(57)【要約】本発明はポリエチレングリコールで修飾したアルギニン デイミナーゼ、癌の処置法および転移の処置および／または抑制法を対象とする。
2004515232.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
連結基を介してポリエチレングリコールに共有結合されたアルギニンデイミナーゼを含んで成る化合物であって、ポリエチレングリコールが約１，０００〜約４０，０００の全重量平均分子量を有し、そして連結基がクスシンイミド基、アミド基、イミド基、カルバメート基、エステル基、エポキシ基、カルボキシル基、ヒドロキシル基、炭水化物、チロシン基、システイン基、ヒスチジン基およびそれらの組み合わせから成る群から選択される、上記化合物。
【請求項２】
連結基がスクシンイミド基である、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
上記スクシンイミド基がスクシンイミジル スクシネート、スクシンイミジル プロピオネート、スクシンイミジル カルボキシメチレート、スクシンイミジル スクシンアミド、Ｎ−ヒドロキシ スクシンイミドまたはそれらの組み合わせである、請求項２に記載の化合物。
【請求項４】
上記スクシンイミド基がスクシンイミジル スクシネート、スクシンイミジル プロピオネートまたはそれらの組み合わせである、請求項３に記載の化合物。
【請求項５】
上記アルギニン デイミナーゼがマイコプラズマ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）属の微生物に由来する、請求項１に記載の化合物。
【請求項６】
上記微生物がマイコプラズマ アルギニニ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ａｒｇｉｎｉｎｉ）、マイコプラズマ ホミヌス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｏｍｉｎｕｓ）、マイコプラズマ アーテリチデス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ａｒｔｈｒｉｔｉｄｅｓ）およびそれらの組み合わせから成る群から選択される、請求項５に記載の化合物。
【請求項７】
上記アルギニン デイミナーゼがステプトコッカス（Ｓｔｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属の微生物に由来する、請求項１に記載の化合物。
【請求項８】
上記微生物がステプトコッカス ピオゲネス（Ｓｔｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、ステプトコッカス ニューモニア（Ｓｔｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）およびそれらの組み合わせから成る群から選択される、請求項７に記載の化合物。
【請求項９】
上記アルギニン デイミナーゼがボレリア（Ｂｏｒｒｅｌｉａ）属の微生物に由来する、請求項１に記載の化合物。
【請求項１０】
上記微生物が ボレリア ブルグドルフェリ（Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）、ボレリア アフゼリー（Ｂｏｒｒｅｌｉａ ａｆｚｅｌｌｉｉ）およびそれらの組み合わせから成る群から選択される、請求項９に記載の化合物。
【請求項１１】
上記アルギニン デイミナーゼがキアルジア（Ｑｉａｒｄｉａ）属の微生物に由来する、請求項１に記載の化合物。
【請求項１２】
上記微生物がキアルジア インテスチナリス（Ｑｉａｒｄｉａ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ）である、請求項１１に記載の化合物。
【請求項１３】
上記アルギニン デイミナーゼがクロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）属の微生物に由来する、請求項１に記載の化合物。
【請求項１４】
上記微生物がクロストリジウム パーフリンゲンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）である、請求項１３に記載の化合物。
【請求項１５】
上記アルギニン デイミナーゼがエンテロコッカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）属の微生物に由来する、請求項１に記載の化合物。
【請求項１６】
上記微生物がエンテロコッカス フェカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）である、請求項１５に記載の化合物。
【請求項１７】
上記アルギニン デイミナーゼがラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属の微生物である請求項１に記載の化合物。
【請求項１８】
上記微生物がラクトバチルス サケ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｋｅ）である、請求項１７に記載の化合物。
【請求項１９】
上記アルギニン デイミナーゼがバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属の微生物に由来する、請求項１に記載の化合物。
【請求項２０】
微生物がバチルス リケニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）である、請求項１９に記載の化合物。
【請求項２１】
上記微生物がマイコプラズマ ニューモニア（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、マイコプラズマ ホミヌス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｏｍｉｎｕｓ）、マイコプラズマ アルギニニ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ａｒｇｉｎｉｎｉ）、ステプトコッカス ピオゲネス（Ｓｔｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、ステプトコッカス ニューモニア（Ｓｔｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、ボレリア ブルグドルフェリ（Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）、ボレリア アフゼリー（Ｂｏｒｒｅｌｉａ ａｆｚｅｌｌｉｉ）、キアルジア インテスチナリス（Ｑｉａｒｄｉａ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ）、クロストリジウム パーフリンゲンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）、バチルス リケニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、エンテロコッカス フェカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）、ラクトバチルス サケ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｋｅ）およびこれらの組み合わせから成る群から選択される、請求項１に記載の化合物。
【請求項２２】
上記アルギニン デイミナーゼが約７〜約１５個のポリエチレングリコール分子に共有結合されている、請求項１に記載の化合物。
【請求項２３】
上記アルギニン デイミナーゼが約９〜約１２個のポリエチレングリコール分子に共有結合されている、請求項２２に記載の化合物。
【請求項２４】
ポリエチレングリコールが、約１０，０００〜約３０，０００の全重量平均分子量を有する、請求項１に記載の化合物。
【請求項２５】
