(57)【要約】本発明は、宿主動物の体温、より特定的には３８．５℃以上の温度で温度感受性であるウマ流産ウイルス（ＥＨＶ−１）変異株に関する。温度感受性変異株は、ＥＨＶ−１感染受容性動物のＥＨＶ−１感染を予防するワクチン接種に使用できる。本発明は更に、このような変異株から誘導された生ワクチンに関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＥＣＡＣＣに登録番号Ｎｏ．Ｖ９９０６１００１で寄託されたＥＨＶ１  Ｔｓ−突然変異株またはその後代であることを特徴とするウマ流産ウイルス（ＥＨＶ−１）の温度感受性（Ｔｓ）変異株。
【請求項２】
請求項１に記載の温度感受性変異株と医薬として許容されるビヒクルまたは担体とから成る医薬組成物。
【請求項３】
請求項１に記載の温度感受性変異株と医薬として許容される担体または希釈剤とから成るウマ科動物のＥＨＶ−１感染症の予防及び／または治療用ワクチン。
【請求項４】
ＥＨＶ−１感染症の予防及び／または治療用ワクチンを製造するための請求項１に記載の温度感受性変異株の使用。
【請求項５】
請求項４に記載のワクチンを動物に投与することから成るＥＨＶ−１感染に対する動物の免疫感作方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、ウマ流産ウイルス（ＥＨＶ−１）の突然変異体、該突然変異体の製造方法、該突然変異体の使用、及び、該突然変異体から誘導された生ワクチンに関する。
【０００２】
ヘルペスウイルスに属するウマ流産ウイルス（ＥＨＶ−１）は、ウイルス誘発性流産、不全麻痺のような神経疾患、上気道の感染症及びウマ新生児病（ｎｅｏｎａｔａｌ  ｆｏａｌ  ｄｉｓｅａｓｅ，ＮＦＤ）の原因となるウマの重大な病原体である。ＮＦＤは出産時期が迫った胎仔の経胎盤感染によって引き起こされ、このような胎仔は、生まれつき弱くて重い呼吸器疾患があったり、また、幾つかの場合には肝臓がＥＨＶ−１感染されて黄疸を呈したりする。これらの動物は通常は生後数日以内に死亡する。ウマの鼻肺炎ウイルス（ＥＨＶ−４）は急性気道疾患（“鼻肺炎”）の主因であり、生後２年以内に殆どのウマに感染する。鼻肺炎の特徴は、発熱、食欲不振、及び、次第に粘液膿性になる多量の鼻漿液の分泌である。稀なケースとして、ＥＨＶ４感染が妊娠した雌ウマの流産を引き起こすこともある。更に、ＥＨＶ１及びＥＨＶ４は終生持続する潜伏感染症として定着する。ウイルスが再活性化すると病気が再発し、これに付随してウイルスが飛散して他の動物に伝播する。
【０００３】
ウマのヘルペスウイルス感染及びそれらによる疾患のコントロール、特にＥＨＶ−１媒介流産、不全麻痺、及び、出産時期が迫った胎仔の経胎盤感染によって引き起こされるウマ新生児病のコントロールはまだ適切に行われていない。不活化ワクチン及び修飾した生ワクチンは存在しているが、どのワクチンも感染を十分に阻止できるとは考えられない。また、どのワクチンも野生型ウイルスの潜伏が定着することを予防できるとは考えられない。従って、これらのウイルスの野外感染の予防効果、特にＥＨＶ−１によって引き起こされる感染症の予防効果が改善された安全なワクチンが大いに要望されている。
【０００４】
本発明はこのようなワクチンを提供する。
【０００５】
第一の特徴によれば本発明は、Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ（ＥＣＡＣＣ），Ｓａｌｉｓｂｕｒｙ，Ｗｉｌｔｓｈｉｒｅ  ＳＰＡ  ０ＪＧ，ＵＫに１９９９年６月１０日付けで登録番号Ｎｏ．Ｖ９９０６１００１で寄託されたＥＨＶ−１  Ｔｓ変異株及びその後代を提供する。
【０００６】
本発明のＥＨＶ−１  Ｔｓ変異株は更に、以下の表現型的特徴を有している：
・複数のウマ細胞系で増殖したときに小プラーク（溶菌斑）を形成する、
・ウサギ腎細胞、特にＲＫ１３細胞では増殖能力を失う、及び、
・ウイルス血症を引き起こす能力は小さい。
