(57)【要約】本発明は、Ｔ細胞に対する免疫応答に関与するウイルスの蛋白質の制限領域、および該領域から誘導される収束コンビナトリーペプチドライブラリに対応する免疫原性ペプチドの、設計および合成に関する。本発明は、Ｃ型肝炎ウイルスに特に適用可能であり、そしてそれに対するワクチン調製物を製造するために有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｔ細胞免疫応答に関与するウイルス蛋白質の制限領域および該領域に由来する収束コンビナトリーペプチドライブラリに対応する免疫原性ペプチドの製造方法であって、以下を含むことを特徴とする方法：
ａ）潜在的Ｔエピトープを構成するアミノ酸の配列を、該ウイルスの蛋白質の天然配列から、クラスＩＩ ＭＨＣ分子についての固着モチーフ（ａｎｃｈｏｒｉｎｇ ｍｏｔｉｆｓ）の、および高密度に該固着モチーフを有する領域の、予測的・非実験的サーチングによって同定すること；
ｂ）ａ）において同定されたエピトープの配列に由来する、収束コンビナトリーペプチドライブラリ（“コンベルトープ（ｃｏｎｖｅｒｔｏｐｅｓ）”と呼ぶ）を、
−　一方で、クラスＩＩ ＭＨＣ分子へ固着する該エピトープの能力を増大させるために、
−　および、他方で、Ｔ細胞レセプターによる該エピトープの認識のレパートリー（ｒｅｐｅｒｔｏｒｙ）を拡大させるために、
選択位置でのアミノ酸の標的化置換によって、該エピトープの各々の非天然縮重（ｎｏｎ−ｎａｔｕｒａｌ ｄｅｇｅｎｅｒａｃｙ）を誘発させるように、設計すること；
ｃ）−　一方で、ａ）において同定されるペプチドの中から選択される天然配列を有するペプチド、
−　および、他方で、ｂ）において同定される対応のコンベルトープ、
を合成すること。
【請求項２】
前記固着モチーフのサーチが、大多数のクラスＩＩ ＭＨＣ対立遺伝子に共通する以下の基準を適用することによって行われることを特徴とする、請求項１に記載の方法：
−　９隣接アミノ酸のモチーフにおいて、Ｐ１位のアミノ酸が必ず疎水性であり、そして脂肪族または芳香族アミノ酸、即ち、Ｖ， Ｉ， Ｌ， Ｆ， Ｍ， ＷまたはＹである；
−　Ｐ４， Ｐ６およびＰ９位のアミノ酸が、それぞれ、好ましくは、Ｉ， Ｖ， Ｌ， Ｍ， ＦまたはＡ；Ａ， Ｐ， Ｇ， ＳまたはＴ；およびＡ， Ｉ， Ｖ， Ｙ， Ｌ， ＦまたはＭである。
【請求項３】
コンベルトープを設計することが、各同定された固着モチーフにおいて、Ｐ４， Ｐ６またはＰ９残基の１以上を、それらが請求項２に定義される共通基準を満足さない場合、よりコンプライアントな（ｃｏｍｐｌｉａｎｔ）アミノ酸で、そして好ましくはアラニンで置換することを含むことを特徴とする、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
１， ４， ６または９以外の１以上の残基［その置換が隣接単位とまたは既にその中に行われた置換と不適合性となる、２以上の隣接する固着単位に共通の残基を除く］を、Ｔ細胞レセプターによる該エピトープの認識に好都合である置換可能性のマトリクス（ａ ｍａｔｒｉｘ ｏｆ ｒｅｐｌａｃｅａｂｉｌｉｔｙ）に従って置換することを更に含むことを特徴とする、請求項１または３に記載の方法。
【請求項５】
各コンベルトープが単一合成で得られ、この間、置換可能な位置に対応する各サイクルについて、該合成ペプチドにおいて当モル比が得られるように調節された天然アミノ酸と置換アミノ酸との混合物が使用されることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか１つに記載の方法。
【請求項６】
前記ウイルスの蛋白質が、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）の、キャプシド蛋白質ならびにＮＳ３およびＮＳ４蛋白質であることを特徴とする、請求項１〜５のいずれか１つに記載の方法。
【請求項７】
ＨＣＶの、キャプシド蛋白質の配列番号１〜８、ＮＳ３蛋白質の配列番号９〜２１、およびＮＳ４蛋白質の配列番号２２〜２６を含む、請求項１ ａ）に記載の方法を使用して同定される潜在的エピトープ配列の群。
【請求項８】
配列番号２７〜５２に示されるような、請求項２および３に記載の方法を使用して、請求項７に記載の配列から誘導されるコンベルトープ。
【請求項９】
