(57)【要約】抗原又は抗体から選択されるタンパク質のアレイの作製方法であって、(i) (a)抗原又は(b)抗体結合性タンパク質のいずれかを50個以下のアミノ酸を有するペプチドと融合させて含む融合タンパク質を組換え細胞中で発現させるステップであって、該ペプチドがSEQ ID NO.1のアミノ酸配列LX1X2IX3X4X5X6KX7X8X9X10     (SEQ ID NO. 1) (ただしX1は天然アミノ酸であり、X2はロイシン、バリン、イソロイシン、トリプトファン、フェニルアラニン又はチロシンを除いた天然アミノ酸であり、X3はフェニルアラニン又はロイシンであり、X4はグルタミン又はアスパラギンであり、X5はアラニン、グリシン、セリン又はトレオニンであり、X6はグリシン又はメチオニンであり、X7はイソロイシン、メチオニン又はバリンであり、X8はグルタミン、ロイシン、バリン、チロシン又はイソロイシンであり、X9はトリプトファン、チロシン、バリン、フェニルアラニン、ロイシン又はイソロイシンであり、X10はアスパラギン又はグルタミンを除いた任意の天然アミノ酸である; また該ペプチドはX6に隣接するリシン残基においてビオチンリガーゼによりビオチン化することができる。)を含むことを特徴とするステップ; (ii)  融合タンパク質の該ペプチドをX6に隣接するリシン残基においてビオチン化するステップ; (iii)ビオチン化融合タンパク質を単離するステップ; (iv)アビジン又はストレプトアビジンをコートした非多孔質基板にビオチン化融合タンパク質を付着させるステップ; (v) (a)融合タンパク質が抗原を含む場合には、抗原アレイの作製を目的にステップ(i)〜(iv)を所望回数実行することにより、又は(b)融合タンパク質が抗体結合性タンパク質を含む場合には、ステップ(iv)の前又は後に複数種の抗体又はその結合性断片を該タンパク質に結合させることにより、基板上に少なくとも3種類のタンパク質からなるアレイを形成させるステップを含む作製方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗原又は抗体から選択されるタンパク質のアレイの作製方法であって、
(i)  (a)抗原又は(b)抗体結合性タンパク質のいずれかを50個以下のアミノ酸を有するペプチドと融合させて含む融合タンパク質を組換え細胞中で発現させるステップであって、該ペプチドがSEQ ID NO.1のアミノ酸配列
LX1X2IX3X4X5X6KX7X8X9X10     (SEQ ID NO. 1)
(式中、X1は天然アミノ酸であり、X2はロイシン、バリン、イソロイシン、トリプトファン、フェニルアラニン又はチロシンを除いた天然アミノ酸であり、X3はフェニルアラニン又はロイシンであり、X4はグルタミン又はアスパラギンであり、X5はアラニン、グリシン、セリン又はトレオニンであり、X6はグリシン又はメチオニンであり、X7はイソロイシン、メチオニン又はバリンであり、X8はグルタミン、ロイシン、バリン、チロシン又はイソロイシンであり、X9はトリプトファン、チロシン、バリン、フェニルアラニン、ロイシン又はイソロイシンであり、X10はアスパラギン又はグルタミンを除いた任意の天然アミノ酸である; また該ペプチドはX6に隣接するリシン残基においてビオチンリガーゼによりビオチン化することができる。)
を含むことを特徴とするステップ;
(ii)  該融合タンパク質の該ペプチドをX6に隣接するリシン残基においてビオチン化するステップ;
(iii)  このビオチン化融合タンパク質を単離するステップ;
(iv)  アビジン又はストレプトアビジンをコートした非多孔質基板に該ビオチン化融合タンパク質を付着させるステップ;
(v)  (a)該融合タンパク質が抗原を含む場合には、抗原アレイの作製を目的にステップ(i)〜(iv)を所望回数実行することにより、又は
(b)該融合タンパク質が抗体結合性タンパク質を含む場合には、ステップ(iv)の前又は後に複数種の抗体又はその結合性断片を該タンパク質に結合させることにより
基板上に少なくとも3種類のタンパク質からなるアレイを形成させるステップ;
を含む作製方法。
【請求項２】
融合タンパク質がさらに、該融合タンパク質に対するアフィニティー又は検出タグ配列としての機能を果たしうる第2ペプチド配列を含み、該配列は1〜30アミノ酸を含むことを特徴とする請求項1に記載の方法。
【請求項３】
ペプチド配列タグをSEQ ID NO. 1アミノ酸配列の末端に融合させる請求項2に記載の方法。
【請求項４】
ペプチド配列タグを、抗原又は抗体結合性タンパク質のSEQ ID NO.1融合側の反対側に融合させる請求項2に記載の方法。
【請求項５】
ペプチド配列タグの少なくとも1個のアミノ酸がヒスチジンである請求項2ないし4のいずれか1項に記載の方法。
【請求項６】
ペプチド配列タグが式His-Xで示され、式中Xは-Gly-、-His-、-Tyr-、-Gly-、-Trp-、-Val-、-Leu-、-Ser-、-Lys-、-Phe-、-Met-、-Ala-、-Glu-、-Ile-、-Thr-、-Asp-、-Asn-、-Gln-、-Arg-、-Cys-及び-Pro-からなる群より選択される請求項5に記載の方法。
【請求項７】
ペプチド配列タグが式Y-Hisで示される請求項5に記載の方法。
【請求項８】
Yが-Gly-、-Ala-、-His-及び-Tyr-より選択される請求項7に記載の方法。
【請求項９】
組換え細胞がビオチンリガーゼを発現し、かつステップ(ii)がビオチンの存在下に、ビオチン化を該細胞中in vivoで起こすように、実行されることを特徴とする先行請求項の任意の1項に記載の方法。
【請求項１０】
組換え細胞がビオチンを発現する請求項9に記載の方法。
【請求項１１】
ステップ(iii)がSEQ ID NO.1のペプチドに対して特異的であるさらなる抗体又はその結合性断片を使用して実行される先行請求項の任意の1項に記載の方法。
【請求項１２】
ステップ(iii)が請求項2ないし8のいずれか1項に記載のペプチド配列タグに対して特異的であるさらなる抗体又はその結合性断片を使用して実行される請求項1ないし10の任意の1項に記載の方法。
【請求項１３】
さらなる抗体又はその結合性断片がカラム又は磁気ビーズ上に固定化されるかもしくはピペットチップ内に装入される請求項11又は12に記載の方法。
【請求項１４】
結合した融合タンパク質をその後でpH値を高めることにより溶離する請求項13に記載の方法。
【請求項１５】
ステップ(iii)で、解離可能にビオチンに結合する分離材を使用して融合タンパク質を溶離する請求項1ないし10のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１６】
分離材は、ビオチンに対するアフィニティーが天然アビジン又はストレプトアビジンよりも低い改良アビジン又はストレプトアビジンである請求項15に記載の方法。
【請求項１７】
分離材を磁気ビーズ又はピペットチップに付着させる請求項15又は16に記載の方法。
【請求項１８】
pH条件を変化させて融合タンパク質を分離材から溶離する請求項15ないし17に記載の方法。
【請求項１９】
ステップ(iv)で使用するコート基板の一部の領域をブロッキング処理して融合タンパク質が該領域に結合するのを防ぐようにする先行請求項の任意の1項に記載の方法。
【請求項２０】
SEQ ID NO.1のペプチドが次のリストから選択される先行請求項の任意の1項に記載の方法。
【化１】
2004532024.tif 000008
【化２】
2004532024.tif 000009
【化３】
2004532024.tif 000010
【化４】
2004532024.tif 000011
【化５】
2004532024.tif 000012
【化６】
2004532024.tif 000013
【化７】
2004532024.tif 000014
【請求項２１】
ペプチドが鎖長15アミノ酸のペプチドである先行請求項の任意の1項に記載の方法。
【請求項２２】
ペプチドがSEQ ID NO.2
Gly Leu Asn Asp Ile Phe Glu Ala Gln Lys Ile Glu Trp His Glu
(SEQ ID NO.2)
のペプチドである請求項21に記載の方法。
【請求項２３】
融合タンパク質が抗原を含む先行請求項の任意の1項に記載の方法。
【請求項２４】
抗原ライブラリーを使用してアレイを作製する請求項23に記載の方法。
【請求項２５】
融合タンパク質が抗体結合性タンパク質を含む請求項1ないし22のいずれか1項に記載の方法。
【請求項２６】
抗体結合性タンパク質が1つ又は複数のプロテインA、プロテインG及びプロテインLである請求項25に記載の方法。
【請求項２７】
抗体結合性タンパク質がプロテインA、プロテインG及びプロテインLの混合物である請求項26に記載の方法。
【請求項２８】
抗体結合性タンパク質をそのN末端でペプチドと融合するか、又はそのC末端で該ペプチドと融合することを特徴とする請求項25ないし27のいずれか1項に記載の方法。
【請求項２９】
ステップ(iv)に先立って発現融合タンパク質の同一性を確認する先行請求項のいずれか1項に記載の方法。
【請求項３０】
同一性の確認に質量分析法を使用する請求項29に記載の方法。
【請求項３１】
内部対照としての機能を果たす融合タンパク質中のSEQ ID NO.1ペプチドを検出することによりタンパク質の正規化を行う先行請求項のいずれか1項に記載の方法。
【請求項３２】
内部対照としての機能を果たす融合タンパク質中の請求項1ないし8のいずれか1項に記載のペプチド配列タグを検出することによりタンパク質の正規化を行う先行請求項のいずれか1項に記載の方法。
【請求項３３】
ペプチドの検出を、該ペプチドに対して高アフィニティーを有する抗体によって行う請求項31又は32に記載の方法。
【請求項３４】
免疫検定法を後続のアレイの使用による生物試料解析と同時に実行することによりタンパク質の正規化を行う請求項31ないし33に記載の方法。
【請求項３５】
ステップ(iv)で使用するアビジン又はストレプトアビジンをコートした非多孔質基板がガラス又はプラスチック素材である先行請求項の任意の1項に記載の方法。
【請求項３６】
基板上のストレプトアビジン層を基層としてその上にさらなるアクセプター層を設ける先行請求項の任意の1項に記載の方法。
【請求項３７】
アレイが3〜10,000種類の融合タンパク質を含む先行請求項の任意の1項に記載の方法。
【請求項３８】
各タンパク質が、SEQ ID NO.1を含むペプチドをN末端に融合させた形とSEQ ID NO.1を含むペプチドをC末端に融合させた形の両方の形で存在する請求項37に記載の方法。
【請求項３９】
先行請求項の任意の1項に記載の方法によって得られるタンパク質アレイ。
【請求項４０】
抗原-抗体結合を検出する方法であって
(vi)  請求項39に記載のアレイに、ステップ(v)(a)のアレイの場合には抗体を含む又は含むと推測される試料を、またステップ(v)(b)のアレイの場合には抗原を含む又は含むと推測される試料を、それぞれ付着させるステップ; 及び
(vii)  基板上の結合抗体又は結合抗原を検出するステップ
を含む方法。
【請求項４１】
ステップ(vii)をELISA法によって行う請求項40に記載の方法。
【請求項４２】
ステップ(vi)及び/又はステップ(vii)の最中に融合タンパク質アレイのタンパク質の品質及び/又は密度を監視し続ける請求項40及び41の方法。
【請求項４３】
SEQ ID NO.1を含むペプチドの検出によって監視を行う請求項42に記載の方法。
【請求項４４】
アレイが第2ペプチド配列をさらに含む融合タンパク質を含み、かつ該第2ペプチド配列を検出することによって監視を行う請求項42に記載の方法であって、該第2ペプチド配列が1〜30アミノ酸を含むことを特徴とする方法。
【請求項４５】
少なくともいくつかのステップを自動化する請求項1ないし38又は請求項40ないし44のいずれか1項に記載の方法。
【請求項４６】
すべてのステップを自動化する請求項45に記載の方法。
【請求項４７】
抗体結合性タンパク質をN末端又はC末端でSEQ ID NO.1を含む13〜50アミノ酸のペプチドと融合させて含む融合タンパク質。
【請求項４８】
SEQ ID NO.1のペプチドがSEQ ID NO.2のペプチドである請求項47に記載の方法。
【請求項４９】
融合タンパク質に対するタグ配列としての機能を果たす1〜20アミノ酸の第2ペプチド配列をさらに含む請求項47又は48に記載の融合タンパク質。
【請求項５０】
抗体結合性タンパク質がプロテインA、プロテインG又はプロテインL、もしくはそれらの混合物である請求項47ないし49のいずれか1項に記載の融合タンパク質。
