(57)【要約】細胞へ導入された増量カルシウムレベル、及び、成長促進因子(ＭＰＦ)抑制剤を使用して、核を移植された胚を活性化する方法が記載されている。２ｍＭ〜約１２ｍＭの範囲で、増量カルシウムレベルを含んでいる培地から胚細胞へ導入された増量カルシウムレベル（ＤＭＡＰを有する培養を直接かつ直ちに後に続ける）が記載されている。さらに、そのように扱われた、胚から産出された動物が記載されている。【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞へ導入された増量カルシウムレベル、及び、成長促進因子（ＭＰＦ）抑制剤を使用して、核移植された胚を活性化する方法。
【請求項２】
増量カルシウムレベルは、増量カルシウムレベルを含んでいる培地から胚細胞に導入される請求項１記載の方法。
【請求項３】
増量カルシウムレベルが、約２ｍＭ〜約１２ｍＭの範囲である請求項２記載の方法。
【請求項４】
増量カルシウムレベルは、カルシウムイオン透過担体、若しくは、他の物理的又は化学的手段によって細胞に導入される請求項１記載の方法。
【請求項５】
細胞への増量カルシウムレベルの導入に続いて、ＭＰＦ抑制剤を有する培養によって、直接かつ直ちに細胞が処理される請求項１記載の方法。
【請求項６】
余分な増量細胞カルシウムレベルは、ＭＰＦ抑制剤の存在下で培養に先立って除去される請求項１記載の方法。
【請求項７】
胚は、単一細胞胚、又は、活性化された多細胞胚である請求項１記載の方法。
【請求項８】
胚は、成長プログラムを組み込まれた細胞分裂を行うように、胚培地で培養される請求項１記載の方法。
【請求項９】
胚は、有蹄類の胚である請求項１記載の方法。
【請求項１０】
有蹄類の胚は、豚胚、牛胚又は羊胚である請求項９記載の方法。
【請求項１１】
請求項１記載の胚から産出された動物。
【請求項１２】
哺乳動物の核移植胚を活性化する方法であって、胚にカルシウムを導入するのに、充分な期間、増量カルシウムレベル及び二価の陽イオン担体を含んでいる胚培地で胚を培養して、カルシウム充填胚を与えること、ＭＰＦ抑制剤の存在下で胚を洗浄することにより、直ちにイオン担体を除去すること、及び、その後、ＭＰＦ抑制剤を有するカルシウム充填胚を培養して、活性化された核移植胚を与えることからなる。
【請求項１３】
増量カルシウムレベルは、増量カルシウムレベルを含んでいる培地から胚へ導入される請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
増量カルシウムレベルは、約２ｍＭ〜約１２ｍＭの範囲にある請求項１２記載の方法。
【請求項１５】
増量カルシウムレベルは、カルシウムイオン透過担体、若しくは、他の物理的又は化学的手段によって細胞に導入される請求項１２記載の方法。
【請求項１６】
細胞への増量カルシウムレベルの導入に続いて、ＭＰＦ抑制剤を有する培養によって、直接かつ直ちに細胞が処理される請求項１２記載の方法。
【請求項１７】
余分な増量細胞カルシウムレベルは、ＭＰＦ抑制剤の存在下で培養に先立って除去される請求項１２記載の方法。
【請求項１８】
胚は、単一細胞胚、又は、活性化された多細胞胚である請求項１２記載の方法。
【請求項１９】
胚は、成長プログラムを組み込まれた細胞分裂を行うように、胚培地で培養される請求項１２記載の方法。
【請求項２０】
胚は、有蹄類の胚である請求項１２記載の方法。
【請求項２１】
有蹄類の胚は、豚胚、牛胚又は羊胚である請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
請求項１記載の胚から産出された動物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核移植胚の活性化の効率を改善する方法に関する。方法は、全ての哺乳動物に適用可能であり、豚の核移植に特に有益である。核移植胚の活性化の効率は、この発明によって劇的に改善される。
【背景技術】
【０００２】
核移植は、摘出された卵母細胞(細胞質体)へドナー細胞又は核(karyoplast)を挿入すること、及び、受容体細胞質によってドナー核を再プログラムすることを含んでいる。一般に、核移植プロトコルは以下のことを含んでいる：
・受容体卵母細胞から染色体の摘出；
・単一細胞核移植（ＮＴ）胚を与えるために、摘出された卵母細胞へのドナー核の移植；及び
・ＮＴ胚卵母細胞の活性化。
【０００３】
活性化された単一細胞ＮＴ胚は、多細胞の活性化された胚を与える細胞分裂に有能で、実行可能な胚(胚盤胞段階への培養で成長する能力がある)である。
【０００４】
例えば、標準の技術によって遺伝学的に操作され、又は、後述されるような様々な方法が使用されて、クローン動物を与えるために、胚盤胞段階の培養の後に、活性化された核移植胚は、妊娠に有能であるホスト子宮に導入されてもよい。
【０００５】
体細胞を使用する核移植又はクローニングは、牛(Cibelli他 1988 Science 280:1256)及び羊（Wilmut他（1997）Nature 385:810）のような様々な動物で首尾よく実行された。