天然配列と、請求項７に記載の配列および請求項８に記載のコンベルトープの中から選択される、請求項１〜６のいずれか１つに記載の方法を使用して得られる縮重配列（コンベルトープ）との対を含むことを特徴とする、Ｃ型肝炎ウイルスに対してのワクチン化に意図される免疫原性ペプチドの混合物に基づく組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、ウイルス蛋白質の、および特にＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）の制限（ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ）領域に対応する免疫原性ペプチドの混合物の設計および合成、ならびに該ウイルスに対するワクチン調製物を製造するためのそれらの使用に関する。
【０００２】
Ｃ型肝炎ウイルスは、１９８９年に同定された（ＣＨＯＯ Ｑ．Ｌ． ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ， １９８９， ２４４， ３５９−３６１）。それは、非経口伝染される、非Ａ、非Ｂ慢性肝炎の主要な原因物質である。
【０００３】
ＨＣＶウイルスによる感染は、症例の６０〜８０パーセントにおいて、慢性病理へと発展する。このような感染は、広く集団において非常に蔓延しており、工業国において、特に西欧において、１〜２パーセントのオーダーである（ＡＬＴＥＲ Ｈ．Ｊ． ｅｔ ａｌ．， Ｂｌｏｏｄ， １９９５， ８５， １６８１−１６９５）。
【０００４】
現在、抗ウイルス処置（インターフェロン、Ｒｉｂａｖｉｒｉｎｅ（登録商標））は、患者の２０％しか治せず、そして何よりも、該疾患から真に保護する抗−ＨＣＶワクチンは存在しない。
【０００５】
ＨＣＶウイルスは、単一のポリプロテインをコードするＲＮＡゲノムを有するＦｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅファミリーのウイルスの１つであり、これはいくつかのサブフラグメントへ切断される：キャプシド蛋白質、２つの糖蛋白，Ｅ１およびＥ２、ならびに６つのいわゆる非構造蛋白質（ｎｏｎ−ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｐｒｏｔｅｉｎｓ）：ＮＳ２， ＮＳ３， ＮＳ４Ａ， ＮＳ４Ｂ， ＮＳ５Ａ， ＮＳ５Ｂ。これらのウイルス蛋白質は、免疫応答についての抗原性標的である：該Ｅ１およびＥ２エンベロープ蛋白質は、中和抗体についての標的を形成し、そして該非構造蛋白質は、細胞傷害性エフェクター応答（ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｒｅｓｐｏｎｓｅ）を誘発し得る。しかし、突然変異が、高頻度でＨＣＶゲノム内にて生じ、そして該ウイルスが宿主の抗ウイルス防御から逃れることを容易にする多数の準種（ｑｕａｓｉ−ｓｐｅｃｉｅｓ）を生じさせる（ＷＥＩＮＥＲ Ａ．Ｊ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， １９９２， ９２，２７５５）。
【０００６】
ＨＣＶウイルスの排除を担う免疫機構は、未だ、明らかには確立されていない。急性感染の段階後に自発的に該ウイルスを排除し得る患者の群（約２０％）の観察によって、回復への進展と、ウイルス抗原（特にキャプシド蛋白質ならびにＮＳ３およびＮＳ４蛋白質）の特異的ＣＤ４リンパ球の相当な増殖との間の強力な相関関係をはっきりさせることが可能になった（ＤＩＥＰＯＬＤＥＲ Ｈ．Ｍ．， Ｌａｎｃｅｔ， １９９５， ３４６：１００６）。ＴＨ１型応答が、恐らく、ＣＤ８細胞によって媒介される細胞傷害性応答を調節することまたは異なる抗ウイルス因子を直接分泌することによる、この免疫についての基礎であるようである。この応答は、それにもかかわらず、該ウイルスの長期の制御を可能にし続けなければならない（ＧＥＲＬＡＣＨ Ｊ．Ｔ． ｅｔ ａｌ．， Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ， １９９９， １１７：９３３）。
【０００７】
該キャプシド蛋白質ならびにＮＳ３およびＮＳ４蛋白質から得られる合成ペプチドは、Ｔヘルパー型応答を誘発するそれらの能力を示した（ＤＩＥＰＯＬＤＥＲ， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．， １９９７， ７１：６０１１）。問題のこれらの蛋白質から得られるペプチド性エピトープの使用によってＣＤ４応答を誘発および維持することは、保護的抗−ＨＣＶ免疫を誘発するための見込みのあるストラテジーを示す。しかし、ペプチドは、一般的に、僅かだけ免疫原性であり、そして何よりも、それらは、めったに、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）の多形分子へ結合される制限（ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ）と独立しては、免疫応答を誘発し得ない。
