(57)【要約】本発明は診断及びドラッグ・デリバリーの分野において活性剤を放出するために有用であるペプチドに関する。
2004523531.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ペプチドの細胞溶解又は剤デリバリー活性が、上記ペプチドに直接的に又は間接的に作用する１以上のパラメーターにおける変化により調節され、ここで、１以上の上記パラメーターにおける変化は生理学的値に近いｐＨで上記ペプチドにより細胞溶解又は剤デリバリーを引き起こす、細胞溶解又は剤デリバリーペプチド。
【請求項２】
上記細胞溶解又は剤デリバリー活性は開始ｐＨから調節ｐＨまでのｐＨにおける変化により調節され、ここで、上記開始ｐＨは生理学的ｐＨ値付近である、細胞溶解又は剤デリバリーペプチド。
【請求項３】
上記細胞溶解又は剤デリバリー活性が起こるｐＨ値が７．４０未満である、請求項１又は２に記載のペプチド。
【請求項４】
ｐＨ６．５〜７．４で細胞溶解する又は剤をデリバリーするよう整えられる、請求項１又は２に記載のペプチド。
【請求項５】
ｐＨ６．６〜７．４で細胞溶解する又は剤をデリバリーするよう整えられる、請求項４に記載のペプチド。
【請求項６】
ｐＨ６．７〜７．４で細胞溶解する又は剤をデリバリーするよう整えられる、請求項４に記載のペプチド。
【請求項７】
ｐＨ６．８〜７．４で細胞溶解する又は剤をデリバリーするよう整えられる、請求項４に記載のペプチド。
【請求項８】
ｐＨ６．９〜７．４で細胞溶解する又は剤をデリバリーするよう整えられる、請求項４に記載のペプチド。
【請求項９】
ｐＨ７．０〜７．４で細胞溶解する又は剤をデリバリーするよう整えられる、請求項４に記載のペプチド。
【請求項１０】
ｐＨ７．１〜７．４で細胞溶解する又は剤をデリバリーするよう整えられる、請求項４に記載のペプチド。
【請求項１１】
ｐＨ７．２〜７．４で細胞溶解する又は剤をデリバリーするよう整えられる、請求項４に記載のペプチド。
【請求項１２】
上記ペプチドの疎水性は、実質的な正電荷を維持する一方で、ｐＨが下がるにつれて増大する、請求項１〜１１のいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項１３】
上記細胞溶解活性又は剤デリバリー活性は上記ペプチドに結合していた剤を放出することを含む、請求項１〜１２のいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項１４】
上記ペプチドは比較的低いＰｉ値を有する主に負に荷電した部分及び比較的高いＰｉ値を有する主に正に荷電した部分を有する、請求項１〜１３のいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項１５】
負に荷電した部分は比較的低いＰｉ値を有する少なくとも２のアミノ酸を含む、請求項１４に記載のペプチド。
【請求項１６】
前記少なくとも２のアミノ酸はグルタミン酸及びアスパラギン酸から選ばれる、請求項１５に記載のペプチド。
【請求項１７】
上記負に荷電した部分のＰｉ値は約４である、請求項１４、１５又は１６に記載のペプチド。
【請求項１８】
上記正に荷電した部分は比較的高いＰｉ値を有する少なくとも２のアミノ酸を含む、請求項１４〜１７のいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項１９】
前記少なくとも２のアミノ酸はリジン、アルギニン又はヒスチジンから選ばれる、請求項１８に記載のペプチド。
【請求項２０】
上記正に荷電した又は負に荷電した部分は上記ペプチドの末端又はその付近である又は上記ペプチドの側鎖により提供される、請求項１４〜１９のいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項２１】
上記正に荷電した部分のＰｉ値は約９である、請求項１８又は１９に記載のペプチド。
【請求項２２】
負に荷電した部分は組成物：
Ｘｎ１  Ｙｎ２
｛式中、ｎ１は＞２であり、及び
ｎ２は７−ｎ１であり、
及び、ここで、Ｘはグルタミン酸及び／又はアルパラギン酸であり、そして
Ｙはリジン、アルギニン又はヒスチジン以外のアミノ酸である。｝
を有する、請求項１４〜２１のいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項２３】
上記正に荷電した部分は組成物：
Ａｎ１  Ｂｎ２
｛ここで、ｎ１＞２、及び
ｎ２＝Ｚ−ｎ１
及び、ここで、Ｘはグルタミン酸及び／又はアルパラギン酸であり、
Ｂはグルタミン酸又はアルパラギン酸以外のアミノ酸であり、そして
Ｚは７〜１４の整数である。｝
を有する、請求項１４〜２１のいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項２４】
Ｚ＝９である、請求項２３に記載のペプチド。
【請求項２５】
上記ペプチドは異なるｐＨへの暴露によりプロトン化され又は脱プロトン化されうる１以上の化学基を含む、請求項１〜２４のいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項２６】
上記基はｐＨ７．４又はそれ未満で負の電荷を有する化合物を含む、請求項２５に記載のペプチド。
【請求項２７】
上記基は６．５〜７．４のｐＨで負の電荷を有する化合物を含む、請求項２６に記載のペプチド。
【請求項２８】
上記化合物はカルボキシル、ヒドロキシル又はフォスフェートである、請求項２６又は２７に記載のペプチド。
【請求項２９】
上記ペプチドは異なるｐＨへの暴露によりプロトン化され又は脱プロトン化されうる１以上の化学基を含むよう改変されている又はされうる、請求項１〜２２のいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項３０】
還元剤への暴露により還元され又は酸化剤への又は異なる酸化還元ポテンシャルへの暴露により酸化されうる１以上の化学基を含む、請求項１〜２９のいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項３１】
少なくとも１の上記基は酸化還元プローブである、請求項３０に記載のペプチド。
【請求項３２】
少なくとも１の上記基はメチオニン、システイン又はヒスチジンの如きアミノ酸又はこれらのアミノ酸のいずれか１の組み合わせである、請求項３０に記載のペプチド。
【請求項３３】
還元剤への暴露により還元され又は酸化剤への又は異なる酸化還元ポテンシャルへの暴露により酸化されうる１以上の化学基を含むよう改変されている又はされうる、請求項１〜３０のいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項３４】
少なくとも１の上記基は酸化還元プローブである、請求項３３に記載のペプチド。
【請求項３５】
少なくとも１の上記基はメチオニン、システイン又はヒスチジンの如きアミノ酸又はこれらのアミノ酸のいずれか１の組み合わせである、請求項３３に記載のペプチド。
【請求項３６】
少なくとも１の光化学的に活性な化学基を含む、請求項１〜３５のいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項３７】
上記光化学的に活性な基は光異性化可能なアゾベンゼン又はスピロピラン及びそれらのアミノ酸アナログを含む、請求項３６に記載のペプチド。
【請求項３８】
少なくとも１の光化学的に活性な化学基を含むよう改変されている又は改変されうる、請求項１〜３５のいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項３９】
上記光化学的に活性な基は光異性化可能なアゾベンゼン又はスピロピラン及びそれらのアミノ酸アナログを含む、請求項３８に記載のペプチド。
【請求項４０】
酵素−基質−結合ペプチドを形成するために酵素の基質に結合される、請求項１〜３９のいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項４１】
上記ペプチドは続いて選択されるパラメーターに応答して溶解することができる活性ペプチドを産生するために前記酵素基質にはたらく酵素に暴露される、請求項４０に記載のペプチド。
【請求項４２】
上記アミノ酸配列ＥＡＡＬＡＥＡＬＡＥＡＬＡＥＧＫ（ビオチニル）ＰＡＬＩＳＷＩＲＲＲＬＱＱを含む又はから成る、請求項１〜４１のいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項４３】
上記アミノ酸配列ＥＡＡＬＡＥＡＬＡＥＡＬＡＥＧＫＰＡＬＩＳＷＩＲＲＲＬＱＱを含む又はから成る、請求項１〜４１のいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項４４】
上記アミノ酸配列ＥＡＡＬＡＥＡＬＡＥＡＬＡＥＧＫＰＡＬＩＳＷＩＲＲＲＫ（ミリストイル）ＱＱを含む又はから成る、請求項１〜４１のいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項４５】
上記アミノ酸配列ＥＡＡＬＡＥＡＬＡＥＡＬＡＥＧＫＰＡＬＩＳＷＩＲＲＲＱＱＫを含む又はから成る、請求項１〜４１のいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項４６】
上記アミノ酸配列ＥＡＡＬＡＥＡＬＡＥＡＬＡＥＧＫＰＡＬＩＳＷＩＲＲＬＱＱを含む又はから成る、請求項１〜４１のいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項４７】
上記アミノ酸配列ＥＡＡＬＡＥＡＬＡＥＡＬＡＥＧＫ（ＥＬＦＴＮＲ）ＰＡＬＩＳＷＩＲＲＲＬＱＱを含む又はから成る、請求項１〜４１のいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項４８】
上記アミノ酸配列ＧＩＧＡＶＬＲＶＬＴＴＧ（ＴＬＬＥＦＬＬＥＥＬＬＥＦＬ）ＫＰＡＬＩＳＷＩＲＲＲＲＱＱを含む又はから成る、請求項１〜４１のいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項４９】
上記アミノ酸配列ＥＡＡＬＡＥＡＬＡＥＡＬＡＥＧＫＰＡＬＩＳＷＩＲＲＲＱＱＫを含む又はから成る、請求項１〜４１のいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項５０】
上記アミノ酸配列ＷＥＡＡＬＡＥＡＬＡＥＡＬＡＥＨＬＡＲＡＬＡＥＡＬＥＡＬＡＡを含む又はから成る、請求項１〜４１のいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項５１】
