(57)【要約】所定の負電荷または正電荷を有し、そしてサンプル中に含まれる成分を分離するための方法が開示される。この方法は、１つの実施形態において、選択された濃度の滴定可能種を有する後端電解質と前端電解質との間に配置されたマイクロチャネルにサンプルを充填する工程を包含する。このマイクロチャネル間に電位を印加することによって、サンプル中の荷電成分が等速回転電気泳動によってスタッキングされ、そして上流端部電極において電気分解によって形成された電解水酸化物イオンまたは水素イオンが、後端イオン緩衝剤中に移動し、その内部の滴定可能種を滴定し、ここで、後端電解質中のこの滴定可能種の濃度は、上流のチャネル領域の長さおよびサンプル充填体積に関連して選択される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
所定の負電荷または正電荷を有し、そしてサンプル中に含まれる成分を分離する方法であって、以下：
分離マイクロチャネルを充填する工程であって、該分離マイクロチャネルは、上流から下流の方向に、上流チャネル領域、サンプル体積チャネル領域、および下流分離チャネル領域を有し、該充填によって、該上流チャネル領域に、選択された濃度の滴定可能種を含有する後端電解質を充填し、該サンプル体積チャネル領域に、希薄サンプルを充填し、そして分離チャネル領域に、前端電解質を充填する、工程、
上流チャネル端部および下流チャネル端部に接触する電極間に電位を印加することによって、該チャネル間に電場電位を発生させる工程、
該印加によって、最初に、該サンプル中の荷電成分を等速回転電気泳動によってスタックし、引き続いて、水酸化物イオンまたは水素イオンを該後端電解質内に移動させ、サンプル体積領域内へおよびこの領域を通る水酸化物イオンまたは水素イオンの移動が、該荷電サンプル成分に追い付くために効果的になる前に、該サンプルが比較的小さいサンプル体積にスタックすることを可能にする条件下で、該電解質中の該滴定可能種を滴定する工程、
を包含し、ここで、該チャネル端部にわたる該電位の印加の継続により、該スタックしたサンプル体積中の荷電サンプル成分が、ゾーン電気泳動によって分離される、方法。
【請求項２】
前記上流チャネル領域が、一対の上流レザバを備え、一方のレザバが、前記後端電解質を収容し、そして他方のレザバが、前記水酸化物イオンまたは水素イオンの供給源を収容し、前記発生させる工程が、最初に、該一方の上流レザバおよび前記下流チャネル端部に接触する電極間に電位を印加し、次いで、該他方の上流レザバおよび該下流チャネル端部に接触する電極間に電位を印加することを包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記上流チャネル領域が、選択された濃度の滴定可能種を含有する後端電解質で充填され、そして前記印加する工程が、前記サンプル中の荷電成分を等速回転電気泳動によってスタックし、そして同時に、前記上流端部電極において電気分解によって形成された電解水酸化物イオンまたは水素イオンを該後端電解質中に移動させて該電解質中の前記滴定可能種を滴定するために効果的であり、ここで、該後端電解質中の該滴定可能種の濃度は、該上流チャネル領域の長さおよびサンプル充填体積に関連して、該上流電極から該サンプル体積領域中へおよび該領域を通る電解イオンの移動が、該荷電サンプル成分に追い付くために効果的である前に、サンプルが比較的小さいサンプル体積にスタックすることを可能にするように選択され、ここで、該チャネル端部間での電位の印加の継続によって、該スタックしたサンプル体積中の荷電サンプル成分がゾーン電気泳動によって分離される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記後端電解質が、後端イオンおよび滴定可能対イオン緩衝剤を、前記選択された濃度で含有する、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記上流端部電極において形成される前記電解イオンが、水酸化物イオンであり、そして前記滴定可能対イオン緩衝剤が、ＴＲＩＳ緩衝剤である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
ナノモル濃度以下で存在する荷電サンプル成分を検出する際に使用するための、請求項１に記載の方法であって、等速回転電気泳動スタッキングの前後でのサンプル体積の比が、少なくとも約１０：１である、方法。
【請求項７】
前記等速回転電気泳動スタッキングの前後でのサンプル体積の比が、少なくとも約５０：１である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
ピコモル濃度以下で存在する荷電サンプル成分を検出する際に使用するための、請求項７に記載の方法であって、等速回転電気泳動スタッキングの前後でのサンプル体積の比が、少なくとも約１００：１である、方法。
【請求項９】
前記サンプル体積領域の長さ対前記分離チャネルの長さの比が、約１：５０〜１：１の間である、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記比が、約１：１０〜１：２の間である、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記前端電解質が、負に荷電した前端イオンを含有し、該前端イオンは、サンプルイオンの有効誘電率より大きい有効誘電率を有し、そして１ｍＭと５０ｍＭとの間の濃度を有し、前記後端電解質が、負に荷電した後端イオンを含有し、該後端イオンは、該サンプルイオンの有効誘電率より低い有効誘電率を有し、そして１ｍＭと５０ｍＭとの間の濃度を有し、そして両方の電解質が、約２ｍＭと５０ｍＭとの間の選択された濃度の、正に荷電した緩衝剤を有する、請求項３に記載の方法。
【請求項１２】
前記分離マイクロチャネルが、マイクロフルイディクスデバイスのチャネルネットワークの一部であり、該マイクロフルイディクスデバイスはまた、軸方向に間隔を空けた交差部において該分離チャネルと交差して該交差部の間に前記サンプル体積領域を規定する、第一の副チャネルおよび第二の副チャネルを備え、前記充填する工程が、前記サンプルを該第一の副チャネルに接続されたサンプルレザバから、該サンプル体積領域を通して、該第二の副チャネル内へと移動させることを包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
サンプル中に含まれる複数の電気泳動タグを分離する際に使用するための、請求項１に記載の方法であって、各タグが、検出可能な部分および該タグに独特の電気泳動移動度を与える移動度改変剤を有し、該方法は、該タグを電気泳動によって分離した後に、該分離されたタグを検出する工程、および該タグの電気泳動移動度から、該タグが切断されたプローブの同定を検出する工程をさらに包含する、方法。
【請求項１４】
前記タグが、分枝ポリマー構造に含まれ、そして光不安定な結合を介して該分枝ポリマー構造に結合しており、そして前記方法が、前記サンプル中の分枝鎖構造を比較的小さいサンプル体積中にスタックさせた後に、該分枝鎖構造を照射して、該タグを該分枝鎖構造から解放する工程をさらに包含し、ここで、前記チャネル端部間での電位の印加の継続によって、該スタックしたサンプル体積中の該タグが、ゾーン電気泳動によって分離される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
所定の負電荷または正電荷を有し、そして希薄サンプル中に含有される成分の電気泳動分離において使用するための、マイクロフルイディクスシステムであって、以下：
