(57)【要約】本発明は、組成物及び植物中でのタンパク質、特に天然の状態において、生物学的に活性となるために複数の構造遺伝子の協調発現を必要とするタンパク質を産生する組成物及び方法を提供する。最終産物は、一般に、治療、診断又は工業的有用性を有する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
植物細胞中で機能的であり、５’から３’に操作可能に結合した以下の要素：転写制御要素；抗原に特異的に結合することができる抗体の免疫学的に活性な部分の第一の部分を含む第一のポリペプチドをコードする第一のコード領域；ＩＲＥＳ要素；抗原に特異的に結合することができる抗体の免疫学的に活性な部分の第二の部分を含む第二のポリペプチドをコードする第二のコード領域；を含む核酸構築物であって、該第一及び第二の部分が発現されるとき、それらが会合して抗原に特異的に結合することができる多サブユニットポリペプチドを形成する核酸構築物。
【請求項２】
植物細胞中で機能的であり、５’から３’に操作可能に結合した以下の要素：転写制御要素；多サブユニットタンパク質の第一のポリペプチドサブユニットをコードする第一のコード領域；ＩＲＥＳ要素；及び多サブユニットタンパク質の第二のポリペプチドサブユニットをコードする第二のコード領域；を含む核酸構築物であって、該第一及び第二のコード領域が同じサブユニットをコードしない核酸構築物。
【請求項３】
植物細胞中で機能的であり、操作可能に結合した以下の要素：転写制御要素；未成熟タンパク質を成熟タンパク質にプロセシングするためのプロセシングタンパク質をコードする少なくとも一つの第一のコード領域；植物細胞中で機能的であるＩＲＥＳ要素；及び未成熟タンパク質をコードする第二のコード領域；を含む核酸構築物であって、同じ植物細胞中における第一及び第二のコード領域の発現が、未成熟タンパク質をその成熟形へプロセシングすることをもたらし、ＩＲＥＳ要素がコード領域の間にあり、そして転写制御要素が、第一及び第二のコード領域の両者をコードするポリシストロン性転写産物を転写する核酸構築物。
【請求項４】
外因性多サブユニットタンパク質をコードするポリシストロン性ｍＲＮＡをコードする配列を含む、宿主植物細胞中で外因性多サブユニットポリペプチドを発現するための核酸構築物であって、外因性ポリペプチドが宿主植物細胞中では自然に発現しない核酸構築物。
【請求項５】
一本鎖Ｔ細胞受容体をコードするポリシストロン性ｍＲＮＡをコードする配列；一本鎖ＭＨＣ分子；免疫グロブリンスーパーファミリーの一本鎖タンパク質又はその融合体；を含む、ポリペプチドを発現するための核酸構築物。
【請求項６】
第一のコード領域及び第二のコード領域が抗体の重鎖又は軽鎖をコードし、第一及び第二のコード領域が同じ鎖をコードしない、請求項１に記載の核酸構築物。
【請求項７】
終止シグナルを更に含む、請求項１〜５のいずれかに記載の核酸構築物。
【請求項８】
第一及び第二のコード領域がターゲッティング配列を更に含む、請求項１〜５のいずれかに記載の核酸構築物。
【請求項９】
転写調節要素がプロモーターである、請求項１〜５のいずれかに記載の核酸構築物。
【請求項１０】
転写調節要素が植物細胞中で機能性であるＩＲＥＳ要素と入れ替わっており、組込みのゲノム座が遺伝子工学処理構築物の転写制御を提供する、請求項１〜５のいずれかに記載の核酸構築物。
【請求項１１】
抗体がモノクローナル抗体である、請求項１に記載の核酸構築物。
【請求項１２】
ＩＲＥＳ要素がＩＲＥＳｍｐ７５である、請求項１〜５のいずれかに記載の核酸構築物。
【請求項１３】
ＩＲＥＳ要素がＩＲＥＳｃｐ１４８である、請求項１〜５のいずれかに記載の核酸構築物。
【請求項１４】
ターゲッティング配列が、植物細胞の小胞体に対する第一及び第二のコード領域のポリペプチド産物を標的とする、請求項１〜５のいずれかに記載の核酸構築物。
【請求項１５】
ターゲッティング配列が、植物細胞のプラスチドに対する第一及び第二のコード領域のポリペプチド産物を標的とする遷移ペプチドである、請求項８に記載の核酸構築物。
【請求項１６】
プラスチドが葉緑体であるである、請求項１５に記載の核酸構築物。
【請求項１７】
ターゲッティング配列が、植物細胞のミトコンドリアに対する第一及び第二のコード領域のポリペプチド産物を標的とする遷移ペプチドである、請求項８に記載のいずれかの核酸構築物。
【請求項１８】
第一のコード領域が抗体分子の重鎖をコードし、第二のコード領域が抗体分子の軽鎖をコードする、請求項１に記載の核酸構築物。
【請求項１９】
第一のコード領域が抗体分子の軽鎖をコードし、第二のコード領域が抗体分子の重鎖をコードする、請求項１に記載の核酸構築物。
【請求項２０】
抗体がヒト又はヒト化されたものである、請求項１に記載の核酸構築物。
【請求項２１】
選択し得るマーカーをコードする遺伝子を更に含む、請求項１〜５のいずれかに記載の核酸構築物。
【請求項２２】
選択し得るマーカーをコードする遺伝子が、マーカーの発現を推進するプロモーターに操作可能に結合している、請求項２１に記載の核酸構築物。
【請求項２３】
少なくとも一つの真核細胞の複製開始点を更に含む、請求項１〜５のいずれかに記載の核酸構築物。
【請求項２４】
原核細胞の複製開始点を更に含む、請求項１〜５のいずれかに記載の核酸構築物。
【請求項２５】
原核細胞の複製開始点を更に含む、請求項２３に記載の核酸構築物。
【請求項２６】
少なくとも一つの付加的構造遺伝子に対するＩＲＥＳ要素５’を含む、少なくとも一つの付加的構造遺伝子を更に含む、請求項１〜５のいずれかに記載の核酸構築物。
【請求項２７】
未成熟タンパク質がプレプロインスリンである、請求項３に記載の核酸構築物。
【請求項２８】
ターゲッティングが、アポプラスト、液胞、葉緑体、プラスチド、ミトコンドリア、ペルオキシソーム又は核に対するもの、又は細胞壁に対するものである、請求項８に記載の核酸構築物。
【請求項２９】
第一の発現単位及び第二の発現単位を含む組成物であって、第一の発現単位が請求項１〜５のいずれかに記載の核酸構築物を含み、第二の発現単位がプロモーター又はＩＲＥＳ要素に操作可能に結合した第三のコード領域を含む組成物。
【請求項３０】
請求項１〜５のいずれかに記載の核酸構築物を含む、植物又はその部分。
【請求項３１】
植物がシロイヌナズナ、アブラナ属、トウモロコシ、アルファルファ、ダイズ、タバコ、アブラナ科、綿実、ヒマワリ、及びマメ科植物からなる群から選択される、請求項３０に記載の植物又はその部分。
【請求項３２】
植物細胞中では自然に産生されない外因性タンパク質を発現することができる宿主植物細胞を産生する方法であって、請求項１〜５のいずれかに記載の核酸構築物を宿主植物細胞に導入することを含む方法。
【請求項３３】
植物細胞から植物を増殖させることを更に含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
植物の子孫を培養することを更に含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
植物細胞が、プロトプラスト、細胞、カルス組織、懸濁培養、葉、根、幹、胚軸、花粉、種子、及び分裂組織から成る群より選択された組織からのものである、請求項３２に記載の方法。
【請求項３６】
タンパク質を発現するステップを更に含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３７】
タンパク質が、抗体、Ｔ細胞受容体、ＭＨＣタンパク質、免疫グロブリンスーパーファミリー、インターフェロン、インターロイキン、ホルモン、抗原、受容体、及び治療タンパク質からなる群から選択されたものである、請求項３２に記載の方法。
【請求項３８】
タンパク質が融合タンパク質である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３９】
融合タンパク質がエフェクター分子を含む、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
外因性多サブユニットタンパク質をコードするポリシストロン性ｍＲＮＡをコードする核酸を含む、少なくとも一つの細胞を含む宿主植物又はその部分であって、外因性タンパク質が宿主植物中では自然に発現しない宿主植物又はその部分。
