(57)【要約】本発明は、腎細胞癌に関係するタンパク質であるＭＮ−ＣＡ９の発現を制御する５’調節領域およびその転写活性断片からのヌクレオチド配列、を含んでなる、腫瘍細胞内の直接発現を指令するプロモーター、エンハンサーおよび他の調節エレメントに関する。特に提供されるのは、ＭＮ−ＣＡ９調節領域が異種遺伝子の発現を制御し、内因性遺伝子もしくは病理プロセスのインヒビターを過剰発現しまたは癌発生および／または進行に重要であると考えられる特定の遺伝子の発現をノックアウトし得ることを特徴とする、発現ベクター、宿主細胞およびトランスジェニック動物である。本発明はまた、前記ベクター、細胞および動物を、癌発生および／または進行のアゴニストおよびアンタゴニストの候補分子をスクリーニングするために利用する方法に関する。本発明はさらに、腫瘍細胞内の化合物の発現をモジュレートする、および腫瘍細胞内の発現をモジュレートする化合物をスクリーニングする組成物と方法に関する。スクリーニングアッセイによって同定した分子および化合物を治療に利用する方法も提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
図１に記したヌクレオチド配列、またはその転写活性断片を含んでなる単離したポリヌクレオチド。
【請求項２】
請求項１に記載のいずれか１つの単離したポリヌクレオチド、またはその相補体と高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、単離したポリヌクレオチド。
【請求項３】
請求項２に記載の単離したポリヌクレオチドを含んでなる、組換えベクター。
【請求項４】
宿主細胞内の核酸の発現を制御する調節性核酸と機能的に関連した請求項２に記載の単離したポリヌクレオチドを含んでなる、発現ベクター。
【請求項５】
請求項２に記載の単離したポリヌクレオチドを含んでなる、遺伝子操作した細胞。
【請求項６】
遺伝子操作が行われて請求項２に記載の単離したポリヌクレオチドを含んでなるトランスジーンを含有する、トランスジェニック非ヒト動物。
【請求項７】
ＭＮ−ＣＡ９プロモーター、送達ベクターおよび毒性、治療および／または異種コード配列を含んでなる、治療薬。
【請求項８】
さらにプロドラッグを含んでなる、請求項７に記載の治療薬。
【請求項９】
前記プロドラッグがアシクロビル（「ＡＣＶ」）およびガンシクロビル（「ＧＣＶ」）からなる群から選択される、請求項８に記載の治療薬。
【請求項１０】
前記送達ベクターがウイルスベクターを含んでなる、請求項７に記載の治療薬。
【請求項１１】
前記ウイルスベクターがアデノウイルスである、請求項１０に記載の治療薬。
【請求項１２】
前記送達ベクターがリポソームを含んでなる、請求項７に記載の治療薬。
【請求項１３】
前記毒性コード配列がチミジンキナーゼおよびシトシンデアミナーゼからなる群から選択される、請求項７に記載の治療薬。
【請求項１４】
前記治療コード配列が増殖因子、サイトカイン、治療タンパク質、ホルモンおよびホルモンのペプチド断片、サイトカインのインヒビター、ペプチド増殖および分化因子、インターロイキン、ケモカイン、インターフェロン、コロニー刺激因子および血管形成因子からなる群から選択される、請求項７に記載の治療薬。
【請求項１５】
前記異種コード配列がレポーター遺伝子である、請求項７に記載の治療薬。
【請求項１６】
前記レポーター遺伝子がルシフェラーゼである、請求項１５に記載の治療薬。
【請求項１７】
腫瘍特異的遺伝子発現をモジュレートすることができる試験化合物を同定する方法であって、
（ａ）化合物をＭＮ−ＣＡ９調節領域またはその転写活性断片の制御下でレポーター遺伝子を発現する細胞と接触させ；そして
（ｂ）前記試験化合物の存在および不在下でレポーター遺伝子発現のレベルを測定し、
もし試験化合物の存在下で得たレベルがその不在下で得たレベルと異なれば、そこで腫瘍特異的遺伝子発現をモジュレートする化合物が同定されたとすることからなる、前記方法。
【請求項１８】
レポーター遺伝子発現が蛍光シグナルを生成する、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
請求項１７に記載の同定した試験化合物を含んでなる、医薬組成物。
【請求項２０】
異種遺伝子と機能的に連結されたＭＮ−ＣＡ９調節領域配列、またはその転写活性断片を含有するベクターを被験者の腫瘍中に導入することを含んでなる、薬物送達の方法。
【請求項２１】
癌または他の増殖性障害を治療および／または改善する方法であって、被験者の前記癌または他の増殖性障害の細胞中にＭＮ−ＣＡ９調節領域配列、またはその転写活性断片、送達ベクター、およびその遺伝子産物が前記細胞を死滅しうる毒性、治療および／または異種コード配列を含有するベクターを導入することを含んでなる、前記方法。
【請求項２２】
前記癌または他の増殖性障害が子宮頚癌、腎細胞癌、胃および大腸癌からなる群から選択される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
さらにプロドラッグを導入することを含んでなる、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
前記プロドラッグがＡＣＶおよびＧＣＶからなる群から選択されることを特徴とする、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記導入が直接適用、または静脈投与、動脈投与、腫瘍内投与、潅流および経口投与を経由する全身応用を介する投与を含んでなることを特徴とする、請求項２１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
１．序論
本発明は、腎細胞癌に関係するタンパク質であるＭＮ−ＣＡ９の発現を制御するプロモーター、エンハンサーおよび他の調節エレメントに関する。特に、本発明は、ＭＮ−ＣＡ９の発現を制御する５’調節領域およびその転写活性断片からのヌクレオチド配列を含んでなる組成物に関する。特に、提供されるのは、ＭＮ−ＣＡ９プロモーターが異種遺伝子の発現を制御し、内因性遺伝子もしくは病理プロセスのインヒビターを過剰発現し、または癌発生および／または進行に重要であると考えられる特定の遺伝子の発現をノックアウトできることを特徴とする発現ベクター、宿主細胞およびトランスジェニック動物である。本発明はまた、前記ベクター、細胞および動物を、癌発生および／または進行のアゴニストおよびアンタゴニスト用の候補分子をスクリーニングするために利用する方法にも関する。
【０００２】
本発明はまた、癌発生および／または進行に関わる化合物の発現をモジュレートする組成物および方法にも関する。本発明はさらに、癌発生および／または進行中に発現をモジュレートする化合物のスクリーニングに関する。スクリーニングアッセイによって同定した分子および化合物を治療に利用する方法も提供する。
【０００３】
本発明はさらに、組織特異的な方法で異種遺伝子を選択的に発現させ得るＭＮ−ＣＡ９プロモーター、およびその転写活性断片を含んでなる方法と組成物に関する。とりわけ、プロモーターは様々な腫瘍内の異種遺伝子の発現を選択的に増加できる。このように、本発明のプロモーターは組織特異性をもつので、治療遺伝子の送達は癌細胞を標的とするのに対して、正常な非新生物細胞への治療遺伝子の送達を免れることができる。さらに、組織特異的な発現は、遺伝子発現が特定の細胞型に限定されかつ局在化されうるので、注射などの直接適用を経由するだけでなく、静脈投与、経口投与などを経由する全身への治療遺伝子の投与を可能にするという、さらなる利点を提供する。
【０００４】
２．発明の背景
２．１　遺伝子治療
体細胞遺伝子治療は、治療の目的で核酸を、典型的にはＤＮＡの形態で投与して標的細胞の遺伝的レパートリーを改変する方法である。実験遺伝子治療の研究は比較的新しい研究分野であるが、過去１０年間に大きな進歩があった（Ａｒａｉ， Ｙ．ら， １９９７， Ｏｒｔｈｏｐａｅｄｉｃ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｓｏｃｉｅｔｙ， ２２：３４１）。ヒトの疾患を治療する体細胞遺伝子治療の可能性は、主に２つの最近の技術的進歩によって、多数の科学者の想像に追いついている。第１に、今や、遺伝子を実験動物にｉｎ ｖｉｖｏで効率的に導入しかつ発現できる多数のウイルスおよび非ウイルス遺伝子治療ベクターが存在する。第２に、ヒトゲノムプロジェクトに対する支援の増加によって、非常に近い将来、ヒトゲノムを含んでなる推定８０，０００遺伝子の正体と配列が得られるであろう。
【０００５】
遺伝子治療は元来、遺伝性欠陥を是正するための機能的活性のある治療遺伝子を標的細胞中に送達する特定遺伝子置換治療と考えられた。体細胞遺伝子治療に向けての最初の試みは、遺伝子を組織に導入する間接的方法に依るもので、ｅｘ ｖｉｖｏ治療と呼ばれ、例えば、標的細胞を身体から取り出し、組換え遺伝子を運ぶベクターにトランスフェクトまたは感染させ、そして身体に再移植（「自家細胞導入」）した。現在では様々なトランスフェクション技術を利用してＤＮＡを細胞にｉｎ ｖｉｔｒｏで導入することができ；それらの技術としては、リン酸カルシウム−ＤＮＡ沈降、ＤＥＡＥ−デキストラントランスフェクション、エレクトロポレーション、リポソーム介在ＤＮＡ導入または組換えウイルスベクターを用いる形質導入が挙げられる。そのようなｅｘ ｖｉｖｏ治療プロトコルが様々な異なる細胞型にＤＮＡを導入するために提案されていて、それらの細胞型としては、上皮細胞（米国特許第４，８６８，１１６号；ＭｏｒｇａｎおよびＭｕｌｌｉｇａｎ Ｗ０８７／００２０１；Ｍｏｒｇａｎら， １９８７， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３７：１４７６−１４７９；ＭｏｒｇａｎおよびＭｕｌｌｉｇａｎ， 米国特許第４，９８０，２８６号）、内皮細胞（Ｗ０８９／０５３４５）、肝細胞（Ｗ０８９／０７１３６；Ｗｏｌｆｆら， １９８７， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８４：３３４４−３３４８；Ｌｅｄｌｅｙら， １９８７ Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ８４：５３３５−５３３９；ＷｉｌｓｏｎおよびＭｕｌｌｉｇａｎ， Ｗ０８９／０７１３６；Ｗｉｌｓｏｎら， １９９０， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ８７：８４３７−８４４１）、繊維芽細胞（Ｐａｌｍｅｒら， １９８７， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８４：１０５５−１０５９；Ａｎｓｏｎら， １９８７， Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． Ｍｅｄ． ４：１１−２０；Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇら， １９８８， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：１５７５−１５７８；Ｎａｕｇｈｔｏｎ ＆ Ｎａｕｇｈｔｏｎ， 米国特許第４，９６３，４８９号）、リンパ球（Ａｎｄｅｒｓｏｎら， 米国特許第５，３９９，３４６号；Ｂｌａｅｓｅ， Ｒ．Ｍ．ら， １９９５， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７０：４７５−４８０）および造血幹細胞（Ｌｉｍ， Ｂ．ら １９８９， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８６：８８９２−８８９６；Ａｎｄｅｒｓｏｎら， 米国特許第５，３９９，３４６号）が挙げられる。
【０００６】
最近では、直接ｉｎ ｖｉｖｏ遺伝子導入が試みられていて、リポソーム内に（Ｌｅｄｌｅｙ ｅｔ ａｌ．， １９８７， Ｊ． Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ １１０： １）またはウイルスエンベロープ受容体タンパク質を含有するタンパクリポソーム内に（Ｎｉｃｏｌａｕら， １９８３， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ． Ｓ． Ａ． ８０：１０６８）封じ込められたＤＮＡ、およびポリリシン−糖タンパク質担体複合体と結合したＤＮＡの製剤が用いられる。さらに、「遺伝子銃」が、細胞中への遺伝子送達に利用されている（オーストラリア特許第９０６８３８９号）。裸のＤＮＡ、またはリポソームと会合したＤＮＡを液担体溶液中に処方して間質空間に注入し、細胞中へのＤＮＡ導入を果たすことすら考案されている（Ｆｅｌｇｎｅｒ， Ｗ０９０／１１０９２）。
【０００７】
遺伝子技術を使用する多数の臨床試験が、嚢胞性線維症（ｃｙｓｔｉｃ ｆｉｂｒｏｓｉｓ）および癌などの各種疾患に対して進められている。この治療手法の医療実施を著しく改善する見込みは広く支持されているが、この技術の使用が臨床現場で成功するにはまだ解決しなければならない多くの障害がある。
【０００８】
恐らく、現在案出されている遺伝子治療に関連する最大の問題の１つは、ｅｘ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｖｏを問わず、有効な治療効果の達成を要する１以上の細胞型に、標的遺伝子の発現を制御しかつ標的遺伝子の発現を限定できないことにある。
【０００９】
組織特異的プロモーターの利用を通しての治療用毒性遺伝子の腫瘍細胞への送達および発現の概念はよく認識されている。この手法は、ベクター（ウイルス、リポソーム、その他）遺伝子送達が正常細胞ならびに癌細胞の感染をもたらすとき，治療遺伝子の近隣の正常細胞に対する毒性効果を減少する。例としては、肝臓癌細胞を標的とするαフェトプロテインプロモーター（Ｋｏｒｙａｍａら， １９９１， Ｃｅｌｌ Ｓｔｒｕｃｔ． Ｐｕｎｃｔ．， １６：５０３−５１０）、胃癌に対する癌胎児性抗原（ＣＥＡ）プロモーター（Ｔａｎａｋａら， １９９６， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， ４６：１３４１−１３４５）、黒色腫細胞を死滅するチロシナーゼプロモーター（Ｖｉｌｅら， １９９４， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， ５４：６２２８−６２３４）、脳の神経膠腫細胞を標的とする骨形成タンパク質プロモーター（Ｓｈｉｍｉｚｕ， Ｋ．， １９９４， Ｎｉｐｐｏｎ Ｒｉｎｓｈｏ， ５２：３０５３−３０５８）、および骨癌と前立腺癌を死滅するオステオカルシンプロモーター（Ｋｏ， Ｓ．ら， １９９６， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， ５６：４６１４−４６１９；Ｇａｒｄｅｎｅｒら， １９９８， Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， ２：４１−５８）の利用が挙げられる。組織および腫瘍が制限されたプロモーターを利用する遺伝子治療のような分子治療方法の利用頻度は増加している。遺伝子治療手法の重要な構成要素は、ｉ）複数の事例ではホルモン、ビタミン、抗生物質、薬物または重金属によって誘導しうる、組織特異的または腫瘍に制限されたプロモーターの選択；ｉｉ）治療（または毒性）遺伝子の選択；ｉｉｉ）レトロウイルス、アデノウイルス、リポソームなどの適当なベクターが挙げられる。正常な宿主組織は免れる一方、適当な腫瘍組織をターゲッティングする鍵は、選んだプロモーターを利用する組織だけに治療遺伝子をホーミングさせ得るプロモーターである。
【００１０】
２．２　ＭＮ−ＣＡ９タンパク質の発現
ＭＮ−ＣＡ９として知られるタンパク質産物は、胎児起源であると考えられ、この表現型発現をもつ腫瘍の高度な転移性挙動のいくつかを説明することができる。本質的に、遺伝子産物は胎児性オンコジーンと類似の挙動を示し、細胞に、局部に進行し、周囲および遠隔の器官に侵入しかつ転移する能力を潜在的に与える。
【００１１】
免疫蛍光および免疫電子顕微鏡研究は、ＭＮ−ＣＡ９が５４ｋｄおよび５８ｋｄの分子量を有し、このタンパク質が細胞の原形質膜上と核内の両方に存在することを明らかにしている。免疫組織学的研究はさらに、ＭＮ−ＣＡ９タンパク質が、例えば、子宮頚癌、腎細胞癌ならびに胃および大腸癌によって産生されることを明らかにしている。そのうえ、このタンパク質は正常な子宮頚部、卵巣または腎組織に発現されない。
【００１２】
米国においては、今年だけで、腎細胞癌、胃および大腸癌ならびに子宮頚癌の新しい症例がそれぞれほぼ３０，０００、２１，９００ならびに１２，８００であると予想されている。そのうえ、これらの癌による死亡者は、米国内で１１，９００、１３，５００および４，８００人にのぼると予想される。この高い死亡者数の割合は、これらの特定の癌でしばしば起こる転移性疾患進行と関連がある。さらに、もし全世界のこれらの癌による死亡率を考えると、これらの数は著しく増加する。これらの癌は全て、高い最終死亡率と著しい罹患率を有する。例えば、腎細胞癌については、癌と診断された患者のほぼ５０％は転移性疾患を発生して、現在のところ治療することができない。
【００１３】
従って、限定されるものでないが、子宮頚癌、腎細胞癌、ならびに胃および大腸癌を含む、様々な癌の治療法が現在欠けていることを考えると、これらの癌に対する新規の治療が緊急に必要である。本発明は、これらの必要性に応えるものであって、このような癌を、モジュレートし、診断しおよび／または治療するために有用なモデルを提供する。
【００１４】
３．発明の概要
本明細書において開示される発明は腫瘍特異的遺伝子転写のモデルを提供する。本発明は部分的に、限定されるものでないが、子宮頚癌、腎細胞癌ならびに胃および大腸癌を含む様々な癌においてだけ活性をもつことが見出されたプロモーターである新規ＭＮ−ＣＡ９プロモーターの、本明細書に記載した機能的特性決定に基づく。
【００１５】
本発明は、癌発生および／または進行中に化合物の発現をモジュレートする化合物をスクリーニングする組成物および方法を提供する。特に、本発明は、ＭＮ−ＣＡ９ ５’調節領域およびその転写活性断片からのヌクレオチド、ならびに高度にストリンジェントなおよび中程度にストリンジェントな条件下でそのようなヌクレオチドとハイブリダイズする核酸を含んでなり、癌関係タンパク質ＭＮ−ＣＡ９の発現を制御する組成物を提供する。特に提供されるのは、異種レポーター遺伝子と機能しうる形で関連したＭＮ−ＣＡ９ ５’調節領域およびその転写活性断片を含んでなる発現ベクター、ならびにそのようなベクターを含有する宿主細胞およびトランスジェニック動物である。本発明はまた、そのようなベクター、細胞および動物を、様々な癌のアゴニストおよびアンタゴニストとなる候補分子をスクリーニングするために利用する方法も提供する。スクリーニングによって同定した分子および化合物を治療のために利用する方法も提供される。
