(57)【要約】本発明は、ポリペプチドが三次構造にある場合にポリペプチドのα−ヘリックスドメイン上に露出される２個またはそれ以上のアミノ酸残基の置換により改変できるタンパク質骨格、例えば鳥類膵臓ポリペプチドを提供する。
2004528802.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１個のアミノ酸残基の置換により改変された鳥類膵臓ポリペプチドであって、上記の少なくとも１個の残基が、ポリペプチドが三次形態にある場合にポリペプチドのα−ヘリックスドメイン上に露出している鳥類膵臓ポリペプチド。
【請求項２】
少なくとも６個の置換残基が置換されている、請求項１記載の改変ポリペプチド。
【請求項３】
少なくとも８個の置換残基が置換されている、請求項１記載の改変ポリペプチド。
【請求項４】
少なくとも１０個の置換残基が置換されている、請求項１記載の改変ポリペプチド。
【請求項５】
少なくとも１２個の置換残基が置換されている、請求項１記載の改変ポリペプチド。
【請求項６】
上記の少なくとも１個の置換残基が、既知タンパク質を介して他の分子との相互作用が起きる該既知タンパク質上のいずれかの部位より選択される、請求項１記載の改変ポリペプチド。
【請求項７】
既知タンパク質がＧＣＮ４、ＣＥＢＰ、Ｍａｘ、ＭｙｃおよびＭｙｏＤよりなる群より選ばれる、請求項６記載の改変ポリペプチド。
【請求項８】
部位が結合部位である、請求項１記載の改変ポリペプチド。
【請求項９】
結合部位がＤＮＡ結合部位である、請求項８記載の改変ポリペプチド。
【請求項１０】
ＤＮＡ結合部位が、ＣＲＥハーフサイト、ＣＥＢＰハーフサイト、ＭｙｏＤハーフサイトおよびＱ５０エングレイルド変異部位よりなる群より選ばれる、請求項９記載の改変ポリペプチド。
【請求項１１】
結合部位がタンパク質結合部位である、請求項８記載の改変ポリペプチド。
【請求項１２】
既知タンパク質がダブルマイニュート２、Ｂｃｌ−２、プロテインキナーゼＡ、ＪｕｎおよびＦｏｓよりなる群より選ばれている、請求項６記載の改変ポリペプチド。
【請求項１３】
既知タンパク質と他の分子との間の相互作用が阻害されている、請求項１から１２までのいずれかに記載の改変鳥類膵臓ポリペプチド。
【請求項１４】
請求項１から１２までのいずれかに記載の改変鳥類膵臓ポリペプチドを発現する複数の組換えファージを含んでなるファージディスプレイライブラリー。
【請求項１５】
請求項１から１２までのいずれかに記載の改変鳥類膵臓ポリペプチドを発現する複数の組換えファージを含んでなるファージディスプレイライブラリー。
【請求項１６】
少なくとも１個のアミノ酸残基の置換により改変されたタンパク質骨格を発現する複数の組換えファージを含んでなるファージディスプレイライブラリーであって、上記の少なくとも１個の残基が、ポリペプチドが三次形態にある場合にポリペプチド上に露出しているファージディスプレイライブラリー。
【請求項１７】
該タンパク質骨格が鳥類膵臓ポリペプチドを含んでなる、請求項１６記載のファージディスプレイライブラリー。
【請求項１８】
請求項１６または１７記載のライブラリーより選ばれるファージ。
【請求項１９】
（ａ）配列番号８、９、１０、１１、１２、１３、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３１、３３、３４、３５、３６、３７、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、７０、７１または７２のアミノ酸配列を含んでなる単離されたポリペプチド、
（ｂ）配列番号８、９、１０、１１、１２、１３、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３１、３３、３４、３５、３６、３７、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、７０、７１または７２の少なくとも１２個のアミノ酸のフラグメントを含んでなる単離されたポリペプチド、
（ｃ）配列番号８、９、１０、１１、１２、１３、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３１、３３、３４、３５、３６、３７、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、７０、７１または７２のアミノ酸配列を含んでなり、１個またはそれ以上の保存性アミノ酸置換を含んでなる単離されたポリペプチド、
（ｄ）配列番号８、９、１０、１１、１２、１３、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３１、３３、３４、３５、３６、３７、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、７０、７１または７２のアミノ酸配列を含んでなり、１個またはそれ以上の天然に存在するアミノ酸配列置換を含んでなる単離されたポリペプチド、および
（ｅ）配列番号８、９、１０、１１、１２、１３、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３１、３３、３４、３５、３６、３７、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、７０、７１または７２に少なくとも９５％のアミノ酸相同を有する単離されたポリペプチド
よりなる群より選ばれる単離されたポリペプチド
【請求項２０】
請求項１９中のポリペプチドのいずれか１種をコードする核酸。
【請求項２１】
（ａ）既知タンパク質と他の分子との間の結合に寄与する少なくとも１個のアミノ酸残基を同定し、そして
（ｂ）ポリペプチドが三次形態にある場合に、上記の少なくとも１種のアミノ酸残基がポリペプチドのα−ヘリックスドメイン上に露出するように、上記の少なくとも１個のアミノ酸残基の置換により鳥類膵臓ポリペプチドを改変する、
段階を含んでなる、既知タンパク質と他の分子との間の相互作用を調節するミニタンパク質を調製する方法。
【請求項２２】
既知タンパク質と他の分子との間の会合を調節するタンパク質骨格を提示する請求項１６記載のファージディスプレイライブラリーから、少なくとも１種の組換えファージクローンを単離する段階を含んでなる、既知タンパク質と他の分子との間の相互作用を調節するミニタンパク質を同定する方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
［関連出願との関係］
本特許出願は、２０００年４月２４日付け出願の米国仮出願６０／１９９，４０８号および２０００年１０月１３日付け出願の米国仮出願６０／２４０，５６６号、および２００１年１月１３日および２００１年２月２３日付け出願の名称「高い親和性および特異性をもってＤＮＡまたはタンパク質を結合する小型ポリペプチド分子」を有する米国仮出願の利益を主張する。これらの出願は、その全体を引用することによって本明細書中に編入される。
【０００２】
本発明は、米国国立衛生研究所補助金５−Ｒ０１−ＧＭ５９４８３号により一部分に政府支援を受けた。
【０００３】
［発明の分野］
本発明は、ポリペプチドが三次形態にある場合にポリペプチドのα−ヘリックスドメイン上に露出される少なくとも１個のアミノ酸残基の置換により改変されるポリペプチド骨格（ｓｃａｆｆｏｌｄ）、例えば鳥類膵臓ポリペプチドに関する。本発明はかかる骨格のためのファージディスプレイライブラリーにも関する。
【０００４】
［発明の背景］
多数のタンパク質は核酸、他のタンパク質または巨大分子集合を部分的に露出されたα−ヘリックスを用いて認識する。本来のタンパク質折り畳みの範囲内で、かかるα−ヘリックスは通常、α−ヘリックス由来および相互由来の両方からの一次配列内で遠位であってもよい残基と広範な三次相互作用により安定化される。顕著な例外（Ａｒｍｓｔｒｏｎｇ ｅｔ ａｌ．， （１９９３） Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２３０， ２８４−２９１） はあるが、これらの三次相互作用の排除はα−ヘリックスを不安定化しそして折り畳まれもせずまた巨大分子認識の機能もない分子となる（Ｚｏｎｄｌｏ ＆ Ｓｃｈｅｐａｒｔｚ， （１９９９） Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． ６９３８−６９３９）。小さい分子の範囲内でα−ヘリックスの認識性を回復または多分改善する能力は、タンパク質機能の合成模擬剤または阻害剤の設計（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ ｅｔ ａｌ．， （１９９７） Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｓｔｒｕｃｔ． Ｂｉｏｌ． ７， ４５７−４６２）またはプロテオミクス研究のための新しい道具として用途を見いだすに違いない。
【０００５】
さもなければ非構造性のペプチド配列上にα−ヘリックス構造を与えるために、２種類の基本的に異なる方法が採用されている。一つの方法は、ヘリックス開始（Ｋｅｍｐ ｅｔ ａｌ．， （１９９１） Ｊ． Ｏｒｇ． Ｃｈｅｍ． ５６， ６６８３−６６９７） またはヘリックス伝播（Ａｎｄｒｅｗｓ ＆ Ｔａｂｏｒ， （１９９９） Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ ５５， １１７１１−１１７４３； Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ ＆ Ｇｒｕｂｂｓ， （１９９８） Ａｎｇｅｗ． Ｃｈｅｍ． Ｉｎｔ． Ｅｄ． Ｅｎｇ． ３７， ３２８１−３２８４； Ｓｃｈａｆｍｅｉｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ．， （２０００） Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． １２２， ５８９１−５８９２）に有利な改変アミノ酸または代用物を使用する。多分最大の成功は、ペプチドのｉとｉ＋７位置を長距離ジスルフィド結合を用いて結合して、ヘリックス構造が高温で維持される分子を生成することで実現した（Ｊａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９１） Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． １１３， ９３９１−９３９２）。第二の方法（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ ｅｔ ａｌ．， （１９９７） Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｓｔｒｕｃｔ． Ｂｉｏｌ． ７， ４５７−４６２； Ｎｙｇｒｅｎ， （１９９７） Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｓｔｒｕｃｔ． Ｂｉｏｌ． ７， ４６３−４６９） は、与えられた認識配列を取り巻く広範な三次構造をはぎ取り、機能を有する可能な限り最小の分子を生成することである。この戦略は、タンパク質ＡのＺドメイン（５９アミノ酸）および心房性ナトリウム利尿ペプチド（２８アミノ酸）の最小バージョンを生成した。それぞれ３３個および１５個のアミノ酸の２種の最小化タンパク質は、高い生物学的活性を示した（Ｂｒａｉｓｔｅｄ ＆ Ｗｅｌｌｓ， （１９９６） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．， ＵＳＡ ９３， ５６８８−５６９２； Ｌｉ ｅｔ ａｌ．， （１９９５） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７０， １６５７−１６６０）。この成功にもかかわらず、α−ヘリックスエピトープが一次配列全体に分散する残基により安定化される多数の場合にこの短小化戦略の簡単で一般的な適用を予想することは困難である。
【０００６】
この限界を考慮して、タンパク質グラフト化と呼ばれるタンパク質短小化のためのさらに順応性がある方法が使用されている。その概要は、タンパク質グラフト化は、分子認識のために必要な残基をそれらの本来のαヘリックスのコンテクストから取り去りそして小さいがしかし安定なタンパク質よりもたらされる骨格上にこれらをグラフトすることを含む。多数の研究者がタンパク質骨格を操作して比較的小さいペプチドキャリヤー上に結合残基を存在させるようにした。これらの骨格は、選択された標的への結合のために重要な残基がその上にグラフトできる小さいペプチドである。これらの残基の空間配列が本来のタンパク質内に見いだされるものを模擬するように、グラフトした残基を特定の位置に配列する。これらの骨格系は一般にミニタンパク質（ｍｉｍｉｐｒｏｔｅｉｎ） と呼ばれる。その共通の特徴は、ミニタンパク質が構築される前に結合残基が既知であることである。
【０００７】
これらのミニタンパク質の例は、３７個アミノ酸タンパク質のカリブドトキシン（ｃｈａｒｙｂｄｏｔｏｘｉｎ）（Ｖｉｔａ ｅｔ ａｌ．， （１９９５） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９２， ６４０４−６４０８； Ｖｉｔａ ｅｔ ａｌ．， （１９９８） Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ ４７， ９３−１００） および３６アミノ酸タンパク質である鳥類膵臓ペプチド（Ｚａｎｄｌｏ ＆ Ｓｃｈｅｐａｒｔｚ， （１９９９） Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． １２１， ６９３８−６９３９）を含む。鳥類膵臓ペプチド（ａＰＰ）は、残基１４〜３２が、残基１〜８により形成されるＮ−末端タイプＩＩポリプロリン（ＰＰＩＩ）ヘリックスとの疎水性接触により安定化されたα−ヘリックスを形成するポリペプチドである。この小さいサイズと安定性により、ａＰＰはα−ヘリックス認識エピトープのタンパク質グラフト化のための優れた骨格である（Ｚａｎｄｌｏ ＆ Ｓｃｈｅｐａｒｔｚ， （１９９９） Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． １２１， ６９３８−６９３９） 。
【０００８】
［発明の要約］
本発明は、少なくとも１個のアミノ酸残基の置換により改変された鳥類膵臓ペプチドを包含し、この残基は、ポリペプチドが三次形態にある場合にポリペプチドのα−ヘリックスドメイン上に露出している。一部の態様では、改変されたポリペプチドは少なくとも６個の置換された残基を含み、また他の態様ではこれは８個の置換残基を含み、また他の態様ではこれは１０個の置換残基を含み、またらに別の態様ではこれは少なくとも１２個の置換残基を含む。
【０００９】
置換残基は、これを介して他の分子との相互作用がおきる既知のタンパク質上のいかなる部位からも選択される。既知のタンパク質は、これらに限定はされないが、ＧＣＮ４、ＣＥＢＰ、Ｍａｘ、Ｍｙｃ、ＭｙｏＤ、ダブルマイニュート２（ｄｏｕｂｌｅ ｍｉｎｕｔｅ ｔｗｏ） 、Ｂｃｌ−２、プロテインキナーゼＡ、ＪｕｎおよびＦｏｓを含む。好ましい態様では、既知タンパク質上の部位は結合部位である。一部の態様では、改変された鳥類膵臓ポリペプチドは、既知タンパク質と他の分子との間の相互作用を阻害することが可能であり、一方他の態様では、これは相互作用を促進することが可能である。一部の態様では、結合部位はＤＮＡ結合部位であり、一方他の場合にはこれはタンパク質結合部位である。好ましいＤＮＡ結合部位は、ＣＲＥハーフサイト（ｈａｌｆ ｓｉｔｅ） 、ＣＥＢＰ部位、ＭｙｏＤハーフサイトおよびＱ５０エングレイルド変異部位（ｅｎｇｒａｉｌｅｄ ｖａｒｉａｎｔ ｓｉｔｅ）を含むがこれらに限定はされない。
【００１０】
本発明は、本発明の上記の改変された鳥類膵臓ポリペプチドのいずれかを発現する複数の組換えファージを含んでなるファージディスプレイライブラリーも包含する。関連する態様では、本発明は、少なくとも１個のアミノ酸残基の置換により改変されたタンパク質骨格を発現する複数の組換えファージを含んでなるファージディスプレイライブラリーを包含し、この残基は、ポリペプチドが三次形態にある場合にポリペプチド上に露出される。一部の態様では、ファージディスプレイライブラリーのタンパク質骨格は、鳥類膵臓ポリペプチドを含んでなる。本発明は、本発明のファージライブラリーより選択された単離されたファージを包含する。
【００１１】
本発明はさらに配列番号８、９、１０、１１、１２、１３、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３１、３３、３４、３５、３６、３７、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、７０、７１または７２のアミノ酸配列を含んでなる単離されたポリペプチド；配列番号８、９、１０、１１、１２、１３、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３１、３３、３４、３５、３６、３７、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、７０、７１または７２の少なくとも１２個のアミノ酸のフラグメントを含んでなる単離されたポリペプチド；配列番号８、９、１０、１１、１２、１３、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３１、３３、３４、３５、３６、３７、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、７０、７１または７２のアミノ酸配列を含んでなり、１個またはそれ以上の保存性アミノ酸置換を含んでなる単離されたポリペプチド；配列番号８、９、１０、１１、１２、１３、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３１、３３、３４、３５、３６、３７、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、７０、７１または７２のアミノ酸配列を含んでなり、１個またはそれ以上の天然に存在するアミノ酸配列置換を含んでなる単離されたポリペプチド；および配列番号８、９、１０、１１、１２、１３、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３１、３３、３４、３５、３６、３７、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、７０、７１または７２に少なくとも９５％のアミノ酸相同を有する単離されたポリペプチド；を含んでなる群より選ばれた単離されたポリペプチドをさらに包含する。関連する態様では、本発明は、本発明の上記のポリペプチドのいずれか１種をコードする核酸も包含する。
