(57)【要約】本発明は、高骨量遺伝子および対応する野生型遺伝子、およびその突然変異体を単離し指令するために用いる方法および材料に関する。また、本発明は、高骨量遺伝子および対応する野生型遺伝子、およびその突然変異体に関する。本発明で同定される遺伝子は、骨発生および病巣接着シグナリング配列に関係している。また、本発明は、コーディング配列、オリゴヌクレオチドプライマー、オリゴヌクレオチドプローブを含む核酸、タンパク質、クローニングベクター、発現ベクター、形質転換された宿主、医薬組成物を開発する方法、骨発生に関与する分子の同定方法、および骨発生に関与する病気の診断および治療方法を提供する。好ましい実施形態において、本発明は、骨粗鬆症を治療、診断および予防する方法に指向される。
2004515209.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２の単離核酸配列。
【請求項２】
核酸配列がＤＮＡである請求項１の単離核酸配列。
【請求項３】
配列番号４の単離アミノ酸配列。
【請求項４】
配列番号４のアミノ酸配列をコードする核酸配列。
【請求項５】
請求項１の核酸配列および単離された宿主細胞で作動できるレプリコンを含む複製クローニングベクター。
【請求項６】
請求項５の複製クローニングベクターにより形質転換された単離された宿主細胞。
【請求項７】
転写調節領域に作動可能に連結した請求項１の核酸配列を含む発現ベクター。
【請求項８】
請求項７の発現ベクターにより形質転換された単離された宿主細胞。
【請求項９】
請求項１の核酸を宿主に投与するステップと、骨調節が起こるか否かを評価するステップとを含む、宿主細胞において骨調節用の治療剤としての物質をテストする方法。
【請求項１０】
宿主が細胞または動物である請求項９の方法。
【請求項１１】
動物がヒト、ゲッ歯類または鳥類である請求項１０の方法。
【請求項１２】
ＨＢＭに結合する、または分子のＨＢＭへの結合を阻害する分子を同定することを含む、骨調節に関与する分子を同定する方法。
【請求項１３】
該分子がタンパク質である請求項１２の方法。
【請求項１４】
Ｚｍａｘ１遺伝子を含む第１の宿主において、ＨＢＭ遺伝子を含む第２の宿主と比較した場合に、異なる発現レベルを有するタンパク質を同定することを含む、骨調節に関与するタンパク質を同定する方法。
【請求項１５】
宿主が細胞または動物である請求項１４の方法。
【請求項１６】
高骨量表現型を有する第１の個体においてタンパク質を同定するステップと、
高骨量表現型を有しない第２の個体においてタンパク質を同定するステップと、
第１の個体のタンパク質を第２の個体のタンパク質と比較するステップと
を含み、ここで、（ｉ）第１の個体に存在するが第２の個体に存在しないタンパク質が候補タンパク質であるか、あるいは、（ｉｉ）第２の個体におけるよりも第１の個体においてより多い量で存在するタンパク質は候補タンパク質であるか、あるいは（ｉｉｉ）第２の個体におけるよりも第１の個体においてより少量で存在するタンパク質は候補タンパク質であることを特徴とする、骨調節に関与する候補タンパク質を同定する方法。
【請求項１７】
候補タンパク質に対する抗体を生産するステップをさらに含む請求項１６の方法。
【請求項１８】
高骨量表現型を有する第１の個体においてタンパク質を同定するステップと、
高骨量表現型を有しない第２の個体においてタンパク質を同定するステップと、
第１の個体のタンパク質を第２の個体のタンパク質と比較するステップと
を含み、ここで、（ｉ）第２の個体には存在するが第１の個体には存在しないタンパク質は候補タンパク質であるか、あるいは（ｉｉ）第１の個体におけるよりも第２の個体においてより多い量で存在するタンパク質は候補タンパク質であるか、あるいは（ｉｉｉ）第１の個体におけるよりも第２の個体においてより少量で存在するタンパク質は候補タンパク質であることを特徴とする、骨調節に関与する候補タンパク質を同定する方法。
【請求項１９】
候補タンパク質に対する抗体を生産するステップをさらに含む請求項１８の方法。
【請求項２０】
ＨＢＭタンパク質を固定化するステップと、タンパク質をＨＢＭタンパク質に結合させるステップと、結合の程度を測定するステップとを含む、ＨＢＭ活性につきテストする方法。
【請求項２１】
タンパク質がＡｐｏＥである請求項２０の方法。
【請求項２２】
配列番号１の核酸配列に結合するか、または配列番号１の核酸配列への分子の結合を阻害する分子を同定するステップと、
配列番号２の核酸配列に結合するか、または分子の配列番号２の核酸配列への結合を阻害する分子を同定するステップと、
各核酸配列への分子の結合の程度、または各核酸配列への分子の結合の阻害の程度を比較するステップと
を含み、ここで、多かれ少なかれ配列番号２の核酸配列若しくは配列番号１の核酸配列に結合する分子、または配列番号２の核酸配列若しくは配列番号１の核酸配列への結合を阻害する分子が候補分子であることを特徴とする、骨調節に関与する候補分子の同定方法。
【請求項２３】
候補分子がタンパク質またはｍＲＮＡである請求項２２の方法。
【請求項２４】
配列番号４のアミノ酸配列に結合する分子を同定することを含む、骨発生障害の治療用医薬を開発する方法。
【請求項２５】
分子がアミノ酸の機能を阻害または増強する請求項２４の方法。
【請求項２６】
Ｚｍａｘ１遺伝子またはＺｍａｘ１タンパク質を含有する第１の宿主を構築するステップと、
ＨＢＭ遺伝子またはＨＢＭタンパク質を含有する第２の宿主を構築するステップと、
第１の宿主および第２の宿主の間の差を分析するステップと、
第１の宿主に添加した場合に、第１の宿主が第２の宿主の特徴を示す分子を同定するステップと
を含む、骨発生障害の治療用医薬を開発する方法。
【請求項２７】
宿主が無細胞抽出物、細胞または動物である請求項２６の方法。
【請求項２８】
差がサロゲートマーカーである請求項２６の方法。
【請求項２９】
請求項１の核酸配列を、骨発生障害に罹った動物の体細胞に導入することを含む動物において骨発生障害を治療する方法。
【請求項３０】
動物がヒトまたは鳥類である請求項２９の方法。
【請求項３１】
請求項１の核酸配列を、骨発生障害に罹った動物の生殖細胞系列に導入することを含む動物において骨発生障害を治療する方法。
【請求項３２】
動物がヒトまたは鳥類である請求項３１の方法。
【請求項３３】
請求項３のアミノ酸配列を、骨発生障害に罹った宿主の体細胞に投与することを含む宿主において骨発生を改変する方法。
【請求項３４】
宿主がヒトまたは鳥類である請求項３３の方法。
【請求項３５】
請求項３のアミノ酸配列を、骨発生障害に罹った宿主において生殖細胞系列に投与することを含む宿主において骨発生を改変する方法。
【請求項３６】
動物がヒトまたは鳥類である請求項３５の方法。
【請求項３７】
請求項３のアミノ酸配列を骨粗鬆症の治療が必要な患者に投与することを含む骨粗鬆症を治療する方法。
【請求項３８】
患者がヒトまたは鳥類である請求項３７の方法。
【請求項３９】
請求項３のアミノ酸配列の細胞外ドメインを骨粗鬆症の治療が必要な患者に投与することを含む骨粗鬆症を治療する方法。
【請求項４０】
患者がヒトまたは鳥類である請求項３９の方法。
【請求項４１】
請求項３のアミノ酸配列の細胞内ドメインを骨粗鬆症の治療が必要な患者に投与することを含む骨粗鬆症を治療する方法。
【請求項４２】
患者がヒトまたは鳥類である請求項４１の方法。
【請求項４３】
請求項１の核酸配列に結合する分子を骨粗鬆症の治療が必要な患者に投与することを含む骨発生障害を治療する方法。
【請求項４４】
患者がヒトまたは鳥類である請求項４３の方法。
【請求項４５】
請求項３のアミノ酸配列に対する抗体を、骨粗鬆症の治療が必要な患者に投与することを含む骨発生障害を治療する方法。
【請求項４６】
患者からの試料を、ＨＢＭのゲノムまたはｃＤＮＡ核酸配列に由来するヌクレオチド配列によりスクリーニングすることを含む骨発生障害に対する遺伝的素因について診断的にスクリーニングする方法。
【請求項４７】
ＨＢＭタンパク質に対する抗体を含むことを特徴とする骨発生障害についての診断アッセイ。
【請求項４８】
請求項１の核酸配列を用いてハプロタイプ分析を行うことを含む骨発生障害に対する遺伝的素因を同定するための方法。
【請求項４９】
請求項１の核酸配列に作動可能に連結した、骨組織において発現を指令するプロモーターを含む発現ベクターを構築することを含む、骨組織においてＨＢＭタンパク質を発現させる方法。
【請求項５０】
骨における発現を指令するプロモーターがオステオカルシンプロモーター、骨シアロタンパク質プロモーターまたはＡＭＬ−３プロモーターである請求項４９の方法。
【請求項５１】
配列番号５、６、７、８、９、１０または１１の核酸配列を有する細菌人工染色体。
【請求項５２】
請求項５１の細菌人工染色体を用いることを含むＺｍａｘ１遺伝子においてヌクレオチド多型を増幅する方法。
【請求項５３】
請求項５１の細菌人工染色体を用いることを含むＨＢＭ遺伝子においてヌクレオチド多型を増幅する方法。
【請求項５４】
請求項１または請求項５１の細菌人工染色体を用いることを含むＨＢＭ遺伝子の調節エレメントを同定する方法。
【請求項５５】
配列番号２の核酸配列の少なくとも１５個の連続したヌクレオチドを含み、ここで、該少なくとも１５個の連続したヌクレオチドの１つが位置５８２におけるチミンであることを特徴とする単離核酸配列。
【請求項５６】
ＤＮＡである請求項５５の単離核酸配列。
【請求項５７】
ＲＮＡである請求項５５の単離核酸配列。
【請求項５８】
請求項５５の核酸配列および宿主細胞において作動可能なレプリコンを含む複製クローニングベクター。
【請求項５９】
請求項５８の複製クローニングベクターにより形質転換された単離された宿主細胞。
【請求項６０】
転写調節領域に作動可能に連結した請求項５５の核酸配列を含む発現ベクター。
【請求項６１】
請求項６０の発現ベクターにより形質転換された単離された宿主細胞。
【請求項６２】
配列番号２の核酸配列の少なくとも１５個の連続したヌクレオチドを含み、ここに、該少なくとも１５連続ヌクレオチドの１つが位置５８２におけるチミンであり、かつ配列番号４の位置１７１におけるバリンに対応するバリンを含むアミノ酸配列をコードすることを特徴とする単離核酸配列。
【請求項６３】
ＤＮＡである請求項６２の核酸配列。
【請求項６４】
位置５８２におけるＧがＴによって置換された配列番号２の核酸配列からの多型部位を含む少なくとも１５個の連続したヌクレオチドの単離核酸セグメント、およびその相補配列。
【請求項６５】
該相補配列が逆相補体である請求項６４の単離核酸セグメント。
【請求項６６】
該逆相補的配列がｍＲＮＡである請求項６５の単離核酸セグメント。
【請求項６７】
ＤＮＡである請求項６４の単離核酸セグメント。
【請求項６８】
ｃＤＮＡである請求項６４の単離核酸セグメント。
【請求項６９】
ＲＮＡである請求項６５の単離核酸セグメント。
【請求項７０】
ヌクレオチド６９１６９がＡによって置換された配列番号９、
ヌクレオチド２７４０２がＧによって置換された配列番号９、
ヌクレオチド２７８４１がＣによって置換された配列番号９、
ヌクレオチド３５６００がＧによって置換された配列番号９、
ヌクレオチド４５６１９がＡによって置換された配列番号９、
ヌクレオチド４６０１８がＧによって置換された配列番号９、
ヌクレオチド４６０９３がＧによって置換された配列番号９、
ヌクレオチド４６１９０がＧによって置換された配列番号９、
ヌクレオチド５０９９３がＣによって置換された配列番号９、
ヌクレオチド５１１２４がＴによって置換された配列番号９、
ヌクレオチド５５４６１がＴによって置換された配列番号９、
ヌクレオチド６３６４５がＡによって置換された配列番号９、
ヌクレオチド６３６４６がＣによって置換された配列番号９、
ヌクレオチド２４８０９がＧによって置換された配列番号９、
ヌクレオチド２７８３７がＣによって置換された配列番号９、
ヌクレオチド３１４８５がＴによって置換された配列番号９、
ヌクレオチド３１６８３がＧによって置換された配列番号９、
ヌクレオチド２４８０８がＧによって置換された配列番号９、
ヌクレオチド３１３４０がＣによって置換された配列番号８、
ヌクレオチド３２５３８がＧによって置換された配列番号８、
ヌクレオチド１３２２４がＧによって置換された配列番号８、
ヌクレオチド２１１１９がＡによって置換された配列番号８、
ヌクレオチド３０４９７がＡによって置換された配列番号８、
ヌクレオチド２４８１１がＣによって置換された配列番号９、
ヌクレオチド６８２８０がＡによって置換された配列番号９および
その相補配列
よりなる群から選択されるエクソン配列からの単一ヌクレオチド多型部位を含む少なくとも１５個の連続したヌクレオチドの単離核酸セグメント。
【請求項７１】
配列番号８の該エクソン配列のヌクレオチド２１１１９がＡによって置換された請求項７０の単離核酸セグメント。
【請求項７２】
ＤＮＡである請求項７０の単離核酸セグメント。
【請求項７３】
ＲＮＡである請求項７０の単離核酸セグメント。
【請求項７４】
プローブまたはプライマーである請求項６４または請求項７０の単離核酸セグメント。
【請求項７５】
病巣接着シグナリングに関与するタンパク質に結合する分子、または病巣接着シグナリングに関与するタンパク質への分子の結合を阻害する分子を同定することを含む骨調節に関与する分子を同定する方法。
【請求項７６】
病巣接着シグナリングに関与する分子が、配列番号８７〜１０９よりなる群から選択されるタンパク質に結合する請求項７５の方法。
【請求項７７】
病巣接着シグナリングに関与する分子が、配列番号９０、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９９および配列番号１０２よりなる群から選択されるタンパク質に結合する請求項７５の方法。
【請求項７８】
病巣接着シグナリングに関与する核酸またはその核酸によりコードされるポリペプチドを調節する薬剤を投与することによって被検対象において骨密度を調節する方法。
【請求項７９】
核酸が、配列番号６３〜８６よりなる群から選択される核酸を含む請求項７８の方法。
【請求項８０】
核酸が配列番号６６、配列番号７１、配列番号７７または配列番号７９を含む請求項７８の方法。
【請求項８１】
ポリペプチドが配列番号８７〜１０９よりなる群から選択される請求項７８の方法。
【請求項８２】
ポリペプチドが配列番号９０、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９９または配列番号１０２である請求項７８の方法。
【請求項８３】
配列番号６６、配列番号７１、配列番号７７または配列番号７９を含む核酸。
【請求項８４】
核酸がＲＮＡまたはＤＮＡである請求項８３の核酸。
【請求項８５】
請求項８３の核酸および宿主細胞で作動可能なレプリコンを含む、複製クローニングベクター。
【請求項８６】
請求項８５の複製クローニングベクターにより形質転換された単離された宿主細胞。
【請求項８７】
請求項８３の核酸配列を含む、発現ベクター。
【請求項８８】
請求項８７の発現ベクターにより形質転換された単離された宿主細胞。
【請求項８９】
配列番号９０、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９９または配列番号１０２を含むポリペプチド。
【請求項９０】
配列番号９０、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９９または配列番号１０２よりなる群から選択されるポリペプチドをコードする核酸。
【請求項９１】
病巣接着シグナリングに関与する核酸またはポリペプチドを調節する薬剤を投与するステップを含む、骨発生障害を治療する方法。
【請求項９２】
該薬剤によって調節された核酸が配列番号６３〜８６のいずれか１つから選択される請求項９１の方法。
【請求項９３】
該薬剤によって調節されるポリペプチドが配列番号８７〜１０９のいずれか１つから選択される請求項９１の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
［発明の分野］
本発明は、一般に、遺伝学、ゲノミクスおよび分子生物学の分野に関する。さらに詳しくは、本発明は、高骨量遺伝子および対応する野生型遺伝子、およびその突然変異体を単離し、検出しおよび配列決定するのに用いられる方法および材料に関する。また、本発明は、高骨量遺伝子、対応する野生型遺伝子、およびその突然変異体に関する。本発明で同定された遺伝子は、骨発生の存在学および生理学に関連付けられる。また、本発明は、核酸、タンパク質、クローニングベクター、発現ベクター、形質転換された宿主、医薬組成物を開発する方法、骨発生に関与する分子を同定する方法、および骨発生に関与する病気を診断し治療する方法を提供する。好ましい実施形態において、本発明は、骨粗鬆症のごとき代謝的骨疾患を含む、骨の正常および異常状態につき治療し、診断し、予防しおよびスクリーニングする方法に指向される。
【０００２】
［発明の背景］
骨粗鬆症の最も普通のタイプのうち２つは、閉経後および老人性骨粗鬆症である。骨粗鬆症は男性ならびに女性を襲い、骨の他の異常と一緒になって、成熟集団に対して常に増大する健康上の危険性を呈する。骨粗鬆症の最も普通のタイプは閉経に関係するものである。ほとんどの婦人は、月経の停止後３〜６年以内に骨の小柱区画において２０から６０％の骨量を失う。この迅速な喪失は、一般に、骨吸収および形成の増加に関連する。しかしながら、吸収サイクルは、より支配的であり、その結果、骨量の正味の喪失をもたらす。骨粗鬆症は閉経後婦人の間での共通かつ深刻な病気である。この病気に罹った米国単独における婦人は２５００万人と見積もられる。骨粗鬆症の結果は、個人的には害があって、また、その慢性性および病気後遺症からの広く長いサポート（入院および看護ホームケア）の必要性のため多大な経済的喪失を占める。これは特により老齢の患者に該当する。加えて、骨粗鬆症は一般には生命を脅かす状態とは考えられないが、２０ないし３０％の死亡率は老齢婦人における臀部骨折に関係する。この死亡率の大きな割合は閉経後の骨粗鬆症に直接関係し得る。
【０００３】
閉経後骨粗鬆症の効果に対する骨における最も傷を受けやすい組織は骨梁骨である。この組織は、しばしば、海綿骨と呼ばれ、関節近傍および脊椎の椎骨における骨の端部近くに特に集中している。小柱組織は、相互に結合する小さな構造ならびに骨の外表面および中心軸を形成するより中実かつ密な皮質組織によって特徴付けられる。小柱の十字形ネットワークは外側皮質構造に横方向の支持を与え、全体構造のバイオメカニカル強度に対して臨界的である。閉経後骨粗鬆症においては、骨の不全および骨折に導くのは主として小柱の正味の吸収および喪失である。閉経後婦人における小柱の喪失に徴すれば、最も普通の骨折が、小柱支持体、例えば、椎骨、大腿の首部、および前腕に大いに依存する骨に関連するのは驚くべきことではない。事実、臀部骨折、コリーズ骨折、および椎骨圧挫骨折は閉経後骨粗鬆症を示す。
【０００４】
閉経後骨粗鬆症の治療のための初期に一般的に認められた方法のうちの１つはエストロゲン置換療法であった。この療法はしばしば成功したが、主として、慢性エストロゲン治療の望ましくない副作用のため患者の応諾は低い。エストロゲン置換療法のしばしば引用された副作用は、月経の再開始、乳癌および子宮癌鼓脹、抑制および懸念を含む。子宮摘出を受けていない婦人において子宮癌の知られた脅威を制限するためには、エストロゲンおよびプロゲスチンサイクル療法のプロトコルがしばしば使用される。このプロトコルは、出産制御方法で用いられるものに類似であって、しばしば、プロゲスチンに特徴的な副作用のため婦人には許容されていない。より最近では、乳癌の治療のために元来は開発された抗エストロゲン剤が閉経後骨粗鬆症の実験モデルで効果的であることが示されている。これらの薬剤の中にはラロキシフェンである（米国特許第５，３９３，７６３号、およびＢｌａｃｋら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，９３：６３−６９（１９９４）参照）。加えて、乳癌の治療で広く用いられる臨床剤であるタモキシフェンは、乳癌に罹った閉経後婦人において骨ミネラル密度を増加させることが示されている（Ｌｏｖｅら、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．，３２６：８５２−８５６（１９９２））。
【０００５】
閉経後骨粗鬆症の治療のためのもう１つの療法は、カルシトニンの使用である。カルシトニンは骨吸収を阻害する天然に生じるペプチドであって、多くの国においてこの用途で認可されている（Ｏｖｅｒｇａａｒｄら、Ｂｒ．Ｍｅｄ．Ｊ．，３０５：５５６−５６１（１９９２））。しかしながら、カルシトニンの使用は幾分制限されている。その効果は骨ミネラル密度を増加させるにおいて正に中程度であって、治療は非常に低価格である。閉経後骨粗鬆症のための治療のためのもう１つの療法はビス−ホスホネートの使用である。これらの化合物は、元来、パジェット病および悪性高カルシウム血症で用いるために開発された。それらは骨吸収を阻害することが示されている。このクラスの１つの化合物であるアレンドロネートは閉経後骨粗鬆症の治療で認可されている。これらの薬剤は骨粗鬆症の治療において助けとなり得るが、これらの薬剤もまた骨軟化症を含む潜在的傾向、骨における極端に長い半減期（２年超）、および可能な「凍結骨症候群」、例えば、正常骨再形成の停止を有する。
【０００６】
老人性骨粗鬆症は、それが骨ミネラル密度の喪失および骨折率、罹患率および関連死亡率の結果としての増大によって特徴付けられる点で、閉経後骨粗鬆症に似ている。一般に、それは人生後半、すなわち、７０歳以降で起こる。歴史的には、老人性骨粗鬆症は女性でより普通であるが、より老人の男性集団の出現に伴い、この病気は両性の健康における主要な因子となりつつある。テストステロンまたはエストロゲンのごときホルモンがこの病気でもしあればどのような役割を有するかは明らかではなく、その病因は曖昧なままである。この病気の治療は非常に満足なものではなかった。ホルモン療法、婦人におけるエストロゲンおよび男性におけるテストステロンは曖昧な結果を示しており、カルシトニンおよびビス−ホスホネートは幾分有用であろう。
【０００７】
成熟期における骨格のピーク質量は大いに遺伝的制御の下にある。双子の研究は、成人一卵性双子の間の骨量のバラツキは二卵性双子の間よりも小さいことを示しており（Ｓｌｅｍｅｎｄａら、Ｊ．Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎｅｒ．Ｒｅｓ．，６：５６１−５６７（１９９１）；Ｙｏｕｎｇら、Ｊ．Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎｅｒ．Ｒｅｓ．，６：５６１−５６７（１９９５）；Ｐｏｃｏｃｋら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，８０：７０６−７１０（１９８７）；Ｋｅｌｌｙら、Ｊ．Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎｅｒ．Ｒｅｓ．，８：１１−１７（１９９３））、骨格量のバラツキの６０％以上までが遺伝すると見積もられている（Ｋｒａｌｌら、Ｊ．Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎｅｒ．Ｒｅｓ．，１０：Ｓ３６７（１９９３））。成人および人生後半における年齢関連骨喪失の速度もまた強力な決定因子であるが（Ｈｕｉら、Ｏｓｔｅｏｐｏｒｏｓｉｓ  Ｉｎｔ．，１：３０−３４（１９９５））、ピーク骨格量は高齢における骨量の最も強力な決定因子である（Ｈｕｉら、Ａｎｎ．Ｉｎｔ．Ｍｅｄ．，１１１：３５５−３６１（１９８９））。骨量は骨折危険性についての主な測定可能な決定因子であるので、成熟期に達成された遺伝的なピーク骨格質量は、人生の後半における骨折の個人の危険性の重要な決定因子である。従って、骨量の遺伝的ベースは、骨粗鬆症による骨折の病因においてかなり興味深い。
【０００８】
最近、ピーク骨量の遺伝的制御における強い興味は骨粗鬆症の分野で発展してきた。この興味は、正常範囲内の骨量のバラツキとの関連性につきテストするための適当な多型を持つ候補遺伝子に主として焦点を当てており、あるいは骨粗鬆症を持つ患者で見出される範囲における低い骨量と関連する遺伝子および遺伝子座の調査に焦点を当ててきた。ビタミンＤ受容体座（ＶＤＲ）（Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ，３６７：２８４−２８７（１９９４））、ＰＴＨ遺伝子（Ｈｏｗａｒｄら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｍｅｔａｂ．，８０：２８００−２８０５（１９９５）；Ｊｏｈｎｓｏｎら、Ｊ．Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎｅｒ．Ｒｅｓ．，８：１１−１７（１９９５）；Ｇｏｎｇら、Ｊ．Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎｅｒ．Ｒｅｓ．，１０：Ｓ４６２（１９９５））およびエストロゲン受容体遺伝子（Ｈｏｓｏｉら、Ｊ．Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎｅｒ．Ｒｅｓ．，１０：Ｓ１７０（１９９５）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ，３６７：２８４−２８７（１９９４））は、この研究で最も卓越して判断されている。これらの研究は困難である。なぜならば、骨量（表現型）は連続的、定量的、ポリジェニック傾向であって、栄養、共存病、年齢、身体的活動および他の因子のごとき環境因子によって混同するからである。また、このタイプの研究デザインは非常に多数の対象を必要とする。特に、現在までのＶＤＲ研究の結果は混乱しており、矛盾している（Ｇａｒｎｅｒｏら、Ｊ．Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎｅｒ．Ｒｅｓ．，１０：１２８３−１２８８（１９９５）；Ｅｉｓｍａｎら、Ｊ．Ｂｏｎｅ．Ｍｉｎｅｒ．Ｒｅｓ．，１０：１２８９−１２９３（１９９５）；Ｐｅａｃｏｃｋ，Ｊ．Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎｅｒ．Ｒｅｓ．，１０：１２９４−１２９７（１９９５））。さらにこの研究は、遺伝的影響が骨量に対してその効果を発揮し得るメカニズムに多くの光を当ててこなかった。
【０００９】
ピーク骨量は環境因子よりもむしろ遺伝学によって大いに決定されることが良く知られているが、骨量のバラツキに関連する遺伝子座（および結局は遺伝子）を決定する研究は、困難であって費用がかかる。連鎖分析の力、例えば、同胞対または拡大された家族を利用する研究デザインは、単一関連研究よりも一般に情報的であるが、後者は価値がある。しかしながら、骨量に関連する遺伝子連鎖研究は２つの主な問題によって妨げられる。最初の問題は前記にて簡単に議論した表現型である。骨量は連続的、定量的性質であって、区別される表現型を確立するのは困難である。測定のための各解剖学的部位は、そのうち多くが部位間で異なり得るいくつかの遺伝子によって影響され得る。第２の問題は表現型の年齢構成である。個体が低い骨量を有すると確認できる時までに、その親または先の世代の他のメンバーは故人となっており、従って、研究に利用できず、かつより若い世代はピーク骨量に達しておらず、遺伝的解析ではその表現型分けを不確かなものとする高い確率がある。
【００１０】
それにもかかわらず、連鎖分析を用いて、遺伝する「障害」を引き起こす遺伝子の位置を見出すことができ、障害の生化学的性質のいずれの知識も必要とせず、すなわち、障害を引き起こすと信じられる突然変異したタンパク質は知る必要がない。伝統的なアプローチは、評価されるべき候補としての公知タンパク質と関連付けるという病気プロセスに関する仮定に依存する。連鎖分析を用いる遺伝子位置決定アプローチを用いて、欠陥遺伝子が位置する一般的染色体領域を見出し、次いで、領域のサイズを徐々に減少させて、できる限り正確に特定された突然変異遺伝子の位置を決定することができる。遺伝子自体が候補領域内で発見された後、メッセンジャーＲＮＡおよびタンパク質を同定し、ＤＮＡと共に、突然変異についてチェックする。
【００１１】
遺伝子位置決定アプローチは現実的な関連を有する。というのは、病気を引き起こす変化した遺伝子が見出される前でさえ、病気の位置を出生前診断に用いることができる。連鎖分析は、家族、病気の子供を有しないものの多くでさえ、病気遺伝子のキャリアであるか否かを知ることを可能とし、分子診断を通じて未だ生まれてない子供の状態を評価するのを可能とすることができる。次いで、家族内の病気の伝播を用いて、欠陥遺伝子を見出すことができる。本明細書中で用いるごとく「高骨量」（ＨＢＭ）への言及は病気状態への言及と類似するが、現実的な見地からは、高骨量は現実には骨粗鬆症として知られた病気を対象が回避するのを助けることができる。
【００１２】
連鎖分析は、親から子孫への染色体の遺伝の性質のため可能である。減数分裂の間に、２つの親ホモログが対となって、娘細胞へのその適切な分離をガイドする。それらが一列となり、対を形成する間に、２つのホモログは、「交差」または「組換え」と呼ばれる事象において染色体片を交換する。得られた染色体はキメラであり、すなわち、それらは双方の親ホモログに由来する部分を含む。２つの配列が染色体上で一緒により近くなれば、組換え事象はそれらの間でより起こらず、より密接にそれらはリンクする。連鎖分析実験において、染色体上の２つの位置をある世代から次の世代まで追跡して、それらの間の組換えの頻度を決定する。遺伝した病気の研究において、染色体位置の１つは病気遺伝子またはその正常片割れによって特徴付けられ、すなわち、染色体領域の遺伝は、個体が病気の兆候を呈するか否かを調べることによって決定することができる。他の位置は、２つのホモログが保有する「マーカー」配列のコピーに基づいて２つのホモログを区別することができるような、集団における天然のバラツキを示すＤＮＡ配列によって特徴付けられる。各家族において、遺伝子マーカー配列の遺伝を病気状態の遺伝と比較する。もし、高骨量のごとき常染色体優勢障害を運ぶ家族内で、各罹患個体がマーカーの同一形態を運び且つすべての未罹患個体がマーカーの少なくとも１つの異なる形態を運ぶならば、病気遺伝子およびマーカーは相互に近く位置する大きな確率がある。このようにして、染色体は公知のマーカーで系統的にチェックし、病気状態と比較することができる。異なる家族から得られたデータを組み合わせて、統計学的方法を用いコンピューターによって一緒に分析する。結果は、遺伝子マーカーおよび病気の間の連鎖の確立を示す情報であり、それらの間の異なる位置を可能とする。ポジティブな結果は、病気がマーカーに非常に近いことを意味し得、他方、ネガティブな結果は、それがその染色体から離れているか、またはまったく異なる染色体上にあることを示す。
【００１３】
連鎖分析は、罹患した家族の全てのメンバーを与えられたマーカー遺伝子座においてタイプ分けし、マーカープローブで特定の病気状態の共遺伝を評価し、それにより、それらの２つがどの程度しばしば遺伝するかを決定することによって行うことができる。組換え頻度は、２つの遺伝子座の間の遺伝的距離の尺度として用いることができる。１％の組換え頻度は１マップ単位または１センチモルガン（ｃＭ）と等しく、これは、大まかにはＤＮＡの１，０００ｋｂに等しい。この関係は約２０％または２０ｃＭの頻度まで保持する。
【００１４】
全ヒトゲノムは３，３００ｃＭ長である。マーカー遺伝子座の５〜１０ｃＭ内で未知の病気遺伝子を見出すためには、ほぼ１０ｃＭ間隔を設けたほぼ３３０情報的マーカー遺伝子座にて、全ヒトゲノムをサーチすることができる（Ｂｏｓｔｅｉｎら、Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．，３２：３１４−３３１（１９８０））。連鎖結果の信頼性は、多数の統計学的方法を用いることによって確立される。ヒトにおける連鎖の分析で最も通常に用いられる方法は、Ｏｔｔ，Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．，２８：５２８−５２９（１９７６）によるコンピュータープログラムＬＩＰＥＤに一体化されたＬＯＤスコア方法（Ｍｏｒｔｏｎ，Ｐｒｏｇ．Ｃｌｉｎ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｓ．，１４７：２４５−２６５（１９８４），Ｍｏｒｔｏｎら、Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．，３８：８６８−８８３（１９８６））である。ＬＯＤスコアは、それらが連鎖しない（＜５０ｃＭ離れる）までの与えられた距離において２つの遺伝子座が連鎖する可能性の比率の対数である。対数値を用いる利点は、それが同一病気を持つ家族の間で合計できることである。これはヒト家族の比較的小さなサイズを仮定すると必要となる。
【００１５】
約束により、＋３．０よりも大きな合計ＬＯＤスコア（すなわち、特定の組換え頻度における連鎖のオッズが連鎖無しのオッズよりも１０００倍大きい）は、その特定の組換え頻度における連鎖に対する有意な証拠であると考えられる。−２．０未満の合計ＬＯＤスコア（すなわち、連鎖なしのオッズは特定頻度における連鎖のオッズよりも１００倍大きい）は、考慮する２つの遺伝子座がその特定の組換え頻度において連鎖しない強力な証拠であると考えられる。最近まで、ほとんどの連鎖分析は、考慮する障害および特定の遺伝子マーカーの間の関係である２点データに基づいて行われてきた。しかしながら、過去数年にわたるヒトゲノムをマッピングするにおける迅速な進歩、およびコンピューター方法における同時改良の結果、多点データを用いて連鎖分析を行うのが容易となった。多点分析は、マーカー間の組換え距離が知られている場合に、病気およびいくつかの連鎖した遺伝子マーカーの間の連鎖の同時分析を提供する。
【００１６】
多点分析は２つの理由で有利である。まず、家系の情報性は通常増加する。各家系は、マーカー遺伝子座に対してヘテロ接合性の数および家族における罹患個体の数に依存した、ある量の潜在的情報を有する。しかしながら、すべてのそれらの個体において情報的なほど十分に多型であるマーカーはほとんどない。もし複数マーカーを同時に考慮するならば、マーカーの少なくとも１つに対してヘテロ接合性である個体の確率は大いに増大する。第２に、マーカーの中で病気遺伝子の位置の表示を決定することができる。これはフランキングマーカーの同定を可能とし、従って、結局は、病気遺伝子が存在する小さな領域の単離を可能とする。Ｌａｔｈｒｏｐら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：３４４３−３４４６（１９８４））は、多点分析のために、最も広く用いられるコンピューターパッケージＬＩＮＫＡＧＥを記載している。
【００１７】
高骨量表現型と関連した遺伝子を同定する技術に対する要望がある。本発明はこの、ならびに他の重要な目的に指向される。
【００１８】
［発明の要約］
本発明は、遺伝子連鎖および突然変異分析によって染色体１１ｑ１３．３上のＺｍａｘ１遺伝子およびＨＢＭ遺伝子を記載する。該遺伝子に連鎖した更なる遺伝子マーカーの使用はこの発見を助けた。連鎖分析および突然変異分析を用いることによって、ＨＢＭに対する素因を持つ個人は容易に同定することができる。細菌人工染色体を用いるクローニング方法は、本発明者らが、１１ｑ１３．３の染色体領域に焦点を当て、常染色体優性遺伝子の配列決定を加速することを可能とした。加えて、本発明はＺｍａｘ１遺伝子およびＨＢＭ遺伝子を同定し、ＨＢＭ遺伝子およびＨＢＭ表現型を生じるＺｍａｘ１遺伝子中の位置５８２におけるグアニンからチミンへの多型突然変異を同定する。
【００１９】
本発明はＺｍａｘ１遺伝子およびＨＢＭ遺伝子を同定し、これを用いて、人々がＨＢＭに対して素因があり、従って、例えば、骨粗鬆症を含む低下した骨密度によって特徴付けられる病気に罹患していない、または例えば骨粗鬆症のごとき異常に高い骨密度によって特徴付けられる病気に対して素因があり、それに罹患しているかを決定することができる。ＨＢＭ遺伝子を運ぶより古い個体ＨＢＭタンパク質を発現し、従って骨粗鬆症は発症しない。換言すれば、ＨＢＭ遺伝子は骨粗鬆症のサプレッサーである。このインビボ観察は、ＨＢＭ遺伝子またはタンパク質、またはその断片での正常個体の治療が骨粗鬆症を軽減する強い証拠である。
【００２０】
さらに、そのような治療は、そのような病巣の治癒における骨再形成のための、骨病巣、特に骨折の治療で示されるであろう。例えば、応力骨折（すなわち、結局は骨皮質を通じる真実の骨折の結果となる、応力―誘導微小骨折の蓄積）の素因がある、またはそれに罹患した人を本発明の手段によって同定しおよび／または治療することができる。さらに、本発明の方法および組成物は、コルチコステロイド投与を伴う内分泌疾患、甲状腺機能亢進症、生殖機能不全、血液学的悪性疾患、吸収不良およびアルコール中毒症のごとき、治療のコースが骨再形成を含む二次的骨粗鬆症、並びに骨軟化症およびくる病のごときビタミンＤおよび／またはリン酸代謝に関連する障害、およびパジェット病のごとき異常または故障した骨再形成によって特徴付けられる病気において、および良性または悪性であり得る骨の新形成で用いられるであろう。
【００２１】
種々の実施形態において、本発明は核酸、タンパク質、ベクター、およびＨＢＭおよびＺｍａｚ１の形質転換された宿主に指向される。
【００２２】
加えて、本発明は、例えば、骨発生障害のための、遺伝子治療、医薬開発および診断アッセイを含む本発明の前記実施形態の適用に指向される。好ましい実施形態において、本発明は、骨粗鬆症について治療、診断、予防およびスクリーニングする方法に試行される。