【０００６】
先行技術(例えば、Susko-Parrish  米国特許6077710参照)は、イオン担体の存在下でカルシウムを有する核移植卵母細胞の活性化（セリントレオニンキナーゼ抑制剤のようなリン酸化抑制剤を使用して、細胞の蛋白質のリン酸化の予防を後に続ける）を記載している。この方法は、牛のような動物で首尾よく使用されたが、豚に使用できない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、動物がクローンを作ることができる効率は、非常に低く(体細胞を使用して構築された羊及び牛の胚で約１％)、また、効率の改善は、非常に必要とされる。特別な問題は、胚盤胞（胚が妊娠に有能であるホスト子宮に移植される多細胞胚成長段階）に成長する活性なＮＴ胚卵母細胞のパーセンテージである。本発明は、少なくとも一部分で、先行技術の問題を論じられる。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、カルシウムイオン担体若しくは他の物理的又は化学的手段によって細胞へ導入される増量カルシウムレベルを使用し、かつ、６−ジメチルアミノプリン(６−ＤＭＡＰ)のような成長促進要因(ＭＰＦ)抑制剤を使用して、核移植胚、特に豚の核移植胚の活性化する方法に最も広い態様に関する。ＤＭＡＰのようなＭＰＦ抑制剤を有する核移植胚の培養は、直接かつ直ちに、カルシウムを導入された活性化を引き起こした。活性化された胚の培養は、活性化された多細胞胚を生じさせる。
【０００９】
別の態様では、本発明は、有蹄類のような哺乳動物の核移植胚を活性化することに関し、胚にカルシウムを導入するのに、充分な期間、増量カルシウムレベル及び二価の陽イオンイオン担体を含んでいる胚培地で胚を培養して、カルシウム充填胚を与えること、ＭＰＦ抑制剤の存在下で胚を洗浄することにより、直ちにイオン担体を除去すること、及び、その後、ＭＰＦ抑制剤を有するカルシウム充填胚を培養して、活性化された核移植胚を与えることからなる。従来の胚の培地で活性化された胚の培養は、例えば、胚盤胞段階に、成長プログラムを組み込まれた細胞分裂を生じさせる。
【００１０】
本発明は、妊娠に有能である子宮へ多細胞胚の導入に続けることを引く起こすとき、活性化された単一細胞胚、活性化された多細胞胚（例えば、２−細胞から胚盤胞まで）、及び、動物を含んでいる。
【００１１】
我々は、現在の方法を使用して、先行技術の電気的な活性化を達成したような約１５％から、本発明の方法によって約５０％まで単為生殖の活性化(核移植胚の活性化のためのモデル)を増加させた。
【００１２】
本発明は、同時融合及び活性化、融合前、活性化ポスト融合摘出、連続核移植等を含む公知の核移植プロトコルを有する使用に適している。
【００１３】
本発明は、全ての種に適し、特に有蹄類に適しており、また、先行技術の方法が許容可能な結果(例えば、牛)を与えることが示される場合には、効率の改善を提示してもよい。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
核移植は、摘出された卵母細胞(細胞質体)へドナー細胞又は核(karyoplast)を挿入すること、並びに、受容体細胞質によってドナー核を再プログラムすることを含んでいる。核移植の方法は、当業者によく知られている。
【００１５】
しかしながら、上述したように、動物がクローンを作ることができる効率は、非常に低く(体細胞を使用して構築された羊及び牛の胚で約１％)、また、改善は非常に必要とされる。
【００１６】
本発明は、カルシウムイオン担体若しくは他の物理的又は化学的手段によって細胞へ導入される増量カルシウムレベルを使用し、かつ、６−ジメチルアミノプリン(６−ＤＭＡＰ)のようなＭＰＦ抑制剤の使用して、核移植胚、特に豚の核移植胚を活性化する方法に最も広い態様に関する。ＤＭＡＰのようなＭＰＦ抑制剤を有する核移植胚の培養は、直接、カルシウムを導入された活性化を引き起こす。活性化された胚の培養は、活性化された多細胞の胚を生じさせる。ＤＭＡＰのようなＭＰＦ抑制剤を有する核移植胚の培養は、直接、カルシウムを導入された活性化を引き起こした。活性化された胚の培養は、活性化された多細胞胚を生じさせる。
【００１７】
別の態様では、本発明は、有蹄類のような哺乳動物の核移植胚の活性化に関し、胚にカルシウムを導入するのに、充分な期間、増量カルシウムレベル及び二価の陽イオン担体を含んでいる胚培地で胚を培養して、カルシウム充填胚を与えること、ＭＰＦ抑制剤の存在下で胚を洗浄することにより、直ちにイオン担体を除去すること、及び、その後、ＭＰＦ抑制剤を有するカルシウム充填胚を培養して、活性化された核移植胚を与えることからなる。従来の胚の培地で活性化された胚の培養は、例えば、胚盤胞段階に、成長プログラムを組み込まれた細胞分裂を生じさせる。
【００１８】
