(57)【要約】【課題】【解決手段】フルオレセイン及び誘導体は、ヒトを含む生きた動物体の疾病であって、嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子のクロライドチャネルの阻害に応答性を示す疾病、例えば、多発性嚢胞腎及び分泌性下痢の治療に用途を有する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトを含む生きた動物体の疾病であって、嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子クロライドチャネルの阻害に応答性を示す疾病を治療するための医薬の製造における、次式Ｉ
【化１】
2004503584.tif 000011
の化合物及び薬学的に許容されるその塩の使用（式中、Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３は、各々、Ｈ、炭素数１〜６のアルキル、及びハロから選択される同一又は異なる基とすることができ、Ｒ４は、Ｈ及び炭素数１〜６のアルキルから選択される基である）。
【請求項２】
請求項１に記載の使用であって、前記化合物が式Ｉ及び薬学的に許容されるその塩を有し、式中、Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３は同一か又は異なっており且つＨ、Ｃｌ、Ｂｒ、及びＩから選択され、Ｒ４はＨ及び炭素数１〜４のアルキルから選択される使用。
【請求項３】
請求項２に記載の使用であって、前記化合物が式Ｉを有し、式中、Ｒ１はＨ、Ｃｌ、Ｂｒ、及びＩから選択され、Ｒ２はＨ、Ｃｌ、Ｂｒ、及びＩから選択され、Ｒ３はＨ、Ｃｌ、Ｂｒ、及びＩから選択され、Ｒ４はＨ、メチル、及びエチルから選択される使用。
【請求項４】
請求項３に記載の使用であって、前記化合物が式Ｉを有し、式中、Ｒ１とＲ２がともにＢｒであり、Ｒ３がＣｌであり、Ｒ４がＨである使用。
【請求項５】
請求項３に記載の使用であって、前記化合物が式Ｉを有し、式中、Ｒ１とＲ２がともにＩであり、Ｒ３がＣｌであり、Ｒ４がＨである使用。
【請求項６】
請求項３に記載の使用であって、前記化合物が式Ｉを有し、式中、Ｒ１、Ｒ２、及びＲ４がＨであり、Ｒ３がＣｌである使用。
【請求項７】
請求項３に記載の使用であって、前記化合物が式Ｉを有し、式中、Ｒ１とＲ２がともにＢｒであり、Ｒ３とＲ４がともにＨである使用。
【請求項８】
請求項３に記載の使用であって、前記化合物が式Ｉを有し、式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、及びＲ４がＨである使用。
【請求項９】
嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子クロライドチャネルの阻害に対して応答性を示す前記疾病が多発性嚢胞腎である請求項１〜８の何れか１項に記載の使用。
【請求項１０】
嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子クロライドチャネルの阻害に対して応答性を示す前記疾病が分泌性下痢である請求項１〜８の何れか１項に記載の使用。
【請求項１１】
嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子クロライドチャネルの阻害に対して応答性を示す前記疾病が心不整脈である請求項１〜８の何れか１項に記載の使用。
【請求項１２】
嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子クロライドチャネルの阻害剤が、血管新生及び腫瘍血管新生を防止するために使用される請求項１〜８の何れか１項に記載の使用。
【請求項１３】
ヒトを含む生きた動物体の疾病であり、嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子（ＣＦＴＲ）クロライドチャネルの阻害に対して応答性を示す疾病を治療する方法であって、ＣＦＴＲクロライドチャネルを阻害する量の前記式Ｉ
【化２】
2004503584.tif 000012
の化合物及び薬学的に許容されるその塩を前記生きた動物体に投与することを備えた方法（式中、Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３が同一か又は異なることができ、各々、Ｈ、炭素数１〜６のアルキルから選択され、Ｒ４はＨ及び炭素数１〜６のアルキルから選択される基である）。
【請求項１４】
請求項１３に記載の方法であって、前記化合物が前記式Ｉ及び薬学的に許容されるその塩を有し、式中、Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３は同一か又は異なっており且つＨ、Ｃｌ、Ｂｒ、及びＩから選択され、Ｒ４はＨ及び炭素数１〜４のアルキルから選択される使用。
【請求項１５】
請求項１４に記載の方法であって、前記化合物が式Ｉを有し、式中、Ｒ１はＨ、Ｃｌ、Ｂｒ、及びＩから選択され、Ｒ２はＨ、Ｃｌ、Ｂｒ、及びＩから選択され、Ｒ３はＨ、Ｃｌ、Ｂｒ、及びＩから選択され、Ｒ４はＨ、メチル、及びエチルから選択される方法。
【請求項１６】
請求項１５に記載の方法であって、前記化合物が式Ｉを有し、式中、Ｒ１とＲ２がともにＢｒであり、Ｒ３がＣｌであり、Ｒ４がＨである方法。
【請求項１７】
請求項１５に記載の方法であって、前記化合物が式Ｉを有し、式中、Ｒ１とＲ２がともにＩであり、Ｒ３がＣｌであり、Ｒ４がＨである方法。
【請求項１８】
請求項１５に記載の方法であって、前記化合物が式Ｉを有し、Ｒ１、Ｒ２、及びＲ４がＨであり、Ｒ３がＣｌである方法。
【請求項１９】
請求項１５に記載の方法であって、前記化合物が式Ｉを有し、式中、Ｒ１とＲ２がともにＢｒであり、Ｒ３とＲ４がともにＨである方法。
【請求項２０】
請求項１５に記載の方法であって、前記化合物が式Ｉを有し、式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、及びＲ４がＨである方法。
【請求項２１】
治療すべき前記疾病が多発性嚢胞腎である請求項１３〜２０の何れか１項に記載の方法。
【請求項２２】
治療すべき前記疾病が分泌性下痢である請求項１３〜２０の何れか１項に記載の方法。
【請求項２３】
治療すべき前記疾病が心不整脈である請求項１３〜２０の何れか１項に記載の方法。
【請求項２４】
血管新生および腫瘍血管新生を治療又は予防するための請求項１３〜２０の何れか１項に記載の方法。
【請求項２５】
オスの避妊薬の製造における請求項１に記載した前記式Ｉの化合物の使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子（ＣＦＴＲ）のクロライド（ＣＩ−）チャネルの阻害に関する。さらに詳細には、本発明は、ＣＦＴＲ　Ｃｌ−チャネルの遮断剤又は阻害剤として分類された所定の化合物群に属する化合物、及びＣＦＴＲ　Ｃｌ−チャネルの機能不全によって引き起こされる疾病の治療におけるこれらの薬剤の使用に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ＣＦＴＲ（１）は、複雑な制御（２、３）を伴うＣｌ−チャネルを形成する。ＣＦＴＲは、上皮の頂端膜中で主として発現し、そこにＣｌ−イオンが移動する経路と、そこでの塩及び水の経上皮移動速度を制御する重要な場所を提供する（４）。
