(57)【要約】遺伝子およびｍＲＮＡの配列の３’非翻訳領域（ＵＴＲ）に存在するアデニレート−ウリジレート−富化（ＡＲＥ）エレメントが開示される。このＡＲＥモチーフは、さらなる制限とともに、配列番号１または配列番号２によって包含される配列を含む。ＡＲＥエレメントを含むデータベース中の遺伝子またはコード配列を同定するコンピューターを用いる方法が開示される。このコンピューターを用いる方法は、遺伝子発見および配列分析に用いられ得る。ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、ハイブリダイゼーションなどを用いてＡＲＥエレメント関連ポリヌクレオチドを同定、単離、および増幅する方法が開示される。ＡＲＥエレメントに関するＰＣＲプライマー、オリゴヌクレオチドアレイ、ポリヌクレオチドライブラリー、コンピュータープログラム、およびコンピューターシステムが開示される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞における遺伝子発現を分析するために１セットの核酸を選択する方法であって、該方法は、以下：
ａ）複数の核酸配列を含むデータベースを提供する工程であって、該核酸配列の各々が、タンパク質コード配列の全長または部分長、ならびに該タンパク質コード配列の下流に隣接している３’非翻訳領域配列を含む、工程；
ｂ）３’非翻訳領域（ＵＴＲ）の上流に隣接して位置する１セットのタンパク質コード配列を同定することによって、該データベースから該タンパク質コード配列を抽出する工程であって、該３’非翻訳領域（ＵＴＲ）が、以下の標的配列：
ｉ）第一標的配列ＷＵ／Ｔ（ＡＵ／ＴＵ／ＴＵ／ＴＡ）Ｕ／ＴＷＷＷであって、ここでこの括弧の外側のヌクレオチドが、異なるヌクレオチドで置換されていないか、またはそのうち１つが異なるヌクレオチドで置換されており、ここでＷがＡ，Ｕ、もしくはＴを示す、第一標的配列；または
ｉｉ）第二標的配列Ｕ／Ｔ（ＡＵ／ＴＵ／ＴＵ／Ｔ）ｎであって、ここでｎは、該第二標的配列がこの括弧内の四量体配列のうち３〜１２を含むことを示す、第二標的配列、
の１つを含む、工程、
を包含する、方法。
【請求項２】
前記データベースが、ｍＲＮＡ配列、ｃＤＮＡ配列、またはその両方を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記データベースがゲノム配列を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記データベースがゲノム配列を含む、請求項１に記載の方法であって、該方法はさらに、前記セットから、前記３’ＵＴＲ以外の領域において標的配列を有する遺伝子の前記タンパク質コード配列を除外する工程、
を包含する、方法。
【請求項５】
細胞における遺伝子発現を分析するための核酸分子のライブラリーを調製する方法であって、以下：
ａ）２つ以上の核酸分子の群を獲得する工程であって、ここで該核酸分子のタンパク質コード配列は、請求項１に記載の方法によって選択され、該核酸分子の各々の該タンパク質コード配列は、該群における他の核酸分子のタンパク質コード配列とは異なる、工程、および
ｂ）該核酸分子の各々を別々の核酸ベクターに組み込んで該ライブラリーを提供する工程、
を包含する、方法。
【請求項６】
前記核酸分子を配列決定する工程をさらに包含する、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
請求項５に記載の方法によって調製された、核酸ライブラリー。
【請求項８】
前記核酸分子が、表６に同定された核酸のコード配列またはそのフラグメントを含む、請求項７に記載の核酸ライブラリー。
【請求項９】
請求項８に記載の核酸ライブラリーであって、該ライブラリーは、タンパク質コード配列が、標的配列を欠く３’ＵＴＲに連続する核酸分子を実質的に含まない、核酸ライブラリー。
【請求項１０】
細胞中のＡＲＥ遺伝子の発現を分析するための、カスタマイズされたアレイを調製する方法であって、該方法は、以下：
（ａ）請求項１に記載の方法によって選択した複数の前記核酸分子の前記タンパク質コード配列を決定する工程；
（ｂ）該核酸分子の各々についての遺伝子プローブを固体支持体に結合させて該アレイを提供する工程、
を包含し、
ここで該プローブの各々が、該タンパク質コード配列またはその相補体内の標的領域に対して、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、
ここで、該プローブの各々が、ヌクレオチドを含む、オリゴヌクレオチド、ｃＤＮＡ分子、または合成遺伝子プローブである、方法。
【請求項１１】
請求項１０に記載の方法によって調製された、カスタマイズされたアレイ。
【請求項１２】
前記アレイが、表６に列挙された核酸に対する複数のプローブを含む、請求項１１に記載のカスタマイズされたアレイ。
【請求項１３】
請求項１２に記載のカスタマイズされたアレイであって、該アレイ上の前記プローブの２０％未満が、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、非ＡＲＥ遺伝子のタンパク質コード配列に結合する、カスタマイズされたアレイ。
【請求項１４】
請求項１２に記載のカスタマイズされたアレイであって、該アレイ上の前記プローブの１０％未満が、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、非ＡＲＥ遺伝子のタンパク質コード配列に結合する、カスタマイズされたアレイ。
【請求項１５】
請求項１２に記載のカスタマイズされたアレイであって、前記プローブが、少なくとも１０ヌクレオチド長であるオリゴヌクレオチドであり、該オリゴヌクレオチドのＧＣ含量が少なくとも４０％であり、そして該オリゴヌクレオチドがヘアピン構造を形成しない、カスタマイズされたアレイ。
【請求項１６】
前記タンパク質コード配列が、ゲノムデータベースからの抽出によって選択される、請求項１１に記載のカスタマイズされたアレイ。
【請求項１７】
ゲノムデータベースからＡＲＥ遺伝子を抽出する方法であって、以下：
ａ）ＡＲＥモチーフを含むゲノム領域を同定する工程；
ｂ）該ゲノム領域の上流であるタンパク質コード領域を位置付ける工程；および
ｃ）工程ｂ）において位置付けられた該ゲノム領域をコンピューター遺伝子推定プログラムに供して、該コード領域および推定アミノ酸配列の出力を得る工程、
を包含する、方法。
【請求項１８】
前記ゲノム領域が、前記ＡＲＥモチーフの６〜２０キロベース上流かつ１〜３キロベース下流に位置するゲノム領域を分析することによって位置決定される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
請求項１に記載の方法によって選択された核酸を用いてＡＲＥ遺伝子のカスタマイズされたアレイを調製する方法であって、該方法は、以下：
ａ）請求項１に記載の方法によって選択したＡＲＥ遺伝子の前記タンパク質コード配列内の特有の配列の群を同定する工程；
ｂ）１セットのオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを調製する工程であって、ここで該セットにおける各オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドは、該群の中の該特有の配列のうちの１つを含む、工程；および
ｃ）該オリゴヌクレオチドまたは該ポリヌクレオチドを固体支持体に結合させる工程、
を包含する、方法。
【請求項２０】
請求項１９に記載の方法であって、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの前記セットが、以下：
ａ）ＤＮＡサンプルまたはＲＮＡサンプルを得る工程；
ｂ）前記特有の配列に特異的なプライマーを用いて該サンプルをＰＣＲ増幅して、該オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを提供する工程、
によって調製される、方法。
【請求項２１】
３’非翻訳領域がＡＲＥ配列を含む遺伝子の開始領域に標的化されたプライマーセットを同定するための方法であって、以下：
ａ）複数の遺伝子のタンパク質コード配列の開始コドンを位置付ける工程であって、該遺伝子の３’ＵＴＲが以下の標的配列：
ｉ）第一標的配列ＷＵ／Ｔ（ＡＵ／ＴＵ／ＴＵ／ＴＡ）Ｕ／ＴＷＷＷ（配列番号１）であって、ここでこの括弧の外側の該ヌクレオチドが、異なるヌクレオチドで置換されていないか、またはそのうち１つが異なるヌクレオチドで置換されており、ここでＷがＡ，Ｕ、もしくはＴを示す、第一標的配列；または
ｉｉ）第二標的配列Ｕ／Ｔ（ＡＵ／ＴＵ／ＴＵ／Ｔ）ｎ（配列番号２）であって、ここでｎは、該第二標的配列がこの括弧内の四量体配列のうち３〜１２を含むことを示す、第二標的配列、
のうち１つを含む、工程；
ｂ）該遺伝子を以下：
ｉ）開始コドンが３’末端に結合されたＡを有するＡＴＧａ遺伝子、および
ｉｉ）開始コドンが３’末端に結合されたＣを有するＡＴＧｃ遺伝子、
ｉｉｉ）開始コドンが３’末端に結合されたＧを有するＡＴＧｇ遺伝子、
ｉｖ）開始コドンが３’末端に結合されたＴを有するＡＴＧｔ遺伝子、
からなる群より選択されるクラスにグループ分けする工程；ならびに
ｃ）該開始コドンの直ぐ上流に位置する９ヌクレオチド、および該開始コドンの直ぐ下流に位置する該ヌクレオチドを分析することによって該クラスの各々についてのコンセンサス配列を構築する工程、
を包含し、
ここで該コンセンサス配列の各々は１３ヌクレオチド長であり、
該コンセンサス配列の各々は、関連のクラスにおける遺伝子の少なくとも７５％を包含し、そして
該４つのコンセンサス配列の各々によって包含される該オリゴヌクレオチドが１つのプライマーセットである、
方法。
【請求項２２】
前記コンセンサス配列の各々が、その関連群における前記遺伝子の少なくとも９０％の配列を包含する、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
３’非翻訳領域がＡＲＥ配列を含む遺伝子の開始領域に標的化されたプライマーセットを同定するための方法であって、以下：
ａ）複数の遺伝子のタンパク質コード配列の開始コドンを位置付ける工程であって、該遺伝子の３’ＵＴＲが以下の標的配列：
ｉ）第一標的配列ＷＵ／Ｔ（ＡＵ／ＴＵ／ＴＵ／ＴＡ）Ｕ／ＴＷＷＷ（配列番号１）であって、ここでこの括弧の外側の該ヌクレオチドが、異なるヌクレオチドで置換されていないか、またはそのうち１つが異なるヌクレオチドで置換されており、ここでＷがＡ，Ｕ、もしくはＴを示す、第一標的配列；または
ｉｉ）第二標的配列Ｕ／Ｔ（ＡＵ／ＴＵ／ＴＵ／Ｔ）ｎ（配列番号２）であって、ここでｎは、該第二標的配列がこの括弧内の四量体配列のうち３〜１２を含むことを示す、第二標的配列、
のうち１つを含む、工程；
ｂ）該遺伝子を以下の１６のクラス：
ｉ）開始コドンＡＴＧが５’末端に結合されたＡ、および３’末端に結合されたＡを有するＡＡＴＧａ遺伝子、
ｉｉ）開始コドンＡＴＧが５’末端に結合されたＣ、および３’末端に結合されたＡを有するＣＡＴＧａ遺伝子、
ｉｉｉ）開始コドンＡＴＧが５’末端に結合されたＧ、および３’末端に結合されたＡを有するＧＡＴＧａ遺伝子、
ｉｖ）開始コドンＡＴＧが５’末端に結合されたＴ、および３’末端に結合されたＡを有するＴＡＴＧｔ遺伝子、
ｖ）開始コドンＡＴＧが５’末端に結合されたＡ、および３’末端に結合されたｃを有するＡＡＴＧｃ遺伝子、
ｖｉ）開始コドンＡＴＧが５’末端に結合されたＣ、および３’末端に結合されたｃを有するＣＡＴＧｃ遺伝子、
ｖｉｉ）開始コドンＡＴＧが５’末端に結合されたＧ、および３’末端に結合されたＣを有するＧＡＴＧｃ遺伝子、
ｖｉｉｉ）開始コドンＡＴＧが５’末端に結合されたＴ、および３’末端に結合されたＣを有するＴＡＧｃ遺伝子、
ｉｘ）開始コドンＡＴＧが５’末端に結合されたＡ、および５’末端に結合されたＧを有するＡＴＧｇ遺伝子、
ｘ）開始コドンＡＴＧが５’末端に結合されたＣ、および３’末端に結合されたＧを有するＣＡＴＧｇ遺伝子、
ｘｉ）開始コドンＡＴＧが５’末端に結合されたＧ、および３’末端に結合されたＧを有するＧＡＴＧｇ遺伝子、
ｘｉｉ）開始コドンＡＴＧが５’末端に結合されたＴ、および３’末端に結合されたＧを有するＴＡＴＧｇ遺伝子、
ｘｉｉｉ）開始コドンＡＴＧが５’末端に結合されたＡ、および３’末端に結合されたＴを有するＡＴＧｔ遺伝子、
ｘｉｖ）開始コドンＡＴＧが５’末端に結合されたＣ、および３’末端に結合されたＴを有するＣＡＴＧｔ遺伝子、
ｘｖ）開始コドンＡＴＧが５’末端に結合されたＧ、および３’末端に結合されたＴを有するＧＡＴＧｔ遺伝子、ならびに
ｘｖｉ）開始コドンＡＴＧが５’末端に結合されたＴ、および３’末端に結合されたＴを有するＴＡＴＧｔ遺伝子、
のうちの１つにグループ分けする工程；ならびに
ｃ）開始コドンの直ぐ上流に位置する９ヌクレオチド、および開始コドンの直ぐ下流に位置する単一ヌクレオチドを分析することによって該クラスの各々についてのコンセンサス配列を構築する工程、
を包含し、
ここで該コンセンサス配列の各々は１３ヌクレオチド長であり、そして開始コドンおよびその３’末端に結合されたヌクレオチドを含み、
該コンセンサス配列の各々は、関連の群における該遺伝子の少なくとも７５％を示し、そして
該１６のコンセンサス配列の各々によって包含される該オリゴヌクレオチドが１つのプライマーセットである、
方法。
【請求項２４】
前記コンセンサス配列の各々が、その関連群における前記遺伝子の少なくとも９０％の配列を包含する、請求項６０に記載の方法。
【請求項２５】
ＡＲＥ遺伝子転写物を選択的に増幅する方法であって、該方法は、以下：
ａ）オリゴｄＴプライマーおよび逆転写酵素を用いて、１つ以上のＡＲＥ遺伝子を発現する細胞から得たＲＮＡ分子を逆転写して、一本鎖ＤＮＡ分子のプールを提供する工程；
ｂ）ポリメラーゼ連鎖反応によって、該プール内のＡＲＥ含有ＤＮＡ分子の一部を増幅する工程であって、該ポリメラーゼ連鎖反応は、以下：
ｉ）１３〜５０ヌクレオチド長であり、そしてＴＡＡＡＴ配列を有する２〜１０のペンタマーを含む３’プライマーであって、該ペンタマー配列は重複しているかまたは重複していない、３’プライマー；および
ｉｉ）請求項２１に記載の方法によって得られた５’プライマーセットのうち１つによって包含される１つ以上のプライマー、
を使用する、工程、
を包含する、方法。
【請求項２６】
請求項２５に記載の方法であって、該方法は、配列が以下：
ＶＲＶＶＲＶＶＡＴＧＡＶ（配列番号１６）、
ＶＶＶＤＲＶＢＡＴＧＣＨ（配列番号１７）、
ＶＶＢＲＶＶＡＴＧＧＭ（配列番号１８）、
ＶＤＢＶＲＨＶＡＴＧＴＹ（配列番号１９）、
からなる群より選択されるコンセンサス配列によって包含される２つ以上の５’プライマーを使用する、方法。
【請求項２７】
前記工程（ｂ）によって生成されるＡＲＥ含有ＤＮＡ分子を配列決定する工程をさらに含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
細胞における遺伝子発現を分析するための核酸分子のライブラリーを調製する方法であって、該方法は、以下：
ａ）２つ以上の核酸分子の群を獲得する工程であって、該核酸分子のタンパク質コード配列は、請求項２７に記載の方法によって同定され、該２つ以上の核酸分子の各々の該タンパク質コード配列は、該群における他の核酸分子のタンパク質コード配列とは異なる、工程、および
ｂ）該核酸分子の各々を別々の核酸ベクターに組み込んで該ライブラリーを提供する工程、
を包含する、方法。
【請求項２９】
請求項２８に記載の方法によって調製された、核酸ライブラリー。
【請求項３０】
前記核酸分子が、図７に同定された核酸分子の前記コード配列またはそのフラグメントを含む、請求項２９に記載の核酸ライブラリー。
【請求項３１】
請求項３０に記載の核酸ライブラリーであって、該ライブラリーは、タンパク質コード配列が、前記標的配列を含む３’ＵＴＲと連続していない核酸分子を実質的に含まない、核酸ライブラリー。
【請求項３２】
細胞中のＡＲＥ遺伝子の発現を分析するためのカスタマイズされたアレイを調製する方法であって、該方法は、以下：
（ａ）請求項２５に記載の方法によって増幅した複数のＡＲＥ核酸分子の前記タンパク質コード配列を決定する工程；
（ｂ）該核酸分子の各々についての遺伝子プローブを固体支持体に結合させて該アレイを提供する工程、
を包含し、
ここで、該プローブの各々が、ストリンジェントな条件下で、該タンパク質コード配列またはその相補体内の標的領域にハイブリダイズし、そして
該プローブの各々が、核酸塩基を含む、オリゴヌクレオチド、ｃＤＮＡ分子、または合成遺伝子プローブである、方法。
【請求項３３】
請求項３２に記載の方法によって調製された、カスタマイズされたアレイ。
【請求項３４】
請求項３３に記載のカスタマイズされたアレイであって、前記プローブが少なくとも１０ヌクレオチド長であるオリゴヌクレオチドであり、該オリゴヌクレオチドのＧＣ含量が少なくとも４０％であり、そして該オリゴヌクレオチドがヘアピン構造を形成しない、カスタマイズされたアレイ。
【請求項３５】
ＡＲＥ遺伝子の発現を分析するためのカスタマイズされたアレイであって、該アレイは、図７に列挙される配列を含む核酸に対してストリンジェントな条件下で結合する複数のプローブを含む、カスタマイズされたアレイ。
【請求項３６】
請求項３５に記載のカスタマイズされたアレイであって、該アレイ上の前記プローブの２０％未満が、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、非ＡＲＥ遺伝子のタンパク質コード配列に結合する、カスタマイズされたアレイ。
【請求項３７】
請求項３５に記載のカスタマイズされたアレイであって、該アレイ上の前記プローブの１０％未満が、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、非ＡＲＥ遺伝子のタンパク質コード配列に結合する、カスタマイズされたアレイ。
【請求項３８】
請求項３５に記載のカスタマイズされたアレイであって、前記プローブが、少なくとも１０ヌクレオチド長であるオリゴヌクレオチドであり、該オリゴヌクレオチドのＧＣ含量が少なくとも４０％であり、そして該オリゴヌクレオチドがヘアピン構造を形成しない、カスタマイズされたアレイ。
【請求項３９】
ＡＲＥ遺伝子転写物を選択的に増幅する方法であって、該方法は、以下：
ａ）オリゴｄＴプライマーおよび逆転写酵素を用いて、１つ以上のＡＲＥ遺伝子を発現する細胞から得たＲＮＡ分子を逆転写して、一本鎖ＤＮＡ分子のプールを提供する工程；