【請求項５１】
請求項47ないし50のいずれか1項に記載の融合タンパク質をコードする核酸配列。
【請求項５２】
ペプチドをコードする配列がSEQ ID NO.9
GGC CTG AAC GAC ATC TTC GAG GCT CAG AAA ATC GAA TGG CAC GAA (SEQ ID NO.9)
の配列である請求項51に記載の核酸。
【請求項５３】
添付図面に関連して上文で詳述したとおりの方法、融合タンパク質又は核酸。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はタンパク質解析を行うためのアレイの、特に抗体、抗原又は抗体結合性タンパク質のアレイの作製方法に、作製されたタンパク質アレイ、該アレイを使用して解析を行う方法及び該アレイに組み込まれる新規物質に、それぞれ関連する。特に、アレイ作製方法はタンパク質解析又は結合解析用の一連の抗原及び/又は抗体を作製しアレイに固定化する方法に関連する。
【背景技術】
【０００２】
異なる多数のタンパク質を表面基板に付着させてタンパク質「アレイ」を作製するという考え方は文献でも広く開示されている(たとえばEP0063810、WO84/03151、US5143854の各明細書を参照)。
【０００３】
最近、多様な種類のきわめて多数のタンパク質を種々のタイプの固体基板上に配列したチップを作製するという構想への関心が富に高まってきた。たとえば抗原、抗体、タンパク質(タンパク質-タンパク質相互作用)及び機能酵素などのアレイである。
【０００４】
その技術的背景やそうしたチップの潜在用途は文献に網羅されており(Joos et al. Electrophoresis 2000, 21, 2641-2650; Haab et al. Genome Biology 2000 1(6); Borrebaeck, Immunology Today, August 2000)、潜在的効用の例は最近の多数の特許出願(たとえばWO 00/07024、WO 99/40434、WO 99/39210及びWO 00/54046)に見ることができる。
【０００５】
抗原アレイ作製構想はEP 0063810明細書(1982)で開示されている。それによれば、抗原及び抗体を多孔質固体基板に結合させることで無限数の抗原-抗体相互作用を同時に行わせることができる。抗原アレイの作製はごく少量の抗原をニトロセルロース膜又は類似基板上に分注し吸着させるだけであり、後は対応する抗体でプローブすればよい。溶液中又はプラスチックプレート中で行う固相酵素免疫検定(ELISA)法の場合と同様に、非特異的相互作用はウシ血清アルブミン(BSA)でブロックするが、これは今日では標準技法となっている。またアレイのエレメント(又はスポット)は拡散せず、膜上にしっかりと吸着したという。
【０００６】
しかし、これらのエレメントはマイクロアレイ・チップ系で実現されるエレメントよりもサイズがずっと大きい。EP0063810明細書は手作業で、「荷電液滴」法又はリソグラフィー法を含む機械的方法で、タンパク質を分注してタンパク質アレイを作製する方法を開示している。この方法では径500ミクロン未満のエレメントが得られた(ちなみに現在の自動アレイ作製システムでは100ミクロン径が実現可能である)。
【０００７】
しかし、非多孔質表面ではなく膜を使用した場合の大きな難点の1つは結合が即座に行われない限り、エレメントが基板材料中に拡散しやすいことである。
【０００８】
この問題を克服するための試みもなされてきた。US4496654明細書は、ストレプトアビジンで処理し(それを表面に吸着させ)た円板紙などのような多孔質表面を使用してビオチン化抗体を任意所望のパターンに配列しうるようにする方法を開示している。円板紙はBSAブロッキング処理の後、抗原(たとえばヒト絨毛性ゴナドトロピン)でプローブし、次いで酵素検定法で検出することができる。ビオチン化抗体は即座に円板紙表面にしっかり結合するので、スポットの拡散も少なくなる。
【０００９】
アビジン又はストレプトアビジンでコートした表面などの「アクセプター」表面を使用してこの方法を実現するには、アレイに固定する各抗体及び抗原をビオチン化した後にアレイに付着させなければならないが、この手順がそのアビディティー(又は抗原を使用する場合にはその抗原性)を、天然タンパク質と比較して、損ねないとの保証はない。
【００１０】
非多孔質表面の難点は、多様なタイプのガラス又はプラスチックなどの固体表面ほど堅牢ではない、従ってそれらと同じようにストリンジェントな条件での洗浄又は処理はできないなどである。
【００１１】
しかし抗原及び抗体アレイでは、タンパク質を固体表面に付着させると一般に抗原の抗原性及び抗体のアビディティーが自由溶液中での観測値よりも低下する結果になりやすいと判明している。
【００１２】
抗原及び抗体を固定化しようとする従来の試み(WO84/03151明細書及び前掲Haab et al. 2000を参照)は概してあまり成功しなかった。WO 84/03151明細書は、抗体を顕微鏡用カバースリップなどのようなガラス表面に直接付着させ乾燥させることが可能だと説明している。ブロッキング処理後に、この場合は全細胞という形の抗原に接触させると抗原はアレイに固定化した。しかしWO84/03151明細書はさらに、これらの抗体は溶液中で行う同等のELISA法と比較して、より高濃度の抗原を付着させる必要があるとも説明している。また抗体を「高度に濃縮しないと、所望の細胞接着を起こすに足る高密度の抗体コートを実現することができない」とも指摘している。また、抗体をガラス表面に吸着させるにはかなりの時間がかかった。
【００１３】
他の抗原及び抗体直接固定化法も報告されてきた。その1つはUS5827669明細書で開示されているような、ヒドロキシアパタイトの形でリン酸カルシウムをろ紙に吸着させ、その上にタンパク質をイオン作用により結合させる方法である。発明者の報告によればこれは酸性タンパク質には無効であり、また抗原がリン酸カルシウム層上で「配向性不良」になる。しかし、この方法はストレプトアビジンの固定化に使用すると成功したという。
【００１４】
非多孔質固体表面にタンパク質を固定化する別の方法は、筋肉から単離した接着性のポリフェノール性タンパク質を使用してタンパク質を付着させるものである(US5817470明細書)。固体表面たとえばポリスチレン製マルチウェルプレートをポリフェノール性タンパク質でコートすると、この処理した基板に多様な抗原を結合させ、一次抗体とそれに続く酵素標識二次抗体とを使用するサンドイッチELISA法で検出することができる。
【００１５】
しかし発明者も認めているように、この方法は固体表面への抗原結合又は吸着量により制約を受ける。最終的にプレート表面に強く結合する抗原の量は多数の因子たとえば抗原の分子特性、固体基板の性質、溶液中の抗原濃度、固体表面のコーティング又は活性化に使用する抗原溶解用緩衝液の特性などにより異なる。一般に固体表面に吸着するのはコーティング液中に存在する抗原のうちごく一部である。
【００１６】
非多孔質表面への抗体及び抗原の直接付着もまた試みられ、113種の抗体と対応する抗原が使用された[Haab et al. Genome Biology 1(6), 2000]。DNAマイクロアレイ向けに開発された技術により、ポリ-s-リシンをコートしたガラススライドを使用して抗原と抗体を固定化する実験が別々に行われた。結果は、アレイ抗原の50%及びアレイ抗体の20%がそれぞれ1.6μg/ml、0.34μg/ml濃度以下で対応リガンドの特異的かつ正確な測定を可能にしたにすぎない。
【００１７】
固体表面への抗体結合のこうした高失敗率は大規模抗体アレイ製造計画では許されないであろう。これは、タンパク質アレイの可能性を実現するに足る抗体/抗原機能の維持という点で抗原及び抗体の直接付着方式は不向きであるとの見解を支持する。
【００１８】
ビオチン標識タンパク質用のバインダーとしての、たとえばアビジン及びストレプトアビジンなどのコーティングの使用は数多くのタンパク質に通用することがよく知られている。この場合は一般にタンパク質をまず単離し、次いでビオチン化する。ビオチンとタンパク質の結合はタンパク質中の任意の又はすべての活性リシン部位で可能である。
【００１９】
従って抗原又は抗体をこうした方法でビオチン化すると、それらのN末端基にもそれらの表面の任意数の潜在活性リシン残基にもビオチン基が存在することになろう。これは抗原及び抗体がひとたびストレプトアビジン層に結合したら任意数の異なる配向をとることを、従って、結合特性が多様になることを意味する。さらに、ストレプトアビジンを介して固定化された抗原又は抗体への接近が立体障害により限定されるため、概して不十分な検定感度となろう。
【００２０】
立体障害を緩和し、免疫検定の感度を高めるために、抗原/抗体とビオチン化部位の間にリンカーを入れることが可能であると判明している。
【００２１】
US5811246明細書は、免疫検定用又は抗血清産生用の小さな合成ペプチドを「担体」タンパク質たとえばアビジン又はストレプトアビジンにリンカーたとえば多様なブラジキニン誘導体を介して結合する方法を開示している。これにはいくつかの利点がある。第1に該ペプチド上の遊離N末端基とリンカーの間の縮合反応では抗体による認識(免疫検定法)又は免疫応答の誘発(免疫法) に必須の荷電残基が保持される。第2にブラジキニンリンカーはその後、該小ペプチド上の遊離荷電基が保持されるようにビオチン化することができる。いずれの場合も、リンカーの存在は免疫検定法の感度向上に、また免疫物質として使用した場合には免疫応答の改善に資するように見受けられる。
【００２２】
しかし、ブラジキニン誘導体のこうした使用はアレイ作製方法にさらなるステップと厄介な問題を持ち込むことになる。
【００２３】
US5723584、US5874239、US5932433の各明細書及びBeckett et al. Protein Sci. (1999) 8(4) 921-9は目的のペプチド又はタンパク質に融合したビオチン化ペプチドを開示している。これらのビオチン化ペプチドは組換えタンパク質をビオチン化して、その迅速な精製、固定化、標識又は検出を可能にするために使用される。これらのペプチドを特に抗原又は抗体結合性タンパク質と共に使用する又はアレイ作製に使用するといった提案はなされていない。
【００２４】
本出願人は、これらの特許で使用されているペプチドがきわめて優れた抗原又は抗体アレイの作製を可能にし、そうしたアレイは非多孔質基板を使用して効率的に、かつこれらのタンパク質の結合アビディティーを実質的に保持しながら作製しうることを発見した。
【発明の開示】
【００２５】
本発明の第1態様では、抗原又は抗体から選択されるタンパク質のアレイの作製方法が提供されるが、該方法は以下のステップを含む:
(i)  (a)抗原又は(b)抗体結合性タンパク質のいずれかを50個以下のアミノ酸を有するペプチドと融合させて含む融合タンパク質を組換え細胞中で発現させるステップであって、該ペプチドがSEQ ID NO.1のアミノ酸配列
LX1X2IX3X4X5X6KX7X8X9X10     (SEQ ID NO. 1)
(式、X1は天然アミノ酸であり、X2はロイシン、バリン、イソロイシン、トリプトファン、フェニルアラニン又はチロシンを除いた天然アミノ酸であり、X3はフェニルアラニン又はロイシンであり、X4はグルタミン又はアスパラギンであり、X5はアラニン、グリシン、セリン又はトレオニンであり、X6はグリシン又はメチオニンであり、X7はイソロイシン、メチオニン又はバリンであり、X8はグルタミン、ロイシン、バリン、チロシン又はイソロイシンであり、X9はトリプトファン、チロシン、バリン、フェニルアラニン、ロイシン又はイソロイシンであり、X10はアスパラギン又はグルタミンを除いた任意の天然アミノ酸である; また該ペプチドはX6に隣接するリシン残基においてビオチンリガーゼによりビオチン化することができる。)
を含むことを特徴とするステップ;
(ii)  融合タンパク質の該ペプチドをX6に隣接するリシン残基においてビオチン化するステップ;
(iii)  ビオチン化融合タンパク質を単離するステップ;
(iv)  アビジン又はストレプトアビジンをコートした非多孔質基板にビオチン化融合タンパク質を付着させるステップ;
(v)  (a)融合タンパク質が抗原を含む場合には、抗原アレイの作製を目的にステップ(i)〜(iv)を所望回数実行することにより、又は
(b)融合タンパク質が抗体結合性タンパク質を含む場合には、ステップ(iv)の前又は後に複数種の抗体又はその結合性断片を該タンパク質に結合させることにより
