(57)【要約】流体試料中の関心対象の分析物量を定量的に測定する方法を開示する。本発明の方法は、投入点、接触領域（分析物結合粒子を含む）、試料捕捉ゾーン、および対照捕捉ゾーンを有する膜を提供する段階を含み、ここで接触領域は、投入点と試料捕捉ゾーン間に位置し、かつ試料捕捉領域は、接触領域と対照捕捉ゾーン間に位置する（図1）。本アッセイ法では、流体がアッセイ成分を、接触領域を介した毛管作用によって、試料捕捉ゾーンの方向へ輸送してこれを通過させ、続いて対照捕捉ゾーンの方向へ輸送してこれを通過させることができる。「サンドイッチアッセイ法」の態様では、流体試料中の分析物の量は、例えば、試料捕捉ゾーン内の分析物結合粒子量と、対照捕捉ゾーン内の分析物結合粒子量の比として決定可能な、補正後の分析物結合粒子の量に比例する。「競合アッセイ法」の態様では、流体試料中の分析物の量は、試料捕捉ゾーン内の分析物被覆粒子の量と、対照捕捉ゾーン内の分析物被覆粒子量の比として決定可能な補正後の分析物被覆粒子の量に反比例する。
2004526156.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の段階を含む、流体試料中の関心対象の分析物の量を定量的に測定する方法：
a）投入点、接触領域、試料捕捉ゾーン、および対照捕捉ゾーンを含む膜ストリップを提供する段階（接触領域は投入点と試料捕捉ゾーン間に位置し、かつ試料捕捉ゾーンは接触領域と対照捕捉ゾーン間に位置する）；
b）膜ストリップの投入点に、関心対象の分析物に関してアッセイ対象となる流体試料を接触させる段階；
c）流体が、流体試料中の関心対象の分析物を、ストリップを介した毛管作用によって接触領域の方向へ輸送しかつ通過させることを可能にする条件で、膜ストリップを維持する段階（接触領域は、内部に固定された分析物結合粒子の集団を有し、ここで分析物結合粒子は分析物結合剤で被覆されている）；
d）関心対象の分析物（試料中に存在する場合）が分析物結合粒子との結合を可能にすることにより、接触状態の分析物結合粒子を作製することを可能にする条件、試料中の流体が、接触状態の分析物結合粒子を、ストリップを介した毛管作用によって動かし、試料捕捉ゾーンの方向へ輸送しかつ通過させることを可能にする条件（試料捕捉ゾーンは、表面に固定された試料捕捉用試薬を有する）、および、接触状態の分析物結合粒子と試料捕捉用試薬の結合を可能にする条件で、膜ストリップをさらに維持する段階；
e）試料中の流体が、ストリップを介した毛管作用によって、接触状態の分析物結合粒子を、対照捕捉ゾーンの方向へ輸送しかつ通過させることを可能にする条件（対照捕捉ゾーンは、表面に固定された対照捕捉用試薬を有する）、および、接触状態の分析物結合粒子と対照捕捉用試薬との結合を可能にする条件で、膜ストリップをさらに維持する段階；
f）試料中の流体が、試料捕捉用試薬とまたは対照捕捉用試薬と結合していない任意の接触状態の分析物結合粒子を、毛管作用によって、対照捕捉ゾーンを越えて輸送することを可能にする条件で、膜ストリップをさらに維持する段階；
g）試料捕捉ゾーン内の接触状態の分析物結合粒子の量、および対照捕捉ゾーン内の接触状態の分析物結合粒子の量を決定する段階；ならびに
h）試料捕捉ゾーン内の分析物結合粒子量、および対照捕捉ゾーン内の分析物結合粒子量から、補正後の分析物結合粒子量を決定する段階（流体試料中の関心対象の分析物の量は、補正後の分析物結合粒子量に正比例する）。
【請求項２】
以下の段階を含む、流体試料中の関心対象の分析物の量を定量的に測定する方法：
a）投入点、接触領域、試料捕捉ゾーン、および対照捕捉ゾーンを含む膜ストリップを提供する段階（接触領域は投入点と試料捕捉ゾーン間に位置し、かつ試料捕捉ゾーンは接触領域と対照捕捉ゾーン間に位置する）；
b）膜ストリップの投入点に、関心対象の分析物に関してアッセイ対象となる流体試料を接触させる段階；
c）流体が、流体試料中の関心対象の分析物を、ストリップを介した毛管作用によって接触領域の方向へ輸送しかつ通過させることを可能にする条件で、膜ストリップを維持する段階（接触領域は、内部に固定された分析物被覆粒子の集団を有し、ここで分析物被覆粒子は関心対象の分析物で被覆されている）；
d）試料中の流体が、分析物被覆粒子を、ストリップを介した毛管作用によって動かし、試料捕捉ゾーンの方向へ輸送しかつ通過させることを可能にする条件（試料捕捉ゾーンは、表面に固定された試料捕捉用試薬を有する）、および、分析物被覆粒子と試料捕捉用試薬の結合を可能にする条件で、膜ストリップをさらに維持する段階；
e）試料中の流体が、ストリップを介した毛管作用によって、分析物被覆粒子を、対照捕捉ゾーンの方向へ輸送しかつ通過させることを可能にする条件（対照捕捉ゾーンは、表面に固定された対照捕捉用試薬を有する）、および、分析物被覆粒子と対照捕捉用試薬との結合を可能にする条件で、膜ストリップをさらに維持する段階；
f）試料中の流体が、試料捕捉用試薬とまたは対照捕捉用試薬と結合していない任意の分析物被覆粒子を、毛管作用によって、対照捕捉ゾーンを越えて輸送することを可能にする条件で、膜ストリップをさらに維持する段階；
g）試料捕捉ゾーン内の分析物被覆粒子の量、および対照捕捉ゾーン内の分析物被覆粒子の量を決定する段階；ならびに
h）試料捕捉ゾーン内の分析物被覆粒子量、および対照捕捉ゾーン内の分析物被覆粒子量から、補正後の分析物被覆粒子量を決定する段階（流体試料中の関心対象の分析物の量は、補正後の分析物被覆粒子量に反比例する）。
【請求項３】
以下の段階を含む、流体試料中の関心対象の分析物の量を測定する方法：
a）投入点、接触領域、試料捕捉ゾーン、および対照捕捉ゾーンを含む膜ストリップを提供する段階（接触領域は投入点と試料捕捉ゾーン間に位置し、かつ試料捕捉ゾーンは接触領域と対照捕捉ゾーン間に位置する）；
b）膜ストリップの試料捕捉ゾーンに流体試料を接触させる段階（試料捕捉ゾーンは、表面に固定された試料捕捉用試薬を有する）、および関心対象の分析物（試料中に存在する場合）が、試料捕捉ゾーンの試料捕捉用試薬と結合することによって、停止状態の分析物を作製することを可能にする条件で、膜ストリップを維持する段階；
c）膜ストリップの投入点に緩衝液を接触させる段階；
d）緩衝液が、接触領域内に固定された分析物結合粒子の集団を、毛管作用によって動かし、試料捕捉ゾーンの方向へ輸送しかつ通過させることを可能にする条件（分析物結合粒子は、分析物に対する抗体で被覆されている）、および停止状態の関心対象の分析物が、分析物結合粒子と相互作用することによって、停止状態の分析物-粒子複合体を作製することを可能にする条件で、膜ストリップを維持する段階；
e）緩衝液が、分析物結合粒子を、毛管作用によって対照捕捉ゾーンの方向へ輸送しかつ通過させることを可能にする条件（対照捕捉ゾーンは、表面に固定された対照捕捉用試薬を有する）、および分析物結合粒子と対照捕捉用試薬を結合可能にする条件で、膜ストリップをさらに維持する段階；
f）試料中の流体が、試料捕捉用試薬とまたは対照捕捉用試薬と結合していない任意の分析物結合粒子を、毛管作用によって対照捕捉ゾーンを越えて輸送することを可能にする条件で、膜ストリップをさらに維持する段階；
g）試料捕捉ゾーン内の分析物結合粒子の量、および対照捕捉ゾーン内の分析物結合粒子の量を決定する段階；ならびに
h）試料捕捉ゾーン内の分析物結合粒子量、および対照捕捉ゾーン内の分析物結合粒子量から、補正後の分析物結合粒子量を決定する段階（流体試料中の関心対象の分析物の量は、補正後の分析物結合粒子量に正比例する）。
【請求項４】
補正後の分析物結合粒子量を、対照捕捉ゾーン内の分析物結合粒子量に対する、試料捕捉ゾーン内の分析物結合粒子量の比として決定する、請求項1、2、または3のいずれか一項記載の方法。
【請求項５】
補正後の分析物結合粒子量を、対照捕捉ゾーン内の分析物結合粒子量と試料捕捉ゾーン内の分析物結合粒子量の合計に対する、試料捕捉ゾーン内の分析物結合粒子量の比として決定する、請求項1、2、または3のいずれか一項記載の方法。
【請求項６】
膜ストリップを、硝酸セルロースまたはガラス繊維から作製する、請求項1または2記載の方法。
【請求項７】
粒子がラテックスビーズである、請求項1または2記載の方法。
【請求項８】
粒子が標識されている、請求項1または2記載の方法。
【請求項９】
標識が、比色分子、蛍光分子、リン光分子、発光分子、化学発光分子、および酵素結合分子からなる群より選択される、請求項8記載の方法。
【請求項１０】
分析物および分析物結合剤が結合対の要素であり、かつ結合対の1つの要素が、タンパク質、ホルモン、酵素、糖タンパク質、ペプチド、小分子、多糖、レクチン、抗体、抗体断片、核酸、薬剤、薬剤接合体、毒素、ウイルス、ウイルス粒子、細胞壁の一部、ハプテン、および受容体からなる群より選択される、請求項1または2記載の方法。
【請求項１１】
分析物結合剤が、抗体、抗体断片、ハプテン、薬剤接合体、および受容体からなる群より選択される、請求項1または2記載の方法。
【請求項１２】
分析物結合剤が抗体である、請求項11記載の方法。
【請求項１３】
対照捕捉用試薬が抗体である、請求項12記載の方法。
【請求項１４】
試料捕捉用試薬が、分析物結合粒子表面の抗体と同じエピトープに対する抗体、および分析物結合粒子表面の抗体とは異なるエピトープに対する抗体からなる群より選択される抗体である、請求項12記載の方法。
【請求項１５】
対照捕捉用試薬が抗免疫グロブリン抗体である、請求項12記載の方法。
【請求項１６】
被験試料が、全血、血漿、血清、尿、脳脊髄液、唾液、精液、硝子体、または滑液からなる群より選択される、請求項1または2記載の方法。
【請求項１７】
関心対象の分析物が、ミオグロビン、CK-MB、トロポニンI、およびPSAからなる群より選択される、請求項1記載の方法。
【請求項１８】
関心対象の分析物が、ジゴキシン、テオフィリン、ホルモンT-3、ホルモンT-4、LSD、THC、およびバルビツール酸塩からなる群より選択される、請求項2記載の方法。
【請求項１９】
