(57)【要約】本発明は、１つ以上の放射性核種が、沈積、吸着、固定されている表面上の任意の領域内のこれらの核種の量を同時量化する方法と装置に関する。これらの放射性核種は、上記の表面上の化学物質に種々の機構で結合された組織区域あるいはより大きな生物学的分子に組み込まれている化合物のマーカーの役目をなす。この方法は、異なるβ線放射性核種としるされた核種を用いてＤＮＡ小配列を推論するのに特に良く適している。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
検視表面上の任意領域内の１つ以上の放射性核種の量の同時量化方法であって、上記の検視表面には上記の核種が沈積、吸着、あるいは固定されていて、各放射性核種は、上記の検視表面上の化学的あるいは生物学的検視物質に沈積、吸着あるいは固定されている目標組織区域、目標化合物あるいは生物学的目標分子に組み込まれた化合物のマーカーとしての役目をなすものにおいて、
検視表面の各領域から放射された粒子と光子との少なくともいずれか一方の位置とエネルギーとが登録されると共に、
各領域からの登録された情報が、その情報の適切な統計的評価によって、上記の領域に存在する各放射性核種の量と活動度との少なくともいずれか一方を絶対量で決定するのに用いられることを特徴とする放射性核種の量の同時量化方法。
【請求項２】
検視表面の各領域から放射された粒子と光子との少なくともいずれか一方の登録された位置とエネルギーが、エネルギー・バンド映像として記憶され集積される、すなわち、全検視表面上の各領域(r)に対するｋｍａｘエネルギー・ビンのベクトルとして記憶されることを特徴とする請求項１に記載した放射性核種の量の同時量化方法。
【請求項３】
上記の統計的評価が、最小二乗法と最尤法との少なくとも一方を含み、
最小二乗法によると、各放射性マーカーに対する前もって記録されたエネルギー・スペクトルの直線的組み合わせ、すなわち各放射性核種からの分担分である未知の係数が、エネルギー・バンド映像(測定された複合エネルギーの分布図あるいはベクトル)の映像要素あるいは領域からのデータに合せられ、
最尤法によっては、各放射性マーカーに対し測定されたエネルギー・スペクトルが、各エネルギー・ビンにおける各放射性マーカーからの最も可能な突き当たり数を発見するのに用いられ、この数により登録されたエネルギー分布図あるいはベクトルが表され、よって、各放射性核種から生じる事象の合計数を提供することを特徴とする請求項２に記載した放射性核種の量の同時量化方法。
【請求項４】
検視領域が２００μｍ未満の直径を有する生物学的小配列と、検視領域が３００μm以上の直径を有する生物学的大配列とに用いられることを特徴とする請求項２または３に記載した放射性核種の量の同時量化方法。
【請求項５】
α、β、γあるいは陽電子と光子との少なくともいずれか一方を放射し、検視面上の検視領域から約１から１００ベクエルに放射能が調整されるように、目標分子に組み込まれる１つ以上の放射性核種の量の量化に用いられることを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載した放射性核種の量の同時量化方法。
【請求項６】
部分的におよび/または完全に重なり合うエネルギー・スペクトルを生じる、β放射性核種を含む非単一性放射性物質に用いられることを特徴とする請求項５に記載し放射性核種の量の同時量化方法。
【請求項７】
β線放射性核種が３３Ｐと３５Ｓとを含むことを特徴する請求項６に記載した放射性核種の量の同時量化方法。
【請求項８】
ある細胞種あるいは腺からの見本における全ｍＲＮＡ対象物を、標準の細胞種あるいは腺からの見本と比較してモニターするのに用いられることを特徴とする方法であって、
０時には適切な濃度の平行細胞培養体からなる培養媒体にａ３５Ｓ−ＵＴＰとａ３３Ｐ−ＵＴＰが加えられ、
次いで、それらの細胞は時間１迄成長せられ、時間１では、放射性核種が十分に組み込まれて、時間0から細胞に発生したＲＮＡを検出でき、
時間１では、１対の平行細胞が、化学的に処理されて、ＲＮＡ合成を阻止し、
時間２では、両細胞が採集されて、ＲＮＡが隔離され、両細胞から等量のＲＮＡが混合され、そして最後に
その混合物が、ｃＤＮＡの組み合わせ検出子として扱われて、生物学的小配列に交雑され、これから両放射性マーカーの全量が決定できることを特徴とする請求項７に記載した放射性核種の量の同時量化方法。
【請求項９】
放射性アミノ酸同位元素を媒体に組み込んで、構造化された数組の抗体を含む生物学的小配列に吸着させることによって、リン酸化の種々の組の蛋白度を同時にモニターするのに用いられることを特徴とする請求項１〜６のいずれかに記載した放射性核種の量の同時量化方法。
【請求項１０】
1つ以上の放射性核種が、沈積、吸着あるいは固定されている検視面上の任意の試験領域内のこれらの核種の量を同時に量化する装置であって、
上記の検視表面の試験領域から放射される放射性粒子または光子の突き当たり位置と沈積エネルギーをリアルタイムで測定する電子システムであって、両側に、各々、直交するｐタイプとｎタイプのストリップを備えた多数ストリップ半導体検出器と、各放射性事象検出器上の突き当たり位置(ｘ、ｙ座標)ならびに粒子あるいは光子の沈積ネルギーを検出することができる読出し電子装置とを備え、検視面を、その全表面に亘って半導体検出器と接触するように位置させることが出来る負荷システムが、半導体検出器を保護するため薄いマイラー箔によってのみ分離されているものと、
各登録された放射性事象の位置とエネルギーとの記録を取って記憶するリアルタイムのデータ編集モデュールであって、半導体検出器の各ピクセル(ｘ、 ｙ位置)に対する登録された事象をｋエネルギー・ビンのベクトルに分割して、エネルギー・バンド映像を形成するものと、
コンピューターモデュールであって、ハードウエアと、半導体センサープレートのいずれのピクセルあるいは濃縮された領域に存在する各放射性核種の量あるいは活動性を絶対量で決定するため上記のエネルギー・バンド映像を使用できるソフトウエアとからなるものと、
半導体センサープレートの各ピクセル、あるいは検視面上の特定の試験領域を横断する各放射性マーカーの活動性の分布を表示するためのモデュールとからなることを特徴とする放射性核種の量の同時量化装置。
【請求項１１】
放射性粒子あるいは光子の突き当たり位置と沈積エネルギーとをリアルタイムで測定するための読出し電子装置であって、
プリアンプリファイアーとフィルターとのユニットと、トリガー・ユニットと、サンプル・ホールド・ユニットとを各ストリップに対し平行に構成されてなる１つのアンプリファイアー・チャネルと、
上記のアンプリファイアー・チャネルと連携するデータ取得システムであって、半導体センサープレートの感度部分に当たる全ての登録された放射性事象の位置(ｘ, ｙ)とエネルギーの記録を取ることが出来るものからなることを特徴とする請求項１０に記載した放射性核種の量の同時量化装置。
【請求項１２】
半導体検出器が、大きさ１０cm2、厚さが約３００μｍである単一半導体材料の二次元板からなり、６４×３２mm2の感度面積を有し、上記の半導体板の両側のｎタイプ感度バンドとこれと直交するｐタイプのストリップのストリップ・ピッチが５０μｍであり、合計で１２８０×６４０のストリップあるいは８２００００ピクセルの二次元格子を生じることを特徴とする請求項１０または１１に記載した放射性核種の量の同時量化装置。
【請求項１３】