（ａ）マイクロフルイディクスデバイスであって、以下：
（ｉ）基板、
（ｉｉ）該基板中に形成された、チャネルネットワークであって、該チャネルネットワーックは、分離チャネル、ならびに該分離チャネルに沿って軸方向に間隔を空けた位置で該分離チャネルと交差する第一の副チャネルおよび第二の副チャネルを有し、該分離チャネルは、上流から下流の方向で、該第一の副チャネルとの交差の上流の上流チャネル領域、該２つの副チャネルの交差部の間のサンプル体積チャネル領域、および該第二の副チャネル交差部の下流の下流分離チャネル領域に分割され、ここで、該サンプル体積領域の長さ対該分離チャネルの長さの比が、約１：５０〜１：１である、チャネルネットワーク、
（ｉｉｉ）該分離チャネルの上流端部および下流端部とそれぞれ連絡している、上流レザバおよび下流レザバ、
（ｉｖ）該第一の副チャネルおよび第二の副チャネルとそれぞれ連絡し、該副チャネル交差部を挟んで該分離チャネルの反対側にある、第一のレザバおよび第二のレザバ、
（ｖ）該上流レザバおよび下流レザバ内に含まれる液体とそれぞれ接触するよう適合された、上流電極および下流電極、
を備える、マイクロフルイディクスデバイス、ならびに
（ｂ）制御ユニットであって、該上流チャネル領域が後端電解質で充填され、該サンプル体積チャネル領域が希薄サンプルで充填され、そして該分離チャネル領域が前端電解質で充填された状態で、該サンプル体積領域へおよび該領域を通っての水酸化物イオンまたは水素イオンの移動が、前記荷電サンプル成分に追い付くために効果的である前に、該サンプルが比較的小さいサンプル体積中にスタックするような条件下で、該上流電極と下流電極との間に電位を印加するための電源を有し、ここで、該チャネル端部間での電位の印加の継続が、該スタックされたサンプル体積中の荷電サンプル成分をゾーン電気泳動によって分離する、制御ユニット、
を備える、システム。
【請求項１６】
前記上流チャネル領域が、一対の上流レザバを備え、一方のレザバが、前記後端電解質を収容し、そして他方のレザバが、前記水酸化物イオンまたは水素イオンの供給源を収容し、そして前記制御ユニットが、まず、該一方の上流レザバおよび前記下流チャネル端部と接触する電極間に電位を印加し、引き続いて、該他方の上流レザバおよび該下流チャネル端部に接触する電極間に電位を印加するように作動される、請求項１５に記載のシステム。
【請求項１７】
前記上流チャネル領域が、選択された濃度の滴定可能種を含有する後端電解質で充填され、そして前記印加する工程が、該サンプル中の荷電成分を等速回転電気泳動によってスタックさせ、そして同時に、前記上流端部電極において電気分解によって形成された電解水酸化物イオンまたは電解水素イオンを該後端電解質中に移動させて、該電解質中の該滴定可能種を滴定するために効果的であり、ここで、該後端電解質中の該滴定可能種の濃度は、該上流チャネル領域の長さおよびサンプル充填体積に関連して、該上流電極から該サンプル体積領域中へおよび該領域を通る電解イオンの移動が、該荷電サンプル成分に追い付くために効果的である前に、サンプルが比較的小さいサンプル体積にスタックすることを可能にするように選択され、ここで、該チャネル端部にわたる電位の印加の継続によって、該スタックしたサンプル体積中の荷電サンプル成分がゾーン電気泳動によって分離される、請求項１５に記載のシステム。
【請求項１８】
ナノモル濃度以下で存在する荷電サンプル成分を検出する際に使用するための、請求項１５に記載のシステムであって、前記デバイスにおける前記サンプル体積領域の長さ対前記分離チャネルの長さの比が、約１：５０〜１：１の間である、システム。
【請求項１９】
複数の異なるマイクロフルイディクスデバイスの１つを備える、請求項１５に記載のシステムであって、該マイクロフルイディクスデバイスは、１：５０と１：１との間の異なるチャネル長比を有し、そして前記制御ユニットは、任意の選択されたマイクロフルイディクスデバイスの長さ比に対して必要とされる前記後端イオン緩衝剤中の荷電緩衝剤イオンのおよその濃度を計算するように作動される、システム。
【請求項２０】
前記制御ユニットが、（ｉ）前記下流レザバと前記第一のレザバおよび第二のレザバのうちの一方との間に界面動電位を印加することによって、前記下流チャネル領域を前記前端電解質で充填し、（ｉｉ）前記上流レザバと該第一および第二のレザバのうちの一方との間に界面動電位を印加することによって、前記上流チャネル領域を前記後端電解質で充填し、そして（ｉｉｉ）該第一のレザバおよび第二のレザバのうちの一方に収容されたサンプルを、前記サンプル体積領域を通して該第一のレザバおよび第二のレザバのうちの他方に向けて移動させるために有効な流体推進力を適用することによって、サンプル体積領域を充填するように作動可能である、請求項１５に記載のシステム。
【請求項２１】
前記マイクロフルイディクスデバイスが、前記第一のレザバおよび第二のレザバ中に収容される液体にそれぞれ接触するよう適合された、第一の電極および第二の電極を備え、そして前記制御ユニットが、該第一の電極と第二の電極との間に界面動電位を印加することによって、前記サンプル体積領域を充填するように作動可能である、請求項２０に記載のシステム。
【請求項２２】
前記制御ユニットが、前記上流電極と下流電極との間に、定電流、定電圧または定電力によって特徴付けられる電位を印加するよう作動可能である。請求項１５に記載のシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明の分野は、マイクロフルイディクスデバイスにおけるサンプルの充填、スタッキング、および分離に関する。
【背景技術】
【０００２】
（背景）
マイクロフルイディクスは、化学的操作および物理的操作のかなりの部分において活動が実施される様式に革命を起こしている。マイクロフルイディクスの１つの領域は、チャネルおよびレザバのネットワークが存在する固体基板上での小体積の液体または液体組成物の取り扱いである。導電性液体を用いて電場を使用することによって、体積および／またはイオンが、１つの部位から別の部位へと移動し得、液体および／またはイオンを混合することによって異なる溶液が形成され、反応が実施され、分離が実施され、そして分析が実行される。実際に、通常の言い方では、このシステムは、「チップ上の実験室」と称されている。この型の種々の先行技術のデバイスとしては、米国特許第６，０１０，６０８号；同第６，０１０，６０７号；同第６，００１，２２９号；同第５，８５８，１９５号；および同第５，８５８，１８７号が挙げられ、これらは、サンプル溶液の注入に関する出願のファミリーである。米国特許第５，５９９，４３２号、ＥＰＡ  ０６２０４３２、およびＶｅｒｈｅｇｇｅｎら，Ｊ．ｏｆ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  ４５２（１９８８）６１５−６２２もまた参照のこと。
【０００３】
これらの操作の多くにおいて、希薄サンプル（例えば、サンプル成分の濃度がフェムトモル濃度〜ナノモル濃度の範囲のサンプル）中に含まれる複数のサンプル成分を電気泳動によって分離することに興味が持たれる。希薄サンプルの効率的な電気泳動注入は、頻繁に、大きなサンプル体積およびサンプル構成要素の乏しい分解能を生じる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
従って、特にサンプル濃度がナノモル濃度以下の濃度で存在する場合に、サンプル成分の改善された分離および分解能のための電気泳動システムを提供することが望ましい。電気泳動分離および分解能を最大にするように、分離条件を調節する方法を提供することが、さらに望ましい。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
