(57)【要約】【解決手段】本発明は、Ｐｅｎｎｉｓｅｔｕｍ　ｇｌａｕｃｕｍを微粒子銃で形質転換し、再生する方法であって、（ａ）５ｍｇ／Ｌの２，４Ｄを含有するＭＳ培地の中で、Ｐ．ｇｌａｕｃａｍの種子から胚形成カルスの形成を開始することと、（ｂ）暗所で、前記カルスを所定の期間インキュベートすることと、（ｃ）３ｍｇ／Ｌの２，４Ｄを含有するＭＳ培地上で、前記カルスを継代培養することと、（ｄ）前記継代培養したカルスを、明所下で、所定の期間インキュベートすることと、（ｅ）微粒子銃装置を用いて、予め同定されている遺伝子を含有するプラスミドＤＮＡを前記カルスに微粒子銃照射することと、（ｆ）増殖しているカルスを成長させ、小植物まで分化させることと、（ｇ）公知の技術を用いて、再生された植物中での前記予め同定されている遺伝子の発現を分析することとを備えた方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｐｅｎｎｉｓｅｔｕｍ　ｇｌａｕｃｕｍ（Ｐｅａｒｌ　ｍｉｌｌｅｔ）を微粒子銃で形質転換し、再生する方法であって、
（ａ）５ｍｇ／Ｌの２，４Ｄを含有するＭＳ培地の中で、Ｐ．ｇｌａｕｃａｍの種子から胚形成カルスの形成を開始させることと、
（ｂ）前記カルスを暗所で所定の期間インキュベートすることと、
（ｃ）３ｍｇ／Ｌの２，４Ｄを含有するＭＳ培地上で、前記カルスを継代培養することと、
（ｄ）前記継代培養したカルスを、明所で所定の期間インキュベートすることと、
（ｅ）微粒子銃装置を用いて、予め同定されている遺伝子を含有するプラスミドＤＮＡを前記カルスに微粒子銃照射することと
（ｆ）増殖しているカルスを成長させ、小植物まで分化させることと、
（ｇ）公知の技術を用いて、再生された植物中での前記予め同定されている遺伝子の発現を分析することと
を備えた方法。
【請求項２】
使用されるＰ．ｇｌａｕｃａｍの変種がＰ．ｇｌａｕｃａｍ　ｖａｒ．８４３Ｂである請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記予め同定された遺伝子が、ＧＵＳ遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、又はＭｎＳＯＤ遺伝子から選択されるマーカー遺伝子である請求項２に記載の方法。
【請求項４】
遺伝子を形質転換するために工程（ｅ）で使用される前記プラスミドが、ｐＩＧ１２１Ｈｍ及びｐＧＶ４構築物から選択される請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記ＰＩｇ１２１ＨｍプラスミドがＧＵＳ及びハイグロマイシン耐性遺伝子を与えるために使用され、ＣａＭＶ３５ｓプロモーターを含有する請求項４に記載の方法。
【請求項６】
工程（ｅ）で使用されるｐＧＶ４プラスミドがＭｎＳＯＤ遺伝子を与えるために使用され、ユビキチンプロモーターとＮＯＳターミネーターを含有する請求項４に記載の方法。
【請求項７】
工程（ｆ）で得られた前記カルスを苗条まで分化させるために使用される培地が、０．３ｐｐｍのベンジルアミノプリンを有するＭＳ基本培地である請求項１に記載の方法。
【請求項８】
苗条を形成させるために、３０日の間、前記カルスを明所に置き続ける請求項７に記載の方法。
【請求項９】
工程（ｆ）で得られた前記カルスを根まで分化させるために使用される培地が、２乃至３ｐｐｍのインドール酢酸（ＩＡＡ）、又は０．３％の活性炭を有するＭＳ培地である請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
