(57)【要約】本発明は、西ナイルウイルス（ＷＮＶ）のキャプシド蛋白質のようなフラビウイルス属又はペスチウイルス属のキャプシド蛋白質又はその機能性断片により細胞死を誘導する方法を提供する。また、本発明は、ＷＮＶのキャプシド蛋白質又はこれをコードする核酸分子を含む医薬組成物を投与することにより高増殖性細胞によって特徴付けられる病気を患っている個体を処置する方法も提供する。抗ウイルス及び／又は抗ＷＮＶ及び／又は抗フラビウイルス及び／又は抗ペスチウイルスのキャプシド蛋白質活性を有する化合物を同定する方法が開示される。また、本発明は、ＷＮＶ又はフラビウイルス属若しくはペスチウイルス属を含めたその他のウイルスからのキャプシド又はその他の蛋白質又はその機能性断片及び製薬上許容できるキャリアーを含むワクチン組成物も提供する。また、本発明は、ＷＮＶ又はフラビウイルス属若しくはペスチウイルス属を含めたその他のウイルスに感染した個体の診断方法及びその個体を特定するためのキットも提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ある細胞を細胞死を誘導するのに有効な量の単離されたフラビウイルス属又はペスチウイルス属のキャプシド蛋白質又はその機能性断片と接触させ、或いは該細胞にフラビウイルス属又はペスチウイルス属のキャプシド蛋白質又はその機能性断片をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子（該核酸は全フラビウイルス又はペスチウイルスゲノムから遊離しているものとする）を導入する段階を含む細胞死を誘導する方法において、該ヌクレオチド配列が該細胞内で細胞死を誘導するのに有効なレベルで発現することを特徴とする細胞死を誘導する方法。
【請求項２】
単離されたキャプシド蛋白質又はその機能性断片又は核酸分子が日本脳炎ウイルス群の亜属から選択されるウイルスからのものである請求項１に記載の方法。
【請求項３】
単離されたキャプシド蛋白質又はその機能性断片又は核酸分子が西ナイルウイルス（ＷＮＶ）からのものである請求項１に記載の方法。
【請求項４】
機能性断片が配列番号８を含む請求項３に記載の方法。
【請求項５】
核酸分子が配列番号８をコードする請求項３に記載の方法。
【請求項６】
細胞が腫瘍細胞である請求項１に記載の方法。
【請求項７】
細胞をフラビウイルス属又はペスチウイルス属のキャプシド蛋白質又はその機能性断片と接触させる請求項１に記載の方法。
【請求項８】
核酸分子を前記細胞に導入する請求項１に記載の方法。
【請求項９】
次の段階：
（ａ）試験化合物の存在下に、細胞と該細胞において検出可能なレベルのアポトーシスを誘導するのに十分な量のフラビウイルス属又はペスチウイルス属のキャプシド蛋白質又はその機能性断片とを接触させ、及び
（ｂ）段階（ａ）で検出されたアポトーシスのレベルと該試験化合物の非存在下に細胞をフラビウイルス属又はペスチウイルス属のキャプシド蛋白質又はその機能性断片と接触させたときに生じたアポトーシスのレベルとを比較すること
を含む、フラビウイルス属又はペスチウイルス属のキャプシド蛋白質又はその機能性断片が細胞のアポトーシスを誘導するのを抑制する化合物を同定する方法。
【請求項１０】
細胞をフラビウイルス又はペスチウイルスキャプシド蛋白質と接触させる請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
細胞をフラビウイルス又はペスチウイルスキャプシド蛋白質の機能性断片と接触させる請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
機能性断片が配列番号８を含む請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
細胞がＨｅＬａ細胞、ＲＤ細胞及び２９３細胞よりなる群から選択される請求項９に記載の方法。
【請求項１４】
検出段階がアポトーシスマーカーを検出する検定法である請求項９に記載の方法。
【請求項１５】
マーカーがホスファチジルセリン（ＰＳ）又は遊離の３’−ヒドロキシＤＮＡ末端である請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
検定法がＴＵＮＥＬ分析又はアネキシンＶフローサイトメトリーである請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
（ａ）フラビウイルス属又はペスチウイルス属のキャプシド蛋白質又はその機能性断片を含む容器及び（ｂ）使用説明書、陽性の対照物、陰性の対照物、データを表現する写真及びデータを表現する図よりなる群から選択される少なくとも１種の追加の構成要素を含む請求項９に記載の方法を実施するためのキット。
【請求項１８】
（ａ）フラビウイルス属又はペスチウイルス属のキャプシド蛋白質又はその機能性断片或いはフラビウイルス属又はペスチウイルス属のキャプシド蛋白質又はその機能性断片をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子及び（ｂ）製薬上許容できるキャリヤーを含む注射用医薬組成物。
【請求項１９】
（ａ）フラビウイルス属又はペスチウイルス属のキャプシド蛋白質又はその機能性断片をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子及び（ｂ）製薬上許容できるキャリヤーを含む請求項１８に記載の注射用医薬組成物。
【請求項２０】
（ａ）フラビウイルス属又はペスチウイルス属のキャプシド蛋白質又はその機能性断片及び（ｂ）製薬上許容できるキャリヤーを含む請求項１８に記載の注射用医薬組成物。
【請求項２１】
（ａ）ＷＮＶのキャプシド蛋白質又はその機能性断片及び（ｂ）製薬上許容できるキャリヤーを含む請求項１８に記載の注射用医薬組成物。
【請求項２２】
有効量の請求項１８に記載の注射用医薬組成物を個体に投与する段階を含む、高増殖性細胞によって特徴付けられる病気と診断された個体又はその病気を患っていると疑われる個体を処置する方法。
【請求項２３】
有効量の請求項１９に記載の注射用医薬組成物を個体に投与する段階を含む、高増殖性細胞によって特徴付けられる病気と診断された個体又はその病気を患っていると疑われる個体を処置する方法。
【請求項２４】
有効量の請求項２０に記載の注射用医薬組成物を個体に投与する段階を含む、高増殖性細胞によって特徴付けられる病気と診断された個体又はその病気を患っていると疑われる個体を処置する方法。
【請求項２５】
有効量の請求項１８に記載の注射用医薬組成物を個体に投与することによって望ましくない細胞を除去することを含む、望ましくない細胞によって特徴付けられる病気と診断された個体又はその病気を患っていると疑われる個体を処置する方法。
【請求項２６】
キャプシド蛋白質又はその機能性断片がＷＮＶキャプシド蛋白質又はその機能性断片である請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
病気が癌である請求項２２に記載の方法。
【請求項２８】
投与段階が注射用医薬組成物の腫瘍内注射によって達成される請求項２２に記載の方法。
【請求項２９】
次の段階：
（ａ）フラビウイルス属又はペスチウイルス属のキャプシド蛋白質に対して特異的な抗体を個体からの試料と接触させ、及び
（ｂ）該抗体が該試料からのフラビウイルス又はペスチウイルスキャプシド蛋白質に結合するかどうかを検出すること
を含むフラビウイルス又はペスチウイルスに感染した個体を特定する方法において、該抗体のフラビウイルス又はペスチウイルスキャプシド蛋白質への結合の検出が、個体がフラビウイルス又はペスチウイルスに感染したことを示すことを特徴とする該ウイルスに感染した個体を特定する方法。
【請求項３０】
キャプシド蛋白質がＷＮＶキャプシド蛋白質である請求項２４に記載の方法。
【請求項３１】
（ａ）フラビウイルス属又はペスチウイルス属のキャプシド蛋白質に対して特異的な抗体を含む第１容器及び（ｂ）フラビウイルス属又はペスチウイルス属のキャプシド蛋白質又はその機能性断片を含む第２容器を含むフラビウイルス又はペスチウイルスに感染した個体を特定するためのキット。
【請求項３２】
第１容器がＷＮＶキャプシド蛋白質に対して特異的な抗体を含み、第２容器がＷＮＶのキャプシド蛋白質又はその機能性断片を含む請求項３１に記載のキット。
【請求項３３】
次の段階：
（ａ）試料をフラビウイルス属又はペスチウイルス属のキャプシド蛋白質と接触させ、及び
（ｂ）該フラビウイルス属又はペスチウイルス属のキャプシド蛋白質が該試料中の抗体に結合するかどうかを検出すること
を含むフラビウイルス又はペスチウイルスに感染した個体を特定する方法において、フラビウイルス属又はペスチウイルス属のキャプシド蛋白質の結合の検出が、個体がフラビウイルス又はペスチウイルスに感染したことを示すことを特徴とする該ウイルスに感染した個体を特定する方法。
【請求項３４】
ウイルスがＷＮＶであり、キャプシド蛋白質がＷＮＶのキャプシド蛋白質である請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
（ａ）フラビウイルス属又はペスチウイルス属のキャプシド蛋白質を含む第１容器及び（ｂ）フラビウイルス属又はペスチウイルス属のキャプシド蛋白質に特異的に結合する抗体を含有する第２容器を含むフラビウイルス又はペスチウイルスに感染した個体を特定するためのキット。
【請求項３６】
キャプシド蛋白質がＷＮＶのキャプシド蛋白質である請求項３５に記載のキット。
【請求項３７】
（ａ）免疫学的に有効な量のフラビウイルス属又はペスチウイルス属のキャプシド蛋白質又はその免疫原性断片及び（ｂ）製薬上許容できるキャリヤーを含むワクチン組成物。
【請求項３８】
フラビウイルス属又はペスチウイルス属のキャプシド蛋白質又はその免疫原性断片がＷＮＶのキャプシド蛋白質又はその免疫原性断片である請求項３７に記載のワクチン。
【請求項３９】
（ａ）フラビウイルス属又はペスチウイルス属のキャプシド蛋白質又はその免疫原性断片をコードする核酸及び（ｂ）製薬上許容できるキャリヤーを含むワクチン組成物。
【請求項４０】
核酸がＷＮＶのキャプシド蛋白質又はその免疫原性断片をコードする請求項３９に記載のワクチン。
【請求項４１】
フラビウイルス又はペスチウイルスからの治療上有効な量のキャプシド蛋白質又はその免疫原性断片或いはフラビウイルス又はペスチウイルスからのキャプシド蛋白質又はその免疫原性断片をコードする核酸を投与することによってフラビウイルス又はペスチウイルスに感染した個体を処置する方法。
【請求項４２】
個体が曝されたウイルスがＷＮＶであり、しかもキャプシド蛋白質若しくはその断片又はキャプシド蛋白質若しくはその免疫原性断片をコードする核酸がＷＮＶからのものである請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
フラビウイルス又はペスチウイルスからの予防に有効な量のキャプシド蛋白質又はその免疫原性断片或いはフラビウイルス又はペスチウイルスからのキャプシド蛋白質又はその免疫原性断片をコードする核酸を投与することによってフラビウイルス又はペスチウイルス感染から個体を保護する方法。
【請求項４４】
個体が保護されるべきウイルスがＷＮＶであり、しかもキャプシド蛋白質若しくはその断片又はキャプシド蛋白質若しくはその免疫原性断片をコードする核酸がＷＮＶからのものである請求項４３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
相互参照の関連出願
本出願は、３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９（ｅ）に準じて、２０００年１０月４日申請の米国特許仮出願第６０／２３７，８８５号（ここに参照して説明に代える）の利益を請求する。
【０００２】
発明の分野
本発明は、アポトーシスによって細胞死を誘発するための、西ナイルウイルス由来のキャプシド蛋白質、並びに他のウイルス（フラビウイルス属及びペスチウイルス属のウイルスを含む）の由来のキャプシド蛋白質及び他の蛋白質の使用；西ナイルウイルスによる、並びに他のウイルス（フラビウイルス属及びペスチウイルス属を含む）による感染に対するワクチン及び診断に関する。本発明は更に、キャプシド蛋白質の有するアポトーシス誘発能を選択的に阻害する化合物を同定することによって、抗ウイルス化合物をスクリーニングする方法に関する。
【０００３】
発明の背景
西ナイルウイルス（ＷＮＶ）感染は、欧米の温帯で近年発生し、ヒト、ウマ、トリに対する脅威となっている。ＷＮＶ感染の最も深刻な発現形態は、致死性脳炎である。１９３７年にウガンダの西ナイルで初めて単離されたＷＮＶは、寸法４０−６０ｎｍのフラビウイルス科フラビウイルス属で、エンベロープに包まれた二十面体のヌクレオキャプシドを有した、１０，０００−１１，０００塩基の単センス鎖ＲＮＡゲノムである。ＷＮＶの近年の研究についてはＨｏｌｌｏｗａｙ（２０００）Ｏｕｔｂｒｅａｋ ｎｏｔ ｃｏｎｔａｉｎｅｄを参照されたい。この西ナイルウイルスは、公衆衛生監視が見直されるきっかけとなった（Ｓｃｉ． Ａｍ．．２８２：２０、２２。ここに参照して説明に代える）。フラビウイルス科のウイルスについては以下の文献に詳しい記載がある：Ｎｅｙｔｓ他（１９９９）Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ ｗｉｔｈ Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ、Ｖｅｒｈ． Ｋ． Ａｃａｄ． Ｇｅｎｅｅｓｋｄ． Ｂｅｌｇ．６１：６６１−６９７、考察６９７−６９９；Ｌｅｙｓｓｅｎ他（２０００）Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ ｗｉｔｈ Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ、Ｃｌｉｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｒｅｖ．１３：６７−８２；Ｓｈｅｒｌｏｃｋ（１９９９）Ｔｈｅ ｈｅｐａｔｉｃ Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ： ｓｕｍｍａｒｙ、Ｊ． Ｖｉｒａｌ． Ｈｅｐａｔ．６ Ｓｕｐｐｌ．１：１−５；及びＦｉｅｌｄｓ， Ｋｎｉｐｅ及びＨｏｗｌｅｙ編、Ｆｉｅｌｄｓ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（第３版）第Ｉ、ＩＩ巻、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ Ｐｕｂｓ．（１９９６）（各文献はここに参照して説明に代える）。
【０００４】
フラビウイルス属及びペスチウイルス属感染に対する予防及び治療を行う、改良された方法が必要とされている。細胞死を誘発して、高増殖性細胞によって特徴付けられる疾患を治療する、改良された方法が必要とされている。
【０００５】
発明の概要
本発明は細胞死を誘発する方法を提供する。本発明の方法は、細胞死を誘発するのに有効な量のフラビウイルス属又はペスチウイルス属のキャプシド蛋白質又はその機能性断片に、細胞を接触させる段階を包含する。本発明の幾つかの態様によると、フラビウイルス属のキャプシド蛋白質又はその機能性断片は、西ナイルウイルス（ＷＮＶ）のキャプシド蛋白質又はその機能性断片である。本発明の幾つかの態様によると、フラビウイルス属又はペスチウイルス属のキャプシド蛋白質又はその機能性断片に細胞を接触させて、細胞死を誘発する。本発明の幾つかの態様によると、フラビウイルス属又はペスチウイルス属のキャプシド蛋白質又はその機能性断片をコードする配列を包含する核酸分子を細胞に導入する。フラビウイルス属又はペスチウイルス属のキャプシド蛋白質又はその機能性断片をコードする配列が発現すると、フラビウイルス属又はペスチウイルス属のキャプシド蛋白質又はその機能性断片が細胞内で産生され、細胞死が引き起こされる。本発明の幾つかの態様によると、フラビウイルス属又はペスチウイルス属のキャプシド蛋白質又はその機能性断片をコードする配列は、細胞内で配列が発現するのに必要な調節因子に操作可能に連結されている。本発明の幾つかの態様によると、核酸分子はＤＮＡである。本発明の幾つかの態様によると、細胞は腫瘍細胞である。
【０００６】
本発明は、フラビウイルス属又はペスチウイルス属のキャプシド蛋白質又はその機能性断片の有するアポトーシス誘発能を、阻害することのできる化合物を同定する方法を提供する。本発明の方法は、（ａ）測定可能な量のアポトーシスを細胞内で誘発するのに充分な量のフラビウイルス属又はペスチウイルス属のキャプシド蛋白質又はその機能性断片に、試験化合物の存在下で細胞を接触させ、そして（ｂ）試験化合物が存在しているときに起こるアポトーシスの量と、試験化合物が存在していないときに起こるアポトーシスの量とを比較する段階を包含する。本発明は、ＷＮＶキャプシド蛋白質又はその機能性断片が細胞内でアポトーシスを誘発するのを抑制する化合物を同定する方法にして、（ａ）測定可能な量のアポトーシスを細胞内で誘発するのに充分な量のＷＮＶキャプシド蛋白質又はその機能性断片に、試験化合物の存在下で細胞を接触させ、そして（ｂ）試験化合物が存在しているときに起こるアポトーシスの量と、試験化合物が存在していないときに起こるアポトーシスの量とを比較する段階を包含する方法に関する。幾つかの態様によると、本発明の方法の測定段階は、細胞膜のホスファチジルセリン（ＰＳ）やＤＮＡ中の遊離３’ヒドロキシ末端等のアポトーシス関連マーカーの存在を検出することによって行う。
【０００７】
本発明は、フラビウイルス属又はペスチウイルス属のキャプシド蛋白質又はその機能性断片と、薬剤として許容される担体とを包含する薬剤組成物に関する。本発明の幾つかの態様によると、薬剤組成物は、ＷＮＶキャプシド蛋白質又はその機能性断片と、薬剤として許容される担体とを包含する。
【０００８】
本発明は、フラビウイルス属又はペスチウイルス属のキャプシド蛋白質又はその機能性断片をコードする配列を包含する核酸分子と薬剤として許容される担体とを包含する、薬剤組成物に関する。本発明の幾つかの態様によると、薬剤組成物は、細胞内で配列が発現するのに必要な調節因子に操作可能に連結された、フラビウイルス属又はペスチウイルス属のキャプシド蛋白質又はその機能性断片をコードする配列を包含する核酸分子を包含する。本発明は、ＷＮＶキャプシド蛋白質又はその機能性断片をコードする配列を包含する核酸分子と薬剤として許容される担体とを包含する薬剤組成物に関する。本発明の幾つかの態様によると、薬剤組成物は、細胞内で配列が発現するのに必要な調節因子に操作可能に連結された、ＷＮＶキャプシド蛋白質又はその機能性断片をコードする配列を包含する核酸分子を包含する。本発明の幾つかの態様によると、薬剤組成物の包含する核酸分子はＤＮＡである。
【０００９】
本発明は、高増殖性細胞によって特徴付けられる疾病を診断された又は患っていると思われる個体を治療する方法にして、高増殖性細胞を死滅させるのに充分な量のフラビウイルス属又はペスチウイルス属のキャプシド蛋白質又はその機能性断片を個体に投与する段階を包含する方法に関する。本発明は、高増殖性細胞によって特徴付けられる疾病を診断された又は患っていると思われる個体を治療する方法にして、高増殖性細胞を死滅させるのに充分な量のＷＮＶキャプシド蛋白質又はその機能性断片を個体に投与する段階を包含する方法に関する。幾つかの態様によると本方法は、ＷＮＶキャプシド蛋白質又はＷＮＶキャプシド蛋白質の機能性断片を有効量でそのような個体に投与する段階を包含する。本発明の幾つかの態様によると、フラビウイルス属又はペスチウイルス属のキャプシド蛋白質又はその機能性断片をコードする配列は、細胞内で配列が発現するのに必要な調節因子に操作可能に連結されている。本発明の幾つかの態様によると、本方法はＷＮＶキャプシド蛋白質又はその機能性断片をコードする配列を包含する核酸分子を有効量でそのような個体に投与する段階を包含する。本発明の幾つかの態様によると、ＷＮＶキャプシド蛋白質又はその機能性断片をコードする配列は、細胞内で配列が発現するのに必要な調節因子に操作可能に連結されている。本発明の幾つかの態様によると核酸分子はＤＮＡである。本発明の幾つかの態様によると、高増殖性細胞によって特徴付けられる疾病は癌又は乾癬である。
【００１０】
本発明は、免疫学的有効量の、ＷＮＶ由来の或いは同族のフラビウイルス属又はペスチウイルス属ウイルス由来のキャプシド蛋白質と、薬剤として許容される担体とを包含するワクチン組成物に関する。本発明の幾つかの態様によると、ワクチン組成物は、免疫学的有効量の、ＷＮＶ由来の或いは関連のフラビウイルス属又はペスチウイルス属ウイルス由来のキャプシド蛋白質の免疫原性断片と、薬剤として許容される担体とを包含する。
【００１１】
本発明は、ＷＮＶ由来の或いはフラビウイルス属又はペスチウイルス属のウイルス由来のキャプシド蛋白質をコードする配列を包含する核酸分子と薬剤として許容される担体とを包含するワクチン組成物に関する。本発明の幾つかの態様によると、ワクチン組成物は、ＷＮＶ由来の或いは同族のフラビウイルス属又はペスチウイルス属ウイルス由来のキャプシド蛋白質の免疫原性断片をコードする配列を包含する核酸分子と、薬剤として許容される担体とを包含する。本発明の幾つかの態様によると、ワクチン組成物は、細胞内で配列が発現するのに必要な調節因子に操作可能に連結された、ＷＮＶ又は関連したフラビウイルス属又はペスチウイルス属ウイルスのキャプシド蛋白質の免疫原性断片をコードする配列を包含する核酸分子を包含する。本発明の幾つかの態様によるとワクチン組成物の包含する核酸分子はＤＮＡである。本発明の幾つかの態様によるとワクチン組成物はプラスミドを包含する。
【００１２】
本発明は、ＷＮＶ或いは同族のフラビウイルス属又はペスチウイルス属ウイルスに対して個体を免疫化する方法に関する。誘導される免疫応答は予防のためのものであっても治療のためのものであってもよい。本方法は、ＷＮＶ由来の或いは同族のフラビウイルス属又はペスチウイルス属のウイルス由来のキャプシド蛋白質又はその免疫原性断片；又はＷＮＶ由来の或いはフラビウイルス属又はペスチウイルス属のウイルス由来のキャプシド蛋白質又はその免疫原性断片をコードする核酸分子を、免疫学的有効量で個体に投与する段階を包含する。
【００１３】
本発明は、ＷＮＶ由来の或いは同族のフラビウイルス属又はペスチウイルス属のウイルス由来のキャプシド蛋白質に特異的に結合する抗体を用いて、ＷＮＶ由来の或いは同族のフラビウイルス属又はペスチウイルス属ウイルス由来のキャプシド蛋白質の存在を試料中に同定することによって、ＷＮＶ由来の或いは同族のフラビウイルス属又はペスチウイルス属ウイルス由来のキャプシド蛋白質に接触した個体を同定する方法に関する。抗体は好ましくはモノクローナル抗体である。個体試料中に存在するＷＮＶ由来の或いは同族のフラビウイルス属又はペスチウイルス属ウイルス由来のキャプシド蛋白質を定量することによって、感染個体の予後を調べることができる。
【００１４】
本発明は、ＷＮＶ或いは同族のフラビウイルス属又はペスチウイルス属のウイルスに接触した個体を同定するキット、及びそのキットに用いられる試薬に関する。キットは、ＷＮＶ由来の或いは同族のフラビウイルス属又はペスチウイルス属のウイルス由来のキャプシド蛋白質に特異的に結合する抗体を含む第１の容器と、ＷＮＶ由来の或いは同族のフラビウイルス属又はペスチウイルス属のウイルス由来のキャプシド蛋白質を含む第２の容器とを包含する。抗体は好ましくはモノクローナル抗体である。個体試料中に存在する、ＷＮＶ由来の或いは同族のフラビウイルス属又はペスチウイルス属のウイルス由来のキャプシド蛋白質を定量できるように、キットが改良されていてもよい。得られる情報を用いて、感染個体の予後を調べることができる。
【００１５】
本発明は、ＷＮＶ由来の或いは同族のフラビウイルス属又はペスチウイルス属ウイルス由来のキャプシド蛋白質を用いて、ＷＮＶ由来の或いは同族のフラビウイルス属又はペスチウイルス属のウイルス由来のキャプシド蛋白質に対する抗体の存在を試料中に検出することによって、ＷＮＶ或いは同族のフラビウイルス属又はペスチウイルス属ウイルスに接触した個体を同定する方法に関する。個体の試料中に存在する、ＷＮＶ由来の或いは同族のフラビウイルス属又はペスチウイルス属由来のキャプシド蛋白質に対する抗体を定量することによって、感染個体の予後を調べることができる。
【００１６】