【００１２】
本発明は、既知タンパク質と他の分子との間の会合に寄与する少なくとも１個のアミノ酸残基を同定し、そして上記のポリペプチドが三次形態にある場合に、少なくとも１種のアミノ酸残基がポリペプチドのα−ヘリックスドメイン上に露出するように、上記の少なくとも１個のアミノ酸残基の置換により鳥類膵臓ポリペプチドを改変する段階を含んでなる、既知タンパク質と他の分子との間の相互作用を調節するミニタンパク質を調製する方法を包含する。
【００１３】
本発明は、さらに、既知タンパク質と他の分子との間の会合を調節するタンパク質骨格を提示する本発明記載のファージディスプレイライブラリーから少なくとも１種の組換えファージクローンを単離する段階を含んでなる、既知タンパク質と他の分子との間の相互作用を調節するミニタンパク質を同定する方法を包含する。
【００１４】
［発明の詳細な記述］
定義
本明細書中に使用される場合に、「結合」という用語は、２個の分子種の間の特定の会合（ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ） または他の特定の相互作用、例えば、これらに限定はされないが、タンパク質−ＤＮＡ相互作用およびタンパク質−タンパク質相互作用を呼ぶ。例えば、タンパク質とそれらのＤＮＡ標的、受容体とそれらのリガンド、酵素とそれらの基質の間の特定の会合である。かかる会合は、２個の相互作用する分子種のそれぞれの上の特定の部位を介して媒介されると考えられる。結合は、構造的および／またはエネルギー的成分により媒介され、後者は反対荷電を有する分子との相互作用を含んでなる。
【００１５】
本明細書中に使用される用語「結合部位」とは、その特定の結合において他の分子と直接関与する巨大分子の反応性領域またはドメインを呼ぶ。例えば、タンパク質または核酸上の結合部位に関係する場合には、結合は、他の分子と相互作用しそして集合的に「結合部位」と呼ばれる特定のアミノ酸または核酸配列それぞれの存在の結果として起きる。
【００１６】
本明細書中に使用される用語「α−ヘリックスドメイン上に露出」とは、例えば鳥類膵臓ポリペプチド内に置換されたアミノ酸が他の分子との会合または相互作用に利用でき、そして鳥類膵臓ポリペプチド上の他のアミノ酸残基にさもなければ結合または会合しないことを意味する。この用語は、用語「溶剤−露出α−ヘリックス面」と本明細書中で相互に互換可能に使用される。
【００１７】
本明細書中に使用される場合に、用語「小型タンパク質（Ｍｉｎｉａｔｕｒｅ ｐｒｏｔｅｉｎ）」または「ミニタンパク質」とは、少なくとも１個のタンパク質骨格およびその三次構造を安定化することを助ける１個またはそれ以上の追加のドメインまたは領域を含む比較的小さいタンパク質を呼ぶ。
【００１８】
本明細書中に使用される場合に、用語「調節」は、２種の分子種の間の会合、例えば、競合的または非競合的な様式で相互作用の特性を改変することによりその標的と相互作用する生物学的剤の有効性を改変することを呼ぶ。
【００１９】
本明細書中に使用される場合に、用語「タンパク質」は、炭素、水素、酸素、窒素および通常は硫黄を含む複雑な有機化合物のいずれかの群を呼び、その特性的な元素は窒素であり、そしれこれは植物および動物中に広範に分布している。２０種の異なるアミノ酸がタンパク質内に通常見いだされそしてそれぞれのタンパク質は、その特定の形状および機能を決定する独自で遺伝的に定義されたアミノ酸配列を有する。用語「タンパク質」は、本明細書中で一般にペプチドおよびポリペプチドの用語と互換的に使用される。
【００２０】
本明細書中に使用される場合に、用語「タンパク質骨格」は、比較的小さいタンパク質、例えば小型タンパク質の領域またはドメインを呼び、これは固定されたコンホーメーションで１種またはそれ以上の特定のアミノ酸残基を示すように改変されることができる保存された三次構造モチーフを有する。
小型タンパク質
本発明は、ＤＮＡの特定の配列、または他のタンパク質と会合（すなわち、またはこれに結合）する操作された小型タンパク質を提供し、そしてこれらの小型タンパク質を設計および調製するための方法も提供する。これらの小型タンパク質は、例えばＤＮＡまたは他のタンパク質に高い親和性および選択性をもって結合する。概念的に、本発明は発明者がタンパク質グラフト化と呼ぶ技術を含む（例えば図１参照）。一つの局面では、この技術はタンパク質とその特定の結合相手との間の結合形の会合に関与する球状タンパク質からの重要な結合部位残基を特定し、次いでこれらの残基を小さいがしかし安定なタンパク質骨格上にグラフトする。本発明の好ましいタンパク質骨格は、膵臓折り畳み（ＰＰ折り畳み）タンパク質ファミリー、特には鳥類膵臓ポリペプチドのメンバーを含んでなる。
【００２１】
本発明のＰＰ折り畳みタンパク質骨格は、一般に３６個のアミノ酸を含みそして最小の既知球状タンパク質である。それらが小さいにもかかわらす、ＰＰ折り畳みタンパク質は安定でありそして生理学的条件下で折り畳まれたままである。本発明の好ましいＰＰ折り畳みタンパク質骨格は、２個の逆平行ヘリックス、アミノ酸残基２および８の間のＮ−末端タイプＩＩポリプロリンヘリックス（ＰＰＩＩ）および残基１４および３１および／または３２との間のα−ヘリックスから成る。本発明のＰＰ折り畳みタンパク質骨格の安定性は、位置１７、２０、２４、２７、２８、３０および３１でのα−ヘリックスの内面上の疎水性残基と位置２、４、５、７および８におけるポリプロリンヘリックスの２個の端部上の残基との間の相互作用に主として由来する。一般に、その三次構造を安定化することに関係する残基は、小型タンパク質の三次構造を維持するために置換されないかまたはファージ提示を用いるために補償される。
【００２２】
一部の態様では、例えば選択された球状タンパク質の重要な結合部位残基の２個またはそれ以上が、三次構造を維持するために本質的ではない位置、好ましくは溶剤露出α−ヘリックス面上でタンパク質骨格上にグラフトされる。一つの好ましい態様では、６個またはそれ以上のかかる結合部位残基がタンパク質骨格上にグラフトされる。さらに好ましい態様では、８個またはそれ以上のかかる結合部位残基がタンパク質骨格上にグラフトされる。もっとさらに好ましい態様では、１０個またはそれ以上のかかる結合部位残基がタンパク質骨格上にグラフトされる。最も好ましい態様では、１２個またはそれ以上のかかる結合部位残基がタンパク質骨格上にグラフトされる。タンパク質骨格上のこれらの結合部位残基をグラフトするために好ましい位置は、これらに限定はされないが、ａＰＰの溶剤露出α−ヘリックス面上の位置を含む。結合部位残基の置換は、好ましさは低いが、小型タンパク質の三次構造を安定化することに関係する残基に対して行ってもよい。
【００２３】
熟練者は、グラフトされた残基の実際の置換は、タンパク質骨格上に起きる必要はないことを容易に認めるであろう。どちらかといえば、ペプチドは、例えば、本発明の会合特性を有する小型タンパク質を構成するポリペプチドを含んでなるファージ提示を介して同定される必要がある。かかるペプチドは、合成および組換え技術を含み、これらに限定はされないあらゆる慣用の手段を用いて調製されてもよい。
【００２４】
本発明が意図するタンパク質骨格のＰＰ折り畳みファミリーのメンバーは、鳥類膵臓ポリペプチド（ａＰＰ）、ニューロペプチドＹ、低位（ｌｏｗｅｒ） 腸ホルモンポリペプチドおよび膵臓ペプチドを含み、これらに限定はされない。最も好ましい態様では、タンパク質骨格は、ＰＰ折り畳みタンパク質、鳥類膵臓ポリペプチド（配列番号０６）（例えばＢｌｕｎｄｅｌｌ ｅｔ ａｌ．， （１９８１） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７８， ４１７５−４１７９； Ｔｏｎａｎ ｅｔ ａｌ．， （１９９０） Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２９， ４４２４−４４２９ 参照） を含んでなる。ａＰＰは、１８残基α−ヘリックスへのタイプＩベータターンを介して連結された短い（８残基）アミノ末端タイプＩＩポリプロリンヘリックスを特徴とするＰＰ折り畳みポリペプチドである。その小さいサイズおよび安定性のために、ａＰＰは、例えばα−ヘリックス認識エピトープのタンパク質グラフト化のための優れたタンパク質骨格である。
ＤＮＡ結合小型タンパク質
別の局面では、本発明は特定のＤＮＡ配列に結合する小型タンパク質を包含しそしてさらにかかる小型タンパク質を調製および使用するための方法を包含する。一部の態様では、これらのＤＮＡ配列は、特定のＤＮＡ配列に結合する既知タンパク質のための部位を含んでなる（意図する既知タンパク質は、例えばプロモーターまたはレギュレーターである）。例えば、ＤＮＡ結合小型タンパク質の設計の際に、その特定のＤＮＡ配列へのタンパク質の結合またはその他の会合に関与する既知タンパク質のアミノ酸残基を特定する。
【００２５】
本発明の一部の態様では、関連する結合残基は、結晶学的研究に基づくタンパク質またはタンパク質複合体の三次元モデルを用いて特定され、一方別の態様では、これらはタンパク質の欠損または置換変異の研究により特定される。次いで、特定のＤＮＡ配列へのタンパク質結合に関与する残基を、ＤＮＡ結合小型タンパク質を形成するためにタンパク質骨格の三次構造を維持するために必要ではない小型タンパク質の位置上にグラフトする。かかる位置の特定は、当該技術分野の熟練者により経験的に容易に決定できる。本発明の他の態様は、特異性ＤＮＡ（または別の場合にはタンパク質）配列またはモチーフへの特異性会合または結合が可能なペプチド種を含む改変されたミニタンパク質のライブラリーのスクリーニングを含む。
【００２６】
一般に、ＤＮＡ配列上のいかなる潜在的結合部位も本発明のＤＮＡ結合小型タンパク質を用いて標的できると考えられる。好ましい態様は、ＤＮＡ結合部位へ結合するヘリックス構造を含む。一部の態様では、結合は、塩基領域ロイシンジッパー（ｂＺＩＰ）構造を含み（Ｋｏｎｉｇ ＆ Ｒｉｃｈｍｏｎｄ， （１９９５） Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２５４， ６５７−６６７） 、一方別の態様では、構造は塩基性−ヘリックス−ループ−ヘリックス（ｂＨＬＨ）構造を含む（Ｓｈｉｍｉｚｕ ｅｔ ａｌ．， （１９９７） ＥＭＢＯ Ｊ． １６， ４６８９−４６９７）。別の態様では、結合はホメオドメインタンパク質内に見いだされるものと同様の構造を含む（Ｓｃｏｔｔ ＆ Ｗｅｉｍｅｒ， （１９８４） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ８１， ４１１５−４１１９） 。好ましいｂＺＩＰ構造は、ＧＣＮ４およびＣ／ＥＢＰ−デルタ内に見いだされるものを含み、これらに限定はされず（Ｓｕｃｋｏｗ ｅｔ ａｌｌ．， （１９９３） ＥＭＢＯ Ｊ． １２， １１９３−１２００）、一方、好ましいｂＨＬＨ構造は、Ｍａｘ（Ｆｅｒｒｅ−Ｄ’Ａｍａｒｅ ｅｔ ａｌ．， （１９９３） Ｎａｔｕｒｅ ３６３， ３８−４５）、ＭｙｃおよびＭｙｏＤ（Ｍａ ｅｔ ａｌ．， （１９９４） Ｃｅｌｌ ７７， ４５１−４５９）中に見いだされるものを含み、これらに限定はされない。好ましいホメオドメイン構造は、Ｑ５０エングレイルド変異タンパク質中に見いだされるものを含み、これらに限定はされない（Ｋｉｓｓｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．， （１９９０） Ｃｅｌｌ ６３， ５７９−５９０） 。
【００２７】
一つの態様では、本発明は、ｃＡＭＰ応答エレメント（ＣＲＥ）ハーフサイトプロモーターＤＮＡ配列（ＡＴＧＡＣ）（配列番号６５）に結合するＤＮＡ結合小型タンパク質を包含する。結合のために本質的な残基は、この配列に結合するｂＺＩＰタンパク質であるタンパク質ＧＣＮ４から同定される。これらの残基は、ｈｓＣＲＥに結合するＧＣＮ４タンパク質の三次元構造を利用しそしてこれらの残基をタンパク質骨格上にグラフトすることにより同定される。ＧＣＮ４（配列番号７）のＣＲＥハーフサイト（ｈｓＣＲＥ）への結合に本質的であるａＰＰの溶剤露出α−ヘリックス面またはドメイン上の残基の種々の組合せをグラフトして、ＧＣＮ４のＤＮＡ接触残基の大部分またはすべておよびａＰＰの折り畳み残基の大部分またはすべてを含む一連のポリプロリンヘリックス塩基性領域（ＰＰＢＲＳＲ）分子が生成される（図２）。この手順は、本質的なＤＮＡ接触およびａＰＰ折り畳み残基がヘリックス上の単一位置を占める３位置（Ｔｙｒ２７、Ｌｅｕ２８およびＶａｌ３０）を生成した（図２）。
【００２８】
ｈｓＣＲＥに結合するＤＮＡ結合小型タンパク質の例は、配列番号１１（ＰＰＢＲ２ＳＲ）、１２（ＰＰＢＲ４ＳＲ）、１３（Ｇ２７）および１４（ＰＰＢＲ４ΔＳＲ）に記載してあるアミノ酸配列を含み、これらに限定はされない。
【００２９】
別の態様では、タンパク質グラフト化が、ＤＮＡ結合性がＣＣＡＡＴ／エンハンサータンパク質Ｃ／ＥＢＰ−デルタのものを模擬する小型タンパク質の設計のために使用された。Ｃ／ＥＢＰ−デルタは、Ｃ／ＥＢＰ−アルファ、Ｃ／ＥＢＰ−ベータ、Ｃ／ＥＢＰ−ガンマ、Ｃ／ＥＢＰ−デルタおよびＣ／ＥＢＰ−イプシロンを含むｂＺＩＰ転写因子のＣ／ＥＢＰサブファミリーの一員である。Ｃ／ＥＢＰタンパク質はｂＺＩＰスーパーファミリーの一員ではあるが、これらはＤＮＡ認識ヘリックス内でＧＣＮ４とは数個の残基が異なる。具体的には、Ｃ／ＥＢＰ−デルタとＧＣＮ４とは、塩基または糖と接触する残基６個の内２個およびＧＣＮ４  ＤＮＡ複合体のすべての公開された構造内でリン酸と接触する残基６個の内３個が異なる。これらの変化、ならびに位置１５におけるチロシンまたはアラニンの置換は、ＧＣＮ４により認識されるＣＲＥ部位（ＡＴＧＡＣＧＴＣＡＴ）（配列番号６８）を越えるＣ／ＥＢＰ部位（ＡＴＴＧＣＧＣＡＡＴ）（配列番号６７）とのＣ／ＥＢＰタンパク質の優先的な相互作用に貢献する。
【００３０】
本発明によるＰＰＥＢＰ（ポリプロリン−エンハンサー結合タンパク質）の設計のために、グラフト化プロトコール中の第一段階は、ａＰＰのα−ヘリックス（残基１４−３６）と関係するタンパク質のα−ヘリックス領域との整列（ａｌｉｇｎｍｅｎｔ） である。ａＰＰα−ヘリックスとヒトＣ／ＥＢＰ−デルタの残基１８７−２２１（ＤＮＡ結合塩基性セグメント）との整列は、３個の相違する位置を特定し（ａＰＰナンバリングシステムによると２７、２８および３０）、ここで、Ｃ／ＥＢＰ−デルタ内のＤＮＡ接触残基とａＰＰ内の折り畳み残基とではヘリックス上の同じ位置を占めていた。本発明のＰＰＥＢＰ１ＳＲ（配列番号４７）小型タンパク質は、位置２７、２８および３０でＣ／ＥＢＰ−デルタに由来するアルギニン残基を含んで結合エネルギーを保存し、それはＰＰＥＢＰ小型タンパク質による高親和性ＤＮＡ認識が、折り畳みエネルギーの随伴する損失にもかかわらずこれらの位置でのＤＮＡ接触残基の保持により増進されるからである。さらに、チロシン、アスパラギンおよびバリン残基は、それぞれ位置１５、２３および２６において置換されてＣ／ＥＢＰハーフサイトＡＴＴＧＣ（ｈｓＣＥＢＰ）の特異性認識を促進する。最後に、Ｃ／ＥＢＰ−デルタ中に見いだされる潜在的にコア破壊性および複合体不安定化性アスパラギン酸の代わりに、そしてａＰＰのこの位置に存在するヘリックス不安定化バリンの代わりに位置３１にアラニン残基が挿入される。
【００３１】
Ｃ／ＥＢＰ部位に結合するＤＮＡ結合小型タンパク質の例は、配列番号４７（ＰＰＥＢＰ１ＳＲ）、４８（ＰＰＥＢＰ２ＳＲ）および４９（ＥＢＰ１ＳＲ）中に示されるアミノ酸配列を含み、これらに限定はされない。
ファージ提示を用いる小型タンパク質の産生
一部の態様では、小型タンパク質はファージ提示法（ＭａＣａｆｆｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ．，（１９９０） Ｎａｔｕｒｅ ３４８， ５５２−５５４）を用いて産生および選択される。かかる方法中では、細菌を感染するウイルスの表面上の組換え小型タンパク質（バクテリオファージまたはファージ）の提示は、広範囲の親和性および動的性質を有する可溶性、組換え小型タンパク質の産生を可能とする。ファージの表面上に小型タンパク質を提示するために、小型タンパク質をコードする合成遺伝子をファージ表面タンパク質（ｐＩＩＩ）をコードする遺伝子内に挿入しそして組換え融合タンパク質がファージ表面上に発現される（ＭａＣａｆｆｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ．，（１９９０） Ｎａｔｕｒｅ ３４８， ５５２−５５４； Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ ｅｔ ａｌ．， （１９９１） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ， １９， ４１３３−４１３７）。変動性は、これらの三次ヘリックス構造を維持するだけでなく、予め選定された標的への増加した親和性も示す小型タンパク質を選定するためにファージディスプレイライブラリー内に導入され、それは、重要な（または貢献はするが重要ではない）結合残基が最適にはヘリックス構造上に位置するからあである。
【００３２】
