(57)【要約】本発明は、CTLA-4遺伝子座における単一ヌクレオチド多形(SNP)およびハプロタイプの同定、およびそれらのバセドウ病(GD)または1型糖尿病(T1DM)のような自己免疫疾患に対する素因、感受性、または抵抗性との関連に関する。
2004523244.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
個体から得られるゲノムDNA配列のCTLA-4遺伝子座内の1またはそれ以上の位置の単一ヌクレオチド多形に存在するヌクレオチドの同一性を確定することを含む、個体のT細胞関連自己免疫疾患に対する感受性の確定方法であって、1またはそれ以上の位置が、CTLA-4遺伝子座の-34563、-23327、-14953、-12527、-11534、-10914、-9914、-8916、-2871、-2201、-1765、-1577、6230、7092、7134、7982、8173、8857、10242、10717、12311、16558、19178、21660、22616、および24212位からなる群から選ばれる方法(ここで、CTLA-4開始コドンのATGのAの5'側のヌクレオチドは‐1で表され、CTLA-4遺伝子座の配列はデータベース受託番号AF225900を有する。)。
【請求項２】
個体のT細胞性自己免疫疾患に対する感受性が該1またはそれ以上の位置に存在するヌクレオチドの同一性により示される請求項1記載の方法。
【請求項３】
T細胞性自己免疫疾患がバセドウ病、または1型糖尿病である請求項2記載の方法。
【請求項４】
1またはそれ以上の位置の単一ヌクレオチド多形性のヌクレオチドの同一性が、表1および配列番号1〜26に示される請求項1〜3のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
CTLA-4遺伝子座内の‐23327および6230位に存在するヌクレオチドの同一性を確定することを含む先の請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
さらに、CTLA-4遺伝子座内の-34563位に存在するヌクレオチドの同一性を確定することを含む請求項5に記載の方法。
【請求項７】
CTLA-4遺伝子座の-23327および6230位にヌクレオチドGを含むハプロタイプの存在を確定することを含む請求項5に記載の方法。
【請求項８】
1またはそれ以上の単一ヌクレオチド多形の特定の対立遺伝子と特異的に結合し、1またはそれ以上の単一ヌクレオチド多形の他の対立遺伝子とは特異的に結合しないオリゴヌクレオチドプローブのゲノムDNAサンプルとの結合を確定することを含む先の請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
オリゴヌクレオチドプローブが標識を含み、該標識の結合が該標識の存在を検出することにより確定する請求項7に記載の方法。
【請求項１０】
1またはそれ以上の位置の単一ヌクレオチド多形を含むゲノムDNAサンプルの領域を増幅することを含む先の請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
ゲノムサンプルの領域がオリゴヌクレオチドプライマー対を用いて増幅され、該プライマー対の第一のメンバーが少なくとも1つの多形の5'側に隣り合った相補配列とハイブリダイズするヌクレオチド配列を含み、該プライマー対の第二メンバーが少なくとも1つの多形の3'側に隣り合った相補配列とハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む請求項9に記載の方法。
【請求項１２】
ゲノムサンプルの領域がオリゴヌクレオチドプライマー対を用いて増幅され、該プライマー対の第一のメンバーが少なくとも1つの多形の3'または5'側に隣り合った相補配列とハイブリダイズするヌクレオチド配列を含み、該プライマー対の第二のメンバーが、特定の対立遺伝子の存在下でのみ増幅が生じるように、ストリンジェント条件下で少なくとも1つの多形の特定の対立遺伝子とハイブリダイズし、他の対立遺伝子とはハイブリダイズしないヌクレオチド配列を含む請求項10に記載の方法。
【請求項１３】
ゲノムサンプルの増幅された領域を配列決定し、ゲノムサンプル中の少なくとも1つの多形の対立遺伝子を確定する請求項10または請求項11記載の方法。
【請求項１４】
1またはそれ以上の多形の特定の対立遺伝子と特異的に結合し、1またはそれ以上の多形の他の対立遺伝子とは特異的に結合しないヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドプローブのゲノムサンプルの増幅された領域との結合を確定することを含む請求項11または請求項12に記載の方法。
【請求項１５】
多形核酸配列の対立遺伝子と特異的に結合するプローブと多形核酸配列を接触させ、該核酸配列とプローブの結合を確定することを含む、試験サンプル中の多形核酸配列の対立遺伝子の存在の有無を確定する方法であって、
該多形核酸配列がCTLA-4遺伝子座の-34563、-23327、-14953、-12527、-11534、-10914、-9914、-8916、-2871、-2201、-1765、-1577、6230、7092、7134、7982、8173、8857、10242、10717、12311、16558、19178、21660、22616、および24212位(ここで、CTLA-4開始コドンのATGのAの5'側のヌクレオチドは‐1で表され、CTLA-4遺伝子座の配列はデータベース受託番号AF225900を有する。)からなる群から選ばれる1またはそれ以上の位置の単一ヌクレオチド多形を含み、
1またはそれ以上の位置の単一ヌクレオチド多形のヌクレオチドの同一性が多形核酸配列の対立遺伝子を確定する
ことを特徴とする方法。
【請求項１６】
試験配列中の、1またはそれ以上の位置の単一ヌクレオチド多形を含む多形核酸配列の対立遺伝子の存在の有無を確定する方法であって、
CTLA-4遺伝子座の-34563、-23327、-14953、-12527、-11534、-10914、-9914、-8916、-2871、-2201、-1765、-1577、6230、7092、7134、7982、8173、8857、10242、10717、12311、16558、19178、21660、22616、および24212位(ここで、CTLA-4開始コドンのATGのAの5'側のヌクレオチドは‐1で表され、CTLA-4遺伝子座の配列はデータベース受託番号AF225900を有する。)からなる群から選ばれる1またはそれ以上の位置の単一ヌクレオチド多形のヌクレオチドの同一性を確定し、
該多形核酸配列の対立遺伝子の存在を1またはそれ以上の位置の単一ヌクレオチド多形のヌクレオチドの同一性により確定することを含む方法。
【請求項１７】
CTLA-4遺伝子座の-23327および6230位のヌクレオチドの同一性を確定することを含む請求項16に記載の方法。
【請求項１８】
CTLA-4遺伝子座の-34563位のヌクレオチドの同一性を確定することを含む請求項17に記載の方法。
【請求項１９】
CTLA-4遺伝子座の-23327および6230位のヌクレオチドGの存在の有無を確定することを含む請求項17に記載の方法。
【請求項２０】
CTLA-4遺伝子座の-34563、-23327、-14953、-12527、-11534、-10914、-9914、-8916、-2871、-2201、-1765、-1577、6230、7092、7134、7982、8173、8857、10242、10717、12311、16558、19178、21660、22616、および24212位からなる群から選ばれる1またはそれ以上の位置の単一ヌクレオチド多形を含む核酸配列の対立遺伝子と特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド。
【請求項２１】
標識を含む請求項20に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項２２】
CTLA-4遺伝子座の-34563、-23327、-14953、-12527、-11534、-10914、-9914、-8916、-2871、-2201、-1765、-1577、6230、7092、7134、7982、8173、8857、10242、10717、12311、16558、19178、21660、22616、および24212位からなる群から選ばれる、1またはそれ以上の位置の単一ヌクレオチド多形の5'側に隣り合った相補配列とハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む第一のメンバー、
1またはそれ以上の位置の単一ヌクレオチド多形の3'側に隣り合った相補配列とハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む該プライマー対の第二メンバーを有する増幅プライマー対。
【請求項２３】
CTLA-4遺伝子座の-34563、-23327、-14953、-12527、-11534、-10914、-9914、-8916、-2871、-2201、-1765、-1577、6230、7092、7134、7982、8173、8857、10242、10717、12311、16558、19178、21660、22616、および24212位からなる群から選ばれる、1またはそれ以上の位置の単一ヌクレオチド多形の5'または3'側に隣り合った相補配列とハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む第一のメンバー、