（発明の要旨）
１つの局面において、本発明は、所定の負電荷または正電荷を有し、そして希薄サンプル中に含有される成分の電気泳動分離において使用するための、マイクロフルイディクスシステムを包含する。このシステムは、基板、およびこの基板に形成されたチャネルネットワークを有する、マイクロフルイディクスデバイスを備える。このチャネルネットワークは、分離チャネル、ならびにこの分離チャネルに沿って軸方向に間隔を空けた位置でこの分離チャネルと交差する、第一の副チャネルおよび第二の副チャネルを有する。これら２つの副チャネルは、この分離マイクロチャネルを、上流から下流の方向で、第一の副チャネルとの交差部の上流の上流チャネル領域、２つの副チャネルの交差部の間のサンプル体積チャネル領域、および第二の副チャネルの交差部の下流の下流分離チャネル領域に分割する。サンプル体積領域の長さ対分離チャネルの長さの比は、約１：５０〜１：１の間である。
【０００６】
このチャネルネットワークは、最初に後端電解質で上流チャネル領域を満たし、希薄サンプルでサンプル体積チャネル領域を満たし、そして前端（ＬＥ）電解質で分離チャネル領域を満たすことによって、充填されるように設計されている。
【０００７】
このデバイスにはまた、分離チャネルの上流端部および下流端部とそれぞれ連絡している、上流レザバおよび下流レザバ、ならびに第一の副チャネルおよび第二の副チャネルとそれぞれ連絡している第一のレザバおよび第二のレザバが備えられ、第一のレザバおよび第二のレザバは、副チャネル交差部を挟んで分離チャネルの反対側にある。このシステムの上流電極および下流電極は、それぞれ上流レザバおよび下流レザバに収容される液体と接触するよう適合される。
【０００８】
このシステムの制御ユニットは、上流チャネル領域が後端電解質で満たされ、サンプル体積チャネル領域が希薄サンプルで満たされ、そして分離チャネル領域が前端電解質で満たされた状態で、サンプル体積領域への、そしてこの領域を通っての水酸化物イオンまたは水素イオンの移動が荷電サンプル成分に追い付くために効果的である前に、サンプルが比較的小さいサンプル体積にスタックするような条件下で、上流電極と下流電極との間で電位を印加するための電源を備え、ここで、これらのチャネル端部間での電場の印加の継続により、スタックしたサンプル体積中の荷電サンプル成分がゾーン電気泳動によって分離される。
【０００９】
１つの一般的な実施形態において、上流チャネル領域は、選択された濃度の滴定可能種を含有する後端電解質で満たされる。電位の印加は、サンプル中の荷電成分が等速回転電気泳動によってスタックし、そして同時に、上流端部電極において電気分解によって形成された電解水酸化物イオンまたは水素イオンが後端電解質中に移動し、この電解質中の滴定可能種を滴定するために十分である。後端電解質中の滴定可能種の濃度は、上流チャネル領域の長さおよびサンプル充填体積に関連して、上流電極からサンプル体積領域内へおよびこの領域を通っての電解質イオンの移動が荷電サンプル成分に追い付くために効果的である前に、サンプルが比較的小さいサンプル体積にスタックすることを可能にするように選択され、ここで、チャネル端部間での電位の印加の継続により、スタックしたサンプル体積中の荷電サンプル成分はゾーン電気泳動によって分離される。
【００１０】
別の一般的な実施形態において、上流チャネル領域は、一対の上流レザバを備え、一方のレザバは、ＴＥ電解質を収容し、そして他方のレザバは、水酸化物イオンまたは水素イオンの供給源（例えば、塩基性溶液または酸性溶液）を収容する。制御ユニットは、最初、一方の上流レザバおよび下流チャネル端部に接触する電極間で電位を印加し、そして引き続いて、他方の上流レザバおよび下流チャネル端部に接触する電極間で電位を印加するように操作される。
【００１１】
このシステムは、ナノモル濃度以下の濃度で存在する荷電サンプル成分を検出するために使用され得、ここで、このデバイスのサンプル体積領域の長さ対分離チャネルの長さの比は、約１：５０〜１：１である。
【００１２】
このシステムは、１：５０と１：１との間の様々なチャネル長さ比を有する、複数の異なるマイクロフルイディクスデバイスのうちの１つを備え得る。この実施形態において、制御ユニットは、任意の選択されたマイクロフルイディクスデバイスの長さ比について必要とされる後続イオン電解質中の滴定可能種の、およその濃度を計算するように操作可能である。
【００１３】
制御ユニットはまた：（ｉ）下流レザバと第一のレザバおよび第二のレザバの一方との間に界面動電位を印加することによって、下流チャネル領域を前端電解質で充填するように、（ｉｉ）上流レザバと第一のレザバおよび第二のレザバのうちの一方との間に界面動電位を印加することによって、上流チャネル領域を後端電解質で充填するように、そして（ｉｉｉ）第一のレザバおよび第二のレザバの一方に収容されるサンプルをサンプル体積領域を通して第一のレザバおよび第二のレザバの他方へと移動させるために効果的な流体駆動力を適用することによって、サンプル体積領域を充填するように、操作され得る。この実施形態のデバイスは、第一のレザバおよび第二のレザバに収容される液体とそれぞれ接触するよう適合された、第一の電極および第二の電極を備え得、ここで、制御ユニットは、第一の電極と第二の電極との間で界面動電位を印加することによって、サンプル体積領域を充填するよう操作可能である。
【００１４】
この制御ユニットは、好ましくは、上流電極と下流電極との間で、定電流、定電圧、または定電力によって特徴付けられる電位を印加するよう作動され得る。
【００１５】
別の局面において、本発明は、所定の負電荷または正電荷を有し、そして希薄サンプル中に含有される成分を分離する方法を包含する。最初に、分離マイクロチャネル（これは、上流から下流の方向に、上流チャネル領域、サンプル体積チャネル領域、および下流分離チャネル領域を有する）が、選択された濃度の滴定可能種を含有する後端電解質で上流チャネル領域が満たされ、希薄サンプルでサンプル体積チャネル領域が満たされ、そして前端電解質で分離チャネル領域が満たされるように、充填される。
【００１６】
次いで、上流端部および下流端部に接触する電極間で電位を印加することによって、チャネルにわたって電場が発生し、最初に、サンプル中の荷電成分が、等速回転電気泳動によってスタックし、引き続いて、サンプル体積領域への、そしてこの領域を通っての水酸化物イオンまたは水素イオンの移動が荷電サンプル成分に追い付くために効果的である前に、サンプルが比較的小さいサンプル体積にスタッキングすることを可能にするような条件下で、水酸化物イオンおよび水素イオンを後端電解質中に移動させて、この電解質中の滴定可能種を滴定し、ここで、これらのチャネル端部間での電場の印加の継続により、スタッキングしたサンプル体積中の荷電サンプル成分がゾーン電気泳動によって分離される。
【００１７】
１つの一般的な実施形態において、上流チャネル領域は、選択された濃度の滴定可能種を含有する後端電解質で満たされる。電位の印加は、上記サンプル中の荷電成分が等速回転電気泳動によってスタックし、そして同時に、上流端部電極において電気分解によって形成された電解水酸化物イオンまたは水素イオンが後端電解質中に移動し、この電解質中の滴定可能種を滴定するために効果的である。後端電解質中の滴定可能種の濃度は、上流チャネル領域の長さおよびサンプル充填体積に関連して、上流電極からサンプル体積領域内へおよびこの領域を通っての電解質イオンの移動が荷電サンプル成分に追い付くために効果的である前に、サンプルが比較的小さいサンプル体積にスタックすることを可能にするように選択され、ここで、チャネル端部間での電位の印加の継続により、スタックしたサンプル体積中の荷電サンプル成分はゾーン電気泳動によって分離される。
