(57)【要約】本発明は、レチノイドＸ受容体とともにヘテロダイマーを形成するＮｕｒｒ１転写因子を、ダイマー化は発生しないがＮｕｒｒ１転写活性化活性が保持されるようにＩボックス領域において変異させることができるという発見に関する。本発明は、このようなＩボックス変異を備えるＮｕｒｒ１ペプチド並びに、Ｎｕｒｒ１のモノマーの活性に影響を及ぼすモジュレーターについてのアッセイ方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
野生型Ｎｕｒｒ１ポリペプチドと比較して１つのアミノ酸相違を有し、ＲＸＲ媒介性転写活性化は促進できないがモノマーとして遺伝子発現を促進する能力を保持しており、前記相違がＩ−ボックス領域内にあるＮｕｒｒ１ポリペプチド。
【請求項２】
相違が残基５２４〜５６６での１個以上のＩ−ボックス残基で発生する請求項１記載のＮｕｒｒ１ポリペプチド。
【請求項３】
相違がＮｕｒｒ１の位置５５４、５５５、５５６、５５７、５５８、５５９、５６０、５６１および５６２から選択された残基で発生する請求項２記載のＮｕｒｒ１ポリペプチド。
【請求項４】
Ｎｕｒｒ１  ＫＬＬ（５５４−５５６）ＡＡＡ、ＧＫＬ（５５７−５５９）ＡＡＡ、ＰＥＬ（５６０−５６２）ＡＡＡおよびＰ５６０Ａの群から選択されたＮｕｒｒ１ポリペプチド。
【請求項５】
野生型がマウスＮｕｒｒ１（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号Ｓ５３７４４）である請求項１〜４のいずれか１項記載のＮｕｒｒ１ポリペプチド。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項記載のＮｕｒｒ１ポリペプチドをコードする核酸配列。
【請求項７】
ある物質がＮｕｒｒ１活性のモジュレーターであるかどうかを判定するためのアッセイ方法であって、前記方法が次のステップを含む方法：
請求項１〜５のいずれか１項記載のＮｕｒｒ１ポリペプチドを推定モジュレート物質と一緒に供給するステップ；および
前記物質が前記ポリペプチドの転写活性をモジュレートできるかどうかを判定するステップ。
【請求項８】
レポーター遺伝子コンストラクトを使用する転写活性化アッセイである請求項６記載のアッセイ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｎｕｒｒ１転写因子の新規変異体、およびＮｕｒｒ１活性のモジュレーターを同定するためのアッセイにおけるそれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｎｕｒｒ１は、核内受容体のスーパーファミリーに属する転写因子である。この受容体ファミリーは、ステロイドホルモン、レチノイド、甲状腺ホルモン、ビタミンＤに対する受容体、およびそれらのリガンドが未知である大きな受容体群から構成される。同定されていないリガンドを有する受容体は、オーファン核内受容体と呼称されている（トラス（Ｔｒｕｓｓ）およびビート（Ｂｅａｔｏ）１９９３，マンゲルスドルフ（Ｍａｎｇｅｌｓｄｏｒｆ）ら  １９９５）。
【０００３】
大多数の核内受容体は、ホモダイマーもしくはヘテロダイマーのどちらかのダイマーとして作用する。２つのダイマー化界面が、各々ＤＮＡ結合ドメインおよびリガンド結合ドメイン（ＬＢＤ）において同定されている。ＬＢＤ−Ｉボックス−におけるダイマー化界面は、正準な核内受容体ＬＢＤ構造におけるへリックス１０に対応するＬＢＤのカルボキシル末端部分にある領域にマッピングされている（パールマン（Ｐｅｒｌｍａｎｎ）ら  １９９６，リー（Ｌｅｅ）ら  １９９８）。この領域は、Ｎｕｒｒ１（図１）およびＮｏｒ１を含む数種のダイマー化受容体間で良好に保存されている。Ｎｕｒｒ１では、Ｉボックスは全長タンパク質の５２４〜５５６アミノ酸の領域である。
【０００４】
Ｎｕｒｒ１は、モノマーとしてＤＮＡに結合することができる（ウィルソン（Ｗｉｌｓｏｎ）ら  １９９１）。さらに、Ｎｕｒｒ１はレチノイドＸ受容体（ＲＸＲ）とヘテロダイマーを形成するが、他の大多数のＲＸＲヘテロダイマーとは対照的にこのダイマーはレチノイドによって活性化され得る（パールマン（Ｐｅｒｌｍａｎｎ）およびヤンソン（Ｊａｎｓｓｏｎ）１９９５，フォーマン（Ｆｏｒｍａｎ）ら  １９９５，ゼッターストローム（Ｚｅｔｔｅｒｓｔｒｏｅｍ）ら  １９９６）。
【０００５】
Ｎｕｒｒ１モノマーおよびＮｕｒｒ１−ＲＸＲヘテロダイマーのｉｎ  ｖｉｖｏでの機能的役割はまだ解明されていない。それでも、Ｎｕｒｒ１に関する発現試験は、Ｎｕｒｒ１が密接に関連する受容体であるＮＧＦＩ−ＢおよびＮｏｒ１と同様に、ＣＮＳ（中枢神経系）中で優勢に発現することを証明している（ミルブラット（Ｍｉｌｂｒａｄｔ）１９８８，ロー（Ｌａｗ）ら  １９９２，オークラ（Ｏｈｋｕｒａ）ら  １９９４，（ゼッターストローム（Ｚｅｔｔｅｒｓｔｒｏｅｍ）ら  １９９６）。ＣＮＳにおいては、Ｎｕｒｒ１は例えば皮質、海馬、視床下部において、および黒質や腹側被蓋野のドーパミン作動性ニューロンにおいて検出される（ゼッターストローム（Ｚｅｔｔｅｒｓｔｒｏｅｍ）ら  １９９６）。
【０００６】
