(57)【要約】本発明は、パントテン酸塩を製造するための改良法を特徴とする。特に本発明は、パントテン酸塩の噴霧乾燥可能な組成物が産生されるように微生物を培養する方法を特徴とする。また本発明は、本発明において開示する方法により製造されるパントテン酸塩組成物を特徴とする。【特許請求の範囲】
【請求項１】
噴霧乾燥可能なパントテン酸塩組成物の製造方法であって、噴霧乾燥可能なパントテン酸塩組成物が産生されるように、Ｃａ（ＯＨ）２で制御されたｐＨ条件下にてパントテン酸塩産生微生物を培養することを含む、上記方法。
【請求項２】
噴霧乾燥可能なパントテン酸塩組成物が、Ｃａ−Ｄ−パントテン酸塩を含む請求項１記載の方法。
【請求項３】
濃縮された噴霧乾燥可能なパントテン酸塩組成物が、約１０％から約８０％の乾物量を有する請求項１記載の方法。
【請求項４】
濃縮された噴霧乾燥可能なパントテン酸塩組成物が、約２０％から約６０％の乾物量を有する請求項１記載の方法。
【請求項５】
濃縮された噴霧乾燥可能なパントテン酸塩組成物が、５０％より多い乾物量を有する請求項１記載の方法。
【請求項６】
パントテン酸塩組成物が噴霧乾燥によって更に処理される請求項５記載の方法。
【請求項７】
噴霧乾燥可能なパントテン酸塩組成物が、約１００℃から約２００℃までの入口温度で噴霧乾燥される請求項６記載の方法。
【請求項８】
噴霧乾燥可能なパントテン酸塩組成物が、約６０℃から約１００℃までの出口温度で噴霧乾燥される請求項７記載の方法。
【請求項９】
バイオマスを噴霧乾燥可能なパントテン酸塩組成物から分離した後に乾燥を行う請求項５記載の方法。
【請求項１０】
バイオマスを噴霧乾燥可能なパントテン酸塩組成物から、濾過、遠心分離、限外濾過、精密ろ過、又はそれらの組み合わせによって分離する請求項９記載の方法。
【請求項１１】
噴霧乾燥可能なパントテン酸塩組成物が濃縮されたものである請求項１記載の方法。
【請求項１２】
Ｃａ（ＯＨ）２で制御されたｐＨ条件が約ｐＨ６．０〜ｐＨ１１．０である請求項１記載の方法。
【請求項１３】
Ｃａ（ＯＨ）２で制御されたｐＨ条件が約ｐＨ７．０である請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
Ｃａ（ＯＨ）２で制御されたｐＨ条件が約ｐＨ１０である請求項１２記載の方法。
【請求項１５】
請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法により製造された噴霧乾燥可能なパントテン酸塩組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２００１年３月９日に出願された米国仮出願第６０／２７４，４５５号（係属中）の利益を主張するものである。本発明は、１９９９年９月２１日に出願された米国特許出願第０９／４００，４９４号の一部継続出願（放棄）である、２０００年９月２１日に出願された米国特許出願第０９／６６７，５６９号（係属中）に関連する。米国特許出願第０９／６６７，５６９号はまた、２０００年６月７日に出願された米国仮出願第６０／２１０，０７２号（失効）、２０００年７月２８日に出願された米国仮出願第６０／２２１，８３６号（失効）、及び２０００年８月２４日に出願された米国仮出願第６０／２２７，８６０号（失効）の利益を主張してなされたものである。上記各出願の全内容が、参照により本明細書中に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
Ｄ−パントテン酸は、世界的な規模で製造されている。大量の合成Ｄ−パントテン酸が、例えば家禽や豚のための飼料添加物として使われている。そのためＤ−パントテン酸の需要が高まっている。
【０００３】
パントテン酸塩は、パントテン酸又はビタミンＢ５としても知られ、ビタミン類のＢ複合体のメンバーであり、家畜類及びヒトなどの哺乳動物の必須栄養素である（例えば、水溶性ビタミン補助食品又は飼料添加物として食物源から得ている）。パントテン酸は、細胞中で、主として補酵素Ａ（ＣｏＡ）及びアシルキャリアータンパク質（ＡＣＰ）の生合成に使われる。これらの補酵素は、これらの分子の４’−ホスホパンテテイン部位のスルフヒドリル基と共にチオエステルを形成するアシル部分の代謝において機能する。これらの補酵素は、全ての細胞で必須であり、細胞代謝の１００を種々の異なる中間反応に関与する。
【０００４】
パントテン酸塩（特に、生物活性なＤ異性体）を合成する従来の手法は、バルク化学薬品からの化学合成によるものであり、ラセミ中間体の光学分割が必要であることに加えて過度の基質の費用の点で制限のある方法である。従って近年、研究者は、パントテン酸塩生合成プロセスに有用な酵素を生成する細菌や微生物系に注目するようになった（細菌がそれ自身でパントテン酸塩を合成できるためである）。特に、生物変換プロセスは、パントテン酸の好ましい異性体の製造に好都合な手段として評価されている。更に近年、直接微生物合成の方法が、Ｄ−パントテン酸塩製造を促進する手段として検討されている。
【０００５】
しかし、改良されたパントテン酸塩製造方法の必要性、特にはより高い収率の生成物及びより簡単に精製される生成物を産生するように最適化された微生物プロセスの必要性が依然としてある。
【発明の開示】
【０００６】
本発明は、パントテン酸塩を製造する改良された方法、特にＣａ−Ｄ−パントテン酸塩含有組成物を製造する方法に関する。本発明はまた、噴霧乾燥可能なパントテン酸塩組成物、好ましくはＣａ−Ｄ−パントテン酸塩を含む噴霧可能な組成物を製造する方法に関する。本発明のＣａ−Ｄ−パントテン酸塩含有組成物及び／又は噴霧可能なパントテン酸塩組成物は、ブドウ糖からパントテン酸塩産生微生物の発酵により、その発酵過程中にＣａ塩を供給することによって、好ましくはｐＨを制御された発酵過程中にＣａ塩を供給することによって産生され得る。好ましい実施形態では、Ｃａ−Ｄ−パントテン酸塩含有組成物及び／又は噴霧可能なパントテン酸塩組成物が、発酵過程中にＣａ（ＯＨ）２を供給することによって産生される。本発明のＣａ−Ｄ−パントテン酸塩含有組成物及び／又は噴霧可能なパントテン酸塩組成物は、パントテン酸塩産生微生物、好ましくは前駆体を使用せずにパントテン酸塩を産生するように遺伝子操作された微生物の発酵によって産生され得る。例えば、Ｃａ−Ｄ−パントテン酸塩含有組成物及び／又は噴霧可能なパントテン酸塩組成物が、β−アラニンやパントイン酸（又はパントイン酸塩）などの前駆体を必要とせずにパントテン酸塩を産生するように遺伝子操作された微生物の発酵によって産生され得る。また、Ｍｇ−Ｄ−パントテン酸塩組成物及び／又はＭｇ−Ｄ−パントテン酸塩を含む噴霧可能なパントテン酸塩組成物を製造する方法、例えば、Ｍｇ塩の供給、好ましくはｐＨが制御された発酵で、最も好ましくはＭｇ（ＯＨ）２の供給を行う方法である。Ｃａ−Ｄ−パントテン酸塩含有組成物、Ｍｇ−Ｄ−パントテン酸塩組成物及び／又は噴霧可能な組成物は、発酵ブロスから調製される。本発明の方法によって産生されたパントテン酸塩組成物は、粉末（又は粉末へと加工可能な組成物）であり、パントテン酸の塩、好ましくはパントテン酸の二価の塩、そして最も好ましくはＣａ−Ｄ−パントテン酸塩又はＭｇ−Ｄ−パントテン酸塩を含む。これらの製造方法は、従来の方法より経済的で効率的である。得られる生成物は、多くの商業上の用途、特にビタミン源や飼料添加物としての用途がある。
【０００７】
本発明はまた、少なくとも部分的には、噴霧乾燥可能なパントテン酸塩組成物が産生されるようにＣａ（ＯＨ）２で制御されたｐＨ条件下にてパントテン酸塩産生微生物を培養することを含む、噴霧乾燥可能なパントテン酸塩組成物の製造方法に関する。この方法は更に、噴霧乾燥可能な組成物を噴霧乾燥することを含んでもよい。好ましくは、噴霧乾燥可能なパントテン酸塩組成物はＣａ−Ｄ−パントテン酸塩を含む。本発明はまた、本発明の方法によって製造されたパントテン酸塩組成物に関する。
【０００８】
本発明の他の特徴及び利点は、以下の詳細な説明及び特許請求の範囲から明らかとなろう。
【０００９】
発明の詳細な説明