少なくとも２日間、前記植物を滅菌水中に順応させて、滅菌土壌中に移すことをさらに備える請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記滅菌土壌が、土と砂を１：１の比率で含有する請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記カルスが、工程（ｂ）において、暗所条件下で３０日間インキュベートされる請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記カルスが、工程（ｄ）において、明所条件下で３０日間インキュベートされる請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
形質転換に使用される前記微粒子銃が、ＰＤＳ−１０００／Ｈｅ銃である請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記微粒子銃が金から選択される高速微小担体を使用する請求項１又は９に記載の方法。
【請求項１６】
前記微小担体がＤＮＡ分子、スペルミジン、ＣａＣｌ２で被覆されている請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記ＤＮＡ分子の濃度が約５μｇ／ｍＬ、０．１Ｍスペルミジン、及び２．５Ｍ　ＣａＣｌ２である請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
使用される金のサイズが１．５乃至３．０μである請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
放出板の圧力が９００ｐｓｉ、ヘリウムの圧力が１１０ｐｓｉであり、２５ｍｇ／Ｈｇの真空が銃チャンバーの中に作出される請求項１４に記載の方法。
【請求項２０】
工程（ｃ）において、９００ｐｓｉの放出板圧と１１００ｐｓｉのヘリウム圧の下、６ｃｍの距離でカルスが称さされる請求項１、及び１４〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
発明の分野
本発明は、パールミレット（Ｐｅａｒｌ　ｍｉｌｌｅｔ）の微粒子銃形質転換（ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ　ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）及び再生（ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）法、とりわけ、ストレス耐性を与えるパールミレット変種８４３Ｂの形質転換法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
背景
幅広い環境的なストレス（寒さ、オゾン、強い光、旱魃など）が穀物に損傷を与え、収穫量を著しく低減させ得る。これらの無関係な全ての悪条件下で共通して起こる現象は、生きた細胞に対して強い毒性を示し、多くの生物学的反応における副産物として産生される活性酸素種（ＡＯＳ、ａｃｔｉｖａｔｅｄ　ｏｘｙｇｅｎ　ｓｐｅｃｉｅｓ）の産生が増大することであり、酸化的ストレスと称される。活性酸素種は、大気汚染、高温、水分含量の低下などの環境的ストレスによって引き起こされる植物細胞に対する損傷に関与していることが示唆されている。ストレス条件下では、酸素ラジカルが極めて多量に発生し、これらの強い活性酸素ラジカル（Ｏ＊）は、植物細胞に対する以下の損傷：
−脂質の分解
−タンパク質の変性
−核酸の破壊
に関与している。
【０００３】