本発明は、ＷＮＶ或いは同族のフラビウイルス属又はペスチウイルス属ウイルスに接触した個体を同定するキット、及びそのキットに用いられる試薬に関する。キットは、ＷＮＶ由来の或いは同族のフラビウイルス属又はペスチウイルス属のウイルス由来のキャプシド蛋白質への接触に応じて産生された抗体を含む第１の容器と、ＷＮＶ由来の或いは同族のフラビウイルス属又はペスチウイルス属のウイルス由来のキャプシド蛋白質を含む第２の容器とを包含する。個体試料中に存在する、ＷＮＶ由来の或いは同族のフラビウイルス属又はペスチウイルス属のキャプシド蛋白質に対する抗体を定量できるように、キットが改良されていてもよい。得られる情報を用いて、感染個体の予後を調べることができる。
【００１７】
図面の簡単な説明
図１の上図は、１９９９年ニューヨークヒト単離ＷＮＶ（ＷＮＶ−ＨＮＹ１９９９）［ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＦ２０２５４１、Ｊｉａ他（１９９９）、Ｌａｎｃｅｔ３５４：１９７１−１９７２。ここに参照して説明に代える］のゲノム構成の概略図である。キャプシド蛋白質は「Ｃｐ」と表してある。下図は、ＷＮＶキャプシド蛋白質発現ベクターｐＷＮＶｈ−ＤＪＹ及びｐＷＮＶｙ−ＤＪＹの構造の概略図である。これらの発現構造体について、本明細書では別の呼称を用いることもある。ｐＷＮＶＣ−ＤＪＹをｐＷＮＶＣｈ−ＤＪＹ又はｐＷＮＶＣｈと称していることもあり、ｐＷＮＶｙ−ＤＪＹをｐＷＮＶＣｙ−ＤＪＹ又はｐＷＮＶＣｙと称していることもある。
【００１８】
図２はＷＮＶキャプシド蛋白質発現ベクターｐＷＮＶｈ−ＤＪＹの制限エンドヌクレアーゼ地図を示す。
【００１９】
図３はＷＮＶキャプシド蛋白質発現ベクターｐＷＮＶｈ−ＤＪＹの特徴地図を示す。
【００２０】
図４は、５８６４ヌクレオチド塩基対を有する、ＷＮＶキャプシド蛋白質発現ベクターｐＷＮＶｈ−ＤＪＹの二本鎖ヌクレオチド全配列を注釈付きで示したものである。制限エンドヌクレアーゼ部位、特徴、及び構造体が発現する蛋白質の部分に関する翻訳情報は、注釈に記載した。上側のヌクレオチド鎖は配列番号１である。アミノ末端ｓＩｇＥリーダーペプチドの蛋白質配列（配列番号２）は、ヌクレオチド９１７〜９７０のコード領域の下に示した。発現された蛋白質のＷＮＶ Ｃｐ蛋白質部分の蛋白質配列（配列番号３）は、ヌクレオチド９７１〜１３３６のコード領域の下に示した。
【００２１】
図５はＷＮＶキャプシド蛋白質発現ベクターｐＷＮＶｙ−ＤＪＹの制限エンドヌクレアーゼ地図を示す。
【００２２】
図６はＷＮＶキャプシド蛋白質発現ベクターｐＷＮＶｙ−ＤＪＹの特徴地図を示す。
【００２３】
図７は、５８６４ヌクレオチド塩基対を有する、ＷＮＶキャプシド蛋白質発現ベクターｐＷＮＶｙ−ＤＪＹの二本鎖ヌクレオチド全配列を注釈付きで示したものである。制限エンドヌクレアーゼ部位、特徴、及び構造体が発現する蛋白質の部分に関する翻訳情報は、注釈に記載した。上側のヌクレオチド鎖は配列番号４である。アミノ末端ｓＩｇＥリーダーペプチドの蛋白質配列は、ヌクレオチド９１７〜９７０のコード領域の下に示した。発現された蛋白質のＷＮＶ Ｃｐ蛋白質部分の蛋白質配列は、ヌクレオチド９７１〜１３３６のコード領域の下に示した。
【００２４】
図８は２種の異なるＷＮＶキャプシド蛋白質構造体ｐＷＮＶｈ−ＤＪＹ及びｐＷＮＶｙ−ＤＪＹの生体外転写／翻訳産物を、３５Ｓ標識化し免疫沈降し、電気泳動分離したオートラジオグラフである。左端の列は分子量マーカーを含んでいる。矢印は、主要な生体外翻訳蛋白質産物の位置を示す。ポリヒスチジンＣ末端標識に結合した蛋白質は、抗Ｈｉｓ抗体を用いて免疫沈降した。
【００２５】
図９はＷＮＶ　Ｃｐ蛋白質の全アミノ酸配列（配列番号５）を示す。実施例３で用いた、３種の腫瘍組織適合（ＭＨＣ）クラスＩＩ制限エピトープペプチド［ＷＮＶＣ−Ｐ１（配列番号６）、ＷＮＶＣ−Ｐ２（配列番号７）及びＷＮＶＣ−Ｐ３（配列番号８）］を、Ｃｐアミノ酸配列の下に示す。
【００２６】
図１０は生体外で刺激された、ＤＮＡ免疫化マウス由来脾臓細胞における、細胞内ＩＦＮ−γ発現のフローサイトメトリー分析を示す。数値は二重に陽性の細胞のパーセントである。図の上段では、細胞はＩＮＦ−γ及びＣＤ４４について染色されている。下段では、細胞はＣＤ４及びＩＦＮ−γについて染色されている。最上列の表示は、マウスを免疫化するのに用いたベクターと、脾臓細胞の再刺激に用いられた刺激とを示す。免疫化ベクターは、ｐｃＤＮＡ３（ｐｃＤＮＡ３．１）、ｐＷＮＶｈ−ＤＪＹ（ｐＷＮＶＣｈ）及びｐＷＮＶｙ−ＤＪＹ（ｐＷＮＶＣｙ）である。「Ａｇなし」は脾臓細胞が生体外翻訳対照物とともに培養されたことを（実施例３に記載）、「蛋白質」は脾臓細胞が、ｐＷＮＶｙ−ＤＪＹ発現構造体により生体外翻訳されたＣｐ蛋白質産物とともに培養されたことを示す。
【００２７】
図１１は、強化緑色蛍光蛋白質（ＥＧＦＰ）発現ベクターｐＥＧＦＰ２−Ｎ１単独で、又はｐＷＮＶｈ−ＤＪＹ又はｐＷＮＶｙ−ＤＪＹと組み合わせてトランスフェクトした後の、ＨｅＬａ細胞のアネキシンＶフローサイトメトリー分析の結果を示す。数値は、ＥＧＦＰについて陽性の細胞（トランスフェクト細胞）群内で、アネキシンＶについて陽性である細胞のパーセントを示す。
【００２８】
図１２Ａ、１２Ｂ及び１２Ｃは、免疫化したマウスにおける、ＷＮＶキャプシド蛋白質（Ｃｐ）特異的抗体応答を示す。図１２Ａ：１００μｇのｐＣＷＮＶ　Ｃｐ発現カセット又は対照ベクターを、第０、４及び８週目に筋肉内注射した。免疫後、様々な経過日数において血清試料を採取し、１：５０、１：１００、１：２００及び１：４００希釈でＷＮＶ　Ｃｐ特異的抗体について検定した。免疫化の５ヶ月後に、ＷＮＶ　Ｃｐ特異的抗体応答が検出された。エラーバーは、免疫化動物（ｎ＝３）から得た結果の標準偏差を表す。図１２Ｂ：ＷＮＶ　Ｃｐ特異的ＩｇＧ抗体応答のＩｇＧサブセット分析を行った。免疫化５ヶ月後に調べたＷＮＶ　Ｃｐ特異的ＩｇＧ１及びＩｇＧ２ａ応答、並びにＩｇＧ２ａ／ＩｇＧ１比を示す。図１２Ｃ：ＷＮＶ　Ｃｐ特異的血清抗体を、免疫沈降／ウエスタンブロット分析によって調べた。固定化膜片をそれぞれｐＣＷＮＶ　Ｃｐ（Ｗ）又はｐＣＤＮＡ３（Ｐ）由来の免疫血清と保温した。陽性の対照物として、膜片を抗６Ｘ　Ｈｉｓモノクローナル抗体（＋）と保温した。
【００２９】
図１３は、刺激を受けたＴ細胞によるＩＦＮ−γ（Ｔｈ１）、ＩＬ−２（Ｔｈ１）及びＩＬ−４（Ｔｈ２）の産生を示す。実施例８に記載するように、マウスを免疫化し脾臓細胞を得た。単離リンパ球をＷＮＶ　Ｃｐペプチドプールで３日間刺激した。上澄みを採取し、ＥＬＩＳＡキットを用いてＩＦＮ−γ、ＩＬ−２及びＩＬ−４プロファイルについて検定した。エラーバーは、各実験の標準偏差（Ｓ．Ｄ．）値を表す。
【００３０】
図１４は、刺激を受けたＴ細胞によるケモカインの産生を示す。実施例８に記載するように、マウスを免疫化し脾臓細胞を得た。単離リンパ球をＷＮＶ　Ｃｐ特異的ペプチドプールで３日間刺激した。上澄みを採取し、ＲＡＮＴＥＳ及びＭＩＰ−１β用ＥＬＩＳＡキットを用いてケモカインプロファイルについて検定した。エラーバーは、各実験の標準偏差（Ｓ．Ｄ．）値を表す。
【００３１】
図１５Ａ及び図１５Ｂは、陽性の抗原特異的ＣＴＬ応答の誘導を示す。図１５Ａ：ＷＮＶキャプシドペプチドプールで処理した標的細胞を用いて、免疫化マウス由来脾臓細胞を、ＣＴＬ応答について調べた。図１５Ｂ：ＣＴＬアッセイ用に刺激したエフェクター由来の上澄みを第５日目に採取し、ＩＦＮ−γ産生について調べた。エラーバーは、各実験の標準偏差（Ｓ．Ｄ．）値を表す。
【００３２】
図１６Ａ、１６Ｂ及び１６Ｃは、筋肉組織の分析を示す。ＤＮＡを注射した動物から冷凍筋肉片を得て、ヘマトキシリン−エオジン（ＨＥ）で染色した。ｐＣＤＮＡ３（対照）免疫化マウス（図１６Ａ）及びｐＣＷＮＶＣｐ免疫化マウス（図１６Ｂ）から得たスライド試料を示す。図のものは倍率４０×で示している。図１６Ｃ：ｐＣＷＮＶＣｐ免疫化マウスにおける筋肉浸潤性細胞の同定。実施例１１に記載するように細胞を採取し、ＣＤ４、ＣＤ８、Ｍａｃ３、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ８６及びＢ２２０に対する抗体を用いたＦＡＣＳによって同定した。．
【００３３】
図１７は、ＷＮＶ　Ｃｐ蛋白質配列と、他のフラビウイルス属由来のキャプシド蛋白質の部分配列とのアラインメントを示す。上段はクンジンウイルス［ＫＪＶ；ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＢＡＡ００１７６（ｇｉ：２２１９６７）。ここに参照して説明に代える］由来のＣｐ蛋白質の最初の１２３アミノ酸（配列番号９）とＷＮＶ　Ｃｐ蛋白質の全１２３アミノ酸配列とを比較している。中段は日本脳炎ウイルス［ＪＥＶ；ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＰ＿０５９４３４（ｇｉ：９６２６４６１）。ここに参照して説明に代える］のＣｐ蛋白質の最初の１１３アミノ酸（配列番号１０）とＷＮＶ Ｃｐ蛋白質の最初の１１４アミノ酸（配列番号１１）とを比較している。下段はデングウイルス［ＤＥＮ２；ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＡＧ３０７３０（ｇｉ：１１１１９７３２）。ここに参照して説明に代える］のＣｐ蛋白質の最初の部分のアミノ酸（配列番号１２）とＷＮＶ　Ｃｐ蛋白質のアミノ酸１０〜９８（配列番号１３）とを比較している。このアラインメントには、ＤＥＮ２配列におけるアミノ酸ＬＴＫＲ領域から、リジン（配列の上に書かれたＫ）を除外することが必要である。括弧内の数値は同一性／相同性スコアを表し、とりうる最大スコアは５９０である。比較とアラインメントはＭａｃＶｅｃｔｏｒによって行った。
【００３４】
図１８は、ＷＮＶ　Ｃｐ蛋白質配列と、他のウイルス由来の蛋白質の部分配列との、並びにアポトーシス促進性蛋白質の部分配列とのアラインメントを示す。ＷＮＶ　Ｃｐ蛋白質（アミノ酸１〜１２３）の全配列は、最上段にボールドで示した。ＷＮＶ　Ｃｐと他のウイルス蛋白質との比較を６種、ＷＮＶ　Ｃｐとアポトーシス促進性蛋白質との比較を５種、示している。ウイルス蛋白質との比較は、以下の通りである。１）ヒト免疫不全ウイルス−１（ＨＩＶ−１）８９．６Ｖｐｒ蛋白質［ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＡＡ８１０３９（ｇｉ：１０５５０３３）。ここに参照して説明に代える］の、内側部分のアミノ酸（配列番号２７）と、ＷＮＶ　Ｃｐ蛋白質のアミノ酸６８〜１１０（配列番号２８）；２）単純性疱疹ウイルス主要キャプシド蛋白質［ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＡＣ５７１０６（ｇｉ：１７１８２７７）。ここに参照して説明に代える］の内側部分のアミノ酸（配列番号２９）と、ＷＮＶ　Ｃｐ蛋白質のアミノ酸８〜１１７（配列番号３０）；３）エボラウイルス核蛋白質［ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＡＧ４０１６４（ｇｉ：１１７６１７４６）。ここに参照して説明に代える］の内側部分のアミノ酸（配列番号３１）と、ＷＮＶ　Ｃｐ蛋白質のアミノ酸１０〜１１７（配列番号３２）；４）エボラウイルス糖蛋白質［ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＡＡ９６７４４（ｇｉ：１１４１７７９）。ここに参照して説明に代える］の内側部分のアミノ酸（配列番号３３）と、ＷＮＶ　Ｃｐ蛋白質のアミノ酸４〜２３（配列番号３４）；５）エボラウイルス糖蛋白質の内側部分の別のアミノ酸（配列番号３５）と、ＷＮＶ　Ｃｐ蛋白質のアミノ酸５０〜７３（配列番号３６）；並びに６）風疹ウイルスキャプシド蛋白質［ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＧＮＷＶＲ４（ｇｉ：７４５１９）。ここに参照して説明に代える］の内側部分のアミノ酸（配列番号３７）と、ＷＮＶ　Ｃｐ蛋白質のアミノ酸６４〜１１４（配列番号３８）。アポトーシス促進性蛋白質との比較は、以下の通りである。１）ヒトＢＡＫ蛋白質［ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｑ１６６１１（ｇｉ：２４９３２７４）。ここに参照して説明に代える］の内側部分のアミノ酸（配列番号３９）とＷＮＶ　Ｃｐ蛋白質のアミノ酸１７〜６３（配列番号４０）；２）ヒトＢｃｌ−２関連Ｘ蛋白質［ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＸＰ＿００９０９３（ｇｉ：１５３０４３８６）。ここに参照して説明に代える］の内側部分のアミノ酸（配列番号４１）と、ＷＮＶ　Ｃｐ蛋白質のアミノ酸１０９〜１２３（配列番号４２）；３）ヒトＢＩＫ蛋白質［ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＸＰ＿０１５３５３（ｇｉ：１３６５５１９９）。ここに参照して説明に代える］の内側部分のアミノ酸（配列番号４３）と、ＷＮＶ　Ｃｐ蛋白質アミノ酸７５〜１１８（配列番号４４）；４）ヒトＢＩＤ蛋白質［ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＸＰ＿００９８２５（ｇｉ：１３６４７２５１）。ここに参照して説明に代える］の内側部分のアミノ酸（配列番号４５）と、ＷＮＶ　Ｃｐ蛋白質のアミノ酸８４〜９５（配列番号４６）；並びに５）ヒトＢａｄ蛋白質［ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＣＡＣ２２４２９（ｇｉ：１２３０９９６６）。ここに参照して説明に代える］の内側部分のアミノ酸（配列番号４７）とＷＮＶ　Ｃｐ蛋白質のアミノ酸１５〜２３（配列番号４８）。括弧内の数値は同一性／相同性スコアを表し、取りうる最大スコアは５９０である。比較とアラインメントはＭａｃＶｅｃｔｏｒによって行った。
【００３５】
図１９は、ＨＩＶ−１　８９．６Ｖｐｒ蛋白質配列と、他のウイルス蛋白質の部分配列との、並びにアポトーシス促進性蛋白質の部分配列とのアラインメントを示す。ＨＩＶ−１　８９．６Ｖｐｒ蛋白質（アミノ酸１〜９６）の全配列は、最上段にボールドで示した。ＨＩＶ−１　８９．６Ｖｐｒ蛋白質と他のウイルス蛋白質との比較を７種、ＨＩＶ−１　８９．６Ｖｐｒ蛋白質とアポトーシス促進性蛋白質との比較を６種、示している。ウイルス蛋白質との比較は、以下の通りである。１）シンドビスウイルス［ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＰ＿０６２８８９（ｇｉ：９７９０３１８）、ここに参照して説明に代える］のｐ２３０非構造蛋白質の内側部分のアミノ酸（配列番号４９）と、ＨＩＶ−１　８９．６Ｖｐｒ蛋白質のアミノ酸２２〜５９（配列番号５０）；２）ＷＮＶ　Ｃｐ蛋白質のアミノ酸６８〜１１０（図１８についての上記説明参照）と、ＨＩＶ−１　８９．６Ｖｐｒ蛋白質のアミノ酸５４〜９５（配列番号５１）；３）キュウリモザイクウイルス［ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＣＡＢ７５９５３（ｇｉ：７１０５８５５）、ここに参照して説明に代える］の２Ａ蛋白質の内側部分のアミノ酸（配列番号５２）と、ＨＩＶ−１　８９．６Ｖｐｒ蛋白質のアミノ酸７７〜８９（配列番号５３）；４）キュウリモザイクウイルスの２Ａ蛋白質の内側部分の別のアミノ酸（配列番号５４）と、ＨＩＶ−１　８９．６Ｖｐｒ蛋白質のアミノ酸４９〜６７（配列番号５５）；５）風疹ウイルスキャプシド蛋白質の内側部分のアミノ酸（配列番号５６）と、ＨＩＶ−１　８９．６Ｖｐｒ蛋白質のアミノ酸３８〜４７（配列番号５７）；６）ニパウイルス融合蛋白質［ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＰ＿１１２０２６（ｇｉ：１３５５９８１３）、ここに参照して説明に代える］の内側部分のアミノ酸（配列番号５８）と、ＨＩＶ−１　８９．６Ｖｐｒ蛋白質のアミノ酸６０〜７２（配列番号５９）；並びに７）レオウイルスコア非主要型Ｍｕ２蛋白質［ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＡＫ５４４６７（ｇｉ：１４１４９１５０）、ここに参照して説明に代える］の内側部分のアミノ酸（配列番号６０）と、ＨＩＶ−１　８９．６Ｖｐｒ蛋白質のアミノ酸６０〜７２（配列番号６１）。アポトーシス促進性蛋白質との比較は、以下の通りである。１）マウスＢＩＭ蛋白質［ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＰ＿０３３８８４（ｇｉ：６７５３１９２）、ここに参照して説明に代える］の内側部分のアミノ酸（配列番号６２）と、ＨＩＶ−１　８９．６Ｖｐｒ蛋白質のアミノ酸７〜７４（配列番号６３）；２）ラットＢＯＤ蛋白質［ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＡＣ２３５９３（ｇｉ：３２２８５６６）、ここに参照して説明に代える］の内側部分のアミノ酸（配列番号６４）と、ＨＩＶ−１　８９．６Ｖｐｒ蛋白質のアミノ酸２３〜７４（配列番号６５）；３）マウスＭｔｄ蛋白質［ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＡＣ５３５８２（ｇｉ：２６８９６６Ｏ）、ここに参照して説明に代える］の内側部分のアミノ酸（配列番号６６）と、ＨＩＶ−１　８９．６Ｖｐｒ蛋白質のアミノ酸１６〜６７（配列番号６７）；４）ヒトＢｃｌ−２関連Ｘ蛋白質の内側部分のアミノ酸（配列番号６８）と、ＨＩＶ−１　８９．６Ｖｐｒ蛋白質のアミノ酸１８〜７５（配列番号６９）；５）ヒトＢｃｌ−２関連Ｘ蛋白質の内側部分の別のアミノ酸（配列番号７０）と、ＨＩＶ−１　８９．６Ｖｐｒ蛋白質のアミノ酸１８〜４２（配列番号７１）；並びに６）ヒトＢａｄ蛋白質の内側部分のアミノ酸（配列番号７２）と、ＨＩＶ−１　８９．６Ｖｐｒ蛋白質のアミノ酸３３〜４４（配列番号７３）。括弧内の数値は同一性／相同性スコアを表し、取りうる最大スコアは５９０である。比較とアラインメントはＭａｃＶｅｃｔｏｒによって行った。
【００３６】
好ましい態様の詳細な説明
本発明は、腫瘍由来細胞においてＷＮＶキャプシド（Ｃｐ）蛋白質がアポトーシス誘発活性を有するという発見に基づくものである。培養細胞においてＷＮＶキャプシド蛋白質が発現すると、アポトーシス経路が誘導され、最終的には高増殖性細胞の死が誘導されることが発見された。ＷＮＶ　Ｃｐ蛋白質のカルボキシル末端領域に由来する２２アミノ酸残基のペプチドが、アポトーシス誘発活性を有することも認められた。ＷＮＶ　Ｃｐ蛋白質にアポトーシス誘発活性があることから、Ｃｐ蛋白質とその機能性断片は、急速成長細胞（癌細胞等）を死滅させる方法に有用であり、アポトーシス誘発活性を阻害する化合物を同定するスクリーニングシステムに有用である。このシステムは、ＷＮＶ感染の治療に有望視されている。
【００３７】
単センス鎖ＲＮＡゲノムウイルスからなるフラビウイルス科のウイルスは、３属に分類される。ウシ下痢ウイルス（ＢＶＤＶ）等のペスチウイルス属、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）等の「Ｃ型肝炎様ウイルス」、及びフラビウイルス属である。フラビウイルス属には未分類のウイルスも含まれるが、血清学的分類上少なくとも１０種の亜属を含む。ＷＮＶは、蚊を媒介とする日本脳炎ウイルス群の一つである。この群には他にＷＮＶと密接な同族である、日本脳炎ウイルス（ＪＥＶ）やセントルイス脳炎ウイルス（ＳＬＥＶ）がある。他のフラビウイルス属としては、黄熱ウイルス（ＹＦＶ）やデング熱ウイルス（ＤＥＮＶ）が挙げられるが、これらは別の亜属に分類される。ヌクレオチド配列分析とアミノ酸配列分析によって、血清グループ内または血清グループ間で、配列の保存があることが明らかになった。ＷＮＶ　Ｃｐ蛋白質は、フラビウイルス科のウイルスや他のウイルス科のウイルスを含む（ただしこれらに限定されるものではない）、他のウイルスのキャプシド及び他の蛋白質と、相同性を有する。ＷＮＶ　Ｃｐ蛋白質はまた、哺乳動物由来のアポトーシス促進性蛋白質を含む非ウイルス蛋白質等の他の蛋白質とも、相同性を有する。
【００３８】
本発明の幾つかの態様において、キャプシド蛋白質はペスチウイルス属に由来するものである。本発明の幾つかの態様において、キャプシド蛋白質の由来するペスチウイルス属は、ＢＶＤＶである。本発明の幾つかの態様において、キャプシド蛋白質はフラビウイルス属に由来するものである。本発明の幾つかの態様において、キャプシド蛋白質の由来するフラビウイルス属は、ＪＥＶである。本発明の幾つかの態様において、キャプシド蛋白質の由来するフラビウイルス属は、ＳＬＥＶである。本発明の幾つかの態様において、キャプシド蛋白質の由来するフラビウイルス属は、ＹＦＶである。本発明の幾つかの態様において、キャプシド蛋白質の由来するフラビウイルス属は、ＤＥＮＶである。本発明の幾つかの態様において、キャプシド蛋白質の由来するフラビウイルス属は、ＷＮＶである。
【００３９】
本発明は特に、フラビウイルス属又はペスチウイルス属等のウイルス由来のキャプシド蛋白質、他の蛋白質又はそれらの機能性断片を用いて、細胞死を誘発する方法を提供する。幾つかの態様において、キャプシド蛋白質又はその機能性断片はＷＮＶ由来のものである。本発明はまた、フラビウイルス属又はペスチウイルス属等のウイルス由来のキャプシド蛋白質、他の蛋白質又はそれらの機能性断片の有する、細胞を死滅させる活性を阻害する化合物をスクリーンする方法を提供する。本発明の幾つかの態様において本発明は、ＷＮＶのキャプシド蛋白質又はその機能性断片の有する、細胞を死滅させる活性を阻害する化合物をスクリーンする方法を提供する。本発明は更に、フラビウイルス属又はペスチウイルス属等のウイルス由来のキャプシド蛋白質、他の蛋白質又はそれらの機能性断片、或いはフラビウイルス属又はペスチウイルス属等のウイルス由来のキャプシド蛋白質、他の蛋白質又はそれらの機能性断片をコードする核酸を包含する薬剤組成物；及び高増殖性細胞によって特徴付けられる疾病を有する個体を、これらの薬剤組成物で治療する方法を提供する。本発明は更に、ＷＮＶ由来或いはフラビウイルス属又はペスチウイルス属を含む他のウイルス由来の、キャプシド蛋白質、他の蛋白質又はそれらの断片、或いはキャプシド蛋白質、他の蛋白質又はそれらの機能性断片をコードする核酸と、薬剤として許容される担体とを包含するワクチン組成物を提供する。本発明はまた、ＷＮＶ或いはフラビウイルス属又はペスチウイルス属を含む他のウイルスに接触した個体の、診断方法及び同定キットを提供する。
【００４０】
本発明の実施においては、特に述べない限りは、ウイルス学、免疫学、微生物学、分子生物学及び組換えＤＮＡ技術で従来用いられている方法を、当分野で公知の技術の範囲内で用いる。これらの技術については、詳細に渡って文献に説明されている［例えばＳａｍｂｒｏｏｋ他編、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（第２版）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク州コールドスプリングハーバー（１９８９）；Ａｕｓｕｂｅｌ他編、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、ニューヨーク州ニューヨーク（２０００）；Ｇｌｏｖｅｒ編、ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ第Ｉ〜ＩＩ巻；Ｃｏｌｏｗｉｃｋ及びＫａｐｌａｎ編、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；Ｗｅｉｒ及びＢｌａｃｋｗｅｌｌ編、Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ第Ｉ〜ＩＶ巻、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｓ．（１９８６）；Ｆｉｅｌｄｓ、Ｋｎｉｐｅ及びＨｏｗｌｅｙ編、Ｆｉｅｌｄｓ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（第３版）第Ｉ〜ＩＩ巻、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ Ｐｕｂｓ．（１９９６）；Ｃｏｌｉｇａｎ他編、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、ニューヨーク州ニューヨーク（２０００）参照。それぞれここに参照して説明に代える］。
【００４１】