負荷機構および半導体検出器、異なる種類の放射能を検出できるよう、半導体プレートが取り外され、類似のピクセル設計且つ大きさであるが、その他の半導体材料からなるもう１つの半導体プレートと取り替えることができるようになされていることを特徴とする請求項１０から１２のいずれか１項に記載した放射性核種の量の同時量化装置。
【請求項１４】
半導体板が、Ｓi、ＧａＡｓ、ＣｄＴｅあるいはＣｄＺｎＴｅの１つからなる単一板であることを特徴とする請求項１３に記載した放射性核種の量の同時量化装置。
【請求項１５】
装置のコンピュータ・モデュールが、最小二乗法あるいは最尤法によって、半導体センサープレートの各ピクセルに対する登録されたエネルギー・スペクトルの各放射性マーカーからの分担分を絶対量で分離あるいは決定するため、各ピクセルのｋエネルギー・ビンの登録されたベクトルの情報を用いるソフトウエアからなり、上記の最小二乗法では、各放射性マーカーに対し前もって記録された予想エネルギー・スペクトルの直線的組み合わせが、各測定された複合エネルギー・スペクトルに合わされ、上記の最尤法では、各放射性マーカーに対する予想エネルギー・スペクトルが、登録されたエネルギー分布図を提供する各エネルギー・ビンにおける各放射性マーカーからの突き当たりの最も可能な数を発見するのに用いられることを特徴とする請求項１０から１４のいずれか１項に記載した放射性核種の量の同時量化装置。
【請求項１６】
各登録された放射性事象の位置とエネルギーとの記録をとり、記憶し、半導体検出器の各ピクセル(ｘ、ｙ位置)に対する登録された事象をｋエネルギー・ビンのベクトルに分割するリアルタイム編集モデュールが、全ての隣り合うピクセルのベクトルからの情報を中央ピクセルのベクトルに加えることによって、計算時間を省き、ディジタル地図の仮想解像を検視面の物理的平面解像に合致させ、および/または見積もった分担分の統計的正確さを増すことを特徴とする請求項１０から１５のいずれか１項に記載した放射性核種の量の同時量化装置。
【請求項１７】
リアルタイムデータ編集モデュールが、幾列もの取り巻くピクセルを加えて、仮想解像を検視面の荒い配列に合致させる、すなわち、１つの列を加える場合は、中央ピクセルを取り巻く全ての８つの隣り合うピクセルが中央ピクセルに加えられ、２の列が加えられる場合は、第１列の全ての８ピクセルと第２の取り巻く列の１６ピクセルが、中央ピクセルに加えられることを特徴とする請求項１６に記載した放射性核種の量の同時量化装置。
【請求項１８】
検視面上の各試験領域の各放射性核種の決定された活動性を示すモデュールが、検視面を示す仮想図の形態のデータを示すグラフィック手段からなり、このグラフィック手段では、各放射性核種が、区別しうる色で示され、検視面の各試験領域での各放射性核種の決定された量が対応する色の強さで示され、色尺度が生物学的配列の仮想図に創りだされ、この色尺度が、従来の蛍光体技術からの出力に匹敵することを特徴とする請求項１０から１７のいずれか１項に記載した放射性核種の量の同時量化装置。
【請求項１９】
各放射性核種の決定された活動性を示すモデュールが、分布図の形態でデータを示す手段からなり、上記の分布図は、検視面の各試験領域に対する各放射性核種の量を絶対量で示すことを特徴とする請求項１０から１７のいずれか１項に記載した放射性核種の量の同時量化装置。
【請求項２０】
エネルギー・バンド映像の全てのバンドを１つの総映像に加えることによって、生物学的配列上の各試験箇所の最上方、最下方、最左方と最右方位置により物理的広がりを決定する手段を備え、上記の総映像のｘ軸およびｙ軸投影を計算し、生物学的配列が０.１°の工程で回転されるとこの方法を繰り返し、複数列の箇所を、総映像のｙ軸投影の変化からのｘ軸と調心し、その投影の中に復数列及び複数柱の箇所を位置せしめるのに用いることを特徴とする請求項１０から１９のいずれか１項に記載した放射性核種の量の同時量化装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、放射性核種が沈積、吸着あるいは固定されている表面上の任意の領域内の１つ以上の放射性核種の量を同時に量化する方法および装置に関する。
これらの放射性核種は、上記の表面上の化学物質に種々のメカニズムにより結合された、組織部分あるいはより大きな生物分子に、特に、組み込まれた化合物のマーカーの役割を果たす。この方法は、異なるβ線を放射する放射性核種の名が付けられている核種を用いてＤＮＡ小配列を推論するのに特に適している。
【背景技術】
【０００２】
生体組織における何千もの遺伝子とその産物、即ちＲＮＡとたんぱく質は、複雑で総合的な方法で作用して、生命の神秘を創造すると広く信じられている。然し、分子生物学における従来の方法は、一般に、1実験で1遺伝子ベースで為されていて、遺伝子の作用について全体的な絵図を得ることが困難である。よって、生物学的小配列は、完全な１組の遺伝子とその産物を同時に検討する機会を与えるので、近年出てきた、生物学的研究における最も有効な新しい手段の１つである。
【０００３】
小配列とは、生物分子の既知および未知の見本と合わせるための媒体を提供する、試験板上の見本箇所において不動になった生物分子の順序配列である。試験板上の不動分子は応々にして検出子であって、試験用の見本からの生物分子は目標分子である。検出子と目標分子とが生物分子の特定の補完対を形成する場合は、試験箇所の順序配列が、生物体から取った試験見本の特定の生物分子の正体を識別するためと、これらの分子の数度を決定するために用いることができる。補完的生物分子の典型的例は、交雑対のＤＮＡ、遺伝子対反遺伝子等である。小配列においては、見本箇所は、例えば、直径２００μｍ未満であるが、例えば、３００μｍ以上の直径の見本箇所を有する大配列がここで記載されている。
【０００４】
生物学的小配列技術は、診療、新しい遺伝子とたんぱく質の識別と発見、薬物の発見、薬学的及び毒物学的研究等の数多くの用途に応用されている。この技術は、いくつかの源、例えば、健康な細胞および腫瘍細胞からの生物学的構成要素が同列に吸着される比較試験にも用いることが出来る。
【０００５】
生物学的小配列の中でも、特に、近年注目を引いている1つの種類があり、それはＤＮＡ小配列である。この特徴は、１つのチップ上の全ゲノム(片親の全染色体)をモニターし、これにより何千もの遺伝子間の相互作用を同時により良く描くことができる。
【０００６】
一般に、ＤＮＡ小配列による生物学的活動を決定する従来の方法は次のようである。
幾撚りもの検視ｃＤＮＡ(特に、５００−５０００の塩基長さ)を特定の順序配列で固体板(特に、ガラス板)上で不動にする。そしてこの検視ｃＤＮＡを(試験見本からのｃＤＮＡとしるしをつけられた)1個あるいは数個の目標物に、別個あるいは混合して晒す。ｃＤＮＡとしるしをつけられた目標物は、試験見本から抽出されて、特定のマーカー分子としるされたＲＮＡの見本から逆トランスクリプターゼ(転写酵素)により酵素的に製造される。見本の逆転写されたＲＮＡ転写物は、小配列上の検視ｃＤＮＡと交雑される。よって、各目標ｃＤＮＡの量と種類とは、小配列上の各試験箇所における各マーカー分子の位置と濃度とを測定することによって決定できる。この理由は、各試験箇所からのマーカー信号が、小配列上の各試験箇所での各特定転写に対する相対的な転写量を反映するからである。見本の変化を無くすため、２つの競合する見本間の信号比を測定するのが好ましい。
【０００７】
蛍光性核種
従来、この技術を用いる信号の検出は、試験管内で組み込まれ、適切な蛍光体の名が付けられている核種に基づいていた。すなわち、識別力のある色の蛍光体(蛍光分子)が、各見本から抽出されたＲＮＡに各々挿入される。こうして、識別力のある色の蛍光体と名づけられた核種は、目標のｃＤＮＡに組み込まれ、このｃＤＮＡは検視ｃＤＮＡに交雑される。蛍光体は、異なる波長によって刺激され、また同様に異なる波長を出す。一般に、レーザー光線と、２つ以上のｃＤＮＡ対象物から信号を分離させるための適当なフィルターを用いるとこれが達成される。
