(57)【要約】本発明は、インスリンの活性な親水性ポリマー改変誘導体を提供する。１つの局面において、本発明のインスリン誘導体は肺への送達に適し、天然インスリンを超えて著しく改善された薬物動態学的特徴および／または薬力学的特徴を示す。肺投与のためのインスリン組成物は、天然に存在しない親水性ポリマーの１以上の分子に共有結合したインスリンの結合体を含む。また、このインスリン組成物は、結合体が親油性部分を保持しない組成物をも含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
肺投与のためのインスリン組成物であって、該組成物は、天然に存在しない親水性ポリマーの１以上の分子に共有結合したインスリンの結合体を含む、組成物。
【請求項２】
前記結合体が親油性部分を保持しない、請求項１に記載のインスリン組成物。
【請求項３】
前記天然に存在しない親水性ポリマーがポリアルキレングリコールである、請求項１に記載のインスリン組成物。
【請求項４】
前記天然に存在しない親水性ポリマーがポリエチレングリコールである、請求項１に記載のインスリン組成物。
【請求項５】
前記天然に存在しない親水性ポリマーがポリエチレングリコールである、請求項２に記載のインスリン組成物。
【請求項６】
天然インスリンより大きい絶対的肺バイオアベイラビリティーによって特徴づけられる、請求項４に記載の組成物。
【請求項７】
天然インスリンの少なくとも２倍である絶対的肺バイオアベイラビリティーによって特徴づけられる、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
１５％より高い絶対的肺バイオアベイラビリティーによって特徴づけられる、請求項４に記載の組成物。
【請求項９】
３０％より高い絶対的肺バイオアベイラビリティーによって特徴づけられる、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
肺に投与した場合、天然インスリンの少なくとも３倍であるＴｍａｘによって特徴づけられる、請求項４に記載の組成物。
【請求項１１】
肺に投与した場合、天然インスリンの少なくとも５倍であるＴｍａｘによって特徴づけられる、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
前記ポリエチレングリコールが末端キャップされている、請求項４に記載の組成物。
【請求項１３】
前記ポリエチレングリコールがアルコキシ基で末端キャップされている、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１４】
前記ポリエチレングリコールが、直鎖ポリエチレングリコール、分岐ポリエチレングリコール、フォーク型ポリエチレングリコール、およびダンベル型ポリエチレングリコールからなる群から選択される、請求項４に記載の組成物。
【請求項１５】
前記ポリエチレングリコールが、生分解性結合を含む、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１６】
前記ポリエチレングリコールが、約２〜３００個のサブユニット、約４〜２００個のサブユニット、および約１０〜１００個のサブユニットからなる群から選択される、多くの（ＯＣＨ２ＣＨ２）サブユニットを含む、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１７】
前記ポリエチレングリコールが、約２００〜約１０，０００ダルトンの見かけの平均分子量を有する、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１８】
前記ポリエチレングリコールが直鎖である、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１９】
前記ポリエチレングリコールが、約２００〜約５，０００ダルトンの見かけの平均分子量を有する、請求項１７に記載の組成物。
【請求項２０】
前記ポリエチレングリコールが、約２００〜２，０００ダルトンの見かけの平均分子量を有する、請求項１７に記載の組成物。
【請求項２１】
前記ポリエチレングリコールが、約２００〜１，０００ダルトンの見かけの平均分子量を有する、請求項１７に記載の組成物。
【請求項２２】
前記インスリンが天然インスリンである、請求項４に記載の組成物。
【請求項２３】
前記結合体が９０％より高い純度を有する、請求項４に記載の組成物。
【請求項２４】
前記インスリンが１つ以上のアミノ部位でポリエチレングリコールと共有結合している、請求項４に記載の組成物。
【請求項２５】
インスリンのＢ−１  Ｐｈｅ部位の少なくとも約７５％が、ポリエチレングリコールと共有結合している、請求項２４に記載の組成物。
【請求項２６】
インスリンのＢ−１  Ｐｈｅ部位の少なくとも約９０％が、ポリエチレングリコールと共有結合している、請求項２５に記載の組成物。
【請求項２７】
インスリンのモノマーとダイマー結合体との混合物を含む、請求項２４に記載の組成物。
【請求項２８】
さらにトリマーインスリン結合体を含む、請求項２７に記載の組成物。
【請求項２９】
前記インスリンが、前記ポリエチレングリコールの末端に位置する連結部分を介して該ポリエチレングリコールと共有結合している、請求項４に記載の組成物。
【請求項３０】
前記ポリエチレングリコールが、インスリンと結合する前に、インスリンとの共有結合に適した１つの末端に活性化連結部分を保持する、請求項４に記載の組成物。
【請求項３１】
前記活性化連結部分が反応性インスリンアミノ基との結合に適している、請求項３０に記載の組成物。
【請求項３２】
前記活性化連結部分が、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド活性エステル、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド活性カーボネート、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドアルデヒド、およびＮ−ヒドロキシスクシンイミドアセタールからなる群から選択される反応性官能基を含む、請求項３１に記載の組成物。
【請求項３３】
インスリンがアミド結合を介してポリエチレングリコールと共有結合している、請求項２９に記載の組成物。
【請求項３４】
エアロゾル化形態である、請求項４に記載の組成物。
【請求項３５】
液体形態また乾燥形態である、請求項４に記載の組成物。
【請求項３６】
薬学的に容認可能な賦形剤をさらに含む、請求項４に記載の組成物。
【請求項３７】
凍結乾燥形態である、請求項４に記載の組成物。
【請求項３８】
インスリンを必要とする哺乳動物被験体にインスリンを送達する方法であって、以下：
請求項４に記載のインスリン組成物をエアロゾル化する工程、および
該被験体の肺での付着および肺からの吸収のために、吸入によって該エアロゾル化インスリン組成物を投与する、工程、
を包含する、方法。
【請求項３９】
インスリンを必要とする被験体の肺へ投与するための、実質的に非免疫原性のインスリン組成物を提供する方法であって、以下：
インスリン−親水性ポリマー結合体を含む組成物を提供するために、天然に存在しない親水性ポリマーの１つ以上の分子とインスリンを共有結合させる、工程、
および
吸入によって該インスリンを必要とする被験体の肺に該組成物を投与する工程であって、ここで該投与の結果として、該インスリンが肺を通過し血液循環に入る、工程
を包含する、方法。
【請求項４０】
前記天然に存在しない親水性ポリマーがポリアルキレングリコールである、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
インスリンを必要とする被験体の肺へ投与するための、延長された効果のインスリン組成物を提供するための方法であって、以下：
インスリン−親水性ポリマー結合体を含む組成物を提供するために、天然に存在しない親水性ポリマーの１つ以上の分子とインスリンとを共有結合する、工程、
吸入によって該インスリンを必要とする被験体の肺に該組成物を投与する工程であって、ここで、該投与の結果として、（ｉ）該インスリンが肺を通過し、血液循環に入り、そして（ｉｉ）インスリンの上昇した血中レベルが、投与後少なくとも８時間維持される、工程、
を含む、方法。
【請求項４２】
前記天然に存在しない親水性ポリマーがポリアルキレングリコールである、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記天然に存在しない親水性ポリマーがポリエチレングリコールである、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
インスリンの上昇したレベルが投与後少なくとも１０時間維持される、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
インスリンの上昇したレベルが投与後少なくとも１２時間維持される、請求項４３に記載の方法。
【請求項４６】
さらに前記投与の結果として、前記被験体のグルコースのレベルが投与後少なくとも１０時間抑制される、請求項４３に記載の方法。
【請求項４７】
さらに前記投与の結果として、前記被験体のグルコースのレベルが投与後少なくとも１２時間抑制される、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記投与工程がエアロゾル化形態で前記組成物を投与することを含む、請求項４３に記載の方法。
【請求項４９】
投与前に前記組成物をエアロゾル化する工程をさらに包含する、請求項４３に記載の方法。
【請求項５０】
前記結合する工程が、部位特異的様式でポリエチレングリコールとインスリンとを共有結合させることを含む、請求項４３に記載の方法。
【請求項５１】
前記結合する工程が、無作為的様式でポリエチレングリコールとインスリンとを共有結合させることを含む、請求項４３に記載の方法。
【請求項５２】
前記結合体が、肺に投与された場合、天然インスリンよりも大きい絶対的肺バイオアベイラビリティーによってさらに特徴づけられる、請求項４３に記載の方法。
【請求項５３】
前記結合する工程が、末端キャップされたポリエチレングリコールの１以上の分子とインスリンとを共有結合させることを含む、請求項４３に記載の方法。
【請求項５４】
前記結合する工程が、直鎖ポリエチレングリコール、分岐ポリエチレングリコール、フォーク型ポリエチレングリコール、およびダンベル型ポリエチレングリコールから選択されるポリエチレングリコールの１つ以上の分子とインスリンとを共有結合させることを包含する、請求項４３に記載の方法。
【請求項５５】
前記結合体が親油性部分を保持しない、請求項４３に記載の方法。
【請求項５６】
前記組成物が親油性成分を含有しない、請求項４３に記載の方法。
【請求項５７】
前記結合する工程が、生分解性結合を含むポリエチレングリコールの１つ以上の分子とインスリンとを共有結合させることを含む、請求項４３に記載の方法。
【請求項５８】
前記ポリエチレングリコールが、約２〜３００個のサブユニット、約４〜２００個のサブユニット、および約１０〜１００個のサブユニットからなる群から選択される、多くの（ＯＣＨ２ＣＨ２）サブユニットを含む、請求項４３に記載の方法。
【請求項５９】
前記ポリエチレングリコールが、約２００〜約１０，０００ダルトンの見かけの平均分子量を有する、請求項４３に記載の方法。
【請求項６０】
前記ポリエチレングリコールが、約２００〜約５，０００ダルトンの見かけの平均分子量を有する、請求項４３に記載の方法。
【請求項６１】
前記ポリエチレングリコールが、約２００〜約２，０００ダルトンの見かけの平均分子量を有する、請求項４３に記載の方法。
【請求項６２】
前記ポリエチレングリコールが、約２００〜約１，０００ダルトンの見かけの平均分子量を有する、請求項４３に記載の方法。
【請求項６３】
前記結合する工程がインスリンの１つ以上の反応性アミノ部位でインスリンとポリエチレングリコールとを共有結合することを含む、請求項４３に記載の方法。
【請求項６４】
前記ポリエチレングリコールが、アミド、ウレタン、およびメチレンアミノからなる群から選択される結合を介して、インスリンの１つ以上の反応性アミノ部位でインスリンと結合する、請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
前記結合する工程が、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド活性エステル、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド活性カーボネート、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドアルデヒド、およびＮ−ヒドロキシスクシンイミドアセタールからなる群から選択される末端反応性基を有するポリエチレングルコースとインスリンの１つ以上の反応性アミノ部位とを反応させることを包含する、請求項６３に記載の方法。
【請求項６６】
前記結合する工程が、インスリンのＢ−１  Ｐｈｅ部位の少なくとも約７５％がポリエチレングリコールと共有結合している組成物を産出する、請求項４３に記載の方法。
【請求項６７】
前記結合する工程が、インスリンのＢ−１  Ｐｈｅ部位の少なくとも約９０％がポリエチレングリコールと共有結合している組成物を産出する、請求項４３に記載の方法。
【請求項６８】
前記結合する工程が、インスリンのモノマーとダイマー結合体との混合物を含む組成物を産出する、請求項４３に記載の方法。
【請求項６９】
前記結合する工程がさらにインスリンのトリマー結合体をさらに含む組成物を産出する、請求項６８に記載の方法。
【請求項７０】
前記ポリエチレングリコールがインスリンとの共有結合に適した１つの末端に活性化結合部分を含む、請求項４３に記載の方法。
【請求項７１】
前記活性化連結部分が、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド活性エステル、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド活性カーボネート、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドアルデヒド、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドアセタールからなる群から選択される反応性官能基を含む、請求項４３に記載の方法。
【請求項７２】
該結合部分が約２〜約２０原子の長さである、請求項７０に記載の方法。
【請求項７３】
前記投与する工程が乾燥粉末吸入器によって前記組成物を投与することを含む、請求項４３に記載の方法。
【請求項７４】
前記投与する工程が計量式吸入器によって前記組成物を投与することを含む、請求項４３に記載の方法。
【請求項７５】
前記投与する工程が噴霧器によって前記組成物を投与することを含む、請求項４３に記載の方法。
【請求項７６】
前記組成物がさらに薬学的に容認可能な賦形剤を含む、請求項４３に記載の方法。
【請求項７７】
前記結合体組成物を投与する工程の結果として、基礎レベルよりも少なくとも２倍高いインスリンの血清レベルが投与後１時間以内に達成される、請求項４３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、吸入による肺への送達のための、生物活性を有する親水性ポリマー改変インスリン誘導体に関する。このような誘導体を調製および投与するための方法もまた、提供される。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
インスリンは、（糖尿病でない）正常人の膵臓のβ細胞において生産されるのポリペプチドホルモンである。ヒトインスリンは、約５８００ダルトンの分子量を有する５１アミノ酸のポリペプチドホルモンである。インスリン分子は、１個のサブユニット内ジスルフィド結合および２個のサブユニット間ジスルフィド結合を含む２本のペプチド鎖（Ａ鎖およびＢ鎖）から構成される。Ａ鎖は、２１アミノ酸から構成から構成される一方、Ｂ鎖は、３０アミノ酸から構成から構成される。インスリンの２本の鎖は、Ａ鎖とＢ鎖の両方において、数個のα−ヘリックス領域で高度に整列された構造を形成する。興味深いことに、インスリンの単離された鎖は、不活性である。溶液中では、インスリンは、単量体として、または二量体として、あるいは六量体として存在し得る。皮下治療のために使用されるかなり濃縮された調製においては、インスリンは、六量体であるが、体液内で希釈されるので、単量体になる。インスリンは、血糖値を減らすことによる炭水化物の代謝の調節のために必要である；インスリンの全身性の欠乏は、糖尿病を引き起こす。糖尿病患者の生存は、受容可能な血糖値を維持するために頻繁かつ長期にわたるインスリンの投与に依存している。
【０００３】
現在のインスリン処方物は、糖尿病の処置において、重篤な医学的な合併症を導き得る欠陥を有する。例えば、糖尿病患者により最も一般に使用される標準的な亜鉛インスリン調製物は、不活性の六量体のインスリン微結晶の懸濁液として存在する。微結晶の溶解に続く六量体の活性型単量体形態への解離は、血流へのインスリンの遅延された吸収および個々に変りやすい吸収を導き得る（Ｆ．Ｌｉｕら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．，８，６６４−６７２（１９９７）；Ｔ．Ｕｃｈｉｏら、Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌ．Ｒｅｖ．，３５，２８９−３０６（１９９９）；Ｋ．Ｈｉｎｄｓら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．，１１，１９５−２０１（２０００）。インスリンの処方物はまた、インスリンが原繊維および不溶性の沈殿物を形成する傾向に起因した物理的な不安定性を生じる。沈殿物は、インスリンポンプにおける使用を意図された処方物にとって特に問題である。処方されたインスリンはまた、化学的な分解（例えば、非酵素的な脱アミド、および共有結合的のインスリン二量体のような高分子量転換産物の形成）の傾向がある。（Ｂｒａｎｇｅ，Ｊら、Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．，９，７１５−７２６（１９９２）；Ｂｒａｎｇｅ，Ｊら、Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．，９，７２７−７３４（１９９２））。インスリンに対する免疫学的応答の発生が、これらのインスリンの共有結合的凝集体の存在に起因し得る有意な根拠がある（Ｒｏｂｂｉｎｓ，Ｄ．Ｃ．ら、Ｄｉａｂｅｔｅｓ，３６，８３８−８４１（１９８７）。その上、さらに高度に精製されたヒトインスリンは、わずかに免疫原性である（Ｋｉｍ，同書）。
【０００４】
上記で述べた処方物の不安定性の問題以外に、投与の観点から、現在のインスリン治療に関連した多数の難点がまた存在する。インスリンは、代表的には、腹部または太股の上部への皮下注射により最も一般的に投与される。インスリンはまた、静脈内または筋肉内に投与され得る。受容可能な血糖値を維持するために、少なくとも１日に１回または１日に２回インスリンを注射することが、しばしば必要であり、必要な場合、インスリンの追加の注射が投与される。糖尿病の積極的な処置は、さらにより頻繁な注射を必要とし得、ここで患者は、自宅診断キットを使用して、血糖値を綿密にモニターする。注射によるインスリンの投与は、多くの観点において、望ましくない。第一に、多くの患者が、受容可能な血糖値を維持するために必要な頻度でインスリンを注射をすることが難しく、そして煩わしく感じる。事実、多くの２型糖尿病患者は、針に対する恐怖のため、何年もの間、インスリンを続けることを避ける。このような嫌気は、服薬不履行を導き得、最も重篤な場合においては、生命を脅かし得る。さらに、皮下注射由来のインスリンの全身性の吸収は、比較的遅く、速効性のインスリン処方物が使用された場合でさえ、しばしば、４５分〜９０分を必要とする。従って、自己注射の必要性を回避し、インスリンの迅速な全身性の有効性を提供し得る代替のインスリン処方物および投与経路を提供することが、長期にわたる目標である。
