(57)【要約】本発明は、表面に結合した架橋ポリマー副分子鎖の集合体を含む多官能性ポリマーネットワークであって、各々のポリマー副分子鎖が、試料またはプローブ分子との相互作用を可能とする１以上の官能基を有する多数の同一または異なる繰返し単位を含むポリマーネットワークに関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
表面に共有結合した架橋ポリマー副分子鎖のアセンブリを含む多官能性ポリマーネットワークであって、各々のポリマー副分子鎖が、ポリマーと試料またはプローブ分子との相互作用を可能とする１以上の官能基を有する、多数の同一または異なる繰返し単位を含むことを特徴とする、多官能性ポリマーネットワーク。
【請求項２】
前記官能基が、ポリマーと試料またはプローブ分子との共有結合性相互作用を可能とする、請求項１に記載の多官能性ポリマーネットワーク。
【請求項３】
前記官能基が、カルボン酸、マレインイミド、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、エポキシド、イソチオシアネート、イソシアネートまたはアジドから選択される、請求項１または２に記載の多官能性ポリマーネットワーク。
【請求項４】
前記試料分子またはプローブ分子が、タンパク質、ペプチド、多糖または核酸およびそれらの誘導体から選択される、請求項１〜３のいずれか１項記載の多官能性ポリマーネットワーク。
【請求項５】
前記ポリマー副分子鎖が、前記ポリマーネットワークを水膨潤性にするセグメントを含む、請求項１〜４のいずれか１項記載の多官能性ポリマーネットワーク。
【請求項６】
前記水膨潤性が、アクリル酸、メタクリル酸、ジメチルアクリルアミドまたはビニルピロリドンから選択されるモノマーによってもたらされる、請求項５に記載の多官能性ポリマーネットワーク。
【請求項７】
前記官能基との反応を介して、前記ポリマー副分子鎖に固定化された多数の同一または異なるプローブ分子を、さらに含む、請求項１〜６のいずれか１項記載の多官能性ポリマーネットワーク。
【請求項８】
前記プローブ分子が、核酸、ＰＮＡ、多糖、タンパク質およびペプチドから選択される、請求項７に記載の多官能性ポリマーネットワーク。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか１項記載の多官能性ポリマーネットワークを有する表面。
【請求項１０】
前記多官能性ポリマーネットワークが、パターン化アレイを形成する、請求項９に記載の表面。
【請求項１１】
下記：
ａ）表面への共有結合に適切な１以上の官能基を含む重合開始剤の単分子膜で表面を被覆する工程、および
ｂ）得られたポリマー副分子鎖と特定の試料分子またはプローブ分子とのカップリング反応、好ましくは共有結合性カップリング反応を可能とする官能基を有するモノマーの存在下、かつ架橋剤の存在下、架橋重合反応を開始し、遂行する工程
を含む、請求項１〜８のいずれか１項記載の多官能性ポリマーネットワークの製造方法。
【請求項１２】
前記開始剤が、クロロシラン、アルコキシシラン、ジスルフィドまたはチオール基を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記開始剤が、アゾ基、ペルオキソ基、または芳香族系に結合したケトン基から選択される基を含む、請求項１１または１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記開始剤が、芳香族ケトンまたはイオウを含む芳香族ケトンから選択される基を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記架橋剤が、ビスアクリレート、ビスメタクリレートおよびビスアクリルアミドよりなる群から選択される、請求項１１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
下記：
プローブと試料との間でハイブリダイゼーション反応を生起させる工程、引き続き、
洗浄工程でハイブリダイズされなかった核酸分子を除去する工程、および
ハイブリダイズされた核酸分子を検出する工程
を含む、請求項７または８に記載の多官能性ポリマーネットワークを用いる、試料核酸分子を検出する方法。
【請求項１７】
下記：
（ａ）前記化合物が、ポリマーネットワークの官能基またはプローブ分子に結合することを可能とする条件下で、前記試料を請求項１〜８のいずれか１項に記載の多官能性ポリマーネットワークと接触させる工程、および
（ｂ）前記試料から前記多官能性ポリマーネットワークまたは前記プローブ分子に結合しなかった物質を除去する工程
を含む、試料から化合物を精製する方法。
【請求項１８】
（ｃ）前記多官能性ポリマーネットワークから結合された複合体を溶離することをさらに含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記化合物が、核酸、（多）糖または（ポリ）ペプチドもしくはその複合体、好ましくは抗体またはそのフラグメントもしくは誘導体である、請求項１７または１８に記載の方法。
【請求項２０】
請求項９または１０に記載の表面の、親和性マトリックスにおける使用。
【請求項２１】
請求項９または１０に記載の表面の、センサーチップにおける使用。
【請求項２２】
請求項９または１０に記載の表面を含む、医療用または診断用機器。
【請求項２３】
請求項９または１０に記載の表面の、オリゴマーまたはポリマーの生成用の、好ましくは核酸またはペプチド合成用の開始剤分子を固定化するための使用。
【請求項２４】
請求項１〜８のいずれか１項記載の多官能性ポリマーネットワークの、電場での分子の分離におけるゲルとしての使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【従来の技術】
多岐にわたる科学的な用途において、微細技術の重要性が確実に増大しているため、表面との分子の相互作用を可能とする系の開発が重要な案件となっている。そのような相互作用は、試料から特定の分子を除去して、例えば、それらの分析／検出を容易にする可能性、同様に、分子を表面上に存在させ、それで引き続いて反応が起こるようにする可能性を含んでいる。分子固定化についてのこれらの原理は、センサーもしくはクロマトグラフシステムにおいて、あるいは一般に修飾された表面の提供に応用することができる。
【０００２】
近年、センサー表面に試料分子を直接あるいは間接的にカップリングする二官能性分子の自己組織化単分子膜（ＳＡＭ）に基づくセンサーチップを製造する数多くのアプローチがなされている。代表的には、これらの二官能性分子は、無機表面との結合を達成するためのシランまたはチオール／ジスルフィド部位および、オリゴヌクレオチド、タンパク質または多糖類等の形態にある生体サンプルにしばしば含まれている、試料分子と相互作用する別途の官能基（例えば、アミノまたはエポキシド基）を有する。
