(57)【要約】本発明は、キャリブラント(calibrant)の調製及び目的とするヌクレオチド配列の定量におけるそれらの使用に関する。【解決手段】本発明は、定量すべき目的のヌクレオチド配列を含み、ベクターに挿入されるキャリブラントであって、線状であることを特徴とするキャリブラント等である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
定量すべき目的のヌクレオチド配列を含み、ベクターに挿入されるキャリブラントであって、線状であることを特徴とするキャリブラント。
【請求項２】
ベクターを含むキャリブラントを調製するための方法であって、次の工程：
目的の配列をベクターに挿入する工程、及び
挿入物の外側で、ベクターの１箇所のみの切断部位を認識するよう選択された制限酵素によって、キャリブラントを線状化する工程、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項３】
請求項２の方法によって得られるキャリブラント。
【請求項４】
キャリブラントが完全に人工的であることを特徴とする請求項１又は３に記載のキャリブラント。
【請求項５】
目的のヌクレオチド配列がDNAであることを特徴とする請求項１、３、４のいずれか１項に記載のキャリブラント。
【請求項６】
ベクターがプラスミドであることを特徴とする請求項１、３〜５のいずれか１項に記載のキャリブラント。
【請求項７】
目的とするヌクレオチド配列を定量するためのキットであって、請求項１、３〜６のいずれか１項に記載のキャリブラントの少なくとも１つの連続した希釈物を含むことを特徴とするキット。
【請求項８】
請求項１、３〜６のいずれか１項に記載の２つのキャリブラントの２つの連続した希釈物を含むものであり、第一のキャリブラントは定量すべき配列を含むものであり、第二のキャリブラントは、遍在性遺伝子又は遍在性遺伝子の転写産物の配列を含むことを特徴とする請求項７に記載のキット。
【請求項９】
希釈溶媒が緩衝液であることを特徴とする請求項７又は８に記載のキット。
【請求項１０】
希釈溶媒が、さらにキャリブラントの目的とする配列とは相同性を有していない核酸を含むことを特徴とする請求項７〜９のいずれか１項に記載のキット。
【請求項１１】
緩衝液のｐＨが７以上であることを特徴とする請求項９に記載のキット。
【請求項１２】
核酸が大腸菌のRNAであることを特徴とする請求項１０に記載のキット。
【請求項１３】
遍在性遺伝子又は遍在性遺伝子の転写産物が、ABL、GUS、及びB2Mからなる群より選択されることを特徴とする請求項８〜１２のいずれか１項に記載のキット。
【請求項１４】
目的とする遺伝子が、AML1−ETO、E2A−PBX1、BCR−ABL、MLL−AF4、TEL−AML1、SIL−TAL、PML−RARA、CBFb−MYH11からなる群より選択されることを特徴とする請求項８〜１３のいずれか１項に記載のキット。
【請求項１５】
一連のキャリブラントを、液状又は凍結乾燥の形態で含めることを特徴とする請求項８〜１４のいずれか１項に記載のキット。
【請求項１６】
以下の工程：
請求項２に示す方法で得られるキャリブラントの調製、及び、
大腸菌のRNAを含むｐＨ７以上の溶媒中での連続した希釈物の調製、
を含むことを特徴とする、目的とするヌクレオチド配列を定量するためのキットを調製する方法。
【請求項１７】
測定すべき試料中の核酸を定量するための、請求項１、３〜６のいずれか１項に記載のキャリブラント、及び／又は請求項７〜１５のいずれか１項に記載のキットの使用。
【請求項１８】
遺伝子を定量するための、請求項１、３〜６のいずれか１項に記載のキャリブラント、及び／又は請求項７〜１５のいずれか１項に記載のキットの使用。
【請求項１９】
融合転写産物を定量するための、請求項１、３〜６のいずれか１項に記載のキャリブラント、及び／又は請求項７〜１５のいずれか１項に記載のキットの使用。
【請求項２０】
白血病に関与する融合転写産物を定量するための、請求項１、３〜６のいずれか１項に記載のキャリブラント、及び／又は請求項７〜１５のいずれか１項に記載のキットの使用。
【請求項２１】
以下の工程：
定量PCRによる定量及び標的ヌクレオチド配列を運ぶキャリブラントの連続した希釈物を使用するキャリブレーション曲線の作成、
定量PCRによる定量及び遍在性遺伝子又は遍在性遺伝子の転写産物の配列を運ぶキャリブラントの連続した希釈物を使用するキャリブレーション曲線の作成、
キャリブレーション曲線を使用した、試料中の標的配列、及び遍在性遺伝子又は遍在性遺伝子の転写産物の配列の定量PCRによる定量、及び、
以下の式を用いることによる、標準化コピー数の計算、
Log(NCN）＝LogTF−LogGU
NCNは標準化コピー数、
TFは標的配列のコピー数、
GUは遍在性遺伝子又は遍在性遺伝子の転写産物のコピー数、
上記定量は二重に行っていることが好ましい、
を含むことを特徴とする試料中の標的核酸の定量方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、キャリブラント(calibrant)の調製及び目的とするヌクレオチド配列の定量におけるその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
目的とするヌクレオチド配列の定量は、いくつかの方法、例えば、試験の最小感度を決定する方法(定性PCR)、競合物を使用する方法(競合的PCR)、あるいは、リアルタイムでの定量PCR、により行うことができる。
【０００３】
定性PCRは、ヌクレオチド配列の検出に関係している。該PCRは、該配列の存在あるいは不存在を確認するために使用される(最終ポイント手法)。したがって、正確な定量を行うことは不可能である。
【０００４】
競合的PCRは、キメラプラスミドの競合物を使用する定量PCRである。この手法は、該PCRの効率が、異なったサイズをもつ競合物と得ようとする転写産物によることを前提としている。他方、この手法は、汚染の危険性を著しく増大させる入れ子PCR(nested  PCR)を使用する。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
