(57)【要約】本発明はリガンドに対する選択的親和性を有する結合分子を同定する方法を提供する。この方法は、結合分子の多様な集団を固体支持体に選択的に固定化する工程、固体支持体上に固定化された多様な集団を２つ以上のリガンドに同時に接触させる工程、およびリガンドの１つ以上に選択的に結合する少なくとも１つの結合分子を決定する工程からなる。本発明はさらに、腫瘍抗原に対する選択的親和性を有する抗体を同定する方法を提供する。この方法は、抗体の多様な集団を固体支持体に選択的に固定化する工程、固体支持体上に固定化された多様な集団を２つ以上の腫瘍抗原に同時に接触させる工程、および腫瘍抗原の１つ以上に選択的に結合する少なくとも１つの抗体を決定する工程からなる。本発明はまた、腫瘍抗原に対して選択的な、単離された結合ポリペプチドを提供する。さらに、本発明は腫瘍抗原に対して選択的な、抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）またはその機能的フラグメントを提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
リガンドに対する選択的親和性を有する結合分子を同定する方法であって：
ａ）結合分子の多様な集団を固体支持体に選択的に固定化する工程；
ｂ）該固体支持体上に固定化された該多様な集団を２つ以上のリガンドに同時に接触させる工程；および
ｃ）該リガンドの１つ以上に選択的に結合する少なくとも１つの結合分子を決定する工程、
を包含する、方法。
【請求項２】
前記工程（ｃ）で決定された結合分子の配列を決定する工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記結合分子に結合する前記リガンドを特徴づける工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記結合分子の集団が発現ライブラリーにおいて生成される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記発現ライブラリーが抗体ライブラリーである、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記リガンドがポリペプチドである、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記ポリペプチドが細胞表面ポリペプチドである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記ポリペプチドが腫瘍抗原である、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記リガンドが細胞溶解物中にある、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
腫瘍抗原に対する選択的親和性を有する抗体を同定する方法であって：
ａ）抗体の多様な集団を固体支持体に選択的に固定化する工程；
ｂ）該固体支持体上に固定化された該多様な集団を２つ以上の腫瘍抗原に同時に接触させる工程；および
ｃ）該腫瘍抗原の１つ以上に選択的に結合する少なくとも１つの抗体を決定する工程、
を包含する、方法。
【請求項１１】
前記抗体の集団がヒト抗体またはその機能的フラグメントである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記抗体の集団が発現ライブラリーとして生成される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
腫瘍抗原に対して選択的な、単離された結合ポリペプチドであって、該結合ポリペプチドが、Ｆ３、Ｆ１３、Ｆ１４、Ｆ１５、Ｆ１９、Ｆ２１、Ｆ２２、Ｆ２３、Ｆ２６、Ｆ３０、Ｆ３１、Ｆ３２、Ｆ３３、Ｆ３４、Ｆ３５、Ｆ３６、Ｆ３７、Ｆ３８、Ｆ４０、Ｆ４１、Ｆ４２、Ｆ４６、Ｆ４９、Ｆ５０、Ｆ５２、Ｆ５４、Ｆ５５、Ｆ５８、Ｆ６３、Ｆ６６、Ｆ６７、Ｆ６８、Ｆ６９、Ｆ７０、Ｆ７２、Ｆ７４、Ｆ７６、Ｆ７８、Ｆ７９、Ｆ８０、Ｆ８１、Ｆ８４、Ｆ８５、Ｆ８６、Ｆ９３、Ｆ９９、Ｆ１０４、Ｆ１１１、Ｆ１１２、Ｆ１１８、Ｆ１２６、Ｆ１２９、Ｆ１３０、Ｆ１３２、Ｆ１３３、Ｆ１３４、Ｆ１３５、Ｆ１３６、Ｆ１３８、Ｆ１５１、Ｆ１５８、Ｆ１６０、Ｆ１７４、Ｆ１７６、Ｆ１７７、Ｆ１８４、Ｆ１８６、Ｆ１９１、Ｆ１９７、Ｆ２００、Ｆ２０２、Ｆ２０３、Ｆ２０７、Ｆ２０８、Ｆ２１２、Ｆ２１４、Ｆ２１７、Ｆ２２４、Ｆ２３１、Ｆ２３６、Ｆ２３８、ＴＡ５０およびＴＡ７３からなる抗体フラグメントの群から選択される抗体フラグメントである、結合ポリペプチド。
【請求項１４】
腫瘍抗原に対して選択的な、単離された結合ポリペプチドであって、該結合ポリペプチドが、Ｆ３、Ｆ１４、Ｆ１５、Ｆ１９、Ｆ２１、Ｆ２２、Ｆ２３、Ｆ２６、Ｆ１３３、ＴＡ５０およびＴＡ７３からなる抗体フラグメントの群から選択される抗体フラグメントである、結合ポリペプチド。
【請求項１５】
請求項１４に記載の抗体フラグメントであって、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８、配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５６、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６８、配列番号７０、配列番号７２、配列番号７４、配列番号７６、配列番号７８、配列番号８０、配列番号８２、配列番号８４、配列番号８６、配列番号８８、配列番号９０、配列番号９２、配列番号９４、配列番号９６、配列番号９８、配列番号１００、配列番号１０２、配列番号１０４、配列番号１０６、配列番号１０８、配列番号１１０、配列番号１１２、配列番号１１４、配列番号１１６、配列番号１１８、配列番号１２０、配列番号１２２、配列番号１２４、配列番号１２６、配列番号１２８、配列番号１３０、配列番号１３２、配列番号１３４、および配列番号１３６として参照されるアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を実質的に含む、抗体フラグメント。
【請求項１６】
抗体フラグメントをコードする、単離された核酸分子であって、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８、配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５６、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６８、配列番号７０、配列番号７２、配列番号７４、配列番号７６、配列番号７８、配列番号８０、配列番号８２、配列番号８４、配列番号８６、配列番号８８、配列番号９０、配列番号９２、配列番号９４、配列番号９６、配列番号９８、配列番号１００、配列番号１０２、配列番号１０４、配列番号１０６、配列番号１０８、配列番号１１０、配列番号１１２、配列番号１１４、配列番号１１６、配列番号１１８、配列番号１２０、配列番号１２２、配列番号１２４、配列番号１２６、配列番号１２８、配列番号１３０、配列番号１３２、配列番号１３４、および配列番号１３６として参照されるアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を実質的にコードするヌクレオチド配列を含む、抗体フラグメントをコードする、単離された核酸分子。
【請求項１７】
請求項１６に記載の単離された核酸分子であって、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４７、配列番号４９、配列番号５１、配列番号５３、配列番号５５、配列番号５７、配列番号５９、配列番号６１、配列番号６３、配列番号６５、配列番号６７、配列番号６９、配列番号７１、配列番号７３、配列番号７５、配列番号７７、配列番号７９、配列番号８１、配列番号８３、配列番号８５、配列番号８７、配列番号８９、配列番号９１、配列番号９３、配列番号９５、配列番号９７、配列番号９９、配列番号１０１、配列番号１０３、配列番号１０５、配列番号１０７、配列番号１０９、配列番号１１１、配列番号１１３、配列番号１１５、配列番号１１７、配列番号１１９、配列番号１２１、配列番号１２３、配列番号１２５、配列番号１２７、配列番号１２９、配列番号１３１、配列番号１３３、配列番号１３５として参照されるヌクレオチド配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む、単離された核酸分子。
【請求項１８】
腫瘍抗原に対して選択的な抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）またはその機能的フラグメントであって、該ＣＤＲが、Ｆ３、Ｆ１３、Ｆ１４、Ｆ１５、Ｆ１９、Ｆ２１、Ｆ２２、Ｆ２３、Ｆ２６、Ｆ３０、Ｆ３１、Ｆ３２、Ｆ３３、Ｆ３４、Ｆ３５、Ｆ３６、Ｆ３７、Ｆ３８、Ｆ４０、Ｆ４１、Ｆ４２、Ｆ４６、Ｆ４９、Ｆ５０、Ｆ５２、Ｆ５４、Ｆ５５、Ｆ５８、Ｆ６３、Ｆ６６、Ｆ６７、Ｆ６８、Ｆ６９、Ｆ７０、Ｆ７２、Ｆ７４、Ｆ７６、Ｆ７８、Ｆ７９、Ｆ８０、Ｆ８１、Ｆ８４、Ｆ８５、Ｆ８６、Ｆ９３、Ｆ９９、Ｆ１０４、Ｆ１１１、Ｆ１１２、Ｆ１１８、Ｆ１２６、Ｆ１２９、Ｆ１３０、Ｆ１３２、Ｆ１３３、Ｆ１３４、Ｆ１３５、Ｆ１３６、Ｆ１３８、Ｆ１５１、Ｆ１５８、Ｆ１６０、Ｆ１７４、Ｆ１７６、Ｆ１７７、Ｆ１８４、Ｆ１８６、Ｆ１９１、Ｆ１９７、Ｆ２００、Ｆ２０２、Ｆ２０３、Ｆ２０７、Ｆ２０８、Ｆ２１２、Ｆ２１４、Ｆ２１７、Ｆ２２４、Ｆ２３１、Ｆ２３６、Ｆ２３８、ＴＡ５０およびＴＡ７３からなる群から選択される抗体フラグメント由来である、相補性決定領域またはその機能的フラグメント。
【請求項１９】
腫瘍抗原に対して選択的な抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）またはその機能的フラグメントであって、該ＣＤＲが、Ｆ３、Ｆ１４、Ｆ１５、Ｆ１９、Ｆ２１、Ｆ２２、Ｆ２３、Ｆ２６、Ｆ１３３、ＴＡ５０およびＴＡ７３からなる群から選択される抗体フラグメント由来である、相補性決定領域またはその機能的フラグメント。
【請求項２０】
請求項１９に記載のＣＤＲであって、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８、配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５６、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６８、配列番号７０、配列番号７２、配列番号７４、配列番号７６、配列番号７８、配列番号８０、配列番号８２、配列番号８４、配列番号８６、配列番号８８、配列番号９０、配列番号９２、配列番号９４、配列番号９６、配列番号９８、配列番号１００、配列番号１０２、配列番号１０４、配列番号１０６、配列番号１０８、配列番号１１０、配列番号１１２、配列番号１１４、配列番号１１６、配列番号１１８、配列番号１２０、配列番号１２２、配列番号１２４、配列番号１２６、配列番号１２８、配列番号１３０、配列番号１３２、配列番号１３４、および配列番号１３６として参照されるアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を実質的に含む、ＣＤＲ。
【請求項２１】
ＣＤＲをコードする、単離された核酸配列であって、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８、配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５６、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６８、配列番号７０、配列番号７２、配列番号７４、配列番号７６、配列番号７８、配列番号８０、配列番号８２、配列番号８４、配列番号８６、配列番号８８、配列番号９０、配列番号９２、配列番号９４、配列番号９６、配列番号９８、配列番号１００、配列番号１０２、配列番号１０４、配列番号１０６、配列番号１０８、配列番号１１０、配列番号１１２、配列番号１１４、配列番号１１６、配列番号１１８、配列番号１２０、配列番号１２２、配列番号１２４、配列番号１２６、配列番号１２８、配列番号１３０、配列番号１３２、配列番号１３４、および配列番号１３６として参照されるアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を実質的にコードするヌクレオチド配列を含む、単離された核酸分子。
【請求項２２】
請求項２１に記載の単離された核酸分子であって、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４７、配列番号４９、配列番号５１、配列番号５３、配列番号５５、配列番号５７、配列番号５９、配列番号６１、配列番号６３、配列番号６５、配列番号６７、配列番号６９、配列番号７１、配列番号７３、配列番号７５、配列番号７７、配列番号７９、配列番号８１、配列番号８３、配列番号８５、配列番号８７、配列番号８９、配列番号９１、配列番号９３、配列番号９５、配列番号９７、配列番号９９、配列番号１０１、配列番号１０３、配列番号１０５、配列番号１０７、配列番号１０９、配列番号１１１、配列番号１１３、配列番号１１５、配列番号１１７、配列番号１１９、配列番号１２１、配列番号１２３、配列番号１２５、配列番号１２７、配列番号１２９、配列番号１３１、配列番号１３３、および配列番号１３５として参照されるヌクレオチド配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む、単離された核酸分子。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本出願は１９９７年８月４日出願の米国特許出願番号第０８／９０５，８２５（これは米国仮特許出願に転換された）に基づく優先権を主張する。この出願の全体は本明細書中に参考として援用される。
【０００２】
（発明の背景）
本発明は概して腫瘍細胞治療に関し、そしてより詳細には新規な腫瘍特異的結合分子および腫瘍特異的抗原の同定に関する。
