(57)【要約】【課題】トランスコバラミン飽和度の測定用分析方法であって、トランスコバラミンを含む液体試料を、トランスコバラミン固定リガンドが固定された多孔質基質と接触させることで、トランスコバラミンとレポーター標識トランスコバラミン結合相手とを接触させ、ついで、前記基質に固定されたレポーター標識からのシグナルを検出することにおいて、ここで、前記リガンドまたは前記結合相手のいずれか一つが、ホロトランスコバラミンに特異的に結合可能な第１のリガンドまたは結合相手を含み、さらにアポトランスコバラミンまたはホロトランスコバラミンおよびアポトランスコバラミンに結合可能な第２のリガンドまたは結合相手を含むことを特徴とする方法。
2004526973.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
トランスコバラミン飽和度の測定用分析方法であって、トランスコバラミンを含む液体試料を、トランスコバラミン固定リガンドが固定された多孔質基質と接触させることで、トランスコバラミンとレポーター標識トランスコバラミン結合相手とを接触させ、ついで、前記基質に固定されたレポーター標識からのシグナルを検出することにおいて、ここで、前記リガンドまたは前記結合相手のいずれか一つが、ホロトランスコバラミンに特異的に結合可能な第１のリガンドまたは結合相手を含み、さらにアポトランスコバラミンまたはホロトランスコバラミンおよびアポトランスコバラミンに結合可能な第２のリガンドまたは結合相手を含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
以下の工程を含む液体試料に含まれるトランスコバラミン中のトランスコバラミン飽和度の測定用の請求項１記載の方法。
（ｉ）前記試料を、トランスコバラミン固定リガンドが固定されている多孔質基質と接触させる工程。；
（ｉｉ）前記（ｉ）工程の前、間または後において、前記試料のトランスコバラミンを、トランスコバラミンに対する第１および第２のレポーター標識結合相手と接触させる工程。ここで、前記第１の結合相手は、ホロトランスコバラミンおよびアポトランスコバラミンの双方に結合可能であるか、またはアポトランスコバラミンに特異的な結合相手であって、前記第２の結合相手は、ホロトランスコバラミンに特異的な結合相手である。；
（ｉｉｉ）前記基質に固定された結合相手のレポーター標識からのシグナルを検出し、そのシグナルから前記試料中のトランスコバラミン飽和度を測定する工程。
【請求項３】
前記基質に、ホロトランスコバラミンおよびアポトランスコバラミンの双方に結合可能であるリガンドを固定し、第１のレポーター標識からのシグナルと第２のレポーター標識からのシグナルとが区別可能である請求項２記載の方法。
【請求項４】
以下の工程を含む請求項１記載の方法。：
（ｉ）液体試料に含まれるトランスコバラミンを、第１および第２のトランスコバラミン固定リガンドが異なる領域に固定された多孔質基質と接触させる工程。ここで、前記第１のリガンドは、ホロトランスコバラミンに特異的に結合でき、前記第２のリガンドは、アポトランスコバラミン、またはアポトランスコバラミンおよびホロトランスコバラミンを固定できる。；
（ｉｉ）前記工程（ｉ）の前、間または後に、トランスコバラミンのためのレポーター標識結合相手と前記試料のトランスコバラミンを接触させる工程；および
（ｉｉｉ）前記基質の異なる領域上に固定した結合相手のレポーター標識からのシグナルを検出し、そのシグナルから前記試料中のトランスコバラミン飽和度を測定する工程。
【請求項５】
ホロトランスコバラミンに特異的な結合相手またはホロトランスコバラミンに特異的に結合できるリガンドが、非ペプチドホロトランスコバラミン結合基を含む請求項２〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
ホロトランスコバラミンに特異的な結合相手またはホロトランスコバラミンに特異的に結合可能なリガンドが、モノクロナール抗体を含む請求項２〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
ホロトランスコバラミンに特異的な結合相手またはホロトランスコバラミンに特異的に結合可能なリガンドが、アポトランスコバラミンと比較してホロトランスコバラミンに対して少なくとも１０倍の特異性を持つ請求項２〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
前記シグナルが電磁放射線である請求項２〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
前記シグナルをデジタルカメラにより検出する請求項８記載の方法。
【請求項１０】
前記試料が血液または血液由来の液体である請求項２〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
前記基質がセルロースシートである請求項２〜１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
前記基質がディップスティック上にマウントされている請求項２〜１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
前記工程（ｉ）において、前記試料を前記多孔質基質の片面に塗布し、前記多孔質基質の面に対して隣接した吸水性物質により促進される毛管現象により前記多孔質基質内に吸収させる請求項２〜１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
前記レポーター標識された特異的な結合相手を自身の質量のみで標識し、表面プラズモン共鳴により検出する請求項２〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
以下のものを含むアッセイキット。
ＴＣ固定リガンドが表面上に固定されている多孔質基質；
トランスコバラミンに対する第１のレポーター標識結合相手および第２のレポーター標識結合相手。なお、前記第１の結合相手は、ホロトランスコバラミンおよびアポトランスコバラミンの双方を結合可能なものかまたはアポトランスコバラミンに特異的な結合相手であり、前記第２の結合相手は、ホロトランスコバラミンに特異的な結合相手である。
【請求項１６】
以下のものを含むアッセイキット。
異なる領域で、第１のトランスコバラミン固定リガンドおよび第２のトランスコバラミン固定リガンドが固定されている多孔質基質。なお、前記第１のリガンドはホロトランスコバラミンに特異的に結合可能で、前記第２のリガンドはアポトランスコバラミン、またはアポトランスコバラミンおよびホロトランスコバラミンを固定可能である。；
トランスコバラミンのためのレポーター標識結合相手。
【請求項１７】
さらに、洗浄剤を含む請求項１５または１６に記載のキット。
【請求項１８】
さらに、酵素レポーター標識のための基質を少なくとも１つ含む請求項１５〜１７のいずれかに記載のキット。
【請求項１９】
さらに、アポＴＣおよびホロＴＣを既知の比率で含む較正標準を少なくとも一つ含む請求項１５〜１８のいずれかに記載のキット。
【請求項２０】
さらに、前記レポーター標識からシグナルを検出可能な検出器を含む請求項１５〜１９のいずれかに記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、診断分析方法の改善、特に、トランスコバラミンの分析に関する。
【背景技術】
【０００２】