上記アミノ酸配列ＷＥＡＬＡＥＡＬＡＥＡＬＡＥＨＬＡＫＡＬＡＥＡＬＥＡＬＡＡを含む又はから成る、請求項１〜４１のいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項５２】
上記アミノ酸配列ＧＩＧＡＶＬＲＶＬＴＴＧ（ＴＬＬＥＦＬＬＥＥＬＬＥＥＬ）ＫＰＡＬＩＳＷＩＲＲＲＲＱＱを含む又はから成る、請求項１〜４１のいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項５３】
上記アミノ酸配列ＷＥＡＡＬＡＥＡＬＡＥＡＳ（フォスフォ）ＡＥＨＬＡＲＡＬＡＥＡＬＥＡＬＡＡ−Ａを含む又はから成る、請求項１〜４１のいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項５４】
上記アミノ酸配列ＬＥＡＡＬＡＥＡＬＥＡＬＡＡＧＫＰＡＬＩＳＷＩＲＲＲＲＱＱ−ＡＭＩＤＥを含む又はから成る、請求項１〜４１のいずれか１項に記載のペプチドであって、薬物デリバリーのためのいずれかの前記請求項に記載のペプチドの使用。
【請求項５５】
遺伝子デリバリーのための、請求項１〜５４のいずれか１項に記載のペプチドの使用。
【請求項５６】
エンドソームのデリバリーのための、請求項１〜５４のいずれか１項に記載のペプチドの使用。
【請求項５７】
リポソーム及び請求項１〜５４のいずれか１項に記載の細胞溶解又は剤デリバリーペプチドを含む複合体。
【請求項５８】
上記ペプチドは請求項１〜５４のいずれか１項に記載のペプチドであり、ここで、生理学的値に近いｐＨにおける変化は細胞溶解又は剤のデリバリーを引き起こす、細胞溶解ペプチド−リポソーム複合体。
【請求項５９】
７．４未満のｐＨで細胞溶解する又は剤をデリバリーするよう整えられる、請求項５８に記載の細胞溶解ペプチド−リポソーム複合体。
【請求項６０】
ｐＨ６．５〜７．４で細胞溶解する又は剤をデリバリーするよう整えられる、請求項５８に記載の細胞溶解ペプチド−リポソーム複合体。
【請求項６１】
ｐＨ６．６〜７．４で細胞溶解する又は剤をデリバリーするよう整えられる、請求項５８に記載の細胞溶解ペプチド−リポソーム複合体。
【請求項６２】
ｐＨ６．７〜７．４で細胞溶解する又は剤をデリバリーするよう整えられる、請求項５８に記載の細胞溶解ペプチド−リポソーム複合体。
【請求項６３】
ｐＨ６．８〜７．４で細胞溶解する又は剤をデリバリーするよう整えられる、請求項５８に記載の細胞溶解ペプチド−リポソーム複合体。
【請求項６４】
ｐＨ６．９〜７．４で細胞溶解する又は剤をデリバリーするよう整えられる、請求項５８に記載の細胞溶解ペプチド−リポソーム複合体。
【請求項６５】
ｐＨ７．０〜７．４で細胞溶解する又は剤をデリバリーするよう整えられる、請求項５８に記載の細胞溶解ペプチド−リポソーム複合体。
【請求項６６】
ｐＨ７．１〜７．４で細胞溶解する又は剤をデリバリーするよう整えられる、請求項５８に記載の細胞溶解ペプチド−リポソーム複合体。
【請求項６７】
ｐＨ７．２〜７．４で細胞溶解する又は剤をデリバリーするよう整えられる、請求項５８に記載の細胞溶解ペプチド−リポソーム複合体。
【請求項６８】
上記ペプチドはリポソームと統合されている、請求項５７〜６７のいずれか１項に記載の複合体。
【請求項６９】
上記ペプチドは上記リポソームとともに上記ペプチドを結合する脂肪酸を含む、請求項６８に記載の複合体。
【請求項７０】
上記脂肪酸は上記ペプチドのＮ末端にある、請求項６９に記載の複合体における使用のためのペプチド。
【請求項７１】
医薬における使用のための前記請求項のいずれか１項に記載のペプチド又は複合体。
【請求項７２】
上記細胞溶解又は剤デリバリーペプチドは少なくとも１のパラメーターにおける変化により上記リポソーム内にとらえられる、請求項５７〜７１のいずれか１項に記載の複合体を形成する方法。
【請求項７３】
請求項１〜５４のいずれか１項に記載のペプチド又は請求項５７〜７１のいずれか１項に記載の複合体において被検体を検出する診断方法。
【請求項７４】
薬物が上記被検体の存在に応答して上記ペプチド又はリポソーム複合体から放出される、請求項７３に記載の診断方法。
【請求項７５】
ｉｎ  ｖｉｖｏ画像化段階を含む、請求項７３又は７４のいずれか１項に記載の診断方法。
【請求項７６】
上記被検体は微生物から由来する又は得られる、請求項７４〜７５のいずれか１項に記載の診断方法。
【請求項７７】
上記被検体は光学的、電気的、電気化学的、磁気的、電気磁気的又は音波的方法により検出される、請求項７４〜７６のいずれか１項に記載の診断方法。
【請求項７８】
ペプチド−リポソーム複合体又はその誘導体は検出可能な分子又は化合物の放出又は活性化に際して、検出可能な分子又は化合物、又は検出可能になる分子又は化合物を放出する又は活性化するよう整えられる、請求項７４〜７６のいずれか１項に記載の診断方法。
【請求項７９】
請求項５７〜７１のいずれか１項に記載のペプチド−リポソーム複合体又はその誘導体を細胞、組織又は器官内に導入することを含む、細胞、組織又は器官の構造、完全さ又は透過性を乱す方法。
【請求項８０】
請求項５７〜７１のいずれか１項に記載のペプチド−リポソーム複合体又はその誘導体を上記動物又は植物の体又はその一部に導入することを含む、動物又は植物の体内又は動物又は植物の体の細胞内に存在する生物の構造、完全さ又は透過性を乱す方法。
【請求項８１】
上記生物は菌、ウイルス又は他の寄生体である、請求項８０に記載の方法。
【請求項８２】
請求項５７〜７１のいずれか１項に記載のペプチド−リポソーム複合体又はその誘導体が動物の体内に導入される及び上記体の特定の位置で結合する又は反応するよう整えられる、治療方法。
【請求項８３】
上記ペプチド−リポソーム複合体又はその誘導体が上記体の特定の位置で結合する又は反応する他の剤により運搬される、請求項８２に記載の治療方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明は薬物デリバリー及び診断の分野に関する。特に、本発明は薬物デリバリー又は診断適用におけるペプチドからの又は上記ペプチドを含むリポソーム若しくは上記ペプチドを含む細胞からの活性剤の放出に関する。
【０００２】
発明の背景
細胞溶解のペプチド又は細胞溶解剤はリポソーム又は細胞から活性剤又は「ペイロード」を放出するのに以前から使用されている。上記ペプチドの活動様式はリポソームの又は細胞の膜を乱すことを含む。これらのペプチドはメリチン、アラメシシン、グラミシヂン、マガイニン及びパルダキシン、ＧＡＬＡ、ＫＡＬＡ、ヘマググルチニンサブユニットＨＡ−２の如き、昆虫、魚類、抗生ペプチド及び合成ペプチドからの毒を含む。天然の有効な細胞溶解ペプチドは広く昆虫から哺乳類まで、特に抗微生物ペプチド又はディフェンシンとして見られ、それらは粘膜で先天的な防御に及びリンパ球において細胞溶解剤として関連する。上記ペプチドの細胞溶解活性を標的化する及び局在化するために、いくつかの特定の段階、例えば、合成の活性化、リソソームからの放出、成熟前ペプチドの切断が必要とされる。上記ペプチドの生物学的デリバリー活性は細胞の及び分子のレベルで厳密に制御される。生物学的には、細胞溶解活性は細胞内及び細胞間で得られる精巧な機構により偽装されるが、これらの機構は診断的に及び治療的にあまり活用可能でない。これはそれゆえ、診断の及び治療の適用における細胞溶解剤の使用を妨げていた。
【０００３】
後によく考慮すると、単純な及び速い均一な生物検出方法は非常少ない。
【０００４】
それらの劣った感受性及び非特異的な変化しやすい背景のために、免疫診断及びハイスループットスクリーニングにおいて今般広まっている自動化された不均一技術に比較して、異なる被検体のための均一な分析を開発することはいつも可能ではない。リポソームは、以前に、補体−仲介溶解を用いる均一な分析において利用されている（Ａｎａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  １１８（１９８１）  ２８６−２９３）。しかしながら、上記分析は、それらが、それらのいずれか１は不活性化されてペイロード放出を減少しうる多くの不安定な成分を含むので、信頼性がないと考えられている。非特異的に標識化されたジゴキシンメリチンを溶解剤として用いる均一なリポソーム分析の開発は補体分析の代替として報告された（Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ７０  （１９８４）１３３−１４０）。この方法は、しかしながら、結合物の溶解性に加えて、溶解活性の保存及び安定性がこの細胞溶解ペプチドの使用をジゴキシンの計測に大きく制限する問題を与えたので、広い使用を得られなかった。このことは主に、それらのほとんどがペプチド機能に重要であり、そしてそれゆえ、改変された場合、理想的に高い活性を保持しない複数の標識化部位を有する天然のペプチドにのみ頼ることによる、有用な細胞溶解結合物の産生に関与する不確定さのために、予想されうる。
【０００５】
さらに、これらの結合物の活性における改変の程度はしばしば不十分であり、高いバックグラウンドシグナルをもたらす。天然のペプチドを用いるときのこれらの困難さのために、他の人は、被検体で非特異的に標識化した、より大きな細胞溶解剤、すなわち、フォスフォリパーゼＣを有する結合物を用いた（Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  １７０  （１９９４）２２５−２３１）。上記結合物は改変後優秀な溶解性及び大きな活性維持を有した。しかしながら、７５〜８５％の活性しか抗血清の存在下で特異的に阻害されず、それはメリチン−オウバイン結合物でのジゴキシンの計測に通常使用される阻害の値と同程度である。信頼できる分析は外因性の刺激に際してマーカー分子の放出を許容するべきであり、そしてバックグラウンドの漏れはゼロに近づく又は少なくとも上記分析時間にわたり一定を維持するべきである。私たちの知る限りでは、これらの条件のどれも、不均一な分析構成に変化しないで、均一なリポソーム分析により満足に用意されていない。その結果、上記分析で、いつも被検体に依存するシグナルを累積的に妨害するバックグラウンドシグナルの危険性がある。リポソーム剤の使用から生ずる長い期間のバックグラウンド問題のいくつかは本質的に時間分解蛍光分析の使用により克服されることができ、そこで、より大きな分子量のタンパク質キレート剤結合物がリポソーム内に封じ込められ、Ｅｕ３＋の如きイオンとの細胞溶解仲介複合体形成に際して蛍光を検出させる（Ａｎａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ２３８（１９９６）２０８−２１１）。これらの分析とともにでさえも、結合物を十分な活性を産生するよう最適化することに加えて、阻害されない結合物による、上記非特異的溶解の固有の問題が残る。その結果、上記分析は変化するバックグラウンドシグナルに対してよく制御された研究室条件の下及び固定された時間で行われることを必要とする。
