(57)【要約】哺乳動物の精子形成に関与する新規な種類のＰＨＧＰｘタンパク質である精子核グルタチオンペルオキシダーゼ（ｓｎＧＰｘ）およびその一部分、ならびに同タンパク質をコードする核酸に関する。本発明は前記核酸を含むベクターおよび同ベクターで形質転換された宿主細胞にも関する。さらに、本発明は上記のタンパク質およびペプチドに特異的な抗体、ならびに雄の不妊の診断または治療における該タンパク質およびペプチドの使用に関する。
2004535160.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
リン脂質ヒドロペルオキシドグルタチオンペルオキシダーゼ（ＰＨＧＰｘ）様のセレン含有タンパク質をコードする核酸であって、ＰＨＧＰｘ遺伝子のエキソン２〜７とＰＨＧＰｘ遺伝子の第１イントロン内の１つの選択的エキソンとを含む核酸。
【請求項２】
哺乳動物のセレン含有タンパク質をコードする請求項１に記載の核酸。
【請求項３】
ヒトのセレン含有タンパク質をコードする請求項２に記載の核酸であって、前記選択的エキソンが配列番号１に示す配列または生物学的に活性のあるペプチドをコードするその一部分を含む核酸。
【請求項４】
マウスのセレン含有タンパク質をコードする請求項２に記載の核酸であって、前記選択的エキソンが配列番号２に示す配列または生物学的に活性のあるペプチドをコードするその一部分を含む核酸。
【請求項５】
ラットのセレン含有タンパク質をコードする請求項２に記載の核酸であって、前記選択的エキソンが配列番号３に示す配列または生物学的に活性のあるペプチドをコードするその一部分を含む核酸。
【請求項６】
ブタのセレン含有タンパク質をコードする請求項２に記載の核酸であって、前記選択的エキソンが配列番号４に示す配列または生物学的に活性のあるペプチドをコードするその一部分を含む核酸。
【請求項７】
配列番号１に示す配列または生物学的に活性のあるペプチドをコードするその一部分を含む、ＰＨＧＰｘ遺伝子の第１イントロン内の選択的エキソン。
【請求項８】
配列番号２に示す配列または生物学的に活性のあるペプチドをコードするその一部分を含む、ＰＨＧＰｘ遺伝子の第１イントロン内の選択的エキソン。
【請求項９】
配列番号３に示す配列または生物学的に活性のあるペプチドをコードするその一部分を含む、ＰＨＧＰｘ遺伝子の第１イントロン内の選択的エキソン。
【請求項１０】
配列番号４に示す配列または生物学的に活性のあるペプチドをコードするその一部分を含む、ＰＨＧＰｘ遺伝子の第１イントロン内の選択的エキソン。
【請求項１１】
請求項１に記載の選択的エキソンを増幅するためのプライマー。
【請求項１２】
配列番号５および６に記載の配列を有する、請求項３に記載の選択的エキソンを増幅するための複数のプライマー。
【請求項１３】
請求項１〜１０に記載の核酸によりコードされる哺乳動物のセレン含有タンパク質。
【請求項１４】
Ｎ末端配列が配列番号７または生物学的活性を維持しているその相同物もしくは断片により規定される、請求項１３に記載のヒトのセレン含有タンパク質。
【請求項１５】
Ｎ末端配列が配列番号８または生物学的活性を維持しているその相同物もしくは断片により規定される、請求項１３に記載のマウスのセレン含有タンパク質。
【請求項１６】
Ｎ末端配列が配列番号９または生物学的活性を維持しているその相同物もしくは断片により規定される、請求項１３に記載のラットのセレン含有タンパク質。
【請求項１７】
Ｎ末端配列が配列番号１０または生物学的活性を維持しているその相同物もしくは断片により規定される、請求項１３に記載のブタのセレン含有タンパク質。
【請求項１８】
配列番号７または生物学的活性を維持しているその相同物もしくは断片により規定されるペプチド。
【請求項１９】
配列番号８または生物学的活性を維持しているその相同物もしくは断片により規定されるペプチド。
【請求項２０】
配列番号９または生物学的活性を維持しているその相同物もしくは断片により規定されるペプチド。
【請求項２１】
配列番号１０または生物学的活性を維持しているその相同物もしくは断片により規定されるペプチド。
【請求項２２】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載の核酸を含む発現ベクター。
【請求項２３】
請求項２２に記載のベクターにより形質転換された宿主細胞。
【請求項２４】
哺乳動物の妊性を試験管内（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）で判断するためのスクリーニング方法であって、
精子のＤＮＡを単離するステップと、
ＰＨＧＰｘ遺伝子の選択的エキソンをＰＣＲにより増幅するステップと、
増幅された遺伝子断片の配列を決定するステップと、
前記増幅された遺伝子断片と請求項１に記載の選択的エキソンの核酸との整合を調べるステップとからなる方法。
【請求項２５】
ヒトの雄の妊性を判断し、前記増幅された遺伝子断片と配列番号１に記載の選択的エキソンの核酸との整合を調べる、請求項２４に記載のスクリーニング方法。
【請求項２６】
マウスの雄の妊性を判断し、前記増幅された遺伝子断片と配列番号２に記載の選択的エキソンの核酸との整合を調べる、請求項２４に記載のスクリーニング方法。
【請求項２７】
ラットの雄の妊性を判断し、前記増幅された遺伝子断片と配列番号３に記載の選択的エキソンの核酸との整合を調べる、請求項２４に記載のスクリーニング方法。
【請求項２８】
ブタの雄の妊性を判断し、前記増幅された遺伝子断片と配列番号４に記載の選択的エキソンの核酸との整合を調べる、請求項２４に記載のスクリーニング方法。
【請求項２９】
スクリーニングの前に精子を染色アッセイにより核の凝縮について試験する、請求項２４〜２８に記載の方法。
【請求項３０】
染色はアクリジンオレンジを用いて実施される請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
請求項１３〜２１に記載のアミノ酸配列のうちの１つに特異的に結合する抗体。
【請求項３２】
モノクローナル抗体である請求項３１に記載の抗体。
【請求項３３】
化学療法剤、毒剤、およびイメージング剤のうち少なくともいずれかに結合される請求項３１または３２に記載の抗体。
【請求項３４】
請求項１３〜２１に記載のアミノ酸のうちのいずれかに対する結合特異性を有するモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマ。
【請求項３５】
請求項１に記載の選択的エキソンが不活性化されているヒト以外の組換え哺乳動物。
【請求項３６】
配列番号２に記載の核酸が不活性化されている組換えマウス。
【請求項３７】
請求項３１〜３３に記載の抗体を備えた試験キット。
【請求項３８】
請求項１１および１２に記載のプライマーを備えた試験キット。
【請求項３９】
請求項１３〜２１のいずれか一項に記載の有効な量のタンパク質およびペプチドのうち少なくともいずれかを、任意選択で医薬として許容可能な担体と組み合わせて含む組成物。
【請求項４０】
雄の不妊を試験管内（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）で診断するための請求項３９に記載の組成物の使用。
【請求項４１】
雄の不妊を試験管内（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）および生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）の少なくともいずれかにおいて治療するための請求項３９に記載の組成物の使用。
【請求項４２】
請求項２２に記載のベクターを用いて宿主細胞を形質転換すること、該宿主細胞を、同宿主細胞による配列の発現を可能にする条件下で培養すること、および該宿主細胞からペプチドを単離することからなる、本質的に純粋なセレン含有タンパク質およびペプチドのうち少なくともいずれかを生成する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、哺乳動物の精子形成に関与する新規な種類のＰＨＧＰｘタンパク質である精子核グルタチオンペルオキシダーゼ（ｓｎＧＰｘ）およびその一部分、ならびに同タンパク質をコードする核酸に関する。また、本発明は同核酸を含むベクターおよび同ベクターで形質転換された宿主細胞を対象とする。さらに、本発明は上記のタンパク質／ペプチドに特異的な抗体、および雄の不妊の診断または治療における該タンパク質／ペプチドの使用も含む。
【背景技術】
【０００２】
リン脂質ヒドロペルオキシドグルタチオンペルオキシダーゼ（ＰＨＧＰｘ、ＧＰｘ−４とも呼ばれる）は、セレン酵素である。同酵素は、活性部位に２１番目のアミノ酸としてセレノシステインを有する、Ｈ２Ｏ２の解毒能力のある酸化還元酵素である。細胞内では、この酵素は細胞質ゾルおよびミトコンドリア内に存在し、遍在的に発現し、かつ他のグルタチオンペルオキシダーゼとは異なり、脂質ペルオキシド、酸化ＬＤＬ、および酸化コレステロールをも還元しうるという独自の特徴を有する。反応を完了するために、グルタチオンが酸化される。ＰＨＧＰｘのもう１つの独自の特徴は、グルタチオンのチオール基を電子供与体として利用できないグルタチオン欠乏状態の際にタンパク質のチオール基を基質として利用することも可能であり、その結果タンパク質にジスルフィド架橋を導入しうるということである。
【０００３】