【０００３】
近年、ガンの発生および進行に関する理解は甚だしく進歩してきている。この知識の増大にも関わらず、ほとんどのタイプのガンによる死亡率の減少はほとんど観察されていない。ガン治療の成功率は早期診断によって上昇する。ガン治療は一般に治療薬による処置を伴い、治療薬はガン細胞のみならず体内の他の細胞にも影響を与え、しばしば衰弱性の副作用を導く。従って、腫瘍特異的標的化因子、例えば腫瘍抗原に結合する抗体は、特定のタイプのガンのより早期の診断に有用な試薬を提供するばかりではなく、非腫瘍組織に対する影響を最小化するガン治療のための腫瘍特異的標的化因子を提供する。
【０００４】
いくつかの腫瘍特異的抗原が同定されているが、有用な腫瘍特異的標的化因子を得ることは未だ困難である。治療目的で興味深いのはヒト抗体であり、これは毒素を特定のタイプの腫瘍に対して標的するのに用いられ得る。ヒト抗体を用いる利点は、これらが、抗体および毒素をガン治療の間に体内から除去する免疫応答を最も引き起こし難そうであることである。しかし、特定の腫瘍を標的し得るヒト抗体の開発は困難であることが判明している。
【０００５】
腫瘍タイプを特異的に標的し得る抗体または他の因子を得るためには、可能な多数の因子のスクリーニングが必要である。例えば、腫瘍抗原に対して特異的なモノクローナル抗体を得るためには、数十から数百のハイブリドーマ細胞株を生成およびスクリーニングすることが必要である。このプロセスは困難であり、時間がかかり、そしてさらに抗原または腫瘍細胞を最初に精製または調製することが必要とされる。
【０００６】
他の多くのスクリーニングアプローチが現在開発されており、これには細菌および酵母を利用する組換え法が含まれ、この方法は目的の特定の分子に対する特異的結合パートナーを同定することを可能にする。例えば、抗体または他のタイプの結合分子の大規模なディスプレイライブラリーまたはコンビナトリアルライブラリーを生成することが現在可能である。しかし、これらの方法は通常、１つ以上の比較的精製された目的の分子を用いてライブラリーをスクリーニングすることを必要とする。
【０００７】
利用可能なスクリーニングアプローチにかかわらず、腫瘍特異的抗原の同定、およびそれに続く単離は困難であることが、長年わたり判明している。細胞溶解物を用いて特異的結合分子をスクリーニングすることによってこの問題を回避すべく試みた方法は、残念ながら、不適切な結合特異性を示す分子を得る結果となった。従って、ガンの診断および治療に適合し得る特異的結合分子は、本質的に、利用可能性に欠けている。
【０００８】
従って、腫瘍抗原に対する特異的結合分子を同定するための迅速かつ有効な方法が必要とされている。本発明はこの必要性を満たし、かつ関連の利点もまた提供する。
【０００９】
（発明の要旨）
本発明はリガンドに対する選択的親和性を有する結合分子を同定する方法を提供する。この方法は、結合分子の多様な集団を固体支持体に選択的に固定化する工程、固体支持体上に固定化された多様な集団を２つ以上のリガンドに同時に接触させる工程、および１つ以上のリガンドに選択的に結合する少なくとも１つの結合分子を決定する工程からなる。本発明はさらに、腫瘍抗原に対する選択的親和性を有する抗体を同定する方法を提供する。この方法は、抗体の多様な集団を固体支持体に選択的に固定化する工程、固体支持体上に固定化された多様な集団を２つ以上の腫瘍抗原に同時に接触させる工程、および１つ以上の腫瘍抗原に選択的に結合する少なくとも１つの抗体を決定する工程からなる。本発明はまた、腫瘍抗原に対して選択的な、単離された結合ポリペプチドを提供する。さらに、本発明は腫瘍抗原に対して選択的な、抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）またはその機能的フラグメントを提供する。
【００１０】
（発明の詳細な説明）
本発明は、１つ以上の目的のリガンドに対して選択的親和性を示す結合分子を同定するための迅速かつ有効な方法を提供する。この方法は、複数の結合分子を複数の目的のリガンドに対して同時にスクリーニングすることを可能とするという点で有利である。さらに、結合分子またはリガンドのいずれかの同一性または機能に関して必要とされるのは非常にわずかの情報である。例えば、結合分子の多様な集団が、リガンドの多様な集団に対して同時にスクリーニングされて、所望の結合特異性を示す多数の分子が迅速に同定され得る。従って、本発明の方法は、ヒトの疾患の診断および処置のための特異的試薬の発見に対して有利に適用され得る。
【００１１】
本明細書で用いられる用語「結合分子」は、リガンドに選択的に結合し得るように、十分なサイズおよび複雑度を有する分子を示すことを意図する。このような分子は通常、ポリペプチド、核酸、炭水化物または脂質のような巨大分子である。しかし、誘導体、アナログおよび模擬（ｍｉｍｅｔｉｃ）化合物、ならびに小有機化合物もまた、この用語の定義内に包含されることが意図される。結合分子のサイズは、その分子がリガンドに対する選択的結合活性を示すか、あるいは示すように成され得る限りは、重要ではない。例えば、結合分子は、少なくは１個または２個、そして多くは数十個または数百個のモノマー基礎単位（これは巨大分子結合分子を構成する）であり得る。同様に、有機化合物は、選択的結合親和性が示され得る限りは、単純または複雑な構造であり得る。
【００１２】
結合分子は、例えば、抗体および他の免疫系のレセプターまたはリガンド結合ポリペプチドを包含し得る。このような他の免疫系の分子は、例えば、Ｔ細胞レセプター（ＴＣＲ）、主要組織適合複合体（ＭＨＣ）、ＣＤ４レセプター、およびＣＤ８レセプターを包含する。加えて、インテグリン、成長因子レセプターおよびサイトカインレセプターのような細胞表面レセプター、ならびにステロイドホルモンレセプターのような細胞質レセプターもまた、結合分子という用語の定義内に実質的に包含され得る。さらに、転写因子およびＤＮＡ複製因子のようなＤＮＡ結合ポリペプチドも同様に、結合分子という用語の定義内に包含される。最後に、ランダムライブラリーおよびコンビナトリアルライブラリーから選択されるようなポリペプチド、核酸および化学化合物もまた、このような分子がリガンドに対する選択的結合活性を示すか、あるいは示すように成され得る限りは、用語の定義内に包含される。
【００１３】
本明細書で用いられる用語「ポリペプチド」は、結合分子またはリガンドに言及して用いられる場合は、２つ以上のアミノ酸のペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質を示すことを意図する。この用語は同様に、その誘導体、アナログおよび機能的模擬体を示すことを意図する。
【００１４】
本明細書で用いられる用語「リガンド」は、結合分子によって選択的に結合され得る分子を示す。リガンドは、本質的に任意のタイプの分子、例えば、ポリペプチド、核酸、炭水化物、脂質、または任意の有機体由来の化合物であり得る。当業者は、用語リガンドの意味によって意味されるものを知っている。リガンドの特定の例は、本明細書中に記載の腫瘍抗原であり、これは実施例に記載のヒト抗体結合分子によって選択的に結合される。
【００１５】
本明細書で用いられる用語「多様な集団」は、２つ以上の異なる分子の群を示すことを意図する。結合分子の多様な集団は、その結合分子の機能または構造が同一ではない限りは、同様の生化学的機能を有し得る。多様な集団は、例えば、同じまたは異なるリガンドを認識することができる抗体である結合分子の集団を含み得る。さらに、同じ結合分子は、異なるリガンドの立体配座に基づいて２つの異なるリガンドを認識し得る。このような場合、結合分子は、機能に基づいて別個のものであると見なされ、従って、同じ結合分子の複数の分子が１つの多様な集団を構成する。
【００１６】
本明細書で用いられる用語「選択的」または「選択的に」は、結合分子のリガンドへの結合、あるいは集団の固体支持体への固定化に関して言及する場合、その相互作用が、望まれない、あるいは非特異的相互作用から識別され得ることを意味すること意図する。識別は、例えば、親和性またはアビディティに基づき得、従って複数の低親和性相互作用、または少数の高親和性相互作用に由来し得る。例えば、結合分子とリガンドとの相互作用は通常、約１０−４Ｍより大きく、好ましくは約１０−５Ｍより大きく、そしてより好ましくは１０−６Ｍより大きい。高親和性相互作用は通常、約１０−８Ｍから１０−９Ｍより大きく、またはそれ以上である。
【００１７】
本明細書で用いられる用語「固定化」またはその文法的等価物は、結合分子の集団の結合を通じてのような、固体支持体への付着を示す。固定化は、結合分子と固体支持体上の因子との特異的相互作用によるものであり得る。因子は、例えば、結合分子の集団を固体支持体に保持するのに十分な共有または非共有相互作用を可能にする化学部分であり得る。固定化はまた、つなぎ止め部分（ｔｅｔｈｅｒ）またはリンカーを通じてのものであり得る。このようなリンカーは共有結合リンカー、加水分解性リンカー、光分解性リンカーまたは結合分子を選択的に付着させることができる他のリンカーであり得る。リンカーはまた、ポリペプチドまたは他の生体分子リンカー、例えば抗体、脂質アタッチメント、ストレプトアビジン、レセプター、融合ポリペプチドであり得、あるいは結合分子を固体支持体につなぎ止め得る任意の生体分子であり得る。加えて、ポリペプチドのドメインも同様にリンカーとなり得る。例えば、分子タグまたは認識配列である特定の配列のせいでプラスチックに直接吸収可能な疎水性ドメインは、ポリペプチドの結合のためのリンカーであり得る。
【００１８】
本明細書で用いられる用語「固体支持体」は、結合分子の集団の固定化が可能となるに十分安定な、固体媒体を示す。固体支持体は、例えば、ニトロセルロース、ナイロン、ポリビニリデンジフルオライド、プラスチック、ガラス、ポリアクリルアミドまたはアガロースのような膜を包含し得る。固体支持体はまた、結合分子の集団の固定化を支持する限りは、本質的にいかなるサイズまたは形状でも作製され得る。例えば、固体支持体は、平板で平らな表面、例えば天然または合成のメンブレンフィルターまたはガラススライドであり得る。あるいは、固体支持体は種々の球状の形状であり得、例えば、ガラス、ポリアクリルアミドまたはアガロース製のビーズを包含する。多孔質の媒体も同様に固体支持体として用いられ得、そしてこのような媒体は本明細書で用いられる用語の定義内に包含される。加えて、いずれの固体支持体も、例えば、結合分子またはリンカーの付着に直接または間接的に用いられ得る化学官能基を含むように、修飾され得る。
【００１９】
本明細書で用いられる用語「抗体」はリガンドに結合するポリペプチドをいい、そして当該分野におけるその意味に一致するように用いられることが意図される。免疫グロブリンという用語も同様に、当該分野で知られかつ用いられているように、抗体という用語の意味の範囲内に入ることが意図される。ポリペプチドは抗体全体であり得、あるいはリガンドに結合するその任意の機能的フラグメントであり得る。この用語の意味は、その機能が損なわれないで残る限りは、抗体の多少の改変および修飾を包含することを意図する。機能的フラグメント、例えばＦａｂ、Ｆ（ａｂ）２、Ｆｖ、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）等も同様に、抗体という用語の定義内に包含される。このような機能的フラグメントは当業者に周知である。従って、これらの用語を抗体の機能的フラグメントの記載に使用することは、当業者に周知の定義に対応することが意図される。このような用語は、例えば、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ（１９８９）；Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ａ　Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ　Ｄｅｓｋ　Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ（Ｍｙｅｒｓ、Ｒ．Ａ．（編）、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ：ＶＣＨ　Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ、Ｉｎｃ．）；Ｈｕｓｔｏｎら、Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ、２２：１８９−２２４（１９９３）；ＰｌｕｃｋｔｈｕｎおよびＳｋｅｒｒａ、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．、１７８：４９７−５１５（１９８９）およびＤａｙ、Ｅ．Ｄ．、Ａｄｖａｎｃｅｄ　Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第２版、Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ、Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、ＮＹ（１９９０）に記載されており、これらは本明細書中に参考として援用される。
【００２０】
抗体およびその機能的フラグメントを記載するために用いられる上記用語の場合と同様に、他の抗体ドメイン、機能的フラグメント、領域、ヌクレオチドおよびアミノ酸配列、ならびにポリペプチドまたはペプチドを示す用語の使用も同様に、当該分野で知られかつ用いられる各用語の意味の範囲内にあることが意図される。このような用語は、例えば、「重鎖ポリペプチド」または「重鎖」、「軽鎖ポリペプチド」または「軽鎖」、「重鎖可変領域」（ＶＨ）および「軽鎖可変領域」（ＶＬ）ならびに用語「相補性決定領域」（ＣＤＲ）を含む。
【００２１】