Ｎｕｒｒ１は、発達中および成人の中脳ドーパミン作動性ニューロンにおいて発現する。これまでの試験では、Ｎｕｒｒ１遺伝子が不活化されているマウス（Ｎｕｒｒ１−／−マウス）は中脳ドーパミン細胞を生成できないので、Ｎｕｒｒ１がこれらのニューロンの発達において極めて重要な役割を果たすことが証明されている（ゼッターストローム（Ｚｅｔｔｅｒｓｔｒｏｅｍ）ら  １９９７，ソーヅドゥ‐カーデナス（Ｓａｕｃｅｄｏ−Ｃａｒｄｅｎａｓ）ら  １９９８，カスティロ（Ｃａｓｔｉｌｌｏ）ら，１９９８，ウォレン（Ｗａｌｌｅｎ）ら  １９９９）。これらのニューロンは、パーキンソン病の患者においては変性するので、従ってＮｕｒｒ１はこの疾患の発生において重要である可能性がある。Ｎｕｒｒ１はさらにまた、Ｎｕｒｒ１のコーディング配列における突然変異が精神分裂病および躁鬱病患者において同定されているので、他のドーパミン伝達の障害においても重要な役割を果たす可能性がある（ビュルヴェニッチ（Ｂｕｅｒｖｅｎｉｃｈ）ら  ２０００）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
そこで、ドーパミン作動性ニューロンにおける潜在的役割のために、Ｎｕｒｒ１はドーパミン伝達を含む障害に対する薬物療法の潜在的ターゲットである。例えば低分子親油性化合物のようなＮｕｒｒ１と相互作用してその転写活性化機能またはＤＮＡ結合特性に影響を及ぼす物質は潜在的治療有用性を有している。
【０００８】
核内受容体をモジュレートする化合物のためのスクリーニングは、しばしば、培養細胞において実施されるレポーター遺伝子活性化アッセイに基づいている。このようなアッセイでは、Ｎｕｒｒ１−ＲＸＲヘテロダイマーの活性に影響を及ぼす物質とＮｕｒｒ１モノマーに対して特異的な物質とを区別するのは困難であろう。従って、このようなアッセイにおいて、野生型Ｎｕｒｒ１の使用は、さらにどの複合体がモジュレートされているのかを判定するための物質の試験が必要とされるであろう。Ｎｕｒｒ１およびＮｕｒｒ１−ＲＸＲ複合体はｉｎ  ｖｉｖｏでは別個の役割を有すると思われるので、このモノマーとヘテロダイマー複合体とをより効率的に区別できれば望ましいであろう。
【０００９】
Ｉボックスを含んでいるＮｕｒｒ１のリガンド結合ドメインは、構造的に複雑である。Ｎｏｒ−１のＩボックスを含む領域の切断が、この受容体のモノマー活性が妨害されることが証明されている（ラベル（Ｌａｂｅｌｌｅ）ら，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １８（２１）：３３０３−８，１９９９）。類推すると、Ｎｕｒｒ１への類似の破壊も同様にこのタンパク質の機能を破壊させると予想できる。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明の発明者らは、驚くべきことにＩボックス領域に特定変異を有するＮｕｒｒ１ポリペプチドは、ＲＸＲとダイマー化することはできないが、しかし、驚くべきことにモノマーとして遺伝子発現を促進する能力を保持していることを発見した。これは特に、Ｎｕｒｒ１のリガンド結合領域は転写活性化機能を含んでいるので、ダイマー化する能力の除去は転写活性化機能の除去をもたらすであろうから注目に値する。
【００１１】
従って本発明は、野生型Ｎｕｒｒ１ポリペプチドと比較して少なくとも１アミノ酸の相違を有し、ＲＸＲ−媒介性転写活性化を促進することはできないが、モノマーとして遺伝子発現を促進する能力を保持しており、前記相違がＩボックス領域にあるＮｕｒｒ１ポリペプチドを提供する。
【００１２】
好ましい相違は、残基５２４〜５６６での１つ以上（例えば、２または３または４）のＩボックス残基で、例えば５５３〜５６３の領域において発生する。好ましい残基は、Ｎｕｒｒ１の位置５５４、５５５、５５６、５５７、５５８、５５９、５６０、５６１および５６２から選択される残基である。
【００１３】
この領域における単一置換全部が望ましい作用を有していた訳ではないが、つまり依然として一部はヘテロダイマーを形成したが、データはこれらのポリペプチド全部がモノマーとして遺伝子発現を促進する能力を保持していたことを証明しており、さらに多数の様々なタイプの改変をＩボックス領域に起こしてこの差別的活性を保持するという原理を確証している。
【００１４】
相違は、ＲＸＲヘテロダイマー化の消失を提供するあらゆる置換、挿入または欠失であってよい。置換にはアラニンによるいずれかの（アラニンとは別の）アミノ酸の置換、正電荷から負電荷（例、Ｅ５６１Ｋ）への改変を生じさせる置換、もしくはその逆、または非電荷アミノ酸から電荷もしくはより極性のアミノ酸（例、Ｌ５６２Ｋ）への改変が含まれる。標準的なタンパク質工学技術におけるタンパク質中のアミノ酸の改変は当分野においてよく知られており、下記に示す実施例において示された様々な改変を証明しており、当業者であれば過度の負担を伴わずにまた別の同様の改変を作製かつ試験することができるであろう。欠失は、Ｉボックス領域の１〜１０、例えば１、２、３、４または５の残基であってよい。欠失した残基は、隣接していても、保持されている他のＩボックス残基の間に位置していてもよい。挿入は、Ｉボックス領域へのアミノ酸の１〜１０、例えば１、２、３、４または５の残基であってよい。２残基以上が挿入される際には、残基は近接していても、または、異なるＩボックスに存在する残基の位置していてもよい。２０個の天然型アミノ酸のいずれか１つが挿入されてよい。好ましくは、挿入される残基は、例えばアラニン、ロイシン、バリン、イソロイシン、グリシン、セリン、リシン等のような非脂肪族であろう。