【０００６】
リポソームは診断適用においてよりも薬物デリバリーにおいて及び又は画像化剤としてより広く使用されている、しかしながら、全ての場合において、リポソームの使用でなされた進展はほとんどなく、刺激に応答した活性剤又はペイロードの制御された及び定量的な放出を達成しようとする異なる脂質調剤の開発に主に努力が払われている。
【０００７】
信頼できる分析のためには、検出可能なマーカー分子の放出は外因性の刺激に応答してのみ起こるべきであり、そしてマーカー分子の漏れは、例えば、ゼロに近づくよう最小である又は少なくとも上記分析期間にわたり一定を維持するべきである。その結果、上記分析においては、マーカー分子の累積的な放出により引き起こされるバックグラウンドシグナルの危険性又は妨害がいつもある。
【０００８】
私たちの初期の特許出願ＷＯ９８／４１５３５（ＰＣＴ／ＧＢ９８／００７９９）は制御された様式で効果的に偽装され及び「ペイロード」を放出するのに使用されうるペプチドを示す。その出願中に開示されるペプチドは特にｐＨ６．５〜７．４の狭い範囲にわたりｐＨ変化に非応答的であった。一方、ほとんどの場合には、ｐＨの低下はペプチド活性の低下をもたらしうる。いくつかのｐＨ感受性ペプチドは酸性条件下でリポソームからのペイロード放出に使用されている（Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ ３８（１９９９）２７９−２８９）。これらのペプチドについて、上記刺激範囲は、しかしながら、生理学的ｐＨとはかけ離れており、リポソームからのペイロード放出のために通常６未満のｐＨ値を必要とする。
【０００９】
ＧＡＬＡは最も効果的なｐＨ特異的ペプチドの１である。このペプチドについては、リポソームからのカルセイン放出は６未満の値で示されている。ｐＨが６よりもかなり低く、典型的に５であると報告されているエンドソームの如き、低いｐＨ環境においてリポソーム内容物を放出することが示されているインフルエンザウイルスＨＡ−２  Ｎ−末端ペプチド、ＥＡＬＡ、ＪＴＳ１及びライノウイルスＶＰ−１  Ｎ−末端ペプチドの如き、多くの他のｐＨ特異的ペプチドがある。リポソーム膜を不安定化する、文献において知られるいくつかのｐＨ感受性ペプチドがある。しかしながら、それらは非常に低いｐＨ（５．５）で通常誘発され、そしてその結果、例えば、正常及び疾患領域の間のｐＨ差が１ｐＨ単位未満でありうる組織又は腫瘍への、薬物デリバリーにおいてほとんど又は全く使用を見出せない。それらの主要な使用は、したがって、エンドソームデリバリーに維持される。
【００１０】
リポソームからの好ましい薬物放出を誘導する組織における微細環境のｐＨ変化の策は、生理学的範囲に近い、狭いｐＨ変化にわたり応答するペプチドを必要とする。私たちの知る限りでは、リポソームからペイソードの放出を効果的に及び７．４の生理学的ｐＨ値付近で誘発するが、その一方でそれらのバックグラウンドの生物学的活性がｐＨ７．４で又はその付近で低い又はゼロに維持されるペプチドは報告されていない。
【００１１】
「らせんの赤血球溶解ペプチド」（ＨＥＬＰ）と名づけられたペプチド（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．  （１９９２），５，３２１）は赤血球を溶解することが知られており、そしてｐＨ６．５未満のみでヘモグロビンの放出を誘発することが示されている。このペプチドは、しかしながら、細胞溶解に特異的であり、そしてリポソームの溶解を示す報告はない。私たちは、リポソームはこのペプチドを用いてｐＨ特異的な様式で溶解されえないことを示した。
【００１２】
ＷＯ９７／３８０１０は薬物、核酸及びタンパク質の如き材料輸送のためのｆｕｓｏｇｅｎｉｃリポソーム及びデリバリーシステムに関する。これらのシステムはリポソームの融合により及び６未満のｐＨ値ではたらく。
【００１３】
発明の説明
本発明の１の局面にしたがって、細胞溶解又は剤デリバリーペプチドが提供され、ここで、上記ペプチドの細胞溶解又は剤デリバリー活性は上記ペプチドに直接的に又は間接的に影響する１以上のパラメーターにおける変化により調節され、ここで、１以上の上記パラメーターにおける変化は生理学的値に近いｐＨで上記ペプチドによる細胞溶解又は剤デリバリーを引き起こす。本発明はそれゆえ、それらの活性が準備状態にすることにより活用され及び低く維持されうるが、もうひとつのパラメーター又は刺激でのみ誘発する「偽装されうる」細胞溶解又は剤デリバリーペプチドを提供する。本発明はｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｉｎ  ｖｉｖｏ診断における、及び薬物のデリバリー及び標的化における使用を発見する。好ましくは、上記細胞溶解又は剤デリバリー活性は１以上のパラメーターにおける変化により調節される。より好ましくは、１の上記パラメーターはｐＨである。
【００１４】
本発明に係る他の局面にしたがって、細胞溶解又は剤デリバリーペプチドが提供され、ここで、上記細胞溶解又は剤デリバリー活性は開始ｐＨから調節ｐＨへのｐＨにおける変化により調節され、ここで、上記開始ｐＨは生理学的ｐＨ値付近である。好ましくは、上記ｐＨ値は７．４０未満である。したがって、細胞が非疾患から疾患状態になるにつれてｐＨの変化が起こるいくつかの疾患条件においては、活性剤はそのｐＨ変化に応答して上記ペプチドにより放出されうる。
【００１５】
上記パラメーターは、例えば、ｐＨ、例えば、受容体又は酵素のリガンドの効果、温度、光、超音波；酸化還元のポテンシャル、ＤＮＡ、核酸結合又は非漏出性複合体、すなわち、上記活性剤又はペイロードが故意に誘発されるまで上記リポソームにより放出されないものの形成のためのリポソームへの上記ペプチドの結合でありうる。
【００１６】
上記ペプチドは実質的な正電荷を維持する一方で、上記ｐＨが中性からわずかに酸性に減少するにつれて疎水性において増大するよう設計される。以前の技術のｐＨ感受性ペプチド（Ｐａｒｅｎｔｅ  ｅｔ  ａｌ，  Ｂｉｏｃｈｅｍ，  （１９９０）２９，  ８７２０）；Ｓｕｂｂａｒａｅ  ｅｔ  ａｌ，  Ｂｉｏｃｈｅｍ（１９８７）２６，２９６４−２９７２）は主にＧｌｕ残基（ｐＫａ約５）を有し、そして中性付近で誘発に必要とされるｐＨ感受性を満たしえない。私たちは、上記負の特性が上記配列に塩基性残基を慎重に含ませることにより相殺され、所望のｐＨ感受性をもたらしうることを見つけた。同様に、上記疎水性特性は上記配列に慎重に位置づけられた脂肪酸又はアルキル鎖を含む改変を含むことにより相殺されうる。好適な改変は、ミリストイル、パルミトイル、ジオールオイル、フォスフォプリピド、ファルネシル、ウンデシル、オクチル及びジェラニルを含む。ペプチドの疎水性−陰イオン性−陽イオン性特性は中性付近の設定で点くが生理学的ｐＨでの設定で消える狭い誘発範囲の達成における重要な因子である。上記誘発範囲は６．５〜７．４のｐＨ範囲内で回転されうる。
【００１７】
本発明に係るペプチドの例は表１中に与えられる。私たちの表１中のペプチドの多くが複数の誘発特性を産生するよう改変されうる。例えば、ペプチド（１３）は特にＳｅｒでリン酸化され、不活性化をもたらしうる（ペプチド（１２）のように）、そしてそれはＬｙｓでビオチニル化され、アビジン結合と不活性化しうる（ペプチド（１）においてのように）、そしてそれはさらにＣ末端でＤＮＡ結合により不活性化されうる。したがって、所望の場合、そのｐＨ誘発特性は利用される必要はない。
【００１８】
１の態様においては、本発明は、クローキング部位を有する、ｐＨ感受性細胞溶解ペプチドを提供し、そしてそれは脂質小胞と統合される又は統合されうる及びクローキング部位での抗体又は受容体結合が最適付近であるために、生理学的ｐＨ近辺で活性化されることができ、その一方で生理学的ｐＨでのその活性は上記ペプチドに影響するｐＨ値の制御により活用され及び低く維持されうる。好ましい態様においては、リポソームとの統合は脂肪酸の如き疎水性基の上記ペプチドへの共有結合により達成される。リポソームをペプチドと結合させるのに使用されうる、パルミチン酸又はイソプレニル基の如きいくつかの他の脂質がある。ペプチド導入のさらなる方法は：フォスフォリピドへの共有結合、リポソーム表面又は細胞上に前導入された受容体又はリガンドへの結合、リポソーム内への上記ペプチドの封じ込め。疎水性又は両親媒性のセグメントのペプチドへの結合及び電荷を有する膜への電気的結合を含む。
【００１９】
本発明に係るペプチドにおいて含まれる二重転換特性は薬物デリバリーシステムにおける潜在的な使用を有する。
【００２０】
例えば、ｐＨ応答細胞溶解又は剤デリバリーペプチドの場合には、上記ペプチドはタンパク質分解感受性配列により不活性化形に維持されることができ、上記ペプチドはその後タンパク質分解切断の後及び上記ｐＨ条件が合わされた（通常酸性）とき活性化されうる。
【００２１】
例えば、上記クローキング部位はリン酸化されることができ、そして誘発はそうして、脱リン酸化及びｐＨ変化を含みうる。あるいは、上記クローキング部位はタンパク質分解感受性配列で改変されることができ、この配列の切断はそれから、上記ペプチドを活性化する。
【００２２】
ｐＨ応答ペプチドの場合には、上記ペプチドはＤＮＡ結合により不活性化されることができ、上記ペプチドはそれから、ＤＮＡ分離の後及び上記ｐＨ条件が正しい（通常酸性）とき活性化されうる。
【００２３】
ｐＨ応答ペプチドははじめに抗体結合により不活性化され、そしてそれから被検体又はエピトープの存在下で及び上記ｐＨ条件が正しい（通常酸性）とき活性化されうる。
【００２４】
ｐＨ応答ペプチド−リポソーム複合体は不活性化状態で特定の細胞への細胞特異的配列の封入により標的化され、そして上記細胞の微細環境が上記ペプチドがペイロードを放出するよう活性化するよう適合されうる。
【００２５】
ｐＨ感受性ペプチドはそれが不活性化状態にある細胞に標的化されうるよう特異的配列を含むことができ、それから外因性の刺激で又はｐＨ調節剤の添加により影響されて誘発する。ｐＨ調節の例はいくつかの悪性の組織におけるｐＨのグルコース仲介減少及びグルコースでのＭＩＢＧ（メタ−ヨードベンジルアミン）ボーラス注入を含み、上記ペプチドからペイロードを放出させるｐＨ活性化をもたらす。細胞標的化配列の例は多くある。腫瘍内の脈管形成管における内皮細胞はアルファインテグリンの如きマーカーを有する。ペプチド構造に存在するモチーフＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＲＤＧ）は選択的にインテグリンに結合する。同様に、ＮＧＲ、ＧＳＬの如きいくつかの他のモチーフがある。ファージディスプレイペプチドライブラリーのスクリーニングは新規標的化配列の発見を大きく高めている。例えば、いくつかの前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）結合ペプチドが知られる。
