(57)【要約】本発明は、免疫グロブリンレベル、特にＩｇＡおよび／またはＩｇＧレベルの測定を用いて、ウマにおいて、成績および遂行潜在能力を評価する方法に関する。本発明はまた、ストレス要因、特に身体ストレス要因に曝露されたウマにおいて、成績低下、疲労および／または感染に対する感受性を予測する方法にも関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ストレス要因に曝露されたウマにおいて、遂行潜在能力、成績低下、疲労および／または感染に対する潜在的な感受性を予測する方法であって：
（ａ）訓練期の免疫グロブリンＡ（ＩｇＡ）および／または免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）レベルを測定し；そして
（ｂ）あらかじめ決定した閾値と、訓練期のＩｇＡおよび／またはＩｇＧレベルを比較することによって、成績低下、疲労および／または感染に対する感受性を予測する
ことを含む、前記方法。
【請求項２】
ウマの身体訓練プログラムの適切さを評価し、そして／または監視する方法であって：
（ａ）訓練期前のＩｇＡおよび／またはＩｇＧレベルを測定し；
（ｂ）訓練期中のＩｇＡおよび／またはＩｇＧレベルを、間隔を置いて測定し、そして
（ｃ）訓練期前のＩｇＡおよび／またはＩｇＧレベルと、訓練期中のＩｇＡレベルを比較し、そしてそれによって、身体訓練プログラムの適切さを評価する
ことを含む、前記方法。
【請求項３】
本明細書に定義するように、ウマの成績および／または疲労レベルに対するストレス要因の影響を評価する方法であって：
（ａ）唾液ＩｇＡおよび／またはＩｇＧレベルを測定し；そして
（ｂ）あらかじめ決定した閾値と、前記ＩｇＡおよび／またはＩｇＧレベルを比較することによって、ウマの成績および／または疲労レベルに対するストレス要因の影響を評価する
ことを含む、前記方法。
【請求項４】
ウマにおいて、呼吸器感染に対する潜在的な感受性を評価する方法であって：
（ａ）訓練初期の唾液ＩｇＡおよび／またはＩｇＧレベルを測定し；そして
（ｂ）あらかじめ決定した閾値と、訓練初期のＩｇＡおよび／またはＩｇＧレベルを比較することによって、呼吸器感染に対する潜在的な感受性を予測する
ことを含む、前記方法。
【請求項５】
ウマにおいて、疲労／感染に対する潜在的な感受性を評価する方法であって：
（ａ）ストレス要因への曝露後、ＩｇＡおよび／またはＩｇＧレベルを測定し；
（ｂ）本明細書に定義するような回復期間を許容し；
（ｃ）回復期間後、ＩｇＡおよび／またはＩｇＧレベルを測定し；
（ｄ）上記工程（ｃ）のＩｇＡおよび／またはＩｇＧレベルと、上記工程（ａ）のＩｇＡおよび／またはＩｇＧレベルを比較することによって、疲労／感染に対する潜在的な感受性を予測する
ことを含む、前記方法。
【請求項６】
ウマの訓練プログラムを設計する方法であって：
（ａ）訓練開始前、
（ｂ）訓練初期、
（ｃ）最適訓練期中および／または競争または重度の身体ストレス中
の一つ以上から選択される時点で、唾液ＩｇＡおよび／またはＩｇＧレベルを測定することを含む、前記方法。
【請求項７】
ウマの訓練プログラムを設計する方法であって：
（ａ）訓練開始前に、唾液ＩｇＡおよび／またはＩｇＧレベルを測定し、
（ｂ）訓練初期に、唾液ＩｇＡおよび／またはＩｇＧレベルを測定し、
（ｃ）最適訓練期中および／または競争または重度の身体ストレス中に、唾液ＩｇＡおよび／またはＩｇＧレベルを測定し、
（ｄ）工程（ａ）から（ｃ）で得たレベルを用いて、そのウマに関するＩｇＡおよび／またはＩｇＧプロフィールを作成して、安定したレベルのＩｇＡおよび／またはＩｇＧを維持する訓練プログラムを設計する
ことを含む、前記方法。
【請求項８】
工程（ｄ）の訓練プログラムを、ＩｇＡおよび／またはＩｇＧレベルがあらかじめ決定したレベルより下に落ちないように設計する、請求項７記載の方法。
【請求項９】
ウマの遂行潜在能力を評価する方法であって：
（ａ）訓練開始前に、免疫グロブリンＡ（ＩｇＡ）および／または免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）レベルを測定し；そして
（ｂ）あらかじめ決定した閾値と、ＩｇＡおよび／またはＩｇＧレベルを比較することによって、遂行潜在能力が劣っていることを予測する
ことを含む、前記方法。
【請求項１０】
ウマの遂行潜在能力を評価する方法であって：
（ａ）訓練開始前に、ＩｇＡおよび／またはＩｇＧレベルを測定し、
（ｂ）訓練初期に、ＩｇＡおよび／またはＩｇＧレベルを測定し、
（ｃ）工程（ａ）から（ｂ）で得たレベルを用いて、そのウマに関するＩｇＡおよび／またはＩｇＧプロフィールを作成し、そして前記プロフィールを用いて、あらかじめ決定した閾値と、該ＩｇＡおよび／またはＩｇＧレベルを比較することによって、遂行潜在能力が劣っていることを予測する
ことを含む、前記方法。
【請求項１１】
ウマが訓練プログラムを完了する能力を予測する方法であって：
（ａ）訓練開始前に、ＩｇＡおよび／またはＩｇＧレベルを測定し、
（ｂ）訓練初期に、ＩｇＡおよび／またはＩｇＧレベルを測定し、
（ｃ）工程（ａ）から（ｂ）で得たレベルを用いて、そのウマに関するＩｇＡおよび／またはＩｇＧプロフィールを作成し、そして前記プロフィールを用いて、あらかじめ決定した閾値と、該ＩｇＡおよび／またはＩｇＧレベルを比較することによって、ウマが訓練プログラムを完了する能力を予測する
ことを含む、前記方法。
【請求項１２】
免疫グロブリンレベルを唾液中で測定する、請求項１から１１のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１３】