ｂ）ポリメラーゼ連鎖反応によって、該プール内のＡＲＥ含有ＤＮＡ分子の一部を増幅する工程であって、該ポリメラーゼ連鎖反応は、以下：
ｉ）１３〜５０ヌクレオチド長であり、そしてＴＡＡＡＴ配列を有する２〜１０のペンタマーを含む３’プライマーであって、該ペンタマー配列は重複しているかまたは重複していない、３’プライマー；および
ｉｉ）請求項２３に記載の方法によって得られた５’プライマーセットのうち１つによって包含される１つ以上のプライマー、
を使用する、工程、
を包含する、方法。
【請求項４０】
請求項３９に記載の方法であって、該方法は、配列が以下：
ＢＨＤＶＭＭＡＡＴＧＡＶ（配列番号２０）、
ＢＳＨＭＲＶＣＡＴＧＡＶ（配列番号２１）、
ＨＢＶＶＲＶＧＡＴＧＡＤ（配列番号２２）、
ＢＤＤＶＲＨＴＡＴＧＡＭ（配列番号２３）、
ＨＤＤＶＲＢＡＡＴＧＣＤ（配列番号２４）、
ＶＲＳＶＲＭＣＡＴＧＣＢ（配列番号２５）、
ＳＳＢＢＲＭＧＡＴＧＣＢ（配列番号２６）、
ＶＢＤＷＷＲＴＡＴＧＣＭ（配列番号２７）、
ＶＶＢＶＲＭＡＡＴＧＧＶ（配列番号２８）、
ＶＶＶＶＲＳＣＡＴＧＧＭ（配列番号２９）、
ＢＶＶＳＲＶＧＡＴＧＧＭ（配列番号３０）、
ＶＤＢＨＲＢＴＡＴＧＧＭ（配列番号３１）、
ＤＲＢＶＲＭＡＡＴＧＴＹ（配列番号３２）、
ＢＶＢＭＲＹＣＡＴＧＴＳ（配列番号３３）、
ＶＤＢＶＲＲＧＡＴＧＴＹ（配列番号３４）、
ＤＶＢＶＷＤＴＡＴＧＴＹ（配列番号３５）、およびそれらの組み合わせ、
からなる群より選択されるコンセンサス配列によって包含される２つ以上の５’プライマーを使用する、方法。
【請求項４１】
前記工程（ｂ）によって生成されるＡＲＥ含有ＤＮＡ分子を配列決定する工程をさらに包含する、請求項３９に記載の方法。
【請求項４２】
細胞における遺伝子発現を分析するための核酸分子のライブラリーを調製する方法であって、該方法は、以下：
ａ）２つ以上の核酸分子の群を獲得する工程であって、該核酸分子のタンパク質コード配列は、請求項４１に記載の方法によって同定され、該２つ以上の核酸分子の各々の該タンパク質コード配列は、該群における他の核酸分子のタンパク質コード配列とは異なる、工程、および
ｂ）該核酸分子の各々を別々の核酸ベクターに組み込んで該ライブラリーを提供する工程、
を包含する、方法。
【請求項４３】
請求項２０４に記載の方法によって調製された、核酸ライブラリー。
【請求項４４】
請求項４３に記載の核酸ライブラリーであって、該ライブラリーは、タンパク質コード配列が、標的配列を含む３’ＵＴＲと連続していない核酸分子を実質的に含まない、核酸ライブラリー。
【請求項４５】
細胞中の遺伝子発現を分析するためのカスタマイズされたアレイを調製する方法であって、該方法は、以下：
（ａ）請求項３９に記載の方法によって増幅した複数のＡＲＥ核酸分子の前記タンパク質コード配列を決定する工程；
（ｂ）該核酸分子の各々についての遺伝子プローブを固体支持体に結合させて該アレイを提供する工程、
を包含し、
ここで、該プローブが、ストリンジェントな条件下で、該タンパク質コード配列またはその相補体内の標的領域にハイブリダイズし、そして
該プローブが、核酸塩基を含む、オリゴヌクレオチド、ｃＤＮＡ分子、または合成遺伝子プローブである、方法。
【請求項４６】
請求項４５に記載の方法によって調製された、カスタマイズされたアレイ。
【請求項４７】
請求項４６に記載のカスタマイズされたアレイであって、該アレイ上の前記プローブの２０％未満が、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、非ＡＲＥ遺伝子のタンパク質コード配列に結合する、カスタマイズされたアレイ。
【請求項４８】
請求項４６に記載のカスタマイズされたアレイであって、該アレイ上の前記プローブの１０％未満が、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、非ＡＲＥ遺伝子のタンパク質コード配列に結合する、カスタマイズされたアレイ。
【請求項４９】
請求項４６に記載のカスタマイズされたアレイであって、前記プローブが、少なくとも１０ヌクレオチド長であるオリゴヌクレオチドであり、該オリゴヌクレオチドのＧＣ含量が少なくとも４０％であり、そして該オリゴヌクレオチドがヘアピン構造を形成しない、カスタマイズされたアレイ。
【請求項５０】
ＡＲＥ遺伝子転写物を選択的に増幅する方法であって、該方法は、以下：
ａ）逆転写酵素および５’末端にＮＨ２基を有するオリゴｄＴプライマーを用いて、１つ以上のＡＲＥ遺伝子を発現する細胞から得たＲＮＡ分子を逆転写して、一本鎖ｃＤＮＡ分子のプールを提供する工程；
ｂ）オリゴマーを該ｃＤＮＡ分子に連結する工程であって、該オリゴマーは、５０〜７０ヌクレオチド長であり、該オリゴマーは３’末端でリン酸化されかつＮＨ２によって５’末端で保護されており、該オリゴマーは、ヒトｍＲＮＡ分子に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズしない配列を有する、工程
ｄ）ポリメラーゼ連鎖反応によって工程（ｃ）において生成された該ｃＤＮＡ分子内のＡＲＥ含有ＤＮＡ分子をＰＣＲ増幅する工程であって、該工程は、以下：
ｉ）１３〜５０ヌクレオチド長であり、そしてＴＡＡＡＴ配列を有する２〜１０のペンタマーを含む３’プライマーであって、該ペンタマー配列は重複しているかまたは重複していない、３’プライマー；および
ｉｉ）配列が該オリゴマー内に含まれる配列に対して同一である５’プライマー、を使用する、工程、
を包含する、方法。
【請求項５１】
前記３’プライマーのＣＧ含量が少なくとも４０％である、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
工程（ｄ）によって生成される前記ＡＲＥ含有ＤＮＡ分子を配列決定する工程をさらに包含する、請求項５０に記載の方法。
【請求項５３】
細胞における遺伝子発現を分析するための核酸分子のライブラリーを調製する方法であって、該方法は、以下：
ａ）２つ以上の核酸分子の群を獲得する工程であって、該核酸分子のタンパク質コード配列は、請求項３０１に記載の方法によって同定され、該２つ以上の核酸分子の各々の該タンパク質コード配列は、該群における他の核酸分子のタンパク質コード配列とは異なる、工程、および
ｂ）該核酸分子の各々を別々の核酸ベクターに組み込んで該ライブラリーを提供する工程、
を包含する、方法。
【請求項５４】
請求項５３に記載の方法によって調製された、核酸ライブラリー。
【請求項５５】
請求項５４に記載の核酸ライブラリーであって、該ライブラリーは、タンパク質コード配列が、標的配列を含む３’ＵＴＲと隣接していない核酸分子を実質的に含まない、核酸ライブラリー。
【請求項５６】
細胞中の遺伝子発現を分析するためのカスタマイズされたアレイを調製する方法であって、該方法は、以下：
（ａ）請求項５０に記載の方法によって増幅した複数のＡＲＥ核酸分子の前記タンパク質コード配列を決定する工程；
（ｂ）該核酸分子の各々についての遺伝子プローブを固体支持体に結合させて該アレイを提供する工程、
を包含し、
ここで、該プローブが、ストリンジェントな条件下で、該タンパク質コード配列またはその相補体内の標的領域にハイブリダイズし、そして
該プローブが、核酸塩基を含む、オリゴヌクレオチド、ｃＤＮＡ分子、または合成遺伝子プローブである、方法。
【請求項５７】
請求項５６に記載の方法によって調製された、カスタマイズされたアレイ。
【請求項５８】
請求項５７に記載のカスタマイズされたアレイであって、該アレイ上の前記プローブの２０％未満が、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、非ＡＲＥ遺伝子のタンパク質コード配列に結合する、カスタマイズされたアレイ。
【請求項５９】
請求項５７に記載のカスタマイズされたアレイであって、該アレイ上の前記プローブの１０％未満が、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、非ＡＲＥ遺伝子のタンパク質コード配列に結合する、カスタマイズされたアレイ。
【請求項６０】
請求項５７に記載のカスタマイズされたアレイであって、前記プローブが、少なくとも１０ヌクレオチド長であるオリゴヌクレオチドであり、該オリゴヌクレオチドのＧＣ含量が少なくとも４０％であり、そして該オリゴヌクレオチドがヘアピン構造を形成しない、カスタマイズされたアレイ。
【請求項６１】
ＡＲＥ遺伝子転写物を選択的に増幅する方法であって、該方法は、以下：
ａ）１プールの一本鎖ＤＮＡ分子を提供するために細胞から得たＲＮＡを逆転写する工程であって、該逆転写は、逆転写酵素、および１３〜５０ヌクレオチド長であって、そしてＴＡＡＡＴ配列を有する２〜１０のペンタマーを含む３’プライマーを使用し、ここで該ペンタマー配列は重複しているかまたは重複していない、工程；
ｂ）ポリメラーゼ連鎖反応によって、該プール内のＡＲＥ含有ＤＮＡ分子を増幅する工程であって、該ポリメラーゼ連鎖反応は、以下：
ｉ）１５〜５０ヌクレオチド長であり、そしてＴＡＡＡＴ配列を有する２〜１０のペンタマーを含む３’プライマーであって、該ペンタマー配列は重複しているかまたは重複していない、３’プライマー；および
ｉｉ）請求項２１に記載の方法によって得られた５’プライマーセットのうち１つによって包含される１つ以上のプライマー、
を使用する、工程、
を包含する、方法。
【請求項６２】
前記逆転写酵素が６０℃で安定である、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
トレハロースが前記逆転写工程に含まれる、請求項６１に記載の方法。
【請求項６４】
請求項６１に記載の方法であって、該方法は、配列が以下：
ＶＲＶＶＲＶＶＡＴＧＡＶ（配列番号１６）、
ＶＶＶＤＲＶＢＡＴＧＣＨ（配列番号１７）、
ＶＶＢＲＶＶＡＴＧＧＭ（配列番号１８）、
ＶＤＢＶＲＨＶＡＴＧＴＹ（配列番号１９）、
からなる群より選択されるコンセンサス配列によって包含される２つ以上の５’プライマーを使用する、方法。
【請求項６５】
前記工程（ｂ）によって生成されるＡＲＥ含有ＤＮＡ分子を配列決定する工程をさらに含む、請求項６１に記載の方法。
【請求項６６】
細胞における遺伝子発現を分析するための核酸分子のライブラリーを調製する方法であって、該方法は、以下：
ａ）２つ以上の核酸分子の群を獲得する工程であって、該核酸分子のタンパク質コード配列は、請求項６５に記載の方法によって同定され、該２つ以上の核酸分子の各々の該タンパク質コード配列は、該群における他の核酸分子のタンパク質コード配列とは異なる、工程、および
ｂ）該核酸分子の各々を別々の核酸ベクターに組み込んでライブラリーを提供する工程、
を包含する、方法。
【請求項６７】
請求項６６に記載の方法によって調製された、核酸ライブラリー。
【請求項６８】
請求項６７に記載の核酸ライブラリーであって、該ライブラリーは、タンパク質コード配列が、標的配列を含む３’ＵＴＲと隣接していない核酸分子を実質的に含まない、核酸ライブラリー。
【請求項６９】
細胞中のＡＲＥ遺伝子の発現を分析するためのカスタマイズされたアレイを調製する方法であって、該方法は、以下：
（ａ）請求項６１に記載の方法によって増幅した複数のＡＲＥ核酸分子の前記タンパク質コード配列を決定する工程；
（ｂ）該核酸分子の各々についての遺伝子プローブを固体支持体に結合させて該アレイを提供する工程、
を包含し、
ここで、該プローブの各々が、ストリンジェントな条件下で、該タンパク質コード配列またはその相補体内の標的領域にハイブリダイズし、そして
該プローブの各々が、核酸塩基を含む、オリゴヌクレオチド、ｃＤＮＡ分子、または合成遺伝子プローブである、方法。
【請求項７０】
請求項６９に記載の方法によって調製された、カスタマイズされたアレイ。
【請求項７１】
請求項７０に記載のカスタマイズされたアレイであって、前記プローブが少なくとも１０ヌクレオチド長であるオリゴヌクレオチドであり、該オリゴヌクレオチドのＧＣ含量が少なくとも４０％であり、そして該オリゴヌクレオチドがヘアピン構造を形成しない、カスタマイズされたアレイ。
【請求項７２】
ＡＲＥ遺伝子転写物を選択的に増幅する方法であって、該方法は、以下：
ａ）１プールの一本鎖ＤＮＡ分子を提供するために細胞から得たＲＮＡを逆転写する工程であって、該逆転写は、逆転写酵素、および１３〜５０ヌクレオチド長であって、そしてＴＡＡＡＴ配列を有する２〜１０のペンタマーを含む３’プライマーを使用し、ここで該ペンタマー配列は重複しているかまたは重複していない、工程；
ｂ）ポリメラーゼ連鎖反応によって、該プール内のＡＲＥ含有ＤＮＡ分子の一部を増幅する工程であって、該ポリメラーゼ連鎖反応は、以下：
ｉ）１３〜５０ヌクレオチド長であり、そしてＴＡＡＡＴ配列を有する２〜１０のペンタマーを含む３’プライマーであって、該ペンタマー配列は重複しているかまたは重複していない、３’プライマー；
ｉｉ）請求項２３に記載の方法によって得られた５’プライマーセットのうち１つによって包含される１つ以上のプライマー、
を使用する、工程、
を包含する、方法。
【請求項７３】
請求項７２に記載の方法であって、該方法は、配列が以下：
ＢＨＤＶＭＭＡＡＴＧＡＶ（配列番号２０）、
ＢＳＨＭＲＶＣＡＴＧＡＶ（配列番号２１）、
ＨＢＶＶＲＶＧＡＴＧＡＤ（配列番号２２）、
ＢＤＤＶＲＨＴＡＴＧＡＭ（配列番号２３）、
ＨＤＤＶＲＢＡＡＴＧＣＤ（配列番号２４）、
ＶＲＳＶＲＭＣＡＴＧＣＢ（配列番号２５）、
ＳＳＢＢＲＭＧＡＴＧＣＢ（配列番号２６）、
ＶＢＤＷＷＲＴＡＴＧＣＭ（配列番号２７）、
ＶＶＢＶＲＭＡＡＴＧＧＶ（配列番号２８）、
ＶＶＶＶＲＳＣＡＴＧＧＭ（配列番号２９）、
ＢＶＶＳＲＶＧＡＴＧＧＭ（配列番号３０）、
ＶＤＢＨＲＢＴＡＴＧＧＭ（配列番号３１）、
ＤＲＢＶＲＭＡＡＴＧＴＹ（配列番号３２）、
ＢＶＢＭＲＹＣＡＴＧＴＳ（配列番号３３）、
ＶＤＢＶＲＲＧＡＴＧＴＹ（配列番号３４）、
ＤＶＢＶＷＤＴＡＴＧＴＹ（配列番号３５）、およびそれらの組み合わせ、
からなる群より選択されるコンセンサス配列によって包含される２つ以上の５’プライマーを使用する、方法。
【請求項７４】
前記工程（ｂ）によって生成されるＡＲＥ含有ＤＮＡ分子を配列決定する工程をさらに含む、請求項７２に記載の方法。
【請求項７５】
細胞における遺伝子発現を分析するための核酸分子のライブラリーを調製する方法であって、該方法は、以下：
ａ）２つ以上の核酸分子の群を獲得する工程であって、該核酸分子のタンパク質コード配列は、請求項７２に記載の方法によって同定され、該２つ以上の核酸分子の各々の該タンパク質コード配列は、該群における他の核酸分子のタンパク質コード配列とは異なる、工程、および
ｂ）該核酸分子の各々を別々の核酸ベクターに組み込んで該ライブラリーを提供する工程、
を包含する、方法。
【請求項７６】
請求項７５に記載の方法によって調製された、核酸ライブラリー。
【請求項７７】
請求項７６に記載の核酸ライブラリーであって、該ライブラリーは、タンパク質コード配列が、標的配列を含む３’ＵＴＲと隣接していない核酸分子を実質的に含まない、核酸ライブラリー。
【請求項７８】
細胞中の遺伝子発現を分析するためのカスタマイズされたアレイを調製する方法であって、該方法は、以下：
（ａ）請求項７２に記載の方法によって増幅した複数のＡＲＥ核酸分子の前記タンパク質コード配列を決定する工程；
（ｂ）該核酸分子の各々についての遺伝子プローブを固体支持体に結合させて該アレイを提供する工程、
を包含し、
ここで、該プローブが、ストリンジェントな条件下で、該タンパク質コード配列またはその相補体内の標的領域にハイブリダイズし、そして
該プローブが、核酸塩基を含む、オリゴヌクレオチド、ｃＤＮＡ分子、または合成遺伝子プローブである、方法。
【請求項７９】
請求項７８に記載の方法によって調製された、カスタマイズされたアレイ。
【請求項８０】
請求項７９に記載のカスタマイズされたアレイであって、該アレイ上の前記プローブの２０％未満が、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、非ＡＲＥ遺伝子のタンパク質コード配列に結合する、カスタマイズされたアレイ。
【請求項８１】
請求項７９に記載のカスタマイズされたアレイであって、該アレイ上の前記プローブの１０％未満が、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、非ＡＲＥ遺伝子のタンパク質コード配列に結合する、カスタマイズされたアレイ。
【請求項８２】
請求項７９に記載のカスタマイズされたアレイであって、前記プローブが、少なくとも１０ヌクレオチド長であるオリゴヌクレオチドであり、該オリゴヌクレオチドのＧＣ含量が少なくとも４０％であり、そして該オリゴヌクレオチドがヘアピン構造を形成しない、カスタマイズされたアレイ。
【請求項８３】
被験体におけるＡＲＥ発現プロフィールを得る方法であって、以下：
ａ）該被験体から得た組織サンプルからＲＮＡを抽出する工程；
ｂ）検出可能なタグを用いて該ＲＮＡを標識する工程；および
ｃ）請求項１１に記載のマイクロアレイ、請求項３３に記載のマイクロアレイ、請求項４６に記載のマイクロアレイ、請求項５７に記載のマイクロアレイ、請求項７０に記載のマイクロアレイ、および請求項７６に記載のマイクロアレイ、からなる群より選択されるマイクロアレイと、該標識されたＲＮＡとを接触させる工程、
ｄ）該マイクロアレイ上に存在するプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする標識されたＲＮＡ分子の配列またはパターンを決定する工程、を包含する、方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の分野）
本発明の分野は、遺伝子の同定および単離である；より詳細には、本発明の分野は、アデニレートウリジレートリッチエレメント（ａｄｅｎｙｌａｔｅ  ｕｒｉｄｙｌａｔｅ  ｒｉｃｈ  ｅｌｅｍｅｎｔ）（ＡＲＥ）を含むｍＲＮＡに共通するコンセンサスヌクレオチド配列の計算機同定、ならびに、ｉ）コンセンサスＡＲＥ配列を含む遺伝子を同定するために、遺伝子データベースを検索するためのこれらのコンセンサス配列の使用、ならびにｉｉ）プライマーを設計し、そしてＡＲＥ配列エレメントを含む単離された細胞性ｍＲＮＡを選択的に増幅およびクローン化するためのこれらのコンセンサス配列の使用である。ＡＲＥ含有ｍＲＮＡをコードする遺伝子またはその特有のフラグメントが、遺伝子発現の分析のためのマイクロアレイ上で、プローブとして使用される。
【０００２】
（背景）
