(57)【要約】診断イメージングならびに、選択組織および細胞への生物活性化合物の送達と共に、標的化イメージングおよび選択された組織および細胞への送達に用いる、エコー源性ポリマーのマイクロカプセルおよびナノカプセルの製造方法が提供される。診断イメージングおよび生物活性剤の送達に使用する、これらのエコー源性ポリマーのマイクロカプセルおよびナノカプセルを含む組成物も提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
エコー源性ポリマーのマイクロカプセルまたはナノカプセルを製造する方法であって、
（ａ）昇華性を有する非水溶性物質を、１種または２種以上の揮発性非極性溶媒に溶解して第１の混合物を形成するステップ、
（ｂ）前記第１の混合物にポリマーを溶解して第２の混合物を形成するステップ、
（ｃ）前記第２の混合物を乳化し、ポリマーと非水溶性物質とを含むマイクロカプセルの第１の個体群を生成するステップ、
（ｄ）前記マイクロカプセルの第１の個体群を、界面活性剤と混合して、マイクロカプセルの第１の個体群を分解し、より小さな寸法のマイクロカプセルまたはナノカプセルの第２の個体群を形成するステップ、
（ｅ）前記マイクロカプセルの第２の個体群を、前記マイクロカプセルを硬化剤と混合することによって硬化させるステップ、
（ｆ）前記マイクロカプセルおよびナノカプセルの第２の個体群を洗浄して、エコー源性ポリマーのマイクロカプセルおよびナノカプセルを得る、ステップ、を含む前記方法。
【請求項２】
ステップ（ｃ）での乳化に先立ち、第２の混合物に水を加えるステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
水が、昇華性を有する水溶性用剤をさらに含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれかに記載の方法よって製造される、エコー源性ポリマーのマイクロカプセルまたはナノカプセル。
【請求項５】
気体を充填された請求項４に記載のエコー源性ポリマーのマイクロカプセルまたはナノカプセルを含む、患者内部の診断イメージング用のコントラスト剤。
【請求項６】
マイクロカプセルまたはナノカプセルの外表面に付着させた標的剤をさらに含む、請求項５に記載のコントラスト剤。
【請求項７】
気体を充填されたエコー源性ナノカプセルを含む、請求項５に記載のコントラスト剤。
【請求項８】
請求項５に記載のコントラスト剤を対象に投与するステップを含む、対象内の１種または２種以上の組織をイメージングする方法。
【請求項９】
請求項６に記載のコントラスト剤を対象に投与するステップを含む、対象内の１種または２種以上の組織を選択的にイメージングする方法。
【請求項１０】
コントラスト剤が罹患組織を選択的に標的化すると共に、罹患組織と正常組織とを区別する、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
コントラスト剤が、悪性組織を選択的に標的化すると共に、悪性組織と良性組織とを区別する、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
対象内部において、マイクロカプセルによってアクセスするには狭すぎる脈管構造を有する組織をイメージングする方法であって、請求項７に記載のコントラスト剤を対象に投与することを含む、前記方法。
【請求項１３】
請求項４に記載のエコー源性ポリマーのマイクロカプセルまたはナノカプセルと、該エコー源性ポリマーのマイクロカプセルまたはナノカプセルセルに吸着、付着、カプセル化された、またはこれらを任意に組み合わせた、生物活性剤とを含む、生物活性剤送達用の組成物。
【請求項１４】
マイクロカプセルまたはナノカプセルの外表面に付着させた標的剤をさらに含む、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
エコー源性ポリマーのナノカプセルを含む、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１６】
請求項１３の組成物を対象に投与するステップと、対象内での生物活性剤の放出を超音波によってトリガーするステップとを含む、生物活性剤を対象に送達する方法。
【請求項１７】
請求項１３の組成物を対象に投与するステップを含み、生物活性剤が、エコー源性ポリマーのマイクロカプセルまたはナノカプセルの崩壊によって放出される、生体活性用剤を対象に送達する方法。
【請求項１８】