様々な研究により、セレンが哺乳動物の精子発生において重要な役割を果たしていることが示されている。ラットについては、青年期の始まりに続いて精巣におけるセレン濃度が著しく増大することが見出されており、精子が同元素の主たる標的細胞でありラットの全てのコンパートメントの中で圧倒的に高いセレン濃度を示すことが見出されている（１）。セレンを枯渇させたラットは、運動性の劣った、中央部分に異常を有する精子を生成する（２）。同様に、セレン欠乏マウスでは、非常に高頻度に精子頭部の奇形を伴う異常が観察された（３）。ラットにおけるセレンの深刻な枯渇は、精巣萎縮と精子形成の完全な停止とをもたらす（４）。
【０００４】
ラットを生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）で７５Ｓｅで標識し、組織のホモジネートをゲル電気泳動法で分離することにより、生物体内において同元素がセレン含有タンパク質の大部分に存在していることが示された（５，６）。この中で、見かけの分子量が約３４ｋＤのタンパク質は精巣と精子とだけに見出されている（５）。同タンパク質は精子細胞の核に存在し、後期の精細胞において高レベルで発現される（７）。このような段階では、核は、プロタミンによるヒストンの置換と、プロタミンのチオールを架橋し化学的ストレスや機械的ストレスに対して強い耐性を有する構造をもたらすことにより制御されるＤＮＡの再編成と凝縮とを特徴とする、著しい変化をとげる（８）。
【０００５】
これまで、ＰＨＧＰｘ酵素は酸化損傷から保護する酵素としての機能のみを有すると考えられていた。しかし、１年半前、フローエおよびアルシーニ（Ｆｌｏｈｅ  ａｎｄ  Ｕｒｓｉｎｉ）（２９）により、酸化型の（すなわち分子間および分子内に架橋されたジスルフィド架橋を有する）同酵素が精子のミトコンドリア鞘の形成に関与することが示された。この目的のために、精子において大量の酵素が必要とされる。
【０００６】
しかしながら、ＰＨＧＰｘのほかに、雄の妊性における構造と機能とが未知である前述のような多数のセレン含有タンパク質が存在する。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
したがって、本発明の目的は、雄の妊性についての重要なマーカーとなる新規なセレン含有タンパク質を提供することである。
【０００８】
本発明のさらなる目的は、試験管内（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）で雄の不妊を診断し治療するための新規な方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明のセレン含有タンパク質および同セレン含有タンパク質をコードする核酸の構造をそれぞれ決定することは、試験管内（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）における雄の不妊の診断ならびに雄の不妊の治療に大きく貢献する。
【００１０】
ここで開示されるのは、新規なセレン含有タンパク質および同セレン含有タンパク質のベースとなる核酸配列である。精製と配列決定の後、発明者らは、ＰＨＧＰｘ  ＲＮＡの選択的スプライシングにより生成される新規な種類のＰＨＧＰｘであるセレン含有タンパク質を単離した。この新規で選択的な種類のＰＨＧＰｘ（ｓｎＧＰｘ）は、精巣においてのみ発現しており、精巣では非常に強く発現している。新規なスプライシング産物において発現される選択的エキソンは高度に塩基性であり、このタンパク質を核へ局在させる。その生化学的性質により、この酵素は核の凝縮（それ自体はプロタミンのチオール基の分子間および分子内架橋により引き起こされる）に関与する可能性が高いと思われる。選択的エキソンはプロタミンについて高い配列相同性を示し、おそらく、高度に塩基性のアミノ酸を介してＤＮＡに直接結合する。核の凝縮を高濃度のジチオスレイトール（ＤＴＴ）により解除可能であることが見出されている。ラットにセレンを枯渇させた食物を与えると、この新規なセレン含有タンパク質の形成量が非常に低下し、該ラットの精子核の凝縮の異常を示す。このことはセレン枯渇状態のラットにおける雄の不妊の原因でもある。従って、この新規な種類のＰＨＧＰｘと核の凝縮との間の因果関係は、機能の面でも説得力がある。
【００１１】
主として、この新規なセレン含有タンパク質はＰＨＧＰｘ遺伝子のエキソン２〜７とＰＨＧＰｘ遺伝子の第１イントロン内の選択的エキソンとを含む核酸によりコードされる。さらに、この核酸は場合によりＰＨＧＰｘ遺伝子のエキソン１を含むことがある。ヒトＰＨＧＰｘ遺伝子のゲノム配列およびコーディング領域は（４１）により、すでに既知である。ヒトのセレン含有タンパク質ＰＨＧＰｘ（ＧＰｘ‐４とも呼ばれる）は、ゲノム配列の塩基２６６３‐２７６４（エキソン１）、３８０６‐３９００（エキソン２）、３９８６‐４１３０（エキソン３）、４２７８‐４４２９（エキソン４）、４８６３‐４８８７（エキソン５）、５０２１‐５０８０（エキソン６）、および５１６１‐５１９３（エキソン７）からなる７つのエキソンによりコードされる。
【００１２】
ＰＨＧＰｘ遺伝子のエキソン１〜７は高度に保存された配列であり、すでにいくつかの哺乳動物の種について記載されている（マウス：（３９）、ブタ：（４０）、ヒト（４１、上記））。
【００１３】
しかしながら、驚くべきことに、新規なセレン含有タンパク質のＮ末端アミノ酸配列が、種々の哺乳動物の種の間でごく弱くしか保存されていない、現時点では未知の選択的エキソンによりコードされるということが見出されている。上述のように、この選択的エキソンとそれによりコードされるタンパク質とは、該セレン含有タンパク質の核への局在化の成立の際に驚くべき機能を有する。それにより、同タンパク質は全体として全面的な機能と雄の不妊において重要な機能を発揮する。ヒトのゲノム配列では選択的エキソンは塩基３３５５−３５５１からなり、従ってこれまで知られていたＰＨＧＰｘセレン含有タンパク質の第１エキソンと第２エキソンとの間（または、言い換えればＰＨＧＰｘ遺伝子の第１イントロン内）に位置付けられる。
【００１４】
本発明の１つの実施形態によれば、核酸配列はヒトのセレン含有タンパク質をコードしており、選択的エキソンは配列番号１に示す配列または生物学的に活性のあるペプチドをコードするその一部分を含む。
【００１５】
マウス、ラット、およびブタのその他の選択的エキソンは配列番号２〜４に規定される。
【００１６】
本明細書中で用いられる選択的エキソンという用語は、例えば単一のＲＮＡの基本的な転写産物を差次的にスプライシングすることにより形成されるエキソンを意味する。本発明の核酸の「部分」とは、生物学的に活性のあるペプチドをコードする誘導体および断片を特に意味することを意図している。この点について生物学的に活性があるということは、該変形物が、本来の機能が保持された、すなわち哺乳動物の妊性を維持可能なセレン含有タンパク質をコードするということを意味する。
【００１７】
上記の核酸の誘導体とは、例えば配列番号１〜４の各配列に比べて１つまたはそれ以上の置換、挿入、および欠失の少なくともいずれかを有する核酸であって、適度に厳密かまたは厳密な（ストリンジェント）条件下で配列番号１〜４の各配列に結合する。本発明の誘導体は、少なくとも１つ、それに２，３，４もしくはそれ以上のヌクレオチドが、該核酸の一端もしくは両端または該核酸の中央部分においても欠失または他のヌクレオチドによって置換されている核酸を特に意味する。
【００１８】
従って、本発明の核酸は配列番号１〜４の核酸に本質的に等価な配列を有する核酸をも含む。本発明の核酸は例えば少なくとも約８０％、一般には少なくとも約９０％または９５％の、配列番号１〜４に記載の核酸に対する配列の同一性を有しうる。しかし、このときの条件は、いずれの場合も該変形物が上記に規定されたセレン含有タンパク質の生物学的機能を満たすことである。さらに、本発明は上記の核酸に相補的な配列を提供する。
【００１９】
「核酸配列」という用語は、ヌクレオチドのヘテロ重合体または同ヌクレオチドの配列を指す。本明細書で使用される「核酸」という用語は、ＲＮＡと、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡおよび合成（例えば化学合成された）ＤＮＡなどのＤＮＡ、ならびにＰＮＡなどのその他の重合体に結合した複数の塩基を含む。
【００２０】
本発明は（上述のように）、適度に厳密かまたは厳密な条件下で本発明の核酸にハイブリダイズする誘導体も含む。
【００２１】
厳密なハイブリダイゼーションおよび洗浄の条件とは、一般に、オリゴヌクレオチドと所望の標的分子との間の二本鎖の分子（完全なハイブリッド）だけが形成され、所望の標的生物だけが検出される反応条件をそれぞれ意味する。厳密なハイブリダイゼーション条件は具体的には６５℃の０．２×ＳＳＣ（０．０３Ｍ  ＮａＣｌ、０．００３Ｍ  クエン酸ナトリウム、ｐＨ７）である。より短い断片、例えば２０個までのヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドの場合、ハイブリダイゼーション温度は６５℃より低く、例えば５５℃より高く、好ましくは６０℃より高いがいずれの場合も６５℃より低い。厳密なハイブリダイゼーション条件は、該核酸の大きさまたは長さおよびそのヌクレオチド組成によって変動し、当業者は手作業の実験により条件を決定することができる。適度に厳密な条件は、例えば４２℃で実施され、４２℃の０．２×ＳＳＣ／０．１％  ＳＤＳ中での洗浄することである。
【００２２】