基板上に少なくとも3種類のタンパク質からなるアレイを形成させるステップ。
【００２６】
本出願人は、抗原又は抗体結合性タンパク質をSEQ ID NO. 1ペプチドと融合させて用いれば、これらのタンパク質を、タンパク質の抗原性又は抗体結合性タンパク質の結合能を実質的に維持しながら、固体表面に固定化しうることを発見した。
【００２７】
これは、タンパク質それ自体ではなく融合ペプチドをビオチン化するのでタンパク質を基板表面に付着させてもその抗原性が破壊される度合いは少ないためであろう。さらに、SEQ ID NO. 1を含むペプチドは立体障害を緩和し抗原-抗体相互作用を可能にするように見受けられる。このペプチドリンカーが確実にタンパク質の末端領域に付着し、また確実にビオチン化部位を含むようにすると、機能に必須であるタンパク質上の部位はほとんど影響を受けないように見受けられる。こうした融合体は抗原又は抗体アレイを使用する解析方法との関連では特に有利である。
【００２８】
非多孔質表面へのタンパク質付着態様(ステップiv)、細胞溶解物からのタンパク質単離態様(ステップiii)及びビオチン化の方法(ステップii)に一貫して同じ融合ペプチドを使用するのは、本書で開示する方法が初めてである。
【００２９】
本書で使用する技術及び学術用語は特に明記しない限りすべて当業者が一般に理解しているとおりの意味とする。
【００３０】
「抗体結合性タンパク質」は本書では、抗体領域に結合することが知られているタンパク質又はその混合物をいう。そうしたタンパク質の例はプロテインA、プロテインL及びプロテインGである。
【００３１】
抗体結合性タンパク質は本発明では抗体アレイの作製に使用される。抗体は抗体結合性タンパク質たとえばプロテインA、G及び/又はL又は１つ又は複数のそうしたタンパク質を含む混合物などに結合するが、抗体結合性タンパク質自体はリンカーを介して基板表面のステトレプトアビジン・コート層に固定化される。天然プロテインA、G及びLはビオチン化処理した市販品があり、そうした市販品は基板表面のステトレプトアビジン・コート層に付着させることができるものの、本出願人はこれらのタンパク質を本発明のようにC及びN末端でビオチン化タグと融合させると、多様なタイプの抗体をきわめて効果的に結合させうることを発見した。これもまた立体因子が緩和される結果であるか、又はタンパク質上の結合部位がすべて容易に利用できるようになるためであろう。
【００３２】
加えて、本発明の方法を使用すれば、ビオチン化融合タンパク質はステップ(iv)で、アビジン又はストレプトアビジンをコートした基板に付着させるとすぐに捕捉されるため、観測可能な拡散がごくわずかな、きわめて離散的なスポットが基板上に形成される。
【００３３】
50個以下のアミノ酸を有し、SEQ ID NO. 1のアミノ酸配列を含むペプチドの具体例はUS5723584、US5874239及びUS5932433の各明細書に記載されており、それらの明細書の内容は参照指示により本書に組み込まれる。前記参考文献に記載のペプチド例を以下に掲げる:
【００３４】
【化１】
2004532024.tif 000002
【００３５】
【化２】
2004532024.tif 000003
【００３６】
【化３】
2004532024.tif 000004
【００３７】
【化４】
2004532024.tif 000005
【００３８】
【化５】
2004532024.tif 000006
【００３９】
【化６】
2004532024.tif 000007
【００４０】
SEQ ID NO.1を含むこれらのペプチド又はその断片はステップ(i)の融合タンパク質産生用のペプチドの好例である。
【００４１】
特に、本発明の融合タンパク質産生方法に使用されるペプチドは13〜20アミノ酸好ましくは約15アミノ酸を有する。
【００４２】
本発明の融合タンパク質産生への使用が特に好ましいペプチドは前掲SEQ ID NO. 78に示す15アミノ酸のペプチド断片である。特に好ましいのはSEQ ID NO. 2のアミノ酸配列
Gly Leu Asn Asp Ile Phe Glu Ala Gln Lys Ile Glu Trp His Glu
(SEQ ID NO. 2)
のペプチドである。
【００４３】
このペプチドはAviTag(商標)と称し、またこの配列をコードするDNAベクターはAvidity Inc.から商品名pAN-4、pAN-5及びpAN-6(タンパク質のN末端にSEQ ID NO. 2のペプチドを付着させた融合タンパク質の産生に好適)、それにpAC-4、pAC-5及びpAC-6 (タンパク質のC末端にSEQ ID NO. 2のペプチドを付着させた融合タンパク質の産生に好適)で市販されている。これらのベクターの配列は以下それぞれSEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7及びSEQ ID NO.8として示す(図7〜12)。これらのベクターはさらに、クローニング補助用のアンピシリン耐性遺伝子blaを含む。ただし、AviTag(商標)配列は他のベクター系に導入することもできる。
【００４４】
ビオチン化には色々なin vivo又はin vitro方法がある。たとえば発現宿主中でのビオチンリガーゼの同時発現、細胞溶解物へのビオチンリガーゼの添加又は精製タンパク質へのビオチンリガーゼの添加などである。本発明の方法の特に好ましい実施態様では、発現宿主中でビオチンリガーゼを同時発現させれば、細胞溶解物からタンパク質を単離する前にin vivoで融合ペプチドのリシン残基を酵素的にビオチン化しうるという原理を利用する。通常in vitro法を用いる場合には、発現タンパク質をまず細胞溶解物から単離し、次いで周知の手段によりin vitroで化学的にビオチン化しなければならない。これは資源の無駄とランダム・ビオチン化が生じる結果となる。多数のビオチン化部位をもつタンパク質は捕捉表面への結合の配向も度合いも予測不能である。本発明の方法の利点は、諸々の発現タンパク質が同じリンカー上の同じ残基を介してアレイに均一に付着することである。
【００４５】
従って、本発明のステップ(i)で使用する組換え細胞は、ビオチンリガーゼをも発現するように、またビオチンをも含むように組み換えて、後の図1で図解するようにステップ(ii)が該細胞内でin vivoで行われるようにするのがふさわしい。図1のDNA(1) は抗原又は抗体結合タンパク質をコードするクローン遺伝子であるのがふさわしいが、これをSEQ ID NO.1のペプチドをコードする配列(3)を含むベクター(2) (pAN-4、pAN-5、pAN-6又はpAC-4、pAC-5、pAC-6など)中にサブクローニングする。次いでサブクローン遺伝子を、該ベクターを導入した発現系たとえばE. coli中で、抗原又は抗体結合性タンパク質(5)をSEQ ID NO.1のペプチド(6)と融合させて含む融合タンパク質(4)として発現させる。構成的に発現したビオチンリガーゼの存在下にin vivoで発現させると、融合ペプチド(6)上のリシン残基は酵素的にビオチン化される。
【００４６】
細胞がビオチンを産生しない場合には、細胞を培地に加えて所望の結果をうむようにしてもよい。これは本発明の方法に要するステップ数を減らす。
【００４７】
本発明の方法への使用に特に好適な宿主細胞はAvidity Inc.(米国カリフォルニア州デンバー)の市販E. coli株AVB100、AVB101及びAVB99である。これらの菌株はどれも染色体中にbirA遺伝子を安定的に組み込んであるためビオチンリガーゼを発現する。AVB100の場合には、L-アラビノースによる誘導でBirAタンパク質の過剰発現が実現されよう。AVB101 E. coli B株はビオチンリガーゼを過剰発現するpACYC184 ColE1和合性プラスミドを含み、細胞中のビオチンリガーゼ濃度が高まると融合タンパク質のin vivo完全ビオチン化が実現する。代替宿主細胞は、ビオチンリガーゼ(pBirAcm)を過剰発現するIPTG-誘導性birA遺伝子を有するプラスミドpACYC184を収めたAVB99 (Avidity Inc.) E. coli菌株(XL1-Blue)である。
【００４８】
ステップ(i)で産生される融合タンパク質は常法で単離しin vitroでビオチン化してもよい。SEQ ID NO.1ペプチドの構造からして、ビオチン化はSEQ ID NO.1内のX6に隣接するリシンで確実に起こるであろう。
【００４９】
本発明の好ましい実施態様では、SEQ ID NO.1のアミノ酸配列を含むペプチドは本発明の方法のステップ(iii)で融合タンパク質を単離する手段としても使用される。組換えDNA技術を用いるタンパク質発現技術は周知である。しかし、発現する各タンパク質はアミノ酸配列が異なるし、少なからぬ配列は選択宿主中での発現が困難であり、あるいは疎水性であるため不溶性であり、又は宿主にとって有害である。最も単純な細菌発現系にあってさえ、目的タンパク質を天然活性状態に保ったままでは破壊しにくい封入体がしばしば形成される。
【００５０】
今日では目的タンパク質を別のタンパク質/ペプチド配列(タグ)と融合して、発現に続く精製工程の助けにするが慣行となっている。そうした融合体発現系には今日広く使用されている例あり、またいくつかの業者がすでに商業化している例もある。その種の融合ペプチド配列はタンパク質配列のアミノ末端又はカルボキシル末端に結合させ、特異的抗体又はアフィニティー樹脂で認識させる。
【００５１】
発現タンパク質は細胞残屑から可溶化しなければならないが、それは非生理的pH値又はカオトロピック試薬の使用などを含む過酷な条件を必要とする場合もあるので、アフィニティー精製工程はそうした条件にも耐えられるほど頑強でなければならない。
【００５２】
発現融合タンパク質の単離又は精製手段としてこの配列を使用すると、追加の精製用タグは不要になる。従って、この配列は二重の目的をはたす。
【００５３】
場合によっては、発現融合タンパク質の単離又は精製手段としてさらなるペプチド配列タグを使用するのが望ましいかもしれない。そうした配列は鎖長1〜30アミノ酸であるのが好ましい。
【００５４】
図13に示すように、ペプチド配列タグの配列(20)は抗原又は抗体結合性タンパク質のN末端又はC末端領域に配置してもよい。しかし、抗原又は抗体結合性タンパク質のSEQ ID NO.1融合側の反対側に配置するのが好ましい。追加のペプチド配列タグをSEQ ID NO.1と同じ末端領域に配置するときは、SEQ ID NO.1の遊離端に融合するのが好ましい。
【００５５】
多数のペプチド配列タグが公知である。本発明の目的に適うペプチド配列タグの例はUS4569794A、EP0282042Bの各明細書で開示されており、これら明細書の内容は参照指示による本書に組み込まれる。
【００５６】
ペプチド配列タグは少なくとも1個のアミノ酸ヒスチジンを含むのが好ましい。ペプチド配列タグは式His-Xで示されるのがなお好ましいが、式中Xは-Gly-、-His-、-Tyr-、-Gly-、-Trp-、-Val-、-Leu-、-Ser-、-Lys-、-Phe-、-Met-、-Ala-、-Glu-、-Ile-、-Thr-、-Asp-、-Asn-、-Gln-、-Arg-、-Cys-及び-Pro-からなる群より選択される。
【００５７】
あるいは、ペプチド配列タグは式Y-Hisで示されるが、式中Yは-Gly-、-Ala-、-His-及び-Tyr-より選択される。
【００５８】
特に好適なペプチド配列タグはEP0282042B明細書で開示されており、好ましい例はヘキサHisタグである。
【００５９】
本発明の方法の一実施態様ではステップ(iii)を、SEQ ID NO.1のアミノ酸配列を含むペプチドに対して特異的であるさらなる抗体又はその結合性断片を使用して実行する。前記のさらなる抗体は、常法により、SEQ ID NO.1のアミノ酸配列を含むペプチド(7)に対して産生させることができる。この方法を図2に図解する。
【００６０】
前記のさらなる抗体は抗融合体抗体(8)であり、カラム、磁気ビーズ(9)又はピペットチップに固定化することができる。固定化の方法は、抗動物種抗体(10)であるのがふさわしい二次抗体を使用する方法、又は文献記載の他の方法たとえばビーズ(9)に結合させたプロテインA、プロテインG又はプロテインLなどのような抗体結合性タンパク質を使用する方法がある。この方式は自動化に、またきわめて多数の、ただし少量の、新規融合タンパク質の同時並行的な単離に大いに適する。結合融合タンパク質(4)は細胞溶解物から分離し、次いでpHを7.0から9.0に引き上げて溶離することができる。
【００６１】