【００１５】
置換、挿入および欠失の組み合わせは、例えば１つ以上の置換および１つ以上の欠失から作られてよい。２つのこれらのカテゴリーの改変の組み合わせが作られる際には、アミノ酸改変の数は、総数が２〜１０までの、例えば２、３、４または５のような改変であってよい。
【００１６】
本発明のポリペプチドの例には、少なくとも２個、好ましくは少なくとも３個の隣接残基が改変させられている、好ましくは置換されているものが含まれる。このような置換は異なるものでも、または全部がアラニンへのように同一であってもよい。
【００１７】
このようなポリペプチドの特定の例には、ポリペプチドＮｕｒｒ１  ＫＬＬ（５５４−５５６）ＡＡＡ、ＧＫＬ（５５７−５５９）ＡＡＡ、ＰＥＬ（５６０−５６２）ＡＡＡまたはＰ５６０Ａが含まれる。
【００１８】
これらの位置での置換は、Ｎｕｒｒ１ポリペプチドがＲＸＲ−媒介性転写活性化を促進する能力を無効にすることが証明されている。しかし、このポリペプチドがモノマーとしてレポーター遺伝子発現を活性化する能力は保持されている。
【００１９】
本発明はさらに、本発明のＮｕｒｒ１ポリペプチドをコードする核酸配列を含むベクターを提供する。
【００２０】
本発明はさらに、ある物質がＮｕｒｒ１活性のモジュレーターであるかどうかを判定するためのアッセイ方法を含んでおり、前記方法は次のステップを含む：
本発明のＮｕｒｒ１ポリペプチドを推定モジュレート物質と一緒に供給するステップ；および
前記物質が前記ポリペプチドの転写活性をモジュレートできるかどうかを判定するステップ。
【００２１】
転写活性をモジュレートする物質は、ポリペプチドがＤＮＡ結合活性を保持することを許容し、転写活性の消失または増加を生じさせる様式でそのポリペプチドに結合することによってこれを行うことができるが、あるいはその物質はＤＮＡ結合活性自体をモジュレートする物質であってもよい。
【００２２】
一般に、本発明のアッセイはレポーター遺伝子アッセイ、コアクチベーター相互作用アッセイ（２−ハイブリッドアッセイ）およびＤＮＡ結合アッセイのクラスに分類される。本発明のＮｕｒｒ１ポリペプチドのＤＮＡ結合アッセイをモジュレートすることによって、タンパク質の転写活性が影響を受けると推測することができる。
【００２３】
Ｎｕｒｒ１は、ドーパミン細胞を発達させる際に重要であり、さらに成人ドーパミンニューロンにおいて機能を果たすものである。従って本発明のアッセイによって発見されるモジュレーターは、パーキンソン病、精神分裂病、薬物嗜癖、注意欠陥多動障害（ＡＤＨＤ）、躁鬱病、およびその他のドーパミンニューロンの異常な活性に関連する状態の治療において利用できよう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２４】
図面の詳細な説明
図１は、ダイマー化のために重要な領域（Ｉボックス）を含む、核内受容体の構造的および機能的ドメインを示した図である。ＮＴ、アミノ末端ドメイン；ＤＢＤ、ＤＮＡ結合ドメイン；ＬＢＤ、リガンド結合ドメイン。添付の実施例において改変させたＮｕｒｒ１  Ｉボックスの１１アミノ酸（配列番号１）に下線を引いて示した。
図２は、Ｎｕｒｒ１  Ｉボックス変異がＲＸＲ−媒介性転写活性化を促進する能力に及ぼす作用を示した図である。野生型および変異型Ｎｕｒｒ１誘導体は、ＪＥＧ３細胞でトランスフェクトさせた。転写活性化する能力は、チミジンキナーゼプロモーターの上流に位置するｈＲＡＲβ２プロモーターＲＡＲＥ（βＲＥ）の３コピーによって駆動されるルシフェラーゼレポーター遺伝子を使用してアッセイした。
図３は、Ｉボックス変異がＮｕｒｒ１のモノマー活性に何の影響も及ぼさないことを示した図である。このモノマー活性は、２９３細胞で試験した。全長受容体誘導体は、ＮＧＦＩ−Ｂ結合部位（ＮＢＲＥ；図Ａ）の３コピーによって調節されたレポーター遺伝子を使用して研究された。
Ｇａｌ４  ＤＮＡ結合ドメインに融合した野生型および変異型リガンド結合ドメインの活性は、最小チミジンキナーゼプロモーターの上流に位置する４つのＧａｌ４結合部位を含むレポーターで試験した（図Ｂ）。実験をＪＥＧ３細胞で実施した場合に、本質的に同一の結果が得られた。
図４は、Ｎｕｒｒ１  ＩボックスがＪＥＧ３細胞でのＲＸＲとの相互作用に及ぼす影響を示した図である。野生型および変異型Ｎｕｒｒ１リガンド結合ドメインはＧａｌ４  ＤＮＡ結合ドメインに融合しており、ＶＰ１６活性化ドメインに融合したＲＸＲとの相互作用をパールマン（Ｐｅｒｌｍａｎｎ）およびヤンソン（Ｊａｎｓｓｏｎ）１９９５によって記載された通りに試験した。
図５は、Ｉボックス変異がＤＮＡ上でのＮｕｒｒ１−ＲＸＲヘテロダイマー化に及ぼす作用を示した図である。Ｎｕｒｒ１誘導体がＲＸＲを有するヘテロダイマーとしてＤＮＡに結合する能力は、カストロ（Ｃａｓｔｒｏ）ら  １９９９によって記載された通りにゲルシフトアッセイを使用してｉｎ  ｖｉｔｒｏで評価した。
放射標識ｈＲＡＲβ２プロモーターＲＡＲＥ（βＲＥ）をプローブとして使用した。
【００２５】