特定の対立遺伝子の存在下でのみ増幅が生じるように、ストリンジェント条件下で1またはそれ以上の多形の特定の対立遺伝子とハイブリダイズし、他の対立遺伝子とはハイブリダイズしないヌクレオチド配列を含む該プライマー対の第二のメンバーを有する増幅プライマー対。
【請求項２４】
請求項22または請求項23に記載の増幅プライマー対および／または請求項20または請求項21に記載のオリゴヌクレオチドを含むアッセイキット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、CTLA-4遺伝子座の単一ヌクレオチド多形(SNP)の同定、およびこれらSNPと自己免疫疾患に対する素因、感受性または抵抗性との関連に関する。
【０００２】
自己免疫疾患は、ヨーロッパの人口の4%が罹患しており、これにはバセドウ病(GD)、1型糖尿病(T1DM:ヨーロッパの人口の0.4%)、橋本甲状腺炎、アジソン病、慢性関節リウマチ、および多発性硬化症のような臓器特異的疾患が含まれる。
【０００３】
CTLA-4(細胞障害性Tリンパ細胞関連-4)は、T細胞活性化の極めて重要な負の調節因子であるから、T細胞性自己免疫疾患の候補遺伝子である。CTLA-4遺伝子は、T1DM(IDDM12)およびGDのような自己免疫疾患に対する感受性をもたらす候補として提案されてきた(Nistico L et al (1996) Hum Mol Genet 5:1075-1080)。
【０００４】
病状(disease condition)に対する感受性を与える遺伝子または遺伝子座は、多形が存在する1またはそれ以上の部位を含むかもしれない。これら多形の存在は、そのうちの1つが病状に対する感受性の増加と関連しているかもしれない、遺伝子または遺伝子座の異なる対立遺伝子をもたらす。
【０００５】
ある病状に感受性の個体は、その個体を、全体の人口よりその生涯の間に該病状を被るリスクがより高い状態に置くその病状に対する素因を持っているかもしれない。そうであるリスクはより高いが、感受性の個体は、実際には決してその病状を招かないかもしれない。
【０００６】
逆に、対立遺伝子は、疾患からの防御をもたらすかもしれない。2つの対立遺伝子を持つ疾患遺伝子に関して、感受性対立遺伝子または防御的対立遺伝子(ここで、もう一方の対立遺伝子は、疾患と中立的もしくは積極的に関連している)を持つ遺伝子を区別することは難しいかもしれない。
【０００７】
最も一般的なタイプの遺伝子多形は、単一位置のゲノム配列(SNP)のヌクレオチドの同一性における変化である。疾患関連遺伝子は、そのコーディング領域または非コーディング領域内のいずれかに多くのSNPを含むかもしれない。疾患関連性は、特定のSNP、もしくは多くのSNPからなる特定のハプロタイプによって引き起こされるかもしれない。
【０００８】
コーディング配列中のSNPは、ポリペプチドの配列を変化させ、病状と関連しているかもしれない欠陥もしくは変異体アイソフォームを生じるかもしれない。非コーディング配列中のSNPも、例えば、ポリペプチド発現を指示するエンハンサーエレメントの活性を変化させることによって病状をもたらすかもしれない。あるいはまた、SNPは、表現形的効果を持たないかもしれない。
【０００９】
罹患個体および非罹患個体の個体群を用いる特定のSNPおよびハプロタイプの関連分析は、SNPまたはハプロタイプが病状と関連することを示すかもしれない。
【００１０】
CTLA-4遺伝子座内の3つの既知SNPを表2に示す(Deichmann et al (1996) Biochem. Biophys. Res. Commun. 225: 817-818, Harper et al (1991) J. Immunol 147: 1037-44, Marron et al (2000) Diabetes 49: 492-499)。いくつかの疾患との関連が49G＞A SNPについて既に知られているが(表2)、このSNPは、CTLA-4遺伝子座と1型糖尿病およびバセドウ病との関連の部分をとらえているだけのようであり、ある個体群では1型糖尿病と全く関連がないため、この関連は、個体における疾患感受性に対する有意義な診断試験を提供するには十分ではない。
【００１１】
本発明者らは、CTLA-4遺伝子座に多くの新規SNPを発見し、個々のSNPとハプロタイプの両方が病状と強い関連があることを示した。これは、CTLA-4関連自己免疫病状の診断と治療に関する方法の開発を可能にする。
【００１２】
本発明の最初の局面は、個体から得られるゲノムDNA配列のCTLA-4遺伝子座内の1またはそれ以上の位置の単一ヌクレオチド多形に存在するヌクレオチドの同一性を確定することを含む、個体のT細胞関連自己免疫疾患に対する感受性の確定方法であって、1またはそれ以上の位置が、CTLA-4遺伝子座の-34563、-23327、-14953、-12527、-11534、-10914、-9914、-8916、-2871、-2201、-1765、-1577、6230、7092、7134、7982、8173、8857、10242、10717、12311、16558、19178、21660、22616、および24212位からなる群から選ばれる方法(ここで、CTLA-4開始コドンのATGのAの5'側のヌクレオチドは‐1で表され、CTLA-4遺伝子座の配列はデータベース受託番号AF225900を有する。)を提供する。
【００１３】
これらSNPを表1および配列番号1〜26に示す。バセドウ病または1型糖尿病のようなT細胞性自己免疫疾患に対する個体の感受性は、該1またはそれ以上の位置に存在するヌクレオチドの同一性によって示される。
【００１４】
1またはそれ以上の位置の単一ヌクレオチド多形のヌクレオチドは、表1および配列番号1〜26に示す対立遺伝子であるかもしれない。
【００１５】
いくつかの態様において、CTLA-4遺伝子座の-23327および6230の単一ヌクレオチド多形の位置のヌクレオチドの同一性、特にこれら位置にヌクレオチドGを含むハプロタイプの存在が確定するかもしれない。
【００１６】
これら2つの位置の単一ヌクレオチド多形におけるヌクレオチドの同一性の確定に加えて、本明細書に記載し、表1に示す他の位置の単一ヌクレオチド多形のヌクレオチドの同一性も確定するかもしれない。特に、-34563のヌクレオチドの同一性、例えばこの位置におけるヌクレオチドTの存在の有無が確定するかもしれない。
【００１７】
他の態様において、方法は、CTLA-4遺伝子座の6230位の単一ヌクレオチド多形のヌクレオチドの同一性、例えばこの位置におけるヌクレオチドGの存在の有無を確定することを含むかもしれない。CTLA-4遺伝子座の6230位の単一ヌクレオチド多形のヌクレオチドの同一性を確定することに加え、本明細書に記載し、表1に示す単一ヌクレオチド多形の他の位置のヌクレオチドの同一性も確定するかもしれない。
【００１８】
他の態様において、方法は、CTLA-4遺伝子座の-23327位の単一ヌクレオチド多形のヌクレオチドの同一性、例えばこの位置におけるヌクレオチドGの存在の有無を確定することを含むかもしれない。CTLA-4遺伝子座の-23327位の単一ヌクレオチド多形のヌクレオチドの同一性を確定することに加え、本明細書に記載し、表1に示す他の位置の単一ヌクレオチド多形のヌクレオチドの同一性も確定するかもしれない。
【００１９】
以前の報告(Perkins et al J. Immunol. (1996) 156: 4154-4159)は、CTLA4配列の335bpが遺伝子の誘導性を制御するのに十分であることを示している。-319C＞T SNPのみがこの領域内にある。しかしながら、CTLA-4の転写を調節する制御エレメントはまだ確立されていない。
【００２０】
CTLA-4の制御領域に位置している多形の特定の対立遺伝子は、遺伝子からの発現を変化させ、もしくはmRNAの転写のプロセシングまたは安定性に影響を及ぼすかもしれない。そのような対立遺伝子の存在は、CTLA-4mRNAの量および／または安定性を測定することによって確定するかもしれない。
【００２１】
本発明のいくつかの局面に基づいた方法は、ゲノムサンプルを得ることを含むかもしれない。ゲノム核酸の試験サンプルは、個体の、細胞または生物学的組織もしくは体液、尿、だ液、ふん便、口腔内スワブ、生検、または好ましくは血液から、または出産前試験用に羊膜、胎盤、または胎児そのものから核酸を抽出することにより得ることができよう。
【００２２】
特定の核酸配列、例えば、表1および配列番号1〜26に示す単一ヌクレオチド多形の位置に特定のヌクレオチドを持つ核酸配列の試験サンプルにおける存在の有無を確定する種々の方法が知られている。さらに、個体またはサンプルの核酸を配列決定することにより、元の核酸そのものに頼ることなく配列情報を保持し、次いで検索することができる。このように、例えば、配列変化または突然変異は、コンピュータまたは他の電子的方法を用いる配列情報のデータベースをスキャンすることによって確認することができよう。
【００２３】
あるいはまた、ゲノムDNA、cDNA、および／またはmRNAを含む調製物を用いて試験を行うことができよう。cDNAまたはmRNAを試験することは、イントロン配列がないことにより核酸配列の複雑さが減るという利点があるが、調製物の作製に余分の時間と努力を必要とする欠点が考えられる。RNAは、RNAアーゼが広範囲に存在するため、DNAより操作が難しい。
【００２４】