【０００８】
これは、本出願人が、既に記載のものと類似の、Ｔエピトープ特性を有する、問題のペプチドを選択し、そして、ＭＣＨの分子へのそれらの固着を増大させそしてＴ細胞のレセプターによるそれらの認識を拡大させるという２つの目的をもって、所定の位置でそれらの天然配列を修飾することによってそれらの免疫原性力を増大させるという仕事を設定した理由である。
【０００９】
従って、問題の各ペプチドについて、ペプチドのコンビナトリーライブラリを作製し、ここで、天然アミノ酸と、選択ペプチドの人工的縮重を生じさせるように選択された置換アミノ酸とが、各々の選択位置（これは、更に定義される）で共存する。
【００１０】
このように作製されるペプチドの混合物は、天然ペプチドと同一の抗原特異性を有する。従って、これらのペプチドの混合物は、収束性（ｃｏｎｖｅｒｇｅｎｔ）と考えられ、そして以下で“コンベルトープ（ｃｏｎｖｅｒｔｏｐｅｓ）”と呼ばれる。
【００１１】
従って、本発明は、該免疫原性ペプチド混合物を製造するための方法に関する。
【００１２】
該方法における第１工程は、ＣＤ４細胞の活性化を潜在的に誘発し得る配列を選択するためのストラテジーに関する。該選択方法は、ＨＣＶウイルスの、キャプシド蛋白質ならびにＮＳ３およびＮＳ４蛋白質の領域に関する；これらの領域は、ＭＨＣのヒトクラスＩＩ分子についての固着モチーフのそれらの高密度について選択される。
【００１３】
ＭＨＣのクラスＩＩ分子の役割は、ＣＤ４ Ｔ細胞へ、ペプチド形態の分解化抗原（ｄｅｇｒａｄｅｄ ａｎｔｉｇｅｎｓ）を提示することである。ＭＨＣのクラスＩＩ分子による、Ｔリンパ球へのこれらの分解化抗原またはＴエピトープの提示は、免疫応答を誘発するための必要条件である。
【００１４】
ＭＨＣの分子は、その各々がＴエピトープとの相互作用という特異的な特性を有する、多数の対立遺伝子によってコードされる多形蛋白質である。ＭＨＣのいくつかのヒトクラスＩＩ分子の結晶学研究は、特に、Ｔエピトープとの特異的相互作用の様式をはっきりさせることを可能にした。
【００１５】
いくつかの重要な基準がある：一方で、該ペプチドの長さは、有効な相互作用を可能にするために、１１残基を超えなければならない；他方で、該抗原性ペプチドの特定の残基は、ＭＨＣの分子の固着ポケット（ａｎｃｈｏｒｉｎｇ ｐｏｃｋｅｔｓ）または微細環境（ｍｉｃｒｏ−ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔｓ）と相互作用することによって、該相互作用において特異的役割を果たす。
【００１６】
Ｐ１， Ｐ４， Ｐ６， Ｐ９として公知の４つの固着ポケットが存在し、これらは、どのようなＭＨＣ対立遺伝子でも、認識において主要な役割を果たす。これら固着ポケットは、互いに独立しており、そして該ペプチドの側鎖の特異的固着を可能にする、特別な物理化学的特性を有する。
【００１７】
ＭＨＣの分子の多形残基は、固着ポケットの領域において主として群にされ、そして従って該ペプチド性抗原の特定の相互作用特徴に影響を与える。
【００１８】
これら主要対立遺伝子の固着ポケットの特徴は、ＳＴＵＲＮＩＯＬＯによって同定された（ＳＴＵＲＮＩＯＬＯ Ｔ．， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．； １９９９， １７：５５５）。
【００１９】
本出願人は、そこから、天然蛋白質配列内の、固着ポケットについての予測的サーチに適用可能である、大多数のクラスＩＩ ＭＨＣ対立遺伝子に共通の基準を、推測した。
【００２０】
従って、９隣接アミノ酸のモチーフにおいて、Ｐ１位のアミノ酸は、必ず疎水性であり、そして脂肪族または芳香族アミノ酸、即ち、Ｖ， Ｉ， Ｌ， Ｆ， Ｍ， ＷまたはＹであり； Ｐ４， Ｐ６およびＰ９位のアミノ酸は、それぞれ、好ましくは、Ｉ， Ｖ， Ｌ， Ｍ， ＦまたはＡ；Ａ， Ｐ， Ｇ， ＳまたはＴ；およびＡ， Ｉ， Ｖ， Ｙ， Ｌ， ＦまたはＭである。
【００２１】
これらの基準は、予測的・非実験的様式で、キャプシド、ならびにＮＳ３およびＮＳ４蛋白質における問題の配列を同定することに適用され、これらの配列は、ｔｈｅ ＳＷＩＳＳ ＰＲＯＴ ｄａｔａ ｂａｎｋから入手可能である（これらのリファレンスを、配列表に添付する）。
【００２２】
上記に定義の基準から１または２アミノ酸だけ異なる、いくつかの潜在的な固着モチーフを、同定した。
【００２３】
