(57)【要約】本発明は雌動物の受胎能にとって，とりわけ孵化ならびに着床の過程において、重要な二つの新規なセリンプロテアーゼを提供する。これらのプロテアーゼ、ならびに、その核酸、断片、類似体、そして／あるいはそれらの阻害剤は、孵化、着床、そして雌動物の受胎能力一般を調整ために使用することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
孵化セリンプロテアーゼ（ＩＳＰ）蛋白質をコードする分離されたＤＮＡ。
【請求項２】
請求項１に記載のＤＮＡにおいて、当該ＤＮＡが
（ａ）配列ＩＤ番号：１または配列ＩＤ番号：２の配列と少なくともおよそ６０％の配列同一性を有するＤＮＡ；および
（ｂ）配列ＩＤ番号：１または配列ＩＤ番号：２の配列と０．５ｘＳＳＣおよび５０℃と等価のストリンジェンシィの下でハイブリダイズ可能なＤＮＡ；
からなる群から選択されるたものであることを特徴とするＤＮＡ。
【請求項３】
請求項１に記載のＤＮＡにおいて、当該ＤＮＡが
（ａ）配列ＩＤ番号：１または配列ＩＤ番号：２の配列と少なくともおよそ７０％の配列同一性を有するＤＮＡ；および
（ｂ）配列ＩＤ番号：１または配列ＩＤ番号：２の配列と０．５ｘＳＳＣおよび５５℃と等価のストリンジェンシィの下でハイブリダイズ可能なＤＮＡ；
からなる群から選択されたものであることを特徴とするＤＮＡ。
【請求項４】
請求項１に記載のＤＮＡにおいて、当該ＤＮＡが
（ａ）配列ＩＤ番号：１または配列ＩＤ番号：２の配列と少なくともおよそ８０％の配列同一性を有するＤＮＡ；および
（ｂ）配列ＩＤ番号：１または配列ＩＤ番号：２の配列と０．１ｘＳＳＣおよび５５℃と等価のストリンジェンシィの下でハイブリダイズ可能なＤＮＡ；
からなる群より選択されたものであることを特徴とするＤＮＡ。
【請求項５】
請求項１に記載のＤＮＡにおいて、当該ＤＮＡが
配列ＩＤ番号：１；および
配列ＩＤ番号：２；
からなる群より選択されたものであることを特徴とするＤＮＡ。
【請求項６】
請求項１に記載のＤＮＡを具えることを特徴とするベクター。
【請求項７】
請求項６に記載のベクターを具えることを特徴とする細胞。
【請求項８】
請求項７に記載の細胞において、当該細胞が真核細胞であることを特徴とする細胞。
【請求項９】
精製されたＩＳＰ蛋白質。
【請求項１０】
請求項９に記載の蛋白質において、当該蛋白質が遺伝子組み換え蛋白質であることを特徴とする蛋白質。
【請求項１１】
請求項９に記載の蛋白質において、当該蛋白質が配列ＩＤ番号：３あるいは、配列ＩＤ番号：４の配列と少なくともおよそ５０％の配列同一性を有することを特徴とする蛋白質。
【請求項１２】
請求項９に記載の蛋白質において、当該蛋白質が配列ＩＤ番号：３あるいは、配列ＩＤ番号：４の配列と少なくともおよそ６０％の配列同一性を有することを特徴とする蛋白質。
【請求項１３】
請求項９に記載の蛋白質において、当該蛋白質が配列ＩＤ番号：３あるいは、配列ＩＤ番号：４の配列と少なくともおよそ７０％の配列同一性を有することを特徴とする蛋白質。
【請求項１４】
請求項９に記載の蛋白質において、当該蛋白質が配列ＩＤ番号：３あるいは、配列ＩＤ番号：４の配列と少なくともおよそ８０％の配列同一性を有することを特徴とする蛋白質。
【請求項１５】
請求項９に記載の蛋白質において、当該蛋白質が配列ＩＤ番号：３あるいは、配列ＩＤ番号：４の配列と少なくともおよそ９０％の配列同一性を有することを特徴とする蛋白質。
【請求項１６】
請求項９に記載の蛋白質において、当該蛋白質が配列ＩＤ番号３および配列ＩＤ番号４からなる群より選択された配列を具えることを特徴とする蛋白質。
【請求項１７】
組み換えＩＳＰ蛋白質を生産する方法において、ＩＳＰ蛋白質をコードするＤＮＡを具える発現ベクターを構築するステップと、この発現ベクターを適切な細胞へ導入し、形質転換体を選択するステップと、ＩＳＰ蛋白質生成に至る条件下で前記形質転換体を培養するステップと、前記ＩＳＰ蛋白質を回収するステップとを具えることを特徴とする方法。
【請求項１８】
請求項１７に記載の方法において、前記ＤＮＡが
（ａ）配列ＩＤ番号：１または配列ＩＤ番号：２の配列と少なくともおよそ６０％の配列同一性を有するＤＮＡ；および
（ｂ）配列ＩＤ番号：１または配列ＩＤ番号：２の配列と０．５ｘＳＳＣおよび５０℃と等価のストリンジェンシィの下でハイブリダイズ可能なＤＮＡ；
からなる群から選択されたものであることを特徴とする方法。
【請求項１９】
請求項１７に記載の方法において、前記ＤＮＡが
（ａ）配列ＩＤ番号：１または配列ＩＤ番号：２の配列と少なくともおよそ７０％の配列同一性を有するＤＮＡ；および
（ｂ）配列ＩＤ番号：１または配列ＩＤ番号：２の配列と０．５ｘＳＳＣおよび５５℃と等価のストリンジェンシィの下でハイブリダイズ可能なＤＮＡ；
からなる群から選択されることを特徴とする方法。
【請求項２０】
請求項１７に記載の方法において、前記ＤＮＡが
（ａ）配列ＩＤ番号：１または配列ＩＤ番号：２の配列と少なくともおよそ８０％の配列同一性を有するＤＮＡ；および
（ｂ）配列ＩＤ番号：１または配列ＩＤ番号：２の配列と０．１ｘＳＳＣおよび５５℃と等価のストリンジェンシィの下でハイブリダイズ可能なＤＮＡ；
からなる群から選択されることを特徴とする方法。
【請求項２１】
哺乳動物の避妊方法において、哺乳動物のＩＳＰ蛋白質、ＩＳＰ蛋白質をコードする核酸、もしくは、前記ＩＳＰ蛋白質または核酸の断片を用いて免疫化するステップを具えることを特徴とする方法。
【請求項２２】
請求項２１に記載の方法において、前記蛋白質が、配列ＩＤ番号：３あるいは配列ＩＤ番号：４の配列と少なくともおよそ７０％の配列同一性を有することを特徴とする方法。
【請求項２３】
請求項２１に記載の方法において、前記蛋白質が、配列ＩＤ番号：３あるいは配列ＩＤ番号：４の配列と少なくともおよそ８０％の配列同一性を有することを特徴とする方法。
【請求項２４】
請求項２１に記載の方法において、前記蛋白質が、配列ＩＤ番号：３あるいは配列ＩＤ番号：４の配列と少なくともおよそ９０％の配列同一性を有することを特徴とする方法。
【請求項２５】
請求項２１に記載の方法において、前記蛋白質が、配列ＩＤ番号：３あるいは配列ＩＤ番号：４の配列を具えることを特徴とする方法。
【請求項２６】
請求項２１に記載の方法において、前記ＩＳＰ蛋白質が融合蛋白質であることを特徴とする方法。
【請求項２７】
請求項２１に記載の方法において、更にアジュバンドを前記哺乳動物に投与することを特徴とする方法。
【請求項２８】
ＩＳＰ１またはＩＳＰ２の抗原決定基を認識する分離された抗体。
【請求項２９】
請求項２８に記載の抗体において、当該抗体がモノクローナルであることを特徴とする抗体。
【請求項３０】
請求項２８に記載の抗体において、当該抗体がポリクローナルであることを特徴とする抗体。
【請求項３１】
請求項２８に記載の抗体において、当該抗体がＩＳＰ蛋白質を阻害できる抗体であることを特徴とする抗体。
【請求項３２】
ＩＳＰ蛋白質またはＩＳＰ蛋白質をコードする核酸を具えることを特徴とする医薬品。
【請求項３３】
請求項３２に記載の医薬品において、当該医薬品が更にアジュバンドを具えることを特徴とする医薬品。
【請求項３４】
請求項３２に記載の医薬品において、前記ＩＳＰ蛋白質が配列ＩＤ番号：３あるいは配列ＩＤ番号：４の配列と少なくともおよそ７０％の配列同一性を有することを特徴とする医薬品。
【請求項３５】
請求項３２に記載の医薬品において、前記ＩＳＰ蛋白質が配列ＩＤ番号：３あるいは配列ＩＤ番号：４の配列と少なくともおよそ８０％の配列同一性を有することを特徴とする医薬品。
【請求項３６】
請求項３２に記載の医薬品において、前記ＩＳＰ蛋白質が配列ＩＤ番号：３あるいは配列ＩＤ番号：４の配列と少なくともおよそ９０％の配列同一性を有することを特徴とする医薬品。
【請求項３７】
請求項３２に記載の医薬品において、前記ＩＳＰ蛋白質が配列ＩＤ番号：３あるいは配列ＩＤ番号：４の配列を有することを特徴とする医薬品。
【請求項３８】
哺乳動物の避妊方法において、避妊に帰着する条件下で有効量のＩＳＰ１またはＩＳＰ２の阻害剤を哺乳動物に投与することを特徴とする避妊方法。
【請求項３９】
請求項３８に記載の避妊方法において、前記阻害剤が抗体であることを特徴とする避妊方法。
【請求項４０】
請求項３８に記載の避妊方法において、前記阻害剤がアンチセンスオリゴヌクレオチドであることを特徴とする避妊方法。
【請求項４１】
避妊に有用な医薬品において、ＩＳＰ１またはＩＳＰ２の阻害剤を具えることを特徴とする医薬品。
【請求項４２】
請求項４１に記載の医薬品において、前記阻害剤が抗体であることを特徴とする医薬品。
【請求項４３】
請求項４１に記載の医薬品において、前記阻害剤がアンチセンスオリゴヌクレオチドであることを特徴とする医薬品。
【請求項４４】
ＩＳＰ１またはＩＳＰ２の阻害剤をスクリーニングする方法において、ＩＳＰ１又はＩＳＰ２の活性測定法を提供するステップと、当該測定法によってＩＳＰ１またはＩＳＰ２の活性に対する候補化合物の影響を決定するステップと、前記ＩＳＰ１またはＩＳＰ２の活性を阻害しうる候補化合物としての阻害剤を同定するステップとを具えることを特徴とする方法。
【請求項４５】
請求項４４に記載の方法において、前記同定された阻害剤が避妊に有用であることを特徴とする方法。
【請求項４６】
哺乳動物の不妊診断方法において、ＩＳＰ１またはＩＳＰ２の活性測定法を提供するステップと、前記哺乳動物から得られる生体試料を提供するステップと、当該生体試料を前記測定法にて検査するステップと、ＩＳＰ１またはＩＳＰ２の活性レベルが低い場合に前記哺乳動物が不妊であると診断するステップとを具えることを特徴とする不妊診断方法。
【請求項４７】
不妊の治療または改善方法において、有効量のＩＳＰ蛋白質あるいはＩＳＰ蛋白質をコードする核酸を提供することを特徴とする方法。
【請求項４８】
請求項４７に記載の方法において、前記ＩＳＰ蛋白質が、配列ＩＤ番号：３あるいは配列ＩＤ番号：４の配列と少なくともおよそ６０％の配列同一性を有することを特徴とする方法。
【請求項４９】
請求項４７に記載の方法において、前記ＩＳＰ蛋白質が、配列ＩＤ番号：３あるいは配列ＩＤ番号：４の配列と少なくともおよそ７０％の配列同一性を有することを特徴とする方法。
【請求項５０】
請求項４７に記載の方法において、前記ＩＳＰ蛋白質が、配列ＩＤ番号：３あるいは配列ＩＤ番号：４の配列と少なくともおよそ８０％の配列同一性を有することを特徴とする方法。
【請求項５１】
請求項４７に記載の方法において、前記ＩＳＰ蛋白質が、配列ＩＤ番号：３あるいは配列ＩＤ番号：４の配列と少なくともおよそ９０％の配列同一性を有することを特徴とする方法。
【請求項５２】
請求項４７に記載の方法において、前記ＩＳＰ蛋白質が、配列ＩＤ番号：３あるいは配列ＩＤ番号：４の配列と同一であることを特徴とする方法。
【請求項５３】
培養胚の着床率を増大させる方法において、当該培養胚を雌の哺乳動物の子宮に転置する前に当該培養胚をＩＳＰ蛋白質と接触させることを特徴とする方法。
【請求項５４】
請求項５３に記載の方法において、前記哺乳動物がヒトであることを特徴とする方法。
【請求項５５】
請求項５３に記載の方法において、前記ＩＳＰ蛋白質が、ＩＳＰ１およびＩＳＰ２からなる群から選択される蛋白質であることを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連した出願
本出願は米国仮出願連続番号60/281,724(2001年4月6日提出);60/294,736(2001年5月30日提出);ならびに60/350,962(2002年1月25日提出)の特典を請求する。これら仮出願のすべてはその全体を参照によってここに包含される。
【０００２】
発明の範囲
本発明は胚の孵化ならびに着床に関わるプロテアーゼと、避妊あるいは受胎促進のためのその使用に関連する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
胚着床およびそれに引き続く妊娠を成功させるためには母体脱落膜への胚の精確な付着とそれに引き続く侵入を可能とする子宮内膜因子−胚盤胞因子間の相互整合が必要とされる(概要:Rinkenbergerら,1997年;Carsonら,2000年)。受精卵は子宮に達するまでに多くの分裂を繰り返し胚盤胞となる。母体脱落膜も時を同じくして増殖し「着床ウィンドウ」と呼ばれる短い期間、栄養芽層細胞の付着に対する受容能力を得る(Psychoyos,1973年;Pariaら,1993年).
【０００４】
マウスにおいて、胚盤胞−子宮間の相互作用を同期させるためにはエストロゲンおよびプロゲステロンが必要とされる。排卵に先だって分泌されるエストロゲンは妊娠の最初の二日間に子宮管腔と子宮内膜上皮の分化を刺激する(Martinら,1973年)。妊娠三日目までには上昇するプロゲステロンのレベルが間質細胞の増殖を刺激する。妊娠四日目には着床前のエストロゲンの急上昇(Huet−Hudsonら,1989年)が、胚盤胞による自然な、あるいは油滴による人為的な触覚刺激に対する感応性を子宮にもたらす(Finn,1966年)。仮に、卵巣除去された雌動物に見られるように、このエストロゲンの急上昇が起こらないとしたら、孵化した胚盤胞は付着することができず子宮内において休眠状態に陥る(Pariaら,1993年)。この着床不能な状態は二十日以内にエストロゲンを投与することによって克服されるが、それも24−48時間のプロゲステロンによる前処理があってはじめて可能となる(YoshinagaとAdams,1966年)。
【０００５】
ホルモンによる着床の全般的な制御に応じて、サイトカインは局所的なオートクライン／パラクライン（autocrine/paracrine）効果を呈し、主として子宮内膜腺、管腔上皮、および胚盤胞間で作動する対話を作り出す。この対話はEGF,LIF,CSFおよびIGFといったいくつかのサイトカインのネットワークにより媒介される(Dasら,1994年;Stewartら,1992年;Pollardら,1991年;Regenstreifら,1989年;Bakerら,1993年)。妊娠初期の段階では、胎盤の確立に先立ち、子宮内膜腺が主要因子と受容体を生産する重要な指令本部としての役割を担う。例えば、エストロゲン。スパイクに対応して子宮内膜腺はLIFを子宮管腔に分泌し、そこにおいてLIFはLIF受容体と相互作用して管腔上皮表面に拘束されるEGFリガンドの発現を促進する(Songら,2000年)。次いでこのEGFリガンドは栄養外胚葉の表面に存在するEGF受容体(ErbB4)(Pariaら,1999年;Wangら,2000年)と相互作用することによって胚盤胞の位置付けを媒介する。CSFもまた子宮内膜腺よりエストロゲン。スパイクに対応して分泌され、栄養芽層の侵入を刺激するように 胚受容体c−fms に信号を送る(Pollardら,1991年)。
脱落膜に付着する前に胚盤胞はその蛋白質性の鞘(透明帯(zona))を脱ぎ捨てねばならない。透明帯は孵化に先行して薄くなるがこれは胚盤胞成長による内部圧力と子宮および胚由来の「溶解素(lysins)」の存在によるものと考えられている(Montag,2000年)。胚由来の「トリプシン様」細胞外活性は生体外での孵化成就に必要であるが、その活性は孵化が開始される胚子外の極(ICMと反対側の栄養外胚葉の極)に組織化学的に局在する(PeromaとWassarman,1986年;Sawadaら,1990年;Hwangら,2000年)。この頂点表面は子宮内において最初に粘着性を帯びる所であり、これが着床小室における胚盤胞の位置を定める(Kirbyら,1967年)。
【０００６】
透明帯からの解放後、いくつかの細胞間質蛋白質は胚盤胞の付着と生体外でのアウトグロウス（アウトグロウス（outgrowth)、付着後の伸展)を促す(Carsonら,1993年)。例えばヘパリン硫酸プロテオグリカンは胚盤胞の胚子外の栄養芽層表面に局在する。生体外での胚盤胞の付着ならびにアウトグロウス（outgrowth)はヘパリナーゼあるいは溶解性ヘパリンによって阻害される(Farachら,1987年).  局在ヘパリン硫酸塩はまた、母体から局在的に分泌されるヘパリン結合性成長因子(HB−EGF)を介して胚−子宮間の対話ならびに胚盤胞の着床能力を助長することがある。分泌されたHB−EGFは生体外における胚盤胞の孵化とアウトグロウス（outgrowth)を促進する(Dasら,1994年)。子宮皮膜組織表面に発現される膜貫通形のHB−EGFはこの局在するヘパリン硫酸プロテオグリカンと頂点的に発現されるEGF受容体(ErbB4)を介して胚盤胞の付着を媒介することがある (Raabら,1996年;Pariaら,1999年;Wangら,2000年)。
【０００７】
胚−子宮間の相互作用ならびに母体陰窩への胚の統合もまた侵入する栄養芽層より分泌される細胞外基質分解酵素により媒介される。発生５日目には胚盤胞由来のウロキナーゼ型プラスミノゲン活性化因子(uPA)が栄養芽層細胞表面の受容体を占拠し、そこにおいて遍在するプラスミノゲンを活性化し、脱落膜の細胞外基質(ECM)分解を開始すると考えられる(Teesaluら,1996年)。プラスミンはまた栄養芽層のMMP９を活性化すると考えられる。MMP9は胚にその侵入的特性を与えると示唆されるところの、ECM構成成分をいくつか分解するマトリックスメタロプロテアーゼである(Harveyら,1995年;Alexanderら,1996年)。
【０００８】
阻害剤を使った研究はuPAとMMP9の双方ともが着床時の胚盤胞アウトグロウス（outgrowth)に重要であると示唆するが(Behrendtsenら,1992年;Werbら,1992年)、標的化変異生成実験はどちらの蛋白質分解酵素も必ずしも必要でないと示唆する(Carmelietら,1994年;Vuら,1998年)。後者の観察は他の蛋白質分解酵素が着床に関わっておりuPAとMMP9の不在を何らかの方法で補っている可能性を示す。これらの追加的蛋白質分解酵素のいくつかが最近同定されたが(Lefebvreら,1995年;Afonsoら,1997年;Vuら,1997年)、それらが着床においてどのような役割を持つかは未だ確認されていない。着床過程に役割をもつ蛋白質分解酵素およびそれらの医療における用途は未だ判明でない。
【０００９】
参照
【特許文献１】
U.S. Patent No. 5,023,252.
【非特許文献１】
Afonso, S. et al. (1997). The expression and function of cystatin C and cathepsin B and cathepsin L during mouse embryo implantation and placentation. Development 124: 3415-3425.
【非特許文献２】
Alexander, C.M. et al. (1996). Expression and function of matrix metalloproteinases and their inhibitors at the maternal-embryonic boundary during mouse embryo implantation. Development 122: 1723-1736.
【非特許文献３】
Altschul, S.F. et al., (1997). Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs. Nucleic Acids Research 25: 3389-3402.
【非特許文献４】
Arcellana-Panlilio, M.Y. and G.A. Schultz (1993). Analysis of messenger RNA Methods in Enzymology. 225: 303-328.
【非特許文献５】
Baker, J. et al. (1993). Role of insulin-like growth factors in embryonic and postnatal growth. Cell 75: 73-82.
【非特許文献６】
Behrendtsen, O. et al. (1992). Metalloproteinases mediate extracellular matrix degradation by cells from mouse blastocyst アウトグロウス（outgrowth)s. Development 114: 447-456.
【非特許文献７】
Behrendtsen, O. et al. (1995). Cooperative interactions between extracellular matrix, integrins and parathyroid hormone-related peptide regulate parietal endoderm differentiation in mouse embryos. Development 121: 4137-4148.
【非特許文献８】
Bider, D. et al. (1997). Assisted hatching by zona drilling of human embryos in women of advanced age. Human Reproduction 12: 317-20.
【非特許文献９】
Burge, C and Karlin, S. (1997). Prediction of complete gene structures in human genomic DNA. J. Mol. Biol. 268: 78-94.
【非特許文献１０】
Carmeliet, P. et al. (1994). Physiological consequences of loss of plasminogen activator gene function in mice. Nature 368: 419-424.
【非特許文献１１】
Carson, D.D. et al. (1993). Heparin sulfate proteoglycan (perlecan) expression by mouse embryos during acquisition of attachment competence. Developmental Biology 155: 97-106.