本発明では、Ｎｕｒｒ１ポリペプチドは、好ましくはマウスポリペプチドである。マウスポリペプチドのサイズが５９８アミノ酸であるアミノ酸配列は、Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号Ｓ５３７４４として入手できる。その他のＮｕｒｒ１ポリペプチドも知られており、同様に使用できる。例えば、ヒトおよびラット配列はマウス配列に対して高度に保存されており、Ｉボックス領域において同一数の残基を有している。ＮＯＴとも呼称されるヒトＮｕｒｒ１は、Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＮＭ００６１８６として入手できる。ラットＮｕｒｒ１（ＲＮＲ）は、Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号Ｕ７２３４５として入手できる。これらは全部がクローン化されているので、従って当分野で入手できる。これらのポリペプチドは高レベルの同一性を有しているために、これらは本発明において同等に使用でき、ここでのＮｕｒｒ１についての言及はこのような他の種のポリペプチド形を含んでいる。
【００２６】
本書に記載する我々のデータは、Ｉボックスが改変したＮｕｒｒ１の転写活性化活性が、Ｎ末端領域の欠失を有するが一部の転写活性化活性は有しているＮｕｒｒ１のフラグメントによって保持されていることを示している。従って、ここでのＮｕｒｒ１ポリペプチドについての言及はさらにまたリガンド結合ドメイン領域を通して転写を活性化する能力を維持しているフラグメントを含んでいる。このようなフラグメントは、全長Ｎｕｒｒ１配列の少なくとも約２００、好ましくは少なくとも約２５０アミノ酸を含んでいてよい。これは２４６アミノ酸のＮｕｒｒ１ポリペプチドがＧａｌ４  ＤＮＡ結合ドメインへ融合している本書の図３Ｂで示されており、さらにこの融合がｔｋプロモーターの上流に位置するＧａｌ４結合部位を含むレポーターからの転写を活性化できることも証明されている。
【００２７】
配列が公衆データベース上に存在しない、例えば他の種からのＮｕｒｒ１ポリペプチドが必要な場合は、これらは標準的なクローニング方法によって入手できる。例えば、哺乳動物または他の種からのｃＤＮＡのライブラリーを作製し、Ｎｕｒｒ１をコードするＤＮＡ配列の全部または部分を用いて、高ストリンジェント条件下で探索することができる。
【００２８】
例えば、ハイブリダイゼーションは、５×ＳＳＣ（ＳＳＣは０．１５Ｍ塩化ナトリウム；０．１５Ｍクエン酸ナトリウム；ｐＨ７である）、５×デンハルト（Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ）試薬、０．５〜１．０％  ＳＤＳ、１００μｇ／ｍＬの変性フラグメント化サケ精子ＤＮＡ、０．０５％ピロリン酸ナトリウムおよび５０％までのホルムアルデヒドを含むハイブリダイゼーション液を使用して従来からよく知られている標準方法に従って実施できる。ハイブリダイゼーションは、３７〜４２℃で少なくとも６時間実施する。ハイブリダイゼーション後、フィルターを次の通りに洗浄する：（１）室温で２×ＳＳＣおよび１％  ＳＤＳ中で５分間；（２）室温で２×ＳＳＣおよび０．１％  ＳＤＳ中で１５分間；（３）３７℃で１×ＳＳＣおよび１％  ＳＤＳ中で３０分間〜１時間；（４）溶液を３０分毎に変えながら、４２〜６５℃で１×ＳＳＣおよび１％  ＳＤＳ中で２時間。
【００２９】
陽性であると同定されたクローンは、Ｎｕｒｒ１をコードするオープンリーディングフレームを同定するために試験できる。全長オープンリーディングフレームを達成するためには、当業者は理解できるように２個以上のクローンを併用することが必要な場合がある。クローンはその後、例えば細菌もしくは酵母のような異種発現系中で発現させ、タンパク質は従来から知られている方法によって精製することができる。
【００３０】
ＰＣＲクローニング法もまた、ラット、マウス、ヒトまたはその他の種において見出された現在知られているＮｕｒｒ１遺伝子間で保存されている配列のために選択されたＰＣＲプライマーに基づいて使用できる。
【００３１】
また別の態様では、本発明は本発明のＮｕｒｒ１ポリペプチドをコードする核酸、およびそのような核酸を含むベクターを提供する。このベクターは、好ましくは発現ベクターであるが、このとき前記核酸は宿主細胞に適合するプロモーターに操作可能に連結されている。従って本発明はさらに、本発明の発現ベクターを含む宿主細胞も提供する。宿主細胞は、細菌（例、大腸菌［Ｅ．ｃｏｌｉ］）、昆虫、酵母または哺乳動物（例、ハムスターまたはヒト）であってよい。ベクターはあらゆる適切なＤＮＡまたはＲＮＡベクターであってよい。
【００３２】
本発明の宿主細胞は、前記ポリペプチドまたはそのフラグメントが発現する条件下で宿主細胞を培養するステップ、およびそのポリペプチドを単離形態で回収するステップを含む、上記に定義した本発明のＮｕｒｒ１ポリペプチドを作成する方法において使用できる。ポリペプチドは、融合タンパク質として発現させてよい。
【００３３】