本明細書に渡って様々な定義がなされている。殆どの言葉については、当業者によって使われている言葉と同じ意味である。下記または本明細書の各所で特に定義した言葉は、概して本発明の文脈内で与えられる意味を有するものであり、通常は当業者に理解されるものである。
【００４２】
ここで細胞死又はアポトーシスについていう「誘発する」及び「誘発」の語は、細胞死の原因となるアポトーシス経路の部分を構成する細胞現象を開始する活性といった、細胞死を導く現象を引き起こす活性のことを言う。
【００４３】
ここでいう「アポトーシス」の語は、壊死とは区別される真核細胞死の形態を意味し、細胞骨格崩壊、細胞質収縮及び濃縮、細胞膜外面におけるホスファチジルセリンの発現、並びに気泡といった現象であり、結果として細胞膜結合小胞体またはアポトーシス小体を形成することをいう。アポトーシス細胞死の概説については、例えばＵｔｚ及びＡｎｄｅｒｓｏｎ（２０００）Ｌｉｆｅ ａｎｄ ｄｅａｔｈ ｄｅｃｉｓｉｏｎｓ：ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ａｐｏｔｏｓｉｓ ｂｙ ｐｒｏｔｅｏｌｙｓｉｓ ｏｆ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ、Ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ Ｄｉｆｆｅｒ．７：５８９−６０２（ここに参照して説明に代える）を参照することができる。
【００４４】
本明細書及び請求項において用いられている単数の表現は、明示しない限りは複数を含むものとする。従って例えば「細胞」の表現は、２以上の細胞の混合を含むものとする。
【００４５】
ここでキャプシド蛋白質又はその機能性断片についていう「細胞死を誘発する有効量」及び「細胞死を誘発する有効レベル」の表現は、細胞に接触するキャプシド蛋白質又はその機能性断片の量、或いは細胞内で発現されるキャプシド蛋白質又はその機能性断片のレベルが、細胞を死滅させる現象を引き起こすのに有効であることを意味する。
【００４６】
ここでいう「蛋白質」の語はアミノ酸残基の重合体を意味し、長さが最小のものに限定されるものではない。ポリペプチド、ペプチド、オリゴペプチド、二量体、マルチマーなどが定義に含まれる。全長蛋白質とその断片との両方が定義に含まれる。この語は更に蛋白質発現後の改変を含み、例えばグリコシル化、アセチル化、リン酸化が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００４７】
ここでキャプシド蛋白質についていう「その機能性断片」の表現は、全長蛋白質より短い断片にして、キャプシド蛋白質の機能を保持し、細胞死又はアポトーシスを誘発することのできる断片のことを言う。
【００４８】
ここでキャプシド蛋白質についていう「その免疫原性断片」の表現は、全長蛋白質より短い断片にして、それに対して免疫応答を誘発できる断片のことを言う。
【００４９】
ここでいう「核酸」の語は、ＤＮＡ及びＲＮＡ、並びにそれらの改変体、例えば糖、塩基又はバックボーンの改変体を含む。
【００５０】
ここでキャプシド蛋白質又はその機能性断片をコードする核酸についていう「フラビウイルス属又はペスチウイルス属の全ゲノムから遊離した」の表現は、核酸が組換えの形状又は構造体であるか、又はさもなくばフラビウイルス属又はペスチウイルス属ゲノム内で天然に存在する状態から単離された形状であることを意味する。
【００５１】
ここでキャプシド蛋白質又はその機能性断片をコードする核酸についていう「ＷＮＶの全ゲノムをから遊離した」の表現は、核酸が組換えの形状又は構造体であるか、又はさもなくばＷＮＶゲノム内で天然に存在する状態から単離された形状であることを意味する。
【００５２】
ここでアポトーシスについていう「検出可能なレベル」の表現は、誘導されたアポトーシスのレベル又は量が、当業者に知られる方法によって検出又は測定可能な閾値にあることをいう。「アポトーシスマーカー」の存在を同定するか、又はその増加を同定するかによって、用いる検出方法は異なる。
【００５３】
ここでいう「アポトーシスマーカー」の表現は、アポトーシスが引き起こされて細胞のアポトーシス死が進行していることを示す指標となる、細胞要素又は形態的変化のことをいう。「アポトーシスマーカー」の例としては、外面化細胞膜ホスファチジルセリン（ＰＳ）、遊離３’ヒドロキシＤＮＡ末端及び細胞質ヌクレオソームが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００５４】
ここでＷＮＶ或いはフラビウイルス属又はペスチウイルス属を含む他のウイルスのキャプシド又は他の蛋白質の有するアポトーシス誘発活性に対する阻害剤についていう「化合物」の語は、同定可能な全ての化学薬品又は分子を含み、例として小分子、ペプチド、ポリペプチド、蛋白質、糖、ヌクレオチド又は核酸などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。そのような化合物は天然のものであっても合成されたものであってもよい。
【００５５】
ここでＷＮＶ或いはフラビウイルス属又はペスチウイルス属を含む他のウイルスのキャプシド又は他の蛋白質の有するアポトーシス誘発活性についていう「阻害」の語は、この活性に対する全ての干渉を含む。例えば「阻害」の語は、アポトーシス誘発活性の除去と低減との両方を含む。キャプシド蛋白質の有するアポトーシス誘発活性に対する阻害は様々な方法で観察することができ、例えばＴＵＮＥＬ（ＴｄＴ媒介ｄＵＴＰ−Ｘニック末端標識化）アッセイを用い、ＰＳをアネキシンＶで観察する方法が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００５６】
ここでいう「注射用薬剤組成物」の表現は、無菌、無発熱源で、かつどのような微粒子も含まない、患者に用いるための薬剤として許容される組成物のことをいう［Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ第１８版、Ｇｅｎｎａｒｏ編、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．、ペンシルバニア州イーストン（１９９０）及びＵ．Ｓ．Ｐ．、ｔｈｅ ｓｔａｎｄａｒｄｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕ． Ｓ． Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａ参照。ここに参照して説明に代える］。
【００５７】
ここでいう「薬剤として許容される担体」の表現は、組成物を受容する個体に対して有害な影響をそれ自身与えることのない、全ての担体のことをいう。例えば「薬剤として許容される担体」は、レシピエントに有害な抗体の産生を誘発するものであってはならない。好適な「薬剤として許容される担体」は当業者に公知のものであり、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（上述）に記載されている。
【００５８】
ここでいう「高増殖性細胞」の語は、不適当な又は正常でない速度又は場所で成長、分裂又は増殖している細胞のことを意味し、Ｇ０又は静止状態にあるべき時に細胞周期に入っている細胞を含む。例えば腫瘍細胞が「高増殖性細胞」の定義に含まれる。「高増殖性細胞」に特徴付けられる又は関する疾病又は病状としては、癌、自己免疫疾患、非悪性成長及び乾癬などが挙げられる。
【００５９】
ここでいう「治療」の語は、疾病又は病状の改善及び／又は除去を含む。「治療」の語は、高増殖性細胞に特徴付けられる又は関連した疾病又は病状を患っている個体について、またＷＮＶ或いはフラビウイルス属又はペスチウイルス属を含む他のウイルスに接触した及び／又は感染した個体についても、用いられる。
【００６０】
ここで疾病又は病状を有する個体の治療についていう「有効量」の表現は、治療を遂行し、かつ疾病又は病状を改善及び／又は除去するのに充分な量を意味する。
【００６１】
ここでワクチン組成物ついていう「免疫学的有効量」の表現は、治療のための又は予防のための免疫応答を誘発するのに充分な量を意味する。
【００６２】
ここでウイルスに感染した個体の処理についていう「予防のための免疫応答」の表現は、ウイルスによる攻撃から予防し防御するための免疫応答を意味する。
【００６３】
ここでウイルスに感染した個体の処理についていう「治療のための免疫応答」の表現は、ウイルス感染を改善する及び／又は除去する免疫応答を意味する。
【００６４】
ここで個体に投与されるワクチンの量についていう「治療的有効量」の語は、治療のための免疫応答を個体に誘発するのに充分な量を意味する。
【００６５】
ここで個体に投与されるワクチンの量についていう「予防的有効量」の語は、予防のための免疫応答を個体に誘発するのに充分な量を意味する。
【００６６】
ここでいう「個体」とは、本発明の薬剤組成物又はワクチン組成物で治療することのできるヒト又は非ヒト動物を意味する。
【００６７】
ここでいう「投与」には腫瘍内注射、経皮、非経口、皮下、筋肉内、経口及び局所的投与が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００６８】
ここで薬剤組成物の投与についていう「腫瘍内注射」の語は、薬剤組成物を注射によって腫瘍内に直接導入することをいう。
【００６９】
本発明の幾つかの形態は、ＷＮＶ由来の或いはフラビウイルス属又はペスチウイルス属を含む他のウイルス由来のキャプシド蛋白質又はその機能性断片の有する、細胞増殖抑制能に関する。本発明の幾つかの形態はまた、フラビウイルス属又はペスチウイルス属を含む他のウイルス由来の他のウイルス性蛋白質又はその機能性断片の有する、細胞増殖抑制能に関する。キャプシド又は他の蛋白質は、細胞にアポトーシスを誘発する。幾つかの態様において、ＷＮＶ由来の或いはフラビウイルス属又はペスチウイルス属を含む他のウイルス由来のキャプシド蛋白質又はその機能性断片、及び／又はそれらをコードする核酸分子が、望ましくない細胞、特に癌などの高増殖性細胞に特徴付けられる又は関連する疾病を患っている個体を治療する薬剤組成物に用いられる。ＷＮＶ或いはフラビウイルス属又はペスチウイルス属を含む他のウイルスのキャプシド又は他の蛋白質は、ウイルス活動に必須であるウイルス機能を阻害するための標的を提供する。従って、本発明の一つの形態においては、ＷＮＶ由来の或いはフラビウイルス属又はペスチウイルス属を含む他のウイルス由来のキャプシド蛋白質、他の蛋白質又はそれらの機能性断片の有するアポトーシス誘発活性を阻害する化合物を同定することによって、抗ウイルスの及び／又は抗ＷＮＶの及び／又は抗フラビウイルス属又は抗ペスチウイルス属の化合物を同定することができる。
【００７０】
本発明はさらに、細胞にアポトーシスを誘導することを目的とした、ＷＮＶ由来の或いはフラビウイルス属又はペスチウイルス属を含む他のウイルス由来のキャプシド蛋白質又は他の蛋白質の機能性断片、及び／又はＷＮＶ由来の或いはフラビウイルス属又はペスチウイルス属を含む他のウイルス由来のキャプシド蛋白質又は他の蛋白質の機能性断片をコードする核酸の使用に関し、またＷＮＶ由来の或いはフラビウイルス属又はペスチウイルス属を含む他のウイルス由来のキャプシド蛋白質又は他の蛋白質の機能性断片、及び／又はＷＮＶ由来の或いはフラビウイルス属又はペスチウイルス属を含む他のウイルス由来のキャプシド蛋白質又は他の蛋白質の機能性断片をコードする核酸を包含する、薬剤組成物に関する。ここでいう「ＷＮＶ由来の或いは同族のフラビウイルス属又はペスチウイルス属を含む他のウイルス由来のキャプシド蛋白質」の「機能性断片」とは、細胞のアポトーシスを誘発する能力を保持している、ＷＮＶ又は同族のフラビウイルス属又はペスチウイルス属のキャプシド蛋白質の断片のことをいう。ここでいう「ＷＮＶ由来の或いはフラビウイルス属又はペスチウイルス属を含む他のウイルス由来のキャプシド蛋白質又は他の蛋白質」の「機能性断片」とは、細胞のアポトーシスを誘発する能力を保持している、ＷＮＶ或いはフラビウイルス属又はペスチウイルス属を含む他のウイルスの断片のことをいう。ＷＮＶ由来の或いはフラビウイルス属又はペスチウイルス属を含む他のウイルス由来のキャプシド蛋白質又は他の蛋白質の機能性断片は、ＷＮＶ或いはフラビウイルス属又はペスチウイルス属を含む他のウイルスのキャプシド又は他の蛋白質に由来する、長さが少なくとも約１０個のアミノ酸であり、ＷＮＶの或いはフラビウイルス属又はペスチウイルス属を含む他のウイルスのキャプシド又は他の蛋白質に由来しないアミノ酸配列を含んでいてもよい。
【００７１】
ＷＮＶ　Ｃｐ蛋白質のカルボキシル末端領域に由来する２２アミノ酸残基のペプチドが、本発明のある態様においてアポトーシス誘発活性を有することも観察されている。図１０に示すこのペプチド（「ＷＮＶＣ−Ｐ３」、或いは「ペプチド３」と称する）は、ＷＮＶ　Ｃｐ蛋白質のアミノ酸残基９０〜１１０にあたる。特に、本発明の幾つかの態様によると、ＷＮＶ　Ｃｐ蛋白質の機能性断片は、ペプチドＷＮＶＣ−Ｐ３又はその断片を含む。ペプチドＷＮＶＣ−Ｐ３の断片は、少なくとも３個のアミノ酸を包含する。ペプチドＷＮＶＣ−Ｐ３の断片は、長さが３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０又は２１アミノ酸残基であってもよい。ＷＮＶ　Ｃｐ蛋白質のペプチドＷＮＶＣ−Ｐ３又はその断片；ペプチドＷＮＶＣ−Ｐ３又はその断片を含むＣｐ蛋白質の断片；Ｃｐ蛋白質又；又はＣｐ蛋白質配列と非Ｃｐ蛋白質配列とを包含する融合蛋白質のいずれにおいても、野生型Ｃｐ蛋白質の有するアポトーシス機能を有するかどうかについて調べることができる。
【００７２】
ＷＮＶ　Ｃｐ由来のキャプシド蛋白質は、フラビウイルス科のウイルスや他の多くのウイルス科のウイルスを含む（ただしこれらに限定されるものではない）、他のウイルスのキャプシド及び他の蛋白質とも、相同性を有する。ＷＮＶ　Ｃｐ蛋白質はまた、哺乳動物由来のアポトーシス促進性蛋白質等の非ウイルス蛋白質とも、相同性を有する。相同性／同一性領域は、ＷＮＶ　Ｃｐと（アポトーシス活性を有する）ＨＩＶ−１　Ｖｐｒ蛋白質、クンジンウイルスＣｐ蛋白質、日本脳炎ウイルスＣｐ蛋白質、デング熱ウイルスＣｐ蛋白質、単純性疱疹ウイルス主要キャプシド蛋白質、エボラウイルス核蛋白質、エボラウイルス糖蛋白質、風疹ウイルスキャプシド蛋白質との間や、アポトーシス促進性非ウイルス蛋白質（ヒトＢＡＫ蛋白質、ヒトＢｃｌ−２関連Ｘ蛋白質、ヒトＢＩＫ蛋白質、ヒトＢＩＤ蛋白質、ヒトＢａｄ蛋白質など）との間において同定されている。その上更に、相同性／同一性領域は、ＨＩＶ−１　Ｖｐｒ蛋白質と、シンドビスウイルスのｐ２３０非構造蛋白質、キュウリモザイクウイルスの２Ａ蛋白質、風疹ウイルスキャプシド蛋白質、ニパウイルス融合蛋白質、レオウイルス コア非主要型Ｍｕ２蛋白質との間や、アポトーシス促進性蛋白質（マウスＢＩＭ蛋白質、ラットＢＯＤ蛋白質、マウスＭｔｄ蛋白質、ヒトＢｃｌ−２関連Ｘ蛋白質、ヒトＢａｄ蛋白質など）との間において同定されている。
【００７３】
当業者は不必要な実験を行うことなく、配列と細胞におけるアポトーシス誘発能とを調べることによって、蛋白質又はペプチドが、ＷＮＶ由来の或いはフラビウイルス属又はペスチウイルス属を含む他のウイルス由来のキャプシド蛋白質の機能性断片であるかどうかを容易に調べることができる。ＷＮＶ或いはフラビウイルス属又はペスチウイルス属を含む他のウイルスのキャプシド蛋白質の末端を切除したものを、容易に入手可能な出発原料から一般的な方法で調製して試験することができる。ここでいう「機能性断片」の語は、ＷＮＶ或いはフラビウイルス属又はペスチウイルス属を含む他のウイルスのキャプシド蛋白質アミノ酸配列と同一である又は少なくとも一部分に実質的に相同性を有するアミノ酸配列を包含し、アポトーシスを誘発することのできる、ペプチド、ポリペプチド、非ペプチド結合で連結したアミノ酸配列、あるいは蛋白質を意味する。「実質的に相同性を有する」とは、保存的置換を有するアミノ酸配列のことをいう。当業者は、ＷＮＶ或いはフラビウイルス属又はペスチウイルス属を含む他のウイルスのキャプシド蛋白質の機能性断片を、本明細書の開示並びに公知の技術に従って作成することができる。このように同定された機能性断片は、不必要な実験を行うことなく、ＷＮＶ或いはフラビウイルス属又はペスチウイルス属を含む他のウイルスの全長キャプシド蛋白質の代わりに用いることができ、配合することができる。
【００７４】
本発明はまた、個体において予防又は治療のための免疫応答を誘発することを目的とした、ＷＮＶ或いはフラビウイルス属又はペスチウイルス属を含む他のウイルスのキャプシド蛋白質の免疫原性断片、及び／又はＷＮＶ或いはフラビウイルス属又はペスチウイルス属を含む他のウイルスのキャプシド蛋白質の免疫原性断片をコードする核酸を包含するワクチンに関する。ここでいう「ＷＮＶ由来の或いはフラビウイルス属又はペスチウイルス属を含む他のウイルス由来のキャプシド蛋白質」の「免疫原性断片」とは、ＷＮＶ或いはフラビウイルス属又はペスチウイルス属を含む他のウイルスのキャプシド蛋白質の断片で、免疫応答を誘発することのできる断片を意味する。ＷＮＶ或いはフラビウイルス属又はペスチウイルス属を含む他のウイルスのキャプシド蛋白質の免疫原性断片は、長さが少なくとも約１０アミノ酸で、ＷＮＶ或いはフラビウイルス属又はペスチウイルス属を含む他のウイルスのキャプシド蛋白質に由来するものであり、ＷＮＶ或いはフラビウイルス属又はペスチウイルス属を含む他のウイルスのキャプシド蛋白質に由来しないアミノ酸配列を包含していてもよい。当業者は、ＷＮＶ或いはフラビウイルス属又はペスチウイルス属を含む他のウイルスのキャプシド蛋白質の断片による免疫化に応答して起こる抗体産生をスクリーンする標準的な免疫アッセイを用いることによって、ある蛋白質又はペプチドが、ＷＮＶ或いはフラビウイルス属又はペスチウイルス属を含む他のウイルスのキャプシド蛋白質の免疫原性断片であるかどうかを容易に調べることができる。このような方法の例としては、１）酵素免疫検定法（ＥＬＩＳＡ）、２）リンパ系器官由来の細胞を用いた増殖アッセイ、並びに３）所定の抗原に対する抗体を産生する細胞数の評価などが挙げられる。これら標準的アッセイの詳細なプロトコルについては、Ｗｅｉｒ ＆ Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ編、Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（上述）やＣｏｌｉｇａｎ他編、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（上述）などの免疫学マニュアルが参照できる。当業者は、ＷＮＶ或いはフラビウイルス属又はペスチウイルス属を含む他のウイルスのキャプシド蛋白質の免疫原性断片を、本明細書の開示並びに公知の技術に従って作成し同定することができる。こうして同定された免疫原性断片は、不必要な実験を行うことなく、ＷＮＶ或いはフラビウイルス属又はペスチウイルス属を含む他のウイルスの全長キャプシド蛋白質の代わりに用いることができ、配合することができる。
【００７５】
本発明の治療上の形態は、癌又は乾癬などの高増殖性細胞に特徴付けられる或いは関連した疾病を患う個体の治療に有用な薬剤組成物における、ＷＮＶ或いはフラビウイルス属又はペスチウイルス属を含む他のウイルスのキャプシド蛋白質、ＷＮＶ或いはフラビウイルス属又はペスチウイルス属を含む他のウイルスのキャプシド蛋白質の機能性断片、ＷＮＶ或いはフラビウイルス属又はペスチウイルス属を含む他のウイルスのキャプシド蛋白質をコードする核酸分子、又はＷＮＶ或いはフラビウイルス属又はペスチウイルス属を含む他のウイルスのキャプシド蛋白質の機能性断片をコードする核酸分子の使用を含む。
【００７６】
本発明の一つの形態は、癌又は乾癬などの細胞の高増殖によって特徴付けられる疾病など（ただしこれらに限定されるものではない）の、望ましくない細胞によって特徴付けられる疾病に対処するための薬剤組成物において、ＷＮＶ或いはフラビウイルス属又はペスチウイルス属を含む他のウイルスのキャプシド蛋白質又はその機能性断片；又はＷＮＶ或いはフラビウイルス属又はペスチウイルス属を含む他のウイルスのキャプシド蛋白質又はその機能性断片をコードする核酸分子を使用することにある。本発明によると、ＷＮＶ或いはフラビウイルス属又はペスチウイルス属を含む他のウイルスのキャプシド蛋白質又はその機能性断片；又はＷＮＶ或いはフラビウイルス属又はペスチウイルス属を含む他のウイルスのキャプシド蛋白質又はその機能性断片をコードするＤＮＡ又はＲＮＡ配列を包含する核酸分子、のいずれかを包含する薬剤組成物が提供される。
【００７７】
本発明の別の形態は、ＷＮＶ或いはフラビウイルス属又はペスチウイルス属を含む他のウイルスのキャプシド蛋白質又はその機能性断片、及び／又はＷＮＶ或いはフラビウイルス属又はペスチウイルス属を含む他のウイルスのキャプシド蛋白質又はその機能性断片をコードする核酸分子と、薬剤として許容される担体又は希釈液とを包含する薬剤組成物に関する。ＷＮＶ或いはフラビウイルス属又はペスチウイルス属を含む他のウイルスのキャプシド蛋白質又はその機能性断片及び／又はＷＮＶ或いはフラビウイルス属又はペスチウイルス属を含む他のウイルスのキャプシド蛋白質又はその機能性断片をコードする核酸分子を包含する薬剤組成物は、高増殖性細胞に特徴付けられる病理又は病状を有する個体の治療に有用である。ここに記載するように、高増殖性細胞等の望ましくない細胞によって特徴付けられる疾病の治療に用いられる薬剤組成物は、ＷＮＶ或いはフラビウイルス属又はペスチウイルス属を含む他のウイルスのキャプシド蛋白質又はその機能性断片、及び／又はフラビウイルス属又はペスチウイルス属のキャプシド蛋白質又はその機能性断片をコードする核酸分子を包含しうる。というのは、ＷＮＶ或いはフラビウイルス属又はペスチウイルス属を含む他のウイルスのキャプシド蛋白質又はその機能性断片は明らかに、細胞にアポトーシス死を誘発する作用物質であるからである。本発明の薬剤組成物は、充実性腫瘍によって特徴付けられる癌に特に有用である。高増殖性細胞を刺激してアポトーシス死を引き起こす能力によって、細胞の高増殖を阻害する手段を提供し、よって腫瘍を縮小させる。細胞の不適当な高増殖によって特徴付けられる癌及び乾癬などの疾病において、アポトーシス細胞死の誘導を通じた高増殖の阻止に本薬剤組成物が有用であり、これによって疾病の治療を行う。
【００７８】
従って本発明の別の形態は、高増殖性細胞に関連した疾病を患う個体を治療する方法にして、前記細胞にアポトーシスを誘発するのに充分な量の、ＷＮＶ或いはフラビウイルス属又はペスチウイルス属を含む他のウイルスのキャプシド蛋白質又はその機能性断片、及び／又はＷＮＶ或いはフラビウイルス属又はペスチウイルス属を含む他のウイルスのキャプシド蛋白質又はその機能性断片をコードする核酸分子を、個体に投与する段階を包含する方法である。
【００７９】
本発明の別の形態は、自己免疫疾患等の望ましくない細胞に関連した疾病を患う個体を治療する方法にして、前記細胞にアポトーシスを誘発するのに充分な量の、ＷＮＶ或いはフラビウイルス属又はペスチウイルス属を含む他のウイルスのキャプシド蛋白質又はその機能性断片、及び／又はＷＮＶ或いはフラビウイルス属又はペスチウイルス属を含む他のウイルスのキャプシド蛋白質又はその機能性断片をコードする核酸分子を、個体に投与する段階を包含する方法である。
【００８０】
本発明の別の形態は、ＷＮＶ或いはフラビウイルス属又はペスチウイルス属を含む他のウイルスのキャプシド蛋白質又はその免疫原性断片及び／又はＷＮＶ或いはフラビウイルス属又はペスチウイルス属を含む他のウイルスのキャプシド蛋白質又はその免疫原性断片をコードする核酸分子と、薬剤として許容される担体又は希釈液とを包含するワクチン組成物に関する。ＷＮＶ由来の或いはフラビウイルス属又はペスチウイルス属を含む他のウイルス由来のキャプシド蛋白質又はその免疫原性断片を包含するワクチン組成物は、ＷＮＶ或いはフラビウイルス属又はペスチウイルス属を含む他のウイルスに対して個体を免疫化するのに有用である。免疫は予防的（感染を防ぐためのもの）であってもよいし、治療的（感染を治療するためのもの）であってもよい。免疫が予防的である場合には、個体はウイルスによる攻撃から守られる。免疫が治療的である場合には、個体のかかっているウイルス感染が治療される。
【００８１】
従って本発明の一つの形態は、ＷＮＶ或いはフラビウイルス属又はペスチウイルス属を含む他のウイルスによる感染を患う個体を治療する方法にして、ＷＮＶ由来或いはフラビウイルス属又はペスチウイルス属を含む他のウイルス由来のキャプシド蛋白質又はその免疫原性断片を、治療のための免疫応答を刺激するのに充分な量で個体に投与する段階を包含する方法である。
【００８２】