コバラミン、あるいはビタミンＢ12は、食物中に見られるビタミンＢ複合体の一部を形成する水溶性ビタミンである。その核となる分子は、必須のコバルト原子を取り囲む４つのピロールユニットのコリン環からなる。コバラミンは、動物または植物により合成することができず、腸内で食物から吸収しなければならない唯一のビタミンである。しかしながら、コバラミンは、肝臓に貯えることができる。コバラミンは、微生物により、特に、嫌気性菌および酵母菌により合成される。
【０００３】
コバラミンは、ビボでは、補酵素およびコバラミン酵素として機能し、三つの型の反応を触媒する。（ｉ）分子内転移、例えば、Ｌ−メチルマロニルＣｏＡからスクシニルＣｏＡの形成。（ii）メチル化、例えば、ホモシステインのメチル化によるメチオニンの形成、および（iii）ある微生物における、リボヌクレオチドのデオキシリボヌクレオチドへの還元。哺乳類では、（ｉ）および（ii）で特別に述べた２の酵素反応のみが、コバラミンを補酵素として必要とすることが知られている。
【０００４】
消化の過程では、ハプトコリンと呼ばれる唾液タンパク質、以下、ＨＣと表すが（このものは、また、当技術分野では、集合名詞的に、ＲバインダーまたはトランスコバラミンＩおよびIIと表される。）、それが消化管上部の中でコバラミンと結合し、複合体を形成し、それは胃を通過する。膵酵素は、前記コバラミンハプトコリン（ホロＨＣ）複合体を回腸内で消化し、コバラミンを放出し、そのコバラミンは、つぎに胃粘膜から分泌される内因子と呼ばれるタンパク質と結合し、さらなる複合体を形成する。前記コバラミン内因子複合体は、末端回腸の裏地(lining)の中で特定のレセプターと結合し、その上で、放出因子により解離させられ、そして、前記コバラミンは、回腸の膜を通して、血管走行の中に活発に輸送される。
【０００５】
コバラミンは、検出可能な量の遊離形態では身体内を循環しない。おそらく、９９％ほどのコバラミンは、トランスコバラミンまたはアルブミンの一つと結合している。
【０００６】
コバラミンを目標とする組織に輸送する原因であると信じられているタンパク質は、重要な微量タンパク質であるトランスコバラミンII（以下、トランスコバラミンまたはＴＣとする）であり、それなしでは、コバラミンは、細胞膜を通過することができない。この重要な代謝機能にもかかわらず、血清中の約６〜２５％のコバラミンしかＴＣに結合せず、かつ、ほとんどは、ＨＣにより運ばれる。ＴＣは、血清、精液および脳脊髄液(cerebro-spinal fluid)中に最初に発見された４５ｋＤａの単一鎖のポリペプチドである。コバラミンに結合したＴＣあるいはホロＴＣは、細胞膜上の特定のレセプターに付着し、そして、いったん結合すると、前記ホロＴＣの複合体は、飲作用により細胞内に取り込まれる。
【０００７】
ＴＣは、肝臓、脈管内皮、腸細胞(enterocyte)、マクロファージおよび繊維芽細胞により合成され、主としてアポＴＣの形態で、すなわち、結合したコバラミンなしで循環する。このものの半減期は、ほぼ９０分と短い。
【０００８】
血漿中の全コバラミンの４分の１未満がＴＣと結合している。残りは、上に述べた他のトランスコバラミンまたはアルブミンと結合している。
【０００９】
コバラミンは食物から吸収しなければならないが、胃機能障害につながる任意の状態、例えば胃腸炎、または胃萎縮につながる状態、または機能的ハプトコリン、内因子、放出因子、ＴＣもしくはＴＣレセプターを生産できないことは、コバラミンの吸収障害および結果としての欠乏症につながり得る。
【００１０】
ある個体群の個体、例えば、高齢の妊娠した女性、慢性または急性の胃腸病患者、自己免疫疾患に苦しむそのような個体、悪性貧血およびエイズに苦しむ家族歴を持つそのような個体は、特に、コバラミン欠乏症に陥りやすい。
【００１１】
コバラミン欠乏症の臨床症状は、多様でありかつ多数であるが、しかし、根本的には、貧血、巨赤芽球の造血(haematopoiesis)ならびに神経系統の機能的および構造的な障害に関係している。コバラミン欠乏症と診断された個体の約６０％は貧血症であるが、しかし、多くの場合、神経症状だけが、観測される臨床症状である。約１０％の患者は、精神医学的な症状を示し、かつ、約４０％は、神経的および精神医学的の両方の症状を示す。
【００１２】
あるコバラミン欠乏症の現われ、特に、精神神経性効果は、早急に発見され、かつコバラミン療法により苦痛を和らげなければ元に戻せないので、コバラミン欠乏症の早期診断は、患者のための良い予想を確立するために重要である。
【００１３】
それゆえ、個体のコバラミンレベルを、適切かつ効果的な方法で、その個体がコバラミン欠乏症に苦しむか否かを確立する観点から、正確に評価することが望ましい。
【００１４】
血漿中コバラミン、すなわちＨＣまたはＴＣと結合したコバラミン（およびコバラミン類似物質）の総量の測定が、コバラミン欠乏を評価するための試みとして使用されてきている。この技術は、正常であると考えられる個体群における広範囲の濃度分布につながり、それゆえに、広い基準範囲を生み出す。個体に関しては、しかしながら、その個体について正常であると考えられる有効なコバラミンの範囲は極めて狭い。代謝活性コバラミンの濃度が自身の基準範囲から外に移動した個体であっても、その血漿中コバラミン総含有量は、個体群にとって正常であると考えられる範囲内に止まることが観測されたことがある。そのような環境下では、コバラミン欠乏症は、発見されないまま進行する可能性がある。そのような信頼性に欠ける方法は、明らかに望ましくなく、また、そのような血清または血漿中のコバラミンの測定は、診断上、低い感度および特異性しか持たないことがよく認識されている。
【００１５】
微生物学的定量は、成長についてコバラミンに依存する微生物に関係し、血漿中コバラミン濃度を測定するために用いられるが、適切な基準範囲を確立することの困難さに加え、これらの方法は、コバラミンの抽出と変換とを必要とし、それは、実験室での迅速なスクリーニングのためには、非常に時間を消費し、煩雑であり、全体として適切でない。
【００１６】
コバラミン欠乏を評価するために他にとり得る方法は、血漿中の代謝物質の蓄積を測定することに関係し、コバラミンを、その変換として必要とする。血漿中マロン酸メチルおよび血漿中ホモシステインのレベルは、コバラミン欠乏症の個体においては増加し、ビタミンＢ12欠乏症との相関関係についての候補物質分子であることを実証している。しかしながら、ホモシステイン評価に基づいた方法は、複雑であり、実用的でなく、不十分な特異性および感度しか示さないことが示されている。マロン酸メチルの測定に基づく方法は、正確で信頼できるが、扱いにくく、かつ、ガスクロマトグラフィーおよびマススペクトルを組み合わせた分析を必要とし、かつ、それゆえに高価であり、これもまた日常的な臨床のスクリーニングには適していない。
【００１７】
血漿中コバラミンの総量に対するものとして、ＴＣに結合したコバラミンを測定することもまた、コバラミン欠乏症の可能性についての信頼できる臨床上の検出手段（indictor）を提供するであろうことが提案されている（例えば、非特許文献１、非特許文献２、特許文献１参照。）。しかしながら、ホロＴＣ濃度を定量するためのそのような努力は、今日までは、ほとんど間接的であり、ホロＴＣ濃度を、血漿中コバラミンの総量とＴＣを除去した血漿中のコバラミン濃度との差として確立している。
【００１８】