エコー源性ポリマーのマイクロカプセルおよびナノカプセルの崩壊と生物活性剤の放出が、超音波によって変更される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
請求項１４に記載の組成物を対象に投与することを含む、対象内部の選択された組織を生物活性剤の標的にする方法。
【請求項２０】
罹患組織を組成物の標的にする、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
悪性組織を組成物の標的にする、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
マイクロカプセルによってアクセスするには狭すぎる脈管構造を介して、対象内の組織に生物活性剤を送達する方法であって、請求項１５に記載の組成物を対象に投与することを含む前記方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の背景
超音波コントラスト剤は医療診断用超音波、および産業用超音波において日常的に使用されている。医療診断目的に対しては、コントラスト剤は通常、気泡であり、これらの気泡のコントラスト特性は、血液とその中に含まれる気体との間の大きな音響インピーダンスミスマッチによって生じる。コントラスト剤の重要なパラメータとしては、粒子寸法、イメージング周波数、密度、圧縮率、粒子挙動（表面張力、内部圧力、泡状品質）、および生物的分布（biodistribution）および耐容性（tolerance）がある。
【０００２】
気体充填粒子は、これまでのところ最良のリフレクタである。直径が１〜１５ミクロンの範囲の様々な気泡に基づく懸濁液が、超音波コントラスト剤としての使用のために開発されている。このような寸法の気泡は、診断用超音波域の共鳴周波数を有し、このために後方散乱強調能力が向上する。音波処理（sonication）は、均一な寸法の微小気泡（microbubbles）を含有する標準化エコーコントラスト剤溶液を製造するための、確実で再現性のある技法である。この技法で生成される気泡の寸法は、一般に直径が１〜１５ミクロンの範囲にあり、平均気泡直径は６ミクロンである（Keller et al., J. Ultrasound Med. 5: 493-498, 1986）。
【０００３】
しかしながら、これらの気泡の血液流中での耐久性は、限定されたものであることがわかっており、微小気泡の新しい製造方法の研究が続けられている。また、微小粒子に気体を充填して超音波イメージングに使用することのできる、中空微小粒子の製造に注目する研究が行われている。しかしながら、これらの中空微小粒子には、薬物生成物と会合されると、薬物送達剤としての用途もある。これらの中空微小粒子はまた、選択された細胞および／または組織を標的にする用剤と会合させると、標的コントラスト剤および／または標的薬物送達剤を製造することができる。
【０００４】
超音波コントラスト剤として使用するための界面活性剤で安定化された微小気泡混合物が、米国特許第５，３５２，４３６号に開示されている。
国際公開９８４７５４０号は、ハロカーボンを含む、生体適合性共沸混合物の分散を含む、診断用超音波および標的疾患イメージングおよび薬物送達用のコントラスト剤を開示している。
国際公開９４２１３０１号は、油相が油溶性気体／流体または気体先行核（precursor）を含む、生体適応性の水中油エマルジョンからなる超音波剤を開示している。
【０００５】
米国特許第５，６３７，２８９号、米国特許第５，６４８，０６２号、米国特許第５，８２７，５０２号、および米国特許第５，６１４，１６９号は、少なくとも２０％の非界面活性水不溶物質、界面活性剤または両親媒性有機酸を混合した、水溶性の微小気泡を生成する炭水化物微小粒子を含む、コントラスト剤を開示している。この用剤は、乾燥混合するか、または成分溶液を混合し、続いて蒸発および微粉化することによって製造される。
【０００６】
米国特許第５，６４８，０９５号は、イメージングおよび薬物送達に使用する中空マイクロカプセルを開示している。この中空マイクロカプセルは、揮発性油分を、澱粉またはポリエチレングリコール結合物などの水溶性物質を含む水相と結合して１次エマルジョンを形成することによって作られる。次いで、この１次エマルジョンを第２の油分と結合して、２次エマルジョンを形成し、このエマルジョンを固化させて揮発油分の液体核の回りにマイクロカプセルが形成される。次いで揮発性油分を蒸発させて除去することによって、中空マイクロカプセルが残される。
【０００７】