【非特許文献１２】
Carson, D.D. et al. (2000). Embryo implantation. Developmental Biology 223: 217-37.
【非特許文献１３】
Compton, S.J. et al. (1998). The role of mast cell tryptase in regulating endothelial cell proliferation, cytokine release, and adhesion molecule expression: tryptase induces expression of mRNA for IL-1 beta and IL-8 and stimulates the selective release of IL-8 from human umbilical vein endothelial cells. Journal of Immunology 161: 1939-1946.
【非特許文献１４】
Daniels, RJ, Peden, JF, Lloyd, C, Horsley, SW, Clark, K, Tufarelli, C, Kearney L, Buckle,VJ, Doggett, NA, Flint, J and Higgs DR. (2001). Sequence, structure and pathology of the fully annotated terminal 2 Mb of the short arm of human chromosome 16. Hum. Mol. Genet. 10: 339-352.
【非特許文献１５】
Danielsson, K.G. et al. (1997). The effect of various doses of mifepristone on endometrial leukaemia inhibitory factor expression in the midluteal phase--an immunohistochemical study. Human Reproduction 12: 1293-1297.
【非特許文献１６】
Das, S.K. et al. (1994). Heparin-binding EGF-like growth factor gene is induced in the mouse uterus temporally by the blastocyst solely at the site of its apposition: a possible ligand for interaction of blastocyst EGF receptor in implantation. Development 120: 1071-1083.
【非特許文献１７】
De Vos, A. and A. Van Steirteghem (2000). Zona hardening, zona drilling and assisted hatching: new achievements in assisted reproduction. Cells Tissues and Organs 166: 220-227.
【非特許文献１８】
Denker ,H.W. (1977). Implantation: the role of proteinases and blockage of implantation by proteinase inhibitors. Advances in Anatomy, Embryology and Cell Biology 53: 3-123.
【非特許文献１９】
Duc-Goiran, P. et al. (1999). Embryo-maternal interactions at the implantation site: a delicate equilibrium. European Journal of Obstetrics, Gynecological and Reproductive Biology 83: 85-100.
【非特許文献２０】
Erbach, G.T. et al. (1994). Differential growth of the mouse preimplantation embryo in chemically defined media. Biology of Reproduction 50: 1027-33.
【非特許文献２１】
Farach, M.C. et al. (1987). Heparin/heparan sulfate is involved in attachment and spreading of mouse embryos in vitro. Developmental Biology 123: 407-410.
【非特許文献２２】
Finn, C.A. (1966). Endocrine control of endometrial sensitivity during the induction of the decidual cell reaction in the mouse. Journal of Endocrinology 36: 239-248.
【非特許文献２３】
Fong, C.-Y. et al. (1998). Blastocyst transfer after enzymatic treatment of the zona pellucida: improving in-vitro fertilization and understanding implantation. Human Reproduction 13 2926-2932.
【非特許文献２４】
Ghosh, D. et al. (1998). Effect of early luteal phase administration of mifepristone (RU486) on leukaemia inhibitory factor, transforming growth factor beta and vascular endothelial growth factor in the implantation stage endometrium of the rhesus monkey. Journal of Endocrinology 157: 115-25.
【非特許文献２５】
Gonzales, D.S. and B.D. Bavinster (1995). Zona pellucida escape by hampster blastocysts in vitro is delayed and morphologically different compared to zona escape in vivo. Biology of Reproduction 52: 470-480.
【非特許文献２６】
Gray, A. et al. (2000). Ovine uterine gland knock-out model: effects of gland ablation on the estrous cycle. Biology of Reproduction 62: 448-456.
【非特許文献２７】
Greb, R.R. et al. (1999). Disparate actions of mifepristone (RU486) on glands and stroma in the primate endometrium. Human Reproduction 14: 198-206.
【非特許文献２８】
Harlow, E. et al. (1988). "Antibodies, A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, NY.
【非特許文献２９】
Harvey, M.B. et al. (1995). Proteinase expression in early mouse embryos is regulated by leukaemia inhibitory factor and epidermal growth factor. Development 121: 1005-1014.
【非特許文献３０】
Higgins, D.G. (1994). CLUSTAL V: multiple alignment of DNA and protein sequences. Methods in Molecular Biology 25: 307-318.
【非特許文献３１】
Hogan, B. et al., (1994). " Manipulating the Mouse Embryo", A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York.
【非特許文献３２】
Huang, C. et al. (2000). Formation of enzymatically active, homotypic, and heterotypic tetramers of mouse mast cell tryptases. Dependence on a conserved Trp-rich domain on the surface. Journal of Biological Chemistry 275: 351-358.
【非特許文献３３】
Huet-Hudson, Y.M. et al. (1989). Cell type-specific localization of c-Myc protein in the mouse uterus: modulation by steroid hormones and analysis of the peri-implantation period. Endocrinology 125: 1683-90.
【非特許文献３４】
Hwang, S. et al. (2000). Intactness of zona pellucida does not affect the secretion of a trypsin-like protease from mouse blastocyst. Journal of Korean Medical Science 15: 529-532.
【非特許文献３５】
Jeziorska, M. et al. (1996). Immunolocalization of the matrix metalloproteases gelatinase B and stromelysin 1 in human endometrium throughout the menstrual cycle. Journal of Reproduction and Fertility 107: 43-51.
【非特許文献３６】
Jones, D.H. et al. (1997). Embryonic expression of the putative gamma subunit of the sodium pump is required for acquisition of fluid transport capacity during mouse blastocyst development. Journal of Cell Biology 139: 1545-1552.
【非特許文献３７】
Joshi, M.S. and I.M. Murray (1974). Immunological studies of the rat uterine fluid peptidase. Journal of Reproduction and Fertility 37: 361-365.
【非特許文献３８】
Keski-Oja, J. et al. (1992). Proteolytic processing of the 72,000-Da type IV collagenase by urokinase plasminogen activator. Experimental Cell Research 202: 471-476.
【非特許文献３９】
Kirby, D.R. et al. (1967). On the orientation of the implanting blastocyst. Journal of Embryology and Experimental Morphology 17: 527-532.
【非特許文献４０】
Kubo, H. et al. (1981). Inhibition of mouse blastocyst attachment and アウトグロウス（outgrowth) by protease inhibitors. Journal of Experimental Zoology 216: 445-451.
【非特許文献４１】
Lefebvre, O. et al. (1995). Developmental expression of mouse stromelysin 3 mRNA. Development 121: 947-955.
【非特許文献４２】
Lindstedt, K.A. et al. (1998). Regulation of the activity of secreted human lung mast cell tryptase by mast cell proteoglycans. Biochemica et Biophysica Acta 1425: 617-627.
【非特許文献４３】
Liu, C.Q. et al. (1999). Mifepristone regulation of leukemia inhibitory factor and uterine receptivity in rabbits. Contraception 60: 309-31.
【非特許文献４４】
Lohi, J. et al. (1992). Pericellular substrates of human mast cell tryptase: 72,000 dalton gelatinase and fibronectin. Journal of Cell Biology 50: 337-349.
【非特許文献４５】
Lutzelschwab, C. et al. (1997). Secretory granule proteases in rat mast cells. Cloning of 10 different serine proteases and carboxypeptidase A from various rat mast cell populations. Journal of Experimental Medicine 185: 13-29.
【非特許文献４６】
Martin, L. et al. (1973). The inhibition of progesterone of uterine epithelial proliferation in the mouse. Journal of Endocrinology 57: 549-554.
【非特許文献４７】
Milligan, S.R. et al. (1995). The minimum requirements for oestradiol to induce uterine sensitivity for implantation and decidualization in mice. Human Reproduction 10: 1502-1506.
【非特許文献４８】
Mintz, B. (1972). Implantation initiating factor from mouse uterus. In Biology of Mammalian Fertilization and Implantation. pp. 343-356 Eds. K.S. Moghissi and E.S. Hafz. Thomas Springfield, IL.
【非特許文献４９】
Mirza, H. et al. (2000). Mitogenic responses through the proteinase activated receptor-2 are induced by expressed forms of mast cell alpha- or beta-tryptases. Blood 90: 3914-22.
【非特許文献５０】
Montag, M. et al. (2000). Significance of the number of embryonic cells and the state of the zona pellucida for hatching in mouse blastocysts in vitro versus in vivo. Biology of Reproduction 62: 1738-1744.
【非特許文献５１】
Muller-Newen, G. et al. (1996). Soluble receptors for cytokines and growth factors. International Archives of Allergy and Immunology 111: 99-106.
【非特許文献５２】
Orsini, M.W. and A. McLaren (1967). Loss of the zona pellucida in mice, and the effect of tubal ligation and ovariectomy. Journal of Reproduction and Fertility 13: 485-499.
【非特許文献５３】
Pampfer, S. et al. (1991). Expression of colony stimulating factor 1 (CSF-1) messenger RNA in human endometrial glands during the menstrual cycle: molecular cloning of a novel transcript that predicts a cell surface form of CSF-1. Molecular Endocrinology 5: 1931-1938.
【非特許文献５４】
Paria, B.C. et al. (1993). Blastocyst's state of activity determines the "window" of implantation in the receptive mouse uterus. Proceeding of the National Academy of Science USA 90: 10159-10162.
【非特許文献５５】
Paria, B.C. et al. (1999). Heparin-binding EGF-like growth factor interacts with mouse blastocysts independently of ErbB1: a possible role for heparan sulfate proteoglycans and ErbB4 in blastocyst implantation. Development 126: 1997-2005.
【非特許文献５６】
Peitsch, M.C., Schwede, T. and Guex, N. (2000). Automated protein modelling - the proteome in 3D. Pharmacogenomics 1: 257-266.
【非特許文献５７】
Perona, R.M. and P.M. Wassarman (1986). Mouse blastocysts hatch in vitro by using a trypsin-like proteinase associated with cells of mural trophoectoderm. Developmental Biology 114: 42-52.
【非特許文献５８】
Pinsker, M.C. et al. (1974). Implantation associated proteinase in mouse uterine fluid. Developmental Biology 38: 285-290.
【非特許文献５９】
Pollard, J.W. et al. (1991). A pregnancy defect in the osterpetrotic (op/op) mouse demonstrates the requirements for CSF-1 in female fertility. Developmental Biology 148: 273-83.
【非特許文献６０】
Prendergast, J.A. et al. (1991). Structure and evolution of the cytotoxic cell proteinase genes CCP3, CCP4 and CCP5. Journal of Molecular Biology 220: 867-875.
【非特許文献６１】
Psychoyos, A. (1973). Endocrine control of egg implantation. In Handbook of Physiology pp. 187-215 Eds. R.O. Greep, E.G. Astwood, S.R. Geiger, American Physiological Society, Washington, DC.
【非特許文献６２】
Raab, G. et al. (1996). Mouse preimplantation blastocysts adhere to cells expressing the transmembrane form of heparin-binding EGF-like growth factor. Development 122: 637-645.
【非特許文献６３】
Rancourt, S.L. and D.E. Rancourt (1997). Murine subtilisin-like proteinase SPC6 is expressed during embryonic implantation, somitogenesis and skeletal formation. Developmental Genetics 21: 75-81.
【非特許文献６４】
Rathjen, P.D. et al. (1990). Developmentally programmed induction of differentiation inhibiting activity and the control of stem cell populations. Genes and Development 4: 2308-2318.
【非特許文献６５】
Regenstreif, L.J. and J. Rossant (1989). Expression of the c-fms proto-oncogene and of the cytokine, CSF-1, during mouse embryogenesis. Developmental Biology 133: 284-294.
【非特許文献６６】
Remington's Pharmaceutical Sciences (19th Ed., 1995), Mack Publishing Company, Philadelphia PA.
【非特許文献６７】
Rinkenberger, J.L. et al. (1997). Molecular genetics of implantation in the mouse. Developmental Genetics 21: 6-20.
【非特許文献６８】
Rosenfeld, M.G. and M.S. Joshi (1981). Effect of a rat uterine fluid endopeptidase on lysis of the zona pellucida. Journal of Reproduction and Fertility 62: 199-203.
【非特許文献６９】
Rutanen, E.M. (2000). Insulin-like growth factors in obstetrics. Current Opinion in Obstetrics and Gynecology 12: 163-168.
【非特許文献７０】
Sambrook, J. et al. (1989). Molecular Cloning: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York.
【非特許文献７１】
Sanderson, P.E. (1999). Small, noncovalent serine protease inhibitors. Medical Research Reviews 19: 179-197.
【非特許文献７２】
Sawada, H. et al. (1990). Trypsin-like hatching protease from mouse embryos: evidence for the presence in culture media and it enzymatic properties. Journal of Experimental Zoology 254: 83-87.
【非特許文献７３】
Schlingensiepen, K.H. and W. Brysch (1992). Phosphorothioate oligomers: Inhibitors of oncogene expression in tumor cells as a tool for gene function analysis. In Gene Regulation: Biology of Antisense RNA and DNA pp. 317-328 Eds. R. Erickson and J. Izant. Raven Press, New York.
【非特許文献７４】
Singh et al. (1999). Advances in vaccine adjuvants. Nat. Biotechnol. 17(11):1075-81.
【非特許文献７５】
Smyth, M.J. et al. (1996). Granzymes: a variety of serine protease specificities encoded by genetically distinct subfamilies. Journal of Leukocyte Biology 60: 555-562.
【非特許文献７６】
Song, H. et al. (2000). Dysregulation of EGF family of growth factors and COX-2 in the uterus during the preattachment and attachment reactions of the blastocyst with the luminal epithelium correlates with implantation failure in LIF-deficient mice. Molecular Endocrinology 14: 1147-61.
【非特許文献７７】
Stewart, C.L. et al. (1992). Blastocyst implantation depends on maternal expression of leukemia inhibitory factor. Nature 359: 76-79.
【非特許文献７８】
Taipale, J. and J. Keski-Oja (1997). Growth factors in the extracellular matrix. FASEB Journal 11: 51-59.
【非特許文献７９】
Teesalu, T. et al. (1996). Embryo implantation in mouse: fetomaternal coordination in the pattern of expression of uPA, uPAR, PAI-1 and alpha 2MR/LRP genes. Mechanisms of Development 56: 103-116.
【非特許文献８０】
Vu, T.H. et al. (1997). Identification and cloning of the membrane-associated serine proteinase, hepsin, from mouse preimplantation embryos. Journal of Biological Chemistry 272: 31315-31320.
【非特許文献８１】
Vu, T.H. et al. (1998). MMP-9/gelatinase B is a key regulator of growth plate, angiogenesis and apoptosis of hypertrophic chondrocytes. Cell 93: 411-422.
【非特許文献８２】
Wang, J. et al. (2000). Acceleration of trophoblast differentiation by heparin-binding EGF-like growth factor is dependent on the stage-specific activation of calcium influx by ErbB receptors in developing mouse blastocysts. Development 127: 33-44.
【非特許文献８３】
Werb, Z. et al. (1992). Expression and function of matrix metalloproteases in development. Matrix s1: 337-343.
【非特許文献８４】
Woltjen, K., Bain, G. and Rancourt, D.E. (2000). Retro-recombination screening of a mouse embryonic stem cell genomic library. Nucl. Acids Res. 28E41:1-7.
【非特許文献８５】
Wu, Q. et al. (1998). Generation and Characterisation of mice deficient in hepsin, a hepatic transmembrane serine protease. Journal of Clinical Investigation 101: 321-326.
【非特許文献８６】
Yoshinaga, K. and C.E. Adams (1966). Delayed implantation in the spayed, progesterone-treated adult mouse. Journal of Reproduction and Fertility 12: 593-595.
【非特許文献８７】
Zhang, J.G. et al. (1998). Identification and characterization of two distinct forms of gp130 and a soluble form of leukemia inhibitory factor receptor a-chain in normal human urine and plasma. Journal of Biological Chemistry 273: 10798-10805.