増量カルシウムレベルは、先行技術の胚のカルシウム導入活性化を使用したことより高いカルシウムレベルである。増量レベルは、一般に２ｍＭＣａ2+〜１２ｍＭＣａ2+（２ｍｍｏｌ／ｌＣａ2+〜１２ｍｍｏｌ／ｌＣａ2+）の範囲にあり、例えば、６ｍＭＣａ2+〜９ｍＭＣａ2+の範囲である。
【００１９】
二価の陽イオン担体の存在下で、胚のカルシウム充填は、比較的急速ステップであり、例えば、５秒から１時間の間（例えば、３分〜１０分、別例では、５分）に高いカルシウム／イオン担体媒体の培養を含んでいてもよい。その後、イオン担体及び高いカルシウムレベルは、ＭＰＦ抑制剤の存在下で洗浄されることによって直ちに除去される。これは、本発明の態様の重要な特徴である。
【００２０】
カルシウム充填胚は、３７℃で、１時間から１０時間までのように適切な期間（例えば、３時間のような２時間から５時間まで）でＭＰＦ抑制剤で培養される。６−メチルアミノプリン(６−ＤＭＰ)は、ＭＰＦ抑制剤の一例である。リン酸化抑制剤のような他のＭＰＦ抑制剤が使用されてもよい。
【００２１】
発明者は下記のことを見出した：
１  豚の核移植胚は、通常使用されるものより、増加されたカルシウム濃度を含んでいる媒体で活性化される必要がある(例えば、１．４ｍＭと対比された７．７ｍＭ）。
２  豚の核移植胚は、イオノマイシン（ionomycin）のようなイオン担体を有する６−ＤＭＡＰの下記の活性化のようなリン酸化剤で直ちに培養される必要がある(イオン担体を洗い出す間)。牛で慣例的に使用されるような数分の遅れさえ、ほとんどない活性化に帰着する。
【００２２】
これらの発見されたものは、他の動物へ適用される。
【００２３】
我々は、現在の方法を使用して、電気的な活性化を使用する約１５％から、約５０％まで単為生殖の活性化(核移植胚の活性化のためのモデル)を増加させた。
【００２４】
その方法は、同時融合及び活性化、融合前、活性化ポスト融合摘出、連続核移植等を含む全ての核移植プロトコルを有する使用に適している。
【００２５】
その方法は、全ての種に適し、特に有蹄類に適しており、また、この方法が許容可能な結果(例えば、牛)を与えることが示される効率の改善を提示してもよい。
【００２６】
摘出は、卵母細胞の二分、中期板の摘出、終期での摘出、核構成時の摘出を含む様々な方法によって達成されてもよい。二者択一で、卵母細胞は、自己除核されてもよい。
【００２７】
受容体染色体を含んでいる受容体細胞質体へのドナー細胞又はkaryoplastの移植は、様々な技術によって達成されてもよい。例えば、薄膜融合、受容体細胞質体へのkaryoplastの直接の挿入、又は、他の手段は、ＮＴ胚を与える。karyoplast注入のときに、改良された胚は、物理的又は化学的手段によって活性化されてもよい。二者択一で、活性化は、ドナー核の挿入前又は後に起こってもよい。
【００２８】
ドナー細胞は、さらに、胚細胞、胚幹細胞、一次細胞培養、胚に由来した培養された細胞ライン、胎児又は成人の体細胞、並びに、同種のものである。さらに例によって、胚細胞は、割球、例えば、１６〜３２の細胞質量(桑実胚)、又は、胚盤胞に由来した分化多能細胞であってもよい。ドナー細胞は、従来の組み換えＤＮＡ操作に従ってもよい。
【００２９】
ドナー細胞は、以前に記載されるような任意の動物から実現されてもよい；家畜動物又はコンパニオン動物を含んでいる。動物に由来したドナー細胞は、ほぼ任意のタイプの組織又は器官から分離されることができる。
【００３０】
繊維芽細胞は、容易に得られ(胎児の組織出所又は成人の組織出所から)、多量に得られ、容易に広められるので、好ましくは遺伝学的に改変され、かつ、生体外で培養される。
【００３１】
卵母細胞及びドナー核の間の細胞周期を同期させる重要性は、以前に実証された。中期ＩＩ卵母細胞の成長促進活動の高レベルは、染色質及び異数体の次の改良への不可逆損害に帰着する（Campbell他  1993 Biology of Reproduction 49:933）。この問題を克服するために、ドナー核の細胞終期は、細胞周期の中期又はＧ１にあることを必要とする。ドナー核は、血清飢餓（Wilmut他  1997）、集団への成長(Onishi他  2000)等のような様々な方法を使用して、細胞周期を同期させることができる。同期させられていない集団も使用されることができる（Cibelli他  1998）。二者択一で、卵母細胞又は受容体細胞質体は、ＭＰＦレベル(所謂、万能受容体)を減少するために活性化されることができる。
【００３２】
受容体細胞質体は、胚からの卵母細胞、接合体又は任意の細胞である。適切な卵母細胞の動物の由来は、ドナー核の由来のために上述されるものである。好ましくは、卵母細胞は、脊椎のある動物から得られ、より好ましくは、有蹄類から得られる。卵又は卵母細胞は、外科又は外科以外の方法を使用して、排卵動物の再生の地域から容易に集められてもよい。卵母細胞を分離する方法は当業者に公知である。排卵は、動物の様々な種の由来の性腺刺激ホルモンの処理により引き起こされてもよい。卵母細胞は、成長した濾胞、又は、集められた次の排卵からの吸引によって集められてもよい。二者択一で未熟な卵母細胞は、生きていること又は虐殺された動物の卵巣から集められてもよく、生体外で、ＷＯ９０／１３６２７（''In vitro maturation of bovine occytes in media containing recombinant gonadotropins along with bovine oviductal cell'', 1989）のように記載された標準の手続きを使用して、成長させられてもよい。卵母細胞は、生体内又は生体外で受精され、接合体を産出されることができる。