【０００８】
然し、始動材料の一般的な必要量は全RNAの５０μgの範囲、即ち、ほぼ５×１０７の細胞当量である。この比較的高い量の材料のため、多数の非常に関連する用途から、診療書の診断を含む標準の技術の使用を排除する。この感度の欠如の１つの非常に重大な要因は、ＲＮＡからｃＤＮＡの逆転写における現在の蛍光性核種の低い組み込み率である。よって、比較的少ない数の蛍光体だけが合成されたｃＤＮＡにより組み込まれる。また、蛍光性核種は、一般には、細胞組織を通して含められないので、細胞培養によって蛍光を組み込むことを必要とする用途は排除される。より良い信号強度を得るための傑出した技術は、見本材料の酵素的増幅および化学的な信号の増幅を含む。そのような方法は、見本の大きさを小さくすることが出来ることを示す。
【０００９】
見本の大きさを、１００ngの全ＲＮＡ始動材料[Ｉ]に減少させる増幅技術が最近公にされた。これは、ＲＮＡとｃＤＮＡとの間での一回以上の循環により達成される。この反応では、一方ではＴ７プロモータを付けてＲＮＡを生じさせると共に、他方ではある種の逆トランスクリプターゼの特徴を用いて、最初の逆トランスクリプターゼ時に最大の５´端の全てのｃＤＮＡに特定の核分子を加えて１サイクルで、始動材料をほぼ５０倍増加させることが出来る。この特徴は、長さの短いｃＤＮＡの発生を回避するのに必要である。
【００１０】
別の方法は、化学的手段により試験材料からの信号を増幅することである。今まで用いられていた最も感度の良い方法は、組み重なり、絡み合った分岐合成ＤＮＡ分子［２，３，４］に依存する。これらは、配列交雑の前に、ｃＤＮＡのポリ−Ａ尾状部に結合される。一般に、信号の強度が２５０倍増加する。
【００１１】
これらの方法のいずれも、信頼ある実績と感度レベルについて厳密に試験されていないが、増幅技術は、その方法の酵素的性質に、異なる転写のためのｍＲＮＡ長さが大きく変化する事とが相俟って始動材料のバイアス(偏り)の程度にまで到りがちである。
【００１２】
多量の試験材料が、適切な信号長さを得るのに必要であり、使える蛍光体が、逆トランスクリプターゼ酵素により許容されるのには困難であるという問題で従来例にはかなりの短所がある。
【００１３】
放射性核種
逆トランスクリプターゼ酵素では許容度が低いという問題は、核種を識別するため放射性アイソトープを用いることにより解決できることが知られている。
今迄、放射性アイソトープが、核酸の感度の良い検出と量化のため広く用いられていた。通常の使用は１個の通常β線を放射する放射性核種に限定されていて、これが検出子(検出核酸)に組み込まれるか、直接試験管に入れられる。検出は、液体発火あるいはγ計数器を用いて行われ、二次元分布(例えば、ノザンブロット法とサザンブロット法)の場合、オートラディオグラフィ・フィルム、燐光性映写機およびディジタル・オートラディオグラフィ・システムが使用される。
【００１４】
組織の薄い区域における放射性化合物の分布あるいはノーザンとサザンの両核酸ブロットの測定は従来オートラディオグラフィ・フィルムで行われており、この方法はまだ精密な解像の検討に普通に選ばれている。然し、ダイナミック・レンジが限定されているし(単に１.５−３の次数の大きさ)、感度が低く、労力がかかり、決定も不正確である。
【００１５】
貯蓄燐光スクリーン映写システムは、オートラディオグラフィ・フィルムよりはるかに感度が良く、３２ＰのＸ線フィルムより２５０倍以上感度が良く、１４Ｃおよび３５Ｓの直接オートラディオグラフィ・フィルムより６０−１００倍以上感度が良い。これらのシステムのリニア・ダイナミック・レンジは、４−５の次数の大きさで、量化方法は、フィルムの場合よりはるかに確実であるという結果を出している。然し、最小限界以下の活動度を有する領域は正確には量化されないし、活動度分布の測定の正確さが限定されるのは避けられない。
【００１６】
２つの後者のラディオグラフィ理学療法の大きな実際の問題は、未露出あるいは過剰露出を避けるよう映像を得る前の露出時間を知ることが必要だということである。特に、フィルムだと、露出時間は数ヶ月になる場合、露出時間を悪く見積もると、かなりの時間の浪費になる。
【００１７】
上記の２つの後者のラディオグラフィ理学療法に伴う問題は、直接事象を検出するディジタル・システムを用いることにより大幅に解決できる。これにより絶対的直線性のある結果を与え、計数率は電子の速度によってのみ限定され、何時でも累積映像を検閲できるので、露出時間を正確に見積もる必要は無い。利用できるシステムの幾何学的解像は、フィルム技術のものと競合できるものではないが、燐光スクリーン映写システムと類似点がある。
【００１８】
然し、これらの技術は、異なる非単一エネルギー核種から分担分を分離することができないので、生物学的小配列上の同じ箇所における２つ以上の異なる放射性放射源の同時量化には適用できない。これにより、明らかに、1つ以上の見本、例えば、健康な細胞と腫瘍細胞の活動性を同時に比較したいと思う全ての用途に適用されない。よって、全階級の重要な診断および研究は、核種とその他の生物学的分子との少なくともいずれか一方と放射性アイソトープとを絡ませることによる恩恵に預かれない。
【００１９】
また、我々の知識では、従来のラディオグラフィ法を行う既知の方法及び装置は、全て、一時には１つの放射性核種しかなくアイソトープの数が限られている表面上の全ての分子を識別することのみに限定されている。よって、生物学的小配列の各場所における２つ以上の異なる放射性核種の放射能あるいはその強度を同時に決定するための一般的な方法が必要である。平行孔のコリメータ(視準望遠鏡)を備えたγカメラが、表面上のγ線を放射する幾つかの放射性核種の分布を同時に測定するのに用いられるが、このカメラは、ミリメートル以下の尺度で空間が広がる構造を解像できない。
【非特許文献１】
Wang, E., Miller, L.D., Ohnmacht, G.A., とLiu, E.T. (2000), "High-fidelity mRNA amplification for gene profiling", Marincola FM Nat Biotechno, 18(4), 457-459.
【非特許文献２】
Nilsen, T. W., Grayzel, J. とPrensky, W. (1997), "Dendritic Nucleic Acid Structures", J, theor. Biol., 187, 273-284.
【非特許文献３】
Wang, J., Rivas, G., Fernandes, J. R., Jiang, M., Paz, J. L. L., Waymire, R., Nilsen, T. W., と, Getts, R. C. (1998), "Adsorption and Detection of DNA Dendrimers at Carbon Electrode", Electroanalysis, 10, 553-556.
【非特許文献４】
Wang, J., Jiang, M., Nilsen, T. W., とGetts, R. C. (1998), "Dendritic Nucleic Acid Probes for DNA Biosensors. "J. Am. Chem. Soc., 120, 8281-8282.