本発明のいくつかの局面に基づいた方法は、オリゴヌクレオチドプローブのゲノムサンプルとの結合の測定を含むかもしれない。該プローブは、少なくとも1つの多形の特定の対立遺伝子と特異的に結合し、少なくとも1つの多形の他の対立遺伝子とは特異的に結合しないヌクレオチド配列を含んでよい。
【００２５】
オリゴヌクレオチドプローブは標識を含んでよく、該プローブの結合は標識の存在を検出することによって確定することができよう。
【００２６】
方法は、1またはそれ以上(例えば2つ)のオリゴヌクレオチドプローブまたはプライマーと標的核酸とのハイブリダイゼーションを含んでよい。核酸が二本鎖DNAであれば、通常、ハイブリダイゼーションに先だって、変性により一本鎖DNAが生成されるであろう。該ハイブリダイゼーションは、PCR法の一部、もしくはPCRを包含しないブロービング法の一部であってよい。方法の例では、PCRと低ストリンジェンシーハイブリダイゼーションが組み合わせられよう。当業者に利用可能な多くのものから選んだスクリーニング法を用いてハイブリダイゼーションの成功を確認し、ハイブリダイズした核酸を単離する。
【００２７】
標的核酸(例えばDNA)に対するプローブの結合は、当業者が自由に使えるあらゆる種々の技術を用いて確定することができよう。例えば、プローブは、放射性標識、蛍光標識もしくは酵素標識されていてよい。プローブの標識を用いない他の方法には、制限断片長多形試験、PCRを用いる増幅、RNアーゼ開裂、および対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプロービングが含まれる。プロービングには標準的サザンブロッティング技術を用いてよい。例えば、DNAを細胞から抽出し、異なる制限酵素で消化してよい。次に、制限断片をアガロースゲル電気泳動により分離し、次いで変性させ、ニトロセルロースフィルターに移すことができよう。標識プローブをフィルター上のDNA断片とハイブリダイズさせ、結合を測定することができよう。ブロービング用のDNAは、細胞から得たRNA調製物から作製することができよう。
【００２８】
当業者は、オリゴヌクレオチドの長さと塩基組成、温度などのような因子を考慮して選択的ハイブリダイゼーションのための、所望のストリンジェンシーの適切な条件を用いることができる。
【００２９】
17〜30塩基のオリゴヌクレオチドの適当な選択的ハイブリダイゼーション条件には、6XSSC中、42ECで一夜ハイブリダイゼーションし、42℃〜65℃の一連の増加する温度で6X SSCで洗浄することが含まれる。
【００３０】
他の適切な条件およびプロトコールは、Molecular Cloning: a Laboratory Manual: 2nd edition, Sambrookら、1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press、およびCurrent Protocols in Molecular Biology, Ausubelら編、John Wiley & Sons, 1992に記載されている。
【００３１】
核酸増幅に用いるオリゴヌクレオチドは、長さ約30ヌクレオチドまたはそれ以下(例えば、18、21もしくは24)であってよい。一般に、特異的プライマーは、長さ14ヌクレオチド以上であるが、18-20以上である必要はない。当業者は、PCRのような方法に用いるプライマーの設計に十分熟練している。オリゴヌクレオチドプライマーを合成するための種々の技術は、ホスホトリエステルおよびホスホジエステル合成方法を含めて当該分野で良く知られている。
【００３２】
核酸は、変異体または対立遺伝子特異的プローブを用いてスクリーニングすることもできよう。そのようなプローブは、自己免疫疾患感受性と関連することが示されている本明細書に記載の1またはそれ以上の単一ヌクレオチド多形を含むCTLA-4遺伝子の領域またはその相補物と順序通り対応するかもしれない。適切なストリンジェント条件下におけるそうのようなプローブと試験核酸の特異的ハイブリダイゼーションは、試験核酸中の配列変化の存在を表している。効率的スクリーニングのために、1以上のプローブを同じ試験サンプルに用いてよい。
【００３３】
ゲノムサンプルまたはその増幅された領域であるかもしれない試験サンプル中の核酸は、多形の対立遺伝子の同一性を確認もしくは確定するために配列決定することができよう。対立遺伝子は、得られた配列を本明細書中のあらゆる図に示す配列と比較することにより同定することができよう。したがって、試験核酸中のSNPの対立遺伝子を本明細書に記載のSNPの感受性対立遺伝子と比較し、試験核酸がGD、T1DM、または他の自己免疫疾患と関連している1またはそれ以上の対立遺伝子を含むかどうかを確定することができる。
【００３４】
一般に、試験サンプル中のすべての核酸または全CTLA-4遺伝子を配列決定することは時間または労力的に効率的でないであろうから、1またはそれ以上のプライマー対を用いるPCRのような特異的増幅反応を用いて、核酸、例えばCTLA-4遺伝子中の目的とする領域、または自己免疫疾患感受性と関連する多形が生じるCTLA-4遺伝子座の特定領域を増幅することができよう。次に、増幅した核酸を上記のごとく配列決定し、そして／または特定の特徴の存在の有無を確定するあらゆる他の方法を用いて試験することができよう。試験用の核酸は、細胞から取り出した、またはライブラリー中の核酸から、種々の他の方法、例えば制限酵素消化および電気泳動を用いて調製することができよう。
【００３５】
増幅された生成物の配列決定には、イソプロパノールで沈殿し、再懸濁し、次いでTaqFS+ Dyeターミネーター配列決定キットを用いて配列決定することが含まれよう。伸長生成物をABI 377 DNA シーケンサを用いて電気泳動し、データをSequence Navigator ソフトウェアを用いて分析することができよう。
【００３６】
試験サンプル中の核酸を、選択的ハイブリダイゼーション条件下でプローブし、そして／またはポリメラーゼ連鎖反応(PCR)のような特異的核酸増幅反応にかけることができよう(例えば、「PCR protocols; A Guide to Methods and Applications」, Innisら編、1990, Academic Press, New York、Mullisら、Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 51: 263, (1987), Ehrlich (ed), PCR technology, Stockton Press, NY, 1989、およびEhrlichら、Science, 252: 1643-1650, (1991)参照)。PCRは、テンプレート核酸の変性(もし二本鎖ならば)、ターゲットへのプライマーのアニーリング、および重合の工程を含む。増幅反応でテンプレートとして用いられまたはプローブされる核酸は、ゲノムDNA、cDNA、またはRNAであるかもしれない。
【００３７】
他の特異的核酸増幅技術には、鎖置換活性化、QB複製系、修復連鎖反応、リガーゼ連鎖反応、ローリングサークル増幅、および連結活性化転写が含まれる。便利さのためおよび一般に好ましいため、用語PCRは、本明細書において、当業者により他の核酸増幅技術が応用されるかもしれない文脈において使用する。文脈が他に必要としない限り、PCRに対する言及は、当該分野で利用可能なあらゆる適切な核増幅反応の使用に及ぶと解釈すべきである。
【００３８】
したがって、本発明の方法は、CTLA-4遺伝子座の部分、および1またはそれ以上の位置の単一ヌクレオチド多形を含む該ゲノムサンプル中の領域を増幅することを含むかもしれない。
【００３９】
対立遺伝子または変異体特異的オリゴヌクレオチドは、試験サンプル中に存在するならば特定の配列を特異的に増幅するためのPCRに用いることができよう。PCRバンドが遺伝子変異体を含むかどうかの評価は、当業者によく知られている多くの方法で行うことができよう。PCR生成物を、例えば、変性ポリアクリルアミドDNAシーケンシングゲル上に多形を表現することができる方法で処理し、遺伝子変異体と関連する特異的バンドを選ぶことができよう。
【００４０】
いくつかの態様において、多形を含むゲノムサンプルの領域は、オリゴヌクレオチドプライマー対の第一のメンバーが単一ヌクレオチド多形の位置の5’側に隣り合っている相補配列とハイブリダイズするヌクレオチド配列を含み、プライマー対の第二のメンバーが単一ヌクレオチド多形の位置の3'側に隣り合った相補配列とハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む、オリゴヌクレオチドプライマー対を用いて増幅することができよう。
【００４１】
他の態様において、オリゴヌクレオチドプライマー対の第一のメンバーは、該多形の5'または3'側に隣り合った相補配列とハイブリダイズするヌクレオチド配列を含み、該対の第二のメンバーは、増幅が特定の対立遺伝子の存在下でのみ生じるように、ストリンジェント条件下で、該多形の特定の対立遺伝子とハイブリダイズするが、他の対立遺伝子とはハイブリダイズしないヌクレオチド配列を含んでよい。
【００４２】
本発明のさらなる局面は、本明細書に記載の方法に用いるのに適したオリゴヌクレオチド増幅プライマー対を提供する。
【００４３】