【００３３】
再び、受容体細胞質体は、家畜動物又はコンパニオン動物を含むドナー核のために上述されたような任意の動物から実現されてもよい。好ましくは、ドナー細胞及び受容体細胞は同じ種から産出される。
【００３４】
細胞融合は、当業者に知られている任意の手段によって実行されてもよい。細胞融合を引き起こす確立されている方法は、融合を促進する化学薬品でのセルの露出、例えば、ポリエチレングリコール（例えば、KanKa他, (1991), Molecular Reproductive Development, 29:110-116参照）、不活性化されたウイルスの使用（例えば、Graham他, (1969), Wistar Inst. Symp. Monogr., 9:19参照）、及び、電気的な脈拍の使用（例えば、Prather他, (1987), Biol. Reprod., 37:859-866参照）を含んでいる。
【００３５】
二者択一で、ドナー核(karyoplast)は、細胞から分離され、受容体細胞質体の細胞質に直接注入されることができる。ドナー細胞へのkaryoplastの直接のマイクロ注入は、従来の方法によって実行されてもよい、例えば、Wakayama他(1998) Nature 394:369)に記載されている。
【００３６】
Betthauser他(2000, Science 18:1055)は、最近、胎児の繊維芽細胞を使用して、クローンされた豚の産出を報告した。それらの論文では、それらが、さらに、牛のための現在の活性化する方法が、豚に適用できないことが知られた。これらの研究者は、低いカルシウムレベルの存在下で、５μＭから１５μＭまで３倍のイオノマイシン（ionomycin）濃度を増加させることによって、これらの研究者が豚の卵母細胞を活性化することができると報告した。これらの研究者は、妊娠を始め、かつ、維持することを支援するために、生体外受精された胚を使用した。この方法を使用して、これらの研究者は、胚盤胞段階(核移植胚の活性化のためのモデル)に卵母細胞の２３％が単為生殖的に成長すると報告した。これは、我々と他のものとが以前に、例えば、電気的な刺激を使用して報告したものに似ている。ここに記載された方法を使用して、我々が、電気的な活性化を使用して約１５％から約５０％まで単為生殖の活性化を増加させた。したがって、方法は、既存の方法に関する相当な改善を示す。より重要なことに、胚が胚盤胞段階に発展する割合は、さらに、この方法によって増加させられることが見られる（表２）。
【００３７】
ＮＴ胚は、１つ以上の分裂のために生体外で培養されることができる。分裂後、ＮＴ胚は、物理的又は化学的手段(胚分裂法)を、どんな適切な段階で(例えば、２〜３２の細胞段階で)２分されることができる。胚細胞又は割球は、そこから分離され、用語（連続クローニング）の開発に有能な多数のＮＴ胚を生産するために核移植の第２及び後のラウンドで使用されてもよい。
【００３８】
核移植の第２ラウンドは、マウスＮＴ胚（Kwon & Kono (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:13010）の発展的な能力を増加させるために使用された。第２の細胞質体は、卵母細胞、接合体又は他の胚である。
【００３９】
ＮＴ胚は、それらの実行可能性を評価する１つ以上の分裂のために生体外で培養され、受容体女性の再生の地域へ移され、又は、標準の手続きによって後の使用のために冷凍で格納されることができる。
【００４０】
本発明は、受容体細胞質体への移植に先立ったドナー細胞又はkaryoplastの遺伝子操作を含んでいてもよい。二者択一で、又は、追加で、遺伝子操作は、ＮＴ細胞生産（ＮＴ胚の遺伝子操作である)を続けて引き起こされてもよい。
【００４１】
発明は、同時融合及び活性化、活性化前の融合、ポスト融合摘出、連続核移植等を含む全ての核移植プロトコルを有する使用に適している。
【００４２】
その発明は、全ての種に適し、特に有蹄類に適し、特に好ましくは豚に適している。
【００４３】
核移植又はクローニング技術のための使用は、以下のことを含んでいる：動物を繁殖させる目的のために、多くの遺伝学的に同一又は同様の動物若しくは個々の動物からのクローンの生産；遺伝学的に操作された生産、すなわち、余分な遺伝子情報が挿入された、又は、既存の遺伝子情報が削除された(遺伝子ノックアウト)遺伝子組み換え動物；及び、細胞療法、遺伝子治療、臓器移植等の目的で、多能性細胞の集団を生産する体細胞の区別（細胞、組織又は器官へ、その後、区別することができる）。そのような細胞は、自己由来であることで長所を有する、すなわち、患者から最初に得られ、患者の免疫系によって破壊されない。