葉緑体（ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔ）は、植物組織中で有毒な酸素誘導体の主要な発生源であり得る。葉緑体は、強い照度の下で、又は他の何らかのストレス条件下で、一重項酸素を発生する。活性酸素種の蓄積は、光合成の不可避的な結果であり、最も好ましい条件下でも起こり得る。それらの毒性に対処するために、植物は、酵素的構成成分と非酵素的構成成分の両者から構成される極めて効率のよい抗酸化防御系を発達させている。植物の中では、通常、様々な酸化的問題に応じて、フリーラジカルの除去（ｓｃａｖｅｎｇｉｎｇ）に関わる多数の酵素が誘導される。しかしながら、ストレス条件が長くなると、解毒系が飽和されるので、損傷が避けられなくなる。主要な関与物質は、スーパーオキサイドディスムターゼ（ＳＯＤ）、アスコルビン酸ペルオキシダーゼ（ＡＰＸ）、及びカタラーゼである。トランスジェニック植物中のこれらのタンパク質のレベルを増大させることによって、酸化的ストレスに対する耐性を向上させることが試みられてきた。
【０００４】
主要なＡＯＳ産生部位の１つである葉緑体に対しては、保護を増強する必要があり、葉緑体中のＡＯＳを効率的に除去するために、ＭｎＳＯＤが葉緑体に誘導（ｔａｒｇｅｔｅｄ）される。真核細胞中では、ＭｎＳＯＤは核によってコードされるタンパク質であり、ミトコンドリアのマトリックス中のスーパーオキサイドラジカルを除去する。スーパーオキサイドラジカルは、多くの生物学的酸化において、細胞の全てのコンパートメント内で遍く発生する。スーパーオキサイドラジカル産生の増加は、植物の多くの生理的疾患と関連している。ストレス条件において、スーパーオキサイドラジカルが多量に発生する葉緑体にＭｎＳＯＤ酵素を誘導することによって、産生され得る任意のラジカルを除去する能力を増加させることができる。葉緑体のＲｕｂｉｓｃｏの小サブユニット輸送ペプチド（ｓｓＴＰ、ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔ　ｔｒａｎｓｉｔ　ｐｅｐｔｉｄｅ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｓｍａｌｌ　ｓｕｂｕｎｉｔ　ｏｆ　Ｒｕｂｉｓｃｏ）は単子葉植物と双子葉植物の両者に使用され、様々なトランスジェニック非色素体（ｐｌａｓｔｉｄ）タンパク質を首尾よく誘導することができる（Ｃａｓｈｍｏｒｅ　ｅｔ　ａｌ　１９８３）。
【０００５】
このことは、ストレス条件下において、ＭｎＳＯＤが劇的に誘導されることによって証明された。スーパーオキサイドラジカルは、各細胞内区画の中で、当該区画に随伴する特定のスーパーオキサイドディスムターゼをコードする核遺伝子を誘導するシグナルとして作用することができる特定の分子を誘発することも示唆されている（Ｂｏｗｌｅｒ　Ｃ　ｅｔ　ａｌ．，１９８９）。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
トランスジェニック植物におけるこれらのタンパク質のレベルを増大させ、酸化的ストレスに対する耐性を向上させることが本発明の目的である。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
この目的を達成するために、本発明は、Ｐｅｎｎｉｓｅｔｕｍ　ｇｌａｕｃｕｍ（パールミレット、Ｐｅａｒｌ　ｍｉｌｌｅｔ）を微粒子銃で形質転換（ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ　ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）し、再生する方法であって、
（ａ）５ｍｇ／Ｌの２，４Ｄを含有するＭＳ培地の中で、Ｐ．ｇｌａｕｃａｍの種子から胚形成カルス（ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｉｃ　ｃａｌｌｉ）の形成を開始させることと、