【００２６】
上記ペプチドは塩基性及び酸性配列の連続した広がりを有し、そして生理学的ｐＨ付近で生物膜の溶解に影響すること又は生理学的範囲近辺でＤＮＡを凝集／脱凝集することを誘発する。好ましくは、ｐＨ感受性ペプチドは１の末端に高く塩基性の配列及びもう一方の末端に高く酸性の配列を含み、そして上記全体のＰｉ値は６．４〜９である。
【００２７】
本発明にしたがうペプチドにおいては、１以上のパラメーターにおける変化は生理学的値に近いｐＨで上記ペプチドにより細胞溶解又は剤デリバリーを引き起こす。
【００２８】
特に、細胞溶解又は剤デリバリー活性が起こるｐＨ値は７．４０未満、好ましくはｐＨ６．５〜７．４；ｐＨ６．６〜７．４；ｐＨ６．７〜７．４；ｐＨ６．８〜７．４；ｐＨ６．９〜７．４；ｐＨ７．０〜７．４；ｐＨ７．１〜７．４；又はｐＨ７．２〜７．４でありうる。
上記ペプチドの疎水性は、実質的な正の電荷を維持する一方で、ｐＨが減少するにつれて増大しうる。
【００２９】
上記細胞溶解活性又は剤デリバリー活性は上記ペプチドに結合していた剤を放出することを含みうる。
【００３０】
上記ペプチドは比較的低いＰｉ値を有する主に負に荷電した部分及び比較的高いＰｉ値を有する主に正に荷電した部分を有しうる。上記負に荷電した部分は比較的低いＰｉ値を有する少なくとも２のアミノ酸を含みうる。前記少なくとも２のアミノ酸はグルタミン酸及びアスパラギン酸から選ばれうる。
【００３１】
好ましくは、上記負に荷電した部分のＰｉ値は約４である。
上記正に荷電した部分は比較的高いＰｉ値を有する少なくとも２のアミノ酸を含む。上記正に荷電した部分のＰｉ値は約９でありうる。前記少なくとも２のアミノ酸はリジン、アルギニン又はヒスチジンから選ばれうる。
【００３２】
上記正に荷電した又は負に荷電した部分は上記ペプチドの末端で又はその付近であり又は上記ペプチドの側鎖により提供されうる。
【００３３】
上記負に荷電した部分は組成物：
Ｘｎ１  Ｙｎ２
｛式中、ｎ１は＞２であり；及び
ｎ２は７−ｎ１であり、
及びここでＸはグルタミン酸及び／又はアスパラギン酸であり、そして
Ｙはリジン、アルギニン又はヒスチジン以外のアミノ酸である。｝
を有しうる。
【００３４】
上記正に荷電した部分は組成物：
Ａｎ１  Ｂｎ２
｛式中、ｎ１＞２であり；及び
ｎ２＝Ｚ−ｎ１
及びここでＸはグルタミン酸及び／又はアスパラギン酸であり、
Ｂはグルタミン酸又はアスパラギン酸以外のアミノ酸であり、そして
Ｚは７〜１４の整数である。｝
を有しうる。
【００３５】
好ましくは、Ｚ＝９又は７である。最も好ましくはＺ＝９である。
【００３６】
本発明の他の局面は付属の請求項から明らかである。
【００３７】
ペプチドはペイロードなしのリポソームと複合体を形成するのに使用されうる。上記複合体はそれから、酸性ｐＨで剤又は「ペイロード」をリポソーム中にのせるのに使用されることができ、それから、上記ペイロードは上記ｐＨを上げることにより捕らえられる。
【００３８】
準備状態にしたペプチドはリポソーム中に封じ込められることができ、それによりリポソームの溶解は上記刺激の準備状態を解除することにより上記リポソーム内から起こる。上記刺激は、ｐＨ応答ペプチドの場合には、例えば、プロトノフォアにより援助されうる又は援助されえないプロトンの移動により又は酵素感受性配列の場合には、共因子により又は他の活性化方法により準備状態を解除されうる。
【００３９】
本発明の他の局面にしたがって、脂質小胞から活性剤を放出する方法、細胞溶解ペプチドに関する１以上のパラメーターを変換させ、それにより上記細胞溶解ペプチドは上記活性剤を含む脂質小胞を細胞溶解させるよう活性化されることを含む方法が提供される。
【００４０】
上記脂質小胞は、例えば、細胞又はリポソームでありうる。
【００４１】
本発明にしたがう診断方法における細胞溶解ペプチドを偽装する１以上の刺激を用いることにより、上記バックグラウンドシグナルは改善され及び低く及び安定に維持されることができ、より単純な分析配置及び複数の被検体のより予想可能な開発を許容する。本発明は生理学的条件付近で誘発するペプチド−リポソーム複合体を提供する。上記複合体は生理学的ｐＨにおけるわずかな変化に応答しうる。本発明のさらなる局面は、それらのうちの１が「安全な捕獲」としてペイロードを放出するよう準備状態にするのに使用される、少なくとも２以上のパラメーターを変換することにより影響されうるペプチド又はそれらのリポソーム複合体の誘発を制御することに関する。好ましい態様においては、上記ペプチドは複合体としてリポソームと統合される。
【００４２】
定義
以下の定義は説明の方法により与えられる：
本明細書中で使用される用語「ペプチド」は天然、改変された天然及び合成アミノ酸から形成されるポリペプチド及びタンパク質を含む。
【００４３】
上記用語「細胞溶解」は細胞、リポソーム、生物膜又は重合体の如き粒子の破壊を意味する。
【００４４】
上記用語「活性剤」は画像化剤又はフルオロフォアの如き非生物学的活性物質を含む。
【００４５】
上記用語「ペイロード」はリポソーム中に封じ込められたものを意味し、そしてそれは本発明に係るペプチドにより放出されうる。
【００４６】
競合的な反応は、特にアフィニティー又は免疫特異的刺激が他の機構（例えば、ｐＨ）により準備状態にされるとき、使用されることができ、それは置換刺激の実際の忠実さを改善するとも期待されうる。クローキング部位（＊）でビオチンで改変された及びリポソームと統合された、配列Ｍｙｒ−ＥＡＡＬＡＥＡＬＡＥＡＬＡＥＧＫ＊ＰＡＬＩＳＷＩＲＲＲＬＱＱ−アミドのｐＨ感受性ペプチドが設計された。
【００４７】
このペプチド−リポソーム複合体は使用されるペプチドの濃度に因るｐＨ依存活性を示す。上記改変されたペプチドはビオチンでの改変に際してその活性及びｐＨ応答特性を維持した。酸性ｐＨでは上記ペプチド−リポソーム複合体は活性であり、一方アルカリｐＨでは上記複合体は不活性のままである（図２）。図２において、上から下への曲線は（ｉ）ｐＨ６．６でのペプチド、（ｉｉ）ｐＨ８でのペプチド及び（ｉｉｉ）ペプチドの非存在下でのバックグラウンドシグナルを示す。図２Ａでは、上から下への曲線は（ｉ）ｐＨ６．６での１１ピッコロのビオチン及び１．２倍過剰のアビジン、（ｉｉ）ｐＨ６．６での１．２倍過剰のアビジン、（ｉｉｉ）ｐＨ８での１１ピッコロのビオチン及び１．２倍のアビジン及び（ｉｖ）ｐＨ８での１．２倍の過剰のアビジンの存在下でのペプチドを示す。さらに上記複合体はアビジン結合で効果的に偽装されうる。図２におけるデータは、被検体（ビオチン）の存在下で検出が酸性ｐＨでのみ誘発されることができ、一方わずかな放出のみがｐＨ８で示されたことを明らかにし、したがって、上記アフィニティー反応及びｐＨの両方がリポソーム内容物を放出するのに必要とされる二重転換ペプチドについての証拠を提供する。
【００４８】
ｐＨ感受性ペプチドを用いるビオチン分析は小さな光又は青色ＬＥＤ光源で照射されうるガラスバイアル中で繰り返された。特に、上記バイアルはカルセインリポソーム（４ｍＭ脂質）及び１．２倍の過剰のアビジンを含むＰＢＳ緩衝液ｐＨ６．２中に１．２ｍｌのビオチニル化ハイブリッドペプチド（１７ｎＭ）を含んだ。ビオチンは増大する濃度でバイアル（３）〜（６）中に存在した。バイアルは次のとおりである：（１）リポソームのみを含むバックグラウンドサンプル、（２）ビオチンなし、（３）１２ピコモル  ビオチン、（４）１５ピコモル  ビオチン、（５）１７ピコモル  ビオチン、（６）５０ピコモル。サンプルは上記キュベットの下側から単一の３ｍｍ青色ダイオードにより照射された。上から下の順の写真がリポソーム添加から示された時間で撮られた。５分間での蛍光計測器上でとられた実際の蛍光計測もグラフで示される。全ての試薬の添加５分後、上記蛍光は、低く及び一定に維持されたバックグラウンドに比較して肉眼でも明らかに視認できるようになり、器具なしで速く１２ピコモルのビオチンを検出することができた（図３）。しかしながら、ほとんどの研究室で入手可能である器具（例えば、蛍光、吸収、発光、電気化学、バイオセンサー）も上記リポソームに導入されたシグナル発展分子を変えることにより定量的な分析に使用されうる。
【００４９】
生物特異的転換活性を有する偽装された細胞溶解ペプチドを用いる一般的な概念は図１中に図解として示される。クローキング部位での構造の及び共有の改変は１以上の機構による生物膜上の上記ペプチドの活性を妨げる（図１）。これらはｐＨ、リガンド、立体障害、（例えば、抗体、アビジン）及びイオン化可能な基の酸化還元滴定を含みうる。これがイオン化可能な基の逆滴定により、結合タンパク質の解離により又はクローキング基の酵素的な切断により戻されるとき、生物膜は小及び大分子に透過性にされうる。これはリポソームからの診断用又は治療用ペイロードの制御された放出に使用されうる又は直接的に細胞を透過性にさせるのに適用されうる。上記ペプチドを活性化するための１以上の刺激の使用は上記プロセスの忠実さ及び特異性を改善すると期待されることができ、そして、原則としては、いかなる組み合わせをも使用されうる。例えば、免疫特異的刺激と混合された生理学的に関連した生理化学的活性化（例えば、ｐＨ、酸化還元）の使用が細胞への細胞溶解活性を制御すること、特異的な生存可能な微生物についての感受性診断試験のためにリポソームから増幅剤を放出させること及びリポソームからの生物応答薬物放出のために使用されうる。
【００５０】
脂質二重層へのペプチド配列の統合はつなぎ部位を形成する非荷電末端の導入により駆動されることができ、一方でクローキング部位は結合反応によりその機能を最も定量的に及ぼしやすいペプチドの中心部分付近の位置に部分特異的に局在する。線は極性−非極性界面を示すのに描かれる。ペプチドを活性化するのに関連する機構は立体、ｐＨ、酸化還元、酵素切断又は複数の刺激の組み合わせを含むことができ、その結果、クローキング分子の解離及び刺激の存在が上記細胞溶解ペプチドを自由にし、上記膜を破る。図解においては、上記ペプチドはリポソーム（示される脂質二重層）と複合体を形成することができ、一方受容体で偽装される。偽装を解除され、リポソームと結合したペプチドは、ｐＨの如きもうひとつのパラメーターが変換されるまで不活性であり、そしてペプチドが活性になると細胞溶解を引き起こす。クローキングはリポソーム複合体が競合的な又は転換様式において機能するよう形成される前又は後のどちらでも行われうると言えることは明らかである。