【００２３】
本発明のこれらおよび他の態様を以下により詳細に記載する。
【００２４】
［発明の詳細な記載］
明細書および特許請求の範囲の理解を助けるために、以下の定義を掲げる。
【００２５】
「遺伝子」とは、特定のペプチドに特徴的なアミノ酸の配列をその鋳型またはメッセンジャーＲＮＡを通じてコードするＤＮＡ配列をいう。用語「遺伝子」は介在、非コーディング領域、ならびに調節領域を含み、５’および３’末端を含むことができる。
【００２６】
「遺伝子配列」とは、非転写または非翻訳を含む双方のＤＮＡ分子を含むＤＮＡ分子をいう。この用語は、また、同一ＤＮＡ分子上に存在する単一の遺伝子又は複数の遺伝子、単一の遺伝子断片又は複数の遺伝子断片、単一の非転写配列または複数の非転写配列、または単一の非翻訳配列または複数の非翻訳配列のいずれの組合せも含む意図である。
【００２７】
本発明の配列は、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡ、合成ＲＮＡまたはその組合せを含む種々の源に由来することができる。そのような配列は、天然に生じるイントロンを含んでも含まなくても良いゲノムＤＮＡを含むことができる。さらに、そのようなゲノムＤＮＡはプロモーター領域またはポリ（Ａ）配列に関して得ることができる。該配列、ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡはいくつかの方法のいずれでも得ることができる。ゲノムＤＮＡは当該分野でよく知られた手段によって適当な細胞から抽出し、精製することができる。別法としてｍＲＡＮは細胞から単離することができ、それを用いて、逆転写または他の手段によってｃＤＮＡを生じさせることができる。
【００２８】
「ｃＤＮＡ」とは、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ（逆転写酵素）の作用によってＲＮＡ鋳型から生じさせた相補的またはコピーＤＮＡをいう。従って、「ｃＤＮＡクローン」は、クローニングベクターに運ばれた、またはＰＣＲ増幅された注目するＲＮＡ分子に相補的な二重鎖のＤＮＡ配列を意味する。この用語は、それから介在配列が除去された遺伝子を含む。
【００２９】
「組換えＤＮＡ」は、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ配列をインビトロスプライシングすることによって組み換えられている分子を意味する。
【００３０】
「クローニング」とは、特定の遺伝子または他のＤＮＡ配列をベクター分子に挿入するためのインビトロ組換え技術の使用をいう。所望の遺伝子を首尾よくクローニングするためには、ＤＮＡ断片を生じさせ、該断片をベクター分子に連結し、該混成ＤＮＡ分子をそれが複製できる宿主細胞に導入し、受容体宿主細胞の中から標的遺伝子を有するクローンを選択するための方法を用いる必要がある。
【００３１】
「ｃＤＮＡライブラリー」とは、生物の完全ゲノムを一緒に含むｃＤＮＡインサートを含有する組換えＤＮＡ分子の収集物をいう。そのようなｃＤＮＡライブラリーは、当業者に知られ、例えば、Ｃｏｗｅｌｌ  ａｎｄ  Ａｕｓｔｉｎ，「ｃＤＮＡ  Ｌｉｂｒａｒｙ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，」Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９７）によって記載された方法によって調製することができる。一般に、そのゲノムから特定の遺伝子をクローニングするのが望ましい生物の細胞からＲＮＡをまず単離する。
【００３２】
「クローニング媒体（ｖｅｈｉｃｌｅ）」とは、宿主細胞中で複製することができるプラスミドまたはファージＤＡＮまたは他のＤＮＡ配列をいう。クローニング媒体は、そのようなＤＮＡ配列が、該ＤＮＡの実質的な生物学的機能の喪失なくして決定的な様式で切断することができる１以上のエンドヌクレアーゼ認識部位によって特徴付けられ、これは、形質転換された細胞の同定で用いるのに適したマーカーを含むことができる。
【００３３】
「発現制御配列」とは、それらの構造遺伝子に作動可能に連結した場合に、構造遺伝子の発現を制御または調節するヌクレオチドの配列をいう。これらは、例えば、ファージラムダのｔｒｐ系、主要オペレーターおよびプロモーター領域、ｆｄコートタンパク質の制御領域および原核生物または真核生物細胞において遺伝子の発現を制御することを知られている他の配列を含む。発現制御配列は、ベクターが、原核生物または真核生物宿主において作動可能に連結した遺伝子を発現するように設計されているか否かに応じて変化し、エンハンサーエレメント、終止配列、組織特異性エレメントおよび／または翻訳開始および終止部位のごとき転写エレメントを含むことができる。
【００３４】
「発現媒体」とは、クローニング媒体に似ているが、宿主に形質転換された後に、それにクローニングされた遺伝子を発現することができる媒体またはベクターをいう。クローニングされた遺伝子は、通常、発現制御配列の制御下に置かれる（すなわち、それに作動可能に連結している）。
【００３５】
「オペレーター」とは、特異的リプレッサーと相互作用し、それにより、隣接する単一の遺伝子または複数の遺伝子の転写を制御することができるＤＮＡ配列をいう。
【００３６】
「プロモーター」とは、ＲＮＡによって認識することができるＤＮＡ配列をいう。そのような配列の存在は、ＲＮＡポリメラーゼが結合し、作動可能に連結した遺伝子配列の転写を開始することを可能とする。
【００３７】
「プロモーター領域」とは、プロモーター、ならびに転写の開始に必要であろう他の遺伝子配列を含む意図である。プロモーター領域の存在は、作動可能に連結した遺伝子配列の発現を引き起こすのに十分である。
【００３８】
「作動可能に連結した」とは、プロモーターが遺伝子の発現の開始を制御することを意味する。もし宿主細胞への導入に際して、プロモーターがＲＮＡの１以上の種への基部側の単一のＤＮＡ配列または複数のＤＮＡ配列の転写を決定するならば、プロモーターは基部側ＤＮＡの配列に作動可能に連結している。もしプロモーターがそのＤＮＡ配列の転写を開始することができれば、プロモーターはＤＮＡ配列に作動可能に連結している。
【００３９】
「原核生物」とは、細菌を含む真の核が無い全ての生物をいう。
【００４０】
「真核生物」とは、哺乳動物細胞を含む真の核を有する生物および細胞をいう。
【００４１】
「宿主」は、酵母糸状菌のごとき原核生物および真核生物、ならびに植物および動物細胞を含む。該用語は、複製可能な発現媒体の受容体である生物または細胞を含む。
【００４２】
遺伝子の「断片」とは、その遺伝子の生物学的活性を保有する遺伝子のいずれの変種をもいう。
【００４３】
「変種」または「変異体」とは、構造および生物学的活性または免疫学的特徴において、完全遺伝子または遺伝子の断片に実質的に同様な遺伝子をいう。２つの遺伝子が同様の活性を保有するならば、たとえアミノ酸残基の配列が同一でなくても本明細書中ではその用語が用いられるごとく、それらは変種と考えられる。
【００４４】
「核酸の増幅」とは、ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）、連結増幅（またはリガーゼ鎖反応、ＬＣＲ）のような方法およびＱ−ベーターレプリカーゼの使用に基づく増幅方法をいう。これらの方法は当該分野でよく知られており、例えば、米国特許第４，６８３，１９５号および第４，６８３，２０２号に記載されている。ＰＣＲを行うための試薬およびハードウェアは商業的に入手可能である。ＨＢＭ領域から配列から増幅するのに有用なプライマーは、好ましくは、ＨＢＭ領域、またはそこで標的領域を近接挟む領域における配列に相補的であり、それに特異的にハイブリダイズする。増幅によって生じたＨＢＭ配列は直接配列決定することができる。別法として、増幅された単一の配列または複数の配列は配列分析に先立ってクローニングすることができる。
【００４５】
「抗体」とは、ＨＢＭタンパク質およびその断片に、またはＨＢＭ領域からの、特にＨＢＭ遺伝子座またはその部分からの核酸配列に結合することができる、ポリクローナルおよび／またはモノクローナル抗体およびその断片、およびその免疫学的結合同等体をいうことができる。用語抗体は、均一分子体、または複数の異なる分子体よりなる血清産物のごとき混合物双方をいうのに用いられる。タンパク質はタンパク質合成器で合成により調製し、担体分子にカップリングさせ、数ヶ月にわたってウサギに注射することができる。ウサギ血清は、ＨＢＭタンパク質または断片に対する免疫反応性につきテストする。モノクローナル抗体は、マウスにタンパク質またはその断片を注射することによって作成することができる。モノクローナル抗体はＥＬＡＳＡによってスクリーニングし、ＨＢＭタンパク質またはその断片で特異的免疫反応性につきテストする。Ｈａｒｌｏｗら、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８８）。これらの抗体はアッセイならびに医薬で有用であろう。
【００４６】
「ＨＢＭ」とは高骨量をいう。
【００４７】
「ＨＢＭタンパク質」とは、それがグリシン１７１からバリンへの変化を含む以外はＺｍａｘ１タンパク質と同一のタンパク質をいう。ＨＢＭタンパク質は、Ｚｍａｘ１真のホモログをコードするいずれの生物についても定義される。例えば、マウスＨＢＭタンパク質とは、グリシン１７０からバリンへの置換を有するマウスＺｍａｘ１タンパク質をいう。
【００４８】
「ＨＢＭ遺伝子」とは、ＨＢＭ特徴または表現型を示す個体で見出されるゲノムＤＮＡ配列をいい、ここに、該配列は配列番号４によって示されるタンパク質をコードする。ＨＢＭ遺伝子およびＺｍａｘ１遺伝子は対立遺伝子である。ＨＢＭ遺伝子によってコードされるタンパク質は上昇した骨量を引き起こす特性を有し、他方、Ｚｍａｘ１遺伝子によってコードされたタンパク質はそうではない。ＨＢＭ遺伝子およびＺｍａｘ１遺伝子は、ＨＢＭ遺伝子が位置５８２にチミンを有し、他方、Ｚｍａｘ１遺伝子が位置５８２にグアニンを有する点で異なる。ＨＢＭ遺伝子は配列番号２として示される核酸配列を含む。また、ＨＢＭ遺伝子は「ＨＢＭ多型」ということもできる。
【００４９】
「正常」、「野生型」、「未罹患」および「Ｚｍａｘ１」は、全て、配列番号３によって示されるタンパク質をコードするゲノムＤＮＡ配列をいう。Ｚｍａｘ１遺伝子は位置５８２にグアニンを有する。Ｚｍａｘ１遺伝子は配列番号１として示される核酸配列を含む。また、「正常」、「野生型」、「未罹患」および「Ｚｍａｘ１」とは、上昇した骨量に寄与しないタンパク質をコードするゲノム配列の対立遺伝子変種をいう。Ｚｍａｘ１遺伝子はヒト集団で共通であり、他方、ＨＢＭ遺伝子は稀である。
【００５０】
「５ＹＷＴ＋ＥＧＦ」とは、５つのＹＷＴ反復、続いてのＥＧＦ反復よりなる、Ｚｍａｘ１タンパク質で見出される反復単位をいう。
【００５１】
「骨発生」とは、一般に、例えば、正常な発生、病気状態の間に起こる変化、および加齢の間に起こる変化を含む、経時的な骨の変化に関与するいずれのプロセスをもいう。「骨発生障害」とは、特に、例えば、病気状態の間に起こる変化および加齢の間に起こる変化を含む、骨発生におけるいずれの障害をもいう。骨発生はその性質が進行的であるかまたはサイクル的であり得る。発生の間に変化し得る骨の態様は、例えば、ミネラル化、特異的解剖学的特徴、および種々の細胞型の相対数または絶対数を含む。
【００５２】
「骨調節」または「骨形成の調節」とは、当業者に認識されるごとく、例えば、とりわけ、破骨細胞または骨芽細胞活性による骨吸収および付着成長骨成長を含む、骨再形成に関与する生理学的プロセスのいずれかに影響する能力をいい、本明細書中で用いる骨形成および発生のいくつかまたは全てを含むことができる。
【００５３】
「正常骨密度」とは、０のＺスコアの２標準偏差内の骨密度をいう。
【００５４】
「Ｚｍａｘ１系」とは、Ｚｍａｘ１が正常または突然変異体形態で存在する、精製されたタンパク質、細胞抽出物、細胞、動物、ヒトまたはいずれもの他の組成物をもいう。
【００５５】
「サロゲートマーカー」とは、ＨＢＭ遺伝子または上昇した骨密度または双方に相関するが、骨密度よりも測定が容易な、細胞、組織、ヒトまたは動物で観察することができる診断症状、兆候、徴候または他の特徴をいう。サロゲートマーカーの一般的概念は診断医薬においてよく認められている。
【００５６】
本発明は、各々、配列番号１および３によって示される形態のＺｍａｘ１遺伝子およびＺｍａｘ１タンパク質、および他の密接に関連する変種、ならびにその正確な発現に必要なＺｍａｘ１の隣接染色体領域を含む。好ましい実施形態において、本発明は、配列番号１の核酸配列の少なくとも１５個の連続したヌクレオチドに対する。
【００５７】
また、本発明は、各々、配列番号２および４によって示される形態のＨＢＭ遺伝子およびＨＢＭタンパク質、および密接に関連する変種、ならびにその正確な発現に必要なＨＢＭ遺伝子の隣接染色体領域を含む。好ましい実施形態において、本発明は、配列番号２の核酸配列の少なくとも１５個の連続したヌクレオチドに対する。最も好ましくは、本発明は、１５個の連続したヌクレオチドの１つがヌクレオチド５８２におけるチミンである、配列番号２の核酸配列の少なくとも１５個の連続したヌクレオチドに対する。
【００５８】
また、本発明は、Ｚｍａｘ１遺伝子領域のヌクレオチド配列、ならびにＨＢＭ遺伝子領域のヌクレオチド配列に関する。さらに詳しくは、好ましい実施形態はＺｍａｘ１遺伝子領域Ｂ２００Ｅ２１−ＨおよびＢ５２７Ｄ１２−Ｈのセグメントを含有するＢＡＣクローンである。好ましい実施形態は配列番号５〜１２よりなるＢＡＣクローンのヌクレオチド配列である。
【００５９】
また、本発明は、Ｚｍａｘ１遺伝子およびＨＢＭ遺伝子に対するＤＮＡプローブを同定するためのヌクレオチド配列の使用、Ｚｍａｘ１遺伝子およびＨＢＭ遺伝子、Ｚｍａｘ１遺伝子およびＨＢＭ遺伝子におけるヌクレオチド多型、およびＺｍａｘ１遺伝子およびＨＢＭ遺伝子の調節エレメントを増幅させるためのＰＣＲプライマーの使用に関する。
【００６０】
本発明は、さらに、遺伝子マーカーＤ１１Ｓ９８７およびＳＮＰ ｃｏｎｔｉｇ０３３−６の間の染色体１１ｑ１３．３上のＺｍａｘ１遺伝子およびＨＢＭ遺伝子、ならびにＺｍａｘ１遺伝子およびＨＢＭ遺伝子のＤＮＡ配列の染色体位置の位置決定を記載する。染色体位置は、遺伝子をマップするのに用いられるマッピングパネルへのより多くの遺伝子マーカーの添加によって、およびより多くの個体を含むための家系の拡大によって精度を上げた。家系拡大は非常に重要である。なぜならば、遺伝子型を特定された新しい個体は、領域を狭くする臨界的な組換え事象を保有するからである。１１ｑ１３．３上の領域における遺伝子を同定するためには、この染色体領域を含むＢＡＣクローンの組を同定した。ＢＡＣクローンはゲノムＤＮＡ配列決定のための鋳型として機能し、また、直接的ｃＤＮＡ選択によってコーディング配列を同定するための試薬としても機能した。ゲノム配列決定および直接的ｃＤＮＡ選択を用いて、１１ｑ１３．３からのＤＮＡの１５０万を超える塩基対を特徴付けた。Ｚｍａｘ１遺伝子はこの領域内で確認され、次いで、罹患および未罹患個体の突然変異分析後にＨＢＭ遺伝子が見出された。
【００６１】
遺伝子が特定の染色体領域に遺伝子的に位置決定されている場合、この領域における遺伝子は、重複クローンの組におけるＤＮＡの全領域のクローニング（物理的マッピング）、直接的ｃＤＮＡ選択、エクソントラッピングおよびＤＮＡ配列決定の組合せによる、これらのクローンによってコードされた遺伝子の特徴付け（遺伝子同定）、およびＨＢＭ親族の罹患および未罹患メンバーの比較ＤＮＡ配列決定によるこれらの遺伝子における突然変異の同定（突然変異分析）、を含む一連の工程によって分子レベルで特徴付けることができる。
【００６２】
物理的マッピングは、注目する染色体領域におけるユニークな分子ランドマークを増幅するように設計されたＰＣＲアッセイを用いて、大腸菌またはサッカロマイセス・セレヴィシエで増殖するベクターにクローニングしたヒトＤＮＡのライブラリーをスクリーニングすることによって達成される。ＨＢＭ候補領域の物理的マップを作成するために、細菌人口染色体（ＢＡＣ）にクローニングしたヒトＤＮＡのライブラリーを、ヒトゲノムプロジェクトの努力によって染色体１１ｑ１２−ｑ１３に以前にマッピングされている配列タグ部位（ＳＴＳ）マーカーの組でスクリーニングした。
【００６３】
ＳＴＳは、ＰＣＲによってアッセイすることができるヒトゲノムにおけるユニークな分子ランドマークである。ヒトゲノムプロジェクトの組み合わされた努力を介し、２２の常染色体および２つの性染色体上の数千のＳＴＳの位置が決定された。位置クローニングの取り組みでは、物理的マップが遺伝子マップに連結される。なぜならば、遺伝子マッピングで用いられるマーカーは、物理的マッピングのためにＳＴＳとしても用いることができるからである。遺伝子マーカー、遺伝子、およびランダムＤＮＡ断片に由来するＳＴＳの組み合わせでによりＢＡＣライブラリーをスクリーニングすることによって、注目する染色体領域におけるＤＮＡの全てを表す重複クローンよりなる物理的マップを組み立てることができる。
【００６４】
ＢＡＣは、大腸菌で増殖するヒトまたは他のＤＮＡの大きな（８０キロベースないし２００キロベース）セグメントについてのクローニングベクターである。ＢＡＣを用いて物理的マップを構築するには、与えられたＳＴＳまたはＳＴＳの組に対応するＤＮＡ配列を保有する個々のクローンが同定されるように、ＢＡＣクローンのライブラリーをスクリーニングする。ヒトゲノムのほとんどを通じて、個々のＢＡＣクローンが典型的には少なくとも２つのＳＴＳマーカーを含むように、ＳＴＳマーカーをほぼ２０ないし５０キロベース離して設ける。加えて、スクリーニングしたＢＡＣライブラリーは、ヒトゲノムの６倍以上をカバーするのに十分なクローン化ＤＮＡを含む。従って、個々のＳＴＳは、典型的には、１を超えるＢＡＣクローンを同定する。ほぼ５０キロベース離して設けた一連のＳＴＳマーカーで６倍網羅ＢＡＣライブラリーをスクリーニングすることによって、一連の重複ＢＡＣクローン、すなわち、ＢＡＣ  ｃｏｎｔｉｇよりなる物理的マップを、ヒトゲノムのいずれの領域に対しても組み立てることができる。このマップは遺伝子マップに密接に連結される。なぜならば、物理的マップを調製するのに用いるＳＴＳマーカーの多くは遺伝子マーカーでもあるからである。
【００６５】
物理的マップを構築する場合、与えられた位置において重複するＢＡＣクローンを同定することが不能な結果となる、ゲノムのＳＴＳマップにギャップがあることがしばしば起こる。典型的には、まず、公に入手可能な文献およびＷｏｒｌｄ  Ｗｉｄｅ  Ｗｅｂ資源を通じて同定されているＳＴＳの組から物理的マップを構築する。最初のマップは、未知の分子距離のギャップだけ離れたいくつかの別々のＢＡＣ  ｃｏｎｔｉｇよりなる。これらのギャップを埋めるＢＡＣクローンを同定するには、ギャップのいずれかの側のクローンの端部から新しいＳＴＳマーカーを開発する必要がある。これは、ギャップを近接挟むＢＡＣの末端２００ないし３００塩基対を配列決定し、次いで、ＰＣＲアッセイを行って、１００以上の塩基対の配列を増幅することによってなされる。もし末端配列がヒトゲノム内でユニークであることが証明されれば、新しいＳＴＳを用いてＢＡＣライブラリーをスクリーニングし、物理的マップにおけるギャップからのＤＮＡを含むさらなるＢＡＣを同定することができる。ＨＢＭ候補領域のサイズ（２，０００，０００以上の塩基対）の領域をカバーするＢＡＣ  ｃｏｎｔｉｇを組み立てるには、しばしば、いくつかのクローンの端部から新しいＳＴＳマーカーを生じさせる必要がある。
【００６６】
ＢＡＣ  ｃｏｎｔｉｇを形成した後、重複するクローンのこの組は、染色体領域にコードされた遺伝子を同定するための鋳型として機能する。遺伝子同定は多くの方法によって達成することができる。次の３つの方法が通常は利用される。（１）全染色体領域を表すためのＢＡＣ  ｃｏｎｔｉｇから選択されたＢＡＣの組を配列決定することができ、コンピューター方法を用いてゲノムの全てを同定することができる。（２）ＢＡＣ  ｃｏｎｔｉｇからのＢＡＣを試薬として用いて、直接的ｃＤＮＡ選択といわれる方法によって、領域にコードされた遺伝子に対応するｃＤＮＡをクローニングすることができる。（３）ＢＡＣ  ｃｏｎｔｉｇからのＢＡＣを用いて、エクソントラッピングと呼ばれる手法において、特異的ＤＮＡ配列モチーフにつき選択することによってコーディング配列を同定することができる。本発明は、最初の２つの方法によって同定された遺伝子を含む。
【００６７】
ＨＢＭ候補領域を表す全ＢＡＣ  ｃｏｎｔｉｇを配列決定するために、ＢＡＣの組を、プラスミドベクターへのサブクローニング、これらのサブクローンの引き続いてのＤＮＡ配列決定のために選択した。ＢＡＣにクローンされたＤＮＡはゲノムＤＮＡを表すのでこの配列決定を、それをｃＤＮＡ配列決定から区別するためにゲノム配列決定という。注目する染色体領域についてのゲノム配列決定を開始するには、いくつかの非重複ＢＡＣクローンを選択する。各ＢＡＣクローンについてのＤＮＡを調製し、クローンをランダムな小さな断片に剪断し、これを引き続いてｐＵＣ１８のごとき標準的なプラスミドベクターにクローニングする。プラスミドクローンを次いで増殖させて、より小さな断片を増殖させ、これらは配列決定用の鋳型である。ＢＡＣ  ＤＮＡ配列のための適切な網羅および配列質を確保するために、十分なプラスミドクローンを配列決定して、ＢＡＣクローンの６倍網羅を得る。例えば、もしＢＡＣが１００キロベース長であれば、ファゲミドを配列決定して６００キロベースの配列を得る。ＢＡＣ  ＤＮＡはファゲミドベクターへのクローニングに先立ってランダムに剪断されたので、６００キロベースの生ＤＮＡ配列をコンピューター方法によって配列ｃｏｎｔｉｇと呼ばれる重複ＤＮＡ配列へ組み立てることができる。コンピューター方法による初期遺伝子同定の目的で、６倍網羅の各ＢＡＣは、１０００塩基対ないしｈ２０，０００塩基対の１０ないし２０配列ｃｏｎｔｉｇを得るのに十分である。
【００６８】
本発明で使用する配列決定戦略は、ＨＢＭ候補領域においてＢＡＣ  ｃｏｎｔｉｇからの「シード」ＢＡＣを最初に配列決定することであった。次いで、「シード」ＢＡＣの配列を用いて、ｃｏｎｔｉｇからの最小に重複するＢＡＣを同定し、これらを引き続いて配列決定した。このように、各ＢＡＣに残るいくつかの小さな配列ギャップにて、全候補領域を配列決定した。この配列は、コンピューター遺伝子同定のための鋳型として機能した。コンピューター遺伝子同定のための１つの方法は、ＢＡＣ  ｃｏｎｔｉｇの配列を、ｃＤＮＡおよびゲノム配列の公に入手できるデータベース、例えば、ユニジーン、ｄｂＥＳＴ、ジーンバンクと比較することである。これらの比較は、典型的には、コンピューターアルゴリズムおよびプログラムのＢＬＡＳＴファミリーを用いてなされる（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５：４０３−４１０（１９９０））。また、ＢＡＣ配列をタンパク質配列に翻訳することができ、タンパク質配列を用いて、タンパク質配列を分析するために設計されたＢＬＡＳＴのバージョンを用い、公に入手可能なタンパク質データベースをサーチすることができる（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２５：３３８９−３４０２（１９９７））。もう１つの方法はＭＺＥＦ（Ｚｈａｎｇ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，９４：５６５−５６８（１９９７））およびＧＲＡＩＬ（Ｕｂｅｒｂａｃｈｅｒら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，２６６：２５９−２８１（１９９６））のごときコンピューターアルゴリズムを用いることであり、これは、全てのエクソンに共通する特異的ＤＮＡ配列モチーフの存在、ならびにヒトタンパク質コーディング配列に典型的なコドン用法の存在に基づいて配列中のエクソンの位置を予測する。
【００６９】
コンピューター方法による遺伝子の同定に加え、遺伝子は直接的ｃＤＮＡ選択によっても同定した（Ｄｅｌ  Ｍａｓｔｒｏら、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．５（２）：１８５−１９４（１９９５））。直接的ｃＤＮＡ選択において、注目する組織からのｃＤＮＡプールを調製し、候補領域からのＢＡＣを、ＢＡＣにおけるコーディング領域に塩基対合するｃＤＮＡを捕獲するための液体ハイブリダイゼーションアッセイで用いる。本明細書中に記載した方法では、ポリＡ  ＲＮＡからの第１ストランドｃＤＮＡをランダムプライミングし、標準的な方法によって第２ストランドｃＤＮＡを合成し、次いで、ｃＤＮＡ断片の端部にリンカーを付加することによって、ｃＤＮＡプールをいくつかの異なる組織から生じさせた。このリンカーを用いて、ｃＤＮＡプールを増幅する。ＢＡＣクローンは、ＢＡＣ  ＤＮＡのビオチン標識コピーを生じさせるためにインビトロＤＮＡ合成用の鋳型として用いる。次いで、ＢＡＣ  ＤＮＡのビオチン標識コピーを変性し、やはり変性した過剰のＰＣＲ増幅させたリンカードｃＤＮＡプールと共にインキュベートする。ＢＡＣ  ＤＮＡおよびｃＤＮＡを溶液中でアニーリングさせてストレプトアビジン被覆磁気ビーズを用い、ＢＡＣおよびｃＤＮＡの間のヘテロ二本鎖を単離する。次いで、ＢＡＣによって捕獲されたｃＤＮＡを、リンカー配列に相補的なプライマーを用いて増幅し、ハイブリダイザーション／選択プロセスを第２ラウンドの間反復する。２ラウンドの直接ｃＤＮＡ選択の後、ｃＤＮＡ断片をクローニングし、これらの直接的選択断片のライブラリーを作り出す。
【００７０】
ｃＤＮＡクローンを直接的選択によって単離し、２つの方法によって分析する。ＨＢＭ候補領域からのＢＡＣのプールを用いてゲノムＤＮＡ配列を提供するので、ｃＤＮＡは個々のＢＡＣにマッピングされなければならない。これは、マイクロタイター皿中にＢＡＣを整列させ、次いで、高密度グリッド中でそれらのＤＮＡを複製することによって達成される。次いで、個々のｃＤＮＡクローンをグリッドにハイブリダイズさせて、それらが、直接的選択で用いられる組からの個々のＢＡＣに対して配列同一性を有することを確認し、そのＢＡＣの特異的同一性を決定する。個々のＢＡＣに対応することが確認されたｃＤＮＡクローンを配列決定する。直接的選択によって単離されたｃＤＮＡクローンが以前に同定された遺伝子に対して配列同一性または類似性を共有するか否かを決定するために、プログラムのＢＬＡＳＴファミリーを用い、ＤＮＡおよびタンパク質コーディング配列を公に入手可能なデータベースと比較する。
【００７１】
ＢＡＣ配列決定によって、および直接的ｃＤＮＡ選択によって提供されたゲノムＤＮＡ配列およびｃＤＮＡ配列の組み合わせは、領域における推定遺伝子の最初のリストを生じる。領域中の遺伝子はＨＢＭ遺伝子座についての全ての候補であった。各遺伝子をさらに特徴付けるために、ノザンブロットを行って、各遺伝子に対応する転写体のサイズを決定し、いずれの推定エクソンが一緒に転写されて個々の遺伝子をなすかを決定した。各遺伝子のノザンブロット分析では、直接的選択ｃＤＮＡクローンから、またはゲノムＤＮＡからの、または注目する推定遺伝子をコードするＢＡＣからの特異的断片を増幅するＰＣＲによって、プローブを調製した。ノザンブロットは、転写体のサイズおよびそれがそこで発現される組織についての情報を与えた。高度に発現されない転写体では、反応用の鋳型として注目する組織からのＲＮＡを用いて逆転写ＰＣＲアッセイを行う必要が時々あった。
【００７２】
コンピューター方法および直接的ｃＤＮＡ選択による遺伝子同定は、染色体の領域中の遺伝子についてのユニークな情報を提供する。遺伝子が同定されれば、各遺伝子中の突然変異につき異なる個体を調べることができる。
【００７３】
Ｉ．ＤＸＡ測定を用いる表現型分け
Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ大学（Ｏｍａｈａ，ネブラスカ州）で行った脊髄骨ミネラル含量（ＢＭＣ）および骨ミネラル密度（ＢＭＤ）は、Ｎｏｒｌａｎｄ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓデンシトメーター（Ｎｏｒｌａｎｄ  ＸＲ２６００デンシトメーター、デュアルエネルギーＸ線アブソープショメトリー、ＤＸＡ）を用いてＤＸＡによって行った。他の位置における脊髄ＢＭＣおよびＢＭＤは入手可能な機械を用いた。米国で現在操作されているＤＸＡマシーンは８００と見積もられる。ほとんどの大都市は、ＤＸＡ能力、通常ＬｕｎａｒまたはＨｏｌｏｇｉｃマシーンを有するオフィスまたはイメージセンターを有する。脊髄ＢＭＣおよびＢＭＤデータを提供した各位置は、それらのマシーンからのプリントアウトのコピーを含み、ＢＭＤの測定のための注目する領域が適切に選択されたという証拠を提供した。完全な臨床履歴および骨格ラジオグラフが得られた。
【００７４】
ＨＢＭ表現型は以下の基準：非常に高い脊髄ＢＭＤ；いずれかの既知の高骨量症候群を欠く臨床的履歴；および付属の骨格の正常な形状を示す骨格ラジオグラフによって規定される。
【００７５】
ＩＩ．マイクロサテライトマーカーの遺伝子型分け
Ｊｏｈｎｓｏｎら、Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．，６０：１３２６−１３３２（１９９７）によって元来報告されたものよりも小さな領域までの遺伝子間隔を狭くするために、染色体１１ｑ１２−１３上のさらなるマイクロサテライトマーカーをタイプ分けした。新しいマーカーは、Ｄ１１Ｓ４１９１、Ｄ１１Ｓ１８８３、Ｄ１１Ｓ１７８５、Ｄ１１Ｓ４１１３、Ｄ１１Ｓ４１３６、Ｄ１１Ｓ４１３９（Ｄｉｂら、Ｎａｔｕｒｅ，３８０：１５２−１５４（１９９６））、ＦＧＦ３（Ｐｏｌｙｍｅｒｏｐｏｌｏｕｓら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．，１８：７４６８（１９９０））、ならびにＧＴＣ ＨＢＭ Ｍａｋｅｒ １，ＧＴＣ ＨＢＭ Ｍａｒｋｅｒ ２，ＧＴＣ ＨＢＭ Ｍａｒｋｅｒ ３，ＧＴＣ ＨＢＭ Ｍａｒｋｅｒ ４，ＧＴＣ ＨＢＭ Ｍａｒｋｅｒ ５，ＧＴＣ ＨＢＭ Ｍａｒｋｅｒ ６，およびＧＴＣ ＨＢＭ Ｍａｒｋｅｒ ７（図２参照）を含む。
【００７６】
血液（２０ｍｌ）を、証明された瀉血専門医によってラベンダーキャップ（ＥＤＴＡ含有）試験管に吸った。ＤＮＡ抽出まで血液を冷蔵貯蔵した。ＤＮＡは、収量の質または量の低下なくして冷蔵庫中に７日まで貯蔵した血液から抽出した。距離部位で吸った血液を有する対象では、１ダース以上の場合にシッピングプロトコルが首尾よく用いられた。血液試料は、冷却を提供するためのフリーザーパックを備えた発砲スチレン容器中にて夜行急行便によって送付した。ラベンダーキャップ試験管を個々のプラスチック送付試験管上に置き、次いで、「ジップ−ロック」バイオハザードバッグに入れた。試料が翌日到着すると、それを直ちに処理してＤＮＡを抽出した。
【００７７】
ＤＮＡ抽出手法は、Ｇｅｎｔｒａ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ミネソタ州）からの購入したキットを用いた。簡単に述べれば、該手法は、３容量の赤血球溶解緩衝液を全血に加えることを含んだ。室温での１０分間のインキュベーションの後に、２，０００×ｇにて、溶液をＢｅｃｋｍａｎテーブルトップ遠心機で１０分間遠心した。白血球細胞ペレットを細胞溶解緩衝液に再懸濁した。一旦ペレットを完全に再懸濁し、細胞クランプを無くすると、溶液を３７℃にてＲＮａｓｅＡで１５分間消化した。提供されたタンパク質沈殿溶液の添加によってタンパク質を沈殿させ、遠心によって除去した。イソプロパノールの添加によって、ＤＮＡは上清から沈殿した。この方法は単純かつ速く、１ないし２時間しか要せず、数ダースの試料の処理を同時に可能とした。ＤＮＡの収量は全血の２０ｍｌ試料ではルーチン的に＞８ｍｇであり、＞５０ｋｂのＭＷを有した。エタノール沈殿として−８０℃で符号を付けた５０μｇアリコットを貯蔵することによって、ＤＮＡを保管した。
【００７８】
ＤＮＡは、１つの蛍光標識オリゴヌクレオチドプライマーおよび１つの未標識オリゴヌクレオチドプライマーを用いて遺伝子型分けした。標識および未標識オリゴヌクレオチドはＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ，アイオワ州）から入手した。マイクロサテライト遺伝子型分けのための全ての他の試薬はＰｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ−Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．（「ＰＥ−ＡＢＩ」）（Ｎｏｒｗａｌｋ，コネチカット州）から購入した。個々のＰＣＲ反応は、ＡｍｐｌｉＴａｇ  ＤＮＡポリメラーゼを用いるＰＥ−ＡＢＩによって、記載されているごとく各マーカーにつき行った。脱イオン化ホルムアミド、ブルーデキストランおよびＴＡＭＲＡ  ３５０サイズ標準（ＰＥ−ＡＢＩ）を含有する３．５μｌの負荷緩衝液に反応物を添加した。９５℃にて５分間加熱してＤＮＡを変性した後、モデル３７７  ＤＮＡシーケンサー（ＰＥ−ＡＢＩ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，カリフォルニア州）についてのオペレーターマニュアルに記載されたごとく、試料を負荷し、電気泳動に付した。ゲル電気泳動の後、ＰＥ−ＡＢＩ  ＧＥＮＥＳＣＡＮ（商標）およびＧＥＮＯＴＹＰＥＲ（商標）ソフトウェアを用い、データを解析した。まず、ＧＥＮＥＳＣＡＮ（商標）ソフトフェア内で、分析の最初の工程に先立って、レーントラッキングを主導で最適化した。ゲルレーンデータを抽出した後、各レーンの標準曲線プロフィールを調べ、直線性およびサイズコーリングにつき確認した。これらのパラメーターのいずれかで問題を有するレーンを再度トラッキングし、確認した。一旦全てのレーンをトラッキングし、サイズ標準を正しく同定すれば、対立遺伝子同定のためにデータをＧＥＮＯＴＹＰＥＲ（商標）に輸入した。対立遺伝子コーリング（ビニング）を行うために、Ｇｕｙ  Ｖａｎ  Ｃａｍｐ博士（ ＨＹＰＥＲＬＩＮＫ ”ｈｔｔｐ：／／ａｌｔ．ｗｗｗ．ｕｉａ．ａｃ．ｂｅ／ｕ／ｄｎａｌａｂ／ｌｄ．ｈｔｍｌ” ｈｔｔｐ：／／ａｌｔ．ｗｗｗ．ｕｉａ．ａｃ．ｂｅ／ｕ／ｄｎａｌａｂ／ｌｄ．ｈｔｍｌ）のインターネットウェブサイトからのプログラムＬｉｎｋａｇｅ  Ｄｅｓｉｇｎｅｒを用いた。このプログラムは、ＧＥＮＯＴＹＰＥＲ（商標）によって生じたデータの家系描写プログラムＣｙｒｉｌｌｉｃ（バージョン２．０，Ｃｈｅｒｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｌｉｍｉｔｅｄ，Ｏｘｆｏｒｄ  英国）への輸入およびプログラム  ＬＩＮＫＡＧＥ（Ｌａｔｈｒｏｐら、Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．，３７：４８２−４９８（１９８５））を用いる、引き続く連鎖分析を大いに容易とする。
【００７９】
ＩＩＩ．連鎖分析
図１は、本発明についての遺伝子連鎖研究で用いる個体の家系を示す。具体的には、プログラムＬＩＮＫＡＧＥ（Ｌａｔｈｒｏｐら、Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．，３７：４８２−４９８（１９８５））のＭＬＩＮＫおよびＬＩＮＫＭＡＰ成分を用い、２点連鎖分析を行った。家系／マーカーデータは、プレファイルとしてＣｙｒｉｌｌｉｃからＭａｋｅｐｅｄプログラムに輸出し、連鎖分析に適したペッドファイルに変換した。
【００８０】
オリジナル連鎖分析を３つの方法、（ｉ）常染色体優性十分浸透性モデル、（ｉｉ）低下した浸透性の常染色体優性モデル、および（ｉｉｉ）定量的傾向モデルを用いて行った。大きな拡大された親族の２２メンバーからの連鎖したマーカーについてのＤＮＡを分析することによって、ＨＢＭ遺伝子座を染色体１１ｑ１２−１３にマップした。６〜２２ｃＭの範囲の間隔にて２２常染色体にわたる３４５蛍光マーカーのパネルと共に高度に自動化した技術を用いた。染色体１１のこの領域からのマーカーのみが連鎖の証拠を示した（ＬＯＤスコア〜３．０）。２点および多点分析によって得られた最高ＬＯＤスコア（５．７４）はＤ１１Ｓ９８７であった（図２においてマップ位置５５）。９５％信頼区間はＨＢＭ遺伝子座をマーカーＤ１１Ｓ９０５およびＤ１１Ｓ９３７の間に置いた（図２においてマップ位置４１〜７１）。また、ハプロタイプ分析はＺｍａｘ１遺伝子をこの同一領域に置く。Ｄ１１Ｓ９８７、Ｄ１１Ｓ９０５およびＤ１１Ｓ９３７のさらなる記載はＧｙａｐａｙら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、Ｖｏｌ．７，（１９９４）に見出すことができる。
【００８１】
本発明においては、本発明者らは、マーカーＤ１１Ｓ９８７およびＧＴＣ ＨＢＭ Ｍａｒｋｅｒ ５の間の領域までのＨＢＭ間隔の狭化を報告する。これらの２つのマーカーはオリジナル分析からの描写マーカーの間に存在し（Ｄ１１Ｓ１１Ｓ９０５およびＤ１１Ｓ９３７）、相互にほぼ３ｃＭである。間隔の狭化は、マーカーＤ１１Ｓ４１９１、Ｄ１１Ｓ１８８３、Ｄ１１Ｓ１７８５、Ｄ１１Ｓ４１１３、Ｄ１１Ｓ４１３６、Ｄ１１Ｓ４１３９（Ｄｉｂら、Ｎａｔｕｒｅ，３８０：１５２−１５４（１９９６）），ＦＧＦ３（Ｐｏｌｙｍｅｒｏｐｏｌｏｕｓら、Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄＲｅｓ．，１８：７４６８（１９９０））（遺伝子マーカーについての情報はＧｅｎｏｍｅ  Ｄａｔａｂａｓｅ、 ＨＹＰＥＲＬＩＮＫ ”ｈｔｔｐ：／／ｇｄｂｗｗｗ．ｇｄｂ．ｏｒｇ／” ｈｔｔｐ：／／ｇｄｂｗｗｗ．ｇｄｂ．ｏｒｇ／のインターネットサイトで見出すことができる）、ならびにマーカー  ＧＴＣ ＨＢＭ Ｍａｒｋｅｒ １，ＧＴＣ ＨＢＭ Ｍａｒｋｅｒ ２，ＧＴＣ ＨＢＭ Ｍａｒｋｅｒ ３，ＧＴＣ ＨＢＭ Ｍａｒｋｅｒ ４，ＧＴＣ ＨＢＭ Ｍａｒｋｅｒ ５，ＧＴＣ ＨＢＭ Ｍａｒｋｅｒ ６およびＧＴＣ ＨＢＭ Ｍａｒｋｅｒ ７からの遺伝子型データを用いて達成された。