この局面によれば、適切な増幅プライマー対は、例えば表1および配列番号1〜26に示す-34563、-23327、-14953、-12527、-11534、-10914、-9914、-8916、-2871、-2201、-1765、-1577、6230、7092、7134、7982、8173、8857、10242、10717、12311、16558、19178、21660、22616、または24212位のCTLA-4遺伝子座中の単一ヌクレオチド多形の5'側に隣り合った相補配列とハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む第一のメンバー、および該単一ヌクレオチド多形の3'側に隣り合った相補配列とハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む第二のメンバーを有するかもしれない。
【００４４】
次に、少なくとも1個の多形の対立遺伝子(すなわち、単一ヌクレオチド多形の位置のヌクレオチドの同一性)は、オリゴヌクレオチドプローブとゲノムサンプルの増幅された領域との結合を測定することにより確定することができよう。適切なオリゴヌクレオチドプローブは、少なくとも1つの多形の特定の対立遺伝子と特異的に結合し、少なくとも1つの多形の他の対立遺伝子とは特異的に結合しないヌクレオチド配列を含む。
【００４５】
他の適切な増幅プライマー対は、例えば表1および配列番号1〜26に示すCTLA-4遺伝子座中の-34563、-23327、-14953、-12527、-11534、-10914、-9914、-8916、-2871、-2201、-1765、-1577、6230、7092、7134、7982、8173、8857、10242、10717、12311、16558、19178、21660、22616、または24212位の単一ヌクレオチド多形の5'または3'側に隣り合った相補配列とハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む第一のメンバー、および増幅が特定の対立遺伝子の存在下でのみ生じるように、ストリンジェント条件下で、該多形の特定の対立遺伝子とハイブリダイズするが、他の対立遺伝子とはハイブリダイズしないヌクレオチド配列を含む第二のメンバーを有してよい。
【００４６】
試験サンプル中の変異体配列の存在を捜すことの代替または補足は、例えば特異的オリゴヌクレオチドプローブまたはプライマーを適切に用いて正常配列の存在を捜すことである。オリゴヌクレオチドプローブおよびプライマーの使用については、先により詳細に記載した。
【００４７】
本発明のさらなる局面は、例えば表1および配列番号1〜26に示すCTLA-4の-34563、-23327、-14953、-12527、-11534、-10914、-9914、-8916、-2871、-2201、-1765、-1577、6230、7092、7134、7982、8173、8857、10242、10717、12311、16558、19178、21660、22616、または24212位の単一ヌクレオチド多形からなる群から選ばれる多形の対立遺伝子を含む核酸配列と特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを提供する。
【００４８】
そのようなオリゴヌクレオチドを核酸のスクリーニング方法に用いることができよう。いくつかの好ましいオリゴヌクレオチドは、配列番号1〜26に示す配列、またはそのような配列と1またはそれ以上のヌクレオチドの付加、置換、挿入または欠失により異なる配列を有するが、好ましくは本明細書に記載の多形の対立遺伝子と選択的にハイブリダイズする能力を消滅させない(すなわち、ある配列の一つと該オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの類似性の程度が十分高い)。
【００４９】
いくつかの好ましい態様において、本発明のオリゴヌクレオチドは、長さが少なくとも約10ヌクレオチド、更に好ましくは長さ少なくとも約15ヌクレオチド、更に好ましくは長さ少なくとも約20ヌクレオチドである。オリゴヌクレオチドは、長さ約100ヌクレオチドまで、更に好ましくは長さ約50ヌクレオチドまで、より好ましくは長さ約30ヌクレオチドまでであるかもしれない。上記で用いる境界値「約Xヌクレオチド」には、境界値「Xヌクレオチド」が含まれる。
【００５０】
本発明の態様の対立遺伝子または変異体特異的オリゴヌクレオチドプローブまたはプライマーは、配列番号1〜26および表1に示すものから選ぶことができよう。プローブと試験核酸配列のハイブリダイゼーション、次いでミスマッチの検出を基にするアプローチを用いてよい。適切な条件(温度、pH等)下で、オリゴヌクレオチドプローブは、完全には補足的でない配列とハイブリダイズするであろう。2つの分子の塩基対化の程度は、ミスマッチにもかかわらずそれらがアニールするのに十分であろう。2つのアニーリング核酸分子間のミスマッチの存在を検出するための種々のアプローチが当該分野で良く知られている。
【００５１】
例えば、RNアーゼAは、ミスマッチ部位を開裂する。開裂は関連プローブまたはプローブがアニールした試験核酸を電気泳動し、完全長プローブ／試験ハイブリッドより小さな分子(すなわち、電気泳動による移動度がより高い分子)を捜すことにより検出することができる。
【００５２】
このように、本明細書に記載のバセドウ病、T1DM、または他の自己免疫疾患感受性に関連するSNPが生じることが知られている正常CTLA-4遺伝子の領域の配列(センスまたはアンチセンス鎖のいずれか)を有するオリゴヌクレオチドプローブを試験核酸とアニールし、ミスマッチの存在の有無を確定することができよう。ミスマッチの存在の検出は、自己免疫または他の疾患感受性と関連する突然変異が試験核酸中に存在することを示すかもしれない。他方、バセドウ病、T1DM、または他の自己免疫疾患感受性に関連する多形を含む遺伝子領域の配列を有するオリゴヌクレオチドプローブを試験核酸とアニールし、ミスマッチの存在の有無を確定することができよう。ミスマッチの存在は、試験サンプル中の核酸が正常配列(ミスマッチがないことは試験核酸が突然変異を持っていることを示す)を持つことを示すかもしれない。いずれにせよ、遺伝子の異なる領域への一組のプローブを用いることができよう。
【００５３】
本発明の核酸は、例えば、オリゴヌクレオチドプローブおよび／または増幅プライマー対は、例えば、内容物を外部環境から保護するバイアルのような適切な容器中にキットの部分として提供することができよう。該キットは、例えば、PCRおよび／または試験サンプル中の目的とする核酸の存在を確定する方法において該核酸を使用するための指示書を含んでよい。核酸がPCRに使用するためのものであるキットは、ポリメラーゼ、ヌクレオシド、緩衝溶液等のような反応に必要な1またはそれ以上の他の試薬を含むかもしれない。核酸は標識されていてよい。目的とする核酸の存在の有無を確定するのに用いるキットは、試験サンプルそれ自身を提供するための手段、例えば、口腔から細胞を取り出すためのスワブ、または血液サンプルを取り出すためのシリンジといった該方法を実施するための1またはそれ以上の物品および／または試薬(そのような成分は一般に無菌である)を含んでよい。
【００５４】
本発明の別の局面は、多形核酸配列の対立遺伝子と特異的に結合するプローブと多形核酸配列を接触させ、該核酸配列とプローブの結合を確定することを含む、試験サンプル中の多形核酸配列の対立遺伝子の存在の有無を確定する方法であって、
該多形核酸配列がCTLA-4遺伝子座の-34563、-23327、-14953、-12527、-11534、-10914、-9914、-8916、-2871、-2201、-1765、-1577、6230、7092、7134、7982、8173、8857、10242、10717、12311、16558、19178、21660、22616、および24212位(ここで、CTLA-4開始コドンのATGのAの5'側のヌクレオチドは‐1で表され、CTLA-4遺伝子座の配列はデータベース受託番号AF225900を有する。)からなる群から選ばれる1またはそれ以上の位置の単一ヌクレオチド多形を含み、
1またはそれ以上の位置の単一ヌクレオチド多形のヌクレオチドの同一性が多形核酸配列の対立遺伝子を確定する
ことを特徴とする方法を提供する。
【００５５】
本発明の別の局面は、試験サンプル中の、1またはそれ以上の位置の単一ヌクレオチド多形を含む多形核酸配列の対立遺伝子の存在の有無を確定する方法であって、
CTLA-4遺伝子座の-34563、-23327、-14953、-12527、-11534、-10914、-9914、-8916、-2871、-2201、-1765、-1577、6230、7092、7134、7982、8173、8857、10242、10717、12311、16558、19178、21660、22616、および24212位(ここで、CTLA-4開始コドンのATGのAの5'側のヌクレオチドは‐1で表され、CTLA-4遺伝子座の配列はデータベース受託番号AF225900を有する。)からなる群から選ばれる1またはそれ以上の位置の単一ヌクレオチド多形のヌクレオチドの同一性を確定し、
該多形核酸配列の対立遺伝子の存在を1またはそれ以上の位置の単一ヌクレオチド多形のヌクレオチドの同一性により確定することを含む方法を提供する。
【００５６】
所望により、そのような方法は、オリゴヌクレオチドプライマー対を用いて多形核酸配列を増幅することを含んでよい。示したように、例えば適切なプローブ、または転写因子、または配列特異的に核酸と結合する他の物質のハイブリダイゼーションを用いる物理的検出を用いるか、またはシリコもしくは適切なデータ分析技術、例えばコンピュータを用いて検出を行うことができよう。