高密度にこれらの固着モチーフを有する蛋白質配列の部分を、同定し、そして選択した。選択されたペプチド配列は、１９〜３６残基の長さを有する。それらは、第１固着単位の上流および最終固着単位の下流に、少なくとも１または２残基を含む。これらの末端は、疎水性残基に非常に富む配列の溶解性を促進させ得る帯電したアミノ酸を該配列へ含めるために、１〜６の更なる天然アミノ酸によって伸張され得る。
【００２４】
合計で、２６配列の群をこの様式で選択した。それらは、表題“配列表”での添付に示される。配列番号１〜８はキャプシド蛋白質の領域であり、配列番号９〜２１はＮＳ３蛋白質の領域であり、そして配列番号２２〜２６はＮＳ４蛋白質の領域である。
【００２５】
問題の配列を同定し、本発明に従う方法における第２工程は、これらの配列に基づいて、収束コンビナトリーぺプチドライブラリ（ｃｏｎｖｅｒｇｅｎｔ ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｙ ｐｅｐｔｉｄｅ ｌｉｂｒａｒｉｅｓ）（”コンベルトープ（ｃｏｎｖｅｒｔｏｐｅｓ）”と呼ぶ）を設計することである。
【００２６】
コンビナトリーライブラリを作製することを目指すアミノ酸置換の選択は、免疫レセプターによる、特に主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）の分子およびＴリンパ球レセプターによる、抗原の認識の分子特徴に、ならびにより詳細に、免疫系による認識のこれらの機構の縮重（ｄｅｇｅｎｅｒａｃｙ）の見解に基づく（特に、Ｈｅｍｍｅｒ ｅｔ ａｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｔｏｄａｙ １９９８， １９， １６３−１６８ ”Ｐｒｏｂｉｎｇ ｄｅｇｅｎｅｒａｃｙ ｉｎ Ｔ−ｃｅｌｌ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｕｓｉｎｇ ｐｅｐｔｉｄｅ ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ ｌｉｂｒａｒｉｅｓ”を参照のこと）。
【００２７】
本発明に従う、後で求められる縮重は、該ウイルスの種々の自然変種（ｖａｒｉａｎｔｓ）の抗原配列に存在する、既存の突然変異に基づいて産生されるいわゆる天然縮重とは異なる、非天然縮重（ｎｏｎ−ｎａｔｕｒａｌ ｄｅｇｅｎｅｒａｃｙ）である（ＧＲＡＳ−ＭＡＳＳＥ Ｈ．， Ｐｅｐｔ． Ｒｅｓ．， １９９２， ５：２１１−２１６）。収束ペプチド混合物の開発のための非天然縮重のこの概念は、最初、ＧＲＡＳ−ＭＡＳＳＥ Ｈ．によって提案された（ＧＲＡＳ−ＭＡＳＳＥ Ｈ．， Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ．， １９９９， １１：２２３−２２８）。
【００２８】
該混合物を使用する目的は、特に、天然ペプチドに関連するがこれとは異なるペプチドの引き続いての認識を可能にし、そして該ウイルスの天然変種において直面され得る、より広い免疫応答を刺激することである。
【００２９】
本発明に従う方法において、第１タイプの縮重は、ＭＨＣの分子へ固着する該エピトープの能力を増大させる目的のために、作製される。
【００３０】
同定される固着モチーフにおいて、天然配列のＰ４， Ｐ６およびＰ９残基が、Ｓｔｕｒｎｉｏｌｏによる研究に従って前記に定義される共通基準（ｃｏｍｍｏｎ ｃｒｉｔｅｒｉａ）を満たすことを、確認する。該アミノ酸がこれらの基準を満たさない場合、よりコンプライアントな（ｃｏｍｐｌｉａｎｔ）アミノ酸による（特に、アラニンによる）その置換が、意図される。
【００３１】
第２タイプの縮重は、Ｔ細胞のレセプターによる該エピトープの認識を増大させる目的のために、作製され得；それは、ＭＨＣの分子へ固着することにおいて何の役割も果たさない部分、即ち１， ４， ６および９以外の残基のみに関する。ここで意図される置換は、Ｇｅｙｓｅｎ（Ｊ． Ｍｏｌ． Ｒｅｃｏｇ． １９８８， １， ３２）によって工夫された置換可能性のマトリクス（ａ ｍａｔｒｉｘ ｏｆ ｒｅｐｌａｃｅａｂｉｌｉｔｙ）に基づき、これは、Ｔレセプターによる該抗原の認識の相当な縮重を考慮する。全ての位置は置換され得、その置換が隣接単位とまたは既にその中に行われた置換と不適合性となる、２以上の隣接する固着単位に共通の残基を除く。
【００３２】
潜在的なＴエピトープとして選択される２６の配列（添付の配列番号１〜２６）において、前記の基準に従って選択された置換は、以下の表Ｉならびに配列番号２７〜５２に示される２６のコンベルトープを生じさせ、これらの設計は、実施例１および図１〜２６において明確化される。配列番号２７〜５２において、可変の性質のアミノ酸は、慣例により、Ｘａａで示される。各コンベルトープは、天然配列を有するペプチド、ならびに示される位置で完全にまたは部分的に置換された配列を有する全てのペプチドを含むことが、指摘されるべきである。
