(57)【要約】本発明は、それらの効力の増大、活性の延長および／または半減期の増大を提供する、修飾生体ペプチドに関する。修飾は、ペプチドのＮ末端、ペプチドのＣ末端、ペプチド鎖に沿った遊離アミノ基またはカルボキシ基上、またはこれらの複数の部位のいずれかでの、少なくとも１つの高次構造的に強固な置換基との、アミド結合を介したカップリングにより行われる。これらのペプチドは、例えばＩＩ型糖尿病のような病理関連性インスリン耐性の病態の治療における、臨床的有用性を示す。
2004509079.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
米国特許第６，０２０，３１１号の請求項１記載のペプチドを除く、式Ｘｎ−Ｒ１のペプチド、ならびに、シス立体配置およびトランス立体配置、エピマー、エナンチオマー、ジアステレオマー、およびラセミ混合物を含む任意のその異性体：
式中、Ｒ１は、ペプチド配列、それらの機能的類似体またはそれらの断片であり；
各Ｘは、互いに同一又は独立であることができ、かつ高次構造的に強固な（ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌｌｙ ｒｉｇｉｄ）部分（ｍｏｉｅｔｙ）により構成された下記一覧
ｉ）直鎖の置換型Ｃ１−Ｃ１０アルキル；
ｉｉ）分枝鎖の置換型Ｃ１−Ｃ１０アルキル；
ｉｉｉ）直鎖または分枝鎖の未置換型または置換型のＣ１−Ｃ１０アルケン；
ｉｖ）直鎖または分枝鎖の未置換型または置換型のＣ１−Ｃ１０アルキン；
ｖ）ヘテロ原子がＯ、ＳまたはＮである、未置換型または置換型で、飽和型または不飽和型のＣ３−Ｃ１０シクロアルキルまたはヘテロ環式アルキル（ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｏａｌｋｙｌ）；
ｖｉ）ヘテロ原子がＯ、ＳまたはＮである、未置換型または置換型のＣ５−Ｃ１４アリールまたはヘテロアリール
から選択され、定義ｉ）からｖｉ）の置換基は、１つまたは複数の
ａ）直鎖もしくは分枝鎖のＣ１−Ｃ６アルキル、
ｂ）直鎖もしくは分枝鎖のＣ１−Ｃ６アルケン、
ｃ）直鎖もしくは分枝鎖のＣ１−Ｃ６アルキン、
ｄ）少なくとも２つの炭素原子が、任意にＣ１−Ｃ１０アルキル、Ｃ１−Ｃ１０アルケン、Ｃ１−Ｃ１０アルキン、Ｃ３−Ｃ１０シクロアルキルもしくはヘテロ環式アルキル、およびＣ５−Ｃ１４アリールもしくはヘテロアリールに結合される、Ｃ３−Ｃ１０シクロアルキルもしくはヘテロ環式アルキル、または
ｅ）アリールもしくはヘテロアリールの少なくとも２つの炭素原子が、Ｃ１−Ｃ１０アルキル、Ｃ１−Ｃ１０アルケン、Ｃ１−Ｃ１０アルキン、Ｃ３−Ｃ１０シクロアルキルもしくはヘテロ環式アルキル、およびＣ５−Ｃ１４アリールもしくはヘテロアリールに結合されるＣ５−Ｃ１４アリールもしくはヘテロアリール
であり；
Ｘ基はまた、以下から選択される少なくとも１つの基を含み：
α）ペプチド配列のＮ末端、ペプチド配列のＣ末端、ペプチド配列鎖上の利用可能なカルボキシ部位又はアミノ部位におけるアミド結合を介したペプチド配列とのカップリングのためのカルボキシ基又はアミノ基、およびそれらの組合せ；ならびに
β）ペプチド配列鎖上の利用可能なヒドロキシ部位でのエステル結合を介したペプチド配列とのカップリングのためのカルボキシ基、およびその組合せ；
ｎは１から５の任意の整数である。
【請求項２】
ペプチド配列が以下からなる群より選択される、請求項１記載のペプチド：
成長ホルモン放出因子（ＧＲＦ）、ソマトスタチン、グルカゴン様ペプチド１（７−３７）アミドヒト（ＧＬＰ−１），ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２、副甲状腺ホルモン断片（ＰＴＨ １−３４）、副腎皮質刺激ホルモン（ＡＣＴＨ）、オステオカルシン、カルシトニン、コルチコトロピン放出因子、ダイノルフィンＡ、β−エンドルフィン、ビッグガストリン−１（Ｂｉｇ Ｇａｓｔｒｉｎ−１）、ＧＬＰ−２、黄体形成ホルモン放出ホルモン、メラニン細胞刺激ホルモン（ＭＳＨ）、心房性ナトリウム利尿ペプチド、ニューロメジンＢ（Ｎｅｕｒｏｍｅｄｉｎ Ｂ）、ヒトニューロペプチドＹ、ヒトオレキシンＡ、ヒトペプチドＹＹ、ヒトセクレチン、血管作動性腸管ペプチド（ＶＩＰ）、抗生物質系ペプチド（マガイニン１、マガイニン２、セクロピンＡ、およびセクロピンＢ）、サブスタンスＰ（ＳＰ）、βカソモルフィン−５、エンドモルフィン−２、プロコリパーゼ（Ｐｒｏｃｏｌｉｐａｓｅ）、エンテロスタチン、ガストリン阻害ペプチド、クロモグラニンＡ、バソスタチンＩおよびＩＩ、プロカルシトニン、ＰｒｏＮＣＴ、ＣＧＲＰ（カルシトニン遺伝子関連ペプチド）、ＩＬ８（単球由来）、ＧＣＰ−２、ＰＦ４、ＩＰ−１０、ＭＩＧ、ＳＤＦ−１α、ＧＲＯ−α、Ｉ−ＴＡＣ、ＲＡＮＴＥＳ、ＬＤ７８、ＭＬＰ−１α、ＭＣＰ−１、ＭＣＰ−２、ＭＣＰ−３、ＭＣＰ−４、エオタキシン、ＭＤＣ、ならびにそれらの機能的類似体および誘導体または断片。
【請求項３】
高次構造的に強固な部分が、少なくとも１つの二重結合、三重結合または飽和型もしくは不飽和型の環を含む、請求項１または２記載のペプチド。
【請求項４】
高次構造的に強固な部分が、本明細書において定義された式１から式６３のうち１つまたは複数の構造を含む、請求項１から３のいずれか一項記載のペプチド。
【請求項５】
ペプチド配列が下記からなる群より選択される、請求項１から４のいずれか一項記載のペプチド、ならびにそれらの機能性ペプチドおよび誘導体または断片：
成長ホルモン放出因子（ＧＲＦ）
2004509079.tif 000106
（式中、Ｘａａ１は、ＴｙｒまたはＨｉｓであり、
Ｘａａ２は、ＶａｌまたはＡｌａであり、
Ｘａａ８は、ＡｓｎまたはＳｅｒであり、
Ｘａａ１３は、ＶａｌまたはＩｌｅであり、
Ｘａａ１５は、ＡｌａまたはＧｌｙであり、
Ｘａａ１８は、ＳｅｒまたはＴｙｒであり、
Ｘａａ２４は、ＧｌｎまたはＨｉｓであり、
Ｘａａ２５は、ＡｓｐまたはＧｌｕであり、
Ｘａａ２７は、Ｍｅｔ、ＩｌｅまたはＮｌｅであり、かつ
Ｘａａ２８は、ＳｅｒまたはＡｓｎである）；
ソマトスタチン
2004509079.tif 000107
（式中、Ｘａａ１２は、ＴｙｒまたはＳｅｒである）；
グルカゴン様ペプチド１（７−３７）（アミドヒト（ｈＧＬＰ−１））
2004509079.tif 000108
；
副甲状腺ホルモン断片（ＰＴＨ １−３４）
2004509079.tif 000109
（式中、Ｘａａ１は、ＳｅｒまたはＡｌａであり、
Ｘａａ５は、ＩｌｅまたはＭｅｔであり、
Ｘａａ７は、ＬｅｕまたはＰｈｅであり、
Ｘａａ１３は、ＬｙｓまたはＧｌｕであり、
Ｘａａ１５は、ＬｅｕまたはＡｒｇであり、
Ｘａａ１６は、ＡｓｎまたはＡｌａまたはＳｅｒまたはＨｉｓであり、
Ｘａａ１７は、ＳｅｒまたはＴｈｒであり、
Ｘａａ１８は、ＭｅｔまたはＶａｌまたはＬｅｕであり、
Ｘａａ２１は、ＶａｌまたはｍｅｔまたはＧｌｎであり、
Ｘａａ２２は、ＧｌｕまたはＧｌｎまたはＡｓｐであり、
Ｘａａ２５は、ＡｒｇまたはＧｌｎであり、
Ｘａａ２６は、ＬｙｓまたはＭｅｔであり、
Ｘａａ３３は、ＡｓｎまたはＳｅｒであり、かつ
Ｘａａ３４は、ＰｈｅまたはＡｌａである）；
副腎皮質刺激ホルモン（ＡＣＴＨ）
2004509079.tif 000110
（式中、Ｘａａ１３は、ＶａｌまたはＭｅｔであり、
Ｘａａ１５は、ＬｙｓまたはＡｒｇであり、
Ｘａａ２０は、ＶａｌまたはＩｌｅであり、
Ｘａａ２６は、ＧｌｙまたはＳｅｒであり、
Ｘａａ２７は、ＡｌａまたはＰｈｅまたはＶａｌであり、
Ｘａａ２８は、ＧｌｕまたはＧｌｎであり、
Ｘａａ２９は、ＡｓｐまたはＡｓｎまたはＧｌｕであり、
Ｘａａ３１は、ＳｅｒまたはＴｈｒであり、
Ｘａａ３２は、ＡｌａまたはＶａｌまたはＳｅｒであり、
Ｘａａ３４は、ＡｌａまたはＡｓｎまたはＧｌｙであり、
Ｘａａ３５は、ＰｈｅまたはＭｅｔであり、
Ｘａａ３６は、ＰｒｏまたはＧｌｙであり、
Ｘａａ３７は、ＬｅｕまたはＶａｌまたはＰｒｏであり、かつ
Ｘａａ３９は、ＰｈｅまたはＶａｌまたはＬｅｕである）；
オステオカルシン
2004509079.tif 000111
（式中、Ｘａａ５２は、ＴｙｒまたはＡｓｐまたはＡｓｎであり、
Ｘａａ５３は、ＧｌｎまたはＨｉｓまたはＡｓｎであり、
Ｘａａ５４は、ＴｒｐまたはＧｌｙであり、
Ｘａａ５９は、ＶａｌまたはＡｌａであり、
Ｘａａ６８は、ＡｒｇまたはＬｙｓまたはＨｉｓであり、
Ｘａａ７７は、ＡｓｐまたはＡｓｎであり、
Ｘａａ８９は、ＧｌｕまたはＡｓｐであり、
Ｘａａ９２は、ＡｒｇまたはＬｙｓであり、
Ｘａａ９４は、ＰｈｅまたはＩｌｅであり、かつ
Ｘａａ９７は、ＰｒｏまたはＴｈｒである）；
カルシトニン
2004509079.tif 000112
（式中、Ｘａａ８６は、ＧｌｙまたはＳｅｒまたはＡｌａであり、
Ｘａａ８７は、ＡｓｎまたはＳｅｒであり、
Ｘａａ９２は、ＭｅｔまたはＶａｌであり、
Ｘａａ９５は、ＴｈｒまたはＬｙｓであり、