【０００５】
経口および経鼻のような多くの注射不可能な処方物の型が、検討されているが、これらの努力（Ｐａｔｔｏｎら、Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，１，３５（２−３），２３５−２４７（１９９９））の結果として、インスリンに対する市販の経口ベースの送達システムまたは経鼻ベースの送達システムは、主に非常に低いバイオアベイラビリティーおよび変り易いバイオアベイラビリティー（Ｈｉｌｓｔｅｄ，Ｊ．ら、Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ  ３８，６８０−６８４，（１９９５））に起因して、開発されていない。バイオアベイラビリティーは、吸収エンハンサーで増強され得るが、これらの薬剤は、粘膜を損傷し得る。
【０００６】
しかしながら、上記の多くの問題点の克服において、非常に期待できるようであるインスリンの吸入可能な処方物が、開発されている。例えば、米国特許番号５、９９７，８４８号（Ｐａｔｔｏｎら、Ｉｎｈａｌｅ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．）は、インスリンの乾燥粉末処方物を記載し、それは、（ｉ）室温で化学的および生理学的に安定であり、そして（ｉｉ）吸入された場合、肺胞の領域の上皮細胞を通って血液循環へ、迅速に吸収される。本明細書中に記載される速効性インスリン処方物および方法は、煩わしい自己注射の必要性を回避し、そして３ヶ月のヒト有効性研究において、皮下注射と比較した場合、Ｉ型およびＩＩ型インスリン依存性糖尿病において同等なグルコースコントロールを提供することを示している（Ｐａｔｔｏｎら、Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，１，３５（２−３），２３５−２４７（１９９９））。Ｐａｔｔｏｎらによって記載された乾燥粉末インスリン処方物は、処方物の不安定性の問題および患者の服薬不履行の問題を克服するが、なおグルコース量の効果的な調節のためにインスリンの頻繁な吸入（例えば、食事時間）を要求する。さらに、この型の代表的なインスリン投薬レジームは、速効性の吸入可能なインスリンに基づいており、なおＩ型およびいくらかのＩＩ型糖尿病のために、就寝時刻における長時間作用性インスリンの単回注射を必要とする。従って、それほど頻繁でない用量を必要とする、活性な、可溶性の、安定なインスリンの形態（例えば、長時間作用性のインスリン処方物、好ましくは吸入により投薬可能なもの）に対する必要性が依然として存在する。
【０００７】
長時間作用性のインスリン処方物は、理想的には、非常に遅い開始および延長された、比較的平坦な作用のピークを有するように特徴づけられる。現在の長時間作用性の注射可能なインスリン処方物、例えば、ウルトラレンテ（持続型インスリン亜鉛懸濁液）およびプロタミン亜鉛インスリン懸濁液は、非常に不満足である。インスリンの低い基底濃度を提供するよりむしろピークを持つ傾向があるこれらの処方物は、予測不可能であり、そして代表的に約１日未満の作用期間を示す。ウルトラレンテインスリンの長い半減期は、最適な投薬の範囲を決定することを難しくし、プロタミン亜鉛インスリンは、その予測不能で延長された作用経過のため、めったに使用されない（Ｇｏｏｄｍａｎ  ＆  Ｇｉｌｍａｎ，「Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ」，第９版、ＨａｒｄｍａｎおよびＬｉｍｂｉｒｄ，編、１９９６、ｐ．１５００）。不成功に終わった探究された他の長時間作用性の注射可能な処方物には、アルブミン結合インスリンおよびコバルト−インスリン六量体処方物が挙げられる（Ｈｏｆｆｍａｎ，Ａ．，Ｚｉｖ  Ｅ．，Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔ，３３（４）：２８５−３０１（１９９７））。
【０００８】
多くの長時間作用性の肺インスリン処方物もまた、探究されている。これらには、インスリンと比較してかなり過剰な脂質を含有するリポソーム（Ｌｉｕ．Ｆ−Ｙら、Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．１０，２２８−２３２，（１９９３））、多孔性のポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）インスリン粒子（Ｅｄｗａｒｄｓ，Ｄ．Ａ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７６（５３２０），１８６８−１８７１（１９９７））、噴霧されたＰＬＧＡナノスフィア（Ｋａｗａｓｈｉｍａ，Ｙ．ら、Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ，６２（１−２）：２７９−２８７（１９９９））およびリン脂質／プロタミンインスリン処方物（Ｖａｎｂｅｖｅｒ，Ｒ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅｌ．Ｂｉｏａｃｔ．Ｍａｔｅｒ．２５，２６１−２６２（１９９８））が挙げられる。不運にも、これらの処方物すべては、ラットに投与された場合の低いバイオアベイラビリティー、または処方物の不足のどちらかに起因して、不満足であることが証明されている。従って、生物活性であり、物理的および化学的に安定であり、水溶性であり、そして好ましくは単量体である、最適化された長時間作用性インスリン処方物に対する、長い間の切実な必要性が存在する。理想的には、このような処方物は、好ましくは、肺投与に適する。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
（発明の要旨）
一つの局面において、本発明は、肺の深部を経由した全身性の循環への投与のためのインスリンの組成物に基づく。具体的には、本発明の組成物は、天然に存在しない親水性のポリマーの１以上の分子と共有結合的に結合したインスリンの結合物を包含する。好ましい実施形態において、天然に存在しない、インスリンに共有結合的に結合した親水性のポリマーは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）のようなポリアルキレングリコールであるが、本明細書中に示される全ての実施形態は、他の天然に存在しない親水性のポリマーに、同様に適用され得る。
【００１０】
一般的に、本発明のインスリン−ポリマー結合体は、特に肺に投与された場合、天然のインスリンよりも改善された薬物動態学的な特性および薬力学的な特性を示す。一つの実施形態において、本明細書中に提供されるＰＥＧ−インスリン結合体は、肺および肺の深部に投与された場合、良好な絶対的バイオアベイラビリティーを示す。特定の実施形態において、本発明のＰＥＧ−インスリン結合体は、天然のインスリンより高い絶対的肺バイオアベイラビリティーにより特徴づけられる。好ましくは、本発明のＰＥＧ−インスリン結合体は、天然のインスリンより、少なくとも１．５倍〜２．０倍高い絶対的肺バイオアベイラビリティーを有することにより特徴づけられる。より好ましい実施形態において、本発明に従うＰＥＧ−インスリン結合体は、約１５％以上、さらにより好ましくは約２０％以上、または最も好ましくは約３０％以上高い、絶対的肺バイオアベイラビリティーにより特徴づけられる。
【００１１】
さらに別の実施形態において、本発明のＰＥＧ−インスリン結合体は、肺に投与された場合、天然のインスリンの少なくとも１．５倍、より好ましくは天然のインスリンの少なくとも２倍または３倍、あるいはさらにより好ましくは天然のインスリンの少なくとも５倍のＴｍａｘ（最高濃度に到達するために必要とされる時間）を示す。
【００１２】
本発明の結合体における使用のためのＰＥＧは、いくつかの異なる特徴を有し得る。本発明の一つの実施形態において、本明細書中に記載されるＰＥＧ−インスリン結合体のポリエチレングリコール部分は、アルコキシ基またはさらに具体的にはメトキシ基のような不活性の末端基あるいは無反応性の末端基で末端キャップされる。
【００１３】
代替の実施形態において、結合体のポリエチレングリコール部分は、特に直鎖状のポリエチレングリコールおよび多重に腕を伸ばした（ｍｕｌｔｉ−ａｒｍｅｄ）ポリエチレングリコールまたは多分枝のポリエチレングリコールを含むインスリンに付着するためによく適した構造を有する。さらに別の実施形態において、ＰＥＧ−インスリン結合体は、二重活性化された（ｄｉ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ）ポリエチレングリコールにより相互に連結された２個の単官能性誘導体化インスリン分子（インスリン−ＰＥＧ−インスリン）を含み得る。あるいは、この「ダンベル」構造内のインスリン分子は、追加のＰＥＧによりさらに改変され得る。
【００１４】
別の実施形態において、本発明のＰＥＧ−インスリン結合体は、ポリマー鎖の一末端に分枝部分を有する、分枝したポリエチレングリコール、およびインスリンへの共有結合的な付着のための分枝部分に連結した２個の遊離反応性基（または、２個のうち１個の多重反応性基（ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｏｆ  ｔｗｏ））を含む。本発明のこの実施形態において、ポリエチレングリコールの分枝構造は、２以上のインスリン分子にポリマー鎖を接着させる。
【００１５】
本発明のインスリン結合体のポリエチレングリコール部分は、必要に応じて１以上の分解可能な結合を含み得る。
【００１６】
代表的には、インスリンは、ＰＥＧの末端に位置する連結部分を介してＰＥＧと共有結合的に結合する。本発明において使用のために好ましい連結部分には、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド活性エステル、活性炭酸塩、アルデヒド、およびアセタールのような、反応性インスリンアミノ基との結合に適した連結部分が挙げられる。
【００１７】
なお別の実施形態において、本発明の結合物中でインスリンと共有結合的に結合されたＰＥＧは、約２サブユニット〜約３００サブユニットの（ＯＣＨ２ＣＨ２）、好ましくは約４サブユニット〜２００サブユニット、そしてさらに好ましくは約１０サブユニット〜１００サブユニットを含む。
【００１８】
代替の実施形態において、インスリンと共有結合的に結合されたＰＥＧは、約２００ダルトン〜約１０，０００ダルトンの見かけの平均分子量を有する。好ましい実施形態において、ＰＥＧは、約２００ダルトン〜約５０００ダルトンの見かけの平均分子量を有する。さらにより好ましい実施形態において、ＰＥＧは、約２００ダルトン〜約２０００ダルトンまたは約２００ダルトン〜約1０００ダルトンの見かけの平均分子量を有する。
【００１９】
特定の実施形態において、結合体のインスリン部分は、天然ヒトインスリンを含む。
【００２０】
なお別の実施形態において、本発明の組成物の結合体は、約９０％より高い純度を有する（すなわち、組成物の結合体部分のうち、９０重量％以上は、１以上のＰＥＧ−インスリンを含む）。すなわち、本発明の組成物は、結合体化されたインスリン成分の純度の高度さにより特徴づけられ得る。すなわち、この組成物には、検出可能な量の遊離ポリエチレングリコール種および他のＰＥＧに関係した不純物が無い。
【００２１】
一つの実施形態において、本発明の組成物は、インスリンが、その１以上のアミノ部位においてＰＥＧと共有結合的に結合される結合体を含む。本発明の組成物中に含まれるインスリンは、１置換され得る（すなわち、それに共有結合的に結合されたＰＥＧを、たった１つしか有さない）。本発明に従う、特定の１置換されたＰＥＧ−インスリン結合体は、ＰｈｅＢ１、ＧｌｙＡ１、およびＬｙｓＢ２９から成る群から選択されるインスリン分子において特定の位置に共有結合的に付着されたポリエチレングリコール部分を有する。
【００２２】
好ましい実施形態において、ＰＥＧ部分は、インスリンのＰｈｅＢ１部位で共有結合的に付着される。一つの実施形態において、インスリンのＢ−１Ｐｈｅ位の少なくとも約７５％は、共有結合的にＰＥＧに結合される。別の実施形態において、インスリンのＢ−１Ｐｈｅ位の少なくとも約９０％は、共有結合的にＰＥＧに結合される。
【００２３】
本発明の組成物はまた、上記に記載される１つ以上の特徴のうちいずれかを有するモノ結合体化（ｍｏｎｏ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ）ＰＥＧインスリンおよびジ結合体化（ｄｉ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ）ＰＥＧインスリンの混合物も含み得る。このような組成物はまた、さらにトリ−結合体化（ｔｒｉ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ）ＰＥＧインスリンを含み得る。
【００２４】
代替の実施形態において、本発明に従うＰＥＧインスリン結合体は、非ペグ化インスリンまたは天然のインスリンに比較して、減弱したタンパク質分解の速度により特徴づけられる。
【００２５】
本発明に従う組成物としてまた、ＰＥＧ−インスリン結合体および非化学的に改変されたインスリンまたは天然のインスリンの混合物が挙げられ得る。
【００２６】
上記のようなエアロゾル化された形態の組成物もまた、含まれる。
【００２７】
本発明の組成物は、液状形態または乾燥形態で溶解あるいは懸濁され得、そしてさらに、薬学的に受容可能な賦形剤を含み得る。
【００２８】
肺深部への吸入による投与に適した生物活性ポリエチレングリコール−インスリン結合体もまた、本明細書中において提供される。
【００２９】
なお別の局面において、本発明は、以前に記載されたようなエアロゾル化された形態のＰＥＧ−インスリン組成物の吸入による投与によって、それを必要とする動物被験体にＰＥＧ−インスリン結合体を送達する方法を提供する。
【００３０】
本発明はまた、別の局面において、肺への投与のための、実質的に非免疫原性インスリン組成物を提供するための方法を提供する。この方法は、本明細書中に記載されるような天然に存在しない親水性ポリマー結合体の１以上の分子に、インスリン組成物を共有結合的に結合する工程、および、吸入により被験体の肺へ、この組成物を投与する工程を包含し、それにより結果として、インスリンは、肺を通過し、血液循環に入る。
【００３１】
別の局面において、ヒト被験体の肺への投与のためのインスリン組成物に延長された効果を提供する方法が、提供される。この方法は、インスリン−親水性ポリマー結合体を含有する組成物を提供するために、天然に存在しない親水性ポリマーの１以上の分子にインスリンを共有結合的に結合する工程、および吸入によるこの組成物の被験体の肺に投与する工程を包含する。投与する工程において、インスリンは、肺を通過し、血液循環に入り、そして上昇したインスリンの血中濃度は、投与後少なくとも８時間維持される。
【００３２】
本発明のＰＥＧ−インスリン結合体は、エアロゾル化され、吸入を介して投与された場合に、糖尿病（ＤＭ）の処置において有用である。
【００３３】
本発明のこれらの目的および特性ならびに他の目的および特性は、以下の詳細な説明が読まれた場合に、より完全に明白になる。
【００３４】
（発明の詳細な説明）
種々の代表的なＰＥＧ−インスリン結合体の設計、合成、および特徴付けが、肺への肺送達のために最適化されてきた。ＰＥＧ−インスリン分子の調製は以前に説明されているが、吸入可能なインスリンの長期作用処方物を提供するための、ＰＥＧの共有結合カップリング体の使用は、これまで実証されていない。この点において、本出願者らが立ち向かった難題は、好ましくは肺の深部を経由して、全身循環に投与するために適切なインスリン組成物を提供するために、インスリン分子と共有結合したＰＥＧ鎖の数量、位置、構造、および分子量の最適なバランスを有するＰＥＧ−インスリン結合体を提供することであった。驚いたことに、上述の見地から、本発明者らは、後述の特徴を一つ以上を有する特定のＰＥＧ改変インスリン処方物を発見した：（ｉ）生物活性がある、言い換えれば、天然のインスリン活性の少なくとも約５％の活性を示すか、または、好ましくは、少なくとも天然のインスリンの生物活性を実質上維持するかもしくは最低限度しか減少していない生物活性を有するか、または、なおさらに好ましくは、天然のインスリンより向上した活性を有する、（ｉｉ）（肺内に“留まること”とは対照的に）肺から血流に吸収される、（ｉｉｉ）化学的、物理的に安定である、（ｉｖ）肺に投与したとき、投与後少なくとも約８時間、ベースラインを超えて上昇した血中インスリンレベルに達する、（ｖ）インスリン分解酵素による酵素的な攻撃に対して耐性がある、および（ｖｉ）吸入によって投与したとき、非ＰＥＧ化インスリンに及ぶ半減期を示す。これらの詳細は、後述の説明を読んだ場合に明らかになる。
【００３５】
（Ｉ．定義）
本明細書で用いた場合の、後述の用語は、示される意味を有する。
【００３６】
本明細書中および添付の特許請求の範囲の中で使う場合、単数形「ａ」「ａｎ」「ｔｈｅ」は、文脈が明らかに他のように指示していなければ、複数の対象物を含む。
【００３７】
本明細書で使われる「インスリン」は、プロインスリンも含む意味を持つことになっており、一次構造構成（つまり、連続した一連のアミノ酸残基）の一部または全ておよび天然に存在するインスリンの生物学的特性の少なくとも一つとを有する、精製された、単離された任意のポリペプチドを包含する。一般的に、用語「インスリン」は、天然のインスリンおよび合成由来のインスリンを包含することになっており、これらの天然のインスリンおよび合成由来のインスリンは、その糖形態およびアナログを含み、このアナログは、（本明細書中に記載される、天然に存在しない疎水性ポリマーを用いる化学的改変の前の）全長インスリンと関連する治療活性の、少なくとも８０％以上を実質的に保持する程度に、一つ以上のアミノ酸改変（欠失、挿入、または置換）を有する、ポリペプチドを包含する。本発明のインスリンは、任意の標準的な様式（膵臓抽出、組換え発現、およびインビトロポリペプチド合成が挙げられるが、これらに限定されない）によって生成され得る。天然インスリンまたは野生型インスリンは、天然で見出されるインスリンのアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を有する、インスリンを指す。天然インスリンまたは野生型インスリンは、天然の物であり得る（すなわち、天然供給源から単離され得る）か、または合成によって生成され得る。
【００３８】
「生理的に切断可能」または「分解可能な」結合は、生理的条件下で水と反応する（すなわち、加水分解される）弱い結合である。ｐＨ８、２５℃で加水分解半減期約３０分間未満を有する結合である。水中での結合が加水分解する傾向は、２つの中心原子をつなぐ一般的な結合様式だけでなく、これらの中心原子が結合している置換基にも依存している。適切な加水分解的に不安定または弱い結合としては、炭酸エステル、リン酸エステル、無水物、アセタール、ケタル、アシルオキシアルキルエーテル、イミン、オルトエステル、ペプチド、およびオリゴヌクレオチド挙げられるが、これらに限定されない。
【００３９】
「加水分解的に安定な」連結または結合は、水中において実質的に安定である（すなわち、長時間に渡り、感知可能な程度には、生理的条件下では加水分解しない）化学結合（代表的には共有結合）を指す。加水分解に安定な連結の例としては、未満が挙げられるが、これらに限定されない：炭素−炭素結合（例えば、脂肪族の鎖内）、エーテル、アミド、ウレタンなど。一般に、加水分解に安定な連結は、生理的な条件下では１日につき約１〜２％未満の加水分解速度を示す連結である。代表的な化学結合の加水分解速度は、ほとんどの標準的な化学の参考書で見出され得る。
【００４０】