米国特許第５，９５５，１４３号は中空ポリマーマイクロカプセルを開示しており、これは、皮膜形成ポリマーを揮発性非水溶性溶媒中に溶解させ、揮発可能な固体核物質の微細に粉砕された粒子をポリマー溶液に分散させ、粒子状固体核物質上に固体ポリマー膜の形成を誘起して、カプセル化された固体核を有するポリマーマイクロカプセルを生成させることによって製造される。次いで、この核を除去して、中空マイクロカプセルが得られ、次いでこれにコントラストイメージング用の気体を充填することができる。
【０００８】
標的化能力を有する、または標的化能力を有さない、コントラストイメージングおよび／または薬物送達用に使用可能な、再生可能な寸法範囲の、生体適合性で、生分解可能なエコー源性を有するマイクロカプセルおよびナノカプセルの製造方法に対する要求が依然としてある。
【０００９】
発明の概要
本発明の一目的は、エコー源性ポリマーのマイクロカプセルおよびナノカプセルを製造する方法であって、非極性溶液中に溶解し、かつ固体状態から昇華する非水溶性物質を、１種または２種以上の揮発性非極性溶媒中に溶解して第１の混合物を形成するステップと、前記第１の混合物中にポリマーを溶解して第２の混合物を形成するステップと、第２の混合物を、水を加えるか、または水なしで乳化させて、ポリマーと非水溶性物質を含むマイクロカプセルの第１の個体群を生成するステップと、前記マイクロカプセルの第１の個体群を、界面活性剤溶液と混合し、攪拌／均質化して、マイクロカプセルの第１の個体群を分解して、より小さい寸法のマイクロカプセルおよび／またはナノカプセルの第２の個体群を形成するステップと、前記マイクロカプセルおよび／またはナノカプセルの第２の個体群を溶媒で硬化させるステップと、前記マイクロカプセルおよび／またはナノカプセルの第２の個体群を洗浄、かつ好ましくは凍結乾燥して、過剰の非水溶性物質を、前記マイクロカプセルおよび／またはナノカプセルの第２の個体群から除去するステップとを含む方法を提供することである。
【００１０】
代替手法としては、これらの方法において製造される第２の混合物を乳化するステップが、水を用いて実施され、水溶性で、昇華性を有する物質を添加するステップをさらに含む方法がある。
本発明の別の目的は、本発明の方法に従って製造されるエコー源性ポリマーのマイクロカプセルおよびナノカプセルを提供することである。
【００１１】
本発明の別の目的は、気体を充填された、本発明のエコー源性ポリマーのマイクロカプセルおよび／またはナノカプセルを含む、対象内の診断イメージング用のコントラスト剤を提供することである。このようなコントラスト剤には、コントラスト剤の標的を選択された組織または細胞にするために、マイクロカプセルおよび／またはナノカプセル表面上に、ペプチドまたは抗体などの標的剤をさらに含めることができる。罹患組織に標的剤を選択的に付着させることで、罹患組織と正常組織を区別するコントラスト剤が提供される。本発明のエコー源性ポリマーナノカプセルを使用すると、マイクロカプセルを介してアクセスするには狭すぎる脈管構造、例えば漏失性の腫瘍脈管構造（leaky tumor vasculature）の位置へのアクセスを介しての組織のイメージングを可能にする。
【００１２】
本発明の別の目的は、気体で充填された本発明のエコー源性ポリマーのマイクロカプセルおよび／またはナノカプセルを含むコントラスト剤を投与することによって、対象内部の１種または２種以上の組織をイメージングする方法を提供することである。この方法において使用されるコントラスト剤には、コントラスト剤の標的を選択された１種または２種以上の組織にして送達するために、マイクロカプセルおよび／またはナノカプセルの表面上のペプチドまたは抗体などの標的剤をさらに含めることができる。罹患組織に選択的に標的剤を付着させることによって、選択イメージングを介して罹患組織を正常組織と区別する方法が提供される。同様に、標的剤を悪性組織に選択的に付着させることによって、選択イメージングを介して悪性組織を良性組織と区別する方法が提供される。
【００１３】
本発明の別の目的は、本発明のエコー源性ポリマーのマイクロカプセルおよび／またはナノカプセルに、吸着、付着、および／またはカプセル化された、あるいはそれらを任意に組み合わせた、生物活性剤の送達のための組成物を提供することである。このような組成物には、選択された組織または細胞に生物活性剤を標的化するための、ペプチドまたは抗体などの標的剤をさらに含めることができる。罹患組織に選択的に標的剤を付着させることによって、生物活性剤を罹患組織に選択的に送達する送達剤が提供される。生物活性剤は、超音波に暴露することおよび／またはポリマーカプセルが崩壊することで、マイクロカプセルおよび／またはナノカプセルから放出することができる。本発明のエコー源性ポリマーナノカプセルを含む組成物の使用によって、生物活性剤を、マイクロカプセルを介してアクセスするには狭すぎる脈管構造の場所、例えば漏失性の腫瘍脈管構造に送達することが可能になる。
