(57)【要約】新規の合成リーダーペプチドを同定した。このリーダーペプチドは、宿主細胞において産生される組換えポリペプチドの分泌を促進する方法における用途を有する。新規のリーダーペプチドをコードするポリヌクレオチドおよびこのポリヌクレオチドを設計する方法が記載される。本発明の別の局面は、新規なリーダーペプチドおよび組換えタンパク質をコードする核酸を含む融合構築物を提供することによって宿主からの組換えタンパク質の分泌を増大する方法である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離されたポリヌクレオチドであって、以下：
第１のリーダーペプチドについてのコード領域を含む第１のヌクレオチド配列であって、ここで該第１のリーダーペプチドが、以下：
（１）Ｎ末端に近い、正に帯電した２つ以上のアミノ酸、
（２）７個と１６個との間の連続した疎水性アミノ酸残基の、領域、および
（３）Ｃ末端における、配列Ｚ−Ｘ−Ｚであって、ここで各Ｚが個々に、小さい側鎖を有するアミノ酸であり、Ｘが遺伝子にコードされた任意のアミノ酸である配列；
を含む、第１のヌクレオチド配列、ならびに
第１のリボソーム結合部位を含む第２のヌクレオチド配列であって、ここで該第２のヌクレオチド配列が、該第１のヌクレオチド配列の５’であって、ここで該第１のリボソーム結合部位が、該第１のリーダーペプチドについての該コード領域に作動可能に結合し、そして該ポリヌクレオチドがＲＮＡであるかまたはＲＮＡに転写される場合、該第１のリボソーム結合部位が、アクセス可能である、第２のヌクレオチド配列
を含む、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項２】
請求項１に記載のポリヌクレオチドであって、ここで前記第１のリーダーペプチドが、αヘリックス崩壊因子として機能するアミノ酸をさらに含み、ここで該αヘリックス崩壊因子のアミノ酸が、前記連続した疎水性アミノ酸残基の領域と前記Ｚ−Ｘ−Ｚ配列との間に位置する、ポリヌクレオチド。
【請求項３】
請求項１または２に記載のポリヌクレオチドであって、第１の組換えタンパク質についてのコード領域を含む第３のヌクレオチド配列をさらに含み、ここで該第３のヌクレオチド配列が前記第１のヌクレオチド配列の３’であり、そして該第１の組換えタンパク質に結合した前記第１のリーダーペプチドを含む第１の融合ポリペプチドがコードされるような様式で、該第３のヌクレオチド配列が該第１のヌクレオチド配列に作動可能に結合する、ポリヌクレオチド。
【請求項４】
請求項３に記載のポリヌクレオチドであって、ここで前記第１の組換えタンパク質が、ヒト成長ホルモン、インターフェロン、免疫グロブリン、インスリン、または免疫付着因子である、ポリヌクレオチド。
【請求項５】
請求項３に記載のポリヌクレオチドであって、ここで前記第１の組換えタンパク質が、免疫グロブリン軽鎖、免疫グロブリン重鎖、免疫グロブリン軽鎖フラグメント、免疫グロブリン重鎖フラグメント、またはｓｃＦｖである、ポリヌクレオチド。
【請求項６】
第４および第５のヌクレオチド配列をさらに含む請求項３に記載のポリヌクレオチドであって、ここで該第４のヌクレオチド配列が、前記第３のヌクレオチド配列の３’であって、該第５のヌクレオチド配列が、該第４のヌクレオチド配列の３’であって、ここで該第４のヌクレオチド配列が、第２のリーダーペプチドについてのコード領域を含み、ここで該第２のリーダーペプチドが、以下：（１）Ｎ末端に近い、正に帯電した２つ以上のアミノ酸、（２）７個と１６個の間の連続した疎水性アミノ酸残基の、領域、および（３）Ｃ末端における、配列Ｚ−Ｘ−Ｚであって、ここで各Ｚが個々に、小さい側鎖を有するアミノ酸であり、Ｘが遺伝子にコードされた任意のアミノ酸である配列
を含み、そして該第５のヌクレオチド配列が第２の組換えタンパク質についてのコード領域を含み、ここで該第２の組換えタンパク質に結合した該第２のリーダーペプチドを含む第２の融合ポリペプチドがコードされるような様式で、該第４のヌクレオチド配列が、該第５のヌクレオチド配列に作動可能に結合し、ここで該第２のリーダーペプチドについてのコード領域が１個と３０個の間のヌクレオチドによって、該第１の組換えタンパク質についてのコード領域から分離され、
そして該ポリヌクレオチドがＲＮＡであるかまたはＲＮＡに転写される場合、該第１のリボソーム結合部位が、アクセス可能である、ポリヌクレオチド。
【請求項７】
請求項６に記載のポリヌクレオチドであって、ここで前記第２のリーダーペプチドがさらに、αヘリックス崩壊因子として機能するアミノ酸を含み、ここで該αヘリックス崩壊因子のアミノ酸が、前記連続した疎水性アミノ酸残基領域と前記Ｚ−Ｘ−Ｚ配列との間に位置する、ポリヌクレオチド。
【請求項８】
請求項６に記載のポリヌクレオチドであって、ここで前記第１の組換えタンパク質および前記第２の組換えタンパク質が、多量体タンパク質のポリペプチドサブユニットである、ポリヌクレオチド。
【請求項９】
請求項６に記載のポリヌクレオチドであって、ここで前記第１の組換えタンパク質および前記第２の組換えタンパク質が、以下：免疫グロブリン軽鎖、免疫グロブリン重鎖、免疫グロブリン軽鎖フラグメントまたは免疫グロブリン重鎖フラグメントからなる群から個々に選択される、ポリヌクレオチド。
【請求項１０】
単離されたポリヌクレオチドであって、以下：
アミノ酸配列Ｍ−Ｘｎ−（Ｋ／Ｒ）−（Ｋ／Ｒ）−Ｊｍ−Ｐ−Ｘｐ−Ｚ−Ｘ−Ｚを有する第１のリーダーペプチドについてのコード領域を含む第１のヌクレオチド配列であって、ここでＭは、メチオニンであり、Ｋは、リジンであり、Ｒは、アルギニンであり、（Ｋ／Ｒ）は、リジンまたはアルギニンのいずれかを表し、Ｐは、プロリンであり、各Ｘは個々に、遺伝子にコードされた任意のアミノ酸であり、各Ｊは個々に、以下：アラニン、ロイシン、バリン、フェニルアラニン、トレオニン、イソロイシン、セリン、グルタミン、アスパラギン、メチオニンおよびチロシンからなる群から選択されるアミノ酸であり、各Ｚは個々に、以下：アラニン、セリン、グリシン、バリンおよびトレオニンからなる群から選択されるアミノ酸であり、ｎは、１〜２の整数であり、ｐは、０〜２の整数であり、そしてｍは、７〜１６の整数である、第１のヌクレオチド配列；ならびに
第１のリボソーム結合部位を含む第２のヌクレオチド配列であって、ここで該第２のヌクレオチド配列が、該第１のヌクレオチド配列の５’であって、ここで該第１のリボソーム結合部位が、該第１のリーダーペプチドについての前記コード領域に作動可能に結合し、そして該ポリヌクレオチドがＲＮＡであるかまたはＲＮＡに転写される場合、該第１のリボソーム結合部位が、アクセス可能である、第２のヌクレオチド配列
を含む、ポリヌクレオチド。
【請求項１１】
単離されたポリヌクレオチドであって、以下：
第１のリーダーペプチドについてのコード領域含む第１のヌクレオチド配列であって、ここで該第１のリーダーペプチドが、以下：配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４および配列番号２３からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、第１のヌクレオチド配列；ならびに
第１のリボソーム結合部位を含む第２のヌクレオチド配列であって、ここで該第２のヌクレオチド配列が、該第１のヌクレオチド配列の５’であって、ここで該第１のリボソーム結合部位が、該第１のリーダーペプチドについての該コード領域に作動可能に結合し、そして該ポリヌクレオチドがＲＮＡであるかまたはＲＮＡに転写される場合、該第１のリボソーム結合部位が、アクセス可能である、第２のヌクレオチド配列
を含む、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１２】
請求項１０または１１に記載のポリヌクレオチドであって、第１の組換えタンパク質についてのコード領域を含む第３のヌクレオチド配列をさらに含み、ここで該第３のヌクレオチド配列が前記第１のヌクレオチド配列の３’であり、そして該第１の組換えタンパク質に結合した前記第１のリーダーペプチドを含む第１の融合ポリペプチドがコードされるような様式で、該第３のヌクレオチド配列が該第１のヌクレオチド配列に作動可能に結合する、ポリヌクレオチド。
【請求項１３】
請求項１１に記載のポリヌクレオチドであって、以下：配列番号５、配列番号６、配列番号７および配列番号８からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む、ポリヌクレオチド。
【請求項１４】
請求項１に記載のポリヌクレオチドおよびプロモーターを含む発現ベクターであり、ここで該プロモーターは前記第２のヌクレオチド配列の５’に位置し、かつ該プロモーターは該第２のヌクレオチド配列に作動可能に結合し、そのことによって前記第１のヌクレオチド配列の転写が該プロモーターによって制御される、発現ベクター。
【請求項１５】
請求項３に記載のポリヌクレオチドおよびプロモーターを含む発現ベクターであり、ここで該プロモーターは前記第２のヌクレオチド配列の５’に位置し、かつ該プロモーターは該第２のヌクレオチド配列に作動可能に結合し、そのことによって前記第１のヌクレオチド配列および前記第３のヌクレオチド配列の転写が該プロモーターによって制御されて、前記第１の融合ポリペプチドをコードするｍＲＮＡの産生が生じる、発現ベクター。
【請求項１６】
請求項６に記載のポリヌクレオチドおよびプロモーターを含む発現ベクターであり、ここで該プロモーターは前記第２のヌクレオチド配列の５’に位置し、かつ該プロモーターは該第２のヌクレオチド配列に作動可能に結合し、そのことによって前記第１のヌクレオチド配列および前記第３のヌクレオチド配列および前記第４のヌクレオチド配列および前記第５のヌクレオチド配列の転写が該プロモーターによって制御されて、前記第１の融合ポリペプチドおよび前記第２の融合ポリペプチドをコードするｍＲＮＡの産生が生じる、発現ベクター。
【請求項１７】
請求項１６に記載の発現ベクターであって、ここで前記第１の組換えタンパク質および前記第２の組換えタンパク質が、多量体タンパク質のポリペプチドサブユニットである、発現ベクター。
【請求項１８】
請求項１６に記載の発現ベクターであって、ここで前記第１の組換えタンパク質および前記第２の組換えタンパク質が、以下：免疫グロブリン軽鎖、免疫グロブリン重鎖、免疫グロブリン軽鎖フラグメントまたは免疫グロブリン重鎖フラグメントからなる群から個々に選択される、発現ベクター。
【請求項１９】
請求項１４に記載の発現ベクターであって、ここで前記プロモーターが、細菌性プロモーターである、発現ベクター。
【請求項２０】
請求項１９に記載の発現ベクターであって、ここで前記プロモーターが、以下：ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ａｒａプロモーター、β−ラクタマーゼプロモーターおよびλ　ＰＬプロモーターからなる群から選択される、発現ベクター。
【請求項２１】
宿主細胞において組換えタンパク質を産生する方法であって、以下：