【非特許文献５】
Kvinnsland, Y. とSkretting, A. (2000), "Methods for separation of contributions from two radionuclides in autoradiography with a silicon strip detector", Phys. Med. Biol., 45, 1183-1193
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２０】
本発明の目的
本発明の主目的は、識別し得るように放射性アイソトープとしるしが付けられ、それから基板に沈積させられた生物学的分子の検視列に吸着される1つ以上の目標生物学的分子の同時量化および／または比較を行う方法及び装置を提供することである。この方法は、上記の問題をほぼ削除するか減少させる。
【００２１】
本発明のもう1つの目的は、β線を放射する放射性核種を顕著に分布して印を付け、ＤＮＡ小配列へ吸着される２つ以上のｃＤＮＡを同時に決定する特定の方法および装置を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００２２】
上記の目的は、以下の記載と添付クレームに記載されている特徴により得られる。
本発明の目的は、
ａ）検出器の表面に当たる各粒子／光子の位置およびエネルギーを記録することができ、
ｂ）リアルタイムで再配列とデータの演繹を行うことができ、
ｃ）再配列されたデータから、検視表面の任意の領域内に存在する２つ以上の放射性核種の量を、例えば、オートラディオグラフィ画像における２つの放射性核種から分担分を分離するための、本発明者５人のうち２人によって最近公開された方法によって同時に見積もることができるディジタル検出システムを用いることによって達成できる。
【００２３】
上記ディジタル検出システムあるいは装置は、器具の検出システムに侵入する各放射性粒子の沈積したエネルギーおよび位置を登録して記録することのできる小さな放射性見本を検出し造影するための電子装置を含む。この装置は、米国特許第５６５６８１８号およびＥＰ特許第０９８３７０５号に開示されている器具を更に改良したものである。両特許は番号のみ記載している。その器具の操作原則は、上記に引用した両特許に開示されている器具と殆ど同じである。よって、ここでは、本発明の器具の操作原則の概略のみ述べる。その器具は、２つの主部品からなる。
【００２４】
１．１枚の板に設計された両側面を有する一直線状半導体ストリップ検出器。
この板は、好ましくは、生物学的小配列より大きいか、少なくとも同等の表面積を有するのが好ましい。典型的な大きさは、約１０cm2の面積で約３００μｍの厚さである。半導体の表面の１側は、感度の良いｐ−タイプ材料の平行帯(ストリップ)で覆われており、その反対側は、ｎ−タイプの材料の平行帯(ストリップ)で覆われている。ｎ−タイプの帯は、ｐ−タイプの帯に直交しており、よって、両帯の各交差上にはｐｎ−ダイオードが形成され、よって、帯はマトリックスを形成し、このマトリックスは、放射性粒子の命中位置を２次元的に読む。即ち、ｐｎ-ダイオードが逆バイアスされる限り、放射性粒子がダイオードの塊に浸入すると、これらが連結されている２つの直交する帯の所で電流パルスで応答する。帯のピッチは、例えば、約５０μｍである。よって、６４mm×３２mmの高感度領域では、１２８０×６４０ のストリップがあり、器具に８２００００ピクセル(画素)の２次元グリッドを与える。半導体検出板は、α、β、γおよび陽電子放射を含む全ての種類の放射性粒子に応答するようになされている。放射能のエネルギーレベルと種類により、Ｓi、ＧaＡs、ＣdＴe、あるいはＣdＺnＴeなどの一直線状板を使用することができる。
【００２５】
２．検出器からの信号を読み出す電子システム。
このシステムは、検出板を取り囲むマルチチップモデュール(ＭＣＭ)からなり、幾つかの平行なＦＥチップ(ＳＳＩＣ)を備え、このチップは、各々、プリアンプリファイアー(前置増幅器)および騒音フィルター増幅路の配列を有する。検出器に当たる各放射性粒子に対しては、最大の信号に、２つ以上の隣接する帯域(ストリップ)の信号をプラスしたものを保持する検出器、ｘおよびｙストリップからのチャージがそのチャージ信号を、対応するＦＥチップにおける対応チャネルによって集積されフィルターされて、粒子のエネルギーを与える。一般に、打ち当たる放射性粒子は、検出板の大部分の材料をイオン化することによりそのエネルギーを蓄積する。よって、粒子のエネルギーは、検出板の実際の帯内に記録された信号の振幅の総計に比例する。ｘおよびｙ側の増幅された信号は、データ取得システム(ＤＡＱ)によって、ＭＣＭから読み出され、管理コンピュータが、打ち当たる放射性粒子のｘ−ｙ座標データを事象のエネルギーと共に受け取る。
【００２６】
半導体技術と高度な総合読み出し電子装置との、この特殊な組み合わせを用いることにより、器具の検出板に浸入する各放射性粒子の位置とエネルギーとを記録する、非常に感度が良く、正確で、確実な器具が得られる。よって、検出板を生物学的小配列に近接させることにより、生物学的小配列上の各試験箇所からの放射能を測定できる。異なる種類の放射に向いた適切な器具を作成するためには、同じ大きさだが、異なる積層半導体材料で作成され、総合読み出し電子装置に簡単に挿入される複数の置換可能な検出板を器具に備えることが考えられる。よって、例として、β線放射に良く応答するシリコンで作成された検出板を用い、γ線放射物体と絡らまった生物学的小配列を調査したい場合は、シリコン検出板をγ線放射に良く応答するカドミウムー亜鉛―テルルで作成された検出板と代えることにより直ぐにこれに対する準備が出来る。
【００２７】
記録中は、小配列ガラス板の面を下に向け、１.３μｍ厚さのマイラー箔で分離して、器具の半導体検出板に近接して置く。こうして、ｐｎ−ダイオードの二次元模様により、検出システムは、入ってくる放射性粒子のエネルギーとそれの源である生物学的小配列上の位置との両方を登録する。このことは、合計された放出濃度が、非常に低くて器具が放出事象を１つづつ登録できることを意味する。確実に測定できる最大の活動度は、宇宙背景放射線(約１Ｂｑ)から１０ＭＢｑまでの全表面範囲内であるが、多くの実際の用途には、４−６ ｋＢｑに限定するのが好ましい。
【００２８】
然しながら、β線放射物の場合、これらは幾つかのエネルギーレベルを放射し、通常連続するエネルギー・スペクトルを形成するので、活動度の比較および／または同時決定には一般的な問題がある。即ち、良く識別できる中間エネルギーを持つβ粒子を放射する２つの放射性アイソトープを用いても、登録された粒子エネルギーにより２つのアイソトープのどれから登録された粒子が出てきたのか決定できない。然しながら、２つのアイソトープのエネルギー・スペクトルは、各放射性核種毎に別個に測定でき、アイソトープが十分に異なるスペクトルを有する限り、これらのスペクトルは各アイソトープからの分担分を分離するのに用いることができる。
【００２９】
本発明による方法では、アイソトープのエネルギー・スペクトルが、放射されたβ粒子の全エネルギー・スパン(部分空間)を、ｋｍａｘが２０以上であることが好ましい正の整数であるｋｍａｘの離散エネルギー・ビンのベクトルに分割して形成される。すなわち、各領域では、検出面上ではrである、登録されたβ粒子は、k番目のエネルギー・ビンのどれに属するかによって、分類される。よって、検出面上の各領域のアイソトープの実際のエネルギー・スペクトルである
【数１】
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の離散ベクトル式が得られる。
【００３０】
リアルタイムのデータ再配列とその後の可能な減数の結果、器具は、前もって設定された測定期間の最後に、kエネルギー・バンド(エネルギー・バンド映像)を含む映像の形態の映像情報を提供する。上記の映像は、赤、青、緑色等としてこれらのバンドを含む色映像に類似するものである。Ｅi,j,kと称されるエネルギー・バンド映像の1つの要素は、ディジタル座標i,jで記録されているk番目のエネルギー間隔内の粒子の数を含む。