【００４４】
したがって、本発明によれば、特定の遺伝子型又は望まれた遺伝子型を有する哺乳動物の再生又は増加が可能である。さらに、本発明は、例えば、細胞、組織又は臓器移植で使用されることができる動物を生産するために、又は、治療分子、成長因子、若しくは、他の医学的に望まれるペプチド又は蛋白質のような望まれる化合物を発現される動物を生産するために使用されることができる。
【００４５】
この発明は、今、下記に限定されない例で記載される。
【実施例１】
【００４６】
ＩＶＭの豚の卵母細胞の単為生殖の活性化
媒体
卵母細胞成長媒体（OMM199a）は、０．１ｍｇ／ｍＬのナトリウムピルビン酸塩、７５μｇ／ｍＬのペニシリン−Ｇ、５０μｇ／ｍＬのストレプトマイシン硫酸塩、１０μｇ／ｍＬの羊ＦＳＨ、５．０μｇ／ｍＬの羊ＬＨ、１．０μｇ／ｍＬの１７β−オエストラジオール（oestradiol）、０．５ｍＭのシステアミン、１．０ｍＭのジブチリルｃＡＭＰ、１０ｍｇ／ｍＬの表皮成長因子（ＥＧＦ）、及び、２５％（ｖ／ｖ）の豚フォルキラ流体（ｐＦＦ）で補われた媒体１９９(アールの塩類、Ｌ−グルタミン、２．２ｍｇ／ｍＬの重炭酸ナトリウム及び２５μＭのＨｅｐｅｓバッファーを有する；Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）からなった。 ｐＦＦは、洞腔の濾胞から集められた材料の遠心分離（２０００×ｇで１５分間）によって準備され、−２０℃で攪拌され、使用の直前に無菌の０．２２μｍの気孔フィルタ(Millipore, MA, 合衆国)を通してろ過された。培地は、４．０ｍｇ／ｍＬのＢＳＡで補われたＮＣＳＣ−２３媒体（Petters及びWells, 1993）からなった。ＴＡＬＰ−ＰＶＡ媒体(１１４．０ｍＭのＮａＣｌ、３．１６ｍＭのＫＣｌ、０．３５ｍＭのＮａＨ2ＰＯ4・２Ｈ2Ｏ、０．５ｍＭのＭｇＳＯ4・６Ｈ2Ｏ、２５ｍＭのＮａＨＣＯ3、２ｍｇ／Ｌのフェノールレッド、０．１％のＰＶＡ、７５ｍｇ／Ｌのペニシリン−Ｇ、５０ｍｇ／Ｌのストレプトマイシン硫酸塩、４．７２ｍＭのＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ、１０ｍＭのナトリウム乳酸塩、０．１０ｍＭのナトリウムピルピン酸塩）は、２．０ｍＭの安息香酸ナトリウムカフェイン、３．０ｍＭのカルシウム乳酸塩及び０．４％のＢＳＡ（ｍＴＡＬＰ−ＰＶＡ）の付加によって改変された。
【００４７】
方法
生体外成長
生体外成長(ＩＶＭ)の卵母細胞の準備は、本質的に以前に記載されていた（Grupen他,  (1997) Reproduction Fertility Development 9:571-575）。虐殺された思春期前の豚からの卵巣は、ペニシリン(１００００Ｕ／ｍＬ)、ストレプトマイシン(１００００μｇ／ｍＬ)及びフンギゾン（fungizone）(２５μｇ／ｍＬ)を含む抗生物質溶液（ＣＳＬ株式会社）の０．６％（ｖ／ｖ）で補われ、３８℃で維持されるDulbeccoのＰＢＳで実験用動物へ移植された。一定の吸収(１Ｌ／ｍｉｎ)が適用された、２１−ゲージ針を使用して、洞腔の濾胞(直径２ｍＭ〜６ｍＭ)は、吸引された。濾胞の内容は、収集チューブでためられた。ぎっしり詰まった堆積細胞の少なくとも３つの一定の層を有する堆積卵母細胞錯体（ＣＯＣ）は、集められた流体から回復され、OMM199aで３回洗浄され、ペトリ皿(Becton Dikinson and Company, Plymouth, 英国)中で鉱油で覆われたOMM199aの５０μｌの小敵(１つの小滴当たり２５のＣＯＣ)に移植され、また、空気中５％ＣＯ2の湿らされた大気中で３８．５℃で培養された。２２時間の成長の後に、拡張されたＣＯＣは、ジブチリルcAMP(OMM199b)のないOMM199で直ぐに洗浄され、OMM199bの５０μｌの小滴に移植され、さらに２４時間培養された。４６時間の成長区間の終わりに、卵母細胞は、１分間０．５ｍｇ／ｍＬのヒアルロニダーゼで処理され、その後、堆積細胞を撤去するように、小さな穴グラスピペットで優しく吸引された。極体を押し出した卵母細胞は、洗浄され、活性化に先立った培地の中で維持された。
【００４８】