【００３３】
【表１】
2004509071.tif 000002
【００３４】
【表２】
2004509071.tif 000003
【００３５】
ペプチド合成は、２段階で行われる：一方で、天然配列のペプチドの合成、および、他方で、該コンベルトープの合成。これらの合成は、慣用的な自動合成機（ａｕｔｏｍａｔｉｃ ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ）において行われる。
【００３６】
コンベルトープを構成するペプチドの群は、単一合成で得られ、この間、置換可能な位置に対応する各サイクルについて、天然アミノ酸と置換アミノ酸との混合物が使用され、この濃度は、該合成ペプチドにおいて等モル比が得られるように調整される。
【００３７】
本発明に従う方法は、Ｃ型肝炎ウイルスについて、そしてより詳細には、このウイルスのキャプシド蛋白質ならびにＮＳ３およびＮＳ４蛋白質について開発された。
【００３８】
選択されるウイルス蛋白質の制限（ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ）領域および収束コンビナトリーペプチドライブラリを含む免疫原性ペプチドを調製する同一方法が、Ｔ細胞免疫応答を含む任意のウイルスに適用可能であることは、非常に明確である。
【００３９】
従って、合成的に、この方法は、以下を含む：
ａ）潜在的Ｔエピトープを構成するアミノ酸の配列を、該ウイルスの蛋白質の天然配列から、クラスＩＩ ＭＨＣ分子についての固着モチーフ（ａｎｃｈｏｒｉｎｇ ｍｏｔｉｆｓ）の、および高密度に該固着モチーフを有する領域の、予測的・非実験的サーチングによって同定すること；
ｂ）ａ）において同定されたエピトープの配列に由来する、収束コンビナトリーペプチドライブラリ（“コンベルトープ（ｃｏｎｖｅｒｔｏｐｅｓ）”と呼ぶ）を、
−　一方で、クラスＩＩ ＭＨＣ分子へ固着する該エピトープの能力を増大させるために、
−　および、他方で、Ｔ細胞レセプターによる該エピトープの認識のレパートリー（ｒｅｐｅｒｔｏｒｙ）を拡大させるために、
選択位置でのアミノ酸の標的化置換によって、該エピトープの各々の天然縮重（ｎｏｎ−ｎａｔｕｒａｌ ｄｅｇｅｎｅｒａｃｙ）を誘発させるように、設計すること；
ｃ）−　一方で、ａ）において同定されるペプチドの中から選択される天然配列を有するペプチド、
−　および、他方で、ｂ）において同定される対応のコンベルトープ、
を合成すること。
【００４０】
前記固着モチーフのサーチは、大多数のクラスＩＩ ＭＨＣ対立遺伝子に共通する以下の基準を適用することによって行われる：
−　９隣接アミノ酸のモチーフにおいて、Ｐ１位のアミノ酸が必ず疎水性であり、そして脂肪族または芳香族アミノ酸、即ち、Ｖ， Ｉ， Ｌ， Ｆ， Ｍ， ＷまたはＹである；
−　Ｐ４， Ｐ６およびＰ９位のアミノ酸が、それぞれ、好ましくは、Ｉ， Ｖ， Ｌ， Ｍ， ＦまたはＡ；Ａ， Ｐ， Ｇ， ＳまたはＴ；およびＡ， Ｉ， Ｖ， Ｙ， Ｌ， ＦまたはＭである。
【００４１】
コンベルトープを設計することは、各同定された固着モチーフにおいて、Ｐ４， Ｐ６またはＰ９残基の１以上を、それらが前記に定義される共通基準を満足さない場合、よりコンプライアントなアミノ酸で、そして好ましくはアラニンで置換することを含む。
【００４２】
コンベルトープを設計することは、更に、１， ４， ６または９以外の１以上の残基［その置換が隣接単位とまたは既にその中に行われた置換と不適合性となる、２以上の隣接する固着単位に共通の残基を除く］を、Ｔ細胞レセプターによる該エピトープの認識に好都合である置換可能性のマトリクス（ａ ｍａｔｒｉｘ ｏｆ ｒｅｐｌａｃｅａｂｉｌｉｔｙ）に従って置換することを含む。
【００４３】
本発明に従う方法で得られる免疫原性ペプチドの混合物は、これらのペプチドが誘導されるウイルスに対するワクチン接種（ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ）に主として意図される。
【００４４】
より詳細には、本発明は、Ｃ型肝炎ウイルスに対するワクチン接種について設計される組成物に関連する。この組成物は、天然配列と、本発明の方法を使用して得られそして表Ｉに示されるコンベルトープの中から選択される縮重配列との対を含む。
【００４５】
該ワクチン組成物は、予防的だけでなく、既に感染された患者の免疫応答を刺激するために治療的である用途が見出され得る。