適切なベクター系の例には、例えばｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８およびｐＵＣ１９のような細菌ベクター、酵母発現ベクター、および例えばモロニー（Ｍｏｌｏｎｅｙ）マウス白血病ウイルスに基づくベクターのような哺乳動物ベクターが含まれる（ラム  ゼット（Ｒａｍ  Ｚ）ら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（１９９３）  ５３；８３−８８；ダルトン（Ｄａｌｔｏｎ）およびトリースマン（Ｔｒｉｅｓｍａｎ），Ｃｅｌｌ（１９９２）６８；５９７−６１２）。これらのベクターは、β−グロビン最小プロモーターで上流に位置するクローン化されたマウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）エンハンサーを含んでいる。開始ＡＴＧまでのβ−グロビン５’非翻訳領域は、クローン化タンパク質の効率的な翻訳を指揮するため供給される。
【００３４】
「操作可能に連結された」は、転写がプロモーターから開始されるために適切に配置されて方向付けられた同一核酸分子の一部として結合されていることを意味している。
【００３５】
本発明のポリペプチドおよび核酸は、例えばそれらが細胞で一緒に見出される他のポリペプチドおよび核酸のようにそれらが天然に会合している物質を含まない、または実質的に含まない単離形態であってよい。ポリペプチドおよび核酸は、当然ながら希釈剤または補助剤を用いて調製されていて、それでも実用的目的のために単離されていてよい。例えばポリペプチドは、通常はゼラチンまたはその他の担体が、免疫アッセイにおいて使用するためのマイクロタイタープレートをコーティングするために使用された場合はそれらと混合されるであろう。ポリペプチドは、自然にまたは異種真核細胞系によってのいずれかでグリコシル化されてよい、またはそれらは（例えば原核細胞での発現によって産生される場合は）グリコシル化されていなくてよい。ポリペプチドは、リン酸化および／またはアセチル化されてよい。
【００３６】
本発明のポリペプチドは、さらにまた実質的に精製された形態であってよく、その場合には一般には調製物中に、調製物中の例えば９５％、９８％または９９％のように９０％を越えるポリペプチドが本発明のポリペプチドであるポリペプチドを含むであろう。
【００３７】
本発明に従って実践されるアッセイ方法は、当業者にはよく知られているようなあらゆる適切な様式で整えられてよい。例えば、アッセイは、本発明のポリペプチドの転写活性化特性を測定するべく、Ｎｕｒｒ１ポリペプチドが結合でき、さらにそうすることによってレポーター遺伝子の転写を活性化できる１種以上（例、２、３、４または５）のエレメントを含有するプロモーター領域を含むレポーター遺伝子コンストラクトを提供することによって構築されてよい。適切なコンストラクトの例は添付の実施例に記載した。
【００３８】
Ｎｕｒｒ１−ＲＸＲダイマーによる転写活性化を測定するためには、ｈＲＡＲβ２プロモーターＲＡＲＥを使用できる。これとは対照的に、下記で記載するＮＧＦＩ−Ｂ応答エレメント（ＮＢＲＥ）は、Ｎｕｒｒ１ポリペプチドのモノマーが結合するためのターゲットとして使用できる。
【００３９】
これらのエレメントは、転写がＮｕｒｒ１ポリペプチドのその対応の（ｃｏｇｎａｔｅ）結合領域への結合によって活性化されるように、例えばチミジンキナーゼ遺伝子開始領域でのような適切な転写開始領域へ結合させることができる。
【００４０】
多数の適切なレポーター遺伝子は従来から知られているように、例えばルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質、クロラムフェニコール、アセチルトランスフェラーゼ、βガラクトシダーゼ等である。
【００４１】
Ｎｕｒｒ１ポリペプチドのその対応の（ｃｏｇｎａｔｅ）ＤＮＡ結合配列への結合に基づく本発明のアッセイは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで実施でき、当業者によく知られているあらゆる適切な形態を取ることができる。
【００４２】
一般に、ＤＮＡおよびポリペプチドの一方または両方は例えば蛍光ラベルのような検出可能なラベルを有しているであろう。ポリペプチドおよびＤＮＡは結合が発生するために適切な条件下で相互に接触させられ、その後結合量が推定モジュレーターの存在下で測定され、適切なコントロールと比較される。例えば、モジュレーターの不在下または所望の特性を備えた事前に選択されたモジュレーターの存在下での結合量のような。
【００４３】
ポリペプチドへのＤＮＡの結合は、当業者にはよく知られている多数の方法で測定できる。例えば、固相担体上で一方または他方の成分が固定化され、他方の成分がそれと接触させられ、インキュベートされ、それから、測定前に未結合物質が洗い流される。
【００４４】
アッセイ様式の１つの例は、解離増強ランタニド蛍光イムノアッセイ（ＤＥＬＦＩＡ）である。これは２個の巨大分子の相互作用を測定するための固相に基づくシステムである。典型的には、１個の分子がマルチウエルプレートの表面へ固定化され、もう１個の分子がこれに、溶液状態で添加される。結合パートナーの検出は、希土類金属のキレートから構成される標識を使用して達成される。この標識は、相互作用する分子へ直接に付着していても、その分子に対する抗体を通して複合体または分子エピトープタグへ導入してもよい。あるいはまた、分子を標識として使用されるビオチンおよびストレプトアビジン−希土類金属キレートに付着していてもよい。標識に使用する希土類金属は、ユーロピウム、サマリウム、テルビウムまたはジスプロシウムであってよい。未結合標識を除去するために洗浄した後、低ｐＨバッファーを含有する変性剤を添加してキレートから希土類金属を解離させる。その後、時間分解蛍光光度法によって高度に蛍光性の金属イオンを定量する。この方法のための、ストレプトアビジン、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼおよびヘキサヒスチジンに対する抗体類のような多数の標識試薬は市販で入手できる。