Ｘａａ９６は、ＴｙｒまたはＬｅｕであり、
Ｘａａ９７は、ＴｈｒまたはＳｅｒであり、
Ｘａａ９８は、ＧｌｎまたはＬｙｓであり、
Ｘａａ９９は、ＡｓｐまたはＧｌｕであり、
Ｘａａ１００は、ＰｈｅまたはＬｅｕであり、
Ｘａａ１０１は、ＡｓｎまたはＨｉｓであり、
Ｘａａ１０２は、ＬｙｓまたはＡｓｎであり、
Ｘａａ１０３は、ＰｈｅまたはＬｅｕであり、
Ｘａａ１０４は、ＨｉｓまたはＧｌｎであり、
Ｘａａ１０６は、ＰｈｅまたはＴｙｒであり、
Ｘａａ１０７は、ＰｒｏまたはＳｅｒであり、
Ｘａａ１０８は、ＧｌｎまたはＧｌｙまたはＡｒｇであり、
Ｘａａ１０９は、ＴｈｒまたはＩｌｅであり、
Ｘａａ１１０は、ＡｌａまたはＧｌｙまたはＳｅｒまたはＡｓｐまたはＡｓｎであり、
Ｘａａ１１１は、ＩｌｅまたはＰｈｅまたはＶａｌまたはＴｈｒであり、
Ｘａａ１１３は、ＶａｌまたはＡｌａまたはＳｅｒであり、
Ｘａａ１１４は、ＧｌｙまたはＧｌｕであり、かつ
Ｘａａ１１５は、ＡｌａまたはＴｈｒである）；
コルチコトロピン放出因子
2004509079.tif 000113
（式中、Ｘａａ１０１は、ＡｌａまたはＰｒｏであり、かつ
Ｘａａ１０２は、ＡｒｇまたはＧｌｙである）；
ダイノルフィンＡ
2004509079.tif 000114
；
β−エンドルフィン
2004509079.tif 000115
（式中、Ｘａａ２４３は、ＳｅｒまたはＰｒｏであり、
Ｘａａ２４５は、ＬｙｓまたはＡｒｇであり、
Ｘａａ２５１は、ＶａｌまたはＭｅｔであり、
Ｘａａ２５９は、ＩｌｅまたはＶａｌであり、
Ｘａａ２６２は、ＡｌａまたはＴｈｒまたはＳｅｒまたはＶａｌであり、
Ｘａａ２６３は、ＴｙｒまたはＨｉｓであり、かつ
Ｘａａ２６７は、ＧｌｕまたはＬｅｕまたはＧｌｎまたはＨｉｓである）；
ビッグガストリン−１
2004509079.tif 000116
（式中、Ｘａａ５９は、ＧｌｕまたはＧｌｎであり、
Ｘａａ６２は、ＰｒｏまたはＬｅｕであり、
Ｘａａ６４は、ＧｌｙまたはＡｓｐであり、
Ｘａａ６５は、ＰｒｏまたはＳｅｒであり、
Ｘａａ６６は、ＰｒｏまたはＧｌｎであり、
Ｘａａ６７は、ＨｉｓまたはＧｌｎであり、
Ｘａａ６８は、ＬｅｕまたはＭｅｔまたはＰｈｅまたはＧｌｎであり、
Ｘａａ６９は、ＶａｌまたはＩｌｅであり、
Ｘａａ７２は、ＰｒｏまたはＬｅｕであり、
Ｘａａ７３は、ＳｅｒまたはＡｌａであり、
Ｘａａ７６は、ＧｌｎまたはＧｌｕであり、
Ｘａａ７７は、ＧｌｙまたはＡｒｇであり、
Ｘａａ７９は、ＴｒｐまたはＰｒｏまたはＡｒｇであり、
Ｘａａ８０は、ＬｅｕまたはＶａｌまたはＭｅｔであり、
Ｘａａ８２は、ＧｌｕまたはＬｙｓであり、かつ
Ｘａａ８５は、ＧｌｕまたはＡｌａである）；
ＧＬＰ−２
2004509079.tif 000117
（式中、Ｘａａ１５２は、ＳｅｒまたはＴｈｒであり、
Ｘａａ１５３は、ＡｓｐまたはＳｅｒであり、
Ｘａａ１５４は、ＧｌｕまたはＡｓｐであり、
Ｘａａ１５５は、ＭｅｔまたはＰｈｅであり、
Ｘａａ１５６は、ＡｓｎまたはＳｅｒであり、
Ｘａａ１５７は、ＴｈｒまたはＬｙｓであり、
Ｘａａ１５８は、ＩｌｅまたはＶａｌまたはＡｌａであり、
Ｘａａ１６１は、ＡｓｎまたはＩｌｅまたはＨｉｓまたはＳｅｒであり、
Ｘａａ１６２は、ＬｅｕまたはＬｙｓであり、
Ｘａａ１６４は、ＡｌａまたはＴｈｒであり、
Ｘａａ１６５は、ＡｒｇまたはＧｌｎまたはＬｙｓであり、
Ｘａａ１６６は、ＡｓｐまたはＧｌｕであり、
Ｘａａ１６８は、ＩｌｅまたはＬｅｕであり、
Ｘａａ１６９は、ＡｓｎまたはＡｓｐであり、
Ｘａａ１７１は、ＬｅｕまたはＩｌｅであり、
Ｘａａ１７２は、ＩｌｅまたはＬｅｕであり、
Ｘａａ１７３は、ＧｌｎまたはＡｓｎまたはＨｉｓであり、
Ｘａａ１７５は、ＬｙｓまたはＰｒｏであり、
Ｘａａ１７６は、ＩｌｅまたはＶａｌであり、
Ｘａａ１７７は、ＴｈｒまたはＬｙｓであり、かつ
Ｘａａ１７８は、ＡｓｐまたはＧｌｕである）；
黄体形成ホルモン放出ホルモン
2004509079.tif 000118
（式中、Ｘａａ１は、ｐＧｌｕ、５−ｏｘｏＰｒｏまたはＧｌｎである。）；
メラニン細胞刺激ホルモン（ＭＳＨ）
2004509079.tif 000119
；
心房性ナトリウム利尿ペプチド
2004509079.tif 000120
（式中、Ｘａａ１３５は、ＭｅｔまたはＩｌｅであり、かつ
Ｘａａ１４２は、ＧｌｙまたはＳｅｒである。）；
ニューロメジンＢ
2004509079.tif 000121
；
ヒトニューロペプチドＹ
2004509079.tif 000122
；
ヒトオレキシンＡ
2004509079.tif 000123
；
ヒトペプチドＹＹ
2004509079.tif 000124
；
ヒトセクレチン
2004509079.tif 000125
；
血管作動性腸管ペプチド（ＶＩＰ）
2004509079.tif 000126
；
下記の抗生物質系ペプチド：
マガイニン１
2004509079.tif 000127
；
マガイニン２
2004509079.tif 000128
；
セクロピンＡ
2004509079.tif 000129
；
セクロピンＢ
2004509079.tif 000130
；
サブスタンスＰ（ＳＰ）
2004509079.tif 000131
；
βカソモルフィン−５
Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ；
エンドモルフィン−２
Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−ＮＨ２；
プロコリパーゼ
2004509079.tif 000132
；
エンテロスタチン
Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ；
ガストリン阻害ペプチド
2004509079.tif 000133
；
クロモグラニンＡ；
バソスタチンＩ；
バソスタチンＩＩ
2004509079.tif 000134
；
プロカルシトニン；
ＰｒｏＮＣＴ；
ＰｒｏＣＧＲＰ；
ケモカインファミリー：
ＣＸＣ群
2004509079.tif 000135
2004509079.tif 000136
ＣＣ群
2004509079.tif 000137
。
【請求項６】
ペプチド配列が、天然ペプチドの配列およびその機能的類似体もしくは断片、または臨床的に安全かつ許容できるそれらの誘導体もしくは類似体である、請求項５記載のペプチド。
【請求項７】
ペプチド配列がソマトスタチンであり、かつ少なくとも１つの高次構造的に強固な部分が、以下のような異なる位置においてアミド結合を介して該ソマトスタチンペプチド配列へカップリングしている、請求項１記載のペプチド：
【化１】
2004509079.tif 000138
。
【請求項８】
ペプチド配列がＰＴＨ １−３４であり、かつ少なくとも１つの高次構造的に強固な部分が、以下のような異なる位置においてアミド結合を介して該ＰＴＨ １−３４ペプチド配列へカップリングしている、請求項１記載のペプチド：
【化２】
2004509079.tif 000139
。
【請求項９】
ペプチド配列がＧＬＰ−１であり、かつ少なくとも１つの高次構造的に強固な部分が、以下のような異なる位置においてアミド結合を介して該ＧＬＰ−１ペプチド配列へカップリングしている、請求項１記載のペプチド：
【化３】
2004509079.tif 000140
【化４】
2004509079.tif 000141
。
【請求項１０】
ペプチド配列がＧＬＰ−２であり、かつ少なくとも１つの高次構造的に強固な部分が、ペプチド配列の異なる位置においてアミド結合またはエステル結合を介して該ＧＬＰ−２ペプチド配列へカップリングしている、請求項１記載のペプチド。
【請求項１１】
ペプチド配列がエンテロスタチンであり、かつ少なくとも１つの高次構造的に強固な部分が、ペプチド配列の異なる位置においてアミド結合を介して該エンテロスタチンペプチド配列へカップリングしている、請求項１記載のペプチド。
【請求項１２】
ペプチド配列がＮＰＹであり、かつ少なくとも１つの高次構造的に強固な部分は、ペプチド配列の異なる位置においてアミド結合を介して該ＮＰＹペプチド配列へカップリングしている、請求項１記載のペプチド。
【請求項１３】
ペプチド配列がＮＰＹＹであり、かつ少なくとも１つの高次構造的に強固な部分が、ペプチド配列の異なる位置においてアミド結合を介して該ＮＰＹＹペプチド配列へカップリングしている、請求項１記載のペプチド。
【請求項１４】
ペプチド配列がセクレチンであり、かつ少なくとも１つの高次構造的に強固な部分が、ペプチド配列の異なる位置においてアミド結合またはエステル結合を介して該セクレチンペプチド配列へカップリングしている、請求項１記載のペプチド。
【請求項１５】
ペプチド配列が血管作動性腸管ペプチドであり、かつ少なくとも１つの高次構造的に強固な部分が、ペプチド配列の異なる位置においてアミド結合またはエステル結合を介して該血管作動性腸管ペプチド配列へカップリングしている、請求項１記載のペプチド。