当該分野で使用され、および／または受け入れられている２つ以上の用語の定義がある場合、本明細書で用いられる用語の定義は、明確に反対であると述べられない限り、そのような全ての意味を含むことを意図する。具体的な例は、用語「ＣＤＲ」の使用であり、重鎖および軽鎖ポリペプチドの両方の可変領域内に見いだされる非連続的な抗原組み合わせ（ｃｏｍｂｉｎｉｎｇ）部位を説明する。この特定の領域は、Ｋａｂａｔら、米国保健福祉省「Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ　ｏｆ　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｏｆ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｉｎｔｅｒｅｓｔ」（１９８３）によって、およびＣｈｏｔｈｉａら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７（１９８７）によって、さらにＭａｃＣａｌｌｕｍら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６２：７３２−７４５（１９９６）によって記載されており、これらは本明細書中に参考として援用され、ここでこの定義は、互いに比較した場合のアミノ酸残基の重なりまたはサブセットを含む。それでもやはり、抗体またはその変異体のＣＤＲをいういずれの定義の適用も、本明細書で定義されかつ用いられる用語の範囲内であることが意図される。上記に引用される各参考文献で定義されるＣＤＲを包含する適切なアミノ酸残基を下記の表１に比較として示す。特定のＣＤＲを包含する正確な残基の数はＣＤＲの配列およびサイズに依存して変化する。抗体の可変領域アミノ酸配列が与えられるならば、当業者は、どの残基が特定のＣＤＲを含むかを、慣用的に決定し得る。
【００２２】
（表１：ＣＤＲの定義）
【００２３】
【表１】
2004503201.tif 000002
【００２４】
１残基の番号付けはＫａｂａｔら（前出）の命名法に従う。
２残基の番号付けはＣｈｏｔｉａら（前出）の命名法に従う。
３残基の番号付けはＭａｃＣａｌｌｕｍら（前出）の命名法に従う。
【００２５】
本明細書で使用される用語「腫瘍抗原」は、腫瘍細胞を正常細胞から識別または区別するためにマーカーとして用いられ得る分子をいう。このような識別マーカーは、優先的な発現、あるいは腫瘍細胞上での独特の細胞局在化または細胞下局在化のような種々の仕方によって、それ自体明白であり得る。このような抗原が優先的にマークする腫瘍細胞は、異常に頻繁な細胞増殖または制御されない生存を被る任意の細胞であり得る。このような細胞は新生物細胞であり得、これは腫瘍またはガン細胞として完全に特徴付けおよび分類されていてもよく、あるいはされていなくても良い。
【００２６】
本発明は、リガンドに対する選択的親和性を有する結合分子を同定する方法を提供する。この方法は：ａ）結合分子の多様な集団を固体支持体に選択的に固定化する工程；ｂ）固体支持体上に固定化された多様な集団を２つ以上のリガンドに同時に接触させる工程；およびｃ）リガンドの１つ以上に選択的に結合する少なくとも１つの結合分子を決定する工程、を包含する。
【００２７】
本発明の方法は結合分子を固体支持体に選択的に固定化すること、および固定化された結合分子を２つ以上の目的のリガンドに対する選択的結合相互作用についてスクリーニングすることを利用する。選択的固定化は、測定される結合相互作用の感度を増大させるように機能する。なぜなら、選択された分子集団を最初に固体支持体上に固定化することは、反応物中に存在し得る無関係な分子または夾雑物との非特異的な結合相互作用を減少させるからである。例えば、選択的結合相互作用の測定の困難度は、結合アッセイの複雑さ、ならびに結合反応物内に存在する異なる種の数および多様性と共に増大する。本発明の方法はこのような困難を回避する。なぜなら、結合分子集団の選択的固定化は、無関係な分子を反応内から除去することによって、望ましくない結合相互作用の数を実質的に減少させるからである。
【００２８】
結合分子の集団を１つ以上の精製された関心のあるリガンドまたは標的に対して生成およびスクリーニングする方法は、当該分野に存在する。しかし、結合分子の集団を、リガンドの集団または複雑な組成物、例えば細胞または細胞抽出物に対してスクリーニングした場合、特異的結合事象の同定は稀である。本発明の方法は、選択的結合事象の迅速な同定のために、結合分子集団をリガンド集団に対して効率よくスクリーニングすることを可能とする。本発明の方法は、結合分子集団を固体支持体上に選択的に固定化することによって、改良された検出の感度および特異性を提供する。
【００２９】
本発明の方法は、結合分子の大集団または小集団の両方に適用可能であり、この集団は例えば、親和性技術による集団の分離によって、実質的に精製または濃縮されていてもよい。あるいは、このような多様な集団は、例えば細胞、細胞抽出物またはインビトロ由来の合成物中に含まれるような、不均一な組成物であり得る。このような集団の選択的固定化は、関心のある２つ以上のリガンドを選択的結合親和性についてスクリーニングするために適用可能となるような、集団の十分な濃縮を提供する。
【００３０】
結合分子集団の選択は、所望の結合分子のタイプ、結合分子の必要性および最終的に意図する用途に依存する。例えば、結合分子の集団は、その集団が関心のあるリガンドまたはリガンド組成物に対する選択的結合親和性を示す少なくとも１つの結合分子を含む限り、あるいはその集団が、関心のあるリガンドに対する選択的結合を示す少なくとも１つの分子をその集団が含む非常に高い蓋然性があるように十分に多様性である限りは、本質的にいかなる供給源から生産され、あるいは由来してもよい。
【００３１】
上記基準に適合する結合分子集団を得るために、少なくとも２つの一般的なアプローチが用いられ得る。１つのアプローチは、結合分子として機能することが知られている分子、あるいは結合活性を示すかまたは示すことが可能であることが知られている分子から、結合分子集団を生成することである。結合分子として機能すること、あるいは結合活性を示すことが知られている分子の特定の例は、抗体または他の免疫レパートリーのレセプターを含む。このような分子の正常な機能は本質的に無限の数の異なる抗原およびリガンドと結合することである。従って、例えば抗体レパートリーから結合分子の多様な集団を生成することは、本質的に任意の所望のリガンドに対して結合分子を同定することを可能にする。多くの他の結合分子集団もまた存在し、そして以下さらに記載される。
【００３２】
第２のアプローチは未知分子の大集団を生成することである。この集団は、関心のあるリガンド組成物に結合する分子を含むように十分多様な配列または構造を含むように生成されるべきである。このアプローチの利点は、配列、構造または機能に関する事前の知識が必要とされないことである。そのかわり、必要とされることは、集団がリガンド複合体に対する特異的結合相互作用を偶然に示す高い蓋然性を有するように、十分なサイズおよび複雑度の集団を生成することである。このような集団の具体的な例は、ペプチド、核酸および低分子化合物のランダムライブラリーである。他の多くのタイプの「ランダム」ライブラリー分子集団が存在し、そして以下さらに記載される。
【００３３】
上述のアプローチのいずれかにより得られた集団が、目的のリガンドまたは組成物についての選択的結合親和性を示す、少なくとも１つの結合分子を含有するかどうかの予備的な知識は、必要ではない。その代わりに、目的のリガンドまたはリガンド組成物に対する結合分子を含有し得るような、意図した必要性または目的について十分多様な集団を生成することが必要であるのみである。当業者は、どのようなサイズおよび多様性が、意図した目的について必要または十分であるかを認識する。
【００３４】
前に述べた様に、使用する結合分子集団の型の選択は、選択した結合分子の特定の必要性および所望の用途に依存する。例えば、高親和性相互作用を有する結合分子が所望されるならば、抗体結合分子の集団の使用が好まれ得る。免疫グロブリンスーパーファミリーのレセプターの他の結合ポリペプチドおよびレセプターもまた使用され得る。その代わりに、例えば、結合分子がレセプターについて所望されるならば、ランダムペプチドまたは核酸配列の集団の使用が所望され得る。特定の実施例は、例えば、細胞表面レセプターに特異的なペプチド結合分子を同定するためのランダムペプチド集団の使用、ステロイドレセプターのような細胞質レセプターに選択的な結合親和性を有する結合分子の同定についてのランダム低分子集団の使用、および核酸結合ポリペプチドについて選択的な結合分子の同定についてランダム核酸集団の使用を含む。当業者は、どの型のアプローチおよびどの型の結合分子集団が、意図した目的および所望の必要性について適用可能かを認識するか、または、決定し得る。
【００３５】
使用する結合分子集団のサイズおよび多様性は、例えば、選択的な結合分子が所望されるリガンド集団またはリガンド組成物、ならびに所望の選択的な結合分子の数、所望される親和性の範囲、および適切な結合分子を同定するために利用可能な期間に依存する。例えば、本発明の方法を適用することが、リガンドについて選択的親和性を有する１つまたは数個の結合分子の同定のためであるなら、限定数の結合分子が固体支持体に選択的に固定されるべき集団を構成し得る。このような限定数の結合分子は、約２〜１０程小さいが、代表的には１０個の分子を含有し得る。
【００３６】
同定されるべき結合分子の所望される数が増加するにつれ、この集団のサイズおよび多様性も増加する。同様に、リガンドについての選択的な親和性を有する結合分子の所望の親和性の範囲および同定の速度が増加するにつれ、この結合分子集団のサイズおよび多様性も増加する。さらに、結合分子の集団のサイズは同様に、選択的な結合分子が所望されるリガンド集団のリガンドの数または複雑性が増加するにつれ増加する。従って、これら因子のそれぞれが増加するにつれ、この結合分子集団のサイズおよび多様性も同様に増加し得る。
【００３７】
中程度のサイズの集団は、この集団内に数百および数千の異なる結合分子からなるのに対し、大きなサイズの結合分子集団は、数万〜数百万の異なる結合分子種からなる。より具体的には、結合分子の同定のために、結合分子の大きくかつ多様な集団は、約１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１０１０、またはより多く異なる結合分子種のいずれかを含む。所望の数の結合分子を同定するために十分な結合分子集団のおおよその多様性は当業者らに認識される。
【００３８】
大きくかつ多様な集団が、目的の２つ以上のリガンドで迅速に生成およびスクリーニングされ得るので、結合分子の組換え体ライブラリーは、本発明の方法について特に有利である。結合分子集団は、例えばライブラリー集団の細胞抽出物から直接使用され得る。この結合分子集団を選択的に固定化するために使用される方法は以下にさらに議論される。さらに、発現ポリペプチドまたは核酸生成物の組換え体ライブラリーは、多数の異なる方法で操作され得、その結果、結合分子集団の固体支持体への選択的固定化を容易にするか、またはそれに直接的に作用するので、それらは本発明の方法に適用される。組換え体ライブラリー法は同様に、固体支持体へのこの集団の選択的な固定化についての特徴を固有に含む天然に生じるレパートリーからの多くの結合分子集団の生成を可能にする。それにもかかわらず、組換え体であれ、またはその他であれ、結合分子集団の本質的に任意の供給源が、この供給源が意図する目的にとって適切な異なる結合分子の十分なサイズおよび多様性を提供する限り、そして結合分子の集団が固体支持体に選択的に固定化され得る限り使用され得る。
【００３９】
従って、本発明は、リガンドに対する選択的な親和性を有する結合分子を同定する方法を提供し、ここでこの結合分子集団は、組換え体ライブラリーにより生成される。組換え体ライブラリー以外の結合分子集団もまた存在し、リガンドに選択的な親和性を有する結合分子のスクリーニングおよび同定のために同様に使用され得る。
【００４０】
結合分子集団の供給源としての組換え体ライブラリーの特定の実施例は、溶原ファージが細菌性発現結合分子ポリペプチドの放出を引き起こすファージ発現ライブラリーである。ファージ発現ライブラリーの別の型において、多くの潜在的な結合分子が、細菌細胞のペリプラズム表面上に融合ポリペプチドとして発現され得る。これらの例の両方において、この発現ポリペプチドは固体支持体上での固定化に利用可能である。酵母および高等な真核生物細胞のライブラリーもまた、存在し、そして本発明の方法に同様に適用可能である。当業者は、どの型のライブラリーが特定の目的に適用可能であるかを認識するか、または決定し得る。
【００４１】
本発明はまた、リガンドに選択的な結合分子を同定する方法を提供するが、ここでこの結合分子は抗体集団から同定される。
【００４２】
以前に述べた様に、リガンドに選択的な結合親和性を有する分子の同定のために使用するための、結合分子の開始集団を得るところの少なくとも幾つかのアプローチがある。１つのアプローチは通常結合機能を示す結合分子の集団を使用することである。抗体結合分子は、固有に結合分子として機能し、そして本質的に任意の抗原に結合特異性を示す生物学的方法および組換え法により産生され得るので、このようなアプローチに従いやすい。従って、本発明の結合分子の集団は、抗体またはその機能的なフラグメントであり得る。
【００４３】
抗体結合分子の集団は、当該者らに公知の種々の方法により産生され得る。例えば、抗体結合分子の集団は、ハイブリドーマ技術から産生され得、そしてモノクローナル抗体の集団は、例えば、リガンドについて選択的親和性を有するモノクローナル抗体結合分子を同定するための本発明の方法に使用され得る。その代わりに、抗体結合分子の大きい集団は、例えば、当該分野で公知の種々の組換え法により発現され得る。
【００４４】
ポリメラ−ゼ連鎖反応および当該者らに公知の他の関連する方法によって、特定の生物の本質的に全ての抗体レパートリーを増幅し、組替え集団として、抗体の重鎖および軽鎖またはそれらの機能的なフラグメントの多様な組合せを発現する方法が当該分野に存在する。抗体レパートリーが由来し得る生物体には、例えば、ヒト、マウス、ヒト、ウサギ、ヤギ、ニワトリ、または抗体を産生し得る任意の生物が含まれる。機能的なフラグメントには、例えば、抗体分子のＦａｂ、Ｆｖ、およびＣＤＲ領域が含まれる。次に、この抗体またはその機能的なフラグメントは、固体支持体上への選択的固定化によりスクリーニングされ得る。本明細書中に記載される実施例において、ヒトＦａｂフラグメント発現ライブラリーが、腫瘍抗原について選択的親和性を有する結合分子をスクリーニングするために使用された。
【００４５】