本発明の別の形態は、個体におけるＷＮＶ或いはフラビウイルス属又はペスチウイルス属を含む他のウイルスによる感染を予防する方法にして、ＷＮＶ由来の或いはフラビウイルス属又はペスチウイルス属を含む他のウイルス由来のキャプシド蛋白質又はその免疫原性断片を、予防のための免疫応答を刺激するのに充分な量で個体に投与する段階を包含する方法である。
【００８３】
ＷＮＶ由来の或いはフラビウイルス属又はペスチウイルス属を含む他のウイルス由来のキャプシド蛋白質又はその免疫原性断片が、ワクチン中の成分として個体に（蛋白質として直接に、あるいはワクチンで投与された核酸から体内で発現するものとして）投与される場合、キャプシド蛋白質又はその免疫原性断片が標的となり、これに対して個体中で免疫応答、感染の予防（予防的）又は感染の治療（治療的）が発達する。処理後にはウイルスによる攻撃から個体が保護されるという点で、免疫応答が治療及び予防の両方を目的としてもよいことが当業者には理解できよう。
【００８４】
キャプシド蛋白質
ＷＮＶキャプシド蛋白質又はその機能性断片は上記したように、容易に入手可能な出発原料を用いて一般的な方法で作成することができる。ＷＮＶキャプシド蛋白質をコードする核酸配列、並びに蛋白質のアミノ酸配列は公知のものである。下記のような多くのＷＮＶ単離体について全ゲノムが文献に記載されており、ＧｅｎＢａｎｋより入手可能である。単離体２７４１（登録番号ＡＦ２０６５１８）、ＮＹ９９−フラミンゴ３８２−９９株（登録番号ＡＦ１９６８３５）、ＨＮＹ１９９９株の全ポリプロテイン遺伝子（登録番号ＡＦ２０２５４１）、並びに登録番号Ｍ１２２９４として認識されている単離体が挙げられる（それぞれここに参照して説明に代える）。ＷＮＶゲノムの配列情報について様々な文献が出されており、その引用はＧｅｎＢａｎｋの配列情報にリンクしている。公的に入手可能な配列情報を含むこれらの文献それぞれは、ここに参照して説明に代える。
【００８５】
他のフラビウイルス属又はペスチウイルス属に由来するキャプシド蛋白質及び核酸の配列情報も、ＧｅｎＢａｎｋで入手することができる。例えばＧｅｎＢａｎｋにより提供される株及び単離体の全ゲノム配列の例としては、ＪＥＶ（登録番号Ｍ１８３７０、Ｄ９０１９４及びＤ９０１９５）、ＳＬＥＶ（登録番号Ｍ１６６１４）、ＹＦＶ（登録番号ＡＦ０９４６１２、Ｕ１７０６７、Ｕ１７０６６、Ｕ５４７９８、Ｕ２１０５５、Ｕ２１０５６及びＸ０３７００）、ＤＥＮＶ（登録番号Ｍ２３０２７、Ｕ８８５３５、Ｕ８８５３６及びＵ８８５３７）及びＢＶＤＶ（登録番号Ｍ３１１８２）（それぞれここに参照して説明に代える）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００８６】
目的の蛋白質をコードする好適なＤＮＡ配列を用意することによって、公知の組換え技術を用いた蛋白質産生が可能になる。コード配列は例えば、公的に入手可能な配列情報に基づいて作成したＰＣＲプライマーを用いて、感染細胞からクローニングすることで得ることができる。ＤＮＡ配列は、ＤＮＡ合成装置を用いて化学的に調製することもできる。コードＤＮＡを合成によって調製する場合には、ＤＮＡの発現される宿主に対して既知のコドンに偏向があるという点を利用することができる。更に、点突然変異、挿入又は欠失といった改変をコード配列に導入して、対照物を作成したりキャプシド蛋白質の他の改変体を作成することができる。
【００８７】
当業者は公知の方法を用いて、ＷＮＶキャプシド蛋白質或いはフラビウイルス属又はペスチウイルス属を含む他のウイルスのキャプシド蛋白質をコードするＤＮＡ分子を作成し、市販の発現ベクターに前記ＤＮＡ分子を挿入し、公知の発現系に用いることができる。例えば市販のプラスミドｐＳＥ４２０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州サンディエゴ）を用いて、大腸菌細胞内でキャプシド蛋白質を産生することができる。市販のプラスミドｐＹＥＳ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州サンディエゴ）を、Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ等の酵母菌内での産生に用いることができる。市販のＭａｘＢａｃ２．０キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州サンディエゴ）にｐＢｌｕｅＢａｃ４ベクターを用いて、Ｓｆ９細胞などの昆虫細胞内でキャプシド蛋白質を産生するためのバキュロウイルス発現系を構築することができる。市販のプラスミドｐｃＤＮＡ　Ｉ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州サンディエゴ）を用いて、チャイニーズハムスター卵巣細胞等の哺乳動物細胞内で、キャプシド蛋白質を産生することができる。
【００８８】
当業者は、これら市販の発現ベクター系又は他の系を利用して、容易に入手可能な出発原料を用いて一般的な方法によってＷＮＶ或いはフラビウイルス属又はペスチウイルス属を含む他のウイルスのキャプシド蛋白質を産生することができる。
【００８９】
当業者は、他の市販の発現ベクター及び系を用いることもできるし、あるいは容易に入手可能な出発材料を用いて公知の方法によってベクターを作成することもできる。プロモーターやポリＡシグナル、さらに好ましくはエンハンサーなどの必須制御配列を含む発現系は、容易に入手可能であり、様々な宿主に使用可能なものが当分野で知られている（例えばＡｕｓｕｂｅｌ他編、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、上述参照）。従って、目的の蛋白質を原核細胞系及び真核細胞系の両方で調製することができ、多様な処理形状の蛋白質を得ることができる。
【００９０】
原核細胞系として大腸菌が最も一般的に用いらているが、枯草菌やシュードモナス属などの他の系も有用である。原核細胞系について好適な制御配列には構造性プロモーターと誘発性プロモーターの両方があり、例としてｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ハイブリッドプロモーター（ｔａｃプロモーターなど）及びλファージＰ１プロモーターが挙げられるが、これらに限定されるものではない。一般に異種蛋白質は、これらの宿主内で融合蛋白質又は成熟型蛋白質のいずれかとして産生することができる。目的の配列が成熟型蛋白質として産生される場合には、産生される配列において、除去しにくいメチオニンが配列の先に来る可能性がある。従って、ここに請求するペプチド及び蛋白質は、バクテリア内で産生された場合にはＮ末端Ｍｅｔが配列の一番目に来るものを含むものとする。その上更に、操作可能なシグナルペプチドがペプチドのコード配列の最初に来る構造体を作成することができ、これによって蛋白質を分泌させることができる。原核細胞宿主内でこのように産生される場合、分泌時にシグナル配列は除去される。
【００９１】
現在、組換え異種蛋白質の産生用に、様々な真核細胞宿主を入手することができる。細菌の場合と同様に、目的の蛋白質を直接産生する発現系で真核細胞宿主を形質転換させてもよいが、より一般的にはシグナル配列を用いて、蛋白質を分泌させる。真核細胞系は、高等生物の蛋白質をコードするゲノム配列中に生じうるイントロンを加工処理する能力があるという点で、更に利点がある。真核細胞系は更に、例えば特定のアミノ酸残基のグリコシレーション、カルボキシル末端アミド化、酸化又は変性化、配座制御といった、様々な加工機構を提供する。
【００９２】
一般的な真核細胞系の例としては、酵母菌、真菌細胞、昆虫細胞、哺乳動物細胞、鳥類細胞及び高等植物細胞が挙げられるが、これらに限定されるものではない。これらの異なった宿主細胞それぞれについて、適合性があり操作可能な好適なプロモーターが入手可能である。例えばバキュロウイルス多面体プロモーターなどの末端配列及びエンハンサーの入手も可能である。上記したように、プロモーターは構造性であっても誘発性であってもよい。例えば哺乳動物系において、重金属イオンを添加することによって、マウスメタロチオネインプロモーターを誘発することができる。
【００９３】
望ましい宿主に好適な発現系の構造の詳細は、当業者に公知のものである。蛋白質の組換え産生においては、その蛋白質をコードするＤＮＡを任意の発現ベクター内に好適に連結し、得られるベクターで適合性のある宿主を形質転換し、次いで異種遺伝子が発現する条件下で培養・維持する。このように産生された本発明の蛋白質を、細胞溶解から又は直接培養基から、当業者に適当であると判断される方法で回収する。
【００９４】
当業者は、そのような発現系を用いて産生したＷＮＶ或いはフラビウイルス属又はペスチウイルス属を含む他のウイルスのキャプシド蛋白質を、公知の方法を用いて単離することができる。
【００９５】
ＷＮＶ或いはフラビウイルス属又はペスチウイルス属を含む他のウイルスのキャプシド蛋白質又はその機能性断片の産生においては、組換え技術による産生に加えて、アミノ酸自動合成装置を用いる方法もある。なお、本明細書に記載の蛋白質を合成により得る場合、蛋白質は遺伝子によってコードされていないアミノ酸によって置換されていてもよい。置き換えられる残基の例としては、式Ｈ２Ｎ（ＣＨ２）ｎＣＯＯＨ（ここでｎ＝２〜６）で表されるアミノ酸が挙げられる。これらは、サルコシン（Ｓａｒ）、ｔ−ブチルアラニン（ｔ−ＢｕＡｌａ）、ｔ−ブチルグリシン（ｔ−ＢｕＧｌｙ）、Ｎ−メチルイソロイシン（Ｎ−Ｍｅｌｌｅ）、及びノルロイシン（Ｎｌｅｕ）などの、中性で非極性のアミノ酸である。例えばフェニルグリシンを、芳香族中性アミノ酸であるＴｒｐ、Ｔｙｒ又はＰｈｅの代わりに用いる。シトルリン（Ｃｉｔ）及びメチオニンスルホキシド（ＭＳＯ）は極性だが中性であり、シクロヘキシルアラニン（Ｃｈａ）は中性かつ非極性であり、システイン酸（Ｃｙａ）は酸性であり、オルニチン（Ｏｒｎ）は塩基性である。これらのうち１個以上がヒドロキシプロリン（Ｈｙｐ）で置換されている場合には、プロリン残基の特徴を与える配座を得ることができる。
【００９６】
本開示の一部は、薬剤組成物に関し、本開示の別の部分は、治療用又は予防用ワクチンに関する。本発明の薬剤組成物は、細胞を死滅させるために個体に投与することを企図しており、本発明のワクチン組成物は、ウイルス感染に対する予防的又は治療的免疫応答を誘発する目的で、個体に投与されることを企図される。本発明の薬剤組成物は、アポトーシスを誘発し細胞を死滅させるのに有効な量で投与される。本発明のワクチン組成物は、免疫応答を誘発する目的を達するのに有効な量で投与される。
【００９７】
組成物が薬剤又はワクチンのいずれとして調製されるにせよ、本発明の薬剤組成物とワクチン組成物とについての数多くある組成、配合、投与量、投与方法の形態は、相関するものであり、同一であってもよいということは、当業者によって容易に理解されよう。例えば本発明の薬剤組成物とワクチンとの両方が、ＷＮＶ或いはフラビウイルス属又はペスチウイルス属を含む他のウイルスのキャプシド蛋白質又はその断片を包含していてもよい。薬剤組成物中のキャプシド蛋白質又はその断片がアポトーシス活性において機能を持つのに対して、ワクチン中のキャプシド蛋白質又はその断片は、免疫原性を持つ。相関した形態に関して開示された部分は、薬剤組成物とワクチンとの両方にあてはまるものとする。
【００９８】
当業者は、高増殖性細胞に特徴付けられる疾病を治療するのに用いられる、ＷＮＶ或いはフラビウイルス属又はペスチウイルス属を含む他のウイルスのキャプシド蛋白質又はその機能性断片と薬剤として許容される担体又は希釈液とを包含する薬剤組成物を、任意の投与方法に応じて選択された組成物を用いて配合することができる。好適な薬学的担体は、当分野の標準的な参考書であるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（上述）に記載がある。
【００９９】
全ての投与経路について、効果的かつ容易に運搬されることが共通の必須条件である。本発明の一つの態様において、薬剤組成物は注射によって投与される。好ましい態様において、組成物は腫瘍内注射によって投与される。他の投与方法の例としては、経皮（ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ）、経皮（ｔｒａｎｓｃｕｔａｎｅｏｕｓ）、皮下、腹腔内、粘膜又は一般的な持続性投与が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【０１００】
非経口投与については、ＷＮＶ或いはフラビウイルス属又はペスチウイルス属を含む他のウイルスのキャプシド蛋白質又はその機能性断片を、例えば薬剤として許容される非経口賦形剤と組み合わせた液体、懸濁液、乳濁液、又は凍結乾燥粉末として配合することができる。そのような賦形剤の例としては、水、食塩水、リンゲル液、デキストロース溶液及び５％ヒト血清アルブミンが挙げられる。リポソーム及び非水系賦形剤（固定油等）を用いることもできる。賦形剤又は凍結乾燥粉末は、等張性を保持する添加物（例えば塩化ナトリウム、マンニトル）及び化学的安定性を保持する添加物（例えば緩衝剤及び保存剤）を含んでいてもよい。配合は一般的な方法で滅菌される。例えば、０．９％塩化ナトリウム溶液に１．５重量％の活性成分を溶解することによって、注射投与に適した非経口組成物を調製する。
【０１０１】
個体によって必要条件は様々であるが、配合の有効量についての最適な範囲は、当業者が決定できるものである。ヒトにおける投与量は、動物を用いた研究のデータに基づいて容易に推定することができる［Ｋａｔｏｃｓ他、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ第１８版、第２７章：Ｇｅｎｎａｒｏ編、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．、ペンシルバニア州イーストン（１９９０）。ここに参照して説明に代える］。一般に、配合の有効量を提供するのに必要な投与量（これは当業者によって調節することができる）は、レシピエントの年齢、健康状態、身体状態、体重、疾病又は疾患の種類及び程度、治療の頻度、平行して行われる治療の性質、（或いは更に必要であれば目的とする効果の性質及び範囲）など数々の要因によって異なる［Ｎｉｅｓ他、Ｇｏｏｄｍａｎ ＆ Ｇｉｌｍａｎ’ｓ Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ第９版、第３章：Ｈａｒｄｍａｎ他編、ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ、ニューヨーク州ニューヨーク（１９９６）。ここに参照して説明に代える］。通常、ＷＮＶ或いはフラビウイルス属又はペスチウイルス属を含む他のウイルスのキャプシド蛋白質又はその機能性断片の一日の投与量は、約１μｇ〜１００ミリグラム／ｋｇ（体重）とすることができる。一般に０．５〜５０、好ましくは１〜１０ミリグラム／ｋｇ／日の量で１日につき１〜６回に分割して、あるいは持続放出の形状で投与するのが、望ましい結果を得るのに有効である。
【０１０２】
本発明の薬剤組成物は、１回で投与してもよいし、複数回で投与してもよい。本発明の薬剤組成物は、単独の治療薬として投与してもよいし、他の治療薬と組み合わせて投与してもよい。本発明の治療法は、従来の治療法と組み合わせることが可能であり、順次又は同時に行うことができる。
【０１０３】
ＷＮＶ或いはフラビウイルス属又はペスチウイルス属を含む他のウイルスのキャプシド蛋白質、その機能性断片又はその誘導体を包含する薬剤組成物の投与には、レシピエント体内において活性物質をその作用部位に到達させることができる手段であればどのようなものを用いてもよい。蛋白質は経口投与された場合消化されてしまうので、通常は非経口投与、すなわち静脈内、皮下、筋肉内投与を行って、吸収を最適化する。加えて本発明の薬剤組成物は、高増殖成長の部位又はその近傍に注射することができる。例えば投与を充実性腫瘍塊内に直接注射して行ってもよいし、それに隣接する組織内に注射して行ってもよい。治療対象の個体が乾癬を患っている場合には、ＷＮＶ或いはフラビウイルス属又はペスチウイルス属を含む他のウイルスのキャプシド蛋白質又はその機能性断片を、薬剤として許容される局所担体と共に配合し、その配合を例えばクリーム、ローション又は軟膏として局所に塗布してもよい。
【０１０４】
当業者は、ＷＮＶ或いはフラビウイルス属又はペスチウイルス属を含む他のウイルスに感染した個体の予防又は治療処理に用いられる、ＷＮＶ或いはフラビウイルス属又はペスチウイルス属を含む他のウイルスのキャプシド蛋白質又はその機能性断片と薬剤として許容される担体又は希釈液とを包含するワクチン組成物を、任意の投与方法に応じて選択された組成物を用いて配合することができる。ワクチンに用いられる好適な薬学的担体は、当分野において標準的な参照文献であるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（上述）に記載があり、組成物を受容する個体にとって有害な抗体の産生を誘発することのない担体であれば、どのようなものを用いてもよい。好適な担体の例としては、蛋白質類、多糖類、ポリ乳酸類、ポリグリコール酸類、高分子量アミノ酸類、アミノ酸共重合体類、及び脂質凝集物（油滴又はリポソームなど）等の緩代謝性高分子が挙げられる。そのような担体は当業者に公知のものである。これらの担体は免疫促進剤（「アジュバント」）としても機能することができる。その上更に、ジフテリア又は破傷風のトキソイドといった、細菌トキソイドに抗原を結合させることができる。
【０１０５】
本発明のワクチン組成物と共に用いることのできるアジュバントの例としては、（１）アルミニウム塩（明礬）、例えば水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、硫酸アルミニウム等；（２）水中油型乳剤配合物、例えば（ａ）合成アジュバント配合物（ＳＡＦ）［Ｃｈｉｒｏｎ（カリフォルニア州エメリービル）より入手可能］、及び（ｂ）２％スクアレン中に解毒化内毒素及びマイコバクテリウム細胞壁成分を含むＲｉｂｉアジュバント系（ＲＡＳ）（Ｃｏｒｉｘａ、ワシントン州シアトル）等；（３）ＴｉｔｅｒＭａｘ［ＣｙｔＲｘ（ジョージア州ノークロス）より入手可能］等の油中水配合物；（４）Ｓｔｉｍｕｌｏｎ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、マサチューセッツ州ウスター）等のサポニンアジュバント、又はそれから調製したＩＳＣＯＭＳ（免疫促進複合体）等の粒子；（４）フロイント完全アジュバント（ＦＣＡ）及びフロイント不完全アジュバント（ＦＩＡ）；（５）サイトカイン、例えばインターロイキン（ＩＬ−１、ＩＬ−２等）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）及び腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）等；及び（６）ワクチン組成物の免疫有効性を促進する免疫促進剤として作用するその他の物質が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【０１０６】
通常、本発明のワクチン組成物は水、食塩水、グリセロル、エタノール等の希釈液を含んでいる。更に、湿潤剤、乳化剤、ｐＨ緩衝物質等の補助物質が前記賦形剤に存在していてもよい。
【０１０７】
通常、本発明のワクチン組成物は液体溶液又は懸濁液いずれかの形状の注射用薬剤として調製される。注射前に液体賦形剤に溶解又は懸濁するのに好適な固体状配合物として調製してもよい。薬剤として許容される担体について上記したように、アジュバント効果を促進する目的で、調製物を乳化するか又はリポソーム内に封入してもよい。
【０１０８】
本発明のワクチン組成物は、免疫学的有効量のＷＮＶ或いはフラビウイルス属又はペスチウイルス属を含む他のウイルスのキャプシド蛋白質、その機能性断片又はその誘導体を包含していてもよく、レシピエントの免疫系が予防の又は治療の免疫応答を発生することができる手段であればどのようなものによって投与してもよい。ＷＮＶ或いはフラビウイルス属又はペスチウイルス属を含む他のウイルスのキャプシド蛋白質、その機能性断片又はその誘導体の免疫学的有効量とは、一回で又は一連投与の部分として個体に投与される、個体の治療的又は予防的処置に有効である量のことを言う。この量は、治療される個体の健康状態や身体状態、治療される個体の分類群（例えばヒト以外の霊長類、霊長類等）、個体の免疫系が抗体を産生する能力、目的とする保護の程度、ワクチンの配合、治療を行う医者による医療状況の評価、及び他の関連要因によって異なる。投与量は比較的広い範囲に渡ると予想されるが、一般的な試行によって決定することができる。
【０１０９】
全ての投与経路に共通の必須条件として、効率と容易な運搬が挙げられる。本発明の一つの態様において、ワクチン組成物は非経口で、例えば皮下又は筋肉内のいずれかの注射によって、投与される。他の投与手段の例としては、経皮（ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ）、経皮（ｔｒａｎｓｃｕｔａｎｅｏｕｓ）、腹腔内、粘膜、又は一般的な持続性投与が挙げられるが、これらに限定されるものではない。投与治療は一回で行ってもよいし、複数回で行ってもよい。ワクチンは他の免疫調整剤及び／又は他のワクチンと組み合わせて投与してもよい。
【０１１０】
核酸
本発明の別の形態は、ＷＮＶ或いはフラビウイルス属又はペスチウイルス属を含む他のウイルスのキャプシド蛋白質又はその機能性断片をコードする核酸分子と薬剤として許容される担体又は希釈液とを包含する薬剤組成物に関する。本発明によると、ＷＮＶ或いはフラビウイルス属又はペスチウイルス属を含む他のウイルスのキャプシド蛋白質又はその機能性断片をコードする遺伝物質は、発現可能な形態で個体に運搬される。遺伝物質であるＤＮＡ又はＲＮＡは、個体の細胞に取り込まれて発現される。そのように産生されたＷＮＶ或いはフラビウイルス属又はペスチウイルス属を含む他のウイルスのキャプシド蛋白質又はその機能性断片は、高増殖性細胞のアポトーシス死を誘発することができる。従って、ＷＮＶ或いはフラビウイルス属又はペスチウイルス属を含む他のウイルスのキャプシド蛋白質又はその機能性断片をコードする遺伝物質を包含する薬剤組成物は、ＷＮＶ或いはフラビウイルス属又はペスチウイルス属を含む他のウイルスのキャプシド蛋白質又はその機能性断片を包含する薬剤組成物と同様に、高増殖性細胞に特徴付けられる又は関連する病理又は病状を有する個体の治療に有用である。本発明の薬剤組成物は、充実性腫瘍によって特徴付けられる癌の治療に特に有用である。
【０１１１】
従って本発明の更なる形態は、発現に必要な調節因子に操作可能に連結した、ＷＮＶ或いはフラビウイルス属又はペスチウイルス属を含む他のウイルスのキャプシド蛋白質又はその機能性断片をコードするヌクレオチド配列を包含する核酸を、ある量で個体に投与する段階を包含する、高増殖性細胞に関連した疾病を持つ個体を治療する方法に関する。
【０１１２】
本発明の別の形態は、ＷＮＶ由来の或いはフラビウイルス属又はペスチウイルス属を含む他のウイルス由来のキャプシド蛋白質又はその免疫原性断片をコードする核酸分子と、薬剤として許容される担体又は希釈液とを包含するワクチン組成物に関する。本発明によると、キャプシド蛋白質又はその免疫原性断片をコードする遺伝物質は、発現可能な形態で個体に運搬される。遺伝物質であるＤＮＡ又はＲＮＡは、個体の細胞に取り込まれて発現される。そのように産生されたキャプシド蛋白質又はその免疫原性断片は、個体内で免疫応答を誘発する。従って、ＷＮＶ由来の或いはフラビウイルス属又はペスチウイルス属を含む他のウイルス由来のキャプシド蛋白質又はその免疫原性断片をコードする遺伝物質を包含するワクチン組成物は、キャプシド蛋白質を包含するワクチン組成物と同様にして、個体を免疫化するのに有用である。免疫性は、個体が感染していない場合には予防的であり、個体が感染している場合には治療的である。従って本発明の更なる形態は、感染を回避する又は感染した個体を治療する方法に関する。
【０１１３】