【００８２】
図１に示すごとく、上記遺伝子マーカーでのハプロタイプ分析は、Ｚｍａｘ１遺伝子がそれに位置する染色体１１の間隔を大いに改良する個体９０１９および９０２０において組換え事象（交差）を同定する。個々の９０１９は、ＨＢＭ遺伝子を持つ母染色体からの染色体１１の一部、および染色体１１ホモログからの一部を遺伝するＨＢＭ−罹患個体である。ＨＢＭ遺伝子を運ぶ染色体から遺伝した部分はマーカーＤ１１Ｓ９３５、Ｇ１１Ｓ１３１３、ＧＴＣ ＨＢＭ Ｍａｒｋｅｒ ４，Ｄ１１Ｓ９８７，Ｄ１１Ｓ１２９６，ＧＴＣ ＨＢＭ Ｍａｒｋｅｒ ６，ＧＴＣ ＨＢＭ Ｍａｒｋｅｒ ２，Ｄ１１Ｓ９７０，ＧＴＣ ＨＢＭ Ｍａｒｋｅｒ ３，Ｄ１１Ｓ４１１３，ＧＴＣ ＨＢＭ Ｍａｒｋｅｒ １，ＧＴＣ ＨＢＭ Ｍａｒｋｅｒ ７およびＧＴＣ ＨＢＭ Ｍａｒｋｅｒ ５を含む。テロマー方向に連続するＤ１１Ｓ４１３６からの部分は、非ＨＢＭ染色体に由来する。このデータは、Ｚｍａｘ１遺伝子を、マーカーＧＴＣ ＨＢＭ Ｍａｒｋｅｒ ５に対して動原体側からの位置に置く。個体９０２０は、やはり臨界的事象を呈する未罹患個体である。この個体は、ＨＢＭ遺伝子を運ぶ彼女の父親の（個体０１１５）染色体１１ホモログからのマーカーＤ１１Ｓ９３５、Ｄ１１Ｓ１３１３、ＧＴＣ ＨＢＭ Ｍａｒｋｅｒ ４，Ｄ１１Ｓ９８７，Ｄ１１Ｓ１２９６およびＧＴＣ ＨＢＭ Ｍａｒｋｅｒ ６、およびＨＢＭ遺伝子を運ばない彼女の父親の染色体１１からのマーカーＧＴＣ ＨＢＭ Ｍａｒｋｅｒ ２，Ｄ１１Ｓ９７０，ＧＴＣ ＨＢＭ Ｍａｒｋｅｒ ３，ＧＴＣ ＨＢＭ Ｍａｒｋｅｒ １，ＧＴＣ ＨＢＭ Ｍａｒｋｅｒ ７，ＧＴＣ ＨＢＭ Ｍａｒｋｅｒ ５，Ｄ１１Ｓ４１３６，Ｄ１１Ｓ４１３９，Ｄ１１Ｓ１３１４およびＤ１１Ｓ９３７を含む組換え親染色体１１を遺伝する。マーカーＤ１１Ｓ４１１３は、個体０１１５におけるそのホモ接合性のため未情報的である。この組換え事象は、ＨＢＭ領域の動原体境界をマーカーＤ１１Ｓ１２９６およびＤ１１Ｓ９８７の間に置く。
【００８３】
やはり２点連鎖分析を用いて、染色体１１上のＺｍａｘ１遺伝子の位置を確認した。十分浸透性のモデル下の２点連鎖分析についての連鎖結果を以下の表１に掲げる。この表は、第１欄における遺伝子マーカーおよび表の頂部を横切る組換え分率をリストする。該欄の各細胞は、第１列に示された組換え分率にてＺｍａｘ１遺伝子に対する連鎖についてテストした個体マーカーについてのＬＯＤスコアを示す。例えば、７．６６のピークＬＯＤスコアはマーカーＤ１１Ｓ９７０で起こり、これは、ハプロタイプ分析によって定義された間隔内である。
【００８４】
【表１】
2004515209.tif 000003
【００８５】
単一ヌクレオチド多型（ＳＬＰ）はさらにＨＢＭ領域を規定する。このＳＮＰはＳＮＰ Ｃｏｎｔｉｇ０３３−６と呼ばれ、遺伝子マーカーＧＴＣ ＨＢＭ Ｍａｒｋｅｒ ５に対して２５ｋｂ動原体側に位置する。このＳＮＰは遺伝子マーカーＧＴＣ ＨＢＭ Ｍａｒｋｅｒ ７に対してテロマー側にある。ＳＮＰ Ｃｏｎｔｉｇ０３３−６はＨＢＭ−罹患個体０１１３に存在する。しかしながら、０１１３の息子であるＨＢＭ−罹患個体９０１９はこのＳＮＰを運ばない。従って、これは、交差がこのＳＮＰに対して動原体側であることを示す。遺伝子マーカーＧＴＣ ＨＢＭ Ｍａｒｋｅｒ ５およびＧＴＣ ＨＢＭ Ｍａｒｋｅｒ ７についてのプライマー配列を以下の表２に示す。
【００８６】
【表２】
2004515209.tif 000004
【００８７】
前記した親族は大いに興味のあるいくつかの特徴を有し、最も重要なのは、彼らの骨が非常に密であるが絶対的な正常な形状を有することである。ＨＢＭ罹患個体の骨格の外側寸法は正常であり、他方、骨髄腔が存在し、造血との干渉はない。ＨＢＭ罹患メンバーは骨折に対して抵抗性のように見え、神経学的徴候はなく、かつ調べたメンバーにおいて器官またはシステム機能の損傷の徴候も無い。該親族のＨＢＭ罹患メンバーは過度の病気または不能なくして高齢まで生きる。さらに、ＨＢＭ表現型は骨粗鬆症、骨粗鬆症偽神経膠腫、エンゲルマン病、リビング病、高ホスファターゼ血症、ファンブッヘム病、メロレオストーシス、大理石骨病、ピクノジソストーシス、硬化狭窄症、オステオポイキリー、末端肥大症、パジェット病、線維性形成異常、管狭窄、骨形成不全、上皮小体機能不全、偽上皮小体機能不全、偽性偽性上皮小体機能不全、一次および二次上皮小体機能亢進症および関連症候群、高カルシウム血症、甲状腺髄様癌、骨軟化症および他の病気のごとき他の骨障害にマッチしない。明らかに、この家族におけるＨＢＭ遺伝子座は骨密度を調節するにおいて非常に強力かつ実質的な役割を有し、その同定は、骨密度および骨粗鬆症のごとき病気の病因を調節する経路を理解するにおける重要な工程である。
【００８８】
加えて、ＨＢＭ遺伝子を運ぶ老齢の個体、従ってＨＢＭタンパク質の発現は、正常な個体に特徴的な骨量の喪失を示さない。換言すれば、ＨＢＭ遺伝子は骨粗鬆症のサプレッサーである。本質的には、ＨＢＭ遺伝子を運ぶ個体にはＨＢＭタンパク質を投与し、その結果、骨粗鬆症を発症しない。このインビボ観察は、ＨＢＭ遺伝子またはタンパク質、またはその断片での正常な個体の処置は骨粗鬆症を軽減するという強力な証拠である。
【００８９】
ＩＶ．物理的マッピング
ＨＢＭ遺伝子座のクローニングおよび特徴づけのための試薬を提供するために、前記した遺伝子マッピングデータを用いて、染色体１１ｑ１３．３上のＺｍａｘ１を含む領域の物理的マップを構築した。物理的マップは、分子ランドマークの順序立った組、および染色体１１ｑ１３．３からのＺｍａｘ１遺伝子領域を含むＢＡＣクローンの組よりなる。
【００９０】
種々の公けに入手可能なマッピング源を利用して、ＨＢＭ領域に存在するＳＴＳマーカー（Ｏｌｓｏｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４５：１４３４−１４３５（１９８９））を同定した。源はＧＤＢ、Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｃｅｎｔｅｒ、ｄｂＳＴＳおよびｄｂＥＳＴ（ＮＣＢＩ）、１１ｄｂ、ｔｈｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｔｅｘａｓ  Ｓｏｕｔｈｗｅｓｔｅｒｎ  ＧＥＳＴＥＣ、ｔｈｅ  Ｓｔａｎｆｏｒｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｃｅｎｔｅｒおよびいくつかの文献（Ｃｏｕｒｓｅａｕｘら、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，４０：１３−２３（１９９７），Ｃｏｕｒｓｅａｕｘら、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，３７：３５４−３６５（１９９６）、Ｇｕｒｕら、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、４２：４３６−４４５（１９９７）、Ｈｏｓｏｄａら、Ｇｅｎｅｓ  Ｃｅｌｌｓ、２：３４５−３５７（１９９７）、Ｊａｍｅｓら、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．８：７０−７６（１９９４）、Ｋｉｔａｍｕｒａら、ＤＮＡ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、４：２８１−２８９（１９９７）、Ｌｅｍｍｅｎｓら、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、４４：９４−１００（１９９７）、Ｓｍｉｔｈら、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．、７：８３５−８４２（１９９７））を含んだ。マップを手動で統合して、Ｚｍａｘ１を含む領域に対するマーカーマッピングを同定した。
【００９１】
現存ＳＴＳに対するプライマーはＧＢＤから入手し、または文献は以下の表３にリストする。従って、表３は、Ｚｍａｘ１遺伝子領域の物理的マップを調製するのに用いたＳＴＳマーカーを示す。
【００９２】
【表３−１】
2004515209.tif 000005
【００９３】
【表３−２】
2004515209.tif 000006
【００９４】
【表３−３】
2004515209.tif 000007
【００９５】
【表３−４】
2004515209.tif 000008
【００９６】
【表３−５】
2004515209.tif 000009
【００９７】
新規なＳＴＳは、公に入手可能なゲノム配列から、または配列−由来ＢＡＣインサート端部から開発された。プライマーは、Ｃｒｏｓｓ ｍａｔｃｈ（Ｐ．Ｇｒｅｅｎ，Ｕ．ｏｆ  Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ）を用い、自動的にベクターおよび反復配列マスキングを行う転写体およびＰｒｉｍｅｒ３（Ｒｏｚｅｎ，Ｓｋａｌｅｔｓｋｙ（１９９６，１９９７））を用いる、引き続くプライマーピッキングを用いて選択した。Ｐｒｉｍｅｒ３は ＨＹＰＥＲＬＩＮＫ ”ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｏｍｅ．ｗｉ．ｍｉｔ．ｅｄｕ／ｇｅｎｏｍｅ ｓｏｆｔｗａｒｅ／ｏｔｈｅｒ／ｐｒｉｍｅｒ２．ｈｔｍｌ” ｗｗｗ．ｇｅｎｏｍｅ．ｗｉ．ｍｉｔ．ｅｄｕ／ｇｅｎｏｍｅ  ｓｏｆｔｗａｒｅ／ｏｔｈｅｒ／ｐｒｉｍｅｒ３．ｈｔｍｌ．で入手可能である。
【００９８】
各プライマー対のためのポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）条件をまずＭｇＣｌ２濃度に関して最適化した。標準緩衝液は１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．３），５０ｍＭ  ＫＣｌ、ＭｇＣｌ２、０．２ｍＭ各ｄＮＴＰ、０．２μＭ各プライマー、２．７ｎｇ／μｌヒトＤＮＡ、０．２５ユニットのＡｍｐｌｉＴａｑ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）および１．０ｍＭ、１．５ｍＭ、２．０ｍＭまたは２．４ｍＭのＭｇＣｌ２濃度であった。サイクリング条件は２分間の９４℃における初期変性、続いての１５秒間の９４℃、２５秒間の５５℃、および２５秒間の７２℃における４０サイクル、続いての３分間の７２℃における最終延長を含んだ。初期ラウンドの最適化からの結果に応じて、要すれば、条件をさらに最適化した。変数は、５８℃または６０℃までのアニーリング温度の上昇、サイクル数の４２までの増加、および３０秒までのアニーリングおよび延長時間、およびＡｍｐｌｉＴａｑＧｏｌｄ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）の使用を含んだ。
【００９９】
注目するＳＴＳマーカーを含むＢＡＣクローン（Ｋｉｍら、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，３２：２１３−２１８（１９９６）、Ｓｈｉｚｕｙａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：８７９４−８７９７（１９９２））は、Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓから購入した全ヒトＢＡＣライブラリーからのＤＮＡプールのＰＣＲ−ベースのスクリーニングによって得た。ヒトＤＮＡの９つのゲノム同等物に対応して、ライブラリープレート１−５９６に由来するＤＮＡプールを用いた。初期スクリーニングプロセスは、スーパープール、すなわち、８つの３８４−ウェルライブラリープレートからの全てのＢＡＣクローンに由来するＤＮＡの混合物に対する個々のマーカーのＰＣＲ反応を含んだ。各陽性スーパープールでは、プレート（８）、列（１６）および行（２４）プールをスクリーニングして、ユニークなライブラリーアドレスを同定した。１×ＴＢＥ中の０．５μｇ／ｍｌ臭化エチジウムを含有する２％アガロースゲル（Ｓｉｇｍａ）にてＰＣＲ産物を電気泳動に付した。用いた電気泳動ユニットは、Ｏｗｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ＰｒｏｄｕｃｔｓからのモデルＡ３−１システムであった。典型的には、ゲルは５０ウェル／層を持つ１０層のレーンを含んだ。分子量マーカー（１００ｂｐラダー、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ）をゲルの両端部に負荷した。ゲルのイメージをＫｏｄａｋ  ＤＣ４０  ＣＣＤカメラで捕獲し、Ｋｏｄａｋ  １Ｄソフトウェアで処理した。ゲルデータはｔａｂ境界決定テキストファイルとして輸出し；ファイルの名称はスクリーニングしたライブラリー、ゲルイメージファイルおよびスクリーニングしたマーカーについての情報を含んだ。これらのデータは、データ貯蔵および分析のためにＦｉｌｅｍａｒｋｅｒ（商標）ＰＲＯ（Ｃｌａｒｉｓ  Ｃｏｒｐ．）データベースへ慣用化されたＰｅｒｌ  スクリプトを用い、自動的に輸入された。不完全なまたは曖昧なクローンアドレス情報が得られた場合には、さらなる実験を行って、ユニークで完全なライブラリーアドレスを回収した。
【０１００】
ライブラリーからのクローナルＢＡＣ培養の回収は、ライブラリーからの試料を、１２．５μｇ／ｍｌクロラムフェニコール（Ｓｉｇｍａ）を含有するＬＢ寒天（Ｍａｎｉａｔｉｓら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｎｕａｌ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８２））へ画線培養することを含んだ。２つの個々のコロニーおよび最初の画線クワドラントの一部を、証明用のコロニーＰＣＲによって、適切なＳＴＳマーカーでテストした。陽性クローンを、−７０℃にて、１２．５μｇ／ｍｌクロラムフェニコールおよび１５％グリセロールを含有するＬＢブロスに保存した。
【０１０１】
いくつかの異なるタイプのＤＮＡ調製方法を、ＢＡＣ  ＤＮＡの単離で用いた。以下にリストした主要アルカリ性溶解ミニプレププロトコル（Ｍａｎｉａｔｉｓら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８２））は、ほとんどの適用、すなわち、制限マッピング、ＣＨＥＦゲル分析、ＦＩＳＨマッピングで首尾よく用いられたが、端部配列決定においては首尾よく再現できなかった。ＡｕｔｏｇｅｎおよびＱｉａｇｅｎプロトコルは、端部配列決定目的でＢＡＣ  ＤＮＡ調製に特異的に用いられた。
【０１０２】
３００ｒｐｍで震盪しつつ、５０ｍｌコニカルチューブ中に１２．５μｇ／ｍｌクロラムフェニコールを含有する１５ｍｌ  Ｔｅｒｒｉｆｉｃ  Ｂｒｏｔｈ中で、３７℃にて２０時間細菌を増殖させた。４℃にて１５分間、培養を３０００ｒｐｍ（〜１８００ｇ）にてＳｏｒｖａｌｌ  ＲＴ  ６０００Ｄ中で遠心した。次いで、上清をできる限り完全に吸引した。ある場合には、この工程において細胞ペレットを−２０℃にて２週間まで凍結した。次いで、ペレットを攪拌して、細胞をホモゲナイズし、クランピングを最小化した。２５０μｌのＰ１溶液（５０ｍＭグルコース、１５ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８、１０ｍＭ  ＥＤＴＡおよび１００μｇ／ｍｌ  ＲＮａｓｅＡ）を添加し、混合物をピペットで上げ下げして混合した。次いで、混合物を２ｍｌのエッペンドルフ試験管に移した。次いで、３５０μｌのＰ２溶液（０．２ＮａＯＨ，１％ＳＤＳ）を添加し、混合物を穏やかに混合し、室温にて５分間インキュベートした。３５０μｌのＰ３溶液（３Ｍ  ＫＯＡｃ，ｐＨ５．５）を添加し、白色沈殿が形成されるまで混合物を温和に混合した。溶液を氷上で５分間インキュベートし、次いで、ミクロ遠心管中で４℃にて１０分間遠心した。上清を注意深く（白色沈殿の回避）新鮮な２ｍｌのエッペンドルフ試験管に移し、０．９ｍｌのイソプロパノールを添加し、溶液を混合し、５分間氷上に放置した。試料を１０分間遠心し、上清を注意深く取り出した。ペレットを７０％エタノール中で洗浄し、５分間風乾した。ペレットを２００μｌのＴＥ８（１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１．０ｍＭ  ＥＤＴＡ）に再懸濁し、ＲＮａｓｅＡ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を１００μｇ／ｍｌまで添加した。試料を３７℃にて３０分間インキュベートし、次いで、０．５ＮまでのＣ２Ｈ３Ｏ２Ｎａ・３Ｈ２Ｏおよび２容量のエタノールの添加によって沈殿させた。試料を１０分間遠心し、ペレットを７０％エタノールで洗浄し、続いて、風乾し、５０μｌのＴＥ８に溶解させた。このＤＮＡプレプについての典型的な収量は３〜５μｇ／１５ｍｌ細菌培養であった。ＨｉｎｄＩＩＩ制限分析のために１０ないし１５μｌを用いた；ＮｏｔＩ消化およびＣＨＥＦゲル電気泳動によるクローンインサートサイジングのためには５μｌを用いた。
【０１０３】
５０ｍｌコニカルチューブ中に１２．５μｇ／ｍｌを含有する１５ｍｌの２×ＬＢブロスにＢＡＣを接種した。４つの試験管を各クローンにつき接種した。激しく震盪しつつ（＞３００ｒｐｍ）、培養を３７℃にて一晩（〜１６時間）増殖させた。ＢＡＣ  ＤＮＡ単離のための標準的な条件は、Ａｕｔｏｇｅｎ  ７４０製造業者によって推奨されているごとく追跡した。クローン当たり合計６０ｍｌまたは２０試験管につき、３ｍｌ試料の培養をＡｕｔｏｇｅｎ試験管に入れた。Ａｕｔｏｄｅｎプロトコルの一部として、１５秒間震盪しつつ、試料を最後に１００μｌのＴＥ８に溶解させた。Ａｕｔｏｇｅｎプロトコルを仕上げた後、ＤＮＡ溶液を各個々の試験管から移し、２ｍｌのエッペンドルフ試験管にプールした。大量のデブリを持つ試験管（デブリのペレット化工程から運ばれる）を回避した。次いで、試験管を０．５ｍｌのＴＥ８で首尾よくすすぎ、この溶液をプールした物質に添加した。ＤＮＡ溶液を４℃で貯蔵し；−２０℃での凍結に際してクランピングが起こる傾向にある。このＤＮＡを、制限マッピング、ＣＨＥＦゲル分析またはＦＩＳＨマッピングのために直接用いるか、あるいは、端部配列決定反応で用いるために後記するごとくさらに精製した。
【０１０４】
該容量のＤＮＡ溶液をＴＥ８で２ｍｌに調整し、次いで、試料を温和に混合し、６５℃にて１０分間加熱した。次いで、ＤＮＡ溶液を４℃にて５分間遠心し、上清を１５ｍｌのコニカルチューブに移した。次いで、ＮａＣｌ濃度を０．７５Ｍに調整した（２ｍｌ試料に対して〜０．３ｍｌの５Ｍ  ＮａＣｌ）。次いで、合計容量をＱｉａｇｅｎカラム平衡緩衝液（緩衝液ＱＢＴ）で６ｍｌに調整した。次いで、ＤＮＡを含有する上清をカラムに適用し、重力流によって進入させた。カラムを１０ｍｌのＱｉａｇｅｎ緩衝液ＱＣで２回洗浄した。次いで、６５℃に保った緩衝液ＱＦの４回の別々の１ｍｌアリコットで、結合したＤＮＡを溶出させた。ＤＮＡを０．７容量のイソプロパノール（〜２．８ｍｌ）でＤＮＡを沈殿させた。次いで、各試料を４つの個々の２．２ｍｌのエッペンドルフ試験管に移し、室温にて２時間または一晩インキュベートした。試料をミクロ遠心管中で４℃にて１０分間遠心した。上清を注意深く取り出し、１ｍｌの７０％エタノールを添加した。試料を再度遠心し、ＤＮＡペレットは、しばしばこの段階で緩くなるので、上清を注意深く取り出した。試料を再度遠心して残りの液体を濃縮し、これをマイクロピペットチップで取り出した。次いで、ＤＮＡペレットをデシケーター中で１０分間乾燥した。２０μｌの滅菌蒸留水および脱イオン水を各試験管に添加し、次いで、これを４℃にて一晩置いた。各クローンについての４つの２０μｌの試料をプールし、試験管をさらに２０μｌの滅菌蒸留水および脱イオン水で最終容量１００μｌにてすすいだ。次いで、試料を６５℃にて５分間加熱し、次いで、温和に混合した。ＮｏｔＩ消化および未切断ラムダＤＮＡとの比較によって評価して、典型的な収量は２〜５μｇ／６０ｍｌ培養であった。
【０１０５】
１２．５μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含有する３ｍｌのＬＢブロスをオートクレーブ処理したＡｕｔｏｇｅｎ試験管に分注した。単一試験管を各クローンで用いた。摂取にはグリセロールストックを−７０℃貯蔵から取り出し、ドライアイス上に置いた。グリセロールストックの少量を、滅菌楊枝で元の試験管から取り出し、Ａｕｔｏｇｅｎ試験管に移した；該楊枝を捨てる前に、少なくとも２分間Ａｕｔｏｇｅｎ試験管中に残した。摂取後、試験管をテープで被覆し、シールが密であることを確認した。全ての試料を摂取すると、試験管ユニットをＡｕｔｏｇｅｎラックホルダーに移し、２５０ｒｐｍにて３７℃にて１６〜１７時間ロータリーシェーカーに入れた。増殖に続き、製造業者によって規定されたＢＡＣ  ＤＮＡ調製のための標準条件を用いて、Ａｕｔｏｇｅｎをプログラムした。プログラムの一部として試料をＴＥ８に溶解させず、ＤＮＡペレットを乾燥したままとした。プログラムが完了すると、試験管を出力トレイから取り出し、３０μｌの滅菌蒸留水および脱イオン水を試験管の底部に直接添加した。次いで、試験管を２〜５秒間穏やかに震盪し、パラフィルムで被覆し、室温にて１〜３時間インキュベートした。次いで、ＤＮＡ試料をエッペンドルフ試験管に移し、配列決定のために直接用いるか、または後に使用するために４℃で貯蔵した。
【０１０６】
Ｖ．物理的マッピングのためのＢＡＣクローンの特徴付け
手動アルカリ溶解によってＤＮＡ試料を調製し、Ａｕｔｏｇｅｎプロトコルを、制限断片サイズの分析のためにＨｉｎｄＩＩＩで消化した。このデータを用いて、クローン間で重複の程度を比較した。典型的には、１〜２μｇを各反応で用いた。反応混合物は：１×緩衝液２（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）、０．１ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミン（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）、５０μｇ／ｍｌのＲＮａｓｅ  Ａ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）および、２０ユニットのＨｉｎｄＩＩＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を２５μｌの最終容量中に含んだ。消化物を３７℃にて４〜６時間インキュベートした。また、ＣＨＥＦゲル分析（後記参照）によるインサートサイズの見積もりのために、ＢＡＣ  ＤＮＡをＮｏｔＩで消化した。反応条件は、２０ユニットのＮｏｔＩを用いた以外はＨｉｎｄＩＩＩのものと同一であった。ブロモフェノールブルーおよびキシレンシアノールを含有する６μｌの６×Ｆｉｃｏｌｌ負荷緩衝液を電気泳動に先立って添加した。
【０１０７】
０．５μｇ／ｍｌの臭化エチジウムを含有する１×ＴＢＥにて、０．６％アガロース（Ｓｅａｋｅｍ，ＦＭＣ  Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ）でＨｉｎｄＩＩＩ消化物を分析した。５０ボルトにて、モデルＡ４電気泳動ユニット（Ｏｗｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）にて、ゲル（２０ｃｍ×２５ｃｍ）を２０〜２４時間電気泳動に付した。分子量サイズマーカーは未消化ラムダＤＮＡ、ＨｉｎｄＩＩＩ消化ラムダＤＮＡ、およびＨａｅＩＩＩ消化  Ｘ１７４  ＤＮＡを含んだ。分子量マーカーをゲルへの負荷に先立って６５℃にて２分間加熱した。イメージをＫｏｄａｋ  ＤＣ４０  ＣＣＤカメラで捕獲し、Ｋｏｄａｋ  １Ｄソフトウェアで分析した。
【０１０８】
製造業者の推奨に従い、ＣＨＥＦ  ＤＲＩＩ（ＢｉｏＲａｄ）電気泳動ユニットでＮｏｔＩ消化物を分析した。簡単に述べれば、１％アガロースゲル（ＢｉｏＲａｄパルスド場グレード）を０．５×ＴＢＥ中で調製し、１４℃にて電気泳動ユニット中で３０分間平衡化し、循環しつつ６ボルト／ｃｍにて１４時間電気泳動に付した。スイッチング時間は１０秒ないし２０秒のランプとした。０．５μｇ／ｍｌの臭化エチジウム中での電気泳動の後にゲルを染色した。分子量マーカーは未消化ラムダＤＮＡ、ＨｉｎｄＩＩＩ消化ラムダＤＮＡ、ラムダラダーＰＦＧラダー、および低い範囲のＰＦＧマーカー（全てＮｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓから）を含んだ。
【０１０９】
手動アルカリ溶解またはＡｕｔｏｇｅｎプロトコルいずれかによって調製したＢＡＣ  ＤＮＡを、少し修飾を施し、製造業者の推奨に従って、Ｂｉｏｐｒｉｍｅ標識キット（ＢｉｏＲａｄ）を用い、ＦＩＳＨ分析のために標識した。ほぼ２００ｎｇのＤＮＡを、各５０μｌの反応で用いた。３μｌを２％アガロースゲルで分析して、標識の程度を測定した。ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションに先立ち、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ５０スピンカラムを用い、反応を精製した。中期ＦＩＳＨは記載されているごとく行った（Ｍａら、Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔ．Ｃｅｌｌ  Ｇｅｎｅｔ．，７４：２６６−２７１（１９９６））。
【０１１０】
ＶＩ．ＢＡＣ端部配列決定
ＢＡＣインサート端部の配列決定は、前記した２つの方法のいずれかによって調製したＤＮＡを利用した。ＡｍｅｒｓｈａｍからのＤＹＥｎａｍｉｃエネルギー移動プライマーおよびＤｙｎａｍｉｃ  Ｄｉｒｅｃｔサイクル配列決定キットを配列決定反応で用いた。Ｍ１３−４０順方向配列決定プライマーを含む既製品配列決定ミックスを、Ｔ７  ＢＡＣベクター末端に用いた（カタログ番号ＵＳ７９７３０）；既製品配列決定ミックス（カタログ番号ＵＳ７９５３０）を、ＳＰ６  ＢＡＣベクター末端のために、Ｍ１３−２８逆方向配列決定プライマー（カタログ番号ＵＳ７９３３９）と混合した。配列決定反応ミックスは、４つの蛍光標識色素−プライマーのうちの１つ、４つのジデオキシ停止ミックスのうちの１つ、ｄＮＴＰ、反応緩衝液およびサーモシクエナーズを含んだ。各ＢＡＣ  ＤＮＡ試料では、３μｌのＢＡＣ  ＤＮＡ試料を４つのＰＣＲストリップ試験管にアリコットした。２μｌの４つの色素プライマー／停止ミックス組合せのうちの１つを、次いで、４つの試験管の各々に添加した。次いで、試験管をシールし、ＰＣＲに先立って軽く遠心した。サーモサイクリング条件は９５℃における１分間の変性、４５℃における１５秒間のアニーリング、および７０℃における１分間の延長であって３５合計サイクルを含んだ。サイクリングの後、プレートを軽く遠心して、全ての液体を試験管の底に集めた。次いで、５μｌの滅菌蒸留水および脱イオン水を各試験管に添加し、プレートをシールし、再度軽く遠心した。次いで、各ＢＡＣにつき４つの試料を一緒にプールした。次いで、１．５μｌの７．５Ｍ  ＮＨ４ＯＡｃおよび１００μｌの−２０℃  １００％エタノールを各試験管に添加することによって、ＤＮＡを沈殿させた。上下に１回ピペッティングすることによって試料を混合した。次いで、プレートをシールし、氷上で１０分間インキュベートした。４℃にて３０分間、プレートを４０００ｒｐｍ（３，２９０ｇ）においてテーブルトップＨａｒａｅｕｓ遠心管中で遠心してＤＮＡを回収した。上清みを取り出し、過剰の液体をペーパータオルにブロットした。１００μｌの−２０℃の７０％エタノールを各試験管に添加し、４０００ｒｐｍ（３，２９０ｇ）において４℃で１０分間再度遠心した。上清を取り出し、ペーパータオル上にブロットすることによって過剰の液体を再度除去した。プレートをペーパータオル上に逆さに置き、遠心管が８００ｒｐｍに到達するまでのみ遠心することによって、残りの痕跡量液体を除去した。次いで、試料を室温にて３０分間風乾した。電気泳動まで、試験管に蓋をし、−２０℃にて乾燥して貯蔵した。電気泳動の直後に、ＤＮＡを１．５μｌのＡｍｅｒｓｈａｍ負荷色素に溶解した。次いで、プレートをシールし、２０００ｒｐｍ（８２５ｇ）にて遠心した。次いで、プレートをプレートシェーカー上で１〜２分間攪拌した。次いで、２０００ｒｐｍ（８２５ｇ）にて試料を軽く遠心した。次いで、試料を６５℃にて２分間加熱し、直ちに氷上に置いた。製造業者の推奨に従い、標準ゲル電気泳動はＡＢＩ３７７蛍光シーケンサーで行った。
【０１１１】
ＶＩＩ．ＨＢＭ  ＢＡＣ  ＤＮＡのサブクローニングおよび配列決定
Ｚｍａｘ１遺伝子領域の物理的マップは、Ｚｍａｘ１遺伝子およびＨＢＭ遺伝子をそれらの中に含むＢＡＣクローンの組を提供する。該領域からのＢＡＣのいくつかのＤＮＡ配列決定は完了している。ＤＮＡ配列データは、当業者が用いてＺｍａｘ１遺伝子およびＨＢＭ遺伝子を同定し、または該単一の遺伝子（または複数の遺伝子）を同定するためにプローブを調製し、または該単一の遺伝子（または複数の遺伝子）を同定するＤＮＡ配列多型を同定することができるデータを含むユニークな試薬である。
【０１１２】
２つのプロトコルの１つ、ＢＡＣ  ＤＮＡのＱｉａｇｅｎ精製（生成物文献に記載されたＱｉａｇｅｎ、Ｉｎｃ．）または標準的なアルカリ溶解／プラスミドＤＮＡの塩化セシウム調製（例えばＡｕｓｕｂｅｌら、ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ（１９９７）参照）の修飾である手動精製いずれかに従ってＢＡＣ  ＤＮＡを単離した。手動プロトコルにつき簡単に述べれば、細胞をペレット化し、ＧＴＥ（５０ｍＭグルコース、２５ｍＭトリス−Ｃｌ（ｐＨ８），１０ｍＭ  ＥＤＴＡ）およびリゾチウム（５０ｍｇ／ｍｌ溶液）、続いてＮａＯＨ／ＳＤＳ（１％ＳＤＳ／０．２Ｎ  ＮａＯＨ）、および次いで３Ｍ  ＫＯＡｃ（ｐＨ４．５〜４．８）の氷冷溶液に再懸濁した。ＲｎａｓｅＡ、続いてプロテイナーゼＫおよび２０％ＳＤＳを、濾過した上清に添加した。次いでＤＮＡをイソプロパノールで沈殿させ、乾燥し、ＴＥ（１０ｍＭトリス、１ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０））に再懸濁した。塩化セシウム密度勾配遠心（Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ（１９９７））によって、ＢＡＣ  ＤＮＡをさらに精製した。
【０１１３】
単離に続き、ＨＰＬＣ（Ｈｅｎｇｅｎ，Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．，２２：２７３−２７４（１９９７））を用い、ＢＡＣ  ＤＮＡを水動力学的に２０００−３０００ｂｐのインサートサイズに剪断した。剪断後、ＤＮＡを濃縮し、標準１％アガロースゲル上で分離した。近似的サイズに対応する単一画分をゲルから切り出し、電気溶出によって精製した（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ、ＮＹ（１９８９））。
【０１１４】
次いで、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼを用い、精製されたＤＮＡ断片を平滑末端とした。次いで、平滑末端ＤＮＡを、ＢｓｔＸＩ−リンカーアダプター（１００−１０００倍モル過剰の５’ＧＴＣＴＴＣＡＣＣＡＣＧＧＧＧおよび５’ＧＴＧＧＴＧＡＡＧＡＣ）に連結した。これらのリンカーは（発明者らによって構築された）ＢｓｔＸＩ−切断ｐＭＰＸベクターに相補的であり、他方、突出は自己相補的ではなかった。従ってリンカーはコンカテマー化せず、また容易にはそれ自体切断−ベクター再連結しないであろう。リンカー−適合インサートを１％アガロースゲル上で未取り込みリンカーから分離し、ＧｅｎｅＣｌｅａｎ（ＢＩＯ１０１，Ｉｎｃ．）を用いて精製した。次いで、リンカー−適合インサートを修飾されたｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔベクターに連結して、「ショットガン」サブクローンライブラリーを構築した。ベクターは、アダプター−ダイマーがクローニングされる事象においてインフレームとなったクローニング部位においてアウトオブ−フレームｌａｃＺ遺伝子を含み、これらがその青色によって回避されるようにする。
【０１１５】
全ての引き続いての工程は、ＡＢＩ３７７自動ＤＮＡ配列決定方法による配列決定に基づくものであった。プロトコルに対する主な修飾のみを強調する。簡単に述べれば、次いで、ライブラリーをＤＨ５αコンピテント細胞に形質転換した（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ，ＤＨ５α形質転換プロトコル）。それは、アンピシリンおよびＩＰＴＧ／Ｘｇａｌを含有する抗生物質プレート上で平板培養することによって評価した。プレートを３７℃にて一晩インキュベートした。次いで、成功した形質転換体を、クローンのプレーテリングおよび配列決定のためのピッキングで用いた。培養を３７℃にて一晩増殖させた。シリカビーズＤＮＡ調製（Ｎｇら、Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．，２４：５０４５−５０４７（１９９６））方法を用い、ＤＮＡを精製した。このように、２５μｇのＤＮＡをクローン当たりに得られた。
【０１１６】
次いで、ＡＢＩ色素−ターミネーター化学を用い、これらの精製されたＤＮＡ試料を配列決定した。ＡＢＩ色素ターミネーター配列リードはＡＢＩ３７７マシーンで行い、ゲルのレーントラッキングに続き、データをＵＮＩＸマシーンに直接移した。欠陥パラメーターおよび品質スコアでのＰＨＲＡＰ（Ｐ．Ｇｒｅｎｎ，Ａｂｓｔｒａｃｔｓ  ｏｆ  ＤＯＥ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｇｒａｍ  Ｃｏｎｔｒａｃｔｏｒ−Ｇｒａｎｔｅｅ  Ｗｏｒｋｓｈｏｐ  Ｖ，Ｊａｎ．１９９６，ｐ．１５７）を用い、全てのリードを組み立てた。最初の組み立ては６倍網羅で行い、平均８〜１５ｃｏｎｔｉｇを生じた。最初の組み立てに続き、失われた接合（１つのストランドリードを与えるに過ぎないクローンからの配列）を同定し、ＡＢＩ技術で配列決定して、さらなる重複ｃｏｎｔｉｇの同定を可能とした。ウォーキングのためのプライマーは、ギャップクロージャーを促進するためのクローンの端部近くのＧｅｎｏｍｅ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  プログラムＰｉｃｋプライマーを用いて選択した。これらのウォークは、選択されたクローンおよびプライマーを用いて配列決定した。データはＰＨＲＡＰにて再度配列ｃｏｎｔｉｇに組み立てた。
【０１１７】
ＶＩＩＩ．コンピューター方法による遺伝子同定
ＢＡＣ配列のｃｏｎｔｉｇへの組み立てに続き、ｃｏｎｔｉｇをコンピューター解析に付して、コーディング領域および公知の遺伝子に対してＤＮＡ配列同様性を担う領域を同定した。このプロトコルは以下の工程を含んだ。
【０１１８】
１．ｃｏｎｔｉｇを脱ギャップする。配列ｃｏｎｔｉｇは、しばしば、個々のＡＢＩ配列リードが挿入または欠失を有する位置を表す（ピリオド記号によって示された）記号を含む。ｃｏｎｔｉｇの自動コンピューター分析に先立ち、ピリオドを除いた。元のデータを将来の参照のために維持した。
【０１１９】
２．プログラムクロスマッチ（Ｐｈｉｌ  Ｇｒｅｅｎ，ｈｔｔｐ：／／ｃｈｉｍｅｒａ．ｂｉｏｔｅｃｈ．ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ．ｅｄｕ／ＵＷＧＣ）を用いることによって、ＢＡＣベクター配列を配列内に「マスク」した。前記したショットガンライブラリーはショットガンライブラリーにいくつかのＢＡＣベクターを残すので、このプログラムを用いて、ＢＡＣ  ｃｏｎｔｉｇの配列をＢＡＣベクターと比較し、引き続いての工程に先立っていずれのベクター配列もマスクした。配列ファイル中の「Ｘ」によって、マスクした配列をマークし、引き続いての分析の間不活性なままでいた。
【０１２０】
３．ＢＡＣ配列を汚染する大腸菌配列を、ＢＡＣ  ｃｏｎｔｉｇを全大腸菌ＤＮＡ配列と比較することによってマスクした。
【０１２１】
４．ヒトゲノムにおいて共通することが知られている反復エレメントを、交差マッチを用いてマスクした。交差マッチの実行において、ＢＡＣ配列をヒト反復エレメントのデータベースと比較した（Ｊｅｒｚｙ  Ｊｅｒｋａ，Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）。マスクした反復をＸによってマークし、引き続いての分析の間不活性なままであった。
【０１２２】
５．配列内のエクソンの位置を、ＭＺＥＦコンピュータープログラムを用いて予測した（Ｚｈａｎｇ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，９４：５６５−５６８（１９９７））。
【０１２３】