【００４６】
以下の実施例は、本発明を例示するに役立つが、その範囲を限定しない。
【００４７】
実施例１：
コンベルトープの設計
書誌データは、Ｃ型肝炎ウイルスのキャプシド蛋白質ならびにＮＳ３およびＮＳ４蛋白質の、潜在的Ｔエピトープを構成する免疫原性ペプチドを調製することにおける、潜在的に興味のある蛋白質として、選択へと至った。
【００４８】
これらの蛋白質の配列は、ｔｈｅ ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ ｄａｔａ ｂａｎｋから入手可能である。
【００４９】
潜在的Ｔエピトープを同定するため、およびこれらに基づいて収束ペプチドライブラリまたは“コンベルトープ（ｃｏｎｖｅｒｔｏｐｅｓ）”を設計するための方法は、以下の工程を含む：
−　第１工程
潜在的な固着モチーフは、ＨＬＡ−ＤＲヒトクラスＩＩ ＭＨＣ分子の対立遺伝子の大多数に共通の規則［即ち、ポケットＰ１と相互作用し得る、９残基の部分の第１位置における、脂肪族または芳香族アミノ酸（Ｖ， Ｉ， Ｌ， Ｆ， Ｍ， Ｗ， Ｙ）］に基づいて、同定される。ＨＬＡ−ＤＲ対立遺伝子に関して、このポケットＰ１は、僅かだけ多形性であり（β鎖における８６位の単一のＶａｌ／Ｇｌｙ二形性の存在）、そして全ての該対立遺伝子によって共有される認識の規則を示す。更に、Ｐ１位における疎水性脂肪族または芳香族残基の存在は、対応の固着ポケットとの相互作用のための必須条件であるようであり、この固着は、特に安定な複合体の形成を可能にすることによって、ＭＨＣ分子と該抗原ペプチドとの相互作用において主要な役割を果たしている。
【００５０】
固着ポケットＰ４， Ｐ６， Ｐ９の領域において固着することに潜在的に関与するアミノ酸残基の同定は、第１位置に数学的に由来している。各固着位置について、ＳＴＵＲＮＩＯＬＯ Ｔ．（Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．， １９９９， １７：５５５）の結果の分析に基づいて、最大数の異なる対立遺伝子と相互作用し得る主要なアミノ酸を探すことによって、コンセンサス（ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ）が規定された。以下の表は、ＭＨＣのＨＬＡ−ＤＲクラスＩＩ分子の４つのポケットＰ１， Ｐ４， Ｐ６およびＰ９の特徴を説明する。
【００５１】
【表３】
2004509071.tif 000004
【００５２】
高密度にこれらの固着モチーフを有するキャプシドならびにＮＳ３およびＮＳ４蛋白質の配列の部分を、同定および選択した。それらは、第１固着単位の上流および最終のものの下流に１または２のアミノ酸を含む。これら末端は、疎水性残基に非常に富む配列の溶解性を促進し得る帯電したアミノ酸を該配列中に含めるために、１〜６の更なる天然アミノ酸によって伸張され得る。
【００５３】
合計で、２６の配列をこのように選択した：キャプシド蛋白質において、配列番号１〜８；ＮＳ３蛋白質において、配列番号９〜２１；ＮＳ４蛋白質において、配列番号２２〜２６。
【００５４】
−　第２工程
得られた潜在的な固着モチーフを、前記に定義されるクラスＩＩ ＭＨＣについてのコンセンサス固着モチーフ（ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ ａｎｃｈｏｒｉｎｇ ｍｏｔｉｆ）と比較した。
【００５５】
天然アミノ酸が表ＩＩに示される条件に合わない場合、アラニンが、Ｐ４， Ｐ６， Ｐ９位へ体系的に導入される。実際に、アラニンは、クラスＩＩ ＭＨＣ分子へ固着することに関与するアミノ酸を置換し得（Ｆｌｅｃｋｅｎｓｔｅｉｎ Ｂ． ｅｔ ａｌ， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈ． １９９６． ２４０：７１， Ｓｔｕｒｎｉｏｌｏ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ １９９９， １７：５５５）、これは、Ｔ細胞による認識に影響を与えることなく、側鎖の負の影響を除去しそして従ってＭＨＣ分子との会合を改善することを可能にすることによる（Ａｈｌｅｒｓ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ． １９９７． ９４：１０８５６）。しかし、天然アミノ酸が、オーバーラップする、隣接する固着モチーフのＰ１固着位に含まれる場合、置換は意図されない。
【００５６】
−　第３工程