リアルタイムでの定量PCRは、試料中の核酸を、蛍光分子を通じて定量しようとするものである。これはリアルタイム手法であり、最終ポイント手法ではない。その測定は、該PCRの指数関数領域にて行われるため、PCR効率は100％であるとみなすことができる。腫瘍学の分野では、Marcucciら[１]が、この方法を初めて発表した。しかしながら、この方法は、実施中において、安定性の点で問題があることが、発明者らによって指摘されていた。さらに、キャリブラントを用いて定量される上記配列の増幅効率は、100％には達せず、また、該方法の標準化に使用される遍在性遺伝子の平均的発現を正確に定量することができない。これらの問題点は、結局、該方法の非再現性の原因となる。
【０００６】
遺伝子の定量法から生じるもう一つの問題は、異なる研究室で行われた同一の測定に対して観察される結果が変動することである。その時に得られる結果は、作業者、方法、及び方法の条件に依存しているように思われる。
【０００７】
本発明者の研究は、試験結果のバラツキの原因となり得る全ての外的因子の影響をなくし、定量を実施する研究室の如何に関わらず、試験結果の完全な再現性を得ることを目的として、対象とするヌクレオチド配列の定量方法を開発した。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、定量すべき目的のヌクレオチド配列を含み、ベクターに挿入されるキャリブラントを提供し、このキャリブラントは線状であることを特徴とするものである。
【０００９】
上記用語「キャリブラント」とは、定量測定を行うことを可能とする構造体を意味する。
【００１０】
キャリブラントが線状であることは、再現性を約束する必須の因子である。実際、キャリブラントが線状であることによって、PCR効率を相当向上させることが可能となる。
【００１１】
本発明は、また、ベクターを含むキャリブラントを調製するための方法を提供し、該方法は、次の工程：
目的の配列をベクターに挿入する工程、及び
該挿入物の外側で、ベクターの１箇所のみの切断部位を認識するよう選択された制限酵素によって、キャリブラントを線状化する工程、
を含むことを特徴とするものである。
【００１２】
好適なベクターは、クローニングベクターで構成される。
【００１３】
上記調製方法で得られるキャリブラントは、本発明の範囲に含まれるものである。
【００１４】
該キャリブラントは、完全に人工的であることが好ましい。完全に人工的なキャリブラントを製造するためのプロトコールは、実施例１で詳細に述べている。
【００１５】
上記特徴により、生物学的試料の複雑さに由来すると思われる、あらゆる定量測定上の妨害を回避することができる。
【００１６】
さらには、目的とする配列は、DNAであることが好ましい。実際、DNAを使用することにより、時間に対して、本発明のキャリブラントのより良い安定性が得られる。
【００１７】
本発明のキャリブラントの調製に使用するベクターは、好ましくは、プラスミドである。
【００１８】
本発明は、また、目的とするヌクレオチド配列を定量するためのキットに関するものであり、該キットは、本発明のキャリブラントの少なくとも１つの連続した希釈物を含むことを特徴とする。
【００１９】
好ましくは、該キットは、本発明の２つのキャリブラントの２つの連続した希釈物を含むものであり、第一のキャリブラントは定量すべき配列を含むものであり、第二のキャリブラントは、遍在性遺伝子又は遍在性遺伝子の転写産物の配列を含むものである。
【００２０】
第二の連続した希釈物により、第一の定量を標準化するための遍在性遺伝子又は遍在性遺伝子の転写産物を正確に定量することができる。
【００２１】
特に、２つの定量における操作条件の類似性は、正確な標準化を可能とする。
【００２２】
好ましい態様は、本発明のキットの希釈溶媒を緩衝液とするものである。該緩衝液を選択することにより、キャリブラントの保存及び定量時における、その安定性を高めることが可能となる。
【００２３】
好ましくは、該希釈溶媒は、さらにキャリブラントの目的とする配列とは相同性を有していない核酸を含む。
【００２４】
連続的に希釈した溶媒中に該核酸が存在することによって、定量すべき試料の生物学的溶媒を人工的に再生することができる。つまり、このことは、全ての定量を類似の条件下で実施するので、最良の再現性が得られることを意味する。
【００２５】
好ましくは、該希釈溶媒をｐＨが７以上の緩衝液とする。このｐＨとすることにより、キャリブラントの最良の安定性が得られる。
【００２６】
好ましい態様は、該希釈溶媒に入れる核酸を大腸菌のRNAとする。
【００２７】
好ましくは、遍在性遺伝子又は遍在性遺伝子の転写産物は、Abelson(ABL)、β―グルクロニダーゼ(GUS)、及びβ―２マイクログロブリン(B2M)からなる群より選択される。
【００２８】
これらの遍在性遺伝子の転写産物は、本発明者により、それらが完全に特性化される程度にまで、特に研究されている(実施例２の表１参照)。それらを使用することにより、定量ごとの再現性を向上させることができる。
【００２９】
本発明のキットは、特に、AML1−ETO、E2A−PBX1、BCR−ABL、MLL−AF4、TEL−AML1、SIL−TAL、PML−RARA、CBFb−MYH11等の遺伝子を目的とする定量に適している。したがって、好ましくは、本発明のキットは、目的とする上記遺伝子の連続した希釈物を含む。これらの融合転写産物の配列及び参考値は、実施例４で述べている。
【００３０】
好ましい態様は、本発明のキットの一連のキャリブラントを、液状又は凍結乾燥の形態で含めるものである。
【００３１】
本発明は、また、目的とするヌクレオチド配列を定量するためのキットを調製する方法を含み、該方法は、以下の工程：
請求項２に示す方法で得られるキャリブラントの調製、及び、
大腸菌のRNAを含むｐＨ７以上の溶媒中での連続した希釈物の調製、
を含むことを特徴とする。
【００３２】
本発明のキャリブラントにより、正確性及び再現性をもって、試料中の測定すべき全ての核酸、好ましくは、病理学に関連した核酸を定量することが可能となる。