【００１６】
例えば、限定されるものでないが、レポーター遺伝子を含んでなる組成物を、本明細書においてＭＮ−ＣＡ９調節領域と呼ぶ腫瘍特異的調節配列と機能的に連結させる。ＭＮ−ＣＡ９により駆動されるレポーター遺伝子を動物内にトランスジーンとして発現させる。そのトランスジェニック動物、およびトランスジェニック動物内の癌細胞から誘導された細胞を利用して、様々な癌をモジュレートするために有用な候補化合物をスクリーニングすることができる。いずれの特定の理論に束縛されることなく、そのような分子は様々な癌に関わる、転写因子などのｔｒａｎｓ作用性因子ならびにプロモーターおよびエンハンサーなどのｃｉｓ作用性因子の機能を妨害する可能性がある。これらの分子は、それら自体で、限定されるものでないが、子宮頚癌、腎細胞癌、ならびに胃および大腸癌ならびにいずれの他のＭＮを産生する新生物も含む癌の治療用として潜在的に強力な候補である。
【００１７】
一実施形態においては、本発明は、腫瘍細胞内で遺伝子の特異的発現をモジュレートする化合物の高スループットスクリーニングの方法を提供する。本発明のこの態様においては、癌組織からの細胞をトランスジェニック動物から取り出してｉｎ ｖｉｔｒｏで培養する。レポーター遺伝子の発現を利用して腫瘍特異的遺伝子活性をモニターする。ある特定の実施形態においては、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）がレポーター遺伝子である。他の実施形態においては、ホタル・ルシフェラーゼがレポーター遺伝子である。この方法によって同定した化合物はさらに、正常細胞において非癌細胞に対するそれらの影響を試験してもよい。
【００１８】
他の実施形態においては、本発明のトランスジェニック動物モデルをｉｎ ｖｉｖｏスクリーニングに利用して、癌細胞に対する効果について候補薬物の作用機序を試験することができる。特に、限定されるものでないが、子宮頚癌、腎細胞癌、ならびに胃および大腸癌を含む様々な癌に対するその薬物の効果をアッセイすることができる。
【００１９】
他の実施形態においては、癌発生および／または進行を治療するための遺伝子治療法が提供される。ＭＮ−ＣＡ９調節配列を薬物または毒素の腫瘍特異的発現を駆動するために利用し、そして様々な癌細胞中に導入する。本方法は、薬物または毒素と機能的に関連したＭＮ−ＣＡ９調節配列を癌細胞中に導入することを含んでなる。
【００２０】
本発明はさらに、ＭＮ−ＣＡ９調節配列をモジュレートする新規の転写因子をスクリーニングする方法を提供する。本方法によって同定されるそのような新規の転写因子は、様々な癌を治療するための標的として利用することができる。
【００２１】
４． 図面の簡単な説明
（図面の簡単な説明については下記参照）
５．発明の詳細な説明
本発明は、ＭＮ−ＣＡ９タンパク質の発現を制御する５’調節領域およびその転写活性断片からのヌクレオチド配列を含んでなる、腫瘍内の発現を指令するプロモーター、エンハンサーおよび他の調節エレメントを提供する。特に、提供されるのは、ＭＮ−ＣＡ９調節領域が異種遺伝子の発現を制御し、内因性腫瘍遺伝子または病理プロセスのインヒビターを過剰発現し、または癌発生および／または進行に重要であると考えられる特定の遺伝子の発現をノックアウトできることを特徴とする、発現ベクター、宿主細胞およびトランスジェニック動物である。そのような癌の例は、限定されるものでないが、子宮頚癌、腎細胞癌、ならびに胃および大腸癌が挙げられる。
【００２２】
本発明はまた、前記ベクター、細胞および動物を、癌発生および／または進行のアゴニストおよびアンタゴニストの候補分子をスクリーニングするために利用する方法を提供する。代わりの実施形態においては、本発明は、癌発生および／または進行に関わる化合物の発現をモジュレートするための組成物および方法、ならびに癌発生および／または進行中に発現をモジュレートする化合物のスクリーニングを提供する。スクリーニングアッセイにより同定した分子および化合物を、治療に利用する方法も提供する。
【００２３】
本発明はさらに、限定されるものでないが、子宮頚癌、腎細胞癌、ならびに胃および大腸癌を含む、癌および他の疾患と障害を治療および／または改善する方法を提供する。
【００２４】
本発明は、部分的に、ベクター（すなわちウイルスベクター）に含まれた毒性および／または治療コード配列をコードするヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列を組織特異的に発現させるプロモーターを利用して細胞および組織特異的な方法で投与できるという発見に基づく。さらに、本発明のベクターはこれらのプロモーターを使用して毒性および／または治療コード配列の発現を制御するので、従って、毒性および／または治療コード配列は特定的に標的とした細胞、すなわちＭＮ−ＣＡ９を発現する細胞内でだけ発現されるので、本発明のベクターは直接適用を経由して投与するときだけでなく全身に投与するときでも有効な治療薬となりうる。
【００２５】
この特性の利点を生かして、本発明の方法は、治療薬をコードする１以上のＤＮＡ分子を治療薬を必要とする部位に効率的に伝達するように設計される。本方法は、翻訳産物（すなわち治療タンパク質）または転写産物（すなわちアンチセンスまたはリボザイム）をコードするＤＮＡを含有するベクターを、哺乳類宿主内の翻訳産物を必要とする部位への投与を含む。ベクターが治療薬を必要とする細胞に感染すると、目的のコード配列、すなわち、チミジンキナーゼが発現され、それによって毒性および／または治療の薬剤、タンパク質もしくはＲＮＡの量を増幅する。
【００２６】
本発明はまた、限定されるものでないが、子宮頚癌、腎細胞癌、ならびに胃および大腸癌を含む癌および他の疾患と障害を治療および／または改善するために利用するＤＮＡを含有するベクターを含んでなる製薬組成物にも関する。本発明の組成物は一般的に、目的の治療タンパク質、すなわちチミジンキナーゼ、増殖因子その他をコードするＤＮＡを含有するベクターを含んでなる生体適合性物質から構成される。生体適合性組成物とは、哺乳類宿主に投与したときにアレルギー、有害または他の都合の悪い反応を起こさない形態の組成物である。
【００２７】
本発明は、特に、限定されるものでないが、子宮頚癌、腎細胞癌、ならびに胃および大腸癌を含む癌および他の疾患と障害を治療するための現行の組換えタンパク質治療に関連する欠点を克服する。第１に、直接遺伝子導入は、トランスフェクトした細胞が（ａ）組織およびコンテキスト特異的な方法で改変された生理学的量の治療タンパク質を作り、かつ（ｂ）このタンパク質を適当な細胞表面シグナル伝達受容体に適当な環境のもとで送達することを可能にする合理的な方法である。そのような分子を外因的に送達する場合には、投薬と送達にかなりの問題を伴うと予想される。第２に、本発明の方法は、誘導プロモーターを含む様々なプロモーターを利用して目的の治療タンパク質の発現レベルを制御できるので、反復投与は可能であるが必要としない。さらに、トランスフェクトしたＤＮＡを組込むので長期間の組換えタンパク質発現が可能である。
【００２８】
以下の５．１および５．２節に記載したのは、ＭＮ−ＣＡ９調節領域のヌクレオチド配列、ならびに、異種遺伝子の発現がＭＮ−ＣＡ９調節領域によって制御される発現ベクター、宿主細胞およびトランスジェニック動物である。５．３節では、そのようなポリヌクレオチド（すなわち、ＭＮ−ＣＡ９遺伝子の調節領域）および融合タンパク質産物を、ＭＮ−ＣＡ９遺伝子の調節領域と相互作用する化合物をスクリーニングするために利用する方法を記載した。この節は、ＭＮ−ＣＡ９調節領域と結合してその活性をモジュレートする小分子、化合物、組換えタンパク質、ペプチド、核酸、抗体などをスクリーニングするｉｎ ｖｉｖｏおよびｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイの両方を記載した。５．４節は、同定したアゴニストおよびアンタゴニストを薬物送達または遺伝子治療に利用する方法を記載した。最後に、５．５節では、そのようなアゴニストおよびアンタゴニストを利用して癌細胞関連障害をモジュレートする製薬組成物を記載した。限定されるものでないが、子宮頚癌、腎細胞癌、ならびに胃および大腸癌を含む様々な癌を治療するための方法と組成物が提供される。
【００２９】
５．１　発明のポリヌクレオチドおよび核酸
本発明は、ＭＮ−ＣＡ９遺伝子の５’調節領域およびその転写活性断片を含んでなるポリヌクレオチド配列を包含する。特に、本発明は、図１に示した、ＭＮ−ＣＡ９遺伝子の転写開始部位の５’に隣接して位置する配列を含んでなるポリヌクレオチドに関する。様々な実施形態においては、ポリヌクレオチドは、長さで５０００、４０００、３０００、２０００、１０００、好ましくはほぼ５００、そしてさらに好ましくは２５０ｂｐであってもよい。
【００３０】
本発明はさらに、ＭＮ−ＣＡ９調節領域のプローブ、プライマーおよび断片を提供する。一実施形態においては、ＭＮ−ＣＡ９遺伝子配列の少なくとも８ヌクレオチド（すなわちハイブリダイズ可能な部分）からなる精製核酸を提供し；他の実施形態においては、核酸はＭＮ−ＣＡ９配列の少なくとも２０（連続）ヌクレオチド、２５ヌクレオチド、５０ヌクレオチド、１００ヌクレオチド、２００ヌクレオチド、５００、１０００、２０００、３０００、４０００または５０００ヌクレオチドからなる。当業者が周知する方法を用いて、これらの配列を単離した形態で、または発現ベクターに含有させて構築することができる。これらの方法は、例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏ組換えＤＮＡ技術、合成技術およびｉｎ ｖｉｖｏ遺伝子組換えが挙げられる。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら， １９８９、前掲、およびＡｕｓａｂｅｌら， １９８９、前掲、を参照；また本明細書に参照によりその全文が組み入れられる「オリゴヌクレオチド合成（Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）」， １９８４， Ｇａｉｔ Ｍ．Ｊ．編， ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ， Ｏｘｆｏｒｄに記載された技術も参照すること。
【００３１】
他の実施形態においては、核酸は長さが２０、２５、３５、２００または５００ヌクレオチドより小さい。核酸は一本鎖または二本鎖であってもよい。本発明はまた、前記配列とハイブリダイズ可能なまたは相補的な核酸を包含する。ある特定の態様においては、ＭＮ−ＣＡ９遺伝子の少なくとも１０、２０、２５、５０、１００、２００、５００ヌクレオチドまたは全調節領域と相補的な配列を含んでなる核酸が提供される。
【００３２】
本発明によって提供されるＭＮ−ＣＡ９調節領域のプローブ、プライマーおよび断片は、様々な目的の研究分野で利用することができる。これらは、サザンブロットゲルの分子量マーカーとして；染色体を同定するため、または関係遺伝子位置をマッピングするための染色体マーカーまたはタグ（標識するときには）として；患者の内因性ＤＮＡ配列と比較して潜在的遺伝子障害を同定するため；ハイブリダイズして新規の関係ＤＮＡ配列を発見するためのプローブとして；遺伝子フィンガープリント用のＰＣＲプライマーを誘導するための情報源として；および他の新規のポリヌクレオチドを発見するプロセスで既知配列を「差引く（ｓｕｂｔｒａｃｔ−ｏｕｔ）」プローブとして利用することができる。当業者は、以上の利用を行うための方法を周知している。そのような方法を開示する参考文献は、限定されるものでないが、「分子クローニング：研究室マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」， ２ｄ ｅｄ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｊ．， Ｅ．Ｆ． Ｆｒｉｔｓｃｈ ａｎｄ Ｔ． Ｍａｎｉａｔｉｓ編， １９８９、ならびに「酵素学の方法：分子クローニング技術の手引き（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ： Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）」， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｂｅｒｇｅｒ， Ｓ．Ｌ． ａｎｄ Ａ．Ｒ． Ｋｉｍｍｅｌ編， １９８７、が挙げられる。
【００３３】
本発明のヌクレオチド配列はまた、図１に示したヌクレオチド配列と少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％もしくはそれ以上のヌクレオチド配列同一性を有するヌクレオチド配列、および／またはその転写活性断片であって、限定されるものでないが、子宮頚癌、腎細胞癌、ならびに胃および大腸癌を含む癌内で特異的に発現を駆動できる前記ヌクレオチド配列を含む。
【００３４】
２つのアミノ酸配列または２つの核酸のパーセント同一性を決定するためには、配列を最適な比較ができるようにアラインする（例えば、ギャップを第１のアミノ酸の配列または核酸配列に導入して、第２のアミノ酸配列または核酸配列と最適なアラインメントにしてもよい）。次いで、対応するアミノ酸位置またはヌクレオチド位置のアミノ酸残基またはヌクレオチドを比較する。第１配列のある位置に、第２配列の対応する位置と同じアミノ酸残基またはヌクレオチドがあるときは、両分子はその位置で同一である。２本の配列の間のパーセント同一性は、配列が共有する同一位置の数の関数である（すなわち、％同一性＝同一重複位置の数／位置の全数 ｘ １００）。一実施形態においては、両配列は同じ長さである。
【００３５】
２本の配列間のパーセント同一性の決定は、また、数学的アルゴリズムを用いて実施してもよい。２本の配列の比較に使用される好ましい数学的アルゴリズムの例は、限定されるものでないが、ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌ （１９９０） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８７：２２６４−２２６８、およびその改定版、ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌ （１９９３） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９０：５８７３−５８７７である。そのようなアルゴリズムを、Ａｌｔｓｃｈｕｌら （１９９０） Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２１５：４０３−４１０のＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラムに組み込む。ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索はＮＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝１００、ワード長＝１２を用いて実施し、本発明の核酸分子と相同的なヌクレオチド配列を得てもよい。ＢＬＡＳＴタンパク質検索は、ＸＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝５０、ワード長＝３を用いて実施し、本発明のタンパク質分子に相同的なアミノ酸配列を得てもよい。比較のためのギャップ入りアラインメントを得るためには、ギャップ入りＢＬＡＳＴを、Ａｌｔｓｃｈｕｌら （１９９７） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２５：３３８９−３４０２に記載の通り使用することができる。あるいは、ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴを利用して繰返し検索を行い、分子間の遠隔の関係を検出することができる（同上）。ＢＬＡＳＴ、ギャップ入りＢＬＡＳＴおよびＰＳＩ−ＢＬＡＳＴプログラムを使用するとき、それぞれのプログラム（例えば、ＸＢＬＡＳＴおよびＮＢＬＡＳＴ）のデフォルトパラメーターを用いることができる（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖを参照）。配列の比較に使用する数学的モデルの他の好ましい例は、限定されるものでないが、ＭｙｅｒｓおよびＭｉｌｌｅｒ， （１９８８） ＣＡＢＩＯＳ ４：１１−１７のアルゴリズムである。そのようなアルゴリズムを、ＧＣＧ配列アラインメントソフトウエアパッケージの一部分であるＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込む。アミノ酸配列の比較にＡＬＩＧＮプログラムを使用するとき、ＰＡＭ１２０ウエート残基表、１２のギャップ長ペナルティおよび４のギャップペナルティを用いることができる。代わりの実施形態においては、アラインメントは、ＮＡ＿ＭＵＬＴＩＰＬＥ＿ＡＬＩＧＮＭＥＮＴ １．０ プログラムを使用し、５のギャップウエートおよび１のギャップ長ウエートを用いて得ることができる。
【００３６】
２本の配列間のパーセント同一性は、以上記載したのと類似の技術を用いて、ギャップを考慮してまたは考慮しないで決定することができる。パーセント同一性を計算する際、典型的には、正確な対合（ｍａｔｃｈ）だけを数える。
【００３７】
本発明はまた、次を包含する：
（ａ）前記ＭＮ−ＣＡ９調節配列および／またはそれらの相補体（すなわちアンチセンス）のいずれかを含有するＤＮＡベクター；
（ｂ）レポーター遺伝子などの異種遺伝子と機能しうる形で関連した前記ＭＮ−ＣＡ９調節エレメント配列のいずれかを含有するＤＮＡ発現ベクター；および
（ｃ）ＭＮ−ＣＡ９調節エレメントが宿主細胞内の異種遺伝子の発現を指令するように、異種遺伝子と機能しうる形で関連した前記ＭＮ−ＣＡ９調節エレメント配列のいずれかを含有する遺伝子操作した宿主細胞。
【００３８】