６．ｂｌａｓｔｎ２アルゴリズム（Ａｌｔｓｈｕｌら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２５：３３８９−３４０２（１９９７））を用い、配列を公けに入手可能なユニジーンデータベース（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌｉｂｒａｒｙ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，３８Ａ，８Ｎ９０５，８６００  Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ  Ｐｉｋｅ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ  ２０８９４；ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｇｏｖ）と比較した。このサーチのためのパラメーターはＥ＝０．０５，ｖ＝５０，Ｂ＝５０であった（ここに、Ｅは予測された確率スコアカットオフであり、Ｖは結果の報告で戻されたデータベースの数であり、Ｂは結果の報告で戻された配列整列の数である（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５：４０３−４１０（１９９０））。
【０１２４】
７．全ての６つのリーディングフレームにつき、配列をタンパク質に翻訳し、タンパク質配列を、Ｇｅｎｐｅｐｔ  Ｓｗｉｓｓｐｒｏｔ  ＰＩＲ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌｉｂｒａｒｙ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，３８Ａ，８Ｎ９０５，８６００  Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ  Ｐｉｋｅ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ  ２０８９４；ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）から編集された非冗長タンパク質データベースと比較した。このサーチについてのパラメーターはＥ＝０．０５，ｖ＝５０，Ｂ＝５０であり、ここに、Ｅ、ＶおよびＢは前記定義に同じである。
【０１２５】
８．ｂｌａｓｔｎ２（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．，２５：３３８９−３４０２（１９９７））を用い、ＢＡＣ  ＤＮＡ配列を、（前記した）直接的選択実験に由来するｃＤＮＡクローンのデータベースと比較した。このサーチについてのパラメーターはＥ＝０．０５，Ｖ＝２５０，Ｂ＝２５０であり、ここに、Ｅ、ＶおよびＢは前記定義に同じである。
【０１２６】
９．ｂｌａｓｔｎ２（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．，２５：３３８９−３４０２（１９９７））を用い、ＢＡＣ配列を、染色体１１ｑ１２−１３上のＨＢＭ領域に由来する全ての他のＢＡＣの配列と比較した。このサーチについてのパラメーターはＥ＝０．０５，Ｖ＝５０，Ｂ＝５０であり、ここに、Ｅ、ＶおよびＢは前記定義に同じである。
【０１２７】
１０．ｂｌａｓｔｎ２（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．，２５：３３８９−３４０２（１９９７））を用い、ＢＡＣ配列を、染色体１１ｑ１２−１３上のＨＢＭ領域からのＢＡＣの端部に由来する配列と比較した。このサーチについてのパラメーターはＥ＝０．０５，Ｖ＝５０，Ｂ＝５０であり、ここに、Ｅ、ＶおよびＢは前記定義に同じである。
【０１２８】
１１．ｂｌａｓｔｎ２（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．，２５：３３８９−３４０２（１９９７））を用い、ＢＡＣ配列を、Ｇｅｎｂａｎｋデータベース（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌｉｂｒａｒｙ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，３８Ａ，８Ｎ９０５，８６００Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ  Ｐｉｋｅ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ  ２０８９４；ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）と比較した。このサーチについてのパラメーターはＥ＝０．０５，Ｖ＝５０，Ｅ＝５０であり、ここに、Ｅ、ＶおよびＢは前記定義に同じである。
【０１２９】
１２．ｂｌａｓｔｎ２（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、１９９７）を用い、ＢＡＣ配列を、Ｇｅｎｂａｎｋデータベーテ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌｉｂｒａｒｙ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，３８Ａ，８Ｎ９０５，８６００  Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ  Ｐｉｋｅ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ  ２０８９４；ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）と比較した。このサーチについてのパラメーターはＥ＝０．０５，Ｖ＝５０，Ｂ＝５０であり、ここに、Ｅ、ＶおよびＢは前記定義に同じである。
【０１３０】
１３．ｂｌａｓｔｎ２（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．，２５：３３８９−３４０２（１９９７））を用い、ＢＡＣ配列を、Ｇｅｎｂａｎｋデータベース（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌｉｂｒａｒｙ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，３８Ａ、８Ｎ９０５、８６００  Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ  Ｐｉｋｅ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ２０８９４；ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）と比較した。このサーチについてのパラメーターＥ＝０．０５，Ｖ＝２５０，Ｂ＝２５０であり、ここに、Ｅ、ＶおよびＢは前記定義に同じである。
【０１３１】
ＩＸ．直接的ｃＤＮＡ選択による遺伝子同定
骨髄、頭蓋冠骨、大腿骨、腎臓、骨格筋、睾丸および全脳から、一次親族ｃＤＮＡプールを調製した。ポリ（Ａ）＋ＲＮＡは頭蓋冠骨および大腿骨組織から調製し（Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１６２：１５６−１５９（１９８７）；Ｄ’Ａｌｅｓｓｉｏら、Ｆｏｒｃｕｓ、９：１−４（１９８７））、ｍＲＮＡの残りはＣｌｏｎｅｔｅｃｈ（ＰａｌｏＡｌｔｏ，カリフォルニア州）から購入した。同一組織からオリゴ（ｄＴ）およびランダム起点ｃＤＮＡプールを生じさせるために、１つの反応にて、２．５μｇのｍＲＮＡをオリゴ（ｄＴ）と混合し、もう１つの反応において、２．５μｇのｍＲＮＡをランダムヘキサマーと混合し、両者を製造業者の推奨に従い、第１および第２ストランドｃＤＮＡに変換した（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ）。６５℃で５分間インキュベートした１：１比率（各々１０μｇ）で混合することによって、対合したリン酸化ｃＤＮＡリンカー（後記配列参照）を一緒にアニールし、室温まで冷却した。
【０１３２】
対合したリンカーオリゴ１／２
オリゴ１：５’ＣＴＧ  ＡＧＣ  ＧＧＡ  ＡＴＴ  ＣＧＴ  ＧＡＧ  ＡＣＣ３’（配列番号１２）
オリゴ２：５’ＴＴＧ  ＧＴＣ  ＴＣＡ  ＣＧＴ  ＡＴＴ  ＣＣＧ  ＣＴＣ  ＧＡ３’（配列番号１３）
対合したリンカーオリゴ３／４
オリゴ３：５’ＣＴＣ  ＧＡＧ  ＡＡＴ  ＴＣＴ  ＧＧＡ  ＴＣＣ  ＴＣ３’（配列番号１４）
オリゴ４：５’ＴＴＧ  ＡＧＧ  ＡＴＣ  ＣＡＧ  ＡＡＴ  ＴＣＴ  ＣＧＡ  Ｇ３’（配列番号１５）
対合したリンカーオリゴ５／６
オリゴ５：５’ＴＧＴ  ＡＴＧ  ＣＧＡ  ＡＴＴ  ＣＧＣ  ＴＧＣ  ＧＣＧ３’（配列番号１６）
オリゴ６：５’ＴＴＣ  ＧＣＧ  ＣＡＧ  ＣＧＡ  ＡＴＴ  ＣＧＣ  ＡＴＡ  ＣＡ３’（配列番号１７）
対合したリンカーオリゴ７／８
オリゴ７：５’ＧＴＣ  ＣＡＣ  ＴＧＡ  ＡＴＴ  ＣＴＣ  ＡＧＴ  ＧＡＧ３’（配列番号１８）
オリゴ８：５’ＴＴＧ  ＴＣＡ  ＣＴＧ  ＡＧＡ  ＡＴＴ  ＣＡＧ  ＴＧＧ  ＡＣ３’（配列番号１９）
対合したリンカーオリゴ１１／１２
オリゴ１１：５’ＧＡＡ  ＴＣＣ  ＧＡＡ  ＴＴＣ  ＣＴＧ  ＧＴＣ  ＡＧＣ３’（配列番号２０）
オリゴ１２：５’ＴＴＧ  ＣＴＧ  ＡＣＣ  ＡＧＧ  ＡＡＴ  ＴＣＧ  ＧＡＴ  ＴＣ３’（配列番号２１）
【０１３３】
製造業者の指示に従い（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ）、リンカーを全てのオリゴ（ｄＴ）およびランダム起点ｃＤＮＡプールに連結した（下記参照）。
【０１３４】
オリゴ１／２をオリゴ（ｄＴ）および骨髄から調製したランダム起点ｃＤＮＡプールに連結した。オリゴ３／４をオリゴ（ｄＴ）および頭蓋冠骨から調製したランダム起点ｃＤＮＡプールに連結した。オリゴ５／６をオリゴ（ｄＴ）および脳および骨格筋から調製したランダム起点ｃＤＮＡプールに連結した。オリゴ７／８をオリゴ（ｄＴ）および腎臓から調製したランダム起点ｃＤＮＡプールに連結した。オリゴ１１／１２をオリゴ（ｄＴ）および大腿骨から調製したランダム起点ｃＤＮＡプールに連結した。
【０１３５】
各々、連結反応物の１μｌの１：１，１：１０および１：１００希釈を用いるＰＣＲ増幅によって、ｃＤＮＡプールを長さ分布につき評価した。ＰＣＲ反応をＰｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ９６００で行い、各２５μｌ容量反応は１μｌのＤＮＡ、１０ｍＭ  トリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、５０ｍＭ  ＫＣｌ、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．００１％ゼラチン、２００ｍＭの各ｄＮＰＴ、１０μＭプライマーおよび１ユニットＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を含有し、以下の条件：９４℃における３０秒、６０℃における３０秒および７２℃における２分での３０サイクル下で増幅した。増幅されたｃＤＮＡプールの長さ分布は、１％アガロースゲル上の電気泳動によって評価した。ランダム起点およびオリゴ（ｄＴ）起点ｃＤＮＡプールの最良の表示を与えたＰＣＲ反応を、〜２−３μｇの各ｃＤＮＡプールが生産されるようにスケールアップした。直接的選択反応についての出発ｃＤＮＡは、０．５μｇのオリゴ（ｄＴ）起点ｃＤＮＡと混合した０．５μｇのランダム起点ｃＤＮＡを含んだ。
【０１３６】
直接的ｃＤＮＡ選択手法で用いた５４のＢＡＣからのＤＮＡを、製造業者（Ｔｈｅ  Ｎｅｓｔ  Ｇｒｏｕｐ，Ｉｎｃ）によって記載されたごとく、Ｎｕｃｌｅｏｂｏｎｄ  ＡＸカラムを用いて単離した。
【０１３７】
ＢＡＣを等モルでプールし、１μｇの単離されたゲノムＤＮＡを、製造業者の指示に従い（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）、ニックトランスレーションによってビオチン１６−ＵＴＰで標識した。ビオチンの取り込みは、当業者が実施できる方法によってモニターした（Ｄｅｌ  ＭａｓｔｒｏおよびＬｏｖｅｔｔ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．，ＮＪ（１９９６））。
【０１３８】
直接的ｃＤＮＡ選択は、当業者が実施できる方法を用いて行った（Ｄｅｌ  ＭａｓｔｒｏおよびＬｏｖｅｔｔ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．、ＮＪ（１９９６））。簡単に述べれば、ｃＤＮＡプールは２つの別々の反応で多重化した。１つの反応では、ＤＮＡは骨髄、頭蓋冠骨、脳および睾丸からのｃＤＮＡプールを混合し、他の反応では、骨格筋、腎臓および大腿骨からのｃＤＮＡプールを混合した。ｃＤＮＡプールにおける反復、酵母配列およびプラスミドの抑制は２０のＣｏｔまで行った。１００ｎｇのビオチン化ＢＡＣ  ＤＮＡを抑制されたｃＤＮＡと混合し、溶液中で２００のＣｏｔまでハイブリダイズさせた。ビオチン化ＤＮＡおよび同族ｃＤＮＡをストレプトアビジン被覆常磁性ビーズ上に捕獲した。ビーズを洗浄し、一次選択ｃＤＮＡを溶出させた。ｃＤＮＡをＰＣＲ増幅し、第２ラウンドの直接選択を行った。第２ラウンドの直接選択の産物を二次選択物質という。１１ｑ１２−１３にマップされることが以前に示されているＧａｌａｎｉｎ  ｃＤＮＡクローン（Ｅｖａｎｓ，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、１８：４７３−４７７（１９９３））を用いて、２ラウンドの選択の間に豊富化をモニターした。
【０１３９】
骨髄、頭蓋冠骨、大腿骨、腎臓、骨格筋、睾丸および全脳からの二次選択物質を、以下に示すオリゴ１、３、５、７および１１の修飾されたプライマーを用いてＰＣＲ増幅し、製造業者の推奨に従い、ＵＤＧベクターｂＡＭＰ１０（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ）にクローニングした。
【０１４０】
修飾されたプライマー配列：
オリゴ１−ＣＵＡ：５’ＣＵＡ  ＣＵＡ  ＣＵＡ  ＣＵＡ  ＣＴＧ  ＡＧＣ  ＧＧＡ  ＡＴＴ  ＣＧＴ  ＧＡＧ  ＡＣＣ３’（配列番号２２）
オリゴ３−ＣＵＡ：５’ＣＵＡ  ＣＵＡ  ＣＵＡ  ＣＵＡ  ＣＴＣ  ＧＡＧ  ＡＡＴ  ＴＣＴ  ＧＧＡ  ＴＣＣ  ＴＣ３’（配列番号２３）
オリゴ５−ＣＵＡ：５’ＣＵＡ  ＣＵＡ  ＣＵＡ  ＣＵＡ  ＴＧＴ  ＡＴＧ  ＣＧＡ  ＡＴＴ  ＣＧＣ  ＴＧＣ  ＧＣＧ３’（配列番号２４）
オリゴ７−ＣＵＡ：５’ＣＵＡ  ＣＵＡ  ＣＵＡ  ＣＵＡ  ＧＴＣ  ＣＡＣ  ＴＧＡ  ＡＴＴ  ＣＴＣ  ＡＧＴ  ＧＡＧ３’（配列番号２５）
オリゴ１１−ＣＵＡ：５’ＣＵＡ  ＣＵＡ  ＣＵＡ  ＣＵＡ  ＧＡＡ  ＴＣＣ  ＧＡＡ  ＴＴＣ  ＣＴＧ  ＧＴＣ  ＡＧＣ３’（配列番号２６）
【０１４１】
各組織源からのクローン化二次選択物質を、製造業者によって推奨されるごとく、ＭＡＸ  Ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ  ＤＨ５ａコンピテント細胞（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｉｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ）に形質転換した。各形質転換した源から３８４のコロニーを拾い、４つの９６ウェルマイクロタイタープレートに整列させた。全ての二次的に選択したｃＤＮＡクローンを、Ｍ１３色素プライマーターミネーターサイクル配列決定キット（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて配列決定し、ＡＢＩ３７７自動蛍光シーケンサー（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）によってデータを収集した。ＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＸおよびＦＡＳＴＡプログラムを用い、全ての配列を分析した（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５：４０３−４１０（１９９０）、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．，２５：３３８９−３４０２（１９９７））。ｃＤＮＡ配列を、ヒト反復、ミトコンドリアＤＮＡ、リボソームＲＮＡ、大腸菌ＤＮＡに由来する配列を含むデータベースと比較して、プログラムｃｒｏｓｓ ｍａｔｃｈを用い、データセットからバックグラウンドクローンを除去した。また、既知の遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ）およびＨＢＭ領域からのＢＡＣ配列に対するプログラムＢＬＡＳＴＬ２を用い、さらなるラウンドの比較を行った。これらの配列に対して＞９０％相同であるそれらのｃＤＮＡを、結果に従って編集し、データをさらなる分析のためにデータベースに貯蔵した。同定したが、ＨＢＭ領域からのＢＡＣ配列に対して有意な同様性を有しないか、あるいはｃｒｏｓｓ ｍａｔｃｈによって排除されたｃＤＮＡ配列を、ＨＢＭ領域からのＢＡＣを含むナイロン膜にハイブリダイズさせて、それらが標的にハイブリダイズするか否かを確認した。
【０１４２】
ハイブリダイゼーション分析を用いて、ｃＤＮＡクローンを、それらを選択したＢＡＣ標的にマップした。ＨＢＭ領域から同定されたＢＡＣを整列させ、９６ウェルマイクロタイタープレートに増殖させた。２５μｇ／ｍｌカナマイシンを含有するＬＤ寒天を、９６ウェルマイクロタイタープレートの蓋に注いだ。一旦寒天が固化すれば、予め切断したＨｙｂｏｎｄ  Ｎ＋ナイロン膜（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を寒天の頂部に重ね、手で保持した９６ウェルレプリカプレーター（Ｖ＆Ｐ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｉｎｃ）を用い、二連にて、ＢＡＣを膜上にスタンプした。プレートを３７℃にて一晩インキュベートした。製造業者の推奨に従い、膜を処理した。
【０１４３】
ハイブリダイゼーションによってマップされる必要があるｃＤＮＡを、そのクローンを増幅するであろう関連プライマー（オリゴ１、３、５、７および１１）を用い、ＰＣＲ増幅した。このＰＣＲ増幅では、オリゴヌクレオチドの５’においてリンカードジゴキシゲニン分子を含むようにプライマーを修飾した。ｃＤＮＡプールの調製（前記）に記載したのと同一条件下で、ＰＣＲ増幅を行った。５μｌのＰＣＲ反応を負荷することによる１％アガロースゲルでの電気泳動によって、ＰＣＲ産物を質および量につき評価した。スタンプされたＢＡＣを含有するナイロン膜を、１０ｍｌのハイブリダイゼーション溶液（５×ＳＳＰＥ、０．５×Ｂｌｏｔｔｏ、２．５％ＳＤＳおよび１ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０））を含有する５０ｍｌコニカルチューブ中で個々にプレハイブリダイズさせた。５０ｍｌのコニカルチューブを６５℃にて２時間、ローティサリー（ｒｏｔｉｓｓｅｒｉｅ）オーブン（Ｒｏｂｂｉｎｓ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に入れた。２５ｎｇの各ｃＤＮＡを変性し、ナイロン膜およびハイブリダイゼーション溶液を含有する個々の５０ｍｌコニカルチューブに添加した。ハイブリダイゼーションを６５度にて一晩行った。以下の溶液：３×ＳＳＰＥ、０．１％  ＳＤＳ；１×ＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳおよび０．１×ＳＳＰＥ、０．１％  ＳＤＳの各々中で、フィルターを６５℃にて２０分間洗浄した。
【０１４４】
膜を５０ｍｌコニカルチューブから取り出し、皿に入れた。アセテートシートを各膜間において、それが相互に粘着するのを防いだ。製造業者の推奨（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）に従い、抗ＤＩＧ−ＡＰおよびＣＤＰ−Ｓｔａｒとの膜のインキュベーションを行った。膜をサランラップに包み、Ｋｏｄａｋ  Ｂｉｏ−Ｍａｘ  Ｘ線フィルムに１時間暴露した。
【０１４５】
Ｘ．ｃＤＮＡクローニングおよび発現分析
公けに入手可能なデータベースと比較する、直接的ｃＤＮＡ選択およびゲノムＤＮＡ配列決定によって同定した遺伝子の発現を特徴付けるために、一連の実験を行って、ＨＢＭ領域における遺伝子をさらに特徴付けた。まず、ｃＤＮＡ、ＥＳＴまたはゲノムＤＮＡがＤＮＡ分子（ｃＤＮＡライブラリー）またＲＮＡ集団から増幅できるように（ＲＴ−ＰＣＲおよびＲＡＣＥ）、ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）で用いるために、オリゴヌクレオチドプライマーを設計した。ＰＣＲプライマーをゲノムＤＮＡを含有する反応で用いて、それが、ゲノム（ＢＡＣ）配列に基づいて予測されたサイズの産物を生成したことを確認した。次いで、多数のｃＤＮＡライブラリーを、特異的ｃＤＮＡまたはＥＳＴの存在につき調べた。特定のｃＤＮＡライブラリーにおける転写ユニットの断片の存在は、同転写ユニットのさらなる部分が同様に存在するであろう高い確率を示す。
【０１４６】
新規な遺伝子を特徴付ける場合に必要な臨界的データピースは、処理された転写物またはメッシェンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）のヌクレオチドでの長さである。当業者であれば、主として、ノザンブロットハイブリダイゼーションによってｍＲＮＡの長さを決定する（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  ＮＹ（１９８９））。臨界的領域において配列決定したＢＡＣに対して有意な配列同様性を呈したＥＳＴおよび直接選択したｃＤＮＡクローンの群を、便宜のために、ほぼ３０キロベースのユニットにグループ分けした。各３０キロベースユニット内に、１以上の独立した転写ユニットよりなる、１ないし５０のＥＳＴおよび直接選択ｃＤＮＡクローンがあった。１以上のＥＳＴまたは直接選択ｃＤＮＡをハイブリダイゼーションプローブとして用いて、製造業者によって推奨される条件下で、商業的に入手可能な試薬（Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｎｏｔｈｅｒｎ  ｂｌｏｔ；Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を用い、種々の組織におけるｍＲＮＡの長さを決定した。
【０１４７】
大腿骨および頭蓋冠骨組織からの方向性クローン化ｃＤＮＡライブラリーを当業者が精通している方法によって構築した（例えば、Ｓｏａｒｅｓ  ｉｎ  Ａｕｔｏｍａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ａｎｄ  Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ａｄａｍｓ，ＦｉｅｌｄｓおよびＶｅｎｔｅｒ，Ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ、１１０−１１４頁（１９９４））。骨をまずハンマーで断片に破壊し、小片を液体窒素中で凍結し、組織パルベライザー中で粉末とした（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）。ポリトロンホモゲナイザー（Ｂｒｉｎｋｍａｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を用い、標準酸グアニジニウムチオシオネート−フェノール−クロロホルム抽出緩衝液（例えば、ＣｈｏｍｅｃｚｙｎｓｋｉおよびＳａｃｃｈｉ，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１６２：１５６−１５９（１９８７））で粉末化骨をホモゲナイズすることによって、ＲＮＡを粉末化骨から抽出した。なお、ヒト脳および肺全ＲＮＡはＣｌｏｎｔｅｃｈから購入した。ポリＡ  ＲＮＡは、製造業者の推奨（Ｄｙｎａｌ，Ｉｎｃ．）に従い、ダイナビーズ−ｄＴを用い、全ＲＮＡから単離した。
【０１４８】
配列：５’−ＡＡＣＴＧＧＡＡＧＡＡＴＴＣＧＣＧＧＣＣＧＣＡＧＧＡＡＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ−３’（配列番号２７）を持つオリゴヌクレオチドプライマーを用い、第１ストランドｃＤＮＡ合成を開始した。このプライマーはｃＤＮＡの３’末端にＮｏｔＩ制限部位（下線）を導入する。製造業者（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ）によって記載されているごとく、「ワン−チューブ」ｃＤＮＡ合成キットを用い、第１および第２ストランド合成を行った。二本鎖ｃＤＮＡをＴ４ポリヌクレオチドキナーゼで処理して、分子の端部が平滑であることを保証し（Ｓｏａｒｅｓ  ｉｎ  Ａｕｔｏｍａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ａｎｄ  Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ａｄａｍｓ，ＦｉｅｌｄｓおよびＶｅｎｔｅｒ，Ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ、１１０−１１４頁（１９９４））、次いで、Ｂｉｏｇｅｌカラム（Ｈｕｙｎｈら  ｉｎ  ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｖｏｌ．１，Ｇｌｏｖｅｒ，ＥＤ．，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，４９−７８頁（１９８５））によって、またはｓｉｚｅ−ｓｅｐ４００セファロースカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，カタログ番号２７−５１０５−０１）にて、平滑末端ｃＤＮＡをサイズした。４００塩基対またはそれ以上の長さのｃＤＮＡのみを引き続いての工程で用いた。次いで、当業者が精通した方法によって、ＥｃｏＲＩアダプター（配列：５’ＯＨ−ＡＡＴＴＣＧＧＣＡＣＧＡＧ−ＯＨ３’（配列番号２８）および５’ｐ−ＣＴＣＧＴＧＣＣＧ−ＯＨ３’（配列番号２９））を二本鎖ｃＤＮＡに連結した（Ｓｏａｒｅｓ，１９９４）。次いで、ＮｏｔＩでの消化（Ｓｏａｒｅｓ，１９９４）によって、ＥｃｏＲＩアダプターをｃＤＮＡの３’末端から除去した。次いで、ｃＤＮＡをプラスミドベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＫＳ＋（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，ＬａＪｏｌｌａ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）に連結し、当業者に精通したエレクトロポレーション方法によって（Ｓｏａｒｅｓ，１９９４）、連結された物質を大腸菌宿主ＤＨ１０ＢまたはＤＨ１２Ｓに形質転換した。３７℃における一晩の増殖の後、Ｍｅｇａ−ｐｒｅｐキット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）につき指令されているごとく処理することによってプレートを掻き取った後、ＤＮＡを大腸菌コロニーから回収した。一次形質転換体の合計数の一部を数え、平均インサートサイズおよびｃＤＮＡインサートを持たないプラスミドのパーセントを決定することによって、ｃＤＮＡライブラリーの質を見積もった。さらなるｃＤＮＡライブラリー（ヒト全脳、心臓、腎臓、白血球および胎児脳）はＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｂｅｔｈｅｓｄｅａ，ＭＤから購入した。
【０１４９】
ＨＢＭ領域：ヒト骨、ヒト脳、ヒト腎臓およびヒト骨格筋内で転写されたｃＤＮＡクローンを単離するために、ｃＤＮＡライブラリー（共にオリゴ（ｄＴ）およびランダムへキサマー（Ｌ６）起点）を用いた（全てのｃＤＮＡライブラリーは、骨格筋（ｄＴ）および腎臓（ｄＴ）ｃＤＮＡライブラリーを除いて本発明者らによって作成された）。ｃＤＮＡライブラリーの各々の４つの１０×１０アレイは以下のごとく調製した。一次形質転換体を用い、ｃＤＮＡライブラリーを２．５×１０６に滴定した。適切な容量の凍結ストックを用いて、２ＬのＬＢ／アンピシリン（１００ｍｇ／ｍｌ）を接種した。この接種した液体培養を各々４ｍｌの４００の試験管にアリコットした。各試験管はほぼ５０００ｃｆｕを含んだ。温和に攪拌しつつ、試験管を３０℃にて一晩インキュベートした。培養を０．７〜０．９のＯＤまで増殖させた。１００μｌの培養および３００μｌの８０％グリセロールをアリットすることによって、凍結ストックを培養の各々につき調製した。ストックをドライアイス／エタノール浴中で凍結し、−７０℃で貯蔵した。残りの培養は、製造業者の指示に従い、Ｑｉａｇｅｎ（Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ，ＣＡ）スピンミニプレプキットを用いて調製したＤＮＡであった。４００培養からのＤＮＡをプールして、８０行および列プールを作成した。ｃＤＮＡライブラリーは、ＰＣＲによると、注目するＨＢＭ  ｃＤＮＡクローンを含有すると判断された。マーカーは推定エクソンを増幅するように設計した。一旦標準ＰＣＲ最適化がなされ、特異的ｃＤＮＡライブラリーが注目するｃＤＮＡクローンを含むと判断されると、マーカーを用いて整列させたライブラリーをスクリーニングした。ｃＤＮＡクローンの存在を示す陽性アドレスは、同マーカーを用い、第２のＰＣＲによって確認した。
【０１５０】
一旦、ｃＤＮＡライブラリーが、ＨＢＭ領域からの注目する特異的転写体に対応するｃＤＮＡクローンを含むようであると同定されれば、それを操作して、ＥＳＴと同一のｃＤＮＡインサートまたは注目する直接選択ｃＤＮＡを含有するクローンまたは複数クローンを単離した。これは、標準「コロニースクリーニング」方法の修飾によって達成された（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  ＮＹ（１９８９））。具体的には、２０の１５０ｍＭ  ＬＢ＋アンピシリン寒天プレートを、２０，０００コロニー形成単位（ｃｆｕ）のｃＤＮＡライブラリーで広げ、コロニーを３７℃で一晩増殖させた。コロニーをナイロンフィルター（ＡｍｅｒｓｈａｍからのＨｙｂｏｎｄ、または同等物）に移し、実質的に記載されているごとく（Ｓａｍｂｒｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  ＮＹ（１９８９））、２つのフィルターを一緒にプレスすることによって複製物を調製した。次いで、「マスター」プレートをさらに６〜８時間インキュベートして、コロニーを戻し増殖させた。次いで、フィルターを順次変性溶液（０．５Ｎ  ＮａＯＨ、１．５Ｍ  ＮａＣｌ）で２分間、中和溶液（０．５Ｍトリス−Ｃｌ  ｐＨ８．０、１．５ＭｎａＣｌ）で２分間（２回）処理することによって、細菌コロニーからのＤＮＡをナイロンフィルターに付着させた。ティッシュペーパーで擦りつつ、２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳの溶液中で１分間洗浄することによって、細菌コロニーをフィルターから除去した。フィルターを風乾し、８０℃にて１〜２時間真空下に戻した。
【０１５１】
ランダムへキサマー標識（ＦｉｎｅｂｅｒｇおよびＶｏｇｅｌｓｔｅｉｎ，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｍｅ．，１３２：６−１３（１９８３））によって、または反応に遺伝子−特異的プライマーを含めランダムへキサマーを含めないことによって（小断片用）、ｃＤＮＡハイブリダイゼーションプローブを調製した。特異的活性を計算し、＞５×１０８ｃｐｍ／１０８μｇのｃＤＮＡであった。次いで、コロニー膜を、１０ｍＭトリス−Ｃｌ  ｐＨ８．０、１Ｍ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．１％ＳＤＳ中で、５５℃にて３０分間予備洗浄した。予備洗浄の後、６×ＳＳＣ、５０％脱イオン化ホルムアミド、２％ＳＤＳ、５×デンハルト溶液、および１００ｍｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡの＞２ｍｌ／フィルター中にて、フィルターを４２℃にて３０分間プレハイブリダイズさせた。次いで、フィルターを、変性α３２Ｐ−ｄＣＴＰ−標識ｃＤＮＡプローブを含有するハイブリダイゼーション溶液（６×ＳＳＣ、２％ＳＤＳ、５×デンハルト、１００ｍｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡ）に移し、４２℃にて１６〜１８時間インキュベートした。
【０１５２】
１６〜１８時間のインキュベーションの後、室温にて２０分間、フィルターを２×ＳＳＣ、２％ＳＤＳ中で一定撹拌下で洗浄し、続いて、各々６５℃にて１５分間２回洗浄した。第２の洗浄は０．５×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ中で６５℃にて１５分間行った。次いで、フィルターをプラスチックラップに包み、ラジオグラフィーフィルムに数時間ないし一晩暴露した。フィルムを現像した後、アンピシリンを含有するＬＢブロスの１ｍｌ溶液中に拾うことができるように、プレート上の個々のコロニーをオートラジオグラフと整列させた。３７℃にて１〜２時間震盪した後、溶液のアリコットを二次スクリーニングのために１５０ｍｍ上で平板培養した。二次スクリーニングは、個々のコロニーがピッキングのために明瞭に同定されるように、それを〜２５０コロニーを含有するプレート上で行う以外は、一次スクリーニング（前記）と同一であった。
【０１５３】
放射性標識プローブでのコロニースクリーニングがｃＤＮＡクローンを生じた後、制限エンドヌクレアーゼ切断、ＰＣＲおよび直接的配列決定によってクローンを特徴付けて、元のプローブおよび単離されたクローンの間の配列同一性を確認した。全長ｃＤＮＡを得るために、同定したクローンの端部からの新規な配列を用いて、ライブラリーを再度プローブした。クローニングしたｃＤＮＡの長さがノザンブロット分析により全長であると見積もられたものとマッチするまで、このプロセスを反復した。
【０１５４】
ＲＴ−ＰＣＲをもう１つの方法として用いて、全長クローンを単離した。「Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  Ｏｎｅ  Ｓｔｅｐ  ＲＴ−ＰＣＲ」キット（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を用い、ｃＤＮＡを合成し、増幅した。該手法は１．５μｇのＲＮＡを以下の、ＭｇＳＯ４およびｄＮＴＰを含む所有緩衝液ミックスである提供された２５μｌの反応ミックス、１μｌのセンスプライマー（１０μＭ）および１μｌのアンチセンスプライマー（１０μＭ）、１μｌの逆転写酵素および提供されたＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼミックスならびに５０μｌの全反応ミックスまでのオートクレーブ処理水に添加することを含んだ。次いで、予測された産物キロベース当たり、１５ないし３０分間の５０℃、次いで１５秒間の９４℃、３０秒間の５５〜６０℃および１分間の６８〜７２℃における１サイクルにて、および最後に５〜１０分間の７２℃の１サイクルにて、反応物をサーモサイクラーに入れた。試料をアガロースゲルで分析した。産物をゲルから切り出し、ゲルから精製した（ＧｅｎｅＣｌｅａｎ，Ｂｉｏ１０１）。精製された産物をｐＣＴＮＲ（Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｃｏｎｔｒａｃｔｏｒ  ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ、５  Ｐｒｉｍｅ−３Ｐｒｉｍｅ、Ｉｎｃ．）でクローニングし、配列決定して、クローンが注目する遺伝子に対して特異的であることを確認した。
【０１５５】