本発明は、少なくとも部分的には、Ｃａ−Ｄ−パントテン酸塩の製造方法に関し、好ましくは、噴霧可能なＣａ−Ｄ−パントテン酸塩組成物の製造方法に関する。この方法は、Ｃａ−Ｄ−パントテン酸塩又は噴霧可能なＣａ−Ｄ−パントテン酸塩組成物が産生されるように、Ｃａ塩の存在下で、好ましくは制御されたｐＨ条件下でＣａ塩の存在下で、更により好ましくはＣａ（ＯＨ）２で制御されたｐＨ条件下で、パントテン酸塩産生微生物を培養することを含む。本発明はまた、少なくとも部分的には、Ｍｇ−Ｄ−パントテン酸塩の製造方法に関し、好ましくは、噴霧可能なＭｇ−Ｄ−パントテン酸塩組成物の製造方法に関する。この方法は、Ｍｇ−Ｄ−パントテン酸塩又は噴霧可能なＭｇ−Ｄ−パントテン酸塩組成物が産生されるように、Ｍｇ塩の存在下で、好ましくは制御されたｐＨ条件下でＭｇ塩の存在下で、更により好ましくはＭｇ（ＯＨ）２で制御されたｐＨ条件下で、パントテン酸塩産生微生物を培養することを含む。この方法は、更に噴霧乾燥可能な組成物を噴霧乾燥することを含んでもよい。パントテン酸塩産生微生物は、例えば本明細書中に記載の組成の発酵培地やブロス中で培養することができる。好ましくは、この方法は、前駆体を供給せずにパントテン酸塩を製造する（例えば、かなりの量のパントテン酸塩を製造する）ように遺伝子操作された組換えパントテン酸塩産生微生物を培養することを特徴とする。
【００１０】
本発明がより容易に理解され得るように、若干の用語を最初に定義する。
【００１１】
用語「パントテン酸塩」は、「パントテン酸」とも称されるパントテン酸塩の遊離形態、並びに、「パントテン酸の塩」とも称されるその任意の塩（例えば、パントテン酸塩又はパントテン酸の酸性水素をカチオン、例えばカルシウム、ナトリウム、カリウム、アンモニウムで置換することによって誘導される）を含む。好ましいパントテン酸の塩は、パントテン酸カルシウム、パントテン酸ナトリウム、パントテン酸マグネシウム、パントテン酸カリウム及び／又はパントテン酸アンモニウムである。本発明のパントテン酸の塩は、本明細書に記載の遊離酸から慣用の方法で調製された塩を含む。他の実施形態では、パントテン酸の塩は、本発明に係る微生物によって直接合成される。本発明のパントテン酸の塩はまた、慣用の方法論によってパントテン酸塩の遊離酸形態又はパントテン酸に変換され得る。好ましいパントテン酸の塩は、Ｃａ−Ｄ−パントテン酸塩（すなわち、Ｃａ（Ｄ−パントテネート）２）である。他の好ましいパントテン酸の塩は、Ｍｇ−Ｄ−パントテン酸塩（すなわち、Ｍｇ（Ｄ−パントテネート）２）である。先行技術で理解されているＣａ−Ｄ−パントテン酸塩の製造方法は、等モル量のＣａ（ＯＨ）２を加えることによってＤ−パントテン酸からＣａ−Ｄ−パントテン酸塩を製造することを含む。Ｄ−パントテン酸塩は、これらに限定されないが、ＷＯ９６／３３２８３号、米国特許第６，０１３，４９２号及びＤＥ１００１６３２１号に記載のものを含む方法によって、Ｄ−パントテン酸塩を含む発酵培地やブロスからルーチンな手順で分離される。
【００１２】
Ｄ−パントテン酸塩は、糖類（例えば、ブドウ糖、ショ糖、糖蜜）や他の炭化水素（例えば、デンプン加水分解物）などの炭素源；β−アラニン、パントイン酸（又はパントイン酸塩）、ケトパントイン酸塩（又はケトパントイン酸）、α−ケトイソ吉草酸塩（又はα−ケトイソ吉草酸）などの前駆体；（ＮＨ４）２ＳＯ４などの窒素源；大豆粉、コーンスティープリカーやイースト抽出物などのタンパク質源；リン酸カリウム又はナトリウムなどのリン源；並びに微量の無機塩類及びビタミン、を含むブロス中で微生物を発酵させることによって製造し得る。微生物は、適当な撹拌器及び通気量の下、適当なｐＨの発酵ブロス中で増殖させる。
【００１３】
用語「パントテン酸塩組成物」は、パントテン酸塩、及び、これらに限定されるものではないが、バッファー、塩、及び／又は他の培地成分、培地残物（すなわち、発酵ブロス由来の複合培地成分の残物）、バイオマス（例えば、微生物、及び／又は発酵ブロス由来の微生物の一部や残物）、及び／又は生成物の製剤化を補助する培地成分（例えば、糖類、穀類や豆類からの生成物、シリカゲル等）を含む組成物のことを云う。
【００１４】
用語「噴霧乾燥可能なパントテン酸塩組成物」は、液体成分を蒸発又は他の方法で除去することにより固体組成物が得られうるパントテン酸塩組成物を含む。噴霧可能なパントテン酸塩組成物が噴霧乾燥又は噴霧造粒される（例えば、流動層噴霧乾燥器を使って行う）ことが好都合であるが、液体成分を除去する他の方法も使用しうる（例えば、蒸発、凍結乾燥など）。噴霧乾燥可能なパントテン酸塩組成物は、発酵ブロス中のバイオマスから、例えばろ過、遠心分離、限外ろ過、精密ろ過、又はそれらの組み合わせによって分離して又は分離せずに、乾燥することができる。一実施形態では、乾燥された噴霧乾燥可能なパントテン酸塩組成物は、さらなる精製ステップを行わずにその意図された機能を果たし得る。例えば、乾燥された噴霧乾燥可能なパントテン酸塩組成物は、更なる精製手順を行わないで、動物用飼料（例えば、家禽や豚の飼料）に直接添加してもよいし又はプレミックス飼料に添加してもよい。
【００１５】
市販の噴霧乾燥装置の例としては、ＮｉｒｏやＡＰＶ  Ａｎｈｙｄｒｏ（共にＣｏｐｅｎｈａｇｅｎ，デンマーク）によって製造されたものがある。流動層噴霧造粒機は、Ｇｌａｔｔ（Ｂｉｎｇｅｎ，ドイツ）、Ｈｅｉｎｅｎ（Ｖａｒｅｌ，ドイツ）、Ｎｉｒｏ−Ａｅｒｏｍａｔｉｖ（Ｂｕｂｅｎｄｏｒｆ，スイス）及びＡｌｌｇａｉｅｒ（Ｕｈｉｎｇｅｎ，ドイツ）によって製造されている。好ましい実施形態では、噴霧乾燥器の入口温度は、約１００℃から約２８０℃、そして有利なものとしては約１２０℃から約２１０℃に設定される。噴霧乾燥器の出口温度は、約３０℃から約１８０℃の範囲、有利なものとしては約５０℃から約１５０℃、そして好ましくは約５０℃から約１００℃に設定される。液体は、二流体ノズル（空気ノズル、圧力ノズル）又は回転円盤によって霧状にされる。また、Ｎｉｒｏ（Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ，デンマーク）により製造されているＦＳＤ（流動噴霧乾燥器）やＡＰＶ  Ａｎｈｙｄｒｏ（Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ，デンマーク）により製造されているＳＢＤ（流動層噴霧乾燥器）と呼ばれる同様の乾燥器を、この乾燥に使うことができる。これらの乾燥器は、噴霧乾燥器と流動層造粒機の組み合わせに相当する。乾燥中に一定の集塊を形成することもできる。最終生成物の所定の粒子サイズ分布を選択するために、非常に小さい粒子を篩にかけて分離し、プロセスに戻してもよい。同様に、非常に大きい粒子をミル中で粉砕しプロセスに戻してもよい。
【００１６】
用語「パントテン酸塩産生微生物」とは、パントテン酸塩を産生する天然の微生物、並びに、パントテン酸塩生合成経路及び／又はイソロイシン−バリン生合成経路が脱調節された微生物（例えば組換え微生物）を含む。本明細書中で使用するように、「パントテン酸塩生合成経路が脱調節された」微生物は、パントテン酸塩産生が強化される（例えば、その生合成の脱調節前の微生物又は野生型の微生物でのパントテン酸塩産生と比較した場合）ように脱調節された（例えば、過剰発現させた）少なくとも１つのパントテン酸塩生合成酵素を有する微生物を含む。好ましくは、「パントテン酸塩生合成経路が脱調節された」微生物は、パントテン酸塩産生が１ｇ／Ｌ以上であるように脱調節された（例えば、過剰発現させた）少なくとも１つのパントテン酸塩生合成酵素を有する微生物を含む。より好ましくは、「パントテン酸塩生合成経路が脱調節された」微生物は、パントテン酸塩産生が２ｇ／Ｌ以上であるように脱調節された（例えば、過剰発現させた）少なくとも１つのパントテン酸塩生合成酵素を有する微生物を含む。
【００１７】
用語「パントテン酸塩生合成酵素」とは、パントテン酸塩生合成経路の化合物（例えば、中間体や産生物）の形成に利用される任意の酵素を含む。例えば、α−ケトイソ吉草酸塩（α−ＫＩＶ）からのパントイン酸塩の合成は、中間体であるケトパントイン酸塩を経て進行する。ケトパントイン酸塩の形成は、パントテン酸塩生合成酵素であるケトパントイン酸ヒドロキシメチルトランスフェラーゼ（ｐａｎＢ遺伝子産物）によって触媒される。パントイン酸塩の形成は、パントテン酸塩生合成酵素であるケトパントイン酸レダクターゼ（ｐａｎＥ遺伝子産物）によって触媒される。アスパラギン酸塩からのβ−アラニンの合成は、パントテン酸塩生合成酵素であるアスパラギン酸−α−デカルボキシラーゼ（ｐａｎＤ遺伝子産物）によって触媒される。パントイン酸塩及びβ−アラニンからのパントテン酸塩の形成（例えば、縮合）は、パントテン酸塩生合成酵素であるパントテン酸合成酵素（ｐａｎＣ遺伝子産物）によって触媒される。
【００１８】
用語「イソロイシン−バリン生合成経路」とは、イソロイシン−バリン生合成酵素（例えば、生合成酵素をコードする遺伝子によりコードされたポリペプチド）、化合物（例えば、前駆体、基質、中間体や生成物）、補因子、及びピルビン酸塩をバリンやイソロイシンに変換する形成又は合成に利用されるものを含む生合成経路を含む。用語「イソロイシン−バリン生合成経路」は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのバリンやイソロイシンの合成を導く生合成経路と共に、微生物中（例えば、ｉｎ  ｖｉｖｏ）でのバリンやイソロイシンの合成を導く生合成経路をも含む。