【０００３】
二官能性化合物と試料分子との間で直接結合を生成することは可能であるが、試料分子は単分子膜を形成するカップリング剤と直接相互作用するとは限らない。あるいは、適切な固定化生体分子それ自体、試料分子検出用のプローブとして働き得る。そのようなプローブ分子は、単分子膜のフリーの官能基との反応を介して、同様に固定化することができる。特に、生体分子がプローブ分子として使用される場合、それらの存在によって、試料分子と修飾された表面との相互作用の特異性は有意に向上する。例えば、ＤＮＡ断片または分子の試料の迅速な分析が求められる場合には、二官能性分子の単分子膜をまず合成オリゴヌクレオチドと接触させることができ、これにより後者が固定される。次いで、試料からの適合する鎖（ストランド）のような特異的な分子のハイブリダイゼーションが、色素標識試料分子が使用される場合、例えば蛍光顕微鏡検査を通して検出される。
【０００４】
これらの技術はこの目的のためには十分確立されているが、特に特異的なタイプの試料分子の検出に役立つ領域が限られている場合には、例えば、多数の分子が並行プロセスで分析される場合には、単分子膜はそれらのグラフト密度で制限されるので、標準的な検出方法の適用は問題である。例えば、センサーの表面単位あたりのハイブリダイズされた二本鎖の数は簡単には増やせないので、適切な検出器はそれらの感度に関して非常に高い要件を満たさなくてはならない。このように、一つのタイプのオリゴヌクレオチドを検出するために必要なセンサー上の最小表面積は、簡単には減らすことができない。また、二次元的に広がった単分子膜上での立体障害により、最大密度、すなわち、一つのカップリング剤の官能基あたり一つの試料または一つのプローブ分子ということはほとんど達成し得ないので、官能基の一部だけが試料またはプローブ分子と反応しうる。したがって、全体としてのグラフト密度は低く、通常は十分には定まっていない。
【０００５】
表面単位当たりの反応部位の数が制限されることに関して、表面に分子の数を増やして固定することが望まれる他の用途において、同様の問題が起こりうる。
【０００６】
上記した問題を解決するために、種々の試みが行われている。オリゴヌクレオチドの分析に関して、オリゴヌクレオチド鎖（またはその結合のための官能基）を有するオリゴマーまたはポリマーを、センサーチップの表面にこれらのオリゴマーまたはポリマーを結合することを可能とする適切な基と共に用いることにより、表面上のグラフト密度を増大させることが試みられている。オリゴマー鎖またはポリマー鎖の高い柔軟性により、表面にカップリングした二官能性オリゴマーまたはポリマー分子の大部分が、オリゴヌクレオチドプローブ分子を固定化することができる。
【０００７】
しかしながら、表面上の二官能性オリゴマーまたはポリマー分子のグラフト密度は限られているので、全体のオリゴヌクレオチドグラフト密度はそれほど有意には増加しない。これは、センサー表面が一旦そのような分子で覆われると更なるポリマーは表面に到達するためには濃度勾配に逆らって拡散しなくてはならないので、オリゴマーまたはポリマーの自己集合は速度論的理由で妨害されるという事実の帰着である。
【０００８】
固定化用の上記の二官能性自己組織化単分子膜への異なるアプローチは、ＤＮＡ分析用のネットワークを用いることである。欠点は、これらのネットワークはセンサー表面にカップリングせずまた構造形成しない、すなわちパターン化アレイを形成しないことである。また、使用されたハイブリダイゼーション媒体中でネットワークは膨潤性であるので、ネットワークが表面から離脱する危険がある。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
したがって、本発明の目的は、表面単位あたりの相互作用する分子の数が従来の二官能性分子の単分子膜に比べて顕著に増加した、試料またはプローブ分子と相互作用するための官能基を含むポリマー層で修飾された表面を提供することである。さらに、有効な相互作用部位の密度は、二官能性ポリマーまたはオリゴマーと表面との反応から得られるものよりも高くあるべきである。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
オリゴヌクレオチドのようなＤＮＡ分子を検出する特定の場合においては、その目的は、低分子量カップリング剤の官能基化された単分子膜に対応するオリゴヌクレオチドをカップリングさせることにより作られるものよりも高い合成オリゴヌクレオチド鎖のグラフト密度を有する表面を提供することとして表現しうる。同じく、グラフト密度は、合成オリゴヌクレオチド一本鎖で修飾されたポリマーまたはオリゴマーと表面との反応から得られるものよりも高くあるべきである。
【００１１】
この目的は、（ネットワークの「メッシュ」を形成する）架橋ポリマー副分子鎖の集合体を含む多官能性ポリマーネットワーク（以下、同様に「ネットワーク」と簡単に呼ぶ）が共有結合された表面により達成された。ここで、そのポリマー副分子鎖は、それぞれ、ポリマーと試料またはプローブ分子との相互作用、好ましくは共有結合性相互作用を可能とする１以上の官能基を有する多数の同一または異なる繰返し単位を含む。表面にネットワークを結合またはカップリングさせる「固定基（アンカー基）」の数が、表面へのネットワークの接着強度および全体の系の機械的強度を決定する。これらの固定点の数は、（下記で説明するように）用いた固定化開始剤の表面密度を通してコントロールされる。例えば、そのような多官能性ポリマーネットワークが１以上の合成オリゴヌクレオチドプローブを固定化するために使用された場合は、ハイブリダイゼーション反応が生じたのち、相補的核酸が引き続いて、試料分子の混合物から検出されうる。驚くべきことに、そのような表面結合された多官能性ポリマーネットワークは、表面での高い官能基密度を達成できないという従来の検出方法の問題を抱えていない。また、多官能性ポリマーネットワークの柔軟性は、センサー表面の完全な被覆を可能とするため、例えばレーザー走査中の、表面効果を回避することができる。さらに、表面結合多官能性ネットワークは安定であり、容易に構造形成、すなわちパターン化アレイが形成され、センサーの感度の改善がもたらされる。
【００１２】
【発明の実施の形態】
本明細書中で使用される、「相互作用」という用語は、共有結合、並びにイオン引力、ファンデルワールス力および水素結合を包含する。相互作用の種類を定める、多官能性ポリマーネットワークまたはプローブ分子内の対応する官能部位は、本発明による表面の所望の用途に応じて選択される。