【００５７】
CTLA-4遺伝子座の-23327および6230位の単一ヌクレオチド多形のヌクレオチドの同一性(特にこれらの位置におけるヌクレオチドGの存在)は、そのような方法を用いて確定することができよう。
【００５８】
本発明の局面は、限定されるものではないが、一例として添付の図面および実験例により例証されるであろう。さらなる局面および態様は当業者に明らかであろう。本明細書に記載のすべての文献は本明細書の一部を構成する。
【００５９】
実験
150kbのCTLA-4領域(Genbank配列データベースAF225900に開示した一次配列)は、本発明者によってこの領域のSNPの高密度マップを確立するために配列決定された。本発明はAF225900の配列に拘束されない。同様の配列におけるSNPの位置の同定が予期される。当業者は、同様の配列を容易に並べ、同じSNPの位置をみつけることができる(例えば、AF225900の6230位に対応するSNPはコーディング配列をアラインメントすることにより同様の配列に同定することができる。)。
【００６０】
次に、変性HPLC系を用いる自動化SNP回収方法を適用した。CTLA-4遺伝子を含む48kb領域から得た87個の500bp PCR断片を、32人の個体においてdHPLCによりスキャンした。dHPLCにおいて異なる移動性を持つ断片を配列決定した。このアプローチにより、本発明者らは、この領域中に50以上の以前に知られていなかったSNPを同定した。
【００６１】
次に、Invader化学(Third Wave Technologies)と呼ばれるSNPタイピング技術を用いた。これには、多形部位と結合したレポーターオリゴヌクレオチドを認識して開裂させる特異的開裂酵素を用いる(Mein CAら、(2000) Genome Research 10: 330-343)。
【００６２】
Invader系は、2つのオーバーラップしているオリゴヌクレオチド、Invaderオリゴヌクレオチド、およびレポーターアームを有するシグナルオリゴヌクレオチドが多形部位を含む標的DNAとハイブリダイズするときに形成された三次元構造のFlapエンドヌクレアーゼ(FEN)による認識および開裂特異性に依存する(Lyamichevら、1999 Nat. Biotechnol. 17 292-296)。シグナルプローブとテンプレート間の完全な適合の存在下でのみ、シグナルプローブレポーターアームまたはフラップが開裂し、蛍光エネルギー伝達(FRET)標識による普遍的二次開裂反応が生じる(Ryanら、(1999) Mol. Diagn. 4: 135-144)。シグナルは、従来の螢光マイクロタイタープレートリーダーを用いてエンドポイントで検出される。
【００６３】
Invader技術に関する参考文献は、あらゆる1またはそれ以上の以下のものを含む(これらの内容は本明細書の一部を構成する):米国特許5,846,717、6,001,567、5,985,557、6,090,543、5,994,069、6,194,149、PCT出願 WO 97/27214、WO 98/42873、WO 98/50403、および刊行物Lyamichevら、Biochemistry 39,9523-32 (2000)、Hallら、Proc Natl Acad Sci U S A 97,8272-8277 (2000)、Reynaldo J Mol Biol 297,511-20 (2000), Griffinら、Analytical Chemistry 72,3298-3302 (2000)。
【００６４】
分析に使われるかもしれない開裂酵素のための文献は、あらゆる1またはそれ以上の以下のものを含む(これらの内容は本明細書の一部を構成する):米国特許5,541,311、5,614,402、5,795,763、6,090,606、PCT出願WO 94/29482、WO 98/23774、および刊行物Lyamichevら、Nat Biotechnol 17, 292-6 (1999)、Maら、J. Biol. Chem. 275 (32), 24693-24700 (2000)、Lyamichevら、Proc Natl Acad Sci U S A 96,6143-8 (1999)、およびKaiserら、J. Biol. Chem. 274: 21387 (1999)。
【００６５】
確固たる高品質なタイピング結果が、このアプローチを用いるPCR生成物で得られた。
【００６６】
CTLA-4領域の50の新規SNPのうち45のSNPおよび以前に報告された3つのSNPを、バセドウ病384症例およびコントロール384-672例でタイピングし、最も疾患に関連する領域を確認し、病因的多形の同定を開始した。いくつかのSNPが、強い疾患関連性を示すことがわかった。
【００６７】
材料および方法
DNAサンプル
DNAは、エプスタイン‐バー(Epstein-Barr)ウイルス(EBV)形質転換末梢血リンパ球から抽出した。簡単には、コンフルエントのEBV細胞100mLを1000rpm、5分間でペレットとした。上清を捨て、細胞を5.25塩酸グアニジ(Sigma)、0.5M酢酸アンモニウム(Sigma)、プロテアーゼK(Sigma)125ng、および1.3%ナトリウムサルコシル(Sigma) 4mLに再懸濁した。溶液を37℃で一夜インキュベーションした。クロロホルム2mLを加えて2500rpmで遠心し、次いで上層を除去して100%エタノール10mLに加え、沈殿したDNAをAllegra 6R 微量遠心機(Beckman、UK)にて3000rpmでペレットとした。ペレットを70%エタノールで洗浄し、Tris-EDTA(TE)(pH7.5) 300μlに再懸濁した。DNAをPico Green(Molecular Probes、Eugene OR)で定量し、使用前にTE(pH7.5)で4ng/μlに希釈した。
【００６８】
PCR
PCR条件は、MgCl2濃度を1〜5mMに変化させ、50℃〜65℃の温度でアニーリングさせることにより最適化した。PCRは、384ウェルポリプロピレンマイクロタイタープレート(Abgene、Epsom、Surrey、UK)を用い、6μlの最終反応容量中で行った。ゲノムDNAの4ng/μlストック液3μlを、PCR前処理専用のBeckman Multimek(登録商標) 96ロボット(Beckman、High Wycombe、UK)で各ウェルに分配した。0.4mM dNTP、2-10mM MgCl2、3.8ng/μlホワードおよびリバースプライマー、およびTaqGold(Perkin Elmer Applied Biosystems、Foster City、CA)0.25単位を含むPCR反応混合物3μlを加え、プレートを粘着性シーリングシート(Abgene、Epsom、Surrey、UK)で覆った。
【００６９】
反応液を95℃で15分間インキュベーションし、次いで蒸発を防止するために加熱された蓋を用い、MJ PCT225サーモサイクラー(MJ Research、Watertown、MA)を用いて、95℃で30秒間、50〜65℃で30秒間、および72℃で30秒間を35サイクル行った。PCR調製のためのすべてのピペッティング工程は、PCR前処理専用のBeckman Multimek(登録商標) 96ロボット(Beckman、High Wycombe、UK)を用いて行った。
【００７０】
Invader(登録商標)分析
各遺伝子座のためのプローブセットは、試験する遺伝子座の配列に基づいてThird Wave Technologies, Inc (Madison, WI) (Lyamichevら、1999; Ryanら、1999)が設計および合成した。
【００７１】
分析は各対立遺伝子ごとに別々に準備した。384ウェルフォーマットにおいて、PCR生成物1を蒸留水4で希釈した。部分標本3μlを、2つの予め調製した384ウェルフォーマットInvader(登録商標) Assay FRET検出プレート(Third Wave Technologies, Madison, WI)に分散した。1.3μM 対立遺伝子特異的プローブ(プローブ1またはプローブ2)、0.13μM Invader(登録商標)プローブ、および7.5mM MgCl2を含むプローブ混合物6μlを加えた。この準備のためのすべてのピペッティング工程はMultimek(登録商標)96ロボット(Beckman、High Wycombe、UK)を用いて行った。プレートを粘着性シーリングシート(Abgene、Epsom、Surrey、UK)で被った。反応液をMJ PTC225サーモサイクラー(MJ Research)を用いて95℃で5分間、65℃で10〜80分間インキュベーションした。
【００７２】
培養終了時にCytofluor 4400 螢光マイクロタイタープレートリーダ(Perkin Elmer Applied Biosystems、Foster City、CA)、励起485/20、放射530/25、および増幅率50を用いて、螢光を直接測定した。結果をエクセルソフトウェア(Microsoft, Redmond, WA)を用いて分析した。個々の遺伝子型は、対立遺伝子1および対立遺伝子2からのシグナル強度の比をとってスコア付けした。遺伝子型をスコア付けするための基準は、遺伝子座間で異なった(「結果」の項参照)。ほとんどの遺伝子座を除き、個体は、2つの対立遺伝子間のシグナルの比率が0.5〜2のヘテロ接合体としてタイピングされた。この範囲外の比率のものをホモ接合体としてタイピングした。両分析からのシグナルが遺伝子座またはフォーマットに依存して閾値以下であれば、分析は失敗として分類した。