免疫グロブリンがＩｇＡまたはそのサブクラスである、請求項１から１２のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１４】
閾値が、正常ウマから得た試料中で決定した正常閾値である、請求項１から１３のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１５】
閾値が内部個体閾値である、請求項１から１３のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１６】
唾液試料が全未刺激唾液である、請求項１から１５のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１７】
ウマが競馬ウマまたは他の競争馬である、請求項１から１６のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１８】
ストレス要因が、免疫系の有効性に影響を与えることが知られる、請求項１から１７のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１９】
免疫グロブリンレベルを、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、免疫拡散およびそれらに匹敵するものからなる群より選択されるイムノアッセイによって測定する、請求項１から１８のいずれか１つに記載の方法。
【請求項２０】
アッセイ装置または系をウマの唾液と接触させることによって、免疫グロブリン含量に関して、ｉｎ  ｓｉｔｕで唾液を解析する、請求項１から１９のいずれか１つに記載の方法。
【請求項２１】
請求項１から２０のいずれか１つに記載の方法で用いる、アッセイ装置。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
技術分野
本発明は、成績低下、疲労および／または感染を検出する方法としての、生物学的液体における免疫グロブリンの測定に関する。より具体的には、本発明は、疲労、成績低下、あるいは成績低下、劣った遂行潜在能力および／または感染のリスクの決定要因としての、ウマにおける唾液ＩｇＡおよび／またはＩｇＧの測定に関する。
【０００２】
背景技術
相互方式で、唾液ＩｇＡレベルを運動選手の成績低下と関連付ける、有意なデータベースがヒトには存在する。最近のデータによって、本質的にすべての選り抜きの運動選手は、Ｂ細胞ゲノムに取り込まれたＥＢウイルスＤＮＡを有すること、そして疲労および成績低下の機構として、ＩｇＡレベルが低い選手では、不適切に多量の訓練をすると、ＥＢＶ排出が活性化されることが示されてきている。成績低下、疲労および／または感染を監視するアッセイを開発するための研究は、他のいかなる動物モデルでも行われてきていない。多様な生物学的液体における免疫グロブリンレベルを用いて、他の種いずれかで成績低下を監視するかまたは評価することが可能であるかどうか（ＥＢＶは、限定された数の動物種に特異的である）は未知である。より具体的には、ＥＢＶはウマに感染しない。
【０００３】
競馬ウマ、並びにポロおよびそれに匹敵するものなどの他のスポーツに参加するウマは、重度の競争ストレスと共に、訓練／運動ストレスに曝露される。運動レベルおよび競争によって課されるストレスを監視し、適切な訓練および休養プログラムが、適切な時、必要とされる場合に、提供されるのを可能にすることが重要であろう。
【０００４】
したがって、身体的または他のストレスに曝露されたウマにおいて、成績低下、疲労を監視し、そして／または感染に対する感受性を予測するか、あるいは劣った成績のリスクまたは遂行潜在能力を評価して、訓練プログラムの変更を行うか、または適切な場合に介入療法を用いることを可能にする、適切な試験が必要である。
【０００５】
先行技術の欠点を克服するかまたは改善し、あるいは有用な代替法を提供するのが本発明の目的である。
発明の概要
ヒトにおけるＩｇＡの測定は、ストレスが誘導する疲労および／または感染感受性の評価における有用なツールであることが立証されている。予期せぬことに、訓練または競争などの身体ストレスに曝露されたウマにおいて、唾液免疫グロブリンレベル、特にＩｇＡおよび／またはＩｇＧが、疲労および／または感染に対する感受性あるいは劣った潜在能力の指標となる可能性があることが、見出された。さらに、ストレス要因への曝露後に起こる、ＩｇＡおよび／またはＩｇＧレベルの低下が、迅速に回復されない場合、これらの免疫グロブリンレベルの長期の低下は、感染に対する感受性および／または疲労を生じ、そしてしたがって、成績の悪化を生じる。上述のように、低下したＩｇＡおよび／またはＩｇＧレベルは、疲労だけでなく、感染に対する感受性の指標でもある。したがって、ＩｇＡおよび／またはＩｇＧレベルの回復速度もまた、感染に対する感受性または遂行潜在能力の低下の優れた指標でもある。
【０００６】
第一の側面にしたがって、本発明は、ストレス要因に曝露されたウマにおいて、遂行潜在能力、成績低下、疲労および／または感染に対する潜在的な感受性を予測する方法であって：
（ａ）訓練期の免疫グロブリンＡ（ＩｇＡ）および／または免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）レベルを測定し；そして
（ｂ）あらかじめ決定した閾値と、訓練期のＩｇＡおよび／またはＩｇＧレベルを比較することによって、成績低下、疲労および／または感染に対する感受性を予測する