また本発明の範囲内に包含されるのは、この調節領域の様々な転写活性断片である。本発明による図１に示した配列の「転写活性（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌｌｙ ａｃｔｉｖｅ）」または「転写機能性（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌｌｙ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ）」断片は、組換え細胞宿主において組換えポリペプチドまたは組換えポリヌクレオチドを発現する調節領域として機能する前記ポリヌクレオチドの断片を含んでなるポリヌクレオチドを意味する。本発明の目的にとって、核酸またはポリヌクレオチドが組換えポリペプチドまたは組換えポリヌクレオチドを発現する調節領域として「転写活性がある」というのは、前記調節ポリヌクレオチドが転写情報を含有するヌクレオチド配列を含んでなり、かつその配列が所望のポリペプチドまたは所望のポリヌクレオチドをコードするヌクレオチド配列と機能しうる形で関連していることである。
【００３９】
特に、本発明のＭＮ−ＣＡ９調節領域の転写活性断片は、ＭＮ−ＣＡ９調節配列と機能しうる形で連結され、かつＭＮ−ＣＡ９発現細胞系にトランスフェクトされた時にレポーター遺伝子の転写を促進するのに十分な長さである断片を包含する。典型的には、調節領域はコード配列の５’に隣接して配置され、かつコード配列と機能しうる形で関連している。本明細書に使用する用語「機能しうる形で関連した」は、調節配列をレポーター遺伝子の５’（上流）に隣接して配置し、転写因子、ポリメラーゼサブユニットおよびアクセサリータンパク質などの転写の開始に必要なｔｒａｎｓ作用因子をこの領域で構築して、レポーター遺伝子のＲＮＡポリメラーゼに依る転写を開始させることができることを意味する。
【００４０】
一実施形態においては、選ばれるポリヌクレオチド配列はさらに、ＭＮ−ＣＡ９遺伝子または異種遺伝子からの他のヌクレオチド配列を含んでなってもよい。他の実施形態においては、プロモーター配列またはその断片の複数コピーがお互いに連結されてもよい。例えば、プロモーター配列またはその断片を、プロモーター配列の他のコピー、またはその他の断片とヘッド・ツー・テイル（ｈｅａｄ ｔｏ ｔａｉｌ）、ヘッド・ツー・ヘッド（ｈｅａｄ ｔｏ ｈｅａｄ）、またはテイル・ツー・テイル（ｔａｉｌ ｔｏ ｔａｉｌ）方向で連結されてもよい。他の実施形態においては、腫瘍特異的エンハンサーを、ＭＮ−ＣＡ９調節配列またはその断片と機能しうる形で連結して、ＭＮ−ＣＡ９調節配列を含有する構築物からの転写を増強するために利用してもよい。
【００４１】
また、本発明の範囲内に包含されるのは、実質的にその転写活性に影響を与えることのないこのヌクレオチド配列の改変である。そのような改変は、付加、欠失および置換を含む。さらに、図１に示した配列の相補体とストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で選択的にハイブリダイズしかつコード配列の発現を活性化できるいずれのヌクレオチド配列も本発明に包含される。中度にストリンジェントな条件の例は次の通りである：ＤＮＡを含有するフィルターのプレハイブリダイゼーションを、８時間〜一夜６５℃にて、６Ｘ ＳＳＣ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ （ｐＨ ７．５）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０２％ ＰＶＰ、０．０２％ Ｆｉｃｏｌｌ、０．０２％ ＢＳＡ、および５００μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡからなるバッファー中で実施する。フィルターを４８時間、６５℃にて、１００μｇ／ｍ変性サケ精子ＤＮＡおよび３２Ｐ−標識プローブの５〜２０ Ｘ １０６ ｃｐｍを含有するプレハイブリダイゼーション混合物中でハイブリダイズする。フィルターの洗浄を、３７℃にて１時間、２ Ｘ ＳＳＣ、０．０１％ ＰＶＰ、０．０１％ Ｆｉｃｏｌｌ、および０．０１％ ＢＳＡを含有する溶液中で実施する。次いで、０．１ Ｘ ＳＳＣ中で５０℃にて４５分間洗浄した後、オートラジオグラフィにかける。あるいは、高ストリンジェンシーの条件の例は次のとおりである：例えば、０．５Ｍ ＮａＨＰＯ４、７％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、１ｍＭ ＥＤＴＡ中で、６５℃にてフィルター結合ＤＮＡとのハイブリダイゼーション、および０．１ ｘ ＳＳＣ／０．１％ ＳＤＳ中で６８℃にて洗浄（Ａｕｓｕｂｅｌ Ｆ． Ｍ．ら編， １９８９， 「分子生物学の現行プロトコル（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）」， Ｖｏｌ．Ｉ， Ｇｒｅｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ， Ｉｎｃ．， ａｎｄ Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ｐ．２．１０．３）。利用しうる高ストリンジェンシーの他の条件は、当業界で周知である。一般的に、長さで１４〜７０ヌクレオチドのプローブの融解温度（ＴＭ）は次式を用いて計算する：Ｔｍ（℃）＝８１．５＋１６．６（ｌｏｇ［一価カチオン（モル）］）＋０．４１（％ Ｇ＋Ｃ）−（５００／Ｎ）
（式中、Ｎはプローブの長さである）。もしハイブリダイゼーションをホルムアミドを含有する溶液中で実施するのであれば、融解温度は次式を用いて計算する：Ｔｍ（℃）＝８１．５＋１６．６（ｌｏｇ［一価カチオン（モル）］）＋０．４１（％ Ｇ＋Ｃ）−（０．６１％ホルムアミド）−（５００／Ｎ）（式中、Ｎはプローブの長さである）。一般的に、ハイブリダイゼーションはＴｍよりほぼ２０〜２５℃（ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッド）または１０〜１５℃（ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッド）低い温度で実施する。
【００４２】
ＭＮ−ＣＡ９調節領域またはその転写機能性断片は、好ましくは哺乳類動物から誘導する。核酸ハイブリダイゼーションによるスクリーニング手段によって、他の生物から任意の遺伝子配列を単離することができる。本明細書に開示した単離したポリヌクレオチド配列またはその断片を標識して利用し、目的の生物由来の適当な細胞または組織（例えば、癌組織）から得たｍＲＮＡを用いて構築したｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることができる。ｃＤＮＡライブラリーが、標識配列が誘導された生物の型と異なる生物から誘導されたときは、使用するハイブリダイゼーション条件は、より低いストリンジェンシーにすべきである。当業者は低ストリンジェンシー条件を周知しており、ライブラリーと標識配列を誘導した特定の生物に依って変わりうる。その条件の手引きとしては、例えば、それぞれ本明細書に参照によりその全文が組み入れられるＳａｍｂｒｏｏｋら， １９８９， 「分子クローニング、研究室マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」， Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ， Ｎ．Ｙ．、およびＡｕｓａｂｅｌら， １９８９， 「分子生物学の現行プロトコル（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）」， Ｇｒｅｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ， Ｎ．Ｙ．を参照すること。さらに、他の哺乳類ＭＮ−ＣＡ９調節領域相同体は、例えばウシまたは他の非ヒト核酸から、本明細書に開示したＭＮ−ＣＡ９調節領域のヌクレオチド配列に基づいて設計した２つのプライマープールを用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅を実施することによって単離することができる。反応用テンプレートは、例えば、ＭＮ−ＣＡ９遺伝子を発現することがわかっているウシまたは他の非ヒト細胞系、または組織から調製したｍＲＮＡを逆転写して得たｃＤＮＡであってもよい。そのような条件の手引きについては、例えば、それぞれが本明細書に参照によりその全文が組み入れられるＩｎｎｉｓら（編） １９９５， 「ＰＣＲストラテジー（ＰＣＲ Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ）」， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ；およびＥｒｌｉｃｈ（編） １９９２， ＰＣＲ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、を参照すること。
【００４３】
ＭＮ−ＣＡ９遺伝子の５’非コード領域内のプロモーター配列は、エキソヌクレアーゼＩＩＩまたは適当な制限エンドヌクレアーゼ消化などの通常の技術を用いて入れ子の（ｎｅｓｔｅｄ）５’および／または３’欠失を構築することによって、さらに定義することができる。得られる欠失断片をプロモーターレポーターベクター中に挿入して、例えば、Ｃｏｌｅｓら （Ｈｕｍ． Ｍｏｌ． Ｇｅｎｅｔ．， ７：７９１−８００， １９９８）が記載したように、欠失がプロモーター活性を低下または抹消したかどうかを決定することができる。この方法で、プロモーターの境界を定義することができる。もし所望であれば、プロモーター内の潜在的な個々の調節部位を、プロモーター内の潜在転写因子結合部位を個々にまたは組合せて抹消する位置指定突然変異誘発またはリンカー走査を利用して同定してもよい。これらの突然変異の転写レベルに対する効果は、プロモーターレポーターベクターのクローニングサイト中に突然変異を挿入することによって決定してもよい。当業者はこれらのタイプのアッセイを周知している（ＷＯ ９７／１７３５９、ＵＳ ５，３７４，５４４、ＥＰ ５８２ ７９６、ＵＳ ５，６９８，３８９、ＵＳ ５，６４３，７４６、ＵＳ５，５０２，１７６、およびＵＳ ５，２６６，４８８）。
【００４４】
ＭＮ−ＣＡ９調節領域およびその転写機能性断片、ならびに本明細書に記載のＭＮ−ＣＡ９調節領域およびその断片を同定するのに役立つ断片およびプローブは、組換えＤＮＡ技術によって当業界で周知の技術を用いて作ることができる。当業者が周知する方法を用いて、これらの配列を単離した形態でまたは発現ベクターに含有させて構築することができる。これらの方法は、例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏ組換えＤＮＡ技術、合成技術およびｉｎ ｖｉｖｏ遺伝子組換えが挙げられる。例えば、本明細書に参照によりその全文が組み入れられる、Ｓａｍｂｒｏｏｋら， １９８９， 前掲、およびＡｕｓａｂｅｌら， １９８９， 前掲、に記載の技術を参照すること；また「オリゴヌクレオチド合成（Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）」， １９８４， Ｇａｉｔ Ｍ．Ｊ．編， ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ， Ｏｘｆｏｒｄ、に記載の技術も参照すること。
【００４５】
調節配列の改変は、当業者が周知する様々な化学および酵素学的方法を利用して作製することができる。例えば、制限酵素切断部位によって定義した配列領域を欠失することができる。オリゴヌクレオチドを指定した突然変異誘発を用いて配列を定義した方法で改変すること、および／または制限酵素切断部位を配列内の特定領域に導入することができる。さらに、欠失突然変異体を、Ｂａｌ３１、ＥｘｏＩＩＩ、またはＳ１ヌクレアーゼなどのＤＮＡヌクレアーゼを用いて作製することができる。ＤＮＡをヌクレアーゼを用いてインキュベートする時間を増加することによって、次第に大きい調節配列の欠失が作製される（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら， １９８９、前掲）。
【００４６】
改変した配列は、適当な宿主細胞において異種コード配列の発現を指令するそれらの能力について評価する。さらなる利用のためにコード配列の発現を指令するそれらの能力を保持する任意の改変した調節配列を組換え発現ベクター中に組み込むことは、本発明の範囲内である。
【００４７】
５．２　腫瘍特異的プロモーター活性の分析
ＭＮ−ＣＡ９遺伝子調節領域は、選択的な組織および細胞型特異性を示す。すなわち、子宮頚癌、腎細胞癌、ならびに胃および大腸癌における遺伝子発現を誘発する。従って、本発明の調節領域、およびその転写活性断片は腫瘍細胞における異種遺伝子の発現を誘発するために利用することができる。本発明は、標的遺伝子の組織特異的な発現を達成するためのＭＮ−ＣＡ９遺伝子調節領域の利用に関する。ＭＮ−ＣＡ９調節領域の活性と特異性はさらに、ＭＮ−ＣＡ９プロモーターと機能しうる形で関連した検出可能なポリヌクレオチドの発現レベルをモニターすることによって、様々な型の細胞および組織内において評価することができる。以下に考察した通り、検出可能なポリヌクレオチドは、すでに定義したオリゴヌクレオチドプローブと特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチドであっても、または検出可能なタンパク質をコードするポリヌクレオチドであってもよい。
【００４８】
５．２．１　ＭＮ−ＣＡ９プロモーターが駆動するレポーター構築物
本発明による調節ポリヌクレオチドは、所望の宿主細胞または宿主生物においてコード配列またはレポーター遺伝子を発現するために利用し得る組換え発現ベクターの部分であることが有利である。本発明のＭＮ−ＣＡ９調節領域、およびその転写活性断片は、異種コード配列の発現を指令するために利用することができる。本発明によれば、ＭＮ−ＣＡ９調節領域の転写活性断片は、領域の、断片が機能しうる形で連結したレポーターコード配列の転写を促進するのに十分な長さである断片を包含する。
【００４９】
当業者が周知する様々なレポーター遺伝子配列を使用することができ、限定されるものでないが、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）などの蛍光タンパク質をコードする遺伝子、酵素（例えば、ＣＡＴ、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ）または抗原性マーカーが挙げられる。本発明のスクリーニングアッセイには、便宜上、比色定量または蛍光定量アッセイによって分析される酵素レポーターおよび発光レポーターが好ましい。
【００５０】
一実施形態においては、例えば、生物発光、化学発光または蛍光タンパク質を本発明の発光レポーターとして使用することができる。基質または補因子を必要としない発光レポーターのタイプは、限定されるものでないが、ビクトリア・エクオリン（Ｖｉｃｔｏｒｉａ ａｅｑｕｏｒｉａ）の野生型緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）（Ｃｈａｌｆｉｅら， １９９４， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６３：８０２−８０５）、および改変ＧＦＰ（Ｈｅｉｍら， １９９５， Ｎａｔｕｒｅ ３７３：６６３−４；ＰＣＴ公開特許ＷＯ ９６／２３８１０）が挙げられる。このタイプのレポーター遺伝子の転写と翻訳は試験細胞内に蛍光タンパク質の蓄積を生じるので、例えば、当業界で周知の方法による蛍光光度計またはフローサイトメーター（例えば、Ｌａｃｋｏｗｉｃｚ， １９８３， 「蛍光分光法の原理（Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ）」， Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、を参照）によって測定することができる。
【００５１】
使用しうるレポーター遺伝子の他の型は、発光するために補因子を必要とする酵素であって、限定されるものでないが、レニラ・ルシフェラーゼ（Ｒｅｎｉｌｌａ ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ）が挙げられる。ルシフェラーゼの他の供給源も当業界では周知であって、限定されるものでないが、ビブリオ・ハルベイ（Ｖｉｂｒｉｏ ｈａｒｖｅｙｉ）の細菌ルシフェラーゼ（ｌｕｘＡＢ遺伝子産物）（Ｋａｒｐ， １９８９， Ｂｉｏｃｈｉｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ １００７：８４−９０；Ｓｔｅｗａｒｔら １９９２， Ｊ． Ｇｅｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ， １３８：１２８９−１３００）、およびホタル、Ｐｈｏｔｉｎｕｓ ｐｙｒａｌｉｓ、からのルシフェラーゼ（Ｄｅ Ｗｅｔら １９８７， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． ７：７２５−７３７）が挙げられ、これらは光生産によってアッセイすることができる（Ｍｉｙａｍｏｔｏら， １９８７， Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １６９：２４７−２５３；Ｌｏｅｓｓｎｅｒら １９９６， Ｅｎｖｉｒｏｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ６２：１１３３−１１４０；およびＳｃｈｕｌｔｚ ＆ Ｙａｒｕｓ， １９９０， Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １７２：５９５−６０２）。
【００５２】
比色分析を用いて分析できるレポーター遺伝子は、限定されるものでないが、β−ガラクトシダーゼ（Ｎｏｌａｎら １９８８， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８５：２６０３０７）、β−グルクロニダーゼ（Ｒｏｂｅｒｔｓら １９８９， Ｃｕｒｒ． Ｇｅｎｅｔ． １５：１７７−１８０）、ルシフェラーゼ（Ｍｉｙａｍｏｔｏら， １９８７， Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １６９：２４７−２５３）、またはβ−ラクタマーゼが挙げられる。一実施形態においては、レポーター遺伝子配列はＬａｃＺ遺伝子産物、β−ガラクトシダーゼをコードするヌクレオチド配列を含んでなる。この酵素は非常に安定であって広い特異性を有し、限定されるものでないが、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドイル−β−Ｄ−ガラクトシド（Ｘ−ｇａｌ）、ラクトース２，３，５−トリフェニル−２Ｈ−テトラゾリウム（ラクトース−テトラゾリウム）およびフルオレセインガラクトピラノシドなどの様々な組織化学的、色素生産性または蛍光生産性基質の利用を可能にする（Ｎｏｌａｎら， １９８８， 前掲、を参照）。