そのようなＴＣの除去は、硫酸アンモニウム（例えば、非特許文献３参照。）、マイクロシリカ（例えば、非特許文献４、非特許文献５参照。）、マイクロファイングラス(microfine glass)（例えば、非特許文献６参照。）または固定化された抗ＴＣポリクローナル抗体（例えば、非特許文献７参照。）への吸着によって成し遂げられる。全血漿中およびＴＣ除去フラクション(depleted fraction)中のコバラミン濃度は、ラジオイムノアッセイまたは酵素イムノアッセイのような当業者に周知の方法により行われる。これらの方法は、自動化のまたは非自動化の日常的なスクリーニングには適していない。なぜならば、これらは、複雑で、時間がかかり、かつ、使用される前記吸着材の低い程度の特異性が、ホロＴＣとホロＨＣの不十分な分離につながり、さらに、ホロＴＣを多く見積もることにつながるからである。前記吸着材のロット間ばらつきはさらなる誤差を導き、かつ、さらに重要なことには、一の大きな体積から他の大きな体積の引き算は、受け入れられない不正確さおよび非信頼性につながる
ＴＣを評価するための他の試みは、ＴＣを、ＨＣを含む他の血漿成分と、その親油性を利用して分離することに関係する。そのように、ヘパリンセファロース、シリカゲルまたはセルロースをそれぞれ用いて、ＴＣをＨＣと分離する方法を開示されている（例えば、非特許文献８、非特許文献９、非特許文献１０参照。）。これらの方法は、しかしながら、前記と同じ吸着材に頼るため、前記間接的方法と同じ欠点により損害を被る。また、ホロＴＣの低い血漿中濃度は、これらの方法を、すでに存在するコバラミン定量方法と組み合わせることを不適切にする。ホロＴＣの正常範囲は３５〜１６０ｐＭであり、３５ｐＭ未満の数値は、一般的に、コバラミン欠乏症を示すと考えられている。血漿中コバラミンのためのもっとも日常的な方法について報告されている分析感度は、約４０ｐＭであるが、実際問題として、それはしばしばはるかに高く、典型的には約９０ｐＭである。このゆえに、正常なホロＴＣの血漿中レベルは、前記コバラミンの定量のための日常的な方法における前記感度限界よりも下かまたはその近くである。
【００１９】
ＴＣに結合したコバラミンを定量するための方法として最近認識された、あるいは最も正確であるかもしれない方法は、ＴＣをシリカに吸着させることと、つぎに、コバラミンを含む前記結合したフラクションを、イムノアッセイ（例えば、非特許文献１１参照。）、または微生物学的検定法により検定することに関係し、後者の方が一見すると、最良の結果を生むように見える。この方法は、わずか２０の検定を実行するのに、丸１労働日を必要とする。これは、非常に高価につき、かつ、非実用的であり、日常的な臨床上の診断の研究室における調査にほとんど適していない。
【００２０】
ホロＴＣ濃度を測定するための代替方法として、例えば、無細胞試料を、ＴＣに特異的な抗体が固定された磁化粒子、ならびに非重複、非固定、放射性同位体で識別したホロＴＣに特異的な抗体と接触させる等がある（例えば、特許文献２参照。）。前記粒子を磁界により分離して洗浄し、それらの放射能を測定することで、前記試料のホロＴＣ含量の測定する。しかしながら、この方法は、較正を必要としているため、医師または医師助手による患者への治療の時よりも、臨床学的実験での使用により適している。
【特許文献１】
ＵＳ４，６８０，２７３号
【特許文献２】
ＷＯ  ００／１７６５９号
【非特許文献１】
Herbert et al. (1990) Am. J. Hematol. 34:132-139
【非特許文献２】
Wickramasinghe and Fida (1993) J. Clin. Pathol. 46:537-539
【非特許文献３】
Carmel (1974) Am. J. Clin. Pathol. 62:367-372
【非特許文献４】
Herzlich & Hubert (1988) Lab. Invest. 58:332-337
【非特許文献５】
Wickramasinghe & Fida (1993) J. Clin. Pathol. 46:537-539
【非特許文献６】
Vu et al. (1993) Am. J. Hematol. 42:202-211
【非特許文献７】
Lindemans et al. (1983) Clin. Chim. Acta 132:53-61
【非特許文献８】
Kapel et al. (1988) Clin. Chim. Acta 172:297-310
【非特許文献９】
Benhayoun et al. (1993) Acta Haematol. 89:195-199
【非特許文献１０】
Toft et al.(1994) Scand. J. Clin. Lab. Invest. 54:62
【非特許文献１１】
Kuemmerle et al. (1992) Clin. Chem. 38/10: 2073-2077
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２１】
以上のことから、現在、治療の時で簡単かつ実施可能なホロＴＣのアッセイが必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【００２２】
本発明は、そのような単純なアッセイを以下のようにして行うことができる方法を提供する。ホロＴＣ含量だけでなくＴＣ飽和量、すなわちホロ型のＴＣの割合を、２つの標識した特異的結合相手、具体的には１つはホロＴＣのためのもの、他方はアポＴＣ、もしくはホロＴＣおよびアポＴＣのためのものを使用して、それら２つのラベルからのシグナル比を測定することで行うことができる方法を提供する。さらには、そのようなアッセイは、体積に依存しないため、使用する液体試料（例えば、体液）の量を正確に測定する必要がない。これは、治療時に使用するにあたって大きな利点である。
【００２３】
すなわち、一つの形態から見ると、本発明は、トランスコバラミン飽和度の測定用分析方法であって、トランスコバラミンを含む液体試料を、トランスコバラミン固定リガンドが固定された多孔質基質と接触させることで、トランスコバラミンとレポーター標識トランスコバラミン結合相手とを接触させ、ついで、前記基質に固定されたレポーター標識からのシグナルを検出することにおいて、ここで、前記リガンドまたは前記結合相手のいずれか一つが、ホロトランスコバラミンに特異的に結合可能な第１のリガンドまたは結合相手を含み、さらにアポトランスコバラミンまたはホロトランスコバラミンおよびアポトランスコバラミンに結合可能な第２のリガンドまたは結合相手を含むことを特徴とする方法。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２４】
一つの実施形態において、本発明の分析方法は、以下の工程を含む。
（ｉ）トランスコバラミンを含む液体試料を、トランスコバラミン固定リガンドが固定されている多孔質基質と接触させる工程。
（ｉｉ）前記（ｉ）工程の前、間または後において、前記試料のトランスコバラミンを、トランスコバラミンに対する第１および第２のレポーター標識結合相手と接触させる工程。ここで、前記第１の結合相手は、ホロトランスコバラミンおよびアポトランスコバラミンの双方に結合可能であるか、またはアポトランスコバラミンに特異的な結合相手であって、前記第２の結合相手は、ホロトランスコバラミンに特異的な結合相手である。
（ｉｉｉ）前記基質に固定された結合相手のレポーター標識からのシグナルを検出し、そのシグナルから前記試料中のトランスコバラミン飽和度を測定する工程。
【００２５】
また、前記基質は、ホロトランスコバラミンに特異的な結合相手であるリガンドが固定された第１の領域、およびアポトランスコバラミンに特異的な結合相手であるリガンドもしくはホロトランスコバラミンおよびアポトランスコバラミンの双方に固定可能であるリガンドが固定された第２の領域を持ち、さらに前記工程（ｉｉｉ）は、前記第１の領域および前記第２の領域からのシグナルを検出することを含む。