【００３１】
どの映像領域ｒにたいしても、登録された離散エネルギー柱図表Ｅｒｋは、実際の放射性アイソトープの各々からの既知のエネルギー・スペクトルの直線的組み合わせである。以下に、２つのアイソトープが使われる場合の方法を示すが、この方法は幾つのものアイソトープにも応用できる。その既知のエネルギー・スペクトルは、エネルギー・バンド映像の取得に用いられたように同等のエネルギー・ビンで取得され、全てのビンの合計が1に等しくなるよう標準化されると以下のように計算される。
【００３２】
アイソトープの純粋見本ＡおよびＢの各々で得られたビンｋでのエネルギー・スペクトルをＳＡＫおよびＳＢＫと称する。更に、アイソトープＡおよびＢ、各々から領域ｒ内の未知の分担分(記録された総放射数)をａｒおよびｂｒとする。基準スペクトルのエネルギー・ビンは、実際の測定のデータ取得中に用いられるものと同じで、エネルギー・バンド映像(Ｅｒｋ)に到る。
だから
【数２】
2004523233.tif 000004
【００３３】
これらの関係は、検査面上の各領域に対する分担分ａｒおよびｂｒを見積もるため５番目の論文の上記したアルゴリズムの１つに用いることができる。この論文には２つの一般的なアルゴリズムである最小二乗法(ＬＳ)と最尤法(ＭＬ)のことが言われている。両方がここで基準として組み込まれており、言っておく必要のあることは、ＬＳアルゴリズムが最も簡単で、ＭＬアルゴリズムよりも計算力がかなり少なくてすむが、見積もりが僅かばかり不正確だということである。よって、以下の記載には、ＬＳアルゴリズムに焦点を合わせるが、両方のアルゴリズムも本発明に組み込まれていることを強調する。
【００３４】
原則として、ＬＳアルゴリズムは次のようになる。目的は、ａｒおよびｂｒの分担分のどちらが、
【数３】
2004523233.tif 000005
で得られる全てのベクトルでＳｒが小誤差合計を与えるかを発見することである。
【００３５】
極小値は次の(３)式により決定される。
【数４】
2004523233.tif 000006
【００３６】
上記したように、この方法は、２つのアイソトープからの分担分を決定するものである。然し、この方法は、上記式の各追加のアイソトープに、単に"Ｓｃｋ*ｃr"の類の言葉を追加することにより如何なる数のアイソトープにも用いることができる。
【００３７】
実際、この方法は以下のように用いられる。
検出板の各ピクセルijにたいしては、ｋｍａｘ計数を備えたベクトルＥijkが器具の記憶装置に設定されている。設定された全データＥijkは最初０に等しく設定されている。ｘ番目とｙ番目のピクセルがβ粒子を登録すると、適切なビンの数ｋを備えたｘ番目とｙ番目の計数は1つ増える。この方法は、十分な数の事象が登録されて、ネルギー・スペクトルの統計的式を提供するまで継続する。この統計的式は、ついで、アルゴリズムの１つに用いられ、検出面の各領域ｒに登録されたエネルギーヒストグラムにおけるアイソトトープＡおよびＢからの分担分を決定する。
【００３８】
広範囲の用途に使える可撓性のある器具を得るため、器具には多数のピクセルを含む非常に高い解像力のある検出板を備える。よって、多くの場合、生物学的小配列の解像度は検出板の解像度より荒くなる。これらの場合、隣接するピクセルから登録されたデータを中央ピクセルに加えることによって、濃縮されれば、かなりの計算時間を省くことができる。即ち、例えば、登録された事象を１つのピクセルに、そしてそれに最も近い周囲の全ての隣接ピクセル(合計９ピクセル)を中央ピクセルに加えることによって、解像度と計算の数は９因子分減少する。もっと荒い解像度を望むなら、２つの取り巻く列に全ての隣接するピクセル(合計２５ピクセル)等を含めることができる。こうして、より荒い検出解像を似せて画き(シムレートして)、これにより必要な計算工程を減少させる。領域への空間的濃縮により、また、生じる濃縮されたエネルギー・バンド映像における各要素Ｅrkに対する登録された事象の数の重要な増加を生む。よって、見積もられた分担分の統計的正確さが改善されることになる。
【００３９】
また、この方法には、各実際の放射性核種の予想されるエネルギー・スペクトルについての進んだ知識が必要である。これは、未知の見本を決定する前に実際の放射性核種各々の表面分布源で器具を校正することによって得られる。
【発明の効果】
【００４０】
校正手続きが、器具に自動手続きとして組み込まれていて、測定されたスペクトルが、検出板の片側(ｘ側)の各ストリップに対し得られる。これらのスペクトルの第１および第２モーメントを決定することにより、基準ストリップに対する原点オフ・セットおよび増加(ゲイン)が決定できる。(校正手続きには、隣接ストリップに蓄積されたエネルギーは考慮されない。）次いで、これらの校正データは、各検出された放射性核種の事象を訂正するためリアルタイムで使用することができる。また、この校正手続きは、分散した放射がスペクトルを変化させる外側光子(γ)源で生じる問題を回避する。
【００４１】
生物学的小配列を含むガラス板は、器具の主軸に対し僅かに回転してもよいので、回転角度は、小配列上の試験箇所が映像に正垂直列および正水平列を形成すると共に円柱を形成するように決定されなければならない。最適角度の決定は、以下のようになされる。合計の映像は、エネルギー・バンド映像Ｅijkにおける全てのバンドを加えること、すなわちインデックスｋの加重により形成される。この映像は、次いで、０.１度のステップで回転され、新しい角度毎に、ｘおよびｙ軸における映像の投影が、各々、計算される。最適角度は、変化の最大(即ち、最大対照変化)に対応する。投影は、マトリックスの上方位置、下方位置、最左方位置および最右方位置を決定するのに簡単に用いることができる。よって、試験箇所の識別が簡単で、その試験箇所によって占有される連携領域が識別できる。よって、各箇所が、１つの試験箇所によって占有される領域に対応する新しいエネルギー・バンド映像を創造することができる。これにより、最終結果の統計の正確さが著しく強化される。マトリックスの外側境界の決定は、また、マトリックスと仮想マトリックスとを相互に関連させることによって決定される。この手続きは使用者からのインプットを必要としない利点を持っている。
【００４２】
この方法と装置は、各アイソトープからの未知の量の重ね合わせである、登録されたエネルギー・スペクトルの放射性アイソトープからの分担分の同時決定に適した包括的なやり方として記載されている。この方法は、β線放射装置の場合、これらが重なり合うエネルギー・スペクトルを持っているので必要なのは明確であるが、もっと単一性エネルギー性質を持っているので、一般には互いには重なりあわない非常に明確なエネルギー・スペクトルを与えるその他の種類の放射線には不必要に思える。然し、本発明による方法は、重なり合うことがあり得るエネルギー分担分を分離するので、エネルギー差が小さい光子あるいは粒子を放射する放射性アイソトープを用いられるので、これらの場合にも有利である。また、この方法は、暗放射および避けられない分散による副次的登録の問題を自動的に処理するので、優れた正確さで決定をなす。この特徴は、全ての種類の放射にとって明らかな利点である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４３】
本発明を、添付図面と好ましい実施例とを参照しながら詳細に記載する。
上記のように、入り込んでくる放射性粒子の突き当たり位置とエネルギーとを登録する装置は２つの部品からなる。１つは、直交するストリップを備えた両面ストリップ検出板で、もう１つは、これを取り巻く読出し電子装置であって、放射性粒子の衝撃で検出板に生じて捕まえた信号を測定するものである。
【００４４】
図１ａは、上記の検出板の両面の直交ストリップの配置と、ストリップの交差点における検出板の内側のｐｎ結合(ダイオード)の形成とをしめす検出板(２)の概略をしめす。