【００５３】
他の実施形態においては、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）β−グルクロニダーゼ遺伝子（ＧＵＳ）の産物をレポーター遺伝子として利用できる（Ｒｏｂｅｒｔｓら １９８９， Ｃｕｒｒ． Ｇｅｎｅｔ． １５：１７７−１８０）。ＧＵＳ活性は、Ｘグルクロニド（Ｘｇｌｕｃ）および４−メチルウンベリフェリルグルクロニドなどの様々な組織化学的および蛍光生産性基質によって検出できる。
【００５４】
好都合な比色応答を与える上記のレポーター遺伝子配列に加えて、例えば、選択レポーター遺伝子配列などの他のレポーター遺伝子配列を日常的に使用することができる。例えば、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）のコード配列を使用して、ＭＮ−ＣＡ９調節領域に依存するクロラムフェニコール耐性細胞増殖を発現させることができる。ＣＡＴの利用と選択レポーター遺伝子の利点は当業者には周知である（Ｅｉｋｍａｎｎｓら １９９１， Ｇｅｎｅ １０２：９３−９８）。他の選択レポーター遺伝子配列も利用することができ、限定されるものでないが、ゼオシン耐性（Ｈｅｇｅｄｕｓら １９９８， Ｇｅｎｅ ２０７：２４１−２４９）またはカナマイシン耐性（Ｆｒｉｅｄｒｉｃｈ ＆ Ｓｏｒｉａｎｏ， １９９１， Ｇｅｎｅｓ． Ｄｅｖ． ５：１５１３−１５２３）を与えるポリペプチドをコードする遺伝子配列が挙げられる。
【００５５】
毒性遺伝子産物、潜在的毒性遺伝子産物、および抗増殖もしくは細胞分裂停止遺伝子産物などの他の遺伝子も利用することができる。そのような遺伝子産物の例は、肝臓癌細胞を標的とするα胎児タンパク質（Ｋｕｒｉｙａｍａ， Ｓ．ら， Ｃｅｌｌ Ｓｔｒｕｃｔ Ｆｕｎｃｔ， １６：５０３，１９９１）、胃癌に対する癌胎児性抗原（ＣＥＡ）プロモーター（Ｔａｎａｋａ， Ｔ．ら， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ， ５６：１３４１， １９９６）、黒色腫細胞を死滅するチロシナーゼプロモーター（Ｖｉｌｅ， Ｒ．Ｇ．ら， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ， ５４：６２２８，１９９４）、脳の神経膠細胞を標的とする骨形成タンパク質（ｂｏｎｅ ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ）（Ｓｈｉｍｉｚｕ， Ｋ．， Ｎｉｐｐｏｎ Ｒｉｎｓｈｏ， ５２：３０５３， １９９４）および骨肉腫および前立腺癌を死滅するオステオカルシンプロモーター（Ｋｏ， Ｓ． Ｃ．ら， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ， ５６：４６１４， １９９６；Ｇａｒｄｎｅｒ， Ｔ． Ａ．ら， Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， ２：４１， １９９８）が挙げられる。他の実施形態においては、検出可能なレポーターポリヌクレオチドは、予め定義したオリゴヌクレオチドプローブと特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチド、またはＭＮ−ＣＡ９ポリペプチドもしくは断片もしくはそれらの変異体を含む検出可能なタンパク質をコードするポリヌクレオチドであってもよい。このタイプのアッセイは当業者には周知である（米国特許第５，５０２，１７６号および米国特許第５，２６６，４８８号）。
【００５６】
ＭＮ−ＣＡ９が駆動するレポーター構築物は、標準の組換えＤＮＡ技術によって構築することができる（例えば、それぞれが本明細書に参照によりその全文が組み入れられる、「酵素学の方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）」， １９８７， ｖｏｌｕｍｅ １５４， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；Ｓａｍｂｒｏｏｋら １９８９， 「分子クローニング−研究室マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」， ２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；およびＡｕｓｕｂｅｌら， 「分子生物学の現行プロトコル（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）」， Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、を参照）。
【００５７】
プロモーター活性をアッセイする方法は当業者には周知である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら， 「分子クローニング、研究室マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， ＮＹ， １９８９を参照）。利用しうる典型的な方法の一例は、レポーター遺伝子とＭＮ−ＣＡ９ゲノム配列からのゲノム配列とを運ぶ組換えベクターに関わる。簡単に説明すると、生物活性のあるポリヌクレオチド断片の制御下に置いた時のレポーター遺伝子（例えば、緑色蛍光タンパク質、ルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼまたはクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ）の発現を検出する。遺伝子の第１エキソンの上流に位置するゲノム配列を任意の適当なプロモーターレポーターベクター中にクローニングすることができる。例えば、複数の市販ベクターを遺伝子操作して本発明のＭＮ−ＣＡ９調節領域を挿入し、哺乳類宿主細胞において発現させることができる。そのようなベクターの例は、限定されるものでないが、ｐＳＥＡＰベーシック、ｐＳＥＡＰ−エンハンサー、ｐβｇａｌ−ベーシック、ｐβｇａｌ−エンハンサー、またはｐＥＧＦＰ−１プロモーターレポーターベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ， Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ， ＣＡ）またはｐＧＬ２−ベーシックまたはｐＧＬ３−ベーシック・プロモーターレス・ルシフェラーゼレポーター遺伝子ベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ， Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩ）である。これらのプロモーターレポーターベクターはそれぞれ、分泌性アルカリホスファターゼ、緑色蛍光タンパク質、ルシフェラーゼまたはβ−ガラクトシダーゼなどの容易にアッセイできるタンパク質をコードするレポーター遺伝子の上流に位置するマルチクローニングサイト（ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｃｌｏｎｉｎｇ ｓｉｔｅ）を含んでなる。ＭＮ−ＣＡ９遺伝子の調節配列をレポーター遺伝子の上流のクローニングサイト中に両方の方向に向けて挿入し、そして適当な宿主細胞中に導入する。レポータータンパク質のレベルをアッセイして、クローニングサイトにインサートを欠くベクターを用いて得たレベルと比較する。対照ベクターと比較して、インサートを含有するベクターの発現レベルが上昇していれば、インサートにプロモーターが存在することを示す。
【００５８】
ＭＮ−ＣＡ９遺伝子調節領域を含んでなる発現ベクターはさらに、選択マーカーをコードする遺伝子を含有してもよい。複数の選択系を利用することができて、限定されるものでないが、ヘルペスシンプレックスウイルスチミジンキナーゼ（Ｗｉｇｌｅｒら， １９７７， Ｃｅｌｌ １１：２２３）、ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｓｚｙｂａｌｓｋａ ＆　Ｓｚｙｂａｌｓｋｉ， １９６２， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ４８：２０２６）およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｌｏｗｙら， １９８０， Ｃｅｌｌ ２２：８１７）遺伝子が挙げられ、それぞれｔｋ−， ｈｇｐｒｔ−ｏｒ ａｐｒｔ−細胞で使用することができる。また、抗代謝物耐性を選択のベースとして利用することができ、メトトレキセート耐性を与えるｄｈｆｒ（Ｗｉｇｌｅｒら， １９８０， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７７：３５６７；Ｏ’Ｈａｒｅら， １９８１， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７８：１５２７）；マイコフェノール酸耐性を与えるｇｐｔ（Ｍｕｌｌｉｇａｎ ＆ Ｂｅｒｇ， １９８１， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７８：２０７２）；アミノグリコシドＧ−４１８耐性を与えるｎｅｏ（Ｃｏｌｂｅｒｒｅ−Ｇａｒａｐｉｎら， １９８１， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １５０：１）；およびハイグロマイシン耐性を与えるｈｙｇｒｏ（Ｓａｎｔｅｒｒｅら， １９８４， Ｇｅｎｅ ３０：１４７）遺伝子が挙げられる。さらなる選択遺伝子は、細胞にトリプトファンの代わりにインドールの利用を可能にするｔｒｐＢ；細胞にヒスチジンの代わりにヒスチノールの利用を可能にするｈｉｓＤ（Ｈａｒｔｍａｎ ＆ Ｍｕｌｌｉｇａｎ， １９８８， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８５：８０４７）；オルチニンデカルボキシラーゼインヒビター、２−（ジフルオロメチル）−ＤＬ−オルニチン、ＤＦＭＯ耐性を与えるＯＤＣ（オルチニンデカルボキシラーゼ）（ＭｃＣｏｎｌｏｇｕｅ Ｌ．， １９８７， Ｉｎ 「分子生物学における最近のコミュニケーション（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）」， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ版）およびグルタミン合成酵素（Ｂｅｂｂｉｎｇｔｏｎら， １９９２， Ｂｉｏｔｅｃｈ １０：１６９）が挙げられる。
【００５９】
５．２．２　転写活性調節断片の特性決定
ＭＮ−ＣＡ９調節領域、またはその断片を含んでなる融合構築物を転写活性についてアッセイすることができる。プロモーター分析の第１段階として、研究する腫瘍特異性遺伝子の転写開始点（＋１部位）を、プライマー伸長アッセイおよび／またはリボヌクレアーゼ保護アッセイを用いて、標準の方法（Ｓａｍｂｒｏｏｋら， １９８９， 「分子クローニング：研究室マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ）に従って決定しなければならない。＋１部位の上流のＤＮＡ配列は一般的に、遺伝子制御を担うプロモーター領域と考えられる。しかし、下流配列（イントロン内の配列を含む）も、遺伝子制御に関わりうる。プロモーター活性の試験を開始するために、−３ｋｂ〜＋３ｋｂ領域（ここで、＋１が転写開始点である）をレポーター遺伝子コード領域の上流にクローニングする。調節領域の５’および／または３’末端切断バージョンを含有する２以上の追加のレポーター遺伝子構築物を作って、腫瘍特異的発現の原因となる領域の同定に役立てることができる。その用途に基づいて、レポーター遺伝子の型を選択する。
【００６０】
好ましい実施形態においては、ＧＦＰレポーター遺伝子構築物を使用する。緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）のレポーターとしての使用は、特に腫瘍特異的遺伝子プロモーターの研究に有用である。ＧＦＰをレポーターとして使用する大きな利点は、ＧＦＰは、基質を必要とせずに新しく単離した腫瘍で検出できるという事実にある。本発明の他の実施形態においては、ルシフェラーゼレポーター構築物を使用する。
【００６１】
トランスジェニックマウスのプロモーター分析については、哺乳類細胞において発現を最適化しておいたＧＦＰが好ましい。プロモーターレスクローニングベクターｐＥＧＦＰｌ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ， Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ， ＣＡ）は、哺乳類細胞において蛍光がより明るくかつ発現がより高くなるように最適化された野生型ＧＦＰの赤色シフト変異体をコードする（Ｃｏｒｍａｃｋら， １９９６， Ｇｅｎｅ １７３：３３；Ｈａａｓら， １９９６， Ｃｕｒｒ． Ｂｉｏｌ． ６：３１５）。さらに、この増強ＧＦＰ（ＥＧＦＰ）の最大励起ピークは４８８ｎｍにあるので、４５０−５００ｎｍで発光するフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）光学系などの通常使用されるフィルターセットを用いて、ＧＦＰ蛍光を視覚化できる。ｐＥＧＦＰｌがトランスジェニックマウスのプロモーター分析のためのレポーター遺伝子として有用であることは実証された（Ｏｋａｂｅら， １９９７， ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ． ４０７：３１３）。別の実施形態においては、ＭＮ−ＣＡ９調節領域がルシフェラーゼレポーター遺伝子の上流にあるトランスジーンを含有するトランスジェニックマウスを使用する。
【００６２】
推定上のプロモーター断片を調製して（通常、プロモーター領域を含む８−１０ｋｂゲノムＤＮＡを含有する親ファージクローンから）、当業界で周知の方法を用いてクローニングすることができる。一実施形態においては、例えば、プロモーター断片をルシフェラーゼレポーターベクターのマルチクローニングサイト中にクローニングする。一実施形態においては、制限酵素を用いて調節領域断片を切り出し、レポーターベクター中に挿入する。しかし、この方法の実施可能性は、調節断片中の適当な制限酵素切断部位の利用可能性に依る。好ましい実施形態においては、所要のプロモーター断片は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ； Ｓａｉｋｉら， １９８８， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：４８７）により、適当な制限酵素切断部位を持つオリゴヌクレオチドプライマーを用いて増幅する。制限酵素切断に必要な配列を、増幅される調節断片にフランキングするフォワードおよびリバースプライマーの５’末端に含ませる。ＰＣＲ増幅後に、適当な末端をＰＣＲ産物の制限酵素消化によって作製する。次いで、いずれかの方法によって作製したプロモーター断片を、レポーターベクターのマルチクローニングサイト中に標準のクローニング方法（Ｓａｍｂｒｏｏｋら， １９８９， 前掲）に従ってライゲートする。トランスジェニック動物を作製する前に、構築物中のＰＣＲで作製したプロモーター断片のＤＮＡ配列を確認することが好ましい。得られるレポーター遺伝子構築物は、レポーター遺伝子のオープンリーディングフレーム、例えば、ＧＦＰまたはルシフェラーゼｃＤＮＡの上流に位置する推定上のプロモーター断片を含有するであろう。
【００６３】
好ましい実施形態においては、以下のプロトコルを用いる。５０〜１００ｐｇのレポーター遺伝子構築物を適当な制限酵素を用いて消化し、トランスジーン断片を遊離させる。制限酵素切断産物を、０．５μｇ／ｍｌエチジウムブロミドおよびＴＡＥバッファー（１ｘ：０．０４Ｍ Ｔｒｉ−酢酸、０．００１Ｍ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）を含有する１％（ｗ／ｖ）アガロースゲルで５〜６ Ｖ／ｃｍにて分離する。ＵＶトランスイルミネーターを用いて、好ましくはＤＮＡのニッキングを抑えるため長波長ＵＶランプを用いて、トランスジーンのバンドをサイズに基づいて位置決定し、そして所要のバンドを含有するゲル片を注意深く切り出す。ゲル切片と１ｍｌの０．５ ｘ ＴＡＥバッファーを、予め１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ ８．０で１０分間煮沸しておいた透析バッグに加えて（Ｓａｍｂｒｏｏｋら， １９８９、前掲）、その両端を閉じる。ゲル片の入った透析バッグを、０．５ ｘ ＴＡＥバッファーの入った水平型ゲル電気泳動槽内に沈め、５〜６ Ｖ／ｃｍにて４５分間、電気泳動にかける。泳動を停止する前に電気泳動槽内の電流を１分間逆転して、透析チューブ壁に付着しているであろうＤＮＡを遊離させる。電気溶出したＤＮＡを含有するＴＡＥバッファーを、透析バッグから新しいエッペンドルフチューブに回収する。ゲル片をＵＶトランスイルミネーター上で観察して、ＤＮＡの電気溶出が完全であることを確認することができる。
【００６４】
電気溶出したＤＮＡサンプルはさらに、Ｅｌｕｔｉｐ Ｄカラムを通過させて精製する。カラムのマトリックスは１〜２ｍｌの高塩バッファー（１．０Ｍ ＮａＣｌ、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ． Ｃｌ、１．０ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．５）を用いて前洗浄し、次いで５ｍｌの低塩バッファー（０．２Ｍ ＮａＣｌ、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ． Ｃｌ、１．０ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ ７．５）を用いて洗浄する。逆流しないように溶液をＥｌｕｔｉｐ Ｄカラムに適用するために、５ｍｌシリンジを用いる。電気溶出したＤＮＡを含有する溶液をゆっくりと供給する。カラムを２〜３ｍｌの低塩バッファーを用いて洗浄し、ＤＮＡを０．４ｍｌの高塩バッファー中に溶出させる。２倍容の冷９５％エタノールを加えてＤＮＡを沈降させる。微量遠心分離機で１４，０００ ｘ ｇにて１０分間遠心分離してＤＮＡを回収し、ＤＮＡペレットを破壊しないように注意深くアルコールを除去する。ペレットを少なくとも２回、７０％（ｖ／ｖ）エタノールを用いて洗浄し、そして乾燥する。残留塩とエタノールは発生中の胚に対して致命的であるので、洗浄と乾燥の工程が重要である。ＤＮＡをインジェクションバッファー（１０ｍＭ ＴＭ、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．５；Ｍｉｌｌｉ−Ｑ品質の水を用いて調製する）に再懸濁する。精製したトランスジーンＤＮＡ断片の濃度を、分光光度計を用いて光学密度をＡ２６０（５０μｇ／ｍｌ ＤＮＡに対してＡ２６０＝１）で測定することにより決定する。この方法で調製したＤＮＡはマウス受精卵中へのマイクロインジェクションに適している。