各温度条件は、選択した実験条件によって、また被験核酸試料によって変わりうるものであり、その場合適宜調整する必要がある。ハイブリダイゼーションによる生成物の検出は、例えば放射標識された分子のオートラジオグラフィを用いて、または蛍光標識された分子を使用する場合は蛍光分析により実施可能である。
【００２３】
当業者は、それ自体周知の方法で、実際に厳密な条件を達成し特異的な検出プロセスを可能にするために、選択された実験方法に条件を適合させることが可能である。好適な「厳密な条件」を、例えば基準とするハイブリダイゼーションを用いて決定可能である。核酸またはオリゴヌクレオチドの適切な濃度をそれぞれ採用しなければならない。ハイブリダイゼーションを適切な温度で実施しなければならない。
【００２４】
さらなる実施形態によれば、本発明は請求項１に記載の核酸によりコードされる哺乳動物のセレン含有タンパク質を含む。このタンパク質は、好ましくは配列番号７〜１０で規定されるＮ末端配列、または生物学的活性を保持しているそれらの相同物（ホモログ）もしくは断片でありうる。
【００２５】
さらに、本発明は配列番号７〜１０のペプチド、または生物学的活性を保持しているそれらの相同物（ホモログ）もしくは断片を含む。
【００２６】
本発明が属する分野の当業者には、本発明の実施が配列番号１〜１０で規定される特定の配列の使用に限定されないことは明らかである。
【００２７】
得られるタンパク質分子にいわゆる「サイレント」な変化を生じる、例えば配列内の欠失、挿入または置換のような配列の修正形態も、本発明の範囲内にあるとみなされる。
【００２８】
一例として、その変化した部位に同等のアミノ酸を生じる核酸配列内の変化が考えられる。
【００２９】
そのようなアミノ酸置換は、あるアミノ酸を類似の構造および／または化学的性質を有する別のアミノ酸で置換すること、すなわち保存的アミノ酸置換の結果であることが好ましい。アミノ酸置換は、必要とされる残基の極性、電荷、溶解性、疎水性、親水性、および両親媒性（アンフィフィリック）の少なくともいずれかの性質における類似性に応じて実施可能である。無極の（疎水性の）アミノ酸の例は、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、およびメチオニンである。極性を有する中性アミノ酸には、グリシン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、およびグルタミンがある。プラスの電荷を有する（塩基性の）アミノ酸には、アルギニン、リシン、およびヒスチジンがある。マイナスの電荷を有する（酸性の）アミノ酸には、アスパラギン酸およびグルタミン酸がある。
【００３０】
「挿入」または「欠失」は通常１〜５アミノ酸の範囲を対象とする。許容可能な変化の程度は、ＤＮＡ組換え技術を用いてペプチド分子内のアミノ酸を系統的に挿入、欠失、または置換することと、その結果得られた組換え変形物を生物学的活性について調べることとにより、実験的に決定することができる。
【００３１】
タンパク質分子のＮ末端およびＣ末端部分に変化をもたらすヌクレオチド変異は、これらの部分が通常生物学的活性に関与しないので、タンパク質の活性を変化させないことが多い。システインが存在すると、タンパク質が組換え手法で生産される場合に望ましくない多量体を形成する可能性があり、その結果精製および結晶化の手順が複雑になるので、配列中に存在する１つ以上のシステインを取り除くことも必要とされうる。提言された各々の修正形態は、コードされるタンパク質により保持される活性の測定がそうであるように、技術上および自然科学上の基礎知識の範囲内にある。
【００３２】
従って、本明細書の記載または請求の範囲のいずれかにおいて「ＤＮＡ配列」という用語が使用されるとき、その用語は生物学的に同等なペプチド／タンパク質の作製から得られるすべての修正形態および変形形態を含むことを意味する。
【００３３】
さらに、本発明は上記に示した核酸配列のうち１つを含む発現ベクターに関する。
【００３４】
細菌の細胞を形質転換する際の使用に適した複数のベクターが知られており、例えばプラスミドおよびファージλのようなバクテリオファージを細菌宿主用に最も普通に使用されるベクターとして使用可能である。哺乳動物および昆虫の細胞のいずれにおいても、例えば外来ＤＮＡ断片を発現させるためにウイルスベクターを使用可能である。典型的なベクターはＳＶ４０およびポリオーマウイルスである。
【００３５】
宿主細胞の形質転換を、ベクターを使用せずに「裸のＤＮＡ」により代わりに実施することが可能である。
【００３６】
本発明の好適な実施形態によれば、配列番号１〜４に記載の核酸、およびそれらの断片、転写物または誘導体を、厳密または適度に厳密なハイブリダイゼーション条件を用いて、調べようとするＤＮＡまたはＲＮＡ試料にプローブとしてそれぞれハイブリダイズさせる。厳密度の条件は、各々の適用について実験的に決定しなければならない。上記の条件を基準として用いても良い。
【００３７】
本明細書中で規定される「プローブ」という用語は、相補的な配列の標的核酸に、１つ以上のタイプの化学結合（通常は水素結合を介して生じる相補的塩基の対合が一般的）により結合することのできる核酸を意味する。
【００３８】
本発明の融合タンパク質の生成は、真核細胞または原核細胞のいずれかにおいて実施可能である。好適な真核細胞の例には、哺乳動物の細胞、植物細胞、酵母細胞、および昆虫細胞がある。好適な原核生物の宿主には、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）および枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）がある。
【００３９】
本発明の１つの実施形態によれば、請求項２２に記載のベクターにより宿主細胞を形質転換すること、該宿主細胞による前記配列の発現を可能にする条件で該宿主細胞を培養すること、および該宿主細胞からセレン含有タンパク質／ペプチドを単離することからなる、本質的に純粋なセレン含有タンパク質／ペプチドを生成する方法が提供される。
【００４０】
本発明のタンパク質／ペプチドは血清学的に活性を有するか、免疫原性であるか、または抗原性であるかの少なくともいずれかでもある。従って、それらをさらにポリクローナルおよびモノクローナルのいずれの特異的な抗体の作製のためにも、免疫原として使用することが可能である。
【００４１】
これらの特異的抗体を診断および予後診断のうち少なくともいずれかに使用することができる。セレン含有タンパク質／ペプチドに特異的な抗体を、例えば、免疫蛍光顕微鏡を用いる実験室内の診断学において、もしくは免疫組織化学的染色において使用可能であり、または臨床試料中のセレン含有タンパク質／ペプチドの検出および定量の少なくともいずれかのためのイムノアッセイにおいて、構成成分として使用することが可能である。そのような特異的抗体を、診断および予後診断のうち少なくともいずれかのキットの構成成分として使用することが可能である。さらに、そのような抗体を本発明のセレン含有タンパク質／ペプチドのアフィニティ精製において使用することが可能である。
【００４２】
ＰＨＧＰｘだけでなくｓｎＧＰｘを特異的に免疫組織化学的に測定することを可能にする、選択的エキソンにより規定されるアミノ酸配列に対する抗体を生産することが好ましい。
【００４３】
さらに、本発明は開示されるタンパク質／ペプチドのうちの１つに対する結合特異性を備えたモノクローナル抗体を有するハイブリドーマを含む組成物に関する。
【００４４】
本発明のセレン含有タンパク質／ペプチドに特異的なモノクローナル抗体を、次のようにして作製することができる。マウスに本発明のセレン含有タンパク質／ペプチドを２回注射する。１回目の注射には完全フロイントアジュバントに本発明のセレン含有タンパク質／ペプチドを含め、皮下に投与する。２回目の注射には不完全フロイントアジュバントに本発明のセレン含有タンパク質／ペプチドを含め、腹腔内に投与する。その後数ヶ月間にわたり別々の時点で数回の注射を実施する。次いで、該マウスから脾臓細胞を得てポリエチレングリコール中でミエローマ細胞に融合させる。次に、得られたハイブリドーマ細胞を、いずれの細胞が所望の特異性を示す抗体を生産するかを判断するためにスクリーニングする（ミルシュタイン、シー．（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．）、モノクローナル抗体（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）、サイエンティフィクアメリカン（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｍｅｒｉｃａｎ）による）。
【００４５】
さらに、本発明は、哺乳動物の妊性を試験管内（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）で判断するためのスクリーニング方法であって：精子のＤＮＡを単離するステップと、ＰＨＧＰｘ遺伝子の選択的エキソンをＰＣＲにより増幅するステップと、増幅された遺伝子断片を配列決定するステップと、増幅された遺伝子断片と本発明の選択的エキソンの核酸との整合をモニターするステップとからなる方法を含む。例えば調べた配列の範囲に挿入／欠失／置換を有する状態の配列の非整合は、問題の哺乳動物が選択的エキソンの発現が不十分であるかまたは発現しないかの少なくともいずれかを原因とする妊性障害／不妊を患っているという重要な指標である。この結果に基づき、不足／欠落している本発明のセレン含有タンパク質を、試験管内（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）／生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）における治療という意味において具体的に投与することが可能である（下記を参照のこと）。
