(57)【要約】本発明は、β−セクレターゼ活性のモジュレーターの同定用の方法および組成物に関する。より詳しくは、本発明は、ヒトＡｓｐ２プロテアーゼのβ−セクレターゼ活性をモニターする新規基質およびそれを用いた方法を提供する。そのような方法および組成物はβ−セクレターゼ活性をモジュレートする剤の同定に有用であり、かくして、アミロイド斑の存在によって特徴付けられる障害の治療介入に用いることができる。かくして、本発明はβ−セクレターゼ切断部位を含むペプチド基質または融合ポリペプチド基質を提供し、該ペプチドを作製し、使用するための方法および組成物を開示する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
式Ｐ２Ｐ１−−Ｐ１’Ｐ２’で規定される少なくとも４個のアミノ酸の配列を含む単離されたペプチドであって、式中、
Ｐ２は荷電アミノ酸、極性アミノ酸、または脂肪族アミノ酸であるが、芳香族アミノ酸ではなく；
Ｐ１は芳香族アミノ酸または荷電アミノ酸であるが、極性アミノ酸または荷電アミノ酸ではなく；
Ｐ１’は荷電アミノ酸、または脂肪族アミノ酸、または極性アミノ酸であるが、芳香族アミノ酸ではなく；
Ｐ２’は非荷電脂肪族極性アミノ酸または芳香族アミノ酸であって；、
ここに、該ペプチドは、配列番号：１または配列番号：３の核酸配列によってコードされるヒトアスパルチルプロテアーゼによってＰ１とＰ１’との間で切断され、および該ペプチドは、配列番号：１９；配列番号：２０；配列番号：２１；配列番号：２６；配列番号：２７；配列番号：２８；配列番号：３１；配列番号：３２；配列番号：３３；配列番号：３４；配列番号：３５；配列番号：３６；配列番号：３７；配列番号：３８；配列番号：３９；または配列番号４０に示されるアミノ酸配列の対応するＰ２Ｐ１−−Ｐ１’Ｐ２’部分を含まない該ペプチド。
【請求項２】
式Ｐ２Ｐ１−−Ｐ１’Ｐ２’Ｐ３’で規定されるアミノ酸を含み、式中、Ｐ３’は任意のアミノ酸であって、ここに、該ペプチドは、配列番号：１９；配列番号：２０；配列番号：２１；配列番号：２６；配列番号：２７；配列番号：２８；配列番号：３１；配列番号：３２；配列番号：３３；配列番号：３４；配列番号：３５；配列番号：３６；配列番号：３７；配列番号：３８；配列番号：３９；または配列番号４０に示されるアミノ酸配列の対応するＰ２Ｐ１−−Ｐ１’Ｐ２’ Ｐ３’部分を含まない請求項１記載の単離されたペプチド。
【請求項３】
式Ｐ３Ｐ２Ｐ１−−Ｐ１’Ｐ２’Ｐ３’で規定されるアミノ酸を含み、式中、Ｐ３は非荷電極性アミノ酸、非荷電脂肪族アミノ酸または芳香族アミノ酸であって、ここに、該ペプチドは、配列番号：１９；配列番号：２０；配列番号：２１；配列番号：２６；配列番号：２７；配列番号：２８；配列番号：３１；配列番号：３２；配列番号：３３；配列番号：３４；配列番号：３５；配列番号：３６；配列番号：３７；配列番号：３８；配列番号：３９；または配列番号４０に示されるアミノ酸配列の対応するＰ３Ｐ２Ｐ１−−Ｐ１’Ｐ２’ Ｐ３’部分を含まない請求項１記載の単離されたペプチド。
【請求項４】
式Ｐ４Ｐ３Ｐ２Ｐ１−−Ｐ１’Ｐ２’Ｐ３’で規定されるアミノ酸を含み、式中、Ｐ４は荷電アミノ酸、極性アミノ酸または脂肪族アミノ酸であるが芳香族アミノ酸ではなく、ここに、該ペプチドは、配列番号：１９；配列番号：２０；配列番号：２１；配列番号：２６；配列番号：２７；配列番号：２８；配列番号：３１；配列番号：３２；配列番号：３３；配列番号：３４；配列番号：３５；配列番号：３６；配列番号：３７；配列番号：３８；配列番号：３９；または配列番号４０に示されるアミノ酸配列の対応するＰ４Ｐ３Ｐ２Ｐ１−−Ｐ１’Ｐ２’ Ｐ３’部分を含まない請求項１記載の単離されたペプチド。
【請求項５】
Ｐ３’のカルボキシ末端位に隣接するＰ４’位にアミノ酸をさらに含み、式中、Ｐ４’は任意のアミノ酸であって、ここに、該ペプチドは、配列番号：１９；配列番号：２０；配列番号：２１；配列番号：２６；配列番号：２７；配列番号：２８；配列番号：３１；配列番号：３２；配列番号：３３；配列番号：３４；配列番号：３５；配列番号：３６；配列番号：３７；配列番号：３８；配列番号：３９；または配列番号４０に示されるアミノ酸配列の対応するＰ３Ｐ２Ｐ１−−Ｐ１’Ｐ２’Ｐ３’Ｐ４’部分を含まない請求項２ないし４いずれか１記載の単離されたペプチド。
【請求項６】
Ｐ２がＮ、Ｌ、Ｋ、Ｓ、Ｇ、Ｔ、Ｄ、Ａ、ＱおよびＥよりなる群から選択されるアミノ酸である請求項１記載の単離されたペプチド。
【請求項７】
Ｐ１がＹ、Ｌ、Ｍ、Ｎｌｅ、ＦおよびＨよりなる群から選択されるアミノ酸である請求項１記載の単離されたペプチド。
【請求項８】
Ｐ１’がＥ、Ａ、Ｄ、Ｍ、Ｑ、ＳおよびＧよりなる群から選択されるアミノ酸である請求項１記載の単離されたペプチド。
【請求項９】
Ｐ２’がＶ、Ａ、Ｎ、Ｔ、Ｌ、ＦおよびＳよりなる群から選択されるアミノ酸である請求項１記載の単離されたペプチド。
【請求項１０】
Ｐ３’がＥ、Ｇ、Ｆ、Ｈ、システイン酸およびＳよりなる群から選択されるアミノ酸である請求項２記載の単離されたペプチド。
【請求項１１】
Ｐ３がＡ、Ｖ、Ｉ、Ｓ、Ｈ、Ｙ、ＴおよびＦよりなる群から選択されるアミノ酸である請求項３記載の単離されたペプチド。
【請求項１２】
Ｐ４がＥ、Ｇ、Ｉ、Ｄ、Ｔ、システイン酸およびＳよりなる群から選択されるアミノ酸である請求項４記載の単離されたペプチド。
【請求項１３】
Ｐ４’がＦ、Ｗ、Ｇ、Ａ、Ｈ、Ｐ、Ｇ、Ｎ、Ｓ、およびＥよりなる群から選択されるアミノ酸である請求項４ないし１２いずれか１記載の単離されたペプチド。
【請求項１４】
第１の標識をさらに含む請求項１ないし１３いずれか１記載の単離されたペプチド。
【請求項１５】
第２の標識をさらに含む請求項１４記載の単離されたペプチド。
【請求項１６】
検出可能な標識および失活部分をさらに含み、ここに、Ｐ１とＰ１’との間での該ペプチドの切断が、該失活部分を該標識から分離して該標識の検出を可能にする請求項１ないし１３いずれか１記載の単離されたペプチド。
【請求項１７】
該システイン酸が共有結合された標識をさらに含む請求項１０または１２記載の単離されたペプチド。
【請求項１８】
該ヒトアスパルチルプロテアーゼによる該ペプチドの切断速度が、ヒトＡＰＰβ−セクレターゼ切断配列：ＳＥＶＫＭ−ＤＡＥＦＲ（配列番号：２０）を含むポリペプチドの切断速度よりも大きい請求項１ないし１７いずれか１記載の単離されたペプチド。
【請求項１９】
該ヒトアスパルチルプロテアーゼによる該ペプチドの切断速度が、ヒトＡＰＰスウェディッシュＫＭ→ＮＬ突然変異体、β−セクレターゼ切断配列：ＳＥＶＮＬ−ＤＡＥＦＲ（配列番号：１９）を含むポリペプチドの切断速度よりも大きい請求項１ないし１７いずれか１記載の単離されたペプチド。
【請求項２０】
該ペプチドが、配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０、配列番号：１１、配列番号：１２、配列番号：１３、配列番号：１４、配列番号：１５、配列番号：１６、配列番号：１７、配列番号：１８、配列番号：１２０、配列番号：１３３、配列番号：１３４、配列番号：１３５、配列番号：１３６、配列番号：１３７、配列番号：１３８、配列番号：１４１、配列番号：１４３、配列番号：１４４、配列番号：１４５、配列番号：１４７、配列番号：１４８、配列番号：１４９、配列番号：１５０、配列番号：１５１、配列番号：１５２、配列番号：１５３、配列番号：１５４、配列番号：１５５、配列番号：１５６、配列番号：１５７、配列番号：１５８、配列番号：１５９、配列番号：１６０、配列番号：１６１、配列番号：１６２、配列番号：１６３、配列番号：１６４、配列番号：１６５、配列番号：１６６、配列番号：１６７、配列番号：１６８、配列番号：１６９、配列番号：１９０、配列番号：１９１、配列番号：１９２および配列番号：１９３よりなる群から選択されるアミノ酸である請求項１記載の単離されたペプチド。
【請求項２１】
式Ｐ２Ｐ１−−Ｐ１’Ｐ２’で規定される少なくとも４個のアミノ酸の配列を含む単離されたペプチドであって、式中、
Ｐ２は、Ｎ、ＳおよびＤよりなる群から選択されるアミノ酸を含み；
Ｐ１は、Ｙ、ＬおよびＮｌｅよりなる群から選択されるアミノ酸を含み；
Ｐ１’は、Ｅ、ＡおよびＤよりなる群から選択されるアミノ酸を含み；
Ｐ２’は、ＡおよびＶよりなる群から選択されるアミノ酸を含み；
ここに、配列番号：１または配列番号：３の核酸配列によってコードされるヒトアスパルチルプロテアーゼ（Ｈｕ−Ａｓｐ２）がＰ１とＰ１’との間で該ペプチドを切断し、ただし、Ｐ１’Ｐ２’が配列ＤＡを含むならば、Ｐ２Ｐ１は配列ＮＬまたはＮＮｌｅを含まない該ペプチド。
【請求項２２】
該ペプチドアミノ酸配列が４〜５０個のアミノ酸からなる請求項２１記載の単離されたペプチド。
【請求項２３】
該Ｈｕ−Ａｓｐ２が該ペプチドを、該Ｈｕ−Ａｓｐ２がＰ２Ｐ１−−Ｐ１’Ｐ２’アミノ酸配列ＫＭＤＡを有する対応するペプチドを切断するよりも大きい速度で切断する請求項２１記載の単離されたペプチド。
【請求項２４】
該Ｈｕ−Ａｓｐ２が該ペプチドを、該Ｈｕ−Ａｓｐ２がＰ２Ｐ１−−Ｐ１’Ｐ２’アミノ酸配列ＫＭＤＡを有する対応するペプチドを切断するよりも大きい速度で切断する請求項２１記載の単離されたペプチド。
【請求項２５】
標識をさらに含む請求項２１記載のペプチド。
【請求項２６】
標識および失活部分をさらに含み、ここに、該標識および該失活部分はＰ１−−Ｐ１ペプチド結合の反対側に結合し、これによって、該Ｐ１−−Ｐ１ペプチド結合の切断が該標識と失活部分とを分離する請求項２１記載のペプチド。
【請求項２７】
請求項２１記載のペプチド配列を含むポリペプチドであって、貫通膜ドメインをさらに含んで、該ポリペプチドが真核細胞中で発現されたとき、該ポリペプチドを細胞膜に局在化させる該ポリペプチド。
【請求項２８】
請求項１ないし２０いずれか１記載のペプチドを含み、貫通膜ドメインアミノ酸配列をさらに含むポリペプチド。
【請求項２９】
該ペプチドが該貫通膜ドメインに対してＮ−末端である請求項２８記載のポリペプチド。
【請求項３０】
該ペプチドおよび該貫通膜ドメインがリンカーによって隔てられている請求項２８または２９記載のポリペプチド。
【請求項３１】
該リンカーが約２０ないし約４０個の間のアミノ酸を含むペプチドリンカーである請求項３０記載のポリペプチド。
【請求項３２】
該貫通膜ドメインがゴルジ体または小胞体よりなる群から選択される細胞内膜に該ポリペプチドを固定する請求項２８ないし３１いずれか１記載のポリペプチド。
【請求項３３】
該貫通膜ドメインが、ガラクトシルトランスフェラーゼの貫通膜ドメイン；シアリルトランスフェラーゼの貫通膜ドメイン；ヒトアスパルチルトランスフェラーゼ１の貫通膜ドメイン；ヒトアスパルチルトランスフェラーゼ２の貫通膜ドメイン；シンタキシン６（ｓｙｎｔａｘｉｎ ６）の貫通膜ドメイン；ユビキチンの貫通膜ドメイン；インスリンＢ鎖の貫通膜ドメインおよびＡＰＰの貫通膜ドメインよりなる群から選択される請求項２８ないし３２いずれか１記載の融合タンパク質。
【請求項３４】
レポータータンパク質アミノ酸配列をさらに含む請求項２８ないし３２いずれか１記載のポリペプチド。
【請求項３５】
該レポータータンパク質がルシフェラーゼ；アルカリホスファターゼ；β−ガラクトシダーゼ；β−グルコリニダーゼ；緑色蛍光タンパク質；クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼよりなる群から選択される請求項３４記載のポリペプチド。
【請求項３６】
請求項２０ないし３５いずれか１記載のペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド。
【請求項３７】
請求項１ないし２７いずれか１記載のペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド。
【請求項３８】
請求項３６記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項３９】
請求項３７記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項４０】
該ポリヌクレオチドが、宿主細胞内で該ポリヌクレオチドによってコードされる融合タンパク質の発現を促進するプロモーターに作動可能に連結されている請求項３８記載のベクター。
【請求項４１】
請求項３６記載のポリヌクレオチドで形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞。
【請求項４２】
請求項３８ないし４０いずれか１記載のベクターで形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞。
【請求項４３】
β−セクレターゼ活性のモジュレーターをアッセイする方法であって、
（ａ）推定モジュレーター化合物の存在下および不存在下の両方で、第１組成物を第２組成物に接触させ、ここに、該第１組成物は哺乳類β−セクレターゼポリペプチドまたは生物学的に活性なそのフラグメントを含み、該第２組成物は基質を含み、ここに、該基質は請求項１ないし２６いずれか１記載のペプチドまたは請求項２７ないし３５いずれか１記載のポリペプチドであり；
（ｂ）該推定モジュレーター化合物の存在下および不存在下で、該基質ペプチドの切断を測定し；次いで
（ｃ）該推定モジュレーター化合物の存在下対不存在下での切断の差異からβ−セクレターゼ活性のモジュレーターを同定し、ここに、β−セクレターゼアンタゴニストであるモジュレーターが当該切断を低減し、β−セクレターゼアゴニストであるモジュレーターが当該切断を増大するステップを含む該方法。
【請求項４４】
該第１組成物が精製ヒトＡｓｐ２ポリペプチドを含む請求項４３記載の方法。
【請求項４５】
該第１組成物がＡｓｐ２β−セクレターゼ活性を保持するヒトＡｓｐ２ポリペプチドの可溶性フラグメントである請求項４３記載の方法。
【請求項４６】
該可溶性フラグメントがＡｓｐ２貫通膜ドメインを欠如するフラグメントである請求項４５記載の方法。
【請求項４７】
該第１組成物のβ−セクレターゼポリペプチドが、該β−セクレターゼポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドで形質転換またはトランスフェクトされた細胞から精製および単離されたポリペプチドを含む請求項４３記載の方法。
【請求項４８】
該第１組成物のポリペプチドが、該ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドで形質転換またはトランスフェクトされた細胞中で発現され、ここに、該測定ステップが該細胞のＡＰＰプロセシング活性を測定することを含む請求項４３記載の方法。
【請求項４９】
Ｈｕ−Ａｓｐ２のインヒビターであると同定された剤でアルツハイマー病を治療するステップを含む請求項４３ないし４８いずれか１記載の方法。
【請求項５０】
請求項４３ないし４８いずれか１記載の方法により同定されたβ−セクレターゼモジュレーター。
【請求項５１】
イン・ビボでβ−セクレターゼ活性を阻害する方法であって、哺乳類に、該哺乳類の細胞中でベータセクレターゼを阻害するのに有効な量にてβ−セクレターゼアンタゴニストである請求項５０記載のモジュレーターを投与するステップを含む該方法。
【請求項５２】
β−セクレターゼアッセイ用の基質を生成する方法であって：
該ポリペプチドの発現を許容するように、請求項４０記載のベクターで形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞を増殖させることを含む該方法。
【請求項５３】
該ポリペプチドを精製することをさらに含む請求項５２記載の方法。
【請求項５４】
該宿主細胞が哺乳類宿主細胞、細菌宿主細胞および酵母宿主細胞よりなる群から選択される請求項５２記載の方法。
【請求項５５】
請求項５０記載のモジュレーターおよび医薬上許容される担体を含む医薬組成物。
【請求項５６】
異常β−セクレターゼ活性で特徴付けられる疾患または体調を治療する方法であって、治療が必要な対象に請求項５５記載の医薬組成物を投与することを含む該方法。
【請求項５７】
アルツハイマー病の治療用医薬の製造における、請求項４３記載の方法によって同定されたモジュレーターの使用。
【請求項５８】
ヒトＡｓｐ２−アスパルチルプロテアーゼ（Ｈｕ−Ａｓｐ２）の活性を阻害する剤を同定する方法であって：
（ａ）試験剤の存在下および不存在下で、請求項１ないし２６いずれか１記載のペプチドまたは請求項２７ないし３５いずれか１記載のポリペプチドをＨｕ−Ａｓｐ２活性を含む組成物に接触させ；
（ｂ）該試験剤の存在下および不存在下で、該Ｈｕ−Ａｓｐ２によるＰ１とＰ１’との間の該ペプチドまたはポリペプチドの切断を決定し；次いで
（ｃ）該試験剤存在下でのＨｕ−Ａｓｐ２の切断活性を該試験剤の不存在下での活性と比較して、該Ｈｕ−Ａｓｐ２による切断を阻害する剤を同定し、ここに、該試験剤の存在下で低下した活性がＨｕ−Ａｓｐ２活性を阻害する剤であると同定するステップを含む該方法。
【請求項５９】
該Ｈｕ−Ａｓｐ２が、Ｈｕ−Ａｓｐ２をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドで形質転換またはトランスフェクトされた細胞から精製および単離された組換えＨｕ−Ａｓｐ２である請求項５８記載の方法。
【請求項６０】
該Ｈｕ−Ａｓｐ２が細胞内で発現され、ここに、該接触が該試験剤の存在下および不存在下で該細胞を増殖させることを含み；および、該決定ステップが該ペプチドまたは融合タンパク質の切断を測定することを含む請求項５８記載の方法。
【請求項６１】
該細胞が該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをさらに含み、ここに、該接触ステップが、該細胞が該ポリペプチドを発現する条件下で該細胞を増殖させることを含む請求項６０記載の方法。
【請求項６２】
該細胞がヒト胚腎臓細胞系統２９３細胞である請求項６０または６１記載の方法。
【請求項６３】
該ヌクレオチド配列が、
（ａ）配列番号：２に記載のＨｕ−Ａｓｐ２（ａ）アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列；
（ｂ）配列番号：４に記載のＨｕ−Ａｓｐ２（ｂ）アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列；
（ｃ）Ｈｕ−Ａｓｐ２（ａ）（配列番号：２）またはＨｕ−Ａｓｐ２（ｂ）（配列番号：４）のフラグメントをコードするヌクレオチド配列、ここに、該フラグメントはＨｕ−Ａｓｐ２（ａ）またはＨｕ−Ａｓｐ２（ｂ）のアスパルチルプロテアーゼ活性特性を示し；および
（ｄ）ストリンジェントハイブリダイゼーション条件下で、配列番号：１および配列番号：３よりなる群から選択されるＨｕ−Ａｓｐ２−コーディングポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドのヌクレオチド配列よりなる群から選択される請求項５９ないし６２いずれか１記載の方法。
【請求項５８】
Ａｓｐ２アスパルチルプロテアーゼの活性をモジュレートする剤を同定する方法であって、
（ａ）試験剤の存在下および不存在下で、Ａｓｐ２アスパルチルプロテアーゼと請求項１ないし２６いずれか１記載のペプチドまたは請求項２７ないし３５いずれか１記載のポリペプチドとを接触させ、ここに、該Ａｓｐ２アスパルチルプロテアーゼは、ストリンジェントハイブリダイゼーション条件下で、配列番号：１および配列番号：３よりなる群から選択されるＨｕ−Ａｓｐ２−コーディングポリヌクレオチドにハイブリダイズする核酸分子によってコードされ；
（ｂ）該試験剤の存在下および不存在下で、該Ａｓｐ２によるＰ１とＰ１’との間の該ペプチドまたは融合タンパク質の切断を決定し；次いで
（ｃ）該試験剤存在下でのＡｓｐ２の切断活性を該試験剤の不存在下での切断活性と比較して、該ポリペプチドの活性をモジュレートする剤を同定し、ここに、Ａｓｐインヒビターであるモジュレーターが当該切断を低減し、Ａｓｐ２アゴニストであるモジュレーターが当該切断を増大する該方法。
【請求項６５】
Ｈｕ−Ａｓｐ２のインヒビターであると同定された剤でアルツハイマー病を治療するステップをさらに含む請求項５８または６４記載の方法。
【請求項６７】
ヒトＡｓｐ２アスパルチルプロテアーゼ（Ｈｕ−Ａｓｐ２）の活性を阻害する剤を同定する方法であって、
（ａ）試験剤の存在下および不存在下で、細胞を増殖させ、ここに、該細胞はＨｕ−Ａｓｐ２を発現し、請求項１ないし２６いずれか１記載のペプチドまたは請求項２７ないし３５いずれか１記載のポリペプチドを含むタンパク質を発現し；
（ｂ）該試験剤の存在下および不存在下で、該細胞中で、該Ｐ１とＰ１’との間の部位にての該タンパク質の切断を決定し；次いで
（ｃ）該試験剤存在下での切断活性を該試験剤の不存在下での切断活性と比較して、Ｈｕ−Ａｓｐ２の活性を阻害する剤を同定し、ここに、該試験剤の存在下で低下した活性がＨｕ−Ａｓｐ２活性を阻害する剤であると同定するステップを含む該方法。
【請求項６８】
該宿主細胞がＨｕ−Ａｓｐ２をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドで形質転換またはトランスフェクトされていて、該ヌクレオチド配列が、
（ａ）配列番号：２に記載のＨｕ−Ａｓｐ２（ａ）アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列；
（ｂ）配列番号：４に記載のＨｕ−Ａｓｐ２（ｂ）アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列；
（ｃ）Ｈｕ−Ａｓｐ２（ａ）（配列番号：２）またはＨｕ−Ａｓｐ２（ｂ）（配列番号：４）のフラグメントをコードするヌクレオチド配列、ここに、該フラグメントはＨｕ−Ａｓｐ２（ａ）またはＨｕ−Ａｓｐ２（ｂ）のアスパルチルプロテアーゼ活性特性を示し；および
（ｄ）ストリンジェントハイブリダイゼーション条件下で、配列番号：１および配列番号：３よりなる群から選択されるＨｕ−Ａｓｐ２−コーディングポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドのヌクレオチド配列よりなる群から選択される請求項６７記載の方法。
【請求項６８】
ステップ（ａ）〜（ｃ）によりＨｕ−Ａｓｐ２のインヒビターであると同定された剤でアルツハイマー病を治療するステップをさらに含む請求項６６ないし６７いずれか１記載の方法。
【請求項６９】
アルツハイマー病の治療用医薬の製造における、請求項６６ないし６７いずれか１記載のＨｕ−Ａｓｐ２のインヒビターであると同定された剤の使用。
【請求項７０】
請求項１ないし２７いずれか１記載のペプチドを含むβ−セクレターゼ基質およびβ−セクレターゼ酵素を含むβ−セクレターゼアッセイを実行するためのキット。
【請求項７１】
該β−セクレターゼ基質が請求項２８ないし３５いずれか１記載のポリペプチドである請求項７０記載のキット。
【請求項７２】
該ペプチドまたは融合タンパク質の切断を検出する試薬をさらに含む請求項７０または７１記載のキット。
【請求項７３】
配列ＳＥＩＳＹ−ＥＶＥＦＲ（配列番号：１５２）を有する少なくとも１０個のアミノ酸を有する配列を含む単離されたペプチド。
【請求項７４】
該ペプチドがＳＥＩＳＹ−ＥＶＥＦＲ（配列番号：１５２）のカルボキシ末端に隣接する少なくとも３個のアミノ酸を含む請求項７３記載の単離されたペプチド。
【請求項７５】
該ペプチドがＳＥＩＳＹ−ＥＶＥＦＲ（配列番号：１５２）のアミノ末端に隣接する少なくとも３個のアミノ酸を含む請求項７３記載の単離されたペプチド。
【請求項７６】
該ペプチドがＳＥＩＳＹ−ＥＶＥＦＲ（配列番号：１５２）のカルボキシ末端に隣接する少なくとも５個のアミノ酸を含む請求項７３記載の単離されたペプチド。
【請求項７７】
該ペプチドがＳＥＩＳＹ−ＥＶＥＦＲ（配列番号：１５２）のアミノ末端に隣接する少なくとも５個のアミノ酸を含む請求項７３記載の単離されたペプチド。
【請求項７８】
該ペプチドがＳＥＩＳＹ−ＥＶＥＦＲ（配列番号：１５２）のアミノ末端に隣接する少なくとも１０個のアミノ酸を含む請求項７３記載の単離されたペプチド。
【請求項７９】
該ペプチドが少なくとも１３個のアミノ酸を含む請求項７３記載の方法。
【請求項８０】
該ペプチドが少なくとも１５個のアミノ酸を含む請求項７３記載の方法。
【請求項８１】
該ペプチドが少なくとも２０個のアミノ酸を含む請求項７３記載の方法。
【請求項８２】
該ペプチドが少なくとも５０個のアミノ酸を含む請求項７３記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明は、β−セクレターゼ活性のモジュレーターの同定用の方法および組成物に関する。より詳しくは、本発明は、ヒトＡｓｐ２プロテアーゼのβ−セクレターゼ活性をモニターする新規基質およびそれを用いた方法を提供する。そのような方法および組成物はβ−セクレターゼ活性をモジュレートする剤の同定に有用であり、かくして、アミロイド斑の存在によって特徴付けられる障害の治療介入に用いることができる。
【０００２】
発明の背景
アルツハイマー病（ＡＤ）は、アミロイド斑形成、神経原線維変化、グリオーシスおよび神経損失の結果の進行性痴呆を引き起こす。この疾患は遺伝的および後天的形態の両方で発生し、それらの臨床的経過および病態特徴は全く同様である。これまでに、３つの遺伝子が、突然変異したとき、アルツハイマー病の常染色体優性体を引き起こすことが発見された。これらはアミロイドタンパク質前駆体（ＡＰＰ）および、２つのタンパク質、プレセニリン−１（ＰＳ１）およびプレセニリン−２（ＰＳ２）をコードし、それらは構造的、機能的に関連する。該３つのタンパク質のいずれにおいても突然変異は、アミロイドベータペプチド（Ａβペプチド、時に、Ａベータという。）、ＡＤ中のアミロイド斑の主要成分である４０〜４２個のアミノ酸ペプチド［ヨウキン（Ｙｏｕｋｉｎ）、「ブレイン・パソロジー（Ｂｒａｉｎ Ｐａｔｈｏｌ．）」、第１（４）巻、１９９１年、ｐ．２５３−６２］；［ハース（Ｈａａｓｓ）、「ジャーナル・オブ・ニューロサイエンス（Ｊ． Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ）」、第１１（１２）巻、１９９１年、ｐ．３７８３−９３］を生成する細胞内経路によるＡＰＰのタンパク質加水分解プロセシングを促進することが観察された。
【０００３】
タンパク質分解プロセシングについての細胞内経路の調節不全はＡＤの病態生理学の中心であろう。斑形成の場合、ＡＰＰ、ＰＳ１またはＰＳ２における突然変異は、一致して、ＡＰＰのタンパク質加水分解プロセシングを変化させて、Ａβ１〜４２、特にアミロイドジェニックであり、かくして、ＡＤにおいて非常に重要であると見られているＡβペプチドの形態の形成を促進する。ＡＰＰは細胞表面を含む分泌物膜構造に局在し、単一のＣ−末端貫通膜ドメインを有する。ヒトに存在することが近年知られているＡＰＰの特異的アイソタイプの例は、［カン（Ｋａｎｇ）ら、「ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）」、第３２５巻、１９８７年、ｐ．７３３−７３６］に記載され、「正常」ＡＰＰと指摘された６９５−アミノ酸ポリペプチド；［ポンテ（Ｐｏｎｔｅ）ら、「ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）」、第３３１巻、１９８８年、ｐ．５２５−５２７］および［タンジ（Ｔａｎｚｉ）ら、「ネイチャー（Ｎａｒｕｒｅ）」、第３３１巻、１９８８年、ｐ．５２８−５３０］に記載された７５１アミノ酸ポリペプチド；および［キタグチ（Ｋｉｔａｇｕｃｈｉ）ら、「ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）」、第３３１巻、１９８８年、ｐ．５３０−５３２］に記載された７７０アミノ酸ポリペプチドを含む。
【０００４】
該Ａβペプチドは貫通膜ドメインの部分に近接し、それを含有するＡＰＰの領域から誘導される。通常、α−セクレターゼ部位にてのＡＰＰのプロセシングは、当該膜に近接するＡβ配列の中央領域を切断し、ＡＰＰの可溶性細胞外ドメインを細胞表面から放出する。このα−セクレターゼＡＰＰプロセシングは可溶性ＡＰＰ−αを生成し、それはＡＤに寄与するとは考えられていない。しかしながら、α−セクレターゼ部位のＮ末端およびＣ末端に局在化されているβ−およびγ−セクレターゼ部位にてのＡＰＰの病理学的プロッシングは、該Ａβペプチドを放出する。β−およびγ−セクレターゼ部位にてのプロセシングは、小胞体内（ニューロン内）および、細胞表面ＡＰＰの再内在化後のエンドソーム／リソソーム経路内（全細胞内）の両方に発生し得る。β−セクレターゼ切断部位は形質膜腔表面からの２８残基に位置し、γ−セクレターゼ切断部位は貫通膜領域に位置する。該β−セクレターゼ部位のイン・ビボプロセシングは、Ａβ産生の律速ステップであると考えられている［シンハ（Ｓｉｎｈａ）およびリーバーベリ（Ｌｉｅｂｅｒｂｕｒｇ）、「プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・サイエンシズ、ＵＳＡ（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ’ｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．， ＵＳＡ）」、第９６（４）巻、１９９９年、ｐ．１１０４９−１１０５３］。
【０００５】
最近、いくつかの調査員のグループが、ヒトアスパルチルプロテアーゼ（Ｈｕ−Ａｓｐ２）がβセクレターゼ切断部位にてのＡＰＰのプロセシングを荷う活性を有することを報告した。Ｈｕ−Ａｓｐ２は膜結合アスパルチルプロテアーゼである［ヤン（Ｙａｎ）ら、「ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）」、第４０２巻、１９９９年、ｐ．５３３−５３６］；［リン（Ｌｉｎ）ら、「プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・サイエンシズ、ＵＳＡ（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ’ｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．， ＵＳＡ）」、第９７（４）巻、２０００年、ｐ．１４５６−１４６０］；［ヴァッサー（Ｖａｓｓａｒ）ら、「サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）」、第２８６巻、１９９９年、ｐ．７３５−７４１］。カセプシンＤ、ペプシン、レニンおよびウイルスアスパルチルプロテアーゼのごときアスパルチルプロテアーゼは、シグニチュア触媒性トリプレット（ｓｉｇｎａｔｕｒｅ ｃａｔａｌｙｔｉｃ ｔｒｉｐｌｅｔ）・・・Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ・・・およびＡｓｐ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ・・・を含む。Ｈｕ−Ａｓｐ２において、これらのシグニチュア触媒性トリプレットはＨｕ−Ａｓｐ２の二葉構造中で互いに対向して存在する。他の知られた哺乳類アスパルチルプロテアーゼにはないＨｕ−Ａｓｐ２の重要な特徴は、Ｈｕ−Ａｓｐ２を該膜に固定するＣ−末端近くに位置する２７個のアミノ酸のストレッチであり、細胞における酵素機能にとって重要である。
