(57)【要約】本発明は、Ｂ型肝炎抗原をシステインの存在下で精製することを含む、ワクチンに使用するのに好適なＢ型肝炎抗原の調製方法、ならびに該抗原を含むワクチンに関するものである。【特許請求の範囲】
【請求項１】
遊離ＳＨ基をもつ還元剤の存在下でＢ型肝炎抗原を精製することを含んでなる、ワクチンに使用するためのＢ型肝炎抗原の調製方法。
【請求項２】
Ｂ型肝炎抗原が痕跡量のチオメルサールも含まない安定な免疫原性抗原である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
精製された抗原産物が、タンパク質２０μｇにつき０．０２５μｇ未満の水銀を含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
精製された抗原産物がチオメルサールを含まない、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
粗製のＢ型肝炎抗原調製物を、
（ａ）　ゲル浸透クロマトグラフィーにかけ、
（ｂ）　イオン交換クロマトグラフィーにかけ、そして、
（ｃ）　遊離ＳＨ基をもつ還元剤と混合する、
請求項１に記載のＢ型肝炎抗原の調製方法。
【請求項６】
還元剤がシステイン、グルタチオン、ジチオトレイトールもしくはβメルカプトエタノールである、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
還元剤がシステインである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
システインを１〜１０ ｍＭの最終濃度で添加する、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
システインを約２ ｍＭの最終濃度で添加する、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
還元剤で処理する前に、抗原をチオメルサールの存在下で精製する、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法によって得ることができる、免疫原性Ｂ型肝炎抗原。
【請求項１２】
前記抗原が、チオメルサールの存在下で調製されたものと少なくとも同程度に免疫原性および抗原性がある、請求項１１に記載の免疫原性Ｂ型肝炎抗原。
【請求項１３】
平均ＥＬＩＳＡタンパク質比が１．５より大きく、チオメルサールの存在下で調製されたＢ型肝炎表面抗原よりも少なくとも３倍低いＩＣ５０値をもつＲＦ１含有量である、請求項１１または１２に記載の免疫原性Ｂ型肝炎抗原。
【請求項１４】
請求項１１〜１３のいずれか１項に記載のＢ型肝炎抗原を含むワクチン組成物。
【請求項１５】
アジュバントをさらに含む、請求項１４に記載のワクチン組成物。
【請求項１６】
アジュバントがアルミニウム塩である、請求項１５に記載のワクチン組成物。
【請求項１７】
Ｔｈ１誘発性アジュバントを含む、請求項１５または１６に記載のワクチン組成物。
【請求項１８】
Ｔｈ１誘発性アジュバントが３−ＤＭＰＬ、ＱＳ２１、３−ＤＭＰＬおよびＱＳ２１、ならびにＣｐＧオリゴヌクレオチドを含む群から選択される、請求項１７に記載のワクチン組成物。
【請求項１９】
ジフテリアトキソイド（Ｄ）、破傷風トキソイド（Ｔ）、無細胞百日咳抗原（Ｐａ）、不活化ポリオウイルス（ＩＰＶ）、インフルエンザ菌（ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ）抗原（Ｈｉｂ）、Ａ型肝炎抗原、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、クラミジア、ＧＳＢ、ＨＰＶ、肺炎連鎖球菌（ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）およびナイセリア抗原からなる群から選択される抗原１種以上をさらに含む、請求項１４〜１８のいずれか１項に記載のワクチン組成物。
【請求項２０】
Ｂ型肝炎抗原およびシステイン溶液を含むワクチン組成物。
【請求項２１】
Ｂ型肝炎抗原が表面抗原である、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の方法、抗原またはワクチン組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）感染の治療または予防に使用するためのＢ型肝炎ワクチンの新規な製造方法に関する。さらに本発明は、本発明の新規方法によって得られるＨＢＶワクチンに関する。
【０００２】
慢性のＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）感染症は、現状ではその治療法に限界があるので、きわめて大きい世界的な公衆衛生上の問題となっている。その数が世界中に３億人を超えると推定される慢性ＨＢＶキャリアには、慢性活動性肝炎、肝硬変および原発性肝細胞癌の発症のリスクがある。
【０００３】
現在入手可能な多くのワクチンは、変質を防止するための保存剤を必要とする。使用されることが多い保存剤は水銀含有化合物のチオメルサールである。ワクチンにおいて水銀を使用することについては、いくつかの懸念が持ち上がっているが、論評者たちはチオメルサール含有ワクチンの潜在的有害性を誇張すべきでないと強調している（Ｏｆｆｉｔ；Ｐ．Ａ． ＪＡＭＡ Ｖｏｌ．２８３；Ｎｏ：１６）。そうであったとしても、製造方法でのチオメルサールの使用に代わる、より安全でありうるワクチンの新しい製造方法を見出すことは有益であるだろう。かくして、特にＢ型肝炎ワクチンにおいて、チオメルサールフリーのワクチンを開発することが必要とされている。
【０００４】
本発明の第１の態様においては、遊離ＳＨ基をもつ還元剤の存在下でＢ型肝炎抗原を精製することを含んでなる、ワクチンに使用するためのＢ型肝炎抗原の調製方法が提供される。
【０００５】
本発明は、好ましくは、遊離ＳＨ基をもつ還元剤の存在下でＢ型肝炎抗原を精製することを含んでなる、痕跡量のチオメルサールも含まない安定なＢ型肝炎抗原の調製方法を提供する。
【０００６】
抗原調製物は、本明細書に記載するような水銀の吸光分光分析法を使用して、精製抗原中にチオメルサールが検出されないとき、一般に痕跡量のチオメルサールも含まないものとする。
【０００７】
肝炎抗原調製物は、適切には吸光分光分析法によって測定したとき、タンパク質２０μｇにつき０．０２５μｇ未満の水銀を含むことが好ましい。
【０００８】
好ましくは、精製をチオメルサールの不在下で実施して、精製された抗原を完全にチオメルサールフリーとする。
【０００９】
好ましくは、抗原は安定であり、例えば本明細書の実施例１に記載するような、チオメルサールの存在下で精製された肝炎抗原と実質的に同程度の安定性があることが好適である。
【００１０】
肝炎抗原は免疫原性があることが好ましい。
【００１１】
還元剤は抗原の精製プロセスの間に添加することが好ましく、有利には肝炎抗原を発現する細胞を増殖させた後に添加する。
【００１２】
好ましくは、還元剤はシステイン、ジチオトレイトール、βメルカプトエタノールもしくはグルタチオンであり、システインが最も好ましい。
【００１３】
したがって、本発明は好ましくは、システインの存在下でＢ型肝炎抗原を精製することを含む、痕跡量のチオメルサールも含有しない、安定な免疫原性Ｂ型肝炎抗原の調製方法を提供する。
【００１４】
好ましくは、精製をシステイン溶液の存在下で実施する。
【００１５】
好ましくは、精製プロセスの間に溶液もしくは粉末形態のシステインを１〜１０ ｍＭ、好ましくは１〜５ ｍＭの最終濃度で添加する。さらに好ましくは、システインを約２ ｍＭの最終濃度で添加する。
【００１６】
