(57)【要約】本発明は配列番号１〜配列番号１１から選択される配列に相当するリステリア・インノキュア由来のヌクレオチド配列、およびそのゲノムとリステリア・モノサイトゲネスのゲノムとの比較分析に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
リステリア属菌株のゲノムに特異的なヌクレオチド配列、特にＬ．インノキュアまたはＬ．モノサイトゲネス（Ｌ．モノサイトゲネスＥＧＤｅまたはＬ．モノサイトゲネス４ｂなど）株に特異的なヌクレオチド配列、を同定する方法。
【請求項２】
Ｌ．モノサイトゲネス（特にＬ．モノサイトゲネスＥＧＤｅおよび／またはＬ．モノサイトゲネス４ｂ）に比べて、Ｌ．インノキュアに特異的な配列が同定され、
Ｌ．インノキュアに比べて、Ｌ．モノサイトゲネス（特にＬ．モノサイトゲネスＥＧＤｅまたはＬ．モノサイトゲネス４ｂ）に特異的な配列が同定され、
Ｌ．インノキュアおよび／またはＬ．モノサイトゲネス４ｂに比べてＬ．モノサイトゲネスＥＧＤｅに特異的な配列が同定され、または
Ｌ．インノキュアおよび／またはＬ．モノサイトゲネスＥＧＤｅに比べてＬ．モノサイトゲネス４ｂに特異的な配列が同定されることを特徴とする、請求項１に記載のヌクレオチド配列同定方法。
【請求項３】
ａ）Ｌ．モノサイトゲネス（特にＬ．モノサイトゲネスＥＧＤｅおよび／またはＬ．モノサイトゲネス４ｂ）のヌクレオチド配列と、Ｌ．インノキュアのヌクレオチド配列とを請求項５〜８、１０〜１７および２１に記載に従いアライメントし、さらに
ｂ）上記の特異的配列を単離するためにこのアライメントを用いて得られたデータを処理する工程を少なくとも含んでなることを特徴とする、請求項１または２に記載のヌクレオチド配列同定方法。
【請求項４】
Ｌ．インノキュアまたはＬ．モノサイトゲネス（特にＬ．モノサイトゲネスＥＧＤｅおよび／もしくはＬ．モノサイトゲネス４ｂ）に特異的なヌクレオチド配列が、高ストリンジェンシー条件下で、それぞれＬ．インノキュアまたはＬ．モノサイトゲネス（特にＬ．モノサイトゲネスＥＧＤｅおよび／もしくはＬ．モノサイトゲネス４ｂ）のヌクレオチド配列、またはそれと相補的な配列とハイブリダイズすることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか一項に記載のヌクレオチド配列同定方法。
【請求項５】
配列番号１〜配列番号１１、配列番号２０５７および配列番号２０５８から選択される配列に相当するものであることを特徴とする、リステリア・インノキュア由来のヌクレオチド配列。
【請求項６】
ａ）配列番号１〜配列番号１１、配列番号２０５７、および配列番号２０５８から選択される配列と少なくとも７５％の同一性を有するヌクレオチド配列、
ｂ）高ストリンジェンシー条件下で配列番号１〜配列番号１１、配列番号２０５７、および配列番号２０５８から選択される配列とハイブリダイズするヌクレオチド配列、
ｃ）配列番号１〜配列番号１１、配列番号２０５７、および配列番号２０５８から選択される配列と相補的な、またはａ）もしくはｂ）で定義されたヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列、あるいは配列ａ）およびｂ）のいずれかに対応するＲＮＡのヌクレオチド配列、
ｄ）配列番号１〜配列番号１１、配列番号２０５７および配列番号２０５８から選択される配列の典型的な断片、またはａ）、ｂ）もしくはｃ）で定義されたヌクレオチド配列の典型的な断片のヌクレオチド配列、
ｅ）ａ）、ｂ）、ｃ）またはｄ）で定義された配列を含んでなるヌクレオチド配列、および
ｆ）ａ）、ｂ）、ｃ）、ｄ）またはｅ）で定義されたヌクレオチド配列の改変されたもの
から選択されるものであることを特徴とする、リステリア・インノキュア由来のヌクレオチド配列。
【請求項７】
配列番号１〜配列番号１１、配列番号２０５７、および配列番号２０５８から選択される配列に由来する配列であり、かつ、ポリペプチドをコードし、好ましくは配列番号１２〜配列番号６８９、配列番号２０５３〜配列番号２０５６および配列番号２０５９〜配列番号２６０１のヌクレオチド配列から選択されるものであることを特徴とする、請求項６に記載のヌクレオチド配列。
【請求項８】
ａ）請求項７に記載のヌクレオチド配列、
ｂ）請求項７に記載のヌクレオチド配列と少なくとも７５％の同一性を有するヌクレオチド配列、
ｃ）高ストリンジェンシー条件下で請求項７に記載のヌクレオチド配列とハイブリダイズするヌクレオチド配列、
ｄ）ａ）、ｂ）またはｃ）で定義された配列に対応する相補的またはＲＮＡヌクレオチド配列、
ｅ）ａ）、ｂ）、ｃ）またはｄ）で定義された配列の典型的な断片のヌクレオチド配列、および
ｆ）ａ）、ｂ）、ｃ）、ｄ）またはｅ）で定義された配列の改変されたもの
から選択されるヌクレオチド配列を含んでなることを特徴とする、ヌクレオチド配列。
【請求項９】
請求項６〜８のいずれか一項に記載のヌクレオチド配列によってコードされる、ポリペプチド。
【請求項１０】
配列番号１２〜配列番号６８９、配列番号２０５３〜配列番号２０５６および配列番号２０５９〜配列番号２６０１から選択される配列によってコードされるポリペプチドから選択されるものであることを特徴とする、請求項９に記載のポリペプチド。
【請求項１１】
ａ）請求項９または１０に記載のポリペプチド、
ｂ）請求項９または１０に記載のポリペプチドと少なくとも８０％の同一性を示すポリペプチド、
ｃ）請求項９または１０に記載の、またはｂ）で定義されたポリペプチドの少なくとも５個のアミノ酸の断片、
ｄ）請求項９または１０に記載の、またはｂ）もしくはｃ）で定義されたポリペプチドの生物学的に活性な断片、
ｅ）請求項９または１０に記載の、またはｂ）、ｃ）もしくはｄ）で定義されたポリペプチドの改変されたもの
から選択されるポリペプチドを含んでなる、ポリペプチド。
【請求項１２】
請求項１１に記載のポリペプチドをコードする、ヌクレオチド配列。
【請求項１３】
配列番号１２〜配列番号６８９および配列番号２０５９〜配列番号２６０１から選択されるものであることを特徴とする、Ｌ．インノキュアに特異的なポリペプチドをコードするヌクレオチド配列。
【請求項１４】
配列番号１０６８〜配列番号２０４１および配列番号２８７２〜配列番号３８９１から選択される配列に相当するものであることを特徴とする、リステリア・モノサイトゲネス血清型４ｂ由来のヌクレオチド配列。
【請求項１５】
ａ）配列番号１０６８〜配列番号２０４１および配列番号２８７２〜配列番号３８９１から選択される配列と少なくとも７５％の同一性を有するヌクレオチド配列、
ｂ）高ストリンジェンシー条件下で、配列番号１０６８〜配列番号２０４１および配列番号２８７２〜配列番号３８９１から選択される配列とハイブリダイズするヌクレオチド配列、
ｃ）配列番号１０６８〜配列番号２０４１および配列番号２８７２〜配列番号３８９１から選択される配列と相補的な、またはａ）もしくはｂ）で定義されたヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列、あるいは配列ａ）およびｂ）のいずれかに対応するＲＮＡのヌクレオチド配列、
ｄ）配列番号１０６８〜配列番号２０４１および配列番号２８７２〜配列番号３８９１から選択される配列の典型的な断片、またはａ）、ｂ）もしくはｃ）で定義されたヌクレオチド配列の典型的な断片のヌクレオチド配列、
ｅ）ａ）、ｂ）、ｃ）またはｄ）で定義された配列を含んでなるヌクレオチド配列、および
ｆ）ａ）、ｂ）、ｃ）、ｄ）またはｅ）で定義されたヌクレオチド配列の改変されたものから選択されるものであることを特徴とする、リステリア・モノサイトゲネス血清型４ｂ由来のヌクレオチド配列。
【請求項１６】
配列番号１０６８〜配列番号２０４１および配列番号２８７２〜配列番号３８９１から選択される配列に由来する配列であり、かつ、ポリペプチドをコードし、好ましくは配列番号６９０〜配列番号１０６７、配列番号２６０２〜配列番号２８７１および配列番号２０４９〜配列番号２０５２の配列から選択されるものであることを特徴とする、請求項１５に記載のヌクレオチド配列。
【請求項１７】
ａ）請求項１６に記載のヌクレオチド配列、
ｂ）請求項１６に記載のヌクレオチド配列と少なくとも７５％の同一性を有するヌクレオチド配列、
ｃ）高ストリンジェンシー条件下で請求項１６に記載のヌクレオチド配列とハイブリダイズするヌクレオチド配列、
ｄ）ａ）、ｂ）またはｃ）で定義された配列に対応する相補的またはＲＮＡヌクレオチド配列、
ｅ）ａ）、ｂ）、ｃ）またはｄ）で定義された配列の典型的な断片のヌクレオチド配列、および
ｆ）ａ）、ｂ）、ｃ）、ｄ）またはｅ）で定義された配列の改変されたもの
から選択されるヌクレオチド配列を含んでなるものであることを特徴とする、ヌクレオチド配列。
【請求項１８】
請求項１５〜１７のいずれか一項に記載のヌクレオチド配列によってコードされる、ポリペプチド。
【請求項１９】
配列番号６９０〜配列番号１０６７、配列番号２０４９〜配列番号２０５２および配列番号２６０２〜配列番号２８７１から選択される配列によってコードされるポリペプチドから選択されるものであることを特徴とする、請求項１８に記載のポリペプチド。
【請求項２０】
ａ）請求項１８または１９に記載のポリペプチド、
ｂ）請求項１８または１９に記載のポリペプチドと少なくとも８０％の同一性を示すポリペプチド、
ｃ）請求項１８または１９に記載の、またはｂ）で定義されたポリペプチドの少なくとも５個のアミノ酸の断片、
ｄ）請求項１８または１９に記載の、またはｂ）もしくはｃ）で定義されたポリペプチドの生物学的に活性な断片、
ｅ）請求項１８または１９に記載の、またはｂ）、ｃ）またはｄ）で定義されたポリペプチドの改変されたもの
から選択されるポリペプチドを含んでなることを特徴とする、ポリペプチド。
【請求項２１】
請求項２０に記載のポリペプチドをコードする、ヌクレオチド配列。
【請求項２２】
配列番号６９０〜配列番号１０６７、配列番号２６０２〜配列番号２８７１および配列番号３８９２〜配列番号４０２５から選択されるものであることを特徴とする、Ｌ．モノサイトゲネスに特異的なポリペプチドをコードするヌクレオチド配列。
【請求項２３】
配列番号２０４９〜配列番号２０５６から選択されることを特徴とする、Ｌ．インノキュアとＬ．モノサイトゲネスの間で少なくとも８７％の同一性を示すポリペプチドをコードするヌクレオチド配列。
【請求項２４】
Ｌ．インノキュアまたはＬ．モノサイトゲネスのポリペプチド、またはその断片であって、
アミノ酸生合成、または補因子、補欠分子団および輸送体の生合成に関与するもの、
Ｌ．インノキュアもしくはＬ．モノサイトゲネスの細胞外被ポリペプチド、または表面に存在するポリペプチドであるもの、
細胞機構に関与するもの、
中枢中間代謝に関与するもの、
エネルギー代謝に関与するもの、
脂肪酸およびリン脂質代謝に関与するもの、
ヌクレオチド、プリン、ピリミジンまたはヌクレオシドの代謝に関与するもの、
調節機能に関与するもの、
複製プロセスに関与するもの、
転写プロセスに関与するもの、
翻訳プロセスに関与するもの、
タンパク質輸送および結合のプロセスに関与するもの、
非定型条件への適応に関与するもの、
医薬品および類似体に対する感受性に関与するもの、または
トランスポゾンに関連する機能に関与するものの一つをコードすることを特徴とする、請求項６〜８、１２、１３、１５〜１７および２１〜２３のいずれか一項に記載のヌクレオチド配列。
【請求項２５】
Ｌ．インノキュアまたはＬ．モノサイトゲネスのポリペプチド：
アミノ酸生合成、または補因子、補欠分子団および輸送体の生合成に関与するもの、
細胞外被ポリペプチド、またはＬ．インノキュアもしくはＬ．モノサイトゲネスの表面に存在するポリペプチドであるもの、
細胞機構に関与するもの、
中枢中間代謝に関与するもの、
エネルギー代謝に関与するもの、
脂肪酸およびリン脂質代謝に関与するもの、
ヌクレオチド、プリン、ピリミジンまたはヌクレオシドの代謝に関与するもの、
調節機能に関与するもの、
複製プロセスに関与するもの、
転写プロセスに関与するもの、
翻訳プロセスに関与するもの、
タンパク質輸送および結合のプロセスに関与するもの、
非定型条件への適応に関与するもの、
医薬品および類似体感受性に関与するもの、または
トランスポゾンに関連する機能に関するもの
であることを特徴とする、請求項９〜１１および１７〜２０のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項２６】
その配列が請求項６〜８、１２〜１７および２１〜２３のいずれか一項に記載のヌクレオチド配列から選択されることを特徴とする、プライマーまたはプローブとして使用できるヌクレオチド配列。
【請求項２７】
放射性化合物または非放射性化合物で標識されてなることを特徴とする、請求項２６に記載のヌクレオチド配列。
【請求項２８】
支持体に共有結合または非共有結合により固定化されてなることを特徴とする、請求項２６および２７のいずれかに記載のヌクレオチド配列。
【請求項２９】
高密度フィルターまたはＤＮＡチップなどの支持体に固定化されてなることを特徴とする、請求項２８に記載のヌクレオチド配列。
【請求項３０】
核酸配列を検出および／または増幅するための、請求項２７〜２９のいずれか一項に記載のヌクレオチド配列。
【請求項３１】
請求項２９に記載の少なくとも一つのヌクレオチド配列を含んでなることを特徴とする、ＤＮＡチップまたはフィルター。
【請求項３２】
前記チップの支持体に固定化された、Ｌ．インノキュアまたはＬ．モノサイトゲネス以外の微生物の少なくとも一つのヌクレオチド配列を含むことを特徴とする、請求項３１に記載のＤＮＡチップまたはフィルター。
【請求項３３】
微生物がＬ．インノキュアまたはＬ．モノサイトゲネス、リステリア属の細菌およびＬ．インノキュアまたはＬ．モノサイトゲネスの変異体に関連する微生物から選択されるものであることを特徴とする、請求項３２に記載のＤＮＡチップまたはフィルター。
【請求項３４】
請求項３１に記載のＤＮＡチップまたはフィルターを含んでなることを特徴とする、Ｌ．インノキュアもしくはＬ．モノサイトゲネス種、または関連の微生物に属する細菌を検出および／または同定するキットまたはセット。
【請求項３５】
請求項３２または３３に記載のＤＮＡチップまたはフィルターを含んでなることを特徴とする、微生物を検出および／または同定するキットまたはセット。
【請求項３６】
請求項３２または３３に記載のＤＮＡチップまたはフィルターを含んでなることを特徴とする、Ｌ．インノキュアまたはＬ．モノサイトゲネスの少なくとも一つの遺伝子の発現を検出および／または同定するキットまたはセット。
【請求項３７】
請求項５〜８、１２、１３、１５〜１７および２１〜２３のいずれか一項に記載のヌクレオチド配列を含んでなることを特徴とする、クローニングおよび／または発現ベクター。
【請求項３８】
請求項３７に記載のベクターで形質転換されてなることを特徴とする、宿主細胞。
【請求項３９】
リステリア属に属する細菌であることを特徴とする、請求項３８に記載の宿主細胞。
【請求項４０】
Ｌ．インノキュアまたはＬ．モノサイトゲネス種に属する細菌であることを特徴とする、請求項３９に記載の宿主細胞。
【請求項４１】
請求項３８〜４０のいずれか一項に記載の形質転換細胞を含んでなる、植物または動物（ただしヒトを除く）。
【請求項４２】
請求項３７に記載のベクターで形質転換された細胞をそのポリペプチドを発現させる条件下で培養し、上記組換えポリペプチドを回収することを特徴とする、ポリペプチド生産方法。
【請求項４３】
請求項４２に記載の方法を用いて得ることができる、組換えポリペプチド。
【請求項４４】
ポリペプチドの化学合成が行われることを特徴とする、請求項９〜１１、１８〜２０および２５のいずれか一項に記載の合成ポリペプチドの作出方法。
【請求項４５】
少なくとも請求項９〜１１、１８〜２０、２５および４３のいずれか一項に記載のポリペプチドの配列、ならびにヒトまたは動物において免疫応答を誘導しうるポリペプチドの配列を含んでなることを特徴とする、ハイブリッドポリペプチド。
【請求項４６】
請求項４５に記載のハイブリッドポリペプチドをコードする、ヌクレオチド配列。
【請求項４７】
請求項４６に記載のヌクレオチド配列を含むことを特徴とする、ベクター。
【請求項４８】
請求項９〜１１、１８〜２０、２５、４３および４５のいずれか一項に記載のポリペプチドを特異的に認識しうることを特徴とする、モノクローナルもしくはポリクローナル抗体、そのフラグメント、またはキメラ抗体。
【請求項４９】
標識抗体であることを特徴とする、請求項４８に記載の抗体。
【請求項５０】
生物サンプルにおいてＬ．インノキュアもしくはＬ．モノサイトゲネス種、または関連の微生物に属する細菌を検出および／または同定する方法であって、以下の
ａ）生物サンプルを請求項４８および４９のいずれかに記載の抗体と接触させ、
ｂ）生じうる抗原−抗体複合体を検出すること
を含んでなることを特徴とする、方法。
【請求項５１】
Ｌ．インノキュアまたはＬ．モノサイトゲネス株を請求項７４または７５に記載の抗体と接触させ、生じうる抗原−抗体複合体を検出することを特徴とする、Ｌ．インノキュアまたはＬ．モノサイトゲネスの遺伝子の発現を検出する方法。
【請求項５２】
請求項５０または５１に記載の方法を実施するためのキットまたはセットであって、以下の構成要素：
ａ）請求項４８および４９のいずれかに記載の抗体、
ｂ）所望により、免疫反応に好適な媒体を構成する試薬、および
ｃ）所望により、免疫反応によって生じた抗原−抗体複合体を検出する試薬
を含んでなることを特徴とする、キットまたはセット。
【請求項５３】
支持体、特にタンパク質チップに固定化されてなることを特徴とする、請求項９〜１１、１８〜２０、２５、４３および４５のいずれか一項に記載のポリペプチド、または請求項４８および４９のいずれかに記載の抗体。
【請求項５４】
請求項９〜１１、１８〜２０、２５、４３および４５のいずれか一項に記載の少なくとも一つのポリペプチド、または請求項４８または４９に記載の少なくとも一つの抗体をチップに固定化して含むことを特徴とする、タンパク質チップ。
