(57)【要約】本発明は、ネクチンポリペプチドおよびポリヌクレオチド、こうしたポリペプチドおよびポリヌクレオチドを作成する方法、並びにこうしたポリペプチドおよびポリヌクレオチドを用いて、細胞接着、細胞遊走、および血管形成を変調する方法、内皮および上皮細胞増殖、遊走、および関門機能を含む、細胞接着に関連する状態を治療する方法、並びにネクチンポリペプチド活性を改変する剤を同定する方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、２４、３１、３４、３７−３９からなる群より選択される配列に、少なくとも８０％同一である配列を含んでなり、ネクチン−１に結合するポリペプチド；および
（ｂ）ネクチン−１に結合する（ａ）の断片
からなる群より選択される、実質的に精製したポリペプチド。
【請求項２】
（ａ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、２４、３１、３４、３７−３９からなる群より選択される配列に、少なくとも９０％同一である配列を含んでなり、ネクチン−１に結合するポリペプチド；および
（ｂ）ネクチン−１に結合する（ａ）の断片
からなる群より選択される、請求項１の実質的に精製したポリペプチド。
【請求項３】
（ａ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、２４、３１、３４、３７−３９からなる群より選択される配列を含んでなるポリペプチド；および
（ｂ）ネクチン−１に結合する（ａ）の断片
からなる群より選択される、請求項１の実質的に精製したポリペプチド。
【請求項４】
（ａ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、２４、３１、３４、３７−３９の細胞外ドメインに、少なくとも８０％同一である配列を含んでなり、ネクチン−１に結合するポリペプチド；
（ｂ）ネクチン−１に結合する（ａ）の断片；および
（ｃ）内皮細胞遊走を阻害する（ａ）の断片
からなる群より選択される、実質的に精製した可溶性ポリペプチド。
【請求項５】
（ａ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、２４、３１、３４、３７−３９の細胞外ドメインに、少なくとも９０％同一である配列を含んでなり、ネクチン−１に結合するポリペプチド；
（ｂ）ネクチン−１に結合する（ａ）の断片；および
（ｃ）内皮細胞遊走を阻害する（ａ）の断片
からなる群より選択される、請求項４の実質的に精製した可溶性ポリペプチド。
【請求項６】
（ａ）配列番号４または６のほぼｘ１から４０４、ここでｘ１は１および３９の間のアミノ酸である、配列番号４または６のほぼアミノ酸５８から１５２、配列番号４または６のほぼアミノ酸５８から２５０、配列番号４または６のほぼアミノ酸５８から３４２、配列番号４または６のほぼアミノ酸５８から４０４、配列番号４または６のほぼアミノ酸７４から１５２、配列番号４または６のほぼアミノ酸７４から２５０、配列番号４または６のほぼアミノ酸７４から３４２、配列番号４または６のほぼアミノ酸７４から４０４、配列番号４または６のほぼアミノ酸１８９から２５０、配列番号４または６のほぼアミノ酸１８９から３４２、配列番号４または６のほぼアミノ酸１８９から４０４、配列番号４または６のほぼアミノ酸２８７から３４２、および配列番号４または６のほぼアミノ酸２８７から４０４からなる群より選択される配列を含んでなるポリペプチド；
（ｂ）配列番号１０または１２のほぼｘ１から３６５、ここでｘ１は１および３９の間のアミノ酸である、配列番号１０または１２のほぼアミノ酸５８から１５２、配列番号１０または１２のほぼアミノ酸５８から２５０、配列番号１０または１２のほぼアミノ酸５８から３４２、配列番号１０または１２のほぼアミノ酸５８から３６５、配列番号１０または１２のほぼアミノ酸７４から１５２、配列番号１０または１２のほぼアミノ酸７４から２５０、配列番号１０または１２のほぼアミノ酸７４から３４２、配列番号１０または１２のほぼアミノ酸７４から３６５、配列番号１０または１２のほぼアミノ酸１８９から２５０、配列番号１０または１２のほぼアミノ酸１８９から３４２、配列番号１０または１２のほぼアミノ酸１８９から３６５、配列番号１０または１２のほぼアミノ酸２８７から３４２、および配列番号１０または１２のほぼアミノ酸２８７から３６５からなる群より選択される配列を含んでなるポリペプチド；
（ｃ）配列番号２４または３４のほぼｘ２から３４９、ここでｘ２は１および１６の間のアミノ酸である、配列番号３６のほぼアミノ酸２７から３５０、配列番号３７のほぼアミノ酸４４から３６２、配列番号３８のほぼアミノ酸３９から２４２、および配列番号３９のほぼアミノ酸４４から３６３からなる群より選択される配列を含んでなるポリペプチド；
（ｄ）ネクチン−１に結合する（ａ）、（ｂ）または（ｃ）の断片；および
（ｅ）内皮細胞遊走を阻害する（ａ）、（ｂ）または（ｃ）の断片
からなる群より選択される、請求項４の実質的に精製したポリペプチド。
【請求項７】
ロイシンジッパーポリペプチド、Ｆｃポリペプチド、またはペプチドリンカーをさらに含んでなる、請求項４記載の可溶性ポリペプチド。
【請求項８】
配列Ｚ１−Ｘ−Ｚ２を含んでなり、Ｚ１およびＺ２が、各々、個々に：
（ａ）配列番号４または６のほぼｘ１から４０４、ここでｘ１は１および３９の間のアミノ酸である、配列番号４または６のほぼアミノ酸５８から１５２、配列番号４または６のほぼアミノ酸５８から２５０、配列番号４または６のほぼアミノ酸５８から３４２、配列番号４または６のほぼアミノ酸５８から４０４、配列番号４または６のほぼアミノ酸７４から１５２、配列番号４または６のほぼアミノ酸７４から２５０、配列番号４または６のほぼアミノ酸７４から３４２、配列番号４または６のほぼアミノ酸７４から４０４、配列番号４または６のほぼアミノ酸１８９から２５０、配列番号４または６のほぼアミノ酸１８９から３４２、配列番号４または６のほぼアミノ酸１８９から４０４、配列番号４または６のほぼアミノ酸２８７から３４２、および配列番号４または６のほぼアミノ酸２８７から４０４からなる群より選択される配列を含んでなるポリペプチド；
（ｂ）配列番号１０または１２のほぼｘ１から３６５、ここでｘ１は１および３９の間のアミノ酸である、配列番号１０または１２のほぼアミノ酸５８から１５２、配列番号１０または１２のほぼアミノ酸５８から２５０、配列番号１０または１２のほぼアミノ酸５８から３４２、配列番号１０または１２のほぼアミノ酸５８から３６５、配列番号１０または１２のほぼアミノ酸７４から１５２、配列番号１０または１２のほぼアミノ酸７４から２５０、配列番号１０または１２のほぼアミノ酸７４から３４２、配列番号１０または１２のほぼアミノ酸７４から３６５、配列番号１０または１２のほぼアミノ酸１８９から２５０、配列番号１０または１２のほぼアミノ酸１８９から３４２、配列番号１０または１２のほぼアミノ酸１８９から３６５、配列番号１０または１２のほぼアミノ酸２８７から３４２、および配列番号１０または１２のほぼアミノ酸２８７から３６５からなる群より選択される配列を含んでなるポリペプチド；
（ｃ）配列番号２４または３４のほぼｘ２から３４９、ここでｘ２は１および１６の間のアミノ酸である、配列番号３６のほぼアミノ酸２７から３５０、配列番号３７のほぼアミノ酸４４から３６２、配列番号３８のほぼアミノ酸３９から２４２、および配列番号３９のほぼアミノ酸４４から３６３からなる群より選択される配列を含んでなるポリペプチド；
（ｄ）ネクチン−１に結合する（ａ）、（ｂ）または（ｃ）の断片；および
（ｅ）内皮細胞遊走を阻害する（ａ）、（ｂ）または（ｃ）の断片
からなる群より選択される、可溶性ポリペプチドであり、そしてＸがペプチドリンカーである、請求項７記載の可溶性ポリペプチド。
【請求項９】
配列番号１３、１４、１５、１６、および３６からなる群より選択される配列を含んでなる、請求項４の可溶性ポリペプチド。
【請求項１０】
請求項１−９のいずれか１つのポリペプチドおよび薬学的に許容しうるキャリアーを含んでなる組成物。
【請求項１１】
請求項１−９のいずれか１つのポリペプチドをコードする、単離ポリヌクレオチド。
【請求項１２】
（ａ）配列番号１、３、５、７、９、１１、３０、３２、３３、または３５の配列を含んでなるポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号３または５のほぼヌクレオチドｘ１から１２１２、ここでｘ１は１および１１５の間のヌクレオチドである、配列番号３または５のほぼヌクレオチド１７２から４５６、配列番号３または５のほぼヌクレオチド１７２から７５０、配列番号３または５のほぼヌクレオチド１７２から１０２６、配列番号３または５のほぼヌクレオチド１７２から１２１２、配列番号３または５のほぼヌクレオチド２２２から４５６、配列番号３または５のほぼヌクレオチド２２２から７５０、配列番号３または５のほぼヌクレオチド２２２から１０２６、配列番号３または５のほぼヌクレオチド２２２から１２１２、配列番号３または５のほぼヌクレオチド５６７から７５０、配列番号３または５のほぼヌクレオチド５６７から１０２６、配列番号３または５のほぼヌクレオチド５６７から１２１２、配列番号３または５のほぼヌクレオチド８６１から１０２６、および配列番号３または５のほぼヌクレオチド８６１から１２１２からなる群より選択される配列を含んでなるポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号９または１１のほぼヌクレオチドｘ１から１０９８、ここでｘ１は１および１１５の間のヌクレオチドである、配列番号９または１１のほぼヌクレオチド１７２から４５６、配列番号９または１１のほぼヌクレオチド１７２から７５０、配列番号９または１１のほぼヌクレオチド１７２から１０２６、配列番号９または１１のほぼヌクレオチド１７２から１０９８、配列番号９または１１のほぼヌクレオチド２２２から４５６、配列番号９または１１のほぼヌクレオチド２２２から７５０、配列番号９または１１のほぼヌクレオチド２２２から１０２６、配列番号９または１１のほぼヌクレオチド２２２から１０９８、配列番号９または１１のほぼヌクレオチド５６７から７５０、配列番号９または１１のほぼヌクレオチド５６７から１０２６、配列番号９または１１のほぼヌクレオチド５６７から１０９８、配列番号９または１１のほぼヌクレオチド８６１から１０２６、および配列番号９または１１のほぼヌクレオチド８６１から１０９８からなる群より選択される配列を含んでなるポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号３２または３３のほぼヌクレオチド７９から１０４７の配列を含んでなるポリヌクレオチド；
（ｅ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、または（ｄ）の配列を含んでなり、そしてネクチン−１に結合するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに、中程度（ｍｏｄｅｒａｔｅ）から非常に（ｈｉｇｈｌｙ）ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド；
（ｆ）配列番号１、３、５、７、９、１１、３０、３２、３３または３５の配列に相補的なヌクレオチド配列；および
（ｇ）ＴがまたＵであることも可能である、（ａ）から（ｆ）のヌクレオチド配列いずれか
からなる群より選択される、単離ポリヌクレオチド。
【請求項１３】
Ｆｃポリペプチド、ロイシンジッパーポリペプチド、およびペプチドリンカーからなる群より選択されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに、機能可能であるように連結した、請求項１２の配列を含んでなる、単離ポリヌクレオチド。
【請求項１４】
請求項１１または１２のポリヌクレオチドを含んでなる、発現ベクター。
【請求項１５】
請求項１１のポリヌクレオチドを含有するように、遺伝子工学的に処理した、組換え宿主細胞。
【請求項１６】
ポリペプチドの発現を促進する条件下で、請求項１５の宿主細胞を培養することを含んでなる、ポリペプチド産生法。
【請求項１７】
ポリペプチドの発現を促進する条件下で、請求項１５の宿主細胞を培養することによって産生したポリペプチド。
【請求項１８】
請求項１または４のポリペプチドに特異的に結合する、実質的に精製した抗体。
【請求項１９】
モノクローナル抗体である、請求項１８の抗体。
【請求項２０】
ヒトまたはヒト化抗体である、請求項１８の抗体。
【請求項２１】
請求項１または４のポリペプチドの生物学的活性を遮断する、請求項１８の抗体。
【請求項２２】
請求項１または４のポリペプチドの阻害剤または結合剤を設計する方法であって、ポリペプチドの三次元構造を決定し、基質またはリガンドの結合部位に関して三次元構造を解析し、ポリペプチドと相互作用すると予測される分子を設計し、そして分子の阻害または結合活性を測定することを含んでなる、前記方法。
【請求項２３】
請求項１または４のポリペプチドの活性を変調する剤を同定する方法であって：
（ａ）剤およびポリペプチドが相互作用するような条件下で、請求項１または４のポリペプチドと剤を接触させ；そして
（ｂ）対照に比較して、剤の存在下でのポリペプチドの活性を測定する、ここで活性の変化が、ポリペプチドの活性を変調する剤の指標となる
ことを含んでなる、前記方法。
【請求項２４】
剤が、抗体、小分子、ペプチド、およびペプチド擬似体（ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃ）からなる群より選択される、請求項２３の方法。
【請求項２５】
活性が、ネクチン−１結合活性、細胞接着活性、接着結合形成活性、上皮性または内皮性関門機能活性、内皮、上皮、または平滑筋細胞増殖または遊走活性、およびウイルスポリペプチド結合活性からなる群より選択される、請求項２３の方法。
【請求項２６】
ネクチン−１ポリペプチドを、請求項１または４のポリペプチドと接触させることを含んでなる、ネクチン−１ポリペプチドの活性を変調する方法。
【請求項２７】
ネクチン−１ポリペプチドおよび請求項１または４のポリペプチド間の結合を変調する剤を同定する方法であって、ネクチン−１ポリペプチドを含有する試料を、剤と接触させ、そして対照試料に比較して、ネクチン−１ポリペプチドと該ポリペプチドの相互作用を測定する、ここで対照と比較した、ネクチン−１ポリペプチドおよび該ポリペプチド間の結合の変化が、結合を変調する剤の指標となる、前記方法。
【請求項２８】
剤が、ポリペプチド、ペプチド、抗体、ペプチド擬似体、および小分子からなる群より選択される、請求項２７の方法。
【請求項２９】
細胞増殖または遊走を変調する方法であって、ネクチン−１活性または発現を変調する剤と細胞を、細胞および剤が相互作用するような条件下で接触させることを含んでなる、前記方法。
【請求項３０】
細胞が、内皮細胞、上皮細胞、および平滑筋細胞からなる群より選択される、請求項２９の方法。
【請求項３１】
平滑筋細胞が血管平滑筋細胞である、請求項３０の方法。
【請求項３２】
剤が、ペプチド、ポリペプチド、ペプチド擬似体、ポリヌクレオチド、抗体、および小分子からなる群より選択される、請求項２９の方法。
【請求項３３】
ポリペプチドが、請求項４の可溶性ポリペプチドである、請求項３２の方法。
【請求項３４】
可溶性ポリペプチドが、Ｆｃ、ロイシンジッパーまたはペプチドリンカーポリペプチドをさらに含んでなる、請求項３３の方法。
【請求項３５】
血管形成を阻害する治療が必要な哺乳動物において血管形成を阻害する方法であって、哺乳動物に、阻害有効量の請求項４のポリペプチドを投与することを含んでなる、前記方法。
【請求項３６】
ポリペプチドが：
（ａ）配列番号４または６のほぼｘ１から４０４、ここでｘ１は１および３９の間のアミノ酸である、配列番号４または６のほぼアミノ酸５８から１５２、配列番号４または６のほぼアミノ酸５８から２５０、配列番号４または６のほぼアミノ酸５８から３４２、配列番号４または６のほぼアミノ酸５８から４０４、配列番号４または６のほぼアミノ酸７４から１５２、配列番号４または６のほぼアミノ酸７４から２５０、配列番号４または６のほぼアミノ酸７４から３４２、配列番号４または６のほぼアミノ酸７４から４０４、配列番号４または６のほぼアミノ酸１８９から２５０、配列番号４または６のほぼアミノ酸１８９から３４２、配列番号４または６のほぼアミノ酸１８９から４０４、配列番号４または６のほぼアミノ酸２８７から３４２、および配列番号４または６のほぼアミノ酸２８７から４０４からなる群より選択される配列を含んでなるポリペプチド；
（ｂ）配列番号１０または１２のほぼｘ１から３６５、ここでｘ１は１および３９の間のアミノ酸である、配列番号１０または１２のほぼアミノ酸５８から１５２、配列番号１０または１２のほぼアミノ酸５８から２５０、配列番号１０または１２のほぼアミノ酸５８から３４２、配列番号１０または１２のほぼアミノ酸５８から３６５、配列番号１０または１２のほぼアミノ酸７４から１５２、配列番号１０または１２のほぼアミノ酸７４から２５０、配列番号１０または１２のほぼアミノ酸７４から３４２、配列番号１０または１２のほぼアミノ酸７４から３６５、配列番号１０または１２のほぼアミノ酸１８９から２５０、配列番号１０または１２のほぼアミノ酸１８９から３４２、配列番号１０または１２のほぼアミノ酸１８９から３６５、配列番号１０または１２のほぼアミノ酸２８７から３４２、および配列番号１０または１２のほぼアミノ酸２８７から３６５からなる群より選択される配列を含んでなるポリペプチド；
（ｃ）配列番号２４または３４のほぼｘ２から３４９、ここでｘ２は１および１６の間のアミノ酸である、配列番号３６のほぼアミノ酸２７から３５０、配列番号３７のほぼアミノ酸４４から３６２、配列番号３８のほぼアミノ酸３９から２４２、および配列番号３９のほぼアミノ酸４４から３６３からなる群より選択される配列を含んでなるポリペプチド；および
（ｄ）ネクチン−１に結合する（ａ）、（ｂ）または（ｃ）の断片
から選択される、請求項３５の方法。
【請求項３７】
内皮増殖、遊走、または血管形成状態を治療する方法であって、こうした治療が必要な組織または被験者を、請求項４のポリペプチドに接触させることを含んでなる、前記方法。
【請求項３８】
内皮増殖、遊走、または血管形成状態が、虚血、アテローム性動脈硬化症、虚血−再灌流傷害、脳卒中、血栓症、再狭窄、および腫瘍増殖からなる群より選択される、請求項３７の方法。
【請求項３９】
ポリペプチドが、配列番号１３、１４、１５、１６、または３６に示すような配列を含んでなる、請求項３７の方法。
【請求項４０】
接触がｉｎ  ｖｉｔｒｏである、請求項３７の方法。
【請求項４１】
接触がｉｎ  ｖｉｖｏである、請求項３７の方法。
【請求項４２】
請求項４のポリペプチドを被験者に投与することを含んでなる、ウイルス感染を治療する方法。
【請求項４３】
ウイルス感染がヘルペスウイルス感染である、請求項４２の方法。
【請求項４４】
接着結合形成活性、上皮性または内皮性関門機能活性、あるいは細胞接着活性を増加させる方法であって、請求項１または４の少なくとも１つのポリペプチドと細胞を接触させることを含んでなる、前記方法。
【請求項４５】
細胞接着活性、接着結合形成活性、上皮性または内皮性関門機能活性、内皮、上皮、または平滑筋細胞増殖または遊走活性、あるいはウイルスポリペプチド結合活性を減少させる方法であって、請求項１または４の少なくとも１つのポリペプチドと細胞を接触させることを含んでなる、前記方法。
【請求項４６】
請求項１または４の少なくとも１つのポリペプチド、あるいは請求項１または４のポリペプチドに特異的に結合する抗体を、被験者に投与することによって、被験者において、細胞接着活性、接着結合形成活性、上皮性または内皮性関門機能活性、内皮増殖または遊走活性；ウイルスポリペプチド結合活性、あるいは血管形成に関連する疾患または障害を治療する方法。
【請求項４７】
上皮性または内皮性関門機能障害が、炎症、敗血症、浮腫、糖尿病網膜症、喘息、アレルギー、同種移植片拒絶、癌細胞転移、腎臓におけるマグネシウム輸送欠陥などの傍細胞輸送障害、および炎症性腸疾患からなる群より選択される、請求項４６の方法。
【請求項４８】
ポリペプチドが、配列番号１３、１４、１５、１６、または３６に示すような配列を含んでなる、請求項２９−４７のいずれか１つの方法。
【請求項４９】
ポリペプチドが多量体の形である、請求項２９−４７のいずれか１つの方法。
【請求項５０】
多量体が二量体または三量体である、請求項４９の方法。
【請求項５１】
多量体が、Ｆｃポリペプチド、ロイシンジッパー、またはペプチドリンカーを含んでなる、請求項４９の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
関連出願へのクロスリファレンス
本出願は、３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９に基づいて、米国仮出願第６０／２３８，５５７号、２０００年１０月５日提出の優先権を主張し、前記出願の開示は、本明細書に援用される。
【０００２】
発明の分野
本発明は、ネクチンポリペプチド、こうしたポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、ネクチンポリペプチドを作成する方法、並びに細胞接着および遊走活性の変調において、ネクチンポリペプチドを使用する方法、並びにこうしたポリペプチドを作成する方法に関する。
【０００３】
背景
ネクチンタンパク質は、細胞−細胞相互作用に関与する免疫グロブリン様細胞接着分子の関連する群である。ネクチンタンパク質は、上皮および内皮細胞、並びに造血細胞を含む、非常に多様な細胞種で発現される。ネクチンタンパク質には、それぞれまた、ポリオウイルス受容体関連（ＰＲＲ）タンパク質１および２、並びにヘルペスウイルス進入（Ｈｖｅ）タンパク質ＣおよびＢとも称する、ネクチン−１およびネクチン−２が含まれる。選択的スプライシングから生じるネクチン−１およびネクチン−２の多数の型が同定されてきている。これらのネクチンポリペプチドへの有意な配列類似性によって関連付けられる別のポリペプチドは、ＣＤ１５５タンパク質とも呼ばれる、ポリオウイルス受容体（ＰＶＲ）である。
【０００４】
細胞−細胞相互作用または細胞へのヘルペスウイルスの結合を伴う状態および疾患のより有効な治療を開発するため、ネクチンポリペプチドの生物学的役割および活性に関する、そして特にネクチンポリペプチドファミリーの先に同定されていないメンバーの特性に関する情報が必要である。
【０００５】
発明の概要
本発明は、ネクチン−３およびネクチン−４ポリペプチド、ポリヌクレオチド、該ポリペプチドおよびポリヌクレオチドを作成し、そして使用する方法を提供する。
【０００６】
したがって、本発明は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、２４、３１、３４、３７−３９からなる群より選択される配列に、少なくとも８０％同一である配列、およびその断片を含んでなり、ネクチン−１に結合する、実質的に精製したポリペプチドを提供する。
【０００７】
本発明は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、２４、３１、３４、３７−３９の細胞外ドメインに、少なくとも８０％同一である配列、およびその断片を含んでなり、ネクチン−１に結合し、そして／または内皮細胞遊走を阻害する、実質的に精製した可溶性ポリペプチドをさらに提供する。
【０００８】
本発明はまた、Ｆｃポリペプチドドメイン、ロイシンジッパードメインおよび／またはペプチドリンカードメインをさらに含んでなる、上記記載の可溶性ポリペプチドも提供する。１つの態様において、融合構築物は、配列Ｚ１−Ｘ−Ｚ２を含んでなり、Ｚ１およびＺ２は、各々、個々に：配列番号４または６のほぼｘ１から４０４、ここでｘ１は１および３９の間のアミノ酸である、配列番号４または６のほぼアミノ酸５８から１５２、配列番号４または６のほぼアミノ酸５８から２５０、配列番号４または６のほぼアミノ酸５８から３４２、配列番号４または６のほぼアミノ酸５８から４０４、配列番号４または６のほぼアミノ酸７４から１５２、配列番号４または６のほぼアミノ酸７４から２５０、配列番号４または６のほぼアミノ酸７４から３４２、配列番号４または６のほぼアミノ酸７４から４０４、配列番号４または６のほぼアミノ酸１８９から２５０、配列番号４または６のほぼアミノ酸１８９から３４２、配列番号４または６のほぼアミノ酸１８９から４０４、配列番号４または６のほぼアミノ酸２８７から３４２、配列番号４または６のほぼアミノ酸２８７から４０４、配列番号１０または１２のほぼｘ１から３６５、ここでｘ１は１および３９の間のアミノ酸である、配列番号１０または１２のほぼアミノ酸５８から１５２、配列番号１０または１２のほぼアミノ酸５８から２５０、配列番号１０または１２のほぼアミノ酸５８から３４２、配列番号１０または１２のほぼアミノ酸５８から３６５、配列番号１０または１２のほぼアミノ酸７４から１５２、配列番号１０または１２のほぼアミノ酸７４から２５０、配列番号１０または１２のほぼアミノ酸７４から３４２、配列番号１０または１２のほぼアミノ酸７４から３６５、配列番号１０または１２のほぼアミノ酸１８９から２５０、配列番号１０または１２のほぼアミノ酸１８９から３４２、配列番号１０または１２のほぼアミノ酸１８９から３６５、配列番号１０または１２のほぼアミノ酸２８７から３４２、配列番号１０または１２のほぼアミノ酸２８７から３６５、配列番号２４または３４のほぼｘ２から３４９、ここでｘ２は１および１６の間のアミノ酸である、配列番号３６のほぼアミノ酸２７から３５０、配列番号３７のほぼアミノ酸４４から３６２、配列番号３８のほぼアミノ酸３９から２４２、配列番号３９のほぼアミノ酸４４から３６３；およびネクチン−１に結合し、そして／または内皮細胞遊走を阻害するポリペプチドを提供する前述の配列のいずれかの断片からなる群より選択される配列を含んでなる、可溶性ポリペプチドであり、そしてＸはペプチドリンカーである。
【０００９】
本発明はさらに、本発明のポリペプチドおよび薬学的に許容しうるキャリアーを含んでなる組成物を提供する。
【００１０】
本発明はさらに、本発明のポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチドを提供する。１つの態様において、ポリヌクレオチドは、配列番号１、３、５、７、９、１１、３０、３２、３３、または３５から選択される配列；配列番号３または５のほぼヌクレオチドｘ１から１２１２、ここでｘ１は１および１１５の間のヌクレオチドである、配列番号３または５のほぼヌクレオチド１７２から４５６、配列番号３または５のほぼヌクレオチド１７２から７５０、配列番号３または５のほぼヌクレオチド１７２から１０２６、配列番号３または５のほぼヌクレオチド１７２から１２１２、配列番号３または５のほぼヌクレオチド２２２から４５６、配列番号３または５のほぼヌクレオチド２２２から７５０、配列番号３または５のほぼヌクレオチド２２２から１０２６、配列番号３または５のほぼヌクレオチド２２２から１２１２、配列番号３または５のほぼヌクレオチド５６７から７５０、配列番号３または５のほぼヌクレオチド５６７から１０２６、配列番号３または５のほぼヌクレオチド５６７から１２１２、配列番号３または５のほぼヌクレオチド８６１から１０２６、および配列番号３または５のほぼヌクレオチド８６１から１２１２からなる群より選択される配列を含んでなるポリヌクレオチド；配列番号９または１１のほぼヌクレオチドｘ１から１０９８、ここでｘ１は１および１１５の間のヌクレオチドである、配列番号９または１１のほぼヌクレオチド１７２から４５６、配列番号９または１１のほぼヌクレオチド１７２から７５０、配列番号９または１１のほぼヌクレオチド１７２から１０２６、配列番号９または１１のほぼヌクレオチド１７２から１０９８、配列番号９または１１のほぼヌクレオチド２２２から４５６、配列番号９または１１のほぼヌクレオチド２２２から７５０、配列番号９または１１のほぼヌクレオチド２２２から１０２６、配列番号９または１１のほぼヌクレオチド２２２から１０９８、配列番号９または１１のほぼヌクレオチド５６７から７５０、配列番号９または１１のほぼヌクレオチド５６７から１０２６、配列番号９または１１のほぼヌクレオチド５６７から１０９８、配列番号９または１１のほぼヌクレオチド８６１から１０２６、および配列番号９または１１のほぼヌクレオチド８６１から１０９８からなる群より選択される配列を含んでなるポリヌクレオチド；配列番号３２または３３のほぼヌクレオチド７９から１０４７の配列を含んでなるポリヌクレオチド；並びに（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、または（ｄ）の配列を含んでなり、そしてネクチン−１に結合するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに、中程度（ｍｏｄｅｒａｔｅ）から非常に（ｈｉｇｈｌｙ）ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドを含んでなる。
【００１１】
本発明のポリヌクレオチドを含んでなる発現ベクターおよび宿主細胞もまた、本発明で提供する。
【００１２】
本発明は、ポリペプチドが発現される条件下で、本発明のポリヌクレオチドを含んでなる宿主細胞を培養することを含んでなる、ポリペプチド産生法をさらに提供する。
【００１３】
本発明は、ポリペプチドの発現を促進する条件下で、本発明のポリヌクレオチドを含んでなる本発明の宿主細胞を培養することによって産生したポリペプチドを提供する。
【００１４】
本発明はさらに、本発明のネクチンポリペプチドに特異的に結合する、実質的に精製した抗体を提供する。
【００１５】
本発明はまた、本発明のネクチンポリペプチドの阻害剤または結合剤を設計する方法であって、ポリペプチドの三次元構造を決定し、基質またはリガンドの結合部位に関して三次元構造を解析し、ポリペプチドと相互作用すると予測される分子を設計し、そして分子の阻害または結合活性を測定することを含んでなる、前記方法も提供する。
【００１６】
本発明はさらに、本発明のネクチンポリペプチドの活性を変調する剤を同定する方法を提供する。該方法は、剤およびポリペプチドが相互作用するような条件下で、本発明のポリペプチドと剤を接触させ、そして対照に比較して、剤の存在下でのポリペプチドの活性を測定する、ここで活性の変化が、ポリペプチドの活性を変調する剤の指標となる。剤は、抗体、小分子、ペプチド、またはペプチド擬似体（ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃｓ）であることが可能である。
【００１７】
さらなる側面において、本発明はネクチン−１ポリペプチドの活性を変調する方法であって、ネクチン−１ポリペプチドをネクチン−３またはネクチン−４ポリペプチド、あるいはその可溶性ドメインと接触させることを含んでなる、前記方法を提供する。
【００１８】
さらに、本発明は、本発明のネクチン−１ポリペプチド、並びにネクチン−３および／またはネクチン−４ポリペプチド間の結合を変調する剤を同定する方法であって、ネクチン−１ポリペプチドを含有する試料を、剤と接触させ、そして対照試料に比較して、ネクチン−１ポリペプチドと該ポリペプチドの相互作用を測定する、ここで対照と比較した、ネクチン−１ポリペプチドおよび該ポリペプチド間の結合の変化が、結合を変調する剤の指標となる、前記方法を提供する。
【００１９】
細胞増殖または遊走を変調する方法であって、ネクチン−１活性または発現を変調する剤と細胞を、細胞および剤が相互作用するような条件下で接触させることを含んでなる、前記方法もまた、提供する。
【００２０】
本発明は、血管形成を阻害する治療が必要な哺乳動物において血管形成を阻害する方法であって、哺乳動物に、阻害有効量のネクチン−３および／または−４ポリペプチド、あるいはその可溶性ポリペプチドを投与することを含んでなる、前記方法をさらに提供する。
【００２１】
本発明は、内皮増殖、遊走、血管形成状態またはウイルス感染を治療する方法であって、こうした治療が必要な組織または被験者を、ネクチン−３および／またはネクチン−４ポリペプチド、あるいはその可溶性ポリペプチドに接触させることを含んでなる、前記方法を提供する。
【００２２】
発明の詳細な説明
本発明は、ネクチンポリペプチドのファミリーメンバーである、ネクチン−３α、ネクチン−３β、ネクチン−３γ、およびネクチン−４ポリペプチド、こうしたポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、並びにこうしたポリペプチドおよびそのアゴニストおよびアンタゴニストを作成し、そして使用する方法を提供する。
【００２３】
ネクチンおよびネクチン関連ポリペプチドの共通の構造的特徴は、一組の３つの細胞外免疫グロブリン（Ｉｇ）ドメインである。ネクチン−１およびネクチン−２のＮ末端Ｉｇドメインは、Ｖ型Ｉｇドメインであり、一方、２つのＣ末端Ｉｇドメインは、Ｃ２型ドメインである。この分子ファミリーのＮ末端Ｉｇドメインは、隣接する細胞上の他のネクチン分子に、ヘテロまたはホモタイプ方式で、トランスに結合するのに必要であることが示されてきている。第三のＩｇドメインは、シスホモ二量体化機能に関与しているようである。ネクチン−１およびネクチン−２の細胞外ドメインは、単純疱疹ウイルスなどのウイルスへの結合に関与し、そして接着結合（ＡＪ）において、カドヘリン分子と結合すると考えられる。ネクチン関連ポリオウイルス受容体であるＣＤ１５５（ネクチン−５）が、単球上で、細胞−細胞および細胞−マトリックス相互作用に関与するタンパク質である、ＣＤ４４にごく近接していることもまた示されている。
【００２４】
ネクチンポリペプチドの別の共通の特徴は、ＡＪに存在するアファディンタンパク質のＰＤＺドメインに結合することが示されてきている、コンセンサスアミノ酸配列を含んでなる、細胞内Ｃ末端である。このＣ末端配列中の変異は、細胞内ドメインが結合するＰＤＺドメインの種類に影響を与えると考えられる。この配列または関連配列を持たないネクチンポリペプチド変異体は、ＰＤＺドメイン結合機能を欠くと予測される。
【００２５】
ネクチンポリペプチドの機能には、カドヘリンに基づくＡＪの形成および維持における役割が含まれる。ＡＪは、発生中の組織編成および成体における組織構造の維持に重要な役割を果たす、細胞間の接着性接触点である。基本的な接着機能に加え、ＡＪは、異なる細胞種において、より特殊化した多様な機能を提供し、これらには、細胞骨格力生成を細胞表面上の部位に連結することおよび細胞内シグナル伝達の仲介が含まれる。例えば、上皮シートおよび内皮において、ＡＪは、細胞周囲に外周ベルトを形成し、そしてその頂端および基底表面を分離する；上皮細胞間の密着結合形成もまた、ＡＪの構成要素であるＥ−カドヘリンの存在と関連する。ＡＪおよび密着結合は、異なる生理学的環境が、関門の各側で維持可能であり、そしてこの関門を横切る、細胞および分子の移動が制御可能であるように、上皮シートまたは内皮の２つの表面間の機能的関門を生成するのに必要である。心筋細胞において、ＡＪ（収縮ディスクとも呼ばれる）は、収縮フィラメントを形質膜に係留する。神経系において、ＡＪは、シナプス細胞表面を共に保持し、シナプスジャンクションを形成し、そしてミエリン細胞層間に存在し、ミエリン細胞膜を、軸索を封入するミエリン鞘の傍結節（ｐａｒａｎｏｄａｌ）ループに形作る。
【００２６】
ネクチン−３α、β、およびγポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、それぞれ配列番号５、１１、および３０に示す。ネクチン−４をコードするポリヌクレオチドを、配列番号３２および３３に示す。ネクチン−３α、β、およびγに対応するアミノ酸配列は、それぞれ配列番号６、１２、および３１である。ネクチン−４に対応するアミノ酸配列は、それぞれ配列番号２４および３４である。配列番号２、４、６、８、１０、１２、２４、３１、および３４を含んでなるポリペプチドは、配列番号１、３、５、７、９、１１、３２、３０、および３３を含んでなるポリヌクレオチドにコードされる。
【００２７】