アルギニン デイミナーゼの循環半減期を増大させる方法であって、該アルギニン デイミナーゼを連結基を介してポリエチレングリコールに共有結合することにより該アルギニン デイミナーゼを修飾することを含んで成り、ポリエチレングリコールが約１，０００〜約４０，０００の全重量平均分子量を有し、そして連結基がクスシンイミド基、アミド基、イミド基、カルバメート基、エステル基、エポキシ基、カルボキシル基、ヒドロキシル基、炭水化物、チロシン基、システイン基、ヒスチジン基およびそれらの組み合わせから成る群から選択される、上記方法。
【請求項２６】
アルギニン デイミナーゼの殺腫瘍活性を増大させる方法であって、該アルギニン デイミナーゼを連結基を介してポリエチレングリコールに共有結合することにより該アルギニン デイミナーゼを修飾することを含んで成り、ポリエチレングリコールが約１，０００〜約４０，０００の全重量平均分子量を有し、そして連結基がクスシンイミド基、アミド基、イミド基、カルバメート基、エステル基、エポキシ基、カルボキシル基、ヒドロキシル基、炭水化物、チロシン基、システイン基、ヒスチジン基およびそれらの組み合わせから成る群から選択される、上記方法。
【請求項２７】
請求項１に記載の化合物を患者に投与することを含んで成る、患者の腫瘍を処置する方法。
【請求項２８】
上記腫瘍が黒色腫である、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
上記ポリエチレングリコールが約２０，０００の全重量平均分子量を有する、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
上記連結基がスクシンイミド基である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
上記スクシンイミド基が、スクシンイミジル スクシネート、スクシンイミジル プロピオネート、スクシンイミジル カルボキシメチレート、スクシンイミジル スクシンアミド、Ｎ−ヒドロキシ スクシンイミドまたはそれらの組み合わせである、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
上記腫瘍が肝癌である、請求項２７に記載の方法。
【請求項３３】
上記ポリエチレングリコールが約５，０００の全重量平均分子量を有する、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
上記連結基がスクシンイミド基である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３５】
上記スクシンイミド基が、スクシンイミジル スクシネート、スクシンイミジル プロピオネート、スクシンイミジル カルボキシメチレート、スクシンイミジル スクシンアミド、Ｎ−ヒドロキシ スクシンイミドまたはそれらの組み合わせである、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
上記腫瘍が肉腫である、請求項２７に記載の方法。
【請求項３７】
請求項１に記載の化合物を患者に投与することを含んで成る、患者における転移を処置し、そして抑制する方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（技術分野）
関連出願
本出願は、１９９７年５月１２日に出願された米国特許仮出願第６０／０４６，２００号の優先権を主張する、承認された米国特許出願第０９／０２３，８０９号の一部継続出願である。
【０００２】
発明の分野
本発明は、ポリエチレングリコールで修飾したアルギニン デイミナーゼ、癌の処置法、および転移を処置し、かつ／または抑制する方法を対象とする。
【０００３】
発明の背景
悪性黒色腫（３期）および肝癌は、診断から１年以内にほとんどの患者が死亡する致命的な疾患である。米国では年間、約１６，０００人がこれらの疾患で死亡している。黒色腫の発症は米国で急激に増加しており、そしてオーストラリのような他の国ではより一層高い。肝癌の発症は肝炎が風土病である世界の地域ではより高い。例えば日本および台湾では肝癌は主要なガンの形態の１つである。これらの疾患に対する効果的な処置が早急に必要である。
【０００４】
必須アミノ酸の選択的欠乏は、数種の形態のガンを処置するために使用されてきた。最もよく知られている例は、急性のリンパ芽球性白血病の処理としてアスパラギンのレベルを下げるためのＬ−アスパラギナーゼの使用である。最もよく使用されるＬ−アスパラギナーゼは大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）から単離される。しかしこの酵素の臨床的使用は、Ｙ．Ｋ．Ｐａｒｋ，ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，１：３７３−３７６（１９８１）に記載されているようにその固有の抗原性および短い循環半減期（ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ ｈａｌｆ ｌｉｆｅ）により抑えられている。ポリエチレングリコールを用いた大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のＬ−アスパラギナーゼの共有的修飾は、例えばＰａｒｋ，Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，ｓｕｐｒａ；Ｙ．Ｋａｍｉｓａｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．，２１６：４１０−４１４（１９８１）；およびＹ．Ｋａｍｉｓａｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｇａｎｎ．，７３：４７−４７４（１９８２）に記載されているように、その抗原性を下げ、そしてその循環半減期を延ばす。癌の処置のために他の必須アミノ酸分解酵素を同定する多大な努力がなされて来たが、根本的に当然、必須アミノ酸の欠乏は多くの、しかも重篤な副作用を主にもたらすことから、いずれも認められなかった。
【０００５】
アルギニンのような非必須アミノ酸を分解する酵素は、数種の形態の癌を制御する効果的手段となり得ることが報告された。例えばシュードモナス プジタ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｄｉｔａ）から単離されたアルギニン デイミナーゼ（ＡＤＩ）がＪ．Ｂ．Ｊｏｎｅｓにより、「マウスの白血病のリンパ芽球に及ぼすアルギニン デイミナーゼの効果（Ｔｈｅ Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ Ａｒｇｉｎｉｎｅ Ｄｅｉｍｉｎａｓｅ ｏｎ Ｍｕｒｉｎｅ Ｌｅｕｋｅｍｉｃ Ｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｓ）」、Ｐｈ．Ｄ．Ｄｉｓｓｅｒｔａｔｉｏｎ、オクラホマ大学、第１〜１６５頁（１９８１）に記載された。インビトロで腫瘍細胞を殺すには効果的であるが、ピー．プジタ（Ｐ．ｐｕｄｉｔａ）から単離されたＡＤＩは中性ｐＨでの酵素活性がほとんど無く、しかも実験動物の循環から急速に排除されるので、インビボで効力を発揮することはできなった。マイコプラズマ アルギニニ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ａｒｇｉｎｉｎｉ）に由来するアルギニン デイミナーゼは、例えばＴａｋａｋｕ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，５１：２４４−２４９（１９９２）および米国特許第５，４７４，９２８号明細書に記載され、その開示は全部、引用により本明細書に編入する。しかしそのようなヘテロロガスなタンパク質の治療的使用に付随する問題は、その抗原性である。マイコプラズマ アルギニニ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ａｒｇｉｎｉｎｉ）に由来するアルギニンデイミナーゼのシアヌル酸クロライド連結基を介したポリエチレングリコールでの化学的修飾は、Ｔａｋａｋｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊｐｎ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．８４：１１９５−１２００（１９９３）に記載された。しかし修飾されたタンパク質は、シアヌル酸クロライド連結基からシアン化物を放出するので代謝された時に毒性であった。