【００３３】
より正確には、本発明のキャリブラントは、特に遺伝子、融合転写産物、とりわけ白血病に関与する融合転写産物の定量に好適である。
【００３４】
本発明は、また、試料中の標的核酸の定量方法を提供するものであり、この方法は、以下の工程：
定量PCRによる定量及び標的ヌクレオチド配列を運ぶキャリブラントの連続した希釈物を使用するキャリブレーション曲線の作成、
定量PCRによる定量及び遍在性遺伝子又は遍在性遺伝子の転写産物の配列を運ぶキャリブラントの連続した希釈物を使用するキャリブレーション曲線の作成、
キャリブレーション曲線を使用した、試料中の標的配列、及び遍在性遺伝子又は遍在性遺伝子の転写産物の配列の定量PCRによる定量、及び、
以下の式を用いることによる、標準化コピー数の計算、
Log(NCN）＝LogTF−LogGU
NCNは標準化コピー数、
TFは標的配列のコピー数、
GUは遍在性遺伝子又は遍在性遺伝子の転写産物のコピー数、
上記定量は二重に行っていることが好ましい、
を含むことを特徴とするものである。
この方法は、実施例２において、充分に詳しく記述している。さらに、実施例３で行った定量試験により、この方法の実施内容が開示される。
【００３５】
実施例１：キャリブラントの調製
Ｉ．操作プロトコールの異なる工程に関する簡単な提示
融合転写産物(MLL−AF4等)は、対応したプライマー[２]を用いて増幅され、該増幅は細胞系又は患者に由来するｃDNAを用いて開始される。PCR産物は適合したベクター(プラスミドpCR II TOPO等)に組み込まれ、その後、形質転換に適した大腸菌の細菌株内でクローン化される。
【００３６】
プラスミドベクターは、その後、標準方法[３]によって抽出され、ＵＶ分光光度法で定量される。
【００３７】
次いで、このベクターは、線状化される。線状化のために選択された制限酵素は、該挿入物の外側で、ベクター上に１箇所のみの切断部位をもつ。
【００３８】
ベクターと挿入物の大きさが与えられれば、プラスミド構造体の大きさは計算される(塩基対で)。その分子量は、ヌクレオチドの平均分子量と推定される。その後、酵素で切断された特定重量のプラスミド中に存在するコピー数が決定される。
【００３９】
連続する希釈物は、その後、調製される。標準のプラスミドは、その時に使用される。
【００４０】
II．プロトコールの詳細な説明
Ａ．クローニングベクターに組み込まれるDNA配列の調製
ベクターを用いてクローニングする前に、目的のヌクレオチド配列の調製を、DNAの第二鎖の合成を任意に引き続いて行う逆転写(RT)工程によってｃDNAに変換されるRNAを用いて開始するか、直接DNAを用いて開始する、ことによって行う。
前者又は後者の方法で得られたDNA断片は、その後、PCRで増幅することができる。
【００４１】
１．RNAからのDNA配列の調製
標的のDNA配列は、最初に、ヒト、動物又は植物を起源とし、原核生物又は多核生物、単一細胞体又は複数細胞体、又は細菌から得られる全RNA、リボソームRNA、又はメッセンジャーRNAを逆転写(RT)することによって調製される。
【００４２】
逆転写は、逆転写プロトコール１[２]又は長い断片に対して適用されるプロトコール２に基づいて行われる。
【００４３】
プロトコール１：逆転写 BIOMED−１
このプロトコールは、参考文献[２]に基づくものである。逆転写は、プライマーを必要とする。それらは、例えば、ランダム(Ｎ(６))又はオリゴdT(30)であり、アンカーPCR(例えば、SEQ ID No.1:５’CGT CGT CGT GAA TTC CTA GAT CTT CTA GAT ATG TT ３’）の実施を可能にする付加的配列を任意に含めることができる。後の使用のために、プライマーの末端を任意に修飾することができる。
【００４４】
逆転写は２つのフェーズで行われる：
RNAの変性：
水8.5μl中のRNA 1μgを次のサイクル：70℃で10分、その後、20℃で保持、で変性させる。
【００４５】
ｃDNAの合成：
変性RNAを、10.5μlの次に示す反応混合物：５×緩衝液(４μl)、dNTPNa 10mM(２μl)、DTT 100mM(２μl)、逆転写プライマー10μM(１μl)、RNase-inh 40Ｕ／μl(0.5μl)、逆転写酵素 50Ｕ／μl(２μl)と混合する。ｃDNAの合成は、次のサイクルで行う：20℃で10分、42℃で45分、99℃で３分、４℃で無制限。この合成は修飾ヌクレオチドに対して任意に実施される。
【００４６】
プロトコール２：長い断片に適用される逆転写
該逆転写は、大きなｃDNAの形成を可能とする試剤を必要とする。ロシュの   Expand Reverse Transcriptase(商標)キットは、それらの実験に使用される。使用されるプライマーは、アンカーPCRの実施を可能とする前記SEQ ID No.1のような付加的配列を任意に含むランダム(Ｎ(６))又はオリゴdTプライマーである。後続の使用のために、プライマーの末端を任意に修飾することができる。
【００４７】
逆転写は、２つのフェーズで行われる：
RNAの変性：
水8.5μl中のRNA １μgを次のサイクル：70℃で10分、その後、20℃で保持、で変性させる。
【００４８】
ｃDNAの合成：
変性RNAを、10.5μlの次に示す反応混合物：５×緩衝液(４μl)、dNTPNa  10mM(２μl)、DTT 100mM(２μl)、逆転写プライマー10μM(１μl)、RNase-inh  40Ｕ／μl(0.5μl)、Expand Reverse Transcriptase 50Ｕ／μl(１μl)と混合する。ｃDNAの合成は、次のサイクルで行う：20℃で10分、42℃で45分から２時間、99℃で３分、４℃で無制限。この合成は修飾ヌクレオチドに対して任意に実施される。
【００４９】
RNase Hによる処理：
２μlのRNase H(50Ｕ／μl）を20μlの前記混合物に添加し、42℃で10分間、インキュベートした後、試験管を20℃に冷却する。その後、混合物の全体を１／３に希釈し、最終容量を60μlとする。
【００５０】
２．DNAの配列