段階（f）において、試料中の流体が、試料捕捉用試薬とまたは対照捕捉用試薬と結合していない任意の接触状態の分析物結合粒子を、毛管作用によって対照捕捉ゾーンを越えて吸い取りパッド中へと輸送する、請求項1または2記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、2001年3月26日に出願された米国特許出願第09/817,781号の一部係属出願である。同出願の全開示は、参照として本明細書に組み入れられる。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
流体試料（特に体液試料）に含まれる細胞および分析物の定量分析を行うことで、医師および患者にとって、診断および治療に関する極めて重要な情報が得られることは少なくない。定量的免疫アッセイ法では、抗原（Ag）抗体（Ab）反応の特異性を利用して、試料中のAgまたはAbの検出および定量を行う。固相免疫アッセイ法では、1種の試薬（例えばAgまたはAb）を固相表面に結合させることで、結合状態の試薬または分析物と、遊離状態の試薬または分析物の分離が容易になる。次に固相に、対象となるAgまたはAbに結合する分析物を含む試料を接触させる。結合の程度を定量することで、試料中の分析物濃度の尺度が得られる。しかし、測定可能なシグナルへと結合事象を変換することは、分析物の存在または量に関連しない、アッセイ成分の結合の変動などの複数の干渉の影響を受ける。このような干渉により、定量的免疫アッセイ法の特異性および応用可能性が制限される。
【発明の開示】
【０００３】
発明の概要
本発明は、内部対照を用いることで、アッセイ成分の特異的結合の変動を補償する、定量的免疫クロマトグラフィーアッセイ法（例えば、サンドイッチ免疫アッセイ法、または阻害免疫アッセイ法）などの固相アッセイ法により、流体試料中の関心対象の分析物の量を測定する方法に関する。本発明の方法では、関心対象の分析物および捕捉用試薬を、特異的な結合対の一部として使用する。
【０００４】
定量的免疫クロマトグラフィーアッセイ法では、本発明の方法は、十分な空隙率と、分析物を含む流体による湿潤性を有し、また毛管作用により粒子の運動を可能にする、硝酸セルロースまたはガラス繊維などの適切な材料で作られた膜ストリップ（membrane strip）を用いる。膜ストリップには、投入点（application point）、接触領域、試料捕捉ゾーン、および対照捕捉ゾーンがあり、接触領域は投入点と試料捕捉ゾーン間に位置し、かつ試料捕捉ゾーンは接触領域と対照捕捉ゾーン間に位置する。
【０００５】
「サンドイッチ」型のアッセイ法では、リポソームや有機高分子ラテックス粒子などの分析物結合粒子の集団が接触領域に固定される。分析物結合粒子は、関心対象の分析物に対する結合剤（例えば抗体）で被覆されている。このような粒子は、比色標識、蛍光標識、発光標識、化学発光標識、（例えばELISAにおける）酵素結合標識、または他の適切な標識を用いて標識することで検出を容易にすることができる。試料捕捉用試薬（例えば、関心対象の分析物に対する抗体などの、関心対象の分析物に結合する薬剤）を試料捕捉ゾーンに固定する。対照捕捉用試薬（例えば、抗免疫グロブリン抗体などの、分析物結合粒子に結合する薬剤）を対照捕捉ゾーンに固定する。
【０００６】
本発明の方法では、膜ストリップの投入点に、関心対象の分析物に関してアッセイ対象となる流体試料を接触させる。次に膜ストリップを、流体の毛管作用が、関心対象の分析物（存在する場合）を膜ストリップを介して、接触領域の方向へ輸送してこれを通過させることを十分可能にする条件で維持する。この装置を、関心対象の分析物が接触領域に到達する際に、接触領域内に固定された、分析物結合粒子表面に被覆された分析物結合剤に分析物が結合するようにさらに維持する。分析物と結合した状態の粒子を含む分析物結合粒子（「分析物結合」粒子）は、流体によって動かされ、また毛管作用によって、ストリップ中を試料捕捉ゾーンの方向へ移動してこれを通過する。
【０００７】
試料捕捉用試薬は、分析物結合粒子と相互作用する。試料捕捉用試薬と分析物結合粒子が相互作用すると、分析物結合粒子は、試料捕捉ゾーンで停止する。流体の毛管作用は、分析物結合粒子を試料捕捉ゾーンの方向へさらに動かしてこれを通過させるだけでなく、（分析物結合粒子が対照捕捉用試薬に結合している）対照捕捉ゾーンの方向へ動かしてこれを通過させる。流体の毛管作用は、対照捕捉ゾーンを越えて、例えば吸い取りパッド（wicking pad）中に残存する、非結合状態の粒子を動かし続ける。次に試料捕捉ゾーンで停止状態にある、また対照捕捉ゾーンで停止状態にある分析物結合粒子の量を決定する。
【０００８】
次に、流体試料中の関心対象の分析物の量を決定する。流体試料中の関心対象の分析物の量は例えば、（1）試料捕捉ゾーンで停止した状態の分析物結合粒子の量と、（2）対照捕捉ゾーン内の分析物結合粒子量の比として決定可能である。あるいは、流体試料中の関心対象の分析物の量は、（1）試料捕捉ゾーンで停止した状態の分析物結合粒子の量と、（2）対照捕捉ゾーン内の分析物結合粒子の量と、試料捕捉ゾーンで停止した状態の分析物結合粒子の量の合計の比として決定可能である。
【０００９】
別の免疫クロマトグラフィーアッセイ法では、関心対象の分析物に関してアッセイ対象となる流体試料を、装置の試料捕捉ゾーンに直接アプライする。膜ストリップは、流体試料中の分析物が試料捕捉用試薬と相互作用し、また試料捕捉ゾーンに固定される適切な条件で維持する。次に水または適切な緩衝液を膜の投入点に添加し、分析物結合粒子を動かす。分析物結合粒子は次に、毛管作用で試料捕捉ゾーンの方向へ輸送されてこれを通過し、続いて対照捕捉ゾーンの方向へ輸送されてこれを通過する。膜ストリップは、分析物結合粒子と、試料捕捉ゾーン内に固定された分析物の相互作用を可能にする条件でさらに維持する。分析物結合粒子が、固定された分析物と相互作用すると、試料捕捉ゾーンで分析物結合粒子の動きが停止する。また、分析物結合粒子が、対照捕捉用試薬と相互作用すると、対照捕捉ゾーンで分析物結合粒子の動きが停止する。流体試料中の分析物の量は、上述したように、対照捕捉ゾーンで停止状態にある分析物結合粒子の量を考慮することで決定される。
【００１０】
別の態様では、「競合」型または「阻害」型の免疫クロマトグラフィーアッセイ法では、分析物被覆粒子の集団が接触領域に固定される。この粒子の検出は、上述の手順で標識することにより、容易になりうる。試料捕捉用試薬（例えば、関心対象の分析物に対する抗体などの、関心対象の分析物に結合する薬剤）を試料捕捉ゾーンに固定する。また対照捕捉用試薬（例えば、分析物被覆粒子には結合するが、分析物そのものには結合しない薬剤）を対照捕捉ゾーンに固定する。
【００１１】
本発明の方法では、膜ストリップの投入点に、関心対象の分析物に関してアッセイ対象となる流体試料を接触させる。次に膜ストリップを、流体の毛管作用が、関心対象の分析物（存在する場合）を膜ストリップを介して、接触領域の方向へ輸送してこれを通過させることを十分可能にする条件で維持する。この装置を、関心対象の分析物が接触領域に到達する際に、分析物被覆粒子が、ストリップを介して試料捕捉ゾーンの方向へ、流体によって、試料中に存在する任意の分析物とともに輸送されてこれを通過し、また毛管作用によって動くように、さらに維持する。
【００１２】
試料捕捉用試薬は、分析物被覆粒子と相互作用する。試料捕捉用試薬と分析物被覆粒子が相互作用すると、分析物被覆粒子は、試料捕捉ゾーンで停止する。試料中では、試料捕捉ゾーンの試料捕捉用試薬上の結合部位をめぐって、分析物被覆粒子と分析物（存在する場合）が競合するので、試料捕捉ゾーンで停止状態にある分析物被覆粒子の量は、試料中の分析物の量に反比例する。流体の毛管作用は、分析物被覆粒子を、試料捕捉ゾーンの方向へさらに輸送してこれを通過させるだけでなく、対照捕捉ゾーンの方向へ輸送してこれを通過させる（分析物被覆粒子は、同ゾーンで対照捕捉用試薬と結合する）。流体の毛管作用は、引き続いて残存する非結合状態の粒子を、対照捕捉ゾーンを越えて（例えば吸い取りパッド中に）動かす。次に、試料捕捉ゾーンで停止状態にある、また対照捕捉ゾーンで停止状態にある分析物被覆粒子の量を決定する。
【００１３】
次に、流体試料中の関心対象の分析物の量を決定する。流体試料中の関心対象の分析物の量は例えば、（1）試料捕捉ゾーンで停止した状態の分析物被覆粒子の量と、（2）対照捕捉ゾーン内の分析物被覆粒子量の比に反比例する。あるいは、流体試料中の関心対象の分析物の量は、（1）試料捕捉ゾーンで停止状態にある分析物被覆粒子の量と、（2）対照捕捉ゾーンで停止状態にある分析物被覆粒子の量と、試料捕捉ゾーンで停止状態にある分析物被覆粒子の量の合計の比に反比例する。
【００１４】
このような定量的アッセイ法における、固相を通過する流体の流れは、このアッセイ法の動的特徴に寄与する。つまり、分析物と粒子の結合の量は、固相上の位置に関連する粒子の位置と同様に変動する。このため、固相反応体の空隙率といった、固相反応体の構造の変化、ならびに流体試料および他の因子の粘性の変化は、アッセイ成分の特異的結合の変動に寄与しうる。本発明の方法では、アッセイ法の動的な性質の結果生じる変動が補償されるので、溶液に含まれる関心対象の分析物量の、より正確な決定が可能となる。また、本発明のシステムは、比（例えば、試料捕捉ゾーンで停止状態にある分析物結合粒子の量と、対照捕捉ゾーン内の分析物結合粒子量の比、または試料捕捉ゾーンで停止状態にある分析物被覆粒子の量と、対照捕捉ゾーン内の分析物被覆粒子の量の比）を関心対象の分析物量の決定に用いることで、アッセイ法の感度が高まる。より多くの粒子が試料捕捉ゾーンで結合した状態にあると、対照捕捉ゾーンにおける利用可能性は小さくなるので、関心対象の分析物濃度の上昇に伴い、分母が小さくなると同時に分子が大きくなる。また同比を用いる場合は、絶対的なシグナル値の使用は、関心対象の分析物量の計算で相殺される。したがって、シグナル値の検出に使用するシグナルリーダーの較正上の不正確さは極めて小さくなる。
【００１５】