クラスＩＩ ＭＨＣ分子への潜在的な固着に関係せずそしてＴ細胞の特異的レセプターとの相互作用に関係するアミノ酸（即ち、Ｐ２， Ｐ３， Ｐ５， Ｐ７およびＰ８位）の場合、これらの位置の１つの置換が行われ得、該置換は、Ｔ細胞による特異的認識に専念される。これらの置換の目的は、天然抗原のより多数のＴ細胞特異性を産生し得る、天然ペプチドに関連する改変体（ｖａｒｉａｎｔｓ）を産生することである。この拡大（ｂｒｏａｄｅｒｉｎｇ）は、Ｔ認識の相当な縮重の点で意図される（Ｈｅｍｍｅｒ Ｂ．， Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｔｏｄａｙ １９９８ １９：１６３）。実際に、クローナルＴ細胞は、ある場合においてはより高い親和性で、天然配列と関連するおよび関連しない、非常に多数のペプチド抗原を認識する能力を有する。
【００５７】
行われる置換は、Ｇｅｙｓｅｎタイプの置換可能性のマトリクス（ａ ｍａｔｒｉｘ ｏｆ ｒｅｐｌａｃｅａｂｉｌｉｔｙ）に基づく（Ｇｅｙｓｅｎ Ｍ． ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｒｅｃｏｇ． １９９８． １， ３２−４１）。この置換可能性のマトリクスは、ペプチド／抗体認識に基づいて作製され、これは、Ｔ細胞のレセプターの認識モードに関連する。Ｐ２， Ｐ３， Ｐ５， Ｐ７およびＰ８位におけるアミノ酸は、それらが隣接する単位に局在する固着モチーフに関係しない場合に、置換され得る。Ｇｅｙｓｅｎのマトリクスによって提案される種々の置換可能性が与えられると、置換は、最良の置換可能性インデックス（ｒｅｐｌａｃｅａｂｉｌｉｔｙ ｉｎｄｅｘｅｓ）の１つを有するアミノ酸に、優先的に関係する。
【００５８】
コンベルトープの設計が、図１〜２６に図示される。
【００５９】
図１〜２６の凡例
問題の天然配列は、図の上部に示される。
【００６０】
固着ポケットとの潜在的反応に関与するアミノ酸は、□で示される。
【００６１】
ＭＨＣ固着ポイントＰ１， Ｐ４， Ｐ６およびＰ９は、例示の対角線モードで、固着モチーフ内で関連する。
【００６２】
本明細書において説明される合理的方法に従う、天然アミノ酸の置換は、下付文字形態で示される。
【００６３】
Ｔ細胞レセプター（ＴＣＲ）による認識を改善するために置換されるアミノ酸がまた示される。
【００６４】
２つの置換アプローチの付加（ＭＨＣおよびＴＣＲ）が、下部（図の囲まれている部分）に要約される。
【００６５】
実施例２
Ａ）ペプチドの調製
ペプチドは、自動化ペプチド合成機（ｍｏｄｅｌ ４３０Ａ， ＡＰＰＬＩＥＤ ＢＩＯＳＹＳＴＥＭ， ＩＮＣ．）において、Ｂｏｃ−ベンジル（またはＦｍｏｃ）タイプの慣用的固相ストラテジーを使用して合成される。側鎖保護基は、以下の通りである： Ａｓｎ（Ｔｒｔ）， Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）， Ａｓｐ（Ｏｃｈｘ）， Ｇｌｕ（Ｏｃｈｘ）， Ｓｅｒ（Ｂｚｌ）， Ｔｈｒ（Ｂｚｌ）， Ｃｙｓ（４−ＭｅＢｚｌ）およびＨｉｓ（Ｄｎｐ）（ＳＨＥＰＰＡＲＤ Ｒ．Ｃ． ｅｔ ａｌ．， Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｃｏｍｐ． Ｏｒｇ． Ｃｈｅｍ．， １９７９， ５：３２１）。アミノ酸は、Ｂｏｃ−Ｘ−Ｐａｍ樹脂（ここで、Ｘは、Ｃ末端位のアミノ酸を示す）上におけるダブルシステマティックカップリング（ｄｏｕｂｌｅ ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ ｃｏｕｐｌｉｎｇ）でのＨＢＴＵ／ＨＯＢｔ活性化プロトコルを使用して導入される。ジニトロフェニル（ｄｉｎｏｔｒｏｐｈｅｎｙｌ）基Ｄｎｐのチオ開裂、続いて最終脱保護およびフッ化水素酸での切断後、切断・脱保護されたペプチドを、冷ジエチルエーテルで析出させ、次いで５％酢酸に溶解し、そして凍結乾燥させる。ペプチドを、５ｍｍ ｘ ２５０ｍｍ， １００ａ Ｎｕｃｌｅｏｓｙｌ Ｃ１８， ＲＰ−ＨＰＬＣ（ＭＡＣＨＥＲＹ ＮＡＧＥＬ， Ｄｕｒｅｎ， Ｇｅｒｍａｎｙ）の分取カラム上で９０％超まで精製する。均質性を、溶媒（トリフルオロ酢酸−アセトニトリル−水）の系で溶出されるＶｙｄａｃカラム上の分析ＨＰＬＣによって確認する。ペプチドのアイデンティティーは、アミノ酸組成を測定することおよびＢｉｏ Ｉｏｎ ２０ ｐｌａｓｍａ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ （ＢＩＯ ＩＯＮ ＡＢ， Ｕｐｐｓａｌａ， Ｓｗｅｄｅｎ）に記録されれる質量分析によって確認される。
【００６６】
Ｂ）コンベルトープの調製