【００１３】
「固定化する」という表現は、以下、選択された条件下で永続的である結合の形成をもたらす、分子と多官能性ポリマーネットワークとの相互作用に対して使用される。例えば、プローブ分子は、センサー上でのそれらの適用中に、多官能性ネットワークにより固定される。しかしながら、条件（例えばｐＨ値、特定の切断剤の添加）を変えることにより、固定化は時々逆戻りされる。
【００１４】
「試料分子」という用語は、本明細書中、試料中に存在し、本発明の多官能性ネットワークに一時的にあるいは永続的に結合する分子に対して使用される。本発明は、本発明の多官能性ネットワークと試料分子との相互作用についての二つの一般原理を包含する。第一の態様では、多官能性ネットワーク内に含まれてなる官能基は、チェーンと試料分子との直接的相互作用が可能となるように選択される。第二の態様では、プローブ分子は多官能性ネットワークの官能基で固定化され、相互作用はそれらのプローブ分子と試料分子との間で生じる。
【００１５】
適切なプローブ分子は少なくとも二官能性である分子であるため、それらが多官能性ポリマーネットワークにカップリングしたのち、本発明の表面結合多官能性ネットワーク中に新たな相互作用部位が存在し、それは試料分子との相互作用を可能とする。好ましくは、プローブ分子は、試料分子に対して高度に特異的な相互作用部位を提供する。それらは天然のあるいは非天然の源に由来しうる。特に好ましいプローブ分子は、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはＰＮＡ（ペプチド核酸）を含む核酸、最も好ましくはオリゴペプチドまたはアプタマー、多糖類、糖で修飾されたタンパク質または抗体、酵素、サイトカイン、ケモカイン、ペプチドホルモンまたは抗生物質を含むタンパク質、およびペプチドのような生体分子である。例えばセンサー使用時の、十分な安定性を確保するために、プローブ分子は多官能性ポリマーネットワークに共有結合されることが好ましい。
【００１６】
用途に応じて、多数の同一のプローブ分子あるいは２以上の異なるプローブの混合物を固定化しうる。
【００１７】
例えば、同一のプローブ分子のセットが、多官能性ポリマーネットワークの親和性マトリックスとしての用途に好ましい。
【００１８】
本発明の多官能性ポリマーネットワークは、表面に結合した架橋ポリマー副分子鎖の集合体を含む。好ましくは、多官能性ポリマーネットワークと表面との結合は共有結合である。分岐ポリマーの導入は、所望ならば、可能である。ある場合には、所望の用途に応じてネットワークの物性の調整を可能とするコモノマーの添加が適当である。
【００１９】
ネットワークの最低限の成分は、官能基化された繰返し単位と架橋単位である。官能基化された繰返し単位として、ポリマーネットワークの副分子鎖は試料またはプローブ分子と相互作用できる少なくとも一つの官能基を有する繰返し単位を含む。しかしながら、ある有利な特性を多官能性ポリマーネットワークに付与するためには、試料またはプローブ分子との相互作用のための特定の官能基を有するこれらのモノマー（以下、「官能基化モノマー」と称する）と他のコモノマーから生成されるコポリマーを使用することができる。
【００２０】
例えば、試料またはプローブ分子と多官能性ポリマーネットワークとの反応は、これらの分子を含む溶媒中で多官能性ポリマーネットワークが膨潤性であれば有意に促進されるので、問題の溶媒と強い相互作用を示すコモノマーを選択するとよい。これは、ネットワークの膨潤性を改善するコモノマーを使用することにより達成することができる。本発明の最も好ましい態様において、通常水溶液に存在する生体分子は多官能性ポリマーネットワークと相互作用するため、多官能性ポリマーネットワークは水膨潤性であることが好ましい。水膨潤性は、適切なモノマーを適切に選択することにより、膨潤性が支持体からのポリマー層の離脱をもたらさず、かつ蛍光性被検物検出に必要な表面特性（すなわち、表面コーティングの均一性または一定な厚さ）に悪影響を与えない限り、広い範囲で調節することができる。
【００２１】
したがって、例えば、官能基化モノマーのホモポリマーが、検出すべき分子と官能基との迅速な反応を可能とする水との十分な相互作用を示さない場合には、極性の、あるいは水溶性ですらある１以上のコモノマーを使用することができる。両方のタイプのモノマー、官能基化されたものおよびコモノマーは、ラジカル重合反応において反応できるＣ−Ｃ二重結合を含むことが好ましい。水膨潤性のポリマーを生成する適切なコモノマーの例は、アクリル酸、メタクリル酸およびそれらの誘導体、例えば好ましくは炭素数１〜１２を含むアルコールまたはアミンとこれらの酸とのエステルおよびアミドである。
【００２２】
このグループのモノマーの一般的な例は、ヒドロキシエチルメタクリレート、アクリルアミドおよびジメチルアクリルアミドである。他の適切なモノマーは、ビニルピロリドンである。まず水不溶性のポリマーを生成し、次いで水溶性誘導体に変換できるモノマーを使用することも可能である。このグループのモノマーの適切な例は、例えばポリ酢酸ビニルのケン化により得ることができるポリビニルアルコールである。
【００２３】
コポリマーを使用する場合、得られる多官能性ポリマーネットワークのポリマー鎖の組成を定めるために、重合プロセスに先立って、コモノマーと官能基化モノマーとの比率が決定される。好ましくは、コモノマーと官能基化モノマーとの比率は、５０／１〜１／１、より好ましくは２０／１〜２／１の範囲である。
【００２４】
多官能性ポリマーネットワークと試料またはプローブ分子との相互作用を可能とするために必要な官能基は、多官能性ポリマーネットワークのポリマー副分子鎖の側鎖に存在することが好ましい。本発明の多官能性ポリマーネットワークのポリマー副分子鎖に含まれる「多数の」官能基は、ポリマー副分子鎖あたり、少なくとも２個、好ましくは２個より多い基を意味する。問題の官能基は、好ましくは多官能性ポリマーネットワークのポリマー副分子鎖を形成する繰返し単位中に含まれるので、それらの数は、固定されるべき試料またはプローブ分子のサイズによるが、単一の副分子鎖中に存在するこれらの基として、数千、例えば１００００までの数である。好ましくは、各々のチェーンは、これらの官能基を２０〜１０００含む。
【００２５】
多官能性ポリマーネットワークのポリマー副分子鎖中に存在する好適な官能基化された繰返し単位は、重合性Ｃ−Ｃ二重結合および重合プロセスに関与しない更なる官能性部分を含む繰返し単位である。この官能基は、スペーサーとしてＣ２〜Ｃ１０、さらに好ましくはＣ３〜Ｃ７アルキル鎖を介して多官能性ポリマーネットワークの主ポリマー副分子鎖に結合していることが好ましい。