【００２６】
特異的な結合相手またはリガンドは、その特定の化学構造またはコンホメーションの効力によって、かつ、単に体液由来の試料中の多くの成分に共通するであろう一般的な物理化学的性質（例えば、親油性）によってでなく、ＴＣ（すなわち、アポＴＣおよび／または必要に応じてホロＴＣ）と結合するものを意味する。
【００２７】
前記特異的結合相手またはリガンドは、例えば、抗体、抗体フラグメント、単一鎖の抗体、抗体フラグメント二量体、三量体もしくは四量体、またはアポＴＣおよび／またはホロＴＣに親和性を有する化合物、より具体的には、細胞表面の受容体、ポリペプチド、オリゴペプチド、オリゴヌクレオチド、小有機化合物等である。ほかの特異的な結合相手またはリガンドは、コンビナトリアルケミストリー、ファージ提示ライブラリまたはＤＮＡもしくはＲＮＡの特異的結合配列から選択してもよい。
【００２８】
前記結合リガンドが抗体である場合、それはポリクローナル抗体であっても良いが、好ましくはモノクローナル抗体である。モノクローナル抗体の方がポリクローナル抗体よりもはるかに大きい特異性および均質性を持たせて生産することができ、かつ、体液の他の成分、特に他のトランスコバラミンおよび適切には前記標的分析物の他のコンホメーションすなわちアポ形態との交差反応性を減少させる。モノクローナル抗体により与えられる均質性および再生産性は、ポリクローナル抗体のそれと比べて、検定において前記分析物がそのように低い濃度であるときに必要なより優れた精度を確立する。その他、それは、抗体フラグメント、例えば、Ｆ（ａｂ）、Ｆ（ａｂ’）2またはＦ（ｖ）断片であっても良い。前記抗体または抗体フラグメントは、一価または二価であって良く、かつ、ハイブリドーマ技術により生産されても合成由来でも、また、組替えＤＮＡ技術または化学合成により発生させても良い。一本鎖抗体または他の抗体誘導体もしくは疑似物質を、例えば使用することができる。前記抗体は、必要に応じて、前記アポＴＣタンパク質および／またはホロＴＣタンパク質のあらゆるエピトープ、構成要素または構造により産生してもよい（directed or raised）。
【００２９】
本発明の分析方法に使用するホロＴＣに特異的な結合相手またはリガンド（ｓｂｐ）は、（アポＴＣと比較して）ホロＴＣに対して少なくとも１０倍の特異性を持つ必要があり、好ましくは少なくとも５０倍であって、少なくとも１００倍であることがより好ましい。すなわち、アポＴＣの量が過剰で、それが少なくとも１０倍であっても、前記ホロＴＣｓｂｐの多くが、アポＴＣよりもホロＴＣに結合する必要があるということである。それゆえ、宿主動物での抗体産生による選択よりもむしろ、ビトロの方法を使用して前記ホロＴＣｓｂｐを選択することが好ましい。したがって、候補ホロＴＣｓｂｐのスクリーニングは、ビトロのライブラリ、例えば、ファージ提示抗体（特に、単一鎖の抗体）のライブラリ、オリゴヌクレオチドライブラリまたは化学ライブラリを用いて行うことが好ましい。また、ホロＴＣに対する前記ホロＴＣｓｂｐの親和性は、ナノモーラー濃度のホロＴＣを検出できることが好ましい。
【００３０】
例えば、候補ホロＴＣｓｂｐは、基質（例えば、ビーズまたはシート）上にホロＴＣを、例えば、アミド結合により固定して選択してもよいし、過剰な固定されていないアポＴＣの存在下で、前記ライブラリをピックアップしてもよい。ついで、前記基質を完全に洗浄して、ホロＴＣに結合した候補を解離し、前記ライブラリの型にあった従来の手法により同定してもよい。
【００３１】
ついで、候補をアポＴＣへの交差反応試験をし、アポＴＣよりもホロＴＣに対して十分な選択性を有する候補を選択してもよい。また、候補ホロＴＣｓｂｐをスクリーニングして、ＨＣに交差反応するｓｂｐを除外することが望ましい。
【００３２】
最も好ましくは、前記ホロＴＣｓｂｐの結合領域を非ペプチド、例えば、有機小分子またはオリゴヌクレオチド（例えば、２０〜５０ｍｅｒ）とすることである。
【００３３】
候補アポＴＣｓｂｐを同様の方法で選択してもよい。しかしながら、ホロＴＣｓｂｐおよび非重複ＴＣｓｂｐ（すなわち、アポＴＣおよびホロＴＣのどちらとも結合するもの）を使用することが好ましく、ＴＣｓｂｐは、下記文献等によりよく知られている（例えば、Quadros et al., Biochem. Biophys. Res. Commun.222: 149-154 (1996)およびMcLean et al., Blood89: 235-242 (1997)を参照。）。
【００３４】
ある候補ホロＴＣｓｂｐおよびＴＣまたはアポＴＣｓｂｐを一旦選択して、それらを従来の方法によりレポーター標識してもよい。
【００３５】
前記レポーターは、異なるリガンドが前記基質の異なる領域に結合していれば、同一であってもよい。しかしながら、異なるレポーターを使用することがよく、すなわちそれらのシグナルが識別できることが好ましい。
【００３６】
前記ｓｂｐのレポーター基は、いかなる従来のレポーター、例えば、発光体または吸収体、特に、電磁放射線または電磁吸収体、酵素であってもよく、放射性同位体で標識すること等も少なからず好ましい。酵素レポーター基を使用する場合、検出するシグナルは、前記酵素により触媒された反応からのシグナル、例えば、発行光である。すなわち、前記検出するシグナルは、直接または間接的に前記レポーター基により生じるものであればよい。
【００３７】
本発明においてｓｂｐの標識に使用する検出可能な発色化合物または蛍光化合物の適当な例としては、アントラキノン、アゾ染料、アジン染料、例えば、オキサジンおよびチアジン、トリアジン、天然型顔料、例えば、ポルフィルン、フィコビリタンパク質、例えば、フィコエリチンおよびフィコキアニン、クロロフィルおよびその類似体ならびに誘導体、カロチノイド、アクリニジン、キサンチン、例えば、フルオレセインおよびローダミン、インディゴ染料、チオキサンチン、クマリン、ポリメチン、例えば、ジアリルメチンならびにトリアリルメチンおよびフタロシアニンならびに金属フタロシアニンの誘導体があげられる。
【００３８】
同様に、広範囲の放射性化合物をシグナル形成標識として使用してもよく、中でも、ヨウ素１２５標識した化合物を使用してもよい。
【００３９】
あるいは、前記ｓｂｐと、化学発光シグナルを生成できる天然化合物または合成化合物とを結合させて、前記シグナルを既知の方法により分析してもよい（例えば、Cormier, M.J. et al.; Chemiluminescence and Bioluminescence, Plenum Press, New York 1973参照。）。適当な化学発光化合物には、ルシフェリン、シュウ酸エステル、１，２−ジオキソエタン、ルミノールまたはそれらの誘導体等があげられるが、これらに限定されない。適当であれば、過酸化水素、酵素、例えば、ルシフェラーゼ、アルカリフォスファターゼまたは別の化学薬品を使用して、使用したシグナル発生分子からの化学発光シグナルを発生させてもよい。
【００４０】
複数のレポーター分子、例えば、酵素、発色団、蛍光団等を持つ高分子の「土台」に、前記ｓｂｐを結合することが好ましい。このようにすると、前記シグナルを、例えば、数百倍に増幅することができる。高分子の土台としては、例えば、デキストラン（例えば、アミデックス）、ポリエチレングリコールおよびデンドリマー（例えば、スターバーストデンドリマー）等が含まれる。
【００４１】