【００７３】
Invader(登録商標)Biplex分析
Invader(登録商標)Biplex(バイプレックス)分析(Third Wave Technologies, Inc. Madison, WI)は、両対立遺伝子特異的プローブ(プローブ1またはプローブ2)を異なる蛍光標識(FAMまたはRED)で標識したことを除き、上記Invaderユニプレックス分析について記載のごとく行った。ユニプレックスインベーダー(invader)分析ではプローブ1およびプローブ2を共にFAMで標識した。これにより、1つの384ウェルフォーマットInvader Assay FRET検出プレートを用いて両対立遺伝子がタイピングされ、同じ反応において両対立遺伝子を検出ことができる。
【００７４】
Taqman(登録商標)分析
SNPも、Taqman(登録商標)システム(Perkin Elmer Applied Biosystem, Foster City, CA)を用い、製造業者の指示書の記載とさらにRanade Kら(2001) Genome Res. 11: 1262-1268に記載の標準的プロトコールに従ってタイピングした。
【００７５】
制限断片長多形
常套的制限断片長多形(RFLP)分析を、Sambrook J.およびRussell D. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3rd Edition New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press 2001 ISBN 0-87969-577-3)に記載のごとく実施し、バセドウ病症例およびコントロールの40%において以下のSNP：CT50、CT53、CT42、CT55、およびCT60を、また英国および米国のT1DファミリーにおいてCT42をタイピングした。
【００７６】
単一ヌクレオチドの結果
51の新規SNPがCTLA-4遺伝子座に確認された。これらSNPのうち45を、先に報告した3つのSNPとともに、上記アプローチを用いてCTLA-4遺伝子座中にタイピングした。自己免疫疾患におけるこれらSNPの役割を調査するため、バセドウ病とこれらSNPとの関連を、-319、49、および1822のこの遺伝子座で知られた3つのSNPの関連と共に調査した。
【００７７】
これらSNPのうち28が、49および1822の2つの既知SNPを含めて、バセドウ病との関連を示した(p＜0.01)。-319の既知SNPは関連を示さない。したがって、26の新規SNPがバセドウ病との関連を示すことが確認された(表1参照)。
【００７８】
CTLA-4の開始MetコドンのATGのAをヌクレオチド+1で示す。+1の5'側のヌクレオチドを-1と数える(Antonarakis SEら、Hum Mutat. 1998; 11: 1-3)。したがって、CTLA-4遺伝子座中のSNPの位置は、開始MetコドンのATGのAと相対的なSNPの位置を表示する1つの数を用いて正確に確立することができる。
【００７９】
SNPは、contig AF225900上のその位置によっても名付けることができよう。
【００８０】
分析した各SNPの詳細、および疾患関連分析の結果は以下の通りである。
【００８１】
1)-34563T＞C(AF343)
contig AF225900における位置(bp):34714
配列領域(SNP、強調):
【化１】
2004523244.tif 000003
対立遺伝子頻度;
2004523244.tif 000004
確率(Odds ratio)=1.6、χ2=17.2、p=2.7x10-5
遺伝子型頻度;
2004523244.tif 000005
遺伝子型リスク比=1.65、χ2=17.6、p=1.5x10-4。
【００８２】
2)-23327G＞C(MH30)
contig AF225900における位置(bp):45950
配列領域(SNP、太字);
【化２】
2004523244.tif 000006
対立遺伝子頻度;
2004523244.tif 000007
確率=1.50、χ2=18.4、p=1.8x10-5
遺伝子型頻度;
2004523244.tif 000008
遺伝子型リスク比=1.71、χ2=18.4、p=9.9x10-5。
【００８３】
3)-14953G＞T(MH26)
contig AF225900における位置(bp):54324
配列領域(SNP、強調);
【化３】
2004523244.tif 000009
対立遺伝子頻度;
2004523244.tif 000010
確率=1.46、χ2=15.9、p=6.9x10-5、
遺伝子型頻度;
2004523244.tif 000011
遺伝子型リスク比 =1.49、χ2=16.4、p=2.8x10-9。
【００８４】
4)-12527G＞A(MH20)
contig AF225900における位置(bp):56750
配列領域(SNP、強調);
【化４】
2004523244.tif 000012
対立遺伝子頻度;
2004523244.tif 000013
確率=1.33、χ2=9.3、p=2.3x10-3
遺伝子型頻度;
2004523244.tif 000014
遺伝子型リスク比=1.47、χ2=10.1、p=6.3x10-3。
【００８５】
5)-11534T＞C(MH18)
contig AF225900における位置(bp):57743
配列領域(SNP、強調);
【化５】
2004523244.tif 000015
対立遺伝子頻度;
2004523244.tif 000016
確率=1.44、χ2=15.1、p=1.0xlO-4
遺伝子型頻度;
2004523244.tif 000017
遺伝子型リスク比=1.53をする、χ2=15.4、p=4.5x10-4。
【００８６】
6)-10914T＞C(MH17)
contig AF225900における位置(bp):58363
配列領域(SNP、強調);
【化６】
2004523244.tif 000018
対立遺伝子頻度;
2004523244.tif 000019
確率=1.30をする、χ2=7.9、p=4.9x10-3
遺伝子型頻度;
2004523244.tif 000020
遺伝子型リスク比=1.42、χ2=8.4、p=1.5x10-2。
【００８７】
7)-9914G＞T(MH15)
contig AF225900における位置(bp):59363
配列領域(SNP、強調);
【化７】
2004523244.tif 000021
対立遺伝子頻度;
2004523244.tif 000022
確率=1.29、χ2=7.5、p=6.0x10-3
遺伝子型頻度;
2004523244.tif 000023
遺伝子型リスク比=1.32、χ2=8.5、p=1.4x10-2。
【００８８】
8)-8916G＞A (MH13-1)
contig AF225900における位置(bp):60361
配列領域(SNP、強調);
【化８】
2004523244.tif 000024
対立遺伝子頻度;
2004523244.tif 000025
確率=1.30、χ2=8.0、p=4.8x10-3
遺伝子型頻度;
2004523244.tif 000026
遺伝子型リスク比=1.29、χ2=9.2、p=0.01。
【００８９】
9)-2871G＞A(MH2)
contig AF225900における位置(bp):66406
配列領域(SNP、強調);
【化９】
2004523244.tif 000027
対立遺伝子頻度;
2004523244.tif 000028
確率=1.29、χ2=7.5、p=6.2x10-3
遺伝子型頻度;
2004523244.tif 000029
遺伝子型リスク比=1.23、χ2=9.9、p=6.9x10-3。
【００９０】
10)-2201C＞T(MH1)
contig AF225900における位置(bp):67076
配列領域(SNP、強調);
【化１０】
2004523244.tif 000030
対立遺伝子頻度;
2004523244.tif 000031
確率=1.30、χ2=7.9、p=5.1x10-3
遺伝子型頻度;
2004523244.tif 000032
遺伝子型リスク比=1.29、χ2=9.5、p=8.5x10-3。
【００９１】
11)-1765T＞C(CT50)
contig AF225900における位置(bp):67512
配列領域(SNP、強調);
【化１１】
2004523244.tif 000033
対立遺伝子頻度;
2004523244.tif 000034
確率=1.32、χ2=9.4、p=2.1x10-3
遺伝子型頻度;
2004523244.tif 000035
遺伝子型リスク比=1.38、χ2=10.4、p=5.4x10-3。
【００９２】
12)-1577G＞A(CT53)
contig AF225900における位置(bp):67700
配列領域(SNP、強調);
【化１２】
2004523244.tif 000036
対立遺伝子頻度;
2004523244.tif 000037
確率=1.44、χ2=14.9、p=1.1x10-4
遺伝子型頻度;
2004523244.tif 000038
遺伝子型リスク比=1.57、χ2=15.3、p=4.9x10-4。
【００９３】
13)49G＞A(CT42)
(Harper et al (1991)J .Immunol 147 :1037-44.)