【請求項５５】
Ｌ．インノキュアもしくはＬ．モノサイトゲネス以外の微生物の少なくとも一つのポリペプチド、またはＬ．インノキュアもしくはＬ．モノサイトゲネス以外の微生物由来の化合物に対する少なくとも一つの抗体を更にチップに固定化して含むことを特徴とする、請求項５４に記載のタンパク質チップ。
【請求項５６】
請求項５４および５５のいずれかに記載のタンパク質チップを含んでなることを特徴とする、Ｌ．インノキュアもしくはＬ．モノサイトゲネス種、または関連の微生物に属する細菌を検出および／または同定するキットまたはセット。
【請求項５７】
請求項５６に記載のタンパク質チップを含んでなる、微生物を検出および／または同定するキットまたはセット。
【請求項５８】
請求項６〜８、１２、１３、１５〜１７、２１〜２４、２６〜３０および４６のいずれか一項に記載のヌクレオチド配列を用いることを特徴とする、生物サンプルにおいてＬ．インノキュアもしくはＬ．モノサイトゲネス種、または関連の微生物に属する細菌を検出および／または同定する方法。
【請求項５９】
ａ）所望により、分析する生物サンプルからＤＮＡを単離するか、または生物サンプルのＲＮＡからｃＤＮＡを得、
ｂ）請求項２６〜３０のいずれか一項に記載の少なくとも一つのプライマーを用い、Ｌ．インノキュアもしくはモノサイトゲネス４ｂ種、または関連の微生物に属する細菌のＤＮＡを特異的に増幅し、
ｃ）増幅産物を検出すること
を含んでなることを特徴とする、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
ａ）請求項２６〜３０のいずれか一項に記載のヌクレオチドプローブを生物サンプルと接触させ（この生物サンプルに含まれている核酸は、適当であれば、従前にそのプローブをＬ．インノキュアもしくはＬ．モノサイトゲネス種、または関連の微生物に属する細菌の核酸とハイブリダイズさせる条件下でハイブリダイズしやすかったものである）、
ｂ）ヌクレオチドプローブと生物サンプルの核酸との間で生じうるハイブリッドを検出すること
を含んでなる、請求項５８に記載の方法。
【請求項６１】
ａ）請求項２８に記載の支持体に固定化したヌクレオチドプローブを生物サンプルと接触させ（このサンプルの核酸は、適当であれば、従前にそのプローブをＬ．インノキュアもしくはＬ．モノサイトゲネス種、または関連の微生物に属する細菌の核酸とハイブリダイズさせる条件下でハイブリダイズしやすかったものである）、
ｂ）支持体に固定化したヌクレオチドプローブと生物サンプルに含まれている核酸との間で生じたハイブリッドを、適当であればそのプローブとハイブリダイズしなかった生物サンプルの核酸を除いた後に、請求項２７に記載の標識ヌクレオチドプローブと接触させ、
ｃ）工程ｂ）で生じた新たなハイブリッドを検出すること
を含んでなることを特徴とする、請求項５８に記載の方法。
【請求項６２】
工程ａ）の前に生物サンプルのＤＮＡ、または所望によりそのサンプルのＲＮＡの逆転写によって得られたｃＤＮＡを請求項２６〜３０のいずれか一項に記載の少なくとも一つのプライマーを用いて増幅することを特徴とする、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
Ｌ．インノキュアもしくはＬ．モノサイトゲネス種、または関連の微生物に属する細菌を検出および／または同定するキットまたはセットであって、以下の構成要素：
ａ）請求項２６〜３０のいずれか一項に記載のヌクレオチドプローブ、
ｂ）所望により、ハイブリダイゼーション反応の実施に必要な試薬、
ｃ）所望により、請求項２６〜３０のいずれか一項に記載の少なくとも一つのプライマー、および、さらにＤＮＡ増幅反応に必要な試薬を含んでなることを特徴とする、キットまたはセット。
【請求項６４】
Ｌ．インノキュアもしくはＬ．モノサイトゲネス種、または関連の微生物に属する細菌を検出および／または同定するキットまたはセットであって、以下の構成要素：
ａ）捕捉プローブとしての、請求項２８に記載のヌクレオチドプローブ、
ｂ）検出プローブとしての、請求項２７に記載のオリゴヌクレオチドプローブ、
ｃ）所望により、請求項２６〜３０のいずれか一項に記載の少なくとも一つのプライマー、および、さらにＤＮＡ増幅反応に必要な試薬を含んでなる、キットまたはセット。
【請求項６５】
Ｌ．インノキュアもしくはＬ．モノサイトゲネス種、または関連の微生物に属する細菌を検出および／または同定するキットまたはセットであって、
ａ）請求項２６〜３０のいずれか一項に記載の少なくとも一つのプライマー、
ｂ）所望により、ＤＮＡ増幅反応の実施に必要な試薬、
ｃ）所望により、増幅断片、さらに詳しくは請求項２６〜３０のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドプローブの配列を証明する成分を含んでなることを特徴とする、キットまたはセット。
【請求項６６】
プライマーおよび／またはプローブがＬ．インノキュアまたはＬ．モノサイトゲネス種に特異的な、請求項６〜８、１２、１３、１５〜１７、２１〜２４、２６〜３０および４６に記載のヌクレオチド配列から選択され、ポリペプチドがＬ．インノキュアまたはＬ．モノサイトゲネス種に特異的な、請求項９〜１１、１８〜２０、２５、４３および４５のいずれか一項に記載のポリペプチドから選択され、かつ、抗体がＬ．インノキュアまたはＬ．モノサイトゲネス種に特異的な、請求項９〜１１、１８〜２０、２５、４３および４５のいずれか一項に記載のポリペプチドから選択されるポリペプチドに対する、請求項４８および４９のいずれかに記載の抗体から選択されることを特徴とする、Ｌ．インノキュアまたはＬ．モノサイトゲネス種に属する細菌を検出および／または同定するための、請求項５０、５１および５８〜６２に記載の方法、または請求項５２、５６、５７および６３〜６５に記載のキットもしくはセット。
【請求項６７】
請求項６〜８、１２、１３、１５〜１７、および２１〜２４のいずれか一項に記載の少なくとも一つのヌクレオチド配列において少なくとも一つの突然変異を含むことを特徴とする、Ｌ．インノキュアまたはＬ．モノサイトゲネス株。
【請求項６８】
突然変異が遺伝子の不活性化をもたらすことを特徴とする、請求項６７に記載のＬ．インノキュアまたはＬ．モノサイトゲネス株。
【請求項６９】
突然変異が遺伝子の過剰発現をもたらす、請求項６７に記載のＬ．インノキュアまたはＬ．モノサイトゲネス株。
【請求項７０】
真核細胞または原核細胞において遺伝子発現を調整、調節、誘導または阻害しうる、かつ／または細胞複製を改変しうる、あるいはＬ．モノサイトゲネスまたはその関連微生物の一つによる感染に関連した動物またはヒト病態を誘発、抑制または悪化しうる有機または無機化合物を選択するための、請求項６〜８、１２、１３、１５〜１７、および２１〜２４のいずれか一項に記載のヌクレオチド配列、請求項９〜１１、１８〜２０、２５、４３および４５のいずれか一項に記載のポリペプチド、請求項４８および４９のいずれかに記載の抗体、請求項３８〜４０のいずれか一項に記載の細胞、および／または請求項４１に記載の形質転換動物の使用。
【請求項７１】
請求項９〜１１、１８〜２０、２５、４３および４５のいずれか一項に記載のポリペプチドと結合しうる、請求項６〜８、１２、１３、１５〜１７および２１〜２４のいずれか一項に記載のヌクレオチド配列と結合しうる、または請求項４８および４９のいずれかに記載の抗体を認識しうる、かつ／または真核細胞もしくは原核細胞の遺伝子発現を調整、調節、誘導または阻害し、かつ／または細胞複製を改変しうる、あるいはＬ．モノサイトゲネスによる感染に関連した動物またはヒト病態を誘発、抑制または悪化しうる化合物を選択する方法であって、以下の
ａ）上記化合物を上記ポリペプチド、上記ヌクレオチド配列、または請求項３８〜４０のいずれか一項に記載の形質転換細胞に接触させ、かつ／または上記化合物を請求項４１に記載の形質転換動物に投与し、
ｂ）上記化合物の、上記ポリペプチドまたは上記ヌクレオチド配列と結合する能力、あるいは遺伝子発現を調整、調節、誘導または阻害する能力、あるいは細胞増殖または複製を調整する能力、あるいはＬ．モノサイトゲネスまたはその関連微生物による感染に関連した上記動物またはヒト病態を誘発、抑制または悪化させる能力を調べること
を含んでなることを特徴とする、方法。
【請求項７２】
以下の化合物：
ａ）請求項６〜８、１２、１３、１５〜１７、および２１〜２４のいずれか一項に記載のヌクレオチド配列；
ｂ）請求項９〜１１、１８〜２０、２５、４３および４５のいずれか一項に記載のポリペプチド；
ｃ）請求項３７または４７に記載のベクター；
ｄ）請求項４８または４９に記載の抗体
から選択される化合物を含んでなる、医薬組成物。
【請求項７３】
所望により医薬上許容されるビヒクルと組み合わせた、請求項７２に記載の組成物。
【請求項７４】
Ｌ．モノサイトゲネス種に属する細菌、または関連の微生物による感染を予防または治療するための、請求項７２および７３のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項７５】
請求項９〜１１、１８〜２０、２５および４３のいずれか一項に記載の一以上のポリペプチド、および／または請求項４５に記載の一以上のポリペプチドを含んでなることを特徴とする、免疫組成物。
【請求項７６】
ワクチン組成物を製造するための、請求項３８〜４０の一以上に記載の細胞、または請求項３７および４７のいずれかに記載のベクターの使用。
【請求項７７】
請求項６〜８、１２、１３、１５〜１７、および２１〜２４のいずれか一項に記載のポリペプチド、請求項３７および４７のいずれかに記載のベクター、および／または請求項３８〜４０のいずれか一項に記載の細胞を含むことを特徴とする、ワクチン組成物。
【請求項７８】
Ｌ．モノサイトゲネス種に属する細菌、またはその関連微生物による感染を予防または治療するための、細胞性免疫または体液性免疫応答を誘導しうる免疫組成物であって、請求項７５および７７のいずれかに記載の免疫組成物を医薬上許容されるビヒクルおよび所望により一以上の好適な免疫アジュバントと組み合わせて含んでなることを特徴とする、免疫組成物。
【請求項７９】
リステリア属の細菌のゲノムライブラリー。
【請求項８０】
プラスミドにクローニングされている、請求項７９に記載のリステリア属の細菌のゲノムＤＮＡライブラリー。
【請求項８１】
上記の細菌がＬ．インノキュアまたはＬ．モノサイトゲネス血清型４ｂである、請求項７９または８０に記載のゲノムＤＮＡライブラリー。
【請求項８２】
２０００年１０月２日にＮｏ．Ｉ−２５６５としてＣＮＣＭに寄託されたＬｉ−ショットガンライブラリーであることを特徴とする、請求項７９または８０に記載のライブラリー。
【請求項８３】
２０００年１０月２日にＮｏ．Ｉ−２５６６としてＣＮＣＭに寄託されたＬｍ４ｂ−ショットガンライブラリーであることを特徴とする、請求項７９または８０に記載のライブラリー。
【請求項８４】
細菌がＬ．インノキュアまたはＬ．モノサイトゲネスである、請求項７９に記載のゲノムライブラリー。
【請求項８５】
Ｌ．インノキュアおよびＬ．モノサイトゲネスに特異的なヌクレオチド配列を単離するための、請求項７９〜８４のいずれか一項に記載のゲノムライブラリーの使用であって、Ｌ．インノキュアおよびＬ．モノサイトゲネスのヌクレオチド配列をアライニングし、上記の特異的配列を単離するためにこのアライメントを用いて得られたデータを処理する、使用。
【請求項８６】
Ｌ．インノキュアまたはＬ．モノサイトゲネスに特異的なポリペプチドに対する抗体を含んでなることを特徴とする、請求項７２〜７４のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項８７】
請求項５〜８、１２〜１７および２１に記載のＬ．モノサイトゲネスおよびＬ．インノキュアのヌクレオチド配列をアライニングし、上記の特異的配列を単離するためにこのアライメントを用いて得られたデータを処理することによる、Ｌ．インノキュアまたはＬ．モノサイトゲネスに特異的な配列を同定する方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明はリステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）属菌株、特にＬ．インノキュア（Ｌ． ｉｎｎｏｃｕａ）またはＬ．モノサイトゲネス（Ｌ． ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）株、のゲノムに特異的なヌクレオチド配列を検出する方法に関する。本発明はまた、そのゲノム配列、およびリステリア・インノキュアのポリペプチド（細胞外被ポリペプチド、分泌性ポリペプチド、または代謝および複製プロセスに特異的なポリペプチド、あるいはそれに関与するポリペプチドなど）をコードするヌクレオチド配列、また、上記の配列を含むベクター、およびこれらのベクターで形質転換された細胞または動物に関する。本発明はまた、これらのヌクレオチド配列と、リステリア・モノサイトゲネス、ＥＧＤｅ株またはＬ．モノサイトゲネス４ｂのポリペプチドをコードする配列との比較に関し、また、これらのリステリア菌株に特異的なヌクレオチド配列に関する。本発明はまた、これらの核酸またはポリペプチドを検出する方法、ならびにリステリア属の細菌による汚染を診断するキット、および汚染株を分類するキットに関する。本発明はまた、他のリステリアによって生じた細菌感染を調節し得る化合物を選択する方法、および上記ヌクレオチド配列または上記ポリペプチドを用いて目的の分子を生合成または生分解する方法に関する。最後に本発明は、細菌感染、特にリステリア感染、とりわけモノサイトゲネス感染を予防および／または治療する医薬組成物、特にワクチン組成物、およびＬ．インノキュアまたはＬ．モノサイトゲネス、ＥＧＤｅ株もしくはＬ．モノサイトゲネス４ｂに特異的なポリペプチドに対する抗体を含有する組成物に関する。
【０００２】
リステリア感染には、リステリア・モノサイトゲネスが最も多く、かつ最も危険である。リステリア・モノサイトゲネスは通性細胞内病原体である。これは、ますます大きな公衆衛生問題となっている食品関連感染であるリステリア症の病原体であり、食品産業に重大な経済的影響与える。リステリア症は最も致死的な食品関連感染である（死亡率およそ３０％）。リステリア・モノサイトゲネスは、腸管関門、血液脳関門、および胎盤関門の３つの関門を通り抜けることができるという希有な特性を有する。リステリア症の臨床発現としては、髄膜炎、髄膜脳炎、流産および敗血症がある。この感染は日和見的で、主として妊婦、乳児、高齢者および免疫抑制者、特にＡＩＤＳ患者を襲う。この疾病はまた、健康な人も侵し、これは汚染食品により相当程度の流行を招く。また、リステリア・モノサイトゲネスは獣医学でも重要であり、主としてヒツジの群れおよびウシにリスクがある。リステリア・モノサイトゲネスは、特にストレスや極端な条件にも耐性があり、食品安全性の問題のみならず、環境安全性の問題としても、注意してその存在を探知することが重要である。
【０００３】
汚染が発見された場合には、汚染の起源を同定するために単離された株を分類する必要がある。さらに同じ設備が二つの連続した事件により汚染されたとされたとき、これらが、二つの独立した汚染であるか、同じ株がこれらの二つの事件の原因であるかを確実性をもって示すことが重要である。現行で用いられている最も効果的な方法である、染色体ＤＮＡの消化後のパルスフィールドゲル電気泳動（ＰＦＧＥ）プロフィールは、系統的に行うことができず、極めて労力を要する方法である。もう一つの方法である、有効性は低いが自動的なリボタイピングは、一回の分析に非常にコストがかかり、使用が限られる。
【０００４】
また、リステリア症のリスクは混入しているリステリア株により著しく変動することも注視すべきである。極端に言えば、危険であると考えられる株もあれば、無害な株（リステリア・インノキュアなど）もある。従ってリステリア汚染は非常に多いが、報告されている事例の数は少ない。このような観点から、汚染に伴うリスクを特定する手法（株のゲノムタイプおよび食品１ｇ当たりの菌数の関数として）が利用可能となれば、食品会社はこのリスクに相関した対応をとることができる。
【０００５】
リステリア・モノサイトゲネスのゲノムの完全配列は２０００年４月１１日にＮｏ．Ｉ−２４４０としてＣＮＣＭに寄託され、さらに２０００年４月１１日出願のフランス特許出願第０００４６２９号に記載されたＥＧＤｅ株について確立されている。この細菌のゲノムは環状であり、およそ３０００キロベースからなる。ＧＣ含量はおよそ３８％である。毒性についての研究では、毒性の作用が明らかに確認されている遺伝子のほとんどを含む限りにおいて、病原性アイランドと見なすことができる１５ｋｂの遺伝子座を同定することができた。
【０００６】
従って、本発明の主題は、リステリア属菌株のゲノムに特異的なヌクレオチド配列、特にＬ．インノキュアまたはＬ．モノサイトゲネス（Ｌ．モノサイトゲネスＥＧＤｅもしくはＬ．モノサイトゲネス４ｂなど）株に特異的なヌクレオチド配列を検出する方法である。
【０００７】
本発明による方法は、特に
Ｌ．モノサイトゲネスに比べて（特にＬ．モノサイトゲネスＥＧＤｅおよび／またはＬ．モノサイトゲネス４ｂに比べて）Ｌ．インノキュアに特異的な配列を同定することができ、
Ｌ．インノキュアに比べてＬ．モノサイトゲネス、（特にＬ．モノサイトゲネスＥＧＤｅまたはＬ．モノサイトゲネス４ｂ）に特異的な配列を同定することができ、
Ｌ．インノキュアおよび／またはＬ．モノサイトゲネス４ｂに比べてＬ．モノサイトゲネスＥＧＤｅに特異的な配列を同定することができ、そして
Ｌ．インノキュアおよび／またはＬ．モノサイトゲネスＥＧＤｅに比べてＬ．モノサイトゲネス４ｂに特異的な配列を同定することができるもの、である。
【０００８】
本発明のこのような方法は好ましくは、少なくとも
ａ）Ｌ．モノサイトゲネス、特にＬ．モノサイトゲネスＥＧＤｅおよび／またはＬ．モノサイトゲネス４ｂ、およびＬ．インノキュアのヌクレオチド配列を本発明に従ってアライメントし、さらに