【００６５】
５．２．３　トランスジェニックマウスを用いる腫瘍特異的プロモーター分析
ＭＮ−ＣＡ９調節領域を用いて、発現、とりわけトランスジェニック動物におけるレポーターコード配列、相同遺伝子または異種遺伝子の発現、を指令することができる。限定されるものでないが、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、ブタ、マイクロブタ、ヤギ、ヒツジ、および非ヒト霊長類、例えばヒヒ、モンキーおよびチンパンジーを含む任意の種の動物を用いてトランスジェニック動物を作製することができる。本明細書で使用する用語「トランスジェニック」は、異なる種由来のＭＮ−ＣＡ９遺伝子配列を発現する動物（例えばＭＮ−ＣＡ９配列を発現するマウス）、ならびに遺伝子操作により内因性（すなわち同じ種の）ＭＮ−ＣＡ９配列を過剰発現するようになった動物または遺伝子操作により特定配列をノックアウトした動物を意味する。
【００６６】
一実施形態においては、本発明は、ＭＮ−ＣＡ９調節領域、またはその転写活性断片の制御下にあるレポーター遺伝子、治療的および／または毒性コード配列などのトランスジーンを全細胞中に保持するトランスジェニック動物、ならびに前記トランスジーンを全細胞ではなく一部の細胞中に保持する動物、すなわちモザイク動物を提供する。トランスジーンは、単一トランスジーンとしてまたはコンカテマー（例えば頭部−頭部直列または頭部−尾部直列）で、組み込むことができる。トランスジーンはまた、例えば、Ｌａｓｋｏら（１９９２， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８９：６２３２−６２３６）の教示に従い、選択的に特定の細胞型中に導入し、そこで活性化してもよい。トランスジーンを内因性の対応する遺伝子の染色体部位中に組み込むことが所望であれば、遺伝子ターゲッティングが好ましい。簡単に説明すると、そのような技術を使用するときは、内因性遺伝子と相同な複数のヌクレオチド配列を含有するベクターを、染色体配列との相同組換えにより組み込まれて内因性遺伝子のヌクレオチド配列の機能を破壊するように設計する。
【００６７】
当業界で周知の任意の技術を利用してＭＮ−ＣＡ９調節領域の制御下にあるトランスジーンを動物に導入し、トランスジェニック動物の創始者系統を作ることができる。そのような技術としては、限定されるものでないが、前核マイクロインジェクション（Ｈｏｐｐｅ ＆ Ｗａｇｎｅｒ， １９８９， 米国特許第４，８７３，１９１号）；静止期に誘導した培養胚性細胞、胎児細胞または成体細胞由来の核の、除核卵母細胞中への核導入（Ｃａｍｐｂｅｌｌら， １９９６， Ｎａｔｕｒｅ ３８０：６４−６６；Ｗｉｌｍｕｔら， Ｎａｔｕｒｅ ３８５：８１０−８１３）；生殖系列中へのレトロウイルス遺伝子導入（Ｖａｎ ｄｅｒ Ｐｕｔｔｅｎら， １９８５， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．， ＵＳＡ ８２：６１４８−６１５２）；胚幹細胞における遺伝子ターゲッティング（Ｔｈｏｍｐｓｏｎら， １９８９， Ｃｅｌｌ ６５：３１３−３２１）；胚のエレクトロポレーション（Ｌｏ， １９８３， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． ３１：１８０３−１８１４）；および精子媒介型遺伝子導入（Ｌａｖｉｔｒａｎｏら， １９８９， Ｃｅｌｌ ５７：７１７−７２３；Ｇｏｒｄｏｎ， １９８９， 「トランスジェニック動物（Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ａｎｉｍａｌｓ）」， Ｉｎｔｌ． Ｒｅｖ． Ｃｙｔｏｌ． １１５：１７１−２２９を参照）が挙げられる。
【００６８】
例えば、受精卵のマイクロインジェクションを行うために、調節領域、レポーター遺伝子およびポリアデニル化シグナルを含有する直鎖状ＤＮＡ断片（トランスジーン）をレポーター遺伝子構築物から切り出す。トランスジーンは当業界で周知の方法、例えば電気溶出法によってゲル精製することができる。ゲル断片の電気溶出後に、微量の不純物もさらにＥｌｕｔｉｐ Ｄカラムを通過させて除去する（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ＆ Ｓｃｈｕｅｌｌ， Ｄａｓｓｅｌ， Ｇｅｒｍａｎｙ）。
【００６９】
好ましい実施形態においては、精製したトランスジーン断片を、Ｂ６ ＣＢＡの雌から標準の方法（Ｈｏｇａｎ， １９８６， 「マウス胚の操作、研究室マニュアル（Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」． Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， ＮＹ）によって得た受精卵の雄性前核中にマイクロインジェクションする。マウスの分析は、複数の胚ステージにて一過性にて行うか、または発生段階を通してさらに成人動物においてトランスジーン発現のより詳細な分析を可能にする創始者系統を確立して行う。トランスジーンの存在は、ＰＣＲにより胎盤から（一過性個体の場合）または尾の切取片から（創始者個体の場合）精製したゲノムＤＮＡを用いて、Ｖｅｍｅｔら， Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． １９９３； ２２５：４３４−４５１の方法に従って分析する。好ましくは、ＰＣＲ反応は、１μｇのゲノムＤＮＡを含有する１００μｌ容量にて、０．２ｍＭ ｄＮＴＰｓ、２ｍＭ ＭｇＣｌ２、６００μＭのそれぞれのプライマー、および２．５ユニットのＴａｑポリメラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ， Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩ）を補充した１×反応バッファー中で、実施する。ＰＣＲの３０サイクルの各サイクルは、９４℃にて１分間の変性、５４℃にて１分間のアニーリング、および７２℃にて１分間の伸長からなる。次いで創始者マウスをＣ５７Ｂ１のパートナーと交配して、マウスのトランスジェニックＦ１系統を作製する。
【００７０】
５．３　スクリーニングアッセイ
腫瘍形成および／または癌の進行を妨害する化合物は、様々な癌における欠陥を標的とする治療を提供できる。そのような化合物を利用して様々な癌の発症または進行を妨害することができる。プロモーター活性を刺激または抑制する化合物も癌の症状を軽減するために使用することができる。
【００７１】
レポーター遺伝子と機能的に連結されたＭＮ−ＣＡ９調節領域、またはその断片を含有する、遺伝子操作した細胞、細胞系、癌細胞、および／またはトランスジェニック動物は、ＭＮ−ＣＡ９転写活性をモジュレートする薬剤をスクリーニングするための系として利用することができる。さらに、ＭＮ−ＣＡ９を含有するトランスジェニックマウスは、限定されるものでないが、子宮頚癌、腎細胞癌、ならびに胃および大腸癌を含む様々な癌を治療する新しい方法を、そのような障害の進行を阻止する薬物をターゲッティングすることにより開発するための、ｉｎ ｖｉｖｏおよびｉｎ ｖｉｔｒｏ両方の実験モデルを提供することができる。
【００７２】
本発明は、ＭＮ−ＣＡ９調節領域の活性をモジュレートする化合物を同定するように設計したスクリーニングアッセイを包含する。本発明は、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよび細胞に基づくアッセイ、ならびにトランスジェニック動物におけるｉｎ ｖｉｖｏアッセイを包含する。以下に記載するように、試験する化合物は、限定されるものでないが、オリゴヌクレオチド、ペプチド、タンパク質、小有機もしくは無機化合物、抗体などが挙げられる。
【００７３】
化合物の例は、例えば可溶性ペプチド（限定されるものでないが、Ｉｇを後ろに付けた融合タンパク質を含む）や、無作為ペプチドライブラリー（例えば、Ｌａｍ，ら， １９９１， Ｎａｔｕｒｅ ３５４：８２−８４；Ｈｏｕｇｈｔｅｎ，ら， １９９１， Ｎａｔｕｒｅ ３５４：８４−８６を参照）ならびにＤ−および／またはＬ−型アミノ酸からなるコンビナトリアル化学由来の分子ライブラリーのメンバーなどのペプチド、リンペプチド（限定されるものでないが、無作為または部分的に縮重した、定方向リンペプチドライブラリーのメンバーを含む；例えば、Ｓｏｎｇｙａｎｇら， １９９３， Ｃｅｌｌ ７２ ：７６７−７７８を参照）、抗体（限定されるものでないが、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、抗イディオタイプ抗体、キメラ抗体または一本鎖抗体、ならびにＦＡｂ、Ｆ（ａｂ’）２およびＦＡｂ発現ライブラリーフラグメント、さらにそれらのエピトープ結合フラグメントを含む）、ならびに小有機または無機分子が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００７４】
そのような化合物はさらに、化合物、特に、様々な癌の症状を軽減することが知られる薬物または薬物のクラスもしくはファミリーのメンバーを含んでなる。
【００７５】
そのような化合物は、限定されるものでないが、リチウム塩、カルバマゼピン、バルプロ酸、リゼルグ酸ジエチルアミド（ＬＳＤ）、ｐ−クロロフェニルアラニン、ｐ−プロピルドープアセトアミドジチオカルバマート誘導体（例えばＦＬＡ６３）などの抗うつ剤のファミリー；抗不安薬、例えばジアゼパム；モノアミンオキシダーゼ（ＭＡＯ）インヒビター、例えば、イプロニアジド、クロルジリン、フェネルジンおよびイソカルボキサジド；生体アミン摂取遮断薬、例えば、デシプラミン、イミプラミンおよびアミトリプチリンなどの三環系抗うつ剤；セロトニン再摂取インヒビター、例えば、フルオキセチン；フェノチアジン誘導体（例えば、クロルプロマジン（トラジン）およびトリフルオプロマジン）、ブチロフェノン（例えば、ハロペリドール（Ｈａｌｄｏｌ））、チオキサンテン誘導体（例えば、クロロプロチキセン）、およびジベンゾジアゼピン（例えばクロザピン）などの抗精神病薬；ベンゾジアゼピン；ドーパミン作動性アゴニストおよびアンタゴニスト、例えば、Ｌ−ＤＯＰＡ；コカイン、アンフェタミン、α−メチルチロシン、レセルピン、テトラベナジン、ベンゾトロピン、パルジリン；ノルアドレナリン作動性アゴニストおよびアンタゴニスト、例えばクロニジン、フェノキシベンザミン、フェントラミン、トロポロン；ニトロ血管拡張剤（例えばニトログリセリン、ニトロプルシドならびにＮＯ生成酵素）；ならびに増殖因子（例えば、ＶＥＧＦ、ＦＧＦ、アンギオポエチンおよびエンドスタチン）が挙げられる。
【００７６】
ある好ましい実施形態においては、異種遺伝子と機能しうる形で連結されたＭＮ−ＣＡ９調節領域を含有する、遺伝子操作した細胞、細胞系、または生殖細胞および／もしくは体細胞の一次培養系を利用して、配列特異的ＤＮＡ−タンパク質相互作用を阻害できる化合物をスクリーニングするためのアッセイ系を開発する。そのような方法においては、ＭＮ−ＣＡ９調節領域またはその転写活性断片の制御下で遺伝子を発現する細胞に、ある化合物を接触させ、遺伝子発現または遺伝子産物活性のレベルを測定し、そしてこのレベルをその化合物の不在下でその細胞によって生成される遺伝子発現または遺伝子産物活性のレベルと比較して、さらにもしその化合物の存在下で得たレベルがその化合物の不在下で得たレベルと異なれば、ＭＮ−ＣＡ９調節領域の発現をモジュレートできる化合物を同定したことになる。遺伝子発現レベルの変化は当業者が周知する多くの任意の方法によって生じさせればよく、例えばレポーター遺伝子活性のアッセイ、ｍＲＮＡ転写物についての細胞ライセートのアッセイ（例えばノーザンブロット分析による）、または細胞によって発現される遺伝子産物をアッセイするための当業界で周知の他の方法の使用によるものであってよい。
【００７７】
他の実施形態においては、顕微解剖および透照を利用することができる。これらの技術は、ＭＮ−ＣＡ９調節領域が駆動するレポーター遺伝子を含有するトランスジェニック動物の腫瘍細胞に対する推定上の薬物の効果をモニターするための迅速アッセイを提供する。この実施形態においては、試験薬剤を様々な方法によってトランスジェニック動物に送達する。試験薬剤を導入する方法は、経口、皮内、筋内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻腔内および乱切（例えば双叉針を用いて皮膚表層を突き通して掻く）または任意の他の標準的な薬物送達経路が挙げられる。腫瘍細胞に対するそのような試験化合物の効果は腫瘍細胞の顕微解剖および透照によって分析することができる。もしその化合物の存在下で観察されたかまたは測定されたレポーター遺伝子発現のレベルがその化合物の不在下で得たレベルと異なれば、ＭＮ−ＣＡ９調節領域の発現をモジュレートすることができる化合物を同定したことになる。
【００７８】
本発明の様々な実施形態においては、腫瘍関連障害のモジュレーターのスクリーニングに利用できる化合物は、ＭＮ−ＣＡ９調節領域結合能力を有することにより、医薬の候補となりうる、天然および／または合成の両方のペプチド、小分子（例えば、小分子またはペプチドのライブラリー）、細胞結合または可溶性分子、有機、非タンパク質分子ならびに組換え分子が挙げられる。
【００７９】
あるいは、タンパク質および化合物として、ＭＮ−ＣＡ９調節領域配列とｉｎ ｖｉｖｏで相互作用する内因性細胞構成成分が挙げられる。細胞ライセートまたは組織ホモジネートを、ＭＮ−ＣＡ９調節領域、またはその断片と結合するタンパク質または他の化合物についてスクリーニングしてもよい。そのような内因性成分は、医薬的および治療的介入の新しい標的を提供しうる。
【００８０】
一実施形態においては、ライブラリーをスクリーニングしてもよい。利用しうる多くのライブラリーが当業界で知られていて、例えば、ペプチドライブラリー、化学合成ライブラリー、組換えライブラリー（例えば、ファージディスプレイライブラリー）、およびｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳に基づくライブラリーがある。本発明の一実施形態においては、ペプチドライブラリーを利用してＭＮ−ＣＡ９と連結したレポーター発現アゴニストまたはアンタゴニストについてスクリーニングすることができる。無作為またはコンビナトリアルペプチドまたは非ペプチドライブラリーなどの多様性ライブラリーを、ＭＮ−ＣＡ９調節領域活性を特異的にモジュレートする分子についてスクリーニングしてもよい。固相支持体と結合したアミノ酸の全ての可能な組合せからなる無作為ペプチドライブラリーを用いて、ＭＮ−ＣＡ９調節領域活性を活性化または抑制できるペプチドを同定してもよい（Ｌａｍ， Ｋ． Ｓ．ら， １９９１， Ｎａｔｕｒｅ ３５４：８２−８４）。ペプチドライブラリーのスクリーニングは、ＭＮ−ＣＡ９の発現をプロモーター領域との相互作用によって刺激または抑制する医薬用薬剤の発見において治療上の価値がある。
【００８１】
化学合成ライブラリーの例は、Ｆｏｄｏｒら， １９９１， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５１：７６７−７７３；Ｈｏｕｇｈｔｅｎら， １９９１， Ｎａｔｕｒｅ ３５４：８４−８６；Ｌａｍら， １９９１， Ｎａｔｕｒｅ ３５４：８２−８４；Ｍｅｄｙｎｓｋｉ， １９９４， ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １２：７０９−７１０；Ｇａｌｌｏｐら， １９９４， Ｊ． Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３７ （９）：１２３３−１２５１；Ｏｈｌｍｅｙｅｒら， １９９３， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９０：１０９２２−１０９２６；Ｅｒｂら， １９９４， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９１：１１４２２−１１４２６；Ｈｏｕｇｈｔｅｎら， １９９２， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １３：４１２；Ｊａｙａｗｉｃｋｒｅｍｅら， １９９４， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９１：１６１４−１６１８；Ｓａｌｍｏｎら， １９９３， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９０：１１７０８−１１７１２；ＰＣＴ公開ＷＯ ９３／２０２４２；ならびにＢｒｅｎｎｅｒおよびＬｅｒｎｅｒ， １９９２， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８９：５３８１−５３８３に記載されている。
【００８２】
ファージディスプレイライブラリーの例は、ＳｃｏｔｔおよびＳｍｉｔｈ， １９９０， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：３８６−３９０；Ｄｅｖｌｉｎら， １９９０， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２４９：４０４−４０６；Ｃｈｒｉｓｔｉａｎ，ら， １９９２， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２２７：７１１−７１８；Ｌｅｎｓｔｒａ， １９９２， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈ． １５２：１４９−１５７；Ｋａｙら， １９９３， Ｇｅｎｅ １２８：５９−６５；ならびに１９９４年８月１８日付けＰＣＴ公開ＷＯ ９４／１８３１８に記載されている。