【請求項１６】
ペプチド配列がガストリン阻害ペプチドであり、かつ少なくとも１つの高次構造的に強固な部分が、ペプチド配列の異なる位置においてアミド結合またはエステル結合を介して該ガストリン阻害ペプチド配列へカップリングしている、請求項１記載のペプチド。
【請求項１７】
ペプチド配列がバソスタチンＩＩであり、かつ少なくとも１つの高次構造的に強固な部分が、ペプチド配列の異なる位置においてアミド結合またはエステル結合を介して該バソスタチンＩＩペプチド配列へカップリングしている、請求項１記載のペプチド。
【請求項１８】
ペプチド配列がＲＡＮＴＥＳであり、かつ少なくとも１つの高次構造的に強固な部分が、ペプチド配列の異なる位置においてアミド結合またはエステル結合を介して該ＲＡＮＴＥＳペプチド配列へカップリングしている、請求項１記載のペプチド。
【請求項１９】
ペプチド配列がエオタキシンであり、かつ少なくとも１つの高次構造的に強固な部分が、ペプチド配列の異なる位置においてアミド結合またはエステル結合を介して該エオタキシンペプチド配列へカップリングしている、請求項１記載のペプチド。
【請求項２０】
高次構造的に強固な部分が、Ｎ末端においてアミド結合またはエステル結合を介してペプチド配列へカップリングしている、請求項１から１８のいずれか一項記載のペプチド。
【請求項２１】
高次構造的に強固な部分が、本明細書中に参照された式６０を有する、請求項８から１９のいずれか一項記載のペプチド。
【請求項２２】
ペプチド配列がＧＬＰ−１である、請求項２０記載のペプチド。
【請求項２３】
インスリン耐性の病態に関連するまたはしないグルコース不耐（ｇｌｕｃｏｓｅ ｉｎｔｏｌｅｒａｎｃｅ）の治療における、請求項２２記載のペプチドの使用。
【請求項２４】
ＩＩ型糖尿病の治療における、請求項２３記載の使用。
【請求項２５】
ペプチド配列がＣＧＲＰであり、かつ少なくとも１つの高次構造的に強固な部分が、ペプチド配列の異なる位置においてアミド結合またはエステル結合を介して該ＣＧＲＰペプチド配列へカップリングされる、請求項１記載のペプチド。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明は、生物学的効力の増大、活性の延長および／または半減期の増大を提供する修飾ペプチドに関する。修飾は、ペプチドＮ末端、ペプチドＣ末端、またはペプチド鎖に沿った遊離アミノ基もしくは遊離カルボキシ基、またはこれらの複数の部位のいずれかにおける、少なくとも１つの高次構造的に強固な置換基とのアミド結合を介したカップリングにより形成される。
【０００２】
発明の背景
大部分のペプチドは、血清培地において迅速に分解され、その結果、それらの代謝産物は、最終的には残留生物活性をほとんどまたは全く有さないことがある。ペプチドの活性を増大するために、様々な技術が提唱されている。そのひとつは、ペプチド配列のＮ末端もしくはＣ末端、またはそのペプチド鎖に沿った他の残基における、疎水鎖の固定である。しかしこの技術には限界がある。例えば、ペプチドが長いペプチド鎖を含む場合、小さい疎水基がＮ末端またはＣ末端に固定されるという事実は、必ずしも修飾ペプチドの活性の増加を生じるものではない。
【０００３】
例えば、ペプチド配列のＣ末端におけるＯＨの、例えば−ＮＥｔ２のようなより疎水性の基との置換によって、比活性の著しい増加が生じうることがわかっている。しかしこれらの結果は、いくつかの刊行物において矛盾しており、例えば、ムラニチ（Ｍｕｒａｎｉｃｈｉ）らはＰｈａｒｍ． Ｒｅｓ．、１９９１、８：６４９−６５２において、Ｎ末端の疎水基としてのラウロイル基は、活性を増加することにおいて効果がないことを強調している。従って、生物学的効力、活性の期間および／または半減期に関する一般的法則または結論があるようには思われず、これは、Ｎ末端またはＣ末端のいずれかのペプチド鎖上の、もしくはペプチド鎖に沿った特定の残基上への置換基の追加の結果として導かれている。
【０００４】
米国特許第６，０２０，３１１号は、硬直化した疎水性残基が、ペプチドのＮ末端においてアミド結合を介してＧＲＦペプチドへカップリングしている、疎水性成長ホルモン放出因子（ＧＲＦ）類似体を開示している。このような類似体は、用量の減少を伴う同化能の改善、および活性の延長を有すると言われている。しかしこの特許の内容によると、硬直化した疎水性残基は、常に、一方の先端にカルボニル基を含み、このことは、ＧＲＦへのアミドカップリングがアミノ部位においてのみ生じ、必要なアミド結合を形成することを意味している。この特許は、硬直化した疎水性残基のカルボニル基のアミノ基との置換により、アミドカップリングがＣ末端に形成された場合に同様の結果が得られることについては、言及、示唆、または暗示をしていない。この特許は、更にアミドカップリングがペプチド鎖の他の場所に生じることについても、言及、示唆、または暗示をしていない。
【０００５】
Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２００１、４０：ｐ２８６０〜２８６９は、ヘキセン酸、硬直化された疎水性部分が、ペプチドのＮ末端で疎水性グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）ペプチドへカップリングするような、ＧＬＰ−１類似体を説明している。この類似体のＧＬＰ−１受容体への親和性が低下するが、インビボの生体活性は、野生型ＧＬＰ−１のものと同等かもしくはわずかに優れていることがこれらの結果により示されており、その理由は、血清分解に対する耐性の増大のためと仮定されている。この研究によると、Ｈｉｓ１へのアシル鎖の連結、Ａｌａ２のアミノ酸置換、およびＮ末端でのアミノ酸配列の付加は、インビボ生体活性を増加するための戦略としては硬直化した疎水鎖の固定よりも優れているであろう。しかし、これらの戦略のほとんどは天然の分子のアミノ酸組成の修飾に関連しており、これは免疫原性および副作用のリスクを含む臨床適用に関して、結果として負の安全性を有するであろう。
【０００６】
従って、ペプチドのの活性が増大されるような方法で修飾され、これにより効力が改善される、すなわち血清分解へのより大きい抵抗および／もしくは過剰アゴニスト特性が改善され、ならびに／または臨床的に安全かつ許容されうるアミノ酸配列を変更することなく半減期を延長するようなペプチドを開発する必要性は大きい。
【０００７】
発明の概要
本発明により、式Ｘｎ−Ｒ１のペプチドが提供される：
式中、
Ｒ１は、Ｘがペプチド配列のＮ末端部位で結合したｔｒａｎｓ−３−ヘキセノイル基を表す場合、ＧＲＦ配列であることができないペプチド配列であり；
各Ｘは、互いに同一又は独立であることができ、かつ、高次構造的に強固な部分により構成された下記一覧
ａ）ペプチド配列のＮ末端、ペプチド配列のＣ末端、ペプチド配列鎖上の利用可能なカルボキシ部位またはアミノ部位における、アミド結合を介したペプチド配列とのカップリングのためのカルボキシ基又はアミノ基、およびそれらの組合せ、ならびに
ｂ）ペプチド配列鎖上での利用可能なヒドロキシ部位におけるエステル結合を介したペプチド配列とのカップリングのためのカルボキシ基、およびその組合せから選択され；ここで、
ｎは、１から５の任意の整数であり；
Ｘは、以下のように定義される：
ｉ）直鎖の置換型Ｃ１−Ｃ１０アルキル；
ｉｉ）分枝鎖の置換型Ｃ１−Ｃ１０アルキル；
ｉｉｉ）直鎖または分枝鎖の未置換型または置換型のＣ１−Ｃ１０アルケン；
ｉｖ）直鎖または分枝鎖の未置換型または置換型のＣ１−Ｃ１０アルキン；
ｖ）ヘテロ原子がＯ、ＳまたはＮである、未置換型または置換型で、飽和型または不飽和型のＣ３−Ｃ１０シクロアルキルまたはヘテロ環式アルキル；
ｖｉ）ヘテロ原子がＯ、ＳまたはＮである、未置換型または置換型のＣ５−Ｃ１４アリールまたはヘテロアリール；
ここで、定義ｉ）からｖｉ）の置換基は、１つまたは複数の
ａ）直鎖もしくは分枝鎖のＣ１−Ｃ６アルキル、
ｂ）直鎖もしくは分枝鎖のＣ１−Ｃ６アルケン、
ｃ）直鎖もしくは分枝鎖のＣ１−Ｃ６アルキン、
ｄ）少なくとも２つの炭素原子が、任意にＣ１−Ｃ１０アルキル、Ｃ１−Ｃ１０アルケン、Ｃ１−Ｃ１０アルキン、Ｃ３−Ｃ１０シクロアルキルもしくはヘテロ環式アルキル、およびＣ５−Ｃ１４アリールもしくはヘテロアリールと結合する、Ｃ３−Ｃ１０シクロアルキルもしくはヘテロ環式アルキル、または
ｅ）アリールもしくはヘテロアリールの少なくとも２つの炭素原子が、任意にＣ１−Ｃ１０アルキル、Ｃ１−Ｃ１０アルケン、Ｃ１−Ｃ１０アルキン、Ｃ３−Ｃ１０シクロアルキルもしくはヘテロ環式アルキル、およびＣ５−Ｃ１４アリールもしくはヘテロアリールに結合する、Ｃ５−Ｃ１４アリールもしくはヘテロアリール；
ならびに、シス立体配置およびトランス立体配置、エピマー、エナンチオマー、ジアステレオマー、およびラセミ混合物を含む、それらの任意の異性体である。