【００４５】
検出板は、一般には、大体、物理学研究用検出器として用いられる、良く知られた装置である。β線放射を登録する場合は、処理された高抵抗率シリコンウエハから切断された長方形の１片である。代表的には、厚さ３００マイクロメータで、大きさは、数１０cm2である。実際的で、もっと特定的な例は、６.４cm×３.２cmの装置である。ピッチが狭くて、低効率が低いストリップがウエハの両側を横断して植えつけられている。一方の側のストリップは、他方の側のストリップに直交しており、一方の側の植え付けは、Ｐ＋であり、他方の側の植え付けは、Ｎ＋である。ストリップは、例えば、５０μｍの間隔をあけて配されており、上記の大きさの例では、一方の側では１２８０ストリップで、直交する他方の側では６４０ストリップとなる。ストリップのＰ＋／Ｎ＋の植え付けにより、各ストリップの交差はＰ＋／Ｎ＋(ＰＮ)結合となり、これは各交差点で小さいダイオードがあることを意味する。更に、この例の装置が、１２８０×６４０ｐｎ結合(ダイオード)の二次元的小配列からなり、これにより上記装置には位置解像映像特性を与える。活動するダイオードに対しては、バイアス電圧が、一方の側のストリップと他方の側のストリップとの間にかけられる。このバイアスはＰ＋側では、ダイオードを逆バイアスするため負でなくてはならない。ここでダイオードは逆方向にバイアスされ、極僅かな電流漏れが起きる。
【００４６】
放射性粒子が見本のマトリックスから放射され、検出板にはいると、検出器のバルク(直交ストリップ間)に浸入し、移動するにつれて結晶の内側にエネルギーを放出する。検出器の実際の使用に関連する多くの場合、その全てのネルギーを放出し最終的に停止する。放出されたエネルギーは、逆バイアスされたダイオードの列を含む塊をイオン化する。浸入角度によれば、１つ以上のダイオードは、移動する粒子によって影響されイオン化されたバルクを含む。影響された全てのダイオードは、このダイオードに対し粒子によって放出されたエネルギーに比例する、電荷の放出によるイオン化に応答する。よって、全ての影響されたダイオードにより放出された電荷を合計することによって、浸入する粒子におけるエネルギーがもともとどんなものだったか分かることができる。従って、両側を有する検出器は、個別の突き当たる粒子の位置とそれらのエネルギーとを測定できる検出装置になる。
【００４７】
大部分の粒子は、平面に直行ではない或る角度で検出器に浸入する(図１ｂ参照)。そこで普通の場合、粒子は或る角度で或る距離移動するに足るエネルギーを有しているので、幾つかのダイオードのバルクを通る軌跡を作る。ストリップを読むことがこれらのダイオードのｘおよびｙ投影しか提供しないので、交差したストリップの構造によりこれらがどのダイオードなのか正確には決定されない。すなわち、影響されたダイオードを含む長方形を識別することは出来る。そのような識別は、粒子が検出器のどの点に入ったかを見極める助けになり、従って、解像の質を高めるので、本発明では重要である。
【００４８】
前述のように、信号のエネルギーを測定することも、また、重要である。全エネルギーは、ストリップからの信号を合計することによって分かるが、ストリップのエネルギー・プロフィールは、粒子の浸入点の最終識別に必要なので、また、重要である。物理的特性により、バルクの中で移動する粒子は停止の際に材料を最もイオン化する。即ち、最高のエネルギーが測定されるストリップが、停止点の投影位置であるから、侵入点は、これを知ることによって決定できる。
【００４９】
シリコン検出器は、コンピューターへのストリップの電荷信号を読出す手段を持たなければ役に立たない。この読出しは、上記の項で記載した特定の特性の読出しを行うために発明された、それを取り囲む読出し電子装置によって行われる。検出器が役立つための最小の形態の電子装置は、各ストリップに増幅器を取り付け、検出器に生じた電荷を増幅器の出力の測定可能な電圧に移送するようなものである。増幅器の出力の電圧変化は、ストリップに取り付けられたダイオードによって放出された電荷の量に比例し、よって、また、このストリップに属する領域の粒子によって放出されたエネルギーにも比例する。図１ｂには、粒子のエネルギー配置がどのようにして増幅器により測定されるか示されている。粒子は、検出板の十字で示された点に入り、それから、図示されていないが、代表的には、矢印で示されているように水平移動構成要素と共に下方に移動する。影響されたストリップは、それに取り付けられた増幅器で電圧幅(Ｖ)を生じ、この出力は実際のストリップに蓄積されたエネルギー(Ｅ)を示す。実施例のストリップ信号幅は垂直棒によって示されている。一方の側の棒の合計は放出された粒子のエネルギーの総量を示し、上記したように、最高の棒は粒子移動の端部点を識別するのに用いられる。
【００５０】
実施例には極少数のストリップしか示されていないが、実際には、ストリップの数は多い。然し、影響されたストリップの代表的な数は、実施例に使われている数に近い。すなわち、この方法は、空間的な解像度を本質的に増加させるのに用いることができるが、比較的に見て、実施例に現れている状態には近くない。多くの用途において、影響されたストリップの唯１つのものを決定するだけで十分に許容できる。
【００５１】
コンピュターがストリップ信号を捕まえられるよう電子装置が使えるためには、各増幅器は、振幅測定ユニットと平行なトリガー・ユニットを伴わなければならない。これは図１ｃに示されている。第１のユニットは、所定の閾値を有する検波装置を含み、粒子が検出されたことをシステムに知らせる。他方のユニットは、サンプル・ホールドを含み、ストリップのエネルギーに依存する振幅値を記憶する。
【００５２】
図１ｄは、最初、粒子によって生じた適切なデータをシステムに移送する、取り巻く電子装置の全構造を示す。検出器の両側は同じ種類の電子を有し、ＡＳＩＣに統合されている。１つのＡＳＩＣでは所定数のチャネル用の空間しかないので、検出器の１方の側全て(全てのストリップ)を覆うよう幾つかのＡＳＩＣが相互に隣接して置かれる。チャンネルの後ろ側に示されている電子はこれらと同じチップの上にあるが、１つ以上のチップが平行に用いられる場合、あたかも全てが１つのチップの上にあるように作用する。従って、実施例は、あたかも一方の側の全ての電子が１つのＡＳＩＣに統合されているように解釈される。
【００５３】
そのようなＡＳＩＣの作用は以下の通りである。
全てのチャンネルは平行してストリップ上の信号を検出する。粒子が検出器に突き当たると、チャンネルの１つがこれをそのトリガー・ユニットにより検出する。実際には、１つ以上のチャンネルが同じ信号を検出できるが、内部調整により１つだけがすることになる。その検出をすると、トリガー信号が(ここでは記載されていない)外側のシステムに送られ、チップからデータを読み取るよう指示する。その作用を行うと、そのチップは、トリガーを発生したチャンネルの位置(アドレス)をシステムに提供し、また、引き続いて、相互作用の中央近くの多数のストリップの信号振幅もシステムに提供する。アナログ値が、上記のトリガーを発生したのと同じチャネルの振幅から始まり、複数方向のうちの1つの方向における隣のストリップ等の振幅に続く順序ストリームで移送される。反対方向のストリップが、他方向の読出しと同時に同じ方法で、同じ点から読まれる。この概念は素早い読出しと可撓性を提供する。可撓性が生じるのは、全てのストリップを走査する必要がなく、トリガー・ストリップに近いものだけを走査すればよりからである。前にも述べたように、この数は極僅かである。システムはどれだけのストリップを読みたいか選択できる。
【００５４】
システムの時計が、データ移送を同期させる。位置アドレスは、振幅値のストリーミングに亘って位置データライン上に停留する場合もあれば、しない場合もある。
【００５５】
検出器の他方の側は一方の側と同じ構造を持ち、上記したのとまさしく同じ方法で作用する。所望の位置情報を集める為には両側の読出しが必要である。