ネクチン−３α、β、およびγは、選択的スプライシング産物として、互いに関連している：これらのポリペプチドの全長アミノ酸配列のＮ末端３５６アミノ酸は、同一である。ネクチン−３α、β、またはγのシグナル配列は、配列番号６、１２、および３１のほぼアミノ酸１から３９の間に位置し、そしてそこから始まり、そしてほぼアミノ酸５７に及び（例えば、ｘ１からほぼ５７、ここでｘ１は１および３９の間のアミノ酸である）、成熟ポリペプチドは、シグナル配列後の切断によって形成される。典型的には、シグナル配列は、用いる宿主細胞などの要因に応じて、アミノ酸５０、５５、または５７の後ろで切断される。したがって、成熟ポリペプチドは、配列番号６、１２、および３１の残基５１および５８の間の、そして両端を含む（例えばアミノ酸５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、または５８の）アミノ酸から出発するアミノ酸配列を含んでなる。ネクチンポリペプチドファミリーメンバーに共通の、３つの細胞外Ｉｇドメインは、ネクチン−３α（配列番号６）、β（配列番号１２）、およびγ（配列番号３１）のほぼアミノ酸７４からほぼ１５２、ほぼアミノ酸１８９からほぼ２５０、およびほぼアミノ酸２８７からほぼ３４２に位置する。ネクチン−３α、β、およびγに共通の細胞外ドメイン部分はまた、配列番号６、１２、および３１の位７３、８３、１２５、１８６、２２２、および３３１に位置するアスパラギン（「Ａｓｎ」または「Ｎ」）残基に、６つの予測されるＮ連結グリコシル化部位も含有する。真核ポリペプチドのＮグリコシル化部位はアミノ酸トリプレットＡｓｎ−Ｘ−Ｙにより特徴付けられ、ここでＸはＰｒｏ以外のいかなるアミノ酸でもよく、そしてＹはＳｅｒまたはＴｈｒである。これらのトリプレットをコードするヌクレオチド配列に対する適切な置換、付加または欠失の結果、Ａｓｎ側鎖での炭水化物残基の結合が防止可能である。例えば、Ａｓｎが異なるアミノ酸によって交換されるように選択される、単一のヌクレオチドの改変は、Ｎグリコシル化部位を不活性化するのに十分である。あるいは、ＳｅｒまたはＴｈｒを別のアミノ酸、例えばＡｌａで交換してもよい。ポリペプチドのＮグリコシル化部位を不活性化するための既知の方法には、米国特許第５，０７１，９７２号およびＥＰ  ２７６，８４６に記載されるものが含まれる。ネクチン−３αの膜貫通ドメインは、配列番号６のほぼアミノ酸４０５からアミノ酸４２４までのアミノ酸を含むと予測され；したがって、ネクチン−３αの細胞外ドメイン（シグナル配列を含む）は、配列番号６のアミノ酸１および３９の間から、ほぼアミノ酸４０４までに及ぶ（例えばほぼｘ１から４０４、ここでｘ１は１および３９の間のアミノ酸である）。ネクチン−３βおよびγの膜貫通ドメインは、それぞれ、配列番号１２または３１のほぼアミノ酸３６６からアミノ酸３８５までのアミノ酸を含むと予測され；したがって、ネクチン−３βおよびγの細胞外ドメイン（シグナル配列を含む）は、配列番号１２または３１のアミノ酸１および３９の間から、ほぼアミノ酸３６５までに及ぶ（例えばほぼｘ１から３６５、ここでｘ１は１および３９の間のアミノ酸である）。ネクチン−３αおよびβは、同様の大きさであるが、全体のアミノ酸配列が異なる、細胞内Ｃ末端ドメインを有する（それぞれ、配列番号６のほぼアミノ酸４２５から５４９、および配列番号１２のほぼアミノ酸３８６から５１０）が、これら２つのネクチンの非常にＣ末端のアミノ酸配列は、類似である：ＩＳＲＲＥＷＹＶ（配列番号６のアミノ酸５４２から５４９）およびＩＤＰＲＥＨＹＶ（配列番号１２のアミノ酸５０３から５１０）。ネクチン−３γは、配列番号３１のほぼ３８６から４３７の細胞内ドメインを有する。ネクチンタンパク質のＣ末端は、ＰＤＺドメイン含有タンパク質に結合し、そしてネクチンポリペプチドの各関連群の少なくとも１つのスプライス変異体（例えば、ヒトネクチン−１α、ヒトネクチン−２α、並びにネズミネクチン３αおよびβ）のＣ末端は、「ＩＳＲＲＥＷＹＶ」コンセンサスアミノ酸配列に高い度合いの類似性を持つ配列を含有する（例えば表１を参照されたい）。ヒトネクチン−３γは、ＰＤＺドメインを欠くと予測される。
【００２８】
表１
ネクチンファミリーメンバーのＣ末端配列
【００２９】
【表１】
2004528008.tif 000002
【００３０】
ネクチン−４（例えば配列番号２４または３４）は、ほぼアミノ酸１および１６の間から始まって、そしてアミノ酸３１に及ぶシグナル配列（例えば、配列番号２４または３４のほぼｘ２から３１、ここでｘ２はアミノ酸１および１６の間である）を含んでなり、成熟ポリペプチドは、シグナル配列後の切断によって形成される。典型的には、シグナル配列の切断は、発現に用いる細胞種などの要因に応じて、アミノ酸２６、２８、または３１の後ろで起こるであろう。したがって、成熟ポリペプチドは、配列番号２４または３４の残基２２および３２の間の、そして両端を含む（例えばアミノ酸２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、または３３の；Ｎ末端アミノ酸は、発現に用いる宿主細胞種に応じて、多様である可能性がある）アミノ酸から始まるアミノ酸配列を含んでなる。ネクチンポリペプチドファミリーメンバーに共通の、３つのＩｇドメインは、配列番号２４または３４のほぼアミノ酸２７および３４９の間（例えば２７−３４９、２８−３４９、２９−３４９、３１−３４９、または３２−３４９）で見られる。ネクチン−４の膜貫通ドメインは、配列番号２４または３４のほぼアミノ酸３５０からアミノ酸３７２までのアミノ酸を含むと予測され；したがって、ネクチン−４の細胞外ドメイン（シグナル配列を含む）は、配列番号２４または３４のアミノ酸１および１６の間から、ほぼアミノ酸３４９までに及ぶ（例えばほぼｘ２から３４９、ここでｘ２は１および１６の間のアミノ酸である）。
【００３１】
ネクチンポリペプチドに共通の、特に保存される領域およびアミノ酸残基は、ネクチンポリペプチド配列を互いに、そしてタンパク質のネクチン−Ｉｇスーパーファミリーの緊密に関連するさらなるメンバーと並列させることによって、同定した。ネクチン−３αおよびネクチン−４のアミノ酸配列（配列番号６および２４）は、多数配列並列プログラムを用いて、他のネクチンおよびＩｇファミリーメンバーのアミノ酸配列（配列番号２０、２２、および２５）と比較した。これらの配列の並列を表２に示し、そして該並列には、並列中のアミノ酸配列の少なくとも大部分の間で同一である、コンセンサス残基（大文字で表す）が含まれる。
【００３２】
ネクチンアミノ酸配列（例えば配列番号６、１２、または２４）に対するアミノ酸置換および他の改変（欠失、挿入等）は、表２に示すようなアミノ酸配列のコンセンサス残基に変化を生じるならば、ネクチンポリペプチド活性を改変するかまたは破壊する可能性がより高いと予測され、そして特にこうした変化が、同様の構造のアミノ酸（脂肪族残基、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、またはＶａｌのいずれか１つの、別の脂肪族残基に対する置換など）、またはその保存領域で他のネクチンポリペプチドに存在する残基で置換しない場合、そうである。逆に、並列中の保存されない位で、表２の他のネクチンおよびネクチン様配列の１つ由来の残基での置換を生じる変化がネクチン−３（α、β、またはγ）またはネクチン−４ポリペプチドに対して行われる場合、こうした改変が、改変されたネクチン−３（α、β、またはγ）またはネクチン−４ポリペプチドの機能に影響を与えるであろう可能性は、より低い。例えば、表２の位９８のコンセンサス残基はアルギニンであり、そしていくつかのネクチンは、その位にリジンを有する。したがって、その位での、アルギニンに対するリジンまたは化学的に類似のヒスチジンでの置換は、トリプトファンまたはチロシンでの置換より、該ポリペプチドの機能を改変する可能性がより低い。本発明は、改変されたアミノ酸配列を含んでなる、ネクチンポリペプチドおよびネクチンポリペプチドの断片、好ましくは、ネクチン−３α、ネクチン−３β、ネクチン−３γ、およびネクチン−４ポリペプチドを提供する。改変されたネクチン−３（α、β、またはγ）ポリペプチド配列は、本明細書に提供するネクチン−３アミノ酸配列の１以上と、少なくとも３０％から７０％、またはより好ましくは、少なくとも７５％から８０％、またはより好ましくは、少なくとも８５％から９０％、またはより好ましくは、少なくとも９５％から９７．５％、またはより好ましくは、少なくとも９９％、または最も好ましくは、少なくとも９９．５％のアミノ酸同一性を共有する。こうした改変を含有するネクチン−３ポリペプチドの例には、配列番号４および配列番号１０が含まれる。これらのポリペプチドは、それぞれ、配列番号２または８のＮ末端に付加された、ネズミネクチン−３のＮ末端の６−７アミノ酸を有する。この結果、ネクチン−３αおよびβポリペプチド（配列番号６および１２）の残基５のＬｅｕに対するＰｒｏの置換、および残基６のＡｒｇに対するＧｌｙの置換が生じる。配列番号１３−１６の融合ポリペプチドもまた、アミノ酸配列の位５および６にこの改変を有する。配列番号４、１３、および１５のアミノ酸配列を有するポリペプチドを発現し、そしてＮ末端シグナル配列は、これらのポリペプチドの分泌に関して、機能した。
【００３３】
表２
保存されるネクチンアミノ酸
（Ｈｓ＝ホモサピエンス（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ））
（Ｍｓ＝ネズミ）
【００３４】
【表２】
2004528008.tif 000003
【００３５】
2004528008.tif 000004
【００３６】
配列番号２４に示すネクチン−４ポリペプチドに加え、ネクチン−４の変異体もまた、本発明に提供される。例えば、本発明のネクチン−４ポリペプチドは、表３のｐｉｌｅｕｐに示すようなアミノ酸改変を有する変異体を含んでなる。表３において、配列番号２４のＮ末端の囲み領域はシグナル配列を示し、そしてＣ末端方向の囲み領域は膜貫通ドメインを示す。配列番号３６の下線領域は、この融合構築物のＦｃドメインを示す。特に興味深いのは、タンパク質のネクチンファミリーに典型的な、第一のＩｇドメインを欠く変異体、配列番号３８である。この型は、例えばネクチン−１に結合しないが、他のネクチン−４型とホモ二量体を形成可能であり、そしてアファディンに結合するであろう。したがって、配列番号３８を含んでなるポリペプチドは、例えばネクチン−１によって活性化されないであろうし、そしてその活性化を遮断可能である。
【００３７】
表３
【００３８】
【表３】
2004528008.tif 000005
【００３９】
2004528008.tif 000006
【００４０】
2004528008.tif 000007
【００４１】
本発明は、表３に示す配列の活性断片、可溶性ポリペプチド、および有用な特徴的なドメインを提供する。シグナル配列は、配列番号２４、３４、および３６−３９に存在する。例えば、配列番号２４、３４、および３６−３９の関連するドメインは以下のとおりである：
【００４２】
【表４】
2004528008.tif 000008
【００４３】
ネクチンファミリーのポリペプチドは、上皮、造血、および血管内皮および平滑筋細胞を含む、大部分の細胞種で発現される。ポリペプチドのこのファミリーと関連する、典型的な生物学的活性または機能には、ＡＪ活性、ウイルスタンパク質結合、およびＰＤＺドメイン結合が含まれる。ネクチンは、Ｆ−アクチン結合タンパク質であるアファディンを通じて、アクチン細胞骨格と関連する。ＡＪ機能と関連する細胞接着活性を有するネクチンポリペプチドは、ホモタイプまたはヘテロタイプ方式で他のネクチンポリペプチドに結合し、そして／またはカドヘリンポリペプチドを変調する。このＡＪ細胞接着活性は、ネクチンポリペプチドの細胞外ドメイン、そして特にＮ末端Ｖ型Ｉｇドメインと関連する。したがって、細胞接着活性を変調する（例えば促進するかまたは阻害する）ため、好ましいネクチンポリペプチドには、Ｎ末端Ｉｇドメインを有し、そしてネクチンおよび／またはカドヘリン結合活性を示すものが含まれる。好ましいネクチンポリペプチドには、さらに、１以上のネクチンポリペプチドの少なくとも１つの細胞外またはＩｇドメイン部分を含んでなるオリゴマーまたは融合ポリペプチド、および細胞接着活性を変調可能な、これらのポリペプチドいずれかの断片が含まれる。好ましくは、ネクチンドメインは、ネクチン分子の細胞外ドメインを含んでなる可溶性ドメインである。出願者らは、本発明が作用する機構を説明するいかなる義務または責任も持たないが、ネクチンポリペプチドの可溶性ポリペプチドドメインの活性が、細胞内シグナル伝達を変調することによって、細胞接着および遊走を変調する可能性がある。例えば、可溶性ネクチンは、ＡＪに存在する天然ネクチンの活性を変調し、それによって、細胞の細胞骨格機能を変調することが可能である。
【００４４】
ネクチンポリペプチドの細胞接着活性は、例えば、１以上のネクチンポリペプチドおよび所望により１以上のカドヘリンポリペプチドを発現するように改変されている、通常は非接着性である細胞（Ｌ細胞など）の間の結合を測定するアッセイにおいて、測定可能である（例えばＳａｔｏｈ−Ｈｏｒｉｋａｗａら，  ２０００，  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．  ２７５（１４）：１０２９１−１０２９９を参照されたい）。あるいは、ポリペプチドの活性は、ホルボールミリスチン酸（ＰＭＡ）、ＥＧＦ、またはＶＥＧＦ／ＦＧＦの存在下の内皮遊走アッセイによって、測定可能である。
【００４５】
ネクチンポリペプチドのウイルスタンパク質結合活性は、これらのポリペプチドの細胞外ドメインと関連する。したがって、ウイルスタンパク質結合活性を変調するため、好ましいネクチンポリペプチドには、細胞外ドメイン、そして特にＮ末端Ｖ型Ｉｇドメインを有し、そしてウイルスタンパク質に結合する能力を示すものが含まれる。好ましいネクチンポリペプチドには、１以上のネクチンポリペプチドの少なくとも１つの細胞外ドメインを含んでなるオリゴマーまたは融合ポリペプチド、およびウイルスタンパク質結合活性を有する、これらのポリペプチドいずれかの断片がさらに含まれる。ネクチンポリペプチドのウイルスタンパク質結合活性は、例えば、ＬａｃＺタンパク質を発現する組換えウイルスに曝露された細胞のβ−ガラクトシダーゼ染色を通じて、またはウイルス粒子に曝露された細胞の免疫組織化学染色によって、ネクチン発現細胞のウイルス感染を測定するアッセイにおいて、測定可能である（例えばＭｅｎｏｔｔｉら，  ２０００，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９７（９）：４８６７−４８７２を参照されたい）。
【００４６】
アファディンなどの特定のポリペプチドのＰＤＺドメインへのネクチンポリペプチドの結合は、これらのポリペプチドの細胞内ドメイン、そして特にポリペプチドのＣ末端部分と関連する。したがって、ＰＤＺドメイン結合活性を必要とする使用のため、好ましいネクチンポリペプチドには、細胞内ドメインを有し、そして１以上のＰＤＺドメインを含んでなるポリペプチドに結合する能力を示すものが含まれる。好ましいネクチンポリペプチドには、１以上のネクチンポリペプチドの少なくとも１つの細胞内ドメインを含んでなるオリゴマーまたは融合ポリペプチド、およびＰＤＺドメイン結合活性を有する、これらのポリペプチドいずれかの断片がさらに含まれる。ネクチンポリペプチドのＰＤＺドメイン結合活性は、例えば、酵母２ハイブリッドアッセイにおいて、またはアフィニティークロマトグラフィーによって、（Ｔａｋａｈａｓｈｉら，  １９９９，  Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  １４５（３）：５３９−５４９を参照されたい）、または本明細書に記載するような競合的結合アッセイにおいて、測定可能である。
【００４７】
ネクチンポリペプチドの生物学的活性の１つの側面は、このポリペプチドファミリーメンバーが、その細胞外ドメインを介して、ネクチンポリペプチド、アファディンポリペプチド、α−カテニン、およびウイルスタンパク質などの特定の結合パートナーに結合し、そしてその細胞内ドメインを介して、ＰＤＺドメインを含んでなるポリペプチドに結合する能力である。ネクチンポリペプチドはまた、その細胞内ドメインを介し、アファディンおよびα−カテニンを介して、カドヘリンとも相互作用する。例えば、ネクチン−３は、ネクチン−１および／またはネクチン−２と相互作用し、そしてネクチン−４は、ネクチン−１と相互作用する。したがって、ネクチン−３および−４ポリペプチドの好ましい使用には、ネクチン−１とその同族体（ｃｏｇｎａｔｅ）、例えばネクチン−３または−４との相互作用を遮断することが含まれる。この態様において、ネクチン−３または−４の可溶性細胞外ドメインを用いて、ネクチン−１の生物学的活性を変調する。理論に束縛されることは望ましくないが、ネクチン−３および−４の可溶性ドメインは、天然ネクチン−３または−４とネクチン−１との相互作用を防止することによって、あるいは細胞内コミュニケーションに対するネクチン−１の活性を変調することによって、作用すると考えられる。ヒトネクチン−１配列が知られ、そしてＧｅｎＢａｎｋ寄託番号Ｘ７６４００、ＡＦ０６０２３１、ＮＭ＿００２８５５、ＡＹ０２９５３９、およびＡＦ１１０３１４を有し、これらは各々、本明細書に援用される。さらに、ヒトネクチン−２配列が知られ、そしてＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＡＦ０５８４４８、ＢＣ００３０９１、およびＸ８００３８を有し、これらは各々、本明細書に援用される。ネズミネクチン−１配列およびネクチン−２配列は、上に同定された寄託番号を用いて同定可能であり、そしてこれらには、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号Ｄ２６１０７およびＭ８０２０６が含まれ、これらは各々、本明細書に援用される。
【００４８】
少なくともいくつかのネクチンポリペプチドはまた、ＣＤ４４ファミリーメンバーまたは他の細胞−マトリックス接着分子とも関連する可能性がある。用語「結合パートナー」には、本明細書において、リガンド、受容体、基質、抗体、他のネクチンポリペプチド、同一のネクチンポリペプチド（ホモタイプ相互作用の場合）、並びに結合パートナーおよびネクチンポリペプチドの特定の部分間の接触または近接を通じて、ネクチンポリペプチドと相互作用する他の分子が含まれる。ネクチンポリペプチドの結合パートナーは、上皮および内皮細胞と共に、神経および心臓細胞を含む他の細胞種によっても発現され、そして細胞を互いに結びつけるＡＪの機能におけるその役割によって、これらの細胞種と関連する。ネクチンポリペプチドの細胞外ドメインは、ネクチンおよびウイルスタンパク質などの結合パートナーに結合するため、細胞外ドメインは、ネクチンポリペプチドの残りとは別個の断片として、または例えば免疫グロブリンＦｃドメインに融合させた可溶性ポリペプチドとして発現された場合、その結合パートナーへのネクチンポリペプチドの結合を乱すと予期される。したがって、こうした可溶性ネクチンは、天然ネクチン分子の機能を変調可能である。１以上の結合パートナーに結合することによって、別個の細胞外ドメインポリペプチドは、天然ネクチンポリペプチド（類）による結合を防止し、そしてしたがって、優性ネガディブ方式で作用して、その結合パートナーへのネクチンポリペプチドの結合を介して仲介される、生物学的活性−例えば細胞接着およびウイルス受容体機能−を阻害する。あるいは、こうした可溶性ネクチン−３または−４ドメインは、同族体に結合し、そして活性を刺激することが可能である。例えば、本明細書にさらに十分に論じるように、可溶性ネクチン−３分子は、ネクチン−１と相互作用し、そしてネクチン−１活性を促進可能である。
【００４９】
本発明の可溶性ネクチン−３および／またはネクチン−４ポリペプチドは、限定なしに、ネクチン−１活性（例えばネクチン−１と同族体（類）の相互作用）、細胞接着活性；ＡＪ活性；内皮性または上皮性関門活性、増殖活性、遊走活性、免疫細胞活性、およびウイルス受容体活性を変調するのに使用可能である。これらの活性は、本明細書に開示するような、標準的アッセイ法によって決定可能であり、そして当業者は、ネクチン生物学的活性を測定するのに、さらなる種類の同様のアッセイを使用可能であると容易に理解するであろう。
【００５０】
ネクチン−３または−４活性を有する断片を含む、ネクチン−３（α、β、またはγ）およびネクチン−４ポリペプチドの使用には、限定されるわけではないが、以下：ポリペプチドを精製し、そしてその活性を測定すること；搬送剤；療法および研究試薬；分子量および等電点電気泳動マーカー；ペプチド断片化の対照；未知のポリペプチドの同定；および抗体の調製が含まれる。
【００５１】
特に興味深いのは、細胞外ドメインまたはその断片（「ｓｏｌネクチン−３」）を含んでなる、可溶性ネクチン−３（α、β、またはγ）ポリペプチドまたはネクチン−４の細胞外ドメインまたはその断片（「ｓｏｌネクチン−４」）である。ｓｏｌネクチン−３またはｓｏｌネクチン−４ポリペプチドは、ネクチン−３またはネクチン−４ポリペプチドのＣ−Ｉｇドメイン、またはＶ−ＩｇドメインおよびＣ−Ｉｇドメインの組み合わせいずれかの、Ｖ−Ｉｇドメインを含んでなることが可能である。こうしたｓｏｌネクチン−３ポリペプチドおよびｓｏｌネクチン−４ポリペプチドは、好ましくは、ネクチン−３または−４の天然細胞外ドメインの生物学的活性（例えばその結合パートナーと相互作用する能力）を保持する。１つの態様において、ｓｏｌネクチン−３ポリペプチドは、ネクチン−１、ネクチン−２および関連分子と相互作用することが可能である。同様に、１つの態様において、ｓｏｌネクチン−４は、ネクチン−１と相互作用することが可能である。さらに、こうしたｓｏｌネクチン−３またはｓｏｌネクチン−４ポリペプチドは、優先的にネクチン−３またはネクチン−４結合パートナーと相互作用し、それによって、それぞれ、結合パートナーとの天然ネクチン−３または−４の結合を阻害するかまたは防止する。可溶性ネクチン−３またはｓｏｌネクチン−４ポリペプチドは、目的のポリペプチド（例えばＦｃまたはロイシンジッパーポリペプチド）と融合させ、１以上のｓｏｌネクチン−３またはｓｏｌネクチン−４ポリペプチドを含んでなるオリゴマーの形成を提供することが可能である。こうしたｓｏｌネクチン−３および／またはｓｏｌネクチン４ポリペプチド、その融合ポリペプチド、およびオリゴマーは、例えば、内皮細胞遊走および／または血管形成の阻害を含む役割を果たすことが可能である。本発明のネクチン−３ポリペプチドに対する抗体もまた、アンタゴニストとして使用して、そして内皮細胞遊走および／または血管形成を阻害することが可能である。以下により十分に論じるように、ネクチン−３またはネクチン−４結合パートナー（例えばネクチン−１）に結合し、そして該結合パートナーの活性を変調する、アゴニスト抗体を設計することが可能である。
【００５２】
ＡＪ機能などの細胞−細胞相互作用の仲介において役割を果たすため、ネクチンポリペプチドは、正常の細胞接着活性に関連する状態と共に、細胞接着の機能不全または制御不全を生じる病理学的または疾患状態と関連する。一例として、その細胞外ドメインを介したネクチンポリペプチドの相互作用は、正常創傷治癒、および再狭窄などの異常な状態、どちらにおいても、上皮および内皮細胞の移動または遊走に関与する。別の例として、ヒトネクチン−３αは、例えばＴ細胞および抗原提示樹状細胞を含む、末梢血液細胞上で発現する（以下の実施例２を参照されたい）。ネクチン−３αは、免疫細胞接着およびシグナル伝達分子のＢ７ファミリーに類似の構造を有し、ネクチンは３つのＩｇドメインを有し、そしてＢ７ファミリーメンバーは２つのＩｇドメインを有する。ヒトネクチン−３  ｍＲＮＡ分子のレベルは、刺激した樹状細胞およびＴ細胞で増加する。したがって、ネクチンは、樹状細胞およびＴ細胞間の相互作用に関与するようである。したがって、ネクチンポリペプチドは、その病因において、共通の特徴として、細胞−細胞相互作用または細胞接着活性（またはその制御不全）を共有する疾患または状態に関与する。より具体的には、表４に示した状態は、ネクチンポリペプチドの生物学的活性を伴うことが知られるか、または伴う可能性があるもののいくつかである。非常に多様な細胞がネクチンを発現するため、これらのポリペプチドは、広い範囲の生物学的機能または活性に、そしてこうした生物学的活性に関連する状態に関与する。例えば神経細胞、間質細胞、樹状細胞、白血球、および心臓細胞を含めて、ネクチンポリペプチドが発現される細胞種が多いことを考慮して、当業者は、表４に示したものに加えて、ネクチンポリペプチドに関連する、無数の他の生物学的機能および状態があることを認識するであろう。
【００５３】
表４
ネクチンポリペプチドの選択された生物学的機能および関連する状態
【００５４】
【表５】
2004528008.tif 000009
【００５５】
ネクチンポリペプチドファミリーメンバーおよびその基質、リガンド、受容体、結合パートナー、および／または他の相互作用ポリペプチド間の相互作用を遮断するかまたは阻害することが、本発明の側面であり、そしてネクチンポリペプチド活性の阻害剤使用を通じて、これらの疾患および状態を治療するかまたは軽減する方法を提供する。こうした阻害剤の例には、ネクチン−３またはネクチン−４同族体に結合するｓｏｌネクチン−３またはｓｏｌネクチン−４、およびネクチン−３（α、β、またはγ）またはネクチン−４に特異的に結合するアンタゴニスト抗体が含まれる。あまりにも少ないネクチン−３（α、β、またはγ）ポリペプチド活性を伴う特定の状態に関しては、これらの状態を治療するかまたは軽減する方法は、単離ネクチン−３（α、β、またはγ）ポリペプチドまたはその活性断片もしくは融合ポリペプチドを提供することによって、あるいは内因性または外因性ネクチン−３ポリペプチドを活性化する剤（アゴニスト）を提供することによって、ネクチン−３（α、β、またはγ）ポリペプチドの量または活性を増加させることを含んでなる。ネクチン−１の活性化剤の例には、ｓｏｌネクチン−３およびｓｏｌネクチン−４ポリペプチド、融合構築物およびオリゴマーが含まれる。
【００５６】
本発明の別の側面において、ネクチン−３またはネクチン−４の発現を上方制御する剤を用い、内皮および上皮細胞が、傷害部位に遊走するのを促進することによって、創傷閉鎖または組織修復を誘導可能である。剤は、生分解性スポンジ、マトリックス、および足場上を含む、いかなる数の方法で、傷害部位に提供することも可能である。したがって、本発明は、組織操作、創傷修復、および再生の方法を提供する。
【００５７】
本発明のネクチン−３またはネクチン−４ポリペプチドには、ネクチン−３α（配列番号６）、β（配列番号１２）、またはγ（配列番号３１）、あるいはネクチン−４（例えば配列番号２４、３４、３７、３８、および３９）に、十分な度合いのアミノ酸同一性または類似性を共有して、当業者に特定の構造ドメインを共有する可能性があるポリペプチドと同定されるか、ネクチン−３またはネクチン−４ポリペプチドと共通の生物学的活性を有するか、そして／またはそれぞれ、ネクチン−３またはネクチン−４ポリペプチドにもまた特異的に結合する抗体に結合する、ポリペプチドが含まれる。本発明のネクチン−３およびネクチン−４ポリペプチドは、天然存在供給源から単離可能である。あるいは、ネクチンポリペプチドは、組換え的に産生可能であり、そして天然存在ネクチンポリペプチドと同一の構造を有するか、または天然存在ネクチン−３または−４ポリペプチドと異なる構造を有するように産生可能である。いかなる種類の改変（例えば限定されるわけではないが、アミノ酸の挿入、欠失、または置換、ポリペプチドのグリコシル化の変化、三次元構造または自己会合状態を変化させるリフォールディングまたは異性化、並びに他のポリペプチドまたは分子との会合の変化）によって、本発明のいかなるネクチンポリペプチドから派生するポリペプチドもまた、本発明の目的のためのネクチンポリペプチドである。したがって、本発明に提供するポリペプチドには、本明細書に記載するネクチン−３ポリペプチドのものに類似の、またはネクチン−４ポリペプチドに類似のアミノ酸配列によって特徴付けられるが、そこに修飾が天然に提供されているかまたは故意に操作されているポリペプチドが含まれる。ネクチン−３ポリペプチドファミリーのメンバーと共通の生物学的活性を共有するポリペプチドは、ネクチン−３ポリペプチド活性を有するポリペプチドである。同様に、ネクチン−４ポリペプチドファミリーのメンバーと共通の生物学的活性を共有するポリペプチドは、ネクチン−４ポリペプチド活性を有するポリペプチドである。
【００５８】
本発明は、ネクチン−３（α、β、またはγ）およびネクチン−４ポリペプチドの全長および成熟型両方を提供する。「全長」ポリペプチドは、最初に翻訳されるようなポリペプチドの完全一次アミノ酸配列を有するものである。全長ポリペプチドのアミノ酸配列は、例えば、ｃＤＮＡ分子の完全オープンリーディングフレーム（「ＯＲＦ」）の翻訳によって、得ることが可能である。その遺伝子座から、選択的スプライシングによって、または多数の翻訳開始部位の使用によって、多数のｍＲＮＡ型が産生される場合、単一の遺伝子座に、いくつかの全長ポリペプチドがコードされることが可能である。本発明の全長ポリペプチドの例には、配列番号６、１２、２４、３１および３４に示すような配列が含まれる。ポリペプチドの「成熟型」は、シグナル配列の切断またはプロドメインを除去するタンパク質分解的切断などの、翻訳後プロセシング工程を経たポリペプチドを指す。特定の全長ポリペプチドの多数の成熟型は、例えば、シグナル配列の多数の部位での切断によって、またはポリペプチドを切断するプロテアーゼの差別的制御によって、産生可能である。こうしたポリペプチドの成熟型（類）は、全長ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、適切な哺乳動物細胞または他の宿主細胞において発現することによって、得ることが可能である。ポリペプチドの成熟型の配列はまた、シグナル配列またはプロテアーゼ切断部位の同定を通じて、全長型のアミノ酸配列からも決定可能である可能性がある。本発明のポリペプチドの成熟型の例は、配列番号６のアミノ酸残基ｘ１からアミノ酸残基５４９、配列番号１２のアミノ酸残基ｘ１からアミノ酸残基５１０、および配列番号３１のアミノ酸残基ｘ１からアミノ酸残基４３７であり、ここでｘ１は、残基５１から５８の間であり、そして両端を含むアミノ酸である。本発明のネクチンポリペプチドはまた、一部切除されている（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）が、生物学的に活性であるポリペプチド、例えばポリペプチドの天然存在可溶性型を生じることが可能な、選択的ｍＲＮＡプロセシングなどの転写後または翻訳後プロセシング事象から生じるものも含む。本発明内にやはり含まれるのは、ポリペプチドからの１以上の末端アミノ酸（一般的には約１から５の末端アミノ酸）のタンパク質分解的除去による、異なる種類の宿主細胞における発現に際する、ＮまたはＣ末端の相違などのタンパク質分解に起因しうる変異である。
【００５９】
本発明は、結合する天然パターングリコシル化を含むまたは含まないネクチン−３（α、β、およびγ）およびネクチン−４ポリペプチドをさらに含む。酵母または哺乳動物発現系（例えばＣＯＳ−１またはＣＨＯ細胞）で発現したポリペプチドは、発現系の選択に応じて、分子量およびグリコシル化パターンにおいて、天然ポリペプチドと同様である可能性も、または有意に異なる可能性もある。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）などの細菌発現系での本発明のポリペプチドの発現は、典型的には、非グリコシル化分子を提供する。さらに、既定の調製は、多数の異なってグリコシル化されたポリペプチド種を含む可能性がある。グリコシル基は、慣用法、特にグリコペプチダーゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を利用するものを通じて、除去可能である。
【００６０】
ネクチン−３（α、β、およびγ）およびネクチン−４ポリペプチドおよびポリヌクレオチドの種相同体もまた、本発明により提供される。本明細書において、「種相同体（ｓｐｅｃｉｅｓ  ｈｏｍｏｌｏｇｕｅ）」は、既定のポリペプチドまたはポリヌクレオチドのものと起源の異なる種であるが、既定のポリペプチドまたはポリヌクレオチドに有意な配列類似性を持つポリペプチドまたはポリヌクレオチドである。種相同体は、本明細書に提供するネクチン−３（α、β、またはγ）およびネクチン−４ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドから、適切なプローブまたはプライマーを作成し、そして望ましい種由来の適切な核酸供給源をスクリーニングすることによって、単離し、そして同定することが可能である。あるいは、相同体は、本発明のネクチン分子の配列（例えば核酸またはアミノ酸）を利用して、１以上の種由来の配列を含有するゲノムデータベースをスクリーニングすることによって、同定することが可能である。こうしたゲノムデータベースは、いくつかの種に関して容易に入手可能である（例えば、ワールドワイドウェブ（ｗｗｗ）上、ｔｉｇｒ．ｏｒｇ／ｔｄｂ；ｇｅｎｅｔｉｃｓ．ｗｉｓｃ．ｅｄｕ；ｓｔａｎｆｏｒｄ．ｅｄｕ／〜ｂａｌｌ；ｈｉｖ−ｗｅｂ．ｌａｎ１．ｇｏｖ；ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｇ．ｇｏｖ；およびｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ；ｐａｓｔｅｕｒ．ｆｒ／ｏｔｈｅｒ／ｂｉｏｌｏｇｙ）。１以上の中間配列を通じて２つのタンパク質を結びつけるコンピューターアルゴリズムを用いて、緊密に関連する相同体と共に、遠い相同体を同定することが可能である。例えば、飽和ＢＬＡＳＴなどの、新たな検索種子として、先のクエリーの結果を反復して使用するアルゴリズムが、使用可能である。タンパク質配列から出発し、飽和ＢＬＡＳＴは、ＢＬＡＳＴ検索を行い、そして次世代の検索のため、代表配列を同定する。該方法は、収束するまで、またはあるあらかじめ定義した判定基準が満たされるまで行う。飽和ＢＬＡＳＴは、ワールドワイドウェブ（ｗｗｗ）上：ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．ｂｕｒｎｈａｍ−ｉｎｓｔ．ｏｒｇ／ｘｂｌａｓｔで入手可能である（Ｌｉら，  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  １６（１２）：１１０５−１１１０，  ２０００も参照されたい）。
【００６１】
本発明はまた、ネクチン−３（α、β、またはγ）およびネクチン−４ポリペプチドおよびポリヌクレオチドのアリル変異体（ａｌｌｅｌｉｃ  ｖａｒｉａｎｔ）；すなわち、アミノ酸またはヌクレオチド配列の相違が、遺伝子多型に起因しうる、こうしたポリペプチドおよびポリヌクレオチドの天然存在型も含む。
【００６２】
本発明のネクチンポリペプチドの断片が本発明に含まれ、そして該断片は直線型であっても、または例えば、Ｈ．Ｕ．  Ｓａｒａｇｏｖｉら，  Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：７７３−７７８（１９９２）およびＲ．Ｓ．  ＭｃＤｏｗｅｌｌら，  Ｊ．  Ａｍｅｒ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  １１４：９２４５−９２５３（１９９２）に記載されるように、既知の方法を用いて環状化してもよい。ネクチン−３（α、β、またはγ）またはネクチン−４ポリペプチドおよびその断片、並びにそれらをコードするポリヌクレオチドは、ネクチン−３（α、β、またはγ）またはネクチン−４ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの長さの少なくとも２５％（より好ましくは少なくとも５０％、６０％、７０％、そして最も好ましくは少なくとも８０％）のアミノ酸またはヌクレオチド配列長を含み、そして配列同一性が、配列ギャップを最小にしつつ、重複および同一性が最大になるように並列させた際のアミノ酸またはヌクレオチド配列の比較によって決定される場合、ネクチン−３（α、β、またはγ）またはネクチン−４ポリペプチドまたはポリヌクレオチドと、少なくとも６０％（より好ましくは少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７．５％、または少なくとも９９％、そして最も好ましくは少なくとも９９．５％）の配列同一性を有する。本発明にやはり含まれるのは、好ましくは少なくとも８または少なくとも１０、または好ましくは少なくとも１５、またはより好ましくは少なくとも２０、またはさらにより好ましくは少なくとも３０、または最も好ましくは少なくとも４０の隣接するアミノ酸を含んでなるセグメントを含有するかまたはコードする、ポリペプチドおよび断片、並びにそれらをコードするポリヌクレオチドである。こうしたポリペプチドおよび断片はまた、配列同一性が、配列ギャップを最小にしつつ、重複および同一性が最大になるように並列させた際のポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列の比較によって決定される場合、ネクチンポリペプチドまたはポリヌクレオチドのいずれかのこうしたセグメントいずれかと、少なくとも７０％（より好ましくは少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７．５％、または少なくとも９９％、そして最も好ましくは少なくとも９９．５％）の配列同一性を共有するセグメントも含有することも可能である。
【００６３】