アデニレートウリジレートリッチエレメント（ＡＲＥ）は、シス作用性配列であり、通常、多くの不安定性ｍＲＮＡの３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）に見出される。そのようなＡＲＥ含有ｍＲＮＡは、比較的短い半減期を有し、そして転写された後に急速に分解される。特定のＡＲＥは不安定性決定基として作用することが、研究によって示されている（ＣｈｅｎおよびＳｈｙｕ，１９９５，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｓｃｉ，２０：４６５−７０）。例えば、特定の長く存続するｍＲＮＡの半減期は、このようなｍＲＮＡの３’ＵＴＲ中にＡＲＥ配列を含めることによって、有意に減少された（ＳｈａｗおよびＫａｍｅｎ、１９８６，Ｃｅｌｌ，４６：６５９−６７）。初期の研究は、機能的ＡＲＥのための最初必要配列が、ＵＵＡＵＵＵＡＵＵであったことを示唆した（ＣｈｅｎおよびＳｈｙｕ，１９９５，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｓｃｉ，２０：４６５−７０；Ｌａｇｎａｄｏら，１９９４，Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ，１４：７９８４−９５；Ｌｅｗｉｓら，１９９８，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，２７３：１３７８１−６；Ｚｕｂｉａｇａら，１９９５，Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ，１５：２２１９−３０）。ｍＲＮＡ中のＡＲＥエレメントに対する特定のタンパク質の結合が研究によって記載され、そしておそらく、これらのタンパク質が、このようなｍＲＮＡの短い半減期を媒介する（Ｂａｋｈｅｅｔら，２００１，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ，２９：２４６−５４）。
【０００３】
既知のＡＲＥ含有ｍＲＮＡは、外因性因子（例えば、炎症性刺激、放射線、およびウイルス）に対する細胞増殖および細胞応答を調節するために機能する、多くの初期応答遺伝子によってコードされる。これらの遺伝子産物の間にあるのは、増殖制御に関与するタンパク質（例えば、癌原遺伝子、ｃ−ｆｏｓ、および造血増殖因子、顆粒球単球コロニー刺激因子）；炎症性刺激に応答するサイトカイン（例えば、ＴＮＦ−αおよびＩＬ−８）；ウイルスに対する初期防御を担う、インターフェロン（例えば、ＩＦＮ−αおよびＩＦＮ−β）；ならびに細胞性レセプター（例えば、組織因子、血液凝固のイニシエーター）である。
【０００４】
ｍＲＮＡ安定性におけるＡＲＥ媒介変化は、細胞増殖、免疫応答、心血管調和（ｔｏｎｉｎｇ）、および外部ストレス媒介経路のような一過性応答を必要とするプロセスにおいて重要である。ＡＲＥ含有ｍＲＮＡをコードする遺伝子の異常な発現（例えば、ｍＲＮＡの安定化による）は、このようなｍＲＮＡによってコードされるタンパク質の増加した濃度を引き起こし得、そして疾患を導き得る。例えば、癌原遺伝子ｃ−ｆｏｓのＡＲＥエレメントの除去は、増加した腫瘍形成力性と相関する（Ｒａｙｍｏｎｄら，１９８９，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  Ｒｅｓ，５：１−１２）。ＡＲＥ含有Ｂｃｌ−２  ｍＲＮＡは、抗アポトーシス性タンパク質をコードし、このタンパク質の増加した濃度は、濾胞性Ｂ細胞の新生物形成性トランスフォーメーションを導き得る（Ｃａｐａｃｃｉｏｌｉら，１９９６，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，１３：１０５−１５；Ｓｃｈｉａｖｏｎｅら，２０００，Ｆａｓｅｂ  Ｊ，１４：１７４−８４）。誤って調節されたＡＲＥ含有ｍＲＮＡによっておそらく引き起こされる疾患の別の例は、マウス（そのＡＲＥ含有領域がＴＮＦ遺伝子から欠失されていた）で検出された慢性炎症性関節炎およびクローン病様炎症性腸疾患である（Ｋｏｎｔｏｙｉａｎｎｉｓら，１９９９，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，１０：３８７−９８）。染色体変化は、大脳外套細胞リンパ腫におけるＣＣＮＤ１  ｍＲＮＡの過剰発現を生じるＣＣＮＤ１遺伝子（サイクリンＤ１、ＰＲＡＤ１、上皮小体腺腫症  １）中のＡＲＥ−３’ＵＴＲの欠失、細胞周期のＧ１−Ｓ移行を乱すと考えられる脱調節事象（ｄｅｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｅｖｅｎｔ）を導き、それによって腫瘍発生に寄与する（Ｒｉｍｏｋｈら，１９９４，Ｂｌｏｏｄ，８３：３６８９−９６）。小さい神経芽細胞細胞の腫瘍形成性は、ＡＲＥ−ｍＲＮＡ，ＭＹＣＮの過剰発現と関連し、そしてまた、基質接着細胞と比較した場合にＡＲＥを標的化し、そしてＡＲＥ  ｍＲＮＡを安定化する、大量のｐ４０  ＥＬＡＶ−タンパク質と関連する（ＣｈａｇｎｏｖｉｃｈおよびＣｏｌｎ，１９９７，Ｅｕｒ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ，３３：２０６４−７）。腫瘍壊死因子（ＴＮＦ−α）は、代表的なＡＲＥ−ｍＲＮＡであるが、前炎症性でもあり、かつ特定の固形癌に対する抗腫瘍活性も有し、この腫瘍壊死因子が、特定の白血病およびリンパ腫において増殖因子として作用し得る実験的な証拠が存在する（Ｌｉｕら，２０００，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，２７５：２１０８６−９３）。
【０００５】
ＡＲＥ−ｍＲＮＡ経路における誤った制御は、影響される他の一過性に調節される生物学的プロセスを引き起こし得る。癌細胞における酸素依存的に増強された解糖であるヴァルブルク効果の７０年間の事象は、癌細胞における６−ホスホフルクトース−２−キナーゼに対する新規ＡＲＥ−ｍＲＮＡアイソフォームの増加した構成的発現と連結し、そしてインビトロおよびインビボにおいて腫瘍成長に必要とされた（Ｃｈｅｓｎｅｙら，１９９９，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ，９６：３０４７−５２）。癌における増強されたグルコース代謝の同じ状況において、グルコース輸送体Ｇｌｕｔｌ  ｍＲＮＡの安定性が、ＡＲＥおよびＡＲＥ結合タンパク質によって調節されること、そして神経膠腫を含む特定の癌と関連することが示された（Ｈａｍｉｌｔｏｎら，１９９９，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ，２６１：６４６−５１）。乳癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ２３１の高い侵襲性が、ウロキナーゼ型プラスミノーゲンアクチベーター（ｕＰＡ）ｍＲＮＡのＡＲＥ媒介崩壊のにおける欠損に起因して、ｕＰＡの増加した構成的レベルによって媒介されることが示された（ＭｏｎｔｅｒｏおよびＮａｇａｍｉｎｅ，１９９９，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，５９：５２８６−９３）。ｕＰＡおよびそのレセプターの増加した活性は、多数の腫瘍における侵襲性と関連している（Ｒｅｕｎｉｎｇら，１９９８，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｏｎｃｏｌ，１３：８９３−９０６）。興味深いことに、ｕＰＡおよびそのレセプターの両方が、ＡＲＥ遺伝子ファミリーに属し（Ｂａｋｈｅｅｔら，２００１，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ，２９：２４６−５４）、このことは、正常な状況における細胞接着の密に調節されたプロセスを示す。転写因子ＣＨＯＰ（これは、ストレスに応答した細胞分裂およびアポトーシスに関与する）のｍＲＮＡは、ＡＲＥによって調節される（Ｕｂｅｄａら，１９９９，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ，２６２：３１−８）。ＡＲＥ媒介安定性における欠損に起因して、オートクライン増殖因子として作用する造血増殖因子（例えば、ＧＭ−ＣＳＦ）の増加した産生は、白血病の病因に寄与し得る（Ｈｏｙｌｅら，１９９７，Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ  Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ，３：１５９−６８；Ｐａｕｌら，１９９７，Ａｍ  Ｊ  Ｈｅｍａｔｏｌ，５６：７９−８５）。ＡＲＥ−ｍＲＮＡ調節タンパク質（ＡＵＦ１およびＨｕＲ）の存在量における増殖調節された変化は、多くの高度に調節されたＡＲＥ−ｍＲＮＡ発現に対する多面発現性効果を有し得、そしてこれは、新生物形成性表現型の発症、維持、および進行に有意に影響を与え得る（Ｂｌａｘａｌｌら，２０００，Ｍｏｌ  Ｃａｒｃｉｎｏｇ，２８：７６−８３）。
【０００６】
しかし、これらの有意さににもかかわらず、おそらく１００個未満のＡＲＥ含有ｍＲＮＡしか、現在までに同定されていない。その誤った調節がヒトの疾患に寄与し得る他のＡＲＥ含有遺伝子が、おそらく存在する。従って、ＡＲＥ含有ｍＲＮＡをコードするさらなる遺伝子を同定することが望ましい。
【０００７】
（発明の要旨）
本発明は、ＡＲＥ含有ｍＲＮＡをコードする遺伝子に特異的な遺伝子発見システムおよび遺伝子発現システムに関する。１つの局面において、本発明は、１つ以上のＡＲＥ検索配列を用いてデータベースからＡＲＥ遺伝子のコード配列を選択するコンピューター方法に関する。このＡＲＥ検索配列は、１０〜８０ヌクレオチド長であり、そして以下の２つの配列のうちの１つによって含まれる配列を含む：（ａ）ＷＵ／Ｔ（ＡＵ／ＴＵ／ＴＵ／ＴＡ）ＴＷＷＷ（配列番号１）（ここで、括弧の外側のヌクレオチドのうちの０個または１個は、異なるヌクレオチドによって置換され、ここで、Ｗは、Ａ、ＵまたはＴを表す）；および（ｂ）Ｕ／Ｔ（ＡＵ／ＴＵ／Ｔ／Ｕ／Ｔ）ｎ（配列番号２）（ここで、ｎは、括弧内に含まれる四量体配列の、３〜１２個を含む検索配列を示す）。この方法は、そのタンパク質コード配列が３’非翻訳領域（ＵＴＲ）（ＡＲＥ検索配列のうちの１つを含む）の上流であり、かつこの領域に隣接する核酸を、データベースから引き出す工程を包含する。このようなデータベースの例は、ｍＲＮＡデータベース、ｃＤＮＡデータベース、およびゲノムデータベース（ヒトゲノムプロジェクトを含む）である。本発明はまた、計算機方法によって選択された複数の核酸を含む、ＤＮＡライブラリーおよびマイクロアレイを作製する方法に関する。本発明はまた、このような方法によって作製されるＤＮＡライブラリーおよびマイクロアレイに関する。１つの実施形態において、このマイクロアレイは、表６に列挙される複数の遺伝子のコード配列にハイブリダイズするプローブを含む。
【０００８】
本発明はまた、その３’ＵＴＲがＡＲＥ配列を含む遺伝子の開始領域に対するプライマーセットの標的を同定する方法に関する。１つの好ましい実施形態において、この方法は、ＡＲＥ検索配列を利用する。ＡＲＥ遺伝子は、４つのクラスまたは１６個のクラスにグループ分けされる。４クラスのグループ分けは、ＡＲＥ遺伝子の開始コドンの３’末端に結合されるヌクレオチド塩基に基づく。１６クラスのグループ分けは、ＡＲＥ遺伝子の開始コドン（ＡＴＧ）の５’末端および３’末端の両方に付着されるヌクレオチド塩基に基づく。データベース中に見出されるＡＲＥ遺伝子を用いて、このクラスの各々についてのコンセンサス配列が、決定される。このコンセンサス配列は、全長ＡＲＥ遺伝子および部分長ＡＲＥ遺伝子を選択的に増幅するために使用され得る５’プライマーセット（例えば、縮重プライマー）を調製するために有用である。
【０００９】
本発明はまた、コンセンサス５’配列モチーフに由来しかつこのモチーフに相補的であるプライマー、ならびにＡＲＥ検索配列に由来しかつこの配列に相補的なプライマーを用いる、ＲＮＡ分子およびｃＤＮＡ分子を選択的に増幅するの方法に関する。このような増幅されたＲＮＡ分子およびｃＤＮＡ分子は、新規ＡＲＥ遺伝子の全長配列または部分長配列を含む。
【００１０】
本発明はまた、１５〜５０ヌクレオチド長であり、そして配列ＴＡＡＡＴを有する２〜１０のペンタマーを含む３’プライマーを利用する、ＡＲＥ遺伝子を選択的に増幅する方法に関する。この配列中のペンタマー配列は、重複するかまたは重複しないかのいずれかである。３’プライマーが、この方法の逆転写工程において使用されるか、この方法のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅工程において使用されるか、またはこの方法の逆転写工程およびＰＣＲ増幅工程の方法において使用される。本発明はまた、本方法によって選択的に増幅されるＡＲＥ遺伝子の一部を含むライブラリーを作製する方法、ならびに本方法によって選択的に増幅されるＡＲＥ遺伝子のタンパク質コード配列の一部に、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするプローブを含むマイクロアレイを作製する方法に関する。本方法はまた、このような方法によって作製されるライブラリーおよびマイクロアレイに関する。
【００１１】
本発明はまた、図７に示される配列を含む遺伝子のコード配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするプローブを含むマイクロアレイに関する。
【００１２】
本発明はまた、ｃＤＮＡマイクロアレイまたはオリゴヌクレオチドマイクロアレイにおいて、それぞれ、固定プローブ（ｉｍｍｏｎｐｉｌｉｚｅｄ  ｐｒｏｂｅ）として使用するための、ＰＣＲ産物またはオリゴヌクレオチドの作製のために、ＡＲＥ遺伝子を用いる方法に関する。
【００１３】
本発明はまた、被験体（詳細には、癌のような疾患を有する被験体）のＡＲＥ発現プロフィールを得るために本発明の方法のマイクロアレイを使用する方法に関する。
【００１４】
（発明の詳細な説明）
（ＡＲＥ遺伝子の同定）
本発明は、ＡＲＥ遺伝子を同定するための計算方法および実験室方法に関連する。
【００１５】
一般に、用語「遺伝子」は、ＲＮＡ、より具体的にはｍＲＮＡに転写されるゲノム中のヌクレオチド塩基の連続した広がりをいう。このようなｍＲＮＡは、その後タンパク質に翻訳される。本明細書中で使用される場合、この用語は、ゲノム中のＤＮＡ（すなわち、ゲノム配列）のみではなく、このＤＮＡから転写されたｍＲＮＡ、およびこのｍＲＮＡのＤＮＡのコピー（これはまた、「ｃＤＮＡ」と呼ばれる）を言及し得る。このような遺伝子は、下記のような、複数の区分、部分または領域（すなわち、コード配列、３’ＵＴＲ、および５’ＵＴＲ）を有する。「完全な」遺伝子はこれらの区分の全てを含む。遺伝子の「フラグメント」は、この全てではない区分からなる。遺伝子のフラグメントは、遺伝子の１つの区分全体より少ないものを含む。ハイブリダイゼーションの目的のために使用される、遺伝子のフラグメントは、「プローブ」という。
【００１６】
本明細書中で使用される場合、用語「タンパク質コード配列」または「コード配列」は、タンパク質への、アミノ酸の直線状位置決定の原因となる遺伝情報を含む遺伝子領域（例えば、ゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡまたはｃＤＮＡ）をいう。このようなコード領域における遺伝情報は、通常は、コドンと呼ばれる、３つ連続したヌクレオチド塩基の群を含む。各コドンは、コードされるタンパク質中の単一のアミノ酸を特定する。このようなコード配列は、これが細胞中で通常見出される長さおよび配列であるタンパク質をコードする場合、「全長」であると呼ばれる。このようなコード配列は、これが細胞中で通常見出されるタンパク質の長さより短いタンパク質をコードする場合、「部分的な長さ」と呼ばれる。このような部分的な長さのコード配列は、例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡをコピーするために使用される酵素が、鋳型として使用されるＤＮＡまたはＲＮＡの全長を忠実にコピーできない場合に、生じ得る。
【００１７】
本明細書中で使用される場合、「３’ＵＴＲ」は、遺伝子、ｃＤＮＡまたはｍＲＮＡのタンパク質コード領域の３’またはその下流に位置する、遺伝子、ｃＤＮＡまたはｍＲＮＡの領域をいう。
【００１８】
本明細書中で使用される場合、「５’ＵＴＲ」は、遺伝子、ｃＤＮＡまたはｍＲＮＡのタンパク質コード領域の５’またはその上流に位置する、遺伝子、ｃＤＮＡまたはｍＲＮＡ領域をいう。
【００１９】
本明細書中で使用される場合、「ＡＲＥ」は、「アデニレートウリジレートリッチエレメント（ａｄｅｎｙｌａｔｅ  ｕｒｉｄｙｌａｔｅ−ｒｉｃｈ  ｅｌｅｍｅｎｔ）」を意味する。このようなＡＲＥは遺伝子の３’ＵＴＲに見出される。本明細書中で使用される場合、ＡＲＥ遺伝子は、その３’ＵＴＲ内にＡＲＥを含む遺伝子をいう。
【００２０】
（ＡＲＥ検索配列の計算的導出）
１つの局面において、本発明は、公開されたデータベースからＡＲＥ遺伝子を選択するために使用され得るＡＲＥ検索配列を提供する。ＡＲＥ検索配列の１つの群は、配列ＷＵ／Ｔ（ＡＵ／ＴＵ／ＴＵ／ＴＡ）Ｕ／ＴＷＷＷ（配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．）１）を含み、ここで、１つ以下の、括弧の外側のヌクレオチドは異なったヌクレオチドによって置換され、そしてここでＷは、Ａ、Ｕ、またはＴを表す。検索配列の別の群は、配列Ｕ／Ｔ（ＡＵ／ＴＵ／ＴＵ／Ｔ）ｎ（配列番号２）を含み、ここでｎは、この検索配列が、括弧内のテトラマー配列の３〜１２個を含むことを示している。このＡＲＥ検索配列は、３’ＵＴＲにＡＲＥ配列を含むことが既知である、５７個のｍＲＮＡの配列解析を通して、導出された。この５７個のｍＲＮＡの中に、ｍＲＮＡを含めるために使用した２つの規則は以下である：ｉ）ＡＲＥ配列がｍＲＮＡの安定性または半減期を制御することが示されている、ｍＲＮＡ、またはｉｉ）一過的に誘導されることが既知であるＡＲＥを含む、ｍＲＮＡ。これらの５７個のｍＲＮＡの３’ＵＴＲから、コンセンサスＡＲＥ配列は、モチーフ導出のための複数期待値最大化（ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｅｘｐｅｃｔａｔｉｏｎ  ｍａｘｉｍｉｚａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｍｏｔｉｆ  ｅｌｉｃｉｔａｔｉｏｎ；ＭＥＭＥ）プログラム（ＢａｉｌｅｙおよびＧｒｉｂｓｋｏｖ、１９９８、Ｊ  Ｃｏｍｐｕｔ  Ｂｉｏｌ、５：２１１〜２１）の使用を通して生成された。配列、ＴＡＴＴＴＡＷＷ（Ｗ＝ＡまたはＴ）が得られた。次いで、この５７個の配列を使用して、コンセンサス解析をＴＡＴＴＴＡＷＷモチーフ周辺で実施した。１つの実施形態におて、この解析のパラメータは、各位置において定めたヌクレオチドの７５％の確実性を特定した。これらのパラメータを使用して、ＡＲＥ検索配列が導出された。