ファージの表面上の組換えタンパク質は機能性であるので、特定の標的ＤＮＡまたはタンパク質に高い親和性で結合する小型タンパク質を有するファージは、抗原親和性クロマトグラフィーにより非結合性または低親和性ファージから分離できる。ファージの混合物は、親和性マトリックスに結合され、非結合性または低親和性ファージは洗浄により除去され、そして結合ファージは酸またはアルカリを用いる処理により溶離される。標的に対する小型タンパク質の親和性に依存して、２０倍から百万倍の濃縮係数が１回の親和性選択で得られる。しかし、溶離されたファージを用いる細菌の感染により、さらに多数のファージが増殖できそして選択の別の操作にかけられる。この方法で、一回の操作での千倍の濃縮が２回の選択で百万倍の濃縮となる。従って、それぞれの回での濃縮が低い場合でも（Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．， （１９９１） Ｊ． Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ． ２２２， ５８１−５９７）、親和性選択の複数回操作は、結合標的に結合またはさもなければ特異的に会合する組換え小型タンパク質のドメインまたはモチーフの配列をコードする稀なファージおよびその中に含まれる遺伝物質の単離に導く。
【００３３】
本発明の種々の態様において、本明細書中に開示される方法は、上記のタンパク質グラフト化法を用いてすでに選択されたＤＮＡまたはタンパク質に結合が可能な小型タンパク質をコードするファージ発現ライブラリーを作製するために使用される。かかる態様では、ファージ提示は、ファージ提示の助けをかりないで産生された小型タンパク質のものよりも高い特定の標的ＤＮＡまたはタンパク質に対する親和性を示す小型タンパク質を同定するために使用できる。さらに別の態様では、本発明は、エピトープまたは結合配列の組合せ（ｃｏｎｂｉｎａｔｏｒｉａｌ） 組を提示して、天然エピトープまたは認識もしくは会合に本来的に使用される特異性結合残基またはモチーフの事前知識がなくても、小型タンパク質による核酸、タンパク質または小型分子の認識を可能とするために設計できる共通ファージディスプレイライブラリーを包含する。
【００３４】
種々の構造的変化も本発明に意図され、これは例えば遺伝子配列の遺伝子操作を可能とする小型タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列中への制限酵素認識部位の付加を含む。従って、再操作した小型タンパク質は、例えばファージ表面上に融合タンパク質の発現を可能とするＭ１３由来バクテリオファージクローニングベクター内に結合できる。これらの方法は、標的リガンドを結合する融合タンパク質をコードするファージクローンを選択することを許容し、そして小型タンパク質の高処理量スクリーニングを可能とする迅速な様式で完了でき、特定の標的に対する最高の親和性および選択性をもって小型タンパク質を同定する。
【００３５】
本発明の方法に従って、改変小型タンパク質を提示するファージのライブラリーを固定化標的ＤＮＡまたはタンパク質と共にインキュベーションして、固定化ＤＮＡまたはタンパク質に特異的に結合するたかまたは特異的に会合する小型タンパク質をコードするファージクローンを選択する。この方法は、固体基質上にオリゴヌクレオチドまたはポリペプチド試料を固定化することを含む。次いで、結合したファージを固定化オリゴヌクレオチドまたはポリペプチドから解離しそして細菌宿主細胞内で培養して増幅する。それぞれ異なる組換え小型タンパク質を発現する個別のウイルスプラークを増大して、結合アッセイを行うために十分のタンパク質の量を産生する。この組換え結合タンパク質をコードするＤＮＡは、真核タンパク質発現ベクター内への結合のためにその後に改変してもよい。真核細胞内での発現のために適合させた改変小型タンパク質を真核タンパク質発現ベクター内に結合する。
【００３６】
本発明の小型タンパク質を作製するために使用できるファージ提示法は、ブリンクマンら（Ｂｒｉｎｋｍａｎ ｅｔ ａｌ．， （１９９５） Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ １８２， ４１−５０）； アメスら（Ａｍｅｓ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ １８４：１７７−８６）；ケッテルボロら（Ｋｅｔｔｅｌｂｏｒｏｕｇｈ ｅｔ ａｌ．， （１９９４） Ｅｕｒ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２４， ９５２−９５８）；パーシックら（Ｐｅｒｓｉｃｅｔ ａｌ．， （１９９７） Ｇｅｎｅ １８７， ９−１８）； バートンら（Ｂｕｒｔｏｎ ｅｔ ａｌ．， （１９９４） Ａｄｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ５７， １９１−２８０）；米国特許（ＵＳ）第５，６９８，４２６ 号； 第５，２２３，４０９ 号； 第５，４０３，４８４ 号； 第５，５８０，７１７ 号； 第５，４２７，９０８ 号； 第５，７５０，７５３ 号； 第５，８２１，０４７号； 第５，５７１，６９８ 号； 第５，４２７，９０８ 号； 第５，５１６，６３７ 号； 第５，７８０，２２５ 号； 第５，６５８，７２７ 号； 第５，７３３，７４３ 号； 第５，８３７，５００ 号および第５，９６９，１０８ 号の開示を含む。
タンパク質結合小型タンパク質
本発明は他のタンパク質に結合する小型タンパク質およびこれらの小型タンパク質を作製するための方法を包含する。小型タンパク質の結合は、タンパク質−タンパク質および／またはタンパク質−リガンド相互作用を調節する。従って、一部の態様では、結合はリガンドと受容体の会合（または特異性結合）をブロックする。リガンドは、他のタンパク質であることもまた分子のいずれかの他の形式、例えば化学的基質であることもできる。本発明の一つの態様では、本発明のタンパク質結合小型タンパク質を作製することは、リガンドタンパク質のその標的受容体タンパク質への結合に本質的であるアミノ酸残基を同定することを含む。一部の態様では、これらの本質的な残基は、結晶学的研究に基づく他のタンパク質へ結合またはこれと相互作用するタンパク質またはタンパク質複合体の三次元モデルを用いて特定され、一方、他の態様では、これらはタンパク質の欠失または置換変異体の研究により特定される。タンパク質の結合に関与する残基を、次いでタンパク質骨格の三次構造を保存するために不要な位置上にグラフトしてタンパク質結合小型タンパク質を形成する。
【００３７】
他のタンパク質に結合するいかなるタンパク質の構造でも、本発明のタンパク質結合小型タンパク質を誘導するために使用できる。好ましい態様は、ヘリックス構造、例えばＦｏｓとＪｕｎ（Ｋｏｕｚａｒｉｄｅｓ ＆ Ｚｉｆｆ，（１９８８） Ｎａｔｕｒｅ ３３６， ６４６−６５１）、Ｂｃｌ−２とＢａｋ（Ｓａｔｔｌｅｒ ｅｔ ａｌ．， （１９９７） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７５， ９８３−９８６） 、ＣＢＰ−ＫＩＸとＣＲＥＢ−ＫＩＤ（Ｒａｄｈａｋｒｉｓｈｎａｎ ｅｔ ａｌ．， （１９９７） Ｃｅｌｌ ９１， ７４１−７４２） との間、およびＤＭ２へのｐ５３結合（Ｋｕｓｓｉｅ ｅｔ ａｌ．， （１９９６） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７４， ９４８−９５３）のタンパク質−タンパク質相互作用に関与するものを含む。一部の態様では、結合はコイルドコイルタンパク質構造および／またはロイシンジッパーを含む。
【００３８】
本発明の一つの態様では、本明細書中で開示された方法は、Ｂｃｌ−２またはＢｃｌ−ＸＬ タンパク質に結合する小型タンパク質を産生するために使用される（Ｓａｔｔｌｅｒ ｅｔ ａｌ．， （１９９７） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７５， ９８３−９８６） 。この方法では、本明細書中に記載のタンパク質グラフト化方法をＢａｋ−ＢＨ３結合ドメインに適用してＢｃｌ−ＸＬ への結合が可能な小型タンパク質を設計する。この方法では、関係するタンパク質の一次配列をａＰＰのα−ヘリックス内の残基と整列（ａｌｉｇｎ） する。Ｂａｋの位置７４−９２とａＰＰの一次配列のすべての可能な整列を２種の方法で評価する。第一に、ａＰＰヘリックス双極子の疎水性コア形成または維持のために重要な残基と、Ｂｃｌ−ＸＬ を結合するために重要なＢａｋ内の残基との間の一次配列整列内の相違の数を考慮する。多数の相違を有する整列は、良く折り畳まれるかまたは高い親和性を有する配列の間の選択を強要するので排除されるが、しかしこれらの両方の性質を有する分子を単離することを困難とする。
【００３９】
それぞれの整列中でＢｃｌ−ＸＬ のＢＨ３ドメインと会合または複合しているＰＰに基づくペプチドの構造モデルは、Ｂｃｌ−ＸＬ のファンデルワールス（Ｖａｎｄｅｒ Ｗａａｌｓ）面とａＰＰ骨格のバックボーンとの間の不都合な相互作用または立体障害に関して評価される。多数の不都合な相互作用または立体障害を有する構造モデルは以後の考察から排除される。
【００４０】
整列は、構造モデルが立体障害を示唆しなかった１個の相違のみをもって特定される。キメラペプチドのファージディスプレイ発現ライブラリーは最終的にこの整列に基づいた。得られたペプチドのライブラリーをＭ１３ファージの面上に提示しそしてＢｃｌを高い親和性で結合する小型タンパク質の選定および単離に使用した。Ｂｃｌに結合するファージディスプレイライブラリーから単離されたタンパク質結合小型タンパク質の例は、配列番号２３（４１００）、２４（４１０１）、２５（４０９９）および２６（４１０２）に示すアミノ酸配列を含み、これらに限定はされない。
【００４１】
本発明の別の態様では、本発明の方法はヒトガンタンパク質ダブルマイニュート２（ｈＤＭ２）に結合する小型タンパク質を産生するために使用される。ｐ５３およびａＰＰのα−ヘリックスセグメントを整列して、折り畳みに重要ないかなるａＰＰ残基も置換することなくａＰＰの露出されたα−ヘリックス面上の３個の重要なｈＤＭ２接触残基（位置２２、２６および２９）を特定する。ｈＤＭ２と相互作用するｐ５３活性化ドメイン内の多数のｐ５３残基は理想のα−ヘリックス範囲の外側のファイおよびプサイ角を示すので、タンパク質グラフト化のこの適用はα−ヘリックスに沿った５個の位置に多様性を導入し、そして最高の親和性リガンドをファージ提示を用いて選択した。
【００４２】
ｈＤＭ２に結合するファージディスプレイライブラリーから単離されたタンパク質結合小型タンパク質の例は、配列番号３１（ｐ５３ＡＤ）、３３（ｐ３２５４）、３４（ｐ３２５５）、３５（ｐ３５４８）、３６（ｐ３５５９）および３７（ｐ３２５７）に示すアミノ酸配列を含み、これらに限定はされない。
小型タンパク質変種
本発明の小型タンパク質は、本明細書中に記載する小型タンパク質の保存性変種をさらに含む。本明細書中に使用される場合に、保存性変種とは、タンパク質の結合または会合能力を本質的にそして不利に影響しないアミノ酸配列内の改変を呼ぶ。置換、挿入または欠損は、改変された配列がタンパク質と関連する機能または活性を妨害または破壊する場合に、小型タンパク質に不利に影響すると言われる。例えば、小型タンパク質の全体的な電荷、構造または疎水性−親水性的性質は、活性に不利に影響することなく改変できる。従って、アミノ酸配列は、例えば、小型タンパク質の活性に不利に影響することなく、さらなる疎水性または親水性をペプチドに与える様に改変できる。
【００４３】
これらの変種は、以上の記載とは僅かに異なるアミノ酸配列を有するけれども、配列番号８、９、１０、１１、１２、１３、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３１、３３、３４、３５、３６、３７、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、７０、７１または７２中に記載の小型タンパク質と関連する同様または類似した性質をまだ有する。
【００４４】
通常、保存性置換変種は、配列番号８、９、１０、１１、１２、１３、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３１、３３、３４、３５、３６、３７、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、７０、７１または７２中に記載の小型配列と少なくとも９０％のアミノ酸配列一致を有するアミノ酸配列を有し、さらに好ましくは少なくとも９５％、さらに好ましくは少なくとも９８％、そして最も好ましくは少なくとも９９％の一致を有する。かかる配列に関する一致性または相同性は、本明細書中では、配列を整列および必要な場合にはギャップを導入して最高の割合の相同性を達成した後、そしていかなる保存性置換も配列一致の一部として考慮しないで、既知ペプチドと一致している候補配列内のアミノ酸残基の割合として定義される。Ｎ−末端、Ｃ−末端または内部延長、欠損またはペプチド配列内への挿入は相同性に影響するとは解釈されない。
【００４５】
従って、本発明のタンパク質は、配列番号８、９、１０、１１、１２、１３、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３１、３３、３４、３５、３６、３７、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、７０、７１または７２のアミノ酸配列を含んでなる分子、本発明の小型タンパク質の少なくとも約２０、２５、３０、３５またはそれ以上のアミノ酸残基の保存配列を有するそれらのフラグメント、少なくとも１個のアミノ酸残基が、開示された配列のＮ−またはＣ−末端またはその中に挿入されているかかる配列のアミノ酸配列変種、開示された配列のアミノ酸配列変種、または他の残基により置換された上記に定義したそれらのフラグメントを含む。意図する変種は、さらにタンパク質が天然に存在するアミノ酸以外の部分（例えば検出可能な部分、例えば酵素または放射性同位元素）で置換、化学的、酵素的またはその他の適当な手段で共有結合的に改変されたこれらの誘導体を含む。
小型タンパク質をコードする核酸分子
本発明は、配列番号８、９、１０、１１、１２、１３、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３１、３３、３４、３５、３６、３７、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、７０、７１または７２のアミノ酸配列および本明細書中に記載した関連する小型タンパク質を好ましくは単離された形で含んでなる小型タンパク質をコードする核酸分子を提供する。本明細書中に使用される場合に、「核酸」とは、ｃＤＮＡおよびｍＲＮＡ、ならびに別のバックボーンに基づく核酸を含みまたは天然由来または合成されたかのいずれかの別の塩基を含む。
【００４６】
本明細書中に使用される場合に、核酸分子が核酸の起源からの他のポリペプチドをコードする汚染核酸から本質的に分離されている場合に、核酸分子は「単離」されていると呼ばれる。
【００４７】
本発明は、さらにコードする核酸分子のフラグメントも提供する。本明細書中に使用される場合に、「コードする核酸分子のフラグメント」とは、小型タンパク質の配列をコードする全タンパク質の一部分を呼ぶ。フラグメントの大きさは、意図する用途により決定されるであろう。例えば、フラグメントがタンパク質の活性部分をコードするように選定される場合には、フラグメントは、タンパク質の機能性領域（１個または多数）をコードするために十分な大きさである必要がある。かかるフラグメントの適当な大きさおよび範囲は、当該技術分野の熟練者により経験的に決定できる。
【００４８】
翻訳の間にタンパク質配列内に組み込まれるアミノ酸の欠損、付加、または改変による一次構造自体の変更は、小型タンパク質の活性を破壊することなく行うことができる。かかる置換またはその他の改変は、本発明の意図する範囲内に入る核酸によりコードされるアミノ酸配列を有する小型タンパク質をもたらす。
【００４９】
本発明は、コーディング配列を含む組換えＤＮＡ分子を提供する。本明細書中に使用される場合に、組換えＤＮＡ分子とは、分子操作を行われたＤＮＡ分子である。組換えＤＮＡ分子を生成するための方法は、当該技術分野では周知であり、例えばサンブルックら「分子クローニング、実験マニュアル」（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， （１９８９） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）参照。好ましい組換えＤＮＡ分子では、コーディングＤＮＡ配列は、発現制御配列およびベクター配列に操作的に連結している。
【００５０】
本発明のタンパク質ファミリーをコードする配列の一つが操作的に連結しているベクターおよび発現制御配列の選択は、当該技術分野では周知のように、所望の機能的性質（例えばタンパク質発現、および形質転換される宿主細胞）に直接依存する。本発明のベクターは、少なくとも複製または宿主染色体内への挿入を導き、そして好ましくは組換えＤＮＡ分子内に含まれる構造遺伝子の発現させることが可能であってもよい。
【００５１】
操作的に連結した小型タンパク質をコードする配列の発現を調節するために使用される発現制御要素は当該技術分野では公知でありそして、誘導可能なプロモーター、構成的プロモーター、分泌シグナル、およびその他の制御要素を含み、これらに限定はされない。好ましくは、誘導可能なプロモーターは容易に制御され、例えば宿主細胞の培地内の栄養に応答性である。
【００５２】
一つの態様では、コーディング核酸分子を含むベクターは、原核レプリコン、すなわち、それを用いて形質転換された原核細胞、例えば細菌宿主細胞内の染色体外の組換えＤＮＡ分子の自発的複製および維持を導く能力を有するＤＮＡ配列を含む。かかるレプリコンは、当該技術分野では周知である。その上、原核レプリコンを含むベクターは、発現が検出可能な標識、例えば耐薬剤性を与える遺伝子も含んでもよい。耐薬剤性遺伝子の典型は、アンピシリンまたはテトラサイクリンへの耐性を与えるものである。
【００５３】
原核レプリコンを含むベクターは、細菌宿主細胞、例えば大腸菌内のコーディング遺伝子配列の発現（転写および翻訳）を導く能力がある原核性またはバクテリオファージプロモーターをさらに含むことができる。プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼの結合および転写を起こすことを許容するＤＮＡ配列により形成された発現制御要素である。細菌宿主と相容性のプロモーター配列は、代表的には本発明のＤＮＡセグメントの挿入のために好都合な制限部位を含むプラスミドベクター内に提供される。いかなる適当な原核宿主も、本発明のタンパク質をコードする組換えＤＮＡ分子を発現するために使用できる。