ことを含む、前記方法を提供する。
【０００７】
第二の側面にしたがって、本発明は、ウマの身体訓練プログラムの適切さを評価し、そして／または監視する方法であって：
（ａ）訓練期前のＩｇＡおよび／またはＩｇＧレベルを測定し；
（ｂ）訓練期中のＩｇＡおよび／またはＩｇＧレベルを、間隔を置いて測定し、そして
（ｃ）訓練期前のＩｇＡおよび／またはＩｇＧレベルと、訓練期中のＩｇＡレベルを比較し、そしてそれによって、身体訓練プログラムの適切さを評価する
ことを含む、前記方法を提供する。
【０００８】
第三の側面にしたがって、本発明は、本明細書に定義するように、ウマの成績および／または疲労レベルに対するストレス要因の影響を評価する方法であって：
（ａ）唾液ＩｇＡおよび／またはＩｇＧレベルを測定し；そして
（ｂ）あらかじめ決定した閾値と、前記ＩｇＡおよび／またはＩｇＧレベルを比較することによって、ウマの成績および／または疲労レベルに対するストレス要因の影響を評価する
ことを含む、前記方法を提供する。
【０００９】
第四の側面にしたがって、本発明は、ウマにおいて、呼吸器感染に対する潜在的な感受性を評価する方法であって：
（ａ）訓練初期の唾液ＩｇＡおよび／またはＩｇＧレベルを測定し；そして
（ｂ）あらかじめ決定した閾値と、訓練初期のＩｇＡおよび／またはＩｇＧレベルを比較することによって、呼吸器感染に対する潜在的な感受性を予測する
ことを含む、前記方法を提供する。
【００１０】
第五の側面にしたがって、本発明は、ウマにおいて、疲労／感染に対する潜在的な感受性、成績低下または遂行潜在能力を評価する方法であって：
（ａ）ストレス要因への曝露後、ＩｇＡおよび／またはＩｇＧレベルを測定し；
（ｂ）本明細書に定義するような回復期間を許容し；
（ｃ）回復期間後、ＩｇＡおよび／またはＩｇＧレベルを測定し；
（ｄ）上記工程（ｃ）のＩｇＡおよび／またはＩｇＧレベルと、上記工程（ａ）のＩｇＡおよび／またはＩｇＧレベルを比較することによって、疲労／感染に対する潜在的な感受性または成績低下を予測する
ことを含む、前記方法を提供する。
【００１１】
第六の側面にしたがって、本発明は、ウマの訓練プログラムを設計する方法であって：
（ａ）訓練開始前に、唾液ＩｇＡおよび／またはＩｇＧレベルを測定し、
（ｂ）訓練初期に、唾液ＩｇＡおよび／またはＩｇＧレベルを測定し、
（ｃ）最適訓練期中および／または競争または重度の身体ストレス中に、唾液ＩｇＡおよび／またはＩｇＧレベルを測定し、
（ｄ）工程（ａ）から（ｃ）で得たレベルを用いて、そのウマに関するＩｇＡおよび／またはＩｇＧプロフィールを作成して、安定したレベルのＩｇＡおよび／またはＩｇＧを維持する訓練プログラムを設計する
ことを含む、前記方法を提供する。
【００１２】
第七の側面にしたがって、本発明は、ウマの訓練プログラムを設計する方法であって、１以上の以下：
（ａ）訓練開始前、
（ｂ）訓練初期、
（ｃ）最適訓練期中および／または競争または重度の身体ストレス中
から選択される時点で、唾液ＩｇＡおよび／またはＩｇＧレベルを測定することを含む、前記方法を提供する。
【００１３】
第八の側面にしたがって、本発明は、ウマの遂行潜在能力を評価する方法であって：
（ａ）訓練開始前に、免疫グロブリンＡ（ＩｇＡ）および／または免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）レベルを測定し；そして
（ｂ）あらかじめ決定した閾値と、ＩｇＡおよび／またはＩｇＧレベルを比較することによって、遂行潜在能力が劣っていることを予測する
ことを含む、前記方法を提供する。
【００１４】
第九の側面にしたがって、本発明は、ウマの遂行潜在能力を評価する方法であって：
（ａ）訓練開始前に、ＩｇＡおよび／またはＩｇＧレベルを測定し、
（ｂ）訓練初期に、ＩｇＡおよび／またはＩｇＧレベルを測定し、
（ｃ）工程（ａ）から（ｂ）で得たレベルを用いて、そのウマに関するＩｇＡおよび／またはＩｇＧプロフィールを作成し、そして前記プロフィールを用いて、あらかじめ決定した閾値と、該ＩｇＡおよび／またはＩｇＧレベルを比較することによって、遂行潜在能力が劣っていることを予測する
ことを含む、前記方法を提供する。
【００１５】
第十の側面にしたがって、本発明は、ウマが訓練プログラムを完了する能力を予測する方法であって：
（ａ）訓練開始前に、ＩｇＡおよび／またはＩｇＧレベルを測定し、
（ｂ）訓練初期に、ＩｇＡおよび／またはＩｇＧレベルを測定し、
（ｃ）工程（ａ）から（ｂ）で得たレベルを用いて、そのウマに関するＩｇＡおよび／またはＩｇＧプロフィールを作成し、そして前記プロフィールを用いて、あらかじめ決定した閾値と、該ＩｇＡおよび／またはＩｇＧレベルを比較することによって、ウマが訓練プログラムを完了する能力を予測する
ことを含む、前記方法を提供する。
【００１６】
本発明の方法は、好ましくは、調教師の評価と組み合わせて用いる。
好ましくは、免疫グロブリンレベルは、最も侵襲性でないため、唾液中で測定するが、他の生物学的液体、例えば血液、涙、生殖液および気道液、並びにそれらに匹敵するものもまた、使用可能である。ＩｇＡおよび／またはＩｇＧサブクラスのレベルが、疲労および／または感染の評価に有用である可能性があることもまた、理解されるであろう。免疫グロブリンサブクラスもまた、使用可能である。
【００１７】
好ましくは、ウマを訓練するかまたは身体ストレスに曝露しようとする場合、閾値は、通常、休息時または訓練前に得る、内部個体閾値である。これによって、個体プロフィールを作成し、そして潜在的な遂行能力の評価に、または適切な訓練プログラムの設計に使用することが可能になる。しかし、特定の適用では、そして特定の例では、正常なウマＩｇＡおよび／またはＩｇＧレベルに関して、正常なウマからまたは公表されたデータから得た試料において、正常閾値を決定することが可能である。