個体の細胞内で発現するのに必要な調節因子に操作可能に連結された、ＷＮＶ或いはフラビウイルス属又はペスチウイルス属を含む他のウイルスのキャプシド蛋白質又はその機能性断片をコードするヌクレオチド配列は、ウイルスベクター（アデノウイルス又はレトロウイルスベクター等）又は核酸の直接移入のいずれか（しかしこれらに限定されるものではない）を用いた遺伝子治療によって、薬剤組成物として運搬することができる。目的の蛋白質をコードする核酸の運搬方法として、ウイルスベクターを用いるものが広く使用されている。レトロウイルスベクター、アデノウイルス又はアデノ関連性ウイルスベクター等の組換えウイルスベクターは、一般的な出発原料を用いて、一般的な方法で調製することができる。組換えウイルスベクターは、ＷＮＶ或いはフラビウイルス属又はペスチウイルス属を含む他のウイルスのキャプシド蛋白質又はその機能性断片をコードするヌクレオチド配列を包含する。そのようなベクターは、薬剤として許容される担体又は希釈液と組み合わせられる。得られる薬剤組成物は個体に投与することができる。ウイルスベクターで個体を感染すると、ＷＮＶ或いはフラビウイルス属又はペスチウイルス属を含む他のウイルスのキャプシド蛋白質又はその機能性断片が、感染細胞内で産生される。
【０１１４】
個体の細胞内で発現するのに必要な調節因子に操作可能に連結された、ＷＮＶ或いはフラビウイルス属又はペスチウイルス属を含む他のウイルスのキャプシド蛋白質又はその免疫原性断片をコードするヌクレオチド配列は、ウイルスベクター（アデノウイルス、アデノ関連性ウイルス、ワクシニアウイルス又はレトロウイルスベクター等）或いは細菌又はマイコバクテリウムベクターを包含するワクチン組成物として投与することができる。その上更に、ヌクレオチド配列を、生菌及び／又は弱毒ワクチン内に組み込むことができる。
【０１１５】
あるいは、ＷＮＶ或いはフラビウイルス属又はペスチウイルス属を含む他のウイルスのキャプシド蛋白質又はその機能性断片又は免疫原性断片をコードする、ヌクレオチド配列を包含する分子は、薬剤組成物又はワクチンとして、感染性ベクターを用いずに直接の核酸移入によって投与することができる。核酸分子はＤＮＡであってもＲＮＡであってもよく、好ましくはＤＮＡである。ＤＮＡ分子は線形であっても環状であってもよく、好ましくはプラスミドである。核酸分子は薬剤として許容される担体又は希釈液と組み合わされる。
【０１１６】
上記したように、本発明の薬剤組成物とワクチンとは、組成物、配合、投与量及び投与について多くの点で相関しており、同一であってもよい。例えば、本発明の薬剤組成物とワクチンは両方とも、ＷＮＶ或いはフラビウイルス属又はペスチウイルス属を含む他のウイルスのキャプシド蛋白質又はその断片をコードする核酸を包含してもよい。薬剤組成物中のコードされるキャプシド蛋白質又はその断片は、アポトーシス活性について機能性を有するのに対し、ワクチン中のコードされるキャプシド蛋白質又はその断片は免疫原性を有する。相関した形態に関して開示された部分は、薬剤組成物とワクチンとの両方にあてはまるものとする。
【０１１７】
薬剤組成物における核酸の量は、充分に発現されて細胞死を誘発するに足る量でなければならない。核酸が断片をコードするものである場合には、断片は機能性断片でなければならない。薬剤組成物においては、免疫原性は対象となる特徴ではない。一方ワクチン組成物において、免疫原性が重要である。ワクチンの主な活性は、予防的又は治療的免疫応答の誘導にある。断片が核酸によってコードされる場合には、免疫原性断片でなければならない。
【０１１８】
本発明によると、ＷＮＶ或いはフラビウイルス属又はペスチウイルス属を含む他のウイルスのキャプシド蛋白質又はその機能性断片をコードする核酸配列を包含する薬剤組成物又はワクチンを、個体に直接投与してもよい。個体本体内に存在する細胞内に遺伝物質を導入する。投与の好適な経路の例としては、筋肉内、腹腔内、皮内及び皮下注射が挙げられる。あるいは薬剤組成物は、個体から除去した細胞内に様々な手段で導入してもよい。そのような手段の例としては、トランスフェクション、電気穿孔法及び微粒子銃が挙げられる。核酸分子が細胞に取り込まれてから、個体に再移植する。あるいは、ワクチン接種細胞が別の個体から採取されたものであったとしても、内部に遺伝構造体が組み込まれた非免疫原性細胞を個体内に移植することができると考えられる。
【０１１９】
遺伝構造体は、一般的な注射器、無針式注射装置、又は「微粒子遺伝子銃」等（ただしこれらに限定されるものではない）の手段によって投与してもよい。本発明の幾つかの態様によると、遺伝子構造体を無針式注射装置によって個体に投与する。本発明の幾つかの態様によると、遺伝子構造体を、無針式注射装置を用いて、皮内、皮下、筋肉内で同時に個体に投与する。針のない注射装置は公知のものであり容易に入手可能である。本明細書の記載に従えば、当業者は無針式注射装置を使用して個体の細胞に遺伝物質を運搬することができる。針のない注射装置は、全ての組織に対して遺伝物質を運搬するのに好適である。上記装置は、遺伝物質を皮膚又は筋肉細胞に運搬するのに特に有用である。幾つかの態様において、無針式注射装置は、ＤＮＡ分子を含む液体を、個体の皮膚表面に向けて発射するのに用いられる。液体は、皮膚表面を貫通するのに充分な速度で発射され、皮膚とその下の筋肉組織に浸透する。従って遺伝物質は、皮内、皮下及び筋肉内に同時に投与される。幾つかの態様において、他の器官の細胞に核酸分子を導入する目的で、無針式注射装置を用いてその器官の組織に遺伝物質を運搬する。
【０１２０】
本発明によると、遺伝ワクチンを個体に直接投与して免疫化してもよいし、個体から分離した細胞にエクスビボで投与して投与後に再移植してもよい。いずれの経路によっても、個体本体に存在する細胞内に遺伝物質が導入される。投与経路の例としては、筋肉内、腹腔内、皮内、皮下、静脈内、動脈内、眼内、経口、経皮、吸入式、座薬が挙げられるが、これらに限定されるものではない。好ましい投与経路としては、筋肉内、腹腔内、皮内及び皮下注射が挙げられる。
【０１２１】
本発明による薬剤組成物又ワクチン組成物は、約１ナノグラム〜約２０００ミクログラムのＤＮＡを包含する。幾つかの好ましい態様において、本発明による薬剤組成物又はワクチン組成物は、約５ナノグラム〜約１０００ミクログラムのＤＮＡを包含する。幾つかの好ましい態様において、薬剤組成物又はワクチン組成物は、約１０ナノグラム〜約８００ミクログラムのＤＮＡを包含する。幾つかの好ましい態様において、薬剤組成物又はワクチン組成物は、約０．１〜約５００ミクログラムのＤＮＡを包含する。幾つかの好ましい態様において、薬剤組成物又はワクチン組成物は、約１〜約３５０ミクログラムのＤＮＡを包含する。幾つかの好ましい態様において、薬剤組成物又はワクチン組成物は、約２５〜約２５０ミクログラムのＤＮＡを包含する。幾つかの好ましい態様において、薬剤組成物又はワクチン組成物は、約１００〜約２００ミクログラムのＤＮＡを包含する。
【０１２２】
本発明による薬剤組成物又はワクチン組成物は、使用される投与方法に応じて配合される。薬剤組成物又はワクチン組成物が注射用薬剤組成物である場合には、それらは滅菌され、発熱源を含まず、かつどのような微粒子も含まないものとする。好ましくは等張性の配合が用いられる。一般に、等張性を得る添加剤の例としては、塩化ナトリウム、デキストロース、マンニトル、ソルビトール及びラクトースが挙げられる。幾つかの場合においては、リン酸緩衝食塩水などの等張液が好ましい。安定剤の例としては、ゼラチン及びアルブミンが挙げられる。幾つかの態様においては、血管収縮剤が配合に添加される。
【０１２３】
幾つかの態様においては、ポリヌクレオチド機能に対するエンハンサー又は「遺伝的ワクチン促進」（ＧＶＦ）剤の投与と組合せて、核酸分子を細胞に運搬する。ポリヌクレオチド機能のエンハンサーについては、米国特許第５，５９３，９７２号、米国特許第５，９８１，５０５号及びＰＣＴ／ＵＳ９４／００８９９（申請日１９９４年１月２６日）に記載がある（それぞれここに参照して説明に代える）。ＧＶＦ剤については、米国特許第５，７３９，１１８号、米国特許第５，８３７，５３３号及びＰＣＴ／ＵＳ９９／０４３３２（国際出願日１９９９年２月２６日）に記載がある（それぞれここに参照して説明に代える）。
【０１２４】
核酸分子と組み合わせて投与される共作用剤は、核酸分子との混合物として投与してもよいし、核酸分子の投与とは別々に、同時に、あるいはその投与前に又はその投与後に、投与してもよい。加えて、トランスフェクション剤及び／又は複製剤及び／又は炎症剤として機能しうる他の作用剤であって、ＧＶＦと共に又はＧＶＦ無しで投与することのできる作用剤の例として、成長因子、サイトカイン及びリンフォカイン［α−インターフェロン、γ−インターフェロン、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）、インターロイキン−１（ＩＬ−１）、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１０及びＩＬ−１２等］並びに繊維芽細胞成長因子；界面活性剤［免疫促進複合体（ＩＳＣＯＭＳ）、フロイント不完全アジュバント等］；リポ多糖類（ＬＰＳ）類似体［ノホスホリルリピッドＡ（ＭＰＬ）等］、ムラミルペプチド、キノン類似体、小胞体、スクアレン、ヒアルロン酸等が挙げられる。幾つかの態様において、免疫調節蛋白質をＧＶＦとして用いることができる。
【０１２５】
本発明に従って細胞に運搬される核酸分子は、予防及び／又は治療性免疫剤として機能する蛋白質の遺伝的鋳型として用いることができる。好ましい態様において核酸分子は、動物の細胞内でコード領域を転写及び翻訳するために必須の調節配列を包含する。
【０１２６】
本発明は、抗原をコードする異種遺伝子の運搬に組換えベクターを用いる、改良された弱毒生菌ワクチン及び改良されたワクチンに関する。異種抗原の運搬に組換えベクターを用いる弱毒生菌ワクチン及びワクチンの例は、米国特許４，７２２，８４８；５，０１７，４８７；５，０７７，０４４；５，１１０，５８７；５，１１２，７４９；５，１７４，９９３；５，２２３，４２４；５，２２５，３３６；５，２４０，７０３；５，２４２，８２９；５，２９４，４４１；５，２９４，５４８；５，３１０，６６８；５，３８７，７４４；５，３８９，３６８；５，４２４，０６５；５，４５１，４９９；５，４５３，３６４；５，４６２，７３４；５，４７０，７３４；及び５，４８２，７１３（それぞれここに参照して説明に代える）に記載がある。遺伝子構造体は、ワクチン内で発現を遂行する機能を有する調節配列に操作可能に連結した、キャプシド蛋白質をコードするヌクレオチド配列を包含するものとして提供される。遺伝子構造体を弱毒生菌ワクチン及び組換えワクチンに組み込んで、本発明によるワクチンを得る。
【０１２７】
本発明のこの形態による薬剤組成物及びワクチン組成物は、約０．１μｇ〜約１０００μｇのＤＮＡを包含する。幾つかの好ましい態様において、薬剤組成物及びワクチン組成物は約１μｇ〜約５００μｇのＤＮＡを含む。幾つかの好ましい態様において、薬剤組成物及びワクチン組成物は約２５μｇ〜約２５０μｇのＤＮＡを含む。最も好ましくは、薬剤組成物及びワクチン組成物は約１００μｇのＤＮＡを含む。
【０１２８】
本発明のこの形態による薬剤組成物及びワクチン組成物は、上記したように、用いられる投与方法に応じて配合することができる。当業者は、ＷＮＶ或いはフラビウイルス属又はペスチウイルス属を含む他のウイルスのキャプシド蛋白質又はその機能性断片をコードする核酸分子を容易に配合することができる。投与方法として筋肉内投与が選択された場合には、等張性配合が用いられる。一般に、等張性を保持する添加物の例としては、塩化ナトリウム、デキストロース、マンニトル、ソルビトール及びラクトースが挙げられる。リン酸緩衝食塩水等の等張溶液を用いてもよい。安定剤としてはゼラチン及びアルブミンが挙げられる。ワクチン組成物において、アジュバント又は免疫促進剤を添加するのが望ましい。
【０１２９】
アポトーシス検定
本発明を別の側面からみれば、次の段階：
まず試験化合物の存在下に細胞を検出可能なレベルのアポトーシスを誘導するのに十分な量のＷＮＶ又はフラビウイルス属若しくはペスチウイルス属を含めたその他のウイルスのキャプシド又はその他の蛋白質或いはその機能性断片と接触させ、
次いで該細胞を観察して該試験化合物の存在下にアポトーシスが起こったかどうかを決定すること
を含むＷＮＶＣｐ又はフラビウイルス属若しくはペスチウイルス属を含めたその他のウイルスのキャプシド又はその他の蛋白質或いはその機能性断片がアポトーシスを受けるように細胞を誘導するのを抑制する化合物を同定する方法に関するものである。ＷＮＶ又はフラビウイルス属若しくはペスチウイルス属を含めたその他のウイルスのキャプシド又はその他の蛋白質或いはその機能性断片のアポトーシス誘導活性を阻害する化合物は、ウイルスを除去し且つＷＮＶ感染症及びフラビウイルス又はペスチウイルス感染症を含めたその他のウイルス感染症を治療するための薬剤として有用であり得る。
【０１３０】
本発明のこの側面によれば、ＷＮＶ又はフラビウイルス属若しくはペスチウイルス属を含めたその他のウイルスのキャプシド蛋白質又はその機能性断片の高増殖性細胞におけるアポトーシス誘導能力を抑制する化合物が同定される。試験化合物の存在下又は非存在下に、ＷＮＶ又はフラビウイルス属若しくはペスチウイルス属を含めたその他のウイルスのキャプシド蛋白質又はその機能性断片によるアポトーシス誘導を比較する検定法が提供される。この検定法を使用すると、ＷＮＶ又はフラビウイルス属若しくはペスチウイルス属を含めたその他のウイルスのキャプシド蛋白質又はその機能性断片のアポトーシス誘導活性を阻害する化合物が同定できる。このような化合物は、抗ＷＮＶ及び／又は抗フラビウイルス若しくは抗ペスチウイルス治療薬として有用であり得る。
【０１３１】
本発明の方法は、試験化合物の存在下に、細胞をＷＮＶ又はフラビウイルス属若しくはペスチウイルス属を含めたその他のウイルスのキャプシド蛋白質又はその機能性断片と接触させる段階を含む。次いで、この細胞を観察してＷＮＶ又はフラビウイルス属若しくはペスチウイルス属を含めたその他のウイルスのキャプシド蛋白質又はその機能性断片がアポトーシスを誘導するかどうかを決定する。試験化合物の非存在下に細胞をＷＮＶ又はフラビウイルス属若しくはペスチウイルス属を含めたその他のウイルスのキャプシド蛋白質又はその機能性断片と接触させる対照法が提供され得る。さらに、ＷＮＶ又はフラビウイルス属若しくはペスチウイルス属を含めたその他のウイルスのキャプシド蛋白質又はその機能性断片の非存在下に試験化合物を細胞と接触させる対照法が提供され得る。試験化合物の存在下にＷＮＶ又はフラビウイルス属若しくはペスチウイルス属を含めたその他のウイルスのキャプシド蛋白質又はその機能性断片と接触した細胞がアポトーシスを受けていなければ、その時には抗アポトーシス活性がこの試験化合物について示される。これは、試験化合物の非存在下にＷＮＶ又はフラビウイルス属若しくはペスチウイルス属を含めたその他のウイルスのキャプシド蛋白質又はその機能性断片と接触した細胞がアポトーシスを検出可能に受け、しかもＷＮＶ又はフラビウイルス属若しくはペスチウイルス属を含めたその他のウイルスのキャプシド蛋白質又はその機能性断片の非存在下に試験化合物と接触した細胞がアポトーシスを受けない場合に確認できる。
【０１３２】
試験化合物は、好ましくは溶液状で与えられる。試験化合物の階段希釈が一連の検定法で使用できる。試験化合物は、０．０１μＭ〜１Ｍの濃度で添加できる。試験化合物の終濃度の好ましい範囲は、１０μＭ〜１００μＭである。
【０１３３】
ＷＮＶ又はフラビウイルス属若しくはペスチウイルス属を含めたその他のウイルスのキャプシド蛋白質又はその機能性断片は、様々な手段によってこの検定に添加できる。本発明のいくらかの具体例では、このものは蛋白質として細胞と混合される。ＷＮＶ又はフラビウイルス属若しくはペスチウイルス属を含めたその他のウイルスのキャプシド蛋白質又はその機能性断片は、細胞培地に直接添加できる。ＷＮＶ又はフラビウイルス属若しくはペスチウイルス属を含めたその他のウイルスのキャプシド蛋白質又はその機能性断片は、上記のような周知技術を使用して広く利用できる出発原料から産生され得る。使用されるＷＮＶ又はフラビウイルス属若しくはペスチウイルス属を含めたその他のウイルスのキャプシド蛋白質又はその機能性断片の好ましい濃度範囲は、約１μｇ／ｍｌ〜１ｍｇ／ｍｌである。
【０１３４】
本発明のその他の具体例では、ＷＮＶ又はフラビウイルス属若しくはペスチウイルス属を含めたその他のウイルスのキャプシド蛋白質又はその機能性断片は、検定の細胞内で核酸から発現される。制限されない例では、ＷＮＶ又はフラビウイルス属若しくはペスチウイルス属を含めたその他のウイルスのキャプシド蛋白質又はその機能性断片は、誘導可能プロモーターの調節下に検定の細胞内で核酸から発現され得る。
【０１３５】
細胞のアポトーシスの観察は、ホールマーク細胞の変化又は「アポトーシスマーカー」を検出する方法によって実施される。例えば、アポトーシス期間の初期には、最終的な細胞死に先立って、細胞膜の変化が細胞膜におけるホスファチジルセリン（ＰＳ）の外面化を生じさせる。アポトーシス中のＰＳの一定の露出は、このものを有用な「アポトーシスマーカー」にさせ且つ様々な検出技術のための魅力的な標的にさせる。ＰＳとの高い親和性を有する内因性ヒト蛋白質であるアネキシンＶは、アポトーシスを受ける細胞を同定するための都合のよい試薬を与える。蛍光標識したアネキシンＶは、アポトーシス細胞を同定するために組織学的研究及び細胞選別の研究のために使用できる。例えば、アネキシンＶは、２５個の蛍光体を含有する大分子であり且つ現在使用される最も明るい色素の１種であるフィコエリトリン（ＰＥ）に結合できる。ＰＥは、商業的に購入でき、或いは周知の単離技術によって藻類から単離できる。結合技術は当業者に周知であり、結合用キットは、ポリザイム社（サンリアンドロ，ＣＡ）を含めて様々な供給メーカーから購入できる。フローサイトメトリー及びその他の用途に使用するために蛍光蛋白質を結合させることについての更なる詳細及びプロトコルに関しては、「ウィアー・ハーゼンバーグ編 Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ 第４版のフローサイトメトリーに使用するための蛍光蛋白質の精製及びカップリング（ハーディー・Ｒ及びハーゼンバーグ著），ブラックウェル・サイエンティフィック出版社，ボストン，１９８６」を参照されたい。本発明はこれを参照している。さらに、放射性同位元素標識したアネキシンＶも体内で腫瘍内アポトーシス細胞を影像化する放射性薬品のために有用である。
【０１３６】
別の「アポトーシスマーカー」は、選択的に活性化されたＤＮアーゼによる細胞性ＤＮＡのヌクレオソーム間での断片化によって生じた遊離３’−ヒドロキシＤＮＡ末端によって表される。このような遊離３’−ヒドロキシＤＮＡ末端は、正常な細胞のそのままのゲノムＤＮＡには存在しないだけでなく、細胞がネクローシスによって死滅するときにも存在しない。アポトーシスに関連した遊離３’−ヒドロキシＤＮＡ末端は、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）仲介ｄＵＴＰニック末端標識（ＴＵＮＥＬ）検定法によってその場で検出できる。アポトーシス中のＤＮＡ切断を検出するための技術の調査のために、「Ｍｅｔｈｏｄ Ｅｎｚｙｍｏｌ，３２２：３−１５，２０００，カウフマン等」を参照されたい。本明細書はこれを参照している。
【０１３７】
また、アポトーシスに関連したヌクレオソーム間の断片化は、２種のヌクレオソームエピトープに特異的な一対のモノクローナル抗体を使用して細胞質のヌクレオソームを酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）用プレート上で捕捉し且つ検出するサンドイッチ検定法によって検出することもできる。「サルゲーム等，１９９７，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．，２５：６８０−６８１」を参照されたい。本発明はこれを参照している。この検定法は、組織培養細胞の大規模スクリーニングに特に適している。
【０１３８】
アポトーシス検出検定は、多くの異なるタイプの細胞及び様々な手段によるフラビウイルス属又はペスチウイルス属のキャプシド蛋白質又はその機能性断片の産生を使用して実施できる。当業者であれば、本明細書の教示に従って、本発明のこの側面を実施するためのいくらかの方法を容易に認識できる。本発明の好ましい具体例では、この検定法は、腺癌由来のＨｅＬａ細胞系及び黄紋筋肉腫由来のＲＤ細胞系のような腫瘍由来の細胞系を使用して、或いはアデノウイルスＤＮＡで形質転換された腎臓細胞系２９３のような形質転換細胞を使用して実施される。
【０１３９】
本発明のさらなる側面は、ＷＮＶ又はフラビウイルス属若しくはペスチウイルス属を含めたその他のウイルスのキャプシド蛋白質又はその機能性断片のアポトーシス誘導活性を抑制する化合物を同定する上記の方法を実施するためのキットに関するものである。本発明のこの側面に従うキットは、ＷＮＶ又はフラビウイルス属若しくはペスチウイルス属を含めたその他のウイルスのキャプシド蛋白質又はその機能性断片を含む容器及び次の少なくとも１種：説明書、対照物及びデータを表す写真又は図を含む。加えて、キットは、フィコエリトリン（ＰＥ）結合アネキシンＶのようなアポトーシスを検出するための試薬を含む第２容器を含むことができる。別法では、説明書は、このキットの使用者にアポトーシスマーカーを検出する多数の既知の方法のいずれかを利用するように指示することができる。また、このキットは、使用者に検定を実施させるように細胞を提供することもできる。例えば、小瓶一本の低温保存された腫瘍細胞がこのキットに含まれ得る。
【０１４０】
診断
ＷＮＶ又はフラビウイルス属若しくはペスチウイルス属を含めたその他のウイルスからの蛋白質に対する抗体の存在を検出することによる診断試験法を開発するための大きなニーズが存在する。
【０１４１】
本発明は、試験試料中のＷＮＶ又はフラビウイルス属若しくはペスチウイルス属を含めたその他のウイルスからのキャプシド蛋白質の存在及び／又は量を決定する診断試験法に関するものである。本発明は、ＷＮＶ又はフラビウイルス属若しくはペスチウイルス属を含めたその他ウイルスからのキャプシド蛋白質を認識する抗キャプシド蛋白質抗体を提供する。また、個体からの試験試料中のキャプシド蛋白質の存在は、感染についての優れた標識でもあり得る。
【０１４２】
本発明は、試料中のキャプシド蛋白質の存在を検出することによってＷＮＶ又はフラビウイルス属若しくはペスチウイルス属を含めたその他のウイルスに感染した個体を特定する方法に関する。抗体は、好ましくはモノクローナル抗体である。この抗体は、好ましくは、ヒト細胞、ＣＨＯ細胞、昆虫細胞又は酵母細胞中で作られるキャプシド蛋白質に対して産生される。個体の試料中に存在するキャプシド蛋白質の量の定量化は、感染した個体の予後を決定する際に使用できる。
【０１４３】
本発明は、ＷＮＶ又はフラビウイルス属若しくはペスチウイルス属を含めたその他のウイルスからのキャプシド蛋白質に特異的に結合する抗体に関するものである。この抗体は、好ましくはモノクローナル抗体である。この抗体は、好ましくは、ヒト細胞、ＣＨＯ細胞、昆虫細胞又は酵母細胞中で作られるキャプシド蛋白質に対して産生される。
【０１４４】
本発明は、ＷＮＶ又はフラビウイルス属若しくはペスチウイルス属を含めたその他のウイルスからのキャプシド蛋白質に特異的に結合する抗体を含む第１容器及びキャプシド蛋白質を含む第２容器を含むＷＮＶ又はフラビウイルス属若しくはペスチウイルス属を含めたその他のウイルスに感染した個体を特定するためのキットに関するものである。このキャプシド蛋白質は、好ましくは、ヒト細胞、ＣＨＯ細胞、昆虫細胞又は酵母細胞中で産生される。この抗体は、好ましくは、ヒト細胞、ＣＨＯ細胞、昆虫細胞又は酵母細胞中で作られるキャプシドに対して産生される。このキットは、個体の試料中に存在する抗キャプシド蛋白質抗体の量を定量化するのに適している。このような情報は、感染した個体の予後を決定する際に使用できる。
【０１４５】
ＷＮＶ又はフラビウイルス属若しくはペスチウイルス属を含めたその他のウイルスからのキャプシド蛋白質及び抗キャプシド蛋白質（ＷＮＶ又はフラビウイルス属若しくはペスチウイルス属を含めたその他のウイルス由来の）抗体を検出するためのキットは、調査並びに診断及び予後の目的に有用である。
【０１４６】