【０００７】
本発明のＥＨＶ−１  Ｔｓ変異株は、その複製がコンベンショナルなウマ科動物の上気道に限定されており続発性のウイルス血症が全く見られないかまたは少ないという利点を有している。Ｔｓ変異株は上気道で増殖後に有意な免疫刺激を生じさせるるにもかかわらず妊娠した雌ウマに安全である。Ｔｓ変異株は動物から動物に容易に戻り継代しないので、伝播及び復帰の潜在能力は小さい。
【０００８】
本発明の目的に沿った“後代”の定義は、寄託されたＥＨＶ−１  Ｔｓ変異株のその後の連続継代によって得られたすべての株を包含する。
【０００９】
本発明の目的に沿った温度感受性変異株の定義は、野生型が正常に増殖するある温度以上で増殖が低下する突然変異ウイルスを意味する。本発明のＥＨＶ−１  Ｔｓ変異株は、宿主動物の体温で温度感受性であることを特徴とする。本発明のＥＨＶ−１  Ｔｓ変異株は３８．５℃−３９．０℃の温度以上で複製されない。好ましくは本発明のＥＨＶ−１  Ｔｓ変異株は３８．５℃の温度で複製されない。
【００１０】
本発明の目的に沿った小プラークの定義は、野生型親株によってウマ細胞中に形成されるプラークの少なくとも１／２−１／３の大きさのプラークを意味する。
【００１１】
本発明の目的に沿った“ウイルス血症を引き起こす能力が小さい”の定義は、ウイルス血症を引き起こす親株の能力に比べて１日から３日または４日までの間にウイルス血症を引き起こす能力が幾つかの動物では全く存在しないかまたは低グレード（即ち、漸く検出できる程度）であることを意味する。
【００１２】
本発明の温度感受性ＥＨＶ−１変異株は、感染したウシ、ウマまたはその他の許容細胞培養物を３４℃で無毒性濃度の５−ブロモ−２−デオキシウリジン、アザシチジンのような突然変異誘発物質によって処理し、次いでウシ、ウマまたはその他の許容細胞系中でこれらの処理培養物から後代ウイルスを生物クローニングすることによって得ることができる。
【００１３】
本発明のＴｓ変異株の有利な特性は、ワクチンを製造するために極めて好適に使用できることである。従って、本発明の第二の特徴によれば、本発明のＥＨＶ−１  Ｔｓ変異株と、医薬として許容される担体またはビヒクルとから成る組成物、特にワクチン組成物が提供される。より特定的には、本発明の（ワクチン）組成物は、ＥＣＡＣＣ，Ｓａｌｉｓｂｕｒｙ，ＵＫに寄託された登録番号Ｖ９９０６１００１を有するＥＨＶ−１  Ｔｓ変異株及び／またはその後代を含む。本発明のワクチンに好適に使用できる医薬として許容される担体またはビヒクルは、滅菌水、塩類溶液、ＰＢＳなどのような水性バッファである。更に、本発明のワクチンは、アジュバント、安定剤、抗酸化剤などのようなその他の添加剤を含有し得る。
【００１４】
本発明のワクチン組成物は安全であり、ウマ科動物のＥＨＶ−１感染症を臨床的及びウイルス的に予防するため、並びに、ウイルス誘発性の流産及び不全麻痺を予防するために使用できる。更に、本発明のワクチンは、経胎盤感染を阻止し、従って産まれたばかりのポニーのウマ新生児病を予防することが知見された。本発明のワクチン組成物は、ウマだけでなく、ロバ、シマウマなどのようなＥＨＶ−１感染受容性の別の動物にも投与できる。ＥＨＶ−１及びＥＨＶ−４の感染に受容性の畜牛もまた本発明のワクチンによって処置できる。
【００１５】
更に意外にも、本発明のＥＨＶ−１  Ｔｓ変異株を含むワクチンがＥＨＶ−１感染症を予防するだけでなくＥＨＶ−４感染による疾患及びこれに付随するウイルスの飛散を予防することが知見された。従ってこのようなワクチンは、ワクチン接種したウマ科動物の交差予防を得るために有効である。このようなワクチンでは予防の改善が得られるので、野生型ウイルスの感染を効果的に阻止する。
【００１６】