好ましくは、システインはＬ−システインである。
【００１７】
本発明はさらに、粗製の抗原をゲル浸透クロマトグラフィーにかけ、イオン交換クロマトグラフィーにかけ、そして遊離ＳＨ基をもつ還元剤と混合することを含んでなる、痕跡量のチオメルサールも含有しない、安定な免疫原性Ｂ型肝炎抗原の調製方法を提供する。
【００１８】
好ましくは、イオン交換クロマトグラフィーはアニオン交換クロマトグラフィーである。
【００１９】
本発明はさらに、本発明の調製方法によって得られるチオメルサールフリーのＢ型肝炎抗原であって、チオメルサールの存在下で調製されたものと少なくとも同程度に免疫原性および抗原性がある上記抗原を提供する。
【００２０】
本発明はさらに、平均ＥＬＩＳＡタンパク質比が１．５より大きく、チオメルサールの存在下で調製されたＢ型肝炎表面抗原よりも少なくとも３倍低いＩＣ５０値をもつＲＦ１含有量である、免疫原性Ｂ型肝炎抗原を提供する。
【００２１】
別の態様においては、本発明は、ワクチンに使用するためのＢ型肝炎抗原を調製する方法であって、チオメルサールの存在下で該抗原を精製し、続いて遊離ＳＨ基を含む還元剤の存在下で該抗原を処理することを含んでなる上記方法に関する。
【００２２】
上記処理を行った後、チオメルサールを除去するための透析工程などの精製工程を実施するのが好適である。
【００２３】
好ましくは、還元剤はシステイン、ＤＴＴ、グルタチオンもしくは２−メルカプトエタノールである。
【００２４】
本発明のＢ型肝炎抗原はＢ型肝炎感染症の治療または予防に使用することができ、特に、例えば慢性のＢ型肝炎感染症の治療または予防に使用される。
【００２５】
本発明はさらに、本発明のＢ型肝炎抗原をアジュバントと共に含むワクチン製剤を提供する。好ましくは、アジュバントはアルミニウム塩またはＴｈ１細胞応答の選択的刺激因子である。
【００２６】
好ましくは、抗原はＢ型肝炎表面抗原である。
【００２７】
Ｂ型肝炎表面抗原の調製については十分な報告がある。例えば、Ｈａｒｆｏｒｄら、Ｄｅｖｅｌｏｐ． Ｂｉｏｌ． Ｓｔａｎｄａｒｄ ５４， ｐ．１２５（１９８３）、Ｇｒｅｇｇら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， ５， ｐ．４７９（１９８７）、ＥＰ−Ａ−０ ２２６ ８４６、ＥＰ−Ａ−０ ２９９ １０８およびそこに引用された文献を参照されたい。
【００２８】
本明細書で使用する「Ｂ型肝炎表面抗原」または「ＨＢｓＡｇ」という表現には、あらゆるＨＢｓＡｇ抗原またはＨＢＶ表面抗原の抗原性を提示するそれらの断片が含まれる。ＨＢｓＡｇ Ｓ抗原の２２６アミノ酸配列（Ｔｉｏｌｌａｉｓら、Ｎａｔｕｒｅ， ３１７， ４８９（１９８５）およびそこに引用された文献を参照）に加えて、本明細書に記載するＨＢｓＡｇは、所望により、上記の文献およびＥＰ−Ａ−０ ２７８ ９４０に記載されるようなプレＳ配列の全部もしくは一部を含んでいてもよい。本明細書に記載するＨＢｓＡｇは、例えばＷＯ ９１／１４７０３に記載される「エスケープ突然変異体」（ｅｓｃａｐｅ ｍｕｔａｎｔ）などの変異体をも意味することがある。
【００２９】
ＨＢｓＡｇはまた、ＥＰ ０ １９８ ４７４またはＥＰ ０ ３０４ ５７８に記載されるポリペプチドを指すこともある。
【００３０】
通常、ＨＢｓＡｇは粒状形態をしている。特に好ましい実施形態では、ＨＢｓＡｇは本質的に上記のＨＢｓＡｇ Ｓ抗原からなるものである。
【００３１】
ワクチンは、有利には、適切なアジュバントなどの製薬上許容される添加剤を含有する。好適なアジュバントが市販されており、例えば以下のものがある：フロイント不完全アジュバントおよび完全アジュバント（Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｄｅｔｒｏｉｔ， ＭＩ）；Ｍｅｒｃｋ Ａｄｊｕｖａｎｔ ６５（Ｍｅｒｃｋ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ， Ｉｎｃ．， Ｒａｈｗａｙ， ＮＪ）；ＡＳ−２（ＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ Ｂｅｅｃｈａｍ， Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ， ＰＡ）；水酸化アルミニウムゲル（ミョウバン）もしくはリン酸アルミニウムなどのアルミニウム塩；カルシウム、鉄もしくは亜鉛の塩；アシル化チロシンの不溶性懸濁液；アシル化糖類；カチオンもしくはアニオン性誘導体化多糖類；ポリホスファゼン；生分解性ミクロスフェア；モノホスホリルリピドＡおよびｑｕｉｌ Ａ。ＧＭ−ＣＳＦまたはインターロイキン−２、−７もしくは−１２などのサイトカインもアジュバントとして使用することができる。
【００３２】
本発明の製剤においては、アジュバント組成物が主としてＴｈ１タイプの免疫応答を誘発することが好ましい。高レベルのＴｈ１タイプのサイトカイン（例えばＩＦＮ−γ、ＴＮＦα、ＩＬ−２およびＩＬ−１２）は、投与された抗原に対する細胞性免疫応答の誘発を導く傾向がある。応答が主としてＴｈ１タイプである好ましい実施形態においては、Ｔｈ１タイプのサイトカインのレベルがＴｈ２タイプのサイトカインのレベルよりも大幅に増加する。これらのサイトカインのレベルは標準的アッセイを使用して容易に評価することができる。サイトカインのファミリーの総説については、ＭｏｓｍａｎｎおよびＣｏｆｆｍａｎ， Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｉｍｍｎｏｌ． ７：１４５−１７３， １９８９を参照されたい。
【００３３】
したがって、主としてＴｈ１タイプの応答を引き出す際に使用するのに好適なアジュバントとしては、例えばアルミニウム塩と組み合わせたモノホスホリルリピドＡ、好ましくは３−デ−Ｏ−アシル化モノホスホリルリピドＡ（３Ｄ−ＭＰＬ）が挙げられる。主としてＴｈ１タイプの免疫応答を引き出すその他の公知のアジュバントとしては、ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドがある。このオリゴヌクレオチドは、ＣｐＧジヌクレオチドがメチル化されていない点に特徴がある。こうしたオリゴヌクレオチドは周知であり、例えばＷＯ ９６／０２５５５に記載されている。また、免疫刺激性ＤＮＡ配列も、例えばＳａｔｏら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７３：３５２， １９９６に記載されている。その他の好適なアジュバントはサポニン、好ましくはＱＳ２１（Ａｑｕｉｌａ Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ Ｉｎｃ．， Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ， ＭＡ）であり、これは単独で使用しても、他のアジュバンドと組み合わせて使用してもよい。例えば、ある促進系は、モノホスホリルリピドＡとサポニン誘導体の組合せ（例えば、ＷＯ ９４／００１５３に記載されるＱＳ２１と３Ｄ−ＭＰＬの組合せ）、またはＷＯ ９６／３３７３９に記載されるような、ＱＳ２１がコレステロールで抑制されている、あまり反応原性でない組成物を含む。その他の好ましい製剤は水中油型乳剤およびトコフェロールを含む。水中油型乳剤中にＱＳ２１、３Ｄ−ＭＰＬおよびトコフェロールを含む特に強力なアジュバント製剤がＷＯ ９５／１７２１０に記載されている。
【００３４】
水中油型乳剤中にＱＳ２１、３Ｄ−ＭＰＬおよびトコフェロールを含む特に強力なアジュバント製剤がＷＯ ９５／１７２１０に記載されており、これは好ましい製剤である。
【００３５】