【００２１】
（ＡＲＥ検索配列を用いて検索されたｍＲＮＡデータベースの導出）
総数３６，９５１個のヒトｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ配列を、ＧｅｎＢａｎｋ  リリース１１３（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ、ＮＣＢＩ）から展開した。全長オープンリーディングフレームをコードする、それらの配列を保持し、そして他のものは破棄した。３’ＵＴＲ配列を、各ｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ配列から抽出した。３’ＵＴＲを含まない配列は、破棄した。１３，０５７個の配列のリストが残った。
【００２２】
（ＡＲＥ検索配列を用いたｍＲＮＡデータベースの検索）
１つの実施形態において、１３，０５７個の配列を、ＷＷＷＴＡＴＴＴＡＴＷＷＷ配列に対し、コアのＴＡＴＴＴＡＴ配列の外にある各側において１ｂｐのミスマッチは許容したＦｉｎｄＰａｔｔｅｒｎ解析ルーチン（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ／Ｏｘｆｏｒｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｏｍｐａｎｙ；Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）を用いて検索した。冗長な配列を除外した。見出された配列は、８９７個の独立したｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ配列（実施例の末尾にある表６に示されているリストを参照）を含んだ。
【００２３】
本発明の他の実施形態において、ＡＲＥ検索配列の他の派生型を使用して、ｍＲＮＡデータベースを検索した。使用され得るＡＲＥ検索配列の例としては、以下が挙げられる：ＷＷＷＴ（ＡＴＴＴＡ）ＴＷＷＷ、配列番号＿＿、ＷＷＷＴ（ＡＴＴＴＡ）ＴＷＷ、配列番号＿＿、ＷＷＷＴ（ＡＴＴＴＡ）ＴＴＷＷ、配列番号＿＿＿、ＷＷＷＴ（ＡＴＴＴＡ）ＴＷＷＷ、配列番号＿＿、ＷＷ（ＡＴＴＴＡＴＴＴＡ）ＷＷ、配列番号＿＿＿＿、ＡＴＴＴ（ＡＴＴＴＡ）ＴＴＴＡ、配列番号＿＿＿、Ａ（ＴＴＴＡ）ｎ、ここでｎは３〜１２であり得る。これらの検索配列は、上記の括弧の中に示されるヌクレオチドから０ヌクレオチドと２ヌクレオチドとの間ほど外側のヌクレオチドがマッチしない（すなわちミスマッチである）ことを許容することによって、さらに改変され得る。
【００２４】
（ＡＲＥ検索配列を用いたゲノムデータベースの検索）
別の実施形態において、ＡＲＥ検索配列を使用して、ゲノムＤＮＡの既存のデータベースを検索した。３’ＵＴＲ配列によって構成されるデータベースを検索する工程と比較したときの、ゲノムデータベースを検索する工程との間の主要な差異は、ＡＲＥ検索配列が、この３’ＵＴＲ以外の遺伝子領域において見出され得ることである。遺伝子のコード領域内にあるＡＲＥ検索配列とマッチする配列の同定することは、有用ではない。３’ＵＴＲの状況に存在するＡＲＥ検索配列のみが、ｍＲＮＡの安定性の決定因子として機能する可能性がある。
【００２５】
ＡＲＥ検索配列が、遺伝子の３’ＵＴＲ以外の状況で見出される可能性を決定するために、診断的な計算機テストを実施した。１つのテストにおいて、例えば、上述した１３，０５７個のｍＲＮＡ／ｃＤＮＡの、全長タンパク質コード配列と３’ＵＴＲ（単なる３’ＵＴＲではない）とを、ＷＷＷＴＡＴＴＴＡＴＷＷＷ配列に対して検索した。この検索の結果は、８９７のマッチであり、これは、これらの遺伝子の３’ＵＴＲ領域のみに検索をかけた場合、これまでに見出されたものと同じ数である。この結果は、ＡＲＥ検索配列が、これらの遺伝子のコード領域内には、見出されないことを示している。
【００２６】
別の診断的計算テストにおいて、ＡＲＥ検索配列は、ヒトゲノム計画によるゲノム配列のデータベースにおいて検索される。ＡＲＥ検索配列が、遺伝子のタンパク質コード領域または５’ＵＴＲ領域で有意な頻度で見出されない一方、ＡＲＥ検索配列は、このゲノムにわたって遺伝子のイントロン中に頻繁に見出される。
【００２７】
それゆえに、さらなる計算方法を使用して、ＡＲＥ検索配列が３’ＵＴＲ以外の領域に見出されるこれらの遺伝子を、この検討材料から除外した。これらのさらなる計算方法はまた、ＡＲＥを含む遺伝子をゲノムデータベース中で探す方法として独立に使用され得る。ＧＥＮＳＣＡＮコンピュータ予測プログラム（ＢｕｒｇｅおよびＫａｒｌｉｎ、１９９７、Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ、２６８：７８−９４）はこの目的に使用される１つの方法でプログラムである。ＧＥＮＳＣＡＮは、遺伝子構造（例えば、エキソン、イントロン、転写プロモーターおよびポリアデニル化シグナル）を検出するための確率モデルを使用して、ＤＮＡデータベース中の遺伝子の存在を予測するプログラムである。ＧＥＮＳＣＡＮを使用して、ＡＲＥ検索配列が、遺伝子の３’ＵＴＲ以外の領域で見出されるか否かを迅速に決定することが可能である。これは、ＡＲＥ検索配列が遺伝子の他の領域（例えば、イントロン内）で見出される、遺伝子を除外する。
【００２８】
ＧＥＮＳＣＡＮプログラムの代替として、ＦＧＥＮＳＨプログラム（ＳｏｌｏｖｙｅｖおよびＳａｌａｍｏｖ、１９９７、Ｐｒｏｃ  Ｉｎｔ  Ｃｏｎｆ  Ｉｎｔｅｌｌ  Ｓｙｓｔ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ、５：２９４−３０２；Ｓｏｌｏｖｙｅｖら、１９９５、Ｐｒｏｃ  Ｉｎｔ  Ｃｏｎｆ  Ｉｎｔｅｌｌ  Ｓｙｓｔ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ、３：３６７−７５）をまた使用する。ＦＧＥＮＳＨは、スプライス部位、５’コード、内部エキソン、および３’コード領域の認識のための線形弁別関数を使用するエキソン認識関数に基づいて開発された。
【００２９】
一旦、ＧＥＮＳＣＡＮまたはＦＧＥＮＳＨソフトウェアがＡＲＥ含有遺伝子を同定するために使用されると、ＡＲＥ配列の上流の６〜２０キロベース対の連続配列、およびＡＲＥ配列の下流の１〜３キロベース対の連続配列が得られる。この遺伝子のオープンリーディングフレームは、これらの連続領域の分析によって得られる。
【００３０】
（逆転写によるＡＲＥ  ｍＲＮＡの選択的増幅）
データベースに存在するＡＲＥ遺伝子のコンピュータによる同定に加えて、実験室方法が、コンピューターのデータベースに存在しないＡＲＥ遺伝子の同定およびクローニングを可能にする。
【００３１】
実験室ベースのＡＲＥ遺伝子の同定への第一の工程として、ｃＤＮＡを、逆転写を使用して総細胞ＲＮＡから合成する。ＲＮＡは、総細胞ＲＮＡまたはｍＲＮＡであり得る。このようなＲＮＡの単離は、当業者に一般的である。このようなＲＮＡは、細胞または組織に由来し得る。
【００３２】
１つの実施形態において、オリゴ（ｄＴ）を、逆転写反応においてプライマーとして使用する。オリゴ（ｄＴ）は、第一鎖ｃＤＮＡ合成の間にｍＲＮＡのポリ（Ａ）テールにハイブリダイズする。全てのｍＲＮＡは、正常にはポリ（Ａ）テールを有することから、第一鎖のｃＤＮＡを、反応物中に存在する全てのｍＲＮＡから（すなわち、特異性なく）作製する。
【００３３】
別の実施形態において、第一鎖のｃＤＮＡは、その３’ＵＴＲにＡＲＥ配列を含むｍＲＮＡからのみ合成される。このような選択性は、オリゴ（ｄＴ）をこのようなｍＲＮＡの３’ＵＴＲ中のＡＲＥ配列に特異的にハイブリダイズする、変性ユニバーサル３’プライマーで置換することによって達成される。このような変性ユニバーサル３’プライマーは、初期に得られたＡＲＥ検索配列に基づき、そして１以上の検索配列によって含まれる配列に相補的である。この３’プライマーは、１５〜５０ヌクレオチド長であり、配列ＴＡＡＡＴを有する２〜１０の五量体を含む。これらの五量体配列は、重複し得る（すなわち、五量体の上流の５番目のヌクレオチドが五量体の下流の１番目のヌクレオチドである場合）かまたは非重複であり得る。プライマーが非重複する五量体を含むこれらの場合において、これらのプライマーは、いずれも分離されない。すなわち、これらのプライマーは隣接するか、または好ましくは１〜５のヌクレオチドによって分離される。
【００３４】
逆転写反応における使用のために適切な３’プライマーの例は、ＡＡＴＡＡＡＴＡＡＡＴＶＡ（Ｄｏｗｎ−ＡＴＰ）（配列番号３）、ＴＡＡＡＴＷＶＡＴＡＡＡＴ（Ｄｏｗｎ−ＡＴＰ）（配列番号４）、ＡＡＴＡＡＡＴＡＡＡＴＡＡ（Ｓ−ＭＯＴＩＦＰ）（配列番号５）、ＣＴＣＧＡＧＷＨＷＷＡＡＡＴＡＡＡＴＡ（ＴＡ−ＸＨＯＰ）（配列番号６）、およびＣＴＣＧＡＧＴＡＡＡＴＷＮＡＴＡＡＡＴ（ＡＴ−ＸＨＯＰ）（配列番号７）であり、ここで、Ｗ＝ＡまたはＴ、Ｈ＝ＡまたはＣまたはＴ、Ｖ＝ＡまたはＧまたはＣ、そしてＮ＝ＡまたはＧまたはＣまたはＴである。
【００３５】
さらなる実施形態において、３’プライマーのさらなる改変体が使用され得る。このような３’プライマーとしては、例えば、ＡＡＴＡＡＡＴＡＡＴＣＡ（配列番号８）、ＡＡＴＡＡＡＴＡＡＴＧＡ（配列番号９）、ＡＷＴＡＡＡＴＡＡＡＴＷＡ（配列番号１０）、およびＷＷＷＴＡＡＡＴＡＡＡＴ（配列番号１１）が挙げられる。複数の重複またな非重複ＡＲＥ五量体エレメント（すなわち、ＡＴＴＴＡ）を有するもののような、より長いプライマーもまた使用され得る。このようなより長いプライマーの例としては、ＡＡＴＡＡＡＴＡＡＡＴＡＡＡＴＡＡＡＴ（配列番号１２）およびＧＧＣＧＧＡＴＣＣＧＧＧＣＴＡＡＡＴＡＡＡＴＡＡＡ（配列番号１３）である。
【００３６】
好ましくは、反応において使用される逆転写酵素は、６０℃を超える温度で安定な、例えば、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＲＴ（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ）である。しかし、ＭＭＬＶ逆転写酵素もまた使用され得る。
【００３７】
好ましい実施形態において、二糖であるトレハロースが、逆転写酵素反応に添加される。トレハロースは、６０℃程度の温度でＲＴを含むいくつかの酵素を安定化させることが示されている二糖である（Ｍｉｚｕｎｏら、１９９９、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ、２７：１３４５−９）。トレハロースの添加は、逆転写酵素反応における高温（例えば、６０℃程度）の使用を可能にする。好ましくは、トレハロースは、最終濃度が２０％〜３０％の間になるように、逆転写酵素反応に添加される。好ましくは、次いで、この逆転写酵素反応は、３５℃〜７５℃の間の温度で、より好ましくは５０℃〜７５℃の間の温度で、最も好ましくは６０℃の温度で実施される。
【００３８】
（ＰＣＲによる、ＡＲＥ  ｃＤＮＡの増幅）
新規ＡＲＥ含有遺伝子の代表的なｃＤＮＡをクローニングするため、合成される第一鎖ｃＤＮＡを、ＡＲＥ配列を含む第一鎖ｃＤＮＡに特異的であるように設計する。１つの実施形態において、これは、２つのプライマーセット、３’セットおよび５’セットを使用する。これらのセットは、ＡＲＥ遺伝子を選択的に増幅するために設計される。
【００３９】
第一のセットのプライマー（３’セット）は、上記の、ＡＲＥ含有ｍＲＮＡの特異的逆転写において使用される３’プライマーと類似であり、そして同一であり得る。しかし、好ましくは、３’セットのプライマーは、逆転写のために使用されるプライマーより長く、そして配列中のＣＧの割合が高い。ＰＣＲのために使用されるプライマーの３’セットの例は、ＧＧＣＧＧＡＴＣＣＧＧＧＣＴＡＡＡＴＡＷＡＴＡＡＡＴＷＡ（ＭＯＴＩＦ−ＡＡ）（配列番号１４）およびＧＧＣＧＧＡＴＣＣＧＧＧＣＡＡＴＡＡＡＴＡＷＡＴＡＡＡＴ（ＭＯＴＩＦ−Ｔ）（配列番号１５）である。これらの３’プライマー配列の他の改変体は、ＰＣＲまたは次の工程（例えば、制限酵素切断部位の内包）のクローニングを容易にするために作製される。
【００４０】
第一鎖のｃＤＮＡによって示される遺伝子の５’末端に対するプライマーの第二のセットは、公知のデータベース中の配列のコンピューター分析によって決定される。例えば、３’ＵＴＲにＡＲＥ配列を含むとして同定された８９７ｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ配列（これらの８９７遺伝子は、表題「ＡＲＥ検索配列のためのｍＲＮＡデータベースの検索」の節で、上で議論した）。これらの８７９配列の各々のＡＴＧ開始コドンに隣接する５’ＵＴＲ中の領域を比較した。翻訳開始コドンの周辺に存在することが公知の全ての真核生物遺伝子中に、いくつかの配列保存が存在する（Ｋｏｚａｋ、１９８７、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ、１５：８１２５−４８；Ｋｏｚａｋ、１９８７、Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ、１９６：９４７−５０）。
【００４１】
８９７配列の５’領域の分析によって、１セットの４つの変性プライマー、あるいは、１６の変性プライマーが設計されて、その結果、プライマーのセットが８９７ｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ配列由来の第一鎖ｃＤＮＡの９９％にハイブリダイズする（表４）。個々の変性プライマーを、ＰＣＲで使用されるこの表から選択する。５’プライマーを、８９７ＡＲＥ遺伝子のサブセットの５’末端にハイブリダイズするような方法で設計する。従って、全ての可能なＡＲＥ含有ｍＲＮＡを増幅するために、異なるプライマーセットを使用する異なるＰＣＲ反応を使用する。
【００４２】
３’プライマーおよび５’プライマーを使用して、このＰＣＲ反応を、好ましくは、Ｔａｑポリメラーゼを使用して実施し、そして好ましくはホットスタートＰＣＲ（すなわち、９５℃で１０分間の加熱の間に、反応物にＴａｑポリメラーゼを添加する）であるか、または抗Ｔａｑ抗体を用いる（すなわち、Ｔａｑポリメラーゼは、加熱による再活性化までポリメラーゼを不活化する抗Ｔａｑ抗体と共に予めインキュベートされる）。好ましくは、最初の４回のＰＣＲサイクルのアニーリング温度は３２℃〜５０℃の間である。その後、アニーリング温度を、２２サイクル〜３５サイクルについては６０℃と６５℃との間に上げる。最終伸長工程は、７℃で３分間実施される。
【００４３】
（ＡＲＥ配列の特異的ＰＣＲ増幅前のＲＮＡリガーゼベースのｃＤＮＡ合成）  別の実施形態において、ｃＤＮＡの合成は、ＲＮＡリガーゼに基づく方法を使用し、次いでＰＣＲを使用するこのようなｃＤＮＡの増幅を使用する（図４）。
【００４４】
このような実施形態において、総細胞ＲＮＡを、好ましくはＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩ逆転写酵素、およびＮＨ２によって５’末端で改変されたオリゴ（ｄＴ）プライマー（アミノ基は、自己連結またはオリゴ（ｄＴ）プライマーおよびＲＬオリゴプライマーのプライマー間連結を防止する）によって、第一鎖のｃＤＮＡに逆転写する。生じる第一鎖ｃＤＮＡは、改変されたオリゴ（ｄＴ）プライマー取り込みを有し、従って、その５’末端は、ＮＨ２によってブロックされる（図４を参照のこと）。次いで、ＡＮａｓｅ  Ｈを、反応物中のＲＮＡを分解するために使用する。次いで、残った一本鎖の第一鎖ｃＤＮＡを、その３’末端で、オリゴヌクレオチド（ＲＬオリゴマーと呼ばれる）（その５’末端でリン酸化され、そしてＮＨ２基によってその３’末端が保護される）に連結する。このようなＲＬオリゴマーは、１０〜７０ヌクレオチド長であり得、そしてその５’末端はリン酸基で改変され、そしてその３’末端でアミノ基によって改変される。このようなＲＬオリゴマーの配列は、好ましくは、ヒトｍＲＮＡに相同性を有さない。
【００４５】
この得られたｃＤＮＡの増幅を、コンセンサスＡＲＥ配列を含む３’プライマー、およびＲＬオリゴマーに相同な５’プライマーを使用するＰＣＲによって実施する。
【００４６】
（ＡＲＥ遺伝子ライブラリー）
本発明はまた、本発明によって同定されるＡＲＥ遺伝子のタンパク質コード配列を含むｃＤＮＡライブラリーに関する。このようなライブラリーを生成するために、第一鎖のｃＤＮＡのＰＣＲ増幅後に生成した二本鎖のＤＮＡを、プラスミドベクター中にクローニングする。このｃＤＮＡは、クローニング前に大きさによって分画されてもよいし、分画されなくてもよい。ｃＤＮＡのクローニングは、適切なベクター（例えば、Ｔ／Ａベクターなど）または当業者に公知の他のクローニング技術を使用する。ＰＣＲ産物のこのようなｃＤＮＡクローニングは、例えば、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）、Ｎｏｖａｇｅｎ（Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（ＬａＪｏｌｌａ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）、または他の会社からの市販のキットの使用によって達成され得る。
【００４７】
挿入物を含むライブラリークローンを選択し、さらにクローニングし、ＤＮＡ抽出し、そして精製する。ＤＮＡサンプルを、挿入物に隣接するベクター配列に特異的なプライマー使用して配列決定する。これらの手順の実施は、当該分野で経験的に周知である。
【００４８】