【請求項４１】
植物がＦ０植物である、請求項４０に記載の植物又はその部分。
【請求項４２】
植物がシロイヌナズナである、請求項４０に記載の植物又はその部分。
【請求項４３】
多サブユニットタンパク質が、Ｔ細胞受容体、ＭＨＣ分子、免疫グロブリンスーパーファミリー又はコレセプターのタンパク質、核酸結合タンパク質、アブザイム、受容体、増殖因子、細胞膜タンパク質、分化因子、ヘモグロビン様タンパク質、及び多量体キナーゼからなる群から選択されたヘテロ二量体又はヘテロ多量体タンパク質を含む、請求項４０〜４２のいずれかに記載の植物又はその部分。
【請求項４４】
活性型に修飾され得る不活性ポリペプチド及び不活性タンパク質を活性型に修飾するためのプロセシングタンパク質をコードする、ポリシストロン性ｍＲＮＡをコードする核酸を含む、少なくとも一つの細胞を含む植物又はその部分。
【請求項４５】
プロセシングタンパク質がプロテアーゼである、請求項４４に記載の植物又はその部分。
【請求項４６】
不活性タンパク質がプレプロインスリンである、請求項４４〜４５のいずれかに記載の植物又はその部分。
【請求項４７】
プロセシングタンパク質がタンパク質に修飾を加えるための酵素である、請求項４４に記載の植物又はその部分。
【請求項４８】
酵素がキナーゼである、請求項４７に記載の植物又はその部分。
【請求項４９】
宿主植物細胞中では自然に発現されない外因性多サブユニットタンパク質を発現することができる宿主植物細胞を産生する方法であって、植物細胞中で多サブユニットタンパク質をコードするポリシストロン性ｍＲＮＡをコードする核酸を発現することを含む方法。
【請求項５０】
植物細胞がＦ０植物由来である、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
植物細胞がシロイヌナズナ細胞である、請求項４９に記載の方法。
【請求項５２】
多サブユニットタンパク質が、Ｔ細胞受容体、ＭＨＣ分子、免疫グロブリンスーパーファミリー又はコレセプターのタンパク質、核酸結合タンパク質、アブザイム、受容体、増殖因子、細胞膜タンパク質、分化因子、ヘモグロビン様タンパク質、及び多量体キナーゼから成る群から選択されたヘテロ二量体又はヘテロ多量体タンパク質を含む、請求項４９〜５１のいずれかに記載の方法。
【請求項５３】
活性型に修飾され得る不活性ポリペプチド及び不活性タンパク質を活性型に修飾するためのプロセシングタンパク質をコードする、ポリシストロン性ｍＲＮＡをコードする核酸を含む、植物中で外因性タンパク質の活性形を産生する方法。
【請求項５４】
プロセシングタンパク質がプロテアーゼである、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
不活性タンパク質がプレプロインスリンである、請求項５３又は５４に記載の方法。
【請求項５６】
プロセシングタンパク質がタンパク質に修飾を加えるための酵素である、請求項５２に記載の方法。
【請求項５７】
酵素がキナーゼである、請求項５６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、植物中における抗体及びその他の複合タンパク質の産生に関する。
【０００２】
（関連出願）
本発明は、２００１年６月８日出願の米国仮出願番号第６０／２９７，１０３号に対する優先権を、米国特許法１１９条（ｅ）[３５ＵＳＣ§１１９（ｅ）]の下に主張するものであり、その全文は、参照することにより本明細書にとり入れられている。
【背景技術】
【０００３】
組換えＤＮＡ技術は、ある種の有益な目的のために、ＤＮＡの特定の断片を有する生物体の遺伝子構成の修飾を必然的に伴う。この結果、広範な種々の応用のための有用な産物を産生するために、微生物、細胞培養、植物及び動物の工学に至っている。このことを実行するための重要な要件は、標準的方法によって以前に達成することができたものに比較して最もコスト的に効果的な方法で、関心のある産物を産生する能力である。本質において、遺伝子工学は、最も有用なそしてコスト的に効果的な生産システムで今や産生できる産物の明細を拡張している。
【０００４】
最初、この仕事は微生物系で実行されたが、種々の微生物真核生物（酵母及びその他の真菌類）及び培養における植物及び動物細胞を包含する生物体の多くの型を形質転換し、形質転換した全植物及び動物を産生する、今やおきまりの手順である。遺伝子組換えの方法がいかなるものであれ、それを通して産物の産生を目指した多くの挑戦がある。微生物系は、しばしば、形質転換細胞をクローニングし産生する速さにおいて最前線の優位性を提供するが、しばしば実験室から大きな発酵槽へのスケールアップに困難が伴う。更に、細菌は効率的に組換えタンパク質や酵素を合成し分泌するが、一般的に、必要な翻訳後修飾の全てを実施する装置を有していない。いくつかの真菌類は、分泌糖タンパク質を産生することができるが、しかし、グリカンの型及びプロセシングが動物において見られるものと異なっている。
【０００５】
哺乳類及び昆虫の細胞培養は、種々のタンパク質の産生に広く使用されてきたが、おそらく、翻訳後プロセシングが最も重要な利点となっているであろう。そうでなければ、培地、器具及び面倒な培養条件が、産生コストを引き上げ、そのシステムに著しい不利となるからである。微生物培養の場合と同様に、実験室スケールから大スケールへの翻訳は直接的ではないので、スケールアップは、又、しばしば重要な事項となる。そのようなシステムの更に別の不利な点は、ヒトの健康に関連する、宿在しているビリオン又はプリオンの可能性である。
【０００６】
遺伝子組換え動物は、ヒトのタンパク質をミルク中に生産する、尿中に排泄する、又は、鳥類の卵を経て産生することについて記載されてきた。一般的に、未だ、動物ウイルスや生体に引き起こす疾病の潜在的な問題がある。更に、生産集団（獣群）のスケールアップ及び維持コストは、顕著で非常に時間が掛かる。動物細胞培養のように、遺伝子組換え動物は、必要な翻訳後修飾を要するタンパク質を提供しなければならない。
【０００７】
組換えタンパク質発現系又は「バイオリアクター」としての植物の使用は、細菌、酵母、昆虫、動物及び細胞を基にした生産システムの魅力的な代替として考察されてきた。植物中でタンパク質を産生する多くの利点があり、遺伝子組換えタンパク質の産生のために植物を使用することは、広範な支持を得つつある。
【０００８】
植物生産系は、動物の病的汚染がなく精製が容易であることが認められている。形質転換法は、多くの植物種に存在する。多くの種子植物及び栽培穀物の場合、方法及び基幹施設は、大量の材料の収穫及び取り扱いが既に存在している。スケールアップは比較的簡単であり、種子の生産及び栽培面積に単純に依存している。それ故、類似の物質を哺乳類細胞培養又は遺伝子組換え動物を経て産生するのに比較して、産生物のコストは実質的に低減し、哺乳類ウイルス又はプリオンの汚染のリスクは減少し、そして原料及び生産設備に要する資本は比較的低い。
【０００９】
植物には、一般にただ一つだけ欠点があり、それはタンパク質の翻訳後の糖鎖形成にある。しかしながら、多くの場合、植物の選択的炭水化物修飾は、糖タンパク質に有害な効果又は望ましくない免疫原性々状の原因とはならないことが実証されている。
【００１０】