本発明において、強力な陰イオン性シグナルを発生する分子を使用することは好ましくない。その理由としては、それらは試料中に存在する血清タンパク質、例えば、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）等と結合する傾向があるからである。使用するものの特に適当な例としては、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミンＢまたはＮ−（レソルフィン−４−カルボニル）ピペリジン−４−カルボン酸−Ｎ−ヒドロキシスクシニイミド−エステル）（ｒｅｓｏｓ）等があげられる。
【００４２】
前記レポーターが発光体または光吸収体である場合、前記レポーターが、前記シグナルを増幅させるために複数の発色団または蛍光団を含むことが特に好ましい（特に、前記標識したホロＴＣｓｂｐ）。特に好ましいレポーター群の一つは、時間遅延蛍光可能なレポーター群であって、別のものとしては誘引発光可能な群である。レポーターの具体例としては、β−ガラクトシダーゼおよびチキンアルカリフォスファターゼ等があげられる。
【００４３】
親和性分子、例えば、分離を目的とした抗体および抗体フラグメントを、例えば、前記リガンドを結合または共役させることにより、既知の固体担体または基質に固定することは、当業者に知られている。また、前記固体担体または基質は、従来幅広く使用されて、分離または固定することが提案されており、当業者に既知の方法により使用することができる。そのような固相は、例えば、小片、シート、ゲル、フィルター、膜、ファイバーまたはキャピラリー等の形状をとっていてもよい。前記リガンドを前記多孔質基質に結合させる方法は、大変よく知られていて、文献に広く記載されている。
【００４４】
本発明の方法において、前記基質は、多孔質シートまたは多孔質小片（例えば、セルロース系材料、好ましくはニトロセルロース）であることが好ましく、非多孔質担体上に貼り付けることが特に好ましく、また、適宜、毛細管現象により前記基質への前記液体試料の吸収を促進させるために背後に吸収支持剤を併用してもよい。すなわち、ある一つの好ましい実施形態において、好ましくは、吸収層に支持されている前記基質層は、ディップスティック上にマウントされている。別の好ましい実施形態において、好ましくは吸収層に支持されている前記基質層が、前記基質層の露出した表面に前記液体試料を適用し、前記基質層からのシグナルを読み取るための孔をもつプラスチックのケージングに担持されている。
【００４５】
シグナル発生は、必要に応じて、選択した標識に適した方法、例えば、光や酵素標識用基質を曝露することにより行うことができ、シグナルの検出は、前記放出されたシグナルを検出するために適当な検出器、例えば、放射能検出器または光検出器により行うことができる。特に、前記シグナルが光シグナルであれば、デジタルカメラを前記検出器として使用することが好ましく、必要であれば、フィルター、プリズムまたは前記検出器を所望の波長帯に到達させることを確実にするための別の手段を付していてもよい。
【００４６】
前記２つの標識したｓｂｐからのシグナルの検出を、同時または連続して行ってもよいが、同時検出が好ましい。
【００４７】
検出シグナル操作を行い、ＴＣ飽和度の定量的指標、半定量的指標または定性的指標を得る。その方法は、例えば、コンピュータで行い、前記アッセイを行うために使用する機械内に組み込まれたものや前記アッセイの処理を制御するために手配されたもので行うことが好ましい。前記シグナルを形成する標識が前記ｓｂｐと異なる場合、前記アッセイは、通常の方法によって較正し、前記シグナル比（Ｓａ／ＳｂまたはＳａ／（Ｓａ＋Ｓｂ）、ここで、Ｓａは、前記ホロＴＣｓｂｐシグナルであり、Ｓｂは、前記ＴＣまたはアポＴＣｓｂｐシグナルである。）をＴＣ飽和値に変換することを必要とする。したがって、前記アッセイは、必要に応じて、アポＴＣおよびホロＴＣを既知の比率で含む較正基準を提供してもよい。
【００４８】
その他の実施形態において、本発明のいかなる方法も、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）検出器内のチップ型の基質の表面で行うことができる。このような方法の場合、特異的なリガンドまたは基質を活性させた標識の必要性がなくなり、前記表面に結合する特異的な結合リガンドまたは特異的な結合相手の付加質量により直接、結合を検出する。この形態の好ましい例において、ＴＣＩＩバインダーは、ＳＰＲ“チップ”の表面上に固定する（例えば、前記チップの金メッキにより、チオール接合ＴＣＩＩバインダーの吸着または前記バインダーとデキストランメッキチップとのアミド結合により）。ついで、前記チップを前記表面プラズモン共鳴検出器中におき、前記試料を含む溶液を前記チップ上溢れさせ、固定されたリガンドに前記試料からホロＴＣおよびアポＴＣを結合させる。ついで、アポＴＣに特異的な第１の特異的なバインダーまたはアポＴＣおよびホロＴＣの双方に特異的な第１の特異的なバインダーを含む溶液を前記チップ上に溢れさせ、表面プラズモン共鳴により前記結合を測定し、第１のシグナルを得る。ついで、この第１の特異的なバインダーを洗い流してもよい。ついで、ホロＴＣのみに特異的な第２の特異的なバインダーを、前記チップ上を通過させる。ホロＴＣへの結合に呼応する第２のシグナルを表面プラズモン共鳴により検出する。ついで、前記第１のＳＰＲと第２のＳＰＲとの違いを用いて、前記ＴＣＩＩ飽和度を計算する。ＳＰＲを使用することにより、「標識」または「レポーター標識」として記載したあらゆるリガンドまたは特異的な結合相手を、あらゆる付加標識または活性標識なしで、質量により検出することができる。この場合、前記「標識」は、単に、前記特異的な結合相手またはリガンドの質量である
前記基質に適用する試料は、体液または組織由来液体が好ましく、より好ましくは無細胞液体、特に哺乳類由来の血漿または血清、さらに特に人または患者由来の血漿または血清である。
【００４９】
さらなる形態からみると、本発明は、下記のものを含むアッセイキットを提供する。
ＴＣ固定リガンドが表面上に固定された多孔質基質；
トランスコバラミンに対する第１のレポーター標識結合相手および第２のレポーター標識結合相手。なお、前記第１の結合相手は、ホロトランスコバラミンおよびアポトランスコバラミンの双方を結合可能なものかまたはアポトランスコバラミンに特異的な結合相手であり、前記第２の結合相手は、ホロトランスコバラミンに特異的な結合相手であり；
洗浄剤（任意）；
酵素レポーター標識のための基質（任意）；
アポＴＣおよびホロＴＣを既知の比率で含む少なくとも１つの較正基準（任意）；および
前記レポーター標識からのシグナルを検出できる検出器（任意）。
【００５０】
代替方法において、前記トランスコバラミン飽和度は、前記基質の異なる領域の２つのリガンドに結合させることにより測定することができ、第１の領域にホロ-ＴＣを固定し、第２の領域にアポＴＣ（またはアポＴＣおよびホロＴＣ）を固定し、前記基質と前記ＴＣを含む試料およびＴＣのためのレポーター標識したｓｂｐとを接触させる。本発明のさらなる形態を形成するこの方法において、前記基質の異なる領域から前記シグナルを読み取り、前記シグナル比、すなわちＳａ／（Ｓａ＋Ｓｂ）またはＳａ／Ｓｂ（ここで、Ｓａは前記ホロＴＣリガンド領域からのシグナルであって、Ｓｂは前記アポＴＣまたはホロＴＣおよびアポＴＣリガンド領域からのシグナルである）は、ＴＣ飽和値の指標となる。本発明のこの形態または別の形態において、前記基質の「領域」は、例えば、膜の表面の異なる部分であっても、ディップスティック上の異なる膜表面であっても、ケーシングの異なる膜であっても、分離ビーズの異なる組（例えば、磁化できる一組、他のもの）であってもよい。
【００５１】