【００２６】
スペーサー分子は官能基化モノマーの一部でありうる。このアプローチに好適な官能基化モノマーとして、Ｃ２〜Ｃ１０アルコールまたはＣ２〜Ｃ１０アミンのアクリル酸およびメタクリル酸エステルまたはアミンが挙げられる。スペーサーとして働くために、これらのアルコールまたはアミンは、エステルまたはアミド結合を形成するものの反対側の末端に追加分の官能基を有する。この官能基は、試料またはプローブ分子との相互作用に必要なものを表すか、あるいはその後の工程でそのような好適な官能基に変換することができる。
【００２７】
あるいは、その形成後、多官能性ポリマーネットワークのポリマー副分子鎖内の好適な反応性セグメントにこれらのスペーサー分子を結合することも可能である。この場合、例えば無水マレイン酸のような、アクリル酸もしくはメタクリル酸クロリドまたはその反応性エステルのような、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドまたは他のモノマーのような、反応性モノマーは、重合中に存在しなくてはならない。これらの好ましい反応性モノマーは、スペーサーとして使用されうる二官能性アルコールまたはアミンと共有結合を形成することができる。
【００２８】
スペーサー単位を有するモノマーは、対応するアクリル酸もしくはメタクリル酸クロリドまたは無水物およびω−アミノまたはヒドロキシカルボン酸から容易に合成することができる。得られる生成物は、例えばＮ−ヒドロキシスクシンイミドを用いることにより、活性エステル誘導体に変換することができる。そのようなモノマーのいくつかの例を合成する詳細な手順は、文献、例えばＨ． −Ｇ． Ｂａｔｚ、Ｊ． Ｋｏｌｄｅｈｏｆｆ ａｃｒｏｍｏｌ． Ｃｈｅｍ． １７７（１９７６）６８３中に見出すことができる。
【００２９】
上記に概説したように、本発明の多官能性ポリマーネットワークのポリマー副分子鎖を直接生成する反応性モノマーを使用することが可能である。あるいは、最終的な表面に用いられる官能基の前駆体、例えば酸クロリドまたは酸無水物を有するモノマーを選択することができる。それらは引き続いて、所望の条件下で多官能性ポリマーネットワークと試料またはプローブ分子との相互作用が可能な、反応性基、例えばＮＨＳエステルまたはグリシジルエステル基に変換することができる。
【００３０】
したがって、多官能性ポリマーネットワークと試料またはプローブ分子との相互作用が可能となるのに必要な官能基と結合できるか、それらを含む限り、すべての重合性モノマーが本発明の目的に好適である。
【００３１】
本発明の目的に使用することができる官能基は、好ましくは、相互作用が達成される分子に応じて選択される。相互作用は、一つの単一タイプの試料分子あるいは多数の試料分子に向けることができる。本発明の一つの重要な用途は、生体試料中の特定分子の検出であるため、多官能性ポリマーネットワーク内に存在する官能基は、生体試料中の分子と特異的に相互作用しうる天然または合成生体分子と好ましくは相互作用し、それらの検出に導く。好適な官能性部位は、好ましくは、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはＰＮＡのような核酸およびそれらの誘導体、例えばオリゴヌクレオチドまたはアプタマー、多糖類、糖で修飾されたタンパク質または抗体、酵素、サイトカイン、ケモカイン、ペプチドホルモンまたは抗生物質を含むタンパク質またはペプチドまたはそれらの標識誘導体と反応することができる。
【００３２】
また、試料またはプローブ分子に有害な条件下で検出されるべき分子または合成オリゴヌクレオチドと多官能性ポリマーネットワークとの間のカップリング反応を行うことが可能である。ついては、核酸センサー用途においては、反応は水溶液中で行う必要があり、温度は９５℃より上げてはならない。
【００３３】
同様に、溶液中で極端なｐＨ値を要することなく好ましくは２４時間以内に検出が完遂できるように、カップリング反応は合理的な速度で進行する必要がある。合成オリゴヌクレオチド一本鎖の固定化には、ｐＨは７〜１１、好ましくは７〜１０の範囲である必要がある。核酸試料分子とプローブ分子とのハイブリダイゼーション反応の間、官能基と合成オリゴヌクレオチド一本鎖との間の結合および多官能性ポリマーネットワークの基質との結合は、６５℃より上の温度および６〜９のｐＨに耐えることができなくてはならない。ＤＮＡを試料分子として使用する場合は、ハイブリダイゼーションに必要なＤＮＡ鎖を分離するために、温度を約９５℃まで上げる必要がある。
【００３４】
大部分のプローブ分子は、特に生理学的および医学的な用途において、立体障害を受けない求核部位を含むので、多官能性ポリマーネットワークとの好ましい相互作用は求核置換または付加反応を含んでなり、ポリマー副分子鎖と試料またはプローブ分子との間の共有結合をもたらす。例えば、合成オリゴヌクレオチドは通常、一つの末端（５′または３′）に遊離のアミン基を有している。そこで、代表的な官能基は、例えば反応性二重結合、（例えば、エポキシ基のような）二重結合の等価体または反応性脱離基を備える。しかしながら、もし官能基がそれに応じて選択されるならば、イオン性の力あるいはファンデルワールス力および水素結合もまた、試料分子と多官能性ポリマーネットワークとのカップリングに用いることができる。
【００３５】
好ましい官能基は、固定化されるべき分子の種類および上記した他の要件（反応時間、温度、ｐＨ値）に応じて先行文献から選択することができる。一般的なリストは、例えばテキストブック「バイオコンジュゲート技術（Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）」Ｇ． Ｔ． Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， １９９６中に見出される。アミノ末端オリゴヌクレオチドを結合する場合には、好適な基の例は、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ−エステル）、エポキシド、好ましくはグリシジル誘導体、イソチオシアネート、イソシアネート、アジド、カルボン酸基またはマレインイミドのようないわゆる活性または反応性エステルである。
【００３６】
多官能性ポリマーネットワークの多官能性ポリマー副分子鎖を直接与える好ましい官能性モノマーとして、以下の化合物を本発明の目的のために用いることができる。
【００３７】
−　アクリル酸またはメタクリル酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、