したがって、本発明の１つの実施形態では、本発明のＢ型肝炎表面抗原を含み、さらにＴｈ１誘発性アジュバントを含むワクチンが提供される。好ましい実施形態は、Ｔｈ１誘発性アジュバントが３Ｄ−ＭＰＬ、ＱＳ２１、ＱＳ２１とコレステロールの混合物、およびＣｐＧオリゴヌクレオチドを含むアジュバントの群から選択されるワクチンである。別の好ましい実施形態は、水中油型乳剤中のモノホスホリルリピドＡもしくはその誘導体、ＱＳ２１およびトコフェロールをアジュバントとして添加したＢ型肝炎表面抗原を含むワクチンである。
【００３６】
好ましくは、ワクチンはさらにサポニン、より好ましくはＱＳ２１を含む。ＣｐＧおよびサポニンを含む特定の好適なアジュバント製剤がＷＯ ００／０９１５９に記載されており、これは好ましい製剤である。最も好ましくは、この特定の製剤中のサポニンがＱＳ２１である。好ましくは、その製剤はさらに水中油型乳剤およびトコフェロールを含む。
【００３７】
本発明はさらに、本発明のＢ型肝炎表面抗原をアジュバントと共に含み、さらに次の群：ジフテリアトキソイド（Ｄ）、破傷風トキソイド（Ｔ）、無細胞百日咳抗原（Ｐａ）、不活化ポリオウイルス（ＩＰＶ）、インフルエンザ菌（ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ）抗原（Ｈｉｂ）、Ａ型肝炎抗原、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、クラミジア、ＧＳＢ、ＨＰＶ、肺炎連鎖球菌（ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）およびナイセリア抗原から選択される１種以上の抗原を含むワクチン製剤を提供する。その他の疾病からの保護を与える抗原も本発明のワクチン製剤に含めることができる。
【００３８】
特定の実施形態において、ワクチン製剤は、本発明の調製方法によって得られるＢ型肝炎抗原を、アジュバントと不活化ポリオウイルスと共に含有する。
【００３９】
本発明はまた、Ｂ型肝炎ウイルス感染の治療および／または予防方法であって、Ｂ型肝炎ウイルス感染にかかっているかまたはかかりやすいヒトもしくは動物被験者に、Ｂ型肝炎感染を予防および／または治療するのに有効かつ安全な量の本発明のワクチンを投与することを含んでなる上記方法を提供する。
【００４０】
さらに本発明は、慢性Ｂ型肝炎ウイルス感染などのＢ型肝炎ウイルス感染にかかっている患者を治療するための医薬の製造における、本発明のＢ型肝炎表面抗原の使用を提供する。
【００４１】
本発明のワクチンは、免疫防御量の抗原を含有するもので、慣用方法によって調製することができる。
【００４２】
ワクチンの調製については、ＰｏｗｅｌｌおよびＮｅｗｍａｎ編， Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌ．６１ Ｖａｃｃｉｎｅ Ｄｅｓｉｇｎ−ｔｈｅ ｓｕｂｕｎｉｔ ａｎｄ ａｄｊｕｖａｎｔ ａｐｐｒｏａｃｈ， Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ， １９９５、Ｖｏｌｌｅｒら編、Ｎｅｗ Ｔｒｅｎｄｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ ｉｎ Ｖａｃｃｉｎｅｓ， Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐａｒｋ Ｐｒｅｓｓ， Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ， Ｍａｒｙｌａｎｄ， Ｕ．Ｓ．Ａ． １９７８に全般的に記載されている。リポソーム内への封入は、例えばＦｕｌｌｅｒｔｏｎの米国特許第４，２３５，８７７号に記載されている。タンパク質の巨大分子へのコンジュゲーションは、例えばＬｉｋｈｉｔｅの米国特許第４，３７２，９４５号およびＡｒｍｏｒらの米国特許第４，４７４，７５７号に開示されている。Ｑｕｉｌ Ａの使用は、Ｄａｌｓｇａａｒｄら、Ａｃｔａ Ｖｅｔ Ｓｃａｎｄ， １８：３４９（１９７７）に開示されている。３Ｄ−ＭＰＬは、Ｒｉｂｉ ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍ， ＵＳＡから入手可能であり、英国特許出願第２２２０２１１号および米国特許第４９１２０９４号に開示されている。ＱＳ２１は米国特許第５０５７５４０号に開示されている。
【００４３】
本発明を以下の実施例によって説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００４４】
実施例１
チオメルサールの存在下でのＢ型肝炎表面抗原の調製方法
ＳＢ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ社のＢ型肝炎１価ワクチン（Ｅｎｇｅｒｉｘ Ｂ（商標））のＢ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）をＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ中で組換えタンパク質として発現させる（Ｈａｒｆｏｒｄら、上記引用文献参照）。２４ ｋＤタンパク質を細胞内で産生させ、組換え酵母細胞中に蓄積させる。発酵の終わりに酵母細胞を回収し、Ｔｗｅｅｎ ２０などの温和な界面活性剤の存在下で破壊して、所望のタンパク質を遊離させる。次に、可溶性の表面抗原粒子を含有している細胞ホモジネートを一連の沈殿で予備精製し、その後限外濾過によって濃縮する。
【００４５】
その後のクロマトグラフィーによる分離によって、組換え抗原のさらなる精製を実施する。第１工程では、粗製の抗原濃縮物をセファロース４Ｂ媒体によるゲル浸透クロマトグラフィーにかける。４Ｂゲル浸透クロマトグラフィー工程での溶離バッファー中にチオメルサールを存在させる。溶離バッファーは以下の組成からなる：１０ ｍＭ Ｔｒｉｓ、５％エチレングリコール、ｐＨ７．０、５０ ｍｇ／Ｌ チオメルサール。このバッファー中にチオメルサールを含ませて、バイオバーデン（ｂｉｏｂｕｒｄｅｎ：微生物負荷）を防止する。このチオメルサールの大部分はイオン交換クロマトグラフィー、超遠心分離および脱塩（ゲル浸透）を含む後続の精製工程において除かれ、結果として、当初の方法で調製された精製バルク抗原調製物はタンパク質２０μｇにつき約１．２μｇおよび２μｇ未満のチオメルサールを含有するようになる。
【００４６】
ＤＥＡＥマトリックスを使用してイオン交換クロマトグラフィー工程を実施し、次にこのプールを、事前に設定した塩化セシウム濃度が異なる４層上でのセシウム勾配超遠心分離にかける。混在する細胞成分から抗原粒子をそれらの勾配中での密度にしたがって分離し、遠心分離工程の最後に溶離させる。次にセファロースゲル上での２回目のゲル浸透クロマトグラフィーによって、このプールから塩化セシウムを除去する。
【００４７】
４Ｂゲル浸透バッファー中にチオメルサールを含む方法によってＨＢｓＡｇを調製する場合、ＣｓＣｌ勾配からプールされたＨＢｓＡｇ含有画分中に３０ ｍｇ／ｍｌを超えるタンパク質濃度が回収され、この濃度はＡｂｂｏｔｔ ＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓからのＡＵＳＺＹＭＥキットでアッセイしたときのＨＢｓＡｇの同等の濃度に対応する。
【００４８】