本明細書中で使う場合、「ＰＥＧ」またはポリエチレングリコールは、任意の水溶性ポリ（アルキレンオキシド）を包含することになっている。最も代表的には、本発明で使うＰＥＧは、後述の構造「−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎＣＨ２ＣＨ２−」を含み、末端基またはＰＥＧ部分全体の実際の構造は、変化し得る。一般に使われるＰＥＧは、末端キャップされたＰＥＧであり、この末端キャップされたＰＥＧにおいて、ＰＥＧの一方の末端が比較的不活性な基（代表的にはメトキシ（−ＯＣＨ３）のようなアルコキシ基）でキャップされおり、それに対して、もう一方の末端は、後に化学的改変を受け得るヒドロキシル基である。本発明のインスリン結合体を調製するのに使用するために、特定のＰＥＧの形態（例えば、分枝ＰＥＧ、直鎖ＰＥＧ、フォークＰＥＧなど）が下記に非常に詳細に記載される。
【００４１】
「ＰＥＧ−インスリン結合体」は、少なくとも一つのポリエチレングリコール部分が共有結合により連結またはカップリングしており、測定可能な程度の何らかのインスリン活性（例えば、天然のインスリン活性の約２％〜約１００％またはそれ以上）を有する、（先に定義したような）インスリン分子を指す。
【００４２】
ＰＥＧのような、本発明の親水性で天然に存在しないポリマーの文脈における「名目上の平均分子量」は、代表的にはサイズ排除クロマトグラフィー、１，２，４−トリクロロベンゼンにおける光散乱または固有の速度により決定される、ポリマーの質量平均分子量を指す。本発明のポリマーは、代表的な多分散性であり、約１．０５未満の低い多分散値を有する。
【００４３】
「親油性部分」は、本発明に従う親水性ポリマーに分解可能な結合または非分解可能な結合のいずれかによって結合された場合に、そのポリマーの親水性（従ってポリマー−インスリン結合体の親水性）を実質的に変えるのに有効な部分である。脂肪酸のような代表的な親油性基は、約１２〜２２個の炭素原子を含む。
【００４４】
「実質的に非免疫原性の」本発明のインスリン結合体は、天然インスリンに対する減少した免疫原性を有する。免疫原性は、ＰＥＧインスリン結合体を投与した際に、マウス、もしくは好ましくはウサギにおける、非改変インスリンと比較した抗体力価を測定することにより評価され得る。
【００４５】
「アルキル」は、代表的には長さが約１〜１５個の原子の範囲である、炭化水素鎖を指す。炭化水素鎖は、必ずしもそうである必要はないが好ましくは飽和状態であり、その鎖に結合したさらなる官能基を必要に応じて含み得る。その炭化水素鎖は、分枝鎖であっても直鎖であってもよい。代表的なアルキル基としては、エチル、プロピル、１−メチルブチル、１−エチルプロピルおよび３−メチルペンチルが挙げられる。本発明の１つの好ましい実施形態において、アルキル化ＰＥＧ（特に、直鎖アルキル化ＰＥＧ）を含む結合体は、脂肪酸でもない他の親油性部分でもないアルキル部分を有する、結合体である。
【００４６】
「低級アルキル」は、１〜５個の炭素原子を含むアルキル基を指し、メチル、エチル、ｎ−ブチル、ｉ−ブチル、ｔ−ブチルにより例示されるように、直鎖であっても分枝鎖であってもよい。
【００４７】
「絶対的肺バイオアベイラビリティ」は、天然インスリンの静脈内投与に対する、吸収されそして哺乳動物の血液循環に入る、肺に送達された薬物投与量（すなわち、本発明に従うＰＥＧ−インスリン結合体）のパーセンテージである。絶対的肺バイオアベイラビリティを決定するための代表的なモデル系としては、ラット、イヌ、ウサギおよびサルが挙げられる。本発明の吸入可能なＰＥＧ−インスリン結合体は、ある局面では、血漿または血液内における少なくとも約２０％の絶対的肺バイオアベイラビリティにより特徴付けられ、絶対的肺バイオアベイラビリティは、一般的に約１０％〜３０％またはそれ以上の範囲である。一般的に、ＰＥＧ−インスリン結合体の特定の性質に依存して、本発明の結合体は、以下のうちの少なくとも約一つの絶対的肺バイオアベイラビリティを有する：１０％、１２％、１５％、１８％、２０％、２２％、２５％、３０％、３２％、３５％またはそれ以上。絶対的肺バイオアベイラビリティは、ＰＥＧ−インスリン結合体の気管内直接投与、滴注または吸入からの吸収を測定することによって推定し得る。
【００４８】
ＰＥＧ−インスリン結合体の半減期に関連する「分布相」は、インスリンが血漿から消失する、初期の急速な相を指す。末期の遅い相の半減期または排泄相の半減期は、インスリンが体から排泄される、ゆっくりとした相を指す。
【００４９】
「延長した効果の（長期効果の）」インスリンは、少なくとも約６時間、好ましくは少なくとも約８時間の効果（すなわち、ベースライン超えて上昇した血中レベル）の持続期間を有するインスリンを指す。
【００５０】
「抑制されたグルコースレベル」とは、ベースラインまたは基礎レベルより低く抑制された、（例えば、本発明のＰＥＧ−インスリン結合体の投与後の）血中グルコースレベルを指す。
【００５１】
「薬学的に受容可能な塩」としては、アミノ酸塩、無機塩を用いて調製した塩（例えば、塩化物塩、硫酸塩、リン酸塩、２リン酸塩、臭化水素酸塩および硝酸塩）または有機塩を用いて調製した塩（例えば、リンゴ酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、酒石酸塩、コハク酸塩、エチルコハク酸塩、クエン酸塩、酢酸塩、乳酸塩、メタンスルホン酸塩、安息香酸塩、アスコルビン酸塩、パラ−トルエンスルホン酸塩、パモ酸塩、サリチル酸塩およびステアリン酸塩ならびにエストレート（ｅｓｔｏｌａｔｅ）、グルセプテート（ｇｌｕｃｅｐｔａｔｅ）およびラクトビオチン酸）が挙げられるが、これらに限定されない。同じように、薬学的に受容可能なカチオンを含む塩としては、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、アルミニウム、リチウム、およびアンモニウム塩（置換アンモニウムを含む）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５２】
「アミノ酸」とは、アミノ基およびカルボン酸基の両方を含む任意の化合物を指す。アミノ基は、最も一般的には、カルボキシ基に隣接した位置に存在しているが、アミノ基は、分子中のあらゆる位置に位置し得る。アミノ酸はまた、アミノ基、チオ基、カルボキシル基、カルボキサミド基、イミダゾール基などのような、さらなる官能基を含み得る。アミノ酸は、合成アミノ酸でもまたは天然に存在するアミノ酸でもあり得、種々の比率のエナンチオマーを含む、そのラセミ形態または光学的に活性な（Ｄ−、またはＬ−）形のいずれかの形で使用され得る。
【００５３】
「ペプチド」は、ペプチド結合により結合した、２つ以上のアミノ酸から構成される。ペプチドには、ホモ−ペプチドまたはヘテロ−ペプチドであり得（すなわち、上記で定義したような、同一のアミノ酸残基もしくは異なるアミノ酸残基から構成され得）、長さが２アミノ酸から数百アミノ酸まで変わり得る。
【００５４】
「乾燥粉末」は、代表的には約１０％未満の水分を含む、粉末組成物を指す。
【００５５】
「肺送達に適切」な組成物は、気道下部および肺胞への浸透を可能とするために、エアロゾル化可能でありかつ、そのエアロゾル化した粒子の一部が肺に届くように吸入可能である組成物を指す。そのような組成物は、「呼吸に適している」または「吸入可能である」と考えられる。
【００５６】
「エアロゾル化した」粒子は、代表的には、乾燥粉末吸入器、噴霧器、計量用量吸入器またはネブライザーのような吸入デバイスの作動（または、発射）の結果として、気体中に懸濁した液体粉末または固体粒子である。
【００５７】
「発射用量」または「ＥＤ」は、発射事象または分散事象後の、適切な吸入デバイスからの薬剤処方物の送達の指標を提供する。より具体的には、乾燥粉末処方物について、ＥＤは、単位用量パッケージから吸い込まれたそして吸入デバイスのマウスピースから出た粉末のパーセンテージの尺度である。ＥＤは、名目上の用量（すなわち、発射前に適切な吸入デバイス中に配置される、単位用量当りの粉末の質量）に対する、吸入デバイスによって送達される用量の比として規定される。ＥＤは、実験的に決められるパラメータであり、代表的には、患者の服用を模して組み立てられたインビトロデバイスを使用して決定される。ＥＤ値を決定するために、代表的には単位用量形態での乾燥粉末の名目上の用量が、適切な乾燥粉末吸入器（例えば、Ｉｎｈａｌｅ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｓｙｓｔｅｍｓに譲渡された、米国特許第５，７８５，０４９号に記載されている吸入器）中に配置され、その後、この吸入器が作動され、その粉末が分散される。その後、生じたエアロゾルは、真空によってそのデバイスから引き出される。このデバイスにおいて、生じたエアロゾルが、デバイスのマウスピースに取りつけられた風袋を秤量したフィルター上に捕獲される。フィルターに達する粉末の量が、発射用量を構成する。例えば、吸入デバイス中に配置された５ｍｇの乾燥粉末を含有する投薬形態について、その粉末の分散が、上記のような風袋を秤量したフィルター上に４ｍｇの粉末が回収された場合、その乾燥粉末組成物についての発射用量は：４ｍｇ（送達される用量）／５ｍｇ（名目上の用量）×１００＝８０（％）である。不均一粉末については、ＥＤ値は、乾燥粉末の送達よりむしろ発射後の吸入デバイスからの薬物の送達の指標を提供し、全粉末重量よりむしろ薬物の量に基づいている。同様に、ＭＤＩおよびネブライザー投薬形態について、ＥＤは、投薬形態から引き出されかつ吸入デバイスのマウスピースを出る、薬物のパーセンテージに対応する。
【００５８】
「微細粒子用量」または「ＦＤＰ」は、３．３μｍ未満の空気力学的直径を有する粉末粒子の質量パーセントとして、代表的には、通常はアンダーセンカスケードインパクター（Ａｎｄｅｒｓｅｎ  ｃａｓｃａｄｅ  ｉｍｐａｃｔｏｒ）での測定により決定される。このパラメータは、薬剤物質を全身に取り込むために、患者の肺の深部に到達する最高の能力を有する粒子の割合の指標を提供する。
【００５９】
「分散可能な」粉末または「分散性」粉末は、少なくとも約３０％、好ましくは４０％〜５０％、なおさらに好ましくは少なくとも約５０〜６０％以上のＥＤ値を有する粉末である。
【００６０】
「質量中央径」または「ＭＭＤ」は、平均粒子サイズの寸法である。なぜなら、本発明の粉末は、一般的に多分散性である（すなわち、一定範囲の粒子サイズからなる）からである。本明細書で使用されるＭＭＤ値は、遠心性沈降によって決定されるが、一般的に使用される多数の技術が、平均粒径を測定するために使用され得る（例えば、電子顕微鏡、光散乱、レーザー回析）。
【００６１】
「空気力学的質量中央径」または「ＭＭＡＤ」は、分散した粒子の空気力学的サイズの寸法である。この空気力学的直径は、エアロゾル化した粉末の沈降挙動に関してそのエアロゾル粉末を記述するために使用され、そしてこの空気力学的直径は、粒子として空気中で同じ沈降速度を有する単位密度球体の直径である。この空気力学的直径は、粒子の形状、粒子の密度および粒子の物理的なサイズを包含する。本明細書で使用される場合は、ＭＭＡＤは、他の表示をしない限り、カスケードインパクションによって決定されるエアロゾル化粉末の、空気力学的粒径分布の中間点または中央値を指す。
【００６２】
「薬学的に受容可能な賦形剤またはキャリア」は、本発明の組成物の中に必要に応じて含まれ得る賦形剤を指す。吸入用組成物に好ましいのは、被験体（特に被験体の肺）に対して有意な有害な毒物学的影響を伴わずに肺の中に摂取され得る、賦形剤である。
【００６３】
「薬理学的有効量」または「生理学的有効量」は、標的血中グルコースレベルを生じるために所望の血流中インスリンレベルを提供するのに必要とされる、本明細書中に記載される治療組成物中に存在するＰＥＧ−インスリン結合体の量を指す。正確な量は、多数の要因（例えば、特定のＰＥＧ−インスリン、使用する送達デバイス、治療組成物の構成成分および物理的性質、意図される患者集団、患者の考慮など）に依存し、そして本明細書中に提供される情報に基づいて、当業者によって容易に決定され得る。
【００６４】
（ＩＩ．天然に存在しない親水性ポリマーインスリン結合体）
本発明に従ういくつかの例示的ＰＥＧ−インスリン結合体を調製した。ポリエチレングリコールは、本発明の結合体における使用に好ましいポリマーであるが、水溶性で、親水性で、天然に存在しない他のポリマーもまた、使用し得る。本発明で使用するのに適した他のポリマーとしては、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ポリアクリロイルモルホリン、ポリオキサゾリンおよびポリ（オキシエチル化ポリオール）（例えば、ポリ（オキシエチル化グリセロール）、ポリ（オキシエチル化ソルビトール）、およびポリ（オキシエチル化グルコース））が挙げられる。上記の水溶性ポリマーから選択されるサブユニットまたはサブユニットブロックを含むポリマーもまた、使用し得る。さらに、ポリエチレングリコールおよびポリプロピレングリコールの共重合体を使用し得る。本発明のポリマーは、好ましくは、脂肪酸基も他の親油性部分も実質的に含まない。
【００６５】
以下の節は、一つ以上のＰＥＧ部分、ペグ化試薬、インスリンペグ化部位、ペグ化条件、およびその後の結合体の精製を注意深く選択することにより、所望の臨床的性質（改善した薬物動力学的性質および／または薬力学的性質）を備えるＰＥＧ−インスリン結合体を、入手し得る。本発明のＰＥＧ−インスリン結合体の特定の特徴を、ここで提供する。
【００６６】
（Ａ．ポリマーの構造的特徴および生じる結合体）
本発明のＰＥＧ−インスリン結合体は、約２００〜約４０，０００ダルトンの範囲、好ましくは約２００〜約１０，０００ダルトンの範囲の分子量を各々有する、一つ以上のＰＥＧ鎖を代表的には含む。好ましくは、本発明で使用するためのＰＥＧは、以下の平均分子量範の囲内のうちの１つを有する：約２００〜１０，０００ダルトン、約２００〜約７，５００ダルトン、約２００〜約６，０００ダルトン、約２００〜約５，０００ダルトン、約２００〜３，０００ダルトン、約２００〜約２，０００ダルトン、および約２００〜約１，０００ダルトン。分子量５，０００ダルトンを有するＰＥＧ、分子量２，０００ダルトンを有するＰＥＧ、および分子量７５０ダルトンを有するＰＥＧを用いて調整された例示的な結合体が、実施例１〜４にて提供される。
【００６７】
肺に投与するのに好ましいＰＥＧ−インスリンは、約５０００ダルトン未満、好ましくは約２０００ダルトン未満、さらに好ましくは約１０００ダルトン未満の分子量を有する、ＰＥＧ部分を有する。本発明の１つの特定の実施形態において、ＰＥＧ−インスリン結合体は、以下の平均分子量のうちの一つを有するＰＥＧ部分を有する：２００、３００、４００、５００、６００、７５０、１０００、１５００、２０００、２５００、３０００、３５００、４０００または５０００。より高分子量のＰＥＧは、特定の場合において、インスリン分子の活性の損失の可能性、または肺適用については、肺を通る効率の減少（実施例８）の可能性に起因して、それより好ましくないことがあり得る。
【００６８】
より低分子量のＰＥＧが、バイオアベイラビリティを増加するために好ましくあり得る一方で、高分子量の（例えば、平均分子量５，０００ダルトン、１０，０００ダルトン、１５，０００ダルトン、２０，０００ダルトン、２５，０００ダルトン、３０，０００ダルトンまたは４０，０００ダルトンまたはそれ以上を有する）ＰＥＧ鎖は、一般に天然インスリンのバイオアベイラビリティを低下させることが分かっているが、特に注射可能な処方物の場合、半減期を増加するために好ましくあり得る。すなわち、（天然と比較して）高分子量のＰＥＧ−インスリンにとって、薬物動力学的パラメータの有意な改善（例えば、曲線下面積（ＡＵＣ））は、低下したその活性を補ってあまりあり得る。
【００６９】
サブユニットの数に関して、本発明で使うためのＰＥＧは、代表的には、以下の範囲のうちの一つ以上にある数の（ＯＣＨ２ＣＨ２）サブユニットを含む：２〜約９００サブユニット、約４〜約２００サブユニット、約４〜約１７０サブユニット、約４〜約１４０サブユニット、約４〜約１００サブユニット、約１０〜約１００サブユニット、約４〜約７０サブユニット、約４〜約４５サブユニット、および約４〜約２５サブユニット。
【００７０】
本発明のＰＥＧ−インスリン結合体は、一置換（すなわち、１箇所の反応性インスリン部位に結合したＰＥＧを有する）であっても、二置換（２箇所の反応性部位に結合したＰＥＧを有する）であっても、三置換であっても、またはインスリン分子上の３つより多くの箇所にポリマー結合を有してもよい。一置換インスリン、二置換インスリンおよび三置換インスリンはまた、本明細書中で各々、ＰＥＧモノマー、ＰＥＧダイマーおよびＰＥＧトリマーとも呼ぶ。多置換インスリン（２箇所以上のインスリン部位に共有結合したＰＥＧを有するインスリンを意味する）は、代表的には、各反応部位結合した同じＰＥＧ成分を有するが、必ずしもそうである必要はない。つまり、インスリンに結合した１つより多くの型のＰＥＧ部分を有するＰＥＧ−インスリン組成物が、企図される。本発明に従う好ましい組成物は、主にモノマーインスリン結合体および／またはダイマーインスリン結合体を含む、組成物である。驚いたことに、（一ヶ所より多くの反応部位に共有結合したＰＥＧを有するＰＥＧ−インスリン種の混合物を含む）部位特異的でないＰＥＧ−インスリン結合体は、特に肺に投与した場合に、天然インスリンより改善された薬物動力学的性質および薬力学的性質を有することが分かった（実施例１１）。
【００７１】
ＰＥＧ置換部位に関して、そのインスリン分子は、ペグ化に適したいくつかの部位を有し、アミノ部位が一般に最も好ましいが、必ずしもその部位で置換する必要はない。ペグ化に適した特定のインスリンアミノ基としては、２つのＮ末端ＧｌｙＡ１およびＰｈｅＢ１、ならびにＬｙｓＢ２９が挙げられる。このインスリン分子上のこれらの部位は、本明細書中において、それぞれ、単にＡ１、Ｂ１、およびＢ２９とも呼ばれる。インスリン上の反応性アミノ基とのカップリングに使用するために求電子的に活性化されたＰＥＧとしては、ｍＰＥＧ２−ＡＬＤ、ｍＰＥＧ−スクシンイミジルプロピオネート、ｍＰＥＧ−スクシンイミジルブタノエート、ｍＰＥＧ−ＣＭ−ＨＢＡ−ＮＨＡ、ｍＰＥＧ−ベンゾトリアゾールカーボネート、ｍＰＥＧ−アセトアルデヒドジエチルアセタールなど（Ｓｈａｅｒｗａｔｅｒ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ，Ａｌａｂａｍａ）が挙げられる。
【００７２】
１つの実施形態においては、本発明の組成物は主に（９０％以上）１置換のインスリン（例えば、モノ−Ａ１インスリン、モノ−Ｂ１インスリン、またはモノ−Ｂ２９インスリン）を含む。その組成物は後述のインスリンを含み得る：ｉ）モノ−Ａ１インスリン、ｉｉ）モノ−Ａ１インスリンとモノ−Ｂ１インスリンの混合物、またはｉｉｉ）モノ−Ａ１インスリン、モノ−Ｂ１インスリンおよびモノ−Ｂ２９インスリンの混合物。あるいは、本発明の組成物は、主に２置換インスリンを含み得る（例えば、ジ−Ａ１，Ｂ１−インスリン、ジ−Ａ１，Ｂ２９−インスリン、ジ−Ｂ１もしくはＢ２９−インスリン、またはそれらの任意の多様な組み合わせ）。
【００７３】
あるいは、本発明に従う組成物は、多様なＰＥＧ−インスリン結合体（すなわち、ありうる結合部位の組み合わせのうちいずれか１つにＰＥＧが結合している）の混合物を含み得る。一例として、インスリンのアミノ部位を使う場合、本発明の組成物は後述するＰＥＧ−インスリン結合体のうち任意の一つ以上を包み得る：モノ−Ａ１−ＰＥＧインスリン、モノ−Ｂ１−インスリン、モノ−Ｂ−２９−インスリン、ジ−Ａ１，Ｂ１−インスリン、ジ−Ａ１，Ｂ２９−インスリン、ジ−Ｂ１，Ｂ２９−インスリンまたはトリ−Ａ１，Ｂ１，Ｂ２９−インスリン。１つの実施形態の中においては、主にモノマーおよびダイマーを含む組成物が好ましい。代表的な組成物は、モノマーとダイマーを合わせて少なくとも約７５％、モノマーとダイマーを合わせて少なくとも約８０％、またはモノマーとダイマーを合わせて少なくとも約８５％〜９０％含むＰＥＧ−インスリン結合体の混合物を含み得る（例えば、実施例５および６）。
【００７４】
ＰｈｅＢ１は、ＰＥＧの結合による化学的改変に対して特に好ましい部位である。特に、本発明で使用するための、ＰＥＧ−インスリン結合体組成物はまた、１つの実施形態において、組成物中のＰＥＧ−インスリンの全体的な種数に関係なく、少なくとも約７０％のインスリンのＢ−１部位にＰＥＧが共有結合した組成物であると特徴付けられ得る（表３Ａ、実施例５）。代替的実施形態では、少なくとも約７５％のインスリンＢ−１部位がＰＥＧと共有結合している、もしくは少なくとも約８０％のインスリンＢ−１部位がＰＥＧと共有結合している、もしくは少なくとも約９０％のインスリンＢ−１部位がＰＥＧと結合している組成物が含まれる。