本発明のワクチン組成物は以下の標準手順によって調製できる。本発明のワクチンは好ましくは生ワクチンである。生ワクチンを製造するためには、ＥＨＶ−Ｔｓ変異株のシード（ｓｅｅｄ）ウイルスをウシまたはウマの腎細胞の一次または二次培養物のような細胞培養物で増殖させる。このようにして増殖させたウイルスは、組織細胞培養液及び／または組織培養細胞を収集することによって回収できる。場合によっては回収中に、増殖基板からの感染性粒子の遊離を改善する技術例えば音波処理によってウイルスの回収率を向上させてもよい。生ワクチンは懸濁液の形態で調製されてもよくまたは凍結乾燥されてもよい。
【００１７】
本発明のワクチンに使用できる適当な医薬として許容される担体は、滅菌水、塩類溶液、ＰＢＳなどのような水性バッファーである。更に、本発明のワクチンはアジュバント、安定剤、抗酸化剤などのような別の添加剤を含み得る。
【００１８】
適当な安定剤は例えば、ソルビトール、マンニトール、デンプン、スクロース、デキストラン及びグルコースのような糖質、アルブミン及びカゼインを非限定例とするタンパク質及びタンパク質分解産物、ウシ血清または脱脂乳のようなタンパク質含有物質、並びに、アルカリ金属リン酸塩を非限定例とするバッファーである。凍結乾燥ワクチン組成物には１種または複数の安定剤を添加するのが好ましい。
【００１９】
適当なアジュバントの非限定例は、水酸化アルミニウム、リン酸塩または酸化物、アンフィジェン、トコフェロール、モノホスフェニルリピドＡ、ムラミルジペプチド、油エマルジョン、グルカン、カーボマー、ブロックコポリマー、サイトカイン及びＱｕｉｌ  Ａのようなサポニンである。アジュバントの添加量はアジュバント自体の種類に依存する。
【００２０】
本発明のＥＨＶ−１  Ｔｓ変異株は好ましくは、胎仔も含む数日から数歳の年齢のコンベンショナルな血清反応陰性動物に投与される。ワクチンは、皮内、経口、噴霧、エアゾール、眼内及び鼻腔内投与を非限定例とする非腸管外経路で動物に投与できる。あるいは、ワクチンは腸管外投与経路で投与できる。好ましくはワクチンを皮内または鼻腔内投与する。
【００２１】
一般には、ＥＨＶ−１感染予防を誘発するために有効な量でＥＨＶ−１  Ｔｓ変異株ウイルスを投与する。投与量は一般に、投与経路、投与時間、並びに、ワクチン接種を受ける動物の年齢、健康及び食餌に依存するであろう。動物１頭あたり１０２−１０９ｐｆｕ／投与、好ましくは１０３−１０５ｐｆｕ／投与、より好ましくは１頭あたり１０４ｐｆｕ／投与の量でウイルスを投与できる。
【００２２】
本発明のワクチンはまた、別の生ワクチンまたは不活化ワクチンと同時的にまたは付随的に投与し得る。これらの追加ワクチンは非腸管外または腸管外の経路で投与できる。好ましくは追加ワクチンの腸管外投与が勧告される。
【００２３】
実施例
１．温度感受性変異株ＥＨＶ−１  ＴＳ  Ｃ１４７の単離及びキャラクタリゼーション
ちょうど集密になる日数まで培養したウマ皮膚（ｅｑｕｉｎｅ  ｄｅｒｍａｌ，ＥＤ）細胞の７５ｃｍ２の単層に０．００１のｍ．ｏ．ｉ．でＥＨＶ−１を感染させた。接種物（２．０ｍｌ）を吸着させ（１時間、３７℃）、除去し、単層をＰＢＳで洗浄し、次いで４０μｇ／ｍｌの５−ブロモ−２−デオキシウリジンを含有する組織培養培地（２５ｍｌ）を補給し、３４℃でインキュベートした。最大ＣＰＥに達すると（接種７日後）、培養物を回収し（−４０℃で凍結し次いで３７℃で解凍）、ＰＢＳに４℃で一夜透析し、３７℃のＥＤ細胞中のＥＨＶ−１感染力を滴定し、次いで、９６−ウェルの微量滴定プレートで増殖させたＥＤ細胞に３４℃でクローニングした。単一のＥＨＶ−１フォーカスをもつウェルを同定し、最大ＣＰＥまで増殖させ、次いで、ＥＤ細胞を使用して許容温度（３４℃）及び制限温度（３９℃）で表現型を判別するために少量（全量２００μｌ中の２０μｌ）のサンプルを使用した。温度感受性クローンを更にウシ腎細胞ＪＣＫ株（Ｊａｙの仔ウシ腎臓−Ｉｎｔｅｒｖｅｔ株）に継代接種し、マスター処理シードを作製した。
【００２４】
２．ＥＨＶ−１  ＴＳ  Ｃ１４７株の温度感受性表現型