DNAの配列は、DNAから直接、又はRNAの逆転写によって得られる。
標的配列をDNAから直接得る場合、該DNAは、ヒト、動物又は植物を起源とし、原核生物又は多核生物、単一細胞体又は複数細胞体、又は細菌から得られるもので、イントロン配列又はエキソン配列、コード鎖又は非コード鎖、から得られるものである。
標的配列をRNAから直接得る場合、該RNAは相補的DNAの第一鎖を得るために、前記段落に従って処理される。
【００５１】
DNAの第二鎖は、３’に配列(テイリング)を付加した後の逆転写、例えば、プロトコール３、又は末端に制限酵素の認識部位を任意に含む前記配列との連結、の操作で得た配列から合成することができる。
【００５２】
プロトコール３：第二鎖合成のためのテイリング
テイリングは、プロトコール２及び参考文献[３]に基づいて調製された産生物に対して行われる。
【００５３】
ｃDNAの精製：
ｃDNAの精製は、Sephadex G50(商標)カラムを用いて行う。ｃDNAは、その後、50μlの水、あるいは10mM/1mM Tris EDTAに溶出される。
【００５４】
以下のように行われるテイリング：
滅菌水(9.5μl)、10×緩衝液1.25μl、任意修飾したdCTP[２mM] 2.5μl、MgCl2［50mM］(0.75μl）、精製ｃDNA(10μl)からなる容量24μlを、94℃で２〜３分間インキュベートする。氷中で１分間冷却する。TdTを加え、ホモジナイズし、37℃で15分間インキュベートする。70℃、10分間でTdTを不活化する。
【００５５】
DNAが得られたら(直接又は間接、単一鎖又は非単一鎖)、その配列は選択的にPCRで増幅されるか、あるいはベクターに直接組み込まれる。
【００５６】
該PCRは１対の公知のプライマー(参考文献１)又は本発明で規定するプライマー(制限酵素が５’末端で認識する配列を任意に含む)を用いて開始、実施される。これらのプライマーは、プロトコール４のPCR BIOMED−１又はプロトコール５のロングフラグメントPCRにより、標的配列の増幅を可能にする。
【００５７】
プロトコール４：PCR BIOMED−１
このPCRプロトコールは、参考文献[２]に基づいており、参考文献[２]に示したプライマー(Ａ及びＢ)が標的とする目的の配列、特に、参考文献[２]に示した融合遺伝子又は遍在性遺伝子を増幅可能とする。後の使用のために、これらのプライマーは、任意にその末端を修飾することができる。
【００５８】
増幅サイクルは次の通りである：94℃で３分、35×(94℃で30秒、65℃で30秒、72℃で１分)、16℃で無制限。増幅はTaq DNA polymerase(商標)、任意に修飾されたヌクレオチド、及び10μlの逆転写産物又は１μlのDNAの存在下で行われる。得られる断片はサイズが短く、その後、適当なベクターでクローン化され得る。
【００５９】
プロトコール５：ロングフラグメントPCR(標準、アンカー、バイアンカー)
増幅のプログラム及びTaq DNA polymerase(商標)により、固有のプライマーに少なくとも５kbをもつ断片を得ることが可能である。該増幅は任意に修飾ヌクレオチドで置き換えられるdNTPを用いて行われる。
【００６０】
増幅サイクルは次の通りである：
94℃で30秒、10×(94℃で10秒、68℃で８分)、20×(94℃で10秒、68℃で８分20秒／サイクル）、68℃で７分、16℃で無制限。
【００６１】
50μlのPCRウェル内の反応混合物は、次の通りである：
逆転写又はPCR産物(10μl)、H2O DEPC(21μl)、dNTP 10mM(2.5μl)、上記SEQ ID No.１に相当するセンス又はアンカープライマー100μＭ(0.5μl)、アンチセンス又はアンカープライマー 100μＭ(0.5μl)、PCR緩衝液(５μl)、MgCl2が最終的に３mM、Taq DNA polymerase(商標)3.5Ｕ。アンカーは規定されたあらゆる配列に相当し、ここで挙げられた配列は、制限酵素の切断部位を含む例である。
【００６２】
この増幅は、増幅の特異性を高めるために、内部プライマーを用いて、任意に第二の増幅を引き続き行うことができる。該プライマーは、後の使用のために、任意に末端を修飾することができる。
【００６３】
３．PCR産物の精製
精製するために、最初、該産物をゲル上に負荷して、サイズ及び公知の濃度の分子量マーカーに比しての相対量をチェックする。該産物の量は、分子量マーカーと関連させて評価される。いくつかのバンドが存在する場合において、目的とするバンドの分離は、求めるバンドのゲルを切り出し、目的とするDNAを抽出することにより行うことができる。
上記産物は、その後、任意にエタノールによる沈殿処理で精製され、続いて、ＵＶ分光光度法[３]又はインターカレーター性蛍光試薬を使用する分光蛍光法で測定するために、Tris EDTA 10mM／１mMの容量とする。
【００６４】
Ｂ．配列のクローニング
調製された産物は、次に、クローン化される。このため、それらはクローニングベクターに組み込まれ、その後、目的とする配列を大量に産性するため、ヒト、動物、細菌、植物起源の原核細胞生物又は真核細胞生物、単一細胞体又は複数細胞体の宿主体に移入される。
【００６５】
１．原核細胞生物又は細菌中での配列の産生
目的とする配列は、クローニング部位にて、リガーゼ又はトポイソメラーゼでベクターに連結される。挿入物を組み込んだプラスミドベクター(Bluescript(商標)又は同等物)、ファージベクター(Lambda又は同等物)、コスミド、細菌、さらに、YAC(酵母)又はBACベクターは、抽出するために大量に増幅される。
受け入れる宿主細胞は、物理的又は化学的方法により、形質転換のための適性が付与された大腸菌株が好ましい。クローン(ベクター＋挿入物)は、他の細菌株あるいは原核細胞生物、例えば、酵母又は昆虫細胞に導入することができる。挿入物を運搬するベクターの抽出は、標準方法[３]によって行われる。
【００６６】
２．真核細胞生物中での配列の産生
目的とする配列は、クローニング部位にて、リガーゼ又はトポイソメラーゼにより真核細胞のベクターに組み込まれ、その後、単一細胞の真核細胞生物（例えば、サッカロマイセスsp(Saccaromyces sp)、カンジダsp(Candida sp)）、複数細胞体、又はヒト、動物又は植物の生細胞系に移入される。