【００７５】
驚いたことに、本発明者らにより、肺に投与する場合、投与後少なくとも６時間、より一般的には少なくとも約８時間、またはそれ以上の時間持続して、（部位の決められたＰＥＧ化よりむしろランダムなＰＥＧ化によって調製された）ＰＥＧ−インスリンのランダム混合物がインスリンの血中レベルを上昇させることが明らかとなった。その混合物は、有益な薬物動態的および薬力学的性質に起因するだけでなく、それらの合成が、その対応する部位特異的なアプローチと比較して、非常に単純である（複数の生成工程を必要としない、保護基の使用を必要としない、複数回にわたる精製を必要としない、など）ということからも、有益である。
【００７６】
天然インスリン分子内のＰＥＧの共有結合による化学的改変が可能な代わりとなる部位として、２Ｃ−末端、Ａｒｇ２２Ｂ、Ｈｉｓ１０Ｂ，Ｈｉｓ５Ａ、Ｇｌｕ４Ａ、Ｇｌｕ１７Ａ、Ｇｌｕ１３Ｂ、Ｇｌｕ２１Ｂが挙げられる。
【００７７】
天然インスリンに加えて、一つ以上のアミノ酸置換、挿入または欠失を有する非天然インスリンが利用され得、その結果、さらなる部位により一つ以上のＰＥＧ部分の結合による化学的改変が利用可能になる。この本発明の実施形態は、さらなる特製のＰＥＧ化部位をインスリン分子内に導入する（例えば、酵素的な分解に対する耐性が向上したＰＥＧ−インスリンの生成）のに、特に有用である。そのようなアプローチは、活性、安定性、溶解性および薬理学的性質の所望のバランスを有する最適なインスリン結合体の設計をするとき、より高い柔軟性を提供する。変異は、インスリン分子内の任意の数の位置にて、すなわち部位特異的変異誘発によって、行われ得るが、Ｂ鎖内の初めの４アミノ酸のうち、任意の一残基がシステイン残基と置き換わっているインスリン変異体が好ましい。そのシステイン残基は、その後、チオール基と特異的に反応する活性化ＰＥＧ（例えば、Ｎ−マレイミジルポリマーまたはその他の誘導体で、米国特許第５，７３９，２０８、および国際特許公開番号ＷＯ  ０１／６２８２７において記載されている）と反応させることが出来る。本発明の特定の実施形態の中で使用する、例示的なスルフヒドリル基選択性ＰＥＧとして、ｍＰＥＧ‐分枝マレイミド（ｍＰＥＧ（ＭＡＬ）２）、ｍＰＥＧ２−分枝マレイミド（ｍＰＥＧ２（ＭＡＬ）２）、ｍＰＥＧ−マレイミド（ｍＰＥＧ−ＭＡＬ）、およびｍＰＥＧ２−マレイミド（ｍＰＥＧ２−ＭＡＬ）（Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）が挙げられる。これらの活性化ＰＥＧの構造は後述の通りである：それぞれ、ｍＰＥＧ−ＣＯＮＨＣＨ［ＣＨ２ＣＯＮＨ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）２ＣＨ２ＣＨ２−ＭＡＬ］、ｍＰＥＧ２−リジン−ＮＨ-ＣＨ［ＣＨ２ＣＯＮＨ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）２ＣＨ２ＣＨ２-ＭＡＬ］２、ｍＰＥＧ−ＭＡＬおよびｍＰＥＧ２−リジン−ＮＨ−ＣＨ２ＣＨ２ＮＨＣ（Ｏ）ＣＨ２ＣＨ２ＭＡＬ。
【００７８】
必要なら、天然インスリンの配列に対するさらなる変異を使用して、ＰＥＧ化の結果としてその生物学的活性が幾分か弱められるＰＥＧ−インスリン結合体の生物活性を上昇させ得る。そのような変異の一つが、Ｔｈｒ８のＨｉｓ８への置換である。さらなる変異は、例えば、内容が本明細書中に参考として援用されている、Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｃａｒｅ，１３（９），（１９９０）の中で見出され得る。
【００７９】
本発明で使用するためのＰＥＧは多様な構造を有し得る：直鎖型、フォーク型、分枝型、ダンベル型など。代表的には、ＰＥＧは、インスリン分子上の所望の部位でのカップリングに適した、適切な活性化基によって活性化される。活性化ＰＥＧは、末端に、インスリンと反応するための反応基を有する。本明細書中で使う場合、用語「リンカー」は、インスリンと反応するための、ＰＥＧの末端に位置する活性化基を包含することを意味し、さらに、活性化ＰＥＧの調製を容易にするための、ポリマーのＰＥＧ部分と末端の活性化基の間に位置する付加的な（代表的には、挿入）原子を含み得る。リンカーは任意の数の原子を含み得るが、これらのリンカーはＰＥＧ骨格と末端の活性化基（例えば、ｍＰＥＧ−スクシンイミジルプロピオネートおよびｍＰＥＧブタノエート）の間に介在するメチレンを含むことが好ましい。代表的な活性化ＰＥＧ誘導体およびこれらの薬剤をインスリンのような薬物と結合体化する方法が当該分野で公知であり、さらにＺａｌｉｐｓｋｙ，Ｓ．ら，“Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎｎｌｉｚｅｄ  Ｐｏｌｙ（Ｅｔｈｉｌｅｎｅ  Ｇｌｉｃｏｌｓ）ｆｏｒ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ”ｉｎ  Ｐｏｌｙｅｔｈｉｌｅｎｅ  Ｇｌｉｃｏｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｊ．Ｍ．Ｈａｒｒｉｓ，Ｐｌｅｎｕｓ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９２）およびＡｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，１６：１５７−１８２（１９９５）に記載されている。
【００８０】
本発明の特定の実施形態の中で、ＰＥＧ−インスリン結合体のＰＥＧ部分は、ポリマーの水溶性またはポリマー−インスリン結合体の水溶性を有意に改変する効果のある親油性基が、一つ以上欠失している。すなわち、ポリマーまたは本発明の結合体のインスリン以外の部分は親水性というより親油性であると考えられる原子の基（例えば、約２〜８−１２個の炭素原子を有する炭素鎖）を有し得るが、もしそのような基の存在が、ポリマーまたは結合体の親水性を有意に変化させる効果がなくても、そのような部分は本発明の結合体の中に包含され得る。すなわち、本発明そのものであるインスリン結合体は、親油性でも疎水性でもなく、親水性として特徴付けられる。代表的には、インスリンとカップリングする前の、そのような親油性基を含んでも含まなくても、インスリン結合体のポリマー部分は、高い親水性／親油性バランス（ＨＬＢ）値を有する。ＨＬＢ値は、分子内のそれぞれタイプ（親水性または親油性）の基の重量比率に基づく；値の代表的な範囲は約１〜４０である。全体として、本発明の結合体で使用するためのポリマーは、一つ以上の親油性置換基の存在とは無関係に、親水性と特徴付けられる。本発明の実施形態の中で、ポリマー−インスリン結合体のポリマー部分は、２５を超えるおよびより好ましくは３０を超えるまたはさらにより好ましくは３５を超えるのＨＬＢ値によって特徴付けられる。そのような親油性部分が存在し得る、本発明の特定の実施形態の中では、その部分はＰＥＧ鎖の末端部分に位置しないことが好ましい。
【００８１】
本発明の結合体に使用するための分枝ＰＥＧは、国際特許公開  ＷＯ  ９６／２１４６９に記載されているものを含み、その内容はその全体が明示的に参考として本明細書中に援用されている。一般的に、分枝ＰＥＧは、式Ｒ（ＰＥＧ−ＯＨ）ｎによって表示でき、Ｒは中心「コア」分子を表し、ｎはアーム数を表す。分枝ＰＥＧは、２本以上のＰＥＧアームに及ぶ中心コアを有する。分枝構成において、分子ポリマーコアは、インスリンと結合するための一つの反応部位を有する。本発明で使用するための分枝ＰＥＧは、代表的に４本より少ないＰＥＧアームを含み、より好ましくは、３本より少ない本数のアームを含む。分枝ＰＥＧは、その直鎖状ＰＥＧ対応物と比べ、より大きく、より密度の高いポリマー塊と結合される反応部位を一つ有する利点を提供する。分枝ＰＥＧのある特定のタイプは、（ＭｅＯ−ＰＥＧ−）ｐＲ−Ｘと表示でき、ｐは２または３と等しく、Ｒはそこで結合する２本または３本のＰＥＧアームを有するリジンまたはグリセロールのような中心コア構造であり、Ｘはインスリンとのカップリングに対する活性があるまたは活性化し得る、任意の適切な官能基を表す。１つのとくに好ましい分枝ＰＥＧは、ｍＰＥＧ２−リジン−スクシンイミド構造を有するｍＰＥＧ２−ＮＨＳ（Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ａｌａｂａｍａ）である。
【００８２】
さらにその他の分枝構造において、「ペンダントＰＥＧ」は、前述の例のように、ＰＥＧ鎖の末端よりむしろ、ＰＥＧ骨格に沿って位置したタンパク質カップリングのための、反応基を有する。カップリングのためのＰＥＧ骨格からインスリンに及ぶ、それらの反応基は、同一であってもよいし異ってもよい。ペンダントＰＥＧ構造は有用であり得るが、一般的に、とくに吸入のための組成物に関しては、あまり好ましくない。
【００８３】
あるいは、ＰＥＧ−インスリン結合体のＰＥＧ部分は、ポリマー鎖の一方の末端に分枝部分およびインスリンと結合するための分枝部分と連結した２つの遊離反応基（２の任意の倍数）を有する、フォーク型構造を含み得る。例示的なフォーク型ＰＥＧは、内容が参考として本明細書中に明示的に援用されている、国際特許公開  ＷＯ  ９９／４５９６４で説明されている。フォーク型ポリエチレングリコールは、ポリマー鎖と反対側の末端に、アルキル基または「Ｒ」基を任意に含み得る。より具体的には、本発明に従うフォーク型ＰＥＧ−インスリン結合体は、下記の式を有する：Ｒ−ＰＥＧ−Ｌ（Ｙ−インスリン）ｎ、Ｒはアルキル、Ｌは加水分解的に安定な分枝点、Ｙはインスリンに対するフォーク型ポリマーの化学結合を提供する結合基であり、ｎは２の倍数を表す。Ｌは、「−ＣＨ−」のような、単一の「コア」基を表し得るか、またはより長い原子鎖を含み得る。例示的なＬ基としては、リジン、グリセロール、ペンタエリスリトールまたはソルビトールが挙げられる。代表的な分枝部分内における特定の分枝原子は、炭素原子である。
【００８４】
本発明の特定の実施形態において、フォーク型ＰＥＧのインスリン分子との連結（Ｙ）は加水分解的に安定である。好ましい実施形態では、ｎは２である。インスリンの反応部位との結合の前の、適切なＹ部分としては、活性エステル、活性炭酸、アルデヒド、イソシアネート、イソチオシアネート、エポキシド、アルコール、マレイミド、ビニルスルホネート、ヒドラジド、ジチオピリジンおよびヨードアセトアミドが挙げられるが、これらに限定されない。適切な活性化基の選択は、所望のインスリン結合部位に依存し、当業者によって容易に決定され得る。得られたＰＥＧ−インスリン結合体において対応するＹ基は、インスリンの適切な反応部位と活性化フォーク型ポリマーとの反応の結果により生じる。それらの最終的な連結の特定の同一性は、当業者に明らかである。例えば、反応性フォーク型ＰＥＧが、スクシンイミドエステルまたはマレイミドエステルのような活性化エステルを含む場合、インスリンのアミン部位を介した結合は、対応するアミド結合を形成する。これらの特定のフォーク型ポリマーは、インスリンのＰＥＧに対するモル比率が２：１以上のモル比率を有する結合体を供与するので、特に魅力的である。それらの結合体は、例えばインスリン分解酵素によるインスリンの酵素分解からインスリンを保護するための設計に際して依然として柔軟性を提供する一方、おそらくインスリン受容部位をブロックする可能性は低い。
【００８５】
関連の実施形態の中で、本発明のフォーク型ＰＥＧ−インスリン結合体は式：Ｒ−［ＰＥＧ−Ｌ（Ｙ−インスリン）２］ｎで表される。この場合、Ｒはそこに少なくとも１つのＰＥＧ−ジ−インスリン結合体が結合する中心コア構造を表す。特に、本発明のこの局面に従う好ましいフォーク型ポリマーは、ｎが１，２，３，４，５および６からなる群から選択されるポリマーである。例示的なコアＲ構造はまた、リジン、グリセロール、ペンタエリトリトールまたはソルビトールから誘導され得る。
【００８６】
代替的実施形態において、本明細書中で提供される任意の代表的な構造において、インスリンとポリマーの分枝点との間の化学的連結は分解可能（すなわち、加水分解的に不安定）であり得る。あるいは、１つ以上の分解可能な連結は、冒頭で結合体内のＰＥＧ鎖より小さなＰＥＧ鎖を有するＰＥＧ−インスリンを結合体の、インビボでの合成を可能とする骨格をポリマー内に含み得る。そのようなポリマー結合体の任意の特徴は、投与する結合体の最終的に所望する薬理学的性質に関して、さらなるコントロールを提供し得る。例えば、分子量が大きく比較的活性の低い結合体（すなわち、その結合体に結合している１つ以上の高分子量ＰＥＧ鎖を有する、例えば、約１０，０００を超える分子量を有するＰＥＧ鎖を１つ以上有する（この結合体は実質的に生物活性のない結合体）が投与され得、次いで、肺内または血流内のいずれかにおいて、これらの結合体が加水分解されて、はじめに存在したＰＥＧ鎖の一部を有する、生物活性のある結合体が生じる。この方法で、ＰＥＧ−インスリン結合体の性質を、幾分か、より効果的に適合するように改変し得る。たとえば、（必ずしもそうである必要はないが、好ましくは吸入による）投与の初期において、ポリマー結合体の吸収はゆっくりと進み得る。加水分解的に分解可能な連結のインビボでの分解により、（分解可能な連結の位置に依存する）遊離インスリンまたはその遊離インスリンに結合する小さなポリエチレンタグを有するインスリンのいずれかは、次いで放出され、肺を通してより容易に吸収されるか、および／または血液中に循環される。
【００８７】
本発明の実施形態の特徴の一つにおいて、加水分解前の完全なポリマー結合体は、投与時に最小限にしか分解されない。その結果、分解可能な結合の加水分解は、全身循環に放出される前のインスリンの酵素的な分解とは対照的に、血流中への活性インスリンのゆっくりとした放出速度を左右するに効果的である。
【００８８】
生理学的に切断可能な適切な連結にはエステル、炭酸エステル、カルバメート、スルフェート、ホスフェート、アシルオキシアルキルエーテル、アセタールおよびケタールが挙げられるが、これらに限定されない。そのような結合体は保存および投与において安定で、生理学的に分割可能な結合を有するはずである。例えば、ＰＥＧ−切断可能な連結−インスリン結合体は、最終的な薬学的組成物の生産、使用される場合は、適切な送達ビヒクルへの溶解、経路を問わない投与において、その完全性が維持されるはずである。
【００８９】
より具体的には、上記で一般的に説明されるように、生分解性の連結を有し、本発明において有用なＰＥＧ−インスリン結合体は、下記の構造によって表される：ＰＥＧ１−Ｗ−ＰＥＧ２−インスリン（ＰＥＧ１とＰＥＧ２は同一でも異っていてもよい）またはＰＥＧ−Ｗ−インスリン（Ｗは弱い生分解性の連結を表す）。これらの結合体は、インビボで除去可能（すなわち、切断可能）なＰＥＧアームまたはＰＥＧアームの一部を含む。これらの特定の改変インスリンは、代表的には分子内のインタクトなＰＥＧ部分のサイズもしくはＰＥＧ鎖によるインスリン分子の活性部位立体構造のブロックのいずれかに起因して、インタクトであるとき、実質的に生物学的に不活性である。しかしながら、そのような結合体は生理学的条件下で切断され、それによってインスリンまたは（例えば、肺から）全身循環に吸収することが出来る生物学的に活性のあるＰＥＧ−インスリンを放出する。例示的な１次構造内で、ＰＥＧ１部分は本明細書中で議論された任意の多くの異なる構造を有し得、代表的には、結合体が投与時に急速に吸収されないように、少なくとも約，１０，０００の分子量を有する。分子内のＰＥＧ２部分は、好ましくは約５０００ダルトン未満、より好ましくは２０００ダルトン未満、さらにより好ましくは１０００ダルトン未満の分子量を有する。ここで、例示的な２次構造であるＰＥＧ−Ｗ−インスリンについて言及すると、ＰＥＧ部分は、一般的に少なくとも約１０，０００ダルトン以上の分子量を有する。
【００９０】
さらに本発明のその他の特定の実施形態において、ＰＥＧ−インスリン結合体は、中心ＰＥＧによって２つのインスリン部分が相互に連結された、ダンベル型構造を有する。より具体的には、そのような結合体は、インスリン−Ｙ−ＰＥＧ−Ｚ−インスリン構造により表し得、ＹおよびＺは、インスリンとＰＥＧ部分を連結する加水分解的に安定な連結基である。特定の実施形態の中で、Ｚは、結合の前は、インスリンのチオール基（例えば、システイン）との反応に安定な活性化スルホンである。あるいは、ＹおよびＺはインスリンとの共有結合に適切な任意の基であり得る。追加の実施例が、米国特許第５，９００，４６１号に書かれており、その内容は参考として明示的に本明細書中に援用されている。
【００９１】
本発明の結合体の調製で使うために、さらなる代表的な、直鎖状または分枝状のいずれかの構造を有するモノ官能性およびジ官能性ＰＥＧをＳｈｅｒｗａｔｅｒ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ａｌａｂａｍａ）から購入し得る。実例となる構造が、Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ社の２００１年版カタログ「Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  Ｇｌｙｃｏｌ  ａｎｄ  Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」に記載されており、その内容は参考として明示的に本明細書中に援用されている。
【００９２】
（Ｂ．  調製）
ＰＥＧとインスリンをカップリングさせる反応条件は、使用する特定のＰＥＧ誘導体、インスリン上の結合部位および特定の反応基のタイプ（すなわち、リジン対システイン）、所望のＰＥＧ化の程度などに依存して変化し、当業者により容易に決定され得る。
【００９３】
下記でさらに詳細に例証されるように、本発明の結合体の合成は、部位特異的（実施例１，２、および４）であってもランダム（実施例３）であってもよい。インスリンのアミノ基（例えば、ＧｌｙＡ１、ＰｈｅＢ１、Ｌｙｓ２９Ｂ）と反応するための適切なＰＥＧ活性基は、トレシレート（ｔｒｅｓｙｌａｔｅ）、アルデヒド、エポキシド、カルボニルイミダゾール、活性カーボネート（例えば、スクシンイミジルカーボネート）、アセタール、および活性エステル（例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）およびＮＨＳ−誘導体化ＰＥＧ）である。これらのうち最も反応性が高いのは、ＰＥＧカルボキシメチル−ＮＨＳ、ノルロイシン−ＮＨＳおよびスクシンイミジルカーボネートである。インスリンとカップリングするための、さらなるＰＥＧ試薬としては、ＰＥＧスクシニミジルスクシネートおよびプロピオネートが挙げられる。本発明での使用に適した（例えば、単一のプロパン酸部分またはブタン酸部分を有する）ＰＥＧ活性エステルは、米国特許第５，６７２，６６２号に記載され、その内容はその全体が本明細書中に参考として援用されている。本発明の結合体の調製に使用するための特定の活性エステルとしては、ｍＰＥＧ−スクシニミジルプロピオネートおよびｍＰＥＧ−スクシンイミジルブタノエート（実施例１〜４）が挙げられる。
【００９４】
特定の結合体における最適な実験条件は、代表的には慣用的な実験法により、当業者によって容易に決定され得る。
【００９５】
インスリンのチオール（スルフヒドリル）基と結合するための、ＰＥＧポリマーの活性化に適した反応基としては、ビニルスルホン、ヨードアセトアミド、マレイミドおよびジチオ−オルトピリジンが挙げられる。とくに好ましい試薬としては、ＰＥＧビニルスルホンおよびＰＥＧ−マレイミドが挙げられる。本発明で使用するための、追加的な代表的なビニルスルホンは米国特許第５，７３９，２０８号に記載されているものを含み、その内容は参考として明示的に本明細書中に援用されている。
【００９６】