【００１０】
上記出版物、特許、ならびに特許出願のすべてはその全体が参照によってここに包含される。これは、各個の出版物、特許出願、あるいは特許の開示がその全体を参照によって包含されると特に個別に示されるに同等なものである。
【発明の開示】
【００１１】
発明の要約
我々は胚の着床部位において発現される二つの新規なセリンプロテアーゼ、着床セリンプロテアーゼ１(ISP1)および着床セリンプロテアーゼ２(ISP２)、を同定した。発現パターンおよび(または)アンチセンスヌクレオチドによる分析結果は、ISP1とISP2が胚の孵化および(または)着床にとって重要であると示唆する。さらに雌マウスのISP1とISP2による免疫化は着床に成功する胚の数の著しい減少に帰着した。
【００１２】
従って、本発明はその一面として、ISP1あるいはISP2をコードするcDNA配列(配列ID番号:1あるいは2)と実質的な配列同一性を有し、かつISP1あるいはISP2の生物学的活性を有する着床セリンプロテアーゼ(ISP)蛋白質をコードする単離された核酸を提供する。配列ID番号:1あるいは配列ID番号:2の配列との同一性は少なくともおよそ60％である事が望ましいが、少なくともおよそ70％であればより望ましく、少なくともおよそ80％であればよりさらに望ましく、少なくともおよそ90％であれば最も望ましい。特例として、単離されたDNAは配列ID番号:1あるいは配列ID番号:2の配列より成る。
【００１３】
本発明はまた、0.5xSSCおよび50oCと等価なストリンジェンシィの下、配列ID番号:1あるいは配列ID番号:2の配列と、もしくはそれらの相補的配列と、ハイブリダイズ可能な単離された核酸も提供する。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシィは0.5xSSCおよび55oCのストリンジェンシィと等価である事が望ましいが、0.1xSSCおよび55oCのストリンジェンシィに等価であればさらに望ましく、0.1xSSCおよび60oCのストリンジェンシィに等価であれば最も望ましい。
【００１４】
本発明の他の特徴として、上記核酸より成るベクター,望ましくは発現ベクター、を提供する。このようなベクターを有する細胞も本発明は提供する。これらの細胞は原核細胞でもよいし、真核細胞でもよい。宿主細胞の例としてはバクテリア細胞、酵母細胞、昆虫細胞、哺乳動物細胞があげられる。
【００１５】
本発明の他の特徴として、ISP1あるいはISP2の生物学的活性を有し、かつISP1(配列ID番号:3)あるいはISP2(配列ID番号:4)と実質的な配列同一性を有するところの精製されたISP蛋白質も提供する。特例として、この蛋白質は組み換え蛋白質である。配列ID番号:3あるいは配列ID番号:4の配列との同一性は少なくともおよそ60％である事が望ましいが、少なくともおよそ70％であればより望ましく、少なくともおよそ80％であればよりさらに望ましく、少なくともおよそ90％であれば最も望ましい。特例として、この蛋白質は配列ID番号:3あるいは配列ID番号:4の配列より成る。
【００１６】
本発明の他の特徴として、組み換えISP蛋白質を生産する方法も提供する。この方法は、ISP蛋白質をコードするDNAの入った発現ベクターの構築、その発現ベクターの適切な細胞への導入ならびに形質転換体の選択、ISP蛋白質産生に至る条件下でのその形質転換体の培養、そしてISP蛋白質の回収、から成る。そのDNA配列は配列ID番号:1あるいは配列ID番号:2の配列と少なくともおよそ60％の同一性を有する事が望ましいが、少なくともおよそ70％であればより望ましく、少なくともおよそ80％であればよりさらに望ましく、少なくともおよそ90％であれば最も望ましい。特例として、そのDNAは配列ID番号:1あるいは配列ID番号:2の配列より成る。代わりに、そのDNA配列は0.5xSSCおよび50oCと等価なストリンジェンシィの下で配列ID番号:1あるいは配列ID番号:2の配列とハイブリダイズ可能なものとする事もできる。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシィは0.5xSSCおよび55oCのストリンジェンシィに等価である事が望ましいが、0.1xSSCおよび55oCのストリンジェンシィに等価であればさらに望ましく、0.1xSSCおよび60oCのストリンジェンシィに等価であれば最も望ましい。
【００１７】
本発明の他の特徴として、ISP蛋白質あるいはISP蛋白質遺伝子をコードする核酸を用いて哺乳動物を免疫化することによる避妊の方法も提供する。この動物は哺乳動物である事が望ましく、ヒトである事が最も望ましい。そのISP蛋白質は配列ID番号:3あるいは配列ID番号:4の配列と少なくともおよそ50%の同一性を有する事が望ましいが、少なくともおよそ60％であればより望ましく、少なくともおよそ70％であればよりさらに望ましく、少なくともおよそ80％であればその上に望ましく、少なくともおよそ90％であれば最も望ましい。特例として、この蛋白質は配列ID番号:3あるいは配列ID番号:4の配列より成る。そのISP蛋白質は融合蛋白質であってもよい。免疫化にはISP蛋白質の断片が使用されることが望ましい。この断片の長さは少なくともおよそ１０アミノ酸であるが、少なくともおよそ20アミノ酸であることが望ましく、少なくともおよそ30アミノ酸であればより望ましく、少なくともおよそ50アミノ酸であればよりさらに望ましく、少なくともおよそ75アミノ酸であればそれ以上に望ましく、少なくともおよそ100アミノ酸であれば最も望ましい。この断片は融合蛋白質の一部であってもよく、あるいは免疫反応を引き起こすためにキャリアと共に投与されるものであってもよい。必要に応じて免疫反応の効率をあげるためにアジュバントも投与される。
【００１８】
本発明の他の特徴として、ISP１あるいはISP２の少なくとも一つの抗原決定基を認識する抗体も提供する。この抗体はモノクローナルであってもよいし、ポリクローナルであってもよい。この抗体は典型的にはISP蛋白質に高い親和性を有し、そのKdはおよそ100nM以下である事が望ましいが、およそ30nM以下であればさらに望ましく、およそ10nM以下ならばなおさらに望ましく、そしておよそ3nM以下ならば最も望ましい。
【００１９】
本発明はさらに、ISP蛋白質、ISP蛋白質をコードする核酸、あるいはISP蛋白質または核酸の断片より成る医薬品も提供する。この医薬品にはさらにアジュバント、製薬学的に容認される賦形剤、そして(あるいは)製薬学的に容認されるキャリアーを含んでいてもよい。そのISP蛋白質は配列ID番号:3あるいは配列ID番号:4の配列と少なくともおよそ50%の同一性を有する事が望ましく、少なくともおよそ60％であればより望ましく、少なくともおよそ70％であればよりさらに望ましく、少なくともおよそ80％であればその上に望ましく、少なくともおよそ90％であれば最も望ましい。特に、その蛋白質は配列ID番号:3あるいは配列ID番号:4の配列を有する。
【００２０】
本発明の他の特徴として、有効量のISP1あるいはISP２の阻害剤を避妊に帰着するような条件下で哺乳動物に投与する避妊方法も提供する。この動物は哺乳動物である事が望ましく、それがヒトであれば最も望ましい。この阻害剤は、例えば、抗体あるいはアンチセンス。オリゴヌクレオチドであってもよい。従って、ISP１あるいはISP２の阻害剤から成る医薬品も本発明によって提供される。
【００２１】
本発明の更なる特徴として、ISP1あるいはISP2の阻害剤をスクリーニングする方法を提供する。この方法はISP1あるいはISP2の活性測定法を提供し、この測定法によりISP1あるいはISP2の活性に対する候補化合物の影響を決定し、ISP1あるいはISP2の活性を阻害しうる候補化合物として阻害剤を同定する。こうして同定された阻害剤は避妊に対しても有用なものであることが望ましい。
【００２２】
本発明の他の特徴として、動物の不妊診断の方法も提供する。この方法はISP１あるいはISP２の活性／レベル測定法を提供し、この測定法により動物からの生体試料を検査して、仮にISP1あるいはISP２の活性／レベルが低く検出されるならばその動物が不妊であるとの診断をする。この動物は哺乳動物であることが望ましく、それがヒトである事が最も望ましい。
【００２３】
本発明の他の特徴として、有効量のISP蛋白質あるいはISP蛋白質をコードする核酸を動物に与える事による不妊の治療あるいは改善の方法を提供する。この動物は哺乳動物であることが望ましく、それがヒトである事が最も望ましい。そのISP蛋白質は配列ID番号:3あるいは配列ID番号:4の配列と少なくともおよそ50%の同一性を有する事が望ましく、少なくともおよそ60％であればより望ましく、少なくともおよそ70％であればよりさらに望ましく、少なくともおよそ80％であればその上に望ましく、少なくともおよそ90％であれば最も望ましい。
【００２４】
本発明の他の特徴として、培養胚を雌動物の子宮に移すに先だちその培養胚をISP蛋白質に接することで着床効率を改良する方法も提供する。この動物は哺乳動物であることが望ましく、それがヒトである事が最も望ましい。そのISP蛋白質は配列ID番号:3あるいは配列ID番号:4の配列と少なくともおよそ50%の同一性を有する事が望ましく、少なくともおよそ60％であればより望ましく、少なくともおよそ70％であればよりさらに望ましく、少なくともおよそ80％であればその上に望ましく、少なくともおよそ90％であれば最も望ましい。
【００２５】
同様に、本発明はISP蛋白質あるいは核酸によって処理された胚を提供する。このように処理された胚は、例えば、不妊の治療においてその治療の成功率を改善するために用いる事が出来る。
【００２６】
発明の詳細な説明
本発明は雌動物の受胎能力にとって、特に孵化ならびに着床の過程で、重要な二つの新規なセリンプロテアーゼを提供する。これらのプロテアーゼ、ならびに関連する核酸、断片、類似物および阻害剤は、孵化、着床そして雌動物の受胎能力一般を調節するのに使用することができる。
【００２７】
本発明についてのさらに詳細な記述をするに先だって、この出願の中で使用される用語は以下のように定義される。
【００２８】
定義
「ISP1」は配列ID番号:3の配列を有する蛋白質である。
【００２９】
「ISP２」は配列ID番号:4の配列を有する蛋白質である。
【００３０】
「着床セリンプロテアーゼ蛋白質」、あるいは「ISP蛋白質」,  とはISP1あるいはISP2の少なくともどちらかの生物学的活性を有する蛋白質であると共にマウスISP1(配列ID番号:3)あるいはマウスISP2(配列ID番号:4)と実質的な配列同一性を有する蛋白質である。ISP蛋白質には、例えば、ISP1あるいはISP2の突然変異体、変種、そして誘導体も含まれる。ISP蛋白質は配列ID番号:3あるいは４の配列において他のプロテアーゼとは類似性の低い領域と実質的な同一性を有する事がさらに望ましい。これらの領域とはIVGG,ヒスチヂン活性サイト、あるいはセリン活性サイトを含まぬ領域であり、特に挙げるならば配列ID番号:3あるいは配列ID番号:４の配列において８０番目のアミノ酸からC−末端までの領域である。
【００３１】
ISP1およびISP2の生物学的活性にはここに発表されるようなプロテアーゼ活性、孵化活性、受胎促進活性といった生物学的活性、ならびに抗ISP1抗体あるいは抗ISP2抗体によって認識される能力が含まれる。プロテアーゼ活性とは蛋白質を少なくとも二つのそれぞれに最低一つのアミノ酸から成る断片に切断する活性を意味する。孵化活性とは孵化過程へのその蛋白質の参加を意味し、それはここに発表されるような方法、あるいはその分野の他の確立された方法、により決定されうる。例として挙げるならば、strypsinの孵化活性はPeronaとWassarman(1986)によって発表された方法によりアッセイされた。仮にある蛋白質が妊娠の機会を増加させるとしたら、あるいはある蛋白質に対する阻害剤が妊娠の機会を減少させるか全く消滅させるとしたら、その蛋白質には 受胎促進活性があることになる。
【００３２】
「実質的な配列同一性」とは核酸あるいはアミノ酸のいずれかのレベルにおいて少なくともおよそ40％の配列同一性を有することである。典型的には、配列同一性のパーセンテージは45,50,55,60,65,70,75,80,85,90,そして95のうちの少なくともひとつに近似する。配列同一性は少なくともおよそ50％である事が望ましいが、少なくともおよそ65％であればより望ましく、少なくともおよそ75％であればよりさらに望ましく、少なくともおよそ85％であればその上に望ましく、少なくともおよそ90％であればまたそれ以上に望ましく、少なくともおよそ95％であれば最も望ましい。代わりに、仮に２種の核酸が0.5xSSCおよび50oCに等価なストリンジェンシィの条件下でハイブリダイズしたとするなら、その核酸は互いに実質的な配列同一性を有するとされる。配列同一性は0.5xSSCおよび55oCのストリンジェンシィに等価である事が望ましいが、0.1xSSCおよび55oCのストリンジェンシィに等価である事がさらに望ましく、0.1xSSCおよび60oCのストリンジェンシィに等価である事が最も望ましい。仮にある蛋白質が一つ以上のサブユニットより成るとして、そのサブユニットのひとつが実質的な配列同一性をISP1あるいはISP2と共有するならばその蛋白質がISP1あるいはISP2と実質的な配列同一性を有すると認めるのに十分である。アミノ酸あるいは核酸のレベルにおける配列同一性の度合いはどのようなアルゴリズムを使用しても決定できるがBLASTを使用する事が望ましい。更に、そのISP蛋白質はヒスチヂンあるいはセリンプロテアーゼ活性サイトとなるようなアミノ酸配列、例えばLTAAHC(配列ID番号:5)そして／あるいはGDSGGPL(配列ID番号:6)を有する事が望ましい。
【００３３】
ISP1またはISP2の「変種」とは自然に生ずるISP蛋白質であり、それには例えばISP1またはISP2の対立形質の変種、マウス以外の種から単離された自然に生ずるISP蛋白質、あるいは他のISP1あるいはISP2ではない自然に生ずるマウスISP蛋白質が含まれる。
【００３４】
ISP蛋白質の「突然変異体」とは組み換えDNA技術によって原型のISP蛋白質のアミノ酸配列を変更することにより創り出されるISP蛋白質である。
【００３５】
ISP蛋白質の「誘導体」とはISP蛋白質のアミノ酸の少なくとも一つの側鎖を化学的に修飾することによって創り出される化学的に修飾されたISP蛋白質である。
【００３６】
「組換え蛋白質」とは外生的に導入された核酸から発現された蛋白質である。
【００３７】
ある核酸がある蛋白質を「コードする」というのは、その核酸塩基配列を翻訳することによりその蛋白質のアミノ酸配列が得られると言う事である。その核酸は、しかしながら、実際の翻訳開始コドンあるいは停止コドンを含む必要がない。
【００３８】
用語「避妊」は妊娠の機会の縮小あるいは除去を意味する。
【００３９】
用語「免疫化」は哺乳動物にそれに対する免疫反応が誘発される条件下で抗原を導入する事を意味する。免疫反応には抗体産生並びに細胞免疫が含まれるがそれらのみに限られるわけではない。免疫化の過程において蛋白質抗原は蛋白質としてもあるいはその蛋白質をコードする核酸としても導入できる。
【００４０】
「融合蛋白質」とは少なくとも二つの異なった蛋白質に由来する領域より成る組換え蛋白質である。
【００４１】
「抗体」とは特定の抗原に特異的に反応する蛋白質分子であり、構造的に異なった五つのクラス(免疫グロブリンA,  免疫グロブリンD,  免疫グロブリンE,  免疫グロブリンG、そして免疫グロブリンM)のうちの一つに属する。
【００４２】
用語「不妊」は動物が妊娠できない、あるいは妊娠できにくい、ことを意味する。
【００４３】
仮にある動物の子宮内に胚が着床されたならその動物は「妊娠している」という。
【００４４】
用語「生物学的試料」とは動物、植物、あるいは微生物のような生物学的対象から収集された試料を意味する。
【００４５】
用語「哺乳動物」は任意の哺乳類の動物を意味する。その哺乳動物としては霊長類動物、げっ歯類動物、犬科動物、猫科動物、家畜である事が望ましい。特にヒト、イヌ、ネコ、ウシ，ヒツジ、ヤギ、マウス、ネズミ、あるいはウサギといった哺乳動物をあげることができる。
【００４６】
「効果的な量」というのは意図する目的を達成するために十分な量を意味する。例えば、避妊を達成するのに効果的なISP蛋白質の量とはそのISP蛋白質を受け取る動物の妊娠の機会を減少あるいは除去するのに十分な量を意味する。ある治療薬の効果的な量は、その治療薬の性質、投与のルート、その治療薬を受け取る動物の種とサイズ，そして投与の目的といった種々の因子により変動する。個別のケースにおける効果的な量は熟練した技師によりその分野において確立された方法に従って経験的に決定されうる。
【００４７】
「治療あるいは改善」とは疾病あるいは病状の徴候の縮小か完全な削除を意味する。
【００４８】
ISP1とISP2のクローニング
着床にとって重要な新規のセリンプロテアーゼを同定するために既知のセリンプロテアーゼで保存されるヒスチヂンならびにセリン活性サイトに対する変性（degenerate）プライマーが設計された。これらのプライマーにはプラスミドベクターへの方向性クローニングのための制限酵素認識配列も含まれた。mRNAは胚ならびに着床部位から単離され、RT−PCRはセリンプロテアーゼから期待される長さ(約５００bp)の産物生成に最適でかつバックグラウンドを最小に抑えるような条件下において行われた。適切な長さのPCR産物がゲルより抽出され、pBluescript（TM）といったプラスミドベクターにクローニングされ、サイクル。シークエンシングといった方法により配列決定された。
【００４９】
BLAST（ＴＭ）といったコンピューター分析を使用して単離された塩基配列が新規なものであるか識別された。新規のプロテアーゼが孵化，着床、あるいはマウス初期発生に関わっているか調べるためmRNAの発現パターンが検討された。これら新規遺伝子の完全長cDNAクローンはcDNAライブラリーのスクリーニングにより得られ，配列決定がされ、それらが完全長cDNAであることが確認された。完全長cDNAは翻訳開始のための認識配列、開始メチオニン。コドン,そして推定蛋白質コード領域とそれに続くpoly(A)tailを含む。
【００５０】
孵化ならびに着床時に発現される新規のセリンプロテアーゼが二種同定され、着床セリンプロテアーゼ(ISP)１および２と命名された。核酸塩基配列ならびにアミノ酸配列はこれらの蛋白質がトリプターゼと認識するのに必要な配列(すなわち、ヒスチヂン、セリン、およびアスパラギン酸活性サイト領域、N−末端のIVGG配列、それからトリプシンとの類似性)を有することを証明した。しかしながら、最大節約法による分析はこれらの蛋白質が、マスト細胞プロテアーゼならびにエラスターゼ／キモトリプシンの群からほぼ同時に分岐したS1超科の内の新しいグループを代表していることを示した．
【００５１】
以前にVuら(1997)はセリンプロテアーゼ活性サイトRT−PCRを着床前の胚のRNAに使用してヘプシンを同定した。ヘプシンは膜会合セリンプロテアーゼであり腎臓ならびに肝臓でも発現される。遺伝子破壊研究はこのセリンプロテアーゼが哺乳類の孵化酵素ではないことを示した(Wuら、1998年)。ISP1あるいはISP2はVuらによっては同定されなかった。同様に我々の探索はヘプシンを同定しなかった。
【００５２】
ISP1の機能
ISP1特異的なプライマーを使用したPCR分析はISP1mRNAが胚盤胞孵化ならびにアウトグロウス（outgrowth)の際に発現されることを示した。ISP1は胚盤胞と子宮内膜腺の両方において発現される。この子宮におけるISP1発現は妊娠に重要な役割を果たすプロゲステロンによって制御される。
【００５３】
ISP1に対する二つのアンチセンス。オリゴヌクレオチドは生体外における胚盤胞孵化に濃度および時間依存的に干渉した。いくつかの胚盤胞は孵化阻止を免れたがそれはおそらく培養液内におけるオリゴヌクレオチドの退化によるものであろう。オリゴヌクレオチドが新鮮な培養液に投与され続けた場合には、孵化に対する 持続的干渉が観察され，そして胚盤胞アウトグロウス（outgrowth)を五日間に渡って影響するには新鮮なオリゴヌクレオチド培養液が必要であった。さらに、オリゴヌクレオチドが培養液より消失するのをそのままにしておいた場合には胚盤胞はアウトグロウス（outgrowth)阻止を免れることができた。胚盤胞が孵化ならびにアウトグロウス（outgrowth)の阻止を免れることができるということはアンチセンス。オリゴヌクレオチドには毒性が無いことを示唆する。そして我々は胚盤胞がアンチセンス。オリゴヌクレオチド処理の結果として死なないことに注目した。しかしながら、ある期間以上胚盤胞が孵化せずアウトグロウス（outgrowth)しない場合には胚が死んでしまう。
【００５４】
mRNAの開始コドンを標的とするアンチセンス。オリゴヌクレオチドは翻訳を阻止し、その結果として標的RNAは退化する(SchlingensiepenとBrysch,1992年)。事実、ISP1に対するアンチセンス。オリゴヌクレオチドは処理8時間後の胚盤胞内のISP1mRNA蓄積を阻止していた。この阻止は一時的なものであり、処理の２４時間後にはISP1mRNAのレベルはほとんど正常値に回復した。
【００５５】
その発現パターン、アンチセンス。オリゴヌクレオチドが孵化に干渉するという事実、そしてトリプターゼとトリプシンの類似性は、ISP1がstrypsinと命名された胚盤胞孵化に関わるトリプシン様活性(PeronaとWassarman,1986年)と同一のものであることがあることを示唆する。ISP1遺伝子が胚盤胞全域にわたって発現されるのに対してstrypsin活性は胚盤胞の遠位極に局在する。ISP1蛋白質が胚子外の極にリクルートされその活性を示すこと、あるいは栄養芽層の頂点部において優先的に翻訳されるということは十分にあり得る。
【００５６】
ISP1に予測される分子量(約27,000Da)は生の（native）なstrypsinの分子量(74,000Da)と比べ相当に低いが、これはISP1がstrypsinである場合にはそれが多量体化によって活性を得ることを示唆する。これはマウスのマスト細胞プロテアーゼを含むトリプターゼが多量化により活性を得，多量化はヘパリン硫酸プロテオグリカンの補助のもとにおこるという観察(Lindstedtら,1998年;Huangら,2000年)と一致する。事実、胚盤胞の胚子外の極はヘパリン硫酸プロテオグリカンに富んでおり(Farachら,1987)、ヘパリナーゼ消化研究はこのヘパリン硫酸塩が胚盤胞の付着ならびにアウトグロウス（outgrowth)に必要であることを実証した(Farachら,1987)。同様に、母体由来のへパリン硫酸塩結合性EGF(HB−EGF)が胚盤胞の孵化およびアウトグロウス（outgrowth)を刺激する作用はトリプターゼ活性化のpH依存性(Lindstedtら,1998年;Huangら,2000年)ならびにHB−EGFのErbB4受容体への結合により引き起こされるイオン流出の変化(Wangら,2000年)により説明することができる。