マスターシードウイルス（ＭＳＶ）＋１°レベルのＥＨＶ−１  ＴＳ  Ｃ１４７株を、ウシ胎仔の肺（ＢＥＬ２６株−Ｉｎｔｅｒｖｅｔ株）、ウシ腎臓（Ｊａｙの仔ウシ腎臓，ＪＣＫ株−Ｉｎｔｅｒｖｅｔ株）、ウマ皮膚（ＥＤ）細胞、ウマ皮膚クローンＷ４８  Ｃ１０（ＥＤ  Ｗ４８  Ｃ１０−Ｉｎｔｅｒｖｅｔ株）及びウマ皮膚クローンＷ７  Ｃ５（ＥＤ  Ｗ７  Ｃ５−Ｉｎｔｅｒｖｅｔ株）中で３７℃及び３８．５℃で平行滴定した。ＭＳＶ＋１°継代レベルのウイルスは３８．５℃で増殖できなかった。結果を表１に示す。
【００２５】
３．ＥＨＶ−１  ＴＳ  Ｃ１４７株はＥＨＶ−４様の特性をもつ
ＥＨＶ−１とＥＨＶ−４とを識別するためのパラメーターは、ウサギ腎（ＲＫ１３）細胞中の複製能力である。ＥＨＶ−１株はＲＫ１３細胞中で複製できるが、この細胞はＥＨＶ−４株に不応性である。ＭＳＶ＋１°レベルのＥＨＶ−１  ＴＳ  Ｃ１４７株、その野生型親株であるＥＨＶ−１株、ｉｍｍｅｄｉａｔｅ  ｅａｒｌｙ  ｇｅｎｅが欠失したＥＨＶ−１株（ＥＨＶ−１  ＩＥ）、病原性ＥＨＶ−１株ＣＨＬｉ及びＥＨＶ−４の野外単離物をＲＫ１３細胞及びウマ皮膚（ＥＤ）細胞中で３７℃で平行滴定した。表２の結果は、ＴＳ  Ｃ１４７株を含む４つのＥＨＶ−１株及びＥＨＶ−４株がＥＤ細胞中では複製され得るが、ＥＨＶ−１  ＴＳ  Ｃ１４７株及びＥＨＶ−４株はＲＫ１３細胞中で複製されなかったことを示す。
【００２６】
【表１】
2004532601.tif 000002
（ａ）５日間のインキュベーション後の力価；＜１．１  ｌｏｇ１０  ＴＣＩＤ５０／ｍｌとして表される力価は、滴定試験した４×２００μｌの最低希釈度（１０−１）のウイルス中にＥＨＶ−１フォーカスが検出されなかったことを表す。
【００２７】
【表２】
2004532601.tif 000003
ａ＝＜１．１  ｌｏｇ１０  ＴＣＩＤ５０／ｍｌとして表される力価は滴定した４×２００μｌの最低希釈度（１０−１）中にＥＨＶ−１  ＣＰＥが検出されなかったことを表す。
【００２８】
４．コンベンショナルポニーのＥＨＶ−１感染及びＥＨＶ−４感染に対する臨床的及びウィルス学的な予防
ＥＨＶ−１中和（ＶＮ）抗体が少ないかまたは存在しない２９頭のコンベンショナルポニーのうち、１５頭には５．３  ｌｏｇ１０  ＴＣＩＤ５０の用量のＥＨＶ−１  ＴＳ  Ｃ１４７株を鼻腔内（ＩＮ）にワクチン接種し、ワクチン非接種対照とするために１４頭にはワクチン接種しなかった。一回のＩＮワクチン接種の約１カ月後、ワクチン接種した８頭のポニー及びワクチン接種しない８頭のポニー（対照）には野外ＥＨＶ−１株をＩＮでチャレンジ投与し、ＥＨＶ−１ワクチン接種した７頭と対照の６頭とから成るグループにはＥＨＶ−４の新しい野外単離物をＩＮでチャレンジ投与した。ワクチン接種及びチャレンジ投与の後、動物の臨床反応、鼻腔粘液中のウイルス飛散、感染白血球（ウイルス血症）及びＥＨＶ−１中和抗体をモニターした。
【００２９】
１５頭のポニーのうちの１１頭では１−８日間でワクチンウイルスが低い力価に増殖し（鼻腔粘液ピーク力価１．５−３．０  ｌｏｇ１０  ＴＣＩＤ５０／ｍｌ）、また、１５頭の動物のうちの７頭では１−４日間で低グレード（漸く検出できる程度）の白血球ウイルス血症が生じた。しかしながら１５頭のポニー全部が血清変換（ｓｅｒｏｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ）していた。対照的に、それぞれ１０日間または１４日間毎日モニターした１４頭の対照ポニーの鼻腔粘液または血液からはＥＨＶ−１が全く回収されず、動物はチャレンジ感染の後までＥＨＶ−１に対して血清反応陰性のままであった。２つのグループ（ワクチン接種群及び対照群）の各々に属する１０頭の動物で同レベルの発熱が観察された。これらの所見を表３にまとめる。
【００３０】