（ｂ）前記カルスを暗所で所定の期間インキュベートすることと、
（ｃ）３ｍｇ／Ｌの２，４Ｄを含有するＭＳ培地上で、前記カルスを継代培養（ｓｕｂ−ｃｕｌｔｕｒｅ）することと、
（ｄ）前記継代培養したカルスを、明所下で、所定の期間インキュベートすることと、
（ｅ）微粒子銃装置を用いて、予め同定されている遺伝子を含有するプラスミドＤＮＡを前記胚形成カルスに微粒子銃照射することと
（ｆ）増殖しているカルスを成長させ、小植物（ｐｌａｎｔｌｅｔ）まで分化させることと、
（ｇ）公知の技術を用いて、再生された植物中での前記予め同定されている遺伝子の発現を分析することと
を備えた方法を提供する。
【０００８】
使用される前記Ｐ．ｇｌａｕｃａｍの変種（ｖａｒｉｅｔｙ）は、Ｐ．ｇｌａｕｃａｍ　ｖａｒ．　８４３Ｂである。前記予め同定されている遺伝子は、ＧＵＳコード遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、又はＭｎＳＯＤ遺伝子から選択されるマーカー遺伝子である。
【０００９】
工程（ｅ）で遺伝子を形質転換するために使用されるプラスミドは、及びｐＧＶ４構築物から選択される。前記ｐＩＧ１２１Ｈｍプラスミドは、ＧＵＳ及びハイグロマイシン耐性遺伝子を与えるために使用され、ＣａＭＶ３５ｓプロモーターを含有する。前記ｐＧＶ４プラスミドは工程（ｅ）において、ＭｎＳＯＤ遺伝子を供与するために使用され、ユビキチンプロモーターとＮＯＳターミネーターとを含有する。
【００１０】
工程（ｆ）で得られた前記カルスを苗条（ｓｈｏｏｔ）まで分化させるために使用される培地は、０．３ｐｐｍのベンジルアミノプリン（ＢＡＰ、Ｂｅｎｚｙｌ　Ａｍｉｎｏ　ｐｕｒｉｎｅ）を有するＭＳ基本培地である。
【００１１】
前記カルスは、苗条を形成させるために、３０日の間、明所に置き続けた。
【００１２】
工程（ｆ）で得られた前記カルスを根（ｒｏｏｔ）まで分化させるために使用される培地は、２〜３ｐｐｍのインドール酢酸（ＩＡＡ、Ｉｎｄｏｌｅ　Ａｃｅｔｉｃ　Ａｃｉｄ）又は０．３％の活性炭を有するＭＳ培地である。
【００１３】
前記方法は、少なくとも２日間、前記植物を滅菌水中に順応させて、滅菌土壌（ｓｔｅｒｉｌｅ　ｓｏｉｌ）中に移すことをさらに備える。前記滅菌土壌は、土（ｓｏｉｌ）と砂を、１：１の比率で含有する。
【００１４】
前記カルスは、工程（ｂ）において、暗所で３０日間インキュベートされる。前記カルスは、工程（ｄ）において、明所（ｌｉｇｈｔ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ）で、３０日間インキュベートされる。
【００１５】
形質転換に使用される前記微粒子銃はＰＤＳ−１０００／Ｈｅ銃である。前記微粒子銃は、金（ｇｏｌｄ）から選択される高速微小担体を使用する。該微小担体は、ＤＮＡ分子、殺精子剤（ｓｐｅｒｍｉｃｉｄｅ）、及びＣａＣｌ２で被覆されている。前記ＤＮＡ分子の濃度は約５μｇ／μＬである。使用する金のサイズは、１．５乃至３．０μである。
【００１６】
放出板（ｒｕｐｔｕｒｅ　ｄｉｓｃ）の圧力は９００ｐｓｉ、ヘリウムの圧力は１１００ｐｓｉであり、銃チャンバーの中には２５ｍｇ／Ｈｇの真空を作出した。
【００１７】
前記カルスは、９００ｐｓｉの放出板圧と１１００ｐｓｉのヘリウム圧の下、６ｃｍの距離で、工程（ｃ）において照射を受け、最良の結果を与えた。
【００１８】
【発明の実施の形態】
発明の詳細な説明
工程１：植物材料の収集