本発明の前述および他の目的、特徴、ならびに利点は、添付の図面において説明される、本発明の好ましい態様についての以下のより具体的な説明から明らかになるであろう。なお、図面中の同じ参照記号は、別の図全体を通して同じ部分を示す。図面は必ずしも実寸を反映しておらず、本発明の原理を説明するために強調されている。
【００１６】
発明の詳細な説明
本発明の好ましい態様について以下に説明する。
【００１７】
本発明は、定量的なリガンド結合アッセイ法における、試薬の特異的結合の変動を補償する方法に関する。本明細書に記載されるように、出願人は、アッセイ法における特異的結合の変動を補償することで、関心対象の分析物の量の測定精度を高める手段を開発した。本発明の方法は、分析物結合粒子に特異的に結合する、対照捕捉ゾーンに対照捕捉用試薬を含む内部対照をアッセイ法に含む。対照捕捉用試薬に関する分析物結合粒子の挙動を、分析物結合粒子と、アッセイ法の表面との反応における変動量の補償に用いる。次に分析物結合粒子の変動量を、関心対象の分析物量を決定する際に考慮することで、分析物結合粒子の特異的な反応の量の、より正確な決定が可能となる。例えば、分析物結合粒子の補正後の量は、（1）試料捕捉ゾーンで停止状態にある分析物結合粒子量と、（2）対照捕捉ゾーン内の分析物結合粒子量の比を元に、または（1）試料捕捉ゾーンで停止状態にある分析物結合粒子の量と、（2）対照捕捉ゾーン内の分析物結合粒子量と、試料捕捉ゾーンで停止状態にある分析物結合粒子の量の合計の比を元に決定することができるほか、反応の特異的結合の成分の変動を除く別の適切な計算法で決定することができる。次に関心対象の分析物の量を、分析物結合粒子の補正後の量から計算することができる。
【００１８】
本明細書で用いる「アッセイ法」とは、試料を分析して1種もしくは複数の分析物の有無を判定したり定量したりする、インビトロにおける手法を意味する。本発明のリガンド結合アッセイ法では、分析物および分析物結合剤を使用する。分析物および分析物結合剤は、特異的な「結合対」の要素であり、結合対の第1の要素（例えば分析物）は、第2の要素（例えば結合剤）と特異的に反応する。結合対の一方または両方の要素は抗体であってもよい。例えば、結合対の第1の要素（例えば関心対象の分析物）は抗体であってもよく、結合対の第2の要素（例えば結合剤）は抗免疫グロブリン抗体であってもよい。あるいは、結合対の第1の要素（例えば分析物）は抗原で、結合対の第2の要素（例えば結合剤）は抗体であってもよい。好ましい態様では、アッセイ法とは、手法の成分として抗体を用いる「免疫アッセイ法」である。特に好ましい態様では、免疫アッセイ法は、「サンドイッチ」アッセイ法などの定量的免疫クロマトグラフィーアッセイ法であり、これは、膜を介する系の成分の毛管作用を引き起こす、分析物に対する抗体などの分析物結合剤で被覆された粒子がその表面に固定されている膜に、分析物を含む流体被験試料を接触させるような、分析物を対象とした試験法である。このアッセイ法で正の結果が得られれば、それは膜の捕捉ゾーンにおける分析物と結合剤被覆粒子間の相互作用が検出されたことを意味する。また、捕捉ゾーンの結合剤被覆粒子の量は、被験試料中の分析物の量に比例する。代表的な定量的免疫クロマトグラフィーアッセイ法については、例えば、内容全体が参照として本明細書に組み入れられる米国特許第5,753,517号を参照されたい。別の特に好ましい態様では、免疫アッセイ法は、分析物を含む流体被験試料を、分析物で被覆された粒子を内部に固定した膜に接触させて、膜を介して系の成分の毛管作用を生じさせる「阻害」アッセイ法または「競合」アッセイ法などの定量的免疫クロマトグラフィーアッセイ法である。このアッセイ法で正の結果が得られれば、それは膜の捕捉ゾーンにおける薬剤被覆粒子間の相互作用が検出されたことを意味する。また、捕捉ゾーンの薬剤被覆粒子の量は、被験試料中の分析物の量に反比例する。
【００１９】
本発明のアッセイ法の他の態様では、分析物も結合剤のいずれも抗体ではなく、例えば結合対の第1の要素はリガンドであり、結合対の第2の要素は受容体でありうり、または、結合対の第1の要素はレクチンであり、結合対の第2の要素は糖でありうる。さらに別の態様では、結合対の第1の要素は核酸（例えばDNA、RNA）であり、結合対の第2の要素は、結合対の第1の要素と特異的にハイブリッドを形成する核酸の場合がある。本明細書で用いる「特異的なハイブリッドの形成」という用語は、第1の核酸が第2の核酸と（第1の核酸が第2の核酸を除く任意の核酸とハイブリッドを形成しないように）ハイブリッドを形成可能なこと（例えば、第1の核酸が、試料中の、ハイブリッドを形成する他の任意の核酸と比較して第2の核酸と高い類似性をもつ）を意味する。ハイブリッド形成の「ストリンジェンシー条件」とは、インキュベーション条件および洗浄条件（例えば、特定の核酸と第2の核酸とのハイブリッド形成を可能にする温度および緩衝液濃度の条件）を意味する当技術分野で用いられる表現であり、第1の核酸は、第2の核酸に対して完全に（すなわち100%）相補的であるか、第1の核酸と第2の核酸は、完全未満（例えば70%、75%、80%、85%、90%、95%）の、ある程度の相補性を有しうる。例えば、ある高いストリンジェンシー条件は、完全に相補的な核酸を、相補性の低い核酸と区別する際に使用されうる。核酸のハイブリッド形成における「高ストリンジェンシー条件」、「中ストリンジェンシー条件」、および「低ストリンジェンシー条件」は、「Current Protocols in Molecular Biology」（Ausubel, F.M.ら、「Current Protocols in Molecular Biology」、John Wiley & Sons（1998）、これらは、その内容全体が参照として本明細書に組み入れられる）の2.10.1〜2.10.16、および6.3.1〜6.3.6で説明されている。ハイブリッド形成のストリンジェンシーを決定する正確な条件は、イオン強度（例えば0.2×SSC、0.1×SSC）、温度（例えば室温、42℃、68℃）、およびホルムアミドなどの不安定化剤、またはSDSなどの変性剤の濃度に依存するだけでなく、核酸配列の長さ、塩基組成、ハイブリッドを形成する配列間のミスマッチ出現率、および他の非同一配列内に含まれる配列のサブセットの出現頻度などの諸因子にも依存する。したがって、同等の条件を、2種の核酸分子間における同程度の同一性または類似性を維持しながら、1種または複数の上記パラメータを変化させることで決定することができる。
【００２０】
分析物および結合剤の組成にかかわらず、これら2種類の成分は、第1の要素が第2の要素と特異的に反応する特異的な結合対を形成する。結合対の要素間の特異的な相互作用は、結合対の第1の要素が、結合対の第2の要素と、好ましくは、アッセイ法に含まれる別の化合物との任意の結合を除外するようにして選択的に結合すること、または相互作用することを意味する。
【００２１】
本明細書で用いる「分析物」または「関心対象の分析物」という用語は、上述の結合対の第1の要素を意味する。分析物とは、その量が測定される分子または化合物である。分析物の例には、ホルモンまたは酵素などのタンパク質、糖タンパク質、ペプチド、小分子、多糖、抗体、核酸、薬剤、毒素（例えば環境毒素）、ウイルスまたはウイルス粒子、細胞壁の一部、および他の化合物などが含まれる。好ましい態様では、分析物は「免疫原性」を有する。この用語は、分析物に対して、または担体（例えば、ハプテンに対する抗体が生じる可能性がある、ハプテン-担体接合体）に結合した状態の分析物に対して抗体（上述）が生じる可能性があることを意味する。いくつかの代表的な態様では、関心対象の分析物は、ミオグロビン、CK-MB、トロポニンI、PSA、ジゴキシン、テオフィリン、ホルモン（例えばT-3もしくはT-4）、または乱用性薬剤（LSD、THC、バルビツール酸塩など）のでありうる。
【００２２】
関心対象の分析物は流体試料中に存在する。流体試料は、比較的少ない成分を含む流体でありうる（例えば関心対象の分析物を含む水溶液）。あるいは流体試料は、複合環境試料（例えば汚水、地下水）、または複合生物学的流体（例えば全血、血漿、血清、尿、脳脊髄液、唾液、精液、硝子体液、滑液、または他の生物学的流体）などの多くの成分を有する流体でありうる。1つの代表的な態様では、関心対象の分析物がミオグロビンの場合、流体試料は通常、全血、血漿、または血清である。望ましいならば、流体試料は例えば、複合的な生物学的流体が流体試料として使用される場合に、溶液（例えば水溶液）で希釈することができる。あるいは、関心対象の分析物が溶液中に存在しない場合（例えば、関心対象の分析物が固体試料中に含まれる場合）、溶液中に抽出することができる。例えば関心対象の分析物が核酸の場合、対象細胞から溶液（例えば水溶液）中に抽出することができる。
【００２３】
本明細書で用いる「分析物結合剤」という用語は、上述の結合対の第2の要素を意味する。分析物結合剤は、抗体、ハプテン、もしくは薬剤接合体、受容体、または別の結合パートナーなどの分析物（結合対の第1の要素）に特異的に結合する化合物である。好ましい態様では、分析物結合剤は、関心対象の分析物に対する抗体である。
【００２４】
「サンドイッチ」アッセイ法
本発明の1つの態様では、米国特許第5,753,517号に記載されている定量的免疫クロマトグラフィーアッセイ法などの定量的アッセイ法を行う。このアッセイ法では、高速抗原測定プラットフォーム（RAMP（商標））装置（米国特許第5,753,517号）などの固相を使用する。固相は、投入点、接触領域、試料捕捉ゾーン、および対照捕捉ゾーンを有する膜ストリップを含む。固相は任意選択で、対照捕捉ゾーンの後に吸い取りパッドを、また投入点の前に試料パッドを含んでもよい。膜ストリップは、（1）膜の表面に沿った、また膜の内部を通過する、流体の毛管作用を可能にする十分な空隙率、（2）被覆粒子の毛管作用による輸送可能性（粒子を妨害してはならない）、および（3）分析物を含む流体によって湿った状態になること（例えば、水性流体の場合は親水性、有機溶媒の場合は疎水性）といった特徴を有する物質から作製することができる。膜の疎水性は、水性流体を使用するために疎水性表面から親水性表面への変換について記載されている米国特許第4,340,482号、または米国特許第4,618,533号などに記載されている過程によって膜を親水性とするように変化させることができる。膜の物質の例には、セルロース、硝酸セルロース、酢酸セルロース、ガラス繊維、ナイロン、高分子電解質イオン交換膜、アクリル共重合体/ナイロン、およびポリエーテルスルホンなどが含まれる。好ましい態様では、膜ストリップは硝酸セルロースから作製される。