候補遺伝子の５’および３’末端をクローニングするための方法として、Ｍａｒａｔｈｏｎ  ｃＤＮＡ増幅キット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）を用い、製造業者の指示に従い、ｃＤＮＡ端部の迅速増幅（ＲＡＣＥ）を行った。第１ストランド合成を行うことによって、ｃＤＮＡプールを全ＲＮＡから調製し、ここに、全ＲＮＡ試料の試料を修飾されたオリゴ（ｄＴ）プライマーと混合し、７０℃まで加熱し、氷上で冷却し、続いて５×第１ストランド緩衝液、１０ｍＭ  ｄＮＴＰミックスおよびＡＭＶ逆転写酵素（２０Ｕ／μｌ）を添加した。試験管を４２℃にて１時間インキュベートし、次いで、反応試験管を氷上に置いた。第２のストランド合成では、以下の成分を反応試験管に直接添加し、５×第２ストランド緩衝液、１０ｍＭ  ｄＮＴＰミックス、滅菌水、２０×第２ストランド酵素カクテル、反応試験管を１６℃にて１．５時間インキュベートした。Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼを反応試験管に添加し、１６℃にて４５分間インキュベートした。第２ストランド合成は、ＥＤＴＡ／Ｇｌｙｃｏｇｅｎミックスの添加によって停止させた。試料をフェノール／クロロホルム抽出および酢酸アンモニウム沈殿に付した。サイズ分布につきアガロースゲル上で分析することによって、ｃＤＮＡプールを質につきチェックした。次いで、Ｍａｒａｔｈｏｎ  ｃＤＮＡアダプター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）をｃＤＮＡ末端に連結した。特異的アダプターは、選択された遺伝子特異的プライマー（ＧＳＰ）の向きに依存して、５’または３’末端いずれかの増幅を可能とするプライマー部位を含んだ。二本鎖ｃＤＮＡのアリコットを以下の試薬に添加した。１０μＭ  Ｍａｒａｔｈｏｎ  ｃＤＮＡアダプター、５×ＤＮＡ連結緩衝液、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ。反応を１６℃にて一晩インキュベートした。反応を加熱不活化させて反応を停止した。ＰＣＲは以下のものを希釈された二本鎖ｃＤＮＡプールに添加することによって行った。１０×ｃＤＮＡ、ＰＣＲ反応緩衝液、１０μＭ  ｄＮＴＰミックス、１０μＭ  ＧＳＰ、１０μＭ  ＡＰ１プライマー（キット）、５０×Ａｄｖａｎｔａｇｅ  ｃＤＮＡポリメラーゼミックス。熱サイクリング条件は３０秒間の９４℃、５サイクルでの５秒間の９４℃、４分間の７２℃、５サイクルでの５秒間の９４℃、４分間の７０℃、２３サイクルでの５秒間の９４℃、４分間の６８℃であった。ＧＳＰを用いて第１ラウンドのＰＣＲを行って、アダプターの末端を延長し、アダプタープライマー結合部位を作り出した後、注目する特異的ｃＤＮＡの指数関数的増幅が観察された。通常、第２ネステッドＰＣＲを行って、特異的ｃＤＮＡを確認した。ＲＡＣＥ産物をアガロースゲルで分析し、次いで、ゲルから切り出し精製した（ＧｅｎｅＣｌｅａｎ、ＢＩＯ１０１）。次いで、ＲＡＣＥ産物をｐＣＴＮＲ（Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｃｏｎｔｒａｃｔｏｒ  ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｓｙｔｅｍ  ５’−３’，ｉｎｃ．）にクローニングし、ＤＮＡ配列を決定して、クローンが注目する遺伝子に対して特異的であることを確認した。
【０１５６】
ＸＩ．突然変異分析
前記した手法を用い、比較遺伝子を同定し、各遺伝子からのエクソンを突然変異検出分析に付した。比較ＤＮＡ配列決定を用いて、染色体１１ｑ１２−１３からのＨＢＭ候補遺伝子における多型を同定した。候補遺伝子についてのＤＮＡ配列は、患者のリンパ芽球細胞系から増幅した。
【０１５７】
本発明者らは、原因となる多型につきサーチするために、候補領域から増幅したＰＣＲ産物の直接的ＤＮＡ配列決定の分析に基づく方法を開発した。該手法は、多型分離を見出すためのＨＢＭ家族の異なるサブセットおよび多型の頻度を評価するための集団パネルを用いた３つの段階よりなるものであった。家族資源は単一創始者に由来し、全ての罹患個体は同一の原因となる多型を共有するであろうという仮定に導く。
【０１５８】
まず、祖先、娘、および彼女の母親、父親および兄弟よりなるＨＢＭ家族のサブセットにおいて候補領域をスクリーニングした。モノ染色体参照配列を同時に生じさせ、比較のために用いた。母親および娘はこの核家族においてＨＢＭ多型を運び、多型伝播をモニターする能力を供する。正味の結果は、２つのＨＢＭ染色体および６つの非ＨＢＭ染色体がスクリーニングされたということである。これは、多数の頻繁な対立遺伝子の排除を可能とした。罹患個体に専ら存在する対立遺伝子のみを次のレベルの分析に回した。
【０１５９】
次いで、この元の家族におけるＨＢＭ表現型で専ら分離した多型を、２つのさらなる核家族よりなるＨＢＭ親族の拡大された部分で再び調べた。これらの家族は５人のＨＢＭおよび３人の未罹患個体よりなるものであった。この群におけるＨＢＭ個体は２人の臨界的交差個体を含み、臨界的領域の動原体および末端小粒境界を供する。これらの個体およびそれらの罹患親の間の多型の遺伝を追跡すると、臨界的領域のさらなる改良を可能とした。この群はスクリーニングしたＨＢＭ染色体の合計を７とし、非ＨＢＭ染色体の合計を１７とした。
【０１６０】
与えられた多型が拡大された群においてＨＢＭ表現型で専ら分離し続ける場合、次いで、集団パネルを調べた。８４の人のこのパネルは、正常骨ミネラル密度を有することが知られている４２個体およびタイプ分けされていない骨ミネラル密度以外は関係がないことが知られている４２個体よりなるものであった。正常な骨ミネラル密度はＢＭＤ  Ｚスコア０の２標準偏差内である。第２の群は広く用いられる個体のＣＥＰＨパネルからのものであった。この集団では稀なことが判明しているいずれの分離多型も、引き続いて、全ＨＢＭ親族およびより大きな集団について調べた。
【０１６１】
ポリメラーゼ鎖で反応（ＰＣＲ）を用いて、ＨＢＭ家族のＤＮＡおよびモノ染色体対照から配列決定鋳型を生じさせた。１１ｑ１２−１３上のＨＢＭ領域内の遺伝子の酵素的増幅は、各エクソンを近接挟むオリゴヌクレオチドならびに各遺伝子の推定５’調節エレメントでのＰＣＲを用いて達成された。プライマーを選択して、各エクソン、ならびにスプライスのいずれか側の各イントロン内の１５以上塩基対を増幅させた。全てのＰＣＲプライマーをキメラとして、色素プライマー配列決定を容易とした。Ｍ１３−２１Ｆ（５’−ＧＴＡ  Ａ  ＣＧＡ  ＣＧＧ  ＣＣＡ  ＧＴ−３’（配列番号３０）および２８ＲＥＶ（５’−ＡＡＣ  ＡＧＣ  ＴＡＴ  ＧＡＣ  ＣＡＴ  Ｇ−３’（配列番号３１）プライマー結合部位を、合成の間に、各々、順方向および各逆方向ＰＣＲプライマーの５’末端に対して形成させた。１５０ｎｇのゲノムＤＮＡを、２Ｕ  ＡｍｐｌｉＴａｑ，５００ｎＭプライマーおよび１２５μＭ  ｄＮＴＰでの５０μｌのＰＣＲで用いた。緩衝液およびサイクリング条件は各プライマーセットに対して特異的であった。ＴａｑＳｔａｒｔ抗体（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を熱開始ＰＣＲで用いて、プライマーダイマーの形成を最小化した。生成物の１０％をアガロースゲルで調べた。配列決定前に、適当な試料を脱イオン水で１：２５希釈した。
【０１６２】
標準的なＥｎｅｒｇｙ  Ｔｒａｎｓｆｅｒプライマー（Ａｍｅｒｓｈａｍ）プロトコルに従い、各ＰＣＲ産物を配列決定した。全ての反応は９６ウェルトレイで起こった。４つの別々の反応（Ａ、Ｃ、ＧおよびＴにつき各１つ）を各鋳型で行った。各反応は２μｌの配列決定反応ミックスおよび３μｌの希釈された鋳型を含んだ。次いで、プレートをホイルテープで熱シールし、熱サイクラーに入れ、製造業者の推奨に従ってサイクルさせた。サイクリングの後、４つの反応をプールした。３μｌのプールした産物を新しい９６ウェルプレートに移し、１μｌの製造業者の負荷色素を各ウェルに添加した。全ての９６ウェルピペット操作は、Ｈｙｄｒａ９６ピペッティングステーションで行った（Ｒｏｂｂｉｎｓ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＵＳＡ）。１μｌのプールした物質を、ＡＢＩ３７７  ＤＮＡシーケンサーで行う４８レーンゲルに直接１０時間（２．４ｋＶラン）負荷した。
【０１６３】
Ｐｏｌｙｐｈｒｅｄ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ）を用いて、Ｃｏｎｓｅｄ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ）で考慮するために、配列組を組み立てた。配列は、全ての関連家族メンバーを表す群および特定の標的領域についての対照で組み立てた。これは、３段階の各々につき別々に行った。モノ染色体鋳型および色注釈参照配列からのリードと共に、順方向および逆方向リードを各個体のために含めた。Ｐｏｌｙｐｈｒｅｄは、紫色旗にて潜在的多型部位を示した。２の読み手は独立して各組立体を観察し、紫色旗部位の有効性を評価した。
【０１６４】
成熟ｍＲＮＡに存在する合計２３のエクソンおよび一次転写体のいくつかの他の部分を、２のＨＢＭ−罹患および２の未罹患個体の核家族におけるヘテロ接合性につき評価した。以下の表に示すごとく、２５ＳＮＰが同定された。
【０１６５】
【表４】
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【０１６６】
表４に掲げた多型に加え、２つのさらなる多型が配列番号２で存在し得る。配列番号２の位置２００２に変化がある。グアニンまたはアデニンいずれかがこの位置に出現し得る。この多型はサイレントであって、アミノ酸配列のいずれの変化にも関係しない。第２の変化は、シトシン（Ｃ）からチミン（Ｔ）への変化において対応する配列番号２の位置４０５９におけるものである。この多型の結果、対応するアミノ酸がバリン（Ｖ）からアラニン（Ａ）に変化する。他の多型は候補遺伝子エクソンおよび隣接イントロン配列で見出された。表４にリストした多型のいずれか１つまたは組み合わせあるいは前記した２つもまた、配列番号２に存在する場合には骨量に対してわずかな効果を有し得る。
【０１６７】
本発明は、前記同定された点突然変異を持つ配列番号１の核酸配列を有する核酸配列を含む。
【０１６８】
好ましくは、本発明は配列番号２の核酸を含む。具体的には、Ｚｍａｘ１（ＨＢＭ遺伝子）のコーディング配列における位置５８２でＧからＴに変化する塩基対置換が全てのＨＢＭ個体でヘテロ接合として同定され、未罹患個体（すなわち、ｂ５２７ｄ１２−ｈ Ｃｏｎｔｉｇ０８７Ｃ １．ｎｔ）では見出されなかった。図５はＢ５２７Ｄ１２におけるｃｏｎｔｉｇの順番を示す。ＨＢＭ遺伝子についての転写の方向は左から右である。Ｂ５２７Ｄ１２のｃｏｎｔｉｇ３０８Ｇの配列は、ＨＢＭ領域に対してコーディング領域の逆相補体である。従って、ＣからＡへの塩基変化置換として表４に示されたｃｏｎｔｉｇ３０８Ｇにおける相対的多型は、ＨＢＭ遺伝子におけるＧからＴへの置換に対して相補体である。この突然変異はグリシン１７１のバリンでの置換を引き起こす（Ｇ１７１Ｖ）。
【０１６９】
個体の異なる群のＤＮＡ配列を調べることによって、ＨＢＭ多型を確認した。ＨＢＭ親族の全てのメンバー（３８個体）において、ＨＢＭ多型は罹患（すなわち、上昇した骨密度）個体のみ（Ｎ＝１８）においてヘテロ接合形態で観察された。未罹患親族（Ｎ＝２０）（ＢＭＤＺ＜２．０）において、ＨＢＭ多型は決して観察されなかった。この多型がＨＢＭ親族の外の個体で観察されるか否かを判断するために、２９７の表現型分けされた個体をＨＢＭ遺伝子の部位において特徴付けた。ＨＢＭ多型の部位においていずれもヘテロ接合性ではなかった。未表現型分け対照群にて、６４の個体のうち、位置５８２でヘテロ接合性であると観察されたものはなかった。一緒に考えると、これらのデータは、高骨量表現型を呈する家系で観察された多型がＺｍａｘ１の位置５８２におけるＧ＜Ｔ多型と強く相関することを証明する。さらに、後記するＡＳＯ結果とカップリングさせたこれらの結果は、ＨＢＭ多型がＨＢＭ表現型と共に遺伝的に分離し、ＨＢＭ多型および表現型双方は一般的集団では稀であることを確立する。
【０１７０】
ＸＩＩ．対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）分析
注目するエクソンに特異的なプライマーを用い、ＨＢＭ１多型を含むアンプリコンをＰＣＲ増幅した。個体の適当な集団を、以下のごとく９６ウェルマイクロタイタープレートでＰＣＲ増幅した。１×Ｐｒｏｍｅｇａ  ＰＣＲ緩衝液（１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２を含有するカタログ番号Ｍ１８８３）、１００ｍＭ  ｄＮＴＰ、２００ｎＭ  ＰＣＲプライマー（１８６３Ｆ：ＣＣＡＡＧＴＴＣＴＧＡＧＡＡＧＴＣＣおよび１８６４Ｒ：ＡＡＴＡＣＣＴＧＡＡＡＣＣＡＴＡＣＣＴＧ）、１Ｕ  Ａｍｐｌｉｔａｑ、および２０ｎｇのゲノムＤＮＡを含有するＰＣＲ反応（２０μｌ）を調製し、以下のＰＣＲ条件：９４℃、１分、（９４℃、３０秒；５８℃、３０秒；７２℃、１分）×３５サイクル）、７２℃、５分、４℃で、保持下で増幅した。次いで、負荷色素を添加し、１μｇ／ｍｌ臭化エチジウムを含有する１．５％アガロースゲルにて、１００〜１５０Ｖで５〜１０分間、１０μｌの産物を電気泳動に付した。ゲルを変性溶液（１．５Ｍ  ＮａＣｌ，０．５Ｎ  ＮａＯＨ）中で２０分間処理し、水で軽くすすいだ。次いで、ゲルを１Ｍトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１．５Ｍ  ＮａＣｌ中で２０分間中和し、水ですすいだ。ゲルを１０×ＳＳＣ中に２０分間浸漬し、１０×ＳＳＣにてナイロン移動膜（Ｈｙｂｏｎｄ  Ｎ＋−Ａｍｅｒｓｈａｍ）に一晩でブロットさせた。フィルターを６×ＳＳＣ中で１０分間すすぎ、ＵＶ架橋させた。
【０１７１】
対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）は、ほぼ中央に多型を持つように設計した。オリゴヌクレオチドは５’末端がリン酸がなく、Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬから購入した。オリゴヌクレオチドの配列は：
２３２６Ｚｍａｘ１．ＡＳＯ．ｇ：ＡＧＡＣＴＧＧＧＧＴＧＡＧＡＣＧＣ
２３２７Ｚｍａｘ１．ＡＳＯ．ｔ：ＣＡＧＡＣＴＧＧＧＴＴＧＡＧＡＣＧＣＣである。多型ヌクレオチドには下線を施す。オリゴを標識するために、１．５μｌの１μｇ／μｌのＡＳＯオリゴ（２３２６．Ｚｍａｘ１．ＡＳＯ．ｇまたは２３２７．Ｚｍａｘ１．ＡＳＯ．ｔ）、１１μｌのｄｄＨ２Ｏ、２μｌの１０×キナーゼ順方向緩衝液、５μｌのγ３２Ｐ−ＡＴＰ（６０００Ｃｉ／ｍモル）および１μｌのＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（１０Ｕ／μｌ）を混合し、反応を３７℃にて３０〜６０分間インキュベートした。次いで、反応を９５℃にて２分間置き、３０ｍｌのＨ２Ｏを添加した。Ｇ２５マイクロスピンカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用い、プローブを精製した。
【０１７２】
１０ｍｌの５×ＳＳＰＥ、５×デンハルト、２％ＳＤＳおよび１００μｇ／ｍｌの変性され超音波処理されたサケ精子ＤＮＡ中で、ブロットを４０℃にて２時間プレハイブリダイズさせた。次いで、キナーゼ処理したオリゴの全反応ミックスを１０ｍｌの新鮮なハイブリダイゼーション緩衝液（５×ＳＳＰＥ、５×デンハルト、２％ＳＤＳ）に添加し、４０℃にて少なくとも４時間ないし一晩ハイブリダイズさせた。
【０１７３】
全ての洗浄は５×ＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳで行った。最初の洗浄は４５℃において１５分間であり；次いで、溶液を交換し、フィルターを５０℃にて１５分間洗浄した。次いで、フィルターを、２つの増感スクリーンを備えたＫｏｄａｋバイオマックスフィルムに−７０℃にて１５分ないし１時間暴露した。要すれば、フィルターを５５℃にて１５分間洗浄し、再度フィルムに暴露した。沸騰する０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中で１０分間少なくとも３回洗浄することによって、フィルターをストリップした。
【０１７４】
それをＡｄｏｂｅ  ＰｈｏｔｏＳｈｏｐに走査することによって、２ＡＳＯで対立遺伝子特異的アッセイを最良に捕獲した２つのフィルムをデジタルイメージに変換した。これらのイメージをＧｒａｐｈｉｃ  Ｃｏｎｖｅｒｔｅｒにおいて相互に重ね、次いで、スコア取りし、ＦｉｌｅＭａｋｅｒ  Ｐｒｏ４．０に貯蔵した（図９参照）。
【０１７５】
人種的に多様な集団におけるＨＢＭ１対立遺伝子頻度を測定するために、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）方法によって、種々の人種群からの６７２のランダム個体をタイプ分けした。この集団は９６のＣＥＰＨ祖父母（主として白人）、１９２の白人、１９２のアフリカ人−アメリカ人、９６人のヒスパニック、および９６人のアジア個体を含んだ。これらの個体のいずれにおいてもＨＢＭ１多型の存在について証拠は得られなかった。総じて、合計９１１の個体を直接配列決定またはＡＳＯハイブリダイゼーションいずれかによってタイプ分けした。全てはＨＢＭ多型の部位においてホモ接合ＧＧであった（図１４）。この情報は、ＨＢＭ１対立遺伝子が種々の人種集団において稀であることを示す。
【０１７６】
従って、本発明は、ＨＢＭ１対立遺伝子を持つ個体を同定する迅速な方法を提供する。この方法は、骨粗鬆症または他の骨障害に対する罹患性についての個体の診断およびスクリーニングの分野で用いることができよう。該アッセイは、ＨＢＭ１対立遺伝子または本明細書中に記載するさらなる多型を持つさらなる個体を同定するのに用いることができる。
【０１７７】
ＸＩＩＩ．Ｚｍａｘ１の細胞位置
Ａ．非アイソトープｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによるラット脛骨における遺伝子発現
ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションはＰａｔｈｏｌｏｇｙ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（ＰＡＩ）、Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ、ＭＤによって行った。この研究は、骨成長および再形成の分野に対する特定の強調を持って、ラット骨においてＺｍａｘ１遺伝子を発現する特異的細胞型を測定するために企画した。この研究で用いたＺｍａｘ１プローブは、８７％配列同一性を有するヒト（ＨｕＺｍａｘ１）およびマウス（ＭｓＺｍａｘ１）ｃＤＮＡから生じさせたものであった。ヒトおよびマウスＺｍａｘ１のラットＺｍａｘ１との相同性は未知である。
【０１７８】
例えば、非アイソトープｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによる遺伝子発現は、以下のごとく行ったが、他の方法は当業者に知られているであろう。脛骨は、二酸化炭素窒息によって安楽死させた２匹の６ないし８週齢雌Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙラットから収集した。末端側端部を取り出し、基部側脛骨を、死亡直後に液体窒素でＯＣＴ埋没媒体中でスナップ凍結させた。組織は−８０℃フリーザーに貯蔵した。
【０１７９】
ｃＤＮＡからのＰＣＲ産物を増幅させるためのプローブは以下のように調製した。ヒトＬＲＰ５（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＢＯ１７４９８）およびマウスＬＲＰ５（Ｇｅｎｂａｎｋ  受託番号ＡＦＯ６４９８４）双方の公開された配列を用い、ｃＤＮＡクローンからのＰＣＲ産物を増幅させるためのプライマーを選択した。ＬＤＬ受容体家族における他の遺伝子との交差反応性を最小化するために、ＰＣＲ産物はタンパク質コーディング領域の細胞内部分から由来したものであった。ＰＣＲはｃＤＮＡクローンを鋳型として用いて５０μｌ反応容量で行った。ＰＣＲ反応は１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ユニットＡｍｐｌｉｔａｑ、２００μＭ  ｄＮＴＰおよび２μＭ各プライマーを含有した。ＰＣＲサイクリング条件は１分間の９４℃、続いての、３５サイクルの３０秒間の９４℃、３０秒間の５５℃、３０秒間の７２℃；続いての７２℃における５分間の延長であった。次いで、反応を１．５％アガローストリス−アセテートゲルで行った。ＤＮＡをアガロースから溶出させ、エタノール沈殿させ、１０ｍＭトリス、ｐＨ８．０に再懸濁した。ゲル精製ＰＣＲ産物はマウスおよびヒトｃＤＮＡ双方につき調製し、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションのためにＰａｔｈｏｌｏｇｙ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌに送付した。
【０１８０】
ヒトおよびマウスＰＣＲプライマーおよび産物の配列は以下の通りであった。
ヒトＺｍａｘ１センスプライマー（ＨＢＭ１２５３）
ＣＣＣＧＴＧＴＧＣＴＣＣＧＣＣＧＣＣＣＡＧＴＴＣ
ヒトＺｍａｘ１アンチセンスプライマー（ＨＢＭ１４６５）
ＧＧＣＴＣＡＣＧＧＡＧＣＴＣＡＴＣＡＴＧＧＡＣＴＴ
ヒトＺｍａｘ１  ＰＣＲ産物
ＣＣＣＧＴＧＴＧＣＴＣＣＧＣＣＧＣＣＣＡＧＴＴＣＣＣＣＴＧＣＧＣＧＣＧＧＧＧＴＣＡＧＴＧＴＧＴＧＧＡＣＣＴＧＣＧＣＣＴＧＣＧＣＴＧＣＧＡＣＧＧＣＧＡＧＧＣＡＧＡＣＴＧＴＣＡＧＧＡＣＣＧＣＴＣＡＧＡＣＧＡＧＧＴＧＧＡＣＴＧＴＧＡＣＧＣＣＡＴＣＴＧＣＣＴＧＣＣＣＡＡＣＣＡＧＴＴＣＣＧＧＴＧＴＧＣＧＡＧＣＧＧＣＣＡＧＴＧＴＧＴＣＣＴＣＡＴＣＡＡＡＣＡＧＣＡＧＴＧＣＧＡＣＴＣＣＴＴＣＣＣＣＧＡＣＴＧＴＡＴＣＧＡＣＧＧＣＴＣＣＧＡＣＧＡＧＣＴＣＡＴＧＴＧＴＧＡＡＡＴＣＡＣＣＡＡＧＣＣＧＣＣＣＴＣＡＧＡＣＧＡＣＡＧＣＣＣＧＧＣＣＣＡＣＡＧＣＡＧＴＧＣＣＡＴＣＧＧＧＣＣＣＧＴＣＡＴＴＧＧＣＡＴＣＡＴＣＣＴＣＴＣＴＣＴＣＴＴＣＧＴＣＡＴＧＧＧＴＧＧＴＧＴＣＴＡＴＴＴＴＧＴＧＴＧＣＣＡＧＣＧＣＧＴＧＧＴＧＴＧＣＣＡＧＣＧＣＴＡＴＧＣＧＧＧＧＧＣＣＡＡＣＧＧＧＣＣＣＴＴＣＣＣＧＣＡＣＧＡＧＴＡＴＧＴＣＡＧＣＧＧＧＡＣＣＣＣＧＣＡＣＧＴＧＣＣＣＣＴＣＡＡＴＴＴＣＡＴＡＧＣＣＣＣＧＧＧＣＧＧＴＴＣＣＣＡＧＣＡＴＧＧＣＣＣＣＴＴＣＡＣＡＧＧＣＡＴＣＧＣＡＴＧＣＧＧＡＡＡＧＴＣＣＡＴＧＡＴＧＡＧＣＴＣＣＧＴＧＡＧＣＣ
マウスＺｍａｘ１センスプライマー（ＨＢＭ１６５５）
ＡＧＣＧＡＧＧＣＣＡＣＣＡＴＣＣＡＣＡＧＧ
マウスＺｍａｘ１アンチセンスプライマー（ＨＢＭ１６５６）
ＴＣＧＣＴＧＧＴＣＧＧＣＡＴＡＡＴＣＡＡＴ
マウスＺｍａｘ１  ＰＣＲ産物
ＡＧＣＡＧＡＧＣＣＡＣＣＡＴＣＣＡＣＡＧＧＡＴＣＴＣＣＣＴＧＧＡＧＡＣＴＡＡＣＡＡＣＡＡＣＧＡＴＧＴＧＧＣＴＡＴＣＣＣＡＣＴＣＡＣＧＧＧＴＧＴＣＡＡＡＧＡＧＧＣＣＴＣＴＧＣＡＣＴＧＧＡＣＴＴＴＧＡＴＧＴＧＴＣＣＡＡＣＡＡＴＣＡＣＡＴＣＴＡＣＴＧＧＡＣＴＧＡＴＧＴＴＡＧＣＣＴＣＡＡＧＡＣＧＡＴＣＡＧＣＣＧＡＧＣＣＴＴＣＡＴＧＡＡＴＧＧＧＡＧＣＴＣＡＧＴＧＧＡＧＣＡＣＧＴＧＡＴＴＧＡＧＴＴＴＧＧＣＣＴＣＧＡＣＴＡＣＣＣＴＧＡＡＧＧＡＡＴＧＧＣＴＧＴＧＧＡＣＴＧＧＡＴＧＧＧＣＡＡＧＡＡＣＣＴＣＴＡＴＴＧＧＧＣＧＧＡＣＡＣＡＧＧＧＡＣＣＡＡＣＡＧＧＡＴＴＧＡＧＧＴＧＧＣＣＣＧＧＣＴＧＧＡＴＧＧＧＣＡＧＴＴＣＣＧＧＣＡＧＧＴＧＣＴＴＧＴＧＴＧＧＡＧＡＧＡＣＣＴＴＧＡＣＡＡＣＣＣＣＡＧＧＴＣＴＣＴＧＧＣＴＣＴＧＧＡＴＣＣＴＡＣＴＡＡＡＧＧＣＴＡＣＡＴＣＴＡＣＴＧＧＡＣＴＧＡＧＴＧＧＧＧＴＧＧＣＡＡＧＣＣＡＡＧＧＡＴＴＧＴＧＣＧＧＧＣＣＴＴＣＡＴＧＧＡＴＧＧＧＡＣＣＡＡＴＴＧＴＡＴＧＡＣＡＣＴＧＧＴＡＧＡＣＡＡＧＧＴＧＧＧＣＣＧＧＧＣＣＡＡＣＧＡＣＣＴＣＡＣＣＡＴＴＧＡＴＴＡＴＧＣＣＧＡＣＣＡＧＣＧＡ
【０１８１】
リボプローブは以下のごとく合成した。Ｔ３プロモーターを再増幅産物の上流に、またはＴ７プロモーターを再増幅産物の下流いずれかに取り込むように設計されたキメラプライマーでＰＣＴ産物を再増幅した。得られたＰＣＲ産物を鋳型として用いて、インビトロ転写（ＩＶＴ）によってジゴキシゲニン−標識リボプローブを合成した。製造業者に従い、ＭＡＸＩｓｃｒｉｐｔ  ＩＶＴキット（Ａｍｂｉｏｎ）を用い、ジゴキシゲニン−１１−ＵＴＰ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ）の存在下にて、各々、Ｔ７およびＴ３  ＲＮＡポリメラーゼを用い、アンチセンスおよびセンスリボプローブを合成した。次いで、該ＤＮＡをＤｎａｓｅ−１で分解し、取り込まれなかったジゴキシゲニンを限外濾過によって除去した。変性ポリアクリルアミドゲルを通す電気泳動によって、リボプローブ一体性を評価した。分子のサイズを１００〜１０００塩基対（ｂｐ）ＲＮＡラダー（Ａｍｂｉｏｎ）の電気泳動を移動度と比較した。プローブ収率および標識はブロット免疫化学によって評価した。リボプローブは−８０℃にて５μｌアリコットに貯蔵した。
【０１８２】
ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションは以下のごとく行った。凍結したラット骨をＪｕｎｇ  ＣＭ３０００クリオスタット（Ｌｅｉｃａ）にて５μＭセクションに切断し、接着スライド（Ｉｎｓｔｒｕｍｅｄｉｃｓ）にマウントした。全てのスライドを調製して、後−固定に先立つｍＲＮＡ分解を４％パラホルムアルデヒド中にて１５分間妨げるまで、セクションを−２０℃のクリオスタットに保持した。後−固定に続き、Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（ＰＡＩ）が誂えたハイブリダイゼーション緩衝液中で、セクションを１ｎｇ／μｌのアンチセンスまたはセンスリボプローブと共に５８℃にてほぼ４０時間インキュベートした。ハイブリダイゼーションに続き、スライドを一連の後−ハイブリダイゼーションストリンジェンシー洗浄に付して、非特異的プローブ結合を減少させた。アルカリ性ホスファターゼにコンジュゲートした抗−ジゴケシゲンン抗体（ＦＡＢ断片）での免疫組織化学によって、ハイブリダイゼーションを可視化した。塩化ニトロブルーテトラゾリウム／リン酸ブロモクロロインドリル（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ）、沈殿するアルカリ性ホスファターゼ基質を発色団として用いて、染色の程度に応じて、ハイブリダイズする細胞を紫色ないしほぼ黒色に染色した。組織切片を核ファーストレッドで逆染色した。アッセイ対照はプローブの省略、プローブおよび抗−ジゴキシゲニン抗体の省略を含んだ。
【０１８３】
ｍＲＮＡのための陽性ハイブリダイゼーションシグナルを示す紫色ないし黒色質および／または核周辺染色を可視化することによって、特異的細胞型をアンチセンスプローブとのハイブリダイゼーションの証明につき評価した。各細胞型を複製切片と比較し、これを各センスプローブとハイブリダイズさせた。もし染色がアンチセンスプローブで観察され、センスプローブで染色がないかまたは弱いバックグラウンドが観察されれば、結果は陽性と考えられた。
【０１８４】
実験プローブの各々についてのハイブリダイゼーションシグナルの細胞位置は表５にまとめる。骨幹端内の骨内膜および小柱を含む、再形成に関与する骨の領域で、Ｚｍａｘ１についてのハイブリダイゼーションが主として検出された。また、骨膜および骨端の選択された骨ライニング細胞におけるハイブリダイゼーションも観察された。また、陽性シグナルが成長プレート内の軟骨細胞、特に増殖する軟骨細胞で認められた。ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション結果の代表的な顕微鏡写真については図１０、１１および１２参照。
【０１８５】
【表５】
2004515209.tif 000011
【０１８６】
これらの研究は、骨再形成および骨形成に関与する細胞におけるＺｎａｘ１の位置発現を確認する。増殖のゾーンにおける、および基部側骨幹端の骨芽細胞および破骨細胞におけるＺｍａｚ１発現は、Ｚｍａｘ１遺伝子が骨成長およびミネラル化のプロセスに関与することを示唆する。骨芽細胞および破骨細胞の活性および分化は、骨が形成される発生の間、および骨が継続的再形成を受ける成長の間ならびに成人生活において密接に協働する。内部骨構造の形成および骨再形成は、活性化された破骨細胞による骨吸収と骨芽細胞による新しい物質の引き続いての沈積とのカップリングに由来する。Ｚｍａｘ１はＬＤＬ受容体遺伝子に関連し、従って、骨再形成のプロセスにおけるメカノセンセーションおよび引き続いてのシグナリングに関与する受容体であり得る。従って、この遺伝子の発現のレベルの変化は、再形成の速度および骨のミネラル化の程度に衝撃を与えることができよう。
【０１８７】
ＸＩＶ．アンチセンス
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、標的化ＲＮＡに対して相補的な塩基配列を含む短い合成核酸である。アンチセンスオリゴヌクレオチドと生きた細胞中のＲＮＡのハイブリダイゼーションはＲＮＡ機能に干渉し、結局は、タンパク質の発現をブロックする。従って、部分的配列が知られているいずれの遺伝子もアンチセンスオリゴヌクレオチドによって標的とされ得る。
【０１８８】
アンチセンス技術は広く用いられる研究ツールとなりつつあり、ゲノム配列決定努力によって同定された治療標的の有効化および解明においてますます重要な役割を演じるであろう。
【０１８９】
アンチセンス技術は、標的遺伝子をコードするｍＲＮＡに相補的なオリゴヌクレオチドを利用することによって遺伝子発現を阻害するために開発された。アンチセンスオリゴヌクレオチドの阻害効果についていくつかの可能なメカニズムがある。とりわけ、ＲＮａｓｅＨによるｍＲＮＡの分解は、タンパク質機能の阻害の主要なメカニズムであると考えられる。この技術は、元来、標的遺伝子の機能を解明するために用いられたが、それが注意深くかつ適切に設計されることを条件として、治療的適用も有することもできる。
【０１９０】
アンチセンスオリゴヌクレオチドを調製するための材料および方法の例は以下の通りに行うことができる。骨芽細胞−様ネズミ細胞系ＭＣ３Ｔ３におけるアンチセンス技術を用い、Ｓｅｑｕｉｔｅｒ（Ｎａｔｉｃｋ，ＭＡ）と共同して予備的研究が企画された。これらの細胞をトリガーして、骨分化配列に沿って発生することができる。初期増殖期間は、分化マーカーの最小発現およびコラーゲン状細胞外マトリックスの初期合成によって特徴付けられる。分化マーカーの引き続いての誘導には、コラーゲンマトリックス合成が必要とされる。一旦マトリックス合成が始まれば、骨芽細胞マーカー遺伝子が明瞭な一時的配列で活性化され：骨シアロタンパク質およびオステオカルシンが分化プロセスの後半で出現する初期の時点において、アルカリ性ホスファターゼが誘導される。遺伝子発現のこの一時的配列は、成熟およびミネラル化プロセスをモニター化するのに有用である。成熟が開始した後数日までに開始しないマトリックスミネラル化は、細胞層−培養プレート界面近くのマトリックス内深くコラーゲンフィブリル上および内でのミネラルの沈積を含む。培養された骨芽細胞によってコラーゲンフィブリル−関連物質は、インビボで婦人の骨で見出されたものと似ており、従って、研究試薬として頻繁に用いられる。
【０１９１】
製造業者の明細書（米国特許第５，８４９，９０２号）に従い、ＭＣ３Ｔ３細胞を分化の第一週にアンチセンスオリゴヌクレオチドでトランスフェクトした。
【０１９２】
Ｚｍａｘ１のために設計されたオリゴヌクレオチドを下記に掲げる。
１０８７５：ＡＧＵＡＣＡＧＣＵＵＣＵＵＧＣＣＡＡＣＣＣＡＧＵＣ
１０８７６：ＵＣＣＵＣＣＡＧＧＵＣＧＡＵＧＧＵＣＡＧＣＣＣＡＵ
１０８７７：ＧＵＣＵＧＡＧＵＣＣＧＡＧＵＵＣＡＡＡＵＣＣＡＧＧ
【０１９３】
図１３は、ＭＣ３Ｔ３細胞におけるＺｍａｘ１のアンチセンス阻害の結果を示す。前記で示した該３つのオリゴヌクレオチドをＭＣ３Ｔ３およびＲＮＡにトランスフェクトし、標準的な手法に従って単離した。ノザン分析は、対照遺伝子ＧＡＰＤＨは未変化のままであるが、Ｚｍａｘ１転写体の顕著に低い定常状態レベルを示す。従って、前記したプライマーを用いるアンチセンス技術は、骨生物学についてのＺｍａｘ１発現の役割の研究を可能とする。
【０１９４】
ＸＶ．酵母２ハイブリッド
Ｚｍａｘ１が関与して骨密度を調節するシグナリング経路を突き止めるために、酵母２ハイブリッドタンパク質相互作用技術を利用した。この技術は、テスタータンパク質を酵母転写系の成分とカップリングさせることによって、相互に作用するタンパク質の同定を容易とする（ＦｉｅｌｄｓおよびＳｏｎｇ，１９８９，Ｎａｔｕｒｅ  ３４０：２４５−２４６；米国特許第５，２８３，１７３  ｂｙ  ＦｉｅｌｄおよびＳｏｎｇ；Ｊｏｈｎｓｔｏｎ，１９８７、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．５１：４５８−４７６；Ｋｅｅｇａｎら、１９８６、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３１：６９９−７０４；Ｄｕｒｆｅｅら、１９９３、ＧｅｎｅｓＤｅｖ．７：５５５−５６９；Ｃｈｉｅｎら、１９９１、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ８８：９５７８−９５８２；Ｆｉｅｌｄｓら、１９９４、Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １０：２８６−２９２；およびＧｙｕｒｉｓら、１９９３、Ｃｅｌｌ  ７５：７９１−８０３）。まず、「ベイト」タンパク質、それについて相互作用するタンパク質が求められるタンパク質を、酵母転写因子のＤＮＡ結合ドメインに融合させる。第２に、同酵母転写因子の転写活性化ドメインに融合したｃＤＮＡを含むｃＤＮＡライブラリーを構築する；これをプレイ（ｐｒｅｙ）ライブラリーと呼ぶ。該ベイト構築体およびプレイライブラリーを酵母細胞に形質転換し、次いで、接合させて二倍体細胞を得る。もし該ベイトがｃＤＮＡライブラリーからの特異的プレイと相互作用すれば、活性化ドメインをこの相互作用を介してプロモーターの近くに運ぶ。次いで、選択可能なマーカー遺伝子を介して転写を駆動し、選択培地での成長は相互作用するタンパク質の存在を示す。
【０１９５】
本明細書中で議論する酵母２ハイブリッド実験で用いるアミノ酸配列は、全細胞質ドメインよりなるものであって、膜貫通ドメインの一部を以下に示す（アミノからカルボキシの向き）：
【化１】
2004515209.tif 000012
【０１９６】
推定膜貫通ドメインの最後の６つのアミノ酸を太文字で示す。推定ＳＨ３ドメインに下線を施す。Ｚｍａｘ１またはＨＢＭ対立遺伝子によってコードされたいずれかのタンパク質における５０アミノ酸またはそれよりも大きな更なるアミノ酸配列をベイト（ｂａｉｔ）として用いることもできる。ベイトとして用いたポリペプチドの上方サイズは、完全な膜貫通ドメインの存在によってのみ制限され（図４参照）、これは該ベイトが酵母２ハイブリッド系において非機能的であるようにする。これらの更なるベイトタンパク質を用いて、病巣接着シグナリング経路において、またはこれらのＨＢＭまたはＺｍａｘ１タンパク質が作用できる他の経路において、ＨＢＭまたはＺｍａｘ１によってコードされるタンパク質と相互作用するさらなるタンパク質を同定することができる。一旦同定されれば、病巣接着シグナリング経路またはＨＢＭが作用する他の経路においてタンパク質を調節する剤を同定する方法を、ＨＢＭおよびＺｍａｘ１タンパク質について本明細書中に記載したごとく行うことができる。
【０１９７】
細胞質Ｚｍａｘ１シグナリング経路を同定するために、Ｚｍａｘ１の細胞質ドメインを２つのベイトベクターにサブクローニングした。第１のベクターは脳をスクリーニングするのに用いられるｐＤＢｌｅｕ、およびベクターｐＰＣ８６（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）にクローンされたＨｅｌａプレイｃＤＮＡライブラリーであった。第２の用いたベイトベクターは、ベクターｐＯＰ４６において、ＴＥ８５骨肉腫細胞系に由来するｃＤＮＡプレイライブラリーをスクリーニングするのに用いたｐＤＢｔｒｐであった。当業者に知られた標準的な技術を、（ＦｉｅｌｄｓおよびＳｏｎｇ，１９８９，Ｎａｔｕｒｅ  ３４０：２４５−２４６；米国特許第５，２８３，１７３  ｂｙ  ＦｉｅｌｄｓおよびＳｏｎｇ；Ｊｏｈｎｓｔｏｎ，１９８７、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．５１：４５８−４７６；Ｋｅｅｇａｎら、１９８６、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３１：６９９−７０４；Ｄｕｒｆｅｅら、１９９３、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．７：５５５−５６９；Ｃｈｉｅｎら、１９９１、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ８８：９５７８−９５８２；Ｆｉｅｌｄｓら、１９９４、Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １０：２８６−２９２；およびＧｙｕｒｉｓら、１９９３、Ｃｅｌｌ  ７５：７９１−８０３）に記載されているごとく用いた。該ベイト構築体およびプレイｃＤＮＡライブラリーを標準的な手法を用いて酵母に形質転換した。
【０１９８】
タンパク質相互作用スクリーニングを行うために、ベイト酵母株の一晩培養を、２％グルコースを含む２０ｍｌのＳＤ選択培地（ｐＤＢＬｅｕ，ＳＤ−Ｌｅｕ培地、ｐＤＢｔｒｐ、ＳＤ−ｔｒｐ培地）中で増殖させた。培養を３０℃にて一晩激しく震盪した。培養を完全培地（２％グルコースを含むＹＥＰＤ）で１：１０希釈し、次いで、培養を震盪しつつ３０℃にて２時間インキュベートした。
【０１９９】
凍結したプレイライブラリーを解凍し、２％グルコースを含む１５０ｍｌのＹＥＰＤ培地中でそれを３０℃にて２時間培養することによって、酵母細胞を再活性化した。フィルターユニットを７０％エタノールで滅菌し、滅菌水で洗浄してエタノールを除去した。ベイトおよびプレイ培養双方の細胞密度は６００ｎｍにおけるＯＤを測定することによって測定した。各酵母株、ベイトおよびプレイ（ライブラリー）の１ｍｌのＯＤ６００＝４の細胞数に対応する酵母細胞の適切な容量を５０ｍｌのＦａｌｃｏｎ試験管に入れた。次いで、滅菌したフィルターユニットを通して混合物を濾過した。次いで、細胞側を上にして、予備加温したＹＥＰＤ寒天プレート上に移し、フィルター直下の全ての気泡を除去した。次いで、プレートを３０℃にて６時間インキュベートした。１つのフィルターを５０ｍｌのＦａｌｃｏｎ試験管に移し、２％グルコースを含む１０ｍｌのＳＤを添加し；１０秒間渦巻かせることによって細胞を再懸濁した。