固有の結合能力を有する結合分子集団についての開始供給源としての抗体レパートリーに加えて、この結合分子集団はまた、公知のまたは固有の結合能力を有する免疫系の他の分子に由来し得る。例えば、この結合分子は、Ｔ細胞レセプター（ＴＣＲ）であり得る。Ｔ細胞レセプターは、２つのサブユニット、αおよびβを含み、これらは構造と機能共に抗体可変領域配列と類似している。これに関して、両サブユニットは、抗体に見い出されるＣＤＲ領域に類似のＣＤＲ領域をコードする可変領域を含有する（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，第３版，Ｋｕｂｙ，Ｊ（編），Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ　＆　Ｃｏ．（１９９７），これは本明細書中に参考として援用される）。ＴＣＲの可変領域を含有するＣＤＲは、抗原提示細胞の細胞表面上に提示された抗原に結合し、本質的に任意の特定の抗原に結合特異性を示し得る。抗体レパートリーを用いた場合、本質的に全ＴＣＲレパートリーの増幅および組換え操作を可能にすることが公知の十分なＴＣＲ配列情報がある。従って、ＴＣＲは、結合分子として生来機能し、本質的に任意の抗原に結合特異性を示す生物学的および組換えの方法により産生され得るので、本発明の方法に従いやすい。
【００４６】
公知のまたは固有の結合機能を示す免疫系の他の例示的結合分子には、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）、ＣＤ４およびＣＤ８のレセプターが含まれる。抗原提示細胞とエフェクターＴ細胞との間の相互作用を媒介することにおいて、ＭＨＣは機能する。ＣＤ４およびＣＤ８レセプターは、エフェクターＴ細胞と抗原呈示細胞との間の結合相互作用において機能する。ＣＤ４およびＣＤ８は、それらが、抗体およびＴＣＲ配列が表すように、類似のＣＤＲ領域構造を表す点において、付加的な利点を有する。
【００４７】
本発明の方法における開始集団としての使用に従いやすい公知のまたは固有の結合機能を示す他の結合分子は、細胞表面レセプター、細胞質レセプター、および核レセプターのような種々のレセプターを含む。結合分子のこれらのクラスのそれぞれの特定の実施例は、以下に提供される。以下に議論される以外の結合分子もまた存在し、本発明の方法に使用し得る。このような他の分子は公知であるか、または本明細書中に提供される教示を使用して、当業者により決定され得る。
【００４８】
例えば、インテグリンは、種々の生理学的プロセス、例えば細胞付着、細胞移動、および細胞増殖に関与する細胞表面レセプターである。インテグリンは、細胞−細胞、および細胞−細胞外マトリックス付着現象の両方を仲介する。構造的にはインテグリンは、単一α鎖ポリペプチドが、非共有的に単一β鎖と結合するヘテロ二量体のポリペプチドから成る。一般的に、異なる結合特異性は、異なるαおよびβ鎖ポリペプチドの独特の組合せに由来する。例えば、ビトロネクチン結合インテグリンは、αｖインテグリンサブユニットを含み、αｖβ３、αｖβ１、およびαｖβ５（これら全ては異なるリガンド結合特異性を示す）を含む。
【００４９】
結合分子集団はまた、他の細胞表面レセプターから生成され得る。これら他の細胞表面レセプターには、リガンドについての成長因子またはホルモンレセプター、例えば血小板由来成長因子、上皮細胞成長因子、インスリン、インスリン様成長因子、肝細胞成長因子、ならびに他の成長因子およびホルモンが含まれる。さらに、細胞表面レセプターには、サイトカインレセプター、例えばインターロイキンおよびインターフェロンについてのものを含む。
【００５０】
細胞質レセプターはさらに、本発明の方法における使用についての結合分子集団として使用され得る。細胞質レセプターは、例えば、甲状腺ホルモンレセプター、レチノイン酸レセプター、糖質コルチコイドレセプター、エストロゲンレセプターなどのようなステロイドホルモンレセプターを含む。さらに結合分子集団は、複製、転写、プロセシング、または翻訳のようなプロセスにおける公知のまたは固有の結合機能を示す、ＤＮＡまたは他の核酸結合ポリペプチドから産生され得る。
【００５１】
以前に述べたように、この結合分子集団はまた、未知の配列または構造のランダムライブラリーに由来し得る。このアプローチでは、この結合分子集団内の１つ以上の配列が目的のリガンドに選択的結合親和性を示す可能性を示すような大きく多様なライブラリーを産生するために十分である。このような集団を使用して本発明の方法を実施するのに必要な全ては、結合分子のランダム集団を固体支持体に選択的に固定化することが可能であることである。本質的に任意の結合分子の集団を固体支持体に選択的に固定化するための方法を以下に記載する。さらに、本明細書に記載した教示を使用して、結合分子の集団を固体支持体に選択的に固定化させるために他の方法を適用する方法は、当業者らに明らかである。
【００５２】
最後に、この結合分子はまた、例えば当業者らに公知のコンビナトリアルケミストリー法により産生される合成化合物であり得る。このようなコンビナトリアルケミストリーライブラリーは固体支持体上に選択的に固定され得、次にリガンドについての選択的な結合親和性を有する分子の同定のためにスクリーニングされ得る。さらに、天然のまたは合成の化合物ライブラリーのような他の化合物の大きな集団もまた、固体支持体に選択的に固定化され得る限り、結合分子集団として等しく適用可能である。
【００５３】
本発明は、リガンドについて選択的な親和性を示す結合分子を、結合分子の多様な集団から同定する方法を提供する。この結合分子は、固定化した結合分子の多様な集団を、２つ以上のリガンドと同時に接触させることにより同定される。
【００５４】
本発明の方法は、目的の２つ以上のリガンドを同時スクリーニングすることを可能にする。選択的親和性を示す結合分子は、目的の１つ以上のリガンドに対して獲得され得る。このリガンド集団は、結合分子の必要性および意図した使用、ならびにこのリガンドまたはリガンド組成物の特徴により選択される。例えば、結合分子の集団を選択的に固定化するための本発明の方法を使用して、選択的な結合因子は、腫瘍細胞または特定の組織型と同様に複雑なリガンドに対して、ならびに２つ以上の異なる種の単一リガンド集団に対して同定され得る。この方法の利点は、比較的粗製のリガンド集団の供給源が使用され得ることであり、これは全組織、腫瘍細胞、および細胞溶解物のリガンド供給源としての使用を容易にする。さらに、生化学的に良く特徴づけされていないリガンドが、本発明の方法においてさらに使用され得る。
【００５５】
このリガンド集団が、組織、細胞、細胞溶解物、および細胞区画または亜細胞区画のような複合組成物である場合、このリガンド集団を構成するのはこれらの複合組成物のそれぞれを含む個々の分子である。従って、細胞または細胞溶解物のような複合組成物を選択することにより、例えば、このリガンド集団は、固体支持体に固定化された結合分子の集団をスクリーニングするのに使用される２つ以上のリガンドを固有に含む。この集団内の少なくとも１つのリガンドに選択的な結合分子を同定することは、この複合組成物自体に選択的な結合分子を産生する。従って、本発明の方法は、例えば治療薬の選択的標的化のための、腫瘍細胞または他の細胞病理学に対する結合分子の効果的な同定に適用され得る。本発明の方法は、例えば、イメージング剤のような診断薬の選択的標的化のための正常なまたは疾患組織に対する結合分子の同定に同様に適用され得る。
【００５６】
このリガンドに対する選択的結合親和性を有する結合ポリペプチドを同定するために、結合分子の集団を選択的に固定化すること、および次に結合分子を２つ以上のリガンドと接触させることが必要である。以下にさらに記述するとおり、この集団内の結合分子の首尾良い結合は、この集団内の少なくとも１つのリガンドとの選択的な結合を示す。選択性は、例えば、ポジティブ結合因子の結合親和性を非特異的リガンドまたは対照リガンド集団と比較することにより、さらに確認され得る。所望ならば、このような比較は、対照として通常細胞および腫瘍細胞、ならびにリガンド集団それぞれを使用する同定のような結合分子の最初の同定の間に、対照として実行され得る。その代わりに、このような比較は、最初のリガンド集団か、あるいはこの結合分子または目的のリガンドのいずれかのより精製した形態のいずれかを使用して引き続いて実行され得る。
【００５７】
従って、本発明は、リガンドに対する選択的な親和性を有する結合分子を同定する方法を提供する。ここで、リガンドは、組織または腫瘍抗原である。本発明はまた、リガンドに対する選択的な親和性を有する結合分子を同定する方法を提供する。ここで、リガンドは、ポリペプチドまたは細胞溶解物におけるほかの高分子である。
【００５８】
粗細胞調製物または他の複合組成物由来のリガンド集団に加えて、リガンド集団はまた、実質的に精製された分子の単一な集団由来であり得る。例えば、メンバーのリガンド集団のいずれか１つのメンバーに対して選択的な結合分子を生成することが所望される場合、各、個々のメンバーは、単一の集団に合わされ得、本発明の方法を使用して同時にスクリーニングされ得る。この分子は、実質的に精製され得、または様々な量の他の無関係な種を含み得る。さらに、このような場合（ここで結合分子が集団のうち１または２〜３のメンバーに選択性であることを所望される）、個々のリガンド種が組換えまたは他の生物学的合成機構によって生成され得るならば、細胞が、このリガンドを発現するように操作され得る。次に、このリガンドは、集団中の少なくとも１つのリガンドに対して選択的である結合分子を同定するため粗細胞抽出物においてスクリーニングされ得る。そのような細胞は、個々に各リガンドを合成するよう操作され得、そして次に、細胞抽出物はスクリーニングのためプールされ得る。あるいは、細胞は、１または数個の細胞抽出物が合わされ、そしてスクリーニングされるのに必要とされるように複数のリガンドを発現するように操作され得る。
【００５９】
このリガンド集団は、異なったサイズの実質的に精製された分子または粗細胞調製物のいずれか、または他の複合組成物で構成され得る。一般に、単一集団のリガンドは、少なくとも２つの異なったリガンド種を含み、そして、３、４、５、６、７、８、９、または１０のいずれかの異なったリガンドから構成され得る。適度なリガンド集団は、約１０および数百の間の異なったリガンド種を含む。複合リガンド集団は、例えば、細胞内の異なった分子数を含む約数万個の異なったリガンド種を含む。この数は、一般に約１０５であると考えられる。なお、さらに、１０６、１０７、１０８および１０１０以上の異なった種と同じ大きさのリガンド集団で構成され得る組替えライブラリーおよびコンビナトリアルライブラリーがスクリーニングされ得る。これらの各集団サイズは、選択的結合親和性を有する結合分子を同定するためのリガンド集団として使用され得る。集団サイズおよびタイプの選択は、結合分子の必要性および意図した使用に依存する。当業者は、どのサイズおよびタイプの集団が特定の必要性にとって適切かえお認識している。
【００６０】
前記のように、上記の集合を含むリガンドは、ポリペプチド、核酸、糖質、脂質または他の有機化合物のような、本質的にいずれのタイプの分子でもあり得る。従って、上で結合分子として議論している分子はまた、リガンドでもあり得ることが理解される。例えば、個々のまたは群の細胞表面レセプター（例えば、インテグリン、増殖因子レセプターまたはサイトカインレセプター）は、これらのレセプターのアゴニストまたはアンタゴニストとして使用され得る結合分子を同定するためにランダムペプチドライブラリーまたはコンビナトリアルケミカルライブラリーをスクリーニングするリガンドとして使用され得る。
【００６１】
リガンドまたはリガンド群と結合する結合分子のスクリーニングを行うために、リガンド自身は、適切な検出法で検出される。この検出法は、直接または間接的であり得、そして例えば、光発光、放射性同位元素、発色の検出またはリガンドを検出できる任意の方法を含み得る。直接検出は、適切な細胞における代謝標識化または適切な放射性アミノ酸でのインビトロ共役転写−翻訳を使用するインビトロ標識化を使用するリガンドの放射性標識化、適切な酵素（例えば、キナーゼ）を使用する放射活性基質での共有結合改変、または放射性同位元素（例えば、ヨウ素化）を使用する化学改変のような方法を含み得る。直接法はまた、リガンドに対する適切な検出分子の融合も含み得る。例えば、リガンドは、ルシフェラーゼと融合され、そして光発光で検出され得るか、またはｌａｃＺと融合され、そして適切な比色検出によって検出され得る。リガンドの集団が生物学的に誘導された検出部分を有することが望まれる場合、ルシフェラーゼおよびｌａｃＺのような検出可能分子と融合されたリガンドを含むライブラリーは、結合分子のスクリーニングをするために使用され得る。リガンドの直接検出はまた、検出され得る化学部分の組み込みによるリガンドの共有結合改変によってなしとげられ得る。例えば、ビオチンは、リガンドと共有結合し、そして、上で議論した検出方法の１つを使用して、ストレプトアビジンで引き続いて検出され得る。
【００６２】
リガンドの間接検出のため、リガンドに共有結合しない分子は、検出のために使用され得る。リガンドと相互作用することが既知の分子は、そのような間接検出法に使用される。例えば、特異的にリガンドを検出し得る既知分子（例えば、抗体）が使用され得る。既知分子は、リガンドの直接検出についての上記の方法の１つによってそのものが検出されるか、または第一の既知分子に特異的な２次分子によって検出されるかいずれかである。例えば、リガンドに特異的な抗体は、直接検出についての上記の検出法を再度使用し、リガンドに対して特異的な第１の抗体と相互作用し得る２次抗体を使用して検出され得る。
【００６３】
１つの実施態様で、リガンドは、腫瘍細胞の細胞表面に由来する。細胞表面分子は、例えば、検出可能部分（放射性同位元素またはビオチン）で標識化され得る。この標識化によってリガンドの供給源が提供され、ここで、知られる必要がある唯一の特徴は、それが細胞表面上にあるということである。実施例で記載されているように、腫瘍抗原リガンドは、乳ガン細胞の細胞表面ポリペプチドをビオチンで標識化することによって調製され、そして腫瘍細胞表面ポリペプチドに選択的なＦａｂフラグメント結合分子を同定するために使用された。他の細胞または細胞下区画由来のリガンド集団は、初期の集団内で少なくとも１つのリガンドに対して選択的親和性を示す結合分子を得るために、本発明の方法において同様に使用され得る。従って、本発明の方法は、多種のリガンド集団に適用し得、ここで選択的結合親和力が疾患の治療処置または診断に必要とされる。