パーセント同一性は、視覚的検査および数学的計算によって、決定可能である。２つのアミノ酸配列または２つのポリヌクレオチド配列のパーセント同一性は、Ｄｅｖｅｒｅｕｘら（Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １２：３８７，  １９８４）により記載され、そしてウィスコンシン大学遺伝学コンピューターグループより入手可能なＧＡＰコンピュータープログラム、バージョン６．０を用いて、配列情報を比較することによって、決定可能である。ＧＡＰプログラムの好ましいデフォルトパラメーターには：（１）ヌクレオチドに関する単一（ｕｎａｒｙ）比較マトリックス（同一に対し１および非同一に対し０の値を含む）、およびＳｃｈｗａｒｔｚおよびＤａｙｈｏｆｆ監修，Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，  ｐｐ．３５３−３５８，  １９７９に記載されるような、ＧｒｉｂｓｋｏｖおよびＢｕｒｇｅｓｓ，  Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １４：６７４５，  １９８６の加重比較マトリックス；（２）各ギャップに対する３．０のペナルティおよび各ギャップ中の各記号に対しさらに０．１０のペナルティ；および（３）末端ギャップに対するペナルティなし、が含まれる。配列比較の当業者に使用される他のプログラム、例えばＮａｔｉｏｎａｌ  Ｌｂｒａｒｙ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅウェブサイト：ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｏｒｆ／ｗｂｌａｓｔ２．ｃｇｉを介しての使用に利用可能なＢＬＡＳＴＮプログラム、バージョン２．０．９、またはＵＷ−ＢＬＡＳＴ  ２．０アルゴリズムなどもまた、使用可能である。ＵＷ−ＢＬＡＳＴ  ２．０の標準的デフォルトパラメーター設定は、以下のインターネットウェブページ：ｂｌａｓｔ．ｗｕｓｔｌ．ｅｄｕ／ｂｌａｓｔ／ＲＥＡＤＭＥ．ｈｔｍｌ＃Ｒｅｆｅｒｎｃｅｓに記載されている。さらに、該ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、好ましくは、ＢＬＯＳＵＭ６２アミノ酸スコア化マトリックスを用い、そして使用可能な所望によるパラメーターは、以下のとおりである：（Ａ）組成上の複雑さが低いクエリー配列のセグメント（Ｗｏｏｔｔｏｎ  ＆  Ｆｅｄｅｒｈｅｎ（Ｃｏｍｐｕｔｅｒｓ  ａｎｄ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９３）のＳＥＧプログラムによって決定されるようなもの；また、ＷｏｏｔｔｏｎおよびＦｅｄｅｒｈｅｎ，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．  ２６６：５５４−７１，  １９９６も参照されたい）、または短い周期の内部反復からなるセグメント（Ｃｌａｖｅｒｉｅ  ＆  Ｓｔａｔｅｓ，  Ｃｏｍｐｕｔｅｒｓ  ａｎｄ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  １９９３のＸＮＵプログラムによって決定されるようなもの）をマスクするフィルターの包含、および（Ｂ）データベース配列に対するマッチを報告する、統計的有意性の閾値、またはＥスコア（ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌ（１９９０）の確率モデルによれば、単なる偶然によって見出されるマッチの期待される確率；マッチに割り当てられた統計的有意性がこのＥスコア閾値より高ければ、該マッチは報告されないであろう）；好ましいＥスコア閾値は０．５であり、または優先性を増加させるため、０．２５、０．１、０．０５、０．０１、０．００１、０．０００１、１０−５、１０−１０、１０−１５、１０−２０、１０−２５、１０−３０、１０−４０、１０−５０、１０−７５、または１０−１００である。ヒトネクチンのパーセント同一性を表５に示し、そしてこれは、ＧＡＰアルゴリズムの使用で決定した。
【００６４】
表５
ヒトネクチンの同一性
【００６５】
【表６】
2004528008.tif 000010
【００６６】
本発明はまた、断片がネクチン−３またはネクチン−４ポリペプチド活性を保持する限り、これらのポリペプチドの特定の断片またはドメインを含んでなる、ネクチン−３（α、β、およびγ）およびネクチン−４ポリペプチドの可溶性型、そして特に、細胞外ドメインまたは細胞外ドメインの１以上の断片を含んでなるものも提供する。可溶性ポリペプチドは、発現される細胞から分泌されることが可能なポリペプチドである。こうした型では、ポリペプチドが発現される細胞から完全に分泌されるように、ポリペプチドの細胞内および膜貫通ドメインの一部またはすべてが欠失される。本発明のポリペプチドの細胞内および膜貫通ドメインは、配列情報からのこうしたドメインの決定のために知られる、既知の技術にしたがって、同定可能である。可溶性ネクチン−３（α、β、またはγ）ポリペプチド（ｓｏｌネクチン−３）および可溶性ネクチン−４ポリペプチド（ｓｏｌネクチン−４）にはまた、可溶性ネクチンポリペプチドが細胞から分泌可能であり、そして好ましくは、ネクチンポリペプチド活性を保持する限り、膜貫通領域の一部を含むポリペプチドも含まれる。可溶性ネクチンポリペプチドには、少なくとも１つのネクチン−３（α、β、またはγ）および／または１つのネクチン−４ポリペプチドの細胞外部分を含んでなるオリゴマーまたは融合ポリペプチド、並びにネクチンポリペプチド活性を有するこれらのポリペプチドいずれかの断片もさらに含まれる。分泌された可溶性ポリペプチドは、培地から、例えば遠心分離によって、望ましいポリペプチドを発現する細胞を分離し、そして望ましいポリペプチド（例えばｓｏｌネクチン−３および／またはｓｏｌネクチン−４）の存在に関して培地（上清）をアッセイすることによって、同定可能である（そしてその非可溶性膜結合対応物と区別可能である）。培地中の望ましいポリペプチドの存在は、ポリペプチドが細胞から分泌され、そしてしたがって、該ポリペプチドの可溶性型であることを示す。可溶性ネクチン−３（α、β、またはγ）および／または可溶性ネクチン−４ポリペプチドの使用は、多くの適用に好適である。可溶性ポリペプチドは細胞から分泌されるため、組換え宿主細胞からのポリペプチドの精製が容易になる。さらに、可溶性ポリペプチドは、一般的に、非経口投与に関して、そして多くの酵素的方法に関して、膜結合型より適している。ネクチン−３およびネクチン−４ポリペプチドの可溶性型の例を本明細書に提供する。配列番号１３および１４は、それぞれ、ＩｇＧ１分子のＦｃドメインをネクチンのＣ末端に融合させた、ネクチン−３αおよびネクチン−３βの細胞外ドメインのアミノ酸配列である。配列番号１５および１６は、それぞれ、ＦＬＡＧ（登録商標）ペプチド配列（配列番号１５のアミノ酸４０５から４２０および配列番号１６のアミノ酸３６６から３８１）および６つのヒスチジン残基のＣ末端ポリＨｉｓ伸長をネクチンのＣ末端に融合させた、ネクチン−３αおよびネクチン−３βの細胞外ドメインのアミノ酸配列である。好ましい可溶性ネクチンポリペプチドのさらなる例は、配列番号２４、３４、または３６のアミノ酸２７から３４９、あるいはそのＩｇドメイン含有断片を含んでなる。
【００６７】
可溶性ネクチン−３および／または可溶性ネクチン−４ポリペプチドは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏ法で、ネクチン−３または−４の生物学的活性を阻害するのに使用可能である。したがって、ネクチン−３（α、β、および／またはγ）および可溶性ネクチン−４ポリペプチドの可溶性／細胞外ドメイン、並びにその断片は、断片として、または融合ポリペプチドの構成要素として発現した際、天然ネクチン−３または−４ポリペプチド機能の「優性ネガティブ」阻害剤として作用する。例えば、本発明の精製ポリペプチドドメインを用いて、内因性結合パートナーへのネクチン−３および／またはネクチン−４ポリペプチドの結合を阻害することが可能である。こうした使用は、効果的にネクチンポリペプチド相互作用を遮断し、そしてネクチンポリペプチド活性を阻害するであろう。本発明のさらに別の側面において、ネクチン結合パートナー（例えばネクチン−１、−２、またはカドヘリンポリペプチド）の可溶性型を用いて、内因性ネクチン−３および／またはネクチン−４ポリペプチドに結合し、そしてその活性を競合的に阻害する。あるいは、精製および修飾ネクチン−３および／または−４ポリペプチドを投与して、ネクチン−３および／または−４ポリペプチドおよびその膜結合型でない結合パートナー間の相互作用を変調することが可能である。こうしたアプローチは、ネクチンが影響を及ぼす生理活性修飾の代替法を可能にするであろう。
【００６８】
別の側面において、本発明は、異なるネクチンポリペプチド由来のポリペプチドドメインの多様な組み合わせ、例えば１つのネクチン由来の細胞外ドメイン（またはＮ末端Ｖ型Ｉｇドメインなどの、その一部）および異なるネクチン由来の細胞内ドメインを含んでなるポリペプチドを提供する。したがって、本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドには、２コピー以上のＮ末端Ｉｇドメインなどのドメイン、２コピー以上のＣ型Ｉｇドメインのいずれかなどのドメイン、または少なくとも１コピーの各ドメインを含んでなるかまたはコードするものであって、少なくとも１つのドメインがネクチン−３（α、β、またはγ）および／またはネクチン−４ポリペプチド由来であり、そしてこれらのドメインが、こうしたポリペプチド内でいかなる順序で存在することも可能である、前記ポリペプチドまたはポリヌクレオチドが含まれる。１つの態様において、少なくとも１つのネクチン−４細胞外ドメインおよび少なくとも１つのネクチン−３細胞外ドメインを含んでなる融合構築物は、ペプチドリンカーを介して連結される。以下に示すように、ネクチン−４およびネクチン−３はどちらも、ネクチン−１との相互作用を示す。ネクチン−４およびネクチン−３両方の可溶性ドメインの組み合わせは、したがって、ネクチン−１に対する可溶性ドメインの変調活性を増加するであろう。
【００６９】
本発明の範囲内のさらなる変異体には、グリコシル基、脂質、リン酸、アセチル基等の他の化学部分と共有または凝集コンジュゲートを形成することによって、修飾され、誘導体を生成する可能性があるポリペプチドが含まれる。共有誘導体は、アミノ酸側鎖上あるいはポリペプチドのＮ末端またはＣ末端の官能基に、化学部分を連結することによって、調製可能である。付着している診断用（例えば検出可能）剤または療法剤を含んでなるコンジュゲートが本明細書に意図される。好ましくは、こうした改変、置換、交換、挿入または欠失は、ポリペプチドまたはその実質的な同等物の望ましい活性を保持する。
【００７０】
他の誘導体には、Ｎ末端またはＣ末端融合ポリペプチドとしての組換え培養中での合成によるなど、他のポリペプチドと該ポリペプチドの共有または凝集コンジュゲートが含まれる。融合ポリペプチドの例は、オリゴマーと関連して、本明細書に論じる。さらに、融合ポリペプチドは、精製および同定を容易にするため付加するペプチドを含んでなることが可能である。こうしたペプチドには、例えば、ポリ−Ｈｉｓまたは米国特許第５，０１１，９１２号およびＨｏｐｐら，  Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６：１２０４，  １９８８に記載される抗原性同定ペプチドが含まれる。こうしたペプチドの１つはＦＬＡＧ（登録商標）ペプチドであり、該ペプチドは抗原性が高く、そして特異的なモノクローナル抗体が可逆的に結合するエピトープを提供し、発現した組換えポリペプチドの迅速なアッセイおよび容易な精製を可能にする。４Ｅ１１と称されるネズミハイブリドーマは、米国特許第５，０１１，９１２号に記載されるように、特定の二価金属陽イオンの存在下でＦＬＡＧ（登録商標）ペプチドに結合するモノクローナル抗体を産生する。４Ｅ１１ハイブリドーマ細胞株は、寄託番号第ＨＢ９２５９号でアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションににより入手可能である。ＦＬＡＧ（登録商標）ペプチドに結合するモノクローナル抗体は、Ｅａｓｔｍａｎ  Ｋｏｄａｋ  Ｃｏ．，  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ、コネティカット州ニューヘブンより入手可能である。
【００７１】
本明細書において、「キメラポリペプチド」または「融合ポリペプチド」は、第二のポリペプチドに機能可能であるように連結した、本発明のネクチン−３および／またはネクチン−４（断片を含む）アミノ酸配列を含んでなる。第二のポリペプチドは、ネクチン−３（α、β、またはγ）またはネクチン−４ポリペプチドの機能と独立の、またはそれに関連する活性または機能を有する、いかなる目的のポリペプチドであってもよい。例えば、第二のポリペプチドは、ネクチン−３（α、β、またはγ）ポリペプチドに関連する活性を有することが可能であるし、そして例えば関連ネクチンポリペプチドの細胞外、細胞質、または膜貫通ドメインなどの、タンパク質のネクチンファミリーの関連するが別個のメンバーのドメインであることが可能である。１つの態様において、ネクチン−３ポリペプチドは、ネクチン−４ポリペプチドに機能可能であるように連結され、好ましくは該ネクチン−３およびネクチン−４ポリペプチドは、分子の細胞外／可溶性ドメインである。融合ポリペプチド内で、用語「機能可能であるように連結した」は、ネクチンポリペプチド配列および第二のポリペプチド配列が、互いにインフレームで融合したことを示すと意図する。第二のポリペプチドは、本発明のネクチン配列のＮ末端またはＣ末端に融合することが可能である。目的のポリペプチドのさらなる例には、ペプチドリンカー、Ｆｃポリペプチド、ロイシンジッパーポリペプチド等が含まれる。
【００７２】
本発明に含まれるのは、ネクチン−３（α、β、またはγ）ポリペプチド、ネクチン−３（α、β、またはγ）ポリペプチドの１以上の断片、あるいは、本明細書に開示するようなその誘導体または変異体型いずれかを含有するオリゴマーまたは融合ポリペプチドである。やはり含まれるのは、ネクチン−４ポリペプチド、ネクチン−４ポリペプチドの１以上の断片、あるいは本明細書に開示するようなその誘導体または変異体型いずれかを含有するオリゴマーまたは融合ポリペプチドである。特定の態様において、オリゴマーは、可溶性ネクチンポリペプチドを含んでなる。オリゴマーは、二量体、三量体、またはより高次のオリゴマーを含む、共有結合または非共有結合多量体型であってもよい。本発明の１つの側面において、オリゴマーはポリペプチド構成要素の結合能を維持し、そして多価（例えば二価、三価）結合部位を有する。別の態様において、本発明は、ポリペプチドに融合している、オリゴマー化を促進する特性を有するペプチド部分間の共有または非共有相互作用を介して連結した多数のネクチンポリペプチドを含んでなるオリゴマーを提供する。以下により詳細に記載するように、付着するポリペプチドのオリゴマー化を促進することが可能なペプチドの中に、ロイシンジッパーおよび抗体由来のポリペプチドがある。
【００７３】
ネクチン−３（α、β、またはγ）ポリペプチドの変異体が膜貫通ドメインを含むよう構築される態様において、これらはＩ型膜ポリペプチドを形成するであろう。膜貫通ネクチン−３ポリペプチドは、リガンドが知られる受容体ポリペプチドの細胞外ドメインに融合させることが可能である。その後、こうした融合ポリペプチドを操作して、膜貫通ネクチンポリペプチドによって誘発される細胞内シグナル伝達経路を調節することが可能である。細胞膜を貫通するネクチン−３ポリペプチドはまた、細胞表面受容体のアゴニストまたはアンタゴニスト、あるいは細胞接着分子と融合させて、ネクチン−３細胞内効果をさらに変調することが可能である。例えば、インターロイキンを、ネクチン−３ポリペプチドおよび他の融合ドメインの間に位置させることが可能である。
【００７４】
本発明のポリペプチドまたはその断片は、ポリペプチド結合部位の結合価を増加させることを含む目的のため、ペプチドリンカーまたは免疫グロブリンなどの分子に融合させることが可能である。例えば、ネクチン−３またはネクチン−４ポリペプチドの断片、好ましくは可溶性断片（例えばｓｏｌネクチン−３またはｓｏｌネクチン−４）は、直接、またはリンカー配列を介して、免疫グロブリンのＦｃ部分に融合させることが可能である。ポリペプチドの二価型のため、こうした融合体は、ＩｇＧ分子のＦｃ部分を含んでなる。他の免疫グロブリンアイソタイプもまた、こうした融合体を生成するのに使用可能である。例えば、ポリペプチド−ＩｇＭ融合は、本発明のポリペプチドの十価型を生成するであろう。本明細書において、用語「Ｆｃポリペプチド」には、Ｆｃ領域のＣＨドメインのいずれかまたはすべてを含んでなる抗体のＦｃ領域で構成される、ポリペプチドの天然および突然変異タンパク質（ｍｕｔｅｉｎ）型が含まれる。二量体化を促進するヒンジ領域を含有する、こうしたポリペプチドの一部切除型（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ  ｆｏｒｍ）もまた含まれる。好ましいＦｃポリペプチドは、ヒトＩｇＧ１抗体由来のＦｃポリペプチドを含んでなる。抗体由来ポリペプチドの多様な部分（Ｆｃドメインを含む）に融合した特定の異種ポリペプチドを含んでなる融合ポリペプチドの調製が記載されている（例えば、Ａｓｈｋｅｎａｚｉら，  ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ８８：１０５３５，  １９９１；Ｂｙｒｎら，  Ｎａｔｕｒｅ，  ３４４：６７７，  １９９０；並びにＨｏｌｌｅｎｂａｕｇｈおよびＡｒｕｆｆｏ，  “免疫グロブリン融合ポリペプチドの構築”，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ中，  Ｓｕｐｐｌ．４，  １０．１９．１−１０．１９．１１ページ，  １９９２を参照されたい）。本発明の１つの態様は、本発明のポリペプチドを抗体由来のＦｃポリペプチドに融合することによって生成される２つの融合ポリペプチドを含んでなる二量体に関する。ポリペプチド／Ｆｃ融合ポリペプチドをコードする遺伝子融合体を適切な発現ベクターに挿入する。組換え発現ベクターで形質転換した宿主細胞でポリペプチド／Ｆｃ融合ポリペプチドを発現し、そして抗体分子によく似た形で集合させ、その結果、Ｆｃ部分間に鎖間ジスルフィド結合が形成され、二価分子を生じるのを可能にする。ＰＣＴ出願ＷＯ  ９３／１０１５１に記載される１つの適切なＦｃポリペプチドは、ヒトＩｇＧ１抗体のＦｃ領域のＮ末端ヒンジ領域から天然Ｃ末端に渡る一本鎖ポリペプチドである。別の有用なＦｃポリペプチドは、米国特許第５，４５７，０３５号およびＢａｕｍら（ＥＭＢＯ  Ｊ．  １３：３９９２−４００１，  １９９４）に記載されるＦｃ突然変異タンパク質である。この突然変異タンパク質のアミノ酸配列は、アミノ酸１９がＬｅｕからＡｌａに変化し、アミノ酸２０がＬｅｕからＧｌｕに変化し、そしてアミノ酸２２がＧｌｙからＡｌａに変化していることを除けば、ＷＯ  ９３／１０１５１に示される天然Ｆｃ配列のものと同一である。該突然変異タンパク質は、Ｆｃ受容体に対し、減少した親和性を示す。Ｆｃ部分を含んでなる上述の融合ポリペプチド（およびそれから形成されるオリゴマー）は、ポリペプチドＡまたはポリペプチドＧカラム上のアフィニティークロマトグラフィーによる容易な精製という利点を提供する。他の態様において、本発明のポリペプチドを、抗体重鎖または軽鎖の可変部に関して置換してもよい。融合ポリペプチドが抗体の重鎖および軽鎖両方で作成されている場合、４つものネクチン−３細胞外領域を持つオリゴマーを形成することが可能である。ネクチン−３／Ｆｃ融合ポリペプチドの例を本明細書に提供する（例えば配列番号１３および１４を参照されたい）。配列番号１３および１４は、それぞれ、ＩｇＧ１分子のＦｃドメインをネクチンのＣ末端に融合させた、ネクチン−３αおよびネクチン−３βの細胞外ドメインのアミノ酸配列である。ネクチン−４−Ｆｃの例は、配列番号３６を含んでなるポリペプチド配列に提供される。配列番号３６のネクチン−４−Ｆｃは、配列番号３５にコードされ、そして配列番号３４のほぼアミノ酸１からアミノ酸３５０を含んでなるネクチン−４の細胞外ドメインを含んでなる。
【００７５】
あるいは、オリゴマーは、ペプチドリンカー（スペーサーペプチド）を含み、または含まず、多数のネクチンポリペプチドを含んでなる融合ポリペプチドである。適切なペプチドリンカーの中には、米国特許第４，７５１，１８０号および第４，９３５，２３３号に記載されるものがある。いくつかの態様において、リンカー部分は、融合ポリペプチド中で、ネクチンポリペプチドドメインおよび第二のポリペプチドドメインを隔てる。こうしたリンカーは、２つのポリペプチドの、それぞれＣおよびＮ末端アミノ酸に、機能可能であるように連結している。典型的には、リンカーはペプチドリンカー部分であろう。リンカー部分の長さは、可溶性ネクチン（例えばｓｏｌネクチン−３および／またはｓｏｌネクチン−４ポリペプチド配列）の生物学的活性を最適にするよう選択し、そして過度の実験を伴わず、経験的に決定することが可能である。リンカー部分は、ネクチン部分が、基質またはリガンドと自由に相互作用可能であるのに十分に長く、そして十分に柔軟でなければならない。好ましいリンカー部分は、長さ約１および３０アミノ酸残基の間の、好ましくは約２および１５アミノ酸残基の間のペプチドである。１つのリンカー部分は、−−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−−リンカーである。リンカー部分は、一本鎖抗体研究で知られるものなどの、柔軟なスペーサーアミノ酸配列を含むことが可能である。連結部分は、例えばＨｕｓｔｏｎ，  Ｊ．Ｓ．ら，  ＰＮＡＳ  ８５：５８７９−５８８３（１９８８）、Ｗｈｉｔｌｏｗ，  Ｍ．ら，  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ６：９８９−９９５（１９９３）、およびＮｅｗｔｏｎ，  Ｄ．Ｌ．ら，  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３５：５４５−５５３（１９９６）に記載される。他の適切なペプチドリンカーは、本明細書に援用される米国特許第４，７５１，１８０号および第４，９３５，２３３号に記載されるものである。望ましいペプチドリンカーをコードするＤＮＡ配列は、いかなる適切な慣用的技術を用い、異種配列（例えば本発明のネクチン配列）および第二のポリペプチド配列間に、そして該配列と同じ読み枠で挿入してもよい。例えば、リンカーをコードする、化学的に合成されたオリゴヌクレオチドを、ネクチンポリペプチドおよび目的の第二のポリペプチドをコードする配列間に連結してもよい。特定の態様において、融合ポリペプチドは、ペプチドリンカーによって分離された、２から４の可溶性ネクチンポリペプチド（例えば１以上の可溶性ネクチン−３ポリペプチドおよび／または１以上の可溶性ネクチン−４ポリペプチド）を含んでなる。
【００７６】
本発明のオリゴマーを調製するための別の方法は、ロイシンジッパーの使用を伴う。ロイシンジッパードメインは、該ドメインが見られるポリペプチドのオリゴマー化を促進するペプチドであり（Ｌａｎｄｓｃｈｕｌｚら，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４０：１７５９，  １９８８）、そして以来、多様な異なるポリペプチドで見出されてきている。既知のロイシンジッパーの中には、二量体化または三量体化する、天然存在ペプチドおよびその誘導体がある。ジッパードメインまたはオリゴマー形成ドメインは、しばしば、他のアミノ酸と共に散らばる４または５のロイシン残基を持つ、７アミノ酸反復を含んでなる。ロイシンジッパーの使用およびロイシンジッパーを用いたオリゴマーの調製は、当該技術分野に知られる。
【００７７】
本発明内にやはり含まれるのは、（１）ネクチン変異体が、なおそのパートナー（類）に結合するが、特定の小分子が改変された結合部位に収まり、そしてその相互作用を遮断するか、または（２）特定の小分子が存在しない限り、ネクチン−３または−４変異体がもはやそのパートナー（類）に結合しないように、高次構造が改変されている、パートナー結合部位を持つ、ネクチン−３または−４ポリペプチド変異体である（例えばＢｉｓｈｏｐら，  ２０００，  Ｎａｔｕｒｅ  ４０７：３９５を参照されたい）。こうした改変ネクチン−３または−４ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、本明細書に記載する方法にしたがって、生物に導入することが可能である。こうした方法は、生物に、全身または局所方式で、小分子化合物を投与することによって、ネクチン−３または−４と、その結合パートナーとの相互作用が、制御されるのを可能にする。
【００７８】
ネクチン−３または−４ポリペプチドは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏ法で、ネクチン−３または−４の生物学的活性を変調するのに使用可能である。本発明内に含まれるのは、断片として、または融合ポリペプチドの構成要素として発現した際、天然ネクチン−３および／またはネクチン−４ポリペプチド機能の「優性ネガティブ」阻害剤として作用する、ネクチン−３（α、β、および／またはγ）ポリペプチドの細胞外ドメインと共に、ネクチン−４ポリペプチドの細胞外ドメイン、およびその断片である。例えば、本発明の精製可溶性ポリペプチドドメインを用いて、内因性結合パートナーへのネクチン−３および／またはネクチン−４ポリペプチドの結合を阻害することが可能である。こうした使用は、効果的にネクチン−３またはネクチン−４ポリペプチド相互作用を遮断し、そしてネクチン−３および／またはネクチン−４ポリペプチド活性を阻害するであろう。本発明のさらに別の側面において、ネクチン結合パートナー（例えばネクチン−１、または−２ポリペプチド）の可溶性型を用いて、内因性ネクチン−３ポリペプチドに結合し、そしてその活性を変調する（例えばネクチン−３活性を阻害するかまたは活性化する）。さらに、ネクチン−３またはネクチン−４ポリペプチドに結合する抗体は、それぞれ、ネクチン−３またはネクチン−４ポリペプチド活性を阻害可能であり、そしてアンタゴニストとして作用する。例えば、本発明のネクチンポリペプチドの１以上のエピトープ、またはネクチンポリペプチドの保存変異体のエピトープ、または本発明のネクチンポリペプチドのペプチド断片を特異的に認識する抗体を、本発明において用いて、ネクチン−３および／またはネクチン−４ポリペプチド活性を阻害可能である。こうした抗体には、限定されるわけではないが、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）、ヒト化またはキメラ抗体、一本鎖抗体、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆａｂ発現ライブラリーに産生される断片、抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体、および上記いずれかのエピトープ結合断片が含まれる。あるいは、精製および修飾ネクチン−３ポリペプチドを投与して、ネクチン−３ポリペプチドおよび膜結合型でないネクチン−３結合パートナー間の相互作用を変調することが可能である。こうしたアプローチは、ネクチンが影響を及ぼす生理活性修飾の代替法を可能にするであろう。同様に、精製および修飾ネクチン−４ポリペプチドを投与して、ネクチン−４ポリペプチドおよび膜結合型でないネクチン−４結合パートナー間の相互作用を変調することが可能である。こうしたアプローチは、ネクチンが影響を及ぼす生理活性修飾の代替法を可能にするであろう。
【００７９】
本発明のポリペプチドは、組換えポリペプチドを発現するのに適した培養条件下で、形質転換および／または組換え宿主細胞を培養することによって、調製可能である。生じた発現ポリペプチドをその後、ゲルろ過およびイオン交換クロマトグラフィーなどの、既知の精製法を用いて、こうした培養（すなわち培地または細胞抽出物）から精製することが可能である。ポリペプチドの精製はまた、ポリペプチドに結合するであろう剤を含有するアフィニティーカラム；コンカナバリンＡ−アガロース、ヘパリン−トヨパール（登録商標）またはチバクロンブルー３ＧＡセファロース（登録商標）のようなアフィニティー樹脂上の１以上のカラム工程；フェニルエーテル、ブチルエーテル、またはプロピルエーテルのような樹脂を用いた疎水性相互作用クロマトグラフィーを伴う１以上の工程；あるいは免疫アフィニティークロマトグラフィーも含むことが可能である。あるいは、本発明のポリペプチドは、精製を容易にするであろう型で発現することも可能である。例えば、マルトース結合ポリペプチド（ＭＢＰ）、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）またはチオレドキシン（ＴＲＸ）を含んでなる融合ポリペプチドとして発現することが可能である。こうした融合ポリペプチドの発現および精製のためのキットは、それぞれ、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏ  Ｌａｂ（マサチューセッツ州ビバリー）、Ｐｈａｒｍａｃｉａ（ニュージャージー州ピスカタウェイ）、およびＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎから、商業的に入手可能である。ポリペプチドはまた、エピトープでタグ化して、そして続いて、こうしたエピトープに対して向けられる特異的抗体を用いることによって、精製することも可能である。１つのこうしたエピトープ（「Ｆｌａｇ（登録商標）」）は、Ｋｏｄａｋ（コネティカット州ニューヘブン）から商業的に入手可能である。最後に、疎水性逆相高性能液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）媒体、例えばペンダントメチルまたは他の脂肪族基を有するシリカゲルを使用する、１以上のＲＰ−ＨＰＬＣ工程を使用して、ポリペプチドをさらに精製することが可能である。多様な組み合わせの前述の精製工程のいくつかまたはすべてを使用して、実質的に精製された、均質な組換えポリペプチドを提供することが可能である。こうして精製したネクチン−３またはネクチン−４ポリペプチドは、他の哺乳動物ポリペプチドを実質的に含まず、そして本発明にしたがって、「実質的に精製したポリペプチド」と定義される；本発明のこうした精製ポリペプチドには、ネクチン−３またはネクチン−４ポリペプチド、断片、変異体、結合パートナー等に結合する抗体が含まれる。本発明のネクチン−３またはネクチン−４ポリペプチドはまた、該ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含有する体細胞または生殖細胞によって特徴付けられる、トランスジェニック動物の産物として、例えば、トランスジェニックウシ、ヤギ、ブタ、またはヒツジのミルクの構成要素として、発現することも可能である。
【００８０】
本発明のネクチン−３またはネクチン−４ポリペプチドに対して生成したモノクローナル抗体などの、ネクチン−３またはネクチン−４ポリペプチドに結合するポリペプチドを含んでなるアフィニティーカラムを利用して、発現したポリペプチドをアフィニティー精製することもまた、可能である。ポリペプチドは、慣用的な技術を用いて、例えば利用するアフィニティーマトリックスに応じて、高塩溶出緩衝液中で、そしてその後、より低塩の緩衝液中に透析することによって、またはｐＨもしくは他の構成要素を変化させることによって、アフィニティーカラムからはずす（ｒｅｍｏｖｅ）ことが可能であるし、あるいは本発明から得られるポリペプチドなどの、アフィニティー部分の天然存在基質を用いて、競合的にはずすことが可能である。本発明のこの側面において、本発明の抗ネクチン−３抗体または本発明のネクチン−３ポリペプチドと相互作用可能な他のポリペプチドなどの、ネクチン結合ポリペプチドは、その表面上に本発明のポリペプチドを発現する細胞を同定するか、分離するかまたは精製するのに適した、カラムクロマトグラフィーマトリックスなどの固相支持体または類似の支持体に結合させることが可能である。固相接触表面への本発明のポリペプチド結合ポリペプチドの付着は、いかなる手段によって達成してもよく；例えば、磁気マイクロスフィアを、これらのポリペプチド結合ポリペプチドでコーディングし、そして磁場を通じてインキュベーション容器中に保持してもよい。細胞混合物の懸濁物を、こうしたネクチン結合ポリペプチドを有する固相と接触させる。表面上に本発明のネクチン−３および／またはネクチン−４ポリペプチドを有する細胞は、固定ネクチン結合ポリペプチドに結合し、そして未結合細胞は洗い流される。このアフィニティー結合法は、溶液から、こうしたポリペプチド発現細胞を精製するか、スクリーニングするか、または分離するのに有用である。陽性に選択された細胞を固相から放出させる方法は、当該技術分野に知られ、そして例えば、酵素の使用を含む。こうした酵素は、好ましくは細胞に対し非毒性および非傷害性であり、そして好ましくは細胞表面結合パートナーを切断するよう指示される。あるいは、本発明のネクチン−３またはネクチン−４発現細胞を含有すると推測される細胞混合物を、ビオチン化した本発明のネクチン−３またはネクチン−４結合ポリペプチドとインキュベーションすることが可能である。インキュベーション時間は、本発明のポリペプチドへの十分な結合を確実にするため、典型的には少なくとも連続１時間である。その後、アビジンでコーティングしたビーズを充填したカラムに、生じた混合物を通過させ、それによりアビジンに対するビオチンの高い親和性が、ポリペプチドが結合した細胞のビーズへの結合を提供する。アビジンでコーティングしたビーズの使用は当該技術分野に知られる（Ｂｅｒｅｎｓｏｎら，  Ｊ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，  １０Ｄ：２３９（１９８６）を参照されたい）。
【００８１】
ポリペプチドはまた、既知の慣用的な化学合成によっても産生可能である。合成手段によって、ポリペプチドを構築する方法は、当該技術分野に知られる。合成によって構築されたポリペプチド配列は、ネクチン−３または−４ポリペプチドと一次、二次または三次構造および／または高次構造特性を共有するため、ネクチン−３または−４活性を含め、それと共通の生物学的特性を所持する可能性がある。したがって、合成ポリペプチドは、療法化合物のスクリーニングにおいて、そして抗体開発のための免疫学的方法において、天然の精製ポリペプチドの生物学的に活性であるまたは免疫学的な置換体として、使用可能である。
【００８２】
望ましい純度は、ポリペプチドの意図される使用に応じる。例えば、ポリペプチドをｉｎ  ｖｉｖｏで投与しようとするとき、比較的高い純度が望ましい。こうした場合、ポリペプチドは、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）による解析に際し、他のポリペプチドに相当するポリペプチドバンドが検出不能であるように精製される。当業者は、異なるグリコシル化、異なる翻訳後プロセシング等のため、該ポリペプチドに相当する多数のバンドがＳＤＳ−ＰＡＧＥにより視覚化される可能性があることを認識するであろう。好ましくは、本発明のポリペプチドは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる解析の際、単一のポリペプチドバンドにより示されるように、実質的に均一に精製される。ポリペプチドバンドは、銀染色、クーマシーブルー染色によって、またはオートラジオグラフィーによって、視覚化可能である。
【００８３】
別の側面において、本発明はさらに、増加したネクチン−３または−４ポリペプチド活性が有益である疾患の症状を治療するかまたは改善するための、ネクチン−３および／またはネクチン−４ポリペプチド活性のアゴニストの使用を含む。こうした疾患または状態には、限定されるわけではないが、炎症、炎症性腸疾患、血管漏洩、および浮腫が含まれる。好ましい側面において、本発明は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの細胞に、ｅｘ  ｖｉｖｏの細胞に、ｉｎ  ｖｉｖｏの細胞に、そして／または多細胞生物に、ネクチン−３および／または−４ポリヌクレオチドまたはポリペプチドを含んでなる組成物を投与することを含む。本発明のネクチンポリペプチドの療法型は、増加した安定性を与えるため、１以上のＤ−アミノ酸を含むことが可能である。好ましい療法型は可溶性型である。本発明のさらに別の側面において、組成物は、疾患治療のため、宿主生物において、ネクチンポリペプチドを発現させるため、ネクチン−３および／またはネクチン−４ポリヌクレオチドを投与することを含んでなる。この点で特に好ましいのは、ネクチンポリペプチドの異常な（例えば減少した）内因性活性と関連する機能障害の治療のための、ヒト被験者における発現である。さらに、本発明は、ネクチン−３および／またはネクチン−４ポリペプチドの内因性活性を増加させることが見出された化合物の細胞および／または生物への投与を含む。ネクチン−３または−４ポリペプチド活性を増加させる化合物の一例は、ネクチン−３または−４ポリペプチドあるいは結合パートナーに結合し、恒常的細胞内シグナル伝達を引き起こす（または「リガンド模倣する」）ことによって、あるいはネクチン−３または−４ポリペプチドへの阻害剤の結合を防止することによって、ポリペプチド活性を増加させる、アゴニスト抗体、好ましくはモノクローナル抗体である。
【００８４】