【０２００】
初代二倍体細胞（ＳＤ−Ｌｅｕ，−Ｔｒｐプレート上で増殖）の数−対−ＳＤ−ＴｒｐおよびＳＤ−Ｌｅｕプレートのみで増殖するコロニー形成単位の数を次いで決定した。異なる希釈をプレートし、３０℃にて２日間インキュベートした。次いで、コロニー形成単位の数をカウントした。二倍体コロニー（ＳＤ−Ｌｅｕ−Ｔｒｐプレート）の数は、プレイ構築体の全ライブラリーを、ベイトを発現する酵母に接合したか否かの計算を可能とする。この情報はスクリーニングの質を判断するのに重要である。
【０２０１】
Ａ．間接的選択
次いで、５濾過接合からの再懸濁した細胞をプールし、５０ｍｌのＦａｌｃｏｎ試験管中での遠心によって細胞を沈降させた。次いで、細胞を２％グルコースを含む１６ｍｌのＳＤ培地に再懸濁した。２ｍｌのこの細胞懸濁液を、滅菌ガラスビーズを含む８つの四角プレート（ＳＤ−Ｌｅｕ，−Ｔｒｐ）上に平板培養し、３０℃にて１８〜２０時間インキュベートすることによって二倍体細胞につき選択した。
【０２０２】
次いで、細胞を該四角プレートから掻き取り、細胞を遠心し、１つの５０ｍｌのＦａｌｃｏｌ試験管中に合した。次いで、２％グルコースを含む２５ｍｌのＳＤ培地に細胞ペレットを再懸濁させた。適切な希釈（通常１：１００ないし１：１０００）をＮｅｕｇｅｂａｕｅｒチャンバーでカウントすることによって、細胞数を決定した。ほぼ５×１０７二倍体細胞を選択培地上で平板培養した。無関係プレイベクターと一緒にしたベイト株の増殖についての観察は、いずれの選択プレートがライブラリースクリーニングで選択されなければならないかを決定するのを助ける。一般に、全てのスクリーニングは、ＳＤ−Ｌｅｕ、−Ｔｒｐ、−Ｈｉｓを各々含む１つの四角プレート上で平板培養し；ＳＤ−Ｌｅｕ、−Ｔｒｐ、Ｈｉｓ、５ｍＭ３ＡＴ、およびＳＤ−Ｌｅｕ、−Ｔｒｐ、−Ｈｉｓ、−Ａｄｅが推奨される。
【０２０３】
次いで、酵母細胞を滅菌ガラスビーズで均一に広げ、３０℃にて４日間インキュベートした。掻き取った細胞懸濁液の異なる希釈物をＳＤ−Ｌｅｕ、−Ｔｒｐプレート上で平板培養することによって、コロニー形成酵母細胞の数を決定した。通常、１００μｌの１０−３および１０−４希釈の平板培養はプレート当たり１０−１０００コロニーを与えた。
【０２０４】
Ｂ．直接的選択
接合した酵母細胞を含む５つのフィルターを、各々、別々の５０ｍｌのＦａｌｃｏｎ試験管に移し、各々、２％グルコースを含む１０ｍｌのＳＤ培地と共に細胞を再懸濁し、引き続いて、１０秒間渦巻かせた。再懸濁した細胞を合わせ、３０００ｒｐｍにおいてＢｅｃｋｍａｎ遠心管中にて遠心した。上澄みを捨て、２％グルコースを含む６ｍｌのＳＤ培地に細胞を再懸濁した。２ｍｌの懸濁液を各選択四角プレート上に広げ、３０℃にて４〜５日間インキュベートした。
【０２０５】
Ｃ．単一コロニーの単離
単離されたコロニーからの酵母細胞を滅菌爪楊枝で拾い、９６ウェルプレートの個々のウェルに移した。細胞を５０μｌのＳＤ−Ｌｅｕ、−Ｔｒｐ、−Ｈｉｓ培地に再懸濁し、３０℃にて１日間インキュベートした。次いで、酵母細胞を、９６ウェル様式のＳＤ−Ｌｅｕ、−Ｔｒｐ、−Ｈｉｓプレート上にスタンプし、３０℃にて２日間インキュベートした。また、酵母細胞を、ＹＥＰＤプレートを被覆するナイロンフィルター上にスタンプし、３０℃にて１日間インキュベートした。ナイロンフィルター上の細胞を、β−Ｇａｌレポーター活性の分析で用いた。
【０２０６】
酵母コロニーを滅菌爪楊枝でＳＤ−Ｌｅｕ、−Ｔｒｐ、−Ｈｉｓプレートから掻き取り、必要であれば、β−Ｇａｌ活性に従って再度配置し、次いで、２０％グリセロールに再懸濁した。これは−８０℃における貯蔵用のマスタープレートとして機能した。
【０２０７】
ＤＮＡ調製では、グリセロールストックからの酵母細胞をＳＤ−Ｔｒｐプレート上にスタンプし、３０℃にて２日間インキュベートした。２日間のインキュベーションの後、酵母コロニーはコロニーＰＣＲおよび配列決定の用意ができた。標準コロニーＰＣＲ条件を用いて、相互作用スクリーニングから回収したプレイからのインサートを増幅した。配列決定は、標準配列決定反応およびＡＢＩ３７７（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）蛍光配列決定マシーンを用いて行った。
【０２０８】
Ｄ．ベイト／プレイ相互作用の証明
注目する該プレイのグリセロールストックを解凍し、グルコース−Ｔｒｐを含むＳＤの１０ｍｌ一晩培養に摂取した。一晩の培養の後、１０ｍｌの培養を含むＢＩＯ  １０１  ＲＰＭ酵母プラスミド単離キットを用い、プラスミドＤＮＡ調製を行った。培養を遠心し、１．５ｍｌのミクロ遠心管に移した。次いで、酵母溶解マトリックスをペレットに添加し、引き続いて２５０μｌのアルカリ溶解溶液を添加した。次いで、試料を５分間渦巻かせた。２５０μｌの中和溶液を添加し、試料を軽く混合した。ミクロ遠心管中で、試料を室温にて２分間遠心した。上清をスピンフィルターに移し、デブリスおよび溶解マトリックスを回避した。２５０μｌのＧｌａｓｓｍｉｌｋ  Ｓｐｉｎ緩衝液を添加し、試験管を逆さにして混合した。試料を１分間遠心し、Ｃａｔｃｈ試験管中の液体を捨てた。５００μｌの洗浄溶液を添加し、試料を１分間遠心し、洗浄溶液を捨てた。洗浄工程を一度反復し、引き続いて、１分間の乾式遠心を行って、残りの液体がスピンフィルターから出るのを早めた。フィルターを新しいＣａｔｃｈ試験管に移し、１００μｌの滅菌水を添加し；次いで、試料を軽く渦巻かせて懸濁させ、３０秒間遠心して、Ｃａｔｃｈ試験管の底にＤＮＡを集めた。
【０２０９】
次いで、標準手法および調製したグリセロールストックを用い、５μｌのＤＮＡをＤＨ１０Ｂ  Ｅｌｅｃｔｒｏｍａｘ細胞に移した。Ｑｉａｇｅｎ  ＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐキットを用い、ミニプレプＤＮＡを調製した。ＤＮＡを最後に３０μｌのＱｉａｇｅｎ  ＥＢ緩衝液で溶出させた。次いで、１μｌのプラスミドＤＮＡ試料を用いて、標準手法を用いて酵母細胞を形質転換した。ＳＤ−Ｔｒｐ培地上での増殖の２日後に、コロニーを拾い、新鮮な培地上に貼り付けた。同様に、ベイトコロニーをＳＤ−Ｌｅｕ培地に貼り付けた。両者を３０℃にて一晩増殖させた。
【０２１０】
接合のために、ベイトおよびプレイパッチからの細胞を一緒にＹＡＰＤ培地上で広げ、３０℃にて１２時間インキュベートした。次いで、このプレートをＳＤ寒天−Ｌｅｕ−Ｔｒｐプレート上で再度レプリカ平板培養し、３０℃にて２日間増殖させた。相互作用の強さをテストするために、ＳＤ寒天−Ｌｅｕ−Ｔｒｐ−Ｈｉｓ、５ｍＭ  ３ＡＴおよび１０ｍＭ３ＡＴを含むＳＤ寒天−Ｌｅｕ−Ｔｒｐ−Ｈｉｓ、ＳＤ寒天−Ｌｅｕ−Ｔｒｐ−Ｈｉｓ−Ａｄｅ、およびＳＤ寒天−Ｌｅｕ−Ｔｒｐ−Ｕｒａ培地上にこれらのプレートをレプリカ平板培養し、３０℃にて２日間増殖させた。
【０２１１】
Ｅ．ガラクトンスターβ−ガラクトシダーゼ活性アッセイ
選択プレート上で陽性相互作用体を画線培養およびレプリカ平板培養した後、コロニーを２００μｌのＳＤ−培地を含む９６ウェル皿に入れ、ウェル１および９６ブランクを得た。第１の９６ウェル皿からの１０マイクロリットルを、１００μｌのＳＤ−培地を含有するもう１つの平底９６ウェル中に平板培養した。対照は陰性で対照および非常に弱い陽性対照よりなるものであった。ＯＤ６００（９６上ウェル分光光度計を利用すると、１の値は１×１０７細胞に対応する）において、細胞密度を測定した。該ＯＤは通常は０．０３および０．１０の間であった。具体的にはルミノメーター用のマイクロプレートを用い、５０μｌの反応混合物を各ウェルにピペットで入れた。５０マイクロリットルの培養を次いで添加し、ピペットで２回上げ下げすることによって混合した。反応を室温にて３０分間インキュベートし、続いて、ルミノメーターを用いて相対的光単位を測定した。
【０２１２】
表６は、テストした３つのプレイライブラリーからの酵母２ハイブリッドスクリーニングで同定された遺伝子をリストする。２つの遺伝子（ｚｙｘｉｎおよびａｘｉｎ）は、全ての３つのスクリーニングにおいてＺｍａｘ１の細胞質ドメインと相互作用することが判明した。３つの遺伝子、α−アクチニン、ＴＣＢおよびＳ１−５は３つのスクリーニングの内２つで相互作用した。
【０２１３】
細胞間および細胞−マトリックス間の接触の部位（病巣接触／接着プラーク）で見出された種々のタンパク質は、Ｚｍａｘ１の細胞質ドメインと相互作用することが示された。これらはα−アクチニン、Ｔｒｉｏ、Ｐｉｎｃｈ様タンパク質およびＺｙｘｉｎを含む。ＰＩＮＣＨは、インテグリン連結キナーゼ、インテグリン中の初期シグネーラーおよび増殖因子シグナリング経路と相互作用することが知られているＬＩＭドメイン含有タンパク質である。酵母２ハイブリッドスクリーニングにおける密接に関連した遺伝子の知見は、細胞外マトリックスシグナルからのインテグリンシグナリングに連結した新規な経路の確率を上昇させる。病巣接着に位置付けられることが知られているＴｒｉｏは、細胞運動に関与する細胞−マトリックス相互作用および骨格筋再編成を協調させるにおいて鍵となる役割を演じると考えられる。Ｚｙｘｉｎ（もう１つのＬＩＭドメイン−含有タンパク質）もまた接着プラークに位置決定されており、インテグリンシグナリング経路を介してトリガーが伝播されると、細胞骨格の再組織化に関与すると考えられる。また、Ｚｙｘｉｎはαアクチニンと相互作用し、これは本発明者らがＺｍａｘ１との相互作用として同定したものであった。同定されれた他のＬＩＭドメイン含有タンパク質は、マウスａｊｕｂａのヒトホモログ、ＬＩＭＤ１、および新規なＬＩＭＤ１−様タンパク質を含む。
【０２１４】
Ａｘｉｎは２ハイブリッド実験からも同定された。このタンパク質はＷｎｔシグナリング経路の阻害に関与し、腫瘍サプレッッサーＡＰＣと相互作用する。前記した病巣接着シグナリングとここにリンクがあり、２つの経路における１つの共通の経路はグリコーゲンシンターゼキナーゼ３の阻害を含み、これは、今度は、β−カテニン／Ｌｅｆ−１およびＡＰ−１転写因子の活性化をもたらす。Ａｘｉｎ／ＡＰＣはこれならびにインテグリンリンクドキナーゼに関与する。該Ｗｎｔ経路は、胚形成の間に細胞の運命を決定するにおいて役割を有する。もし不適切に活性化されれば、該Ｗｎｔ経路は癌に導き得る。また、該Ｗｎｔ経路は細胞骨格再配置において役割を有するようである。病巣接着シグナリングへのＺｍａｘ１関与を描くモデルは図１５に示す。
【０２１５】
他の研究と結合させたこのデータは、インテグリンシグナリング経路が機械的な応力および接着に対する細胞応答で役割を有することを示唆する。これは、骨生物学におけるＺｍａｘ１の作用のメカニズムについての魅力的なモデルを提供する。Ｚｍａｘ１は直接的に機械的ストレスまたは機械的検知に関連する細胞外マトリックス中の分子への結合を検知することに関与する可能性がある。引き続いての経路を通じてのシグナリングは、骨細胞における細胞形態、細胞接着、移動、増殖、分化およびアポトーシスに対する効果のため、骨再形成に関与し得る。
【０２１６】
【表６】
2004515209.tif 000013
【０２１７】
【表６（つづき）】
2004515209.tif 000014
【０２１８】
図１５に描いたモデルおよび表６に示された結果に徴すれば、本発明によって考えられるもう１つの態様は、病巣接着シグナリングを調節することによって骨密度および骨量障害を調節することであろう。該調節は、酵母２ハイブリッド系によって同定された病巣接着シグナリング経路に関与するメンバーのいずれかによってコードされたＤＮＡ、ｍＲＮＡ転写体またはタンパク質を調節することによって起こり得る。
【０２１９】
また、ＨＢＭ酵母２ハイブリッド系によって同定された新規な核酸およびタンパク質も考えられる。これらは配列番号６６（Ａｊｕｂａ）、配列番号７１（ＬＩＭドメイン含有タンパク質１をコードする遺伝子と同様の遺伝子）、配列番号７７（Ｇｌｕ−Ｌｙｓ豊富タンパク質）、配列番号７９（ＰＩＮＣＨ様遺伝子）、配列番号９０（Ａｊｕｂａタンパク質）、配列番号９３（ＴＲＯに類似のタンパク質）、配列番号９４（）配列番号９９（Ｇｌｕ−Ｌｙｓ豊富タンパク質）および配列番号１０２（ＰＩＮＣＨ様タンパク質）を含むが、これらに限定されるものではない。
【０２２０】
ＸＶＩ．潜在的機能
Ｚｍａｘ１によってコードされたタンパク質は低密度リポタンパク質受容体（ＬＤＬ受容体）である。Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎら、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，１：１−３９（１９８５）；Ｂｒｏｗｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３２：３４−４７（１９８６）参照。該ＬＤＬ受容体は、低密度リポタンパク質、コレステロールを含む資質−タンパク質凝集体の摂取を担う。ＬＤＬ受容体における欠陥を持つ個体はコレステロール除去に欠け、アテローム性動脈硬化症を発症する傾向がある。加えて、欠陥ＬＤＬ受容体を持つ細胞は、部分的には、コレステロール合成酵素の改変されたフィードバック調節のため、および部分的には、これらの酵素についての遺伝子の増大した転写のため、コレステロールの増加した生産を示す。いくつかの細胞型において、コレステロールはステロイドホルモンの形成についての前駆体である。
【０２２１】
従って、ＬＤＬ受容体は、直接的または間接的にシグナル変換タンパク質として機能することができ、遺伝子発現を調節できる。Ｚｍａｘ１はＬＤＬ受容体に関連するので、このタンパク質は、骨再形成に影響する方法で、細胞間のシグナリングに関与することもできる。
【０２２２】
グリシン１７１アミノ酸はＺｍａｘ１の機能で重要なようである。なぜならば、このアミノ酸はＺｍａｘ１のマウスホモログでも発見されているからである。密接に関連するＬＲＰ６タンパク質は対応する位置にグリシンを含有する（Ｂｒｏｗｎら、ＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌおよびＢｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｍｍ．，２４８：８７９−８８８（１９８８））。タンパク質の構造または機能で重要なアミノ酸は種間で保存される傾向にある。なぜならば、天然の選択は、重要な位置の改変されたアミノ酸での突然変異が起こるのを妨げるからである。
【０２２３】
加えて、Ｚｍａｘ１の細胞外ドメインは、５つのＹＷＴＤモチーフ、続いてのＥＦＧモチーフよりなる４つの反復を含有する。この５ＹＷＴＤ＋ＥＧＦ反復は区別される折り畳まれたタンパク質ドメインを形成するようである。というのは、この反復はＬＤＬ受容体および他のＬＤＬ受容体−関連タンパク質においても見出されているからである。該最初の３つの５ＹＷＴＤ＋ＥＧＦ反復は構造が非常に似ており、他方、４番目のものが高度に発散している。グリシン１７１は、Ｚｍａｘ１における第１の５ＹＷＴＤ＋ＥＧＦ反復の中心ＹＷＴＤモチーフで起こる。ＬＤＬ受容体タンパク質における５ＹＷＴＤ＋ＥＧＦ反復がそうであるように、Ｚｍａｘ１の他の２つの同様な５ＹＷＴＤ＋ＥＧＦ反復もまた対応する位置においてグリシンを含有する。しかしながら、アミノ酸の１７．６％のみがＺｍａｘ１における最初の３つの５ＹＷＴＤ＋ＥＧＦ反復のおよびＬＤＬ受容体における単一反復の中で同一である。これらの観察は、グリシン１７１がこの反復の機能に必須であって、グリシン１７１の突然変異がＺｍａｘ１の機能的改変を引き起こすことを示す。ｃＤＮＡおよびペプチドの配列を図６Ａ〜６Ｅに示す。ヌクレオチド位置５８２における臨界的塩基を太文字で示し、下線を施す。
【０２２４】
ノザンブロット分析（図７Ａ〜Ｂ）は、Ｚｍａｘ１がヒト骨組織ならびに多数の他の組織で発現されることを明らかにする。多重―組織ノザンブロット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）をＺｍａｘ１からのエクソンでプローブした。図７Ａに示すごとく、５．５ｋｂのＺｍａｘ１転写体は心臓、腎臓、肺、肝臓および膵臓で高度に発現され、骨格筋および脳において低レベルで発現される。図７Ｂに示される第２のノザンブロットは５．５ｋｂにおける転写体サイズを確認し、Ｚｍａｘ１が骨、骨髄、頭蓋冠およびヒト骨芽細胞系で発現されることを示した。
【０２２５】
一緒にすると、酵母２ハイブリッドと結合させたこれらの結果は、Ｚｍａｘ１遺伝子におけるＨＢＭ多型がＨＢＭ表現型を担い、Ｚｍａｘ１遺伝子が骨発生で重要であることを示す。加えて、Ｚｍａｘ１の突然変異は骨ミネラル化および発生を改変できるので、Ｚｍａｘ１に結合する分子は有用にも骨発生を改変できるようである。そのような分子は、例えば、小分子、タンパク質、ＲＮＡアプタマー、ペプチドアプタマー等を含むことができる。
【０２２６】
ＸＶＩＩ．核酸、ベクター、形質転換および宿主細胞の調製
適当な宿主細胞中の複製によって、大量の本発明の核酸を生産することができる。所望の断片をコードする天然または合成核酸断片は組換え核酸構築体、通常、原核生物または真核生物細胞に導入でき、その中で複製可能であるＤＮＡ構築体に取り込まれるであろう。通常、核酸構築体は酵母または細菌のごとき単細胞宿主中での複製に適するが、培養された哺乳動物もしくは植物または他の真核細胞系への導入も意図することができる（ゲノム内への組み込みは有りまたは無し）。本発明の方法によって生産された核酸の精製は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ．Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｎｕａｌ，２ｎｄ  Ｅｄ．（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８９）またはＡｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊ．Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，ＮＹ（１９９２）に記載されている。
【０２２７】
また、本発明の核酸は化学的合成によって、例えば、Ｂｅａｕｃａｇｅら、Ｔｅｔｒａ．Ｌｅｔｔｓ．，２２：１８５９−１８６２（１９８１）によって記載されたホスホフアミダイト方法またはＭａｔｔｅｕｃｃｉら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１０３：３１８５（１９８１）に従ったトリエステル方法によって生産することもでき、市販の自動オリゴヌクレオチド合成器で行うことができる。二本鎖断片は、相補的ストランドを合成し、次いで適当な条件下でストランドを一緒にアニールすることによって、あるいは適当なプライマー配列と共にＤＮＡポリメラーゼを用いて相補的ストランドを添加することによって、化学的合成の一本鎖産物から得ることができる。
【０２２８】
原核生物または真核生物宿主への導入のために調製された核酸構築体は宿主によって認識される複製系を含むことができ、所望のタンパク質をコードする意図した核酸断片を含み、好ましくは、タンパク質コーディングセグメントに作動可能に連結した転写および翻訳開始調節配列も含むであろう。発現ベクターは、例えば、複製起点または自律複製配列（ＡＲＳ）および発現制御配列、プロモーター、エンハンサー、およびリボソーム−結合部位、ＲＮＡスプライス部位、ポリアデニル化、転写ターミネーター配列、およびｍＲＮＡ安定化配列のごとき必要なプロセッシング情報部位を含むことができる。天然ＨＢＭまたはＺｍａｘ１タンパク質から、または他の受容体から、または同一または関連種の分泌されたタンパク質からを問わず、適切な場合分泌シグナルも含むことができ、これは、タンパク質が細胞膜において交差および／または存在することを可能とし、従って、その機能的トポロジーを達成し、あるいは細胞から分泌される。そのようなベクターは、当該分野で知られ、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ．Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｎｕａｌ，２ｎｄ  Ｅｄ．（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８９）またはＡｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊ．Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，ＮＹ（１９９２）で議論された標準的な組換え技術によって調製することができる。
【０２２９】
適当なプロモーターおよび他の必要なベクター配列は宿主中で機能的であるように選択され、適当な場合、Ｚｍａｘ１またはＨＢＭ遺伝子に天然では会合しているものを含む。細胞系および発現ベクターの働くことができる組合せの例はＳａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ．Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｎｕａｌ，２ｎｄ  Ｅｄ．（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８９）またはＡｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊ．Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，ＮＹ（１９９２）に記載されている。多くの有用なベクターは当該分野で公知であり、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ、Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｂｉｏｔｅｃｈその他のごとき販売業者から入手することができる。ｔｒｐ、ｌａｃおよびファージプロモーター、ｔＲＮＡプロモーターおよび解糖酵素プロモーターのごときプロモーターを原核生物宿主で用いることができる。有用な酵母プロモーターは、メタロチオネイン、３−ホスホグリセレートキナーゼあるいはエノラーゼまたはグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼのごとき他の解糖酵素、マルトースおよびガラクトース資化等を担う酵素についてのプロモーター領域を含む。酵母発現で用いるのに適したベクターおよびプロモーターはさらにＥＰ７３，６７５Ａに記載されている。適当な非天然哺乳動物プロモーターはＳＶ４０からの初期および後期プロモーター（Ｆｉｅｒｓら、Ｎａｔｕｒｅ，２７３：１１３（１９７８））またはネズミモロニー白血病ウイルス、マウス腫瘍ウイルス、鳥類肉腫ウイルス、アデノウイルスＩＩ、ウシパピローマウイルスまたはポリオーマに由来するプロモーターを含むであろう。加えて、遺伝子の複数コピーが作成できるように、構築体を増幅可能な遺伝子（例えば、ＤＨＦＲ）に連結することができる。適切なエンハンサーおよび他の発現制御配列については、ＥｎｈａｎｃｅｒｓおよびＥｕｋａｒｙｏｔｉｃ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８３）も参照されたし。
【０２３０】
そのような発現ベクターは自律的に複製できるが、それは、当該分野でよく知られた方法により、宿主細胞のゲノムに挿入されることによって、複製することもできる。
【０２３１】
発現およびクローニングベクターは選択マーカー、ベクターで形質転換された宿主細胞の生存または増殖に必要なタンパク質をコードする遺伝子を含むようである。この遺伝子の存在は、インサートを発現する宿主細胞のみの増殖を保証する。典型的な選択遺伝子は、ａ）抗生物質または他の毒性物質、例えば、アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキセート等に対する抵抗性を付与する；ｂ）栄養要求性欠陥を補う、またはｃ）複雑な培地から利用できない臨界的な栄養素を供給するタンパク質をコードする（例えば、ＢａｃｉｌｌｉについてのＤ−アラニンラセマーゼをコードする遺伝子）。適当な選択マーカーの選択は宿主細胞に依存し、異なる宿主についての適切なマーカーは当該分野でよく知られている。
【０２３２】
注目する核酸を含むベクターはインビトロで転写され、得られたＲＮＡはよく知られた方法により、例えば、注入（Ｋｕｂｏら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｓ．２４１：１１９（１９８８）参照）によって宿主細胞に導入でき、あるいはベクターは当該分野でよく知られた方法によって宿主細胞に直接導入でき、これは、細胞宿主のタイプに依存して変化し、エレクトロポレーション；塩化カルシウム、塩化ルビジウム、リン酸カルシウム、ＤＥＡＥ−デキストラン、または他の物質を使用するトランスフェクション；マイクロプロジェクタイル衝撃；リポフェクション；注入（ここに、ベクターはレトロウイルスゲノムのごとき感染剤である）他の方法を含む。一般に、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９およびＡｕｓｕｂｅｌら、１９９２参照。前記したものを含む、当該分野で知られたいずれかの方法による宿主細胞への核酸の導入を本明細書中では「形質転換」という。前記した核酸が導入された細胞は、そのような細胞の子孫を含むことも意味する。
【０２３３】
大量の本発明の核酸およびタンパク質は、適合する原核生物または真核生物宿主細胞においてベクターまたは他の発現媒体中のＺｍａｘ１またはＨＢＭ核酸またはその部分を発現させることによって調製することができる。最も普通に用いられる原核生物宿主は大腸菌であるが、枯草菌またはシュードモナスのごとき他の原核生物も用いることもできる。
【０２３４】
酵母、糸状菌、植物、昆虫、または両生類または鳥類種のもののごとき哺乳動物または他の真核生物宿主細胞もまた本発明のタンパク質の生産で有用であろう。培養における哺乳動物細胞の増殖はそれ自体よく知られている。ＪａｋｏｂｙおよびＰａｓｔａｎ（ｅｄｓ．），Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，５８巻  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｈａｒｃｏｕｒｔ  Ｂｒａｃｅ  Ｊｏｖａｎｏｖｉｃｈ，ＮＹ，（１９７９）参照。通常に使用される哺乳動物宿主細胞系の例はＶＥＲＯおよびＨｅＬａ細胞、チャイニーズハムスター断層（ＣＨＯ）細胞、およびＷＩ３８、ＢＨＫおよびＣＯＳ細胞系であるが、他の細胞系も、例えば、高度な発現所望グリコシル化パターンまたは他の特徴を提供するのに適当であり得ることを当業者は認識するであろう。
【０２３５】
ベクター構築の様式に応じてマーカーを用いることによって、クローンが選択される。マーカーは同一または異なるＤＮＡ分子上、好ましくは、同一ＤＮＡ分子上にあり得る。原核生物宿主においては、形質転換体は、例えば、アンピシリン、テトラサイクリンまたは他の抗生物質に対する抵抗性によって選択できる。温度感受性に基く特定産物の生産もまた適切なマーカーとして機能することができる。
【０２３６】
本発明の核酸で形質転換した原核生物または真核生物細胞は、本発明の核酸およびタンパク質の生産のみならず、例えば、Ｚｍａｘ１またはＨＢＭタンパク質の特徴を研究するにおいても有用であろう。
【０２３７】
アンチセンス核酸配列は、当業者によって認識されるであろうごとく、Ｚｍａｘ１またはＨＢＭの発現を妨げまたはそれを少なくするのに有用である。例えば、Ｚｍａｘ１またはＨＢＭ遺伝子の全てまたは部分、またはＺｍａｘ１またはＨＢＭ領域からの他の配列を含む核酸ベクターを、アンチセンス向きにプロモーターの制御下に置き、細胞に導入することができる。細胞内のそのようなアンチセンス構築体の発現はＺｍａｘ１またはＨＢＭ転写および／または翻訳および／または複製に干渉するであろう。
【０２３８】
本明細書中に開示したＺｍａｘ１およびＨＢＭ遺伝子配列に基づくプローブおよびプライマーを用いて、他の種における相同Ｚｍａｘ１およびＨＢＭ遺伝子配列およびタンパク質を同定する。これらのＺｍａｘ１およびＨＢＭ遺伝子配列およびタンパク質は、それが単離された種のために、本明細書中に記載した診断／予後、治療および薬物スクリーニング方法で用いられる。
【０２３９】
ＸＶＩＩＩ．タンパク質の発現および精製
本発明のＨＢＭタンパク質の発現および精製は実質的に後記にて概説されるごとく行うことができる。膜およびＨＢＭ遺伝子から分泌されたタンパク質のクローニング、発現および精製を容易とするためには、大腸菌における組換えタンパク質のクローニングおよび発現のための、ｐＥＴシステム（Ｎｏｖａｇｅｎ）のごとき遺伝子発現系を選択した。また、ペプチドタグ、Ｈｉｓ−ＴａｐをコードするＤＮＡ配列を注目するＤＮＡ配列の３’末端に融合させて、組換えタンパク質産物の精製を容易とする。融合のために３’末端を選択して、いずれの５’末端シグナル配列の変化も回避した。
【０２４０】
ＨＢＭクローニングのために配列番号１、３および５〜１２に記載した核酸から選択された核酸はポリメラーゼ反応鎖（ＰＣＲ）によって調製した。ＨＢＭヌクレオチド配列の５’および３’末端に特異的な合成オリゴヌクレオチドプライマーは設計し、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）から購入した。（配列の５’末端に特異的な）全ての順方向プライマーは、５’末端にＮｃｏＩクローニング部位を含むように設計した。これらのプライマーは、ＮｃｏＩ部位内にコードされたメチオニン残基、続いての、バリン残基およびＨＢＭ  ＤＮＡ配列によってコードされたタンパク質におけるタンパク質翻訳の開始を可能とするように設計した。（配列の３’末端に特異的な）全ての逆方向プライマーは、ＨＢＭ配列のｐＥＴ−２８ｂのリーディングフレームへのクローニングを可能とするために５’末端にＥｃｏＲＩ部位を含んだ。ｐＥＴ−２８ｂベクターは、ヒスチジン親和性タグを含む（Ｃ−末端における）６つのヒスチジン残基を含むさらなる２０カルボキシル末端アミノ酸をコードする配列を供した。
【０２４１】
ＨＢＭ遺伝子から調製したゲノムＤＮＡは、ＰＣＲ増幅用の鋳型ＤＮＡの源として用いた（Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ（１９９４））。ＨＢＭヌクレオチド配列を含むＤＮＡ配列を増幅させるために、１００マイクロリットルの最終容量中に２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、規定されたＨＢＭに相補的かつそれを近接挟む１μＭ合成オリゴヌクレオチドプライマー（順方向および逆方向プライマー）、０．２ｍＭの各デオキシヌクレオチド３リン酸、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＯ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰおよび２．５ユニットの熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ（Ａｍｐｌｉｔａｑ，Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｒａｎｃｈｂｕｒｇ，ＮＪ）を含有する反応ウイルスにゲノムＤＮＡ（５０ｎｇ）を導入した。
【０２４２】
熱サイクリング反応の完了に際して、Ｑｉａｑｕｉｃｋ  Ｓｐｉｎ  ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を用い、増幅されたＤＮＡの各資料を精製した。全ての増幅されたＤＮＡ試料を制限エンドヌクレアーゼ、例えば、ＮｃｏＩおよびＥｃｏＲＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）（Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（１９９４））での消化に付した。次いで、ＤＮＡ試料を１．０％ＮｕＳｅｉｖｅ（ＦＭＣ  ＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ，Ｒｏｃｋｌａｎｄ，ＭＥ）アガロースゲルでの電気泳動に付した。ＤＮＡは臭化エチジウムおよび長波長ＵＶ照射への暴露によって可視化した。アガロースゲルから単離したスライスに含まれるＤＮＡは、Ｂｉｏ  １０１  Ｇｅｎｅ  Ｃｌｅａｎキットプロトコル（Ｂｉｏ１０１，Ｖｉｓｔａ，ＣＡ）を用いて精製した。
【０２４３】
ｐＥＴ−２８ｂベクターは、制限エンドヌクレアーゼ、例えば、ＮｃｏＩおよびＥｃｏＲＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）（Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（１９９４））での消化によってクローニングのために調製した。挿入された遺伝子の５’末端に融合することができるヒスチジン親和性タグをコードするｐＥＴ−２８Ａベクターは、適当な制限エンドヌクレアーゼでの消化によって調製した。
【０２４４】
消化に続き、ＤＮＡインサートを、既に消化されたｐＥＴ−２８ｂ発現ベクターにクローニングした（Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ（１９９４））。次いで、連結反応の産物を用いて、後記するごとく、大腸菌のＢＬ２１を形質転換した（Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（１９９４））。
【０２４５】
コンピテント細菌、大腸菌株ＢＬ２１または大腸菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）を、標準的な方法に従い（Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（１９９４））、クローン化ＨＢＭ配列を運ぶ組換えｐＥＴ発現プラスミドで形質転換した。簡単に述べれば、１μｌの連結反応物を５０μｌのエレクトロコンピテント細胞と混合し、高電圧パルスに付し、しかる後、震盪しつつ、３７℃にて、０．４５ｍｌのＳＯＣ培地（０．５％酵母抽出物、２．０％トリプトン、１０ｍＭ  ＮａＣｌ、２．５ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ  ＭｇＳＯ４および２０ｍＭグルコース）中で１時間インキュベートした。次いで、増殖用の２５μｇ／ｍｌ硫酸カナマイシンを含有するＬＢ寒天プレート上で試料を一晩広げた。次いで、ＢＬ２１の形質転換されたコロニーを拾い、分析して、後記するごとくクローン化インサートを評価した。
【０２４６】
元のＰＣＲ増幅クローニング反応で用いたＨＢＭ配列に特異的な同順方向および逆方向プライマーを用い、クローン化インサートのＰＣＲ増幅によって、組換えｐＥＴ−２８ｂ  ＨＢＭヌクレオチド配列で形質転換された個々のＢＬ２１クローンを分析した。成功した増幅により、発現ベクターへのＨＢＭ配列の取込みが確認される（Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（１９９４））。
【０２４７】
適切にクローン化されたＨＢＭヌクレオチド配列を運ぶ組換えｐＥＴ−２８ｂベクターの個々のクローンを拾い、５ｍｌのＬＢブロス＋２５μｇ／ｍｌ硫酸カナマイシン中で一晩インキュベートした。Ｑｉａｇｅｎプラスミド精製プロトコルを用い（Ｑｉａｇｅｎ  Ｉｎｃ．，Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ，ＣＡ）、翌日、プラスミドＤＮＡを単離し、精製した。
【０２４８】
クローニングまたはプラスミド調製の目的で、ｐＥＴベクターは、いずれかの大腸菌Ｋ−１２株、例えば、ＨＭＳ１７４、ＨＢ１０１、ＪＭ１０９、ＤＨ５等中で増殖させることができる。発現用の宿主は、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ用の遺伝子の染色体コピーを含む大腸菌株を含む。これらの宿主は、バクテリオファージＤＥ３、ｌａｃＩ遺伝子を運ぶラムダ誘導体、ｌａｃＵＶ５プロモーターおよびＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ用の遺伝子の溶原菌であった。イソプロピル−β−Ｄチオガラクトシド（ＩＰＴＧ）の添加によってＴ７  ＲＮＡポリメラーゼを誘導し、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼは、注目するその遺伝子を運ぶ、ｐＥＴ−２８ｂのごとき機能的Ｔ７プロモーターを含有するいずれかの標的プラスミドを転写する。株は、例えば、ＢＬ２１（ＤＥ３）を含む（Ｓｔｕｄｉｅｒら、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１８５：６０−８９（１９９０））。
【０２４９】
組換えＨＢＭ配列を発現させるために、前記したごとく５０ｎｇのプラスミドＤＮＡを単離して、記載されているごとく（ｐＥＴ発現キットの一部としてＮｏｖａｇｅｎによって提供された）コンピテントＢＬ２１（ＤＥ３）細菌を形質転換する。ｌａｃＺ遺伝子（β−ガラクトシダーゼ）をＨＢＭ組換え構築で記載したごとくｐＥＴ−システムで発現させる。形質転換した細胞をＳＯＣ培地中で１時間培養し、次いで、２５μｇ／ｍｌ硫酸カナマイシンを含有するＬＢプレート上で培養を平板培養した。翌日、細菌コロニーをプールし、硫酸カナマイシン（２５μｇ／ｍｌ）を含有するＬＢ培地中で、０．５ないし１．０  Ｏ．Ｄ．ユニットの６００ｎＭにおける光学密度まで増殖させ、その時点で、１ｍＭ  ＩＰＴＧＯ培養に３時間で添加して、ＨＢＭ組換えＤＮＡ構築の遺伝子発現を誘導した。