【０００８】
「アリール」という用語は、フェニル、ナフチルなどを含み、「ヘテロ環式アルキル」という用語は、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロチオファニル、テトラヒドロチオピラニル、テトラヒドロピラニル、およびそれらの部分的に脱水素された誘導体、アゼチジニル、ピペリジニル、ピロリジニルなどを含み、「ヘテロアリール」という用語は、ピリジル、インドリル、フラニル、イミダゾリル、チオファニル、ピロリル、キノリニル、イソキノリニル、ピリミジニル、オキサゾリル、チアゾリル、イソチアゾリル、イソオキサゾリル、ピラゾリルなどを含む。
【０００９】
「高次構造的に強固な部分」という用語は、高次構造的に制限されている、すなわち単結合について回転、移動性が制限されている部分を意味する。このような移動性は、例えば、高次構造的にほとんどまたは全く移動性を有さないような二重結合、三重結合、または飽和もしくは飽和環により制限される。結果的に、配座異性体または回転異性体の数は、例えば対応する直鎖の未置換型かつ飽和型の脂肪族鎖と比較すると、減少する。この高次構造的に強固な部分は、疎水性であるが、これは必須条件ではない。
【００１０】
本発明の好ましい態様に従い、ペプチド配列は、成長ホルモン放出因子（ＧＲＦ）、ソマトスタチン、グルカゴン様ペプチド１（７−３７），アミドヒト（ＧＬＰ−１），ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２、副甲状腺ホルモン断片（例えばＰＴＨ １−３４）、副腎皮質刺激ホルモン（ＡＣＴＨ）、オステオカルシン、カルシトニン、コルチコトロピン放出因子、ダイノルフィンＡ、β−エンドルフィン、ビッグガストリン−１、ＧＬＰ−２、黄体形成ホルモン放出ホルモン、メラニン細胞刺激ホルモン（ＭＳＨ）、心房性ナトリウム利尿ペプチド、ニューロメジンＢ、ヒトニューロペプチドＹ、ヒトオレキシンＡ、ヒトペプチドＹＹ、ヒトセクレチン、血管作動性腸管ペプチド（ＶＩＰ）、抗生物質系ペプチド（マガイニン１、マガイニン２、セクロピンＡ、およびセクロピンＢ）、サブスタンスＰ（ＳＰ）、βカソモルフィン−５、エンドモルフィン−２、プロコリパーゼ、エンテロスタチン、ガストリン阻害ペプチド、クロモグラニンＡ、バソスタチンＩおよびＩＩ、プロカルシトニン、ＰｒｏＮＣＴ、ＰｒｏＣＧＲＰ、ＩＬ８（単球由来）、ＧＣＰ−２、ＰＦ４、ＩＰ−１０、ＭＩＧ、ＳＤＦ−１α、ＧＲＯ−α、Ｉ−ＴＡＣ、ＲＡＮＴＥＳ、ＬＤ７８、ＭＬＰ−１α、ＭＣＰ−１、ＭＣＰ−２、ＭＣＰ−３、ＭＣＰ−４、エオタキシン、ＭＤＣ、およびそれらの機能的誘導体または断片からなる群より選択される。
【００１１】
発明の詳細な説明
本出願においてアミノ酸は、生化学用語に関するＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ委員会により推奨された、一般にペプチド技術分野において許容されている、以下に示した慣習的三文字略号により確定される。
2004509079.tif 000003
【００１２】
本明細書において示した全てのペプチドは、一般に許容される慣例に従い記載されており、そのためＮ末端アミノ酸は左側に記載され、かつＣ末端アミノ酸は右側に記載される。
【００１３】
本発明は、薬学的特性の増大を伴うペプチドの新規ファミリーを作成するための、少なくとも１つの高次構造的に強固な部分の使用に関する。
【００１４】
本発明の修飾ペプチドは、当技術分野において固相合成として周知である、下記の一般的方法に従い調製される。
【００１５】
カルボキシ基を含む高次構造的に強固な部分は、ペプチドＮ末端同様リシン側鎖においても見出されるようなアミノ基への固定に使用される。アミノ基を含む高次構造的に強固な部分は、アスパラギン酸もしくはグルタミン酸の側鎖またはペプチドのＣ末端において見出されるようなカルボキシ基への固定に使用される。このような場合の固定反応は、文献（Ｂ． Ｃａｓｔｒｏら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ ｌｅｔｔｅｒｓ、１４：１２１９（１９７５））においてＣａｓｔｒｏが説明したようなベンゾトリアゾール−１−イル−オキシ−トリス（ジメチルアミノ）ホスホニウムヘキサフルオロリン酸を使用し、固相支持体上で行われることが好ましい（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ Ｒ．Ｂ．、Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ．、８５：２１４９（１９６３）およびＪ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ．、８６：３０４（１９６４））。
【００１６】
固定動態（ａｎｃｈｏｒｉｎｇ ｄｙｎａｍｉｃ）に関して、好ましい作業温度は２０℃〜６０℃である。より疎水性の残基の場合の固定反応時間は、温度に反比例して変動し、かつ０．１時間〜２４時間の間を変動する。
【００１７】
合成段階を、手動ペプチド合成装置において、Ｆｍｏｃ戦略を用い、固相法により実行した。Ｆｍｏｃアミノ酸は、Ｃｈｅｍ Ｉｍｐｅｘ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社（シカゴ）および他の販売業者から供給された。Ｃ末端カルボン酸生成のために、カップリング試薬としてＢＯＰを使用する逐次的Ｆｍｏｃ化学が、ＰＬ−Ｗａｎｇ樹脂（Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、カタログ番号：１４６３−４７９９）に適用した。
【００１８】
Ｆｍｏｃ脱保護は、連続３段階においてＤＭＦを溶媒とする２０％ピペリジン溶液により実現した。Ｆｍｏｃ保護基の主要部分を除去するために、常時窒素相洗浄（ｓｃｒｕｂｂｉｎｇ）下で、第一の２０％ピリジン溶液を１分間使用した。その後この溶液を排液し、別の新鮮な２０％ピリジン溶液をこの時点で３分間導入し、再度排液し、最後に別の２０％ピリジン溶液を１０分間導入した。その後このペプチド樹脂を、窒素相洗浄下で、ＤＭＦ ５０ｍＬにより連続４回洗浄した。合成が完了した後、樹脂をＤＭＦおよびＤＣＭで十分洗浄し、その後乾燥した。
【００１９】
側鎖保護基およびペプチド樹脂結合の最終的な切断は、下記の混合物を用いて行った：ＴＦＡ、エタンジチオール、トリイソプロピルシラン、チオアニオソール、フェノール、水（９２：１．６６：１．６６：１．６６：１：２）。乾燥したペプチド樹脂１ｇ当り切断カクテル２０ｍＬの最終濃度で、樹脂からペプチドを切断した。この切断反応は、室温で２時間かけて行った。次にＴＦＡカクテル溶液中の遊離ペプチドを、粗いガラス濾板付きロートで濾過した。その後この樹脂を、純粋なＴＦＡで３回洗浄した。ペプチド／ＴＦＡ混合物を、回転蒸発器において減圧下で蒸発させ、沈殿させ、エーテルで洗浄した後、それを水に溶解し、凍結乾燥し、残留する微量の溶媒および捕捉剤を除去した。
【００２０】
第一のＦｍｏｃ−アミノ酸のＷａｎｇ樹脂へのカップリング
本発明者らは、４−アルコキシベンジルアルコールポリスチレン（Ｗａｎｇ樹脂）およびＤＭＦを溶媒とする２当量の所望のＦｍｏｃ−アミノ酸を使用し、かつ両方の生成物を室温で１５分間の窒素相洗浄下で混合した。その後３．３当量のピリジンおよび２当量の２，６−ジクロロ塩化ベンゾイルを連続添加し、この反応を窒素相洗浄下で１５〜２０時間実行した（Ｓｅｉｂｅｒ Ｐ．、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ、２８（４９）：６１４７−６１５０（１９８７））。この反応後、反応容器から排液し、樹脂を窒素相洗浄下でＤＭＦにより連続４回洗浄した。樹脂の残留ヒドロキシル基を、２時間かけてＤＣＥ（ジクロロエタン）中の３当量の塩化ベンゾルおよびピリジンにより全てベンゾイル化した。
【００２１】
伸長中のペプチド上の各残留アミノ酸のカップリング
下記のＦｍｏｃ−アミノ酸の各々について、本発明者らは、３当量のＦｍｏｃ−アミノ酸を、ＤＭＦを溶媒とする３当量のＢＯＰ（ベンゾトリアゾール−１−イル−オキシ−トリス（ジメチルアミノ）ホスホニウムヘキサフルオロリン酸）に溶解し（Ｂ． Ｃａｓｔｒｏら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ ｌｅｔｔｅｒｓ、１４：１２１９（１９７５））、得られる溶液を反応容器中の樹脂に添加し、窒素相洗浄を開始し、６当量のＤＩＰＥＡ（ジイソプロピルエチルアミン）を添加し、カップリング反応を開始した。このカップリング混合液を、反応容器中で、６０分間窒素相下で洗浄し、その後、容器から排液し、樹脂を３回連続してＤＭＦで洗浄し、かつ定性的ニンヒドリン試験を行い反応が完了したことを確認した。
【００２２】
Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｌｙｓ（Ａｌｏｃ）−ＯＨ（ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社、カタログ番号：ＧＥＮ９１１２０９）、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｇｌｕ（ＯＡｌ）−ＯＨ（ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社、カタログ番号：ＧＥＮ９１１２０７）およびＦｍｏｃ−Ｌ−Ａｓｐ（ＯＡｌ）−ＯＨ（ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社、カタログ番号：ＧＥＮ９１１２０５）のカップリングを、先に記したＦｍｏｃ−アミノ酸と同じ方法で行った。
【００２３】
アリル型基の脱保護
次に、ペプチド樹脂（Ｘｍｍｏｌ）を、窒素相洗浄下でＤＣＭ中に導入し、１０分後、この混合液にＰｄＣｌ２（ＰＰｈ３）２（Ｘｍｍｏｌ×０．０５／０．０５当量）（パラジウム（ＩＩ）ビス−トリフェニルホスフィン）を添加した（Ｂｕｒｇｅｒ Ｈ．、Ｋｉｌｉｏｎ Ｗ．、Ｊ． Ｏｒｇａｎｏｍｅｔａｌｌｉｃｓ、１８：２９９（１９６９））。次に、（ＣＨ３ＣＨ２ＣＨ２）３ＳｎＨ （Ｘｍｍｏｌ×６／６当量）（トリブチル水素化スズ）をＤＣＭ中に希釈し、前記ペプチド樹脂懸濁液に、添加漏斗（ａｄｄｉｔｉｏｎ ｆｕｎｎｅｌ）を用い３０分間かけて滴下した。この反応を、更に１０分間継続し、その後容器を切断混合物から排液させ、その直後にＤＣＭで４回およびＤＭＦで４回洗浄した（Ｄａｎｇｌｅｓ ０．、Ｇｕｉｂｅ Ｆ．、Ｂａｌａｖｏｉｎｅ Ｇ．、Ｌａｖｉｅｌｌｅ Ｓ．、Ｍａｒｑｕｅｔ Ａ．、Ｊ． Ｏｒｇ． Ｃｈｅｍ．、５２：４９８４（１９８７））。
【００２４】
高次構造的に強固な酸およびアルキルアミドのカップリング
高次構造的に強固な酸およびアミンのペプチド樹脂の側鎖へのカップリングは、本発明者らがこれらの側鎖の修飾のために３当量ではなく１０当量の強固な部分およびカップリング試薬を使用したこと以外は、Ｆｍｏｃ−アミノ酸の場合と同じ条件下で行われた。
【００２５】
本発明は、特定のペプチド配列に限定されるものではない。好ましいペプチド配列Ｒ１は、治療的特性を伴うもの、更にはそれらの機能的誘導体または断片である。本発明に従い使用することができるこのようなペプチドの治療的特性は、骨粗鬆症、閉経後骨粗鬆症および骨沈着を含む骨疾患の治療、癌治療、血糖値の調節、ＩＩ型糖尿病、腸疾患患者における粘膜再生を増大するための治療、炎症反応に関連した疾患の治療、肥満症の治療、自閉症および広汎性発達障害の治療、過増殖性の皮膚病態、加齢、末梢血単核細胞増殖の変化、子宮筋収縮およびプロスタグランジン放出の調節、ＡＣＴＨ放出の刺激、インターロイキン−８産生の阻害、酸放出の刺激、腸疾患患者における粘膜調節の増大、ホルモン依存型癌のようなホルモン依存型疾患および病態の治療、メラニン細胞の情報伝達過程の調節、圧力および容量のホメオスタシス関連、外分泌および内分泌、平滑筋収縮、摂食、血圧、血糖値、体温並びに細胞増殖の調節、食物摂取およびエネルギーバランスの調節、癌細胞増殖の阻害、膵分泌の刺激、または細胞増殖の刺激を含むが、これらに限定されるものではない。
【００２６】
成長ホルモン放出因子（ＧＲＦ）：
2004509079.tif 000004
式中、Ｘａａ１は、ＴｙｒまたはＨｉｓであり；
Ｘａａ２は、ＶａｌまたはＡｌａであり；
Ｘａａ８は、ＡｓｎまたはＳｅｒであり；
Ｘａａ１３は、ＶａｌまたはＩｌｅであり；
Ｘａａ１５は、ＡｌａまたはＧｌｙであり；
Ｘａａ１８は、ＳｅｒまたはＴｙｒであり；
Ｘａａ２４は、ＧｌｎまたはＨｉｓであり；
Ｘａａ２５は、ＡｓｐまたはＧｌｕであり；
Ｘａａ２７は、Ｍｅｔ、ＩｌｅまたはＮｌｅであり；かつ
Ｘａａ２８は、ＳｅｒまたはＡｓｎである。
【００２７】
ソマトスタチン：
2004509079.tif 000005
式中、Ｘａａ１２は、ＴｙｒまたはＳｅｒである。
【００２８】
グルカゴン様ペプチド１（７−３７），（アミドヒト（ｈＧＬＰ−１））：
2004509079.tif 000006
【００２９】
副甲状腺ホルモン断片（ＰＴＨ １−３４）：
2004509079.tif 000007
式中、Ｘａａ１は、ＳｅｒまたはＡｌａであり；
Ｘａａ５は、ＩｌｅまたはＭｅｔであり；
Ｘａａ７は、ＬｅｕまたはＰｈｅであり；
Ｘａａ１３は、ＬｙｓまたはＧｌｕであり；
Ｘａａ１５は、ＬｅｕまたはＡｒｇであり；
Ｘａａ１６は、ＡｓｎまたはＡｌａまたはＳｅｒまたはＨｉｓであり；
Ｘａａ１７は、ＳｅｒまたはＴｈｒであり；
Ｘａａ１８は、ＭｅｔまたはＶａｌまたはＬｅｕであり；
Ｘａａ２１は、ＶａｌまたはｍｅｔまたはＧｌｎであり；
Ｘａａ２２は、ＧｌｕまたはＧｌｎまたはＡｓｐであり；
Ｘａａ２５は、ＡｒｇまたはＧＬｎであり；
Ｘａａ２６は、ＬｙｓまたはＭｅｔであり；
Ｘａａ３３は、ＡｓｎまたはＳｅｒであり；かつ
Ｘａａ３４は、ＰｈｅまたはＡｌａである。
【００３０】
副腎皮質刺激ホルモン（ＡＣＴＨ）：
2004509079.tif 000008
式中、Ｘａａ１３は、ＶａｌまたはＭｅｔであり；
Ｘａａ１５は、ＬｙｓまたはＡｒｇであり；
Ｘａａ２０は、ＶａｌまたはＩｌｅであり；
Ｘａａ２６は、ＧｌｙまたはＳｅｒであり；
Ｘａａ２７は、ＡｌａまたはＰｈｅまたはＶａｌであり；
Ｘａａ２８は、ＧｌｕまたはＧｌｎであり；
Ｘａａ２９は、ＡｓｐまたはＡｓｎまたはＧｌｕであり；
Ｘａａ３１は、ＳｅｒまたはＴｈｒであり；
Ｘａａ３２は、ＡｌａまたはＶａｌまたはＳｅｒであり；
Ｘａａ３４は、ＡｌａまたはＡｓｎまたはＧｌｙであり；
Ｘａａ３５は、ＰｈｅまたはＭｅｔであり；
Ｘａａ３６は、ＰｒｏまたはＧｌｙであり；
Ｘａａ３７は、ＬｅｕまたはＶａｌまたはＰｒｏであり；かつ
Ｘａａ３９は、ＰｈｅまたはＶａｌまたはＬｅｕである。
【００３１】
オステオカルシン：
2004509079.tif 000009
式中、Ｘａａ５２は、ＴｙｒまたはＡｓｐまたはＡｓｎであり；
Ｘａａ５３は、ＧｌｎまたはＨｉｓまたはＡｓｎであり；
Ｘａａ５４は、ＴｒｐまたはＧｌｙであり；
Ｘａａ５９は、ＶａｌまたはＡｌａであり；
Ｘａａ６８は、ＡｒｇまたはＬｙｓまたはＨｉｓであり；
Ｘａａ７７は、ＡｓｐまたはＡｓｎであり；
Ｘａａ８９は、ＧｌｕまたはＡｓｐであり；
Ｘａａ９２は、ＡｒｇまたはＬｙｓであり；
Ｘａａ９４は、ＰｈｅまたはＩｌｅであり；かつ
Ｘａａ９７は、ＰｒｏまたはＴｈｒである。
【００３２】
カルシトニン：
2004509079.tif 000010
式中、Ｘａａ８６は、ＧｌｙまたはＳｅｒまたはＡｌａであり；
Ｘａａ８７は、ＡｓｎまたはＳｅｒであり；
Ｘａａ９２は、ＭｅｔまたはＶａｌであり；
Ｘａａ９５は、ＴｈｒまたはＬｙｓであり；
Ｘａａ９６は、ＴｙｒまたはＬｅｕであり；
Ｘａａ９７は、ＴｈｒまたはＳｅｒであり；
Ｘａａ９８は、ＧｌｎまたはＬｙｓであり；
Ｘａａ９９は、ＡｓｐまたはＧｌｕであり；
Ｘａａ１００は、ＰｈｅまたはＬｅｕであり；
Ｘａａ１０１は、ＡｓｎまたはＨｉｓであり；
Ｘａａ１０２は、ＬｙｓまたはＡｓｎであり；
Ｘａａ１０３は、ＰｈｅまたはＬｅｕであり；
Ｘａａ１０４は、ＨｉｓまたはＧｌｎであり；
Ｘａａ１０６は、ＰｈｅまたはＴｙｒであり；
Ｘａａ１０７は、ＰｒｏまたはＳｅｒであり；
Ｘａａ１０８は、ＧｌｎまたはＧｌｙまたはＡｒｇであり；
Ｘａａ１０９は、ＴｈｒまたはＩｌｅであり；
Ｘａａ１１０は、ＡｌａまたはＧｌｙまたはＳｅｒまたはＡｓｐまたはＡｓｎであり；
Ｘａａ１１１は、ＩｌｅまたはＰｈｅまたはＶａｌまたはＴｈｒであり；
Ｘａａ１１３は、ＶａｌまたはＡｌａまたはＳｅｒであり；
Ｘａａ１１４は、ＧｌｙまたはＧｌｕであり；かつ
Ｘａａ１１５は、ＡｌａまたはＴｈｒである。
【００３３】
コルチコトロピン放出因子：
2004509079.tif 000011
式中、Ｘａａ１０１は、ＡｌａまたはＰｒｏであり；かつ
Ｘａａ１０２は、ＡｒｇまたはＧｌｙである。
【００３４】
ダイノルフィンＡ：
2004509079.tif 000012
【００３５】
β−エンドルフィン：
2004509079.tif 000013
式中、Ｘａａ２４３は、ＳｅｒまたはＰｒｏであり；
Ｘａａ２４５は、ＬｙｓまたはＡｒｇであり；
Ｘａａ２５１は、ＶａｌまたはＭｅｔであり；
Ｘａａ２５９は、ＩｌｅまたはＶａｌであり；
Ｘａａ２６２は、ＡｌａまたはＴｈｒまたはＳｅｒまたはＶａｌであり；
Ｘａａ２６３は、ＴｙｒまたはＨｉｓであり；かつ
Ｘａａ２６７は、ＧｌｕまたはＬｅｕまたはＧｌｎまたはＨｉｓである。
【００３６】
ビッグガストリン−１：
2004509079.tif 000014
式中、Ｘａａ５９は、ＧｌｕまたはＧｌｎであり；
Ｘａａ６２は、ＰｒｏまたはＬｅｕであり；
Ｘａａ６４は、ＧｌｙまたはＡｓｐであり；