この構成において、本発明の分析方法は、例えば、下記工程を含む。
（ｉ）トランスコバラミンを含む液体試料と、その異なる領域において第１および第２のトランスコバラミン固定リガンドが固定されている多孔質基質とを接触させる工程。ここで、前記第１のリガンドは、ホロトランスコバラミンに特異的に結合でき、前記第２のリガンドは、アポトランスコバラミンまたはアポトランスコバラミンおよびホロトランスコバラミンを固定できる。
（ｉｉ）前記工程（ｉ）の前、間または後に、トランスコバラミンのためのレポーター標識した結合相手と前記試料のトランスコバラミンを結合させる工程。
（ｉｉｉ）前記基質の異なる領域上に固定した前記結合相手のレポーター標識からのシグナルを検出し、そこから前記試料中のトランスコバラミン飽和度を測定する工程。
【００５２】
したがって、さらなる形態からみると、本発明は、以下のものを含むアッセイキットを提供する。
異なる領域で、第１のトランスコバラミン固定リガンドおよび第２のトランスコバラミン固定リガンドが固定されている多孔質基質。ここで、前記第１のリガンドはホロトランスコバラミンに特異的に結合可能で、前記第２のリガンドはアポトランスコバラミン、またはアポトランスコバラミンおよびホロトランスコバラミンを固定可能である。；
トランスコバラミンのためのレポーター標識した結合相手。；
洗浄剤（任意）；
酵素レポーター標識のための基質（任意）；
アポＴＣおよびホロＴＣを既知の比率で含む少なくとも１つの較正基準（任意）；および
前記レポーター標識からのシグナルを検出できる検出器（任意）。
【００５３】
以下の実施例および図面を用いて本発明についてさらに説明するが、本発明は、これらに限定されない。
【００５４】
図１は、ＴＣリガンドが固定されている基質を示し；
図２は、２つの領域をもつ基質を示し、第１はホロＴＣＩＩに特異的な固定されたリガンドを含み、第２はアポＴＣＩＩに特異的な固定されたリガンドを持ち；
図３は、前記表面上に固定されたＴＣの抗体を持つ表面プラズモン共鳴検出器内のチップを示す。
【００５５】
図１において、「標識−ｓｂｐ１」は、第１の標識を持つ第１の特異的な結合相手を示し、「ｓｂｐ−標識２」は、結合した第２の標識を持つ第２の特異的な結合相手を示す。標識１からのシグナルは、前記ホロＴＣレベルに対応し、標識２からのシグナルが、全アポおよびホロＴＣレベルに対応することがわかる。
【００５６】
図２において、ホロＴＣＩＩは第１の領域（左側）に結合し、アポＴＣＩＩは第２の領域（右側）に結合していることがわかる。前記「ｓｂｐ−標識１」は、結合した標識１を持つＴＣに特異的な結合相手を示す。このように、前記２つの領域からのシグナルは、前記ホロＴＣ量およびアポＴＣ量をそれぞれ示す。
【００５７】
図３において、チップ表面が、第１のモノクロナール抗体（ｍＡｂ１）の結合により修飾されている。これは、試料のアポＴＣおよびホロＴＣへ結合する。また、前記第２の抗体（ｍＡｂ２）は、ホロＴＣまたはアポＴＣに結合し、これにより、全ＴＣ量のＳＰＲシグナルを得ることができる。前記第３の抗体（ｍＡｂ３）は、ホロＴＣのみに結合するため、前記ホロＴＣ量を示すＳＰＲシグナルを得ることができる。
【実施例１】
【００５８】
ホロＴＣｓｂｐの生成
Ａ）ビーズ上へのホロＴＣの固定
０．１Ｍ  ２−（Ｎ−モルホリン）−エタンスルホン酸（ＭＥＳ）（ｐＨ５．０）中の０．２Ｍ  １−エチル−３−（３−ジメチルアミノ−プロピル）カルボジイミド（ＥＤＡＣ）１ｍｌと０．１Ｍ  ＭＥＳ（ｐＨ５．０）中の２％（ｗ／ｖ）カルボン酸を修飾したビーズ（直径１μｍ、Ｍｅｒｃｋ−Ｅｓｔａｐｏｒ社製）１ｍＬとを混合した。前記混合物をバス・ソニケーション（bath sonication）して前記試薬を分散させ、ついで、室温で一時間、上下に回転させた。前記混合物を３００ｇで遠心し、そのペレットを０．１Ｍ  ＭＥＳ（ｐＨ７．０）で洗浄して遠心し、ついで１．０ｍＬの脱イオン水で再懸濁した。プラスチック製の小さなバイアル瓶中で、前記ＥＤＡＣ活性化ビーズと０．１Ｍ  ３−［Ｎ−モルホリノ］−プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）（ｐＨ７．５）中の１ｍｇ／ｍＬホロＴＣとを同量で混合し、室温で一晩回転させた。その後、前記混合物を０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０（水溶液）で２回洗浄して、さらに５ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡを含む５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．４）で２回洗浄した。約１０μｇ／ｍｇのホロＴＣの単層を持つ被覆したビーズを、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．４）、０．１５Ｍ  ＮａＣｌおよび１ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡ中で０．１％となるように保存した。
【００５９】
Ｂ）  （ｉ）前記目的分子としてのホロＴＣをもつアプタマーライブラリのバイオパンニング（biopanning）
化学工程および酵素工程の組み合わせにより、二本鎖ＤＮＡ配列のライブラリを準備した。具体的には、４０のヌクレオチド長の１０14〜１０15の一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）配列を合成し、ついで、酵素手法により二本鎖に変換した後、ＰＣＲ増幅した。第２に、その二本鎖ＤＮＡを転写して、一本鎖ＲＮＡまたは修飾ＲＮＡのライブラリを得た。第３に、そのＲＮＡライブラリを対象とする目的分子で調べた。その選択された分子を逆転写して、ＰＣＲにより増幅した（ＤＮＡライブラリに対してＰＣＲが十分な程度にまで）。前記対象に結合した配列の部分集合は、第２回目のバイオパンニングのためにプールした。前記選択工程は、だいたい７〜１５回行う。
【００６０】
明確なプライマーアニーリング配列に挟まれた４０ヌクレオチドの連続配列を含む配列（[5'-GGGAGGACGATGCGG-(N)40-CAGACGACTCGCCCGA-3']（配列番号１））をゲル精製した合成鋳型ＤＮＡ５ｎｍｏｌを、プライマー5'-TAATACGACTCACTATAGGGAGGACGATGCGG-3'（配列番号２）および5'-TCGGGCGAGTCGTCTG-3'（配列番号３）でＰＣＲを４サイクル行うことにより、増幅させた。前記ＰＣＲ由来の鋳型ＤＮＡ（約５×１０14分子）約８００ｐｍｏｌを３ｍＬの転写反応液中のＴ７ＲＮＡポリメラーゼによりビトロで転写した。ここで、前記転写反応液は、４０ｍＭ  ＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１２ｍＭ  ＭｇＣｌ2、１ｍＭスペルミジン（Spermidine）、５ｍＭジチオセレイトール（ＤＴＴ）、０．００２％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−ｌ００（ｖ／ｖ）、４％ポリエチレングリコール（ｗ／ｖ）、グアニジン−５’−トリホスフェート（ＧＴＰ）、２’−ＮＨ2ＣＴＰおよび２’−ＮＨ2ＵＴＰ（ＣＴＰ＝シチジン５’−トリホスフェートおよびＵＴＰ＝ウリジン５’−トリホスフェート）前記各ＡＴＰを２ｍＭずつ含む。全長転写生成物を、変性条件下で、８％ポリアクリルアミドゲルで精製し、結合緩衝液（１０ｍＭ  ＴｒｉｓＨＣｌ、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ、２．５ｍＭ  ＭｇＣｌ2、ｐＨ６．８）中に懸濁して７０℃に加熱し、氷上で冷却した。