ネクチン−３（α、β、またはγ）またはネクチン−４ポリペプチドと免疫反応性である抗体を本明細書に提供する。こうした抗体は、抗体の抗原結合部位を介して（非特異的結合と対照的に）、ポリペプチドに特異的に結合する。本発明において、特異的に結合する抗ネクチン−３抗体は、ネクチン−３ポリペプチド、相同体、および変異体を特異的に認識して、そしてこれらの分子と結合するが、他の分子とは結合しないであろうものである。同様に、特異的に結合する抗ネクチン−４抗体は、ネクチン−４ポリペプチド、相同体、および変異体を特異的に認識して、そしてこれらの分子と結合するが、他の分子とは結合しないであろうものである。１つの好ましい態様において、抗体は、ネクチン−３またはネクチン−４ポリペプチドに特異的であり、そして関連ネクチンを含む、他のポリペプチドとは交差反応しない。この方式で、上述のようなネクチンポリペプチド、断片、変異体、融合ポリペプチド等を、それと免疫反応性である抗体を産生する際の「免疫原」として使用することが可能である。
【００８５】
免疫に用いるネクチン−３または−４の抗原決定基またはエピトープは、直鎖でもまたは高次構造的（断続的）でもどちらでもよい。直鎖エピトープは、該ポリペプチドのアミノ酸の単一の部分で構成されるが、高次構造的または断続的エピトープは、ポリペプチドフォールディングに際してごく近接する、ポリペプチド鎖の異なる領域由来のアミノ酸部分で構成される（Ｊａｎｅｗａｙら，  Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ  ３：９（Ｇａｒｌａｎｄ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｉｎｃ．，  第２版，  １９９６））。フォールディングされたポリペプチドは、複雑な表面を有するため、利用可能なエピトープの数は非常に多い；しかしながら、ポリペプチドの高次構造および立体障害のため、実際にエピトープに結合する抗体の数は、利用可能なエピトープの数より少ない（Ｊａｎｅｗａｙら、上記）。エピトープは、当該技術分野に知られるいかなる方法によって同定してもよい。したがって、本発明の１つの側面は、ネクチン−３またはネクチン−４ポリペプチドの抗原性エピトープに関する。こうしたエピトープは、以下にさらに詳細に記載するように、抗体、特にモノクローナル抗体を作成するのに有用である。さらに、本発明のポリペプチド由来のエピトープは、アッセイにおいて研究試薬として、そしてポリクローナル血清または培養ハイブリドーマの上清などの物質から、特異的に結合する抗体を精製するために、使用可能である。こうしたエピトープまたはその変異体は、固相合成、ポリペプチドの化学または酵素的切断、あるいは組換えＤＮＡ技術の使用など、当該技術分野に知られる技術を用いて、産生することが可能である。
【００８６】
ポリクローナルおよびモノクローナル抗体（ｍＡｂ）はどちらも、エピトープが単離されていてもまたはポリペプチドの一部のままであっても、本発明のポリペプチドのエピトープにより、慣用的技術によって引き出すことが可能である。例えば、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ：  Ａ  Ｎｅｗ  Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｎａｌｙｓｅｓ，  Ｋｅｎｎｅｔら（監修），  Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，  ニューヨーク（１９８０）；およびＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｈａｒｌｏｗら（監修），  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  ニューヨーク州コールドスプリングハーバー（１９８８）；ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ（米国特許第４，３７６，１１０号）；ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｓｂｏｒら，  １９８３，  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ  ４：７２；Ｃｏｌｅら，  １９８３，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８０：２０２６）；およびＥＢＶハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅら，  １９８５，  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，  Ａｌａｎ  Ｒ．  Ｌｉｓｓ．  Ｉｎｃ．，  ｐｐ．７７−９６）を参照されたい。ネクチン−３またはネクチン−４ポリペプチドに特異的なモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞株もまた、本明細書に意図される。こうしたハイブリドーマは、慣用的技術によって産生しそして同定することが可能である。本発明のｍＡｂを産生するハイブリドーマは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで培養可能である。ｉｎ  ｖｉｖｏでは高力価でｍＡｂが産生されるため、これが現在好ましい産生法である。こうしたハイブリドーマ細胞株を産生するための１つの方法は、動物を本発明のポリペプチドまたはその抗原性断片で免疫し；免疫された動物から脾臓細胞を採取し；前記脾臓細胞を骨髄腫細胞株に融合させ、それによりハイブリドーマ細胞を生成し；そして本発明のポリペプチドに結合するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞株を同定することを含んでなる。抗体産生のため、１以上の以下：ネクチン−３またはネクチン−４ポリペプチド、ネクチン−３またはネクチン−４ポリペプチドの断片、ネクチン−３またはネクチン−４ポリペプチドの機能的同等物、あるいはネクチン−３またはネクチン−４ポリペプチドの突然変異体型を注射することによって、多様な宿主動物を免疫することが可能である。こうした宿主動物には、限定されるわけではないが、ウサギ、マウス、およびラットが含まれる。宿主種に応じて、多様なアジュバントを用いて、免疫学的反応を増加させることが可能であり、こうしたアジュバントには、限定されるわけではないが、フロイント（完全および不完全）、水酸化アルミニウムなどのミネラルゲル、リゾレシチン、プルロニックポリオール、ポリアニオンなどの界面活性物質、ペプチド、油エマルジョン、キーホールリンペット（ｋｅｙｈｏｌｅ  ｌｉｍｐｅｔ）ヘモシアニン、ジニトロフェノール、並びにＢＣＧ（カルメット・ゲラン桿菌）および坐瘡プロピオンバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐａｒｖｕｍ）などの潜在的に有用なヒトアジュバントが含まれる。モノクローナル抗体は、慣用的技術によって回収可能である。こうしたモノクローナル抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、およびそのいかなるサブクラスも含む、いかなる免疫グロブリンクラスのものであってもよい。
【００８７】
さらに、適切な生物学的活性のヒト抗体分子由来の遺伝子と、適切な抗原特異性のマウス抗体分子由来の遺伝子を共にスプライシングすることによる、「キメラ抗体」の産生のために開発された技術（Ｔａｋｅｄａら，  １９８５，  Ｎａｔｕｒｅ，  ３１４：４５２）を用いることが可能である。キメラ抗体は、異なる部分が異なる動物種に由来する分子であり、ブタｍＡｂに由来する可変領域およびヒト免疫グロブリン定常領域を有するものなどである。本発明のモノクローナル抗体にはまた、ネズミモノクローナル抗体のヒト化型も含まれる。こうしたヒト化抗体は、既知の技術によって調製可能であり、そして抗体をヒトに投与した際、減少した免疫原性という利点を提供する。１つの態様において、ヒト化モノクローナル抗体は、ネズミ抗体の可変領域（またはその抗原結合部位のみ）およびヒト抗体由来の定常領域を含んでなる。あるいは、ヒト化抗体断片は、ネズミモノクローナル抗体の抗原結合部位およびヒト抗体由来の可変領域断片（抗原結合部位を欠く）を含んでもよい。キメラおよびさらなる操作モノクローナル抗体の産生法には、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら（Ｎａｔｕｒｅ，  ３３２：３２３，  １９８８）、Ｌｉｕら（ＰＮＡＳ，  ８４：３４３９，  １９８７）、Ｌａｒｒｉｃｋら（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  ７：９３４，  １９８９）、およびＷｉｎｔｅｒら（ＴＩＰＳ，  １４：１３９，  Ｃａｎ，  １９９３）に記載されるものが含まれる。トランスジェニック的に抗体を生成する方法は、ＧＢ  ２，２７２，４４０、米国特許第５，５６９，８２５号および第５，５４５，８０６号、並びに関連特許に見出すことが可能である。好ましくは、ヒトで使用するため、抗体はヒトであるかまたはヒト化されており；こうしたヒトまたはヒト抗体を生成する技術が知られ、そして例えばＭｅｄａｒｅｘ  Ｉｎｃ（ニュージャージー州プリンストン）およびＡｂｇｅｎｉｘ  Ｉｎｃ．（カリフォルニア州ファーモント）から入手可能である。
【００８８】
特異的エピトープを認識する抗原結合抗体断片は、既知の技術によって生成可能である。例えば、こうした断片には、限定されるわけではないが：抗体分子のペプシン消化によって産生可能なＦ（ａｂ’）２断片および（ａｂ’）２断片のジスルフィド架橋を還元することによって生成可能なＦａｂ断片が含まれる。あるいは、Ｆａｂ発現ライブラリーを構築し（Ｈｕｓｅら，  １９８９，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２４６：１２７５）、望ましい特異性を持つモノクローナルＦａｂ断片の迅速でそして容易な同定を可能にしてもよい。一本鎖抗体の産生に関して記載される技術（米国特許第４，９４６，７７８号；Ｂｉｒｄ，  １９８８，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３；Ｈｕｓｔｏｎら，  １９８８，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８５：５８７９；およびＷａｒｄら，  １９８９，  Ｎａｔｕｒｅ  ３３４：５４４）を適応させ、ネクチン遺伝子産物に対する一本鎖抗体を産生することもまた可能である。一本鎖抗体は、アミノ酸架橋を介してＦｖ領域の重鎖および軽鎖断片を連結することによって形成する。さらに、当業者に知られる技術を用いて、ネクチン−３またはネクチン−４ポリペプチドに対する抗体を利用して、ネクチン−３またはネクチン−４ポリペプチドを「模倣」し、そしてネクチンポリペプチドに結合することが可能な抗イディオタイプ抗体を生成することが可能である（例えばＧｒｅｅｎｓｐａｎら，  １９９３，  ＦＡＳＥＢ  Ｊ  ７（５）：４３７；およびＮｉｓｓｉｎｏｆｆ，  １９９１，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １４７（８）：２４２９を参照されたい）。
【００８９】
こうした抗体を同定可能なスクリーニング法が知られており、そして例えば免疫アフィニティークロマトグラフィーを伴う可能性がある。抗体は、アゴニスト（すなわちリガンド模倣）特性に関してスクリーニング可能である。こうした抗体は、細胞表面上のネクチンへの結合に際して、ネクチン結合パートナーが細胞表面上のネクチンに結合した際に誘導される生物学的影響と類似の生物学的影響（例えば生物学的シグナルの伝達）を誘導する。アゴニスト抗体を用いて、ネクチンが仲介する共刺激経路または細胞間コミュニケーションを誘導可能である。
【００９０】
結合パートナーへの本発明のネクチン−３またはネクチン−４ポリペプチドの結合を遮断可能な抗体を用いて、こうした結合から生じ、ネクチンが仲介する細胞間コミュニケーションまたは細胞接着を阻害可能である。こうした遮断抗体は、ネクチン−３またはネクチン−４の、ネクチン結合パートナーを発現する細胞またはウイルス粒子への結合を阻害する能力に関して、抗体を試験することによるなど、いかなる適切なアッセイ法を用いて同定することも可能である。あるいは、遮断抗体は、標的細胞またはリガンドへのネクチン−３またはネクチン−４の結合から生じる生物学的影響を阻害する能力に関するアッセイにおいて、同定可能である。例えば、抗体は、ネクチン結合パートナーが仲介する共刺激経路を阻害する能力に関して、アッセイ可能である。こうした抗体は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ法で使用可能であるし、またはｉｎ  ｖｉｖｏで投与して、抗体を生成した実体によって仲介される生物学的活性を阻害することが可能である。このように、細胞表面結合パートナーとネクチン−３の相互作用によって（直接または間接的に）引き起こされるかまたは悪化される障害を治療することが可能である。療法は、ネクチン−３結合パートナーが仲介する生物学的活性を阻害するのに有効な量の遮断抗体を、哺乳動物にｉｎ  ｖｉｖｏ投与することを伴う。一般的に、こうした療法の使用には、モノクローナル抗体が好ましい。１つの態様において、抗原結合抗体断片が使用される。ネクチンに対して向けられる抗体、および生理学的に許容しうる希釈剤、賦形剤、またはキャリアーを含んでなる組成物を、本明細書に提供する。こうした組成物の適切な構成要素を以下に記載する。
【００９１】
本明細書にやはり提供するのは、本発明の抗体に付着した検出可能（例えば診断用）または療法剤を含んでなるコンジュゲートである。こうした剤の例を本明細書に記載する。該コンジュゲートは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏ法に使用を見出す。本発明の抗体はまた、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏいずれかの、本発明のポリペプチドまたは断片の存在を検出するアッセイにおいても使用可能である。抗体はまた、免疫アフィニティークロマトグラフィーによって、本発明のポリペプチドまたは断片を精製する際にも使用可能である。
【００９２】
やはり提供するのは、本発明のネクチン−３またはネクチン−４、あるいはその組み合わせを用いて設計した合理的薬剤である。合理的薬剤設計を用いて、目的の生物学的活性ポリペプチドまたはそれらが相互作用する小分子、例えば阻害剤、アゴニスト、アンタゴニスト等の構造的類似体を産生する。合理的薬剤設計を用いて、ポリペプチドの、より活性であるかまたは安定な型である薬剤、あるいはｉｎ  ｖｉｖｏでポリペプチドの機能を増進するかまたは該機能に干渉する薬剤を形作ることが可能である（Ｈｏｄｇｓｏｎ，  １９９１，  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９：１９）。１つのアプローチにおいて、本発明のネクチン−３またはネクチン−４ポリペプチド、あるいはポリペプチド−阻害剤複合体の三次元構造は、Ｘ線結晶学によって、核磁気共鳴によって、またはコンピューター相同性モデリングによって、あるいは最も典型的には、これらのアプローチの組み合わせによって、決定する。構造を解明し、そして分子の活性／結合部位（類）を決定するため、ポリペプチドの形状および荷電両方を確定しなければならない。より頻繁でないが、相同ポリペプチドの構造に基づいてモデリングすることによって、ポリペプチドの構造に関する有用な情報が得られる可能性がある。どちらの場合も、適切な構造情報を用いて、類似のネクチン様分子を設計するか、有効な阻害剤を同定するか、またはネクチンに結合可能である小分子を同定する。ネクチン−３および−４は同様の構造および生物学的活性（例えばネクチン−１への結合）を持つため、ネクチン−３およびネクチン−４三次元構造情報を組み合わせて利用し、阻害剤または結合剤を設計可能である。合理的薬剤設計の有用な例には、Ｂｒａｘｔｏｎら（１９９２  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３１：７７９６）に示すように、改善された活性または安定性を有する分子、あるいはＡｔｈａｕｄａら（１９９３  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  １１３：７４２）に示すように、天然ペプチドの阻害剤、アゴニスト、またはアンタゴニストとして作用する分子が含まれる可能性がある。阻害剤設計および阻害剤−ネクチンポリペプチド相互作用を補助するための、分子モデリングソフトウェア系における、ネクチンポリペプチド構造情報の使用もまた、本発明に含まれる。本発明の特定の方法は、基質のありうる結合部位に関して、ネクチン−３またはネクチン−４ポリペプチドの三次元構造を解析し、予測される反応部位を取り込む新規分子を合成し、そして本明細書に記載するように、新規分子をアッセイすることを含んでなる。タンパク質の三次元構造に基づいて、基質または結合剤をモデリングするアルゴリズム、ソフトウェア、および方法の例は、その開示が本明細書に援用される、ＰＣＴ公報ＷＯ１０７５７９Ａ２、表題「酵素活性を測定するための方法および組成物」に記載される。
【００９３】
本明細書に記載するような、機能アッセイによって選択される、標的特異的抗体を単離し、そしてその後、結晶構造を解析することもまた可能である。このアプローチによって、続く薬剤設計の基礎とすることが可能なファーマコア（ｐｈａｒｍａｃｏｒｅ）を得ることが可能である。機能する薬理学的活性抗体に対する抗イディオタイプ抗体（抗ｉｄ）を生成することによって、ポリペプチド結晶学を完全に回避することが可能である。鏡像の鏡像として、抗ｉｄの結合部位は、元来の受容体の類似体であると予測されるであろう。次いで、抗ｉｄを用いて、化学的または生物学的に産生したペプチドのバンクからペプチドを同定し、そして単離することが可能である。その後、単離ペプチドは、ファーマコアとして働くであろう。
【００９４】
本発明の精製ネクチンポリペプチド（ポリペプチド、その断片、変異体、オリゴマー、および他の型を含む）は、多様なアッセイで有用である。例えば、本発明のネクチン分子を用いて、ネクチンポリペプチドの結合パートナーが同定可能であり、この結合パートナーをまた用いて、細胞間コミュニケーション、細胞接着、ウイルスタンパク質結合、または免疫細胞活性が変調可能である。あるいは、これらを用いて、細胞間コミュニケーション、細胞接着、ウイルスタンパク質結合、または免疫細胞活性を変調する、非結合パートナー分子または物質が同定可能である。
【００９５】
用語「ポリヌクレオチド」は、長さ少なくとも１０塩基のヌクレオチドのポリマー型を指す（より小さいヌクレオチド配列は、典型的には、オリゴヌクレオチドと称する）。ヌクレオチドは、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、またはいずれかの種類のヌクレオチドの修飾型であってもよい。該用語には、ＤＮＡまたはＲＮＡの一本鎖および二本鎖型が含まれる。ＤＮＡには、例えば、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、化学的に合成したＤＮＡ、ＰＣＲによって増幅したＤＮＡ、およびそれらの組み合わせが含まれる。本発明のポリヌクレオチドには、全長遺伝子およびｃＤＮＡ分子と共に、その断片の組み合わせが含まれる。本発明のポリヌクレオチドは、好ましくは、ヒト供給源に由来するが、本発明は、非ヒト種に由来するものもまた、含む。
【００９６】
「単離ポリヌクレオチド」は、由来する生物の天然存在ゲノムにおいてすぐ隣接している（５’端にあるものおよび３’端にあるもの）コード配列両方と、すぐ隣接していないポリヌクレオチドを意味する。該用語にはしたがって、例えば組換えポリヌクレオチド分子であって、ベクター、例えば発現ベクターに；自律複製プラスミドまたはウイルスに；あるいは原核または真核生物のゲノムＤＮＡに取り込まれた、前記組換えポリヌクレオチド分子、あるいは他の配列と独立の別個の分子（例えばｃＤＮＡ）として存在するものが含まれる。
【００９７】
本発明のネクチン−３ポリヌクレオチドは、（１）配列番号６、１２、または３１、あるいはその断片の配列を含んでなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；（２）配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５，２６，２７，２８，２９、または３０に示すような配列；（３）配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５，２６，２７，２８，２９、または３０に示すような配列に相補的な配列；（４）中程度から非常にストリンジェントな条件下で、（２）または（３）のポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズする、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５，２６，２７，２８，２９、または３０の断片、あるいはそれらの相補体；および（５）ＴがまたＵであることも可能な（例えばＲＮＡ配列）、（２）、（３）、または（４）の配列を含んでなる。本発明にやはり含まれるのは、本発明のネクチン−３ポリヌクレオチドの相同体である。ポリヌクレオチド相同体は、適切な供給源からのゲノムまたはｃＤＮＡ分子の単離、あるいは入手可能なＤＮＡ配列データベースのコンピューター検索を含む、いくつかの方法で、同定可能である。
【００９８】
本発明のネクチン−４ポリヌクレオチドは、（１）配列番号２４、３４、３７、３８、３９、あるいはその断片の配列を含んでなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；（２）配列番号３２または３３に示すような配列；（３）配列番号３２または３３に示すような配列に相補的な配列；（４）中程度から非常にストリンジェントな条件下で、（２）または（３）のポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズする、配列番号３２または３３の断片、あるいはそれらの相補体；および（５）ＴがまたＵであることも可能な（例えばＲＮＡ配列）、（２）、（３）、または（４）の配列を含んでなる。本発明にやはり含まれるのは、本発明のネクチン−４ポリヌクレオチドの相同体である。ポリヌクレオチド相同体は、適切な供給源からのゲノムまたはｃＤＮＡ分子の単離、あるいは入手可能なＤＮＡ配列データベースのコンピューター検索を含む、いくつかの方法で、同定可能である。
【００９９】
本明細書に記載するアミノ酸配列に対応するポリヌクレオチドは、核酸単離のためのプローブまたはプライマーとして、あるいはデータベース検索のためのクエリー配列として、使用可能である。こうしたプローブまたはプライマーは、アミノ酸配列から「逆翻訳（ｂａｃｋ−ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ）」することによって、またはコードＤＮＡ配列が同定されているポリペプチドとアミノ酸同一性を持つ領域を同定することによって、得ることが可能である。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法を使用して、ネクチン−３またはネクチン−４ポリペプチドあるいはネクチンポリペプチド断片の望ましい組み合わせをコードするポリヌクレオチドを単離し、そして増幅することが可能である。ＤＮＡ断片の組み合わせの望ましい末端を定義するオリゴヌクレオチドを、５’および３’プライマーとして使用する。オリゴヌクレオチドは、発現ベクターに、増幅されたＤＮＡ断片を挿入するのを容易にするため、制限エンドヌクレアーゼの認識部位を、さらに含有してもよい。ＰＣＲ技術は、Ｓａｉｋｉら，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：４８７（１９８８）；Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ  Ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ，  Ｗｕら監修，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｉｎｃ．，  サンディエゴ（１９８９），  ｐｐ．１８９−１９６；およびＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：  Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ，  Ｉｎｎｉｓら監修，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｉｎｃ．（１９９０）に記載される。好ましいＰＣＲプライマー配列を、配列番号２６−２９に示す。配列番号２６および２７は、それぞれ、開始および末端コドンを含む、全ネクチン−３αコード領域を増幅するための、順方向および逆方向プライマーであり；これらのプライマーは、その５’端に制限部位を有し、そして配列番号２６は、マウスネクチン−３αのＮ末端部分のコドンに対応するいくつかのヌクレオチドを含有するが、典型的なアニーリング温度で、ネクチン−３α配列を増幅可能である。配列番号２８および２９は、それぞれ、ネクチン−３αスプライス型に特異的な細胞外ドメインの一部をコードするネクチン−３αコード領域の一部を増幅するための、順方向および逆方向「α−特異的」プライマーである。プライマー対、配列番号２６および２９、並びに配列番号２７および２８もまた、ネクチン−３α配列を増幅するのに使用可能である。
【０１００】
本発明にはまた、中程度にストリンジェントな条件、そしてより好ましくは非常にストリンジェントな条件下で、本明細書に記載するネクチン−３またはネクチン−４ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズする、ポリヌクレオチドも含まれる。ハイブリダイゼーション条件の選択に影響を与える基本的なパラメーターおよび適切な条件を考案するための手引きは、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  ニューヨーク州コールドスプリングハーバー，  第９章および第１１章；およびＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  １９９５，  Ａｕｓｕｂｅｌら監修，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｉｎｃ，  セクション２．１０および６．３−６．４）によって示されており、そして例えばＤＮＡの長さおよび／または塩基組成に基づいて、一般の当業者によって容易に決定可能である。中程度にストリンジェントな条件を達成する１つの方法は、５ｘＳＳＣ、０．５％  ＳＤＳ、１．０ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）を含有する前洗浄溶液、約５０％ホルムアミド、６ｘＳＳＣのハイブリダイゼーション緩衝液、および約５５℃のハイブリダイゼーション温度（または約４２℃のハイブリダイゼーション温度を伴う、約５０％ホルムアミドを含有するものなどの他の同様のハイブリダイゼーション溶液）、並びに約６０℃、０．５ｘＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳ中の洗浄条件の使用を伴う。一般的に、高ストリンジェントな条件は、上記のようなハイブリダイゼーション条件と定義されるが、およそ６８℃、０．２ｘＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳでの洗浄を伴うと定義される。ハイブリダイゼーションおよび洗浄緩衝液において、ＳＳＰＥ（１ｘＳＳＰＥは、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、および１．２５ｍＭ  ＥＤＴＡ，ｐＨ７．４である）をＳＳＣ（１ｘＳＳＣは、０．１５Ｍ  ＮａＣｌおよび１５ｍＭクエン酸ナトリウムである）に対して置換することが可能である；洗浄は、ハイブリダイゼーションが完了した後、１５分間行う。当業者に知られるように、そして以下にさらに記載するように、ハイブリダイゼーション反応および二重鎖安定性を支配する基本原理を適用することによって、必要に応じて、望ましい度合いのストリンジェンシーを達成するよう、洗浄温度および洗浄塩濃度を調整可能である（例えばＳａｍｂｒｏｏｋら、１９８９を参照されたい）。核酸を未知の配列の標的核酸にハイブリダイズさせる際、ハイブリッド長は、ハイブリダイズする核酸のものと仮定される。既知の配列の核酸をハイブリダイズさせる際、ハイブリッド長は、核酸の配列を並列し、そして最適配列相補性を持つ、単数または複数の領域を同定することによって、決定可能である。長さ５０塩基対未満であると予測されるハイブリッドのハイブリダイゼーション温度は、ハイブリッドの融解温度（Ｔｍ）より５から１０℃低くなければならず、Ｔｍは、以下の等式にしたがって決定する。長さ１８塩基対未満のハイブリッドに関しては、Ｔｍ（℃）＝２（Ａ＋Ｔ塩基数）＋４（Ｇ＋Ｃ��基数）である。長さ１８塩基対を超えるハイブリッドに関しては、Ｔｍ（℃）＝８１．５＋１６．６（ｌｏｇ１０［Ｎａ＋］）＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）−（６００／Ｎ）であり、式中、Ｎはハイブリッド中の塩基数であり、そして［Ｎａ＋］はハイブリダイゼーション緩衝液中のナトリウムイオン濃度である（１ｘＳＳＣの［Ｎａ＋］＝０．１６５Ｍ）。好ましくは、こうしたハイブリダイズする核酸分子は各々、少なくとも１５ヌクレオチド（またはより好ましくは少なくとも１８から約２０ヌクレオチド、または少なくとも２５から約３０ヌクレオチド、または少なくとも４０ヌクレオチド、または最も好ましくは少なくとも５０ヌクレオチド）の長さを有するか、またはハイブリダイズする本発明のポリヌクレオチドの長さの少なくとも２５％（より好ましくは少なくとも５０％、または少なくとも６０％、または少なくとも７０％、そして最も好ましくは少なくとも８０％）の長さを有し、そして配列同一性が、上述のように配列ギャップを最小にしつつ、重複および同一性が最大になるように並列させた際のハイブリダイズする核酸配列の比較によって決定される場合、ハイブリダイズする本発明のポリヌクレオチドと、少なくとも６０％（より好ましくは少なくとも７０％から約７５％、少なくとも８０％から約８５％、少なくとも９０％から約９５％、少なくとも９７．５％、または少なくとも９９％、そして最も好ましくは少なくとも９９．５％）の配列同一性を有する。
【０１０１】
本発明はまた、本明細書に開示するポリヌクレオチドに対応する遺伝子も提供する。「対応する遺伝子」は、転写されて、ｃＤＮＡ分子が由来するｍＲＮＡを産生する、ゲノム領域であり、そしてこうした遺伝子の制御された発現に必要なゲノムの隣接領域を含むことが可能である。したがって、対応する遺伝子には、限定されるわけではないが、コード配列、５’および３’非翻訳領域、選択的スプライシングされるエクソン、イントロン、プロモーター、エンハンサー、およびサイレンサーまたはサプレッサー要素が含まれる可能性がある。対応する遺伝子は、本明細書に開示する配列情報を用いて、既知の方法にしたがい、単離することが可能である。こうした方法には、適切なゲノムライブラリーまたはゲノム材料の他の供給源における、遺伝子の同定および／または増幅のため、開示される配列情報からのプローブまたはプライマーの調製が含まれる。「単離遺伝子」は、遺伝子を単離する生物のゲノムに、隣接するコード配列が存在するとすれば、こうしたコード配列から分離されている遺伝子である。
【０１０２】
ネクチン−３およびネクチン−４ポリペプチドを作成する方法を以下に示し、ネクチン−３ポリペプチド発現および精製のための好ましい方法を実施例３に示す。本発明のポリペプチドおよび断片の発現、単離および精製は、いかなる適切な技術によって達成してもよく、限定されるわけではないが以下の方法を含む。
【０１０３】
本発明の単離ポリヌクレオチドは、ポリペプチドを組換え的に産生するため、Ｋａｕｆｍａｎら，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １９，  ４４８５−４４９０（１９９１）；およびＰｏｕｗｅｌｓら，  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｖｅｃｔｏｒｓ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，  ニューヨーク，  （１９８５）に開示される、ｐＤＣ４１２またはｐＤＣ３１４ベクター（Ｍｉｃｒｏｂｉｘ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．、カナダ・トロント）、あるいはｐＭＴ２またはｐＥＤ発現ベクターなどの発現調節配列に、機能可能であるように連結することが可能である。多くの適切な発現調節配列が当該技術分野に知られる。組換えポリペプチドを発現させる一般的な方法もまた知られ、そしてＲ．  Ｋａｕｆｍａｎ，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １８５，  ５３７−５６６（１９９０）に例示される。本明細書において、「機能可能であるように連結した」は、本発明のポリヌクレオチドおよび発現調節配列が、構築物、ベクター、または細胞内で、適切な分子（例えばポリメラーゼ）が存在する場合、ポリヌクレオチドにコードされるポリペプチドが発現されるような方式で、位置していることを意味する。１つの態様において、少なくとも１つの発現調節配列が、組換え宿主細胞またはその子孫において、本発明のネクチン−３またはネクチン−４ポリヌクレオチドに、機能可能であるように連結しており、ポリヌクレオチドおよび／または発現調節配列が、例えば形質転換またはトランスフェクションによって、あるいは他の適切な方法いずれかによって、宿主細胞に導入されている。別の態様において、少なくとも１つの発現調節配列が、ネクチン−３またはネクチン−４ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに、機能可能であるように連結しているように、組換え宿主細胞のゲノムに組み込まれる。本発明の１つの態様において、少なくとも１つの発現調節配列が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたは組換え宿主細胞いずれかにおいて、転写因子などのトランス作用因子の作用を通じて、本発明のポリヌクレオチドに機能可能であるように連結される。
【０１０４】
さらに、適切なシグナルペプチド（天然または異種）をコードするポリヌクレオチドを、発現ベクターに取り込んでもよい。シグナル配列の選択は、組換えポリペプチドを産生しようとする宿主細胞の種類などの要因に応じる可能性がある。例えば、哺乳動物宿主細胞で機能する、異種シグナルペプチドの例には、米国特許第４，９６５，１９５号に記載されるインターロイキン−７（ＩＬ−７）のシグナル配列；Ｃｏｓｍａｎら，  Ｎａｔｕｒｅ  ３１２：７６８（１９８４）に記載されるインターロイキン−２受容体のシグナル配列；ＥＰ  ３６７，５６６に記載されるインターロイキン−４受容体シグナルペプチド；米国特許第４，９６８，６０７号に記載されるＩ型インターロイキン−１受容体シグナルペプチド；およびＥＰ  ４６０，８４６に記載されるＩＩ型インターロイキン−１受容体シグナルペプチドが含まれる。シグナル配列（分泌リーダー）のＤＮＡ配列を、インフレームで本発明のポリヌクレオチド配列に融合させ、ＤＮＡがまず転写され、そしてｍＲＮＡがシグナルペプチドを含む融合ポリペプチドに翻訳されるようにしてもよい。意図される宿主細胞で機能するシグナルペプチドは、ポリペプチドの細胞外分泌を促進する。シグナルペプチドは、細胞からのポリペプチドの分泌に際し、ポリペプチドから切断される。当業者はまた、シグナルペプチドが切断される、単数または複数の位は、コンピュータープログラムに予測されるものと異なる可能性があり、そして組換えポリペプチドを発現するのに使用される宿主細胞の種類などの要因にしたがって、多様である可能性があることも認識するであろう。ポリペプチド調製は、１より多い部位でのシグナルペプチドの切断から生じる、異なるＮ末端アミノ酸を有するポリペプチド分子の混合物を含む可能性がある。
【０１０５】