【００４６】
好適な実施形態では、ヒト、マウス、ラット、およびブタの各々について、配列番号１〜４の核酸配列に関して測定を実施する。しかし、本発明がこれらの動物種に限定されないことは理解されるべきである。それとは反対に、本発明をすべての農業用動物および家畜の妊性の測定において（およびネガティブな配列整合の場合は不妊の測定においても）有利に使用することができる。そのような農業用動物および家畜は、例えばウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ネコ、およびイヌである。
【００４７】
好適な実施形態によれば、第１に、アクリジンオレンジ、フォイルゲン試薬または酸性アニリンブルーを用いて染色し、顕微鏡で検出することにより核の凝縮を測定する。凝縮された精子核は色素（フォイルゲン試薬、アニリンブルー）を取り込まず、熱または酸性の媒質によるＤＮＡの変性に耐性である。特定のＵＶ励起により、アクリジンオレンジは二本鎖ＤＮＡを緑色に染色するが、一本鎖ＤＮＡおよびＲＮＡは赤色に染まる。核の凝縮が妨げられると、ＤＮＡは酸（酸性アルコール中での固定）または熱により変性されうる。この場合、アクリジンオレンジは核を赤色に染める。凝縮された核のＤＮＡを変性させることはできず、該ＤＮＡは緑色の蛍光を発する。これらの方法を用いて、精子頭部の凝縮に異常のある患者の試料を検出可能である。この事前選択によりそのような精子の試料を特異的に選択することが可能であり、該試料は次いでさらに複雑なスクリーニング法に使用される。
【００４８】
ｓｎＧＰｘの欠如もしくは量の不足、およびそれらを原因とする不妊には、いくつかの原因が存在し得る。すなわち、
１  セレンの欠乏。従って、患者のセレンについての状態を測定すべきである。
２  環境化学物質および重金属のような、ｓｎＧＰｘの活性に影響を与えるその他の物質。
３  不完全な選択的スプライシングの原因となる遺伝的欠陥。
４  ｓｎＧＰｘが十分量あるにもかかわらず核内へ移送されないような、局在化シグナルの領域の配列内の突然変異。このような作用はごく軽微な配列の変化ですでに起こる可能性がある。
５  ｓｎＧＰｘの配列中、ひいては機能におけるその他の異常。
【００４９】
従って、選択的な種類のＰＨＧＰｘの欠如により精子核の凝集において選択的に不具合が生じるが、一方で酸化ストレスからＤＮＡを保護するというＰＨＧＰｘの他のすべての機能は影響を受けない。本発明者らによる動物実験から、すでに古典的な種類のＰＨＧＰｘのある対立遺伝子の欠如が、不完全な精子形成と精子のミトコンドリア鞘の形成とを引き起こすことが明らかとなった。遺伝に関しては、これらの突然変異は子孫がないためすぐに除かれるが、その結果現在まで遺伝的研究においては認識されえなかった。不完全な精子核の凝縮を示す不妊の雄個体のゲノムの両対立遺伝子についてＰＨＧＰｘ遺伝子の突然変異を具体的に調査するだけで、この種類の不妊の原因を解明することができる。
【００５０】
精子における核の凝縮を検出することにより、ＩＶＦ（体外受精）が不適な雄の不妊患者を特定することが可能である。従ってこれらの患者にはＩＣＳＩ（細胞質内精子注入法）が提示される。ＰＨＧＰｘ遺伝子の突然変異を有するこのような患者をさらに検出することにより、雄の不妊の診断が向上し、場合によりその遺伝的基礎についての洞察も得られる。
【００５１】
このような形態学的検出方法と分子レベルの検出方法との組合せにより、これらの患者の特定と分類とが可能となり、診断が向上し、新たな予後上および治療上の可能性が広がる。
【００５２】
本発明はさらに、請求項１に記載のＤＮＡ配列が不活性化されたヒト以外の組換え哺乳動物に関する。配列番号２に記載の核酸が不活性化された組換えマウスが提供されることが好ましい。このようにして、そのような組換えノックアウトマウスを用いて動物モデルを確立することができる。これらの動物モデルは、雄の哺乳動物の不妊に関係のあるいくつかの障害の原因に関する新たな洞察を提供する。
【００５３】
最後に、本発明は、請求項１３−２１のいずれかに記載の有効な量のタンパク質／ペプチドを医薬として許容可能な担体と組合せて含む組成物、ならびに雄の不妊の試験管内（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）診断および雄の不妊の試験管内（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）／生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）治療におけるそれらの使用を含む。
【００５４】
本発明のタンパク質を、例えば雄の不妊という障害の場合に生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）で使用可能であり、その不妊の原因が例えば次の問題のうちの１つによる場合である：すなわち（ａ）選択的スプライシングにおける異常の原因となる遺伝的欠陥、（ｂ）ｓｎＧＰｘが十分量あるにもかかわらず該セレン含有タンパク質が核内へ移送されないような、局在化シグナルの領域の配列内の突然変異。このような作用はごく軽微な配列の変化ですでに起こる可能性がある；または（ｃ）ｓｎＧＰｘの配列中、ひいては機能におけるその他の異常。
【００５５】
本発明のタンパク質の生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）への投与は、睾丸内へ直接注射することにより実施するのが好ましい。同タンパク質を治療のために試験管内（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）で、例えばＩＶＦのための精子の処理において使用することも可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５６】
ラットの精巣から単離した３４ｋＤのセレン含有タンパク質を、ＰＨＧＰｘの性質に類似の性質を有する固有の精子核グルタチオンペルオキシダーゼ（ｓｎＧＰｘ）として同定した。最初のＮ末端アミノ酸分析、データベース検索、ポリメラーゼ連鎖反応、およびｃＤＮＡの塩基配列決定による、該タンパク質の一次構造の決定から、そのＮ末端の配列がＰＨＧＰｘの配列とは異なっていることが示された。ＰＨＧＰｘ遺伝子の第１イントロン内の選択的エキソンによりコードされるこの配列は、プロタミンの配列に５０％を超える相同性を示し、核局在化シグナルを含む。ラットでは、ｓｎＧＰｘは後期の精細胞の核において高度に発現しており、そこでは存在する唯一のセレン含有タンパク質である。その出現は、架橋されたプロタミンのチオールにより安定化された高度に凝縮されたクロマチンを生じるＤＮＡの再構成と時期が重なる。ｓｎＧＰｘの濃度が正常レベルの３分の１にまで減少している、セレンを枯渇させたラットでは、クロマチンの凝縮は著しく不完全である。本発明者らは、ｓｎＧＰｘが、活性酸素種の還元によるジスルフィド架橋を担うプロタミンチオールペルオキシダーゼとして作用することを示している。クロマチンの凝縮および精子ＤＮＡの酸化からの保護における該酵素の二重の機能は、雄の妊性と精子の質を確保するために必要である。
（３４ｋＤセレン含有タンパク質の同定）
第１のステップとして、セレンを適量含んだ食物を与えたラットの後期の精細胞のＳＲＳ核から３４ｋＤのセレン含有タンパク質を精製した。これらの核の表面を界面活性剤ＣＴＡＢで処理した後、図１の３レーンのオートラジオグラフからわかるように３４ｋＤのタンパク質がこれらの核内において唯一のセレン含有タンパク質であることが見出された。セレン濃度、従ってＣＴＡＢ処理されたＳＲＳ核内の３４ｋＤのセレン含有タンパク質については、約６０μｍｏｌ／ｋｇ（乾燥重量）の比較的高い値が測定され、この値は例えば肝臓（１４μｍｏｌ  Ｓｅ／ｋｇ（乾燥重量））および脳（８μｍｏｌ  Ｓｅ／ｋｇ（乾燥重量））などの他のラットの組織の核画分におけるセレン濃度をはるかに超えていた。
【００５７】
トリプシン消化後のＭＡＬＤＩ−ＭＳを用いたタンパク質断片の解析から、該３４ｋＤのタンパク質と、別のセレン含有タンパク質、すなわちグルタチオンの酸化によりペルオキシドの還元を触媒するこれまでに同定された４つのグルタチオンペルオキシダーゼのうちの１つであるＰＨＧＰｘとの間のかなりの類似性が示された（１２，１５−１７）。
【００５８】
この類似性は、ある実験において、図１の最初のレーンに示すように該３４ｋＤのタンパク質が抗ＰＨＧＰｘ抗体に反応するという発見によりさらに顕著なものとなった。該タンパク質はグルタチオンペルオキシダーゼ活性も阻害し、かつ、ＰＨＧＰｘと同様に例えば過酸化水素、ｔ−ブチルヒドロペルオキシドおよびホスファチジルコリンヒドロペルオキシドなどの種々のペルオキシドの還元を触媒した（１２）。同タンパク質の比活性は、ホスファチジルコリンヒドロペルオキシドを基質として用いた場合に約３０００Ｕ／ｍｇタンパク質であった。局在化するので、このタンパク質は精子核グルタチオンペルオキシダーゼ（ｓｎＧＰｘ）と呼ばれる。
【００５９】