【０２５０】
ＩＰＴＧでの遺伝子発現の誘導の後、４℃における１５分間の３５００×ｇでのＳｏｒｖａｌｌ  ＲＣ−３Ｂ遠心管中での遠心によって細菌を集めた。５０ｍｌ冷ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、０．１Ｍ  ＮａＣｌおよび０，１ｍＭ  ＥＤＴＡ（ＳＴＥ緩衝液）中にペレットを再懸濁した。次いで、２０００×ｇにて、４℃で２０分間細胞を遠心した。湿潤ペレットを秤量し、タンパク質で精製が用意できるまで−８０℃で凍結した。
【０２５１】
当該分野で知られた種々の方法を用いて、単離されたタンパク質を精製することができる（Ｃｏｌｏｇａｎら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ（１９９５））。例えば、凍結した細胞を解凍し、緩衝液に再懸濁し、小容量のミクロプルイダイザー（Ｍｏｄｅｌ  Ｍ−１１０Ｓ，Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ  ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｒｐ．，Ｎｅｗｔｏｎ，ＭＡ）を通す何回かの通過によって破壊することができる。得られたホモゲネートを遠心して透明な上清（粗製抽出物）が得られ、濾過に続き、粗製抽出物をカラムで分画した。ＯＤ２８０ｎｍにおける吸光度によって画分をモニターし、ピーク画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析することができる。
【０２５２】
精製されたタンパク質調製物の濃度を、アミノ酸含量から計算した吸光係数を用いて分光光度により定量する（Ｐｅｒｋｉｎｓ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１５７：１６９−１８０（１９８６））。標準としてのウシ血清アルブミンを用い、Ｂｒａｄｆｏｒｄ，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ，７２：２４８−２５４（１９７６）および、Ｌｏｗｒｙら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９３：２６５−２７５（１９５１）によってタンパク質濃度を測定する。
【０２５３】
種々の濃度のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルはＢｉｏＲａｄ（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）から購入し、クーマシーブルーで染色した。分子量マーカーはウサギ骨格筋ミオシン（２００ｋＤａ）、大腸菌−β−ガラクトシダーゼ（１１６ｋＤａ）、ウサギ筋肉ホスホリラーゼＢ（９７．４ｋＤａ）、ウシ血清アルブミン（６６．２ｋＤａ）、オボアルブミン（４５ｋＤａ）、ウシカルボニックアンヒドラーゼ（３１ｋＤａ）、大豆トリプシン阻害剤（２１．５ｋＤａ）、卵白リゾチウム（１４．４ｋＤａ）およびウシアプロチミン（６．５ｋＤａ）を含むことができる。
【０２５４】
一旦十分な量の所望のタンパク質が得られれば、それは種々の目的に用いることができる。典型的な用途は結合に特異的な抗体の生産である。これらの抗体はポリクローナルまたはモノクローナルであってよく、当該分野でよく知られたインビトロまたはインビボ技術によって生産することができる。前記したごとく同定し単離したペプチドのいずれかのエピトープに対するモノクローナル抗体は、ネズミハイブリドーマから調製することができる（Ｋｏｈｌｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５（１９７５））。要約すれば、マウスに数マイクログラムのＨＢＭタンパク質で２週間にわたって接種する。次いで、マウスを犠牲にする。次いで、抗体を生産する細胞をマウスの脾臓から取り出す。次いで、脾臓を、ポリエチレングリコールを用いてマウス骨髄腫細胞と融合させる。首尾よく融合した細胞をマイクロタイタープレートで希釈し、培養の増殖を継続する。ウェル当たりの抗体の量は、ＥＬＩＳＡのごときイムノアッセイ方法によって測定する（Ｅｎｇｖａｌｌ，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，７０：４１９（１９８０））。抗体を生産するクローンを広げ、さらに増殖させてＨＢＭ抗体を生産することができる。他の適当な技術はリンパ球の抗原性ポリペプチドへのインビトロ暴露、またはファージまたは同様のベクター中の抗体のライブラリーの選択を含む。Ｈｕｓｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４６：１２７５−１２８１（１９８９）参照。抗体生産についてのさらなる情報については、Ｄａｖｉｓら、Ｂａｓｉｃ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｅｌｅｓｅｖｉｅｒ，ＮＹ，Ｓｅｃｔｉｏｎ２１−２（１９８９）を参照されたし。
【０２５５】
ＸＩＸ．使用の方法：遺伝子治療
近年、遺伝子病および後天的病気双方に対する遺伝子治療の分野において、かなりの技術的進歩がなされた（Ｋａｙら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，：１２７４４−１２７４６（１９９７））。治療目的でのＤＮＡの思慮深い導入として遺伝子治療を定義することができる。遺伝子導入方法の改良は、種々のタイプの病気の治療のための遺伝子治療プロトコルの開発を可能とした。また、遺伝子治療は、新しい治療遺伝子の同定の最近の進歩、ウイルスおよび非ウイルス遺伝子送達系双方の改良、遺伝子調節の良好な理解、および細胞の単離および移植の改良を利用してきた。
【０２５６】
これまでの実験は、上昇した骨量を与える優性突然変異としてのＨＢＭ遺伝子を同定する。この突然変異が優性であるという事実は、ＨＢＭタンパク質の発現が骨密度を上げることを示す。ＨＢＭ遺伝子を運ぶ、従って、ＨＢＭタンパク質を発現する他の個体は骨粗鬆症に罹らない。これらの個体はＨＢＭタンパク質で治療されつつある個体と同等である。これらの観察は、ＨＢＭタンパク質での治療的処置が骨粗鬆症を予防するという強い実験的表明である。ＨＢＭ遺伝子の骨量上昇活性を「ＨＢＭ機能」と呼ぶ。
【０２５７】
従って、本発明によると、ＨＢＭ機能を間葉幹細胞に供給する方法も提供される（Ｏｎｙｉａら、Ｊ．Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎｅｒ．Ｒｅｓ．，１３：２０−３０（１９９８）；Ｋｏら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，５６：４６１４−４６１９（１９９６））。そのような機能の供給は骨粗鬆症に対して保護を与える。ＨＢＭ遺伝子または該遺伝子の一部は、該遺伝子が染色体外に留まるように、ベクター中にて細胞に導入することができる。そのような状況において、染色体外位置から遺伝子は細胞によって発現されるであろう。
【０２５８】
組換え用および染色体外維持用の遺伝子の導入のためのベクターは当該分野で知られており、いずれかの適当なベクターを用いることができる。エレクトロポレーション、リン酸カルシウム共沈殿、およびウイルス導入のようなＤＮＡを細胞に導入する方法は当該分野で知られており、方法の選択は当業者の能力の範囲内にある（Ｒｏｂｂｉｎｓ，Ｅｄ．，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｈｕｍａｎ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＪ（１９９７））。ＨＢＭ遺伝子で形質転換した細胞は、骨粗鬆症および骨成長を促進する薬物治療を研究するためのモデル系として用いることができる。
【０２５９】
前記にて一般的に議論したごとく、適用可能であれば、ＨＢＭ遺伝子または断片を遺伝子治療方法で用いて、間葉幹細胞におけるそのような遺伝子の発現産物の量を増加させることができる。また、野生型遺伝子が正常に発現される細胞においてさえ、与えられたＨＢＭタンパク質またはその断片の発現のレベルを増加させるのに有用であろう。遺伝子治療は、例えば、Ｆｒｉｅｄｍａｎ，Ｔｈｅｒａｐｙ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ，Ｆｒｉｅｄｍａｎ，Ｅｄ．，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，ｐａｇｅｓ  １０５−１２１（１９９１）によって記載されているごとく、一般的に認められた方法に従って行われるであろう。
【０２６０】
発現制御エレメントに連結したＨＢＭ遺伝子のコピーを含有し、かつ間葉幹細胞内部で複製することができるウイルスまたはプラスミドベクターを調製する。適当なベクターは公知であり、例えば、引用によりその開示を全て本明細書に一体化させる米国特許第５，２５２，４７９号およびＷＯ９３／０７２８２に記載されている。次いで、ベクターを患者に局所的に骨髄または全身に注入して（他の部位、すなわち、血液中に位置するいずれの間葉幹細胞にも到達する）。もしトランスフェクトされた遺伝子が標的化細胞の各々のゲノムに永久的に組み込まれないならば、治療は周期的に反復されなければならないであろう。
【０２６１】
当該分野で知られた遺伝子導入系は、本発明の遺伝子治療方法の実施で有用であり得る。これらはウイルスおよび非ウイルス導入方法を含む。ポリオーマ、すなわち、ＳＶ４０（Ｍａｄｚａｋら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．，７３：１５３３−１５３６（１９９２））、アデノウイルス（Ｂｅｒｋｎｅｒ，Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５８：３９−６１（１９９２）；Ｂｅｒｋｎｅｒら、Ｂｉｏ  Ｔｅｃｈｉｎｉｑｕｅｓ，６：６１６−６２９（１９８８）；Ｇｏｒｚｉｇｌｉａら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６６：４４０７−４４１２（１９９２）；Ｑｕａｎｔｉｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：２５８１−２５８４（１９９２）；Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら、Ｃｅｌｌ，６８：１４３−１５５（１９９２）；Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２０：２２３３−２２３９（１９９２）；Ｓｔｒａｔｆｏｒｄ−Ｐｅｒｒｉｃａｕｄｅｔら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．，１：２４１−２５６（１９９０））、ワクシニアウイルス（Ｍａｃｋｅｔｔら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２４：４９５−４９９（１９９２））、アデノ−関連ウイルス（Ｍｙｚｕｃｚｋａ，Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５８：９１−１２３（１９９２））；Ｏｈｉら、Ｇｅｎｅ，８９：２７９−２８２（１９９０））、ＨＳＶおよびＥＢＶを含むヘルペスウイルス（Ｍａｒｇｏｌｓｋｅｅ，Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５８：６７−９０（１９９２）；Ｊｏｈｎｓｏｎら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６６：２９５２−２９６５（１９９２）；Ｆｉｎｋら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．，３：１１−１９（１９９２）；Ｂｒｅａｋｆｉｅｌｄら、Ｍｏｌ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．，１：３３７−３７１（１９８７；）Ｆｒｅｓｓｅら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，４０：２１８９−２１９９（１９９０））、および鳥類（Ｂｒａｎｄｙｏｐａｄｈｙａｙら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，４：７４９−７５４（１９８４）；Ｐｅｔｒｏｐｏｕｐｌｏｓら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６６：３３９１−３３９７（１９９２）），ｍｕｒｉｎｅ（Ｍｉｌｌｅｒ，Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５８：１−２４（１９９２）；Ｍｉｌｌｅｒら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，５：４３１−４３７（１９８５）；Ｓｏｒｇｅら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，４：１７３０−１７３７（１９８４）；Ｍａｎｎら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，５４：４０１−４０７（１９８５））、およびヒト起源（Ｐａｇｅら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６４：５３７０−５２７６（１９９０）；Ｂｕｃｈｓｃｈａｌｃｈｅｒら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６６：２７３１−２７３９（１９９２））のレトロウイルスを含む、多数のウイルスが遺伝子導入ベクターとして用いられてきた。ほとんどのヒト遺伝子治療プロトコルは不能にしたネズミレトロウイルスに基づくものであった。
【０２６２】
当該分野で知られた非ウイルス遺伝子導入方法はリン酸カルシウム共沈殿のごとき化学的技術（Ｇｒａｈａｍら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，５２：４５６−４６７（１９７３）；Ｐｅｌｌｉｃｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０９：１４１４−１４２２（１９８０））、機械的技術、例えば、マイクロインジェクション（Ａｎｄｅｒｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７：５３９９−５４０３（１９８０）；Ｇｏｒｄｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７：７３８０−７３８４（１９８０）；Ｂｒｉｎｓｔｅｒら、Ｃｅｌｌ，２７：２２３−２３１（１９８１）；Ｃｏｎｓｔａｎｔｉｎｉら、Ｎａｔｕｒｅ，２９４：９２−９４（１９８１））、リポソームを介する膜融合−媒介導入（Ｆｅｌｇｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４：７４１３−７４１７（１９８７）；Ｗａｎｇら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２８：９５０８−９５１４（１９８９）；Ｋａｎｅｄａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６４：１２１２６−１２１２９（１９８９）；Ｓｔｅｗａｒｔら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．，３：２６７−２７５（１９９２）；Ｎａｂｅｌら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４９：１２８５−１２８８（１９９０）；Ｌｉｍら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，８３：２００７−２０１１（１９９２））、および直接的ＤＮＡ摂取および受容体−媒介ＤＮＡ導入（Ｗｏｌｆｆら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４７：１４６５−１４６８（１９９０）；Ｗｕら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１１：４７４−４８５（１９９１）；Ｚｅｎｋｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７：３６５５−３６５９（１９９０）；Ｗｕら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６４：１６９８５−１６９８７（１９８９）；Ｗｏｌｆｆら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１１：４７４−４８５（１９９１）；Ｗａｇｎｅｒら、１９９０；Ｗａｇｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８：４２５５−４２５９（１９９１）；Ｃｏｔｔｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７：４０３３−４０３７（１９９０）；Ｃｕｒｉｅｌら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８：８８５０−８８５４（１９９１）；Ｃｕｒｅｉｅｌら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．，３：１４７−１５４（１９９１））を含む。ウイルス−媒介遺伝子導入は、周囲の細胞へではなく間葉幹細胞に対する直接的インビボベクターと組み合わせることができる（Ｒｏｍａｎｏら、Ｉｎ  Ｖｉｖｏ，１２（１）：５９−６７（１９９８）；Ｇｏｎｅｚら、Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，７（１２）：１９１３−９（１９９８））。別法として、レトロウイルスベクター生産者細胞系を骨髄に注入することができる（Ｃｕｌｖｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５６：１５５０−１５５２（１９９２））。次いで、生産者細胞の注入はベクター粒子の継続的源を提供するであろう。この技術は、手術不可能な脳腫瘍を持つヒトでの使用が認可されている。
【０２６３】
生物学的および物理学的遺伝子導入方法を組み合わせるアプローチにおいて、いずれかのサイズのプラスミドＤＮＡを、アデノウイルスヘキソンタンパク質に対して特異的なポリリシン−コンジュゲート抗体と組み合わせ、得られた複合体をアデノウイルスベクターに結合させる。次いで、三分子複合体を用いて細胞を感染させる。アデノウイルスベクターは、効果的な結合、インターナライゼーション、およびカップリングしたＤＮＡが損傷する前のエンドソームの分解を可能とする。
【０２６４】
リポソーム／ＤＮＡ複合体は、直接的インビボ遺伝子導入を媒介できることが示されている。標準的なリポソーム調製においては、遺伝子導入プロセスは非特異的であるが、例えば、直接的ｉｎ  ｓｉｔｕ投与に従い、局所化されたインビボ摂取および発現が腫瘍寄託で報告されている（Ｎａｂｅｌ，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．，３：３９９−４１０（１９９２））。
【０２６５】
ＸＸ．使用の方法：形質転換された宿主、医薬および研究ツールの開発
ＨＢＭ遺伝子を運ぶ細胞および動物をモデル系として用いて、治療剤としての潜在能力を有する物質につき研究し、テストすることができる（Ｏｎｙｉａら、Ｊ．Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎｅｒ．Ｒｅｓ．，１３：２０−３０（１９９８）；Ｂｒｏｄｅｒら、Ｂｏｎｅ，２１：２２５−２３５（１９９７））。細胞は、典型的には、培養された間葉幹細胞である。これらは、体細胞または生殖系ＨＢＭ遺伝子を持つ個体から単離することができる。別法として、前記したごとく、ＨＢＭ遺伝子を運ぶように細胞系を作成することができる。テスト物質を細胞に適用した後、細胞の形質転換された表現型を測定する。培養における骨マトリックスの形成（Ｂｒｏｄｅｒら、Ｂｏｎｅ，２１：２２５−２３５（１９９７））、機械的特性（Ｋｉｚｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９４：１０１３−１０１８（１９９７））および推定治療剤の適用に対する応答を含む、形質転換された細胞のいずれの特性を評価することもできる。
【０２６６】
生殖細胞系列または接合体の治療の後、治療剤をテストするための動物を選択することができる。そのような治療は、Ｚｍａｘ１遺伝子の挿入、ならびにＨＢＭ遺伝子の挿入および破壊された相同遺伝子を含む。別法として、例えば、Ｃａｐｅｃｈｉ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４：１２８８（１９８９）；Ｖａｌａｎｃｕｉｓら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，１１：１４０２（１９９１）；Ｈａｓｔｙら、Ｎａｔｕｒｅ，３５０：２４３（１９９１）；Ｓｈｉｎｋａｉら、Ｃｅｌｌ，６８：８５５（１９９２）；Ｍｏｍｂａｅｒｔｓら、Ｃｅｌｌ，６８：８６９（１９９２）；Ｐｈｉｌｐｏｔｔら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５６：１４４８（１９９２）；Ｓｎｏｕｗａｅｒｔら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５７：１０８３（１９９２）；Ｄｏｎｅｈｏｗｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ，３５６：２１５（１９９２）に記載されているもののごとき、慣用的技術を用い、他の遺伝子的改変の挿入または欠失突然変異によって、動物の挿入されたＺｍａｘ１遺伝子（または複数の遺伝子）および／またはＨＢＭ遺伝子（または複数の遺伝子）を破壊することができる。テスト物質を動物に投与した後、骨の成長を評価しなければならない。もしテスト物質が骨の成長を促進するならば、テスト物質は候補治療剤である。これらの動物モデルは、潜在的治療産物のための極端に重要な媒体を提供する。
【０２６７】
ＨＢＭ遺伝子を運ぶ個体は上昇した骨密度を有する。骨発生に関与する他の分子の活性、レベル、発現パターンおよび修飾状態を改変することによって、ＨＢＭ遺伝子はこの表現型を起こす。種々の確立された技術を用い、その活性、レベル、発現パターン、および修飾状態が、Ｚｍａｘ１遺伝子を含有する系およびＨＢＭ遺伝子を含有する系の間である分子、好ましくはタンパク質またはｍＲＮＡを同定することができる。そのような系は、例えば、無細胞抽出物、細胞、組織、またはマウスもしくはヒトのごとき生きた生物であり得る。Ｚｍａｘ１の突然変異体形態では、Ｚｍａｘ１の完全な欠失、タンパク質の細胞外または細胞内一部を欠く突然変異、またはＺｍａｘ１遺伝子におけるいずれかの他の突然変異を用いることができる。また、アンチセンスＺｍａｘ１  ＲＮＡまたはオリゴヌクレオチドの発現を用いて、Ｚｍａｘ１タンパク質の生産を阻害することができる。ＨＢＭの突然変異体形態では、ＨＢＭの完全な欠失、ＨＢＭタンパク質の細胞外または細胞内部分を欠く突然変異、またはＨＢＭ遺伝子におけるいずれかの他の突然変異を用いることができる。また、アンチセンスＨＢＭ  ＲＮＡまたはオリゴヌクレオチドの発現を用いて、ＨＢＭタンパク質の生産を阻害することができる。
【０２６８】
Ｚｍａｘ１系およびＨＢＭ系の比較によって同定した分子を、医薬の開発において、またはヒトまたは動物骨の病気の診断においてサロゲートマーカーとして用いることができる。別法として、そのような分子は骨の病気の治療で用いることができる。Ｓｃｈｅｎａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７０：４６７−４７０（１９９５）参照。
【０２６９】
例えば、マウスホモログにおけるＨＢＭ遺伝子を運ぶトランスジェニックマウスを構築する。遺伝子型ＨＢＭ／＋のマウスは活力があり、健康であり、かつ上昇した骨量を有する。上昇した骨量についてのサロゲートマーカーを同定するために、ＨＢＭ／＋（すなわち、ヘテロ接合性）および同質遺伝子＋／＋（すなわち、野生型）マウスを犠牲にする。骨組織ｍＲＮＡを各動物から抽出し、＋／＋個体で発現されたｍＲＮＡに対応する「遺伝子チップ」を構築する。異なる組織からのｍＲＮＡを各遺伝子型の動物から単離し、逆転写し、蛍光標識し、次いで、固体支持体に付着させた遺伝子断片にハイブリダイズさせる。２つの集団の間の蛍光密度の比率は、＋／＋およびＨＢＭ／＋動物における特異的ｍＲＮＡの相対的豊富さの指標である。野生型対照に対する過剰および過少発現されたｍＲＮＡをコードする遺伝子は、ＨＢＭ遺伝子によって共同して調節された遺伝子についての候補である。
【０２７０】
既に発見されたタンパク質としての同一シグナリングカスケードの一部である新しいタンパク質の同定のための１つの標準的手法は以下の通りである。細胞を放射性リンで処理し、既に発見されたタンパク質をより活性または活性が低くなるように操作する。次いで、他のタンパク質のリン酸化状態をポリアクリルアミドゲル電気泳動およびオートラジオグラフィーまたは同様の技術によってモニターする。公知のタンパク質の活性のレベルは、例えば、薬物または抗体のごとき特異的阻害剤を用いる野生型突然変異体タンパク質の比較、公知の細胞外タンパク質の単なる添加または非添加、または公知のタンパク質の発現のアンチセンス阻害の使用を含む多くの方法によって、公知のタンパク質の活性のレベルを操作することができる（Ｔａｍｕｒａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８０（５３６９）：１６１４−７（１９８８）；Ｍｅｎｇ，ＥＭＢＯ  Ｊ．，１７（１５）：４３９１−４０３（１９９８）；Ｃｏｏｐｅｒら、Ｃｅｌｌ，１：２６３−７３（１９８２））。
【０２７１】
もう１つの例において、異なるレベルのリン酸化を持つタンパク質は、Ｚｍａｘ１についてのセンスまたはアンチセンスｃＤＮＡいずれかを発現するＴＥ８５骨肉腫細胞で同定される。ＴＥ８５細胞は、通常、高レベルのＺｍａｘ１を発現する（Ｄｏｎｇら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．＆Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．，２５１：７８４−７９０（１９９８））。センス構築体を含有する細胞はより高いレベルのＺｍａｘ１でさえ発現し、他方、アンチセンス構築体を発現する細胞はより低レベルで発現する。細胞を３２Ｐの存在下で増殖させ、収穫し、溶解し、溶解物をＳＤＳポリアミドゲルに流してタンパク質を分離し、ゲルをオートラジオグラフィーに付す（Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ（１９９７））。センスおよびアンチセンス細胞系の間で密度が異なるバンドは、そのリン酸化状態または絶対レベルがＺｍａｘ１のレベルに応答して変化するリンタンパク質を表す。３２Ｐ−標識に対する代替法として、未標識タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、プローブとして商業的に入手可能な抗ホスホチロチン抗体を用いるイムノブロッティングに付すことができる（Ｔｈｏｍａｓら、Ｎａｔｕｒｅ，３７６（６５３７）：２６７−７１（１９９５））。アンチセンスＲＮＡの発現に対する代替法として、化学的に修飾されたアンチセンスオリゴヌクレオチドでのトランスフェクションを用いることができる（Ｗｏｏｌｆら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１８（７）：１７６３−９（１９９０））。
【０２７２】
骨粗鬆症のごとき多くの骨障害は遅い開始および治療に対する遅い応答を有する。従って、骨発生およびミネラル化についての代替物マーカーを開発するのは有用である。そのようなマーカーは、骨障害のための、および骨障害の晩年の発生の危険性があり得る患者を診断するための治療を開発するために有用である。好ましいマーカーの例は、引用してその開示を全部一体化させる米国特許第５，４５５，１７９号，５，６４１，８３７号および第５，６５２，１１２号に記載されたＮ末端およびＣ末端テロペプチドマーカーである。ＨＩＶ病の領域においてＣＤ４カウントおよびウイルス負荷は、病気進行についての有用なサロゲートマーカーである（Ｖｌａｈｏｖら、ＪＡＭＡ，２７９（１）：３５−４０（１９９８））。骨病の領域においては、類似のサロゲートマーカーに対する要望が存在する。
【０２７３】
サロゲートマーカーは、容易にテストされ、非特異的影響に対して比較的鈍感であるいずれの特徴でもあり得る。例えば、サロゲートマーカーは、組織におけるまたは血清におけるタンパク質またはｍＲＮＡのごとき分子であり得る。別法として、サロゲートマーカーは、苦痛に対する感度、反射応答等のごとき診断兆候であり得る。
【０２７４】
さらにもう１つの例において、上昇した骨量についてのサロゲートマーカーは、ＨＢＭ遺伝子を運ぶヒトの親族を用いて同定される。ＨＢＭ遺伝子を運ぶ３つの個体から、および運ばない３つの密接に関係する個体から血液試料を抜く。これらの個体からの血清中のタンパク質を二次元ゲルシステムにて電気泳動に付し、ここに、一次元はサイズによってタンパク質を分離し、もう１つの次元は等電点によってタンパク質を分離する（Ｅｐｓｔｅｉｎら、Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，１７（１１）：１６５５−７０（１９９６））。タンパク質に対応するスポットを同定する。その正常な親族と比較して、ＨＢＭ個体につき、少数のスポットは異なる量またはわずかに異なる位置に存在することが予測される。これらのスポットは、候補サロゲートマーカーであるタンパク質に対応する。タンパク質の同一性はミクロ配列決定によって決定され、タンパク質に対する抗体は、診断的テスト手法で用いられる標準的な方法によって生産することができる。ＨＢＭタンパク質または他の候補サロゲートマーカーについての診断アッセイは、ヒト体液、膜、骨、細胞、組織またはその抽出物中のＨＢＭを検出するための、本発明で記載した抗体およびレポーター分子の使用を含む。抗体は、検出可能なシグナルを供する物質とそれを共有結合的にまたは非共有結合的に合わせることによって標識することができる。多くの科学および特許文献において、放射性核種、酵素、蛍光、化学蛍光または発色剤を含む種々のレポーター分子または標識が記載されている（米国特許第３，８１７，８３７号、第３，８５０，７５２号、第３，９３９，３５０号、第３，９９６，３４５号，４，２７７，４３７号、第４，２７５，１４９号および第４，３６６，２４１号）。
【０２７５】
これらの抗体を用い、正常個体ならびに骨粗鬆症、骨粗鬆症偽性神経膠腫、エングルマン病、リビング病、高ホスファターゼ血症、ヴァン・ビューレン病、メロレオストーシス、大理石骨病、サイコディソストーシス、硬化狭窄、オステオポイキリー、先端巨大症、パジェット病、腺維性形成異常、管状狭窄、骨形成不全症、上皮小体機能低下症、偽性上皮小体機能低下症、偽性偽性上皮小体機能低下症、一次および二次上皮小体機能亢進症ならびに関連症候群、高カルシウム尿症、甲状腺の髄質癌腫、骨軟化症および他の病気のごとき骨障害に罹った患者において、候補サロゲートマーカーのレベルが測定される。抗体を用いる臨床的状況において血清中のタンパク質のレベルを測定する技術はよく確立されている。特定の病気タイプの病気を運ぶ個体でのより高いまたは低いレベルで執拗に存在するタンパク質は有用なサロゲートマーカーである。
【０２７６】
サロゲートマーカーは骨障害の診断で用いることができる。例えば、骨折の高い頻度を持つ子供が医師に示されたことを考えてみる。根本的な原因は子供の濫用、子供による不適切な挙動、または骨障害であり得る。骨障害につき迅速にテストするためには、前記した抗体を用いてサロゲートマーカータンパク質を測定する。
【０２７７】
サロゲートマーカーの修飾状態のレベルを、開発されつつある薬物のありそうな有効性の指標として測定することができる。骨障害についての治療を作り出すにおいてサロゲートマーカーを用いるのは特に便利である。なぜならば、骨発生またはミネラル化における改変は観察するのに長い時間を必要とし得るからである。例えば、「ＨＢＭ誘導性ｍＲＮＡセット」と呼ばれる骨ｍＲＮＡセットは、前記した＋／＋マウスと比較してＨＢＭ／＋マウスにおいて過剰発現することが判明する。この組の発現をサロゲートマーカーとして用いることができる。具体的には、もし化合物での＋／＋マウスの治療の結果、ＨＢＭ誘導性ｍＲＮＡセットの過剰発現がもたらされれば、その化合物はさらなる開発のための有望な候補と考えられる。
【０２７８】
本発明は、種々の薬物スクリーニング技術のいずれかにおいて、Ｚｍａｘ１またはＨＢＭタンパク質またはその結合断片を用いることによって化合物をスクリーニングするのに特に有用である。
【０２７９】
そのようなテストで使用されるＺｍａｘ１またはＨＢＭタンパク質または断片は溶液中で遊離しているか固体支持体に付着しているか、または細胞表面に担持されていてもよい。薬物スクリーニングの１つの方法は、好ましくは競合結合アッセイにおいて、タンパク質または断片を発現する組換え核酸で安定に形質転換される真核生物または原核生物宿主細胞を利用する。生きたまたは固定された形態いずれかのそのような細胞は、標準結合アッセイで用いることができる。例えば、Ｚｍａｘ１またはＨＢＭタンパク質または断片およびテストすべき剤の間の複合体の形成につき測定することができるか、またはＺｍａｘ１またはＨＢＭタンパク質または断片の間の複合体の形成がテストすべき剤によって干渉される程度を調べることができる。
【０２８０】
従って、本発明は、そのような剤をＺｍａｘ１またはＨＢＭタンパク質またはその断片と接触させ、（Ｉ）剤とＺｍａｘ１またはＨＢＭタンパク質または断片との間の複合体の存在につき、または（ＩＩ）Ｚｍａｘ１またはＨＢＭタンパク質または断片とリガンドとの間の複合体の存在につき、当該分野でよく知られた方法によってアッセイすることを特徴とする薬物のスクリーニング方法を提供する。そのような競合結合アッセイにおいては、Ｚｍａｘ１またはＨＢＭタンパク質または断片を典型的には標識する。遊離Ｚｍａｘ１またはＨＢＭタンパク質または断片はタンパク質、タンパク質複合体に存在するものから分離し、遊離（すなわち、非複合体化）標識の量は、各々、テストすべき剤のＺｍａｘ１またはＨＢＭへの結合、またはＺｍａｘ１またはＨＢＭ：リガンド結合とのその干渉の尺度である。
【０２８１】
薬物スクリーニングのためのもう１つの技術はＺｍａｘ１またはＨＢＭタンパク質に対する適当な結合親和性を有する化合物についての高スループットスクリーニングを提供し、これはＷＯ８４／０３５６４に詳細に記載されている。簡単に述べれば、多数の異なる小さなペプチドテスト化合物を、プラスチックピンまたはいくつかの他の表面のごとき固体基材上で合成する。ペプチドテスト化合物をＺｍａｘ１またはＨＢＭタンパク質と反応させ、洗浄する。次いで、当該分野でよく知られた方法によって結合したＺｍａｘ１またはＨＢＭタンパク質を検出する。精製されたＺｍａｘ１またはＨＢＭを、前記した薬物スクリーニング技術で用いるために、直接プレート上にコートすることができる。しかしながら、タンパク質に対する非中和抗体を用いて抗体を捕獲して、Ｚｍａｘ１またはＨＢＭタンパク質を固相に固定化することができる。
【０２８２】
また、本発明では、競合薬物スクリーニングアッセイの使用が考えられ、ここに、Ｚｍａｘ１またはＨＢＭタンパク質に特異的に結合できる中和抗体が、Ｚｍａｘ１またはＨＢＭタンパク質またはその断片に結合するテスト化合物と競合する。このように、抗体を用いて、Ｚｍａｘ１またはＨＢＭタンパク質の１以上の抗原決定基を有するいずれのペプチドの存在も検出することができる。
【０２８３】
薬物スクリーニングのためのさらなる技術は、非機能的Ｚｍａｘ１またはＨＢＭ遺伝子を有する（前記したごとき）宿主真核生物細胞系または細胞の使用を含む。これらの宿主細胞系または細胞はＺｍａｘ１またはＨＢＭタンパク質のレベルで欠陥がある。宿主細胞系または細胞を薬物化合物の存在下で増殖させる。宿主細胞の増殖速度を測定して、化合物がＺｍａｘ１またはＨＢＭ欠陥細胞の増殖を調節できるかを決定する。
【０２８４】