合成は、慣用的な合成におけるように、縮重位置を除いて、前述された方法に従って行われ、ここで、等モル量の保護されたアミノ酸が、単一アミノ酸（ｓｉｎｇｌｅ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ）の代わりにカップリング反応において使用される、。異なるアミノ酸の反応性レベルの速度論的差異（ｋｉｎｅｔｉｃ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ）を補償するために、第１カップリングを、１ｍｍｏｌ（総量）のＢｏｃ−アミノ酸（または混合物）で行う。次いで、２ｍｍｏｌ（総量）を使用する第２カップリングを、系統的に行う。切断後、未精製のペプチドをトリフルオロ酢酸に溶解し、そして冷ジエチルエーテルの溶液中で析出させる。遠心分離後、析出物を水に溶解し、次いでＴＳＫ ＨＷ４０Ｓカラム（ＭＥＲＫ， Ｄａｒｍｓｔａｄｔ， Ｇｅｒｍａｎｙ）上でのゲル濾過によって精製する。アリコートを、アミノ酸組成を測定するために、酸加水分解に供する。
【００６７】
実施例３
該混合物の免疫原性の評価
天然ペプチドおよびそれから誘導されたコンベルトープの配列を、配列表および表ＩＩに示す。これらの産物、およびその異なる組み合わせは、免疫化目的のための抗原として使用される。
【００６８】
該ペプチドおよび該コンベルトープの免疫原性を、２つの相補的アプローチを使用して評価する：一方で、ヒト化マウスのインビボでの免疫化による；他方で、ＨＬＡタイプ化ドナーヒトからのヒト細胞のインビトロでの免疫化による。
【００６９】
Ａ）マウスクラスＩＩ ＭＨＣ分子を欠損した（Ａ（Ｏ）および種々のヒトクラスＩＩ ＭＨＣ分子に関してトランスジェニックな（ＤＲ１， ＤＲ２， ＤＲ３， ＤＱ６， ＤＱ８）マウスを、１条件当たり３匹のマウスを使用して、選択されたペプチドの混合物で免疫化する。マウスを、皮下投与される、水／フロイント完全アジュバントの混合物１００マイクロリットルの容積中１００マイクログラムのペプチドで免疫化する。マウスを、水／フロイント不完全アジュバントの混合物１００マイクロリットル中５０マイクログラムのペプチドで、１５日間隔で１または２回、再刺激する。免疫化マウスの血清サンプルを、特異的抗体の産生、ならびにインビボでのサイトカインの産生を評価するために、各注射の前に回収する。最後の注射の１週間後、異なるグループの動物の、神経節ならびに脾臓を回収し、グループに基づいてプールし、次いで培養し、インビトロで細胞増殖を誘発する能力、およびインビトロでＴＨ１またはＴＨ２タイプサイトカインの産生を誘発する能力を研究して、最良の免疫原性を有するペプチドおよびコンベルトープを同定する。
【００７０】
Ｂ）インビトロでの免疫化を以下のように行った：陽性選択（ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）によって単離されたＣＤ１４＋ 血液単球を、５日間ＩＬ４およびＧＭ−ＣＳＦと接触した状態を維持した後、樹状細胞へ分化させる。次いで、同一ドナーから単離されたＣＤ４＋ 細胞を、ペプチドおよびコンベルトープの異なる混合物で、インビトロで免疫化する。１つの引き続いての再刺激を、同一条件下で行い、次いで同一ドナーのＢリンパ球を、抗原−提示細胞として使用する。異なるサイトカインの産生を、インビトロでの免疫化の２４および４８時間後に、培養上澄みにおいて求める。
【図面の簡単な説明】
【図１】
コンベルトープの設計
【図２】
コンベルトープの設計
【図３】
コンベルトープの設計
【図４】
コンベルトープの設計
【図５】
コンベルトープの設計
【図６】
コンベルトープの設計
【図７】
コンベルトープの設計
【図８】
コンベルトープの設計
【図９】
コンベルトープの設計
【図１０】
コンベルトープの設計
【図１１】
コンベルトープの設計
【図１２】
コンベルトープの設計
【図１３】
コンベルトープの設計
【図１４】
コンベルトープの設計
【図１５】
コンベルトープの設計
【図１６】
コンベルトープの設計
【図１７】
コンベルトープの設計
【図１８】
コンベルトープの設計
【図１９】
コンベルトープの設計
【図２０】
コンベルトープの設計
【図２１】
コンベルトープの設計
【図２２】
コンベルトープの設計
【図２３】
コンベルトープの設計
【図２４】
コンベルトープの設計
【図２５】
コンベルトープの設計
【図２６】
コンベルトープの設計
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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