精子が睾丸から精巣上体へ移行する際、図１の２，４レーンに見られるように、３４ｋＤのセレン含有タンパク質の３分の２が分子量２４，２２および２０ｋＤを有するより小さなタンパク質に変換された。この断片化は、３４ｋＤのタンパク質についての１０を越える強い塩基性のｐＨ値から、２０ｋＤのタンパク質についての約７．５というｐＨ値へのｐＨ値の変化に関係がある（図２）。しかしながら、質量の減少はプロセシングを受けた該タンパク質の酵素としての性質に影響を与えなかった。
【００６０】
該３４ｋＤの化合物のＮ末端配列の解析から、この化合物がアミノ酸ＳＲＡＡＡＲＧＲＫＲで始まることが示された。データベース検索により、該タンパク質がこれまで未知であったことが明らかとなった。しかし、この検索を入手可能な全てのゲノム配列に拡げ、これらの配列を全ての読み枠内に変換した場合、結局マウスのＰＨＧＰｘ遺伝子の第１イントロンの類似の配列に行き着いた。新規なセレン含有タンパク質の形成を担う選択的エキソンは、利用可能なＤＮＡおよびタンパク質の配列情報から得たプライマーを用いたｃＤＮＡの増幅により、マウスおよびラットの精巣のＲＮＡ中に特定された（図３）。マウスおよびラットのこのエキソンと、ヒトおよびブタの推定される該当エキソンの配列を、図３ｂに示す。該配列は最初のメチオニンのすぐ後にアルギニンに富む配列をコードする。
【００６１】
前記配列の機能に関する情報を、２つのＧＦＰ融合遺伝子を構築する実験から得た。第１にマウスの配列の選択的エキソン全体、および第２に２番目のメチオニンに続く配列を、ＧＦＰに融合させる。両構築物を２種類の哺乳動物の細胞株にトランスフェクションした後、２つの融合タンパク質の細胞内の局在をＧＦＰの蛍光を用いて調べた。最も大きいＧＦＰ融合タンパク質だけが核内に入り、Ｎ末端のアルギニンに富む配列が核局在化シグナルを含むことが示された（データは示さない）。
【００６２】
ｓｎＧＰｘのＥａ配列またはＰＨＧＰｘの全配列をプローブとしたマウスの種々の組織のノーザンブロット解析（図４）により、ｓｎＧＰｘが精巣においてのみ発現することが示された。このことは、マウス生体における７５Ｓｅ標識されたタンパク質の分布の測定により確認された。この場合、ｓｎＧＰｘは、以前ラットにおいて見出された（５）ように、精巣および精子においてのみ検出されたが、この事実は本セレン酵素の特有の機能を示唆するものである。
（ｓｎＧＰｘの機能についての検討）
精子形成後期におけるｓｎＧＰｘの出現は、プロタミンによるＤＮＡのパッケージングおよびその結果生じるプロタミンのジスルフィドの架橋により高度に凝縮されたクロマチンの安定化と、時期が一致する（８）。このプロセスは活性酸素種（ＲＯＳ）により誘導され（１８）、グルタチオンペルオキシダーゼにより触媒されるグルタチオンの酸化とペルオキシドの還元に類似している。精細胞発生の後期における精細胞中のグルタチオン濃度が著しく減少する（１９）という発見と合わせて、このことは該セレン酵素がプロタミンのシステイン残基を還元剤として用いることができ、従ってプロタミンチオールレダクターゼとして作用し得ることを示唆する。
【００６３】
従って、ＣＴＡＢ処理したＳＲＳ核におけるセレン、したがってｓｎＧＰｘの濃度が、セレンを適量摂取させたラットにおける６０μｍｏｌ  Ｓｅ／ｋｇ（乾燥重量）という値に比べて２０μｍｏｌ  Ｓｅ／ｋｇ（乾燥重量）に減少しているセレン欠乏ラットにおいて、精子核の凝縮について調べた。両群の核を、二本鎖と一本鎖の核酸の区別を可能にするアクリジンオレンジで染色した。精子のＤＮＡはプロタミンのジスルフィド架橋の前にのみ加熱により変性可能であり、架橋後には変性できないので、アクリジンオレンジ染色を用いて哺乳動物の精子核のクロマチン凝縮の際のチオールのジスルフィドの状態を染色処理後にモニターすることができる（１４）。染色により、セレン欠乏ラットの輸精管由来のほとんどすべての精子細胞が不完全に凝縮されることが明らかとなった（図５）。
【００６４】
セレンを適量摂取させたラットの精子核を用いた試験管内（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）の実験から、ジチオスレイトールによりプロタミンのジスルフィドを還元したときは凝縮状態でなくなり、過酸化水素の添加により再構築されうることが示された。再凝縮は、ＰＨＧＰｘの阻害剤であるブロモスルホフタレインの添加により（２０）、またはＧＳＨの形の別のチオールが過剰に存在することにより阻止される。これらの知見から、ｓｎＧＰｘがプロタミンのスルフィドの架橋に関与すると結論付けることが可能である。
【００６５】
精巣および精子中に見出された３４ｋＤのセレン含有タンパク質（５）は、ＰＨＧＰｘの性質に類似の性質を有する固有の精子核グルタチオンペルオキシダーゼとしてここに同定された。同タンパク質はＰＨＧＰｘ遺伝子によりコードされるが、その一方で精巣においてのみ発現し、選択的エキソンにコードされるアルギニンに富むＮ末端配列で始まる。この配列は、ｓｎＧＰｘが精子の核内に入ることのできる唯一のセレン含有タンパク質である要因となっている核局在化シグナルを含む。
【００６６】
この配列の重要性に関する他の情報は、同配列がプロタミンの配列に５０％を越える相同性を示すという事実である。プロタミンは、アルギニンおよびシステインに富み、精子の成熟の際にヒストンに取って代わる小さな塩基性のタンパク質である。プロタミンがそのポリアルギニン領域を介してＤＮＡに結合することは周知のことであり、ｓｎＧＰｘが類似の方法でＤＮＡに結合する可能性は非常に高い。
【００６７】
ｓｎＧＰｘが架橋されたプロタミンジスルフィドの形成ひいては凝縮された精子核の安定化を担うプロタミンチオールペルオキシダーゼとして作用し、ｓｎＧＰｘレベルの減少によりクロマチンの凝縮が著しく異常になるという本発明者らの発見により、セレンの別の重要な役割が立証された。クロマチン凝縮のプロセスは、精子細胞の成熟だけでなく妊性および子孫の生成にとっても重要であると思われる。ヒトでは、正常な精子の凝縮と体外受精率との間に高い相関が見出されている（２２）。マウスにおける実験により、正常な受精および胚発生を確実にするためには安定なマトリクスを有する凝縮された精子核が必要であることが示されている（２３）。従って、ｓｎＧＰｘ依存性のプロタミンのチオールの酸化は、雄の妊性および生殖において重要な役割を果たしていると思われる。
【００６８】
精子が精巣上体頭に達し凝縮プロセスが完了するとすぐに、ｓｎＧＰｘは部分的にプロセシングを受け、同じ酵素活性を有するが塩基性のアルギニンに富むＮ末端配列が失われたことを示す中性のｐＨ値を有する、より小さなタンパク質となる。従って、ｓｎＧＰｘおよびプロセシングを受けたタンパク質は２つの機能を有する。すなわち、第１に完全長のＤＮＡに結合したｓｎＧＰｘによるプロタミンの酸化、第２に、同酵素と、同酵素から生じＤＮＡに結合しないためＲＯＳの分解に一層の効果を発揮しうる形態とによる、酸化損傷からの精子のＤＮＡの保護である。
【００６９】
いくつかの研究により、ヒトの精子の質がＤＮＡに対する酸化損傷の増大と共に低下するということが示されている。しかし、ＲＯＳのある程度の発生はプロタミンのチオールの架橋に必要なので、過剰量のＲＯＳによるＤＮＡの損傷が子孫の健康に悪影響を与える（２４）。従って、精子核のｓｎＧＰｘの状態を測定することが、精子の質を明らかにするために重要なものとなりうる。
【００７０】
ＰＨＧＰｘがクロマチンの凝縮（２５）および酸化損傷からの精子ＤＮＡの保護（２６）に関与することが示唆されている。しかし、ＰＨＧＰｘは細胞質型およびミトコンドリア型でのみ発現し、精子においては主に膜結合型である（２５）。この矛盾は、ｓｎＧＰｘを精細胞の核に存在する唯一のセレン含有タンパク質として同定することと、そのプロタミンチオールペルオキシダーゼとしての特徴付けとにより、解決可能であろう。
【００７１】
セレンが雄の生殖系における種々のプロセスに関与することは周知である。ＰＨＧＰｘはミトコンドリア鞘の構成要素として作用し（２７）、従って鞭毛の形成に必要であり、一方核内ではｓｎＧＰｘとそのプロセシング産物がクロマチンの凝縮および酸化損傷からの生殖細胞系列の保護に関与する。さらに、セレンは現時点では特定されていない方法でのテストステロンの生合成に必要であるとも報告されている（４）。セレン含有タンパク質の形成と機能とにおけるどの程度の異常が雄の妊性障害を引き起こすかを見出すことは、非常に興味深いことであろう。
【００７２】
以下の実施例は単なる例示であり、本発明の範囲を限定するものとみなされるべきではない。
【実施例】
【００７３】
（動物実験）
ラットに、２〜５μｇ  Ｓｅ／ｋｇを含むセレン欠乏食、または基本的な食物に３００μｇ  Ｓｅ／ｋｇを亜セレン酸ナトリウムの形で加えたセレンを適量含む食物のいずれかを、数世代にわたって与えた。トレーサー実験では、２０ＭＢｑの７５Ｓｅ（比活性１８〜３５ＭＢｑ／μｇ）の用量を亜セレン酸ナトリウムの形で注射することによりｉｎ  ｖｉｖｏで動物を標識した。食物の組成と動物の処置については他所（６）に記載されている。マウスを用いたトレーサー実験では、成体マウスに基本的な食物を２週間与え、次いで３ＭＢｑの７５Ｓｅ‐亜セレン酸塩の用量を注射することにより標識した。
（セレンの測定）
組織および精巣画分のセレン濃度を、機器中性子放射化分析により以前他所（９）に記載されたように測定した。トレーサー実験では、組織および組織の画分中の７５Ｓｅ活性を、４チャネル分析器に接続されたＮＡＩ（ＴＩ）ドリルホール検出器（キャンベラ（Ｃａｎｂｅｒｒａ）、ドイツ国フランクフルト所在）を用いて測定した。ＳＤＳ‐ＰＡＧＥにより分離した７５Ｓｅ標識されたセレン含有タンパク質を、光感受性イメージングシート（フジＢＡＳ１０００、レイテスト（Ｒａｙｔｅｓｔ）社、ドイツ国ストローベンハート（Ｓｔｒａｕｂｅｎｈａｒｄｔ）所在）を用いてオートラジオグラフィにより調べた。