【００１９】
用語「イソロイシン−バリン生合成酵素」は、イソロイシン−バリン生合成経路の化合物（例えば、中間体や生成物）の形成に利用される任意の酵素を含む。ピルビン酸塩からのバリンの合成は、中間体である、アセト乳酸塩、α，β−ジヒドロキシイソ吉草酸塩（α，β−ＤＨＩＶ）及びα−ケトイソ吉草酸塩（α−ＫＩＶ）を経て進行する。ピルビン酸塩からのアセト乳酸塩の形成は、イソロイシン−バリン生合成酵素であるアセトヒドロキシ酸合成酵素（ｉｌｖＢＮ遺伝子産物、又は、ａｌｓＳ遺伝子産物）によって触媒される。アセト乳酸塩からのα，β−ＤＨＩＶの形成は、イソロイシン−バリン生合成酵素であるアセトヒドロキシ酸イソメロレダクターゼ（ｉｌｖＣ遺伝子産物）によって触媒される。α，β−ＤＨＩＶからのα−ＫＩＶの合成は、イソロイシン−バリン生合成酵素であるジヒドロキシ酸デヒドラターゼ（ｉｌｖＤ遺伝子産物）によって触媒される。更に、バリンとイソロイシンとは、分枝鎖アミノ酸のアミノ基転移酵素によって相互に変換し得る。
【００２０】
一実施形態では、本発明の組換え微生物は、グラム陽性の生物体（例えば、微生物をとりまくグラム陽性壁の存在のために、塩基性色素、例えばクリスタルバイオレットを保持する微生物）である。好ましい実施形態では、組換え微生物は、バチルス、コリネバクテリウム、ラクトバチルス、乳酸球菌及びストレプトミセスからなる群より選ばれる属に属する微生物である。より好ましい実施形態では、組換え微生物はバチルス属に属するものである。他の好ましい実施形態では、組換え微生物は、バチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バチルス・レンチモーバス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｅｎｔｉｍｏｒｂｕｓ）、バチルス・レンタス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｅｎｔｕｓ）、バチルス・ファーマス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｉｒｍｕｓ）、バチルス・パントテンチカス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐａｎｔｏｔｈｅｎｔｉｃｕｓ）、バチルス・アミロリクファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、バチルス・セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ）、バチルス・サーキュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）、バチルス・コアギュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、バチルス・プミラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｕｍｉｌｕｓ）、バチルス・チューリンゲンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）、及び他のグループ１のバチルス種、例えば１６Ｓ  ｒＲＮＡタイプ（Ｐｒｉｅｓｔ（１９９３）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ａｎｄ  Ｏｔｈｅｒ  Ｇｒａｍ−Ｐｏｓｉｔｉｖｅ  Ｂａｃｔｅｒｉａ，Ｓｏｎｅｎｓｈｅｉｎら編，ＡＳＭ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．６頁）と特徴とするものからなる群より選ばれる。他の実施形態では、組換え微生物は、バチルス・ブレビス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ）又はバチルス・ステアロサーモフィラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）である。また別の実施形態では、組換え微生物は、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バチルス・アミロリクファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、バチルス・ハロデュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｈａｌｏｄｕｒａｎｓ）、バチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、及びバチルス・プミラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｕｍｉｌｕｓ）からなる群より選ばれる。
【００２１】
他の実施形態では、組換え微生物はグラム陰性（塩基性色素を排除する）生物である。好ましい実施形態では、組換え微生物は、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、エッシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）、及びプロテウス（Ｐｒｏｔｅｕｓ）から選ばれる属に属する微生物である。より好ましい実施形態では、組換え微生物はエッシェリヒア属に属するものである。更により好ましい実施形態では、組換え微生物は大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）である。他の実施形態では、組換え微生物はサッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）（例えば、Ｓ．セレビジェ）である。特に好ましい「パントテン酸塩産生微生物」としては、例えば、米国特許出願第０９／６６７５６９号に記載されているものが挙げられる。
【００２２】
用語「培養する」は、本発明の生存する微生物を維持する及び／又は増殖させること（例えば、培養物や菌株の維持及び／又は増殖）を含む。一実施形態では、本発明の微生物は、液体培地、例えば発酵ブロス中で培養される。好ましい実施形態では、本発明の微生物は、微生物の維持及び／又は増殖に必須又は有益な栄養素（例えば、炭素源や炭素基質、例えば炭水化物、炭化水素、油、脂肪、脂肪酸、有機酸、及びアルコール；窒素源、例えばペプトン、イースト抽出物、肉エキス、麦芽エキス、尿素、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硝酸アンモニウム、及びリン酸アンモニウム；リン源、例えばリン酸、そのナトリウム及びカリウム塩；微量元素、例えばマグネシウム、鉄、マンガン、カルシウム、銅、亜鉛、ホウ素、モリブデン、及び／又はコバルト塩；更にアミノ酸、ビタミンなどの増殖因子、成長促進因子など）を含む培地（例えば、滅菌液体培地）中で培養される。
【００２３】
好ましくは、本発明の微生物は、制御されたｐＨ条件下で培養される。一実施形態では、微生物は６．０〜１１．０のｐＨで培養される。一実施形態では、微生物は６．０〜８．５のｐＨで、例えば約７のｐＨで培養される。ｐＨを制御する好ましい試薬は、水酸化アンモニウム、水酸化ナトリウム及び／又は水酸化カリウムを含む。ｐＨを調製する試薬の使用は、塩（例えば、二価のカチオン、例えばＣａ２＋（ＣａＣｌ２）やＭｇ２＋（ＭｇＣｌ２））が発酵培地に加えられる場合に、特に重要である。他の実施形態では、微生物は「Ｃａ（ＯＨ）２で制御されたｐＨ条件」下で培養される。用語「Ｃａ（ＯＨ）２で制御されたｐＨ条件」は、所望の生産物、例えば噴霧可能なＣａ−パントテン酸塩組成物を産出するために有利な少なくともある程度のＣａ（ＯＨ）２を添加した条件を含む。好ましくは、所望ｐＨは、Ｃａ（ＯＨ）２の添加によって維持され、必要な場合にｐＨを上げ、そして必要な場合に当業者に知られた任意の方法でｐＨを下げることによって維持される。他の好ましい実施形態では、微生物は「Ｍｇ（ＯＨ）２で制御されたｐＨ条件」下で培養される。用語「Ｍｇ（ＯＨ）２で制御されたｐＨ条件」は、所望の生産物、例えば噴霧可能なＭｇ−パントテン酸塩組成物を産出するために有利な少なくともある程度のＭｇ（ＯＨ）２を添加した条件を含む。好ましくは、所望ｐＨは、Ｍｇ（ＯＨ）２の添加によって維持され、必要な場合にｐＨを上げ、そして必要な場合に当業者に知られた任意の方法でｐＨを下げることによって維持される。