いくつかの場合に、選択的にＰＥＧ化したインスリン（すなわち、結果として生じる結合体）を含む本発明の組成物は、ＰＥＧ化の位置および程度に関して、実質的に均一である。すなわち、アミノ基の部位特異的ＰＥＧ化により、インスリン結合体組成物を生じ、主として、意図した標的部位（例えば、ＰｈｅＢ１）は、その標的部位に結合するＰＥＧ部分を有する。意図したＰＥＧ化部位に依存して、保護／非保護合成方法には、（例えば、ｔ−ＢＯＣ（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）またはジ−ＢＯＣ（ジ−ブトキシカルボニル）のような保護基の使用による）インスリン分子内の標的でない反応部位のＰＥＧ化の阻害が必要となり得る。その他の適切なアミノ保護基としては、カルボベンゾキシ（ＣＢＺ）、トリチル（Ｔｒ）のようなトリチル誘導体，ジメトキシトリチル（ＤＭＴｒ）などが挙げられる。環状ジアシル基またはニトロフェニルスルフェニル（Ｎｐｓ）のような、その他の保護基はアミノ基の保護のために有用であることが分かり得る。例示的な５Ｋ−ＰＥＧ−インスリン組成物の部位特異的合成を実施例１および２に示す。
【００９７】
本発明のインスリン結合体を提供するために使われる、そのような部位特異的にカップリングする化学的物質から、インスリン分子上の特定の反応部位に置換の大部分を有する組成物が生じる。これらの組成物は、要求されれば、基本的に純粋なモノ官能性ＰＥＧ−インスリンまたは二官能性ＰＥＧ−インスリンの組成物を提供するために、さらに精製され得る。
【００９８】
本質的に純粋なＰＥＧ−インスリン結合体は、後述の分析方法のいずれか１つによって、少なくとも９０％の純度および好ましくは少なくとも約９５％の純度を有する組成物を指す。ここで、純度はＰＥＧ−インスリン結合体含有量を指す。すなわち、少なくとも約９０％の純度のＰＥＧ−インスリン結合体は、ＰＥＧ−インスリン結合体種の少なくとも約９０重量％を含み、一方残りのほぼ１０％はＰＥＧ−インスリン結合体ではない不純物を表す。本発明のＰＥＧ−インスリン結合体は、代表的にイオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、疎水的相互作用クロマトグラフィーおよび逆相クロマトグラフィーのような精製技術を一つ以上使って精製されている。生じるＰＥＧ−インスリンの全体的な均質性（存在するインスリン−ＰＥＧ形態の数）は、後述の方法を一つ以上を使って評価され得る：クロマトグラフィー、電気泳動、質量分光法および、特に、ＭＡＬＤＩ−ＭＳおよびＮＭＲ分光法。インスリンの改変部位を識別するのに、とくに有用な方法の一つが、エンドプロテイナーゼＧｌｕ−Ｃを使うヒトインスリン向けのＵＳＰ識別テストと組み合わせたＲＰ−ＨＰＬＣペプチドマッピングである（実施例６）。
【００９９】
（Ｃ．ＰＥＧ−インスリン結合体の特徴）
本発明の一局面に従って、肺への投与に適したＰＥＧ−インスリン結合体組成物を提供する。実施例７〜１１のインビボデータによって示され得るように、肺に投与するとき、本発明のＰＥＧ−インスリン結合体は、天然インスリン以上に改善した薬物動態的性質および薬力学的性質を有する。インスリンは５，０００Ｋ〜１０，０００Ｋまたはそれ以上の分子量を有するＰＥＧで改変され得、改変後もなお活性を保持することが示された。代表的なＰＥＧ−インスリン結合体である、５Ｋ−ＰＥＧ-インスリンの活性を実施例７に示す。さらに、本明細書中に提供される実施例から認められ得るように、７５０ダルトン〜２，０００ダルトン、５，０００ダルトンの範囲の平均分子量のＰＥＧ鎖を有する、例示的なＰＥＧ−インスリン結合体は、静脈内および肺の両方に投与するとき、生物活性があり、肺に投与するとき、検出可能な血清中インスリンレベルによって証明されるように、実質的には肺内で活性は持続されず、あるケースでは、天然インスリンで見られる持続時間よりも持続時間が有意に長く、効果的にグルコースを実質的に抑制する（実施例７〜１１）。さらに、肺に投与したとき、（投与から１時間以内に）迅速な作用の開始が見られるＰＥＧ−インスリン結合体を、本明細書中に記載する。本発明の例示的ＰＥＧ−インスリン組成物の薬物動態的および薬力学的パラメータの要約を表１３に示す。
【０１００】
一般的に、本発明のＰＥＧ−インスリン組成物は後述の特徴を一つ以上有する。本発明のＰＥＧ−インスリン結合体は、少なくとも測定可能な程度の特定の活性を保持する。すなわち、本発明に従うＰＥＧ−インスリン結合体は、天然インスリンの約２％〜約１００％もしくはそれ以上の比活性を有する。本発明の好ましい実施形態において、ＰＥＧ−インスリン結合体は、改変していない天然インスリンの生物学的活性の少なくとも１０％以上の生物学的活性を有し、実質的に非免疫原性である。好ましくは、本発明の結合体の生物活性は、天然インスリンの生物活性の約５％から少なくとも約２０％もしくはそれ以上に及ぶ。本発明の結合体の生物活性は、例えば、対応する薬力学的および／または薬物動態的データを生じる血中グルコースレベルおよび血中インスリンレベルをモニターすることによって、もしくはＲＩＡ（放射免疫測定）によって、間接に特徴付けられる。
【０１０１】
ＰＥＧ−インスリン結合体の（例えば、肺への）投与後のインスリンの血清中濃度を考察する際、本明細書中に記載されている結合体は、代表的に投与後２〜８時間あたりに血清中濃度が最高点に達し（すなわち、濃度曲線のＣｍａｘまたは最も高い点に達し）、より代表的には投与後３〜６時間あたりに最高点に達する。さらに、本発明の化学的改変インスリン、および特に本明細書中に記載される長期効果インスリンは、測定可能なグルコース低下効果および天然インスリンよりも長時間に渡るインスリン濃度の持続のいずれを提供することにおいても、有効である。さらに具体的に、ＰＥＧ−インスリン結合体は、肺に投与したとき、投与後少なくとも約６時間および好ましくは少なくとも８時間、上昇した（基礎的なレベルまたはベースラインレベルを超えて上昇した）インスリンレベルを示す。好ましくは、肺に投与したとき、ＰＥＧ−インスリン結合体は、投与後少なくとも９時間、１０時間、１２時間または少なくとも１４時間の長期間にわたって、血中インスリンレベルを上昇させる、つまり、投与後、そのような延長された持続期間にわたって基礎的なレベルを超えた血流中のインスリン結合体レベルの検出が可能である。これらの特徴を実証する代表的な組成物を実施例に記載する。
【０１０２】
以前に記載したように、本発明のインスリン結合体は、血糖レベルを低下させるために効果的である。血糖を抑えるための本発明に関する組成物の能力をここで参照すると、ＰＥＧインスリン結合体は、（例えば、肺に）投与される場合、少なくとも投与後６時間、血糖レベルを基礎レベル以下に抑えるために効果的である。より詳細には、本発明のＰＥＧ−インスリン組成物は、少なくとも投与後８時間、好ましくは少なくとも投与後１０時間、またはさらに好ましくは少なくとも投与後１２時間以上、血糖レベルをベースライン以下に抑えるために効果的である。
【０１０３】
さらに、本発明のＰＥＧ−インスリン処方物は、天然インスリンより改善された絶対的肺バイオアベイラビリティー（ａｂｓｏｌｕｔｅ  ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ｂｉｏａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ）を示す。具体的には、本明細書中で提供される場合、ＰＥＧ−インスリン処方物は、天然インスリンの少なくとも約１．２倍の絶対的肺バイオアベイラビリティー、好ましくは、天然インスリンの少なくとも約１．５倍の絶対的肺バイオアベイラビリティー、さらに好ましくは、天然インスリンの少なくとも約２倍以上の絶対的肺バイオアベイラビリティー、またはなおさらに好ましくは、天然インスリンの少なくとも約２．５倍以上もしくは約３倍以上の絶対的肺バイオアベイラビリティーを保有する（実例の結果を、図１３に提供する）。
【０１０４】
（ＩＩＩ．処方物）
本発明のポリマー−インスリン結合体の組成物は、そのまま投与され得るか、または付加的賦形剤、溶媒、安定剤などを含む治療的／薬学的組成物で投与され得、投与形態および剤形の特定様式に依存する。本発明の結合体は、非経口的ならびに経口的に投与され得る。特定の投与経路としては、以下が挙げられる：経口、直腸、頬側、局所、経鼻、眼、皮下、筋肉内、静脈内、経皮、および肺。最も好ましくは、非経口経路および肺経路である。
【０１０５】
哺乳動物投与用および好ましくはヒト投与用の薬学的処方物は、特に肺用の組成物に関して、以下により詳しく記載しているが、１種類以上の薬学的に受容可能なキャリアと一緒に、代表的に本発明の少なくとも１種類のＰＥＧ−インスリン結合体を含む。本発明の処方物（例えば、非経口投与用）は、最も代表的には、溶液または水性懸濁液であるのに対して、肺投与用の吸入可能な処方物は、一般的に液体または粉末であり、粉末処方物が一般的に好ましい。しかし、さらに本発明の化学的に改変されたインスリンに関するより好ましくない組成物としては、シロップ、クリーム、軟膏剤、錠剤などが挙げられる。
【０１０６】
インスリンの処方物および対応する用量は、使用されるインスリン濃度の生物活性と共に変わる。注射可能なインスリンは、ＵＳＰインスリン単位（Ｕ）およびＵＳＰインスリンヒト単位（Ｕ）で測定され；インスリンの１単位は、絶食ウサギで、４５ｍｇ／ｄｌ（２．５ｍＭ）まで、血糖濃度を減少させるために必要な量と等しい。注射用のインスリン調製物の代表的濃度は、１ｍＬあたり約３．６ｍｇのインスリンである３０〜１００単位／ｍＬに及ぶ。患者において所望される生理学的効果を達成するために必要なインスリン量は、患者および患者の疾患の詳細（例えば、ＩＩ型糖尿病と対比したＩ型糖尿病）に関してだけでなく、使用されるインスリンの強さおよび特定のタイプと共に変化する。例えば、レギュラーインスリン（迅速に作用する）に関する投薬量の範囲は、１日あたり体重１ｋｇあたり約２〜約０．３Ｕのインスリンである。本発明の組成物は、一つの局面においては、治療を受ける患者で、約９０ｍｇ／ｄｌと約１４０ｍｇ／ｄｌの間の絶食血糖濃度、および約２５０ｍｇ／ｄｌ以下の食後値を達成するために効果的である。正確な投薬量は、特定の投与経路のために使用される正確なインスリン結合体の薬物動態学と薬力学とを結びつけて、当業者によって決定され得、そして定期的グルコースモニタリングに応じて容易に調整され得る。
【０１０７】
所望される全体の投薬量が、代表的に約１〜約１０呼吸で、そして好ましくは約１〜約４呼吸で達成される場合、吸入可能なインスリン結合体処方物用の（一吸入ベースあたりにおける）個々の投薬量は、代表的に約０．５ｍｇ〜約１５ｍｇの範囲内のインスリン結合体である。平均して、一投薬セッションあたりの吸入によって投与されるＰＥＧ−インスリンの全体用量は、約１０Ｕ〜約４００Ｕに及び、（一吸入に対応する）各個々の投薬量または単位投薬形態は、約５Ｕ〜約４００Ｕを含む。
【０１０８】
（Ａ．化学的に改変されたインスリンの吸入可能な処方物）
上記されるように、本発明のインスリン結合体のための１つの好ましい投与経路は、肺に吸入することによる。特定の処方物の成分、特徴、および送達デバイスは、ここにさらに十分に記載されている。
【０１０９】
この処方物中のインスリン結合体の量は、単位用量あたりのインスリンの治療的に効果的な量を送達するために、必要なインスリン結合体の量であり、天然インスリンの少なくとも１つの治療効果（すなわち、正常血糖近くまで血糖レベルを制御する能力）を達成する。実際、これは、特定のインスリン結合体、特定のインスリン結合体の活性、処置される糖尿病状態の重症度、患者個体数、処方物の安定性などに依存して大きく変化する。この組成物は、一般的にどこでも約１重量％〜約９９重量％のＰＥＧ−インスリン、代表的に約２重量％〜約９５重量％の結合体、そしてさらに代表的に約５重量％〜約８５重量％の結合体を含み、そしてまた、この組成物に含まれる賦形剤／添加剤の相対量に依存する。さらに詳細には、この組成物は、ＰＥＧ−インスリンの以下のパーセンテージのうち、代表的に少なくともおよそ１つを含む：１０重量％、２０重量％、３０重量％、４０重量％、５０重量％、６０重量％、７０重量％、８０重量％、９０重量％またはそれ以上。好ましくは、粉末組成物は、少なくとも約６０重量％（例えば、ＰＥＧ−インスリンを約６０〜１００重量％）を含む。１種類以上のインスリンが、本明細書中で記載される処方物中に組み込まれ得ること、そして用語「薬剤」、または用語「インスリン」の使用は、２種類以上のインスリンまたは別の活性薬剤とのインスリンの組み合わせの使用を決して排除しないことが理解される（例えば、実例のＰＥＧ−インスリン処方物はまた、天然インスリンを含む）。
【０１１０】
（Ａ．１．賦形剤）
本発明の組成物は、ほとんどの場合、１種類以上の賦形剤を含む。好ましくは、炭水化物の賦形剤単独、または他の賦形剤もしくは他の添加剤との組み合わせである。本発明の組成物に使用される代表的な炭水化物としては、以下が挙げられる：糖、糖誘導体（例えば、アルジトール）、アルドン酸、糖エステル、及び糖ポリマー。本発明の使用に適した代表的な炭水化物の賦形剤としては、例えば、以下が挙げられる：単糖類（例えば、フルクトース、マルトース、ガラクトース、グルコース、Ｄ−マンノース、ソルボースなど）；二糖類（例えば、ラクトース、スクロース、トレハロース、セロビオースなど）；多糖類（例えば、ラフィノース、メレチトース、マルトデキストリン、デキストラン、デンプンなど）；およびアルジトール（例えば、マンニトール、キシリトール、マルチトール、ラクチトール、キシリトールソルビトール（グルシトール）、ピラノシルソルビトール、ミオイノシトールなど）。インスリン結合体と組み合わせる場合、好ましくは、非還元糖、実質的に乾燥非晶質相またはガラス相を形成し得る糖であり、そして糖は、以下の比較的高いＴｇを保有する：例えば、４０℃よりも高く、好ましくは５０℃よりも高く、さらに好ましくは６０℃よりも高く、およびなおさらに好ましくは７０℃よりも高く、および最も好ましくは８０℃以上のＴｇを保有する。
【０１１１】
さらなる賦形剤としては、アミノ酸、ペプチド、および特にオリゴマー（２〜９個のアミノ酸を含む）、およびさらに好ましくはダイマー〜ペンタマー、ならびにポリペプチドが挙げられ、これらの全ては、ホモ種またはヘテロ種であり得る。代表的アミノ酸としては、以下が挙げられる：グリシン（ｇｌｙ）、アラニン（ａｌａ）、バリン（ｖａｌ）、ロイシン（ｌｅｕ）、イソロイシン（ｉｌｅ）、メチオニン（ｍｅｔ）、プロリン（ｐｒｏ）、フェニルアラニン（ｐｈｅ）、トリプトファン（ｔｒｐ），セリン（ｓｅｒ）、スレオニン（ｔｈｒ）、システイン（ｃｙｓ）、チロシン（ｔｙｒ）、アスパラギン（ａｓｐ）、グルタミン酸（ｇｌｕ）、リジン（ｌｙｓ）、アルギニン（ａｒｇ）、ヒスチジン（ｈｉｓ）、ノルロイシン（ｎｏｒ）、およびこれらの改変形態。１つの特に好ましいアミノ酸は、ロイシンである。
【０１１２】
また好ましくは、吸入可能な組成物中の賦形剤として使用するために、その全体が本明細書中で参考として援用される吸入治療システムの国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ００／０９７８５に記載されているように、２個以上のロイシル残基を含むジペプチドおよびトリペプチドである。
【０１１３】
また好ましくは、約４０℃よりも高く、さらに好ましくは、約５０℃よりも高く、なおさらに好ましくは６０℃よりも高く、そして最も好ましくは７０℃よりも高いガラス遷移温度を有するジペプチドおよびトリペプチドである。
【０１１４】
水中のジペプチドおよびトリペプチドの限定的溶解度が原因で、より好ましくないが、本発明の使用に関する付加的安定性およびエアロゾルの性能を増強するペプチドは、上記されるように、アミノ酸の任意の組み合わせを含むテトラマーおよびペンタマーである。さらに好ましくは、このテトラマーおよびこのペンタマーは、２個以上のロイシン残基を含む。このロイシン残基は、ペプチド内の任意の位置を占め得るのに対して、残りの（すなわち、非ロイシル）アミノ酸の位置は、上記されるように、任意のアミノ酸によって占められるが、生じたテトラマーまたはペンタマーは、少なくとも約１ｍｇ／ｍｌの水中溶解度を有する。好ましくは、テトラマーまたはペンタマー中の非ロイシルアミノ酸は、親水性アミノ酸（例えば、リジン）であり、これによって水中のペプチド溶解度を増大させる。
【０１１５】
ポリアミノ酸、および特に本明細書中で記載されるアミノ酸のいずれかを含むポリアミノ酸はまた、安定剤として使用するのに適する。好ましくは、例えば、ポリリジン、ポリグルタミン酸、およびポリ（リジン、アラニン）のようなポリアミノ酸である。
【０１１６】
本発明の組成物および方法において、有用なさらなる賦形剤および添加剤としては、非生物学的ポリマーおよび生物学的ポリマーが挙げられるが、これらに限定されず、単独であり得るか、または組み合わせであり得る。適切な賦形剤は、吸入治療システムの国際公開ＷＯ  ９６／３２０９６および同９８／１６２０５で提供される賦形剤である。好ましくは約３５℃を超え、好ましくは約４０℃を超え、さらに好ましくは４５℃を超え、最も好ましくは約５５℃を超えるガラス遷移温度（Ｔｇ）を有する賦形剤である。
【０１１７】
代表的なタンパク質の賦形剤としては、以下が挙げられる：アルブミン（例えば、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、組換えヒトアルブミン（ｒＨＡ）、ゼラチン、カゼイン、ヘモグロビンなど。これらの組成物は、代表的には必ずしも有機酸または有機塩基から調製された塩ではないが、緩衝液またはｐＨ調整剤をまた含み得る。代表的緩衝液としては、以下が挙げられる：クエン酸の有機酸塩、アスコルビン酸の有機酸塩、グルコン酸の有機酸塩、カルボン酸の有機酸塩、酒石酸の有機酸塩、コハク酸の有機酸塩、酢酸の有機酸塩、またはフタル酸の有機酸塩。他の適切な緩衝液としては、以下が挙げられる：トリス、トロメタミン塩酸塩、ホウ酸塩、グリセロールリン酸塩およびリン酸塩。アミノ酸（例えば、グリシン）もまた、適切である。
【０１１８】
本発明の組成物はまた、以下を含み得る：付加的なポリマー賦形剤／添加剤（例えば、ポリビニルピロリドン）、誘導体化セルロース（例えば、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、およびヒドロキシプロピルメチルセルロース）、フィコール（ポリマー糖）、ヒドロキシエチルスターチ（ＨＥＳ）、デキストレート（例えば、２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンおよびスルホブチルエーテル−β−シクロデキストリンのようなシクロデキストリン）、ポリエチレングリコール、およびペクチン。
【０１１９】
この組成物は、さらに以下を含み得る：香料添加剤、味覚マスキング（ｔａｓｔｅ−ｍａｓｋｉｎｇ）剤、無機塩（例えば、塩化ナトリウム）、抗菌薬（例えば、塩化ベンザルコニウム）、甘味料、抗酸化薬、帯電防止剤、界面活性剤（例えば、「ＴＷＥＥＮ２０」および「ＴＷＥＥＮ８０」のようなポリソルベート）、およびプルロニック（ｐｌｕｎｏｎｉｃ；例えば、ＢＡＳＦから入手可能なＦ６８およびＦ８８）、ソルビタンエステル、脂質（例えば、好ましくは、リポソーム形態ではないものが、レシチンおよび他のホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミンのようなリン脂質）、脂肪酸および脂肪エステル、ステロイド（例えば、コレステロール）、ならびにキレート剤（例えば、ＥＤＴＡ、亜鉛および他のこのような適切なカチオン）。穿孔された微細構造（すなわち、中空のある、多孔性微粒子）を製造するために、特定のジ置換（ｄｉ−ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｄ）ホスファチジルコリンの使用が以下により詳細に記載されている。本発明に従う組成物中に使用するのに適した他の薬学的賦形剤および／または薬学的添加剤は、以下に載せられる：「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ＆Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ」、第１９版、Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｌｉａｍｓ，（１９９５），および「Ｐｈｙｉｃｉａｎ’ｓ  Ｄｅｓｋ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ」第５２版、Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｅｃｏｎｏｍｉｃｓ，Ｍｏｎｔｖａｌｅ，ＮＪ（１９９８）。