−　Ｎ−メタクリロイル−６−アミノプロパン酸ヒドロキシスクシンイミドエステル、
−　Ｎ−メタクリロイル−６−アミノカプロン酸ヒドロキシスクシンイミドエステル、あるいは
−　アクリル酸またはメタクリル酸グリシジルエステル。
【００３８】
用途によっては、例えば異なるタイプの官能基化モノマーの存在下にポリマー副分子鎖を与える重合を行うことにより、２以上の異なる官能基の組み合わせを有する多官能性ポリマーネットワークのポリマー副分子鎖を提供することができる。あるいは、官能基は同一でありうる。
【００３９】
本発明の多官能性ポリマーネットワークの有利で好ましい製造方法を以下に説明する。
【００４０】
第一工程において、表面は重合開始剤または開始分子の単分子膜によって共有結合で被覆される。重合を開始しうるこれらの開始剤における基は、熱的に開始されるラジカル機構が用いられる場合には、通常、例えばペルオキソ基またはアゾ基から選択される。ポリマーが光化学的開始によって生成される場合には、ベンゾイン、ベンジルまたはベンゾフェノンのような芳香族ケトンを用いることが好ましい。所望ならば、光開始用の好適な波長をより長波長領域にシフトさせるために、イオウを含む芳香族ケトンを同様に用いてもよい。そのような不安定な基の他に、本発明の好ましいプロセス用の好適な開始剤は、多官能性ポリマーネットワークのポリマー副分子鎖によって被覆される表面にそれらが結合するのに好適な１以上の基を有する。同一または異なる開始剤が重合混合物中に同様に存在していてもよい。
【００４１】
本発明の多官能性ポリマーネットワークのポリマー副分子鎖は、通常、チェーン反応を介して表面から成長し、同時に架橋される（一部固定化開始剤を用いる架橋重合）。実用上の理由からラジカル機構が好ましいが、イオン重合あるいは他の重合手法の適用も可能である。
【００４２】
表面結合用の開始剤分子に含まれる官能基は、用いたセンサー表面に適合される必要がある。金属酸化物、とくにシリコン酸化物表面（蒸着またはスパッタされたＳｉＯｘ層、シリコンウエハーのＳｉＯ２表面、ガラス、石英）上に開始剤の単分子膜を調製するためには、クロロシラン部位やアルコキシシランが使用される。金表面の修飾には、チオールまたはジスルフィド基を用いることができる。しかしながら、表面での安定性が増大することから、シランが通常好ましい。また、本発明は、無機表面に限定されない。有機ポリマー表面も同様に多官能性ポリマーネットワークを有する基質として用いることができ、そのような表面形成ポリマーに直接、重合反応用の開始剤を含ませることも可能である。したがって、本発明の好適な表面は、好ましくは、例えば顕微鏡用スライド、研磨されたシリコンウエハー、ポリマープレート、ガラス瓶およびウエルのような非孔性の材料から選択される。
【００４３】
本発明の目的に使用できる開始剤の好ましい例を、それらの構造式と共に、以下に列挙する。
【００４４】
−　４，４′−アゾビス−（４−シアノペンタン酸（３′−クロロジメチルシリル）プロピルエステル）、化合物１または対応するジ−およびトリクロロもしくはモノ−、ジ−およびトリアルコキシシラン類縁体；
−　２，４′−アゾ−（４−シアノペンタン酸（３″−クロロジメチルシリル）プロピルエステル）、化合物２または対応するジ−およびトリクロロもしくはモノ−、ジ−およびトリアルコキシシラン類縁体；あるいはプロピルスペーサーではなくウンデシルスペーサーを有する対応する化合物、または、この一般的なタイプのアゾ化合物のジスルフィドもしくはチオール誘導体、
−　４−（３′−クロロジメチルシリル）プロピルオキシ）ベンゾフェノン、化合物３または対応するジ−およびトリクロロもしくはモノ−、ジ−およびトリアルコキシシラン類縁体、
−　アリールアゾマロジニトリルのシランおよびジスルフィド／チオール誘導体、例えば化合物４。
【００４５】
【表１】
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【００４６】
好適な架橋剤の好ましい例は、ビスアクリレート、ビスメタクリレート、例えば、エチレングリコールビスメタクリレートのようなオリゴエチレングリコールビスメタクリレート、およびビスアクリルアミド、例えばエチレンジアミンビスアクリルアミドである。
【００４７】
重合性官能基化モノマーおよび架橋剤の存在下に好ましくは加熱工程（熱的開始）または放射光への暴露（光開始）による重合反応の開始で、ポリマー副分子鎖は表面から成長し、同時に架橋される。重合はこの分野で既知の標準的な反応条件下で行うことができる。この手法が適用される場合、得られる多官能性ポリマーネットワークのグラフト密度は、例えば重合時間を変えることによって、広い範囲にわたってコントロールすることができる。また、他の方法では得がたいグラフト密度を達成することができる。したがって、多官能性ポリマーネットワークのポリマー副分子鎖は、表面上の固定部位間の平均距離が５ｎｍ以下、例えば２〜５ｎｍとなるように固定することができる。有利には、そのようなグラフト密度は、固定されたチェーンの分子量に関係なく、例えば１０００００ｇ／ｍｏｌの分子量であっても、達成することができる。
【００４８】
さらに、本発明に従って、表面上に多官能性ポリマーネットワークを好ましいインシチュー法で生成することにより、グラフト密度に関係なく、多官能性ポリマーネットワークの固定されたポリマー副分子鎖の平均分子量をコントロールすることが可能となる。
【００４９】
パラメータ、グラフト密度、架橋密度および分子量の精確なコントロールにより、対応する多官能性ポリマーネットワークの特性を種々の用途に適合させることが可能となる。反応条件を調整することにより、数ナノメートルから数ミリメートルあるいはそれ以上の範囲の厚さを有するネットワークを調製しうる。例えば、それらのサイズや構造がかなり変動しうる、続いて結合されるプローブや試料分子に対する官能基の接近しやすさに関して、得られる多官能性ポリマーネットワークの特性を微調整することも可能である。
【００５０】
上記の好ましい方法を介して得られた多官能性ポリマーネットワークは、表面上にそれらが固定化されるそれらの構造中に開始剤のフラグメント、すなわち固定部位に始まって、すべての種類の開始剤、とくにこの出願で述べられたものについてこの分野で既知である所定の開始点に至る部分を保持している。
【００５１】
開始剤分子の合成、それらの表面との反応、および重合の好ましい条件についての詳細な情報は、
−　Ｏ． Ｐｒｕｃｋｅｒ、Ｊ． Ｒｕｅｈｅ、Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ、１９９８、３１、５９２；