【００５７】
ISP1とstrypsinの分子量に基づいて、ISP1は四量体を形成すると予測される。我々はこの可能性をSWISS−MODEL(Peitschら,2000年;  http://www.expasy.org/swissmod/SWISS−MODEL.html)ならびにRasmol(http://www.umass.edu/microbio/rasmol/)といった蛋白質モデル化のアルゴリスムを使用して調査した。ISP1を既に確定されたヒトのベータ。トリプターゼの四量体構造に上乗せしてみたところ、ISP1は 四量体を形成することができるという結果がでた。
【００５８】
我々のアンチセンスRNA実験は孵化のメカニズムを明瞭にするために役立った。これらの実験では透明帯が胚盤胞の成長に従って薄くなることが見られた。胚盤胞が透明帯内で死んだ際には、胚の退化は透明帯の薄化傾向を逆転させた。この観測は透明帯薄化は、少なくとも部分的には、胚盤胞膨張によるという仮説を確認するものである。胚盤胞膨張ならびに透明帯薄化は孵化が適切時に起きることを(多分この蛋白質性の鞘の特異的な蛋白分解サイトを露出することにより)保証する重要な制御的役割を果たしていることがある。
孵化に必要な酵素は同時にまた着床開始因子であるとMintz(Mintz,1972年)ならびにPinskerら(Pinskerら,1974年)が最初に示唆した後、GonzalesおよびBavinster(1995年)は生体外での焦点的孵化に必要な酵素は実は胚盤胞の付着と侵入を促進する酵素であろうと推測した。本発明はISP1のこの着床促進の補足的役割を確認した。
【００５９】
胚盤胞の胚子外の極は生体外における付着と細胞外基質侵入の能力を得るが、この能力は局在するヘパリン硫酸プロテオグリカンの機能とヘパリン結合性EGFの作用としてもたらされる(Farachら,1987年;Dasら,1994年)。いかなる理論にも縛られること無く考えるに、ISP1は胚盤胞孵化から胚子外の極の着床能力の開始と樹立までをつなぐ機能を果たすことがある。歴史的に言って、孵化とアウトグロウス（outgrowth)は無関係の分子現象とみられてきた。セリンプロテアーゼ阻害剤が孵化(PeronaとWassarman,1986年)ならびにアウトグロウス（outgrowth)(Kuboら,1998年;Behrendtsenら,1992年)の双方に影響することは報告されているが、これらは孵化におけるstrypsinの役割ならびにアウトグロウス（outgrowth)におけるuPAの役割に焦点をしぼった研究であった。Bis[5−amido−2−benzimidazole]も含み、実験で使用された阻害剤はすべてではないにしてもその大半は効果的なトリプターゼ阻害剤である(Comptonら,1998年;Sanderson,1999年)。本発明はこれら阻害剤がアウトグロウス（outgrowth)に影響する作用はISP1を標的にしたものかも知れず、細胞外基質を分解する能力と共にISP1が孵化ならびに胚盤胞アウトグロウス（outgrowth)の双方に必須である事を示唆する。
【００６０】
胚盤胞アウトグロウス（outgrowth)における細胞外基質の分解に加えて、ISP1(strypsin)はまた他のプロテアーゼ(例えばMMP9のようにトリプターゼにより生体内で活性化されるもの;Lohiら,1992年;Keski−Ojaraら,1992年)の活性化を介して間接的にECM分解に参加することがある。透明帯の障壁除去は長い間着床にとって決定的な第一段階と見られてきたが、我々の結果は孵化プロテアーゼが着床において受動的というよりむしろ積極的な役割を有することを証明する。その早期発現からして、ISP1(strypsin)は着床時におけるプロテアーゼ活性カスケードの第一キーファクターでありうる。
胚盤胞付着およびアウトグロウス（outgrowth)を促進する孵化プロテアーゼの役割はまた不妊治療病院で遂行される孵化補助処置がなぜヒト胚の着床成功に結びつかないかを説明する(概要:DeVosとVanSteirteghem,2000年)。事実、高年齢女性由来の胚はしばしば生体外での孵化に失敗するがそれは孵化酵素活性不足のためであることがある(Biderら,1997年)。ISP1遺伝子はそれゆえヒトの受胎能力の重要な診断ツールとして使用されうるし、ISP1蛋白質から成る医薬品は生殖援助の改良に使用されうる。
【００６１】
ISP2の機能
懐妊中のISP2遺伝子発現は発育する胎盤でもわずかにみられるが我々は着床時のそれが圧倒的であることを見い出した。ISP1とは異なり,  ISP2遺伝子は着床前の胚では発現されない。代わりに、本来の位置の（in  situ）ハイブリダイゼーション実験はISP2遺伝子が子宮内膜腺上皮で着床時周辺を通して(4.5日目から8.5日目)発現されることを見い出した。ISP2遺伝子の発現は着床の際まず(胚に近い領域も含む)脱落膜全域の腺においておこるが、脱落膜退化と胎盤形成の期間中に腺が縮小して子宮陰窩周辺に移動する時には局在化して見られるようになる。
【００６２】
In  situ  ハイブリダイゼーション実験はISP2遺伝子の発現がプロゲステロンによって調節されることを明らかにした。着床部位間にある腺上皮で見られるISP2mRNAのハイブリダイゼーションはISP2遺伝子の発現が胚の存在に依存しないことがあると示唆する。これはオイル誘発脱落膜腫がホルモン処理された偽妊娠雌動物に樹立される時確認される。ISP2mRNAは脱落膜化されなかったコントロール子宮角の腺に検出される。卵巣切除ならびに遅延着床モデルを用いたさらなる研究はISP2遺伝子発現がプロゲステロン投与のみに依存することを明らかにした。エストロゲンはそれのみでもあるいはプロゲステロンとの組み合わせでも何の効果も示さなかった。プロゲステロンに抗するRU486の存在下ではISP2遺伝子発現は妊娠ならびに偽妊娠の双方で消滅された。従って、腺ISP2遺伝子発現はプロゲステロンによって正の調節を受ける。
【００６３】
着床成功のための最大要点は胚および子宮内膜の発育の時間的同調性にある。この同調性は時を得た準備によって達成されるが、この準備はまずホルモンによって調節され、胚盤胞孵化後は子宮内膜と胚の間のサイトカイン。シグナリングによって調節される。妊娠４日目になりプロゲステロンのレベルが上昇するにつれてようやく腺上皮は分化し分泌可能となる(Duc−Goiranら,1999年；Pariaら,1999年)。我々の本来の位置のハイブリダイゼーション実験はISP2mRNAが子宮内膜腺分泌期以前の段階では検出されないことを実証する。それゆえ,ISP2の腺ならびに子宮内腔への分泌はプロゲステロンにより誘発された上皮分化の結果として起きることがある。
【００６４】
子宮内膜腺は妊娠時に着床を支持するサイトカイン至急便を送り受け取る「指令本部」の役をする。子宮内膜腺を持たない動物は妊娠を支持できない(Grayら,2000年)。例えば、白血病抑制因子(LIF)は子宮内膜腺より子宮内腔へ分泌され、そこで内腔のLIF受容体と相互に作用しあい，その結果胚の位置付けに必要なEGF受容体の出現を起こすと考えられている(Songら,2000年)。ISP2に観測されるように、LIF遺伝子はRU486投与の後は発現されない(Danielssonら,1997年;Ghoshら,1998年；Liuら,1999年)。
【００６５】
RU486は分泌腺皮膜組織分化の防止に深遠な効果があり、それがおそらくLIF発現ならびに着床防止におけるその効果を説明する(Grebら,1999年)。LIF分泌はそれがエストロゲンにも依存する(Songら,2000年)という点でISP2と異なる。エストロゲンは「着床ウィンドー」内でのLIF発現を調整するものとみられるが、形態学的に正常な子宮内膜腺が内腔への分泌には必要である。完全に機能的な子宮内膜腺の生成におけるプロゲステロンの役割を考えるとなぜ遅延着床においてはエストロゲン。パルスに先だってプロゲステロンによる下準備が必要であるか説明がつく。ISP2遺伝子発現はエストロゲン。スパイクには依存せずプロゲステロンによる下準備の間に起きるので、ISP2の最初の蛋白分解酵素としての役割は着床の前にある。
【００６６】
ISP1とISP2は子宮内膜腺で発現される唯二の既知のセリンプロテアーゼである。マトリックスメタロプロテアーゼ。９(MMP9)は腺上皮において着床中に発現され子宮内腔液に検出される(Jeziorskaら,1996年)が、着床時に起こるECM再構築に参加するものと推定される。MMP9はトリプターゼにより生体内で活性化されるので(Lohiら,1992年；Keski−Ojaら,1992年)、ISP2がMMP9を活性化する可能性もある。さらに、細胞間基質改築にISP2が直接的な役割を果たしていることも可能である。
【００６７】
細胞外シグナリングに及ぼすトリプターゼの新たに明らかにされつつある役割(Mirzaら,2000年)をもとに考えるに、ISP１とISP２の胚ならびに子宮における機能は細胞間基質改築に限られたものでは無いことがある。最近、セリンプロテアーゼは細胞外シグナリングに多重の役割を持つことが見いだされた。マスト細胞トリプターゼは特に最近になってパラクリン因子であると示唆され、プロテアーゼにより活性化される新クラスのG蛋白連結受容体上のtetheredリガンドの切断を通して細胞の有糸分裂と分化を媒介すると認識された(Mirzaら,2000年)。同様に，プラスミンやエラスターゼといった関連セリンプロテアーゼはtetheredサイトカインの解放あるいはサイトカイン受容体の剥離によりシグナリングに参加することが見い出された(TaipaleとKeski−Oja,1997年;Muller−Newenら,1996)。ホルモンコントロールのもと重要な着床サイトカイン(すなわちLIF,CSF,IGF)のシグナルを送受するという子宮内膜腺の中心的役割から考えて、ISP2もまた着床の成就にとって重要な細胞外シグナルの調整という役割を担っていることがある。例えば、固定型のLIF、CSF、およびIGFが妊娠時に同定されているし(Rathjenら,1990年;Pampferら,1991年;Rutanen,2000年)、また可溶型のLIF受容体、gp130、およびLIF受容体アルファ鎖も同定されている(Zhangら,1998年)。ISP2の子宮内膜腺内腔への分泌はこれらサイトカインおよび(あるいは)その受容体の剥離に関連しているのことがある。
【００６８】
いかなる理論に縛られる事なく、我々はISP2が着床前の透明体退化に関与する子宮プロテアーゼとして作用し、さらに着床時のサイトカイン信号を媒介する補足的な役割も有すると考える。
【００６９】
子宮の「溶解素(lysins)」は透明体薄化促進に重要であると示唆されてきた(Montagら,2000年)。最近の文献は生体外で起こる「焦点的」孵化は、その薄化後「溶解」するように見える子宮内での孵化とは異なったものであると示唆する(GonzalesとBavister,1995年；Montagら,2000年)。子宮内での孵化は生体外のそれよりもほぼ１日早く起きるゆえ、GonzalesとBavinster(1995年)は生体外孵化を子宮の「溶解素プロテアーゼ」不在のもとに起こる人工的産物と記述した。それによると、別個な「溶解素」蛋白質が着床前の内腔液に生ずることが示唆される。子宮分泌に関与しホルモンにより制御されるプロテアーゼが孵化に寄与すること(OrsiniとMcLaren,1967年;JoshiとMurray,1974年;RosenfeldとJoshi,1981年)、そしてこのプロテアーゼはプロゲステロンによって制御されること(Denker,1977年)、を示唆する証拠がある。しかしながら、そのプロテアーゼは子宮内に胚の存在を必要としない(OrsiniとMcLaren,1967年)。「溶解素」とISP2の発現プロフィールの著しい類似性を考えるに，我々はISP2遺伝子がこの「溶解素プロテアーゼ」をコードすると考える。
【００７０】
上記の蛋白質モデル化アルゴリズムによって分析すると、ISP2はISP1同様、理論上で四量体形成をする能力を有する。さらにISP1とISP2はどちらのホモ四量体より相当に安定なヘテロ四量体を形成できる。我々はさらにISP1が子宮内膜腺において時間的ならびに空間的にISP2と同様なパターンで発現されることを発見した。事実、ウエスタン。ブロット分析はISP1とISP2が子宮内でヘテロ多量体(おそらくをヘテロ四量体)を形成すると示唆する。理論に縛られることなく、我々は子宮内膜腺内で発現されるISP1とISP2は子宮内腔で相互作用し胚の孵化を外側より促進すると考える。加えるに、胚のISP1は孵化した胚盤胞と子宮壁の相互作用の促進も行う。ゆえに本発明はISP1とISP2のホモマーおよびISP1あるいはISP2のヘテロマーを孵化、着床、そして不妊の治療用に提供する。
【００７１】
組成
本発明は新規な着床セリンプロテアーゼ(ISP)蛋白質とそのISP蛋白質をコードする核酸を提供する。これらISP蛋白質はISP1あるいはISP2の少なくともどちらか一つの生物学的活性を有すると共に、ISP1(配列ID番号:3)あるいはISP2(配列ID番号:４)と実質的な配列同位性を有する。ISP1とISP2の生物学的活性はここにおいて記述されるごとく、プロテアーゼ活性、孵化活性、受胎促進活性、そして抗ISP1抗体あるいは抗ISP2抗体により認識される能力を含む。プロテアーゼ活性とは蛋白質を少なくとも二つのそれぞれに最低一つのアミノ酸から成る断片に切断する活性を示す。孵化活性とは、ここに発表されるような方法あるいは他の確立された方法により確認されるところの、孵化過程におけるその蛋白質の参加を示す。孵化活性はアンチセンス核酸、抗体、あるいはISP蛋白質阻害剤を孵化系に添加することにより、もしくはノックアウト実験により決定されることが望ましい。
【００７２】
ISP蛋白質とはISP1またはISP2と実質的な配列同位性を共有するものである。ISP蛋白質は挿入、削除、置換によるISP1およびISP2の変種あるいは突然変異体も包含する。これらの突然変異体は通常ISP1あるいはISP2をコードするDNA塩基の位置特異的変異生成によりその突然変異体をコードするDNAを得た後、そのDNAを組み換え細胞培養で発現することにより準備される。しかしながら、およそ１００から１５０アミノ酸残基より成るISP蛋白質突然変異体断片は生体外反応により便利に準備されうる。
【００７３】
ISP蛋白質突然変異体は典型的には自然におこるISP蛋白質と同質の生物学的活性を示す。しかしながら，nativeなISP蛋白質とは(抗体の交差反応性は例外として)類質の生物学的活性を示す能力の無いISP蛋白質でもISP蛋白質あるいは抗ISP蛋白質抗体の診断アッセイには有用である。さらに、既知の方法によって固相化された場合には、それらは抗血清あるいはハイブリドーマ培養上精よりの抗ISP蛋白質抗体の精製に使用することができる。さらにその上に、それらはISP蛋白質に対する抗体を作成するための免疫原として使用されるするようにしてもよいし、あるいはこれらの類似体に少なくとも一つのISP1かISP2の抗原決定基が残っているならばイムノアッセイキットの構成品としても(標識品をnativeなISP蛋白質に対する争奪試薬として，あるいは非標識品をISP蛋白質アッセイの標準試薬として)使用するようにしてもよい。
【００７４】
加えるに、あるISP蛋白質はISP1かISP2の拮抗剤であってもよい。拮抗剤は例えばISP1かISP2に対する生物学的アッセイでISP1かISP2の活性を阻害できる蛋白質として同定されうる。
【００７５】
アミノ酸変異の位置は予め決めておいてもよいが、変異それ自体を予め決める必要はない。例えば、ある一定位置の変異が成果をもたらすための至適化には目的コドンにおけるランダム突然変異あるいは飽和突然変異(２０全ての可能な残基を挿入)の作成が実行され，発現されるISP蛋白質突然変異体をスクリーニングして希望する活性が最適な組み合わせで得られるようにする。この様なスクリーニングはその分野においては通常の技術である。
【００７６】
アミノ酸挿入には通常一つから十のアミノ酸残基を用い、置換は典型的には単一の残基に行われ、削除はおよそ一つからおよそ３０までの残基をもって行われる。削除あるいは挿入は隣接する対で行われるのが望ましい。すなわち、二残基の削除あるいは二残基の挿入である。置換、削除、挿入あるいはそれらの組み合わせは単一の突然変異体に導入されることがある。
【００７７】
生の（Nativeな）ISP蛋白質の挿入突然変異体とはnativeなISP蛋白質に存在しないひとつかそれ以上のアミノ酸を目的ISP蛋白質の予め決められた位置に導入したものである。通常、挿入突然変異体は異種起源の蛋白質あるいはポリペプチドをISP蛋白質のアミノ末端かカルボキシル末端に融合したものである。このような突然変異体はISP蛋白質と通常その挿入位置に存在しないポリペプチド配列の融合蛋白質とされる。
【００７８】
免疫学的に活性なISP蛋白質誘導体ならびに融合体はISP蛋白質とISP蛋白質以外の抗原決定基を有するポリペプチドより成る。このように免疫学的に活性なISP蛋白質の誘導体ならびに融合体は本発明の範囲内にある。ISP蛋白質以外の抗原決定基は免疫学的に有能ならばいかなるポリペプチドでもよい。すなわち、その融合体が投与される動物において免疫反応を誘発できるような任意のポリペプチド，あるいはそれに対する抗体に結合できるようなISP以外の蛋白質由来の任意のポリペプチドである。
【００７９】
置換突然変異体とはISP1かISP2の少なくとも一つの残基が除去され異なった残基がその位置に挿入された変異体である。新規のアミノ酸配列ならびに等配性（isosteric）の類似体(アミノ酸あるいはそれ以外のもの)は本発明の範囲内に含まれる。
【００８０】
ある種の削除、挿入、そして置換はISP蛋白質分子の特性に根本的な変化を生じさせないだろう。しかしながら、例えばISP蛋白質上の免疫抗原決定基の変更 という例で示されるように、削除、挿入、そして置換の影響を予め精確に予測することは困難ではあるが，その分野の技術に熟練した者ならば日常のスクリーニング。アッセイでその影響を評価できることが認識できよう。例えば、ある特定抗体にたいする親和性というようなISP蛋白質の免疫学的特性の変化は競合性免疫測定法により測定され得る。蛋白質特性の変化(例えば酸化還元、熱安定性、疎水性、蛋白質分解にたいする感受性、キャリアーと集合体をつくる傾向、あるいは多量体を生成する傾向)はその分野の当業者によく知られた方法によりアッセイされうる。
【００８１】
システインあるいは他の不安定なアミノ酸残基の削除もまた望ましい。例えば、そのような削除はISP蛋白質の酸化安定性を増加させることがある。潜在的な蛋白質分解サイト(例えばアルギニンーアルギニン)の削除あるいは置換はその塩基性残基の一つの削除あるいグルタミン残基あるいはヒスチジン残基での置換により達成される。
【００８２】
ISP蛋白質の共有結合による修飾は本発明の範疇にある。そのような修飾は選ばれたアミノ酸側鎖あるいは末端アミノ酸残基と反応可能な有機性誘導薬を目的アミノ酸残基と反応させることにより導入される。結果として得られるISP蛋白質の共有結合誘導体はISP蛋白質の生物学的活性に重要な残基の同定，ISP蛋白質の免疫学的測定，あるいは組み換えISP蛋白質のアフィニテイ精製のための抗ISP蛋白質抗体の準備に有用となる。このような修飾は当業者には自明であり、特別な実験を行うことなく行うことができる。
【００８３】
ISP蛋白質断片もまた本発明により提供される。ISP蛋白質断片は例えば抗体の準備，生物学的試料中の抗体検出、またはISP蛋白質の作動薬あるいは拮抗剤のスクリーニングに使用することができる。断片は少なくとも１０アミノ酸の長さを有する。断片の長さは少なくともおよそ３０であることが望ましく、少なくともおよそ５０であればさらに望ましく、少なくともおよそ１００であればよりさらに望ましく、少なくともおよそ１５０のアミノ酸の長さがあれば最も望ましい。その断片は融合蛋白質の一部であってもよい。
【００８４】
本発明はISP蛋白質をコードする核酸断片も提供する。それらの断片はISP蛋白質あるいは蛋白断片を発現するのに使用できる。さらに核酸断片は、例えば、核酸分析のプローブとして，核酸合成のプライマーとして，あるいはアンチセンス核酸として使用できる。断片は１本鎖あるいは２本鎖で、少なくとも１５ヌクレオチドの長さがある。断片は少なくともおよそ３０である事が望ましいが、少なくともおよそ５０であればより望ましく、少なくともおよそ１００であればよりさらに望ましく、少なくともおよそ２００であればその上に望ましく、少なくともおよそ３００であればまたそれ以上に望ましく、少なくともおよそ４００ヌクレオチドの長さがあれば最も望ましい。
【００８５】
本発明はまたISP蛋白質をコードする核酸を含むベクターならびにこのようなベクターを有する原核細胞そして真核細胞も提供する。このようなベクターは通常複製開始起点を有するが、この起点は染色体への組み込みが起きる場合には必要ない。発現ベクターはまた形質転換された細胞を表現型により淘汰するためのマーカー配列も含んでいてもよい。発現ベクターはまた転写ならびに翻訳の制御に有用な塩基配列を含むことが最善である。
【００８６】
宿主真核細胞で使用される発現ベクターはmRNA発現に影響することがある転写終止に必要な配列も含む。発現ベクターは淘汰可能なマーカーとして淘汰用遺伝子を含んでいてもよい。哺乳類細胞のための適切な淘汰用遺伝子の例としてはジヒドロフォレート還元酵素、チミヂン。キナーゼ、ネオマイシンあるいはハイグロマイシンを挙げることができる。
【００８７】
本発明はまたISP1あるいはISP2の抗原決定基の少なくとも一つを認識する抗体も提供する。ISP蛋白質に対する抗体は従来の方法(Harlowら,1988年)によりヤギかウサギに抗原を注入することにより準備されうる。例えば、完全なISP蛋白質あるいはISP蛋白質類似の少なくとも１０アミノ酸より成るペプチドの皮下注入をまずFreundの完全アジュバント中で行い、ブースターのための腹腔内あるいは皮下への注入をFreundの不完全アジュバント中にて行うことができる。抗ISP蛋白質抗体はISP蛋白質の一つあるいはそれ以上の抗原決定基を狙って作製されうる。ISP蛋白質に対するモノクローナル抗体はその分野で既知の技法(Harlowら,1988年)により準備できる。抗体は例えば放射性あるいは蛍光性の標識をされうる。標識化合物に共有結合した抗ヤギ抗体あるいは抗ヒツジ抗体に結合することによりその抗体を間接的に標識することも考慮している。
【００８８】