【００５１】
実施例：
上記ペプチドの第一の配列は表１中に与えられる。上記細胞溶解ペプチドを０．５ｍｍｏｌのｐ−メチルベンスドリルアミン（ＭＢＨＡ）樹脂を用いて固相ｔ−Ｂｏｃ化学により手動で合成した。アミノ酸（ＢＡＣＨＥＭ  ＵＫ）の側鎖保護はリジンについては２−クロロベンジルオキシカルボニル；アルギニンについてはｐ−トルエンスルフォニル、スレオニン、セリン及びグルタミン酸についてはベンジルであった。カップリングをＮ，Ｎ−ジメチルフォルムアミド（ＤＭＦ）中で４０分間、１．５ｍＭアミノ酸、１．５ミリモルベンゾトリアゾール−１−イル−オキシトリス（ジメチルアミノ）フォスフォニウムヘキサフルオロフォスフェート（ＢＯＰ）及び４．５ｍＭ  Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）を用いて行った。
【００５２】
第二のカップリングを、必要なときは、上記反応をほとんど完了するまで（＞９９．８％）駆動するのに使用した。ミリスチン酸をアミノ酸と同じ様式でカップリングした。上記配列がリシル残基から分岐したペプチド（表１中の括弧内に示される配列）の場合には、私たちはε−アミノ上でＦｍｏｃ保護を使用し、それを２０％ピペリジンを用いて選択的に脱保護し、合成は通常通り続けた。合成の最後に、上記ペプチドをスカベンジャーとして０．５ｇのｐ−チオクレゾール及び０．７５ｇのｐ−クレゾールの存在下でＨＦを用いて切断した。上記ペプチドをＣ−４逆相半調製カラム（Ｖｙｄａｃ  Ｃ−４、２５０×４．６ｍｍ）上でアセトニトリル／０．１％  ＴＦＡ勾配を用いて精製した。上記ペプチドのＨＰＬＣ純度を分析逆相ＨＰＬＣにより決定した。９５％の純度値未満のペプチドは使用されなかった。特徴付けはＭＡＬＤＩ（Ｔｈｅｒｍｏｂｉｏａｎａｌｙｓｉｓ）マススペクトロメトリーを用いて行われた。
【００５３】
表１は合成された及びわずかに酸性の緩衝液中で誘発されるが、ｐＨ７．４では非常に低い活性を示す又は全く活性を示さないことが示されたペプチドの例を示す。
【００５４】
【表１】
2004523531.tif 000003
【００５５】
ビオチニル化ペプチドを調製するために、上記ペプチド（０．０２ｍｍｏｌｅ）を４ｍｌ  ＤＭＦに溶解し、そしてビオチンＮ−ヒドロキシスクシミド（０．１ｍｍｏｌｅ）を、続いてＤＩＰＥＡ（０．３ｍｍｏｌｅ）を添加し、そして上記混合物を攪拌した。これら全ての調製において、上記反応はニンヒドリン分析を用いてアミン内容物における低下により判断される完了まで進められた。反応混合物からの溶媒を吸引下で除去し、そして上記生成物をアセトニトリル及び０．１％  ＴＦＡ勾配を用いてＣ−４調製カラム上で逆相ＨＰＬＣにより精製した。特徴付けは上記のようにマススペクトロメトリーにより行われた。
【００５６】
ペイロードを有するリポソーム
カルセイン色素を封じ込めるリポソームを噴出法により調製した（Ｂｉｏｃｈｉｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ａｃｔａ，  ８１２（１９８５）５５）。４ｍｌの５０％  ｖ／ｖクロロフォルムメタノール溶液中に溶解したフォスファチジルコリン（５０ｍｇ）及びコレステロール（１３．０８ｍｇ）を蒸発させ、丸底フラスコ内で脂質フィルムを形成させた。リポソームの運命を追うことが重要である場合には、ＤｉＩ（５０μｇ）の如き脂肪親和性色素が水和の前に脂質フィルム中に導入されうる。上記フィルムをその後１０ｍＭリン酸ナトリウム２０ｍＭ塩化ナトリウム緩衝液ｐＨ７．４中に調製された４ｍｌの１２０ｍＭカルセイン溶液で水和した。リポソームをＬｉｐｏｓｏｆａｓｔ  １００（Ａｖｅｓｔｉｎ）噴出装置を用いて０．２ミクロン又は０．１ｕｍポリカーボネートフィルターを通して１０噴出周期で形成した。封じ込められなかった色素を等−浸透性の緩衝液を用いてＰＤ−１０カラム上でゲルろ過により除去した。上記リポソームの総脂質濃度をＳｔｅｗａｒｔ分析により計測し、そしてｍｌ当たり３ｍｇに調節した。
【００５７】
生理学的ｐＨ付近での転換特性
ｐＨ応答ペプチドの細胞溶解活性を２又は３μｌのリポソームを２ｍｌの分析容積に添加し、そして連続して蛍光を記録することにより追った。緩衝液はいくつかの異なるｐＨ値で１０ｍＭ  Ｎａ  リン酸、１４０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、５ｍＭ  ＨＥＰＥＳから成った。ｐＨ７付近での誘発を示す表１からのさまざまなペプチドのｐＨ特性は図４中に示される。特に、図４はリポソーム上ではたらくペプチド（２）、（７）及び（９）の結果を示す。上記実験において、リポソーム（４μＭ脂質）及び（Ａ）１４ｎＭペプチド（２）、（Ｂ）２０ｎＭペプチド（７）、（Ｃ）４５ｎＭペプチド（９）を含む２ｍｌの１０ｍＭ  Ｎａ  リン酸、１４０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液（図上で示されるｐＨの）が使用された。全ての場合において、蛍光における鋭い下降により示されるペプチドが添加された。上記ｐＨ値はそれぞれのトレースについて示されるとおりである。このｐＨはほとんどの受容体について最適に近い及び上記誘発は以前に示されたことはないことに注意せよ。一般的に、受容体、酵素及び抗体を含む多くのタンパク質が通常生理学的値付近でｐＨ最適値を有することはよく証明されている。上記ｐＨ最適値のどちらかの側で、上記結合活性は減少される。しかしながら、一般的に活性プロファイルは典型的にベル型であるから、ほとんどのタンパク質は少なくとも最適値から１ｐＨ単位の変動に耐えうる。明らかに上記結果がｐＨ７．４に近づけば近づくほど、標的タンパク質又は受容体との有効な結合のための機会が高くなる。
【００５８】
ｐＨで準備状態にすることによるビオチン検出
ペプチドを脱イオン化し、ペプチドの活性に因り、１〜０．０１ｍｇ／ｍｌの範囲の濃度で調製した。アビジンのストック溶液（ｍｌ当たり５単位、１ユニットのアビジンは１μｇのビオチンに結合する）をＰＢＳ  ｐＨ７．４緩衝液中に調製した。ＤＭＳＯ中に調製した１０ｍｇ／ｍｌのストック溶液からのビオチンを水で１００００倍に希釈し、１μｇ／ｍｌのワーキング濃度を得た。典型的な細胞溶解分析を上記のように調製されるカルセインリポソーム（５μＭ脂質）を含む総容積２ｍｌのＰＢＳ緩衝液中で行った。色素の漏れの進行をそれぞれ４９０及び５２０ｎｍの励起及び発光波長を用いて連続的に追った。既知の濃度のペプチドをある時点で添加し、そして上記溶液をシグナルの計測を続けながら速く混合した。ビオチンを用いるペプチド活性のクローキング解除には、アビジン、ビオチンでの２分間のインキュベーション、続いてビオチニル化ペプチド（４４ｎＭ）の添加の順で、連続的に緩衝液中に添加を行った。上記混合物をさらに２分間インキュベートし、そして蛍光計測を開始した。選択した時点でリポソーム（７μＭ）を添加し、そして溶液を混合した。クローキング実験については、上記添加は遊離ビオチンが添加されないことを除いては基本的に同じであった。上記アビジン濃度は完全なクローキングを確実にするために１．２倍過剰単位であった。ビオチニル化ペプチドの二重刺激転換特性を評価するために、２ｍｌの緩衝液中のリポソーム（７μＭ脂質）をペプチド（２．８ｎＭ）で処理し、そして蛍光を連続して計測した。クローキング実験及びｐＨで準備状態にすることについては、上記ペプチド溶液（２．８ｎＭ）を１．２倍過剰のアビジン溶液で３分間インキュベートし、そして上記細胞溶解分析をｐＨ６．６及び８で行った。クローキング解除実験については、上記アビジンを１１ピコモルのビオチン溶液で前インキュベートした。データは図２中に示される。
【００５９】
ビオチン被検体の画像検出
コントロールサンプルにおいては、リポソーム（４μＭ脂質）を１．２倍過剰のアビジンで前インキュベートされた１．２ｍｌのペプチド（１４ｎＭ）溶液に添加した。試験サンプルは既知の濃度のビオチンを含んだ。添加をビオチン、アビジン、続いて１分間のインキュベーション、ペプチド、続いて２分間のインキュベーション及び最後にリポソームの順で連続して行った。上記サンプルを３ボルトのバッテリーにより作動する単一の３ｍｍの広い角度の超明青色ダイオード（ＲＳ  Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ）で下側から照射した。上記シグナルを視覚的に観察するために、写真を５分、１時間及び１８時間後に標準のデジタルカメラで撮った。５分後の実際の蛍光計測も蛍光計測器を用いて記録した。
【００６０】
ｐＨで準備状態にしたリポソーム分析によるＶＴＢエピトープ及びＶＴＥＣの検出
二重刺激検出の利点を示すために、図４中に示されるｐＨ応答特性を有するペプチドＰｅｐｔｉｄｅ（２）をベロ毒素サブユニットＢのエピトープ（Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ＆  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（１９９１）５９、７５０−７５７）であることが知られる短い配列（ＥＬＦＴＮＲ）についてクローキング部位で改変し、ペプチド（６）を得た。このペプチドもその親配列Ｐｅｐｔｉｄｅ（２）に類似のｐＨ感受性であった。ペプチドが活性であるｐＨでのＶＴＥＣの検出のために、上記分析の状態は以下のとおりであった：２ｍｌの分析緩衝液（５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ及び１ｍＭ  ＥＤＴＡを含むｐＨ６．８の１４０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液）＋３μｌのカルセインリポソーム（１００ｎｍ直径）を抗エピトープ抗体（６μｌのｍｇ／ｍｌ純タンパク質Ａ）で前インキュベート（２分間）した、１０μｌのペプチド（６）（Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ｇｒａｄｅ）で処理した。図５は上記データを示す。下側の曲線は抗体存在下でのｐＨ７．４での同じ実験を示す。蛍光は４９０ｎｍでの励起の後５２０ｎｍでの発光をモニターにより記録された。カルセインの総放出はＴｒｉｔｏｎＸ−１００の添加により達成された。
【００６１】
酸性条件（中間の曲線）での明らかなバックグラウンドは、計測が図５中で示されるように必要とされるまで、生理学的ｐＨ値で低く保たれうる。したがって、検出が生理学的ｐＨより下でのみ可能でありうることは明らかである。以下の実施例は上記ペプチドリポソーム複合体はｐＨ６．８で準備状態を解除されることができ、被検体が検出されることを示す。