【００６７】
３．挿入物の質的管理及びシークエンシング
ベクターを運搬する有機体の選択は、好ましくは、通常の方法[３]で行われ、挿入物の存在は、特に実施例のプロトコール４の操作で、ベクターに結合される非特異的プライマー又は挿入物に特異的なプライマーを選択することにより、PCRで確認される。
【００６８】
挿入された産物のシークエンシングは、クローン産生物中の変異、及び該産生物の挿入における鋳型の存在を確認するために行われる。シークエンシングは、クローニングベクター(例えば、M13、Sp6、T7)にある普遍的プライマー、又は挿入物に特異的なプライマーを用いて開始する標準技術に従って行われる。
【００６９】
Ｃ．目的とする遺伝子の定量
キャリブラントは、異なる形態、すなわち、二本鎖又は一本鎖DNA、RNAの形態で、目的とする遺伝子(挿入物)を含むことができる。
【００７０】
１．二本鎖DNA
クローニングベクターは、標準的な抽出技術(SAMBROOK)を用いて、細胞から抽出される。該産物はTris EDTA 10mM／１mM、ｐＨ＝８の溶液中に溶解され、ＵＶ分光光度法[３]又はインターカレーター性試薬を使用する分光蛍光法で定量される。
【００７１】
次いで、この産物20μgは、ベクターを線状化するため、10Ｕの適切な制限酵素(BamHI、HindIII、その他)を用いて、37℃で１時間、 20μl中で消化させる。
その後、ベクターの分子量、挿入物のサイズ、及び確定された容量(公式１)中のクローン化された産物の量を考慮して、マスユニット中における目的の配列又はその同等物のコピー数が決定される。
公式１：PMｃ＝（NTV＋NTI）×PMN／Ｎ
PMｃは一つの挿入物を運ぶベクターの１コピーの分子量（ｇ）
NTVはベクターのヌクレオチドの数
NTIは挿入物のヌクレオチドの数
PMNはヌクレオチドの平均分子量、例えば、321.44ｇ、
Ｎはアボガドロ定数、例えば、6.02×1023
【００７２】
２．一本鎖DNA
普遍的配列であるM13F、M13Rを運ぶ線状化したベクター(前記段落参照)から、所望するストランドを得るために、相当するプライマーの存在下、標準のプロトコール(SAMBROOK)に従い、ポリメラーゼ(KLENOWタイプ又は同等物)を用いて一本鎖DNAの配列が産生される。その後、該産物は、ゲルで精製され、次いで、Tris EDTA 10mM／１mM、ｐＨ＝８の溶液中に溶解され、ＵＶ分光光度法[３]又はインターカレーター性試薬を使用する分光蛍光法で定量される。
その後、マスユニット中の目的とする配列又はその同等物のコピー数は、挿入物のサイズ、及び確定された容量(公式１)中の産物の量を考慮して決定される。
【００７３】
３．RNA
RNAから調製するために、上記した目的の配列を運搬するクローニングベクター（pCR II TOPO又はBlue Script）が、RNAポリメラーゼSP6又はT7のためのプロモーターを有するという事実を利用する。これらのポリメラーゼは、通常のプロトコール[３]に基づき、該ベクターのプロモーター部位から一本鎖RNAを産生するために使用される。ポリメラーゼの選択は、目的とする配列をもつ挿入物の鋳型の機能による。
【００７４】
産生されたRNAは、その後、標準の単離技術[３]に従って精製される。そして、ＵＶ分光光度法[３]又はインターカレーター性試薬(Hoescht又はInterchim)を使用する分光蛍光法で定量される。
最終的に、マスユニット中の目的とする配列又はその同等物のコピー数は、挿入物の分子量、及び確定された容量(公式１)中のクローン産物の量を考慮して決定される。
【００７５】
Ｄ．調製物の希釈
次に、確定された容量中の正確な量を知るために、目的の配列は希釈される。最終産物は、一つの試料又は該試料の連続したカスケードの希釈物であり、該試料は、核酸の同じ断片又は異なる断片によって運ばれる一本鎖又は二本鎖DNA及び／又はRNAの１又はそれ以上の配列を含む。
その量は、参考配列のマスユニットの形で、あるいは調製物中に同じく存在する既知量の第二配列と対比した絶対数又は相対数として表すことができる。拡張することにより、同一試料中に既知量の配列を大量に含む混合物は、同様に調製することができる。
【００７６】
最終産物は、凍結乾燥又は不活化剤、活性化剤を任意に含む好適な溶媒の溶液とすることができる。
【００７７】
１．DNA希釈物の実際の調製
既知の量の一本鎖又は二本鎖DNAからDNAの希釈物を調製するため、この試料を10ごとに、又は半分ごとにカスケード希釈する。
これらの希釈は、RNA(ヒト、動物又は植物を起源とし、原核生物又は多核生物、単一細胞体又は複数細胞体、又は細菌から得られるRNAで調製される希釈物)又はDNAのTris EDTA 10mM／１mM、ｐＨ＝８の溶液で、１又はそれ以上の不活化剤(グリセロール、ウシ血清アルブミン、粉乳、デキストラン、真核生物のリボソームRNA16Ｓ、23Ｓ、他のあらゆる化学安定剤)の存在下で実施される。
【００７８】
２．RNA希釈物の実際の調製
RNA希釈物を調製するため、既知の量のRNAを10ごとに、又は半分ごとにカスケード希釈する。これらの希釈は、RNA(ヒト、動物又は植物由来であって、原核生物又は多核生物、単一細胞体又は複数細胞体、又は細菌からのRNAで調製される希釈物)又はDNAのTris EDTA 10mM／１mM、ｐＨ＝８の溶液で、１又はそれ以上の不活化剤(グリセロール、ウシ血清アルブミン、粉乳、デキストラン、真核生物のリボソームRNA16Ｓ、23Ｓ、他のあらゆる化学安定剤)の存在下で実施される。
【００７９】
例えば、10-1と規定される最初の溶液は、溶液１μlあたり、２・109コピーのプラスミドを含み、最終容量が500μl のDEPC水で希釈した酵素消化物の容量Ｖから得られる。その後、溶液１μlあたりの最終濃度を200,000、20,000、2,000、200、20、２コピーとするために、大腸菌の16Ｓ、23ＳのRNAを20ng／μl含むTris EDTA 10mM／１mM、ｐＨ＝８の緩衝液でカスケード希釈を行う。