Ｘａａ６５は、ＰｒｏまたはＳｅｒであり；
Ｘａａ６６は、ＰｒｏまたはＧｌｎであり；
Ｘａａ６７は、ＨｉｓまたはＧｌｎであり；
Ｘａａ６８は、ＬｅｕまたはＭｅｔまたはＰｈｅまたはＧｌｎであり；
Ｘａａ６９は、ＶａｌまたはＩｌｅであり；
Ｘａａ７２は、ＰｒｏまたはＬｅｕであり；
Ｘａａ７３は、ＳｅｒまたはＡｌａであり；
Ｘａａ７６は、ＧｌｎまたはＧｌｕであり；
Ｘａａ７７は、ＧｌｙまたはＡｒｇであり；
Ｘａａ７９は、ＴｒｐまたはＰｒｏまたはＡｒｇであり；
Ｘａａ８０は、ＬｅｕまたはＶａｌまたはＭｅｔであり；
Ｘａａ８２は、ＧｌｕまたはＬｙｓであり；かつ
Ｘａａ８５は、ＧｌｕまたはＡｌａである。
【００３７】
ＧＬＰ−２：
2004509079.tif 000015
式中、Ｘａａ１５２は、ＳｅｒまたはＴｈｒであり；
Ｘａａ１５３は、ＡｓｐまたはＳｅｒであり；
Ｘａａ１５４は、ＧｌｕまたはＡｓｐであり；
Ｘａａ１５５は、ＭｅｔまたはＰｈｅであり；
Ｘａａ１５６は、ＡｓｎまたはＳｅｒであり；
Ｘａａ１５７は、ＴｈｒまたはＬｙｓであり；
Ｘａａ１５８は、ＩｌｅまたはＶａｌまたはＡｌａであり；
Ｘａａ１６１は、ＡｓｎまたはＩｌｅまたはＨｉｓまたはＳｅｒであり；
Ｘａａ１６２は、ＬｅｕまたはＬｙｓであり；
Ｘａａ１６４は、ＡｌａまたはＴｈｒであり；
Ｘａａ１６５は、ＡｒｇまたはＧｌｎまたはＬｙｓであり；
Ｘａａ１６６は、ＡｓｐまたはＧｌｕであり；
Ｘａａ１６８は、ＩｌｅまたはＬｅｕであり；
Ｘａａ１６９は、ＡｓｎまたはＡｓｐであり；
Ｘａａ１７１は、ＬｅｕまたはＩｌｅであり；
Ｘａａ１７２は、ＩｌｅまたはＬｅｕであり；
Ｘａａ１７３は、ＧｌｎまたはＡｓｎまたはＨｉｓであり；
Ｘａａ１７５は、ＬｙｓまたはＰｒｏであり；
Ｘａａ１７６は、ＩｌｅまたはＶａｌであり；
Ｘａａ１７７は、ＴｈｒまたはＬｙｓであり；かつ
Ｘａａ１７８は、ＡｓｐまたはＧｌｕである。
【００３８】
黄体形成ホルモン放出ホルモン：
2004509079.tif 000016
式中、Ｘａａ１は、ｐＧｌｕ、５−ｏｘｏＰｒｏまたはＧｌｎである。
【００３９】
メラニン細胞刺激ホルモン（ＭＳＨ）：
2004509079.tif 000017
【００４０】
心房性ナトリウム利尿ペプチド：
2004509079.tif 000018
式中、Ｘａａ１３５は、ＭｅｔまたはＩｌｅであり；かつ
Ｘａａ１４２は、ＧｌｙまたはＳｅｒである。
【００４１】
ニューロメジンＢ：
2004509079.tif 000019
【００４２】
ヒトニューロペプチドＹ：
2004509079.tif 000020
【００４３】
ヒトオレキシンＡ：
2004509079.tif 000021
【００４４】
ヒトペプチドＹＹ：
2004509079.tif 000022
【００４５】
ヒトセクレチン：
2004509079.tif 000023
【００４６】
血管作動性腸管ペプチド（ＶＩＰ）：
2004509079.tif 000024
【００４７】
下記の抗生物質系ペプチド：
マガイニン１：
2004509079.tif 000025
【００４８】
マガイニン２：
2004509079.tif 000026
【００４９】
セクロピンＡ：
2004509079.tif 000027
【００５０】
セクロピンＢ：
2004509079.tif 000028
【００５１】
サブスタンスＰ（ＳＰ）：
2004509079.tif 000029
【００５２】
βカソモルフィン−５：
Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ
【００５３】
エンドモルフィン−２：
Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−ＮＨ２
【００５４】
プロコリパーゼ：
2004509079.tif 000030
【００５５】
エンテロスタチン：
Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ
【００５６】
ガストリン阻害ペプチド：
2004509079.tif 000031
【００５７】
クロモグラニンＡ
バソスタチンＩ
バソスタチンＩＩ：
2004509079.tif 000032
【００５８】
プロカルシトニン
ＰｒｏＮＣＴ
ＰｒｏＣＧＲＰ
【００５９】
ケモカインファミリー：
2004509079.tif 000033
2004509079.tif 000034
ならびにそれらの機能的誘導体または断片。
【００６０】
先に列挙した配列の完全な定義は、特に、メントレイン（Ｍｅｎｔｌｅｉｎ）， Ｒ（１９９９）Ｒｅｇｕｌ． Ｐｅｐｔ．、８５：９−２４およびデメースター（Ｄｅ Ｍｅｅｓｔｅｒ）， Ｉ．ら（２０００）Ａｄｖ ＥｘｐＭｅｄ Ｂｉｏｌ．、４７７：６７−８７において公知である。これらの論文は、本出願に参照として組入れられている。
【００６１】
より好ましい態様において、ペプチドは、１つまたは複数の高次構造的に強固な部分により置換されている。高次構造的に強固な部分の構造は、二重結合、三重結合または飽和型もしくは不飽和型の環を持つ構造を含むことが好ましい。
【００６２】
以下は、本発明の目的に適した、式１〜式６３として同定された、好ましい高次構造的に強固な部分の式の簡単な一覧である。
【００６３】
本発明による好ましい修飾ペプチドの中の、天然ペプチド配列であるペプチド配列を示す。
【化５】
2004509079.tif 000035
【化６】
2004509079.tif 000036
【化７】
2004509079.tif 000037
【化８】
2004509079.tif 000038
【化９】
2004509079.tif 000039
【化１０】
2004509079.tif 000040
【化１１】
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【化１２】
2004509079.tif 000042
【化１３】
2004509079.tif 000043
【化１４】
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【化１５】
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【化１６】
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【化１７】
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【化１８】
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【化１９】
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【化２０】
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【化２１】
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【化２２】
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【化２３】
2004509079.tif 000053
【化２４】
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【化２５】
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【化２６】
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【化２７】
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【化２８】
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【化２９】
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【化３０】
2004509079.tif 000060
【化３１】
2004509079.tif 000061
【化３２】
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【化３３】
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【化３４】
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【化３５】
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【化３６】
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【化３７】