請求項１５に記載の発現ベクターを用いて宿主細胞を形質転換する工程であって、ここで前記プロモーターが、該宿主細胞中で機能性である、工程、
前記第１の融合ポリペプチドが発現しかつ該宿主細胞から分泌されるような条件下で、該宿主細胞を培養する工程、および
前記第１の組換えタンパク質を単離する工程
を包含する、方法。
【請求項２２】
請求項２１に記載の方法であって、ここで前記宿主細胞が細菌細胞である、方法。
【請求項２３】
宿主細胞において組換えタンパク質を産生する方法であって、以下：
請求項１６に記載の発現ベクターを用いて宿主細胞を形質転換する工程であって、ここで前記プロモーターが、該宿主細胞中で機能性である、工程、
前記第１の融合ポリペプチドおよび前記第２の融合ポリペプチドが発現しかつ該宿主細胞から分泌されるような条件下で、該宿主細胞を培養する工程、ならびに
前記第１の組換えタンパク質および前記第２の組換えタンパク質を単離する工程
を包含する、方法。
【請求項２４】
請求項２３に記載の方法であって、ここで前記宿主細胞が細菌細胞である、方法。
【請求項２５】
融合ポリペプチドであって、以下：
組換えタンパク質に結合したリーダーペプチドを含み、該リーダーペプチドのカルボキシ末端が、該組換えタンパク質のアミノ末端に結合し、ここで該リーダーペプチドが、以下：（１）Ｎ末端に近い、正に帯電した２つ以上のアミノ酸、（２）７個と１６個との間の連続した疎水性アミノ酸残基の、領域、および（３）Ｃ末端における、配列Ｚ−Ｘ−Ｚであって、ここで各Ｚが個々に、小さい側鎖を有するアミノ酸であり、Ｘが遺伝子にコードされた任意のアミノ酸である配列を含むリーダーペプチドである、融合ポリペプチド。
【請求項２６】
請求項２５に記載の融合ポリペプチドであって、ここで前記リーダーペプチドが、αヘリックス崩壊因子として機能するアミノ酸をさらに含み、ここで該αヘリックス崩壊因子のアミノ酸が、前記連続した疎水性アミノ酸残基の領域と前記Ｚ−Ｘ−Ｚ配列との間に位置する、ポリペプチド。
【請求項２７】
請求項２５に記載の融合ポリペプチドであって、ここで前記リーダーペプチドが、以下：配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４および配列番号２３からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、融合ポリペプチド。
【請求項２８】
融合ポリペプチドの分泌を促進するために融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを設計する方法であって、以下：
（ａ）リーダーペプチドについてのコード領域を含む第１のヌクレオチド配列を選択する工程であって、ここで該リーダーペプチドが、以下：
（１）Ｎ末端に近い、正に帯電した２つ以上のアミノ酸、
（２）７個と１６個との間の連続した疎水性アミノ酸残基の、領域、および
（３）Ｃ末端における、配列Ｚ−Ｘ−Ｚであって、ここで各Ｚが個々に、小さい側鎖を有するアミノ酸であり、Ｘが遺伝子にコードされた任意のアミノ酸である配列
を含む、工程；
（ｂ）リボソーム結合部位を含む第２のヌクレオチド配列を選択する工程であって、ここで該第２のヌクレオチド配列は、該第１のヌクレオチド配列の５’であるように該第１のヌクレオチド配列に結合し、ここで該結合した第１のヌクレオチド配列および第２のヌクレオチド配列が、ＲＮＡであるかまたはＲＮＡに転写される場合、該リボソーム結合部位はアクセス可能である、工程；
（ｃ）組換えタンパク質をコードする第３のヌクレオチド配列を選択する工程であって、ここで該組換えタンパク質に結合した該リーダーペプチドを含む融合ポリペプチドがコードされるような様式で、該第３のヌクレオチド配列が、該第１のヌクレオチド配列に結合する、工程；ならびに
（ｄ）該選択された第１、第２および第３のヌクレオチド配列を１つのポリヌクレオチドに構築する工程
を包含する、方法。
【請求項２９】
請求項２８に記載の方法であって、ここで前記リーダーペプチドが、αヘリックス崩壊因子として機能するアミノ酸をさらに含み、ここで該αヘリックス崩壊因子のアミノ酸が、前記連続した疎水性アミノ酸残基の領域と前記Ｚ−Ｘ−Ｚ配列との間に位置する、方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（導入）
（発明の分野）
本発明は、宿主細胞からの組換えタンパク質の分泌を増強するための方法に有用な新規なリーダーペプチド配列およびリーダーペプチドをコードするヌクレオチド配列に関する。
【０００２】
（背景および関連文献）
多くの市販の有意なタンパク質は、適切な原核宿主細胞または真核宿主細胞における組換え遺伝子発現によって生成される。細胞培地中あるいはグラム陰性細胞の場合、「細胞膜周辺腔」または「ペリプラズム」（内細胞膜と外細胞膜との間）への分泌後、発現されたタンパク質産物を単離することが頻繁に所望される。分泌されたタンパク質は、典型的には、可溶性であり、そして混入した宿主タンパク質および他の細胞成分から容易に分離され得る。多くの発現系において、分泌の割合は、タンパク質産物の全体の収量を制限し、そしてかなりの量の産物は、単離することが難しい細胞内の不溶性画分として蓄積する。従って、細菌および他の宿主型からの異種タンパク質の分泌を指向するための改善された方法を同定する必要がある。
【０００３】
原核生物と真核生物の両方における、ほとんど全ての分泌されたタンパク質が分泌経路に入ること、分泌の間に開裂されるポリペプチド鎖のＮ末端における特定のシグナルペプチドによって指向される。しかし、シグナルペプチドが、分泌経路に新生ポリペプチド鎖を指向し、そして正確かつ十分なタンパク分解性開裂を指向して、成熟タンパク質を放出する機構は、完全に理解されていない。シグナル配列は、本質的に主に疎水性である（膜に新生ペプチドを指向し、原核生物の内膜および真核生物の小胞体膜に分泌タンパク質を移行するのに重要であり得る特徴）。しかし、分泌は、細胞分泌器官のいくつかのエレメントおよびシグナルペプチド中の特定の配列エレメントに関与する多段階プロセスである（例えば、Ｍｉｌｌｅｒら，（１９９８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：１１４０９−１１４１２を参照のこと）。
【０００４】
哺乳動物細胞において、シグナル配列により、親生鎖が、シグナル認識粒子（ＳＲＰ）の５４Ｋタンパク質によって認識される。これは、小胞体膜に接触するまで、移行成分コンホメーション中心新生鎖を保持すると考えられる。ＳＲＰは、７Ｓ　ＲＮＡおよび６個の異なるポリペプチドからなる。哺乳動物ＳＲＰの７Ｓ　ＲＮＡおよび５４Ｋシグナル配列結合タンパク質（ＳＲＰ５４）は、細菌中でシグナル認識粒子を形成するＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉの４．５Ｓ　ＲＮＡおよびＰ４８タンパク質（Ｆｆｈ）に対して高度に類似の配列を示す（Ｌｕｉｒｉｎｋら，（１９９２）Ｎａｔｕｒｅ　３５９：７４１−７４３）。
【０００５】
シグナルペプチドの特徴であるアミノ酸の疎水性ストレッチに加えて、多くの通常の特徴は、原核細胞において機能する多くの分泌シグナルによって共有され、そして特徴の別々のセットは、真核細胞からのシグナルペプチドによって共有される。
【０００６】
原核細胞において、多くのシグナルペプチドは、中間に疎水性領域（１２〜１４アミノ酸残基長）およびＮ末端の近くに陽性に荷電した領域を有する、２０〜３０アミノ酸長である（Ｐｕｇｓｌｅｙ（１９９３）Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．５７：５０−１０８）。類似性にかかわらず、今日までＥ．ｃｏｌｉにおいて同定された各シグナルペプチドは、固有の配列を有する。異なるシグナルペプチドにおいて見出される種々の配列は、固有の方法において分泌と相互作用するようである。
【０００７】
多くの分泌シグナルペプチドは、異種組換えタンパク質の分泌を指向するために使用され得る原核タンパク質およびファージタンパク質から同定されている（例えば、Ｇｅｎｎｉｔｙら（１９９０）Ｊ．Ｂｉｏｅｎｇ．Ｂｉｏｍｅｍｂ．２２：２３３−２６９を参照のこと）。異なるシグナルペプチドは、異種タンパク質の分泌を指向するシグナルペプチドの効率を変えるが、限定された数の原核生物シグナルペプチドが、以下の由来のシグナルペプチドを含む、Ｅ．ｃｏｌｉからの異種のタンパク質の分泌のために現在広く使用される：Ｅｒｗｉｎｉａ　ｃａｒｏｔｏｖｏｒａ（ＰｅｌＢ）由来のペクチン酸リアーゼＢタンパク質；Ｅ．ｃｏｌｉ外膜タンパク質（ＯｍｐＡ；米国特許第４，７５７，０１３号）；熱安定性エンテロトキシンＩＩ（ＳｔＩＩ）；アルカリホスファターゼ（ＰｈｏＡ）、外膜タンパク質（ＰｈｏＥ）、および外膜λレセプター（ＬａｍＢ）。例えば、ＰｅｌＢシグナルペプチドは、Ｅ．ｃｏｌｉから抗体フラグメントを発現するために使用されている（米国特許第５，６９８，４３５号）。
【０００８】
いくつかの場合において、真核シグナル配列は、細菌において機能し得、そしてその逆もまたあり得る（Ｚｅｍｅｌ−ＤｒｅａｓｅｎおよびＺａｍｉｒ（１９８４）Ｇｅｎｅ　２７：３１５−３２２；Ｈａｌｌら（１９９０）Ｊ　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｍ　２６５：１９９９６−９；Ｇａｒｃｉａら（１９８７）Ｊ　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｍ　２６２：９４６３−８）。
【０００９】
シグナル配列の改変はまた、分泌レベルを改善するために使用される。例えば、改変されたＯｍｐＡシグナル配列は、Ｅ．ｃｏｌｉからヒトＮＧＦを分泌するために使用され（米国特許第５，４７０，７１９号）、そしてＯｍｐＡシグナル配列の疎水性コアにおける変異は、第２の細菌タンパク質（ＴＥＭ　β−ラクタマーゼ；Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎら（１９９０）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７２：１２２５−１２３１）ではなく、第１の細菌タンパク質（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓヌクレアーゼＡ）の分泌を増大した。ＬａｍＢシグナルペプチドにおける変異のライブラリーは、ウシ成長ホルモンの分泌のための改善されたリーダーを同定した（Ｋｌｅｉｎら，（１９９２）Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇ．５：５１１−５１７）。
【００１０】