ISP蛋白質、核酸(アンチセンス核酸を含む)、それらの断片、ベクターあるいは宿主細胞は他の成分も備えた製品に含むことができる。特に医薬品は製薬学的に容認され得る補形剤そして／あるいはキャリアーを含む形で提供されることが望ましい。本発明の製品を作成するにあたって、活性成分は通常補形剤と混合され，補形剤によって希釈されるかあるいはカプセル、小袋，紙あるいは他の容器といった形のキャリアーに包合される。製薬学的に容認され得る補形剤を希釈剤と使用できる場合には，その希釈剤は固体，半固体、あるいは液体物質であり得り、活性成分の運搬剤、キャリアーもしくは媒質として作用する。このようにして、製品は錠剤、丸剤、粉末、菓子錠剤、小袋、カシュー、エリキシル、懸濁液、乳濁液、溶液、シロップ剤、煙霧剤(固体あるいは液体媒質中)、重量で例えば10％までの活性成分を含む軟膏、柔らかい／堅いゲラチンカプセル剤、坐薬、無菌の注射可能な溶液、そして無菌の包まれた粉末剤といった形であり得る。
【００８９】
いくつかの適切な補形剤の例としては乳糖、ブドウ糖、蔗糖、ソルビトール、マンニトール、澱粉、アラビアゴム、リン酸カルシウム、アルギン、トラガカント、ゲラチン、ケイ酸カルシウム、微晶性セルローズ、ポリビニルピロリドン、セルローズ、無菌水、シロップ、そしてメチルセルローズが挙げられる。処方はさらにタルク、ステアリン酸マグネシウム、鉱油といった潤滑剤、湿潤剤、乳化剤ならびに懸濁剤、メチル安息香酸塩そしてプロピルヒドロキシ安息香酸塩といった保存剤、甘味料、ならびに香料を含むことができる。本発明の製品は当業者に既知の方法を使用して患者に投与した後、その活性成分が迅速に、持続的に、あるいは遅延して放出されるように処方することができる。
【００９０】
錠剤のような固形製品を準備するには、主要活性成分が製薬学的補形剤と混合され本発明化合物の均一な混合物を含む固体の処方前組成を作る。これらの処方前組成を均一と呼ぶ際には、錠剤、丸剤、カプセルのような効果的な単位投薬形式にその製品が容易に細分化されるように活性成分が製品全域にわたって均等に分散されていることを意味する。
【００９１】
本発明の錠剤あるいは丸剤は持続的作用の利点を得られるような投薬形式を供給するために被覆されるかもしくはそれなりに組成されるようにしてもよい。例えば、錠剤あるいは丸剤は内部投薬および外部投薬成分で作製することができ、外部成分は内部成分を包むことになる。二つの成分は腸溶皮によって分離することができ、この腸溶皮は胃中での分解に抵抗し内部成分が十二指腸へ無傷のまま移動するのを許すか、遅延放出させるために使われる。様々な物質がこのような腸溶皮あるいは被覆として使用されるが、それらにはいくつかの重合体の酸、重合体の酸とシェラック、セチルアルコールおよび酢酸セルロースといったものの混合物が含まれる。
【００９２】
経口投与あるいは注入投与できるように本発明の新規製品を液体形式としたものには水溶液、適切に風味を付けたシロップ、水性あるいは油性懸濁液、そして風味を付けた食用油(例えばトウモロコシ油、綿実油、胡麻油、やし油、あるいはピーナッツ油)との乳濁液、ならびにエリキシルや同様の製薬学的運搬剤が含まれる。
【００９３】
吸入法あるいはガス注入法のための製品は溶液、製薬学的に容認される水性か有機性の溶媒またはそれらの混合物中での懸濁液、ならびに粉末を含む。液体あるいは固体の製品はここに述べられるような適切な製薬学的に容認される補形薬を含んでいてもよい。製品は局所的または全身系効果のため経口あるいは経鼻呼吸ルートをもって投与されるのが望ましい。製薬学的に容認される溶媒中の製品は不活性ガスの使用によって霧状にしてもよい。霧状になった溶液は噴霧器から直接吸入されうるし、あるいは噴霧器は顔面マスクのガーゼないしは間歇的陽圧呼吸器に装着しうる。溶液、懸濁液，あるいは粉末製品は，望むことなら経口的にまたは経鼻的に、処方を適切な方法で送り届ける装置から投与されうる。
【００９４】
本発明の方法で使用されるもう一つの望ましい処方には経皮配達装置(「パッチ」)がある。活性成分の制御された量を持続的にあるいは非持続的に注入するのにこのような経皮的パッチを使用するようにしてもよい。製薬学的な試薬を送り届けるための経皮的パッチの構築と使用はその分野においてはよく知られている。例えば、ここに参照されている米国特許5,023,252号を参照されたい。このようなパッチは製薬学的試薬が持続的、脈動的、あるいは必要に応じて供給されるように製作することができる。
【００９５】
本発明の動物免疫化用製品は免疫防御の抗体滴定濃度の増加あるいは細胞性免疫反応の増加をおこす目的でアジュバントも含んでいてもよい。このようなアジュバントにはFreundの完全および不完全アジュバント、水酸化アルミニウム、dimethyldioctadecyl−ammonium  bromide,Adjuvax(Alpha−Beta  Technology)，Inject  Alum(Pierce)、Monophosphoryl  Lipid  A(Ribi  Immunochem  Research)、MPL＋TDM(Ribi  Immunochem  Research)、Titermax(CytRx)、QS21、CpG配列(Singhら,1999年)、毒素、トキソイド、糖蛋白質、脂質、糖脂質、バクテリア細胞壁、サブユニット(バクテリアあるいはウィルス)、炭水化物成分(単糖類，二糖類、三糖類、四糖類、オリゴ糖類、そして多糖類)、様々なリポゾーム類、あるいはサポニンが含まれるが，それらに限られるわけでは無い。
【００９６】
本発明で使用されるその他の適切な処方はレミングトンの製薬科学(Remington's  Pharmaceutical  Sciences)(第19版)に記載されている。
【００９７】
方法
本発明はISP蛋白質をコードする核酸を用いてISP蛋白質を生産する方法を提供する。簡潔に言えば、その核酸から成る発現ベクターが構築され適切な細胞へ導入、形質転換体が選択され、ISP蛋白質を産生する条件下での培養後、ISP蛋白質は精製される。適切な細胞には例えばバクテリア、イースト、昆虫、そして哺乳類動物細胞が含まれる。
【００９８】
ここに実証されるようにISP蛋白質には孵化活性ならびに着床活性があり、避妊に使用することができる。避妊は、動物をISP蛋白質で免疫化することによってISP蛋白質に対する免疫反応を誘発し、それにより受胎に必要なその蛋白質の機能に干渉することで達成されうる。避妊はまたISP蛋白質阻害剤の投与により受胎に必要なその蛋白質の機能を阻害することで達成されうる。その阻害剤とは、例えば、抗ISP蛋白質抗体あるいはISP蛋白質の量を減少させるようなアンチセンス核酸であってもよい。その阻害剤とはまた、薬物スクリーニングによりISP蛋白質のプロテアーゼ活性、孵化あるいは着床活性を阻害できると確認される化学物質であってもよい。ISP蛋白質のプロテアーゼ活性、孵化あるいは着床活性はここに発表されるような方法あるいはその分野で既知の方法によって測定されうる。
【００９９】
本発明はまた不妊症、とりわけISP蛋白質の低レベルか低活性に関連した不妊症、の診断に使用できる。それゆえ診断の対象となる動物より得られた生物学的試料がISP測定に使われる。正常値より低いISP活性かISPレベルはその動物が受胎する可能性の低さを示唆する。正常値範囲は同じ動物の受胎可能な集団から得られる。測定対象となるものには、プロテアーゼ活性、孵化活性、着床活性といったISP活性、あるいは例えば抗ISP蛋白質抗体を用いて測定され得るところのISP蛋白質レベルがある。
【０１００】
ISPはまた培養胚を雌性動物の子宮に移す前にISP蛋白質存在下に培養することによって生体外受精による受胎を促進するためにも使用できる。このような応用はその分野での技術の内にある。例えば、受容能のある子宮への移植前のヒト胚子の透明体をプロナーゼで酵素処理すると胚の着床率が劇的に増加することが最近示された(Fongら、1998年)。
【０１０１】
以下の例は本発明を例証するために提示されるものであって、決して本発明の範囲を制限するような解釈を許すためのものではない。
【０１０２】
例
下記の例において、以下の略語は以下に定義される意味を持つ。定義されない略語はそれらの一般に容認された意味を持つ。
oC            ＝     度（摂氏）
hr            ＝     時間
min           ＝     分
mM             ＝    マイクロモル（濃度）
mM             ＝    ミリモル （濃度）
M              ＝    モル （濃度）
ml            ＝     ミリリットル
ml            ＝     マイクロリットル
mg            ＝     ミリグラム
mg            ＝     マイクログラム
PAGE           ＝    ポリアクリルアミドゲル電気泳動法
rpm           ＝     １分あたりの回転数
FBS           ＝     ウシ胎児血清
DTT           ＝     ジチオスレイトール
SDS           ＝     ドデシル硫酸ナトリウム
PBS           ＝     リン酸バッファー
DMEM            ＝   ダルベッコMEM培地
MEM           ＝     modified  Eagle's  medium
ME            ＝     メルカプトエタノール
EGF           ＝     上皮増殖因子
PDGF          ＝     血小板由来増殖因子
DMSO          ＝     ジメチルスルホキシド
IPTG           ＝     イソプロピルーa−D−チオガラクトピラノシド
【０１０３】
必要な物質ならびに方法
動物とその取り扱い
CD1マウスは6−7週のものをCharles  River  Canada(St.Constant、PQ)より得、温度制御(20oC)ならびに照明制御(７時より１９時まで照明)された標準の研究動物設備で飼育された。飼育およびその取り扱いはカルガリー大学動物保護コミテイーに承認された標準研究動物保護プロトコールに全く従うものである。自然の妊娠を得るためには雌マウスを成熟雄マウスと対にし、交尾のしるしとしての膣の交尾プラグの存在が毎日検査された。胚の収集には、プラグの検出された日の正午を0.5日目としてそれら胚の年令を表した。妊娠した雌動物は特定の胎生日数後に頸椎脱臼により犠牲にされ，子宮及び／又は卵巣を手術で切離し、解剖あるいは洗出により 胚が単離した(Hoganら,1994年)。
【０１０４】
すべての外科的処置はマウスをアベルチン(2%(v/w)トリブロモエタノール：Aldrich  Chemical  Co.  Milwaukee、WI)の腹腔内注入により麻酔にかけた後に行われた。卵巣切除は背側面の切開により行われた(Hoganら,1994年)。卵巣切除されたマウスは脱落膜腫誘導の前に少なくとも１週間の回復を許された。RU486を含むすべてのステロイド。ホルモンは胡麻油に溶解され皮下注入された。実験の各段階では胡麻油のみ(0.1ml／マウス)を注入されたコントロール。マウスが使用された。できるだけ偽妊娠に近く模造するために脱落膜腫の人工的誘導の標準療法(Finn、1966年)には変更が加えられた(Milligan,1995年)。ここでは、最初のプロゲステロン処理はエストロゲンに曝された二日後に始められた。この改変された療法では胎生零日から毎日100ngのエストロゲン投与、胎生３日目以降は１mgのプロゲステロンと10ngのエストロゲンの投与がされた。脱落膜腫は胎生５日目(14時から16時の間に)に外科的に胡麻油(１０ml)を一つの子宮角内腔にその卵巣側端より注入して誘導された。注入された子宮角ならびに注入されなかった子宮角は24、48、あるいは72時間後に組織学的な切片準備および本来の位置のハイブリダイゼーション分析のため収集された。
遅延した着床は胎生3日目相当のマウスの卵巣切除とそれに続く胎生４日目と６日目のプロゲステロン(2mg／マウス)投与により誘導かつ維持された。続いて、これらのマウスの半分は７日目の朝にエストロゲン(25ng／マウス)投与され、残りの半分は正常なプロゲステロン注入を受けた。マウスは24時間後に本来の位置のハイブリダイゼーション分析のため犠牲にされた。
【０１０５】
胚盤胞不在下での子宮発達に対するステロイドの効果はマウスの卵巣除去と それらマウスの二週間の回復期間後のホルモン処理により検討された。それらのマウスはプロゲステロンのみ(１mg/マウス)かエストロゲンのみ(100ng/マウス)、あるいは両方の組み合わせ(10ngのエストロゲンと１mgのプロゲステロン／マウス)の注入を３日間受けた。その後マウスは４日目の朝、犠牲にされた。ISP2遺伝子発現に対するプロゲステロンの重要性をさらに決定するために多排卵処理された妊娠マウスならびに偽妊娠マウス(Hoganら,1994年)は膣プラグ検出後３日目の朝にRU486(400mg/マウス)で処理された。２４時間後それらのマウスは犠牲にされその子宮角が本来の位置のハイブリダイゼーションのため収集された。
【０１０６】
胚培養
桑実胚は多排卵処理された2.5日目の妊娠雌の卵管からM2培養液(Hoganら,1994年)に採集された。孵化のためには桑実胚はおよそ24時間マイクロウエル内のKSOMaa培養液(Erbachら,1994年)中で、37oC、5%の二酸化炭素の条件下で培養された。胚のアウトグロウス（outgrowth)には、孵化した胚盤胞はさらに48時間、マイクロウエル内で5%(v/v)ウシ胎児血清を含むダルベッコMEM培養液において37oC、5%の二酸化炭素の条件下で培養された。このために使用されたマイクロウエルは10%(v/v)トリトンX−100処理されたマウス胎児線維芽細胞由来の細胞外基質によって被覆されていた(Behrendtsenら、1995年)。
【０１０７】
胚RNAの準備
トータルRNAは胚および脱落膜(胎生6.5日目の着床部位)、胚(胎生8.5,11.5,13.5日目)そして胎盤(胎生11.5,13.5日目)からトリゾル試薬(Life  Technologies)を用いて収集された。孵化時の胚盤胞(50%孵化)は遠心により集められトリゾル試薬によりRNAが得られた。アウトグロウス（outgrowth)する胚盤胞のRNAはmicrowell中で直接トリゾル試薬により収集された。PolyA+RNAは胎生6.5日目の胚/脱落膜トータルRNAよりオリゴdTセルロース。クロマトグラフィーを使用して濃縮された(Sambrookら,1989年)。
【０１０８】
セリンプロテアーゼ活性サイトRT−PCRクローニング
胎生6.5日目の胚/脱落膜より得られたトータルRNA(１mg)がSuperscriptII(Life  Technologies)で逆転写され、それをテンプレートとしてdegenerateヒスチジン活性サイトプライマー(5'−CGGAATTCTI(ACT)TI(AT)(GC)IGC(AGCT)G(AGCT)CA(CT)TG−3';配列ID番号:7)およびセリン活性サイトプライマー(5'−GCGGATCCA(AG)IGGICCICC(ACGT)(CG)(TA)(AG)TC(AGCT)CC−3';配列ID番号:8)を用いた活性サイトPCR(Prendergastら,1991年)が行われた。12.5mlの反応溶液は、10mMトリス塩酸バッファー(pH9.0)、50mM  塩化カリウム、1.5mM  塩化マグネシウム、130mM  dNTPs、１mM  の各プライマー、１ユニットのTaqDNAポリメラーゼ(Amersham  Pharmacia)より成り、それに0.5mlのcDNAが加えられた。94oCで１分、55oCで2分、そして72oCで2分のサーマル。サイクルが40回繰り返された。増幅産物はエタノール沈澱され、プライマー末端に組み込まれた５’EcoRI認識配列と3'  BamHI認識配列が切断され、1%(w/v)アガロースゲルで分離精製後、EcoRI/BamHIで切断されたpBluescriptKS＋(Stratagene)にクローンされた。個々のクローンのインサートは制限酵素により分析され(Sambrookら,1989年)、ダイターミネーター法(PE  Biosystems)による配列決定後、NCBIネットワーク。サーバーが提供するBLASTプログラム(Altschulら,1997年)を使用してGenBank配列データベースを検索した。
【０１０９】
ライブラリー構築、cDNAクローニングならびに配列分析
10mgのpolyA+RNA（胎生6.5日目の胚/脱落膜）はSuperScriptcDNAクローニングキット(Life  Technologies)によりランダムプライマーあるいはオリゴ(dT)プライマーを用いて二本鎖cDNAに変換された。NotI−EcoRIアダプターがcDNAに付加され、アダプター付加されたcDNAはSephacryl  S−500  HRカラム(Life  Technologies)を用いたゲル濾過クロマトグラフィーによりサイズ選択され、過剰リンカーはGene  Clean(Bio101)により除去された。１mgのアダプター付加されたcDNAが５mgの脱燐酸されたEcoRI切断ラムダgt10(Amersham  Pharmacia)に連結され、Gigapack  Gold  II(Stratagene)を用いてファージに包み込まれた。２x１０６の組み換えファージは寒天培地上で増幅され、収集されたライセートは7%(v/v)DMSO中に凍結(-80oC)された(Sambrookら,1989年)。
【０１１０】
このライブラリーの５x１０５のプラークをスクリーンするのに478bpのISP1PCR産物あるいは478bpのISP2PCR産物がプローブとして使用され、1.3kbのインサートを持つ二つのcDNAクローンが同定された。ISP1cDNAクローン内部のBamHI認識配列は0.5kbおよび0.8kbのEcoRI−BamHI断片のpBluescriptKS+(Stratagene)への方向性クローニングを可能とし、サイクル。シークエンス法(PE  Biosystems)により配列決定がなされた。この塩基配列はSwiss  Protein  ExPAsyツール(http://expasy.cbr.nrc.ca/tools/dna.html)を用いて蛋白配列に翻訳された。このISP1はBLAST相同性検索で同定された12のセリン。プロテアーゼとClustal  W(Higgins,1994年；http://dot.imgen.bcm.tmc.edu:9331/multi-align/multi-align.html)によりアラインメントされた。
【０１１１】
ISP2は1.3kbのEcoRI断片がpBKCMV(Stratagene)にサブクローンされ、サイクル。シークエンス法(PE  Biosystems)により配列決定された。この塩基配列はSwiss  Protein  ExPAsyツール(http://expasy.cbr.nrc.ca/tools/dna.html)を用いて蛋白配列に翻訳された。このISP２はBLAST相同性検索で同定された９セリン。プロテアーゼとClustal  W(Higgins、1994年；http://dot.imgen.bcm.tmc.edu:9331/multi−align/multi−align.html)でマルチプルアラインメントされ、それらの比較から最大節約法(http://bioweb.pasteur.fr/seqanal/phylogeny/phylip-uk.html)により樹状図が作成された。
【０１１２】
発現分析
胎生6.5日目の胚/脱落膜からのpolyA+RNA５mgが1.2%(w/v)ホルムアルデヒドアガロースゲル中で高分子量RNAサイズマーカー(Life  Technologies)と共に電気泳動された。Hybond  N+メンブレン(Amersham  Pharmacia)にトランスファー後、そのメンブレンは1.2kbのP32標識されたISP1cDNA断片，あるいは1.2kbのP32標識されたISP2cDNAクローン、をプローブとして分析された。
【０１１３】
胚ならびに胎盤におけるISP1転写産物の存在はRT−PCRによって調査された。トータルRNA(１mg)は逆転写され、ISP1に特異的なプライマー(ISP1for:5'−GGAGCAGGAACTTCTGAACA−3';配列ID番号:９、および、ISP1rev:5'−GTCAAAGATGGCCACAGC−3';配列ID番号:10)を用いて４０サイクルのサーマルサイクリング(94oCで1分,60oCで2分,72oCで2分)により増幅された。GAPDHのRT−PCRによる増幅(mRNA分析量のコントロール)については他の文献に記述されている(Arcellana−PanlilioとSchultz,1993年)。予測された175と380bpの増幅産物は2%(w/v)アガロースゲル上で分離された。
【０１１４】
胚ならびに胎盤におけるISP２転写産物の存在は同様な方法でISP２に特異的なプライマー(ISP２for:5'−TGTGAGCCGGGTCATCATCC−3';配列ID番号:11、および、ISP2rev:5'−GGCATTGTGGTACATCTCCT−3';配列ID番号:12)を使用して調査された。予測された175と3６0bpの増幅産物は2%(w/v)アガロースゲル上で分離された。
【０１１５】
ジゴコシゲニン標識RNAプローブを用いたホールマウント  in  situ  ハイブリダイゼーションは本質的に以前記述されたごとく(RancourtとRancourt,1997年)実行された。ISP1プローブとしてはRT−PCRでpBluescriptKS+にサブクローンされた478bpのインサートが使用された。ISP2プローブも同様にpBluescriptKS+にRT−PCRでサブクローンされた478bpのインサートが使用された。アンチセンス。プローブはEcoRIでリニアライズされたプラスミドからT3ポリメラーゼを使用して合成された。センス。プローブはBamHIでリニアライズされたプラスミドからT7ポリメラーゼにより合成された。すべての実験においては非特異的ハイブリダイゼーションを検出するためセンスRNAプローブが並行して使われた。Strypsin活性の組織化学的染色は本質的に以前概説されたごとく(PeromaとWassarman,1986年)行われた。胚は初期胚盤胞としてM２培養液に収集され、1.25%(w/v)グルタールアルデヒドによって0.25M蔗糖および50mMリン酸ナトリウム(pH7.5)中、５分間、4oCにおいて軽く固定された。固定化に引き続き、胚盤胞は基質Na−benzoyl−DL−arginie  βnapthylamide(0.56mM;Sigma)ならびにFast  Garnet  GBC塩(1.86  mM;Sigma)を含む50mMリン酸ナトリウム(pH7.5)内に置かれ、室温にて５分間インキュベートされた後、50 mM リン酸ナトリウム(pH7.5)で洗浄された。
【０１１６】
アンチセンス  オリゴヌクレオチドによる研究