ＣｓＣｌ超遠心分離工程では、ＨＢｓＡｇ調製物から残留脂質、ＤＮＡおよびマイナーなタンパク質混入物が効果的に除去される。これはＢｅｃｋｍａｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ （Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ， Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）製のＴｉ １５ローターで速度 ３０，０００ ｒｐｍ、約４０〜６０時間のゾーン遠心分離によって実施する。精製しようとするサンプルを、最終濃度が０．７５、１．５、２．５および３．２５ ＭのＣｓＣｌ溶液の層にアプライする。遠心分離の最後に、その勾配を画分へと溶離させる。ＨＢｓＡｇ含有画分は、２８０ ｎｍでのＵＶ吸収によるか、またはＡＵＳＺＹＭＥキットで画分の希釈物を試験することによって、確認することができる。ＨＢｓＡｇバンドは１．１７〜１．２３ ｇ／ｃｍ３の密度の部分に存在する。
【００４９】
ワクチン製剤の調製に使用する前に、精製したＨＢｓＡｇを含有する溶液を滅菌濾過する。
【００５０】
酵母細胞溶解物からの精製は複雑である。なんとなれば、抗原が細胞内で産生され、純粋なバルク抗原を取得するためには、様々なタイプの（酵母）混入物を排除するように設計された一連の分離技法が必要となるからである。精製すべき産物が表面抗原ポリペプチドの複数のコピーを含有するリポタンパク質粒子であり、この構造を精製プロセス全体を通して維持しなければならないので、精製の各工程は重要である。この方法の特殊性は、免疫原性を増強するためのさらなる化学的処置を施す必要のない、十分に免疫原性のある表面抗原粒子をもたらすことにある（ＥＰ０１３５４３５と比較されたい）。
この調製方法の詳細は欧州特許第０１９９６９８号にさらに記載されている。
【００５１】
実施例２
チオメルサールフリーの方法による酵母由来のＨＢｓＡｇの調製および特性決定
１．酵母由来のＨＢｓＡｇの調製および精製
１．１　調製方法の概要
Ｂ型肝炎表面抗原は、例えばＨａｒｆｏｒｄら（上記引用文献）に記載されるような、適切なＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株の発酵によって生産することができる。
【００５２】
組換え酵母株の大規模発酵の終了時に、細胞を回収し、Ｔｗｅｅｎ ２０などの温和な界面活性剤の存在下で破壊する。次に、上記実施例１の記載に正確に従って、セファロース ４Ｂでの最初のゲル浸透工程までの多工程抽出・精製手順によって表面抗原を単離する。
【００５３】
１．２　チオメルサールフリーの精製法
チオメルサールフリーの方法では、実施例１に記載した方法に対して以下の２つの変更を導入した。
１．　４Ｂゲル浸透クロマトグラフィー工程の溶離バッファーがここではチオメルサールを含まない。
２．　アニオン交換クロマトグラフィー工程からの溶離液プールにシステイン（最終濃度 ２ ｍＭ）を添加する。
【００５４】
４Ｂゲル浸透バッファーからチオメルサールを取り除くと、ＣｓＣｌ密度勾配遠心分離工程においてＨＢｓＡｇ粒子の沈殿が生じ、産物の損失および回収抗原の集合もしくは凝集をもたらすことがわかった。
【００５５】
前工程のアニオン交換クロマトグラフィーからの溶離液プールに最終濃度２ ｍＭのシステインを添加すると、ＣｓＣｌ密度勾配遠心分離中の抗原の沈殿および損失が防止される。
【００５６】
システインはこの処理にとって好ましい物質である。なぜなら、システインは天然に存在するアミノ酸であり、カラムマトリックスとしてセファロース ４ＢＣＬＦＦを用いたゲル浸透カラムによる後続の脱塩工程で除去できるからである。
実施例１に記載した方法に対して、その他に調製方法の変更はない◎。
【００５７】
このチオメルサールフリーの方法からは、実施例１の方法で得られる抗原に匹敵する純度と性質をもつバルク抗原が得られる。
【００５８】
１．２ａ
４Ｂバッファーに５０μｇ／ｍｌで添加されたチオメルサールは分解すると考えられ、生成するエチル水銀がタンパク質のシステイン残基上の遊離スルフヒドリル基に共有結合することがある。このタンパク質は１４個のシステイン残基を含有し、そのうち７個が１０１位と１５０位の間に位置している。
【００５９】
このタンパク質領域は、粒子の表面に在って、免疫優性ａ領域およびＲＦ１モノクローナル抗体のための認識部位を含むＨＢｓＡｇの主要抗原領域を含有していると考えられる（Ｗａｔｅｒｓ Ｊら、Ｐｏｓｔｇｒａｄ． Ｍｅｄ． Ｊ．， １９８７：６３（Ｓｕｐｐｌ． ２）：５１−５６、およびＡｓｈｔｏｎ−ＲｉｃｋａｒｄｔおよびＭｕｒｒａｙ， Ｊ． Ｍｅｄ． Ｖｉｒｏｌｏｇｙ， １９８９：２９：１９６）。４Ｂゲル浸透バッファー中にチオメルサールを存在させて精製した抗原は、精製プロセスの最後に約０．５〜０．６μｇの水銀を含んでいる。この水銀は単純な透析では完全には除去されない。
【００６０】
ある実験において、バルク抗原調製物に対して、タンパク質２０μｇにつき水銀０．５６μｇが測定された。この調製物を１５０ ｍＭ ＮａＣｌ、１０ ｍＭ ＮａＰＯ４バッファー ｐＨ６．９に対して室温で１６時間透析した。透析の終了時、タンパク質２０μｇにつき０．３３μｇの水銀濃度が測定された。
【００６１】
これに対して、０．１〜５．０ ｍｇ／ｍｌのＬ−システイン、５０ ｍＭのＤＴＴもしくは０．５ Ｍの２−メルカプトエタノールなどの還元剤の存在下で透析し、続いて還元剤を除去するための２回目の透析を行うと、抗原調製物の水銀含量はタンパク質２０μｇにつき水銀０．０２５μｇ未満に低下する。この数値はこの方法の検出下限にあたる。
【００６２】
水銀含量は吸光光度分析法によって測定した。０．０１％ｗ／ｖの重クロム酸カリウム（Ｋ２Ｃｒ２Ｏ７）および５％ｖ／ｖの硝酸を含有する溶液中に抗原を希釈する。水銀源としてチオメルサールを用いて標準溶液を調製する。サンプルおよび標準溶液の原子吸光を、蒸気発生器中で気化させた後、水銀特異的カソードによって２５３．７ ｎｍで測定する。ブランクとして希釈用液体の原子吸光を測定する。標準溶液から作成した検量線からサンプルの水銀含量を算出する。結果はタンパク質２０μｇあたりの水銀μｇで表す。
【００６３】
１．３　チオメルサールフリーのバルク抗原の調製
バルク抗原を精製するためのプロセス工程を図１に示す。
【００６４】
１．４　チオメルサールを使用しないで製剤化したワクチンの組成
チオメルサールフリーの方法によって調製した抗原から製剤化された、保存剤を含まないＢ型肝炎ワクチンの典型的な量的組成を表１に示す。
【００６５】
【表１】
2004505992.tif 000002
３Ｄ−ＭＰＬおよび／またはその他のアジュバントの添加によって、この組成を変更してもよい。
【００６６】
２．チオメルサールフリーの方法によって調製したバルク抗原およびワクチンの特性決定
２．１　精製したバルク抗原の試験およびアッセイ
２．１．１　比較の基準
この実施例（実施例１．２）に従うチオメルサールフリーの方法によって３ロットのバルク抗原を調製した。これをＨＥＦ００１、ＨＥＦ００２およびＨＥＦ００３と命名する。これらを、チオメルサールの存在下で従来の方法（実施例１に記載）によって調製した１ロットのバルク抗原（ＨＥＰ２０５５）と比較した。
【００６７】
２．１．２　バルク抗原の試験およびアッセイ
チオメルサールフリーの方法によって調製した３ロットのバルク抗原を試験した。その結果を表２に要約する。
タンパク質含量はＬｏｗｒｙらの方法（Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． １９５１：１９３：２６５）によって測定した。
エンドトキシン含量は、Ｃａｐｅ Ｃｏｄ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ（７０４ Ｍａｉｎ Ｓｔ．， Ｆａｌｍｏｕｔｈ， ＭＡ ０２５４０， ＵＳＡ）から市販されているキットを使用し、リムルス（Ｌｉｍｕｌｕｓ）ゲル凝固法によって測定した。試薬は米国薬局方エンドトキシン標準品（ＵＳ Ｐｈａｒｍ． Ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｓｔａｎｄａｒｄ）に対して標準化する。
