(57)【要約】本発明は、ドアを備える密閉式保温器、幾つかのウェルを有する培養箱、前記箱のウェルの１つの中にある生物、及びとりわけ胚を含むインキュベータであって、生物を入っているウェルから取り出し、新しい培地を満たした他のウェル内に入れるための外部から制御する手段を含むことを特徴とするインキュベータに関する。本発明は、生物のインキュベーション方法にも同様に関する。
2004528020.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ドアを備える密閉式保温器、保温器内に置かれる幾つかのウェルを有する培養箱、前記箱のウェルの１つの中にある生物を含むインキュベータであって、生物を入っているウェルから取り出し、新しい培地を満たした他のウェル内に入れるための外部から制御する手段を含むことを特徴とするインキュベータ。
【請求項２】
生物を入っているウェルから取り出し、培地を満たした他のウェル内に入れるための外部から制御する前記手段は、ピペットであることを特徴とする請求項１に記載のインキュベータ。
【請求項３】
保温器外部に置かれたはディスプレイ上で生物の培養を観察することを可能にする顕微鏡を含むことを特徴とする請求項１又は２のいずれかに記載のインキュベータ。
【請求項４】
前記顕微鏡のステージは、保温器内部にあることを特徴とする請求項３に記載のインキュベータ。
【請求項５】
前記顕微鏡は、光の有害な効果から生物を保護するフィルタを有することを特徴とする請求項３又は４のいずれかに記載のインキュベータ。
【請求項６】
幾つかのウェルを有する培養箱の保温器内に、保温器外部から制御する、ステップバイステップ移動手段を含むことを特徴とする請求項１から５のいずれかに記載のインキュベータ。
【請求項７】
培養箱のステップバイステップ移動手段は：
‐制御線を介してコンピュータによって制御されるステップバイステップモータによってそれ自体が回転駆動される、駆動ローラによって駆動されるエンドレスコンベヤベルトか、
‐処理する培養箱を採取し、かつそれを処置ゾーンに送ることが可能な、コンピュータによって制御され、線状又は回転移動を有し得る連接操作アームからなることを特徴とする請求項６に記載のインキュベータ。
【請求項８】
ウェルの上に通じる弁を有する導管と連通する培地源、及び規定量の培地をウェル内に注ぐように、弁制御手段を含むことを特徴とする請求項１から７のいずれかに記載のインキュベータ。
【請求項９】
一方のウェルから他方のウェルへの前記弁の移動手段を含むことを特徴とする請求項８に記載のインキュベータ。
【請求項１０】
保温器内部の大気の自動調節及び監視を可能にするセンサを備えることを特徴とする請求項１から９のいずれかに記載のインキュベータ。
【請求項１１】
生物を密閉式保温器に入れ、培地を満たした培養ウェル内でインキュベートし、かつそれをｎ回、培地を取り替えることからなり、ｎは１より大きく、かつ５０より小さい整数である生物のインキュベーション方法であって、
ｉ）保温器内に置かれた箱の一連の（ｎ＋１）のウェルの１つの中に生物を入れ、他方で一連のｎの他のウェルは、あらゆる生物を有さないこと、
ｉｉ）新しい培地を満たした一連の次のウェル内に生物を入れるために、生物を、保温器から取り出すことなく、入っているウェルから移動させること、及び
ｉｉｉ）多くとも、使用できるウェルが残っているのと同じ回数だけ、移動を反復することからなることを特徴とする方法。
【請求項１２】
指示薬を含み、かつ生物が入っている、一連の（ｎ＋１）の着色されたウェル中の１つのウェル内に含まれる培地の色変化を顕微鏡で観察し、かつこの色変化の際にウェルの生物を取り替えることからなることを特徴とする請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
インキュベータ内の光学濃度を監視し、かつ光学濃度が禁止閾値を超える時にウェルを取り替えることからなることを特徴とする請求項１１又は１２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、インキュベータ及び生物のインキュベーション方法に関する。本発明は、胚を培養し、かつできるだけ良好な発育温度及び大気条件において監視するためにとりわけ応用される。
【背景技術】
【０００２】
試験管内受精の際に、精子及び卵子は、一緒に置かれる。古典的な試験管内受精又は微量注入による、この受精の後に、配偶子が培地内に置かれ、かつインキュベータ内に預けられる。それらは、培地取替え、顕微鏡観察、又はその他のあらゆる操作のために、胚が子宮内へ移動するまで、毎日、１日当り１〜２回取り出される。