ｂ）上記の特異的配列を単離するために、このアライメントを用いて得られたデータを処理する工程を含んでなることを特徴とする。
【０００９】
好ましい態様では、本発明の方法にあっては、Ｌ．モノサイトゲネスのヌクレオチド配列、特にＬ．モノサイトゲネスＥＧＤｅおよび／またはＬ．モノサイトゲネス４ｂのヌクレオチド配列が、以下のゲノムヌクレオチド配列から選択される：
Ｌ．モノサイトゲネスＥＧＤｅ、特にＬ．モノサイトゲネスＥＧＤｅの完全ゲノムの配列番号１の配列に関して２０００年４月１１日出願のフランス特許出願第０００４６２９号、または２００１年４月１１日出願の国際特許出願ＰＣＴ／ＦＲ０１／０１１１８に記載のもの、および
Ｌ．モノサイトゲネス４ｂに関する配列番号１０６８〜２０４１または配列番号２８７２〜３８９１の配列。
【００１０】
また好ましい態様では、本発明による方法は、Ｌ．インノキュアまたはＬ．モノサイトゲネスに特異的なヌクレオチド配列、特にＬ．モノサイトゲネスＥＧＤｅおよび／もしくはＬ．モノサイトゲネス４ｂに特異的なヌクレオチド配列が、高ストリンジェンシー条件下でそれぞれＬ．インノキュアまたはＬ．モノサイトゲネスのヌクレオチド配列またはそれと相補的な配列、特にＬ．モノサイトゲネスＥＧＤｅおよび／もしくはＬ．モノサイトゲネス４ｂのヌクレオチド配列、またはそれと相補的な配列とハイブリダイズすることを特徴とする。
【００１１】
本発明は、リステリア・インノキュアのヌクレオチド配列およびポリペプチドに関し、また、相当する配列と、リステリア・モノサイトゲネスＥＧＤｅおよび／または４ｂ株の配列との比較に関する。
【００１２】
本発明は、特に
リステリア・モノサイトゲネスＥＧＤｅ株に比べてリステリア・インノキュアに特異的な、配列番号１２〜６８９（表Ｖ参照）および配列番号２０５９〜２６０１（表ＶＩ参照）、特に配列番号２０５９〜２６０１の核酸配列、
リステリア・インノキュアに比べてリステリア・モノサイトゲネスＥＧＤｅ株に特異的な、配列番号６９０〜１０６７（表Ｖ参照）および配列番号２６０２〜２８７１（表ＶＩＩ参照）、特に配列番号２６０２〜２８７１の核酸配列、
リステリア・インノキュアおよびリステリア・モノサイトゲネスＥＧＤｅ株に比べてリステリア・モノサイトゲネス４ｂに特異的な、配列番号３８９２〜４０２５（表ＩＸ参照）の核酸配列、さらに
それらの前記特異性を保存するに十分な長さのそれらの断片、それと相補的な配列、それらの特異的プライマーもしくはプローブ、これらの核酸配列によってコードされるペプチド、またはこれらのペプチドに対する抗体、およびそれらの使用であって特にリステリアの株をまた同定するため、または生物サンプルにおいて、リステリアの病原性株と非病原性株とを識別するために、特に以下に示される、あるいは当業者に公知な方法または診断キットを用いるものに関する。
【００１３】
本発明のこれらの特定の配列を用い、当業者ならばプライマーもしくはプローブを設計すること、またはこれらの診断方法を実施するために、または以下に示される、あるいは標準的な診断キットの開発のために必要な、特定のペプチドまたはこれらのペプチドに対する抗体を作出することができる。
【００１４】
よって本発明の一つの目的は、リステリア・インノキュアゲノム、特にこの株のゲノムから作製されたゲノムライブラリーに含まれ、２０００年１０月２日にＮｏ．Ｉ−２５６５としてＣＮＣＭに寄託されたＣＬＩＰ１１２６２、また上記ゲノムに含まれる総ての遺伝子および非コード調節配列の完全配列を開示することにある。
【００１５】
ＣＬＩＰ１１２６２株は乳製品から単離されたものである。この株はパスツール研究所（ＷＨＯ協力センター）のＣｅｎｔｒｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ ｄｅ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｄｅｓ Ｌｉｓｔｅｒｉａ ［Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｌｉｓｔｅｒｉａ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｃｅｎｔｅｒ］で保存されている。
Ｌ．モノサイトゲネスＥＧＤｅ株およびリステリア・インノキュアＣＬＩＰ１１２６２株ゲノムの完全配列を比較すると、これらのゲノムのおよそ８６％が極めて高度に保存されている（８０〜９５％のＤＮＡが同一）。一方、残りの１４％は各々株に特異的なものである。実施の点からは、各種の総ての遺伝子を表すチップでは、プローブの８６％がこの２株のＤＮＡで陽性シグナルを示し、１４％はこの２株の一方のＤＮＡでシグナルを示すだけである。
【００１６】
これらの結果はリステリア株の多様性に関する文献のデータと一致するものである。さらにまた、Ｌ．モノサイトゲネス（血清型４ｂ（ＣＬＩＰ８０４５９））の伝染株の配列決定に関する最近のデータではこのような多様性が確実なものとなっているが、特に血清型４ｂ株は、ゲノムがすでに配列決定されているＬ．モノサイトゲネス血清型１／２ａ株と同程度にＬ．インノキュアに近いことを疑う余地なく示している。ＣＬＩＰ８０４５９は伝染株である。これはパスツール研究所（ＷＨＯ協力センター）のＣｅｎｔｒｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ ｄｅ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｄｅｓ Ｌｉｓｔｅｒｉａ ［Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｌｉｓｔｅｒｉａ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｃｅｎｔｅｒ］で保存されている。また、インノキュア株に病原性はなく、従って、Ｌ．モノサイトゲネスに特異的な遺伝子が病原性に関与している可能性があるということも、注目すべきである。さらにまた、ＥＧＤｅ株のゲノム解析により、主要なコンピテンス遺伝子、すなわち水平遺伝子移動を促す遺伝子を同定することが可能となった。結局、ある特定のリステリア株は形質転換され得る能力を持つ。このように株間の水平移動はよく起こり、単離物間で見られる大きな多様性を説明する。
【００１７】
リステリア・モノサイトゲネス血清型４ｂ株はまた、本願では、互換的に、リステリア・モノサイトゲネス４ｂともいう。
【００１８】
これらの知見は総て、Ｌ．モノサイトゲネスＥＧＤｅ株とＬ．インノキュアの間で異なっているとみなされる遺伝子は、リステリアゲノムの多様性を表すものであるはずである、ということを示す。
【００１９】
本発明はまた、リステリア株の分類のための新規な手段に関する。これらの手段はＤＮＡ「チップ」タイプのものであっても、別のタイプのものであってもよい。これらの分類手段の新しい特徴は以下の通りである。
・迅速かつ簡便に利用できること、
・株間の識別能力が高いこと、そして
・分析した株のゲノム内容に関する情報が得られ、所望によりリステリア汚染に伴うリスクを予測することが可能となることである。
【００２０】
よって、本発明は、配列番号１〜配列番号１１、配列番号２０５７、および配列番号２０５８、特に配列番号２０５７および配列番号２０５８、から選択される配列に相当することを特徴とする、リステリア・インノキュアのヌクレオチド配列に関する。
【００２１】
本発明はまた、
ａ）配列番号１〜配列番号１１、配列番号２０５７、および配列番号２０５８、特に配列番号２０５７および配列番号２０５８、から選択される配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または９８％の同一性を含むヌクレオチド配列、
ｂ）高ストリンジェンシー条件下で配列番号１〜配列番号１１、配列番号２０５７および配列番号２０５８から選択される配列とハイブリダイズするヌクレオチド配列、
ｃ）配列番号１〜配列番号１１、配列番号２０５７および配列番号２０５８から選択される配列と相補的な、またはａ）もしくはｂ）で定義されたヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列、あるいは配列ａ）およびｂ）のいずれかに対応するＲＮＡのヌクレオチド配列、
ｄ）配列番号１〜配列番号１１、配列番号２０５７および配列番号２０５８から選択される配列の典型的な断片のヌクレオチド、またはａ）、ｂ）もしくはｃ）で定義されたヌクレオチド配列の典型的な断片のヌクレオチド配列、
ｅ）ａ）、ｂ）、ｃ）またはｄ）で定義された配列を含んでなるヌクレオチド配列、および
ｆ）ａ）、ｂ）、ｃ）、ｄ）またはｅ）で定義されたヌクレオチド配列の改変されたもの、から選択されることを特徴とする、リステリア・インノキュア由来のヌクレオチド配列に関する。
【００２２】
より詳しくは、本発明の主題は、配列番号１〜配列番号１１、配列番号２０５７および配列番号２０５８から選択される配列に由来することを特徴とするヌクレオチド配列であり、また、ポリペプチドをコードし、配列番号１２〜配列番号６８９、配列番号２０５３〜配列番号２０５６および配列番号２０５９〜配列番号２６０１、特に配列番号２０５９〜配列番号２６０１の配列、から選択されることを特徴とするヌクレオチド配列である。
【００２３】
本発明はまた、より一般には、配列番号１〜配列番号１１、配列番号２０５７および配列番号２０５８に由来し、かつ、Ｌ．インノキュアのポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に関し、例えば配列番号１〜配列番号１１、配列番号２０５７および配列番号２０５８、特に配列番号２０５７および配列番号２０５８から単離されうるものに関する。
【００２４】
さらに、
ａ）配列番号１２〜配列番号６８９、配列番号２０５３〜配列番号２０５６および配列番号２０５９〜配列番号２６０１、特に配列番号２０５９〜配列番号２６０１から選択される、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、
ｂ）配列番号１２〜配列番号６８９、配列番号２０５３〜配列番号２０５６および配列番号２０５９〜配列番号２６０１、特に配列番号２０５９〜配列番号２６０１から選択される、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または９８％の相同性を有するヌクレオチド配列、
ｃ）配列番号１２〜配列番号６８９、配列番号２０５３〜配列番号２０５６および配列番号２０５９〜配列番号２６０１、特に配列番号２０５９〜配列番号２６０１から選択される、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列と高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列、
ｄ）ａ）、ｂ）またはｃ）で定義された配列に対応する相補的配列またはＲＮＡ配列、
ｅ）ａ）、ｂ）、ｃ）またはｄ）で定義された配列の典型的な断片のヌクレオチド配列、および
ｆ）ａ）、ｂ）、ｃ）、ｄ）またはｅ）で定義された配列の改変されたもの
から選択されるヌクレオチド配列を含んでなることを特徴とする、ヌクレオチド配列も本発明の主題である。
【００２５】
本発明はまた、配列番号１０６８〜配列番号２０４１および配列番号２８７２〜配列番号３８９１、特に配列番号２８７２〜配列番号３８９１の配列のリステリア・モノサイトゲネス血清型４ｂのヌクレオチド配列に関する。
【００２６】
本発明はまた、
ａ）配列番号１０６８〜配列番号２０４１および配列番号２８７２〜配列番号３８９１、特に配列番号２８７２〜配列番号３８９１と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または９８％の相同性を有するヌクレオチド配列、
ｂ）高ストリンジェンシー条件下で配列番号１０６８〜配列番号２０４１、配列番号２８７２〜配列番号３８９１、特に配列番号２８７２〜配列番号３８９１とハイブリダイズするヌクレオチド配列、
ｃ）配列番号１０６８〜配列番号２０４１、配列番号２８７２〜配列番号３８９１、特に配列番号２８７２〜配列番号３８９１と相補的な、またはａ）もしくはｂ）で定義されたヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列、あるいは配列ａ）およびｂ）のいずれかに対応するＲＮＡのヌクオチド配列、
ｄ）配列番号１０６８〜配列番号２０４１、配列番号２８７２〜配列番号３８９１、特に配列番号２８７２〜配列番号３８９１の典型的な断片、またはａ）、
ｂ）もしくはｃ）で定義されたヌクレオチド配列の典型的な断片のヌクレオチド配列、
ｅ）ａ）、ｂ）、ｃ）またはｄ）で定義された配列を含んでなるヌクレオチド配列、および
ｆ）ａ）、ｂ）、ｃ）、ｄ）またはｅ）で定義されたヌクレオチド配列の改変されたもの
から選択されることを特徴とする、リステリア・モノサイトゲネス血清型４ｂ由来のヌクレオチド配列に関する。
【００２７】
より詳しくは、本発明の主題はまた、配列番号１０６８〜配列番号２０４１、配列番号２８７２〜配列番号３８９１、特に配列番号２８７２〜配列番号３８９１に由来することを特徴とするヌクレオチド配列であり、かつ、ポリペプチドをコードし、配列番号６９０〜配列番号１０６７、配列番号２０４９〜配列番号２０５２および配列番号２６０２〜配列番号２８７１、特に配列番号２６０２〜配列番号２８７１、から選択されることを特徴とするヌクレオチド配列である。
【００２８】
本発明はまた、より一般には、配列番号１０６８〜配列番号２０４１、配列番号２８７２〜配列番号３８９１、特に配列番号２８７２〜配列番号３８９１に由来し、かつ、配列番号６９０〜配列番号１０６７、配列番号２０４９〜配列番号２０５２および配列番号２６０２〜配列番号２８７１、特に配列番号２６０２〜配列番号２８７１から単離されうるものなど、Ｌ．モノサイトゲネスのポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に関する。
【００２９】
さらに、
ａ）配列番号６９０〜配列番号１０６７、配列番号２６０２〜配列番号２８７１、特に配列番号２６０２〜配列番号２８７１の配列から選択される、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、
ｂ）配列番号６９０〜配列番号１０６７、配列番号２６０２〜配列番号２８７１、特に配列番号２６０２〜配列番号２８７１の配列から選択される、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または９８％の同一性を含むヌクレオチド配列、
ｃ）配列番号６９０〜配列番号１０６７、配列番号２６０２〜配列番号２８７１、特に配列番号２６０２〜配列番号２８７１の配列から選択される、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列と高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列、
ｄ）ａ）、ｂ）またはｃ）で定義される配列に対応する相補的ヌクレオチド配列またはＲＮＡヌクレオチド配列、
ｅ）ａ）、ｂ）、ｃ）またはｄ）で定義された配列の典型的な断片のヌクレオチド配列、および
ｆ）ａ）、ｂ）、ｃ）、ｄ）またはｅ）で定義された配列の改変されたもの
から選択されるヌクレオチド配列を含んでなることを特徴とするヌクレオチド配列も本発明の主題である。
【００３０】
「核酸」、「核酸配列」、「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」、「ポリヌクレオチド配列」および「ヌクレオチド配列」は本明細書では区別なく用いられるが、これらの用語は、改変されていても改変されていなくてもよく、核酸の断片または領域を定義することを可能とし、非天然型ヌクレオチドを含んでも含んでいなくてもよく、また、二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＤＮＡおよびこれらＤＮＡの転写産物に等しく対応しうる正確なヌクレオチド鎖を表すものとする。よって本発明の核酸配列はＰＮＡ（ペプチド核酸）もまた包含する。
【００３１】
本発明はそれらの天然の染色体環境、すなわち自然状態でのヌクレオチド配列に関するものではないことを理解すべきである。それらは単離および／または精製された配列であり、すなわちそれらは例えば複製により直接的または間接的に取り出されたものであり、それらの環境は少なくとも部分的に改変されている。従って化学合成によって得られた核酸もまた示すものとする。
【００３２】