【００２５】
「投入点」とは、流体試料をアプライする膜上の位置である。膜の「接触領域」は、投入点に隣接する。分析物結合剤で被覆された「分析物結合粒子」の集団が、膜の「接触領域」中に固定される（膜表面に被覆される、および/または膜内に浸透する）。粒子集団の数は、粒子の大きさおよび組成、膜の組成、ならびにアッセイ法の感度レベルに応じて変化する。粒子集団の数は通常、約1×103〜1×109個であるが、望ましいならば、より少ない、またはより多いものを使用することができる。好ましい態様では、粒子集団は約2×107個の粒子である。
【００２６】
分析物結合粒子は、分析物結合剤（結合対の第2の要素）で被覆可能な粒子である。好ましい態様では、分析物結合粒子は、リポソーム、有機高分子ラテックス粒子、無機蛍光粒子、またはリン光粒子である。特に好ましい態様では、粒子はポリスチレンラテックスビーズであり、具体的には、界面活性剤を含まないSuperactive Uniform Aldehyde/Sulfate Latexes （Interfacial Dynamics Corp.、Portland、OR）などの、界面活性剤の非存在下で調製されたポリスチレンラテックスビーズである。
【００２７】
粒子の大きさは膜の空隙率に比例するので、粒子は、流体の毛管作用によって膜に沿って輸送されるためには十分小さくなければならない。粒子を標識することで、検出が容易になる可能性がある。粒子は、粒子の物理的特性に大きく影響しない手段で標識されうる。例えば粒子の内部を標識することができる（すなわち標識を、リポソームの内部、またはポリスチレンラテックスビーズの内部などの粒子内に含める）。代表的な標識には、発光標識、化学発光標識、リン光標識、酵素結合標識、および比色性標識（色素もしくは蛍光標識など）がある。1つの態様では蛍光標識が使用される。別の態様では、リン光粒子、特に米国特許第5,043,265号に記載されているような「上位変換性（up-converting）」のリン光粒子が使用される。
【００２８】
粒子を、結合対の第2の要素である分析物結合剤で被覆することができる。上述したように、分析物結合剤（結合対の第2の要素）は、関心対象の分析物（結合対の第1の要素）に特異的および選択的に結合する。代表的な分析物結合剤には、抗体（または抗体断片）、ハプテン、薬剤接合体、受容体、または他の結合パートナーなどが含まれる。1つの好ましい態様では、分析物結合剤は、関心対象の分析物に対する抗体である。抗体は、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体でありうる。本明細書で用いる「抗体」という用語は、関心対象の分析物に十分結合する抗体断片を意味する場合もある。あるいは別の態様では、分析物結合部位を有する工学的に作製されたタンパク質などの、関心対象の分析物に特異的に結合する分子を使用することもできる（Holliger, P.およびH.R. Hoogenbloom、Trends in Biotechnology 13：7-9 （1995）；Chamow, S.M.およびA. Ashkenazi、Trends in Biotechnology 14：52-60：1996））。さらに別の態様では、関心対象の分析物が薬剤の場合、ハプテンまたは他の薬剤接合体を分析物結合剤として使用することができる。あるいは他の態様では、分析物に結合する受容体を使用することができる（例えば関心対象の分析物がリガンドの場合）。分析物が既知の特異性をもつ抗体の場合、粒子は、分析物抗体が誘導される抗原で被覆することができるほか、分析物抗体に対する抗体で被覆することができる。また分析物および分析物結合剤は結合対を形成するので、代表的な分析物として記載されている化合物または分子は、分析物結合剤として作用する場合もあり、また代表的な分析物結合剤として記載されているものは、上述したように同様に分析物となりうる。
【００２９】
膜の接触領域は、投入点と膜の「試料捕捉ゾーン」間に位置する。試料捕捉ゾーンとは、「試料捕捉用試薬」が固定される（例えば膜表面に被覆される、および/または膜を介して浸透する）、膜ストリップ上の部分を指す。試料捕捉用試薬は、上述したような分析物結合剤である。試料捕捉用試薬は、上記と同じ分析物結合剤である必要はない。しかし、試料捕捉用試薬も、関心対象の分析物と特異的および選択的に結合するという点で、関心対象の分析物と結合対を形成する。好ましい態様では、試料捕捉用試薬は、分析物に対する抗体であり、これは、分析物の同じエピトープに対する場合、または粒子表面に被覆された分析物結合剤として使用される抗体に結合するエピトープに由来する、分析物の異なるエピトープに対して誘導されうる。
【００３０】
本装置はさらに、「対照捕捉ゾーン」内に固定された「対照捕捉用試薬」を付加的に含む。対照捕捉用試薬は、分析物結合粒子と反応するが、測定対象の分析物とは相互作用しない試薬である。例えば、対照捕捉用試薬は、分析物結合剤被覆粒子表面の分析物結合剤と反応してもよく、粒子表面の別の材料と反応してもよく、または粒子そのものと反応してもよい。例えば分析物結合剤が抗体の場合、対照捕捉用試薬は抗免疫グロブリン抗体でありうる。好ましい態様では、分析物結合剤は抗体であり、対照捕捉用試薬は抗免疫グロブリン抗体である。対照捕捉用試薬は、対照捕捉ゾーンの膜上に固定される（膜表面に被覆される、および/または膜内に浸透する）。
【００３１】
対照捕捉ゾーンは、試料捕捉ゾーンが接触領域と対照捕捉ゾーン間に位置するように配置される。好ましい態様では、対照捕捉ゾーンは、試料捕捉ゾーンのすぐ隣に配置する。こうすることで、アッセイ成分の毛管作用の動態が、対照捕捉ゾーンと試料捕捉ゾーンの両方において同等（例えば本質的に同等）となる。対照捕捉ゾーンと試料捕捉ゾーンは密接に隣接するが、各ゾーンで停止状態にある粒子を（例えばクロストークなしに）個別に定量可能にするための十分な空間も確保する。また好ましい態様では、試料捕捉ゾーンは、試料捕捉ゾーンと対照捕捉ゾーン間の短い距離に対して長い距離を設けることで、接触領域から分離される。毛管先端（capillary front）（膜内を毛管作用で移動する流体の境界）の進む速度は、流体の投入点から毛管先端までの距離に反比例する。粒子捕捉は本発明のアッセイ法の律速段階なので、接触領域（毛管先端が分析物結合粒子を動かす場所）と、捕捉ゾーン（粒子が捕捉される場所）との距離は、毛管先端の速度を、毛管先端が試料捕捉ゾーンに到達したときに粒子の捕捉を可能にするように十分緩やかにするものでなければならない。また、この距離は、総移動時間（毛管先端が膜全体を移動する時間）が、流体試料中の遊離の分析物を分析物結合粒子と結合させるために十分長くなるように十分広くなければならない。膜ストリップ上における成分間の最適距離は、常用の実験法で決定および調節することができる。
【００３２】
定量的免疫クロマトグラフィーアッセイ法を行うためには、上述したように、関心対象の分析物の有無の評価対象となる流体試料を用いる。流体は、（1）膜材料を湿らせる流体、（2）抗体/抗原反応などの、関心対象の分析物と分析物結合剤間の反応を支持する（抗体/抗原の相互作用に干渉しない）流体、および（3）毛管作用による流体の輸送を可能にするために十分低い粘性をもつ流体である。好ましい態様では、流体は水溶液（体液など）である。
【００３３】
定量的免疫クロマトグラフィーアッセイ法の第1の態様では、膜ストリップの投入点に、関心対象の分析物に関してアッセイ対象となる流体試料を接触させる（図1の段階1を参照）。膜ストリップの投入点に、関心対象の分析物を含む流体試料を接触させた後に、毛管作用によって流体を膜の「接触領域」の方向へ動かしてこれを通過させることを可能にすることで、関心対象の分析物（流体中に存在する場合）を接触領域の方向へ輸送してこれを通過させることを可能にする条件で膜ストリップを維持する。分析物が接触領域の方向へ輸送されてこれを通過すると、流体中に存在する分析物（存在する場合）は、接触領域内に固定された分析物結合粒子と結合する。分析物と分析物結合粒子の「結合」とは、粒子表面を被覆した分析物結合剤が、関心対象の分析物と相互作用している（例えば結合している）ことを意味する。流体に含まれる分析物（存在する場合）が、接触領域内に固定された分析物結合粒子と結合することを可能にする条件で維持された分析物結合粒子は、本明細書では「接触状態の分析物結合粒子」と表現する。接触状態の分析物結合粒子は、分析物が流体試料中に存在するか否かに、また分析物が分析物結合粒子表面で分析物結合剤に結合した状態にあるか否かに依存して、分析物結合剤に結合した状態の分析物を含んでも含まなくてもよい。分析物結合粒子表面には、分析物に対する結合部位が複数存在するので、分析物結合粒子に結合した状態の分析物の存在および濃度はさまざまであり、分析物結合粒子に結合した状態の分析物の濃度は、流体試料中に存在する分析物の量に比例して大きくなり、また分析物結合粒子が、試料捕捉ゾーンで停止状態（後述）にある確率は、分析物結合粒子に結合した状態の分析物の量が増加するにつれて同様に大きくなる。したがって、接触状態にある分析物結合粒子の集団は、分析物結合剤に結合した状態の、さまざまな量の分析物を含む粒子、ならびに分析物結合剤に結合した状態の分析物を（分析物結合粒子が当初、分析物結合剤に結合した状態の分析物を含まないように）含まない粒子を含む可能性がある。
【００３４】