【０００３】
図１：ＣＦＴＲ　Ｃｌ−チャネルの調節
チャネルゲーティングを制御する嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子（ＣＦＴＲ）のドメイン構造の概略を図１に示す。このモデルの下方に、チャネルゲーティングの模式図を示す。Ｃは閉じた状態、Ｏは開放された状態である。略語：ＭＳＤ、膜貫通ドメイン；ＮＢＤ、ヌクレオチド結合ドメイン；Ｐ、Ｒドメインのリン酸化；ＰＫＡ、ｃＡＭＰ依存性タンパク質キナーゼ；ＰＰａｓｅ、ホスファターゼ；Ｒ、制御ドメイン；イン、細胞内；アウト、細胞外。白色の四角形は、細胞膜を示す。
【０００４】
ＣＦＴＲは、５つのドメイン、すなわち、２つの膜貫通ドメイン（ＭＳＤ）、２つのヌクレオチド結合ドメイン（ＮＢＤ）、及び１つの制御（Ｒ）ドメイン（１）からなる。ＭＳＤは、Ｃｌ−選択的な細孔の形成に寄与し、一方、ＮＢＤとＲドメインは、チャネル活性を調節する（２、３）。ｃＡＭＰ依存性タンパク質キナーゼ（ＰＫＡ）の活性化は、Ｒドメイン内で複数のセリン残基のリン酸化を起こす。Ｒドメインがリン酸化されると、チャネルゲーティングはＮＢＤでのＡＴＰ加水分解サイクルによって制御される。
【０００５】
ＣＦＴＲの機能障害は、多様な疾病と関係がある。突然変異は、一般にＣＦＴＲの機能を破壊し、遺伝病の嚢胞性線維症（ＣＦ；４）を引き起こす。しかし、いくつかの形式のオスの不妊症、びまん性気管支拡張症、及び慢性膵炎は、ＣＦＴＲ機能を部分的には残すと考えられる突然変異によっても引き起こされる（４）。正常よりも高いＣＦＴＲ　Ｃｌ−チャネル活性は、他の特定の疾病、例えば、多発性嚢胞腎及び分泌性下痢と関係すると考えられる（５、６）。
【０００６】
ＡＴＰなどのヌクレオシド三リン酸は、ＣＦＴＲ　Ｃｌ−チャネル活性を調節する。ＰＫＡによってリン酸化されると、ＣＦＴＲ　Ｃｌ−チャネルの開閉を制御するために、マイクロモル濃度のＡＴＰが必要になる。細胞内ＡＴＰは、ＡＴＰ感受性Ｋ＋チャネル（ＫＡＴＰチャネル）と呼ばれる一群のＫ＋チャネルも制御する（７）。膵臓β細胞、筋細胞、及びいくつかの神経細胞内におけるＫＡＴＰチャネルの開放は、ＡＴＰの細胞質内濃度と連関する。ＡＴＰがＮＢＤと相互作用してチャネルゲーティングを調節するＣＦＴＲ　Ｃｌ−チャネルに対して、ＡＴＰは、ＫＡＴＰチャネルの細孔を通じたＫ＋のフローを妨げてチャネル活性を阻害する。
【０００７】
ＫＡＴＰチャネルは、薬理が明確である。ＫＡＴＰチャネルは、スルホニル尿素、インシュリン非依存性糖尿病の治療に用いられる低血糖誘発薬剤類によって阻害され、Ｋ＋チャネルオープナーと呼ばれる新規薬物類によって刺激される（８）。これに対し、ＣＦＴＲ　Ｃｌ−チャネルの薬理は、これより不明確である。スルホニル尿素、グリベンクラミド及びトルブタミド、並びにＫ＋チャネルオープナーのジアゾキシド、ＢＲＬ　３８２２７（レブクロマカリム）、及びミノキシジル硫酸塩は、野生型ヒトＣＦＴＲを発現する細胞内のｃＡＭＰによって刺激されたＣｌ−電流を阻害することが示された（９）。そのデータから、グリベンクラミドは、ＣＦＴＲ　Ｃｌ−電流の強力な阻害剤であることが示された。続いて、グリベンクラミドが、ＣＦＴＲ細孔の細胞内末端を閉塞させ、Ｃｌ−の浸透を阻止することによって、ＣＦＴＲを阻害することが示された（１０）。
【０００８】
米国特許第５，２３４，９２２号は、分泌性下痢の治療に使用するＣＦＴＲ　Ｃｌ−チャネル遮断剤又は阻害剤として、トルブタミド及びグリベンクラミドを含むある種のスルホニル尿素化合物を開示している。ＣＦＴＲ　Ｃｌ−チャネル遮断機能を有するものとして、カリウムチャネルオープナーとしての活性を有する化合物も開示されている。
【０００９】
化合物フルオレセインの特定の誘導体は、ＫＡＴＰチャネル活性を変化させることが判明した（１１）。これらのフルオレセイン誘導体は、二つの相反する効果を有することが見出された。第一に、これらは、ＫＡＴＰチャネルを阻害することができる。第二に、これらは、チャネル活性を維持するために必要な細胞質成分の不存在下で不活化した（「ランダウン」と呼ばれる）ＫＡＴＰチャネルを再活性化することができる。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
本発明は、特定のフルオレセイン誘導体がＣＦＴＲ　Ｃｌ−チャネルを阻害するために使用することができ、その結果、これらの化合物がＣＦＴＲ　Ｃｌ−チャネルの阻害又は遮断に応答性を示す（ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ）疾病又は症状、例えば、多発性嚢胞腎及び分泌性下痢の治療に有用であるという発見に基づく。
【００１１】
したがって、本発明は、ヒトを含む生きた動物体の疾病であって、嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子のクロライドチャネル阻害に応答性を示す疾病を治療するための医薬の製造における、式Ｉ
【化３】
2004503584.tif 000002
の化合物及び薬学的に許容されるそれらの塩を使用することを提供するものである（式中、Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３は、各々、Ｈ、炭素数１〜６のアルキル、及びハロから選択される同一又は異なる基とすることができ、Ｒ４は、Ｈ及び炭素数１〜６のアルキルから選択される基である）。
【００１２】
本発明はさらに、ヒトを含む生きた動物体の疾病であり、ＣＦＴＲ　Ｃｌ−チャネルの阻害に応答性を示す疾病を治療する方法であって、生きた動物体にＣＦＴＲ　Ｃｌ−チャネルを阻害する量の式Ｉの化合物を投与することを備えた方法を提供する。
【００１３】
【発明の実施の形態】
本発明の実施に際して有用であることが判明したフルオレセイン化合物は、式Ｉ
【化４】
2004503584.tif 000003
（式中、Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３は、各々、Ｈ、炭素数１〜６のアルキル、及びハロから選択される同一又は異なる基とすることができ、Ｒ４は、Ｈ及び炭素数１〜６のアルキルから選択される基である）又は薬学的に許容される塩を形成する陽イオン基を有する。
【００１４】
Ｒ４が水素の場合、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３は、水素、炭素数１〜４のアルキル基から選択される同一又は異なる基である化合物、又は薬学的に許容されるカルボン酸塩が好ましい。
【００１５】
Ｒ１がＨ、Ｃｌ、Ｂｒ、及びＩから選択され、Ｒ２がＨ、Ｃｌ、Ｂｒ、及びＩから選択され、Ｒ３がＨ、Ｃｌ、Ｂｒ、及びＩから選択され、Ｒ４が水素、メチル、及びエチルから選択される上記式Ｉの化合物がさらに好ましい。
【００１６】
フルオレセインは、周知の化合物である。本明細書に記載のフルオレセインとその誘導体は、当分野で既知の手順に従い合成することができる。
【００１７】