【００６４】
本発明の方法は、固体支持体に結合分子の多様な集団を選択的に固定化する工程からなる。選択的な固定化に関しては、この集団を構成する結合分子の固有の特徴が選択的な結合を提供するために利用されるか、あるいは、分子が選択的固定化のために使用される特定の特徴を含むように操作されるかどちらかである。例えば、結合分子そのものは、疎水性固体（例えば、プラスチック）に対する結合分子の固定化を引き起こす疎水性化学基またはドメインを含み得、または、疎水性固体（例えば、プラスチック）に対する結合分子の固定化を引き起こす疎水性化学基またはドメインと融合され得る。他の例では、固体支持体は、結合分子集団を構成する結合分子のみに結合し、そしてこれを選択的に固定化し得るような化学部分または生分子でコーティングされ得る。例えば、この固体支持体は、結合分子に対して共通なドメインまたは配列に選択的に結合する生分子でコーティングされ得る。リンカーまたはテザー（ｔｅｔｈｅｒ）のような生分子の使用は、それらが、結合分子へのリガンド結合を妨げないように選択されるべきである。例えば、抗体の不変部に対する抗体は、抗体結合分子を選択的に固定化するために使用され得る。そのようなアプローチは、実施例に記載されたように抗ヒトκ抗体を用いてヒトＦａｂフラグメントを固定化するために使用される。または、ペプチドタグに特異的な抗体が、固体支持体上に結合分子集団を選択的に固定化するために同様に機能する。
【００６５】
選択的固定化の１つの利点は、目的の特異的結合分子を検出するために感度の増加および非特異的結合の減少を提供することである。固体支持体は、例えば、高い濃度の結合分子を固定化し得る。そのような高い濃度の結合分子は、リガンドとの低親和性相互作用の検出および低濃度でのリガンドの検出能力を増加するために貢献し得る。基本的に、任意の固体支持体は、本発明の方法における使用に受け入れられる。この支持体は、特定の必要に適合し、そして集団のすべてまたは統計的代表数の結合分子を固定化する能力を示すように選ばれるべきである。さらに、固体支持体は、より大きな密度の固定化結合分子を達成し得る多孔性材料から作製され得る。
【００６６】
固体支持体はまた、結合分子集団を保持する能力を維持したまま、所望のスクリーニングの操作性を増加させるように選択され得る。そのような操作は、非結合リガンド集団の除去のためおよび非特異的相互作用を除く洗浄のため重要であり得る。操作の容易性は、多数の結合分子の高処理能スクリーニングを行う場合、利点となり得る。
【００６７】
本発明の方法を実施するために、一度、結合分子の集団が固体支持体に固定化されると、固定化された集団を、同時に２以上のリガンドの集団と接触させる。このリガンド集団は、結合分子にリガンドを結合させるように、選択的に固定化された結合分子と共に、適切な条件下で適切な期間インキュベートされる。選択的親和性を有する結合分子は、少なくとも１つの結合分子への集団内の少なくとも１つのリガンドの結合を測定することによって同定される。当業者は、リガンドへの結合分子の選択的結合を検出する（従って、リガンドに対する選択的親和性を有する結合分子の同定を可能にする）ように、適切な条件を認識しており、そして結合分子およびリガンド間の相互作用を可能にするに十分な条件を容易に決定し得る。
【００６８】
さらに、本発明は、同定された結合分子の配列を決定するための方法を提供する。例えば、結合分子が発現ライブラリーで生成される場合、コードしている核酸は、スクリーニングで同定された結合分子を発現している選抜クローンから単離され得る。次に、このコードしている核酸は、当業者に公知の方法を使用して配列決定され得る。
【００６９】
さらに、本発明は、結合分子によって選択的に結合されているリガンドを特徴付けるための方法を提供する。一度、リガンドに対して選択的である結合分子が同定されると、このリガンドは、例えば、当業者に公知のアフィニティー法によって単離され得、そして特徴付けされ得る。この特徴付けは、スクリーニングで使用されたリガンドがよく特徴付けされていない場合、有益であり得る。リガンドの特徴付けは、ゲル電気泳動による見かけの分子量の測定のような技術を含む。リガンドを特徴付けるために適用できる他の方法は、例えば、高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、質量分析法、またはリガンドの物理的、生化学的または機能的特性についての情報を提供する他の方法を含む。当業者は、リガンドのそのような特徴付けのための適切な方法を認識している。
【００７０】
本発明はさらに、腫瘍抗原に対する選択的親和性を有する抗体を同定するための方法を提供する。この方法は、以下の工程からなる：ａ）固体支持体に多様な抗体集団を選択的に固定化する工程；ｂ）固体支持体上に固定化された多様な集団を２以上の腫瘍抗原と同時に接触させる工程；およびｃ）１以上の腫瘍抗原と選択的に結合する少なくとも１つの抗体を決定する工程。
【００７１】
本発明の方法は、結合分子およびリガンド集団として抗体および腫瘍細胞をそれぞれ使用して実施され得る。抗体結合分子の集団は、例えば、発現ライブラリーで生成され得る。腫瘍細胞の細胞表面分子の標識化は、検出可能な腫瘍抗原リガンドの集団を提供する。
【００７２】
本発明の方法を使用して、抗体結合分子は、例えば、抗体結合分子の不変部に対し特異的な抗体、または特定のイソ型または抗体サブユニットに対し特異的な抗体の使用によって、固体支持体に選択的に固定化される。例えば、抗κ鎖抗体が、インタクトな抗体およびＦａｂフラグメントを固体支持体へ固定化するために使用され得る。
【００７３】
固体支持体に固定化された抗体結合分子は、腫瘍抗原を抗体結合分子に結合させるように、適切な条件下で腫瘍抗原とインキュベートされ得る。この抗原は、全細胞、細胞抽出物として、または特定の細胞画分として適用され得る。適切な期間後、非結合腫瘍抗原は、固体支持体から取り除かれ、そして選択的結合は、以前に記載のように検出される。当業者は、どの条件が抗体への腫瘍細胞リガンドの結合を可能にするかを認識しており、そして、腫瘍抗原に特異的な抗体の同定を可能にする相互作用を可能とするに十分な条件を容易に決定できる。腫瘍抗原は、腫瘍抗原と特異的に相互作用する１以上の抗体結合分子を決定するために検出される。腫瘍抗原についての抗体結合分子の選択性は、コントロールとして使用される正常細胞に対して決定され得る。従って、本発の方法は、診断または治療目的に使用され得る腫瘍抗原特異的抗体結合分子を同定するための手段を提供する。
【００７４】
腫瘍特異的リガンドに対して選択的な多数の抗体結合分子が、本発明の方法によって同定された。これらの抗体結合分子は、実施例において以下に記載される。さらに、ヌクレオチド配列は、これらの腫瘍選択的抗体結合分子のＣＤＲ領域について決定された。そのようなコード核酸は、同様に実施例において以下に記載される。従って、本発明は、ヒト抗体またはその機能的フラグメントの集団を同定する方法を提供する。
【００７５】
本明細書で提供されるのはまた、腫瘍抗原に対して選択的な単離された結合ポリペプチドである。この単離された結合ポリペプチドは、抗体フラグメントの群から選択される抗体フラグメントであり、それは、Ｆ３、Ｆ１３、Ｆ１４、Ｆ１５、Ｆ１９、Ｆ２１、Ｆ２２、Ｆ２３、Ｆ２６、Ｆ３０、Ｆ３１、Ｆ３２、Ｆ３３、Ｆ３４、Ｆ３５、Ｆ３６、Ｆ３７、Ｆ３８、Ｆ４０、Ｆ４１、Ｆ４２、Ｆ４６、Ｆ４９、Ｆ５０、Ｆ５２、Ｆ５４、Ｆ５５、Ｆ５８、Ｆ６３、Ｆ６６、Ｆ６７、Ｆ６８、Ｆ６９、Ｆ７０、Ｆ７２、Ｆ７４、Ｆ７６、Ｆ７８、Ｆ７９、Ｆ８０、Ｆ８１、Ｆ８４、Ｆ８５、Ｆ８６、Ｆ９３、Ｆ９９、Ｆ１０４、Ｆ１１１、Ｆ１１２、Ｆ１１８、Ｆ１２６、Ｆ１２９、Ｆ１３０、Ｆ１３２、Ｆ１３３、Ｆ１３４、Ｆ１３５、Ｆ１３６、Ｆ１３８、Ｆ１５１、Ｆ１５８、Ｆ１６０、Ｆ１７４、Ｆ１７６、Ｆ１７７、Ｆ１８４、Ｆ１８６、Ｆ１９１、Ｆ１９７、Ｆ２００、Ｆ２０２、Ｆ２０３、Ｆ２０７、Ｆ２０８、Ｆ２１２、Ｆ２１４、Ｆ２１７、Ｆ２２４、Ｆ２３１、Ｆ２３６、Ｆ２３８、ＴＡ５０およびＴＡ７３からなる。このような腫瘍抗原に対して選択的な単離された結合ポリペプチドは、例えば、Ｆ３、Ｆ１４、Ｆ１５、Ｆ１９、Ｆ２１、Ｆ２２、Ｆ２３、Ｆ２６、Ｆ１３３、ＴＡ５０またはＴＡ７３抗体フラグメントであり得る。
【００７６】
腫瘍抗原に対して選択的である特に有用な単離された結合ポリペプチドは、３つの特定の軽鎖ＣＤＲ配列および３つの特定の重鎖ＣＤＲ配列を含むアミノ酸配列を有する抗体フラグメントであり得る。腫瘍抗原に対して選択的な単離された抗体フラグメントは、例えば、Ｆ３に見出される３つの軽鎖ＣＤＲ配列（配列番号６、２８、および５０）および３つの重鎖ＣＤＲ配列（配列番号７２、９４および１１６）を含むアミノ酸配列を有し得るか、または実質的に同様または非関連のＣＤＲによって１以上のこれらのＣＤＲが置き換えられるアミノ酸配列を有し得る。上の記述から、当業者は、本発明の単離された抗体フラグメントが６個のＦ３ＣＤＲの任意のサブコンビネーション（任意の２、３、４または５個のＦ３ＣＤＲ）を有し得るか、または単一のＦ３ＣＤＲを有し得ることを理解する。腫瘍抗原に対して選択的な単離された抗体フラグメントはまた、Ｆ１４に見出される３つの軽鎖ＣＤＲ配列（配列番号８、３０および５２）および３つの重鎖ＣＤＲ配列（配列番号７４、９６および１１８）を含むアミノ酸配列を有し得るか、または実質的に同様または非関連のＣＤＲにより１以上のこれらのＣＤＲが置換されるアミノ酸配列を有し得る。上の記述から、当業者は、本発明の単離された抗体フラグメントが、６個のＦ１４ＣＤＲの任意のサブコンビネーション（２、３、４または５個のＦ１４ＣＤＲ）を有し得るか、または単一のＦ１４ＣＤＲを有し得ることを理解する。
【００７７】
別の実施態様において、腫瘍抗原に対して選択的な単離された抗体フラグメントは、Ｆ１５において見出される、配列番号１０、配列番号３２、および配列番号５４の３つの軽鎖ＣＤＲ配列、ならびにＦ１５において見出される、配列番号７６、配列番号９８および配列番号１２０の３つの重鎖ＣＤＲ配列を含むアミノ酸配列を有し得るか、あるいはこれらのＣＤＲの１つ以上が、実質的に類似するか、または関連しないＣＤＲに置換されるアミノ酸配列を有し得る。上記の記載より、当業者は、本発明の単離された抗体フラグメントが６つのＦ１５　ＣＤＲの任意のサブコンビネーション（例えば、任意の２、３、４、または５つのＦ１５　ＣＤＲ）を有し得るか、あるいは１つのＦ１５　ＣＤＲを有し得ることを、理解する。別の実施態様において、腫瘍抗原に対して選択的な単離された抗体フラグメントは、Ｆ１９において見出される、配列番号１２、配列番号３４、および配列番号５６の３つの軽鎖ＣＤＲ配列、ならびにＦ１９において見出される、配列番号７８、配列番号１００および配列番号１２２の３つの重鎖ＣＤＲ配列を含むアミノ酸配列を有し得るか、あるいはこれらのＣＤＲの１つ以上が、実質的に類似するか、または関連しないＣＤＲに置換されるアミノ酸配列を有し得る。上記の記載より、当業者は、本発明の単離された抗体フラグメントが６つのＦ１９　ＣＤＲの任意のサブコンビネーション（例えば、任意の２、３、４、または５つのＦ１９　ＣＤＲ）を有し得るか、あるいは１つのＦ１９　ＣＤＲを有し得ることを、理解する。
【００７８】
別の実施態様において、腫瘍抗原に対して選択的な単離された抗体フラグメントは、Ｆ２１において見出される、配列番号１４、配列番号３６、および配列番号５８の３つの軽鎖ＣＤＲ配列、ならびにＦ２１において見出される、配列番号８０、配列番号１０２および配列番号１２４の３つの重鎖ＣＤＲ配列を含むアミノ酸配列を有し得るか、あるいはこれらのＣＤＲの１つ以上が、実質的に類似するか、または関連しないＣＤＲに置換されるアミノ酸配列を有し得る。上記の記載より、当業者は、本発明の単離された抗体フラグメントが６つのＦ２１　ＣＤＲの任意のサブコンビネーション（例えば、任意の２、３、４、または５つのＦ２１　ＣＤＲ）を有し得るか、あるいは１つのＦ２１　ＣＤＲを有し得ることを、理解する。別の実施態様において、腫瘍抗原に対して選択的な単離された抗体フラグメントは、Ｆ２２において見出される、配列番号１６、配列番号３８、および配列番号６０の３つの軽鎖ＣＤＲ配列、ならびにＦ２２において見出される、配列番号８２、配列番号１０４および配列番号１２６の３つの重鎖ＣＤＲ配列を含むアミノ酸配列を有し得るか、あるいはこれらのＣＤＲの１つ以上が、実質的に類似するか、または関連しないＣＤＲに置換されるアミノ酸配列を有し得る。上記の記載より、当業者は、本発明の単離された抗体フラグメントが６つのＦ２２　ＣＤＲの任意のサブコンビネーション（例えば、任意の２、３、４、または５つのＦ２２　ＣＤＲ）を有し得るか、あるいは１つのＦ２２　ＣＤＲを有し得ることを、理解する。
【００７９】
別の実施態様において、腫瘍抗原に対して選択的な単離された抗体フラグメントは、Ｆ２３において見出される、配列番号１８、配列番号４０、および配列番号６２の３つの軽鎖ＣＤＲ配列、ならびにＦ２３において見出される、配列番号８４、配列番号１０６および配列番号１２８の３つの重鎖ＣＤＲ配列を含むアミノ酸配列を有し得るか、あるいはこれらのＣＤＲの１つ以上が、実質的に類似するか、または関連しないＣＤＲに置換されるアミノ酸配列を有し得る。上記の記載より、当業者は、本発明の単離された抗体フラグメントが６つのＦ２３　ＣＤＲの任意のサブコンビネーション（例えば、任意の２、３、４、または５つのＦ２３　ＣＤＲ）を有し得るか、あるいは１つのＦ２３　ＣＤＲを有し得ることを、理解する。別の実施態様において、腫瘍抗原に対して選択的な単離された抗体フラグメントは、Ｆ２６において見出される、配列番号２０、配列番号４２、および配列番号６４の３つの軽鎖ＣＤＲ配列、ならびにＦ２６において見出される、配列番号８６、配列番号１０８および配列番号１３０の３つの重鎖ＣＤＲ配列を含むアミノ酸配列を有し得るか、あるいはこれらのＣＤＲの１つ以上が、実質的に類似するか、または関連しないＣＤＲに置換されるアミノ酸配列を有し得る。上記の記載より、当業者は、本発明の単離された抗体フラグメントが６つのＦ２６　ＣＤＲの任意のサブコンビネーション（例えば、任意の２、３、４、または５つのＦ２６　ＣＤＲ）を有し得るか、あるいは１つのＦ２６　ＣＤＲを有し得ることを、理解する。