代替実施態様では、ビオチンに対しある程度のアフィニティーをもつがビオチンをかなり容易に解離するような分離材を用いて融合タンパク質を単離する。分離材は、天然のアビジン又はストレプトアビジンよりもビオチンに対するアフィニティーを弱くした改良型のアビジン又はストレプトアビジンであるのがふさわしい。そうした分離材の具体例としてはMolecular Probes社(米国オレゴン州ユージン)からCaptAvidin(商標)として市販されている改良型アビジンがある。
【００６２】
この実施態様では、融合タンパク質は常法により培地由来の細胞残屑、界面活性剤及び塩などから、細胞溶解混合物のpHを6.0に引き下げ、次いで (a)磁気ビーズ又は(b)ピペットチップに付着させたCaptAvidin(商標)を用いるアフィニティー精製で単離する。後は結合融合タンパク質を磁気ビーズ又はミニカラムから、pHを6.0から9.5に高めて溶離することができる。
【００６３】
ステップ(iv)の前に、発現した融合タンパク質の同一性を確認するのが好ましい。ある特定の手法では、ごく少量(10μl)の単離融合タンパク質をマイクロタイタープレートから取り出す。この試料をトリプシンで(周知の方法により)消化する。得られたペプチド抽出物を脱塩し、ZipTip(商標)(Millipore社、米国マサチューセッツ州)又は等価物を使用して濃縮した後に質量分析計で分析する。融合タンパク質の配列は判明しているので、その同一性の確認は通常はペプチドの同定を目的としたMALDI質量分析計による同定で十分である。この手法はタンパク質研究に広く使用されており、またT. Rabilloud (Ed.) Proteome Research: 2D gel electrophoresis and identification methodsで要約されている。さらに、この手法は自動化が可能であり、Amersham Pharmacia Biotech、Bio Rad、AbiMed及びGenomic Solutions (WO  07/4852A1明細書)などを含む数社から多数の商業システムが市販されている。
【００６４】
同様に、ステップ(iv)の前に、各発現タンパク質の濃度を可能な場合には正規化してエレメント間のばらつきを除去するのが好ましい。タンパク質濃度のばらつきが大きいとタンパク質アレイから得られたデータの解釈が困難になる[タンパク質免疫検定法やタンパク質アレイの定量面及び検定感度の定義はEkins, Clinical Chemistry (1998) 44:9 2015-2030; US5807755明細書; 及びUS5432099明細書を参照]。タンパク質の正規化は全タンパク質濃度の決定又は内部対照の使用により行うことができる。
【００６５】
本発明の方法の特に好ましい実施態様では、融合体タグを内部対照として使用し、融合タンパク質中のSEQ ID NO.1を含むアミノ酸配列のペプチドに対し高アフィニティーを有する抗体により検出する。あるいは、融合タンパク質をさらなるペプチド配列タグと共に発現させ、これを内部対照として使用することもできる。そうしたタグは、ビオチン化融合タンパク質の一部として発現させる前記のさらなるペプチド配列タグたとえば前述のヘキサHisタグなどでもよい。このタグ付き融合タンパク質は適当な抗体たとえば抗Hisタグ抗体を使用して検出してもよい。
【００６６】
これは、後続のアレイによる生物試料解析と同時に又はその最中に古典的なサンドイッチ免疫検定法を実行することにより行うことができる。
【００６７】
ビオチン化融合ペプチドに対する抗体を使用すれば、融合タンパク質の含量をμlあたりで、また全タンパク質量の比として、求めることができる。この方法はヒツジ・ポリクローナル一次抗体と蛍光色素で標識した二次抗体[たとえばヤギ抗マウス抗体+Alexa 488 (Molecular Probes社、米国ユージン)]とのサンドイッチを使用して実行されよう。この使用蛍光色素は生物試料に対する二次抗体に使用されるいずれの色素ともスペクトルが異なる。どちらの方法もすでに自動化用に最適化されている。
【００６８】
本発明の方法のステップ(iv)で使用されるアビジン又はストレプトアビジンをコートした非多孔質基板はガラス又はプラスチック素材であるのがふさわしい。そうした基板は小さな凝縮アレイの作製に好適である。これは重要である。生物試料は一般にきわめて希少で、従ってきわめて貴重だからである。タンパク質アレイでは目的物を収める表面積を極小にする必要があるが、その一方で要求される検定感度をなお実現しうるようにするのが好ましい。加えて、アレイの抗原又は抗体が高濃度であれば、検定法に使用したときにS/N比が改善する。
【００６９】
さらに、非多孔質表面は膜などを含む多孔質表面基板に比して、物理的により堅牢であり、自動化にも十分適するし、また蛍光スキャナーによる画像化に際してバックグラウンドが低くなる。
【００７０】
非多孔質表面は常法によりアビジン又はストレプトアビジンでコートしてもよい。たとえば非多孔質表面たとえばポリスチレン製マルチウェルプレートへのストレプトアビジンの固定化は技術上周知である。その最も単純な形式では、ストレプトアビジン溶液を該表面に数時間接触させておく。次いで、未結合タンパク質を洗浄除去し、プラスチック表面上の残留活性部分をBSA又は等価物でブロックする。この方式は受動的かもしれないが、効果的である。ポリスチレン又はニトロセルロース表面へのストレプトアビジンの非共有結合はWO98/37236明細書に記載のとおり、安定性も高温や高濃度のカオトロピック試薬に対する耐性も高いようである。
【００７１】
アビジンはManning et al. Biochemistry 16: 1364-1370 (1977)の記載に従いアビジンのN-ヒドロキシスクシンイミド活性エステルを使用してガラスに化学的に付着させることができるし、またJasiewicz et al. Exp. Cell Res. 100: 213-217 (1976)の記載に従いカルボジイミド・ベースのカップリング方法によりナイロンに付着させることもできる。
【００７２】
別の方法では、高分子化合物たとえばビオチン-N-ヒドロキシスクシンイミド=エステル、N-ビオチニル-6-アミノカプロイル-N-ヒドロキシスルホスクシンイミド=エステル、スルホスクシンイミジル-2-(ビオチンアミド)エチル-1,3-ジチオプロピオナートなどをビオンチン化し、好適表面のコーティングに使用する。次いでEP0620438明細書で開示されている要領で、アビジン又はストレプトアビジンを第2層としてコートし、高分子化合物に付着させたビオチンリンカーとの結合を介して保持させる。
【００７３】
基板表面のビオチン層を介してストレプトアビジンを付着させる方法はWO 98/59243明細書でさらに展開された。同明細書は化学的手段により又は365nmでの光活性化によりビオチンを表面に付着させる方法を開示している。その利点は特定表面領域のマスキングが可能になることである。こうしたアプローチは、ビオチンがガラス表面に共有結合しうる一方で、処理した基板領域内だけのストレプトアビジンとは非共有結合するという意味で巧妙である。これはストレプトアビジン「アクセプター」タンパク質のパターンを基板上に必要に応じて作成しうることを意味する。
【００７４】
しかし本発明の好ましい実施態様では、非多孔質基板の全表面をアビジン又はストレプトアビジンでコートし、次いで結合に不必要な領域は、たとえばウシ血清アルブミン(BSA)の添加などにより、ブロックする。従って、融合タンパク質と基板との非特異的相互作用は少なくなる。
【００７５】
ガラス又はプラスチック表面に直接付着させたタンパク質は固体表面上の荷電基又は固体表面の活性部分(一般的にはガラス中のシラノール基又はポリスチレン上の荷電表面残基)との相互作用により非共有結合で固定化される。ガラス及びプラスチック表面への抗原又は抗体のそうした非特異的吸着はその抗原性又は抗原結合能をそれぞれ著しく減じる。従ってアビジン又はストレプトアビジン層は、第1にビオチン化融合タンパク質を結合させ(同時精製される非ビオチン化タンパク質は結合しないので、さらなる精製ステップを可能にする)、第2に高密度ストレプトアビジン層によりビオチン化融合タンパク質を、基板表面との望ましくない非特異的相互作用から防護するという二重の役目を果たす。
【００７６】
ステップ(iv)で融合タンパク質を基板上のアビジン又はストレプトアビジンに付着させると、非常に堅固な、ただし非共有的な結合が起こる。好ましくは、非多孔質基板はストレプトアビジンでコートする。ストレプトアビジンへのビオチンの結合は多価であり、基板表面に直接結合した抗原に比して、きわめて強い結合力が得られる。ひとたびタンパク質を付着させてアレイを作製すると、その結合は十分に強いため、広範囲にわたる厳しい洗浄に耐えられるし融合タンパク質をそれほど失うこともない。これを図解したのが図3である。ビオチン化融合タンパク質(4)はアレイ基板(12)の表面にストレプトアビジン(14)との堅固な非共有的相互作用を介して付着する。好ましい実施例では、ストレプトアビジン(14)を基板に非共有結合させる。ストレプトアビジン分子が結合していないアレイ基板上の部位はBSA又は他の表面改質剤(13)でブロックする。融合タンパク質は融合ペプチド(6)表面のビオチン標識(7)を介してストレプトアビジン(14)と結合する。
【００７７】
さらに、アビジン又はストレプトアビジン層は基板表面に直接付着しているかビオチン化リンカーを介して付着しているかにかかわらず、きわめて安定であり、乾燥保存がきき、また加熱し又は攻撃的な試薬で処理しても(大部分の抗原又は抗体と違って)明白な機能喪失を伴うことがない。必要なら、ストレプトアビジン層を土台にしてその上にさらなる「アクセプター」層を設けることもできる。そうした層は他の、周知の抗体結合性タンパク質を含んでもよい。
【００７８】
本発明のアレイは、ビオチン結合用の多価部位を有するストレプトアビジンの凝縮効果を利用するという利点があろう。これは抗原、抗体両アレイとビオチンとの相互作用を4倍にする。従ってアレイの各エレメント内の抗原又は抗体濃度を増すことができるが、それは同じシグナルを実現しながらmm2あたりエレメント数を増加させうること意味し(定量面の検討はUS5807755及び5432099明細書を参照)、また固体表面の利用表面積が小さくて済むことを意味する。その利点は生物試料の必要量が少なくなることである。
【００７９】
アレイが顕微鏡フォーマット上に配列した抗原からなるときは、きわめて多数の抗原を、たとえば3〜10,000種の融合タンパク質を含むのがふさわしい。これらのタンパク質は、アレイを使用して実行しようとする解析の内容や対象物に応じて、多様な源泉から生成させ、又は獲得することができよう。しかし、各タンパク質は2つの融合タンパク質の形で、1つはC末端に付着させたSEQ ID NO.1を含むペプチドを有し、もう1つはN末端に付着させたSEQ ID NO.1を含むペプチドを有する融合タンパク質の形で発現させるのが好ましい。そうすれば、それぞれの融合タンパク質の相補性抗体に対する相対的な抗原性を評価することができる。
【００８０】
抗体結合性タンパク質たとえばプロテインA、G及びLなどの使用は広範に報告されてきた。そうしたタンパク質は抗体への結合が十分に堅固であるため、分離及び検出法への使用が可能である。これらのタンパク質は多様な種類の抗体の保存領域に結合することが知られている。本発明の方法を抗体アレイの作製に使用するとき、抗体の結合はSEQ ID NO.1を含むペプチドと融合させた抗体結合性タンパク質の層を設けることで実現される。この層はビオチン化タグ付きプロテインA、G及びLの混合物からなるのが好ましく、またそのなかにC末端で融合したものあれば、N末端で標識したものもあるのが好ましい。抗体結合性タンパク質の混合物を創出することにより、ほぼどのような抗体(たとえばポリクローナル、モノクローナル、二本鎖断片又は単鎖抗体、及びその中にプロテインA、G又はL部位が存在するかあるいは組み込まれた抗体活性ファージなど)の付着でも可能にする汎用アクセプターが創出される。アレイには任意の抗体を、抗体の前処理又は修飾の必要もなく、組み込むことができる。
【００８１】
そうした抗体結合性タンパク質をステップ(iv)でアビジン又はストレプトアビジン・コート表面に付着させると、きわめて高密度の結合タンパク質(多価ストレプトアビジンに結合するビオチン化タグ付きタンパク質)が得られる。この方法には、ただ1個のアミノ酸残基がビオチン化されるが、それは融合ペプチドの一部をなすため、レクチン表面の抗体結合部位は利用可能のまま残されるという利点がある。これらの抗体結合性タンパク質は固体表面上に第2層を効果的に創出する。結合融合体タグ付きプロテインA、G及びLからなるこの層は任意の抗体に対応する汎用アクセプター表面として機能し、該アクセプターは任意の抗体を、直接ビオチン化する必要もなく、受け入れる (図6)。これは時間と抗体の節約になるし、また対応する抗原に対する抗体結合の劣化という可能性を一掃する。