本発明の目的で、２つの核酸またはアミノ酸配列間の「同一性パーセンテージ」とは、ベストアライメント後に得られた、比較される２つの配列間で同一のヌクレオチドまたはアミノ酸残基のパーセンテージを表すものとし、このパーセンテージは単に統計学的なものであり、２つの配列間の違いはランダムに、それらの配列にわたって分布している。「ベストアライメント」または「最適アライメント」は以下のように決定される同一性パーセンテージが最大となるアライメントを表すものとする。２つの核酸またはアミノ酸配列間の配列比較は便宜には、それらを最適にアライメントした後に、これらの配列を比較することにより行い、かかる比較は配列類似性の局部領域を特定および比較するためのセグメントまたは「比較ウインドウ」によって行う。比較のための最適な配列アライメントは、手動でのＳｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ， （１９８１， Ａｄ． Ａｐｐ． Ｍａｔｈ． ２：４８２）のローカルホモロジーアルゴリズム、Ｎｅｄｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ （１９７０， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ４８：４４３）のローカルホモロジーアルゴリズム、Ｐｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ （１９８８， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８５：２４４４）の類似性検索法による他、これらのアルゴリズムを用いたコンピューターソフトウェア（ＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＢＬＡＳＴ  Ｐ、ＢＬＡＳＴ  Ｎ、ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡ， ｔｈｅ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ， Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ， ５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒｉｖｅ， Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩ）により行うことができる。最適アライメントを得るためには、ＢＬＡＳＴプログラムをＢＬＯＳＵＭ６２マトリックスとともに用いるのが好ましい。また、ＰＡＭまたはＰＡＭ２５０マトリックスも使用できる。
【００３３】
２つの核酸またはアミノ酸配列間の同一性パーセンテージは、最適にアライニングしたこれらの２つの配列を比較することにより決定する（なお、比較する核酸またはアミノ酸配列はこれら２つの配列間の最適アライメントに関する参照配列に対して付加または欠失を含む可能性がある）。同一性パーセンテージは、ヌクレオチドまたはアミノ酸残基が２つの配列で同一である同一部分の数を数え、この同一部分の数を比較する部分の総数で割り、得られた結果に１００をかけることにより算出し、これによりこれら２つの配列間の同一性パーセンテージが得られる。
【００３４】
「参照配列を用いて最適アライメントを行った後に少なくとも７５％、好ましくは８０％、８５％または９０％、より好ましくは９５％、あるいは９８％といった同一性パーセンテージを示す核酸配列」とは、参照核酸配列に対してある改変、特に欠失、末端切断、伸張、キメラ融合および／または置換、特に点置換などを示す核酸配列、ならびに最適アライメントの後に参照核酸配列と少なくとも７５％、好ましくは８０％、８５％、９０％、９５％または９８％の同一性を示すその核酸配列を表すものとする。それらは好ましくは、その相補的配列が参照配列と特異的にハイブリダイズしうる配列であることが好ましい。好ましくは、特異的または高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件は、最適アライメントの後に２つの配列のうちの一方とそれと相補的な配列との間で少なくとも７５％、好ましくは８０％、８５％、９０％、９５％または９８％の同一性を保証するものである。
【００３５】
高ストリンジェンシー条件下でのハイブリダイゼーションとは、温度およびイオン強度の条件が２つの相補的ＤＮＡ断片間でハイブリダイゼーションが維持できるように選択されることを意味する。例としては、上記のポリヌクレオチド断片を定義する目的でのハイブリダイゼーション工程の高ストリンジェンシー条件は以下の通りが有利である。
【００３６】
ＤＮＡ−ＤＮＡまたはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリダイゼーションは２つの工程：（１）４２℃、５×ＳＳＣ（１×ＳＳＣは０．１５Ｍ  ＮａＣｌ＋０．０１５Ｍクエン酸ナトリウムの溶液に相当する）、５０％ホルムアミド、７％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、１０×デンハートの溶液、５％硫酸デキストランおよび１％サケ精子ＤＮＡを含有するリン酸バッファー（２０ｍＭ、ｐＨ７．５）中で３時間のプレハイブリダイゼーション；（２）プローブの長さによって異なる温度（すなわち、１００ヌクレオチド長を超えるプローブでは４２℃）で２０時間実際のハイブリダイゼーションを行った後、２０℃、２×ＳＳＣ＋２％ＳＤＳにて２０分間２回洗浄、２０℃、０．１×ＳＳＣ＋０．１％ＳＤＳにて２０分間１回洗浄。最後の洗浄は、１００ヌクレオチド長を超えるプローブでは６０℃で、０．１×ＳＳＣ＋０．１％ＳＤＳにて３０分間行う。当業者ならば、所定の長さのポリヌクレオチドに対する上記の高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ． （１９８９， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ： ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ， ２ｎｄ Ｅｄ． Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ）の教示に従い、より長い、またはより短いオリゴヌクレオチドに対して調節することができる。
【００３７】
さらに「本発明の配列の代表的な断片」とは、それが由来する少なくとも１５個の保存されたヌクレオチド、好ましくは少なくとも３０、７５、１５０、３００および４５０個の保存されたヌクレオチドの配列を有するいずれかのヌクレオチド断片を表すものとする。
【００３８】
「典型的な断片」とは、以下に定義するが、特にポリペプチドの生物学的に有効な断片をコードする核酸配列を意味するものとする。
【００３９】
「典型的な断片」とはまた、遺伝子間配列、特に調節シグナル（プロモーター、ターミネーター、あるいはまたエンハンサーなど）を有するヌクレオチド配列も意味するものとする。
【００４０】
このような典型的な断片のうち、ＯＲＦと呼ばれ、一般に開始コドンと終結コドンの間、または２つの終結コドンの間に含まれ、好ましくは少なくとも１００アミノ酸のポリペプチドをコードし、例えば限定されるものではないが、次に記載されるＯＲＦ配列などのような、オープンリーディングフレームに相当するヌクレオチド配列を有するものが好ましい。
【００４１】
本明細書において以下で用いられるＯＲＦヌクレオチド配列の番号は上記のＯＲＦにコードされているタンパク質のアミノ酸配列の番号に相当する。
【００４２】
本発明の典型的な断片は例えばＰＣＲなどの特異的増幅により、または本発明のヌクレオチド配列の好適な制限酵素による消化の後に得ることができ、この方法は特にＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．による研究に記載されている。これらの典型的な断片はまた、それらが長すぎるものでなければ、当業者に周知の方法に従って化学合成によって得ることもできる。
【００４３】
本発明の配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または９８％の同一性を示す配列によって自然に生じる配列もまた、本発明の配列または典型的な断片を含む配列に含まれるものとする。
【００４４】
「改変されたヌクレオチド配列」とは、当業者に周知の技術による突然変異誘発によって得られ、かつ、正常配列に対する改変、例えばポリペプチドの発現を調節および／または促進する配列の突然変異、特に該ポリペプチドの発現レベルまたは活性の改変をもたらすものを含むいずれかのヌクレオチド配列を意味するものとする。
【００４５】
「改変されたヌクレオチド配列」とはまた、以下に定義されるような改変ポリペプチドをコードするいずれかのヌクレオチド配列を意味するものとする。
【００４６】
本発明の典型的な断片はまたプローブまたはプライマーであってもよく、これらは核酸配列を検出、同定、アッセイまたは増幅する方法で使用できる。
【００４７】
本発明の目的では、プローブまたはプライマーは例えば１２塩基〜数ｋｂ、特に１５〜数百塩基、好ましくは１５〜５０または１００塩基を含み、かつ、所定の条件下でハイブリダイゼーション特性を有し、標的核酸とハイブリダイゼーション複合体を形成する核酸の一本鎖断片または変性した二本鎖断片であると定義される。
【００４８】
本発明のプローブおよびプライマーは当業者に周知の方法を用いて、検出可能かつ／または定量可能なシグナルを得るために放射性または非放射性化合物で直接的または間接的に標識することができる。（仏国特許第ＦＲ７８１０９７５号ならびにＣｈｉｒｏｎの欧州特許ＥＰ２２５８０７およびＥＰ５１００８５のｂＤＮＡ）。
【００４９】
本発明のポリヌクレオチドの非標識配列はそのままプローブまたはプライマーとして使用できる。
【００５０】
一般に、多くの適用で使用できる配列を得るためにはこれらの配列は標識される。本発明のプライマーまたはプローブの標識は放射性元素または非放射性分子を用いて行う。
【００５１】
用いられる放射性同位元素としては、３２Ｐ、３３Ｐ、３５Ｓ、３Ｈおよび１２５Ｉが挙げられる。非放射性のものとしてはビオチン、アビジンまたはストレプトアビジン、ジゴキシゲニン、ハプテンなどのリガンド、色素および発光剤（放射性発光剤、化学発光剤、生物発光剤、蛍光剤またはリン光剤など）から選択される。
【００５２】
本発明のポリヌクレオチドはこのように、特にＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）技術（Ｒｏｌｆｓ ｅｔ ａｌ．， １９９１， Ｂｅｒｌｉｎ： Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ）を用いた方法においてプライマーおよび／またはプローブとして使用できる。この技術には増幅しなければならない断片をフレーミングするオリゴヌクレオチドプライマー対の選択が必要とされる。例えば米国特許第４，６８３，２０２号に記載の技術が参照できる。増幅された断片は例えばアガロースもしくはポリアクリルアミドゲル電気泳動の後、またはゲル濾過もしくはイオン交換クロマトグラフィーの後に配列決定して確認することができる。増幅の特異性は本発明のポリヌクレオチドのヌクレオチド配列をマトリックスとして用いて制御することができ、プラスミドはこれらの配列または誘導された増幅産物を含有する。増幅したヌクレオチド配列は、生物サンプルにおいて、その増幅ヌクレオチド断片の配列と相補的な配列の標的核酸の存在を証明するため、ハイブリダイゼーション反応で試薬として使用することができる。
【００５３】
本発明はまた、本発明のプライマーを用いた増幅によって得ることができる核酸に向けられる。
【００５４】
標的核酸を増幅する他の技術は有利なことに本発明のヌクレオチド配列のプライマー対を用いてＰＣＲの代わりに（ＰＣＲ様）使用することができる。「ＰＣＲ様」とは、核酸配列の直接的または間接的再生産を用いる、あるいはまたその標識系が増幅されている総ての方法を表すものとし、これらの技術はもちろん公知のものである。一般に、これはポリメラーゼによるＤＮＡの増幅を含み、サンプルの起源がＲＮＡである場合には、予め逆転写を行わなければならない。例えばＳＤＡ（鎖置換増幅）法（Ｗａｌｋｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９９２， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２０：１６９１）、Ｋｗｏｈ ｅｔ ａｌ． （１９８９， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８６， １１７３）によって記載されているＴＡＳ（転写に基づく増幅系）法、Ｇｕａｔｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ． （１９９０， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８７：１８７４）によって記載されている３ＳＲ（自立配列複製）法、Ｋｉｅｖｉｔｉｓ ｅｔ ａｌ． （１９９１， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ， ３５， ２７３）によって記載されているＮＡＳＢＡ（核酸配列に基づく増幅）法、ＴＭＡ（転写媒介増幅）法、Ｌａｎｄｅｇｒｅｎ ｅｔ ａｌ． （１９８８， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４１， １０７７）によって記載されているＬＣＲ（リガーゼ連鎖反応）、Ｓｅｇｅｖ （１９９２， Ｃ． Ｋｅｓｓｌｅｒ， Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ， Ｂｅｒｌｉｎ， Ｎｅｗ−Ｙｏｒｋ， １９７−２０５）によって記載されているＲＣＲ（修復連鎖反応）法、Ｄｕｃｋ ｅｔ ａｌ． （１９９０， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ， ９， １４２）によって記載されているＣＰＲ（サイクリングプローブ反応）、およびＭｉｅｌｅ ｅｔ ａｌ． （１９８３， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， １７１， ２８１）によって記載されているＱ−β−リプリカーゼ増幅法など、現在のところこの増幅のために極めて多数の方法がある。これらの技術のいくつかは以降改良されている。
【００５５】
検出する標的ポリヌクレオチドがｍＲＮＡである場合、本発明のプライマーを用いて増幅反応を行う前、または本発明のプローブを用いた検出方法を行う前に、生物サンプル中に含まれるｍＲＮＡからｃＤＮＡを得るために逆転写酵素型の酵素を用いるのが有利である。次に、得られたｃＤＮＡを、本発明の増幅または検出方法で用いるプライマーまたはプローブの標的として用いる。
【００５６】
プローブハイブリダイゼーション法は種々の方法で行うことができる（Ｍａｔｔｈｅｗｓ ｅｔ ａｌ．， １９８８， Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， １６９， １−２５）。最も一般的な方法は種々の組織の細胞または培養細胞から抽出した核酸を支持体（ニトロセルロース、ナイロンまたはポリスチレンなど）に固定化し、十分定義された条件下でこの固定化した標的核酸をプローブとともにインキュベートすることからなる。ハイブリダイゼーション後、過剰なプローブを除去し、生じたハイブリッド分子を適当な方法（プローブと会合した放射性、蛍光または酵素活性を測定する）を用いて検出する。
【００５７】
本発明の核酸プローブのもう一つの具体例によれば、これを捕捉プローブとして用いることができる。この場合、「捕捉プローブ」と呼ばれるプローブを支持体に固定化し、これを用いて特異的ハイブリダイゼーションにより試験する生物サンプルから得られた標的核酸を捕捉し、次にこの標的核酸は、容易に検出可能なエレメントで標識された「検出プローブ」と呼ばれる第二のプローブを用いて検出される。
【００５８】
よって有利な核酸断片としては、特にアンチセンスオリゴヌクレオチド、すなわちその構造が標的配列とのハイブリダイゼーションによってその対応する産物の発現の阻害をもたらすオリゴヌクレオチドを挙げるべきである。また、その対応する産物の発現の調節に関与するタンパク質との反応によってこの発現の阻害または活性化のいずれかを誘導するセンスオリゴヌクレオチドも挙げるべきである。
【００５９】
好ましくは、本発明のプローブまたはプライマーは共有結合または非共有結合により支持体に固定化する。特にこの支持体はＤＮＡチップまたは高密度もしくは中密度フィルターであってもよく、これらもまた本発明の主題である（特許ＷＯ９７／２９２１２、ＷＯ９８／２７３１７、ＷＯ９７／１０３６５およびＷＯ９２／１０５８８）。
【００６０】
「ＤＮＡチップ」または「高密度フィルター」とは、ＤＮＡ配列を結合させ、それらの各々がその地理学的位置によって正確な位置を示すことができる支持体を意味するものとする。これらのチップまたはフィルターは主としてそれらの大きさ、支持体の素材、所望により結合させるＤＮＡ配列の数によって異なる。
本発明のプローブまたはプライマーは固相支持体、特にＤＮＡチップに種々の製造方法によって結合させることができる。特にｉｎ ｓｉｔｕ合成は、光化学アドレッシングまたはインクジェットにより行うことができる。他の技術としては、ｅｘ ｓｉｔｕ合成を行い、物理的もしくは電気的アドレッシングまたはインクジェットによってＤＮＡチップの支持体にプローブを結合させることからなるものがある。これら種々の方法は当業者に周知のものである。
【００６１】
よって、本発明のヌクレオチド配列（プローブまたはプライマー）により、特異的核酸配列を検出および／または増幅することが可能となる。特に、これらの配列の検出は、ＤＮＡチップまたは高密度フィルターにプローブを結合させた場合に容易となる。
【００６２】
実際にＤＮＡチップまたは高密度フィルターの使用により、Ｌ．モノサイトゲネスまたはインノキュアに近いゲノム配列を有する生物における遺伝子発現を調べること、また、目的の株を分類することが可能となる。
【００６３】
本発明に示されるようにこれらの生物の遺伝子の同定によって完成されたＬ．インノキュアのゲノム配列およびＬ．モノサイトゲネス４ｂの部分配列はこれらのＤＮＡチップまたはフィルターを構築する基礎として役立つ。
【００６４】
これらのフィルターまたはチップの製造としては、適当な長さ、例えば約３００〜８００塩基の間の断片を増幅するためにその遺伝子の５’および３’末端以内の断片に相当するオリゴヌクレオチドを合成することからなる。これらのオリゴヌクレオチドは本発明により開示されるゲノム配列およびその注釈付けを用いて選択する。これらのオリゴヌクレオチドをＤＮＡ上の対応する部位で対合させる温度は各オリゴヌクレオチドともほぼ同じであるはずである。これにより、高度に自動化された環境で適当なＰＣＲ条件を用いて各遺伝子に対応するＤＮＡ断片を作出することが可能となる。次に、増幅された断片をガラス、シリコーンもしくは合成ポリマー製のフィルターまたは支持体に固定化し、これらの媒体をハイブリダイゼーションに用いる。