【００５４】
真核細胞、好ましくは脊椎動物細胞と相容性の発現ベクターも、コーディング配列を含む組換えＤＮＡ分子を形成するために使用できる。真核細胞発現ベクターは当該技術分野では周知でありそして多数の商業的供給源から入手できる。典型的には、かかるベクターは、所望のＤＮＡセグメントの挿入のための好都合な制限部位を含んで提供される。
【００５５】
本発明の組換えＤＮＡ分子を構築するために使用される真核細胞発現ベクターは、さらに真核細胞内で有効である選択可能な標識、好ましくは耐薬剤性選択標識を含んでもよい。好ましい耐薬剤性選択標識は、発現がネオマイシン耐性をもたらす遺伝子、すなわちネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｎｅｏ）遺伝子である（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｅｔ ａｌ．， （１９８２） Ｊ． Ｍｏｌ． Ａｎａｌ． Ｇｅｎｅｔ． １， ３２７−３４１） 。あるいは、選択可能標識は、別のプラスミド上に存在することも可能であり、２個のベクターは宿主細胞の同時トランスフェクションにより導入され、そしてトランスフェクタントは選択可能標識に対する適当な薬剤中での培養により選択される。
形質転換宿主細胞
本発明は、さらに本発明の小型タンパク質をコードする核酸分子を用いて形質転換された宿主細胞を提供する。宿主細胞は原核性または真核性のいずれであってもよい。本発明の小型タンパク質の発現に有用な真核細胞は、細胞が細胞培養方法と適合性でありそして発現ベクターの伝播および遺伝子産物の発現と適合性である限り、限定されない。
【００５６】
本発明の小型タンパク質をコードする組換えＤＮＡ分子を用いる適当な宿主細胞の形質転換は、使用するベクターの形式および使用する宿主系に典型的に依存する周知の方法により達成される。原核宿主細胞の形質転換に関して、エレクトロポレーションおよび塩処理法が使用できる（例えばＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， （１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ； Ｃｏｈｅｎ ｅｔ ａｌ．， （１９７２） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ６９， ２１１０−２１１４ 参照）。組換えＤＮＡを含むベクターを用いる脊椎細胞の形質転換に関して、エレクトロポレーション、陽イオン性脂質または塩処理法が使用できる（例えばＧｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．， （１９７３） Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ５２， ４５６−４６７、Ｗｉｇｌｅｒ ｅｔ ａｌ．， （１９７９） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７６， １３７３−１３７６参照）。
【００５７】
成功した形質転換細胞（本発明の組換えＤＮＡ分子を含む細胞）は、選択可能標識の選択を含む周知の技術により同定できる。例えば、本発明の組換えＤＮＡの導入よりもたらされた細胞は、単一コロニーを産生するためにクローニングできる。これらのコロニーからの細胞は、採取、溶解そしてこれらのＤＮＡ内容物をサザン（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ， （１９７５） Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ９８， ５０３−６１７）が記載したような方法を用いて組換えＤＮＡの存在について検査するかまたは免疫学的方法を介してアッセイした細胞からタンパク質を産生できる。
組換え小型タンパク質の産生
本発明は、さらに本明細書中に記載の核酸分子を用いる本発明の小型タンパク質を産生するための方法を提供する。一般的用語として、タンパク質の組換え形の産生は典型的には下記の段階を含む：本発明のタンパク質をコードする核酸分子、例えば配列番号８、９、１０、１１、１２、１３、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３１、３３、３４、３５、３６、３７、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、７０、７１または７２中に記載の小型タンパク質のいずれかをコードする核酸分子を得る。次いで核酸分子を好ましくは上記の適当な制御配列と操作可能に連結して配置してタンパク質オープンリーディングフレームを含む発現単位を形成する。発現単位は適当な宿主を形質転換するために使用されそして形質転換した宿主は組換え小型タンパク質の産生を可能とする条件下で培養される。場合により、組換え小型タンパク質は培地または細胞から単離される。いくらかの不純物を許容してもよいような場合には、タンパク質の回収および精製を行わなくてもよい。
【００５８】
上記のそれぞれの段階は種々の様式で行うことができる。種々の宿主中で操作可能な発現ベクターの構築は、上記のような適当なレプリコンおよび制御配列を用いて達成される。制御配列、発現ベクターおよび形質転換方法は、遺伝子を発現するために使用される宿主細胞の形式に依存する。通常は利用できないとしても、適当な制限部位をコーディング配列の末端に付加してこれらのベクター内に挿入した切除可能な遺伝子を提供することもできる。熟練者は、組換え小型タンパク質を産生するために本発明の核酸分子を用いるための当該技術分野では既知のいずれかの宿主／発現系を容易に適用できる。
結合相手を特定するための方法
本発明は、本発明の小型タンパク質の結合相手を単離および特定するために使用する方法を提供する。いくつかの態様では、本発明の小型タンパク質を可能な結合相手または細胞の抽出物もしくは画分と、本発明のタンパク質を可能な結合タンパク質との会合を可能とする条件下で混合する。混合の後、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質または本発明の小型タンパク質と会合する他の分子を混合物から分離する。次いで本発明のタンパク質に結合した結合相手を取り出しそしてさらに分析できる。結合相手を特定および単離するために、全小型タンパク質を使用できる。あるいは、結合ドメインを含む小型タンパク質のフラグメントを使用できる。
【００５９】
本明細書中に使用される場合に、「細胞抽出物」とは、溶解または破壊された細胞から作製された調製物または部分を呼ぶ。細胞の抽出物を得るために種々の方法が使用できる。細胞は物理的または化学的のいずれかの破壊方法を用いて破壊できる。物理的破壊方法の例は音波処理および機械的せん断を含み、これらに限定はされない。化学的溶解方法の例は界面活性剤溶解および酵素溶解を含み、これらに限定はされない。熟練者は、本方法中に使用するための抽出物を得るために細胞抽出物を調製するための方法に容易に適応できる。
【００６０】
細胞抽出物が調製されると、小型タンパク質と結合相手との会合が起きることができる条件下で、抽出物を本発明の小型タンパク質と混合する。種々の条件が使用でき、最も好ましいのはヒト細胞の細胞質内に見いだされる条件に近似した条件である。例えば容積モル浸透圧濃度（ｏｓｍｏｌａｒｉｔｙ），ｐＨ、温度、および使用した細胞抽出物濃度などの特徴は、タンパク質と結合相手との会合を最適化するために変化できる。
【００６１】
適当な条件下で混合した後、結合した複合体を混合物から分離する。混合物を分離するために種々の技術が利用できる。例えば、本発明のタンパク質に特異性の抗体は結合相手の複合体を免疫沈降させるために使用できる。あるいは、標準の化学的分離技術、例えばクロマトグラフィーおよび密度沈降遠心分離が使用できる。
【００６２】
抽出物中に見いだされた非会合細胞成分を除去した後、慣用の方法を用いて複合体から結合相手を解離できる。例えば、解離は混合物の塩濃度またはｐＨを変化して得られる。
【００６３】
混合した抽出物から会合した結合相手の対の分離を助けるために、本発明の小型タンパク質は固体担体上に固定化できる。例えば、小型タンパク質はニトロセルロースマトリックスまたはアクリルビーズに付着できる。固体担体への小型タンパク質の付着は抽出物中に見いだされる他の成分からペプチド結合相手の対の分離を助ける。特定された結合相手は、単一のＤＮＡ分子もしくはタンパク質または２個またはそれ以上のタンパク質から形成されたタンパク質もしくは複合体のいずれかであることができる。あるいは、結合相手は、フラナガンおよびファンデルヘーゲン（Ｆｌａｎａｇａｎ ＆ Ｖａｎｄｅｒｈａｅｇｈｅｎ， （１９９８） Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． ２１， ３０９−３４５） またはタカハシら（Ｔａｋａｈａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．， （１９９９） Ｃｅｌｌ ９９， ５９−６９） の方法によるアルカリホスファターゼ融合アッセイを用いて特定、タカヤマら（Ｔａｋａｙａｍａ ｅｔ ａｌ．，（１９９７） Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ６９， １７１−１８４） またはサウダーら（Ｓａｕｄｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｇｅｎ． Ｖｉｒｏｌ． （１９９６） ７７， ９９１−９９６）の方法によるファーウエスタンアッセイまたはエピトープを付加したタンパク質またはＧＳＴ融合タンパク質の使用を介して特定してもよい。
【００６４】
あるいは、本発明の小型タンパク質をコードする核酸分子は、酵母２ハイブリッド（ｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄ）システム中に用いることができる。酵母２ハイブリッドシステムは、他のタンパク質相手対を特定するために使用されそして本明細書中に記載の核酸分子を使用するために容易に適応できる（例えばＳｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｈｙｂｒｉｚａｐ ＴＭ２ハイブリッドシステム参照）。
スクリーニング、診断および治療への使用
本発明の小型タンパク質は、小型タンパク質としての同じ結合部位への結合が可能な薬剤を同定するための薬剤スクリーニングのために特に有用である。小型タンパク質は、本発明の小型タンパク質に結合するＤＮＡまたはタンパク質の存在を同定および／またはレベルを検出するための診断目的にも有用である。診断的態様では、本発明の小型タンパク質は生物学的試料中の特定のＤＮＡまたはタンパク質の存在を検出するために使用するキット内に含まれる。本発明の小型タンパク質は、特定のＤＮＡまたはタンパク質の存在と関連する疾患の治療における治療的使用も有する。一つの治療的態様では、小型タンパク質はＤＮＡと結合して転写を促進または阻害するために使用でき、別の治療的態様では、小型タンパク質はタンパク質に結合してタンパク質の阻害または刺激をもたらす。
【００６５】
これ以上記載しなくても、当該技術分野の通常の熟練者は、上記の記載および下記の実施例を用いて本発明の化合物を調製および使用そして特許請求した方法を実施できると考える。従って、下記の実施例は、本発明の好ましい態様を特定して指摘し、そして本開示の残部をいかなる意味でも制限すると解釈されないものとする。
【００６６】
実施例
実施例１−ＤＮＡ結合小型タンパク質の合成
小型タンパク質を構成するポリペプチドは、固相法を用いて調製されそして特に指摘しない限りカルボキシ末端アミドおよび遊離アミノ末端を含む。高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）は、Ｗａｔｅｒｓ ４９０Ｅ ｍｕｌｔｉｗａｖｅｌｅｎｇｔｈ ｄｅｔｅｃｔｏｒを備えたＷａｔｅｒｓ ６００Ｅ Ｍｕｌｔｉｓｏｌｖｅｎｔ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ＳｙｓｔｅｍまたはＲａｉｎｉｎ Ｄｙｎａｍａｘ ＰＤＡ−２Ｄｉｏｄｅ Ａｒｒａｙ Ｄｅｔｅｃｔｏｒを備えたＲａｉｎｉｎ Ｄｙｎａｍａｘ ＳＤ−２００ Ｓｏｌｖｅｎｔ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍ のいずれかで行った。
【００６７】
固相ペプチド合成は、パーセプティブバイオサーチ（Ｐｅｒｓｅｐｔｉｖｅ ＢｉｏＳｅａｒｃｈ）９６００ペプチド合成装置で行った。標準研究グレードアルゴン（Ｃｏｎｎｅｃｔｉｃｕｔ ＡｉｒＧａｓ）をオキシクリア（ＯｘｙＣｌｅａｒ）酸素スクラッバーを通して次いで合成装置に導入した。ＨＡＴＵ（Ｏ−（７−ベンゾトリゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウム  ヘキサフルオロホスファート）を補足のベンゾトリアゾールを加えないで活性化剤として使用した。ジメチルホルムアミド、ピペリジンおよび塩化メチレン（Ｂａｋｅｒ） は新しくそして窒素中で保管した。無水ジメチルホルムアミドをジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ、再蒸留した０．４６Ｍ）と混合して基本活性化溶液を調製した。９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆ−ｍｏｃ）保護アミノ酸は下記の側鎖保護基を使用した：Ｏ−ｔ−ブチル（Ａｓｐ、Ｇｌｕ）；ｔ−ブチル（Ｔｙｒ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ）；２，２，４，６，７−ペンタメチルジヒドロベンゾフラン−５−スルホニル（Ｐｂｆ）（Ａｒｇ）；ｔ−ブトキシカルボニル（Ｌｙｓ）；およびトリフェニルメチル（Ｃｙｓ、Ｈｉｓ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ）。合成は、ＰＡＬ（ペプチドアミドリンカー）樹脂（Ｆｍｏｃ−ＮＨ２ −ＣＨ２ −（ジ−ｍ−メトキシ，ｐ−Ｏ−（ＣＨ２ ）４ Ｃ（Ｏ）−ポリスチレン）を用いて０．１０ミリモルスケールで行い、これはアミド化カルボキシ末端をもたらした。Ｆｍｏｃアミノ酸およびＨＡＴＵは、４倍過剰で使用した（カプリングあたりに０．４ミリモル）。最終カプリングが終了した後、Ｆｍｏｃ保護基を外しそして樹脂を最終的に洗浄した。樹脂を乾燥し、切断および脱保護を開始するまでデシケーター中に保管した。
【００６８】
逆相ＨＰＬＣを緩衝液Ａ（９８％ＨＰＬＣ水、２％アセトニトリル、０．０５％トリフルオロ酢酸）および緩衝液Ｂ（２０％ＨＰＬＣ水、８０％アセトニトリル、０．０６％トリフルオロ酢酸）の混合物から成る溶離剤を用いて行った。すべてのＨＰＬＣ溶剤は、使用前に０．２ミクロンフィルターを通して濾過した。ペプチド合成のための溶剤および化学薬品は、特に断らない限りオルドリッチ（Ａｌｄｒｉｃｈ） およびパーセプチブ・バイオサーチから入手した。サヴァント（Ｓａｖａｎｔ）ＳＣ１００高速真空装置を用いてペプチドを凍結乾燥した。変性ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）分析は、高密度ゲル（グリセロール中に含浸した２０％アクリルアミド）を用いるファルマシアファストゲル（Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＰｈａｓｔＧｅｌ）システムを用いて行った。アミノ酸分析はベックマン（Ｂｅｃｋｍａｎ） 分析装置でアッセイした。
【００６９】
ＰＰＥＢＰ１ＳＨの脱保護および精製のために、保護されたＰＰＥＢＰ１ＳＨを含むＰＡＬ樹脂（１５ｍｇ）を脱保護カクテル（８４％トリフルオロ酢酸、４％フェノール、４％エタンジチオール、４％チオアニソールおよび４％水）中、室温で５時間反応させた。溶液上に窒素流を吹きつけて体積が約０．２５ｍｌとなるまで溶剤を除去した。ジエチルエーテル（１ｍｌ）およびジチオトレイトール（２０ｍｇ）を加えてペプチドを沈降させそしてシステインを安定化させた。遠心分離の後に上清を除去しそして沈降物を乾燥した。ジチオトレイトール（５ｍｇ）を加えた１ｍｌリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．５）中に粗ペプチドを溶解しそして０．２ミクロンフィルターを用いて濾過した。ペプチドを逆相ＨＰＬＣ（Ｖｙｄａｃ 半分取３００オングストロームＣ１８、５ミクロン、１０．０ｘ２５０ｍｍ）により、緩衝液Ｂ中の１００−３０％緩衝液Ａの１２０分間の線型勾配を用いて精製した。ペプチドは流量４ｍｌ／分を用いて４９．３分で溶離しそしてエレクトロスプレ−イオン化質量分析により分析した。予想および測定した質量は、それぞれ４７２９．４および４７３０．０であった。
【００７０】
ＰＰＥＢＰ１ＳＲの調製のために、ＰＰＥＢＰ１ＳＨ０．０８０ｍｇを、２０ｍＭ  リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）中の２ｍｇ／ｍｌ（１５ｍＭ）２−ブロモアセトアミドの０．５０ｍｌ中に溶解した。反応を３０分間、室温で進行させた。逆相ＨＰＬＣ（ライニン（Ｒａｉｎｉｎ）分析１００オングストロームＣ１８、５ミクロン、４．６ｘ２５０ｍｍ）により、緩衝液Ｂ中の１００−３０％緩衝液Ａの４０分間の線型勾配を用いてペプチドを精製した。ペプチドは流量１ｍｌ／分を用いて２３．３分で溶離しそしてエレクトロスプレーイオン化質量分析およびアミノ酸分析により特性付けた。ＡＡＡ予測：Ａｌａ５  Ａｓｘ５  ＣｍＣｙｓ１  Ｇｌｘ２  Ｐｈｅ１  Ｇｌｙ４  Ｈｉｓ０  Ｌｌｅ０  Ｌｙｓ３  Ｌｅｕ２  Ｍｅｔ０  Ｐｒｏ４  Ａｒｇ８  Ｓｅｒ２  Ｔｈｒ１  Ｖａｌ２  Ｔｙｒ２、測定Ａｌａ５．２  Ａｓｘ４．８  ＣｍＣｙｓ０．６  Ｇｌｘ２．０  Ｐｈｅ１．０  Ｇｌｙ４．１  Ｈｉｓ０  Ｌｌｅ０  Ｌｙｓ２．９  Ｌｅｕ２．０  Ｍｅｔ０  Ｐｒｏ３．７  Ａｒｇ６．９  Ｓｅｒ１．８  Ｔｈｒ０．８  Ｖａｌ２．０  Ｔｙｒ１．８、質量  予測４７８６．４、測定４７８７．１。