【００２４】
微生物は、少なくとも２０ｇ／Ｌのパントテン酸塩を約３６時間で産生する、少なくとも約２０〜３０ｇ／Ｌのパントテン酸塩を約４８時間で産生する、又は少なくとも約３５〜４０ｇ／Ｌのパントテン酸塩を約７２時間で産生する、という条件下で培養される。培地、プロセス又は菌株の最適化によって又はその三つの組み合わせによって、最終ブロス中のパントテン酸塩濃度は、４０ｇ／Ｌ、４５ｇ／Ｌ、５０ｇ／Ｌ、５５ｇ／Ｌ、６０ｇ／Ｌ、６５ｇ／Ｌ、  ７０ｇ／Ｌ、８０ｇ／Ｌ、９０ｇ／Ｌ又は９０ｇ／Ｌ以上にも、達し得る。
カルシウム−Ｄ−パントテン酸塩は、食品添加物として広く用いられている。Ｃａ−Ｄ−パントテン酸塩はまた、「プレミックス」の成分としても使用されている。「プレミックス」は、例えば動物の成長及び／又は健康を補助するビタミン、ミネラル、及び／又はアミノ酸を含む人工組成物（例えば、食品添加物）である。従って、Ｃａ−Ｄ−パントテン酸塩が糖などの新たな供与源から、パントテン酸塩前駆体（例えばβ−アラニン）を添加することなく製造するプロセスを設計することが、非常に望ましい。
この目的のために、Ｃａ−イオンを、ドイツ特許出願第１００４６４９０号に記載されているように発酵終了後に下流の処理工程の任意のステップにおいてＤ−パントテン酸又はその塩を含む発酵ブロスに添加することが出来る。他の実施形態では、Ｃａ−イオンを、発酵過程の進行中に発酵ブロスに加え得る。例えば、Ｃａ−イオンを、ＣａＯ，Ｃａ（ＯＨ）２，ＣａＣｌ２，ＣａＣＯ３，ＣａＳＯ４，ＣａＨＰＯ４、あるいは有機酸、例えばギ酸Ｃａ，酢酸Ｃａ，プロピオン酸Ｃａ，グリシン酸Ｃａや乳酸Ｃａ、又はこれら塩の組み合わせを含む溶液を供給することによって発酵ブロスに添加することもできる。尚、他のＣａ−塩も使用可能であり、この例示は限定と見なされるべきでない。好ましくは、ＣａＯ又はＣａ（ＯＨ）２を、これらの化合物がｐＨの滴定に役立つものであることから発酵で使用する。好ましくは、少なくともＣａ−塩１モルを、産生されるＤ−パントテン酸塩２モルに対して加える。他の実施形態では、１モル以上のＣａ−塩を、産生されるＤ−パントテン酸塩２モルに対して加ええることができる。他の実施形態では、上記例示したような他のＣａ−塩を、発酵プロセス中にＣａ−塩を供給することによって発生した発酵ブロスに、発酵終了後加える（例えば、実施例４及び５参照）。
【００２５】
Ｃａ−Ｄ−パントテン酸塩を含む発酵ブロスは、本明細書に記載されるように、噴霧乾燥又は噴霧造粒できる。一実施形態では、糖、例えばラクトースやマルトデキストリン、穀類や豆類からの生成物、例えば全麦、籾殻又は大豆若しくは小麦の粉末、ミネラル塩、例えばＣａ−，Ｍｇ−，Ｎａ−及びＫ−塩、シリカゲルなどの添加物、そして更にはＤ−パントテン酸及び／又はその塩（化学合成又は発酵で製造されたもの）を、噴霧乾燥又は噴霧造粒工程に先立ち又はその最中に、発酵ブロスに加える。
【００２６】
好ましい実施形態では、他のさらなる要素を全く加えることなく、発酵ブロスを直接噴霧乾燥する。
【００２７】
一実施形態では、バイオマスを発酵ブロスから分離し、上清のみ噴霧乾燥する。バイオマス分離は、濾過、遠心分離、限外濾過、精密ろ過、又はこれらの組み合わせなどの技法によって実施する。得られたバイオマスは洗浄ステップを行い、その液体を分離した発酵上清に加えてもよい。他の実施形態では、バイオマスを含む発酵ブロスを、バイオマスを分離せずに噴霧乾燥する。また他の実施形態では、発酵ブロスを、追加的な濃縮ステップを行うことなく噴霧乾燥する。
【００２８】
他の実施形態では、発酵ブロスの濃縮を実施する。結果として固形分含有量が増加する。これは例えば、蒸発脱水法によって達成され得る。蒸発は、多段階で真空下に行い得る。この蒸発は、薄膜蒸発器、例えば各会社ＧＩＧ（４８００  Ａｔｔｎａｎｇ  Ｐｕｃｈｈｅｉｍ、オーストリア）、ＧＥＡ  Ｃａｎｚｌｅｒ（５２３０３  Ｄｕｒｅｎ、ドイツ）、Ｄｉｅｓｓｅｌ（３１１０３  Ｈｉｌｄｅｓｈｅｉｍ、ドイツ）、及びＰｉｔｔｏｎ（３５２７４  Ｋｉｒｃｈｈａｉｎ、ドイツ）によって製造されているものを用いて行い得る。発酵ブロス中の固形分含有量はまた、膜技法（例えば、ナノフィルトレーション、逆浸透等）の使用によっても増加させ得る。濃縮後、固形分含有量は約２０％〜約８０％になるだろう。一実施形態では、除去した水を発酵ブロスへ戻し、消費する水の量を低減させる。
【００２９】
一実施形態では発酵ブロスの滅菌を、発酵終了直後に発酵槽で行う。他の実施形態では、滅菌を、ブロスを発酵槽から分離した後に行う。また、上述した分離手段によって発酵ブロスからバイオマスを除去した後で培養上清を滅菌することも可能である。
【００３０】
発酵ブロスの乾燥や製剤は、当業界で知られた慣用手段によって行い得る。例えば、発酵ブロスの噴霧乾燥、流動層噴霧造粒やスピンフラッシュ乾燥を使用しうる（Ｕｌｌｍａｎｎ’ｓ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，第六版，１９９９，電子リリース，“Ｄｒｙｉｎｇ  ｏｆ  ｓｏｌｉｄ  ｍａｔｅｒｉａｌｓ”の章）。
【００３１】
本発明によって得られる生成物は、Ｃａ−Ｄ−パントテン酸塩に加えて他の発酵ブロスの成分、例えばリン酸塩、炭酸塩、残留炭水化物、バイオマス、複合培地成分等を含み得る。この生成物は、白色から茶の色、５％の水分含有量、好ましくは１から３％の水分含有量を有することを特徴とする。生成物の凝固を防ぐために、５％の水分含有量を超えるべきでない。Ｃａ−Ｄ−パントテン酸塩の含有量は１０〜９０％、好ましくは２０〜８０％、より好ましくは５０〜８０％である。
【００３２】
また、Ｃａ−Ｄ−パントテン酸塩を含む発酵ブロスを、グルコースから調製することができ、その際β−アラニンや他のパントテン酸塩前駆体を供給する必要なく、Ｄ−パントテン酸塩の量は２０，２５，３０，３５，４０，４５，５０，５５，６０，６５，７０，７５，８０，８５，更には９０ｇ／Ｌ以上に達する。好ましい実施形態では、本発明の微生物を、制御された通気の下で培養する。用語「制御された通気」は、所望の生成物（例えば、噴霧乾燥可能なパントテン酸塩）を産生するために十分な通気（例えば、酸素）を含む。一実施形態では、通気は、培養液中の酸素レベルを調節することにより、例えば培養液中に溶解した酸素量を調節することにより、制御する。好ましくは、培養液の通気は、培養液を撹拌することによって制御される。撹拌は、プロペラや同様の機械的な撹拌装備により、培養器（例えば、チューブやフラスコ）を回転又は振とうすることにより、あるいは様々なポンプ装備により行うことができる。通気は更に、滅菌した空気や酸素が培地（例えば、発酵混合物）を通過するようにすることによって制御してもよい。また好ましくは、本発明の微生物は、過剰の発泡無く培養する（例えば、消泡剤の添加により行う）。
【００３３】
更に、本発明の微生物は、制御された温度の下で培養される。用語「制御された温度」は、所望の生成物（例えば、噴霧可能なパントテン酸塩）を産生する任意の温度を含む。一実施形態では、制御された温度は１５℃〜９５℃の温度を含む。他の実施形態では、制御された温度は、１５℃〜７０℃の温度を含む。好ましい温度は２０℃〜５５℃、より好ましくは３０℃〜５０℃である。
【００３４】
微生物は、液体培地中で培養（例えば、維持及び／又は育てること）でき、好ましくは、連続した又は間隔をもって、静置培養、試験管培養、振とう培養（例えば、回転式振とう培養、振とうフラスコ培養等）、通気スピナー培養、又は発酵などの従来の培養方法により培養する。好ましい実施形態では、微生物を振とうフラスコ中で培養する。より好ましい実施形態では、微生物を発酵槽中で培養する（例えば、発酵プロセス）。本発明の発酵プロセスは、これに限定されるものではないが、発酵の、バッチプロセス、バッチ供給プロセス、及び連続プロセス又は方法を含む。語句「バッチプロセス」や「バッチ発酵」は、栄養素、補助添加物などの培地の組成が、発酵の開始時に設定されて発酵中には変更しないが、過剰な培地の酸性化及び／又は微生物の死滅を防ぐためにｐＨ及び酸素濃度のような要因を制御することは行ってもよいという方式のことを云う。語句「バッチ供給プロセス」や「バッチ供給発酵」は、発酵進行時に一以上の基質や補給剤を添加する（例えば、量を増大させて又は連続的に添加される）ことを行うバッチ発酵のことを云う。語句「連続プロセス」や「連続発酵」は、一定の発酵培地を発酵槽に連続的に添加し、同時に等量の使用済み又は「順化した」培地を、好ましくは所望生成物（例えば、噴霧乾燥可能なパントテン酸塩組成物）の回収のために取り出す方式のことを云う。様々のこのようなプロセスが開発されており、当業界で周知である。
【００３５】