【００６２】
ＶＴＢエピトープは抗エピトープ抗体について競合する遊離エピトープ（ＥＬＦＴＮＲ）の存在下でのペプチド（６）による３μｌのリポソーム（１００ｎｍ）からのカルセインの放出により検出されうる。上記分析を２ｍｌの緩衝液（１４０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭリン酸ナトリウム、５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ及び１ｍＭ  ＥＤＴＡ）中で行った。ペプチド（６）及び遊離エピトープを添加前に６μｇの抗体について競合状態に置いた。このデータは図６中に示される。
【００６３】
ＶＴＢサブユニットも以下の条件を用いて同様に検出されることができた。抗エピトープ抗体について競合するＶＴＢサブユニットの存在下でのペプチド（６）による３μｌのリポソーム（１００ｎｍ）からのカルセインの放出。ＶＴＢ及び抗体をペプチド（６）の添加の前に３分間前インキュベートした。上記分析を上記トレース上に示されるエピトープの検出された濃度で５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ及び１ｍＭ  ＥＤＴＡを含む２ｍｌ  １４０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ６．８中で行った。データは上記トレース上に示されるＶＴＢの検出された濃度で図７中に示される。
【００６４】
リポソーム−ペプチド統合複合体
ペプチドのＮ末端上に導入された脂肪酸はリポソームと配列をつなぎ、統合複合体を形成し、それはその後上記ｐＨが理想的（すなわち、生理学的  ７．４）又は酸性（例えば、６．２）であるとき誘発されてリポソームの内容物を放出しうる単一の安定な試薬として使用されうる。はじめの場合には、私たちはペプチド（１０）を用いてｐＨ８緩衝液中で脂質対ペプチド（３０：１）の予め決定された割合でリポソーム−ペプチド複合体を調製した。上記割合は一連の異なる濃度での溶解特性及びｐＨ７．４で溶解がほとんど又は全く観察されないが、酸性の値では顕著な放出が明らかである条件に達するｐＨ値を行うことにより予め決定された。リポソーム及びペプチドの複合体は１００μｌのカルセインを封じ込めたリポソームを含む、１４０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、５ｍＭ  Ｈｅｐｅｓを含む２００μｌの１０ｍＭ  ＮａＰ  ｐＨ８緩衝液にペプチドを添加することにより形成された。上記混合物を使用前に複合体を形成するために２０分間インキュベートした。上記溶解が複合体の形成のために起こっており、そしてペプチドの活性自身のためでないことを確認するために、リポソーム−ペプチド複合体を精製することは重要であった。この複合体におけるペプチド対脂質の割合は１：３０である。上記複合体をＳｐｈａｒｏｓｅ  ＣＬ−６Ｂカラムに適用した。リポソームに対応する画分は肉眼で明らかに視認できるので回収した。この画分の等分をその後酸性及び生理学的ｐＨ値での溶解活性について試験した。上記鍵となる方法は、上記ペプチドがリポソーム関連であり、そしてしたがって無効容積中のリポソーム画分で溶離されうることを確立することであった。私たちは１００μｌの複合体（１カラムで精製した画分）を使用し、そして続いて２の異なるｐＨ値でカルセインを放出した。
【００６５】
図８は以下を示す：
【００６６】
図８Ａ： 緩衝液中のセファロースＣＬ−６Ｂカラム後の複合体の誘発
特に、ｐＨ８．０１でＮａＰ緩衝液により平衡化されたＳｅｐｈａｒｏｓｅ−６Ｂカラムをとおした溶離後の１００μｌリポソーム＋ペプチド複合体を２の異なるｐＨ濃度で最終容積２ｍｌのＮａＰ緩衝液（１０ｍＭリン酸ナトリウム＋１５０ｍＭ  ＮａＣｌ＋５ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ＋１ｍＭ  ＥＤＴＡ）に添加した。上側の曲線ｐＨ５．８。下側ｐＨ７．４。
【００６７】
図８Ｂ： 精製ペプチド（Ｐ９）−リポソーム複合体状態
２ｍｌ緩衝液（１０ｍＭ  リン酸ナトリウム、１４０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ）＋５０μｌ精製複合体。使用されたリポソームは５０ｎｍ噴出であった。上から下の曲線はｐＨ６．２、６．４、６．７、７．０、７．４である。
【００６８】
図８Ｃ： 複合体の溶解分析
複合体２０μｌリポソーム＋６０μｌｐＨ８緩衝液＋２０μｌペプチド（０．１ｍｇ／ｍｌ）を調製し、そして２分以内に使用した。１０μｌを２ｍｌの緩衝液を含むキュベットそれぞれに添加した。上側の曲線ｐＨ６．２（完全な溶解を確認するために、蛍光における鋭い下降により示されるトライトンが終わりにむかって添加された）、下側の曲線はｐＨ７．４である。サンプルは同時に計測された。
【００６９】
図８Ｄ： 調製から２０分の（ｉｎ  ｖｉｖｏ研究に使用される）複合体の安定性
２ｍｌの緩衝液中の５μＬの複合体を調製後２０分試験した。上側曲線ｐＨ６．２、下側曲線ｐＨ７．４。
【００７０】
図８Ｅ： 調製から１．５時間の（ｉｎ  ｖｉｖｏ研究に使用される）複合体の安定性
２ｍｌの緩衝液中の５μＬの複合体を調製後５時間試験した。上側曲線ｐＨ６．２及び下側曲線ｐＨ７．４。
【００７１】
図８Ｆ： 調製から２４時間の（ｉｎ  ｖｉｖｏ研究に使用される）複合体の安定性
２ｍｌの緩衝液中の５μＬの複合体を調製後２４時間試験した。上側曲線ｐＨ６．２、下側曲線ｐＨ７．４。
【００７２】
図８Ａ中のデータはリポソーム−ペプチド複合体が無傷の状態のままであること及びｐＨ応答特性を示すことを示す。上記リポソームの精製の間、私たちはカラムの上部のいくらかのカルセインに注目した。これは複合体が形成されるとき上記色素の漏れがあることを示す。ｐＨ５．８での上側のトレースは酸誘発放出を示し、一方でｐＨ７．４でのトレースはほとんど又は全く放出を示さず、安定な複合体を示す。
【００７３】
他のペプチド（ペプチド（９））により形成された複合体も誘発特性が精製後に維持されることを示した（図８Ｂ）。このペプチドについては、異なるペプチド対脂質の割合（１：３００）が使用された。
【００７４】
上記実験から上記ペプチドがペイロードの放出を引き起こすリポソーム関連のままであることが決定的であった。
【００７５】
上記トレース中のデータは規則的なカルセインリポソームについてであった。ｉｎ  ｖｉｖｏ適用のために、私たちは定量化を補助するために他の色素ＤｉＩをリポソームに導入した。これらのリポソームは上記ペプチドとともに十分な誘発特性を示した。図８Ｃ中のデータはこれらのリポソームでのペプチド（９）（表１）の誘発を示す。リポソーム、ペプチド及び緩衝液のいくつかの試行錯誤の割合を用いて、最も最適化された複合体は２０μｌのペプチド（０．１ｍｇ／ｍｌ）が添加される６０μｌ  ｐＨ８緩衝液と混合された２０μｌリポソームを必要とした。図８Ｄ、Ｅ、Ｆ中のトレースは調製後２０分、５時間及び２４時間に試験されるｐＨ誘発特性の保持による上記複合体の安定性を示す。
【００７６】
精製なしで安定な複合体はペプチド対脂質の割合及び単一試薬形成を産生する実在を強調する濃度を最適化することにより産生されうる。
他のペプチドは酸性媒体中で誘発する複合体を形成しうる（上側曲線）。例えば、図９中に示されるのはペプチド（１）についてのデータである。
【００７７】
あるいは、形成された複合体は結合していないペプチドを除くためにゲルろ過されることができ、そして溶離液の等分は試験され活性を示した。複合体の形成は脂質対ペプチドの割合の慎重な研究を必要とする。しかしながら、一度条件が決定されると、この型の準備状態になった複合体は増量され、腫瘍の如き酸性領域でペイロードを放出するのに使用されうる。アビジンのビオチニル化ペプチドへの結合は追加された忠実さについての活性を消すのにも使用されうる。標的部位にこれらの複合体を蓄積し、そしてその後ｐＨを調節して局所的にペイロードを放出することも可能である。ｐＨの調製方法は以前に報告されている（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １９８２，  １５０５−１５１２  ＆  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １９９４，  ３７８５−３７９２）。
【００７８】
同様の方法は腫瘍のｉｎ  ｖｉｖｏ画像化のために使用されることができ、ここで上記ペイロードはリポソーム内部に隔離されたマーカー又は診断試薬である。例えば、色素カルセインを用いるとき、ｐＨ放出色素は緑色蛍光における増大により検出されうる。図１０は上記ペプチドのカルセインリポソームとのｐＨで準備状態にされた複合体でのこの影響を例示するデータを示す。複合体は１０μｌのｐＨ８緩衝液を４μｇのペプチドに添加し、そこにカルセインを封じ込めた１５０μｌのリポソームを添加することによりビオチニル化ペプチド（１）から調製された。上記複合体を短くインキュベートし、そして１００μｌを埋め込まれた腫瘍を有するマウスに尾の静脈を介して注入した。コントロールマウスに当量値の無処理のリポソームを与えた。埋め込まれた腫瘍（Ｒｉｆ−１同種移植片）を有する、背面ウィンドウチャンバーモデル（Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ  １９９７，１７８５−１７９０  ＆  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １９９９，  １７，  １０３３−１０３５）を用いて、上記腫瘍内及びその周辺のカルセインの直接のｉｎ  ｖｉｖｏ試験を蛍光顕微鏡及びコンピュータ制御時間経過画像により行った。
【００７９】
図１０中に示される写真は、準備状態にされた複合体リポソームはコントロールリポソーム（Ａ）に比較して強い画像（Ｂ）を示し、このことは上記複合体が腫瘍ｐＨにより準備状態を解除されていることを示すということを例示する。動物及びヒトにおける多くの腫瘍、Ｒｉｆ−１は１の例であるが、正常な組織のｐＨよりもわずかに低い環境ｐＨを有する（Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９８０，  ２１０，  １２５３−１２５５  ＆  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １９８９，  ４３７３−４３８４）ことに注意せよ。この腫瘍の病理学的特性は癌の検出に使用されうる。したがって、生理学的ｐＨより低いがその付近で誘発する複合体の準備状態を解除することは直ちに色素の放出を引き起こす。この方法で、上記準備状態にされた複合体は疾患のｉｎ  ｖｉｖｏ検出に、特にがんの検出に使用されうる。同様に、上記ペイロードがカルセイン色素及び抗癌薬の組み合わせであった場合、同じ調剤で検出及び処置することが可能であることができ、診断及び治療についての主要な利点を提供する。