【０００６】
現在まで、組換えＨｕ−Ａｓｐ２または脳から精製されたＨｕ−Ａｓｐ２でのイン・ビトロアッセイは、ＡＰＰスウェディッシュ突然変異配列・・・ＥＶＮＬ−ＤＡＥＦＲ・・・（配列番号：１１３）（ここで、ハイフンは、ペプチドがβ−セクレターゼによって切断される点を表す。）のごときβ−アミロイド前駆体配列（すなわち、ＡＰＰ配列）のβ−セクレターゼ認識配列を含むペプチド基質に頼る。同じアプローチがＨｕ−Ａｓｐ２を発現する細胞系統におけるβ−セクレターゼアッセイに使用されている。
【０００７】
現在、Ｈｕ−Ａｓｐ２のＡＰＰ基質に対する代替物（ｓｕｒｒｏｇａｔｅ）として作用するであろう化合物を同定する必要がある。そのような基質を同定することは、β−セクレターゼ部位にてのＡＰＰプロセシングに影響する治療剤を同定するための新規イン・ビトロおよびモデルイン・ビボアッセイを容易にする。最終的には、そのような基質の同定およびアッセイはアルツハイマー病の有益な介入のための治療化合物の同定に利点をもたらすであろう。
【０００８】
発明の概要
本発明は、アスパルチルプロテアーゼアッセイを実行するための新規基質、アッセイおよび方法を提供する。より詳しくは、本発明の一つの局面は、式Ｐ２Ｐ１−−Ｐ１’Ｐ２’で規定される少なくとも４個のアミノ酸の配列を含む単離されたペプチドであって、式中、Ｐ２は荷電アミノ酸、極性アミノ酸、または脂肪族アミノ酸であるが、芳香族アミノ酸ではなく；Ｐ１は芳香族アミノ酸または荷電アミノ酸であるが、極性アミノ酸または荷電アミノ酸ではなく；Ｐ１’は荷電アミノ酸、または脂肪族アミノ酸、または極性アミノ酸であるが、芳香族アミノ酸ではなく；Ｐ２’は非荷電脂肪族極性アミノ酸または芳香族アミノ酸であって；ここに、該ペプチドは、配列番号：１または配列番号：３の核酸配列によってコードされるヒトアスパルチルプロテアーゼによってＰ１とＰ１’との間で切断され、および該ペプチドは、配列番号：１９；配列番号：２０；配列番号：２１；配列番号：２６；配列番号：２７；配列番号：２８；配列番号：３１；配列番号：３２；配列番号：３３；配列番号：３４；配列番号：３５；配列番号：３６；配列番号：３７；配列番号：３８；配列番号：３９；または配列番号４０に示されるアミノ酸配列の対応するＰ２Ｐ１−−Ｐ１’Ｐ２’部分を含まない該ペプチドを提供する。
【０００９】
ある具体例において、該単離されたペプチドは式Ｐ２Ｐ１−−Ｐ１’Ｐ２’Ｐ３’で規定されるアミノ酸を含み、式中、Ｐ３’は任意のアミノ酸であって、ここに、該ペプチドは、配列番号：１９；配列番号：２０；配列番号：２１；配列番号：２６；配列番号：２７；配列番号：２８；配列番号：３１；配列番号：３２；配列番号：３３；配列番号：３４；配列番号：３５；配列番号：３６；配列番号：３７；配列番号：３８；配列番号：３９；または配列番号４０に示されるアミノ酸配列の対応するＰ２Ｐ１−−Ｐ１’Ｐ２’ Ｐ３’部分を含まない。
【００１０】
さらなる特定の具体例において、該単離されたペプチドは式Ｐ３Ｐ２Ｐ１−−Ｐ１’Ｐ２’Ｐ３’で規定されるアミノ酸を含み、式中、Ｐ３は非荷電極性アミノ酸、非荷電脂肪族アミノ酸または芳香族アミノ酸であって、ここに、該ペプチドは、配列番号：１９；配列番号：２０；配列番号：２１；配列番号：２６；配列番号：２７；配列番号：２８；配列番号：３１；配列番号：３２；配列番号：３３；配列番号：３４；配列番号：３５；配列番号：３６；配列番号：３７；配列番号：３８；配列番号：３９；または配列番号４０に示されるアミノ酸配列の対応するＰ３Ｐ２Ｐ１−−Ｐ１’Ｐ２’ Ｐ３’部分を含まない。
【００１１】
他の具体例において、該単離されたペプチドは式Ｐ４Ｐ３Ｐ２Ｐ１−−Ｐ１’Ｐ２’Ｐ３’で規定されるアミノ酸を含み、式中、Ｐ４は荷電アミノ酸、極性アミノ酸または脂肪族アミノ酸であるが芳香族アミノ酸ではなく、ここに、該ペプチドは、配列番号：１９；配列番号：２０；配列番号：２１；配列番号：２６；配列番号：２７；配列番号：２８；配列番号：３１；配列番号：３２；配列番号：３３；配列番号：３４；配列番号：３５；配列番号：３６；配列番号：３７；配列番号：３８；配列番号：３９；または配列番号４０に示されるアミノ酸配列の対応するＰ４Ｐ３Ｐ２Ｐ１−−Ｐ１’Ｐ２’ Ｐ３’部分を含まない。他の特定の具体例において、該単離されたペプチドはＰ３’のカルボキシ末端位に隣接するＰ４’位にアミノ酸をさらに含み、式中、Ｐ４’は任意のアミノ酸であって、ここに、該ペプチドは、配列番号：１９；配列番号：２０；配列番号：２１；配列番号：２６；配列番号：２７；配列番号：２８；配列番号：３１；配列番号：３２；配列番号：３３；配列番号：３４；配列番号：３５；配列番号：３６；配列番号：３７；配列番号：３８；配列番号：３９；または配列番号４０に示されるアミノ酸配列の対応するＰ３Ｐ２Ｐ１−−Ｐ１’Ｐ２’Ｐ３’Ｐ４’部分を含まない。
【００１２】
特に好ましい具体例において、Ｐ２はＮ、Ｌ、Ｋ、Ｓ、Ｇ、Ｔ、Ｄ、Ａ、ＱおよびＥよりなる群から選択されるアミノ酸である。
好ましい具体例において、Ｐ１はＹ、Ｌ、Ｍ、Ｎｌｅ、ＦおよびＨよりなる群から選択されるアミノ酸である。
好ましい具体例において、Ｐ１’はＥ、Ａ、Ｄ、Ｍ、Ｑ、ＳおよびＧよりなる群から選択されるアミノ酸である。
好ましい具体例において、Ｐ２’はＶ、Ａ、Ｎ、Ｔ、Ｌ、ＦおよびＳよりなる群から選択されるアミノ酸である。
好ましい具体例において、Ｐ３’はＥ、Ｇ、Ｆ、Ｈ、システイン酸およびＳよりなる群から選択されるアミノ酸である。
好ましい具体例において、Ｐ３はＡ、Ｖ、Ｉ、Ｓ、Ｈ、Ｙ、ＴおよびＦよりなる群から選択されるアミノ酸である。
好ましい具体例において、Ｐ４がＥ、Ｇ、Ｉ、Ｄ、Ｔ、システイン酸およびＳよりなる群から選択されるアミノ酸である。
好ましい具体例において、Ｐ４’はＦ、Ｗ、Ｇ、Ａ、Ｈ、Ｐ、Ｇ、Ｎ、Ｓ、およびＥよりなる群から選択されるアミノ酸である。多くの高度に好ましい残基は詳細な記載から明らかになるであろう。
【００１３】
本発明の好ましい具体例において、該単離されたペプチドは第１の標識をさらに含む。特別の具体例において、該ペプチドは共有結合された標識をさらに含むシステイン酸を含む。他の好ましい具体例は、単離されたペプチドが第２の標識をさらに含むことを意図する。本発明のこの局面において、該標識はペプチドの検出および／または定量に普通に用いられる任意の標識であってよいことを意図する。特別の具体例において、本発明のペプチドは検出可能な標識および、該標識と失活部分とが近接したときに該標識の検出可能特性を失活する失活部分を含むことができる。より詳しくは、該失活部分および標識は、Ｐ１とＰ１’との間での該ペプチドの切断が、該失活部分を該標識から分離して該標識の検出を可能にするように選択される。かくして、好ましい具体例において、該標識および該失活部分はＰ１−−Ｐ１ペプチド結合の反対側に結合する。
【００１４】
本発明の好ましい具体例において、本発明は、ヒトＡＰＰβ−セクレターゼ切断配列：ＳＥＶＫＭ−ＤＡＥＦＲ（配列番号：２０）を含むポリペプチドの切断速度よりも大きな速度にて、ヒトアスパルチルプロテアーゼＨｕ−Ａｓｐ２によって切断されるペプチドの属を提供する。さらにより好ましい具体例は、ヒトＡＰＰスウェディッシュＫＭ→ＮＬ突然変異体、β−セクレターゼ切断配列：ＳＥＶＮＬ−ＤＡＥＦＲ（配列番号：１９）を含むポリペプチドの切断速度よりも大きな速度にて、ヒトアスパルチルプロテアーゼＨｕ−Ａｓｐ２によって切断されるペプチドの属を提供する。
【００１５】
本発明の特に好ましいペプチドは、限定されないが、配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０、配列番号：１１、配列番号：１２、配列番号：１３、配列番号：１４、配列番号：１５、配列番号：１６、配列番号：１７、配列番号：１８、配列番号：１２０、配列番号：１３３、配列番号：１３４、配列番号：１３５、配列番号：１３６、配列番号：１３７、配列番号：１３８、配列番号：１４１、配列番号：１４３、配列番号：１４４、配列番号：１４５、配列番号：１４７、配列番号：１４８、配列番号：１４９、配列番号：１５０、配列番号：１５１、配列番号：１５２、配列番号：１５３、配列番号：１５４、配列番号：１５５、配列番号：１５６、配列番号：１５７、配列番号：１５８、配列番号：１５９、配列番号：１６０、配列番号：１６１、配列番号：１６２、配列番号：１６３、配列番号：１６４、配列番号：１６５、配列番号：１６６、配列番号：１６７、配列番号：１６８、配列番号：１６９、配列番号：１９０、配列番号：１９１、配列番号：１９２および配列番号：１９３に記載された配列のいずれか１を含むものを含む。
【００１６】
本発明のさらなる局面は、本発明のペプチドの一つによって記載される新規β−セクレターゼ切断部位のアミノ酸配列を含む融合ポリペプチドおよびさらなるアミノ酸配列に関する。より詳しくは、本発明は本発明のペプチドを含み、貫通膜ドメインアミノ酸配列をさらに含むポリペプチドを意図する。特定の具体例において、該β−セクレターゼ切断部位を含有するペプチドは該貫通ドメインに対してＮ−末端であるが、Ｃ−末端も意図される。ある具体例において、該ペプチドおよび該貫通膜ドメインはリンカーによって隔てられていてよい。より詳しくは、該リンカーは約２０ないし約４０個のアミノ酸を含むペプチドリンカーであってよい。特に好ましい具体例において、該貫通膜ドメインは、該ポリペプチドをゴルジ体または小胞体よりなる群から選択される細胞内膜に固定する。そうであるので、該貫通膜ドメインは、そのようなタンパク質を発現する細胞のゴルジ体またはＥＲ膜に固定されたタンパク質の貫通膜ドメインアミノ酸配列を含む。好ましい具体例において、該融合ポリペプチドは、ガラクトシルトランスフェラーゼの貫通膜ドメイン；シアリルトランスフェラーゼの貫通膜ドメイン；ヒトアスパルチルトランスフェラーゼ１の貫通膜ドメイン；ヒトアスパルチルトランスフェラーゼ２の貫通膜ドメイン；シンタキシン６（ｓｙｎｔａｘｉｎ ６）の貫通膜ドメイン；ユビキチンの貫通膜ドメイン；インスリンＢ鎖の貫通膜ドメインおよびＡＰＰの貫通膜ドメインよりなる群から選択される融合タンパク質を含む。
【００１７】
本発明の好ましい具体例において、該融合タンパク質は該ペプチド配列に加えて、レポータータンパク質アミノ酸配列をさらに含むことができる。該レポーター配列は、好ましくは、検出可能および定量可能な特性（例えば、光学特性）を付与するか、または、基質を生成物に触媒する酵素であって、ここに、該基質または生成物は検出可能および定量可能な特性を付与する。レポータータンパク質アミノ酸配列および、本発明のペプチド配列を含有するβ−セクレターゼ切断部位を含む融合ポリペプチドも意図される。本発明の好ましい局面において、該レポータータンパク質は、ルシフェラーゼ；アルカリホスファターゼ；β−ガラクトシダーゼ；β−グルコリニダーゼ；緑色蛍光タンパク質；クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼよりなる群から選択される。
【００１８】
ある局面において、本発明は、野生型ＡＰＰの天然β−セクレターゼ切断部位が本発明の基質のうちの一つのβ−セクレターゼ切断部位を含有するように修飾されている突然変異体または誘導ＡＰＰ分子を意図する。そのような突然変異体または誘導ＡＰＰ分子は部位特異的突然変異誘発によってまたは本明細書に記載されたペプチド合成によって生成することができる。
【００１９】
本発明のさらなる局面は、本発明の融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを意図する。他の具体例は本発明のペプチド基質をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを意図する。本発明のポリヌクレオチドのいずれかを含むベクターも本明細書で意図される。好ましい具体例において、該ベクターは、本発明のペプチドまたは融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むベクターを含み、ここに、該ポリヌクレオチドは、宿主細胞内で該ポリヌクレオチドによってコードされる融合タンパク質の発現を促進するプロモーターに作動可能に連結されている。他の具体例は、本発明によって記載されるポリヌクレオチドまたはベクターで形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞を意図する。好ましい具体例において、該宿主細胞を該ポリヌクレオチド／ベクターおよびポリヌクレオチド／Ｈｕ−Ａｓｐ２をコードするベクターで共トランスフェクトする。
【００２０】
該ポリペプチドの発現を許容するように、本発明のベクターで形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞を増殖させることを含むβ−セクレターゼアッセイ用の基質を製造する方法も本明細書に記載される。本発明のこの局面のさららなる具体例は、該ポリペプチドを精製することをさらに含む。好ましい具体例において、該宿主細胞は哺乳類宿主細胞、細菌宿主細胞および酵母宿主細胞よりなる群から選択される。
【００２１】
β−セクレターゼ切断として本発明のペプチドのうちの一つを有するＡＰＰ突然変異体を含むトランスジェニック動物を本明細書で意図される。
【００２２】
さらなる局面において、本発明は、β−セクレターゼ活性のモジュレーターをアッセイする方法であって、推定モジュレーター化合物の存在下および不存在下の両方で、第１組成物を第２組成物に接触させるステップを含み、ここに、該第１組成物は哺乳類β−セクレターゼポリペプチドまたは生物学的に活性なそのフラグメントを含み、該第２組成物は基質を含み、ここに、該基質は本発明のペプチドまたはポリペプチドである該方法を提供する。好ましい具体例において、該方法は、該推定モジュレーター化合物の存在下および不存在下で、該基質ペプチドの切断を測定し；次いで該推定モジュレーター化合物の存在下対不存在下での切断の差異からβ−セクレターゼ活性のモジュレーターを同定し、ここに、β−セクレターゼアンタゴニストであるモジュレーターが当該切断を低減し、β−セクレターゼアゴニストであるモジュレーターが当該切断を増大するステップをさらに含む。特定の具体例において、該第１組成物は精製ヒトＡｓｐ２ポリペプチドを含む。他の具体例において、該第１組成物はＡｓｐ２β−セクレターゼ活性を保持するヒトＡｓｐ２ポリペプチドの可溶性フラグメントを含むことができる。より詳しくは、該可溶性フラグメントはＡｓｐ２貫通膜ドメインを欠如するフラグメントであってよい。好ましい具体例において、該第１組成物のβ−セクレターゼポリペプチドは、該β−セクレターゼポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドで形質転換またはトランスフェクトされた細胞から精製および単離されたポリペプチドを含む。
【００２３】
他の特定の具体例において、該第１組成物のポリペプチドは、該ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドで形質転換またはトランスフェクトされた細胞中で発現され、ここに、該測定ステップが該細胞のＡＰＰプロセシング活性を測定することを含む。
【００２４】
本発明のさらなる局面は、本発明の方法によってＨｕ−Ａｓｐ２のインヒビターであると同定された剤で、アルツハイマー病を治療することを意図する。好ましい局面は、本発明の方法によって同定されたβ−セクレターゼモジュレーターをさらに意図する。詳しくは、イン・ビボでβ−セクレターゼ活性を阻害する方法であって、哺乳類に、該哺乳類の細胞中でベータセクレターゼを阻害するのに有効な量にてβ−セクレターゼアンタゴニストである請求項５０記載のモジュレーターを投与するステップを含む該方法が意図される。
【００２５】
本発明の方法によって同定されたβ−セクレターゼモジュレーターおよび医薬上許容される担体を含む医薬組成物も本明細書に記載される。本発明のさらなる局面は、異常β−セクレターゼ活性で特徴付けられる疾患または体調を治療する方法であって、治療が必要な対象に上記の医薬組成物を投与することを含む該方法を記載する。他の具体例は、アルツハイマー病の治療用医薬の製造における、本発明により同定されたモジュレーターの使用を記載する。
【００２６】
関連する局面において、本発明は、本発明により同定されたモジュレーターを含む組成物を含有するコンテナーを提供し、該コンテナーはアルツハイマー病を治療するためのモジュレーターの指標を表示する標識を含有する。好ましくは、該組成物は、医薬担体をさらに含む。より詳しくは、該組成物は単位用量製剤である。
【００２７】
ヒトＡｓｐ２−アスパルチルプロテアーゼ（Ｈｕ−Ａｓｐ２）の活性を阻害する剤を同定する方法であって：試験剤の存在下および不存在下で、本発明のペプチドまたは融合ポリペプチドをＨｕ−Ａｓｐ２活性を含む組成物に接触させ；該試験剤の存在下および不存在下で、該Ｈｕ−Ａｓｐ２によるＰ１とＰ１’との間の該ペプチドまたはポリペプチドの切断を決定し；次いで該試験剤存在下でのＨｕ−Ａｓｐ２の切断活性を該試験剤の不存在下での活性と比較して、Ｈｕ−Ａｓｐ２による切断を阻害する剤を同定し、ここに、該試験剤の存在下で低下した活性がＨｕ−Ａｓｐ２活性を阻害する剤であると同定するステップを含むさらなる方法を記載する。好ましい具体例において、該Ｈｕ−Ａｓｐ２はＨｕ−Ａｓｐ２をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドで形質転換またはトランスフェクトされた細胞から精製および単離された組換えＨｕ−Ａｓｐ２である。他の具体例において、該Ｈｕ−Ａｓｐ２は細胞内で発現され、ここに、該接触が該試験剤の存在下および不存在下で該細胞を増殖させることを含み、該決定ステップが該ペプチドまたは融合タンパク質の切断を測定する。特定の具体例において、該細胞は該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをさらに含み、ここに、該接触ステップが、該細胞が該ポリペプチドを発現する条件下で該細胞を増殖させることを含む。好ましい具体例において、該細胞はヒト胚腎臓細胞系統２９３細胞およびマウスＮｅｕｒｏ−２ａ神経芽腫細胞系統である。他の好ましい具体例において、該ヌクレオチド配列は、配列番号：２に記載のＨｕ−Ａｓｐ２（ａ）アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列；配列番号：４に記載のＨｕ−Ａｓｐ２（ｂ）アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列；Ｈｕ−Ａｓｐ２（ａ）（配列番号：２）またはＨｕ−Ａｓｐ２（ｂ）（配列番号：４）のフラグメントをコードするヌクレオチド配列、ここに、該フラグメントはＨｕ−Ａｓｐ２（ａ）またはＨｕ−Ａｓｐ２（ｂ）のアスパルチルプロテアーゼ活性特性を示し；およびストリンジェントハイブリダイゼーション条件下で、配列番号：１および配列番号：３よりなる群から選択されるＨｕ−Ａｓｐ２−コーディングポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドのヌクレオチド配列よりなる群から選択される。
【００２８】
さらなる局面は、Ａｓｐ２アスパルチルプロテアーゼの活性をモジュレートする剤を同定する方法であって、試験剤の存在下および不存在下で、Ａｓｐ２アスパルチルプロテアーゼを本発明のペプチドまたは融合ポリペプチドに接触させ、ここに、該Ａｓｐ２アスパルチルプロテアーゼは、ストリンジェントハイブリダイゼーション条件下で、配列番号：１および配列番号：３よりなる群から選択されるＨｕ−Ａｓｐ２−コーディングポリヌクレオチドにハイブリダイズする核酸分子によってコードされ；該試験剤の存在下および不存在下で、該Ａｓｐ２によるＰ１とＰ１’との間の該ペプチドまたは融合タンパク質の切断を決定し；次いで該試験剤存在下でのＡｓｐ２の切断活性を該試験剤の不存在下での切断活性と比較して、該ポリペプチドの活性をモジュレートする剤を同定し、ここに、Ａｓｐインヒビターであるモジュレーターが当該切断を低減し、Ａｓｐ２アゴニストであるモジュレーターが当該切断を増大する該方法を記載する。好ましい具体例において、該方法は、本発明によりＨｕ−Ａｓｐ２のインヒビターであると同定された剤でアルツハイマー病を治療するステップをさらに含む。
【００２９】
ヒトＡｓｐ２アスパルチルプロテアーゼ（Ｈｕ−Ａｓｐ２）の活性を阻害する剤を同定する方法であって、試験剤の存在下および不存在下で、細胞を増殖させ、ここに、該細胞はＨｕ−Ａｓｐ２またはマウスＡｓｐ２を発現し、本発明のペプチドまたは融合ポリペプチドを含むタンパク質を発現し；該試験剤の存在下および不存在下で、該細胞中で、該Ｐ１とＰ１’との間の部位にての該タンパク質の切断を決定し；次いで該試験剤存在下での切断活性を該試験剤の不存在下での切断活性と比較して、Ｈｕ−Ａｓｐ２の活性を阻害する剤を同定し、ここに、該試験剤の存在下で低下した活性がＨｕ−Ａｓｐ２活性を阻害する剤であると同定するステップを含む該方法も記載する。好ましい具体例において、該宿主細胞はＨｕ−Ａｓｐ２をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドで形質転換またはトランスフェクトされているかのいずれかであって、該ヌクレオチド配列が、配列番号：２に記載のＨｕ−Ａｓｐ２（ａ）アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列；配列番号：４に記載のＨｕ−Ａｓｐ２（ｂ）アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列；Ｈｕ−Ａｓｐ２（ａ）（配列番号：２）またはＨｕ−Ａｓｐ２（ｂ）（配列番号：４）のフラグメントをコードするヌクレオチド配列、ここに、該フラグメントはＨｕ−Ａｓｐ２（ａ）またはＨｕ−Ａｓｐ２（ｂ）のアスパルチルプロテアーゼ活性特性を示し；およびストリンジェントハイブリダイゼーション条件下で、配列番号：１および配列番号：３よりなる群から選択されるＨｕ−Ａｓｐ２−コーディングポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドのヌクレオチド配列よりなる群から選択される。本発明は、アルツハイマー病の治療用医薬の製造における、本発明によりＨｕ−Ａｓｐ２のインヒビターであると同定された剤の使用も意図する。
【００３０】
前記段落は、本発明のペプチド基質または該ペプチドを含むポリペプチドを用いるアスパルチルプロテアーゼ活性のモジュレーターを同定する方法を記載する。それらの方法の各々に関し、好ましい具体例は、アスパルチルプロテアーゼインヒビターであると同定されたさらなるモジュレーターを合成するさらなるステップを含む。好ましい変形において、該方法は医薬上許容される希釈剤、アジュバントまたは担体を含む組成物を合成することをさらに含む。所望により、該方法は該組成物を哺乳類に投与して該哺乳類においてアスパルチルプロテアーゼ活性を阻害するさらなるステップをさらに含む。
【００３１】
さらに、本発明は、本発明のβ−セクレターゼ基質ペプチドをβ−セクレターゼ酵素と共に梱包されて含むβ−セクレターゼアッセイを実行するためのキットを意図する。特定の具体例において、該β−セクレターゼ基質は本発明の融合ポリペプチドであってよい。さらなる具体例は、該キットが該ペプチドまたは融合タンパク質の切断を検出する試薬をさらに含んでよいことを意図する。本発明は、配列ＳＥＩＳＹ−ＥＶＥＦＲ（配列番号：１５２）を有する少なくとも１０個のアミノ酸の配列を含む他の好ましいペプチドも記載する。ＳＥＩＳＹ−ＥＶＥＦＲ（配列番号：１５２）のカルボキシ末端および／またはＳＥＩＳＹ−ＥＶＥＦＲ（配列番号：１５２）のアミノ末端に隣接する３、４、５、１０、１２、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５または１００個のアミノ酸を含むペプチドも記載する。好ましいペプチドは、１０、１３、１５、１６、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００個またはそれより長いアミノ酸であってよい。
【００３２】
本発明のさらなる特徴および変形は図面および詳細な記載を含む本出願の全てから当業者には明らかであろうし、同様に、本明細書に記載された本発明の特徴は、特徴の組合わせが本発明の局面または具体例として詳しく上記されているかどうかにはかかわらず、本Ｈつ名の局面として意図されるさらなる具体例に組換え得る。また、本明細書で、本発明にとって臨界的であるとして記載された当該限定のみがそのように見られるべきであり；限定がなく、本明細書で臨界的であるとは記載されていない本発明の変形は本発明の局面である。
上記に加えて、本発明は、さらなる局面として、詳しく上記された変形よりもいかなるようにも狭い範囲の本発明の全ての具体例を含む。本出願人らはここに添付された完全なる請求の範囲を発明したが、ここに添付され請求の範囲はその範囲内に他人の先行技術を包含することを意図しない。したがって、請求の範囲内の法定の先行技術は特許庁または他の存在または個人によって本出願人に喚起された場合、本出願人（ら）は、適用可能な特許法の下、そのような請求項の記載事項を、特に、そのような請求項の範囲からそのような法定の先行技術または法定の先行技術の明白な変形を除外するように再規定する補正する権利を行使する権利を保有する。そのような補正した請求項によって規定される本発明の変形も本発明の局面として意図される。以下に示す詳細な記載は、本発明の好ましい具体例を提供するが、本発明の範囲内の変化および修正が可能であるので、例示的なものとしてのみ意図され、さらに全体として、本発明の精神内にある具体例も提供する。
【００３３】
図面の簡単な記載
以下の図面は本明細書の一部を形成し、本発明の局面をさらに実証するために含まれる。本発明は、ここに与えられた特定の具体例の詳細な記載と組合わせて、図面を参照することによって、さらに理解されるであろう。
図１Ａないし図１Ｄは、本発明の代表的融合ポリペプチド（配列番号：１２８）の連続的完全配列およびポリペプチド（配列番号：１２７）をコードするヌクレオチド配列を図示する。ＭＬＬＬ（配列番号：４４）・・・からＤＡＡＨＰＧ（配列番号：４５）までの分泌されたアルカリホスファターゼの全コーディング配列は通常フォントで示す。修飾されたβ−セクレターゼ切断部位を持つインスリンβ−鎖から誘導体された配列はイタリックである。Ａｓｐ２ ４５４〜４７７からの貫通膜ドメインは下線が付されている。ＤＹＫＤＤＤＫ（配列番号：１１４）はフラッグタグ配列である。
図２は、細胞ベースアッセイにおけるＡｓｐ２に対する基質としての推奨キメラを示す。それぞれ、キメラタンパク質において、「外部」と示された部分はドメイン外部をいい、「内部」と示された部分はドメイン内部をいい、「膜」と示された部分は膜ドメインをいう。
図３は、β−セクレターゼによるＡＰＰプロセシングのウェスタンブロット分析を図示する像を含有する。より高いレベルのＡｓｐ２を発現する安定ＨＥＫ−２９３細胞系統はｗｔ−ＡＰＰまたは様々な突然変異ＡＰＰ ＤＮＡ構築物のいずれかでトランスフェクトされた。トランスフェクションの４８時間後、細胞抽出物をウェスタン分析によって分析した。ヒトＡＰＰのＣ−末端を認識する抗体Ｃ８を完全長ＡＰＰおよびそのプロセシング生成物を検出するのに用いた。β−セクレターゼ活性はＣＴＦ９９の生成またはＣＴＦ８３に対するＣＴＦ９９の割合で判断した。
【００３４】
好ましい具体例の詳細な記載
アルツハイマー病は、進行性痴呆および皮質萎縮および老人斑の沈着および神経原線維変化によって特徴付けられる病態に関連する主要な加齢障害である。該斑の主要な成分は４０〜４２個のアミノ酸長のペプチドであり、完全長ＡＰＰの貫通膜ドメインの部分に隣接し、それを含有するＡＰＰの領域から誘導されたＡβである。この病態ペプチドはβ−およびγ−セクレターゼ活性によるシーケンシャルプロセシングの結果として発生する。これらの酵素の同定のために広汎な捜査がなされているが、該タンパク質の正確な同定には分らないことが残っている。しかしながら、近年、相当たる証拠が蓄積され、Ｈｕ−Ａｓｐ２が該β−セクレターゼ活性のもっともらしい候補であろうと示唆されている。本発明はＨｕ−Ａｓｐ２によって切断され、該ＡＰＰ基質の代替物として作用することができる化合物、分子または基質を提供する。これらの化合物を製造および使用するための方法および組成物は以下にさらに詳細に示される。
【００３５】
Ｉ．Ｈｕ−Ａｓｐ２に対する新規ペプチド基質
本発明は、Ｈｕ−Ａｓｐ２に対する基質を提供する。最初に、Ｈｕ−Ａｓｐ２の可能性のある基質として多数のペプチドを試験した。それらのペプチド：
ＡｃＧＳＥＳＭＤＳＧＩＳＬ−ＤＮＫＷ （配列番号： １１５）、
ＷＫＫＧＡＩＩＧＬ−ＭＶＧＧＶＶＫＫ （配列番号： １１６）、
ＡＮＬ−ＳＴＦＡＱＰＲＲ （配列番号： １１７）、
ＹＲＹＱＳＨＤＹＡＦ−ＳＳＶＥＫＬＬＨＬＧＧＣ（配列番号： １１８）、
ＹＲＹＱＳＨＤＹ−ＡＦＳＳＶＥＫＬＬＨＬＧＧＣ （配列番号： １１９）
をハイフンで隔てられている２つのアミノ酸の間で切断する。
（Ｈｉｓ）６ユビキチンおよび融合タンパク質（Ｈｉｓ）６ユビキチン−ＣＴＰＩＩＩも配列
・・・ ＫＴＩＴＬ−ＥＶＥＰＳ・・・ （配列番号： １２０）
中のＬｅｕ残基のＣ−末端側にて切断する。
【００３６】