【０００３】
これらの様々な培地取替え及び顕微鏡観察、又はその他のあらゆる操作の間に、胚培養は、下記の多数の問題にさらされる：
‐３７℃（インキュベータの温度）から２０℃（培地取替え及び顕微鏡観察が行われる外界温度）への熱衝撃、
‐培地のｐＨの変動をもたらすＣＯ２濃度の変動、
‐胚に有害な生成物の出現を伴う温度変動による、培地の栄養特性の悪化、
‐顕微鏡観察の際に胚に光を当てること、
‐外傷性胚の操作、
‐細菌及び菌類学的汚染の危険、
‐遊離基の濃度増加、及び基質の濃度減少をもたらす遅い培地取替え、
‐胚喪失を伴う操作の間違い。
【０００４】
胚が直面する上述の問題の幾つかは、胚にとって非常の有害な効果を有し得る。実際、２２℃の温度に３分を超す間、置かれた胚は、もはや発育できないことが証明された。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、培地取替えを容易にし、かつ操作の間違い及び外傷性操作を減少させるように自動化しながら、熱衝撃及び細菌及び菌類学的汚染の危険を取り除く、インキュベータ及びインキュベーション方法によって、これらの不都合が生じないようにする。従って試験管内受精の枠内で利用される本発明は、生育力があり、かつ良質な胚の数を改良することを可能にする。
【０００６】
本発明の枠内において、「生物」とは、配偶子（卵母細胞及び精子）、受精卵母細胞、胚培養、及び胚だけでなく、株細胞、病原微生物または病原でない微生物等のようなあらゆる細胞培養も意味する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
従って本発明は、ドアを備える密閉式保温器、保温器内に置かれる幾つかのウェルを有する培養箱、前記箱のウェルの１つの中にある生物を含むインキュベータであって、生物を入っているウェルから取り出し、新しい培地を満たした他のウェル内に入れるための外部から制御する手段を含むことを特徴とするインキュベータを対象とする。好適には、本発明の枠内において、ウェルから生物を取り出し、培地を満たした他のウェル内に入れるための外部から制御する手段は、ピペットである。
【０００８】
このようにして、生物、及び特に胚をそのウェルから取り出し、培地を替え、かつ胚をウェル内に再び置くために、もはや培養箱を取り出す必要はない。今や胚をインキュベータから取り出すことなく、それが入っているウェルから取り出し、まだ胚と接触しておらず、かつそれ故毒素を有さない培地を満たした次のウェルに入れることができるが、この培地を以下で「新しい培地」と呼ぶ。保温器は閉鎖されたままであるが、ディスプレイ上で作業を監視することを可能にする顕微鏡のおかげで、培養ウェルから次のものへの胚の移行は、正確に行われ得る。生物の進化を、望むだけ頻繁に追うことができるが、この検査に係る作業が生物に有害となることはない。
【０００９】
本発明によれば、顕微鏡は、生物の培養を観察し、かつ様々な操作（一方のウェルから他方のウェルへ生物を移動すること及びウェルを満たすこと）を監視するように保温器内部又は外部に取り付けられ、顕微鏡は、保温器外部に置かれるディスプレイに連結される。顕微鏡が保温器の内部又は外部に位置しようとも、両方の場合において、顕微鏡のステージは、保温器内部にある。顕微鏡が保温器内部にあるならば、保護ケーシングが、保温器内部の温度及びＮ２、Ｏ２及びＣＯ２濃度の条件において機能するために必要になり得る。本発明の枠内で好適には利用される顕微鏡は、顕微鏡での観察の際に、光の有害な効果から生物を保護するフィルタを有する。更に、本発明の対象であるインキュベータは、固定又は可動ステージを有する顕微鏡及び／又は固定又は可動軸を有する顕微鏡による応用例を許容する。
【００１０】
本発明の対象であるインキュベータは、ゾーンに分割され、少なくとも：
‐観察及び様々な胚の操作（培地を満たすこと及びウェル取替え）に当てられる「処置ゾーン」、
‐培養箱の貯蔵に当てられる「培養ゾーン」、
‐「処置ゾーン」と共通であっても良く、かつ消耗品（培地、錐状体）の貯蔵及び廃物の排出に当てられる追加ゾーンを含み得る。
【００１１】
異なる３つのゾーンは、同じレベルにあっても、又は異なるレベルにあっても良い。
【００１２】