ＥＨＶ−１の鼻腔内チャレンジ投与後、ワクチン接種したポニーの鼻腔粘液に排出されたウイルスは対照動物から回収されたウイルスに比べてかなり減少していた。同様に、８頭中の７頭では１回のワクチン接種によって白血球ウイルス血症が予防されたが、１頭は１日でウイルス陽性になった。しかしながら対照的に、ワクチン接種しなかったポニーは８頭全部がウイルス血症になり、７頭は３−４日で、１頭は１日でウイルス血症になった。対照ポニーは８頭全部が１−６日で微熱から高熱の発熱を生じたが、ワクチン接種した動物は８頭全部が平熱を維持していた。ワクチン接種した動物はチャレンジ感染に対して８頭全部が免疫記憶的に反応しなかったが、対照動物は８頭全部が有意なＥＨＶ−１中和抗体で反応した。これらの所見を表４にまとめる。
【００３１】
ＥＨＶ−４の鼻腔内チャレンジ投与後、ワクチン接種したポニーでは７頭中の１頭の鼻腔粘液からウイルスが一回だけ回収されたが、対照ポニーでは６頭全部が２−３日で有意に増加した力価のウイルスを排出した。例外は１頭であった。ＥＨＶ−１ワクチン接種したポニーは７頭全部がウイルス血症にならなかったが、対照的に対照ポニーは６頭中の３頭が１−３日間でウイルス血症になった。ＥＨＶ−４のチャレンジ感染に対しては、対照動物は６頭中の３頭が２−３日の発熱を生じたが、ワクチン接種したポニーは７頭全部が影響をうけなかった。ワクチン接種した動物では７頭中の４頭及び対照動物では６頭中の５頭でそれぞれ１−３日及び２−６日の多少の呼吸数増加が見られた（１５−２０呼息／分）。これらの所見を表５にまとめる。
【００３２】
【表３】
2004532601.tif 000004
【００３３】
【表４】
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【００３４】
【表５】
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【００３５】
５．ＥＨＶ−１感染が原因のウマの不全麻痺及び流産の予防方法
ＥＨＶ−１中和（ＶＮ）抗体が少ないかまたは存在しない１２頭の妊娠雌ウマに対して、そのうちの６頭には妊娠約６カ月目にワクチンを鼻腔内（ＩＮ）接種し、次いで１２頭の雌ウマ全部に、ＥＨＶ−１流産の危険が最も高い妊娠時期、即ち妊娠約９カ月目に病原性ＥＨＶ−１株をＩＮでチャレンジ投与した。ワクチン接種及びチャレンジ投与の後、動物の臨床反応、鼻腔粘液中のウイルス飛散、感染白血球（ウイルス血症）及びＥＨＶ−１中和抗体をモニターした。
【００３６】
ワクチン接種した雌ウマでは６頭全部の鼻腔粘液からワクチンウイルスは全く回収されなかったが、６頭中の５頭で低グレードの一過性（１−３日）ウイルス血症が検出され、６頭全部がＥＨＶ−１に対する有意なＶＮ抗体をもつように血清変換していた。ワクチン接種した動物と平行に１０−１４日間モニターした対照雌ウマでは６頭全部の鼻腔粘液または白血球からＥＨＶ−１が検出されなかったが、６頭中の１頭はほぼ２カ月半後に血清変換を示した。これらの所見を表６にまとめる。
【００３７】
チャレンジ投与の後、ワクチン接種した雌ウマでは鼻腔粘液中に排出されたウイルスが有意に減少していた（６頭中の５頭から６頭中の２頭に減少、１−２日で２．４−３．７  ｌｏｇ１０  ＴＣＩＤ５０／ｍｌから１．５−１．７  ｌｏｇ１０  ＴＣＩＤ５０／ｍｌに減少）。また、ワクチン接種しなかった対照雌ウマでは６頭中の５頭がウイルス血症になったが、ワクチン接種した雌ウマは６頭全部がウイルス血症にならなかった。対照グループの雌ウマは６頭中の５頭が１−５日で発熱し、３頭は不全麻痺が進行して重い黄疸が併発し、２頭は子宮頸部のプラグが崩壊して胎児駆出の徴候を示した。この２頭のうちの１頭は死亡したが、もう１頭は最終的に安楽死させなければならなかった。双方の動物の胎仔は死亡していた。別の３頭の雌ウマは流産した。５つの胎仔の胎内組織はＥＨＶ−１陽性であった。しかしながら対照的に、ワクチン接種した雌ウマは６頭全部が正常に出産した。ワクチン接種した雌ウマで観察された唯一の臨床反応は６頭中の１頭が示した一過性（１日）の発熱であった。正常に出産した対照雌ウマはチャレンジ投与の直前に実際には血清変換していた。これらの所見を表７に示す。