しかしながら、これら全ての基質はスウェディッシュ突然変異体形態のＡＰＰ：ＳＥＶＮＬ−ＡＡＥＦＲ（配列番号：１９）に対応するペプチドよりも低い効率で切断される。興味深いことに、酸化されたインスリンＢ鎖はＡｓｐ２の基質であり、ＳＥＶＮＬ−ＤＡＥＦＲ（配列番号：１９）に匹敵する速度にて切断される。該インスリンＢ鎖の切断部位は配列ＶＥＡＬＹ−ＬＶＣ（ＳＯ３）ＧＥＲ（配列番号：１２１）の間にある。システイン酸の代わりにＧｌｕを持つさらなるペプチド（ＶＥＡＬＹ−ＬＶＥＧＥＲ（配列番号：１２２））も試験され、Ｈｕ−Ａｓｐ２によって切断されることが分った。これらの観察を用いて、本発明者らは、上記Ｈｕ−Ａｓｐ２基質とさらなる既知のＨｕ−Ａｓｐ２基質とのさらなる比較を行って、該切断部位およびその周囲を占有する特定のアミノ酸に関する情報を調査した。
【００３７】
アミノ酸についての従来の略号を以下のごとく本明細書で用いる：アラニン、Ａｌａ，Ａ；アルギニン、Ａｒｇ，Ｒ；アスパラギン、Ａｓｎ，Ｎ；アスパラギン酸、Ａｓｐ，Ｄ；システイン、Ｃｙｓ，Ｃ；グルタミン、Ｇｌｎ，Ｑ；グルタミン酸、Ｇｌｕ，Ｅ；グリシン、Ｇｌｙ，Ｇ；ヒスチジン、Ｈｉｓ，Ｈ；イソロイシン、Ｉｌｅ，Ｉ；ロイシン、Ｌｅｕ，Ｌ；リジン、Ｌｙｓ，Ｋ；メチオニン、Ｍｅｔ，Ｍ；フェニルアラニン、Ｐｈｅ，Ｆ；プロリン、Ｐｒｏ，Ｐ；セリン、Ｓｅｒ，Ｓ；トレオニン、Ｔｈｒ，Ｔ；トリプトファン、Ｔｒｐ，Ｗ；チロシン、Ｔｙｒ，Ｙ；バリン、Ｖａｌ，Ｖ；アスパラギン酸またはアスパラギン、Ａｓｘ，Ｂ；グルタミン酸またはグルタミン、Ｇｌｘ，Ｚ；ノルロイシン、Ｎｌｅ；アセチル−グリシン、（Ａｃ）Ｇ；任意のアミノ酸、Ｘａａ，Ｘ。さらなる修飾アミノ酸も本明細書に記載されたように用いることができる。例えば、Ｃ（ＳＯ３）はシステイン酸をいう。
【００３８】
テーブル１に示されたペプチドはＨｕ−Ａｓｐ２についての推定切断部位を示すハイフンを含む。
【００３９】
【表１】
2004504018.tif 000002
【００４０】
【表２】
2004504018.tif 000003
【００４１】
本明細書全体を通して用いられるように、ＣＯＸおよびＣ（ＳＯ３）は酸化システインといい、さもなくば、本明細書でシステイン酸といい、これらの用語は本明細書および当該分野で交換可能に用いられる。システイン酸を本発明のペプチド基質の特定の残基に用いる限りその残基にシステインを含むさらなる基質も意図されることは特筆すべきである。好ましい具体例において、配列番号：３６および配列番号：３７中のシステインをシステイン酸に酸化する。
【００４２】
本発明のペプチドは、シェヒター（Ｓｃｈｅｃｈｔｅｒ）およびベルガー（Ｂｅｒｇｅｒ）［「バイオケミカル・アンド・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケーションズ（Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ．）」、第２７巻、１９６７年、ｐ．１５７；「バイオケミカル・アンド・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケーションズ（Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ．）」、第３２巻、１９６８年、ｐ．８９８］によっる命名法を用いて記載し、それらにおいて、切断を受けるペプチド基質中のアミノ酸残基は切れやすい結合からＮ−末端に向って始まるＰ１・・・Ｐｎとして、および切れやすい結合からＣ−末端に向って始まるＰ１’・・・Ｐｎ’として定義される。かくして、切れやすい結合は、該ペプチドサブユニットのＰ１とＰ１’残基との間にあり、本明細書を通して、Ｐ１とＰ１’との間のハイフンで表す。
【００４３】
有効なＨｕ−Ａｓｐ２基質である本発明のペプチドにおいて、Ｔｙｐ／ＰｈｅおよびＬｅｕはＰ１部位にて最も豊富なアミノ酸であり；ＡｓｎはＰ２部位に何度か出現し；Ｇｌｕ、Ａｓｐ、およびＡｌａはＰ１’において優勢であり；ＶａｌはＰ２’に頻繁に出現し；配列Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｇｌｕは、もう一つのＡｓｐ２基質であるユビキチンのＰ１’Ｐ２’Ｐ３’に出現し；他の位置はいかなる明白な優先性も示さなかった。これらの観察を用いて、酸化されたインスリンβ−鎖の切断部位、特にＰ２−Ｐ３’の辺りのアミノ酸置換を行った。
【００４４】
テーブル２に列記したペプチドをＨｕ−Ａｓｐ２のための基質としてデザインし、合成し、活性につき試験した。２１０ｎＭ Ｈｕ−Ａｓｐ２酵素と共に、２００μＭの各試験基質をｐＨ４．５、３７℃にて３時間インキュベートした。もちろん、これらは単に代表的なアッセイ条件であると理解されるべきであり、当業者はこれらの条件を変化させ、さらには、適切なＨｕ−Ａｓｐ２活性を付与することが可能である。例えば、該アッセイは約４．０から約７．０の間のｐＨ範囲にて実行することが想像される。所定の反応混合物に添加される酵素量も変化させることができ、当業者は、所定のアッセイにつき必要とされる最適酵素濃度を規定するアッセイを行うことができ、１５０ｎｍ；２００ｎｍ；２５０ｎｍ：３００ｎｍまたはそれ以上、またはそれ以下の酵素を添加することができる。それは、一つの基質が一つの濃度にて最適活性を生ずるが、もう一つの基質は最適切断速度を生ずるために異なる濃度にて存在する必要があるということであろう。しかしながら、そのような酵素アッセイ条件の最適化は十分に当業者の技術範囲にあり、過度の実験を必要としない。
【００４５】
以下のテーブル２において、活性を生ずる基質を「＋」で表し、より大きな活性にはさらなる「＋」を与える。Ｈｕ−Ａｓｐ２によって切断されないそれらの基質は「−」で表す。
【００４６】
【表３】
2004504018.tif 000004
【００４７】
推定基質の上記リストから、ＫＶＥＡＮＹ−ＥＶＥＧＥＲＫＫ（配列番号：５）がさらなる研究に選ばれた。詳しくは、ＣｙｓをＲとＫＫとの間に挿入して、ペプチドＫＶＥＡＮＹ−ＥＶＥＧＥＲＣＫＫ（配列番号：６）を得た。このペプチドはＨｕ−Ａｓｐ２について良好な基質であった。さらなるステップにおいて、このペプチドをＮ−末端ビオチン化し、該Ｃｙｓ残基にオレゴングリーンを共有結合することによって蛍光性にした。得られた化合物、ビオチン−ＫＶＥＡＮＹ−ＥＶＥＧＥＲＣ（オレゴングリーン）ＫＫ（配列番号：４９）を以下の条件で試験した：１０μＭ 基質、５０ｎＭ 酵素、３７℃にて。反応を２時間進行させ、試料を何度か抜き出した。結果は、２０％、３７％、５７％、および８２％の切断が、それぞれ、１５、３０、６０、および１２０分間後に生じたことを示した。質量分光分析は、ＴｙｒとＧｌｕとの間でのみ切断が生じたことを示した。新たなビオチン化蛍光ペプチドは、スウェディッシュ突然変異ペプチドから誘導化された以前のビオチン化蛍光基質について得られた値の少なくとも２倍の値であるＶｍａｘおよびＫｍ値を得たことを示す。
【００４８】
それぞれ、配列番号：５および配列番号：７のＰ１’−Ｐ３’位に出現するＥＶＥおよびＡＶＥ配列（テーブル２）がさらなる修飾のために選ばれた。蛍光基質ビオチン−ＫＶＥＡＮＹ−ＥＶＥＧＥＲＣ（オレゴングリーン）ＫＫ（配列番号：４９）を開発する場合なので、ＥＶＥ配列を修飾の出発点として選んだ。詳しくは、デカペプチドＫＴＩＴＬ−↓−ＥＶＥＰＳ（配列番号：１２０）の場合、ＥＶＥ配列を選んだ。なぜならば、このデカペプチド中のアミノ酸配列はユビキチン中で見つかった切断部位Ｌ−↓−Ｅを包含する１０個のアミノ酸のストレッチ（テーブル１の配列番号：２６を参照せよ）の正確な模倣体だからである。
【００４９】
【表４】
2004504018.tif 000005
【００５０】
Ｐ１’−Ｐ３’（ＥＶＥ）部位にての修飾に加えて、Ｐ２−Ｐ１部位にも修飾を行った。ＫＴＩＴＬ−↓−ＥＶＥＰＳ（配列番号：１２０）の６つの変異体を構築し、Ａｓｐ２の基質としてのそれらの活性をスウェディッシュ突然変異ペプチド（配列番号：１９）および野生型ペプチド（配列番号：２０）（テーブル３）によって示された活性と比較した。配列番号：１２０の配列を有するユビキチン誘導ペプチドは野生型ペプチド（配列番号：２０）よりも６倍よいが、スウェディッシュ突然変異体（配列番号：１９）（テーブル３）によって示された活性の約１３％しかなかった。しかしながら、該Ｐ２ ＴｈｒのＡｓｎでの置換はスウェディッシュ突然変異体（配列番号：１９）のものと同等の活性を持つ配列番号：１３３の配列を持つペプチドを生じた。ペプチド＃２（配列番号：１３３）のＰ１位にてのＬｅｕの非天然アミノ酸ノルロイシンでの置換（ペプチド＃３、配列番号：１３４）は、スウェディッシュ突然変異体のものと同等の活性を与えた。Ｐ３’におけるペプチド＃３（配列番号：１３４）のＧｌｕのＡｓｐでの置換（ペプチド＃４、配列番号：１３５）も非常に十分に寛容であった。しかしながら、ペプチド＃３（配列番号：１３４）のＰ１’およびＰ３’位にある２つのＧｌｕ残基の２つのＡｓｐ残基での突然変異は、ペプチド＃５（配列番号：１３６）を与え、活性を約１０倍低下させる。ペプチド＃１（配列番号：１２０）は、セリン残基をＰ２に、ＡｓｐをＰ１’位に置くことによって修飾して、ＫＴＩＳＬ−↓−ＤＶＥＰＳ（ペプチド＃６、配列番号：１３７）を得る。この二重置換は十分に寛容であり、野生型ペプチドの約３５倍高い活性およびスウェディッシュ突然変異体（配列番号：１９）の活性の６９％活性を与えた。しかしながら、ペプチド＃６（配列番号：１３７）のＰ３’位にＧｌｕの代わりにＡｓｐを置いて、ペプチド＃７（配列番号：１３８）を得たとき、活性は実質的に降下した。ペプチド＃５（配列番号：１３６）で観察したように、Ｐ１’およびＰ３’位のＧｌｕ残基は同じ位置のＡｓｐ残基に対して非常に好ましい。
【００５１】
上記のＡｓｐ２基質の最適化はＡｓｎをＰ２に残す（テーブル２および３）。これはイン・ビトロアッセイにとって許容される。なぜならば、最適化はインスリンＢ−鎖およびユビキチンの場合になされたからである。しかしながら、いくつかの場合、該ＡＰＰ配列の最小限の崩壊の細胞ベースアッセイを開発することが望ましい。これまでに、インスリンＢ−鎖およびユビキチンの配列に対する変形を含む研究はＡｓｐ２のβ−セクレターゼ切断部位およびその近くのアミノ酸の効果およびこの酵素によるＡＰＰプロセシングに対するそれらの効果についての大量の情報をもたらした。この情報を用いて配列ＳＥＶＫＭ−↓−ＤＡＥＦＲ（配列番号：２０）／ＳＥＶＮＬ−↓−ＤＡＥＦＲ（配列番号：１９）（野生型／スウェディッシュ突然変異体）におけるＰ２−Ｐ２’を修飾し、β−セクレターゼ切断に対して高度に感受性である最小限に変化させたＡＰＰ形態を生成し得る。そのような基質はＡＰＰプロセシング、Ａβ生成、およびβ−セクレターゼモジュレーションについての細胞ベースアッセイ、ならびに野生型または突然変異ＡＰＰを用いるであろういずれかの他のアッセイに有用である。
【００５２】
上記の原理を用いて、本発明者らは、ＡＰＰのＰ２位にての残基を調査して、セリンが本発明のＡｓｐ２基質におけるＬｙｓ／Ａｓｎの良好な置換物であることを発見した。かくして、特に好ましい具体例において、本発明の基質中のＰ２位にてのアミノ酸はセリンである。したがって、ＡＰＰにおけるβ−セクレターゼ切断部位を取り囲む４つのアミノ酸、すなわち、・・・ＫＭ−↓−ＤＡ・・・（配列番号：１３９）の・・・ＳＹ−↓−ＥＶ・・・（配列番号：１４０）での置換えは、野生型に見られるものの７０倍大きな速度にてＡｓｐ２によって加水分解されたペプチドＳＥＶＳＹ−↓−ＥＶＥＦＲ（配列番号：１４１）を生成した。この発見は、β−セクレターゼ切断に対して非常に感受性である最小限に変化させたＡＰＰを生成する手段を提供し、したがって、Ａｓｐ２のインヒビターについて試験する改良された細胞ベースアッセイに対する基礎として機能する。
【００５３】
【表５】
2004504018.tif 000006
【００５４】
テーブル４において、該Ａｓｐ２の活性を３つの新規に合成された化合物、野生型、およびスウェディッシュ突然変異体と比較する。ＳＥＶＳＹ−↓−ＤＡＥＦＲ（配列番号：１４３）活性は野生型に対して約９倍増加したが、依然として、スウェディッシュ突然変異体（配列番号：１９）の約５倍も低い。トリプレットＫＭ−↓−ＤをＳＹ−↓−Ｅで置換してＳＥＶＳＹ−↓−ＥＡＥＦＲ（配列番号：１４４）を得ると野生型に対して４０倍のオーダーの活性の向上が生じ、スウェディッシュ突然変異体のものに匹敵する活性を有した。野生型ペプチドの活性部位にての４つのアミノ酸、ＫＭ−↓−ＤＡ（配列番号：１３９）をＳＹ−↓−ＥＶ（配列番号：１４０）で置換して配列ＳＥＶＳＹ−↓−ＥＶＥＦＲ（配列番号：１４１）を得ると、野生型ペプチドに対して７０倍近くの増加およびスウェディッシュ突然変異体に対して１．４倍の増加が得られた。
【００５５】
さらに、本発明者らは、さらなる基質を生成して、Ａｓｐ２切断可能性につき基質ＳＥＶＳＹ−↓−ＥＶＥＦＲ（配列番号：１４１）を超えてさらに向上させた。得られた結果をテーブル５にまとめる。一つの方策において、ＳＥＶＳＹ−↓−ＥＶＥＲＲ（配列番号：１４１）を、詳しくは、５−、１０−および１５−残基分、Ｎ−末端延長した。これらの延長に含まれる全てのアミノ酸はＡＰＰ天然配列からのものである。
【００５６】
【表６】
2004504018.tif 000007
【００５７】
興味深いことに、ＴＲＰＧＳＧＬＴＮＩＫＴＥＥＩＳＥＶＳＹ−ＥＶＥＦＲ（配列番号：１４５）は、ＳＥＶＳＹ−↓−ＥＶＥＦＲ（配列番号：１４１）の８．４倍速い速度で切断される（テーブル５）。ＳＥＶＳＹ−↓−ＥＶＥＦＲ（配列番号：１４１）より５残基長いだけのペプチドＫＴＥＥＩＳＥＶＳＹ−ＥＶＥＦＲ（配列番号：１４１）は、後者ペプチドの３．６倍速い速度で切断される（テーブル５）。第２の方策において、本発明者らは、Ｐ側のＳＥＶＳＹ−↓−ＥＶＥＦＲ（配列番号：１４１）、詳しくは、Ｐ５、Ｐ３およびＰ１位を修飾して、Ａｓｐ２に対する活性を増大した。本発明者らはこの方策を用いて、ＳＥＶＳＹ−↓−ＥＶＥＦＲ（配列番号：１４１）で観察された活性よりも高い活性レベルを達成する基質を得た（テーブル５）。本発明の特に良好な基質は、ＳＥＩＳＹ−ＥＶＥＦＲ （配列番号： １５２）であり、ここに、Ｉｌｅは、ＳＥＶＳＹ−↓−ＥＶＥＦＲ （配列番号： １４１）中のＰ３ Ｖａｌに取って代わる。ＶａｌのＩｌｅでの置換は活性において５倍増加をもたらした。
【００５８】
Ｐ３位のアミノ酸Ｉｌｅはユビキチン切断部位に対応する（テーブル３を参照せよ）。テーブル５の結果に基づき、本発明者らは、例えば、５ないし１５残基分のＳＥＩＳＹ−ＥＶＥＦＲ （配列番号： １５２）のＮ−末端の延長が活性において実質的な増加をもたらすと予想した。そのような延長されたペプチドの例は、限定されないが、ＳＥＩＳＹ−ＥＶＥＦＲＸＫＫ（配列番号：１５４）；ＫＴＥＥＩＳＥＩＳＹ−ＥＶＥＦＲＸＫＫ（配列番号：１５５）；ＧＬＴＮＩＫＴＥＥＩＳＥＩＳＹ−ＥＶＥＦＲＸＫＫ（配列番号：１５６）；ＴＲＰＧＳＧＬＴＮＩＫＴＥＥＩＳＥＩＳＹ−ＥＶＥＦＲＸＫＫ（配列番号：１５７）；ビオチン−ＳＥＩＳＹ−ＥＶＥＦＲＸＫＫ（配列番号：１５８）；ビオチン−ＫＴＥＥＩＳＥＩＳＹ−ＥＶＥＦＲＸＫＫ（配列番号：１５９）；ビオチン−ＧＬＴＮＩＫＴＥＥＩＳＥＩＳＹ−ＥＶＥＦＲＸＫＫ（配列番号：１６０）；Ｘがトリプトファンであるビオチン−ＴＲＰＧＳＧＬＴＮＩＫＴＥＥＩＳＥＩＳＹ−ＥＶＥＦＲＸＫＫ（配列番号：１６１）およびＳＥＩＳＹ−ＥＶＥＦＲＸＫＫ（配列番号：１６２）；ＫＴＥＥＩＳＥＩＳＹ−ＥＶＥＦＲＸＫＫ（配列番号：１６３）；ＧＬＴＮＩＫＴＥＥＩＳＥＩＳＹ−ＥＶＥＦＲＸＫＫ（配列番号：１６４）；ＴＲＰＧＳＧＬＴＮＩＫＴＥＥＩＳＥＩＳＹ−ＥＶＥＦＲＸＫＫ（配列番号：１６５）；ビオチン−ＳＥＩＳＹ−ＥＶＥＦＲＸＫＫ（配列番号：１６６）；ビオチン−ＫＴＥＥＩＳＥＩＳＹ−ＥＶＥＦＲＸＫＫ（配列番号：１６７）；ビオチン−ＧＬＴＮＩＫＴＥＥＩＳＥＩＳＹ−ＥＶＥＦＲＸＫＫ（配列番号：１６８）；Ｘがオレゴングリーンまたは他の蛍光性部分であるビオチン−ＴＲＰＧＳＧＬＴＮＩＫＴＥＥＩＳＥＩＳＹ−ＥＶＥＦＲＸＫＫ（配列番号：１６９）を含む。この開示を考慮して、当業者は本明細書に開示されたペプチド基質のいずれを修飾し延長して、さらなる有用なＡｓｐ２基質を得ることができることが意図される。
【００５９】
本発明の他の好ましいペプチドは、ＳＥＩＳＹ−ＥＶＥＦＲＷＫＫ（配列番号：１９０）、ＧＬＴＮＩＫＴＥＥＩＳＥＩＳＹ−ＥＶＥＦＲＷＫＫ（配列番号：１９１）、ビオチン−ＫＥＩＳＥＩＳＹ−ＥＶＥＦＲ（Ｃｙｓ−オレゴングリーン）ＫＫ（配列番号：１９２）およびビオチン−ＧＬＴＮＩＫＴＥＥＩＳＥＩＳＹ−ＥＶＥＦＲ（Ｃｙｓ−オレゴングリーン）ＫＫ（配列番号：１９３）を含む。後の２つのペプチドにおいて、該ビオチンはストレプトアビジンでの捕捉を容易にし、オレゴングリーンは配列番号：１９０および配列番号：１９１のペプチド中のトリプトファンからの発光より優れた蛍光発光を与える。
【００６０】
基質ＳＥＩＳＹ−ＥＶＥＦＲＷＫＫ（配列番号：１９０）およびＧＬＴＮＩＫＴＥＥＩＳＥＩＳＹ−ＥＶＥＦＲＷＫＫ（配列番号：１９１）において、ペプチドＳＥＩＳＹ−ＥＶＥＦＲＷＫＫ（配列番号：１９０）の１０個のＮ−末端アミノ酸はペプチドＳＥＩＳＹ−ＥＶＥＦＲ（配列番号：１５２）のそれらと同一である。これら２つのペプチドの差異は、配列番号：１９０のペプチド中の１つのトリプトファンおよび２つのリジンの存在である。ＳＥＩＳＹ−ＥＶＥＦＲＷＫＫ（配列番号：１９０）およびＳＥＩＳＹ−ＥＶＥＦＲ（配列番号：１５２）は、Ｈｕ−Ａｓｐ２に対して同じような活性を有するが、蛍光トリプトファンの付加がＨＰＬＣアッセイの感度を増大した。さらに、２つのリジンの付加が溶解性を増大した。Ｈｕ−Ａｓｐ活性がＳＥＩＳＹ−ＥＶＥＦＲＷＫＫ（配列番号：１９０）およびＧＬＴＮＩＫＴＥＥＩＳＥＩＳＹ−ＥＶＥＦＲＷＫＫ（配列番号：１９１）に対して試験された。予想通り、配列番号：１９１のペプチドは配列番号：１９０のペプチドよりもかなり活性であった。これらのペプチドの活性差はｐＨ４．０〜４．６の範囲で特に劇的であった。詳しくは、それは配列番号：１９０のペプチドの６．３〜４．８倍高かった。配列番号：１９０のペプチドの活性はイオン強度の増加と共に配列番号：１９１のペプチドの活性よりも急激に低下した。両方のペプチドはＤＭＳＯの濃度の増加によって阻害された。１００ｍＭ ＮａＯＡｃ−ＨＯＡｃ、ｐＨ４．５にて行われた研究において、配列番号：１９０のペプチドはＶｍａｘ＝１８５ｎｍｏｌ／ｍｇ／分およびＫｍ＝８６．７μＭを示し、一方、配列番号：１９１のペプチドはＶｍａｘ＝１２６０ｎｍｏｌ／ｍｇ／分およびＫｍ＝４３．１μＭを示した。予想通り、Ｎ−末端延長は活性を増大した。さらに、該スウェディッシュ突然変異体ＡＰＰが該β−セクレターゼ切断部位を取り込んだ後に生成された内部失活ペプチド基質（ＭＣＡ）Ａｃ−ＳＥＶＮＬ−ＤＡＥＦＲＫ（Ｄｎｐ）ＲＲ−ＮＨ２（配列番号：１９５）は、Ｖｍａｘ＝１８ｎｍｏｌ／ｍｇ／分およびＫｍ＝７μＭを示した。明らかに、Ｖｍａｘにおける７０倍の向上が、配列番号：１９５のスウェディッシュ突然変異体ペプチドから配列番号：１９１のペプチドに移行して達成した。配列番号：１９０および配列番号：１９１の基質の開発はＨｕ−Ａｓｐ阻害研究およびＥ．ｃｏｌｉ封入体から再折畳みされる組換えＨｕ−Ａｓｐに関する研究において大きな価値がある。
【００６１】
本発明のペプチド基質は、配列番号：１９；配列番号：２０；配列番号：２１；配列番号：２６；配列番号：２７；配列番号：２８；配列番号：３１；配列番号：３２；配列番号：３３；配列番号：３４；配列番号：３５；配列番号：３６；配列番号：３７；配列番号：３８；配列番号：３９；または配列番号：４０の配列のいずれにも示されていないβ−セクレターゼ切断部位を含むアミノ酸であるかぎり、任意の長さのアミノ酸であってよい。好ましくは、Ｈｕ−Ａｓｐ２に対する新規ペプチド基質は、長さにおいて少なくとも約５個のアミノ酸であり、ある具体例において、本発明の新規ペプチドは約５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４５、５０個、またはそれ以上のアミノ酸の連続アミノ酸配列を含むことができる。
【００６２】
一般に、本発明のペプチドは、シェヒターおよびベルガー命名法と一致する基礎的モチーフによって規定され、Ｐ２Ｐ１−Ｐ１’Ｐ２’Ｐ３’；Ｐ２Ｐ１−Ｐ１’Ｐ２’Ｐ３’Ｐ４’；Ｐ３Ｐ２Ｐ１−Ｐ１’Ｐ２’Ｐ３；Ｐ３Ｐ２Ｐ１−Ｐ１’Ｐ２’Ｐ３Ｐ４’；Ｐ４Ｐ３Ｐ２Ｐ１−Ｐ１’Ｐ２’Ｐ３；Ｐ４Ｐ３Ｐ２Ｐ１−Ｐ１’Ｐ２’Ｐ３’Ｐ４’を含み、ここに、Ｐ２は荷電アミノ酸、極性アミノ酸、または脂肪族アミノ酸であるが、芳香族アミノ酸ではなく；Ｐ１は芳香族アミノ酸または荷電アミノ酸であるが、極性アミノ酸または荷電アミノ酸ではなく；Ｐ１’は荷電アミノ酸、または脂肪族アミノ酸、または極性アミノ酸であるが、芳香族アミノ酸ではなく；Ｐ２’は非荷電脂肪族極性アミノ酸または芳香族アミノ酸であり；Ｐ３’は、好ましくは、荷電アミノ酸であるが、任意の他のアミノ酸であってよく；Ｐ３は極性アミノ酸、脂肪族アミノ酸または芳香族アミノ酸であるが、荷電アミノ酸でなく；Ｐ４は荷電アミノ酸、極性アミノ酸または脂肪族アミノ酸であるが芳香族アミノ酸ではなく；およびＰ４’は、好ましくは、極性アミノン酸であるが、任意のアミノ酸であってよい。
【００６３】
最終的に、新規基質の配列がＰｎ・・・Ｐ１−Ｐ１’・・・Ｐｎ’の配列を含むことができることが意図される。該ペプチドの長さは、該基質がＨｕ−Ａｓｐ２によって切断され得るβ−セクレターゼ切断部位を含むかぎり、任意の長さであってもよい。同様に、ｎ’によって規定される整数は、該基質がＨｕ−Ａｓｐ２によって切断され得るβ−セクレターゼ切断部位を含むかぎり、任意の整数であってもよい。ｎおよびｎ’は同一または異なってよい。好ましくは、該β−セクレターゼ切断部位は、（その成熟形態および生物学的に活性なフラメントを含む）配列番号：１または配列番号：３の核酸配列によってコードされるヒトアスパルチルプロテアーゼによって切断されることが可能なものである。
【００６４】
芳香族アミノ酸、荷電アミノ酸、脂肪族アミノ酸および極性アミノ酸なる用語は当業者によく知られ、本発明のそれらの使用は当該分野の用語と一致する。例えば、芳香族アミノ酸はフェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファンであり、（生理的ｐＨにて）荷電アミノ酸はリジン、アルギニン、アスパラギン酸塩、グルタミン酸塩および場合によってヒスチジンであり、極性アミノ酸はアスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギンおよびグルタミンであって、脂肪族側鎖を代表するアミノ酸はグリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリンおよびトレオニンである。
【００６５】
Ｐ４、Ｐ３、Ｐ２、Ｐ１、Ｐ１’、Ｐ２’、Ｐ３’またはＰ４’の位置のいずれかに位置すべき特定のアミノ酸を考慮すると、本明細書に記載されたＨｕ−Ａｓｐ２に対する有効な基質として知られているペプチドにおける各位置にてのアミノ酸のハイドロパシー指標を検討し、および同様のハイドロパシー指標を持つもので所定のアミノ酸を置換することが有用であろう。アミノ酸の相対的ハイドロパシー特性が得られたタンパク質またはペプチドの二次構造に寄与し、その結果、それがそのタンパク質と他の分子、例えば、酵素、基質、受容体、ＤＮＡ、抗体、抗原等との相互作用を規定する。各アミノ酸はそれらの疎水性および荷電特性を基にしてハイドロパシー指標に割当てられている（［カイト（Ｋｙｔｅ）およびドゥーリトル（Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ）、「ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．）」、第１５７（１）巻、１９８２年、ｐ．１０５−１３２］、出典明示して本明細書に含まれる）。一般に、アミノ酸は同様のハイドロパシー指標またはスコアを有する他のアミノ酸によって置換することができ、依然として、同様の生物学的活性をもらたし、すなわち、依然として、生物学機能的に同等なタンパク質またはペプチドを得る。本発明のペプチドの場合、生物学機能的に同等なタンパク質またはペプチドは配列番号：２０を含む未変性ＡＰＰペプチドの切断速度を超える速度にてβ−セクレターゼによって依然として切断されるものであろう。
【００６６】
さらに、類似するアミノ酸の置換は疎水性を基にして効率的になし得る。出典明示して本明細書に含まれる米国特許第４，５５４，１０１号は、タンパク質の最大局所平均疎水性はその隣接アミノ酸の疎水性に左右され、該タンパク質の生物学的特性に相関する。そうであるので、アミノ酸は同様の疎水性値を有する他のものと置換され、依然として生物学的に同等であって、免疫学的に同等なタンパク質を得る。
【００６７】
テーブル６は、Ｐ４、Ｐ３、Ｐ２、Ｐ１、Ｐ１’、Ｐ２’、Ｐ３’およびＰ４’位それぞれに有用である代表的なアミノ酸を示す。
【００６８】
【表７】
2004504018.tif 000008
【００６９】
ペプチドが上記テーブルから構築され、例えば、Ｐ１位に、Ｐ１欄のアミノ酸Ｂ１ないしＢ７のいずれかを有することが意図される。かくして、本発明の場合に有用であろう特定の基質は、
●ＡＮＹ−ＥＶＥＦ（配列番号：４９）；Ｅ＃ＮＹ−ＥＶＥＦ（配列番号：５０）；ＥＡ＄Ｙ−ＥＶＥＦ（配列番号：５１）；ＥＡＮ◆−ＥＶＥＦ（配列番号：５２）；ＥＡＮＹ−◇ＶＥＦ（配列番号：５３）；ＥＡＮＹ−Ｅ＆ＥＦ（配列番号：５４）；ＥＡＮＹ−ＥＶ￥Ｆ（配列番号：５５）；ＥＡＮＹ−ＥＶＥ＆（配列番号：５６）；●ＶＬＬ−ＡＡＧＷ（配列番号：５７）；Ｇ＃ＬＬ−ＡＡＧＷ（配列番号：５８）；ＧＶ＄Ｌ−ＡＡＧＷ（配列番号：５９）；ＧＶＬ◆−ＡＡＧＷ（配列番号：６０）；ＧＶＬＬ−◇ＡＧＷ（配列番号：６１）；ＧＶＬＬ−Ａ＆ＧＷ（配列番号：６２）；ＧＶＬＬ−ＡＡ￥Ｗ（配列番号：６３）；ＧＶＬＬ−ＡＡＧ＆（配列番号：６４）；●ＩＫＭ−ＤＮＦＧ（配列番号：６５）；Ｉ＃ＫＭ−ＤＮＦＧ（配列番号：６６）；ＩＩ＄Ｍ−ＤＮＦＧ（配列番号：６７）；ＩＩＫ◆−ＤＮＦＧ（配列番号：６８）；ＩＩＫＭ−◇ＮＦＧ（配列番号：６９）；ＩＩＫＭ−Ｄ＆ＦＧ（配列番号：７０）；ＩＩＫＭ−ＤＮ￥Ｇ（配列番号：７１）；ＩＩＫＭ−ＤＮＦ＆（配列番号：７２）；●ＳＳＮｌＥ−ＭＴＨＡ（配列番号：７３）；Ｄ＃ＳＮｌＥ−ＭＴＨＡ（配列番号：７４）；ＤＳ＄ＮｌＥ−ＭＴＨＡ（配列番号：７５）；ＤＳＳ◆−ＭＴＨＡ（配列番号：７６）；ＤＳＳＮｌＥ−◇ＴＨＡ（配列番号：７７）；ＤＳＳＮｌＥ−Ｍ＆ＨＡ（配列番号：７８）；ＤＳＮｌＥ−ＭＴ￥Ａ（配列番号：７９）；ＤＳＮｌＥ−ＭＴＨ＆（配列番号：８０）；●ＨＧＦ−ＱＬＣ＊Ｈ（配列番号：８１）；Ｔ＃ＧＦ−ＱＬＣ＊Ｈ（配列番号：８２）；ＴＨ＄Ｆ−ＱＬＣ＊Ｈ（配列番号：８３）；ＴＨＧ◆−ＱＬＣ＊Ｈ（配列番号：８４）；ＴＨＧＦ−◇ＬＣ＊Ｈ（配列番号：８５）；ＴＨＧＦ−Ｑ＆Ｃ＊Ｈ（配列番号：８６）；ＴＨＧＦ−ＱＬ￥Ｈ（配列番号：８７）；ＴＨＧＦ−ＱＬＣ＊＆（配列番号：８８）；●ＹＴＨ−ＳＦＳＰ（配列番号：８９）；Ｃ＊＃ＴＨ−ＳＦＳＰ（配列番号：９０）；Ｃ＊Ｙ＄Ｈ−ＳＦＳＰ（配列番号：９１）；Ｃ＊ＹＴ◆−ＳＦＳＰ（配列番号：９２）；Ｃ＊ＹＴＨ−◇ＦＳＰ（配列番号：９３）；Ｃ＊ＹＴＨ−Ｓ＆ＳＰ（配列番号：９４）；Ｃ＊ＹＴＨ−ＳＦ￥Ｐ（配列番号：９５）；Ｃ＊ＹＴＨ−ＳＦＳ＆（配列番号：９６）；●ＴＤＸ−ＧＳＸＧ（配列番号：９７）；Ｓ＃ＤＸ−ＧＳＸＧ（配列番号：９８）；ＳＴ＄Ｘ−ＧＳＸＧ（配列番号：９９）；ＳＴＤ◆−ＧＳＸＧ（配列番号：１００）；ＳＴＤＸ−◇ＳＸＧ（配列番号：１０１）；ＳＴＤＸ−Ｇ＆ＸＧ（配列番号：１０２）；ＳＴＤＸ−ＧＳ￥Ｇ（配列番号：１０３）；ＳＴＤＸ−ＧＳＸ＆（配列番号：１０４）；●ＦＡＸ−ＸＸＸＮ（配列番号：１０５）；Ｘ＃ＡＸ−ＸＸＸＮ（配列番号：１０６）；ＸＦ＄Ｘ−ＸＸＸＮ（配列番号：１０７）；ＸＦＡ◆−ＸＸＸＮ（配列番号：１０８）；ＸＦＡＸ−◇ＸＸＮ（配列番号：１０９）；ＸＦＡＸ−Ｘ＆ＸＮ（配列番号：１１０）；ＸＦＡＸ−ＸＸ￥Ｎ（配列番号：１１１）；ＸＦＡＸ−ＸＸＸ＆（配列番号：１１２）を含み、ここに、「Ｘ」は任意のアミノ酸を表し；「●」は、例えば、Ｅ、Ｇ、Ｉ、Ｄ、Ｔ、Ｃ＊、Ｓを表し；「＃」は、例えば、Ａ、Ｖ、Ｉ、Ｓ、Ｈ、Ｙ、Ｔ、Ｆを表し；「＄」は、例えば、Ｎ、Ｌ、Ｋ、Ｓ、Ｇ、Ｔ、Ｄ、Ａ、Ｑ、Ｅを表し；「◆」は、例えば、Ｙ、Ｌ、Ｍ、Ｎｌｅ、Ｆ、Ｈを表し；「◇」は、例えば、Ｅ、Ａ、Ｄ、Ｍ、Ｑ、Ｓ、Ｇを表し；「＆」は、例えば、Ｖ、Ａ、Ｎ、Ｔ、Ｌ、Ｆ、Ｓを表し；「￥」は、例えば、Ｅ、Ｇ、Ｆ、Ｈ、Ｃ＊、Ｓを表し；「＆」は、例えば、Ｆ、Ｗ、Ｇ、Ａ、Ｈ、Ｐ、Ｇ、Ｎ、Ｓ、Ｅを表す。
【００７０】
本発明の特に好ましいペプチドは、ＫＶＥＡＮＹ−ＥＶＥＧＥＲＫＫ（配列番号：５）；ＫＶＥＡＮＹ−ＥＶＥＧＥＲＣＫＫ（配列番号：６）；ＫＶＥＡＮＹ−ＡＶＥＧＥＲＫＫ（配列番号：７）；ＫＶＥＡＮＹ−ＡＶＥＧＥＲＣＫＫ（配列番号：８）；ＥＡＮＹ−ＥＶＥＦ（配列番号：９）；ＧＶＬＬ−ＡＡＧＷ（配列番号：１０）；ＩＩＫＭ−ＤＮＦＧ（配列番号：１１）；ＤＳＳＮｌｅ−ＭＴＨＡ（配列番号：１２）；ＴＨＧＦ−ＱＬＣ＊Ｈ（配列番号：１３）；ＣＹＴＨ−ＳＦＳＰ（配列番号：１４）；ＳＴＦＸ−ＧＳＸＧ（配列番号：１５）；ＸＦＡＸ−ＸＸＸＮ（配列番号：１６）；ＸＸＱＸ−ＸＸＸＳ（配列番号：１７）；およびＸＸＥＸ−ＸＸＸＥ（配列番号：１８）を含む。
【００７１】
上記の教示はＨｕ−Ａｓｐ２に対するペプチド基質を可能にし、それはＨｕ−Ａｓｐ２のモジュレーターおよび／またはＡβ斑形成のモジュレーターの同定において有用であることを証明する。上記同定された基質およびその変異体を作製し、用いる方法は、本明細書中、以下により詳細に記載される。
【００７２】
ＩＩ．新規Ｈｕ−Ａｓｐ２ペプチド基質の誘導体
本明細書におけるＨｕ−Ａｓｐ２基質ペプチドは誘導体を構築するのに有用なコア構造を与える。そのような誘導体は、その配列の部分として上記基質を含む融合タンパク質もしくはペプチドであるか、または、それらは標識されているか、もしくは、さもなくば修飾されているＨｕ−Ａｓｐ２基質であって、標識化または修飾を用いて該ペプチドの精製、該ペプチド自体の検出またはＨｕ−Ａｓｐ２の作用による該ペプチド基質の切断生成物の検出を容易にすることができる。代表的な修飾は、本明細書中、以下にさらに詳細に記載される。
【００７３】
Ａ．融合ポリペプチド