【００７１】
ＰＰＥＢＰ２ＳＨの脱保護および精製のために、保護されたＰＰＥＢＰ２ＳＨを含むＰＡＬ樹脂（１０ｍｇ）を脱保護カクテル中、室温で７時間反応させそして溶剤を除去した。ジエチルエーテル（１ｍｌ）およびジチオトレイトール（２０ｍｇ）を加え、遠心分離の後に上清を除去しそして沈降物を乾燥した。新しいジチオトレイトール５ｍｇを含む１ｍｌリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．５）中に粗ペプチドを溶解しそして濾過した。ペプチドを逆相ＨＰＬＣ（Ｖｙｄａｃ 半分取３００オングストロームＣ１８、５ミクロン、１０．０ｘ２５０ｍｍ）により、緩衝液Ｂ中の１００−５０％緩衝液Ａの１２０分間の線型勾配を用いて精製した。ペプチドは流量４ｍｌ／分を用いて６７．８分で溶離しそしてエレクトロスプレ−イオン化質量分析により分析した。予想および測定した質量、４６５４．２および４６５３．６であった。
【００７２】
ＰＰＥＢＰ２ＳＲの調製のために、ＰＰＥＢＰ２ＳＨ０．０７０ｍｇを、２０ｍＭ  リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）中の２ｍｇ／ｍｌ（１５ｍＭ）２−ブロモアセトアミドの０．５０ｍｌ中に溶解した。反応を４０分間、室温で進行させた。逆相ＨＰＬＣにより、緩衝液Ｂ中の１００−３０％緩衝液Ａの４分間の線型勾配を用いてペプチドを精製した（ライニン分析１００オングストロームＣ１８、５ミクロン、４．６ｘ２５０ｍｍ）。ＰＰＥＢＰ２ＳＨは流量１ｍｌ／分を用いて２４．９分で溶離しそしてエレクトロスプレーイオン化質量分析およびアミノ酸分析により特性付けた。ＡＡＡ予測：Ａｌａ５  Ａｓｘ６  ＣｍＣｙｓ１
Ｇｌｘ３  Ｐｈｅ１  Ｇｌｙ４  Ｈｉｓ０  Ｌｌｅ０  Ｌｙｓ３  Ｌｅｕ２  Ｍｅｔ０  Ｐｒｏ４  Ａｒｇ７  Ｓｅｒ２  Ｔｈｒ１  Ｖａｌ２  Ｔｙｒ１、測定Ａｌａ５．０  Ａｓｘ５．８  ＣｍＣｙｓ０．９  Ｇｌｘ３．０  Ｐｈｅ１．０  Ｇｌｙ４．０  Ｈｉｓ０  Ｌｌｅ３．０  Ｌｙｓ３．０  Ｌｅｕ２．１  Ｍｅｔ０  Ｐｒｏ４  Ａｒｇ７  Ｓｅｒ２  Ｔｈｒ１  Ｖａｌ２  Ｔｙｒ１、質量
予測４７１１．３、測定４７１０．８。
【００７３】
ＥＢＰ１ＳＨの脱保護および精製のために、保護されたＥＢＰ１ＳＨを含むＰＡＬ樹脂（１２ｍｇ）を脱保護カクテル中、室温で６時間反応させそしてＰＰＥＢＰ１ＳＲ中に記載のようにして処理した。ジチオトレイトール（５ｍｇ）を加えた１ｍｌリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．５）中に粗ペプチドを溶解しそして濾過した。ペプチドを逆相ＨＰＬＣ（Ｖｙｄａｃ 半分取３００オングストロームＣ１８、５ミクロン、１０．０ｘ２５０ｍｍ）により、緩衝液Ｂ中の１００−７０％緩衝液Ａの７２分間の線型勾配を用いて精製した。ＥＢＰ１ＳＨは流量１ｍｌ／分を用いて４９．６分で溶離しそしてエレクトロスプレ−イオン化質量分析により特性付けた。予想質量、３３４６．９、測定、３３４６．２。
【００７４】
ＥＢＰ１ＳＲの調製のために、ＥＢＰ１ＳＨ１５０μｇを、２０ｍＭ  リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）中の２ｍｇ／ｍｌ（１５ｍＭ）２−ブロモアセトアミドの０．５０ｍｌ中に溶解した。反応を３０分間、室温で進行させた。逆相ＨＰＬＣ（ライニン分析１００オングストロームＣ１８、５ミクロン、４．６ｘ２５０ｍｍ）により、緩衝液Ｂ中の１００−３０％緩衝液Ａの４０分間の線型勾配を用いてペプチドを精製した。ＥＢＰ１ＳＲは流量１ｍｌ／分を用いて１７．０分で溶離しそしてエレクトロスプレーイオン化質量分析およびアミノ酸分析により特性付けた。ＡＡＡ予測：Ａｌａ４  Ａｓｘ３  ＣｍＣｙｓ１  Ｇｌｘ１  Ｐｈｅ１  Ｇｌｙ２  Ｈｉｓ０  Ｌｌｅ０  Ｌｙｓ３  Ｌｅｕ２  Ｍｅｔ０  Ｐｒｏ０  Ａｒｇ８  Ｓｅｒ１  Ｔｈｒ０  Ｖａｌ１  Ｔｙｒ１、測定Ａｌａ３．９
Ａｓｘ３．０  ＣｍＣｙｓ０．９  Ｇｌｘ１．０  Ｐｈｅ１．０  Ｇｌｙ２．１  Ｈｉｓ０  Ｌｌｅ０  Ｌｙｓ２．８  Ｌｅｕ２．０  Ｍｅｔ０  Ｐｒｏ０  Ａｒｇ６．９  Ｓｅｒ０．９  Ｔｈｒ０  Ｖａｌ１．０  Ｔｙｒ１．０、質量  予測３４０４．０、測定３４０３．７。
【００７５】
Ｃ／ＥＢＰ１５２ のために、精製したＣ／ＥＢＰペプチドのストック溶液を、１０ｍＭジチオトレイトールを含むリン酸緩衝生理食塩水中に溶解して調製した。溶液を９５℃に加熱しそしてペプチドのカルボキシ末端近傍のシステインの還元を確実にするために室温までゆっくりと冷却した。次いでペプチドを直ちにＥＭＳＡ分析に使用した。ペプチドはアミノ酸分析により特性付けた。ＡＡＡ予測：Ａｌａ８  Ａｓｘ１８  Ｇｌｘ１８  Ｐｈｅ５  Ｇｌｙ６  Ｈｉｓ０  Ｌｌｅ４  Ｌｙｓ１４  Ｌｅｕ１２  Ｍｅｔ３  Ｐｒｏ６  Ａｒｇ１３  Ｓｅｒ１５  Ｔｈｒ７  Ｖａｌ９  Ｔｙｒ２、測定Ａｌａ９．２  Ａｓｘ１６．９  Ｇｌｘ１８．０  Ｐｈｅ４．５  Ｇｌｙ７．０  Ｈｉｓ０  Ｌｌｅ３．８  Ｌｙｓ１４．２  Ｌｅｕ１１．３  Ｍｅｔ２．７  Ｐｒｏ６．０  Ａｒｇ１０．８  Ｓｅｒ１３．０  Ｔｈｒ７．０  Ｖａｌ１８．０  Ｔｙｒ１．７。
【００７６】
実施例２−ＤＮＡへの小型タンパク質の結合
ＤＮＡへの小型タンパク質の結合は、１４ｘ１６ｃｍゲルプレートを用いるモデルＳＥ６００二重制御器垂直スラブユニット（Ｄｕａｌ−Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｒ Ｖｅｒｔｉｃａｌ Ｓｌａｂ Ｕｎｉｔ， Ｈｏｅｆｅｒ）中で行う電気泳動移動度シフトアッセイを用いて測定した。温度は定温浴を用いて制御した。反応は、１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、２．７ｍＭ  ＫＣｌ、４．３ｍＭ  Ｎａ２ ＨＰＯ４ 、１．４ｍＭ  ＮａＨ２ ＰＯ４ （ｐＨ７．４）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．１％ＮＰ−４０、０．４ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ（非アセチル化）および５％グリセロールから成る結合緩衝液中で行った。ｂＺＩＰペプチドＣ／ＥＢＰ１５２ を含む実験のために、結合緩衝液に２ｍＭジチオトレイトールを補足した。段階ペプチド希釈を結合緩衝液を用いる１：１希釈として行った。一般に、結合緩衝液中のガンマ３２Ｐ標識、二本鎖ＤＮＡ（ＣＲＥ２４、ｈｓＣＲＥ２４、Ｃ／ＥＢＰ２４またはｈｓＣＥＢＰ２４；結合緩衝液中の最終濃度≦５０ｐＭ；Ｋａｐｐ ＜５００ｐＭを有するペプチドに対して最終濃度≦５ｐＭ）０．００２ｍｌを、氷上の段階ペプチド希釈物の０．００８ｍｌに加えた。ペプチド−ＤＮＡ混合物を３０分間、氷上でインキュベーションし次いで１０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８．１）中で調製した予備平衡化した本来のポリアクリルアミドゲル（８％アクリルアミド：ビスアクリルアミド）に加えた。ゲルを０．７５〜１．５時間、５００Ｖで流しそしてモデルＳＥ１１６０ドライゲル（Ｄｒｙｇｅｌ）Ｓｒ．ゲル乾燥機（Ｈｏｅｆｅｒ）で乾燥した。ストーム８４０ホスホリメージャー（Ｓｔｏｒｍ ８４０ Ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｍａｇｅｒ， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ）を用いてゲルを分析した。遊離および結合ＤＮＡの量を定量しそしてカレイダグラフ（ＫａｌｅｉｄａＧｒａｐｈ， Ｓｙｎｅｒｇｙ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）３．０プログラムを用いて解析した。解離定数は、データをラングミュア式＝ｃ〔（１＋（Ｋａｐｐ ／ペプチドＴ Ｎ ））−１〕（ここでＰＰＥＢＰＳＲおよびＥＢＰＳＲに対してはｎ＝１、Ｃ／ＥＢＰ１５２ に対してはｎ＝２）にあてはめて決定した。これらの式中、シータ＝タンパク質−ＤＮＡ複合体中のｃｐｍ／（タンパク質−ＤＮＡ複合体中のｃｐｍ＋遊離ＤＮＡのｃｐｍ）；ペプチドＴ ＝全ペプチド濃度、そしてｃはシータの最大値を表す調製可能なパラメーター（ｃ≦１；多くのペプチドに対してｃは１と定義された）。報告された値は、少なくとも３回の独立した実験の平均±標準偏差を表す。プロット上のエラーバーは、それぞれのデータ点に対する標準偏差を表す。
【００７７】
結合化学量論を決定するために、結合反応はＥＭＳＡ実験に使用されたものと同じ緩衝液中で行った。それぞれの反応は、２００ｎＭ  ｈｓＣＲＥ２４および２５ｎＭ〜１６００ｎＭの間のＰＰＥＢＰ１ＳＲを含んでいた。ｈｓＣＥＢＰ２４濃度は、２６０ｎｍにおけるそれぞれの一本鎖オリゴヌクレオチドの吸光度を測定して決定した。それぞれの二重鎖の一本の鎖をガンマ−３２Ｐを用いて標識した。少量（０．０１０ｍｌ）の標識ＤＮＡを同じ鎖の０．００２ｍＭストックに加えた。標識した鎖がその相補体に完全にアニールすることを確実にするために、過剰の低温相補鎖を加え、混合物を９５℃で２分間アニールしそして室温までゆっくりと冷却した。標識したｈｓＣＥＢＰ２４をＰＰＥＢＰ１ＳＲ溶液に加え、そして反応混合物を４℃で３０分間インキュベーションし、次いで１０ｍＭトリス緩衝液（４℃でｐＨ＝８．０）中で調製した本来の８％（８０：１アクリルアミド：ビスアクリルアミド）に加えた。水循環定温浴内への浸漬により４℃に保持された１０ｍＭトリス緩衝液を含むチェンバー内にゲルを懸濁した。ゲルを乾燥しそしてホスホリメージャー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ）を用いて定量した。
【００７８】
１個またはそれ以上のこれらのＤＮＡ−接触残基を欠くペプチドＰＰＢＲ０ＳＲ（配列番号８）、ＰＰＢＲ１０ＳＲ（配列番号９）およびＰＰＢＲ１１ＳＲ（配列番号１０）を用いて、有意のＤＮＡ結合は検出されなかった。高親和性ＤＮＡ結合は、これらの３種の残基を含むペプチドを用いて観察された。ｈｓＣＲＥに結合するＰＰＢＲ２ＳＲ（配列番号１１）の平衡解離定数（Ｋｄ ）は、生理学的イオン強度の条件下で５ｎＭであった。ＤＮＡ親和性は、ペプチドの総括α−ヘリックス化傾向を上昇する選択性アラニン置換によりさらに上昇して、ＰＰＢＲ４ＳＲ−ｈｓＣＲＥ２４複合体を産生し、そのＫｄ は同じ条件下で１．５ｎＭであった。ＰＰＢＲ４ＳＲ−ｈｓＣＲＥ２４複合体の形成は、ポリ（ｄＩｄＣ）−（ｄＩｄＣ）（Ｇａｒｎｅｒ ＆ Ｒｅｖｚｉｎ， （１９８１） Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ９， ３０４７−３０４８）； Ｆｒｉｅｄ ＆ Ｃｒｏｔｈｅｒｓ， （１９８１） Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ９， ６５０５−６５０６）、またはスクランブルしたＣＲＥ部位（ＮＯＮ）の高濃度により影響されず、ＰＰＢＲ４ＳＲ−ｈｓＣＲＥ２４の高い安定性が主として非特異性イオン相互作用に一次的にはよらないことを示す。円偏光二色性実験は、ｂＺＩＰペプチドと同様に（Ｗｅｉｓｓ ｅｔ ａｌ．， （１９９０） Ｎａｔｕｒｅ ３４７，５７５−５７８； Ｏ’Ｎｅｉｌ， （１９９０） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９， ７７４−７７８） 、二次構造に検出可能な変化は起きなかったことを示した。ＰＰＢＲ４ＳＲ（配列番号１２）は、特異性ＤＮＡの存在下でのみ完全なα−ヘリックスコンフォーメーションに達した。ＰＰＢＲ４ＳＲのＣＤスペクトルは、０．００１と０．０２０ｍＭとの間では変化せず、この範囲内では二次構造中に検出可能な変化は起きなかったことを示す。ｈｓＣＲＥ  ＤＮＡの添加は、ＰＰＢＲ４ＳＲのα−ヘリックス含有量を有意の増加し、一方ｈｓＣＥＢＰ  ＤＮＡの添加ではこれより少ない変化が観察された。
【００７９】
他の研究者は、塩基性セグメントペプチドによる単独（ｍｏｎｏｐａｒｔｉｔｅ） ＤＮＡ認識を記載しているけれども、報告された親和性は中程度であり（６０ｎＭ〜０．００３ｍＭ）、そして複合体は非常に低いイオン強度緩衝液内でのみ安定であった（Ｐａｒｋ ｅｔ ａｌ．， （１９９６） Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． １１８， ４２３５−４２３９； Ｍｏｒｉｉ ｅｔ ａｌ．，（１９９６） Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． １１８， １００１１−１００１２）。ＰＰＢＲ４ＳＲは、生理学的イオン強度での高親和性、単独、メジャーグルーブ（Ｍａｊｏｒ ｇｒｏｏｖｅ）認識の最初の例である。
【００８０】
実施例３−ＤＮＡへの小型タンパク質結合における疎水性コアの役割
ＰＰＢＲ４ＳＲ−ｈｓＣＲＥ２４複合体安定性への疎水性コア形成の寄与をＵＶ円偏光二色性実験を用いて試験した。円偏光二色性スペクトルは、ＰＢＳ中でアヴィヴ（Ａｖｉｖ）２０２ＣＤスペクトル計で記録しそしてバックグラウンド補正を行ったが、平滑化は行わなかった。波長走査は４℃で２００と２６０ｎｍの間を１ｎｍ間隔で、それぞれの間隔で５秒間の記録時間をとって行った。熱変性曲線は、２２２ｎｍにおいて４℃と９８℃の間を２℃の段階で、それぞれの温度で１分間の平衡で測定した。平均残留楕円率およびヘリシティの百分率を、バックグラウンド補正をした後の２２２ｎｍでの値から算出した。
【００８１】
Ｇ２７はポリプロリンヘリックスおよびターンを欠き、一方ＰＰＢＲ４−デルタＳＲは位置４にＤ−トリプトファンおよび位置３１にロイシンを含んでいた。モデル化研究は、これらの置換がポリプロリンまたはα−ヘリックスのキンクによるコア形成を破壊するであろうことを示唆する。Ｇ２７−ｈｓＣＲＥ２４およびＰＰＢＲ４−デルタＳＲ−ｈｓＣＲＥ２４複合体の安定性は、ＰＰＢＲ４ＳＲ−ｈｓＣＲＥ２４複合体よりもそれぞれ３．１および３．２ｋｃａｌ−ｍｏｌ−１だけ低かった。これらのデータは、疎水性コア形成がＰＰＢＲ４ＳＲ−ｈｓＣＲＥ２４複合体を３ｋｃａｌ−ｍｏｌ−１だけ安定化したことを示す。
【００８２】
実施例４−小型タンパク質結合のＤＮＡ配列特異性
ＰＰＢＲ４ＳＲの配列特異性は、ｈｓＣＲＥ２４（配列番号１３）へのその親和性を、Ｃ／ＥＢＰ  ｂＺＩＰタンパク質により認識されるハーフサイトを含む配列であるｈｓＣＥＢＰ２４（配列番号４）（図２）（Ａｇｒｅ ｅｔ ａｌ．， （１９８９） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４６， ９２２−９２６）へのその親和性と上記の電気泳動移動度シフトアッセイを用いて比較して検討した。ハーフサイト（ＡＴＴＧＣ）は、ＣＲＥハーフサイト（ＡＴＧＡＣ）と２個の塩基対が相違しそして塩基対特異性の優れた尺度を提供する（Ｓｕｃｋｏｗ ｅｔ ａｌ．， （１９９３） ＥＭＢＯ Ｊ． １２， １１９３−１２００； Ｊｏｈｏｎｓｏｎ， （１９９３） Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． １３， ６９１９−６９３０）。ＰＰＢＲ４ＳＲはｈｓＣＲＥ２４に対して顕著な特異性を示した。ＰＰＢＲ４ＳＲによるｈｓＣＲＥ２４の優先認識を記述する特異性比Ｋｒｅｌ （Ｋｄ （ｈｓＣＲＥ）／Ｋｄ （ｈｓＣＥＰＢ））は、２６００（デルタ，デルタ−Ｇ＝−４．４ｋｃａｌ−ｍｏｌ−１）であった。反対に、ＧＣＮ４のｂＺＩＰ要素を含んでなるＧ５６は、低い親和性を示した。１１８および１８０の特異性比は、ｈｓＣＥＢＰ２４（配列番号４）に優先するＧ５６によるＣＲＥ２４（配列番号３）の結合およびｈｓＣＥＢＰ２４に優先するｈｓＣＲＥ２４の結合に対して観察された（それぞれデルタ，デルタ−Ｇ＝−２．６および−２．９ｋｃａｌ−ｍｏｌ−１）。Ｇ５６およびＰＰＢＲ４ＳＲの相対特異性は、２種のＤＮＡの半分を結合するために必要なそれぞれのタンパク質の濃度を考慮した場合に最も認められる。ＰＰＢＲ４ＳＲに対して、この相違は２６００の比に相当し、一方Ｇ５６に対して、これは１１の比に相当する。ＰＰＢＲ４ＳＲはｈｓＣＲＥ２４とｈｓＣＥＢＰ２４との間の２個の塩基対の相違を、Ｇ５６が６〜１０個の塩基対が相違する２個の配列であるｈｓＣＥＢＰ２４をＣＲＥ２４から識別するよりも容易に識別する。これらの比較は、ＰＰＢＲ４ＳＲが、設計の基礎とされたタンパク質であるＧＣＮ４よりもさらに著しく選択性であることを強調する。
【００８３】
実施例５−小型タンパク質をコードする合成遺伝子の構築
以下に詳細に記載するように、ファージ提示ベクターｐＪＣ２０は、一価ファージ提示ベクターｐＣＡＮＴＡＢ５Ｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ） より誘導された。ｐＪＣ２０は、ｐＣＡＮＴＡＢ５Ｅ内に見いだされたユニークなＳｆｉＩとＮｏｔＩとの制限部位の間にａＰＰをコードする合成遺伝子を挿入することにより調製された。合成ａＰＰ遺伝子は、大腸菌内の最適タンパク質発現のためのコドンおよびｐＣＡＮＴＡＢ５Ｅ中に存在しない４個の制限部位（ＸｍａＩ、ＡｇｅＩ、ＢｇｌＩＩおよびＰｓｔＩ）を含んでいた。これらの制限部位は、種々の別個の小型タンパク質をコードする遺伝子の効率的な構築ならびに遺伝子多様性の導入を可能とする。ベクターｐＪＣ２１は、ＰＰＢＲ４の残基１８−４２をコードする合成遺伝子を、ｐＪＣ２０のユニークなＢｇｌＩＩとＮｏｔＩとの間に挿入することにより調製された。ｐＪＣ２０とｐＪＣ２１の正確性は、自動化ＤＮＡ配列決定により確認された。
【００８４】
ａＰＰのための合成遺伝子は、大腸菌内での発現を最適化するために選択されたコドンを用いて構築されそしてカセット変異誘発を促進するために４個のユニーク制限部位を組み込んだ。１４２塩基対の二重鎖挿入は、相互プライムする合成および互いに１９塩基対が重なるオリゴヌクレオチドＡＰＰ．ＴＳ（ＣＴＡ
ＴＧＣ  ＧＧＣ  ＣＣＡ  ＧＣＣ  ＧＧＣ  ＣＧＧ  ＴＣＣ  ＧＴＣ  ＣＣＡ