種々の試みが、どのＮ末端が、シグナルペプチドの機能を実施し得るかを推定するために行なわれている。例えば、広く使用されるアルゴリズムは、Ｎｉｅｌｓｅｎら（１９９７）Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇ．１０：１−６に記載される。このアルゴリズムは、どの配列が、有するシグナルペプチドとして役立ち得るかを適切な程度の正確で推定する。しかし、このアルゴリズムは、どの配列が、最も効率よく機能するかは推定しない。このような方法はまた、シグナルペプチドと成熟タンパク質との間の結合における開裂の部位を推定することを部分的に可能にする；例えば、Ｎｉｅｌｓｏｎらの方法は、原核生物シグナル配列の８９％のみにおけるシグナルペプチドの開裂部位を正確に予想する。実際は、開裂部位におけるｖｏｎ　Ｈｅｉｊｎｅの−３、−１法則に従ってコンセンサス配列を含む領域に偏向するが、シグナルペプチドは、開裂部位のまわりの特定のアミノ酸配列よりも未知の３次元モチーフを認識するようである（ＤｅｖおよびＲａｙ（１９９０）Ｊ　Ｂｉｏｅｎｅｒｇ　Ｂｉｏｍｅｍｂｒ　２２：２７１−９０）。
【００１１】
異種タンパク質の効率的な分泌のための適切なシグナル配列の選択は、成熟タンパク質内の下流配列と開裂されたシグナルペプチド内の配列との相互作用によってさらに難しくなる。原核生物において、アミノ酸Ａｌａ、Ａｓｐ／Ｇｌｕ、Ｓｅｒ／Ｔｈｒに対して首尾よく開裂した成熟タンパク質の最初の５個のアミノ酸において偏向がある。成熟タンパク質のＮ末端付近の荷電した残基は、分泌に負の影響を与える（「荷電ブロック」効果）（Ｊｏｈａｎｓｓｏｎら（１９９３）Ｍｏｌ　Ｇｅｎ　Ｇｅｎｅｔ．２３９：２５１−２５６）。タンパク質の成熟部分によるＯｍｐＡシグナルペプチドの塩基領域におけるモジュレーションの変異の効果もまた、報告されている（Ｌｅｎｈａｒｄら，（１９８８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３：１０３００−１０３０３）。
【００１２】
（発明の要旨）
本発明は、種々の宿主において産生される組換えタンパク質の分泌を増大するのに有用である新規の合成リーダーペプチド配列およびリーダーペプチドを設計するための方法に関する。新規なリーダーペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドおよびポリヌクレオチドの配列を設計するための方法もまた提供される。本発明の別の局面は、新規なリーダーペプチドおよび組換えタンパク質をコードする核酸を含む融合構築物を提供することによって宿主からの組換えタンパク質の分泌を増大する方法である。本発明のなお別の局面は、リーダーペプチドの使用を介した宿主細胞からの組換えタンパク質を分泌することによって組換えタンパク質を産生する方法である。リーダーペプチドまたは融合構築物をコードする核酸を含む発現ベクターもまた提供される。本発明のこれらおよび他の局面は、本明細書中に提供される開示から明らかである。
【００１３】
（特定の実施形態の説明）
（定義）
一般に、本明細書中で使用される学名ならびに細菌培養および動物細胞培養、組換えＤＮＡおよびタンパク質化学における研究手順は、当該分野において周知であり、そして通常使用される。他に規定されない限り、本明細書中で使用される全ての技術用語および科学用語は、この発明の所属する当業者によって通常理解されるのと同じ意味を有する。
【００１４】
本発明のリーダーペプチドのアミノ酸配列は、天然に存在するアミノ酸のための従来の一文字または三文字コドンを使用して、ペプチドまたはタンパク質についての従来の様式で示され、そして隣接したアミノ酸が正常なアミド結合または「ペプチド」結合を介して結合され、左にアミノ末端および右にカルボキシ末端が書かれる。
【００１５】
従来の表記法は、本明細書中のヌクレオチド配列を言及する場合に使用される。一般的に、二本鎖核酸についてさえヌクレオチド配列の１本鎖のみが、示される。核酸が、タンパク質をコードする場合、コード鎖は示される。ヌクレオチド配列の左手末端は、５’末端であり、右手末端は、３’末端である。コード配列内において、最も５’のヌクレオチド配列は、Ｎ末端アミノ酸をコードし、最も３’のヌクレオチド配列は、Ｃ末端アミノ酸をコードする。コード配列のヌクレオチド配列５’は、「上流」として称され、そしてコード配列のヌクレオチド配列３’は、「下流」として称される。
【００１６】
「リーダーペプチド」は、分泌経路にタンパク質を指向する、タンパク質、一般に、Ｎ末端に存在するペプチド配列を意図する。リーダーペプチドは、シグナルペプチダーゼによる分泌プロセスの間にタンパク質から開裂される。リーダーペプチドはまた、シグナルペプチド、リーダー配列またはシグナル配列と称され得る。
【００１７】
「組換えタンパク質」は、組換え遺伝子から産生されるタンパク質を意図する。「組換え遺伝子」は、インビトロでのＤＮＡまたはＲＮＡのいくつかの操作の結果として天然に存在する形態以外の形態における遺伝子を意図する。インビトロにおけるいくつかの操作の結果として、新しい遺伝子配置に異種の生物体または同種の生物体に移行される、ある生物体由来の天然に存在する遺伝子は、「組換え遺伝子」として意図される。遺伝子のヌクレオチド配列は、プロセスの間改変されてもされなくてもよい。組換え遺伝子はまた、完全な人工遺伝子（すなわち、任意の形態における天然に存在しない遺伝子）を含む。本明細書中において使用される場合、用語「遺伝子」は、タンパク質をコードする核酸を意図し、そしてイントロンを有するか、もしくは有さない、全体のコード領域ならびに転写および翻訳に必要とされる任意の調節配列（例えば、プロモーター、エンハンサー、転写開始点および転写終結点）または他の任意の部分を含み得る。
【００１８】
「分泌」は、タンパク質が、外部細胞環境またはグラム陰性細菌の場合、細胞膜周辺腔に移行されるプロセスを意図する。
【００１９】
「融合構築物」は、リーダーペプチドに関するコード配列および組換えタンパク質に関するコード配列（イントロンを有す、または有しない）を含む核酸を意図する。ここで、それらのコード配列が、隣接し、そして同じリーディングフレームにあり、その結果、融合構築物は、宿主において転写および翻訳される場合、リーダーペプチドのＣ末端が、組換えタンパク質のＮ末端に結合される。タンパク質が生成されるように、ここで融合構築物のタンパク質産物は、「融合ポリヌクレオチド」として本明細書中に示される。
【００２０】
リボソーム結合部位に適用される場合、「アクセス可能な」は、ｍＲＮＡにおけるリボソーム結合部位（ＲＢＳ）の偏向が、リボソームの結合に相対的に利用可能であることが意図される。「相対的に利用可能な」は、７０％未満のＲＢＳの偏向および関連転写開始コドンが、Ｇｅｎｅｑｕｅｓｔプログラム（ＤＮＡＳＴＡＲ，Ｉｎｃ．，Ｍａｄｉｓｏｎ　ＷＩ）を使用して予想されるｍＲＮＡの二次構造のモデルにおいて塩基対を形成することを意味する。塩基対を形成した塩基の割合は、塩基対形成された塩基の数をリボソーム結合部位における塩基の全数と転写開始コドンの塩基の全数によって割り、１００をかけた％によって計算され得る［（塩基対形成に関与するＲＢＳの塩基の数＋塩基対形成に関与する開始コドンにおける塩基の数）／（ＲＢＳの塩基の数＋開始コドンにおける塩基の数）×１００％］。
【００２１】
タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドについての「コード領域」または「コード配列」によって、これらのタンパク質、ポリペプチド、またはペプチドを「コードする」ヌクレオチド配列が意図され；すなわち、適切な細胞機構によって、同じタンパク質、ポリペプチド、ペプチドへと最終的に翻訳されるか、または翻訳され得る、一連のコドンを含むヌクレオチド配列（ＤＮＡとしてかまたはＲＮＡとして）が意図される。「コード領域」は、タンパク質全体、ポリペプチド全体、またはペプチド全体に対する一連のコドンを、必ずしも含むに及ばないが、これらのタンパク質、ポリペプチド、ペプチドの一部分のみをコードし得る。このコード領域は、必ずしもイントロンを含むにおよばないが、これらを含み得る。これらのイントロンは、スプライシングを受け、機能的なｍＲＮＡを形成する。
【００２２】
「作動的に連結する」とは、２つ以上高分子（ポリヌクレオチド、タンパク質など）について言及する場合、成分分子または成分配列が共に機能して意図する目的を達成する様式で、成分分子または成分配列が連結されることを意味する。リボソーム結合部位およびコード領域について言及する場合、作動的に連結するとは、このコード配列の翻訳が、このリボソーム結合部位でリボソームの結合を介してもたらされることを意味する。２つのコード領域について言及する場合、作動的に連結するとは、これらのコード領域がインフレームであり、そして翻訳され得、単一のポリペプチドを産生し得ることを意味する。プロモーターおよび遺伝子もしくはコード配列について言及する場合、作動的に連結するとは、この遺伝子またはコード配列の転写がこのプロモーターによって制御されることを意味する。
【００２３】
本発明は、原核生物宿主または真核生物宿主からの、組換えタンパク質の分泌を増強するのに有用な新規の合成リーダーペプチド配列、およびこれらのリーダーペプチドについてのコード領域を含むポリヌクレオチドを提供する。これらのリーダーペプチドは、代表的には２０と２５との間のアミノ酸長であるが、１５アミノ酸ほど短くもあり得るし、または３０アミノ酸ほど長くもあり得る；すなわち、このリーダーペプチドは、１５アミノ酸残基長、１６アミノ酸残基長、１７アミノ酸残基長、１８アミノ酸残基長、１９アミノ酸残基長、２０アミノ酸残基長、２１アミノ酸残基長、２２アミノ酸残基長、２３アミノ酸残基長、２４アミノ酸残基長、２５アミノ酸残基長、２６アミノ酸残基長、２７アミノ酸残基長、２８アミノ酸残基長、２９アミノ酸残基長または３０アミノ酸残基長であり得る。このリーダーペプチドは、これを宿主から分泌される組換えタンパク質のＮ末端に位置付けることによって、最も効率的に使用される。従って、本発明は、リーダーペプチド配列および組換えタンパク質配列を含む、融合ポリペプチドを提供する。このリーダーペプチドをコードする核酸は、リーダーペプチドコード領域が、上流（すなわち、５’末端）にあり、組換えタンパク質コード領域と同じリーディングフレームに一致し、融合構築物を提供するような様式で、組換えタンパク質のコード領域を含む核酸に作動的に連結され得る。この融合構築物は、宿主細胞で発現され、このリーダーペプチドを含む融合ポリペプチドを提供し得、このリーダーペプチドは、リーダーペプチドのカルボキシ末端において、この組換えタンパク質のアミノ末端に連結されている。融合ポリペプチドは、宿主細胞から分泌され得る。代表的には、このリーダーペプチドは、分泌プロセスの間に融合ポリペプチドから切断され、外部細胞環境において、またいくつかの場合には、ペリプラズム間隙において、分泌された組換えタンパク質の集積を生じる。
【００２４】