アンチセンス。オリゴヌクレオチドによる研究では収穫された胚盤胞が0.001%(v/v)L−α−lysophosphatidylcholineに60秒間浸けられた後(Jonesら,1997年)、2.5mM,  5mM  オリゴヌクレオチドあるいは同容積の蒸留水で平衡化された微小滴に移された。二つのアンチセンス。オリゴヌクレオチドはISP1の開始コドンを包囲する領域に対して設計された:  AS1(5'−TCTAACTACCGTCTAACAACG−3'；配列ID番号:13)は上流に位置し、AS2(5'−GAACTCTTCTAACTACCGTCT−3'；配列ID番号:14)は下流に位置する。コントロール。オリゴヌクレオチドSS1(5'−ACGGTAGTTAGAAGAGTTCT−3'；配列ID番号:15)は開始コドンを囲む領域においてスクランブルされたセンス配列を代表する。これらのオリゴヌクレオチドはOligoTMソフトウェアを用いて設計され、UCDNAサービス(カルガリー大学)のRichard  Pon博士により合成かつ精製された。胚盤胞孵化の進展状況は20,30,40,60時間後に検査された。これらの研究においてAS1とAS2は両方共に胚盤胞孵化に特異的に干渉した。しかしながらAS1はAS2よりもさらに効果的であると認められ、すべての引き続く実験ではAS1が使用された。８時間の処理後、胚盤胞の一部はRT−PCRによるISP1転写産物の有無の検査に使用された。24時間の処理後、胚盤胞の一部はstrypsin活性の組織化学的アッセイに使用された。アウトグロウス（outgrowth)の研究では胚盤胞は孵化を許され，それからオリゴヌクレオチドあるいは蒸留水で平衡に保たれた微小滴中に移された。アウトグロウス（outgrowth)の進展状況は５日間モニターされた。
【０１１７】
組み換え蛋白質生産
(a)  小規模な蛋白質生産：ISP1とISP2からのDNA断片が次のプライマーを用いて増幅された：
i)  ISP1に対しては
5'-GCGGATCCGTGGGGGAAGTA-3'（配列ID番号:16)と
5'-GCGAATTCAGCTTTGTGCTCGTC-3'（配列ID番号:17)
ii)  ISP2に対しては
5'-GCGATCCTATGGGGGCAAG-3'（配列ID番号:18)と
5'-GCGAATCGTGGTACATCTC-3'（配列ID番号:19)。
PCR産出の断片はpGEX−2T(Pharmacia)のBamHI認識配列とEcoRI認識配列の間に連結され、大腸菌BL21株に形質転換され、NZY−アンピシリン寒天培地にまかれた。形質転換されたバクテリアの単一コロニーが2.5mlのYT(2X)−アンピシリン(100mg/ml)培養液の埴菌に使用され、37oCにて一晩育成された。5mlのYT−アンピシリンが100mlのカルチャーで埴菌され、37oCで５時間、OD600が0.5に達するまで震盪された。10mlの100mM  IPTGがGST融合蛋白質の発現を誘発するためにカルチャーに加えられ、さらに30oCにて3−5時間培養された。1.5mlのこのカルチャーが細胞を沈澱させるため13,000xgで遠心され，上清は廃棄された。沈澱は200mlの氷冷STEで一回洗浄され300mlの氷冷STEに懸濁された。この懸濁液は５秒間撹乱混合され、液が透明に成るまで氷上にて１０秒間超音波処理された。5分間4oCで遠心後上清は新しい遠心管に移された。トリトンX−100が最終濃度20%に添加され、撹乱混合後、遠心管は4oCにて30分間揺すられた。抽出液は不溶性の屑を取り除くため13,000xgにて5分間遠心され、上清は新しい遠心管に移され、沈澱は300mlの氷冷STEに懸濁された。上清ならびに懸濁された沈澱から10mlずつの部分標本が採られ10%SDSポリアクリルアミドゲル上にて分離された。
【０１１８】
(b)  大規模生産。0.5リットルのYT(2X)−アンピシリン(100mg/ml)培養液を植菌するのに2mlのオーバーナイト。カルチャーが用いられ、37oCでOD600が0.5−1.0になるまで培養された。融合蛋白質発現を誘発するためIPTGが最終濃度で0.5mMに添加され、カルチャーは30oCで一晩震盪培養された。バクテリアは7,000xgで５分間遠心して沈澱され、最終濃度10%(v/v)になるようにSTE中に懸濁された。リゾチームが最終濃度1mg/mlに加えられ、細胞は室温で20分間インキュベートされた。混合物は5000xgで10分間遠心され，上清は廃棄され、沈澱は氷上に置かれたのち0.1%のデオキシコール塩酸ナトリウムを含む10ml氷冷STEに懸濁された。氷上で10分間、時折り混合しながらインキュベートした後、この懸濁液にはMgCl2およびDNaseIがそれぞれの最終濃度が8mMならびに10mg/mlとなるように加えられた。懸濁液は粘性が消えるまで時折混合しながら4oCでインキュベートされ、封入体が遠心沈澱された。沈澱は1%NP−40を含むSTEに懸濁かつ遠心沈澱することにより一回洗浄された。この洗浄はSTEのみによって繰り返された。沈澱は2.5mlのSTEに懸濁され、3回30秒ずつ超音波処理された。試料用緩衝液の添加後、溶液は煮沸され、蛋白質は10%SDSポリアクリルアミドゲル上で解析された。
【０１１９】
抗体生産
ゲル精製されたGST融合蛋白質に対する抗体がウサギを用いて作成された。全蛋白質が10%SDSポリアクリルアミドゲル上で分離され、0.05%クマシーブリリアントブルー水溶液により染色、それから水により脱色された。融合蛋白質は同定され、ゲルから切り出された。ゲル切片は液体窒素中で凍結され、乳鉢と乳棒を使って粉末化された。粉末はDPBS中に懸濁され、およそ100mgの融合蛋白質が同一容積のFreundの完全アジュバント(DIFCO)と混合され、ニュージーランド白ウサギに皮下注入された。3週間後、そのウサギから血液サンプルが採集され、Freundの不完全アジュバント(DIFCO)と混合された100mgの融合蛋白質でブーストされた。引き続く採血/ブーストは3週間ごとにおこなわれた。
【０１２０】
例1
ISP1は、S1プロテアーゼのトリプターゼ亜科の新規な分科を代表する
過去の、生体内および生体外双方における胚盤胞侵入アッセイを用いた着床の研究は、プロテアーゼのカスケードが着床時における胚と子宮の相互作用ならびに子宮脱落膜への胚の統合を媒介すると示唆している。胎生6.5日目の着床部位ならびに胚由来のRNAと変性プライマーを用いた活性サイトRT−PCR(Prendergastら,1991年)が着床時周辺に発現される新規のセリンプロテアーゼcDNA同定のために用いられた。着床のこの段階において胚は脱落膜への侵食に完全に従事している。ヒスチジンおよびセリン活性サイト領域を包囲する変性プライマーによるPCR増幅は0.4−0.5kb範囲内に数多くの断片を生じたが、これは既知セリンプロテアーゼのヒスチヂンーセリン領域間の部分的cDNAの長さと一致するものである(図1a)。これら部分的cDNAのクローニングならびに配列決定は数多くのセリンプロテアーゼ(ウロキナーゼ型プラスミノゲン活性化因子、組織型プラスミノゲン活性化因子、グランザイムD、グランザイムF、等)を同定した。二つの以前に未確認の遺伝子が識別され、これらはここにおいて着床セリンプロテアーゼ(ISP)、より明確にはISP1およびISP2、と参照される。
【０１２１】
胎生6.5日目の胚/脱落膜polyA+RNAとISP1の478bp部分的cDNAを用いてのノーザンブロット分析はISP1転写産物が1.3kbであると示唆した(図1b).1.2kbの完全長ISP1cDNAは胎生6.5日目の胚/脱落膜のlgt10cDNAライブラリーを作成、スクリーニングして単離された。ISP1の配列分析(図3)は273アミノ酸より成る蛋白質を予測した(図５)。BLAST相同性検索(Altschulら,1997年)によるとISP1は造血セリンプロテアーゼ，とりわけマウスのマスト細胞プロテアーゼー６、と高い配列類似性を共有する(45%アミノ酸同一性;Lutzelschwabら,1997年)ことが見いだされた。他のマスト細胞プロテアーゼも同程度の配列同一性を示した。次に最も近い亜科にはキモトリプシンとエラスターゼが含まれ、およそ38%の同一性があった。ISP1とS1ペプチダーゼ科の関連はそれらが保存されたヒスチヂンならびにセリン活性サイト部位(LTAAHCとGDSGGPL)を有すること、および成熟したトリプターゼ（図5;Smythら,1996年)に共通のN−末端配列(IVGG；配列ID番号:24)を持つことからも明白である。
【０１２２】
例2
ISP２は、S1プロテアーゼのトリプターゼ亜科のもうひとつの新規な分科を代表する
活性サイトRT−PCRによって得られた478bpのISP2cDNA断片を用いて、胎生6.5日目の胚/脱落膜のcDNAライブラリーがスクリーニングされ、1.2kbのcDNAクローンが同定された。胎生6.5日目の胚/脱落膜のpolyA+RNAのノーザンブロット分析は、この1.2kbのcDNAクローンをプローブとしてハイブリダイズした時、単一の1.３kbのmRNAバンドを検出し(図2a)、ISP1同様、このcDNAが完全長であることを示唆した。
【０１２３】
ISP2の配列分析(図４)は290アミノ酸より成る蛋白質(図６)を予測した。BLAST相同性検索(図２;Altschulら,1997年)はISP2がISP1ならびに造血トリプターゼと適度な配列相同性を共有することを明らかにした(MMNP6、45%アミノ酸同一性；Lutzelschwabら,1997年)。他のマスト細胞プロテアーゼも同程度の配列同一性を示した。次に最も近い亜科にはキモトリプシンとエラスターゼが含まれ、その同一性はおよそ34%である。ISP1同様、ISP２とS1ペプチダーゼ科の関連はそれらが保存されたヒスチヂンならびにセリン活性サイト部位(LTAAHCとGDSGGPL)を有すること、および成熟トリプターゼ(図6c;Smythら,1996年)に共通のN−末端配列(IVGG；配列ID番号:24)を有することからも明白である。最大節約法(Higginsら,1994年)による分析は、両ISPとそのマスト細胞トリプターゼ科内で最も近いメンバーとの間の低い類似性をもとに、両ISPはS1プロテアーゼ超科の特異的な枝を形成すると示唆する。S1プロテアーゼ超科はエラスターゼ/キモトリプシンおよびマスト細胞プロテアーゼ群とほぼ同時期に分岐した(図7).
【０１２４】
例３
着床前の胚、生体外孵化時ならびにアウトグロウス（outgrowth)時におけるISP1遺伝子の発現
その配列の特性をもとに、ISP1遺伝子は以前胚盤胞孵化に関わると記述されたトリプシン様プロテアーゼ,strypsin(PeronaとWassarman,1986年)、をコードすると仮定された。この仮説と一致するように、RT−PCR分析はISP1が孵化時ならびに胚のアウトグロウス（outgrowth)時に発現され(図8a)、かつ接合体をも含む着床前の全段階において検出可能である(図3b)ことを見いだした。着床以降、ISP1の発現は胎生11.5および13.5日目の胎盤中にてわずかに検出可能であったが、胎生8.5,11.5,あるいは13.5日目の胚においては検出できなかった。In  situハイブリダイゼーションの染色は桑実胚中において胚盤胞中よりも強く見られたが(図9)，これは以前のRT−PCR発現データと一致するものであった。胚盤胞中では、ISP1RNAの発現が胚の全領域にて検出された。ここでは、一層の栄養芽層よりも多層の内部細胞塊(ICM)のほうが強く染色されているように見えるが(図9d)、割球の染色は 均等であった。
【０１２５】
例４
アンチセンスオリゴによる胚盤胞中ISP1遺伝子発現およびStrypsin活性の撤廃
アンチセンス。オリゴヌクレオチド処理(Behrendtsenら,1995年;Jonesら,1997年)は胚盤胞中のISP1mRNAを減少しうるか、そして孵化過程の変更に帰着しうるか、を決定することで孵化におけるISP1の可能な役割が調査された。ISP1翻訳開始コドンを包囲する二つのアンチセンス。オリゴヌクレオチドが設計されたが、その一つはコドンのすぐ上流(AS1)、もう一つはそのすぐ下流(AS2)に対するものであった。コントロール。オリゴ(SS1)は翻訳開始コドン周辺のセンス配列をスクランブルしたものであった。胚盤胞孵化の進展状況は20,30,40,60時間後に検査された。これらの研究においてAS1とAS2は両方共に胚盤胞孵化に特異的に干渉した(表１)。AS1はAS2よりもさらに効果的であり、すべての引き続く実験ではAS1が使用された。
【０１２６】
胚盤胞がAS1オリゴヌクレオチド処理された時、ISP1転写産物の蓄積量は８時間の培養後、少なくとも100倍減少した(図8c)。SS1コントロール。オリゴヌクレオチド処理した胚盤胞には意味ある減少は見られず、未処理コントロールと変わらないISP1転写産物レベルを示した。AS1オリゴヌクレオチド処理された胚盤胞はまた未処理あるいはコントロール。オリゴヌクレオチド処理された胚盤胞と比べstrypsin活性の減少を示した。コントロール。オリゴヌクレオチドで処理された胚盤胞中では胚子外の極に組織化学的に局在するstrypsin活性が見られた(図10d)。これに対して、アンチセンス。オリゴヌクレオチド処理した胚盤胞中にはstrypsin活性は検出できなかった(図10e).  この観測は我々の仮説と一致するものであり、ISP1遺伝子が孵化に重要なstrypsin活性をコードすることを示唆した。
【０１２７】
例５
ISP1アンチセンスRNAによる生体外孵化の阻害
アンチセンス。オリゴヌクレオチド処理された胚盤胞は時間経過とともに孵化能力の少なからぬ劣化を示した(表1)。未処理あるいはコントロール。オリゴヌクレオチド処理された胚盤胞と比べ、相当な割合のアンチセンス。オリゴヌクレオチド処理された胚盤胞が孵化に失敗した(図11).  他のアンチセンス。オリゴヌクレオチド処理された胚盤胞は遅延した孵化を示し、アンチセンス処理が培養液中のオリゴヌクレオチド濃度が減退するまでの間、一時的に孵化を阻害することを示唆した。
【０１２８】
コントロール。オリゴヌクレオチド処理された胚盤胞は正常に発展かつ孵化し(図10a)、並行して培養された未処理胚盤胞(データの表示なし)と同じ結果を示した。２０時間程経過した頃から、透明帯は薄く成り胚盤胞は胚子外の極に生ずる裂開より流出した。これに対して、大多数のアンチセンス。オリゴヌクレオチド処理された胚盤胞は透明帯の壁を圧迫し薄くするまで成長したが(図10c)、裂開を引き起こすことはできなかった。６０時間このように透明帯内に留まった後、アンチセンス。オリゴヌクレオチド処理された胚盤胞は死に始め、壁から縮み離れていった(図10b).
【０１２９】
例６
ISP1アンチセンスRNAによる胚盤胞侵入の阻害
ISP1が生体外における胚盤胞アウトグロウス（outgrowth)中に発現されることから、孵化後の胚盤胞アウトグロウス（outgrowth)に対するアンチセンスRNAの影響が研究された(図6).  コントロール。オリゴヌクレオチド処理された胚盤胞は２日間の培養後、細胞外基質に付着し基質を侵食したが、これは未処理胚盤胞において見られるものと変わりなかった(図12a,b)。ISP1アンチセンス。オリゴヌクレオチド処理された胚盤胞は基質に付着するのに５日間かかり、成長が非常に遅れコントロール胚に観察されるようなサイズあるいは程度のアウトグロウス（outgrowth)に達することができなかった(図12c,d)。この観察はISP1発現が胚盤胞の細胞外基質への付着開始とそれに続く着床時のアウトグロウス（outgrowth)にも必須であることを示唆した。
【０１３０】
例７
妊娠中におけるISP2の時間的発現パターン
妊娠過程におけるISP2発現の特徴がRT−PCRによって調べられた(図2b)。強い発現が胎生6.5日目の胚/脱落膜RNAにおいて検出されたがこれはノーザンブロット分析による観測と一致するものであった。より弱い発現が胎生11.5ならびに13.5日目の胎盤RNAに検出された。ISP2遺伝子の発現は胎生8.5ならびに11.5日目の胚本体のRNAには観測されなかったが、極くわずかな発現が胎生13.5日目の胚本体からは検出された。このISP2発現パターンは以前に同定されたISP1のそれに類似するものであった。胚盤胞の孵化ならびにアウトグロウス（outgrowth)におけるISP1の役割をもとに、ISP2もまた胚盤胞内で発現されるか否か，そしてISP1と同様な役割を持つか否か、が興味深い研究の対象となった。しかしながら、孵化した胚盤胞あるいは生体外でアウトグロウス（outgrowth)した胚盤胞から得られたRNAを使ってのRT−PCRによるとISP2は初期胚では発現されないことが示唆された(図2b)。桑実胚ならびに胚盤胞上で追加的におこなわれた本来の位置のハイブリダイゼーションはISP2発現の不在を示し(データの表示なし)、それはRT−PCRの結果を確認することになった。こうした発現パターンの研究結果をもとに、ISP2の機能はISP1のそれと異なるものであり、おそらく着床の際の子宮脱落膜内で機能するものであろうと考えられる。
【０１３１】
例８
着床の際 ISP2は腺上皮において発現される
縦面切片のin  situハイブリダイゼーションはISP2遺伝子発現が脱落膜に起こることを確認した。着床周辺の期間を通して、ISP2mRNAの強い染色がとりわけ内膜腺上皮内で観測された(図１３)。ISP2発現は最初に胎生6.5日目の着床位置の縦面切片で検出され(データの表示なし)、その後胎生7.5ならびに8.5日目の着床位置にて検出された(図13a,b)。胎生6.5日目にはISP2mRNAの染色は胚より遠く離れた着床位置の間の領域でも観測された(図13c)。これらの結果は我々にISP2遺伝子発現は着床位置を包囲する脱落膜に制限されるものでもなければあるいはそれにのみ依存するものでも無いことを示唆した。しかしながら、ISP2mRNAは処女子宮内には検出されず(図13d)、それはISP2遺伝子発現が妊娠に特異的に反応して起こることを示唆した。ISP2遺伝子発現は桑実胚が卵管にある胎生2.5日目(図13e)、あるいは胚盤胞が子宮に入る胎生3.5日目(図13f)、にも検出されなかった。しかしながら、ISP2mRNAは着床ウィンドーが開く胎生4.5ならびに5.5日目には検出された(図13g,h)。これらの結果はISP2発現が着床に反応して起こるかあるいはホルモン制御により着床に同調して起こることを示唆する。
【０１３２】
例９
偽妊娠におけるISP2遺伝子発現
ISP2遺伝子発現の制御におけるホルモンと脱落膜化反応の潜在的な役割は、卵巣除去された雌にプロゲステロンとエストロゲンによる前処理後、子宮内へのオイル注入により偽妊娠を誘発させることにより調査された(Finn,1966年;Milligan,1995年)。実験の企画の一端として、脱落膜化反応が動物の片側だけで起こるようにオイルは一方の子宮角のみに導入された。反対側はISP2遺伝子発現に対するホルモン処理の潜在的な役割を調べるためのコントロールとされた。本来の位置のハイブリダイゼーションはISP2mRNAを両方の子宮角において検出し、ISP2遺伝子発現が偽妊娠時にもそして脱落膜化の不在下でも起こることを示唆した(図14)。
【０１３３】
例１０
ISP2遺伝子発現はプロゲステロンにより誘発される
ステロイドホルモンの影響は妊娠および偽妊娠のモデルを用いて検討された。遅延着床実験においては、ISP2遺伝子発現は卵巣除去手術により改廃された(図15a)。しかしながら、プロゲステロンが妊娠維持のために投与された場合には正常なISP2発現が観測された(図15b)。エストロゲンのみの存在では同様なISP2遺伝子発現の維持は観測されなかった(図15c)。これらの結果は妊娠時におけるISP2遺伝子発現維持にプロゲステロンが必要であることを示唆した。
【０１３４】
子宮ISP2遺伝子発現に対するプロゲステロンの必要性を確認するために、妊娠３日目あるいは偽妊娠のマウスはRU486処理され子宮切片中でISP2発現が分析された。翌日に犠牲にされた時、賦形剤のみで処理されたコントロールマウスには正常なISP2mRNA発現が観測された(図16a,c)。しかし、そのプロゲステロン遮断剤で処理されたマウスにはISP2mRNAは検出できなかった(図16b,d)。これらの結果は妊娠におけるISP2遺伝子発現維持にはプロゲステロンが必要であることを確立した。
【０１３５】
ISP2遺伝子の発現は卵巣切除による妊娠中絶後もプロゲステロンにより誘発できた(図15d)。卵巣切除後にプロゲステロン維持がなされなかった場合、ISP2遺伝子発現は検出されなかった(データの表示なし)。しかし、妊娠の失敗が卵巣切除により誘発された場合でも、ISP2遺伝子発現はまだ卵巣切除後１４日間誘発可能であった(図15d)。これらの結果は卵巣切除後そして長期のプロゲステロン。シグナルの不在後も子宮はプロゲステロンに対して応答可能な状態にあることを確認し、ISP2遺伝子発現がプロゲステロンによって誘発されることを示唆した。エストロゲンはISP2遺伝子発現に対する刺激作用あるいは阻害作用のどちらも持たないことが同様な実験によって示された。プロゲステロン維持不在下の卵巣切除後、エストロゲンはISP2遺伝子発現に刺激作用を持たないことが観測された(図15f)。さらに、妊娠失敗誘発後のプロゲステロンと組み合わせたエストロゲンの投与はプロゲステロンのみの処理と比べて何の変化ももたらさなかった(図15d)。これらの結果はプロゲステロンのみがISP2遺伝子の最大限な発現に必要かつ十分であることを示唆した。
【０１３６】
例１１
ISP1ならびにISP2免疫化は妊娠を阻害する
ISP1ならびにISP2免疫化の妊娠への影響を調査するため、ISP1とISP2の融合蛋白質が準備されマウスの免疫化に使用された。それらのマウスはその後交尾され免疫化の効果が決定された。
【０１３７】
融合蛋白質はISP1とISP2の間で相違する領域(図17)をPCRにより増幅しpGEX融合蛋白質発現ベクターに挿入することで準備された。5'−EcoRI認識配列と3'−BamHI認識配列を有するISP1とISP2の増幅産物がISP1とISP2の完全長cDNAクローン(10ng  DNAテンプレート)より次のプライマーを用いて得られた:  ISP1−5'(BamHI):  5'−GCGGATCCCAGGACAACAAGAGC−3';  配列ID番号:20，と、ISP1−3'(EcoRI)：5'−GCGAATTCAGCTTTGTGCTCGTC−3';  配列ID番号:21、ならびに、ISP2−5'(BamHI):  5'−GCGGATCCGACAACTCACTTTGT−3'  配列ID番号:22、と、ISP2−3'(EcoRI):  5'−GCGAATTCGTGGTACATCTCCTC−3';  配列ID番号:23。増幅は10mM  トリス塩酸バッファー(pH8.3)，50mM  塩化カリウム,  1.5mM  塩化マグネシウム、１３０mM  dNTP中で、Taqポリメラーゼ(Sigma)を用いた35サイクルのPCR(95oC−30秒、55oC−30秒、72oC−30秒)によりおこなわれた。得られた増幅産物はエタノール沈澱され、5'端ならびに3'端のBamHIおよびEcoRI認識配列が切断され、１％(w/v)アガロースゲル上で単離された後、BamHI／EcoRIで切断されたpGEX2Tベクター(Pharmacia)にクローニングされた。個々のクローンのインサートは制限酵素切断分析によりスクリーニングされ、ダイターミネーター法(Applied  Biosystes)により配列決定されて正しいISP1とISP2融合遺伝子を有するクローンが同定された。