【００６１】
前記溶液中にビーズ上に固定した約１０μｇのホロＴＣおよび競合相手として１００μｇの固定されていないアポＴＣを加え、それらとともに、３７℃で１５分間、前記ＲＮＡプールを培養した。前記ビーズを遠心により分離し、その後すぐに５ｍＬの結合緩衝液で洗浄した。ｐＨを低くすることによりそのビーズから結合したＲＮＡ分子を溶離し、エタノール沈殿により回収し、プライマーとしてＤＮＡ配列5'-TCGGGCGAGTCGTCTG-3'（配列番号４）を用いて、鳥類の骨髄細胞症ウィルス転写酵素（Life Science）により、４８℃で４５分間逆転写した。前記ｃＤＮＡのＰＣＲ増幅の後に、得られた二本鎖のＤＮＡ鋳型をビトロで転写して第２の選択用のＲＮＡを得た。前記結合液中のビーズで覆われたホロＴＣの量を断続的に減らし、徐々に選択圧を増加させた。ホロＴＣ用の豊富なＲＮＡプールの親和性が十分に増加するまで、前記選択工程を繰り返した。この時点で、ｃＤＮＡをプライマー5'-CCGAAGCTTAATACGACTCACTATAGGGAGGACGATGCGG-3'（配列番号５）および5'-GCCGGATCCTCGGGCGAGTCGTCTG-3'（配列番号６）でＰＣＲにより増幅させ、前記ＰＣＲ産物の5'-末および3'-末にＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩ制限酵素認識部位（下線部）をそれぞれ導入した。前記ＰＣＲ産物をＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩ、酵素で短くし、エレクトロポレーションにより大腸菌由来のＳＵＲＥ（ストラテジーン）に導入した。プラスミドを単一のバクテリアクローンから短離し、選別し、従来技術で適当なもの、例えば、Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, pp C1.に記載の方法を用いて配列を決定した。
【００６２】
ＲＮＡヌクレアーゼ耐性を比較するために、前記ＲＮＡ分子をその糖の2'の位置で、例えば、アミノ置換等により改変しても良い。
【００６３】
前記ライブラリがＲＮＡアプタマーに基づくものであろうとｓｓＤＮＡアプタマーに基づくものであろうと、もしくは前記ライブラリが偏っていようとなかろうと、前記バイオパンニング（biopanning）手法は本質的には同じものである。要するに、その違いは、ｓｓＤＮＡライブラリが転写を必要としていないことである。
【００６４】
（ｉｉ）ファージ提示ペプチドまたは抗体ライブラリとホロＴＣとのバイオパンニング
１ｐｍｏｌのファージ提示ライブラリを、１００μＬ  ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ１０μｇのビーズ上に固定したホロＴＣおよび１００μｇのアポＴＣ、１ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡまたは３％  ＢＬＯＴＴＯと混合した。（ＢＬＯＴＴＯは、１００ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ塩化ナトリウム中の５％ｗ／ｖ脱脂粉乳、ｐＨ７．４、０．０１％消泡剤Ａ、０．０１％チメロサール（thimerosal）のことである）。その混合物を４℃で一晩インキュベートし、前記ビーズを遠心により選別し、１ｍＬ  ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで９回洗浄し、標準食塩水で１回洗浄して、緩衝能力を除去した。前記ビーズを６００μＬの０．１Ｍグリシン−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ２．２）に再懸濁して、１５分後にそのビーズを３０００ｇで３分間の遠心により選別した。その上清を除去して、３６μＬの２Ｍ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ９．０）で中和して、４００μＬの大腸菌（例えば、Ｋ９１−Ｋａｎ）と混合した。プラスミドを単一のバクテリアクローンから単離して、標準的な方法、例えば、Sambrook J. et al., supraに記載の方法により配列を決定した。前記結合反応および抽出反応を少なくとも３回行った。前記結合反応でＢＳＡおよびＢＬＯＴＴＯを交互に使用して、これらのタンパク質に結合するファージの濃縮を抑制した。
【実施例２】
【００６５】
セルロース紙上へのＴＣ特異的な結合剤の固定
セルロース紙（例えば、Whatman No. 52）を最初に脱イオン水で３分間膨張させ、ついで、３％ＣＮＢｒ（ａｑ）で処理した。そのｐＨを１ｍＭ  ＮａＯＨの添加により１０．５まで上昇させた。３０分後、前記セルロース紙を５００ｍＬの５μＭ  ＮａＨＣＯ3で１２回、５００ｍＬの脱イオン水で２回、５００ｍＬの２５％アセトン、５０％アセトンならびに７５％アセトンでそれぞれ２回ずつ洗浄した。最後に、５００ｍＬアセトンで４回洗浄し、室温で空気乾燥させた。
【００６６】
抗ＴＣ抗体の共有結合を、１００ｍＬの０．１Ｍ  ＮａＨＣＯ3で１０μｇ／ｍＬまで前記抗体を希釈することにより行い、２０ｇのcut paperを添加した。前記混合物を４℃で３時間穏やかに撹拌し、ついで室温で１０分間１０ｍＬ  ０．５ｍＭ  ＮａＨＣＯ3で２回洗浄し、３０分間１００ｍＬの０．１Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．０）で洗浄し、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．１％Ｔｗｅｅｎおよび０．１％ゼラチンを含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）で２回洗浄した。前記抗体を充填した紙は、少量の前記緩衝液に保存した。
【００６７】
ついで、前記抗体を充填した紙の一部分を柔軟性のあるプラスチック製のディップスティックに付着させた。
【実施例３】
【００６８】
分析
５０μＬのヒト血清を、実施例２により調製したディップスティックの膜パッドに塗布した。５分後、前記ディップスティックを１００μＬのＴｒｉｓ緩衝化食塩水（ＴＢＳ−１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．２、１５０ｍＭ塩化ナトリウム）ですすぎ、５０μＬの検出溶液を添加して５分間インキュベートした。前記検出溶液は、β−ガラクトシダーゼに接合する非重複、抗ヒトＴＣ特異的モノクロナール抗体およびトリ由来のアルカリフォスファターゼに接合する実施例１のホロＴＣｓｂｐ（または非重複抗ヒトＴＣ特異的モノクロナール抗体）を含む。ついで、前記ディップスティックを１００μＬのＴＢＳですすいだ。ＴＢＳ中のアルカリフォスファターゼに対する発光基質５０μＬ添加した（例えば、０．２５ｍＭ  Ｔｒｏｐｉｘ由来のＣＰＤ−Ｓｔａｒ）。前記ディップスティックを照度計で１秒から１５分間測定した。ついで、前記ディップスティックを１００μＬのＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）ですすぎ、ＰＢＳ中のβ−ガラクトシダーゼに対する発光基質（例えば、０．１ｍＭ  Ｔｒｏｐｉｘ由来Ｇａｌａｃｔｏｎ−Ｓｔａｒ）を５０μＬのアルカリフォスファターゼ阻害剤（例えば、４０μＭ  シクロヘキサンとリスメチレンスルホネート）を添加した。ついで、前記ディップスティックを再び前記照度計で読み取った。最初の読み取り値が前記ディップスティック上のホロＴＣ量を示すのに対し、２回目の読み取り値は全ＴＣ量を示す。それらの比は、前記試料中のＴＣのコバラミン飽和値に独立した値を示す。