一実施形態では、噴霧乾燥可能なパントテン酸塩組成物を、例えば微生物が生物学的に有害でない（例えば、安全）場合には、微生物から精製を行わない。例えば、培養液や発酵ブロス（又は上清）全体を、生成物の供与源（例えば、未精製製品）として使用し得る。一実施形態では、培養液（又は培養上清）を調整すること無く使用する。他の実施形態では、培養液（又は培養上清）を濃縮する。また他の実施形態では、培養液（又は培養上清）を乾燥又は凍結乾燥する。
【００３６】
本発明の製造方法は、所望化合物を著しく高い収量で生成する。語句「著しく高い収量」とは、十分に改善された又は同等の製造方法で普通レベルを超える製造レベル又は収量であって、例えば所望製品の商業ベースの生産に十分なレベルにまで向上されていること（例えば、商業的に引き合うコストでの生成物製造）、を含む。一実施形態では、本発明は、所望生成物（例えば、パントテン酸塩）を２ｇ／Ｌより多いレベルで産生するような条件下で、組換え微生物を培養することを含む製造方法を特徴とする。他の実施形態では、本発明は、所望生成物（例えば、パントテン酸塩）を１０ｇ／Ｌより多いレベルで産生するような条件下で、組換え微生物を培養することを含む製造方法を特徴とする。他の実施形態では、本発明は、所望生成物（例えば、パントテン酸塩）を２０ｇ／Ｌより多いレベルで産生するような条件下で、組換え微生物を培養することを含む製造方法を特徴とする。また他の実施形態では、本発明は、所望生成物（例えば、パントテン酸塩）を３０ｇ／Ｌより多いレベルで産生するような条件下で、組換え微生物を培養することを含む製造方法を特徴とする。さらに他の実施形態では、本明は、所望生成物（例えば、パントテン酸塩）を４０ｇ／Ｌより多いレベルで産生するような条件下で、組換え微生物を培養することを含む製造方法を特徴づける。また他の実施形態では、本発明は、所望生成物（例えば、パントテン酸塩）を５０ｇ／Ｌより多いレベルで産生するような条件下で、組換え微生物を培養することを含む製造方法を特徴とする。さらに他の実施形態では、本発明は、所望生成物（例えば、パントテン酸塩）を６０ｇ／Ｌより多いレベルで産生するような条件下で、組換え微生物を培養することを含む製造方法を特徴とする。本発明は更に、十分に改善されたレベルの化合物を商業的に望ましい時間内に産生するという条件の下で組換え微生物を培養すること、を含む所望化合物を製造するための製造方法を特徴とする。
【００３７】
さらにまた別の実施形態では、本発明は、所望生成物（例えば、パントテン酸塩）を、培養液を回収し、ブロスからバイオマスを分離し（又は、分離せず）、培養液を滅菌し（バイオマス除去の前又は後で行う）、ブロスを濃縮し（又は、濃縮せず）、そしてＣａ−Ｄ−パントテン酸塩が生成物中に１０％より多いレベル（２０−３０−４０％等）で含まれるように上記の任意の手段によって培養液を乾燥して、製造するという条件の下で組換え生物を培養することを含む製造方法を特徴とする。
【００３８】
本発明は、以下の実施例によりさらに説明するが、本発明は、これらの実施例により限定されるものと解されるべきではない。本出願で引用されている全ての参考文献、特許及び公開特許出願の内容を、参照により本明細書中に組み入れる。
【実施例】
【００３９】
実施例１：ＰＡ６６８−２４株でのパントテン酸カルシウムの製造
２０Ｌのラボ・スケールの発酵槽（Ｉｎｆｏｒｓ  ＡＧ，スイス）中で、４Ｌの水ベースの一回発酵培地を下記表に従って調製した：
【表１】
2004529632.tif 000002
【００４０】
水を加えて最終体積を４Ｌとした。滅菌（１２１℃，  ３０分）後、１Ｌの滅菌溶液を添加した。ブロス成分の濃度は、次の通りである：
【表２】
2004529632.tif 000003
【００４１】
微量元素の溶液ＳＭ−１０００ｘは次の組成を有した：すなわち、０．１５ｇのＮａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ，２．５ｇのＨ３ＢＯ３，０．７ｇのＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ，０．２５ｇのＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ，１．６ｇのＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ，０．３ｇのＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏを、水に溶解し、１Ｌとした。ＳＭ−１０００ｘは、滅菌した注射器で一回発酵培地に添加した。
【００４２】
５Ｌの開始体積に対して、バチルス・ズブチリスＰＡ６６８−２４株の接種培養液１００ｍＬ（ＳＶＹ培地中ＯＤ＝１０）と一回分の培地に添加した。
【００４３】
接種材料は、１５ｍｇ／Ｌのテトラサイクリンと５ｍｇ／Ｌのクロラムフェニコールを添加したＰＡ６６８−２４株の凍結ストックを１００ｍＬのＳＶＹ培地に接種して調製した。このＳＶＹ培地は、２５ｇのＤｉｆｃｏ子ウシ侵出物ブロス、５ｇのＤｉｆｃｏイースト抽出物、５ｇのグルタミン酸Ｎａ、及び７４０ｍＬ水中の２．７ｇ（ＮＨ４）２ＳＯ４の滅菌した混合物から作製した。この滅菌した培地に対し、１Ｍの滅菌Ｋ２ＨＰＯ４（ｐＨ７）２００ｍＬと５０％滅菌グルコース溶液６０ｍＬを加え、最終体積１リットルとした。そして、この培養液を３７℃で１２〜１８時間にわたり回転式振とう器でインキュベートした。
【００４４】
凍結ストックは、バッフル付きの２５０ｍＬ三角フラスコ中に調製した。５０ｍＬのＳＶＹ培地に、１５ｍｇ／Ｌのテトラサイクリンと５ｍｇ／Ｌのクロラムフェニコールを添加し、寒天プレート上の単一コロニーからのＰＡ６６８−２４株を接種した。回転式振とう器で一晩インキュベートした後、１０ｍＬの滅菌８０％グリセロール溶液をこの培養液に添加した。１ｍＬアリコートを凍結チューブ中に調製し、各々−８０℃で凍結した。
【００４５】
接種後、発酵を開始した。温度は４３℃に設定した。初期の撹拌器速度は毎分４００回転に設定し、初期の空気流速は４Ｌ／分に設定した。全発酵工程は、グルコースを制限したバッチ供給プロセスとした。初期バッチの２％グルコースは、指数関数的増殖の間に消費された。その後、グルコース濃度は、下記表に示されるようなグルコース溶液を連続的に供給することにより、０〜１ｇ／Ｌの間で維持された。
【表３】
2004529632.tif 000004
【００４６】
発酵最初の８時間の間、ｐＨは、２５％ＮＨ３溶液の添加により維持した。その後、ｐＨは、必要な時にＣａ（ＯＨ）２の２５％水性懸濁液を発酵ブロスに加えてｐＨを上昇させることによって制御した。時折、ｐＨが好ましいｐＨ範囲を超えた時には、２０％リン酸の添加によってｐＨを低下させた。撹拌器速度と空気流速は、溶解した酸素値（ｐＯ２）に従って制御し、この酸素値は飽和値の２０％に設定した。グルコース溶液の供給は、ｐＯ２値と関連したアルゴリズムによって制御した。発泡を制御するために、消泡剤を時折加えた。４８時間の発酵時間時に、グルコース溶液の供給を止めた。
【００４７】
ｐＯ２が９５％の値に達した後、発酵ブロスを回収した。Ｄ−パントテン酸塩濃度は、２１．４ｇ／Ｌであった。バイオマスは、遠心分離によって分離した。上清に残留する細胞は１２１℃で３０分間の滅菌により死滅させたが、これは、ブロスのサンプルを寒天プレート（Ｄｉｆｃｏトリプトン血液寒天ブロス３３ｇ／Ｌ、３０ｍｇ／Ｌのテトラサイクリンと３０ｍｇ／Ｌクロラムフェニコールを添加したもの）上に塗布し、３７℃で一晩インキュベートしてコロニー増殖を検査することにより証明した。最終上清中のＤ−パントテン酸塩の濃度は、１５ｇ／Ｌであった。
【００４８】
この発酵ブロスは薄膜蒸発器中で濃縮し、２１％の最終固形分が得られた。濃縮発酵ブロスは、５５．４ｇ／ＬのＣａ−Ｄ−パントテン酸塩を含有していた。
【００４９】
実施例２：Ｃａ−Ｄ−パントテン酸塩を含有する発酵ブロスの製剤化
実施例１で生成した濃縮発酵ブロス５００ｇを、ラボ・スケールの二流体噴射ノズル付きの噴霧乾燥器（直径１．２ｍｍ；Ｍｉｎｏｒ‘Ｈｉ−Ｔｅｃ’；Ｎｉｒｏ，Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ，デンマーク）で乾燥した。発酵ブロス懸濁液の均質性を連続的な撹拌により維持した。入口温度は１８５〜１９２℃、出口温度は８８〜９１℃であり、空気圧は２バールとした。
【００５０】
７０％の収量で、７４．８ｇの黄から茶色の粉末が得られた。粉末は２５％のＣａ−Ｄ−パントテン酸塩を含有した。水分は１．７％であった。
【００５１】
実施例３：Ｃａ−Ｄ−パントテン酸塩を含有する発酵ブロスの製剤化