【００８０】
ペプチド又は複合体のリン酸化
本発明に係るペプチド又は複合体は酵素により切断されうる配列又は化学改変を含むことにより準備状態にされうる。これはリン酸化ペプチドを用いて例示される。上記ペプチド又は複合体は不活性を達成するためにもリン酸化されうる。脱リン酸化及びｐＨの低下はそれからペイロードの制御された放出を提供する。
【００８１】
ペプチド（１２）（表１）を０．２５ｍｍｏｌｅのＲｉｎｋアミド樹脂を固体支持として用いて固相Ｆｍｏｃ（９−フルオレニルメトキシカルボニル）化学により手動で合成した。以下の標準のＦｍｏｃ−アミノ酸側鎖保護が使用された：Ｇｌｕ：ｔ−Ｂｕ；Ｈｉｓ：トリチル；Ａｒｇ：Ｐｍｃ。セリンについてはＣａｌｂｉｏｃｈｅｍ−Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ（ＵＫ）から得られたＦｍｏｃ−Ｏ−ベンジル−Ｌ−フォスフォセリンが使用された。上記Ｆｍｏｃ保護はそれぞれ、ジメチルフォルムアミド（２０％、ｖ／ｖ）中のピペリジン溶液で樹脂を処理することにより除去された。保護されたＦｍｏｃ−アミノ酸（ＮｏｖａＢｉｏｃｈｅｍ）を３当量（ｅｑ）のアミノ酸、３ｅｑのベンゾトリアゾール−１−イル−オキシ−トリス−（ジメチルアミノ）−フォスフォニウムヘキサフルオロフォスフェート（ＢＯＰ）、３ｅｑのＮ−ヒドロキシベンゾトリアゾール一水和物（ＨＯＢｔ）及び６ｅｑのＤＩＰＥＡ（Ｎ，Ｎ−ジ−イソプロピルエチルアミン）を用いてそれらのカルボキシル基で活性化した。活性化されたＦｍｏｃ−アミノ酸を上記樹脂上の伸長するペプチドの遊離のアミノ末端にカップリングした。それぞれのアシル化段階の完了をＫａｉｓｅｒ試験によりモニターした。上記カップリングが不完全であった場合は、再カップリングが行われた。ミリスチン酸をアミノ酸と同じ様式でカップリングした。
【００８２】
Ｃ末端アミドとしてのフォスフォペプチドを９４％ＴＦＡ、２．５％水、２．５％エタンジチオール及び１％トリイソプロピルシラン（Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いて樹脂から切断した。上記粗いペプチドをＣ−４逆相半調製（Ｖｙｄａｃ  ２５０×４．６ｍｍ  ｃｍ）カラム上で精製した。溶離を０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を含む１０〜１００％水性アセトニトリルの３０分間の勾配を用いて８ｍｌ／分の流速で達成した。主要な画分を回収し、そして凍結乾燥した。
【００８３】
Ｓｉｇｍａから得られたアルカリフォスファターゼ（ウシ小腸粘膜）をリン酸化セリンでのペプチドの脱リン酸化に使用した。１０μｌＰｅｐｔｉｄｅ溶液（０．０１ｍｇ／ｍｌ）をｐＨ６．８で２ｍｌの１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液に添加し、そして１０単位のアルカリフォスファターゼを添加した。脱リン酸化のために１０分間インキュベーションした後、カルセインリポソーム（５μＭ脂質）を添加し、蛍光強度を励起に４９０ｎｍ及び発光に５２０ｎｍの波長を用いて記録した。コントロール実験をアルカリフォスファターゼの非存在下で行った。
【００８４】
図１４Ａは酵素の非存在下での低い放出（低い放出）に比較したアルカリフォスファターゼ存在下での実質的な色素放出（上側曲線）を示すトレースを比較する。したがって、上記酵素処理は脱リン酸化ペプチドを産出し、少し酸性条件の下で上記ペプチドの活性化をもたらした。３μｌの０．１ｍｇ／ｍｌのペプチド（１２）（表１）を２０μｌの１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８緩衝液中でアルカリフォスファターゼで１０分間インキュベートした。これをその後３μｌのカルセインリポソーム（３ｍｇ／ｍｌ脂質濃度）を含む２ｍｌのＰＢＳ  ｐＨ６．６緩衝液に添加した（図１４Ｂ上の矢印を参照のこと）。蛍光をそれぞれ、４９０ｎｍ及び５２０ｎｍの励起及び発光波長で時間の機能として記録した。同様の実験をアルカリフォスファターゼ非存在下で行った。図１４Ｂ中のデータは明らかに上記酵素処理が脱リン酸化ペプチドを産出し、無処理（曲線（２））サンプル中で割合の増大が全く又はほとんどないことに比較して、少し酸性条件（曲線（１））下で活性化により色素の放出をもたらしたことを示す。
【００８５】
多くの腫瘍は上昇したタンパク質分解値を有する又は特定の酵素を産出することが知られる。プロテアーゼ特異的配列、例えば、システイン又はセリンプロテアーゼ感受性配列は上記ペプチド又は複合体を不活性にさせるペプチドに結合することができ、低いｐＨにしたがうこの配列の切断は上記ペプチドを活性化させペイロードを放出させる。この様式で使用されうる、いくつかのプロテアーゼ特異的配列がある。例えば、前立腺特異的抗原により切断されるペプチド基質配列が知られる。エラスターゼ、スロンビン及びカテプシンＢ、Ｄ、Ｈ及びＬの如きエンドソームのリソソームの酵素のような酵素についての他のタンパク質分解配列も知られる。これに加えて、好適なプロテアーゼが細胞又は組織に標的化されうる。
【００８６】
ｐＨで準備状態にするＤＮＡデリバリー
表１中のペプチド（１３）をｐＨ及びＤＮＡ結合でのクローキングペプチド活性を示すのに使用した。（５μＭ脂質）を含むカルセインリポソームを上記ペプチド（０．４μＭ）を含む２ｍｌのリン酸緩衝塩水に添加し、そして上記蛍光を記録した。これを６．６及び７．４のｐＨ値で行った。５分後の漏れを示す蛍光強度を１０μｌの１０％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００で得られる％溶解として表し、後者を１００％溶解を示すとしてとった。上記実験を上記ペプチドが電荷率でウシの胸腺ＤＮＡ（Ｓｉｇｍａ）で前凝縮されｐＨ７．４で最小の溶解を与えるよう繰り返した。図１５中の結果はＤＮＡが存在しないとき上記ペプチドが酸性ｐＨで活性化されることを示す。ＤＮＡ結合は上記ペプチドの実質的な不活性化をもたらすことが結論付けられうる。したがって、上記ペプチドのＤＮＡ濃縮物は溶解を引き起こすために上記脱凝縮化及びわずかに酸性条件を必要としうる。ＤＮＡ結合及びｐＨでのペプチドのクローキングは低いｐＨでエンドソーム経路を介して遺伝子をデリバリーすることが合うとき明らかな利点を有する。同じポリペプチド配列内の高く陰性の領域（表１、ペプチド（１３）のＮ末端に向かって、残基ＬＥＡＡＬＡＥＡＬＥＡＬ）及び高く陽性の領域（表１、ペプチド（１３）のＣ末端、残基ＲＲＲＲＱＱ）の組み合わせはこの機能に重要である。
【００８７】
ペプチドへのＤＮＡの凝縮及び細胞溶解活性へのその影響を評価するために、分析をいくつかの異なるｐＨ値で及び異なるペプチド対ＤＮＡの割合で行った。ペプチドはＤＮＡに結合した生理学的ｐＨでは不活性であるように見え、一方、上記ＤＮＡが実質的に解離する酸性ｐＨでは活性を取り戻す。上記ペプチド又は複合体はＤＮＡ結合に重要である１の末端に高い塩基性特性を保持する、その一方で、ｐＨ転換に重要である上記分子の他の半分に高く酸性特性を保持する特性を有する。
【００８８】
ドラッグ・デリバリー
上記ペプチドは生理学的ｐＨ付近で誘発されることが示され、そしてこれは酸性領域への薬物デリバリーに使用されうる。上記ペプチドはリポソームを含む薬物と複合体を形成するのに使用されうる結合した脂肪酸を有する。これらのリポソームは治療的重要性を有する。上記ペプチドリポソーム配列は細胞に標的化又は腫瘍中に蓄積されることができ、それにより特定のマーカーへの結合及びｐＨにおける変化は上記薬物の特定の放出に影響する。あるいは、上記複合体は単純なｐＨ変化により薬物放出を誘発しうる。腫瘍へのデリバリーはいくつかの腫瘍は正常な組織のｐＨに比較して酸性であることが示されているので、重要な関連性を有する。癌細胞への薬物のデリバリーを改善するために、上記ペプチドは腫瘍において切断されうるプロテアーゼ特異的配列を結合することにより不活性化されうる。しかしながら、さらに上記活性を制御するために、上記ペプチドはそれからリポソームの内容物を放出するために酸性ｐＨを必要としうる。このようにして、存在する同じプロテアーゼのトレースを有しうる正常な組織への損害は標的部位での非常に生物特異的な放出により最小化されうる。
【００８９】
カルセイン（１２０ｍＭ）を封じ込める及び標識ＤｉＩ（色素対脂質の割合は１００μｇ色素：１００ｍｇＰＣ付近であった）を有するリポソームを使用した。２０〜２５ｇのＣ３Ｈ共通遺伝子のマウス８〜１０週齢を使用した。上記マウスを剃った後背側に皮下の腫瘍をＫＨＴ細胞（５×１０６細胞／動物）を用いて埋め込んだ。典型的に２００μｌのペプチドリポソーム複合体（１００μｌの二重色素リポソーム＋１００μｌのペプチド０．１ｍｇ／ｍｌ）をマウス当たり静脈内投与し、そして腫瘍を移植片の３時間後摘出した。上記腫瘍を無菌状態で除去し、そしてＰＢＳｐＨ８．０緩衝液中に保ち、そして薄い切片（１６０μｍ〜２００μｍ）をスライス器でカットし、蛍光顕微鏡下で調べた。上記緩衝液のｐＨを４００μｌのＮａＰ緩衝液ｐＨ５．８を添加し、一方で同時に４００μｌのｐＨ８．０緩衝液を除去することにより調節した。蛍光強度における変化を記録した。リポソームペプチド複合体の状態はその後酸性緩衝液中でのインキュベーションの前及び後に組織スライスにおける蛍光を計測することにより無傷であるか又は溶解されているかどうか決定される。酸性緩衝液中の蛍光における増大はまだ無傷であり、犠牲になるときに再消費されうるリポソームの量を示す。図１１はペプチド（９）を有するリポソーム複合体はこのｅｘ  ｖｉｖｏ実験におけるカルセインの放出を誘発することができたことを示す。上側曲線はカルセイン色素の蛍光強度を示し、一方下側曲線はＤｉＩ色素の蛍光強度を示す。同様の証明はその後以下に示されるようにｉｎ  ｖｉｖｏで行われた。
【００９０】