【００１４】
本発明のさらに別の目的は、本発明のエコー源性ポリマーのマイクロカプセルおよび／またはナノカプセルに、吸着、付着、および／またはカプセル化された、またはそれらのを任意に組み合わせた、生物活性剤を含む組成物の投与によって、対象に生物活性剤を送達する方法を提供することである。この方法において使用する組成物には、生物活性剤を対象の組織または細胞に標的化するために、エコー源性ポリマーのマイクロカプセルおよび／またはナノカプセル表面上に、たんぱく質または抗体などの標的剤をさらに含めることができる。この方法では、生物活性剤は、超音波に暴露するか、ポリマーカプセルの崩壊によるか、あるいはその組み合わせによって、マイクロカプセルおよび／またはナノカプセルから放出される。
【００１５】
発明の詳細な説明
本発明は、エコー源性ポリマーのマイクロカプセルおよびナノカプセル、ならびに診断イメージングにコントラスト剤として使用するためのそれらの製造方法、ならびに生物活性剤の送達用の組成物に関する。本発明はさらに、本発明のコントラスト剤のエコー源性ポリマーのマイクロカプセルおよびナノカプセルへの標的剤の付着、ならびに標的化診断イメージングのために本発明の生物活性剤を送達するための組成物、および選択された組織または細胞への生物活性剤の送達に関する。本発明に従ってエコー源性ポリマーナノカプセルを製造することによって、マイクロカプセルを介してアクセルするには狭すぎる脈管構造の領域のイメージングと、その領域への生物活性剤の送達が可能になる。
【００１６】
本発明の目的に対しては、「エコー源性」とは、マイクロカプセルまたはナノカプセルが、血液とマイクロカプセルまたはナノカプセルとの間の音響インピーダンス不整のために、超音波によって音波処理されたときに、検出可能なエコーを生成する能力があることを意味する。好ましい一態様においては、エコー源性特性は、マイクロカプセルおよび／またはナノカプセルが中空かつ／または有孔性であることに起因する。本発明の目的においては、「有孔性」とは、カプセルが１個または２個以上の孔隙を含むことを意味する。
【００１７】
本発明の一態様においては、エコー源性ポリマーのマイクロカプセルおよび／またはナノカプセルは、以下のように製造される。まず、非極性溶媒に溶解し、固体状態から昇華する非水溶性物質を、１種または２種以上の揮発性非極性溶媒に溶解して、第１の混合物を生成する。非極性溶媒に溶解し、かつ固体状態から昇華する、任意の非水溶性物質を使用して、この第１の混合物を製造することができる。例としては、それに限定はされないが、カンファー、パラ−フェノール、カンフェン、ナフタレン、ココアバターおよびカカオ脂などがある。使用可能な非極性溶媒には、それに限定はされないが、塩化メチレン、アセトン、アセトニトリル、テトラヒドロフラン、クロロホルム、ペンタン、ペンテン、およびメチルエチルケトンなどがある。好ましい一態様においては、非水溶性物質は、カンファーであり、溶媒は塩化メチレンである。カンファーと塩化メチレンの好ましい比は、０．０５ｇ：１０ｍｌである。
【００１８】
上記に列記した例から、追加の非極性溶媒を混合物に添加し、ナノ寸法域にあるカプセル（ナノカプセル）の寸法を制御することもできる。第２の、好ましくは異なる溶媒を添加すると、その性質が異なるために、カプセルの寸法は減少する。例えば、硬化段階において溶媒がカプセルから出る速度は、カプセルの寸法に影響する。具体的には、溶媒が速く出るほど、カプセルは小さくなる。アセントンは、塩化メチレンよりも、カプセルから出るのが速い。したがって、アセトンを第２の溶媒として添加すると、塩化メチレンだけを使用する場合に形成されるミクロン寸法のカプセルと比較して、ナノメートル寸法のカプセルが生成される。
【００１９】
本発明の目的では、「ナノカプセル」とは、人体の毛細脈管構造（microvasculature）に入るのに十分なほど小さな寸法のカプセルを意味する。本発明のナノカプセルの寸法は、約１０ｎｍから約５００ｎｍの範囲であるのに対して、本発明のマイクロカプセルの寸法は、約５００ｎｍから約１０００ミクロンの範囲である。この寸法のナノカプセルは、マイクロカプセルでは、アクセスするのが不可能ではないにしろ、困難である領域にアクセスすることができるという利点がある。例えば、ナノカプセルは、漏失性の腫瘍脈管構造を通過することができる。さらに、ナノカプセルは、異なる共鳴周波数を有し、このためにイメージングと生物活性剤の送達の両方において有利である。本発明のナノカプセルは、１０ＭＨｚより上でエコー源性であることがわかっている。