【００６８】
Ｔｗｅｅｎ２０は、ＨｕｄｄｌｅｓｔｏｎおよびＡｌｌｒｅｄの方法（Ｊ． Ａｍｅｒ． Ｏｉｌ Ｃｈｅｍｉｓｔ Ｓｏｃ．， １９６５：４２：９８３）によって測定した。
ＨＢｓＡｇ含量は、Ａｂｂｏｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｏｎｅ Ａｂｂｏｔｔ Ｐａｒｋ Ｒｏａｄ， Ａｂｂｏｔｔ Ｐａｒｋ， ＩＬ ６００６４， ＵＳＡ）から市販されているＡｕｓＺＹＭＥキットによって測定した。製造元のアッセイ手順Ｂを採用した。用量応答曲線を確立するための標準として、チオメルサールを使用する方法で精製したバルク抗原のバッチを使用した。
【００６９】
多糖類はＤｕｂｏｉｓらの方法（Ａｎａｌ． Ｃｈｅｍ． １９５６：２８：３５０）によって測定した。
脂質はＥ．Ｍｅｒｃｋ（Ｂ．Ｐ．４１１９， Ｄａｒｍｓｔａｄ Ｄ−６１００， Ｇｅｒｍａｎｙ）の市販キット（Ｍｅｒｋｏｔｅｓｔ Ｔｏｔａｌ Ｌｉｐｉｄｓ ３３２１）を使用して測定した。
ＤＮＡ含量は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ Ｃｏｒｐ．（Ｇｕｔｅｎｂｅｒｇｓｔｒａｓｓｅ １０， Ｉｓｍａｎｉｎｇ， Ｍｕｎｉｃｈ， Ｇｅｒｍａｎｙ）から入手し得る装置および試薬を使用してＴｈｒｅｓｈｏｌｄ法によって測定した。
【００７０】
これらの試験およびアッセイで得られた数値は、ＥＬＩＳＡによる抗原活性を除いて、セファロース４Ｂゲル浸透工程の溶離バッファー中にチオメルサールを使用して調製したバルク抗原ロットについて見られる範囲内に存在する。３つのＨＥＦ調製物についてのこの例外の測定値は、バルク抗原ロットＨＥＰ２０５５について見られるもの（ＥＬＩＳＡ／タンパク質比が１．１３）よりも高い（１．６３〜２．２５）。チオメルサールを含有するバルク抗原のバッチについてＡＵＳＺＹＭＥキットで測定したＥＬＩＳＡ／タンパク質比は一般的に約１．０であり、０．８〜１．２の範囲内であって、１．４を超えることは非常に稀である。
【００７１】
２．１．３　ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル分析
還元条件でのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析およびクーマシーブルー（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ ｂｌｕｅ）染色によってバルク抗原調製物をアッセイした。全サンプルが２４ Ｋに主要バンドを示し、痕跡量の二量体タンパク質が存在した。混在タンパク質の目視できるバンドの消失によって評価して、サンプルは高純度（純度＞９９％）であると判定した。
【００７２】
還元および非還元条件でのＳＤＳ−ＰＡＧＥならびに銀染色によって、バルク抗原調製物のサンプル（１μｇ）をアッセイした（図２）。還元条件ではサンプルは２４ Ｋに泳動する強いバンドを示し、痕跡量の二量体および多量体が存在した。ゲルパターンは比較物としてのＨＥＰ２０５５のものと区別できない。サンプルを非還元条件でも分析した。これらの条件では２４ Ｋに泳動する物質は少なくなり、二量体および多量体の位置に泳動するポリペプチドの量が増加する。チオメルサールフリーのバルク抗原ロットは比較物のＨＥＰ２０５５ロットよりも重合の度合いがやや高いようである。
【００７３】
クーマシーブルーまたは銀染色によって明らかになった２４ Ｋポリペプチドの正体（アイデンティティー）を、血漿ＨＢｓＡｇに対するウサギポリクローナル抗体を用いたウエスタンブロットによって確認した。バルク抗原調製物は２４ Ｋに主要バンドを示すとともに二量体および三量体も示す。この技法からは表面抗原タンパク質の分解産物がごくわずかに見られる。チオメルサールフリーの方法によって調製したバルク抗原とＨＥＰ２０５５ロットとの間に差異はない。
【００７４】
残留酵母タンパク質の存在は、還元条件でのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析および酵母タンパク質に対するウサギポリクローナル抗血清を用いたウエスタンブロットによってアッセイした（図３）。この技法は定性的なものであって、不純物の定量はできない。
【００７５】
１つを除外して、チオメルサールフリーの方法によって調製した３つのバルク抗原ロットおよびＨＥＰ２０５５ロットについて、一定のバンドパターンが示される。
【００７６】
ＨＥＰ２０５５バルク抗原に存在する強く染色した±２３ Ｋのバンドは、３つのＨＥＦ調製物には肉眼では存在しない。ウエスタンブロットは、チオメルサールフリーの精製法の結果、より純粋な抗原産物が得られることを示している。
【００７７】
【表２】
2004505992.tif 000003
【００７８】
２．１．４　その他の生化学的試験およびアッセイ
２．１．４．１　ＤＮＡ含量
Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ Ｃｏｒｐ）によって、３つのバルク抗原ロットのＤＮＡ含量を測定した。測定した量はタンパク質２０μｇにつきＤＮＡ １０ ｐｇ未満であり、現在承認されている方法によって調製されたバルク抗原で見られるＤＮＡ含量と同レベルであった。
【００７９】
２．１．４．２　アミノ酸組成
３つのＨＥＦバルク抗原ロットのアミノ酸組成は、６Ｎ ＨＣｌでの酸加水分解後、イオン交換カラムによるアミノ酸のクロマトグラフィーおよびカラム後のニンヒドリン検出によって測定した。プロリンとトリプトファンは測定しなかった。結果を表３に示す。
【００８０】
見出された組成はＨＥＰ２０５５について測定したものおよびＤＮＡ配列から予測された組成と良好に一致する。ＨＥＰ２０５５について測定したグリシン残基の数は予測組成に近似するが、バルク抗原調製物については１６〜１７残基数がより普通に測定される。見出されたシステイン残基の平均数は予測された１４であり、ＣｓＣｌ勾配工程での処理の結果、粒子に余分のシステインが結合していないことを示している。
【００８１】
２．１．４．３　遊離システインの定量
記載した方法に従って取得したバルク抗原調製物中に存在する遊離システインの量を、事前の酸加水分解をせずに過ギ酸による粒子の酸化後に測定した。酸化した遊離システイン残基をイオン交換カラムで分離し、カラム後にニンヒドリンによって検出した。この方法によるシステインの検出限界は１μｇ／ｍｌである。
【００８２】
表２に示す初期タンパク質濃度で試験したとき、３つのＨＥＦ抗原調製物では遊離のシステインを測定することはできなかった。
この技法では、バッファー中に存在する遊離システイン残基と、ジスルフィド結合によってＨＢｓＡｇタンパク質に結合しているがポリペプチド配列の一部を構成するものではないシステイン残基の両方が測定される。
【００８３】
２．１．４．４　Ｎ−末端配列分析
改変方法によって調製された３つのバルク抗原ロット中の混在タンパク質および分解産物の存在を、エドマン分解を基礎とするＮ−末端配列分析によって評価した。ＨＢｓＡｇタンパク質のＮ−末端配列 ＭＥＮＩＴＳ．．．は、他の配列に干渉されることなく検出された。通常の方法によって調製されたＨＢｓＡｇポリペプチドについて以前に観察されたように、Ｎ−末端メチオニンがアセチル化によって６０〜７５％ブロックされることも確認された。
【００８４】
【表３】
2004505992.tif 000004
【００８５】
２．１．４．５　レーザー光散乱分析
改変方法を使用して調製したＨＢｓＡｇ粒子とＨＥＰ２０５５参照ロットとの間で、レーザー光散乱によって粒子サイズの比較を実施した（表４）。
測定された平均分子量は両調製物間で良好な一致を示す。
【００８６】