上述の通り、ＣＦＴＲ　Ｃｌ−チャネルの阻害又は遮断に応答性を示す疾病又は症状に罹患したヒトを含む動物体の治療の際に、前記式Ｉの化合物は、薬学的に活性な成分として使用される。治療を要する動物体への投与量は、実際に使用する活性化合物、必要な治療の様式と治療のタイプに当然依存するであろう。もちろん、活性化合物は、単独で、あるいは例えば薬学的に許容される適切な担体又は稀釈剤を含有する適切な薬剤組成物の形式で投与することができる。当業者にはその使用が周知であるアジュバント、安定剤などの他の物質が、このような医薬組成物中に存在してもよい。この活性化合物は、あらゆる適切な手段による治療が必要なヒトを含む動物体に投与することができる。この活性化合物又はこれを含有する医薬調製物は、通常は、経口又は静脈内経路で投与される。
【００１８】
嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子のクロライドチャネルの阻害に応答性を示し、したがって、このような疾病又は症状に罹患したヒトを含む動物体に対して、ＣＦＴＲクロライドチャネルを阻害する用量の上記式Ｉのフルオレセイン化合物を投与して治療できるかもしれない疾病又は症状の例としては、多発性嚢胞腎、分泌性下痢、心不整脈、血管新生、及び腫瘍血管新生が挙げられる。さらに、上記フルオレセイン化合物は、オスの避妊薬としても有用と考える。
【００１９】
実験方法
１．電気生理実験
方法
細胞培養
本発明者らは、電気生理実験では、野生型ヒトＣＦＴＲを安定に発現するマウス乳腺上皮細胞（Ｃ１２７細胞）を用いた（１２）。野生型ＣＦＴＲを発現するＣ１２７細胞は、既報（１０）の通りに培養した。カバーガラスの上に細胞を播種し、４８時間以内に使用した。
【００２０】
電気生理学
既報（１０、１３）の通り、Ａｘｏｐａｔｃｈ　２００Ａパッチクランプ増幅器（Ａｘｏｎ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ　Ｉｎｃ．、Ｆｏｓｔｅｒ　Ｃｉｔｙ、ＵＳＡ）、及びｐＣＬＡＭＰデータ収集解析ソフトウェア（バージョン６．０３、Ａｘｏｎ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ　Ｉｎｃ．）を用いて、切除したインサイドアウト膜パッチ中でＣＦＴＲ　Ｃｌ−チャネルを記録した。実験を通じて、確立された符号に関する決まりを使用した。すなわち、細胞内液から細胞外液に移動する正電荷（逆方向に移動するアニオン）によって発生する電流は、正の電流として示される。
【００２１】
ピペット（細胞外）液は、Ｎ−メチル−Ｄ−グルカミン（ＮＭＤＧ）１４０ｍＭ、アスパラギン酸１４０ｍＭ、塩化カルシウム５ｍＭ、硫酸マグネシウム２ｍＭ、及びＮ−トリス［ヒドロキシメチル］メチル−２−アミノエタンスルホン酸（Ｔｅｓ）１０ｍＭを含有し、トリス（［Ｃｌ−］、１０ｍＭ）でｐＨ７．３とした。浴槽（細胞内）液は、ＮＭＤＧ１４０ｍＭ、塩化マグネシウム３ｍＭ、エチレングリコール−ビス（β−アミノエチルエーテル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸セシウム塩（ＣｓＥＧＴＡ）１ｍＭ、Ｔｅｓ１０ｍＭを含有し、塩酸（［Ｃｌ−］、１４７ｍＭ；［Ｃａ２＋］ｆｒｅｅ＜１０−８Ｍ）でｐＨ７．３とした。すべての実験を３７°Ｃで実施した。
【００２２】
膜パッチをＣ１２７細胞から切除した後、タンパク質キナーゼＡ（ＰＫＡ；７５ｎＭ）及びＡＴＰ（１．０ｍＭ）の触媒サブユニットを細胞内液に添加して、ＣＦＴＲ　Ｃｌ−チャネルを活性化した。その後、ＡＴＰ濃度を０．３ｍＭ（細胞内ＡＴＰによるＣＦＴＲ　Ｃｌ−チャネル活性化に対するＥＣ５０）に低下させた。実験の間、ＰＫＡを細胞内液中に保持した。特段の記述がない限り、電圧は−５０ｍＶとした。
【００２３】
ＣＦＴＲ　Ｃｌ−チャネルに対するフロキシンＢの効果を検討するため、本発明者らは、経時実験では多数の活性なチャネルを含む膜パッチを使用し、シングルチャネル実験では５以下の活性チャネルを含む膜パッチを使用した。パッチ当たりのチャネル数は、既報（１０）の通り、実験時間中に観測されるチャネルの最大同時開口数から決定した。ＣＦＴＲ　Ｃｌ−チャネルに対するいくつかのフルオレセイン誘導体の効果が完全には元に戻らなかったので（結果参照）、特定の操作については、等濃度のＡＴＰとＰＫＡを用いるがフルオレセイン誘導体を用いないコントロール期間を含めなかった。しかし、ＰＫＡとＡＴＰが継続的に存在しているときには、Ｃ１２７細胞から切除した膜パッチ中のＣＦＴＲ　Ｃｌ−チャネルのランダウンが最低になることを、本発明者等は以前に示している（１０）。
【００２４】
デジタルテープレコーダ（Ｂｉｏｌｏｇｉｃ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、ＤＴＲ−１２０４モデル；Ｉｎｔｒａｃｅｌ　Ｌｔｄ、Ｒｏｙｓｔｏｎ、ＵＫ）を用いて、１０ｋＨｚの帯域幅で、デジタルオーディオテープに、ＣＦＴＲ　Ｃｌ−電流を最初に記録した。再生の際、８極ベッセルフィルター（Ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ　Ｄｅｖｉｃｅｓ、９０２ＬＰＤ２モデル；Ｓｃｅｎｓｙｓ　Ｌｔｄ、Ａｙｌｅｓｂｕｒｙ、ＵＫ）を用いて、コーナー周波数５００Ｈｚで、記録にフィルターをかけ、Ｄｉｇｉｄａｔａ　１２００インターフェース（Ａｘｏｎ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ　Ｉｎｃ．）及びｐＣＬＡＭＰを用いて、サンプリングレート２．５ｋＨｚ（経時実験）又は５．０ｋＨｚ（シングルチャネル実験）で、記録を収集した。
【００２５】
経時実験では、各ポイントは、４秒間連続的に採取したデータポイントの平均電流であるが、液交換の間はデータを採取しなかった。特定の操作に対する平均電流（Ｉ）は、その操作の間採取した全データポイントの平均値として決定した。薬物濃度とＣＦＴＲ阻害との関係を、ヒル（Ｈｉｌｌ）の式：
ＩＤｒｕｇ／ＩＣｏｎｔｒｏｌ＝１／｛１＋（［薬物］／Ｋｉ）ｎ｝　　（１）
にフィッティングさせた。式中、［薬物］は薬物濃度であり、ＩＤｒｕｇ／ＩＣｏｎｔｒｏｌは、表記の薬物濃度での電流の、添加薬物のない同一溶液の電流に対する割合であり、Ｋｉは最大阻害の半分の阻害（ｈａｌｆ−ｍａｘｉｍａｌ　ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ）を起こす薬物濃度であり、ｎは勾配係数（ｓｌｏｐｅ　ｆａｃｔｏｒ）（ヒル（Ｈｉｌｌ）係数）である。線形最小二乗回帰を用いて、平均値データを式（１）の線形形式にフィッティングさせ、Ｋｉ及びｎ値を求めた。
【００２６】
シングルチャネル電流振幅（ｉ）を測定するため、電流振幅ヒストグラムにガウス分布をあてはめた。開口確率（ＰＯ）及び動力学解析のために、イベント検出のための１／２振幅交差基準を用いて、開口時間と閉鎖時間のリストを作成した。持続時間が１ｍｓ未満の変化は、解析から除外した。次式を用いてＰｏを計算した。
【００２７】
Ｐｏ＝（Ｔ１＋Ｔ２＋．．．＋ＴＮ）／（ＮＴｔｏｔ）　　（２）
式中、Ｎはチャネル数、Ｔｔｏｔは全解析時間、Ｔ１は１以上のチャネルが開口した時間、Ｔ２は２以上のチャネルが開口した時間であり、以下同様である。シングルチャネルの動力学解析には、単一の活性チャネルを含む膜パッチのみを使用した。
【００２８】