ＩＣＭＢ−２株とも称されるパールミレット変種８４３Ｂの種子は、高度に均一な均交系で、カンザス州立大学Ｆｏｒｔ　Ｈａｙｓ　ｂｒａｎｃｈ　ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ　ｓｔａｔｉｏｎで育種したＢＫＭ２０６８から選択された。これは、雄性の無菌株８４３Ａの維持株である。これらは、商用における雑種の大規模分配および産生用に、１９８４年にＡＩＣＰＭＩＰによって推奨された。８４３Ｂは早期に成熟する（４２日）、ｄ２矮小型で、良好な分蘖を示し（４〜５円錐花序）、やや小型の円錐花序および大きな種子を有する（ＩＣＲＩＳＡＴ、ミレット研究グループ、ハイデラバード）。
【００１９】
種子を水で洗浄し、次いで表面を滅菌するために７０％エタノールで処理した。次に、蒸留水で徹底的に洗浄し、市販の漂白剤溶液５０％で２０分間滅菌した。この種子は、これらの化学薬品に過剰に曝露してもカルスを形成しないので、塩化第２水銀は役に立たないことがわかった。この種子を層流空気流中で滅菌上類推で６回徹底的に洗浄した。外植体の胚盤組織はｉｎ　ｖｉｔｒｏで増殖し、最大限に再生および器官形成する可能性を有する。
【００２０】
工程２：
胚形成カルスは２，４−Ｄ　５ｍｇ／ｌを含有するＭＳ培地（ＭＳ５）内の種子から開始させた。これらのカルス培養物は、ＢＯＤ内で２５℃で暗所に置いた。カルスを５日毎に新鮮な培地に移し、高フェノール含量のために生じるカルスの褐変を抑えた。２，４−Ｄ濃度の低い培地に３０日毎にカルスを継代培養した。ＭＳ３段階のカルスを微粒子銃を用いた（ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ）形質転換に使用した。滅菌した種子をプレート当たり３０個ずつ、ＭＳ５培地に置いた。種子は、２〜３日以内にカルス形成を開始した。胚形成カルスの硬い小さな塊が、器官形成を欠如した軟らかいカルスの塊の中に封じ込められている。胚形成カルスをＭＳ３プレートに植え継ぎ、３０日間光下に置いた。この段階が、微粒子銃照射に最も適している。ＢＡＰ　０．３％を含有する発射培地中のカルスは、非常に良好に増殖して分化して、緑色の新芽を形成する。これらのプレート光下に維持する。細かい白根が形成するまで、小植物を木炭含有発根培地に移す。成熟した小植物は２日間滅菌水中で硬くしてから、１：１土砂混合物を含有する植木鉢に移す。
【００２１】
パールミレットの胚形成カルスの微粒子銃照射に用いた方法
２種類のプラスミドを別々の実験に使用した。１）ｐＧ１２１Ｈｍ（１６．２ｋｂ）　ＧＵＳコーディング配列および、ＣａＭＶ３５ｅプロモータおよびＮＯＳターミネータの制御下でハイグロマイシン耐性をもたらすＨｐｈ遺伝子を含有する。２）ｐＧＶ４（４．２ｋｂ）ＵＢＩプロモーターおよびＮＯＳターミネータによって作動するＭｎＳＯＤ配列を有する。プロモーターによって作動するユビキチンは、他の単子葉植物のプロモータよりも比較的に強力で、活性化されている。植物内に導入された遺伝子の安定性の維持にもまた役立つ。（９）。
【００２２】
微粒子銃装置および微粒子銃照射
使用した微粒子銃銃は、Ｂｉｏｄａｄ製ＰＤＳ−１０００／Ｈｅである。これは、金またはタングステンなどの高速微粒子担体を使用してカルスまたはその他の組織に外来ＤＮＡを導入するために使用する装置である。金は植物系内で不活性および非活性化の性質であるため、我々の実験に使用する。ＤＮＡ分子をコーティングした微粒子担体を加速するためにヘリウムガスを使用する。この方法では、どんな種類の組織でも形質転換に使用することができ、擬陽性が広範囲に減少する。一時的なアッセイを容易に実施することができる。標準化実験中には、停止スクリーンから異なる距離をカルスプレートに試験した。カルスの３種類の異なる段階、すなわちＭＳ５、ＭＳ３、ＭＳ１もまた、微粒子銃照射のために試験した。使用する金のサイズは、１．５乃至３．０μである。放出板の圧力は９００ｐｓｉ、ヘリウムの圧力は１１００ｐｓｉであり、銃チャンバーの中には２５ｍｇ／Ｈｇの真空が作出される。使用したＤＮＡ分子の濃度は約５μｇ／μＬである。