上記した新規ペプチド基質に加えて、本発明は、上記または本発明により同定されたＨｕ−Ａｓｐ２基質の融合タンパク質または融合ポリペプチドともいう世代末端付加体（ｔｈｅ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｔｅｒｍｉｎａｌ ａｄｄｉｔｉｏｎｓ）をさらに意図する。この融合ポリペプチドは、一般に、天然分子（すなわち、上記Ｈｕ−Ａｓｐ２ペプチド基質）の全てまたは相当な部分を有し、第２または第３のポリペプチドの全てまてたは部分にＮ−および／またはＣ−末端にて連結されている。該融合ポリペプチドは組換えタンパク質生成によって、または実際には本明細書の別の箇所で論じられる自動化ペプチド合成によって生成することができることが意図される。
【００７４】
融合タンパク質をデザインし、作製する一般原理は当業者によく知られている。例えば、融合体は、典型的には、他の種からのリーダー配列を用いて、異種宿主内でタンパク質またはペプチドの組換え発現を許容する。もう一つの有用な融合体は、抗体エピトープのごとき免疫学的に活性なドメインの付加を含んで、該融合ポリペプチドの精製を容易にする。融合接合またはその付近に切断部位を包含することは、精製後の外来ポリペプチドの除去を容易にする。これらの融合体の組換え生成は本明細書の別の箇所にさらに詳細に記載される。他の有用な融合体は、酵素、グリコシル化ドメイン、細胞標的シグナルまたは貫通膜領域のごとき機能性ドメインの連結を含む。
【００７５】
より詳しくは、本発明は、本発明のＨｕ−Ａｓｐ２ペプチド基質を含有するＨｕ−Ａｓｐ２切断部位を含む第１成分が貫通膜ドメインを含む第２成分に結合した融合タンパク質を意図する。さらなる具体例において、該融合ポリペプチドはレポーター遺伝子産物を含む第３成分をさらに含むことができる。なおさらなる具体例において、該融合ポリペプチドはタグド（ｔａｇｇｅｄ）配列成分をさらに含むことができる。特に好ましい融合ポリペプチドは、細胞内貫通膜ドメイン配列の一方の側にレポーター遺伝子産物、ＥＲ／ゴルジ体標的シグナルと共に貫通膜ドメインに結合されたＨｕ−Ａｓｐ２切断部位、および該貫通膜ドメインの他方の側にタグド配列を有するものである。
【００７６】
ＡＰＰβセクレターゼ切断ドメインの立体的特性を模倣するために、切断部位と貫通膜ドメインの開始との間の距離が約２０〜４０個のアミノ酸であることが意図される。この距離は、該貫通膜領域を付与するタンパク質から生じさせるか、または、それは異種ペプチドリンカーによって生じさせることができる。好ましくは、この領域は該貫通膜タンパク質からのものである。該融合ポリペプチドの貫通膜ドメイン成分は、実質的に、所定の細胞のゴルジ体または小胞体を標的し、そこに局在する任意の貫通膜ドメイン成分であってもよい。特に好ましい膜標的配列は、限定されないが、ガラクトシルトランスフェラーゼ（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＦ１５５５８２を参照せよ。）の貫通膜ドメイン；シアリルトランスフェラーゼ（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＭ＿００３０３２を参照せよ。）の貫通膜ドメイン；ヒトアスパルチルトランスフェラーゼ１（Ａｓｐ１、例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＦ２００３４２を参照せよ。）の貫通膜ドメイン；ヒトアスパルチルトランスフェラーゼ２（Ａｓｐ２、例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＭ＿０１２１０４を参照せよ。）の貫通膜ドメイン；シンタキシン６（ｓｙｎｔａｘｉｎ ６） （例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＭ＿００５８１９を参照せよ。）の貫通膜ドメイン；アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＭ＿００２４０６を参照せよ。）の貫通膜ドメインおよびＡＰＰ（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ａ３３２９２を参照せよ。）の貫通膜ドメインを含む。上記したＧｅｎｂａｎｋ受託番号は完全タンパク質配列の詳細を示す。本発明の目的のため、これらのタンパク質の全てまたは部分を用いることができる。特定の具体例において、該Ａｓｐ２の残基４５４〜４７７、ＡＰＰ（例えば、ＡＰＰ６９５）の残基５９８〜６６１、ガラクトシルトランスフェラーゼの残基４〜２７、Ａｓｐ１の残基４７０〜４９２、シアリルトランスフェラーゼの残基１０〜３３、アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼの残基７〜２９およびシンタキシン６の残基２６１〜２９８がこの点で特に有用であろう。
【００７７】
本発明の融合ポリペプチドに用いるレポーター遺伝子産物は当業者によって普通に用いられる任意のレポータータンパク質であってもよい。代表的なレポータータンパク質は、限定されないが、ルシフェラーゼ；分泌されたアルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）；β−ガラクトシダーゼ；β−グルコリニダーゼ；緑色蛍光タンパク質およびクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼを含む。
【００７８】
他の特定の具体例は、本発明の融合タンパク質の第４成分としてタグド配列をさらに意図する。本発明の場合にタグド配列を与えるために用いることができる様々な商業的に入手可能な融合タンパク質発現系がある。特に有用な系は、限定されないが、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）系（ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、ニュージャージー州ピスケータウェイ）、マルトース結合タンパク質系（ＮＥＢ、マサチューセッツ州バーバリー）、ＦＬＡＧ系（ＩＢＩ、コネチカット州ニューヘイブン）、および６×Ｈｉｓ系（チアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）、カリフォルニア州チャッツワース）を含む。これらの系は、ほんの少数のさらなるアミノ酸を持つ組換えポリペプチドを生成することが可能であり、それらは該組換え融合タンパク質の生物学的に関連のある活性に影響しないようである。例えば、該ＦＬＡＧ系および該６×Ｈｉｓ系はほんの短い配列だけを付加し、それらは両方とも、あまり抗原性でないことが知られ、それらは該ポリペプチドのその未変性配座への折畳みに不都合な影響を及ぼさない。有用であると意図されるもう一つのＮ−末端融合体は、タンパク質またはペプチドのＮ−末端領域にてのＭｅｔ−Ｌｙｓジペプチドの融合体である。そのような融合体はタンパク質発現および／または活性における有益な増大を生じるであろう。本発明に用いるために意図された特定のタグド配列は、ＦＬＡＧタグ配列ＤＹＫＤＤＤＤＫ（配列番号：１８６）およびＡＰＰの残基６６２〜６９５を含む。
【００７９】
本発明の好ましい融合タンパク質の典型例は、ＳＥＡＰが部分的または完全長インスリンＢ鎖のいずれかに融合されたもので、本発明に記載された新規Ｈｕ−Ａｓｐ２のうちの一つを含有するＡｓｐ２切断部位およびＨｕ−Ａｓｐ２の貫通膜ドメイン（残渣４５４〜４７７）を短いＣ−末端フラッグタグドテールと共に含む。代表的な融合ポリペプチドの配列を図１に図示する（配列番号：１２８）。Ｈｕ−Ａｓｐ２によって、キメラ構築物の切断をモニターするために。該キメラ構築物はレポータータンパク質としてアルカリホスファターゼを用いた。イン・ビトロアッセイで切断され得るペプチドは、細胞内条件においてプロテアーゼではうまく整列されないので、ＳＥＡＰと貫通膜ドメインとの間に挿入された配列を変化させて最適条件を得る。そのような最適化は該レポータータンパク質と該切断部位との間の最適距離を与えるペプチドリンカーを用いることができる。該Ｈｕ−Ａｓｐ２貫通膜ドメインはインスリンまたはユビキチンベースの基質をそれが活性Ｈｕ−Ａｓｐ２に結合し、切断され得る細胞環境へ効率的にデリバリーすることを保証する。
【００８０】
代替的なデザインはＡＰＰからのＣ−末端の９７個のアミノ酸を用いて、その天然の間隙および膜ドメインを模倣する。本質的に、この構築物は、切断部位がＫＭ−ＤＡＥ（配列番号：１２９）から上で定義したＰ２Ｐ１−Ｐ１’Ｐ２’Ｐ３’の配列に突然変異誘発されたことを除けば、ＡＰＰ貫通膜ドメインおよびＡβペプチド配列のほとんどを有する。
【００８１】
該融合タンパク質が、細胞系統内でＨｕ−Ａｓｐ２と共に共発現するか、またはより高いＨｕ−Ａｓｐ２活性を生じる細胞系統内で発現するとき、Ｈｕ−Ａｓｐ２は該融合タンパク質を切断して、ＳＥＡＰを細胞媒質内に放出する。かくして、プロテアーゼ活性を該媒質におけるＳＥＡＰ活性に基づきモニターすることができる。
【００８２】
上のセクションＩで論じたように、ＳＥＶＳＹ−↓−ＥＡＥＦＲ（配列番号：１４４）およびＳＥＶＳＹ−↓−ＥＶＥＦＲ（配列番号：１４１）はＡＰＰの未変性構造の突然変異誘発に基づく本発明の代表的なＡｓｐ２ペプチド基質である。前者のペプチドはスウェディッシュ突然変異体に匹敵する活性を有し、後者のペプチドはスウェディッシュ突然変異体に勝る活性を有する。ＳＥＶＳＹ−↓−ＥＡＥＦＲ（配列番号：１４４）の場合、ＡＰＰ中のβ−セクレターゼ切断部位を取巻くアミノ酸は、（野生型（配列番号：１３９）／スウェディッシュ突然変異体（配列番号：１４２）中の）・・・ＫＭ／ＮＬ−↓−ＤＡ・・・から・・・ＳＹ−↓−ＥＶ・・・（配列番号：１４０）に変化している。
【００８３】
本明細書の実験データは、該ＡＰＰ配列中のたった４個のアミノ酸の上記変化がＡｓｐ２に対する優れたＡＰＰ修飾基質を生じ、それが細胞ベースアッセイにおいて容易に測定可能なレベルのＡβ（または他の検出可能な切断生成物）を与えることを示す。かくして、配列ＳＹ−↓−ＥＡ（配列番号：１８７）、またはＳＹ−↓−ＥＶ（配列番号：１４０）、またはＳＹ−↓−ＡＶ（配列番号：１８８）、またはそれらのアナログが該融合タンパク質をＥＲまたはゴルジ体のごとき所望の細胞内膜に固定する能力を有する配列に融合されることが意図される。配列ＳＹ−↓−ＥＡ（配列番号：１８７）、またはＳＹ−↓−ＥＶ（配列番号：１４０）、またはＳＹ−↓−ＡＶ（配列番号：１８８）を用いて、図２のスキームの「１」と標識されたカラムの下の野生型ＡＰＰにおける配列ＫＭ−↓−ＤＡ（配列番号：１３９）を置換する。本明細書において、ペプチドデータは、これらの構築物が、未変性ＡＰＰの切断速度と比較して、β−セクレターゼによって容易に切断されることを示す。
【００８４】
図２も、一般的用語で、ＳＥＡＰのごときレポーター遺伝子産物を細胞内貫通膜セグメントの外側ドメイン上に用いられる本発明のＡｓｐ２細胞ベースアッセイ用のキメラ基質を記載する。好ましい具体例において、そのようなキメラタンパク質は、中央に、ＥＲ／ゴルジ体標的シグナルと共に貫通膜ドメインに結合された本発明のペプチドのＡｓｐ２切断部位を含有する配列の短いストレッチと、該膜の反対側に、タグド配列とを含む。
【００８５】
代表的な構築物はＳＥＡＰをＡＰＰ−ＣＴ９９に融合させることによって得ることができる。ＳＥＡＰとＡＰＰ−ＣＴ９９との間の接合は図２の「２」の下に示されたように修飾され、Ａｓｐ２による切断を促進する。もう一つの構築物はユビキチン中の切断部位（図２、カラム「３」）に基づく。詳しくは、ＳＥＡＰは、Ａｓｐ２の貫通膜ドメイン（残基４５４−４７７）でＣ−末端延長されたユビキチンと、短Ｃ−末端フラッグ−テールとに融合される。この構築物において、ユビキチンの切断可能配列ＫＴＩＴＬ−↓−ＥＶＥＰＳ（配列番号：１２０）を修飾して切断を促進する。例えば、Ｐ２のＴをＮまたはＳで置換し、Ｐ１のＬをＹで置換する。他の可能性のある置換は図２の各カラムの隣および本明細書に記載された実験詳細に示される。
【００８６】
ユビキチンを融合タンパク質として用いる場合、好ましくは、ユビキチンＣ−末端残基Ｇｌｙ−Ｇｌｙをある他のアミノ酸に換えて、ユビキチン加水分解によるユビキチンＣ−末端の後ろでの切断を回避する。Ａｓｐ２貫通膜ドメインは、活性Ａｓｐ２によって認識され、切断され得る細胞環境への対象の構築物の効率的なデリバリーを保証する。後者の融合タンパク質が、細胞系統内でＨｕ−Ａｓｐ２と共に共発現するか、またはより高いＨｕ−Ａｓｐ２活性を生じる細胞系統内で発現するとき、Ｈｕ−Ａｓｐ２は該基質を認識し切断する。このイベントは（切断部位に対してＮ−末端側に位置する）ペプチドを細胞媒質内に放出し、かくして、プロテアーゼ活性の直接アッセイを可能にする。
【００８７】
Ｂ．他の修飾
すでに記載したように融合タンパク質を提供することに加えて、本発明は、例えば、標識または他の検出可能な部分を取り込むようにさらに修飾された融合タンパク質またはペプチドを提供する。
【００８８】
好ましいペプチド基質は、該ペプチド基質の切断後、増大された検出性をもたらす内部失活標識を含む。該ペプチド基質を修飾して、限定されないが、それぞれ７−アミノ−４−メチルクマリンおよび２，４−ジニトロフェノールを含む対になる蛍光物質および消光物質を結合するようにし、該Ｈｕ−Ａｓｐ２によるペプチドチドの切断が該蛍光物質と消光物質との物理的分離による増大された蛍光を生じるようにすることができる。他の対になる蛍光物質および消光物質はＢＯＤＩＰＹ−テトラメチルローダミンおよびＧＳＹ−５（モレキュラー・プローブ・インコーポレイテッド（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ， Ｉｎｃ．））を含む。このアッセイの変形において、ビオチンまたは別の適当なタグを該ペプチドの一端に配置して該ペプチドを基質アッセイプレートに固定し、蛍光物質を該ペプチドの他端に配置することができる。有用な蛍光物質は上で挙げられたものならびにＷ８０４４（ＥＧ＆ｇ　ワラック・インコーポレイテッド（ＥＧ＆ｇ Ｗａｌｌａｃ， Ｉｎｃ．））のごときユーロピウム標識を含む。好ましい標識はＣｙｓ残基に結合することができるオレゴングリーンである。Ａｓｐ２による該ペプチドの切断は該蛍光物質または他のタグを該プレートから放出し、化合物が保持された蛍光における上昇によって示されるようにＡｓｐ２タンパク質加水分解の阻害についてアッセイされるようにする。Ｈｕ−Ａｓｐ加水分解化活性の好ましい比色アッセイは他の適当な基質を用い、それらはアミド架橋でｏ−ニトロフェノールに連結された、切断の認識部位を含むＰ２およびＰ１アミノ酸を含んで、該Ｈｕ−Ａｓｐによる切断が当該アッセイバッファーをアルカリ性ｐＨに変えた後光学密度に増加を生じるようにする。
【００８９】
さらに、該ペプチドを当業者によく知られた標識を用いて標識することができ、例えば、ビオチン標識が特に意図される。そのような標識の使用は当業者によく知られ、例えば、米国特許第３，８１７，８３７号；米国特許第３，８５０，７５２号；米国特許第３，９９６，３４５号；および米国特許第４，２７７，４３７号に記載されている。有用であろう他の標識は、限定されないが、放射能標識、蛍光標識およびケミルミネッセント標識を含む。そのような標識の使用に関する米国特許は、例えば、米国特許第３，８１７，８３７号；米国特許第３，８５０，７５２号；米国特許第３，９３９，３５０号および米国特許第３，９９６，３４５号を含む。本発明のペプチドのいずれも１個、２個またはそれ以上のこれらの標識を含むことができる。
【００９０】
本発明によって特に意図される他の誘導体は、本発明のβ−セクレターゼ基質のスタチン誘導体のごとき加水分解不可能誘導体を含む。スタチン−含有ペプチドはアスパルチルプロテアーゼに対して阻害効果を有するものと認識される［シェウェール・ジェイ・ジイ（Ｓｈｅｗａｌｅ， Ｊ．Ｇ．）；タカハシ・アール（Ｔａｋａｈａｓｈｉ， Ｒ．）；タン・ジェイ（Ｔａｎｇ， Ｊ．）、「Ａｓｐａｒｔｉｃ Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ」、コツカ・ブイ（Ｋｏｓｔｋａ， Ｖ．）編、ウォルター・ド・グリュター（Ｗａｌｔｅｒ ｄｅ Ｇｒｕｙｔｅｒ）： ベルリン、１９８６年、ｐ．１０１−１１６］。スタチンインヒビターの例は、カセプシンＤにつき［リン・ティー−ワイ（Ｌｉｎ， Ｔ．−Ｙ）；ウィリアムス（Ｗｉｌｌｉａｍｓ）、「ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ． Ｂｉｏｌｏ． Ｃｈｅｍ．）」、第２５４巻、１９７９年、ｐ．１１８７５−１１８８３；リッチ（Ｒｉｃｈ）およびアガーウォール・エヌ・エス（Ａｇａｒｗａｌ， Ｎ．Ｓ．）、「ジャーナル・オブ・メディカル・ケミストリー（Ｊ． Ｍｅ． Ｃｈｅｍ．）」、第２９巻、１９８６年、ｐ．２５１９−２５２４］、プラスメプシンにつき［シルバ・エイ・エム（Ｓｉｌｖａ， Ａ．Ｍ．）ら、「プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・サイエンシズ（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ’ｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．）」、第９３巻、１９９６年、ｐ．１００３４−１００３９］にも記載されている。
【００９１】
スタチンはペプスタチンに存在する非標準アミノ酸残基であり、化学名（３Ｓ，４Ｓ）−４−アミノ−３−ヒドロキシ−６−メチルヘプタン酸で知られ、さらに、メルクインデックス（第１１版）のモノグラフ８７５９に同定されている。スタチンは容易に、例えば、シグマ−アルドリッチ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）（ミズリー州セントルイス）から商業的に入手可能である。スタチンの三文字略号は、ペプチド分野でＳｔａである。スタチン誘導体は米国特許第４，３９７，７８６号に開示された方法によって調製することができる。他の方法は、［「Ｔｈｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ， Ｖｏｌ．５： Ａｎａｌｙｓｉｓ， Ｂｉｏｌｏｇｙ」；（アカデミック・プレス、ニューヨーク；１９８３年）］；［ケスラー（Ｋｅｓｓｌｅｒ）およびシュドック（Ｓｈｕｄｏｋ）、「シンセシス（Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）」、第６巻、１９９０年、ｐ．４５７−８］；［ニシ（Ｎｉｓｈｉ）およびモリサワ（Ｍｏｒｉｓａｗａ）、「「ヘテロサイクルズ（Ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｅｓ）」、第２９（９）巻、１９８９年、ｐ．１８３５−４２］に記載され、それぞれ、出典明示して本明細書に含まれる。かくして当業者はそのような技術を用いて本発明のスタチン誘導体を生成することが可能である。ＷＯ００／７７０３０はβ−セクレターゼ酵素のスタチン誘導ペプチドインヒビターを記載し、それはペプチドのスタチン誘導体を生成するための教示として詳しく出典明示して本明細書に含まれる。
【００９２】
スタチン誘導体に加えて、多くの他の加水分解不可能ペプチド結合、ならびに、そのような結合を含有するペプチドの合成手順が当該分野で知られている。加水分解不可能結合は、−−［ＣＨ２ＮＨ］−−還元アミドペプチド結合、−−［ＣＯＣＨ２］−−ケトメチレンペプチド結合、−−［ＣＨ（ＣＮ）ＮＨ］−−（シアノメチレン）アミノペプチド結合、−−［ＣＨ２ＣＨ（ＯＨ）］−−ヒドロキシメチレンペプチド結合、−−［ＣＨ２Ｏ］−−ペプチド結合、および−−［ＣＨ２Ｓ］−−チオメチレンペプチド結合（例えば、米国特許第６，１７２，０４３号を参照せよ）。
【００９３】
ＩＩＩ．アスパルチルプロテアーゼ
新規ペプチド基質に加えて、本発明は様々なＨｕ−Ａｓｐ２アッセイにおいてそのようなペプチド基質を用いる方法に向けられる。このセクションはβ−セクレターゼ活性を有するこれらのタンパク質の考察を記載する。
ＰＣＴ公開番号ＷＯ００／１７３６９は、詳しく出典明示してその全体が本明細書に含まれ、本明細書を通してＡｓｐ２というβセクレターゼ酵素の同定およびキャラクタリゼーションに関する方法および組成物を記載する。さらに、１９９９年１０月１３日に出願された米国特許出願番号０９／４１６，９０１も出典明示してその全体が本明細書に含まれ、Ａｓｐ２の性質、機能およびキャラクタリゼーションならびにＡＤにおいてこれらのプロテアーゼが有する役割に関するさらなる開示を提供する。
これらの特許出願は、本発明の場合に用いることができるＨｕ−Ａｓｐ−２（ａ）およびＨｕ−Ａｓｐ−２（ｂ）というヒトＡｓｐ２の２つのアイソトープ、ならびにそのフラグメント、アナログ、オルトログおよび変異体を記載する。全てのそれらの形態は本発明の場合に用いることができ、アルツハイマー病患者における未変性形態に最も類似する形態が好ましい。
【００９４】
特定の具体例において、本発明の有用なアスパルチルプロテアーゼは配列番号：１または配列番号：３によってコードされる。配列番号：１核酸は、予測されたアミノ酸配列ヒトＡｓｐ−２（ａ）である配列番号：２の配列をコードすることが予想される。Ａｓｐ２（ａ）アミノ酸配列は残基１ないし２１を含む推定シグナルペプチド；残基４５まで延長したシグナルペプチドの後ろの推定プリプロペプチド（ｐｒｅｐｒｏｐｅｐｔｉｄｅ）（ＣＨＯ細胞において組換えＡｓｐ２（ａ）のプロセシング観察によって評価され）および、プロテアーゼ認識配列の特徴を有する観測されたＧＲＲ↓ＧＳ配列の観察に基づき少なくともだいたい残基５７まで延長することができる推定プロペプチド（ｐｒｏｐｅｐｔｉｄｅ）を含む。Ａｓｐ２（ａ）は、残基４５５〜４７７を含む貫通膜ドメイン、残基４７８〜５０１を含む細胞質ドメイン、および残基２０〜４５４を含む推定αラセンスペーサー領域を含み、プロテアーゼ触媒性ドメインと貫通膜ドメインとの間でＡｓｐ２の適正な折畳みを必要とすると確信される。配列番号：３の核酸配列は、予測されたアミノ酸ヒトＡｓｐ２（ｂ）である配列番号：４の配列をコードすると予測される。Ａｓｐ２（ｂ）アミノ酸配列はＡｓｐ２（ａ）につき上記した推定シグナルペプチド、プレペプチドおよびプロペプチドを含む。Ａｓｐ２（ｂ）は、さらに、残基４３０〜４５２を含む貫通膜ドメイン、残基４５３〜４７６を含む細胞質ドメインおよび残基３９５〜４２９を含む推定αラセンスペーサー領域を含み、プロテアーゼ触媒性ドメインと貫通膜ドメインとの間でＡｓｐ２の適正な折畳みを必要とすると確信される。本明細書で用いられるとき、「Ｈｕ−Ａｓｐ２」への全ての言及は、Ｈｕ−Ａｓｐ２（ａ）およびＨｕ−Ａｓｐ２（ｂ）の両方への言及であると理解されるべきである。本発明は、単離されたまたは突然変異したＨｕ−Ａｓｐ１、Ｈｕ−Ａｓｐ２（ａ）およびＨｕ−Ａｓｐ２（ｂ）ポリペプチドならびに、アスパルチルプロテアーゼ活性を示すそれらのフラグメントも意図する。
【００９５】
本発明の基質の切断を決定する代表的なアッセイにおいて、Ａｓｐ２はＨｉｇｈＦｉｖｅＴＭ昆虫細胞から調製された。一般的に、該アッセイはｎＭまたはサブナノモーラーの酵素の存在下、酸性ｐＨ（４．０ないし５．０）の溶液中、２５〜３７℃にて行う。適当なインキュベーション期間後、４％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）の添加によって、所望の時刻に反応を停止する。基質と生成物とを逆相ＨＰＬＣを用いて分離する。該基質の消滅および該生成物の出現は２２０ｎｍにて溶出液の吸収の連続測定によってモニターする。さらに、該ペプチドがトリプトファン残基を含むならば、モニタリングは、さらにまたは代替として、トリプトファン蛍光の連続蛍光モニター（２８０ｎｍにて励起、２４８ｎｍにて発光）を含むことができる。オレゴングリーンを単独でまたはビオチン標識に加えてのいずれかで含む本発明のペプチドは、高スループットスクリーニングに特に適している。この目的のため、ペプチドビオチン−ＫＥＩＳＥＩＳＹ−ＥＶＥＦＲ（Ｃｙｓ−オレゴングリーン）ＫＫ（配列番号：１９２）およびビオチン−ＧＬＴＮＩＫＴＥＥＩＳＥＩＳＹ−ＥＶＥＦＲ（Ｃｙｓ−オレゴングリーン）ＫＫ（配列番号：１９３）が高スループットスクリーニングに特に適している。
【００９６】
典型的なアッセイにおいて、２１０ｎＭ酵素および２００μＭ基質をｐＨ４．５の０．２Ｍ酢酸ナトリウム中、１００μｌ体積で、３７℃にて１ないし３時間インキュベートした。５０μｌの４％ＴＦＡを添加してｐＨを該酵素の活活性範囲より低く下げることによって、アッセイを停止した。続いて、１００μｌのこの混合物を、９５％Ａ（水中０．１５％ＴＦＡ）、５％Ｂ（アセトニトリル中０．１５％ＴＦＡ）で予め平衡化されたバイダック（Ｖｙｄａｃ）カラム（直径４．６ｍｍ×１５０ｍｍ、５μｍ）を装着したヒューレット・パッカード（Ｈｅｗｌｅｔｔ Ｐａｃｋａｒｄ）モデル１０９０ＨＰＬＣに注入した。次いで、構成物を次の線形勾配：０〜１５分：５〜５０％Ｂ；１５〜１７分：５０〜１００％Ｂ；１７〜２０分：１００〜５％Ｂ；２０〜２２分：５％Ｂ）でカラムから溶出した。次いで、加速インテグレータを用いて切断生成物を定量した。
【００９７】
配列番号：１９０または配列番号：１９１に示されるそのＮ−末端延長バージョンの基質についての上記アッセイの変形において、該基質は、５〜５０μＭペプチド基質、１〜１０ｎＭ酵素、ｐＨ４ないし５の０．１Ｍ酢酸ナトリウムバッファーからなる２００μｌの最終反応溶液体積（５０〜１００μｌの反応混合物も用いるが）に対して酵素と共にインキュベートする。反応を３７℃にて１〜３時間進行させ、１００μｌの４％ＴＦＡを添加して停止する。続いて、混合物のアリコート、例えば、５０μｌないし１００μｌをオールテック（Ａｌｌｔｅｃｈ）Ｃ１８３μＭロケットカラム（５３ｍｍ長、直径７ｍｍ、パーツ番号５０６０５）を装着したＨＰＬＣ装置（アジレント（Ａｇｉｌｅｎｔ）１１００シリーズ）に注入する。このカラムからの基質のＨＰＬＣ溶出のための溶媒Ａは水中０．１％ＴＦＡであり；溶媒Ｂはアセトニトリル中０．１％ＴＦＡであった。次いで、基質を次の線形勾配：時刻０：１２％溶液Ｂ；時刻４：３０％溶媒Ｂ；時刻６：５０％溶媒Ｂ；時刻６．５：９０％溶媒Ｂ；時刻７：１２％溶媒Ｂ；時刻８：１２％溶媒Ｂでカラムから溶出した。
【００９８】
Ｈｕ−Ａｓｐに加えて、本発明の基質は、例えば、Ａｓｐ１、ペプシン、ガストリクシン、カセプシンＤ、カセプシンＥおよびレニンのごとき他のアスパルチンプロテアーゼを用いるアッセイにおける有用性も証明することを意図する。
【００９９】
ＩＶ．タンパク質またはペプチドの生成および精製
本発明は、Ｈｕ−Ａｓｐ２のモジュレータの同定に用いるためのタンパク質またはペプチドを提供する。そのようなタンパク質またはペプチドは従来の自動ペプチド合成法によって、または組換え発現によって生成することができる。
【０１００】
Ａ．合成的ペプチド生成
本発明のペプチドまたは実際には完全長融合タンパク質さえも従来技術に準じて溶液中または固相支持体上で合成し得る。様々な自動合成装置が商業的に入手可能であり、知られているプロトコルに準じて用い得る。例えば、それぞれ出典明示して本明細書に含まれる［スチュワート（Ｓｔｅｗａｒｔ）およびヤング（Ｙｏｕｎｇ）、「Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」、第２版、ピアース・ケミカル社（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．）、１９８４年］；［タム（Ｔａｍ）ら、「ジャーナル・オブ・アメリカン・ケミカル・ソサイエティー（Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ．）」、第１０５巻、１９８３年、ｐ．６４４２］；［メリフィールド（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ）、「サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）」、第２３２巻、１９８６年、ｐ．３４１−３４７］；［バラニー（Ｂａｒａｎｙ）およびメリフィールド（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ）、「Ｔｈｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ」、グロス（Ｇｒｏｓｓ）およびマイエンホファー（Ｍｅｉｅｎｈｏｆｅｒ）編、アカデミック・プレス、ニューヨーク、ｐ．１〜２８４（１９７９年）］を参照せよ。β−セクレターゼ切断部位を含む本発明の新規Ａｓｐ２基質は容易に合成され、次いで、Ｈｕ−Ａｓｐ２スクリーニングアッセイにおいてスクリーンされる。
【０１０１】
特に好ましい方法において、本発明のペプチドはアプライド・バイオシステムズ・インコーポレイテッド（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ， Ｉｎｃ．）のモデル４３３Ａを用いる固相技術によって合成した。自動ペプチド合成でまたは組換え法のいずれかで生成された任意の所定のペプチド基質の純度は逆相ＨＰＬＣ分析を用いて決定することができる。各ペプチドの化学的品質は当業者によく知られているいずれかの方法によって確認してもよい。好ましい具体例において、品質は実施例に記載するように質量分析によって確認する。
【０１０２】
さらに、ペプチドは、マイクロ波加水分解を行うアミノ酸分析を用いて定量することができる。そのような分析はＣＥＭ社のＭＤＳ２０００電子レンジのごとき電子レンジを用いることができる。約０．５％（体積対体積）フェノール（マリンクロット（Ｍａｌｌｉｎｃｋｒｏｄｔ））入りの６Ｎ ＨＣｌ（ピアース・コンスタント・ボイリング（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｏｎｓｔａｎｔ Ｂｏｉｌｉｎｇ）、例えば、約４ｍｌ）に、該ペプチド（約２μｇタンパク質）を接触させる。加水分解前に、試料を交互に撤去し、Ｎ２で洗い流す。タンパク質加水分解は、二段階法を用いて行う。第１段階の間、該ペプチドを約１００℃の反応温度に付し、その温度で１分間保つ。このステップの直後、温度を１５０℃に上昇させ、その温度で約２５分間保つ。冷却後、試料を乾燥させ、加水分解されたペプチド試料からのアミノ酸をカルバミン酸６−アミノキノリル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルを用いて誘導化して３９５ｎｍで蛍光発光する安定ウレアを得た（ウォーターズ　ＡｃｃＱ・タグ　ケミストリー・パッケージ（Ｗａｔｅｒｓ ＡｃｃＱ・Ｔａｇ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｐａｃｋａｇｅ））。試料は逆相ＨＰＬＣによって分析することができ、定量は加速インテグレータを用いて達成することができる。