【００１８】
後端電解質は、好ましくは、上記選択された濃度で、後端イオンおよび滴定可能な対イオン緩衝剤を含有する。上流端部電極において形成される電解イオンが水酸化物イオンである場合、滴定可能な対イオン緩衝剤は、ＴＲＩＳ緩衝液であり得る。
【００１９】
別の一般的な実施形態において、上流チャネル領域は、一対の上流レザバを備え、一方のレザバは、後端電解質を収容し、そして他方のレザバは、水酸化物イオンまたは水素イオンの供給源を収容する。電位は、最初、一方の上流レザバおよび下流チャネル端部に接触する電極間で印加され、そして引き続いて、電位は、他方の上流レザバおよび下流チャネル端部に接触する電極間で印加される。
【００２０】
ナノモル濃度以下の濃度で存在する荷電サンプル成分を検出する際に使用するためには、等速回転電気泳動スタッキングの前後でのサンプル体積の比は、少なくとも約１０：１であり、そして少なくとも約５０：１であり得る。ピコモル濃度以下の濃度で存在する荷電サンプル成分の検出については、等速回転電気泳動スタッキングの前後でのサンプル体積の比は、少なくとも約１００：１であり得る。
【００２１】
サンプル体積領域の長さ対分離チャネルの長さの比は、好ましくは、約１：５０〜１：１の間であり、より好ましくは、約１：１０〜１：２の間である。
【００２２】
１つの例示的な方法において、前端電解質は、サンプルイオンの有効誘電率より大きい有効誘電率および１ｍＭ〜５０ｍＭの間の濃度を有する負に荷電した前端イオンを含有し、そして後端電解質は、サンプルイオンの有効誘電率より低い有効誘電率および１ｍＭ〜５０ｍＭの間の濃度を有する負に荷電した後端イオンを含有し、そして両方の電解質は、約２ｍＭと５０ｍＭとの間の選択された濃度で、正に荷電した緩衝剤を有する。
【００２３】
サンプル中に含有される複数の電気泳動タグを分離する際に使用するためには、各タグは、検出可能な部分およびこのタグに独特の電気泳動移動度を与える移動度改変剤を有し得る。この方法は、タグを電気泳動によって分離した後に、分離されたタグを検出する工程、およびこれらの電気泳動移動度および濃度から、生体分子相互作用についての情報を得る工程をさらに包含する。
【００２４】
これらのタグが分枝したポリマー構造に含まれ、そしてこの構造に光不安定な結合を介して結合される場合、この方法は、サンプル中の分枝した構造を比較的小さいサンプル体積にスタックさせた後に、この分枝した構造を照射してそこからタグを解放する工程をさらに包含し得る。チャネル端部間での電場の印加の継続により、スタックしたサンプル体積中のタグがゾーン電気泳動によって分離される。
【００２５】
本発明のこれらおよび他の目的は、以下の発明の詳細な説明を、添付の図面と組み合わせて読む場合に、より十分に明らかとなる。
【００２６】
（発明の詳細な説明）
（Ｉ．マイクロフルイディクスシステム）
本発明は、１つの局面において、所定の負電荷または正電荷を有し、そして希薄サンプル中に含有される成分の電気泳動分離において使用するための、マイクロフルイディクスシステムを包含する。「サンプル」とは、電気泳動によって分離され得、そして好ましくは、キャピラリーゾーン電気泳動に適用可能な標準的な光学技術によって検出され得る、１種以上の荷電成分を含有する水性サンプルを意味する。「希薄サンプル」とは、分離および検出されるべき成分のうちの少なくとも１種が、１００ｆＭ（フェムトモル濃度）程度の低濃度、代表的には１ｐＭ（ピコモル濃度）〜より高い濃度（例えば、数百ナノモル濃度以上、好ましくは、１〜５００ｐＭの範囲）で存在するサンプルを意味する。
【００２７】
本発明に従う１つの例示的なシステムは、図１において２２で示される。このシステムは、内部に形成された１つ以上のチャネルネットワーク（例えば、上流から下流の方向で上流チャネル領域２７、サンプル体積チャネル領域２８、および下流分離チャネル領域３０を有する、分離マイクロチャネル２６からなるネットワーク２６）を有するマイクロフルイディクスデバイス２４を備える。サンプル充填領域は、その上流端部において、第一の副チャネル３２および第二の副チャネル３４によって規定され、これらの副チャネルは、示されるように、軸方向に間隔を空けた位置で、分離チャネルと交差する。より具体的には、サンプル充填領域ｄの長さは、示されるように、第一のチャネルの上流側（すなわち、第一のチャネル領域の上流側に近い領域）と、第二のチャネルの下流側（すなわち、下流チャネル側に隣接する領域）との間の距離として測定される。下流分離領域は、長さｄ’を有する。本発明の好ましい実施形態において、デバイスのサンプル体積領域の長さ対分離チャネルの長さの比（ｄ：ｄ’）は、約１：５０〜１：１の間である。
【００２８】
以下に議論されるように、このシステムは、各々が、様々な選択されたｄ：ｄ’の比を有する、示される型の複数のデバイス（例えば、１：５０、１：２０、１：１０、１：５、１：２、および１：１の選択された比を有するデバイス）を備え得、ここで、選択される特定のデバイスは、所望の成分分離のために最適な比を有する。単一のチャネルネットワークのみが示されるが、このデバイスは、各々がネットワーク２６について記載された一般的特徴を有するチャネルネットワークのアレイを備え得る。この実施形態において、このデバイスは、ネットワーク中の対応するレザバの各々を制御ユニットへの接続のための共通のリード線へと接続する、微小パターン化された導体を備え得る。
【００２９】
分離チャネルは、その上流端部および下流端部において、それぞれ上流レザバ３６および下流レザバ３８で終結し、そしてこれらのレザバと流体連絡している。同様に、第一の副チャネルおよび第二の副チャネルは、第一のレザバ４０および第二のレザバ４２で終結し、そしてこれらのレザバと流体連絡している。各レザバは、電極を備えるかまたは電極を受容するよう適合され、この電極は、基板上に形成されても独立して形成されてもよい（例えば、関連するレザバ中の液体と接触する電極のための基板上への配置のための電極板上）。レザバ３６、３８、４０、４２に関連する電極は、それぞれ４４、４６、４８、５０で示される。各電極は、制御ユニットまたは電圧制御装置５４（これは、以下に記載される種々の様式で作動する）に作動可能に接続される。
【００３０】
図１Ｂは、上で言及されたものと実質的に同じ構成要素を有し、そして以下を除いて同じ参照番号によって示される、改変されたシステム２４’を示す。上流チャネル領域２７’は、Ｙ字型チャネルであり、このチャネルは、１つの上流レザバ３６ａで終結する１つのアーム２７ａ、および別の上流レザバ３６ａで終結する第二のアーム２７ｂを有する。制御ユニットは、示される導体接続を介して、２つのレザバ中の電極４４ｂおよび４４ａに作動可能に接続される。
【００３１】
以下に見られるように、第一のレザバ４０および第二のレザバ４２中の電極は、それぞれ、レザバの内外へと流体材料を界面動電位によって（例えば、電気浸透流（ＥＯＦ）によって）移動させるために使用される。あるいは、電極の内外への流体の移動は、第一のレザバおよび第二のレザバに作動可能に接続され、そして制御ユニットの制御下にある、圧力または減圧源によってもたらされ得る。
【００３２】