【００４５】
核内受容体をターゲットとする化合物は、製薬工業において実質的に商業的に重要である。一般に、核内受容体は例えばステロイド、甲状腺ホルモン、レチノイド、プロスタノイド、脂肪酸、脂肪酸誘導体のような低分子親油性分子である化合物および多数の低分子合成疎水性化合物によってターゲットとされるものであることができる。従って本発明のアッセイにおいて使用できる潜在的モジュレーター化合物は、これらのクラスの薬物スクリーニングプログラムにおいて使用される天然または合成化合物であってよい。
【００４６】
アゴニストおよびアンタゴニストの両方を含む本発明の方法に従って入手される候補モジュレーター化合物は、医薬調製物として作製できる。このような調製物は、その化合物と一緒に適切な担体、希釈剤および賦形剤を含むであろう。このような調製物は、本発明のまた別の態様を形成する。これらの調製物は、例えば上記のようなドーパミンニューロンの異常機能に関連する様々な状態の治療方法において使用できる。
【００４７】
本発明のアッセイに添加できる推定阻害剤化合物の量は、通常は使用される化合物のタイプに依存して試行錯誤して決定されるであろう。典型的には、例えば０．１〜１０ｎＭのような０．０１〜１００μＭの濃度の推定阻害化合物を使用できる。
【実施例】
【００４８】
本発明を下記の実施例を参照しながら詳細に説明する。
【００４９】
材料および方法
Ｎｕｒｒ１  Ｉボックス変異体は、ジーンエディター（ＧｅｎｅＥｄｉｔｏｒ）（登録商標）ｉｎ  ｖｉｔｒｏ部位特異的変異導入システム（プロメガ［Ｐｒｏｍｅｇａ］製）を製造業者の取扱説明書に従って使用して作製した。手短には、全長マウスＮｕｒｒ１をコードするｐＣＭＸ−Ｎｕｒｒ１発現ベクターを鋳型として使用した。所望の変異を含有する２１〜４０ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドを変性させた鋳型へハイブリダイズさせ、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼを用いて伸長させ、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼを用いてライゲートした。使用したオリゴヌクレオチドは次の通りであった：
ＫＬＬ（５５４−５５６）ＡＡＡのためには：
５’−ＣＣＣＡＡＣＴＡＣＣＴＧＴＣＴＧＣＡＧＣＧＧＣＧＧＧＧＡＡＧＣＴＧＣＣＡＧＡＡＣ−３’（配列番号２）；
ＧＫＬ（５５７−５５９）ＡＡＡのためには：
５’−ＣＴＧＴＣＴＡＡＡＣＴＧＴＴＧＧＣＧＧＣＧＧＣＧＣＣＡＧＡＡＣＴＣＣＧＣＡＣＣ−３’（配列番号３）；
ＰＥＬ（５６０−５６２）ＡＡＡのためには：
５’−ＣＴＧＴＴＧＧＧＧＡＡＧＣＴＧＧＣＡＧＣＡＧＣＣＣＣＧＣＡＣＣＣＴＴＴＧＣＡＣ−３’（配列番号４）；
Ｋ５５８Ａ：
５’−ＡＡＡＣＴＧＴＴＧＧＧＧＧＣＧＣＴＧＣＣＡＧＡＡＣＴＣ−３’（配列番号５）；
Ｐ５６０Ａ：
５’−ＴＴＧＧＧＧＡＡＧＣＴＧＧＣＡＧＡＡＣＴＣＣＧＣＡＣＣ−３’（配列番号６）；
Ｐ５６１Ａ：
５’−ＡＡＧＣＴＧＣＣＡＧＣＡＣＴＣＣＧＣＡＣＣ−３’（配列番号７）；
Ｌ５６２Ａ：
５’−ＡＡＧＣＴＧＣＣＡＧＡＡＧＣＣＣＧＡＣＣＣＴＴＴＧＣ−３’（配列番号８）。
【００５０】
アラニンをコードする塩基には下線を付した。形質転換後に入手した細菌コロニーをダイレクトシーケンシングによってスクリーニングした。
【００５１】
Ｉボックス変異がＮｕｒｒ１転写活性およびＲＸＲと相互作用する能力に及ぼす影響をパールマン（Ｐｅｒｌｍａｎｎ）およびヤンソン（Ｊａｎｓｓｏｎ）１９９５、ゼッターストローム（Ｚｅｔｔｅｒｓｔｒｏｅｍ）ら  １９９６、およびカストロ（Ｃａｓｔｒｏ）ら  １９９９によって記載された通りに試験した。Ｎｕｒｒ１−ＲＸＲヘテロダイマー媒介性転写活性化はヒト絨毛癌ＪＥＧ３細胞で試験した。この細胞は１０％ウシ胎児血清を補充した最小必須培地中で維持した。トランスフェクションは、リン酸カルシウム沈降法を使用して２４ウエルプレートにおいて４回ずつ実施した。細胞は、トランスフェクション前に２４時間プレーティングした。各ウエルは、Ｎｕｒｒ１変異体に対する発現ベクター１００ｎｇ、レポータープラスミド１００ｎｇ、およびβガラクトシドプラスミド２００ｎｇ（トランスフェクション効率についての内部コントロールとして使用した）を用いてトランスフェクトさせた。使用したルシフェラーゼレポーターは、チミジンキナーゼプロモーターの上流に位置するヒトレチノイド酸受容体β２（ｈＲＡＲβ２）遺伝子プロモーター（βＲＥ）のレチノイド酸応答エレメント（ＲＡＲＥ）の３コピーによって駆動させた。