【００８０】
別の実施態様において、腫瘍抗原に対して選択的な単離された抗体フラグメントは、Ｆ１３３において見出される、配列番号２２、配列番号４４、および配列番号６６の３つの軽鎖ＣＤＲ配列、ならびにＦ１３３において見出される、配列番号８８、配列番号１１０および配列番号１３２の３つの重鎖ＣＤＲ配列を含むアミノ酸配列を有し得るか、あるいはこれらのＣＤＲの１つ以上が、実質的に類似するか、または関連しないＣＤＲに置換されるアミノ酸配列を有し得る。上記の記載より、当業者は、本発明の単離された抗体フラグメントが６つのＦ１３３　ＣＤＲの任意のサブコンビネーション（例えば、任意の２、３、４、または５つのＦ１３３　ＣＤＲ）を有し得るか、あるいは１つのＦ１３３　ＣＤＲを有し得ることを、理解する。
【００８１】
別の実施態様において、腫瘍抗原に対して選択的な単離された抗体フラグメントは、ＴＡ５０において見出される、配列番号２４、配列番号４６、および配列番号６８の３つの軽鎖ＣＤＲ配列、ならびにＴＡ５０において見出される、配列番号９０、配列番号１１２および配列番号１３４の３つの重鎖ＣＤＲ配列を含むアミノ酸配列を有し得るか、あるいはこれらのＣＤＲの１つ以上が、実質的に類似するか、または関連しないＣＤＲに置換されるアミノ酸配列を有し得る。上記の記載より、当業者は、本発明の単離された抗体フラグメントが６つのＴＡ５０　ＣＤＲの任意のサブコンビネーション（例えば、任意の２、３、４、または５つのＴＡ５０　ＣＤＲ）を有し得るか、あるいは１つのＴＡ５０　ＣＤＲを有し得ることを、理解する。
【００８２】
なお別の実施態様において、腫瘍抗原に対して選択的な単離された抗体フラグメントは、ＴＡ７３において見出される、配列番号２６、配列番号４８、および配列番号７０の３つの軽鎖ＣＤＲ配列、ならびにＴＡ７３において見出される、配列番号９２、配列番号１１４および配列番号１３６の３つの重鎖ＣＤＲ配列を含むアミノ酸配列を有し得るか、あるいはこれらのＣＤＲの１つ以上が、実質的に類似するか、または関連しないＣＤＲに置換されるアミノ酸配列を有し得る。上記の記載より、当業者は、本発明の単離された抗体フラグメントが６つのＴＡ７３　ＣＤＲの任意のサブコンビネーション（例えば、任意の２、３、４、または５つのＴＡ７３　ＣＤＲ）を有し得るか、あるいは１つのＴＡ７３　ＣＤＲを有し得ることを、理解する。
【００８３】
さらに、腫瘍抗原に対して選択的な抗体の、ＣＤＲまたはその機能的なフラグメントが提供される。ここでこのＣＤＲは、Ｆ３、Ｆ１３、Ｆ１４、Ｆ１５、Ｆ１９、Ｆ２１、Ｆ２２、Ｆ２３、Ｆ２６、Ｆ３０、Ｆ３１、Ｆ３２、Ｆ３３、Ｆ３４、Ｆ３５、Ｆ３６、Ｆ３７、Ｆ３８、Ｆ４０、Ｆ４１、Ｆ４２、Ｆ４６、Ｆ４９、Ｆ５０、Ｆ５２、Ｆ５４、Ｆ５５、Ｆ５８、Ｆ６３、Ｆ６６、Ｆ６７、Ｆ６８、Ｆ６９、Ｆ７０、Ｆ７２、Ｆ７４、Ｆ７６、Ｆ７８、Ｆ７９、Ｆ８０、Ｆ８１、Ｆ８４、Ｆ８５、Ｆ８６、Ｆ９３、Ｆ９９、Ｆ１０４、Ｆ１１１、Ｆ１１２、Ｆ１１８、Ｆ１２６、Ｆ１２９、Ｆ１３０、Ｆ１３２、Ｆ１３３、Ｆ１３４、Ｆ１３５、Ｆ１３６、Ｆ１３８、Ｆ１５１、Ｆ１５８、Ｆ１６０、Ｆ１７４、Ｆ１７６、Ｆ１７７、Ｆ１８４、Ｆ１８６、Ｆ１９１、Ｆ１９７、Ｆ２００、Ｆ２０２、Ｆ２０３、Ｆ２０７、Ｆ２０８、Ｆ２１２、Ｆ２１４、Ｆ２１７、Ｆ２２４、Ｆ２３１、Ｆ２３６、Ｆ２３８、ＴＡ５０およびＴＡ７３からなる群から選択される抗体フラグメントより誘導される。そのようなＣＤＲは、例えば、これらの抗体フラグメントの１つをコードするアミノ酸配列のＣＤＲコード部分と、実質的に類似するか、または同一のアミノ酸配列を有し得る。
【００８４】
本発明はまた、本発明の抗体フラグメントをコードする単離された核酸分子を提供する。そのような核酸分子は、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８、配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５６、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６８、配列番号７０、配列番号７２、配列番号７４、配列番号７６、配列番号７８、配列番号８０、配列番号８２、配列番号８４、配列番号８６、配列番号８８、配列番号９０、配列番号９２、配列番号９４、配列番号９６、配列番号９８、配列番号１００、配列番号１０２、配列番号１０４、配列番号１０６、配列番号１０８、配列番号１１０、配列番号１１２、配列番号１１４、配列番号１１６、配列番号１１８、配列番号１２０、配列番号１２２、配列番号１２４、配列番号１２６、配列番号１２８、配列番号１３０、配列番号１３２、配列番号１３４、または配列番号１３６として参照されるアミノ酸配列を実質的にコードするヌクレオチド配列を、含む。
【００８５】
抗体フラグメントをコードする核酸分子は、例えば、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４７、配列番号４９、配列番号５１、配列番号５３、配列番号５５、配列番号５７、配列番号５９、配列番号６１、配列番号６３、配列番号６５、配列番号６７、配列番号６９、配列番号７１、配列番号７３、配列番号７５、配列番号７７、配列番号７９、配列番号８１、配列番号８３、配列番号８５、配列番号８７、配列番号８９、配列番号９１、配列番号９３、配列番号９５、配列番号９７、配列番号９９、配列番号１０１、配列番号１０３、配列番号１０５、配列番号１０７、配列番号１０９、配列番号１１１、配列番号１１３、配列番号１１５、配列番号１１７、配列番号１１９、配列番号１２１、配列番号１２３、配列番号１２５、配列番号１２７、配列番号１２９、配列番号１３１、配列番号１３３、または配列番号１３５として参照されるヌクレオチド配列を含み得る。
【００８６】
１つの実施態様において、腫瘍抗原に対して選択的な抗体のＣＤＲまたはその機能的フラグメントは、Ｆ３、Ｆ１４、Ｆ１５、Ｆ１９、Ｆ２１、Ｆ２２、Ｆ２３、Ｆ２６、Ｆ１３３、ＴＡ５０またはＴＡ７３抗体フラグメントより誘導され得る。そのようなＣＤＲは、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８、配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５６、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６８、配列番号７０、配列番号７２、配列番号７４、配列番号７６、配列番号７８、配列番号８０、配列番号８２、配列番号８４、配列番号８６、配列番号８８、配列番号９０、配列番号９２、配列番号９４、配列番号９６、配列番号９８、配列番号１００、配列番号１０２、配列番号１０４、配列番号１０６、配列番号１０８、配列番号１１０、配列番号１１２、配列番号１１４、配列番号１１６、配列番号１１８、配列番号１２０、配列番号１２２、配列番号１２４、配列番号１２６、配列番号１２８、配列番号１３０、配列番号１３２、配列番号１３４、または配列番号１３６として参照されるアミノ酸配列を実質的に含み得る。
【００８７】
本発明はまた、本発明のＣＤＲをコードする単離された核酸分子を提供する。そのような核酸分子は、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８、配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５６、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６８、配列番号７０、配列番号７２、配列番号７４、配列番号７６、配列番号７８、配列番号８０、配列番号８２、配列番号８４、配列番号８６、配列番号８８、配列番号９０、配列番号９２、配列番号９４、配列番号９６、配列番号９８、配列番号１００、配列番号１０２、配列番号１０４、配列番号１０６、配列番号１０８、配列番号１１０、配列番号１１２、配列番号１１４、配列番号１１６、配列番号１１８、配列番号１２０、配列番号１２２、配列番号１２４、配列番号１２６、配列番号１２８、配列番号１３０、配列番号１３２、配列番号１３４、または配列番号１３６として参照されるアミノ酸配列を実質的にコードするヌクレオチド配列を含む。
【００８８】
ＣＤＲをコードする核酸分子は、例えば、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４７、配列番号４９、配列番号５１、配列番号５３、配列番号５５、配列番号５７、配列番号５９、配列番号６１、配列番号６３、配列番号６５、配列番号６７、配列番号６９、配列番号７１、配列番号７３、配列番号７５、配列番号７７、配列番号７９、配列番号８１、配列番号８３、配列番号８５、配列番号８７、配列番号８９、配列番号９１、配列番号９３、配列番号９５、配列番号９７、配列番号９９、配列番号１０１、配列番号１０３、配列番号１０５、配列番号１０７、配列番号１０９、配列番号１１１、配列番号１１３、配列番号１１５、配列番号１１７、配列番号１１９、配列番号１２１、配列番号１２３、配列番号１２５、配列番号１２７、配列番号１２９、配列番号１３１、配列番号１３３、または配列番号１３５として参照されるヌクレオチド配列を含み得る。
【００８９】
本発明の種々の実施態様の活性に実質的に影響しない変更はまた、本明細書において提供される本発明の定義内に含まれることが理解される。従って、以下の実施例は、説明を意図するが、本発明を限定することを意図しない。
【００９０】
（実施例Ｉ）
（ヒトＦａｂフラグメント集団を選択的に固定化する固体支持体の調製）
この実施例は、結合分子の集団の選択的固定化のための、フィルターの調製方法を記載する。
【００９１】
この実施例において選択的に固定化される結合分子の集団は、組換え的に発現されたヒトＦａｂフラグメントであった。この場合、腫瘍関連細胞表面抗原に対して反応性のキメラ抗体である、ヒトＢＲ９６　Ｆａｂフラグメントを使用して、ヒトＦａｂフラグメントの結合条件を決定した。ＢＲ９６抗体は、通常リソソームに局在化する膜内在性タンパク質であるｌａｍｐ−１と主に会合するルイスＹ関連糖質（ＬｅＹ抗原）に対して、反応性である。ヒトＦａｂフラグメントの集団を、ニトロセルロースフィルターを抗ヒトκ抗体でコートすることにより、固体支持体に固定化した。抗ヒトκ抗体を、フィルターへの結合のための薬剤として使用した。なぜなら、この抗体は抗体集団に対して特異的であるからである。従って、この抗体を使用して、その集団をフィルター上に選択的に固定化または「捕獲」し得る。
【００９２】
最初に、選択的にニトロセルロースフィルター上に固定化され得る抗体の量を最適化するために、条件を決定した。ヒトＦａｂフラグメントの選択的固定化のための試薬として、種々の抗ヒトイムノグロブリン試薬を試験した。事実上、試験した抗ヒトイムノグロブリン試薬の全ては、未処理のニトロセルロースフィルターと比較して、増強したシグナルを示した。そしてアフィニティー精製したポリクローナルヤギ抗ヒトκ抗体が、ＢＲ９６　Ｆａｂフラグメントの選択的固定化において最も効率的であることを決定した。このアプローチによって生成される非特異的なシグナルを、ファージに感染していない領域、および関係ない抗体を発現するファージプラークの両方にフィルターを重層することにより、決定した。このアッセイのバックグラウンドは、低く、そしてこれらのコントロールのいずれによって生成されたシグナルにおいても、差異は観察されなかった。
【００９３】
選択的固体化のために、ポリクローナル抗ヒトκ抗体を使用して、ＢＲ９６　Ｆａｂフラグメントの最大の結合のための、抗ヒトκ抗体の濃度を決定した。手短には、１ｍＭのイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を含む溶解した０．７％アガーおよびｓｕｐＥアンバーサプレッサー株ＸＬ１−Ｂｌｕｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を、固めたボトムの１．５％アガーＬｕｒｉａ　Ｂｒｏｔｈ培地に重層して、３７℃で３時間インキュベートした。３μｌのファージストックのアリコート（約１０１２ファージ／ｍｌ）を、細菌の層（ｌａｗｎ）上に直接スポットして、２５℃で１５分間アガー中に染み込ませた。次に、プレートを大きなプラークが見えた時に、３７℃に３〜４時間移した。プラークに１ｃｍ２のニトロセルロースフィルターを重層した。フィルターを取り除き、１．５ｍＭ　ＫＨ２ＰＯ４、８ｍＭ　Ｎａ２ＨＰＯ４、２．７ｍＭ　ＫＣｌ、１３７ｍＭ　ＮａＣｌ、ｐＨ７．５（ＰＢＳ）を用いて４回リンスした。機能的ＢＲ９６　Ｆａｂの選択的固定化を検出するために、フィルターを、０．７７２μｇ／ｍｌの西洋わさびペルオキシダーゼ結合化ＬｅｗｉｓＹ抗原、５％　脱脂粉乳、０．２％　Ｔｗｅｅｎ　２０、０．０１％　消泡剤Ａエマルジョンおよび０．０１％　チメロサールを含むＰＢＳ中に置いて、２時間、４℃でインキュベートした。フィルターをＰＢＳで５回洗浄して、１ｍｇ／ｍｌのｏ−フェニレンジアミンジヒドロクロライドおよび０．００３％過酸化水素を含む、５０ｍＭ　クエン酸、１００ｍＭ　Ｎａ２ＨＰＯ４、ｐＨ５中に、配置した。反応を、Ｈ２ＳＯ４を、最終濃度０．３６Ｍまで添加して停止して、アリコートを取り出し、そしてＯＤ４９０を分光計で測定した。
【００９４】
図１Ａに示すように、抗ヒトκ抗体の、約１０μｇ／ｍｌまでの漸増濃度は、より大量のＢＲ９６　Ｆａｂフラグメントを保持した。１０μｇ／ｍｌを超える抗ヒトκ抗体を用いてコートしたフィルターは、増強されていたが、最適を下回るシグナルを生成した。一方、１μｇ／ｍｌ未満の抗体を用いたコーティングは、シグナルを明らかには増幅しなかった。未処理のフィルターおよび低濃度（０．２μｇ／ｍｌ未満）の抗ヒトκ抗体でコートしたフィルターは、バックグラウンドを超えるアッセイシグナル（Ａ４９０＝約０．０５）を生成しなかった。従って、１０μｇ／ｍｌ抗ヒトκ抗体を用いてコートされたフィルターから得られたシグナルに基づく場合（Ａ４９０＝約０．４５）、選択的固定化フィルターリフト技術は、シグナルを少なくとも９倍まで増幅した。
【００９５】