【０１３８】
得られたクローンよりプラスミドがミニプレップ法により精製され，蛋白質生成誘発のため引き続いて大腸菌BLー21株に導入された。両融合蛋白質クローンの100mlカルチャーはアンピシリンが添加された(50mg/ml)2xYT培養液中で対数増殖期まで培養された後、IPTGが添加され(0.5mM)、30oCで一夜培養してGST−ISP1およびGST−ISP2の両融合蛋白質の発現が誘発された。融合プラスミド培養液ならびにそれに相当するpGEX−2Tプラスミドのみの培養液の一部分が超音波処理により溶解されSDS−PAGEにより分析された(図17)。融合蛋白質精製には、遠心により得られた封入体が分取用SDS−PAGEにより分離精製された。クマシーブリリアントブルー染色後、融合蛋白質バンドが切り出され透析メンブレン中で溶出、PBSに対して透析，凍結乾燥、そして2mlのPBS中に再溶解された。蛋白質濃度はSDS−PAGE上標準マーカーとの比較によりにより推定された。
【０１３９】
ISP1とISP2のGST融合蛋白質10mgが100mlのFreundsの完全アジュバントと混合されてマウスの最初の免疫化に使用された。生後６週目のBALB  C雌マウス(Charles  River)(計15匹)が100mlのFreundsの完全アジュバントと混合されたISP1とISP2のGST融合蛋白質(10mg)の腹腔内注入により免疫化された。それと並行して、陰性コントロールとして５匹の雌がFreundの完全アジュバントのみを用いて模擬免疫化された。マウスはFreundの不完全アジュバント(100ml/接種）と混合された両融合蛋白質(10mg)の腹腔内接種により3週置きに４回ブーストされた。３度目のブーストに先立ち、各マウスの尾静脈より100mlの血液が収集され、ISP1とISP2の融合蛋白質に対するウエスタンブロットで免疫反応が各実験マウス中で特異的に起きていることを確認した。
【０１４０】
最終ブースト１週間後、BALB  C雄マウスが免疫化された雌マウス、あるいは模擬免疫化された雌マウス、と交尾され雌マウスの受胎能に対するISP免疫化の効果が調査された。膣プラグ識別後、妊娠中期から後期にかけてのマウスが頸椎脱臼により犠牲にされ、胎児の有無が確認された。その結果(表2)は、ISP1およびISP2免疫化が免疫処理されたマウス(A1−A5,B1−B5とC1−C5)の胎児数に有意差のある減少を起こしたのに対して、Freundのアジュバントのみを受け取ったコントロール。マウス(D1−D5)の胎児数は正常であった。それゆえ、ISP1およびISP2免疫化はマウスの受胎能力を減少させ、ISP1およびISP2が受胎に必須であることを確認した。
【０１４１】
【表２】
2004535169.tif 000002
【０１４２】
グループA,BおよびCのマウスはFreundのアジュバント中に混合されたISP1−GST融合蛋白質ならびにISP2−GST融合蛋白質により免疫化された。それと並行にコントロールマウス(グループD)はFreundのアジュバントのみで処理された。
【０１４３】
例１２
マウスISP1ならびにISP2のゲノム核酸配列の産生
ISP1およびISP2のゲノム核酸配列を単離するために、ラムダTKベクター(Woltjenら,2000年)中に作成されたSau3AI限定分解マウスES細胞ゲノムライブラリーをISP1およびISP2cDNAの３２P標識プローブによりプラークハイブリダイゼーションでスクリーンした。標準ハイブリダイゼーション条件(5xSSC,5XDenharts,0.5%SDS,65oC)ならびにストリンジェントな洗浄条件(0.1XSSC,0.5%SDS,65oC)が特異的なクローンを分離するのに使用された。個々のファージ。クローンは大規模なスケールで培養され、CsCl平衡密度勾配遠心法によりDNA塩基配列決定のための高純度DNAが得られた。
【０１４４】
各ISP遺伝子を含むゲノム領域は5'および3'非翻訳領域の間を目的としたプライマーを用いてファージよりPCRにより増幅された。ISP1については2.2kbのゲノム断片が下記のプライマー、TaqポリメラーゼとPCR条件により分離された。
5'−UTR: 5'−ATATGAATTCGACTGTTGCTCCTGGCTCTC−3'(配列ID番号:28);
3'−UTR:5'−ATATCTCGAGTGAGAAGATTGATGGCAGAT−3'(配列ID番号:29);ならびに95oC−3分;(95oC−1分;58oC−1分;72oC−3分)X35サイクル;72oC−7分;4oCで一夜保存。
【０１４５】
ISP2については3.8kbのゲノム断片が下記のプライマー、TaqポリメラーゼとPCR条件により分離された。
5'−UTR: 5'−ATATGAATTCCGTCCTGTGAGTGGTTCTCA−3'(配列ID番号:30);
3'−UTR:5'−ATATAAGCTTAGGAAGCCAGGAAACTGAGC−3'(配列ID番号:31);ならびに95oC−3分;(95oC−1分;63oC−1分;72oC−5分)X35サイクル;72oC−7分;4oCで一夜保存
【０１４６】
これらのプライマーはPCR産物の末端に制限酵素認識配列を導入しpBluescriptKS+ベクター(Stratagene  Inc,La  Jolla,CA)へのサブクローニングを容易とした．ISP1ゲノム断片は5'EcoRIおよび3'XhoI認識配列を用いてサブクローンされた。ISP2ゲノム断片はEcoRIおよびHindIII認識配列を用いてサブクローンされた。各遺伝子について4つの代表的クローンが分離されダイプライマー法(Perkin  Elmer−Applied  Biosystems,Foster  City,CA)により配列決定された。末端部分の塩基配列はまずベクター特異的なシークエンシング。プライマーを用いて決定された。内部の塩基配列はISP1あるいはISP2のエクソン特異的なプライマーを用いて「sequence  walk」によって決定された。さらに、5'および3'最末端の塩基配列は最初のバクテリオファージ中のゲノムクローンより直接に決定された。
【０１４７】
ゲノム塩基配列は図18(ISP1ゲノム;配列ID番号:25)および図19(ISP2ゲノム;配列ID番号:26)にそれぞれ提示される。
【０１４８】
例１３
ヒトISP2cDNA配列の同定
ヒトISP2オーソログは高速ゲノムDNAシークエンシング法により産生されたヒトゲノム塩基配列から予測された。マウスISP2cDNA塩基配列を用いたNCBIデータベース(www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/)のblastn検索およびblastx検索(Altschulら,1997)によりヒトのオーソログと推測される配列が同定された。両検索ともに強い相同性を同一領域(AE006466ホモサピエンス16p13.3シークエンス、８のうちの５番目のセクションの塩基197,185と塩基199,032の間の領域)(Danielsら,2001年)に見い出した。この領域内のヒトISP2cDNA配列はGenScan(BurgeとKarlin,1997年)により予測されBlastpアラインメントツール(Altschulら,1997年)を用いてISP2蛋白質配列と並べられた。このオーソログの発現はヒト子宮および胎盤由来のRNA、ならびに予測されたヒトISP2遺伝子に対するプライマー（5'−CTGGGTGCGGATGTGGCCCTGCTCC−3':配列ID番号32;  5'−CTGCAGGCGGTAGGGCGGCGGCAGCG−3':配列ID番号33)を用いたRT−PCRにより確認された。使用されたPCR条件は(95oC−1分;58oC−1分;72oC−3分)X35サイクル;72oC−7分;4oCにて一夜保存、であった。
【０１４９】
このようにして同定されたヒトISP2(hISP2)のアミノ酸配列(配列ID番号:27)は図20に示され、ISP1およびISP2と比較されている。ヒトISP2のcDNA配列(配列ID番号:34)は図21に示される。
【図面の簡単な説明】
【０１５０】
【図１】マウス着床部位RNAより得られた ISP1cDNAの同定(a)  胎生6.5日目の胚／脱落膜のRNAとセリンプロテアーゼの保存配列領域(ヒスチヂン領域とセリン領域)に対する変性プライマーを用いた活性サイトRT−PCRは三つの400−500bp断片を産生する。(b)  胎生6.5日目の胚／脱落膜のpoly(A+)RNAのノーザン分析はISP1cDNAにハイブリダイゼーションする1.3kbのmRNAを検出する。
【図２】着床時および発生過程におけるマウスISP2遺伝子の発現(a)  胎生6.5日目の胚／脱落膜のpoly(A+)RNAのノーザン分析はISP2cDNAにハイブリダイズする1.3kbのmRNAを検出する。(b)  RT−PCRにより検出された発生過程におけるISP2(上段パネル)ならびにGAPDH(コントロール)の発現。ISP2遺伝子は胎生6.5日目の着床部位(1)で発現されるが胎生8.5日目(2)ならびに胎生13.5日目(3)の妊娠時には検出されない。ISP2遺伝子の発現は胎生11.5日目(4),  胎生13.5日目(5)の妊娠時の胎盤RNA、ならびに胎生13.5日目(6)の胎児にも見られる。ISP2遺伝子の発現は孵化時(7)あるいはアウトグロウス（outgrowth)する胚盤胞(8)では見られない。
【図３】マウスISP1cDNAの核酸塩基配列(配列ID番号:1)
【図４】マウスISP２cDNAの核酸塩基配列(配列ID番号:2)
【図５】ISP1に予測されるアミノ酸配列(配列ID番号:3)と関連セリンプロテアーゼとのアラインメント。  同一アミノ酸は黒く囲われ、同類アミノ酸は灰色で囲われている。プリならびにプロ蛋白切断サイトは矢印で示される。ヒスチヂンならびにセリン活性サイトの 共通配列は下線により示される。
【図６】ISP2に予測されるアミノ酸配列(配列ID番号:4)と関連セリンプロテアーゼとのアラインメント。  同一アミノ酸は黒く囲われ、同類アミノ酸は灰色で囲われている。プリならびにプロ切断サイトは矢印で示される。ヒスチヂンならびにセリン活性サイトの 共通配列は下線により示される。
【図７】代表的なセリンプロテアーゼの関係を示す樹状図。  ISPはエラスターゼ／キモトリプシンならびにマスト細胞プロテアーゼの群よりほぼ同時に分岐したS1プロテアーゼ超科の内で特異的な枝を成す。
【図８】RT-PCRによって検知される着床前胚盤胞におけるISP1の発現。(a)  生体外において孵化(１)あるいはアウトグロウス（outgrowth)(２)する胚盤胞におけるISP1の発現。(b)  受精卵(３)、桑実胚(４)、あるいは胚盤胞(５)として収集された着床前の胚におけるISP1の発現。着床部位(６)における ISP1の発現。(c)  胎生3.0日目の胚盤胞(７)、アンチセンス。オリゴヌクレオチドで処理された胚盤胞(８)、ならびにコントロール。オリゴヌクレオチドで処理された胚盤胞(９)における ISP1の発現。GAPDHがコントロールとして用いられた。
【図９】桑実胚ならびに胚盤胞におけるISP1遺伝子の発現。桑実胚(a,b)および胚盤胞(c,d)はセンス(コントロール)(a,c)ならびにアンチセンス(b,d)  ISP1プローブを用いたホールマウント本来の位置のハイブリダイゼーションにより染色された。
【図１０】ISP1アンチセンス。オリゴヌクレオチドによる胚盤胞の孵化阻害とstrypsin活性の組織化学的染色。(a)  コントロール。オリゴヌクレオチドで処理された胚盤胞は孵化できる。透明帯が薄くなるにつれ胚盤胞が胚子外の極に生ずる裂開より出現する。黒の矢印は孵化しつつある胚盤胞を示し、白い矢印は孵化後の抜け殻を示す。(b)  アンチセンス。オリゴヌクレオチドで処理された胚盤胞は孵化できない。孵化失敗後１日経って退化した胚が示される。 透明帯が厚くなっている事に気付く。(c)  (b)より１日前に胚が透明帯を圧迫するまでに成長したことを示す。黒の矢印は胚盤胞が一杯に膨張した際に非常に薄くなった透明帯を示す。(d)  コントロール。オリゴヌクレオチドで処理された胚盤胞ではstrypsin活性が正常に胚子外の極(白の矢印)に集中していることを示す。(e)  アンチセンス。オリゴヌクレオチドで処理された胚盤胞ではstrypsin活性が胚子外の極(白の矢印)にほとんど見られない。
【図１１】SS1オリゴヌクレオチド(コントロール)あるいはアンチセンスAS1オリゴヌクレオチド(試験)による時間依存的な胚盤胞孵化阻害。水(ブランク)は補足的コントロールとして使用されている。
【図１２】ISP1アンチセンス。オリゴヌクレオチドによる胚盤胞のアウトグロウス（outgrowth)阻害。(a)  孵化前にコントロール。オリゴヌクレオチドで処理された胚盤胞は正常に 細胞外基質を侵食できる。(b)   コントロール胚盤胞の拡大写真は侵食しつつある 栄養芽層(矢印)を示す。(c)  孵化前にアンチセンス。オリゴヌクレオチドで処理された胚盤胞は細胞外基質を侵食できない。(d)  細胞外基質を侵食しなかった(c)の胚盤胞の拡大写真は侵食する栄養芽層の不在を示す。反射光(矢印)が認識されるがこれは前にこの培養皿に敷かれた細胞外基質によるものである。
【図１３】縦状子宮切片の本来の位置のハイブリダイゼーションにより検出される妊娠マウスならびに処女マウスの着床時の子宮内膜腺におけるISP2mRNAの発現。強いシグナルが胎生7.5日目(a)および胎生8.5日目(b)では遠位に、胎生6.5日目(c)では着床部位間に見られる。ISP2mRNAは処女の子宮(d)、胎生2.5日目(e)あるいは胎生3.5日目(f)の子宮には見られないが、胎生4.5日目(g)ならびに胎生5.5日目(h)の子宮において初めて検出される。
【図１４】偽妊娠の子宮における脱落膜化に依存しないISP2遺伝子発現。プロゲステロンとエストロゲンによる前処理後、マウスの一方の子宮角に胡麻油を注入して脱落膜化を誘導した。ISP2遺伝子発現は偽妊娠マウスの脱落膜化した 子宮角でも(a) 脱落膜化しなかった子宮角でも(b)共に検出された。
【図１５】ホルモン処理された卵巣切除マウスの子宮ISP2mRNAの本来の位置のハイブリダイゼーション。  妊娠マウスは卵巣切除後ただちに(a,b,c)あるいは二週間の回復期間後(d.e.f)プロゲステロンとエストロゲンの組み合わせ(あるいはどちらか一方のみ)により処理され、子宮ISP2遺伝子の発現が検査された。ホルモン処理されなかったマウス(a),あるいはエストロゲンのみで処理されたマウス(c)では子宮内膜腺においてISP2mRNAは検出できない。遅延着床の間にプロゲステロン処理されたマウスの子宮内膜腺(b)においてISP2mRNAは検出される。卵巣切除そして長期間にわたるプロゲステロンの不在後もISP2遺伝子発現はプロゲステロン処理(d)によって引き起こされるが、エストロゲン(f)では引き起こす事ができない。プロゲステロン処理によって誘導されたISP2遺伝子の発現は附随的に投与されたエストロゲン(e)によってはほとんど変化しない。
【図１６】ISP2mRNAはRU486処理された妊娠および偽妊娠のマウスの子宮には検出されないことが本来の位置のハイブリダイゼーションにより示される。(a)  媒介体(油)処理された妊娠マウスの子宮ではISP2mRNAの強い染色が見られる 。(b)  RU486処理された妊娠マウスのより小さな子宮ではISP2mRNAの染色は見えない。 (c)  媒介体(油)処理された偽妊娠マウスの子宮では並みの強さのISP2mRNAの染色が見られる。 (d)   RU486処理された偽妊娠の子宮には ISP2mRNAの染色は見られない。
【図１７】ISP1とISP2のGST融合蛋白質。(A)  ISP1の一領域(上線で示された部分のアミノ酸配列)並びにISP2の一領域(下線で示された部分のアミノ酸配列)がpGEX−2Tベクター中にクローンされ融合蛋白合成がIPTGにより誘発された。この融合蛋白質は(B)に示されるようにポリアクリルアミドゲル電気泳動により分析された。
【図１８】ISP1のゲノム塩基配列(マウス;配列ID番号:25)。  エクソンの塩基配列は下線と太字で示され、翻訳開始コドン(ATG)ならびに停止コドン(TAG)には陰影がつけられた。
【図１９】ISP2のゲノム塩基配列(マウス;配列ID番号:26)。エクソンの塩基配列は下線と太字で示され、翻訳開始コドン(ATG)ならびに停止コドン(TAG)には陰影がつけられた。
【図２０】ISP2(配列ID番号:４),  ヒトISP2(hISP2;配列ID番号:27),  ならびにISP1(配列ID番号:3),  に予測されるアミノ酸配列のアラインメント。同一アミノ酸は黒で囲まれ、同類アミノ酸置換は灰色で囲まれている。プリならびにプロ蛋白切断サイトは矢印で示されている。ヒスチヂン(His)ならびにセリン(Ser)プロテアーゼに対する活性サイトの共通アミノ酸配列は下線により示されている。hISP2塩基配列内のX印はまだ明解でないイントロンーエクソン境界にあるアミノ酸残基を示す。
【図２１】ヒトISP2(配列ID番号:34)のcDNA塩基配列
【図１】
2004535169.tif 000003
【図２】
2004535169.tif 000004
【図３】
2004535169.tif 000005
【図４】
2004535169.tif 000006
【図５】
2004535169.tif 000007
【図６】
2004535169.tif 000008
【図７】
2004535169.tif 000009
【図８】
2004535169.tif 000010
【図９】
2004535169.tif 000011
【図１０】
2004535169.tif 000012
【図１１】
2004535169.tif 000013
【図１２】
2004535169.tif 000014
【図１３】
2004535169.tif 000015
【図１４】
2004535169.tif 000016
【図１５】
2004535169.tif 000017
【図１６】
2004535169.tif 000018
【図１７】
2004535169.tif 000019
【図１８−１】
2004535169.tif 000020
【図１８−２】
2004535169.tif 000021
【図１９−１】
2004535169.tif 000022
【図１９−２】
2004535169.tif 000023
【図２０】
2004535169.tif 000024
【図２１】
2004535169.tif 000025
【国際公開パンフレット】
2004535169.tif 000026
2004535169.tif 000027
2004535169.tif 000028
2004535169.tif 000029
2004535169.tif 000030
2004535169.tif 000031
2004535169.tif 000032
2004535169.tif 000033
2004535169.tif 000034
2004535169.tif 000035
2004535169.tif 000036
2004535169.tif 000037
2004535169.tif 000038
2004535169.tif 000039
2004535169.tif 000040
2004535169.tif 000041
2004535169.tif 000042
2004535169.tif 000043
2004535169.tif 000044
2004535169.tif 000045
2004535169.tif 000046
2004535169.tif 000047
2004535169.tif 000048
2004535169.tif 000049
2004535169.tif 000050
2004535169.tif 000051
2004535169.tif 000052
2004535169.tif 000053
2004535169.tif 000054
2004535169.tif 000055
2004535169.tif 000056
2004535169.tif 000057
2004535169.tif 000058
2004535169.tif 000059
2004535169.tif 000060
2004535169.tif 000061
2004535169.tif 000062
2004535169.tif 000063
2004535169.tif 000064
2004535169.tif 000065
2004535169.tif 000066
2004535169.tif 000067
2004535169.tif 000068
2004535169.tif 000069
2004535169.tif 000070
2004535169.tif 000071
2004535169.tif 000072
2004535169.tif 000073
2004535169.tif 000074
2004535169.tif 000075
2004535169.tif 000076
2004535169.tif 000077
2004535169.tif 000078
2004535169.tif 000079
2004535169.tif 000080
2004535169.tif 000081
2004535169.tif 000082
2004535169.tif 000083
2004535169.tif 000084
2004535169.tif 000085
2004535169.tif 000086
2004535169.tif 000087
2004535169.tif 000088
2004535169.tif 000089
2004535169.tif 000090
2004535169.tif 000091
2004535169.tif 000092
2004535169.tif 000093
2004535169.tif 000094
2004535169.tif 000095
2004535169.tif 000096
2004535169.tif 000097
2004535169.tif 000098
2004535169.tif 000099
2004535169.tif 000100
2004535169.tif 000101
2004535169.tif 000102
2004535169.tif 000103
2004535169.tif 000104
2004535169.tif 000105
2004535169.tif 000106
2004535169.tif 000107
2004535169.tif 000108
2004535169.tif 000109
2004535169.tif 000110
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004535169.tif 000111