接触状態にある分析物結合粒子はさらに、流体の毛管作用によって流体試料から動かされ（図1の段階2を参照）、また接触状態の分析物結合粒子は膜に沿って、膜上の「試料捕捉ゾーン」の方向へ動いてこれを通過し、続いて、「対照捕捉ゾーン」の方向へ動いてこれを通過する（図1の段階3を参照）。膜ストリップは、接触状態の分析物結合粒子を、試料捕捉ゾーンの方向、また（続いて）対照捕捉ゾーンの方向へ動かし、また両ゾーンを通過させ、続いて対照捕捉ゾーンを越えて（例えば吸い取りパッド中に）、毛管作用によって膜に沿って動かすことを可能にすることで、任意の非結合状態の粒子を捕捉ゾーンから除く条件（例えば十分な時間と流体容積）で維持する。
【００３５】
一部の接触状態の分析物結合粒子の動きは、接触状態の分析物結合粒子が、試料捕捉ゾーンの試料捕捉用試薬と結合することにより、続いて一部の接触状態の分析物結合粒子が、対照捕捉ゾーンの対照捕捉用試薬と結合することにより停止する。分析物結合剤が対象抗原に対する抗体である1つの好ましい態様では、対照捕捉用試薬は、分析物結合剤が由来する種の免疫グロブリンに対する抗体でありうる。この態様では、免疫グロブリンに対する抗体は、試料中の他の成分と交差反応しないはずである。例えば、ヒト試料を検討する場合、ヒトの免疫グロブリンと反応しない抗体を、対照捕捉用試薬として使用することができる。
【００３６】
試料捕捉用試薬は、接触状態の分析物結合粒子表面の分析物結合剤に結合した状態にある分析物との結合を可能にすることにより、接触状態の分析物結合粒子に結合する。本明細書で用いる「試料-試薬-粒子の複合体」という用語は、試料捕捉用試薬と、接触状態の分析物結合粒子の複合体を意味する。接触状態の分析物結合粒子は、試料捕捉ゾーンで停止状態にあり、試料捕捉ゾーンにおいて分析物と試料捕捉用試薬の相互作用によって接触状態の分析物結合粒子が捕捉されることから、試料-試薬-粒子の複合体を形成する。
【００３７】
対照捕捉用試薬は、接触状態の分析物結合粒子表面の分析物結合剤との結合を可能にすることにより、接触状態の分析物結合粒子に結合する。本明細書で用いる「対照-試薬-粒子の複合体」という用語は、対照捕捉用試薬と、接触状態の分析物結合粒子の複合体を意味する。接触状態の分析物結合粒子は、対照捕捉ゾーンで停止状態にあり、対照捕捉ゾーンにおける分析物結合粒子と対照捕捉用試薬の相互作用により、接触状態の分析物結合粒子が捕捉されることによって、対照-試薬-粒子の複合体を形成する。上述したように、対照捕捉用試薬は、分析物結合粒子（例えば、分析物結合剤被覆粒子表面の分析物結合剤、もしくは粒子表面の別の材料、または粒子そのもの）と相互作用するが、分析物そのものとは相互作用しない。
【００３８】
次に毛管作用によって、試料捕捉ゾーンまたは対照捕捉ゾーンのいずれにおいても停止状態にない任意の接触状態の分析物結合粒子が、対照捕捉ゾーンを越えるように移動することで、停止状態にない任意の粒子が、試料捕捉ゾーンおよび対照捕捉ゾーンの両方から除去される。好ましい態様では、流体は、いずれの捕捉ゾーンにおいても停止状態にない任意の接触状態の分析物結合粒子を、対照捕捉ゾーンに続く吸い取りパッド中に動かす。
【００３９】
次に、試料捕捉ゾーンで停止状態にある分析物結合粒子の量を測定する。分析物結合粒子は、分析物結合粒子に使用される標識の型に適した手法で検出する。好ましい態様では、分析物結合粒子の量を、分析物結合粒子の標識の蛍光量を測定する方法などの光学的方法で検出する。対照捕捉ゾーンで停止状態にある分析物結合粒子の量は、試料捕捉ゾーン内の分析物結合粒子の量と同様の手順で検出する。1つの態様では、分析物結合粒子の量は、固相（例えば膜ストリップ）に沿った位置に存在する標識の量に正比例する曲線で表される。例えば、膜ストリップ上の各位置（例えば試料捕捉ゾーン、および対照捕捉ゾーン、および/または試料捕捉ゾーンと対照捕捉ゾーンの間、または両ゾーンに隣接する領域、および/または膜ストリップの他の領域）における粒子の量を決定して、膜ストリップに沿った位置の距離の関数としてプロットすることができる。次に粒子量を、存在する標識の量に比例する曲線下面積の関数として計算することができる。
【００４０】
補正後の分析物結合粒子量を決定し、次に分析物の量を、補正後の分析物結合粒子量から、適切な計算法で決定することができる。補正後の分析物結合粒子量は、試料捕捉ゾーンおよび対照捕捉ゾーンで停止状態にある分析物結合粒子の量に基づく。例えば1つの態様では、補正後の分析物結合粒子量は、試料捕捉ゾーンに存在する分析物結合粒子量と、対照捕捉ゾーンに存在する分析物結合粒子量の比（R）として決定される。次に、存在する分析物の量は、補正後の分析物結合粒子量（比）から、標準曲線を参照して決定することができる。標準曲線は、検出対象となる分析物を含む流体に既知濃度の関心対象の分析物を含む一連の対照試料（分析物を含まない血清など）を調製することで作成する。次に、定量的免疫クロマトグラフィーアッセイ法を、一連の対照試料を対象に行い、R値を各対照試料について測定し、同値を、対照試料中の分析物の濃度の関数としてプロットする。未知量の分析物を含む試料（「被験試料」）を、被験試料のR値を測定することでアッセイし、被験試料中の分析物の濃度を、標準曲線を参照して決定する。上述したように、1つの標準曲線を、1つのロットの全被験試料に対して（例えば、被験試薬用の特殊な調製物を用いる全被験試料に対して）作成して使用することができる。標準曲線を、各被験試料用に再び作成する必要はない。別の態様では、補正後の分析物結合粒子量を、対照捕捉ゾーンに存在する分析物結合粒子量と試料捕捉ゾーンに存在する分析物結合粒子量の合計の比（R）に対する、試料捕捉ゾーンに存在する分析物結合粒子の量の比として決定する。次に、存在する分析物の量は、補正後の分析物結合粒子量（比）から、標準曲線を参照して決定することができる。あるいは、他の比、および/または標準曲線を参照して、試料中に含まれる分析物の量を決定することもできる。また望ましいならば、バックグラウンドの標識量を、試料捕捉ゾーンに存在する分析物結合粒子の量と対照捕捉ゾーンに存在する分析物結合粒子の量から、比（R）の計算を行う前に差し引くこともできる。
【００４１】
本発明の第2の態様では、流体試料を（投入点ではなく）膜ストリップの捕捉ゾーンに接触させる。この膜ストリップを、流体試料中の関心対象の分析物と、試料捕捉ゾーンの試験捕捉用試薬との結合を十分可能にすることで停止状態の分析物を作製することを可能にする条件で維持する。次に膜の投入点に、水または緩衝液を接触させる。緩衝液は、（1）膜材料を湿らせ、（2）関心対象の分析物と分析物結合剤の反応を支持し（例えば抗体/抗原相互作用に干渉しない）、また（3）毛管作用による流体移動を可能にするように十分低い粘性を有する水性流体でありうる。緩衝液の例には、例えば生理食塩水、または50 mM Tris-HCl、pH 7.4が含まれる。このような緩衝液は、膜の接触領域内部に固定された分析物結合粒子の集団を、毛管作用によって動かし、試料捕捉ゾーンの方向へ輸送してこれを通過させ、続いて対照捕捉ゾーンの方向へ輸送してこれを通過させる。この膜ストリップを、停止状態の分析物（試料捕捉ゾーンで停止状態にある）と、分析物結合粒子との相互作用を十分可能にする条件でさらに維持する。停止状態の分析物と、分析物結合粒子が相互作用すると、分析物結合粒子の動きが止まり、停止状態の試料-試薬-粒子の複合体が生じる。次に、試料捕捉ゾーン内の分析物結合粒子の量を上述の手順で測定し、対照捕捉ゾーンで停止状態にある分析物結合粒子量と、流体試料中の分析物の量を、上述したように、補正後の分析物結合粒子の量を決めることで決定する。例えば、流体試料中の関心対象の分析物の量は、（例えば標準曲線を参照して）補正後の分析物結合粒子量に比例しうる。望ましいならば、この量も、追加の内部対照成分を用いて決定し、また比を上述の手順で決定することができる。
【００４２】
「競合」アッセイ法または「阻害」アッセイ法
本発明の別の態様では、米国特許第5,753,517号に記載されている定量的免疫クロマトグラフィーアッセイ法などの定量的アッセイ法を、競合アッセイ法または阻害アッセイ法として行う。このようなアッセイ法では、高速抗原測定プラットフォーム（RAMP（商標））装置（米国特許第5,753,517号）などの固相を使用する。上述の物質から作製された膜ストリップには、投入点、接触領域、試料捕捉ゾーン、および対照捕捉ゾーンが含まれる。膜ストリップは任意選択で、対照捕捉ゾーンに続く吸い取りパッド、および投入点の手前の試料パッドを含みうる。前述したように、「投入点」とは、流体試料をアプライする膜上の位置である。膜の「接触領域」は、投入点に隣接する。膜の「接触領域」には、（「サンドイッチ」アッセイ法について説明したように、分析物結合剤で被覆されるのではなく）関心対象の分析物、または関心対象の分析物の類似物で被覆されている上述の粒子集団が固定される。本明細書で用いる、分析物の「類似物」とは、上述した、分析物結合剤と結合対を形成するという点で、分析物と類似の結合特性を有する化合物である。分析物、または分析物の類似物は、粒子表面を直接被覆することができるほか、粒子に間接的に結合させることができる。後述するように、「分析物被覆粒子」という用語は、関心対象の分析物、または関心対象の分析物の類似物のいずれかで被覆された粒子を意味してもよい。
【００４３】
膜の接触領域は膜の投入点と試料捕捉ゾーン間に位置し、ここに試料捕捉用試薬が停止する。試料捕捉用試薬は、上述したような分析物結合剤（例えば結合対の第2の要素）である。好ましい態様では、試料捕捉用試薬は、分析物に対する抗体である。
【００４４】
装置は、試料捕捉ゾーンが、接触領域と対照捕捉ゾーン間に配置されるように位置する対照捕捉ゾーン内に固定された対照捕捉用試薬を追加的に含む。上述したように、対照捕捉用試薬は分析物結合粒子と反応するが、測定対象となる分析物とは相互作用しない。例えば対照捕捉用試薬は、粒子表面の別の材料（例えば、粒子と結合状態にある分析物の担体；または抗体）と、または粒子そのものと反応しうる。好ましい態様では、試料捕捉用試薬および対照捕捉剤はいずれも抗体である。対照捕捉用試薬は、対照捕捉ゾーンの膜上に固定される（膜表面に被覆される、および/または膜内に浸透する）。