植物でタンパク質を発現する多くの生産システムが開発されている。それらの生産システムとして、油体類でのタンパク質の発現（Ｒｏｏｉｊｅｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  １０９：１３５３−１３６１（１９９５）；Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｒｅｅｄｉｎｇ  ３：４６３−４７０（１９９７））、根茎分泌を経るタンパク質の発現（Ｂｏｒｉｓｊｕｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １７：４６６−４６９（１９９９））、種子におけるタンパク質の発現（Ｈｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｒｅｅｄｉｎｇ  ３：２９１−３０６（１９９７）；Ｈｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  ｖｉａ  Ｈｉｇｈｅｒ  Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（Ｓｈａｈｉｄｉら編）、Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｒｐ．ｐｐ．１２７−１４８（１９９９）；Ｋｕｓｎａｄｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ５６：４７３−４８４（１９９７）；Ｋｕｓｎａｄｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ６０：４４−５２（１９９８）；Ｋｕｓｎａｄｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｐｒｏｇｒｅｓｓ１４：１４９−１５５（１９９８）；Ｗｉｔｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｒｅｅｄｉｎｇ４：３０１−３１２（１９９８））、ウイルス表面のエピトープとしてのタンパク質の発現（Ｖｅｒｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ２２０：６９−７５（１９９８）；Ｂｒｅｎｎａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ７３：９３０−９３８（１９９９）；Ｂｒｅｎｎａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ１４５：２１１−２２０（１９９９））、及びポテト塊茎でのタンパク質の安定な発現（Ａｒａｋａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ６：４０３−４１３（１９９７）；Ａｒａｋａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１６：２９２−２９７（１９９８）；Ｔａｃｋｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ４：６０７−６０９（１９９８））が挙げられる。組換えタンパク質は、又、タンパク質の高レベルの蓄積を与えるための位置を同定するために、種子、葉緑体又は細胞外空間を対象とすることができる。
【００１１】
産物をコードするＤＮＡの基本的な機能的断片は、タンパク質コード領域に続くプロモーター及び次いでターミネーターを包含することが、一般的に認められている。この基本的な単一シストロン性（別に、「モノシストロン性」とも云う）フォーマットは、どのような生物体においても遺伝子の発現の長い間の標準であった。リボソームスキャニングモデルによると、伝統的な最も真核性のｍＲＮＡ類である、４０Ｓリボソームサブユニットは、５’キャップに結合し、ＡＵＧコドンに達するまで非翻訳５’配列に沿って移動する（Ｋｏｚａｋ，Ａｄｖ．Ｖｉｒｕｓ  Ｒｅｓ．３１：２２９−２９２（１９８６）；Ｋｏｚａｋ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１０８：２２９−２４１（１９８９））。真核性ｍＲＮＡ類の大部分について、第一のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）のみが翻訳的に活性であるが、ｍＲＮＡは、複数のコード領域が、別々のプロモーターによって各々が制御されることなく発現されるように、ポリシストロン的に機能する異なったメカニズムがある（Ｋｏｚａｋ，Ａｄｖ．Ｖｉｒｕｓ  Ｒｅｓ．３１：２２９−２９２（１９８６））。
【００１２】
国際特許公開第９８／５４３４２号は、植物ウイルス由来のインターナル・リボソーム・エントリー・サイト（ＩＲＥＳ：ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｒｉｂｏｓｏｍｅ  ｅｎｔｒｙ  ｓｉｔｅ）を用いて植物で所望の遺伝子の同時発現方法を教示している。同公報は、又、タバモウイルスＩＲＥＳ要素が、植物、動物、ヒト及び酵母細胞における二シストロン性キメラＲＮＡ転写産物から３’近位遺伝子発現の内部翻訳経路を提供しており、外来遺伝子がＩＲＥＳから下流に挿入され発現され得ることを開示している。国際特許公開第００／７８９０８５号は、穀物で多重穀物保護形質の積み重ねを許容するように（即ち、農薬耐性及び殺虫性毒素の発現、Ｂｔ）、又は植物代謝物を変えることができる遺伝子を発現するように設計された遺伝子構築物で、ＩＲＥＳ要素を使用して、ある種のプラスチックの前駆体として役立つポリヒドロキシアルコネート類（ｐｏｌｙｈｙｄｒｏｘｙａｌｃｏｎａｔｅｓ、ＰＨＡ類）を産生することを記載している。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明は、植物中のタンパク質、特に天然の状態において、生物学的に活性となるために複数の構造遺伝子の協調発現を必要とするタンパク質を産生する組成物及び方法を提供する。最終産物は一般的には治療、診断又は工業的有用性を有する。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
従って、本発明の一態様は、５’から３’を包含し、内部リボソーム結合配列（ＩＲＥＳ：ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｒｉｂｏｓｏｍｅ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）によって各々分離された、転写イニシエーター及び複数の構造遺伝子を包含する組換え核酸分子、又は発現単位を目的としている。好ましい実施態様において、転写イニシエーターは、植物細胞中で機能的なプロモーターである（植物中で天然に見出される必要性は必ずしもないが）。転写イニシエーターは、更に、発現の程度及び／又は発現の特異性を調節するための、エンハンサー配列又はその他の制御要素（例えば、転写の時間的及び／又は空間的制御を提供する）を付加的に含む。
【００１５】
好ましくは、構造遺伝子は、多サブユニットタンパク質のサブユニットをコードする。本明細書で使用する「多サブユニットタンパク質」は、二つ以上の分離したポリペプチド、又は、単一球状タンパク質を形成するために互いに会合したタンパク質鎖を含んだタンパク質で、分離したポリペプチドの少なくとも二つが異なった遺伝子によってコードされているタンパク質である。一つの好ましい態様において、多サブユニットタンパク質は、少なくとも抗体の免疫学的に活性な部分を含み、それ故、抗原と特異的に結合することができる。例えば、多サブユニットタンパク質は、抗体分子の重鎖及び軽鎖、又はその部分を含むことができる。該部分を結合した多抗原は、多価抗体を生成するために、異なった構造遺伝子によってコードされることができる。
【００１６】
しかしながら、いかなる多サブユニットタンパク質も本発明の範囲内に包含される。例示的な多サブユニットタンパク質は、限定されないが、Ｔ細胞受容体、ＭＨＣ分子、免疫グロブリンスーパーファミリーのタンパク質、核酸結合タンパク質（例えば、複製因子、転写因子等）、酵素、アブザイム、受容体（特に、可溶性受容体）、増殖因子、細胞膜タンパク質、分化因子、ヘモグロビン様タンパク質、多量体キナーゼ、その他のようなヘテロ二量体又はヘテロ多量体タンパク質を包含する。
【００１７】
別の態様において、構造遺伝子は、協調的に機能するタンパク質複合体、例えば、酵素複合体、分化因子の複合体、複製複合体、その他の成分をコードする。
【００１８】
一つの態様において、本発明は、植物細胞中で機能的な転写イニシエーター、第一の多サブユニットタンパク質の一つのサブユニットをコードする構造遺伝子（例えば、抗体分子の重鎖及び軽鎖を含む）及び植物細胞中で活性な選択マーカーをコードする第一のレポーター遺伝子を含む、第一の発現単位を提供する。第二の発現単位は、又、植物細胞中で機能的な転写イニシエーター、第二の多サブユニットタンパク質（例えば、抗体分子の重鎖及び軽鎖）の別のサブユニットをコードする少なくとも一つの構造遺伝子、及び第一の発現単位におけるそれとは異なった選択マーカーをコードし植物細胞中で活性である第二のレポーター遺伝子を包含して提供され得る。少なくとも一つの発現単位は、原核的及び又は真核的な複製開始点を含むことができる。真核的起源の複数の異なった型は、例えば、植物細胞、哺乳類細胞、酵母細胞、昆虫細胞、その他の一つ又はそれ以上における発現単位の複製を可能にするように提供され得る。