【０１０３】
Ｂ．組換えタンパク質生成
自動ペプチド合成の代わりとして、組換えＤＮＡテクノロジーを用いることができ、そこでは、本発明のペプチドをコードするヌクレオチド配列が発現ベクターに挿入され、適当な宿主細胞内に形質転換またはトランスフェクトされ、本明細書の以下に記載するように発現に適した条件下で培養する。組換え法は本発明のペプチド配列を含む長めのポリペプチドを生成するのに特に好ましい。
【０１０４】
新規ＨｕＡｓｐ２基質ペプチド配列の開示から、組換え技術によってペプチドおよび融合ポリペプチドを生成することが可能である。様々な発現ベクター／宿主系を用いてペプチドまたは融合ポリペプチドコーディング配列を含有し、発現することができる。これらは、限定されないが、組換えバクテリオファージ、プラスミドまたはコスミドＤＮＡで形質転換された細菌のごとき微生物；酵母発現ベクターで形質転換された酵母；ウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）でインフェクトされた昆虫細胞系；ウィルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス、ＣａＭＶ；タバコモザイクウイルス、ＴＭＶ）または細菌発現ベクター（例えば、ＴｉまたはｐＢＲ３２２プラスミド）でトランスフェクトされた植物細胞系；または動物細胞系を含む。組換えタンパク質生成に有用な哺乳類細胞は、限定されないが、ＶＥＲＯ細胞、ＨｅＬａ細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞系統、（ＣＯＳ−７のごとき）ＣＯＳ細胞、Ｗ１３８、ＢＨＫ、ＨｅｐＧ２、３Ｔ３、ＲＩＮ、ＭＤＣＫ、Ａ５４９、ＰＣ１２、Ｋ５６２および２９３細胞を含む。細菌、酵母または他の脊椎動物中でのペプチド基質または融合ポリペプチドの組換え発現のための代表的なプロトコルは本明細書の以下に記載される。
【０１０５】
一般的に、原核宿主で使用するための発現ベクターは１以上のフェノタイプ選択マーカー遺伝子を含む。一般的に、そのような遺伝子は、例えば、抗菌耐性を付与するか、または栄養素要求性の要求を供給するタンパク質をコードする。広汎なそのようなベクターは容易に商業源から入手可能である。例えば、ｐＳＰＯＲＴベクター、ｐＧＥＭベクター（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ））、ｐＰＲＯＥＸベクター（ＬＴＩ、メリーランド州ベセスダ）、ブルースクリプトベクター（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））、ｐＥＴベクター（ノバゲン（Ｎｏｖａｇｅｎ））、およびｐＱＥ（チアゲン（Ｑｉａｇｅｎ））が含まれる。所定のペプチド基質または融合ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列はＰＣＲによって増幅され、そのようなベクター、例えば、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）を含む融合タンパク質を生成するようにデザインされたｐＧＥＸ−３Ｘ（ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、ニュージャージー州ピスケータウェイ）にクローン化され、ＤＮＡフラグメントによってコードされたタンパク質が該ベクターのクローニング部位に挿入される。該ＰＣＲのプライマーを例えば適当な切断部位を含むように生じさせることができる。トロンビンまたは因子Ｘａ（ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、ニュージャージー州ピスケータウェイ）での組換え融合ポリペプチドの処理は該融合タンパク質を切断し、該基質またはポリペプチド含有する基質をＧＳＴ部分から放出する。ｐＧＥＸ−３Ｘ／ＨｕＡｓｐ２構築物はＥ．ｃｏｌｉＸＬ−１ブルー細胞（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、カリフォルニア州ラホーヤ）中に形質転換され、個々の形質転換物は単離され増殖される。個々の形質転換物からのプラスミドＤＮＡを精製し、自動シーケンサーを用いて部分的に配列決定して、所望のペプチドまたは適正な配向の核酸インサートをコードするポリペプチドの存在を確認する。
【０１０６】
本発明のある具体例が合成ペプチドシンセサイザーを用いてペプチドまたはポリペプチドを生成し、引き続き、ＦＰＬＣ分析およびシステイン二重結合の適当な再折畳みを意図する一方、組換えタンパク質生成を用いてペプチド組成物を生成することも意図される。例えば、ＧＳＴ／基質融合タンパク質の誘発は、波長６００ｎｍにて０．４の光学密度まで（カルベニシリンで補足された）ＬＢ培地中３７℃にて形質転換ＸＬ−１ブルー培養を増殖させて、続いて、０．５ｍＭのイソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトピラノシド（シグマ・ケミカル社（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．）、ミズリー州セントルイス）の存在下さらに４時間インキュベートすることによって達成する。
【０１０７】
細菌中で不溶性封入体として生成されると予想されたＧＳＴ融合タンパク質は次のようにして精製することができる。細胞を遠心によって収穫し、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８、１ｍＭ ＥＤＴＡで洗浄し；次いで、０．１ｍｇ／ｍｌリゾチーム（シグマ・ケミカル社（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．））で室温にて１５分間処理した。ライゼートを超音波発振で明澄化し、細胞デブリを１２，０００×ｇで１０分間遠心することによってペレットにする。融合タンパク質含有ペレットを５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８、および１０ｍＭ ＥＤＴＡに再懸濁させ、５０％グリセロール上に重ね、６０００×ｇにて３０分間遠心する。ペレットをＭｇ＋＋およびＣａ＋＋なしの標準リン酸バッファードサリン（ＰＢＳ）に再懸濁させる。融合タンパク質は、変性ＳＤＳポリアクリルアミドゲル［サンブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、前掲］中で再懸濁ペレットを分画することによってさらに精製する。ゲルを０．４Ｍ ＫＣｌに浸してタンパク質を視覚化し、それを切取り、ＳＤＳを欠如するゲルランニングバッファー中で電気溶出するＧＳＴ／ＨｕＡｓｐ２融合タンパク質が細菌中で可溶性タンパク質として生成されるならば、それはＧＳＴ精製モジュール（ファルマシア・バイオテック（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ））を用いて精製することができる。
【０１０８】
融合タンパク質をトロンビン消化に付して該ＧＳＴを成熟ＨｕＡｓｐ２基質ペプチドまたはＨｕＡｓｐ基質含有ポリペプチドから切断することができる。該消化反応（２０〜４０μｇ融合タンパク質、２０〜３０単位ヒトトロンビン（０．５ｍｌＰＢＳ中４００Ｕ／ｍｇ（シグマ））を室温にて１６〜４８時間インキュベートし、変性ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上に載せて、反応生成物を分画する。ゲルを０．４Ｍ ＫＣｌに浸して、タンパク質バンドを視覚化する。ＨｕＡｓｐ２基質または融合ポリペプチドの予測分子量に対応するタンパク質バンドの同定は、自動シーケンサー（アプライド・バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）モデル４７３Ａ、カリフォルニア州フォスターシティ）
【０１０９】
あるいは、融合ポリペプチドを含有する予測基質をコードするＤＮＡ配列を所望のプロモーターおよび、所望によりリーダ配列を含有するプラスミドにクローン化することができる（例えば、［ベター（Ｂｅｔｔｅｒ）ら、「サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）」、第２４０巻、１９８８年、ｐ．１０４１−４３］を参照せよ）。この構築物の配列は自動シーケンサーによって確認することができる。ついで、ＣａＣｌ２インキュベーションおよび細菌のヒートショック処理を用いる標準手順によって、プラスミドをＥ．ｃｏｌｉに形質転換する［サンブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、前掲）。形質転換された細菌をカルベニシリンで補足したＬＢ培地で増殖させ、発現タンパク質の生成を適当な培地での増殖によって誘発する。存在すれば、該リーダー配列は成熟ＨｕＡｓｐ２基質または融合タンパク質の分泌に影響し、分泌の間に切断される。
分泌された組換えタンパク質は本明細書を通して記載された方法によって細菌性培養培地から精製する。
【０１１０】
同様に、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ピチア（Ｐｉｃｈｉａ）およびクルベロミシス（Ｋｌｕｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）を含む属からの酵母宿主細胞を用いて該組換えペプチドを生成することができる。好ましい酵母宿主は、エス・セレビシエ（Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）およびピイ・パストリス（Ｐ． ｐａｓｔｏｒｉｓ）である。酵母ベクターは、しばしば、２Ｔ酵母プラスミドからの複製配列の起源、自己複製配列（ＡＲＳ）、プロモーター領域、ポリアデニル化のための配列、転写終止のための配列、および選択マーカー遺伝子を含有する。酵母およびＥ．ｃｏｌｉ両方で複製可能なベクター（シャトルベクターという）を用いることもできる。酵母ベクターの上記の特徴に加えて、シャトルベクターはＥ．ｃｏｌｉにおける複製および選択のための配列も有する。酵母宿主中で発現されるポリペプチドの直接分泌は基質コーディングヌクレオチド配列の５’端に、酵母Ｉ因子リーダー配列をコードするヌクレオチド配列を包含することによって達成することができる。
【０１１１】
一般に、所定の基質は、商業的に入手可能な発現系、例えば、ピチア発現系（インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、カリフォルニア州サンディエゴ）を製造者のインストラクションに準じて用いることによって組換え発現することができる。この系は、直接分泌に対してプレ−プロ−アルファ−配列にも頼るが、該インサートの転写はメタノールによる誘発で、アルコールオキシダーゼ（ＡＯＸ１）プロモーターによって駆動される。
分泌された組換え基質は、例えば、細菌および哺乳類細胞上清から基質を精製するのに用いられる方法によって、酵母増殖培地から精製する。
【０１１２】
あるいは、本発明の新規基質をコードする合成ＤＮＡをバキュロウイルス発現ベクターｐＶＬ１３９３（ファルミンゲン（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）、カリフォルニア州サンディエゴ；［ルッコフ（Ｌｕｃｋｏｗ）およびサマーズ（Ｓｕｍｍｅｒｓ）、「バイオ／テクノロジー（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）」、第６巻、１９８８年、ｐ．４７］）にクローン化することができる。次いで、この基質含有ベクターを製造者の指示（ファルミンゲン）に準じて用いて、ｓＦ９タンパク質なし培地にスポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）細胞をインフェクトする。該タンパク質またはペプチドを精製し、ヘパリンセファロースカラム（ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、ニュージャージー州ピスケータウェイ）およびシーケンシャル分子サイジングカラム（アミコン（Ａｍｉｃｏｎ）、マサチューセッツ州バーバリー）を用いて培地から濃縮し、次いでＰＢＳに再懸濁させる。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析は単一バンドを示し、タンパク質のサイズを確認し、ポートン２０９０（Ｐｏｒｔｏｎ ２０９０）ペプチドシーケンサーでのエドマン配列決定はそのＮ−末端配列を確認する。
【０１１３】
あるいは、ＨｕＡｓｐ２基質を昆虫系中で発現することができる。タンパク質発現のための昆虫系は当業者によく知られている。一つのそのような系において、オートグラファ・カリフォルニカ・ニュクレア・ポリヘドロシス・ウイルス（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ ｎｕｃｌｅａｒ ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓ ｖｉｒｕｓ）（ＡｃＮＰＶ）をベクターとして用いて、スポドプテラ・フルギペルダ細胞またはトリコプルシア（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ）幼生中で外来遺伝子を発現する。基質コーディング配列をポリへドリン遺伝子のごとき、ウイルスの不可欠ではない領域にクローン化し、ポリヘドリンプロモーターの制御下におく。基質の成功した挿入はポリヘドリン遺伝子を不活性にし、コートタンパク質のコートを欠如する組換えウイルスを生成する。次いで、該組換えウイルスを用いてエス・フルギペルダ細胞またはトリコプルシア幼生をインフェクトし、そこで基質を発現する［スミス（Ｓｍｉｔｈ）ら、「ジャーナル・オブ・バイロロジー（Ｊ． Ｖｉｒｏｌ）」、第４６巻、１９８３年ｐ．５８４］；［エンゲルハード・イーケイ（Ｅｎｇｅｌｈａｒｄ ＥＫ）ら、「プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・サイエンシズ （Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ’ｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．」、第９１巻、１９９４年、ｐ．３２２４−７］。
【０１１４】
組換えタンパク質の発現のための哺乳類宿主系も当業者によく知られている。宿主細胞株は発現タンパク質をプロセスするか、またはタンパク質活性を付与するのに有用であろうある転写後修飾を生じる特定の能力につき選択することができる。該ポリペプチドのそのような修飾は、限定されないが、アセチル化、カルボキシル化、グリコシル化、リン酸化、脂質化およびアシル化を含む。該タンパク質の「プレプロ」形態を切断する転写後プロセシングも正しい挿入、折畳みおよび／または機能について重要である。ＣＨＯ、ＨｅＬａ、ＭＤＣＫ、２９３、ＷＩ３８等のごとき様々の宿主細胞は、そのような転写後活性のための特異的細胞機関および特徴的機構を有し、導入された外来タンパク質の正しい修飾およびプロセシングを保証するように選ぶことができる。
【０１１５】
そのような安定な発現が望ましいので、形質転換細胞を長期高収率タンパク質生成に用いることが好ましい。一旦、所望する発現カセットと共に選択マーカーを含有するベクターでそのような細胞を形質転換すれば、該細胞を富化培地中でで１〜２日間増殖し、その後、それらを選択培地に替えることができる。該選択マーカーは選択に対する耐性を付与するようにデザインし、そその存在は導入した配列を上手く発現する細胞の増殖および回収を許容する。安定に形質転換された細胞の抵抗性クランプは、該細胞に対して適当な組織培養技術を用いて増殖すし得る。
【０１１６】
多数の選択系を用いて、組換えタンパク質生成のために、形質転換されている細胞を回収することができる。そのような選択系は、限定されないが、それぞれ、ｔｋ−、ｈｇｐｒｔ−またはａｐｒｔ−細胞中のＨＳＶチミジンキナーゼ、ヒポキサシン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼおよびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子を含む。また、抗代謝抵抗は、メトトレキサートに対する抵抗性を付与するｄｈｆｒ；マイコフェノール酸に対する抵抗性を付与するｇｐｔ；アミノグリコシドＧ４１８に対する抵抗性を付与するｎｅｏ；またクロールスルフロンに対する抵抗性も付与し；およびハイグロミシンに対する抵抗性を付与するｈｙｇｒｏを選択する基礎として用い得る。有用であろうさらなる選択遺伝子は、細胞がトリプトファンの代わりにインドールを用いるようにするｔｒｐＢ、または細胞がヒスチジンの代わりにヒスチノールを用いるようにするｈｉｓＤを含む。形質転換物の同定のための視覚的同定を与えるマーカーは、アントシアニン、β−グルクロニダーゼおよびその基質ＧＵＳ、ならびにフシフェラーゼおよびその基質ルシフェリンを含む。
【０１１７】
Ｃ．部位特異的突然変異誘発
部位特異的突然変異誘発は個々のＨｕ−Ａｓｐ２基質ペプチドおよびさらに特別には、成分として本発明のＨｕ−Ａｓｐ２基質ペプチドを含む融合ポリペプチドの調製に有用なもう一つの技術である。この技術は、（修飾につき標的されるアミノ酸配列をコードする基本的なＤＮＡの特異的突然変異誘発を用いる。この技術は、１以上の前記考慮点を含み、１以上のヌクレオチド配列変化を該ＤＮＡに導入することによって、配列変異体を調製し、試験するすぐに使える能力を与える。部位特異的突然変異誘発は、所望の突然変異のＤＮＡ配列ならびに十分数の隣接ヌクレオチドをコードする特異的オリゴヌクレオチド配列の使用により突然変異体の生成を許容して、十分なサイズおよび配列複雑度のプライマー配列を得て、安定な二本鎖を配列の接合の両側に横切って形成する。典型的に、１７ないし２５個のヌクレオチド長のプライマーが好ましく、該配列の接合の両側の約５ないし１０個の残基が変化している。
【０１１８】
該技術は、典型的に一本鎖および二本鎖形態の両方で存在するバクテリオファージベクターを用いる。部位特異的突然変異誘発に有用な典型的なベクターは、Ｍ１３ファージのごときベクターを含む。これらのファージベクターは商業的に入手可能で、それらのしようは一般的に当業者によく知られている。二本鎖プラスミドも規定的に部位特異的突然変異誘発に用いられ、それは対象の遺伝子をファージからプラスミドに移すステップを除外する。
【０１１９】
一般に、部位特異的突然変異誘発は、先ず、一本鎖ベクターを得るか、その配列に所望のタンパク質をコードするＤＮＡ配列を含む二本鎖の二本の鎖を融解することによって行う。所望の突然変異配列を保有するオリゴヌクレオチドプライマーは合成で調製する。次いで、このプライマーを１本鎖ＤＮＡ調製物とアニールし、ハイブリダイゼーション（アニーリング）条件を選択するとき誤対合の度合を考慮し、Ｅ．ｃｏｌｉポリメラーゼＩクレノフフラグメントのごときＤＮＡ重合酵素に付して、突然変異保有鎖の合成を完了させる。かくして、１本の鎖が元の非突然変異配列をコードし、第２の鎖が所望の突然変異を保有するヘテロ二本鎖を形成する。次いで、このヘテロ二本鎖ベクターを用いて、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞のごとき適当な細胞を形質転換し、突然変異配列編成を保有する組換えベクターを含むクローンを選択する。
【０１２０】
もちろん、部位特異的突然変異誘発に関する上記アプローチは潜在的に有用な突然変異ペプチドを生成するための唯一の方法ではなく、限定する意味はない。本発明は、例えば、対象の遺伝子を伴なう組換えベクターをヒドロキシルアミンのごとき突然変異誘発剤で処理して配列変異体を得ることのごとき、突然変異誘発を達成する他の方法も意図する。
【０１２１】
Ｄ．たんぱく質精製
本発明のペプチドは精製するのが望ましい。タンパク質精製技術は当業者によく知られている。これらの技術は、あるレベルにて、ポリペプチドおよび非ポリペプチドフラクションに対する細胞環境の粗フラクショネーションを含む。本発明のペプチドまたはポリペプチドを他のタンパク質から分離したら、対象のペプチドまたはポリペプチドは、クロマトグラフィーまたは電気泳動技術を用いて更に精製して、部分的または完全精製（すなわち、ホモジニティーまでの精製）を達成することができる。純粋ペプチドの調製に特に適した分析方法はイオン交換クロマトグラフィー、排除クロマトグラフィー；ポリアクリルアミドゲル電気泳動；等電点フォーカシングである。ペプチドを精製する特に効率的な方法は高速タンパク質液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）または高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）である。
【０１２２】
本発明のある局面は、精製、特定の具体例において、コードされたポリペプチド、タンパク質またはポリペプチドの実質的な精製に関する。本明細書で用いられる「精製されたポリペプチド、タンパク質またはペプチド」なる用語は、他の成分から分単離された組成物をいうことを意図し、ここに、該ポリペプチド、タンパク質またはペプチドはその天然に得られる状態に対していずれかの程度まで精製されている。したがって、精製されたポリペプチド、タンパク質またはペプチドはそれが天然に産生する環境から離れたポリペプチド、タンパク質またはペプチドもいう。
【０１２３】
一般に、「精製」は、フラクショネーションに付されて種々の他の成分が除去されているポリペプチド、タンパク質またはペプチド組成物をいい、その組成物は実質的にその発現された生物学的活性を保持する。「実質的に精製された」なる用語を用いる場合、この表記はポリペプチド、タンパク質またはペプチドが約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％またはそれ以上のタンパク質のその組成中に構成するごとく、該組成物の主要な成分を形成することをいう。
【０１２４】
ポリペプチド、タンパク質またはペプチドの精製度合を定量する種々の方法が、本開示を考慮して、当業者に知られている。これらは、例えば、活性フラクションの特異的活性を決定するか、または、ＳＤＳ／ＰＡＧＥ分析によりフラクション内のポリペプチドの量を評価することを含む。フラクションの純度を評価する好ましい方法は、該フラクションの特異的活性を算出し、それを初期抽出物の特異的活性と比較し、かくして、「‐倍の精製数」として、純度を算出することである。活性の量を表すのに用いる実際の単位は、もちろん、精製を行うのに選択された特定のアッセイ技術および発現されたポリペプチド、タンパク質またはペプチドが検出可能な活性を示すか否かに依存するであろう。
【０１２５】
タンパク質精製に用いるのに適した種々の技術が当業者によく知られている。これらは、例えば、硫酸アンモニウム、ＰＥＧ、抗体等での沈殿、または熱変性後の遠心によって；イオン交換、ゲル濾過、逆相、ヒドロキシアパタイトおよびアフィニティークロマトグラフィー；等電点フォーカシング；ゲル電気泳動；およびそのようなまたは他の技術の組合わせを含む。当該分野で一般に知られているように、種々の精製ステップを実行する順序は変化させることができ、ある種のステップは除外することができ、それでも、依然として、実質的に精製されたポリペプチド、タンパク質またはペプチドを調製するのに適した方法をもたらす。
【０１２６】
該ポリペプチド、タンパク質またはペプチドが、常に、それらの最も精製された状態で提供されるという全般的な要求はない。実際、実質的より低く精製された生成物はある具体例において有用性を有することが意図される。部分的精製は、より少ない精製ステップを組み合せて用いるか、または同一の一般的精製スキームの異なる形態を用いるかによって達成することができる。例えば、ＨＰＬＣ装置を用いて実行される陽イオン交換カラムクロマトグラフィーは、一般的に、低圧クロマトグラフィーシステムを用いる同一技術よりもより大きな「‐倍」精製をもたらすと理解される。より低い相対精製を示す方法は、タンパク質生成物の全回収においてまたは発現されたタンパク質の活性を維持することにおいて利点を有するであろう。
【０１２７】
ポリペプチドの移動度は、異なる条件のＳＤＳ／ＰＡＧＥで、時に、著しく変化し得る［カパルディ（Ｃａｐａｌｄｉ）ら、「バイオケミカル・アンド・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケーションズ（Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍ．）」、第７６巻、１９７７年、ｐ．４２５］。したがって、異なる電気泳動条件下、精製されたまたは部分的に精製された発現生成物の見かけの分子量は変化するであろうことが理解される。
【０１２８】
Ｖ．本発明の基質の生成に使用するための発現構築物
本発明において、本発明のペプチド基質またはペプチド−基質融合タンパク質を発現する必要がある。そのような発現を達成するために、本発明は本発明のペプチド基質または融合タンパク質をコードするためのポリヌクレオチド分子を含むベクターならびにそのようなベクターで形質転換した宿主細胞を用いる。そのようなポリヌクレオチド分子はベクターに接続することができ、それは、通常、宿主細胞における繁殖のために選択マーカーおよび複製源を含む。本発明に用いる発現構築物のこれらの要素は本明細書の以下にさらに詳細に記載する。
【０１２９】
該発現ベクターは上記または下記の所定のペプチドまたは融合ポリペプチドＨｕ−Ａｓｐ２基質のいずれかをコードするＤＮＡを含み、哺乳類、微生物、ウイルスまたは昆虫の遺伝子から誘導されたもののごとき、適当な転写または翻訳調節配列に作動可能に連結される。調節配列の例は、転写プロモーター、オペレーター、またはエンハンサー、ｍＲＮＡリボソーム結合部位、および転写および翻訳を制御する適当な配列を含む。
「発現ベクター」、「発現構築物」または「発現カセット」なる用語は、本明細書において交換可能に用いられ、配列をコードする核酸の部分または全てが転写される得る遺伝子産物の核酸コーディングを含有する任意の型の遺伝子構築物をも含むことを意味する。
【０１３０】
本発明のペプチドまたはポリペプチドの発現のための適当な発現ベクターの選択は、もちろん、用いられる特定の宿主細胞に依存し、当業者の技術範囲内である。適当な発現ベクターは、ｐｃＤＮＡ３（インビトロゲン）およびｐＳＶＬ（ファルマシア・バイオテック）を含む。本発明における発現に好ましいベクターは、ｐｃＤＮ３．１−Ｈｙｇｒｏ（インビトロゲン）である。哺乳類宿主細胞に用いる発現ベクターはウイルスゲノムから誘導された転写および翻訳制御配列を含むことができる。本発明に用いることができる普通に用いられるプロモーター配列およびエンハンサー配列は、限定されないが、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、アデノウイルス２、ポリオーマウイルス、およびシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）を含む。哺乳類発現ベクターを構築する方法は、例えば、［オカヤマ（Ｏｋａｙａｍａ）およびベルグ（Ｂｅｒｇ）、「モレキュラー・アンド・セルラー・バイオロジー（Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ．）」、第３巻、１９８３年、ｐ．２８０］；［コスマン（Ｃｏｓｍａｎ）ら、「モレキュラー・イムノロジー（Ｍｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．）」、第２３巻、１９８６年、ｐ．９３５］；［「ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）」、第３１２巻、１９８４年、ｐ．７６８］；ＥＰ−Ａ−０３６７５６６；およびＷＯ９１／１８９８２に開示されている。
【０１３１】
該発現構築物は本発明の特別のペプチド基質または融合ポリペプチドをコードする核酸領域を含む。そのような発現ベクターを構築するのに使用するコーディング領域は、少なくとも本明細書に記載されたペプチドのβ−セクレターゼ切断をコードすべきであるが、生成されたペプチドが、アスパルチルプロテアーゼおよび、好ましくはＨｕ−Ａｓｐによって切断され易いβ−セクレターゼ切断部位を含むものである限り、より大きなポリペプチドをコードすることができること意図する。
【０１３２】
本発明のある局面において、発現構築物は該ペプチドまたはポリペプチドの発現の検出を可能にする選択マーカーをさらに含むことができる。普通、薬物選択マーカーの包含は形質転換物、例えば、ネオマイシン、プロマイシン、ハイグロマイシン、ＤＨＦＲ、ゼオシンおよびヒスチジノールのクローニングおよび選択を促進する。あるいは、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ｔｋ）（真核）、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、またはクロラムフェニカルアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）（原核）を用いることができる。免疫学的マーカーも用い得る。例えば、ＦＬＡＧ系（ＩＢＩ、コネチカット州ニューヘイブン）、ＨＡおよび６×Ｈｉｓ系（チアゲン、カリフォルニア州チャッツワース）のごときエピトープタグを用いることができる。さらに、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）系（ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、ニュージャージー州ピスケータウェイ）、またはマルトース結合タンパク質系（ＮＥＢ、マサチューセッツ州バーバリー）を用いることもできる。用いられる選択マーカーは、それが遺伝子産物をコードする核酸と同時に発現されることが可能である限り、重要ではないと確信される。選択マーカーのさらなる例は、当業者によく知られている。本発明に用いることができる特に好ましい選択マーカーはネオマイシン抵抗またはＧＦＰマーカーである。