【００４５】
競合アッセイ成分は、「サンドイッチ」アッセイ法に関して既に述べた位置と同様に位置する。例えば好ましい態様では、対照捕捉ゾーンは試料捕捉ゾーンに隣接するので、このアッセイ成分の毛管作用の動態は、対照捕捉ゾーンと試料捕捉ゾーンの両方において同等（例えば本質的に同等）であり、またさらに対照捕捉ゾーンと試料捕捉ゾーンは、各ゾーンに停止した状態にある粒子が個別に定量可能な十分な空間も有する。さらに好ましい態様では、試料捕捉ゾーンは、キャピラリ先端の進む速度が、粒子の捕捉を可能にするように十分緩やかになって、また総移動時間が、分析物と試料捕捉用試薬の結合を可能にするように十分長くなることを確実なものとするために、試料捕捉ゾーンと対照捕捉ゾーンの間の短い距離に対して距離の長い空間によって接触領域から隔てられる。
【００４６】
競合的な定量的免疫クロマトグラフィーアッセイ法を行うためには、関心対象の分析物の有無の評価対象となる流体試料を上述の手順で得る。膜ストリップの投入点に、関心対象の分析物に関してアッセイ対象となる流体試料を接触させる。膜ストリップの投入点に、関心対象の分析物を含む流体試料を接触させた後に、流体を接触領域の方向へ輸送してこれを通過させることによって関心対象の分析物（流体中に存在する場合）を接触領域の方向へ輸送してこれを通過させることを可能にする条件で膜ストリップを維持する。接触領域の分析物被覆粒子は、試料中の分析物（存在する場合）とともに、流体の毛管作用で、流体試料からさらに動かされ、また分析物被覆試料は、膜に沿って、流体および分析物とともに、膜上の「試料捕捉ゾーン」の方向へ動いてこれを通過し、またこれに続いて「対照捕捉ゾーン」の方向へ動いてこれを通過する。膜ストリップは、分析物被覆粒子を毛管作用によって膜に沿って試料捕捉ゾーンの方向へ動かしてこれを通過させ、また（これに続く）対照捕捉ゾーンの方向へ動かしてこれを通過させ、およびこれに続いて、対照捕捉ゾーンを越える移動（例えば吸い取りパッド中に移動）を可能にすることで、任意の非結合粒子を捕捉ゾーンから除去する条件（例えば十分な時間および流体容積）で維持する。
【００４７】
一部の分析物被覆粒子の動きは、試料捕捉ゾーンにおける分析物被覆粒子と試料捕捉用試薬との結合と、これに続く、対照捕捉ゾーンにおける一部の分析物被覆粒子と対照捕捉用試薬との結合によって停止する。分析物被覆粒子は、試料捕捉用試薬との結合をめぐって、試料中の分析物（存在する場合）と競合する。試料捕捉用試薬は、分析物被覆粒子表面の分析物との結合を可能にすることにより、分析物被覆粒子と結合する。本明細書で用いる「試料-試薬-分析物被覆粒子の複合体」という用語は、試料捕捉用試薬と分析物被覆粒子の複合体を意味する。分析物被覆粒子は、試料捕捉ゾーンに停止状態にあり、分析物被覆粒子が、粒子表面の分析物と、試料捕捉ゾーンの試料捕捉用試薬との相互作用によって捕捉されるために、試料-試薬-分析物被覆粒子の複合体を形成する。
【００４８】
対照捕捉用試薬は、分析物そのものを除く、分析物被覆粒子の任意の成分に結合することで、分析物被覆粒子に結合する。上記のように使用される「対照-試薬-分析物被覆粒子の複合体」という用語は、対照捕捉用試薬と分析物被覆粒子の複合体を意味する。上述したように、分析物被覆粒子は対照捕捉ゾーンで停止状態となって、分析物結合粒子と、対照捕捉ゾーンの対照捕捉用試薬の相互作用によって分析物被覆粒子が捕捉されるために、対照-試薬-分析物被覆粒子の複合体を形成する。
【００４９】
次に毛管作用は、試料捕捉ゾーンまたは対照捕捉ゾーンのいずれにおいても停止状態にない任意の分析物被覆粒子を、対照捕捉ゾーンを越える方向に向かって動かすことによって、停止状態にない任意の粒子を試料捕捉ゾーンおよび対照捕捉ゾーンの両方から除去する。好ましい態様では、流体は、いずれの捕捉ゾーンにおいても停止状態にない、任意の接触状態の分析物被覆粒子を、対照捕捉ゾーンに続く吸い取りパッド中に動かす。
【００５０】
次に、試料捕捉ゾーンで停止状態にある分析物結合粒子の量を決定する。分析物結合粒子は、分析物結合粒子に使用する標識の型に適した手法で検出する。好ましい態様では、分析物結合粒子量は、分析物結合粒子の標識の蛍光量を測定する方法などの光学的な方法で決定する。対照捕捉ゾーンで停止状態にある分析物結合粒子の量は、試料捕捉ゾーン内の分析物結合粒子の量と同様に決定する。1つの態様では、上述したように、分析物結合粒子の量は、固相（例えば膜ストリップ）に沿った位置に存在する標識の量に正比例する曲線で表される。例えば、膜ストリップの各位置（例えば、試料捕捉ゾーンおよび対照捕捉ゾーン、および/または試料捕捉ゾーンと対照捕捉ゾーンの間の領域、または試料捕捉ゾーンと対照捕捉ゾーンに隣接する領域、および/または膜ストリップの他の領域）における粒子の量を決定して、膜ストリップに沿った位置の距離の関数としてプロットすることができる。次に粒子量を、存在する標識の量に比例する曲線下面積の関数として計算することができる。
【００５１】
補正後の分析物被覆粒子量を決定し、次に分析物の量を、補正後の分析物被覆粒子量から適切な計算法で決定することができる。補正後の分析物被覆粒子量は、試料捕捉ゾーン、および対照捕捉ゾーンに停止状態にある分析物被覆粒子の量に基づく。例えば1つの態様では、補正後の分析物被覆粒子量は、試料捕捉ゾーンに存在する分析物被覆粒子量と、対照捕捉ゾーンに存在する分析物被覆粒子量の比（R）に反比例する。次に、存在する分析物の量を、補正後の分析物被覆粒子量（比）から、標準曲線を参照して決定することができる。標準曲線は、検出対象となる分析物を含む流体に既知濃度の関心対象の分析物を含む一連の対照試料（分析物を含まない血清など）を調製することで作成する。次に、定量的免疫クロマトグラフィーアッセイ法を一連の対照試料を対象に行い、R値を各対照試料について測定し、同値を、対照試料中の分析物の濃度の関数としてプロットする。未知量の分析物を含む試料（「被験試料」）のアッセイ法を、被験試料のR値を測定することで行い、被験試料中の分析物の濃度を、標準曲線を参照して決定する。上述したように、1つの標準曲線を作成して、1つのロットの全被験試料（試験用試薬の特定の調製物を用いる全被験試料）に対して使用することが可能であり、標準曲線を各被験試料について再び作成する必要はない。別の態様では、補正後の分析物被覆粒子量は、対照捕捉ゾーンに存在する分析物被覆粒子の量と、試料捕捉ゾーンに存在する分析物被覆粒子量の合計に対する、試料捕捉ゾーンに存在する分析物被覆粒子量の比（R）に反比例する。次に、存在する分析物の量を、補正後の分析物被覆粒子量（比）を元に、標準曲線を参照して決定することができる。あるいは、他の比、および/または標準曲線を参照して、試料中の分析物の量を決定することもできる。また望ましいならば、バックグラウンドの標識量を、試料捕捉ゾーンに存在する分析物結合粒子の量、および対照捕捉ゾーンに存在する分析物結合粒子の量から差し引いてから比（R）の計算を行うことができる。
【００５２】
本発明のアッセイ法は、特に定量的免疫クロマトグラフィーアッセイ法に関して説明されているが、本発明のアッセイ法は、上記の他の結合対（例えば核酸、受容体-リガンド、レクチン-糖）を対象に、上記と同じ方法で、分析物および分析物結合剤として所望の成分を対象に同様に使用することができる。本発明はまた、本明細書に記載されている方法に使用されるキットも含む。キットの成分には、特異的な結合対の第1および/または第2の要素、緩衝液、流体採取法、および標準曲線の作成に使用する対照試料、分析物結合粒子、および/または対照粒子、捕捉用試薬、および/または抗体が含まれる。
【００５３】
本発明は以下の実施例により説明されるが、これは何ら制限する意図をもつものではない。
【００５４】
実施例
ミオグロビンを対象としたサンドイッチアッセイ法
直径約0.3ミクロンのラテックス粒子（Interfacial Dynamics、Portland、OR）を入手し、粒子内にインターカレートする蛍光色素で着色した（Molecular Probes、Eugene OR、またはDuke Scientific、Palo Alto、CA）。着色後のラテックス粒子を、分析物結合抗体と以下の手順で結合した。まず粒子を遠心分離して洗浄し、リン酸緩衝液中に約0.2%（固体）の濃度になるように再懸濁した。抗体（ミオグロビンに対するマウス抗体）を1 mg/mlの濃度になるように調製した。次に0.5 mlの2%ラテックス粒子懸濁物を4 mlの抗体溶液に添加し、抗体と粒子間に共有結合をもたらすような、シアノホウ化水素ナトリウムおよびスキムミルクの溶液とインキュベートし、粒子の残りの表面をスキムミルクタンパク質で飽和させた。この懸濁物を次にボルテックミキサーで攪拌し、超音波処理を行って凝集物を破壊した。
【００５５】
膜ストリップは、ニトロセルロース膜（Sartorius）を用いて作製した。試料捕捉剤および対照捕捉剤は、膜ストリップ上のそれぞれ試料捕捉ゾーンおよび対照捕捉ゾーンに、直線ストリップ作製装置（IVEK）を用いて固定した。ミオグロビンのアッセイ法を行う場合は、ヤギ抗ミオグロビンポリクローナル抗体（1 mg/ml）を試料捕捉剤として、またヤギ抗マウス免疫グロブリン（0.4 mg/ml）を対照捕捉剤として使用した。次に膜ストリップを乾燥した。
【００５６】
膜ストリップをポリビニルアルコール（PVA）の1%溶液に浸してブロックし、余分なタンパク質結合を防いだ。次に、膜ストリップを水で洗浄してから乾燥した。
【００５７】
次に分析物結合粒子を、膜ストリップの接触領域にアプライした。最初に接触領域に30%ショ糖溶液でストライプをつけてから乾燥した。次に粒子を0.1%の懸濁物として、2 μl/cmのストライプ生成速度でアプライした。次に、膜を乾燥させてからアッセイ法を行った。
【００５８】