【００８３】
非ペプチドライブラリーの例としては、ベンゾジアゼピンライブラリー（例えば、Ｂｕｎｉｎら， １９９４， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９１：４７０８−４７１２を参照）を適合させて使用できる。ペプトイドライブラリー（Ｓｉｍｏｎら， １９９２， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８９：９３６７−９３７１）も使用することができる。利用しうるライブラリーの他の例として、ペプチドのアミド官能基をパーメチル化して化学的に変換したコンビナトリアルライブラリーを作製したライブラリーが、Ｏｓｔｒｅｓｈら（１９９４， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９１：１１１３８−１１１４２）に記載されている。
【００８４】
そのようなｉｎ ｖｉｔｒｏスクリーニングアッセイの特定の実施形態を以下に記載する。ＭＮ−ＣＡ９調節領域−レポーターベクターを用いてトランスジェニックマウスを作製し、そのマウスから、ＭＮ−ＣＡ９調節領域−レポーターベクター生殖細胞の一次培養系を確立する。１ウエル当たりほぼ１０，０００個の細胞を、細胞系に適した培地を使い、全容量１００μｌで、９６ウエルプレートにまく。ＭＮ−ＣＡ９遺伝子発現の候補インヒビターを細胞に加える。ＭＮ−ＣＡ９遺伝子活性化のインヒビターの作用は、ＭＮ−ＣＡ９調節領域によって駆動されるレポーター遺伝子の応答を測定することによって決定できる。このアッセイは、９６ウエルフォーマットで、化合物ライブラリーを、レポーター遺伝子活性を低下（または増加）するが細胞傷害性はない化合物について評価する高スループットスクリーニングモードに容易に設定することができる。６時間のインキュベーション後に、１００μｌ ＤＭＥＭ培地＋２．５％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を１．２５％最終血清濃度まで細胞に加え、これを合計２４時間（すなわち、さらに１８時間）インキュベートする。２４時間経過したらプレートをＰＢＳを用いて洗浄し、ブロットを乾燥し、−８０℃で凍結する。翌日プレートを解凍してレポーター活性の存在を分析する。
【００８５】
ｉｎ ｖｉｖｏスクリーニングアッセイの好ましい例においては、トランスジェニックマウスから誘導された腫瘍細胞を、通常のまたは他の所望の表現型をもつマウスに移植してもよい（Ｂｒｉｎｓｔｅｒら， １９９４， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９１：１１２９８−３０２；Ｏｇａｗａら， １９９７， Ｉｎｔ． Ｊ． Ｄｅｖ． Ｂｉｏｌ． ４１：１１１−１２）。次いでそのようなマウスを使用して、腫瘍関連疾患に対する化合物および他の様々な要因の効果を試験することができる。上記に掲げた化合物および薬剤に加えて、そのようなマウスを使用して、他の方法を用いて試験することが困難である要因または条件、例えば食餌効果、体内ｐＨ、温度などをアッセイすることができる。
【００８６】
ＭＮ−ＣＡ９調節領域活性を抑制または増強する化合物が一旦同定されると、次いでそれを動物に基づくアッセイで試験して、その化合物が、限定されるものでないが、子宮頚癌、腎細胞癌、ならびに胃および大腸癌を含む様々な癌の症状を軽減する薬物として作用する能力を示すかどうかを判定することができる。
【００８７】
本発明のアッセイは、最初、小規模で（すなわち、試験管内で）最適化し、次いで高スループットアッセイ用にスケールアップしてもよい。本発明のスクリーニングアッセイは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、すなわち試験管内で、精製した成分または細胞ライセートを用いて実施できる。本発明のスクリーニングアッセイはまた、培養中の細胞そのものでもまた動物モデルでも実施できる。本発明によれば、ＭＮ−ＣＡ９調節領域の活性を本明細書に記載のようにｉｎ ｖｉｔｒｏでモジュレートすることが示された試験化合物を、さらに培養細胞および動物モデルにおいてｉｎ ｖｉｖｏでアッセイして、その試験化合物がｉｎ ｖｉｖｏで類似の効果を有するかどうかを判定し、また様々な癌に対する試験化合物の効果を判定するであろう。
【００８８】
５．４　ＭＮ−ＣＡ９調節領域のヌクレオチドを治療に利用するための組成物と方法
ＭＮ−ＣＡ９ポリヌクレオチド、またはその転写活性断片は、ＭＮ−ＣＡ９、またはＭＮ−ＣＡ９調節領域と連結した異種遺伝子のレベルまたは発現を腫瘍特異的な方法で改変することによって改善し得る疾患、症状または障害を治療するために利用することができる。そのような治療処置の方法を本節に記載する。
【００８９】
ＭＮ−ＣＡ９調節領域は、遺伝子治療プロトコルにおいて組織特異的発現を達成するために使用することができる。そのような細胞が腫瘍細胞である場合、ＭＮ−ＣＡ９調節領域による細胞傷害性産物の誘導を、ＭＮ−ＣＡ９発現に必要なトランス作用因子を含有する腫瘍細胞に特異的に標的化する癌遺伝子治療の形で、利用することができる。このようにして、ＭＮ−ＣＡ９調節領域は、ＭＮ−ＣＡ９タンパク質を発現する様々な癌への遺伝子治療手法の送達経路として用いることができる。これらの癌の例は、限定されるものでないが、腎細胞癌、胃癌、大腸癌および子宮頚癌が挙げられる。さらに、本明細書に記載した発現構築物を用いて、アンチセンス、抗原またはアプタマーオリゴヌクレオチドを細胞に送達してもよい。リボザイムまたは一本鎖ＲＮＡを細胞中で発現させて目的の標的遺伝子の発現を抑制することもできる。これらのアンチセンスまたはリボザイム分子が標的とする遺伝子は細胞維持に必須な遺伝子産物をコードする遺伝子でなければならない。
【００９０】
本発明のＭＮ−ＣＡ９調節領域、およびその転写活性断片は、多様な目的、例えばＭＮ−ＣＡ９遺伝子発現をダウンレギュレーションするために、または、代わりに、異種遺伝子の腫瘍特異的、ステージ特異的発現を達成するために使用することができる。
【００９１】
一実施形態においては、例えば、ＭＮ−ＣＡ９遺伝子の発現を特異的にダウンレギュレートするように、内因性ＭＮ−ＣＡ９調節領域を標的化することができる。例えば、調節領域に相補的なオリゴヌクレオチドを設計して細胞に送達してもよい。そのようなオリゴヌクレオチドは調節配列とアニーリングして転写活性化を抑制する。あるいは、調節配列またはその部分を、細胞に飽和濃度で送達し、転写因子結合と競合させてもよい。遺伝子治療法の全般的なレビューについては、Ｇｏｌｄｓｐｉｅｌら， １９９３， Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｈａｒｍａｃｙ １２：４８８−５０５；ＷｕおよびＷｕ， １９９１， Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ ３：８７−９５；Ｔｏｌｓｔｏｓｈｅｖ， １９９３， Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． Ｔｏｘｉｃｏｌ． ３２：５７３−５９６；Ｍｕｌｌｉｇａｎ， １９９３， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６０：９２６−９３２；ならびにＭｏｒｇａｎおよびＡｎｄｅｒｓｏｎ， １９９３， Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ６２：１９１−２１７；Ｍａｙ， １９９３， ＴＩＢＴＥＣＨ １１：１５５−２１５を参照すること。組換えＤＮＡ技術の分野で公知の利用しうる方法は、Ａｕｓｕｂｅｌら編， １９９３， 「分子生物学の最新プロトコル（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）」， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， ＮＹ；およびＫｒｉｅｇｌｅｒ， １９９０， 「遺伝子導入と発現、研究室マニュアル（Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」， Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ， ＮＹ、に記載されている。
【００９２】
他の実施形態においては、様々な癌を改善するための遺伝子治療法が提供される。ＭＮ−ＣＡ９調節領域配列を薬物または毒素の腫瘍特異的発現を駆動するのに利用して、腫瘍に導入する。その方法は、薬物または毒素遺伝子と機能的に結合したＭＮ−ＣＡ９調節領域配列を腫瘍に導入することを含んでなる。
【００９３】
さらに他の実施形態においては、本発明は、癌または他の増殖性障害を治療するための遺伝子治療法を提供する。ＭＮ−ＣＡ９調節領域を使用して、患者の腫瘍細胞中で１以上のタンパク質の発現を特異的に指令する。そのようなタンパク質は、例えば、腫瘍サプレッサー遺伝子、チミジンキナーゼ（アシクロビルと組合せて使用する）、毒素、またはアポトーシス経路に関わるタンパク質などの細胞死滅に関わるタンパク質である。
【００９４】
一実施形態においては、本発明は、毒性遺伝子治療に有用であるＭＮ−ＣＡ９プロモーターを含んでなる治療薬を提供する。この方法は、真核生物性送達ベクターと毒性遺伝子とを含む。好ましい実施形態においては、そのベクターはアデノウイルス（Ａｄ）であり、その遺伝子はチミジンキナーゼ（ＴＫ）である。従って、治療薬は、Ａｄ−ＭＮ−ＣＡ９−ＴＫの式で表されるが、実際には本明細書に含まれる新規の概念は、異種コード配列の癌特異的発現の駆動力としてのＭＮ−ＣＡ９プロモーターである。
【００９５】
本発明のベクターを調製するため、目的の翻訳または転写産物をコードするＤＮＡを、大規模なＤＮＡ複製を提供する様々なベクター系中に遺伝子組換えしてもよい。これらのベクターは、癌細胞が取りこんだＤＮＡ配列の転写および／または翻訳を指令するために必要なエレメントを含有するように設計することができる。
【００９６】
使用しうるベクターとしては、限定されるものでないが、組換えバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡまたはコスミドＤＮＡに由来するものが挙げられる。例えば、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ １９／１８、ｐＵＣ １１８、１１９およびＭ１３ ｍｐ系のベクターなどのプラスミドベクターを使用することができる。バクテリオファージベクターとしては、λｇｔｌＯ、λｇｔ１１、λｇｔｌ８−２３、λＺＡＰ／ＲおよびＥＭＢＬ系のバクテリオファージベクターが挙げられる。使用しうるコスミドベクターとしては、限定されるものでないが、ｐＪＢ８、ｐＣＶ １０３、ｐＣＶ １０７、ｐＣＶ １０８、ｐＴＭ、ｐＭＣＳ、ｐＮＮＬ、ｐＨＳＧ２７４、ＣＯＳ２０２、ＣＯＳ２０３、ｐＷＥ１５、ｐＷＥ１６およびｃｈａｒｏｍｉｄ ９系のベクターが挙げられる。ＳＰ６ベクターなどのＲＮＡのｉｎ ｖｉｔｒｏ転写を可能にするベクターも、ウイルスベクター中に組み込みうる大量のＲＮＡを生産するために使用できる。
【００９７】
あるいは、限定されるものでないが、ヘルペスウイルス、レトロウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルスまたはウシパピローマウイルスなどのウイルス由来のものを含む組換え複製可能または不能ウイルスベクターを作製してもよい。組み込みベクターを使用することはできるが、疾患に関係のない修復および再生のためには、複数世代にわたり娘細胞へ遺伝子産物を伝達しない非組み込み系が好ましい。この方法では、遺伝子産物は修復プロセスの間は発現し、そしてその遺伝子が子孫世代で希釈されるにつれて発現遺伝子産物の量が減少する。
【００９８】
治療用遺伝子発現を駆動するために組織特異的プロモーターを使用すると、ウイルス媒介型遺伝子送達が正常細胞に感染したときに、近隣正常細胞に対する治療遺伝子の毒性効果をさらに低下しうる。これは、全身投与を用いて治療用ベクターを身体全体に送達するが、トランスジーン発現を限られた特定数の細胞型について維持しうるような疾患において、特に重要である。さらに、ＴＧＦ−βなどの多くの骨増殖因子は多面的な作用を有するので、もし増殖因子遺伝子が全細胞にて発現されると、恐らく多数の有害な副作用が現れるであろう。
【００９９】
複数の事例では、プロモーターエレメントは構成または誘導プロモーターであって、目的の遺伝子の高レベルまたは調節された発現を指令する適当な条件下で使用することができる。構成プロモーターの制御下の遺伝子発現は、遺伝子発現を誘導する特異的基質の存在が不要であって、細胞増殖の全ての条件下で起こりうる。対照的に、誘導プロモーターによって制御される遺伝子の発現は、誘導薬剤の存在または不在に応答する。例えば、細胞を治療用の誘導性トランスジーンを用いて安定的にトランスフェクトすると、その発現は個体の全生存期間にわたって制御されうる。
【０１００】
特定の開始シグナルも、挿入されたタンパク質コード領域の十分な翻訳のために必要である。これらのシグナルは、ＡＴＧ開始コドンと隣接配列とを含む。開始コドンと隣接配列を含む全コード配列を適当な発現ベクターに挿入する場合、さらなる翻訳制御シグナルは必要でない。しかし、コード配列の部分だけを挿入する場合には、ＡＴＧ開始コドンを含む外因性翻訳制御シグナルを与えなければならない。さらに、開始コドンは、インサート全体の翻訳を保証するために、タンパク質コード配列のリーディングフレームと一致しなければならない。これらの外因性翻訳制御シグナルおよび開始コドンは、様々な起源の、天然および合成両方のものであってよい。発現の効率と制御は、転写減衰配列、エンハンサーエレメントなどを組み込むことによって増強できる。
【０１０１】
本発明の他の実施形態においては、治療薬を腫瘍へ送達することを含んでなる癌または他の増殖性障害を治療する方法が提供される。治療薬は、ＭＮ−ＣＡ９プロモーターが駆動する毒性チミジンキナーゼ（Ｔｋ）を含有する組換えアデノウイルスベクター（Ａｄ）を含む。本発明のさらなる態様は、限定されるものでないが、アシクロビル（ＡｃＶ）などの適当なプロドラッグを加えてＴｋの発現を調節する方法を提供する。ＭＮ−ＣＡ９プロモーターが駆動する毒性遺伝子治療を含有する治療薬は、適当なプロドラッグの存在のもとで、限定されるものでないが、子宮頚癌、腎細胞癌、ならびに胃および大腸癌を含む癌に投与することができる。
【０１０２】
さらに他の実施形態においては、ＭＮ−ＣＡ９調節領域は、免疫調節機能をもつ様々な遺伝子に対するもの、例えばインターロイキン１〜１５、特に例えばＩＬ２、ＩＬ１２、γインターフェロン、腫瘍壊死因子、ＧＭＣＳＦなどのサイトカインに対するもの、および／または他の遺伝子、例えば、明細書ＷＯ８８／００９７１ （ＣＳＩＲＯ， Ａｕｓｔｒａｌｉａｎ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ： Ｒａｍｓｈａｗら）およびＷＯ９４／１６７１６ （Ｖｉｒｏｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｒｐ； Ｐａｏｌｅｔｔｉら）に記述された遺伝子に対してコードするものであってもよい。
【０１０３】
また、以下の遺伝子を本発明のＭＮ−ＣＡ９調節領域にコードしてもよい：インターフェロンα、βまたはγ；腫瘍壊死因子；顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）に対する遺伝子、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、好中球活性化タンパク質ＮＡＰなどのケモカイン、マクロファージ化学遊走物質および活性化因子ＭＣＡＦ、ＲＡＮＴＥＳ、マクロファージ炎症性ペプチドＭＩＰ−１ａおよびＭＩＰ−１ｂ、補体成分およびそれらの受容体、８７．１、８７．２、ＩＣＡＭ−１．２もしくは３などのアクセサリー分子、またはサイトカイン受容体に対する遺伝子。２以上の免疫調節タンパク質をコードするヌクレオチド配列を挿入する場合、それらは２以上のサイトカインを含んでいてもまたはサイトカインとアクセサリー分子の組合せであってもよい。
【０１０４】
５．４．１　調節、アンチセンス、リボザイムおよび三重らせん手法
別の実施形態においては、腫瘍細胞に関わる症状、障害または疾患の症候は、ＭＮ−ＣＡ９調節領域発現のレベルを低下する周知のアンチセンス、遺伝子「ノックアウト」、リボザイムおよび／または三重らせん（ｔｒｉｐｌｅ ｈｅｌｉｘ）方法を用いてＭＮ−ＣＡ９調節領域活性のレベルを低下させることによって、改善することができる。様々な癌および関連障害の症候を改善する能力を含めた、ＭＮ−ＣＡ９調節領域の活性、発現または合成をモジュレートする能力を示すことができる化合物には、アンチセンス、リボザイムおよび三重らせん分子がある。そのような分子を設計して、無傷の、または適当な場合、突然変異したＭＮ−ＣＡ９調節領域活性を低下また抑制することができる。そのような分子の生産および使用についての技術は当業者には周知である。
【０１０５】
アンチセンスＲＮＡおよびＤＮＡ分子は、ターゲティングされるｍＲＮＡとハイブリダイズし、タンパク質翻訳を妨げることによって、ｍＲＮＡの翻訳を直接ブロックするように作用する。アンチセンス手法は、標的遺伝子ｍＲＮＡと相補的であるオリゴヌクレオチドの設計を含む。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、相補的標的遺伝子ｍＲＮＡ転写物と結合して翻訳を妨げるだろう。絶対的相補性は、好ましいが、必要ではない。
【０１０６】
本明細書で参照する、ＲＮＡの部分と「相補的」な配列は、ＲＮＡとハイブリダイズして安定な二重らせんを形成しうるのに十分な相補性を有する配列を意味し；二本鎖アンチセンス核酸の場合には、従って二重らせんＤＮＡの一本鎖を試験しても、または三重らせん形成をアッセイしてもよい。ハイブリダイズする能力は、アンチセンス核酸の相補性の程度と長さの両方に依存しうる。一般的に、ハイブリダイズする核酸が長いほど、それが含有しうるＲＮＡとの塩基ミスマッチが大きくてもなお安定な二重らせん（または場合によって三重らせん）を形成しうる。当業者であれば、ハイブリダイズした複合体の融点を決定する標準的方法を用いて、許容しうるミスマッチの程度を確認することができる。
【０１０７】
一実施形態においては、目的の遺伝子の非コード領域と相補的なオリゴヌクレオチドを、内因性ｍＲＮＡの翻訳を抑制するアンチセンス手法に用いることができる。アンチセンス核酸は、長さで少なくとも６ヌクレオチドであるべきであって、好ましくは長さで６〜約５０ヌクレオチドの範囲のオリゴヌクレオチドである。特定の態様においては、オリゴヌクレオチドは少なくとも１０ヌクレオチド、少なくとも１７ヌクレオチド、少なくとも２５ヌクレオチドまたは少なくとも５０ヌクレオチドである。