【０１３３】
発現は、適当なシグナルがベクター中に提供されることを要求する。このセクションは、宿主細胞中で対象の核酸の発現を駆動するのに用いることができるウイルスおよび哺乳類の両方の起源からのエンハンサー／プロモーターのごとき、種々の調節要素の考察を含む。宿主細胞におけるメッセンジャーＲＮＡ安定性および翻訳性を最適化するようにデザインされた要素も定義される。当該生成物を発現する恒久的安定細胞クローンを確立するための多数の優勢薬物選択マーカーの使用の条件も、該薬物選択マーカーの発現を突然変異フェノタイプの発現にリンクさせる要素なので提供される。
【０１３４】
好ましい具体例において、所定のペプチドをコードする核酸または選択マーカーをコードする核酸はプロモーターの転写制御の下にある。「プロモーター」は、当該細胞の合成機関によって認識されるＤＮＡ配列または導入された合成機関をいい、遺伝子の特異的転写を開始させるのに必要とされる。
【０１３５】
当該調節配列が該ペプチド基質または該融合ポリペプチドをコードするＤＮＡに機能的に関連する場合、ヌクレオチド配列が作動可能に連結される。かくして、プロモーターヌクレオチド配列が該配列の転写を指揮するのであれば、プロモーターヌクレオチド配列は所定のＤＮＡ配列に作動可能に連結される。同様に、「転写制御の下」なる語句は、該プロモーターが、核酸に対して正しい位置および方向にあって、ＲＮＡポリメラーゼ開始および遺伝子の発現を制御していることを意味する。
【０１３６】
プロモーターなる用語が本明細書で用いられ、ＲＮＡポリメラーゼＩＩの開始部位の周りに集まった転写制御モジュールの群をいう。いかにプロモーターが統制されるかという考えのほとんどは、いくつかのウイルスプロモーターの解析に由来し、ＨＳＶチミジンキナーゼ（ｔｋ）およびＳＶ４０早期転写ユニットのものを含む。これらの研究は、より最近の研究によって増加し、プロモーターは、それぞれ約７〜２０ｂｐのＤＮＡからなる別個の機能的モジュールを含み、転写アクチベーターまたはレプレッサータンパク質に対する１以上の認識部位を含有する。
【０１３７】
各プロモーターの少なくとも１のモジュールがＲＮＡ合成の出発部位を位置付ける働きをする。これの最もよく知られた例はＴＡＴＡボックスであが、哺乳類終止デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ遺伝子のプロモーターおよびＳＶ４０後期遺伝子のプロモーターのごとき、いくつかのプロモーターはＴＡＴＡボックスを欠如し、開始部位自体に重なる別個の要素は開始の位置を固定する。
【０１３８】
さらなるプロモーター要素は転写開始の頻度を調節する。典型的に、これらは開始部位の上流の領域３０〜１１０ｂｐに位置するが、最近、多数のプロモーターが該開始部位の下流にも機能性要素を含有することが示された。プロモーター要素間の間隔はしばしばフレキシブルであり、それによって、要素がお互いに対して逆位置になるか移動させたとき、プロモーター機能が保存される。該ｔｋプロモーターにおいて、プロモーター間の間隔は活性が低下するまで、５０ｂｐまで離すように増加し得る。プロモーターに依存して、個々の要素は共作動的かまたは独立的かのいずれかで機能して、転写を活性下し得る。
【０１３９】
対象の核酸配列の発現を制御するため用いられる特別のプロモーターは、それが当該標的された細胞において核酸の発現を指揮することが可能である限り、重要ではないと確信される。かくして、ヒト細胞を標的する場合、核酸コーディング領域をヒト細胞中で発現されることが可能なプロモーターに隣接するように位置し、そのプロモーターの制御下にあることが好ましい。一般的にいえば、そのようなプロモーターはヒトまたはウイルスプロモーターのいずれかを含むことができるであろう。
【０１４０】
種々の具体例において、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）前初期遺伝子プロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター、ラウス肉腫ウイルス・ロングターミナルリピート（ｌｏｎｇ ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｐｅａｔ）、β−アクチン、ラットインスリンプロモータ、ホスホグリセロールプロモーターおよびグリセロアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼプロモーターは、全て当業者によく知られ、容易に入手可能であり、対象のコーディング配列の高レベル発現を得るために用い得る。対象のコーディング配列の発現を達成するとして当該分野でよく知られている他のウイルスまたは哺乳類の細胞または細菌ファージプロモーターの使用も、発現レベルが所定の目的にとって十分であることを条件に、同様に意図される。よく知られた特性を持つプロモーターを用いることによって、トランスフェクションまたは形質転換後の対象のタンパク質の発現のレベルおよびパターンを最適化し得る。
【０１４１】
特定の生理学的または合成的シグナルに対する反応において調節されるプロモーターの選択は、当該遺伝子産物の誘発性発現を許容し得る。いくつかの誘発性プロモーター系はウイルスベクターの生成に利用可能である。一つのそのような系はエクダイソン系（インビトロゲン、カリフォルニア州カールスバッド）であり、それは哺乳類細胞において対象の遺伝子の調節された発現を可能にするようにデザインされる。それは、実際上トランスジーンの基礎レベル発現なしで、２００倍以上の誘発性を可能にする厳密に調節された発現機構からなる。
【０１４２】
もう一つの有用な誘発性系は、元々はゴッセン（Ｇｏｓｓｅｎ）およびブジャード（Ｂｕｊａｒｄ）［「プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・サイエンシズ、ＵＳＡ（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ’ｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．， ＵＳＡ）」、１５、第９６（４）巻、１９９２年、ｐ．５５４７−５１］；ゴッセンら［「サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）」、第２６８（５２１８）巻、１９９５年、ｐ．１７６６−９］によって開発されたＴｅｔ−ＯｆｆＴＭまたはＴｅｔ−ＯｎＴＭ系（クロンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、カリフォルニア州パロアルト）である。
【０１４３】
哺乳類細胞において、ＣＭＶ前初期プロモーターが、しばしば、強力な転写活性化を得るために用いられる。効力の低いＣＭＶプロモーターの修飾バージョンも、トランスジーンの低下したレベルの発現を望む場合に用いられてきた。ＭＬＶまたはＭＭＴＶ由来のＬＴＲのごときレトロウイルスプロモーターは本発明において有用であることが意図される。用いることができる他のウイルスプロモーターは、ＳＶ４０、ＲＳＶ ＬＲＴ、ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２ ＬＴＲ、Ｅ１Ａ、Ｅ２ＡまたはＭＬＰ領域由来のごときアデノウイルスプロモーター、ＡＡＶ ＬＴＲ、カリフラワーモザイクウイルス、ＨＳＶ−ＴＫ、ならびに鳥類肉腫ウイルスを含む。
【０１４４】
いくつかの具体例において、調節可能なプロモーターが有用であると証明されるであろう。そのようなプロモーターは、例えば、調節可能なホルモンまたはサイトカインであるものである。ホルモン調節可能プロモーターは、ＭＭＴＣ、ＭＴ−１、エクダイソン、およびＲｕＢｉｓｃｏならびに、甲状腺、下垂体および副腎のホルモンに反応するもののごとき他のホルモン調節プロモーターを含む。
【０１４５】
本発明における使用に意図されるもう一つの調節要素はエンハンサーである。これらは、同一分子のＤＮＡの遠位に位置するプロモーターからの転写を増加させる遺伝子要素である。エンハンサーはプロモーターとよく似通って構成される。すなわち、それらはいくつもの要素からなり、それらの各々は１以上の転写タンパク質に結合する。エンハンサーとプロモーターとの間の根本的な区別は、作動可能性である。全体としてエンハンサー領域は、ある距離で転写を刺激できるべきであり；これはプロモーター領域またはその成分要素ではそうあるべき必要はない。一方、プロモーターは、特定の部位にて、および特定の方向でＲＮＡ合成の開始を指揮する１以上の要素を有するべきであり、一方、エンハンサーはこれらの特異性を欠如する。プロモーターおよびエンハンサーは、しばしば、重複し、連続し、しばしば、非常に似通ったモジュラー組織を有するようである。本発明の有用なエンハンサーは当業者によく知られ、用いられる特定の発現系に依存する［シャーフ・ディー（Ｓｈａｒｆ Ｄ）ら、「リザルツ・アンド・プロブレムス・イン・セル・ディフェレンシエーション（Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｐｒｏｂｌ Ｃｅｌｌ Ｄｉｆｆｅｒ）」、第２０巻、１９８７年、ｐ．１２５−６２］；［ビットナー（Ｂｉｔｔｅｎｅｒ）ら、「メソッズ・イン・エンチモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ）」、第１５３巻、１９８７年、ｐ．５１６−５４４］。発現構築物がｃＤＮＡインサートを用いる場合、典型的に、ポリアデニル化シグナル配列を含んで当該遺伝子転写の適正なポリアデニル化を実行することが望ましい。ヒトまたはウシ成長ホルモンおよびＳＶ４０ポリアデニル化シグナルのごとき、選択されたトランスジェニック動物種の細胞によって認識されるあらゆるポリアデニル化シグナル配列は本発明の実施に適している。
【０１４６】
ターミネーターも発現カセットの要素として意図される。これらの要素はメッセージレベルを促進し、該カセットから他の配列への読み通しを最小限にするように機能し得る。第１に用いられる終止領域は便宜上選択されたものであろう。なぜならば、本発明によって意図されるもののごときアプリケーションのための終止領域は比較的交換可能のようだからである。該終止領域は転写開始で未変性であるか、対象のＤＮＡ配列に対して未変性であるか、または別の起源に由来するものであってよい。
【０１４７】
本発明のある具体例において、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）要素は多重遺伝子、またはポリシストロン性メッセージを作成することが意図される。ＩＲＥＳ要素は、５’メチル化Ｃａｐ依存性翻訳のリボソームスキャニングモデルをバイパスし、内部サイトにて翻訳を始める［ペレチエ（Ｐｅｌｌｅｔｉｅｒ）およびゾネンベリ（Ｓｏｎｅｎｂｅｒｇ）、「ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）」、第３３４巻、１９８８年、ｐ．３２０−３２５］。ピコルナウイルスファミリー（ポリオウイルスおよびエンセファロミオカルディティス）の２つのメンバーからのＩＲＥＳ要素［ペレチエおよびゾネンベリ、１９８８年、前掲］ならびに哺乳類メッセージからのＩＲＥＳ要素［マセヤック（Ｍａｃｅｊａｋ）およびサルノウ（Ｓａｒｎｏｗ）、「ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）」、第３５３巻、１９９１年、ｐ．９０−９４］が記載されている。ＩＲＥＳ要素を非相同オープン・リーディング・フレームに連結し得る。多重オープン・リーディング・フレームを一緒に転写し得、各々はＩＲＥＳによって隔てられ、ポリシストロン性メッセージを作成する。ＩＲＥＳ要素のお蔭で、各オープン・リーディング・フレームは、効率的な翻訳のためリボソームにアクセス可能である。多重遺伝子は単一のプロモーター／エンハンサーを用いて効率的に発現して単一メッセージを転写し得る。
【０１４８】
いずれの非相同性オープン・リーディング・フレームもＩＲＥＳ要素に連結し得る。これは、分泌されたタンパク質、独立した遺伝子によってコードされる多数サブユニットタンパク質、細胞内および膜結合タンパク質ならびに選択マーカーを含む。このように、いくつかのタンパク質の発現を単一構築物および単一選択マーカーを持つ細胞内に同時に加工し得る。
【０１４９】
ＶＩ．Ｈｕ−Ａｓｐ２アッセイにおける基質の使用
特定の具体例において、本発明は、Ｈｕ−Ａｓｐ２の活性および／または機能、より詳しくは、Ｈｕ−Ａｓｐ２のβ−セクレターゼ活性および／または機能をモニターするアッセイに関する。これらのアッセイは溶液中でＨｕ−Ａｓｐ２ポリペプチドを本発明の適当な基質と共にインキュベーションすることを含み、Ｈｕ−Ａｓｐ２タンパク質加水分解活性の指標としてペプチド基質の切断を用いる。
【０１５０】
Ａ．アッセイフォーマット
特定の具体例において、本発明はヒトＡｓｐ２アスパルチルプロテアーゼ（Ｈｕ−Ａｓｐ２）の活性をモジュレートする剤を同定する方法に関する。例えば、一つの変形として、そのような方法は：
（ａ）試験剤の存在下および不存在下で、本発明のペプチドまたは融合タンパク質のいずれかとＨｕ−Ａｓｐ２活性を含む組成物と接触させ；
（ｂ）該試験剤の存在下および不存在下で、該Ｈｕ−Ａｓｐ２によるＰ１とＰ１’との間の部位の該ペプチドまたは融合タンパク質の切断を決定し；次いで
（ｃ）該試験剤存在下でのＨｕ−Ａｓｐ２の切断活性を該試験剤の不存在下での切断活性と比較して、該Ｈｕ−Ａｓｐ２による切断をモジュレートする剤を同定するステップを含み、
ここに、該試験剤の存在下でのＨｕ−Ａｓｐ２における変化が該Ｈｕ−Ａｓｐ２活性のモジュレータである剤を同定する。
【０１５１】
対照（試験剤なし）と比較して増大した切断を生じる剤は、アゴニスト、またはＡｓｐ２タンパク質加水分解活性のスチムレータとスコアされ、一方、減少した切断を生じる剤はインヒビターとスコアされる。該インヒビターは特に興味深いものである。なぜならば、Ａｓｐ２活性のインヒビターはアルツハイマー病またはその症状もしくは進行の治療および予防の治療的または予防的暗示を有するからである。
【０１５２】
本発明のペプチドまたは融合タンパク質の使用により（ＡＰＰおよびＡＰＰペプチド配列に代えて）修飾し得る代表的なアッセイは、ＰＣＴ公開番号ＷＯ００／１７３６９および１９９９年１０月１３日に出願された米国特許出願第０９／４１６，９０１号に記載され、両方とも、Ａｓｐ２活性アッセイおよびＡｓｐ２活性のモジュレーターのアッセイに関するそれらの教示につき、出典明示して本明細書に含まれる。該Ａｓｐ２は、例えば、Ｈｕ−Ａｓｐ２（ａ）、Ｈｕ−Ａｓｐ２（ｂ）、または、それらの生物学的に活性なフラグメント、アナログもしくは変異体であろう。ヒトＡｓｐ２の非ヒトオルトログをアッセイに用いることができる。
【０１５３】
そのようなアッセイは、無細胞系中でＨｕ−Ａｓｐ２ポリペプチドで、またはＨｕ−Ａｓｐならびにその変異体またはアイソフォームを発現する培養された細胞で行うことができる。例えば、無細胞系において、接触ステップは、試験剤の存在下または不存在下で、Ｈｕ−Ａｓｐ２酵素と本発明のペプチドまたはタンパク質基質を混合することによって行うことができる。最上の結果では、該酵素および該基質は好ましくは実質的に精製され、明確に制御された量で混合され、酵素活性を最適にし、および／または生理条件を模倣する適当なバッファ中で混合する。決定ステップは、Ｎ−末端フラグメント、Ｃ−末端フラグメントまたは両方の測定を含むか、または、切断を示す他のパラメータの測定を含むことができる。例えば、該ペプチド基質は、切断されて当該標識が失活部分から分離されたときにのみ、より検出可能になる失活標識を含有することができる。あるいは、該ペプチド基質は、固体支持体に対して、Ｎ−末端またはＣ−末端で固定することができる。この配置において、切断は切断フラグメントの固体支持体からの放出によって測定し得る。放出は媒質中の標識の増加または該固体支持体に結合した標識の減少によって測定することができる。あるいは、放出は、放出されたペプチドの（例えば、抗体での）定量的捕捉によって測定することができる。
【０１５４】
代表的な捕捉アッセイにおいて、３８４−ウェルマイクロタイタープレートをＢＳＡ酵素（７．５ｎＭ）でブロックし、次いで、５０μＭの試験すべき化合物を１時間インキュベートし、２５０ｎＭの基質、例えば、ビオチン−ＫＶＥＡＮＹＥＶＥＧＥＲＣ［ｃｙｓ−オレゴングリーン］ＫＫの添加によって、反応を開始する。最終アッセイ条件において、体積は３０μｌ／ウェル（ｐＨ５．０）；５０μＭ化合物；７．５４ｎＭ酵素（または１５ｎｇ／ウェル）；２５０ｎＭ基質；５％ＤＭＳＯおよび０．００１％ＴＷＥＥＮ−２０である。アッセイ物を室温にて一晩インキュベートし、反応をＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．３を添加して停止する。６．２５ｐモルの基質を含有するアリコートを取り出し、切断および／または未切断ビオチン化基質をストレプトアビジン被覆プレート中に捕捉する。該プレートを３回洗浄し、バッファーを添加する。捕捉アッセイはＬＪＬ Ａｎａｌｙｓｔでオレゴングリーンの蛍光発光を読取ることによってモニターする（励起４８５／発光５３０）。
【０１５５】
本明細書で用いることができるもう一つのアッセイは蛍光偏光アッセイである。蛍光偏光は、本発明のβ−セクレターゼ基質の影響をモニターするために調査し得る敏感で手軽な非破壊アッセイである。それを用いて、これらの基質とＨｕＡｓＰ２酵素との相互作用をモニターし得る。制御された条件下、蛍光偏光測定は、溶液中の蛍光分子の「分子転倒」の程度を明らかにし得る。例えば、コンパクトな分子体積の小分子は急速に転倒すると予想される。偏向した光が照射されれば、溶液中の分子の急速な運動は光の著しい偏光解消をもたらし、「低」偏向値の読みを与える。同一の条件下で、分子体積が増大した大分子または大きなコンプレックスは分子回転（転倒）プロセスを遅くするであろう。その結果、入射面偏光の低偏向が得られ、より高い偏向値が測定されるであろう。
【０１５６】
蛍光プローブで小リガンドを標識することによって、該リガンドと他の系成分との相互作用に由来する蛍光偏光の変化を測定し得る。そのような方法を適用して、酵素（ＨｕＡｓｐ２）と蛍光性酵素基質との間の相互作用の強さを測定することができる。
【０１５７】
代表的な蛍光偏光アッセイにおいて、プレブロック低アフィニティーブラックプレート（３８４−ウェル）中、酵素（０．５ｎＭ）および化合物（１０〜２０μＭ）を３０分間インキュベートし、最終体積３０μ／ウェルに対して、１５０ｎＭ基質（例えば、ビオチン−ＧＬＮＩＫＴＥＥＩＳＥＩＳＹ−ＥＶＥＦＲ［ｃｙｓ−オレゴングリーン］ＫＫまたはＰ１−−Ｐ１’位に加水分解不可能結合を含有する同様の基質）の添加によって反応を開始する。最終アッセイ条件は：ｐＨ４．５にて３０μｌ／ウェル；５０μＭ化合物、０．５ｎＭ酵素または１ｎｇ／ウェル；１５０ｎＭ基質、２％ＤＭＳＡおよび０．００１％ＴＷＥＥＮ−２０である。アッセイ物を３７℃にて３時間インキュベートし、飽和濃度の免疫純粋ストレプトアビジンの添加によって反応を停止する。次いで、プレートを室温にて１５分間インキュベートし、ＬＪＬ Ａｃｑｕｅｓｔで蛍光偏光を測定する（励起４８５／発光５３０）。
【０１５８】
該酵素の活性部位またはアロステリック部位に結合する化合物を検出する結合アッセイも本発明により意図される。そのような決定につき、本発明の基質の加水分解不可能誘導体の使用が特に好ましい。そのようなアッセイの代表的な派生において、Ｐ１にてのスタチン誘導体の存在が本発明のペプチドをＰ１−−Ｐ１’位にて加水分解不可能にする。該基質は、適当な蛍光タグ、例えば、ＢＯＤＩＰＹ ＦＬの付加で修飾して、検出を容易にすることができる。
【０１５９】
特定の実施例において、スタチン含有ペプチド（ＳＥＶＮ［Ｓｔａ］ＶＡＥＦＲＧＧＣ；配列番号：１９６）を合成し、それはＨｕＡｓｐ酵素活性の阻害を示す。このインヒビターの蛍光誘導体に（ＳＥＶＮ［Ｓｔａ］ＶＡＥＦＲＣ（Ｂｏｄｉｐｙ ＦＬ））も合成し、下記するように用いた。溶液中のこれらのスタチン誘導基質の蛍光偏光は最小限である。しかしながら、ＨｕＡｓｐ２との相互作用により、蛍光偏光に劇的な増大が生じる。このセクションにおいて実施例がスタチン誘導体の言及を論じるとき、蛍光部分を含有する他の加水分解不可能誘導体を蛍光偏光アッセイに用いることができることを意図する。
【０１６０】
本発明の基質は上記のように標識し、ＨｕＡｓｐ２についての蛍光偏光結合アッセイを開発するために用いることができる。該酵素と該基質との間の相互作用についての平衡解離定数（ＫＤ）は、該基質を酵素で滴定することで生じる蛍光偏光変化を測定することによって決定する。
本発明の基質とＨｕＡｓｐ２との相互作用についてのＫＤを決定するために、種々の量のβ−セクレターゼを３．１ｎＭの蛍光性基質と組合わせて室温にて３時間インキュベートする。インキュベーション後、蛍光偏光をＬＪＬ Ａｎａｌｙｓｔ（９６ウェルフォーマット）またはＰａｎ Ｖｅｒａ Ｂｅａｃｏｎ（単一セルフォーマット）を用いて決定する。代表的なアッセイは２５ｍＭ酢酸ナトリウム、２０％グリセロール、ｐＨ４．７５で行う。得られたデータの偏向値を縦軸に、酵素濃度を横軸に記したグラフプロットは該酵素の該基質との相互作用についてのＫＤを決定するための結合等温線を与える。次いで、データを関係式Ｐｘ＝ＰＦ＋（ＰＢ−ＰＦ）＊［Ｅ］／（ＫＤ＋［Ｅ］）（式中、Ｐ＝偏向値、ｘ＝試料、Ｆ＝遊離インヒビター、Ｂ＝結合インヒビター、Ｅ＝β−セクレターゼ［「Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ Ｇｕｉｄｅ」、１９９８年、パン・ベラ（Ｐａｎ Ｖｅｒａ）、ウィスコンシン州マディソン］）を用いて解析して、ＫＤを得る。このアッセイを用いて該酵素の活性部位に結合する化合物をスクリーンするのに用い得る。
【０１６１】
上記アッセイを用いて、蛍光偏光結合アッセイを有効にし、野生型またはスウェディッシュ突然変異体を含有するペプチド基質につきＫＤを測定する。例えば、そのような初期アッセイは蛍光誘導体（ＳＥＶＮ［Ｓｔａ］ＶＡＥＦＲＣ（Ｂｏｄｉｐｙ ＦＬ））を用いて行うことができる。引き続き、該アッセイを本発明の有用な基質の活性を決定するのに用いるための競争結合フォーマットにおける使用のために修正することができる。ＳＥＶＮ［Ｓｔａ］ＶＡＥＦＲＣ（Ｂｏｄｉｐｙ ＦＬ）基質を含有する溶液を有望な競争インヒビターで滴定する。例えば、３．１ｎＭ ＳＥＶＮ［Ｓｔａ］ＶＡＥＦＲＣ（Ｂｏｄｉｐｙ ＦＬ）基質、４８ｎＭ酵素および種々の濃度の有望な競争インヒビターを適当な時間インキュベートして反応を進行させる。このアッセイからのデータを縦軸が偏向を表し、横軸が競争インヒビター濃度を表すグラフ上にプロットすることができる。
【０１６２】
数多くの細胞ベース具体例も存在する。例えば、一つの変形において、Ｈｕ−Ａｓｐ２を細胞内で発現させ、該接触は、試験剤の存在下および不存在下で、該ペプチドの存在下該細胞を増殖させることを含む。天然にＡｓｐ２を発現する細胞を選択することができる。好ましい具体例において、細胞を組換え的に修飾して、増大した量のＡｓｐ２を発現させる。どの変形を用いるかによらず、該基質ペプチドまたは融合タンパク質を該細胞系（例えば、媒質）に添加するか、またはＡｓｐ２と共に細胞によって共発現することができる。例えば、好ましい具体例において、該細胞は、該ペプチドをＥＲまたはゴルジ体に局在化させる貫通膜ドメインを含み、本明細書に記載された適当なタグ、標識、融合パートナー、レポータータンパク質等をさらに含む本明細書にきさいされた融合ポリペプチドを組換え的に発現して、切断の検出を容易にする。
【０１６３】
代表的な細胞アッセイにおいて、ＨＡ−タグド酵素を発現する安定なＨＥＫ−２９３細胞系統をＡＰＰ変異体でトランスフェクトする。トランスフェクションしてから４８時間後、抗体Ｃ８でのウェスタンブロットにより、Ｈｕ−Ａｓｐ切断生成物Ｃ９９を測定するために、細胞抽出物を調製する。総分泌ＡＰＰフラグメントのレベルを抗体２２Ｃ１１（ベーリンガー・マンハイム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ））で、およびα−セクレターゼで切断された分泌ＡＰＰαを抗体６Ｅ１０（シンテック（Ｓｙｎｔｅｋ）、ミズリー州セントルイス）で測定するために、同じ量の調整した培地を用いる。
【０１６４】
試験剤の存在下および不存在下での活性測定は、並行して、またはいずれかの順番で連続して行い得る。さらに、一旦、特定の反応条件について酵素活性の信頼できるベースラインが得られれば、全ての試験剤について対照測定（すなわち、試験剤の不存在下での切断測定）を並行して繰り返す必要がない。インヒビターの不存在下での特定の基質に対するＡｓｐ２の酵素アッセイについての得られた知見を比較ステップを実行するための基礎として用い得る。
【０１６５】
また、上記の考察は全般的にＨｕ−Ａｓｐ２活性のモジュレーターへ言及されているが、本発明のアッセイはＨｕ−Ａｓｐ２の生成を変化させる候補基質も同定し、これによって、該Ｈｕ−Ａｓｐ２の単位あたり活性に反して、存在するＨｕ−Ａｓｐ２の量を増加または減少する。Ｈｕ−Ａｓｐ２の生成を減少させる剤もアルツハイマー病の治療または予防の暗示を有する。
【０１６６】
Ｂ．候補基質
本明細書で用いるとき、「候補基質」または「試験基質」なる用語は、Ｈｕ−Ａｓｐ２活性、好ましくは、Ｈｕ−Ａｓｐ２β−セクレターゼ活性をモジュレートすることが可能ないずれの分子をもいう。候補基質はタンパク質またはそのフラグメント、小分子インヒビター、またはさらに核酸分子であろう。スクリーニングアッセイのアプリケーションによる同定のための最も有用な薬理学的化合物が大きな化合物ライブラリーにより同定されるか、またはＡＰＰプロセシングの他の既知のモジュレーターに構造的に関連する化合物であることが証明されるであろう。活性化合物は天然に産出する化合物のフラグメントまたは部分を含んでよく、さもなくば不活性である既知の化合物との活性な組合わせとして発見されるのみであろう。しかしながら、ヒトまたは動物モデルにおいてそのような化合物を試験する前に、どれが可能性を有するかどうかを決定するために様々な候補を試験する必要がある。
【０１６７】
したがって、該活性化合物は天然に産出する化合物のフラグメントまたは部分を含んでよく、さもなくば不活性である既知の化合物との活性な組合わせとして発見されるのみであろう。したがって、本発明は、細胞ＡＰＰプロセシングを刺激または阻害する剤を同定するスクリーニングアッセイを提供する。動物、細菌、真菌、葉および樹皮を含む植物起源、海洋試料のごとき天然起源から単離された化合物を潜在的に有用な医薬剤の存在につき、候補としてアッセイすることができる。
【０１６８】
スクリーンされるべき医薬剤は化学物質または人工の化合物から誘導または合成もされ得ることは理解されるべきである。かくして、本発明によって同定された候補基質はポリペプチド、ポリヌクレオチド、小分子インヒビターまたは、Ｈｕ−Ａｓｐ２活性および／またはＡＰＰプロセシングの既知のスチムレーターまたはインヒビターから出発する合理的薬物デザインによりデザインすることができるあらゆる他の無機または有機化学化合物であってよいことが理解される。
【０１６９】
候補スクリーニングアッセイは簡単に設定および実行される。かくして、候補基質についてのアッセイにおいて、機能的Ｈｕ−Ａｓｐを発現する細胞を得た後、測定可能なＨｕ−Ａｓｐ２活性が発生するように、候補基質を該細胞と混合するであろう。このようにして、候補基質が該細胞の活性を刺激する能力を、該候補基質の存在下および不存在下で測定し得る。同様に、機能的Ｈｕ−Ａｓｐを発現する細胞を得た後のインヒビターのアッセイにおいて、候補基質を該細胞と混合する。このようにして、候補阻害基質が該細胞からＨｕ−Ａｓｐ２によって媒介される生物学的効果を低減し、撤廃し、さもなくば減少させる能力を検出することができる。
【０１７０】
ある状況における基質の「有効量」は、本発明のペプチド基質のβ−セクレターゼ切断部位の切断の形成において、該候補基質の不存在下での切断のそれらの正常レベルと比較して、所定のＨｕ−Ａｐｐ２活性またはＡＰＰプロセシングを再現的に変化させるのに有効な量である。活性において明らかに適当な変化を達成する化合物を用いる。
【０１７１】
Ｈｕ−Ａｓｐ２活性または機能における明らかな変化は、例えば、本発明の新規Ｈｕ−Ａｓｐペプチド基質を用いて測定され（例えば、実施例１を参照せよ。）、少なくとも約３０％〜４０％の活性における増加／減少、および、最も好ましくは少なくとも約５０％またはもちろん可能であればより高い値での変化で表される。
【０１７２】
本発明の新規Ｈｕ−Ａｓｐ２基質を用いる上記アッセイは多数の高スループットスクリーニング（ＨＴＳ）に馴染みやすい（概説として、［ジャヤウィックレーム（Ｊａｙａｗｉｃｋｒｅｍｅ）およびコスト（Ｋｏｓｔ）、「カレント・オピニオン・イン・バイオテクノロジー（Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．）」、第８巻、１９９７年、ｐ．６２９−６３４］を参照せよ）。自動化または小型化ＨＴＳアッセイも、例えば、ヒューストン（Ｈｏｕｓｔｏｎ）およびバンクス（Ｂａｎｋｓ）、「カレント・オピニオン・イン・バイオテクノロジー（Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．）」、第８巻、１９９７年、ｐ．７３４−７４０］に記載されるように、意図される。
【０１７３】