【００２０】
非水溶性物質が完全に非極性溶媒に溶解した後に、ポリマー材料を第１の混合物に添加する。この方法に使用可能なポリマーの例としては、それに限定はされないが、ポリラクチド、ポリグリコライド、ポリカプロラクトン、ポリラクチドとポリグリコライドとのコポリマー、ラクチドとラクトンとのコポリマ−、ポリサッカリド、ポリ無水化物、ポリスチレン、ポリアルキルシアノアクリレート、ポリアミド、ポリホスファーゼン、ポリ（メチルメタクリレート）、ポリウレタン、メタクリル酸とアクリル酸とのコポリマー、ヒドロオキシエチルメタクリレートとメチルメタクリレートのコポリマー、ポリアミノ酸、およびポリペプチドなどがある。好ましいポリマーは、生体適合性かつ／または生分解性のものである。好ましい一態様においては、ポリマーはポリ乳酸とグリコール酸のコポリマー（ＰＬＧＡ（polylactic co-glycolic acid））である。この態様においては、ポリマー０．５ｇを第１の混合物溶液１０ｍｌに添加するのが好ましい。
【００２１】
次いで、このポリマーを第１の混合物に添加し、完全に溶解するまで攪拌して、第２の混合物を形成する。
次いで、この第２の混合物を、水を加えるか、または水なしで乳化させる。水を加えて乳化するには、蒸留水のアリコート、好ましくは１ｍｌを、塩化メチレン、カンファーおよびＰＬＧＡを含む１０ｍｌの第２の混合物に添加し、プローブ音波処理機を３０秒間使用する。同様な乳化手順を、水添加なしで実施することができる。塩化メチレン、カンファーおよびＰＬＧＡの第２の混合物を乳化することによって、寸法範囲０．１〜１ｍｍのマイクロカプセルの個体群(population)が生成される。本発明の意味においては、このマイクロカプセルの個体群を、第１個体群のマイクロカプセルと呼ぶ。
【００２２】
次いで、第１個体群のマイクロカプセルを、界面活性剤中に注入して、数分間均質化させる。本発明において使用可能な界面活性剤の例としては、それに限定はされないが、ポリ（ビニル）アルコール、ツイーン（Tweens）および非イオン化界面活性剤などがある。好ましい一態様においては、カンファーとＰＬＧＡのマイクロカプセルを、５％ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）溶液５０ｍｌに添加し、５分間、９５００ｒｐｍで均質化する。界面活性剤の添加によって、マイクロカプセルが、より小さなビーズに分解し、第２の個体群のマイクロカプセルまたはナノカプセルが生成される。この手順は、製造工程における重要なステップである、マイクロカプセルの寸法低減を増強する。
【００２３】
一態様においては、第２の個体群のマイクロカプセルを、２％イソプロパノール溶液１００ｍｌのような硬化剤中に注入して、１時間攪拌する。これによって、残留塩化メチレンが除去されて、マイクロカプセルが硬化する。代替手法としては、イソプロパノールを、マイクロカプセルを保持する容器に投入して、１時間攪拌し、残留塩化メチレンを除去して、マイクロカプセルを硬化させる。使用可能な硬化剤の例としては、それに限定はされないが、イソプロパノール、エタノール、メタノール、エチルエーテル、石油エーテル、ヘプタン、およびヘキサンなどがある。
【００２４】
この硬化処理ステップに続いて、マイクロカプセルを遠心分離処理によって収集し、過剰蒸留水で洗浄し、再び遠心分離処理し、さらに、ポリマ−を溶解することなく非水溶性物質を除去する、ヘキサンなどの溶媒で複数回洗浄する。ヘキサンはまた、硬化剤としても作用して、残留塩化メチレンを除去して、さらにカプセルを乾燥させる。各洗浄後に、洗浄溶媒はピペッティングによって除去する。次いで、蒸留水による最終洗浄を行う。次いで、洗浄された個体群のポリマーマイクロカプセルおよび／またはナノカプセルを遠心分離処理し、−８５℃で凍結し、次いで凍結乾燥して、カプセルを乾燥させると共に、その他の残留非水溶性物質をすべて除去する。これによって、保管時に安定であり、食塩水などの薬学的に許容されるビヒクル中に、用いる直前に定型的な方法によって再懸濁することのできる、マイクロカプセルおよび／またはナノカプセルの易流動性粉末が得られる。
【００２５】
カンファー、塩化メチレンおよびＰＬＧＡから製造されたエコー源性ポリマーマイクロカプセルの最終個体群の粒子寸法解析によると、個体群は０．４〜１．６ミクロンの範囲で、寸法的に均一であった。