本発明の対象であるインキュベータは、幾つかのウェルを有する培養箱の保温器内に、保温器外部から制御する、ステップバイステップ移動手段を含む。培養箱のあらゆるステップバイステップ移動手段は、本発明の枠内で利用可能である。好適には、利用される移動手段は：
‐制御線を介してコンピュータによって制御されるステップバイステップモータによってそれ自体が回転駆動される、駆動ローラによって駆動されるエンドレスコンベヤベルトか、
‐処理する培養箱を採取し、かつそれを処置ゾーンに送ることが可能な、コンピュータによって制御され、線状又は回転移動を有し得る連接操作アームからなる。
【００１３】
培地の保温器の全てのウェルを予め満たすことを計画することができる。しかしまさに胚がウェル内に置かれる前に、培地が蒸発するか、汚染されることを防ぐために、インキュベータが、ウェルの上に通じる弁を有する導管と連通する培地源、及び規定量の培地をウェル内に注ぐように、弁制御手段を含むことが好まれる。培地源は、インキュベータ外部にあっても良く、又はインキュベータ内、例えば消耗品貯蔵に当てられたゾーン内に備えられても良い。問題のウェルが胚を受ける直前に、ウェルを培地で満たす。好ましくは、導管が、前記場所にあるウェルの上に通じ、このことがそこでも顕微鏡を用いた作業を監視することを可能にする。
【００１４】
同様に好ましい、もう一つの実施態様によれば、導管は、前記場所にあるウェルのすぐ上流のウェルの上に通じる。このようにして上流のこのウェルを満たすことを同時に行い、かつピペットを用いて胚を吸い込み、前記場所にあるウェルから胚を取り出すことができる。導管をウェルの上に届かせるためのより広い空間を同様に自由に使える。
【００１５】
本発明の対象であるインキュベータが、一方のウェルから他方のウェルへ培地を満たすために有用な弁の移動手段を含むことも同様に検討できる。
【００１６】
本発明の枠内で、培養箱のウェルを培地で満たすための他の手段が検討可能である。電動式でありかつ外部から制御する注入器であって、消耗品貯蔵に当てられたゾーン内にあるフラスコ内の培地を直接吸い込み、かつ注入器の動作を反転させてウェル内に配分する注入器の利用を検討することも同様にできる。配分する培地は同様に、例えば使い捨て錐状体のような外部から制御する採取システムによってフラスコ内に採取され、かつ次にウェル内に配分され得る。
【００１７】
好適には保温器は、細胞培養及びとりわけ胚培養の発育に理想的な温度及びＮ２、Ｏ２及びＣＯ２濃度の条件を示す。好適には、これら条件は、３７℃の温度、並びにＯ２５％、ＣＯ２５％及びＮ２９０％の大気である。好適には、本発明の対象であるインキュベータは、保温器内部の大気の自動調節及び監視を可能にするセンサを備える。これらのセンサにより、培養期間中にわたり、温度及びＮ２、Ｏ２及びＣＯ２濃度を検査することが可能である。保温器の条件での温度及びＮ２、Ｏ２及びＣＯ２濃度の変動を測定することに適したあらゆるセンサが、本発明の枠内で利用可能である。
【００１８】
本発明は、生物を密閉式保温器に入れ、培地を満たした培養ウェル内でインキュベートし、かつそれをｎ回、培地を取り替えることからなり、ｎは１より大きく、かつ５０より小さい整数である生物のインキュベーション方法であって、
ｉ）保温器内に置かれた箱の一連の（ｎ＋１）のウェルの１つの中に生物を入れ、他方で一連のｎの他のウェルは、あらゆる生物を有さないこと、
ｉｉ）新しい培地を満たした一連の次のウェル内に生物を入れるために、生物を、保温器から取り出すことなく、入っているウェルから移動させること、及び
ｉｉｉ）多くとも、使用できるウェルが残っているのと同じ回数だけ、移動を反復することからなることを特徴とする方法も同様に対象とする。
【００１９】
全ての作業は、顕微鏡の監視下で、インキュベータ内部で行われ、かつコンピュータによって自動的に制御され得る。
【００２０】
胚を取り出すために、顕微鏡が観察する場所にあるウェル内にピペットを入れ、生物を吸い込み、ピペットをウェルから取り出し、次のウェルを前記場所に来させ、ピペットをこの新しいウェル内に突っ込み、ウェル内でピペットから胚を放し、かつピペットをウェルから引き出す。胚の操作は、このように非常に配慮され、補助され、かつ更には自動化され、このことは事故及び外傷の危険を非常に減少させる。
【００２１】