【００６５】
このようなフィルターおよび／またはチップと、対応する注釈付けされたゲノム配列が利用できるということで、リステリア・インノキュアおよびＬ．モノサイトゲネス４ｂに関連する微生物の遺伝子の大部分のセット、あるいはまたその総ての発現を、相補的ＤＮＡを作製し、それらをフィルターまたはチップに固定化したＤＮＡまたはオリゴヌクレオチドとハイブリダイズさせることによって研究することが可能となる。同様に、これらのフィルターまたはチップによって、これらの生物のＤＮＡを調製し、それとフィルターまたはチップに固定化したＤＮＡまたはオリゴヌクレオチドとをハイブリダイズさせることによりその株または種の変異性を研究することも可能となる。
【００６６】
種々の株または種のゲノム配列間の差異はハイブリダイゼーションの強さに著しく影響を及ぼし、その結果、結果の解釈を妨げる場合がある。従って、研究しようとする株の遺伝子の正確な配列を得ておく必要があると考えられる。本発明に開示されるＬ．インノキュアおよびＬ．モノサイトゲネス４ｂの完全ゲノム配列に従ってゲノムの無作為な断片の配列を決定してそれらを組織化することを含む、後に詳細に説明される遺伝子検出法が極めて有用である。
【００６７】
本発明のヌクレオチド配列は突然変異解析を行うためにＤＮＡチップで使用することができる。この解析は本発明のヌクレオチド配列の各塩基を分析することができるチップの構築に基づくものである。この目的で、特にＤＮＡチップをマイクロシーケンシングする技術が使用されうる。突然変異は、解析する配列のマトリックスのちょうど探している変異ヌクレオチドに隣接した位置でハイブリダイズする固定化プライマーの伸張によって検出される。解析する配列の一本鎖ＲＮＡまたはＤＮＡマトリックスは常法に従い、ＰＣＲ型の技術によって増幅された産物を用いて有利に作製される。このようにして得られた一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡマトリックスを次に、それらの、固定化プライマーへの特異的ハイブリダイゼーションを可能とする条件下でＤＮＡチップに乗せる。熱安定性ポリメラーゼ、例えばＴｔｈまたはＴａｑＤＮＡポリメラーゼは固定化プライマーの３’末端を、種々の部位のその位置においてそのヌクレオチドに相補的な標識ヌクレオチド類似体で特異的に延長する。なお、温度周期は例えば蛍光ジデオキシリボヌクレオチドの存在下で行う。実験条件は特に用いるチップ、固定化プライマー、用いるポリメラーゼ、および選択する標識系に対して調整する。プローブハイブリダイゼーションに基づく技術に比べた場合のミクロシーケンシグの利点は、均一な反応条件の下で最適な識別力により種々のヌクレオチドの総てが同定可能であり、ＤＮＡチップとして用いた場合には、多重突然変異の日常的・産業上の検出にとって最適な分解能および特異性が可能となる。
【００６８】
このように高密度フィルターおよび／またはチップの使用により、産業上重要な生物、特に多様な条件下で繁殖したリステリアにおける遺伝子調節に関する新たな知見が得られる。また、多くの産業用途に用いられる株のゲノム間の差異の迅速同定も可能となる。
【００６９】
さらに、ＤＮＡチップまたはフィルターは微生物を調査、検出および／または同定する極めて有利な手段となりうる。よって、リステリア・モノサイトゲネス４ｂまたはリステリア・インノキュア以外の微生物の少なくとも一つのヌクレオチド配列もかかるチップの支持体に固定化して含む本発明のＤＮＡチップも好ましい。微生物はリステリア属の細菌（以下、Ｌ．モノサイトゲネス関連細菌と呼ぶ）、またはリステリア・モノサイトゲネスＥＧＤ−ｅの変異株から選択するのが好ましい。
【００７０】
本発明のＤＮＡチップまたはフィルターは微生物、特にリステリア・モノサイトゲネス種に属する細菌または関連微生物を検出および／または同定する特定のキットまたはセットの極めて有用な構成要素であり、これも本発明の主題である。
さらにまた、リステリア・インノキュアまたはモノサイトゲネスに特異的なプローブまたはプライマーを含有する本発明のＤＮＡチップまたはフィルターはリステリア・インノキュアまたはモノサイトゲネス（または関連微生物）の遺伝子の発現を検出および／または定量するキットまたはセットの極めて有利な構成要素である。
【００７１】
特にこの遺伝子発現制御は、一以上の新規な遺伝子を発現させるか、または細胞中にすでに存在している遺伝子の発現を改変するかのいずれかにより、ある株の増殖および収量を至適化する上で重要な点である。本発明は遺伝子発現が可能なＬ．インノキュアにおいて本来活性な配列の総てを提供する。よってこれにより、Ｌ．インノキュアで発現する配列の総てが同定可能となる。本発明はまた、その発現が所定のスキームを受ける遺伝子を特定する手段も提供する。これを行うため、Ｌ．インノキュアおよびモノサイトゲネスの遺伝子の総てまたはいくつかのＤＮＡを本発明のプライマーを用いて増幅し、次に例えばガラスもしくはナイロンなどの支持体、またはＤＮＡチップに結合させてこれらの遺伝子の発現プロフィールを追跡する手段を構築することができる。この手段はコード配列を含む支持体からなり、細胞で発現したメッセンジャーＲＮＡを反映する標識分子（特に本発明の標識プローブ）の混合物に対するハイブリダイゼーションマトリックスとして役立つ。この実験を様々な時間で繰り返し、好適な処理を用いて総てのデータを合成することで、次にこれら総ての遺伝子の発現プロフィールが得られる。所定の調節スキームを受ける配列についての知見はまた、例えばホモロジーによるなど指定の方式で、若干の違いはあるが全体としては同じ調節スキームを受ける他の配列を検索するのに利用することもできる。さらに、プローブとして機能するセグメントの上流に存在する各制御配列を単離すること、およびレポーター遺伝子（ルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ＧＦＰ）などの好適な手段を用いてその活性を追跡することができる。これらの単離配列は次に、その至適発現の点から、目的の配列による代謝操作によって改変および組み込みが可能である。
【００７２】
本発明はまた、本発明のヌクレオチド配列によって、好ましくはＯＲＦ配列に相当する上記の配列の典型的な断片によってコードされるポリペプチドに関する。特に配列番号１２〜配列番号６８９、配列番号２０４２および２０４３、配列番号２０４７および２０４８、配列番号２０５３〜２０５６および配列番号２０５９〜２６０１、特に配列番号２０５９〜２６０１の配列によりコードされるリステリア・インノキュアのポリペプチド、または配列番号６９０〜配列番号１０６７、配列番号２０４９〜配列番号２０５２および配列番号２６０２〜２８７１、特に配列番号２６０２〜２８７１の配列によりコードされるポリペプチドから選択されることを特徴とするリステリア・モノサイトゲネスＥＧＤｅのポリペプチド、または配列番号３８９２〜配列番号４０２５の配列によりコードされるポリペプチドから選択されることを特徴とするリステリア・モノサイトゲネス４ｂのポリペプチドに関し、これらも本発明の主題である。
【００７３】
本発明はまた、
ａ）本発明のポリペプチド、
ｂ）本発明のポリペプチドと少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％および９８％の同一性を示すポリペプチド、
ｃ）本発明の、またはｂ）で定義されたポリペプチドの少なくとも５個のアミノ酸の断片、
ｄ）本発明の、またはｂ）もしくはｃ）で定義されたポリペプチドの生物学的に活性な断片、および
ｅ）本発明の、またはｂ）、ｃ）もしくはｄ）で定義されたポリペプチドの改変されたものから選択されるポリペプチドを含んでなることを特徴とするポリペプチドを含む。
【００７４】
上記のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列もまた本発明の主題である。
本明細書において「ポリペプチド」、「ポリペプチド配列」、「ペプチド」および「タンパク質」は互換的に用いられる。「ポリペプチド」とは抗体応答を生じさせうるいずれのアミノ酸配列も含む。
【００７５】
本発明は天然形態のポリペプチドに関するものではなく、すなわちそれらは自然環境下にあるとはみなされないことを理解すべきである。一方本発明は、単離、すなわち天然源から精製することによって得ることができたもの、あるいは遺伝子組換えまたは化学合成によって得られたものに関するものであり、従ってそれらは以下に記載されているように非天然アミノ酸も含みうる。
【００７６】
「別のものと特定の同一性パーセンテージを示すポリペプチド」とは、「相同ポリペプチド」とも呼ばれるが、天然のポリペプチドと比べた場合に改変、特に少なくとも一つのアミノ酸の欠失、付加もしくは置換、末端切断、伸張、キメラ分離および／または突然変異を示すポリペプチド、あるいは翻訳後修飾を示すポリペプチドを表すものとする。相同ポリペプチドとしては、そのアミノ酸配列が本発明のポリペプチドのアミノ酸配列と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％および９８％の相同性を示すものが好ましい。置換の場合、一以上の保存的または非保存的アミノ酸が「同等の」アミノ酸に置き換わっている。ここで「同等のアミノ酸」とは、次に定義されるように、対応するペプチドの生物活性を実質的に変化させずに基本構造のアミノ酸のあるものを置換しうるいずれかのアミノ酸を表すものとする。
【００７７】
これら同等のアミノ酸は置換するアミノ酸との構造的相同性に基づき、または生じやすい種々のポリペプチド間の比較生物活性アッセイの結果に基づいて判断することができる。
【００７８】
例としては、対応する改変ポリペプチドの生物アッセイの著しい改変を生じることなくなしうる置換の可能性が挙げられる。このように、ロイシンをバリンまたはイソロイシンで、アスパラギン酸をグルタミン酸で、グルタミンをアスパラギンで、アルギニンをリジンなどで置換することができ、本質的に、同じ条件の下での逆置換を考えることもできる。
【００７９】
相同ポリペプチドはまた、これまでに定義したように、相同または同一のヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチドに相当し、従って本定義にはリステリアに存在する可能性があり、特に少なくとも一つのアミノ酸残基の末端切断、置換、欠失および／または付加に相当する種間または種内変異に相当するポリペプチドを含む。
【００８０】
２つのポリペプチド間の同一性パーセンテージは２つの核酸配列間と同様に算出されることが分かる。このように、２つのポリペプチド間の同一性パーセンテージは最大相同性ウインドウでのこれら２つの配列の最適アライメント後に算出される。かかる最大相同性ウインドウを定義するには、核酸配列に対するものと同様のアルゴリズムが使用できる。
【００８１】
「本発明のポリペプチドの生物学的に活性な断片」とは、特に以下に定義されるように本発明のポリペプチドの生物学的特徴の少なくとも一つを示すポリペプチド断片を意味するものとし、特にそこでは一般に
【００８２】
酵素（代謝）活性、または有機もしくは無機化合物の生合成または生分解に関与しうる活性、
構造活性（細胞外被、シャペロン分子、リボゾーム）、
輸送活性（エネルギー輸送、イオン輸送）、またはタンパク質分泌における活性、
特にＤＮＡ、ＲＮＡまたはタンパク質の複製、増幅、調製、転写、翻訳または突然変異誘発のプロセスにおける活性などの部分的活性でさえ働かせることができる。
【００８３】
「本発明のポリペプチド断片」とは、少なくとも５個のアミノ酸、好ましくは１０、１５、２５、５０、１００および１５０アミノ酸を含んでなるポリペプチドを表すものとする。
【００８４】
これらのポリペプチド断片はリステリア株に天然に存在する単離または精製された断片、あるいはトリプシンもしくはキモトリプシンもしくはコラゲナーゼなどのタンパク質分解酵素または化学試薬（臭化シアン、ＣＮＢｒ）でこのポリペプチドを切断することにより、またはこのポリペプチドを強酸環境（例えば、ｐＨ＝２．５）に置くことにより得ることができる断片に相当しうる。ポリペプチド断片はまた化学合成によって、またはその断片の発現を可能とする核酸を含み、かつ、適当な調節および／または発現エレメントの制御下に置かれた本発明の発現ベクターで形質転換された宿主から調製することもできる。
【００８５】
本発明のポリペプチドの「改変ポリペプチド」は遺伝子組換え、または後に記載されるように化学合成によって得られ、通常の配列に比べて少なくとも一つの改変を示すポリペプチドを表すものとする。これらの改変は特に活性の特異性もしくは有効性に必要な、あるいは本発明のポリペプチドの構造コンホメーション、電荷または疎水性を司るアミノ酸に対してなしうる。このように、同等の、上昇した、または低下した活性を有する、あるいは同等の、より厳しい、またはより広範な特異性を有するポリペプチドを作り出すことができる。改変ポリペプチドとしては、５個までのアミノ酸が改変、ＮもしくはＣ末端で末端切断、または欠失もしくは付加等されうるポリペプチドが挙げられる。
【００８６】
示されているように、ポリペプチドの改変の目的は特に、
有機または無機化合物の生合成または生分解の方法においてその使用を可能とすること、
特にＤＮＡ、ＲＮＡまたはタンパク質の複製、増幅、修復、および転写、翻訳または突然変異誘発の調節の方法においてその使用を可能とすること、
その分泌を高めること、
その溶解度、またはその活性の有効性もしくは特異性を改変すること、またはその精製を容易にすること
である。
【００８７】
化学合成はまた、非天然アミノ酸または非ペプチド結合を使用できるという利点も有する。例えば非天然アミノ酸、例えばＤ型、またはアミノ酸類似体、特に硫黄含有型を用いるのが有利でありうる。
【００８８】
本発明はリステリア・インノキュアゲノムのヌクレオチド配列およびにリステリア・モノサイトゲネス血清型４ｂの部分配列、またいくつかのポリペプチド配列を提供する。
【００８９】
好ましくは本発明は、アミノ酸生合成に関与するリステリア・インノキュアもしくはモノサイトゲネス４ｂのポリペプチドまたはその断片の一つをコードすることを特徴とする、本発明のヌクレオチド配列に関する。
【００９０】
好ましくは本発明は、補因子、補欠分子団および輸送体の生合成に関与するリステリア・インノキュアもしくはモノサイトゲネス４ｂのポリペプチドまたはその断片の一つをコードすることを特徴とする、本発明のヌクレオチド配列に関する。
【００９１】
好ましくは本発明は、リステリア・インノキュアもしくはモノサイトゲネス４ｂの細胞外被ポリペプチドまたは表面に存在するポリペプチドまたはその断片の一つをコードすることを特徴とする、本発明のヌクレオチド配列に関する。
【００９２】
好ましくは本発明は、細胞機構に関与するリステリア・インノキュアもしくはモノサイトゲネス４ｂのポリペプチドまたはその断片の一つをコードすることを特徴とする、本発明のヌクレオチド配列に関する。
【００９３】
好ましくは本発明は、中枢中間代謝に関与するリステリア・インノキュアもしくはモノサイトゲネス４ｂのポリペプチドまたはその断片の一つをコードすることを特徴とする、本発明のヌクレオチド配列に関する。
【００９４】
好ましくは本発明は、エネルギー代謝に関与するリステリア・インノキュアもしくはモノサイトゲネス４ｂのポリペプチドまたはその断片の一つをコードすることを特徴とする、本発明のヌクレオチド配列に関する。
【００９５】
好ましくは本発明は、脂肪酸およびリン脂質代謝に関与するリステリア・インノキュアもしくはモノサイトゲネス４ｂのポリペプチドまたはその断片の一つをコードすることを特徴とする、本発明のヌクレオチド配列に関する。
【００９６】
好ましくは本発明は、ヌクレオチド、プリン、ピリミジンまたはヌクレオシドの代謝に関与するリステリア・インノキュアもしくはモノサイトゲネス４ｂのポリペプチドまたはその断片の一つをコードすることを特徴とする、本発明のヌクレオチド配列に関する。
【００９７】
好ましくは本発明は、調節機能に関与するリステリア・インノキュアもしくはモノサイトゲネス４ｂのポリペプチドまたはその断片の一つをコードすることを特徴とする、本発明のヌクレオチド配列に関する。
【００９８】
好ましくは本発明は、複製プロセスに関与するリステリア・インノキュアもしくはモノサイトゲネス４ｂのポリペプチドまたはその断片の一つをコードすることを特徴とする、本発明のヌクレオチド配列に関する。
【００９９】
好ましくは本発明は、転写プロセスに関与するリステリア・インノキュアもしくはモノサイトゲネス４ｂのポリペプチドまたはその断片の一つをコードすることを特徴とする、本発明のヌクレオチド配列に関する。
【０１００】
好ましくは本発明は、翻訳プロセスに関与するリステリア・インノキュアもしくはモノサイトゲネス４ｂのポリペプチドまたはその断片の一つをコードすることを特徴とする、本発明のヌクレオチド配列に関する。
【０１０１】
好ましくは本発明は、タンパク質輸送および結合のプロセスに関与するリステリア・インノキュアもしくはモノサイトゲネス４ｂのポリペプチドまたはその断片の一つをコードすることを特徴とする、本発明のヌクレオチド配列に関する。
【０１０２】
好ましくは本発明は、非定型条件への適応に関与するリステリア・インノキュアもしくはモノサイトゲネス４ｂのポリペプチドまたはその断片の一つをコードすることを特徴とする、本発明のヌクレオチド配列に関する。
【０１０３】
好ましくは本発明は、医薬品および類似体に対する感受性に関与するリステリア・インノキュアもしくはモノサイトゲネス４ｂのポリペプチドまたはその断片の一つをコードすることを特徴とする、本発明のヌクレオチド配列に関する。
【０１０４】
好ましくは本発明は、トランスポゾンに関連する機能に関与するリステリア・インノキュアもしくはモノサイトゲネス４ｂのポリペプチドまたはその断片の一つをコードすることを特徴とする、本発明のヌクレオチド配列に関する。