哺乳動物細胞内にＤＮＡを導入するための確立された方法が、記載されている（Ｋａｕｆｍａｎ，  Ｌａｒｇｅ  Ｓｃａｌｅ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ，  １９９０，  ｐｐ．１５−６９）。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ脂質試薬（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）またはＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ−Ｐｌｕｓ脂質試薬などの商業的に入手可能な試薬を用いた、さらなるプロトコルを用いて、細胞をトランスフェクションすることが可能である（Ｆｅｌｇｎｅｒら，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８４：７４１３−７４１７，  １９８７）。さらに、エレクトロポレーションを用い、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  第２版  Ｖｏｌ．１−３，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  １９８９）におけるもののような慣用法を用いて、哺乳動物細胞をトランスフェクションすることが可能である。安定形質転換体の選択は、例えば細胞傷害性薬剤に対する耐性など、当該技術分野に知られる方法を用いて、行うことが可能である。Ｋａｕｆｍａｎら，  Ｍｅｔｈ．  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １８５：４８７−５１１，  １９９０は、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）耐性などのいくつかの選択計画を記載する。ＤＨＦＲ選択に適した株は、ＤＨＦＲ不全であるＣＨＯ株ＤＸ−Ｂ１１でありうる（Ｕｒｌａｕｂら，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ７７：４２１６−４２２０，  １９８０）。ＤＨＦＲ  ｃＤＮＡを発現しているプラスミドを株ＤＸ−Ｂ１１に導入することが可能であり、そしてプラスミドを含有する細胞のみを適切な選択培地中で増殖させることが可能である。発現ベクターに組込み可能な選択可能マーカーの例には、Ｇ４１８およびハイグロマイシンＢなどの抗生物質に対する耐性を与えるｃＤＮＡが含まれる。該ベクターを有する細胞を、こうした化合物に対する耐性に基づいて選択可能である。
【０１０６】
あるいは、遺伝子産物は、相同組換え、または「遺伝子ターゲティング」技術を介して、得ることが可能である。こうした技術は、ゲノム上の特にあらかじめ決定した部位において、外因性転写調節要素（ＣＭＶプロモーター等）の導入を使用して、本発明の内因性ネクチン−３またはネクチン−４の発現を誘導する。宿主染色体またはゲノムへの組込み位置は、遺伝子の既知の位置および配列を考慮すれば、当業者の１人によって決定可能である。１つの態様において、本発明は、増幅可能遺伝子と組み合わせた、外因性転写調節要素を導入して、増加した量の遺伝子産物を産生することを意図する。相同組換えまたは遺伝子ターゲティングの実施は、米国特許第５，２７２，０７１号において、Ｃｈａｐｐｅｌによって説明される（Ｓｃｈｉｍｋｅら，  “哺乳動物体細胞における遺伝子増幅，”  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １５１：８５（１９８７）、およびＣａｐｅｃｃｈｉら，  “新マウス遺伝学：遺伝子ターゲティングによるゲノム改変，”  ＴＩＧ  ５：７０（１９８９）もまた参照されたい）。
【０１０７】
いくつかの細胞種が、本発明のポリペプチドの発現に適した宿主細胞として働くことが可能である。哺乳動物宿主細胞には、例えば、サル腎臓細胞のＣＯＳ−７株（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６５１）（Ｇｌｕｚｍａｎら，  Ｃｅｌｌ  ２３：１７５，  １９８１）、Ｌ細胞、Ｃ１２７細胞、３Ｔ３細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  １６３）、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＨｅＬａ細胞、ＢＨＫ（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １０）細胞株、ＭｃＭａｈａｎら（ＥＭＢＯ  Ｊ．  １０：２８２１，  １９９１）に記載されるような、アフリカミドリザル（Ａｆｒｉｃａｎ  ｇｒｅｅｎ  ｍｏｎｋｅｙ）腎臓細胞株ＣＶ１（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ７０）由来であるＣＶ１／ＥＢＮＡ細胞株、ヒト腎臓２９３細胞、ヒト上皮Ａ４３１細胞、ヒトＣｏｌｏ２０５細胞、他の形質転換霊長類細胞株、正常二倍体細胞、初代組織のｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養由来の細胞株、初代外植片、ＨＬ−６０、Ｕ９３７、ＨａＫまたはＪｕｒｋａｔ細胞が含まれる。あるいは、酵母などのより低次の真核生物において、または細菌などの原核生物において、ポリペプチドが産生可能である可能性がある。潜在的に適切な酵母株には、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）、クロイベロミセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）株、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、または異種ポリペプチドを発現可能ないかなる酵母株も含まれる。潜在的に適切な細菌株には、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、または異種ポリペプチドを発現可能ないかなる細菌株も含まれる。ポリペプチドが、酵母または細菌で作成される場合、機能するポリペプチドを得るため、そこで産生されるポリペプチドを、例えば適切な部位でのリン酸化またはグリコシル化によって、修飾することが必要である可能性がある。こうした共有結合は、既知の化学的または酵素的方法を用いて、達成可能である。ポリペプチドはまた、本発明の単離ポリヌクレオチドを、１以上の昆虫発現ベクターの適切な調節配列に、機能可能であるように連結し、そして昆虫発現系を使用することによって、産生することも可能である。バキュロウイルス／昆虫細胞発現系の材料および方法は、例えばＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、米国カリフォルニア州サンディエゴからキットの形で（ＭａｘＢａｃ（登録商標）キット）商業的に入手可能であるし、またはＳｕｍｍｅｒｓおよびＳｍｉｔｈ，  Ｔｅｘａｓ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ  Ｓｔａｔｉｏｎ  Ｂｕｌｌｅｔｉｎ  Ｎｏ．１５５５（１９８７）、並びにＬｕｃｋｏｗおよびＳｕｍｍｅｒｓ，  Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６：４７（１９８８）に記載されるとおりである。本明細書において、本発明のポリヌクレオチドを発現可能な宿主細胞は「形質転換」されている。細胞不含翻訳系もまた、本明細書に開示するポリヌクレオチド構築物由来のＲＮＡを用いて、ポリペプチドを産生するのに使用可能である。好ましくは、少なくとも１つの発現調節配列に機能可能であるように連結している、本発明の単離ポリヌクレオチドを含んでなる宿主細胞は、「組換え宿主細胞」である。
【０１０８】
本発明のネクチン−３およびネクチン−４ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、多くの診断または他の有用な目的に使用可能である。本発明のポリヌクレオチドは、解析、性質決定または療法使用のために組換えポリペプチドを発現するため；対応するポリペプチドを（恒常的あるいは組織分化もしくは発生の特定の時期にまたは疾患状態において）優先的に発現する組織のマーカーとして；サザンゲル上の分子量マーカーとして；染色体を同定するかまたは関連する遺伝子位をマッピングするための染色体マーカーまたはタグとして（標識した場合）；潜在的な遺伝子障害を同定するために被験者における内因性ＤＮＡ配列と比較するために；ハイブリダイズしそしてしたがって新規関連核酸分子を発見するためのプローブとして；遺伝子フィンガープリンティングのためのＰＣＲプライマーを導くための情報供給源として；他の新規核酸を発見する過程において、既知の配列を「取り去る（ｓｕｂｔｒａｃｔ−ｏｕｔ）」ためのプローブとして；発現パターンの検査を含む、「遺伝子チップ」または他の支持体に付着するオリゴマーを選択し、そして作成するため；ＤＮＡ免疫技術を用いて、抗ポリペプチド抗体を作成するため；抗ＤＮＡ抗体を作成するかまたは別の免疫反応を誘発するための抗原として、そして遺伝子療法のために使用可能である。これらの使用に適したいずれかのまたはすべてのポリヌクレオチドは、製品として商品化するため、試薬等級またはキット形式に発展させることが可能である。例えば、本発明のキットは、区切られ、そしてプライマー（例えば、それぞれネクチン−３αまたはβを増幅するための配列番号２６および２７および／または２８および２９）、抗体、ポリペプチドおよび関連試薬（例えばＴａｑポリメラーゼ等）を保持するように設計された、１以上の容器を含むであろう。これらの使用を実行する方法は、当該技術分野に知られる。こうした方法を開示する参考文献には、限定されるわけではないが、“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”，  第２版，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｓａｍｂｒｏｏｋら監修，  １９８９、および“Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ：  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ”，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  ＢｅｒｇｅｒおよびＫｉｍｍｅｌ監修，  １９８７が含まれる。
【０１０９】
プローブおよびプライマー  開示するネクチン−３およびネクチン−４ポリヌクレオチド、およびその断片の組み合わせの使用の中に、プローブまたはプライマーとしての断片の使用がある。こうした断片は、一般的に、ＤＮＡ配列の少なくとも約１７の隣接するヌクレオチドを含んでなる。他の態様において、ＤＮＡ断片は、ＤＮＡ配列の少なくとも３０、または少なくとも６０の隣接するヌクレオチドを含んでなる。ハイブリダイゼーション条件の選択に影響を与える基本的なパラメーターおよび適切な条件を考案するための手引きは、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９に示され、そして本明細書に記載している。遺伝暗号の知識を、上に示すアミノ酸配列と組み合わせて用い、縮重オリゴヌクレオチドの組を調製することが可能である。こうしたオリゴヌクレオチドは、例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）において、プライマーとして有用である。特定の態様において、非ヒト遺伝子ライブラリー用のプローブとして、縮重プライマーを使用することが可能である。こうしたライブラリーには、限定されるわけではないが、ｃＤＮＡライブラリー、ゲノムライブラリー、およびエレクトロニックＥＳＴ（発現配列タグ）またはＤＮＡライブラリーさえ含まれるであろう。その後、この方法で同定された相同配列をプローブとして用いて、非ヒトネクチン−３相同体を同定するであろう。
【０１１０】
染色体マッピング  当業者は、ネクチン−３およびネクチン−４ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、並びにこれらのポリヌクレオチドの開示する断片および組み合わせを用いて、公知の技術を用い、これらのポリヌクレオチドがマッピングするヒト染色体を同定することが可能である。有用な技術には、限定されるわけではないが、放射ハイブリッド（ｒａｄｉａｔｉｏｎ  ｈｙｂｒｉｄ）マッピング（高解像度）、染色体伸展（ｓｐｒｅａｄ）に対するｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（中程度の解像度）、および個々のヒト染色体を含有するハイブリッド細胞株に対するサザンブロットハイブリダイゼーション（低解像度）などの技術におけるプローブとして、オリゴヌクレオチドを含む配列または部分を使用することが含まれる。例えば、染色体は放射ハイブリダイゼーションによってマッピング可能である。まず、９３の放射ハイブリッドのＷｈｉｔｅｈｅａｄ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ／ＭＩＴ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｇｅｎｅｂｒｉｄｇｅ４パネルを用い、ＰＣＲを行う：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ−ｇｅｎｏｍｅ．ｗｉ．ｍｉｔ．ｅｄｕ／ｆｔｐ／ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ／ｈｕｍａｎ＿ＳＴＳ＿ｒｅｌｅａｓｅｓ／ｊｕｌｙ９７／ｒｈｍａｐ／ｇｅｎｅｂｒｉｄｇｅ４．ｈｔｍｌ。目的の遺伝子の推定上のエクソン内にあり、そしてヒトゲノムＤＮＡから産物を増幅するが、ハムスターゲノムＤＮＡを増幅しないプライマーを用いる。ＰＣＲの結果をデータベクトルに変換し、インターネット上のＷｈｉｔｅｈｅａｄ／ＭＩＴ放射マッピングサイト（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ−ｓｅｑ．ｗｉ．ｍｉｔ．ｅｄｕ）に提出する。該データはスコア化され、そして放射ハイブリッドマップ上の既知の配列タグ部位（ＳＴＳ）マーカーに比べた染色体割り当ておよび配置が提供される。以下のウェブサイトは、放射ハイブリッドマッピングに関するさらなる情報を提供する：ｗｗｗ−ｇｅｎｏｍｅ．ｗｉ．ｍｉｔ．ｅｄｕ／ｆｔｐ／ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ／ｈｕｍａｎ＿ＳＴＳ＿ｒｅｌｅａｓｅｓ／ｊｕｌｙ９７／０７−９７．ＩＮＴＲＯ．ｈｔｍｌ。
【０１１１】
診断法および遺伝子療法  当業者は、ネクチン−３およびネクチン−４ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、および開示する断片、並びにこれらのポリヌクレオチドの組み合わせを用いて、既知の技術を用い、これらの分子に対応する遺伝子と関連する異常を解析することが可能である。これによって、このマーカーが再編成されているかまたは欠失している状態を識別することが可能になる。さらに、本発明のポリヌクレオチドまたはその断片を位置マーカーとして用いて、未知の位置の他の遺伝子をマッピングすることが可能である。本発明のポリヌクレオチドに相当する遺伝子の不全または不十分な量によって（直接または間接的に）仲介されるいかなる障害に対する治療を開発するのにも、該ＤＮＡが使用可能である。ポリヌクレオチド配列の本明細書の開示により、不全遺伝子の検出、および正常遺伝子でのその置換が可能になる。不全遺伝子は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ診断アッセイにおいて、そして本明細書に開示する天然ヌクレオチド配列と、この遺伝子に不全を宿すると推測されるヒト由来の遺伝子のものとを比較することによって、検出可能である。
【０１１２】
ネクチン−３および／またはネクチン−４ポリペプチドを中和するか、または本発明のネクチン−３および／またはネクチン−４遺伝子の発現（転写または翻訳）を阻害するいかなる方法を用いて、本発明のネクチンポリペプチドの生物学的活性を減少することも可能である。特定の態様において、アンタゴニストが、ネクチン−３および／またはネクチン−４同族体とネクチン−３および／またはネクチン−４ポリペプチドとの結合または相互作用を阻害し、それによって、細胞へのこうしたネクチンポリペプチドの結合または相互作用によって誘導される生物学的活性を阻害する。本発明の別の態様において、アンタゴニストを設計して、内因性ネクチン−３および／またはネクチン−４遺伝子発現のレベルを減少させることが可能であり、例えばネクチン−３および／またはネクチン−４  ｍＲＮＡ転写物の翻訳を阻害するかまたは妨げる、既知のアンチセンスまたはリボザイムアプローチ；転写を阻害する三重らせんアプローチ；あるいは、ネクチン−３および／またはネクチン−４遺伝子またはその内因性プロモーターもしくはエンハンサー要素を不活性化するかまたは「ノックアウト」する、標的化相同組換えを用いる。こうしたアンチセンス、リボザイム、および三重らせんアンタゴニストを設計して、損なわれた、または適切な場合、突然変異体ネクチン遺伝子活性いずれかを減少させるかまたは阻害することが可能である。
【０１１３】
アンチセンスＲＮＡおよびＤＮＡ分子は、ターゲティングするｍＲＮＡにハイブリダイズし、そしてポリペプチド翻訳を妨げることによって、ｍＲＮＡの翻訳を直接遮断するよう作用する。アンチセンスアプローチは、ネクチン−３および／またはネクチン−４  ｍＲＮＡに相補的なオリゴヌクレオチド（ＤＮＡまたはＲＮＡいずれか）の設計を伴う。絶対の相補性は、好ましいが、必要ではない。本明細書に称されるような、核酸の部分に「相補的な」オリゴヌクレオチドは、核酸とハイブリダイズし、安定な二重鎖（または適切な場合、三重鎖）を形成することが可能であるのに十分な相補性を有する配列を意味する。したがって、二本鎖アンチセンス核酸の場合、二重鎖ＤＮＡの一本鎖を試験してもよいし、または三重鎖形成をアッセイしてもよい。ハイブリダイズする能力は、アンチセンス核酸の相補性の度合いおよび長さ両方に応じるであろう。ＡＵＧ開始コドンまでおよび該開始コドンを含む、５’非翻訳領域に相補的なオリゴヌクレオチドは、翻訳を阻害するのに最も効率的に働くはずである。しかし、ネクチン−３および／またはネクチン−４遺伝子転写物の５’または３’非翻訳、非コード領域いずれかに相補的なオリゴヌクレオチドは、アンチセンスアプローチにおいて、内因性ｍＲＮＡの翻訳を阻害するのに使用可能である。アンチセンス核酸は、少なくとも長さ６ヌクレオチドでなければならず、そして好ましくは、長さ６から約５０ヌクレオチドの範囲のオリゴヌクレオチドである。特定の側面において、オリゴヌクレオチドは、少なくとも長さ１０、少なくとも１７、少なくとも２５または少なくとも５０ヌクレオチドである。オリゴヌクレオチドは、一本鎖または二本鎖のＤＮＡまたはＲＮＡまたはキメラ混合物またはその誘導体または修飾型であってもよい。オリゴヌクレオチドは、塩基部分、糖部分、またはリン酸主鎖で修飾し、例えば分子の安定性、ハイブリダイゼーション等を改善することが可能である。オリゴヌクレオチドは、ペプチド（例えば宿主細胞受容体をｉｎ  ｖｉｖｏでターゲティングするため）、または細胞膜を横切る輸送を促進する剤（例えばＬｅｔｓｉｎｇｅｒら，  １９８９，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．  ８６：６５５３−６５５６；Ｌｅｍａｉｔｒｅら，  １９８７，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ８４：６４８−６５２；ＰＣＴ公報第ＷＯ８８／０９８１０号を参照されたい）、あるいはハイブリダイゼーション誘発切断剤または挿入剤（ｉｎｔｅｒｃａｌａｔｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）（例えばＺｏｎ，  １９８８，  Ｐｈａｒｍ．  Ｒｅｓ．  ５：５３９−５４９を参照されたい）などの他の付随する基を含んでもよい。アンチセンス分子は、ネクチン−３および／またはネクチン−４転写物をｉｎ  ｖｉｖｏで発現する細胞に搬送する。アンチセンスＤＮＡまたはＲＮＡを細胞に搬送するために、いくつかの方法が開発されている；例えば、アンチセンス分子は、組織または細胞由来部位に直接注入してもよいし、または望ましい細胞を標的とするよう設計された、修飾アンチセンス分子（例えば標的細胞表面上に発現される受容体または抗原に特異的に結合するペプチドまたは抗体に連結したアンチセンス）を、全身投与してもよい。好ましいアプローチは、アンチセンスオリゴヌクレオチドが、強いｐｏｌＩＩＩまたはｐｏｌＩＩプロモーターの調節下に置かれる、組換えＤＮＡ構築物を利用する。被験者において、標的細胞をトランスフェクションするための、こうした構築物の使用は、内因性ネクチン遺伝子転写物と相補的塩基対を形成するであろう一本鎖ＲＮＡの十分な量の転写を生じ、そしてそれによって、ｍＲＮＡの翻訳を妨げるであろう。例えば、ベクターが細胞に取り込まれ、そしてアンチセンスＲＮＡの転写を指示するように、ベクターをｉｎ  ｖｉｖｏで導入することが可能である。こうしたベクターは、転写され、望ましいアンチセンスＲＮＡを産生することが可能でありさえすれば、エピソームにとどまっても、または染色体に組み込まれてもよい。こうしたベクターは、当該技術分野で標準的な組換えＤＮＡ技術法によって、構築することが可能である。ベクターは、哺乳動物細胞における複製および発現で用いられる、プラスミド、ウイルス性、または当該技術分野に知られる他のものであってもよい。
【０１１４】
ネクチン−３および／またはネクチン−４  ｍＲＮＡ転写物を触媒的に切断するよう設計されたリボザイム分子もまた、ネクチン−３または−４  ｍＲＮＡの翻訳および対応するネクチンポリペプチドの発現を防止可能である（例えば、ＰＣＴ国際公報ＷＯ９０／１１３６４；米国特許第５，８２４，５１９号を参照されたい）。本発明で用いることが可能なリボザイムには、ハンマーヘッドリボザイム（Ｈａｓｅｌｏｆｆら，  １９８８，  Ｎａｔｕｒｅ，  ３３４：５８５−５９１）、テトラヒメナ・サーモフィラ（Ｔｅｔｒａｈｙｍｅｎａ  Ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）に天然に存在し（ＩＶＳ、またはＬ−１９  ＩＶＳ  ＲＮＡとして知られる）、そしてＴｈｏｍａｓ  Ｃｅｃｈおよび共同研究者（国際特許出願第ＷＯ  ８８／０４３００号；Ｂｅｅｎら，  １９８６，  Ｃｅｌｌ，  ４７：２０７−２１６）によって、詳細に記載されているものなどのＲＮＡエンドリボヌクレアーゼ（「Ｃｅｃｈ型リボザイム」）が含まれる。アンチセンスアプローチにおけるように、リボザイムは、修飾オリゴヌクレオチドで構成されていてもよく（例えば改善された安定性、標的化などのため）、そしてｉｎ  ｖｉｖｏでネクチンポリペプチドを発現する細胞に搬送する。搬送の好ましい方法は、トランスフェクションされた細胞が、十分な量のリボザイムを産生し、内因性ネクチンｍＲＮＡを破壊し、そして翻訳を阻害するであろうように、強い恒常的ｐｏｌＩＩＩまたはｐｏｌＩＩプロモーターの調節下にあるリボザイムコードＤＮＡ構築物を用いることを伴う。リボザイムは、アンチセンス分子と異なり、触媒性であるため、有効であるために、より低い細胞内濃度しか必要とされない。
【０１１５】
あるいは、標的遺伝子の制御領域（すなわち標的遺伝子プロモーターおよび／またはエンハンサー）に相補的デオキシリボヌクレオチド配列をターゲティングして、標的ネクチン遺伝子の転写を妨げる三重らせん構造を形成することによって、内因性ネクチン−３および／またはネクチン−４遺伝子発現を減少させることが可能である（一般的には、Ｈｅｌｅｎｅ，  １９９１，  Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓ．  ６（６）：５６９−５８４；Ｈｅｌｅｎｅら，  １９９２，  Ａｎｎ．  Ｎ．Ｙ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．，  ６６０，  ２７−３６；およびＭａｈｅｒ，  １９９２，  Ｂｉｏａｓｓａｙｓ  １４（１２）：８０７−８１５を参照されたい）。
【０１１６】
本発明のアンチセンスＲＮＡおよびＤＮＡ、リボザイム、並びに三重らせん分子は、ＤＮＡおよびＲＮＡ分子合成のための、当該技術分野に知られるいかなる方法によって、調製することも可能である。これらには、例えば固相ホスホロアミダイト化学合成などの、ＤＮＡまたはＲＮＡオリゴヌクレオチドを化学的に合成するための技術が含まれる。オリゴヌクレオチドは、当該技術分野に知られる標準法によって、例えば自動化ＤＮＡ合成装置（ＢｉｏｓｅａｒｃｈおよびＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから商業的に入手可能なものなど）の使用によって、合成することが可能である。例えば、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは、Ｓｔｅｉｎら，  １９８８，  Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １６：３２０９の方法によって、合成することが可能である。メチルホスホネートオリゴヌクレオチドは、制御孔ガラスポリマー支持体（Ｓａｒｉｎら，  １９８８，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．  ８５：７４４８）の使用によって、調製することが可能である。あるいは、ＲＮＡ分子は、アンチセンスＲＮＡ分子をコードするＤＮＡ配列のｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏ転写によって、生成することが可能である。こうしたＤＮＡ配列は、Ｔ７またはＳＰ６ポリメラーゼプロモーターなどの適切なＲＮＡポリメラーゼプロモーターを取り込む、非常に多様なベクターに取り込むことが可能である。あるいは、用いるプロモーターに応じて、恒常的にまたは誘導性に、アンチセンスＲＮＡを合成する、アンチセンスｃＤＮＡ構築物を、細胞株に安定して導入することが可能である。
【０１１７】
内因性標的遺伝子発現はまた、標的化相同組換えを用いて、標的遺伝子またはそのプロモーターを不活性化するかまたは「ノックアウト」することによって、減少させることも可能である（例えばＳｍｉｔｈｉｅｓら，  １９８５，  Ｎａｔｕｒｅ  ３１７：２３０；Ｔｈｏｍａｓら，１９８７，  Ｃｅｌｌ  ５１：５０３；Ｔｈｏｍｐｓｏｎら，  １９８９，  Ｃｅｌｌ  ５：３１３を参照されたい）。標的遺伝子をｉｎ  ｖｉｖｏで発現する細胞をトランスフェクションするため、例えば、内因性標的遺伝子（標的遺伝子のコード領域または制御領域いずれか）に相同なＤＮＡが隣接する、突然変異体非機能標的遺伝子（または完全に関連しないＤＮＡ配列）を、選択可能マーカーおよび／または陰性選択可能マーカーを伴い、または伴わず、用いることが可能である。標的化相同組換えを介した、ＤＮＡ構築物の挿入は、標的遺伝子の不活性化を生じる。こうしたアプローチは、ＥＳ（胚性幹）細胞への修飾を用いて、不活性な標的遺伝子を持つ動物子孫を生成することが可能な場合の農業分野において（例えばＴｈｏｍａｓら、１９８７；およびＴｈｏｍｐｓｏｎ、１９８９、上記を参照されたい）、また「ＲＮＡ干渉」（「ＲＮＡｉ」）技術（Ｇｒｉｓｈｏｋら，  ２０００，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８７（５４６２）：２４９４）、または導入遺伝子の導入（Ｄｅｒｎｂｕｒｇら，  ２０００，  Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．  １４（１３）：１５７８）を用いて、特定の標的遺伝子の発現を阻害する、線虫（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ）などのモデル生物において、特に適している。このアプローチは、組換えＤＮＡ構築物が、ウイルスベクターなどの適切なベクターを用いて、ｉｎ  ｖｉｖｏで、直接投与されるかまたは必要な部位を標的とするのであれば、ヒトで使用するために、適応させることが可能である。
【０１１８】
ネクチン−３および／または−４ポリヌクレオチドに対応する遺伝子（類）の、増進した、減少した、または修飾された発現を有する生物を提供する。遺伝子発現の望ましい変化は、該遺伝子から転写されるｍＲＮＡに結合し、そして／または該ｍＲＮＡを切断する、アンチセンス核酸またはリボザイムの使用を通じて達成することが可能である（Ａｌｂｅｒｔら，  １９９４，  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  Ｓｃｉ．  １５（７）：２５０；Ｌａｖａｒｏｓｋｙら，  １９９７，  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｍｏｌ．  Ｍｅｄ．  ６２（１）：１１；およびＨａｍｐｅｌ，  １９９８，  Ｐｒｏｇ．  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ５８：１）。好ましくは、形質転換細胞およびその子孫内に安定して維持される遺伝子構築物で、細胞を形質転換することによって産生される、本明細書に開示するポリヌクレオチドに対応する遺伝子（類）の多コピーを有するトランスジェニック動物を提供する。遺伝子発現レベルを増加させるかまたは減少させる、あるいは遺伝子発現の時間的または空間的パターンを変化させる、修飾遺伝子調節領域を有する、トランスジェニック動物もまた、提供する（欧州特許第０  ６４９  ４６４  Ｂ１を参照されたい）。さらに、ネクチン−３および／またはネクチン−４ポリヌクレオチドに対応する遺伝子（類）が、対応する遺伝子（類）への外来性配列の挿入を通じて、あるいは対応する遺伝子（類）のすべてまたは一部の欠失を通じて、部分的にまたは完全に不活性化されている、生物を提供する。部分的または完全遺伝子不活性化は、挿入、好ましくは、その後の転位因子の不正確な切除を通じて達成する（Ｐｌａｓｔｅｒｋ，  １９９２，  Ｂｉｏｅｓｓａｙｓ  １４（９）：６２９；Ｚｗａａｌら，  １９９３，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９０（１６）：７４３１；Ｃｌａｒｋら，  １９９４，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９１（２）：７１９）か、あるいは相同組換えを通じて達成し、好ましくは、陽性／陰性遺伝子選択戦略によって検出することが可能である（Ｍａｎｓｏｕｒら，  １９８８，  Ｎａｔｕｒｅ  ３３６：３４８；米国特許第５，４６４，７６４号；第５，４８７，９９２号；第５，６２７，０５９号；第５，６３１，１５３号；第５，６１４，３９６号；第５，６１６，４９１号；および第５，６７９，５２３号）。改変された遺伝子発現を持つ、これらの生物は、好ましくは真核生物であり、そしてより好ましくは非ヒト哺乳動物である。こうした生物は、ネクチン−３および／またはネクチン−４を伴う障害の研究のためのモデルの開発に、そして対応する遺伝子（類）のポリペプチド産物（類）と相互作用する分子の同定のためのアッセイ系の開発に、有用である。
【０１１９】
結合パートナーを同定するアッセイ  本発明のポリペプチドおよびその断片を用いて、結合パートナーを同定可能である。例えば、これらは、慣用的結合アッセイなどの、いかなる適切なアッセイにおいても、候補結合パートナーに結合する能力に関して、試験可能である。例えば、ネクチン−３または−４ポリペプチドあるいはその可溶性断片を検出可能剤（例えば放射性核種、発色団、および比色または蛍光定量反応を触媒する酵素等）で標識してもよい。標識ポリペプチドを、候補結合パートナーを発現する細胞と接触させる。その後、細胞を洗浄し、未結合標識ポリペプチドを除去し、そして標識の性質にしたがって選択した適切な技術によって、細胞結合標識の存在を決定する。
【０１２０】
結合アッセイ法の１つの例では、候補結合パートナーｃＤＮＡを含有する組換え発現ベクターを、宿主細胞にトランスフェクションする。トランスフェクション細胞を培養し、そしてその後、２４ウェルプレートに分ける。さらに４８時間培養した後、トランスフェクション細胞を洗浄し、そして多様な濃度の、例えば本明細書に示すように作成した可溶性ネクチン−３ポリペプチド／Ｆｃ融合ポリペプチドと、３７℃で１時間インキュベーションする。細胞を洗浄し、そして結合緩衝液中、一定の飽和濃度の１２５Ｉマウス抗ヒトＩｇＧとインキュベーションする。洗浄後、トリプシン処理を介して細胞を遊離させる。上で使用するマウス抗ヒトＩｇＧは、ヒトＩｇＧのＦｃ領域に対して向けられ、そしてＪａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  Ｉｎｃ．、ペンシルバニア州ウェストグローブから得ることが可能である。該抗体は、標準的クロラミン−Ｔ法を用いて放射ヨウ素標識する。該抗体は、細胞に結合しているいかなるポリペプチド／ＦｃポリペプチドのＦｃ部分にも結合するであろう。すべてのアッセイにおいて、１２５Ｉ抗体の非特異的結合をネクチン−３ポリペプチド／Ｆｃの非存在下でアッセイすると共に、Ｆｃ融合ポリペプチドおよび２００倍のモル過剰の非標識マウス抗ヒトＩｇＧ抗体の存在下でもアッセイする。細胞結合１２５Ｉ抗体は、Ｐａｃｋａｒｄ  Ａｕｔｏｇａｍｍａカウンター上で定量化する。親和性計算（Ｓｃａｔｃｈａｒｄ，  Ａｎｎ．  Ｎ．  Ｙ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ５１：６６０，  １９４９）はＲＳ／１（ＢＢＮ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ、マサチューセッツ州ボストン）上で生み出される。結合は、また、シンチレーション近接アッセイ（Ｕｄｅｎｆｒｉｅｎｄら，  １９８５，  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８２：８６７２）、均質時間分解蛍光法（Ｐａｒｋら，  １９９９，  Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ２６９：９４）、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）法（Ｃｌｅｇｇ，  １９９５，  Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ６：１０３）、または結合したポリペプチドが潜在的な結合パートナーに曝露された際、例えばＢｉａｃｏｒｅ  ＡＢ（スウェーデン・ウプサラ）に供給されるようなバイオセンサーを用いて、表面プラズモン共鳴におけるいかなる変化も測定する方法などの高処理スクリーニング法に適している方法を用いても、検出可能である。ネクチン−３ポリペプチドへの結合に関してアッセイ可能な剤には、限定されるわけではないが、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（ミズーリ州セントルイス）、Ａｒｑｕｌｅ（マサチューセッツ州ウォバーン）、Ｅｎｚｙｍｅｄ（アイオワ州アイオワシティー）、Ｍａｙｂｒｉｄｇｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．（英国・コーンウォール州トレビレット）、ＭＤＳ  Ｐａｎｌａｂｓ（ワシントン州ボセル）、Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａ（ニュージャージー州プリンストン）、およびＴｒｅｇａ（カリフォルニア州サンディエゴ）などの企業から−しばしば大きいコンビナトリアルケミストリー化合物「ライブラリー」の一部として−商業的に入手可能なものなどの、小有機分子が含まれる。これらのアッセイを用いてスクリーニングするのに好ましい小有機分子は、通��、１０Ｋ分子量未満であり、そして細胞侵入（ｐｅｎｅｔｒａｔｉｏｎ）を増進し、分解に抵抗し、そして／またはその生理学的半減期を延長する、いくつかの物理化学的および薬理学的特性を所持することが可能である（Ｇｉｂｂｓ，  １９９４，  Ｃｅｌｌ  ７９（２）：１９３）。天然産物、無機化学薬品、並びにタンパク質および毒素などの生物学的に活性である物質を含む剤もまた、ネクチン−３および／またはネクチン−４ポリペプチドに結合する能力に関して、これらの方法を用いてアッセイすることが可能である。
【０１２１】
酵母ツーハイブリッドまたは「相互作用トラップ」アッセイ  ネクチン−３および／またはネクチン−４ポリペプチドが、（例えば受容体−リガンド相互作用において）別のポリペプチドに結合するか、または潜在的に結合する場合、ネクチンポリペプチドをコードするポリヌクレオチドはまた、相互作用トラップアッセイ（例えばＧｙｕｒｉｓら，  Ｃｅｌｌ  ７５：７９１−８０３（１９９３）を参照されたい）に使用して、結合が起こる他のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを同定するか、または結合相互作用の阻害剤を同定することも可能である。これらの結合相互作用に関与するポリペプチドはまた、結合相互作用のペプチドまたは小分子阻害剤またはアゴニストに関して、スクリーニングするのにも使用可能である。