実施例１で生成した濃縮発酵ブロス５００ｇを、ラボ・スケールの二流体噴射ノズル付きの噴霧乾燥器（直径１．２ｍｍ；Ｍｉｎｏｒ‘Ｈｉ−Ｔｅｃ’；Ｎｉｒｏ，Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ，デンマーク）で乾燥した。発酵ブロス懸濁液の均質性は連続的な撹拌により維持した。入口温度は１５３〜１５９℃、出口温度は７２〜７８℃であり、空気圧は２バールとした。
【００５２】
７９．２ｇの黄から茶色の粉末が得られた。粉末は２４．１％のＣａ−Ｄ−パントテン酸塩を含有した。水分は１．９％であった。
【００５３】
実施例４：Ｃａ−Ｄ−パントテン酸塩を含有する発酵ブロスの製剤化
実施例１で生成した濃縮発酵ブロス５００ｇに、２．２ｇの固体Ｃａ（ＯＨ）２を加え、溶液の塩基性をｐＨ１０に上昇させた。そしてこの溶液を、ラボ・スケールの二流体噴射ノズル付きの噴霧乾燥器（直径１．２ｍｍ；Ｍｉｎｏｒ‘Ｈｉ−Ｔｅｃ’；Ｎｉｒｏ，Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ，デンマーク）で乾燥した。発酵ブロス懸濁液の均質性は連続的な撹拌により維持した。入口温度は１３５〜１４３℃、出口温度は７３〜７７℃であり、空気圧は２バールとした。
【００５４】
８２．４ｇの黄から茶色の粉末が得られた。粉末は２３．７％のＣａ−Ｄ−パントテン酸塩を含有した。水分は１．６％であった。
【００５５】
実施例５：Ｃａ−Ｄ−パントテン酸塩を含有する発酵ブロスの製剤化
実施例１で生成した濃縮発酵ブロス５００ｇに、５．０ｇの固体ＣａＣｌ２を加えた。得られた溶液を、ラボ・スケールの二流体噴射ノズル付きの噴霧乾燥器（直径１．２ｍｍ；Ｍｉｎｏｒ‘Ｈｉ−Ｔｅｃ’；Ｎｉｒｏ，Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ，デンマーク）で乾燥した。発酵ブロス懸濁液の均質性は連続的な撹拌により維持した。入口温度は１２９〜１３０℃、出口温度は７５〜７８℃であり、空気圧は２バールとした。
【００５６】
６５．１ｇの黄から茶色の粉末が得られた。粉末は２３．４％のＣａ−Ｄ−パントテン酸塩を含有した。水分は１．７％であった。
【００５７】
実施例６：ＰＡ６６８−２Ａ株でのＣａ−Ｄ−パントテン酸塩製造
２０Ｌのラボ・スケールの発酵槽（Ｉｎｆｏｒｓ  ＡＧ，スイス）中で、４Ｌの水ベースの一回発酵培地を下記表に従って調製した：
【表４】
2004529632.tif 000005
【００５８】
水を加えて最終体積を４Ｌとした。１２１℃で３０分間の滅菌後、１リットルの滅菌溶液を添加し、下記表に示す最終濃度になった：
【表５】
2004529632.tif 000006
【００５９】
微量元素の溶液ＳＭ−１０００ｘは、水１リットルに溶解した０．１５ｇのＮａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ，２．５ｇのＨ３ＢＯ３，０．７ｇのＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ，０．２５ｇのＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ，１．６ｇのＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ，０．３ｇのＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏの組み合わせから構成される。微量元素溶液ＳＭ−１０００ｘは、滅菌した注射器で発酵一回分の培地に加えた。
【００６０】
一回発酵培地の開始体積は、５Ｌとした。バチルス・ズブチリス（ＰＡ６６８−２Ａ株）の接種培養液（ＳＶＹ培地中ＯＤ＝１０）１００ｍＬを一回分の培地に加えた。
【００６１】
接種材料を調製するために、１００ｍＬのＳＶＹ培地（１５ｍｇ／Ｌのテトラサイクリンと５ｍｇ／Ｌのクロラムフェニコールを添加した）に、ＰＡ６６８−２Ａ株の凍結ストックを接種した。ＳＶＹ培地、Ｄｉｆｃｏ子ウシ侵出物ブロス２５ｇ、Ｄｉｆｃｏイースト抽出物５ｇ、グルタミン酸Ｎａ５ｇ、７４０ｍＬのＨ２Ｏ中の２．７ｇ（ＮＨ４）２ＳＯ４、を滅菌し、１Ｍの滅菌Ｋ２ＨＰＯ４（ｐＨ７）２００ｍＬと５０％滅菌グルコース溶液６０ｍＬを加えたものである（最終体積１Ｌ）。この培養液を３７℃で１２〜１８時間にわたり回転式振とう器でインキュベートした。
【００６２】
凍結ストックは、バッフル付きの２５０ｍＬ三角フラスコ中に調製された。１００ｍＬのＳＶＹ培地（１５ｍｇ／Ｌのテトラサイクリンと５ｍｇ／Ｌのクロラムフェニコールを添加したもの）に、寒天プレート上の単一コロニーからのＰＡ６６８−２４Ａ株を接種した。回転式振とう器で一晩インキュベートした後、１０ｍＬの８０％滅菌グリセロール溶液をこの培養液に添加した。１ｍＬアリコートの培養液を凍結チューブ中に調製し、各々−８０℃で凍結した。
【００６３】
接種後、発酵を開始いた。温度は４３℃に設定した。初期の撹拌器速度は毎分４００回転に設定し、初期の空気流速は４Ｌ／分に設定した。
【００６４】
全発酵工程は、グルコースを制限したバッチ供給プロセスとした。初期バッチの２％グルコースは、指数関数的増殖の間に消費された。その後、グルコース濃度は、下記表に示されるような８００ｇ／Ｌグルコース溶液を連続的に供給することにより、０〜１ｇ／Ｌの間に維持した。
【表６】
2004529632.tif 000007
【００６５】
発酵の最初の２４時間の間、ｐＨは、２５％ＮＨ３溶液の添加により制御した。その後、Ｃａ（ＯＨ）２の２５％水性懸濁液を発酵ブロスに加えることによってｐＨを制御した。稀に発生する塩基性ｐＨの滴定には、２０％リン酸を添加した。撹拌器速度と空気流は、溶解した酸素値（ｐＯ２）に従って制御し、この酸素値は飽和値の２０％に設定した。グルコース溶液の供給は、ｐＯ２値と関連したアルゴリズムによって制御した。発泡は、消泡剤を時折加えることにより制御した。４８時間の発酵時間時に、グルコース溶液の供給を停止した。Ｄ−パントテン酸塩濃度は、４４．８ｇ／Ｌであった。ｐＯ２が９５％の値に達した後、発酵ブロスを１２１℃で３０分間の滅菌した。滅菌の完了は、ブロスのサンプルを寒天プレート（Ｄｉｆｃｏトリプトン血液寒天ブロス３３ｇ／Ｌ、３０ｍｇ／Ｌのテトラサイクリンと３０ｇ／Ｌクロラムフェニコールを添加したもの）上に塗布し、３７℃で一晩インキュベートしてそのコロニー増殖を検査することにより確認できる。バイオマスは、３８ｇ／ＬのＤ−パントテン酸塩を含むブロスから除去しなかった。
【００６６】
このブロスは薄膜蒸発器中で濃縮し、３０％の最終固形分となった。
【００６７】
実施例７：Ｃａ−Ｄ−パントテン酸塩とバイオマスを含有する発酵ブロスの製剤化
実施例６で生成した濃縮発酵ブロス５００ｇを、ラボ・スケールの二流体噴射ノズル付きの噴霧乾燥器（直径１．２ｍｍ；Ｍｉｎｏｒ‘Ｈｉ−Ｔｅｃ’；Ｎｉｒｏ，Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ，デンマーク）で乾燥した。発酵ブロス懸濁液の均質性を連続的な撹拌により維持した。入口温度は１８５〜１９２℃、出口温度は８８〜９１℃とした。空気圧は２バールとした。Ｃａ−Ｄ−パントテン酸塩を含む黄から茶色の粉末１０５ｇが得られた。収量は７０％であった。
【００６８】
上記実施例中に使用した株は、次のように作製した：
パントテン酸塩産生株の開発の出発点は、バチルス・ズブチリス１６８（Ｍａｒｂｕｒｇ株ＡＴＣＣ６０５１）であり、これは遺伝子型ｔｒｐＣ２（Ｔｒｐ−）を有するものである。バチルス・ズブチリス１６８株から、Ｔｒｐ＋マーカーの導入（バチルス・ズブチリス野生型Ｗ２３由来のもの）によりＰＹ７９株を作出した。ΔｐａｎＢ及びΔｐａｎＥ１突然変異を古典的遺伝子工学（例えば、Ｈａｒｗｏｏｄ，Ｃ．Ｒ．ａｎｄ  Ｃｕｔｔｉｎｇ，Ｓ．Ｍ．（編），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ（１９９０）Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｌｔｄ．，Ｃｈｉｃｈｅｓｔｅｒ，イギリス中に記載されている）によりＰＹ７９株に導入した。
【００６９】
得られた株は、バチルス・ズブチリスＰＡ２２１株（遺伝子型Ｐ２６ｐａｎＢＣＤ，ｔｒｐＣ２（Ｔｒｐ−））からのゲノムＤＮＡとバチルス・ズブチリスＰＡ３０３株（遺伝子型Ｐ２６ｐａｎＥ１）のゲノムＤＮＡを用いて形質転換した。得られたＰＡ３２７株は、遺伝子型Ｐ２６ｐａｎＢＣＤ，Ｐ２６ｐａｎＥ１を有し、トリプトファン（Ｔｒｐ−）栄養素要求性変異体である。
【００７０】