卵母細胞成長媒体（OMM199a）は、０．１ｍｇ／ｍＬのナトリウムピルビン酸塩、７５μｇ／ｍＬのペニシリン−Ｇ、５０μｇ／ｍＬのストレプトマイシン硫酸塩、１０μｇ／ｍＬの羊ＦＳＨ、５．０μｇ／ｍＬの羊ＬＨ、１．０μｇ／ｍＬの１７β−オエストラジオール（oestradiol）、０．５ｍＭのシステアミン、１．０ｍＭのジブチリルｃＡＭＰ、１０ｍｇ／ｍＬの表皮成長因子（ＥＧＦ）、及び、２５％（ｖ／ｖ）の豚フォルキラ流体（ｐＦＦ）で補われた媒体１９９(アールの塩類、Ｌ−グルタミン、２．２ｍｇ／ｍＬの重炭酸ナトリウム及び２５μＭのＨｅｐｅｓバッファーを有する；Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）からなった。ｐＦＦは、洞腔の濾胞から集められた材料の遠心分離（２０００×ｇで１５分間）によって準備され、−２０℃で攪拌され、使用の直前に無菌の０．２２μｍの気孔フィルタ(Millipore, MA, 合衆国)を通してろ過された。培地は、４．０ｍｇ／ｍＬのＢＳＡで補われたＮＣＳＣ−２３媒体（Petters及びWells, 1993）からなった。
【００４９】
実験は、核移植胚ではなく、卵母細胞で今後行なわれた。これらの実験は、肥沃になった胚なしで行われるので、単為生殖と名付けられる。単為生殖の実験は、大部分はＮＴ胚に関連した費用及び付加的な実験操作のせいで、ＮＴを調査するために、モデルシステムとして慣例的に使用される。単為生殖の実験は、ＮＴ技術の開発に非常に有用な情報を供給し、ＮＴ結果を直接予期する。
【００５０】
電気的な活性化
卵母細胞は、成長のスタートの後に、６〜４８時間まで活性化された。卵母細胞は、培地から除去され、直ぐに洗浄され、活性化に先立ってＰＢ１媒体に移植された。脈拍をうたれる卵母細胞は、活性化媒体で徹底的に洗浄され、活性化チャンバースライドのステンレス鋼電極(１ｍＭ、別々に)の間の活性化媒体に置かれ、BTX Electro Cell Manipulator 2001(BTX社、SanDiego,  CA、合衆国)を使用して、１秒間隔で適用された、２つのＣＤの脈拍(１．５ｋＶ／ｃｍ、６０μｓｅｃ)に露出された。卵母細胞活性化媒体は、０．３ｍＭのマンニトール、０．１ｍＭのＣａＣｌ2、０．２ｍＭのＭｇＳＯ4、及び、０．１ｍｇ／ｍＬのポリビニルアルコールを含んでいた。卵母細胞は、２度洗浄され、脈拍の管理直後にＰＢ媒体に移植された。脈拍をうった卵母細胞は、２度洗浄されるか、培地油に返されたかのどちらか一方を行われた。
【００５１】
イオノマイシン（ionomycin）／6-DMAPの処理
卵母細胞は、成長のスタートの後に、４６〜４８時間まで活性化された。極体を押し出した、裸にされた卵母細胞は、洗浄され、活性化に先立って約１時間、３．０ｍＭのＣａ−乳酸塩(ｍＴＡＬＰ−ＰＶＡ)で補われた改変されたＴＡＬＰ−ＰＶＡ媒体で維持された。卵母細胞は、５分間、５μＭのイオノマイシン（ionomycin）を含んでいるｍＴＡＬＰ−ＰＶＡに移植された。その後、卵母細胞は、２度洗浄され、３時間、２ｍＭの６−ＤＭＡＰを含んでいる培地で培養された。その後、６−ＤＭＡＰで処理された卵母細胞は、２度洗浄され、鉱油で５０μｌの小敵の培地に移植された。イオノマイシン（ionomycin）処理で、卵母細胞は、６−ＤＭＡＰを含んでいる媒体の中で洗浄されなかった。卵母細胞が、ＮＣＳＵ−２３で培養されたとき、６−ＤＭＡＰへの露出は、５〜１０分後まで生じなかった。
【００５２】
【表１】
2004519226.tif 000002
【００５３】
【表２】
2004519226.tif 000003
【実施例２】
【００５４】
受容体細胞質体としてＩＶＭ卵母細胞を使用して構築された核移植胚の活性化
媒体
培地及びｍＴＡＬＰ−ＰＶＡ媒体は、実施例１に記載されている。Dulbeccoのリン酸塩バッファーの食塩水(ＤＰＢＳ；１３６．９８ｍＭのＮａＣｌ、２．６８ｍＭのＫＣｌ、０．４９ｍＭのＭｇＣｌ2・６Ｈ2Ｏ、８．０８ｍＭのＮａ2ＨＰＯ4、１．４７ｍＭのＫＨ2ＰＯ4、及び、０．９０ｍＭのＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ；ｐＨ７．４)は、１％の胎児の子牛血清(ＦＣＳ)で補われた。HepesバッファーのＭＥＭは、３３６ｍｇ／ＬのＮａＨＣＯ3、２１ｍＭのHepesバッファー、６０ｍｇ／Ｌのペニシリン−Ｇ、及び、０．５％の牛の血清アルブミン（ＢＳＡ）で補われたMinimum Essential Medium(アールの塩類、Ｌ−グルタミン及び非必須アミノ酸を有する； Gibco-BRL, Grand Island, NY, 合衆国)からなった。リン酸塩バッファーのＮＣＳＵ−２３（ｐＮＣＳＵ−２３）媒体は、１２７．８ｍＭのＮａＣｌ、４．９７ｍＭのＫＣｌ、１．０ｍＭのＫＨ2ＰＯ4、１．１９ｍＭのＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、３．０ｍＭのＮａ2ＨＰＯ4、５．５５ｍＭのＤ−グルコース、７５ｍｇ／Ｌのペニシリン−Ｇ、５０ｍｇ／Ｌのストレプトマイシン硫酸塩、１．７ｍＭのＣａＣｌ2、１．０ｍＭのＬ−グルタミン、７．０ｍＭのタウリン、５．０ｍＭのハイポタウリン、０．４％ＢＳＡ、及び、１０％ＦＣＳを含んでいた。Ｃａ2+フリーのｐＮＣＳＵ−２３媒体は、１２７．８ｍＭのＮａＣｌ、４．９７ｍＭのＫＣｌ、１．０ｍＭのＫＨ2ＰＯ4、１．１９ｍＭのＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、３．０ｍＭのＮａ2ＨＰＯ4、５．５５ｍＭのＤ−グルコース、７５ｍｇ／Ｌのペニシリン−Ｇ、５０ｍｇ／Ｌのストレプトマイシン硫酸塩、１．０ｍＭのＬ−グルタミン、７．０ｍＭのタウリン、５．０ｍＭのハイポタウリン、０．４％ＢＳＡ、及び、１０％ＦＣＳを含んでいた。Ｃａ2+フリーのマンニトール融合媒体は、０．２８ｍＭのマンニトール、０．２ｍＭのＭｇＳＯ4、及び、０．０１％のポリビニルアルコールからなった。Dulbecco's Modified Eagle Medium(ＤＭＥＭ)は、Ｌ−グルタミン、１１０ｍｇ／Ｌのナトリウムピルビン酸塩、及び、ピリドキシン塩酸塩を有する高いグルコースを含んでいた。