【０１０８】
標的配列の選択に関わらず、ｉｎ ｖｉｔｒｏ研究では最初にアンチセンスオリゴヌクレオチドの標的遺伝子発現を抑制する能力の定量を実施することが好ましい。これらの研究は、アンチセンス遺伝子抑制とオリゴヌクレオチドの非特異的な生物学的効果とを識別する対照を使用することが好ましい。また、これらの研究は、標的ＲＮＡまたはタンパク質のレベルを内部対照ＲＮＡまたはタンパク質のレベルと比較することも好ましい。さらに、アンチセンスオリゴヌクレオチドを用いて得た結果を、対照オリゴヌクレオチドを用いて得た結果と比較することも想定している。対照オリゴヌクレオチドは試験オリゴヌクレオチドとほぼ同じ長さであってかつオリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列は標的配列と特異的ハイブリダイゼーションを妨げるために必要な程度だけアンチセンス配列と異なることが好ましい。
【０１０９】
オリゴヌクレオチドは、ＤＮＡまたはＲＮＡまたはキメラ混合物または誘導体またはそれらの改変バージョンであって、一本鎖もしくは二本鎖であってもよい。オリゴヌクレオチドは塩基部分、糖部分、またはリン酸主鎖において、例えば分子の安定性、ハイブリダイゼーションなどを改善するために改変してもよい。オリゴヌクレオチドは、ペプチド（例えば、ｉｎ ｖｉｖｏで宿主細胞受容体をターゲティングするために）、または細胞膜（例えば、Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら， １９８９， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ８６：６５５３−６５５６；Ｌｅｍａｉｔｒｅら， １９８７， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ８４：６４８−６５２；１９８８年１２月１５日公開されたＰＣＴ公開第Ｗ０８８／０９８１０号を参照）もしくは血液脳関門（例えば、１９８８年４月２５日公開されたＰＣＴ公開第Ｗ０８９／１０１３４号を参照）を横切る輸送を容易にする薬剤、ハイブリダイゼーションで引き起こされる切断剤（例えば、Ｋｒｏｌら， １９８８， ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ６：９５８−９７６を参照）またはインターカレート剤（ｉｎｔｅｒｃａｌａｔｉｎｇ ａｇｅｎｔ）（例えば、Ｚｏｎ， １９８８， Ｐｈａｒｍ． Ｒｅｓ． ５：５３９−５４９を参照）などの他の付加グループを含んでもよい。この目的で、オリゴヌクレオチドを別の分子、例えばペプチド、ハイブリダイゼーションで引き起こされる架橋剤、輸送剤、ハイブリダイゼーションで引き起こされる切断剤などとコンジュゲートしてもよい。
【０１１０】
アンチセンスオリゴヌクレオチドは少なくとも１つの改変塩基部分を含んでなってもよく、前記改変塩基部分は、限定されるものでないが、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４−アセチルシトシン、５−（カルボキシヒドロキシルメチル）ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、β−Ｄ−ガラクトシルキューオシン（ｇａｌａｃｔｏｓｙｌｑｕｅｏｓｉｎｅ）、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−アデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、β−Ｄ−マンノシルキューオシン、５’−メチキシカルボキシメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、ワイブトキソシン、シュードウラシル、キューオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、５−メチル−２−チオウラシル、３−（３−アミノ−３−Ｎ−２−カルボキシプロピル）ウラシル、（ａｃｐ３）ｗ、および２，６−ジアミノプリンを含む群から選択される。
【０１１１】
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、また少なくとも１つの改変糖部分を含んでなってもよく、前記改変糖部分は、限定されるものでないが、アラビノース、２−フルオロアラビノース、キシルロース、およびヘキソースを含む群から選択される。
【０１１２】
さらに別の実施形態においては、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの改変リン酸主鎖を含んでなり、前記改変リン酸主鎖は、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホルアミドチオエート、ホスホルアミデート、ホスホルジアミデート、メチルホスホネート、アルキルホスホトリエステル、およびホルムアセタールまたはそれらの類似体からなる群から選択される。
【０１１３】
さらに別の実施形態においては、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、α−アノマーのオリゴヌクレオチドである。α−アノマーのオリゴヌクレオチドは、通常のβ−ユニットとは逆に、両鎖がお互いに平行して走ることを特徴とする、相補的ＲＮＡとの特異的二本鎖ハイブリッドを形成する（Ｇａｕｔｉｅｒら， １９８７， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １５：６６２５−６６４１）。オリゴヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド（Ｉｎｏｕｅら， １９８７， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １５：６１３１−６１４８）、またはキメラＲＮＡ−ＤＮＡ類似体（Ｉｎｏｕｅら， １９８７， ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ． ２１５：３２７−３３０）である。
【０１１４】
本発明のオリゴヌクレオチドは、当業界で公知の標準的方法、例えば自動ＤＮＡ合成器（例えばＢｉｏｓｅａｒｃｈ、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓなどから市販されているもの）を用いて合成することができる。例えば、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは、Ｓｔｅｉｎら （１９８８， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １６：３２０９）の方法によって合成できるし、メチルホスホネートオリゴヌクレオチドは制御した多孔質ガラスポリマー支持体などを用いて調製できる（Ｓａｒｉｎら， １９８８， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ． Ｓ． Ａ． ８５：７４４８−７４５１）。
【０１１５】
標的遺伝子コード領域配列と相補的なアンチセンスヌクレオチドを用いてもよいが、転写した未翻訳領域と相補的なアンチセンスヌクレオチドが最も好ましい。
【０１１６】
アンチセンス分子は、標的遺伝子をｉｎ ｖｉｖｏで発現する細胞に送達されるべきである。アンチセンスＤＮＡまたはＲＮＡを細胞へ送達する多数の方法が開発されている；例えば、アンチセンス分子を組織部位に直接注入することができるし、または所望の細胞をターゲティングするよう設計して改変したアンチセンス分子（例えば、標的細胞表面上に発現された受容体または抗原と特異的に結合するペプチドまたは抗体に連結したアンチセンス）を全身に投与することができる。
【０１１７】
内因性ｍＲＮＡの翻訳を抑制するのに十分なアンチセンスの細胞内濃度を得るための好ましい手法は、アンチセンスオリゴヌクレオチドを強力なｐｏｌ ＩＩＩまたはｐｏｌ ＩＩプロモーターの制御下に配置した組換えＤＮＡ構築物を使用する。そのような構築物を用いて患者の標的細胞をトランスフェクトすると、内因性標的遺伝子転写物と相補的塩基対を形成しうるのに十分な量の一本鎖ＲＮＡの転写が行われ、それによって標的遺伝子ｍＲＮＡの翻訳が妨げられるだろう。例えば、ベクターを導入し、例えば、細胞に取込まれ、アンチセンスＲＮＡの転写を指令することができる。そのようなベクターは、転写されて所望のアンチセンスＲＮＡを産生し得る限り、エピソームとして留まるかまたは染色体に組み込まれてもよい。そのようなベクターは、当業界の標準的な組換えＤＮＡ技術の方法によって構築できる。ベクターは、哺乳類細胞における複製と発現に用いられるプラスミド、ウイルス、または当業界で知られる他のベクターであってもよい。アンチセンスＲＮＡをコードする配列の発現は、哺乳類、好ましくはヒトの細胞で作用することが当業界で知られるいずれのプロモーターによってもよい。そのようなプロモーターは誘導性または構成的であってよい。そのようなプロモーターとしては、限定されるものでないが：ＳＶ４０初期プロモーター領域（ＢｅｒｎｏｉｓｔおよびＣｈａｍｂｏｎ， １９８１， Ｎａｔｕｒｅ ２９０：３０４−３１０）、ラウス肉腫ウイルスの３’長末端反復配列に含有されるプロモーター（Ｙａｍａｍｏｔｏら， １９８０， Ｃｅｌｌ ２２ ：７８７−７９７）、ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター（Ｗａｇｎｅｒら， １９８１， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ７８：１４４１−１４４５）、メタロチオネイン遺伝子の調節配列（Ｂｒｉｎｓｔｅｒら， １９８２， Ｎａｔｕｒｅ ２９６：３９−４２）などが挙げられる。いずれの型のプラスミド、コスミド、ＹＡＣまたはウイルスベクターを用いて、組織部位中に直接導入しうる組換えＤＮＡ構築物を調製してもよい。あるいは、所望の組織を選択的に感染するウイルスベクターを使用してもよく、その場合、投与は別の経路によって（例えば、静脈内投与、経口投与などを介して全身に）達成してもよい。
【０１１８】
また触媒作用で標的遺伝子ｍＲＮＡ転写物を切断するように設計したリボザイム分子も、標的遺伝子ｍＲＮＡの翻訳、従って標的遺伝子産物の発現を妨げるために使用することができる（例えば、１９９０年１０月４日に公開されたＰＣＴ国際公開Ｗ０９０／１１３６４；Ｓａｒｖｅｒら， １９９０， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４７，１２２２−１２２５を参照）。
【０１１９】
リボザイムは、ＲＮＡの特異的切断を触媒することができる酵素性ＲＮＡ分子である（概説については、Ｒｏｓｓｉ， １９９４， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｂｉｏｌｏｇｙ ４：４６９−４７１を参照）。リボザイム作用の機構は、リボザイム分子と相補的標的ＲＮＡとの配列特異的ハイブリダイゼーション、次いで起こるエンドヌクレオライティック（ｅｎｄｏｎｕｃｌｅｏｌｙｔｉｃ）切断事象を含む。リボザイム分子の組成は、標的遺伝子ｍＲＮＡと相補的な１以上の配列を含まねばならないし、かつｍＲＮＡ切断に役割を果たす周知の触媒配列を含まねばならない。この配列については、例えば、本明細書に参照によりその全体が組み入れられる米国特許第５，０９３，２４６号を参照すること。
【０１２０】
部位特異的認識配列でｍＲＮＡを切断するリボザイムを使用して標的遺伝子ｍＲＮＡを破壊できるが、ハンマーヘッドリボザイム（ｈａｍｍｅｒｈｅａｄ ｒｉｂｏｚｙｍｅ）の使用が好ましい。ハンマーヘッドリボザイムは、標的ｍＲＮＡと相補的な塩基対を形成するフランキング領域によって指令される位置でｍＲＮＡを切断する。唯一の要件は、標的ｍＲＮＡが次の２塩基の配列：５’−ＵＧ−３’を有することである。ハンマーヘッドリボザイムの構築と産生は当業界では周知であり、Ｍｙｅｒｓ， １９９５， 「分子生物学とバイオテクノロジー：広範な机上参考書（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ： Ａ Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｄｅｓｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ）」， ＶＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，（特にｐ８３３、図４を参照）ならびに本明細書に参照によりその全体が組み入れられるＨａｓｅｌｏｆｆおよびＧｅｒｌａｃｈ， １９８８， Ｎａｔｕｒｅ， ３３４：５８５−５９１にさらに詳しく記載されている。
【０１２１】
好ましくは、リボザイムは、切断認識部位が標的遺伝子ｍＲＮＡの５’末端近傍に位置する、すなわち効率を増加しかつ非機能性ｍＲＮＡ転写物の細胞内蓄積を最小化するように、遺伝子操作する。
【０１２２】
本発明のリボザイムはまた、天然にテトラヒメナ・テルモフィラ（Ｔｅｔｒａｈｙｍｅｎａ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）に存在し（ＩＶＳ、またはＬ−１９ ＩＶＳ ＲＮＡとして知られる）かつＴｈｏｍａｓ Ｃｅｃｈおよび共同研究者によって広範に記載されているもの（Ｚａｕｇら， １９８４， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２２４：５７４−５７８；ＺａｕｇおよびＣｅｃｈ， １９８６， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２３１：４７０−４７５；Ｚａｕｇら， １９８６， Ｎａｔｕｒｅ， ３２４：４２９−４３３；Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐａｔｅｎｔｓ Ｉｎｃ．による公開国際特許出願第ＷＯ８８／０４３００号；ＢｅｅｎおよびＣｅｃｈ， １９８６， Ｃｅｌｌ， ４７：２０７−２１６）などのＲＮＡエンドリボヌクレアーゼ（以後、「Ｃｅｃｈ型リボザイム」と呼ぶ）も含む。Ｃｅｃｈ型リボザイムは、標的ＲＮＡ配列とハイブリダイズして次いで標的ＲＮＡの切断が起こる８塩基対活性部位を有する。本発明は、標的遺伝子に存在する８塩基対活性部位配列をターゲティングするこれらのＣｅｃｈ型リボザイムを包含する。
【０１２３】
アンチセンス手法の場合のように、リボザイムは、改変オリゴヌクレオチド（例えば、安定性の改善、ターゲッティングなどのために）から成ってもよく、かつ標的遺伝子をｉｎ ｖｉｖｏで発現する細胞に送達されるべきである。送達の好ましい方法は、強力な構成的ｐｏｌ ＩＩＩまたはｐｏｌ ＩＩプロモーターの制御下のリボザイムを「コードする」ＤＮＡ構築物を用いて、トランスフェクトした細胞に内因性標的遺伝子メッセージを破壊し、翻訳を抑制させるのに十分な量のリボザイムを産生させるようにすることを含む。リボザイムはアンチセンス分子と異なった触媒作用であるので、効率のためにより低い細胞内濃度が必要である。
【０１２４】
内因性標的遺伝子発現はまた、ターゲティング相同的組換えを用いて標的遺伝子またはそのプロモーターを不活化するかまたは「ノックアウトする」ことによって低下させることもできる（例えば、それぞれが本明細書に参照によりその全体が組み入れられるＳｍｉｔｈｉｅｓら， １９８５， Ｎａｔｕｒｅ ３１７ ：２３０−２３４；ＴｈｏｍａｓおよびＣａｐｅｃｃｈｉ， １９８７， Ｃｅｌｌ ５１：５０３−５１２；Ｔｈｏｍｐｓｏｎら， １９８９， Ｃｅｌｌ ５ ：３１３−３２１を参照）。例えば、内因性標的遺伝子（標的遺伝子のコード領域または調節領域）と相同的なＤＮＡがフランキングする突然変異体、非機能性標的遺伝子（または完全に無関係なＤＮＡ配列）を用いて、選択マーカーおよび／もしくは陰性選択マーカーを伴ってまたは伴わずに、標的遺伝子をｉｎ ｖｉｖｏで発現する細胞をトランスフェクトすることができる。ターゲティング相同的組換えを介するＤＮＡ構築物の挿入は、標的遺伝子の不活化をもたらす。そのような手法は、ＥＳ（胚幹）細胞に対する改変を用いて不活性な標的遺伝子をもつ動物子孫を生成できる農学分野において特に適当である（例えば、ＴｈｏｍａｓおよびＣａｐｅｃｃｈｉ， １９８７、ならびにＴｈｏｍｐｓｏｎ， １９８９， 前掲を参照）。しかしこの手法は、組換えＤＮＡ構築物を直接投与するかまたは適当なウイルスベクターを用いてｉｎ ｖｉｖｏで所要部位にターゲティングさせるのであれば、ヒトにおける使用に適合させることができる。
【０１２５】
あるいは、内因性標的遺伝子発現は、標的遺伝子の調節領域（すなわち、標的遺伝子プロモーターおよび／またはエンハンサー）と相補的なデオキシリボヌクレオチド配列をターゲティングして三重らせん構造体を形成し、身体の標的細胞における標的遺伝子の転写を妨げることによって低下させることができる（一般的に、Ｈｅｌｅｎｅ， １９９１， Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓ．， ６（６）：５６９−５８４；Ｈｅｌｅｎｅら， １９９２， Ａｎｎ． Ｎ．Ｙ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．， ６６０：２７−３６；およびＭａｈｅｒ， １９９２， Ｂｉｏａｓｓａｙｓ １４（１２）：８０７−８１５を参照）。
【０１２６】
転写抑制のための三重らせん形成に使用する核酸分子は、一本鎖であって、かつデオキシヌクレオチドから成るべきである。これらのオリゴヌクレオチドの塩基組成は、一般的に二重らせんの１つの鎖に存在するプリンまたはピリミジンのいずれかのかなり大きなストレッチ（ｓｔｒｅｔｃｈ）を要求するフーグスティーン（Ｈｏｏｇｓｔｅｅｎ）型塩基対合規則を介する三重らせん形成を促進するように設計しなければならない。ヌクレオチド配列はピリミジンに基づくものであってもよく、その場合は、得られる三重らせんの３本の結合鎖にわたってＴＡＴおよびＣＧＣ＋トリプレットを生じうる。ピリミジン−リッチ分子は、二重らせんの一本鎖のプリン−リッチ領域に対してその鎖と平行な方向に塩基相補性を与える。さらに、プリン−リッチである、例えば、Ｇ残基のストレッチを含有する核酸分子を選んでもよい。これらの分子は、ＧＣ対の豊富なＤＮＡ二重らせんと三重らせんを形成し得て、ここで、プリン残基の大多数はターゲティングされる二重らせんの一本鎖上に配置されて、三重らせんの３本の鎖にわたってＧＧＣトリプレットを生じる。