【０１２２】
競合的結合アッセイ  別の種類の適切な結合アッセイは、競合的結合アッセイである。例えば、変異体の生物学的活性は、変異体が、候補結合パートナーへの結合に関して、天然ポリペプチドと競合する能力に関してアッセイすることによって、決定可能である。競合的結合アッセイは、慣用的方法論によって実行可能である。競合的結合アッセイに使用可能な試薬には、放射標識ネクチン、および細胞表面上にネクチン（内因性または組換え）を発現する、損なわれていない（ｉｎｔａｃｔ）細胞が含まれる。例えば、放射標識ｓｏｌネクチン−３を用いて、結合パートナーへの結合に関して、可溶性ネクチン−３変異体と競合させることが可能である。あるいは、放射標識ｓｏｌネクチン−３を用いて、結合パートナー（例えばネクチン−１）への結合に関して、ｓｏｌネクチン−４と競合させることが可能である。損なわれていない細胞の代わりに、Ｆｃ部分とのポリペプチドＡまたはポリペプチドＧ（固相上）の相互作用を通じて、固相に結合する可溶性結合パートナー／Ｆｃ融合ポリペプチドで代用可能である。ポリペプチドＡおよびポリペプチドＧを含有するクロマトグラフィーカラムには、Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，  Ｉｎｃ．、ニュージャージー州ピスカタウェイより入手可能なものが含まれる。
【０１２３】
細胞間コミュニケーション、細胞接着または遊走、あるいは免疫細胞活性のモジュレーターを同定するアッセイ  細胞間コミュニケーション、細胞接着および遊走、または免疫細胞活性に対する、ネクチンの影響は、標的細胞において、これらの活性を調節するよう操作可能である。例えば、開示するネクチン−３および／またはネクチン−４ポリペプチド、ポリヌクレオチド、こうしたポリペプチドのアゴニスト、またはアンタゴニストを細胞または細胞群に投与して、標的細胞において、細胞間コミュニケーション、細胞接着または遊走、ウイルスタンパク質結合、あるいはネクチン−３および／またはネクチン−４に関連する他の活性を誘導するか、増進するか、抑制するか、または抑止することが可能である。この方式で使用可能なネクチン−３および／またはネクチン−４ポリペプチド、アゴニスト、またはアンタゴニストの同定は、当業者に知られる多様なアッセイを介して行うことが可能である。こうしたアッセイに含まれるのは、細胞間コミュニケーション、細胞接着または遊走、あるいはウイルスタンパク質結合活性に影響を与える（これらを阻害するかまたは促進する）、本発明のネクチンポリペプチド（例えば可溶性ネクチン−３または−４ポリペプチド）の能力を評価するものである。こうしたアッセイは、例えば、ネクチン−３またはネクチン−４ポリペプチドあるいは可溶性断片の存在下での、細胞相互作用の解析を伴うであろう。こうしたアッセイにおいて、ネクチンポリペプチドの存在下で、コミュニケーションまたは細胞接着の率を決定し、そしてその後、こうしたコミュニケーションまたは細胞接着が、候補アゴニストまたはアンタゴニストの存在下で、改変されるかどうかを決定するであろう。本発明のこの側面のための典型的なアッセイには、サイトカイン分泌アッセイ、Ｔ細胞接着アッセイ、内皮遊走アッセイ、並びに抗原提示細胞およびＴ細胞を伴う混合リンパ球反応が含まれる。これらのアッセイは当業者に知られ、そして／または本明細書に例示する。
【０１２４】
別の側面において、本発明は、試験剤が、細胞間コミュニケーション、細胞接着または遊走、あるいは細胞のウイルスタンパク質結合活性に影響を与える能力を検出する方法を提供する。この側面において、方法は、ネクチン−３またはネクチン−４ポリペプチド、あるいはその断片（例えばｓｏｌネクチン−３および／またはｓｏｌネクチン−４）を含めて、試験剤と第一の群の標的細胞を、用いる特定のアッセイに適した条件下で接触させ；標的細胞間の細胞間コミュニケーション、細胞接着または細胞遊走の正味割合（ｎｅｔ  ｒａｔｅ）を測定し；そして（例えば試験剤の非存在下で）それ以外は第一の群の細胞と同一の条件下で、対照細胞間の細胞間コミュニケーションまたは細胞接着の正味割合を観察することを含んでなる。この態様において、対照細胞における細胞間コミュニケーションまたは細胞接着の正味割合を、試験剤で処理した細胞のものと比較する。比較によって、細胞間コミュニケーション、細胞接着、または細胞遊走のエフェクターが同定可能であるように、細胞間コミュニケーションまたは細胞接着の正味割合の相違が提供されるであろう。試験剤は、細胞間コミュニケーション、細胞接着、または遊走を活性化するかまたは上方制御することによって、あるいは阻害するかまたは下方制御することによって、エフェクターとして機能することが可能である。
【０１２５】
細胞増殖、細胞死、細胞分化、および細胞接着アッセイ  本発明のポリペプチドは、細胞活性化または刺激、細胞増殖（誘導または阻害いずれか）、細胞分化（誘導または阻害いずれか）活性を示す可能性があり、あるいは特定の細胞集団で細胞遊走を誘導する可能性がある。現在までに発見された多くのポリペプチド因子は、１以上の因子依存細胞増殖アッセイにおいて、こうした活性を示してきており、そしてしたがって、該アッセイは、細胞刺激活性の好適な確認として働く。本発明のポリペプチドの活性は、限定なしに、３２Ｄ、ＤＡ２、ＤＡ１Ｇ、Ｔ１０、Ｂ９、Ｂ９／１１、ＢａＦ３、ＭＣ９／Ｇ、Ｍ＋（プレＢ  Ｍ＋）、２Ｅ８、ＲＢ５、ＤＡ１、１２３、Ｔ１１６５、ＨＴ２、ＣＴＬＬ２、ＴＦ−１、Ｍｏ７ｅおよびＣＭＫを含む細胞株に関するいくつかの日常的な因子依存細胞増殖アッセイのいずれか１つによって立証される。ネクチン−３またはネクチン−４ポリペプチドあるいはその断片（例えばｓｏｌネクチン−３および／またはｓｏｌネクチン−４）の活性は、以下の方法によって測定可能である：
【０１２６】
脾臓細胞、リンパ節細胞、胸腺細胞、または末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）のサイトカイン産生および／または増殖に関するアッセイには、限定なしに：ポリクローナルＴ細胞刺激，  ＫｒｕｉｓｂｅｅｋおよびＳｈｅｖａｃｈ，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ中，  Ｃｏｌｉｇａｎら監修  Ｖｏｌ．１  ｐｐ．３．１２．１−３．１２．１４，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，  トロント．  １９９４；およびＳｃｈｒｅｉｂｅｒ、上記、Ｖｏｌ  １  ｐｐ．６．８．１−６．８．８．に記載されるものが含まれる。
【０１２７】
平滑筋細胞活性、アテローム性動脈硬化症および血管傷害の変調に関するアッセイには、適切な動物モデルを、ネクチン−１、ネクチン−２、ネクチン−３および／またはネクチン−４ポリペプチドまたはその可溶性断片と、血管傷害の前、後、またはそれと同時に接触させ、そしてネクチンポリペプチドで処置しない対照に比較して、動物における血管傷害の進行を決定することが含まれる。
【０１２８】
造血およびリンパ球新生細胞の増殖および分化に関するアッセイには、限定なしに：ヒトおよびネズミ・インターロイキン２およびインターロイキン４の測定，  Ｂｏｔｔｏｍｌｙら，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ中．  Ｃｏｌｉｇａｎら監修  Ｖｏｌ  １  ｐｐ．６．３．１−６．３．１２，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，  トロント．  １９９１；マウスおよびヒト・インターロイキン６の測定，  Ｎｏｒｄａｎ，  上記  ｐｐ．６．６．１−６．６．５；ヒト・インターロイキン１１の測定，  Ｂｅｎｅｔｔら，  上記  ｐｐ．６．１５．１；マウスおよびヒト・インターロイキン９の測定，  Ｃｉａｒｌｅｔｔａら，  上記  ｐｐ．６．１３．１；ｄｅＶｒｉｅｓら，  Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．  １７３：１２０５−１２１１，  １９９１；Ｍｏｒｅａｕら，  Ｎａｔｕｒｅ  ３３６：６９０，  １９８８；Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇｅｒら，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．  ８０：２９３１，  １９８３；Ｓｍｉｔｈら，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．  ８３：１８５７，  １９８６に記載されるものが含まれる。
【０１２９】
抗原に対するＴ細胞クローン反応に関するアッセイ（例えば、増殖およびサイトカイン産生を測定することによる、ＡＰＣ−Ｔ細胞相互作用に影響を与えると共にＴ細胞の影響を導くポリペプチドを同定するであろうもの）には、限定なしに：Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，  Ｃｏｌｉｇａｎら監修，  Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ刊行（第３章；第６章；第７章）；Ｗｅｉｎｂｅｒｇｅｒら，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ７７：６０９１，  １９８０；Ｗｅｉｎｂｅｒｇｅｒら，  Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎ．  １１：４０５，  １９８１；Ｔａｋａｉら，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １３７：３４９４，  １９８６；Ｔａｋａｉら，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １４０：５０８，  １９８８に記載されるものが含まれる。
【０１３０】
混合リンパ球反応（ＭＬＲ）アッセイ（例えば、主にＴｈ１およびＣＴＬ反応を生じるポリペプチドを同定するであろうもの）には、限定なしに：Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，  Ｃｏｌｉｇａｎら監修，  Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ刊行（第３章，  ３．１−３．１９；第７章）；Ｔａｋａｉら，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １３７：３４９４，  １９８６；Ｔａｋａｉら，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １４０：５０８，  １９８８；Ｂｅｒｔａｇｎｏｌｌｉら，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １４９：３７７８，  １９９２に記載されるものが含まれる。
【０１３１】
樹状細胞依存アッセイ（例えば、未処置Ｔ細胞を活性化する樹状細胞に発現されるポリペプチドを同定するであろうもの）には、限定なしに：Ｇｕｅｒｙら，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １３４：５３６，  １９９５；Ｉｎａｂａら，  Ｊ．  Ｅｘｐｅｒ．  Ｍｅｄ．  １７３：５４９，  １９９１；Ｍａｃａｔｏｎｉａら，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １５４：５０７１，  １９９５；Ｐｏｒｇａｄｏｒら，  Ｊ．  Ｅｘｐｅｒ．  Ｍｅｄ．  １８２：２５５，  １９９５；Ｎａｉｒら，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ６７：４０６２，  １９９３；Ｈｕａｎｇら，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６４：９６１，  １９９４；Ｍａｃａｔｏｎｉａら，  Ｊ．  Ｅｘｐｅｒ．  Ｍｅｄ．  １６９：１２５５，  １９８９；Ｂｈａｒｄｗａｊら，  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ．  ９４：７９７，  １９９４；およびＩｎａｂａら，  Ｊ．  Ｅｘｐｅｒ．  Ｍｅｄ．  １７２：６３１，  １９９０に記載されるものが含まれる。
【０１３２】
リンパ球生存／アポトーシスに関するアッセイ（例えば、スーパー抗原誘導後のアポトーシスを防ぐポリペプチドおよびリンパ球恒常性を制御するポリペプチドを同定するであろうもの）には、限定なしに：Ｄａｒｚｙｎｋｉｅｗｉｃｚら，  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  １３：７９５，  １９９２；Ｇｏｒｃｚｙｃａら，  Ｌｅｕｋｅｍｉａ  ７：６５９，  １９９３；Ｇｏｒｃｚｙｃａら，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５３：１９４５，  １９９３；Ｉｔｏｈら，  Ｃｅｌｌ  ６６：２３３，  １９９１；Ｚａｃｈａｒｃｈｕｋ，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １４５：４０３７，  １９９０；Ｚａｍａｉら，  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  １４：８９１，  １９９３；Ｇｏｒｃｚｙｃａら，  Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｏｎｃｏｌ．  １：６３９，  １９９２に記載されるものが含まれる。
【０１３３】
Ｔ細胞拘束および発生の初期段階に影響を与えるポリペプチドに関するアッセイには、限定なしに：Ａｎｔｉｃａら，  Ｂｌｏｏｄ  ８４：１１１，  １９９４；Ｆｉｎｅら，  Ｃｅｌｌ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １５５：１１１，  １９９４；Ｇａｌｙら，  Ｂｌｏｏｄ  ８５：２７７０，  １９９５；Ｔｏｋｉら，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ．  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８８：７５４８，  １９９１に記載されるものが含まれる。
【０１３４】
胚性幹細胞分化に関するアッセイ（例えば、胚性分化造血に影響を与えるポリペプチドを同定するであろうもの）には、限定なしに：Ｊｏｈａｎｓｓｏｎら，  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．  １５：１４１，  １９９５；Ｋｅｌｌｅｒら，  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．  １３：４７３，  １９９３；ＭｃＣｌａｎａｈａｎら，  Ｂｌｏｏｄ  ８１：２９０３，  １９９３に記載されるものが含まれる。
【０１３５】
幹細胞生存および分化に関するアッセイ（例えば、リンパ造血を制御するポリペプチドを同定するであろうもの）には、限定なしに：メチルセルロースコロニー形成アッセイ，  Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，  Ｍ．Ｇ．  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  Ｃｅｌｌｓ中．  Ｒ．Ｉ．  Ｆｒｅｓｈｎｅｙら監修，  Ｖｏｌ  ｐｐ．２６５−２６８，  Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，  Ｉｎｃ．，  ニューヨーク州ニューヨーク  １９９４；高増殖可能性を持つ原始的造血コロニー形成細胞，  ＭｃＮｉｅｃｅら  上記  Ｖｏｌ  ｐｐ．２３−３９；丸石（ｃｏｂｂｌｅｓｔｏｎｅ）領域形成細胞アッセイ，  Ｐｌｏｅｍａｃｈｅｒ，  上記  Ｖｏｌ  ｐｐ．１−２１；間質細胞の存在下での長期骨髄培養，  Ｓｐｏｏｎｃｅｒら，  上記  Ｖｏｌ  ｐｐ．１６３−１７９；長期培養開始細胞アッセイ，  Ｓｕｔｈｅｒｌａｎｄ，  上記  Ｖｏｌ  ｐｐ．１３９−１６２；Ｈｉｒａｙａｍａら，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８９：５９０７，  １９９２；Ｎｅｂｅｎら，  Ｅｘｐ．  Ｈｅｍａｔｏｌ．  ２２：３５３，  １９９４に記載されるものが含まれる。
【０１３６】
組織生成活性に関するアッセイには、限定なしに：国際特許公報第ＷＯ９５／１６０３５号（骨、軟骨、腱）；国際特許公報第ＷＯ９５／０５８４６号（神経、ニューロン性）；国際特許公報第ＷＯ９１／０７４９１号（皮膚、内皮）に記載されるものが含まれる。創傷治癒活性に関するアッセイには、限定なしに：ＥａｇｌｓｔｅｉｎおよびＭｅｒｔｚ，  Ｊ．  Ｉｎｖｅｓｔ．  Ｄｅｒｍａｔｏｌ  ７１：３８２（１９７８）に修飾されるような、Ｗｉｎｔｅｒ，  Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  Ｗｏｕｎｄ  Ｈｅａｌｉｎｇ，  ｐｐ．７１−１１２（ＭａｉｂａｃｈおよびＲｏｖｅｅ監修），  Ｙｅａｒ  Ｂｏｏｋ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，  Ｉｎｃ．，  シカゴに記載されるものが含まれる。
【０１３７】
アクチビン／インヒビン活性に関するアッセイには、限定なしに：Ｖａｌｅら，  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．  ９１：５６２，  １９７２；Ｌｉｎｇら，  Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：７７９，  １９８６；Ｖａｌｅら，  Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：７７６，  １９８６；Ｍａｓｏｎら，  Ｎａｔｕｒｅ  ３１８：６５９，  １９８５；Ｆｏｒａｇｅら，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８３：３０９１，  １９８６に記載されるものが含まれる。
【０１３８】
細胞運動および接着に関するアッセイには、限定なしに：Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，  Ｃｏｌｉｇａｎら監修，  Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ刊行（第６章，  ６．１２．１−６．１２．２８）；Ｔａｕｂら  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ．  ９５：１３７０，  １９９５；Ｌｉｎｄら  ＡＰＭＩＳ  １０３：１４０，  １９９５；Ｍｕｌｌｅｒら  Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２５：１７４４；Ｇｒｕｂｅｒら  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １５２：５８６０，  １９９４；Ｊｏｈｎｓｔｏｎら  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １５３：１７６２，  １９９４に記載されるものが含まれる。
【０１３９】
止血および血栓溶解活性に関するアッセイには、限定なしに：Ｌｉｎｅｔら，  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  ２６：１３１，  １９８６；Ｂｕｒｄｉｃｋら，  Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ  Ｒｅｓ．  ４５：４１３，  １９８７；Ｈｕｍｐｈｒｅｙら，  Ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｓｉｓ  ５：７１（１９９１）；Ｓｃｈａｕｂ，  Ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎｓ  ３５：４６７，  １９８８に記載されるものが含まれる。
【０１４０】
受容体−リガンド活性に関するアッセイには、限定なしに：Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，  Ｃｏｌｉｇａｎら監修，  Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ刊行（第７章，  ７．２８．１−７．２８．２２）；Ｔａｋａｉら，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８４：６８６４，  １９８７；Ｂｉｅｒｅｒら，  Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．  １６８：１１４５，  １９８８；Ｒｏｓｅｎｓｔｅｉｎら，  Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．  １６９：１４９，  １９８９；Ｓｔｏｌｔｅｎｂｏｒｇら，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  １７５：５９，  １９９４；Ｓｔｉｔｔら，  Ｃｅｌｌ  ８０：６６１，  １９９５に記載されるものが含まれる。
【０１４１】
カドヘリン接着および侵襲性抑制因子活性に関するアッセイには、限定なしに：Ｈｏｒｔｓｃｈら  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７０（３２）：１８８０９，  １９９５；Ｍｉｙａｋｉら  Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １１：２５４７，  １９９５；Ｏｚａｗａら  Ｃｅｌｌ  ６３：１０３３，  １９９０に記載されるものが含まれる。
【０１４２】
結合パートナーに関してスクリーニングする方法  本発明のネクチン−３（α、β、またはγ）ポリペプチドおよび／またはネクチン−４ポリペプチドは、各々、方法における試薬として、単独で、また組み合わせて用いて、結合パートナーに関してスクリーニングするかまたは結合パートナーを同定することが可能である。例えば、ネクチン−３ポリペプチドを固体支持物質に付着させることが可能であり、そしてアフィニティークロマトグラフィーに類似の方式で、その結合パートナーに結合することが可能である。一例として、ポリペプチドのアミノ酸側鎖上の官能基と反応するであろう官能基を含有するクロマトグラフィーカラムが入手可能である（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，  Ｉｎｃ．、ニュージャージー州ピスカタウェイ）。代替法において、ネクチン−３（またはネクチン−４）ポリペプチド／Ｆｃ融合構築物（上に論じるようなもの）を、Ｆｃ部分との相互作用を通じて、ポリペプチドＡまたはポリペプチドＧ含有クロマトグラフィーカラムに付着させる。ネクチン−３および−４ポリペプチドはまた、細胞表面上にネクチン−１などの結合パートナーを発現する細胞を同定するのにも使用を見出す。例えば、磁気マイクロスフィアを該ポリペプチドでコーティングし、そして磁場を通じてインキュベーション容器中に保持してもよい。潜在的な結合パートナー発現細胞を含有する細胞混合物の懸濁物を、ポリペプチドをその上に有する固相と接触させる。細胞表面上に結合パートナーを発現する細胞が固定ポリペプチドに結合し、そして、未結合細胞を洗い流す。あるいは、検出可能な部分に本発明のネクチンポリペプチドをコンジュゲート化し、その後、結合パートナー発現に関して試験しようとする細胞とインキュベーションしてもよい。インキュベーション後、未結合標識物質を除去し、そして細胞上の検出可能部分の存在または非存在を測定する。さらなる代替法において、結合パートナーを発現すると推測される細胞混合物を、ビオチン化ポリペプチドとインキュベーションする。インキュベーション時間は、十分な結合を確実にするため、典型的には少なくとも連続１時間である。その後、アビジンでコーティングしたビーズを充填したカラムに、生じた混合物を通過させ、それによりアビジンに対するビオチンの高い親和性が、望ましい細胞のビーズへの結合を提供する。アビジンでコーティングしたビーズの使用法が知られる（Ｂｅｒｅｎｓｏｎら，  Ｊ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，  １０Ｄ：２３９，  １９８６を参照されたい）。非結合成分を除去する洗浄および結合細胞の遊離は、慣用法を用いて行う。ある場合では、結合パートナーに関してスクリーニングするかまたは結合パートナーを同定する上述の方法を用いるかまたは修飾して、こうした結合パートナー分子または該分子を発現する細胞を単離するかまたは精製することもまた、可能である。
【０１４３】
生物学的活性の測定  ポリペプチドはまた、その結合親和性に関して、ネクチン結合ポリペプチドの生物学的活性を測定するのにも使用を見出す。したがって、ポリペプチドは、例えば異なる条件下でのポリペプチドの貯蔵寿命および安定性をモニターするための、「品質保証」研究を行うものによって、使用可能である。例えば、ポリペプチドは、異なる温度で保存されている、または異なる細胞種で産生された結合パートナーポリペプチド（例えばネクチン−１またはネクチン−２）の生物学的活性を測定する、結合親和性研究に使用可能である。ポリペプチドはまた、結合パートナーポリペプチドの修飾（例えば、化学的修飾、一部切除、突然変異等）後、生物学的活性が保持されているかどうか決定するのにも使用可能である。修飾ポリペプチドの結合親和性を、非修飾結合ポリペプチドのものと比較して、その生物学的活性に対する該修飾のいかなる不利な影響も検出する。
【０１４４】
キャリアーおよび搬送剤  該ポリペプチドはまた、付着する剤を、同定された結合パートナーを所持している細胞に搬送するためのキャリアーとしての使用も見出す。したがって、該ポリペプチドは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏ法において、診断用剤または療法剤をこうした細胞（あるいは、ネクチン−１または−２などの結合パートナーを、細胞表面上に発現することが見出された、他の細胞種）に搬送するのに使用可能である。ポリペプチドに付着させてもよい検出可能（診断用）および療法剤には、限定されるわけではないが、毒素、他の細胞傷害性剤、薬剤、放射性核種、発色団、比色または蛍光定量反応を触媒する酵素等が、意図する適用にしたがって選択される特定の剤と共に含まれる。毒素の例は、リシン、アブリン、ジフテリア毒素、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）外毒素Ａ、リボソーム不活性化ポリペプチド、トリコセセンなどのマイコトキシン、並びにそれらの誘導体および断片（例えば一本鎖）である。診断使用に適した放射性核種には、限定されるわけではないが、１２３Ｉ、１３１Ｉ、９９ｍＴｃ、１１１Ｉｎ、および７６Ｂｒが含まれる。療法使用に適した放射性核種の例は、１３１Ｉ、２１１Ａｔ、７７Ｂｒ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、２１２Ｐｂ、２１２Ｂｉ、１０９Ｐｄ、６４Ｃｕ、および６７Ｃｕである。こうした剤は、いかなる適切な慣用法によって、ポリペプチドに付着させてもよい。ポリペプチドは、例えば、望ましい剤上の官能基と反応し、共有結合を形成することが可能である、アミノ酸側鎖上の官能基を含んでなる。あるいは、ポリペプチドまたは剤を誘導体化し、望ましい反応性官能基を生成するか、または付着させてもよい。誘導体化には、多様な分子をポリペプチドに付着させるのに利用可能である、二官能性カップリング試薬（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ、イリノイ州ロックフォード）の１つの付着を伴ってもよい。ポリペプチドを放射標識するいくつかの技術が知られる。例えば、適切な二官能キレート剤を用いることによって、放射性核種金属をポリペプチドに付着させることが可能である。該コンジュゲートを、特定の適用に適した量で投与するか、または別の方式で使用する。
【０１４５】
本発明のネクチン−３およびネクチン−４ポリペプチド、断片（可溶性断片を含む）、変異体、抗体、および結合パートナーは、限定されるわけではないが、細胞接着、細胞遊走、またはヘルペスウイルス受容体活性に関連する状態を含む、医学的状態および疾患を治療するのに有用である。用いる療法分子または分子類は、治療しようとする状態の病因および関与する生物学的経路に応じるであろう。ネクチン−３および／またはネクチン−４ポリペプチドの変異体、断片、および結合パートナーは、天然ネクチン−３およびネクチン−４ポリペプチドと類似のまたは異なる影響を有することが可能である。例えば、ｓｏｌネクチン−３および／またはｓｏｌネクチン−４を用いて、細胞接着／遊走活性を阻害することが可能であるし、そして細胞接着または細胞−細胞相互作用が関与する状態の治療に関して選択することが可能である。ネクチン−３またはネクチン−４の可溶性断片は、例えば、それ自体、その活性の有効な優性ネガティブモジュレーターとして作用する可能性がある。したがって、以下の段落において、「ネクチンポリペプチド」には、ネクチン−３またはネクチン−４ポリペプチドの全長、成熟型、および断片が含まれる。本明細書において、「可溶性断片」は、特に、とりわけ、ネクチン−３またはネクチン−４ポリペプチドの可溶性断片、より好ましくは、ネクチン−３またはネクチン−４ポリペプチドの細胞外ドメインの可溶性断片、そして最も好ましくは、例えばＦｃポリペプチドに連結させたネクチン−３および／またはネクチン−４の可溶性細胞外ドメインを含んでなる融合構築物である。本明細書に記載する生物学的および療法的考慮にしたがって、本発明の態様として提供されたものから、特定の分子または分子類が選択可能であることを、当業者は理解する。
【０１４６】
本明細書に記載する、開示するネクチンポリペプチドまたは可溶性断片、組成物および併用療法は、細菌、ウイルスまたは原生動物感染、およびそれらから生じる合併症を治療する医薬品中で、有用である。１つのこうした疾患は、肺炎マイコプラズマ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）である。さらに、本明細書に提供するのは、ＡＩＤＳおよび関連状態を治療するための、ネクチンポリペプチドまたは可溶性断片の使用である。本明細書に提供するのは、マラリアおよび住血吸虫症を含む、原生動物疾患を治療するための、ネクチンポリペプチドまたは可溶性断片の使用である。さらに提供するのは、らい性結節性紅斑；細菌性またはウイルス性髄膜炎；肺結核を含む結核；および細菌またはウイルス感染から派生する肺炎を治療するための、ネクチンポリペプチドまたは可溶性断片の使用である。本発明のネクチンポリペプチドまたは可溶性断片はまた、ヘルペス性間質角膜炎、角膜病変、およびウイルス誘導角膜障害などの、ヘルペスウイルスによって引き起こされる状態を治療するための療法的組成物を調製するのにも使用可能である。さらに、ネクチンポリペプチドまたは可溶性断片は、ヒトパピローマウイルス感染を治療する際に使用可能である。本発明のネクチンポリペプチドまたは可溶性断片を用いて、インフルエンザを治療する療法組成物を調製する。
【０１４７】
大動脈瘤；動脈炎；大脳動脈閉塞を含む血管閉塞；冠動脈バイパス手術の合併症；虚血／再灌流傷害；アテローム性動脈硬化心臓疾患、慢性自己免疫心筋症およびウイルス性心筋症を含む心筋症を含む、心臓疾患；慢性心不全、心不全の悪液質を含む心不全；心筋梗塞；手術後の再狭窄；無症候性心筋虚血を含む、心臓血管障害が、開示するネクチンポリペプチドまたは可溶性断片、薬剤組成物または併用療法で治療可能である。
【０１４８】
やはり提供されるのは、内分泌系の多様な障害を治療するための、ネクチンポリペプチドまたは可溶性断片、組成物または併用療法の使用法である。例えば、ネクチンポリペプチドまたは可溶性断片を用いて、若年発症糖尿病（自己免疫およびインスリン依存型両方）を治療し、そしてまた、成熟発症糖尿病（インスリン非依存型および肥満仲介両方）と共に、糖尿病に関連する二次的状態（例えば糖尿病網膜症、腎移植拒絶、肥満仲介インスリン抵抗症、および腎不全）を治療する。
【０１４９】
セリアック病；クローン病；潰瘍性大腸炎；特発性胃不全麻痺；慢性膵炎および急性膵炎と関連する肺傷害を含む、膵炎；並びに胃および十二指腸潰瘍を含む潰瘍を含む、胃腸系の状態もまた、ネクチンポリペプチドまたは可溶性断片、組成物または併用療法で治療可能である。
【０１５０】
やはり含まれるのは、自己免疫、毒素に曝露されたための糸球体腎炎あるいは溶連菌または他の感染性病原体での感染から派生する糸球体腎炎を含む糸球体腎炎などの尿生殖器系の障害を治療するための、ネクチンポリペプチドまたは可溶性断片、組成物、または併用療法の使用法である。
【０１５１】
やはり本明細書に提供するのは、多様な血液学的および腫瘍学的障害を治療するための、ネクチンポリペプチドまたは可溶性断片、組成物または併用療法の使用法である。例えば、ネクチンポリペプチドまたは可溶性断片を用いて、急性骨髄性白血病、慢性または急性リンパ芽球性白血病および毛様細胞性白血病を含む白血病；エプスタイン−バーウイルス陽性上咽頭癌、神経膠腫、結腸、胃、前立腺、腎細胞、子宮頚および卵巣癌、肺癌（ＳＣＬＣおよびＮＳＣＬＣ）を含む、多様な型の癌を治療する。開示するネクチンポリペプチドまたは可溶性断片、アンタゴニスト、組成物、または併用療法で、多様なリンパ球増殖性障害もまた、治療可能である。これらには、限定されるわけではないが、自己免疫リンパ球増殖症候群（ＡＬＰＳ）、末梢Ｔ細胞リンパ腫、小リンパ球性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、バーキットリンパ腫、エプスタイン−バーウイルス陽性Ｔ細胞リンパ腫、細網肉腫、ホジキン病、びまん性急速進行型リンパ腫、急性リンパ性白血病、Ｔ−γ−リンパ球増殖性疾患、皮膚Ｂ細胞リンパ腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫（すなわち菌状息肉腫）、およびセザリー症候群が含まれる。
【０１５２】
本ネクチンポリペプチドまたは可溶性断片、組成物、または併用療法で治療可能なさらなる疾患は、腺癌（例えば乳癌）および扁平細胞上皮癌などの、肉腫、骨肉腫、および癌腫を含む、固形腫瘍である。本化合物、組成物および併用療法で治療可能な他の悪性疾患には多発性骨髄腫が含まれる。
【０１５３】
血管形成と関連する障害を治療するための併用療法には、少なくとも１つの抗血管形成ネクチンポリペプチドまたは可溶性断片（例えばｓｏｌネクチン−３および／またはｓｏｌネクチン−４）、および１以上の他の抗血管形成因子または他の療法剤（類）の組み合わせが含まれる。さらなる療法剤（類）は、本発明のネクチンポリペプチドまたは可溶性断片の投与前、投与と同時、または投与後に投与してもよい。１より多い療法剤の使用は、治療している被験者が固形腫瘍を有する際に、特に好適である。本発明のいくつかの態様において、治療はさらに、被験者を放射線で治療することを含んでなる。放射線は、近接照射療法および遠隔療法を含め、ネクチンポリペプチドまたは可溶性断片および／またはさらなる療法剤（類）の投与前、投与と同時、または投与後に投与してもよい。
【０１５４】
いくつかの態様において、該方法には、ネクチンポリペプチドまたは可溶性断片断片に加え、アルキル化剤、代謝拮抗剤、ビンカアルカロイドおよび他の植物由来化学療法剤、抗腫瘍抗生物質、抗腫瘍酵素、トポイソメラーゼ阻害剤、白金類似体、副腎皮質抑制剤、ホルモンおよび抗ホルモン剤、抗体、免疫療法剤、放射療法剤、並びに生物学的反応修飾剤からなる群より選択される、１以上の療法剤の投与が含まれる。
【０１５５】
いくつかの態様において、該方法には、ネクチンポリペプチドまたは可溶性断片に加え、シスプラチン、シクロホスファミド、メクロレタミン、メルファラン、ブレオマイシン、カルボプラチン、フルオロウラシル、５−フルオロデオキシウリジン、メトトレキセート、タキソール、アスパラギナーゼ、ビンクリスチン、並びにビンブラスチン、インターロイキン類、インターフェロン類（α、β、またはδ）およびＴＮＦなどのリンホカイン類およびサイトカイン類、クロラムブシル、ブスルファン、カルムスチン、ロムスチン、セムスチン、ストレプトゾシン、ダカルバジン、シタラビン、メルカプトプリン、チオグアニン、ビンデシン、エトポシド、テニポシド、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ブレオマイシン、プリカマイシン、マイトマイシン、Ｌ−アスパラギナーゼ、ヒドロキシ尿素、メチルヒドラジン、ミトタン、タモキシフェン、フルオキシメステロン、ＩＬ−８阻害剤、アンジオスタチン、エンドスタチン、クリングル５、アンジオポエチン−２または他のアンジオポエチン−１のアンタゴニスト、血小板活性化因子のアンタゴニスト、塩基性線維芽細胞増殖因子のアンタゴニスト、並びにＣＯＸ−２阻害剤からなる群より選択される１以上の療法剤の投与が含まれる。