【００１８】
好ましくは、唾液免疫グロブリンは、全未刺激唾液試料由来であり、そして最も好ましくは、唾液試料は、空腹時試料でない。
好ましくは、ウマは、競馬ウマまたは他の競争馬である。
【００１９】
好ましくは、ストレス要因は、免疫系の有効性に影響を与えることが知られる。
好ましくは、ウマを身体的および／または生理学的ストレス要因に曝露する。好ましくは、身体的および／または生理学的ストレス要因は、長期身体訓練、過剰訓練または競争である。
【００２０】
好ましくは、免疫グロブリンレベルは、ＥＬＩＳＡによって、または同様のイムノアッセイによって、測定する。好ましくは、アッセイ装置または系をウマの唾液と接触させることによって、免疫グロブリン含量に関して、ｉｎ  ｓｉｔｕで唾液を解析する。
【００２１】
本発明の背景において、語「ストレス要因」は、その意味内に、限定されるわけではないが、疲労を含む、身体的、生理学的、心理学的および栄養上のストレス要因を含む。
【００２２】
本発明の背景において、語「成績」は、その意味内に、他のウマに比較した成績、または個体の成績レベルに比較した成績、あるいは遂行潜在能力を含む。同様に、用語「疲労」は、その意味内に、他のウマに比較した疲労または個体の疲労レベルに比較した疲労を含む。
【００２３】
本発明は、身体ストレス要因に曝露されたウマに関連した例によって例示されるが、当業者には、疲労および／または感染に対する感受性の同様の評価が、他のストレスの多い活動にあてはまるであろうことが明らかであろう。
【００２４】
本発明の背景において、用語「回復期」は、ストレス要因またはストレス要因類への曝露後の休息期を含む。適切な長さの回復期は、当業者によって決定され、そしてストレス要因の種類およびウマの種類で多様であろう。
【００２５】
本発明は、主に、成績低下および疲労を評価する背景で記載しているが、当業者には、同一の原理を、潜伏性感染の再活性化を含む、感染に対する感受性、および遂行潜在能力に適用可能であることが理解されるであろう。
好ましい態様の説明
ウマＩｇＡの測定を可能にするため、ウマ唾液中のＩｇＡ量を検出するＥＬＩＳＡアッセイを開発した。こうしたアッセイの使用は、ウマにおける唾液ＩｇＡレベルの測定を可能にし、そしてしたがって訓練の結果および疲労の開始および成績低下を評価する手段を提供する。疲労はまた、身体ストレスから生じる感染の結果である可能性もあり、そしてしたがって、該アッセイを用いて、ウマが一般的に遭遇する感染、例えばウマインフルエンザ、ウマ連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｑｕｉ）およびウマヘルペスウイルスに関連する一般的な気道感染に対する感受性または素因を評価することが可能である。
【００２６】
本発明を例示するため、該アッセイを用いて、休息および運動／訓練中のウマから得た唾液を測定した。唾液ＩｇＡレベルは、ウマが多様にストレスを受ける、大きな競技会の最中に、２９頭のポロのウマで測定した。これらの健康なウマでは、ＩｇＡレベルに目立った変動があった（１．６９から５７９  ＥＬＩＳＡ単位（ＥＵ））。この広い範囲は、均質な集団に期待されるものの外である。したがって、これが、ストレス反応を反映する可能性があり、低レベルのＩｇＡが、成績低下、疲労および／または感染に対する感受性のリスクを示す。
【００２７】
同様の方式で競馬ウマに対してもまた、研究を行って、成績を評価し、そして適切な訓練プログラムを設計するのに使用可能なデータを得た。
ここで、特定の、しかし限定されない実施例に言及することによって、より詳細に本発明を記載するであろう。
【００２８】
【実施例】
実施例１：唾液収集
１．ウマ唾液は、１０ｍｌシリンジにつないだカニューレを用いて、口腔底から吸引によって収集した。その後、カニューレをシリンジからはずし、そして実験室でプロセシングするまで、ドライアイス上に置いた。
【００２９】
２．カニューレから全量を１．５ｍｌエッペンドルフ試験管に空け、そしてその後、５０００ｒｐｍで２０秒間遠心分離した。
３．エッペンドルフ試験管中にピペッティングすることによって、０．２−０．５ｍｌの唾液を収集し、氷上に置き、そしてその後、アッセイまで−７０℃で保存した。
【００３０】
変法を用いた唾液収集
より多量の唾液を収集するため、ウマの口腔全体を、綿棒でふき取った。その後、唾液が染み込んだ綿棒を２０ｍｌシリンジ外筒に入れ、その後、中にプランジャーを取り付けて、綿棒から無菌収集試験管中に唾液を搾り出した。この方法を用いると、総量０．２５−１．５ｍｌのウマ唾液を収集可能である。遠心分離して破片を除去した後、アッセイまで唾液を−２０℃で保存する。
【００３１】
実施例２：ＩｇＡおよびＩｇＧに関するＥＬＩＳＡアッセイ
１．９６ウェルマイクロタイタープレートのウェルを、ホウ酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８）中、１：１０００希釈のウサギ抗ＩｇＧまたは抗ＩｇＡ（Ｂｅｔｈｙｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ニューサウスウェールズ州シドニー）でコーティングした。
【００３２】
２．ＰＢＳ中の１％  Ｔｗｅｅｎ２０で洗浄した後、ＰＢＳ中の２％  ＢＳＡ（１００μｌ）を用いて、室温で１時間、ウェルをブロッキングした。