調製物はその後、検査される。
【００８０】
Ｅ．調製物の検査
１．挿入物の存在の質的検査
挿入物の存在の質的検査は、クローン産生物中に求める挿入物が存在するかどうかを確認するために行われる。ゲル上の増幅されたバンドの様子から、調製の質を評価することができる。この検査は、クローニングベクターの普遍的プライマー、又はBIOMED-1の増幅プログラムに基づき、PCR断片の産生に寄与するプライマーで開始するPCRによって行われる。該検査は、DNA試料から直接行うか、逆転写(特には、RNA試料からのプロトコール１、２に基づく)後に行う。
【００８１】
２．挿入物の存在の量的検査
挿入物の存在の量的検査は、目的とする配列又はベクターの量を確認するために行われる。この検査は、クローニングベクターの普遍的プライマー、又はプロトコール６の増幅プログラムに基づき、PCR断片の産生に寄与するプライマーで開始するPCRによって行われる。
【００８２】
プロトコール６：Taqman(商標)タイプの定量PCR
増幅サイクルは次の通りである：50℃で２分、94℃で２分、50×(94℃で３秒、60℃で１分)、16℃で無制限。
反応混合物の組成は次の通りである：DNA又はcDNA試料(100ngのDNA又はその同等物)、センス及びアンチセンスプライマー、最終300nM、増幅産物又はこれらの成分を含む反応混合物を検出させる最終200nMの発蛍光団又はその同等物(インターカレーター性蛍光試薬、例えば、SYBR green(商標))でラベルされたTaqman(商標)プローブ、PCR緩衝液、ポリメラーゼ及び定量に寄与するあらゆる他の成分を含む反応混合物。
【００８３】
コントロールは、DNA試料を用いて直接行うか、逆転写の後、RNAを用いて行う(特に、プロトコール１又は２に基づく)。定量も又、溶液中又は定量に適用される物質の固相担体上にあるヌクレオチド配列を測定するための最近の技術を用いて行うことができる。
【００８４】
緩衝液中のベクター(二本鎖DNA)の直接希釈から得られた産物を除き、ベクターの配列は、最終産物には決して生じない。
【００８５】
実施例２：定量方法
定量は２つの主要な工程を含む。第一の工程は、目的とする遺伝子の定量からなり、第二の工程は、実施される定量を標準化することを目的とする。
標準化は「遍在性」と言われる遺伝子を定量することにより行われる。
全ての定量は、定量PCRによって行われる。
【００８６】
各工程において、本発明のキャリブラントを利用することにより、「プラスミド標準曲線」と称されるキャリブレーション曲線が作成される。その後、試料中に存在する目的の遺伝子及び遍在性遺伝子の定量が行われる。そして、定量値は、内挿法により、キャリブレーション曲線を用いて決定される。
【００８７】
Ａ．試料中の遍在性遺伝子又は遍在性遺伝子の転写産物の定量
「遍在性遺伝子」は、測定の標準化に寄与する参照遺伝子である。その定量は測定ごとに正確で再現性がある。
【００８８】
遍在性遺伝子の転写産物も同様である。ヒトの体の細胞内での発現が概略知られているいくつかの遍在性遺伝子(β−グロビン、β−アクチン、GAPDH又は  Abelson等の転写産物、β−２マイクログロブリンB2M、β−グルクロニダーゼGUS、ポルフォビリノーゲンデアミナーゼPBGD、TATAボックス結合蛋白質TPB等)がある
【００８９】
実施例として、好ましい遍在性遺伝子とそれらの測定値について、次に示す表に記載した。
（表１）
2004524034.tif 000002
Ｎ：試料数
平均10CN：本試料に由来する全RNA10ngあたりの試料中の平均コピー数
範囲：試料の95％を含む範囲の上限及び下限値
SP：末梢血液
CSSP：末梢血液幹細胞
【００９０】
遍在性遺伝子は種々のパラメータの機能として選択され、第一に、その発現は、実験条件下で安定であることを要し、また、該発現は、例えば、該発現が標的の発現と一定の関係にあるように、分解工程の間、標的の発現と相関関係があることを要する。
【００９１】
遍在性遺伝子は目的とする遺伝子と同じ方法で調製される。同様にして、遍在性遺伝子を含むキャリブラントの連続した希釈物が得られる。
【００９２】
「遍在性遺伝子」又はその転写産物の定量は、実施される定量の質に関する情報を提供する。実際、該定量は、定量されるDNA又はRNA、特に、複雑な媒質を呈する試料中のDNA又はRNAの分解を示すことができる定量PCRにより行われる。定量されるDNA又はRNAの該分解に伴って、同様の割合で、「遍在性遺伝子又は転写産物」の類似した分解が起こると考えられる。もしも該PCRにより決定される遍在性遺伝子の正確な量がわかれば、それから、該遺伝子の分解を推論することができ、また、上記規定の基礎条件に基づき、試料中の定量すべき目的の遺伝子の分解を推論することができる。
【００９３】
プラスミド標準曲線は、同一の実験で２回定量された３つの対数希釈物に基づいて作成される。希釈物の第一と第二のポイントの位置は、検討中の遺伝子に観察された平均の発現を基にして決定される。対象試料中のコピー数は、内挿法で決定される。
例えば、遍在性遺伝子ABLの平均の発現は、0.1μgのRNA同等物あたり、20,000コピーである。第一のプラスミド希釈物は、５μl溶液中に100,000コピーを含むように計算される。第二及び第三は、５μl溶液中にそれぞれ10,000及び1,000コピーを含む。このようにして、試料中のRNAのいかなる分解も、より少ないコピー数で表現され、第二及び第三の希釈物に含められるであろう。
【００９４】
Ｂ．目的とする配列の定量
プラスミド標準曲線は、同一の実験で２回定量された４〜５の対数希釈物に基づいて作成される。全範囲中の最初のポイントは、遺伝子の1,000,000コピーに相当し、最後は10コピーに相当する。中間の希釈物は、100,000、1,000、100コピーである。検討すべき試料中のコピー数は、内挿法により決定される。
【００９５】
Ｃ．結果の発現
PCR産物の増幅は幾何級数の法則に従う。繰り返し行った測定において、試料中のコピー数の統計的分布は対数関数的である。したがって、標準化計算を行うために、対数値を考慮する必要がある。