【００５５】
生体外成長
方法は、実施例１に記載されている。
【００５６】
ドナー細胞準備
豚の胎児の繊維芽細胞の主要な培地は、３８．５℃の５％ＣＯ2の湿らされた大気中で、１５％ＦＣＳで補われたＤＭＥＭ中で７〜１４日後に集団に育てられた。ドナー細胞は、ＤＰＢＳで融合単分子層を２度洗浄することにより、核移植のために準備され、０．０５％のトリプシンを含んでいるＤＰＢＳを後に追加される。３８．５℃での培養の５分後、ＤＭＥＭ＋１５％ＦＣＳは、トリプシン反応を停止するために、分離された細胞に追加された。その後、分離された細胞は、５分間、３００×ｇでの遠心分離よってペレット化され、ＤＭＥＭ＋１５％ＦＣＳ中で再度懸濁された。分離された細胞は、極微操作へ先立って、少なくとも０．５時間、３９℃、５％ＣＯ2で培養された。
【００５７】
極微操作
極微操作については、卵母細胞及び細胞が、７．５μｇ／ｍｌのサイトカラシンＢ及び１０％ＦＣＳを有するｐＮＣＳＵ−２３の油の下に小敵で置かれた。卵母細胞は、約２０μｍの内部の直径を有するマイクロピペットを使用して、中期板を含んでいる隣接した細胞質と共に第１の極体を除去することにより摘出された。大多数の卵母細胞では、明瞭なスペースが暗い細胞質に対して差異をなしたので、中期板は、位相差異光学の下で目視可能であった。摘出中に作成された透明帯の同じ穴を通って、中型のドナー細胞へ小さなものが、その後、共役体を作成するために各卵母細胞の細胞質に接して置かれた。操作の後に、共役体は、直ぐに洗浄され、１０％ＦＣＳで補われたＮＣＳＵ−２３に移植され、融合前に、少なくとも０．５時間、３８．５℃で空気中の５％ＣＯ2の湿らされた大気中で培養された。
【００５８】
共役体融合
融合に先立って、共役体は洗浄され、Ｃａ2+フリーのｐＮＣＳＵ−２３媒体に移植され、そして、少なくとも１５分間、３８℃で培養された。１０までの共役体のグループは、Ｃａ2+フリーのマンニトール融合媒体中で、徹底的に洗浄され、また、その後、融合媒体で覆われた、１ｍｍ間隔の電極を有する融合チャンバーへ移植された。共役体は、３０本のゲージ針を使用して、手動で配列され、その結果、ドナー及び受容体の細胞間の接触の平面が電極と平行であった。細胞融合は、単一のＤＣ脈拍の１５０Ｖ／ｍｍの電界の強さ及び６０μｓｅｃの持続で引き起こさた。共役体も、融合脈拍の直前に、２秒間、４．０ＶのＡＣ脈拍、及び、融合脈拍の直後にＡＣ脈拍(２秒間で４．０〜０．０Ｖに減少された)に露出された。電気的な脈拍が処理された後、共役体は洗浄され、Ｃａ2+フリーのｐＮＣＳＵ−２３媒体に移植され、そして、少なくとも１５分間、３８℃で培養された。融合されていない共役体は、１秒、同じ融合手続きに露出された。融合共役体(細胞質雑種)は、直ぐに洗浄され、１０％ＦＣＳで補われたＮＣＳＵ−２３に移植され、そして、活性化に先立って１〜３時間、３８．５℃で空気中の５％ＣＯ2の湿らされた大気中で培養された。
【００５９】
イオノマイシン（ionomycin）／6-DMAPの処理
方法は、本質的に実施例１に記載されたものと同じである。１〜３ｈのポスト融合、融合共役体(細胞質雑種)は、洗浄され、ｍＴＡＬＰ−ＰＶＡ媒体に移植され、そして、活性化に先立って１５〜２０分間、培養された。その後、融合共役体は、５分間、５μＭのイオノマイシン（ionomycin）を含んでいるｍＴＡＬＰ−ＰＶＡ媒体に移植された。融合共役体は、その後、２度洗浄され、５０μｌの小滴の培地（鉱油に覆われた２ｍＭの６−ＤＭＡＰを含んでいる）に移植され、そして、３時間、３８．５℃で空気中の５％ＣＯ2の湿らされた大気中で培養された。その後、活性化された融合共役体は、２度洗浄され、鉱油で覆われている、５０μｌの小滴の培地に移植され、そして、生体外の成長を評価する７日間、又は、同期させられた受容体の中への移植に先立った３日間の一方で培養された。
【００６０】
結果
表３で示されたデータは、イオノマイシン（ionomycin）／6-DMAPの処理が、受容体細胞質体として、ＩＶＭ卵母細胞を使用して改変された核移植胚を有効に活性化したことを示す。イオノマイシン（ionomycin）／6-DMAPの処理を使用して、融合共役体(細胞質雑種)が融合の３時間後に活性化されたとき、胚盤胞段階への成長の高い割合(２１％)は、生体外で培地の７日間後に達成された。イオノマイシン（ionomycin）／6-DMAPの処理にさらされなかった融合共役体は、胚盤胞を形成せず、大多数の細胞質雑種が、活性化されていない次の融合のままだったことを示して、１７％だけの割合で分裂した。