応用例によれば、本発明の対象である方法は、指示薬を含み、かつ生物が入っている、一連の（ｎ＋１）の着色されたウェル中の１つのウェル内に含まれる培地の色変化を顕微鏡で観察し、かつこの色変化の際にウェルの生物を取り替えることからなる。実際、好ましくはしばしば、又は連続して、特にｐＨの、着色した指示薬、例えばフェノールレッドを加えた培地の色変化が顕微鏡で観察される。このようにしてウェルを取り替えるべきである正確な瞬間を知らされる。色変化を監視するために、光学濃度計を保温器内に、かつ濃度計によって供給される信号を保温器外部に向ける手段、特に警報による音響手段を備えることもできる。
【００２２】
胚培養に適したこの装置内に、卵胞液内での卵母細胞研究、配偶子の調製、卵母細胞の状態検査（decoronisation）、微量注入、補助孵化、及び卵母細胞成熟等のような培地取替え以外の操作も備えることができる。
【００２３】
本発明のその他の利点及び特徴は、図面を参照した本発明の特殊な実施態様に関する以下の実施例から現れるであろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２４】
図１に表した本発明によるインキュベータの略断面図は、インキュベータが密閉して閉鎖し得るドア２を備える密閉式保温器１を含むことを示す。保温器１内部に、駆動ローラ４によって駆動され、かつ案内ローラ５上を通るエンドレスコンベヤベルト３が取り付けられる。駆動ローラ４は、保温器１外部にあるが、その内部にも同様に備えられ得、かつこの場合、線７によって駆動ローラ４に連結されるモータ６によって回転駆動される。ステップバイステップモータ６は、制御線９を介してコンピュータ８によって制御される。コンベヤ３の上部繊維上に、３つのウェル１１ａ、１１ｂ及び１１ｃを含む培養箱１０が置かれる。ウェル１１ａは、コンベヤの移動方向Ｆにおいてウェル１１ｂの上流にあり、他方、ウェル１１ｃは下流にある。箱１０は、時宜を得ないで移動することを妨げる扶壁１２によってコンベヤ３上に保持される。
【００２５】
図でウェル１１ｂがある場所の上に、この場所にあるウェル１１ｂを見ることを可能にするディスプレイ装置１５に、線１４によって連結される顕微鏡１３が固定して取り付けられる。この同じ場所に、線１７を介してコンピュータ８によって制御されるピペット１６が同様に達する。コンピュータ８は、ピペットを制御すること、及び特に前記場所にあるウェル内に、この場合、図ではウェル１１ｂ内にピペットを降ろすこと、又は取り出すことを可能にし、かつウェル１１ｂの中味の一部を吸い込むか、又はこの場所にあるウェル内にピペットから一部を放すことを可能にするレバ１９に、線１８によって連結される。
【００２６】
保温器２内部に備えられるコンソール２０上に、弁２３を備えた導管２２によってウェル１１ａの上に、又は同様に図に表す応用例によれば、ウェル１１ｂの上に通じる、培地のびん２１が担持される。但し、これらの応用例の一方を利用するが、同時に両方を利用しないことが理解される。
【００２７】
閾値のベルを有する光学濃度計２４は、ウェル１１ｂの培地の光学濃度を辿ることを可能にする。
【００２８】
胚を培養するために、保温器１のドア２を開放し、かつ保温器１内の、培地で満たした胚をウェル１１ｃ内に入れ、他方ウェル１１ａ及び１１ｂは空である。但し、それらはすでに培地で満たされても良いことが理解される。従って、一連の３つのウェル１１ａ、１１ｂ及び１１ｃがあり、その内１つのみが胚を含む。ドア２を閉鎖する。ドアは、培養が終了するまでもはや開放しない。その場合、顕微鏡１３の下にあるウェル１１ｃ内で胚を成長させ、この顕微鏡、及び場合により濃度計２４により、そこで起きることを観察すること、及び必要な場合、培地を取り替えるべき最良の瞬間を決定することが可能である。一定の期間後に、培地を取り替えることを決定することも同様にできる。培地を取り替えることを決定する時、ウェル１１ｃ内にピペット１６を下げ、ピペット１６内にウェル１１ｃの胚を、吸い込みによって通し、ウェル１１ｃからピペット１６を引き出し、かつ前にウェル１１ｃがあった場所に、顕微鏡１３に相対してウェル１１ｂを今度は導くためにコンベヤ３を１ピッチ進める。次に、図に表した位置を得るために、ウェル１１ｂ内にピペット１６を下げる。弁２３及び導管２２のびん２１を用いて培地でウェル１１ｂを満たす作業を前にすでに行ってなかったなら、この作業を行い、次にピペット１６を下げ、かつウェル１１ｂ内に胚を放し、これらの作業が正確に行われることを、ディスプレイ装置１５上で観察する。次にウェル１１ｂからピペット１６を引き出す。次にたった今示した作業を再度開始するが、ウェル１１ａは、ウェル１１ｂに代わり、かつウェル１１ｂは、ウェル１１ｃが前に果たした役割を果たす。
【００２９】