【００９６】
このように、与えられた目的とする遺伝子、例えば、融合転写産物(FT1、FT2)及びその遍在性遺伝子(UG1、UG2)、に対して二重に定量された試料において、得られる値は次の式に従う。
2004524034.tif 000003
NCN は標準化コピー数、
TFは標的配列(例えば、融合転写産物)のコピー数、
GUは遍在性遺伝子又は遍在性遺伝子の転写産物のコピー数、
CN(任意)は検討された遺伝子に対して観察されたコピー数のメジアンの対数値(例えば、ABLに対して、CN＝４)。これにより、ABLの10,000コピーに対する結果を表現することができる。
Logは、常用対数を意味する。
【００９７】
その後、該結果は、誘導される単位：モル、グラム又はそれらの派生単位の数に関係付けることができる。
【００９８】
実施例３：対照転写産物と対比した標的転写産物の定量
融合転写産物(MLL−AF4)及び遍在性遺伝子(ABL)の増幅は、定量PCRによって平行して行われる。装置からの何の訂正も加えない出たままの結果は、次の表に示される。
【００９９】
（表２）
2004524034.tif 000004
診断中の患者から得た試料とプラスミドからのABLとMLL−AF4の２つの転写産物の平行した増幅の実施例
【０１００】
プラスミド希釈物についての、装置から得られる何の訂正も加えない出たままの値（Ct）は、横軸にコピー数の対数をプロットし、縦軸に希釈物のCtをプロットすることにより回帰曲線を作成するために使用される。相当する回帰曲線は表２に示される。相当するコピー数は内挿法によって計算される。
【０１０１】
公式２を用いて、患者から得られた結果は、Log(NCN)＝3.71−4.01＝−0.30、NCN＝10(-0.30)＝0.501 対照転写産物(ABL)の１コピーあたりのMLL−AF4のコピー、のように計算される。
【０１０２】
実施例４：白血病に関与する転写産物の定量
１．転写産物の提示
融合転写産物は、２つの遺伝子の融合に起因するものである。
【０１０３】
下の表は、既述した転写産物を産生するために融合した２つの遺伝子の配列に対するGenbank database(商標)のアクセスナンバーを提示する。
【０１０４】
（表３）
2004524034.tif 000005
【０１０５】
２．参照値の決定
白血病に関与する主要な融合転写産物の発現レベルの値は、現在に至るまで、総括的に提示されていない。
【０１０６】
以下の表はそれらの値を提示する。それらは本発明の定量方法で得ることができ、定量の後に比較値として使用できる。これらの定量値は、特に診断(例えば、診断方法の一部として)の目的、あるいは、提案した方法により検出可能な遺伝子の異常(遺伝子又は転写産物)が診断によって示された、あらゆる病理学的状態に関する治療法の有効性を評価する目的に使用されうるものである。特に、本発明の定量方法及び診断方法は、抗白血病の治療法のモニタリングを可能とするものである。
【０１０７】
これら全ての値は、図１に要約されている。この図では、TGは融合転写産物、NCNは標準化コピー数、LALは急性リンパ性白血病、LMCは慢性骨髄性白血病を意味する。
【０１０８】
以下の表では、特に特定されていなければ、１コピーのABL遺伝子、GUS遺伝子あるいは100コピーのB2Mに対する、融合遺伝子の標準化コピー数が記載されている。メジアン値は、数値の95％をカバーする範囲のものとして規定している。相関係数は遍在性遺伝子による標準化前を規定している。
血液と骨髄の試料から得られた結果の間には、統計的に重大な相違は認められなかった。
【０１０９】
（表４）細胞系及び診察中の患者のABL、B2M、GUS、E2A−PBX1遺伝子の増幅
2004524034.tif 000006
【０１１０】
（表５）細胞系及び診察中の患者のABL、B2M、GUS、E2A−PBX1遺伝子の増幅
2004524034.tif 000007
【０１１１】
（表６）細胞系及び診察中の患者のABL、B2M、GUS、TEL−AML1遺伝子の増幅
＊GUSに対し、12の血液試料と17の骨髄試料を試験した。
2004524034.tif 000008
【０１１２】
（表７）細胞系及び診察中の患者のABL、B2M、GUS、BCR−ABL(mBCR)遺伝子の増幅
2004524034.tif 000009
【０１１３】
（表８）細胞系及び診察中の患者のABL、B2M、GUS、BCR−ABL(MBCR)遺伝子の増幅
2004524034.tif 000010
【０１１４】
（表９）細胞系及び診察中の患者のABL、B2M、GUS、SIL−TAL遺伝子の増幅
2004524034.tif 000011
【０１１５】
（表１０）細胞系及び診察中の患者のABL、B2M、GUS、PML−RARA遺伝子の増幅
2004524034.tif 000012
【０１１６】
（表１１）細胞系及び診察中の患者のABL、B2M、GUS、CEFb−MYH11遺伝子の増幅
2004524034.tif 000013
【０１１７】
（表１２）細胞系及び診察中の患者のABL、B2M、GUS、AML1−ETO遺伝子の増幅
2004524034.tif 000014
【０１１８】
参考文献
［１］Marcucciら.‘Detection of minimal residual disease in patients  with AML1/ETO-associated acute myeloid leukemia using a novel quantitative reverse transcription polymerase chain reaction assay’,Leukemia,1998,12:1482-1489
［２］Van Dongenら., Report of the European BIOMED 1 concerted Action, Leukemia,  1999
［３］SAMBROOKら.,  MOLECULAR CLONING a laboratory manual 2nd Ed.  Cold Spring Harbor Laboratory Press,  1989.