【００８２】
好ましい実施態様では、モル過剰量の抗体をビオチン化ペプチド+抗体結合性タンパク質(プロテインA、G又はLなど)融合体と予混合し、最高15分間インキュベートする。次にこの抗体-抗体結合性タンパク質混合物を、ストレプトアビジンでコートしたアレイ基板に直接付着させる。あるいはストレプトアビジンでコートしたアレイ基板にビオチン化抗体結合性タンパク質融合体をまず付着させ、次いで個別抗体をコート基板表面に付着させてアレイを作製するようにしてもよい。
【００８３】
いずれの方法で作製されるアレイも、観測可能な拡散がごくわずかな、きわめて離散的なスポットを含むため、検定目的に適った良好なアレイが得られる。
【００８４】
本発明の方法を用いて得られるアレイは抗原-抗体結合を検出する方法に使用するのがふさわしい。
【００８５】
従って第2態様では、本発明は抗原-抗体結合を検出する方法であって、(vi)第1態様の方法を用いて得られたアレイに、ステップ(v)(a)のアレイの場合には抗体を含む又は含むと推測される試料を、またステップ(v)(b)のアレイの場合には抗原を含む又は含むと推測される試料を、それぞれ付着させるステップ、及び(vii)基板上の結合抗体又は抗原を検出するステップを含む方法を提供する。
【００８６】
本発明の方法のステップ(vi)及び(vii)は慣用のやり方で、周知の免疫検定法たとえば標識特に蛍光標識二次抗体を使用するサンドイッチELISA法を含む種々のELISA法などを用いて行うのがふさわしい。これを抗原アレイの場合について図解したのが図4である。ストレプトアビジン(14)を介してアレイ基板(12)に結合した抗原(4)の検出には好適な一次抗体(15)を使用する。シグナルの増幅には標識(17)を結合した好適な二次抗体を用いる。好ましい実施態様では該標識はAlexa 488などのような蛍光色素であるが、任意数の他タイプの公知標識でもよい。
【００８７】
タンパク質アレイはタンパク質解析装置の使用中、品質特にタンパク質密度を監視し続けるのがふさわしい。これは本発明の好ましい実施態様に沿って、SEQ ID NO.1を含むペプチド又は前述のヘキサHisタグなどのようなさらなるペプチド配列タグ、もしくは内部標準としてのこの機能を前述のプレアレイ段階タンパク質正規化の場合と同様に果たす他の任意好適なタグを使用して実現する。多数のタンパク質調製物に由来する抗原を基板表面に配列し終えたら、次はそのアレイを使用して抗体品質の評価(WO 99/39210を参照)又は血清試料中の抗体力価の測定(Joos et al. Electrophoresis 2000, 21, 2641-2650)を行うことができる。これらの例では、一次試料に内部標準を加えることによりアレイ内の異なるエレメント間のタンパク質相対量を求めることができる。内部標準として好ましいのは融合ペプチドに対して生成させたヒツジ・ポリクローナル抗体である。これを一次抗体溶液(抗体又は血清)に添加して、一次試料に対する標識二次抗体とはスペクトル的に区別される好適な蛍光色素で標識した抗ヒツジ二次抗体によって検出する。市販スライドイメージャーを使用して二色画像を生成し、各エレメントに対応するシグナルを融合タンパク質由来のシグナルで正規化する。プレアレイ段階のタンパク質含量の正規化と組み合せれば、ばらつきの少ないアレイを生成させることができる。
【００８８】
前記方法は好ましくは少なくともいくつかのステップを、最も好ましくはすべてのステップを自動化して、スループットを高め、作業時間の短縮及びコスト低減をはかるようにする。
【００８９】
多数の新規タンパク質を使用して抗原アレイを作製する以上は、作製方法を実行可能にするには最小限のステップでタンパク質を固定化しなければならない。ビオチン化が容易かつ特異的に行えて、しかも検定目的の結合性タンパク質としてだけでなく精製手段や品質監視用の内部対照としての役目も果たすようなペプチドの使用こそがそうした方法をもたらす。
【００９０】
本発明の方法は多様なタンパク質コレクションを固定化する際に汎用手順、最小限のステップ及び最大限の配向予測性の実現を可能にする。本発明の方法は大規模な、たとえばハイスループット・スクリーニングの実行などに好適である。
【００９１】
本発明は第3態様では第1態様の方法を使用して得られる非多孔質基板のタンパク質アレイを提供する。
【００９２】
前記の方法に使用されるいくつかの要素は新規であり、従って本発明のさらなる態様を構成する。本発明は特に第4態様で、抗体結合性タンパク質をN又はC末端でSEQ ID NO.1を含む13〜50アミノ酸のペプチドたとえばSEQ ID NO.2のペプチドと融合させた融合タンパク質を提供する。抗体結合性タンパク質は特にプロテインA、G又はLであり、それらの混合物であるのが好ましい。該融合タンパク質は前述のようにさらなるペプチド配列タグたとえばヘキサHisタグ又は周知の別の好適な配列タグを追加的に含んでもよい。そうした配列タグは抗原又は抗体結合性タンパク質のN又はC末端に配置してもよいが、抗原又は抗体結合性タンパク質の、SEQ ID NO.1のアミノ酸配列を融合する側とは反対側に配置するのが好ましい。配列タグは、SEQ ID NO.1と同じ末端領域に配置する場合にはSEQ ID NO.1の遊離端に融合する。
【００９３】
本発明の第5態様は、第4態様の融合タンパク質をコードする核酸配列を含む。特にこの場合には、該ペプチドをコードする配列は次のSEQ ID NO.9の配列であるのがふさわしい。
【００９４】
GGC CTG AAC GAC ATC TTC GAG GCT CAG AAA ATC GAA TGG CAC GAA (SEQ ID NO.9)
発明の詳細な説明
ステップ1: クローニング
すべての発現遺伝子をcDNA調製物から各pAN及びpACシリーズ・ベクター(米国Avidity Inc.)に直接クローニングした。これらのベクターはそれぞれN末端及びC末端融合タンパク質の発現に使用した。使用融合ペプチド配列は前記SEQ ID NO.2であった。インサート配列はDNA配列解析により確認したが、解析は377 (PE Corporation Inc.)及びMagaBase (Amersham Pharmacia Biotech)装置により、メーカーの説明書に従って行った。
【００９５】
ステップ2: 発現
融合タンパク質はすべて、厳重に抑制したTrcプロモーターの制御下に発現させたが、IPTG誘導性である。タンパク質はすべて、birA遺伝子を染色体に安定的に組み込んだ菌株AVB100(Avidity Inc.; 米国コロラド州)すなわちE. coli K12株[MC1061 araD139 delta(ara-leu)7696 delta(lac)l74 galU galK hsdR2(rK-mK+) mcrB1 rpsL(Strr)]で発現させた。
【００９６】
L-アラビノースによる誘導でBirAタンパク質の過剰発現を実現した。安定的に組み込まれたbirA遺伝子は抗生物質の維持を必要としなかったし、またAVB100とIPTG誘導性ベクターたとえばpAC及びpAC (Avidity Inc.)との併用は目的の発現遺伝子とBirAレベルを別々に制御することを可能にした。
【００９７】
菌株AVB99 (avidity Inc.)もまた使用したが、これはビオチンリガーゼ(pBirAcm)を過剰発現させるためにIPTG誘導性birA遺伝子を組み込んだプラスミドpACYC184を導入したE. coli株(XL1-Blue)である。
【００９８】
菌株AVB101 (avidity Inc.)もまた使用したが、これはビオチンリガーゼ(pBirAcm)を過剰発現させるためにIPTG誘導性birA遺伝子を組み込んだプラスミドpACYC184を導入したE. coli B株(hsdR, lon11, sulA1)である。
【００９９】
ビオチンリガーゼ、融合タンパク質両方の発現はIPTG(1mM)で誘導した。ビオチンは誘導時に濃度50μMとなるように加えた。
【０１００】
ステップ3: 精製
ビオチン化融合タンパク質を2つの別々の方法で単離した。これらの方法は択一的に使用するか、又は超高純度調製品が必要とされる場合には2段階法として併用した。
【０１０１】
a)  抗融合ペプチド抗体を使用する精製
C末端融合ペプチドに対する部分精製マウス・モノクローナル抗体を入手し、C及びN末端融合タンパク質に対するポリクローナル抗体をウサギで産生させた。
【０１０２】
i)  第1の方法では、抗C末端マウス・モノクローナル抗体を、表面をトシル化で活性化した2.4ミクロン径磁気ビーズ(Dynal Biotech ASA; ノルウェー)に、次の要領で直接付着させた:
コーティング手順。Dynabeads M-280 Tosylactivatedをピペッティングと約1分間のボルテックスにより再懸濁し直ちにピペットで反応チューブに注入した。ビーズと溶液を分離するためにマグネット(Dynal MPC)でビーズを集め上清を除いた。上清はビーズをかき乱さないように除いた。ビーズを十分な容量の0.1M燐酸Na緩衝液pH7.4に再懸濁し2分間穏やかに混ぜた。再びマグネットを使用して上清をピペットで除き、洗浄ビーズを同容量の0.1M燐酸Na緩衝液pH7.4に再懸濁し所望の濃度とした。
【０１０３】
好適な抗体を0.1M燐酸Na緩衝液pH7.4中に透析した。抗体の量は3μg-抗体/107Dynabeads (約20μg/mg)であり、ビーズを1分間ボルテックスして再懸濁した。混合物を37℃で16〜24時間、ゆっくりとチルト回転させながらインキュベートした。インキュベーション後、1〜4分間マグネットを使用して磁気ビーズを集め、上清を除いた。コートしたビーズを4回洗浄した。内訳は×1 PBS(燐酸緩衝生理食塩水)pH7.4+0.1%(w/v) BSAにより4℃で5分間を2回、0.2M Tris-HCl pH8.5+0.1(w/v) BSAにより20℃で24時間又は37℃で4時間を1回(Trisは遊離トシル基をブロックする)、最後に×1 PBS pH7.4+0.1%(w/v) BSAにより4℃で5分間を1回である。Dynabeads M-280 Tosylactivatedの抗体コーティング手順は以上である。
【０１０４】
目的の融合タンパク質を発現する細胞を氷冷×1 PBS pH7.4 + 1% NP-40+プロテアーゼインヒビターで15分間溶解した後、溶解物を2,000×gで3分間遠心にかけた。溶解物をプレクリアした。これには(1.5ml Eppendorfチューブ中で)氷冷溶解物を、好適な抗体をプレコートしたDynabeadsと2時間インキュベートする(0.5mg Dynabeads/1×106細胞の溶解物)という方法を用いた。Dynabeadsを1.5ml氷冷PBS+1%NP-40で3回洗浄した。洗浄は、各洗浄ステップが終わるたびにDynal MPC (Magnetic Particle Concentrator)を使用してビーズを内壁に集めながら実行した。pHを9.0超に調整して融合タンパク質-抗体-磁気ビーズ複合体を破壊した。MPCで上清をビーズから分離し、検定で全タンパク質濃度、融合ペプチド濃度を求め、またタンパク質をPerSeptive Voyager MALDI(以下を参照)使用の質量分析法で同定した。
【０１０５】
ii)  第2の方法では、抗体をDynal磁気ビーズに間接的に、あらかじめメーカーがビーズ表面に固定化しておいたプロテインAとプロテインGを介して付着させた。
【０１０６】
Dynabeads-プロテインAとDynabeads-プロテインGの混合物を1〜2分間ボルテックスして再懸濁させた。前述のマグネチック・ワークステーションを使用してビーズを集め、上清を除いた。0.01%のTween 20と0.1%(w/v) BSAとを添加した0.5mlの0.1M燐酸Na緩衝液pH7.0を加え、洗浄操作を3回繰り返した。
【０１０７】