試験試料中の蛋白質又は抗体の存在を検出するための手段は日常的なものであり、当業者であれば、周知の方法を使用して蛋白質又は抗体の有無を検出することができる。蛋白質又は抗体の存在を検出する一つの周知の方法は、結合検定である。当業者であれば、結合検定を実施して蛋白質又は抗体の存在を検出するための多数の方法を容易に認識できる。例えば、抗体は、特定の蛋白質を検出又は定量する免疫検定法のために有用である。抗原は、特定の抗体を検出又は定量する免疫検定法のために有用である。ある種の免疫検定法は、試験試料中の蛋白質を固相担体に又は固相に固定された抗体に結合させることを含む。次いで、対象の蛋白質又は複合体を形成していない抗体のいずれかに選択的に結合する検出可能な抗体を添加する。この検出可能な抗体の検出は、この検出可能な抗体が対象の蛋白質に対して特異的であるならばその蛋白質が存在すること示し、或いはこの検出可能な抗体が複合体を形成していない抗体に対して特異的であるならば対象の蛋白質が存在しないことを示す。ある種の免疫検定法は、試験試料中の抗体を固相担体に固定された抗原に結合させ、対象の抗体又は抗原のいずれかに結合する検出可能な抗体を使用して抗原／抗体の複合体を検出することを含む。様々な免疫検定法の手順は、フォラー等著，「Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ８０’ｓ」，ユニバーシティーパーク出版社，ボルチモア（１９８１）に記載されている。本明細書はこれを参照している。
【０１４７】
固相担体を試験試料と接触させる簡単な結合検定が実行できる。試験試料中に存在するいかなる蛋白質も固相担体に結合し且つ特異的な検出可能な抗体の調製によって検出できる。このような技術は、ドットブロット、ウェスタンブロット及びその他のそのような類似の検定法の基本的要素である。また、試験試料中の特異的な抗体の存在は、類似の態様で検出することもできる。特定の抗体が結合する標的蛋白質を試験試料と接触させ、次に抗体への結合（該試験試料中に存在するならば）を当業者に周知の様々な方法によって分析する。試験試料中に存在するいかなる抗体も固相担体に結合し且つ検出可能な抗原又は特異的な検出可能な抗体の調製によって検出できる。
【０１４８】
その他の免疫検定法はより複雑であり得るが、実際には優れた結果が得られる。典型的且つ好ましい免疫学的検定法には、固相担体に結合した第１抗蛋白質抗体を試験試料に接触させる蛋白質の検出のための「正」検定が含まれる。好適なインキュベーション期間の後に、固相担体を洗浄して結合していない蛋白質を除去する。次いで、第１抗体によって認識されない特定の蛋白質の一部分に対して特異的である別の第２の抗蛋白質抗体を添加する。この第２抗体は、好ましくは検出可能である。この検出可能な抗体が第１抗体を介して固相担体に結合した特定の蛋白質と複合体を形成するのを可能にする第２インキュベーション期間の後に、この固相担体を２回洗浄して結合していない検出可能な抗体を除去する。別法では、この第２抗体は検出可能でなくてもよい。この場合には、この第２抗体に結合する第３の検出可能な抗体がこの系に添加される。このタイプの「正のサンドイッチ」検定法は、結合が起こったかどうかを決定するための単純な結合／非結合検定であることができ、或いは検出可能な抗体の量と対照で得られた量との比較によって定量することができる。このような「２部位」又は「サンドイッチ」検定は、ワイドによる「Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｅ Ａｓｓａｙ Ｍｅｔｈｏｄ」，カークハム編，イーアンドエス・リビングストーン，エジンバラ（１９７０）ｐｐ．１９９−２０６に記載されている。本明細書はこれを参照している。
【０１４９】
また、この「正」検定法は、試験試料中に存在し得る抗体（以後、「試料抗体」と呼ぶ）の検出にも適し得る。試料抗体が結合する特異的な標的蛋白質は、固相担体に結合し且つ試験試料と接触される。好適なインキュベーション期間の後に、この固相担体を洗浄して結合していない試料抗体を除去する。試料抗体のＦｃ部分に結合する第１抗体が添加される。この第１抗体は、好ましくは検出可能である。別法として第１抗体が検出可能でない場合には、第１抗体に結合する第２の検出可能な抗体をその結合を検出するために使用しなければならない。検出可能な抗体が標的蛋白質／固相担体に結合した試料抗体と複合体を形成するのを可能にする第２インキュベーション期間の後に、この固相担体を２回洗浄して結合していない検出可能な抗体を除去する。また、このタイプの「正のサンドイッチ」検定法は、結合が起こったかどうかを決定するための単純な結合／非結合検定であることもでき、或いは検出可能な抗体の量と対照で得られた量とを比較することによって定量することもできる。
【０１５０】
その他のタイプの免疫学的検定法は、いわゆる「同時」及び「逆」検定法である。同時検定法は、固相担体に結合した第１抗体、第２の検出可能な抗体及び試験試料を同時に添加する単一インキュベーション段階を包含する。このインキュベーションが完了した後に、固相担体を洗浄して結合していない蛋白質を除去する。次いで、固相担体に結合した検出可能な抗体の存在を慣用型の「正のサンドイッチ」検定と同様に判定する。また、この同時検定法は、試験試料中の抗体の検出にも類似の態様で応用できる。
【０１５１】
「逆」検定法は、検出可能な抗体溶液の試験試料への段階的な添加、その後のインキュベーション期間及び固相担体に結合した抗体の添加、その後の追加のインキュベーション期間を含む。固相担体を慣用法で洗浄して結合していない蛋白質／抗体複合体及び未反応の検出可能な抗体を除去する。次いで、固相担体に結合した検出可能な抗体の存在を「同時」及び「正」検定と同様に判定する。また、この逆検定法は、試験試料中の抗体の検出にも類似の態様で応用できる。
【０１５２】
この免疫学的検定法の第１成分は、ニトロセルロース又は蛋白質を固定できるその他の固相担体に添加され得る。試験試料中のＷＮＶ又はフラビウイルス属若しくはペスチウイルス属を含めたその他のウイルスからのキャプシド蛋白質の存在を判定するための第１成分は抗キャプシド蛋白質抗体であるのに対して、試験試料中の抗キャプシド蛋白質抗体の存在について検査するための第１成分はキャプシド蛋白質である。「固相担体」又は「担体」とは、蛋白質を結合することのできる任意の材料を意図するものである。周知の固相担体には、ガラス、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、デキストラン、ナイロン、アミラーゼ、天然及び変性セルロース、ポリアクリルアミド、アガロース及び磁鉄鉱が含まれる。担体の性質は、本発明の目的のためにある程度まで可溶であるか又は不溶であるかのいずれかであることができる。この担体の形状は、ビーズのように球状であり又は試験管の内部表面若しくは棒材の外部表面のように円柱状であることができる。別法として、その表面は、シート、試験用ストリップなどのように平坦であることができる。当業者であれば、蛋白質を結合させるための多くの他の好適な「固相担体」を熟知しており、或いは日常的な実験法を使用することによってこのものを確認することができるであろう。好ましい固相担体は、９６ウェルマイクロタイタープレートである。
【０１５３】
蛋白質（この場合、キャプシド蛋白質又は抗キャプシド蛋白質抗体のいずれか）の存在を検出するために、抗キャプシド蛋白質抗体又は抗ヒト抗体のような検出可能な抗体が使用される。抗体を検出するためのいくつかの方法は周知である。
【０１５４】
抗体を検出する方法一つとして、抗体をある種の酵素に結合させ、次いで酵素免疫測定法（ＥＩＡ）又は（ＥＬＩＳＡ）、例えば捕捉ＥＬＩＳＡの抗体を使用する方法が挙げられる。この酵素は、その後基質に曝されたときにその基質と反応し、そして、例えば、分光的、蛍光的又は視覚的な手段によって検出できる化学的部分を生じさせる。抗体を検出可能に標識するのに使用できる酵素には、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、スタフィロコッカスヌクレアーゼ、δ−５−ステロイドイソメラーゼ、酵母アルコールデヒドロゲナーゼ、α−グリセロリン酸デヒドロゲナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、アスパラギナーゼ、グルコースオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、リボヌクレアーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、グルコアミラーゼ及びアセチルコリンエステラーゼが含まれるが、これらに制限されない。当業者であれば、使用できるその他の酵素を容易に認識しよう。
【０１５５】
抗体が検出できるその他の方法としては、引き続き放射性免疫測定法（ＲＩＡ）で使用するために抗体を放射性同位元素に結合させる方法が挙げられる（例えば、ワーク等の「Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｎｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」，ノースオランダパブリッシング社，ニューヨーク（１９７８）を参照されたい。本明細書はこれを参照している）。放射性同位元素は、γ線計数器又はシンチレーション計数管を使用するような手段によって、或いはオートラジオグラフィーによって検出できる。本発明の目的のために特に有用である同位元素は、３Ｈ、１２５Ｈ、１３１Ｉ、３５Ｓ及び１４Ｃである。１２５Ｉが好ましい同位体である。当業者であれば、使用できるその他の放射性同位元素を認識しよう。
【０１５６】
また、抗体を蛍光性化合物で標識することも可能である。蛍光標識した抗体が適切な波長の光源に曝されるときに、その蛍光のためにその存在が検出できる。最も一般的に使用される蛍光標識用化合物のなかでは、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、フィコエリトリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、ｏ−フタルアルデヒド及びフルオレサミンである。当業者であれば、使用できるその他の蛍光性化合物を容易に認識しよう。
【０１５７】
また、抗体は、１５２Ｅｕ又はランタニド系列のその他のもののような蛍光発光性金属を使用して検出可能に標識されることもできる。これらの金属は、ジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＤＴＰＡ）又はエチレンジアミン四酢酸のような金属キレート基を使用して蛋白質に特異的な抗体に結合できる。当業者であれば、使用できるその他の蛍光発光性金属並びにその他の金属キレート基を容易に認識しよう。
【０１５８】
また、抗体は、化学発光化合物に結合させることによって検出可能に標識することもできる。化学発光化合物を標識した抗体の存在は、化学反応の過程中に生じる発光の存在を検出することによって決定される。特に有用な化学発光標識用化合物の例は、ルミノール、イソルミノール、テロマチック（ｔｈｅｒｏｍａｔｉｃ）アクリジニウムエステル、イミダゾール、アクリジニウム塩及び蓚酸エステルである。当業者であれば、使用できるその他の化学発光化合物を容易に認識しよう。
【０１５９】
同様に、生物発光化合物も抗体を標識するのに使用できる。生物発光化合物は、触媒蛋白質が化学発光反応の効率を上昇させる生体系で発見された化学発光体のタイプである。生物発光蛋白質の存在は、発光の存在を検出することによって決定される。標識する目的のために重要な生物発光化合物は、ルシフェリン、ルシフェラーゼ及びエクオリンである。当業者であれば、使用できるその他の生物発光化合物を容易に認識しよう。
【０１６０】
蛋白質特異的抗体、断片又は誘導体の検出は、例えば検出可能な標識が放射性のγ放射体であるならばシンチレーション計数管によって達成できる。別法として、検出は、例えば標識が蛍光物質であるならば蛍光測定器によって達成できる。酵素標識の場合には、その検出は、その酵素のための基質を使用する比色法によって達成できる。また、検出は、基質の酵素反応の程度を同様に調製した標準物と比較する肉眼的な比較によっても達成できる。当業者であれば、使用できるその他の適切な検出方法を容易に認識しよう。
【０１６１】
所定ロットの抗体の結合活性は、周知の方法にしたがって決定できる。当業者であれば、日常的な実験法を使用することによってそれぞれの決定のための有効且つ最適な検定条件を決定することができるであろう。
【０１６２】
既知量の蛋白質を検定法に加える及び蛋白質を全く加えないそれぞれ陽性及び陰性の対照法が実行できる。当業者であれば、適切な対照法を実施するのに必要な知識を有していよう。試験試料中のキャプシド蛋白質又は抗キャプシド蛋白質抗体の量を決定するために、試験試料中で検出される蛋白質の量は、陽性の対照で検出される蛋白質の量と比較される。この陽性の対照値から標準曲線が描かれ、この標準曲線から試験試料中の蛋白質の量が推定される。当業者であれば、標準曲線を作成し且つ試験試料の値を推定するための知識を有していよう。
【０１６３】
試験試料には、血液、大脳の髄液、羊水、リンパ液、精液、膣分泌液又はその他の体液から構成され得るＷＮＶ又はフラビウイルス属若しくはペスチウイルス属を含めたその他のウイルスに感染していることが疑われる個体から得られる試料が含まれる。また、試験試料には、調査の目的のために使用されるもののような研究室で調製された試料も含まれる。存在するならば、細胞は、遠心分離又は溶解のような方法によって除去され得る。当業者であれば、キャプシド蛋白質又は抗キャプシド蛋白質抗体について検査できる試験試料の多様性を容易に認識しよう。試験試料は、針により流体を取り出すような方法によって又は綿棒によって得られ得る。当業者であれば、試験試料を得るその他の方法を容易に認識しよう。
【０１６４】
「抗体組成物」とは、蛋白質の検出のために必要とされる抗体のことをいうものとする。例えば、試験試料中のキャプシド蛋白質の検出のために使用される抗体組成物は、キャプシド蛋白質に結合する第１抗体並びに第２又は第３の検出可能な抗体（これらの抗体は、それぞれ第１抗体又は第２抗体に結合する）を含む。
【０１６５】
抗キャプシド蛋白質抗体の存在について試験試料を検査するために、標準的な免疫学的検定法が実施できる。１０〜５０μｇ／ｍｌのキャプシド蛋白質が９６ウェルマイクロタイタープレートのような固相担体に大量の緩衝液で添加される。５０μｌが１ウェル毎に添加される。固相担体は、結合が起こるのに十分な期間にわたってインキュベートされ、次いでリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄されて結合していないキャプシド蛋白質が除去される。適切な条件の例は、室温で２時間又は４℃一晩である。次いで、この固相担体をＰＢＳ／ＢＳＡ溶液でブロックして試験試料中の蛋白質がこの固相担体に非特異的に結合しないようにする。連続希釈の試験試料が固相担体に添加され、次いで結合が起こるのに十分な時間にわたってインキュベートされる。この固相担体をＰＢＳで洗浄して結合していない蛋白質を除去する。ヒト抗体のＦｃ領域を認識する標識抗ヒト抗体がこの固相担体混合物に添加される。このプレートは、結合が起こるのに十分な時間にわたってインキュベートされ、次いでＰＢＳで洗浄されて結合していない標識抗ヒト抗体が除去される。次いで、結合した標識抗ヒト抗体の量が標準的技術によって決定される。使用できる抗ヒト抗体には、製品説明書に従って１：１２０００で使用される西洋ワサビペルオキシダーゼ標識したヤギ抗ヒト抗体（べーリンガー・マンハイム社製）が含まれる。
【０１６６】
キャプシド蛋白質の存在について試験試料を検査するために、以下に記載されるような標準的な免疫学的検定法が実施できる。キャプシド蛋白質の特定の部分を認識する第１抗キャプシド蛋白質抗体を９６ウェルマイクロタイタープレートに大量の緩衝液で添加する。このプレートを結合が起こるのに十分な時間にわたってインキュベートし、次いでＰＢＳで洗浄して結合していない抗キャプシド蛋白質抗体を除去する。次いで、このプレートをＰＢＳ／ＢＳＡ溶液でブロックして試料蛋白質がマイクロタイタープレートに非特異的に結合しないようにする。次いで、連続希釈の試験試料をウェルに添加し、このプレートを結合が起こるのに十分な時間にわたってインキュベートする。このウェルをＰＢＳで洗浄して結合してない蛋白質を除去する。第１抗キャプシド蛋白質抗体によって認識されないキャプシド蛋白質部分を認識する標識抗キャプシド蛋白質抗体をウェルに添加する。このプレートを結合が起こるのに十分な時間にわたってインキュベートし、次いでＰＢＳで洗浄して結合していない標識抗キャプシド蛋白質抗体を除去する。次いで、結合した標識抗キャプシド蛋白質抗体の量を標準的な技術によって決定する。キャプシド蛋白質を認識するウサギ抗キャプシド抗体を１：１０００で使用する。適切な条件の例は、室温で２時間又は４℃一晩である。
【０１６７】
試験試料中のキャプシド蛋白質の検出のために有用であるキットは、固相担体、陽性及び陰性の対照物、緩衝液、適切な抗キャプシド蛋白質抗体及び基本的には先述したような捕捉ＥＬＩＳＡ検定を実施するための説明書を含む。試験試料中の抗キャプシド蛋白質抗体の検出のために有用であるキットは、固相担体、陽性及び陰性の対照物、緩衝液、キャプシド蛋白質及び基本的には先述したような捕捉ＥＬＩＳＡ検定を実施するための説明書を含む。
【０１６８】
治療組成物及び治療方法に関する本明細書中の開示の部分は、主としてヒトを治療する治療学及び方法に関するものであるが、本発明の組成物及び方法は、同様に獣医学に適用できる。ヒトでないもの並びにヒト個体を治療する方法を提供することは本発明の範囲内にある。従って、本発明は、全ての動物、特に、ヒト、ウシ、ヒツジ、ブタ、ウマ、イヌ及びネコ種を含めたほ乳類種を治療する方法に関するものである。
【０１６９】
本発明は、本発明を説明することを意図した次の実施例によってさらに例示される。これらの例は、本発明の範囲を限定するように意図されるものでなく、またそのように解釈すべきではない。本発明が特にここで記載されたものとは別の方法で実施できることが明らかになるであろう。本発明の多数の変更及び改変は、ここでの技術からみて可能であるので、これらは本発明の範囲内にある。
【０１７０】
（実施例）
例１：キャプシド蛋白質発現用構築物
２種のＷＮＶのキャプシド蛋白質（Ｃｐ）発現ベクター（ｐＷＮＶｈ−ＤＪＹ及びｐＷＮＶｙ−ＤＪＹ）を、ニューヨーク１９９９年ヒト単離ウイルス（ＷＮＶ−ＨＮＹ１９９９）についての報告されたそのポリプロテイン遺伝子配列を基にして構築した（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＦ２０２５４１，チャ等，１９９９、ランセット，３５４：１９７１−１９７２）。ＷＮＶ−ＨＮＹ１９９９のゲノム構成を図１の上部分に示す。ベクターの構築を図１の下部分に概略的に示す。それぞれの構築物は、Ｃｐの最初のアミノ酸についてのコード配列がない（最初のアミノ酸残基（ｍｅｔ）が欠失している）Ｃｐのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の５’上流に融合されたヒトＩｇＥ（ｓｌｇＥ）からのシグナルペプチド（リーダー配列）についてのコード配列を含有する。このクローンを、種最適化コドンを最終構成物に導入するように設計されたプライマーのセット［キム等，１９９７，Ｇｅｎｅ，１９９：２９３−３０１（本明細書はこれを参照している）］を使用する３つの別々のＰＣＲ反応による重複ＰＣＲ法を使用して構築した。ｐＷＮＶｈ−ＤＪＹ構築物は、完全な融合ｓＩｇＥシグナルペプチド／Ｃｐコード配列についてのヒト最適化コドンを含有する。ｐＷＮＶｙ−ＤＪＹ構築物は、シグナルペプチドについての酵母最適化コドンとＣｐ蛋白質のアミノ酸残基２〜６個についてのコドン及びＣｐコード配列の残余についてのヒト最適化コドンを含有する。さらに、適切なコザック配列を、ＰＣＲプライマーの使用によりシグナルペプチドコード配列の上流に導入した。それぞれのコード配列を、Ｃｐ−Ｈｉｓタグ融合蛋白質を発現させるＣＭＶプロモーターの制御下での発現用構築物を生じさせるために、ｐｃＤＮＡ３．１／Ｖ５−ＨｉｓＣ（インビトロゲン社製，カリフォルニア州サンディエゴ）にＨｉｎｄＩＩＩ及びＮｏｔＩのポリクローニング部位間でクローン化した。両者の構築物は、ＷＮＶＣｐ蛋白質の２〜１２３個のアミノ酸、次いでＶ５エピトープを融合したアミノ末端ｓＩｇＥリーダーペプチド及びポリヒスチジンカルボキシ末端テールを有する同一の蛋白質をコードする。
【０１７１】
重複ＰＣＲ構築は、次の１０個のプライマーを使用した。
プライマー１．ｓＩｇｈ−ＶＣｈＵ１＋（９０ｍｅｒ）
ＡＴＧＧＡＣＴＧＧＡＣＣＴＧＧＡＴＣＣＴＧＴＴＣＣＴＧＧＴＧＧＣＣＧＣＣＧＣＣＡＣＣＣＧＣＧＴＧＣＡＣＡＧＣＴＣＴＡＡＧＡＡＡＣＣＡＧＧＡＧＧＣＣＣＣＧＧＣＡＡＧＡＧＣＣＧＣＧＣＣ（配列番号１４）
プライマー２．ｓＩｇｙ−ＶＣｙＵ１．１＋（９０ｍｅｒ）
ＡＴＧＧＡＴＴＧＧＡＣＴＴＧＧＡＴＣＴＴＡＴＴＴＴＴＡＧＴＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＡＣＴＡＧＡＧＴＴＣＡＴＴＣＴＴＣＴＡＡＡＡＡＡＣＣＡＧＧＴＧＧＣＣＣＣＧＧＣＡＡＧＡＧＣＣＧＣＧＣＣ（配列番号１５）
プライマー３．ｓＩｇｈ−ＶＣｈＬ１−（８８ｍｅｒ）
ＧＧＣＴＣＡＧＣＡＴＧＧＣＧＣＧＣＴＴＣＡＧＧＣＣＡＡＴＣＡＧＧＣＴＣＡＧＣＡＣＧＣＧＧＧＧＣＡＴＧＣＣＧＣＧＣＴＴＣＡＧＣＡＴＧＴＴＣＡＣＧＧＣＧＣＧＧＣＴＣＴＴＧＣＣＧＧＧ（配列番号１６）
プライマー４．ｓＩｇｈ−ＶＣｈＵ２＋（９０ｍｅｒ）
ＧＧＣＣＴＧＡＡＧＣＧＣＧＣＣＡＴＧＣＴＧＡＧＣＣＴＧＡＴＣＧＡＣＧＧＣＡＡＧＧＧＣＣＣＣＡＴＡＣＧＣＴＴＣＧＴＧＣＴＧＧＣＣＣＴＧＣＴＧＧＣＣＴＴＣＴＴＣＣＧＣＴＴＣＡＣＣＧＣＣ（配列番号１７）
プライマー５．ｓＩｇｈ−ＶＣｈＬ２−（８９ｍｅｒ）
ＧＧＴＧＣＴＴＣＡＴＧＧＣＧＧＴＣＴＧＣＴＴＧＴＴＣＡＣＧＣＣＧＣＧＣＣＡＧＣＧＧＴＣＣＡＧＣＡＣＧＧＣＧＣＧＧＧＴＧＧＧＧＧＣＡＡＴＧＧＣＧＧＴＧＡＡＧＣＧＧＡＡＧＡＡＧＧＣＣ（配列番号１８）
プライマー６．ｓＩｇｈ−ＶＣｈＵ３＋（８９ｍｅｒ）
ＣＣＧＣＣＡＴＧＡＡＧＣＡＣＣＴＧＣＴＧＡＧＣＴＴＣＡＡＧＡＡＧＧＡＧＣＴＧＧＧＣＡＣＣＣＴＧＡＣＣＡＧＣＧＣＣＡＴＣＡＡＣＣＧＣＣＧＣＡＧＧＡＧＣＡＡＧＣＡＧＡＡＧＡＡＧＣＧＣ（配列番号１９）
プライマー７．ｓＩｇｈ−ＶＣｈＬ３−（８１ｍｅｒ）
ＣＧＣＧＣＣＣＡＣＧＣＴＧＧＣＧＡＴＣＡＧＧＣＣＡＡＴＣＡＴＣＡＣＧＧＣＡＡＴＧＣＣＧＧＴＣＴＴＧＣＣＧＣＣＧＣＧＣＴＴＣＴＴＣＴＧＣＴＴＧＣＴＧＣＴＧＣＧＧＣＧ（配列番号２０）
プライマー８．ｓＩｇｈ−ＶＣｈＦＳ１＋（３９ｍｅｒ）
ＣＣＣＡＡＧＣＴＴＧＣＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＡＣＴＧＧＡＣＣＴＧＧＡＴＣＣＴＧ（配列番号２１）
プライマー９．ｓＩｇｙ−ＶＣｙＦＳ１．１＋（３３ｍｅｒ）
ＣＣＣＡＡＧＣＴＴＧＣＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＡＴＴＧＧＡＣＴＴＧＧ（配列番号２２）
プライマー１０．ｓＩｇｈ−ＶＣｈＦＡＳ２−（３７ｍｅｒ）
ＡＴＡＧＴＴＴＡＧＣＧＧＣＣＧＣＧＣＣＣＡＣＧＣＴＧＧＣＧＡＴＣＡＧＧＣＣ（配列番号２３）。
【０１７２】
３セットのプライマーをＰＣＲ反応のために一組にして次の３種の重複ＰＣＲ生成物を生じさせた。プライマー１と３（ｐＷＮＶｈ−ＤＪＹのための）又はプライマー２と３（ｐＷＮＶｙ−ＤＪＹのための）、プライマー４と５及びプライマー６と７である。それぞれのセットのプライマーを自己アニールさせ且つｐｆｕＤＮＡポリメラーゼによって伸長させた（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ　Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）。最後に、全長の挿入物を１セットのプライマーのプライマー８と１０（ｐＷＮＶｈ−ＤＪＹのための挿入物を生じさせる）又はプライマー９と１０（ｐＷＮＶｙ−ＤＪＹのために挿入物を生じさせる）で増幅し、次いでＨｉｎｄＩＩＩ（５’末端）及びＮｏｔＩ（３’末端）のエンドヌクレアーゼ制限部位で末端を切断した。これらの最終挿入生成物は、ＨｉｎｄＩＩＩ及びＮｏｔＩで制限されており、ＨｉｎｄＩＩＩ／ＮｏｔＩ消化したｐｃＤＮＡ３．１／Ｖ５−ＨｉｓＣにクローン化した。得られた組換えベクター（ｐＷＮＶｈ−ＤＪＹ及びｐＷＮＶｙ−ＤＪＹ）をシーケンス法によって確認した。図２及び５は、それぞれｐＷＮＶｈ−ＤＪＹ及びｐＷＮＶｙ−ＤＪＹの制限エンドヌクレアーゼ地図を示している。図３及び６は、それぞれｐＷＮＶｈ−ＤＪＹ及びｐＷＮＶｙ−ＤＪＹの特徴地図を示している。図４及び７は、それぞれｐＷＮＶｈ−ＤＪＹ及びｐＷＮＶｙ−ＤＪＹについての全ヌクレオチド配列を注釈付きで示している。
【０１７３】
例２．ｐＷＮＶｙ−ＤＪＹ及びｐＷＮＶｈ−ＤＪＹから発現されたＷＮＶキャプシド蛋白質の生物学的特徴。
組織培養細胞中でのｐＷＮＶｙ−ＤＪＹ及びｐＷＮＶｈ−ＤＪＹからのＣｐ蛋白質の発現