【図面の簡単な説明】
【０１１９】
【図１】転写産物の発現レベルを示す図である。
【図１】
2004524034.tif 000015
【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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2004524034.tif 000092
2004524034.tif 000093
【手続補正書】
【提出日】平成15年6月5日(2003.6.5)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
定量すべき目的のDNA配列を含み、ベクターに挿入されるキャリブラントであって、線状であることを特徴とするキャリブラント。
【請求項２】
ベクターを含むキャリブラントを調製するための方法であって、次の工程：
DNA配列をベクターに挿入する工程、及び
挿入物の外側で、ベクターの１箇所のみの切断部位を認識するよう選択された制限酵素によって、キャリブラントを線状化する工程、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項３】
請求項２の方法によって得られるキャリブラント。
【請求項４】
キャリブラントが完全に人工的であることを特徴とする請求項１又は３に記載のキャリブラント。
【請求項５】
ベクターがプラスミドであることを特徴とする請求項１、３、４のいずれか１項に記載のキャリブラント。
【請求項６】
DNA配列を定量するためのキットであって、請求項１、３〜５のいずれか１項に記載のキャリブラントの少なくとも１つの連続した希釈物を含むことを特徴とするキット。
【請求項７】
請求項１、３〜５のいずれか１項に記載の２つのキャリブラントの２つの連続した希釈物を含むものであり、第一のキャリブラントは定量すべき配列を含むものであり、第二のキャリブラントは、遍在性遺伝子又は遍在性遺伝子の転写産物の配列を含むことを特徴とする請求項６に記載のキット。
【請求項８】
希釈溶媒が緩衝液であることを特徴とする請求項６又は７に記載のキット。
【請求項９】
希釈溶媒が、さらにキャリブラントの目的とする配列とは相同性を有していない核酸を含むことを特徴とする請求項６〜８のいずれか１項に記載のキット。
【請求項１０】
緩衝液のｐＨが７以上であることを特徴とする請求項８に記載のキット。
【請求項１１】
核酸が大腸菌のRNAであることを特徴とする請求項９に記載のキット。
【請求項１２】
遍在性遺伝子又は遍在性遺伝子の転写産物が、ABL、GUS、及びB2Mからなる群より選択されることを特徴とする請求項７〜１１のいずれか１項に記載のキット。
【請求項１３】
目的とする遺伝子が、AML1−ETO、E2A−PBX1、BCR−ABL、MLL−AF4、TEL−AML1、SIL−TAL、PML−RARA、CBFb−MYH11からなる群より選択されることを特徴とする請求項７〜１２のいずれか１項に記載のキット。
【請求項１４】
一連のキャリブラントを、液状又は凍結乾燥の形態で含めることを特徴とする請求項７〜１３のいずれか１項に記載のキット。
【請求項１５】
以下の工程：
請求項２に示す方法で得られるキャリブラントの調製、及び、
大腸菌のRNAを含むｐＨ７以上の溶媒中での連続した希釈物の調製、
を含むことを特徴とする、目的とするヌクレオチド配列を定量するためのキットを調製する方法。
【請求項１６】
測定すべき試料中のDNAを定量するための、請求項１、３〜５のいずれか１項に記載のキャリブラント、及び／又は請求項６〜１４のいずれか１項に記載のキットの使用。
【請求項１７】
遺伝子を定量するための請求項１６に記載の使用。
【請求項１８】
融合転写産物を定量するための請求項１６に記載の使用。
【請求項１９】
白血病に関与する融合転写産物を定量するための請求項１８の使用。
【請求項２０】
以下の工程：
定量PCRによる定量及び標的ヌクレオチド配列を運ぶキャリブラントの連続した希釈物を使用するキャリブレーション曲線の作成、
定量PCRによる定量及び遍在性遺伝子又は遍在性遺伝子の転写産物の配列を運ぶキャリブラントの連続した希釈物を使用するキャリブレーション曲線の作成、
キャリブレーション曲線を使用した、試料中の標的配列、及び遍在性遺伝子又は遍在性遺伝子の転写産物の配列の定量PCRによる定量、及び、
以下の式を用いることによる、標準化コピー数の計算、
Log(NCN)＝LogTF−LogGU
NCNは標準化コピー数、
TFは標的配列のコピー数、
GUは遍在性遺伝子又は遍在性遺伝子の転写産物のコピー数、
上記定量は二重に行っていることが好ましい、
を含むことを特徴とする試料中の標的核酸の定量方法。
【国際調査報告】
2004524034.tif 000094
2004524034.tif 000095
2004524034.tif 000096
2004524034.tif 000097
2004524034.tif 000098