【０１２７】
あるいは、三重らせん形成のためにターゲティングされうる潜在配列を、いわゆる「スイッチバック」核酸分子を作製することによって増加してもよい。スイッチバック分子は、交互に５’−３’、３’−５’というやり方で合成され、それらは二重らせんの第１の一本鎖と次いで他の鎖と塩基対を形成するので、二重らせんの一本鎖に存在すべきプリンまたはピリミジンのいずれかのかなり大きなストレッチの必要性をなくする。
【０１２８】
本明細書に記載したアンチセンス、リボザイム、および／または三重らせん分子を使って突然変異遺伝子発現を抑制する場合、この技術は正常な標的遺伝子対立遺伝子によって産生されるｍＲＮＡの転写（三重らせん）および／または翻訳（アンチセンス、リボザイム）を効率的に低下または抑制するので、存在する正常な標的遺伝子産物の濃度が正常な表現型に必要とされるものより低くなる可能性を生じうる。そのような場合、標的遺伝子活性の実質的に正常なレベルが維持されることを確実にするために、従って、正常な標的遺伝子活性を示す標的遺伝子ポリペプチドをコードしかつ発現する核酸分子を、以下の第５．４．２節に記載されるような遺伝子治療法を介して、どのようなアンチセンス、リボザイム、または三重らせん処置を使用しても影響されやすい配列を含有しない細胞に導入することができる。あるいは、標的遺伝子が細胞外タンパク質をコードする場合、標的遺伝子活性の必要なレベルを維持するために正常な標的遺伝子タンパク質を同時投与することが好ましい場合がある。
【０１２９】
本発明のアンチセンスＲＮＡおよびＤＮＡ、リボザイムおよび三重らせん分子は、以上考察したように、ＤＮＡおよびＲＮＡ分子を合成するための当業界で知られるいずれの方法によって調製してもよい。これらの方法としては、例えば固相ホスホロアミダイト化学合成などの、当業界で周知であるオリゴデオキシリボヌクレオチドおよびオリゴリボヌクレオチドを化学合成する技術が挙げられる。あるいは、ＲＮＡ分子は、アンチセンスＲＮＡ分子をコードするＤＮＡ配列のｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏでの転写によって生成することができる。そのようなＤＮＡ配列は、Ｔ７またはＳＰ６ポリメラーゼプロモーターなどの好適なＲＮＡポリメラーゼプロモーターを組み込む広く様々なベクター中に組み込んでもよい。あるいは、使用するプロモーターに依存してアンチセンスＲＮＡを構成的にまたは誘導的に合成するアンチセンスｃＤＮＡ構築物を、細胞系に安定して導入してもよい。
【０１３０】
５．４．２　遺伝子置換治療
第５．１節に上記した本発明の核酸配列を用いて、組換え核酸配列を細胞に導入しかつ前記配列を受容細胞において発現させることができる。そのような技術は、例えば、細胞のマーキングにまたは様々な癌および関連障害の治療に用いることができる。そのような治療は遺伝子置換治療の形態であってよい。特に、正常な遺伝子の１以上のコピーまたは正常な遺伝子機能を示す遺伝子産物の産生を指令する遺伝子の一部分を患者内の適当な細胞中に、限定されるものでないが、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルスおよびレトロウイルスベクターを含むベクター、さらにリポソームなどのＤＮＡを細胞に導入する他の粒子を用いて、挿入することができる。
【０１３１】
哺乳類細胞における発現のために遺伝子を導入する方法は、当分野では周知である。一般的に、そのような遺伝子治療法としては、異種コード配列と機能的に連結されたＭＮ−ＣＡ９調節領域を発現する標的細胞またはトランスジェニックマウス中に、核酸を直接ｉｎ ｖｉｖｏ投与する。これは当業界で公知の方法のいずれによっても達成することができ、例えば、適当な核酸発現ベクターの部分として構築して、それが細胞内に入るように投与することによって、例えば、欠陥または弱毒化レトロウイルスまたは他のウイルスベクターを用いる感染によって（例えば、米国特許第４，９８０，２８６号を参照）、裸の（ｎａｋｅｄ）ＤＮＡの直接注入によって、微粒子ボンバードメントの使用によって（例えば、遺伝子銃；バイオリスティック（Ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ）、ＤｕＰｏｎｔ）、脂質または細胞表面受容体またはトランスフェクト剤を用いたコーティングによって、リポソーム、微粒子、またはミクロカプセルに封入することによって、核に進入することが知られるペプチドと連結した投与によって、または特異的に受容体を発現する細胞型をターゲティングするのに用いることができる、受容体介在エンドサイトーシスを受けるリガンドと連結して投与することによって（例えば、ＷｕおよびＷｕ， １９８７， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６２：４４２９−４４３２を参照）達成することができる。別の実施形態においては、リガンドがエンドソームを破壊する膜融合性（ｆｕｓｏｇｅｎｉｃ）ウイルスペプチドを含有することを特徴とする核酸−リガンド複合体を形成することができ、核酸分子がリソソーム分解を避けうるようにすることができる。さらに別の実施形態においては、特定の受容体をターゲティングすることによって、核酸をｉｎ ｖｉｖｏで細胞特異的取込みと発現にターゲティングすることを可能にする（例えば、１９９２年４月１６日付けのＰＣＴ公開ＷＯ９２／０６１８０；１９９２年１２月２３日付けのＷＯ９２／２２６３５；１９９２年１１月２６日付けのＷ０９２／２０３１６；１９９３年７月２２日付けのＷ０９３／１４１８８；１９９３年１０月１４日付けのＷＯ ９３／２０２２１を参照）。あるいは、核酸を細胞内に導入し、相同的組換えによって宿主細胞ＤＮＡ内に組み込んで発現させることができる（ＫｏｌｌｅｒおよびＳｍｉｔｈｉｅｓ， １９８９， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８６：８９３２−８９３５；Ｚｉｊｌｓｔｒａら， １９８９， Ｎａｔｕｒｅ ３４２：４３５−４３８）。
【０１３２】
本発明の核酸を脳内に発現したいときには、そのような遺伝子置換治療技術は、患者内のこれらの細胞型に遺伝子配列を送達できるに違いない。従って、一実施形態においては、当業者が周知する技術（例えば、１９８８年４月２５日に公開されたＰＣＴ公開第Ｗ０８９／１０１３４号を参照）を用いて遺伝子配列を血液脳関門を容易に通過させ、その配列を脳内細胞に送達することができる。血液脳関門を通過しうる送達については、例えば、以上に記載したウイルスベクターが好ましい。
【０１３３】
別の実施形態においては、送達の技術は、例えば遺伝子配列を発現すべき細胞部位への遺伝子配列の定位送達（ｓｔｅｒｅｏｔａｃｔｉｃ ｄｅｌｉｖｅｒｙ）による、直接投与を含む。
【０１３４】
遺伝子発現および／または遺伝子産物活性の全レベルを増加するために使用できる他の方法としては、以上考察したように、ターゲティング相同的組換え方法の使用が挙げられ、この方法では、細胞または微生物内の内因性遺伝子の発現特性を改変するために、異種ＤＮＡ調節エレメントを挿入し、挿入した調節エレメントが目的の内因性遺伝子と機能的に連結させる。従って、ターゲティング相同的組換えを用いて、「転写上サイレントな」、すなわち通常発現されないもしくは通常非常に低いレベルでしか発現されない内因性遺伝子の転写を活性化するか、または通常発現される内因性遺伝子の発現を増強することができる。
【０１３５】
さらに、標的遺伝子発現および／または遺伝子産物活性の全レベルは、適当な標的遺伝子発現細胞、好ましくは自己由来細胞を、様々な癌および関連障害の症候を改善するのに十分な位置におよび数だけ患者へ導入することによって、増加することができる。そのような細胞は組換え体であってもまたは非組換え体であってもよい。
【０１３６】
投与すべき細胞が非自己由来細胞であるときは、導入細胞に対する宿主免疫応答の発生を避ける周知の技術を使用して、それらの細胞を投与することができる。例えば、細胞を封入した形態で導入し、直接の細胞外環境との成分交換はできるが、導入細胞が宿主免疫系によって認識されないようにしてもよい。
【０１３７】
さらに、上記の技術を介して同定したような、ＭＮ−ＣＡ９調節領域の活性をモジュレートする能力のある化合物を、当業者が周知する標準的技術を用いて投与することができる。投与する化合物が脳細胞との相互作用に関わる場合には、投与技術は、血液脳関門の通過を可能にする周知の技術を含んでなるべきである。
【０１３８】
５．５　医薬調製物および投与方法
ＭＮ−ＣＡ９調節領域活性または遺伝子産物活性を改変することが決定された化合物を患者に治療上有効な用量で投与して、様々な癌および関連障害を治療および改善することができる。治療上有効な用量とは、そのような障害の症候の改善をもたらすのに十分な量の化合物を意味する。
【０１３９】
５．５．１　有効用量
そのような化合物の毒性と治療効力は、細胞培養物または実験動物における標準的な薬学的方法、例えば、ＬＤ５０（集団の５０％に対する致死用量）およびＥＤ５０（集団の５０％に対する治療上有効な用量）の決定によって決定できる。毒性と治療効果との間の用量比は治療指数であって、ＬＤ５０／ＥＤ５０の比として表現することができる。大きな治療指数を示す化合物が好ましい。毒性副作用を示す化合物を使用してもよいが、そのような化合物を患部組織の部位にターゲティングし、未感染細胞への潜在的損傷を最小限にして副作用を軽減する送達系を設計するように注意しなければならない。
【０１４０】
細胞培養アッセイおよび動物研究から得たデータを、ヒトに使用する用量の範囲を処方するのに使用することができる。そのような化合物の用量は、好ましくは、ＥＤ５０を含みかつ毒性が少ししかまたは全くない循環濃度の範囲内にある。用量はこの範囲内で、使用する剤形および使用する投与経路に応じて変化しうる。本発明の方法で用いるいずれの化合物についても、治療上有効な用量は、最初、細胞培養アッセイから推定することができる。動物モデルにおいては、用量は細胞培養で決定したＩＣ５０（すなわち、症候の最大半減抑制を達成する試験化合物濃度）を含む循環血漿濃度を達成するように処方することができる。そのような情報を用いてヒトに有用な用量をさらに正確に決定することができる。血漿中のレベルは、例えば、高性能液体クロマトグラフィーによって測定してもよい。
【０１４１】
５．５．２　製剤と使用
本発明によって使用する医薬組成物は、１以上の生理学的に許容される担体または賦形剤を使用して通常の方法で製剤化することができる。
【０１４２】
従って、化合物とその生理学的に許容される塩および溶媒化合物を、吸入または吹送による（口または鼻を通して）投与用に、または経口、バッカル、非経口または直腸投与用に製剤化することができる。
【０１４３】
経口投与用には、医薬組成物は、例えば錠剤またはカプセルの形態をとって、通常の手段で、結合剤（例えば、プレゼラチン化（ｐｒｅｇｅｌａｔｉｎｉｓｅｄ）トウモロコシ澱粉、ポリビニルピロリドンまたはヒドロキシプロピルメチルセルロース）；充填剤（例えば、乳糖、微晶質セルロースまたはリン酸水素カルシウム）；滑沢剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルクまたはシリカ）；崩壊剤（例えば、ジャガイモデンプンまたはナトリウムデンプングリコレート（ｓｏｄｉｕｍ ｓｔａｒｃｈ ｇｌｙｃｏｌａｔｅ））；または湿潤剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウム）などの製薬上許容される賦形剤を用いて調製してもよい。錠剤は、当業界で周知の方法によってコーティングしてもよい。経口投与用の液体調製物は、例えば、溶液、シロップまたは懸濁液の形態をとってもよいし、または使用前に水または他の好適なビヒクルを用いて構成する乾燥製品として提供してもよい。そのような液体調製物は通常の手段によって、懸濁剤（例えば、ソルビトールシロップ、セルロース誘導体または水素化食用脂肪）；乳化剤（例えば、レシチンまたはアカシア）；非水性ビヒクル（例えば、アーモンド油、油状エステル、エチルアルコールまたは分留植物油）；および保存剤（例えば、メチルもしくはプロピル−ｐ−ヒドロキシベンゾエートまたはソルビン酸）などの製薬上許容される添加剤を用いて調製してもよい。調製物はまた、適当な場合にはバッファー塩、着香剤、着色剤および甘味剤を含有してもよい。
【０１４４】
経口投与用の調製物は、活性化合物の制御放出を供与するように好適に製剤化できる。
【０１４５】
バッカル投与用には、組成物は通常の方法で製剤化した錠剤またはロゼンジの形態であってよい。
【０１４６】
吸入による投与用には、本発明によって使用する化合物は、通常、好適な噴射剤、例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素または他の好適なガスを使用した、加圧パックまたは噴霧器からのエーロゾルスプレイ吹付けの形態で送達される。加圧エーロゾルの場合、投与単位は、計測した量を送達するバルブを提供することで決定してもよい。吸入器または吹送器に使用する、例えばゼラチンのカプセルおよびカートリッジは、化合物とラクトースまたはデンプンなどの好適な粉末基剤の粉末混合物を含有するように製剤化してもよい。
【０１４７】
化合物は、注入による、例えばボーラス注射または連続輸液による非経口投与用に製剤化してもよい。注入用製剤は、単位剤形、例えばアンプル、または複数用量容器中に、保存剤を添加して提供してもよい。組成物は、油状または水性ビヒクル中の懸濁液、溶液またはエマルジョンなどの形態をとってもよいし、懸濁剤、安定剤および／または分散剤などの製剤補助剤（ｆｏｒｍｕｌａｔｏｒｙ ａｇｅｎｔ）を含有してもよい。あるいは、活性成分は、使用前に好適なビヒクル、例えば無菌発熱物質非含有水を用いて構成する粉末形態であってもよい。
【０１４８】
化合物はまた、座剤または保持浣腸、例えば、ココアバターまたは他のグリセリドなどの通常の座剤基剤を含有する、直腸組成物に製剤化してもよい。
【０１４９】
ある特定の実施形態においては、本発明の医薬組成物を治療の必要がある領域に局所的に投与することが望ましい場合がある。これは、例えば、限定されるものでないが、外科手術中の局所的輸液によって、例えば外科手術後の創傷包帯と一緒に局所適用によって、注入によって、カテーテルを使って、座剤を使って、またはインプラント（同インプラントは、多孔質、非多孔質、またはシアラスチック（ｓｉａｌａｓｔｉｃ）膜などの膜を含むゼラチン質材料または繊維である）を使って実施することができる。一実施形態においては、投与は、悪性腫瘍または新生物性もしくはプレ新生物性組織の部位（または既往部位）における直接注入によってもよい。
【０１５０】
局所適用には、化合物を担体と組合せて、所望の活性に基づく有効な用量を送達してもよい。
【０１５１】
先に記載した製剤に加えて、化合物はまた、デポー（ｄｅｐｏｔ）調製物として製剤化してもよい。そのような長期作用性製剤は、移植（例えば、皮下または筋内）によってまたは筋内注射によって投与することができる。従って、例えば、化合物を好適なポリマーまたは疎水性材料（例えば、許容されるオイル中のエマルジョンとして）またはイオン交換樹脂を用いて、あるいは難溶性（ｓｐａｒｉｎｇｌｙ ｓｏｌｕｂｌｅ）誘導体、例えば難溶性塩として製剤化してもよい。
【０１５２】
組成物は、もし所望であれば、活性成分を含有する１以上の単位剤形を含有しうるパックまたはディスペンサー装置で提供することができる。パックは、例えば、ブリスターパックなどの、金属またはプラスチック箔を含んでなってもよい。パックまたはディスペンサー装置は投与のための説明書を付随してもよい。
【０１５３】
６．　引用した参考文献
本明細書に開示した特定の実施形態は本発明の複数の態様の説明を意図するものであるので、本明細書に記載しかつ請求した本発明はこれらの実施形態によって範囲を限定されるものでない。いずれの同等の実施形態も本発明の範囲内にあることが意図される。実際、本明細書に示されかつ記載されたものに加えて、本発明の様々な改変が、以上の説明から当業者には明らかになるであろう。そのような改変もまた、添付の特許請求の範囲内であることが意図される。
【０１５４】
本明細書に記述した全ての刊行物、特許および特許出願は、それぞれの個々の刊行物、特許または特許出願が特定してかつ個々に参照により組み入れられると示されたかのような程度に、本明細書に参照により組み入れられる。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、１〜５４０塩基対のＭＮプロモーター配列である。また、図中にプロモーター配列内の制限酵素切断部位も記した。
【図２】図２Ａ〜２Ｃは、ＭＮ−ＣＤ（図２Ａ）、ＭＮＳＰ−ＣＤ（図２Ｂ）およびＭＮ−Ｅｌａ（図２Ｃ）組換えアデノウイルスシャトルベクターの構築物である。これらのベクターは、組換え複製欠陥（Ａｄ−ＭＮ−ＣＤおよびＡｄ−ＭＮＳＰ−ＣＤ）および複製制限（Ａｄ−ＭＮ−Ｅｌａ）アデノウイルスベクターを構築するために利用した。
【図３】図３は、様々な細胞系におけるＭＮプロモーター構築物の相対ルシフェラーゼ活性である。本図は、ＭＮ発現（ＳＫ−ＲＣＣ ３１、ＳＫ−ＲＣＣ−３８）およびＭＮ非発現（ＳＫ−ＲＣＣ−２９、ＳＫ ＲＣＣ−４２）両方の腎癌株化細胞、ＭＮ発現子宮頚癌株化細胞（ＨｅＬａ）およびＭＮ非発現前立腺癌株化細胞（ＬＮＣａＰ）における、単独ならびにＳＶ−４０プロモーターのＳＶ−４０エンハンサー領域と結合したＭＮプロモーター構築物の相対ルシフェラーゼ活性を示す。ＭＮ非発現体は、ｐＧＬ３プラスミドと比較して、それぞれＭＮプロモーターだけを伴う場合は最小限のルシフェラーゼ活性を示し、ＳＶ−４０プロモーターエンハンサーセグメントをＭＮプロモーターに付加してもほんの僅かにしか増強されない。さらに、ＭＮ発現細胞系は、ＭＮプロモーターの制御下で有意な基底ルシフェラーゼ活性を発現し、ＳＶ４０プロモーターエンハンサー領域の付加によって有意に（８〜１２倍）増強される。
【図４】図４は、腎細胞癌および子宮頚癌株化細胞におけるＭＮプロモーター欠失分析である。図３と同じ株化細胞を用いて、ＭＮ発現株化細胞のＭＮプロモーター領域の特異性を実証した。プロモーターセグメントのいずれの欠失も、ＭＮ発現株化細胞のＭＮプロモーターの全セグメントによって示された特異性と活性の喪失と関連づけられる。
【図５】図５は、ＭＮ−ルシフェラーゼ構築物の模式図である。一番上の線はＭＮ ５’配列を表す。数字はＭＮ転写開始部位からの塩基での距離である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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