音響用量反応実験(acoustic dose-response experiment)を、これらのエコー源性ポリマーマイクロカプセルを使用して実施した。中央周波数がそれぞれ２．２５ＭＨｚ、５ＭＨｚ、７．５ＭＨｚおよび１０ＭＨｚの、単独エレメント、ブロードバンド、１２．７ｍｍエレメント直径、５０．８ｍｍ球面焦点の４つのトランスデューサ（Panametrics社、Waltham、MA）を、従来型医療超音波範囲を表すものとして選択した。トランスデューサの６ｄＢバンド幅は、それぞれ８９％、９２％、７１％および６５％であった。
【００２６】
ある既知の量（０．０１〜１．０ｇ）のエコー源性ポリマーマイクロカプセルを計量して、サンプル容器中のリン酸塩緩衝生理食塩水中に加え、用量反応を記録した。用量反応曲線上に存する点の用量は６回反復した。各用量毎に、新しい緩衝液を使用し、用剤を１０秒遅れで容器内に後段投与することによって、信号収集の前に確実かつ適切に混合させた。この信号は、ウォール信号（wall signal）からの共鳴（ringing）がおさまった後に、２．０マイクロ秒の時間ゲートをかけた。ゲート信号の自乗平均（ｒｍｓ）を計算し、用剤を含まない５０のＡラインの平均をとり、ベースラインｓ０（ｔ）とした。同様に、コントラスト剤を含む、５０のＡラインの平均ｓＣＡ（ｔ）を計算し、ｓ０（ｔ）に対して、強調量（ΣＥ）としてｄＢで表した。
【００２７】
ΣＥ＝２０ｌｏｇ１０［ｒｍｓ（ｓＣＡ（ｔ）／ｒｍｓ（ｓ０（ｔ））］
【００２８】
本発明のマイクロカプセルは、ある用量反応関係を示した。
本発明の別の態様においては、エコー源性ポリマーのマイクロカプセルおよび／またはナノカプセルは、以下の修正によって、上記のマイクロカプセルと同様な方法で製造することが可能である。乳化ステップにおいて、水溶液に溶解し、かつ昇華性を有する用剤が添加される。水溶性で、かつ昇華性を有する、そのような用剤の例としては、それに限定はされないが、炭酸アンモニウムおよびその他のアンモニウム塩、テオブロミンならびに酢酸テオブロミンなどがある。好ましい一態様においては、４％炭酸アンモニウム水溶液１．０ｍｌを、プローブ音波処理の前に、第２の混合物に添加する。
Coulter寸法解析による、これらのマイクロカプセルの寸法分布解析の結果、平均直径は１．２４２μｍであった。また、Horiba寸法解析によるマイクロカプセルの寸法分布解析から、平均直径が１．２１０μｍであることがわかった。
【００２９】
カンファーと炭酸アンモニウムを使用するこの方法によって調製されるポリマーマイクロカプセルは、エコー源性であり、インビトロ用量反応は、カプセルを超音波処理する周波数に関係して、２．２５、５、７．５および１０ＭＨｚの超音波エネルギーで超音波処理されるとき、マイクロカプセル８μｇ／緩衝液１ｍｌ（１ｍｌあたり、約１．６×１０６マイクロバブル）のわずかな投与に対して、１４．８、２５．４、２５．３および２０．８ｄＢの改善が得られることがわかった。この用量は、カンファーだけをカプセル化して昇華させるマイクロカプセルによって２３ｄＢの強調を達成するのに必要な６ｍｇ／ｍｌ投与と比較して相対的に少ない。したがって、溶解可能で昇華性の用剤、炭酸アンモニウムを水溶液に溶解して、乳化の前に追加する方法によって調整されるマイクロカプセルは、この追加ステップなして調整されるマイクロカプセルと同一の音響改善を得るのに必要な用量が少なくてすむ。
【００３０】
マイクロカプセルには造影効果（shadowing effect）も観察された。
これらのマイクロカプセルをコントラスト剤として使用したニュージーランド白ウサギ（New Zealand White rabbits）において、インビボパワードップラー（Power Doppler）イメージングも実施し、この結果、用剤なしで行ったイメージングと比較してイメージの強調が見られた。インビボ用量反応曲線には、０．１５ｍＬ／ｋｇの投与によって、２４ｄＢまでの大幅な音響強調が見られた。
【００３１】
したがって、本明細書で示したように、これらの方法によって製造したエコー源性ポリマーのマイクロカプセルおよびナノカプセルは、それに限定はされないが、腎組織、脳組織、腫瘍脈管構造、皮膚組織、膵組織、乳腺組織、心臓組織、前立腺組織、卵管組織、副腎組織、網膜組織、筋組織、プラーク領域および虚血領域などの、日常的に超音波技法でイメージングされる、様々な組織ならびに、その上皮および／または内皮の任意のものをイメージングするのに使用することができる。
【００３２】