【００２３】
金懸濁物
金粒子６ｍｇを量り、１００％エタノール１００μｌを添加して、１分間攪拌した。これを１００００ｒｐｍで１０秒間遠心した。上清をピペットで除去し、滅菌水１００μｌ」をペレットに添加した。攪拌し、遠心して、同工程を繰り返した。最終金懸濁物５０μｌを微粒子銃に使用した。
【００２４】
粒子コーティング方法
金懸濁物５０μｌにＤＮＡ５μｇを添加し、よく混合した。これに、０．１Ｍスペルミジン（Ｓｉｇｍａ　Ａｌｄｒｉｃｈ）２０μｌを添加し、ボルテックスミキサを低速にして混合した。２．５Ｍ　ＣａＣｌ２　５０μｌを添加して、よく混合した。この混合物を室温で１０分間静置した。１００００ｒｐｍで１０秒間遠心して、上清をピペットで除去して、１００％エタノール５０μｌをペレットに添加した。
【００２５】
微粒子銃照射
ＤＮＡを結合した微小担体を微小担体ディスクにコーティングした。エタノールを留去した後、該微小担体を容器に入れた。放出板および停止スクリーンを定位置に備え、その他の必要なパラメータもまた維持した。カルスに微粒子銃照射するまえにｏｓｍｏｔｉｃｕｍに４時間置いた。ｏｓｍｏｔｉｃｕｍは、マンニトールまたはソルビトールを３０ｇ／ｌ含有した。微粒子銃照射用物質の準備におけるこの段階は、照射する遺伝子の一時的発現の増加に役立つ。一時的発現および細胞の安定な形質転換は、標的細胞の原形質分離によって促進される（１０）。原形質分離した細胞は、粒子が細胞を通過した後原形質が押し出される傾向が少ない（１０）。微粒子銃照射後、カルスをｏｓｍｏｔｉｃｕｍに入れて暗所で１６時間置いた。該カルスをハイグロマイシン３０ｍｇ／ｌを有するＭＳ３プレートに移す（１次選択）。一時的Ｇｕｓアッセイのために、カルスをＧｕｓ緩衝液一晩移し、暗所で２４時間置いた。１次選択培地中のカルスを１５日後２次選択培地に移した（ハイグロマイシン５０ｍｇ／ｌを有するＭＳ３）。カルスの耐性コロニーがプレート内に認められるまで、２週間毎に継代培養した。
【００２６】
ＧＵＳアッセイ
ＧＵＳ活性は、０．２Ｍ　リン酸緩衝液、トリトン−ｘ　１００％、黒ラムフェニコール（１００ｍｇ　ｍｌ）、アジ化ナトリウム（１００ｍｇ　ｍｌ）、ＭｉｌｌｉＱ水中で、基質としてｘ−Ｇｌｕを使用して測定した。カルスは３７℃で２４時間インキュベートした（Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ法）。
【００２７】
ＰＣＲ分析
Ｋ．Ｅｄｗａｒｄｓ、ＪｏｈｎｓｔｏｎｅおよびＴｈｏｍｐｓｏｎ（８）の方法を使用して、ＰＣＲのためにＤＮＡを抽出した。カルスを滅菌したエッペンドルフ管に集め、抽出緩衝液を使用しないで室温で１５分間浸軟した。抽出緩衝液（２００ｍＭ　トリスＨＸＣｌ、ＮａＣｌ　２５０ｍＭ、ＥＤＴＡ　２５ｍＭ、０．５％ＳＤＳ　ｐＨ７．５）を添加して、５秒間混合した。抽出物を１３０００ｒｐｍで１分間遠心した。上清３００μｌを採取し、新しい管に入れ、イソプロパノール３００μｌを添加した。これを室温で２分間静置した。１３０００ｒｐｍで遠心して、ペレットを５分間真空乾燥した。該乾燥ペレットに、定期量のＴＥを添加し、ＤＮＡを４℃で保存した。１次選択培地で選択して３０日してからカルスをスクリーニング用に採取した。ＤＮＡを前述の方法を使用してカルスから抽出した。ＤＮＡの濃度は約５０ｎｇ／μｌであった。ＧＵＳ断片を陽性対照として使用した。ＭｎＳＯＤ断片をその他の実験系の陽性対照として使用した。８４３Ｂの形質転換しなかったカルスのＤＮＡを陰性対照として使用した。ＰＣＲ分析は、２５μｌの量（ＰＣＲ緩衝液、２．５μｌ、ＭｇＣｌ２　５０ｍＭ、ｄＮＴＰ　１０ｍＭ、フォワードプライマー　０．