バチルス・ズブチリスＰＡ３２７株を用いたところ、５ｇ／Ｌのβ−アラニンと５ｇ／Ｌのα−ケトイソ吉草酸塩を添加したＳＶＹ培地（２５ｇ／ＬのＤｉｆｃｏ子ウシ侵出物ブロス，５ｇ／ＬのＤｉｆｃｏイースト抽出物，５ｇ／Ｌのグルタミン酸Ｎａ，水に溶解した２．７ｇ／Ｌの（ＮＨ４）２ＳＯ４，水で７４０ｍＬにされた２００ｍＬの１Ｍ滅菌リン酸カリウム，ｐＨ７．０と６０ｍＬの５０％滅菌グルコース溶液を加えたもの）の１０ｍＬ培養液において、３ｇ／Ｌ（２４時間）までのパントテン酸塩量を達成した。
【００７１】
バチルス・ズブチリスＰＡ２２１株（遺伝子型Ｐ２６ｐａｎＢＣＤ，ｔｒｐＣ２（Ｔｒｐ−））の作製について以下に記載する：
古典的な遺伝子工学の方法により、バチルスのｐａｎＢＣＤオペロンを、大腸菌のｐａｎＢＣＤオペロンの配列情報を使って、バチルス・ズブチリスＧＰ２７５株のプラスミドライブラリからクローニングした（Ｍｅｒｋｅｌら、ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．，１４３，１９９６：２４７−２５２参照）。
【００７２】
クローニング手順では、大腸菌ＢＭ４０６２株（ｂｉｒｔｓ）とバチルスのオペロンがｂｉｒＡ遺伝子座に隣接して存在する情報とが用いられた。ｐａｎＢＣＤオペロンを、大腸菌複製可能プラスミドにクローニングした。ｐａｎＢＣＤオペロンの発現を強化するために、バチルス・ズブチリスファージＳＰ０１の強力な構成的プロモーター（例えば、Ｐ２６）を用いた。更に、ｐａｎＢ遺伝子の上流のリボソーム結合部位（ＲＢＳ）を配列「ＣＣＣＴＣＴ−ＡＧ−ＡＡＧＧＡＧＧＡＧＡＡＡＡＣＡＴＧ」を有する人工ＲＢＳと置換した。プラスミド上のＰ２６ｐａｎＢＣＤカセットのすぐ上流に、バチルス内の天然ｐａｎＢ遺伝子のすぐ上流側に生来位置するＤＮＡ断片を挿入した。このプラスミドを、バチルス・ズブチリスＲＬ−１株（古典的な突然変異誘発により作出されたバチルス・ズブチリス１６８株（Ｍａｒｂｕｒｇ株ＡＴＣＣ  ６０５１）の誘導株，遺伝子型ｔｒｐＣ２（Ｔｒｐ−））に形質転換させ、相同組換えにより天然ｐａｎＢＣＤオペロンをＰ２６ｐａｎＢＣＤオペロンと置換した。得られた株は、ＰＡ２２１と称し、遺伝子型Ｐ２６ｐａｎＢＣＤ，ｔｒｐＣ２（Ｔｒｐ−）を有するものであった。
【００７３】
バチルス・ズブチリスＰＡ２２１株を用いたところ、５ｇ／Ｌのβ−アラニンと５ｇ／Ｌのα−ケトイソ吉草酸塩を添加したＳＶＹ培地の１０ｍＬ培養液において、０．９２ｇ／Ｌ（２４時間）までのパントテン酸塩量を達成した。
【００７４】
バチルス・ズブチリスＰＡ３０３株（遺伝子型Ｐ２６ｐａｎＥ１）の調製手順を以下に記載する：
大腸菌ｐａｎＥ遺伝子配列を知ることができたため、バチルスｐａｎＥ遺伝子をクローニングした。面白いことに、バチルス・ズブチリス中の２つの遺伝子が大腸菌ｐａｎＥ遺伝子と相同であり、これをｐａｎＥ１及びｐａｎＥ２と称した。ノックアウト解析によって、ｐａｎＥ１遺伝子がパントテン酸塩産生の９０％に寄与し、一方ｐａｎＥ２遺伝子の欠失はパントテン酸塩産生に有意な影響を及ぼさないことが示された。ここでもまた、プロモーターを強力な構成的Ｐ２６プロモーターと置換し、ｐａｎＥ１の上流のリボソーム結合部位を人工ＲＢＳと置換した。Ｐ２６ｐａｎＥ１断片をプラスミドベクター中にクローニングしたが、このベクターは、Ｐ２６ｐａｎＥ１断片をバチルス・ズブチリスのゲノム中の元の天然ｐａｎＥ１遺伝子座に組み込まれるように設計されたものである。形質転換及び相同組換えの後、得られた株をＰＡ３０３と称した。これは、遺伝子型Ｐ２６ｐａｎＥ１を特徴とする。
【００７５】
バチルス・ズブチリスＰＡ３０３株を用いたところ、５ｇ／Ｌのβ−アラニンと５ｇ／Ｌのα−ケトイソ吉草酸塩を添加したＳＶＹ培地の１０ｍＬ培養液において１．６６ｇ／Ｌ（２４時間）までのパントテン酸塩量を達成した。
【００７６】
さらなる株の開発を、Ｐ２６ｉｌｖＢＮＣオペロンとスペクチノマイシンのマーカー遺伝子を含むプラスミドを用いたＰＡ３２７の形質転換により行った。このＰ２６ｉｌｖＢＮＣオペロンはａｍｙＥ遺伝子座に組み込まれていることがＰＣＲ解析により確かめられた。この形質転換菌のうちの１つをＰＡ３４０株と称した（遺伝子型Ｐ２６ｐａｎＢＣＤ，Ｐ２６ｐａｎＥ１，Ｐ２６ｉｌｖＢＮＣ，ｓｐｅｃＲ，ｔｒｐＣ２（Ｔｒｐ−））。
【００７７】
バチルス・ズブチリスＰＡ３４０株を用いたところ、５ｇ／Ｌのβ−アラニンを添加したＳＶＹ培地の１０ｍＬ培養液において、３．６ｇ／Ｌ（２４時間）までのパントテン酸塩量を達成した。５ｇ／Ｌのβ−アラニンと５ｇ／Ｌのα−ケトイソ吉草酸塩を添加したＳＶＹ培地の１０ｍＬ培養液のいいては、４．１ｇ／Ｌ（２４時間）までのパントテン酸塩量を達成した。
【００７８】
更に、脱調節されたｉｌｖＤカセットを、ＰＡ３４０株に導入した。この理由で、Ｐ２６プロモーター及び人工ＲＢＳの制御下にｉｌｖＤ遺伝子を含むプラスミドをＰＡ３４０に形質転換した。相同組換えによってこのＰ２６ｉｌｖＤ遺伝子を天然ｉｌｖＤ遺伝子座に組み込んだ。得られたＰＡ３７４株は、遺伝子型Ｐ２６ｐａｎＢＣＤ，Ｐ２６ｐａｎＥ１，Ｐ２６ｉｌｖＢＮＣ，Ｐ２６ｉｌｖＤ，ｓｐｅｃＲ及びｔｒｐＣ２（Ｔｒｐ−）を有した。
【００７９】
バチルス・ズブチリスＰＡ３７４株を用いることにより、５ｇ／Ｌのβ−アラニンを添加したＳＶＹ培地の１０ｍＬ培養液において、２．９９ｇ／Ｌ（２４時間）までのパントテン酸塩量を達成した。
【００８０】
β−アラニン前駆体を供給することなくパントテン酸塩を産生することができるように、アスパラギン酸−α−デカルボキシラーゼをコードする遺伝子ｐａｎＤのさらなるコピーをＰＡ３７４株に導入した。ＰＡ４０１株の染色体ＤＮＡをＰＡ３７４に形質転換した。テトラサイクリンでの選択によってＰＡ３７７株が得られた。
【００８１】
得られたＰＡ３７７株は、遺伝子型Ｐ２６ｐａｎＢＣＤ，Ｐ２６ｐａｎＥ１，Ｐ２６ｉｌｖＢＮＣ，Ｐ２６ｉｌｖＤ，ｓｐｅｃＲ，ｔｅｔＲ及びｔｒｐＣ２（Ｔｒｐ−）を有した。
【００８２】
バチルス・ズブチリスＰＡ３７７株を用いたところ、β−アラニンやα−ケトイソ吉草酸塩などのいずれの前駆体をも供給することなくＳＶＹ培地の１０ｍＬ培養液において、１．３１ｇ／Ｌ（２４時間）及び３．６ｇ／Ｌ（４８時間）までのパントテン酸塩量を達成した。
【００８３】
バチルス・ズブチリスＰＡ４０１株（遺伝子型Ｐ２６ｐａｎＤ）の作製について以下説明する：
バチルス・ズブチリスのｐａｎＤ遺伝子を、ｐａｎＢＣＤオペロンから、テトラサイクリンのマーカー遺伝子を含むプラスミドベクターにクローニングした。ｐａｎＤ遺伝子の上流に、プロモーターＰ２６と上記の人工ＲＢＳとを挿入した。制限酵素消化により、テトラサイクリンのマーカー遺伝子とＰ２６ｐａｎＤ遺伝子を含む断片をこのベクターから調製した。この断片は、再度連結し、上記のＰＡ２２１株に形質転換した。こうする事により断片をＰＡ２２１株のゲノム中に組み込んだ。得られたＰＡ４０１株は、遺伝子型Ｐ２６ｐａｎＢＣＤ，Ｐ２６ｐａｎＤ，ｔｅｔＲ及びｔｒｐＣ２（Ｔｒｐ−）を特徴とする。
【００８４】
バチルス・ズブチリスＰＡ４０１株を用いることにより、５ｇ／Ｌのα−ケトイソ吉草酸塩を添加したＳＶＹ培地の１０ｍＬ培養液において、０．３ｇ／Ｌ（２４時間）までのパントテン酸塩量を達成した。５ｇ／ＬのＤ−パントイン酸と１０ｇ／ＬのＬ−アスパラギン酸塩を添加したＳＶＹ培地の１０ｍＬ培養液においては、２．２ｇ／Ｌ（２４時間）までのパントテン酸塩量を達成した。
【００８５】
ＰＡ３７７株をＰＹ７９株の染色体ＤＮＡで形質転換して、トリプトファン原栄養株を作出した。得られたＰＡ８２４株は、遺伝子型Ｐ２６ｐａｎＢＣＤ，Ｐ２６ｐａｎＥ１，Ｐ２６ｉｌｖＢＮＣ，Ｐ２６ｉｌｖＤ，ｓｐｅｃＲ，ｔｅｔＲ及びＴｒｐ＋を有していた。バチルス・ズブチリスＰＡ８２４株を用いることにより、前駆体などの添加を行うことなくＳＶＹ培地の１０ｍＬ培養液において４．９ｇ／Ｌ（４８時間）までのパントテン酸塩量を達成した。
【００８６】
バチルス・ズブチリスＰＡ６６８株の作製について以下記載する：
バチルスｐａｎＢ遺伝子を、ｐａｎＢＣＤオペロンからクローニングし、クロラムフェニコールのマーカー遺伝子とバチルス・ズブチリスｖｐｒ遺伝子座の配列とを含むベクタープラスミドへ挿入した。強力な構成的プロモーターＰ２６を、ｐａｎＢ遺伝子の上流に挿入した。Ｐ２６ｐａｎＢ遺伝子、染色体マーカー遺伝子及びｖｐｒ配列を含む断片を制限酵素処理により生成した。単離した断片を再度連結し、それを使用してＰＡ８２４株を形質転換した。得られた株はＰＡ６６８と名付けた。ＰＡ６６８の遺伝子型は、Ｐ２６ｐａｎＢＣＤ，Ｐ２６ｐａｎＥ１，Ｐ２６ｉｌｖＢＮＣ，Ｐ２６ｉｌｖＤ，Ｐ２６ｐａｎＢ，ｓｐｅｃＲ，ｔｅｔＲ及びＴｒｐ＋である。ＰＡ６６８の２つのコロニーを単離し、その１つをＰＡ６６８−２Ａと称し、他方をＰＡ６６８−２４と称した。