−　Ｏ． Ｐｒｕｃｋｅｒ、Ｊ． Ｒｕｅｈｅ、Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ、１９９８、３１、６０２および
−　Ｏ． Ｐｒｕｃｋｅｒ、Ｊ． Ｒｕｅｈｅ、ラングミューア、１９９８、２４（１４）、６８９３に記載されている。
【００５２】
重合後、適切な溶媒を用いて、未反応モノマーおよび非結合または架橋ポリマーチェーンを除去することに注意が必要である。
【００５３】
変法によれば、第一工程で、多官能性ポリマーネットワークが予め生成され、次いで表面に共有結合される。さらに別の方法は、固定化された（表面結合）開始剤（いわゆる「ポリマーブラシ」）から開始して、適切な官能基を有する長いポリマーチェーンを合成すること、そしてその後、後者を架橋することを含む。
【００５４】
上記の方法に従って調製された多官能性ポリマーネットワークは、広範な表面に、それらの形状に関係なく適用することができる。嵩高いポリマー分子を表面に向かって拡散させる必要がないので、従来の表面修飾法ではなしえなかったような表面にさえも、本発明の多官能性ポリマーネットワークを形成することができる。
【００５５】
また、多官能性ポリマーネットワークのパターン化アレイを種々の手段により作成することが可能である。一つの方法は、この工程（開始剤単分子膜マスクの光分解または光アブレーション）の前に重合後に（マスクを通してのポリマーの光アブレーション）、あるいはマスクを通しての光重合による重合の間に適用することができる、標準的なホトリソグラフである。パターン化された多官能性ポリマーネットワークを作成するための他の可能な手法は、開始剤層の作成中あるいは重合中に適用しうる、マイクロコンタクト印刷または関連する方法である。最後に、インクジェット法または他の微小プロッティング法を、パターン化された多官能性ポリマーネットワークにその後に変換できる、パターン化された開始剤単分子膜を作成するために使用することができる。これらの手法のいずれかを用いて、マイクロメートル範囲の寸法で表面構造を作成することができる。高次パラレルモードでのシグナル発生および分析データの統合における有意な改善は、そのような手法の最も有望な特徴であり、したがって自動分析方法の最適化が可能となる。
【００５６】
多官能性ポリマーネットワーク上への試料またはプローブ分子の固定化の成功を検出するためには、多数の手法を適用することができる。特に、本発明の多官能性ポリマーネットワークは、ふさわしい方法、例えば偏光解析法で検出することができるそれらの厚さを有意に増大させることが見出された。
【００５７】
核酸、例えば生体試料中の所望のヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチドまたはＤＮＡ分子を分析する場合には、合成オリゴヌクレオチド一本鎖を多官能性ポリマーネットワークと反応させることができる。反応は、高湿度下、好ましくは緩衝水溶液中で行う。反応温度は、オリゴヌクレオチドに問題のない限り、室温より上の温度に上げることができる。好ましい温度は、４０〜６０℃の範囲である。この用途では、多数の同一の合成オリゴヌクレオチド鎖または異なる鎖の混合物を使用することができる。異なる鎖が使用される場合は、それらの配列は既知であることが好ましい。
【００５８】
このように調製された表面をハイブリダイセーション反応で使用する前に、未反応の官能基を、適切な求核剤、好ましくは単純な一級アルキルアミン（例えば、プロピルもしくはブチルアミン）、二級アミン（ジエチルアミン）のようなＣ１〜Ｃ４アミンまたはアミノ酸（グリシン）を添加して不活性化する。
【００５９】
標識された、例えばＰＣＲから得られたオリゴヌクレオチド一本鎖の混合物にさらすと、ＰＣＲ産物に相補的なプローブとしての合成鎖を提供する表面領域のみが、ハイブリダイセーションにより、走査すると検出可能なシグナルを示す。異なるオリゴヌクレオチド配列の並列検出を容易にするために、センサー表面を、異なるタイプの合成オリゴヌクレオチドプローブが試験溶液に提示される複数の領域に区切ることを可能とする、印刷法を用いることができる。
【００６０】
本発明で用いられる「ハイブリダイセーション」なる用語は、ストリンジェントなあるいは非ストリンジェントな条件にかかわる。もし特別に規定されないならば、条件は好ましくは非ストリンジェントである。このハイブリダイセーション条件は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、「分子クローニング、実験マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、ＮＹ． （１９８９）、Ａｕｓｕｂｅｌ、「分子生物学における最新プロトコル（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、Ｇｒｅｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、Ｎ．Ｙ． （１９８９）、またはＨｉｇｇｉｎｓおよびＨａｍｅｓ（編）「核酸ハイブリダイセーション、実用的アプローチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ， ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ）」、ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ Ｏｘｆｏｒｄ、ワシントンＤＣ、（１９８５）に記載された従来のプロトコルに従って樹立されうる。条件の設定は、当業者がなしうるものであり、従来技術に記載されたプロトコルに従って決定される。したがって、特異的にハイブリダイズする配列のみの検出は、通常、ストリンジェントなハイブリダイセーションおよび例えば０．１ｘＳＳＣ、６５℃の０．１％ＳＤＳのような洗浄条件を必要とする。相同あるいは完全には相補性ではない配列を検出するための例示的な非ストリンジェントなハイブリダイセーション条件は、６ｘＳＳＣ、６５℃の０．１％ＳＤＳに設定される。周知のように、プローブの長さおよび決定されるべき核酸の組成は、ハイブリダイセーション条件のその他のパラメータを構成する。
【００６１】
分析されるべき核酸は、合成および半合成核酸ライブラリーを含む、ＤＮＡライブラリーまたはゲノムライブラリーに由来する。好ましくは、核酸ライブラリーはオリゴヌクレオチドを含む。
【００６２】
固定化状態でのそれらの検出を容易にするために、核酸分子を標識することが好ましい。好適な標識として、放射性、蛍光、りん光、生物発光もしくは化学発光標識、酵素、抗体または官能性フラグメントもしくはその官能性誘導体、ビオチン、アビジンあるいはストレプトアビジンが挙げられる。