ＧＣＣ  ＧＡＣ  ＣＴＡ  ＣＣＣ  ＧＧＧ  ＴＧＡ  ＣＧＡ  ＣＧＣ  ＡＣＣ
ＧＧＴ  ＴＧＡ  ＡＧＡ  ＴＣＴ  ＧＡＴ  ＣＣＧ  ＴＴＴ  ＣＴＡ  ＣＡＡ
ＣＧＡ  ＣＣＴ  ＧＣＡ  ＧＣＡ  ＧＴＡ  ＣＣＴ  ＧＡＡ  ＣＧＴ  ＴＧＴ
ＴＡＣ  ＣＣＧ  ＴＣＡ  ＣＣＧ  ＴＴＡ  ＣＧＣ  ＧＧＣ  ＣＧＣ  ＡＧＧ
ＴＧＣ  Ｇ）（配列番号３９）およびＡＰＰ．ＢＳ（ＣＴＡ  ＴＧＣ  ＧＧＣ
ＣＣＡ  ＧＣＣ  ＧＧＣ  ＣＧＧ  ＴＣＣ  ＧＴＣ  ＣＣＡ  ＧＣＣ  ＧＡＣ
ＣＴＡ  ＣＣＣ  ＣＧＧ  ＧＴＧ  ＡＣＧ  ＡＣＧ  ＣＡＣ  ＣＧＧ  ＴＴＧ
ＡＡＧ  ＡＴＣ  ＴＧＡ  ＴＣＣ  ＧＴＴ  ＴＣＴ  ＡＣＡ  ＡＣＧ）（配列番号４０）を用いて作製した。反応混合物（２０ｍｌ）は、８ピコモルＡＰＰ．ＴＳ、８ピコモルＡＰＰ．ＢＳ、１ｘサーモポル（ＴｈｅｒｍｏＰｏｌ） 緩衝液（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ） 、２ｍｇ  ＢＳＡ、１ｍＭ  ｄＮＴＰｓ、２５ｍＣｉ〔ガンマ−３２Ｐ〕ＡＴＰ、５ｍＭ  ＭｇＳＯ４ および２ｍｌヴェント（Ｖｅｎｔｏ） （ｅｘｏ−）ＤＮＡポリメラーゼを含み、そして９４℃で３０秒間、６０℃で３０秒間および７２℃で１分間インキュベーションした。主要な反応産物を変性（８Ｍ尿素）１０％アクリルアミド（２９：１アクリルアミド：ビス−アクリルアミド）ゲルから精製しそしてプライマーＣＴＡ  ＴＧＣ  ＧＧＣ  ＣＣＡ  ＧＣＣ  ＧＧＣ  ＣＧＧ（配列番号４１）およびＣＧＣ  ＡＣＣ  ＴＧＣ  ＧＧＣ  ＣＧＣ  ＧＴＡ
ＡＣＧ（配列番号４２）の１５００ピコモル、０．０１０ｍｌ鋳型、０．２５ｍＭ  ｄＮＴＰｓ、５ｍＭ  ＭｇＳＯ４ 、１ｘサーモポル緩衝液（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ） および２ｍｌヴェント（ｅｘｏ−）（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ） を含む０．１００ｍｌ体積中でＰＣＲにより増幅した。ＰＣＲ反応は、変性（９４℃で３０秒間）、アニーリング（６０℃で３０秒間）および伸長（７２℃で１分間）の３０サイクルで行った。挿入物をＳｆｉ  Ｉを用いて５０℃でＮＥＢ緩衝液２中、４時間消化した。次いでこの緩衝液に最終濃度１００ｍＭまでＮａＣｌを、そして最終濃度５０ｍＭまでトリス−ＨＣＬを補足して、次いでＮｏｔ  Ｉを用いて４時間、３７℃で消化した。得られた挿入物を、８００単位Ｔ４  ＤＴＴリガーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ） 、５０ｍＭ  トリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．８）、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２ 、１０ｍＭ  ＤＴＴ、２５ｍｇ／ｍｌＢＳＡ、１ｍＭ  ＡＴＰ、２５０ｎｇ  ｐＣＡＮＴＡＢ５Ｅ（ｐＨ７．８）を含む反応混合物中、１６℃で１．５時間でベクターｐｃＡＮＴ  ＡＢ−５Ｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ） 内に連結した。連結産物をエレクトロポレーションによりＴＧ１大腸菌中に形質転換しそして得られたプラスミドをｐＪＣ２０と名付けた。ＰＰＢＲ４のための合成遺伝子は、ａＰＰ合成遺伝子（ｐＪＣ２０中）の３’末端の５７塩基対を、ＰＰＢＲ４のＣ−末端２５アミノ酸をコードする配列で置換して作製した。
【００８５】
オリゴヌクレオチドＰＰＢＲ４ＴＳ（ＧＡＴ  ＣＴＧ  ＡＡＧ  ＣＧＣ  ＴＴＴ  ＣＧＴ  ＡＡＣ  ＡＣＣ  ＣＴＧ  ＧＣＴ  ＧＣＧ  ＣＧＣ  ＣＧＴ  ＴＣＣ  ＣＧＴ  ＧＣＡ  ＣＧＴ  ＡＡＡ  ＧＣＴ  ＧＣＡ  ＣＧＴ  ＧＣＴ  ＧＣＡ  ＧＣＴ  ＧＧＴ  ＧＧＴ  ＴＧＣ  ＧＣ）（配列番号４３）およびＰＰＢＲ４ＢＳ（ＣＧＣ  ＡＣＣ  ＴＧＣ  ＧＧＣ  ＣＧＣ  ＧＣＡ  ＡＣＣ  ＡＣＣ  ＡＧＣ  ＴＧＣ  ＡＧＣ  ＡＣＧ  ＴＧＣ  ＡＧＣ  ＴＴＴ  ＡＣＧ  ＴＧＣ  ＡＣＧ  ＧＧＡ  ＡＣＧ  ＧＣＧ  ＣＧＣ  ＡＧＣ  ＣＡＧ  ＧＧＴ  ＧＴＴ  ＡＣＧ  ＡＡＡ  ＧＣＧ  ＣＴＴ  ＣＡＧ  ＡＴＣ  ＴＴＣ  ＡＡＣ  Ｃ）（配列番号４４）をアニールしそして５’末端をリン酸化してＰＰＢＲ４挿入物を形成した。あらかじめＢｇｌＩＩおよびＮｏｔＩを用いて消化したｐＪＣ４０内にＰＰＢＲ４挿入物を連結し、次いで酵素を用いて脱リン酸化した。連結反応混合物は、５０ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ７．８）、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２ 、１０ｍＭ  ＤＴＴ、２５ｍｇ／ｍｌＢＳＡ、１ｍＭ  ＡＴＰ、９０ｎｇ  消化ｐＣＡＮＴＡＢ−５Ｅおよび８ｎｇのアニールした挿入物中に８００単位Ｔ４  ＤＮＡリガーゼを含んでいた。反応の後、連結混合物をエレクトロ−コンピテントＴＧ１大腸菌内に形質転換した。プラスミドは消化したｐＪＣ２１であった。すべての最終構築物の配列は自動化配列決定により確認した。
【００８６】
実施例６−ＤＮＡ結合小型タンパク質ファージライブラリー構築
１００ｍｇ／ｍｌアンピシリンおよび２％グルコースを含む２ｘＹＴの１０ｍｌ体積を、プラスミドｐＪ２０またはｐＪ２１を含むＴＧ−１大腸菌の５００ｍｌの一晩培養物を用いて接種し、そして３７℃でＯＤ６００ ＝０．８となるまで振とうした。Ｍ１３ＫＯ７ヘルパーファージの４ｘ１０１０ｐｆｕを加えそしてさらに１時間振とうを続けた。細胞を１５分間、５０００ｘｇでペレット化しそして１００ｍｇ／ｍｌアンピシリンおよび５０ｍｇ／ｍｌカナマイシンを含む２ｘＹＴの等量中に再懸濁しそして１０時間振とうしながら培養した。細胞を２０分間、５０００ｘｇの遠心分離でペレット化しそしてファージ上清を０．４５ミクロンフィルターを通して濾過し、次いで氷上のＰＥＧ／ＮａＣｌ（ｄｄＨ２ Ｏ中の２０％ｗ／ｖ  ＰＥＧ８０００、２．５Ｍ  ＮａＣｌ）を用いて４５分間沈降させた。ファージを１３０００ｘｇで３０分間、４℃でペレット化しそして結合緩衝液中に再懸濁した。
【００８７】
実施例７−Ｍ１３ファージによる小型タンパク質の発現
ファージの表面上での小型タンパク質発現に向けた第一段階として、発明者らは、ｌａｃプロモーターの制御下にある合成遺伝子からａＰＰが発現されることを確認しようと試みた。この目的で、ｐＪＣ２０を内包するＴＧ−１大腸菌をイソプロピルチオガラクトシド（ＩＰＴＧ）を用いて誘導し、溶解しそして細胞溶解物をラビット抗ａＰＰ抗体（Ｐｅｎｉｎｓｕｌａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， ＃ＲＧＧ−７１９４） を用いて以下の記載のようにしてプローブした。
【００８８】
ｐＪＣ２０を含むＴＧ１細胞を、１時間、３０℃で１００ｍｇ／ｍｌアンピシリンおよび２％グルコースを含む２ｘＹＴ中で培養した。細胞を５０００ｘｇで遠心分離してペレット化しそして１００ｍｇ／ｍｌアンピシリンおよび１ｍＭ
ＩＰＴＧを含む等量の２ｘＹＴ中に再懸濁し、３時間、３０℃で培養し次いでＳＤＳ試料緩衝液中で煮沸して溶解した。アリコートをファルマシア・ファスト（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｐｈａｓｔ） ＨＯＭＯ２０ゲル上に加えそして溶液前端がゲルから流出するまで９５℃で電気泳動した。ゲル中のタンパク質をインモビロン（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ） −Ｐ膜に６５℃で１時間で転移した。膜を３０分間、０．５％ＢＳＡを含むＴＢＳＴ（２０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０５％トウイーン−２０）を用いてブロックし次いで４ｍｇ／ｍｌで提供されたラビット抗−ａＰＰ（Ｐｅｎｉｎｓｕｌａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， ＃ＲＧＧ−７１９４） の１：１００００希釈物と一緒にインキュベーションした。次いで膜をＴＢＳＴを用いて３回洗浄し（１回の洗浄は５分間）、次いでヤギ抗ラビットアルカリホスファターゼ共役物（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ ｓｃ−２００７）を１：１０００希釈で含むＴＢＳＴを用いてインキュベーションした。ＴＢＳＴを用いる５分間洗浄３回およびＴＢＳ（トウイーン−２０を含まないＴＢＳＴ）を用いる洗浄１回の後、膜をＶＩＳＴＲＡ  ＥＣＦ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ） を用いて染色しそしてＳＴＯＲＭ８５０ホスホイメージャー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ）で４０５ｎｍにおいて可視化した。
【００８９】
ファージ粒子上のウエスタンブロットのために、ファージ１０ｍｌを作製しそして上記のようにしてＰＥＧ／ＮａＣｌを用いて沈降させた。次いでファージを１ｍｌ  ｄｄＨ２ Ｏ中に再懸濁し、ＰＥＧ／ＮａＣｌ２００ｍｌを用いて沈降させ、１００ｍｌ  ｄｄＨ２ Ｏ中に再懸濁しそして９５℃でＳＤＳ試料緩衝液中で１０分間加熱した。次いでファージタンパク質を１０％ＳＤＳゲル（２９：１アクリルアミド：ビスアクリルアミド）に加えそして２０ｍＡでトリス−グリシン電気泳動緩衝液中で溶剤前端がゲルから流出するまで電気泳動した。分離したタンパク質をインモビロン−Ｐ膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ） に２０Ｖで４時間、タウビン（Ｔｏｗｂｉｎ）緩衝液（２０％ＭｅＯＨ、２５ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８）、１９２ｍＭグリシン、０．１％ＳＤＳ（ｗ／ｖ））を含むＴＥ６２装置（Ｐｈａｒｍａｃｉａ） を用いて４℃で転移した。ＴＢＳＴ中の５％脱脂牛乳を用い１６時間ブロックしそしてＴＢＳＴを用いる洗浄２回（１回の洗浄が５分間）の後、２．５％脱脂牛乳を補足したＴＢＳＴ中の抗ａＰＰを用いて３０分間、膜をプローブした。膜を３回（１回の洗浄は５分間）ＴＢＳＴを用いて洗浄し、次いで２．５％脱脂牛乳を含むＴＢＳＴ中で１：５０００の希釈のヤギ抗ラビットアルカリホスファターゼ共役物（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ ｓｃ−２００７）に１５分間露出した。ＴＢＳＴを用いる洗浄３回（１回の洗浄が５分間）およびＴＢＳを用いる洗浄２回（１回の洗浄が５分間）の後、膜をＶＩＳＴＲＡ  ＥＣＦ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ） を用いて染色しそしてＳＴＯＲＭ８５０ホスホイメージャー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ）で４０５ｎｍにおいて可視化した。
【００９０】
これらの実験は、Ｍ１３バクテリオファージのマイナーキャプシドタンパク質ＩＩＩに融合したａＰＰのＩＰＴＧ誘発発現の明確な証拠を実証する。融合タンパク質が有効なファージ粒子内にアセンブルされたかどうかを研究するために、精製されたファージは、ファージタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて分離しそしてラビット抗ａＰＰ抗体を用いてプローブした。ウエスタンブロットは、ａＰＰおよびタンパク質ＩＩＩを含む融合タンパク質が完全にアセンブルされたＭ１３ファージ粒子中に組み込まれたことを明確に示す。ｐＪＣ２１を有する細胞から産生されたファージがラビット抗ａＰＰ抗体を用いてプローブされた場合に、いかなる兆候も観察されなかった。
【００９１】
実施例８−ファージ上のＤＮＡ結合小型タンパク質の機能選択
ＰＰＢＲ４の最適化に向けた第一段階として、発明者らは、ＰＰＢＲ４を示すファージが特異性ＤＮＡ結合に基づいて分別された場合に、ａＰＰを有するファージ上で選択できたことを確認した。ＰＰＢＲ４またはその前駆体であるａＰＰのいずれかを示すファージを、ＰＰＢＲ４により認識される５塩基対配列、ハーフサイトＣＲＥ（ｈｓＣＲＥ、ＡＴＧＡＣ）を含む２４塩基対二重鎖オリゴヌクレオチドでコートされた磁性ビーズに対してパン（ｐａｎ） した。ＤＮＡを３’ビオチンＴＥＧ（トリエチレングリコール）リンカー（Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ） を介してストレトアビジンコートしたビーズに付着させた。パニング（ｐａｎｎｉｎｇ） は本質的に以上の記載および以下の記載のようにして行った（Ｃｈｏｏ ＆ Ｋｌｕｇ， （１９９４） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９１， １１１６３−１１１６７）。
【００９２】
パニング実験のために、ストレプトアビジンをコートしたＭ−２８０磁性ビーズ（Ｄｙｎａｌ） ０．５ｍｇを６回、２ｘＢ＋Ｗ緩衝液（１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、２．０Ｍ  ＮａＣｌ）の５０ｍｌを用いて洗浄した。それぞれの洗浄段階は２分間で行った。ビーズを６％脱脂牛乳を含む１ｘＢ＋Ｗ５０ｍｌ中で１４時間インキュベーションしてブロックした。次いでビーズを５回、１ｘＢ＋Ｗ５０ｍｌを用いて洗浄しそして一本の鎖上に３’ビオチン標識を有する約１ｍＭ  二重鎖ｈｓＣＲＥ２４２を含む１ｘＢ＋Ｗ５０ｍｌ中に２０分間で再懸濁した。この操作は、ビーズｍｇあたりに約７５ピコモルＤＮＡを負荷した。次いでビーズをファージ結合緩衝液（０．４ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ、０．１％ＮＰ−４０および２．５ｍｇのポリｄＩｄＣを補足したリン酸緩衝生理食塩水）５０ｍｌを用いて５回洗浄した。０．４ｍｌの体積の１０１０ファージをビーズに４℃で加えそしてラブクエークシェーカー・ロティセリー（Ｌａｂｑｕａｋｅｒ ｓｈａｋｅｒ ｒｏｔｉｓｓｅｒｉｅ） 上で２時間回転しながらインキュベーションした。ビーズを５回、５分間、４℃で洗浄緩衝液（ポリ−ｄＩｄＣを欠くファージ結合緩衝液）を用いて洗浄した。結合ファージを４Ｍ  ＮａＣｌ含む洗浄緩衝液を加えて溶離しそして温度を２５℃に２時間上昇させた。溶離物２００ｍｌおよびパニングされなかったファージ２００ｍｌを対数期のＴＧ−１大腸菌７ｍｌを感染させるために使用した。１時間後に、感染した細胞の段階希釈物をＳＯＢＡＧ（１００ｍｇ／ｍｌまでのアンピシリンおよび２％グルコースを補足したＳＯＢ培地）上にプレーティングしそして１２時間、３０℃で培養した。保持率の値を算出し、ここで保持率＝（出口力価／入口力価）ｘ１００である。
【００９３】
本実験において、洗浄条件はＥＥＢＲ４を示すファージおよびａＰＰを示すファージの微分保持率（Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ）を最大とするように最適化した。０．１％ＮＰ−４０、０．４ｍｇ／ｍｌＢＳＡおよび２．５μｇ／ｍｌポリ−ｄＩｄＣを補足したリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で、ｈｓＣＲＥビーズ上のＰＰＢＲＥ４ファージの保持率は、ａＰＰファージのものより１０倍大きかった。この結果は、タンパク質グラフト化により産生された小型タンパク質が機能的にＭ１３ファージ上で選択できることを示す。
【００９４】
実施例９−高度に選択性のＤＮＡ結合小型タンパク質の単離
高い親和性および特異性をもって結合するほぼ折り畳まれたＰＰＢＲ４類似体を同定するために、上記の実施例中の記載と本質的に同様にして２種のファージライブラリーを創成した（図３）。ライブラリーＡおよびＢのメンバーは、ＰＰＩＩヘリックス上の３（ライブラリーＡ）または４（ライブラリーＢ）位置でＰＰＢＲ４と相違する。ライブラリーＡの位置２および５で保持されるプロリン残基は、ＰＰ−折り畳みタンパク質の間で高度に保存される。これら２個のプロリンの保存は、ライブラリーＡメンバーに利用できるコンフォーメーション空間を有効に制約しそして大部分がＮ−末端ＰＰＩＩヘリックスを含むことが予想された。かかるコンフォーメーション的制約はライブラリーＢには存在せず、ＤＮＡ結合α−ヘリックスを安定化するために多数の方法があるであろうことが認められる。
【００９５】
ライブラリーＢの位置２および５におけるアミノ酸はプロリンに制限されないので、このライブラリーは利用できるファイ−プサイ空間の大きい部分を試料採取すると予想される。ファージは、配列ＡＴＧＡＣ（ｈｓＣＲＥ）を含むオリゴヌクレオチド二重鎖を結合するこれらの能力に基づいて３ラウンドで分別された。室温で高い親和性をもってｈｓＣＲＥを結合した配列の同定に有利とするために、４℃での選択の２ラウンドに続いて室温で１ラウンド行った。最終ラウンドには、ライブラリーＡファージをＰＰＢＲ４ファージにのみ同程度であるレベルで保持しそしてそれ以上の考慮は行わなかった。ライブラリーＢファージは、最初のラウンド後にＰＰＢＲ４ファージと同程度のレベルで保持されたが、しかしその後の２ラウンドの後のＰＰＢＲ４ファージよりも１５〜１６倍良いレベルであった。１２個のライブラリーＢクローンを第３ラウンドの後に配列決定した（図３ｃ）。６個の配列（ｐ００７、ｐ００９、ｐ０１１、ｐ０１２、ｐ０１３、およびｐ０１６）を合成しそして４個のＤＮＡ結合性を詳細に分析した。
【００９６】