（３４ｋＤセレン含有タンパク質の精製）
被膜を除いた後、精巣を４倍容量の緩衝液Ａ（２０ｍＭ  ＭＥＳ、０．３１Ｍスクロース、３ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．１％  ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、５０ｍＭベンズアミド塩酸塩、０．１ｍＭ  ＰＭＳＦ、ｐＨ６．０‐６．１）中でホモジナイズした。１０００×ｇで遠心分離した後、後期精細胞の超音波処理に耐性を有する核（ＳＲＳ核）を、Ｂ１５  Ｂｒａｎｓｏｎ細胞破砕機（ハイネマン（Ｈｅｉｎｅｍａｎｎ）社、ドイツ国シュバービシュ‐ムント（Ｓｃｈｗａｅｂｉｓｃｈ‐Ｇｍｕｅｎｄ）所在）を用いて、すでに以前他所（１０）に記載されたようにして単離した。緩衝液Ｂ（１％  ＣＴＡＢ、５０ｍＭトリス、２０ｍＭ  ＤＴＴ、ｐＨ８）およびＣ（１％  ＣＨＡＰＳ、５０ｍＭトリス、２０ｍＭ  ＤＴＴ、ｐＨ８）とともにインキュベーションし、緩衝液Ｄ（５０ｍＭトリス、２０ｍＭ  ＤＴＴ、ｐＨ８）で数回洗浄し、ＮａＣｌ溶液（５０ｍＭトリス中に１ＭのＮａＣｌ、２％  β‐メルカプトエタノール、ｐＨ８）で抽出し、１０００×ｇで遠心分離した後、上清を蒸留水に対して透析し、３４ｋＤのタンパク質をＳＤＳ‐ＰＡＧＥにより他のタンパク質から分離した。
（ＭＡＬＤＩ‐ＭＳによるタンパク質の同定）
ＳＤＳ‐ＰＡＧＥによる分離後、３４ｋＤのバンドをゲルから切り出し、（１１）に記載のとおりトリプシン消化を実施した。消化物を、１％のトリフルオロ酢酸を含むアセトニトリルで抽出した。断片の質量を、遅延引き出しを備えた修正Ｂｒｕｋｅｒ  Ｒｅｆｌｅｘ（登録商標）III を用いて測定した。質量を同定するためにＰｅｐｔｉｄｅ  Ｓｅａｒｃｈ（「ペプチドマスデータによるタンパク質の同定」、ハイデルベルク（Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ）所在のＥＭＢＬ）を使用した。
（酵素アッセイ）
グルタチオンペルオキシダーゼ活性を、基質として過酸化水素またはｔ‐ブチルペルオキシドを用いて、（１２）に記載のとおりに３４０ｎｍで分光分析により測定した。ＰＨＧＰｘ活性を、特異的基質として使用したホスファチジルコリンヒドロペルオキシダーゼにより測定した。
（抗ＰＨＧＰｘ抗体との反応）
ＳＤＳ‐ＰＡＧＥにより単離された３４ｋＤのタンパク質をＰＶＤＦ膜（バイオメトラ（Ｂｉｏｍｅｔｒａ）社、ドイツ国ゲッティンゲン（Ｇｏｅｔｔｉｎｇｅｎ）所在）にトランスファーし、精製した抗ラットＰＨＧＰｘ抗体を用いて調べた。
（Ｎ末端配列決定）
３４ｋＤのタンパク質をＳＤＳ‐ＰＡＧＥにより単離し、ＰＶＤＦ膜（バイオメトラ（Ｂｉｏｍｅｔｒａ）社、ドイツ国ゲッティンゲン（Ｇｏｅｔｔｉｎｇｅｎ）所在）にトランスファーし、アミドブラックで染色した。問題のバンドを切り出した後、ＡＢＩ  ４９４型Ｐｒｏｃｉｓｅ（登録商標）エドマン法シーケンサ（ＰＥバイオシステムズ（ＰＥ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）社、米国カリフォルニア州フォスター・シティ所在）を用いて同バンドについてＮ末端配列決定を実施した。アミノ酸をＰＴＨ誘導体の形で分析した。このようにして得た配列決定データを、ＮＣＢＩの「ＢＬＡＳＴ  ＳＥＡＲＣＨ」を用いてデータベースの配列と比較した。
（ＰＣＲによるｃＤＮＡの合成）
３’ＲＡＣＥ実験をＧＥＮＥＡｍｐ（登録商標）システム２４００サーマルサイクラー（パーキンエルマー（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）社、米国コネチカット州ノーウォーク（Ｎｏｒｗａｌｋ）所在）で実施した。続いて配列決定をするために、各ＰＣＲ産物をｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ（登録商標）ベクター（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）社、オランダ国グローニンゲン（Ｇｒｏｎｉｎｇｅｎ）所在）にクローニングした。
【００７４】
（マウスｓｎＧＰｘ）：ＰｏｌｙＡＴｒａｃｔ（登録商標）ｍＲＮＡ単離システムIV（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）社、米国ウィスコンシン州マディソン所在）を用いて、ポリＡ＋  ＲＮＡをマウスの精巣から単離した。製造業者（クロンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）社、米国カリフォルニア州パロアルト（Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ）所在）の取扱説明書に従ってアダプタに結合した精巣ｃＤＮＡを合成した。選択的エキソンを、プライマーＰＨＧＰｘ  Ｅａ‐ｆ１（ＧＧＧＡＣＧＣＴＧＣＡＧＡＣＡＧＣＧＣＧＧＣＧＧＡＴＣＣ）およびＡｄｖａｎｔａｇｅ（登録商標）２ポリメラーゼ（クロンテック社）を用いて３’ＲＡＣＥの手法により増幅させた。
【００７５】
（ラットｓｎＧＰｘ）：マウスの選択的エキソンＥａの配列を用いたデータベース検索の結果、ラット由来のＰＨＧＰｘのエキソンＩおよびマウスのＥａに一致するラットのＥｓｔクローン（Ｇｉ：３３９９３１９）を得た。ホモジナイズした精巣から、酸性のグアニジンチオシアネート‐フェノール‐クロロホルムの手順（１３）により全ＲＮＡを単離した。ｓｎＧＰｘ特異的プライマー（ＡＴＧＧＧＣＣＧＣＧＣＧＧＣＣＧ）およびラットＰＨＧＰｘのエキソン７由来のプライマー（ＣＧＧＣＡＧＧＴＣＣＴＴＣＴＣＴＡＴＣＡＣＣＴＧ）を用いて、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（登録商標）Ｏｎｅ‐Ｓｔｅｐ  ＲＴ‐ＰＣＲシステム（ライフテクノロジーズ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）社、ギブコＢＲＬ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）社、ドイツ国カールスルーエ（Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ）所在）によりＲＴ‐ＰＣＲを実施した。
【００７６】
（ヒトｓｎＧＰｘ）：得られたアミノ酸配列をヒトＰＨＧＰｘ遺伝子（遺伝子ＡＦ０６０９７３のヌクレオチド７７０‐９６４）と比較した結果、ヒトの３４ｋＤについてのＥａと考えられるものが見出された。ｓｎＧＰｘ特異的プライマー１（ＡＴＧＧＧＣＣＧＣＧＣＧＧＧＣＧＣＡＧＧＣＴＣＣＣ）およびプライマー２（ＣＴＴＧＣＧＡＣＣＧＧＡＧＡＴＣＣＡＣＧＡＡＴＧＴＣＣＣ）ならびにＡｄｖａｎｔａｇｅ（登録商標）２ポリメラーゼ（クロンテック社）を用いて、アダプタに結合した精巣ｃＤＮＡ（クロンテック社）について３’ＲＡＣＥを実施した。エキソンＥａの最後の１４ヌクレオチドおよびＰＨＧＰｘへの移行部だけが得られた。Ｅｓｔデータベースを検索した結果、Ｅａ配列を網羅するＥｓｔクローン（Ｇｉ：２７５４４０８）、および開始メチオニンと思われるメチオニンを含む他のＥｓｔクローン（Ｇｉ：６７０３７０５）が得られた。
【００７７】
（ブタｓｎＧＰｘ）：ヒトｓｎＧＰｘについて、得られたアミノ酸配列を比較することによりブタのＰＨＧＰｘ遺伝子（Ｓｕｓ  ｓｃｒｏｆａ  受入番号：Ｘ７６０８８）から選択的エキソンと思われるエキソンが得られた。該エキソンは推定上の転写開始部の後にアルギニンに富む配列をコードする。しかし、ＰＨＧＰｘへの移行部が不明確であり、該ヌクレオチド配列はヒトのものと一致する。
（ノーザンブロット解析）
ホモジナイズした組織から、ｐｅｑＧＯＬＤ  ＴｒｉＦａｓｔ（登録商標）（ペクラボ（ｐｅｑＬａｂ）社、ドイツ国エルランゲン（Ｅｒｌａｎｇｅｎ）所在）を用いて全ＲＮＡを単離した。レーンあたり２０μｇの全ＲＮＡを供し、Ｈｙｂｏｎｄ（登録商標）‐Ｎ＋（アマシャムファルマシア（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ）社、ドイツ国フライブルク（Ｆｒｅｉｂｕｒｇ）所在）にブロットし、ＰＨＧＰｘの全ｃＤＮＡをプローブとして選択的エキソンのコーディング領域を探索した。
（緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を含む構築物）
２つのＮ末端ＧＦＰ融合タンパク質を、オーバーラップＰＣＲ法により作製した。１つは選択的エキソンの完全なコーディング領域を含み、もう１つは第２の転写開始点と思われる地点で始まっていた。プライマー対、すなわち
（ＧＡＴＣＴＣＴＡＧＡＣＣＧＧＣＧＧＧＣＡＴＧＧＧＣＣＧＣＧＣＧ）（ＧＦＰ‐Ｅａ‐ｆ１）および（ＧＣＴＣＣＴＣＧＣＣＣＴＴＧＣＴＣＡＣＣＡＡＧＣＣＣＡＧＧＡＡＣＴＣＧＧＡＧＣ）（ＧＦＰ‐Ｅａ‐ｒ２）、ならびに
（ＧＡＴＣＴＣＡＧＡＣＴＣＧＣＣＧＧＡＴＧＧＡＧＣＣＣＡＴＴＣＣ）（ＧＦＰ‐Ｅａ‐ｆ２）およびＧＦＰ‐Ｅａ‐ｒ２を、それぞれ長い産物用または短い産物用として、ｐＭＣ４２を鋳型として用いたＮ末端部分の増幅に使用した。