アッセイ法を行うためには、ミオグロビンを含む段階希釈の緩衝液の試料（0 ng/ml、2.5 ng/ml、5 ng/ml、10 ng/ml、20 ng/ml、40 ng/ml）を膜ストリップの投入点に添加し、次に流体を毛管作用で膜ストリップ全体を移動させながら、膜ストリップを室温で維持した。次に接触状態の分析物結合粒子の量を、蛍光量を検出することで、試料捕捉ゾーンおよび対照捕捉ゾーンで測定した。図2A〜図2Fに結果を示すが、スキャン距離20 mmの直前（試料捕捉ゾーンの位置）の曲線下面積（蛍光量を示す）が、ミオグロビン濃度の上昇に伴って増加し、一方で、スキャン距離25 mmの直前（対照捕捉ゾーンの位置）の曲線下面積は、ほぼ一定の状態で変わらないことがわかる。曲線下面積が変化するのは、試験法が変動する（例えば、対照捕捉ゾーンの曲線下面積は、試料捕捉ゾーンの曲線下面積と同じパーセントで変化する）ためである。この変動は、本明細書に記載されている方法で補正される。
【００５９】
標準曲線（図3）を以上のデータから作成した。（試料捕捉ゾーンにおける曲線下面積を総合することで計算される）試料捕捉ゾーンに存在する分析物結合粒子の量（試料捕捉ゾーンにおける曲線下面積を積算して計算される）の、対照捕捉ゾーンに存在する分析物結合粒子量（対照捕捉ゾーンにおける曲線下面積を積算して計算される）と、試料捕捉ゾーンに存在する分析物結合粒子量（上記の手順で計算される）の合計に対する比（R）を決定し、ミオグロビンの濃度（ng/ml）と比較した。この比は、ミオグロビンの濃度の上昇に伴い大きくなることがわかる。
【００６０】
本発明を、本発明の好ましい態様に関して特に説明および記述したが、添付の特許請求の範囲に含まれる本発明の範囲から逸脱することなく、形状および詳細のさまざまな変更がなされることは、当業者により理解される。
【図面の簡単な説明】
【００６１】
【図１】定量的免疫クロマトグラフィーアッセイ法の動的性質を示す図であり、ここで、関心対象の分析物を含む流体を膜の投入点に添加し（段階1）、関心対象の分析物に結合する抗体で被覆された粒子を、流体が接触領域から動かすように膜をインキュベートし（段階2）、膜に沿って、試料捕捉ゾーンの方向へ動かし、続いて対照捕捉ゾーンの方向へ動かす（段階3）。
【図２】図2A〜図2Fは、一連の被験試料中のミオグロビンの量を測定した定量的免疫クロマトグラフィーアッセイ法の結果を示す一連のグラフである。試料捕捉ゾーンおよび対照捕捉ゾーンで検出された蛍光分析物結合粒子の量に対応するシグナルの量は、被験試料中のミオグロビンの量の関数であることがわかる。図2Aは、0 ng/ml ミオグロビンの場合である。図2Bは、2.5 ng/ml ミオグロビンの場合である。図2Cは、3 ng/ml ミオグロビンの場合である。図2Dは、10 ng/ml ミオグロビンの場合である。図2Eは、20 ng/ml ミオグロビンの場合である。図2Fは、40 ng/ml ミオグロビンの場合である。
【図３】「サンドイッチ」定量免疫クロマトグラフィーアッセイ法によるミオグロビン量の測定に用いる標準曲線を示すグラフである。対照捕捉ゾーンに存在する分析物結合粒子の量および、試料捕捉ゾーンに存在する分析物結合粒子の量の合計に対する、試料捕捉ゾーンに存在する分析物結合粒子量の比（R）を、試料中のミオグロビンの濃度（ng/ml）と比較する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際公開パンフレット】
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【手続補正書】
【提出日】平成15年5月20日(2003.5.20)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の段階を含む、流体試料中の関心対象の分析物の量を定量的に測定する方法：
a）投入点、接触領域、試料捕捉ゾーン、および対照捕捉ゾーンを含む膜ストリップを提供する段階（接触領域は投入点と試料捕捉ゾーン間に位置し、かつ試料捕捉ゾーンは接触領域と対照捕捉ゾーン間に位置する）；
b）膜ストリップの投入点に、関心対象の分析物に関してアッセイ対象となる流体試料を接触させる段階；
c）流体が、流体試料中の関心対象の分析物を、ストリップを介した毛管作用によって接触領域の方向へ輸送しかつ通過させることを可能にする条件で、膜ストリップを維持する段階（接触領域は、表面に被覆されたおよび/または内部に浸透した分析物結合粒子の集団を有し、ここで分析物結合粒子は分析物結合剤で被覆されている）；
d）関心対象の分析物（試料中に存在する場合）が分析物結合粒子との結合を可能にすることにより、（分析物結合粒子の表面で分析物結合剤と結合した関心対象の分析物を有していてもいなくてもよい）接触状態の分析物結合粒子を作製することを可能にする条件、試料中の流体が、接触状態の分析物結合粒子を、ストリップを介した毛管作用によって動かし、試料捕捉ゾーンの方向へ輸送しかつ通過させることを可能にする条件（試料捕捉ゾーンは、表面に固定された試料捕捉用試薬を有する）、および、接触状態の分析物結合粒子と試料捕捉用試薬の結合を可能にする条件で、膜ストリップをさらに維持する段階；
e）試料中の流体が、ストリップを介した毛管作用によって、接触状態の分析物結合粒子を、対照捕捉ゾーンの方向へ輸送しかつ通過させることを可能にする条件（対照捕捉ゾーンは、表面に固定された対照捕捉用試薬を有し、ここで、対照捕捉用試薬は分析物結合粒子と反応することができるが関心対象の分析物とは相互作用しない）、および、接触状態の分析物結合粒子と対照捕捉用試薬との結合を可能にする条件で、膜ストリップをさらに維持する段階；
f）試料中の流体が、試料捕捉用試薬とまたは対照捕捉用試薬と結合していない任意の接触状態の分析物結合粒子を、毛管作用によって、対照捕捉ゾーンを越えて輸送することを可能にする条件で、膜ストリップをさらに維持する段階；
g）試料捕捉ゾーン内の接触状態の分析物結合粒子の量、および対照捕捉ゾーン内の接触状態の分析物結合粒子の量を決定する段階；ならびに
h）（補正後の分析物結合粒子量が、対照捕捉ゾーン内の分析物結合粒子量に対する試料捕捉ゾーン内の分析物結合粒子量の比である）補正後の分析物結合粒子量を決定する段階（流体試料中の関心対象の分析物の量は、補正後の分析物結合粒子量に正比例する）。
【請求項２】
以下の段階を含む、流体試料中の関心対象の分析物の量を定量的に測定する方法：
a）投入点、接触領域、試料捕捉ゾーン、および対照捕捉ゾーンを含む膜ストリップを提供する段階（接触領域は投入点と試料捕捉ゾーン間に位置し、かつ試料捕捉ゾーンは接触領域と対照捕捉ゾーン間に位置する）；
b）膜ストリップの投入点に、関心対象の分析物に関してアッセイ対象となる流体試料を接触させる段階；
c）流体が、流体試料中の関心対象の分析物を、ストリップを介した毛管作用によって接触領域の方向へ輸送しかつ通過させることを可能にする条件で、膜ストリップを維持する段階（接触領域は、表面に被覆されたおよび/または内部に浸透した分析物結合粒子の集団を有し、ここで分析物結合粒子は分析物結合剤で被覆されている）；
d）関心対象の分析物（試料中に存在する場合）が分析物結合粒子との結合を可能にすることにより、（分析物結合粒子の表面で分析物結合剤と結合した関心対象の分析物を有していてもいなくてもよい）接触状態の分析物結合粒子を作製することを可能にする条件、試料中の流体が、接触状態の分析物結合粒子を、ストリップを介した毛管作用によって動かし、試料捕捉ゾーンの方向へ輸送しかつ通過させることを可能にする条件（試料捕捉ゾーンは、表面に固定された試料捕捉用試薬を有する）、および、接触状態の分析物結合粒子と試料捕捉用試薬の結合を可能にする条件で、膜ストリップをさらに維持する段階；
e）試料中の流体が、ストリップを介した毛管作用によって、接触状態の分析物結合粒子を、対照捕捉ゾーンの方向へ輸送しかつ通過させることを可能にする条件（対照捕捉ゾーンは、表面に固定された対照捕捉用試薬を有し、ここで、対照捕捉用試薬は分析物結合粒子と反応することができるが関心対象の分析物とは相互作用しない）、および、接触状態の分析物結合粒子と対照捕捉用試薬との結合を可能にする条件で、膜ストリップをさらに維持する段階；
f）試料中の流体が、試料捕捉用試薬とまたは対照捕捉用試薬と結合していない任意の接触状態の分析物結合粒子を、毛管作用によって、対照捕捉ゾーンを越えて輸送することを可能にする条件で、膜ストリップをさらに維持する段階；
g）試料捕捉ゾーン内の接触状態の分析物結合粒子の量、および対照捕捉ゾーン内の接触状態の分析物結合粒子の量を決定する段階；ならびに
h）（補正後の分析物結合粒子量が、対照捕捉ゾーン内の分析物結合粒子量および試料捕捉ゾーン内の分析物結合粒子量の合計に対する試料捕捉ゾーン内の分析物結合粒子量の比である）補正後の分析物結合粒子量を決定する段階（流体試料中の関心対象の分析物の量は、補正後の分析物結合粒子量に正比例する）。
【請求項３】
以下の段階を含む、流体試料中の関心対象の分析物の量を定量的に測定する方法：
a）投入点、接触領域、試料捕捉ゾーン、および対照捕捉ゾーンを含む膜ストリップを提供する段階（接触領域は投入点と試料捕捉ゾーン間に位置し、かつ試料捕捉ゾーンは接触領域と対照捕捉ゾーン間に位置する）；
b）膜ストリップの投入点に、関心対象の分析物に関してアッセイ対象となる流体試料を接触させる段階；
c）流体が、流体試料中の関心対象の分析物を、ストリップを介した毛管作用によって接触領域の方向へ輸送しかつ通過させることを可能にする条件で、膜ストリップを維持する段階（接触領域は、表面に被覆されたおよび/または内部に浸透した分析物被覆粒子の集団を有し、ここで分析物被覆粒子は関心対象の分析物で被覆されている）；
d）試料中の流体が、分析物被覆粒子を、ストリップを介した毛管作用によって動かし、試料捕捉ゾーンの方向へ輸送しかつ通過させることを可能にする条件（試料捕捉ゾーンは、表面に固定された試料捕捉用試薬を有する）、および、分析物被覆粒子と試料捕捉用試薬の結合を可能にする条件で、膜ストリップをさらに維持する段階；
e）試料中の流体が、ストリップを介した毛管作用によって、分析物被覆粒子を、対照捕捉ゾーンの方向へ輸送しかつ通過させることを可能にする条件（対照捕捉ゾーンは、表面に固定された対照捕捉用試薬を有し、ここで、対照捕捉用試薬は分析物被覆粒子と反応することができるが関心対象の分析物とは相互作用しない）、および、分析物被覆粒子と対照捕捉用試薬との結合を可能にする条件で、膜ストリップをさらに維持する段階；