５μｌおよびリバースプライマー　０．５μｌ、Ｔａｑ　ＤＮＡポリメラーゼ　０．２μｌおよび鋳型ＤＮＡ　２５μｇ）で実施した。ＧＵＳフォワードプライマー：５″ＣＣＡＴＡＣＣＴＧＴＴＣＡＣＣＧＡＣＧＡ３″、ＧＵＳリバースプライマー：５″ＧＧＡＡＴＴＧＡＴＣＡＧＣＧＴＴＧＧＴＧ３″、ＳＯＤフォワードプライマー：５″ＣＴＡＣＧＴＣＧＣＣＡＡＣＴＡＣＡＡＣＡＡ３″、ＳＯＤリバースプライマー：ＴＡＧＴＣＴＧＧＴＣＴＧＡＣＡＴＴＣＴＴＧ３″をＰＣＲ分析用に使用した。Ｐｅｌｔｉｅｒ熱サイクル（ＭＪ）、最初の３分は９３℃、９３℃４秒、５０℃４５秒を４０回、最終伸長温度７２℃５分を使用して、ＰＣＲを実施した。増幅産物は、アガロース電気泳動によって分離し、臭化エチジウムで染色した。
【００２８】
ＰＣＲ産物のサザンブロット分析
ＰＣＲゲルをサザンブロットのために使用した。ゲルを３時間ブロットして、ＤＮＡをナイロン膜（ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ、ａｍｅｒｓｈａｍ）に移した。プレハイブリダイゼーションを６０℃３時間（硫酸デキストラン　５％、５ｘＳＳＣ、ＳＤＳ　０．１％）で実施し、２％ｗ／ｖ液体ブロックを使用した。ＧＵＳおよびＭｎＳＯＤ特異的プローブを使用して１６時間該膜をプローブした。該膜を１ｘＳＳＣおよびＳＤＳ１％で、６０℃で各１５分間、２回洗浄した。該膜を緩衝液Ａおよび液体ブロックの溶液で室温で１時間インキュベートした。継いで、該膜を抗フルオロセイン−ＡＰ複合抗体で１時間処理した。該膜を緩衝液Ａおよび０．３％テゥイーン−２０で各５分間、２回徹底的に洗浄した。暗所で、該膜のＤＮＡ側をＣＤＰ−ｓｔａｒ検出試薬の上に置いた。過剰な試薬をふき取り、１時間および所望するバンドを検出するために２４時間曝露曝露する前にプラスチック製の袋に密封した。使用したプローブは、ＰＡＨＣ２７プラスミドのＧＵＳの２．０８ｋｂ　Ｓａｃ１およびＢａｍＨ１断片およびｐＧＶ４プラスミドのＭｎＳＯＤ断片の９００ｂｐ　ｐｓｔ１断片であった。
【００２９】
結果：
植物の再生と照射
禾穀類中の胚盤領域（ｓｃｕｔｅｌｌａｒ　ｒｅｇｉｏｎ）は増殖が著しい領域であり、カルスを豊富に形成して、万能なカルス組織を生じ得る。パールミレット変種８４３Ｂの成熟した種子を、培地に面した胚盤部分におくと、胚盤領域から離れた培地に置いたときよりも、カルス形成速度（ｃａｌｌｕｓｉｎｇ　ｒａｔｅ）が良好であった。３０ｇ／Ｌのショ糖、１０ｍｇ／Ｌのミオイノシトール、及び様々な濃度の２，４−Ｄ（５ｍｇ／Ｌ、３ｍｇ／Ｌ、及び１ｍｇ／Ｌ）を有するＭＳ培地で、カルス形成速度は極めて効率的であった。光は、種子のカルス形成効率に対して大きな影響を与えた。ＭＳ３プレートを暗所に置き続けると、全ての穀物でそうであるように、カルスは、明所における場合よりも、より多量の石炭酸類（ｐｈｅｎｏｌｉｃｓ）の産生を開始する。このように、カルスのｂｒｏｗｎ（ｃａｌｌｉ　ｂｒｏｗｎ）及び増殖は停止するか、大幅に遅くなる。褐変現象（ｂｒｏｗｎｉｎｇ　ｐｈｅｎｏｍｅｎａ）を抑えるために、５日ごとに、新鮮なＭＳ培地の中にカルスを移し、ＭＳ３段階から後には、明所においた。ミレット組織培養における主たる欠点のひとつは、スポンジ状の柔らかな白いカルスが形成されることである。これらは、稀にしか、又は決して組織化（ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ）を行わない。胚形成カルスの硬い稠密な塊を得るために、これらのカルスは時々除去しなければならない。Ｐｅｎｎｉｓｅｔｕｍ　ｇｌａｕｃｕｍ　ｖａｒ．８４３Ｂの再生率は、３０％であった。体細胞胚形成によって得られた植物は、正常な染色体数を有しており、正常な種子群を示す（図１〜４）。