システムにおけるマイクロフルイディクスデバイスの作製に関して、チャネルネットワークは、従来通りに、基板またはカード５２上に形成され得、そして透明なカバーまたはフィルム５４（これは、従来通りにカードに付着または結合される）によって覆われ得る。チャネルが存在する基板は、一般に、少なくとも約２０μｍ、より通常には少なくとも約４０μｍであり約０．５ｃｍ以下、通常は約０．２５ｃｍ以下の厚さを有する。基板の幅は、収容されるユニットの数によって決定され、そして約２ｍｍ程度の小ささから約６ｃｍ以上までであり得る。他方の方向の寸法は、一般に、少なくとも約０．５ｃｍであり約５０ｃｍ以下、通常は約２０ｃｍ以下である。
【００３３】
基板は、可撓性フィルムであっても比較的非可撓性の固体であってもよく、レザバおよびチャネルのような微小構造の位置は、エンボス加工、成形、機械加工などによって提供され得る。チャネル寸法は、一般に、約０．１μｍ〜１ｍｍの範囲の深さ、および約０．５μｍ〜１ｍｍの幅であり、ここで、断面は、一般に、０．１μｍ２〜約１ｍｍ２である。チャネル長さは、そのチャネルが使用される操作に依存して広範に変動し、一般に、約０．０５ｍｍ〜５０ｃｍの範囲、より通常には約０．５ｍｍ〜２０ｃｍの範囲である。主チャネルおよび副チャネルは、同じ断面積を有しても異なる断面積を有してもよく、そして同じ形状を有しても異なる形状を有してもよい。上記のように、サンプル充填領域の長さと分離領域の長さとの比は、代表的に、１：５０〜１：１の選択された比である。
【００３４】
レザバは、一般に、約１０ｎｌ〜１００μｌの範囲の体積を有する；より通常には約５００ｎｌ〜１０μｌの範囲の体積を有する。レザバは、円筒形状、円錐形状（例えば、切頭体）、または他の規則的な形状であり得る。
【００３５】
デバイスの作製は、微小特徴、支持フィルム、収容フィルム、またはこれらの組み合わせを備える基板を含み得る。支持フィルムは、一般に、少なくとも約４０μｍであり約５ｍｍ以下の厚さである。チャネルおよびレザバの底部を収容するために使用されるフィルムは、一般に、約１０μｍ〜２ｍｍの範囲、より通常には、約２０μｍ〜１ｍｍの範囲の厚さを有する。選択される厚さは、良好な熱移動（例えば、温度制御）のための望みによって制御され得るが、そうでなければ、通常、良好なシーリングおよび器具を収容するためにデバイスが使用される様式の好都合および保証のうちの１つである。収容フィルムはまた、基板の底部が完全に閉じられる場合、上記範囲内の厚さを有し、そしてチャネルを収容しながら、レザバまたはアクセスを必要とする他の特徴と整列する穿孔を備える。従って、これらの範囲は重要ではない。
【００３６】
示されるように、基板は、可撓性フィルムであっても非可撓性の固体であってもよく、従って、作製の方法は、基板の性質によって変化する。エンボス加工のためには、少なくとも２つのフィルムが使用され、ここで、これらのフィルムは、ロールから引き出され得、一方のフィルムはエンボス加工され、そして他方のフィルムは、エンボス加工されたフィルムに接着されて、物理的な支持を提供する。個々のユニットは別々に使用され得るように刻み目を付けられ得るか、またはデバイスのロールはインタクトなままであり得る。例えば、出願番号ＰＣＴ／９８／２１８６９を参照のこと。デバイスが個々に作製される場合、これらのデバイスは、通常、従来の成形技術を使用して成形される。基板および付随するフィルムは、一般に、プラスチックであり、特に、有機ポリマー（ここで、このポリマーとしては、付加ポリマー（例えば、アクリレート、メタクリレート、ポリオレフィン、ポリスチレンなど）または縮合ポリマー（例えば、ポリエーテル、ポリエステル、ポリアミド、ポリイミド、ジアルキルシロキサン、またはノルボラン（Ｚｅｏｎｏｒ系）ポリマー）が挙げられる）であるが、ガラス、シリコンまたは他の材料が使用され得る。望ましくは、ポリマーは、低い蛍光強度を有するか、または添加剤もしくは漂白（例えば、光漂白）によって低い蛍光強度にされ得る。フィルムは、通常、少なくともチャネルを収容するように基板上に配置され、このフィルムは、通常、レザバと連絡するため、および必要である場合には、レザバ内に電極を導入するための開口部を有する。収容フィルムは、任意の好都合な手段（例えば、熱結合、接着など）によって、基板に付着される。文献は、このようなフィルムを接着する多くの例を有し、例えば、米国特許第４，５５８，３３３号；および同第５，５００，０７１号を参照のこと。
【００３７】
制御ユニットは、示されるように、デバイスの電極に作動可能に接続される、電源または電圧原を備える。電源は、制御デバイスにおいて、電気制御装置の制御下にある。制御装置は、本発明の方法を実施する際の、電極に印加される電圧の周波数およびタイミング、ならびに電圧レベルを決定する。制御装置の作動および設計は、以下に記載されるデバイスの操作から明らかである。
【００３８】
（ＩＩ．サンプル成分分離方法）
上記システムは、本発明に従って分離方法を実施するために設計される。この分離方法は、Ａ節に記載される等速回転電気泳動（ＩＴＰ）条件下で実施される、最初のサンプルスタッキング工程を包含する。本発明の重要な局面に従って、デバイスにおいて使用される電解質成分は、特に、サンプル体積領域の長さ（すなわち、全サンプル体積）に関連して、電解質条件または電極制御がキャピラリー電気泳動（ＣＥ）によるサンプル分離を導く様式でシフトする前に、サンプルがＩＴＰによって小さい体積にスタックすることを可能にするように、選択される。
【００３９】
（Ａ．等速回転電気泳動分離）
ＩＴＰ分離の理論は、例えば、「Ｃａｐｉｌｌａｒｙ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  ｉｎ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ」、Ｒｉｇｈｔｅｔｔｉ，Ｐ．Ｇ．編、１９９６、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，８４〜８７頁に記載されている。簡単にいえば、図２Ａおよび２Ｂを参照して、異なる電気泳動移動度を有する成分を含有するサンプル５８が、前端イオンを含む電解質６０と、末端イオンまたは後端イオンを含む電解質６２との間に配置される。本発明において、この成分は、キャピラリー管に入れられ、その一部が、５６で示されている。前端イオンは、小さいイオン（例えば、塩化物イオン）であり、これは、いずれのサンプル成分の電気泳動移動度よりも大きい電気泳動移動度を有する。前端イオンの対イオンは、好ましくは、その溶液を緩衝する能力によって選択される。
【００４０】
同様に、後端イオンは、最も遅く移動するサンプル成分より低い電気泳動移動度を有するイオンである。本発明の重要な特徴によれば、後端イオンまたは対イオンの少なくとも一方が、滴定可能なイオン種（すなわち、滴定可能な酸基または塩基基を有する化合物）である。サンプルにわたる電位の印加により、サンプル成分は、最も速く移動するサンプル成分が前端電解質に隣接して濃縮され、そして最も遅く移動する成分が後端電解質に当たるまで、サンプルを通って移動することによってバンドに分離する。
【００４１】
図において、分離されるサンプル成分は、先行イオンおよび後続イオンと同様に負に荷電しており、そして電位の極性は、示される極性で印加されて、負に荷電した成分を図の右側へと引きつける。システムの各セクションにわたる電場は、そのセクションの導電率に逆比例するので、前端イオンに関連するセクションは、比較的低い電場によって特徴付けられ、そして後端イオンに関連するセクションは、比較的高い電場を有する。
【００４２】