洗浄Dynabeadsに抗体を加え、穏やかにかき混ぜながら10〜40分間インキュベートした。マグネチック・ワークステーションを使用して上清を除いた。0.01%のTween 20と0.1%(w/v) BSAとを添加した0.5mlの0.1M燐酸Na緩衝液pH7.0にビーズを2回再懸濁させてタンパク質を安定化した。上清を除き、ビーズを前記要領で調製した細胞溶解物の混合液に加えた。融合タンパク質の結合を2〜8℃で10分間〜1時間行った。Dynabeads-プロテインG当初容量μlあたり約25μgの目的タンパク質を使用して過剰量のタンパク質を確保するようにした。マグネチック・ワークステーションを使用して融合タンパク質-Ig Dynabeads-プロテインG複合体から界面活性剤と細胞溶解物とを含む上清を分離し、×1 PBS (pH7.4) + 0.01% Tween 20で3回洗浄した。融合タンパク質-Ig Dynabeads-プロテインG/A複合体から結合融合タンパク質を溶離するには、pHを9.0超に調整し、精製融合タンパク質を含むようになった上清を分離するのが最善であった。マグネチック・ワークステーションを使用して磁気ビーズから上清を分離し、検定で全タンパク質濃度、融合ペプチド濃度を求め、またタンパク質をPerSeptive Voyager MALDI(以下を参照)使用の質量分析法で同定した。
【０１０８】
iii)  別の実施例では、プロテインA、G及びLの混合物を、好適に調製したピペットチップに固定化した。0.01% Tween 20と0.1%(w/v)BSAとを添加した50mM Tris-HCl緩衝液(pH8.0)中、室温で60分間、抗体をピペットチップとインキュベートした。コートしたピペットチップを次いで、3ピペット容量の0.01% Tween 20 + 0.1%(w/v)BSA添加50mM Tris-HCl緩衝液(pH8.0)ですすいだ。200μlの細胞溶解物をピペット底から手作業で、又はロボット・ワークステーションを用いて数回吸引し、ビオチン化融合タンパク質が確実に抽出されるようにした。細胞溶解物を捨てた。ピペットチップを3倍容量の0.01% Tween 20 + 0.1%(w/v)BSA添加10mM Tris-HCl緩衝液(pH8.0)ですすいだ。結合融合タンパク質を1/2ピペット容量の0.01% Tween 20添加50mM炭酸水素ナトリウムHCl緩衝液(pH10.0)中に、この溶離液をピペット底まで穏やかに吸い上げることにより、溶離した。融合タンパク質を含む溶出液は後述の要領で検定した。
【０１０９】
iv)  別の好ましい方法ではヘキサHisタグを加えて代替ビオチン化融合タンパク質を構築した。このヘキサHis融合ペプチドはしばしば標準精製方法に使用されており、当業者には周知である。一般に細胞は細胞湿量グラムあたり5mlの緩衝液に溶解した。溶解緩衝液組成: ×1 NBB (20mM Tris CL、100mM NaCl、5mMイミダゾール、pH8.0)、1/100容量の10mg/mlリゾチーム、1/100容量のプロテアーゼインヒビターカクテル(Calbiochemプロテアーゼインヒビターカクテルセット3)、10mMベータメルカプトエタノール、+ ×1界面活性剤カクテル(Novagen; 米国マジソン)。細胞は30〜37℃で15分間溶解した。
【０１１０】
細胞タンパク質は、尿素を加えて最終濃度6M及び2Mのチオ尿素とすることで変性させた。この溶液を0.22ミクロンのフィルターに通して清澄化し、ついでニッケルアガロースマトリックス(ドイツQiagen社のNTA)に直接付着させた。タンパク質をこのニッケルアガロースビーズと15分間インキュベートし、非結合性タンパク質を遠心で除去した。6M尿素及び2M尿素を添加した10倍容量の溶解緩衝液でビーズを3回洗浄した。最終洗浄後、洗浄緩衝液を50%取り除き、次いで10mMベータメルカプトエタノールを添加した20mM Tris HCl、100mM NaCl (pH8.0)緩衝液で希釈した。このステップを3回繰り返した。最後に、ビーズを10倍容量の緩衝液すなわち20mM Tris HCl、100mM NaCl (pH8.0)(尿素/チオ尿素無添加)で洗浄した。
【０１１１】
タンパク質を、種々の濃度のイミダゾールを加えた緩衝液[20mM Tris HCl、100mM NaCl (pH8.0)]で数回溶離した。結合タンパク質の溶離に使用したイミダゾールの一般的な濃度範囲は20mM〜500mMであった。溶離タンパク質を含む画分を合せた。
【０１１２】
b)  CaptAvidin(商標)(Molecular Probes社、米国オレゴン州)を使用する精製
別の実験では、好適表面に固定化された新種のストレプトアビジン商品CaptAvidin(商標)を使用してビオチン化融合タンパク質を単離した。この改良型ストレプトアビジンでは、ビオチン結合部位のチロシン残基がニトロ化されているために1015M-1〜109M-1のKaとのきわめて強力な非共有結合を弱める。従ってビオチンとCaptAvidin(商標)との会合は後述のようにpHを9〜10へと高めることにより破壊することができる:
i)  好ましい実施態様では、CaptAvidin(商標)タンパク質をトシル化磁気ビーズ(Dynal Biotech ASA; ノルウェー)に付着させ、前述の要領で洗浄し調製した。CaptAvidin(商標)をコートしたビーズを0.01% Tween 20と0.1%(w/v) BSAとを添加した50mMクエン酸リン酸緩衝液pH4.0で3回洗浄し、上清を捨てた。細胞溶解混合物を前述の要領で調製し、pHを5.0に調整した。CaptAvidin(商標)コート・ビーズを、0.5mg Dynabeads/1×106細胞溶解物の割合で加えた。この溶液を10〜60分間穏やかに撹拌しながらインキュベートした。マグネチック・ワークステーション(Dynal Biotech ASA;ノルウェー)により磁気ビーズを集めて上清を除き、0.01% Tween 20添加10mM Tris-HCl緩衝液pH8.0で3回洗い、上清を捨てた。
【０１１３】
0.01% Tween 20添加50mM炭酸水素ナトリウムHCl緩衝液pH10.0を加え、懸濁液を室温で15分間穏やかにかき混ぜることにより、ビオチン化融合タンパク質をCaptAvidin(商標)コート・ビーズから脱離させた。マグネチック・ワークステーションにより磁気ビーズを除き、ビオチン化融合タンパク質を含む上清を残した。
【０１１４】
ii) 別の実施例では磁気ビーズの代用としてアガロースビーズ結合CaptAvidin (商標) (Molecular Probes Inc.; 米国オレゴン州)と等容量のSepharose(登録商標)CL-4Bアガロース(Amersham Pharmacia Biotech Ltd.; 英国)との混合物のミニカラムを作製し、カラム床体積を大きくするようにした。ミニカラムは前記混合物を0.01% Tween 20添加50mMクエン酸リン酸緩衝液pH4.0に懸濁させ、その懸濁液をピペットチップに注入して作製した。細胞溶解混合物からのビオチン化融合タンパク質の分離はアフィニティークロマトグラフィーで行った。非結合物質は10カラム容量の0.01% Tween 20添加10mM Tris-HCl緩衝液pH8.0でカラムから溶離し、またビオチン化融合タンパク質は2カラム容量の0.01% Tween 20添加50mM炭酸水素ナトリウムHCl緩衝液pH10.0でカラムから溶離した。
【０１１５】
iii)  さらに別の実験では、CaptAvidin(商標)アガロースビーズをピペットチップ内に固定化し、融合タンパク質の結合と溶離を前述の要領で行った。
【０１１６】
ステップ4: タンパク質の同定
発現させ、精製した融合タンパク質をペプチド・フィンガープリント法で同定した。Rabilloud (Ed.), Proteome Researchで概説されている方法を用いて、融合タンパク質をトリプシンで消化し、得られたペプチド溶液をZipTip(商標)(Millipore社; 米国マサチューセッツ州)逆相カラムで脱塩濃縮し、マトリックス溶液で希釈し、ターゲットプレートに付着させ、PerSeptive Boyager(商標) MALDI質量分析計で解析した。得られたペプチド質量スペクトルを、ExPASy検索アルゴリズム(スイスGeneBio社)をウェブサイト(www.expasy.com)経由で使用して、前記タンパク質の予想ペプチドフィンガープリントと比較した。
【０１１７】
ステップ5: タンパク質アッセイ(正規化)
精製融合タンパク質3〜5μlをストック液から分取して全タンパク質含量を検定したが、検定には、タンパク質試料中に界面活性剤が存在するため、Bradford検定法ではなくBCA法を使用した。ビオチン化融合タンパク質の濃度は免疫検定法により次の要領で求めた: 精製融合タンパク質3〜5μlをストック液から分取し、ストレプトアビジンをコートした黒色のマイクロタイタープレート(米国Beckton Dickson社)に入れてインキュベートした。ウェルを0.01% Tween 20添加50mM Tris-HCl緩衝液pH8.0で3回洗浄した。同じ緩衝液+1%(w/v) BSAでウェルを30分間ブロッキング処理し、次いで0.01% Tween 20添加50mM Tris-HCl緩衝液pH8.0で3回すすいだ。こうした固定化したビオチン化融合タンパク質を、ウサギで産生させ0.01% Tween 20+0.1%(w/v) BSA添加50mM Tris-HCl緩衝液pH8.0で希釈した抗N末端又は抗C末端ポリクローナル抗体とインキュベートした。ウェルを緩衝液で3回すすぎ、次いでAlexa 488 (Molecular Probes Inc.; 米国オレゴン州)で標識したマウス抗ウサギモノクローナル抗体でプローブし、シグナルをPerkinElmer Flight蛍光プレートリーダーで測定した。US 5723584、US5874239及びUS5932433に記載の発現系を使用して発現させた既知量のグルタチオンS-トランスフェラーゼによる標準曲線を使用して、ウェルあたり0.1〜500μg-融合タンパク質の範囲内で校正を行った。
【０１１８】
ステップ6: タンパク質アレイの作製
a)  ストレプトアビジンをコートした顕微鏡スライドの創出
ストレプトアビジンをコートした顕微鏡スライドをまず、多様な市販スライドリーダーにより、480nmの励起波長と520nmの放射波長を使用して画像化し、コーティングの均一性を評価した。
【０１１９】
b)  抗原アレイの作製
ストレプトアビジンをコートしたスライドを×1リン酸緩衝生理食塩水pH7.3で再水和した。先端径100〜150ミクロンのソリッドピン(Biorobotics社; 英国ケンブリッジ)を使用して手作業及びロボットシステムで濃度約1μg/μlの精製ビオチン化融合タンパク質をスライド表面にスポットした。スライドを湿度制御環境中、室温で30分間インキュベートした。次いでスライドを一般には0.01% (v/v) Tween 20添加×1 PBS (pH7.3)で洗浄し、次いでスライドを1% (w/v) BSAと10分間インキュベートしてブロッキング処理した。スライドを0.01% (w/v) Tween 20添加×1 PBS (pH7.3)ですすぎ、次いで選択一次抗体を0.01%(w/v)Tween 20 + 0.1%(w/v)BSA添加×1 PBS (pH7.3)で、又は生物試料由来の免疫グロブリンを含む複合タンパク質混合物たとえば希釈血清試料で、1:400希釈した。次いでスライドを0.01%(w/v)Tween + 0.1%(w/v)BSA添加×1 PBS (pH7.3)ですすぎ、適当な二次抗体[たとえば血清中の免疫グロブリンを検出するためのAlexa 488 (Molecular Probes社)標識マウス抗ヒトIgGモノクローナル抗体]とインキュベートした。次いでスライドのAlexa 488を480/520nmの励起/放射波長で画像化したが、数多くのそうした二次抗体には他にも多様な標識(比色、代替蛍光、放射性同位体又は化学発光などの標識)を使用できることは当業者には自明である。得られた結果の一例を図5に示す。
【０１２０】
c)  抗体アレイの作製
汎用抗体アクセプター層の創出
Streptococcus aureus由来のプロテインA、G及びLを前述のように発現ベクター(pAN-4、pAN-5、pAN-6、pAC-4、pAC-5及びpAC-6)中にクローニングし、発現させ、精製して、やはり前述のようにin vivoビオチン化C-及びN-末端融合タンパク質を共に得た。ストレプトアビジン・コート顕微鏡スライドをプロテインA、G及びLの融合タンパク質(C-末端、N-末端両融合体)混合物の×1 PBS (pH7.3)溶液(濃度1mg/ml)でコートした。スライドを湿度制御環境中、室温で30分間インキュベートした。スライドを2mMアジ化ナトリウム添加×1 PBS (pH7.3)で洗浄した後、密閉容器に入れて(乾燥を防ぐため)湿り空気中4℃で用時まで保存した。
【０１２１】
抗体アレイの印刷