上記の検出板と読出し電子装置とを、データ取得ユニットおよび[５]で与えられたアルゴリズムの１つあるいは両方を行うことのできるソフトウエアを備えたコンピュータに接続することにより、小配列上の各放射性アイソトープからの分担分を決定する本発明の方法の好ましい実施例の概略が、図２および図３のように得られる。この例は、２つの区別のあるβ線照射物と記され、ＤＮＡ小配列に吸着されているＤＮＡ分子の活動性を決定する場合である。上記から、適切な時間範囲内でのβ放射を決定できるには、２つの放射性核種のエネルギー・スペクトルが本質的には区別できるもので、適切な減衰特性とエネルギー・レベルを有する必要がある。このための２つの適切な放射性核種は３５Ｐと３３Ｓである。これらのアイソトープの純粋見本のエネルギー・スペクトルが図４に示されている。
【００５６】
図２において、未知量のβ放射物３５Ｐと３３Ｓとを有すると記されたＤＮＡ小配列を含むガラス・スライドには数字１が付けられている。このガラス・スライドは、シリコンで作成された二次的集積構造の半導体検出板(２)の下方で、ＤＮＡ小配列が検出板で覆われるようにこれに押さえ付けらる。検出板(2)とＤＮＡ小配列は、厚さ１.３μmのマイラー箔(図示略)によって分離されている。こうして、β粒子が１つの放射性核種から放射されると、これは検出板(２)に突き当たり、β粒子を放射した放射性核種のほぼ直接上方にあるｐｎダイオードに小さな電流パルスを生ぜしめる。そしてこの装置の読出し電子システム(３)は、ピクセルの位置(ｘ−ｙ座標)、したがって、β粒子が出てきたＤＮＡ小配列上の実際の試験箇所を摘出する。電子装置は、また、β粒子のエネルギーを測定し、この情報をディジタル形態でデータ取得ユニット(４) に送り、このユニット(４)は全ての登録された事象を集積し、登録された位置とエネルギーに従って編集する。データ取得ユニット(４)は、ＲＡＭ記憶チップ、ハードディスク、フレキシブルディスク、ＣＤ−ＲＯＭ等のようなどの従来のディジタル記憶ユニットでもよい。
【００５７】
データ取得ユニットが、統計学的に信頼できる分析をするのに十分なデータを受け取ると、すなわち、Ｅijkの要素が十分な情報を保持すると、検出器からの事象の登録は停止する。
【００５８】
次いで、登録されたエネルギー・バンド映像は、前述したように領域に濃縮した後は、[５]で与えられたアルゴリズムの１つを用いて小配列の各試験箇所における各ピクセル用の各アイソトープの量を決定するソフトウエア・プログラム用インプットを構成する。すなわち、アルゴリズムは、より大きな箇所の場合は、各放射性核種が、どれだけ(幾つの登録された事象で)ＥijkあるいはＥrkに寄与したかを決定する。(適切な量化は、実際の放射性核種の核種半減期および検出感度(表面での活動性の単位当たりの登録事象)を知る必要がある。これらの手順は、図２および図３の目立った箱に概略がしめされている。これらの図は、最小二乗法アルゴリズムで決定される２つのβ放射性核種を用いて、ピクセルが９の因子(１層の全ての取り巻くピクセルが中央ピクセルに加えられる)で濃縮される場合をしめす。
【００５９】
この方法の１つの利点は、各試験箇所における各アイソトープの量が絶対量で決定されるということである。これにより、情報を提供するのに幾つかの選択が生じる。２つのアイソトープの場合の１つの選択は、各箇所におけるアイソトープの比率を決定し、これを生物学的小配列を示す仮想地図に提供することである。もう１つの選択では、１つの映像に、赤と緑の蛍光技術で得られた色を似させることができる。すなわち、一方の放射性核種の映像の強さを赤色に他方のものを緑色に振り分けることにより、赤と緑とを異なる割合で混合する色尺度が創作される。各放射性核種の絶対量を示すヒストグラム・チャート(度数分布図)を提供することもできる。
【００６０】
ＲＮＡの絶対量の決定
本発明の方法と装置との好ましい実施例の実行の可能性を、既知の量の３３Ｐと３５Ｓで印を付けたＲＮＡの絶対量を決定する場合を示す。
器具を調整後、ＤＮＡ小配列の測定前に、３３Ｐと３５Ｓのスペクトルを以下のように別個に測定した。
放射性核種の溶液をガラススライド上に均一に沈積させて、乾燥させた。これらのスライドで得られた多数のエネルギー・バンド映像は１５ｋeＶのエネルギー・ビンの大きさを持っていた。２０ｋeＶの低い閾値を開始したものは２０ビンあった。同じビンの大きさと数を用いてスペクトルが生じた。これは、検出器の位置とは別個であると思われる。よって、全映像がスペクトルに貢献した。各ピクセル(あるいはドット)に対し、33Ｐと35Ｓからの、各々の未知の分担分ＰとＳが復帰分析と最尤法とにより決定される。その結果生じる映像ＰとＳとは、蛍光体で得られた映像を示すのに通常用いられる様式で、単一の映像として表示された。燐酸映像(Ｐ)は、表示器の赤チャネルに、硫酸映像は緑のチャネルに送られた。赤と緑の等量は黄色になった。
以下のプロトコルに付着する全ての例のＤＮＡ配列が作成された。
【００６１】
被覆
７５×２５mmの大きさのJ. Melvin Freed Brand(Sigma. Cat. No. S-8902)製で、ポリ−L−リジンで被覆した洗浄前の顕微鏡スライドが、プリント用に用いられた。このスライドは、軌道シェイカー上に２時間ＮaＯＨ／ＥtＯＨ溶液(７５gのＮaＯＨ、３００mlのddＨ２Ｏと４５０mlの９６％ＥtＯＨ)に置くことによりリジンを被覆し、高純度水(二重に蒸留した水、ddＨ２Ｏ)に移送し、スライドの表面がきれいになるまで１０回以上浸したり、上げたりする。次いで、スライドは新鮮なddＨ２Ｏで振りながら繰り返し洗浄し、１時間軌道シェイカー上でポリ−Ｌ−リジン溶液(４０ml ポリ−Ｌ−リジン、４０ml ＰＢＳおよび３００mlのddＨ２Ｏ)に浸した。最後に、スライドをddＨ２Ｏで繰り返し洗浄して、回転乾燥(５００rcfで、 ５分間)し、その後５５℃の温度に１時間晒した。そして、プリントする前に、スライドを室温で２週間以上経時させた。
【００６２】
プリンティング
ＮＩＨのP. Meltzer の明細書で作った自社製のロボットを配列印刷機として用いた。Ｂｅｅｃｈｅｒ Ｉｎｃ社により作製されたカーバイド割ピンを用い、１走行４８個のスライドを８本のピン(２×４)でプリントした。これらのピンを２分間１モルのＮaＯＨ、次いで２２分間１０％ＳＤＳに浸して、ddＨ２Ｏで短く洗った。更に、ddＨ２Ｏで洗浄する前に、１０秒間短い超音波処理を行い、それからピンを加圧空気で風乾燥した。ＤＮＡが、Costar ９６穴板(Ｕ字底で、ポリスチレンcat.no. 3367)から直接印刷された。そこでは、ＤＮＡ ＰＣＲ生産物が沈殿し、２５μl、３×ＳＳＣに溶解していた。約５０％の湿度でプリントがおこなわれ、プリント期間中温度は、約２７−３０℃であった。２２００〜２７００個の遺伝子を含む配列が用いられた。
【００６３】
処理後
１００mJのＵＶ投与量でスライドを処理して、ＤＮＡをポリ−Ｌ−リジンに架橋結合した。障壁溶液を、６.０g の無水コハク酸を３３５mlの１−メチル−２−ピロリヂノンと１５mlの(pH８.０)の１モル硼酸とに溶解することによって作った。そして、スライドをこの溶液に沈浸し、軌道シェイカーに１５〜２０分乗せた。このスライドをddＨ２Ｏで短時間洗浄し、９５℃の熱湯に２分間沈め、それから３０秒間冷たい９６％ＥtＯＨに移送した。最後に、スライドを(５分間、５００rcf)で乾燥し、直ぐ使用できるように貯蔵した。
【００６４】
全ての実験のための放射性ｃＤＮＡ検出子の作成は、以下のプロトコルに従って、行われた。
【００６５】
２−５μgの全ＲＮＡを３３Ｐ／３５Ｓと記された1連のｃＤＮＡに変換
Amersham Pharmacia Biotech、cat. no. AH9904 のa−３３Ｐ-ｄＡＴＰを１０ mCi／mlとAmersham Pharmacia Biotech、cat. no. AG1000の a−３５Ｓ-ｄＡＴＰを１０ mCi／mlとを放射性を導入するため用いた。
ＲＴ反応を氷上で行った。