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【化３８】
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【化３９】
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【化４０】
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【化４１】
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【化４２】
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【化４３】
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【化４４】
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【化４５】
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【化４６】
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【化４７】
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【化４８】
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【化４９】
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【化５０】
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【化５１】
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【化５２】
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【化５３】
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【化５４】
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【化５５】
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【化５６】
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【化５７】
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【化５８】
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【化５９】
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【化６０】
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【化６１】
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【化６２】
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【化６３】
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【化６４】
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【化６５】
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【化６６】
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【化６７】
2004509079.tif 000097
（式中、Ｒは、水素、ＣＨ３、またはＣＨ２ＣＨ３である。）。
【００６４】
本発明の好ましい態様は、以下のペプチドにより構成され、ここでペプチド配列はソマトスタチンであり、かつ少なくとも１つの高次構造的に強固な部分が、異なる位置においてアミド結合を介して該ソマトスタチンペプチド配列へカップリングされる。
【化６８】
2004509079.tif 000098
【００６５】
本発明の別の好ましい態様は、以下のペプチドにより構成され、ここでペプチド配列はＰＴＨ １−３４であり、かつ少なくとも１つの高次構造的に強固な部分が、異なる位置においてアミド結合を介して該ＰＴＨ １−３４ペプチド配列へカップリングされる。
【化６９】
2004509079.tif 000099
【００６６】
本発明の更に好ましい態様は、以下のペプチドにより構成され、ここでペプチド配列がＧＬＰ−１であり、かつ少なくとも１つの高次構造的に強固な部分が、異なる位置においてアミド結合を介して該ＧＬＰ−１ペプチド配列へカップリングされる。
【化７０】
2004509079.tif 000100
【化７１】
2004509079.tif 000101
【００６７】
また、本発明による修飾ペプチドの中では、以下のようなペプチドが好ましい：
ペプチド配列がＧＬＰ−２であり、かつ少なくとも１つの高次構造的に強固な部分が、ペプチド配列の異なる位置においてアミド結合またはエステル結合を介して該ＧＬＰ−２ペプチド配列へカップリングされる；
ペプチド配列がエンテロスタチンであり、かつ少なくとも１つの高次構造的に強固な部分が、ペプチド配列の異なる位置においてアミド結合を介して該エンテロスタチンペプチド配列へカップリングされる；
ペプチド配列がＮＰＹであり、かつ少なくとも１つの高次構造的に強固な部分が、ペプチド配列の異なる位置においてアミド結合またはエステル結合を介して該ＮＰＹペプチド配列へカップリングされる；
ペプチド配列がＮＰＹＹであり、かつ少なくとも１つの高次構造的に強固な部分が、ペプチド配列の異なる位置においてアミド結合またはエステル結合を介して該ＮＰＹＹペプチド配列へカップリングされる；
ペプチド配列がセクレチンであり、かつ少なくとも１つの高次構造的に強固な部分が、ペプチド配列の異なる位置においてアミド結合またはエステル結合を介して該セクレチンペプチド配列へカップリングされる；
ペプチド配列が血管作動性腸管ペプチドであり、かつ少なくとも１つの高次構造的に強固な部分が、ペプチド配列の異なる位置においてアミド結合またはエステル結合を介して該血管作動性腸管ペプチド配列へカップリングされる；
ペプチド配列がガストリン阻害ペプチドであり、かつ少なくとも１つの高次構造的に強固な部分が、ペプチド配列の異なる位置においてアミド結合またはエステル結合を介して該ガストリン阻害ペプチド配列へカップリングされる；
ペプチド配列がバソスタチンＩＩであり、かつ少なくとも１つの高次構造的に強固な部分が、ペプチド配列の異なる位置においてアミド結合またはエステル結合を介して該バソスタチンＩＩペプチド配列へカップリングされる；
ペプチド配列がＲＡＮＴＥＳであり、かつ少なくとも１つの高次構造的に強固な部分が、ペプチド配列の異なる位置においてアミド結合またはエステル結合を介して該ＲＡＮＴＥＳペプチド配列へカップリングされる；
ペプチド配列がエオタキシンであり、かつ少なくとも１つの高次構造的に強固な部分が、ペプチド配列の異なる位置においてアミド結合またはエステル結合を介して該エオタキシンペプチド配列へカップリングされる。
【００６８】
本発明の修飾ペプチドにおいて、高次構造的に強固な部分は、好ましくはＮ末端においてアミド結合を介して該ペプチド配列へカップリングされる。
【００６９】
高次構造的に強固な部分が本明細書において式６０と記載されたような、本発明による修飾ペプチドが、特に関心対象となる。
【００７０】
本発明の修飾ペプチドを、例えば静脈内、皮下、皮内、経皮的、腹腔内、経口または局所的など、様々な方法で投与することができる。また本発明の修飾ペプチドを、粉末の形状またはエアゾールの形状である場合には、吸入により投与することもできる。更に、本発明の修飾ペプチドの送達のための薬学的に許容できる担体は、リポソーム、ナノソーム、貼付剤、移植片または任意の送達装置を含むが、これらに限定されるわけではない。
【００７１】
