは、電極アレイアイソレーターと接続され得る。この電極アレイアイソレーターは、細胞がフィールドフローフラクショネーション分離器から出た後に細胞を捕捉するために使用される。ＰＦＰの種々の実施形態は、係属中の米国特許出願番号第０９／２４９，９５５号（以前に本明細書に参考として援用された）において考察される。
【０１１５】
以前に示したように、アレイアイソレーターは、複数の螺旋状トラップからなり得る。ＰＦＰは、当該分野で公知の多様な手段により螺旋状トラップに接続され得る。例えば、ＰＦＰは、チャネルにより螺旋状トラップに接続され得るか、またはＰＦＰは、螺旋状トラップと一体化され得る。１つ以上のＰＦＰが存在し得る。各螺旋状トラップは、それ自体のＰＦＰを有し得るか、または複数の螺旋状トラップが、単一のＰＦＰに接続され得る。
【０１１６】
一旦、細胞が螺旋状トラップ上に捕捉されると、それらは、さらなる分析のためにＰＦＰに移動され得る。一旦、細胞が移動されると、ＰＦＰを使用して、細胞を種々の様式でプログラム可能に操作し得る。図１２は、ＰＦＰを備える本発明の１つの実施形態を示す。図１２に示されるように、単一のＰＦＰは、各々の螺旋状トラップに接続され得る。
【０１１７】
（参考文献）
以下の参考文献は、特に、本明細書中で参考として援用される。
【０１１８】
【数１５】
2004532968.tif 000017
2004532968.tif 000018
2004532968.tif 000019
2004532968.tif 000020
2004532968.tif 000021
2004532968.tif 000022
2004532968.tif 000023
【図面の簡単な説明】
以下の図面は、本明細書の一部を形成し、そして本発明の特定の局面をさらに実証するための例示を含み、これに限定されるわけではない。本発明は、これらの図面の１以上を参照（ここで、同様の参照は、類似の要素を示す）し、本明細書中に提供される特定の実施形態の詳細な説明と組み合わせて、より良く理解され得る。
【図１】
図１は、異なるＤＥＰ交差周波数を示すグラフである。９人のヒト腫瘍細胞型についての交差周波数と正常な末梢血単核細胞とを比較する。
【図２】
図２Ａ〜２Ｄは、ｃＤＥＰ親和性トラップによって、血液からの培養された乳癌細胞の除去を示す画像である。
【図３】
図３は、ｃＤＥＰ／ＦＦＦ分画のいくつかの作動原理を図示する概略図である。
【図４】
図４は、種々の細胞型についてのＤＥＰ−ＦＦＦ分離データを要約するチャートである。
【図５】
図５は、ｔｗＤＥＰによって細胞を集中させるために使用され得る、螺旋状電極アレイを示す図である。
【図６】
図６Ａ〜６Ｂは、（Ａ）Ｔ−リンパ球、および（Ｂ）ＭＤＡ−ＭＢ−４３５乳癌細胞の場／周波数のバースト特性を示すチャートである。
【図７】
図７は、２個の対立する磁石から現れる磁場強度を示すグラフである。
【図８】
図８は、細胞の単離および分析のためのデバイスの機能的段階を図示するフローチャートである。
【図９】
図９は、プレフィルター段階、分離器段階、およびアイソレーターおよび分析段階を含む、一体型流体システムの概略図である。
【図１０】
図１０は、ＤＥＰ−ＭＡＰ−ＦＦＦチャンバの短いセクションを示す概略図である。
【図１１】
図１１は、磁気泳動アセンブリの端面図である。この磁石は、ＳｍＣｏまたはＮｄＦｅＢである。分離チャンバは、焼結された鉄球の真上の磁束勾配中に位置する。燒結された鉄球は、異なる所望の磁束勾配特性を生じる、楔型鉄またはフィラメントと置換され得る。
【図１２】
図１２は、一体型流体システムの一実施形態の概略図であり、これは、プレフィルター段階、分離器段階、ならびにプログラム可能な流体処理装置を備えるアイソレーター段階および分析段階を含む。
【図１】
2004532968.tif 000024
【図３】
2004532968.tif 000025
【図４】
2004532968.tif 000026
【図６】
2004532968.tif 000027
【図７】
2004532968.tif 000028
【図８】
2004532968.tif 000029
【図９】
2004532968.tif 000030
【図１０】
2004532968.tif 000031
【図１１】
2004532968.tif 000032
【図１２】
2004532968.tif 000033
【国際公開パンフレット】
2004532968.tif 000034
2004532968.tif 000035
2004532968.tif 000036
2004532968.tif 000037
2004532968.tif 000038
2004532968.tif 000039
2004532968.tif 000040
2004532968.tif 000041
2004532968.tif 000042
2004532968.tif 000043
2004532968.tif 000044
2004532968.tif 000045
2004532968.tif 000046
2004532968.tif 000047
2004532968.tif 000048
2004532968.tif 000049
2004532968.tif 000050
2004532968.tif 000051
2004532968.tif 000052
2004532968.tif 000053
2004532968.tif 000054
2004532968.tif 000055
2004532968.tif 000056
2004532968.tif 000057
2004532968.tif 000058
2004532968.tif 000059
2004532968.tif 000060
2004532968.tif 000061
2004532968.tif 000062
2004532968.tif 000063
2004532968.tif 000064
2004532968.tif 000065
2004532968.tif 000066
2004532968.tif 000067
2004532968.tif 000068
2004532968.tif 000069
2004532968.tif 000070
2004532968.tif 000071
2004532968.tif 000072
2004532968.tif 000073
2004532968.tif 000074
2004532968.tif 000075
2004532968.tif 000076
2004532968.tif 000077
2004532968.tif 000078
2004532968.tif 000079
2004532968.tif 000080
2004532968.tif 000081
2004532968.tif 000082
2004532968.tif 000083
2004532968.tif 000084
2004532968.tif 000085
2004532968.tif 000086
2004532968.tif 000087
2004532968.tif 000088
2004532968.tif 000089
2004532968.tif 000090
2004532968.tif 000091
2004532968.tif 000092
2004532968.tif 000093
2004532968.tif 000094
2004532968.tif 000095
2004532968.tif 000096
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004532968.tif 000097
2004532968.tif 000098
【国際調査報告】
2004532968.tif 000099
2004532968.tif 000100
2004532968.tif 000101