【００８７】
バチルス・ズブチリスＰＡ６６８−２Ａ株を用いることにより、前駆体などを添加することなくＳＶＹ培地の１０ｍＬ培養液において１．５ｇ／Ｌ（４８時間）までのパントテン酸塩量を達成した。１０ｇ／ＬのＬ−アスパラギン酸塩を添加したＳＶＹ培地の１０ｍＬ培養液においては、５．０ｇ／Ｌ（４８時間）までのパントテン酸塩量を達成した。５ｇ／ＬのＤ−パントイン酸と１０ｇ／ＬのＬ−アスパラギン酸塩を添加したＳＶＹ培地の１０ｍＬ培養液においては、４．９ｇ／Ｌ（４８時間）までのパントテン酸塩量を達成した。
【００８８】
バチルス・ズブチリスＰＡ６６８−２４株を用いることにより、前駆体などを添加することなくＳＶＹ培地の１０ｍＬ培養液において１．８ｇ／Ｌ（４８時間）までのパントテン酸塩量を達成した。１０ｇ／ＬのＬ−アスパラギン酸塩を添加したＳＶＹ培地の１０ｍＬ培養液においては、４．９ｇ／Ｌ（４８時間）までのパントテン酸塩量を達成した。５ｇ／ＬのＤ−パントイン酸と１０ｇ／ＬのＬ−アスパラギン酸塩を添加したＳＶＹ培地の１０ｍＬ培養液においては、６．１ｇ／Ｌ（４８時間）までのパントテン酸塩量を達成した。
【００８９】
本明細書中に記載するＰ２６プロモーター配列は以下の通りである：
2004529632.tif 000008
【００９０】
上記のＰＡ３７７株は、ＳＶＹ培地（２５ｇ／Ｌ  Ｄｉｆｃｏ子ウシ侵出物ブロス，５ｇ／Ｌ  Ｄｉｆｃｏイースト抽出物，５ｇ／Ｌトリプトファン，５ｇ／Ｌグルタミン酸Ｎａ，２ｇ／Ｌ（ＮＨ４）２ＳＯ４，１０ｇ／Ｌ  ＫＨ２ＰＯ４，２０ｇ／Ｌ  Ｋ２ＨＰＯ４，０．１ｇ／Ｌ  ＣａＣｌ２，１ｇ／Ｌ  ＭｇＳＯ４，１ｇ／Ｌクエン酸Ｎａ，０．０１ｇ／Ｌ  ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ及び１ｍＬ／Ｌの微量元素溶液（組成：０．１５ｇ  Ｎａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ，２．５ｇ  Ｈ３ＢＯ３，０．７ｇ  ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ，０．２５ｇ  ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ，１．６ｇ  ＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ，０．３ｇ  ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏを水に溶解し、最終体積は１Ｌ））中のグルコースを制限した発酵において試験した。グルコース溶液の連続供給の下、１０Ｌ規模の発酵で、１８〜１９ｇ／Ｌ（３６時間）及び２２〜２５ｇ／Ｌ（４８時間）のパントテン酸塩量を達成した。
【００９１】
ＰＡ３７７のトリプトファン原栄養性誘導株であるＰＡ８２４もまた、ＹＥ培地（１０ｇ／Ｌ  Ｄｉｆｃｏイースト抽出物，５ｇ／Ｌグルタミン酸Ｎａ，８ｇ／Ｌ（ＮＨ４）２ＳＯ４，１０ｇ／Ｌ  ＫＨ２ＰＯ４，２０ｇ／Ｌ  Ｋ２ＨＰＯ４，０．１ｇ／Ｌ  ＣａＣｌ２，１ｇ／Ｌ  ＭｇＳＯ４，１ｇ／Ｌクエン酸Ｎａ，０．０１ｇ／Ｌ  ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ及び１ｍＬ／Ｌの上記の微量元素溶液）中のグルコース制限発酵で試験した。グルコース溶液の連続供給の下、１０Ｌ規模の発酵で、２０ｇ／Ｌ（３６時間）、２８ｇ／Ｌ（４８時間）及び３６ｇ／Ｌ（７２時間）のパントテン酸塩量を達成した。
【００９２】
ＰＡ８２４は更に、１０ｇ／Ｌ  Ｄｉｆｃｏイースト抽出物，１０ｇ／Ｌ  ＮＺアミンＡ（Ｑｕｅｓｔ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＧｍｂＨ，Ｅｒｆｔｓｔａｄｔ，ドイツ），１０ｇ／Ｌグルタミン酸Ｎａ，４ｇ／Ｌ（ＮＨ４）２ＳＯ４，１０ｇ／Ｌ  ＫＨ２ＰＯ４，２０ｇ／Ｌ  Ｋ２ＨＰＯ４，０．１ｇ／Ｌ  ＣａＣｌ２，１ｇ／Ｌ  ＭｇＳＯ４，１ｇ／Ｌクエン酸Ｎａ，０．０１ｇ／Ｌ  ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ及び１ｍＬ／Ｌの上記の微量元素溶液、からなるバッチ培地中でのグルコース制限発酵において試験した。グルコース溶液の連続供給の下、１０Ｌ規模の発酵で、３７ｇ／Ｌ（３６時間）及び４８ｇ／Ｌ（４８時間）のパントテン酸塩量を達成した。
【００９３】
これらの試験発酵は、本明細書中に記載するようにパントテン酸塩を過剰産生し、前駆体を必要とせずにパントテン酸を産生するように遺伝子操作された菌株を例示する。
【００９４】
発酵ブロス中のパントテン酸塩の量は、培地の最適化や開発により、発酵時間の増加により、プロセス及び菌株の改善により、そして上記方法の組み合わせによっても、更に増大する可能性がある。例えば、上記のパントテン酸塩量は、上述のＰＡ８２４株やＰＡ６６８株の誘導株である菌株を発酵させることによって達成し得る。誘導株は、古典的な突然変異誘発法などの古典的菌株開発を利用して、遺伝子工学の方法論を適用することによっても作出できる。培地、菌株やプロセスの開発によって、発酵ブロス中のパントテン酸塩量は、４０，４５，５０，５５，６０，６５，７０，７５，８０，８５以上，そして＞９０ｇ／Ｌにも増大し得る。
【００９５】
等価物
当業者であれば、本明細書に記載の本発明の具体的な実施形態と等価な多くの等価物を理解し、特別の実験法を行うことなくそれを確認することができる。そのような等価物は、添付の特許請求の範囲に含まれることを意図するものである。
【国際公開パンフレット】
2004529632.tif 000009
2004529632.tif 000010
2004529632.tif 000011
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2004529632.tif 000035
2004529632.tif 000036
2004529632.tif 000037
【手続補正書】
【提出日】平成15年2月21日(2003.2.21)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
β−アラニンを含まない噴霧乾燥可能なパントテン酸塩組成物の製造方法であって、噴霧乾燥可能なパントテン酸塩組成物が産生されるように、Ｃａ（ＯＨ）２で制御されたｐＨ条件下にてβ−アラニンを供給することなくパントテン酸塩産生微生物を培養することを含む、上記方法。
【請求項２】
噴霧乾燥可能なパントテン酸塩組成物が、Ｃａ−Ｄ−パントテン酸塩を含む請求項１記載の方法。
【請求項３】
濃縮された噴霧乾燥可能なパントテン酸塩組成物が、約１０％から約８０％の乾物量を有する請求項１記載の方法。
【請求項４】
濃縮された噴霧乾燥可能なパントテン酸塩組成物が、約２０％から約６０％の乾物量を有する請求項１記載の方法。
【請求項５】
濃縮された噴霧乾燥可能なパントテン酸塩組成物が、５０％より多い乾物量を有する請求項１記載の方法。
【請求項６】
パントテン酸塩組成物が噴霧乾燥によって更に処理される請求項５記載の方法。
【請求項７】
噴霧乾燥可能なパントテン酸塩組成物が、約１００℃から約２００℃までの入口温度で噴霧乾燥される請求項６記載の方法。
【請求項８】
噴霧乾燥可能なパントテン酸塩組成物が、約６０℃から約１００℃までの出口温度で噴霧乾燥される請求項７記載の方法。
【請求項９】
バイオマスを噴霧乾燥可能なパントテン酸塩組成物から分離した後に乾燥を行う請求項５記載の方法。
【請求項１０】
バイオマスを噴霧乾燥可能なパントテン酸塩組成物から、濾過、遠心分離、限外濾過、精密ろ過、又はそれらの組み合わせによって分離する請求項９記載の方法。
【請求項１１】
噴霧乾燥可能なパントテン酸塩組成物が濃縮されたものである請求項１記載の方法。
【請求項１２】
Ｃａ（ＯＨ）２で制御されたｐＨ条件が約ｐＨ６．０〜ｐＨ１１．０である請求項１記載の方法。
【請求項１３】
Ｃａ（ＯＨ）２で制御されたｐＨ条件が約ｐＨ７．０である請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
Ｃａ（ＯＨ）２で制御されたｐＨ条件が約ｐＨ１０である請求項１２記載の方法。
【請求項１５】
請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法により製造された噴霧乾燥可能なパントテン酸塩組成物。
【国際調査報告】
2004529632.tif 000038
2004529632.tif 000039