【０００６】
非必須アミノ酸を分解し、そして従来技術に付随する問題を持たない組成物が必要である。本発明はこれらの、ならびに他の重要な目的を対象とする。
【０００７】
発明の要約
本発明は、ポリエチレングリコールで修飾されたアルギニンデイミナーゼを対象とする。好適な態様ではアルギニン デイミナーゼは、約１，０００〜約５０，０００の全重量平均分子量を有するポリエチレングリコールで直接、または生物適合性連結基を介して修飾される。
【０００８】
本発明の別の観点は、例えば肉腫、肝癌および黒色腫を含む癌を処置する方法を対象とする。また本発明は腫瘍細胞の転移を処置し、かつ／または抑制する方法を対象とする。
【０００９】
本発明のこれらのおよび他の観点は、本発明の以下の詳細な説明から明確になるだろう。
【００１０】
本発明の詳細な説明
正常細胞はアルギニノコハク酸シンターゼおよびアルギニノコハク酸リアーゼにより触媒される２段階工程でシトルリンからアルギニンを合成することができるので、成長にアルギニンを必要としない。対称的に黒色腫、肝癌および数種の肉腫はアルギニノコハク酸シンターゼを発現せず；したがってそれらはアルギニンについて栄養要求性である。この代謝的な差異はこれらの形態の癌を処置するために安全かつ効果的な治療の開発に利用できる。アルギニン デイミナーゼはアルギニンのシトルリンへの転換を触媒し、そしてアルギニンを排除するために使用できる。すなわちアルギニン デイミナーゼは黒色腫、肝癌および数種の肉腫の処置に利用することができる。
【００１１】
天然のアルギニン デイミナーゼは微生物中に見いだされ、そして抗原性であり、しかも患者の循環から急速に排除される。これらの問題はアルギニン デイミナーゼをポリエチレングリコール（ＰＥＧ）で共有的に修飾することにより克服することができる。ポリエチレングリコール（連結基を含む、または含まない）で共有的に修飾したアルギニン デイミナーゼを今後、「ＡＤＩ−ＰＥＧ」と称する。天然のアルギニン デイミナーゼと比較した時、その酵素活性を最も保持するＡＤＩ−ＰＥＧは抗原性がはるかに低く、循環半減期が大きく延び、そして腫瘍の処置により一層効力的である。
【００１２】
「ポリエチレングリコール」または「ＰＥＧ」は、分枝または直鎖の一般式Ｈ（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎＯＨ（式中、ｎは少なくとも４である）で表される、エチレンオキシドと水の縮合ポリマーの混合物を称する。「ポリエチレングリコール」または「ＰＥＧ」は、およその重量平均分子量を表すために接尾数字と組み合わせて使用される。例えばＰＥＧ５，０００は約５，０００の全重量平均分子量を有するポリエチレングリコールを称し；ＰＥＧ１２，０００は約１２，０００の全重量平均分子量を有するポリエチレングリコールを称し；そしてＰＥＧ２０，０００は約２０，０００の全重量平均分子量を有するポリエチレングリコールを称する。
【００１３】
「黒色腫」という用語は、口腔、食道、肛門管、膣、軟髄膜、および／または結膜または目を含む皮膚および他の器官のメラノサイト系から生じる悪性または良性の腫瘍であり得る。用語「黒色腫」には、例えば末端部黒子黒色腫、メラニン欠乏性黒色腫、良性若年性黒色腫、悪性黒子黒色腫、悪性黒色腫、結節性黒色腫、爪下黒色腫および表在拡大型黒色腫を含む。
【００１４】
「肝癌」は、肝臓の悪性または良性の腫瘍であり、例えば肝細胞癌を含む。
【００１５】
「患者」は動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトを称する。
【００１６】
「生物適合性」とは、一般に生物機能に対して有害ではなく、しかもアレルギーおよび疾患状態を含む許容できない程度の毒性をもたらさない材料または化合物を称する。
【００１７】
本開示を通して、以下の略号を使用する：ＰＥＧ、ポリエチレングリコール；ＡＤＩ、アルギニン デイミナーゼ；ＳＳ、スクシンイミジル スクシネート；ＳＳＡ、スクシンイミジル スクシンアミド；ＳＰＡ、スクシンイミジル プロピオネート；およびＮＨＳ、Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミド。
【００１８】
本発明は、ポリエチレングリコールで修飾したＡＤＩがある種の癌の処置および癌の転移の抑制に優れた結果を提供するという予期せぬ知見に基づく。ＡＤＩは連結基を用いて、または用いずにポリエチレングリコールに共有的に結合することができるが、好適な態様では連結基を利用する。
【００１９】
本発明では、アルギニン デイミナーゼ遺伝子は例えば微生物、組換え生物工学またはれらの組み合わせを含む任意の供給源から派生し、クローン化され、または生産され得る。例えばアルギニン デイミナーゼはマイコプラズマ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）属、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）属、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、ボレリア（Ｂｏｒｒｅｌｉａ）属、エンテロコッカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）属、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属、キアルジア（Ｑｉａｒｄｉａ）属の微生物からクローン化することができる。アルギニン デイミナーゼはマイコプラズマ ニューモニア（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、マイコプラズマ ホミヌス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｏｍｉｎｕｓ）、マイコプラズマ アルギニニ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ａｒｇｉｎｉｎｉ）、ステプトコッカス ピオゲネス（Ｓｔｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、ステプトコッカス ニューモニア（Ｓｔｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、ボレリア ブルグドルフェリ（Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）、ボレリア アフゼリー（Ｂｏｒｒｅｌｉａ ａｆｚｅｌｌｉｉ）、キアルジア インテスチナリス（Ｑｉａｒｄｉａ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ）、クロストリジウム パーフリンゲンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）、バチルス リケニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、エンテロコッカス フェカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）、ラクトバチルス サケ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｋｅ）、またはこれらの任意の組み合わせからクローン化されることが好ましい。特に本発明で使用するアルギニン デイミナーゼは、図１および１０〜１３に表す１以上のアミノ酸配列を有することができる。
【００２０】