【００１９】
別の好ましい実施態様において、発現単位の構造遺伝子は、未熟なタンパク質を成熟生物活性形に処理するのに必要な少なくとも一つのタンパク質をコードする。例えば、構造遺伝子は、プレプロインスリンのような未熟タンパク質を、タンパク質を開裂することによって、成熟型であるインスリンに加工するのに必要なプロテアーゼをコードすることができる。未熟タンパク質をコードする遺伝子は、同じ発現単位の部分として、又は異なった発現単位の部分として提供され得る。
【００２０】
更に別の好ましい実施態様において、組換え核酸分子又は発現単位は、植物細胞の内部又は外部のいくつかの位置に対する遺伝子の発現産物を指示するための、ターゲッティングペプチド配列（例えば、遷移ペプチド）をコードする配列である、少なくとも一つの構造遺伝子の５’を包含する。一態様において、各構造遺伝子は、選択された位置に対する構造遺伝子を指示している５’ターゲッティング配列を含む。５’ターゲッティング配列は、同じか又は異なっていてもよく、例えば、遺伝子産物のいくつかの組み合わせが、同じか又は異なった位置を標的とすることができる。組換え核酸分子は、選択マーカー遺伝子及び／又はポリアデニル化配列を、更に含むこともできる。好ましくは、ポリアデニル化配列は、発現単位の３’の殆どの部分である。
【００２１】
本発明の別の態様は、組換え核酸分子を含むベクターを調製し、ベクターを植物細胞に導入し、そのようにして形質転換植物細胞を産生し、複数のコード化配列を発現する形質転換植物細胞由来の植物を選択することを含む、植物中でタンパク質を産生する方法を目的としている。好ましい実施態様において、発現産物は、細胞膜、細胞外空間又は細胞内小器官、例えば葉緑体のようなプラスチドのような特異的な位置を標的としている。別の好ましい実施態様において、植物細胞は、シロイヌナズナ属の細胞である。形質転換植物細胞、組換え核酸分子を含む遺伝子組換え植物、形質転換植物細胞、植物の部分、及び形質転換植物由来の種子から再生された植物を包含するものが提供される。
【００２２】
本発明は、植物及び植物細胞において一過性又は安定的な発現のいずれかに有用であり、植物によって内在的には生産されない活性な生体分子を発現する、遺伝子構築物を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
本発明による、種々の遺伝子構築物は、図１及び図２に模式的に図示されている。図１は、プロモーターが、おのおのがＩＲＥＳ要素によって分離されている一連の遺伝子における第一の遺伝子を駆動する構築物を図示している。ＩＲＥＳ配列は、選択された植物細胞でキャップ構築物非依存性翻訳を開始する。好ましい実施態様において、ポリアデニル化シグナルが、転写の効率的なプロセシングを可能ならしめるように発現されるべく最後の遺伝子配列の３’に直接挿入されている。構築物の転写は、一つのポリシストロン性ｍＲＮＡの形成をもたらす。リボソームは、ｍＲＮＡの５’末端及び各ＩＲＥＳ要素に独立して結合し、ポリシストロン性ｍＲＮＡにおける全てのタンパク質の、独立しているがしかし協調的な発現を可能にしている。
【００２４】
図２は、本発明の別の実施態様を図示しており、ＩＲＥＳ要素がプロモーターよりもＤＮＡ構築物の５’末端に位置している。これによって、ＤＮＡ構築物が転写中に挿入される宿主の座位の転写活性によって制御されるように発現される構築物の遺伝子が可能となる。関連した実施態様において、ＤＮＡ構築物は、所望の転写発現プロフィールを有する前もって決められた染色体の座位に部位特異的に組み込みができる配列を包含している。それ故、図２によって表された実施態様において、５’ＩＲＥＳ要素は、遺伝子構築物が挿入された遺伝子座の転写制御に基づいて発現される遺伝子とすることが可能となる。
【００２５】
＜植物プロモーター＞
プロモーターは、植物細胞中で機能的であるとすれば、構成的であり、組織特異的であり、発生的に制御されるか或いは誘導され得るか又は抑制され得る。多くの植物プロモーターが、構成的か、又はある種の様式で制御される、遺伝子発現を指向することができると記載されている。制御は時間的、空間的又は発生の手掛かりを基にし、環境的にシグナル化されており、或いは化学的誘導物質又は抑制物質によって制御可能であり、そしてそのような物質は天然又は合成起源であり、そしてプロモーターは天然起源又は遺伝子工学処理されたものである。転写開始領域は、プロモーター及び少なくとも一つの付加的制御要素、例えばエンハンサーを含む。プロモーターは、又、キメラ、即ち少なくとも二つの異なった天然又は合成プロモーターからの配列要素を使用したものから由来する。
【００２６】
植物プロモーターは、当業者に知られた方法によって、異なった植物組織で導入遺伝子の発現を制御するように選択することができる（Ｇａｓｓｅｒ＆Ｆｒａｌｅｙ，Ｓｃｉｅｎｃｅ２４４：１２９３−９９（１９８９））。カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーター（ＣａＭＶ）及びＣａＭＶプロモーターの増強した誘導体（Ｏｄｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３（１３）：８１０（１９８５））、アクチンプロモーター（ＭｃＥｌｒｏｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ２：１６３−７１（１９９０））、ＡｄｈＩプロモーター（Ｆｒｏｍｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ８：８３３−３９（１９９０）；Ｋｙｏｚｕｋａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２２８：４０−４８（１９９１））、ユビキチンプロモーター、ゴマノハグサモザイクウイルスプロモーター、マンノピンシンターゼプロモーター、ノパリンシンターゼプロモーター及びオクトピンシンターゼプロモーター及びその誘導体が、考えられる構成プロモーターである。制御されるプロモーターは、光誘発（例えばリブロースビスリン酸カルボキシラーゼプロモーターの小サブユニット）、熱ショックプロモーター、硝酸及びその他の化学的に誘導されるプロモーター（例えば、米国特許第５，３６４，７８０号及び第５，７７７，２００号を参照）として記載されている。
【００２７】
組織特異的プロモーターは、植物の特別な部分でタンパク質を発現する理由があるときに使用される。葉特異的プロモーターは、３５Ｓエンハンサーに付随したＣ４ＰＰＤＫプロモーター（Ｓｈｅｅｎ，１５ＥＭＢＯ，１２：３４９７−５０５（１９９３））又は葉で特異的に発現するその他のプロモーターを含む。種子でタンパク質を発現するには、ナピン（ｎａｐｉｎ）遺伝子プロモーター（米国特許第５，４２０，０３４号及び第５，６０８，１５２号）、アセチルＣｏＡカルボキシラーゼプロモーター（米国特許第５，４２０，０３４号及び第５，６０８，１５２号）、２Ｓアルブミンプロモーター、種子貯蔵タンパク質プロモーター、ファセオリンプロモーター（Ｓｌｉｇｈｔｏｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８０：１８９７−１９０１（１９８３））、オレオシンプロモーター（Ｐｌａｎｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏ．２５：１９３−２０５（１９９４）；Ｒｏｗｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ１３５４：１−４（１９９７）；米国特許第５，６５０，５５４号；ＰＣＴ国際特許公開第９３／２０２１６号）、ゼインプロモーター、グルテリンプロモーター、デンプンシンターゼプロモーター、及びデンプン分枝酵素プロモーターが、全て有用である。