３．ブロッキング緩衝液を除去した後、ウェルをＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ中で洗浄し、そして紙タオルの上で軽く叩くことによって、過剰な緩衝液を除去した。
【００３３】
４．ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ中で１：２０００−１：５０００に希釈したウマ唾液を、１００μｌアリコットで各ウェルに添加し、そして室温で１時間インキュベーションした。ＩｇＧおよびＩｇＡに関する標準物質として、ウマ血清（Ｈｕｎｔｅｒ  Ａｎｔｉｓｅｒａ、ニューサウスウェールズ州ニューキャッスル）を添加した。
【００３４】
５．ウェルをＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ中で洗浄した後、１００μｌアリコット中の、ペルオキシダーゼをコンジュゲート化したヒツジ抗ＩｇＡまたは抗ＩｇＧ（ＩＣＮ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ、ニューサウスウェールズ州セブンヒルズ）を各ウェルに添加した。
【００３５】
６．１時間インキュベーションした後、ウェルをＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ中で洗浄し、その後、酵素基質、テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）溶液の１００μｌアリコットを各ウェルに添加した。
【００３６】
７．２０分間インキュベーションした後、２Ｍ  Ｈ２ＳＯ４溶液を添加することによって、発色反応を停止し、そしてＥＬＩＳＡプレート読み取り装置中、４５０ｎｍで吸光度を読み取った。結果は、試験試料の吸光度を、１，０００ＥＵのＩｇＡ濃度を持つ標準ウマ血清の希釈から構築した検量線の直線部分から内挿して、ＥＬＩＳＡ単位（ＥＵ）として表した。
【００３７】
ＥＬＩＳＡアッセイは、多くの異なる形式、例えば、すべて当業者に知られる、視覚的読み取り型、ディップスティック、およびそれらに匹敵するもので、使用可能である。他の適切なイムノアッセイもまた、使用可能であるし、そしてまた当業者に知られるであろう。
【００３８】
実施例３：ウマにおける唾液免疫グロブリンレベル
運動またはポロ競技会後の、２８頭の「休息中の」サラブレッド系統のウマ由来の唾液におけるＩｇＡおよびＩｇＧ濃度範囲を表１に示す。１頭のウマを除き、ＩｇＡ濃度範囲は、ＩｇＧより有意により高く（ｐ＜０．０１１）、ＩｇＡの局所産生および分泌への能動輸送の存在が示唆された。
【００３９】
表１．ウマ唾液ＩｇＡおよびＩｇＧ
【００４０】
【表１】
2004519660.tif 000002
【００４１】
より低いレベルの唾液ＩｇＡは、唾液試料を収集した日、訓練またはポロ競技会後の影響からの回復が遅いことを反映する可能性がある。ヒト研究からの証拠によって、選り抜きの運動選手において、激しい運動または過剰訓練が、唾液ＩｇＡレベルのより遅い回復および感染に対する感受性によって特徴付けられる免疫抑制につながることが示された。ストレスによる同様の影響が、訓練または競技会後のウマにおいて生じる可能性がある。
【００４２】
実施例４：唾液ＩｇＡレベルおよびウマにおける成績の間の関係
別の群のウマから唾液ＩｇＡを収集し、以下のように１（最低）から５（最高）の成績に等級付けした、視覚的アナログスケールを用いて、その成績の評価もまた、行った：
１＝劣っている；２＝優れている；３＝非常に優れている；４＝優秀である；５＝傑出している。
【００４３】
成績は、特定の動物から期待されるものに比較して判定した。
データを以下の表２に示す。表中の数字は、ＥＵ／ｍｌの唾液ＩｇＡレベルを示す。適切な場合、データの統計解析の目的のため、スコア群４および５を合わせ、そして群１と比較した。
【００４４】
表２：成績スコアおよび唾液ＩｇＡレベルの間の関係
【００４５】
【表２】
2004519660.tif 000003
【００４６】
高スコア対低スコア解析（ＥＬＩＳＡ単位に関する対応のないｔ検定）
【００４７】
【表３】
2004519660.tif 000004
【００４８】
Ｅｌｉｓａ単位に関する群情報
【００４９】
【表４】
2004519660.tif 000005
【００５０】
図１は、グラフ形式で要約したデータを示す。
このデータは、唾液ＩｇＡの特定の切り捨て値、例えば本実施例１０では１００ＥＵ／ｍｌを用いて、特別な注意を要するかもしれない成績の悪いウマをすべて、または大部分、同定することが可能であることを示す。
【００５１】
さらに、優れた成績のウマにおける、高レベルの唾液ＩｇＡ、例えば４００ＥＵ／ｍｌ以上は、最適訓練プログラムを実行できるが、訓練を増加することについて配慮できるということを示す可能性がある。一方、それほど優れた成績でないウマにおける、高レベルの唾液ＩｇＡは、訓練プログラムを増加するかまたは最適化する必要を示す可能性がある。下向き、安定または上向きいずれかの傾向を検出する、訓練プログラムにと一体化することが可能な進行外観、例えば毎週または毎月の評価を利用するのが特に有用であろう。
【００５２】
同様に、優れた成績のウマにおける、低レベルのＩｇＡ、例えば１５０ＥＵ／ｍｌ未満は、該動物が、成績を失するリスクにあるか、または劣った遂行潜在能力を有し、そしてしたがって、注意して扱わなければならないことを示す可能性がある。訓練を修正するかまたは一時中断し、そして唾液ＩｇＡレベルの綿密な監視を要する可能性がある。成績が劣ったウマでは、低ＩｇＡレベルは、直ちに注意を向け、そして該動物に長い休息期間を許容することを考慮する必要性を示す可能性がある。唾液ＩｇＡレベルは、回復の指針として監視することが可能である。