本発明の特定の態様では、アルギニン デイミナーゼがマイコプラズマ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）属の微生物からクローン化されることが好ましい。より好ましくはアルギニン デイミナーゼはマイコプラズマ アルギニニ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ａｒｇｉｎｉｎｉ）、マイコプラズマ ホミヌス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｏｍｉｎｕｓ）、マイコプラズマ アーテリチデス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ａｒｔｈｒｉｔｉｄｅｓ）またはそれらの任意の組み合わせからクローン化される。特に本発明で使用するアルギニン デイミナーゼは、図１に表す１以上のアミノ酸配列を有することができる。
【００２１】
本発明の１つの態様では、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）は約１，０００〜約５０，０００；より好ましくは約３，０００〜約４０，０００、より好ましくは約５，０００〜約３０，０００；より好ましくは約８，０００〜約３０，０００；より好ましくは約１１，０００〜約３０，０００；さらにより好ましくは約１２，０００〜約２８，０００；さらにより一層好ましくは約１６，０００〜約２４，０００；さらにより一層好ましくは約１８，０００〜約２２，０００；さらにより一層好ましくは約１９，０００〜約２１，０００、そして最も好ましくは約２０，０００の全重量平均分子量を有する。一般に３０，０００以上の分子量を有するポリエチレングリコールは溶解し難く、そして配合された生成物の収率は大きく減少する。ポリエチレングリコールは分枝または直鎖でよく、好ましくは直鎖である。一般にポリエチレングリコールの分子量が増加すると、ＡＤＩの免疫原性が下がる。この態様で記載する分子量を有するポリエチレングリコールを、ＡＤＩおよび場合によっては生物適合性の連結基と一緒に使用して、例えば黒色腫、肝癌および肉腫を含む癌、好ましくは黒色腫を処置することができる。
【００２２】
本発明の別の態様では、ポリエチレングリコールは約１，０００〜約５０，０００；より好ましくは約３，０００〜約３０，０００；より好ましくは約３，０００〜約２０，０００；より好ましくは約４，０００〜約１２，０００；さらにより一層好ましくは約４，０００〜約１０，０００；さらにより一層好ましくは約４，０００〜約８，０００；さらにより一層好ましくは約４，０００〜約６，０００の全重量平均分子量を有し；約５，０００が最も好ましい。ポリエチレングリコールは分枝または直鎖でよく、好ましくは直鎖である。この態様で記載する分子量を有するポリエチレングリコールを、ＡＤＩおよび場合によっては生物適合性の連結基と一緒に使用して、例えば黒色腫、肝癌および肉腫を含む癌、好ましくは肝癌を処置することができる。
【００２３】
ＡＤＩをＰＥＧに共有的に結合するために使用する連結基は、任意の生物適合性の連結基でよい。上記のように、「生物適合性」とは化合物または基が非毒性であり、そして損傷、病気、疾患または死を引き起こす事なくインビトロまたはインビボで利用することができることを示す。ＰＥＧは例えばエーテル結合、エステル結合、チオール結合またはアミド結合を介して連結基に結合することができる。適当な生物適合性の連結基には、例えばエステル基、アミド基、イミド基、カルバメート基、カルボキシル基、ヒドロキシル基、炭水化物、クスシンイミド基（例えばクシンイミジル スクシネート（ＳＳ）、スクシンイミジル プロピオネート（ＳＰＡ）、スクシンイミジル カルボキシメチレート（ＳＣＭ）、スクシンイミジル スクシンアミド（ＳＳＡ）またはＮ−ヒドロキシ スクシンイミド（ＮＨＳ）を含む）、エポキシド基、オキシカルボニルイミダゾール基（例えばカルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）を含む）、ニトロフェニル基（例えばニトロフェニルカルボネート（ＮＰＣ）またはトリクロロフェニル カルボネート（ＴＰＣ）を含む）、トリシラート基、アルデヒド基、イソシアネート基、ビニルスルホン基、チロシン基、システイン基、ヒスチジン基または１級アミンを含む。好ましくは生物適合性の連結基はエステル基および／またはスクシンイミド基である。より好ましくは連結基はＳＳ、ＳＰＡ、ＳＣＭ、ＳＳＡまたはＮＨＳであり；ＳＳ、ＳＰＡまたはＮＨＳがより好ましく、そしてＳＳまたはＳＰＡが最も好適である。
【００２４】
あるいはＡＤＩはＰＥＧに、アミノ基、スルフィドリル基、ヒドロキシル基またはカルボキシル基を介して直接（すなわち連結基なしで）カップリングすることもできる。
【００２５】
ＡＤＩはＰＥＧに、例えばＰａｒｋ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，１：３７３−３７６（１９８１）；およびＺａｐｌｉｐｓｋｙ ａｎｄ Ｌｅｅ、ポリエチレングリコール化学：生物工学的および生物医学的応用（Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ Ｇｌｙｃｏｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）、Ｊ．Ｍ．Ｈａｒｒｉｓ、編集、プレナム（Ｐｌｅｎｕｍ）出版、ニューヨーク、第２１章（１９９２）（これらの開示は引用により全部、本明細書に編入する）に記載されているように当該技術分野で既知の方法を使用して生物適合性の連結基を介して共有的に結合することができる。
【００２６】
ＰＥＧのＡＤＩへの結合は、ＡＤＩの循環半減期を上げる。一般にＰＥＧをＡＤＩの１級アミンに結合する。アルギニン デイミナーゼに対するポリエチレングリコールの結合部位の選択は、当業者には既知であるようにタンパク質の活性ドメイン内の各部位の役割により決定される。ＰＥＧは酵素活性を実質的に失うことなくアルギニン デイミナーゼの１級アミンに結合することができる。例えばマイコプラズマ アルギニニ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ａｒｇｉｎｉｎｉ）、マイコプラズマ アーテリチデス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ａｒｔｈｒｉｔｉｄｅｓ）およびマイコプラズマ ホミヌス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｏｍｉｎｕｓ）からクローン化されたＡＤＩは、この手法により修飾され得る約１７個のリシンを有する。換言すると、１７個のリシンはすべてＡＤＩがＳＳ、ＳＰＡ、ＳＣＭ、ＳＳＡおよび／またはＮＨＳのような生物適合性連結基を介してＰＥＧに結合することが可能な点である。本発明の開示の観点において当業者には明らかであるように、ＰＥＧはＡＤＩ上の他の部位にも結合することもできる。
【００２７】
１から３０個のＰＥＧ分子をＡＤＩに共有的に結合することができる。好ましくはＡＤＩは約７〜約１５個のＰＥＧ分子、より好ましくは約９〜約１２個のＰＥＧ分子を用いて修飾される。換言すると、アルギニン デイミナーゼ中の約３０％〜約７０％の１級アミノ基、好ましくはアルギニン デイミナーゼ中の約４０％〜約６０％、より好ましくは約４５％〜約５５％、そして最も好ましくは約５０％の１級アミノ基がＰＥＧで修飾される。ＰＥＧがＡＤＩの末端に共有的に結合される時、好ましくは１つのＰＥＧ分子のみが利用される。ＡＤＩ上のＰＥＧ単位の数が上昇すると、酵素の循環半減期が上昇する。しかしＡＤＩ上のＰＥＧ単位の数が上昇すると、酵素の比活性は下がる。すなわち本発明の開示の観点において当業者には明らかであるように、この２つの間にはバランスが達成される必要がある。
【００２８】
本発明では、最も好適な生物適合性連結基に共通する特徴は、それらがマレイミド基を介してアルギニン デイミナーゼの１級アミンに結合することである。いったんアルギニン デイミナーゼをカップリングしたら、ＳＳ−ＰＥＧはＰＥＧの隣にエステル連結基を有し、これによりの部位を血清エステラーゼに対して感受性とすることができ、これにより体内でＡＤＩからＰＥＧを放出することができる。ＳＰＡ−ＰＥＧおよびＰＥＧ２−ＮＨＳはエステル連結を持たないので、それらは血清エステラーゼに対して感受性ではない。
【００２９】