発現され、そしてコートされたフィルターによって選択的に固定化された機能的な抗体Ｆａｂフラグメントの量を、２５℃で、０〜８時間の種々の時間に、評価した。図１Ｂに示すように、シグナルは、０〜４時間増加した。４時間の時点で、さらなるトランスファーの時間は、明らかにはシグナルを増加しなかった。
【００９６】
これらの結果に基づき、ニトロセルロースフィルターを、ＰＢＳ中の１０μｇ／ｍｌのヤギ抗ヒトκ抗体を含む溶液中で、３時間インキュベートした。ニトロセルロース上の未反応の部位をブロックするために、ニトロセルロースフィルターをＰＢＳ中の１％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含む溶液中で、２時間インキュベートした。
【００９７】
この方法で調製したフィルターを、以下の研究において使用した。
【００９８】
（実施例ＩＩ）
（ヒトＦａｂフラグメントの固体支持体への固定化は、ヒトＦａｂフラグメントの検出の感度を増強した）
この実施例は、結合分子集団の固定化が、特異的結合事象の検出の感度を増加することを実証する。
【００９９】
ＢＲ９６反応性Ｆａｂ（２４０Ｈ２）を発現するファージライブラリーを、Ｅ．ｃｏｌｉ細菌の層（ｌａｗｎ）上にプレートして、３７℃で８時間増殖させた。ニトロセルロースフィルターを、細菌の層に適用して、２２℃で４時間インキュベートすることによって、コントロールフィルターリフトを、生成した。これらのコントロールニトロセルロースフィルターを取り除いた。従って、コントロールフィルターリフトは、ファージプラークにおいて発現する結合分子を選択的には固定化しなかったが、その代わりに、結合分子を含む、全ての分泌ポリペプチドおよび溶解によって放出される全てのポリペプチドを直接固定化する。ヒトＦａｂフラグメントを選択的に固定化するために、実施例Ｉにおいて調製したように、ヤギ抗ヒトκ抗体を用いてコートされたニトロセルロースフィルターを、細菌の層（ｌａｗｎ）に適用して、２２℃で４時間インキュベートした。これらの選択的固定化フィルターリフトを取り除いた。次のステップは、コントロールフィルターリフトおよび選択的固定化フィルターリフトを用いて並行して行った。フィルターリフトを、１％　ＢＳＡ中でブロックして、西洋わさびペルオキシダーゼ結合化ＢＲ９６抗原（ＬｅＹ抗原）中でインキュベートした。フィルターを、製造業者によって記載された手順を使用し（Ａｍｅｒｓｈａｍ；Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ　Ｈｅｉｇｈｔｓ　ＩＬ）、増強した化学発光（ＥＣＬ）によって発色させ、３０秒間フィルムに曝露した。結果は、細菌の層（ｌａｗｎ）に適用したフィルターの順番に依存しなかった。
【０１００】
図２に示すように、ヒトＦａｂフラグメントは、選択的固定化フィルターリフト上において容易に検出された（図２において捕獲リフトと称する）、一方、コントロールフィルターリフト（図２において通常リフトと称する）は、非常に低レベルの検出可能なヒトＦａｂフラグメントを有した。選択的固定化フィルターリフトは、コントロールフィルターリフト（ニトロセルロースフィルターを直接、細菌の層（ｌａｗｎ）に適用）と比較して、腫瘍抗原ＢＲ９６を認識するヒト抗体について、非常により強いシグナルを有した。従って、目的の特異的結合分子（この場合、ヒトＦａｂフラグメント）の濃度を増加するために選択的固定化フィルターリフトを用いると、目的の結合分子の検出について、より高い感度をもたらした。
【０１０１】
これらの結果は、選択的固定化フィルターリフトが、結合分子がフィルターに直接結合されるコントロールフィルターリフトと比較して、感度を増加し、かつバックグラウンドの結合を減少することを示す。
【０１０２】
（実施例ＩＩＩ）
（ビオチン化細胞表面抗原の調製および抽出）
この実施例は、細胞表面腫瘍抗原を標識する方法を記載する。この実施例はまた、選択的に固定化された抗体の検出のために使用する場合、低いバックグラウンド結合をもたらす細胞表面腫瘍抗原抽出物の調製を記載する。
【０１０３】
Ｈ３３９６細胞を、単層で増殖させ、そして続いての４℃での操作のために、氷上にて冷却した。細胞を、３回ＰＢＳを用いてリンスした。３０分後、細胞を、ＰＢＳ中の１．５ｍｇ／ｍｌのスルホスクシンイミジル−６−（ビオチンアミド）ヘキサノエート（ｓｕｌｆｏｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ−６−（ｂｉｏｔｉｎａｍｉｄｏ）ｈｅｘａｎｏａｔｅ）（Ｐｉｅｒｃｅ）とともに２時間インキュベートした。細胞を１度５０ｍＭのグリシンを含むＰＢＳ中でリンスして、次に、ＰＢＳでさらに２回リンスした。細胞を、１００μＭ［４−２−アミノエチル）−ベンゼンスルホニルフルオライド、ＨＣｌ］、１μＭ　ペプスタチンＡおよび１０μＭ　ロイペプチンヘミスルフェートを含むＰＢＳ中でスクレイピングによって収集した。タンパク質濃度を測定し、Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００を１０：１（重量：重量）の最終濃度まで添加して、懸濁液を回転式円盤上で４℃で、オーバーナイトインキュベートした。粒子状の物質を、１１，０００×ｇで３０分間、４℃の遠心分離、続いて、５４０，０００×ｇで７分間、４℃の超遠心分離によって除去した。上清は、可溶性のビオチン化細胞表面抗原を含む。
【０１０４】
これらの結果は、細胞表面ポリペプチドがスクリーニング方法における使用のためにビオチンを用いて標識され得ることを実証する。これらの結果はまた、ミクロソームを含む妨害する粒子状物質を欠く抽出物が低いバックグラウンド結合をともなう選択的固定化フィルターリフトのプロービングにおける使用のために調製され得ることを実証する。
【０１０５】
（実施例ＩＶ）
（コントロールフィルターリフトと比較した、選択的固定化フィルターリフトのバックグラウンドの減少）
この実施例は、選択的固定化フィルターリフトがコントロールフィルターリフトと比較して非特異的細菌タンパク質結合の減少したバックグラウンドを提供することを、実証する。
【０１０６】
ＢＲ９６反応性Ｆａｂ（２４０Ｈ２）を発現するファージを、関係のないファージストック（ＩＸ６４）（Ｆａｂを全く発現しない）と混合して、Ｅ．ｃｏｌｉ細菌の層（ｌａｗｎ）上にプレートして、３７℃で８時間増殖させた。４つの複製フィルターリフト（２つのコントロールフィルターリフトおよび２つの選択的固定化フィルターリフト）を、連続して細菌の層（ｌａｗｎ）とともに、４時間２２℃でインキュベートした。２つのコントロールフィルターリフト（ＡおよびＢ）ならびに２つの選択的固定化フィルターリフト（ＣおよびＤ）を、種々の試薬とインキュベートした。細菌の層（ｌａｗｎ）上に存在する全てのプラークを位置決めするために、フィルターリフトＡをウサギ抗ｆｄバクテリオファージ抗体とともに、０．１％　アジ化ナトリウムを含むＰＢＳ中の１％　ＢＳＡ中でインキュベートし、ＰＢＳ中で３回洗浄し、続いて、アルカリホスファターゼヤギ抗ウサギ抗体中でインキュベートした。フィルターをＰＢＳで６回洗浄して、０．１Ｍ　Ｔｒｉｓ、ｐＨ９．５、０．４ｍＭ　２，２’−ジ−ｐ−ニトロフェニル−５，５’−ジフェニル−３，３’−（３，３’−ジメトキシ−４，４’−ジフェニレン）ジテトラゾリウムクロリドおよび０．３８ｍＭ　５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシルホスフェートモノ−（ｐ−トルイジニウム）塩を含むアルカリホスファターゼ比色分析試薬中のインキュベーションによって発色させた。フィルターリフトＣを、西洋わさびペルオキシダーゼ結合化ＬｅｗｉｓＹ抗原（ＢＲ９６抗原）とともに、インキュベートした。フィルターリフトＣを、ＥＣＬを用いて発色させ、そして３０秒間フィルムに曝露した。
【０１０７】
選択的固定化フィルターリフトが細胞抽出物中のリガンドを区別する能力を研究するために、Ｈ３３９６細胞をビオチン化して、膜抽出物を実施例ＩＩＩに記載のように調製した。フィルターリフトＢおよびＤを、ビオチン化細胞表面抗原（実施例ＩＩＩに記載のように調製し、ＰＢＳ中の１％　ＢＳＡ、１％　Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００、０．１４５％　ドデシル硫酸ナトリウムおよび０．１％　アジ化ナトリウム中に、４０μｇ／ｍｌに希釈した腫瘍細胞抽出タンパク質）とともに、２時間４℃でインキュベートした。フィルターリフトＢおよびＤをＰＢＳ中の０．１％　Ｔｗｅｅｎ　２０を用いて６回洗浄し、続いて、アルカリホスファターゼ結合化ストレプトアビジンとともにインキュベートした。プラークを、アルカリホスファターゼ比色分析試薬中の発色後に可視化した。
【０１０８】
図３に記載のように、全てのプラークを、抗ｆｄバクテリオファージ抗体を用いてフィルターＡ上で可視化した。同様に、たとえ、ＩＸ６４由来のプラークがＦａｂフラグメントを発現していなくても、コントロールリフトＢをビオチン化細胞表面抗原でプローブした場合、全てのプラークが可視化した。従って、ファージ溶菌によって放出される細菌タンパク質に起因する有意なバックグラウンドがあるようである。腫瘍細胞抽出物の非特異的結合を減少するための多数の試みがなされ、これには、以下：（１）腫瘍細胞膜を可溶化するための、種々の界面活性剤の使用、（２）よりストリンジェントな、フィルターの洗浄パラメーターの使用、（３）広範囲のブロッキング試薬の評価、および（４）ファージ発現Ｆａｂを捕獲するための、異なるタイプのマトリックスの使用、が挙げられる。これらのアプローチの全ては、バックグラウンドも減少し得ないか、またはシグナルを完全に消滅させた。
【０１０９】
直接結合した結合分子および非特異的細菌タンパク質を含むコントロールフィルターと対照的に、精製ＢＲ９６抗原を用いるか（図３、フィルターリフトＣ）、またはＢＲ９６抗原、ならびに他のビオチン化細胞表面抗原を含有する細胞膜溶解物を用いる（フィルターリフトＤ）選択的固定化フィルターリフトのプロービングは、プラーク検出の同様のパターンをもたらした。粗細胞膜溶解物をＢＲ９６抗原の供給源として使用した場合、コントロールフィルターリフト上において、全てのプラーク（ＢＲ９６特異的Ｆａｂフラグメントを発現しないプラークを含む）に対して、非特異的結合を生じた（フィルターリフトＢ）。一方、同一の抽出物を使用して、選択的固定化フィルターリフト上において、ＢＲ９６特異的Ｆａｂフラグメントを検出し得た（フィルターリフトＤ）。従って、選択的固定化フィルターリフトは、コントロールフィルターリフトよりも、細菌タンパク質に対する有意により低いバックグラウンド結合を有した。
【０１１０】
これらの結果は、ニトロセルロースフィルターに対する結合分子の選択的固定化手順が細菌タンパク質のバックグラウンド結合を減少させることを示す。従って、フィルター上に選択的に固定化された結合分子による目的の結合分子の捕獲が、細菌プラーク溶解物中の結合分子を選択的に捕獲することによって、結合分子の濃度を増加させる。さらに、非特異的細菌タンパク質の結合を減少することによって、バックグラウンドが減少した。従って、選択的固定化フィルターリフト方法は、リガンドの集団を用いて結合分子をスクリーニングする場合、増強した感度、および減少したバックグラウンドを提供する。
【０１１１】
（実施例Ｖ）
（固体支持体上の選択的な固定化によって同定される、腫瘍特異的Ｆａｂフラグメントの同定）
この実施例は、腫瘍特異的Ｆａｂフラグメントを発現するクローンの同定を実証する。
【０１１２】
Ｆａｂフラグメントライブラリーを、乳房腫瘍組織および結腸腫瘍組織を用いて生成した。大多数のＦａｂフラグメントを、細胞表面腫瘍抗原に対する特異性を用いて同定した。
【０１１３】
Ａ２、Ａ３、およびＡ４と称される、ヒトＦａｂフラグメントを発現する３つのライブラリーを、３つの異なる腫瘍の供給源から生成した。Ａ２ライブラリーを、乳ガン患者から得られた、腫瘍を排出するリンパ節組織から構築した。Ａ３ライブラリーを、ヒト結腸腫瘍組織から構築した。Ａ４ライブラリーを、前立腺腫瘍組織から構築した。そのライブラリーを、腫瘍組織サンプルにおいて存在するＢ細胞から構築した。手短には、ＲＮＡを、ＴＲＩＺＯＬ試薬（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）を使用して、腫瘍組織から抽出した。ＲＮＡからのｃＤＮＡの合成に続いて、ＩｇＧ重鎖およびκ軽鎖を、タッチダウンポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅した。１本鎖ＤＮＡを単離して、２つのベクターＩＸ１０４およびＩＸ２０３中にクローン化した。ＩＸ１０４ベクターは、イムノグロブリン重鎖とｐＶＩＩＩタンパク質との間にアンバー終止コドンを含む。ＩＸ２０３ベクターは、アンバー終止コドンを取り除かれている。
【０１１４】
ヒトＦａｂライブラリーを、抗ヒトκ抗体でコートしたニトロセルロースフィルター上に選択的に固定化した（実施例Ｉのように調製）。表２に、Ｈ３３９６細胞株由来のビオチン化細胞表面ポリペプチド（実施例ＩＩＩのように調製）に対するＩＸ１０４またはＩＸ２０３ベクターのいずれかにおけるヒトＦａｂライブラリーの３つの独立したスクリーニング実験の結果の概要を述べる。選択的固定化フィルターリフト技術を用いると、ポジティブクローンの頻度は３つの独立した実験において異なっていた（表２を参照のこと）。これらの実験において定義されるように、ポジティブクローン（表２において、捕獲リフトポジティブクローンと称する）を、最初のスクリーニングにおいて同定し、採取し、再度プレートし、そして第２の選択的固定化フィルターリフトスクリーニングにおいて確認した。
【０１１５】
（表２．腫瘍細胞を用いたＦａｂライブラリースクリーニングの概要）
【０１１６】
【表２】
2004503201.tif 000003
【０１１７】
１１５μｇ／ｍｌ以下のＦａｂフラグメント濃度で、未反応。
【０１１８】