contig AF225900における位置(bp):69325
配列領域(SNP、強調);
【化１３】
2004523244.tif 000039
対立遺伝子頻度;
2004523244.tif 000040
確率=1.36、χ2=1.1、p=5.9x10-4
遺伝子型頻度;
2004523244.tif 000041
遺伝子型リスク比=1.52、χ2=12.1、p=2.3x10-3。
【００９４】
14)1822T＞C(CT55)
(Marron et al (2000) Diabetes 49:492-499)
contig AF225900における位置(bp):71098
配列領域(SNP、強調);
【化１４】
2004523244.tif 000042
対立遺伝子頻度;
2004523244.tif 000043
確率=1.41、χ2=14.0、p=1.8x10-4
遺伝子型頻度;
2004523244.tif 000044
遺伝子型リスク比=1.55、χ2=14.5、p=7.2x10-4。
【００９５】
15)6230G＞A(CT60)
contig AF225900における位置(bp):75506
配列領域(SNP、強調);
【化１５】
2004523244.tif 000045
対立遺伝子頻度;
2004523244.tif 000046
確率=1.60、χ2=26.3、p=2.9x10-7
遺伝子型頻度;
2004523244.tif 000047
遺伝子型リスク比=1.82、χ2=25.6、p=2.6x10-6。
【００９６】
16)7092G＞A (Jo37-3)
contig AF225900における位置(bp):76368
配列領域(SNP、強調);
【化１６】
2004523244.tif 000048
対立遺伝子頻度;
2004523244.tif 000049
確率=1.39、χ2=12.2、p=4.7x10-4
遺伝子型頻度;
2004523244.tif 000050
遺伝子型リスク比=1.55、χ2=12.8、p=1.7x10-3。
【００９７】
17)7134G＞A (JO37-2)
contig AF225900における位置(bp):76410
配列領域(SNP、強調);
【化１７】
2004523244.tif 000051
対立遺伝子頻度;
2004523244.tif 000052
確率=1.43、χ2=14.4、p=1.5x10-4
遺伝子型頻度;
2004523244.tif 000053
遺伝子型リスク比=1.56、χ2=15.0、p=5.7x10-4。
【００９８】
18)7982A＞G(JO36)
contig AF225900における位置(bp):77258
配列領域(SNP、強調);
【化１８】
2004523244.tif 000054
対立遺伝子頻度;
2004523244.tif 000055
確率=1.42、χ2=13.4、p=2.5x10-4
遺伝子型頻度;
2004523244.tif 000056
遺伝子型リスク比=1.47、χ2=14.9、p=5.8x10-4。
【００９９】
19)8173T＞C(JO35)、
contig AF225900における位置(bp):77449
配列領域(SNP、強調);
【化１９】
2004523244.tif 000057
対立遺伝子頻度;
2004523244.tif 000058
確率=1.43、χ2=13.7、p=2.1x10-4
遺伝子型頻度;
2004523244.tif 000059
遺伝子型リスク比=1.57、χ2=14.5、p=6.9x10-4。
【０１００】
20)8857A＞G(JO34)
contig AF225900における位置(bp):78133
配列領域(SNP、強調);
【化２０】
2004523244.tif 000060
対立遺伝子頻度;
2004523244.tif 000061
確率=1.60、χ2=24.4、p=9.7x10-7
遺伝子型頻度;
2004523244.tif 000062
遺伝子型リスク比=1.66、χ2=17.2、p=1.9x10-4。
【０１０１】
21)10242G＞T(JO31)
contig AF225900における位置(bp):79518
配列領域(SNP、強調);
【化２１】
2004523244.tif 000063
対立遺伝子頻度;
2004523244.tif 000064
確率=1.59、χ2=24.4、p=6.4x10-7
遺伝子型頻度;
2004523244.tif 000065
遺伝子型リスク比=1.64、χ2=24.6、p=4.4x10-6。
【０１０２】
22)10717G＞A(JO30)
contig AF225900における位置(bp):79993
配列領域(SNP、強調);
【化２２】
2004523244.tif 000066
対立遺伝子頻度;
2004523244.tif 000067
確率=1.46、χ2=16.9、p=4.0x10-5
遺伝子型頻度;
2004523244.tif 000068
遺伝子型リスク比=1.55、χ2=16.6、p=2.5x10-4。
【０１０３】
23)12311T＞C (JO27-1)
contig AF225900における位置(bp):81587
配列領域(SNP、強調);
【化２３】
2004523244.tif 000069
対立遺伝子頻度;
2004523244.tif 000070
確率=1.51、χ2=20.1、p=7.4x10-6
遺伝子型頻度;
2004523244.tif 000071
遺伝子型リスク比=1.61、χ2=19.9、p=4.8x10-5。
【０１０４】
24)16558T＞C(JO18)
contig AF225900における位置(bp):85834
配列領域(SNP、強調);
【化２４】
2004523244.tif 000072
対立遺伝子頻度;
2004523244.tif 000073
確率=1.41、χ2=13.2、p=2.8x10-4
遺伝子型頻度;
2004523244.tif 000074
遺伝子型リスク比=1.58、χ2=13.0、p＝1.5x10-3。
【０１０５】
25)19178T＞C(JO13)
contig AF225900における位置(bp):88454
配列領域(SNP、強調);
【化２５】
2004523244.tif 000075
対立遺伝子頻度;
2004523244.tif 000076
確率=1.40、χ2=10.3、p=1.3x10-3
遺伝子型頻度;
2004523244.tif 000077
遺伝子リスク比=1.63、χ2=4.4、p=3.6x10-2。
【０１０６】
26)21660T＞C (JO8-2)
contig AF225900における位置(bp):90936
配列領域(SNP、強調);
【化２６】
2004523244.tif 000078
対立遺伝子頻度;
2004523244.tif 000079
確率＝1.4、χ2=13.0、p=3.1x10-9
遺伝子型頻度;
2004523244.tif 000080
遺伝子型リスク比=1.58、χ2=13.1、p=1.4x10-3。
【０１０７】
27)22616A＞G (JO6-1)
contig AF225900における位置(bp):91892
配列領域(SNP、強調);
【化２７】
2004523244.tif 000081
対立遺伝子頻度;
2004523244.tif 000082
確率＝1.43、χ2=11.9、p=5.5x10-4
遺伝子型頻度;
2004523244.tif 000083
遺伝子型リスク比=1.61、χ2=12.5、p=1.9x10-3。
【０１０８】
28)24212C＞A(J03)
contig AF225900における位置(bp):93488
配列領域(SNP、強調);
【化２８】
2004523244.tif 000084
対立遺伝子頻度;
2004523244.tif 000085
確率=1.42、χ2=14.0、p=1.9x10-4
遺伝子型頻度;
2004523244.tif 000086
遺伝子型リスク比=1.60、χ2=13.7、p=1.0x10-3。
【０１０９】
T1DMファミリータイピング分析
英国の384組の罹患兄弟(sibling)ペアファミリーをBritish Diabetic Association Warren Repository (Davies (1994) Nature 371: 130-136)から得た。米国の287組の罹患兄弟ペアファミリーをHuman Biological Database Interchange (Lernmarkら、(1990) Am J. Hum. Gen. 47: 1028-1030)から得、その各々は、罹患兄弟の少なくとも1人が29歳以下の年齢で診断されていた。
【０１１０】
遺伝性T1DMを示す英国ファミリーにおいて5つのSNP：-23327G＞C(MH30)、-11534T＞C(MH18)、-1765T＞C(CT50)、49G＞A(CT42)、および6230G＞A(CT60)がタイピングされた。
【０１１１】
遺伝性T1DMを示す米国ファミリーにおいて9つのSNP：-23327G＞C(MH30)、-11534T＞C(MH18)、-2871G＞A(MH2)、-2201C＞T(MH1)、-1765T＞C(CT50)、-1577G＞A(CT53)、49G＞A(CT42)、6230G＞A(CT60)、および10242G＞T(J031)がタイピングされた。
【０１１２】
単一SNP対立遺伝子およびいくつかのマーカーハプロタイプの、ヘテロ接合性の親から罹患子孫(子)および非罹患子孫両方への対立遺伝子関連性、伝達を、TDTに基づいて評価した(Spielmanら、(1993) Am. J. Hum. Genet 52: 487-498)。伝達不均衡試験(TDT)は、ヘテロ接合性の親からの対立遺伝子またはハプロタイプの伝達を試験し、ある対立遺伝子またはハプロタイプがその他のものより優先的に伝達されることを評価する。該試験は、疾患関連対立遺伝子またはハプロタイプが、偶然に予期されるより高頻度に罹患した子供に伝達されることを想定している。
【０１１３】