（ＧＣＴＣＣＧＡＧＴＴＣＣＴＧＧＧＣＴＴＧＧＴＧＡＧＣＡＡＧＧＧＣＧＡＧＧＡＧＣ）（ＧＦＰ‐Ｆ３）および（ＣＣＴＣＴＡＣＡＡＡＴＧＴＧＧＴＡＴＧＧ）（ＧＦＰ‐ｒ１）を、ｐＥＧＦＰ−Ｎ１を鋳型として用いたＧＦＰ部分の生成に使用した。オーバーラップＰＣＲを、産物と、最も外側のプライマーとを組み合わせて実施した。全てのＰＣＲをパーキンエルマー（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）社のＧＥＮＥＡｍｐ（登録商標）システム２４００サーマルサイクラーで実施した。２つの産物をＸｈｏＩ／ＸｂａＩを介してｐＣＤＮＡ３にクローニングし、ＮＩＨ３Ｔ３細胞およびＨｅＬａ細胞に一過性にトランスフェクションした。
（精子のクロマチン構造アッセイ（ＳＣＳＡ））
本明細書において評価される異常なクロマチン構造は、アクリジンオレンジ（ＡＯ）の蛍光の緑色（ｄｓＤＮＡ）から赤色（変性した、ｓｓＤＮＡ）への異染色性の変化をフローサイトメトリーにより測定することにより、定量的に測定される。この変化は全体の蛍光の強さ（赤色＋緑色）に対する赤色の比を表す関数αｔで表され（ダルツィンキービッツら（Ｄａｒｚｙｎｋｉｅｗｉｃｚ  ｅｔ  ａｌ．）、１９７５年）、それにより細胞の全ＤＮＡに対する変性したｓｓＤＮＡの量を表す。ＳＣＳＡにおいて試料中の各精子のαｔを算出し、その結果を平均値（ｘ  αｔ）、αｔ分布の標準偏差（ＳＤ  αｔ）、および過剰なｓｓＤＮＡを有する細胞を表す、主要な集団から外れた細胞（ＣＯＭＰ）と呼ばれる高いαｔ値を有する細胞の比率（％  ＣＯＭＰ  αｔ）として表現される。得られたαｔ値の範囲は０〜１０２４の範囲の蛍光チャネルで表される。
（ＡＯを用いた精子の染色）
融解した精子の試料をＴＮＥ緩衝液（０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０１Ｍ  Ｔｒｉｓ‐ＨＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４）で希釈し、ポリプロピレン製チューブ内で精子の終濃度が約２×１０６／ｍｌとなるように希釈した。希釈済みの精子のうちの一定分量（０．２ｍｌ）を液体窒素の蒸気（ＬＮ２）中ですぐに急速冷凍し、次いで超低温冷凍庫（−８０℃）に移し、ＦＣＭ試験までその中に保存した（スパノら（ＳＰＡＮＯ  ｅｔ  ａｌ．）、１９９９年）。試料を暗号化し、ＦＣＭ解析の盲目試験を実施した。破砕した氷中で融解した後、精子細胞をｉｎ  ｓｉｔｕの部分変性に供し、ＡＯ（メルク社）で染色した。この目的のために、精子の試料を、低いｐＨを有する０．４ｍｌの界面活性剤溶液（０．１７％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ‐１００、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、および０．０８Ｎ  ＨＣｌ、ｐＨ１．４）と混合した。３０秒後に、６μｇ／ｍｌのＡＯを含む１．２ｍｌの溶液（０．１Ｍクエン酸、０．２Ｍ  Ｎａ２ＨＰＯ４、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ６．０）により細胞を染色した。染色済みの試料を二等分し、ＡＯ染色後３〜５分以内に試験した。
（フローサイトメトリー解析）
試料を、標準的光学部品を備えたＦＡＣＳｔａｒ  Ｐｌｕｓ（登録商標）フローサイトメータ（ベクトンディッキンソンイムノケミストリーシステムズ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）社、米国カリフォルニア州サンノゼ（Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ）所在）を用いて試験した。４８８ｎｍおよび２００ｍＷに調整したＡｒイオンレーザー（Ｉｎｎｏｖａ（登録商標）９０、コヒーレント（Ｃｏｈｅｒｅｎｔ）社、米国カリフォルニア州サンタクララ（Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ）所在）で励起した後、二本鎖ＤＮＡに挿入（インターカレート）されたＡＯは緑色の蛍光（５３０±３０ｎｍ）を示し、一本鎖ＤＮＡに結合したＡＯは赤色の蛍光（＞６３０ｎｍ）を発する。細胞約２００個／秒の流速で各試料について総数１０，０００の結果を測定した。フローサイトメータの蛍光の安定性は標準ビーズ（Ｆｌｕｏｒｅｓｂｒｉｔｅ（登録商標）、無処理、ＹＧ  １．０μｍ；ポリサイエンシズ社（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＩＮＣ．）、米国ペンシルベニア州ウォリントン所在）を用いて毎日評価した。全ての試料について同等の計測機器を使用した。赤色‐緑色の蛍光強度の座標の各点が個々に各精子を評価する、生データの分布図分析を、Ｃｅｌｌｑｕｅｓｔ（登録商標）バージョン３．１（ベクトンディッキンソン（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ））を用いて実施した。左下のすみに集積している結果は、試料由来の細胞の破片に相当するものであり、試験から除外した（評価結果については図６および７を参照のこと）。
【００７８】
【表１】
2004535160.tif 000003
【００７９】
【表２】
2004535160.tif 000004
【００８０】
【表３】
2004535160.tif 000005
【図面の簡単な説明】
【００８１】
【図１】後期の精細胞（ＳＲＳ／ＣＴＡＢ  核）および精巣上体の精子（ＳＲＳＰ／ＣＴＡＢ  核）の、ＣＴＡＢ処理された超音波処理に耐性を有する核におけるセレン含有タンパク質を示す図。ラットをｉｎ  ｖｉｖｏで７５Ｓｅ標識し、ＳＤＳ‐ＰＡＧＥにより核を単離した後、ＰＶＤＦ膜にトランスファーしたセレン含有タンパク質を抗ＰＨＧＰｘ抗体を用いた免疫反応、または７５Ｓｅトレーサーのオートラジオグラフィにより測定した。
【図２】部分的にｓｎＧＰｘのプロセシングを原因とする、精子の核に存在するセレン含有タンパク質の等電点の差異を示す図。ＣＴＡＢ処理された精巣上体の精子の核のタンパク質を二次元電気泳動により分離し、７５Ｓｅ標識されたセレン含有タンパク質をオートラジオグラフィにより測定した。
【図３】精子核のグルタチオンペルオキシダーゼ（ｓｎＧＰｘ）のＮ末端配列をコードする選択的エキソンＥａの構成を示す図。（ａ）ＰＨＧＰｘおよびｓｎＧＰｘの一次構造の差異：ＰＨＧＰｘは７つのエキソンＥ１〜Ｅ７によりコードされ（２８）、ｓｎＧＰｘは選択的スプライシングによりエキソンＥａ〜Ｅ７によりコードされる。（ｂ）マウス（Ｍａｕｓ）、ラット（Ｒａｔｔｅ）、ヒト（Ｍｅｎｓｃｈ）およびブタ（Ｓｃｈｗｅｉｎ）におけるｓｎＧＰｘのＥａの配列および対応するＮ末端配列。
【図４】ノーザンブロット分析により測定されたマウス組織におけるｓｎＧＰｘおよびＰＨＧＰｘの分布を示す図。１レーンあたり２０μｇの全ＲＮＡを供し、膜にブロットし、選択的エキソンのコーディング領域（１）または完全長のＰＨＧＰｘ  ｃＤＮＡ（２）をプローブとして測定した。
【図５】ラットにおける精子核の凝縮に対するセレン欠乏の効果を示す図。適量のセレンを与えられたラットの精子（ａ）およびセレン欠乏ラットの精子（ｂ）を輸精管から採取してアクリジンオレンジで染色した。アクリジンオレンジは二本鎖ＤＮＡを緑色に、一本鎖ＤＮＡを赤色に染色する。精子のＤＮＡはプロタミンがジスルフィドにより架橋されている場合に限り酸への耐性を有するので、該方法によりクロマチンの凝縮とプロタミンのジスルフィドの状態とを測定することが可能である。セレン欠乏ラットのほとんど全ての精子核が異常な凝縮を示している。
【図６Ａ】３７歳の男性ボランティア（妊性あり、健康）のＳＣＳＡを示す図。
【図６Ｂ】３７歳の男性ボランティア（妊性あり、健康）のＳＣＳＡを示す図。
【図７Ａ】匿名の男性ボランティア（不妊）のＳＣＳＡを示す図。
【図７Ｂ】匿名の男性ボランティア（不妊）のＳＣＳＡを示す図。
【図１】
2004535160.tif 000006
【図４】
2004535160.tif 000007
【図６Ａ】
2004535160.tif 000008
【図６Ｂ】
2004535160.tif 000009
【図７Ａ】
2004535160.tif 000010
【図７Ｂ】
2004535160.tif 000011
【国際公開パンフレット】
2004535160.tif 000012
2004535160.tif 000013
2004535160.tif 000014
2004535160.tif 000015
2004535160.tif 000016
2004535160.tif 000017
2004535160.tif 000018
2004535160.tif 000019
2004535160.tif 000020
2004535160.tif 000021
2004535160.tif 000022
2004535160.tif 000023
2004535160.tif 000024
2004535160.tif 000025
2004535160.tif 000026
2004535160.tif 000027
2004535160.tif 000028
2004535160.tif 000029
2004535160.tif 000030
2004535160.tif 000031
2004535160.tif 000032
2004535160.tif 000033