合理的な薬物デザインの目標は、注目する生物学的活性なタンパク質の、またはそれと相互作用する小分子（例えば、アゴニスト、アンタゴニスト、阻害剤）の構造アナログを生じさせて、例えば、タンパク質のより活性なまたは安定な形態である、または例えばインビボでタンパク質の機能を増強するまたは機能と干渉する薬物を作成することである。例えば、Ｈｏｄｇｓｏｎ，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，９：１９−２１（１９９１）参照。１つのアプローチにおいて、注目するタンパク質（例えば、Ｚｍａｘ１またはＨＢＭタンパク質）の、またはＺｍａｘ１−またはＨＢＭ−受容体またはリガンド複合体の三次元構造を、Ｘ線結晶学によって、コンピューターモデリングによって、最も典型的にはアプローチの組合せによってまず測定する。しばしばではないが、タンパク質の構造に関する有用な情報は、相同タンパク質の構造に基づくモデリングによって獲得することができる。合理的な薬物デザインの例はＨＩＶプロテアーゼ阻害剤の開発である（Ｅｒｉｃｋｓｏｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４９：５２７−５３３（１９９０））。加えて、ペプチド（例えば、Ｚｍａｘ１またはＨＢＭタンパク質）をアラニン走査によって分析する（Ｗｅｌｌｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，２０２：３９０−４１１（１９９１））。この技術において、アミノ酸残基はＡｌａによって置き換えられ、ペプチドの活性に対するその効果が測定される。ペプチドのアミノ酸残基の各々をこのようにして分析して、ペプチドの重要な領域を測定する。
【０２８５】
また、機能的アッセイによって選択された標的特異的抗体を単離し、次いで、その結晶構造を解明することもできる。原理的には、このアプローチは、引き続いての薬物デザインがそれを基礎とすることができるファルマコアを生じる。機能的な薬理学的活性抗体に対する抗イディオタイプ抗体（抗ｉｄｓ）を作り出すことによって、一緒にタンパク質結晶学を迂回することができる。鏡像の鏡像としては、抗−ｉｄｓの結合部位は元の受容体のアナログであると予測されよう。次いで、抗−ｉｄを用いて、ペプチドの化学的または生物学的に生産されたバンクのペプチドのバンクからペプチドを同定し、それを単離できよう。次いで、選択されたペプチドはファルマコアとして作用するであろう。
【０２８６】
従って、例えば、改良されたＺｍａｘ１またはＨＢＭタンパク質活性または安定性を有する、またはＺｍａｘ１またはＨＢＭタンパク質活性の阻害剤、アゴニスト、アンタゴニスト等として作用する薬物を設計することができる。クローン化Ｚｍａｘ１またはＨＢＭ配列の利用可能性によって、十分な量のＺｍａｘ１またはＨＢＭタンパク質を利用可能にして、Ｘ線結晶学のごとき分析研究を行うことができる。加えて、本明細書中で提供されたＺｍａｘ１またはＨＢＭタンパク質配列の知識は、Ｘ線結晶学の代わりに、またはそれに加えて、コンピューターモデリング技術を使用するものをガイドするであろう。
【０２８７】
ＸＸＩ．使用の方法：鳥類および哺乳動物育種学
Ｚｍａｘ１  ＤＮＡおよびＺｍａｘ１タンパク質および／またはＨＢＭ  ＤＮＡおよびＨＢＭタンパク質を脊椎動物、好ましくはヒトの治療剤のために、および家畜育種を含む鳥類および哺乳動物剤のために用いることができる。例えば、ニワトリ、オンドリ、メンドリ、シチメンチョウ、ダチョウ、アヒル、クジャクおよびウズラを含む鳥類は、高骨量についての遺伝子および経路の同定から利益を受け得る。文献で引用された多くの例において（例えば、ＭｃＣｏｙら、Ｒｅｓ．Ｖｅｔ．Ｓｃｉ．，６０（２）：１８５−１８６（１９９６））、育種条件により弱った骨はケージ層疲労、骨粗鬆症および高死亡率を引き起こす。鳥類において骨粗鬆症または他の骨病気を治療するためのさらなる治療剤は、鳥類の福祉および、例えば、肉および卵生産を含む畜産産業の経済的状態に対してかなりの有益な効果を有し得る。
【０２８８】
ＸＸＩＩ．使用の方法：骨発生に影響する遺伝子的改変の検出のためのＺｍａｘ１−特異的オリゴヌクレオチドを用いる診断アッセイ
骨発生の変化または病気がＺｍａｘ１遺伝子またはＨＢＭ遺伝子の改変を含むと疑われる場合、特異的オリゴヌクレオチドを構築し、それを用いて、骨組織または骨発生に影響するもう１つの組織において、各々、Ｚｍａｘ１  ｍＲＮＡまたはＨＢＭ  ｍＲＮＡのレベルを評価することができる。
【０２８９】
例えば、人が骨密度に影響するＨＢＭ遺伝子を有するか否かをテストするために、ポリメラーゼ鎖反応を用いることができる。２つのオリゴヌクレオチドを標準的な方法によって合成するか、あるいは既製のオリゴヌクレオチドの商業的供給業者から入手する。Ｏｌｉｇｏ  ４．０プライマーピッキングプログラム（Ｗｏｊｃｈｉｃｈ  Ｒｙｃｈｌｉｋ，１９９２）を用い、標準的な基準によって、長さおよびベース組成物を測定する。オリゴヌクレオチドのうちの１つは、それが、用いるＰＣＲ条件下でＨＢＭ  ＤＮＡのみにハイブリダイズするように設計される。他のオリゴヌクレオチドは、これらのオリゴヌクレオチドプライマーを用いるＤＮＡの増幅が便宜には同定されたＤＮＡ断片を生産するように、Ｚｍａｘ１ゲノムＤＮＡのセグメントにハイブリダイズするように設計される。例えば、プライマーの対ＣＣＡＡＧＴＴＣＴＧＡＧＡＡＧＴＣＣ（配列番号３２）およびＡＡＴＡＣＣＴＧＡＡＡＣＣＡＴＡＣＣＴＧ（配列番号３３）は、以下の条件を用いる場合にＤＮＡ試料から５３０塩基対ＤＮＡ断片を増幅する。１２０秒間の９５℃における工程１；３０秒間の９５℃における工程２；３０秒間の５８℃における工程３；１２０秒間の７２℃における工程４；ここに、工程２〜４は３５回反復される。組織試料は毛包、全血、頬腔から得ることができる。
【０２９０】
前記手法によって生じた断片を標準的な技術によって配列決定する。ＨＢＭ遺伝子にヘテロ接合性である個体は、グリシン１７１についてのコドンにおける第２の位置に等しい量のＧおよびＴを示すであろう。正常またはホモ接合性野生型個体はこの位置にＧのみを示すであろう。連結−媒介ＰＣＲまたはＱ−βレプリカーゼを含む技術のような、ＰＣＲに加えて他の増幅技術を別法として用いることができる（Ｃａｈｉｌｌら、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．，３７（９）：１４８２−５（１９９１））。例えば、オリゴヌクレオチドＡＧＣＴＧＣＴＣＧＴＡＧＣＴＧＴＣＴＣＴＣＣＣＴＧＧＡＴＣＡＣＧＧＧＴＡＣＡＴＧＴＡＣＴＧＧＡＣＡＧＡＣＴＧＧＧＴ（配列番号３４）およびＴＧＡＧＡＣＧＣＣＣＣＧＧＡＴＴＧＡＧＣＧＧＧＣＡＧＧＧＡＴＡＧＣＴＴＡＴＴＣＣＣＴＧＴＧＣＣＧＣＡＴＴＡＣＧＧＣ（配列番号３５）を変性されたヒトＤＮＡ試料にハイブリダイズさせ、ＤＮＡリガーゼで処理し、次いで、プライマーオリゴヌクレオチドＡＧＣＴＧＣＴＣＧＴＡＧＣＴＧＴＣＴＣＴＣＣＣＴＧＧＡ（配列番号３６）およびＧＣＣＧＴＡＡＴＧＣＧＧＣＡＣＡＧＧＧＡＡＴＡＡＧＣＴ（配列番号３７）を用いるＰＣＲ増幅に付す。最初の２つのオリゴヌクレオチドにおいて、外側の２７塩基はプライマー結合部位に対応するランダム配列であって、内側３０塩基はＺｍａｘ１遺伝子における配列に対応する。最初のオリゴヌクレオチドの端部におけるＴはＨＢＭ遺伝子に対応する。最初の２つのオリゴヌクレオチドは、ＨＢＭ遺伝子を運ぶヒトＤＮＡにハイブリダイズする場合のみに連結され、その結果、増幅可能な１１４ｂｐ  ＤＮＡ断片が形成される。
【０２９１】
増幅の産物は、アガロースゲル電気泳動、定量的ハイブリダイゼーション、または分子生物学の分野の当業者に知られた核酸検出のための同等技術によって検出することができる（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ，ＮＹ（１９８９））。
【０２９２】
Ｚｍａｘ１遺伝子またはＨＢＭ遺伝子における他の改変は、それらの改変を同定するように設計されたオリゴヌクレオチドを用いることによる、同一タイプの増幅検出手法によって診断することができる。これらの手法を動物ならびにヒトで用いて、骨発生に影響するＺｍａｘ１またはＨＢＭにおける改変を同定することができる。
【０２９３】
骨組織におけるＺｍａｘ１またはＨＢＭの発現は、各々、Ｚｍａｘ１またはＨＢＭのｃＤＮＡを、脊椎動物細胞を遺伝子工学により作成するためのベクターの関係で骨−特異的プロモーターに融合させることによって達成することができる。ＤＮＡ構築体は、ＤＮＡをウイルスキャプシドにパッケージングすることによって、カチオン性リポソーム、エレクトロポレーションを用いることによって、またはリン酸カルシウムトランスフェクションによって細胞に導入される。トランスフェクトされた細胞、好ましくは、骨芽細胞を培養で実験することができるか、あるいは骨への直接的注入によって、または骨芽細胞の静脈内注射、引き続いての骨組織への取込みによって、骨組織に導入することができる（Ｋｏら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，５６（２０）：４６１４−９（１９９６））。例えば、骨芽細胞で特異的に活性であるオステオカルシンプロモーターを用いて、Ｚｍａｘ１遺伝子またはＨＢＭ遺伝子の転写を指令することができる。レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクターまたはカチオン性リポソーム、または他の方法およびここに記載するベクターを用いるトランスフェクション後に維持されるベクターのような、いくつかのベクターおよびトランスフェクション方法のいずれかを用いることができる。
【０２９４】
機能的Ｚｍａｘ１タンパク質またはＨＢＭタンパク質のレベルの変化は骨ミネラル化のレベルに影響する。機能的Ｚｍａｘ１タンパク質またはＨＢＭタンパク質のレベルを操作することによって、骨発生に影響させ、骨ミネラル化のレベルを増大または減少させることができる。例えば、骨粗鬆症を持つ患者において骨ミネラル化を増加さすのは有用であり得る。別法として、骨粗鬆症またはパジェット病を持つ患者において骨ミネラル化を低下させるのは有用であり得る。また、Ｚｍａｘ１レベルまたはＨＢＭレベルの変化は研究ツールとして用いることもできる。具体的には、そのレベルまたは修飾状態が、Ｚｍａｘ１またはＨＢＭの機能的レベルの変化に応答して変化するタンパク質、ｍＲＮＡおよび他の分子を同定することができる。骨障害の病理学および病因は公知であり、例えば、ＲｕｂｉｎおよびＦａｒｂｅｒ（編），Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，２ｎｄ  Ｅｄ．，Ｓ．Ｂ．Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｃｏ．，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ（１９９４）に記載されている。
【０２９５】
種々の技術を用いて、機能的Ｚｍａｘ１またはＨＢＭのレベルを変化させることができる。例えば、Ｚｍａｘまたはその突然変異、またはＨＢＭまたはその突然変異の細胞外部分の静脈内または骨内注射は、処置したヒト、動物または鳥類の身体において、各々、Ｚｍａｘ１活性またはＨＢＭ活性のレベルを変化させるであろう。また、Ｚｍａｘ１タンパク質またはＨＢＭタンパク質の切形バージョンを注射して、各々、機能的Ｚｍａｘ１タンパク質またはＨＢＭタンパク質のレベルを変化させることもできる。Ｚｍａｘ１またはＨＢＭのある形態は内因性タンパク質の活性を増強させ、他方、他の形態は阻害性である。
【０２９６】
好ましい実施形態において、ＨＢＭタンパク質を用いて骨粗鬆症を治療する。さらなる好ましい実施形態において、ＨＢＭタンパク質の細胞外部分を用いる。このＨＢＭタンパク質は、所望により、タンパク質を細胞の表面に接着させる部位の添加によって修飾することができる。タンパク質は医薬上許容される溶液中にて調製され、注射、または許容される薬物動態学および分布を達成する他の方法によって投与される。
【０２９７】
この方法の第２の実施形態において、遺伝子治療技術によってＺｍａｘ１またはＨＢＭレベルを上昇させ、または低下させる。Ｚｍａｘ１またはＨＢＭレベルを上昇させるためには、骨芽細胞または他の有用な細胞型を遺伝子工学的に作成して、前記したごとく高レベルのＺｍａｘ１またはＨＢＭを発現させる。別法として、Ｚｍａｘ１またはＨＢＭレベルを低下させるには、翻訳可能なＺｍａｘ１またはＨＢＭ  ｍＲＮＡのレベルを特異的に低下させるアンチセンス構築体を用いることができる。一般に、ＣＭＶプロモーターまたは発現ベクターで見出される他の商業的に入手可能なプロモーターのごとき組織−非特異的プロモーターを用いることができる（Ｗｕら、Ｔｏｘｉｃｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，１４１（１）：３３０−９（１９９６））。好ましい実施形態において、Ｚｍａｘ１  ｃＤＮＡまたはそのアンチセンスをオステオカルシンまたは他のプロモーターのごとき骨−特異的プロモーターによって転写して、骨組織において特異的発現を達成する。このようにして、もしＺｍａｘ１−発現ＤＮＡ構築体またはＨＢＭ−発現構築体を非骨組織に導入すれば、それは発現されないであろう。
【０２９８】
この方法の第３の実施形態において、Ｚｍａｘ１またはＨＢＭに対する抗体を用いてその機能を阻害する。そのような抗体はここに同定される。
【０２９９】
この方法の第４の実施形態において、Ｚｍａｘ１機能またはＨＢＭ機能を阻害する薬物を用いる。そのような薬物は本明細書中に記載され、医薬開発の分野の当業者によく知られた医療化学の技術に従って最適化される。
【０３００】
ＺｍａｘおよびＨＢＭはＡｐｏＥのごときいくつかのタンパク質と相互作用する。Ｚｍａｘ１またはＨＢＭおよびＡｐｏＥまたはもう１つの結合パートナーの間の相互作用を阻害する分子は、骨発生およびミネラル化を変化させると予測される。そのような阻害剤は、骨粗鬆症、大理石骨病、または骨ミネラル化の他の病気の治療における薬物として有用であり得る。そのような阻害剤は低分子量化合物、タンパク質または他のタイプの分子であり得る。Ｋｉｍら、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（Ｔｏｋｙｏ），１２４（６）：１０７２−１０７６（１９９８）参照。
【０３０１】
Ｚｍａｘ１またはＨＢＭの間の相互作用の阻害剤および相互作用タンパク質は、標準的な薬物−スクリーニング技術によって単離することができる。例えば、Ｚｍａｘ１タンパク質（またはその断片）またはＨＢＭタンパク質（またはその断片）は、マイクロタイターウェルのベースのごとき固体支持体上に固定化することができる。ＡｐｏＥのごとき第２のタンパク質またはタンパク質断片を誘導体化して、例えば、フルオレセインでの検出を助ける。次いで、各々、Ｚｍａｘ１またはＨＢＭのこのタンパク質−タンパク質ドメインを特異的に阻害することができる候補化合物の存在下で、ヨウ素またはビオチンをＺｍａｘ１またはＨＢＭに添加し、従って、その膜貫通セグメントに関する問題を回避する。このタイプの薬物スクリーニングは医薬開発の分野の当業者によく知られている。
【０３０２】
Ｚｍａｘ１およびＨＢＭは骨発生に関与するので、Ｚｍａｘ１およびＨＢＭに結合するタンパク質は骨発生に関与すると予測される。そのような結合タンパク質は、共免疫沈澱、共分画、または２ハイブリッドスクリーニング（Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ（１９９７））のごとき標準的な方法によって同定することができる。例えば、２ハイブリッド系を用いてＺｍａｘ１−相互作用タンパク質またはＨＢＭ−相互作用タンパク質を同定するには、Ｚｍａｘ１またはＨＢＭの細胞外ドメインをＬｅｘＡに融合させ、酵母ベクターｐＥＧ２０２（該「ベイト」））につき発現させ、酵母株ＥＧＹ４８で発現させる。候補相互作用タンパク質に融合したガラクトース誘導転写−活性化配列を酵母する、適当なベクター中の「プレイ」ライブラリーで酵母株を形質転換する。この方法によって相互作用タンパク質をまず選択し、引き続いてそれを確認するための技術は分子生物学の分野の当業者によく知られている（Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ（１９９７））。
【０３０３】
好ましい実施形態において、ＨＢＭと相互作用するが、Ｚｍａｘ１とは相互作用しないタンパク質は、前記手法の変形を用いて同定される（Ｘｕら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９４（２３）：１２４７３−８（Ｎｏｖ．１９９７））。２ハイブリッド系のこの変形は２つのベイトを用い、Ｚｍａｘ１およびＨＢＭを、各々、ＬｅｘＡおよびＴｅｔＲに融合させる。別法として、ＨＢＭと相互作用するがＺｍａｘ１とは相互作用しないタンパク質も単離される。これらの手法は分子生物学の分野の当業者によく知られており、それは標準的な２ハイブリッド手法の単純な変形である。
【０３０４】
Ｚｍａｘ１またはＨＢＭ相互作用タンパク質を単離する別の方法として、生化学アプローチを用いる。細胞外ドメインのごときＺｍａｘ１タンパク質またはその断片、あるいは細胞外ドメインのごときＨＢＭタンパク質またはその断片を化学的にセファロースビーズにカップリングさせる。Ｚｍａｘ１結合ビーズまたはＨＢＭ結合ビーズをカラムに注ぐ。血清タンパク質、骨バイオプシーの上清中のタンパク質、または穏やかに溶解させたＴＥ８５骨芽細胞からの細胞内タンパク質のごときタンパク質の抽出物をカラムに添加する。非特異的に結合したタンパク質を溶出させ、カラムを低塩緩衝液で数回洗浄し、次いで、きつく結合するタンパク質を高塩緩衝液で溶出させる。これらはＺｍａｘ１またはＨＢＭに結合する候補タンパク質であり、標準的なテストおよび対照実験によって特異的結合によってテストすることができる。カップリングタンパク質で用いるセファロースビーズおよびカップリングを行うための方法は商業的に入手可能であり（Ｓｉｇｍａ）、本明細書中で記載した手法はタンパク質生化学の分野の当業者によく知られている。
【０３０５】
前記手法の変形として、次いで、Ｚｍａｘ１セファロースカラムまたはＨＢＭセファロースカラムから高塩によって溶出されるタンパク質をＨＢＭ−Ｚｍａｘ１セファロースカラムに添加する。スティッキングなくして流れて通過するタンパク質は、Ｚｍａｘ１に結合するが、ＨＢＭには結合しないタンパク質である。別法として、ＨＢＭタンパク質に結合するが、Ｚｍａｘ１タンパク質には結合しないタンパク質は、カラムを用いる順番を逆にすることによって単離することができる。
【０３０６】
ＸＸＩＩＩ．使用の方法：形質転換−関連組換え（ＴＡＲ）クローニング
Ｚｍａｘ１の新規な対立遺伝子変種の同定で必須なことは、個体における遺伝子の双方のコピーの配列を調べる能力である。これを達成するためには、２つの「フック」、または有意な同様性の領域を、クローニングすべきＤＮＡの一部をそれらが近接挟むようなゲノム配列内で同定する。最も好ましくは、これらのフックの第１のものは注目する第１のエクソンに対して５’側の配列に由来し、第２のものは注目する最後のエクソンに対して３’側の配列に由来する。これらの２つの「フック」を、Ｌａｒｉｏｎｏｖら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９４：７３８４−７３８７（１９９７）によって記載されているもののごとき細菌／酵母シャトルベクターにクローニングする。また、他の同様なベクター系を用いることもできる。Ｚｍａｘ１遺伝子の全ゲノムコピーを回収するには、２つの「フック」を含有するプラスミドを制限エンドヌクレアーゼで線状化するか、あるいはＰＣＲのごときもう１つの方法によって生じさせる。典型的に、この線状ＤＮＡ断片をヒトゲノムＤＮＡと共に酵母細胞に導入する。Ｌａｒｉｏｎｏｖら（印刷中）は同様にニワトリ宿主細胞の使用を報告しているが、酵母サッカロマイセス・セレヴィシエを宿主細胞として用いる。形質転換のプロセスの間および後に、内因性宿主細胞は組換え事象によって線状プラスミドを円状に変換し、それにより、「フック」に相同なヒトゲノムＤＮＡの領域はプラスミドに挿入される。このプラスミドは当業者によく知られた方法によって回収し、分析することができる。明らかに、この反応についての特異性は、宿主細胞機構が線状断片に存在する「フック」に似た配列を認識することを要する。しかしながら、Ｋｏｕｐｒｉｎａら、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，５３（１）：２１−２８（Ｏｃｔｏｂｅｒ  １９９８）（そこでは、著者は齧歯類／ヒトハイブリッド細胞系からヒトＤＮＡの断片を回収するための、ヒトゲノムに共通する変性反復配列の使用を記載する）によって示されているごとく、１００％配列同一性は要求されない。
【０３０７】
もう１つの例において、Ｌａｒｉｏｎｏｖら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９５（８）：４４６９−７４（Ａｐｒｉｌ  １９９８）によって記載されているごとく、ただ１つの「フック」が要求される。「ラジアルＴＡＲクローニング」と呼ばれるこのタイプの実験では、組換えを駆動する配列同様性の他の領域はゲノムからの反復した配列に由来する。このように、Ｚｍａｘ１遺伝子コーディング領域に隣接するＤＮＡの領域を回収し、機能に影響し得る変化につき調べることができる。
【０３０８】
ＸＸＩＶ．使用の方法：ゲノミクスクリーニング
ＨＢＭ遺伝子またはＺｍａｘ１に連結した多型遺伝子マーカーの使用は骨粗鬆症または他の骨の病気に対する罹患性を予測するのに非常に有用である。Ｋｏｌｌｅｒら、Ａｍｅｒ．Ｊ．Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎ．Ｒｅｓ．，１３：１９０３−１９０８（１９９８）は、多型遺伝子マーカーの使用が連鎖分析で有用なことを証明している。同様に、高骨量遺伝子内での多型遺伝子マーカーの同定は、骨発生に影響する他の遺伝的病巣と連鎖不均衡な関係にある特異的対立遺伝子変種の同定を可能とするであろう。ＢＡＣからのＤＮＡ配列を用い、ジヌクレオチドＣＡｎ反復を同定し、この反復を含むゲノミックＤＮＡを増幅するであろう２つのユニークなＰＣＲプライマーを以下のごとく設計し、
Ｂ２００Ｅ２１Ｃ１６ Ｌ：ＧＡＧＡＧＧＣＴＡＴＡＴＣＣＣＴＧＧＧＣ（配列番号３８）
Ｂ２００Ｅ２１Ｃ１６ Ｒ：ＡＣＡＧＣＡＣＧＴＧＴＴＴＡＡＡＧＧＧＧ（配列番号３９）および遺伝子マッピング研究で用いた。
【０３０９】
この方法は他の当業者によって首尾よく用いられている（例えば、Ｓｈｅｆｆｉｅｌｄら、Ｇｅｎｅｔ．，４：１８３７−１８４４（１９９５）；ＬｅＢｌａｎｃ−Ｓｔｒｅｃｅｓｋｉら、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，１９：３４１−９（１９９４）；Ｃｈｅｎら、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，２５：１−８（１９９５））。集団または個体でのこれらの試薬の使用は骨粗鬆症に対するそれらの危険性を予測するであろう。同様に、前記表４に示されたもののごとき単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）を同様に用いて、ＨＢＭ遺伝子の場合に、骨の病気の発症に対する危険性または骨粗鬆症に対する抵抗性を予測することができる。
【０３１０】
ＸＸＶ．使用の方法：組織石灰化のモジュレーター
ヒト身体における組織の石灰化はよく書物に記載されている。Ｔｏｗｌｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７３：３０４２７−３４（１９９８）は、モデル系において頭蓋を発症する石灰化を調節することが知られているいくつかのタンパク質がカルシウム沈着した大動脈で発現されることを証明した。カルシウム沈着血管組織におけるＭｓｘ２、骨先祖細胞で転写される遺伝子の発現は、骨発生で重要な遺伝子が他の組織の石灰化に関与することを示す。ＨＢＭタンパク質、アゴニストまたはアンタゴニストでの試料は、骨ミネラル密度に対するその証明された効果のため、（血管形成、象牙質および頭蓋内臓の骨のごとき）石灰化を緩和するようである。組織石灰化が示されている実験形において、Ｚｍａｘ１活性の過剰発現または抑制は、Ｚｍａｘ１遺伝子によって直接調節される分子の同定を可能とする。これらの遺伝子は、組織石灰化を調節することを狙った治療のための潜在的標的である。例えば、ＬＤＬＲ−／−マウスのごとき動物に高脂質ダイエットを与え、Ｚｍａｘ１を含む組織石灰化のマーカーの発現を示すことを観察する。次いで、これらの動物をＺｍａｘ１またはＨＢＭタンパク質に対する抗体、Ｚｍａｘ１またはＨＢＭ  ｃＤＮＡに対して向けられるアンチセンスオリゴヌクレオチドで、またはＺｍａｘ１またはＨＢＭタンパク質に結合することが知られている化合物またはその結合パートナーもしくはリガンドで処置する。ＲＮＡまたはタンパク質を血管組織から抽出し、該組織で発現された遺伝子の相対的発現レベルを当該分野でよく知られた方法によって測定する。組織で調節される遺伝子は、組織石灰化のモジュレーターとしての医薬開発のための潜在的治療標的である。
【０３１１】
個体に与えられるべき本発明の核酸、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、小分子または他の医薬上有用な化合物は、当該分野でよく知られた、医薬上許容される担体、賦形剤または希釈剤を含む組成物の形態で投与することができる。該個体は哺乳動物または鳥類、好ましくはヒト、ラット、マウスまたは鳥類であり得る。そのような組成物は医薬上有効量にて個体に投与することができる。投与する量は、治療すべき疾患および治療すべき患者に応じて変化するであろう。組成物は単独でまたは他の治療剤と組み合わせて投与することができる。
【０３１２】
実施例
説明のために提供し、断じて本発明を限定するものと解釈されるべきでない、以下の実施例を参照して本発明を記載する。当該分野でよく知られた標準的な技術または以下に具体的に記載する技術を利用した。
【０３１３】
実施例１
発端者を、彼女の医師が、何が異常に密な骨であるように見えるかの評価のために、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ  Ｏｓｔｅｏｐｏｒｏｓｉｓ  Ｃｅｎｔｅｒに照会した。彼女は１８歳であり、彼女は乗客として乗っていた車が追突された自動車事故によって突如引き起こされた背中の痛みのため２年前に医学的注意をするに至った。彼女の唯一の負傷は、痛みおよび筋肉圧痛によって発現された彼女の背中下部に対する柔組織負傷であった。Ｘ線写真では骨折または亜脱臼の証拠はなかった。彼女は十分な時間、学校に行くことができたが、痛みは２年間続いた。彼女がＣｅｎｔｅｒに来るまでに、痛みはほとんどなくなっており、彼女は高校生としての普通の活動に戻った。身体検査により、彼女は身長６６インチ、体重１２８ポンドの正常な健康な若い女性であることが明らかとなった。全骨格のＸ線写真により、厚い皮質をもった骨を持つ緻密に見える骨が明らかとなった。全骨格の全ての骨が含まれていた。最も重要なことには、全ての骨の形は完全に正常であった。脊髄ＢＭＣはＬ１−４が９４．４８グラムであり、脊髄ＢＭＤはＬ１−４が１．６６７ｇｍ／ｃｍ２であった。ＢＭＤは婦人のピーク骨格質量より５．６２標準偏差（ＳＤ）上であった。これらはＨｏｌｏｇｉｃ２０００〜を用いるＤＸＡによって測定された。次いで、彼女の母親をスキャンし、５８．０５グラムの腰椎脊髄ＢＭＣおよび１．５００ｇｍ／ｃｍ２のＢＭＤが発見された。彼女の母親の値はピーク質量を４．１２ＳＤ超えており、彼女の同年代のものよりも４．９８ＳＤ超えていた。彼女の母親は５１歳であり、身長６５インチであって、体重１４０ポンドであった。彼女の母親は健康に優れ、筋骨格または他の兆候の履歴はなかった。彼女の父親の腰椎ＢＭＣは７５．３３グラムであって、彼のＢＭＤは１．１１８ｇｍ／ｃｍ２であった。これらの値は男性についてのピーク骨量を０．２５ＳＤ超えた。彼は良好な健康で、身長が７２インチであって、体重は１８７ポンドであった。
【０３１４】
これらの臨床的データは、発端者が彼女の母親からの傾向を受け継ぎ、その結果、正常な骨格を除いて非常に高い骨量がもたらされたが、母系親族に注意が当てられた。米国特許第５，６９１，１５３号において、これらのメンバーのうち２２人がＤＸＡにより骨密度が測定された。しかしながら、１つの場合において、発端者の母方祖父は故人であり、医療記録、死前骨格Ｘ線写真およびＤＮＡ遺伝子型分けのためにパラフィンに埋めた膀胱検体を手に入れた。彼のＸ線写真は、大腿および脊髄を含む検査で利用できる骨の全ての明らかな極端な密度を示し、彼女は罹患メンバーに含められた。本発明において、家系は３７の情報的個体を含むように拡大された。これらの付加は元の親族関係よりもかなりの改良である（Ｊｏｈｎｓｏｎら、Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．，６０：１３２６−１３３２（１９９７））。なぜならば、元の研究以来付加された１４の個体の中では、２の個体が鍵となる交差を保有するからである。Ｘ連鎖は、個体１２ないし１４および１５からの男性−対−男性伝播の存在によって除外された。
【０３１５】
実施例２
本発明は、これらのクローンの組立体である、以下の表７で明らかな、ＨＢＭ遺伝子領域からの２つのＢＡＣクローンに由来するＤＮＡ配列を記載する。クローンｂ２００ｅ２１−ｈ（ＡＴＣＣ番号９８０８１２；配列番号１０〜１１）を１９９７年１２月３０日にアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｔｉｏｎ）（ＡＴＣＣ），１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｌｖｄ．，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ２０１１０−２２０９  Ｕ．Ｓ．Ａ．に寄託した。クローンｂ５２７ｄ１２−ｈ（ＡＴＣＣ番号９８０７２０：配列番号５〜９）は１９９８年１０月２日にアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）（ＡＴＣＣ），１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｌｖｄ．，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ  ２０１１０−２２０９  Ｕ．Ｓ．Ａ．に寄託した。これらの配列は、Ｚｍａｘ１遺伝子についてのＤＮＡプローブ、該遺伝子を増幅するためのＰＣＲプライマー、Ｚｍａｘ１遺伝子におけるヌクレオチド多型、またはＺｍａｘ１遺伝子の調節エレメントを同定するのに当業者が用いることができるユニークな試薬である。
【０３１６】
【表７】
2004515209.tif 000015
【０３１７】
明細書中で引用した特許、特許出願および公開の各々の開示は、引用によりその全体を本明細書の一部とみなす。
【０３１８】
本発明を詳細に記載してきたが、当業者であれば、多数の変形および修飾をなすことができ、本発明の精神および範囲を逸脱することなくそのような変形および修飾をなすことができるのは当業者が認識するであろう。
【０３１９】
本出願は、ここに引用してその全てを全部一体化させる、１９９８年１月１３日に出願された米国仮出願番号６０／０７１，４４９および１９９８年１０月２３日に出願された米国仮出願番号６０／１０５，５１１の利益を主張する、１９９９年１月１３日に出願された出願番号０９／２２９，３１９の一部継続出願である２０００年４月５日に出願された米国出願番号０９／５４３，７７１および０９／５４４，３９８に対する優先権を主張する。
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は、遺伝子連鎖実験で用いた個体の系図を示す。各個体の下にＩＤ番号があり、脊髄ＢＭＤおよび対立遺伝子についてのｚ−スコアは染色体１１上に臨界的マーカーを要求する。実線の記号は「罹患した」個体を表す。「Ｎ」を含む記号は「未罹患」個体である。３７個体からのＤＮＡを遺伝子型分けした。クエスチョンマークは未知の遺伝子型または遺伝子型を特定されなかった個体を示す。
【図２】
図２は１１ｑ１３．３におけるＨＢＭ領域のＢＡＣ／ＳＴＳ内容物理的マップを示す。遺伝子、ＥＳＴ、マイクロサテライト、ランダム配列、およびＢＡＣ端部配列に由来するＳＴＳマーカーを長い水平方向の線上方に示す。ＧＤＢに存在するマーカーでは、同一の命名法が用いられた。遺伝子座の名称（Ｄ１１Ｓ＃＃＃＃）は、もし利用可能であれば主要名称後に括弧に入れて掲げる。ＢＡＣ端部配列に由来するＳＴＳを、最初のＢＡＣ名称、続いての、各々、クローンの左および右端部についてのＬまたはＲと共に掲げる。２つの大きな矢印は、ＨＢＭ臨界的領域を否定する遺伝子マーカーを示す。ＳＴＳ下方の水平線は、９倍網羅ＢＡＣライブラリーのＰＣＲ−ベースのスクリーニングによって同定されたＢＡＣクローンを示す。塗り潰ぶしていない丸は、マーカーがライブラリースクリーニングの間に対応するＢＡＣライブラリーアドレスを増幅しなかったことを示す。クローンの名称は以下の約束を用いる。ＢＡＣについてのＢ、プレート、列および行アドレス、続いての、ＨＢＭプロジェクトを示す−Ｈ（すなわち、Ｂ３６Ｆ１６−Ｈ）。
【図３Ａ〜３Ｆ】
図３Ａ〜３Ｆは、フランキングイントロン配列と共にＺｍａｘ１のゲノム構造を示す。翻訳は、エクソン１中の下線を施した「ＡＴＧ」によって開始される。ＨＢＭ遺伝子における多型の部位はエクソン３であり、下線を施した「Ｇ」によって表され、それにより、このヌクレオチドはＨＢＭ遺伝子中の「Ｔ」である。ｍＲＮＡの３’非翻訳領域はエクソン２３（エクソン１、配列番号４０；エクソン２、配列番号４１；エクソン３、配列番号４２；エクソン４、配列番号４３；エクソン５、配列番号４４；エクソン６、配列番号４５；エクソン７、配列番号４６；エクソン８、配列番号４７；エクソン９、配列番号４８；エクソン１０、配列番号４９；エクソン１１、配列番号５０；エクソン１２、配列番号５１；エクソン１３、配列番号５２；エクソン１４、配列番号５３；エクソン１５、配列番号５４；エクソン１６、配列番号５５；エクソン１７、配列番号５６；エクソン１８、配列番号５７；エクソン１９、配列番号５８；エクソン２０、配列番号５９；エクソン２１、配列番号６０；エクソン２２、配列番号６１；エクソン２３、配列番号６２）内で下線を施す。
【図４】
図４は、ＹＷＴＤスペーサー、細胞外付着部位、ＬＤＬおよびカルシウム用の結合部位、システインに富んだ長因子反復、膜貫通領域、ＣＫ−ＩＩリン酸化部位を持つ理想的ＰＥＳＴ領域およびインターナライゼーションドメインを含むＺｍａｘ１のドメイン組織化を示す。また、図４は、ＨＢＭタンパク質で起こるグリシンからバリンへの変化の部位を示す。シグナルペプチドはアミノ酸１〜２２に位置し、細胞外ドメインはアミノ酸２３〜１３８５に位置し、膜貫通ドメインセグメントはアミノ酸１３８６〜１４１３に位置し、および細胞質ドメインはアミノ酸１４１４〜１６１５に位置する。
【図５】
図５は、ＨＢＭ遺伝子に関連するＢＡＣ  ｃｏｎｔｉｇＢ５２７Ｄ１２およびＢ２００Ｅ２１の模式図である。
【図６Ａ〜６Ｅ】
図６Ａ〜６Ｅは、野生型遺伝子Ｅｍａｘ１のヌクレオチドおよびアミノ酸の配列である。ヌクレオチド５８２におけるグアニンからチミンへの塩基対置換についての位置は、下線を施す。この対立遺伝子変種はＨＢＭ遺伝子である。該ＨＢＭ遺伝子は、１７１位におけるグリシンからバリンへのアミノ酸置換を持つタンパク質をコードする。５’非翻訳領域（ＵＴＲ）は塩基１ないし７０の境界であり、３’ＵＴＲは塩基４９１６〜５１２０の境界である。
【図７Ａおよび７Ｂ】
図７Ａおよび７Ｂは、種々の組織におけるＺｍａｘ１の発現を示すノザンブロット分析である。
【図８】
図８は、ＰＣＲ産物分析である。
【図９】
図９は、Ｚｍａｘ１エクソン３突然変異の特異的オリゴヌクレオチド検出である。
【図１０】
図１０は、センスおよびアンチセンスプローブを用いる１００×倍率におけるｉｎ  ｓｉｔｕハイブリタイゼーションによるマウスＺｍａｘ１の細胞位置である。
【図１１】
図１１は、センスおよびアンチセンスプローブを用いる４００×倍率におけるｉｎ  ｓｉｔｕハイブリタイゼーションによるマウスＺｍａｘ１の細胞位置である。
【図１２】
図１２は、センスおよびアンチセンスプローブを用いる４００×倍率における骨内膜中での骨芽細胞のｉｎ  ｓｉｔｕハイブリタイゼーションによるマウスＺｍａｘ１の細胞位置である。
【図１３】
図１３は、ＭＣ−３Ｔ３細胞におけるＺｍａｘ１発現のアンチセンス阻害である。
【図１４】
図１４は、野生型Ｚｍａｘ１対立遺伝子（左側パネル、Ｇ特異的オリゴ；５５℃洗浄）と比較したＨＢＭ１対立遺伝子（右側パネル；Ｔ特異的オリゴ；５８℃洗浄）の稀性を示すＺｍａｘ１エクソン３対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）アッセイを示す。右側パネルに出現する陽性スポットはポジティブコントロールであった。
【図１５】
図１５は、病巣接着シグナリングにおけるＺｍａｘ１の潜在的役割を表すモデルを示す。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図３Ｆ】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図６Ｅ】
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【図６Ｆ】
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【図６Ｇ】
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【図６Ｈ】
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【図６Ｉ】
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【図６Ｊ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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