本発明のリーダーペプチドのアミノ酸配列は、以下の特徴を含み得る：（１）Ｎ末端に近い２つ以上の正に荷電したアミノ酸の領域、（２）７と１６との間の連続した疎水性アミノ酸残基、（３）αヘリックス崩壊因子（ｄｉｓｒｕｐｔｅｒ）として作用する１つ以上のアミノ酸、および（４）Ｃ末端における、配列Ｚ−Ｘ−Ｚ（ここで、Ｚは小さい側鎖を有するアミノ酸であり、そしてＸは、任意のアミノ酸である）。これらの特徴の各々は、以下に別個に記載される。このリーダーペプチド配列は、最低限、上記の（１）、（２）および（４）の特徴を備える。好ましくは、このリーダーペプチドは、上記４つ全ての特徴を含む。様々な特徴は、存在する場合、リーダーペプチドのＮ末端からリーダーペプチドのＣ末端へ、上に提示した順番で存在し、すなわち、Ｎ末端近くの２つ以上の正に荷電したアミノ酸の後に（Ｃ末端方向に）、疎水性アミノ酸、その後にαヘリックス崩壊因子、その後に「Ｚ−Ｘ−Ｚ」配列が続く。殆どの実施形態において、この「Ｚ−Ｘ−Ｚ」は、リーダーペプチドが組換えタンパク質に融合ポリペプチド中で融合している場合、リーダーペプチドの切断部位の直前に存在する。
【００２５】
本発明のリーダーペプチドは、Ｎ末端近くの２つ以上の正に荷電したアミノ酸残基を有する。「Ｎ−末端近く」とは、正に荷電したアミノ酸残基がＮ末端から２〜６アミノ酸以内に存在することを意味する。一般に、正に荷電したアミノ酸は、Ｎ末端自体には存在しない。なぜならば、このＮ末端は、代表的にはメチオニン残基またはホルミルメチオニン残基であるからである。正に荷電したアミノ酸はまた、Ｎ末端アミノ酸に直接隣接しない。Ｎ末端アミノ酸残基を１としてかぞえるとき、この正に荷電したアミノ酸は、２以上の残基、すなわち３、４、５、６、または７で存在する。この２以上の正に荷電したアミノ酸は、一般に連続な残基であるが、１つまたは２つの介在するアミノ酸によって互いに分離され得る。適切な介在するアミノ酸は、小さく、非荷電側鎖を有した残基（例えば、グリシンまたはアラニン）である。このような介在するアミノ酸はまた、好ましくは、Ｎ末端アミノ酸を２以上の正に荷電したアミノ酸から分離する。この２つ以上の正に荷電したアミノ酸は、同じアミノ酸であり得るし、また異なったアミノ酸でもあり得る。適切な正に荷電したアミノ酸としては、リジンおよびアルギニンが挙げられる。好ましくは、Ｎ末端近くの、２個、３個、または４個の正に荷電したアミノ酸が存在し、より好ましくは、Ｎ末端近くの、２個、３個、または４個のリジン残基が存在する。
【００２６】
本発明のリーダーペプチドは、７と１６との間の連続した疎水性アミノ酸の領域を有する；すなわち、この領域は、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、または１６の連続した疎水性アミノ酸残基を有し得る。好ましくは、疎水性領域は、１２と１６との間のアミノ酸長である。適切な疎水性アミノ酸としては、アラニン、ロイシン、バリン、フェニルアラニン、スレオニン、イソロイシン、セリン、グルタミン、アスパラギン、メチオニン、およびチロシンが挙げられる。疎水性アミノ酸の領域についてのアミノ酸配列は、適切な疎水性残基の中から無作為に選択され得るが、好ましくは、Ａ：Ｌ：Ｖ：Ｆ：Ｔ：Ｉ：Ｓ：Ｑ：Ｎ：Ｍ：Ｙについて１６：１４：１４：５：５：４：３：２：２：１：１の比率で偏りがある。好ましい疎水性アミノ酸は、アラニン、ロイシン、バリン、フェニルアラニン、スレオニン、イソロイシン、セリン、グルタミン、アスパラギン、およびメチオニンであり；より好ましいのは、アラニン、ロイシン、バリン、フェニルアラニン、スレオニン、セリン、グルタミン、メチオニンである。
【００２７】
本発明のリーダーペプチドは、一般に、αヘリックス崩壊因子として作用する、少なくとも１つのアミノ酸残基を有する。好ましい実施形態において、このαヘリックス崩壊因子ミノ酸は、リーダーのＣ末端において、疎水性領域とＺ−Ｘ−Ｚ基との間に位置づけられる。好ましくは、１つのへリックス崩壊因子残基が存在するが、１より多く約１０まで存在し得る。αヘリックス崩壊因子として作用する、適切なアミノ酸としては、プロリン、アルギニン、グリシン、リジン、グルタミン酸、アスパラギンおよびアスパラギン酸が挙げられる。好ましくは、プロリン残基またはアルギニン残基が、ヘリックス崩壊因子として選択され；より好ましくは、プロリンである。
【００２８】
本発明のリーダーペプチドは、Ｃ末端において、配列Ｚ−Ｘ−Ｚを有し、ここで、「Ｚ」は、小さい側鎖を有するアミノ酸であって、Ｘは、２０種の遺伝的にコードされるアミノ酸のうちのいずれかである。「Ｃ末端」によって、リーダーペプチドについて言及する場合、そのＮ末端から遠位にあるリーダーペプチド配列の末端が意図される。このリーダーペプチドのＣ末端は、組換えタンパク質のＮ末端と連結され得、分泌可能な融合ポリペプチドを形成する。従って、リーダーペプチドのＣ末端は、リーダーペプチドが組換えタンパク質に連結されている場合、実際のタンパク質の末端ではないことが明らかである。この「Ｚ」アミノ酸は、同じであるかまたはお互いに異なり得るが、但し、各々は小さい側鎖を有するアミノ酸である。「ＺＸＺ」配列の中の「Ｚ」として適切な小さい側鎖を有するアミノ酸としては、アラニン、セリン、グリシン、バリン、またはスレオニンが挙げられる。好ましくは、少なくとも１つの「Ｚ］がアラニン残基である。より好ましくは、両方の「Ｚ」残基がアラニンである。「ＺＸＺ」配列についての好ましい「Ｘ」残基としては、チロシン、アスパラギン、およびロイシンが挙げられる。
【００２９】
本発明のリーダーペプチドの特に好ましい実施形態は、以下のアミノ酸構造：
Ｍ−Ｘｎ−（Ｋ／Ｒ）−（Ｋ／Ｒ）−Ｊｍ−Ｐ−Ｘｐ−Ｚ−Ｘ−Ｚ
を有し、ここで、各Ｚは独立して、小さい側鎖を有するアミノ酸であり、各Ｘは独立して、任意の遺伝的にコードされるアミノ酸であり、Ｍ、Ｋ、ＲおよびＰは、それぞれ、メチオニン、リジン、アルギニン、およびプロリンについての従来の１文字コードであり、（Ｋ／Ｒ）は、リジンまたはアルギニンのいずれかがその位置に存在することを示し、各Ｊは、以下：アラニン、ロイシン、バリン、フェニルアラニン、スレオニン、イソロイシン、セリン、グルタミン、アスパラギン、メチオニン、およびチロシンからなる群より独立して選択されるアミノ酸であり、ｎは１または２から選択される整数であり、ｐは０、１、または２から選択される整数であり、ｍは、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、または１６から選択される整数である。好ましい実施形態において、Ｋ／ＲはＫであるか、あるいはｎは１であり、あるいはｐは０であるか、あるいはｍは、１２、１３、１４、１５、または１６であるか、あるいはＺはアラニンであるか、ありはＸはアラニン、グリシン、チロシン、またはロイシンであるか、あるいは前述した好ましい選択の組み合わせである。
【００３０】
リーダーペプチドの特に好ましい実施形態としては、以下のアミノ酸配列のいずれかを有するリーダーペプチドが挙げられる：
ＭＡＫＫＮＳＴＬＬＶＡＶＡＡＬＩＦＭＡＧＲＡＮＡ（配列番号１）、
ＭＡＫＫＮＳＴＬＬＶＡＶＡＡＬＩＭＦＴＱＰＡＮＡ（配列番号２）
ＭＧＫＫＱＴＡＶＡＦＡＬＡＬＬＡＬＳＭＴＰＡＹＡ（配列番号３）
ＭＧＲＫＱＴＡＶＡＦＡＬＡＬＬＳＬＡＦＴＮＡＹＡ（配列番号４）または
ＭＡＫＫＮＳＴＬＬＶＡＶＡＡＬＩＦＭＡＧＲＡＬＡ（配列番号２３）。
【００３１】
アミノ酸配列を考慮することに加え、融合ポリペプチドの効率的な分泌は、この融合ポリペプチドについてのコード領域の核酸環境、特にｍＲＮＡレベルへの配慮が必要である。従って、本発明はまた、リーダーペプチドをコードする核酸配列を含み、そして翻訳開始部位の上流にある（すなわち、コード鎖上の翻訳開始の５’端）核酸配列を含むポリヌクレオチドを提供する。本発明のポリヌクレオチドは、リーダーペプチドをコードする、第１のヌクレオチド配列（ここでリーダーペプチドは、以下を含む：（１）Ｎ末端近くの、２以上の正に荷電したアミノ酸（２）７と１６との間の連続した疎水性アミノ酸残基の領域、（３）必要に応じて、αヘリックス崩壊因子として作用するアミノ酸、および（４）Ｃ末端における、配列Ｚ−Ｘ−Ｚ（ここで、各Ｚは独立して小さい側鎖を有するアミノ酸であり、そしてＸは遺伝的にコードされたアミノ酸である））、ならびにリボソーム結合部位を有する、第２のヌクレオチド配列（ここで、第２のヌクレオチド配列は、第１のヌクレオチド配列の５’であり、そしてこのリボソーム結合部位は、このリーダーペプチドのコード領域に作動的に連結し、上記のポリヌクレオチドはＲＮＡであるか、またはＲＮＡに転写される場合、本明細書中で定義するように、上記のリボソーム結合部位は接触可能である）を含む。
【００３２】
このポリヌクレオチドについての適切なヌクレオチド配列の選択は、当該分野で公知であるように遺伝コードを参照して、このリーダーペプチドのアミノ酸配列をコードする、全ての可能性のあるヌクレオチド配列を決定することで始まる。このヌクレオチド配列を設計する際、意図する宿主生物のコドン偏位およびＲＮＡにおける２次構造の可能性が考慮される。
【００３３】
このコドン偏位の考慮については、一般に、このポリヌクレオチド配列は、リーダーペプチド／融合ポリペプチドが発現される、宿主生物についてのコドン偏位を使用して設計される；すなわち、リーダーペプチドをコードする核酸配列についてのコドン使用頻度は、実用的なほど近く、意図する宿主生物のコドン使用頻度を反映する。多くの原核生物および真核生物についてのコドン偏位が公知である。例えば、ＳｈａｒｐおよびＭａｔａｓｓｉ（１９９４）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ　Ｇｅｎｅｔ．Ｄｅｖｅｌ．４：８５１−８６０；ＺｈａｎｇおよびＺｕｂａｙ（１９９１）Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　１３：７３−１１３を参照のこと。
【００３４】
コドン偏位に関連する考慮に加え、リーダーペプチドをコードするｍＲＮＡの２次構造が、翻訳に影響し得、そして、このコードされるタンパク質の効率的な分泌を得るために、この領域のＲＮＡの配列を最適化することが所望され得る。シグナルペプチドをコードするＤＮＡへ導入された「サイレント」変異（このペプチド配列を変更しない変異）が、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて抗体Ｆｖフラグメントの発現効率に影響を与えることが示されている（Ｓｔｅｍｍｅｒら（１９９３）Ｇｅｎｅ　１２３：１−７）。この点に関して、発現の最適化は、最大可能翻訳速度の選択を必ずしも必要としない。むしろ、翻訳速度の減少によって、改善されたタンパク質の折り畳みを許容し、それによって、全体の分泌速度を増大する。
【００３５】