【０１０５】
好ましくは本発明は、リステリア・インノキュアもしくはモノサイトゲネス４ｂに特異的なポリペプチドまたはその断片の一つをコードすることを特徴とする、本発明のヌクレオチド配列に関する。
【０１０６】
もう一つの態様では、本発明の主題は好ましくは、アミノ酸生合成に関与するリステリア・インノキュアもしくはモノサイトゲネス４ｂのポリペプチドまたはその断片の一つであることを特徴とする、本発明のポリペプチドである。
【０１０７】
もう一つの態様では、本発明の主題は好ましくは、補因子、補欠分子団および輸送体の生合成に関与するリステリア・インノキュアもしくはモノサイトゲネス４ｂのポリペプチドまたはその断片の一つであることを特徴とする、本発明のポリペプチドである。
【０１０８】
もう一つの態様によれば、本発明の主題は好ましくは、リステリア・インノキュアもしくはモノサイトゲネス４ｂの細胞外被ポリペプチドまたは表面ポリペプチド、またはその断片の一つであることを特徴とする、本発明のポリペプチドである。
【０１０９】
もう一つの態様では、本発明の主題は好ましくは、細胞機構に関与するリステリア・インノキュアもしくはモノサイトゲネス４ｂのポリペプチドまたはその断片の一つであることを特徴とする、本発明のポリペプチドである。
【０１１０】
もう一つの態様では、本発明の主題は好ましくは、中枢中間代謝に関与するリステリア・インノキュアもしくはモノサイトゲネス４ｂのポリペプチドまたはその断片の一つであることを特徴とする、本発明のポリペプチドである。
【０１１１】
もう一つの態様では、本発明の主題は好ましくは、エネルギー代謝に関与するリステリア・インノキュアもしくはモノサイトゲネス４ｂのポリペプチドまたはその断片の一つであることを特徴とする、本発明のポリペプチドである。
【０１１２】
もう一つの態様では、本発明の主題は好ましくは、脂肪酸およびリン脂質代謝に関与するリステリア・インノキュアもしくはモノサイトゲネス４ｂのポリペプチドまたはその断片の一つであることを特徴とする、本発明のポリペプチドである。
【０１１３】
もう一つの態様では、本発明の主題は好ましくは、ヌクレオチド、プリン、ピリミジンまたはヌクレオシドの代謝に関与するリステリア・インノキュアもしくはモノサイトゲネス４ｂのポリペプチドまたはその断片の一つであることを特徴とする、本発明のポリペプチドである。
【０１１４】
もう一つの態様では、本発明の主題は好ましくは、調節機能に関与するリステリア・インノキュアもしくはモノサイトゲネス４ｂのポリペプチドまたはその断片の一つであることを特徴とする、本発明のポリペプチドである。
【０１１５】
もう一つの態様では、本発明の主題は好ましくは、複製プロセスに関与するリステリア・インノキュアもしくはモノサイトゲネス４ｂのポリペプチドまたはその断片の一つであることを特徴とする、本発明のポリペプチドである。
【０１１６】
もう一つの態様では、本発明の主題は好ましくは、転写プロセスに関与するリステリア・インノキュアもしくはモノサイトゲネス４ｂのポリペプチドまたはその断片の一つであることを特徴とする、本発明のポリペプチドである。
【０１１７】
もう一つの態様では、本発明の主題は好ましくは、翻訳プロセスに関与するリステリア・インノキュアもしくはモノサイトゲネス４ｂのポリペプチドまたはその断片の一つであることを特徴とする、本発明のポリペプチドである。
【０１１８】
もう一つの態様では、本発明の主題は好ましくは、タンパク質輸送および結合に関与するリステリア・インノキュアもしくはモノサイトゲネス４ｂのポリペプチドまたはその断片の一つであることを特徴とする、本発明のポリペプチドである。
【０１１９】
もう一つの態様では、本発明の主題は好ましくは、非定型条件への適応に関与するリステリア・インノキュアもしくはモノサイトゲネス４ｂのポリペプチドまたはその断片の一つであることを特徴とする、本発明のポリペプチドである。
【０１２０】
もう一つの態様では、本発明の主題は好ましくは、医薬品または類似体に対する感受性に関与するリステリア・インノキュアもしくはモノサイトゲネス４ｂのポリペプチドまたはその断片の一つであることを特徴とする、本発明のポリペプチドである。
【０１２１】
もう一つの態様では、本発明の主題は好ましくは、トランスポゾンに関連する機能に関与するリステリア・インノキュアもしくはモノサイトゲネス４ｂのポリペプチドまたはその断片の一つであることを特徴とする、本発明のポリペプチドである。
【０１２２】
もう一つの態様では、本発明の主題は好ましくは、リステリア・インノキュアもしくはモノサイトゲネス４ｂに特異的なポリペプチドまたはその断片の一つであることを特徴とする、本発明のポリペプチドである。
【０１２３】
しかしながら、生きている生物が完全な存在であり、それとして考えるべきであることに着目することが重要である。従って、その特性を生起および顕現させるうるには、どんな生物においても様々な代謝経路間の相互作用が必要である。よって、上に述べた分類は限定されるものではなく、一つの遺伝子が２つの違った代謝経路に関与することもありうる。
【０１２４】
本発明の主題はまた、上記配列が、その形式および特性が上記の配列の読み取り、分析および／または活用を助ける記録媒体に記録されることを特徴とする、本発明のヌクレオチドおよび／またはポリペプチド配列である。これらの媒体はまた、得られた結果の比較分析および活用を助けるために、本発明から導き出された他の情報、特に既知の配列との類似性および／または他の微生物のヌクレオチドおよび／またはポリペプチド配列に関する情報を含む。
【０１２５】
これらの記録媒体としては特に、磁気媒体、光媒体、電子媒体またはハイブリッド媒体、特にコンピューターディスク、ＣＤ−ＲＯＭおよびコンピューターサーバーなどのコンピューターで読み取り可能な媒体が好ましい。かかる記録媒体も本発明の主題である。
【０１２６】
情報が盛り込まれた本発明の記録媒体はリステリア・インノキュアもしくはモノサイトゲネス４ｂまたはその生物の近縁株において遺伝子を同定するヌクレオチドプライマーまたはプローブを選択するのに極めて有用である。同様に、リステリア・インノキュアまたはモノサイトゲネス４ｂに近縁の株の遺伝子多形を、特に同一線上の領域を調べることによって研究するためのこれらの媒体の使用は、これらの媒体がリステリア・インノキュアまたはモノサイトゲネス４ｂのゲノムのヌクレオチド配列だけでなく、上記配列におけるゲノム構成も提供するものである限り、極めて有用である。このように本発明の記録媒体の使用も本発明の主題である。
【０１２７】
種々の配列間の相同性の分析は実際には、上記のＢｌａｓｔプラグラムなどの配列比較プログラムまたはＧＣＧパッケージのプログラムを用いて行うのが有利である。
【０１２８】
本発明はまた、本発明のヌクレオチド配列を含むクローニングおよび／または発現ベクターに向けられる。
【０１２９】
本発明のベクターは所定の宿主細胞においてヌクレオチド配列を発現および／または分泌させるエレメントを含んでなるのが好ましい。
【０１３０】
例えばベクターはプロモーター、翻訳開始および終結シグナル、また、転写調節に好適な領域を含んでなる。それは宿主細胞で安定して維持されうるものでなければならず、所望により翻訳されたタンパク質の分泌を条件付ける特定のシグナルを含んでもよい。これら種々のエレメントは当業者により、用いる細胞宿主に応じて選択および至適化される。これを行うため、本発明のヌクレオチド配列を、選択した宿主で自律複製するベクターに挿入することもできるし、あるいは選択した宿主に組み込まれるベクターもありうる。
【０１３１】
かかるベクターは当業者により一般的に用いられる方法によって調製され、得られたクローンは、リポフェクション、エレクトロポレーション、熱ショックまたは化学的方法などの標準的な方法を用いて好適な宿主へ導入することができる。
【０１３２】
本発明のベクターは例えばプラスミドベクターまたはウイルス起源のベクターである。これらは本発明のヌクレオチド配列をクローニングまたは発現させるために宿主細胞を形質転換する際に用いられる。
【０１３３】
本発明はまた、本発明のベクターで形質転換した宿主細胞を含んでなる。
【０１３４】
細胞宿主は原核または真核細胞系、例えば細菌細胞だけでなく酵母細胞または動物細胞、特に哺乳類細胞から選択すればよい。また、昆虫細胞または植物細胞も使用できる。本発明の好ましい宿主細胞は特に原核細胞であり、好ましくはリステリア属、リステリア・インノキュアもしくはモノサイトゲネス４ｂ種に属する細菌、またはリステリア・インノキュアもしくはモノサイトゲネス４ｂ種に関連の微生物である。本発明はまた、本発明の形質転換細胞を含んでなる植物および動物（ヒトは除く）に関する。本発明の形質転換細胞は本発明の組換えポリペプチドを生産する方法に使用できる。本発明のベクターで形質転換したベクターおよび／または細胞を用いることを特徴とする、本発明のポリペプチドを組換え型として生産する方法はそれ自体本発明に含まれる。好ましくは、本発明のベクターで形質転換した細胞はそのポリペプチドを発現させる条件下で培養し、その組換えポリペプチドを回収する。
【０１３５】
すでに述べたように、細胞宿主は原核または真核細胞系から選択することができる。特にかかる原核または真核細胞系で分泌を助ける本発明のヌクレオチド配列を確認することができる。従って、かかる配列を含む本発明のベクターは、分泌させようとする組換えタンパク質を生産するために有利に使用することができる。結果としてこれら目的の組換えタンパク質の精製は、それらが宿主細胞の内部よりもむしろ培養上清に存在しているということで容易となる。
【０１３６】
本発明のポリペプチドはまた、化学合成によって作製することもできる。かかる作製方法も本発明の主題である。当業者ならば例えば固相を用いる方法（特にＳｔｅｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．， １９８４， Ｓｏｌｉｄ ｐｈａｓｅ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ， Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍ． Ｃｏｍｐａｎｙ， Ｒｏｃｋｆｏｒｄ， １１１， ２ｎｄ Ｅｄ．， （１９８４）参照）、または断片縮合もしくは通常の液相合成による部分的固相を用いる方法が思い当たるであろう。化学合成によって得られ、対応する非天然アミノ酸を含んでなるポリペプチドも本発明に含まれる。
【０１３７】
本発明はまた、本発明の少なくとも一つのポリペプチドまたはその断片の一つ、およびヒトまたは動物で免疫応答を誘導しうるポリペプチドの配列を有するハイブリッドポリペプチドに関する。
【０１３８】
この抗原決定基は体液性および／または細胞性応答を誘導しうるものであることが有利である。
【０１３９】
かかる決定基は、本発明のポリペプチドまたはその断片の一つを、複数のエピトープに対する抗体の合成を誘導しうる免疫組成物を得る目的で用いられるグルコシル化形態で含んでなればよい。かかるポリペプチドまたはそれらのグリコシル化断片も本発明の一部である。
【０１４０】
これらのハイブリッド分子は本発明のポリペプチドまたはそれらの断片を有する分子の一部を、所望により免疫組成物、特にジフテリア毒、破傷風毒、Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原（仏国特許ＦＲ７９２１８１１）、ポリオウイルスのＶＰ１抗原、または他のいずれかのウイルスもしくは細菌の抗原もしくは毒素のエピトープと組み合わせて含んでもよい。
【０１４１】
ハイブリッド分子を合成する方法としては、所望のポリペプチド配列をコードするハイブリッドヌクレオチド配列を構築するために遺伝子療法で用いられる方法を含む。例えば有利には１９８４年にＭｉｎｔｏｎによって記載されている融合タンパク質をコードする遺伝子を得る技術が挙げられる。
【０１４２】
上記のハイブリッドヌクレオチド配列の発現によって得られた組換えポリペプチドであることを特徴とする、本発明のハイブリッドポリペプチドをコードする上記ハイブリッドヌクレオチド配列もまた本発明の一部である。
【０１４３】
本発明はまた上記ハイブリッドヌクレオチド配列の一つを含むことを特徴とするベクターも含む。上記のベクターによって形質転換された宿主細胞、その形質転換細胞の一つを含んでなるトランスジェニック動物、および上記ベクター、上記形質転換細胞および／または上記トランスジェニック動物を用いて組換えポリペプチドを生産する方法もまた本発明の一部である。
【０１４４】
本発明のポリペプチドと免疫ポリペプチドとの間のカップリングは化学的に行っても生物学的に行ってもよい。よって、本発明によれば、本発明のポリペプチドと免疫刺激ポリペプチドとの間のカップリング反応を促進するため（この免疫刺激抗原の共有結合はおそらく本発明のポリペプチドのＮまたはＣ末端で起こる）、一以上の結合エレメント、特にアミノ酸を導入することができる。このカップリングのための二官能性試薬はこのカップリングを行うために選択する末端に応じて決定し、カップリング法は当業者に周知のものである。
【０１４５】
ペプチドのカップリングから得られるコンジュゲートは遺伝子組換えによって作製してもよい。ハイブリッドペプチド（コンジュゲート）は実際には組換えＤＮＡ技術により、あるいは抗原ペプチド、免疫原ペプチドまたはハプテンペプチドをコードする配列を本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡ配列に挿入または付加することにより作製できる。遺伝子組換えによりハイブリッドペプチドを作製するこれらの技術は当業者に周知のものである（例えば、Ｍａｋｒｉｄｅｓ， １９９６， Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ６０， ５１２−５３８参照）。
【０１４６】
上記の免疫ポリペプチドは毒素、特にジフテリア毒または破傷風毒、連鎖球菌由来タンパク質（ヒト血清アルブミン結合タンパク質など）、ＯＭＰＡ膜タンパク質および外膜タンパク質複合体、外膜ビヒクルまたは熱ショックタンパク質を含むペプチドの群から選択するのが好ましい。
【０１４７】
本発明のハイブリッドポリペプチドは、本発明のポリペプチドを特異的に認識しうるモノクローナルまたはポリクローナル抗体を得るのに極めて有用である。実際、本発明のハイブリッドポリペプチドは、免疫分子と結合した本発明のポリペプチドに対して免疫応答を生じさせる。本発明のポリペプチドを認識するこのうようなモノクローナルもしくはポリクローナル抗体、そのフラグメントまたはキメラ抗体も本発明の主題である。
【０１４８】
特定のモノクローナル抗体はＫｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ （１９７５， Ｎａｔｕｒｅ ２５６，４９５）により記載されている通常のハイブリドーマ培養法によって得ることができる。
【０１４９】
本発明の抗体としては、例えばキメラ抗体、ヒト化抗体、またはＦａｂもしくはＦ（ａｂ’）２フラグメントがある。それらは免疫コンジュゲートの形態であっても、検出可能および／または定量可能なシグナルを得るために標識した抗体の形態であってもよい。
【０１５０】
よって、本発明の抗体は、生物サンプルにおいてリステリア・インノキュアもしくはモノサイトゲネス４ｂ種に属する細菌または関連の微生物を検出および／または同定する方法で使用することができ、それは以下の
ａ）生物サンプルを本発明の抗体と接触させ、
ｂ）生じうる抗原−抗体複合体を検出すること
を含んでなることを特徴とする。
【０１５１】
本発明の抗体はまた、リステリア・インノキュアもしくはモノサイトゲネス４ｂまたは関連の微生物の遺伝子の発現を検出するために使用することもできる。特に、上記の発現産物に特異的な抗体によって認識される遺伝子の発現産物の存在を、リステリア・インノキュアもしくはモノサイトゲネス４ｂ種または関連の微生物株を本発明の抗体と接触させた後に生じた抗原−抗体複合体の存在により検出することができる。用いる菌株は「調製された」、すなわち遠心分離、凍結乾燥して、免疫反応に好適な媒体を構成する適当な試薬中に置かれたものであってよい。特に、還元条件の有無の下、菌株の溶解物に対してポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を行った後に行えるウエスタンブロット法に相当する、遺伝子発現検出法が好ましい。ポリアクリルアミドゲル上でタンパク質を移動および分離させた後、これらのタンパク質を好適な膜（例えばナイロン製）に移し、目的のタンパク質またはポリペプチドの存在を、この膜を本発明の抗体と接触させることによって検出する。
【０１５２】
よって、本発明はまた、記載のような方法（リステリア・インノキュアもしくはモノサイトゲネス４ｂまたはそれらの関連微生物の遺伝子の発現を検出する、あるいはリステリア・インノキュアもしくはモノサイトゲネス４ｂ種に属する細菌または関連の微生物を検出および／または同定することを目的とする）を実施するのに必要なキットまたはセットを含んでなり、このキットまたはセットは以下の構成要素：
ａ）本発明のポリクローナルまたはモノクローナル抗体、
ｂ）所望により、免疫反応に好適な媒体を構成する試薬、
ｃ）所望により、免疫反応によって生じた抗原−抗体複合体を検出する試薬をを含んでなる。
【０１５３】
本発明のポリペプチドおよび抗体は有利なことに支持体、特にタンパク質チップに固定化することができる。かかるタンパク質チップも本発明の主題であり、これはまたリステリア・インノキュアまたはモノサイトゲネス４ｂ以外の微生物の少なくとも一つのポリペプチド、またはリステリア・インノキュアまたはモノサイトゲネス４ｂ以外の微生物の化合物に対する抗体を含んでいてよい。
【０１５４】