コントラスト剤としての使用に対しては、本発明のエコー源性マイクロカプセルおよび／またはナノカプセルは、気体を充填できるように中空または有孔質であるのが好ましい。このような気体充填ポリマーマイクロカプセルは、エコー源性の中空または有孔質ポリマーマイクロカプセルを、ポリマーマイクロカプセル中に気体を拡散させるのに十分な期間、気体と接触させて、気体充填ポリマーマイクロカプセルとすることにより、製造される。この中空または有孔質ポリマーマイクロカプセルを気体に暴露する手順は、室内圧力（大気圧力）、大気圧以下、または高圧で実施することができる。
【００３３】
中空マイクロカプセルに気体を充填するのに必要な時間は、比較的短く、一般には数分しかかからず、実際の時間は、中空マイクロカプセルを気体と平衡させる方法および圧力によって決まる。本明細書で使用する「気体」の用語は、通常の保存状態、例えば約１５〜２５℃、および／または通常の哺乳類体温、例えばヒトの３７℃において気体形態である物質を含む。これによって得られる、本発明の気体充填ポリマーマイクロカプセルは、乾燥した、易流動性粉末として、好ましくはポリマーマイクロカプセル内に気体が収納され状態で保管する。
【００３４】
気体充填マイクロカプセルは、超音波診療などの医療イメージングにおけるコントラスト剤として有用である。超音波コントラスト組成物は、一般に、中空または有孔質ポリマーマイクロカプセルを含み、これに気体が充填されて、コントラスト剤のキャリアの役割を果たす水溶液中に分散される。使用可能な水溶液としては、それに限定はされないが、等張食塩水、リン酸塩緩衝生理食塩水などがある。次いで、コントラスト剤組成物は、血流中に注入されて、特定の血管または体組織の超音波による可視化に使用される。
【００３５】
本発明のポリマーのマイクロカプセルおよびナノカプセルは、生物活性剤の送達に使用することができる。この態様においては、生物活性剤を、マイクロカプセルまたはナノカプセルの表面に、吸着および／または付着させることができる。薬物生成物をマイクロカプセル表面に吸着させるために、薬物を蒸留水または緩衝液に溶解させ、次いで乾燥させたマイクロカプセルを蒸留水中で薬物と共に懸濁させる。懸濁液は、一晩攪拌し、次いで懸濁液を遠心分離処理してカプセルを収集する。この結果得られるマイクロカプセルを、次いで、洗浄、凍結および凍結乾燥する。凍結乾燥されたマイクロカプセルは、その表面に、送達しようとする薬物生成物(drug product)が吸着している。
【００３６】
周知の結合方法（method for conjugation）を用いて、マイクロカプセルおよび／またはナノカプセルに生物活性剤を付着させることもできる。例えば、例８で教示するような結合方法を使用して、ＲＧＤペプチドを生物活性剤で置換することができる。この代わりに、あるいはこれに追加して、マイクロカプセルまたはナノカプセルに生物活性剤をカプセル化することもできる。水溶性生物活性剤は、乳化中に水を含め、この水に生物活性剤を溶解させることによってマイクロカプセルまたはナノカプセル中にカプセル化することができる。非水溶性生物活性剤は、これらのカプセルを調製する最初のステップにおいて、生物活性化合物を非極性有機溶媒に溶解させることによって、マイクロカプセルまたはナノカプセル内にカプセル化することができる。
【００３７】
本発明のマイクロカプセルおよび／またはナノカプセル内に吸着、付着、および／またはカプセル化することのできる生物活性剤の例としては、それに限定はされないが、アザシチジン、シタラビン、フルオロウラシル、メルカプトプリン、メトトレキセート、チオグアニン、ブレオマイシン、ペプチド抗生物質、エトポシド、ＶＰ‐１６、テニポシド、およびＶＭ‐２６などのポドフィリンアルカロイド類、ビンクリスチン、ビンブラスチンおよびパクリタクセルなどの植物アルカロイド類、ブサルファン、シクロホスファミド、メクロレサミン、メルファンラン、およびチオテパなどのアルキレート剤、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、プリカマイシンおよびミトマイシンなどの抗生物質、ＢＣＮＵ、ＣＣＮＵおよびメチルＣＣＮＵなどのシスプラチンおよびニトロソウレア類、抗ＶＥＧＦ（血管内皮増殖因子）分子、遺伝子治療ベクター、およびＭＭＰ‐２およびＭＭＰ−９などのペプチド抑制剤、などの抗新生物剤および抗癌剤であり、これらは腫瘍に局所化される(localize)と腫瘍の成長を防止する。
【００３８】