トランスフェクションの６〜８時間後に、細胞に１０％活性炭処理ウシ胎児血清およびＲＸＲリガンド（ＳＲ１１２３７；１μＭ）を補充した新鮮培地を与えた。これらの細胞を２４時間後に採取し、溶解させた。細胞抽出液をルシフェラーゼ活性およびβガラクトシダーゼ活性についてアッセイした。Ｎｕｒｒ１変異体がＲＸＲと相互作用する能力は、哺乳動物２−ハイブリッドアッセイを使用して試験した。野生型および変異型両方のＮｕｒｒ１変異体のリガンド結合ドメイン（アミノ酸３５３−５９８；ＬＢＤ）は、ｐＣＭＸ−Ｇａｌ４発現ベクター内の酵母Ｇａｌ４  ＤＮＡ結合ドメイン（アミノ酸１−１４７）を有するインフレームでクローニングした。（パールマン（Ｐｅｒｌｍａｎｎ）およびヤンソン（Ｊａｎｓｓｏｎ）１９９５）ＪＥＧ３細胞を、ｐＣＭＸ−Ｇａｌ４−Ｎｕｒｒ１−ＬＢＤ誘導体およびヒトＲＸＲαの完全コーディング配列に続く単純ヘルペスＶＰ１６転写活性化ドメインを含有するｐＣＭＸ−ＶＰ１６−ＲＸＲを用いてコトランスフェクトした。４コピーのＧａｌ４結合部位を含むレポーター遺伝子を使用した。
【００５２】
モノマーとしてレポーター遺伝子発現を活性化する変異体の能力は、ヒト胎生期腎２９３細胞で試験した。細胞は、１０％ウシ胎児血清を添加したダルベッコ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ）改変イーグル（Ｅａｇｌｅｓ）培地中で維持した。トランスフェクションは、３コピーのＮＧＦＩ−Ｂ（神経成長因子誘発性−Ｂ）応答エレメント（ウィルソン（Ｗｉｌｓｏｎ）ら，１９９１）（ＮＢＲＥ）によって調節されたレポーターを使用したこと以外はＪＥＧ３細胞を用いた場合と同様に実施した。変異型リガンド結合ドメインの転写活性はＧａｌ４ＤＮＡ結合ドメインへの融合として評価し、４コピーのＧａｌ４結合部位を含むレポーター遺伝子を使用した。全トランスフェクション実験は、４枚ずつの培養皿で実施し、各実験は本質的に同一の結果が得られるまで少なくとも２回繰り返した。代表的な実験の結果を示した。
【００５３】
ＤＮＡ結合実験は、カストロ（Ｃａｓｔｒｏ）ら，１９９９によって記載されたように実施した。手短には、ゲルモビリティーシフトアッセイのためのＮｕｒｒ１およびＲＸＲタンパク質を製造業者の取扱説明書に従って網状赤血球溶解液中でのｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写翻訳共役反応によって作製した（ＴＮＴ  Ｑｕｉｃｋ  Ｃｏｕｐｌｅｄ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ／Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（登録商標）；プロメガ）。タンパク質は１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）、４０ｍＭ  ＫＣｌ、０．０５％  ＮＰ−４０、６％グリセロール、１ｍＭ  ＤＴＴ、０．２ｍｇポリ（ｄＩ−ｄＣ）およびプロテアーゼ阻害剤を含有する結合バッファー中でインキュベートした。βＲＥプローブ（ａｇｃｔｔａａｇｇＧＧＴＴＣＡＣＣＧＡＡＡＧＴＴＣＡｃｔｃｇｃａｔ；配列番号９）はクレノウフラグメントを使用するフィルイン反応によって３２Ｐを用いて標識した。プローブの添加後、反応液を氷上で２０分間インキュベートした。タンパク質−ＤＮＡ複合体を電気泳動によって０．５×ＴＢＥに溶解させた４％非変性ポリアクリルアミドゲル上で解離させた。電気泳動後、オートラジオグラフィーのためにゲルを乾燥させた。
【００５４】
結果
数個のＮｕｒｒ１−Ｉボックスアミノ酸は組み合わせて、または個別のどちらかで変異させ、これらの変異の作用をＲＸＲダイマー化に関して試験した。最初に、３個のアミノ酸アラニン置換をＩボックスへ導入した［ＫＬＬ（５５４−５５６）ＡＡＡ、ＧＫＬ（５５７−５５９）ＡＡＡおよびＰＥＬ（５６０−５６２）ＡＡＡ］。これらの変異は全部、Ｎｕｒｒ１のＲＸＲ−媒介性転写活性化を促進する能力を消滅させた（図２）。しかし、モノマーとしてレポーター遺伝子発現を活性化する能力は無傷であった（図３）。３種類の変異体に加えて、我々は４つの個別アラニン置換（Ｋ５５８Ａ、Ｐ５６０Ａ、Ｅ５６１ＡおよびＬ５６２Ａ）を、これら残基のＮｕｒｒ１−ＲＸＲダイマー化への寄与を試験するために作製した。Ｐｒｏ５６０からアラニンへの変異は、Ｎｕｒｒ１がＲＸＲとともにダイマーとしてレポーター遺伝子発現を活性化する能力を消滅させたが、モノマーの活性には全く影響を及ぼさなかった（図２および３Ａ）。Ｌｙｓ５５８からアラニンへの転換は、Ｎｕｒｒ１／ＲＸＲヘテロダイマー媒介性転写活性化に中程度な作用しか有していなかった。Ｎｕｒｒ１がＮｕｒｒ１−ＲＸＲヘテロダイマー調節レポーター遺伝子を活性化する能力は、アラニンによるＬｅｕ５６２の置換によって低減したが、Ｐ５６０Ａ変異より少ない程度であった。Ｇｌｕ５６１からアラニンへの転換は何の作用も及ぼさなかった。従って、３残基のアラニン置換およびＰ５６０Ａ変異はＮｕｒｒ１がＲＸＲ媒介性転写を促進する能力を消滅させた。
【００５５】
全長タンパク質のＮ末端切断形態もまた転写活性化活性を維持した（図３Ｂ）。
【００５６】