このようなＡＲＥ  ｃＤＮＡライブラリーは、複数の異なるＡＲＥ遺伝子を共に示す複数のＤＮＡ分子を含む。このような個々のＤＮＡ分子は、通常、所定のＡＲＥ遺伝子のフラグメントを含む。このようなフラグメントは、コード配列の全長または部分長を含み得る。このような部分長コード配列は、全長コード配列の約１０％〜約９０％を含み得る。好ましくは、このような部分長のコード配列は、ＡＲＥ遺伝子以外の遺伝子のタンパク質コード配列内に含まれない独自の配列を含む。このような配列の独自性を、公に利用可能な配列データベースのコンピューター検索によって決定する。この方法で単離したいくつかのＡＲＥ遺伝子の配列は、公のデータベース中に見出されない。いくつかのこのような配列を、図７に示す。ライブラリー（好ましくは、本明細書中以降「ＡＲＥライブラリー」という）は、ＥＲＡ遺伝子の部分でないタンパク質コード配列を有する核酸分子を実質的に含まない。本明細書中で使用する場合、ライブラリーを含む分子またはクローンの１０％以下が非ＡＲＥ遺伝子由来のコード配列を含む場合に、このライブラリーは、非ＡＲＥ遺伝子を実質的に含まない。
【００４９】
（ＡＲＥマイクロアレイ）
本発明はまた、ＡＲＥ遺伝子のヌクレオチド配列由来のヌクレオチド分子であるプローブを含むマイクロアレイに関する。本明細書中で使用する場合、用語「マイクロアレイ」は、複数のＡＲＥ遺伝子プローブを含む固体支持体を言う。好ましくは、アレイ上の２０％未満、より好ましくは１０％未満のプローブが、非ＡＲＥ遺伝子のタンパク質コード配列に対して、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で結合する。このようなマイクロアレイは、ＥＡＲ遺伝子のタンパク質コード配列全体を実質的に含み得る。
【００５０】
マイクロアレイを含むプローブは、コンピューター検索方法および上記のようなＡＲＥ  ｃＤＮＡライブラリーの実験的生成の両方によって同定されるＡＲＥ遺伝子に由来する。ＡＲＥ遺伝子由来の配列を、公に利用可能なＵｎｉｇｅｎｅのデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｉｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＵｎｉＧｅｎｅ／）中に存在する遺伝子に対して、ＢＬＡＳＴデータベース中の配列を検索してＵｎｉｇｅｎｅの番号を決定することによって、一致させる。このＵｎｉｇｅｎｅデータベースは、各々のＵｎｉｇｅｎｅの配列またはクラスターが独自の遺伝子を表す、遺伝子の発見のための資源である。Ｕｎｉｇｅｎｅのクラスター同定番号に対応するクローンを使用して、次いで、４０，０００のｃＤＮＡクローンの市販のセット（ヒト４０Ｋセット；Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｇｎｅｎｅｔｉｃｓ；Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ、Ａｌａｂａｍａ）またはＩ．Ｍ．Ａ．Ｇ．Ｅ．  Ｃｏｎｓｏｒｅｔｉｕｍのクローンセット（ｈｔｔｐ：／／ｉｍａｇｅ．ｌｌｎｌ．ｇｏｖ／）のいずれかから得られるクローンを同定する。
【００５１】
マイクロアレイ上に設置された固定核酸（例えば、プローブ）の供給源は、マイクロアレイに依存し、そしていくつかの異なるプローブ型を含む。このようなプローブは、ＡＲＥライブラリーに存在するクローンから増幅された核酸、またはＲｅｓｅａｒｃｈ  ＧｎｅｎｅｔｉｃｓもしくはＩ．Ｍ．Ａ．Ｇ．Ｅ．  Ｃｏｎｓｏｒｅｔｉｕｍから得た核酸を含み得る。このような場合において、これらのクローンからの挿入ＤＮＡ（すなわち、ＡＲＥ  ｃＤＮＡ）を、クローニングされた挿入物に隣接するベクターＤＮＡ配列にハイブリダイズするプライマーを使用するＰＣＲによって増幅する。あるいは、挿入ＤＮＡを、クローニングされた挿入物の配列に特異的な３’プライマーおよび５’プライマーを使用して増幅する。ＡＲＥクローンから増幅されたＰＣＲ産物に加えて、プローブは、ＡＲＥクローン由来のフラグメント（例えば、ＡＲＥクローンの制限エンドヌクレアーゼ切断を介して作製されるフラグメント）を含み得る。
【００５２】
さらに、他の型の分子を、マイクロアレイにおける遺伝子プローブとして使用し得る。例えば、少なくとも１０ヌクレオチド、好ましくは約１０〜約１００ヌクレオチド、より好ましくは約１０〜約３０ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドを使用し得る。ＡＲＥ遺伝子からの配列情報を使用して、このようなオリゴヌクレオチド（これは、次いで、マイクロアレイ上に設置される）を設計し、合成する。このようなオリゴヌクレオチドによってコードされる配列が独自である（すなわち、この配列が、ゲノム内の他のいずれの遺伝子にも存在しない）限り、このようなオリゴヌクレオチドを、ＡＲＥ含有遺伝子の任意の領域（すなわち、５’ＵＴＲ、コード領域、３’ＵＴＲ）に基づいて設計し得る。このようなオリゴヌクレオチドは、好ましくは少なくとも４０％のＧＣ比（すなわち、ＧおよびＣを含むヌクレオチド塩基の割合）を有する。このようなオリゴヌクレオチドはまた、好ましくはオリゴヌクレオチド自体に対して内部でハイブリダイズしない（すなわち、これらは、「ヘアピン」構造を形成しない）。オリゴオリゴヌクレオチドに加えて、合成遺伝子プローブ（例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ））を含む核酸塩基を含む他の遺伝子プローブをまた使用し得る。
【００５３】
ＡＲＥ遺伝子の代表的な配列を含むことに加えて、マイクロアレイはまた、コントロールの目的のために、より少数の、ＡＲＥエレメントを含まない遺伝子の代表的な配列を含む。このような非ＡＲＥ遺伝子は、好ましくは、いわゆる「ハウスキーピング」遺伝子（例えば、β−アクチンまたはＧＡＰＤＨなど）である。
【００５４】
マイクロアレイを、種々の方法で作製する。プローブを、予め決定された量のプローブを個体支持体上に正確に設置するロボット機器にロードし得る。１つの実施形態において、プローブを、ＳＤＤＣ−２マイクロアレイロボット（Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｓｅｒｖｉｃｅ  Ｉｎｃ．；Ｔｏｒｏｎｔｏ、Ｃａｎａｄａ）を使用してポリ−Ｌ−リジンで被覆し、次いでＵＶ−架橋し、そして残ったポリ−Ｌ−リジンを中和したスライドガラスにスポットする。別の実施形態において、オリゴヌクレオチドプローブを、個体支持体の表面上で直接合成する。マイクロアレイの作製は、いくつかの刊行物（Ｓｏｕｔｈｅｒｎら、１９９９、Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ、２１：５−９；Ｄｕｇｇａｎら、１９９９、Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ、２１：１０−４；Ｃｈｅｕｎｇら、１９９９、Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ、２１：１５−９；Ｌｉｐｓｈｕｔｚら、１９９９、Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ、２１：２０−４）ならびに米国特許（例えば、第５，８３７，８３２号、第６，１１０，４２６号およびに第６，１５３，７４３号）に記載されてきた。これらの刊行物および特許は、本明細書中で参考として援用される。
【００５５】
次いで、ＡＲＥマイクロアレイを、ハイブリダイゼーション実験において使用する。マイクロアレイ上のプローブに対する、細胞株または組織由来のｍＲＮＡ、より好ましくはｍＲＮＡから作製されたｃＤＮＡのハイブリダイゼーションは、この細胞株または組織（マイクロアレイ上の特定のプローブに対応する）における、ＡＲＥ遺伝子の、転写のレベルでの発現を示す。マイクロアレイ上のプローブ全体に対する細胞株ＲＮＡまたは組織ＲＮＡのハイブリダイゼーションの量の決定によって、細胞株または組織を含む、全てのＡＲＥ遺伝子の発現パターンを決定し得る。
【００５６】
ｍＲＮＡから作製されるｍＲＮＡまたはｃＤＮＡ（すなわち、標的核酸）を、通常は蛍光標識する。１つの実施形態において、ＡＲＥ転写物の存在および量について試験される総ＲＮＡを、細胞または組織から抽出し、オリゴ（ｄＴ）１１〜１８プライマーおよびＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＲＴを使用する逆転写酵素反応において、シアニン−５−ｄＵＴＰ（Ｃｙ５、赤、Ａｍｅｒｓｈａｍ；Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ）で標識する。同様に、コントロールＲＮＡを、シアニン−３−ｄＵＴＰ（Ｃｙ３、緑）で標識する。標識したｃＤＮＡサンプルを、ＮａＯＨによって加水分解し、カラムクロマトグラフィーによって精製し、そしてＴＥ緩衝液で濃縮する。この標識したｃＤＮＡを混合し、そしてガラススライド上の配列にハイブリダイズさせる。
【００５７】
標的のプローブへのハイブリダイゼーションのための条件は、記載されるように（Ｗａｈｌら、１９８７、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ，１５２：３９９−４０７）、核酸結合複合体またはプローブの融解温度（Ｔｍ）に依存している。本明細書中で使用される場合、用語「ストリンジェントな条件」約Ｔｍ−５（プローブの融解温度の５℃下）からＴｍの約２０℃下までの範囲内で生じる。本明細書中で使用される場合、「高度にストリンジェントな」条件は、少なくとも０．２×ＳＳＣでそして少なくとも６５℃で使用する。当該分野で認識されるように、ストリンジェンシー条件は、プローブの長さおよび性質、標的配列（すなわち、標識されたｃＤＮＡ）の長さおよび性質、ハイブリダイゼーション溶液の塩および他の成分の濃度（例えば、ホルムアミド、硫酸デキストラン、およびポリエチレングリコール）のような変化する多数の因子によって達成される。これらの因子の全ては、上記の条件に等しいストリンジェンシーの条件を生成するために変化され得る。
【００５８】
１つの実施形態において、標識されたｃＤＮＡに加えて、ハイブリダイゼーション溶液は、ポリｄＡ４０−６０（８ｍｇ／ｍｌ）、酵母ｔＲＮＡ（４ｍｇ／ｍｌ）、およびＣｏＴ１  ＤＮＡ（１０ｍｇ／ｍｌ）、３μｌの２０×ＳＳＣ、および１μｌの５０×デンハルトブロッキング溶液を含む。このような標的のマイクロアレイ上のプローブへのハイブリダイゼーション条件は、当業者に公知である。このような条件は、十分に公開されている。このような情報についての１つの供給源は、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（１９９９、Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ，補遺、２１：１〜６０）（これは、参考として本明細書中に援用される）の１９９９年１月刊行（補遺）における一連の記事に存在する。
【００５９】
ハイブリダイゼーション後、標的核酸のマイクロアレイ上の個々のプローブへのハイブリダイゼーションの量の測定、ｍＲＮＡ由来の細胞株または組織中のＡＲＥ遺伝子の発現パターンが決定される。１つの実施形態において、ガラススライドは、洗浄され、そして、ＧｅｎｅＰｉｘ  ４０００Ａスキャナー（ＡｘｏｎＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ；Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）によって読み取り、遺伝子発現データを生成する。このスキャナープログラムは、アレイ上のβアクチンコントロールプローブを使用して、Ｃｙ３（コントロールサンプル）とＣｙ５（実験サンプル）との比の標準化を可能にする。強度比（Ｃｙ３対Ｃｙ５）は、ＡＲＥ遺伝子の相対的な発現プロフィールを示す。特定のＡＲＥ遺伝子の発現における異なるサンプル間（例えば、２つの異なる細胞株、薬物で処理された１つのサンプルを未処理のもう一方のサンプルと比較した場合の同じ細胞株、２つの異なる組織など）の変化が、決定される。
【００６０】
（実施例）
以下の実施例は、本発明の好ましい局面を例示することを意味し、そしていずれの点においても本発明の局面を制限すると解釈されないことを意味する。
【００６１】
（実施例１：ＡＲＥモチーフの計算の誘導）
ＡＲＥ検索配列を、５７の以前に同定されたＡＲＥ含有ｍＲＮＡに属する配列を使用して定義し、そしてＡＲＥモチーフの計算の誘導のために使用した。
【００６２】
分析のためのこれらのｍＲＮＡの選択を、ｍＲＮＡの能力に基づき、２つの基準のうちの１つを満たす：ｉ）３’ＵＴＲのＡＲＥがそのｍＲＮＡの半減期に影響することが実験的に示されている、ｍＲＮＡ、ｉｉ）３’ＵＴＲのＡＲＥが、半減期に影響することが実験的に示されていないが、そのｍＲＮＡは一過的に誘導されることが知られている、ｍＲＮＡ。
【００６３】
これらの基準に基づいて、この計算に使用された５７の以前に同定されたＡＲＥ含有ｍＲＮＡは以下のようである：初期リンパ球活性化抗原ＣＤ６９（Ｓａｎｔｉｓ，ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，２５：２１４２−６．）、６−ホスホフルクト−２−キナーゼ（ＰＦＫ−２）／フルクトース−２，６−ビホスフェート（Ｃｈｅｓｎｅｙ，ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ，９６：３０４７−５２．）、Ｂ−細胞白血病／リンパ腫２  オンコジーン  （Ｂｃｌ−２）（Ｃａｐａｃｃｉｏｌｉ，ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，１３：１０５−１５）、ｃ−ｆｏｓプロトオンコジーン（Ｃｈｅｎ，ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ，１４：４１６−２６．）、ＣＨＯＰ／増殖停止およびＤＮＡ損傷誘導性因子（Ｕｂｅｄａ，ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ，２６２  ：３１−８．）、ｃ−ｍｙｂプロトオンコジーン（Ｒｅｅｖｅｓ  ａｎｄ  Ｍａｇｎｕｓｏｎ，１９９０，Ｐｒｏｇ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ，３８：２４１−８２）、ｃ−ｍｙｃプロトオンコジーン（Ｂｒｅｗｅｒ，１９９１，Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ，１１：２４６０−６．）、サイクリンＤ１（Ｒｉｍｏｋｈ，ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｂｌｏｏｄ，８３：３６８９−９６．）、シクロオキシゲナーゼ（Ｌａｓａ，ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ，２０：４２６５−７４．）、エンドセリン−２（Ｓａｉｄａ，ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，６４：５１−６１．）、上皮増殖因子レセプター（ＭｃＣｕｌｌｏｃｈ，ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ，３０：１２６５−７８．）、エストロゲンレセプターα（Ｋｅｎｅａｌｙ，ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，１４１：２８０５−１３．）、線維芽細胞増殖因子２（Ｔｏｕｒｉｏｌ，ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，２７４：２１４０２−８．）、顆粒球単球コロニー刺激因子（Ｒｅｅｖｅｓ  ａｎｄ  Ｍａｇｎｕｓｏｎ，１９９０，  Ｐｒｏｇ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ，３８：２４１−８２；Ｂｒｏｗｎ，ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，２７１：２０１０８−１２．）、グルコーストランスポーター１（Ｈａｍｉｌｔｏｎ，ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ，２６１：６４６−５１．）、顆粒球単球コロニー刺激因子（Ｓｈａｗ  ａｎｄ  Ｋａｍｅｎ，１９８６，Ｃｅｌｌ，４６：  ６５９−６７．；Ｗｉｎｚｅｎ，ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｅｍｂｏ  Ｊ，１８：４９６９−８０．）、ｇｒｏ−α（Ｓｉｒｅｎｋｏ，ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ，１７：３８９８−９０６．）、誘導性酸化窒素シンターゼ（Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ−Ｐａｓｃｕａｌ，ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，２７５：２６０４０−９．）、インターフェロン−α（Ｒｅｅｖｅｓ  ａｎｄ  Ｍａｇｎｕｓｏｎ，１９９０，Ｐｒｏｇ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ，３８：２４１−８２；Ｃａｐ��ｔ，ｅｔ  ａｌ．，１９８６，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ，  ８３：１６７０−４．）、インターフェロン−αＡＡ（Ｃａｐｕｔ，ｅｔ  ａｌ．，１９８６，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ，８３：１６７０−４．）、インターフェロン−αｌ（Ｒｅｅｖｅｓ  ａｎｄ  Ｍａｇｎｕｓｏｎ，１９９０，Ｐｒｏｇ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ，３８：２４１−８２；Ｃａｐｕｔ，ｅｔ  ａｌ．，１９８６，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ，８３：１６７０−４．）、インターフェロン−αｌＢ（Ｃａｐｕｔ，ｅｔ  ａｌ．，１９８６，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ，８３：１６７０−４．）