【００６１】
【表３】
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【実施例３】
【００６２】
受容体細胞質体として、vivo由来の卵母細胞で使用して構築された核移植胚の活性化に続く、クローンされた豚の産出
媒体
培地、ｍＴＡＬＰ−ＰＶＡ媒体、ＤＰＢＳ、HepesバッファーのＭＥＭ、ｐＮＣＳＵ−２３媒体、Ｃａ2+フリーのマンニトール融合媒体、及び、ＤＭＥＭは、実施例１及び実施例２に記載されている。
【００６３】
卵母細胞回復
新鮮に排卵された卵母細胞は、ＤＰＢＳを有するｈＣＧ注入後４８ｈに、非常に刺激された豚ドナーの卵管から洗い流され、HepesバッファーＭＥＭで実験用動物へ移植された。その後、それらは、１ｍｇ／ｍｌのヒアルロニダーゼを含んでいるｐＮＣＳＵ−２３でピペットで移すことにより、付着堆積細胞をはぎ取られた。その後、裸にされた卵母細胞は洗浄され、１０％ＦＣＳで補われた培地に移植され、そして、極微操作に先立って０．５〜２時間、３８．５℃で空気中の５％ＣＯ2の湿らされた大気中で培養された。
【００６４】
ドナー細胞準備
方法は、実施例２に記載されている。
【００６５】
極微操作
方法は、実施例２に記載されている。
【００６６】
共役体融合
方法は、Ｃａ2+フリーのｐＮＣＳＵ−２３媒体の代わりにｐＮＣＳＵ−２３媒体が使用されたことを除いて、実施例２に記載されたものと同様である。
【００６７】
イオノマイシン（ionomycin）／6-DMAP
方法は、融合共役体が活性化に先立って３０〜４５分間、ｍＴＡＬＰ−ＰＶＡで培養されたことを除いて、実施例２に記載されたものと同様である。
【００６８】
結果
表４で示されたデータは、イオノマイシン（ionomycin）／6-DMAPの処理が、受容体細胞質体として、vivo由来の卵母細胞で使用して改変された核移植胚を有効に活性化したことを示す。イオノマイシン（ionomycin）／6-DMAPの処理を使用して、融合共役体(細胞質雑種)が融合の３時間後に活性化されたとき、胚盤胞段階への成長の高い割合(２３％)は、生体外で培地の６日間後に達成された。イオノマイシン（ionomycin）／6-DMAPの処理にさらされなかった融合共役体は、胚盤胞を形成せず、大多数の細胞質雑種が、活性化されていない次の融合のままだったことを示して、７％だけの割合で分裂した。６日間の生体外の培地の後、差異にラベルを付けることは、核移植胚盤胞が内部の細胞の質量(平均１０)及びトロフェクトダーム（trophectoderm）細胞(平均３１)の良好な数値であったことを示した。
【００６９】
【表４】
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改変された胚が、３日間、培養され、続いて同期させられた受容体へ移植されたとき、イオノマイシン（ionomycin）／6-DMAPの処理の効率も実証された（表５）。構築された共役体の約７０％は、無事に融合された。イオノマイシン（ionomycin）／6-DMAPの処理を使用して、活性化することに続いて、融合共役体の９０％は分裂して、続いて３日間の生体外の培地の後に受容体へ移植された。１０の移植から、５の受容体が２５日で充満していることがわかった。受容体のうちの２は、期間に妊娠しているままであり、また、１の生きているクローンされた子豚は、各々、1の雄及び1の雌から得られた。このデータは、イオノマイシン（ionomycin）／6-DMAPの処理が受容体細胞質体としてvivo由来の卵母細胞を使用して構築された核移植胚を効率的に活性化し、期間に成長する核移植胚の能力を危険にさらさなかったことを実証する。
【００７０】
【表５】
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当業者は、ここに記載された発明は、特に記載されたもの以外の変更及び修正をしてもよいことを認識する。発明が、趣旨及び範囲以内にあるような変更及び修正をすべて含むと理解される。発明は、さらに、ステップ、特徴、構成及び化合物（明細書で引用した又は示された、個々に又は集団的に、並びに、２つ以上の任意の前記ステップ又は特徴の任意又は全ての組合せ）を全て含む。
【００７１】
全体にわたって、この明細書及び請求項（単語「含む」、又は、「含ます」あるいは「含んでいる」のような変化を含む）は、もし状況が他の方法を要求しなければ、他の整数、ステップ、又は、整数あるいはステップのグループの排除ではなく、定期の整数、ステップ、又は、整数あるいはステップのグループを含むことを意味することが理解される。
【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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