【００３８】
【表６】
2004532601.tif 000007
ａ＝動物をワクチン接種グループから隔離しておいたのでモニターしなかった。
【００３９】
【表７】
2004532601.tif 000008
５＋  対照雌ウマは、グループ１の雌ウマのワクチン接種の３カ月後の採血で血清反応陰性であったがチャレンジ投与前に血清変換していた。
【００４０】
６．妊娠雌ウマに対するＥＨＶ−１  ＴＳ  Ｃ１４７の安全性
妊娠約９カ月（ＥＨＶ−１流産の危険が最も高い時期）の４頭の雌ウマに保護用量の１０倍量を自然経路で接種し、流産をモニターした。表８の結果は、これらの雌ウマは４頭全部がＥＨＶ−１に対して血清変換されたこと、４頭中の１頭が一過性のウイルス血症になったが正常に出産したことを示す。これらのポニーがそれぞれの母乳を飲む前に採取した血液サンプル中のＥＨＶ−１  ＶＮ抗体は４頭中の３頭で陰性であったが、１頭は初乳摂取に起因するＶＮ抗体陽性を示した（モニター期間の中間の早い時間に産まれた）。これらの結果を表８にまとめる。
【００４１】
【表８】
2004532601.tif 000009
ａ＝誕生時のＥＨＶ−１中和抗体
ｂ＝モニター期間の中間の早い時間に誕生し、誕生後少なくとも３時間を経過したポニーから採血した。
ｃ＝未解決、即ち、試験待ち。
【００４２】
７．ターゲット種の間でＥＨＶ−１  ＴＳ  Ｃ１４７伝播は生じない
ＥＨＶ−実験に使用されたことのない（すべてのタイプの）離乳したポニー（特定病原体非含有のＳＰＦポニー）で戻し継代試験を実施した。
【００４３】
２頭のＳＰＦポニーに、保護用量の１０倍量のマスタシードウイルス＋１°継代レベルのＥＨＶ−１  ＴＳ  Ｃ１４７株を鼻腔内（ＩＮ）接種し、数日間にわたって収集したウイルス陽性鼻腔粘液を使用して別の２頭のポニーに同様に感染させた。ＩＮ接種後、ポニーの（ｉ）鼻腔粘液中のウイルス飛散、（ｉｉ）臨床反応及び（ｉｉｉ）ＥＨＶ−１に対する血清変換をモニターした。
【００４４】
ＭＳＶ＋１°レベルのＥＨＶ−１  ＴＳ  Ｃ１４７株を与えたポニーは鼻腔粘液中にウイルスを排出し、血清変換を示した。しかしながら、ウイルス陽性鼻腔粘液サンプルのプールはＥＨＶ−１実験に使用されたことのない別の２頭のポニーに感染できなかった。これは、これらのポニーの鼻腔粘液からＥＨＶ−１を回収できなかったこと、及び、ＥＨＶ−１に対する血清変換を示さなかったことから判断した。別の４頭のＳＰＦポニーで試験を繰り返すことによって、即ち、２頭にＭＳＶ＋１°で接種し次いで別の２頭に最初の２頭のポニーから採取したウイルス陽性鼻腔粘液を与えることによってこれらの結果を確認した。結果を表９及び１０にまとめる。
【００４５】
【表９】
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【００４６】
【表１０】
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【国際公開パンフレット】
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2004532601.tif 000014
2004532601.tif 000015
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2004532601.tif 000020
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【国際調査報告】
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2004532601.tif 000030
2004532601.tif 000031