サンプル成分をサンプル成分の狭いバンド内に維持するものは、異なる電場または電圧勾配であり、各々のバンドは、一旦、サンプル成分が狭いバンドにスタックすると、その電気泳動移動度に基づいて分離する。拡散によって後端電解質中に戻るサンプルイオンは、より高い電場の下で「加速」する。同様に、先行電解質中に前方に拡散するサンプルイオンは、より低い電場の下で減速する。同時に、各サンプル成分は、電気泳動移動度が最も近いサンプル成分維密接に隣接した位置に移動して、それらの成分を、先行イオン電解質と後続イオン電解質との間で分離された成分の狭いサンプルバンドにスタックさせる。
【００４３】
図３Ａ〜３Ｂは、最初のＩＴＰスタッキングについて上で記載された型のマイクロフルイディクスデバイスに、サンプルを充填する際の工程を示す。これらの図は、２つの副チャネルによって交差され、上記のように、分離チャネルを３つのセグメント６６、６８、７０に分割する、分離チャネルを有するチャネルネットワーク６４を示す。このチャネルネットワークは、示されるチャネルセグメントと連絡する４つのレザバ７２、７４、７６、７８を備える。このネットワークは、図３Ａに示されるように、ＩＴＰ分離のために、先行電解質をレザバ７４に添加し、そしてこの電解質をレザバ７８の方へと、レザバ７８に減圧を適用するかまたはこれら２つのレザバの間に電位を印加するかのいずれかで電解質を移動させることによって引くことで、充填される。後続電解質は、レザバ７２に添加され、次いで、この物質は、上記のように、そして図３Ｂに示されるように、レザバ７８の方へと引かれる。次いで、サンプル体積セグメント６８は、図３Ｃのように、先行電解質をレザバ７６からレザバ７８の方へと引くことによって、先行電解質で満たされる。最後に、サンプルを含有する後続電解質が、図３Ｄに示されるように、レザバ７８に入れられる。電位がレザバ７６と７８との間に印加される場合、サンプル材料は、これら２つのレザバの間のサンプル体積領域を満たし、実際に、このサンプルを、サンプル体積領域中に含まれるＬＥ電解質中に引き込む。
【００４４】
ＩＴＰスタッキングは、図２Ａおよび２Ｂに示される極性でレザバ７２と７４との間に電位を印加することによって達成され、先行電解質と後続電解質との間のサンプル充填領域またはセグメントへのサンプル成分のスタッキングを引き起こす。
【００４５】
ＩＴＰシステムがサンプル成分を大きいサンプル体積中にスタックさせる能力が、図４Ａ〜４Ｄに示される。図４Ａにおいて、２つの副チャネル間のサンプル充填領域は、長さが２５０ミクロンであり、そして約５００μＬの全サンプル体積を収容する。図４Ｂに示されるように、ＩＴＰスタッキングは、サンプルバンドを約２９ミクロン（すなわち、サンプル成分の約８．６倍の濃度）の長さのバンドにスタックさせるために効果的である。この効果は、図４Ｃおよび４Ｄに示されるような、より長いサンプル充填領域を用いてもなおより劇的である。ここで、サンプル充填領域（長さ３ｍｍ）中のサンプルは、ＩＴＰによって約３１ミクロンの長さ（すなわち、ほぼ１００倍の濃縮因子）を有するサンプルバンドに濃縮される。本発明のＩＴＰスタッキング段階において、ＩＴＰスタッキングの前後でのサンプル体積の比は、好ましくは、少なくとも約１０：１であり、そして５０：１以上に大きくあり得る（例えば、１００：１以上）。
【００４６】
前述のことから、最初のＩＴＰスタッキングは、比較的長いサンプル充填体積に入れられたサンプルについて特に、優れたスタッキング効率を提供することが理解され得る。特に、このことは、非常に希薄なサンプルを、サンプル充填領域の長さに依存して、１００以上の因子で効率的に濃縮することを可能にする。しかし、ＩＴＰの限界は、希薄なサンプル成分の比較的乏しい分解能である。極端に希薄なサンプル成分については、機能特異的な濃度を得るために必要とされるバンド幅は、電気的に不連続な境界厚さより小さい。その結果、希薄なサンプル成分は、検出不可能な分解能で、単一の狭いバンドに濃縮する傾向がある。このことは、図５Ａに示されており、これは、先行電解質と後続電解質との間の境界において、分解不可能なサンプル成分を示す。図５Ｂは、３ｍｍの最初の注入プラグ中に注入され、そして蛍光性分子を５００ｐＭの濃度で、および異なる電気泳動移動度を有する第二の蛍光性分子もまた５００ｐＭの濃度で含有する希薄サンプルについてのＩＴＰプロフィールを示す。見られるように、ＩＴＰシステムは、これら２つの種を低濃度のサンプル成分で分解し得ない。
【００４７】
（Ｂ．組み合わせられたＩＴＰおよびキャピラリーゾーン電気泳動）
上記のように、ＩＴＰは、高効率の分離を生じるが、非常に希薄なサンプル成分については、分析の空間的分離が乏しい。他方で、ＣＺＥは、効率は低いが、異なる電気泳動移動度の希薄なサンプル成分をより良好に空間的に分解し得る。この節に記載されるように、本発明は、ＩＴＰスタッキングとＣＺＥ分離とを組み合わせることによって、両方の分離方法の利点を利用し、そしてこれらの欠点を最小にする。具体的には、この方法は、ＩＴＰによる最初の小体積スタッキング、一旦ＩＴＰスタッキングが達成されると、引き続いてＣＺＥに移行することを可能にする条件を使用する。
【００４８】
図１Ａに示されるシステムに適切な、１つの一般的な実施形態において、この方法は、電解質イオン（すなわち、システム中の２つの電極の間に電位差が配置される場合に発生する水酸化物イオンおよびプロトン）の利点を利用する。図２Ａおよび２Ｂに示される電極配置において、水酸化物イオンは、後端電解質と接触するカソードにおいて発生し、そしてプロトンは、図６Ａに示されるように、反対のアノード電極において発生する。後端電解質中の水酸化物イオンがこの電解質中を移動するにつれて、これらのイオンはイオン化可能な酸、塩基またはヒドロキシル基（すなわち、ｐＨ依存性イオン化可能プロトンを有する機）を有する種を滴定する。後端電解質中の滴定可能種は、負に荷電した後端種（例えば、ＴＡＰＳ）、または後端イオンの緩衝対イオン（例えば、ＴＲＩＳ）であり得る。
【００４９】
水酸化物イオンが後端電解質を通って移動するにつれて、これらのイオンは、この後端イオン緩衝剤中の滴定可能種（例えば、ＴＲＩＳ緩衝剤）を中和する。水酸化物イオンが後続イオン電解質を通って完全に移動すると、これらのイオンは、サンプル領域（これは、さらなる滴定可能種（例えば、ＴＲＩＳ緩衝剤イオン）を含有し得る）を通って下流の方向へと移動し続ける。水酸化物イオンがサンプル成分内へおよびサンプル成分を通って移動する場合、これらのイオンは、より遅く移動する後続イオンと置き換わり、最も遅く移動するサンプル成分と後端電解質との間の界面を効果的に破壊する。図６Ｂに示されるように、水酸化物イオンがサンプルバンドを通って移動するにつれて、これらのイオンは、最も速く移動するサンプル成分と前端電解質との間の界面を破壊する。この時点で、サンプル成分は、先行イオンと後続イオンとの両方として水酸化物イオンを含有する培地中にスタックされる。これらの条件下で、バンドは、自由に移動し、そして通常の電気泳動分離に従って分離される。
【００５０】
より一般的には、前端イオンを含有するサンプルについては、ＩＴＰからＣＺＥへの移行は、サンプルイオンが後端電解質中の後続イオンに追い付き始めるときに起こる。後端イオンを含有するサンプル中で、この移行は、上流チャネル部分における前端イオンがサンプルイオンに追い付き始めるときに起こる。サンプル注入電圧の印加を継続することによって、予めスタックされた成分は、ＣＺＥによってさらに分離される。
【００５１】