、インターフェロン−αＦ（Ｒｅｅｖｅｓ  ａｎｄ  Ｍａｇｎｕｓｏｎ，１９９０，Ｐｒｏｇ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ，３８：２４１−８２；Ｃａｐｕｔ，ｅｔ  ａｌ．，１９８６，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ，８３：１６７０−４．）、インターフェロン−αＧ（Ｒｅｅｖｅｓ  ａｎｄ  Ｍａｇｎｕｓｏｎ，１９９０，Ｐｒｏｇ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ，３８：２４１−８２；Ｃａｐｕｔ，ｅｔ  ａｌ．，１９８６，  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ，８３：１６７０−４．）、インターフェロン−αＨ（Ｒｅｅｖｅｓ  ａｎｄ  Ｍａｇｎｕｓｏｎ，１９９０，Ｐｒｏｇ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ，３８：２４１−８２；Ｃａｐｕｔ，ｅｔ  ａｌ．，１９８６，  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ，８３：１６７０−４．）、インターロイキン−ｌα（Ｇｏｒｏｓｐｅ  ａｎｄ  Ｂａｇｌｉｏｎｉ，１９９４，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，２６９：１１８４５−５１．）、インターフェロン−β（Ｐｅｐｐｅｌ，ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ，１７３：３４９−５５．；Ｇｒａｆｉ，ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ，１３：３４８７−９３．）、インターフェロン−γ（Ｇｉｌｌｉｓ  ａｎｄ  Ｍａｌｔｅｒ，１９９１，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，２６６：３１７２−７．）、インターロイキン−ｌβ（Ｋａｓｔｅｌｉｃ，ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｃｙｔｏｋｉｎｅ，８：７５１−６１．）、インターロイキン−１０（Ｋｉｓｈｏｒｅ，ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，１６２：２４５７−６１．）、インターロイキン−２（Ｌｉｎｄｓｔｅｉｎ，ｅｔ  ａｌ．，  １９８９，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４：３３９−４３．；Ｈｅｎｉｃｓ，ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，２６９：５３７７−８３．）、インターロイキン−３（Ｓｔｏｅｃｋｌｉｎ，ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ，２０：３７５３−６３．）、インターロイキン−４（Ｒｅｅｖｅｓ  ａｎｄ  Ｍａｇｎｕｓｏｎ，１９９０，Ｐｒｏｇ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ，３８：２４１−８２）、インターロイキン−６（Ｗｉｎｚｅｎ，ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｅｍｂｏ  Ｊ，１８：４９６９−８０．）、インターロイキン−８（Ｗｉｎｚｅｎ，ｅｔ  ａｌ．，１９９９，  Ｅｍｂｏ  Ｊ，１８：４９６９−８０．）、インターロイキン−１１（Ｙａｎｇ  ���ｎｄ  Ｙａｎｇ，１９９４，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，２６９：３２７３２−９．）、リンホトキシン（Ｒｅｅｖｅｓ  ａｎｄ  Ｍａｇｎｕｓｏｎ，１９９０，Ｐｒｏｇ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ，３８：２４１−８２）、Ｋ−ｒａｓプロトオンコジーン（Ｑｕｉｎｃｏｃｅｓ  ａｎｄ  Ｌｅｏｎ，１９９５，Ｃｅｌｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｄｉｆｆｅｒ，６：２７１−９．）、白血病阻害因子（Ｃａｒｌｓｏｎ，ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｇｌｉａ，１８：１４１−５１．）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｃｈａｍｂｅｒｓ  ａｎｄ  Ｋａｃｉｎｓｋｉ，１９９４，Ｊ  Ｓｏｃ  Ｇｙｎｅｃｏｌ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇ，１：３１０−６．）、マクロファージ走化性タンパク質−１（Ｂｈａｔｔａｃｈａｒｙａ，ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ，２７：１４６４−７２．）、マクロファージ炎症性タンパク質−α（Ｗａｎｇ，ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｉｎｆｌａｍｍ  Ｒｅｓ，４８：５３３−８．）、マクロファージ阻害タンパク質−２α（Ｈａｒｔｎｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔ，５１：１７５４−６０．）、Ｍｄａ−７（Ｍａｄｉｒｅｄｄｉ，ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，１９：１３６２−８．）、単球走化性タンパク質−３（Ｋｏｎｄｏ，ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，９９：５６１−８．）、ＭＹＣＮ（Ｃｈａｇｎｏｖｉｃｈ  ａｎｄ  Ｃｏｈｎ，１９９７，Ｅｕｒ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ，３３：２０６４−７．）、神経増殖因子（Ｃａｐｕｔ，ｅｔ  ａｌ．，  １９８６，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ，８３：１６７０−４．；Ｓｈｅｒｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｅｘｐ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ，２４１：１８６−９３．）、血小板由来増殖因子／ｃ−ｓｉｓプロトオンコジーン（Ｌｉａｎｇ  ａｎｄ  Ｐａｒｄｅｅ，１９９２，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５７：９６７−７１．）、Ｐｉｍ−１  プロトオンコジーン（Ｗｉｎｇｅｔｔ，ｅｔ  ａｌ．，１９９１，  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，１４７：３６５３−９．）、２型プラスミノゲン活性化因子インヒビター（Ｍａｕｒｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，１９９９，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ，２７：１６６４−７３．）、チオレドキシンレダクターゼ（Ｇａｓｄａｓｋａ，ｅｔａｌ．，１９９９，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，２７４：２５３７９−８５．）、組織因子  （Ａｈｅｒｎ，  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，２６８：２１５４−９．）、腫瘍壊死因子（Ｓｈａｗ  ａｎｄ  Ｋａｍｅｎ，１９８６，Ｃｅｌｌ，４６：６５９−６７．；Ｚｕｂｉａｇａ，ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ，１５：２２１９−３０．）、ウロキナーゼ型プラスミノゲンレセプター（Ｍｏｎｔｅｒｏ  ａｎｄ  Ｎａｇａｍｉｎｅ，１９９９，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，５９：５２８６−９３．）、ウロキナーゼ型プラスミノゲン活性化因子（Ｍｏｎｔｅｒｏ  ａｎｄ  Ｎａｇａｍｉｎｅ，１９９９，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，５９：５２８６−９３．）ならびに血管内皮増殖因子（Ｐａｇｅｓ，ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，２７５：２６４８４−９１．）。
【００６４】
これらのｍＲＮＡ配列の３’ＵＴＲ領域を、コード配列の下流の配列を抽出する、Ａｓｓｅｍｂｌｅプログラム（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ；Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）を使用して計算的に抽出した（すなわち、＞ＣＤＳ）。次いで、５７の３’ＵＴＲを、関連した整列されていない配列（ＢａｉｌｅｙおよびＧｒｉｂｓｋｏｖ，１９９８，Ｊ  Ｃｏｍｐｕｔ  Ｂｉｏｌ，５：２１１−２１）の群内に保存されたギャップ化されていない短いモチーフを見出するＭＥＭＥ（モチーフ誘発の多数の期待値最大化）プログラムによって分析した。ＭＥＭＥは、モチーフパターンＵＡＵＵＵＡＷＷを生じた。次に、このモチーフ周辺のコンセンサス分析を行ない、これは、各位置において７５％の確実性で、パターンＷＷＷＵＡＵＵＵＡＵＷＷＷ（Ｗ＝ＡまたはＵ）を生じた（表１）。
【００６５】
【表１】
2004524801.tif 000002
（実施例２：ＡＲＥについて検索するための配列データベースの決定）
目的は、ＡＲＥ検索配列ＷＷＷＵＡＵＵＵＡＵＷＷＷ（これは、実施例１において決定された）を含む配列を同定するためにヒトデータベースを検索することであった。これを行なうために、検索される配列を得なければならない。これを、以下のように行なった。
【００６６】
総数３６，９５１のヒトｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ配列を、ＧｅｎＢａｎｋエントリー中の組織分野（Ｏｒｇａｎｉｓｍ  Ｆｉｅｌｄ）（供給源）におけるＨｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓと共に、規定分野（Ｄｅｆｉｎｉｔｉｏｎ  Ｆｉｅｌｄ）においてｍＲＮＡまたはｃＤＮＡを見出するために使用されたＬｏｏｋｕｐプログラム（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ）を使用して、ＧｅｎＢａｎｋ  Ｒｅｌｅａｓｅ  １１３（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ，ＮＣＢＩ）から抽出した。引き続き、ＰＥＲＬコード（実践的な抽出およびレポート言語）を、ＣＤＳを有していないこれらの配列を除外するために、Ｆｅａｔｕｒｅｓ  Ｔａｂｌｅ（タンパク質コード領域を含んだ配列を含む）における分野ＣＤＳを含んだ配列を抽出するように記載した。これは、２７，４０３のＣＤＳ含有ｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ配列を生じた。このファイルを、完全なＣＤＳ（すなわち、＜、＞、補数または結合のような多義性のＣＤＳなしで）を有する配列を抽出した別のＰＥＲＬプログラムに対する入力として使用した。出力は、ｍＲＮＡ／ｃＤＮＡファイル中の１５，１４８全長ＣＤＳ含有配列であった。このファイル中の配列の３’ＵＴＲを、Ａｓｓｅｍｂｌｅプログラム（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ）（これは、ＣＤＳの下流の配列を抽出する）を使用して構築した（すなわち、＞ＣＤＳ）。これを、ＡＲＥ配列が見出される遺伝子の３’ＵＴＲ領域を得るために行なった。この３’ＵＴＲ抽出工程は、必要である。なぜなら、ＧｅｎＢａｎｋ記録の多くは、この情報は、ここで実行されたＣＤＳ特徴から計算的に抽出し得るという事実にも関わらず、重要な特徴（Ｆｅａｔｕｒｅ  ｋｅｙ）として注釈される３’ＵＴＲを欠いているためである。ＵＮＩＸ（登録商標）コマンド、Ｓｔｒｅａｍ  Ｅｄｉｔｏｒ（Ｓｅｄ）を使用して、３’ＵＴＲを有さない配列を除去する。１３，０５７ヒト全長ＣＤＳ／３’ＵＴＲ含有ｍＲＮＡ配列の結果の列挙を最終的に編集する。
【００６７】
（実施例３：ＡＲＥ検索配列に対するデータベースの検索）
実施例１で配列決定された１３ｂｐのパターン（ＷＷＷＵＡＵＵＵＡＵＷＷＷ）を、ＦｉｎｄＰａｔｔｅｒｎ（Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ）を用い、実施例２で決定された１３，０５７の配列中で検索した。この検索から最大の回収率を可能にするために、コアパターン（ＵＡＵＵＵＡＵ）に隣接するヌクレオチドの各方向中に１つのミスマッチを可能にすることによりストリンジェンシーを減少させた。このステップは、完全長ＣＤＳ／３’ＵＴＲ含有ｍＲＮＡリストの３’ＵＴＲ上で実施した。得られる配列のサブセットは、最長の利用可能な配列を含んだ出力ファイルを生成した、９０％類似性および９０％重複のパラメーターとともに、ＣＬＥＡＮＵＰプログラム（Ｇｒｉｌｌｏら、１９９６、Ｃｏｍｐｕｔ  Ａｐｐｌ  Ｂｉｏｓｃｉ，１２：１−８）を用い、最小限に冗長とした。ＡＲＥ−ｍＲＮＡリストにおける約１７％の冗長性は、計算機により取り除いた。解析されたヒトｍＲＮＡ配列の約８％である合計８９７の最小限に冗長な配列（実施例の最後のリストを参照のこと）を最後に得、そして次いで「ＡＲＥ−ｍＲＮＡデータベース（ＡＲＥＤ）」と称した。このデータベースを、フラットＧｅｎＢａｎｋファイルとして記憶し、そしてさらなる分析のために、市販のＶｅｃｔｏｒ  ＮＴＩソフトウェアのバージョン５．５（ＩｎｆｏｒＭａｘ；Ｂｅｔｈｅｓｄａ、Ｍａｒｙｌａｎｄ）中に取り込んだ。このデータベース中の各配列は、３’ＵＴＲ，完全長ＣＤＳ（すなわち、タンパク質コード配列）、および少なくとも１０ｂｐの５’ＵＴＲを含んでいた。
【００６８】
（実施例４：ＡＲＥ検索配列の特異性の試験）
実施例３では、実施例１で決定されたコンセンサスＡＲＥ配列を用い、実施例２で決定されたように、３’ＵＴＲ配列のデータベースを検索した。コンセンサスＡＲＥ配列の特異性（すなわち、それが上記３’ＵＴＲに特異的であること）に関する独立のチェックとして、これらＡＲＥ配列を、ＡｓｓｅｍｂｌｅおよびＦｉｎｄＰａｔｔｅｒｎを用い、３’ＵＴＲ配列およびコード配列の両方を含んでいた完全なＡＲＥＤデータベース中で検索した。データは、２ミスマッチ（１つはコアＵＡＵＵＵＡＵパターンの各側鎖にある）をもつ１３ｂｐのＡＲＥパターンが、ＣＤＳと比較したとき３’ＵＴＲに対し高度に選択的（８９％特異性）であったことを示す（Ｐ＜０．０００１）。この選択性はまた、いくつかの、ＡＲＥ含有配列を失うことを犠牲にしたが、９６％まで増大し得た（表２）。
【００６９】
【表２】
2004524801.tif 000003
８９７のＡＲＥ−ｍＲＮＡリストを、３’ＵＴＲおよびＣＤＳに対し、ＡＲＥ含有データベースのコンピューターによる編集のために用いられた、異なる検索ストリンジェンシー条件（例えば、保存されたコアに隣接するヌクレオチド中に１ミスマッチおよび２ミスマッチを用いて）の下で、１３ｂｐのパターンの特異性およびデータベース担保範囲について検証した。
【００７０】
１  この検索により検索された、３−ＵＴＲまたはＣＤＳ（タンパク質コード配列）いずれかに存在する１３ｂｐのＡＲＥ検索配列をもつｍＲＮＡ配列の数。
【００７１】
２  各サブセット中に見出されたＡＲＥパターンの数を示す。
【００７２】
３  ３’ＵＴＲまたはＣＤＳあたりの１３ｂｐ  ＡＲＥパターンの発見の平均。
【００７３】
４  ％担保範囲＝％（ＡＲＥパターンをもつ３’ＵＴＲの数／合計８９７のｍＲＮＡ配列）
５  ％特異性（％ｓｐ）＝１−（パターンを含むＣＤＳ／合計８９７のｍＲＮＡ配列）
６  Ｐ値は、Ｗｅｌｃｈ矯正（Ｆ検定により検証されたような有意に異なる分散（Ｐ＜０．０００１）に起因して用いられた）ともに不対ｔ検定を用い、ＡＲＥ  ｍＲＮＡあたり１３ｂｐＡＲＥパターンの平均間の統計的有意差を示す。
【００７４】
Ｎ．Ａ．＝発見が小数であることに起因して利用可能でない。
【００７５】
代表的なＡＲＥ−ｍＲＮＡにおける１３ｂｐＡＲＥ検索配列の区別可能な特徴は、有意な数のＡＲＥ  ｍＲＮＡ（総ＡＲＥ−ｍＲＮＡの約４０％）が、ＷＷＷＵＡＵＵＵＡＵＵＵＡＷＷの優勢パターンでＡＵＵＵＡ（ｎ＞１）の連続パターンを有することである。
【００７６】
（実施例５：ＧＥＮＳＣＡＮを用いるＡＲＥ遺伝子の採掘）
ＧＥＮＳＣＡＮは、ヒトゲノム配列の遺伝子構造の確率的モデルに基づく完全な遺伝子構造を予測するために設計されたソフトウェアプログラムである（ＢｕｒｇｅおよびＫａｒｌｉｎ、１９９７、Ｊ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ、２６８：７８−９４）。このようなモデルは、基本的な転写、翻訳およびスプライシングシグナル、ならびにエキソン、イントロンおよび遺伝子間領域の長さ分布および組成的特徴の記述を取り込んでいる。
【００７７】
ＧＥＮＳＣＡＮプログラムが用いられる２つの例がある。第１の例では、ＧＥＮＳＣＡＮを用いて、ＦｉｎｄＰａｔｔｅｒｎのようなプログラムを用いるＡＲＥ検索配列を含む遺伝子のためのゲノムデータベースを検索した後に得られた遺伝子配列を分析する。このような分析は、３’ＵＴＲ以外の遺伝子の領域（例えば、イントロンまたは遺伝子間領域）中のＡＲＥコンセンサス配列を含むような遺伝子を取り除くために用いられる。第２の例では、このＧＥＮＳＣＡＮプログラムは、ＦｉｎｄＰａｔｔｅｒｎ分析ルーチンを用いることの代替として用いられる。ＦｉｎｄＰａｔｔｅｒｎは、コンセンサスＡＲＥ配列を含む遺伝子を、例えば、この配列が遺伝子内のどこにあろうと同定する。しかし、ＧＥＮＳＣＡＮは、ＡＲＥコンセンサス配列が遺伝子の３’ＵＴＲ中にあるような遺伝子だけを同定するために用いられ得る。ＧＥＮＳＣＡＮは、ゲノム領域のコードセグメントを予測する。従って、ＧＥＮＳＣＡＮは、ＡＲＥ遺伝子を予測するために用いられ得る。最初に、ＦｉｎｄＰａｔｔｅｒｎプログラムを用いてＡＲＥ領域のＡＲＥ遺伝子上流を位置決めする。次いで、この上流ゲノム領域を、ＧＥＮＳＣＡＮまたは別のコンピューター遺伝子予測プログラムで処理し、タンパク質コード領域および予測されたアミノ酸配列の出力を得る。