本発明では、特定の連結基はＰＥＧ−ＡＤＩの循環半減期およびその特異的な酵素活 性に影響を及ぼさないようである。しかし本発明では生物適合性連結基を使用することが重要である。タンパク質に結合したＰＥＧは、ＳＳ−ＰＥＧ、ＳＰＡ−ＰＥＧおよびＳＣ−ＰＥＧのような単鎖、あるいはＰＥＧ２−ＮＨＳのようにＰＥＧの分枝鎖を使用してもよい。本発明における好適な連結基の構造式を以下に説明する。
【００３０】
【化１】
2004515232.tif 000003
【００３１】
本発明の１つの化合物の治療に効果的な量は、腫瘍の成長を抑制するために効果的な量である。一般に処置は少ない投薬用量から開始し、これをその状況下で最適な効果が達成されるまで小さい増分で増すことができる。一般に本発明の化合物の治療的投薬用量は、１週間に２回からおよそ２週間に１回の約１〜約２００ｍｇ／ｋｇであり得る。例えば投薬用量は２ｍｌの静脈内注射として１週間１回の約１ｍｇ／ｋｇから３日に１回の約２０ｍｇ／ｋｇでよい。ＡＤＩ−ＳＳ−ＰＥＧ５，０００の最適な投薬用量はおよそ１週間に２回であるが、ＡＤＩ−ＳＳ−ＰＥＧ２０，０００での最適な投薬用量はおよそ１週間に１回からおよそ２週間に１回であり得る。ＰＥＧ−ＡＤＩはリン酸緩衝化生理食塩水または当業者に既知の他の適当な溶液と注射前に混合することができる。ＰＥＧ−ＡＤＩ配合物は所望により、固体（凍結乾燥物）として、または液体製剤として投与することができる。
【００３２】
本発明の方法は、インビトロまたはインビボの応用を含むことができる。細胞培養の応用を含むインビトロの応用の場合、本明細書に記載する化合物は培養中の細胞に加え、そしてインキューベーションすることができる。本発明の化合物は当該技術分野で周知の抗体生産技術を使用して、モノクローナルおよび／またはポリクローナル抗体の生産を容易にするためにも使用することができる。次いでモノクローナルおよび／またはポリクローナル抗体は、当業者には明らかな広い種々の診断的応用に使用することができる。
【００３３】
本発明の化合物を投与するためのインビボ手段は、目的とする応用に依存して変動するだろう。当業者は本発明のＰＥＧ−ＡＤＩ組成物の投与が例えば経口で、鼻内に、腹腔内に、非経口的に、静脈内に、リンパ内に、腫瘍内に、筋肉内に、間隙に、動脈内に、皮下に、眼内に、滑液包内、経上皮および経皮的に行うことができると認識するだろう。
【００３４】
【実施例】
本発明を以下の実施例でさらに示し、これは具体的説明を目的とし、そして本発明の範囲を限定することは意図しない。
【００３５】
実施例
実施例１：組換えＡＤＩの生産
マイコプラズマ アルギニニ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ａｒｇｉｎｉｎｉ）（ＡＴＣＣ２３２４３）、マイコプラズマ ホミヌス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｏｍｉｎｕｓ）（ＡＴＣＣ２３１１４）およびマイコプラズマ アーテリチデス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ａｒｔｈｒｉｔｉｄｅｓ）（ＡＴＣＣ２３１９２）のカルチャーは、メリーランド州、ロックビルのアメリカン タイプ カルチャー コレクションから得た。
【００３６】
アルギニン デイミナーゼをマイコプラズマ アルギニニ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ａｒｇｉｎｉｎｉ）、マイコプラズマ ホミヌス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｏｍｉｎｕｓ）およびマイコプラズマ アーテリチデス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ａｒｔｈｒｉｔｉｄｅｓ）からクローン化し、そしてＳ．Ｍｉｓａｗａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３６：１４５−１５５（１９９４）（この開示は引用により全部、本明細書に編入する）によりすでに記載されているように大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中で発現させた。上記の各種に由来するアルギニン デイミナーゼのアミノ酸配列を図１に示す。ＡＤＩＰＲＯＴと確認される上段のアミノ酸配列は、マイコプラズマ アルギニニ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ａｒｇｉｎｉｎｉ）に由来し；ＡＲＴＡＤＩＰＲＯと確認される中段のアミノ酸配列はマイコプラズマ アーテリチデス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ａｒｔｈｒｉｔｉｄｅｓ）に由来し；そしてＨＯＭＡＤＩＰＲＯと確認される下段のアミノ酸配列はマイコプラズマ ホミヌス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｏｍｉｎｕｓ）に由来する。各アミノ酸配列は９６％以上保存されている。特異的酵素活性、Ｋｍ、Ｖｍａｘおよび至適ｐＨに関する各タンパク質の当業者に既知の方法による特性決定により、それらが生化学的に互いに識別できないことが判明した。至適ｐＨはクエン酸バッファー（ｐＨ５〜６．５）、リン酸バッファー（ｐＨ６．５〜７．５）およびホウ酸バッファー（ｐＨ７．８〜８．５）を使用して決定した。ＫｍおよびＶｍａｘは酵素を種々の濃度のアルギニンとインキューベーションし、そしてシトルリンの生成を定量することにより決定した。種々の酵素に関するＫｍは約０．０２〜０．０６μＭであり、そしてＶｍａｘは約１５〜２０μｍｏｌ／分／ｍｇであり、この値は互いに標準誤差内であった。
【００３７】
アルギニン デイミナーゼ遺伝子は、例えばＴ．Ｏｈｎｏ ｅｔ ａｌ，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．５８：３７８８−３７９５（１９９０）（この開示は引用により全部、本明細書に編入する）により記載されているように、エム．アルギニニ（Ｍ．ａｒｇｉｎｉｎｉ）の公開された配列に由来する以下のプライマー対を使用してポリメラーゼ連鎖反応により増幅した：
配列番号：４，５′−ＧＧＧＡＴＣＣＡＴＧＴＣＴＧＴＡＴＴＴＧＡＣＡＧＴ−３′
配列番号：５，５′−ＴＧＡＡＡＧＣＴＴＴＴＡＣＴＡＣＣＡＣＴＴＡＡＣＡＴＣＴＴＴＡＣＧ−３′
ポリメラーゼ連鎖反応の産物はＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントとして発現プラスミドｐＱＥ１６にクローン化した。ＤＮＡ配列分析はＰＣＲによるエム．アルギニニ（Ｍ．ａｒｇｉｎｉｎｉ）に由来するフラグメントがＴ．Ｏｈｎｏ ｅｔ ａｌ，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．ｓｕｐｒａにより記載されたアルギニン デイミナーゼ遺伝子と同じ配列を有することを示した。マイコプラズマ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）のトリプトファンをコードするＡＤＩ遺伝子中の５個のＴＧＡコドンは、例えばＪ．Ｒ．Ｓａｙｅｒｓ ｅｔ ａｌ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１３：５９２−５９６（１９９２）により教示されるように大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中での遺伝子発現前に、オリゴヌクレオチド−特異的突然変異誘発法によりＴＧＧコドンに変えられた。組換えＡＤＩは全細胞タンパク質の１０％レベルで封入体中に発現した。
【００３８】
上記３種の各マイコプラズマ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）に由来するタンパク質は約９５％の相同性を有し、そしてカラムクロマトグラフィーにより容易に精製される。約２００ｍｇの純粋なタンパク質が１リットルの発酵ブロスから単離できる。組換えＡＤＩは３７℃で約２週間、そして４℃で保存する時、少なくとも８カ月安定である。当業者に既知な方法により決定されるように、タンパク質はアルギニンに対して高い親和性（０．０４μＭ）、そして約７．２〜約７．４の生理学的な至適ｐＨを有する。