【００５３】
中程度の唾液ＩｇＡレベルは、上に論じるような傾向を確証するため、より綿密な監視を必要とする可能性がある。成績レベルに関わらず、ＩｇＡレベルを監視して、個体プロフィールを決定しなければならない。
【００５４】
実施例５：激しい訓練後の競馬ウマにおけるＩｇＡレベルおよび成績
シドニーでトップクラスの２厩舎の４３頭のサラブレッド系統の競馬ウマに、８週間の期間に渡り、毎日レーストラックで激しい訓練をさせて、成績および唾液ＩｇＡレベルに関して評価した。唾液試料は、訓練前（第１週）および訓練中（第２週−第８週）に、個々のウマから毎週収集した。ウマの成績は、ＩｇＡ試験を行っている実験室スタッフから何も知らせずに、２人の調教師によって評価し、そして記録し、そしてその逆もまた、同様であった。８週間終了時、上述のＥＬＩＳＡ試験によって、ウマＩｇＡレベルに関し、すべての唾液試料を測定した。その後、２人の調教師からの１から５の平均成績指標と、唾液ＩｇＡレベルを、各ウマに関してマッチさせた。
【００５５】
図２Ａ、２Ｂおよび２Ｃに示すように、評価した４３頭のウマのうち２２頭が、休息のため（疲労、不活発または身体的外傷）、訓練プログラムを完了するのに失敗し、１３頭のウマ（例えばウマＧＷ００１、ＧＷ００５、ＧＷ０１１、ＧＷ０１２、ＧＷ０２４、ＧＷ０２５、ＧＷ０３２、ＧＷ０２４）は、訓練プログラムにしたがって、４週間を超えて進むのに失敗した。大部分の場合、そのＩｇＡレベルは、訓練前または訓練中のレベルと比較して、訓練プログラムから離脱した時点で、最低であった。訓練と共にＩｇＡレベルに上昇および下降があったが、８週間の訓練プログラムに渡って遂行に失敗したウマ（例えばＧＷ００２、ＧＷ００６、ＧＷ０１８、ＧＷ０１４、ＧＷ０３７、ＧＷ０１４、ＧＷ０２８、ＧＷ０３０）もまた、先の閾値レベルと比較して、唾液ＩｇＡレベル回復が劣っていた。顕著に対照的に、訓練プログラムを完了した２１頭のウマは、より高いレベルのＩｇＡを有しただけでなく（例えばウマＧＷ０１０、ＧＷ００３、ＲＱ０１５、ＧＷ０１６、ＧＷ０１９、ＧＷ０４４、ＧＷ０４５、ＧＷ０４２、ＧＷ０４８、ＧＷ０４６）、激しい訓練からの、唾液ＩｇＡレベルのより優れた回復、および調教師に評価されるような、優れた成績も有した（図３Ａ、３Ｂおよび３Ｃ）。総合すると、該データは、唾液ＩｇＡレベルの測定に基づいて、激しい訓練などのストレス要因が、ウマの成績または疲労レベルまたは遂行潜在能力に与える影響を評価する方法の最初の証拠を提供する。
【００５６】
さらに、訓練中にＩｇＡまたはＩｇＧいずれかの唾液レベルの低下を監視し、その後、指定した期間に渡り、これらの免疫グロブリン唾液レベルの回復を監視して、これを、ウマが訓練プログラムを完了するかどうか、そして最適成績を達成するため、訓練中、ウマをどのように管理する必要があるかの有用な予測因子として、使用可能である。また、ＩｇＡの出発レベルは、持続した成績および／または特定の訓練プログラムの適切さの優れた指標である。
【００５７】
予備的解析は、研究で得たデータをどのように使用可能であるかの例を提供する。ＩｇＡデータは、例えば、以下のことを示す：
・ウマが訓練プログラムを切り抜けるのに成功するかどうかを予測可能である（第７週および第８週前後の高いＶＡスコアに注目されたい）−すなわち２１／２２頭のウマは、≧３．５のＶＡＳを有する。＜３．５のＶＡＳを持つ１頭の馬は、０時点で、低い（＜５０ＥＵ／ｍｌ）ＩｇＡレベルを有した。訓練プログラムの前半でのＶＡＳは、結果を予測しない。
【００５８】
・最初（訓練前）のＩｇＡレベルは結果と相関した：
【００５９】
【表５】
2004519660.tif 000006
【００６０】
＊第２週で＜５０ＥＵであった２頭のウマは、続いて反発し、そしてその後、持続するＩｇＡレベルを有した。
・ＩｇＡプロフィール決定もまた、有用である可能性があり、例えば、訓練を成功裡に完了するのに失敗したが、大半の時間、訓練に残ったウマはいずれも、持続したレベル（特に５０ＥＵを超える）のＩｇＡを持たなかった（７頭の被験体）。しかし、訓練を成功裡に完了したウマの、２２頭のうち１８頭が、持続する高レベルの唾液ＩｇＡを有した。最終的に訓練を完了するのに失敗したウマでは、＜５０ＥＵのＩｇＡしか、連続して毎週回復しない頻度が、３倍増加していた。
【００６１】
実施例６：ＩｇＡは、訓練監視にどのように使用可能であるかの例
この実施例の目的のためのＩｇＡの絶対値は重大ではなく、そして切り捨て値のみが指針である。
（ｉ）訓練開始および１週間の訓練後（ＩｇＡレベルをＥＵで示す）
・休息レベルで＞１００ＥＵ、第１週に＞５０ＥＵ−修正なしに標準的（例えば８週間に渡る）訓練を完了する非常に高い確率。
（ｉｉ）・毎週連続する＜５０ＥＵのレベルは、成績低下の高いリスクを同定する。
【００６２】
・訓練の特に後半で、レベルを持続する（特に＞５０ＥＵ）のに失敗することは、成績低下を予測する。
（ｉｉｉ）・個体の低レベル（＜５０ＥＵ）
例えば＜５０ＥＵの値に関して
【００６３】
【表６】
2004519660.tif 000007
【００６４】
＊総測定の％
・試料収集時、ＶＡＳに関して＜３．０にランキングされる確率が２倍、しかし、これは、ウマが「完了失敗」群にある場合、３倍である。
【００６５】
（ｉｖ）個体の高レベル（＞１００ＥＵ）
・概して、＞３．０のＶＡＳが、３倍の確率（「完了群」では４倍）。したがって、個体の測定は、リスク評価に価値を有する。