【０１５６】
いくつかの態様において、該方法には、ネクチンポリペプチドまたは可溶性断片に加え、Ｆｌｔ３リガンド（米国特許第５，５５４，５１２号を参照されたい）、ＣＤ４０リガンド（米国特許第５，７１６，８０５号を参照されたい）、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、４−１ＢＢリガンド（米国特許第５，６７４，７０４号を参照されたい）、抗４−１ＢＢ抗体、ＴＲＡＩＬ（米国特許第５，７６３，２２３号を参照されたい）、ＴＮＦアンタゴニストおよびＴＮＦＲ／Ｆｃを含むＴＮＦ受容体（ＴＮＦＲ）アンタゴニスト、Ｔｅｋアンタゴニスト（ＰＣＴ公報第ＷＯ００／７５３２３号を参照されたい）、ＴＷＥＡＫアンタゴニストおよびＴＷＥＡＫ−Ｒ／Ｆｃを含むＴＷＥＡＫ−Ｒ（ＵＳ第６０／１７２，８７８号および第６０／２０３，３４７号、並びにＦｅｎｇら，  Ａｍ．  Ｊ．  Ｐａｔｈｏｌ．  １５６（４）：１２５３を参照されたい）アンタゴニスト、抗ＶＥＧＦ抗体を含むＶＥＧＦアンタゴニスト、ＶＥＧＦ受容体（Ｆｌｔ１およびＦｌｋ１またはＫＤＲとしても知られる、ＶＥＧＦ−Ｒ１およびＶＥＧＦ−Ｒ２を含む）アンタゴニスト、ＣＤ１４８（ＤＥＰ−１、ＥＣＲＴＰ、およびＰＴＰＲＪとも呼ばれる、Ｔａｋａｈａｓｈｉら，  Ｊ．  Ａｍ．  Ｓｏｃ．  Ｎｅｐｈｒｏｌ．  １０：２１３５−４５，  １９９９；およびＰＣＴ公報第ＷＯ  ００／１５２５８号を参照されたい）結合タンパク質からなる群より選択される、可溶性型を含む、１以上の療法ポリペプチドの投与が含まれる。
【０１５７】
いくつかの態様において、ネクチンポリペプチドまたは可溶性断片は、ＢｒｏｗｄｅｒらおよびＫｌｅｍｅｎｔら（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ６０：１８７８，  ２０００；Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ．  １０５（８）：Ｒ１５，  ２０００）（Ｂａｒｉｎａｇａ，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８８：２４５，  ２０００も参照されたい）に記載されるものなどの「メトロノーム療法」の構成要素として、または該療法と組み合わせて用いる。本発明のネクチンポリペプチドまたは可溶性断片と組み合わせた抗血管形成剤の使用は、腫瘍組織に栄養分を与える血管新生を減少させる。
【０１５８】
開示するネクチンポリペプチドまたは可溶性断片、組成物、および併用療法によって治療可能な他の状態には、頭部または脊髄への傷害から生じるものが含まれ、そして頭部への外傷による硬膜下血腫が含まれる。
【０１５９】
開示するネクチンポリペプチドまたは可溶性断片、組成物、および併用療法を用いて、アルコール、薬剤誘導またはウイルス性肝炎、Ａ型、Ｂ型およびＣ型肝炎、硬化性胆管炎および肝臓炎症を含む、肝炎などの肝臓状態が治療可能である。
【０１６０】
本発明の別の側面において、ネクチンポリペプチドまたは可溶性断片、組成物、および併用療法を用いて、慢性気管支炎または肺気腫に関連する慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）；嚢胞性線維症、特発性肺線維症および放射線誘導肺線維症などの線維性肺疾患；肺サルコイドーシス；並びにアレルギー性鼻炎、接触性皮膚炎、アトピー性皮膚炎および喘息を含むアレルギーを含む、肺障害を治療する。
【０１６１】
他の態様は、多様なリウマチ性障害を治療するための、開示するネクチンポリペプチドまたは可溶性断片、組成物、または併用療法の使用法を提供する。これらには、成人および若年性慢性関節リウマチ；全身性エリテマトーデス；痛風；変形性関節症；リウマチ性多発性筋痛；血清陰性脊椎関節症（例えば強直性脊椎炎）；およびライター病が含まれる。ネクチンポリペプチドまたは可溶性断片、組成物、および併用療法を用いて、乾癬性関節炎および慢性ライム関節炎と共にスティル病および慢性関節リウマチに関連するブドウ膜炎が治療可能である。さらに、本発明の化合物、組成物、および併用療法を用いて、筋組織の炎症を生じる障害（例えば皮膚筋炎および多発性筋炎）が治療可能である。
【０１６２】
本発明のネクチンポリペプチドまたは可溶性断片、組成物および併用療法を用いて、肥大性瘢痕が阻害可能である。本発明のネクチンポリペプチドまたは可溶性断片は、単独で、またはＴＮＦα阻害剤などの、肥大性瘢痕を阻害する他の剤と同時に、投与可能である。
【０１６３】
本発明のネクチンポリペプチドまたは可溶性断片、組成物、および併用療法は、原発性および続発性アミロイドーシスを治療するのに有用である。こうした状態には、例えば、アルツハイマー病；続発性反応性アミロイドーシス；ダウン症候群；および透析関連アミロイドーシスが含まれる。
【０１６４】
心臓、肝臓、肺、皮膚、腎臓または他の器官の移植を含む、固形器官移植から生じる、移植片対宿主疾患、および合併症などの、移植に関連する障害もまた、開示するネクチンポリペプチドまたは可溶性断片、組成物、または併用療法で治療可能である。
【０１６５】
例えば裂孔原性網膜剥離、炎症性眼疾患、糖尿病網膜症、および黄斑変性症を含む、目の疾患もまた、開示するネクチンポリペプチドまたは可溶性断片、組成物、または併用療法で治療可能である。
【０１６６】
本発明のネクチンポリペプチドまたは可溶性断片、並びに開示する組成物および併用療法はまた、女性生殖系に影響を与える障害を治療するのにも有用である。例には、限定されるわけではないが、多重着床失敗／不妊症；胎児損失症候群またはＩＶ胚損失（自然流産）；子癇前症妊娠または子癇；および子宮内膜症が含まれる。
【０１６７】
皮膚または粘膜に関与する障害もまた、開示するネクチンポリペプチドまたは可溶性断片、組成物、または併用療法を用いて、治療可能である。こうした障害には、ダリエ病、毛包性角化症および尋常性天疱瘡を含む、棘細胞離開疾患が含まれる。本ネクチンポリペプチドまたは可溶性断片、組成物および併用療法でやはり治療可能なのは、ざ瘡；しゅさ性ざ瘡；円形脱毛症；アフタ性口内炎；水疱性類天疱瘡；熱傷；湿疹；多形性紅斑および多形水疱性紅斑（スティーブンズ−ジョンソン症候群）を含む、紅斑；炎症性皮膚疾患；扁平苔癬；直鎖ＩｇＡ水疱性疾患（小児期慢性水疱性皮膚炎）；皮膚弾性損失；粘膜表面潰瘍；好中球皮膚炎（スイート症候群）；毛孔性紅色粃糠疹；乾癬；壊疽性膿皮症；および中毒性表皮壊死症である。
【０１６８】
本発明は、ネクチン−３α、β、またはγ、あるいはネクチン−４と関連する医学的障害、障害または疾患を患う被験者、好ましくは哺乳動物被験者、そして最も好ましくはヒト被験者を治療する化合物、組成物、および方法を提供し、ある場合、疾患または障害は、ネクチン−１およびネクチン−２などの他のネクチンと関連する可能性がある。こうしたネクチン関連障害には、ネクチン−３および／またはネクチン−４ポリペプチドおよび結合パートナー（例えばネクチン−１または−２）間の結合によって（直接または間接的に）引き起こされるかまたは悪化される状態が含まれる。例えば、ＲＡＳシグナル伝達を改変することが示されているアファディン（ＡＦ−６）、およびＳＨ３／ＰＤＺは、ポンシンとネクチンの相互作用を架橋することによって、ＰＤＺ結合ドメインを介してネクチンと相互作用することが示されてきている。アファディンおよびポンシンはどちらも、ＲＴＫ受容体を通じた活性化において、役割を果たすことが示されてきており、ＲＴＫ受容体は最もよく知られるインスリン受容体であり、そして二方向性エフリン−エフリン受容体系である。アルファ−カテニンは、アファディンを介してネクチンに結合することが示されてきている。アルファ−カテニンは、ベータ−カテニンシグナル伝達経路改変の非存在下で、皮膚において、ＲＡＳ−ＭＡＰＫ経路を通じたシグナル伝達において、役割を果たすと関連付けられてきている。ＲＡＳ−ＭＡＰＫは、血管形成を促進する、リガンド（例えばＶＥＧＦ、ＡＮＧ、ＥＧＦ、およびベータ−ＦＧＦ）とＲＴＫの相互作用を介して、遊走内皮細胞において活性化される。ＲＴＫの接着結合補充は、そのシグナル伝達能力を非常に増加させる。これは、ＥＧＦＲ、ＥＰＨＲ類およびＶＥＧＦＲ類などの関連するＲＴＫに関して、特に立証されてきている。したがって、ＲＡＳ−ＭＡＰＫ経路は、刺激された細胞で活性化され、そしてｓｏｌネクチン３−Ｆｃ（またはｓｏｌネクチン４−Ｆｃ）のネクチン−１結合が、この経路の阻害を導き、そしてしたがって、過剰増殖状態を変調することが可能である。
【０１６９】
用語「疾病」、「疾患」、「障害」、「医学的状態」、「異常な状態」および「医学的障害」等は、交換可能に用いられる。用語「治療する（ｔｒｅａｔ）」、「治療すること（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」および「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」には、本明細書において、治癒的、防御的（例えば予防的）および対症的または寛解的治療が含まれる。こうした療法的使用のため、ネクチン−３および／またはネクチン−４ポリペプチドおよび可溶性断片、ネクチン−３および／またはネクチン−４ポリヌクレオチド、並びに／あるいはネクチン−３およびネクチン−４ポリペプチドのアゴニストまたはアンタゴニストは、既知の投与法を通じて、被験者に投与することが可能である。本発明の組成物は、天然ポリペプチド、変異体、誘導体、オリゴマー、および生物学的活性断片などの、本明細書に記載するいかなる型のポリペプチドを含有してもよい。特定の態様において、組成物は、可溶性ポリペプチド、あるいは可溶性ネクチン−３および／または可溶性ネクチン−４ポリペプチドを含んでなるオリゴマーを含んでなる。
【０１７０】
本発明の治療法または使用法を実施する際、本発明の療法剤の療法的有効量を、好ましくはネクチン−３および／またはネクチン−４ポリペプチドの活性に関連する疾患を治療するかまたは寛解するため、治療しようとする状態を有する被験者に投与する。「療法剤」には、限定なしに、ネクチン−３またはネクチン−４ポリペプチド、断片、および変異体；ネクチン−３またはネクチン−４ポリヌクレオチド、断片、および変異体；ネクチン−３またはネクチン−４ポリペプチドの可溶性型；ネクチン−３またはネクチン−４ポリペプチドまたは断片に対する抗体；ネクチン−３またはネクチン−４ポリペプチド結合パートナー（例えばネクチン−１およびネクチン−２）；ネクチン−３または−４ポリペプチド、断片、変異体、および結合パートナーで形成される複合体などのいずれかが含まれる。本明細書において、用語「療法的有効量」は、意味がある目的の利益、例えば相当する医学的状態の治療、治癒、予防または寛解、あるいはこうした状態の治療、治癒、予防または寛解率の増加を示すのに十分な薬剤組成物または方法の各療法剤または他の活性構成要素の総量を意味する。単独で投与する、個々の療法剤または活性成分に適用した場合、該用語は、その成分のみを指す。併用に適用した場合、該用語は、組み合わせて、連続して、または同時に投与するのであっても、療法効果を生じる成分の組み合わせた量を指す。本明細書において、句、療法剤の「療法的有効量を投与する」は、障害の重症度を反映する、少なくとも１つの指標において、改善、そして好ましくは持続した改善を誘導するのに十分な量および時間、前記療法剤で被験者を治療することを意味する。改善は、被験者が、１週間以上離れた、少なくとも２回の機会に改善を示したならば、「持続した」とみなされる。改善の度合いは、徴候または症状に基づいて決定され、そして決定はまた、生活の質（ｑｕａｌｉｔｙ  ｏｆ  ｌｉｆｅ）アンケートなどの、ヒト被験者に実施されるアンケートを使用することも可能である。被験者の疾病の度合いを反映する多様な指標は、治療の量および期間が十分であるかどうか決定するため、評価することが可能である。選択された単数または複数の指標に関するベースライン値は、療法剤の最初の用量の投与前に、被験者を検査することによって、確認する。好ましくは、ベースライン検査は、最初の用量投与の約６０日以内に行う。急性症状を治療するために療法剤が投与される場合、最初の用量は、傷害が生じた後、現実的にできるだけ速やかに、投与する。被験者が、選択された単数または複数の指標のベースラインを越える改善を明示するまで、ネクチン−３ポリペプチド、ネクチン−４ポリペプチド、またはそれらの可溶性断片などの療法剤を投与することによって、改善を誘導する。慢性状態を治療する際、改善のこの度合いは、少なくとも１ヶ月以上、例えば、１、２、もしくは３ヶ月またはそれ以上の期間、あるいは無期限に、この療法組成物を反復投与することによって、得られる。１から６週間の期間、または単回用量であっても、しばしば、急性状態を治療するのに十分である。傷害または急性状態には、単一用量で十分である可能性がある。治療後の被験者の疾病の度合いが、１��上の指標にしたがって、改善されているように見えたとしても、同一レベル、あるいは減少した用量または頻度で、無期限に治療を続けてもよい。ひとたび治療を減少させるかまたは中断したら、後に、症状が再出現した場合、元来のレベルで再開してもよい。
【０１７１】
当業者は、適切な投薬量は、治療しようとする障害の性質および重症度、被験者の体重、年齢、全身状態、および以前の疾病および／または治療、並びに投与経路などの要因に応じて、多様であろうことを認識するであろう。予備的用量は、動物試験にしたがって、決定することが可能であり、そしてヒト投与の投薬量決定は、標準的投薬量決定試験などの、当該技術分野に認められた慣例にしたがって行う。例えば、療法的有効用量は、最初に、細胞培養アッセイから概算することが可能である。投薬量は、剤の比活性に応じるであろうし、そして日常的な実験によって、容易に決定可能である。用量は、動物モデルにおいて、細胞培養で決定されるようなＩＣ５０（すなわち症状の最大阻害の半分を達成する試験剤の濃度）を含みつつ、毒性を最小限にする、循環血漿濃度範囲を達成するよう、処方することが可能である。こうした情報を用いて、ヒトにおいて、有用な用量を、より正確に決定することが可能である。最終的には、主治医が、個々の被験者各々を治療する、本発明のポリペプチド（例えばｓｏｌネクチン３またはｓｏｌネクチン４）または抗体の量を決定するであろう。被験者にとって最適な療法効果が得られるまで、本発明のポリペプチド、可溶性断片、または抗体の用量を投与することが可能である。本発明の方法を実施するのに用いられる、多様な薬剤組成物は、ｋｇ体重あたり、本発明のポリペプチド、可溶性断片または抗体、約０．０１ｎｇから約１００ｍｇ（好ましくは約０．１ｎｇから約１０ｍｇ、より好ましくは約０．１マイクログラムから約１ｍｇ）を含有すべきであることが意図される。本発明の１つの態様において、ネクチンポリペプチドまたは可溶性断片を、本明細書に開示する多様な医学的障害を治療するため、週１回投与し、別の態様において、少なくとも週２回投与し、そして別の態様において、少なくとも週３回投与する。注射する場合、成人用量あたり、有効量のネクチンポリペプチドまたは可溶性断片は、１−２０ｍｇ／ｍ２の範囲であり、そして好ましくは約５−１２ｍｇ／ｍ２である。あるいは、均一用量を投与してもよく、その量は、５−１００ｍｇ／用量の範囲であってもよい。皮下注射によって投与される均一用量の典型的な用量範囲は、５−２５ｍｇ／用量、２５−５０ｍｇ／用量および５０−１００ｍｇ／用量である。１つの態様において、本明細書に記載する多様な徴候を、２５ｍｇ／用量でネクチンポリペプチドまたは可溶性断片を含有するか、あるいは用量あたり５０ｍｇを含有する、注射に許容しうる調製を投与することによって治療する。２５ｍｇまたは５０ｍｇ用量は、特に慢性状態に対して、反復投与することが可能である。注射以外の投与経路を用いる場合、用量は、標準的医学的慣例にしたがって、適切に調整する。多くの場合、被験者状態の改善は、少なくとも３週間の期間に渡って、週１から３回、約２５ｍｇの用量のネクチンポリペプチドまたは可溶性断片を、あるいは少なくとも３週間、週１または２回、５０ｍｇの用量のネクチンポリペプチドまたは可溶性断片を注射することによって、得られるであろうが、望ましい度合いの改善を誘導するのに、より長い期間の治療が必要である可能性がある。不治の慢性状態では、措置は、被験者の医師によって、こうしたものが必要だと思われたならば、用量および頻度に調整を行ったうえ、無期限に続けてもよい。前述の用量は、１８歳以上の年齢のヒトである、成体被験者に関する例である。小児科被験者（年齢４−１７歳）に関しては、適切な措置は、週あたり１回以上の皮下注射によって投与される、最大用量２５ｍｇまでのネクチンポリペプチドまたは可溶性断片の０．４ｍｇ／ｋｇの皮下注射を伴う。ネクチンポリペプチドに対する抗体を、ネクチンポリペプチドアンタゴニストとして用いる場合、好ましい用量範囲は、０．１から２０ｍｇ／ｋｇ、そしてより好ましくは１−１０ｍｇ／ｋｇである。抗ネクチンポリペプチド抗体の別の好ましい用量範囲は、０．７５から７．５ｍｇ／体重ｋｇである。ヒト化抗体が好ましい。こうした抗体は、静脈内注射または投与することが可能である。
【０１７２】
本発明のネクチンポリペプチドまたは可溶性断片（例えばｓｏｌネクチン−３、ｓｏｌネクチン−４、またはそのオリゴマー）（例えば組換えおよび非組換え供給源を含む、いかなる供給源由来でもよいもの）の有効量を、生理学的に許容しうる希釈剤、キャリアー、または賦形剤などの他の構成要素と組み合わせて含んでなる組成物を、本明細書に提供する。用語「薬学的に許容しうる」は、活性成分（類）の生物学的活性の有効性に干渉しない非毒性成分を意味する。投与に適した処方には、酸化防止剤、緩衝剤、静菌剤、および処方をレシピエントの血液と等張にする溶質を含有してもよい水性および非水性無菌注射溶液；並びに懸濁剤または粘稠化剤を含んでもよい水性および非水性無菌懸濁物が含まれる。ポリペプチドは、薬学的に有用な組成物を調製するのに用いられる既知の方法にしたがって、処方可能である。これらは、単一の活性成分として、または既定の徴候に適した他の既知の活性成分と共に、薬学的に許容しうる希釈剤（例えば、生理食塩水、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、酢酸、およびリン酸緩衝溶液）、保存剤（例えば、チメロサル、ベンジルアルコール、パラベン類）、乳化剤、可溶化剤、アジュバント（ａｄｊｕｖａｎｔ）および／またはキャリアーと混合して組み合わせてもよい。薬剤組成物に適した処方には、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，  第１６版，  １９８０，  Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，  ペンシルバニア州イーストンに記載されるものが含まれる。さらに、こうした組成物は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、金属イオンと複合体化しているか、またはポリ酢酸、ポリグリコール酸、ヒドロゲル類、デキストラン等のポリマー化合物に取り込まれているか、またはリポソーム、マイクロエマルジョン、ミセル、単層もしくは多層小胞、赤血球ゴーストもしくはスフェロブラストに取り込まれていてもよい。リポソーム処方に適した脂質には、限定なしに、モノグリセリド類、ジグリセリド類、スルファチド類、リゾレシチン、リン脂質類、サポニン、胆汁酸類等が含まれる。こうしたリポソーム処方の調製は、例えば、米国特許第４，２３５，８７１号；第４，５０１，７２８号；第４，８３７，０２８号；および第４，７３７，３２３号に開示されるように、当該技術分野の技術レベルの範囲内である。こうした組成物は、物理的状態、可溶性、安定性、ｉｎ  ｖｉｖｏ放出速度、またはｉｎ  ｖｉｖｏクリアランス速度に影響を与えるであろうし、そしてしたがって、意図される適用にしたがって選択され、そのため、キャリアーの特性は、選択された投与経路に応じるであろう。本発明の好ましい態様において、ネクチンポリペプチドまたは可溶性断片の持続放出型を用いる。開示する方法で使用するのに適した持続放出型には、限定されるわけではないが、緩慢溶解生体適合性ポリマー（米国特許第６，０３６，９７８号に記載されるアルギン酸微小粒子など）に被包されたネクチンポリペプチドまたは可溶性断片、このようなポリマー（局所適用ヒドロゲル類を含む）と混合されたもの、およびまたは生体適合性半透性移植物中に入れられたものが含まれる。
【０１７３】
本発明のネクチンポリペプチド（可溶性断片を含む）は、多量体（例えばヘテロ二量体またはホモ二量体）、あるいはそれ自体または他のポリペプチドとの複合体中（例えばネクチン−４と複合体化したネクチン−１、ネクチン−２、ネクチン−３等）で、活性である可能性がある。その結果、本発明の薬剤組成物は、こうした多量体または複合体型で、本発明のポリペプチドを含んでもよい。こうした組成物は、オリゴマーとしてのいずれかの組み合わせのネクチン−１、ネクチン−２、ネクチン−３、およびネクチン−４の可溶性断片（例えばネクチン−１−Ｆｃ、ネクチン−２−Ｆｃ、ネクチン−３−Ｆｃ、ネクチン−４−Ｆｃ、ｓｏｌネクチン３−Ｆｃ、ｓｏｌネクチン４−Ｆｃ等）の調製を意図する。本発明の薬剤組成物は、ポリペプチドまたはペプチド抗原と一緒の本発明のポリペプチド（類）の複合体の形であってもよい。本発明は、同一被験者に投与される、１以上の他の薬剤と同時に、ネクチンポリペプチドまたは可溶性断片を投与することをさらに含み、各薬剤は、その療法組成物に適した措置にしたがって、投与される。「同時投与」は、組み合わせた構成要素での同時または連続治療と共に、薬剤を交互に投与する措置、または一方の構成要素を長期に投与し、そして単数または複数の他方のものを断続して投与する措置を含む。構成要素は、同一または別個の組成物中で、そして同一または異なる投与経路によって投与してもよい。本発明の薬剤組成物中に含まれてもよい構成要素の例は：Ｍ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＮＦ、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＦＮ、ＴＮＦ０、ＴＮＦ１、ＴＮＦ２、Ｇ−ＣＳＦ、Ｍｅｇ−ＣＳＦ、トロンボポエチン、幹細胞因子、およびエリスロポエチンなどの、サイトカイン類、リンホカイン類、または他の造血因子である。薬剤組成物は、ポリペプチドの活性を増進するか、あるいは治療中のその活性または使用を引き立たせるかいずれかの他の剤をさらに含有してもよい。こうしたさらなる因子および／または剤を薬剤組成物中に含み、本発明のポリペプチドまたは可溶性断片との相乗効果を生じることも、または副作用を最小限にすることも可能である。逆に、本発明のネクチンポリペプチドまたは可溶性断片を、特定のサイトカイン、リンホカイン、他の造血因子、血栓溶解または抗血栓因子、あるいは抗炎症剤と共に処方中に含み、サイトカイン、リンホカイン、他の造血因子、血栓溶解または抗血栓因子、あるいは抗炎症剤の副作用を最小限にすることが可能である。同時に投与すべき薬剤の例には、限定されるわけではないが、抗ウイルス剤、抗生物質、鎮痛剤、コルチコステロイド、炎症性サイトカインのアンタゴニスト、非ステロイド性抗炎症剤、ペントキシフィリン、サリドマイド、並びにアザチオプリン、シクロホスファミド、シクロスポリン、ヒドロキシクロロキン硫酸、メトトレキセート、レフルノミド、ミノサイクリン、ペニシラミン、スルファサラジン、および経口金、金チオリンゴ酸ナトリウム、および金チオグルコースなどの金化合物などの疾患修飾抗リウマチ薬剤（ＤＭＡＲＤ）が含まれる。さらに、本発明のネクチンポリペプチドまたは可溶性断片は、ネクチンポリペプチドに対する抗体、または天然ネクチンポリペプチドの競合的阻害剤として作用するネクチンポリペプチド由来ペプチドを含む、第二のネクチンポリペプチド／アンタゴニストと組み合わせることが可能である。
【０１７４】
いかなる有効な投与経路を用いて、ポリヌクレオチドを含んでなる組成物を含む、本発明のネクチンポリペプチドまたは可溶性断片を、療法的に投与してもよい。非経口投与には、例えば、多量（ｂｏｌｕｓ）注射によるか、または連続注入による、関節内、静脈内、筋内、病巣内、腹腔内、または皮下経路を介した、注射が含まれ、そしてまた、例えば疾患または傷害部位での局所投与が含まれる。投与の他の適切な手段には、移植物からの持続放出；エアロゾル吸入および／またはガス注入；点眼剤；膣または直腸坐薬；頬側調製；丸剤（ピル）、シロップ、ロゼンジまたはチューインガムを含む経口調製；およびローション、ゲル、スプレー、軟膏または他の適切な技術などの局所調製が含まれる。あるいは、ネクチンポリペプチドまたは可溶性断片を発現する、組換えまたは宿主細胞を移植することによって、本発明のネクチンポリペプチドまたは可溶性断片を、投与することが可能である。細胞はまた、増殖させるため、またはこうした細胞中の活性に対する望ましい効果を生じるため、本発明のポリペプチドの存在下で、ｅｘ  ｖｉｖｏで培養することも可能である。その後、処理した細胞を、療法目的のため、ｉｎ  ｖｉｖｏで導入することが可能である。別の態様において、本発明のネクチンポリペプチドまたは可溶性断片をコードするＤＮＡでの、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏのトランスフェクションによって、被験者自身の細胞が、本発明のネクチンポリペプチドまたは可溶性断片を産生するよう、誘導する。該ＤＮＡは、例えば、ネクチンポリペプチドまたは可溶性断片をコードする裸のＤＮＡまたはリポソーム被包ＤＮＡを注入することによって、あるいはトランスフェクションの他の手段によって、被験者の細胞に導入することが可能である。本発明のポリヌクレオチドはまた、細胞または生物への核酸（限定なしに、ウイルスベクターまたは裸のＤＮＡの形でのものが含まれる）の導入のための他の既知の方法によっても、被験者に投与することが可能である。本発明のネクチンポリペプチドまたは可溶性断片を、１以上の他の生物学的に活性である化合物と組み合わせて投与する際、これらは、同一のまたは異なる投与によって投与可能であり、そして同時に、別個に、または連続して投与可能である。
【０１７５】
本発明のネクチンポリペプチドまたは可溶性断片の療法的有効量を経口投与する際、該ポリペプチドは、錠剤、カプセル、粉末、溶液またはエリキシル剤の形であろう。錠剤型で投与する際、本発明の薬剤組成物は、さらに、ゼラチンまたは佐剤などの固体キャリアーを含有してもよい。錠剤、カプセル、および粉末は、本発明のポリペプチドまたは可溶性断片を約５から９５％、そして好ましくは本発明のポリペプチドまたは可溶性断片を約２５から９０％含有する。液体型で投与する際、水、石油、ピーナツ油、ミネラルオイル、ダイズ油、またはゴマ油などの動物または植物起源の油、あるいは合成油などの液体キャリアーを添加してもよい。薬剤組成物の液体型はさらに、生理学的生理食塩溶液、デキストロースまたは他の糖類溶液、あるいはエチレングリコール、プロピレングリコールまたはポリエチレングリコールなどのグリコール類を含有してもよい。液体型で投与する際、薬剤組成物は、本発明のポリペプチドまたは可溶性断片を、重量約０．５から９０％、そして好ましくは、本発明のポリペプチドを、約１から５０％含有する。
【０１７６】
本発明のネクチンポリペプチドまたは可溶性断片の療法的有効量を、静脈内、皮膚または皮下注射によって投与する際、ネクチンポリペプチドまたは可溶性断片は、発熱物質不含で非経口的に許容しうる水性溶液の形であろう。ｐＨ、等張性、安定性等を十分考慮した、こうした非経口的に許容しうる溶液の調製は、当該技術分野の範囲内である。静脈内、皮膚、または皮下注射のための好ましい薬剤組成物は、ネクチンポリペプチドまたは可溶性断片に加え、塩化ナトリウム注射剤、リンゲル注射剤、デキストロース注射剤、デキストロースおよび塩化ナトリウム注射剤、乳酸リンゲル注射剤、または当該技術分野に知られるような他のビヒクルを含有すべきである。本発明の薬剤組成物はまた、当業者に知られる、安定化剤、保存剤、緩衝剤、酸化防止剤、または他の添加物も含有してもよい。本発明の薬剤組成物を用いた静脈内療法の期間は、治療する疾患の重症度、並びに個々の被験者各々の状態および潜在的な特異体質反応に応じて、多様であろう。ネクチンポリペプチドまたは可溶性断片の各適用期間は、連続静脈内投与１２から２４時間の範囲内であろうと意図される。最終的には、主治医が、本発明の薬剤組成物を用いた静脈内療法の適切な期間に関して、決定するであろう。
【０１７７】
骨、軟骨、腱または靭帯障害を治療するのに有用な本発明の組成物に関しては、療法は、局所的に、全身性に、局在的に、あるいは移植物または装置と関連して、組成物を投与することを含む。投与する際、本発明に使用するための療法組成物は、発熱物質不含で、生理学的に許容しうる型である。さらに、組成物は、望ましくは、骨、軟骨、または組織損傷部位に搬送するため、粘稠性の型で被包または注射してもよい。創傷治癒および組織修復には、局所投与が適している可能性がある。
【０１７８】
ヒト被験者に加え、ネクチンポリペプチドまたは可溶性断片は、ペット（イヌ、ネコ、鳥、霊長類等）、飼育農場動物（ウマ、ウシ、ブタ、鳥類等）などの、非ヒト動物の疾患状態の治療に有用である。こうした例では、適切な用量は、動物の体重にしたがって決定可能である。例えば、０．２−１ｍｇ／ｋｇの用量が使用可能である。あるいは、用量は、動物の表面面積にしたがって決定され、典型的な用量は、０．１−２０ｍｇ／ｍ２、またはより好ましくは５−１２ｍｇ／ｍ２の範囲である。イヌまたはネコなどの小動物に関しては、適切な用量は０．４ｍｇ／ｋｇである。好ましい態様において、ネクチンポリペプチドまたは可溶性断片（好ましくは被験者と同じ種由来の遺伝子で構築される）は、動物の状態が改善されるまで、週１回以上、注射または他の適切な経路によって投与するか、あるいは無期限に投与可能である。
【０１７９】
本発明はまた、本明細書に開示するものを含む医学的状態の予防または療法的治療のための療法組成物製造における、ネクチン−３またはネクチン−４ポリペプチド、断片、および変異体；ネクチン−３またはネクチン−４ポリヌクレオチド、断片、および変異体；ネクチン−３またはネクチン−４ポリペプチドの可溶性型；ネクチン−３またはネクチン−４ポリペプチドあるいは断片に対する抗体；ネクチン−３またはネクチン−４ポリペプチド結合パートナー（例えばネクチン−１およびネクチン−２）；ネクチン−３または−４ポリペプチド、断片、変異体、および結合パートナーで形成される複合体等の使用にも関する。
【０１８０】
別に定義しない限り、本明細書に用いるすべての技術的および科学的用語は、本発明が属する当該技術分野の一般的な当業者の１人に通常理解されるのと同一の意味を有する。本明細書に提供する、すべての表題および小見出しは、もっぱら読みやすさのためであり、そして本発明を限定するとみなしてはならない。本明細書において、用語「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈が明らかに単数形を指示しない限り、複数形を含むよう意味する。本発明を実施するかまたは試験する際に、本明細書に記載するものに類似のまたはそれと同等の方法および材料を使用することが可能であるが、適切な方法および材料を以下に記載する。本明細書に言及するすべての刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献は、その全体が本明細書に援用される。対立する場合、定義を含め、本明細書が支配するであろう。さらに、材料、方法、および実施例は例示のためのみであり、そして限定することを意図しない。以下の実施例は、特定の態様を例示することを意図し、そして本発明の範囲を限定することを意図しない。
【０１８１】
【実施例】
実施例１
同定、クローニングおよび染色体マッピング
ヒトゲノムにおいて、既知のメンバーと重複し、そしてクラスターを形成している可能性がある、新規Ｂ７ファミリーメンバーの検索において、ＣＤ８６（Ｂ７−２）の放射ハイブリッドマップ位を調べた。この位近くにマッピングされるＥＳＴを同定し、そしてこれらのＥＳＴのＩＭＡＧＥクローンを得て、そして標準法によって、ＥＳＴの完全ヌクレオチド配列を決定した。１つのＩＭＡＧＥクローン、Ｈ０５９９９は、ネクチン−３産物の一部をコードすることが見出された。ネクチン−３ポリペプチドをコードするさらなるポリヌクレオチドを、ｃＤＮＡ端迅速増幅（ＲＡＣＥ）解析によって同定した。すべてのＲＡＣＥ産物をベクターにクローニングし、そして配列決定した。ＲＡＣＥ産物の配列解析によって、実質的に同一の配列を有する、いくつかのクローンが同定された。ＲＡＣＥ解析キットは、Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓを含む、いくつかの企業より入手可能である。ＲＡＣＥ産物比較によって見出されるコンセンサス配列に基づいて、プライマーを設計した。
【０１８２】
ＲＡＣＥ  ＰＣＲ、およびネクチン−３配列由来の放射標識核酸プローブを用いたｃＤＮＡライブラリースクリーニングの組み合わせを通じて、アミノ酸１−６以外の全ネクチン−３αおよびβコード配列を単離した。マウスネクチン−３とのデータベース比較によって、マウスタンパク質の最初の６アミノ酸を含有するキメラポリペプチドのＤＮＡを設計した。マウス配列の最初の６アミノ酸を、ネクチン−３（αまたはβ）のコード領域、またはネクチン−３（αまたはβ）の細胞外領域（シグナル配列の部分を含む）をコードするＤＮＡと融合させ、そしてこれをさらに、ヒトＩｇＧ１  Ｆｃコード領域と融合させた。哺乳動物細胞へのこれらのＤＮＡのトランスフェクションの結果、キメラシグナル配列が切断され、そして培地に、完全成熟細胞結合ネクチン−３または成熟可溶性Ｆｃ融合体が分泌された。
【０１８３】
ネクチンコンセンサス配列およびネクチン−３配列を用いて、ヒトゲノムにコードされると予測される一組のアミノ酸配列を含有するＣｅｌｅｒａ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ（メリーランド州ロックビル）のデータセットを検索し、ネクチンファミリーのさらなるメンバーを同定した。ＧｅｎＢａｎｋデータベースにおいて、さらなる検索を行った。閾値パーセント同一性を持つ分子を同定する、コンピューターアルゴリズム検索を用いて、ネクチン−３およびネクチン−１に有意な相同性を持つ分子を同定し、そしてネクチン−４と名づけた。特異的プライマーおよびテンプレートとしてヒト胎盤ｃＤＮＡを用いたＲＴ−ＰＣＲによって、この新規ネクチン分子のｃＤＮＡを単離した。
【０１８４】
１つの同定されたクローン（配列番号３３）をベクターにクローニングし、そして続いて、配列決定し、そしてネクチン−４−Ｆｃ融合構築物を構築するのに用いた。シグナル配列中のプロリンを引き起こす点突然変異（例えば配列番号３４、アミノ酸１８を参照されたい）を、成熟ポリペプチドから切り取った。
【０１８５】
ヒトネクチン−３のα、β、およびγスプライス型をコードする遺伝子は、ヒト染色体３の遺伝子マップ９８上：マーカーｓｔＳＧ２５５２、インターバルＤ３Ｓ１３０２−Ｄ３Ｓ１６１０に位置決定された。放射ハイブリッド（ＲＨ）マッピング結果は、ｓｔＳＧ２５５２に関して、Ｓａｎｇｅｒ  Ｃｅｎｔｅｒ（英国ケンブリッジ）から得て、ＧＢ４マップ上：染色体３；参照インターバルＤ３Ｓ１３０２−Ｄ３Ｓ１６１０（１２５．５−１３０．１ｃＭ）；物理的位３９５．２６  ｃＲ３０００（Ｐ＞３．００）、ＲＨｄｂ  ＲＨ１２０１１であった。
【０１８６】
ネクチン−４の開示型をコードする遺伝子は、ヒト染色体１、コンティグＧＡ＿Ｘ５４ＫＲＥ８ＤＢＣ７（本明細書に援用される）の塩基３２５００１および３７５０００の間に位置決定された。
【０１８７】
実施例２
ヒトネクチン−３転写物の発現およびヒトネクチン−３発現の制御
多様な組織供給源由来のＲＮＡ分子のノーザンブロットを調製し、そしてαおよびβ転写物両方が検出されるように、αおよびβスプライスバリアント両方に存在する細胞外ドメインを含む、ヒトネクチン−３αのコード配列にハイブリダイズする配列を用いて、探査した。プローブ配列およびハイブリダイゼーション条件は、他のヒトネクチン転写物への交差ハイブリダイゼーションを排除するように選択した。以下の表６に列挙する組織各々において、多数のヒトネクチン−３スプライス型に対応する、多数の（少なくとも２および５まで）ハイブリダイズバンドが検出された。
【０１８８】
表６
【０１８９】
【表７】
2004528008.tif 000011
【０１９０】
†：ヒトネクチン−３αに対応する部分的ＥＳＴが、他グループによって、前立腺、子宮および精巣から単離されてきている。
【０１９１】
＊＊：高レベルのｍＲＮＡ発現が、脳、心臓および胃腸管で検出された。
逆転写酵素−ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）実験もまた行って、特定の細胞種および細胞株における、ヒトネクチン−３αの発現を検出した。さらに、これらの細胞のいくつかをサイトカインまたは他の細胞刺激分子で処理して、これらの処理に反応したヒトネクチン−３転写物の発現変化に関して試験した。
実験結果を以下の表７に示す。
【０１９２】
表７
【０１９３】
【表８】