当然に、例えば反動回転車又はその他を用いて、顕微鏡１３の下にある場所にウェルを置くために、ウェル移動装置を修正することは可能である。また一連当り、より多数のウェルを有する幾つかの一連のウェル１１ａ、１１ｂ及び１１ｃ、及び各一連のウェルの固有の移動手段を備えることも同様に可能である。
【００３０】
図２及び３は、各々が幾つかの培養箱を含むことが可能な２つのタイプのインキュベータを示す。
【００３１】
図２のインキュベータは、処置ゾーン（Ａ１）、消耗品の貯蔵に当てられるゾーン（Ａ２）、及びインキュベーションゾーン（Ｂ）が同じレベルにあるインキュベータである。連接かつ電動式アームは、箱の貯蔵に当てられるインキュベーションゾーン（Ｂ）内に処理する箱を採取し、かつ処置ゾーンに向けて送る。この処置ゾーンで、胚のウェル取替え、及びウェルに培地を満たすことである、プロセスの様々な作業が展開される。この、本発明の実施の場合、処理する箱のみが操作される。更に、各箱は、インキュベーションゾーン内の位置（ｘ、ｙ）によって画定され、このことは、箱を論理的にかつ首尾一貫して整列させること、及び箱の間の、かつそれ故に培養の間の間違いを回避することを可能にする。
【００３２】
図３のインキュベータは、２段から構成されるシステムである。第１段（Ｅ１）に対して、箱が貯蔵され、従ってこの段は、インキュベーションゾーン（Ａ）に対応する。台は固定されている。気密室により４つの箱を同時に導入することが可能になる。第２段（Ｅ２）は、操作アームを経由して移る処置段である。顕微鏡の軸は、固定され、かつ観察する箱が置かれる顕微鏡のステージは、ｘ及びｙで移動し、顕微鏡は、焦点合わせのためにｚで移動する。台の中央（Ｃ）で、消耗品が貯蔵され、かつ培地及び錐状体の採取作業、及びそれらの排出が行われる。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】本発明によるインキュベータの略断面図を表す。
【図２】本発明の対象の、あるタイプのインキュベータを表す。
【図３】本発明の対象の、もう１つのタイプのインキュベータを表す。
【符号の説明】
【００３４】
１  保温器
２  ドア
３  エンドレスコンベヤベルト
４  駆動ローラ
６  モータ
８  コンピュータ
９  制御線
１０  培養箱
１１ａ、１１ｂ、１１ｃ  ウェル
１３  顕微鏡
１５  ディスプレイ装置
１６  ピペット
２２  導管
２３  弁
Ａ１  処置ゾーン
【図１】
2004528020.tif 000003
【図２】
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【図３】
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【国際公開パンフレット】
2004528020.tif 000006
2004528020.tif 000007
2004528020.tif 000008
2004528020.tif 000009
2004528020.tif 000010
2004528020.tif 000011
2004528020.tif 000012
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2004528020.tif 000014
2004528020.tif 000015
2004528020.tif 000016
2004528020.tif 000017
2004528020.tif 000018
2004528020.tif 000019
2004528020.tif 000020
2004528020.tif 000021
2004528020.tif 000022
2004528020.tif 000023
2004528020.tif 000024
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004528020.tif 000025
2004528020.tif 000026
【国際調査報告】
2004528020.tif 000027
2004528020.tif 000028
2004528020.tif 000029
2004528020.tif 000030
2004528020.tif 000031
2004528020.tif 000032
2004528020.tif 000033
2004528020.tif 000034