実施例２：組換えＡＤＩの再生および精製
Ｍｉｓａｗａ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３６：１４５−１５５（１９９４）（この開示は引用により全部、本明細書に編入する）により記載されるように、わずかな修飾を含むＡＤＩタンパク質を再生した。１００ｇの細胞ペーストを８００ｍｌの１０ｍＭ Ｋ２ＰＯ４ｐＨ７．０、１ｍＭ ＥＤＴＡ（バッファー）に再懸濁し、そして細胞をＭｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｚｅｒ（マイクロフルイデックス（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ）社、ニュートン、マサチューセッツ州）を２回通すことにより破壊した。Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を加えて４％（容量／容量）の最終濃度とした。ホモジネートを４℃で３０分間撹拌し、次いで１３，０００ｇで３０分間遠心した。ペレットを集め、そして０．５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を含む１リットルのバッファーに再懸濁した。溶液は１００ｋＤ保持等級（マイクロゴン（Ｍｉｃｒｏｇｏｎ）社、ラグナヒル、カリフォルニア州）の中空ファイバーカートリッジを使用して、５容量の変性バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ、ｐＨ８．５、１０ｍＭ ＤＴＴ）に対して透析した。グアニジン ＨＣｌを加えて６Ｍの最終濃度とし、そして溶液を４℃で１５分間撹拌した。溶液をリホールディングバッファー１、１０ｍｍ Ｋ２ＰＯ４、ｐＨ７．０で１００倍に希釈し、そして１５℃で４８時間撹拌し、粒子を１５，０００×ｇでの遠心により除去した。
【００３９】
生じた上清は、リホールディングバッファーで前平衡化したＱ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦａｓｔＦｌｏｗ（ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）社、ピスカタウェイ、ニュージャージー州）カラムで濃縮した。ＡＤＩは０．２Ｍ ＮａＣｌを含有するリホールディングバッファーを使用して溶出した。この精製手順によりＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析で推定される９５％より高い純度のＡＤＩタンパク質を得た。８ｇの純粋な再生ＡＤＩタンパク質が１ｋｇの細胞ペーストから得られ、これは１リットルの発酵あたり２００ｍｇの精製ＡＤＩに相当する。
【００４０】
ＡＤＩ活性は、Ｏｇｉｎｓｋｙ ｅｔ ａｌ，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，（１９５７）３：６３９−６４２により記載された方法をわずかに変更することにより決定した。０．１ｍ Ｎａ２ＰＯ４、ｐＨ７．０（ＢＵＮアッセイバッファー）中の１０μｌのサンプルを９６ウェルのマイクロタイタープレートに入れ、４０μｌの０．５ｍＭ アルギニン（ＢＵＮアッセイバッファー中）を加え、そしてプレートを覆い、そして３７℃で１５分間インキューベーションした。２０μｌの完全ＢＵＮ試薬（シグマダイアグノスティックス（Ｓｉｇｍａ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ））を加え、そしてプレートを１００℃で１０分間インキューベーションした。次いでプレートを２２℃に冷却し、そしてマイクロタイタープレートリーダー（モレキュラーデバイス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）社）により４９０ｎｍで分析した。１．０ＩＵは１分間に１マイクロモルのＬ−アルギニンをＬ−シトルリンに転換する酵素の量である。タンパク質濃度はピアス（Ｐｉｒｅｃｅ）のクーマシーブルータンパク質アッセイ試薬（ピアス社、ロックフォード、イリノイ州）を使用して、標準としてウシ血清アルブミンを用いて決定した。
【００４１】
精製したＡＤＩ調製物の酵素活性は、１７〜２５ＩＵ／ｍｇであった。
実施例３：ＰＥＧのＡＤＩへの結合
ＰＥＧは１００ｍＭ リン酸バッファー、ｐＨ７．４中でＡＤＩに結合した。簡単に説明すると、リン酸バッファー中のＡＤＩを１００モル過剰なＰＥＧと混合した。反応物を室温で１時間撹拌し、次いで混合物を徹底的に透析して取り込まれなかったＰＥＧを除去した。
【００４２】
第１実験はＰＥＧ−ＡＤＩ組成物で使用した連結基の効果を評価した。ＰＥＧおよびＡＤＩを４種の異なる連結基を介して共有的に結合した：ＳＳ、ＳＳＡ、ＳＰＡおよびＳＳＰＡを含むエステル基またはマレイミド基、ここでＰＥＧは５，０００、１０，０００、１２，０００、２０，０００、３０，０００および４０，０００の全重量平均分子量を有した：エポキシ基、ＰＥＧ−エポキシ、ここでＰＥＧは５，０００の全重量平均分子量を有した；および分枝ＰＥＧ基、ＰＥＧ２−ＮＨＳ、ここでＰＥＧは１０，０００、２０，０００および４０，０００の全重量平均分子量を有した。
【００４３】
生成した組成物の５．０ＩＵをマウスに注射した（各群５匹のマウス）。アルギニンの血清レベルを決定するために、マウス後眼窩叢から採血した（１００μｌ）。採取直後、等容量の５０（重量／容量）％トリクロロ酢酸を加えた。沈殿を遠心（１３，０００×ｇで３０分間）により除去し、そして上清を取り出し、そして−７０℃で凍結保存した。次いでサンプルは自動化アミノ酸分析機およびベックマン インスツルメント（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）からの試薬を使用して製造元により供給されたプロトコールを使用して分析された。この方法によるアルギニンの感度の限界は２〜６μＭであり、そして測定の再現性は約８％内であった。血清アルギニンの量は、アミノ酸分析により決定した。図３の結果から分かるように、ＰＥＧとＡＤＩを共有的に結合する連結基は、ＡＤＩがインビボで血清アルギニンを下げる能力に測定できる効果をもたなかった。換言すると、非−毒性の連結基をインビボの応用に使用しなければならないことを除いて連結基は実験の結果には重要ではない。
【００４４】
第２実験を行い、連結基およびＰＥＧの分子量がインビボの血清シトルリンレベルに及ぼす効果を評価した。マウス（各群５匹のマウス）にＡＤＩおよびＰＥＧ−ＡＤＩの種々の組成物を５．０ＩＵで与えた。シトルリンの血清レベルを決定するために、マウス後眼窩叢から採血した（１００μｌ）。採取直後、等容量の５０（重量／容量）％トリクロロ酢酸を加えた。沈殿を遠心（１３，０００×ｇで３０分間）により除去し、そして上清を取り出し、そして−７０℃で凍結保存した。次いでサンプルは自動化アミノ酸分析機およびベックマン インスツルメントからの試薬を使用して製造元により供給されたプロトコールを使用して分析した。この方法によるアルギニンの感度の限界は２〜６μＭであり、そして測定の再現性は約８％内であった。シトルリンの量を決定し、そして曲線下の面積を近似し、そしてμｍｏｌ 日で表した。
【００４５】
図４では、白丸は天然ＡＤＩにより生成されたシトルリンの量を示し、黒丸はＡＤＩ−ＳＣ−ＰＥＧであり、白色四角はＡＤＩ−ＳＳ−ＰＥＧであり、白色三角はＡＤＩ−ＳＰＡ−ＰＥＧであり、そして黒色三角は分枝鎖ＰＥＧ−ＮＨＳ−ＰＥＧ２である。図４に示す結果は、ＰＥＧの分子量がＰＥＧ−ＡＤＩ組成物の効果を決定することを示す。ＰＥＧ−ＡＤＩ組成物の効果は、生物適合性の連結基がインビボの応用に使用されなければならないことを除き、ＰＥＧのＡＤＩへの結合の方法または手段に必ずしも基づかない。
【００４６】
図４の結果はまた、ＰＥＧの最適な分子量が２０，０００であることも示す。ＰＥＧ３０，０００は薬物動態学的な意味でＰＥＧ２０，０００よりも優れているように見えるが、ＰＥＧ３０，０００は溶解性が低く、これは作業を難しくする。酵素活性の回収に基づく収率は、ＰＥＧ５，０００およびＰＥＧ１２，０００については約９０％；ＰＥＧ２０，０００については約８５％、そしてＰＥＧ３０，０００に関しては約４０％であった。したがってＰＥＧ２０，０００は、シトルリン生成により決定されるように収率と循環半減期との間の最高のかねあいである。