f）試料中の流体が、試料捕捉用試薬とまたは対照捕捉用試薬と結合していない任意の分析物被覆粒子を、毛管作用によって、対照捕捉ゾーンを越えて輸送することを可能にする条件で、膜ストリップをさらに維持する段階；
g）試料捕捉ゾーン内の分析物被覆粒子の量、および対照捕捉ゾーン内の分析物被覆粒子の量を決定する段階；ならびに
h）（補正後の分析物被覆粒子量が、対照捕捉ゾーン内の分析物被覆粒子量に対する試料捕捉ゾーン内の分析物被覆粒子量の比である）補正後の分析物被覆粒子量を決定する段階（流体試料中の関心対象の分析物の量は、補正後の分析物被覆粒子量に反比例する）。
【請求項４】
以下の段階を含む、流体試料中の関心対象の分析物の量を定量的に測定する方法：
a）投入点、接触領域、試料捕捉ゾーン、および対照捕捉ゾーンを含む膜ストリップを提供する段階（接触領域は投入点と試料捕捉ゾーン間に位置し、かつ試料捕捉ゾーンは接触領域と対照捕捉ゾーン間に位置する）；
b）膜ストリップの投入点に、関心対象の分析物に関してアッセイ対象となる流体試料を接触させる段階；
c）流体が、流体試料中の関心対象の分析物を、ストリップを介した毛管作用によって接触領域の方向へ輸送しかつ通過させることを可能にする条件で、膜ストリップを維持する段階（接触領域は、表面に被覆されたおよび/または内部に浸透した分析物被覆粒子の集団を有し、ここで分析物被覆粒子は関心対象の分析物で被覆されている）；
d）試料中の流体が、分析物被覆粒子を、ストリップを介した毛管作用によって動かし、試料捕捉ゾーンの方向へ輸送しかつ通過させることを可能にする条件（試料捕捉ゾーンは、表面に固定された試料捕捉用試薬を有する）、および、分析物被覆粒子と試料捕捉用試薬の結合を可能にする条件で、膜ストリップをさらに維持する段階；
e）試料中の流体が、ストリップを介した毛管作用によって、分析物被覆粒子を、対照捕捉ゾーンの方向へ輸送しかつ通過させることを可能にする条件（対照捕捉ゾーンは、表面に固定された対照捕捉用試薬を有し、ここで、対照捕捉用試薬は分析物被覆粒子と反応することができるが関心対象の分析物とは相互作用しない）、および、分析物被覆粒子と対照捕捉用試薬との結合を可能にする条件で、膜ストリップをさらに維持する段階；
f）試料中の流体が、試料捕捉用試薬とまたは対照捕捉用試薬と結合していない任意の分析物被覆粒子を、毛管作用によって、対照捕捉ゾーンを越えて輸送することを可能にする条件で、膜ストリップをさらに維持する段階；
g）試料捕捉ゾーン内の分析物被覆粒子の量、および対照捕捉ゾーン内の分析物被覆粒子の量を決定する段階；ならびに
h）（補正後の分析物被覆粒子量が、対照捕捉ゾーン内の分析物被覆粒子量および試料捕捉ゾーン内の分析物被覆粒子量の合計に対する試料捕捉ゾーン内の分析物被覆粒子量の比である）補正後の分析物被覆粒子量を決定する段階（流体試料中の関心対象の分析物の量は、補正後の分析物被覆粒子量に反比例する）。
【請求項５】
以下の段階を含む、流体試料中の関心対象の分析物の量を測定する方法：
a）投入点、接触領域、試料捕捉ゾーン、および対照捕捉ゾーンを含む膜ストリップを提供する段階（接触領域は投入点と試料捕捉ゾーン間に位置し、かつ試料捕捉ゾーンは接触領域と対照捕捉ゾーン間に位置する）；
b）膜ストリップの試料捕捉ゾーンに流体試料を接触させる段階（試料捕捉ゾーンは、表面に固定された試料捕捉用試薬を有する）、および関心対象の分析物（試料中に存在する場合）が、試料捕捉ゾーンの試料捕捉用試薬と結合することによって、停止状態の分析物を作製することを可能にする条件で、膜ストリップを維持する段階；
c）膜ストリップの投入点に緩衝液を接触させる段階；
d）緩衝液が、接触領域の表面に被覆されたおよび/または内部に浸透した分析物結合粒子の集団を、毛管作用によって動かし、試料捕捉ゾーンの方向へ輸送しかつ通過させることを可能にする条件（分析物結合粒子は、分析物に対する抗体で被覆されている）、および停止状態の関心対象の分析物が、分析物結合粒子と相互作用することによって、停止状態の分析物-粒子複合体を作製することを可能にする条件で、膜ストリップを維持する段階；
e）緩衝液が、分析物結合粒子を、毛管作用によって対照捕捉ゾーンの方向へ輸送しかつ通過させることを可能にする条件（対照捕捉ゾーンは、表面に固定された対照捕捉用試薬を有する）、および分析物結合粒子と対照捕捉用試薬を結合可能にする条件（対照捕捉用試薬は分析物結合粒子と反応することができるが関心対象の分析物とは相互作用しない）で、膜ストリップをさらに維持する段階；
f）試料中の流体が、試料捕捉用試薬とまたは対照捕捉用試薬と結合していない任意の分析物結合粒子を、毛管作用によって対照捕捉ゾーンを越えて輸送することを可能にする条件で、膜ストリップをさらに維持する段階；
g）試料捕捉ゾーン内の分析物結合粒子の量、および対照捕捉ゾーン内の分析物結合粒子の量を決定する段階；ならびに
h）（補正後の分析物結合粒子量が、対照捕捉ゾーン内の分析物結合粒子量に対する試料捕捉ゾーン内の分析物結合粒子量の比である）補正後の分析物結合粒子量を決定する段階（流体試料中の関心対象の分析物の量は、補正後の分析物結合粒子量に正比例する）。
【請求項６】
以下の段階を含む、流体試料中の関心対象の分析物の量を測定する方法：
a）投入点、接触領域、試料捕捉ゾーン、および対照捕捉ゾーンを含む膜ストリップを提供する段階（接触領域は投入点と試料捕捉ゾーン間に位置し、かつ試料捕捉ゾーンは接触領域と対照捕捉ゾーン間に位置する）；
b）膜ストリップの試料捕捉ゾーンに流体試料を接触させる段階（試料捕捉ゾーンは、表面に固定された試料捕捉用試薬を有する）、および関心対象の分析物（試料中に存在する場合）が、試料捕捉ゾーンの試料捕捉用試薬と結合することによって、停止状態の分析物を作製することを可能にする条件で、膜ストリップを維持する段階；
c）膜ストリップの投入点に緩衝液を接触させる段階；
d）緩衝液が、接触領域の表面に被覆されたおよび/または内部に浸透した分析物結合粒子の集団を、毛管作用によって動かし、試料捕捉ゾーンの方向へ輸送しかつ通過させることを可能にする条件（分析物結合粒子は、分析物に対する抗体で被覆されている）、および停止状態の関心対象の分析物が、分析物結合粒子と相互作用することによって、停止状態の分析物-粒子複合体を作製することを可能にする条件で、膜ストリップを維持する段階；
e）緩衝液が、分析物結合粒子を、毛管作用によって対照捕捉ゾーンの方向へ輸送しかつ通過させることを可能にする条件（対照捕捉ゾーンは、表面に固定された対照捕捉用試薬を有する）、および分析物結合粒子と対照捕捉用試薬を結合可能にする条件（対照捕捉用試薬は分析物結合粒子と反応することができるが関心対象の分析物とは相互作用しない）で、膜ストリップをさらに維持する段階；
f）試料中の流体が、試料捕捉用試薬とまたは対照捕捉用試薬と結合していない任意の分析物結合粒子を、毛管作用によって対照捕捉ゾーンを越えて輸送することを可能にする条件で、膜ストリップをさらに維持する段階；
g）試料捕捉ゾーン内の分析物結合粒子の量、および対照捕捉ゾーン内の分析物結合粒子の量を決定する段階；ならびに
h）（補正後の分析物結合粒子量が、対照捕捉ゾーン内の分析物結合粒子量および試料捕捉ゾーン内の分析物結合粒子量の合計に対する試料捕捉ゾーン内の分析物結合粒子量の比である）補正後の分析物結合粒子量を決定する段階（流体試料中の関心対象の分析物の量は、補正後の分析物結合粒子量に正比例する）。
【請求項７】
膜ストリップを、硝酸セルロースまたはガラス繊維から作製する、請求項1から6のいずれか一項記載の方法。
【請求項８】
粒子がラテックスビーズである、請求項1から6のいずれか一項記載の方法。
【請求項９】
粒子が標識されている、請求項1から6のいずれか一項記載の方法。
【請求項１０】
標識が、比色分子、蛍光分子、リン光分子、発光分子、化学発光分子、および酵素結合分子からなる群より選択される、請求項9記載の方法。
【請求項１１】
分析物および分析物結合剤が結合対の要素であり、かつ結合対の1つの要素が、タンパク質、ホルモン、酵素、糖タンパク質、ペプチド、小分子、多糖、レクチン、抗体、抗体断片、核酸、薬剤、薬剤接合体、毒素、ウイルス、ウイルス粒子、細胞壁の一部、ハプテン、および受容体からなる群より選択される、請求項1、2、5または6のいずれか一項記載の方法。
【請求項１２】
分析物結合剤が、抗体、抗体断片、ハプテン、薬剤接合体、および受容体からなる群より選択される、請求項1、2、5または6のいずれか一項記載の方法。
【請求項１３】
分析物結合剤が抗体である、請求項12記載の方法。
【請求項１４】
対照捕捉用試薬が抗体である、請求項13記載の方法。
【請求項１５】
試料捕捉用試薬が、分析物結合粒子表面の抗体と同じエピトープに対する抗体、および分析物結合粒子表面の抗体とは異なるエピトープに対する抗体からなる群より選択される抗体である、請求項13記載の方法。
【請求項１６】
対照捕捉用試薬が抗免疫グロブリン抗体である、請求項13記載の方法。
【請求項１７】
被験試料が、全血、血漿、血清、尿、脳脊髄液、唾液、精液、硝子体、または滑液からなる群より選択される、請求項1から6のいずれか一項記載の方法。
【請求項１８】
関心対象の分析物が、ミオグロビン、CK-MB、トロポニンI、およびPSAからなる群より選択される、請求項1、2、5または6のいずれか一項記載の方法。
【請求項１９】
関心対象の分析物が、ジゴキシン、テオフィリン、ホルモンT-3、ホルモンT-4、LSD、THC、およびバルビツール酸塩からなる群より選択される、請求項3または4記載の方法。
【請求項２０】
段階（f）において、試料中の流体が、試料捕捉用試薬とまたは対照捕捉用試薬と結合していない任意の接触状態の分析物結合粒子を、毛管作用によって対照捕捉ゾーンを越えて吸い取りパッド中へと輸送する、請求項1または2記載の方法。
【国際調査報告】
2004526156.tif 000044