2004523233.tif 000007
【００６６】
反応を６５℃の温度で５分間行ない、５分間で４２℃の温度まで冷却した。１μlの
Super Script II酵素を加え、更に、４２℃の温度で３０分間培養をした。もう1μlの
Super Script IIの酵素を加え、更に、４２℃の温度で３０分間培養した。５μlの５００ mM ＥＤＴＡを加えることによって反応を停止し、１０μlの１モルのＮaＯＨを加え、その混合物を６２℃の温度で６０分間培養してＲＮＡを加水分解した。それから混合物を室温まで冷やし、溶液を中和するため２５μl、１モルのトリ−ＨＣＬ(pH ７.５)を加えた。完成した検出子は洗浄まで氷の上に貯蔵された。
【００６７】
検出子の洗浄と調整
マイクロコン塔を用いて洗浄し、３００μl×ＴＥが各ＲＴ反応に加えられ、２つの異なる印を付けた見本をマイクロコン塔へ移す前に組み合わせ、３０〜５０μlの溶液が残るまで１３Ｋで回転させた。追加と回転を繰り返した後、最後には１０μlの容積の洗浄物が残った。上記の
を新しい管に転化し、１３Ｋで１分間回転し、検出子を回収した。(２２×２０mmのカバースリップの大きさに対して)１８μlの容積の最終検出子の中には、次のものが含まれていた。
１μlの１０μg／μl ＣＯＴ−１ ＤＮＡ、１μlの８μg／μlポリＡ、１μlの４μg／μl酵母 ｔＲＮＡ、１μlの１０μg／μl ＢＳＡ、１μlの５０×デンハーツ溶液、３.１μlの２０× ＳＳＣ(最終濃度、３.５×ＳＳＣ)、そして０.５μlの１０％ ＳＤＳ (最終濃度０.３％)。
次いで、検出子を、１０分間１３Ｋで回転する前に２分間沸騰水で加熱した。
【実施例１】
【００６８】
本発明による方法と装置の可撓性を見せる為、鮭の精子のＤＮＡで希釈し、非希釈箇所１箇所につきほぼ１ベクレル(Ｂｑ)の放射能を発するようガラス・スライド上に点在させた２つのアイソトープ３３Ｐと３５Ｓとでモデル実験を行った。更に、本発明による方法と装置の動的範囲を見せるため一連の希釈を行って５ログを希釈した。この希釈を２つのアイソトープの各々に対し別個にと、これらのアイソトープの組み合わせに対し行った。中間距離２５０μｍと４００μｍとの２つの点格子を用いた。３回の全ての結果を第５図にしめす。どちらも、希釈との量的関係を示すため蛍光体曲線と、ｘ軸への信号の投影としての記録されたエネルギースペクトルの形態で示されている。
【実施例２】
【００６９】
本発明の方法と装置が、小配列にも適用できることを立証するため、量を少なくした２つの細胞腺ＲＮＡを用いて実験を行った。その他の点では標準の小配列手順を用いた。２つの細胞腺からのＲＮＡ、すなわちＯＨＳ骨肉腫細胞腺とＭＣＦ−７乳癌細胞腺を使って、核種の成功した分離が示され、第６図に２つのアイソトープの重なり合う擬似色映像の形態で蛍光体曲線として現れている。この図は、本発明による方法と装置が、蛍光体を使うが、著しく低いＲＮＡ開始材料を用いた類似の実験から予想される信号を動的に変化させることを明確に示している。
【００７０】
上で述べたように、放射性と記された生物学的物質は、最も蛍光性のある物質に対向して生きた細胞に簡単に組み込まれる。これは、放射性アイソトープが前もって組み込まれている、核種、アミノ酸等の中間物質あるいはその他の構成要素を加えることによってなされる。この可能性により新たな範囲の応用が可能となり、そのうちの２つをここに記載する。
【実施例３】
【００７１】
１つの細胞内のどのたんぱく質の量もその対応するＲＮＡの安定性によって１部規制される。これは、一般には、ポリ−Ａの尾状物の大きさに、そして１部はその他のシーケンス特定因子に関係していると考えられている。今まで、個別のｍＲＮＡスピーシーズの試験が選らばれた方法であったが、２つの放射性標識(核種)を組み込むことによって、標準と比較して、対象物内の全てのｍＲＮＡをモニターすることができるようになった。これにより、ＤＮＡ小配列と組み合わせてＲＮＡ半減期のゲノムの幅広い走査ができる。
【００７２】
最後に、比率を発見するため、信号が記録され、分析されて、各核種からの分担分を発見する。このデータは、細胞腺で検出できる全てのＲＮＡスピーシーズの相対的半減期を反映する。この新規な手順により、標準フォーマットでの小配列から得られた従来の情報と相俟って、ＲＮＡ半減期の重要な細胞の調節機能の幅広いゲノムモニターができる。
【実施例４】
【００７３】
話題となっている蛋白代謝の分野では、実施例３で示されたのと類似の方法が、アミノ酸タッグ(放射性同位元素)を用いる場合適用される。例えば、蛋白質の種々のホスホリ化度、すなわち全ての細胞の主要調整現象のモニターが、媒体に加えられる放射性同位元素を組み込むことによって行われる。抗体配列をプリントすることによって、蛍光体放射性同位元素の多数の異なる蛋白質への組み込みが同時にモニターされる。
【００７４】
本発明は、各々、区別できるβ線放射性核種と標識をつけた２つのＤＮＡ／ＲＮＡの比較試験例として記載されたが、本発明の方法と装置は、生物学的小配列に吸着される放射性生物学的分子の量を決定するための一般的な方法である。これは、α、β、γおよび陽電子放射を含む全ての種類の放射能及び全ての放射性核種、特に、放射能が小配列の各箇所からの約１〜１００ベクエルに調整されるように目標分子に組み込まれるものに適用される。また、この方法は、重なり合うエネルギー・スペクトル(β放射物)を有する放射能の場合は特に適しているが、特に、エネルギー差の小さい放射線を放射する放射性核種を用いる場合、この方法における登録された放射性事象の統計的処理が単一的エネルギー放射に対してもまた利点をもたらす。これらの利点のうちには、背景のノイズ(騒音)(２次的放射等)の素晴らしいフィルターまたは分離と非常に高い感度とを含む。この方法と装置は、１以上のどんな数の異なる放射性核種にも適用されるようになされている。この数には理論的な限界は無いが、実際の限界は、ほぼ２０未満、好ましくは、ほぼ１０未満、更に好ましくは５未満の異なる放射性核種である。
【図面の簡単な説明】
【００７５】
【図１ａ】ストリップを備えた検出板の略図であり、ｐｎ結合(ダイオード)の２次元配列の概略を示す。
【図１ｂ】検出板上の突き当たり位置近くのストリップにおける測定された蓄積ネルギーの代表的な分布を示すグラフィック図である。この図において、放射線粒子が十字のしるしを付けた点で検出板に当たり、矢印で示された点で終わっている。
【図１ｃ】１つの増幅路の概略をしめすフローチャートである。
【図１ｄ】検出板と、放射性粒子の突き当たり位置とエネルギーとを決定する検出板の周囲の電子装置である。
【図２】明確な分布を持つβ線を放射する放射性核種と印を付けられ、その後ＤＮＡ小配列に吸着される２つ以上のｃＤＮＡの同時決定の場合における本発明の好ましい実施例の概略を示すフローチャートである。
【図３】各放射性アイソトープから分担分を分離するためのデータ処理の概略を示すブロック図である。
【図４】エネルギー間隔(エネルギー・ビン)の実際の数を用いて、本発明による装置によって測定された33Ｐと35Ｓアイソトープのエネルギー・スペクトルを示すチャートである。
【図５】33Ｐと35Ｓとに印を付けた鮭の精子の、個別と組み合わせとの両方の決定のx軸投影を示す。
【図６】ＯＨＳ骨肉腫およびＭＣＦ−７乳癌細胞各々からの33Ｐと35Ｓとに印を付けたＲＮＡ線の同時決定の仮想蛍光体図を示す。
【図１ａ】
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【図１ｂ】
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【図１ｃ】
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【図１ｄ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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