【０１２０】
１つの実施形態においては、本発明に従う組成物は、刺激作用を引き起こし得、そして吸収の実質的増強を提供するためにしばしば必要な高レベルで有毒である、浸透増強剤を欠き得る。本発明の組成物に欠き得る特定の増強剤は、洗浄剤様の増強剤（例えば、デオキシコレート、ラウレス−９、ＤＤＰＣ、グリココレート、およびフシデート）である。しかし、インスリンを酵素分解から保護するような特定の増強剤（例えば、α−１アンチプロテアーゼ、カプトロプリル（ｃａｐｔｒｏｐｒｉｌ）、チオルファン、およびＨＩＶプロテアーゼインヒビターのようなプロテアーゼインヒビターおよびペプチダーゼインヒビター）は、本発明の特定の実施形態においては、本発明のＰＥＧ−インスリン処方物の中に組み込まれ得る。さらなる別の実施形態においては、本発明のＰＥＧ−インスリン結合体は、リポソーム、脂質マトリックス、およびカプセル化剤を欠き得る。
【０１２１】
一般的に、本発明の薬学的組成物は、約１重量％〜約９９重量％の賦形剤、好ましくは約５重量％〜約９８重量％の賦形剤、さらに好ましくは約１５重量％〜約９５重量％の賦形剤を含む。なおさらに好ましくは、噴霧乾燥の組成物が、約０重量％〜約５０重量％の賦形剤、さらに好ましくは０重量％〜４０重量％の賦形剤を含む。一般的に高濃度インスリンは、最終的な薬学的組成物中に所望される。代表的に、賦形剤／添加剤の最適量は実験的に、すなわち、賦形剤の異なる量（少量から多量に及ぶ）を含む組成物を調製すること、ＰＥＧ−インスリンの化学的安定性および物理的安定性、薬学的組成物のＭＭＡＤおよび分散性を試験することによって決定され、そして次いでエアゾールの最適性能が、インスリンの安定性への有意な有害な影響なく達成される範囲をさらに探索する。
【０１２２】
（Ａ．２．乾燥粉末の調製）
ＰＥＧ−インスリン結合体を含む本発明の乾燥粉末処方物は、多くの乾燥技術のいずれかによって、そして好ましくは噴霧乾燥によって調製され得る。この処方物の噴霧乾燥は、例えば、一般的に以下に記載されているように行われる：「Ｓｐｒａｙ  Ｄｒｙｉｎｇ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ」、第５版、Ｋ．Ｍａｓｔｅｒｓ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，ＮＹ，ＮＹ（１９９１），およびＰｌａｔｚ，Ｒ．ら、国際特許公開ＷＯ  ９７／４１８３３（１９９７）およびＷＯ  ９６／３２１４９（１９９６）、これらの内容は、本明細書中で参考として援用される。
【０１２３】
ＰＥＧ−インスリン結合体の溶液は、従来型の噴霧乾燥器（例えば、Ｎｉｒｏ  Ａ／Ｓ（デンマーク）、Ｂｕｃｈｉ（スイス）などのような販売元から入手可能な噴霧乾燥器）で噴霧乾燥させ、その結果、分散可能な乾燥粉末が生じる。ＰＥＧ−インスリン溶液を噴霧乾燥させるための最適条件は、処方物の成分に依存して変化し、そして一般的に実験的に決定される。不活性ガス（例えば、窒素またはアルゴン）もまた適するが、材料を噴霧乾燥するために使用されるガスは、代表的に空気である。さらに、噴霧された材料を乾燥させるために使用されるガスの吸気および排気の両方の温度は、噴霧された材料において、ＰＥＧ−インスリンの分解を引き起こさないような温度である。このような温度は、代表的に実験的に決定されるが、一般的には吸気温度は、約５０℃〜約２００℃に及び、排気温度は、約３０℃〜約１５０℃に及ぶ。優先されるパラメーターとしては、約２０〜約１５０ｐｓｉ、好ましくは約３０〜約４０ｐｓｉから約１００ｐｓｉに及ぶ噴霧圧が挙げられる。代表的に使用される噴霧圧は、以下のうちの１つである（ｐｓｉ）：２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０またはそれ以上。
【０１２４】
本明細書中で記載される特徴を有する、呼吸可能なＰＥＧ−インスリン組成物はまた、ＷＯ  ９９／１６４１９（これらの全体の内容は、本明細書中で参考として援用される）に記載されるような、穿孔した微細構造の粉末の形成を生じる、特定処方物の成分を乾燥することによって生成され得る。穿孔した微細構造の粉末は、大きな内部空隙で規定された、比較的細い多孔性の壁を有する、噴霧乾燥した中空の微粒子を代表的に含む。穿孔した微細構造の粉末は、乾燥する前に安定化された分散物を提供するために、選択された懸濁液媒体（例えば、非水性発泡剤および／またはフッ化発泡剤）中で分散され得る。比較的低密度の穿孔した（または多孔性の）微細構造または微粒子の使用は、粒子間の引力を有意に減少させ、これによって剪断力を低下させ、生じる粉末の流動性および分散性を増大させ、そしてこれらの安定化された分散物の凝結、沈降またはクリ−ミングによる分解を減少させる。
【０１２５】
あるいは、肺送達用のＰＥＧ−インスリン組成物は、米国特許第６，１３６，２９５号に記載されているように、空気力学的に軽い粒子を含み得る。
【０１２６】
本発明の粉末処方物はまた、凍結乾燥、真空乾燥、噴霧凍結乾燥、臨界超過流体処理（ｓｕｐｅｒ  ｃｒｉｔｉｃａｌ  ｆｌｕｉｄ  ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ；例えば、Ｈａｎｎａら、米国特許第６，０６３，１３８号に記載されている）、空気乾燥、または蒸発乾燥の他形式によって調製され得る。
【０１２７】
さらなる別のアプローチにおいて、例えば、本明細書中で参考として援用する、Ａｈｌｎｅｃｋ，Ｃ．ら、国際ＰＣＴ公開ＷＯ  ９５／０９６１６、１９９５に記載されるように、乾燥粉末は、粉末成分を塊にすること、塊を得るために材料を篩にかけること、さらなる球状の塊を提供するために球面化すること、そして均一大の生成物を得るために大きさを変えることによって、調製され得る。
【０１２８】
乾燥粉末はまた、乾燥粉末形態で、処方物成分を混合すること、粉砕すること、篩にかけること、またはジェットミルにかけることによって調製され得る。
【０１２９】
一旦形成されると、乾燥粉末組成物は、好ましくは、製造中、処理中および貯蔵中、乾燥条件（すなわち、相対的に低湿度）下で保持される。使用される乾燥プロセスにかかわりなく、このプロセスは、好ましくは本明細書中で記載されるような、化学的に改変されたインスリンを含む吸入可能で高分散可能な粒子を生じる。
【０１３０】
（Ａ．３．乾燥粉末処方物の特徴）
本発明の粉末は、いくつかの（最も注目すべきは、以下の１つ以上の）特徴によって、さらに特徴付けられる：（ｉ）貯蔵時でさえ維持される一貫した高分散性（ｉｉ）空気力学的に小さな粒子大（ＭＭＡＤ）、（ｉｉｉ）改善された微粒子の用量価（すなわち、３．３ミクロンのＭＭＡＤよりも小さな粒子の、より高いパーセンテージを有する粉末）、これらの全ては、全身循環に送達するために、より細い気道組織（すなわち、肺胞）へ浸透する、この粉末の改善された能力に寄与する。以下にさらに十分に記載されるが、本発明の吸入可能な粉末のこれらの物理的特徴は、深部肺へのこのような粉末のエアロゾル送達の効果を最大化するのに重要である。
【０１３１】
本発明の乾燥粉末は、肺内に浸透させるために、効果的なエアロゾルが可能な粒子から構成される。本発明のこの粒子は、約２０〜約３０μｍよりも小さな主要部中位径（ＭＭＤ）、または２０μｍよりも小さなＭＭＤ、または約１０μｍよりも小さなＭＭＤ、好ましくは約７．５μｍよりも小さなＭＭＤ、およびさらに好ましくは約４μｍよりも小さなＭＭＤ、およびなお約３．５μｍよりも小さなＭＭＤを有し、そして通常は、直径で０．１μｍ〜５μｍの範囲内である。好ましい粉末は、約０．２〜約４．０μｍのＭＭＤを有する粒子で構成される。いくつかの場合においては、呼吸不可能な粒子が代表的に約４０ミクロンよりも大きい場合、この粉末はまた、呼吸不可能なキャリア粒子（例えば、ラクトース）を含む。
【０１３２】
本発明の粉末は、さらに約１０μｍの空気力学的な主要部中位径（ＭＭＡＤ）よりも小さなエアロゾル粒子大の分布によってさらに特徴付けられ、好ましくは、約５μｍよりも小さなＭＭＡＤ、さらに好ましくは、４．０μｍよりも小さなＭＭＡＤ、なおさらに好ましくは、３．５μｍよりも小さなＭＭＡＤ、そして最も好ましくは、３μｍよりも小さなＭＭＡＤを有する。粉末の空気力学的な主要部中位径は、特徴的に約０．１〜約１０μｍのＭＭＡＤ、好ましくは約０．２〜約５．０μｍのＭＭＡＤ、さらに好ましくは約１．０〜約４．０μｍのＭＭＡＤ、そしてなおさらに好ましくは約１．５〜約３．０μｍのＭＭＡＤに及ぶ。空気力学的に小さな直径は、最適な噴霧乾燥条件ならびに賦形剤の選択および濃度の組み合わせによって、一般的に達成され得る。
【０１３３】
本発明のＰＥＧ−インスリンの粉末は、これらの密度によって、さらに特徴付けられ得る。吸入用の粉末組成物は、約０．１〜約１０ｇ／立法センチメートル、好ましくは約０．１〜約２ｇ／立法センチメートル、そしてさらに好ましくは約０．１５〜約１．５ｇ／立法センチメートルのバルク密度を一般的に保有する。
【０１３４】
この粉末は、一般的に約２０重量％以下、通常は約１０重量％以下、および好ましくは約５重量％以下の含水量を有する。本発明に従う好ましい粉末は、以下の１つ以上の重量パーセンテージよりも少ない含水量を有する：１５％、１０％、７％、５％。または３％。このような低水分を含有する個体は、梱包する際、および貯蔵する際、より高い安定性を示す傾向がある。
【０１３５】
さらに、本明細書中で記載される噴霧乾燥法および噴霧乾燥安定剤は、高分散可能なＰＥＧ−インスリン処方物を提供するために効果的である。粉末処方物に関して、これらの粉末からの放出用量（ＥＤ）は、代表的に３０％よりも大きく、そして通常は４０％よりも大きい。さらに好ましくは、本発明の粉末のＥＤは、５０％よりも大きく、そしてしばしば６０％よりも大きい。
【０１３６】
本明細書中で記載される組成物はまた、化学的安定性および物理的安定性の両方（すなわち、時間経過におけるエアロゾルの性能）に関して、優れた安定性を保有する。一般的に、化学的安定性に関しては、処方物中に含まれるＰＥＧ−インスリン結合体は、噴霧乾燥の際に、約１５％以下が分解される。すなわち、この粉末は、少なくとも約８５％のインタクトなＰＥＧ−インスリン結合体、好ましくは少なくとも９０％または９５％のインタクトな結合体を保有し、そしてなおさらに好ましくは少なくとも約９７％以上のインタクトなＰＥＧ−インスリンを含む。好ましくは、噴霧乾燥プロセスは、約１０％よりも低い全タンパク質の凝集体を有する粉末を生じ、すなわち、９０重量％よりも高い化学的に改変されたインスリンが、モノマー形態で存在する。
【０１３７】
エアロゾルの性能に関して、本発明の組成物は、３カ月の期間に環境条件下で貯蔵される場合、約２０％以下、好ましくは約１５％以下、そしてさらに好ましくは約１０％以下の放出用量の低下によって一般的に特徴付けられる。
【０１３８】
（Ａ．４．組成物の投与）
本明細書中で記載されるＰＥＧ−インスリン処方物は、任意の適切な乾燥粉末吸入器（ＤＰＩ）（すなわち、乾燥粉末薬物を肺まで輸送する媒体として、患者の吸入呼吸を利用する吸入器デバイス）を使用して、送達され得る。好ましくは、以下に記載される吸入治療システムの乾燥粉末吸入デバイスである：Ｐａｔｔｏｎ，Ｊ．Ｓ．ら、米国特許第５，４５８，１３５号、１９９５年１０月１７日；Ｓｍｉｔｈ，Ａ．Ｅ．ら、米国特許第５，７４０，７９４号、１９９８年４月２１日；およびＳｍｉｔｈ，Ａ．Ｅ．ら、米国特許第５，７８５，０４９号、１９９８年７月２８日、これらは、本明細書中で参考として援用される。このタイプのデバイスを使用して、投与される場合、この粉末薬物は、穿刺可能な蓋、または他の接近表面を有する容器（好ましくはブリスター包装またはブリスターカートリッジ）の中に含まれ、この場合、この容器は、単一投薬量単位または複数の投薬量単位を含み得る。測定された用量の乾燥粉末薬物によって、多数の空洞を満たす（すなわち、単位用量の充填）ための簡便な方法が例えば、Ｐａｒｋｓ，Ｄ．Ｊ．ら、国際特許公開ＷＯ  ９７／４１０３１，１９９７年１１月６日に記載されており、これは本明細書中で参考として援用される。
【０１３９】
乾燥粉末肺投与用の他の乾燥粉末の分散デバイスとしては、例えば、以下に記載される乾燥粉末の分散デバイスが挙げられる：Ｎｅｗｅｌｌ，Ｒ．Ｅ．ら、ヨーロッパ特許第ＥＰ１２９９８５号、１９８８年９月７日；Ｈｏｄｓｏｎ，Ｐ．Ｄ．ら、ヨーロッパ特許第ＥＰ４７２５９８号、１９９６年７月３日；Ｃｏｃｏｚｚａ，Ｓ．ら、ヨーロッパ特許第ＥＰ４６７１７２号、１９９４年４月６日、およびＬｌｏｙｄ，Ｌ．Ｊ．ら、米国特許第５，５２２，３８５号、１９９６年６月４日、これらは、本明細書中で参考として援用される。ＰＥＧ−インスリンの乾燥粉末を送達するためにまた適するものは、吸入デバイス（例えば、Ａｓｔｒａ−Ｄｒａｃｏの「ＴＵＲＢＵＨＡＬＥＲ」）である。このタイプのデバイスは、以下に詳しく記載されている：Ｖｉｒｔａｎｅｎ，Ｒ．ら、米国特許第４，６６８，２１８号、１９８７年５月２６日；Ｗｅｔｔｅｒｌｉｎ、Ｋ．ら、米国特許第４，６６７，６６８号、１９８７年５月２６日；およびＷｅｔｔｅｒｌｉｎ、Ｋ．ら、米国特許第４，８０５，８１１号、１９８９年２月２１日であり、これらの全てが、本明細書中で参考として援用される。他の適切なデバイスとしては、以下が挙げられる：乾燥粉末吸入器（例えば、Ｒｏｔａｈａｌｅｒ（登録商標）（Ｇｌａｘｏ），Ｄｉｓｃｕｓ（登録商標）（Ｇｌａｘｏ），Ｓｐｉｒｏｓ（登録商標）吸入器（Ｄｕｒａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、およびＳｐｉｎｈａｌｅｒ（登録商標）（Ｆｉｓｏｎｓ）。また、適するものは、粉末薬物を飛沫同伴させるか、空気がスクリーンを通り抜けることによって、キャリアスクリーンから薬物を取り除くか、または混合室中で、粉末薬物と空気を混合することのいずれかで、空気を提供するためにピストンを使用する、以下に記載されているようなデバイスであり、その後、デバイスの吸口を通して、患者に対してこの粉末を導入する：Ｍｕｌｈａｕｓｅｒ，Ｐ．ら、米国特許第５，３８８，５７２号、１９９７年９月３０日、これは本明細書中で参考として援用される。
【０１４０】
吸入可能なＰＥＧ−インスリン組成物はまた、加圧型の定量吸入器（ＭＤＩ；例えば、Ｖｅｎｔｏｌｉｎ（登録商標）定量吸入器）を使用して、送達され得、以下に記載されているように、薬学的に不活性の液体噴霧剤中の薬物溶液または薬物懸濁液（例えば、クロロフルオロカーボンまたはフルオロカーボン）を含む：Ｌａｕｂｅら、米国特許第５，３２０，０９４号、１９９４年６月１４日、およびＲｕｂｓａｍｅｎ，Ｒ．Ｍ．ら、米国特許第５，６７２，５８１号（１９９４）、これらは、両方とも本明細書中で参考として援用される。
【０１４１】
あるいは、本明細書中で記載されるＰＥＧ−インスリンは、溶媒（例えば、水または生理食塩水）中で溶解または懸濁され得、そして噴霧によって投与され得る。エアロゾル溶液を送達するための噴霧器としては、以下が挙げられる：ＡＥＲｘ（登録商標）（Ａｒａｄｉｇｍ），Ｕｌｔｒａｖｅｎｔ（登録商標）（Ｍａｌｌｉｎｋｒｏｄｔ）、Ｐａｒｉ  ＬＣ  Ｐｌｕｓ（登録商標）またはＰａｒｉ  ＬＣ  Ｓｔａｒ（登録商標）（Ｐａｒｉ株式会社、ドイツ）、ＤｅＶｉｌｂｉｓｓ  Ｐｕｌｍｏ−Ａｉｄｅ，およびＡｃｏｒｎＩＩ（登録商標）（Ｍａｒｑｕｅｓｔ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）。
【０１４２】
以前に記載したように、本明細書で記載されるこのＰＥＧ−インスリン結合体はまた、静脈内注射によって、またはより好ましくない、筋肉内注射によってもしく皮下注射によって、非経口的に投与され得る。このような処方物の正確な成分は、当業者によって容易に決定され得る。非経口投与のための適切な処方物のタイプとしては、以下が挙げられる：注射用に準備される溶液、使用前の溶媒と配合するための乾燥粉末、注射用に準備される懸濁液、使用前の媒体と配合するための不溶性の乾燥組成物、投与前の希釈用エマルジョン濃縮物および液体濃縮物。例えば、本発明のＰＥＧ−インスリン組成物の注射可能な溶液としては、以下が挙げられ得る：水性媒体（例えば、塩化ナトリウム水溶液）、リンガー溶液、デキストロース注射溶液、乳酸加リンガー溶液などで溶解される組成物、そして上記のような１種類以上の薬学的に受容可能な互換性賦形剤または互換性添加剤が挙げられ得る。
【０１４３】
（ＩＶ．用途）
本発明の組成物は、任意の適切な投与経路によって投与される場合、有用であり、そして、好ましくは糖尿病（および特にＩ型糖尿病またはＩＩ型糖尿病）の処置のために、哺乳動物の被験体に対して治療的に有効量で、吸入経路によるかまたは注射経路によって投与される。
【０１４４】
本明細書中で参照される全ての論文、本、特許および他の刊物は、本明細書にその全体が参考として援用される。
【実施例】
【０１４５】
以下の実施例は、本発明の範囲を説明するが、限定することを決して意図しない。
【０１４６】
（実施例）
（材料および方法）
Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ、Ａｌａｂａｍａ）からポリエチレングリコール試薬を入手した。
【０１４７】
Ｄｉｏｓｙｎｔｈ、Ｉｎｃ．からヒトインスリンを入手した。
【０１４８】
（実施例１）
（ジ−ＮαＡ１，ＮεＢ２９−ｔ−Ｂｏｃ−インスリンの合成）
例示的な直鎖の５，０００ダルトンのポリエチレングリコールを用い、実施例１および実施例２に記載の部位特異的様式で、主にモノ−ペグ化インスリンから構成される組成物を調製した。
【０１４９】
最初に、ジ−保護化インスリンを以下のように調製した。１６６μＬのトリエチルアミンを含む３．０ｍＬの無水ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中に、６０２ｍｇのヒトインスリン（０．１０３ｍｍｏｌ）を溶解した。インスリン溶液に５０μｌのジ−ｔｅｒｔ−ブチルジカーボネート（０．２１５ｍｍｏｌ）を添加した。室温で６０分後、２４０ｍＬのアセトンに反応溶液を注ぎ、その後、凝集を開始させるために３滴の６Ｍ  ＨＣｌを添加した。濾過によって沈殿物を単離し、減圧下で乾燥させた。Ｗａｔｅｒｓ  ２５×１００ｍｍ  Ｃ１８カラム（平均粒子サイズ、１５μｍ；孔サイズ、１００Ａ）を使用する調製用ＨＰＬＣによって、反応生成物を精製した。溶出液として、アセトニトリルと０．１％ＴＦＡの脱イオン水中の混合液を、３．０ｍＬ／分の速度で使用した。生成物を回収し、アセトニトリルを除去するために蒸留し、そしてその後凍結乾燥した。収量は、１６４．８ｍｇ（２６．７％、ＭＷ  約６０００（ＭＡＬＤＩによる））であった。
【０１５０】
（実施例２）
（モノ−ペグ化ｍＰＥＧ−５Ｋ−ＳＰＡ−ＰｈｅＢ１−インスリン結合体（ＮαＢ１−メトキシポリ（エチレングリコール）５Ｋ−インスリン（ｍＰＥＧ５Ｋ−ＰｈｅＢ１−インスリン））の合成）
実施例１から新しく精製されたジ−ＮαＡ１、ＮεＢ２９−ｔ−ｂｏｃ−インスリン（１５０ｍｇ（約０．０２５ｍｍｏｌ））を、９５μＬのトリエチルアミンを含むＤＭＳＯ（４ｍＬ）に溶解した。１６９ｍｇ（０．０３２ｍｍｏｌ）のｍＰＥＧ−ＳＰＡ−５０００（ｍＰＥＧ−プロピオン酸スクシンイミジル、ｍＰＥＧ−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２Ｃ（Ｏ）Ｏ−スクシンイミド、ＭＷ  ５，０００）を、インスリン溶液に添加した。一晩（２９時間）室温でインキュベーションした後、得られたｍＰＥＧ−インスリン誘導体を脱イオン水で１００ｍＬに希釈し、４時間脱イオン水に対し透析し、その後凍結乾燥した。凍結乾燥した生成物を、４ｍＬの無水ＴＦＡに再び溶解し、Ｂｏｃ保護基を取り除くために１．５時間０℃でＮ２下で維持した。脱保護ｍＰＥＧ−インスリンを、脱イオン水で５０ｍＬに希釈し、一晩０．１％  ＮＨ４ＨＣＯ３および脱イオン水に対し透析した。生成物の凍結乾燥は、白い粉末を産出した。収量は１１７．６ｍｇ（４１．６％、ＭＷ約１１３１１．６（ＭＡＬＤＩによる））であった。