【表４】
2004505992.tif 000005
【００８７】
２．１．４．６　電子顕微鏡検査
バルク抗原調製物を、固定および酢酸ウラニルによる染色後、電子顕微鏡検査で試験した。
観察された粒子は全サンプルにおいて類似しており、ＨＢｓＡｇに典型的な±２０ ｎｍの不完全球形または玉石様粒子であった。３つのＨＥＦロットにおいて観察された粒子はＨＥＰ２０５５のものと区別できなかった。
【００８８】
２．１．５　免疫学的分析
２．１．５．１　ＲＦ１モノクローナル抗体との反応性
ＥＬＩＳＡ阻害アッセイによって、３つのバルク抗原調製物をそれらのＲＦ１モノクローナル抗体との反応性について試験した。ＲＦ１モノクローナル抗体は、ＨＢＶチャレンジからチンパンジーを防御することがわかっており、このことからＨＢｓＡｇ粒子上の防御性立体配座エピトープを認識すると考えられる（Ｉｗａｒｓｏｎ Ｓら、１９８５， Ｊ． Ｍｅｄ， Ｖｉｒｏｌ．， １６：８９−９６）。
【００８９】
Ｂａｌｂ／Ｃマウスの腹腔内または組織培養下でＲＦ１ハイブリドーマを増殖させることができる。
飽和バッファー（１％ ＢＳＡ、０．１％ Ｔｗｅｅｎ ２０を含有するＰＢＳ）で１／５００００に希釈した腹水を、試験するＨＢｓＡｇサンプルのＰＢＳ中の各種希釈物（１００μｇ〜０．０５μｇ／ｍｌの範囲の最終濃度）と１：１に混合した。
【００９０】
混合物をＮｕｎｃ Ｉｍｍｕｎｏｐｌａｔｅｓ（９６Ｕ）中３７℃で１時間インキュベートした後、ＨＢｓＡｇの標準調製品をコートしたプレートに３７℃で１時間移した。標準ＨＢｓＡｇ調製品はチオメルサール含有方法によって精製したバルク抗原のロット（Ｈｅｐ ２８６）とした。０．１％のＴｗｅｅｎ ２０を含有するＰＢＳで洗浄した後、飽和バッファーで１／１０００に希釈したビオチン結合ヒツジ抗マウスＩｇＧを添加して、３７℃で１時間インキュベートした。洗浄工程後、飽和バッファーで１／１０００に希釈したストレプトアビジン−ビオチン化ペルオキシダーゼ複合体を同ウェルに添加し、３７℃で３０分インキュベートした。プレートを洗浄し、０．１Ｍ クエン酸バッファー ｐＨ４．５中のＯＰＤＡ ０．０４％、Ｈ２Ｏ２ ０．０３％の溶液とともに室温で２０分インキュベートした。２Ｎ Ｈ２ＳＯ４で反応を停止させ、４９０／６３０ｎｍで光学密度（Ｏ．Ｄ．）を測定し、グラフにプロットした。
【００９１】
コートしたＨＢｓＡｇへの抗体結合を５０％阻害する抗原の濃度（インヒビター濃度）として定義されるＩＣ５０は、４パラメーター式を使用して算出し、ｎｇ／ｍｌで表した。
【００９２】
ＨＥＰ２０５５を含む一連のＨＥＰ抗原ロットも、陰性対照としての単純ヘルペスｇＤ抗原とともに試験した。このアッセイでは、マイクロタイタープレートに結合させた標準抗原調製品（ＨＥＰ２８６）へのＲＦ１の結合を阻害する各試験抗原の能力を測定する。
【００９３】
表５に、固定抗原へのＲＦ１結合を５０％阻害することがわかった各抗原の濃度を示す。
【００９４】
【表５】
2004505992.tif 000006
【００９５】
結果は、ＲＦ１結合を阻害するために必要とされるＨＥＦ抗原は４〜７倍少ないことを示している（表５）。このことから、改変方法で調製した抗原はＨＥＰバルク抗原に比較してＲＦ１エピトープの提示が増大していることがわかる。
【００９６】
ＲＦ１ ｍＡｂの代わりにＥｎｇｅｒｉｘ Ｂ（商標）ワクチンからのヒト血清を使用して同様の阻害アッセイを実施したが、ＨＥＰ抗原ロットとＨＥＦ抗原の間に差異は見られなかった。
【００９７】
２．１．５．２．　モノクローナルＲＦ１への結合親和性
３つのＨＥＦ抗原ロットおよびＨＥＰ２０５５へのＲＦ１モノクローナル抗体結合の速度論的パラメーターは、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ （Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｌａｃｅ， Ｌｉｔｔｌｅ Ｃｈａｌｆｏｎｔ， Ｂｕｃｋｓ， ＵＫ） 製のＢｉａｃｏｒｅ ２０００装置を使用して、表面プラズモン共鳴により測定した。測定した速度論的パラメーターは以下のものである：
ｋａ：会合速度定数（Ｍ−１Ｓ−１）
ｋｄ：解離速度定数（Ｓ−１）
Ｋａ：平衡もしくは親和定数（Ｍ−１）
ここで、Ｋａ＝ｋａ／ｋｄ
得られた数値を表６に示す。
【００９８】
【表６】
2004505992.tif 000007
【００９９】
３つのＨＥＦ抗原ロットは同様の会合／解離定数および結合親和性の数値を示した。対照的に、ＨＥＰ２０５５はＲＦ１への結合親和性が比較的低かった。これは、チオメルサールフリーの方法で調製した抗原はＲＦ１エピトープの提示が増大していたことを示すＥＬＩＳＡ阻害アッセイの結果と一致している。
【０１００】
２．２．　改変方法で調製した抗原を用いて製剤化したワクチンについての試験およびアッセイ
３つのＨＥＦ抗原ロットを水酸化アルミニウムに吸着させ、表１に示した組成に従ってワクチンとして製剤化した。この表示はバイアル中の成人用量である（１ｍｌ中に抗原タンパク質 ２０μｇ）。これらのロットをＤＥＮＳ００１Ａ４、ＤＥＮＳ００２Ａ４およびＤＥＮＳ００３Ａ４として識別する。
【０１０１】
ワクチンの効力は、Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ製のＡＵＳＺＹＭＥ ＥＬＩＳＡキットおよび標準品として従来のワクチンロット（５０μｇ／ｍｌのチオメルサールを用いて製剤化したもの）を使用して、ｉｎ ｖｉｔｒｏ抗原含量アッセイにより測定した。ＰｈａｒｍａＥｕｒｏｐａ Ｓｐｅｃｉａｌ Ｉｓｓｕｅ Ｂｉｏ９７（１９９７年１２月）に記載されている方法Ｂを使用して、ワクチン効力を測定した。３つのＨＥＦロットは抗原含量について高い数値を示し、２０μｇ抗原タンパク質の所定含量のほぼ２倍である。
【０１０２】
２．２．１　ＤＥＮＳワクチンとＲＦ１モノクローナル抗体との反応性
吸着させたワクチンの抗原性を、ＲＦ１モノクローナル抗体による阻害アッセイにおいてさらに試験した。このアッセイでは、固定したバルク抗原（ＨＥＰ２８６）へのＲＦ１結合を阻害するワクチンサンプルの能力を測定する。
飽和バッファー（１％ ＢＳＡ、０．１％ Ｔｗｅｅｎ ２０を含有するＰＢＳ）で１／５００００に希釈した腹水を、試験するワクチンサンプルのＰＢＳ中の各種希釈物（２０μｇ〜０．０５μｇ／ｍｌの範囲の最終濃度）と１：１に混合した。
【０１０３】
混合物をＮｕｎｃ Ｉｍｍｕｎｏｐｌａｔｅｓ（９６Ｕ）において３７℃で２時間振盪させながらインキュベートした後、ＨＢｓＡｇをコートしたプレートに移した。コーティングのために使用したＨＢｓＡｇ調製品はチオメルサール含有方法で精製したバルク抗原ロット（Ｈｅｐ２８６）とした。その後これらのプレートを振盪させながら３７℃で２時間インキュベートした。０．１％ Ｔｗｅｅｎ ２０を含有するＰＢＳで洗浄した後、飽和バッファーで１／１０００に希釈したビオチン結合ヒツジ抗マウスＩｇＧを添加して、３７℃で１時間インキュベートした。洗浄工程後、飽和バッファーで１／１０００に希釈したストレプトアビジン−ビオチン化ペルオキシダーゼ複合体をそのウェルに添加し、３７℃で３０分インキュベートした。プレートを洗浄し、０．１Ｍ クエン酸バッファー ｐＨ４．５中にＯＰＤＡ ０．０４％、Ｈ２Ｏ２ ０．０３％を含有する溶液とともに室温で２０分インキュベートした。２Ｎ Ｈ２ＳＯ４で反応を停止させ、４９０／６３０ ｎｍで光学密度（Ｏ．Ｄ．）を測定し、グラフにプロットした。
【０１０４】
コートしたＨＢｓＡｇへの抗体結合を５０％阻害する抗原の濃度（インヒビター濃度）として定義されるＩＣ５０は、４パラメーター式を使用して算出し、ｎｇ／ｍｌで表した。
【０１０５】