本発明のタンパク質を含有するタンパク質チップまたは高密度フィルターは本発明のＤＮＡチップと同じ方法で構築することができる。実施上、タンパク質チップ直接結合したポリペプチドの合成を行うか、あるいはｅｘ ｓｉｔｕ合成を行った後に合成されたポリペプチドをこのチップに結合させるかのいずれかが可能である。後者の方法はかなりの大きさのタンパク質を支持体に結合させる場合に好ましく、これらのタンパク質は有利には遺伝子操作によって製造する。しかし、このチップの支持体にペプチドのみを結合させる場合には、これらのペプチドを直接ｉｎ ｓｉｔｕ合成する方が有利である。
【０１５５】
本発明のタンパク質チップはリステリア・インノキュアもしくはモノサイトゲネス４ｂ種に属する細菌または関連の微生物を検出および／または同定するキットまたはセット、あるいはより一般には、微生物を検出および／または同定するキットまたはセットで有利に用いることができる。本発明のポリペプチドをＤＮＡチップに結合させる場合、供試サンプル中の抗体の存在を調べるが、本発明の抗体をタンパク質チップの支持体へ結合させることで、抗体が特性を示すタンパク質の同定が可能となる。
【０１５６】
好ましくは本発明の抗体をタンパク質チップの支持体へ結合させ、リステリア・インノキュアもしくはモノサイトゲネス４ｂまたは関連の微生物に特異的な、相当する抗原の存在を検出する。
【０１５７】
本発明のＤＮＡチップの他、上記のタンパク質チップは、遺伝子産物を検出し、その遺伝子の発現プロフィールを確立するのに用いることができる。
本発明のタンパク質チップはまた、ある微生物の種々のタンパク質間の相互作用を研究するプロテオミック実験に極めて有用である。簡便な方法では、ある生物の種々のタンパク質の典型的なペプチドを支持体に結合させる。次にこの支持体を標識タンパク質と接触させ、所望により洗浄工程を経た後、標識タンパク質と、タンパク質チップに結合したペプチドとの間の相互作用を検出する。
【０１５８】
よって、本発明のポリペプチド配列または本発明の抗体を含んでなるタンパク質チップも本発明の主題であり、それらを含むキットまたはセットも同様である。
【０１５９】
本発明はまた、本発明のヌクレオチド配列を使用し、生物サンプルにおけるリステリア・インノキュアもしくはモノサイトゲネス４ｂ種に属する細菌または関連の微生物を検出および／または同定する方法を含む。
【０１６０】
本発明において「生物サンプル」とは、生きている生物から採取したサンプル（特に血液、組織、臓器その他哺乳類から採取されるもの）、または生物素材、すなわちＤＮＡまたはＲＮＡを含有するサンプルに関すると理解すべきである。かかる生物サンプルはまた、細菌を含有する食品組成物（例えばチーズ、乳製品）だけでなく、酵母を含有する食品組成物（ビール、パン）その他を含む。「生物サンプル」とはまた、これらのサンプルまたは食品組成物から単離された細菌にも関連する。
【０１６１】
本発明のヌクレオチド配列を用いた検出および／または同定方法は本質的に多様なものである。
【０１６２】
以下の
ａ）所望により、分析する生物サンプルからＤＮＡを単離するか、または生物サンプルのＲＮＡからｃＤＮＡを得、
ｂ）本発明の少なくとも一つのプライマーを用い、リステリア・インノキュアもしくはモノサイトゲネス４ｂ種または関連の微生物に属する細菌のＤＮＡを特異的に増幅し、
ｃ）増幅産物を検出すること
を含んでなる方法が好ましい。
【０１６３】
この方法はＤＮＡの特異的増幅、特にポリメラーゼ連鎖反応によるものに基づいている。
【０１６４】
以下の
ａ）本発明のヌクレオチドプローブを生物サンプルと接触させ（この生物サンプルに含まれている核酸は、適当であれば、従前にそのプローブをリステリア・インノキュアもしくはモノサイトゲネス種、または関連の微生物に属する細菌の核酸とハイブリダイズさせる条件下でハイブリダイズしやすかったものである）、
ｂ）ヌクレオチドプローブと生物サンプルのＤＮＡとの間で生じうるハイブリッドを検出すること
を含んでなる方法が好ましい。
【０１６５】
かかる方法は試験する生物サンプルに含まれるＤＮＡの存在の検出に限られたものではなく、そのサンプルに含まれるＲＮＡを検出するのにも使用できる。この方法は特にサザンおよびノーザンブロット法を包含する。
【０１６６】
本発明のもう一つの好ましい方法は以下の
ａ）本発明の支持体に固定化したヌクレオチドプローブを生物サンプルと接触させ（このサンプルの核酸は、適当であれば、従前にそのプローブをリステリア・インノキュアもしくはモノサイトゲネス種、または関連の微生物に属する細菌の核酸とハイブリダイズさせる条件下でハイブリダイズしやすかったものである）、
ｂ）支持体に固定化したヌクレオチドプローブと生物サンプルに含まれている核酸との間で生じたハイブリッドを、適当であればそのプローブとハイブリダイズしなかった生物サンプルのＤＮＡを除いた後に、本発明の標識ヌクレオチドプローブと接触させ、
ｃ）ｂ）で生じた新たなハイブリッドを検出すること
を含んでなる。
【０１６７】
この方法は本発明のＤＮＡチップとともに用いるのが有利であり、核酸がそのチップの表面に存在するプローブとハイブリダイズするかどうかを調べ、標識プローブを用いて検出する。この方法は有利には本発明のプライマーを用いて、ＤＮＡまたは所望により逆転写により得られた相補的ＤＮＡを増幅する先行工程を組み合わせて行う。
【０１６８】
このように本発明はまた、以下の構成要素：
ａ）本発明のヌクレオチドプローブ、
ｂ）所望により、ハイブリダイゼーション反応の実施に必要な試薬、
ｃ）所望により、本発明の少なくとも一つのプライマー、およびまた、ＤＮＡ増幅反応に必要な試薬
を含んでなることを特徴とし、リステリア・インノキュアもしくはモノサイトゲネス４ｂ種、または関連の微生物に属する細菌を検出および／または同定するキットまたはセットを包含する。
【０１６９】
同様に本発明はまた、以下の構成要素：
ａ）捕捉プローブと呼ばれる、本発明のヌクレオチドプローブ、
ｂ）検出プローブと呼ばれる、本発明のオリゴヌクレオチドプローブ、
ｃ）所望により、本発明の少なくとも一つのプライマー、およびまた、ＤＮＡ増幅反応に必要な試薬
を含んでなることを特徴とし、リステリア・インノキュアもしくはモノサイトゲネス４ｂ種、または関連の微生物に属する細菌を検出および／または同定するキットまたはセットを包含する。
【０１７０】
最後に、以下の構成要素：
ａ）本発明の少なくとも一つのプライマー、
ｂ）所望により、ＤＮＡ増幅反応の実施に必要な試薬、
ｃ）所望により、増幅断片、さらに詳しくは本発明のオリゴヌクレオチドプローブの配列を証明する成分
を含んでなることを特徴とし、リステリア・インノキュアもしくはモノサイトゲネス４ｂ種、または関連の微生物に属する細菌を検出および／または同定するキットまたはセットもまた本発明の主題である。
【０１７１】
好ましくは本発明の方法および／またはキットもしくはセットに用いられる本発明のプライマーおよび／またはプローブおよび／またはポリペプチドおよび／または抗体はリステリア・インノキュアまたはモノサイトゲネス４ｂ種に特異的なプライマーおよび／またはプローブおよび／またはポリペプチドおよび／または抗体から選択される。好ましくはこれらの構成要素は分泌タンパク質をコードするヌクレオチド配列から、分泌ポリペプチドから、あるいはリステリア・インノキュアまたはモノサイトゲネス４ｂの分泌ポリペプチドに対する抗体から選択される。
【０１７２】
本発明の主題はまた、本発明のヌクレオチド配列、特にＯＲＦ配列またはその調節エレメント（特にプロモーター）に一以上の突然変異を含むリステリア・インノキュアもしくはモノサイトゲネス４ｂおよび／または関連の微生物株である。
【０１７３】
本発明によれば、細胞機構、特に分泌、中枢中間代謝、エネルギー代謝、ならびにアミノ酸合成、転写および翻訳、およびポリペプチド合成のプロセスに関与するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列において一以上の突然変異を示すリステリア・インノキュアまたはモノサイトゲネス４ｂ株が好ましい。
【０１７４】
上記の突然変異は遺伝子の不活性化、特にそれらがその遺伝子の調節エレメントに存在する場合にはこの遺伝子の過剰発現をもたらしうる。
【０１７５】
本発明はまた、真核細胞または原核細胞において遺伝子発現を調整、調節、誘導または阻害しうる、かつ／または細胞複製を改変しうる、あるいはリステリア・インノキュアもしくはモノサイトゲネス４ｂまたはその関連微生物の一つによる感染に関連した病態を誘発、抑制または悪化しうる有機または無機化合物を選択するための、本発明のヌクレオチド配列、本発明のポリペプチド、本発明の抗体、本発明の細胞、および／または本発明の形質転換動物の使用に関する。
【０１７６】
本発明はまた、本発明のポリペプチドまたはその断片の一つと結合しうる、本発明のヌクレオチド配列と結合しうる、または請求項に記載の抗体を認識しうる、かつ／または真核細胞もしくは原核細胞において遺伝子発現を調整、調節、誘導または阻害し、かつ／または細胞増殖もしくは複製を改変しうる、あるいはリステリア、例えばＬ．モノサイトゲネス４ｂまたはその関連微生物の一つによる感染に関連した動物またはヒトの病態を誘発、抑制または悪化しうる化合物を選択する方法を含んでなり、その方法は、以下の
ａ）上記化合物を上記ポリペプチド、上記ヌクレオチド配列、または本発明の形質転換細胞に接触させ、かつ／または上記化合物を本発明の形質転換動物に投与し、
ｂ）上記化合物の、上記ポリペプチドまたは上記ヌクレオチド配列と結合する能力、あるいは遺伝子発現を調整、調節、誘導または阻害する能力、あるいは細胞増殖または複製を調整する能力、あるいはリステリア、例えばＬ．モノサイトゲネス４ｂまたはその関連微生物の一つによる感染に関連した上記形質転換動物の病態を誘発、抑制または悪化させる能力を調べること
を含んでなることを特徴とする。
【０１７７】
本発明の形質転換細胞および／または動物は有利なことにリステリア・モノサイトゲネスにより誘発されるまたは悪化する病態の一因となる、あるいはこれらの病態を予防および／または治療しうる化合物を研究、同定および／または選択するモデルとして役立ち、またそれを目的とした方法で用いられる。特に、本発明のベクターによる形質転換が例えばその感染力の上昇もしくは阻害、または感染によって通常誘発されるまたは悪化しうる病態を調整しうる、形質転換宿主細胞、特にリステリア属の細菌を動物に感染させ、そこでその病態の発現を追跡する。これら非形質転換動物に例えば形質転換リステリア菌を感染させたものは研究モデルとして役立つ。同様に、本発明の形質転換動物はリステリアによる疾病を予防および／または治療しうる化合物を選択する方法でも使用できる。かかる形質転換細胞および／または形質転換動物をこのような方法も本発明の一部である。
【０１７８】
選択しやすい化合物としてはポリペプチドもしくは炭水化物などの有機化合物、または既知のその他いずれかの有機もしくは無機化合物、または分子モデリング技術を用いて開発された、また化学合成もしくは生化学合成によって（これらの技術は当業者に公知である）得られた新規な有機化合物がある。
【０１７９】
このような選択化合物を用い、リステリア・インノキュアもしくはモノサイトゲネス４ｂ、または他のいずれかの関連微生物の細胞増殖および／または複製をモデリングし、従ってこれらの微生物による感染を制御することができる。また、本発明のこれら化合物を用いて、いずれかの真核細胞または原核細胞、特に腫瘍細胞および感染性微生物の細胞増殖および／または複製をモデリングすることもでき、それに対してそれらの化合物が活性であることが分かる。なお、これらの調整を調べる方法は当業者に周知のものである。
【０１８０】
「微生物の増殖を調整しうる化合物」とは、上記微生物の発達、成長、増殖速度および／または活性を改変、制限および／または低下に介入することを可能とするいずれかの化合物を表すものとする。
【０１８１】
この調整は例えばタンパク質と結合しうる、従ってその生物活性を阻害もしくは促進しうる、または微生物の外表膜タンパク質と結合し、その微生物の宿主細胞への浸透を阻害する、またはその微生物に対する感染生物の免疫系の作用を促進しうる薬剤を用いて行うことができる。この調整はまた、微生物のＤＮＡまたはＲＮＡのヌクレオチド配列と結合し、例えばその生物活性または構造活性がその微生物の増殖または複製に必要であるポリペプチドの発現を阻害しうる薬剤を用いて行うこともできる。
【０１８２】
本発明において「関連の微生物」とは、本発明の化合物により遺伝子発現が調整、調節、誘導または阻害されうる、または細胞増殖もしくは複製もまた調整されうるいずれの微生物をも表すものとする。本発明において「関連の微生物」とはまた、本発明のヌクレオチド配列またはポリペプチドを含んでなるいずれの微生物をも表すものとする。これらの微生物はある場合には、本発明のものと同一または相同なポリペプチドまたはヌクレオチド配列を含んでもよく、本発明の検出および／または同定のための方法またはキットを用いて検出および／または同定してもよく、本発明の化合物の標的としても役立つ。「微生物」とはまた、いずれかの血清型のリステリア・モノサイトゲネス微生物のいずれをも表すものとする。
【０１８３】
本発明は本発明の選択方法を用いて選択できる化合物に関する。
本発明はまた、以下の化合物、
ａ）本発明のヌクレオチド配列、
ｂ）本発明のポリペプチド、
ｃ）本発明のベクター、
ｄ）本発明の抗体、および
ｅ）所望により医薬上許容されるビヒクルと組み合わせた、本発明の選択方法を用いて選択できる化合物
から選択される化合物を含んでなる医薬組成物に関する。
【０１８４】
「有効量」とは、リステリア・インノキュアもしくはモノサイトゲネス４ｂまたは関連の微生物の増殖を調整するため、本発明の化合物もしくは抗体、またはポリペプチドの十分な量を表すものとする。
【０１８５】
本発明はまた、リステリア属に属する細菌または関連の微生物による感染を予防または治療するための、本発明の医薬組成物に関する。
【０１８６】
本発明はまた、本発明の一以上のポリペプチドおよび／または本発明の一以上のハイブリッドポリペプチドを含んでなることを特徴とする、免疫組成物および／またはワクチン組成物に向けられる。
【０１８７】
本発明はまた、ワクチン組成物を製造するための、本発明の形質転換細胞の使用を含む。
【０１８８】
本発明はまた、本発明のヌクレオチド配列、本発明のベクターおよび／または本発明の形質転換細胞を含有することを特徴とする、ワクチン組成物に向けられる。
【０１８９】
本発明はまた、リステリア属に属する細菌または関連の微生物による感染を予防または治療するための、本発明のワクチン組成物に関する。
【０１９０】
好ましくは、リステリアまたは関連の微生物による感染の予防または治療を意図した本発明の免疫組成物および／またはワクチン組成物はリステリア細胞外被タンパク質またはその断片の一つに相当するポリペプチドまたはその断片の一つを含んでなる免疫組成物および／またはワクチン組成物から選択する。ヌクレオチド配列を含んでなるワクチン組成物は好ましくは、リステリア細胞外被タンパク質またはその断片の一つに相当するポリペプチドまたはその断片の一つをコードするヌクレオチド配列もまた含んでなる。
【０１９１】
本発明の免疫組成物の一部となる本発明のポリペプチドまたはそれらの断片は、例えばその増殖またはインターロイキンの分泌を引き起こし、これらのポリペプチドに対する抗体の産生させる、例えばＴ細胞を刺激する上記ポリペプチドの能力など、当業者に公知の技術を用いて選択することができる。
【０１９２】
マウスでは、ヒトで用いる用量に相当する体重用量のワクチン組成物を投与し、血清サンプルを採取して、常法に従い、血清中に存在する抗体とワクチン組成物の抗原との間の複合体の形成を調べることにより抗体反応を調べる。
【０１９３】
本発明によれば、これらのワクチン組成物は好ましくは医薬上許容されるビヒクルおよび適当であれば一以上の好適な免疫アジュバントと組み合わせる。
【０１９４】
現在では、感染性疾病からヒトを保護するため、弱毒生菌（結核のウシ結核菌（Ｍ． ｂｏｖｉｓ）−ＢＣＧ）、不活性化微生物（流感ウイルス）、無細胞抽出物（百日咳の百日咳菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｉｓ））、組換えタンパク質（Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原）および多糖類（肺炎双球菌）などの種々のタイプのワクチンを利用することができる。合成ペプチドから、または異種抗原を発現する遺伝的に改変した微生物から製造したワクチンが研究下にある。さらに最近では、防御抗原をコードする遺伝子を有する組換えプラスミドＤＮＡがもう一つのワクチン戦略として提案されている。このタイプの免疫化はｉｎ ｖｉｖｏで複製せず、かつ、免疫タンパク質だけをコードする大腸菌プラスミド由来の特定のプラスミドを用いて行う。単にこの裸のプラスミドＤＮＡを筋肉内に注射することで動物は免疫化された。この技術によりワクチンタンパク質のｉｎ ｓｉｔｕ発現、ならびに細胞性（ＣＴＬ）および体液性（抗体）免疫応答がもたらされる。このような免疫応答の二重の誘導は裸のＤＮＡで免疫化を行う技術の主な利点の一つである。
【０１９５】
ヌクレオチド配列、またはその配列が挿入されるベクターを含んでなるワクチン組成物は特に国際出願ＷＯ９０／１１０９２および国際出願ＷＯ９５／１１３０７に記載されている。
【０１９６】
本発明のワクチン組成物を構成するヌクレオチド配列は、このポリヌクレオチドの細胞への浸透または細胞核へのその輸送を促進する化合物に結合させた後に宿主細胞に注射することができる。得られたコンジュゲートは国際出願ＷＯ９４／２７２３８（Ｍｅｄｉｓｏｒｂ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）に記載のように、高分子マイクロ粒子に封入することができる。
【０１９７】
本発明のワクチン組成物のもう一つの具体例によれば、ヌクレオチド配列、好ましくはＤＮＡを核タンパク質または脂質とともにＤＥＡＥ−デキストランと複合化するか、あるいはリポソームに封入するか、またはその細胞へのトランスフェクションを助けるゲルの形態で導入する。本発明のポリヌクレオチドまたはベクターはまた、バッファー溶液に懸濁させてもよいし、またはリポソームと会合させてもよい。