【０１５１】
質量スペクトルのデータに基づくモノ結合体化インスリンの割合は約９０％であり、これはこの合成アプローチの部位特異的性質を確認した。さらなる特徴付けデータを実施例５に示す。得られた生成物のインスリン含有量は５１．３％であった。参照を容易にするために、ＮαＢ１−メトキシポリ（エチレングリコール）５Ｋ−プロピオンアミド−インスリンすなわちｍＰＥＧ５Ｋ−ＰｈｅＢ１−インスリンを、本明細書にて「５Ｋ  ＰＥＧ  インスリン」と称する。
【０１５２】
（実施例３）
（ｍＰＥＧ−２Ｋ−ＳＰＡ−インスリン結合体の合成）
約２，０００ダルトンの分子量を有する例示的な直鎖ポリエチレングリコールを使用する非部位特異的（すなわち、無作為的）様式でペグ化したインスリンを調製するために、以下のアプローチを用いた。０．１０１２ｇのインスリン（ＭＷ  ５８２６Ｄａ、０．０１７３７ｍｍｏｌ）を、０．５ｍＬの無水ＤＭＳＯに溶解し、５０μＬのトリエチルアミン（０．３５８７ｍｍｏｌ、２０倍モル濃度過剰）で処理した。上記の反応混合物に、５２ｍｇのｍ−ＳＰＡ−２０００（ｍＰＥＧ−プロピオン酸スクシンイミジル、Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ＭＷ約２０００Ｄａ、０．０２６０５ｍｍｏｌ、１．５倍モル濃度過剰）を添加した。窒素下で室温で約１７時間、その混合物を攪拌した。次いで、反応混合液を総容量５．５ｍＬになるよう０．１％ＴＦＡに溶解し、そしてＣ−１８カラムおよび溶出液としてアセトニトリル／０．１％ＴＦＡ反応混合液を用いる逆相ＨＰＬＣによって精製した。逆相ＨＰＬＣは、モノ−ぺグ化（１つのＰＥＧが結合）生成物およびジ−ペグ化（２つのＰＥＧが結合）生成物の両方の混合物を明らかにした；本明細書にて組成物を「２Ｋ  ＰＥＧ  インスリン」と称する。
収量：６８ｍｇ
ＲＰ−ＨＰＬＣによりインスリン容量：５０．５ｍｇ
（実施例４）
（ｍＰＥＧ−７５０Ｄａ−ＳＰＡ−インスリン結合体の合成）
インスリンに共有結合するために適切なプロピオン酸スクシンイミジル末端を有する、代表的なポリエチレングリコール改変剤（すなわち、直鎖７５０ダルトンポリエチレングリコール）を使用する部位特異的様式で、主にＢ１部位でペグ化されたインスリンから構成された組成物を調製した。
４Ａ．ジ−ＮＡ１，ＮＢ２９−ｔ−Ｂｏｃ−インスリンの合成
ジ保護化インスリンを以下のように調製した。６０２ｍｇのヒトインスリン（０．１０３ｍｍｏｌ）を１６６μＬのトリエチルアミンを含む無水ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）（３．０ｍＬ）に溶解した。５０μｌのジ−ｔｅｒｔ−ブチルジカーボネート（０．２１５  ｍｍｏｌ）をインスリン溶液に添加した。室温で６０分後、反応溶液を２４０ｍＬのアセトンに注ぎ、その後、凝集を開始させるために３滴の６Ｍ  ＨＣｌを添加した。沈殿物を濾過によって単離し、減圧下で乾燥させた。Ｗａｔｅｒｓ  ２５×１００ｍｍ  Ｃ１８カラム（平均粒子サイズ、１５μｍ；孔サイズ、１００Ａ）を使用する分取用ＨＰＬＣによって、反応生成物を精製した。アセトニトリルと脱イオン水中の０．１％ＴＦＡの混合液を、溶出液として、３．０ｍＬ／分の速度で使用した。生成物を回収し、アセトニトリルを除去するために蒸留し、次いでその後凍結乾燥した。収量は、１６４．８ｍｇ（２６．７％、ＭＷ  約６０００（ＭＡＬＤＩによる））であった。
【０１５３】
（４Ｂ．ｍＰＥＧ−７５０  Ｄａ−ＳＰＡ−ＰｈｅＢ１−インスリン結合体の合成）
実施例４Ａからの新しく精製されたジ−ＮＡ１，ＮＢ２９−ｔ−ｂｏｃ−インスリン（６３．４ｍｇ（約０．０１０５６ｍｍｏｌ）を２００μＬのトリエチルアミンを含む０．５ｍＬのＤＭＳＯに溶解させた。３３ｍｇ（０．０３１７３ｍｍｏｌ、ｍＳＰＡ  ７５０のＭＷは約１０４０Ｄａである）のｍＰＥＧ−ＳＰＡ−７５０（ｍＰＥＧ−プロピオン酸スクシンイミジル、ｍＰＥＧ−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２Ｃ（Ｏ）Ｏ−スクシンイミド、ＰＥＧ  ＭＷ  ７５０）をインスリン溶液に添加した。室温で一晩（２９時間）のインキュベーション後、３００μＬのＴＦＡを反応溶液に添加し、そして得られるｍＰＥＧ−インスリン誘導体が１００ｍＬのエチルエーテルで沈殿し、減圧下で乾燥させた。収量は、逆相ＨＰＬＣによって測定されたインスリン含有物（２１．３ｍｇ）を含む約２８．５ｍｇであった（３３．６％、ＭＷ約６６３９．３Ｄａ（ＭＡＬＤＩによる））。簡潔にするため、本明細書にて組成物を「７５０  ＰＥＧインスリン」と称する。
【０１５４】
１つの例外を除き上記の合成技術を両方用いて、この物質に関して２つの異なる合成を行なった：１つの合成を、ｍＰＥＧ−ＳＰＡ−７５０：インスリンのモル比が７：１で行い、一方で他の合成を、ｍＰＥＧ−ＳＰＡ−７５０：インスリンのモル比が３：１で行なった。これらの２つの調製から得られた製品組成物を、本明細書にて「７５０−１  ＰＥＧインスリン」（ＰＥＧ試薬：インスリンのモル比は７：１であった）および「７５０−２  ＰＥＧインスリン」（ＰＥＧ試薬：インスリンのモル比は３：１であった）を称する。
【０１５５】
（実施例５）
（例示的ＰＥＧ−インスリン組成物の特性）
上に記載のペグ化インスリン結合組成物はさらに、様々な分析技術によって特徴付けられた。
【０１５６】
相対ピーク面積に基づいて、各組成物に存在するモノ結合体化インスリン、ジ結合体化インスリンおよびトリ結合体化インスリン（ＰＥＧインスリンモノマー、ＰＥＧインスリンダイマーおよびＰＥＧインスリントリマーとも称される）の相対量を推定するために、質量分析を使用した。以下の表１に結果を与える。
【０１５７】
（表１．質量分析法に基づくモノ結合体化インスリン、ジ結合体化インスリン、およびトリモノ結合体化インスリンの相対量）
【０１５８】
【表１】
2004535401.tif 000002
Ｗａｔｅｒｓ  ２６９０  ＨＰＬＣシステムのシリーズで組み込まれた、２つのＳｈｏｄｅｘ  ＳＥＣカラム（部品番号ＫＷ−８０２．５）を使用して、上記の７５０−１  ＰＥＧ−インスリン組成物、７５０−２  ＰＥＧ−インスリン組成物および２Ｋ  ＰＥＧ−インスリン組成物について、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を行なった。移動相は、水中の２２％の氷酢酸および３３％のアセトニトリル（Ｖ／Ｖ）を含有した。これらの組成物のそれぞれのモノ結合体化インスリン、ジ結合体化インスリン、およびトリ結合体化インスリンの相対量を決定するための、代替のアプローチとして、クロマトグラフィーのデータを使用した。以下の表２に結果を示す。表１および表２のデータの比較によって見られ得るように、２つの異なる方法は、組成物に存在するそれぞれのタイプの結合体の相対量に関して、ほぼ一致する結果を提供する。
【０１５９】
（表２．ＨＰ−ＳＥＣに基づく、モノ結合体化インスリン、ジ結合体化インスリン、およびトリ結合体化インスリンの相対量）
【０１６０】
【表２】
2004535401.tif 000003
３つの例示的な組成物（すなわち、３つの可能な結合部位（Ａ−１Ｇｌｙ、Ｂ−１ＰｈｅまたはＢ−２９Ｌｙｓ）でのそれぞれの置換基の広がり）のそれぞれの様々な位置結合体の分配を決定するために、さらなる研究を行なった。インスリンサンプル中のジスルフィド結合を減少するために、ジチオスレイトール（ＤＴＴ、シグマ）を使用し、インスリンＡ鎖とインスリンＢ鎖の間の共有結合を切断した。
【０１６１】
還元反応を行なうために、それぞれの結合体化された種に対し当量のインスリンの質量（約０．２ｍｇ／ｍＬ）で０．４Ｍ  重炭酸アンモニウムを含む８Ｍ  尿素に、ＰＥＧ−インスリンサンプルを溶解させた。水性ＤＴＴ溶液を生成するために、ＤＴＴを水に溶解させた（７ｍｇ／ｍｌ）。次いで、ＤＴＴ溶液の一部を５部の各インスリン溶液に添加し、そして還元反応を１５分間５０℃で行なった。還元された７５０ＰＥＧインスリン組成物を、ヨードアセトアミド（Ｓｉｇｍａ）でアルキル化した。クロマトグラフィーおよび酵素的消化より前に、１部の１００ｍＭヨードアセトアミドと６部のＰＥＧインスリン溶液を反応させた。次いで、反応生成物をＨＰＬＣによって分析した。インスリンのＡ鎖またはＢ鎖のいずれかとの結合の割合を、コントロールより遅く溶出された（ポリエチレングリコールとの結合に起因する）インスリンのＡ鎖およびＢ鎖の量に基づいて推定した。従って、コントロールにおいて、これらの遅く溶出するピークは、推定される保持時間に存在しない。相対ピーク面積を、インスリンのＡ鎖またはＢ鎖のいずれかに対するポリエチレングリコールの結合の割合を示すために使用した。
【０１６２】
Ｂ１−Ｐｈｅに対しＢ−２９  Ｌｙｓと結合したＰＥＧの相対量をさらに調査するため、
上記のＤＴＴ還元法からの７５０−１  ＰＥＧインスリン組成物および７５０−２  ＰＥＧインスリン組成物の還元およびアルキル化Ａ鎖およびＢ鎖をさらに、配列決定酵素Ｅｎｄｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  Ｇｌｕ−Ｃ（Ｓｉｇｍａ）で消化させた。水性重炭酸アンモニウムに０．１２５μｇ／μＬで酵素を含む溶液を調製した。酵素溶液を添加する前に、各還元溶液混合体のインスリン濃度は、０．４Ｍ重炭酸アンモニウムを含む８Ｍ  尿素中に０．０５μｇ／μＬであった。次いで、１部の酵素溶液を４０部のインスリン溶液に添加した。Ｅｎｄｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  Ｇｌｕ−Ｃ酵素での消化は、Ａ１−Ａ４、Ａ５−Ａ１７、Ａ１８−Ａ２１、Ｂ１−Ｂ１３、Ｂ１４−Ｂ２１、およびＢ２２−Ｂ３０のインスリンペプチドのフラグメントを産出する。
【０１６３】
これらの組成物のそれぞれについて、インスリンへのＰＥＧ結合部位の全体分布を推定するために、７５０−１  ＰＥＧインスリン組成物および７５０−２  ＰＥＧインスリン組成物のＡ鎖およびＢ鎖の両方についての酵素的消化から得られるフラグメントを、ＨＰＬＣによって分析した。そのフラグメントがクロマトグラムにより他の場所で溶出するので、コントロールと比較してピークのない割合で、ＰＥＧと結合したフラグメントの量が推定できた。
表３Ａ
例示的なＰＥＧインスリン処方物についてのＰＥＧ結合部位の分布
【０１６４】
【表３Ａ】
2004535401.tif 000004
＊消化データなし、還元された収率のみ
表３Ａの数値は、それぞれの部位が１００％の結合されるという可能性に基づいている。例えば、各モノ種は、３つの可能な構造（モノ−Ａ１、モノ−Ｂ１、モノ−Ｂ−２９）を有し、各ジ結合体は３つの構造（ジ−Ａ１，Ｂ−１；ジ−Ａ−１，Ｂ−２９；およびジ−Ｂ−１，Ｂ−２９）を有する。表３Ａのデータを見ると、例えば、組成物に存在する可能な種の全ての中でＰＥＧ−７５０−１について、ＰＥＧ−インスリン結合体の９５％は、Ｂ−１部位に共有結合したポリエチレングリコールを有した。
表３Ｂ．可能である様々な結合種
【０１６５】
【表３Ｂ】
2004535401.tif 000005
（実施例６）
（未改変インスリンに対する７５０−２  ＰＥＧインスリンの酵素的消化の比率の比較）
キモトリプシンによる７５０−２  ＰＥＧ−インスリンの酵素的消化の比率を、インスリンの酵素的消化の比率と比較した。
【０１６６】
インスリンのコントロールおよびＰＥＧ  ７５０インスリン−２組成物を、ｐＨ７．８でリン酸緩衝化生理食塩溶液に１ｍｇ/ｍＬで調製した。キモトリプシンを、１ｍＭ  ＨＣｌ溶液に１ｍｇ/ｍＬで調製した。酵素溶液の１部を、インスリン溶液の２０部に添加した。混合された溶液の小さなアリコートを、約１時間毎に回収した。
【０１６７】
過塩素酸ナトリウム、リン酸、およびアセトニトリルを含む移動相を有するＣ−１８カラムを用いる、ＲＰ（逆相）ＨＰＬＣ法を開発した。２１４ｎｍで観察された、僅かに分離したピークのグループのＰＥＧ化インスリン種の組み合わせを溶出するために、アセトニトリル勾配を使用した。ピークのグループを１つのピークとして手動で一体化し、ＰＥＧインスリンとして標識化した、消化が進行するにしたがって、未反応のＰＥＧインスリンおよびインスリンの損失をプロットした（図１）。キモトリプシンの存在下の半減期を推定した。
【０１６８】
７５０−２  ＰＥＧインスリン組成物の主要成分の濃度の半分を酵素的に消化するために必要とされる時間の長さは、未改変インスリンの５倍以上である。つまり、説明のためのペグ化インスリンの濃度の半分のキモトリプシンによる消化は、標準のインスリンよりも５倍長い時間を要した。これらの結果は、未改変インスリンと比較した場合、タンパク質分解に対する向上した耐性に起因しで、肺胞の耐性時間を延長する、ＰＥＧインスリン結合の可能性を実証した。
【０１６９】
（実施例７）
（ラットへの５Ｋ  ＰＥＧインスリンの静脈内投与後の血清グルコースおよびインスリン濃度の評価（Ｐ−２００１−０１５））
５Ｋ  ＰＥＧインスリン組成物のインスリン活性が、例示的な５Ｋポリエチレングリコール鎖での化学的改変に基づき得られるかどうかを決定するために、および静脈内に投与したときのこれらの組成物についての用量とグルコースの応答曲線を調査するために、本研究を行なった。
【０１７０】
首の後部の表皮下に貫くアクセスポートを有する、予めカニューレを挿入された（頚静脈／大腿静脈［ＪＶＣ／ＦＶＣ］）雄ＳＤ系のラット（３２５−３５０ｇ）は、Ｈｉｌｌｔｏｐ  Ｌａｂ  Ａｎｉｍａｌｓ  Ｉｎｃ．（Ｐ．Ｏ．Ｂｏ×  １８３、Ｓｃｏｔｔｄａｌｅ、ＰＡ  １５６８３）から提供された。効力を保持するため、頸静脈カニューレに、薬学的グレードのＰｏｌｙｖｉｎｙｌ−Ｐｙｒｒｏｌｉｄｏｎｅ（ＰＶＰ−ＭＷ４０，０００）。生理食塩水およびヘパリンナトリウムの溶液（管腔充填剤）を充填した。研究の当日、カニューレを密封するナイロンフィラメントプラグを取り、Ｍｏｎｏｊｅｃｔブラントカヌーレ２３Ｇ×１（ＶＷＲ  ＃５３４９８−４８４）と置き換えた。検査システムは、プラセボグループのために無作為に選択された１匹の雄ラット、非ペグ化グループのために無作為に選択された２匹の雄ラット、およびＰＥＧインスリングループのために無作為に選択された４匹の雄ラットを含む。本研究のためのペグ化インスリンの供給源は、実施例２からの５Ｋ  ＰＥＧインスリンであった。用量を静脈内投与した。
【０１７１】
動物の数／性
第１日目：１Ｍ／プラセボグループ１のためのグループ
２Ｍ／グループ２のためのグループ；４Ｍ／グループ３〜５のためのグループ
本研究の開始前に１２〜１８時間、動物を絶食させた。使用前に、ヒトインスリン（Ｄｉｏｓｙｎｔｈ）を−２０℃で保存した。使用前に、５Ｋ  ＰＥＧインスリン（実施例２）を−２０℃で保存した。投与のための２つの異なる溶液を調製した：
Ｉ．Ｖ．投与のための溶液
非ＰＥＧ化ヒトインスリン（１．０ｍｇ／ｍｌ  ストック）：１．０ｍｌのＰＢＳを、１．０ｍｇのインスリン粉末に添加した。
【０１７２】
５Ｋ  ＰＥＧインスリン：（１．０ｍｇ／ｍｌ  ヒトインスリン濃度は、結合体よりもインスリンに基づく）：６．０ｍｌのＰＢＳを１１．７ｍｇの５Ｋ  ＰＥＧインスリン粉末に添加した。
【０１７３】
吸入イソフランで動物に麻酔をかけた。ＦＶＣを介してｉ．ｖ用量（３００μＬ／動物）を与え、次いで血液の逆流による混入（ｃｒｏｓｓ  ｃｏｎｔａｍｉｎａｔｉｏｎ）を取り除くため、カテーテルを結んでとめた。ＪＶＣを介して、全ての血液サンプルを取り出した。リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）を、３００μＬのｉ．ｖ．用量として、グループ１に投与した。非ペグ化ヒトインスリンを、２０μｇ／動物ｉ．ｖ．用量としてグループ２に投与した。ＰＥＧ化ヒトインスリン処方物を、２０μｇ／動物ｉ．ｖ．用量としてグループ３に、４０μｇ／動物ｉ．ｖ．用量としてグループ４に、３０μｇ／動物ｉ．ｖ．用量としてグループ５に投与した。投与前の用量（ｐｒｅｄｏｓｅ）（投与の２時間〜０．２５時間前）、１０分、１５分、３０分、６０分、１２０分、および１８０分後の投与後の量（ｐｏｓｔｄｏｓｅ）で、ＪＶＣを介して血液サンプル（約５００μＬ）を回収した。Ｇｌｕｃｏｍｅｔｅｒ  Ｅｌｉｔｅグルコースモニター（Ｂａｙｅｒ  Ｃｏｒｐ、Ｅｌｋａｒｔ、ＩＮ）によって、血中グルコースを測定するために、グルコース検査小片に少量の血液を置いた。サンプルの残りを血清分離チューブに入れ、血液を分離するために遠心分離機に設置した。次いで、血清を分離チューブにデカントし、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）によって分析した。Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ（登録商標）Ｅｘｃｅｌ  ２０００を使用して、平均標準偏差（ＳＤ）を計算した。
【０１７４】
（表４．インビトロ実験の概要）
以下は、投与された実際の用量およびグループ毎の使用された実際の用量である。この研究は１日で完了した。
【０１７５】
【表４】
2004535401.tif 000006
この結果は、５Ｋ  ＰＥＧインスリン組成物が、生物活性を有する（例えば、血中グルコースを低減する能力によって観察されるように、インスリン分子は、ポリエチエレングリコールを改変するときに活性のままである）ことを実証した。ペグ化インスリンのｉ．ｖ．投与後の平均血清インスリン濃度は、用量依存性であった；グルコースレベルにおける用量依存性の減少がまた観察された。図２および図３に結果とまとめた。図２は、実例の組成物である、非ペグ化インスリンに対しペグ化インスリンをｉ．ｖ．投与した後の平均血清インスリン濃度のプロットである。図３は、上記の組成物をｉ．ｖ．投与した後の血中グルコース濃度のプロットである。
【０１７６】
（実施例８）
（肺への５Ｋ  ＰＥＧインスリンの投与（Ｐ−２００１−０１７））
（ｉ）ペグ化インスリンの活性が、肺への投与のときに維持されるかどうか、そして（ｉｉ）もしあれば、肺へ直接送達したときの、血清インスリン濃度および血中グルコース濃度へのペグ化インスリンの影響を決定するために、例示的なペグ化インスリン（５Ｋ  ＰＥＧインスリン）を、静脈投与を介しラットに投与した。
【０１７７】
（ストック溶液）
非ペグ化インスリン：１ｍｇ／ｍｌストック溶液を調製するために、１ｍｌのＰＢＳを１．０ｍｇのインスリン粉末に添加した。研究の初日にインスリンのストック溶液（コントロール）を調製した。
【０１７８】
５Ｋ  ＰＥＧインスリン：１ｍｇ／ｍｌ（インスリンに基づく）のストック溶液を調製するために、４．０ｍｌのＰＢＳを７．８ｍｇの５Ｋ  ＰＥＧインスリン粉末に添加した。
【０１７９】
（投与する溶液）
４０μｇ／動物のインスリン：投与の２時間以内に、６６７μｌのインスリンストック溶液を、４．３３ｍｌのＰＢＳに添加した。
【０１８０】
１５０μｇ／動物のインスリンＢ−１：投与の２時間以内に、２．５ｍｌの５Ｋ  ＰＥＧインスリンストック溶液を２．５ｍｌのＰＢＳに添加した。
【０１８１】
（気管内点滴注入法）
プレキシガラス製麻酔チャンバーで約５分間酸素と混合した、吸入３．０〜５．０％イソフルラン（Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を使用し、ラットに軽く麻酔をかけた。１ｍＬのシリンジに適合する栄養補給針（ｇａｖａｇｅ  ｎｅｅｄｌｅ）（Ｐｏｐｐｅｒ＆Ｓｏｎｓ  Ｉｎｃ．；１８×３”Ｗ２−１／４ｍｍボール，Ｎｅｗ  Ｈｙｄｅ  Ｐａｒｋ、ＮＹ  １１０４０）をラットの口に気管から主要気管分岐部の真上にかけて挿入することによって、投与を完了した。栄養補給針を気管に挿入するとき、栄養補給針のボールを使用して、喉の皮膚の下の軟骨輪の粗さを感じることによって、適切な挿入を検出した。この方法を使用して用量を肺に投与し、そしてその後に栄養補給針を取り除いた。
【０１８２】