フルオレセイン誘導体によるＣＦＴＲ阻害が電圧に依存するかどうかを検討するために、本発明者等は電圧ランプ法を用いた。フルオレセイン誘導体の不在下及び存在下で、１５〜３０ランプでそれぞれ２秒間電圧を−５０ｍＶに固定して発生する電流を平均することにより、巨視的な電流−電圧（Ｉ−Ｖ）関係を得た。フルオレセイン誘導体の不在下及び存在下で記録した基本電流から、ＰＫＡ及びＡＴＰの不在下で記録した基本電流を差し引いて、ＣＦＴＲ　Ｃｌ−電流に対するこれら薬剤の効果を決定した。
【００２９】
試薬
ＰＫＡの触媒サブユニットは、Ｐｒｏｍｅｇａ　Ｌｔｄから購入した。ＡＴＰ（二ナトリウム塩）、ベンガルローズＢ、エオシンＹ、フルオレセイン、グリベンクラミド、フロキシンＢ、Ｔｅｓ、及びテトラクロロフルオレセインは、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ　Ｃｏｍｐａｎｙ　Ｌｔｄ（Ｐｏｏｌｅ、ＵＫ）から入手した。他の薬品はすべて試薬グレードであった。
【００３０】
フルオレセイン誘導体は、上記構造Ｉに基づく。フルオレセインの場合、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、及びＲ４はＨである。テトラクロロフルオレセインでは、Ｒ１、Ｒ２、及びＲ４はＨであり、Ｒ３はＣｌである。エオシンＹでは、Ｒ１及びＲ２はともにＢｒであり、Ｒ３及びＲ４はともにＨである。フロキシンＢでは、Ｒ１及びＲ２はともにＢｒ、Ｒ３はＣｌ、Ｒ４はＨである。ベンガルローズＢでは、Ｒ１及びＲ２はともにＩ、Ｒ３はＣｌ、Ｒ４はＨである。
【００３１】
フルオレセイン誘導体の原液は、ジメチルスルホキシド中で調製し、−２０℃で保存した。使用直前に、原液を細胞内液に希釈して、最終濃度とした。ＣＦＴＲ　Ｃｌ−チャネル活性には、溶媒は影響しなかった（１４）。
【００３２】
統計
結果は、ｎ回の測定の平均値±平均値標準誤差として表されている。データ比較には、スチューデントのｔ‐検定を用いた。Ｐ＜０．０５のときの差を統計的に有意と見なした。すべての検定はＳｉｇｍａＳｔａｔ（バージョン１．０３；Ｊａｎｄｅｌ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　ＧｍｂＨ、Ｅｒｋｒａｔｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて実施した。
【００３３】
結果
フロキシンＢは、ＣＦＴＲ　Ｃｌ−電流の活性を変化させる
フロキシンＢの野生型ヒトＣＦＴＲに対する効果を調べるために、野生型ヒトＣＦＴＲを安定して発現するＣ１２７細胞から切除したインサイドアウト膜パッチ中のＣＦＴＲ　Ｃｌ−電流を検討した。ＡＴＰ（ｎ＝４）及びＰＫＡ（ｎ＝４）の何れかを除去し、膜の細胞内側を浸した液にフロキシンＢを添加しても、ＣＦＴＲ　Ｃｌ−チャネル活性には影響がなかった（データ示さず）。しかし、ＰＫＡ及びＡＴＰが継続的に存在する場合には、フロキシンＢを細胞内液に添加すると、チャネル活性が変化した。
【００３４】
図２　フロキシンＢはＣＦＴＲ活性を変化させる
野生型ＣＦＴＲを安定して発現するＣ１２７細胞から切除したインサイドアウト膜パッチ中のＣＦＴＲ　Ｃｌ−電流の時間変化。ＡＴＰ（０．３ｍＭ）、ＰＫＡ（７５ｎＭ）、及びフロキシンＢ（Ｐｈｌｘ　Ｂ；５〜５０μＭ）が、横棒で示した時間、細胞内液中に存在した。電圧は−５０ｍＶであり、膜の間にはＣｌ−濃度勾配が存在した（内側［Ｃｌ−］＝１４７ｍＭ；外側［Ｃｌ−］＝１０ｍＭ）。各ポイントは４秒間の平均電流値であり、液を変える間はデータを採取しなかった。図示のために時間経過を反転させたため、上方への振れは、内向き電流を表す。
【００３５】
図２は、フロキシンＢがＣＦＴＲ　Ｃｌ−電流活性を変化させることを示している。フロキシンＢ（１〜５μＭ）を細胞内液に添加すると、ＣＦＴＲ　Ｃｌ−電流を増加させた。これに対し、より高濃度のフロキシンＢ（２０〜５０μＭ）では、ＣＦＴＲ　Ｃｌ−電流は濃度に依存して減少した。
【００３６】
フロキシンＢに加え、本発明者等は、フルオレセイン、テトラクロロフルオレセイン、エオシンＹ、及びベンガルローズＢを含む他のフルオレセイン誘導体を試験した。
【００３７】
図３　フルオレセイン誘導体の濃度−応答関係
Ａ、データは各濃度でのｎ＝３〜９の測定の平均値±平均値標準誤差である。異なる記号によって、フルオレセイン誘導体を示す（ローズベンガルＢ、円；フロキシンＢ、正方形；エオシンＹ、三角形；テトラクロロフルオレセイン、菱形；フルオレセイン、六角形）。点線よりも上方にある値は、ＣＦＴＲの刺激を示し、点線よりも下方にある値は阻害を示している。Ｂ、フロキシンＢ、エオシンＹ及びテトラクロロフルオレセインによるＣＦＴＲ阻害のＡに示したデータに対するヒル（Ｈｉｌｌ）プロットである。実線は、１次回帰によるデータのフィッティングである。フロキシンＢではＫｉ＝１７μＭ及びｎ＝２、エオシンＹではＫｉ＝４８μＭ及びｎ＝１．６、テトラクロロフルオレセインではＫｉ＝５８μＭ及びｎ＝０．７である。他の詳細は図２に示す通りである。
【００３８】
図３は、フルオレセイン誘導体が、ＣＦＴＲ　Ｃｌ−チャネル活性を変化させたことを示している。試験したフルオレセイン誘導体はすべて、チャネル活性を阻害したのに対して、エオシンＹ、フロキシンＢ及びベンガルローズＢのみがチャネル活性を増加させた。ＣＦＴＲ阻害効力の順位は、ベンガルローズＢ＞フロキシンＢ＞エオシンＹ≧テトラクロロフルオレセイン＞＞フルオレセインであった。エオシンＹによるＣＦＴＲ阻害は、可逆性を容易に示した（ｎ＝７；データ示さず）。これに対し、フロキシンＢ及びテトラクロロフルオレセインによる阻害は完全には可逆的ではなく（ｎ＝３〜６；図６及びデータ示さず）、ベンガルローズＢによる阻害は不可逆であった（ｎ＝３；データ示さず）。
【００３９】
図３Ｂは、エオシンＹ、フロキシンＢ、及びテトラクロロフルオレセインの場合、薬物濃度と電流阻害の関係が、ヒル（Ｈｉｌｌ）の式とよく適合したことを示している。これらのデータは、フルオレセイン誘導体がＣＦＴＲ　Ｃｌ−チャネルの強力な遮断剤であることを示唆している。ベンガルローズＢ及びフロキシンＢは、広く使用されているＣＦＴＲ　Ｃｌ−チャネル遮断剤であるグリベンクラミド（９）と同等又はそれ以上に強力にＣＦＴＲを阻害する。エオシンＹ及びテトラクロロフルオレセインは、グリベンクラミドほど強力にはＣＦＴＲを阻害しないが、アリールアミノベンゾエート、ジフェニルアミン−２−カルボキシレート（ＤＰＣ）及び５−ニトロ−２−（３−フェニルプロピルアミノ）−安息香酸（ＮＰＰＢ）、スチルベンジスルホン酸、４，４’−ジイソチオシアノスチルベン−２，２’−ジスルホン酸（ＤＩＤＳ）及び４，４’−ジニトロスチルベン−２，２’−ジスルホン酸（ＤＮＤＳ）及びフラボノイド、ゲニステイン（１５〜１８）を含む他の多くのＣＦＴＲ　Ｃｌ−チャネル遮断剤よりは強力にＣＦＴＲを阻害する。興味深いことに、このデータはまた、フロキシンＢ及びエオシンＹが協同的に相互作用する２つの部位に結合してＣＦＴＲを阻害するのに対して、テトラクロロフルオレセインは単一部位に結合してＣＦＴＲを阻害することも示唆している。
【００４０】
フロキシンＢによるＣＦＴＲ阻害の機序
以前の研究から、いくつかの薬剤はＣＦＴＲ細孔内に結合することによってＣＦＴＲを阻害してＣｌ−の浸透を阻止するが、別の薬物はチャネルの開口速度を著しく低下させることによってＣＦＴＲを阻害することが示されている（１８〜２０）。フロキシンＢがＣＦＴＲをどのようにして阻害するのかを検討するために、本発明者等は、５以下の活性なチャネルを含む膜パッチを用いてＣＦＴＲシングルチャネル活性に対するフロキシンＢ（２０μＭ）の効果を調べた。