本発明に従って、後続イオン電解質中の滴定可能種の濃度は、上流チャネル領域の長さおよびサンプル充填体積に関連して、上流電極からサンプル充填領域中へおよびこの領域を通る電解質イオン（例えば、水酸化物イオン）の移動が荷電サンプル成分に追い付くために効果的である前に、サンプルが比較的小さいサンプル体積にスタックすることを可能にするように、選択される。従って、後端電解質中の滴定可能種の濃度が高いほど、そして体積（上流チャネル領域の長さ）がより大きいほど、上流電極において発生した水酸化物イオンがサンプル成分に追い付くために必要な時間がより長くなる。さらに、前端電解質中の滴定可能イオン（例えば、ＴＲＩＳイオン）は、ＬＥ電解質からＴＥ電解質へと移動し得るので、ＬＥ電解質中の滴定可能種（例えば、ＴＲＩＳイオン）の濃度もまた、水酸化物イオンがサンプル領域中へおよびこの領域を通って移動する速度に影響を与え得る。
【００５２】
図１Ｂに示されるシステムに適切な、別の一般的な実施形態において、この方法は、最初に、ＴＥ緩衝剤を収容する上流レザバと下流チャネルレザバとの間のチャネルにわたって電場を印加する工程、次いで、水酸化物イオンまたは水素イオン（プロトン）を収容する別の上流レザバと下流チャネルレザバとの間で電場を印加して、水酸化物イオンまたは水素イオンを、上記のように、チャネル中のＴＥ電解質中へおよびこの電解質を通して引く工程を包含する。電極の切り換えは、ヒドロキシルイオンまたは水素イオンが、サンプルに追い付き、そしてＩＴＰスタッキングのために必要なＴＥ／ＬＥ勾配条件を破壊する前に、サンプル成分が小さい体積にスタックされ得るようなタイミングにされる。
【００５３】
図７は、本発明に従って、組み合わせられたＩＴＰサンプルスタッキング／ＣＺＥバンド分離方法における、バンド分解能に対するＴＲＩＳ緩衝剤（後端電解質中の滴定可能種）の濃度の影響を示す。ここで、前端電解質は、２ｍＭの塩化物イオン、１％のポリエチレンオキシド（ＰＥＯ）を含有した。このサンプルは、３０００ミクロンのサンプル体積長さ（およそ５ｎＬのサンプル総体積）に、蛍光性分子を含有した。後端緩衝剤は、２ｍＭのＴＡＰＳ、１％のＰＥＯ、ならびに２ｍＭ、３ｍＭ、４ｍＭ、５ｍＭ、および６ｍＭの選択されたＴＲＩＳ濃度を含有した。チャネルの分離領域（サンプル体積領域の下流）の長さは、５．５ｃｍであり、そして印加電圧は２００Ｖ／ｃｍであった。
【００５４】
図７において観察される異なる移動時間は、後端電解質中のより大きいＴＲＩＳ濃度に関連するより大きいＩＴＰスタッキング時間に起因する。ＩＴＰによるサンプルスタッキングはまた、電気泳動により泳動されたサンプル成分のピーク高さによって明らかであるように、ＴＲＩＳ濃度の増加と共に次第に増強された。約２〜３ｍＭの閾値ＴＲＩＳ濃度未満では、ＩＴＰによるサンプルスタッキングは、容易に検出されるサンプルバンドを生じるには不十分であった。
【００５５】
上記のことから、本発明の首尾よい実施は、３つの変数の考慮を包含することが理解される。第一は、所定のサンプル中のサンプル成分、特に、検出されるべき最低濃度のサンプル成分の濃度である。第二の変数は、サンプル体積であり、特に、最低濃度のサンプル成分を検出するために必要なサンプル体積である。所定の検出方法（例えば、サンプル蛍光の検出）の制約内で、特定の最小モル濃度量のサンプル成分が必要とされ、そしてこれは、必要とされるサンプルの総容量を決定する。第三の変数は、図７に見られる効果によって示されるように、後端電解質中の滴定可能種の濃度である。所定のサンプル体積について、滴定可能種の濃度は、ＣＺＥへの移行の前にＩＴＰスタッキングを可能にするために十分に高くなければならない。
【００５６】
本発明の１つの一般的な実施形態において、サンプル体積は、例えば、図１に示される型の単一のチャネルネットワークに関して一定である。この実施形態において、後端電解質中の滴定可能種の濃度は、ＣＺＥへの移行の前のＩＴＰによる良好なサンプルスタッキングを可能にするように選択される。図７に示される方法において使用されるＴＲＩＳ濃度は、この選択のための指針を提供する。５ｎＬの全サンプル体積および３０００ミクロンのサンプル体積長さに基づいて、５〜６ｍＭのＴＲＩＳ濃度が選択される。選択されるＴＲＩＳ濃度は、より大きいかまたは小さいサンプル体積およびサンプル領域長さに対して、比例的により高いかまたは低い。
【００５７】
電解質の濃度は、一般に、約０．１〜１，０００ｍＭの範囲であり、より通常には約１〜５０ｍＭの範囲である。末端電解質に対して、この範囲は、一般に、約１〜５０Ｍの範囲であり、一方で先行電解質に対しては、この範囲は、一般に、約１〜１０００ｍＭの範囲である。このサンプル濃度はまた、サンプルの性質、成分の数、これらのサンプルが分離され得る容易さなどに依存して、広範に変動し得る。一般に、アッセイされるサンプルの成分の全濃度は、約０．１ｐＭ〜１μＭの範囲である。
【００５８】
例示的な電解質（主として、先行イオンおよび末端イオンを提供するために使用される塩をいう）としては、塩化ナトリウム、ＨＥＰＥＳ、ＴＡＰＳ、クエン酸ナトリウム、リン酸ナトリウム、ホウ酸ナトリウム、四ホウ酸ナトリウム、タウロデオキシコール酸ナトリウム、ＣＡＰＳ、グリシン酸ナトリウム、Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、ギ酸ナトリウム、エタンスルホン酸ナトリウム、ペンタンスルホン酸ナトリウム、クエン酸ナトリウムなどが挙げられる。Ｔｒｉｓおよびナトリウムは、もっとも通常の対イオンであるが、これらは、陽イオンについてはアンモニウム、リチウム、カリウム、マグネシウムなど、そして陰イオンについては臭化物、硝酸、亜硝酸、硫酸、シアン化物など、ならびに上に示される電解質イオンで置き換えられ得る。主チャネル中の電解質溶液と比較した場合の、サンプルのイオン強度は、広範に変動し得、主チャネル中の電解質溶液のイオン強度より低くても、少なくとも等しくても、より大きくてもよい。これは、サンプル溶液中への、約５〜２５０ｍＭの範囲、より通常には約５〜１００ｍＭの範囲、そして好ましくは約２０〜７５ｍＭの範囲での塩（例えば、アルカリ金属塩化物）の添加によって達成され得る。
【００５９】
別の一般的な実施形態において、本発明は、種々のチャネル体積（例えば、異なる長さのチャネル体積領域）を有する複数の異なるデバイスを提供し、これらは、分析される特定のサンプルに対して最小の十分な体積を提供するように選択され得る。例えば、サンプル体積領域の長さ対分離チャネルの長さの比は、最小の約１：５０から最大の約１：１まで変動し得る。２つの長さの比が増加するにつれて、より多くのサンプルが適用され得、より低濃度の成分の検出を可能にするが、ＴＥ電解質中のより高濃度の滴定可能種を必要とする。必要とされる滴定可能種の濃度の選択は、上に提供される指針に従う。
【００６０】
操作において、サンプル充填工程の後に、制御ユニット（図１）は、サンプル注入工程の一部として、図５Ｂに示されるように、電解質チャネルの上流部分と下流部分との間に電位を印加するよう作動する。ここで、サンプル成分は、サンプルイオンがサンプル体積を通って移動するにつれて、それらの移動度に従ってスタックされる。
【００６１】
先行イオンおよび末端イオンの役割は、ちょうど記載された方法において逆にされ得ることが理解され、ここで、先行イオンは、レザバ２０から供給され、末端イオンは、レザバ４０から供給され、サンプルは、レザバ４２から供給され、そして先行イオンは、レザバ２４から供給される。
【００６２】
（Ｃ．例示的な方法）
組み合わせられたＩＴＰ／ＣＥ方法を、低濃度のサンプル成分を検出する際の分解能および感度について、従来のＣＺＥと比較した。ＣＺＥについて、緩衝剤は、６ｍＭ  ＴＲＩＳ、２ｍＭ  Ｃｌ、１％  ＰＥＯであった。最初の注入体積は、約０．４ｎＬであり、これは、２５０ミクロンの最初の注入プラグ長さに対応する。ＩＴＰ緩衝剤は、ＬＥについては、６ｍＭ  ＴＲＩＳ、２ｍＭ  Ｃｌ、および１％  ＰＥＯであり、そしてＴＥについては、６ｍＭ  ＴＲＩＳ、２ｍＭ  ＴＡＰＳ、および１％  ＰＥＯであった。最初の注入プラグは、３ｍｍの長さであった。ＡＣＬＡ  １６０ＦおよびＡＣＬＡ  １７７Ｆを、両方同じ濃度（これは、２５０ｐＭと５００ｆＭとの間で変動した）で含有するサンプル。