ｉｎ  ｖｉｖｏ実験のために、上記腫瘍をＣ３Ｈマウスの背側の皮膚で育てた。ウィンドウチャンバー計測をＲＩＦ腫瘍移植片について行った。リポソーム注入時に腫瘍の酸性化を達成するために、動物の一部をＭＩＢＧ／グルコースで前処理した。腫瘍を有するマウスに、腫瘍のｐＨを下げるために、４０ｍｇ／ｋｇ  ＭＩＢＧ（メタ−インドベンジルアミン、ＰＢＳ中の４ｍｇ／ｍｌの溶液の０．０１ｍｌ／体重ｇ）の用量で、ＭＩＢＧの腹腔内注入を与え、及び１．５ｇ／ｋｇ  Ｄ−グルコース（０．１５ｇ／ｍｌの溶液の０．０１ｍｌ／体重ｇ）を上記リポソーム調製の注入の１時間前に与えた。上記マウスにその後尾の静脈注入により０．２ｍｌの総容積で上記剤（０．１ｍｌのリポソーム＋０．１ｍｌのＰＢＳ  ｐＨ８．０）又はペプチドリポソーム複合体（０．１ｍｌ＋ＰＢＳ  ｐＨ８中のペプチド）を与えた。上記コントロール又はペプチド−リポソームを尾の静脈中に注入し、一方、上記マウスを顕微鏡のステージに置いた。コンピュータ制御画像化システムに両方の蛍光チャネル（カルセイン及びＤｉＩ）中で時間経過画像を得ることを始めるよう指示した。画像は１分当たり４〜１２画像の割合で得られた。蛍光における変化を連続してモニターした。ＤｉＩ強度はＴｅｘａｓ  Ｒｅｄフィルターセット（励起５６０／二色性のカットオフ５９５／発光６２０）を用いて計測した。カルセイン強度は蛍光フィルターセット（４８０／５０５／５２０）を用いて計測された。カルセイン色素のリポソームからの放出速度を二重フルオロフォア速度計測法により決定した。自動化されたデータ取得作業はｉｍａｇｉｎｇ／ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｍｅｔａｍｏｒｐｈ、Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｉｍａｇｉｎｇ）を用いて描かれた。これらの作業はランプフィルターの輪及び蛍光励起の制御のためのシャッターの操作、画像取得のための冷却された科学的ＣＣＤカメラの操作、及び画像の分析を制御する。以下の計算はリアルタイムで行われる：バックグラウンド強度値の控除；平均、最大及び蛍光強度の変化の計算；それぞれの蛍光チャネルについての強度における比較変化；及び異なる波長での強度の割合。放出速度論は２の蛍光チャネル（緑色／カルセイン／内容物及び赤色／ＤｉＩ／リポソーム）のそれぞれについて強度対時間として生の形で記録される。正規化した速度論プロットはリポソームシグナルで内容物シグナルを割ることにより得られる。
【００９１】
【数１】
2004523531.tif 000004
【００９２】
又は
【００９３】
【数２】
2004523531.tif 000005
【００９４】
注入後はじめの３０分の間に集められた生の強度対時間データをカルセイン蛍光対ＤｉＩ蛍光強度の割合に変換し、そして注入直後の割合（すなわち、組織蛍光における段階増大が起こるとき）が１になるように正規化した。その結果、１よりも高い割合がカルセインの放出を示すようとられる。
【００９５】
ＤｉＩ及びカルセイン蛍光における速い急増が上記組織の血管区画の充填に対応して観察された。続いて、ＤｉＩ蛍光の緩やかな増大又は減少が起こり、血漿クリアランス（強度を減少させる傾向）及び小腸空間への管外遊出又は細胞への取り込み（強度を増大させる傾向）の組み合わせの効果を反映する。カルセイン強度は常に連続した増大を示し、リポソームからのカルセインの放出及び脱−消去を反映する。
【００９６】
図１２は無処理の（上側）及びＭＩＢＧ／グルコース処理の（下側）腫瘍組織におけるＤｉＩ標識したコントロールリポソームについてのカルセイン強度における正規化した変化を示す。
【００９７】
図１３は無処理の（上側）及びＭＩＢＧ／グルコース処理の（下側）腫瘍組織におけるＤｉＩ標識したペプチドリポソーム複合体についてのカルセイン強度における正規化した変化を示す。使用されたペプチドは表１中のペプチド（９）であった。ＭＩＢＧ／グルコース処理はリポソーム前３時間投与された。
【００９８】
カルセイン放出の速度は、正規化されたカルセインＤｉＩ率で示され、無処理のコントロール腫瘍において上記コントロールリポソームについて及び上記ペプチド−リポソーム複合体について〜１．２５又はそれ未満のままであった。しかしながら、上記率はＭＩＢＧ／グルコース処理腫瘍における複合体について一貫して１．５を超え、そして通常２又はそれ以上に達した。上記他の群に比較して、ペプチド複合体及びＭＩＢＧ処理を受けた腫瘍は顕著により高いピークの正規化されたカルセイン：ＤｉＩ率を示す（ｕｎｐａｉｒｅｄ  ｔ−テストによりｐ＜０．００１）。上記ウィンドウチャンバーデータは腫瘍ｐＨに応答したペイロード（カルセイン）の放出についての強い証拠を提供する。上記ピークで正規化された率はリポソームからの放出のためのカルセイン蛍光における変化を示す。１の値は変化がないこと示す。１．３３の値に比較して、２の値は３倍大きな変化に対応する。
【００９９】
初期の実験（図１０）中で示されるデータはペプチド（９）よりも生理学的ｐＨ付近で誘発することが示された異なるペプチド（ペプチド（１））を使用した。図１０中に示されるように、ペイロードの顕著な放出は無処理（ＭＩＢＧ／グルコースなし）マウスにおいてさえも示された。
【０１００】
腫瘍ｐＨの計測はこの組織のｐＨが酸性であり、そして複合体の誘発範囲内であったことを示すために保証される。ｐＨ計測のために、２０Ｇの針中の針型のコンビネーションｐＨ微小電極が使用された（先の直径０．８９ｍｍ；モデル８１８；Ｄｉａｍｏｎｄ  Ｇｅｎｅｒａｌ、Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ、  ＭＩ）。これらのｐＨ電極は内部標準電極を含んだ。上記動物を麻酔し、そしてｐＨを腫瘍内に針の先のプローブを挿入することにより計測した。それぞれの組織型について、１５〜２０計測がとられた。私たちは無処理の及びＭＩＢＧ／グルコース処理のマウスの腫瘍組織における微小電極ｐＨ計測を比較した。上記方法はｉｎ  ｖｉｖｏ腫瘍モデルが酸性であるかどうか、そして上記ＭＩＢＧ／グルコース前処理プロトコールがより低いｐＨへの追加の移行を誘発するかどうかを試すためであった。上記無処理の動物は６．８の平均ＲＩＦ腫瘍ｐＨ値を示し、一方上記処理動物は６．６のｐＨ値を示した。私たちはＫＨＴ腫瘍においても同様の計測を行った。再び、腫瘍ｐＨは典型的に６．６４〜６．６９の範囲内で酸性であった。ＭＩＢＧ処理はこの腫瘍モデルにおいてほとんど差異はなかった。
【０１０１】
複数−誘発
ペプチド活性を転換するのに使用されたパラメーターは低いｐＨを必ずしも含まない複数−誘発を達成するのに組み合わせられうることは当業者に明らかである。これらのパラメーターも私たちの発明の範囲内に入る。例えば、プロテアーゼ感受性ペプチドは他の受容体又は抗体又はリガンド結合タンパク質又はＤＮＡに結合することにより不活性にされることができ、それによりタンパク質分解切断及び結合タンパク質からの遊離が活性化を達成するのに必要とされる。ほんとうに、上記ペプチドはｐＨ活性である場合、全ての３のパラメーターは刺激が明らかである前に合わせられる必要があるであろう。
【０１０２】
本発明にしたがうペプチド、ペプチド／リポソーム複合体、薬物デリバリー方法、診断は、付属の図面、図１〜１５に関して、例としてのみ、今示されるであろう、ここで：
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は本発明にしたがう準備状態にしたペプチド−リポソーム複合体の概念図の例示である；
【図２】
図２Ａ及び２ＢはｐＨで準備状態にしたペプチド１（表１）によるビオチンの検出を示すグラフである；
【図３】
図３Ａ、３Ｂ及び３Ｃは表１からのペプチド（１）での実験的なビオチン分析を示すグラフであり、及び３Ｄは写真である；
【図４Ａ】
表１からのさまざまなペプチドでのリポソームからの色素の放出における異なるｐＨ値の効果を示すグラフである；
【図４Ｂ】
表１からのさまざまなペプチドでのリポソームからの色素の放出における異なるｐＨ値の効果を示すグラフである；
【図４Ｃ】
表１からのさまざまなペプチドでのリポソームからの色素の放出における異なるｐＨ値の効果を示すグラフである；
【図５】
図５はグラフであり、そして抗体結合及びｐＨ７．４でのｐＨ準備状態に関する実験の結果を示す。
【図６】
図６はＶＴＢエピトープの検出のための分析での実験結果を示すグラフである；
【図７】
図７はＶＴＢサブユニットの検出のための分析での実験結果を示すグラフである；
【図８Ａ】
異なるｐＨ値でのペプチドリポソーム複合体からの色素の放出を示すグラフである；
【図８Ｂ】
異なるｐＨ値でのペプチドリポソーム複合体からの色素の放出を示すグラフである；
【図８Ｃ】
異なるｐＨ値でのペプチドリポソーム複合体からの色素の放出を示すグラフである；
【図８Ｄ】
異なるｐＨ値でのペプチドリポソーム複合体からの色素の放出を示すグラフである；
【図８Ｅ】
異なるｐＨ値でのペプチドリポソーム複合体からの色素の放出を示すグラフである；
【図８Ｆ】
異なるｐＨ値でのペプチドリポソーム複合体からの色素の放出を示すグラフである；
【図９】
図９は調製から４０分間試験されたペプチド（１）の複合体の試験結果を示すグラフである；
【図１０】
図１０はリポソーム及びｐＨ準備状態ペプチドリポソーム複合体の投与後のＲｉｆ腫瘍の画像である；及び
【図１１】
図１１は腫瘍におけるリポソームからの色素の放出を示すグラフである；
【図１２】
図１２は腫瘍におけるリポソームからの色素の放出を示すグラフである；
【図１３】
図１３は腫瘍におけるリポソームからの色素の放出を示すグラフである。
【図１４Ａ】
図１４Ａはアルカリフォスファターゼの存在（上側曲線）下及び非存在（下側）下でのペプチド（１２）でのカルセインリポソームの溶解を示すグラフである。
【図１４Ｂ】
図１４Ｂは酵素（アルカリフォスファターゼ）によるペプチドの活性化を示すグラフであり、酸性ｐＨでのカルセイン放出を与える。曲線（１）は上記酵素で処理したペプチドを示し、一方、曲線（２）は無処理のペプチドを示す；及び
【図１５】
図１５はＤＮＡの存在下及び非存在下での酸性及び生理学的ｐＨでのカルセインリポソームの比較溶解を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図８Ｅ】
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【図８Ｆ】
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【図９】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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2004523531.tif 000085
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