選択的固定化フィルターリフト技術によって同定されたポジティブクローンを単離し、そして、さらなる特徴づけのための可溶性Ｆａｂをより大量に生成する供給源として使用した。手短には、ＸＬ１−Ｂｌｕｅ細菌を２×ＹＴ培地にて、３７℃で、培養物が０．９〜１．２　ＯＤ６００の密度に達するまで増殖させた。最終濃度１ｍＭまでのＩＰＴＧの添加後、培養物を、高力価ストック（＞１０１０プラーク形成単位／ｍｌ）からの１０μｌのファージを用いて感染させ、そして１時間３７℃でインキュベートした。培養物を２５℃にシフトしてさらに１４〜１６時間増殖させた。細胞を、６０００×ｇ　１０分間でペレット化し、１００μＭ（４−２−アミノエチル）−ベンゼンスルホニルフルオライド、ＨＣｌ）、１μＭ　ペプスタチンＡおよび１０μＭ　ロイペプチンヘミサルフェートを含む１０ｍｌの５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０中に再懸濁し、そしてマイクロチップを備えたＢｒａｎｓｏｎ　Ｓｏｎｉｆｉｅｒ　４５０を用いて、１５％の出力で１分間、音波振動によって破砕した。超音波処理後、５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０中の１０００ＵのＤＮａｓｅＩを添加し、そして溶解物を３０分間、２５℃でインキュベートした。溶解物を、１２，０００×ｇで３０分間、４℃で遠心分離し、上清を取り除き、そしてＦａｂフラグメントの精製のために使用した。
【０１１９】
Ｆａｂフラグメントを、１ｍｌのＨｉＴｒａｐ　ＮＨＳ活性化カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）上への２０ｍｇへのヤギ抗ヒトＩｇＧ　Ｆａｂのカップリングにより構築したアフィニティーカラムを使用して精製した。Ｔｗｅｅｎ　２０を、０．０５％の最終濃度まで、細菌細胞溶解物に添加し、そして溶解物を０．４５μｍフィルターを通して濾過して、アフィニティーカラムにアプライした。未結合画分を回収し、そして２回目のアプライをした。カラムを５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０、０．５Ｍ　ＮａＣｌおよび０．０５％　Ｔｗｅｅｎ　２０を含む緩衝液を用いて洗浄して、その後、５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０緩衝液で洗浄した。Ｆａｂを、０．５Ｍ　ＮａＣｌを含む１００ｍＭ　グリシン−ＨＣｌ、ｐＨ２．３を用いて、１０分の１容量の１Ｍ　Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０中に溶出した。Ｆａｂフラグメントを含有する画分を、ＰＢＳで平衡化したＰＤ−１０　Ｓｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ２５−Ｍカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）にアプライした。
【０１２０】
精製したＦａｂフラグメントをさらに特徴づけるために、Ｈ３３９６細胞の単層を、ＰＢＳ中の２％パラホルムアルデヒドを用いて、２５℃で１５分間固定した。パラホルムアルデヒドをアスピレートして、細胞を、ＰＢＳを用いて２回洗浄した。固定した細胞を、ＰＢＳ中に１％ＢＳＡを含有するブロッキング緩衝液中でインキュベートして、Ｆａｂフラグメントをブロッキング緩衝液中に適切な濃度に希釈して、固定した細胞と２５℃で２時間インキュベートした。サンプルをアスピレートして、固定した細胞をＰＢＳで３回洗浄して、細胞を０．５μｇ／ｍｌのアルカリホスファターゼ結合化ヤギ抗ヒトκ軽鎖抗体とともに２５℃で１時間インキュベートした。固定した細胞をＰＢＳで４回洗浄して、アルカリホスファターゼ比色分析試薬を用いて発色させた。
【０１２１】
フィルターリフト上の選択的固定によって同定されたＦａｂフラグメントの約４０〜５０％は、ビオチン化細胞膜溶解物を生成するために使用した細胞株であるＨ３３９６腫瘍細胞の、固定した単層上において滴定可能なシグナルを生成した（表２を参照のこと）。固定した単層上において滴定されなかったＦａｂフラグメントの約５０％のうちのいくつかは、パラホルムアルデヒド処理によって破壊された抗原性エピトープに依存するようである。パラホルムアルデヒド処理を使用しない異なる技術を使用して、これらの残りのＦａｂフラグメントクローンを特徴づけし得る。
【０１２２】
固体支持体上での選択的な固定化によって単離されたポジティブなＦａｂフラグメントクローン（表２において捕獲リフトポジティブクローンと称される）はまた、ＧＭ０５６５８正常ヒト線維芽細胞に対するクローン化Ｆａｂフラグメントの反応性について試験された。５０，６００のもとのクローンをスクリーニングした１つの実験において、２を超えるクローンは線維芽細胞に反応せず、そして線維芽細胞ネガティブと分類された。１３９，４００のもとのクローンをスクリーニングした第２の実験において、９を超えるクローンを、線維芽細胞ネガティブクローンとして同定した。従って、選択的な固定化は、腫瘍細胞に特異的に結合するが、正常線維芽細胞に結合しないヒトＦａｂフラグメントの同定を可能にする。
【０１２３】
選択的固定化フィルターリフト技術を使用して、表３に示すように、Ｆａｂフラグメントを発現する８１クローンを同定した。
【０１２４】
ＤＮＡをＦａｂクローンから単離し、そして軽鎖ＣＤＲ領域に対応するＤＮＡフラグメントを、ＩＸ１０４特異的プライマー　ＧＣＣＡＧＴＴＣＣＡＧＡＴＴＴＣＡＡＣＴＧ（配列番号１）、またはＩＸ２０３特異的プライマー　ＣＴＣＴＧＴＧＡＣＡＣＴＣＴＣＣＴＧＧＧＡ（配列番号２）を用いて配列決定した。重鎖ＣＤＲ領域に対応するＤＮＡフラグメントを、プライマー　ＧＴＡＧＴＣＣＴＴＧＡＣＣＡＧＧＣＡ（配列番号３）または　ＡＡＧＡＣＣＧＡＴＧＧＧＣＣＣＴＴＧＧＴＧＧＡＧＧＣ（配列番号４）を用いて配列決定した。表４は、クローン化Ｆａｂフラグメントの軽鎖において見出された３つのＣＤＲ領域のアミノ酸配列を示す。表５は、クローン化したＦａｂフラグメントの軽鎖のＣＤＲ領域のヌクレオチド配列を示す。表６は、クローン化したＦａｂフラグメントの重鎖において見出された３つのＣＤＲ領域のアミノ酸配列を示す。表７は、クローン化されたＦａｂフラグメントの重鎖のＣＤＲ領域に対応するヌクレオチド配列を示す。フィルター上の選択的な固定化によって同定されたＦａｂクローンの各々は、独特のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む。
【０１２５】
（表３．選択的固定化フィルターリフト技術によって同定された、腫瘍特異的ヒトＦａｂクローン）
【０１２６】
【表３】
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【０１２７】
2004503201.tif 000005
【０１２８】
（表４．選択的固定化フィルターリフト技術によって単離されたＦａｂフラグメントの軽鎖のＣＤＲ領域のアミノ酸配列）
【０１２９】
【表４】
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【０１３０】
（表５．選択的固定化フィルターリフト技術によって単離されたＦａｂフラグメントの軽鎖のＣＤＲ領域のヌクレオチド配列）
【０１３１】
【表５】
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【０１３２】
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【０１３３】
（表６．選択的固定化フィルターリフト技術によって単離されたＦａｂフラグメントの重鎖のＣＤＲ領域のアミノ酸配列）
【０１３４】
【表６】
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【０１３５】
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【０１３６】
（表７．選択的固定化フィルターリフト技術によって単離されたＦａｂフラグメントの重鎖のＣＤＲ領域のヌクレオチド配列）
【０１３７】
【表７】
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【０１３８】
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【０１３９】
選択的固定化フィルターリフト技術を用いて、発現ライブラリーにおいて生成された大多数のヒトＦａｂフラグメントを同定した。この技術は、大多数のクローンのスクリーニングを可能にする。単離されたＦａｂクローンの選ばれた数のＤＮＡ配列決定は、種々の遺伝子的に異なるＦａｂフラグメントが同定されたことを明らかにした。
【０１４０】
これらの結果は、選択的固定化フィルターリフト技術が、大多数の異なるヒトＦａｂフラグメントの同定を可能にすることを示す。
【０１４１】
（実施例ＶＩ）
（固体支持体上への選択的な固定化によって同定された腫瘍細胞特異的ヒトＦａｂフラグメントの特徴づけ）
この実施例は、固定したおよび生存する腫瘍細胞株に関する、Ｆａｂクローンの細胞特異的反応性を実証する。
【０１４２】
選択的固定化フィルターリフト技術を使用して同定されたＦａｂフラグメントを、実施例Ｖに記載されるように精製した。種々の細胞株を実施例Ｖに記載のようにパラホルムアルデヒド中で固定し、そして精製Ｆａｂフラグメントの漸増濃度（２．５×１０−１〜３×１０１μｇ／ｍｌ）とともにインキュベートした。実施例Ｖに記載のように、未結合のＦａｂを除去して、固定した細胞をアルカリホスファターゼ結合化抗ヒトκ抗体とともにインキュベートした。発色試薬とのインキュベートの後、ＯＤ５６０を測定した。
【０１４３】
図４Ａにおいて、精製Ｆａｂ　Ｆ１５の滴定曲線を、２つの乳房腫瘍細胞株（Ｈ３３９６およびＨ３４６４）ならびにＧＭ０５６５８正常線維芽細胞において、示した。Ｆａｂ　Ｆ１５は、両方の乳房細胞株に対する特異的結合を示すが、正常線維芽細胞に対する特異的結合は示さない。図４Ｂにおいて、Ｆａｂ　Ｆ１３３の滴定曲線を、同一の２つの乳房細胞株およびＧＭ０５６５８正常ヒト線維芽細胞を用いて示す。Ｆａｂ　Ｆ１３３は、スクリーニング抽出物を作製するために使用したＨ３３９６細胞について特異的結合を示す。しかし、Ｆａｂ　Ｆ１３３は、第２の乳房細胞株または正常線維芽細胞に対して結合しない。
【０１４４】
精製Ｆａｂフラグメントをまた、Ｂｅｃｔｏｎ　Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ　ＦＡＣＳｏｒｔ　ｓｙｓｔｅｍでのＦＡＣＳ分析によって、生存腫瘍細胞への結合に関して特徴づけした。精製Ｆａｂ　Ｆ３をＨ３３９６細胞において、非特異的Ｆａｂフラグメントと比較した（図５Ａを参照のこと）。Ｈ３３９６細胞とＦａｂ　Ｆ３とのインキュベーションは、Ｈ３３９６細胞におけるシフトを生じ、このことは、非特異的Ｆａｂとインキュベートした細胞と比較して、細胞表面抗原との反応性を示した。Ｆａｂ　Ｆ３がシフトさせた細胞のピークはシャープであり、このことは、Ｈ３３９６細胞の集団がその抗原の発現において比較的均一であることを示す。
【０１４５】
同様のＦＡＣＳ分析を、Ｆａｂ　Ｆ１５を用いて行った。図５Ｂに示すように、Ｆａｂ　Ｆ１５は、Ｈ３３９６細胞において、Ｆａｂ　Ｆ３を用いて観察されるよりも、非特異的Ｆａｂと比較してより大きなシフトを生じた。このことは、Ｆａｂ　Ｆ１５が細胞表面抗原と反応することを示す。シフトしたＦａｂ　Ｆ１５のピークは、Ｆａｂ　Ｆ３を用いて観察されたピークよりも広く、このことは，Ｈ３３９６細胞におけるＦａｂ　Ｆ１５抗原のより不均一な発現と一致する。
【０１４６】
ＦＡＣＳ分析を、Ｆａｂ　Ｆ４０を用いてまた、行った。Ｆａｂ　Ｆ４０を、乳房細胞株Ｈ３３９６の膜抽出物を用いて同定した。興味深いことに、Ｆａｂ　Ｆ４０は、結腸ガン種細胞株Ｈ３７１９と交差反応性である（図５Ｃを参照のこと）。Ｆａｂ　Ｆ４０は、コントロールの非特異的Ｆａｂと比較して、Ｈ３７１９細胞のシフトを生じる。このことは、Ｆａｂ　Ｆ４０が、結腸ガン腫細胞株の細胞表面抗原を認識することを示す。Ｆａｂ　Ｆ４０のピークは、いくぶん広く、このことは、Ｆ４０抗原の発現がより不均一であることを示す。従って、Ｆａｂ　Ｆ４０は、腫瘍細胞の２つの異なるタイプの細胞表面抗原を認識する。
【０１４７】
選択的固定化フィルターリフト技術は、固定された生腫瘍細胞についての特異性を有する大多数のヒトＦａｂフラグメントの単離を可能とした。いくつかのＦａｂフラグメントが、乳ガン腫細胞に対して特異的であるか、または特定の乳房細胞株に対して特異的であるが、他のＦａｂフラグメントは、結腸ガン腫細胞株に対して交差反応する。これらのＦａｂフラグメントは、腫瘍細胞上の特異的な結合を提示したが、正常線維芽細胞に対しては、結合しなかった。
【０１４８】
これらの結果は、選択的固定化フィルターリフト技術が腫瘍細胞に対する特異性を有するヒトＦａｂフラグメントの同定を可能にすることを示す。
【０１４９】
上記に提供された全ての学術誌文献および参考文献は、括弧内であってもまたはそうでなくても、上記に述べられていても、述べられていなくても、その全体が本明細書において参考として援用される。
【０１５０】
本発明は、上記に提供される実施例に対する参照とともに記載されてきたが、種々の変更を本発明の精神から逸脱することなくなし得ることが理解されるべきである。従って、本発明は特許請求の範囲によってのみ限定される。
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は、固体支持体上に固定化されたヒトＦａｂ結合分子の最適化を示す。
【図２】
図２は、固体支持体上に選択的に固定化された結合分子を用いる、腫瘍抗原に対するヒトＦａｂ結合分子の同定を示し、そして固体支持体上に直接固定化された結合分子に対する検出効率を比較する。
【図３】
図３は、固体支持体上に選択的に固定化されたヒトＦａｂ結合分子集団を用いる検出の増大した結合特異性と減少したバックグラウンドを、直接固定化と比較して示す。
【図４】
図４は、固体支持体上の選択的固定化によって同定されたヒトＦａｂ結合分子の、腫瘍細胞単層に対する結合特異性を示す。
【図５】
図５は、固体支持体上の選択的固定化によって同定されたヒトＦａｂ結合分子による腫瘍細胞の蛍光活性化細胞選別を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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