ファミリーのデータを分析し、ハプロタイプの頻度をTDTphase(ftp://ftp-gene.cimr.cam.ac.uk/pub/software; Dudbridgeら)を用いて計算した。ケースコントロール試験のデータを分析し、ハプロタイプ頻度を、EMアルゴリズムを用いてハプロタイプ頻度を見積るcasecon(ftp://ftp-gene.cimr.cam.ac.uk/pub/software; Dudbridgeら)を用いて計算した。このソフトウェアは当該分野でよく知られており、インターネット(ftp://ftp-gene.cimr.cam.ac.uk/pub/software; Dudbridgeら)から利用可能である。
【０１１４】
確証関連分析
予備試験の結果を確認するため、二次分析を行った。最初のタイピング結果を確認し、潜在的不確実性を解明するため、この二次分析において下記のごとく鍵となるマーカーを再タイピングした。
【０１１５】
英国のT1DDMの-23327G＞C(MH30)および6230G＞A(CT60)、およびバセドウ病およびコントロールのMH30を、Invader(登録商標) SNPバイプレックスアッセイ(Third Wave Technologies Inc, Madison, WI)を用いて再タイピングした。-34563C＞T(AF343)もInvader(登録商標) SNPバイプレックスアッセイを用いてタイピングした。
【０１１６】
6230G＞A(CT60)および10242G＞T(JO31)を、TaqMan(登録商標)プローブ(Perkin Elmer Applied Biosystem, Foster City, CA)を用いてバセドウ病症例とコントロールにおいて再タイピングした。
【０１１７】
最初の分析に用いたInvader(登録商標)SNPユニプレックス分析を用い、-1577G＞A(CT53)を再タイピングした。
【０１１８】
再タイピングで最初のタイピングの結果を得ることができなかったコントロールは、図1に示す修正データから除外した。
【０１１９】
結果
3つのSNPが、遺伝性T1DMを示す英国および米国の両ファミリーにおいてタイピングされた；-23327G＞C(MH30)、49G＞A(CT42)、および6230G＞A(CT60)。-23327G＞C(MH30)は、英国と米国の両方のファミリーで疾患関連性を示すことがわかり、6230G＞A(CT60)は英国のファミリーにおいて疾患関連性を示すことがわかった。
【０１２０】
49(CT42)のこの遺伝子座の既知の関連SNP(Kristiansenら、(2000) Genes and Immunity 1: 170-184)は、この研究において両T1DMファミリーとの疾患関連性を示さない。
【０１２１】
図2は、英国および米国の両T1DMファミリーにおけるこの遺伝子座の、-23327(MH30)および6230(CT60)の各マーカーおよび2つのマーカーのハプロタイプの関連を示す。このデータは、図4に示す予備データ分析の結果を裏付ける。
【０１２２】
図2における関連の尺度は、親から子供へのハプロタイプの対立遺伝子の伝達率(非疾患関連対立遺伝子またはハプロタイプでは50%である)(a)、および-log(p値)(b)である。
【０１２３】
-23327(MH30)および6230(CT60)のこの遺伝子座におけるマーカーおよび2つのマーカーのハプロタイプは、図2において強い疾患関連性を示す。
【０１２４】
英国のT1DMファミリーのハプロタイプとの関連に関する予備的結果を表3aに示す。-23327(MH30)および6230(CT60)(これらの位置にヌクレオチドGを含む)のこの遺伝子座における2つのマーカーのハプロタイプ(1,1)は、T1DMと強く関連している。米国のT1DMファミリーも含む確証分析を表3bに示す。この分析において、不確実性を解明し、最初のタイピングの結果を確認するため鍵となるマーカーを再タイピングした。二次分析は、最初の分析において観察された関連性を裏付ける。
【０１２５】
-23327(MH30)および6230(CT60)のこの遺伝子座における2つのマーカーの他のハプロタイプは、英国のT1DMファミリーにおける防御的ハプロタイプである。
【０１２６】
英国のT1DMおよびバセドウ病の症例におけるハプロタイプの関連性についての予備分析を表4aに示す。最初のタイピング結果を確認し、不確実性を修正するために鍵となるマーカを再タイピングした確証分析を表4bに示す。データの二次分析は、最初の分析において観察されたハプロタイプの関連性を裏付ける。
【０１２７】
これらの結果は、-23327(MH30)および6230(CT60)のこの遺伝子座における2つのマーカーのハプロタイプ(1,1)がT1DMおよびバセドウ病の両方と高い関連があることを示す。ハプロタイプの頻度は、両疾患において同様であり、このハプロタイプが両疾患の共通の疾患感受性ハプロタイプであることを示唆する。
【０１２８】
-34563 (AF343)のマーカーは、高いD値が示すように(値D'=0がLDなしを意味する時、D'=1は完全なLDを意味する)、症例およびコントロールの両方で-23327(MH30)のマーカーと強い関連不均衡を示した。
【０１２９】
バセドウ病と、マーカ-34563(AF343)、-23327(MH30)、および6230(CT60)のハプロタイプの関連を表6に示す。これらマーカの(2,1,1)ハプロタイプは、バセドウ病と強く関連していることが示された。
【０１３０】
したがって、本明細書に記載のSNPはバセドウ病と強く関連している。あるポピュレーションにおいてI型糖尿病は、CTLA-4と以前は関連していなかった。しかしながら、本明細書に記載のデータから、この関連は、バセドウ病での関連と同じくらい強い。
【０１３１】
したがって、本明細書に記載のSNPおよびハプロタイプは、バセドウ病および1型糖尿病のようなT細胞関連自己免疫疾患の有効なリスクマーカーである。
【０１３２】
【表１】
2004523244.tif 000087
【０１３３】
【表２】
2004523244.tif 000088
1) Deichmann et al (1996) Biochem. Biophys. Res. Commun. 225: 817-818
2) Harper et al (1991) J. Immunol 147: 1037-44
3) Marron et al (2000) Diabetes 49: 492-499
【０１３４】
【表３ａ】
2004523244.tif 000089
【０１３５】
【表３ｂ】
2004523244.tif 000090
【０１３６】
【表４ａ】
2004523244.tif 000091
【０１３７】
【表４ｂ】
2004523244.tif 000092
【０１３８】
【表５ａ】
2004523244.tif 000093
【０１３９】
【表５ｂ】
2004523244.tif 000094
【０１４０】
【表６】
2004523244.tif 000095
【図面の簡単な説明】
【０１４１】
【図１】バセドウ病のための関連分析を示す。開始コドンのATGのAと相対的な位置を示す単一数を用いてCTLA-4遺伝子座中のSNPの位置をx軸に示す。y軸は-log(p値)を示す。P値は、χ2検定により計算した。
【図２】英国と米国の両T1DMファミリーにおける個々のマーカーMH30(-23327)、CT42(49)、およびCT60(6230)、ならびにMH30(-23327)およびCT60(6230)のハプロタイプの関連を示す。図2(a)において、関連の尺度は、親から子供へのハプロタイプの対立遺伝子の伝達率である(非疾患関連対立遺伝子またはハプロタイプでは50%である)。図2(b)に-log(p値)を示す。
【図３】図1に対応し、バセドウ病の関連分析の予備的結果を示す。
【図４】図2に対応し、T1DMのマーカーおよびハプロタイプの関連分析の予備的結果を示す。
【図１】
2004523244.tif 000096
【図２】
2004523244.tif 000097
【図３】
2004523244.tif 000098
【図４】
2004523244.tif 000099
【国際公開パンフレット】
2004523244.tif 000100
2004523244.tif 000101
2004523244.tif 000102
2004523244.tif 000103
2004523244.tif 000104
2004523244.tif 000105
2004523244.tif 000106
2004523244.tif 000107
2004523244.tif 000108
2004523244.tif 000109
2004523244.tif 000110
2004523244.tif 000111
2004523244.tif 000112
2004523244.tif 000113
2004523244.tif 000114
2004523244.tif 000115
2004523244.tif 000116
2004523244.tif 000117
2004523244.tif 000118
2004523244.tif 000119
2004523244.tif 000120
2004523244.tif 000121
2004523244.tif 000122
2004523244.tif 000123
2004523244.tif 000124
2004523244.tif 000125
2004523244.tif 000126
2004523244.tif 000127
2004523244.tif 000128
2004523244.tif 000129
2004523244.tif 000130
2004523244.tif 000131
2004523244.tif 000132
2004523244.tif 000133
2004523244.tif 000134
2004523244.tif 000135
2004523244.tif 000136
2004523244.tif 000137
2004523244.tif 000138
2004523244.tif 000139
2004523244.tif 000140
2004523244.tif 000141
2004523244.tif 000142
2004523244.tif 000143
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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