【００２８】
＜植物のＩＲＥＳ要素＞
ＩＲＥＳ要素は、以前に記載されたものの一つ（Ａｔｅｂｅｋｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，国際特許公開第９８／５４３４２号及び米国特許第６，３７６，７４５号；Ｓｎｅｌｌ，国際特許出願第２００００７８９８５号）又は植物細胞で活性な人工ＩＲＥＳ（即ち、合成又は遺伝子工学処理ＩＲＥＳ）である。多ＩＲＥＳ含有構築物のためには、異なったＤＮＡ配列を有するＩＲＥＳ要素を使用することが有用である。最近新しいタバモウイルス、ｃｒＴＭＶ、がＯｌｅｒａｃｉａ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ  Ｌ．植物から単離され、ｃｒＴＭＶゲノムが配列決定された（６，３１２ヌクレオチド）（Ｄｏｒｏｋｈｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｏｋｌａｄｙ  ｏｆ  Ｒｕｓｓｉａｎ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，３３２：５１８−５２２（１９９３）；Ｄｏｒｏｋｈｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．））。
【００２９】
典型的なタバモウイルスのＲＮＡと違って、ｃｒＴＭＶＲＮＡの３’近位ＣＰ遺伝子の翻訳は、特異的配列要素、ＩＲＥＳＣＰによって仲介されるインターナル・リボソーム・エントリー（ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｒｉｂｏｓｏｍｅ  ｅｎｔｒｙ）の機構によってインビトロ及びインプランタにおこる（Ｉｖａｎｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２３２，３２−４３（１９９７））。その結果は、ｃｒＴＭＶＲＮＡのＣＰ遺伝子の上流１４８ヌクレオチド領域が、インビトロ及びインビボ（プロトプラスト及び遺伝子組換え植物）での翻訳の内部開始を促進するＩＲＥＳＣＰを含有していたことを示した。
【００３０】
最近、タバモウイルスのゲノムＲＮＡは、インビトロでキャップ非依存的に配列に操作可能に結合したキメラｍＲＮＡ類から３’近位遺伝子の発現を促進することができるＭＰ遺伝子の上流配列を含むことが示された（Ｓｈｕｌａｃｈｅｖ  ｅｔ  ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２６３：１３９−１５４（１９９９））。ｃｒＴＭＶＲＮＡのＭＰ遺伝子から上流２２８ヌクレオチド配列（ＩＲＥＳＭＰ２２８ＣＲ）は、バイシストロン性転写から３’近位ＧＵＳ遺伝子の翻訳を仲介する。ｃｒＴＭＶＲＮＡのＭＰ遺伝子の上流７５ヌクレオチド領域は、２２８ヌクレオチド配列のようにまだ有効である。それ故、７５ヌクレオチド配列は、ＩＲＥＳＭＰ要素を含んでいる（ＩＲＥＳＭＰ７５ＣＲ）。ｃｒＴＭＶＲＮＡに類似して、タバモウイルス群（ＴＭＶＵＩ）の型のメンバーのゲノムＲＮＡの上流７５ヌクレオチド配列は、又、３’近位遺伝子のキャップ非依存性翻訳を仲介することができるＩＲＥＳＭＰ７５ＵＩ要素を含んでいることが見出された。
【００３１】
タバモウイルスは、ピコルナウイルス及びその他のウイルス及び真核ｍＲＮＡ類に示されたＩＲＥＳのそれとは著しく異なった、翻訳の内部開始の新しい例を提供する。キャップ非依存性翻訳を仲介することができるＩＲＥＳＭＰ要素は、ｃｒＴＭＶＲＮＡばかりでなくタバモウイルス群の型メンバー、ＴＭＮＵＩ、及び別のタバモウイルス、キュウリ緑斑モザイクウィルスのゲノム中にも含有されている。従って、タバモウイルス群の異なったメンバーがＩＲＥＳＭＰを含有している。
【００３２】
実施例として、二つの特異的ＩＲＥＳ要素が本発明の実証において使用されている。アブラナ科タバコモザイクウイルス（ｃｒＴＭＶ）のゲノムからの二つのＩＲＥＳ要素のヌクレオチド配列：
【００３３】
＜配列表１＞
2004535192.tif 000002
【００３４】
＜配列表２＞
2004535192.tif 000003
【００３５】
＜構造遺伝子によってコードされたタンパク質＞
一実施態様において、発現ユニットによってコードされ、本発明の方法によって発現されるタンパク質は、生物学的に活性になるために複数の構造遺伝子の協調発現を天然の状態で必要とするタンパク質である。一例において、タンパク質は、活性となるために複数のサブユニットの組み立てを必要とする。別の例においては、タンパク質は、未熟な形で産生され、活性となるためにプロセシング、例えば、少なくとも一つのタンパク質又はタンパク質修飾（リン酸化、グリコシル化、プレニル化、リボシル化等）を必要とする。
【００３６】
本発明の実例において記載された非限定的な実施例は、抗体（例えば、モノクローナル抗体）及びインスリンである。両クラスのタンパク質において、本発明は、協調発現の方法によって機能的分子を産生する能力ばかりでなく、遺伝子構築物及びそれに続く本明細書に開示されたポリシストロン性ｍＲＮＡ類の遺伝子構築物が、植物細胞においては通常ではないが、細胞のタンパク質分泌装置によって適正に認識されることを実証している。特に、ハイブリドーマ細胞の生成を必要とすることなしに、モノクローナル抗体を本発明の構築物及び方法によって産生することができる。
【００３７】
モノクローナル抗体の遺伝子は、ネズミ、ヒト又はその他の動物源から得ることができる。代わりに、それらは、合成的、例えば、抗体分子の重鎖又は軽鎖成分をコードする遺伝子のキメラ又は修飾形であることができる。コード領域、例えば、重鎖次いで軽鎖、又は軽鎖次いで重鎖、の順序は重要ではない。重鎖及び軽鎖ポリペプチド（例えば、可変重鎖及び可変軽鎖ポリペプチド）をコードする遺伝子は、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ又はＩｇＭを産生する細胞から誘導することができる。免疫グロブリン可変領域遺伝子をクローニングすることができる、ゲノムＤＮＡの断片を調製する方法は公知技術である。例えば、Ｈｅｒｒｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５２：１８０−１８３（１９８３）；Ｆｒｉｓｃｈａｕｆ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５２：１８３−１９０（１９８７）；Ｆｒｉｓｃｈａｕｆ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５２：１９９−２１２（１９８７）を参照。
【００３８】
免疫グロブリン産物をコードする遺伝子を単離するのに有用なプローブは、ＶＨ及びＶＬの枠組み構築物領域をコードするＶＨ及びＶＬ配列の不変部領域をコードする配列、及び完全再配列免疫グロブリン遺伝子の不変部領域用のプローブを含み、これらの配列は、得られる起源から入手できる。例えば、Ｅａｒｌｙ  ａｎｄ  Ｈｏｏｄ，Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，  Ｓｅｔｌｏｗ  ａｎｄ  Ｈｏｌｌａｅｎｄｅｒ  ｅｄｓ．Ｖｏｌ．３：１５７−１８８，Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｒｐ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８１）；及びＫａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔｓ，ＮＩＨ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９８７）を参照。
【００３９】
インスリンは、その自然の環境において、前駆体の形でコードされ翻訳され、次いで少なくとも一つのタンパク質分解の開裂ステップによって修飾されて、タンパク質の成熟及び機能的な形を形成する、タンパク質の例である。翻訳後、プレプロインスリンタンパク質の成熟形へのプロセシングは、アミノ末端分泌シグナル配列の脱離（真核分泌経路における一般的なステップ）及びズブチリシンファミリープロテアーゼ、例えばＰＣ２及びＰＣ１／ＰＣ３プロテアーゼ、による内部の部位におけるプロセシング、及びカルボキシペプチダーゼＥによるトリミングを含むタンパク質分解開裂を包含している。開裂は、内部ペプチド、Ｃ−ペプチド及びＡ及びＢペプチドの分離をもたらす。Ａ及びＢペプチドは、鎖内部及び鎖中ジスルフィド結合の形成を受け、成熟インスリンタンパク質を形成する。