【００６６】
特定の時点での調教師の評価は、訓練プログラムの完了に関する優れた予測因子ではない（特にプログラムの前半）。
本研究で得たデータには、当業者に明らかに認識されるであろう、他の重要な知見が含まれ、そして慣用的な統計法（コンピューター補助を伴いまたは伴わず）をこの解析に使用可能である。
【００６７】
したがって、激しい訓練中の訓練後回復期における定期的な唾液ＩｇＡレベルの解析は、競馬ウマの訓練強度を監視し、そして予測するのに価値を有する。異常、下降、および持続されないレベル（すなわち、例えば５０ＥＵ未満に低下すること）は、ウマが訓練を完了しない可能性を最も優れて予測する。
【００６８】
激しい訓練期に入るウマは、休息ＩｇＡレベルおよび評価した潜在的な成績に基づいて、成績低下の傾向があると評価可能である−特に、激しい訓練１週間後の回復レベルが優れている（例えば≧５０ＥＵ）場合、有用な指標は、高い休息時ＩｇＡレベル（例えば＞１００ＥＵ）である。これは、訓練プログラムから優れた結果が得られる高い確率を示し、そしてすべてのウマの１５−２０％に相当するが、訓練を完了した群全体のおよそ５０％である。これらの数字が、研究した特定の実施例に関連し、そしてウマのコホートは、訓練パターンに応じて多様であろうことが認識されるであろう。ベースラインまたはプロフィールパターンのため、成績低下のリスクにあることが見出されたウマは、訓練強度の改変から利益を得る可能性があることもまた、認識されるであろう。
【００６９】
したがって、唾液ＩｇＡの測定、並びに傾向および個体プロフィールの作成を、個々に、または組み合わせて用いて、そして訓練スケジュール、休息期間、心理学的パラメーター、成績およびそれらに匹敵するものに関して、管理戦略を決定し、そして最適化することが可能である。
【００７０】
本発明は特定の実施例および好ましい態様に関して記載してきているが、本発明の原理および精神と一致する変動および修飾もまた、意図され、そして当業者に理解されることが理解されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【図１】ウマにおける唾液ＩｇＡレベルおよび成績の間の関係
【図２】（Ａ、Ｂ、Ｃ）：８週間の訓練を完了するのに失敗したウマ（すなわち劣った成績および／または外傷のため、休息させたウマ）におけるＩｇＡレベルおよび平均視覚的アナログスコア（ＶＡＳ）（バーの上）。
【図３】（Ａ、Ｂ、Ｃ）：８週間の訓練プログラムを完了したウマにおけるＩｇＡレベルおよび平均ＶＡＳ（バーの上）。
唾液ＩｇＡレベル（棒グラフ）および調教師の成績指標（棒グラフの上に示す）を個々のウマで測定した。ＩｇＡレベルは、ＥＬＩＳＡによって測定し、そして結果をｍｌあたりのＥＬＩＳＡ単位（ＥＵ）で表した。成績スコアは以下のとおりであった：１−１．５、劣っている、２−２．５、普通；３−３．５；優れている、４−４．５、非常に優れている；５、傑出している。各ウマは、図のパネルに示したコードによって同定した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際公開パンフレット】
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【手続補正書】
【提出日】平成14年10月9日(2002.10.9)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】請求項１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項１】
ストレス要因に曝露されたウマにおいて、遂行潜在能力、成績低下、疲労および／または感染に対する潜在的な感受性を予測する方法であって：
（ａ）訓練期の免疫グロブリンＡ（ＩｇＡ）および／または免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）レベルを測定し；そして
（ｂ）あらかじめ決定した閾値と、訓練期のＩｇＡおよび／またはＩｇＧレベルを比較することによって、成績低下、疲労および／または感染に対する感受性を予測する
ことを含み、訓練期におけるより低いレベルにより遂行潜在能力、成績低下、疲労および／または感染に対する潜在的な感受性を予測する、前記方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】請求項２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項２】
ウマの身体訓練プログラムの適切さを評価し、そして／または監視する方法であって：
（ａ）訓練期前のＩｇＡおよび／またはＩｇＧレベルを測定し；
（ｂ）訓練期中のＩｇＡおよび／またはＩｇＧレベルを、間隔を置いて測定し、そして
（ｃ）訓練期前のＩｇＡおよび／またはＩｇＧレベルと、訓練期中のＩｇＡレベルを比較する
ことを含み、ここで、訓練期中のレベルの低下が身体訓練プログラムの適切さを示す、前記方法。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】請求項３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項３】
本明細書に定義するように、ウマの成績および／または疲労レベルに対するストレス要因の影響を評価する方法であって：
（ａ）唾液ＩｇＡおよび／またはＩｇＧレベルを測定し；そして
（ｂ）あらかじめ決定した閾値と、前記ＩｇＡおよび／またはＩｇＧレベルを比較することによって、ウマの成績および／または疲労レベルに対するストレス要因の影響を評価する