各々、ペプチドのＣ末端およびＮ末端に存在するカルボキシ基およびアミノ基に加え、ペプチド鎖上のその他のカルボキシ部位およびアミノ部位を利用することができる。例えば、ペプチド鎖がアスパラギン酸およびグルタミン酸のようなカルボン酸側鎖を備えたアミノ酸を含む場合、これによりその鎖上の追加のカルボキシ部位を、アミド化に利用できるでと考えられる。ペプチド鎖が、アスパラギンおよびグルタミンのようなカルボキシアミド側鎖を伴うアミノ酸を含むならば、これらが対応するアスパラギン酸およびグルタミン酸により合成的に接続される（ａｃｃｅｓｓ）という条件下で、これらはまた高次構造的に強固な部分によるアミド化のための追加のカルボキシ基を提供する。更に、ペプチドがアルギニン、ヒスチジンまたはリシンのような塩基性側鎖を備えたアミノ酸を含むならば、追加のアミノ部位は、高次構造的に強固な部分によるアミド化のための鎖上で利用利用可能であると考えられる。ペプチド鎖は、酸性および塩基性のアミノ酸を両方含むことができ、このことは、高次構造的に強固な置換基は、Ｎ末端、Ｃ末端、ペプチド鎖上のカルボキシ部位、ペプチド鎖上のアミノ部位、またはこれらのうち複数の部位で、ペプチド鎖へカップリングされうることを意味している。
【００７２】
本発明は、下記の実施例を参照することによりより容易に理解されると考えられるが、これらは本発明の例示のために提供されるものであり、その範囲を限定するものではない。
【００７３】
実施例１
ＧＬＰ−１類似体の合成
本発明に従い、下記のように、少なくとも１つの下記の高次構造的に強固な部分を、異なる位置においてアミド結合を介してＧＬＰ−１ペプチド配列へカップリングした。
【化７２】
2004509079.tif 000102
【００７４】
ｈＧＬＰ−１（７−３７）類似体の合成
アミノ末端で強固な疎水性部分により修飾されたｈＧＬＰ−１（７−３７）誘導体を、Ｓｙｍｐｈｏｎｙ装置（Ｒａｉｎｉｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ社）上で、Ｆｍｏｃ化学を用いて合成した（１）。Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−Ｗａｎｇ樹脂（Ｏ．７Ｏｍｍｏｌ／ｇ）および５当量の試薬（１００μｍスケール、アミノ酸濃度２００ｍＭ）を、カップリング時間（ｔｉｍｅ ｃｏｕｐｌｉｎｇ）３０分間で使用した。反応を、Ｋａｉｓｅｒ試験によりモニタリングした。ｈＧＬＰ−１（７−３７）のＮ末端に導入された３つの高次構造的に強固な部分は、以下の通りである：
ペプチド＃１＝（０−トリル酢酸−Ｈｉｓ７）−ｈＧＬＰ−１（７−３７） ［Ｏ−トリル酢酸（１３）（１０当量／カップリング；カップリング時間４５分間）；
ペプチド＃２＝（（＋，−）−ｃｉｓ−２−エチルシクロプロピル酢酸−Ｈｉｓ７）−ｈＧＬＰ−１（７−３７） ［（＋，−）−ｃｉｓ−２−エチルシクロプロピル酢酸（６０） （７．５当量／カップリング：カップリング時間６０分間）］。
【００７５】
ペプチドを、ＴＦＡカクテル（９２％ＴＦＡ、２％エタンジチオール、２％チオアニソール、２％トリイソプロピルシラン、２％水、２％（ｗ／ｖ）フェノール）を用い、２時間かけて切断した。全ての類似体を、逆相ＨＰＬＣで精製した。これらを、分析的ＨＰＬＣおよびＭＳ（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）により分析した。
【００７６】
ＧＬＰ−１類似体の合成は、当業者に周知であり、かつ更に一般的参考文献である「Ｆｍｏｃ固相ペプチド合成：実践法（Ｆｍｏｃ Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ）」Ｃｈａｎ， Ｗ．Ｃ．およびＷｈｉｔｅ， Ｐ．Ｄ．（２０００）Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ社、ニューヨーク、ＵＳＡの３４６頁に例示されており、これは本明細書に参照として組入れられている。
【００７７】
ＧＬＰ−１類似体の生物学的評価
材料および方法
経口耐糖能試験（ＯＧＴＴ）
６週齢のメスＣＤ１マウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ社）を、少なくとも１６時間絶食させた。マウスに、体重１ｇ当り１．５ｍｇのグルコースを水に溶かし、胃への挿管栄養補給により、ｔ＝０分時点でに経口投与し、かつｔ＝０分、１０分、２０分、３０分、６０分、９０分および１２０分に、尾静脈から採血し、糖測定器（ｇｌｕｃｏｓｅ ｍｅｔｅｒ）（Ｌｉｆｅｓｃａｎ社）を用い血糖値を測定した。ペプチドまたは溶媒を、グルコース投与の５分前に皮下注射した。データを、台形則を用い、各時点における血糖値の変化（Δ）から算出した曲線下面積として示した。従って、データは、グルコース投与後１２０分間にわたる血糖値の積分された増加を表している。示されたデータを、１群につき４匹〜１１匹の動物の平均±ＳＥＭで表した。
【００７８】
被験物質
野生型ＧＬＰ−１（７−３７）を含む全てのペプチドを、下記の３種の異なる濃度において、ＯＧＴＴ試験で試験した：マウス一匹あたり１ｕｇ、５ｕｇ、および１０ｕｇ。最初の実験セット（試験Ａ）においては、ペプチド３を、溶媒およびｈＧＬＰ−１（７−３７）と比較試験した。第二の実験セット（試験Ｂ）においては、ペプチド１および２を、溶媒およびｈＧＬＰ−１（７−３７）と比較試験した。
野生型ＧＬＰ１：ｈＧＬＰ（７−３７）
ペプチド＃１：（Ｏ−トリル酢酸−Ｈｉｓ７）−ｈＧＬＰ−１（７−３７）
ペプチド＃２：（（＋，−）−ｃｉｓ−２−エチルシクロプロピル酢酸−Ｈｉｓ７）−ｈＧＬＰ−１（７−３７）
ペプチド＃３：（ヘキセノイル−ｔｒａｎｓ−３−Ｈｉｓ７）−ｈＧＬＰ−１（７−３７）
【００７９】
結果および結論
結果を、図１（試験Ａ）および図２（試験Ｂ）に示した。
【００８０】
試験ＡおよびＢにおいて、溶媒の投与により、グルコースレベルについて同様の積分（ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ）反応が生じ（試験Ａ：３８０±５７ 対 試験Ｂ：３０９±６８ ｍＭ×１２０分）、これは本方法論の正当性および再現性を示している。野生型ＧＬＰ−１は、グルコース反応における用量関連性減少を誘導したが、このペプチドは、いずれの用量においても、グルコース反応を完全に抑制することはできず、これは、その臨床的有用性の可能性の限界として解釈される。対照的に、ペプチド３（試験Ａ、図１）は、１０ｕｇ用量においてのみ（９±２６ｍＭ×１２０分間）、グルコース反応を完全になくすことができた。驚くべきことに、ペプチド２（試験Ｂ、図２）はペプチド３よりも更により強力であり、５ｕｇおよび１０ｕｇの両用量においてグルコース反応を全般的に妨害することができる（５ｕｇ：−１７±６７ｍＭ×１２０分間；１０ｕｇ：６１±６４ｍＭ×１２０分間）。結論として、ペプチド２に相当するＧＬＰ−１類似体は、野生型ＧＬＰ−１（７−３７）よりも顕著に増大した生物学的効力を伴うことが同定され、この効力の増大により、このペプチドは、ＩＩ型糖尿病などの病理関連性インスリン耐性の病態の治療において臨床的に有用でありうる。
【化７３】
2004509079.tif 000103
【００８１】
実施例２
ＰＴＨ １−３４類似体
本発明に従い、下記の高次構造的に強固な部分のうち少なくとも１種が、異なる位置においてアミド結合を介してＰＴＨ １−３４ペプチド配列へカップリングされる。
【化７４】
2004509079.tif 000104
【００８２】
実施例３
ソマトスタチン類似体
本発明に従い、下記の高次構造的に強固な部分のうち少なくとも１種が、異なる位置においてアミド結合を介してソマトスタチンペプチド配列へカップリングされる。
【化７５】
2004509079.tif 000105
【００８３】
本発明は特定の態様に関連して説明されているが、更なる変更が可能であること、および、一般に本発明の原理に従う本発明の任意の変法、用途または適合に及ぶことが意図されており、かつ、本発明が属する技術分野に公知または慣習的実践内であり、かつ本明細書において前述した本質的特徴に適合しうり、かつ添付の特許請求の範囲に従うような記載からの逸脱を、本発明が含むことができることが、理解されると考えられる。
【図面の簡単な説明】
【図１】試験Ａの結果を示す。
【図２】試験Ｂの結果を示す。
【図１】
2004509079.tif 000142
【図２】
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【国際公開パンフレット】
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2004509079.tif 000219
2004509079.tif 000220
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004509079.tif 000221
【国際調査報告】
2004509079.tif 000222
2004509079.tif 000223
2004509079.tif 000224
2004509079.tif 000225
2004509079.tif 000226
2004509079.tif 000227
2004509079.tif 000228