【００３０】
３つの段階のカルスを照射に使用した。これらの段階のうちで、ＭＳ３段階が最も適した段階であることが明らかとなった。効率的な形質転換のためには、カルスプレートの距離は、停止スクリーン（ｓｔｏｐｐｉｎｇ　ｓｃｒｅｅｎ）から６ｃｍが理想的であった。このことは、一過性Ｇｕｓアッセイによって証明された。カルスの中に透明な青い点が観察され、カルスの中にＧｕｓ遺伝子が存在することが確認された。
【００３１】
形質転換されたカルスの選択
ＧＵＳとＭｎＳＯＤ構築物で胚形成カルスを照射した。ハイグロマイシン含有選択培地上にこれらを置いた。１ヶ月の間に、合計２０の耐性カルスが得られた。対照プレートには、生存したカルスは存在しなかった。前記選択培地中でのカルスの増殖は、非選択培地上での非形質転換細胞株のカルスの増殖と同様であった。全てのカルスが、最大５０ｍｇ／Ｌまでの濃度のハイグロマイシンに対して耐性を有していた。
【００３２】
ＰＣＲ分析：
ランダムに選択した耐性カルスのＰＣＲ分析は、ＧＵＳとＭｎＳＯＤに対する適切なプライマーを用いて行った。実行中は、適切なパラメーターを全て維持した（材料と方法）。ＧＵＳ遺伝子の存在について分析した１２のカルスのうち、３つのカルスが、陽性対照中に、ＧＵＳ遺伝子に対応するバンドを示した（２．０ｋｂ）（図５）。ＰＣＲの結果に基づいた形質転換効率は２３％であることが分かった。ＰＣＲを繰り返して、該結果を確認した。ＭｎＳＯＤを照射したカルスのＰＣＲ分析は、分析した１４のカルスのうち１つのカルスが、陽性対照中のバンドに対応する所望のＭｎＳＯＤ遺伝子インサート（９００ｂｐ）を有することを示している。何れの場合も、陰性対照は何らのバンドも示さなかった。該結果を確認するために、ＰＣＲを繰り返した。
【００３３】
サザンブロット分析
ＧＵＳとＭｎＳＯＤ遺伝子の存在を明らかにするためのサザンブロットを行うために、前記のＰＣＲのゲルをブロットした。ブロット処理を行っても、陰性対照レーン中にはシグナルは観察されなかった。これは、パールミレットが半乾燥穀物（ｓｅｍｉ　ａｒｉｄ　ｃｒｏｐ）なので、パールミレット中には、ネイティブのＭｎＳＯＤ遺伝子が存在するためかもしれない。ＧＵＳとＭｎＳＯＤブロットの両ブロット中の陽性対照は、陽性試料レーン中のシグナルに対応するシグナルを示した。この結果は、ＰＣＲの結果と合致していた。
【００３４】
【表１】
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【００３５】
ＯＳＭ−カルスに対する浸透圧処理の時間
ＤＩＳＴ−停止スクリーンからのカルスの距離
ＴＲＡＮ−形質転換効率
表１は、パールミレト８４３Ｂの形質転換効率を示している。
【００３６】
ＧＵＳａ性は、異なる段階のカルスに対して異なる結果を与えた。６ｃｍの距離にあるＭＳ３段階のカルスの形質転換効率が最良であることが示された。
【００３７】
【参考文献】
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【００３８】
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は、ＭＳ３及びＭＳ１段階にあるパールミレット変種８４３Ｂの胚形成カルスを示す。
【図２】
図２は、０．３％ＢＡＰを含有する再生培地中のカルスを示す。
【図３】
図３は、０．３％の活性炭を含有する発根培地中に根を形成した滅菌水中の苗木を示す。
【図４】
図４は、室温中で再生した成熟パールミレット植物を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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