汎用抗体アクセプター層を使用して、多様な種類の抗体及びプロテインA、G又はL結合部位を含むよう遺伝子組換えで産生したファージ分子を付着させるようにした。抗体調製品を0.01% (w/v) Tween添加×1 PBS (pH7.3)で濃度0.2〜10mg/mlに希釈する。この抗体溶液を汎用抗体アクセプター層へと、先端径100〜150ミクロンのソリッドピン(Biorobotics社; 英国ケンブリッジ)を使用して手作業及びロボットシステムで付着させた。次いでスライドを0.01% (w/v) Tween添加×1 PBS (pH7.3)に溶解した1% BSAでブロックした。スライドを0.01% (w/v) Tweenと2mMアジ化ナトリウムとを添加した×1 PBS (pH7.3) ですすいだ後、密閉容器に入れて(乾燥を防ぐため)湿り空気中4℃で用時まで保存した。
【０１２２】
抗原アレイの場合と同様のスキャニングにより、図6に示すような結果が得られた。
【０１２３】
ステップ7:  複合タンパク質混合物の蛍光色素による標識
一般に、タンパク質試料は生物試料に応じて多様な緩衝液及び界面活性剤中で可溶化して調製した。2D電気泳動ゲルの第1次元向けタンパク質の調製に使用されるのと同じような非イオン系界面活性剤や8M尿素の使用を必要とするような攻撃的な可溶化手順が求められる試料も多かった。可溶化ではたとえば7M尿素+2Mチオ尿素か又は8M尿素を添加した4% CHAPS、50mM PBS (pH7.6)を含む溶液に試料を混ぜてホモジナイズする必要があった。第一級アミノ基たとえばTRIS及びグリシンを含む緩衝液は結合反応を阻害するので、使用を避けた。低濃度(<2%)の殺生剤たとえばアジ化物又はチメロサールなどの存在はタンパク質の標識付けに影響しなかった。可溶化タンパク質を10,000×gで遠心にかけて細胞残屑や非可溶化物質を除去し、ただちに混合物を標識した。
【０１２４】
生物試料由来の複合タンパク質混合物を蛍光色素で標識してから前述の要領で抗体アレイとインキュベートした。当業者には自明であろうが、この方法には他の標識たとえば放射性標識、化学発光色素及び可視色素なども応用できる。さらに、他の蛍光色素もまた応用可能である。
【０１２５】
好ましい実施態様では、英国Amersham Pharmacia Biotech Ltd.のCy3及びCy5一官能基色素を使用する。複合タンパク質混合物の色素標識は結果が予測できないため、生物試料のタイプごとに最適化しなければならなかった。特に色素分子がアミン基をもつ残基を介してタンパク質に結合すると、しばしばある種のタンパク質では抗原性が弱まり機能抗体による認識が無理になる。
【０１２６】
メーカー推奨の方法は1mgのタンパク質を色素/タンパク質(D/P)最終モル比1〜4まで標識するよう工夫されている。その前提となる平均タンパク質分子量は155,000 Daである。本発明では、平均D/P比が2〜3を超えると多くの研究対象タンパク質で抗原抗体反応が妨げられると判明した。D/P比はタンパク質濃度と緩衝液pH値を変更するだけで調節しうることも判明した。
【０１２７】
タンパク質濃度と反応pH値を変更すると、反応系の標識効率が著しく変化した。標識効率はpH 9で最大となり、pH値を7.6に下げるとD/P比は1〜3に低下した。タンパク質濃度を高めると標識効率が高まったので、タンパク質濃度の調節もまた重要であると判明した。単一タンパク質種の10μg/μl濃度以下の溶液ではD/P比は10〜14であるので、よりふさわしい濃度は0.1〜1.0μg/μlであると判明した。代表的な方法は次のとおりであった: 前述の要領で調製した複合タンパク質混合物を0.2% CHAPS添加×1 PBS緩衝液でいくつか濃度に希釈し、平均タンパク質種濃度が1.0μg/μlとなるようにした(全タンパク質濃度は50〜100μg/μlの範囲であった)。タンパク質溶液を室温で30分間、たえず穏やかにかき混ぜながらインキュベートした。標識タンパク質は抗体アレイとのインキュベーションの前に過剰な未結合色素から分離しなければならない。メーカーは未結合タンパク質からの分離にゲル透過法を推奨している。しかし、難溶性の膜結合タンパク質が存在するため、このステップは単に過剰量のグリシンを溶液に加えて反応を停止させるという方法で代用した。標識タンパク質溶液をさらに15分間インキュベートして残留遊離色素を確実に除去するようにした。標識タンパク質はさらなる操作を加えずに2〜8℃で保存した。遊離色素の除去には、SM-2ビーズ(Bio-Rad社; 米国カリフォルニア州)と一晩インキュベートするというUnlu et al. (1997)の方法も用いた。
【０１２８】
最終色素/タンパク質(D/P)比は次のようにして推定した: 標識タンパク質溶液の一部を希釈して最大吸光度が0.5〜1.5AUとなるようにした。色素とタンパク質のモル濃度を計算した。吸光係数はタンパク質の種類ごとに異なろうが、複合混合物に用いる妥当な平均値である。各タンパク質に対する平均結合色素分子数の比は次のようにして計算した:
Cy5/タンパク質比はCy5、タンパク質混合物それぞれの650nm、280nmでのモル吸光係数を250,000 M-1cm-1、170,000M-1cm-1として計算した。計算では、メーカーの製品データシートに従ってCy5色素の280nmでの吸光度(650nmでの吸光度の約5%)について補正を行った。[Cy5色素]=(A650)/250000、[タンパク質]=[A280-(0.05 x A650)]/170000、最終(D/P)=[色素]/[タンパク質]、最終(D/P)= [0.68 x (A650)]/[A280-(0.05 x A650)]。
【０１２９】
Cy3/タンパク質比はCy3、タンパク質混合物それぞれの552nm、280nmでのモル吸光係数を150,000 M-1cm-1、170,000M-1cm-1として計算した。計算では、メーカーの製品データシートに従ってCy5色素の280nmでの吸光度(552nmでの吸光度の約8%)について補正を行った。[Cy3色素]=(A552)/150000、[抗体]=[A280-(0.08 x A552)]/170000、最終(D/P)=[色素]/[抗体]、最終(D/P)= [1.13 x (A552)]/[A280-(0.08 x A552)]。
【０１３０】
ステップ8: 抗体アレイの使用によるタンパク質発現の判定
Cy3標識タンパク質とCy5標識タンパク質を、前記のようにして求めた色素/タンパク質比を基にして等モル量混合した。この混合物100μlを、あらかじめ数スライド容量の0.01% Tween添加×1 PBS (pH7.6)ですすいでおいた抗体アレイとインキュベートした。標識タンパク質混合物を英国特許出願GB0028647.6明細書(未公開)に従った自動スライドプロセッサーにより30℃で1時間インキュベートした。次いでスライドを10スライド容量の0.01% Tween添加×1 PBS (pH7.6)ですすいだ。スライドを遠心で乾燥させ、ただちに市販スライドイメージャーにによりメーカーの操作手順に従って画像化した。Cy3及びCys5標識タンパク質の比を解析し、多数のマーカータンパク質たとえばアクチン及びGAPDHで正規化した。この正規化方式はほぼ同じ要領で調製した組織試料又は他生物試料には好適であるが、異なる組織タイプと他生物試料の間での適用には注意を要する。というのは、全細胞中の各タンパク質含量は組織により大きく異なるからである。
【０１３１】
タンパク質アレイはその可能性が長年検討されてきたし、また大いに必要とされるツールであることも明らかである。タンパク質の発現、精製、検定、そして特に非多孔質固体表面への付着といった課題はいずれも解決が困難な課題となっている。本発明はUS5723584、US5874239及びUS5932433の各特許明細書で開示されているベクター技術の新規活用により、研究者がこれらの技法を上首尾に適用することを可能にするような抗体アレイ、抗原アレイを共に提供する。
【０１３２】
以上言及した諸々の参考文献は参照指示により本明細書に組み込まれる。当業者には自明であろうが、本発明はその範囲と精神から逸脱することなく他の変更態様が可能である。明細書では本発明を好ましい個別実施態様との関連で説明したが、当然ながら請求の範囲に記載の本発明はそうした個別実施態様に不当に限定されるものではない。実際、以下の請求項の範囲には、当業者には自明である本発明の多様な変更態様が包含されるものとする。
【図面の簡単な説明】
【０１３３】
【図１】抗原であるか又は抗体結合性タンパク質たとえばプロテインA、G又はLであるタンパク質の、本発明の方法に使用できるような形での発現の図解である。
【図２】本発明の実施態様に基づく、抗タグ抗体の使用による細胞残屑からの融合タンパク質の単離を図解している。
【図３】本発明の実施態様に基づく、ストレプトアビジンをコートした基板表面への発現融合タンパク質の付着を図解している。
【図４】本発明の実施態様に基づく、Alexa 488など蛍光マーカーで標識した二次抗体を使用する古典的サンドイッチELISA法による結合抗原の検出を図解している。
【図５】融合ペプチドをGSTと融合して含む融合タンパク質をいくつかの濃度で、ストレプトアビジンをコートした顕微鏡スライド上に配列するという一連の実験の結果であり、実験に使用した最低濃度は500pg/スポットに相当する。図のパネル(a)は485nmの励起波長と520nmの放射波長を使用する市販スキャナーで生成した画像である。この例では本文記載のとおり二次抗体をAlexa 488で標識している。パネル(b)は (a)の反転画像であり、見易くしている。パネル(c)は濃度500pg/スポットの融合タンパク質アレイ基板の拡大図である。これらのスポットのS/N比は、検出限界(S/N比3:1)が10〜50 pg-タンパク質/スポットとなることを示している。
【図６】パネル(a)は、C及びN末端融合タンパク質として発現したプロテインA、G及びL (18)の溶液を、ストレプトアビジンをコートしたスライド(12)とインキュベートする方法の図解である。(a) C及びN末端融合タンパク質として発現したプロテインA、G及びL (18)の溶液を、ストレプトアビジンをコートしたスライド(12)とインキュベートした。抗体(19)はソリッドピン装置などを使用して配列すれば、きわめて離散的なスポットとしてスライドに付着させることができる。抗体は二価のタンパク質結合性タンパク質(プロテインA、G又はL)に高密度で結合する。これはAlexa 488で標識したヤギ抗マウス抗体の結合により例証されたし、また画像はスライドを放射波長485nm、励起波長520nmでスキャンした得た[挿入パネル(b)]。
【図７】Avidity Inc.から入手可能なpAN-4 DNAベクターの構造であり、S-Dボックス(ASGGA)は太字で、開始メチオニンコドンは斜体+下線で、SEQ ID NO.2ペプチドをコードする配列は下線で、アンピシリン耐性遺伝子blaは太字で、またlaclqは太字+下線で、それぞれ示す。
【図８】Avidity Inc.から入手可能なpAN-5 DNAベクターの構造であり、注釈は図7の場合とほぼ同じである。
【図９】Avidity Inc.から入手可能なpAN-6 DNAベクターの構造であり、注釈は図7の場合とほぼ同じである。
【図１０】Avidity Inc.から入手可能なpAC-4 DNAベクターの構造であり、注釈は図7の場合とほぼ同じである。
【図１１】Avidity Inc.から入手可能なpAC-5 DNAベクターの構造であり、注釈は図7の場合とほぼ同じである。
【図１２】Avidity Inc.から入手可能なpAC-6 DNAベクターの構造であり、注釈は図7の場合とほぼ同じである。
【図１３】抗原であるか又は抗体結合性タンパク質たとえばプロテインA、G又はLであるタンパク質の、本発明の方法に使用できるような形での発現の図解であり、第2ペプチド配列タグの2つの代替位置を示している。
【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004532024.tif 000131
【手続補正書】
【提出日】平成15年6月30日(2003.6.30)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗原又は抗体から選択されるタンパク質のアレイの作製方法であって、
(i)  (a)抗原又は(b)抗体結合性タンパク質のいずれかを50個以下のアミノ酸を有するペプチドと融合させて含む融合タンパク質を組換え細胞中で発現させるステップであって、該ペプチドがSEQ ID NO.1のアミノ酸配列
LX1X2IX3X4X5X6KX7X8X9X10     (SEQ ID NO. 1)