留置頚静脈カテーテル（ＪＶＣ）を有する、１４匹（Ｎ＝７／グループ）の絶食した雄ラット（Ｈｉｌｌｔｏｐ  Ｌａｂ  Ａｎｉｍａｌｓ、Ｓｃｏｔｔｓｄａｌｅ、ＰＡ（３００−３５０ｇ））を、本研究に使用した。非ペグ化ヒトインスリンを、４０μｇ／３００μＬ  ｉ．ｔ．用量としてグループ１に投与した。ＰＥＧ化ヒトインスリン処方物を、１５０μｇ／３００μＬ  ｉ．ｔ．用量としてグループ２に投与した。投与前の用量（ｐｒｅｄｏｓｅ）（投与の２時間〜０．２５時間前）、１５分、３０分、６０分、１２０分、２４０分、３６０分、４８０分、および２７０分後の投与後の量（ｐｏｓｔｄｏｓｅ）で、血液サンプル（約５００μＬ）を回収した。Ｇｌｕｃｏｍｅｔｅｒ  Ｅｌｉｔｅグルコースモニター（Ｂａｙｅｒ  Ｃｏｒｐ、Ｅｌｋａｒｔ、ＩＮ）によって、血中グルコースを測定するために、グルコース検査小片に少量の血液を置いた。サンプルの残りを血清分離チューブに入れ、ラジオイムノアッセイによって分析した。Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ（登録商標）Ｅｘｃｅｌ  ２０００を使用して、平均標準偏差（ＳＤ）を計算した。動物２〜３は、カテーテルの詰まりに起因して、この研究から取り除いた。
【０１８３】
（表５．ラットにおけるインビボ実験の概要）
以下は、投与された実際の用量およびグループ毎の使用された実際の用量である。
【０１８４】
【表５】
2004535401.tif 000007
（表６．インビボ用量のレベル）
【０１８５】
【表６】
2004535401.tif 000008
静脈内投与後のインスリンおよび５Ｋ  ＰＥＧインスリンの平均血清中濃度、および平均血中濃度を、図４および図５にそれぞれプロットし示した。結果は、本発明のペグ化インスリン組成物が肺への送達のときに活性を保持し、肺内に残留することを実証する。非内因性インスリンに関する検出可能な血清インスリンレベルによって証明されるように、薬物動態学的データは、ペグ化インスリンが肺を通り循環するだけでなく、一方で活性を維持をもすることを実証する。静脈投与後、約１時間以内に観察されたインスリンの血中レベルに起因し、ペグ化インスリンは実質的に肺内に留まらず、投与後短時間で肺を通過し血流に到達する。この結果はさらに、ペグ化インスリンが、肺に投与された後、血中グルコースを低減するのに効果的であることを示唆する。しかし、本実施例において、血中グルコースを低減するときに投与された用量で、ペグ化インスリンは非ペグ化インスリンよりも効果が低いことが明らかである。図４のプロフィールに基づいて、ＰＥＧインスリンが、非ペグ化インスリンよりも長く作用していることが明らかであるが、静脈内投与されたペグ化インスリンについての薬物動態学的および薬力学的応答曲線は、いくらか非ペグ化インスリンと類似する。本明細書に示されるガイダンスに基づき、そして任意の化学的改変インスリン生成物の投与要求、意図した患者集団、処置条件などに依存し、用量のおよび特定のポリエチレングリコール調整剤のさらなる最適化が当業者により容易に達成され得る。
【０１８６】
（実施例９）
（肺への７５０−１  ＰＥＧインスリンの投与（Ｐ−２００１−０２５））
代表的なペグ化インスリン（７５０−１  ＰＥＧインスリン）を、静脈内投与によってラットに投与した。肺に投与する場合、一部、約１，０００ダルトン以下の分子量を有する、１つ以上のポリエチレングリコール鎖に共有結合したインスリンの組成物の効果を調査するために、この研究を行なった。
【０１８７】
基本的に上記の実施例８に記載のように、インビボのラット研究を行なった。従った正確な投薬レジメンおよび投与した用量を、以下の表にまとめる。
【０１８８】
（表７．）
【０１８９】
【表７】
2004535401.tif 000009
（表８．）
【０１９０】
【表８】
2004535401.tif 000010
ラットにおける静脈内投与後の、血清インスリン濃度とインスリンおよび７５０−１  ＰＥＧ  インスリンの血中グルコース濃度を、図６および図７にそれぞれプロットし示した。図６の平均血清インスリン濃度のプロットに注目した場合、天然および非ペグ化インスリンは、約１５分で最大血清中濃度に到達したが、ペグ化インスリン組成物は、６時間（１００μｇ／動物）および８時間（３００μｇ／動物）で最大の血清中濃度に達し、これは吸入によって肺に投与されたときのこれらの組成物の長く作用する性質を実証した。図６で見られ得るように、未改変インスリンは投与後約６時間でベースラインまで戻ったが、６時間でのペグ化インスリンのインスリンのレベルは、ベースラインより有意に上であった（ベースラインの値よりも約３〜７倍大きい）。さらに、ペグ化インスリンの静脈内投与は、投与後１２時間でさえベースラインに戻らなかった全身でのインスリンの持続したレベルを生じた。実際、８時間および１２時間の両方で、ペグ化インスリンのインスリンのレベルは、ベースラインのレベル（すなわち、未改変インスリンに対する値）よりも３倍以上であった。これらの結果のプロットを図６に示す。
【０１９１】
つまり、７５０−１  ＰＥＧインスリンは、肺へ投与したとき、未改変インスリンと比較して増加した全身インスリンレベルを生じた。さらに、ペグ化インスリンのグループについての全身インスリンレベルはさらに、１２時間後でさえベースラインより有意に上であった。つまり、高いインスリンのレベルは、ペグ化インスリンのグループについて、非改変インスリンよりも少なくとも２倍長い間維持された。このデータはさらに、ペグ化インスリンが肺を通過し、生理活性であり、非改変インスリンと比較した場合、インスリンの延長された全身レベルを与えることを実証する。
【０１９２】
７５０−１  ペグ化インスリンに対する非ペグ化インスリンの静脈内投与後の平均血中グルコース濃度のプロットを図７に提供する。血中グルコース応答レベルは、ペグ化インスリンのグループについての血清中インスリンのレベルと密接な相関関係があった（つまり、高い血清中インスリンのレベルにおいて、対応する血中グルコースの抑制／低下がまた観察された）。図７に注目すると、本発明のペグ化インスリン組成物は、肺へ経口的投与された場合、多くの持続性放出処方物に典型的な作用の遅発よりむしろ、天然インスリンに匹敵する作用の遅発を示することが見出され得る。つまり、グルコースの抑制が、投与後短時間で起こる。さらに、天然インスリンまたは非ペグ化インスリンは、約２時間で最大のグルコース低下に達するが、ペグ化インスリンについて最大のグルコース低下に達する時間は、５００μｇで少なくとも４時間、１００μｇで少なくとも６時間、そして３００μｇで少なくとも８時間に延長された。そのように、肺に投与した場合のペグ化インスリンについて最大の血中グルコース低下に達する時間は、非ペグ化インスリンよりも２〜４倍長かった。全体的に、７５０−１  ＰＥＧインスリングルコースの抑制は、未改変インスリンと比較した場合、１２時間以上有意に増加した。８時間で、グルコースのレベルは基本的に、未改変インスリンの標準に戻ったが、ＰＥＧインスリングループについてのグルコースのレベルは、未改変インスリンよりも１．３〜３倍低かった。ペグ化インスリングループについてのグルコースのレベルは、１２時間でさえベースラインに戻らず、さらに本発明の化学的誘導化インスリンについての高いグルコース抑制を示唆している。
【０１９３】
（実施例１０）
（肺への７５０−１  ＰＥＧインスリンの投与（Ｐ−２００２−００１））
上記の実施例９に類似した研究において、実施例９で使用した用量よりも低い用量で気管内投与によって、７５０−１−ＰＥＧインスリンをラットに投与した。
【０１９４】
基本的に上記の実施例８に記載のように、インビボ気管内のラット研究を行なった。正確な投与レジメンおよび投与用量を、以下の表にまとめる。
【０１９５】
（表９．）
【０１９６】
【表９】
2004535401.tif 000011
（表１０．）
【０１９７】
【表１０】
2004535401.tif 000012
ラットへの気管内投与後の血清中インスリンと未改変インスリンおよび７５０−１  ＰＥＧインスリンの血中グルコース濃度をプロットし、そして結果をそれぞれ図８および図９に示す。図８の平均血清中インスリン濃度のプロットに注目すると、天然インスリンまたは非ペグ化インスリンは、約１５分で最大の血清中濃度に達したが、ペグ化インスリン組成物は、２時間（８０μｇ／動物）および６時間（１６０μｇ／動物）で最大血清中濃度に達した。つまり、ｐｅｇ改変インスリンについてのインスリンの最大血清中レベルに達する時間は、肺を介して体循環器に投与された場合、天然インスリンまたは非ペグ化インスリンより８〜２４倍長かった。図８に見られ得るように、未改変インスリンは、投与後約１２時間でベースラインに戻ったが、ＰＥＧインスリングループについてのインスリンのレベルは、同じ１２時間の時点ではベースラインの値の２．５〜３．５倍にまで及んだ。ペグ化インスリングループのインスリンのレベルは、約２５時間までベースラインに戻らず、これは非改変インスリンと比較した場合、ペグ化インスリングループのインスリンのレベルがベースラインまで戻る時間の２倍の時間を要したことを意味する。全身インスリンレベルは、ペグ化インスリングループおいて、未改変インスリンの維持時間よりも約２倍（ｆｏｌｄ）または２倍（ｔｗｉｃｅ）の維持時間（１２時間に対し２５時間）の間維持された。約６時間までの時点で、２つのペグ化インスリングループについてのインスリンのレベルは、投与した用量におおよそ対応した（つまり、１６０μｇ／動物グループにおけるインスリン濃度は、８０μｇ／動物グループにおける濃度の約２倍であった。
【０１９８】
７５０−１  ペグ化インスリンに対する非ペグ化インスリンの気管内投与後の平均血中グルコース濃度のプロットを、図９に提供する。投与後２５時間において、未改変インスリンとは対照的に、両方のペグ化インスリングループについてのグルコース抑制は、まだベースラインに戻らなかった。実施例９からの結果と同様に、ペグ化インスリンについての全体的なプロフィールは、グルコース抑制が長期化されて２５時間以上に及ぶことを実証する。８時間において、グルコースレベルは、未改変インスリンのほぼ標準に戻ったが、ＰＥＧインスリンのグループについてのグルコースレベルは、非改変インスリンについてのグルコースレベルよりも約１．５倍低かった。これらの結果は、１以上のポリエチレングリコールの部分でインスリンを改変することが、肺を通過する良好なバイオアベイラビリティーおよび長期化した全身インスリンレベルならびに長期化したグルコース抑制を生じることをさらに実証する。
【０１９９】
（実施例１１）
（肺への７５０−２  ＰＥＧインスリンの投与（Ｐ−２００２−００３））
代表的なペグ化インスリン組成物（７５０−２−ＰＥＧインスリン）を、気管内投与によってラットに投与した。肺に直接投与した場合の非ペグ化インスリンに対するペグ化インスリンの様々な用量の効果をさらに調査するために、この研究を行なった。１匹の動物当たり８０μｇのインスリンの用量で、ペグ化形態および非ペグ化形態のインスリンの両方を動物に投与した。基本的に上記の実施例８に記載のように、インビボのラット研究を行なった。従った正確な投与レジメンおよび投与した用量を以下の表にまとめる。
【０２００】
（表１１．）
【０２０１】
【表１１】
2004535401.tif 000013
（表１２．）
【０２０２】
【表１２】
2004535401.tif 000014
８０μｇ／動物の用量で非ペグ化インスリンおよび７５０−１  ＰＥＧインスリンの両方を気管内投与した後の、平均血清中インスリン濃度のプロットを図１０に示す。８０μｇ／動物の用量で非ペグ化インスリンおよび７５０−１  ＰＥＧインスリンの両方を気管内投与した後の、平均血中グルコース濃度のプロットを図１１に示す。実施例９および実施例１０の結果に類似した結果が得られた。
【０２０３】
実施例１０および実施例１１からの薬物動態学的パラメーターの作表を以下に与える。バイオアベイラビリティーは、絶対的バイオアベイラビリティー（すなわち、静脈内投与されたインスリンと比較して）である。
【０２０４】
（表１３．平均血清中インスリン薬物動態学）
【表１３】
2004535401.tif 000015
＊データセットからアウトライアーを取り除かなかった。
【０２０５】
＊＊ＩＶ２０μｇ／動物の用量に相対的な。アウトライアーを取り除いた値は２２％であった。
【０２０６】
＊＊＊ＩＶ３０μｇ／動物の用量に相対的な。アウトライアーを取り除いた値は変化しなかった。
【０２０７】
絶対的バイオアベイラビリティーを以下に従って計算した：
【０２０８】
【数１】
2004535401.tif 000016
（実施例１２）
（肺への２Ｋ  ＰＥＧインスリンの投与（Ｐ−２００２−０１０））
気管内投与によって、別の例示的なペグ化インスリン組成物（２Ｋ  ＰＥＧインスリン）をラットに投与した。実施例３に記載のように、この研究に使用された２Ｋ  ＰＥＧインスリンを調製した。１匹の動物当たり８０μｇのインスリンの用量で、非ペグ化インスリンを動物に投与した。１匹の動物当たり３００μｇのインスリン、１匹の動物当たり６００μｇのインスリン、１匹の動物当たり９００μｇのインスリン、および１匹の動物当たり１２００μｇのインスリンの用量で、２Ｋ  ＰＥＧインスリンを動物に投与した。基本的に上記の実施例８に記載のように、インビボのラット研究を行なった。以下の表に、従った正確な投与レジメンおよび投与した用量をまとめる。
【０２０９】
（表１４．）
【０２１０】
【表１４】
2004535401.tif 000017
（表１５．）
【０２１１】
【表１５】
2004535401.tif 000018
気管内投与後の平均血中グルコース濃度のプロットを図１２に示す。ペグ化インスリン組成物について、肺に投与した場合、良好な用量反応が観察された（すなわち、より高用量の２Ｋ  ＰＥＧインスリンは、血中グルコース濃度のより大きな減少を導いた）。最大のグルコースの抑制がなされたときの曲線の時点は、ペグ化組成物および非ペグ化組成物の両方において約３時間のようであるが、非ペグ化インスリンに対するペグ化インスリンについてのプロフィールは、グルコースの抑制の持続時間に関して著しく異なる。特に、約６時間を過ぎた時点において、３つのより高い２Ｋペグ化インスリン用量（１匹の動物当たり、６００μ、９００μｇ、および１２００μｇ）で、グルコースのレベルが、非ペグ化インスリンのグルコースのレベルよりも著しく低く抑制された。これらの結果はさらに、長期化した全身での効果が、肺へのペグ化インスリンの投与によって達成され得ることを実証する。
【０２１２】
（実施例１３）
（ラットにおける２Ｋ  ＰＥＧインスリン静脈内投与後の血清グルコース濃度およびインスリンの濃度の評価（Ｐ−２００２−００９））
例示的な２Ｋ  ＰＥＧインスリン組成物においてインスリンの活性をさらに調査し、そして約３０〜４０ｍｇ／ｄＬの濃度に血中グルコースを低下するのに効果的なペグ化ヒトインスリン（ＰＥＧ２Ｋ−１）の静脈内（ｉ．ｖ．）用量を決定するために、この研究を行なった。
【０２１３】
以下の表にまとめた組成物、動物グループおよび用量を使用して、実施例７に記載のプロトコールと類似したプロトコールを実施した。
【０２１４】
（表１６．）
【０２１５】
【表１６】
2004535401.tif 000019
（表１７．）
【０２１６】
【表１７】
2004535401.tif 000020
２０μｇ／動物（非ペグ化インスリン）および２０、３０、および４０μｇ／動物（２Ｋ  ＰＥＧインスリン）の用量で、非ペグ化インスリンおよび２Ｋ  ＰＥＧインスリンを静脈内投与後の、平均血清インスリン濃度のプロットを、図１３に示す。上記の用量で非ペグ化インスリンおよび２Ｋ  ＰＥＧインスリンを静脈内投与後の平均血中グルコース濃度のプロットを、図１４に示す。
【図面の簡単な説明】
【０２１７】
【図１】図１は、実施例６において詳細に記載されるような、例示的なＰＥＧ−インスリン結合体（「７５０−２  ＰＥＧインスリン」）対  未改変のインスリンコントロールの酵素的消化の速度のプロットである。
【図２】図２は、ペグ化インスリン（５Ｋ  ＰＥＧインスリン）  対  非ペグ化インスリンの例示的な組成物の静脈内投与後の平均血清インスリン濃度のプロットである（詳細は、実施例７において提供される）。
【図３】図３は、ペグ化インスリン（５Ｋ  ＰＥＧインスリン）  対  非ペグ化インスリンの例示的な組成物の静脈内投与後の血糖濃度のプロットである（詳細は、実施例７において提供される）。
【図４】図４は、雄性ラットにおける、ペグ化ヒトインスリン（１５０μｇ／動物、５Ｋ  ＰＥＧインスリン）  対  非ペグ化ヒトインスリン（４０μｇ／動物）の気管内喉頭注入法後の平均血清インスリン濃度のプロットである（実施例８）。
【図５】図５は、雄性ラットにおける、ペグ化ヒトインスリン（１５０μｇ／動物、５Ｋ  ＰＥＧインスリン）  対  非ペグ化ヒトインスリン（４０μｇ／動物）の気管内喉頭注入法（ｉｎｔｒａｔｒａｃｈｅａｌ  ｉｎｓｔｉｌｌａｔｉｏｎ）後の平均血糖濃度のプロットである（実施例８）。
【図６】図６は、雄性ラットにおける、ペグ化ヒトインスリン（７５０−１  ＰＥＧインスリン）  対  非ペグ化ヒトインスリンの気管内喉頭注入法後の平均血清インスリン濃度のプロットである（実施例９）。
【図７】図７は、雄性ラットにおける、ペグ化ヒトインスリン（７５０−１  ＰＥＧインスリン）  対  非ペグ化ヒトインスリンの気管内喉頭注入法後の平均血糖濃度のプロットである（実施例９）。
【図８】図８は、雄性ラットにおける、ペグ化ヒトインスリン（７５０−１  ＰＥＧインスリン、８０μｇ／動物および１６０μｇ／動物）  対  非ペグ化ヒトインスリン（８０μｇ／動物）の気管内喉頭注入法後の平均血清インスリン濃度のプロットである（実施例１０）。
【図９】図９は、雄性ラットにおける、ペグ化ヒトインスリン（７５０−１  ＰＥＧインスリン、８０μｇ／動物および１６０μｇ／動物）  対  非ペグ化ヒトインスリン（８０μｇ／動物）の気管内喉頭注入法後の平均血糖濃度のプロットである（実施例１０）。
【図１０】図１０は、雄性ラットにおける、ペグ化ヒトインスリン（７５０−２  ＰＥＧインスリン、８０μｇ／動物）  対  非ペグ化ヒトインスリン（８０μｇ／動物）の気管内喉頭注入法後の平均血清インスリン濃度のプロットである（実施例１１）。
【図１１】図１１は、雄性ラットにおける、ペグ化ヒトインスリン（７５０−１  ＰＥＧインスリン、８０μｇ／動物）  対  非ペグ化ヒトインスリン（８０μｇ／動物）の気管内喉頭注入法後の平均血糖濃度のプロットである（実施例１１）。
【図１２】図１２は、雄性ラットにおける、ペグ化ヒトインスリン（２Ｋ  ＰＥＧインスリン、３００μｇ／動物、６００μｇ／動物、９００μｇ／動物、および１２００μｇ／動物）  対  非ペグ化ヒトインスリン（８０μｇ／動物）の気管内喉頭注入法後の平均血糖濃度のプロットである（実施例１２）。
【図１３】図１３は、ペグ化インスリン（２Ｋ  ＰＥＧインスリン）  対  非ペグ化インスリンの例示的な組成物の静脈内投与後の平均血清インスリン濃度のプロットである（詳細は、実施例１３において提供される）。
【図１４】図１４は、ペグ化インスリン（２Ｋ  ＰＥＧ  インスリン）  対  非ペグ化インスリンの例示的な組成物の静脈内投与後の血糖濃度のプロットである（詳細は、実施例１３において提供される）。
【図１】
2004535401.tif 000021
【図２】
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【図３】
2004535401.tif 000023
【図４】
2004535401.tif 000024
【図５】
2004535401.tif 000025
【図６】
2004535401.tif 000026
【図７】
2004535401.tif 000027
【図８】
2004535401.tif 000028
【図９】
2004535401.tif 000029
【図１０】
2004535401.tif 000030
【図１１】
2004535401.tif 000031
【図１２】
2004535401.tif 000032
【図１３】
2004535401.tif 000033
【図１４】
2004535401.tif 000034
【国際公開パンフレット】
2004535401.tif 000035
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
2004535401.tif 000121