作製した変異は、Ｎｕｒｒ１がＲＸＲとダイマー化するのを防止することによって、またはＮｕｒｒ１を非許容的なＲＸＲパートナーへ転換させることによってのどちらかでＮｕｒｒ１−ＲＸＲヘテロダイマー媒介性レポーター遺伝子発現を消滅できた。これらの変異が、ヘテロダイマー化に及ぼす作用を、哺乳動物２―ハイブリッドアッセイを使用して試験した。Ｎｕｒｒ１−ＲＸＲ媒介性レポーター遺伝子発現を遮断したすべての変異は、細胞でのヘテロダイマー化も阻害した（図４）。これらの変異体がＤＮＡ上でヘテロダイマー化できないことは、ゲルシフト実験によりｉｎ  ｖｉｔｒｏで確証された（図５）。さらにまたいずれの変異もモノマーのＤＮＡ結合に影響を及ぼさないことが観察された。
【００５７】
これらをまとめると、ＲＸＲとヘテロダイマー化できない４種のＮｕｒｒ１変異体を産生した。これらのうちの３種は３残基置換を有しており、そのうちの１種は単一アミノ酸変異であった。これらの変異体は全部がＤＮＡに結合して、モノマーとして転写を活性化することができた。このため、これらの置換はＮｕｒｒ１  ＬＢＤの全体構造または推定リガンドに結合する能力に何らかの重要な影響を及ぼすと考えられる。従ってこのような変異体［例、Ｎｕｒｒ１  ＫＬＬ（５５４−５５６）ＡＡＡ、ＧＫＬ（５５７−５５９）ＡＡＡ、ＰＥＬ（５６０−５６２）ＡＡＡおよびＰ５６０Ａ］は潜在的Ｎｕｒｒ１活性化リガンドを探索するときに有用なツールとして役立つであろう。これらの変異体を使用すると、Ｎｕｒｒ１単独とＮｕｒｒ１−ＲＸＲヘテロダイマー活性化化合物とを識別することができるであろう。
【００５８】
参考文献
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パールマン  ティ（Ｐｅｒｌｍａｎｎ  Ｔ）およびヤンソン  エル（Ｊａｎｓｓｏｎ  Ｌ），１９９５，ＮＧＦＩ−ＢおよびＮＵＲＲ１とのＲＸＲヘテロダイマー化によって媒介されるビタミンＡシグナリング新規経路，Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ  ９：７６９−７８２．
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トラス  エム（Ｔｒｕｓｓ  Ｍ）およびビート  エム（Ｂｅａｔｏ  Ｍ），１９９３，Ｅｎｄｏｃｒ  Ｒｅｖ  １４：４５９−４７９．
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ゼッターストローム  アールエイチ（Ｚｅｔｔｅｒｓｔｒｏｅｍ  ＲＨ）ら，１９９７，Ｎｕｒｒ−１欠損マウスにおけるドーパミンニューロンの発育不全，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７６：２４８−２５０．
【図面の簡単な説明】
【００５９】
【図１】ダイマー化のために重要な領域（Ｉボックス）を含む、核内受容体の構造的および機能的ドメインを示した図であり、ＮＴ、アミノ末端ドメイン；ＤＢＤ、ＤＮＡ結合ドメイン；ＬＢＤ、リガンド結合ドメインで、添付の実施例において改変させたＮｕｒｒ１  Ｉボックスの１１アミノ酸（配列番号１）に下線を引いて示した
【図２】Ｎｕｒｒ１  Ｉボックス変異がＲＸＲ−媒介性転写活性化を促進する能力に及ぼす作用を示した図であり、野生型および変異型Ｎｕｒｒ１誘導体は、ＪＥＧ３細胞でトランスフェクトして、転写活性化する能力は、チミジンキナーゼプロモーターの上流に位置するｈＲＡＲβ２プロモーターＲＡＲＥ（βＲＥ）の３コピーによって駆動されるルシフェラーゼレポーター遺伝子を使用してアッセイした
【図３】Ｉボックス変異がＮｕｒｒ１のモノマー活性に何の影響も及ぼさないことを示した図であり、このモノマー活性は、２９３細胞で試験し、全長受容体誘導体は、ＮＧＦＩ−Ｂ結合部位（ＮＢＲＥ、パネルA）の３コピーによって調節されたレポーター遺伝子を使用して試験し、Ｇａｌ４  ＤＮＡ結合ドメインに融合した野生型および変異型リガンド結合ドメインの活性は、最小チミジンキナーゼプロモーターの上流に位置する４つのＧａｌ４結合部位を含むレポーター上で試験し（パネルB）、実験をＪＥＧ３細胞で実施した場合に、本質的に同一の結果が得られた
【図４】Ｎｕｒｒ１  ＩボックスがＪＥＧ３細胞でのＲＸＲとの相互作用に及ぼす影響を示した図であり、野生型および変異型Ｎｕｒｒ１リガンド結合ドメインはＧａｌ４  ＤＮＡ結合ドメインに融合しており、ＶＰ１６活性化ドメインに融合したＲＸＲとの相互作用をパールマン（Ｐｅｒｌｍａｎｎ）および（ヤンソン（Ｊａｎｓｓｏｎ）１９９５によって記載された通りに試験した。
【図５】Ｉボックス変異がＤＮＡ上でのＮｕｒｒ１−ＲＸＲヘテロダイマー化に及ぼす作用を示した図であり、Ｎｕｒｒ１誘導体がＲＸＲを含むヘテロダイマーとしてＤＮＡに結合する能力は、カストロ（Ｃａｓｔｒｏ）ら  １９９９によって記載された通りにゲルシフトアッセイを使用してｉｎ  ｖｉｔｒｏで評価して、放射標識ｈＲＡＲβ２プロモーターＲＡＲＥ（βＲＥ）をプローブとして使用した。
【図１】
2004519227.tif 000002
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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