【００４１】
図４　フロキシンＢ（２０μＭ）は、ＣＦＴＲシングルチャネル活性を阻害する
Ａは、３つのＣＦＴＲ　Ｃｌ−チャネル活性に対するフロキシンＢ（２０μＭ）の効果を示す代表的な記録である。ＡＴＰ（０．３ｍＭ）及びＰＫＡ（７５ｎＭ）は、細胞内液に継続して存在する。電圧は−５０ｍＶであり、膜の間にはＣｌ−濃度勾配が存在した（内側［Ｃｌ−］＝１４７ｍＭ；外側［Ｃｌ−］＝１０ｍＭ）。点線は、閉じたチャネルの状態を示し、下方への振れは、チャネルの開口に対応する。左側の記録線は２０秒間のものであり、横棒で示した１秒間の範囲を右側に時間スケールを拡大して示す。Ｂ及びＣは、それぞれ、ｉ及びＰｏに対するフロキシンＢの効果である。円柱と誤差バーは、各濃度でのｎ＝６の測定の平均値±平均値標準誤差を示す。アスタリスクは、コントロール値に対して有意差のある値（Ｐ＜０．０５）を示す。他の詳細はＡと同様である。
【００４２】
図４Ａは、ＰＫＡによるリン酸化後の３つのＣＦＴＲ　Ｃｌ−チャネル活性に対するフロキシンＢ（２０μＭ）の効果を示している。これらの線を目視検査したところ、フロキシンＢ（２０μＭ）が、チャネルゲーティングのパターンを劇的に変化させることが示唆されている。野生型ＣＦＴＲのゲーティングパターンは、バースト間のより長期の閉鎖によって隔られた短いフリッカー閉鎖（ｆｌｉｃｋｅｒｙ　ｃｌｏｓｕｒｅｓ）が介在する活性のバーストを特徴とする（図４Ａ、上の線）。フロキシンＢ（２０μＭ）は、ＣＦＴＲのゲーティング挙動を３つの点で変化させた。第一に、バースト間の閉鎖時間の間隔を著しく延長させた（図４Ａ）。第二に、チャネル活性のバーストを中断するフリッカー閉鎖を大幅に増加させた（図４Ａ）。第三に、バーストの期間を延長しているように見えた（図４Ａ）。これらの効果を定量化するため、本発明者等は、ｉ及びＰ０を測定した。図４Ｂ及びＣは、フロキシンＢ（２０μＭ）がｉとＰｏの両者を有意に低下させたことを示している（Ｐ＜０．０５）。
【００４３】
本発明者等は、ＣＦＴＲのシングルチャネル活性に対するエオシンＹ、テトラクロロフルオレセイン及びベンガルローズの効果も試験した。
【００４４】
図５　エオシンＹ及びテトラクロロフルオレセインによるＣＦＴＲのシングルチャネル活性の阻害
左、ｉに対するフルオレセイン誘導体の効果。右、Ｐ０に対するフルオレセイン誘導体の効果。ＡとＢはエオシンＹ（１００μＭ）、ＣとＤはテトラクロロフルオレセイン（ＴＣＦ；１００μＭ）である。円柱と誤差バーは、各濃度でのｎ＝６〜７の測定の平均値±平均値標準誤差を示す。アスタリスクは、コントロール値に対して有意差のある値を示す（Ｐ＜０．０５）。他の詳細は図４と同様である。
【００４５】
2004503584.tif 000004
【００４６】
フルオレセイン誘導体は、ＫＡＴＰチャネルに結合したグリベンクラミドを阻害する（１１）。これらのデータに基づき、本発明者等は、グリベンクラミドによるＣＦＴＲ　Ｃｌ−チャネル阻害に対するフロキシンＢの効果を試験することを考えた。
【００４７】
図６　フロキシンＢによるＣＦＴＲ阻害に対するグリベンクラミド及びＡＴＰの効果
Ａ及びＢ、フロキシンＢによるＣＦＴＲ阻害に対する、グリベンクラミド及びＡＴＰ濃度それぞれの効果を示すＣＦＴＲ　Ｃｌ−電流の時間経過。横棒で示した期間、ＡＴＰ（０．３又は５ｍＭ）、ＰＫＡ（７５ｎＭ）、フロキシンＢ（２０μＭ）、及びグリベンクラミド（Ｇｌｉｂ；５０μＭ）が細胞内液に存在した。他の詳細は図２と同様である。
【００４８】
フロキシンＢ（１μＭ）でＣＦＴＲを刺激しても、グリベンクラミド（５０μＭ）によるチャネル遮断を阻止することはできなかった（ｎ＝５、データ示さず）。さらに、図６Ａは、フロキシンＢ（２０μＭ）によるチャネル遮断をグリベンクラミド（５０μＭ）が強化することを示している。フロキシンＢ（２０μＭ）が、Ｉをコントロール値の５９±４％に低下させたのに対し（ｎ＝５）、フロキシンＢ（２０μＭ）とグリベンクラミド（５０μＭ）は、Ｉをコントロール値の１０±２％に低下させた（ｎ＝５；Ｐ＜０．００１）。
【００４９】
2004503584.tif 000005
【００５０】
阻害濃度のフロキシンＢが誘発するフリッカー閉鎖によって中断されるチャネルの開口が延長されることは、フロキシンＢがＣＦＴＲのオープンチャネルの遮断剤であるかもしれないことを示唆する。この考えを検討するために、本発明者等は、チャネル阻害の電圧依存性を調査した。濃度勾配のない１４７ｍＭ　Ｃｌ−液に膜パッチを浸し、フロキシンＢ（４０μＭ）の不在下及び存在下で、電圧ランプ法を用いて、±１００ｍＶの電圧範囲にわたり、ＣＦＴＲ　Ｃｌ−電流を記録した。
【００５１】
図７　フロキシンＢ、エオシンＹ及びテトラクロロフルオレセインによるＣＦＴＲ　Ｃｌ−電流阻害の電圧依存性
Ａ、Ｂ及びＣ、濃度勾配のない１４７ｍＭ　Ｃｌ−液に膜パッチを浸したときの、それぞれフロキシンＢ（４０μＭ）、エオシンＹ（１００μＭ）及びテトラクロロフルオレセイン（１００μＭ）の不在下及び存在下で記録したＣＦＴＲ　Ｃｌ−電流のＩ−Ｖ関係。細胞内液にはＡＴＰ（１ｍＭ）及びＰＫＡ（７５ｎＭ）が継続的に存在した。Ｉ−Ｖ関係は、「方法」に記載した通りに作成され、固定電圧は−５０ｍＶであった。Ｄ、フロキシンＢ（４０μＭ、正方形）、エオシンＹ（１００μＭ、三角形）及びテトラクロロフルオレセイン（１００μＭ、菱形）によって阻害されたＣＦＴＲ　Ｃｌ−電流の割合に対する電圧の効果。各値は、各電圧での平均値±平均値標準誤差（ｎ＝５〜６）である。
【００５２】
図７Ａ〜Ｄは、フルオレセイン誘導体のフロキシンＢ、エオシンＹ及びテトラクロロフルオレセインによるＣＦＴＲ阻害が、電圧に依存することを示している。負電圧では、フロキシンＢ（４０μＭ）、エオシンＹ（１００μＭ）及びテトラクロロフルオレセイン（１００μＭ）は、ＣＦＴＲ　Ｃｌ−電流を減少させた。正電圧では、フロキシンＢ（４０μＭ）及びテトラクロロフルオレセイン（１００μＭ）によるチャネル遮断が緩和され、エオシンＹ（１００μＭ）はチャネル活性を増加させた。したがって、これらのデータは、フルオレセイン誘導体であるフロキシンＢ、エオシンＹ及びテトラクロロフルオレセインによるＣＦＴＲ阻害が、電圧に依存し、ＡＴＰ濃度の変化に影響されないことを示している。また、これらのデータは、フロキシンＢの結合部位の位置が、グリベンクラミドのそれと異なるかもしれないことも示唆している。
【００５３】
考察
本発明者等のデータは、フロキシンＢなどのフルオレセイン誘導体が、ＣＦＴＲ　Ｃｌ−チャネルを阻害することを示している。チャネルの開口を遅くする、及び開口したチャネルを遮断するという２通りの方法でフルオレセイン誘導体がＣＦＴＲを阻害することを、このデータは示している。このデータはまた、フロキシンＢ及びベンガルローズＢが、広く使用されているＣＦＴＲ阻害剤であるグリベンクラミドと同等又はそれ以上に強力にＣＦＴＲを阻害することも示している（９、本研究）。
【００５４】