【手続補正書】
【提出日】平成14年4月8日(2002.4.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
着床セリンプロテアーゼ（ＩＳＰ）蛋白質をコードする単離されたＤＮＡ。
【請求項２】
請求項１に記載のＤＮＡにおいて、当該ＤＮＡが
（ａ）配列ＩＤ番号：１、配列ＩＤ番号：２、および配列ＩＤ番号：４２からなる群から選択された配列と少なくともおよそ６０％の配列同一性を有するＤＮＡ；および
（ｂ）配列ＩＤ番号：１、配列ＩＤ番号：２、および配列ＩＤ番号：４２からなる群から選択された配列と０．５ｘＳＳＣおよび５０℃と等価のストリンジェンシィの下でハイブリダイズ可能なＤＮＡ；
からなる群から選択されたものであることを特徴とするＤＮＡ。
【請求項３】
請求項１に記載のＤＮＡにおいて、当該ＤＮＡが
（ａ）配列ＩＤ番号：１、配列ＩＤ番号：２、および配列ＩＤ番号：４２からなる群から選択された配列と少なくともおよそ７０％の配列同一性を有するＤＮＡ；および
（ｂ）配列ＩＤ番号：１、配列ＩＤ番号：２、および配列ＩＤ番号：４２からなる群から選択された配列と０．５ｘＳＳＣおよび５５℃と等価のストリンジェンシィの下でハイブリダイズ可能なＤＮＡ；
からなる群から選択されたものであることを特徴とするＤＮＡ。
【請求項４】
請求項１に記載のＤＮＡにおいて、当該ＤＮＡが
（ａ）配列ＩＤ番号：１、配列ＩＤ番号：２、および配列ＩＤ番号：４２からなる群から選択された配列と少なくともおよそ８０％の配列同一性を有するＤＮＡ；および；
（ｂ）配列ＩＤ番号：１、配列ＩＤ番号：２、および配列ＩＤ番号：４２からなる群から選択された配列と０．１ｘＳＳＣおよび５５℃と等価のストリンジェンシィの下でハイブリダイズ可能なＤＮＡ；
からなる群から選択されるたものであることを特徴とするＤＮＡ。
【請求項５】
請求項１に記載のＤＮＡにおいて、当該ＤＮＡが配列ＩＤ番号：１，配列ＩＤ番号：２、および、配列ＩＤ番号：４２からなる群から選択されたものであることを特徴とするＤＮＡ。
【請求項６】
請求項１に記載のＤＮＡを具えることを特徴とするベクター。
【請求項７】
請求項６に記載のベクターを具えることを特徴とする細胞。
【請求項８】
請求項７に記載の細胞において、当該細胞が真核細胞であることを特徴とする細胞。
【請求項９】
精製されたＩＳＰ蛋白質。
【請求項１０】
請求項９に記載の蛋白質において、当該蛋白質が遺伝子組み換え蛋白質であることを特徴とする蛋白質。
【請求項１１】
請求項９に記載の蛋白質において、当該蛋白質が、配列ＩＤ番号：３、配列ＩＤ番号：４、配列ＩＤ番号２７からなる群から選択された配列と少なくともおよそ５０％の配列同一性を有することを特徴とする蛋白質。
【請求項１２】
請求項９に記載の蛋白質において、当該蛋白質が、配列ＩＤ番号：３、配列ＩＤ番号：４、配列ＩＤ番号２７からなる群から選択された配列と少なくともおよそ６０％の配列同一性を有することを特徴とする蛋白質。
【請求項１３】
請求項９に記載の蛋白質において、当該蛋白質が、配列ＩＤ番号：３、配列ＩＤ番号：４、配列ＩＤ番号２７からなる群から選択された配列と少なくともおよそ７０％の配列同一性を有することを特徴とする蛋白質。
【請求項１４】
請求項９に記載の蛋白質において、当該蛋白質が、配列ＩＤ番号：３、配列ＩＤ番号：４、配列ＩＤ番号２７からなる群から選択された配列と少なくともおよそ８０％の配列同一性を有することを特徴とする蛋白質。
【請求項１５】
請求項９に記載の蛋白質において、当該蛋白質が、配列ＩＤ番号：３、配列ＩＤ番号：４、配列ＩＤ番号２７からなる群から選択された配列と少なくともおよそ９０％の配列同一性を有することを特徴とする蛋白質。
【請求項１６】
請求項９に記載の蛋白質において、当該蛋白質が、配列ＩＤ番号：３、配列ＩＤ番号：４、配列ＩＤ番号２７からなる群から選択された配列を有することを特徴とする蛋白質。
【請求項１７】
遺伝子組み換えＩＳＰ蛋白質を生産する方法において、ＩＳＰ蛋白質をコードするＤＮＡを有する発現ベクターを構築するステップと、当該発現ベクターを適切な細胞へ導入し、形質転換体を選択するステップと、前記ＩＳＰ蛋白質生成に至る条件下で前記形質転換体を培養するステップと、前記ＩＳＰ蛋白質を回収するステップとを具えることを特徴とする方法。
【請求項１８】
請求項１７に記載の方法において、前記ＤＮＡが
（ａ）配列ＩＤ番号：１、配列ＩＤ番号：２、および配列ＩＤ番号：４２からなる群から選択された配列と少なくともおよそ６０％の配列同一性を有するＤＮＡ；および
（ｂ）配列ＩＤ番号：１、配列ＩＤ番号：２、および配列ＩＤ番号：４２からなる群から選択された配列と０．５ｘＳＳＣおよび５０℃と等価のストリンジェンシィの下でハイブリダイズ可能なＤＮＡ；
からなる群から選択されたものであることを特徴とする方法。
【請求項１９】
請求項１７に記載の方法において、前記ＤＮＡが
（ａ）配列ＩＤ番号：１、配列ＩＤ番号：２、および配列ＩＤ番号：４２からなる群から選択された配列と少なくともおよそ７０％の配列同一性を有するＤＮＡ；および
（ｂ）配列ＩＤ番号：１、配列ＩＤ番号：２、および配列ＩＤ番号：４２からなる群から選択された配列と０．５ｘＳＳＣおよび５５℃と等価のストリンジェンシィの下でハイブリダイズ可能なＤＮＡ；
からなる群から選択されたものであることを特徴とする方法。
【請求項２０】
請求項１７に記載の方法において、前記ＤＮＡが
（ａ）配列ＩＤ番号：１、配列ＩＤ番号：２、および配列ＩＤ番号：４２からなる群から選択された配列と少なくともおよそ８０％の配列同一性を有するＤＮＡ；および
（ｂ）配列ＩＤ番号：１、配列ＩＤ番号：２、および配列ＩＤ番号：４２からなる群から選択された配列と０．１ｘＳＳＣおよび５５℃と等価のストリンジェンシィの下でハイブリダイズ可能なＤＮＡ；
からなる群から選択されたものであることを特徴とする方法。
【請求項２１】
哺乳動物の避妊方法において、当該哺乳動物をＩＳＰ蛋白質、ＩＳＰ蛋白質をコードする核酸、あるいはＩＳＰ蛋白質または核酸の断片によって免疫化するステップを具えることを特徴とする方法。
【請求項２２】
請求項２１に記載の方法において、前記蛋白質が配列ＩＤ番号：３、配列ＩＤ番号：４、および配列ＩＤ番号：２７からなる群から選択される配列と少なくともおよそ７０％の配列同一性を有することを特徴とする方法。
【請求項２３】
請求項２１に記載の方法において、前記蛋白質が配列ＩＤ番号：３、配列ＩＤ番号：４、および配列ＩＤ番号：２７からなる群から選択される配列と少なくともおよそ８０％の配列同一性を有することを特徴とする方法。
【請求項２４】
請求項２１に記載の方法において、前記蛋白質が配列ＩＤ番号：３、配列ＩＤ番号：４、および配列ＩＤ番号：２７からなる群から選択される配列と少なくともおよそ９０％の配列同一性を有することを特徴とする方法。
【請求項２５】
請求項２１に記載の方法において、前記蛋白質が配列ＩＤ番号：３、配列ＩＤ番号：４、および配列ＩＤ番号：２７からなる群から選択される配列を有することを特徴とする方法。
【請求項２６】
請求項２１に記載の方法において、前記蛋白質が融合蛋白質であることを特徴とする方法。
【請求項２７】
請求項２１に記載の方法において、前記哺乳動物にアジュバンドを更に投与することを特徴とする方法。
【請求項２８】
ＩＳＰ１またはＩＳＰ２の抗原決定基を認識する分離された抗体。
【請求項２９】
請求項２８に記載の抗体において、当該抗体がモノクローナルであることを特徴とする抗体。
【請求項３０】
請求項２８に記載の抗体において、当該抗体がポリクローナルであることを特徴とする抗体。
【請求項３１】
請求項２８に記載の抗体において、当該抗体がＩＳＰ蛋白質を阻害できることを特徴とする抗体。
【請求項３２】
ＩＳＰ蛋白質またはＩＳＰ蛋白質をコードする核酸を具えることを特徴とする医薬品。
【請求項３３】
請求項３２に記載の医薬品において、更にアジュバンドを具えることを特徴とする医薬品。
【請求項３４】
請求項３２の医薬品において、前記ＩＳＰ蛋白質が配列ＩＤ番号：３、配列ＩＤ番号：４、および配列ＩＤ番号：２７からなる群から選択される配列と少なくともおよそ７０％の配列同一性を有することを特徴とする方法。
【請求項３５】
請求項３２の医薬品において、前記ＩＳＰ蛋白質が配列ＩＤ番号：３、配列ＩＤ番号：４、および配列ＩＤ番号：２７からなる群から選択される配列と少なくともおよそ８０％の配列同一性を有することを特徴とする方法。
【請求項３６】
請求項３２の医薬品において、前記ＩＳＰ蛋白質が配列ＩＤ番号：３、配列ＩＤ番号：４、および配列ＩＤ番号：２７からなる群から選択される配列と少なくともおよそ９０％の配列同一性を有することを特徴とする方法。
【請求項３７】
請求項３２の医薬品において、前記ＩＳＰ蛋白質が配列ＩＤ番号：３、配列ＩＤ番号：４、および配列ＩＤ番号：２７からなる群から選択される配列を有することを特徴とする方法。
【請求項３８】
哺乳動物の避妊方法において、ＩＳＰ１、ＩＳＰ２，ｈＩＳＰ−２からなる群から選択された蛋白質に対する阻害剤を避妊に帰着する条件下で哺乳動物に投与することを特徴とする避妊方法。
【請求項３９】
請求項３８に記載の方法において、前記阻害剤が抗体であることを特徴とする方法。
【請求項４０】
請求項３８に記載の方法において、前記阻害剤がアンチセンスオリゴヌクレオチドであることを特徴とする方法。
【請求項４１】
避妊に有用な医薬品において、ＩＳＰ１、ＩＳＰ２，ｈＩＳＰ−２からなる群から選択された蛋白質に対する阻害剤を具えることを特徴とする医薬品。
【請求項４２】
請求項４１に記載の医薬品において、前記阻害剤が抗体であることを特徴とする医薬品。
【請求項４３】
請求項４１に記載の医薬品において、前記阻害剤がアンチセンスオリゴヌクレオチドであることを特徴とする医薬品。
【請求項４４】
ＩＳＰ１、ＩＳＰ２，ｈＩＳＰ−２からなる群から選択された蛋白質に対する阻害剤をスクリーニングする方法において、前記蛋白質の活性測定法を提供するステップと、前記測定法における前記蛋白質の活性に対する候補化合物の影響を決定するステップと、前記蛋白質の活性を阻害しうる候補化合物としての阻害剤を同定するステップとを具えることを特徴とする方法。
【請求項４５】
請求項４４に記載の方法において、前記同定された阻害剤が避妊に有用であることを特徴とする方法。
【請求項４６】
哺乳動物の不妊診断方法において、ＩＳＰ１、ＩＳＰ２，ｈＩＳＰ−２からなる群から選択された蛋白質の活性測定法を提供するステップと、前記哺乳動物から生体試料を得るステップと、当該生体試料を前記測定法にて検査するステップと、前記蛋白質の活性レベルが低い場合に前記哺乳動物が不妊であると診断する方法。
【請求項４７】
不妊の治療または改善方法において、有効量のＩＳＰ蛋白質あるいはＩＳＰ蛋白質をコードする核酸を哺乳動物に投与することを特徴とする方法。
【請求項４８】
請求項４７に記載の方法において、前記ＩＳＰ蛋白質が、配列ＩＤ番号：３、配列ＩＤ番号：４、及び配列ＩＤ番号：２７からなる群から選択される配列と少なくともおよそ６０％の配列同一性を有するものであることを特徴とする方法。
【請求項４９】
請求項４７に記載の方法において、前記ＩＳＰ蛋白質が、配列ＩＤ番号：３、配列ＩＤ番号：４、及び配列ＩＤ番号：２７からなる群から選択される配列と少なくともおよそ７０％の配列同一性を有するものであることを特徴とする方法。
【請求項５０】
請求項４７に記載の方法において、前記ＩＳＰ蛋白質が、配列ＩＤ番号：３、配列ＩＤ番号：４、及び配列ＩＤ番号：２７からなる群から選択される配列と少なくともおよそ８０％の配列同一性を有するものであることを特徴とする方法。
【請求項５１】
請求項４７に記載の方法において、前記ＩＳＰ蛋白質が、配列ＩＤ番号：３、配列ＩＤ番号：４、及び配列ＩＤ番号：２７からなる群から選択される配列と少なくともおよそ９０％の配列同一性を有するものであることを特徴とする方法。
【請求項５２】
請求項４７に記載の方法において、前記ＩＳＰ蛋白質が、配列ＩＤ番号：３、配列ＩＤ番号：４、及び配列ＩＤ番号：２７からなる群から選択される配列を有するものであることを特徴とする方法。
【請求項５３】
培養胚の着床率を増大させる方法において、当該培養胚を雌の哺乳動物の子宮に転置する前に、ＩＳＰ蛋白質と接触させることを特徴とする方法。
【請求項５４】
請求項５３に記載の方法において、前記哺乳動物がヒトであることを特徴とする方法。
【請求項５５】
請求項５３に記載の方法において、前記ＩＳＰ蛋白質がＩＳＰ１、ＩＳＰ２、およびｈＩＳＰ―２からなる群から選択されたものであることを特徴とする方法。
【請求項５６】
配列ＩＤ番号：４２と少なくともおよそ９５％の配列同一性を有する精製されたＩＳＰ蛋白質。
【請求項５７】
配列ＩＤ番号：４２の配列を有する精製されたＩＳＰ蛋白質。
【請求項５８】
請求項５６に記載の蛋白質をコードする単離されたＤＮＡ。
【請求項５９】
請求項５７に記載の蛋白質をコードする単離されたＤＮＡ。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図面の簡単な説明
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図面の簡単な説明】
【図１】マウス着床部位RNAより得られた ISP1cDNAの同定
(a)  胎生6.5日目の胚／脱落膜のRNAとセリンプロテアーゼの保存配列領域(ヒスチヂン領域とセリン領域)に対するdegenerateプライマーを用いた活性サイトRT&#8212;PCRは三つの400&#8212;500bp断片を産生する。
(b)  胎生6.5日目の胚／脱落膜のpoly(A+)RNAのノーザン分析はISP1cDNAにハイブリダイゼーションする1.3kbのmRNAを検出する。
【図２】着床時および発生過程におけるマウスISP2遺伝子の発現
(a)  胎生6.5日目の胚／脱落膜のpoly(A+)RNAのノーザン分析はISP2cDNAにハイブリダイズする1.3kbのmRNAを検出する。
(b)  RT&#8212;PCRにより検出された発生過程におけるISP2(上段パネル)ならびにGAPDH(コントロール)の発現。ISP2遺伝子は胎生6.5日目の着床部位(1)で発現されるが胎生8.5日目(2)ならびに胎生13.5日目(3)の妊娠時には検出されない。ISP2遺伝子の発現は胎生11.5日目(4),  胎生13.5日目(5)の妊娠時の胎盤RNA、ならびに胎生13.5日目(6)の胎児にも見られる。ISP2遺伝子の発現は孵化時(7)あるいはoutgrowthする胚盤胞(8)では見られない。
【図３】マウスISP1cDNAの核酸塩基配列(配列ID番号:1)
【図４】マウスISP２cDNAの核酸塩基配列(配列ID番号:2)
【図５】ISP1に予測されるアミノ酸配列(配列ID番号:3)と関連セリンプロテアーゼとのアラインメント。
同一アミノ酸は黒く囲われ、同類アミノ酸は灰色で囲われている。プリならびにプロ蛋白切断サイトは矢印で示される。ヒスチヂンならびにセリン活性サイトの 共通配列は下線により示される。
【図６】ISP2に予測されるアミノ酸配列(配列ID番号:4)と関連セリンプロテアーゼとのアラインメント。
同一アミノ酸は黒く囲われ、同類アミノ酸は灰色で囲われている。プリならびにプロ切断サイトは矢印で示される。ヒスチヂンならびにセリン活性サイトの 共通配列は下線により示される。
【図７】代表的なセリンプロテアーゼの関係を示す樹状図。
ISPはエラスターゼ／キモトリプシンならびにマスト細胞プロテアーゼの群よりほぼ同時に分岐したS1プロテアーゼ超科の内で特異的な枝を成す。
【図８】RT-PCRによって検知される着床前胚盤胞におけるISP1の発現。
(a)  生体外において孵化(１)あるいはoutgrowth(２)する胚盤胞におけるISP1の発現。
(b)  受精卵(３)、桑実胚(４)、あるいは胚盤胞(５)として収集された着床前の胚におけるISP1の発現。着床部位(６)における ISP1の発現。
(c)  胎生3.0日目の胚盤胞(７)、アンチセンス。オリゴヌクレオチドで処理された胚盤胞(８)、ならびにコントロール。オリゴヌクレオチドで処理された胚盤胞(９)における ISP1の発現。GAPDHがコントロールとして用いられた。
【図９】桑実胚ならびに胚盤胞におけるISP1遺伝子の発現。
桑実胚(a,b)および胚盤胞(c,d)はセンス(コントロール)(a,c)ならびにアンチセンス(b,d)  ISP1プローブを用いたホールマウント  in  situ  ハイブリダイゼーションにより染色された。
【図１０】ISP1アンチセンス。オリゴヌクレオチドによる胚盤胞の孵化阻害とstrypsin活性の組織化学的染色。
(a)  コントロール。オリゴヌクレオチドで処理された胚盤胞は孵化できる。透明帯が薄くなるにつれ胚盤胞がabembryonic  poleに生ずる裂開より出現する。黒の矢印は孵化しつつある胚盤胞を示し、白い矢印は孵化後の抜け殻を示す。
(b)  アンチセンス。オリゴヌクレオチドで処理された胚盤胞は孵化できない。孵化失敗後１日経って退化した胚が示される。 透明帯が厚くなっている事に気付く。
(c)  (b)より１日前に胚が透明帯を圧迫するまでに成長したことを示す。黒の矢印は胚盤胞が一杯に膨張した際に非常に薄くなった透明帯を示す。
(d)  コントロール。オリゴヌクレオチドで処理された胚盤胞ではstrypsin活性が正常にabembryonic  pole(白の矢印)に集中していることを示す。
(e)  アンチセンス。オリゴヌクレオチドで処理された胚盤胞ではstrypsin活性がabembryonic  pole(白の矢印)にほとんど見られない。
【図１１】SS1オリゴヌクレオチド(コントロール)あるいはアンチセンスAS1オリゴヌクレオチド(試験)による時間依存的な胚盤胞孵化阻害。水(ブランク)は補足的コントロールとして使用されている。
【図１２】ISP1アンチセンス。オリゴヌクレオチドによる胚盤胞のoutgrowth阻害。
(a)  孵化前にコントロール。オリゴヌクレオチドで処理された胚盤胞は正常に 細胞外基質を侵食できる。
(b)   コントロール胚盤胞の拡大写真は侵食しつつある 栄養芽層(矢印)を示す。
(c)  孵化前にアンチセンス。オリゴヌクレオチドで処理された胚盤胞は細胞外基質を侵食できない。
(d)  細胞外基質を侵食しなかった(c)の胚盤胞の拡大写真は侵食する栄養芽層の不在を示す。反射光(矢印)が認識されるがこれは前にこの培養皿に敷かれた細胞外基質によるものである。
【図１３】縦状子宮切片のin  situ  ハイブリダイゼーションにより検出される妊娠マウスならびに処女マウスの着床時の子宮内膜腺におけるISP2mRNAの発現。
強いシグナルが胎生7.5日目(a)および胎生8.5日目(b)では遠位に、胎生6.5日目(c)では着床部位間に見られる。ISP2mRNAは処女の子宮(d)、胎生2.5日目(e)あるいは胎生3.5日目(f)の子宮には見られないが、胎生4.5日目(g)ならびに胎生5.5日目(h)の子宮において初めて検出される。
【図１４】偽妊娠の子宮における脱落膜化に依存しないISP2遺伝子発現。
プロゲステロンとエストロゲンによる前処理後、マウスの一方の子宮角に胡麻油を注入して脱落膜化を誘導した。ISP2遺伝子発現は偽妊娠マウスの脱落膜化した 子宮角でも(a) 脱落膜化しなかった子宮角でも(b)共に検出された。
【図１５】ホルモン処理された卵巣切除マウスの子宮ISP2mRNAのin  situ  ハイブリダイゼーション。
妊娠マウスは卵巣切除後ただちに(a,b,c)あるいは二週間の回復期間後(d.e.f)プロゲステロンとエストロゲンの組み合わせ(あるいはどちらか一方のみ)により処理され、子宮ISP2遺伝子の発現が検査された。ホルモン処理されなかったマウス(a),あるいはエストロゲンのみで処理されたマウス(c)では子宮内膜腺においてISP2mRNAは検出できない。遅延着床の間にプロゲステロン処理されたマウスの子宮内膜腺(b)においてISP2mRNAは検出される。卵巣切除そして長期間にわたるプロゲステロンの不在後もISP2遺伝子発現はプロゲステロン処理(d)によって引き起こされるが、エストロゲン(f)では引き起こす事ができない。プロゲステロン処理によって誘導されたISP2遺伝子の発現は附随的に投与されたエストロゲン(e)によってはほとんど変化しない。
【図１６】ISP2mRNAはRU486処理された妊娠および偽妊娠のマウスの子宮には検出されないことが  in  situ  ハイブリダイゼーションにより示される。
(a)  媒介体(油)処理された妊娠マウスの子宮ではISP2mRNAの強い染色が見られる 。
(b)  RU486処理された妊娠マウスのより小さな子宮ではISP2mRNAの染色は見えない。
(c)  媒介体(油)処理された偽妊娠マウスの子宮では並みの強さのISP2mRNAの染色が見られる。
(d)   RU486処理された偽妊娠の子宮には ISP2mRNAの染色は見られない。
【図１７】ISP1とISP2のGST融合蛋白質。(A)  ISP1の一領域(上線で示された部分のアミノ酸配列)並びにISP2の一領域(下線で示された部分のアミノ酸配列)がpGEX&#8212;2Tベクター中にクローンされ融合蛋白合成がIPTGにより誘発された。この融合蛋白質は(B)に示されるようにポリアクリルアミドゲル電気泳動により分析された。
【図１８】ISP1のゲノム塩基配列(マウス;配列ID番号:25)。  エクソンの塩基配列は下線と太字で示され、翻訳開始コドン(ATG)ならびに停止コドン(TAG)には陰影がつけられた。
【図１９】ISP2のゲノム塩基配列(マウス;配列ID番号:26)。エクソンの塩基配列は下線と太字で示され、翻訳開始コドン(ATG)ならびに停止コドン(TAG)には陰影がつけられた。
【図２０】ISP2(配列ID番号:42),  ヒトISP2(hISP2;配列ID番号:27),  ならびにISP1(配列ID番号:3),  に予測されるアミノ酸配列のアラインメント。同一アミノ酸は黒で囲まれ、同類アミノ酸置換は灰色で囲まれている。プリならびにプロ蛋白切断サイトは矢印で示されている。ヒスチヂン(His)ならびにセリン(Ser)プロテアーゼに対する活性サイトの共通アミノ酸配列は下線により示されている。hISP2塩基配列内のX印はまだ明解でないイントロンーエクソン境界にあるアミノ酸残基を示す。
【図２１】ヒトISP2(配列ID番号:34)のcDNA塩基配列


【手続補正３】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図２０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図２０】
2004535169.tif 000112
【国際調査報告】
2004535169.tif 000113
2004535169.tif 000114
2004535169.tif 000115
2004535169.tif 000116
2004535169.tif 000117
2004535169.tif 000118