【０１９８】
有利にはかかるワクチンを、１９９６年にＴａｃｓｏｎ ｅｔ ａｌ．またはＨｕｙｇｅｎ ｅｔ ａｌ．によって記載されている技術に従い、あるいはまたＤａｖｉｓ ｅｔ ａｌ．によって国際出願ＷＯ９５／１１３０７に記載されている技術に従って製造する。
【０１９９】
かかるベクターはまた、ヒトまたは動物でそれを発現させるための調節エレメントの制御下に置いた本発明のベクターを含有する組成物の形態で製造してもよい。目的のポリペプチド抗原のｉｎ ｖｉｖｏ発現のためのベクターとしては例えば、プラスミドｐｃＤＮＡ３またはプラスミドｐｃＤＮＡ１／ｎｅｏ（いずれもＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ （Ｒ ＆ Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ， Ａｂｉｎｇｄｏｍ， Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ製））が使用できる。かかるワクチンは有利には組換えベクターの他、生理食塩水、例えば塩化ナトリウム溶液を含む。
【０２００】
「医薬上許容されるビヒクル」とは、医薬組成物またはワクチン組成物を含め、いずれの副反応も起こさず、例えば有効化合物の投与を助ける、生物中でのその寿命かつ／またはその有効性を高める、溶液中でのその溶解度を高める、あるいはまたその保存性を高めることを可能とする化合物または化合物の組合せを表すものとする。これらの医薬上許容されるビヒクルは周知のものであり、当業者により、選択された有効化合物の性質および投与方法に対して調整される。
【０２０１】
ワクチン製剤については、それらは例えば水酸化アルミニウム、ムラミルペプチド系の典型的なもの（Ｎ−アセチルムラミルのペプチド誘導体のあるものなど）、細菌溶解物、またはフロイントの不完全アジュバントなど、当業者に公知の好適な免疫アジュバントを含んでもよい。
【０２０２】
好ましくは、これらの化合物は全身投与、特に静脈内、筋肉内、皮内、または皮下投与、あるいは経口投与する。より好ましくは、本発明のポリペプチドを含んでなるワクチン組成物は数回皮内または皮下投与し、経時的に拡散させる。
【０２０３】
これらの化合物の最適な投与法、用量および医薬形は、一般に例えば患者の年齢または体重、患者の健康状態の重篤度、治療耐性および留意すべき副作用など、患者にとって好適な治療を確立することを考慮した基準に従って決定することができる。
【０２０４】
最後に、本発明は、リステリアの存在によって誘導されるまたは悪化する疾病を治療または予防するための、本発明の組成物の使用を含む。
【０２０５】
さらに本発明の主題はまた、リステリア属、好ましくはリステリア・インノキュアまたはモノサイトゲネス、好ましくは４ｂ株の細菌のゲノムＤＮＡライブラリーである。
【０２０６】
本発明に記載のゲノムＤＮＡライブラリー、特に２０００年１０月２日にＮｏ．Ｉ−２５６５としてＣＮＣＭ［Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ ａｎｄ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ］に寄託されたＬｉ−ショットガンライブラリーおよび２０００年１０月２日にＮｏ．Ｉ−２５６６としてＣＮＣＭに寄託されたＬｍ４ｂ−ショットガンライブラリーは実際にはそれぞれリステリア・インノキュアおよびリステリア・モノサイトゲネス４ｂのゲノムをカバーしている。大腸菌の致死性の問題により上記ライブラリーへのある領域のクローニングはできなかったが、これらの領域は当業者ならば、コンティグを形成する種々のクローンの末端配列に特異的なオリゴヌクレオチドを用いて容易に増幅および同定することができる。
【０２０７】
本発明はまた、あるリステリア株には存在するが別の株には存在しない目的のポリヌクレオチドを単離する方法に関し、その方法では例えばリステリアゲノムを含むプラスミドｐｃＤＮＡ２．１に基づく少なくとも一つのＤＮＡライブラリーを用いる。目的のポリヌクレオチドを単離する本発明の方法は以下の
ａ）リステリア由来ＤＮＡライブラリーのクローンに含まれる少なくとも一つのポリヌクレオチドを単離し、
ｂ）リステリアの少なくとも一つのゲノムポリヌクレオチドまたはｃＤＮＡ（このリステリアは工程ａ）のＤＮＡライブラリーを構築するのに用いた株とは異なる株に属するものである）、あるいはまた
工程ａ）のＤＮＡライブラリーを構築するのに用いたリステリアとは異なるリステリアゲノムから作製したＤＮＡライブラリー由来のクローンに含まれる少なくとも一つのポリヌクレオチド
を単離し、
ｃ）工程ａ）のポリヌクレオチドと工程ｂ）のポリヌクレオチドとをハイブリダイズさせ、
ｄ）工程ｂ）のポリヌクレオチドとはハイブリダイゼーション複合体を形成しなかった工程ａ）のポリヌクレオチドを選択し、
ｅ）選択したポリヌクレオチドを同定すること
を含んでなりうる。
【０２０８】
工程ａ）のポリヌクレオチドは、少なくとも一つの組換えクローンを好適な制限酵素で消化し、所望によりそれから得られたポリヌクレオチドインサートを増幅することによって製造することができる。
【０２０９】
よって本発明の方法により、当業者はリステリア属の種々の株または種の間で、例えば病原株とそれらの非病原株の間で比較ゲノム研究を行うことが可能となる。
【０２１０】
特にこれらの株間での多形領域を研究および決定することができる。
【０２１１】
【実施例】
１．ライブラリーの構築
調べる株の染色体ＤＮＡは、プロテイナーゼＫ処理およびフェノール抽出を含む常法（Ｃ． Ｊａｃｑｕｅｔ ｅｔ ａｌ．， Ｚｅｎｔｒａｌｂｌ Ｂａｋｔｅｒｉｏｌ．， ２７６：３５６−３６５， １９９２）を用いて調製した。約１０μｇのＤＮＡをネブリゼーション（圧力１バール下で１分）によって断片化した（Ｃ． Ｂｕｃｈｒｉｅｓｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｉｎｆｅｃｔ． Ｉｍｍｕｎ．， ６７：４８５１−４８６１， １９９９）。これらのＤＮＡ断片の末端を、４ヌクレオチド三リン酸の存在下、３７℃にて１５分間Ｔ４バクテリオファージＤＮＡポリメラーゼを作用させることで平滑末端化した。７５℃で１５分間インキュベートすることでこの酵素を失活させた。次にこの末端にリンカー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎカタログ番号４０８−１８）を連結した。連結後、アガロースゲル電気泳動に付した後、１０００〜３０００ｂｐの間の大きさの染色体ＤＮＡ断片を精製した。ライブラリーの構築に用いたベクターｐｃＤＮＡ２．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）をＢｓｔＸ１酵素で消化し、アガロースゲル電気泳動に付した後にジーンクリーン（ＢＩＯ−１０１）で精製した。この染色体ＤＮＡと精製ベクターをＴ４バクテリオファージリガーゼの作用により連結させた。この連結混合物を大腸菌株ＸＬ２−ブルー（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に形質転換により導入した。連結混合物μＬ当たり約４０００コロニーが得られた。
この方法を用い、リステリア・インノキュア株（ＣＬＩＰ１１２６２）に関して２０００年１０月２日にＮｏ．Ｉ−２５６５としてＣＮＣＭに寄託されたＬｉ−ショットガンライブラリーを、また、リステリア・モノサイトゲネス血清型４ｂ（ＣＬＩＰ８０４５９）に関して２０００年１０月２日にＮｏ．Ｉ−２５６６としてＣＮＣＭに寄託されたＬｍ４ｂ−ショットガンライブラリーを構築した。
【０２１２】
２．プラスミドの調製および配列決定
プラスミドはアルカリ溶解法（Ｈ．Ｃ． Ｂｉｍｂｏｉｍ， Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．， １００：２４３−２５５， １９８３）を基にＧＭＰ研究室（Ｇｅｎｏｍｉｑｕｅ ｄｅｓ Ｍｉｃｒｏ−ｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ Ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓ ｄｅ ｌ’Ｉｎｓｔｉｔｕｔ Ｐａｓｔｅｕｒ ［Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ｏｆ Ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｐａｓｔｅｕｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ］）において開発された半自動調製方法によって調製した。これらの染色体インサートをＴ７およびユニバーサルプライマーを用い、供給者（ＰＥ−Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）の奨励に従ってそれらの両末端から配列決定した。配列決定は３７７および３７００型のオートシーケンサー（ＰＥ−Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて行った。
【０２１３】
３．配列のアセンブリ
ワシントン大学， Ｐｈｒｅｄ， Ｐｈｒａｐ ａｎｄ Ｃｏｎｓｅｄ （Ｂ． Ｅｗｉｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．， ８：１８６−１９４， １９９８； Ｄ． Ｇｏｒｄｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．， ８：１９５−２０２， １９９８）で開発されたソフトウェアパッケージを用いてこれらの配列のアセンブリを行った。配列はソフトウェアパッケージＧＭＰＴＢ（Ｌ． Ｆｒａｎｇｅｕｌ ｅｔ ａｌ．， Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ， １４５：２６２５−２６３４， １９９９）を用いて完成させた。この最終工程は配列が相対的に不確かな領域を再シーケンシグすること、およびコンティグ間にある配列を配列決定することにある。これはＰＣＲ産物を配列決定するか、またはライブラリー由来のクローンでウォーキングを行うかのいずれかで行った。オリゴヌクレオチドの配列はＣｏｎｓｅｄ ａｎｄ  Ｐｒｉｍｏソフトウェア（Ｄ． Ｇｏｒｄｏｎ ｅｔ ａｌ．， １９９８； Ｐ． Ｌｉ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｏｍｉｃｓ， ４０：４７６−４８５， １９９７）を用いて決定した。
【０２１４】
４．配列の注釈付け
コード配列（ＣＤＳ）はＧＭＰＴＢソフトウェアパッケージを用いて同定した。このプログラムは種々の方法：（ｉ）オープンリーディングフレームの認識とそれらの大きさに関してのその分類；（ｉｉ）Ｇｅｎｅｍａｒｋソフトウェア（Ａ．Ｖ． Ｌｕｋａｓｈｉｎ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， １５：１１０７−１１１５， １９９８）を用いたコードされている確率の分析；（ｉｉｉ）翻訳開始部（開始コドンおよびリボゾーム結合配列）の認識、（ｉｖ）ＢＬＡＳＴＰソフトウェアを用いた、推定タンパク質配列と配列バンクに含まれるタンパク質配列の類似性、の結果を組み合わせるものである。
同定されたコード配列によりコードされているタンパク質の機能は、ＢＬＡＳＴＰソフトウェアを用いてバンク内の類似性を検索した結果を分析することによって推定した（Ｓ．Ｆ． Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， ２５：３３８９−４０２， １９９７）。
【０２１５】
５．ゲノム比較
ａ）Ｌ．モノサイトゲネスＥＧＤｅ株およびＬ．インノキュア株に特異的なＣＤＳの同定
各ゲノムの推定コード配列から導き出された総てのタンパク質配列を、ＢＬＡＳＴＰソフトウェアを用いて他のゲノムによってコードされている可能性がある総てのタンパク質配列と比較した。ある単離物に特異的なタンパク質を確認するため、タンパク質の全長にわたって７５％の同一性を限界値に選択した。オルト遺伝子とパラ遺伝子の間の識別に最良であることから、この極めて高い値が選択された（Ｗ．Ｓ． Ｆｉｔｃｈ， Ｓｙｓｔ． Ｚｏｏｌ， １９：９９−１１３， １９７０）。配列の保存性が高い（＞７０％）タンパク質配列については、遺伝子のヌクレオチド配列の保存自体も高く、比較的ストリンジェントでないハイブリダイゼーション条件下でもシグナルが得られると考えられる。試験結果を分析する際にはこのことを考慮する必要がある。
【０２１６】
ｂ）Ｌ．モノサイトゲネスＥＧＤｅ株およびＬ．インノキュア株に比べてＬ．モノサイトゲネス血清型４ｂ株に特異的なＣＤＳの同定
Ｌ．モノサイトゲネスＥＧＤｅおよびＬ．インノキュア株には存在しないＬ．モノサイトゲネス血清型４ｂ株の染色体領域をＣｒｏｓｓｍａｔｃｈ／Ｐｈｒａｐパッケージ（Ｐｈｉｌ Ｇｒｅｅｎ， Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ， Ｓｅａｔｔｌｅ， 未発表）を用いて同定した。このソフトウェアにより、一以上の参照配列に類似する全配列または部分配列をマスキングすること（Ｃｒｏｓｓｍａｔｃｈ）により、ヌクレオチド配列のアセンブリ（Ｐｈｒａｐ）が可能となる。用いた参照配列は、Ｌ．モノサイトゲネスＥＧＤｅのゲノムの完全配列、Ｌ．インノキュアのゲノムの完全配列およびそのプラスミドの配列である。マスクする領域のクロスマッチによる同定は、デフォルトパラメータを用い、分析する配列と参照配列の間で同じ１１文字からなるワード、およびこれらのワードの延長を検索することを基にしている。Ｃｒｏｓｓｍａｔｃｈ ａｎｄ Ｐｈｒａｐソフトウェアに関してさらに詳しい情報はウェブサイト：
ｈｔｔｐ：／／ｂｏｚｅｍａｎ．ｍｂｔ．ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ．ｅｄｕ／．
で得られる。
【０２１７】
６．注釈付けの例
６．１．Ｌ．モノサイトゲネス特異的遺伝子  Ｌ．モノサイトゲネスの遺伝子のヌクレオチド配列とＬ．インノキュアのゲノムの間に有意な類似性は認められない。
【０２１８】
【表１】
2004515227.tif 000002
【０２１９】
６．２．Ｌ．インノキュア特異的遺伝子  Ｌ．インノキュアの遺伝子のヌクレオチド配列とＬ．モノサイトゲネスのゲノムの間に有意な類似性は認められない。
【０２２０】
【表２】
2004515227.tif 000003
【０２２１】
６．３．推定タンパク質配列の類似性（同一性）が７５％より小さい２株に共通の遺伝子およびヌクレオチドレベルでの類似性の値
【０２２２】
【表３】
2004515227.tif 000004
【０２２３】
６．４．Ｌ．モノサイトゲネスおよびＬ．インノキュアに共通の遺伝子
【表４】
2004515227.tif 000005
【０２２４】
表５：凡例
配列番号１〜１１：リステリア・インノキュアのアセンブリから得られた１０のコンティグと一つのプラスミドのヌクレオチド配列
配列番号１２〜６８９：Ｌ．インノキュアに特異的な（Ｌ．モノサイトゲネスＥＧＤには存在しない）タンパク質のヌクレオチド配列
配列番号６９０〜１０６７：Ｌ．モノサイトゲネスＥＧＤに特異的な（Ｌ．インノキュアには存在しない）タンパク質のヌクレオチド配列
配列番号１０６８〜２０４１：リステリア・モノサイトゲネス４ｂのアセンブリから得られた９７４のコンティグのヌクレオチド配列（１２３１５３７塩基）
配列番号２０４２〜２０５６：注釈例としてのさらなる配列
【０２２５】
【表５】
2004515227.tif 000006
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【０２２６】
表６：凡例
配列番号２０５９〜２６０１：リステリア・インノキュアＣｌｉｐ１１２６２に特異的な５４３の遺伝子のヌクレオチド配列。最初の欄は配列番号、二つめの欄は遺伝子名、三つめの欄はＩＰＦ番号（＜パスツール研究所＞識別番号略号、これにより配列を表５の配列と対応させることができる）、最後の欄は対応する注釈を示す。
表６
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【０２２７】
表７：凡例
配列番号２６０２〜２８７１：リステリア・モノサイトゲネスＥＧＤｅに特異的な２７０個の遺伝子のヌクレオチド配列。最初の欄は配列番号、二つめの欄は遺伝子名、三つめの欄はＩＰＦ番号（＜パスツール研究所＞識別番号、これにより配列を表５の配列と対応させることができる）、最後の欄は対応する注釈を示す。
表７
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【０２２８】
表８：凡例
配列番号２８７２〜３８９１：リステリア・モノサイトゲネス４ｂの１３９１９個の配列のアセンブリから得られた１０２０個のコンティグの配列。
これらの配列では、未同定の塩基は「Ｎ」で表される。これらコンティグのいくつかは上記Ｌｍ４ｂ配列番号１０６８〜２０４１の９７４個のコンティグを含む。最初の欄は配列番号、二つめの欄はコンティグ番号および対応する表５の配列番号１０６８〜２０４１の配列の番号を示す。
表８
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【０２２９】
表９：凡例
配列番号３８９２〜４０２５：Ｌ．モノサイトゲネスＥＧＤｅおよびＬ．インノキュアＣｌｉｐ１１２６２の配列を除いた後のリステリア・モノサイトゲネス４ｂの１３９１９個の配列のアセンブリから得られた１３４個のコンティグの配列。
表９
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