改変方法で調製したバルク抗原から製剤化したワクチンを、従来のＨＥＰバルク抗原から製剤化し、保存剤としてチオメルサールを含まないＥｎｇｅｒｉｘ Ｂ（商標）ワクチンと比較した。アッセイを３回繰り返して実施した。
【０１０６】
結果を表７に示すが、これらの結果から、ＲＦ１結合を５０％阻害するために必要とされるＤＥＮＳワクチンの量は、保存剤を含まないＥｎｇｅｒｉｘ Ｂ（商標）ワクチンに比較して、約半量であることがわかる。これはＨＥＦ／ＤＥＮＳ抗原上のＲＦ１エピトープ提示の増加を反映しており、精製バルク抗原についてＲＦ１抗体を用いて実施した試験と一致している。
【０１０７】
【表７】
2004505992.tif 000008
【０１０８】
２．２．２　マウスにおけるＤＥＮＳワクチンの免疫原性
Ｂａｌｂ／Ｃマウスにおいて、３つのＤＥＮＳコンシステンシーロットの免疫原性を、現在の抗原調製法に従って調製しチオメルサールを用いて製剤化したＥｎｇｅｒｉｘ Ｂ（商標）の免疫原性と比較するための研究を実施した。
【０１０９】
以下のロットを試験した：
＃ＤＥＮＳ００１Ａ４
＃ＤＥＮＳ００２Ａ４
＃ＤＥＮＳ００３Ａ４
＃ＥＮＧ２９５３Ａ４／Ｑ（参照）
簡単に述べると、１２匹／群のマウスを免疫するために、成人用量の１／１０（２μｇ）または１／５０（０．４μｇ）に相当するワクチン用量を２週間おきに２回筋内注射した。２８日目に採取した血清から、ＨＢｓＡｇに対する抗体応答およびワクチン接種によって誘発されたアイソタイププロファイルをモニターした。
【０１１０】
実験計画
以下のワクチン用量を０日目および１５日目に１２匹／群のマウスの両足に筋内注射（２ｘ５０μｌ）した。
【０１１１】
【表８】
2004505992.tif 000009
【０１１２】
１５日目（１回目の２週間後）および２８日目（２回目の２週間後）に、眼窩後洞から血液を採取した。
この実験の計画（１２匹／群のマウスを用いて４製剤×２用量）のために、ＰＡＳＳ統計プログラムによって演繹的に効力を概算した。ＰＡＳＳ（Ｐｏｗｅｒ ａｎｄ Ｓａｍｐｌｅ Ｓｉｚｅ）統計プログラムはＮＣＳＳ （３２９ Ｎｏｒｔｈ １０００ Ｅａｓｔ， Ｋａｙｓｖｉｌｌｅ， Ｕｔａｈ ８４０３７）から入手した。二元分散分析については、α誤差５％を有する製剤間の２．５倍のＧＭＴの差はｐｏｗｅｒ＞９０％で検出すべきである。
【０１１３】
結果
血清学：
抗ＨＢｓ抗体の結合を明らかにするため、コーティング抗原としてのＨＢｓＡｇ（Ｈｅｐ２８６）およびビオチン結合抗マウス抗体を使用するＥＬＩＳＡアッセイによって、体液性応答（総Ｉｇおよびアイソタイプ）を測定した。２回目後の血清のみを分析した。
表９は、２回目の２週間後の各血清について測定した、平均およびＧＭＴ抗ＨＢｓ Ｉｇ抗体応答を示す。
匹敵する抗体応答がＤＥＮＳおよび従来のＢ型肝炎製剤によって誘発される。すなわち、２μｇ用量では、ＳＢ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ社のＢ型肝炎１価ワクチン（Ｅｎｇｅｒｉｘ ＢＴＭ）が２８８２ ＥＵ／ｍｌであるのに対して、ＤＥＮＳロットは２３０４〜３９７６ ＥＵ／ｍｌの範囲のＧＭＴであり、０．４μｇ用量では、ＳＢ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ社のＢ型肝炎１価ワクチン（Ｅｎｇｅｒｉｘ ＢＴＭ）が６２７ ＥＵ／ｍｌであるのに対して、ＤＥＮＳロットは６９６〜１１８２ ＥＵ／ｍｌの範囲のＧＭＴである。
【０１１４】
・予想されたように、２μｇおよび０．４μｇ用量の全製剤について、明らかな抗原用量範囲の効果が認められ、３〜６倍のＧＭＴの差がある。
・注射に使用した抗原用量またはロットとは明確な関連なしに、４匹の非応答マウス（力価＜５０ ＥＵ／ｍｌ）が観察された（１、２、３および８群；各群に１匹）。統計的分析（Ｇｒｕｂｂｓ検定）に基づいて、これらのマウスを以後の分析から除外した。
【０１１５】
【表９】
2004505992.tif 000010
【０１１６】
統計的分析：
ワクチン（４ロット）および抗原の用量（２μｇおよび０．４μｇ）を要因として使用して、２回目後のデータのｌｏｇ変換後の抗ＨＢｓ力価について二元分散分析を実施した。この分析により、２つの抗原用量間で統計的有意差が認められた（ｐ値＜０．００１）が、ワクチンロット間では有意差が認められなかった（ｐ値＝０．２６７４）。先に記載したように、効力は演繹的に概算され、実験の設計は、α誤差５％を有する２．５倍のＧＭＴの差がｐｏｗｅｒ＞９０％で製剤間に検出されるようにした。
【０１１７】
アイソタイプのプロファイル：
表１０は、２回目後にプールした血清の分析から算出したアイソタイプ再分割（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａおよびＩｇＧ２ｂ）を示す。
【０１１８】
・予想されたように、主としてＩｇＧ１抗体が観察されるので、明らかなＴｈ２応答がこれらミョウバンベースのワクチンによって誘発される。
【０１１９】
アイソタイププロファイルの見地からは、ＤＥＮＳロットまたはＳＢ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ社のＢ型肝炎１価ワクチン間で差異は認められなかった。
【０１２０】
【表１０】
2004505992.tif 000011
【０１２１】
実施例３
複合ワクチン製剤
本発明のバルク抗原はＩＰＶを含む複合ワクチン製剤に特に好適である。
【０１２２】
複合ＤＴＰａ−ＨＢＶ−ＩＰＶワクチンの初期ロットについて実施した安定性の研究では、ｉｎ ｖｉｔｒｏイムノアッセイ（ＥＬＩＳＡによるＤ抗原含量の測定）およびｉｎ ｖｉｖｏラット効力試験を使用したとき、ＩＰＶ成分、特に１型ポリオ抗原の効力の低下が示された。３型については効力の低下がまったく観察されなかった。２型については、効力の低下は予測された範囲内（貯蔵１年につき１０％以下の低下）であった。
【０１２３】
複合ＤＴＰａ−ＨＢＶ−ＩＰＶワクチンにおけるこの効力低下の原因を調べるための研究を開始した。ＳＢ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ社のＤＴＰａ−ＩＰＶワクチンに含まれるＩＰＶの安定性が満足すべきもの（貯蔵１年につき１０％以下の抗原含量低下）であるという観察から、ＤＴＰａ−ＨＢＶ−ＩＰＶワクチン中ではＨＢＶ成分がＩＰＶの不安定性の原因となるらしいと結論づけた。
【０１２４】
初期のＤＴＰａ−ＨＢＶ−ＩＰＶ製剤で使用したＨＢＶ成分は、ＳＢ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ社のＢ型肝炎１価ワクチンの製造にも使用される、実施例１の記載のとおりに調製した、精製されたｒ−ＤＮＡ、酵母由来ＨＢｓＡｇである。
【０１２５】
ＨＢＶ成分中のどの要素がＩＰＶに有害であるかを判定するための最初の試験として、ＨＢｓＡｇバルクをチオメルサールの存在について分析した。ＤＴＰワクチンの保存剤として使用したチオメルサールはＤＴＰ−ＩＰＶ複合剤中の「ポリオウイルスにとって有害である」ことがすでにわかっている（Ｄａｖｉｓｓｏｎら、１９５６， Ｊ． Ｌａｂ． Ｃｌｉｎ． Ｍｅｄ ４７：８−１９）。この観察を配慮して、ワクチン製造業者はＩＰＶ含有ワクチンを製剤化するにあたってチオメルサールを別の保存剤と取り替えている。さらに最近になって、＋４℃での長期貯蔵条件下でチオメルサールがＩＰＶの効力に及ぼす影響を再試験した。４〜６ヵ月後に１型ポリオウイルス抗原の効力の検出不能レベルまでの低下が報告された（Ｓａｗｙｅｒ，Ｌ．Ａ．ら、１９９４， Ｖａｃｃｉｎｅ １２：８５１−８５６）。
【０１２６】
原子吸光分光分析を使用して、実施例１に従って精製した抗原中に、ＨＢｓＡｇ ２０μｇあたり水銀（Ｈｇ）約０．５μｇが検出された。
【０１２７】