2004535160.tif 000034
2004535160.tif 000035
2004535160.tif 000036
2004535160.tif 000037
2004535160.tif 000038
2004535160.tif 000039
2004535160.tif 000040
2004535160.tif 000041
2004535160.tif 000042
2004535160.tif 000043
2004535160.tif 000044
2004535160.tif 000045
2004535160.tif 000046
2004535160.tif 000047
2004535160.tif 000048
2004535160.tif 000049
2004535160.tif 000050
2004535160.tif 000051
2004535160.tif 000052
2004535160.tif 000053
2004535160.tif 000054
2004535160.tif 000055
2004535160.tif 000056
2004535160.tif 000057
2004535160.tif 000058
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004535160.tif 000059
2004535160.tif 000060
【手続補正書】
【提出日】平成15年4月11日(2003.4.11)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
リン脂質ヒドロペルオキシドグルタチオンペルオキシダーゼ（ＰＨＧＰｘ）様のセレン含有タンパク質をコードする核酸であって、ＰＨＧＰｘ遺伝子のエキソン２〜７とＰＨＧＰｘ遺伝子の第１イントロン内の１つの選択的エキソンとより構成される核酸。
【請求項２】
哺乳動物のセレン含有タンパク質をコードする請求項１に記載の核酸。
【請求項３】
ヒトのセレン含有タンパク質をコードする請求項２に記載の核酸であって、前記選択的エキソンが配列番号１に示す配列または生物学的に活性のあるペプチドをコードするその一部分を含む核酸。
【請求項４】
マウスのセレン含有タンパク質をコードする請求項２に記載の核酸であって、前記選択的エキソンが配列番号２に示す配列または生物学的に活性のあるペプチドをコードするその一部分を含む核酸。
【請求項５】
ラットのセレン含有タンパク質をコードする請求項２に記載の核酸であって、前記選択的エキソンが配列番号３に示す配列または生物学的に活性のあるペプチドをコードするその一部分を含む核酸。
【請求項６】
ブタのセレン含有タンパク質をコードする請求項２に記載の核酸であって、前記選択的エキソンが配列番号４に示す配列または生物学的に活性のあるペプチドをコードするその一部分を含む核酸。
【請求項７】
配列番号１に示す配列または生物学的に活性のあるペプチドをコードするその一部分を含む、ＰＨＧＰｘ遺伝子の第１イントロン内の選択的エキソン。
【請求項８】
配列番号２に示す配列または生物学的に活性のあるペプチドをコードするその一部分を含む、ＰＨＧＰｘ遺伝子の第１イントロン内の選択的エキソン。
【請求項９】
配列番号３に示す配列または生物学的に活性のあるペプチドをコードするその一部分を含む、ＰＨＧＰｘ遺伝子の第１イントロン内の選択的エキソン。
【請求項１０】
配列番号４に示す配列または生物学的に活性のあるペプチドをコードするその一部分を含む、ＰＨＧＰｘ遺伝子の第１イントロン内の選択的エキソン。
【請求項１１】
請求項１に記載の選択的エキソンを増幅するためのプライマー。
【請求項１２】
配列番号５および６に記載の配列を有する、請求項３に記載の選択的エキソンを増幅するための複数のプライマー。
【請求項１３】
請求項１〜１０に記載の核酸によりコードされる哺乳動物のセレン含有タンパク質。
【請求項１４】
Ｎ末端配列が配列番号７または生物学的活性を維持しているその相同物もしくは断片により規定される、請求項１３に記載のヒトのセレン含有タンパク質。
【請求項１５】
Ｎ末端配列が配列番号８または生物学的活性を維持しているその相同物もしくは断片により規定される、請求項１３に記載のマウスのセレン含有タンパク質。
【請求項１６】
Ｎ末端配列が配列番号９または生物学的活性を維持しているその相同物もしくは断片により規定される、請求項１３に記載のラットのセレン含有タンパク質。
【請求項１７】
Ｎ末端配列が配列番号１０または生物学的活性を維持しているその相同物もしくは断片により規定される、請求項１３に記載のブタのセレン含有タンパク質。
【請求項１８】
配列番号７または生物学的活性を維持しているその相同物もしくは断片により規定されるペプチド。
【請求項１９】
配列番号８または生物学的活性を維持しているその相同物もしくは断片により規定されるペプチド。
【請求項２０】
配列番号９または生物学的活性を維持しているその相同物もしくは断片により規定されるペプチド。
【請求項２１】
配列番号１０または生物学的活性を維持しているその相同物もしくは断片により規定されるペプチド。
【請求項２２】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載の核酸を含む発現ベクター。
【請求項２３】
請求項２２に記載のベクターにより形質転換された宿主細胞。
【請求項２４】
哺乳動物の妊性を試験管内（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）で判断するためのスクリーニング方法であって、
精子のＤＮＡを単離するステップと、
ＰＨＧＰｘ遺伝子の選択的エキソンをＰＣＲにより増幅するステップと、
増幅された遺伝子断片の配列を決定するステップと、
前記増幅された遺伝子断片と請求項１に記載の選択的エキソンの核酸との整合を調べるステップとからなる方法。
【請求項２５】
ヒトの雄の妊性を判断し、前記増幅された遺伝子断片と配列番号１に記載の選択的エキソンの核酸との整合を調べる、請求項２４に記載のスクリーニング方法。
【請求項２６】
マウスの雄の妊性を判断し、前記増幅された遺伝子断片と配列番号２に記載の選択的エキソンの核酸との整合を調べる、請求項２４に記載のスクリーニング方法。
【請求項２７】
ラットの雄の妊性を判断し、前記増幅された遺伝子断片と配列番号３に記載の選択的エキソンの核酸との整合を調べる、請求項２４に記載のスクリーニング方法。
【請求項２８】
ブタの雄の妊性を判断し、前記増幅された遺伝子断片と配列番号４に記載の選択的エキソンの核酸との整合を調べる、請求項２４に記載のスクリーニング方法。
【請求項２９】
スクリーニングの前に精子を染色アッセイにより核の凝縮について試験する、請求項２４〜２８に記載の方法。
【請求項３０】
染色はアクリジンオレンジを用いて実施される請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
配列番号７〜１０に記載のアミノ酸配列のうちの１つに特異的に結合する抗体。
【請求項３２】
モノクローナル抗体である請求項３１に記載の抗体。
【請求項３３】
化学療法剤、毒剤、およびイメージング剤のうち少なくともいずれかに結合される請求項３１または３２に記載の抗体。
【請求項３４】
請求項１３〜２１に記載のアミノ酸のうちのいずれかに対する結合特異性を有するモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマ。
【請求項３５】
請求項１に記載の選択的エキソンが不活性化されているヒト以外の組換え哺乳動物。
【請求項３６】
配列番号２に記載の核酸が不活性化されている組換えマウス。
【請求項３７】
請求項３１〜３３に記載の抗体を備えた試験キット。
【請求項３８】
請求項１１および１２に記載のプライマーを備えた試験キット。
【請求項３９】
請求項１３〜２１のいずれか一項に記載の有効な量のタンパク質およびペプチドのうち少なくともいずれかを、任意選択で医薬として許容可能な担体と組み合わせて含む組成物。
【請求項４０】
雄の不妊を試験管内（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）で診断するための請求項３９に記載の組成物の使用。
【請求項４１】
雄の不妊を試験管内（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）および生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）の少なくともいずれかにおいて治療するための請求項３９に記載の組成物の使用。
【請求項４２】
請求項２２に記載のベクターを用いて宿主細胞を形質転換すること、該宿主細胞を、同宿主細胞による配列の発現を可能にする条件下で培養すること、および該宿主細胞からペプチドを単離することからなる、本質的に純粋なセレン含有タンパク質およびペプチドのうち少なくともいずれかを生成する方法。
【国際調査報告】
2004535160.tif 000061
2004535160.tif 000062
2004535160.tif 000063
2004535160.tif 000064
2004535160.tif 000065
2004535160.tif 000066
2004535160.tif 000067
2004535160.tif 000068
2004535160.tif 000069
2004535160.tif 000070