(式中、X1は天然アミノ酸であり、X2はロイシン、バリン、イソロイシン、トリプトファン、フェニルアラニン又はチロシンを除いた天然アミノ酸であり、X3はフェニルアラニン又はロイシンであり、X4はグルタミン又はアスパラギンであり、X5はアラニン、グリシン、セリン又はトレオニンであり、X6はグリシン又はメチオニンであり、X7はイソロイシン、メチオニン又はバリンであり、X8はグルタミン、ロイシン、バリン、チロシン又はイソロイシンであり、X9はトリプトファン、チロシン、バリン、フェニルアラニン、ロイシン又はイソロイシンであり、X10はアスパラギン又はグルタミンを除いた任意の天然アミノ酸である; また該ペプチドはX6に隣接するリシン残基においてビオチンリガーゼによりビオチン化することができる。)
を含むことを特徴とするステップ;
(ii)  該融合タンパク質の該ペプチドをX6に隣接するリシン残基においてビオチン化するステップ;
(iii)  このビオチン化融合タンパク質を単離するステップ;
(iv)  アビジン又はストレプトアビジンをコートした非多孔質基板に該ビオチン化融合タンパク質を付着させるステップ;
(v)  (a)該融合タンパク質が抗原を含む場合には、抗原アレイの作製を目的にステップ(i)〜(iv)を所望回数実行することにより、又は
(b)該融合タンパク質が抗体結合性タンパク質を含む場合には、ステップ(iv)の前又は後に複数種の抗体又はその結合性断片を該タンパク質に結合させることにより
基板上に少なくとも3種類のタンパク質からなるアレイを形成させるステップ;
を含む作製方法。
【請求項２】
SEQ ID NO.1のペプチドが以下から選ばれる、請求項１に記載の方法：
【化１】
2004532024.tif 000132
【化２】
2004532024.tif 000133
【化３】
2004532024.tif 000134
【請求項３】
抗原又は抗体から選択されるタンパク質のアレイの作製方法であって、
(i)  (a)抗原又は(b)抗体結合性タンパク質のいずれかを50個以下のアミノ酸を有するペプチド又は13個以上のアミノ酸を有するその断片と融合させて含む融合タンパク質を組換え細胞中で発現させるステップであって、該ペプチドが以下から選択される配列：
【化４】
2004532024.tif 000135
【化５】
2004532024.tif 000136
【化６】
2004532024.tif 000137
【化７】
2004532024.tif 000138
【化８】
2004532024.tif 000139
を含むことを特徴とするステップ;
(ii)  該融合タンパク質の該ペプチドをビオチン化するステップ;
(iii)  このビオチン化融合タンパク質を単離するステップ;
(iv)  アビジン又はストレプトアビジンをコートした非多孔質基板に該ビオチン化融合タンパク質を付着させるステップ;
(v)  (a)該融合タンパク質が抗原を含む場合には、抗原アレイの作製を目的にステップ(i)〜(iv)を所望回数実行することにより、又は
(b)該融合タンパク質が抗体結合性タンパク質を含む場合には、ステップ(iv)の前又は後に複数種の抗体又はその結合性断片を該タンパク質に結合させることにより
基板上に少なくとも3種類のタンパク質からなるアレイを形成させるステップ;
を含む作製方法。
【請求項４】
融合タンパク質がさらに、該融合タンパク質に対するアフィニティー又は検出タグ配列としての機能を果たしうる第2ペプチド配列を含み、該配列は1〜30アミノ酸を含むことを特徴とする請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
【請求項５】
第２ペプチド配列をSEQ ID NO. 1アミノ酸配列又は請求項3のペプチドの末端に融合させる請求項3に記載の方法。
【請求項６】
第２ペプチド配列を、抗原又は抗体結合性タンパク質のSEQ ID NO.1のアミノ酸配列又は請求項3のペプチドの融合側の反対側に融合させる請求項4に記載の方法。
【請求項７】
ペプチド配列タグの少なくとも1個のアミノ酸がヒスチジンである請求項4ないし6のいずれか1項に記載の方法。
【請求項８】
ペプチド配列タグが式His-Xで示され、式中Xは-Gly-、-His-、-Tyr-、-Gly-、-Trp-、-Val-、-Leu-、-Ser-、-Lys-、-Phe-、-Met-、-Ala-、-Glu-、-Ile-、-Thr-、-Asp-、-Asn-、-Gln-、-Arg-、-Cys-及び-Pro-からなる群より選択される請求項5に記載の方法。
【請求項９】
ペプチド配列タグが式Y-Hisで示される請求項7に記載の方法。
【請求項１０】
Yが-Gly-、-Ala-、-His-及び-Tyr-より選択される請求項9に記載の方法。
【請求項１１】
組換え細胞がビオチンリガーゼを発現し、かつステップ(ii)がビオチンの存在下に、ビオチン化を該細胞中in vivoで起こすように、実行されることを特徴とする請求項1〜10のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１２】
組換え細胞がビオチンを発現する請求項11に記載の方法。
【請求項１３】
ステップ(iii)がSEQ ID NO.1のペプチド又は請求項3のペプチドに対して特異的であるさらなる抗体又はその結合性断片を使用して実行される請求項1〜12のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１４】
ステップ(iii)が請求項4ないし10のいずれか1項に記載の第２ペプチド配列に対して特異的であるさらなる抗体又はその結合性断片を使用して実行される請求項4ないし10のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１５】
さらなる抗体又はその結合性断片がカラム又は磁気ビーズ上に固定化されるかもしくはピペットチップ内に装入される請求項13又は14に記載の方法。
【請求項１６】
結合した融合タンパク質をその後でpH値を高めることにより溶離する請求項15に記載の方法。
【請求項１７】
ステップ(iii)で、解離可能にビオチンに結合する分離材を使用して融合タンパク質を溶離する請求項1ないし12のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１８】
分離材は、ビオチンに対するアフィニティーが天然アビジン又はストレプトアビジンよりも低い改良アビジン又はストレプトアビジンである請求項17に記載の方法。
【請求項１９】
分離材を磁気ビーズ又はピペットチップに付着させる請求項17又は18に記載の方法。
【請求項２０】
pH条件を変化させて融合タンパク質を分離材から溶離する請求項17ないし18に記載の方法。
【請求項２１】
ステップ(iv)で使用するコート基板の一部の領域をブロッキング処理して融合タンパク質が該領域に結合するのを防ぐようにする請求項1〜20のいずれか1項に記載の方法。
【請求項２２】
ペプチドが鎖長15アミノ酸のペプチドである請求項1〜21のいずれか1項に記載の方法。
【請求項２３】
ペプチドがSEQ ID NO.2
Gly Leu Asn Asp Ile Phe Glu Ala Gln Lys Ile Glu Trp His Glu
(SEQ ID NO.2)
のペプチドである請求項22に記載の方法。
【請求項２４】
融合タンパク質が抗原を含む請求項1〜23のいずれか1項に記載の方法。
【請求項２５】
抗原ライブラリーを使用してアレイを作製する請求項24に記載の方法。
【請求項２６】
融合タンパク質が抗体結合性タンパク質を含む請求項1ないし23のいずれか1項に記載の方法。
【請求項２７】
抗体結合性タンパク質が1つ又は複数のプロテインA、プロテインG及びプロテインLである請求項26に記載の方法。
【請求項２８】
抗体結合性タンパク質がプロテインA、プロテインG及びプロテインLの混合物である請求項23に記載の方法。
【請求項２９】
抗体結合性タンパク質をそのN末端でペプチドと融合するか、又はそのC末端で該ペプチドと融合することを特徴とする請求項26ないし28のいずれか1項に記載の方法。
【請求項３０】
ステップ(iv)に先立って発現融合タンパク質の同一性を確認する請求項1〜29のいずれか1項に記載の方法。
【請求項３１】
同一性の確認に質量分析法を使用する請求項30に記載の方法。
【請求項３２】
内部対照としての機能を果たす融合タンパク質中のSEQ ID NO.1ペプチド又は請求項3のペプチドを検出することによりタンパク質の正規化を行う請求項1〜31のいずれか1項に記載の方法。
【請求項３３】
内部対照としての機能を果たす融合タンパク質中の請求項4ないし10のいずれか1項に記載のペプチド配列タグを検出することによりタンパク質の正規化を行う請求項1〜32のいずれか1項に記載の方法。
【請求項３４】
ペプチドの検出を、該ペプチドに対して高アフィニティーを有する抗体によって行う請求項32又は33に記載の方法。
【請求項３５】
免疫検定法を後続のアレイの使用による生物試料解析と同時に実行することによりタンパク質の正規化を行う請求項32ないし34のいずれか1項に記載の方法。
【請求項３６】
ステップ(iv)で使用するアビジン又はストレプトアビジンをコートした非多孔質基板がガラス又はプラスチック素材である請求項1〜35のいずれか1項に記載の方法。
【請求項３７】
基板上のストレプトアビジン層を基層としてその上にさらなるアクセプター層を設ける請求項1〜36のいずれか1項に記載の方法。
【請求項３８】
アレイが3〜10,000種類の融合タンパク質を含む請求項1〜37のいずれか1項に記載の方法。
【請求項３９】
各タンパク質が、SEQ ID NO.1を含むペプチド又は、請求項3のペプチドをN末端に融合させた形とSEQ ID NO.1を含むペプチド又は請求項3のペプチドをC末端に融合させた形の両方の形で存在する請求項38に記載の方法。
【請求項４０】
請求項1〜39のいずれか1項に記載の方法によって得られるタンパク質アレイ。
【請求項４１】
抗原-抗体結合を検出する方法であって
(vi)  請求項40に記載のアレイに、ステップ(v)(a)のアレイの場合には抗体を含む又は含むと推測される試料を、またステップ(v)(b)のアレイの場合には抗原を含む又は含むと推測される試料を、それぞれ付着させるステップ; 及び
(vii)  基板上の結合抗体又は結合抗原を検出するステップ
を含む方法。
【請求項４２】
ステップ(vii)をELISA法によって行う請求項41に記載の方法。
【請求項４３】
ステップ(vi)及び/又はステップ(vii)の最中に融合タンパク質アレイのタンパク質の品質及び/又は密度を監視し続ける請求項41及び42の方法。
【請求項４４】
SEQ ID NO.1を含むペプチドの検出によって監視を行う請求項43に記載の方法。
【請求項４５】
アレイが第2ペプチド配列をさらに含む融合タンパク質を含み、かつ該第2ペプチド配列を検出することによって監視を行う請求項43に記載の方法であって、該第2ペプチド配列が1〜30アミノ酸を含むことを特徴とする方法。
【請求項４６】
少なくともいくつかのステップを自動化する請求項1ないし39又は請求項41ないし45のいずれか1項に記載の方法。
【請求項４７】
すべてのステップを自動化する請求項46に記載の方法。
【請求項４８】
抗体結合性タンパク質をN末端又はC末端でSEQ ID NO.1又は請求項3のペプチドを含む13〜50アミノ酸のペプチドと融合させて含む融合タンパク質。
【請求項４９】
SEQ ID NO.1のペプチド又は請求項3のペプチドがSEQ ID NO.2のペプチドである請求項48に記載の方法。
【請求項５０】
融合タンパク質に対するタグ配列としての機能を果たす1〜20アミノ酸の第2ペプチド配列をさらに含む請求項48又は49に記載の融合タンパク質。
【請求項５１】
抗体結合性タンパク質がプロテインA、プロテインG又はプロテインL、もしくはそれらの混合物である請求項48ないし50のいずれか1項に記載の融合タンパク質。
【請求項５２】
請求項48ないし51のいずれか1項に記載の融合タンパク質をコードする核酸配列。
【請求項５３】
ペプチドをコードする配列がSEQ ID NO.9
GGC CTG AAC GAC ATC TTC GAG GCT CAG AAA ATC GAA TGG CAC GAA (SEQ ID NO.9)
の配列である請求項52に記載の核酸。
【国際調査報告】
2004532024.tif 000140
2004532024.tif 000141
2004532024.tif 000142
2004532024.tif 000143
2004532024.tif 000144