【００７８】
（実施例６：細胞からのＲＮＡの単離）
ＡＲＥ配列を含む遺伝子のコンピューターによる同定に加え、これら、および先に同定されていないＡＲＥ含有遺伝子の実験室単離もまた、実施した。ＡＲＥ含有遺伝子の実験室単離における最初のステップは、細胞からのＲＮＡの単離であった。
【００７９】
この研究では、単核球性の白血病細胞株であるＴＨＰ−１（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ；Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）が用いられた。この細胞株は、ＡＲＥ  ｍＲＮＡ、インターロイキン−８（ＩＬ−８）およびβアクチンを産生することが知られており、これは、後に論議される。この細胞は、１０％ウシ胎仔血清を補充したＲＰＭＩ  １６４０中で増殖させた。この細胞株は、サイトカインの誘導剤であるリポポリ多糖（ＬＰＳ）（Ａｌ−Ｈｕｍｉｄａｎら、１９９８、Ｃｅｌｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ、１８８：１２−８）、および、タンパク質合成をブロックしそして転写にタンパク質合成を必要としない初期応答遺伝子の発現を増大するシクロヘキシミド（ＣＨＸ）（ＲｅｅｖｅｓおよびＭａｇｎｕｓｏｎ、１９９０、Ｐｒｏｇ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ、３８：２４１−８２）で処理し、そしてＡＲＥ−ｍＲＮＡ安定性を増大させた（ＳｈａｗおよびＫａｍｅｎ、１９８６、Ｃｅｌｌ、４６：６５９−６７）。
【００８０】
総ＲＮＡを、Ｔｒｉ試薬を用いるグアニジンイソチオシアナート法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｅｒ；Ｃｉｎｃｉｎｎａｔｉ、Ｏｈｉｏ）を用いて細胞から抽出した。このＲＮＡをＤＮａｓｅＩ処理に供し、次いでクロロホルム抽出し、沈殿させ、そしてジエチルピロカーボネート処理（ＤＥＰＣ）水中に再懸濁した。
【００８１】
（実施例７：逆転写によるＡＲＥ  ｍＲＮＡの選択的増幅）
ＡＲＥ遺伝子を単離するために、実施例６に記載の単離されたＲＮＡをＤＮＡに逆転写した。単離されたＲＮＡの逆転写は、配列ＷＷＷＴＡＡＡＴＡＡＡＴの１３ヌクレオチド長の縮重プライマーを用いた。逆転写は、ヌクレアーゼフリーの微小遠心分離チューブ中２０μｌ容量中で実施した。総ＲＮＡ（０．５μｇ）を、異なる濃度のプライマーと７０℃まで１０分間加熱し、その後氷上で急速に冷却した。内容物を手短な遠心分離で集め、そして以下を添加した：１×第１鎖緩衝液（２５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．３、３７５ｍＭ  ＫＣｌ、１５ｍＭ  ＭｇＣｌ２）、５００μＭ  ｄＮＴＰ混合物（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ；Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇｈ、Ｍａｒｙｌａｎｄ）、１０μＭ  ｄＴＴ（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ）、および２０Ｕ  ＲＮＡｓｉｎ（Ｐｈａｒａｃｉａ；Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）。このチューブの内容物を穏やかに混合し、そして適切な温度でインキュベートした。次いで、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩ（Ｒｎａｓｅ  Ｈ−ｍｉｎｕｓ  ＭＭＬＶ；ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ）酵素を添加し、そして２時間インキュベートした。反応を沸騰させることにより不活性化した。
【００８２】
この時点で、第１鎖ｃＤＮＡのプールを得た。ＷＷＷＴＡＡＡＴＡＡＡＴプライマーは、ＡＲＥエレメントを含むｍＲＮＡに特異的にハイブリダイズするはずなので、これらのｍＲＮＡは、第１鎖ｃＤＮＡ中に優先的に逆転写されたはずである。ＡＲＥエレメントを含んでいなかったｍＲＮＡは、より優先的でなく逆転写されたはずである。
【００８３】
ＡＲＥエレメントを含むｍＲＮＡが優先的に逆転写されたか否かを試験するために、ｃＤＮＡｓｉｎ、２つのサンプル遺伝子に対応する第１鎖ｃＤＮＡプールの量を決定した。第１の遺伝子、インターロイキン−８（ＩＬ−８）は、その３’ＵＴＲに、不連続の複数なノナマーＶＷＡＵＵＵＡＵＵを含む。従って、ＩＬ−８は、ＡＲＥ含有ｍＲＮＡをコードする遺伝子である。第２の遺伝子、ハウスキーピング遺伝子β−アクチンは、その３’ＵＴＲ中に、単一の代表的ではないＡＲＥペンタマーＵＣＡＧＧ（ＡＵＵＵＡ）ＡＡＡＡを含む。従って、β−アクチンは、ＡＲＥエレメントを含まないと考えられるｍＲＮＡをコードする。これはコントロールである。
【００８４】
第１鎖ｃＤＮＡプールを、ＩＬ−８およびβ−アクチンのＰＣＲ増幅のテンプレートとして用いた。β−アクチンに対するＩＬ−８のＰＣＲ産物の比率の決定は、逆転写により作製されたｃＤＮＡのプール中の２つの第１鎖ｃＤＮＡの相対的豊富さの尺度である。
【００８５】
ＩＬ−８  ｃＤＮＡの増幅には、プライマーは以下のようであった：ＩＬ−８、センス、ＡＴＧＡＣＴＴＣＣＡＡＧＣＴＧＧＣＣＧＴＧＧＣＴ；ＩＬ−８、アンチセンス、ＴＣＴＣＡＧＣＣＣＴＣＴＴＣＡＡＡＡＡＣＴＴＣＴＣ。β−アクチンｃＤＮＡの増幅には、プライマーは以下のようであった：β−アクチン、センス；ＡＴＧＧＡＴＧＡＴＧＡＴＡＴＣＧＣＣＧＣＧ；β−アクチン、アンチセンスＣＴＣＣＴＴＡＡＴＧＴＣＡＣＧＣＡＣＧＡＴＴＴＣ。ＰＣＲは、４０μｇのｃＤＮＡを用い、以下の試薬を以下に示すそれらの最終濃度で用いて実施した：１単位のＴａｑポリメラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）、１×ＰＣＲ緩衝液（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）、各々１０μＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、およびｄＴＴＰ、１μＭのセンスおよびアンチセンス両プライマー。ホットスタート、（すなわち、９５℃で１０分間チューブを加熱する間、反応チューブにＴａｑポリメラーゼを添加する）を用いたか、または、それに代わって、ＴａｑポリメラーゼをＴａｑに対する抗体（Ｓｉｇｍａ；Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、Ｍｉｓｓｏｕｒｉ．）とプレインキュベートした（これは、最初の変性サイクルで加熱することにより再活性化化されるまでＴａｑポリメラーゼを不活性にした）。サイクリング条件は以下の通りであった：９４℃１分間、３５℃（可変温度）２分間、７２℃２分間の最初の４サイクル；９４℃４５秒間、６０℃１分間、７２℃２分間の２５サイクル；７２℃７分間の最終伸長サイクル、４℃一晩貯蔵。
【００８６】
この実験の結果を図１に示す。異なる濃度のプライマーおよび異なる温度で作製されたｃＤＮＡを試験した。図１において左から右に移動したとき、ＩＬ−８バンドの強度をβ−アクチンバンドの強度と比較することにより、β−アクチンに対するＩＬ−８の比率が増大することが観察される。図１のレーン５中では、β−アクチンからのｃＤＮＡの合成が、ほぼ完全に抑制された。これらの条件下（２５μｇ／ｍｌのプライマーおよび５２℃の反応温度）では、ｃＤＮＡ合成は、ＡＲＥ含有ＩＬ−８ｍＲＮＡに特異的であった。
【００８７】
二糖類トレハロースを、ＡＲＥ  ｃＤＮＡの選択を維持しながら、β−アクチンｃＤＮＡ量のさらなる精緻な抑制のために用いた（図２）。ＲＮＡを、ＡＲＥプライマーと混合し、そして３０％グリセロール溶液中で６５℃で１０分間加熱し、そして５０℃まで冷やした。ＲＴ緩衝液ミックスは上記のようであったが、トレハロース（８０％ｗ／ｖ）および０．１％ＢＳＡを含んだ。このＲＴ反応中のトレハロースの最終濃度は、約２０％ｗ／ｖであった。ＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩを反応あたり２００Ｕで添加し、そして反応物を５５〜６０℃のアニーリング温度に２分間保った。最後に、反応を、煮沸により不活性化するまで、１時間のさらなるインキュベーションにより進行させた。次いで、ＰＣＲを上記のように実施した。
【００８８】
逆転写反応へのトレハロース添加の結果は、ＡＲＥコンセンサス配列を含まなかったｍＲＮＡの逆転写と比較した、ＡＲＥ含有ｍＲＮＡに対する逆転写反応の、より高い特異性であった。
【００８９】
図２に示されるように、トレハロースを含めること、そしてそれ故、より高い６０℃程度のアニーリング温度は、より少ない量のＩＬ−８  ｃＤＮＡシグナルに影響することなく、多量のｃＤＮＡの劇的な抑制を生じた。
【００９０】
（実施例８：５’ＵＴＲまたはＡＲＥ含有ｍＲＮＡ中のモチーフのコンピューターによる導出）
実施例７において作成されたＡＲＥ含有第１鎖ｃＤＮＡの代表的な配列をクローニングするために、ｃＤＮＡを増幅した。１つの実施形態において、これは、ＰＣＲ増幅によって行なわれた。このＰＣＲ増幅は、コンセンサスＡＲＥ配列モチーフの代表的な３’プライマーを使用した。ＡＲＥ含有ｃＤＮＡの５’領域に由来する、さらなるプライマーもまた、必要とした。このような５’プライマーは、遺伝子の翻訳開始部位を含む遺伝子の領域に由来し、これは、ＡＴＧ開始コドンを含む。５’プライマーの設計を、以下の実施例に記載する。
【００９１】
ＡＲＥ−ｍＲＮＡデータベース（実施例３に記載される８９７個の遺伝子）における配列の５’ＵＴＲ開始コンテクスト配列（すなわち、開始コドン（ＡＴＧに隣接する配列）を分析した。ＡＴＧ開始コドンの周りのヌクレオチド配列が保存されていることは、公知である（Ｋｏｚａｋ  １９８７，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ，１５：８１５２−４８；Ｋｏｚａｋ，１９８７，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ，１９６：９４７−５０）。従って、この領域を、ＡＲＥ遺伝子が、全ての遺伝子と比較してＡＴＧの周りの配列のわずかに異なる保存を有するいう考えを用いて５’プライマーを設計するために選択した。
【００９２】
８９７個のＡＲＥ遺伝子の範囲外の、６０５個のＡＲＥ遺伝子は、データベースにおいてＡＴＧ開始コドンの少なくとも１０ｂｐの上流（すなわち、５’）を有する。これらの６０５個の配列を、ＡＴＧ開始コドンの周りの領域を試験するために使用した。これらの６０５個の配列を、それぞれ、配列名ＡＴＧＮおよびＮＡＴＧＮ（Ｎ＝ＡまたはＣまたはＧまたはＴ）を使用して、４種のサブセットまたは１６種のサブセットのいずれかに分割された。これは、ＰｉｌｅＵＰプログラム（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ）を使用する６０５個の配列の短縮型５’ＵＴＲ（−７ｂｐ  ＡＴＧ，＋２ｂｐ）の整列に続く。それぞれの位置で７５％の確実度のレベルにおける４個および１６個のコンセンサスパターンは、整列に由来した（表３）。表３におけるコンセンサス配列は、最も頻繁に生じることに注意することは重要である。従って、ＡＲＥＤ配列データベースにおけるすべての配列が、本明細書中で表されるわけではない。
【００９３】
ＡＲＥ  ｍＲＮＡデータベースにおける全体のコンセンサス開始部位は、それぞれの位置での５０％の確実度レベルにおいてＳＳＭＡＭＳＡＴＧＲＭであった。比較すると、非クラスター化ランダムヒト配列の開始コンセンサスは、ＳＳＳＲＭＳＡＴＧＲＭであった。保存されたパターン、ＣＡＣＣＡＴＧＧをまた、表３において記載し、そして全ＡＲＥ  ｍＲＮＡの約３０％に出現する。これは、以前に報告されたＫｏｚａｋ配列ＣＲＣＣＡＴＧに類似し、そしてＴｒａｎｓＴｅｒｍデータベース１（１Ｔｒａｎｓ  Ｔｅｒｍは、多くの異なる種に関する、開始コドンおよび停止コドンならびにコドン用法データに関する配列情報を含むデータベースである。ＵＲＬは、ｈｔｔｐ：／／ｕｔｈｅｒ．ｏｔａｇｏ．ａｃ．ｎｚ／Ｔｒａｎｓｔｅｒｍ．ｈｔｍｌである）において入手可能なより大きなリストのパターン、ＣＡＭＣＡＴＧＧＣに類似する。
【００９４】
【表３】
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４個および１６個の１０マー（−６ＡＴＧ，＋１）コンセンサス配列の統計分析を実施した（表４）。１６個のサブセットのそれぞれにおける配列を、開始コンテクスト配列に関して分析した。各コンセンサスパターンは、５個の保存ヌクレオチド（すなわち、各方向における１つの隣接ヌクレオチドを有するＡＴＧ）および６個のさらなる上流変性ヌクレオチドおよび１つのさらなる下流ヌクレオチドを含む。開始領域における多くの共通コンセンサスは、ＣｇコンセンサスＶＶＶＶＲＳＣＡＴＧＧＭである（表４）。他の頻繁な開始コンセンサスは、Ｃａ、ＡｇおよびＧｇである。それぞれは、全てのＡＲＥ  ｍＲＮＡの約９〜１０％を占める。
【００９５】
全てのコンセンサス配列が、開始領域に固有であるわけではない。これは、コンセンサス配列が、転写イニシエーターＡＴＧを含まないｍＲＮＡ配列の領域（タンパク質コード配列内）に見出され得たことを意味する。特定のコンセンサス配列に依存して、開始領域に加えて内部の部位の種々の程度の内部部位が存在した。任意のＡＴＧに周りの多くの共通コンセンサス配列は、全体のＡＲＥ−ｍＲＮＡ分子の３９％に存在するＡａコンセンサス（表４）であった。最小の生じたコンセンサス配列は、ＡＴＧのＴ上流（例えば、Ｔａ、Ｔｃ、ＴｇおよびＴｔコンセンサス）によって隣接された配列である。任意のサブセットおける開始領域中のコンセンサスの最も高い集団は、７１％の部位（開始および内部）が、開始配列であったＧｃコンセンサスであった。１個のｍＲＮＡあたりの全体のコンセンサス部位は、１．０〜１．６５の範囲であった（すなわち、コンセンサス配列が、翻訳開始領域以外のｍＲＮＡに見出される場合、＞１）。
【００９６】
【表４】
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（実施例９：ＰＣＲによるＡＲＥ  ｃＤＮＡの増幅）
一旦、第１鎖のｃＤＮＡを、細胞内のＲＮＡから合成し、第１鎖のｃＤＮＡを、二重鎖ＤＮＡへと作製し、そして二重鎖ＤＮＡを増幅した。この実施例において、二重鎖ＤＮＡの増幅は、ＰＣＲを使用して行なった。実施例８に記載されるプライマーを含む５’プライマーおよび以前に、この適用において記載された３’ＡＲＥ特異的プライマーを使用して行なった。
【００９７】
ＡＲＥ−ｃＤＮＡ  ＰＣＲと称されるＰＣＲプロトコルを、ＡＲＥ  ｃＤＮＡを選択的に増幅するために使用した。ＡＲＥ  ｃＤＮＡの選択的な増幅を、種々の数のＡＲＥ反復を有する公知のＡＲＥ  ｍＲＮＡ分子（ＩＬ−８、ｃ−ｆｏｓおよびＴＮＦ−α）に対する特定のＰＣＲを使用して、そして実施例７のように、非ＡＲＥβ−アクチンシグナルの発生量のモニタリングによって検証した。ＴＮＦ−α  ｍＲＮＡは、連続する範囲  ＵＵＡＵＵＵＡＵＵ（ＡＵＵＵＡ）５を含むが、ＩＬ−８は、ＡＲＥ隣接領域において非連続的な多数のノナマーを含む。癌原遺伝子、ｃ−ｆｏｓは、２つの連続する重複ノナマー（すなわち、ＵＡＡＵＵＵＡＵＵＵＡＵＵ）を有する。以前に議論されるように、β−アクチンは、ＡＲＥエレメントを含まないと考えられるｍＲＮＡをコードする。ＡＲＥ−ｃＤＮＡ  ＰＣＲの目標は、典型的なＡＲＥ−ｃＤＮＡを増幅し、そして非ＡＲＥ配列の増幅を同時に抑制することである。
【００９８】
最適化ＡＲＥ−ｃＤＮＡ  ＰＣＲ（実施例６に記載され、そして図３に簡単の簡単な説明における改変のように）を使用して、β−アクチン  ｃＤＮＡシグナルと比較した場合、ＩＬ−８  ｃＤＮＡとＴＮＦ−α  ｃＤＮＡの両方は、特異的に増幅された（図３）。図３はまた、最適なアニーリング温度およびＰＣＲサイクル数に関するさらなるデータを示す。例えば、ＡＲＥアニーリング温度における小さな差異（すなわち、第１の４回のサイクルの間）は、不連続な複数のノナマーを有するＩＬ−８の場合における特異性に有意な影響をもたらすが（図３ａ）、連続する重複する複数のノナマーを有するＴＮＦ−αでは、もたらさない（図３ｂ）。β−アクチンの発生量は、実質的に、全ての株において抑制された。
【００９９】
全ての実験において、特定のＰＣＲに対するプライマーが、１より多いエキソンにわたるように設計された場合、ＤＮＡ夾雑物は、より大きなＰＣＲ産物の欠損によってモニタされた。ＡＲＥ−ｃＤＮＡ  ＰＣＲを伴って実施された、ＴＮＦ−αおよびＩＬ−８  ｃＤＮＡの特異的な増幅は、繰越ｃＤＮＡが原因ではなかった。この繰越ｃＤＮＡは、４ｎｇの量を有し、そして５０μＭのｄＮＴＰおよび２５サイクルの使用を含む高いストリンジェントな条件下で実施された。
【０１００】
（実施例１０：ＡＲＥを含む配列の特定のＰＣＲ増幅後のＲＮＡリガーゼ媒介増幅）
選択的な逆転写の代替案または第１鎖ｃＤＮＡへのＡＲＥ含有ｍＲＮＡの選択的な増幅の代替案としては、代替案は、ＲＮＡ媒介増幅である（図４）。
【０１０１】
ＲＬ−ＡＲＥ−ＰＣＲと称される、この手順を実施するために、全ＲＮＡを、使用されるプライマーが、ＮＨ２の添加によって、その３’末端において改変されたオリゴ（ｄＴ）であったことを除けば、実施例７において記載されるようなＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩによって逆転写した。このｃＤＮＡ反応において、２ユニットのＲＮａｓｅ  Ｈを、添加し、そして２０分間、３７℃でインキュベートし、次いで２分間、９０℃でインキュベートした。次いで、この反応におけるｃＤＮＡを、５’−リン酸化改変オリゴマーとＮＨ２  ３’−末端改変オリゴマーとを連結した（ＲＬ  オリゴ；Ｏｐｅｒｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．；Ａｌａｍｅｄａ，ＣＡ）。オリゴ（ｄＴ）の３’末端プライマーおよびＲＬオリゴプライマーを、アミノ（ＮＨ２）基でブロックして、オリゴ（ｄＴ）とＲＬオリゴマーの自己連結または相互連結を防止した。２５μｌの反応物は、以下の含む：２．５μｌの１０×リガーゼ緩衝液、１６．７μｌ（２μｇ）のｃＤＮＡ、０１．０μｌ（１０Ｕ）のＴ４  ＲＮＡリガーゼ、０１．０μｌ（０．５μｇ）の３’末端ＮＨ２ブロック化プライマーおよび５’末端リン酸化プライマー。この反応物を、３７℃で１．５時間インキュベートし、その後、１６℃で１．５時間インキュベートし、そして次いで、１００℃で２分間インキュベートした。