【００４０】
真核分泌経路の細胞コンパートメントは適切なタンパク質成熟、折りたたみ、及びジスルフィド結合の形成に好適な環境を提供するので、植物でのこの様式におけるヒト又は動物タンパク質の発現は、適切に形成した成熟タンパク質の産生に有利であることを証明しているようである。成熟インスリンを合成する他の方法は、Ａ及びＢペプチドの各々を別々に発現し、ジスルフィド結合の形成をもたらすインビトロの適切な還元的環境を提供することを含む（米国特許第４，４２１，６８５号及び第４，５５９，３００号）。
【００４１】
ポリシストロン構築物の多くの型を、本発明に従ってインスリンを産生するために調製することができる。一実施態様において、ポリシストロン遺伝子構築物は、インスリンコード領域と共にそれ自身の分泌シグナル又は植物分泌シグナル、及びタンパク質プロセシング酵素をコードする構造遺伝子を含んでいる。ヒトインスリンの遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号Ｊ００２６５）は、種々の公知の方法を用いてクローニングすることができる。クローニングの好ましい形は、成熟ｍＲＮＡから誘導され、イントロン配列を除去し、クローニングされた遺伝子の全サイズを減縮したｃＤＮＡである。同様に、タンパク質分解酵素（ＰＣ２、ＰＣ１／ＰＣ３及びカルボキシペプチダーゼＥ）をコードする遺伝子は、例えば、上記したように、少なくとも一つの発現単位で、以下に記載した配列の少なくとも一つを含む、公知のＤＮＡ配列情報を用いて、全てクローニングすることができる。
【００４２】
【表１】
2004535192.tif 000004
【００４３】
これらの場合の各々において、遺伝子の好ましい型は、成熟ｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡ又はその等価ＤＮＡ配列である。植物内で成熟インスリンの高レベル発現を達成するためにこれらの構成要素の全ての発現を必要な比率でもたらすための、多くのポリシストロン性ベクターを生成することができる。それ故、本発明は、必要な遺伝子の全てをポリシストロン性ベクターに組み合わせることによって、処理した成熟治療タンパク質の植物における完全合成を提供する。
【００４４】
好ましい実施態様において、核酸構築物又は発現単位は、５’から３’の方向に、ヒトインスリン遺伝子の発現を駆動するプロモーターとその後に続くＩＲＥＳ（好ましくは、ｃｐ１４８又はｍｐ７５）、ＣＰ２のコード領域、第二のＩＲＥＳ、ＣＰ３のコード領域、第三のＩＲＥＳ、及びＣＰＥのコード領域を含む。完全なセグメントを、適切な植物転写終結シグナル及びポリアデニル化シグナルで３’末端において終結させ、転写の最も効率的なプロセシングを確実にする。図３を参照。遺伝子の単一の順序を記載したが、治療タンパク質のコード領域のいかなる与えられた配列に最適なコード領域の順序も標準技術に従って決定することができ、遺伝子が異なった順序を有する発現単位は、本発明の範囲内に包含される。
【００４５】
別の実施態様において、本発明の構築物及び方法は、インスリンの未成熟な形をコードする構造遺伝子が植物細胞に別々に、例えば、プロセシングタンパク質をコードする構造遺伝子を含有する構築物が導入された後に、導入されるように修飾することができる。このように、「宿主」プロセシング植物は調製され、インスリン遺伝子を含む発現単位が導入されるまで増殖される。例えばインスリンの場合、ポリシストロン性構築物はインスリンコード領域を含有せず、プロモーターは、第一（ＰＣ２）プロセシング酵素の発現を駆動し、次いでＰＣ３及びＣＰＥ遺伝子のＩＲＥＳによる駆動発現が続く。インスリン遺伝子は、次いで安定な遺伝子要素として、又は一過性の発現方法によって植物に導入される。そのような構築物の模式的な表示は、図３Ｂに示される。これら遺伝子の各々の産物は、ヒト細胞において起こるようなプロセスに最も似ている適切な細胞下のコンパートメントに局在している。
【００４６】
＜ターゲッティング配列＞
タンパク質が細胞内で合成される際、それらはターゲッティング配列によって特異的細胞下又は細胞外の場所を到達目標とする。ある場合は、アミノ酸の配列は、ポリペプチドのアミノ末端部分として合成され、そして、転移（トランスロケーション）又は局在化（ローカリゼーション）プロセスの後又はその間にプロテアーゼによって開裂される。例えば、真核生物におけるタンパク質分泌経路のモデルは、ｍＲＮＡにリボソームが結合し翻訳が開始されるのに続いて、新生ポリペプチド鎖が出現する。もしそれが分泌を運命づけられたタンパク質であるなら、タンパク質の中に出現したアミノ末端はシグナル認識粒子（ＳＲＰ）によって認識されて翻訳の一時的な失速をもたらし、一方、ｍＲＮＡ、リボソーム及びＳＰＲ複合体は小胞体（ＥＲ）と結合する。結合した後、タンパク質鎖は翻訳に伴ってＥＲ内腔へ移動するが、翻訳は再開される。タンパク質は翻訳後に移動することも可能であるが、しかし、このインビボプロセスは遥かに非効率であり、一般的にＥＲに入る正常な経路とは考えられない。
【００４７】
米国特許第５，４７４，９２５号は、細胞壁のセルロースマトリックスに対するタンパク質を標的にする組換えタンパク質に翻訳的に融合した、シグナルタンパク質を利用する発現構築物を記載している。これは、回復し得るセルロースマトリックスと共にタンパク質の単離を可能とし、ワタ（綿）におけるタンパク質の発現に特に有用である。それ故、本発明の一実施態様において、発現単位は、そのようなシグナルペプチドをコードする配列に枠内で融合する構造遺伝子を含むことができる。
【００４８】
別の態様において、タンパク質は、組織液から直接単離される抗体、好ましくはモノクローナル抗体のような、タンパク質が存在可能な植物の組織液を対象とする。組織液からタンパク質を単離する一つの例示的方法は、米国特許第６，２８４，８７５号に記載されている。従って、発現単位の一実施態様において、発現単位は、組織液に分泌されるタンパク質からの標的配列にインフレーム（ｉｎ  ｆｒａｍｅ）で融合した構造遺伝子を含む。そのようなタンパク質は、例えば、米国特許第６，２８４，８７５号に記載されている。
【００４９】
本発明において、及び特に好ましい実施態様、例えば構造遺伝子が抗体分子の重鎖及び軽鎖をコードする実施態様において、構造遺伝子は、分泌経路に対する発現単位産物に向けたターゲッティングペプチドを包含する。抗体は、通常タンパク質から分泌されるので、分泌プロセスは成熟抗体分子の産生に重要な役割を演じている。植物においてこれを達成するため、遺伝子が、その自然のままの哺乳類シグナルペプチドをコードする領域、或いは植物分泌シグナルペプチドが置換されている融合体として、いずれかを有するように合成（例えば、クローン化）される。シグナルペプチドとタンパク質の間の融合は、植物によるプロセシングにおいて、結果として得られるタンパク質のアミノ末端が、ヒト宿主において形成されるのと同じようにならなければならない。
【００５０】
植物の内膜系に対するターゲッティングタンパク質は、タンパク質のアミノ末端の適切な成熟を提供するので、本発明の好ましい実施態様である。内膜系の特異的領域に対する更なる局在は、もし問題のタンパク質が、更なるターゲッティング情報を含むように遺伝子工学処理しているか、或いは、されるなら、達成することができる。
【００５１】