2004528008.tif 000012
【０１９４】
実施例３
ヒトネクチン−３ポリペプチドの発現および精製
ＨＩＶＴＡＴプロモーターに機能可能であるように連結した、ネクチン−３挿入物（例えば配列番号１、３、５、７、９、または１１）を含有するベクターを、ＤＥＡＥデキストラン技術によって、ＣＶ１ＥＢＮＡ／マンノース受容体細胞にトランスフェクションした。発現産物への血清ポリペプチドの混入を低下させるため、低ＩｇＧまたは血清不含条件中、標準的哺乳動物細胞培養条件下で、細胞をインキュベーションした。
【０１９５】
可溶性ポリペプチドに関しては、上清を毎週採取してプールし、そして膜貫通ネクチンポリペプチドに関しては、培養細胞から膜分画を得て、その後ポリペプチドを精製する。あるいは、ＣＨＯ細胞クローンＣＳ−９を、ｐＤＣ３１４のＣＭＶｉｅｐに並べて挿入した可溶性融合ポリペプチドをコードする領域でトランスフェクションする。メトトレキセートで増幅した後、増幅細胞プールまたはクローンを、ＩＧＦ−１を含有する血清不含培地中、懸濁中でインキュベーションする。細胞は、０．２−１．０ｍＭナブチレート（Ｎａｂｕｔｙｒａｔｅ）で誘導することが可能であり、そしてインキュベーション期間は、３５℃で１２日間までであろう。
【０１９６】
ｓｏｌネクチン−３−Ｆｃをコードするポリヌクレオチドを構築するため、配列番号６のアミノ酸１−４０４または配列番号１２の１−３６６を含んでなる細胞外ドメイン（シグナル配列を含む）をコードするヌクレオチド配列を、ヒトＩｇＧ１由来のＦｃ部分をコードする核酸に融合させた。シグナル配列を欠く融合構築物（例えば配列番号６、１２、および３１のアミノ酸１から５７は除外可能である）は、それぞれ、配列番号６および１２のアミノ酸５８−４０４または５８−３６６を含んでなるであろう。あるいは、ヒトネクチン−３分子の非常にＮ末端で、ネズミネクチン−３由来の最初の７アミノ酸を用いて、ヒト分子のＮ末端７アミノ酸を置換することが可能である。したがって、これらの構築物にコードされるｓｏｌネクチン−３−Ｆｃ（αまたはβ）は、配列番号１３および１４（それぞれｓｏｌネクチン−３α−Ｆｃおよびｓｏｌネクチン−３β−Ｆｃ）に示すような配列を含んでなった。その後、該分子の可溶性型は、配列番号１３または１４のアミノ酸５８で開始すると予測される。Ｆｃ配列は、アミノ酸４０４（配列番号１３）または３６６（配列番号１４）で開始する。
【０１９７】
ｓｏｌネクチン−４−Ｆｃをコードするポリヌクレオチド（例えば配列番号３６）を構築するため、配列番号３４のアミノ酸１−３４９を含んでなる細胞外ドメイン（シグナル配列を含む）をコードするヌクレオチド配列を、ヒトＩｇＧ１由来のＦｃ部分をコードする核酸に融合させる。シグナル配列を欠く融合構築物（例えば配列番号２４のアミノ酸１から２６）は、融合構築物において、除外することが可能であり、そしてしたがって、配列番号３４のアミノ酸２７−３４９を含んでなるであろう。したがって、ｓｏｌネクチン−４−Ｆｃポリヌクレオチドの例は、配列番号３５を含んでなり、そして配列番号３６に示すような配列を含んでなるｓｏｌネクチン−４−Ｆｃをコードする。その後、該分子の可溶性型は、配列番号３６のアミノ酸２７で開始すると予測される。Ｆｃ配列は、配列番号３６のアミノ酸３５０で始まる。
【０１９８】
上述のように生成したＦｃ−融合ポリペプチドの精製のため、細胞培養上清は、プロテインＡ多孔樹脂上を通過させた。結合Ｆｃ融合ポリペプチドは、５０ｍＭクエン酸ｐＨ３で溶出し、そして１．４Ｍ  Ｈｅｐｅｓ  ｐＨ１１で直ちに中和し、そしてピーク分画をプールし、そしてＰＢＳに対して透析した。ポリＨｉｓタグ化ポリペプチドの精製のため、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｔａｎｇｅｎｔｉａｌ  Ｆｌｏｗ  Ｆｉｌｔｅｒ装置を用いて、上清を濃縮し、そして２０ｍＭ  ＮａＰＯ４  ｐＨ７．４＋３００ｍＭ  ＮａＣｌ＋５ｍＭイミダゾールに緩衝液交換し、そしてその後、Ｃｏ２＋キレートカラム（ＴＡＬＯＮ  Ｓｕｐｅｒｆｌｏｗ）上を通過させた。結合ポリペプチドは、５００ｍＭイミダゾールを用いて溶出し、そしてピーク分画をプールし、そしてＰＢＳに対して透析した。溶出組換えポリペプチドの純度および完全性は、アリコットのＳＤＳ−ＰＡＧＥによって、それと共にＮ末端配列決定およびアミノ酸解析（ＡＡＡ）によって、監視する。内毒素混入の決定はＬＡＬアッセイによって試験する。ポリペプチドをアリコットに分け、そして凍結保存する。
【０１９９】
実施例４
ヒト内皮細胞への可溶性ヒトネクチン−３の結合
培地のみ（ＥＧＭ−１）、培地＋ヒトＴＮＦ−α（２０ｎｇ／ｍｌ）、またはＰＭＡ（５０ｍｇ／ｍｌ）中で一晩培養した、ヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を、トリプシン／ＥＤＴＡを用いて、組織培養容器から穏やかに除去し、そしてフローサイトメトリーのため、結合培地（２％  ＦＢＳ、２％正常ウサギ血清、１０％正常ヤギ血清、０．１％アジ化ナトリウムを加えたＰＢＳ）に再懸濁した。５マイクログラム／ｍｌの濃度の対照Ｆｃポリペプチドまたはヒトｓｏｌネクチン−３α−Ｆｃ（配列番号１３）を、結合培地中で、細胞に添加し、そして４℃で３０分間インキュベーションした。結合培地中で細胞を洗浄した後、１０マイクログラム／ｍｌビオチン化ヤギ抗ヒトＦｃ特異的抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ；ペンシルバニア州ウェストグローブ）を含有する結合培地中で、細胞を４℃で３０分間インキュベーションすることによって、結合Ｆｃ含有ポリペプチドを検出した。結合培地中で細胞を洗浄した後、ストレプトアビジン−ＰＥコンジュゲート（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ；オレゴン州ユージーン）を含有する結合培地中で、細胞を４℃で３０分間インキュベーションすることによって、結合ビオチン化抗ヒトＦｃ特異的抗体を検出した。ＨＵＶＥＣへのヒトネクチン−３α−Ｆｃの結合は、Ｃｅｌｌ  ＱｕｅｓｔソフトウェアおよびＦＡＣＳＣＡＮ装置（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ；カリフォルニア州サンノゼ）を用いたフローサイトメトリーによって、解析した。実験結果を以下の表に示し、そして結合は、細胞に結合した分子の量の直接の測定値である、ＭＦＩ（平均蛍光強度）として表す。
【０２００】
【表９】
2004528008.tif 000013
【０２０１】
結果は、ネクチン−３α−Ｆｃが、増殖中のＨＵＶＥＣと高強度で結合することを示す。ＴＮＦαによるＨＵＶＥＣのさらなる活性化は、ネクチン−３α−Ｆｃ結合に４０％の減少を生じる。ＰＭＡによるＨＵＶＥＣ活性化は、ネクチン−３α−Ｆｃ結合に７５％を超える減少を生じる。ＴＮＦαまたはＰＭＡによって活性化されたＨＵＶＥＣ上で観察される、ネクチン−３α−Ｆｃ結合の有意な減少は、インテグリンＣＤ５４のＨＵＶＥＣ発現と明確に対照的であり、ＣＤ５４発現は、ＴＮＦαなどの炎症性サイトカインへのＨＵＶＥＣ曝露後、顕著に増加する。炎症性シグナルによって、内皮細胞上の対構造（類）（ｃｏｕｎｔｅｒｓｔｒｕｃｔｕｒｅ（ｓ））へのネクチン−３α−Ｆｃ結合が制御されることによって、ネクチン−３α−Ｆｃが、炎症性免疫反応、組織リモデリング、および虚血／再灌流状態中の内皮細胞機能、運動性／補充、および血管外遊走において、重要な生物学的役割を果たす可能性があることが示唆される。
【０２０２】
ネクチン−３α−Ｆｃはまた、培養ヒト真皮微小血管内皮細胞およびヒト結腸癌細胞株Ｔ８４に、高強度で結合する。さらなる実験によって、ＰＭＡ刺激したＭＶＥＣに、外因性ネクチン−３−Ｆｃを添加すると、これらの細胞の遊走を阻害可能であることが示された。また、組換えネクチン−３−Ｆｃが、創傷治癒アッセイにおいて、ＰＭＡ誘導腎臓内皮細胞遊走を阻害可能であることも確定された。
【０２０３】
一過性トランスフェクションを用いた研究は、可溶性ネクチン−３−Ｆｃ（ｓｏｌネクチン３−Ｆｃ）が、ネクチン−１トランスフェクション細胞に強く結合し、そしてネクチン−２トランスフェクタントには、するとしても弱くしか結合しないことを示す。ｓｏｌネクチン３−Ｆｃは、ネクチン−３およびネクチン−４トランスフェクタントには結合しない。さらに、可溶性ネクチン−１−Ｆｃは、ネクチン−３トランスフェクタントには強く結合するが、ネクチン−１またはネクチン−２トランスフェクタントには結合しない。しかし、可溶性ネクチン−１−Ｆｃは、ネクチン−４トランスフェクタントには強く結合する。対照的に、可溶性ネクチン−２−Ｆｃは、ネクチン−１、ネクチン−２、またはネクチン−４トランスフェクタントには結合しないようであるが、ネクチン−３トランスフェクタントに結合する。可溶性ネクチン−４−Ｆｃ（ｓｏｌネクチン４−Ｆｃ）は、ネクチン−１トランスフェクタントによく結合する。
【０２０４】
内皮細胞を用いた研究によって、ネクチン−１およびネクチン−２が細胞表面上に存在することが示される。ネクチン−３は存在しないか、または非常に低いレベルで存在するか、いずれかである。内皮細胞は、ネクチン−４を発現しないようである。多様な処理後のｓｏｌネクチン３−Ｆｃ結合の増加したまたは減少したレベルが、細胞表面上のネクチン−１の増加および減少と並行して見られ、一方、ネクチン−２レベルは、処理によって不変であるようであるため、ネクチン−１およびネクチン−２に対する抗体によって、ネクチン−１が内皮細胞上の主要な結合パートナーであることが示される。したがって、ネクチン−１は、可溶性ネクチン−３−Ｆｃで見られる抗血管形成効果を仲介する細胞表面分子の、最も強い候補である。以下の表８は、相互作用データの要約を提供する。
【０２０５】
表８
【０２０６】
【表１０】
2004528008.tif 000014
【０２０７】
Ｎ／Ｄ−検出されず；＊ネクチン１Ｆｃはネクチン３およびネクチン４に特異的に結合し、一方または両方の分子は大動脈平滑筋細胞上に存在する。
【０２０８】
実施例５
可溶性ヒトネクチン−３による内皮細胞遊走の変調
ヒト真皮微小血管内皮細胞（ＨＭＶＥＣ−ｄ）は、培地（例えばＥＧＭ−２培地、Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ；メリーランド州ウォーカーズビル）中で、そしてＰＭＡ（５０ｎｇ／ｍｌ）の存在または非存在下で、一晩（１８時間）培養し、そしてその後、細胞を洗浄し、そして４μＭカルセイン色素を含有するＰＢＳ中で、２時間標識した。カルセイン標識後、４８８ｎｍで励起した後、細胞は蛍光を発し、そしてＰＢＳ中で洗浄し、基本培地（ＥＢＭ±０．１％  ＦＢＳ）中に再懸濁し、そして２４ウェルプレート（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ；ニュージャージー州フランクリンレークス）用の３ミクロン孔サイズフルオロブロックインサート中の培養に入れた。５００００のＨＭＶＥＣ−ｄ細胞は、フルオロブロックインサート中、３００マイクロリットルの基本培地中で培養し、そしてインサートの不透明３ミクロンフィルターを通じて、２４ウェルプレート中に、ＨＭＶＥＣ−ｄの遊走または移動（走触性）を引き起こす潜在能力を有するサイトカインおよび／または血清を含む培地１ｍｌを含有する２４ウェル無菌培養プレート中に、細胞を含有するインサートを入れた。フィルターを通じた細胞の遊走は、Ｗａｌｌａｃ  Ｖｉｃｔｏｒ  ＩＩマルチ標識カウンター（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ；マサチューセッツ州ウェレスレイ）を用いて、底部ウェルにおいて、５３０ｎｍで観察した蛍光発光のレベルを測定することによって検出した。遊走結果は、蛍光カウントとして表す。底部ウェルで検出される蛍光のレベルは、フィルターを通じて移動した内皮細胞数の直接の測定値である。この遊走アッセイにおいて、フルオロブロックインサート中、基本培地中で培養したＨＭＶＥＣ−ｄに２５マイクログラム／ｍｌの濃度でネクチン−３α−Ｆｃを添加すると、基本培地中で培養したＨＭＶＥＣ−ｄのＥＧＭ−２勾配誘導遊走に比較して、ＥＧＭ−２勾配（血清＋ＦＧＦ−２＋ＶＥＧＦを含有する）によって誘導される遊走／走触性が４２％阻害された（図１）。遊走のネクチン−３α−Ｆｃ阻害は、（ＥＧＭ−２中の遊走−ネクチン−３α−Ｆｃを加えたＥＧＭ−２中の遊走）／（ＥＧＭ−２中の遊走−ＥＢＭ基本培地中の遊走）ｘ１００％として計算した。底部ウェルにおいて、ＥＧＭ−２培地勾配に２５マイクログラム／ｍｌの濃度で、ネクチン−３α−Ｆｃを添加すると、ＥＧＭ−２勾配のみで培養したＰＭＡ刺激ＨＭＶＥＣ−ｄの遊走に比較して、ＰＭＡ刺激ＨＭＶＥＣ−ｄの遊走が５５％阻害された（図２）。このデータは、ネクチン−３α−Ｆｃが、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで内皮細胞遊走／走触性を減少させることが可能であると示し、そしてネクチン−３αが、ｉｎ  ｖｉｖｏで内皮細胞移動および管形成／血管形成において、役割を果たす可能性があると示す。
【０２０９】
実施例６
創傷閉鎖アッセイにおける可溶性ヒトネクチン−３の活性
平面内皮細胞遊走（創傷閉鎖）アッセイを用いて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、ネクチン−３α−Ｆｃによる血管形成阻害を定量化した。このアッセイにおいて、内皮細胞遊走は、培養細胞単層における環状創傷の閉鎖速度として測定する。創傷閉鎖速度は直線性であり、そしてｉｎ  ｖｉｖｏで血管形成を刺激する剤および阻害する剤によって、動的に制御される。Ｍａｒｔｉｎら，  １９９７，  Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  Ｃｅｌｌ  Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ  ３３：２６１に記載されるように、初代ヒト腎臓微小血管内皮細胞、ＨＲＭＥＣを単離し、培養し、そして融解後、第三継代で用いた。集密ＨＲＭＥＣ単層に、シリコンチップドリルプレスを用いて、複製環状損傷、「創傷」（直径６００−８００ミクロン）を生成した。創傷を加えた時点で、２０ｎｇ／ｍｌ  ＰＭＡ（ホルボール−１２−ミリステート−１３−アセテート）、３０マイクログラム／ｍｌ  ネクチン−３α−Ｆｃ、２０ｎｇ／ｍｌ  ＰＭＡおよび３０マイクログラム／ｍｌ  ネクチン−３α−Ｆｃの組み合わせ、４０ｎｇ／ｍｌ  ＥＧＦまたは４０ｎｇ／ｍｌ  ＥＧＦおよび増加する濃度のネクチン−３α−Ｆｃの組み合わせを含む培地（ＤＭＥＭ＋１％ＢＳＡ）を補った。顕微鏡および画像解析ソフトウェア（Ｂｉｏｑｕａｎｔ、テネシー州ナッシュビル）を用いて、時間（０−１２時間）の関数として、残った創傷面積を測定した。相対遊走速度を各剤に関して計算し、そして残った創傷面積の直線回帰によって、剤の組み合わせを、時間に渡ってプロットした。結果を図３に示す。３０マイクログラム／ｍｌのネクチン−３α−Ｆｃは、ＰＭＡが誘導する内皮遊走を阻害し、遊走速度を、未刺激細胞に関して観察されるのとほぼ同じに減少させた。ＥＧＦ誘導内皮遊走は、濃度依存方式で、ネクチン−３α−Ｆｃに阻害された。ＥＧＦ誘導内皮細胞遊走は、９マイクログラム／ｍｌのネクチン−３α−Ｆｃ濃度で、＞５０％阻害された（図４）。
【０２１０】
ネクチン−３（Ｂ７Ｌ４）およびネクチン−２（ＰＲＲ２）は、単層の創傷後、他の細胞間結合分子：アファディン、ベータ−カテニンおよびＺＯ−１と共に、細胞単層上で染色された。これらの分子は、上皮細胞で立証されるように、細胞表面の細胞間結合を特徴的に染色する。これらの創傷アッセイにおける結果は、創傷に曝露された細胞の縁でのネクチン−３の細胞表面染色である。これは、ネクチンが、接着結合以外の構造において、細胞表面に局在する、最初の立証である。ネクチン−３はまた、これらの創傷アッセイで免疫位置決定された他の細胞間結合タンパク質とも顕著に異なる。アファディンは、ネクチンの唯一の同定された結合パートナーであり、そして創傷に曝露された細胞表面に局在しない。さらに、ベータ−カテニンおよびＶＥ−カドヘリンはどちらも、他の細胞と接触する細胞表面（すなわち細胞：細胞界面）に特異的であり、そして他の細胞と接触していないかまたは創傷に曝露されている細胞の縁にはまったく存在しない。これは、ネクチンが、細胞間結合を編成する以外の能力の細胞活性において、役割を果たす最初の指標である。
【０２１１】
いくつかの細胞は、創傷を受けた単層の縁から離れて遊走する細胞の推定上の先端で、ネクチン−３およびネクチン−２に関する興味深い染色パターンを示した。ネクチン−２およびネクチン−３が、創傷に曝露された細胞の細胞表面上のみで見られるだけでなく、遊走中の細胞の先端でも集積することが明らかである。この染色は、先端領域で点状となるかまたは凝縮しているように見える。また、ネクチン−２およびネクチン−３の染色は、この表面で互いに重複するようであり、これは、機能が重複することを示す可能性がある。
【０２１２】
実施例７
内皮細胞とリンパ球の相互作用に対する可溶性ネクチンの影響
血管内皮細胞とリンパ球の相互作用に対する可溶性ネクチンの影響を決定するため、マウスリンパ球を収集し、洗浄し、そして概して、上にＨＭＶＥＣ−ｄ細胞に関して上述するように、カルセイン色素で蛍光標識する。その後、Ｆｒｅｎｅｔｔｅら（１９９５，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ．  ９２：７４５０−７４５４；１９９８，  Ｂｌｏｏｄ  ９１：１３１８−１３２４；２０００，  Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １９１（８）：１４１３−１４２２）に記載されるように、生体内顕微鏡および画像解析によって、血管内皮細胞とこれらの細胞の相互作用をアッセイする。簡潔には、蛍光標識したリンパ球を、ネクチン−Ｆｃなどの可溶性ネクチンポリペプチド（０．５−２ｍｇ／ｋｇ、レシピエントマウス体重）またはＩｇＧ  Ｆｃ対照いずれかと、室温で１０分間インキュベーションする。各Ｆｃポリペプチドを含むリンパ球懸濁物を、野生型（例えば、Ｃ５７ＢＬ／６ｘ１２９Ｓｖ  Ｆ１）レシピエントマウスに、尾静脈を通じて注入する。マウスを２．５％トリブロモエタノール０．１５ｍｌ／１０ｇで麻酔し、そしてＦｒｅｎｅｔｔｅら；１９９８，  Ｂｌｏｏｄ  ９１：１３１８−１３２４に記載されるように、腸間膜の生体内顕微鏡用に準備する。細静脈は、カルシウムイオノホアＡ２３１８７（ＰＢＳ中の１０μＭ溶液、３０マイクロリットル）の灌流によって活性化する。動物あたり１つの細静脈を２０分間記録する。中心線赤血球速度、細静脈剪断率、および臨界速度（Ｖｃｒｉｔ）を、Ｆｒｅｎｅｔｔｅら；１９９８，  Ｂｌｏｏｄ  ９１：１３１８−１３２４に記載されるように、測定する。リンパ球−内皮相互作用の定量化は、研究群に関して無知である（ｂｌｉｎｄ）研究者が行う。Ｖｃｒｉｔより遅い速度で３０ミクロンの距離を移動するリンパ球は「回転（ｒｏｌｌｉｎｇ）」としてスコア付けする。Ｖｃｒｉｔより遅い速度で生じる内皮とリンパ球のいかなる相互作用も、「束縛（ｔｅｔｈｅｒｉｎｇ）」とみなされる。２５０ミクロンの細静脈部分に渡る、分あたりの束縛または回転血小板の平均数は、１分間を１０回カウントした平均を取ることによって決定する（撮影半分各々において５回）。捕捉され、細静脈壁上を回転しないリンパ球数は、「束縛」から「回転」を引くことによって得る。
【０２１３】
あるいは、内皮とリンパ球の相互作用は、Ｔｈｏｍｐｓｏｎら，  ２０００，  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６５（１）：４２６−４３４に記載されるように、電子顕微鏡によってアッセイすることが可能である。所望により、上述のようなリンパ球反応の動的定量化後、試験血管を含有する腸間膜の一部を切除し、そして２．５％グルタルアルデヒドを含有する緩衝液（５０ｍＭカコジル酸ナトリウム、４ｍＭ  ＨＣｌ、および０．１８ｍＭ  ＣａＣｌ２）中で固定する。その後、試料を、１％酸化オスミウム（ＶＩＩＩ）中で後固定（ｐｏｓｔｆｉｘ）し、その後、メタノール中で脱水し、切片作成前にアラルダイト樹脂中に包埋する。薄切片（１μｍ）をトルイジンブルーで染色し、細静脈の位置決定を可能にする。超薄切片（０．１μｍ）を銅メッシュグリッド上にマウントし、そして透過型電子顕微鏡（Ｈｉｔａｃｈｉ  ７０００、Ｈｉｔａｃｈｉ  Ｕ．Ｋ．、Ｈａｙｅｓ，  Ｕ．Ｋ．）上で見る前に、酢酸ウラニルおよびクエン酸鉛で染色する。各血管に結合するリンパ球総数をカウントし、そして以下の分類にしたがったその位置を記録した：Ａ、細静脈管腔内；Ｂ、内皮横断中；Ｃ、内皮および血管周囲基底膜の間；Ｄ、基底膜横断中；およびＥ、細静脈の外であるが５０μｍ以内。各細静脈に関して、内皮を横断したが、まだ基底膜内にあるリンパ球の割合を、以下の等式、Ｃ／（Ｃ＋Ｄ＋Ｅ）にしたがって計算する。実験の各シリーズにおいて、少なくとも３匹の対照動物および３匹の可溶性ネクチンポリペプチド処置動物由来の組織試料を解析し、そして各動物から少なくとも３つの血管を詳細に調べる。
【０２１４】
さらに、多形核白血球などのリンパ球の活性化に対する可溶性ネクチンポリペプチドの影響、内皮細胞シートとの相互作用、および内皮関門機能における生じた変化は、Ｇａｕｔａｍら，  ２０００，  Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １９１（１１）：１８２９−１８３９に記載する多様な方法にしたがって、アッセイする。
【０２１５】
実施例８
内皮構造形成に対する可溶性ネクチンの影響
内皮細胞がＶＥＧＦに反応して管状構造を形成する能力に対する、ネクチン３−Ｆｃまたは他の可溶性ネクチンポリペプチドの影響は、Ｅｒｇｕｅｎら，  ２０００，  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  ５（２）：３１１−３２０の方法によってアッセイする。Ｐｅｐｐｅｒら（１９９２，  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｒｅｓ．  Ｃｏｍｍｕｎ．  １８９：８２４−８３１）に記載されるように、三次元Ｉ型コラーゲンゲル（Ｖｉｔｒｏｇｅｎ  １００；Ｃｏｌｌａｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．；カリフォルニア州パロアルト）を、４８ウェルクラスター組織培養プレート（Ｃｏｓｔａｒ；マサチューセッツ州ケンブリッジ）中に調製する。ヒト真皮微小血管内皮細胞を、５％  ＦＣＳを含有するＭＶ培地３００マイクロリットル中、２ｘ１０４／ウェルの濃度で、凝固ゲル上に蒔く。集密時、さらなる補充物を含まず、２％  ＦＣＳを含有する基本培地によって、培地を交換する。２４時間後、ＶＥＧＦ、ＦＧＦ−２、およびＣＥＡＣＡＭなどの血管形成因子を、単独で、または組み合わせて、ネクチン−ＦｃまたはＩｇＧ  Ｆｃ対照ポリペプチドの存在下または非存在下で、細胞に添加する。３日ごとに、位相差顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ；ドイツ・イエナ）によって写真撮影した後、因子および／またはＦｃポリペプチドを新しくする。内皮管形成は、Ｅｒｇｕｅｎら，  ２０００，  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  ５（２）：３１１−３２０に示されるように、視覚的にアッセイする。ネクチン活性がこれらの内皮構造形成に必要であるならば、可溶性ネクチン−Ｆｃポリペプチドを添加することによって、ネクチン結合相互作用を阻害すると、内皮管形成が妨げられる可能性があり、これは、こうしたネクチンポリペプチドが、血管形成および血管新生に役割を果たしていることを示す。
【０２１６】
実施例９
傷害に反応した血管組織リモデリングに対するネクチンポリペプチドの影響
傷害後の内皮回復に対するネクチン３−Ｆｃまたは他の可溶性ネクチンポリペプチドの影響は、Ｈａｙａｓｈｉら，  ２０００，  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １０２（１４）：１７１０−１７１７の方法によって、動脈傷害モデルにおいて、アッセイする。ラットを得て、そして米国衛生研究所によって指導されるように飼育する（実験動物の飼育および使用指針、ＮＩＨ刊行物第８６−２３、１９８５年改訂）。これらのラットは、ペントバルビタールナトリウム（５０ｍｇ／ｋｇ  ＩＰ）で麻酔し、そして左総頚動脈に、膨張させた２Ｆ  Ｆｏｇａｒｔｙ塞栓除去カテーテル（Ｂａｘｔｅｒ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を３回通過させることによって、傷害する。動物各々に関して、一定の度合いの血管壁傷害を得るため、バルーンの直径および引き抜く時の抵抗を、動物各々に関して、一定に維持し、そして同一にする。偽手術は、バルーン傷害を伴わない左外頚動脈の単純な結紮を伴う。
【０２１７】
動脈傷害３０分前、およびバルーン損傷後、連続７日間、可溶性ネクチンポリペプチド処置群中のラットには、４ｍｇ／ｋｇの可溶性ネクチンを腹腔内投与し、そして対照群のラットには、同用量のＩｇＧ  Ｆｃなどの対照ポリペプチドを投与する。多様な時間間隔で、ペントバルビタールナトリウムの致死用量で、動物を人道的に殺す。傷害および対側性の非傷害頚動脈を、生理学的圧下で、冷０．１モル／ｌ  ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で灌流し、その後、頚動脈を注意深く切除する。内皮裸出の存在は、死の３０分前に注入した、エバンスブルー色素（６０ｍｇ／ｋｇ  ＩＶ）での染色によって評価する。青く染色される傷害左頚動脈の中央部分は、再内皮形成されていない領域とみなされる。バルーン傷害１４日後、および５６日後、傷害および非傷害対側性頚動脈を上述のように採取し、そして両動脈の中央部を２つのリングに分ける。一方を、光学顕微鏡用に、４％パラホルムアルデヒド中で固定し、そしてパラフィンに包埋し；そして他方を走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）用に調製する。各頚動脈由来の５切片をワン・ギーソンのエラスチン染色で染色し、そして盲検方式でコンピューター化デジタル画像解析系（ＮＩＨ  Ｉｍａｇｅ）ビデオ顕微鏡（ＨＣ−３００ｉ、Ｎｉｋｏｎ）によって、形態計測学的に調べる。外弾性板内の面積（ＥＥＬ面積）、内弾性板内の面積（ＩＥＬ面積）、および管腔面積を測定する。他の面積は、以下のように計算する：中膜面積＝ＥＥＬ面積−ＩＥＬ面積；新生内膜面積＝ＩＥＬ面積−管腔面積；新生内膜対中膜比（Ｉ／Ｍ）＝新生内膜面積／中膜面積。ＥＥＬ、ＩＥＬ、および管腔の外周（長さ）もまた測定し、血管収縮を決定する。傷害１４日後の傷害動脈管腔表面の血栓形成性は、ＳＥＭによって評価する。上述のように調製した、傷害および対側性非傷害頚動脈リングは、０．１モル／ｌ  リン酸緩衝液（ｐＨ７．２）中の２．５％グルタルアルデヒドで固定し、長軸方向の片にスライスし、そしてその後、１％四酸化オスミウムで後固定する。これらは、段階的な一連のアルコールで脱水し、ＣＯ２で臨界点乾燥し、そして白金パラジウムで飛散コーティング（ｓｐｌａｔｔｅｒ−ｃｏａｔｉｎｇ）する。その後、これらをＪＳＭ−６０００（ＪＥＯＬ）ＳＥＭ、５ｋＶで調べる。血栓形成性は、両群において、傷害管腔表面に付着した血小板の数を計数することによって、定量的に評価する。１５のランダムに選択した視野のＳＥＭ写真を、ｘ２５００の拡大率で撮影する。その後、傷害表面に付着した血小板総数を、盲検方式で、写真各々において、計数する。さらに、パラフィンに包埋した隣接切片を用いて、免疫組織染色を行い、管腔表面が、管腔平滑筋細胞で覆われていることを確認する。平滑筋ミオシン重鎖アイソフォーム（ＳＭ１）１８に対するモノクローナル抗体を用いて、平滑筋細胞を同定し、そして因子ＶＩＩＩ関連抗原に対するポリクローナル抗体を用いて、内皮細胞を同定する。
【０２１８】
実施例１０
本発明のネクチンポリペプチドに結合するモノクローナル抗体
本実施例は、ネクチンポリペプチドに結合するモノクローナル抗体を調製する方法を例示する。こうした抗体生成に使用してもよい、適切な免疫原には、限定されるわけではないが、精製ネクチン−３ポリペプチド、精製ネクチン−４ポリペプチド、またはそれらの免疫原性断片が含まれる。
【０２１９】
精製したネクチン−３ポリペプチドを用い、米国特許第４，４１１，９９３号に記載されるものなどの慣用的技術を用いて、それと免疫反応性であるモノクローナル抗体を生成することが可能である。簡潔には、完全フロイントアジュバント中で乳化したネクチン−３ポリペプチド免疫原でマウスを免疫し、そして１０−１００マイクログラムの範囲の量を、皮下または腹腔内注射する。１０から１２日後、免疫した動物に、不完全フロイントアジュバント中で乳化した、さらなるネクチンポリペプチドを追加免疫する。その後、毎週から隔週（ｂｉ−ｗｅｅｋｌｙ）の免疫スケジュールで、マウスに定期的に追加免疫する。後眼窩出血または尾先端切除によって、血清試料を定期的に採取し、ドットブロットアッセイ、ＥＬＩＳＡ（酵素連結免疫吸着アッセイ）またはネクチン−３ポリペプチド結合パートナーへのネクチン−３ポリペプチドの結合阻害によって、ネクチン−３ポリペプチド抗体に関して試験する。
【０２２０】
適切な抗体力価を検出した後、陽性動物に、生理食塩水中のネクチンポリペプチドを最後に一度、静脈内注射する。３から４日後、動物を屠殺し、脾臓細胞を採取し、そして脾臓細胞をネズミ骨髄腫細胞株、例えばＮＳ１または好ましくはＰ３ｘ６３Ａｇ８．６５３（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １５８０）に融合させる。融合によってハイブリドーマ細胞が生成され、これを、非融合細胞、骨髄腫ハイブリッド、および脾臓細胞ハイブリッドの増殖を阻害するＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジン）選択培地中、マルチマイクロタイタープレートに蒔く。
【０２２１】
ハイブリドーマ細胞は、Ｅｎｇｖａｌｌら（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍ．  ８：８７１，  １９７１）および米国特許第４，７０３，００４号に開示される技術の適応によって、精製したネクチンポリペプチドに対する反応性に関して、ＥＬＩＳＡによってスクリーニングする。好ましいスクリーニング技術は、Ｂｅｃｋｍａｎｎら（Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １４４：４２１２，  １９９０）に記載される抗体捕捉技術である。陽性ハイブリドーマ細胞を、同系ＢＡＬＢ／ｃマウスに腹腔内注射して、高濃度の抗ネクチンポリペプチドモノクローナル抗体を含有する腹水を産生することが可能である。あるいは、ハイブリドーマ細胞を、多様な技術によって、フラスコまたはローラーボトル中、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで増殖させてもよい。マウス腹水中で産生したモノクローナル抗体は、硫酸アンモニウム沈殿によって、続いてゲル排除クロマトグラフィーによって、精製可能である。あるいは、ポリペプチドＡまたはポリペプチドＧに対する抗体の結合に基づくアフィニティークロマトグラフィーもまた使用可能であり、ネクチンポリペプチドへの結合に基づくアフィニティークロマトグラフィーも使用可能である。
【０２２２】
実施例１１
角膜ポケットアッセイにおける可溶性ネクチン−３−Ｆｃ（ｓｏｌネクチン３−Ｆｃ）ポリペプチドの活性
マウス角膜ポケットアッセイを用いて、ｉｎ  ｖｉｖｏで、ネクチン−３−Ｆｃポリペプチドによって、血管形成の阻害を定量化した。このアッセイでは、血管形成または抗血管形成活性に関して試験しようとする剤を、ヒドロンペレット中、緩慢放出型で固定し、これを麻酔したマウスの角膜上皮に生成した微小ポケットに移植した。血管新生は、通常は無血管である角膜への血管形成角膜縁から増殖する血管の外見、密度、および度合いとして測定した。
【０２２３】
Ｋｅｎｙｏｎら，  Ｉｎｖｅｓｔ  Ｏｐｈｔｈａｍｏｌ．  ＆  ＶｉｓｕａｌＳｃｉｅｎｃｅ  ３７：１６２５，  １９９６に記載されるようなヒドロンペレットは、ｂＦＧＦ（９０ｎｇ／ペレット）、ｂＦＧＦおよびＩｇＧ（１１μｇ／ペレット、対照）、またはｂＦＧＦおよびある範囲の濃度の試験しようとする剤（例えばｓｏｌネクチン３−Ｆｃポリペプチド）を含むスクラルファートを取り込んだ。ペレットは、６−８週齢オスＣ５７ＢＬマウスの角膜縁の内側から外側に１ｍｍ微小切開することによって生成した角膜間質微小ポケットに、外科的に移植した。５日後、ｂＦＧＦへの新生血管反応のピーク時に、ペレットを含有する経線内の原線から３５−５０°の初期角度で、Ｚｅｉｓｓスリットランプを用いて、角膜の写真を撮影した。画像をデジタル化し、そしてサブトラクティブカラーフィルター（Ａｄｏｂｅ  Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ  ４．０）でプロセシングし、ヘモグロビン含量によって、確立された微小血管を描写した。画像解析ソフトウェア（Ｂｉｏｑｕａｎｔ、テネシー州ナッシュビル）を用いて、血管新生されている角膜画像の部分、血管新生領域内の血管密度、および総角膜内の血管密度を計算した。ｓｏｌネクチン−３−Ｆｃポリペプチド用量の関数としてのｂＦＧＦ誘導角膜血管形成の阻害を決定した。
【０２２４】
データは、それぞれ配列番号１３または１４に示すようなｓｏｌネクチン３−Ｆｃ（αまたはβ）が、マウス角膜アッセイにおいて、ＦＧＦが誘導する血管形成を遮断したことを立証した。
【０２２５】
実施例１２
ネズミ移植モデルにおける、可溶性ネクチン−３−Ｆｃポリペプチドによる血管新生の阻害
１匹のマウスドナー由来の、遺伝的に同様の別のマウスの耳皮膚への異所（ｈｅｔｅｒｏｔｏｐｉｃａｌｌｙ）移植心臓組織の生存は、移植された心臓および周囲の組織による、生存および心筋機能のためのエネルギーを促進するための、適切な血管新生を必要とする。移植部位での不適切な血管系は、心臓に対する過剰な虚血、組織損傷、および組織移植の失敗を引き起こす。内皮細胞遊走および血管形成に関与する因子をアンタゴナイズする剤は、移植部位での血管形成を減少させ、それによって、移植組織機能および最終的には移植自体を限定する可能性がある。ネズミ異所心臓同系移植モデルを用いて、血管新生に対するｓｏｌネクチン３−Ｆｃポリペプチドの阻害効果を立証する。
【０２２６】
メスＢＡＬＢ／ｃ（＝１２週齢）レシピエントに、同一系統のドナーマウス由来の新生児心臓移植片を与える。ドナー心臓組織は、第０日にレシピエントの左耳介に移植し、そしてマウスを２群に分ける。対照群には、ヒトＩｇＧ（Ｈｕ  ＩｇＧ）を、一方、他方の群には、ｓｏｌネクチン３−Ｆｃポリペプチドを、どちらも腹腔内投与する。処置は、連続５日間、続ける。移植片の機能性は、移植後、第７日および第１４日の、可視拍動活性を監視することによって、決定する。ｓｏｌネクチン３−Ｆｃの用量の関数として、機能移植片の阻害を決定する。移植部位の浮腫、並びに宿主およびドナー組織血管系に対するｓｏｌネクチン３−Ｆｃの影響を可視化するため、移植心臓の組織像を調べる（例えば因子ＶＩＩＩ染色を用いる）。
【０２２７】
実施例１３
可溶性ネクチン−３−Ｆｃポリペプチドでの腫瘍の処置
ｓｏｌネクチン３−Ｆｃを、固形腫瘍の動物モデルにおいて試験する。ｓｏｌネクチン３−Ｆｃの影響は、腫瘍頻度および腫瘍増殖を測定することによって、決定する。ｓｏｌネクチン３−Ｆｃの生物学的活性はまた、カルシウム動員アッセイおよび血小板活性化、補充、または凝集を測定するアッセイなどの、当該技術分野に知られる他のｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏ、およびｉｎ  ｖｉｖｏアッセイにおいても、立証される。
【０２２８】
前述の本発明は、理解を明確にする目的で、例示および実施例によって、ある程度詳細に記載してきているが、本発明の解説に照らして、付随する請求項の精神または範囲から逸脱することなく、特定の変化および修飾を行うことが可能であることが、当業者には容易に明らかであろう。
【０２２９】
配列表
【０２３０】
【表１１】
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【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、ネクチン−３の可溶性型、ネクチン−３α−Ｆｃが、内皮細胞遊走を阻害することを示す。
【図２】図２は、ネクチン−３α−Ｆｃが、ＰＭＡが刺激する内皮細胞の遊走を阻害することを示す。
【図３】図３は、ネクチン−３α−Ｆｃが、創傷閉鎖アッセイにおいて、内皮細胞相互作用を阻害することを示す。
【図４】図４は、ネクチン−３α−Ｆｃが、ＥＧＦが誘導する内皮細胞の遊走を阻害することを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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