定量的な電気泳動移動度シフト実験は、ｐ００７、ｐ０１１、ｐ０１２、およびｐ０１６のＤＮＡ親和性を評価するために上記の実施例に記載のようにして行った。試験したすべてのペプチドは、ＰＰＢＲ４またはＧ２７（ＣＧＮ４の単離された塩基性領域）と同様にまたはこれより良くｈｓＣＲＥを結合した。４℃で、ｐ０１１およびｐ０１２は１．５±０．２ｎＭおよび２．５±０．５ｎＭの親和性でｈｓＣＲＥを結合し、一方ｐ０１６は３００±６０ｐＭの親和性でｈｓＣＲＥを結合した。特に興味があるのはｐ００７であって、これは解離定数２３±１．２ｐＭで例外的に安定な複合体を形成してｈｓＣＲＥを結合した。このペプチドはＰＰＢＲ４（Ｋｄ ＝１．９±０．２ｎＭ）よりも約１００倍良くそしてＧ２７（Ｋｄ ＝４１０±５３ｎＭ）よりも約２０，０００倍良く特定のＤＮＡを結合した。さらに２５℃で、ｐ００７は１．６±０．１ｎＭの親和性でｈｓＣＲＥを結合した。ＰＰＢＲ４またはＧ２７のいずれもこの温度でＤＮＡ結合の証拠を示さなかった。ｐ００７は、ＤＮＡの５塩基対を４００ｎＭの親和性で結合するトラムトラック（Ｔｒａｍｔｒａｃｋ） ジンクフィンガー（タンパク質）からの２個のフィンガー（Ｓｅｇａｌ ＆ Ｂａｒｂａｓ，（２０００） Ｃｕｒｒ． Ｏｐ． Ｃｈｅｍ． Ｂｉｏｌ． ４， ３４−３５）よりも著しくさらに緊密に特定のＤＮＡを結合する。
【００９７】
実施例１０−高度に選択性の小型タンパク質ＤＮＡ結合の特異性
ＤＮＡ結合の特異性は、上記の実施例に記載と同様にして定量的電気泳動移動度シフトアッセイを用いて５塩基対ｈｓＣＲＥ配列内に２個の塩基対変化を含む数種の二重鎖オリゴヌクレオチドに関してｐ００７の親和性を決定して研究した。ｐ００７は極端に識別性であり、２００および８００の間の特異性比Ｒ（特異性および変異複合体の解離定数の比として定義される）を示す（デルタ，デルタＧ＝−３．３〜４．０ｋｃａｌ  ｍｏｌ−１）。差別のこの高いレベルは、５塩基対ｈｓＣＲＥ配列の全体にわたって観察され、一つの相互作用がｐ００７−ｈｓＣＲＥ複合体の自由エネルギーを支配するのではないことおよび結合エネルギーが全タンパク質ＤＮＡ界面にわたって分布していることを示す。反対に、４℃で、ＰＰＢＲ４は、ｈｓＣＲＥの５’末端における変異を有する配列に対して識別性が低い（デルタ，デルタＧ＝−１．７ｋｃａｌ  ｍｏｌ−１）。
【００９８】
これら４個以外のＤＮＡ配列がｐ００７を緊密に結合する可能性を研究するために、どちらかのＤＮＡ鎖上のすべての登録中に潜在的結合部位を有するコウシ胸腺ＤＮＡ（ＣＴ  ＤＮＡ）に対するｐ００７の親和性を測定した。ＣＴ  ＤＮＡ内のいずれの部位に対しても優先するｈｓＣＲＥの認識に対する平均特異性比は、４１６９であった。この比は、潜在的競合部位の数（４５ ＝１０２４）よりも著しく大きい。３重のジンクフィンガー構築物Ｚｉｆ２６８およびファージ提示により選択されたその変種はこれらの９個の塩基対結合部位の１〜２個の塩基対を一義的には特定しないけれども（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．， （１９９２） Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３１， １２４５−１２５３）、ｐ００７は完全にその標的配列のすべての５個の塩基対を指定する。実際、それぞれの可能な５個の塩基対競合部位が標的部位に等しいモル濃度で存在しても、ｐ００７分子の８０％は、質量作用の効果にもかかわらすｈｓＣＲＥに結合するであろう。
【００９９】
実施例１１−小型タンパク質構造のＮＭＲ特性検討
ＮＭＲ分光分析のために、ｐ００７を、４ｍＭ  ＫＣｌ、２０５ｍＭ  ＮａＣｌ、６．５ｍＭ  Ｎａ２ ＨＰＯ４ 、２．１ｍＭ  ＫＨ２ ＰＯ４ （ｐＨ７．４）を含む９０％Ｈ２ Ｏ／１０％Ｄ２ Ｏ中に溶かした。ペプチド濃度は約１．５ｍＭであった。化学シフトは内部３−（トリメチルシリル）プロピオン−２，２，３，３−ｄ４酸、ナトリウム塩よりのｐｐｍで表した。すべてのスペクトルをヴァリアン（Ｖａｒｉａｎ）８００ＭＭｚイノヴァ（Ｉｎｏｖａ） 装置を用い、２℃でスイープ幅９０００Ｈｚを用いて記録した。ＮＯＥＳＹ実験は、４０９６ｔ２ｘ５００ｔ１複合点を有する水抑制のためのウオーターフリップ−ウオーターゲート（ｗａｔｅｒｆｌｉｐ−ｗａｔｅｒｇａｔｅ） パルス配列を用いて行った。５０、１５０および３００ｍｓの混合時間を得た。ＤＱＦ−ＣＯＳＹスペクトル（６０ｍｓ混合時間）は２０４８ｔ２ｘ３００ｔ１複合点で得られた。データ処理はフェリックス（Ｆｅｌｉｘ） ９８（ＭＳＩ）を用いるシリコン・グラフィックス（Ｓｉｌｉｃｏｎ Ｇｒａｐｈｉｃｓ）ワークステーションで行った。自由誘導減衰のフーリエ変換の前に、ガウスウインドウ関数をＮＯＳＥＹスペクトルに適用し、一方カイザーウインドウ関数をＤＱＦ−ＣＯＳＹスペクトルに適用した。ＮＯＳＥＹスペクトルのディジタル分解度は２．２Ｈｚ／ｐｔであった。ＤＱＦ  ＣＯＳＹデータはゼロフィリングであり１．１Ｈｚのディジタル分解度をもつ８１９２ｘ８１９２マトリックスを得た。スペクトルは標準方法により帰属させた。
【０１００】
多次元ＮＭＲ実験は、ｐ００７の構造の詳細な特性化を可能とした。ｐ００７中のバックボーンおよび側鎖結合性は、合理的に分散したＮＯＳＥＹスペクトルに基づいて帰属させた。位置ｉとｉ＋３およびｉとｉ＋４における残基間のアミド−アミドクロスピークの存在は、残基１４−３０に対するα−ヘリックスコンフォーメーションを定義する。残基８と１７、８と２０、７と２０、５と２０、４と２７、２と２９、２と３０の間の１１個の長距離ＮＯＥは、１．６オングストロームのバックボーンｒｍｓｄを有するａＰＰの残基５−８および１５−２８上に重ねられる折り畳み構造を規定する。従って、ｐ００７おおびａＰＰの主鎖折り畳みは著しく類似し、ここで残基５、７および８は残基２０に近位であり、そして残基１および２は残基３０に近位である。膵臓折り畳みポリペプチドの以前の研究のように（Ｂｌｕｎｄｅｌｌ ｅｔ ａｌ．， （１９８１） ７８， ４１７５−４１７６） 、ｐ００７の残基１−８に提案されたＰＰＩＩヘリックスはＮＭＲデータにより定義されない（ｕｎｄｅｒ−ｄｅｆｉｎｅｄ） 。しかし、ａＰＰとｐ００７折り畳みの間の類似性を考慮して、ｐ００７はＰＰＩＩヘリックスに類似した構造を含むに違いない。
【０１０１】
実施例１２−タンパク質結合小型タンパク質ファージライブラリー構築
ａＰＰＢＡＫライブラリーを構築するために、変異誘発をＮＮＳコドンスキームを用いて行った。ここでＮ＝いずれかの塩基そしてＳ＝Ｇ／Ｃである。このスキームは、全ての２０種のアミノ酸および使用した大腸菌ＳｕｐＥ系統内でグルタミンの挿入により阻害されているアンバー終止コドンＴＡＧをコードする。オリゴヌクレオチドＢＡＫＬＩＢ：ＧＧＴ  ＧＡＣ  ＧＡＣ  ＧＣＡ  ＣＣＧ  ＧＴＴ  ＧＡＡ  ＧＡＴ  ＣＴＧ  ＡＴＣ  ＣＧＣ  ＴＴＴ  ＧＴＴ  ＮＮＳ  ＣＧＴ  ＣＴＧ  ＣＴＧ  ＮＮＳ  ＴＡＣ  ＡＴＣ  ＮＮＳ  ＧＡＣ  ＮＮＳ  ＡＴＣ  ＡＡＣ  ＣＧＴ  ＣＧＴ  ＧＣＧ  ＧＣＣ  ＧＣＡ  ＧＧＴ  ＧＣＧ（配列番号４５）およびＰＢＡＫＬＩＢ  ＣＧＣ  ＡＣＣ  ＴＧＣ  ＧＧＣ  ＧＧＣ  ＡＣＧ  ＡＣＧ（配列番号４６）を合成しそして変性ゲル電気泳動により精製した。それぞれのオリゴヌクレオチド４００ピコモルを全体積０．２０ｍｌ中の１ｘシークエナーゼ（Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ） 緩衝液（ＵＳＢ）中でアニールした。アニールしたオリゴヌクレオチドを、２．５ｍＭ  ｄＮＴＰｓ、１ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡおよびシークエナーゼ（ＵＳＢ）５０単位を加えそして３７℃で３０分間インキュベーションしてプライマー伸長により二重鎖ＤＮＡに変換した。二重鎖ＤＮＡを、全体積０．４３０ｍｌ中で０．０１５ｍｌ  ＢｇｌＩＩ、０．０１５ｍｌ  ＮｏｔＩ、２．５ｍＭ  ＤＴＴ、０．１ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡを加えて１ｘ緩衝液３（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｖｉｏｌａｂｓ） 内で消化した。反応混合物を等量のトリス緩衝フェノール（ｐＨ８．０）を用いて２回抽出しそして５００Ｖで１ｘＴＢＥ中の１５％アクリルアミド（２９：１アクリルアミド：ビスアクリルアミド）ゲルに加えた。二重に消化した産物をエチジウム染色により可視化、切除および１ｘＴＥ中に抽出した。挿入物をエタノール沈降させた。ベクターｐＪＣ２０の０．１２ｍｇを全体積０．６０ｍｌ中でＢｇｌＩＩ、ＮｏｔＩおよびＰｓｔＩの０．０５ｍｌを用いて消化した。消化したベクターをクロマスピン（Ｃｈｒｏｍａｓｐｉｎ）１０００サイズ排除クロマトグラフィー（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）およびフェノールクロロホルム抽出次いでエタノール沈降により精製した。連結は、ベクター（ｐＪＣ２０）８３０ｎｇおよび挿入物１４ｎｇを用いて連結発現キット（Ｃｈｒｏｍａｓｐｉｎ）を用いて行った。ＴＧ−１大腸菌内へのエレクトロポレーションによる形質転換は、３ｘ１０６ 個の形質転換体を生成した。形質転換体の数は、ライブラリーの理論的な多様性（３２４   ＝１．０５ｘ１０６ ）よりも大きくそしてライブラリーは統計学的に９０％以上完全である。２０個のクローンの自動化ＤＮＡ配列決定は、変異遺伝子がすべての場合に正しく挿入されたことを示した。
【０１０２】
実施例１３−ファージ上のタンパク質結合小型タンパク質の機能選択
ａＰＰＢＡＫライブラリーのバイオパニング（ｂｉｏｐａｎｎｉｎｇ）のために、グルタチオン被覆マイクロタイタープレート（Ｒｅａｃｔｉ−結合グルタチオン被覆プレート＃１５１４０、Ｐｉｅｒｃｅ） を、各洗浄にＰＢＳ０．２０ｍｌを用いて３回洗浄した。ヒト組換えＢｃｌ−２（１−２０５）をサンタクルス・バイオテクノロジー（Ｓａｎｔａ ＣｒｕｚＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）から可溶性ＧＳＴ−融合物として入手した。ＰＢＳ０．２０ｍｌ中のＢｃｌ−２の９．０ピコモルをそれぞれのウエルに加えそして４℃で１２時間、振とうしながらインキュベーションした。次いでウエルを５％脱脂牛乳を含むＴＢＳＴ０．２０ｍｌを用いて３時間ブロックした。使用の前に、ウエルを、ＴＢＳＴを用いて洗浄毎に５分間で３回洗浄した。
【０１０３】
ファージは、上記の実施例記載のようにして産生、採取および増殖したが、３〜５ラウンドでＴＧ−１細胞の代わりにＸＬ１−ブルー細胞を使用してファージ粒子を増殖した点が異なる。この変更は、これまで選択の後半のラウンドで遭遇した欠失の問題を除き、これはＴＧ−１大腸菌のＲｅｃＡ＋性に帰せられる。ファージ粒子をＴＢＳＴ２ｍｌ中に再懸濁した。ファージ０．２０ｍｌ（１ｘ１０１０粒子）をそれぞれのウエルに加えそして選択の最初の２ラウンドは４℃、終わりの３ラウンドは２５℃で３時間インキュベーションした。次いでウエルを１０回、ＴＢＳＴ０．２０ｍｌを用いて洗浄し、その最初のラウンドは２分間洗浄そして以後のラウンド５分間洗浄であった。洗浄は結合反応と同じ温度で行った。選択の５ラウンドの後、１６クローンを自動化ＤＮＡ配列決定により配列決定した。
【０１０４】
ファージライブラリーＢＡＫＬＩＢを固定化ＧＳＴ−Ｂｃｌ−２に対するパニングの５ラウンドにかけた。ファージライブラリーの保持率は最初のラウンドの０．０１％から最後の第５ラウンドの２．２５％まで、選択の過程で２２５倍増加した。最終ラウンドが２５℃で行われ一方最初のラウンドは４℃でおこなわれたので、保持のこの増加はライブラリー保持の改善を過小評価している。５ラウンドの後、１６ファジェミド（ｐｈａｇｅｍｉｄ）ライブラリークローンを配列決定した。選択された配列（図４）は、高度の収束を示した。７種の別個の配列を単離し、４種の配列は複数回現れた。興味あることに、ＢａｋのＩ８１に相当するライブラリー中の残基２８は、最初のプール内で固定されるにもかかわらず、１６個のラウンド５クローンの１１個中でＦに変異している。この結果は、骨格の範囲内で、Ｂｃｌ−２の疎水性ポケット内への結合において、Ｆ２８がＩ２８よりも良いことを示す。１６配列中の１１個は、Ｂａｋ中と同様に位置７５および８２にグリシンを含む。実際、１６回の２個を表す一つの配列は、すべての４つのランダム化された位置においてＢａｋのものと一致する残基を含み、しかしこの配列は位置２８でのＩ−Ｆ変異も含んでいた。他のＢＨ３含有タンパク質との選択された配列の比較はさらに類似性を明らかにした。例えば、ライブラリーの位置２６では、Ｒは１６個の配列中の７個に存在しそしてＲまたはＫは、大部分のＢＨ３ドメイン中にこの位置（Ｂａｋ中の残基７９）で優先されるアミノ酸である。同様に、ライブラリーの位置３１におけるＥは、１６個の配列中の６個で選択され、一方Ｅ／Ｄは大部分の既知ＢＨ３ドメインの相当する位置で優先されるアミノ酸である。
【０１０５】
Ｂａｋおよびその他のＢＨ３ドメイン中のものへのこの位置において選択されたアミノ酸の類似性は、ＢＨ３ドメインの配列がＢｃｌ−２ファミリータンパク質を結合するための必要性から起きたことであって、他の生物学的機能のためではないことを示す。さらに、これは、Ｂａｋと同様に同じ疎水性ポケット内で選択されたペプチドがＢｃｌ−２を結合することを示す。興味あることに、２回現れた一つの配列は、ライブラリーの位置３１にトレオニンを含んでいた。この残基は、疎水性コア形成に寄与できるバリンのメチル基およびＢＨ３ドメイン中の本来のＤ／Ｅ残基と同様に水素結合受容体を提供できるヒドロキシル基の両者を提供する。配列決定されたラウンド５クローン中に２回現れる一つの配列は、ａＰＰ折り畳み残基と登録されないＢｃｌ−２残基の両者を位置させるライブラリー設計に関して、単一アミノ酸欠失を含んでいた。
【０１０６】
実施例１４−タンパク質結合小型タンパク質の合成
Ｆｍｏｃ化学を用いて０．１０ｍＭスケールでペプチドを合成した。それぞれのペプチドは、遊離のＮ−末端アミンおよびＣ−末端アミドを含んでいた。上記の実施例中の記載と同様にしてペプチドを逆相ＨＰＬＣにより精製した。２組のペプチド、ペプチド４０９９−４１０２およびＢａｋペプチド（配列番号７３）を調製した。蛍光標識およびその後のＫｄ 決定のためのペプチドは、追加のカルボキシ−末端ＹＣ配列（ＹはＢａｋの本来の配列からもたらされる）を含み、そのシステインは５−ヨードアセトアミドフルオレセイン（５ＩＡＦ）を用いて標識された。最終濃度２００−４００ｍＭのペプチドを、Ｃ−末端システインの硫黄原子において、ＤＭＦおよびＰＢＳの５０／５０混合物０．２０ｍｌ中の５ＩＡＦ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）の１０当量を用いるインキュベーションによりアルキル化した。標識付与反応は、暗所内で６時間、室温で行った。アルキル化は、ＨＰＬＣにより判定し、本質的に定量的であった。標識したペプチドを逆相Ｃ−１８  ＨＰＬＣにより精製した。ペプチドの同定は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析（Ｖｏｙａｇｅｒ， Ｐｅｒｓｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）により確認した。分子量は、予想通りであった：ｐ４０９９理論〔ＭＨ＋〕＝３９０７、測定〔ＭＨ＋〕＝３９０７；ｐ４１００理論〔ＭＨ＋〕＝４０２０、測定〔ＭＨ＋〕＝４０２０；ｐ４１０１理論〔ＭＨ＋〕＝３９２１、測定〔ＭＨ＋〕＝３９２２；ｐ４１０２理論〔ＭＨ＋〕＝３９０１、測定〔ＭＨ＋〕＝３９０２；Ｂａｋ７２−９４理論〔ＭＨ＋〕＝１７２４、測定〔ＭＨ＋〕＝１７２３；ｐ４１２１−ｆｌｕ理論〔ＭＨ＋〕＝４５６２、測定〔ＭＨ＋〕＝４５６０；ｐ４１２２理論〔ＭＨ＋〕＝４６７５、測定〔ＭＨ＋〕＝４７６６；ｐ４１２３理論〔ＭＨ＋〕＝４５７６、測定〔ＭＨ＋〕＝４５７７；ｐ４１２４理論〔ＭＨ＋〕＝４５５６、測定〔ＭＨ＋〕＝４５５６；Ｂａｋ−ｆｌｕ理論〔ＭＨ＋〕＝２５３５、測定〔ＭＨ＋〕＝２５３５。ペプチド濃度はアミノ酸分析により決定した。
【０１０７】
実施例１５−他のタンパク質への小型タンパク質の結合
選択されたペプチドまたはＢａｋ  ＢＨ３ペプチドへのＢｃｌ−２結合の平衡解離定数を測定するために、０．０２０−０．０４０ｍＭの間の一定濃度で加えた蛍光標識ペプチドを用いてＰＢＳ中で０．００３６ｍＭより段階的に希釈した。４℃における４０分間の平衡化の後、ＰＳ−２２０Ｂランプパワーサプライ（Ｐｈｏｔｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ） を用いてフルオレセインを４９２ｎｍで励起しそして５０５と５６０ｎｍの間の蛍光発光スペクトルを２ｎｍステップで１秒間の平衡時間を用い、５ｎｍスリット幅を用いて８１４フォトマルティプライアー（ｐｈｏｔｏｍｕｌｔｉｐｌｉｅｒ） 検出システム（Ｐｈｏｔｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ） に記録した。３回の独立した試験に対する５１５ｎｍにおける蛍光放出極大を平均しそして以上に記載のようにして解離定数を算出した（ｎｅｅｄ ｒｅｆ）。同様の実験をＢａｋペプチドまたはカルボニックアンヒドラーゼＩＩ（Ｓｉｇｍａ） またはカルモジュリン（Ｓｉｇｍａ） を結合する選択されたペプチドに対する解離定数を決定するために使用した。カルモジュリン結合は、２０ｎＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．２）、１３０ｍＭ  ＫＣｌ、１ｍＭ  ＣａＣｌ２ から成る緩衝液中で測定し、一方カルボニックアンヒドラーゼ結合はＰＢＳ中で測定した。
【０１０８】
ラウンド５からの１６種の配列決定したクローン内に複数回現れた４種の配列に伴うＢａｋペプチドを化学的に合成した。ペプチドのＢｃｌ−２結合親和性は、ペプチドに対するカルボキシ末端フルオレセイン標識の蛍光放出の変化をＢｃｌ−２濃度の関数として測定して決定した。このアッセイを確認するために、Ｂｃｌ−２に結合するＢａｋペプチドに対するＫｄ を測定した。このＫｄ は３６３ｎＭ±５６ｎＭであり、ＢａｋペプチドＢｃｌ−ＸＬ 相互作用に対して以前に報告した３４０ｎＭのＫｄ （Ｂｃｌ−ＸＬ 中の固有トリプトファンの蛍光クエンチングにより測定）およびＢａｋ  Ｂｃｌ−２相互作用に対して報告した約２００ｎＭのＫｄ （フルオレセイン標識Ｂａｋペプチドの蛍光偏光により測定）と一致する。選択したペプチドに対するＫｄ は：ｐ４０９９  Ｋｄ ＝３５２±３３ｎＭ、ｐ４１００  Ｋｄ ＝４０１±４０ｎＭ、ｐ４１０１  Ｋｄ ＝８１１±２０ｎＭ、ｐ４１０２  Ｋｄ ＝３７００±１４００ｎＭであった。欠失がないすべてのペプチドに対するＫｄ は、これらが、α−ヘリックス中に欠失を含む変異体ｐ４１０２よりも著しく良く結合することを示す。この一連のペプチド内で、ｐ４０９９（ＧＡＧＴ）はｐ４１０２（ＧＡＧＤ）よりも約２倍良く結合し、これらは位置３１でＤがＴに変わっているだけである。ｐ４１００（ＧＲＧＥ）は、ｐ４０９９と同程度の親和性で結合し、これらの２種のペプチドがタンパク質−タンパク質界面を形成するための収束性で同等の解決を表すことを示す。