プラスチド（例えば、葉緑体）及びミトコンドリアのようなオルガネラを標的にすることは、これらの場所のいずれかを標的とすることが、引き続いて開裂という事象を受けるアミノ末端シグナル配列によって命令されているので、所望のアミノ末端の成熟を達成するために有利である。好ましい実施態様において、シグナル伝達ペプチドは、発現産物をプラスチド（例えば、葉緑体）又はその他の細胞下のオルガネラに割り当てる。一例として、アルファルファのリブロース−ビスリン酸カルボキシラーゼの小サブユニットの遷移ペプチドが挙げられる（Ｋｈｏｕｄｉ，ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ１９７：３４３−３４５（１９９７））。ペルオキシソームのターゲッティング配列は、例えば植物Ｃ末端ターゲッティングトリペプチドＳＫＬのような、タンパク質をペルオキシソームに対して標的とすることができるＮ末端、内部、Ｃ末端のいずれかのペプチド配列のいずれにも関係している（Ｂａｎｊｏｋｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１０７：１２０１−０８（１９９５））。
【００５２】
一方、核局在化シグナルは、当然ながら、５’末端位（アミノ末端）に限定されず、そして、どのような公知の細胞の機構によってもタンパク質分解的には脱離しない。図３は、リブロース１，５−ビスリン酸カルボキシラーゼ小サブユニットをコードする、タバコの核遺伝子からの葉緑素ターゲッティングペプチドの配列を示す（ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号Ｘ０２３５３）。入り込むと、シグナリング或いは遷移ペプチドは、オルガネラのプロテアーゼの作用によって脱離する。５’末端にこの配列を含む、問題のタンパク質の成熟型の第一のアミノ酸に始まる配列（即ち、抗体重鎖又は軽鎖）への遺伝子融合は、タンパク質の成熟型を産生するのに有用である。
【００５３】
液胞での局在又は分泌のための内膜系に対するターゲッティングタンパク質のシグナル配列は、植物と動物で似ている。図４は、少数の抗体遺伝子のアミノ末端領域と並べて、植物カルレティキュリンタンパク質のアミノ末端部分の配列の比較を示す。この並びには、プレタンパク質の部分として作られたが、分泌経路を経由してプロセシングが続き最終の成熟タンパク質には存在しない、抗体タンパク質の部分を含んでいる。植物シグナルペプチドは、哺乳類の配列よりも１０〜１１アミノ酸だけ長く、真核生物の分泌シグナルペプチドに関連していることが知られている共通の特徴を明らかに共有している。この例において見られるように、このようなシグナル配列は幾分か長さにおいて変化していることは、めずらしいことではない。標準的な技術に従って、シグナリングペプチドは、本発明における使用に適合させることができる（例えば、任意の別の遺伝子とインフレーム（ｉｎ  ｆｒａｍｅ）で、クローニングに適切な末端を有して調製される）。
【００５４】
＜融合タンパク質＞
構造遺伝子は、又、融合タンパク質をコードする。例えば、多量体タンパク質又は多サブユニットタンパク質、もしくは処理されるタンパク質のポリペプチドサブユニットをコードする構造遺伝子は、エフェクターポリペプチドをコードする配列を含み得る。本明細書で使用されるように、「エフェクター分子」は、タンパク質、ポリペプチド又はペプチドのようなアミノ酸配列を意味し、制御因子、酵素、抗体、毒素、その他を含むことができるが、これに限定されない。エフェクター分子によって作られる所望の効果の非限定的例示は、細胞増殖又は細胞死の誘導、免疫応答の開始、或いは診断用の検出分子として作用する（例えば、融合は、ＧＦＰ、ＥＧＦＰ、ＢＦＰ、ＹＦＰ、ＥＢＦＰ、その他のような蛍光ポリペプチドをコードし得る）ことを包含する。
【００５５】
＜選択マーカー及び／又はレポーター遺伝子＞
選択マーカー、例えば抗生物質（例えば、カナマイシン及びヒグロマイシン）耐性、除草剤（グルホシネート、イミダズリノン又はグリホサート）耐性遺伝子又はレポーター遺伝子によってコードされる生理マーカー（可視又は生化学的）が、本発明の核酸構築物と共に形質転換された細胞の選択に使用される。一方、非遺伝子組換え細胞（例えば、非形質転換体）は、選択された条件下では、死滅するか、或いは優先的に生育できない。レポーター遺伝子は、構築物中に含まれるか、或いは究極的に構築物を植物細胞に輸送するベクター中に含まれ得る。本明細書において使用される「レポーター遺伝子」は、それが観察できるか又は測定できる表現型で発現される細胞を提供することができれば、どのような遺伝子でもよい。
【００５６】
好ましくは、レポーター遺伝子の発現は、検出し得る結果、例えば、生理的応答（例えば、増殖の差、増殖率の変化、分化の状態、その他）に基づいて形質転換体の選択を可能とするような、可視的な比色、蛍光、発光、又は生化学的にアッセイし得る産物及び／又は選択マーカーを生じる。細胞中でのレポーター遺伝子の発現は、細胞に可視的な生理学的又は生化学的特性を表示させることができる。一般的に使用されるレポーター遺伝子として、容易に可視化され或いはアッセイし得る、ｌａｃＺ（β−ガラクトシダーゼ）、ＧＵＳ（β−グルクロニダーゼ）、ＧＦＰ（グリーン蛍光タンパク質）、ルシフェラーゼ、又はＣＡＴ（クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ）が挙げられる。そのような遺伝子は、組み合わせて、又は問題とするクローンを容易に見つけることができるように、選択マーカーの代わりに使用される。選択マーカーは、マーカーを発現する細胞の単離を容易にする分子を包含することもできる。例えば、選択マーカーは、抗体によって認識され、親和性に基づいた精製技術又はフローサイトメトリーにより形質転換細胞を単離し得る抗原をコードすることができる。レポーター遺伝子は、又、植物細胞には外来であることによって（例えば、ＰＣＲによって検出可能）検出される配列を含む。この実施態様において、レポーター遺伝子はタンパク質を発現する必要はなく、又、表現型における可視的変化をきたす必要もない。
【００５７】
＜植物の形質転換＞
ＤＮＡ分子を植物宿主ゲノムに運搬し組み込む方法は、よく知られている。シロイヌナズナ真空浸潤法又は浸漬法のような方法は、多くの植物を狭いスペースで形質転換することができ、形質転換体をスクリーニングするための大量の種子を産するので好ましい。アグロバクテリウムは、一般に、明確な末端（Ｔ−ＤＮＡ境界）を有する直鎖状ＤＮＡ断片（Ｔ−ＤＮＡ境界）を運搬するので、同様に好ましい方法である。マイクロインジェクション、化学的処理、或いはマイクロプロジェクタイル法（バイオリスティックス）のような、直接ＤＮＡ形質転換法も又有用である。組換えＤＮＡ構築物の大きさに制限がなければ、本発明による配列をコードするポリシストロン性遺伝子は、ウイルスベクターを用いて植物に送達することができる。形質転換された植物細胞は、プロトプラスト、細胞培養、カルス組織、懸濁培養、葉、花粉或いは分裂組織であり得る。
【００５８】
形質転換細胞は、適切な場合、新しい核の材料がゲノムに安定的に挿入された全植物に再生され得る。形質転換された単子葉植物及び双子葉植物の両者が、このようにして得られる。本発明の核酸構築物で形質転換することができる植物には種々の型がある。産生され得る他の遺伝子修飾植物の例としては、作物、穀物、果実及び野菜、例えばカノーラ、タバコ、テンサイ、ワタ、ダイズ、トウモロコシ、コムギ、オオムギ、コメ、モロコシ、トマト、マンゴー、モモ、リンゴ、ナシ、イチゴ、バナナ、メロン、ジャガイモ、ニンジン、レタス、キャベツ、タマネギが挙げられる。好ましい植物は、シロイヌナズナ、アブラナ属、トウモロコシ、アルファルファ、ダイズ、タバコ、アブラナ科、綿実、ヒマワリ、及びマメ科植物である。
【００５９】
＜タンパク質の単離＞
培養後、組換え植物は収穫され、産生された多サブユニット化タンパク質又は処理タンパク質（及び／又は本発明に記載の構造遺伝子によって産生されたその他のタンパク質）を回収する。この収穫ステップは、全植物、或いは植物の葉、又は根又は細胞のみを収穫することを含む。このステップは、植物を殺処分するか、或いは、もし組換え植物の部分が収穫されるだけなら、植物の残りは生育を続けさせることができる。
【００６０】
収穫後、タンパク質の単離が、当該技術における常法を使用して実施される。例えば、少なくとも植物の部分が、ホモジナイズされ、そしてタンパク質が抽出され、更に精製される。抽出は、ホモジネートを適切な溶媒に液浸又は浸漬することを含む。上記で考察したように、タンパク質は、例えば、米国特許第６，２８４，８７５号に記載されているように、真空浸潤法によって植物の組織液から単離することができる。
【００６１】