特に、２次構造の考慮に関して、リーダーペプチドをコードする核酸配列およびこのコード配列の直ぐ上流の核酸配列は、産生されるｍＲＮＡのリボソーム結合部位の利用可能性を最適化するように設計される。リボソーム結合部位（ＲＢＳ）の利用可能性は、当該分野で周知の方法によって、ＲＢＳを取り巻くｍＲＮＡの核酸の２次構造から予測され得る。例えば、ｍＲＮＡの２次構造は、ＤＮＡＳＴＡＲ，Ｉｎｃ．（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）から入手可能なＧｅｎｅｑｕｅｓｔプログラムを使用して決定され得る。このＧｅｎｅｑｕｅｓｔプログラムは、Ｚｕｋｅｒによって記載された最適なＲＮＡフォールディング法（Ｚｕｋｅｒ，Ｍ．Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８９）２４４：４８−５２およびＪａｅｇｅｒら　Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８９）８６：７７０６−７７１０）のＶｉｅｎｎａ　ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｓｃｈｕｓｔｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｒ．Ｓｏｃ．Ｌｏｎｄ．Ｂ．Ｂｉｏｌ．Ｓｃｉ．（１９９４）２５５：２７９−２８４）を使用して、ＲＮＡ２次構造を予測する。ＲＢＳおよびリーダーペプチドについてのコード配列を含むヌクレオチド配列に対してこのような方法を適用することによって、リボソーム結合に対するＲＢＳの利用可能性の決定は可能である。一般に、このリボソーム結合部位の利用可能性は、ＲＮＡ２次構造における塩基対形成に関与する、ＲＢＳ自体の内の塩基の数およびＡＵＧ翻訳開始コドンの内の塩基の数、ならびにこのＲＢＳおよびＡＵＧがステムループ構造のステムに埋没しているか否かに関して記述され得る。一般に、塩基対形成に関与するＲＢＳおよびＡＵＧの塩基が少なければ少ないほど、このＲＢＳは、リボソーム結合についてより利用可能である。同様に、このＲＢＳは、これがステムループ構造中に埋没してない場合に、リボソーム結合についてより利用可能である。代表的に、ｍＲＮＡの２次構造の分析によって、始め（すなわち、ｍＲＮＡの５’末端）からリボソーム結合部位および翻訳開始点（ＡＵＧ）を通って、リーダーペプチドコード領域の末端までの、ｍＲＮＡの配列が考慮される。このＡＵＧの上流のｍＲＮＡ配列は、通常、融合構築物を作製する場合に使用される特定のプロモーターの配列に依存する。従って、ｍＲＮＡの２次構造は、リーダーペプチドのアミノ酸配列の選択のみでなく、使用されるプロモーターおよびＲＢＳの選択によっても影響を受ける。
【００３６】
このＧｅｎｅｑｕｅｓｔプログラムを、ＲＮＡの２次構造決定のために使用する場合、温度パラメーターは、３７℃に設定され、そしてＧＵ塩基対形成は、許容される。Ｇｅｎｅｑｕｅｓｔプログラムの出力は、予測された塩基対領域を示すＲＮＡの構造のグラフィック表示である。特定のアミノ酸配列を有するリーダーペプチドについての好ましいヌクレオチド配列は、ＲＢＳおよび付随するＡＵＧ翻訳開始コドンの塩基のうち７０％以下が、２次構造（すなわち、塩基形成）に関与するヌクレオチド配列であり、かつステムループ構造に埋没しないＲＢＳを有する、ヌクレオチド配列である。塩基対形成に関与する塩基のパーセンテージを計算する際に、塩基対形成に関与する、ＲＢＳおよびＡＵＧの塩基の数が加算され、そしてＲＢＳおよびＡＵＧを合わせた塩基の総数に対して比較される。ＲＮＡの２次構造を決定する際に、プロモーターからこのリーダーペプチドのコード領域の末端を通る、ポリヌクレオチドの配列が考慮される。
【００３７】
細菌系において、リボソーム結合部位は、代表的には、１６ｓ　ｒＲＮＡの３’末端に対して相補的な配列を有する（例えば、Ｒｉｎｇｑｕｉｓｔ，Ｓ．ら（１９９２）Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６：１２１９参照のこと）。本発明に関連する使用のために有用なリボソーム結合部位は、Ｅ．ｃｏｌｉ由来のＡｒａＢＡＤプロモーターに天然で結合するリボソーム結合部位である。このプロモーターは、ｐＢＡＤ−ＨｉｓＡベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中に簡便に見出され得る。この特定のリボソーム結合部位は、ヌクレオチド配列ＡＧＧＡＧＧを有する。
【００３８】
本発明のポリヌクレオチドは、ＲＮＡまたはＤＮＡであり得、そして１本鎖または２本鎖であり得る。このポリヌクレオチドがＲＮＡである場合、２次構造の決定は、このポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を使用して実施される。このポリヌクレオチドがＤＮＡである場合、２次構造の決定は、対応するＲＮＡのヌクレオチド配列を使用して実施される。「対応するＲＮＡ」によって、ＴがＵで置換されることを除いてＤＮＡポリヌクレオチドと同じヌクレオチド配列を有するＲＮＡが意図される。
【００３９】
従って、融合ポリペプチドの分泌の増大のための融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを設計する方法は、このリーダーペプチドのアミノ酸配列ならびにこのリーダーペプチドコードするヌクレオチド配列およびｍＲＮＡ中でリーダーコード配列から上流の領域の考慮を含まなければならないことは明らかである。融合ポリペプチドの分泌の増大のための融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを設計する本発明の方法は、以下を包含する：（ａ）リーダーペプチドをコードする、第１のヌクレオチド配列を選択する工程であって、ここで上記リーダーペプチドが以下：
（１）Ｎ末端に近い、２つ以上の正に荷電したアミノ酸、
（２）７と１６との間の連続した疎水性アミノ酸残基の領域、
（３）必要に応じて、αヘリックス崩壊因子として作用するアミノ酸；および
（４）Ｃ末端における、配列Ｚ−Ｘ−Ｚ（ここで、各Ｚは独立して小さい側鎖を有するアミノ酸であり、そしてＸは、任意のアミノ酸である）
を含む、工程；（ｂ）リボソーム結合部位を含む第２のヌクレオチド配列を選択する工程であって、上記第２のヌクレオチド配列が、上記第２のヌクレオチド配列が上記第１のヌクレオチド配列の５’であるように、上記第１のヌクレオチド配列に作動的に連結する場合であって、かつ上記連結した第１のヌクレオチドおよび第２のヌクレオチド配列がＲＮＡであるか、またはこれがＲＮＡに転写される場合に、上記リボソーム結合部位が接触可能である、工程；（ｃ）組換えタンパク質をコードする、第３のヌクレオチド配列を選択する工程であって、上記第３のヌクレオチド配列は、上記第１のヌクレオチド配列の３’であって、かつ上記リーダーペプチドおよび上記組換えタンパク質を含む融合タンパク質がコードされる様式で、第１のヌクレオチド配列に作動的に連結している、工程；および（ｄ）第１のヌクレオチド配列、第２のヌクレオチド配列、および第３のヌクレオチド配列を、単一のポリヌクレオチド中に構築する工程。様々なヌクレオチド配列を構築する工程は、当該分野で周知の任意の多くの技術、例えば、制限フラグメントまたはＰＣＲ生成フラグメントの連結、ＰＣＲ増幅、あるいはポリヌクレオチド全体またはその部分の合成によって、達成される。
【００４０】
本発明の好ましいポリヌクレオチドは、以下のヌクレオチド配列のうち１つを有する：
【００４１】
【化１】
2004510410.tif 000002
。
【００４２】
リーダーペプチドについての翻訳開始コドンを、上記の配列の各々においてイタリック体で示す。
【００４３】
本発明のリーダーペプチドと関連して有用な組換えタンパク質およびそれをコードするヌクレオチド配列は、細菌タンパク質および真核生物タンパク質（例えば、哺乳動物タンパク質、またはより好ましくはヒトタンパク質）を含む。ヒト組換えタンパク質の例は、天然のヒトタンパク質（例えば、インスリン、ヒト成長ホルモン、インターフェロン、および免疫グロブリンスーパーファミリーのタンパク質（免疫グロブリンおよびＭＨＣタンパク質を含む））；ならびにヒトタンパク質の変異体バージョン（例えば、コンセンサスインターフェロンフラグメントまたはタンパク質フラグメント（例えば、免疫グロブリンフラグメント（例えば、ＦａｂフラグメントまたはＦｖフラグメント）））である。あるいは、組換えタンパク質は、天然に存在しないタンパク質または操作されたタンパク質（例えば、天然のヒトタンパク質の改変体、天然のタンパク質のフラグメント、キメラタンパク質または全く新規の操作されたタンパク質）であり得る。組換えタンパク質は、天然に存在するかまたはモノマーとして機能する組換えタンパク質であり得るか、あるいは、より大きいポリペプチド複合体（例えば、ホモダイマーもしくはヘテロダイマーまたは他のマルチマータンパク質）の１以上のポリペプチドサブユニットであり得る。マルチマータンパク質は、同一なポリペプチドサブユニットから構成され得るか、または多くの非同一なポリペプチドサブユニットから構成され得る。本発明において有用な組換えタンパク質の例としては、免疫付着因子（ｉｍｍｕｎｏａｄｈｅｓｉｎ）（例えば、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ）、および免疫グロブリン由来の可変ドメイン（抗体のｓｃＦｖ、ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２フラグメントを含む）、単鎖抗体、二重特異的抗体、ディアボディー（ｄｉａｂｏｄｙ））を含むタンパク質が挙げられる。免疫グロブリン可変ドメインおよび抗体フラグメントは、ヒトまたはヒト化であり得、そしてヒトまたはマウスの定常ドメインに連結され得る。組換えタンパク質がマルチマータンパク質である場合、このマルチマーを形成する各ポリペプチドサブユニットについてのコード領域は、そのＮ末端でリーダーペプチドに連結され得る。選択されるリーダーペプチドは、各ポリペプチドサブユニットについて同じかまたは異なり得る。組換えタンパク質が天然に分泌されるタンパク質である場合、タンパク質の成熟形態のみについてのコード配列は、代表的に、天然に存在するリーダーペプチドを本発明の合成リーダーペプチドで置換した融合構築物において使用される。
【００４４】
本発明の１つの局面において、合成リーダーペプチドは、組換え体（すなわち、形質転換された）宿主生物において産生される組換えタンパク質の分泌を指向または増強するために使用される。好ましい実施形態において、この合成リーダーペプチドは、免疫グロブリン関連ポリペプチド（例えば、そのＮ末端ドメインとして、免疫グロブリン可変ドメインを有する組換えタンパク質）の分泌を指向または増強するために使用される。このような可変ドメインとしては、それぞれ、抗体の重鎖または軽鎖に由来するＶｈドメインおよびＶｌドメインが挙げられる。これらのドメインは、より大きな組換えタンパク質（例えば、抗体のｓｃＦｖフラグメント、ＦａｂフラグメントおよびＦ（ａｂ’）２フラグメント、単鎖抗体、二重特異的抗体またはディアボディー）の一部であり得る。成熟組換えタンパク質のＮ末端残基は、リーダーペプチドの開裂に影響しえることから、分泌レベルは、リーダーペプチド開裂部位の近傍における、アミノ酸残基の適切な選択によってさらに最適化され得る。例えば、組換えタンパク質のＮ末端領域における荷電残基は、可能であれば回避されるべきである。さらに、開裂部位のいずれかの側でのプロリン残基の配置は、回避されるべきである。より好ましい実施形態において、合成リーダーペプチドは、原核生物宿主からの免疫グロブリン関連ポリペプチドの分泌を指向または増強するために使用される。