【００６３】
図８Ａおよび８Ｂは、各サンプル成分が２５０ｐＭの濃度で存在したサンプル材料についての電気泳動図を示す。見られるように、組み合わせられたＩＴＰ／ＣＺＥ法（８Ｂ）は、ＣＺＥ単独（８Ａ）と比較した場合に、より鋭いピーク、より高い分解能、およびより低い信号対ノイズ比を与えた。組み合わせ方法の利点は、５０ｐＭのサンプル濃度についての図９Ａおよび９Ｂ、５ｐＭのサンプル濃度についての図１０Ａおよび１０Ｂ、ならびに５００ｆＭのサンプル濃度についての図１１Ａおよび１１Ｂに見られるように、より低いサンプル濃度においてより顕著になった。
【００６４】
より一般的には、本発明の方法は、サンプルについて、特に、ＩＴＰによって分解するために希薄すぎ、そしてＣＺＥによって検出するために希薄すぎるサンプルについて、高い分解能、鋭いピークおよび高い信号対ノイズ比を可能にする、改善されたサンプル分離方法を提供する。
【００６５】
（ＶＩ．組み合わせられたサンプル処理および分離）
本発明の方法の１つの適用は、タグのサンプル中に代表的には希薄なタグ濃度で含まれる、電気泳動タグを分離する際のものである。このようなタグは、代表的に、電気泳動プローブがプローブ特異的標的に結合している場合に、電気泳動プローブの標的特異的切断によって生成される。この型の電気泳動プローブおよびタグ、ならびに多重アッセイにおけるこれらの使用のための方法は、例えば、共有にかかるＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ００／１１３９６（これは、本明細書中に参考として援用される）に記載されている。
【００６６】
１つの多重プローブ実施形態において、各プローブは、サンプル標的に結合するよう設計された標的特異的部分、および標的特異的切断部位（ここで、標的特異的切断試薬によってレポーターがこの部分から切断され得る）を介してこの標的特異的部分に付着したマルチタグレポーターからなる。各レポーターは、次に、骨格構造（例えば、分枝ポリマー）を含み、そして複数の電気泳動タグが、切断可能な結合を介してこの構造に付着される。好ましくは、この結合は、光分解性であるが、化学切断結合（例えば、ジスルフィド結合または酵素切断可能結合）もまた企図される。チャネルネットワークの部分は、サンプル充填領域を含む。この実施例においてサンプル充填領域に配置されるサンプル材料は、複数の異なる標的特異的プローブを反応させ、そして標的と反応する（例えば、標的に結合する）プローブを切断することから生じる、プローブ混合物である。従って、このサンプル混合物は、切断されていないプローブおよび切断されたレポーターを含有する。これらのプローブおよび切断されたレポーターは、この方法において使用されるＩＴＰ緩衝液のｐＨにおいて逆の正味の電荷を有し、その結果、これら２つは、分離の最初のＩＴＰ段階の間に電場に供される場合に、逆の方向に移動する。
【００６７】
サンプルスタッキングの後であるがＩＴＰからＣＺＥへの移行の前に、切断されたレポーターは、レポーターから電気泳動タグを解放するために効果的な溶解条件に供される。この溶解条件は、レポーターからタグを光分解によって解放するための、光マスクを介しての選択的照射、または局在した化学的条件（例えば、ＩＴＰ緩衝剤中の、照射条件下で一重項酸素を生成し得る薬剤の光活性化）であり得る。重要な特徴は、局在したタグ解放であり、これによって、切断されたレポーターに会合したタグは解放されるが、切断されていないプローブに会合したタグは解放されない。上記のように、開放されたタグは、各異なる解放されたレポーターについて異なる電気泳動移動度を有する１つ以上の検出可能な電気泳動タグを代表する。
【００６８】
ＩＴＰからＣＺＥへの移行の後に、様々な解放されたタグは、電気泳動によって分離され、既知の電気泳動移動度を有する分解された電気泳動タグを生成する。タグが視覚的に検出可能な基（例えば、蛍光性基）を有する場合、バンドは、直接検出され得る。各タグの既知の移動度から、それらのタグが解放されたプローブ、およびサンプル中で会合したプローブ標的の存在が決定され得る。あるいは、タグは、選択された試薬の存在下で検出可能な呈色反応を触媒するために効果的な触媒基を有し得る。この実施形態において、タグは、システム中の検出試薬と首尾よく混合により合わせられ得る。
【００６９】
ここで、本発明を完全に記載したので、多くの変化および改変が、添付の特許請求の範囲の精神または範囲から逸脱することなく、本発明に対してなされ得ることが、当業者に明らかである。
【図面の簡単な説明】
【００７０】
【図１Ａ】図１Ａは、本発明の分離方法を実施するための、本発明に従って構築されたマイクロフルイディクスシステムを示す。
【図１Ｂ】図１Ｂは、本発明に従って構築されたマイクロフルイディクスデバイスの別の実施形態を示す。
【図２Ａ】図２Ａは、緩衝成分の観点での、サンプル中の荷電成分の等速回転電気泳動（ＩＴＰ）分離の一般的原理を示す。
【図２Ｂ】図２Ｂは、電場強度の観点での、サンプル中の荷電成分の等速回転電気泳動（ＩＴＰ）分離の一般的原理を示す。
【図３】図３Ａ〜３Ｄは、本発明の方法においてマイクロフルイディクスデバイスを充填する際の連続的な工程を示す。
【図４】図４Ａ〜４Ｄは、２つの異なる長さのサンプル体積領域にスタックする蛍光性サンプルのＣＣＤ画像を示す。
【図５Ａ】図５Ａは、分離チャネル中の距離の関数としてサンプル成分濃度のプロットを示す、限界希釈サンプル中を用いたＩＴＰ分離の限界を示す。
【図５Ｂ】図５Ｂは、異なる成分の分解が不可能であることを示す、限界希釈サンプル中を用いたＩＴＰ分離の限界を示す。
【図６Ａ】図６Ａは、本発明のＩＴＰ方法における、移動する反応境界を示す。
【図６Ｂ】図６Ｂは、本発明のＩＴＰ方法における、移動する反応境界を示す。
【図７】図７は、使用される前端緩衝剤中の緩衝剤濃度の関数として、本発明の方法における成分分解能のプロットを示す。
【図８Ａ】図８Ａは、２５０ｐＭのサンプルにおいて、キャピラリーゾーン電気泳動（ＣＺＥ）を単独で用いて達成可能なサンプル成分感度を示す。
【図８Ｂ】図８Ｂは、２５０ｐＭのサンプルにおいて、本発明に従って実施されるＩＴＰおよびＣＺＥの組み合わせを用いて達成可能なサンプル成分感度を示す。
【図９Ａ】図９Ａは、５０ｐＭのサンプルにおいて、キャピラリーゾーン電気泳動（ＣＺＥ）を単独で用いて達成可能なサンプル成分感度を示す。
【図９Ｂ】図９Ｂは、５０ｐＭのサンプルにおいて、本発明に従って実施されるＩＴＰおよびＣＺＥの組み合わせを用いて達成可能なサンプル成分感度を示す。
【図１０Ａ】図１０Ａは、５ｐＭのサンプルにおいて、キャピラリーゾーン電気泳動（ＣＺＥ）を単独で用いて達成可能なサンプル成分感度を示す。
【図１０Ｂ】図１０Ｂは、５ｐＭのサンプルにおいて、本発明に従って実施されるＩＴＰおよびＣＺＥの組み合わせを用いて達成可能なサンプル成分感度を示す。
【図１１Ａ】図１１Ａは、５００ｆＭのサンプルにおいて、キャピラリーゾーン電気泳動（ＣＺＥ）を単独で用いて達成可能なサンプル成分感度を示す。
【図１１Ｂ】図１１Ｂは、５００ｆＭのサンプルにおいて、本発明に従って実施されるＩＴＰおよびＣＺＥの組み合わせを用いて達成可能なサンプル成分感度を示す。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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