化学物質ライブラリー、天然産物ライブラリーおよび、ランダムまたはデザインされたペプチド、オリゴヌクレオチド、もしくは有機分子からなるコンビナトリアルライブラリーを含む小分子モジュレーターの同定に用いる多数の異なるライブラリーがある。化学物質ライブラリーは、既知化合物の構造アナログまたは天然産物スクリーニングまたによりまたは潜在的治療標的に対するスクリーニングからヒットまたはリードとして同定された化合物からなる。天然産物ライブラリーは微生物、動物、植物、昆虫または海洋生物由来の産物のコレクションであり、例えば、土壌、植物または海洋生物由来のブロスの醗酵物または抽出物によるスクリーニングの混合物を生成するために用いられる。天然産物ライブラリーはポリペプチド、非リボソームペプチドおよびそれらの非天然産出変異体を含む。概説として、［サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、第２８２巻、１９９８年、ｐ．６３−６８］を参照せよ。コンビナトリアルライブラリーは多数のペプチド、オリゴヌクレオチドまたは有機化合物を混合物として含む。それらは、伝統的な自動合成方法、ＰＣＲクローニングまたは他の合成方法によって調製するのが比較的簡単である。特に興味深いライブラリーは、ペプチド、タンパク質、ペプチドミメティクス、マルチパラレル合成コレクション、組換えおよびポリペプチドライブラリーを含む。コンビナトリアルライブラリーおよびそれから作成されたライブラリーの概説は、［マイヤーズ（Ｍｙｅｒｓ）、「カレント・オピニオン・イン・バイオテクノロジー（Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．）」、第８巻、１９９７年、ｐ．７０１−７０７］。次いで、記載された種々のライブラリーの使用によって同定された候補モジュレーターを、例えば、合理的薬物デザインによってＨ８−Ａｓｐ２の活性をモジュレートするように、最適化することができる。
【０１７４】
もちろん、本発明のスクリーニング方法の全ては、有効候補が発見されないかもしれないという事実にかかわらず、それ自体有用であると理解されるであろう。本発明はそのような候補を見つける方法だけではなく、それらをスクリーニングする方法を提供する。
【０１７５】
Ｃ．イン・ビトロアッセイ
本発明は、種々の動物モデルの使用も包含する。本発明の開示を考慮すると、正常ＡＰＰβオ−セクレターゼが本発明のペプチド基質で置換されているＡＰＰプロセシングの非ヒトモデルを生成することが可能であろう。これは、正常に発現される全動物系において、Ｈｕ−Ａｓｐ２の機能を調査する優れた機会を与えるであろう。本発明の正常β−セクレターゼ基質を発現するマウスを開発し、同定することによって、ヒトおよび他の動物においてアルツハイマー病を高度に予測し、可能性のある治療を同定するモデルを提供する。そのような動物を作製する方法は本明細書のいずれかの箇所に記載される。
【０１７６】
試験化合物での動物の治療は、該化合物を適当な形態で動物に投与することを含む。臨床的または非臨床的に用い得るいずれの経路にもよっても投与され、限定されないが、経口、鼻腔内、頬側、直腸内、膣内または局所を含む。あるいは、投与は、気管内点滴、気管支内点滴、皮内、皮下、筋肉内、腹腔内または血管内注射によるであろう。詳しくは、全身血管内注射、血液、髄液（ＣＳＦ）またはリンパ供給による局所投与、および腫瘍内注射が意図される。
【０１７７】
イン・ビボでの化合物の有効性を決定することは、様々な異なる基準を含むことができる。そのような基準は、限定されないが、生存率、増大した活性レベル、および向上した食物摂取を含む。評価の他の方法は、特に脳組織の病態調査を含み、アミロイドベータまたはアミロイドベータ斑の形成の減少または脳の萎縮の減少のごとき変化したベータセクレターゼ活性の徴候を予測する。
【０１７８】
Ｄ．医薬の製造
本発明のアッセイは、アルツハイマー病を含む異常レベルのベータセクレターゼ活性によって特徴付けられる疾患の治療用の候補治療を代表するベータセクレターゼモジュレーターを同定する。かくして、モジュレーター剤を同定した後、本発明の方法は、所望により、剤を製造／合成し、医薬上許容される希釈剤、補剤または担体を用いて、剤を組成物に調剤するさらなるステップまたは複数のステップを含む。医薬組成物は以下により詳しく記載する。
【０１７９】
ＶＩＩ．トランスジェニック動物の作製方法
上記したように、本発明の特定の具体例は、β−セクレターゼ切断として本発明のペプチドのうちの一つを有するＡＰＰ突然変異体を含むトランスジェニック動物の作製を意図する。本発明の代表的なトランスジェニック動物は、転写の５’→３’方向に、当該宿主動物における発現に関連する転写および翻訳開始領域、タンパク質として発現されたときに、β−セクレターゼ切断部位にて、野生型またはスウェディッシュ配列を欠如し、その代わり、本発明の新規Ｈｕ−Ａｓｐ２ペプチド基質および／または選択マーカー遺伝子を含む突然変異ＡＰＰ遺伝子を発現するＤＮＡ、および、該宿主動物における転写および翻訳終止領域機能を含む発現カセットを用いて構築される。
【０１８０】
該トランスジェニック動物は、Ｈｕ−Ａｓｐ２の機能の研究およびＡＤの治療介入のプロトコルおよび処方計画の開発のためのモデルを提供する。好ましい動物はＡＤの病態生理学に関連する特徴を示す。突然変異ＡＰＰトランスジーンを発現するトランスジェニック動物、そのような動物に由来する組換え細胞系統、およびトランスジェニック胚は全て本発明のこの局面の範囲内にある。
【０１８１】
Ａ．使用する動物
ある場合には、トランスジェニックマウスを作製し、様々な抗うつ剤の効果を試験するのに用いることができるコロニーを作製するためにマウスのコロニーを設定することが有用である。受精卵細胞または胚幹細胞の起源として用いる動物はいずれの動物にもよる。しかしながら、宿主動物は、多世代研究に役立つものであることが一般的に好ましい。トランスジェニック動物は、限定されないが、爬虫類、両生類、鳥類、哺乳類および魚類を含む多数の動物からの受精卵から作製することができる。特定の好ましい具体例のうち、トランスジェニックマウスが作製され、それは野生型またはスウェディッシュ突然変異配列の代わりに本発明のペプチドのうちの一つのβ−セクレターゼ切断部位を含むＡＰＰの突然変異形態を発現する。このセクションは全般的にマウスコロニーを考察するが、本発明に用いられるか、または本発明により作製されるいずれの動物にも、同様の考えが適用されることは理解されるべきである。
【０１８２】
トランスジェニック動物の作製および分析用の動物のコロニーは、５つのカテゴリー：受精卵を作製するための交配用の雌動物；稔性繁殖用雄；想像妊娠雌を作製するための不稔繁殖用雄；想像妊娠受容体および里母として作用する雌マウス；および創始動物およびそのような創始動物に由来するトンラスジェニック系統を含むトランスジェニック動物に分けることができる。
【０１８３】
雌のＣ５７ＢＬ／６Ｊ近親交配株は、今まで、受精卵を作製するために交配させるために最も広く用いられている。しかしながら、注入は、Ｆ１ハイブリッド雄と雌マウス（例えば、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ、×ＣＢＡ／Ｊ）Ｆ１雌×Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ、×ＣＢＡ／Ｊ）Ｆ１雄）の交配から作製されたＦ２ハイブリッドでしばしば行われる。Ｆ１ハイブリッドからのＦ２ハイブリッド接合体はトランスジェニックマウスを作製するのに成功裏に用いられてきた。これらのＦ１ハイブリッドは、限定されないが、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ×ＣＢＡ／Ｊ；Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ×ＳＪＬ；Ｃ３Ｈ／ＨｅＪ×Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ；Ｃ３Ｈ／ＨｅＪ×ＤＢＡ／２ＪおよびＣ５７ＢＬ／６Ｊ×ＤＢＡ／２Ｊを含む。当業者は稔性胚を発生し得る雌マウスの他の株に気付くであろう。ある具体例において、本発明のトランスジェニックマウスは、１２９ｓｖ雌中で成長する１２９ｓｖマウス株由来のＥＳ細胞を用いて作製される。次いで、これらのトランスジェニックマウスをＣ５７ＢＬ／６種に対して逆交配させる。一般に、トランスジェニック動物の作製およびその後のそれらの繁殖は、Ｆ２接合体をマイクロインジェクションに用いるならば、より効果的である。
【０１８４】
トランスジェニックマウスを作製するためのコロニーは、不稔繁殖用雄も含む。そのような雄は別個のカゴで飼育して、ケンカおよびケガを避ける。
これらの雄は数週間別個のカゴに入れ、その後、受精卵を作製するのに用いる過剰排卵された雌マウスに対面させる。これは、優勢な雄が、彼の同腹児のテストステロンおよび、かくして、精製生成を抑制するからである。各過剰排卵雌を別々に繁殖用雄と一緒に入れる。
【０１８５】
不稔雄も想像妊娠受容体を作製するために必要であり、普通、精管切除によって作製される。あるいは、遺伝的に不稔の繁殖動物を用い得る。想像妊娠雌マウスは精管切除されたまたは遺伝的に不稔の雄と自然発情により交配させることによって作製する。想像妊娠雌は胚を受容するのに適しているが、いかなる受精卵も含有しない。想像妊娠雌はトランスジェニック動物を作製するのに重要である。なぜならば、それらはＤＮＡまたは胚幹細胞を注入された胚に対する代理母として機能するからである。最善の想像妊娠受容体は動物の同胞をすでに育てた雌である。
【０１８６】
当該注入卵から発生したマウスは「創始マウス」という。創始マウスが同定されたらすぐに、トランスジェニック系統を開始するために交配させる。可能性のある創始トランスジェニックマウスは、普通、尾部から抽出されたＤＮＡに対してサザンまたはドットブロットハイブリダイゼーションを行うことによって、該注入遺伝子の存在または不存在につきスクリーンする。タンパク質およびＲＮＡ発現を分析し、トランスジーン複製数および／または発現レベルを当業者に知られている方法を用いて決定する。タンパク質、ＲＮＡ発現、およびトランスジーン複製数を離乳児動物（４〜５週）で決定する。離乳齢およびそれより上の齢の動物に一致して活性なプロモータを用いるとき、離乳齢を超えたトランスジェニックＲＮＡ発現動物における変化は期待されない。発達および／または組織特異的プロモーターを用いるとき、タンパク質レベルをモニターして、齢と共に発現レベルを決定する。該トランスジェニック動物は臨床学的変化についても観察する。評価に対する神経行動的障害の例は、新規設定において、低い交配応答、興奮、低下した探査行動であり、不活性は、十分に、うつに関連する重要な行動的特徴であろう。ＡＤに対するある種のトランスジェニック動物モデルが、例えば、米国特許第５，８７７，３９９号；米国特許第５，３８７，７４２号；米国特許第５，８１１，６３３号に記載されている。
【０１８７】
Ｂ．トランスジェニック動物を作製する方法
トランスジェニック動物は多数のやり方で調製し得る。トランスジェニック生物はそのゲノム中に、時には、ＤＮＡの内因片を置換しえて、余分のまたはＤＮＡの外部フラグメントを内包するものである。少なくともこの発明の目的のため、ゲノムが修飾されて未変性ＡＰＰに突然変異が導入されたあらゆる動物、ならびにその突然変異子孫がトランスジェニック動物とみなされる。余分のまたは外部ＤＮＡの安定した遺伝を達成するために、統合イベントが機能的生殖細胞を生じ得る細胞型において発生すべきである。トランスジェニック動物を発生するために用いる２つの動物細胞型は受精卵細胞および胚幹細胞である。胚幹（ＥＳ）細胞はイン・ビトロ培養から「宿主」胚に戻され得、そこで、それらは発達中の動物に内包されるようになり、生殖細胞を含む全ての組織にトランスジェニック細胞を生じ得る。該ＥＳ細胞を培養中でトランスフェクトし、次いで、該細胞を胚に注入することによって、突然変異体を生殖系統に移入する。次いで、突然変異生殖細胞を保有する動物を飼育して、トランスジェニック子孫を作製する。マウス生殖系統における遺伝子変化を作製するためのＥＳ細胞の使用はよく認識される。この技術の概説として、当業者は、［ブロンソン（Ｂｒｏｎｓｏｎ）およびスミシーズ（Ｓｍｉｔｈｉｅｓ）、「ジャーナル・オブ・バイロジカル・ケミストリー（Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．）」、第２６９（４４）巻、１９９４年、ｐ．２７１５５−２７１５８］；［トレス（Ｔｏｒｒｅｓ）、「カレント・トピックス・イン・デベロップメンタル・ケミストリー（Ｃｕｒ． Ｔｏｐ． Ｄｅｖ． Ｂｉｏｌ．）」、第３６巻、１９９８年、ｐ．９９−１１４］およびそれらに含有される引用文献を参照する。
【０１８８】
一般に、胚盤胞を発達の所定の段階で妊娠マウスから単離する。例えば、マウスからの胚盤胞を発達の第４日（第１日はプラグの日と定義する）に、ＥＳ細胞を未分化多分化能状態で懸濁するバッファー中に単離する。ＥＳ細胞系統は、当業者によく知られた方法によって単離することができる。例えば、胚盤胞を培養皿に付着するようにし、およそ７日後、成長した内部細胞マスを選択し、トリプシン消化し、次いで、同一培養培地中で別の培養皿に移す。ＥＳ細胞コロニーが体外培養された内部細胞マスの各々から生じた５〜７個体のコロニーの間で２〜３週間後に出現した。次いで、ＥＳ細胞系統はさらなる分析に拡張し得る。あるいは、ＥＳ細胞系統は、（［マーチン（Ｍａｒｔｉｎ）、「プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・サイエンシズ、ＵＳＡ（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ’ｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．， ＵＳＡ）」、第７８巻、１９８１年、ｐ．７６３４−７６３８］に記載される）免疫外科技術を用いて単離し得、そこでは、栄養外胚葉を抗マウス抗体を用いて破壊し、その後、該内部細胞マスを体外培養する。
【０１８９】
トランスジェニック動物の発生において、同種組換えによって操作されているＥＳ細胞系統を（［ウィリアムス（Ｗｉｌｌｉａｍｓ）ら、「セル（Ｃｅｌｌ）」、第５２巻、１９８８年、ｐ．１２１−１３１］に記載されるように）胚盤胞注入によって胚環境に再導入する。簡単には、胚盤胞を妊娠マウスから単離して拡張する。拡張した胚盤胞を油滴培養中で４℃にて１０分間維持し、その後、培養する。ＥＳ細胞は、個々のコロニーを選び、次いで、それをリン酸バッファードサリン、０．５ｍＭ ＥＧＴＡ中で５分間インキュベートし；単一の細胞懸濁液を１％（ｖ／ｖ）ニワトリ血清を含有するトリプシン−ＥＤＴＡ中で４℃にてさらに５分間インキュベートすることによって調製する。２０個のＥＳ細胞中５個を（１０％（ｖ／ｖ）胎児ウシ血清および３，０００単位／ｍｌＤＮＡアーゼ１入りの２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ［ｐＨ８．０］中のダルベッコ修正イーグル培地中で、）各胚盤胞に注入した。次いで、該胚盤胞を想像妊娠受容体に移し、正常に発達させる。トランスジェニックマウスをコートマーカー［ホーガン（Ｈｏｇａｎ）ら、「Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏ」、１９８６年、ニューヨーク州コールドスプリングハーバー］によって同定する。ＥＳ細胞を単離し、成長させるさらなる方法は、例えば、米国特許第５，１６６，０６５号；米国特許第５，４４９，６２０号；米国特許第５，４５３，３５７号；米国特許第５，６７０，３７２号；米国特許第５，７５３，５０６号；米国特許第５，９８５，６５９号に見ることができ、それらは出典明示して本明細書に含まれる。
【０１９０】
トランスジェニック動物を作製する接合体注入を含む代替的な方法は、例えば、米国特許第４，７３６，８６６号に記載され、出典明示して本明細書に含まれる。トンスジェニック動物を作製するさらなる方法は、全般的に、ワーグナー（Ｗａｇｎｅｒ）およびホップ（Ｈｏｐｐｅ）［米国特許第４，８７３，１９１号；出典明示して本明細書に含まれる］、ブリンスター（Ｂｒｉｎｓｔｅｒ）ら［「プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・サイエンシズ、ＵＳＡ（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ’ｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．， ＵＳＡ）」、第８２（１３）巻、１９８５年、ｐ．４４３８−４４４２；出典明示してその全体が本明細書に含まれる］；［「Ｍａｕｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏ； Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」、第２版、ホーガン（Ｈｏｇａｎ）、ベディントン（Ｂｅｄｄｉｎｇｔｏｎ）、コスタンチミ（Ｃｏｓｔａｎｔｉｍｉ）およびロング（Ｌｏｎｇ）編、コールドスプリングハーバー・ラボラトリー・プレス、１９９４年；出典明示してその全体が本明細書に含まれる］に記載される。
【０１９１】
簡単には、この方法は、ＤＮＡを受精卵または接合体に注入し、次いで、該卵を想像妊娠母体中で発達するようにすることを含む。該接合体は同一株の雄およびメスの動物も用いて、または異なる株の雄および雌から得る。生まれたトランスジェニックは、創始動物であり、飼育して同一ＤＮＡインサートを持つさらなる動物を作製する。トランスジェニック動物を作製するためのこの方法において、新たなＤＮＡは、典型的には、非ホモログイベントによってゲノム中に無秩序に統合される。該ＤＮＡの１ないし数千の複製を該ゲノムの部位に統合することができる。
【０１９２】
一般的に、該ＤＮＡを前核のひとつ、普通、より大きな雄前核に注入する。次いで、接合体を想像妊娠雌の卵管に、同日に移すか、または一晩培養して２−細胞胚を形成し、次いで、移す。産まれた動物は所望の統合ＤＮＡの存在につきスクリーンする。
【０１９３】
マイクロインジェクション用のＤＮＡクローンは当該分野で知られているいずれかの方法によっても調製し得る。例えば、細菌性プラスミド配列を除去するための適当な酵素で切断し得、該ＤＮＡフラグメントを標準技術を用いて、ＴＢＥバッファー中で１％寒天ゲル上で電気泳動する。ＤＮＡバンドを臭化エチジウムで視覚化し、発現配列を含有するバンドを切り出す。次いで、切り出したバンドを０．３Ｍ酢酸ナトリウム、ｐＨ７．０を含有する透析バッグに入れる。ＤＢＡを該透析バッグ中に電気溶出し、１：１フェノール：クロロホルム溶液で抽出し、２倍体積のエタノールで沈殿させる。ＤＮＡを１ｍｌの低塩バッファー（０．２Ｍ ＮａＣｌ、０．２ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．４、および１ｍＭ ＥＤＴＡ）に再溶解しＥｌｕｔｉｐ−ＤＴＭカラムで精製する。該カラムを先ず３ｍｌの高塩バッファー（１Ｍ ＮａＣｌ、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．４、および１ｍＭ ＥＤＴＡ）で始め、続いて、５ｍｌの低塩バッファーで洗浄する。該ＤＮＡ溶液を該カラムに３回通して、ＤＮＡをカラムマトリクスに結合させる。３ｍｌの低塩バッファーで１回洗浄した後、該ＤＮＡを０．４ｍｌの高塩バッファーで溶出し、２倍体積のエタノールで沈殿させた。ＤＮＡ濃度をＵＶ分光装置で２６０ｎｍにての吸収によって測定する。マイクロインジェクションについては、ＤＮＡ濃度は５ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．４および０．１ｍＭ ＥＤＴＡ中３ｍｇ／ｍｌに調整する。
【０１９４】
マイクロインジェクション用のＤＮＡのさらなる精製方法は、ホーガン（Ｈｏｇａｎ）ら［「Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏ」、１９８６年、ニューヨーク州コールドスプリングハーバー］；パルミター（Ｐａｌｍｉｔｅｒ）ら［「ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）」、第３００巻、１９８２年、ｐ．６１１］；チアゲン・インコーポレーション、カリフォルニア州チャッツワースによって発行された［「Ｔｈｅ Ｑｉａｇｅｎｏｌｏｇｉｓｔ， Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ」、第３版］；および［サンブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」、コールドスプリングハーバー・ラボラトリー、ニューヨーク州コールドスプリングハーバー］に記載される。
【０１９５】
代表的なマイクロインジェクション手順において、６週齢の雌マウスを過剰排卵誘発する。過剰排卵雌を雄と一緒に入れ、交配させる。約２１時間後、交配した雌を犠牲にして胚を切り出した卵管から回収し、適当なバファー、例えば、０．５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ；シグマ）入りのダルベッコリン酸バッファードサリン中に入れる。取巻く累積細胞をヒアルロニダーゼ（１ｍｇ／ｍｌ）でで取り除く。次いで、前核胚を洗浄し、注入時まで、３７．５℃、５％ＣＯ２、９５％空気中の加湿雰囲気のインキュベータ中の０．５％ＢＳＡを含有するアールス平衡化塩溶液に入れる。胚を２細胞段階にて移植する。
【０１９６】
無秩序サイクルの成体雌マウスを精管切除雄とペアにする。Ｃ５７ＢＬ／６またはスイスマウスまたは他の匹敵する株をこの目的に用いることができる。受容雌を同時に提供雌としてとして交配させる。胚移入のとき、受容雌をグラム体重あたり０．０１５ｍｌの２．５％アベルチンの腹腔内注射により麻酔する。卵管を単一中央背部切開によって露出させる。次いで、該卵管直上の体壁中を切開する。次いで、卵管嚢を時計製造用鉗子で引裂く。移入すべき胚をＤＰＢＳ（ダルベッコリン酸バッファードサリン）および、移入用ピペットの先端に入れる（約１０ないし１２胚）。ピペット先端を後葉に挿入し、胚を移入する。移入後、切開を２縫合で閉じる。次いで、妊娠動物に創始動物を出産させて、それをトランスジェニック系統に用いる。
【０１９７】
ＶＩＩＩ．医薬組成物
本発明により同定されたＨｕ−Ａｓｐ、ＡＰＰプロセシングおよび／またはβ−セクレターゼ切断は、最終的に、医薬組成物、すなわち、イン・ビボアプリケーションに適した形態に調剤することができる。一般的に、これは発熱物質ならびにヒトまたは動物にとって有害であろう不純物が実質的にない組成物を調製することを伴なう。
【０１９８】
一般的に、該組成物を安定にするために適当な塩およびバッファーを用い、標的細胞による摂取を可能にする。バッファーは、組換え細胞を患者に導入するときにも用いる。「医薬上または生理学上許容される」なる語句は、動物またはヒトに投与したとき、不利な、アレルギー性の、または他の不都合な反応を生じない分子部分または組成物をいう。本明細書で用いるとき、「医薬上許容される担体」は、あらゆるすなわち全ての溶媒、分散媒体、コーティング剤、抗菌および抗真菌剤、等張および吸収遅延剤等を含む。医薬上活性な物質に対するそのよう媒体または剤の使用は当該分野でよく知られている。いずれかの従来の媒体または剤が本発明により同定されたモジュレーターと不適合である場合を除き、治療組成物におけるその使用が意図される。補足的有効成分も該組成物に含ませ得る。
【０１９９】
本発明のモジュレーター組成物は典型的な医薬製剤を含む。本発明によるこれらの組成物の投与は、該標的組織がその経路で利用可能である限り、任意の普通の経路による。医薬組成物をいずれかの従来の方法で当該対象に導入することができ、例えば、血管内、皮内、筋肉内、乳房内、腹腔内、鞘内、眼内、眼球後、肺内（例えば、時期限定放出（ｔｅｒｍ ｒｅｌｅａｓｅ））；経口、舌下、経鼻腔、経肛門、経膣、または経皮デリバリー、または特定部位への外科的移植、例えば、脾臓膜、脳下または角膜内の埋込みによる。治療は単一用量または一定期間にわたる複数用量からなってよい。
【０２００】
本発明を用いて同定されたモジュレーター化合物は、ヒドロキシセルロースのごとき界面活性剤と適当に混合された水中の遊離塩基または医薬上許容される塩の溶液として、投与のために調製することができる。分散液もグリセロール、液状ポリエチレングリコールおよびそれらの混合物中、ならびに油中で調製し得る。貯蔵および使用の通常条件下、これらの調製物は微生物の増殖を防止するための防腐剤を含有する。
【０２０１】
注射使用に適した医薬形態は滅菌水性溶液または分散液および滅菌注射可能溶液または分散液の即席調製物用の滅菌粉剤を含む。全ての場合、形態は滅菌され、簡単にシリンジ使用可能性が存在する程度に流動性であるべきである。それは、製造および貯蔵の条件下で安定であるべきで、細菌および真菌のごとき微生物の汚染作用に対して防腐されるべきである。担体は、溶媒または分散媒体であり得、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、ポリプレングリコール、および液状ポリエチレングリコール等）、それらの適当な混合物、および植物油を含有する。適当な流動性は、例えば、レクチンのごときコーティング剤の使用によって、分散液の場合、必要な粒子サイズの維持によって、および界面活性剤の使用によって、維持し得る。微生物の活動の防止は、種々の抗菌剤または抗真菌剤、例えば、パラベン類、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサール等によって達成し得る。多くの場合、等張剤、例えば、糖類または塩化ナトリウムを含むことが好ましいであろう。注射可能組成物の延長化吸収は吸収を遅延する剤の組成物、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチン中の使用によって達成し得る。
【０２０２】
滅菌注射可能溶液は、必要な量の活性化合物を適当な溶媒中に、必要であれば、上で列記した種々の他の成分と共に配合し、次いで濾過滅菌することによって調製する。一般的に、分散液は種々の滅菌有効成分を基礎的分散媒体および、上で列記したものからの必要とされる他の成分を含有する滅菌賦形剤に配合することによって調製する。滅菌注射可能溶液の調製用の滅菌粉剤の場合、好ましい調製方法は、有効成分に加えて任意のさらなる所望する成分を以前に滅菌濾過したその溶液から得る真空乾燥および凍結乾燥である。
【０２０３】
本明細書で用いるとき、「医薬上許容される担体」は、あらゆるおよび全ての溶媒、分散媒体、コーティング剤、抗菌および抗真菌剤、等張および吸収遅延剤等を含む。医薬上活性な物質に対するそのような媒体または剤の使用は当該分野でよく知られている。いずれかの従来の媒体または剤が本発明により同定されたモジューレーターと不適合である場合を除き、治療組成物におけるその使用が意図される。捕捉的有効成分も該組成物に含ませ得る。
【０２０４】
経口投与に関し、本発明によって同定されたモジュレーターは補形剤と配合し、摂取不可の洗口剤および歯磨き剤の形態で用いる。洗口剤は必要な量の有効成分を、ホウ酸ナトリウム溶液（ドベル液）のごとき適当な溶媒中に配合することによって調製することができる。あるいは、有効成分は、ホウ酸ナトリウム、グリセリンおよび炭酸水素カリウムを含有する防腐洗浄液に配合することができる。有効成分は、ゲル、ペースト、粉剤およびスラリーを含有する歯磨き剤中に分散させることもできる。有効成分は治療上有効量で、水、結合剤、研磨剤、香味剤、発泡剤および湿潤剤を含むことができるペースト状歯磨き剤に添加することができる。
【０２０５】
本発明の組成物は中和または塩の形態で調剤することができる。医薬上許容される塩は、（タンパク質の遊離アミノ基と形成された）酸付加塩、および、例えば、塩酸、リン酸のごとき無機酸、または酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸等のごとき有機酸と形成されたものを含む。遊離カルボキシル基と形成された塩も、例えば、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、または鉄の水酸化物のごとき無機塩基、およびイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカイン等のごとき有機塩基から誘導し得る。
【０２０６】
本発明の組成物は中和または塩の形態で調剤することができる。医薬上許容される塩は、（タンパク質の遊離アミノ基と形成された）酸付加塩、および、例えば、塩酸、リン酸のごとき無機酸、または酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸等のごとき有機酸と形成されたものを含む。遊離カルボキシル基と形成された塩も、例えば、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、または鉄の水酸化物のごとき無機塩基、およびイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカイン等のごとき有機塩基から誘導し得る。
【０２０７】
調剤により、溶液は剤形に適合するように、治療上有効な量で投与する。製剤は注射可能溶液、薬物放出カプセル剤等のごとき種々の剤形で容易に投与し得る。水性溶液での非経口投与に関して、例えば、当該溶液は、必要であれば、適当のバッファー化し、液状希釈剤を先ず十分な食塩水およびグルコースで等張にする。これらの特定の水性溶液は、血管内、筋肉内、皮下および腹腔内投与に特に適している。
【０２０８】
「単位用量」は、適当な担体に分散された個別の治療組成物と定義する。例えば、非経口投与は初期ボーラスに続いて薬物生成の治療的循環レベルを維持するために連続注入によって行うことができる。当業者は、良好な医療実践および個別の患者の臨床的状態によって決定して、有効用量および投与計画を容易に最適化する。より詳しくは、該用量はＡβ−ペプチドの形成、より詳しくは、ＡＤを示す対象の脳中の斑形成を低減し、阻害し、減少させ、さもなくば、撤廃するように選択される。この効果のため、当業者はＡＤの動物モデルを使用して（例えば、米国特許第５，８７７，３９９号；米国特許第５，３８７，７４２号；米国特許第５，８１１，６３３号に開示されているように）、用量投与プロトコルを最適化し、ヒト対象におけるＡＤの介入に必要な医薬剤の適切な量を予測することが可能である。
【０２０９】
用量の頻度は剤の薬理動力学パラメータおよび投与の経路に依存するであろう。最適医薬製剤は投与経路および所望する用量に依存して当業者によって決定される。例えば、出典明示して本明細書に含まれるレミントン・ファーマシューティカル・サイエンシズ（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）、第１８版、（１９９０年、マック・パブリッシャー・コーポレイテッド（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌ． Ｃｏ．）、ペンシルバニア州イーストン）を参照せよ。そのような製剤は、投与された剤の物理的状態、安定性、イン・ビボ放出速度およびイン・ビボクリアランス速度に影響するであろう。投与の経路に依存して、適当な用量を体重、体表面積または器官サイズにより計算することができる。適切な治療用量を決定するのに必要な計算のさらなる精密化は当業者によって過度の実験をすることなく、特に本明細書に開示された用量情報およびアッセイならびに動物またはヒト臨床試験で観察された薬理動力学データに鑑みて、規定通りになされる。