【００４５】
本発明のポリヌクレオチドは、当業者に周知の種々の方法、および例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．およびＭａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．またはＡｕｓｕｂｅｌら（１９９８）Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．に記載される種々の方法のいずれかによって調製される。核酸は、自動化ＤＮＡ合成機（例えば、Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ、Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓなどから市販されるもの）の使用によって、容易に合成され得る。ＤＮＡの別個のフラグメント（例えば、組換えタンパク質をコードするＤＮＡ）は、制限酵素を使用して調製およびクローニングされ得る。あるいは、別個のフラグメントは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用して、適切な配列を有するプライマーを用いて調製され得る。
【００４６】
本発明のリーダーペプチドをコードするポリヌクレオチドは、融合構築物を提供するために組換えタンパク質をコードする核酸に連結され得る。代表的には、リーダーペプチドをコードする核酸の３’末端は、組換えタンパク質をコードする核酸の５’末端に連結される。２つのコード領域は、同じリーディングフレームになるように連結される。この方法において、融合構築物は、組換えタンパク質がＣ末端に続く、Ｎ末端にリーダーペプチドを有する単一のタンパク質をコードする。このリーダーペプチドおよび組換えタンパク質は、直接連結され得るか、またはこれらを連結する１つまたはいくつかのアミノ酸が存在し得る。特定のアミノ酸は、シグナルペプチダーゼによる開裂を妨げることが周知であり（例えば、プロリン）、そしてこれらの残基は、融合ポリペプチドのための開裂部位を設計する際に回避される。組換えタンパク質が、本来は（すなわち、そのネイティブな形態では）シグナルペプチドを含む場合、この配列は、好ましくは融合ポリペプチドには含まれない。同様に、組換えタンパク質が本来は開始Ｍｅｔ（またはホルミル−Ｍｅｔ）残基をＮ末端に含む場合、このＭｅｔ（またはホルミル−Ｍｅｔ）は、代表的には融合ポリペプチドには含まれない。
【００４７】
リーダーペプチドまたは融合構築物をコードする核酸を含む発現ベクターは、当該分野で周知の方法によって調製され得る。一般に、この発現ベクターは、プロモーターの制御下で、リーダーペプチドまたは融合構築物をコードする核酸を含む。いくつかの実施形態において、１より多くのリーダーペプチドまたは融合構築物は、単一のプロモーターの制御下に置かれる。このような実施形態において、ジ−シストロンまたはポリシストロンのメッセージは、単一のプロモーターからの転写によって生成され得る。これらの実施形態において、さらなる融合構築物は、最初の融合構築物の下流に配置され、そして３０ヌクレオチド以下、上流の融合構築物から隔てられる；すなわち、下流の融合構築物の翻訳開始コドンから、上流の融合構築物の終止コドンを隔てる、３０ヌクレオチド以下が存在する。好ましくは、ジ−シストロンまたはポリシストロンの実施形態における融合構築物は、１〜３０ヌクレオチドの間、より好ましくは３〜２０ヌクレオチドの間、隔てられる。いくつかの場合、融合構築物は、僅かに重複さえし得る。
【００４８】
プロモーターは、目的の宿主において転写を指向し得るように選択される。種々の宿主細胞において転写を指向し得るプロモーターは、周知であり、そして、いくつかの例を以下に記載する。任意の適切なプロモーターが選択され得る。一般に、「プロモーター」は、リーダーペプチドまたは融合ポリペプチドコード領域の転写に必要な、翻訳開始（ＡＵＧコドン）の上流の全てのヌクレオチド配列を含む。プロモーターは、リボソーム結合部位の配列を含むか、または重複し得る。プロモーターの選択は、しばしば、リボソーム結合部位の選択にも影響する。本明細書中の他で記載されるように、プロモーターの特定のヌクレオチド配列は、それが対となるリーダーペプチドコード領域の選択に影響する。発現ベクターはまた、目的の宿主における選択のための選択マーカー遺伝子および／または宿主においてベクターの自律的複製を提供するための複製起点を含み得る。あるいは、またはさらに、発現ベクターは、宿主染色体へのベクターの組み込みを補助するヌクレオチド配列を含み得る。
【００４９】
種々の宿主における融合ポリペプチドの産生のために発現ベクターを構築するための方法はまた、当該分野で一般に公知である。発現は、原核生物宿主および真核生物宿主のいずれかにおいてもたらされ得る。原核生物は、最も頻繁にＥ．ｃｏｌｉの種々の株によって代表される。しかし、バチルス（例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、種々の種のＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、または他の細菌株のような他の微生物株がまた使用され得る。このような原核生物系において、宿主に適合性の種に由来する複製部位および制御配列を含むプラスミドベクターが、しばしば使用される。例えば、Ｅ．ｃｏｌｉについて役立つベクターとしては、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、ｐＢＡＤおよびこれらの誘導体が挙げられる。一般に使用される、転写開始のためのプロモーターを含む原核生物制御配列は、必要に応じて、リボソーム結合部位配列に付随するオペレーターを有し、以下のような一般に使用されるプロモーター（例えば、β−ラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）およびラクトース（ｌａｃ）プロモーター系、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系、アラビノースプロモーター、ならびにλ由来ＰＬプロモーター）ならびにＮ遺伝子リボソーム結合部位を含む。しかし、原核生物に適合性の任意の利用可能なプロモーター系が使用され得る。Ｅ．ｃｏｌｉにおける組換えタンパク質の産生のために有用な技術は、Ｂａｎｅｙｘ，Ｆ．（１９９９）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ　Ｂｉｏｔｅｃｈ．１０：４１１−４２１および米国特許第５，６９８，４３５号に見出される。
【００５０】
真核生物宿主において有用な発現ベクターは、適切な真核生物遺伝子に由来するプロモーターを含む。酵母において有用なクラスのプロモーターとしては、例えば、解糖酵素の合成のためのプロモーター（例えば、３−ホスホグリセリン酸キナーゼのためのプロモーター）が挙げられる。他の酵母プロモーターとしては、ＹＥｐ１３から得られるエノラーゼ遺伝子またはＬｅｕ２遺伝子由来のプロモーターが挙げられる。哺乳動物細胞のために適切なプロモーターとしては、ＳＶ４０由来の初期プロモーターおよび後期プロモーター、または他のウイルスプロモーター（例えば、ポリオーマ、アデノウイルスＩＩ、ウシパピローマウイルスまたはトリ肉腫ウイルス由来のプロモーター）、ヒトサイトメガロウイルス（ｈＣＭＶ）プロモーター（例えば、ｈＣＭＶ−ＭＩＥプロモーター−エンハンサー）が挙げられる。さらなる適切な哺乳動物プロモーターとしては、β−アクチンプロモーター−エンハンサーおよびヒトメタロチオネインＩＩプロモーターが挙げられる。植物細胞が発現ベクターのための宿主として使用される事象において、例えば、Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ由来のノパリン合成プロモーターが、適切である。
【００５１】
発現ベクターは、周知の技術（例えば、制限技術および連結技術、相同組換え技術、またはＰＣＲ増幅技術）を使用して構築され、適切な宿主に形質転換される。宿主細胞の形質転換は、選択された宿主細胞に適切な標準的な技術を使用して、達成される。発現ベクターを含む細胞は、融合ポリペプチドの産生に適切な条件下で培養され、次いで、融合ポリペプチドまたは開裂された成熟組換えタンパク質（すなわち、リーダーペプチドを有するかまたは有さない、発現されたタンパク質）は、回収されそして精製される。一般に、回収されるタンパク質は、融合ポリペプチドまたは組換えタンパク質（リーダーペプチドの開裂後）、あるいはこれら両方である。融合ポリペプチドが分泌され、そしてリーダーペプチドがプロセスの間に開裂される場合、回収されるタンパク質が組換えタンパク質またはその改変形態であることが明らかである。いくつかの場合、融合ポリペプチドは、リーダーペプチドと組換えタンパク質との間にさらなるアミノ酸が存在するように設計される。これらの例において、融合ポリペプチドからのリーダーペプチドの開裂は、Ｎ末端にさらなるアミノ酸を有する改変された組換えタンパク質を生成し得る。あるいは、融合ポリペプチドは、リーダーペプチドの開裂のための部位が組換えタンパク質の配列中のいくつかのアミノ酸で生じるように設計され得る。これらの例において、変更されたＮ末端を有する改変された組換えタンパク質が、生成され得る。
【００５２】
本発明のリーダーペプチドをコードする核酸（融合構築物および発現ベクターを含む）は、選択された宿主に適切であり、そして当該分野において周知かつＡｕｓｕｂｅｌら（１９９８）前出に記載される方法によって、目的の宿主細胞に形質転換され得る。
【００５３】
本発明はまた、宿主細胞において組換えタンパク質を産生するための方法を提供し、この方法は、融合構築物を含む発現ベクターを用いて宿主細胞を形質転換する工程（ここで、この発現ベクターはまた、選択された宿主細胞において機能的なプロモーターを含む）、および融合ポリペプチドが発現されそして宿主細胞から分泌されるような条件下で、形質転換された宿主細胞を培養する工程を包含する。宿主細胞は、原核生物細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）あるいは真核生物細胞（例えば、真菌細胞（例えば、酵母細胞）、昆虫細胞、植物細胞または哺乳動物細胞）であり得る。本発明のこの局面における使用のために適切な哺乳動物細胞としては、トランスジェニック動物の細胞および組織培養細胞が挙げられる。好ましくは、哺乳動物宿主細胞は、確立された細胞株（例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞）、げっ歯類骨髄腫細胞株またはハイブリドーマ細胞株、あるいはヒト細胞株である。各特定の宿主について、発現ベクターは、プロモーターおよび選択マーカー（存在する場合）が、選択された宿主において機能的であるように選択される。さらに、リーダーペプチドをコードするヌクレオチド配列は、本明細書中に記載のように、特定の宿主のために最適化され得る。形質転換された宿主細胞は、発現ベクターによってコードされる融合ポリペプチドの発現のために適切な条件下で培養される。適切な条件は、選択される特定の宿主および融合ポリペプチドの発現を制御する特定のプロモーターによって変化する。当業者は、適切な培養条件を選択する能力がある。融合ポリペプチドおよび／または組換えタンパク質の産生は、当業者に明らかな多くの方法のいずれかによってモニターされ得る。例えば、細胞質、ぺリプラズムまたは培養培地中のタンパク質レベルは、酵素的アッセイによってか、またはタンパク質染色されたＰＡＧＥゲル上のバンドのデンシトメトリーによってモニターされ得る。