【０１０２】
これの後、ＲＬ配列に特異的な５’プライマーおよびＡＲＥ領域に特異的な３’プライマーを使用して、ＲＬ−連結化ｃＤＮＡの増幅が続いた。ＰＣＲは、実施例７に記載されるように行なった。このＰＣＲに使用されたプライマーは、ＧＡＣＴＣＣＡＣＡＡＣＣＡＣＧＡＣＡＣＡおよびＰＴＧＴＧＴＣＧＴＧＧＴＴＧＴＧＧＡＧＴＣＬであった。ここで、Ｐ＝リン酸、およびＬ＝アミノリンカーである。このＰＣＲ実験は、β−アクチンではなくて、ＡＲＥ−ｃＤＮＡ、ＴＮＦ−αの増幅を検証した。
【０１０３】
（実施例１１．ＰＣＲ産物のクローニング）
ＰＣＲ産物のクローニングは、ＡＲＥ遺伝子のライブラリーを構築するために必要であった。ｐＵＣ１９ミニライブラリーの試験的な構築は、ＲＬ−ＡＲＥ−ＰＣＲの最適な条件から生成された増幅ＡＲＥ−ＰＣＲ産物を使用して実施した（図５）。これは、ＰＣＲ産物を採取し、次いでＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメンドおよびｄＮＴＰを使用してＰＣＲ産物を処理して、ＰＣＲ産物のＤＮＡ末端を平滑化した。次いで平滑化末端を、Ｔ４キナーゼを使用してリン酸化した。このＤＮＡを、フェノールで抽出し、そしてクロロホルムで抽出した。次いで、このＰＣＲ産物を、制限エンドヌクレアーゼを用いて直線化したｐＵＣ１９プラスミドベクターに連結した。このようなプラスミドは、平滑化された末端を有し、そして酵素的に脱リン酸化、好ましくはアルカリホスホターゼを用いた。この連結されたプラスミドを、細菌の形質転換に使用した。
【０１０４】
形質転換体によって得られた細菌のコロニーを、無作為に選択し、そしてミニプラスミド調製を、評価目的のために実施した。増幅インサートの平均サイズは、６００ｂｐであり、そしてこのインサートのサイズは、３５０から８００ｂｐの範囲であった。このサイズの範囲は、マイクロアレイのｃＤＮＡスポットプローブを作成する目的を満たした。このクローンのこのインサートを、配列決定して、このインサートのＤＮＡ配列情報を提供した。これらクローンの配列の多くを、公的に利用可能な配列データベースにおいて見出した。これらのクローンの他の配列を、このようなデータベースにおいて見出さなかった。これは、このようなクローンが、以前に未知であった遺伝子を同定することを示唆する。このようなクローンの多くの配列を、図７に示す。
【０１０５】
（実施例１２．ＡＲＥマイクロアレイの作成および使用）
この研究は、ＡＲＥ遺伝子の代表的なＤＮＡ配列を含むマイクロアレイの作成を記載する。このようなマイクロアレイは、遺伝子発現分析のために使用する。
【０１０６】
このようなマイクロアレイを作成するために、単遺伝子クラスターＩＤを、ＡＲＥデータベース（ＡＲＥＤ）において８９７個の遺伝子を得た。単遺伝子ＩＤを有しない８９７間の遺伝子、そしてＡＲＥライブラリーに含まれるＡＲＥ遺伝子に関して（実施例１１）、これらの遺伝子由来の配列情報は、ＢＬＡＳＴＮの入力のために使用されて、これらの配列に対応する遺伝子および対応する単遺伝子クラスターＩＤ遺伝子を検索する。次いで、単遺伝子クラスターＩＤを、使用して、ＡＲＥ−ｃＤＮＡの大部分である、Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｉｎｃのクローンの４０Ｋセット由来の対応するクローンを抽出した。さらに、個々のＩＭＡＧＥクローンをまた、購入し、そして注文の配列改を検証した。さらに、３０個のハウスキーピング遺伝子のリスト（コントロール遺伝子）を、質のコントロールおよび正規化の目的のためにアレイにおいて含まれるように編集した。
【０１０７】
ｃＤＮＡクローン（グリセロール培養ストック）を、９６ウェル増殖ブロックにおいて増殖した。ガラススライドにスポットしたプローブｃＤＮＡを、クローンからの挿入ＤＮＡのＰＣＲ増幅によって得た。精製したプラスミドＤＮＡは、ＰＣＲ反応物に関するテンプレートとして役立った。このプラスミドを、市販のプラスミドミニ調製物キットを使用して調製した。全てのＰＣＲ反応は、９６ウェル薄壁ＰＣＲプレート中で実行した。この反応混合物は、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ（ｐＨ８．４）、５０ｍＭ  ＫＣｌ、１．５ｍｇ  ＭｇＣｌ２、０．８ｍＭのそれぞれのｄＡＴＰ、ｄＴＴＰおよびｄＣＴＰ、０．１μＭの順方向オリゴヌクレオチドプライマー（５’−ＧＴＴＧＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴＧ）、０．１μＭの逆方向オリゴヌクレオチドプライマー（５’−ＣＡＣＡＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧ）および５ユニットのＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ。この反応物は、１００μｌの全容積を有し、そして１００〜３００ｎｇの精製プラスミドを有して、テンプレートＤＮＡを提供する。ＰＣＲを、以下のサーマルサイクラープログラムを使用して実施した：９４℃を２分間の１サイクル、９４℃を３０秒間、５５℃を３０秒間そして７２℃を２．５分間の２７サイクル、７２℃を５分間の１サイクル。次いで、このＰＣＲ産物（５μｌの反応）物を、アガロースゲル電気泳動によって分析し、そしてさらなるプロセスまで−２０℃で保存した。ＰＣＲ産物を、さらに、エタノール沈殿または市販のＤＮＡ精製プレートのいずれかによって、９６ウェルフォーマットにおいて処理した。精製したまたは沈殿したＰＣＲ産物を、塩溶液（例えば、３×ＳＳＣ）中に懸濁した。
【０１０８】
これらの再懸濁したＤＮＡは、ＡＲＥ含有遺伝子アレイを与えるためにガラススライドにスポットされたプローブＤＮＡであった。このスライドを、ポリ−Ｌ−リジンで最初にコートした。ポリ−Ｌ−リジンスライドコーティング手順は、以下のようであった。単純金シール顕微鏡スライドバッチを、２時間攪拌しながら、洗浄溶液中（６０％のエタノール中２．５Ｍ  ＮａＯＨ）でインキュベートした。次いで、このスライドを、滅菌水で、各リンスを５分間かけて、５回リンスした。次いで、このスライドを、攪拌しながら、１時間ポリ−Ｌ−リジン溶液（０．１×標準組織培養ＰＢＳ中の０．０１％のポリ−Ｌ−リジン）中でインキュベートした。次いで、スライドを、１分間滅菌水でリンスして、そして任意の遊離した液体を、低速のスライドの遠心分離によって除去した。コートされたスライドを、粉塵なしで保存し、そして数週間アレイプリンテイングのために使用し得た。
【０１０９】
プローブＤＮＡを、ＥＳＩからのＳＤＤＣ−２マイクロアレイロボット（Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ  Ｉｎｃ．；Ｔｏｒｏｎｔｏ，Ｃａｎａｄａ）を使用してスライドにアレイした。設定は、各スライドに同時に、８個の個々のプローブＤＮＡを送達し、全てのプローブピックアップ工程間でピンを２回水中で洗浄する８個のプリントピンを使用した。プローブＤＮＡは、３８４ウェルプレートに含まれて、プリンティング手順の間、蒸発による消失を最小化した。各スライドにおけるアレイ領域のサイズはアレイにおけるプローブＤＮＡの数に依存した。近接ＤＮＡスポットの中心間の距離は、２００μｍであった。すべてのプローブＤＮＡを、少なくとも２連で各アレイ上にスポットした。例えば、８個のプリントピンを使用して３８４ウェルプレートからプリントされた１０００遺伝子のアレイ（従って、２０００アレイスポット）は、約１７０ｍｍ２のスライドの領域を覆った。プリンティング後、このアレイスライドを、ＵＶ架橋の前に、２〜４時間粉塵なしで保存した。
【０１１０】
アレイしたプローブＤＮＡを、４５０ｍＪのＵＶ線量を用いるＳｔｒａｔａｌｉｎｋｅｒ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を使用してポリ−Ｌ−リジンコートに架橋した。アレイスライド上のリジン残基の正電荷を、新しく調製した、１−メチル−２−ピロリジノン／７７ｍＭ  ホウ酸緩衝液中の１．７％の無水コハク酸の溶液でスライドを３０分間、インキュベートすることによって中性化した。次いでこのスライドを、最初に９５℃の蒸留水に２分間浸漬し、そして第２の９５％のエタノールに浸漬した。次いで、過度のエタノールを、低速の遠心分離によって除去し、そしてｃＤＮＡマイクロアレイを、ハイブリダイゼージョンのために使用する用意できた状態で、粉塵なしで室温で保存した。
【０１１１】
遺伝子発現実験のためのＡＲＥマイクロアレイを使用するために、全ＲＮＡ（１００μｇ）サンプルを、Ｑｉａｇｅｎ  Ｒｎｅａｓｙ  ＲＮＡ精製キットを使用してＣＨＸおよびＬＰＳで以前に処理したＴＨＲ−１細胞から抽出し、そして、Ｔｒｉｚｏｌ試薬（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）によって精製した。ＲＮＡサンプルを、ｏｌｉｇ（ｄＴ）１１〜１８プライマーおよびＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＲＴを使用する２つの別々のＲＴ反応において、シアニン−３−ｄＵＴＰ（Ｃｙ３、緑色）およびシアニン−５−ｄＵＴＰ（Ｃｙ５、赤色、Ａｍｅｒｓｈａｍ）を用いて標識した。標識化ｃＤＮＡサンプルを、ＮａＯＨによって加水分解し、そしてＭｉｃｒｏ  Ｂｉｏ−Ｓｐｉｎ（登録商標）６クロマトグラフィーカラム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）で精製し、そしてＴＥ緩衝液で濃縮した。標識化ｃＤＮＡサンプル混合物を、マイクロアレイにハイブリダイズさせた。このハイブリダイゼージョン溶液は、ポリｄＡ４０〜６０（８ｍｇ／ｍｌ）、酵母ｔＲＮＡ（４ｍｇ／ｍｌ）およびＣｏＴ１  ＤＮＡ（１０ｍｇ／ｍｌ）、３μｌの２０×ＳＳＣおよび１μｌの５０×Ｄｅｎｈａｒｄｔのブロッキング溶液を含んだ。この混合物を、ＡＲＥ−ｃＤＮＡガラススライドにアプライし、そしてストリンジェントな条件下でハイブリダイズした。次いで、ガラススライドを洗浄した。
【０１１２】
マイクロアッセイへのハイブリダイゼージョンの分析は、ＧｅｎｅＰｉｘ  ４０００Ａ  スキャナー（Ａｘｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を用いてマイクロアレイのスキャニングを使用した。このスキャニングプログラムは、アレイ上のβ−アクチンコントロールを使用してＣｙ３（ＴＨＰ−１コントロールサンプル）とＣｙ５（ＬＰＳ＋ＣＨＸ処置ＴＨＰ−１サンプル）との比の正規化を可能にする。２連のほとんどが、類似の読み取りを与えた。ＡＲＥ−ｃＤＮＡマイクロアレイを使用して測定された２つのｃＤＮＡサンプルからの強度の比は、２つの開始ＲＮＡサンプルにおけるＡＲＥ遺伝子の相対的な発現プロフィールを表す。図６は、多くのＡＲＥ−ｃＤＮＡの異なる発現を示すＡＲＥ−ｃＤＮＡアレイの発現プロフィールを示す（図６ａ、６ｂ）。この結果は、ＡＲＥの機能を支持した：（ｉ）大きな集団を、早い時点（２０分、図６ｂ）で誘導した、（ｉｉ）多くが、一過性の発現パターンを示した（図６ｃ）、（ｉｉｉ）多くの集団が、タンパク質合成に独立していた（ＣＨＸ処置）、および（ｉｖ）多くの集団が、ＣＨＸ処置を用いて下方制御された。
【０１１３】
【表５】
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【図面の簡単な説明】
【図１】
逆転写によるＡＲＥ含有ｃＤＮＡの選択。総ＲＮＡ（０．５μｇ）を、ＣＨＸ（５μｇ／ｍｌ）およびＬＰＳ（１０μｇ／ｍｌ）を用いて処理したＴＨＰ−１細胞から抽出した。ｃＤＮＡを、１５μｇ／ｍｌ（レーン２およびレーン３）または２５μｇ／ｍｌ（レーン４およびレーン５）のいずれかの濃度におけるＡＴ−Ｐプライマー（ＷＷＷＴＡＡＡＴＡＡＡＴ）を用いて、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩを使用してこのＲＮＡから合成した。異なるＲＴ反応温度を使用した：４２℃（レーン２およびレーン４）および５２℃（レーン３およびレーン５）。ＩＬ−８に特異的なＰＣＲ（上のボックス）およびβ−アクチンに特異的なＰＣＲ（下のボックス）を、標準的なＰＣＲ条件を用いて実行した。ＩＬ−８およびβ−アクチンの通常の存在量を、レーン１に示す。ＤＮＡ夾雑がないことは、特異的増幅されるより大きい産物がないこと（上の矢印）またはＲＮＡを含むネガティブコントロール（ＮＣ）によって確認した。
【図２】
特異的ＡＲＥプライミングの効率に対するトレハロースの影響および豊富なｃＤＮＡの逆転。総ＲＮＡを、ＣＨＸ＋ＬＰＳ処理したＴＨＰ−１細胞から抽出した。ｃＤＮＡを、２５μｇ／ｍｌの濃度のＴＡ−Ｐプライマー（ＴＡＡＡＴＷＶＡＴＡＡＡＴ）を用いてＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩを使用して合成した。ＲＴを、トレハロースの非存在下（レーン１、レーン２、およびレーン３）または存在下（レーン４およびレーン５）で、６０℃のプライミングアニーリング温度で実行した。ＩＬ−８およびβ−アクチンについての特異的ＰＣＲ（ｃＤＮＡの投入量：レーン２および３、０．５μｇ；レーン４および５、０．２５）を、標準的なＰＣＲ条件を使用して実行した。レーン１は、使用した同じＰＣＲ条件におけるβ−アクチンおよびＩＬ−８の通常の存在量を示す。上のバンドは、β−アクチン産物の予想される大きさであり、一方、下のバンドは、予想されるサイズのＩＬ−８産物である。ＤＮＡ夾雑がないことは、特異的に増幅されるより大きい産物がないことによって確認した。
【図３】
不連続ＡＲＥ−ｃＤＮＡおよび連続ＡＲＥ−ｃＤＮＡの選択性に対する開始アニーリング温度およびサイクル数の影響。ＬＰＳ＋ＣＨＸ処理したＴＨＰ−１細胞由来の総ＲＮＡ（１μｇ）を、抽出し、そしてＲＴに供した。４０ｎｇのｃＤＮＡを、５’プライマー、Ｃａ（表３）、および３’ＡＲＥプライマーを用いて、異なる開始アニーリング温度（４サイクル）、続く異なるサイクル（レーン１、２０サイクル；レーン２、２５サイクル；レーン３、３０サイクル、レーン４、３５サイクル）を使用する、高いアニーリング温度（６０℃）における、ＡＲＥ−ｃＤＮＡ  ＰＣＲのために使用した。増幅したＡＲＥ産物のアリコートを、ＡＲＥ増幅の選択性をモニターするためのβ−アクチンに加えて、ＩＬ−８（ａ）およびＴＮＦ−α（ｂ）に特異的なストリンジェントな条件において第２のＰＣＲに供した。繰り越されたｃＤＮＡ量（４ｎｇ）からのＰＣＲが、同じＰＣＲ条件において検出可能なＩＬ−８メッセージおよびＴＮＦ−αメッセージを示さなかったので、ＩＬ−８の特異的な増幅産物は、本来のｃＤＮＡからのｃＤＮＡの繰り越しによるものではなかった。
【図４】
ＡＲＥ−ｃＤＮＡの全長コード領域の、ＲＮＡリガーゼで指向された増幅の概略図。ＲＬオリゴは、その５’端でリン酸化され、そしてアミノ基を伴った３’端で改変された３０マーオリゴヌクレオチドである。
【図５】
ＲＮＡリガーゼで指向されたＡＲＥ−ＰＣＲ（ＡＲＥ−ＲＬ−ＰＣＲ）による、ＡＲＥ−ｃＤＮＡの選択的増幅。総ＲＮＡをＴＨＰ−１細胞から抽出した。ｃＤＮＡを（２つの異なったアニーリング温度、４２℃および５２℃における）ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩによって、オリゴ（ｄＴ）プライマーを用いて合成し、その後、５’リン酸化しかつ３’アミノ改変したオリゴマー（ＲＬオリゴマー）を、このｃＤＮＡの３’端に、ＲＮＡリガーゼを用いて連結した。ＲＬオリゴマーに特異的な５’プライマー、およびＡＲＥ領域に特異的な３’プライマーを用いるＰＣＲを、アニーリング温度４２．５℃で実施した。ＴＮＦ−αおよびβ−アクチンに対する第２の特異的なＰＣＲを、１／１０のｃＤＮＡ（レーン１おいびレーン３）または１／５０のｃＤＮＡ（レーン２およびレーン４）のいずれかを用いて実施した。ＰＣＲを、２つの異なったｄＮＴＰ濃度を用いて使用した：１０μＭ（レーン１およびレーン２）ならびに４０μＭ（レーン３およびレーン４）。上のバンドはＴＮＦ−αの期待されるサイズ（５４８ｂｐ）であり、その一方、下のバンドは、β−アクチン産物のサイズ（８３８ｂｐ）を示し、その間、ＤＮＡ夾雑を欠いていることは、それぞれ、１４５０ｂｐおよび１２１６ｂｐのより大きいバンドがないことによって、確証した。Ｃは、もとのｃＤＮＡからのｃＤＮＡ繰り越しコントロールを示す。
【図６】
第１の生成ＡＲＥ−ｃＤＮＡマイクロアレイの試験。ＴＨＰ−１細胞を、ＬＰＳ（１０μｇ／ｍｌ）およびシクロヘキシミド（５μｇ／ｍｌ）で処理した。処理済みの細胞および未処理の細胞からの総ＲＮＡサンプル（１００μｇ）を、Ｃｙ３およＣｙ５でそれぞれ標識し、そしてＡＲＥ−ｃＤＮＡマイクロアレイにハイブリダイズさせた（ａ）。（ｂ）二連のスポット上を、ＧｅｎｅＰｉｘ  ４０００Ａスキャナーを使用して測定した、処理済サンプル  対  未処理サンプルの平均蛍光シグナルをプロットし、ＬＰＳおよびＬＰＳ＋ＣＨＸの場合における２つの遺伝子発現プロファイル、アレイ中の約１０００のｃＤＮＡに関連する発現したＡＲＥ遺伝子の百分率、およびこれらの最大誘導倍率を明示した。（ｃ）階層型Ｗａｒｄクラスターモデル（ＳＡＳ−ＪＭＰ）を用いるクラスター分析を使用したＡＲＥ遺伝子（約１００遺伝子）に特徴的な、ベル型の一過性応答曲線の例。
【図７】
ＡＲＥ  ｍＲＮＡの逆転写、続くＡＲＥ配列のＰＣＲまたはＲＮＡリガーゼにより指向されたＡＲＥ−ＰＣＲのいずれかの後の、得られたＡＲＥ  ｃＤＮＡの配列決定後に得られた、ＤＮＡ配列。
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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