【０２１０】
適切な用量は、関連する用量−反応データと組合わせて血中レベルを決定する確立されたアッセイを使用により確定することができる。最終用量処方は担当医によって薬物の作用を変化させる因子、例えば、薬物特異的活性、患者の損傷の重篤度および反応性、患者の年齢、体調、体重、性別および規定食、いずれかの感染の重篤度、投与の時間および他の臨床因子を考慮して決定される。研究が行われ、さらなる情報が特定の疾患および体調に対する適切な用量レベルおよび治療の持続時間に関して現われる。
【０２１１】
本発明の医薬組成物および治療方法はヒト薬剤および獣医学薬剤の分野で有用であろう。かくして、治療すべき対象は哺乳類、好ましくはヒトまたは他の動物であろう。獣医学の目的には、対象は、例えば、ウシ、ヒツジ、ブタ、ウマおよびヤギを含む家畜、イヌおよび猫のごときペット動物、外来および／または動物園の動物、マウス、ラット、ウサギ、モルモットおよびハムスターを含む研究動物；ニワトリ、シチメンチョウ、アヒル、およびガチョウのごとき家禽を含む。
【０２１２】
ＩＸ．実施例
以下の実施例は好ましい具体例および技術を提供するが、限定する意図はない。当業者は本開示に鑑みて、開示された特定の材料および方法に多くの変化をなし、依然として、本発明の精神および範疇から逸脱することなく似通ったまたは同様の結果を得る。
【０２１３】
実施例１
β−セクレターゼアッセイ
Ａｓｐ２（ａ）についての活性アッセイは、以下のごとく本発明の合成ペプチド基質を用いて行うことができる。反応は、例えば、５０ｍＭ ２−［Ｎ−モルホリノ］エタンースルホン酸塩（「Ｎａ−ＭＥＳ」、ｐＨ５．５）または５０ｍＭ 酢酸ナトリウムのごとき適当なバッファー中、４．０と６．０との間のｐＨ範囲にて、７０ｍＭペプチド基質、および組換えＡｓｐ２（ａ）（１〜５μｇタンパク質）３７℃にて様々な時間行うことができる。代表的なバッファーは、１％β−オクチルグルコシドを含有するものを含む。反応生成物は、３０分間かけて０〜７０Ｂ（Ａ＝水中０．１％ＴＦＡ、Ｂ＝０．１％ＴＦＡ／１０％水／９０％ＡｃＣＮ）の線形勾配を用いるＲＰ−ＨＰＬＣによって定量する。溶出プロファイルは２１４ｎｍの吸収でモニターする。
【０２１４】
そのようなアッセイにおいて、無傷ペプチド基質より前の２つの生成ピーク溶出は、例えば、エドマン配列決定または質量分光分析を用いてＰｎ・・・Ｐ１配列およびＰ１’・・・Ｐｎ’配列とし確認することができる。該ペプチド基質のパーセント加水分解は該２つの生成ペプチドの積分ピーク面積と２１４ｎｍの吸収からの出発物質との比較によって算出する。切断／加水分解生成物の配列はエドマン配列決定およびＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分光分析を用いて確認することができる。
【０２１５】
該プロテアーゼ切断反応の特異性は８μＭペプスタチンＡの存在下およびプロテアーゼインヒビター（例えば、１０μＭロイペプシン、１０μＭ Ｅ６４、および５ｍＭ ＥＤＴＡ）のカクテルの存在下、β−セクレターゼアッセイを行うことによって決定し得る。ペプスタチン（カセプシンＤおよび他のアスパルチルプロテアーゼのインヒビター）またはカクテル（それぞれ、セリンプロテアーゼ、システイニルプロテアーゼ、およびメタロプロテアーゼのインヒビター）に非感受性のβ−セクレターゼタンパク質加水分解活性はβ−セクレターゼ活性の特異性を示す。
【０２１６】
代替的なアッセイは、ＣＨＯ細胞中で発現され、β−オクチルグルコシドでの抽出と同一条件を用いて生成されたＨｕ−Ａｓｐ２（ｂ）、およびＭｏｎｏＱＲおよびＭｏｎｏＳＲ上のシーケンシャルクロマトグラフィーを用いる。
代替的なβ−セクレターゼアッセイは内部消光蛍光基質を用いて、単一試料または複数ウェルフォーマットで、蛍光分光分析を用いて、酵素活性をモニターする。各反応物は、例えば、５０ｍＭ Ｎａ−ＭＥＳ（ｐＨ５．５）、本発明のペプチド基質（５０μＭ）および生成Ｈｕ−Ａｓｐ−２酵素を含有する。これらの成分は様々な時間３７℃に平衡化され、反応は基質の添加によって開始される。励起は３３０ｎｍで行われ、反応キネティクスは３９０ｎｍにて蛍光発光を測定することによってモニターする。Ｈｕ−Ａｓｐ−２活性をモジュレートする化合物を検出するために、試験化合物を該反応のプレインキュベーションの間に添加し、該反応のキネティクスを上記のようにモニターする。アクチベーターを蛍光の出現率を増大する化合物として記録し、一方、インヒビターは蛍光の出現率を低減させる。
【０２１７】
さらにもう一つの代替において、該Ｈｕ−Ａｓｐ２β−セクレターゼアッセイを細胞ベースアッセイを用いて実行し、そこでは、例えば、ＨＥＫ２９３細胞のごとき細胞が本発明のＨｕ−Ａｓｐ２ペプチド基質を含む第１の部分、該ペプチドを該細胞のゴルジ体または小胞体に固定する貫通膜ドメインを含む第２の部分、および、例えば、ＳＥＡのごときレポーター遺伝子を含む第３の部分を含む融合ポリペプチドを発現する。貫通膜ドメインは該ペプチド基質の細胞環境への効率的なデリバリーを保証し、そこでそれは活性Ｈｕ−Ａｓｐ２に結合し、切断され得る。切断は該培地に放出されたＳＥＡＰ活性の尺度として検出される。
【０２１８】
実施例２
アミノ酸分析によるペプチド定量の方法
この実施例はアミン酸分析によるペプチド基質の定量の代表的な方法を記載する。この方法は、本発明の種々の基質を定量するのに用いられた。
ペプチドをＣＥＭ社のＭＤＳ２０００電子レンジを用いるマイクロ波加水分解を用いて定量した。約２μｇタンパク質を含有するヒューレット・パッカード３００μｌマイクロバイアルを０．５％（体積対体積）フェノール（マリンクロフト）入りの４ｍＬの６Ｎ ＨＣｌ（ピアース・コンスタント・ボイリング）を含有するテフロンＲ ＰＦＡ消化ベッセル（ＣＥＭ社）の内部に入れた。次いで、試料を交互に取り出し、Ｎ２で５回洗い流した。タンパク質を二段階法を用いて加水分解した。第１段階の間、フルパワーの５０％（約６５０Ｗ）で温度を１００℃にまで上昇させ、その温度を１分間維持した。その直後、７５％のパワーで温度を１５０℃にまで上昇させ、その温度を２５分間維持した。冷却後、試料を乾燥させた（サバント・スピード・バック（Ｓａｖａｎｔ Ｓｐｅｅｄ Ｖａｃ））。カルバミン酸６−アミノキノリル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルを用いて誘導化した試料に対してアミノ酸分析を行って、３９５ｎｍで蛍光発光する安定なウレアを得た（ウォーターズ　ＡｃｃＱ・タグ　ケミストリー・パッケージ）。試料をヒューレット・パッカード１１００システムでの逆相ＨＰＬＣによって分析し、定量はヒューレット・パッカードのケムステーション（ＣｈｅｍＳｔａｔｉｏｎ）加速インテグレーターを用いて行った。
【０２１９】
実施例３
ユビキチン／酸化インスリンＢ鎖の構造に基づく
本発明の代表的なペプチドの試験
基質ＫＶＥＡＮＹ−ＥＶＥＧＥＲＫＫ（配列番号：５）は、アプライド・バイオシステムズ・インコーポレーテッドからのモデル４３３Ａを用いる固相技術によって合成した。この基質の純度はＨＰＬＣ分析によって評価した。簡単には、粗ペプチドを希酢酸に溶解し、濾過し、分取用逆相カラム（バイダック（Ｖｙｄａｃ）　Ｃ−１９、２２×２５０ｍｍ、１０ミクロン）に４ｍｌ／分１００％Ａ（Ａ：水中０．１％ＴＦＡ、Ｂ：アセトニトリル中０．０７％ＴＦＡ）にて充填した。用いた勾配は、０→１０％Ｂ、１０分間、次いで１０→５０％Ｂ、２００分間であった。カラム溶出物を２２０ｎｍおよび２８０ｎｍの吸収でモニターした。画分を分析用逆相システム（バイダック、Ｃ１８、４．６×２５０ｍｍ、５ミクロン）でモニターした。溶媒および波長は上記同様である。このＲＰ−ＨＰＣＬの線形勾配は、１．０ｍｌ／分にて２０分間、０〜７０％Ｂであった。
該ペプチドの化学的品質は質量分光分析を用いて決定した。より詳しくは、各ペプチドの化学的品質は、ヒューレット・パッカードシリーズ１０５０ＨＰＬＣシステムを装着したマイクロマスプラットフォームＩＩマススペクトロメーターを用いる質量分光分析によって確認した。該ペプチドの同定は５μｌの試料を１００μｌ／分の１：１メタノール：水のフロー中に注入することによって確認した。該マススペクトロメーターは、ニードル電圧３ｋＶ、温度１２０℃およびコーン電圧３０Ｖでエレクトロスプレーイオン化モードで操作した。
【０２２０】
上記ペプチドをＨｕ−Ａｓｐ２活性の基質として、２００ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ４．５、２００μＭ基質、２００ｎＭ Ｈｕ−Ａｓｐ２酵素を含む反応物中３７℃にて試験した。反応生成物を実施例１に記載されたようにモニターし、ＫＶＥＡＮＹ−ＥＶＥＧＥＲＫＫ（配列番号：５）がＨｕ−Ａｓｐの良好な基質であることが分った。
【０２２１】
ＫＶＥＡＮＹ−ＥＶＥＧＥＲＫＫ（配列番号：５）ペプチドをｃｙｓ残基をＲとＫＫとの間に挿入する挿入によってさらに修飾して、ペプチドＫＶＥＡＮＹ−ＥＶＥＧＥＲＣＫＫ（配列番号：６）を得た。このペプチドをＮ−末端ビオチン化し、Ｃｙｓ残基にオレゴングリーンを共有結合して蛍光性にした。簡単には、ビオチン化に関して、樹脂結合ペプチドをジイソプロピルエチルアミン（０・１５ｍｌ）を含有する約（１０ｍｌ）のジメチルホルムアミドに懸濁させ、室温にて、５０ｍｇのＥＺ−連結ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチン（ピアース）と反応させた。反応物を２４時間（すなわち、ニンヒドリン陰性）まで進行させた。次いで、ビンチン化ペプチドをエチルメチルスルフィド：アニソール：一，２−エタンジチオール（１：３：１；全部で５％）を含有する１０ｍｌのトリフルオロ酢酸中で、室温にて２時間切断した。切断溶液を焼結ガラスロートを通して濾過し、減圧下で乾燥近くまで蒸発させた。粗ペプチドを冷ジエチルエーテルで切断溶液から沈殿させた。沈殿ペプチドを焼結ガラスロートで収集し、ジエチルエーテルで洗浄し、希酢酸に溶解し、減圧下で蒸発乾固した。残渣を氷酢酸に溶解し、透析した。
【０２２２】
精製したビオチン化ペプチドを予め脱ガスした約５ｍｌの（０．１Ｎ）ＮａＨ２ＰＯ４（ｐＨ８．０）に溶解した。次いで、０．５ｍｌのジメチルホルムアミドに溶解した５ｍｇのオレゴングリーン４８８マレイミド（モレキュラー・プローブ）を添加し、混合物を暗闇で室温にて３０分間攪拌した。反応後、未反応試薬を１５ｍｇのＬ−シスチンの添加によってさらに３０分間反応停止した。次いで、最終混合物を焼結ガラスロートを通して濾過し、氷酢酸の添加によって酸性化し、初期溶出条件（１００％Ａ）を溶出されたＤＭＦピークが出現するまで一定に保った以外は上記と同様に分取用逆相ＨＰＬＣによって精製した。
【０２２３】
得られた化合物、ビオチン−ＫＶＥＡＮＹ−ＥＶＥＧＥＲＣ（オレゴングリーン）ＫＫをＨｕ−Ａｓｐ２活性の基質として、以下の条件：３７℃にて、２００ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ４．５、１０μＭ基質、５０ｎＭ酵素を用いて試験した。反応物を２時間進行させ、試料を何回か取り出した。結果は、２０％、３７％、５７％および８７％切断がそれぞれ１５、３０、６０および１２０分間後に起きた。それらは未変性またはＡＰＰ−ＳＷに対する比較＃を有するか？
質量分光分析は、切断がＴｙｒとＧｌｕとの間でのみ起きることを示した。この新たなビオチン化蛍光性ペプチドは、スウェディッシュ突然変異ペプチド：ＳＥＶＮＬ−ＤＡＥＦＲ（配列番号：１９）由来の以前のビオチン化蛍光性基質よりも少なくとも２倍いＶｍａｘおよびＫｍを有していた。
【０２２４】
実施例４
突然変異β−セクレターゼ切断部位を含有するＡＰＰ構築物
この実施例は、組換え方法を用いて本発明の合成Ａｓｐ２の配列を導入して、ＡＰＰの突然変異体を作製する方法を記載する。
１２５と名付けられた哺乳類細胞発現二シストロン性構築物は、スウェディッシュ突然変異体ＡＰＰ６９５およびＣ−末端に余分な２つのリジン残基を含有し、それを出発物質として用いて、本発明の配列を含有する新規ＡＰＰ突然変異体を作製した。このＡＰＰ６９５の残基５９３ないし５９７にＶＮＬＤＡをコードする配列を部位特異的突然変異誘発を用いて、ＶＳＹＥＡ（配列番号：１８９）、ＩＳＹ−ＥＶ（配列番号：１７９）またはＶＳＹＥＶ（配列番号：１７７）と置換した。
【０２２５】
部位特異的突然変異誘発は、以下のプライマー：
＃ＩＳＹＥＶ５　　５’−ＧＡＧ ＡＴＣ ＴＣＴ ＧＡＡ ＡＴＴ ＡＧＴ ＴＡＴ ＧＡＡ ＧＴＡ ＧＡＡ ＴＴＣ ＣＧＡ ＣＡＴ ＧＡＣ ＴＣＡ ＧＧ−３’
（配列番号：１７１）
＃ＩＳＹＥＶ３　　５’−ＴＧＡ ＧＴＣ ＡＴＧ ＴＣＧ ＧＡＡ ＴＴＣ ＴＡＣ ＴＴＣ ＡＴＡ ＡＣＴ ＡＡＴ ＴＴＣ ＡＧＡ ＧＡＴ ＣＴＣ ＣＴＣ−３’
（配列番号：１７２）
＃ＶＳＹＥＶ５　　５’−ＧＡＧ ＡＴＣ ＴＣＴ ＧＡＡ ＡＧＴ ＡＧＴ ＴＡＴ ＧＡＡ ＧＴＡ ＧＡＡ ＴＴＣ ＣＧＡ ＣＡＴ ＧＡＣ ＴＣＡ ＧＧ−３’
（配列番号：１７３）
＃ＶＳＹＥＶ３　　５’−ＴＧＡ ＧＴＣ ＡＴＧ ＴＣＧ ＧＡＡ ＴＴＣ ＴＡＣ ＴＴＣ ＡＴＡ ＡＣＴ ＡＣＴ ＴＴＣ ＡＧＡ ＧＡＴ ＣＴＣ ＣＴＣ−３’
（配列番号：１７４）
＃ＶＳＹＥＡ５　　５’−ＧＡＧ ＡＴＣ ＴＣＴ ＧＡＡ ＡＴＴ ＡＧＴ ＴＡＴ ＧＡＡ ＧＣＡ ＧＡＡ ＴＴＣ ＣＧＡ ＣＡＴ ＧＡＣ ＴＣＡ ＧＧ−３’
（配列番号：１７５）
＃ＶＳＹＥＡ３　　５’−ＴＧＡ ＧＴＣ ＡＴＧ ＴＣＧ ＧＡＡ ＴＴＣ ＴＧＣ ＴＴＣ ＡＴＡ ＡＣＴ ＡＡＴ ＴＴＣ ＡＧＡ ＧＡＴ ＣＴＣ ＣＴＣ−３’
（配列番号：１７６）
を用いる市販キット（ＱＵＩＣＫＣＨＡＮＧＥ、部位特異的突然変異誘発、ストラタジーン、カリフォルニア州ラホーヤ）で行った。
【０２２６】
部位特異的突然変異誘発を行うＰＣＲ条件は以下であった：変性９５℃にて１分間；アニーリング、５６℃にて３０秒間および増幅、６８℃にて１６分間。反は、１５０ｎｇの各プライマー、５０ｎｇのテンプレートＤＮＡ、２．５ｕのｐｆｕターボＤＮＡポリメラーゼおよび２００μＭのｄＮＴＰを含有する５０μｌの反応溶液中で行った。増幅生成物を制限酵素ＤｐｎＩで６０分間消化し、その後形質転換した。プラスミドＤＮＡのミニプレップ（Ｍｉｎｉ−ｐｒｅｐｓ）を調製し、ＤＮＡ配列決定を行って所望の修飾配列を含有する突然変異クローンを同定した。
【０２２７】
実施例５
野生型ＡＰＰ配列にデザインされた
本発明のペプチド配列の細胞ベース試験
本発明者らは、前記実施例４に記載されたように、ＡＰＰ発現構築物を突然変異ＫＭ−ＤＡ５９４−５９７（配列番号：１３９）からＳＹＥＶ５９４−５９７（配列番号：１４０）またはＳＹＥＡ５９４−５９７（配列番号：１８７）で修飾して、これらの突然変異体が、細胞中で、得られた修飾（突然変異）ＡＰＰのβ−セクレターゼによる効率的タンパク質加水分解プロセシングを可能にするかどうかを試験した。得られた発現構築物はＣ−末端の２つのリジンを含むように修飾され、さらに上記の特異的突然変異体で修飾された野生型ＡＰＰ６９５の発現を駆動するＣＭＶプロモーターを含有した。ＡＰＰ変異体はｐＩＲＥＳ−ＥＧＦＰベクター（クロンテック、カリフォルニア州パロアルト）にサブクローンしたので、発現効率は緑色蛍光シグナルの存在によってモニターし得る。より高いレベルのＨｕ−Ａｓｐ２を発現するＨＥＫ２９３誘導体細胞を異なるＡＰＰ変異体で４８時間トランスフェクトした後、細胞抽出物を調製し、４〜１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで移動させるウェスタンブロットによって分析した。Ｈｕ−Ａｓｐ２活性は特異的抗体Ｃ８で認識されるβ−セクレターゼ切断生成物ＣＴＦ−９９の増加を観察することによってモニターし得る。図３に示すように、両方の突然変異ＡＰＰはＡｓｐ２によって上手く切断された。イン・ビトロ活性と同様に、ＳＹＥＶ５９４−５９７（配列番号：１４０）を持つＡＰＰは、ＳＹＥＡ５９４−５９７（配列番号：１８７）を持つＡＰＰよりも効率的に切断された。
【０２２８】
ＡＰＰプロセシングの一つのインジケーターとして、トランスフェクトされたＨＥＫ−２９３細胞の培地から分泌されたＡβのレベルを測定した。測定は抗体６Ｅ１０（シンテック（Ｓｙｎｔｅｃｋ）、ミズリー州セントルイス）を用いるＥＬＩＳＡにより、ＡβおよびＡβ４０に対する抗体２０８およびＡβ４２に対する抗体１６５を捕捉した。２０８　２０８および１６５の両方は、リサーチ・ファウンデーション・オブ・メンタル・ハイジーン（Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｅｎｔａｌ Ｈｙｇｉｅｎｅ）（ニューヨーク州ステイトン・アイランド）から購入し、、Ｄ５９６Ａ５９７からＥ５９６Ａ５９７またはＥ５９６Ｖ５９７へのいずれかの突然変異がＡβペプチドのＥＬＩＳＡ検出に影響しないかが独立して決定された。分泌Ａβ４０およびＡβ４２の増大した生成がＡＰＰのこれら２つの突然変異形態でトランスフェクトされた細胞で観察された。ペプチド活性アッセイにおいてさらなる構築物を用いて、Ａｓｎ残基がＳｅｒの代わりに置換されてＳＥＶＮＹ−↓−ＥＶＥＦＲ（配列番号：１７０）を与えれば、このペプチドはＳＥＶＳＹ−↓−ＥＶＥＰＲ（配列番号：１４１；テーブル４）のもののたった１／５の活性しか有さないことが決定された。この観察は、特定位置にてのアミノ酸最適化は残りの基質配列に依存することを再確認した。
【０２２９】
そのようなアッセイに有用なさらなる細胞は含む
要するに、ＳＥＶＳＹ−↓−ＥＶＥＦＲ（配列番号：１４１）はＡｓｐ２の優れたＡＰＰ修飾基質であり、細胞ベースアッセイにおいて容易に測定可能レベルのＡβを与える。
【０２３０】
実施例６
突然変異ＡＰＰ形態を発現する細胞系統
前記は形質転換ＨＥＫ−２−３細胞系統を用いるアッセイを記載する。他の有用な細胞は、限定されないが、ヒトＨｅＬａ、ＩＭＲ−３２、ＳＫ−Ｎ−ＭＣ、ＳＨＹ−５Ｙ細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞、マウスＮｅｕｒｏ−２ａ細胞およびラットＰＣ１２細胞を含む。これらの細胞の全ては、ＡＴＣＣから容易に入手可能である。好ましい具体例において、修飾ＡＰＰ形態を導入するために用いるベクターは抗菌耐性遺伝子も含有し、例えば、安定した細胞系統がＧ４１８抵抗性条件下で選択され得るようにする。もう一つの好ましい具体例において、本明細書に記載されたように両方の突然変異ＡＰＰを発現し、組替えて基にＡｓｐ２も発現する細胞系統が作製される。ひとつの変形において、個別の抗菌剤下での選択（例えば、ハイグロマイシン選択）を許容する第２の構築物を用いてＡｓｐ２を導入する。そのような細胞系統はＡｓｐ２−介在ＡＰＰプロセシングのモジュレーター用の高スループットスクリーニングに特によく適していると考えられる。
【０２３１】
実施例７
Ａｓｐ２モジュレーター用の高スループット細胞ベースアッセイ
実施例５に記載されたもののごときアッセは、それらを自動で急速に、およびいくつもの試料を並行して実行するとき、最も有用である。この後に記載される一般手順は、上で同定されたものを含む様々な細胞系統に適用可能である。好ましくは、細胞ベースアッセイは９６ウェルフォーマットで実行し、各候補化合物は重複して測定される。
約２５，０００個の細胞は処理の前日に各ウェル上に塗布し、通常細胞培養条件（３７℃、５％ＣＯ２）で増殖させる。
【０２３２】
適当な濃度の化合物ストックをＤＭＡＳＯ中で調製する。理想的なストック溶液は、試験すべき濃度の約１，０００倍高い。マイクロプレート上で、化合物はＤＭＳＯ（２５μｌ＋２００μｌ ＤＭＳＯ）で連続的に１：３希釈され、次いで、１：５ｖ／ｖ化合物：培地（５０μｌ＋２００μｌ培地）の比率にて培地中で希釈して、さらなる希釈に用いる中間プレートを得た。該中間プレートを１：２０（１３μｌ＋２４７μｌ培地）希釈して、重複して、最終的に所望する濃度の１０倍の濃度を得た。
【０２３３】
アッセイを開始するために、２０μｌの最終化合物希釈物を１８μｌの培地を含有する細胞プレートに添加し、培養を継続するために、該プレートを組織培養インキュベーターに戻す。３時間のインキュベーション後、培地を収集し、細胞を再び１８０μｌの培地プラス２０μｌの化合物で処理し、次いで、一晩培養する。該細胞からの培地を翌日収集し、アッセイしてＡＰＰのプロセシングの証拠を測定する。例えば、ＡβレベルはＥＬＩＳＡによって収集した培地から測定する。ＡＰＰプロセシングに起因するＮ−末端フラグメントも測定し得る。
【０２３４】
実施例８
ＭＢＰおよびＡＰＰを含むキメラたんぱく質
ならびに本発明のＡｓｐ２認識配列
ＡＰＰのＣ−末端から１２５個のアミノ酸を持つマルトース結合タンパク質（配列番号：１９４）を含む融合タンパク質は、ＭＢＰＣ１２５構築物の発現をグ合成し、該構築物をＥ．ｃｏｌｉ宿主に形質転換することによって作製した。ＭＢＰ（ＮＥＢ、マサチューセッツ州バーバリー）は、本発明の基質のＡｓｐ２切断後の切断を検出するのに有用な検出基質を与える。
ＡＰＰよびマルトース−結合タンパク質（ＭＢＰ）の融合体は、（本発明のβ−セクレターゼ基質を当該融合タンパク質に含有させる以外は）基本的に米国特許５７４４３４６号および米国特許第５，９４２，４００号に記載されたように作製する。これらの書類は、該融合ポリペプチドをβＡのアミノ末端にてＡＰＰの１２５個のアミノ酸部分を切断するβ−セクレターゼに暴露することによって行うアッセイも記載する。次いで、ＭＢＰ部分を捕捉し、β−セクレターゼの切断によって露出されたＡＰＰフラグメントのカルボキシ末端を該末端に特異的な１９２個の抗体で同定することができる。本発明において、これらのアッセイに用いられるＡＰＰは本発明のペプチドをβ−セクレターゼ切断部位に含むであろう。
【０２３５】
正常ＡＰＰのβ−セクレターゼ切断部位（ＶＫＭ−ＤＡ、配列番号：１８０）をＶＳＹ−ＥＶ（配列番号：１７７）、ＶＳＹ−ＤＡ（配列番号：１７８）またはＩＳＹ−ＥＶ（配列番号：１７９）に突然変異させるアプローチは前記実施例に記載されている。
【０２３６】
関連する手順において、ＭＢＰＣ１２５−ＶＳＹＥＶを含有するＭＢＰＣ１２５構築物は位置Ｐ３Ｐ２Ｐ１に対応する残基ＶＳＹの後に終止コドンを導入することによってさらに修飾した。この構築物は−−−−ＶＳＹで終了するＭＢＰＣ１２５融合タンパク質の切取りバージョンを作製することを許容する。この切取りタンパク質はＭＰＢＣ１２５タンパク質のＡｓｐ２切断生成物を測定するための標準アッセイ曲線を設定するのに有用である。何故ならば、それは予測切断生成物に対応するからである。以下のプライマー対を突然変異誘発に用い得る。
＃ＶＳＹＥＮＤ５　５’−ＧＡＣ ＡＴＣ ＴＣＴ ＧＡＡ ＧＴＧ ＡＧＴ ＴＡＴ ＴＡＧ ＧＣＡ ＧＡＡ ＴＴＣ ＣＧＡ ＣＡＴ ＧＡＣ ＴＣＡ ＧＧ−３
（配列番号：１８１）
＃ＶＳＹＥＮＤ３　５’−ＴＧＡ ＧＴＣ ＡＴＧ ＴＣＧ ＧＡＡ ＴＴＣ ＴＧＣ ＣＴＡ ＡＴＡ ＡＣＴ ＣＡＣ ＴＴＣ ＡＧＡ ＧＡＴＣＴＣ ＣＴＣ−３’
（配列番号：１８２）
前記実施例に記載されたＰＣＲ手順を該突然変異を導入するのに用い得る。
【０２３７】
実施例９
ＳＥＡＰ、インスリンＢ鎖、および本発明のＡｓｐ２認識配列を含む
代表的な融合タンパク質の作製
この実施例は融合タンパク質を記載し、そこでは、分泌されたアルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）が、短いＣ−末端フラッグタグドテールと一緒に修飾された最適Ａｓｐ２切断部分およびＨｕ−Ａｓｐ２の貫通膜ドメイン（残基４５４〜４７７）を持つ部分的または完全長インスリンＢ鎖のいずれかに融合されている。
該融合タンパク質が細胞系統中でＨｕ−Ａｓｐ２と組換え的に共発現されるか、または内因性Ｈｕ−Ａｓｐ２活性を持つ細胞系統中で発現されたとき、Ｈｕ−Ａｓｐ２は該融合タンパク質を切断して、ＳＥＡＰを細胞培地中に放出する、かくして、プロテアーゼ活性は培地中のＳＥＡＰ活性に基づいてモニターすることができる。
【０２３８】
融合タンパク質の生成：
レポーターとして分泌されたアルカリホスファタオーゼを持つ融合タンパク質を作製するために、Ｔｏｐｉｘ（マサチューセッツ州ベッドフォード）からのｐＣＭＶ／ＳＥＡＰベクターＤＮＡを用いた。次いで、ＳＥＡＰコーディング領域の終止コドンＴＴＡを突然変異誘発によってＥｃｏＲＩ部位ＧＡＡＴＴＣに突然変異させる。次いで、突然変異したプラスミドをＥｃｏＲＩで完全に消化し、子ウシインテスチンアルカリホスファターゼで処理して該ベクターＤＮＡを脱リン酸化した。この処理されたベクターＤＮＡを次なるＤＮＡフラグメントの挿入に用いて、以下のテーブル４中の成分２ないし４をカバーする。
【０２３９】
ヒトインスリンβ−鎖をコードする一本鎖ｃＤＮＡフラグメントを合成し、二本鎖ＤＮＡをこの鎖をテンプレートとして用いてＰＣＲ増幅によって作製した。５’−プライマーはＥｃｏＲＩ切断部位のオーバーハングを含有する、３’−プライマーはＢＧｌＩＩ部位を含有する。ヒトＡｓｐ２の貫通膜ドメインも、フラッグタグコーディング配列およびＥｃｏＲＩクローニング部位でオーバーハングした３’−プライマーおよびＢｇｌＩＩ部位を持つ５’−プライマーでのＰＣＲ増幅によって作製した。該２つのＤＮＡフラグメントを制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＢｇｌＩＩで消化し、引き続き、上記のベクターＤＮＡにライゲートした。β−セクレターゼ切断部位に広がる本発明の種々のペプチドは部位特異的突然変異誘発によって生成する。
【０２４０】
【表８】
2004504018.tif 000009
【０２４１】
意図される別のタイプの融合タンパク質はＡＰＰのＣ−末端領域を用いる。ＡＰＰのＣ−末端の９７個のアミノ酸（残基５９８〜６９５）の対応するＰＣＲ産物を作製する。残基５９８に天然ＥｃｏＲＩ部位があり、ＥｃｏＲＩ部位は３’−プライマーに含まれるであろう。ＰＣＲ産物をＥｃｏＲＩで消化し、次いで、ＳＥＡＰベクターに挿入する。本発明において記載される様々なＨｕ−Ａｓｐ２ペプチド基質をコードするＤＮＡ配列は、部位特異的突然変異誘発アプローチによってＡＰＰのβ−セクレターゼ切断領域に挿入する。
【０２４２】
実施例１０
突然変異ＡＰＰトランスジェニックマウスを
作製するための構築物の生成
上記したように、本発明の合成ベータセクレターゼ認識配列を含むトランスジェニック動物は、疾患状態の有用な動物モデルを含む。例えば、これらの動物はアルツハイマー病の有用なモデルであろう。この実施例はそのような配列をマウスに導入するのに適した構築物を記載する。
【０２４３】
トランスジェニック動物を作製する物質および方法は今やよく知られ、文献に記載され、本発明のトランスジェニックマウスを作製するのために容易に適合される。例えば、米国特許第５，８７７８，３９９号（出典明示して本明細書に含まれる）はＡＰＰスウェディッシュ突然変異体を発現するトランスジェニックマウスを記載する。さらなるトランスジェニックマウスは米国特許第５，３８７，７４２号に記載される。前記特許に記載されたものと同様の技術を本発明の教示と組合わせて用いて、マウスモデルを得ることができる。詳しくは、本発明のトランスジェニックマウスを作製するための構築物は本発明のペプチドチのうちの一つをコードする配列を含むように（好ましくは、その天然β−セクレターゼ認識配列のコドンにてまたはその近くで突然変異されているＡＰＰを含む。
【０２４４】
特別の代表的なトランスジェニックマウスにおいて、突然変異ＡＰＰはＡＰＰ中のβ−セクレターゼ切断部位を取り囲む４個のアミノ酸の置換、すなわち、ＫＭ−↓−ＤＡ（配列番号：１３９）のＳＹ−↓−ＥＶ（配列番号：１４０）での置換を有する。他の特定の具体例において、突然変異ＡＰＰ（例えば、ヒトＡＰＰ６９５の突然変異体）は、Ｃ−末端に２つのリジンの付加を持つ本発明のいずれのペプチドをも含むことを意図する。好ましい構築物は、Ｃ−末端に２つのリジンおよび本発明のＳＹＥＶベータセクレターゼ認識配列を持つ突然変異ヒトＡＰＰ６９５である。
【０２４５】
ライフ・テック（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈ）から商業的に入手可能なげっ歯類プリオン（ＰｒＰ）タンパク質ベクターを実験に選んだ。このベクターをＸｈｏＩで消化し、平滑断端化した。ｔｔｒ配列をＰｒＰベクターのＸｈｏＩ部位に平滑クローン化し向きは配列分析によって選択した。
【０２４６】
マウスに導入するために選択されたベータセクレターゼ基質はＣ−末端に２つのリジン付加および本発明のＳＹＥＶベータセクレターゼ認識配列を持つヒトＡＰＰ６９５（ＡＰＰ−ｋｋ−ｓｙｅｖ、配列番号：１８３）を含む。この修飾ＡＰＰ配列をｐＤＯＮＲ２０１にクローン化し、組換え反応は該ＡＰＰ−ｋｋ−ｓｙｅｖ配列をマウスプリオンプロモーターの下流およびマウスＰＲＰ３’フランキング配列の上流でＰｒＰベクターに挿入する。
【０２４７】
当該分野で知られているおよび／または上記したホモログ組換え技術を用いて、この構築物を用いて該修飾配列をげっ歯類胚幹細胞に導入し得、該細胞を用いて本発明の人工ベータセクレターゼ基質配列を含有するＡＰＰを保有するトランスジェニックマウスを生成し得る。
【０２４８】
本発明は、前記の記載または実施例に特別に記載された以外にも実施することができるのは明らかである。
本発明の多数の修飾および変形が上記教示に鑑みて可能であり、したがって、本発明の範疇にある。本明細書で引用された全ての刊行物の全開示は出典明示して本明細書に含まれる。
【０２４９】
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の代表的融合ポリペプチド（配列番号：１２８）の連続的完全配列およびポリペプチド（配列番号：１２７）をコードするヌクレオチド配列を図示する配列。
【図２】細胞ベースアッセイにおけるＡｓｐ２に対する基質としての推奨キメラを示す概略図。
【図３】β−セクレターゼによるＡＰＰプロセシングのウェスタンブロット分析を図示する像。
【図２】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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