【００５４】
以下の実施例は、本発明の例示のために提供され、限定することを意図しない。
【００５５】
（実施例）
（実施例１−ｈ４Ｄ５ｓｃＦｖを用いたリーダーペプチドの設計および融合構築物の調製）
３つのリーダーペプチドについてのアミノ酸配列を、組換えタンパク質のＮ末端における融合のために設計した。最初に選択されたこれら３つのアミノ酸配列を、ＳＳＳ１Ａ、ＳＳＳ１ＢおよびＳＳＳ２として、以下に示す。
【００５６】
合成タンパク質配列をコードするヌクレオチド配列を、標準的なオリゴヌクレオチド合成技術によって構築し、そしてプラスミドｐＢＡＤ／ＨｉｓＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中に挿入した。各リーダーペプチドをコードするように選択されたヌクレオチド配列を、以下に示す。この合成リーダーペプチドを、既知のリーダーペプチド（ＳｔＩＩ、ＯｍｐＡおよびｐｅｌＢリーダー配列）と、タンパク質の分泌を指向する能力について比較した（ｐｅｌＢリーダーは、既知の配列から僅かに改変されていた）。合成リーダーペプチド配列または天然に存在するシグナル配列をコードするＤＮＡを、それぞれ、ｐＢＡＤ／ＨｉｓＡプラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中のｈ４Ｄ５ｓｃＦｖ（Ｃａｒｔｅｒら、１９９２、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、ＵＳＡ、８９、４２８５−４２８９）をコードするＤＮＡ配列の５’末端に連結し、そして発現プラスミドを、製造業者の指示に従うアラビノーズ誘導後のｈ４Ｄ５ｓｃＦｖ発現の評価のために、Ｅ．ｃｏｌｉ中に導入した。
【００５７】
ＳｔＩＩリーダーペプチドおよびＣ末端ヘキサヒスチジンタグを有する４Ｄ５ｓｃＦｖ遺伝子を、合成オリゴヌクレオチドを使用するＰＣＲによって構築し、次いで、ＢｓｐＨＩ−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントとして、ＮｃｏＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで予め消化したｐＢＡＤ／ＨｉｓＡベクター中にクローニングした。さらなる構築物を、リーダーペプチドをコードする合成オリゴヌクレオチドカセットを、ＮｃｏＩ−ＳａｃＩフラグメント、ＮｃｏＩ−ＢｓｉＷＩフラグメントまたはＮｃｏＩ−ＮｇｏＭＩＶフラグメントとして導入することによって、他の天然に存在するリーダーペプチドまたは合成リーダーペプチドから調製した。リーダーペプチド構築物のＤＮＡ配列を、ＤＮＡ配列決定によって確認した。Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ株ＴＯＰ１０を、タンパク質産生をモニターするために、ｐＢＡＤベースの発現ベクターで形質転換した。
【００５８】
（実施例２−融合ポリペプチドの調製）
実施例１からの形質転換体のそれぞれの細菌コロニーをピックアップし、１００μｇ／ｍｌのカルベニシリンを含む３ｍｌのＳｕｐｅｒＢｒｏｔｈ中で一晩増殖させた。この前培養物（１００μｌ）を使用して、５０ｍｌのコニカルチューブ中の１００μｇ／ｍｌのカルベニシリンを含有する１０ｍｌのＳｕｐｅｒＢｒｏｔｈに播種した。この培養物を、中間の対数期まで増殖させ（３．７５〜４時間）、０．０１％のアラビノースで誘導させ、そして４．５〜５時間後に回収した。培養物を、１５０ｒｐｍで振盪しながら３０℃で増殖させた。細胞を、ＳＬ−２５０Ｔローター（Ｓｏｒｖａｌｌ）中で、１０，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離することによって回収した。ブロス上清のサンプル中のタンパク質を、ＴＣＡで沈殿させた。この細胞ペレットを、２．５ｍｌの氷冷したスクロース緩衝液（２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ　ｐＨ８．０、２８％スクロース、および２ｍＭ　ＥＤＴＡ）中に再懸濁し、１０分間氷上に置き、次いでＳＬ−２５０Ｔローター（Ｓｏｒｖａｌｌ）中で、１４，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離した。スクロース抽出物中のタンパク質を、ＴＣＡで沈殿させ、そして細胞ペレットの小さいサンプルを、ＰＡＧＥ分析のためにＮｕＰＡＧＥサンプル緩衝液（Ｎｏｖｅｘ）中に取った。ＴＣＡ沈殿物を、遠心分離によって収集し、冷却（−２０℃）アセトンで洗浄し、このペレットをＳｐｅｅｄＶａｃ（Ｓａｖａｎｔ）を使用して乾燥させ、そして２００μｌのＮｕＰＡＧＥサンプル緩衝液中に再懸濁した。全てのタンパク質サンプルを、４〜１２％ＮｕＰＡＧＥゲル（Ｎｏｖｅｘ）上に充填する前に１０分間１００℃で加熱し、そしてこのゲルを２００ボルトでＭＯＰＳ緩衝液（Ｎｏｖｅｘ）中で電気泳動した。電気泳動後、このゲルを約５０ｍｌの脱イオン水中で、５分間ずつ３回洗浄した。次いでこのゲルを、ＧＥＬＣＯＤＥ　Ｂｌｕｅ　Ｓｔａｉｎ　Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｐｉｅｒｃｅ）中で１時間染色し、そして脱イオン水を何回か交換しながら数時間脱染色した。乾燥させたゲル（ＤｒｙＥａｓｅ−Ｎｏｖｅｘ）を、対照のために黄色のフィルターを備える平台スキャナ（Ｄｕｏｓｃａｎ　Ｔ１２００−ＡＧＦＡ）を使用して、スキャンした（Ｆｏｔｏｌｏｏｋソフトウェア−ＡＧＦＡ）。４Ｄ５　ｓｃＦｖタンパク質のバンド強度を、Ｓｌｏｔ−Ｂｌｏｔ　Ａｎａｌｙｓｉｓソフトウェア（ＧｅｌＥｘｐｅｒｔ−Ｎｕｃｌｅｏｔｅｃｈ）を使用して決定し、そして単位領域あたりの強度としてグラフ化した。バックグラウンドを、マーカーレーン中の等分子量領域から取り、そして強度の値から減算した。正確な４Ｄ５　ｓｃＦｖのバンドを、ＩＮＤＩＡ　ＨｉｓＰｒｏｂｅ−ＨＲＰ（Ｐｉｅｒｃｅ）またはＩｍｍｕｎｏＰｕｒｅ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｌ−ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ結合試薬（Ｐｉｅｒｃｅ）によるいずれかでプローブしたブロット上の陽性シグナルによって確認した。
【００５９】
それぞれの合成的リーダーペプチドは、培養ブロス中の成熟ｈ４Ｄ５　ｓｃＦｖタンパク質の出現によって決定されるような分泌シグナルとして作用し得、標準的な技術に従ってポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）によって分析した。ｓｃＦｖタンパク質のバンドの同定を、ペルオキシダーゼ結合Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｌを使用したウェスタンブロットにより行った。最初の実験において、３つの合成的シグナル配列の効率における驚くべき差異を観察した。ＳＳＳ１Ａは、ＳｔＩＩ原核生物シグナル配列を使用して分泌される、培養ブロス中に分泌される同量のｈ４Ｄ５　ｓｃＦｖを生成した。ＳＳＳ１Ｂは、ＳｔＩＩまたはＳＳＳ１Ａのいずれかよりも多くの分泌ｈ４Ｄ５　ｓｃＦｖを産生し、そしてＳＳＳ２は、分泌ｓｃＦｖの最小量を産生した。
【００６０】
どのエレメントが分泌効率における差異に関与するかを決定する試みにおいて、ＳＳＳ２リーダーペプチドを、さらに改変してＳＳＳ２Ｂを形成した。ＳＳＳ２Ｂにおいて、Ｎ末端近くのアミノ酸配列ＲＫは、ＳＳＳ１リーダーペプチドにおけるようなＫＫに変化し、アラニンは、疎水性コアの中心のより近くに移動し、そしてアスパラギン残基は、ＡＸＡに隣接するα−ヘリックスのブレーカーとしてプロリンで置換された。次いで、ｈ４Ｄ５　ｓｃＦｖの分泌を、ＳＳＳ２Ｂをシグナル配列として使用して試験し、そして２つの通常使用される原核生物シグナル配列（ＯｍｐＡおよびＰｅｌＢ＊）と比較した。ＰｅｌＢ＊は、ペクテートリアーゼ（ＰｅｌＢ）シグナル配列の改変形態であり、Ｃ末端の配列ＱＰＡＭＡは、ＱＰＡＮＡで置換されている。周辺質から抽出されるｓｃＦｖの産生、または培養培地中の存在は、ＳＳＳ２Ｂをリーダーペプチドとして使用することによって、ＳＳＳ２と比較した場合に、非常に増加した。ＳＳＳ２Ｂを使用して産生される、周辺質におけるｓｃＦｖの量はまた、ＯｍｐＡまたはＰｅｌＢ＊シグナル配列のいずれかを使用して産生した量よりも多かった。ＳＳＳ２Ｂをリーダーペプチドとして使用する培養培地中に蓄積されるｓｃＦｖのレベルは、ＯｍｐＡを用いて得られるレベルと同様であり、そしてＰｅｌＢ＊シグナル配列を使用するよりも非常に大きかった。
【００６１】
４つの異なる合成的リーダーペプチドに融合される場合、スクロース抽出物、ブロス、または細胞ペレットにおける４Ｄ５　ｓｃＦｖの産生のための代表的なゲルを、図１に示す。４Ｄ５　ｓｃＦｖタンパク質の分泌を駆動するリーダーペプチドの効率を評価するために、染色されたバンドの強度を決定し、そして棒グラフにプロットした（図２）。図１および図２において見られ得るように、ＳＳＳ２は、他の３つの合成的リーダーペプチドほど多くのタンパク質をブロスサンプル中で産生しない。これは、培養ブロス中へのタンパク質のより少ない引き続く漏出を生じる、周辺質への乏しい（または遅延した）分泌に、最も起因するようである。実際、より早い時点、すなわちより低いアラビノース誘導濃度では、他の合成的リーダーペプチドを使用して作製される融合構築物を用いて産生されるより、ＳＳＳ２融合構築物を用いて産生される方が、より少ない４Ｄ５　ｓｃＦｖがスクロース抽出物中で一貫して存在する（データは示さず）。ＳＳＳ２を除いて、合成的リーダーペプチド（ＳＳＳ１Ａ、ＳＳＳ１Ｂ、およびＳＳＳ２Ｂ）は、通常使用されるリーダーペプチド（ＳｔＩＩ、ＰｅｌＢ、およびＯｍｐＡ）と同じ量の４Ｄ５　ｓｃＦｖタンパク質を産生する（図３および図４を参照のこと）。実際、試験された条件下で、ＳＳＳ２Ｂは、代表的に、分析された他のリーダーペプチドよりも約１０％多くのタンパク質を、スクロース抽出物中で産生する（図２および図４を参照のこと）。
【００６２】