ＣＦＴＲ　Ｃｌ−チャネルを刺激する多数の薬剤が、高濃度ではチャネル活性を阻害することが示されている。その中には、ＡＭＰ−ＰＮＰ（１９）、ゲニステイン（１８、２１）、及びピロリン酸（２２）が含まれる。これらの各薬剤は、ＮＢＤ２と堅く結合して、ＮＢＤ２によって仲介されるチャネル閉鎖の速度を大幅に低下させ、したがって、チャネル活性のバースト期間を劇的に延長させることによって、ＣＦＴＲ　Ｃｌ−チャネルを活性化する（１８、２３、２４）。
【００５５】
フルオレセイン誘導体によるＣＦＴＲ阻害の特徴は、ＡＭＰ−ＰＮＰ及びゲニステインのそれとやや類似していた。ＡＭＰ−ＰＮＰ及びゲニステインは、ＮＢＤ１により仲介されるチャネル開放を強く抑制することによって、ＣＦＴＲ　Ｃｌ−チャネルを遮断する（１８、１９、２１）。さらに、ゲニステインは、ＣＦＴＲ細孔を弱く閉塞する（２１）。ゲニステイン及びフロキシンＢは何れも、バースト期間を延長し、かつバースト間の閉鎖時間を劇的に延長するフリッカー遮断を起こす（１８、２１、本研究）。しかし、これらの薬剤によるチャネル遮断に対して、ＡＴＰ（５ｍＭ）及び電圧は、著しく異なる効果を示した。ゲニステインによる阻害は、電圧に依存せず、ＡＴＰ（５ｍＭ）によって緩和された（２１）。これに対し、フロキシンＢによる阻害は、電圧に依存したが、ＡＴＰ（５ｍＭ）の影響は受けなかった（本研究）。本発明者等はＣＦＴＲからの解離が速いフルオレセイン誘導体であるエオシンＹでも同じ結果を得たので（ｎ＝５、データ示さず）、ＡＴＰ（５ｍＭ）がフロキシンＢによるＣＦＴＲ阻害を緩和できないことは、チャネルからのフロキシンＢの解離が遅いことによるものではなかった。フルオレセイン誘導体によるＣＦＴＲ阻害が電圧に依存するという本発明者等の知見は、これらの薬物が膜の電場内で動かなくなることを示している。フルオレセイン誘導体がアロステリックなメカニズムでＣＦＴＲを遮断する可能性はあるが、このデータの最も簡単な解釈は、これらの薬物がＣＦＴＲの細孔内で動かなくなり、Ｃｌ−の浸透を阻止することである（２０）。このことは、フロキシンＢによって誘発されたチャネル開口のフリッカー遮断とバースト間の閉鎖時間延長が、ともに、フロキシンＢによるＣＦＴＲ細孔の閉塞によって引き起こされることを示唆する。
【００５６】
フルオレセイン誘導体がＣＦＴＲ　Ｃｌ−チャネルを強力に阻害するという発見は、ＣＦＴＲ機能障害に関連する疾病の治療への示唆を与える。多発性嚢胞腎及び分泌性下痢などの、ＣＦＴＲ　Ｃｌ−チャネルの増大した活性が関与している可能性がある（５、６）疾病の治療に、ＣＦＴＲ　Ｃｌ−チャネルを強く阻害するフルオレセイン誘導体は価値があると考えられる。ＣＦＴＲは心筋細胞及び内皮細胞内に発現するため（２、２５）、ＣＦＴＲの阻害剤は、心臓不整脈、血管新生、及び腫瘍血管新生を抑制するためにも使用することができるかもしれない。
【００５７】
２．嚢胞成長実験
方法
細胞培養
嚢胞成長及び細胞増殖実験において、本発明者らは、１型Ｍａｄｉｎ−Ｄａｒｂｙ　ｃａｎｉｎｅ　ｋｉｄｎｅｙ（ＭＤＣＫ）細胞を使用した。ｃＡＭＰアゴニスト存在下にてコラーゲンゲル中で増殖させると１型ＭＤＣＫ細胞が嚢胞を形成し（２６）、ＣＦＴＲ　Ｃｌ−チャネルを発現する（２７）ので、本発明者らはこの細胞を選択した。ＭＤＣＫ培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｅａｇｌｅ　Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）とＨａｍ’ｓ　Ｆ−１２　ｎｕｔｒｉｅｎｔ　ｍｅｄｉｕｍを１：１で混合し、１００Ｕ　ｍｌ−１ペニシリン及び１００μｇ　ｍｌ−１ストレプトマイシン及び、１０％　ウシ胎児血清（ＦＢＳ、嚢胞成長）又は、５％　ＦＢＳと１％　インスリン−トランスフェリン−セレニウム−Ｘ（ＩＴＳ−Ｘ）補助物質（細胞増殖）との何れかを補充した培地）中で、加湿した５％　ＣＯ２雰囲気中、３７℃にてＭＤＣＫ細胞を培養した（全てＬｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ　Ｌｔｄ，Ｐａｉｓｌｅｙ，ＵＫより購入）。
【００５８】
嚢胞成長
嚢胞を成長させるために、Ｇｒａｎｔｈａｍらの方法（２６）の改変法を用いてコラーゲンゲル中でＭＤＣＫ細胞を培養した。０．２５％（ｗｔ／ｖｏｌ）トリプシンにより３７℃にて３０分間、細胞をトリプシン処理し、１０％　ＦＢＳを含有するＭＤＣＫ培地で希釈し、１〜３Ｘ１０４個　ｍｌ−１の細胞密度の細胞懸濁液を調製し、２４穴プレート（０．１ｍｌ／ウェル）の各ウェルに分注した。１０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）１０Ｘ最小必須培地、１０ｍＭ　Ｎ−［２−ヒドロキシエチル］ピペラジン−Ｎ’−［２−エタンスルホン酸］（Ｈｅｐｅｓ）、２７ｍＭ　ＮａＨＣＯ３、１００Ｕ　ｍｌ−１　ペニシリン、及び１００μｇ　ｍｌ−１ストレプトマイシンをさらに加え、ＮａＯＨでｐＨ７．４に調整した０．４ｍｌの氷冷Ｖｉｔｒｏｇｅｎ（３．０ｍｇ　ｍｌ−１　コラーゲン、Ｃｏｈｅｓｉｏｎ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ　Ｉｎｃ．，Ｐａｌｏ　Ａｌｔｏ，ＵＳＡ）が各ウェルに分注されていた。２４穴プレートを穏やかに揺らして細胞がＶｉｔｒｏｇｅｎ全体に分布するようにし、３７℃の水浴中で９０分間インキュベーションを行い、Ｖｉｔｒｏｇｅｎのゲル化を進めた。
【００５９】
ゲル化後、１０％　ＦＢＳを含有する１．５ｍｌのＭＤＣＫ培地を２４穴プレートの各ウェルに添加した。嚢胞成長を促進するために、本発明者らはｃＡＭＰアゴニスト（フォルスコリン（１０μＭ）、３−イソブチル−１−メチルキサンチン（ＩＢＭＸ、１００μＭ）、及び８−（４−クロロフェニルチオ）アデノシン３’；５’−サイクリック一リン酸（ＣＰＴ−ｃＡＭＰ、５００μＭ）をＭＤＣＫ培地に添加した。加湿した５％　ＣＯ２雰囲気中、３７℃にてプレートを維持し、ｃＡＭＰアゴニストを含有するＭＤＣＫ培地を３日毎に交換した。
【００６０】
コラーゲンゲルにＭＤＣＫ細胞を播種してから１２日後に、位相差光学系を備えた倒立顕微鏡（Ｌｅｉｃａ，ｍｏｄｅｌ　ＤＭＩＬ，Ｍｉｌｔｏｎ　Ｋｅｙｎｅｓ，ＵＫ）を用いてＸ１００倍の倍率で嚢胞が容易に見出された。嚢胞の増殖に対するＣＦＴＲモジュレーターの効果を調べるために、ｃＡＭＰアゴニストの継続的な存在下で、ＭＤＣＫ培地に薬物を添加した。９日間の全培養期間にわたって、ｃＡＭＰアゴニスト及びＣＦＴＲモジュレーターを含有するＭＤＣＫ培地を３日毎に交換した。ＣＦＴＲモジュレーターを添加する前と、実験期間中３日毎とに、個々の嚢胞の写真を撮影した。個々の嚢胞を見分けるために、２４穴プレートの下部にあるグリッドを用いて各嚢胞に固有の参照番号を割り当てた。
【００６１】
嚢胞の体積測定
同じ倍率で拡大した像を使用して、嚢胞の写真から嚢胞の直径を直接測定した。嚢胞が球形のものであると仮定して、嚢胞体積を計算した（４／３・π・ｒ３）。
【００６２】
細胞増殖
ＭＤＣＫ細胞の増殖に対するＣＦＴＲモジュレーターの影響を調べるために、本発明者らは、５％ＦＢＳ及び１％　ＩＴＳ−Ｘ補助物質を含有する培地で培養した１型ＭＤＣＫ細胞を使用した。実験開始１日前に、１％　ＦＢＳ及び１％　ＩＴＳ−Ｘ補助物質を含有するＭＤＣＫ培地が入っている３５ｍｍ培養皿に７．５Ｘ１０４個細胞ｍｌ−１の細胞密度でＭＤＣＫ細胞を播種した。第０日目に、さらに０．０１％までＦＢＳ濃度を低下させ、ＣＦＴＲモジュレーターをＭＤＣＫ培地に添加した。全期間６日にわたり、ＣＦＴＲモジュレーターを含有するＭＤＣＫ培地を２日毎に交換した。３５ｍｍ培養皿あたりの細胞数を調べるために、トリプシン（０．２５％、重量／体積）を用いて１型　ＭＤＣＫ細胞を回収し、１２００ｒｐｍで５分間遠心し、血球計算盤を用いて細胞数を計数する前に１ｍｌのＭＤＣＫ培地中に再懸濁した。