【実施例４】
【００６９】
ヒト由来トランスコバラミンおよびヒト由来ホロトランスコバラミンに特異的なマウスモノクロナール抗体の開発
ｉ）免疫
ＢＡＬＢ／ｃメスマウスに、AdjuPrime 免疫変調成分(Pierce, IL, USA)と混合した組み換えヒト由来ホロトランスコバラミンを２０μｇ免疫注射（i.p.）し、その後４週間ごとに２０μｇのブースター注射した。
【００７０】
ｉｉ）細胞融合
最後のブースター注射より４日後に脾臓を取り出し、ＰＥＧ（ベーリンガー・マンハイム社製（ドイツ））を用いて脾臓嚢胞とＨＡＴ(ヒポサンチン，アミノプロテイン，チミジン（Hypoxanthine，Aminopterin，Thymidine）；シグマ社製)感受性形質細胞種ＯＵＲ１(X63-Ag8.653のサブクローン)とを細胞融合した。ＨＡＴ存在下の培地(10% CPSR3（シグマ社製）添加DMEM/Ham's F12（インビトロゲン社製）)を含む５×９６Ｆトレイ（ヌンク（Ｎｕｎｃ）社製）に、細胞融合生成物を塗布した。一週間後、ＨＴ（シグマ社製）を含む培地でその融合物を育てた。
【００７１】
ｉｉｉ）最初のスクリーニング
２週間後、固相捕捉アッセイを用いて、培地から前記ハイブリドーマをスクリーニングした。ヒツジ由来の抗マウスＩｇＧ抗体（メルク−エスタポア社製（Merck-Estapor）（フランス））で被覆した１μｍ磁化ビーズ１％の懸濁液１０μＬと前記細胞媒体とを混合し、室温で１時間保持した。マウスモノクロナール抗体と結合した磁化ビーズを、マグネットを用いて単離して、１ｍＬリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）、０．１５Ｍ  ＮａＣｌおよび１ｍｇ／ｍＬウシ血清アルブミンで４回洗浄した。５７Ｃｏで標識したコバラミン（ＩＣＮ、ＵＳＡ）で前処理したプールしたヒト血清（スキャンティボディ社製（Scantibodies）、USA）１００μＬで洗浄したビーズを再懸濁し、前記血清中のアポトランスコバラミンを５７Ｃｏで標識したホロＴＣに変換した。前記混合物を室温で３０分間保持して、マグネットを用いてビーズを単離した。前記ビーズに伴う放射能をガンマカウンターで計測した。
【００７２】
ｉｖ）クローニング
Ｂａｌｂ／ｃ腹膜フィダーセル（１００００ｐｅｒ  ｃｅｌｌ）でプレシードした９６ウェルＦトレイ（ヌンク社製（Ｎｕｎｃ））上で限界希釈することにより、抗トランスコバラミン抗体に陽性のウェルをクローニングした。陽性のクローンを選別し、１００％のサブクローンが特異的な抗体を生成するまでクローニングを繰り返した。１０％ＤＭＳＯ（シグマ社製）を含むＣＰＲ３（シグマ社製）中に細胞を入れ、液体窒素で凍結することに保存した。
【００７３】
第２のスクリーニング。細胞培地から抗体を前記した磁化ビーズ上に単離した。前記抗体で被覆したビーズ１０μＬと前述の５７Ｃｏで標識した血清とを、組み換えヒト由来アポトランスコバラミンまたは組み換えヒト由来ホロトランスコバラミンの濃度を増加させた状態で混合した。
【００７４】
２つの抗トランスコバラミン抗体（ｍＡｂ１およびｍＡｂ２）は、アポトランスコバラミンおよびホロトランスコバラミンの双方に対する親和性に基づいて選択し、１つのモノクロナール抗体（ｍＡｂ３）は、ホロトランスコバラミンに対する特異性に基づいて選択した。それぞれのクローンをビトロで、テクノマウス社製のＣＬ１０００で拡張した（expanded）。タンパク質Ａアフィニティークロマトグラフィーにより培地から抗体を精製した。要約すると、前記抗体を含む培地上清を、１Ｍ  ＮａＣｌ（結合緩衝液）を含む０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）で１：１に希釈し、結合緩衝液で平衡化した前記タンパク質Ａカラムに適用した。ついで、前記タンパク質Ａカラムをカラムの１５倍の容量の結合緩衝液で広範囲にわたって洗浄した。前記抗体を０．１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ４．０）で溶出し、１Ｍ  Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ８．０）でｐＨ７．０に中和して、セファデックスＧ−２５カラムで０．１５Ｍ  ＮａＣｌを含む０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）に緩衝液を交換した。
【実施例５】
【００７５】
ＴＣ特異的モノクロナール抗体ｍＡｂ１のデキストラン被覆表面への固定
前記デキストランで被覆したチップ（ファルマシア社製、スウェーデン）のカルボキシル化した表面を０．０５Ｍ  Ｎ−ヒドロキシスクシニイミド（ＮＨＳ）／０．２Ｍ  Ｎ−エチル−Ｎ’−［３−（ジメチルアミノ）プロピル］カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）で活性化し、脱イオン水ですすぎ、０．０１  ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）（０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．００３Ｍ  ＥＤＴＡおよび０．００５％ポリソルベート（ＨＢＳ）含有）中で５０μｇ／ｍＬのｍＡｂ１（実施例４より）で共有的に被覆した。未反応のＮＨＳは、１Ｍエタノールアミンにより反応を遮断し、前記チップをＨＢＳで広範囲にわたって洗浄した。
【実施例６】
【００７６】
ホロトランスコバラミン、ｍＡｂ２およびｍＡｂ３と固定したｍＡｂ１との結合
前記結合の様子は、表面プラズモン共鳴を用いてリアルタイムで追跡し、ビアコア（Ｂｉｏｃｏｒｅ）装置（ビアコア社製、スウェーデン）で行った。前記チップに結合する遊離リガンドの量を応答単位（ＲＵ）で測定し、なお、前記応答単位とは、結合したリガンドの量と固定したターゲットに対する親和性のどちらも踏まえたものである。ｍＡｂ１を固定したチップ（実施例５）を前記装置に導入し、５μＬの１００ｎＭホロトランスコバラミン、５μＬの５０μｇ／ｍＬ  ｍＡｂ２ならびに５μＬの５０μｇ／ｍＬ  ｍＡｂ３を連続して注入し、それぞれ注入の間に洗浄工程を行った。前記装置にホロトランスコバラミンを流入した後、５６５ＲＵのｍＡｂ３と前記固定したｍＡｂ１とを結合した。ホロトランスコバラミンがない場合は、ｍＡｂ２もｍＡｂ３も前記固定したｍＡｂ１を持つチップに結合しなかった。
【図面の簡単な説明】
【００７７】
【図１】図１は、ＴＣリガンドが固定されている基質を示す模式図である。
【図２】図２は、２つの領域をもつ基質を示す模式図である。
【図３】図３は、前記表面上に固定されたＴＣの抗体を持つ表面プラズモン共鳴検出器内のチップを示す模式図である。
【配列表フリーテキスト】
【００７８】
配列番号１    合成鋳型ＤＮＡ、ｎはヌクレオチド
配列番号２    ＰＣＲ用プライマー
配列番号３    ＰＣＲ用プライマー
配列番号４    ＲＴＰＣＲ用プライマー
配列番号５    ＰＣＲ用プライマー
配列番号６    ＰＣＲ用プライマー
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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