３７℃で７日間インキュベートしたＩＰＶバルク濃縮物において、この量の（チオメルサールおよびチオメルサールの分解産物である塩化エチル水銀としての）水銀は、１型Ｄ抗原含量に対するＥＬＩＳＡ応答を検出不能レベルにまで低下させることが可能である。
【０１２８】
ＨＢｓＡｇバルク中に存在する水銀を放出させるための方法が確立された。水銀はＨＢｓＡｇ粒子上のチオール基に結合しており、したがって還元剤の存在下で放出させることができるものと仮定した。他の還元剤を用いた実験の後、ＨＢｓＡｇ粒子から水銀を放出させるための薬剤として、Ｌ−システインが選択された。５．７ｍＭ Ｌ−システインを含有する生理食塩水に対してＨＢｓＡｇバルクを透析した後、保持物質中に水銀はまったく検出されなかった（この試験法の検出限界：２５ｎｇ Ｈｇ／２０μｇ ＨＢｓＡｇ）。透析した抗原をＩＰＶバルク濃縮物と混合し、３７℃で７日間インキュベートした後のＤ抗原含量を測定することによって１型ウイルスの安定性を評価した。対照として、ＨＢｓＡｇと混合しないＩＰＶバルク濃縮物、およびシステインで処理してないＨＢｓＡｇと混合したＩＰＶバルク濃縮物を使用した。＋２℃〜＋８℃で７日間貯蔵したサンプルについて参照ＥＬＩＳＡ力価を取得した。
【０１２９】
結果を表１１にまとめてある。
【０１３０】
【表１１】
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【０１３１】
これらの実験調製物から得られたデータは、ＩＰＶとの混合前にＨＢｓＡｇをシステインで処理して残留水銀を除去すると、１型ポリオウイルスの安定性が顕著に改善されることを明確に証明している。
【０１３２】
上に示したデータはまた、３７℃で７日間のインキュベーション後、参照ＩＰＶ調製物ではＤ抗原含量が２３％低下することも示している。これは、既報（Ｓａｗｙｅｒ，Ｌ．Ａ．ら、１９９４， Ｖａｃｃｉｎｅ １２：８５１−８５６）の１型Ｍａｈｏｎｅｙポリオウイルスの固有の不安定性を確証するものである。
【０１３３】
ＤＴＰａ−ＨＢＶ−ＩＰＶおよびＤＴＰａ−ＨＢＶ−ＩＰＶ／Ｈｉｂワクチンの市販のロットは、残留水銀を除去し、またＩＰＶの安定性を保持するため、５．７ｍＭ Ｌ−システインを用いる透析法を使用して調製されたものであるが、この透析法は大規模生産には適さず、チオメルサールもしくは水銀フリーのＨＢｓＡｇを調製するための一連の補助工程が必要となる。これに対して、チオメルサールを使用しないで調製された本発明のＨＢｓＡｇは、特にＩＰＶを含む複合ワクチンの製剤化に直接使用することができる。
【０１３４】
４．総括
酵母由来の表面抗原を精製するためにこれまで使用されてきた方法は、ゲル浸透工程を含むが、この工程ではバイオバーデンを防ぐために水銀含有抗微生物化合物のチオメルサールが溶離バッファー中に添加される。このチオメルサールは精製法の後続の工程で完全には除去されず、タンパク質２０μｇにつき約１．２μｇのチオメルサールが精製バルク抗原中に存在する。完全にチオメルサール（水銀）フリーのバルク抗原を調製するため、この精製法は２工程が変更された：
・４Ｂゲル浸透工程の溶離バッファーからチオメルサールを排除する。
・アニオン交換クロマトグラフィー工程からの溶離液プールにシステイン（最終濃度 ２ ｍＭ）を添加する。これはＣｓＣｌ密度勾配遠心分離中の抗原の沈殿を防止する。
調製方法にその他の変更はない。
【０１３５】
改変方法によって調製したバルク抗原の特性を決定した。物理化学的試験およびアッセイにより、チオメルサールフリーの抗原は、その性質の点で、従来使用された方法によって調製された抗原と区別できないことが示された。抗原粒子はその構成成分がまったく同じである。
【０１３６】
ＨＢｓＡｇポリペプチドの正体および完全性は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析、ポリクローナル抗ＨＢｓＡｇ抗体を使用するウエスタンブロッティング、Ｎ−末端配列解析およびアミノ酸組成で判定して、この改変方法によって影響を受けない。電子顕微鏡検査およびレーザー光散乱解析は、これらの粒子が酵母由来のＨＢｓＡｇに予測される典型的な形態およびサイズであることを示している。抗酵母タンパク質血清を用いたウエスタンブロッティングによる分析によれば、チオメルサールフリーの方法で調製した抗原は混在酵母タンパク質の同様のパターンを示した。しかし、２３Ｋに泳動する混在タンパク質のバンドの量は、改変方法を用いて調製した３つのＨＢｓＡｇロットにおいて著しく減少していた。
【０１３７】
免疫学的分析は、チオメルサールフリーの粒子はその抗原性が増加することを示している。これらの粒子はＡｂｂｏｔｔ ＡＵＳＺＹＭＥキット（モノクローナル抗体の混合物を含有）との反応性がより高く、ＥＬＩＳＡ／タンパク質比が１．６〜２．２５である。この増大した抗原性は防御ＲＦ１モノクローナル抗体によっても示される。標準固定化抗体へのＲＦ１の結合を阻害するために必要な、チオメルサールフリーの抗原は約４〜７倍少なくてよい。チオメルサールフリー抗原および従来の抗原による結合曲線の阻害は、２つの明確に区別されるファミリーに区分される。この差異は、表面プラズモン共鳴を用いてＲＦ１に対する結合親和定数を測定することによっても示される。チオメルサールフリーの調製物の結合親和性は、従来のバルク抗原のロットに比較して３〜４倍高い。
【０１３８】
バルク抗原調製物は、保存剤を使用しないで、水酸化アルミニウムに吸着させることによってワクチンとして製剤化した。
【０１３９】
Ａｂｂｏｔｔ ＡＵＳＺＹＭＥ ＥＬＩＳＡキットおよび標準品としてのＳＢ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ社のチオメルサール含有Ｂ型肝炎１価ワクチンを使用するｉｎ ｖｉｔｒｏ効力についての試験は、高いｉｎ ｖｉｔｒｏ効力値が得られたことを示した。この試験によって測定された抗原含量は、２０μｇタンパク質／ｍｌの規定値のほぼ２倍であった。
【０１４０】
チオメルサールフリーの抗原から調製したワクチンの反応性の増加は、固定した抗原への結合についてのＲＦ１モノクローナル抗体による阻害アッセイにおいても見られた。従来の方法で精製して、保存剤を使用しないで製剤化した抗原に比較して、固定した抗原へのＲＦ１結合の５０％阻害を与えるために必要とされるチオメルサールフリーのワクチンの量は、約半分であった。
【０１４１】
チオメルサールフリーのワクチンのＲＦ１に対するこの増加した抗原性は、バルク抗原調製物について実施したｉｎ ｖｉｔｒｏ効力試験（抗原含量）の結果およびＲＦ１抗体試験と一致している。
【０１４２】
初回および追加ワクチン接種を２週間間隔で２および０．４μｇの抗原を使用して、マウス免疫原性試験を実施した。２８日目（追加ワクチン接種の１４日後）にマウスから採血した。血清の抗体力価およびアイソタイプ組成を分析した。２つの投与量について明確な抗原用量効果が認められたが、チオメルサールフリーおよび保存剤フリーのワクチン間で、抗体力価（ＧＭＴ）から見た応答には統計的有意差が見られなかった。アイソタイプのプロファイルについては実質的な差異が認められなかった。
【図面の簡単な説明】
【図１】
Ｅｎｇｅｒｉｘ Ｂ（商標）についてのチオメルサールフリーの調製工程を示した図である。
【図２】
バルク抗原ロットのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示した図である。
【図３】
チオメルサールフリーの方法で調製したバルク抗原ロット中の残留酵母タンパク質を示した図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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