【００６３】
抗体としては、それらに限定されないが、ポリクローナル、モノクローナル、キメリックもしくは一本鎖抗体、またはそのような抗体の官能性フラグメントもしくは誘導体が挙げられる。
【００６４】
抗体を製造する一般的な方法論は周知であり、例えば、ＫｏｅｈｌａｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ） ２５６（１９７５）、４９６に記載されており、またＪ． Ｇ． Ｒ． Ｈｕｒｒｅｌ編、「モノクローナルハイブリドーマ抗体：　手法と応用（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）」、ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．、Ｂｏｃｏ Ｒａｒｏｎ、ＦＬ（１９８２）に総説されている。同じく、Ｌ． Ｔ． Ｍｉｍｍｓら、ビロロジー（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）１７６（１９９０）、６０４〜６１９で教示されている方法も適用しうる。上記したように、本発明において、「抗体」なる用語は、モノクローナルまたはポリクローナル抗体にかかわる。官能性抗体フラグメントまたは誘導体は、元の抗体と同一の特異性を持ち、Ｆ（ａｂ′）２、Ｆａｂ、ＦｖまたはｓｃＦｖフラグメントを含んでなり、例えばＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、「抗体、実験マニュアル（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｎｕａｌ）」、ＣＳＨ Ｐｒｅｓｓ １９８８、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．を参照されたい。好ましくは、本発明の抗体はモノクローナル抗体である。さらに、本発明に従って、誘導体はペプチド模倣物により製造することができる。そのような製造方法は、この分野で周知であり、苦もなく当業者が適用することができる。
【００６５】
適用された標識方法に応じて、検出はこの分野で既知の方法、例えばレーザー走査またはＣＣＤカメラの使用により行うことができる。
【００６６】
同様に、本発明に含まれるものは、検出が間接的に行われる方法である。そのような間接的な検出の例は、問題の生体分子（試料分子）に結合する抗体のような、第一の化合物に向けた二次的な標識抗体の使用である。
【００６７】
本発明の多官能性ポリマーネットワークの更なる用途は、例えば物質の精製用の、アフィニティクロマトグラフィーの分野におけるものである。この目的には、同一の官能基またはプローブ分子を有する多官能性ポリマーネットワークを用いることが好ましく、それらは試料と接触される。多官能性ポリマーネットワークにより所望の物質を固定化したのち、結合していない物質を、例えば洗浄工程で除去しうる。精製された物質をその後、適切な溶離剤で、親和性マトリックスから分離することができる。
【００６８】
そのようなマトリックスに固定化しうる好ましい物質は、核酸分子、抗体とそれらの官能性フラグメントもしくは誘導体のようなペプチドもしくはポリペプチド（もしくはそれらの複合体）、糖類または多糖類である。
【００６９】
固定化を行ったのち表面を再生することは可能であるが、結果の質を確かなものとするためには、一回使用が好ましい。
【００７０】
本発明の多官能性ポリマーネットワークを用いて、種々のタイプの試料を、精度がより高く、および／または順次のおよび並列の検出方法においてより少ない必要スペースで、分析することができる。本発明の多官能性ポリマーネットワークが結合したセンサー表面は、したがって、例えば血液、血清、喀痰等の生理的な液体中の成分を検出するための、診断用機器や他の医療用用途で役立つことができる。
【００７１】
本発明の多官能性ポリマーネットワークを有する表面は、とくに、例えばオリゴ−もしくはポリマーのインシチューでの生成における、固相合成での合成用途の開始剤分子を固定化することもできる。好ましくは、オリゴ−もしくはポリマーは生体分子であり、ペプチド、タンパク質、オリゴ−もしくは多糖類またはオリゴ−もしくはポリ核酸を含む。固定化開始剤として、これらの高分子のモノマーを用いることができる。
【００７２】
また、本発明の多官能性ポリマーネットワークは、電場での分子、好ましくは生体分子の分離におけるゲルとして使用することができる。
【００７３】
一般的に、本発明は、優れた表面吸着特性と改良された機械強度を有する多官能性ポリマーネットワークで均一に修飾された表面の提供を可能とする。さらに、例えば開始剤分子のパターン化アレイから重合を開始することにより、構造化された表面を提供することができる。その結果、多官能性ポリマーネットワークはそれぞれの用途に最適なように調整することができる。
【００７４】
本明細書中で引用された文献の開示内容は、ここに参照により組み入れられるものである。
【００７５】
本発明の態様を、さらに以下の項目中で説明する。
【００７６】
本発明の多官能性ポリマーネットワークを用いる、試料の核酸分子、好ましくは一本鎖核酸分子の好ましい検出方法は、
本発明の多官能性ポリマーネットワークで被覆された表面を調製する工程、
適切なプローブ分子、好ましくはオリゴヌクレオチドの一本鎖を、多官能性ポリマーネットワーク中に存在する官能基との反応を介して多官能性ポリマーネットワーク上に固定化する工程、
オリゴヌクレオチドの一本鎖と試料の核酸分子との間でハイブリダイゼーション反応を生起させる工程、
ハイブリダイズされなかった核酸分子を洗浄工程で除去する工程、および
ハイブリダイズされた核酸分子を、好ましくは蛍光分析で、検出する工程
を含む。
【００７７】
本発明の多官能性ポリマーネットワークを用いる、試料から化合物を精製する好ましい方法は、
本発明の多官能性ポリマーネットワークで修飾された表面を調製する工程、
多数の同一のプローブ分子を多官能性ポリマーネットワーク上に固定化する工程、
化合物がプローブ分子に結合することを可能とする条件下で、試料を得られたポリマーネットワークと接触させる工程、および
試料からプローブ分子に結合しなかった物質を除去する工程
を含む。
【００７８】
この方法はさらに、適切な溶離剤を用いることにより、プローブ分子から化合物を分離する工程を含んでいてもよい。
【００７９】
以下の例は、本発明を説明する。
【００８０】
開始剤の合成
例として、化合物１の調製について説明する。反応経路を、以下に図示する。図中、インデックス（ｉ）〜（ｉｉｉ）は本文中のそれぞれの工程の記述に対応するものである。