【０１０９】
Ｂａｋペプチドへの４０９９の特異性を比較するために、カルモジュリンとのこれらの相互作用を研究した。カルモジュリンは、ある範囲のα−ヘリックス、および大きい疎水性くぼみを有するカルボニックアンヒドラーゼＩＩを結合することが知られる。ｐ４０９９はカルモジュリンと０．０２５±０．００４ｍＭのＫｄ で、Ｂａｋペプチドはカルモジュリンと０．０２５±０．００４ｍＭのＫｄ で結合した。ｐ４０９９はカルボニックアンヒドラーゼＩＩを０．００８６±０ｍＭのＫｄ で結合し、Ｂａｋペプチドはカルボニックアンヒドラーゼと０．００２２±０．００４６ｍＭのＫｄ で結合した。ｐ４０９９はこれらの非特異性タンパク質を良く識別し、これはペプチドとＢｃｌ−２との間の相互作用がファンデルワールス接触の立体特異性の組からもたらされることを示す。
【０１１０】
実施例１６−タンパク質結合小型タンパク質の構造
円偏光二色性スペクトルをアヴィブ２０２ＣＤ分光計でＰＢＳ中で記録しそしてバックグランウンドは補正したが平滑化は行わなかった。波長走査は４℃で２００と２６０ｎｍの間、１ｎｍ間隔で、それぞれの間隔において５秒間の記録時間をもって行った。Ｂａｋ（７２−９４）、４０９９、４１００、４１０１、４１０２をそれぞれ濃度０．０２８ｍＭ、０．００６９ｍＭ、０．０１１９ｍＭ、０．０１４ｍＭおよび０．０１６ｍＭの濃度で使用した。熱変性曲線を２２２ｎｍで４〜９８℃の間を２℃段階で、それぞれの温度で１分間の平衡で測定した。ペプチドは、上記の波長走査のために使用した最高の濃度で使用した。平均残留楕円率およびヘリシティ百分率は、バックグランウンド補正の後に２２２ｎｍの値から算出した。
【０１１１】
ペプチドの構造を上記のように遠紫外円偏光二色性により研究した。波長走査は、Ｂａｋペプチドに対して以前に報告したランダムコイルの特徴を明らかにした。反対に、選択されたペプチド４０９９、４１００、４１０１、４１０２は、α−ヘリックス含有の特徴である２０８および２２２ｎｍに極小を示す。ペプチド４０９９の平均楕円率は、０．００１１ｍＭの最低測定可能濃度まで濃度に依存しないことを示した。ｐ４０９９のヘリシティ百分率は、約６０％であり、残基１４−３５がヘリックスコンフォーメーションをとるａＰＰ類似折り畳みと一致する。このヘリシティは、上記の実施例に記載のような高い親和性および特異性を用いてＤＮＡを結合するように発展したペプチドであるｐ００７に見られるものと同様である。ペプチドの熱変性は、２２２ｎｍにおける遠紫外円偏光二色性により測定した。ｐ４０９９は約６５℃のＴｍ を有する協同熱溶融を有し、これはａＰＰに報告されたＴｍ と同程度である。
実施例１７−ｈＤＭ２−ｐ５３相互作用を阻害する小型タンパク質
ｈＤＭ２は、ｐ５３活性化ドメイン（ｐ５３ＡＤ）に結合し、転写装置を有するこのドメインの相互作用を阻害しそして分解のためにｐ５３を標的とすることによりｐ５３を阻害する。ｐ５３ＡＤのわずか１５個のアミノ酸がｈＤＭ２の高親和性相互作用を支持する。ｐ５３およびａＰＰのα−ヘリックスセグメントを図５に整列して記載する。この整列は、３個の重要なｈＤＭ２接触残基（Ｐｈｅ２２、Ｌｅｕ２９、およびＴｒｐ２６）を、折り畳みにとって重要ないかなるａＰＰ残基を見捨てることなくａＰＰの露出α−ヘリックス面上に位置させる。ｐ５３ＡＤ−ｈＤＭ２構造中の多数のｐ５３残基が理想のα−ヘリックス範囲外のファイ−プサイ角を示すので、α−ヘリックスに沿う５位置において多様性が導入されそしてファージ提示を用いて最高の親和性のリガンドを選択した。生成したＭ１３ファージのライブラリーは、６ｘ１０７ 形質転換体を含み、これは理論的な多様性（３．４ｘ１０７ ）を越える値である。グルタチオン被覆９６ウエルプレート上に固定化したＧＳＴ−ｈＤＭ２（残基１−１８８）へのファージの親和性に基づいてファージを３ラウンドで選別した。弱く結合したファージは十分洗浄して除去しそして結合したファージは低ｐＨで溶離した。３回の選択ラウンドは、ＧＳＴ−ｈＤＭ２に対する親和性において１００倍の濃縮に導いた。ラウンド２およびラウンド３からの種々のペプチドを合成しそして蛍光偏光分析のためにフルオレセインを用いてＣ−末端で標識した。
【０１１２】
ｈＤＭ２に対するそれぞれのペプチドの親和性を決定するために、ＧＳＴ−ｈＤＭ２の種々の濃度（５０ｎＭ〜０．００２ｍＭ）を標識したペプチドの一定濃度（２５ｎＭ）を用い、４℃で２０分間インキュベーションした。４９２ｎｍで試料を照射しそして蛍光を５１５ｎｍで測定した。ｐ５３ＡＤ（残基１５−３３）を含むペプチドを陽性対照として使用した。このアッセイの条件下で、ｐ５３ＡＤ−ｈＤＭ２複合体を、直接測定する場合にはＫｄ ＝２６１ｎＭ、競合により測定する場合には１．２ｍＭで特性検討し、蛍光部分がこの相互作用の安定性に対して測定可能な効果を有することを確認した。直接測定する場合には、選択されたペプチドのそれぞれはＧＳＴ−ｈＤＭ２に対して高い親和性を示し、その解離定数はナノモル濃度の範囲内であった。選択されたペプチドの一つであるｐＺｕｔｓｈｉ（配列番号３６）は、ｐ５３ＡＤ自体よりも著しく強力であり、ＧＳＴ−ｈＤＭ２をＫｄ ＝９９ｎＭ±１ｎＭで結合した。このようにｐＺｕｔｓｈｉ（ｐ３５５９）は３１個のアミノ酸を含み、ｐ５３ＡＤペプチド（およびその変種）が１０９残基チオレドキシンの活性部位ループ内に組み込まれた進化したタンパク質アンタゴニストに類似の活性を示す。
【０１１３】
ｐＺｕｔｓｈｉとｈＤＭ２との間の相互作用の特異性をプローブするために、我々は、ラセン状または疎水性ペプチドまたは小分子を結合する一連の受容体および酵素に対する小型タンパク質の親和性を測定した。多数のα−ヘリックスペプチドおよびタンパク質を結合するその能力のために有名なＥＦハンドタンパク質であるカルモジュリンは、ｐＺｕｔｓｈｉをミリモル濃度範囲の親和性を以て温和に結合した（Ｋｄ ≒２．５ｍＭ）。同様のＫｄ 値が、他のｂＺＩＰタンパク質とダイマー性複合体を形成するＦｏｓのｂＺＩＰ領域（４２μＭ）、ＣＯ２ を結合するカルボニックアンヒドラーゼ（０．２９８ｍＭ）およびプロテインキナーゼＡ（０．０１６ｍＭ）を用いて行った類似の実験において測定された。これらの複合体の安定性とｐＺｕｔｓｈｉとＧＳＴ−ｈＤＭ２との間で形成された複合体との安定性（９９ｎＭ）との間の大きい相違は、後者の複合体が特異性でありそしてファンデルワールス接触の高い立体特異性組により安定化されていることを示唆する。
【０１１４】
ｐＺｕｔｓｈｉが、ｐ５３の同時結合を阻害する様式でｈＤＭ２を結合するかどうかおよびこの阻害の濃度依存性を確定するために競合実験を行った。４００ｎＭ  ＧＳＴ−ｈＤＭ２および１０ｎＭ  ｐ５３ＡＤ−ＦｌｕをｐＺｕｔｓｈｉの種々の濃度でインキュベーションしそして平衡におけるｐ５３ＡＤ−Ｆｌｕ結合の割合を測定した。ｐＺｕｔｓｈｉが存在しないと、ｐ５３ＡＤの約６０％がこれらの溶液条件下で結合される。ｐＺｕｔｓｈｉを添加すると、ＧＳＴ−ｈＤＭ２に結合したｐ５３ＡＤのフラクション内での濃度依存性低下（Ｋｉ ＝７２２ｎＭ）となった。同様のＫｉ 値がさらに短いおよびさらに長いインキュベーション時間で決定され、平衡に到達していたことを示した。
【０１１５】
ｈＤＭ２が存在しない場合のｐＺｕｔｓｈｉの二次構造を円偏光二色性分光測定を用いて研究した。ｐＺｕｔｓｈｉのＣＤスペクトルは、２０８ｎｍおよび２２２ｎｍにおける著しく負の楕円率を特徴とし、これはａ−ヘリックスを含むタンパク質に対して予想される通りである。温度依存性実験は、ｐＺｕｔｓｈｉが４７℃のＴｍ を特徴とする協力溶融転移を受けることを示した。０．００２７５および０．００６７５ｍＭにおけるＣＤスペクトルは一致し、ｐＺｕｔｓｈｉがこの範囲内では濃度依存性コンフォーメーション変化を受けないことを示唆しそして溶液内ので良く折り畳まれたモノマーとしてこが存在することへの支持を提供する。反対に、ｐ５３ＡＤのＣＤスペクトルは、２５℃のラセン構造の証拠をほとんど示さない。
【０１１６】
実施例１８−プロテインキナーゼＡを阻害するための小型タンパク質
ＰＫＡ（ｐＰＫＩ１、ｐＰＫＩ２、ｐＰＫＩ３）の３種の異なる可能な小型タンパク質阻害剤を、ＰＫＡの公知のα−ヘリックスペプチド阻害剤であるＰＫＩからの残基をａＰＰの露出α−ヘリックス面上にグラフト化して設計した。これらの可能な小型タンパク質は、ＰＫＡを結合しそしてａＰＰを折り畳むために重要な残基がどのように整列されることに関し、および残基のどの形式が相違の位置に保持されるかに関して異なった。一つの小型タンパク質（ａＰＫ１２）がＰＫＡを結合して阻害しそしてＫｄ ＝９９ｎＭおよびＩＣ５０＝８ｎＭを示し、これはＰＫＩ自体で測定された値（Ｋｄ ＝３１．２ｎＭおよびＩＣ５０＝８ｎＭ）と同様であった。さらにａＰＫ１２はＰＫＡを選択的に阻害し、これはＡＴＰを模擬する多数の小分子阻害剤とは異なる。８炭素リンカーを介してこのような小分子キナーゼ阻害剤、Ｋ２５２ａに束縛されたａＰＫ１２の阻害能力を特性化するための研究が進行中である。Ｋ２５２ａ単独では、ＰＫＡとＰＫＣとの間を識別せずそしてＰＫＡを用いた実験で３５ｎＭのＩＣ５０値を示した。
【０１１７】
実施例１９−同時活性化タンパク質ＣＲＥＢ−結合タンパク質（ＣＢＰ）との相互作用を介する活性化転写のための小型タンパク質
グラフト化プロトコールの第一段階として、プロテインキナーゼＡ（ＰＫＡ）認識部位およびヘリックスＢ（残基１３０−１４６）の両者を包含するＣＲＥＢの領１０、ＰＫＡによるリン酸化、ＣＢＰによる結合またはａＰＰの折り畳みに必要な残基間に相違が起きないようにしてａＰＰのα−ヘリックスと整列した。折り畳まれた小型タンパク質の同定を助けるために、これらの残基全部およびａＰＰ  ＰＰＩＩラセンに沿う５位置におけるすべての２０アミノ酸を含む（一つの例外あり）ファージ提示のためのペプチドのライブラリーを創成した。これらの位置は配列ＧＸＳ  ＸＸＴ  ＸＸＧ  ＤＤＡ  ＰＶＲ  ＲＬＳ  ＦＦＹ  ＩＬＬ  ＤＬＹ  ＬＤＡ  Ｐ（配列番号６９）中に「Ｘ」で示されている。ＣＲＥＢのＴｙｒ１３４に相当する残基をライブラリー内でＰｈｅ残基として固定した。ＣＲＥＢ  ＫＩＤドメインの範囲内で、ＴｙｒからＰｈｅへの変異はＫＩＸへの親和性に影響しないが、しかしＰＫＡによるリン酸化に対するＫｍ を低下する。Ｐｈｅ残基が我々のグラフトしたペプチドの範囲内で類似した役割を演じそしてファージ面上でリン酸化されるこれらの能力を増強すると推論された。グラフト化されたペプチドの残基２、４、５、７おび８は、ライブラリー内のすべての２０アミノ酸およびアンバーＴＡＧ終止コドンにランダム化された。ａＰＰのポリプロリンラセン内の相当する残基は、疎水性コアに貢献する。我々のライブラリーは５ｘ１０７ の独立した形質転換体を含み、これは理論的な多様性３２５ ＝３．３ｘ１０７ より大きい。統計的に、ライブラリーは７５％完全より大きい。ライブラリーファージをプロテインキナーゼＡを用いて処理し、次いで固定化ＧＳＴ−ＫＩＸへの結合に基づいて選別した。選択の８ラウンドを行い、その２ラウンドは４℃そして６ラウンドは２５℃で行った。
【０１１８】
２０種のクローンをラウンド６および７より配列決定し、そして３８種のクローンをラウンド８から配列決定した。一つの配列（ＰＰＫＩＤ１）：ＧＡＳ  ＤＭＴ  ＹＷＧ  ＤＤＡ  ＰＶＲ  ＲＬＳ  ＦＦＹ  ＩＬＬ  ＤＬＹ  ＬＤＡ  Ｐ（配列番号７０）はラウンド６で１回そしてラウンド７で１回見いだされた。他の配列（ＰＰＫＩＤ２）：ＧＭＳ  ＲＶＴ  ＰＧＧ  ＤＤＡ  ＰＶＲ  ＲＬＳ
ＦＦＹ  ＩＬＲ  ＤＬＹ  ＬＤＡ  Ｐ（配列番号７２）はラウンド６で１回、ラウンド７で４回そしてラウンド８で１９回見いだされた。この配列は、元のライブラリーと比較して一個のアミノ酸変異（ＬｅｕからＡｒｇ）を含むことに注意のこと。第三の配列（ＰＰＫＩＤ３）：ＧＡＳ  ＰＨＴ  ＳＳＧ  ＤＤＡ  ＰＶＲ  ＲＬＳ  ＦＦＤ  ＩＬＬ  ＤＬＹ  ＬＤＡ  Ｐ（配列番号７３）は、ラウンド７で２回そしてラウンド８で１４回見いだされた。この配列も元のライブラリーと比較して一個のアミノ酸変異（ＴｙｒからＡｓｐ）を含むが、しかしＰＰＫＩＤ２のものとは異なる変異である。
【０１１９】
これら３種の配列のそれぞれに相当する合成ペプチドをリン酸化および非リン酸化の両方の形で合成し、アセトアミドフルオレセインを用いてＣ−末端Ｃｙｓ上に標識し、そしてＣＢＰのＫＩＸドメインへのこれらの親和性を蛍光偏光により測定した。これらの結合実験中の陽性対照として使用するために２種のペプチドを合成した。その一つのＫＩＤ３１は、ＣＲＥＢの残基１１９−１４８を含み、そしてアッセイがＫＩＸ結合親和性の正確な測定を与えることを確実とするために使用した。リン酸化ＫＩＤ３１はＧＳＴ−ＫＩＸを０．００１２ｍＭのＫｄ で結合し、これは５５０と７５０ｎＭの間の報告された値に近い値である。ＣＲＥＢの残基１３０−１４８（すなわちグラフト化残基）を含む第二のペプチドであるＫＩＤ２０は、単離されたヘリックスＢのＫＩＸ結合親和性を測定するために使用された。リン酸化ＫＩＤ２０はＧＳＴ−ＫＩＸを０．０４８ｍＭのＫｄ で結合した。反対にすべての３種の選択されたペプチドは、リン酸化された場合にも、またさらに弱いけれどの非リン酸化の場合にも共に大幅に高い親和性でＧＳＴ−ＫＩＸを結合した。リン酸化ＰＰＫＩＤ１：Ｋｄ ＝３１ｎＭ、リン酸化ＰＰＫＩＤ２：Ｋｄ ＝２８０ｎＭ、非リン酸化ＰＰＫＩＤ２：Ｋｄ ＝０．００７６ｍＭ、リン酸化ＰＰＫＩＤ３：Ｋｄ ＝７３ｎＭ、非リン酸化ＰＰＫＩＤ３：Ｋｄ ＝６８１ｎＭ。
【０１２０】
実施例２０−共通小型タンパク質ファージディスプレイライブラリーの調製
小型タンパク質の発見および操作において一般に使用するめに設計される組合せライブラリーも、本発明の方法を用いて構築できる。この共通ライブラリーは、認識のために用いられる天然エピトープの事前知識がなくても、小型タンパク質による核酸、タンパク質または小分子の認識を可能とするエピトープの組み合わせた一組を提示するように設計される。共通ライブラリーは、最適には、疎水性ａＰＰコアの形成に寄与しないａＰＰの溶剤露出面上の変化する（少なくとも約）６個の残基により形成される（図６）。ａＰＰのこれらの残基は、Ｔｙｒ２１、Ａｓｎ２２、Ａｓｐ２２、Ｇｌｎ２３およびＡｓｎ２６を含む。この共通ライブラリーのすべてのメンバーは、認識のために利用できる多様で機能性な溶剤露出面を導入すると同時に、鳥類膵臓ポリペプチドの顕著な安定性およびコンパクトな構造を保持する。６員ライブラリーの配列空間をカバーするために必要な独立した形質転換体の数（２．５ｘ１０９ クローン）は実験的に実現可能である。
【０１２１】
本発明は上記の実施例を引用して詳細に説明したが、本発明の精神から離れることなく種々の変更が可能であることと理解される。従って、本発明は請求の範囲によってのみ限定される。本出願中に引用したすべての特許および出版物は、引用することによって本明細書中に編入される。本明細書中に開示した実験の一部の結果は、すでに公開されている（Ｚｏｎｄｌｏ ＆ Ｓｃｈｅｐａｒｔｚ， （１９９９） Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． １２１， ６９３８−６９３９； Ｃｈｉｎ ＆ Ｓｃｈｅｐａｒｔｚ，（２００１） １２３ ２９２９−２９３０）。
【図面の簡単な説明】
【図１】
ＤＮＡ結合小型タンパク質の設計のためのタンパク質グラフト化戦略。
【図２】
（Ａ）タンパク質設計を誘導するために使用したａＰＰおよびＧＣＮ４塩基性−スペーサーセグメント配列の整列。ＧＣＮ４中の本質的なＤＮＡ接触残基はピンクで示す。ａＰＰ中の本質的な折り畳み残基は黄色または青色で示す。相違する位置は破線で示す。（Ｂ）使用したペプチドおよびｈｓＣＲＥ４へのこれらの親和性。安定なＰＰＢＲＳＲ−ｈｓＣＲＥ複合体の平衡解離定数を右に表示する。Ｇ５６およびＧ２７を除くすべてのペプチドは、これらのカルボキシル末端にＧＧＣ配列を含む。Ｇ２７は１個のシステインを含む。カルボキシ末端システインは、タンパク質モノマー（ＰＰＢＲＳＲおよびＧ２７）を研究するためにブロモアセトアミドを用いてアルキル化されるかまたはジスルフィド−連結ダイマー（ＰＰＢＲＳＳ）を研究するために酸化された。
【図３】
（Ａ）ａＰＰの結晶構造上にマップされた変動を標的とするＰＰＢＲ４の残基。ライブラリーＡ中で変化した側鎖は黄色、ライブラリーＢ中で変化した側鎖は緑色で示す。（Ｂ）ＰＰＢＲ４配列および２種のライブラリー配列。変化した残基はＸで示す。それぞれの位置をＮＮＳコドンスキームを用いてＤＮＡレベルでランダム化した。（Ｃ）３回の選択ラウンド後のライブラリーＢクローンのＤＮＡ配列から誘導したＮ−末端アミノ酸の配列。ＰＰＢＲ４の残留残基が続く四角に入れた配列を含むペプチドを合成しそしてこれらの性質を生体外で研究した。
【図４】
ＢＡＫＬＩＢファージライブラリーから単離された７種の識別された配列。Ｂｃｌ−２に結合する小型タンパク質に対する解離定数を右に示す。
【図５】
ｈＤＭ２に結合するｐ５３を阻害するｐ５３小型タンパク質の配列。ａＰＰコアを安定化する残基は黄色または青色、ｈＤＭ２を結合すことに貢献する残基を紫色、ファージ提示により同定された残基を赤色で示す。安定なＰＰＢＲＳＲ−ｈｓＣＲＥ複合体の平衡解離定数を右に表示する。
【図６】
ａＰＰ溶剤露出面（上図）上の変化（ベージュ色）のために選定された６個の残基の相対配置を示す共通ライブラリーの図２枚。左側の図はα−ヘリックスに沿って位置し、右側の図はα−ヘリックス軸に垂直に位置する。青色の残基はａＰＰ疎水性コアを形成するために貢献する。ａＰＰおよび共通ライブラリーの整列（下図）。青色の残基はａＰＰ疎水性コアを安定化する。赤色の残基は変化を標的とする。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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