２チャンバースライド上に接種したＨｅＬａ、ＲＤ又は２９３細胞をＣａＰＯ４共沈法によって２μｇの精製プラスミドＤＮＡ（ｐＷＮＶｙ−ＤＪＹ又はｐＷＮＶｈ−ＤＪＹのいずれか）でトランスフェクトした。トランスフェクションの後に、この細胞を固定し、マウス抗ＨｉｓｍＡｂと共にインキュベートし、次いでＦＩＴＣ結合ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体と共にインキュベートした。その遺伝子発現をＵＶランプ顕微鏡で検査した。Ｃｐ蛋白質の発現は、構築ｐＷＮＶｙ−ＤＪＹ及びｐＷＮＶｈ−ＤＪＹの両者から３種の細胞系の全てで達成され、その蛋白質は、細胞質に局在していた。ｐＷＮＶｈ−ＤＪＹでトランスフェクトされたＲＤ細胞におけるＣｐ蛋白質発現の免疫蛍光分析は、ＦＩＴＣフィルターを使用して局在Ｃｐ蛋白質を表す緑色のシグナルを明らかにした。また、この画像を、特定のシグナルと背景のシグナルとを区別するためにＦＩＴＣの二重フィルター及びローダミンで捕捉した。二重フィルター下での緑色蛍光は、Ｃｐ蛋白質の存在を立証した。細胞の核酸を明らかにするためにＤＡＰＩフィルターを使用し［核酸は、ＤＡＰＩ（４’，６−ジアミジン−２’−フェニルインドール二塩化水素化物）で染色した］、細胞形態は、その画像を光照射野内でＤＡＰＩフィルターによって捕捉したときに明らかになった。
【０１７４】
ＷＮＶキャプシド蛋白質の試験管内での翻訳
３５Ｓ標識した蛋白質生成物を、ＴＮＴ−Ｔ７を一緒にした転写／翻訳システム（プロメガ社，マジソン，ＷＩ）を使用して調製した。１０μｌの放射性同位元素標識した蛋白質試料及び１μｌの抗Ｈｉｓ（Ｃ末端）（インビトロゲン社，サンディエゴ，ＣＡ）抗体を３００μｌのＲＩＰＡ緩衝液に添加し、穏やかに混合した。４℃で９０分間インキュベートした後、プロテインＡセファロースビーズ（ＬＫＢ−ファルマシアバイオテック社）を蛋白質と抗体の複合体に１本の試験管当たり５μｇの終濃度で添加し、この試料を回転振とう器中で４℃で９０分間インキュベートした。このビーズをＲＩＰＡ緩衝液で３回洗浄し、２×ＳＤＳ試料緩衝液に懸濁した。免疫沈降した蛋白質複合体をセファロースビーズから短時間の煮沸によって溶離させ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１５％）ゲルで分離した。この蛋白質試料の移動度を商業的に入手可能な１４Ｃメチル化分子量マーカー（シグマ社）の移動度と比較した。このゲルを固定し、１Ｍのサリチル酸ナトリウム溶液で簡単に処理し、ゲル乾燥機（バイオラド社）中で乾燥させた。乾燥したゲルをＸ線フィルム（コダック社）に一晩暴露した。この試験管内で翻訳された蛋白質は、２１．５ｋＤａの見掛けの分子寸法を有していた。
【０１７５】
例３．ｐＷＮＶｙ−ＤＪＹ及びｐＷＮＶｈ−ＤＪＹから発現されたＷＮＶキャプシド蛋白質に対する免疫応答の評価。
ペプチド
ＷＮＶＣｐアミノ酸配列の３種の主要組織適合性（ＭＨＣ）クラスＩＩ制限エピトープをＭａｃベクターソフトフェア（オックスフォードモレキュラーグループ，ＭＡ）を使用して選択した（このものは、抗原決定基及び親水性領域を予測することができる）。このペプチドを標準的なペプチド合成によって合成した。次に示す。
2004510714.tif 000002
図８は、ＷＮＶＣｐ蛋白質の全長に従って並んだこれらのペプチドを示している。
【０１７６】
試験管内で翻訳された蛋白質
また、放射性活性のない試験管内で翻訳されるＣｐ蛋白質を、上の例２に記載したように、ＴＮＴ−Ｔ７を一緒にした転写／翻訳システム（プロメガ社，マジソン，ＷＩ）を使用して非放射性成分により生成した。試験管内翻訳の対照物を、試験管内翻訳キットを使用して発現できる挿入物を欠失させたｐｃＤＮＡ３．１ベクター（インビトロゲン社，サンディエゴ，ＣＡ）により生成した。
【０１７７】
マウスのＤＮＡ接種
ＷＮＶＣｐ遺伝子産物に対するＴ細胞仲介免疫応答を評価するために、生体内でのマウスの実験を組み立てた。６〜８週間の雌のＢＡＬＢ／ｃマウス（ハーレン・スピローグ・ドーリー社，インディアナポリス，ＩＮ）の大腿四頭筋に１００μｇのｐＷＮＶｈ−ＤＪＹ、ｐＷＮＶｙ−ＤＪＹ又はｐｃＤＮＡ３．１（挿入物なし）のＰＢＳ及び０．２５％ブピバカイン・ＨＣｌ（シグマ社，セントルイス，ＭＯ）溶液を注射した。２週間後、このマウスは、さらに１００μｇのＤＮＡ注射の増量を受けた。この増量注射の３０日後に、このマウスを犠牲にし、その脾臓を採取し、そしてそのリンパ球を単離し、細胞の免疫応答について試験した。
【０１７８】
リンパ増殖性検定
採取された脾臓リンパ球を、それぞれの免疫化された群につき２匹のマウスについて貯留し、５×１０６細胞／ｍｌの濃度に懸濁した。５×１０５の細胞を含有する１００μｌのアリコートを９６ウェル平底マイクロタイタープレートのそれぞれのウェルに直ちに添加した。再構成ペプチド、試験管内翻訳蛋白質又は試験管内翻訳対照物を５μｇ／ｍｌ及び１μｇ／ｍｌ（並びに試験管内翻訳蛋白質及び試験管内翻訳対照蛋白質について０．５μｇ／ｍｌ）の濃度でウェルに添加した。コンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）を陽性の増殖性対照物として使用した。この検定条件を３通りで組み立てた。この細胞を５％のＣＯ２中３５℃で３日間培養した。１μＣｉのトリチウムチミジンをそれぞれのウェルに添加し、その細胞を３７℃で１８時間培養した。プレートを採取し、取り込まれたトリチウムチミジンの量をベータプレート読みとり装置（ウォレス社，トゥルク，フィンランド）で測定した。刺激指数を次式から決定した。
刺激指数（ＳＩ）＝（実験的計数／自発的計数）。
自発的計数のウェルには、無関係の蛋白質の対照として与えた５％のウシ胎仔血清が含まれた。結果を表２に示す。
【０１７９】
ｐＷＮＶｙ−ＤＪＹ又はｐＷＮＶｈ−ＤＪＹ（「Ｈ」又は「Ｙ」）のいずれかで免疫化されたマウスから単離され且つＷＮＶＣ−Ｐ３（「ペプチド３」）又は全３種のＣｐペプチド（「ペプチド１２３」）の混合物と共に培養された脾臓細胞は、基礎ベクターｐｃＤＮＡ３．１で免疫化された群中のマウスから単離された脾臓細胞よりも有意に高いＳＩ値をもたらした。
【表１】
2004510714.tif 000003
表２は、リンパ球増殖性検定の結果を示している。それぞれの条件について示された値は、３組のウェルについて平均された刺激指数である。試験されたそれぞれの免疫化の群について、脾臓細胞をこの群内の２匹のマウスから貯留した。「Ｈ」は、ｐＷＮＶｈ−ＤＪＹで免疫化した群からの脾臓細胞を示す。「Ｙ」は、ｐＷＮＶｙ−ＤＪＹで免疫化されたマウスの群からの脾臓細胞を示す。「ｐｃＤＮＡ３．１」は、ｐｃＤＮＡ３．１で免疫化されたマウスの対照群からの脾臓細胞を示す。ペプチド１、２及び３は、上記のＷＮＶＣ−Ｐ１、ＷＮＶＣ−Ｐ２及びＷＮＶＣ−Ｐ３ペプチドである。「ペプチド１２３」は、ペプチド１、２及び３の混合物を示す。「Ｙ蛋白質」は、ｐＷＮＶｙ−ＤＪＹ構築物から試験管内で翻訳されたＣｐ蛋白質を示す。「対照タンパク」は、上述したように、発現できる挿入物を全く含有しないｐｃＤＮＡ３．１ベクターにより生じた試験管内翻訳対照物を示している。
【０１８０】
フローサイトメトリーによる細胞内ＩＦＮ−γの検出
５％のウシ胎仔血清（ＦＢＳ）（Ｒ５媒体）が追加され、５０Ｕ／ｍｌの組換えヒトインターロイキン２（ｒＨｕＩＬ−２）（インタージェン社，パーチェス，ＮＹ）を含有する１００μｌのＲＰＭＩ−１６４０、１０μｇ／ｍｌのブレフェルジンＡ（ＢＤファーミンジェン社，サンディエゴ，ＣＡ）、１００ｎｇ／ｍｌのホルボール１２ミリステート１３−アセテート（ＰＭＡ）（シグマ社，セントルイス，ＭＯ）及び１μｇ／ｍｌのイノマイシン（シグマ社）を丸底９６ウェルプレートのそれぞれのウェルに添加した。４μｇ／ｍｌでの試験管内翻訳Ｃｐ蛋白質又は試験管内翻訳対照蛋白質を５０μｌのＲ５媒体中で添加した。蛋白質抗原（Ａｇ）を添加した後に、単離した脾臓細胞をそれぞれのウェルに１×１０６細胞で５０μｌのＲ５媒体中で添加した。フローサイトメトリーの補正のために、実験を受けていないマウスからの脾臓細胞をＩＬ−２及びブレフェルジンＡのみでインキュベートした。このプレートを３７℃の５％ＣＯ２インキュベーター中で５〜６時間インキュベートした。また、対照として、脾臓細胞を抗原なしでインキュベートした。インキュベーション後に、プレートを１２００ｒｐｍで５分間回転させ、上澄み液を捨てた。それぞれのウェル中の細胞を１％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）が追加された２００μｌのＰＢＳで再懸濁し、氷上に１５分間置き、１２００ｒｐｍで回転させ、そして０．１μｇのＰＥ結合抗ＣＤ−４ｍ抗体及び０．１μｇのＣｙＣ結合抗ＣＤ４４ｍ抗体（両者はＢＤファーミンジェン社（サンディエゴ，ＣＡ）製である。）を含有する５０μｌのＰＢＳ／１％ＢＳＡで再懸濁した。３０分間４℃でインキュベートした後、細胞をＰＢＳ／１％ＢＳＡで２回洗浄し、この細胞ペレットを１００μｌのＣｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍ溶液（ＢＤファーミンジェン社，サンディエゴ，ＣＡ）に再懸濁し、４℃で２０分間インキュベートした。細胞を１×Ｐｅｒｍ／Ｗａｓｈ（ＢＤファーミンジェン社，サンディエゴ，ＣＡ）で２回洗浄し、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）結合抗ＩＦＮ−γ抗体（ＢＤファーミンジェン社，サンディエゴ，ＣＡ）を０．１μｇ／試料の濃度で含有する５０μｌのＰｅｒｍ／Ｗａｓｈ溶液に再懸濁した。４℃で３０分間インキュベートした後、細胞を１×Ｐｅｒｍ／Ｗａｓｈ溶液で２回洗浄し、２％のｐ−ホルムアルデヒドで固定し、そしてフローサイトメトリーによって分析されるまで４℃で保管した。
【０１８１】
ＣＤ４４の発現を活性化マーカーとして使用する。ＣＤ４４は、造血及び非造血細胞で広く発現する細胞接着受容体である。ＢＡＬＢ／ｃマウスは、ＣＤ４４＋Ｔ細胞の比較的大きな部分集合を有する。末梢では、ＣＤ４４発現のレベルは、Ｂ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞及び記憶細胞の活性化により増加し、これは、それらのＣＤ４４ｈｉ表現型（高レベルのＣＤ４４Ｈアイソフォームを発現する）によって同定できる。
【０１８２】
ＣＤ４＋Ｔ細胞依存性細胞内ＩＦＮ−γ産生をフローサイトメトリーによって定量した。その結果は、図１０に示すように、基礎ベクターｐｃＤＮＡ３．１又はＣｐ蛋白質発現用構築物のｐＷＮＶｈ−ＤＪＹ若しくはｐＷＮＶｙ−ＤＪＹによって免疫化されたマウスからの脾臓細胞について抗原に特異的なＩＦＮ−γの応答を示す。ｐＷＮＶｙ−ＤＪＹ免疫化マウスから単離された脾臓細胞は、試験管内で翻訳されたＣｐ蛋白質による刺激に基づいて、ｐＷＮＶｈ−ＤＪＹ免疫化マウスから単離された脾臓細胞よりも高レベルのＩＦＮ−γを発現した。
【０１８３】
例４．ＴＵＮＥＬ検定によるアポトーシスの検査
個々の細胞のアポトーシスをＴＵＮＥＬ検定によって３種の異なる細胞系：ＨｅＬａ細胞、ＲＤ細胞及び２９３細胞で決定した。細胞をｐＷＮＶｈ−ＤＪＹ又はｐＷＮＶｙ−ＤＪＹ構築物のいずれかでトランスフェクトし、ＴＵＮＥＬ検定によってアポトーシスについて検査した。両構築物は、３種の細胞系の全てでアポトーシスを誘導した。
【０１８４】
ＴＵＮＥＬ検定を「フルオレセイン Ｉｎ ｓｉｔｕ 細胞死検出キット」（ロシュモレキュラーバイオケミカルズ社，インディアナポリス，ＩＮ）を製品プロトコルに従って使用して実施した。ＤＮＡの切断を、ゲノムＤＮＡの遊離３’末端をフルオレセイン−ｄＵＴＰで標識するターミナルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）によって検出した。簡単に言うと、細胞を固定し且つ０．１％のＴｒｉｔｏｎ−Ｘ、０．１％のクエン酸ナトリウムが追加されたＰＢＳで浸透化させ、次いでこの細胞を、ＴｄＴ及びフルオレセイン−ｄＵＴＰを含有する「ＴＵＮＥＬ反応混合液」でインキュベートした。フルオレセインを結合し、取り込まれたｄＵＴＰを蛍光顕微鏡で検出した。
【０１８５】
ｐＷＮＶｈ−ＤＪＹ又はｐＷＮＶｙ−ＤＪＹ構築物のいずれかでトランスフェクトされたＨｅＬａ細胞、ＲＤ細胞及び２９３細胞の分析のためのデータは、特異的なシグナルを特定するために顕微鏡において異なるフィルターで捕捉した。ＦＩＴＣフィルターによって明らかにされるような緑色のシグナルは、アポトーシス細胞に取り込まれたフルオレセインを表していた。また、この細胞の画像は、特定のアポトーシスシグナルと背景のシグナルとを分けるためにＦＩＴＣの二重フィルター及びローダミンで捕捉した。二重フィルター下での緑色蛍光は、取り込まれたフルオレセイン−ｄＵＴＰからの正しい蛍光シグナルを示していた。ＤＡＰＩフィルターを使用して細胞の核酸（このものはＤＡＰＩで染色した）を明らかにした。全ての細胞がＴＵＮＥＬ陽性であったわけではなかった。細胞形態は、その画像が照射野内でＤＡＰＩフィルターで捕捉されたときに明らかになった。
【０１８６】
類似の結果がヒト神経芽細胞腫細胞系（ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ−２２６６）内のｐＷＮＶｙ−ＤＪＹ構築物によって得られた。
【０１８７】
例５：アネキシンＶフローサイトメトリー分析
ＨｅＬａ細胞を、強化緑色蛍光蛋白質（ＥＧＦＰ）発現ベクターｐＥＧＦＰ２−Ｎ１（クローンテック社）単独で（トランスフェクションのマーカーとして）又はｐＷＮＶｈ−ＤＪＹ若しくはｐＷＮＶｙ−ＤＪＹのいずれかを組み合わせたｐＥＧＦＰ２−Ｎ１でトランスフェクトした。トランスフェクションの２日後に、この細胞をフィコエリトリン（ＰＥ）結合アネキシンＶで染色した。染色細胞をフローサイトメトリーによって分析した。アネキシンＶ陽性細胞の母集団をＥＧＦＰ陽性の事象のゲートから計数し、そのデータをＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェアを使用して取得した。対照細胞と比較して１０倍までのアポトーシスの誘導がＷＮＶ−Ｃｐによる処理によって観察された（図１３）。
【０１８８】
例６：ＷＮＶ−Ｃｐ蛋白質のアポトーシス誘導ドメインの分析
上記の例３及び図１１に記載されるように、ペプチドＷＮＶＣ−Ｐ３を、培養細胞のアポトーシスを誘導するその能力について試験した。ペプチドＷＮＶＣ−Ｐ３をＳＨ−ＳＹ５Ｙ神経芽細胞腫細胞（ＡＴＣＣ，マナッサス，ＶＡ）と共に１×１０５細胞当たり１０μｇのペプチド濃度でインキュベートした。２４時間後に、ＴＵＮＥＬ分析を実施した。ＴＵＮＥＬ陽性細胞がＷＮＶＣ−Ｐ３ペプチドで処理した細胞について同定されたが、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）からの対照ペプチドで処理した細胞については同定されなかった。
【０１８９】
例７：ｐＣＷＮＶＣｐによる免疫化は抗原特異的体液性免疫応答を誘導する。
ＤＮＡワクチンによって生じた生体内での免疫応答のレベルを調査するために、マウスをｐＣＷＮＶＣｐ又はｐＣＤＮＡ３対照プラスミドで筋肉注射により免疫化させた。６〜８週間の雌のＢＡＬＢ／ｃマウス（ハーラン・スピローグ・ドーリー社，インディアナポリス，ＩＮ）の大腿四頭筋にリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）及び０．２５％のブピバカイン−ＨＣｌ（シグマ社，セントルイス，ＭＯ）中に処方された対象となる１００μｇの各ＤＮＡ構築物を０、４及び８週間時に注射した。注射前及び注射後の様々な時点で、このマウスを眼窩後で出血させ、その血清を後の分析のために集めた。集めた血清試料をＥＬＩＳＡにより１：１００、１：４００、１：８００及び１：１６００の希釈でＣｐペプチド（ＷＮＶＣ−Ｐ３：ＴＬＴＳＡＩＮＲＲＳＳＫＱＫＫＲＧＧＫＴＧＩ）に対する特異的な抗体の応答について分析した。ＰＢＳで１０μｇ／ｍｌの濃度に希釈した５０μｌのＷＮＶＣ−Ｐ３を、キム等の「ＣＤ８陽性Ｔ細胞はケモカインの発現を介して抗原特異的免疫応答を制御する」，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ，１０２：１１１２−１１２４（本明細書はこれを参照している）に前もって記載されたように、マイクロタイターのウェル上に一晩４℃で吸着させた。このプレートをＰＢＳ−０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０で洗浄し、０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０を含む３％のＢＳＡのＰＢＳ溶液で３５℃で１時間にわたってブロックした。マウス抗血清を０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０で希釈し、３７℃で１時間インキュベートし、次いでＨＲＰ結合ヤギ抗マウスＩｇＧ（シグマ社，セントルイス，ＭＯ）と共にインキュベートした。このプレートを洗浄し、３’３’５’５’ＴＭＢ（シグマ社）緩衝液で展開した。
【０１９０】
注射前の血清（０日目に集めた）は、いかなるＣｐ特異的抗体応答も示さなかった（データは示さない）。ｐｃＤＮＡ３対照物で免疫化されたマウスはいかなるＣｐ特異的抗体応答も示さなかったが、ｐＣＷＮＶＣｐで免疫化されたマウスでは強力なＣｐ特異的抗体応答が検出された。特に、ＤＮＡ免疫化によって生じたＣｐ特異的抗体応答のレベルは、ＡＴＣＣ（マナッサス，ＶＡ）から得られた陽性の高度免疫マウス血清のそのレベルよりも強力であった。
【０１９１】
さらに、ＤＮＡワクチンによって誘導されたＷＮＶＣｐ特異的ＩｇＧのサブクラスを決定した。ＩｇＧ１のイソタイプの産生はＴｈ２型サイトカインによって誘導されるが、ＩｇＧ２ａイソタイプはＴｈ１型サイトカインによって調節されることが報告された（フィンケルマン等，１９９０，「生体内での免疫グロブリンイソタイプ選択のリンホカインの制御」，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，８：３０３−３３３、本明細書はこれを参照している）。Ｃｐ特異的ＩｇＧサブクラスの相対的レベルの決定のために、ＨＲＰを結合した抗ネズミＩｇＧ１及びＩｇＧ２ａ（Ｚｙｍｅｄ社，サンフランシスコ，ＣＡ）を抗ネズミＩｇＧ−ＨＲＰの代わりに使用した。その後、これにＡＢＴＡ基質溶液（ケミコン社，テメキュウラ，ＣＡ）を添加した。それぞれの段階において、プレートを洗浄用緩衝液（ＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０）で３回洗浄した。このプレートをダイナテックＭＲ５０００プレート読み取り器で４５０ｎｍでの光学密度でもって読みとった。図１２Ｂに示すように、ＤＮＡ免疫化から生じたｐＣＷＮＶＣｐによるＩｇＧ応答の大部分は、ＩｇＧ２ａイソタイプのものであった。この強いＴｈ１型の偏りは、ＩｇＧ２ａの大きさ及びＩｇＧ２ａ対ＩｇＧ１（Ｔｈ１対Ｔｈ２）の相対比の両方によって証明された。
【０１９２】
ＷＮＶＣｐ特異的血清抗体を免疫沈降／ウェスタンブロット分析によって決定した。放射性同位元素なしに試験管内で翻訳されたＷＮＶＣｐ蛋白質を抗６ＸＨｉｓ（Ｃ末端）ポリクローナル抗体（ＮＢＬ社，名古屋，日本）で免疫沈降させ、１５％のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで分離し、ＰＤＶＦ膜（ミリポア社）に移行させ、このものを帯状に切った。それぞれの帯状物をｐＣＷＮＶＣｐ又はｐｃＤＮＡ３で免疫化したマウス（１：１００希釈で）からのマウス免疫血清と共にインキュベートし、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合抗マウスＩｇＧと１：２０００の濃度でハイブリッド形成させた。すすぎ後に、この帯状物をＥＣＬ化学発光検出キット（アマーシャム社）で現像した（図１２Ｃ）。
【０１９３】
例８：ｐＣＷＮＶＣｐによる免疫化は強力な抗原特異的Ｔｈ１型細胞性免疫応答を誘導する。
Ｔ細胞によって放出されたサイトカインのレベルは、免疫応答の動向及び大きさを反映する。刺激されたＴ細胞によって産生されたＴｈ１（ＩＦＮ−γとＩＬ−２）及びＴｈ２（ＩＬ−４）型サイトカインを検査した。原型的なＴｈ１型サイトカインであるＩＦＮ−γは、ＣＤ４＋Ｔｈ１細胞及びＣＤ８＋Ｔ細胞によって主に産生される。刺激されたＴ細胞によって発現されるＩＦＮ−γのレベルは、Ｔ細胞応答の大きさを反映する。ＩＬ−２は、外部刺激によって活性化されたＴ細胞により主に産生される。このことは、抗原特異的Ｔ細胞の増殖及びクローン性増殖にとって重要である（モーガン等，１９７６，「通常のヒト骨髄からのＴリンパ球の選択的な試験管内での培養」，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９３：１００７−１００８、本発明はこれを参照している）。一方、ＩＬ−４は、Ｂ細胞仲介免疫応答において主要な役割を果たす原型的なＴｈ２型サイトカインである（シーダー及びポール，１９９４，「ＣＤ４＋Ｔ細胞によるリンホカイン産生表現型の獲得」，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１２：６３５−６７３、本明細書はこれを参照している）。
【０１９４】
また、免疫化後のＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞仲介免疫応答のレベルも検査した。マウスは、２週に区切られた２種のＤＮＡ免疫化（それぞれ１００μｇ）を受けた。２回目の注射後１週間で、このマウスを安楽死させ、脾臓を採取した。リンパ球を脾臓から採取し、赤血球を除去し且つキム等，１９９７，「補助的刺激分子の共放出を介したＤＮＡ免疫化に対する生体内免疫応答の工学技術」，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１５：６４１−６４６（本明細書はこれを参照している）に記載されたような新鮮な媒体で数回洗浄することによってエフェクター細胞として調製した。単離細胞懸濁液を５×１０６細胞／ｍｌの濃度に再懸濁した。５×１０５細胞を含有する１００μｌのアリコートを９６ウェルマイクロタイター平底プレートのそれぞれのウェルに直ちに添加した。５μｇ／ｍｌの終濃度でのＷＮＶキャプシド特異的ペプチドプール（ＷＮＶＣ−Ｐ１：ＳＫＫＰＧＧＰＧＫＳＲＡＶＮＭＬＫＲＧＭＰＲ、ＷＮＶＣ−Ｐ２：ＫＲＡＭＬＳＬＩＤＧＫＧＰＩＲＦＶＬＡ、ＷＮＶＣ−Ｐ３：ＴＬＴＳＡＩＮＲＲＳＳＫＱＫＫＲＧＧＫＴＧＩ）を３通りでウェルに添加した。この細胞を５％ＣＯ２中で３７℃で４日間インキュベートした。これらのウェルから上澄み液を４日目に集め、ＥＬＩＳＡキット（バイオソース社，カマリロ，ＣＡ、ＲアンドＤシステムズ社，ミネアポリス，ＭＮ）を使用してサイトカインＥＬＩＳＡ法によってＩＦＮ−γ、ＩＬ−２又はＩＬ−４の放出について試験した。
【０１９５】
図１３に示すように、ｐＣＷＮＶＣｐ免疫化マウスからＩＦＮ−γ及びＩＬ−２の有意な発現レベルが観察されたが、対照の免疫化マウスからは背景レベルのみが観察された。一方、全ての免疫化された群から放出されたＩＬ−４のレベルは類似していた。これらの結果は、ＤＮＡワクチン接種が免疫化マウスにおいて特異的且つ強力なＴｈ−１型細胞性免疫応答の誘導を生じさせたことを示している。
【０１９６】
例９：ｐＣＷＮＶＣｐによる免疫化はケモカインＭＩＰ−１β及びＲＡＮＴＥＳの抗原特異的な産生を誘導する。
ワクチンで誘導された細胞性免疫応答の特徴付けは、刺激されたＴ細胞からのβ−ケモカイン（ＭＩＰ−１β及びＲＡＮＴＥＳ）の発現プロフィルを検査することによって拡大された。ケモカインは、免疫及び炎症応答の重要なモジュレーターである。これらのものは、白血球を血管から宿主防衛の周辺部位に輸送する分子調節に特に重要である。Ｔ細胞産生ケモカインは、細胞の免疫の拡大に重要な役割を果たすことが報告された（キム等，１９９８，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，「ｓｕｐｒａ」、キム等，２０００，「顆粒球コロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）は、生体内で免疫応答を調節し且つ樹状細胞を引き寄せ得る」，Ｈｕｍａｎ　Ｇｅｎｅ　Ｔｈｅｒａｐｙ，１１：３０５−３２１、本明細書はこれらを参照している）。従って、刺激されたＴ細胞によって産生されたケモカインのレベルは、抗原に特異的な細胞性免疫応答のレベル及び資質についてさらなる見識を与える。例８に記載されたように、刺激されたＴ細胞からの上澄み液をＥＬＩＳＡキット（バイオソース社，カマリロ，ＣＡ、ＲアンドＤシステムズ社，ミネアポリス，ＭＮ）を使用してβ−ケモカインＭＩＰ−１β及びＲＡＮＴＥＳの放出について試験した。ｐＣＷＮＶＣｐワクチンによる免疫化は、対照ベクターの免疫化よりも大きいレベルのＭＩＰ−１β及びＲＡＮＴＥＳの発現を有意に誘導した（図１４）。ｐＣＷＮＶＣｐ免疫化動物からのＭＩＰ−１β及びＲＡＮＴＥＳのこれらの増加レベルは、ｐＣＷＮＶＣｐ免疫化が上に観察された抗原特異的Ｔ細胞応答を誘発したという結論をさらに支持するものである。