【００６３】
試薬
ブメタニド、ＣＰＴ−ｃＡＭＰ、ＤＩＤＳ、フォルスコリン、ゲニステイン、グリベンクラミド、Ｈｅｐｅｓ、ＩＢＭＸ、ウアバイン、及びフロキシンＢをＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ　Ｃｏｍｐａｎｙ　Ｌｔｄ．（Ｐｏｏｌｅ、ＵＫ）から購入した。平均値標準誤差ａｔ　Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ（ＵＫ）Ｌｔｄ．（Ｓｔ．Ａｌｂａｎｓ、ＵＫ）からＮＰＰＢを入手した。フロキシンＢの化学構造は上記されている。他の化学物質は全て試薬グレードであった。
【００６４】
蒸留水中にＣＰＴ−ｃＡＭＰを溶解し、フォルスコリンはメタノール中に、ＩＢＭＸはエタノール中に溶解し、他の薬物は全てＤＭＳＯ中に溶解した。原液を−２０℃で保存し、使用直前にＭＤＣＫ培地で希釈して最終濃度になるように調製した。ブメタニド、ウアバイン及びＣＦＴＲモジュレーターを使用する際には、光感受性反応に対して注意を払った。溶媒（ＤＭＳＯ）は、嚢胞成長（対照群：第１２日目から第２１日目の間に１１２±２０％成長、ｎ＝２９、ＤＭＳＯ（０．４％　ｖ／ｖ）、第１２日目から第２１日目の間に９９．３６％成長、ｎ＝８、Ｐ＞０．５）及び細胞増殖（ｎ＝８、Ｐ＞０．０５）には影響を与えなかった。
【００６５】
ＤＩＤＳの効果を調べるために、本発明者らは、切り取って裏返した膜小片の細胞内側にＤＩＤＳを添加し、ＣＦＴＲ　Ｃｌ−チャネルに対するその影響を調べた。Ｌｉｎｓｄｅｌｌ及びＨａｎｒａｈａｎのデータ（１７）と同様に、ＤＩＤＳ（２００μＭ）は、ＣＦＴＲ活性を強力に阻害した（ｎ＝３、データは示さない）。
【００６６】
統計
結果は、ｎ個の観察の平均値±平均値標準誤差として表す。一連のデータを比較するために、本発明者らは、スチューデントのｔ検定又はＭａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ　順位和検定の何れかを使用した。Ｐ＜０．０５である場合、統計的に有意差があるとみなした。すべての検定は、ＳｉｇｍａＳｔａｔＴＭ（バージョン１．０３、Ｊａｎｄｅｌ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　ＧｍｂＨ、Ｅｒｋｒａｔｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて行った。
【００６７】
結果
本発明者らは、まず、コラーゲンゲルへＭＤＣＫ細胞を播種し、ｃＡＭＰアゴニスト（フォルスコリン（１０μＭ）、ＩＢＭＸ（１００μＭ）及びＣＰＴ−ｃＡＭＰ（５００μＭ））を含有する培地中でこれらの細胞をインキュベートしてから３〜６日後の嚢胞を観察した。
【００６８】
図８：ＣＦＴＲ阻害剤処理前（Ａ、Ｃ、Ｅ及びＧ）と処理後（Ｂ、Ｄ、Ｆ及びＨ）の嚢胞の位相差像
Ａ及びＢは対照、Ｃ及びＤはグリベンクラミド（１００μＭ）処理、Ｅ及びＦはＮＰＰＢ（４００μＭ）処理、Ｇ及びＨはＤＩＤＳ（２００μＭ）処理したものである。コラーゲンゲルにＭＤＣＫ細胞を播種後第１２日目（Ａ、Ｃ、Ｅ及びＧ）及び第２１日目（Ｂ、Ｄ、Ｆ及びＨ）に顕微鏡写真を撮った。バーは、２００μｍである。
【００６９】
嚢胞は次第に拡大し、第１２日目には、位相差光学系を備えた倒立顕微鏡を用いてＸ１００の倍率で容易に見出された（図８Ａ）。持続してｃＡＭＰアゴニストを添加した条件下で、嚢胞は拡大し続けた。図８Ａ及びＢにより、第１２日目から第２１日目の間に嚢胞の大きさが明らかに拡大したことが示される。この期間を通して、嚢胞体積は１１２±２０％（ｎ＝２９）に増加した。これらのデータに基づいて、本発明者らは第１２日目から第２１日目の嚢胞成長に対するＣＦＴＲブロッカーの影響を調べた。
【００７０】
本発明者らは、スルホニルウレア、グリベンクラミド、アリルアミノベンゾエート、ＮＰＰＢ、及びフラボノイドであるゲニステインが嚢胞成長に与える影響を調べた。グリベンクラミド及びＮＰＰＢは、ＣＦＴＲの細孔を通じたＣｌ−イオンの透過を妨害することによりＣＦＴＲ　Ｃｌ−チャネルを阻害したのに対して（１０、１６）、ゲニステインはチャネル開口速度を著しく低下させることによりＣＦＴＲ　Ｃｌ−チャネルを阻害する（１８、２１）。対照として、本発明者らは、スチルベンジスルホン酸誘導体であるＤＩＤＳが嚢胞成長に及ぼす影響を調べた。ＤＩＤＳを細胞膜外側に添加した場合、ＣＦＴＲ　Ｃｌ−チャネルに影響を与えない（２８）。これによりＣＦＴＲと細胞外ＤＩＤＳにより阻害される他の上皮Ｃｌ−チャネルとは区別される（２８）。図８Ｃ〜Ｆは、グリベンクラミド（１００μＭ）及びＮＰＰＢ（４００μＭ）で処理した嚢胞の大きさが明らかに減少していることを示す。ゲニステイン（１００μＭ、データ示さず）でも同様の結果が得られた。対照的に、ＤＩＤＳ（２００μＭ）は嚢胞成長に影響を与えなかった（図８Ｇ及びＨ）。
【００７１】
ＣＦＴＲ−Ｃｌ−チャネル阻害剤が嚢胞成長に及ぼす影響を定量的に調べるために、本発明者らは嚢胞体積を測定した。対照として、本発明者らは、嚢胞成長を抑制するウアバイン及びブメタニド（２６）の２種類の薬剤が嚢胞体積に及ぼす影響を調べた。ウアバインはＮａ＋−Ｋ＋−ＡＴＰａｓｅを阻害するが、ブメタニドはＮａ＋−Ｋ＋−２Ｃｌ−コトランスポーターを遮断する。
【００７２】
図９：ＣＦＴＲブロッカーは嚢胞成長を阻害する。
【００７３】
データは、嚢胞体積に対するウアバイン（１μＭ）、ブメタニド（ｂｕｍｅｔ、１００μＭ）、グリベンクラミド（ｇｌｉｂ、１００μＭ）、ＮＰＰＢ（４００μＭ）、ゲニステイン（１００μＭ）及びＤＩＤＳ（２００μＭ）の影響を示している。対照の嚢胞には処理を施さなかった。白及び陰影カラムは、それぞれ第１２日目及び第２１日目に測定した嚢胞体積を示す。値は、各薬物に対する平均値＋平均値標準誤差（ｎ＝４〜５実験から得た２３〜３０個の嚢胞）である。
【００７４】
図９は、コラーゲンゲルにＭＤＣＫ細胞を播種した後第１２日目から第２１日目の間に対照嚢胞の体積が有意に増加したことを示す（Ｐ＜０．００１）。ＤＩＤＳ（２００μＭ、Ｐ＞０．５）を除く試験した全ての阻害剤が嚢胞体積を減少させた。この減少効果は、グリベンクラミド（１００μＭ）≧ウアバイン（１μＭ）≧ＮＰＰＢ（４００μＭ）≧ゲニステイン（１００μＭ）≧ブメタニド（１００μＭ、Ｐ＜０．００１、図９）であった。
【００７５】
本発明者らのデータから、ＣＦＴＲ−Ｃｌ−チャネルのブロッカーが嚢胞成長を阻害するということが示される。これらのデータに基づいて、本発明者らは、フルオレセイン誘導体が嚢胞成長を阻害する可能性があると推測した。この仮説について調べるために、フロキシンＢの影響を調べた。
【００７６】
図１０：フロキシンＢ（４０μＭ）は嚢胞成長を阻害する。
【００７７】