ことを含み、ここで、ストレス要因への曝露後におけるレベルの低下が当該ストレス要因による悪影響を示す、前記方法。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】請求項４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項４】
ウマにおいて、呼吸器感染に対する潜在的な感受性を評価する方法であって：
（ａ）訓練初期の唾液ＩｇＡおよび／またはＩｇＧレベルを測定し；そして
（ｂ）あらかじめ決定した閾値と、訓練初期のＩｇＡおよび／またはＩｇＧレベルを比較することによって、呼吸器感染に対する潜在的な感受性を予測する
ことを含み、訓練初期におけるより低いレベルが呼吸器感染に対する潜在的な感受性を示す、前記方法。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】請求項５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項５】
ウマにおいて、疲労／感染に対する潜在的な感受性を評価する方法であって：
（ａ）ストレス要因（類）への曝露後、ＩｇＡおよび／またはＩｇＧレベルを測定し；
（ｂ）本明細書に定義するような回復期間を許容し；
（ｃ）回復期間後、ＩｇＡおよび／またはＩｇＧレベルを測定し；
（ｄ）上記工程（ｃ）のＩｇＡおよび／またはＩｇＧレベルと、上記工程（ａ）のＩｇＡおよび／またはＩｇＧレベルを比較することによって、疲労／感染に対する潜在的な感受性を予測する
ことを含み、上記工程（ｃ）におけるより低いレベルが疲労／感染に対する潜在的な感受性を示す、前記方法。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００６】
第一の側面にしたがって、本発明は、ストレス要因に曝露されたウマにおいて、遂行潜在能力、成績低下、疲労および／または感染に対する潜在的な感受性を予測する方法であって：
（ａ）訓練期の免疫グロブリンＡ（ＩｇＡ）および／または免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）レベルを測定し；そして
（ｂ）あらかじめ決定した閾値と、訓練期のＩｇＡおよび／またはＩｇＧレベルを比較することによって、成績低下、疲労および／または感染に対する感受性を予測する
ことを含み、訓練期におけるより低いレベルにより遂行潜在能力、成績低下、疲労および／または感染に対する潜在的な感受性を予測する、前記方法を提供する。


【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００７】
第二の側面にしたがって、本発明は、ウマの身体訓練プログラムの適切さを評価し、そして／または監視する方法であって：
（ａ）訓練期前のＩｇＡおよび／またはＩｇＧレベルを測定し；
（ｂ）訓練期中のＩｇＡおよび／またはＩｇＧレベルを、間隔を置いて測定し、そして
（ｃ）訓練期前のＩｇＡおよび／またはＩｇＧレベルと、訓練期中のＩｇＡレベルを比較する
ことを含み、ここで、訓練期中のレベルの低下が身体訓練プログラムの適切さを示す、前記方法を提供する。


【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００８】
第三の側面にしたがって、本発明は、本明細書に定義するように、ウマの成績および／または疲労レベルに対するストレス要因の影響を評価する方法であって：
（ａ）唾液ＩｇＡおよび／またはＩｇＧレベルを測定し；そして
（ｂ）あらかじめ決定した閾値と、前記ＩｇＡおよび／またはＩｇＧレベルを比較することによって、ウマの成績および／または疲労レベルに対するストレス要因の影響を評価する
ことを含み、ここで、ストレス要因への曝露後におけるレベルの低下が当該ストレス要因による悪影響を示す、前記方法を提供する。


【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００９】
第四の側面にしたがって、本発明は、ウマにおいて、呼吸器感染に対する潜在的な感受性を評価する方法であって：
（ａ）訓練初期の唾液ＩｇＡおよび／またはＩｇＧレベルを測定し；そして
（ｂ）あらかじめ決定した閾値と、訓練初期のＩｇＡおよび／またはＩｇＧレベルを比較することによって、呼吸器感染に対する潜在的な感受性を予測する
ことを含み、訓練初期におけるより低いレベルが呼吸器感染に対する潜在的な感受性を示す、前記方法を提供する。


【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１０】
第五の側面にしたがって、本発明は、ウマにおいて、疲労／感染に対する潜在的な感受性、成績低下または遂行潜在能力を評価する方法であって：
（ａ）ストレス要因への曝露後、ＩｇＡおよび／またはＩｇＧレベルを測定し；
（ｂ）本明細書に定義するような回復期間を許容し；
（ｃ）回復期間後、ＩｇＡおよび／またはＩｇＧレベルを測定し；
（ｄ）上記工程（ｃ）のＩｇＡおよび／またはＩｇＧレベルと、上記工程（ａ）のＩｇＡおよび／またはＩｇＧレベルを比較することによって、疲労／感染に対する潜在的な感受性または成績低下を予測する
ことを含み、上記工程（ｃ）におけるより低いレベルが疲労／感染に対する潜在的な感受性を示す、前記方法を提供する。




【国際調査報告】
2004519660.tif 000043
2004519660.tif 000044