精製方法は、免疫親和性精製、及びタンパク質／タンパク質複合体の特異的な大きさ、電気泳動の移動度、生物活性、及び／又は単離される多量体タンパク質の実効電荷に基づいた精製手順を包含するが、これらに限定されるものではない。
【００６２】
実施例
次に、本発明を、いくつかの実施例によって説明する。これら実施例は、例示の目的のためであり、いずれの方法においても本発明を限定することを意味しない。
【実施例１】
【００６３】
プラスミドＩＣＰ１１７６（図５）は、哺乳類の組織因子タンパク質を認識するＩｇＧ１サブクラスモノクローナル抗体（ｐｓｐＨＣＩｇＧ１）の重鎖コード領域を包含している。プラスミドＩＣＰ１２２１（図６）は、上記の重鎖と共に所望の特異性を有する全鎖モノクローナル抗体を形成するκ軽鎖コード領域（ｐｓｐＬＣＩｇＧ１／４）を包含している。両クローンにおいて、標準的方法を使用して制限末端を作り、クローニングを容易にした。両コード領域は、ＮｃｏＩからＸｂａＩ制限断片として遊離される。（図８）に示す例において、軽鎖領域が（ＯＣＳ）３ＭＡＳプロモーターに隣接した植物発現ベクターにクローン化され、そして次に、ＩＲＥＳ（ｃｐ１４８）及び重鎖がその３’に挿入され、続いてＮｏｓ転写終結シグナルが挿入された。同じベクターは、２ｘ３５Ｓプロモーターの転写制御の下に、植物選択マーカー（ＢＡＲ）を担持している（ｐＩＣＧＨｐｏｌｙＡＢ１、図８）。
【００６４】
ＤＮＡ構築物はそれ故図１に記載された分子に類似しており、ここで、軽鎖遺伝子は遺伝子１であり、重鎖遺伝子は遺伝子２である。重鎖及び軽鎖遺伝子の順序が逆になった、同様なプラスミドが構築された。このベクターは、次に、アグロバクテリウムに移され、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ、Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｊｕｎｃｅａ及びＢ．ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓの一過性発現及び形質転換に使用された。シロイヌナズナのアグロバクテリウムでの形質転換は、アグロバクテリウム仲介植物形質転換を実施するための多くのプロトコールがあることが認められているが、真空浸潤法を用いて実行された。一過性発現アッセイが、葉の外植片と全幼植物の真空浸潤を用いて実施された。
【００６５】
図９に示す例において、構造遺伝子は抗体の軽鎖をコードする。遺伝子は（ＯＣＳ）３ＭＡＳプロモーターに隣接した植物発現ベクターにクローンニングされ、そして図に示すように、ＩＲＥＳ（ｃｐ１４８）及び植物選択マーカー（ＮＰＴＩＩ）が構造遺伝子に対し３’に挿入される。ＣａＭＶ３５Ｓ転写終結シグナルが、この構築物の３’末端に提供される。同じベクターが（ＯＣＳ）３ＭＡＳプロモーターに隣接してクローニングされた抗体の重鎖をコードする遺伝子を担持する。ＩＲＥＳ（ｃｐ１４８）及び植物選択マーカー（ＢＡＲ）が、重鎖遺伝子に対し３’に挿入され、ＣａＭＶ３５Ｓ転写終結シグナルが続いている（ｐＸＢ１５００、図１０）。この様式で、ＤＮＡ構築物は図１に記載した分子に類似しており、ここで、抗体鎖遺伝子は遺伝子１であり、選択マーカー遺伝子は遺伝子２である。
【００６６】
同様なプラスミドで、重鎖及び軽鎖の順序が逆になったものが構築された。このベクターは、次に、アグロバクテリウムに移すことができ、上記したように、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ、Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｊｕｎｃｅａ及びＢ．ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓの一過性発現及び形質転換に使用することができる。シロイヌナズナのアグロバクテリウムでの形質転換は、アグロバクテリウム仲介植物形質転換を実施するための多くのプロトコールがあることが認められているが、真空浸潤法を用いて実行することができる。一過性発現アッセイは、公知のようにして、葉の外植片と全幼植物の真空浸潤を用いて実施することができる。
【００６７】
アグロバクテリウムの形質転換の場合において、Ｔ１種子を選択剤を含有する培地で発芽し生育したものを、重鎖及び軽鎖コード領域の存在をＰＣＲ分析によってスクリーニングした。このようにして試験して陽性の材料は、更に増殖し、そしてウエスタンブロット法及びＥＬＩＳＡによって試験した。
【実施例２】
【００６８】
本実施例では、モノクローナル抗体の産生が記載される。
【００６９】
プラスミドＩＣＰ１１７７（図７）は、ＩｇＧ４サブクラスモノクローナル抗体（ｐｓｐＨＣＩｇＧ４）の重鎖コード領域を包含している。プラスミドＩＣＰ１２２１（図６）は、上記の重鎖と共に、所望の特異性を有する全鎖モノクローナル抗体を形成する、κ軽鎖コード領域（ｐｓｐＬＣＩｇＧ１／４）を包含している。
【００７０】
クローニングの手順（ｐＩＣＧＨｐｏｌｙＡｂ４を得る、図９）、植物形質転換、及び選択、及び産物の分析は、本質的に実施例１に記載されたものと同じである。
【実施例３】
【００７１】
本実施例では、単一のプロモーターによって駆動される三つのコード領域がある。この場合、植物選択マーカーは、プロモーターに隣接する５’に直結する遺伝子としてＤＮＡ構築物に直接含まれており、そして重鎖はその下流にｃｐ１４８ＩＲＥＳと共に５’末端に挿入されている。軽鎖遺伝子はその下流にｍｐ７５ＩＲＥＳと共に５’末端に挿入されており、そして最後に終結／ポリＡ部位が挿入されている。別の配置は、実施例１及び２におけるように、プロモーターによって駆動されるポリシストロン性重鎖及び軽鎖遺伝子、及び同じＤＮＡ構築物上に自身のプロモーターを有する選択マーカーを置いている。この様式で、抗体遺伝子は、プロモーターの一つの型の制御下にあり、選択マーカー遺伝子は別である。このことは、実施例１及び２に記載した共役形質転換法と比較してマーカーと抗体遺伝子のより強固な結合を提供するが、しかしなお、遺伝子の発現の分離された明白な制御を可能にしている。
【００７２】
本明細書に引用された特許及び非特許文献は、本発明に関係する当業者の技術水準を表すものである。これらの全ての文献及び特許出願は、あたかも、個々の文献又は特許出願が、本明細書に参照することによってとり入れられているように特異的に且つ個別に示されているのと同じ程度に、参照することによって、本明細書にとり入れられている。
【００７３】
当業者は、本明細書に記載された常法の実験、特定の物質の多くの均等物及び手順を使って認識又は確認をするであろう。そのような均等物は本発明の範囲内にあると考えられ、そして前述の特許請求の範囲内にある。
【図面の簡単な説明】
【００７４】
本発明の目的及び特徴は、以下の詳細な説明及び付属の図面を参照してよりよく理解することができる。
【００７５】
【図１】図１は、本発明の核酸構築物の模式的説明である。
【図２】図２は、本発明の核酸構築物の模式的説明である。
【図３】図３は、リブロース１，５−ビスリン酸カルボキシラーゼ小サブユニットからの葉緑体ターゲッティングペプチドの配列（ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号Ｘ０２３５３）を示す。
【図４】図４は、植物のカルレティキュリンタンパク質のアミノ末端部分を、種々の抗体遺伝子のアミノ末端領域と並べた、配列の比較を提供する。
【図５】図５は、ｐＩＣＰ１１７６のプラスミドマップである。
【図６】図６は、ｐＩＣＰ１２２１のプラスミドマップである。
【図７】図７は、ｐＩＣＰ１１７７のプラスミドマップである。
【図８】図８は、ｐＩＣＧＨｐｏｌｙＡｂ１のプラスミドマップである。
【図９】図９は、ｐＩＣＧＨｐｏｌｙＡｂ４のプラスミドマップである。
【図１０】図１０は、ｐＸＢ１５００のプラスミドマップである。
【図１１】図１１は、インスリンの産生に有用な本発明の核酸構築物の模式的説明である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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