Ａ−Ｄ、フロキシンＢ（４０μＭ）処理前（Ａ及びＣ）及び処理後（Ｂ及びＤ）のＭＤＣＫ嚢胞の位相差像。Ａ及びＢは対照、Ｃ及びＤはフロキシンＢ（４０μＭ）処理。コラーゲンゲルへＭＤＣＫ細胞を播種した後第１２日目（Ａ及びＣ）と第２１日目（Ｂ及びＤ）とに顕微鏡写真を取った。バー＝２００μＭ。Ｅ、ＭＤＣＫ嚢胞体積に対するフロキシンＢ（４０μＭ）及びグリベンクラミド（１００μＭ）の影響。白抜き及び斜線カラムは、それぞれ第１２日目と第２１日目に測定した嚢胞体積を表す。値は、平均値±平均値標準誤差、５つの実験から得たｎ＝２９〜３０個の嚢胞、である。対照及びグリベンクラミドのデータは、図８及び図９からのものである。
【００７８】
図１０Ａ〜Ｄは、コラーゲンゲルへのＭＤＣＫ細胞播種後第１２日目及び第２１日目におけるフロキシンＢ（４０μＭ）存在下及び非存在下で培養した嚢胞の位相差顕微鏡写真を示す。フロキシンＢ非存在下においては、嚢胞のサイズが増大した（図１０Ａ及びＢ）。対照的に、フロキシンＢ（４０μＭ）存在下においては、嚢胞の大きさが明らかに減少した（図１０Ｃ及びＤ）。嚢胞体積の平均減少は、ＣＦＴＲ　Ｃｌ−チャネル及び嚢胞成長に対する強力な阻害剤であるグリベンクラミド（１００μＭ）と同等であった（９、図１０Ｅ）。
【００７９】
多発性嚢胞腎において、嚢胞の発達及び成長は、未成熟な上皮細胞の増殖と関連しており、細胞外マトリクス及び嚢胞腔内への液体の蓄積を変化させる（５）。ＣＦＴＲ　Ｃｌ−チャネルのブロッカーが嚢胞壁の肥厚を伴わずに嚢胞成長を阻害したので（図８及び１０）、本発明者らは、これらの薬剤が液性物質蓄積及び細胞増殖をともに阻害する可能性があると推測した。細胞増殖に対するＣＦＴＲ　Ｃｌ−チャネル阻害剤の影響を調べるために、本発明者らは１型ＭＤＣＫ細胞を用いた。
【００８０】
図１１：ＣＦＴＲブロッカーはＭＤＣＫ細胞の増殖を阻害する。
【００８１】
データは、（Ａ）対照（黒丸）、グリベンクラミド（１００μＭ、白丸）、フロキシンＢ（４０μＭ、白四角）及びＤＩＤＳ（２００μＭ、白三角）、（Ｂ）対照（黒三角）、ウアバイン（１μＭ、白丸）及びブメタニド（１００μＭ、白四角）、（Ｃ）対照（黒丸）、ｃＡＭＰアゴニスト（フォルスコリン、（１０μＭ）、ＩＢＭＸ（１００μＭ）、及びＣＰＴ−ｃＡＭＰ（５００μＭ）、白丸）、ＮＰＰＢ（４００μＭ、白四角）、及びゲニステイン（１００μＭ、白三角）で処理した細胞の増殖の時間的経過を示す。値は、各時点における観察値の平均値±平均値標準誤差（ｎ＝６〜１０）である。エラーバーは、示したものを除き、記号のサイズより小さい。
【００８２】
図１１は、ＣＦＴＲ　Ｃｌ−チャネルのブロッカーが１型ＭＤＣＫ細胞の増殖を阻害することを示す。第０日目から第６日目の間に、対照の細胞数が著しく増加した。ＤＩＤＳ（２００μＭ）及びブメタニド（１００μＭ）を除き、試験を行った全阻害剤が細胞増殖を阻害した。その阻害効果は、ウアバイン（１μＭ）＝フロキシンＢ（４０μＭ）＝ゲニステイン（１００μＭ）＝ＮＰＰＢ（４００μＭ）＞グリベンクラミド（１００μＭ）であった。フロキシンＢのように、ベンガルローズＢ（５μＭ）、エオシンＹ（２００μＭ）及びテトラクロロフルオレセイン（２００μＭ）が１型ＭＤＣＫの細胞増殖を阻害した（ｎ＝３〜８、データを示さない）。
【００８３】
以前の研究から、ｃＡＭＰアゴニストが細胞増殖を刺激又は阻害し得るということが示されている（２９）。図１１Ｃから、ｃＡＭＰアゴニストが１型ＭＤＣＫ細胞増殖速度を低下させるということが示される。しかし、第６日目において、ｃＡＭＰアゴニスト存在下での細胞数は、対照での細胞数と相違がなかった。（Ｐ＞０．０５、図１１Ｃ）。ＣＦＴＲブロッカーによる細胞増殖阻害に対して、ｃＡＭＰアゴニスト（グリベンクラミド及びフロキシンＢ（ｎ＝７〜８）、ＮＰＰＢ及びゲニステイン（ｎ＝２）、データを示さない）は影響を及ぼさなかった。
【００８４】
考察
本発明者のデータから、ＣＦＴＲ　Ｃｌ−チャネルブロッカーが嚢胞成長を阻害するということが示される。ＣＦＴＲ　Ｃｌ−チャネルのように（１０、１６、１８、本研究）、グリベンクラミド、ＮＰＰＢ及び高濃度のゲニステイン及びフロキシンＢが嚢胞拡大及び細胞増殖を阻害した。対照的に、他の上皮Ｃｌ−チャネルを阻害するがＣＦＴＲを阻害しない薬剤であるＤＩＤＳ（２８）は、嚢胞成長及び細胞増殖に対して影響を与えなかった。
【００８５】
本発明者のデータは、多発性嚢胞腎の治療に対する重要な示唆を含んでいる。現在のところ、この疾患に対する治療法が存在しない。その代わりに、多発性嚢胞腎患者に対して、疼痛、感染及び高血圧を管理する薬物を用いた処置が行われている（３０）。しかし、一旦腎不全が悪化すると、多発性嚢胞腎患者の生命を維持するために長期間の透析及び腎臓移植が必要となる（３０）。多発性嚢胞腎に対する新しい治療法の探索において、以前の研究では、嚢胞成長に対して細胞増殖阻害薬が及ぼす影響について調べられてきた。例えば、パクリタキセル（タキソール）は、ｃｐｋマウスの多発性嚢胞腎の進行を劇的に遅らせた（３１）。しかし、この疾患の他のげっ歯類モデルにおいて、パクリタキセルは効果を示さなかった（３２）。ＣＦＴＲ　Ｃｌ−チャネルブロッカーが嚢胞の成長を遅らせるという本発明者らの観察により、多発性嚢胞腎に対する処置においてＣＦＴＲ阻害剤が治療に役立つ可能性を有することが強調される。嚢胞成長を遅らせることにより、治療上の効果を有するＣＦＴＲ阻害剤が腎臓の構造破壊を防止し、ゆえに腎臓機能を維持させる可能性がある。このような薬物により、嚢胞腎疾患を持つ患者のクオリティーオブライフが大きく向上するだろう。
【００８６】
【参考文献】
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【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は、チャネルゲーティングを制御する嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子（ＣＦＴＲ）のドメイン構造を示す概略図である。
【図２】
図２は、野生型ＣＦＴＲを安定して発現するＣ１２７細胞から切除したインサイドアウト膜パッチ中の、ＣＦＴＲ　Ｃｌ−電流の時間変化を示す図である。
【図３】
図３は、フルオレセイン誘導体の濃度−応答の関係を示すグラフである。
【図４】
図４は、フロキシンＢ（２０μＭ）がＣＦＴＲシングルチャネル活性を阻害することを示すグラフである。
【図５】
図５は、エオシンＹ及びテトラクロロフルオレセインによるＣＦＴＲのシングルチャネル活性の阻害を示すグラフである。
【図６】
図６は、フロキシンＢによるＣＦＴＲ阻害に対するグリベンクラミド及びＡＴＰの効果を示す図である。
【図７】
図７は、フロキシンＢ、エオシンＹ及びテトラクロロフルオレセインによるＣＦＴＲ　Ｃｌ−電流阻害の電圧依存性を示すグラフである。
【図８】
図８は、ＣＦＴＲ阻害剤処理前（Ａ、Ｃ、Ｅ及びＧ）と処理後（Ｂ、Ｄ、Ｆ及びＨ）の嚢胞の位相差像を示す写真である。
【図９】
図９は、ＣＦＴＲブロッカーが嚢胞成長を阻害することを示すグラフである。
【図１０】
図１０は、フロキシンＢ（４０μＭ）が嚢胞成長を阻害することを示す写真（Ａ〜Ｄ）およびグラフ（Ｅ）である。
【図１１】
図１１は、ＣＦＴＲブロッカーがＭＤＣＫ細胞の増殖を阻害することを示す写真である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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