【００８１】
【化１】
2004505170.tif 000003
【００８２】
（ｉ）　氷浴で冷却した５０ｍｌの塩化メチレン中の４０ｇの五塩化リン（ＰＣｌ５）の懸濁液に、５０ｍｌの塩化メチレン中の１０ｇの４，４′−アゾビス−（４−シアノペンタン酸）の懸濁液を滴下した。混合物を室温まで温め、一晩攪拌した。過剰のＰＣｌ５をろ過して除き、残った溶液をＰＣｌ５がそれ以上分離しなくなるまで濃縮した。混合物を再度ろ過し、ろ液を３００ｍｌの冷ヘキサンに加え、酸クロリドを白色固体として分離した（収率：９０％）。
【００８３】
（ｉｉ）　０℃の５０ｍｌの塩化メチレン中の２．７ｍｌのアリルアルコールと６．５ｍｌのピリジンの溶液に、５０ｍｌの塩化メチレン中の１０ｇの酸クロリドの溶液を滴下した。混合物を室温まで温め、一晩攪拌した。次いで、溶液を２ＮのＨ２ＳＯ４、ＮａＨＣＯ３水溶液、および水で２回洗浄した。有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥し、溶媒を留去した。得られたビスアリルエステルはメタノールから再結晶した（収率：９０％）。
【００８４】
（ｉｉｉ）　３０ｍｌのジメチルクロロシラン中の３ｇのビスアリルエステルの懸濁液に、０．５ｍｌのジメチルエーテル／エタノール（１／１ｖ／ｖ）中の３０ｍｇのヘキサクロロ白金酸の溶液を加え、混合物を還流下、３時間加熱した。過剰のシランを留去して、化合物１を淡緑色油状体として定量的に得た。残余の白金触媒を、生成物の塩化メチレン溶液を無水Ｎａ２ＳＯ４上でろ過して除去した。
【００８５】
開始剤単分子膜の生成
（１）で合成した開始剤を、無水トルエンを溶媒として、また乾燥トリエチルアミンを触媒として用いて、不活性条件（乾燥窒素雰囲気）下、ガラス表面上に室温で固定化した。トルエン溶液は、約５０ｍｍｏｌ／ｌの開始剤濃度であることを示し、またトリエチルアミンは約１０ｍｍｏｌ／ｌの濃度で加えられる。その試料を溶液中で一晩保持し、その後、メタノールとクロロホルムでよくリンスすることにより清浄化した。
【００８６】
官能基化モノマーの合成
例として、Ｎ−メタクリロイル−６−アミノカプロン酸ヒドロキシスクシンイミドエステルの合成について説明する。反応経路を、以下に示す。図中、インデックス（ｉ）〜（ｉｉｉ）は本文中のそれぞれの工程の記述に対応するものである。
【００８７】
【化２】
2004505170.tif 000004
【００８８】
（ｉ）　１００ｍｌの水と５０ｍｌの１，４−ジオキサン中の１３．２ｇの６−アミノカプロン酸と２０ｇのＮａＨＣＯ３の溶液を、５０ｍｌの１，４−ジオキサン中の１０．３ｍｌのメタクリル酸クロリドの溶液に徐々に加えた。溶液を一晩攪拌した。次いで、５０ｍｌの水を加え、混合物を１００ｍｌずつの酢酸エチルで３回洗浄した。水層を希塩酸で酸性（ｐＨ２）にし、次いで１００ｍｌずつの酢酸エチルで３回抽出した。合わせた有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥し、約５０ｍｌの容積まで濃縮し、さらに３５０ｍｌの冷ヘキサンに加えた。この混合物を−２０℃まで冷却すると、生成物が白色結晶として一晩で徐々に分離した（収量：約１４ｇ）。
【００８９】
（ｉｉ）　３００ｍｌの塩化メチレン中の１４ｇのその酸の溶液を５℃に冷却し、８．２ｇのＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）と１４．６ｇのＮ，Ｎ−ジシクロヘキシルカルボジイミドを加えた。混合物を５℃で一晩保持した。析出物（ジシクロヘキシル尿素）をろ過で除き、溶媒を留去した。この工程中、ある場合には更に尿素が分離するが、同様にろ過で除いた。粗生成物をイソプロパノールから再結晶し、約１５ｇのＮＨＳエステルモノマーを得た。
【００９０】
多官能性ポリマーネットワークの生成
以下の成分を含む溶液を用いた。
【００９１】
４０モル％のＮ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド（水膨潤性ベースポリマー用）
１０モル％のＮ−メタクリロイル−６−アミノカプロン酸ヒドロキシスクシンイミドエステル（官能基化された繰返し単位用）
５モル％のエチレングリコールビスメタクリレート（架橋単位用）
１モル％のアゾビスイソブチロニトリル（開始剤として）
残余（１００モル％になるまで）のエタノール
この溶液を型に入れ、その型を開始剤で修飾した基質（固定化開始剤を有する）上にきつく押し当てた。７０℃に加熱したのち、重合を１０時間行った。その後、型を取り除き、得られた表面に結合したネットワークをエタノールで洗浄した。
【００９２】
オリゴペプチド鎖の検出
得られた表面を１ｎｌの１０μＭオリゴヌクレオチド溶液にさらし、水溶液中で約４０〜５０℃にて２時間カップリング反応を進行させた。
【００９３】
合成オリゴヌクレオチドは５−アミノ修飾体であり、溶液は１００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液でｐＨ８．０に緩衝した。カップリング反応の後、センサー表面をリン酸ナトリウム緩衝液でリンスした。並行検出用センサー表面上の特定タイプのオリゴヌクレオチドの空間的な外廷を明確にするために、反応物を多官能性ポリマーネットワーク上に印刷した。
【００９４】
このように調製された表面を、２ｘＳＳＣ、１０％硫酸デキストランおよび５０％ホルムアミドの緩衝液中、１２時間２８℃でＣｙ５標識ＰＣＲ産物と反応させた。ＤＮＡ含量は１００ｎｇＤＮＡ／８０μｌ試料であった。ハイブリダイゼーション反応が生起したのち、表面をＳＳＣ−緩衝液中で洗浄し、結果をレーザーでの活性化を介して、ＣＣＤカメラを用い、蛍光分析で検出した。蛍光シグナルは、ＰＣＲ産物と相補性がある合成オリゴヌクレオチドを有する領域についてのみ検出することができた。
【国際公開パンフレット】
2004505170.tif 000005
2004505170.tif 000006
2004505170.tif 000007
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2004505170.tif 000010
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2004505170.tif 000039
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004505170.tif 000040
【国際調査報告】
2004505170.tif 000041
2004505170.tif 000042
2004505170.tif 000043