【００４７】
第３実験では、ＡＤＩ−ＳＳ−ＰＥＧ５，０００およびＡＤＩ−ＳＳ−ＰＥＧ２０，０００を用いた血清アルギニン消費およびシトルリンの生成の用量応答を決定した。マウス（各群５匹のマウス）に、０．０５ＩＵ、０．５ＩＵまたは５．０ＩＵのＡＤＩ−ＳＳ−ＰＥＧ５，０００またはＡＤＩ−ＳＳ−ＰＥＧ２０，０００のいずれかを単回注射で与えた。示した時期に、上記のように血清を集め、そしてアミノ酸分析を行って血清アルギニン（図５Ａおよび５Ｃ）および血清シトルリン（図５Ｂおよび５Ｄ）を定量した。両方の配合物は用量依存的な血清アルギニンの減少および血清シトルリンの増加を誘導した。しかしＡＤＩ−ＳＳ−ＰＥＧ２０，０００により誘導される効果は、ＡＤＩ−ＳＳ−ＰＥＧ５，０００により誘導される効果よりも顕著であり、しかも長期であった。
実施例４：ＡＤＩが媒介する細胞傷害性の選択性
アルギニン デイミナーゼが媒介する細胞傷害性の選択性を、多数のヒト腫瘍を使用して証明した。具体的にはヒト腫瘍をインビトロでＡＤＩ−ＳＳ−ＰＥＧ５，０００（５０ｎｇ／ｍｌ）に対する感度について試験した。カルチャーの生存能は７日後に測定した。カルチャーが「抑制された」と定義されるには、細胞の９５％以上がトリパンブルー色素を取り込まなければならない。内皮細胞、平滑筋細胞、上皮細胞および繊維芽細胞を含む正常細胞の宿主も試験し、そしていずれもＡＤＩ−ＳＳ−ＰＥＧ５，０００により抑制されなかった。アルギニン デイミナーゼは正常な、およびほとんどの腫瘍細胞に対しては測定できる毒性を持たないが、ＡＤＩ−ＳＳ−ＰＥＧ５，０００はＡＴＣＣ、ＭＳＫＣＣおよびヨーロッパで入手可能なすべてのヒト黒色腫および肝癌を大いに抑制した。
【００４８】
【表１】
2004515232.tif 000004
【００４９】
平行した実験組では、ｍＲＮＡを腫瘍から単離した。ヒトのアルギニノコハク酸シンターゼｃＤＮＡプローブを使用したノーザンブロット分析では、アルギニン デイミナーゼ処理に対する感度とアルギニノコハク酸シンターゼを発現できないこととの間に完全な一致が示された。このデータはＡＤＩ毒性がアルギニノコハク酸シンターゼを誘導できなることから生じることを示唆している。したがってこれらの細胞はシトルリンからアルギニンを合成することができず、そして成長に必要なタンパク質を合成することができない。
実施例５：循環半減期
Ｂａｌｂ Ｃマウス（各群５匹）に、図２Ａもしくは２Ｂに示すように天然のアルギニン デイミナーゼまたはポリエチレングリコールで修飾した種々のアルギニン デイミナーゼの配合物のいずれかを、５．０ＩＵ用量で単回、静脈内注射した。アルギニンおよびシトルリンの血清レベルを決定するために、マウス後眼窩叢から採血した（１００μｌ）。採取直後、等容量の５０（重量／容量）％トリクロロ酢酸を加えた。沈殿を遠心（１３，０００×ｇで３０分間）により除去し、そして上清を取り出し、そして−７０℃で凍結保存した。次いでサンプルは自動化アミノ酸分析機およびベックマン インスツルメントからの試薬を使用して製造元により供給されたプロトコールを使用して分析した。この方法によるアルギニンの感度の限界は６ｐＭであり、そして測定の再現性は約８％内であった。
【００５０】
図２Ａでの黒丸により示すように、血清アルギニンレベルの用量依存的減少、および図２Ｂの白色三角により示す血清シトルリンの上昇が、天然ＡＤＩ（黒丸）またはＡＤＩ−ＳＳ−ＰＥＧ（白色三角）の単回用量投与から検出された。しかし血清アルギニンの減少および血清シトルリンの上昇は短期であり、すぐに正常に戻った。アルギニン消費の半減期を以下の表にまとめる。
【００５１】
【表２】
2004515232.tif 000005
【００５２】
この実験は正常な細胞および組織が細胞内でシトルリンをアルギニンに転換し戻すことができるが、黒色腫および肝癌はアルギニノコハク酸シンターゼを欠くためにできないことを示す。
実施例６：ＰＥＧ修飾ＡＤＩの抗原性
天然のＡＤＩ、ＡＤＩ−ＳＳ−ＰＥＧ５，０００およびＡＤＩ−ＳＳ−ＰＥＧ２０，０００の抗原性を決定するために、例えばＰａｒｋ，Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，ｓｕｐｒａおよびＫａｍｉｓａｋｉ，Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．，ｓｕｐｒａに記載されている手順に従った。簡単に説明すると、Ｂａｌｂ Ｃマウス（各群５匹）に、約０．５ＩＵ（１００μｇのタンパク質）の天然ＡＤＩ、ＡＤＩ−ＳＳ−ＰＥＧ５，０００またはＡＤＩ−ＳＳ−ＰＥＧ２０，０００を週に１回、１２週間、静脈内注射した。動物は実験の始めおよび４、８および１２週目に後眼窩叢から採血した（０．０５ｍｌ）。血清を単離し、そして−７０℃で保存した。抗−ＡＤＩ ＩｇＧの力価はＥＬＩＳＡにより決定した。５０μｇのＡＤＩを９６ウェルのマイクロ−タイタープレートの各ウェルに加え、そして室温で４時間インキューベーションした。プレートをＰＢＳですすぎ、次いでウシ血清アルブミン（１ｍｇ／ｍｌ）でコートして非特異的なタンパク質結合部位を遮断し、そして４℃で一晩保存した。翌日、マウスの血清を希釈し、そしてウェルに加えた。１時間後、プレートをＰＢＳですすぎ、そしてペルオキシダーゼにカップリングしたウサギ抗−マウスＩｇＧをウェルに加えた。プレートを３０分間インキューベーションし、そして次いで生じたＵＶ吸収をマイクロ−タイタープレートリーダーを使用して測定した。力価はバックグラウンドの吸収（約０．５０ ＯＤ）から２倍の上昇を生じる血清の最高希釈と定めた。
【００５３】
結果を図６に示す。白丸は天然ＡＤＩを注射した動物から得たデータを示し、これは大変抗原性であった。黒丸はＡＤＩ−ＳＳ−ＰＥＧ５，０００を注射した動物から得たデータを示し、一方白色三角はＡＤＩ−ＳＳ−ＰＥＧ２０，０００を注射した動物から得たデータを示す。図６から分かるように、ＡＤＩ−ＳＳ−ＰＥＧ５，０００およびＡＤＩ−ＳＳ−ＰＥＧ２０，０００は天然ＡＤＩより抗原性が有意に低い。例えば天然ＡＤＩのわずか４回の注射で約１０６の力価が生じるが、いずれのＰＥＧ−ＡＤＩ配合物の４回の注射も測定できる抗体を生成することができなかった。しかし８回の注射後、ＡＤＩ−ＰＥＧ５，０００は約１０２の力価を有するが、ＡＤＩ−ＰＥＧ２０，０００はこの量の免疫応答を１２回の注射後まで誘導しなかった。この結果はＰＥＧをＡＤＩに結合させることは、タンパク質に対する免疫応答を鈍くすることを示す。
実施例７：ヒト黒色腫の腫瘍抑制
ヌードマウスを対象としたヒト黒色腫（ＳＫ−Ｍｅｌ２８）の成長に及ぼすＰＥＧ−ＡＤＩの効果を決定した。ヌードマウス（各群５匹）に、腫瘍が約３〜５ｍｍの直径に達するまで成長できる１０６ＳＫ−ｍｅｌ ２ヒト黒色腫細胞を注射した。マウスは未処置のまま（白丸）か、または８週間にわたり１週間に１回、５．０ＩＵのＡＤＩ−ＳＳ−ＰＥＧ５，０００（黒色三角）、ＡＤＩ−ＳＳ−ＰＥＧ１２，０００（白色三角）またはＡＤＩ−ＳＳ−ＰＥＧ２０，０００（黒丸）で処置した。腫瘍のサイズは毎週測定し、そして腫瘍の平均直径を図７に表す。
【００５４】
図８はヌードマウスにおいてインビボで成長した３種のヒト黒色腫（ＳＫ−ｍｅｌ ２、ＳＫ−ｍｅｌ ２８、Ｍ２４−ｍｅｔ）に対するＡＤＩ−ＳＳ−ＰＥＧ２０，０００の効果を表す。ヌードマウス（各群５匹）に、１０６ＳＫ−ｍｅｌ ２、ＳＫ−ｍｅｌ ２８またはＭ２４−ｍｅｔヒト黒色腫細胞を注射した。腫瘍はそれらが約３〜５ｍｍの直径に達するまで成長させた。その後、動物に５．０ＩＵのＡＤＩ−ＳＳ−ＰＥＧ２０，０００を１週間に１回注射した。結果を図８に示し、そしてＰＥＧ−ＡＤＩが腫瘍の成長を抑制し、そして最終的には腫瘍が退縮および消失し始めたことを示す。腫瘍はアルギニノコハク酸シンターゼを持たないので、それらはタンパク質を合成できないため（ＡＤＩがアルギニンを排除し、そして腫瘍はそれを作成することができない）、細胞は「飢え死にした」。
【００５５】