次いで、合成的リーダーペプチドを、２つの異なるアラビノース誘導濃度（０．０１％および０．００１％）で、３０℃で１５０ｒｐｍで振盪しながら増殖させ培養物を用いて試験した。サンプルを、アラビノース誘導後１．５時間および５時間で回収した。培養培地、周辺質および最終細胞ペレットにおける、ｈ４Ｄ５　ｓｃＦｖの産生レベルを、ＰＡＧＥによって評価した。ＳＳＳ１ＡおよびＳＳＳ１Ｂリーダーペプチドは、より高い分子量の種（プロセシングされないシグナル配列を有するｈ４Ｄ５　ｓｃＦｖがもっともありそうである）は、細胞ペレット中で時間と共に、またはより高い誘導濃度で増加するという点で、ＳｔＩＩおよびＯｍｐＡ配列と同様の結果を生じた。このより高い分子量の種は、ＳＳＳ２、ＳＳＳ２ＢまたはＰｅｌＢ＊シグナル配列を使用して観察されなかった。一般に、ｈ４Ｄ５　ｓｃＦｖの培養培地中の産生レベルは、一般的傾向：ＳＳＳ２Ｂ≒ＳＳＳ１Ｂ＞ＳＳＳ１Ａ≒ＳｔＩＩ≒ＯｍｐＡ＞＞ＰｅｌＢ＊＞＞ＳＳＳ２に従うが、このレベルは、回収時間、誘導濃度または増殖条件に依存して変化し得る。周辺質分画中のｓｃＦｖレベルの相対差は、培養培地中におけるように明白ではなく、回収時間、増殖条件および誘導濃度に依存していくらか変化した。ほとんどの実験において、ＳＳＳ２Ｂリーダーは、周辺質において他のリーダーペプチドよりも多くのｈ４Ｄ５　ｓｃＦｖを産生した。
【００６３】
合成的リーダーペプチドＳＳＳ１ＡおよびＳＳＳ１Ｂのアミノ酸配列は、疎水性コアの末端かつリーダーペプチド切断部位（ＡＮＡ）の前の５アミノ酸だけが異なり、そして予測されるように、これら２つのリーダーペプチドの両方は、４Ｄ５　ｓｃＦｖをかなり分泌する。しかし、ＳＳＳ２およびＳＳＳ２Ｂもまた、５アミノ酸だけが異なるが、ＳＳＳ２は、ＳＳＳ２Ｂよりも非常に少ないタンパク質しか培養ブロス中に産生しない。産生レベルの差異が、ペプチド配列またはｍＲＮＡ配列のどちらに起因するかを試験するために、２つの新規なＳＳＳ２の改変体（ＳＳＳ２ＫＰおよびＳＳＳ２ｍ）を作製した。ＳＳＳ２ＫＰにおいて、３位のアルギニンをリジンに置換し、そして２１位のアスパラギンをプロリンに置換して、これらの位置のアミノ酸をＳＳＳ２Ｂリーダーペプチドに存在するアミノ酸に変換した。ＳＳＳ２ｍにおいて、ＳＳＳ２のアミノ酸配列は保持されているが、６アミノ酸のゆらぎ位置を、５’ｍＲＮＡ構造および／またはコドンの用法を変更するために変化させた。ｈ４Ｄ５　ｓｃＦｖとの融合構築物を、上記のようにそれぞれの新規なリーダーペプチドを用いて調製した。ＳＳＳ２ＫＰリーダーまたはＳＳＳ２ｍリーダーの融合構築物を保有する２つの独立したクローンを、他の４つの合成的リーダーペプチドに対して試験した（図５）。ＳＳＳ２ＫＰは、ＳＳＳ２とほとんど同じく機能し、一方、ＳＳＳ２ｍは、４Ｄ５　ｓｃＦｖタンパク質を、ＳＳＳ２Ｂほど効率的に分泌する（図５において分析される条件下で、ＳＳＳ２ｍは、他の合成的シグナル配列よりも、より多くのタンパク質を培養培地中でさらに産生する）。これらの結果は、シグナル配列の翻訳開始および／または翻訳伸長は、分泌の効率において役割を果たすことを示唆する。
【００６４】
（合成的リーダーペプチド配列およびそれをコードする好ましいポリヌクレオチド）
【００６５】
【化２】
2004510410.tif 000003
（細菌シグナル配列）
【００６６】
【化３】
2004510410.tif 000004
（＊構成を単純化するために、野生型ＰｅｌＢ配列−ＱＰＡＭＡを−ＱＰＡＮＡに変化させた）
【００６７】
【化４】
2004510410.tif 000005
（実施例３−融合構築物のＲＮＡ二次構造の決定）
融合構築物のそれぞれから転写されたｍＲＮＡの５’領域の予想される二次構造を、Ｇｅｎｅｑｕｅｓｔプログラム（ＤＮＡＳＴＡＲ，Ｉｎｃ．からのＬａｓｅｒＧｅｎｅソフトウェアから）を使用して決定した。ＡＵＧ開始コドンの５’のｍＲＮＡ配列は、全ての構築物について同じであり、そしてＡＣＣＣＧＴＴＴＴＴＴＧＧＧＣＴＡＡＣＡＧＧＡＧＧＡＡＴＴＡＡＣＣ（配列番号２２）であった。このＲＮＡの最初の１０５塩基の配列（５’末端からリーダーペプチドのコード領域を通って）を、ＲＮＡ二次構造を予測するために使用した。温度パラメータを、３７℃に設定し、そしてＧＵ対形成を許可した。表２は、対であるＲＢＳおよびＡＵＧの塩基の数に関する結果およびＲＢＳまたはＡＵＧのどちらがステムループ構造中に埋もれているかを示す。
【００６８】
【表１】
2004510410.tif 000006
（実施例４−ジシストロンｍＲＮＡ由来の組換えＦａｂ’）
組換えヒト免疫グロブリンＦａｂ’フラグメントを、構築されたＦａｂ’フラグメントの周辺質間隙への分泌を指向するために、合成的リーダーペプチド配列を使用してＥ．ｃｏｌｉ中に発現させた。単一のＲＮＡ転写産物由来のＦａｂ’フラグメントの重鎖および軽鎖の両方を発現し得るジシストロンメッセージをコードするＤＮＡ配列を、構築した。ヒト免疫グロブリンκ鎖（Ｖｋ１）のためのコード配列を、ＳＳＳ２Ｂ合成的リーダーをコードする配列の下流に、およびこの配列とインフレームで配置した。κ鎖の翻訳終止コドンの３ヌクレオチド後ろに、別の翻訳開始シグナルを、ＮｄｅＩ部位を介して、ＳＳＳ１Ａのシグナルペプチド配列とインフレームで挿入した。重鎖可変領域配列（ＶＨ３）を、ヒトＣＨ１ドメインおよびヒンジ領域をコードする配列に沿って、シグナルペプチドの後ろに連結する。正確な終結を確実にするために、２つの翻訳停止シグナルを、コード領域の末端に含めた。ＳＳＳ１Ａのリーダーペプチドは、アミノ酸配列ＭＡＫＫＮＳＴＬＬＶＡＶＡＡＬＩＦＭＡＧＲＡＬＡ（配列番号２３）を有し、これは、ヌクレオチド配列ＡＴＧＧＣＴＡＡＡＡＡＧＡＡＣＴＣＣＡＣＣＣＴＧＣＴＣＧＴＴＧＣＡＧＴＡＧＣＴＧＣＧＣＴＧＡＴＣＴＴＣＡＴＧＧＣＣＧＧＡＡＧＧＧＣＣＴＴＧＧＣＣ（配列番号２４）によってコードされる。
【００６９】
ジシストロンメッセージをコードするＤＮＡを、ｐＢＡＤＨｉｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のＮｃｏＩ部位とＨｉｎＤＩＩＩ部位との間に挿入してｐＢＡＤ２Ｂ１Ａ−ｖｋ１−ｖｈ３を形成し、それによりジシストロンメッセージの発現が、ａｒａＢプロモーターの制御下となった。ｐＢＡＤ２Ｂ１Ａ−ｖｋ１−ｖｈ３のジシストロン部分の概略図を、図６に示す。このプラスミドを、特徴付けおよび発現のためにＴＯＰ１０　Ｅ．ｃｏｌｉ株へ形質転換した。一晩培養したものをＳｕｐｅｒＢｒｉｔｈ中へ１００μｇ／ｍＬのカルベニシリンで１／１００に希釈した。この培養物を、バッフルなしのフラスコ中で２２５ＲＰＭで、ＯＤ６００が０．５になるまで（２〜３時間）３７℃で増殖させた。この時点で、アラビノースを、最終濃度が０．０１％になるように添加し、温度を３０℃まで低下させ、そしてこの培養物をさらに３時間、振盪しながらインキュベートした。誘導後、細菌ペレットを遠心分離によって収集し、そしてタンパク質を実施例２に記載されるように抽出した。構築されたＦａｂ’（これは、標的抗原に結合し得る）を、約１ｍｇ／ｌ／ＯＤの収率で単離した。
【００７０】
本明細書中で言及されるすべての刊行物および特許出願は、まるで個々の刊行物または特許出願が詳細に、および個々に参考として援用されて示されるのと同じ程度に、参考として本明細書中に援用される。
【００７１】
ここで本発明を十分に記載してきたが、多くの変更および改変が、本発明の精神および範囲から逸脱することなくなされ得ることが、当業者に明らかである。
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は、スクロース抽出物、細胞培地（「ブロス」）および細胞ペレット由来のタンパク質サンプルの染色したポリアクリルアミドゲルを示す。リーダーペプチドｈ４Ｄ５　ｓｃＦｖ融合物を含む細菌株ＴＯＰ１０の１０ｍｌの培養物を、４時間増殖させ、アラビノース（０．０１％）で誘導し、そして誘導後、５時間で回収した。１０μｌ、３６μｌおよび５μｌのサンプルを、スクロース抽出物、ブロスおよび細胞ペレットにそれぞれロードした。ｋＤａのサイズマーカー（Ｍ）の分子量を、ゲルの左側に示し、そしてプロセスされていない４Ｄ５　ｓｃＦｖおよびプロセスされた成熟タンパク質の予想される位置を、ゲルの右側に、それぞれ、閉矢印および開矢印によって示す（ｋＤａの予想される分子量もまた、示す）。ｓｃＦｖを分泌するために使用される合成リーダーペプチドは、各レーンの上部に標識した。１Ａ，１Ｂ、２および２Ｂは、それぞれ、合成リーダーペプチドＳＳＳ１Ａ、ＳＳＳ１Ｂ、ＳＳＳ２およびＳＳＳ２Ｂに対応する。
【図２】
図２は、図１のゲルから染色されたｈ４Ｄ５　ｓｃＦｖバンドの相対的強度のグラフを示す。
【図３】
図３は、天然に存在するＳｔＩＩリーダーペプチドとの融合物を含む、種々のリーダーペプチドｈ４Ｄ５　ｓｃＦｖ融合物で形質転換された最近から得られたタンパク質サンプルのＰＡＧＥ後の染色されたｈ４Ｄ５　ｓｃＦｖの相対的強度の棒グラフを示す。スクロース抽出物および培養培地（「ブロス」）から得られたタンパク質サンプルを、別のグラフに示す。融合構築物で形質転換されたＴＯＰ１０の１０ｍｌの培養物を、３．７４時間増殖させ、アラビノース（０．０１％）で誘導し、そして誘導後４．５時間で回収した。１０μｌおよび３４μｌのサンプルを、それぞれ、ＴＣＡ沈殿されたスクロース抽出物およびブロスサンプルにロードした。ＳＳＳ１Ａ、ＳＳＳ１ＢおよびＳＳＳ２の２つの異なるクローン（１および２と標識される）を、染色されたタンパク質ゲルから分析した。
【図４】
図４は、天然に存在するＯｍｐＡリーダーペプチドおよびＰｅｌＢリーダーペプチドと融合物を含む、種々のリーダーペプチドｈ４Ｄ５ｓｃＦｖ融合物で形質転換された細菌から得られたタンパク質サンプルのＰＡＧＥ後に染色されたｈ４Ｄ５　ｓｃＦｖバンドの相対的強度のグラフを示す。スクロース抽出物および培養培地（「ブロス」）から得られたタンパク質サンプルを、別々のグラフに示す。１０ｍｌの培養物を、４時間増殖させ、アラビノース（０．０１％）で誘導し、そして誘導後、５時間で回収した。１０μｌおよび３４μｌのサンプルを、それぞれ、ＴＣＡ沈殿したスクロース抽出物およびブロスサンプルにロードした。ＯｍｐＡ、ＰｅｌＢおよびＳＳＳ２Ｂの２つの異なるクローン（１および２）を試験した。
【図５】
図５は、種々のリーダーペプチドｈ４Ｄ５ｓｃＦｖ融合物で形質転換された細菌から得られたタンパク質サンプルのＰＡＧＥ後に、染色されたｈ４Ｄ５ｓｃＦｖバンドの相対的強度のグラフを示す。スクロース抽出物および培養培地（「ブロス」）から得られたタンパク質サンプルを、別々のグラフに示す。１０ｍｌの培養物を、３．７５時間増殖させ、アラビノース（０．０１％）で誘導し、そして誘導後、５時間で回収した。２０μｌおよび３６μｌのサンプルを、それぞれ、ＴＣＡ沈殿したスクロース抽出物およびブロスサンプルにロードした。ＳＳＳＫＰおよびＳＳＳ２ｍの２つの異なるクローン（１および２）を試験した。
【図６】
図６は、プラスミドｐＢＡＤ２Ｂ１Ａ−ｖｋ１−ｖｈ３のジシストロン部分の概略図である。２Ｂは、ＳＳＳ２Ｂリーダーペプチドを示し、１Ａ’は、ＳＳＳ１Ａ’リーダーペプチドを示す。シストロン間領域のヌクレオチド配列を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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