例１０：ｐＣＷＮＶＣｐによる免疫化は抗原特異的ＣＴＬ応答を誘導する。
また、免疫化後の抗原特異的障害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）応答のレベルも検査した。５時間の５１Ｃｒ放出の大量ＣＴＬ検定を、先に記載したように（キム等，１９９７，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，「ｓｕｐｒａ」）、エフェクター脾臓細胞を試験管内で刺激し、その後特異的及び非特異的なペプチド処理標的からのクロム放出を測定することによって実施した。エフェクター脾臓細胞を５×１０６細胞／ｍｌでのＣＴＬ培地中でＷＮＶキャプシドペプチド（ＫＧＰＩＲＦＶＬ（配列番号２４）、ＧＧＰＧＫＳＲＡ（配列番号２５）及びＩＡＰＴＲＡＶＬ（配列番号２６））のプールで１０μｇ／ｍｌの濃度で５日間にわたって試験管内で刺激した。ＣＴＬ培地は、ＲＰＭＩ１６４０（ギブコ−ＢＲＴ社，グランドアイランド，ＮＹ）、１０％のウシ胎仔血清（ジブコ−ＢＲＬ）及びＣｏｎＡなしの１０％ＲＡＴ−Ｔ−ＳＴＩＭ（ベクトン・ディキンソン・ラブウェア社，ベッドフォード，ＭＡ）からなる。ペプチド処理標的物をＰ８１５マウスの肥満細胞腫を１０μｇ／ｍｌ濃度のペプチドプールと共にインキュベートすることによって調製した。この標的細胞を１００μＣｉ／ｍｌのＮａ２５１ＣｒＯ４で１２０分にわたって標識し、刺激されたエフェクター脾臓細胞と共に３７℃で６時間インキュベートした。ＣＴＬの溶解を１００：１及び５０：１のエフェクター：標的物（Ｅ：Ｔ） 比で決定した。特定の溶解の％を次式：
１００×（実験に基づく放出−自発的な放出）／（最大の放出−自発的な放出）
から決定した。最大の放出を１％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含有する培地中で標的細胞を溶解させることによって決定した。「自発的な放出」数についての値が「最大の放出」の２０％を超過したならば検定が有効であるとはみなさなかった。ｐｃＤＮＡ３で免疫化された対照動物から背景レベルの特異的な致死が観察された。しかしながら、ｐＣＷＮＶＣｐで免疫化された動物は、１００：１及び５０：１のエフェクター対標的物（Ｅ：Ｔ）の比で正のＣＴＬ活性を示した（図１５Ａ）。さらに、ＣＴＬ検定のための試験管内で刺激されたエフェクター細胞からの上澄み液の分析は、免疫化マウスからの増加レベルのＩＦＮ−γ産生を示した（図１５Ｂ）。
例１１：ｐＣＷＮＶＣｐによる免疫化はリンパ球の免疫化動物の筋肉への浸潤を誘導する。
ＨＩＶ及びＨＳＶのＤＮＡ免疫化モデルにおけるワクチン誘導細胞仲介免疫応答の大きさは、ワクチン注射の部位での細胞浸潤のレベルとよく相関することが分かった［キム等，２０００，Ｈｕｍａｎ　Ｇｅｎｅ　Ｔｈｒａｐｙ，「ｓｕｐｒａ」、カッターグーン等，２０００，「人工的に作り出されたＦａｓ仲介アポトーシスによる樹状細胞を含めた抗原提示細胞への標的抗原の送達」，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，１８：９７４−９７９（本明細書はこれを参照している）、アガジャニアン等，１９９９，「ＣＤ８６（Ｂ７−２）は生体内でＭＨＣ制限抗原特異的細胞障害性Ｔリンパ球応答を促進させるように機能し得る」，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６２：３４１７−３４２７（本明細書はこれを参照している）］。ｐＣＷＮＶＣｐ免疫化によって誘導された免疫活性化の力価をさらに調査するために、免疫化マウスの筋肉組織を注射部位で免疫組織化学的に検査した。
【０１９７】
６〜８週間の雌のＢａｌｂ／ｃマウス（チャールズリバーラボラトリーズ社，ウィルミントン，ＭＡ）にリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）及び０．２５％のブピバカイン−ＨＣｌ（シグマ社，セントルイス，ＭＯ）中の１００μｇのｐＣＷＮＶＣｐ又はｐｃＤＮＡ３を筋肉注射した。トランスフェクションの４８時間後に、頸骨筋を採取した。次いで、この新鮮な筋肉組織をＯ．Ｃ．Ｔ化合物（サクラファインテックＵＳＡ社，トランス，ＣＡ）中で冷凍した。４ミクロンの冷凍薄片をライカ１８００定温維持装置（ライカ社，ディアフィールド，ＩＬ）を使用して作製した。筋肉中のリンパ球の存在を検出するために、スライドをヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ及びＥ）染色液（ベクターラボ社）で染色した。このスライドをニコンＯＰＴＩＰＨＯＴ蛍光顕微鏡（株式会社ニコン，東京，日本）で４０倍の対物レンズ（ニコンＦｌｕｏ４０×Ｐｈ３Ｄ２）を使用して観察した。ニコンＵＦＸ−ＩＩによる露出調節のニコンカメラＦＸ３５ＤＸ及びコダックＥｋｔａｃｈｒｏｍｅ１６０Ｔスライドフィルムを使用してスライド写真を得た。ｐＣＷＮＶＣｐにより免疫化されたマウスの筋肉への免疫細胞の劇的な浸潤を図１６Ｂに示している。
【０１９８】
この浸潤細胞をＦＡＣＳ分析によって特徴付けた。この浸潤細胞を、「キム等，２０００，Ｈｕｍａｎ　Ｇｅｎｅ　Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｓｕｐｒａ」で先述されるように、全脚部筋肉を切開し且つ機械的力でミンチにすることによって筋肉から採取した。この細胞をグラスウール栓付き漏斗によって濾過することにより回収した。この浸潤細胞を、「キム等，２０００，Ｈｕｍａｎ　Ｇｅｎｅ　Ｔｈｅｒａｐｙ，ｓｕｐｒａ」及び「カッターグーン等、１９９０，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６０：５７０７−５７１８（本明細書はこれを参照している）」で先述されるように、ＣＤ４、ＣＤ８、Ｍａｃ−３、ＣＤ１１ｃ及びＢ２２０（ファーミンジェン社）に対する抗体を使用してＦＡＣＳにより同定した。試料は、コールターＥＰＣＳ（登録商標）ＸＬ−ＭＣＬ流動血球計算器を使用して分析した。ｐＣＷＮＶＣｐで免疫化されたマウスからの浸潤細胞には、Ｔ細胞（ＣＤ４＋とＣＤ８＋の両方）及びマクロファージ（抗Ｍａｃ３抗体で検出した）が含まれた（図１６Ｃ）。免疫化された筋肉中のこの高レベルのＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞は、高レベルのＴ細胞活性化のさらなる証拠を提供する。一方、ｐｃＤＮＡ３（対照）で免疫化されたマウスから抽出された筋肉薄片は、細胞浸潤のいかなる痕跡も示さなかった。総合すれば、これらの結果は、抗原特異的免疫応答がＤＮＡワクチン接種によって効率的に生じ得ることを示している。
例１２：ＷＮＶキャプシド蛋白質とその他のフラビウイルスキャプシド蛋白質とのアラインメント。
図１７は、ＷＮＶのキャプシド蛋白質とクンジンウイルス（ＫＪＶ）、日本脳炎ウイルス（ＪＥＶ）及びデングウイルス（ＤＥＮ２）を含めたその他のフラビウイルスからのキャプシド蛋白質の部分とのアラインメントを示しており、これらの蛋白質の中で高い一致性があることを示している。
【０１９９】
例１３：ＷＮＶＣｐ蛋白質はミトコンドリア経路によって生体内及び試験管内でアポトーシスを誘導する。
西ナイルウイルスのＣｐ蛋白質は、その他のＷＮＶ遺伝子産物の非存在下では、組織培養の際に速やかに核凝集及び細胞死を誘導する。アポトーシスはミトコンドリア経路によって誘導される。なぜならばミトコンドリア膜電位の観察された変化は、カスパーゼ９の活性化及び下流のカスパーゼ３の活性化を伴ったからである。さらに、アポトーシス決定ドメインは、欠失変異分析によってＷＮＶＣｐ蛋白質の３’末端にあることが同定された。ＷＮＶＣｐ発現カセットの筋肉注射後に、筋肉組織でアポトーシスがはっきりと観察された。最も重要なことには、ＷＮＶＣｐ遺伝子のマウス脳の線条体への送達は、生体内でキャプシド誘導アポトーシスによる細胞死を生じさせた。これらの研究は、ＷＮＶのキャプシド蛋白質がアポトーシスカスケードの誘導によってウイルス性病原の側面を司ることを示し、このアポトーシス機能の抑制をＷＮＶ感染の治療のための実行可能な治療方法として利用できるという技術思想を支持するものである。さらに、ＷＮＶキャプシド蛋白質とＨＩＶ−１ｖｐｒ遺伝子産物の既知のアポトーシス誘導領域との間には配列の一致性／相同性がある（アヤボー等，１９９７，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．，３：１１１７−１１２３、スチュアート等，１９９７，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７１：５５７９−５５９２、本明細書はこれらのいずれも参照している）（図１８及び１９）。
【０２００】
例１４：ＷＮＶＣｐ及びＨＩＶＶｐｒとその他のアポトーシス関連ウイルスの蛋白質との比較。
用語「アポトーシス」、「脳炎」及び「脳膜炎」についてのＭｅｄｌｉｎｅ検索は、感染した個体のこのような症状によって同定された様々なウイルスのリストをもたらした。これらのウイルス蛋白質のアミノ酸配列をＷＮＶキャプシド蛋白質又はＨＩＶ−１８９．６蛋白質についてのアミノ酸配列と比較した。
ＷＮＶキャプシド蛋白質のアラインメント（図１９）
１．ＨＩＶ：ＷＮＶキャプシド蛋白質とＨＩＶ−１Ｖｐｒ（既知のアポトーシス誘導性蛋白質）とは、配列相同性を共有する。
２．単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）：ＨＳＶの主要なキャプシド蛋白質とＷＮＶＣｐの配列アラインメントは、可能性のあるアポトーシス誘導能力を示した。興味深いことに、脳炎による破壊は、病気の結果と相関するように関係していた。
３．エボラウイルスは、フィロウイルス科内のフィロウイルス属の一員である。この病原体は、出血熱の誘導と結びつけられてきた。ＷＮＶキャプシド蛋白質とエボラヌクレオキャプシド蛋白質のアラインメントは、ＷＮＶとｎｅｆアポトーシスドメインのなかで検出可能なアミノ酸の相同性を示した。また、ＷＮＶキャプシド蛋白質との糖蛋白質のアラインメントは、前アポトーシスドメインの相同性を示した。
４．風疹ウイルスは、トガウイルス科の一員であり且つ試験管内の観点からアポトーシス誘導に結びつけられてきた。風疹ウイルスキャプシド蛋白質の配列アラインメントは、ＷＮＶキャプシド蛋白質並びにアポトーシスドメインの中でＨＩＶ−１Ｖｐｒ蛋白質（図１９参照）及びＴａｔ蛋白質（データは示さない）と相同性を示した。
ＨＩＶ−１８９．６Ｖｐｒとのアラインメント（図１９）
１．シンドビスウイルス：公開されたデータでは、特に、神経細胞の細胞死に至るシンドビスウイルスのアポトーシスの性質が報告されている。シンドビスウイルスのｐ２３０非構造蛋白質とＨＩＶ−１Ｖｐｒ蛋白質（及びＴａｔ蛋白質（データは示さない））とのアラインメントは、Ｂｃｌ−２会合アポトーシス領域内で孤立した相同性を示した。興味深いことに、近年公開されたデータでは、Ｂａｘによるシンドビスアポトーシスの抑制が示された。
２．キュウリモザイクウイルス：以前に公開された報告では、キュウリモザイクウイルスがネクローシスによる深刻な細胞致死を誘導することが示された。しかしながら、近年のデータでは、トマト内で細胞死に関連したアポトーシス特性が示された。興味深いことに、我々のｖｐｒ８９．６とＣＭＶ２Ａ蛋白質の配列アラインメントもアポトーシスドメインの相同性を示した。また、ＴａｔＨＩＶ遺伝子との比較は、ＣＭＶキャプシド蛋白質との前アポトーシス相同性も与えた。
３．ＨＴＬＶ：このウイルスとＨＩＶ−１のＴａｔ蛋白質との比較は、このウイルスのアポトーシス誘導能力について可能性のある見識を与えた。ＴａｔとＨＴＬＶ−１ｐ２７蛋白質との配列アラインメントは、アポトーシスドメイン内で配列の相同性を示した。
４．ニバウイルス：このウイルスは、パラミクソウイルス科の一員であり且つヒトにおいて非常に致命的であり得る。近年の発生は、シンガポールで観察され、しかして米国に移動する可能性を増大させた。さらに、このウイルスは、西ナイルウイルス及び脳脊髄液を標的とするその他にウイルスに類似する臨床転帰を有し且つ神経脳炎を引き起こすように思われる。ニバウイルスの融合蛋白質とＨＩＶ８９．６Ｖｐｒ蛋白質との比較は、興味深い相関関係を与えた。強い相同性がニバ融合蛋白質内の細胞周期停止ドメインで見いだされた。この表面蛋白質は、有力なＤＮＡワクチンの候補であるかもしれない。この意味は、このものがアポトーシス及び細胞周期停止の発生に重要な役割を果たすということである。
５．レオウイルス：レオウイルスは、神経細胞でＴＲＡＩＬ依存性アポトーシスを誘導し且つＧ２／Ｍ期の細胞周期停止を誘導する。レオウイルスのコアマイナー型Ｍｕ２蛋白質の一部分とＨＩＶ８９．６Ｖｐｒ蛋白質との間で相同性が確認された。
【０２０１】
前述の例は、本発明を例示することを意図し且ついかなる方法でも本発明を限定するように解釈すべきではない。当業者であれば、本発明の精神及び範囲内にある変更を認識するであろう。
【０２０２】
ここで引用した全ての参考文献は、その全体を参照することによってここに盛り込まれる。
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１の上図は、１９９９年ニューヨークヒト単離ＷＮＶのゲノム構成の概略図である。下図は、ＷＮＶキャプシド蛋白質発現ベクターｐＷＮＶｈ−ＤＪＹ及びｐＷＮＶｙ−ＤＪＹの構造の概略図である。
【図２】
図２はＷＮＶキャプシド蛋白質発現ベクターｐＷＮＶｈ−ＤＪＹの制限エンドヌクレアーゼ地図を示す。
【図３】
図３はＷＮＶキャプシド蛋白質発現ベクターｐＷＮＶｈ−ＤＪＹの特徴地図を示す。
【図４】
図４は、５８６４ヌクレオチド塩基対を有する、ＷＮＶキャプシド蛋白質発現ベクターｐＷＮＶｈ−ＤＪＹの二本鎖ヌクレオチド全配列を注釈付きで示したものである。上側のヌクレオチド鎖は配列番号１である。アミノ末端ｓＩｇＥリーダーペプチドの蛋白質配列（配列番号２）は、ヌクレオチド９１７〜９７０のコード領域の下に示した。発現された蛋白質のＷＮＶ Ｃｐ蛋白質部分の蛋白質配列（配列番号３）は、ヌクレオチド９７１〜１３３６のコード領域の下に示した。
【図５】
図５はＷＮＶキャプシド蛋白質発現ベクターｐＷＮＶｙ−ＤＪＹの制限エンドヌクレアーゼ地図を示す。
【図６】
図６はＷＮＶキャプシド蛋白質発現ベクターｐＷＮＶｙ−ＤＪＹの特徴地図を示す。
【図７】
図７は、５８６４ヌクレオチド塩基対を有する、ＷＮＶキャプシド蛋白質発現ベクターｐＷＮＶｙ−ＤＪＹの二本鎖ヌクレオチド全配列を注釈付きで示したものである。上側のヌクレオチド鎖は配列番号４である。アミノ末端ｓＩｇＥリーダーペプチドの蛋白質配列は、ヌクレオチド９１７〜９７０のコード領域の下に示した。発現された蛋白質のＷＮＶ Ｃｐ蛋白質部分の蛋白質配列は、ヌクレオチド９７１〜１３３６のコード領域の下に示した。
【図８】
図８は２種の異なるＷＮＶキャプシド蛋白質構造体ｐＷＮＶｈ−ＤＪＹ及びｐＷＮＶｙ−ＤＪＹの生体外転写／翻訳産物を、３５Ｓ標識化し免疫沈降し、電気泳動分離したオートラジオグラフである。
【図９】
図９はＷＮＶ　Ｃｐ蛋白質の全アミノ酸配列（配列番号５）を示す。実施例３で用いた、３種の腫瘍組織適合（ＭＨＣ）クラスＩＩ制限エピトープペプチド［ＷＮＶＣ−Ｐ１（配列番号６）、ＷＮＶＣ−Ｐ２（配列番号７）及びＷＮＶＣ−Ｐ３（配列番号８）］を、Ｃｐアミノ酸配列の下に示す。
【図１０】
図１０は生体外で刺激された、ＤＮＡ免疫化マウス由来脾臓細胞における、細胞内ＩＦＮ−γ発現のフローサイトメトリー分析を示す。図の上段では、細胞はＩＮＦ−γ及びＣＤ４４について染色されている。下段では、細胞はＣＤ４及びＩＦＮ−γについて染色されている。
【図１１】
図１１は、強化緑色蛍光蛋白質（ＥＧＦＰ）発現ベクターｐＥＧＦＰ２−Ｎ１単独で、又はｐＷＮＶｈ−ＤＪＹ又はｐＷＮＶｙ−ＤＪＹと組み合わせてトランスフェクトした後の、ＨｅＬａ細胞のアネキシンＶフローサイトメトリー分析の結果を示す。
【図１２】
図１２Ａは、免疫化したマウスにおける、ＷＮＶキャプシド蛋白質（Ｃｐ）特異的抗体応答を示す。図１２Ｂは免疫化マウスにおけるＷＮＶ　Ｃｐ特異的ＩｇＧ抗体応答のＩｇＧサブセット分析を行い、免疫化５ヶ月後に調べたＷＮＶ　Ｃｐ特異的ＩｇＧ１及びＩｇＧ２ａ応答、並びにＩｇＧ２ａ／ＩｇＧ１比を示す。図１２Ｃは免疫化マウスにおけるＷＮＶ　Ｃｐ特異的血清抗体を、免疫沈降／ウエスタンブロット分析によって調べた結果を示す。
【図１３】
図１３は、刺激を受けたＴ細胞によるＩＦＮ−γ（Ｔｈ１）、ＩＬ−２（Ｔｈ１）及びＩＬ−４（Ｔｈ２）の産生を示す。
【図１４】
図１４は、刺激を受けたＴ細胞によるケモカインの産生を示す。
【図１５】
図１５Ａ及び図１５Ｂは、陽性の抗原特異的ＣＴＬ応答の誘導を示す。
【図１６】
図１６Ａ、１６Ｂ及び１６Ｃは、筋肉組織の分析を示す。
【図１７】
図１７は、ＷＮＶ　Ｃｐ蛋白質配列と、他のフラビウイルス属由来のキャプシド蛋白質の部分配列とのアラインメントを示す。上段はクンジンウイルス由来のＣｐ蛋白質の最初の１２３アミノ酸（配列番号９）とＷＮＶ　Ｃｐ蛋白質の全１２３アミノ酸配列とを比較している。中段は日本脳炎ウイルスのＣｐ蛋白質の最初の１１３アミノ酸（配列番号１０）とＷＮＶ Ｃｐ蛋白質の最初の１１４アミノ酸（配列番号１１）とを比較している。下段はデングウイルスのＣｐ蛋白質の最初の部分のアミノ酸（配列番号１２）とＷＮＶ　Ｃｐ蛋白質のアミノ酸１０〜９８（配列番号１３）とを比較している。
【図１８】
図１８は、ＷＮＶ　Ｃｐ蛋白質配列と、他のウイルス由来の蛋白質の部分配列との、並びにアポトーシス促進性蛋白質の部分配列とのアラインメントを示す。ＷＮＶ　Ｃｐ蛋白質（アミノ酸１〜１２３）の全配列は、最上段にボールドで示した。
【図１９】
図１９は、ＨＩＶ−１　８９．６Ｖｐｒ蛋白質配列と、他のウイルス蛋白質の部分配列との、並びにアポトーシス促進性蛋白質の部分配列とのアラインメントを示す。
【図１】
2004510714.tif 000004
【図２】
2004510714.tif 000005
【図３】
2004510714.tif 000006
【図６】
2004510714.tif 000007
【図８】
2004510714.tif 000008
【図１０】
2004510714.tif 000009
【図１１】
2004510714.tif 000010
【図１２】
2004510714.tif 000011
【図１３】
2004510714.tif 000012
【図１４】
2004510714.tif 000013
【図１５】
2004510714.tif 000014
【図１６】
2004510714.tif 000015
【国際公開パンフレット】
2004510714.tif 000016
2004510714.tif 000017
2004510714.tif 000018
2004510714.tif 000019
2004510714.tif 000020
2004510714.tif 000021
2004510714.tif 000022
2004510714.tif 000023
2004510714.tif 000024
2004510714.tif 000025
2004510714.tif 000026
2004510714.tif 000027
2004510714.tif 000028
2004510714.tif 000029
2004510714.tif 000030
2004510714.tif 000031
2004510714.tif 000032
2004510714.tif 000033
2004510714.tif 000034
2004510714.tif 000035
2004510714.tif 000036
2004510714.tif 000037
2004510714.tif 000038
2004510714.tif 000039
2004510714.tif 000040
2004510714.tif 000041
2004510714.tif 000042
2004510714.tif 000043
2004510714.tif 000044
2004510714.tif 000045
2004510714.tif 000046
2004510714.tif 000047
2004510714.tif 000048
2004510714.tif 000049
2004510714.tif 000050
2004510714.tif 000051
2004510714.tif 000052
2004510714.tif 000053
2004510714.tif 000054
2004510714.tif 000055
2004510714.tif 000056
2004510714.tif 000057
2004510714.tif 000058
2004510714.tif 000059
2004510714.tif 000060
2004510714.tif 000061
2004510714.tif 000062
2004510714.tif 000063
2004510714.tif 000064
2004510714.tif 000065
2004510714.tif 000066
2004510714.tif 000067
2004510714.tif 000068
2004510714.tif 000069
2004510714.tif 000070
2004510714.tif 000071
2004510714.tif 000072
2004510714.tif 000073
2004510714.tif 000074
2004510714.tif 000075
2004510714.tif 000076
2004510714.tif 000077
2004510714.tif 000078
2004510714.tif 000079
2004510714.tif 000080
2004510714.tif 000081
2004510714.tif 000082
2004510714.tif 000083
2004510714.tif 000084
2004510714.tif 000085
2004510714.tif 000086
2004510714.tif 000087
2004510714.tif 000088
2004510714.tif 000089
2004510714.tif 000090
2004510714.tif 000091
2004510714.tif 000092
2004510714.tif 000093
2004510714.tif 000094
2004510714.tif 000095
2004510714.tif 000096
2004510714.tif 000097
2004510714.tif 000098
2004510714.tif 000099
2004510714.tif 000100
2004510714.tif 000101
2004510714.tif 000102
2004510714.tif 000103
2004510714.tif 000104
2004510714.tif 000105
2004510714.tif 000106
2004510714.tif 000107
2004510714.tif 000108
2004510714.tif 000109
2004510714.tif 000110
2004510714.tif 000111
2004510714.tif 000112
2004510714.tif 000113
2004510714.tif 000114
2004510714.tif 000115
2004510714.tif 000116
2004510714.tif 000117
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004510714.tif 000118
【国際調査報告】
2004510714.tif 000119
2004510714.tif 000120
2004510714.tif 000121
2004510714.tif 000122