Ｍ２４−ｍｅｔヒト黒色腫は高度に転移性であるので、Ｍ２４−ｍｅｔヒト黒色腫細胞を注射した動物を処置から４週間後に屠殺し、そして動物の肺に転移した数を決定した。対照動物は平均３２個の転移があり、一方ＡＤＩ−ＳＳ−ＰＥＧ２０，０００で処置した動物には転移がなかった。この結果はＡＤＩ−ＳＳ−ＰＥＧ２０，０００が原発性の黒色腫の腫瘍の成長を抑制するだけでなく、転移の形成も抑制することを示すようである。
【００５６】
試験した２００匹の動物について、転移の平均数は対照群で４９±１８であるが、１匹の処置した動物に１つの転移が観察されただけであったことは注目に値する。
実施例８：ヒト肝癌の腫瘍抑制
ＰＥＧ−ＡＤＩがヒトの肝癌の成長をインビボで抑制する能力を試験した。ヌードマウス（各群５匹）に、１０６個のヒト肝癌ＳＫ−Ｈｅｐ１細胞を注射した。腫瘍を２週間成長させ、次いで動物は５．０ＩＵのＳＳ−ＰＥＧ５，０００−ＡＤＩ（黒丸）、ＳＳ−ＰＥＧ１２，０００−ＡＤＩ（黒色三角）またはＳＳ−ＰＥＧ２０，０００−ＡＤＩ（白色三角）で１週間に１回処置した。結果を図９に説明する。未処置動物（白丸）は３週間以内にすべて死亡した。対照的にＡＤＩで処置した動物は、図９から分かるようにより長い余命を有した。すべての生存マウスは６カ月後に安楽死させ、そして検死ではそれらに腫瘍が無かったことが示された。
【００５７】
驚くべきことには、ＰＥＧ５，０００−ＡＤＩがインビボでの肝癌成長の抑制に最も効果的である。これが起こる正確なメカニズムは不明である。本発明が作用するいかなる理論にも拘束されることなく、ＳＳ−ＰＥＧ５，０００−ＡＤＩを配合したタンパク質は肝臓内に封鎖されるようになると思われる。より大きな分子量のＰＥＧはそうならず、これは肝臓の内皮および空間（窓）がより大きな分子量のＰＥＧ−ＡＤＩ結合物を排除するようなサイズであるという独自性によるのかもしれない。
実施例９なヒトへの応用
ＰＥＧ５，０００−ＡＤＩおよびＰＥＧ−２０，０００−ＡＤＩを、正常なヒト血清とエクスビボでインキューベーションし、そしてアルギニン濃度に及ぼす効果をアミノ酸分析により決定し、ここで酵素は完全に活性であり、そしてマウスが関与する実験と同じ動力学ですべての検出可能なアルギニンを分解することができることが分かった。反応は３７℃で１時間、０．１ｍｌの容量で行った。さらにヒト血清中のアルギニンおよびシトルリンレベルは、マウスで見られるものと同一である。ＰＥＧ−タンパク質はマウスよりもヒトでより長く循環する。例えばアデノシン デイミナーゼ、アスパラギナーゼ、グルコセルブロシダーゼ、ウリカーゼ、ヘモグロビンおよびスーパオキシドジスムターゼに結合したＰＥＧの循環半減期は、すべてマウス中での同じ配合物よりも５〜１０倍長い。過去においてこれを意味したのは、ヒトで最もよく使用される用量がマウスで使用される用量の１／５〜１／１０であるということである。したがってＰＥＧ−ＡＤＩはマウスよりもヒトでより一層長く循環するはずである。
【００５８】
本明細書に記載する各特許、特許出願および公報は引用により全部、本明細書に編入する。
【００５９】
本明細書に記載したものに加えて本発明の種々の修飾が、前述の記載の観点において当業者には明らかであろう。そのような修飾も前記に特許請求する範囲内にあるものとする。
【図面の簡単な説明】
【図１】
マイコプラズマ アルギニニ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ａｒｇｉｎｉｎｉ）（ＡＤＩＰＲＯＴと確認される上段のアミノ酸配列、配列番号１）、マイコプラズマ アーテリチデス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ａｒｔｈｒｉｔｉｄｅｓ）（ＡＲＴＡＤＩＰＲＯと確認される中段のアミノ酸配列、配列番号２）およびマイコプラズマ ホミヌス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｏｍｉｎｕｓ）（ＨＯＭＡＤＩＰＲＯと確認される下段のアミノ酸配列、配列番号３）に由来するクローン化されたアルギニン デイミナーゼのアミノ酸配列を表す。
【図２】
図２Ａおよび２Ｂは、天然のアルギニン デイミナーゼおよびポリエチレングリコール（例えば分子量５，０００）で修飾したアルギニン デイミナーゼの単回用量が、マウスの血清アルギニンレベルおよび血清シトルリンレベルに及ぼす効果を示すグラフである。
【図３】
種々の連結基を介してＰＥＧ１０，０００をＡＤＩに共有的に結合した時に、血清アルギニンレベルに及ぼす効果を示すグラフである。
【図４】
連結基およびポリエチレングリコールの分子量が、ＰＥＧ−ＡＤＩの単回用量を注射したマウスにおけるシトルリン生成に及ぼす効果を示すグラフである。
【図５】
図５Ａおよび図５Ｂは、ＡＤＩ−ＳＳ−ＰＥＧ５，０００が血清アルギニンおよびシトルリンレベルに及ぼした用量応答を示すグラフである。図５Ｃおよび５Ｄは、ＡＤＩ−ＳＳ−ＰＥＧ２０，０００が血清アルギニンおよびシトルリンレベルに及ぼした用量応答を示すグラフである。
【図６】
天然ＡＤＩ、ＡＤＩ−ＳＳ−ＰＥＧ５，０００およびＡＤＩ−ＳＳ−ＰＥＧ２０，０００の抗原性を示すグラフである。
【図７】
ＡＤＩ−ＳＳ−ＰＥＧ５，０００、ＡＤＩ−ＳＳ−ＰＥＧ１２，０００またはＡＤＩ−ＳＳ−ＰＥＧ２０，０００を用いた処置が、ＳＫ−ｍｅｌ ２ ヒト黒色腫細胞を注射したマウスの腫瘍サイズに及ぼした効果を示すグラフである。
【図８】
ＡＤＩ−ＳＳ−ＰＥＧ２０，０００を用いた処置が、ＳＫ−ｍｅｌ ２８、ＳＫ−ｍｅｌ ２またはＭ２４−ｍｅｔヒト黒色腫細胞を注射したマウスの腫瘍サイズに及ぼした効果を示すグラフである。
【図９】
ＡＤＩ−ＰＥＧ５，０００、ＡＤＩ−ＰＥＧ１２，０００またはＡＤＩ−ＰＥＧ２０，０００を用いた処置が、ヒト肝癌ＳＫ−Ｈｅｐ１細胞を注射したマウスの生存に及ぼした効果を示すグラフである。
【図１０】
ステプトコッカス ピオゲネス（Ｓｔｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）（ＳＴＲＡＤＩＰＹＲと確認される上段のアミノ酸配列、配列番号６）およびステプトコッカス ニューモニア（Ｓｔｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）（ＳＴＲＡＤＩＰＮＥと確認される下段のアミノ酸配列、配列番号７）からクローン化されたアルギニン デイミナーゼのアミノ酸配列を表す。
【図１１】
ボレリア ブルグドルフェリ（Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）（ＢＯＲＡＤＩＢＵＲと確認される上段のアミノ酸配列、配列番号８）、ボレリア アフゼリー（Ｂｏｒｒｅｌｉａ ａｆｚｅｌｌｉｉ）（ＢＯＲＡＤＩＡＦＺと確認される下段のアミノ酸配列、配列番号９）からクローン化されたアルギニン デイミナーゼのアミノ酸配列を表す。
【図１２】
キアルジア インテスチナリス（Ｑｉａｒｄｉａ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ）（ＱＩＡＡＤＩＩＮＴと確認される上段のアミノ酸配列、配列番号１０）、クロストリジウム パーフリンゲンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）（ＣＬＯＡＤＩＰＥＲと確認される中段のアミノ酸配列、配列番号１１）、およびバチルス リケニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）（ＢＡＣＡＤＩＬＩＣと確認される下段のアミノ酸配列、配列番号１２）のアミノ酸配列を表す。
【図１３】
エンテロコッカス フェカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）（ＥＮＴＡＤＩＦＡＥと確認される上段のアミノ酸配列、配列番号１３）およびラクトバチルス サケ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｋｅ）（ＬＡＣＡＤＩＳＡＫと確認される下段のアミノ酸配列、配列番号１４）のアミノ酸配列を表す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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