一旦調製されると、生物活性剤を含む、マイクロカプセルおよび／またはナノカプセルは、ヒトを含む動物中に注入するために薬学的に許容されるビヒクル中に懸濁することができる。一旦注入されると、ポリマーマイクロカプセル構造の経時的な生分解によるか、生物活性剤の超音波への暴露による放出の開始によるか、またはこれらの組み合わせによって、生物活性剤を放出することができる。
【００３９】
本発明の組成物を使用することにより，生物活性剤の送達を、腎組織、肺組織、脳組織、腫瘍脈管構造、皮膚組織、膵組織、乳腺組織、心臓組織、前立腺組織、腸組織、子宮組織、副腎組織、網膜組織、筋組織、プラーク領域、炎症領域および虚血領域を含む、任意の様々な組織、ならびにその上皮および／または内皮に導くことができる。
【００４０】
本発明のマイクロカプセルおよび／またはナノカプセルには、カプセル表面に付着させた標的剤をさらに含めることができ、この標的剤は、系統的な投与時に、コントラスト剤または送達剤を、体内の選択された１種または２種以上の組織、または細胞に標的化することができる。本発明において有用な標的剤には、ペプチド、抗体、抗体組織、組織または細胞に対して選択性である細胞表面受容体特異的リガンド（receptor-specific ligands）を含めることができる。例としては、それに限定はされないが、腫瘍血管上のαｖインテグリンと結合するＲＧＤ、腫瘍血管上のアミノペプチダーゼＮと結合するＮＧＲモチーフ、およびフィブロネクチンのＥＢＤドメインと結合するＳｃＦｖｃがある。
【００４１】
したがって、標的剤を定型的に選択することによって、本発明のコントラスト剤または送達剤、あるいはその組み合わせが、選択された組織や細胞などの体内の所望位置に導くか、あるいは本発明のコントラスト剤または送達剤が、罹患組織と正常組織、あるいは悪性組織と良性組織とを区別するようにすることができる。標的コントラスト剤および／または送達剤は、単独で、あるいは、本発明のコントラスト剤および／またはさらに標的剤を含まない送達剤の個体群と共に投与することができる。
【００４２】
ＲＧＤペプチドは、本発明のエコー源性ポリマーマイクロカプセルに共役結合させた。マイクロカプセルは、血管形成、αｖβ３およびαｖβ５に特有のインテグリンを標的にする、ＲＧＤペプチドで被覆した。次いでマイクロカプセルを、ラット神経芽細胞腫細胞に、６時間以内に、体外で結合させた。この研究の結果によって、選択された標的剤に結合されたマイクロスフィアを使用して、選択された細胞を標的にすることができることが実証された。このようなマイクロカプセルは、標的イメージング、標的治療イメージング、および本発明のマイクロスフィアをビヒクルとして使用する生物活性剤の送達に有用である。
本発明をさらに説明するために、以下の非限定の例を示す。
【００４３】
例
例１：材料
ポリ（Ｄ，Ｌ‐乳酸・グリコール酸コポリマー５０：５０，ＰＬＧＡ）（Medisorb 5050 DL 3A, lot 1010-412）はAlkermesから購入した。８８％モル加水分解、モル重量（Ｍｗ）２５０００のポリ（ビニルアルコール）（ＰＶＡ）はPolysciences, Inc.から購入した。（１Ｒ）−（＋）−カンファー、リン酸二水素アンモニウム、ＧＲＧＤＳ（Gly-Arg-Gly-Asp-Ser）ペプチド錯体、ＥＤＣ（１‐エチル‐３，‐３‐ジメチルアミノ‐プロピル）カルボジイミド、ＮＨＳ（Ｎ‐ヒドロキシスルホサクシンイミド）、抗体（ペニシリンおよびストレプトマイシン）およびＬ‐グルタミンはSigmaから購入した。Dulbecco's Modified Eagle Medium（ＤＭＥＭ）、Hank's Balanced Salt SolutionおよびFetal Bovine Serum（ＦＢＳ）はFisherから購入した。炭酸アンモニウムはJ. T. Bakerから購入した。その他の薬品はすべて、Fisherから購入した試薬用のものである。
【００４４】
例２：カンファー含有マイクロカプセルの製造
カンファー（０．０５ｇ）とＰＬＧＡ（０．５ｇ）を１０ｍｌの塩化メチレンに溶解し、１１７ボルトで３０秒間、プローブ超音波処理を施した。次いで、得られたエマルジョンを、５％ＰＶＡ溶液に投入し、９５００ｒｐｍで５分間均質化した。次いで、ホモジェネートを、２％イソプロパノール溶液に投入し、１時間攪拌した。カプセルを遠心分離によって収集し、ヘキサンで３回、次いで脱イオン水で１回洗浄し、Virtis Benchtop凍結乾燥機を使用して凍結乾燥して、カンファー核を除去した。
【００４５】
例３：カンファーおよび炭酸アンモニウム含有マイクロカプセルの調製
カンファー（０．０５ｇ）とＰＬＧＡ（０．５ｇ）を１０ｍｌの塩化メチレンに溶解した。このポリマー溶液に、４％炭酸アンモニウム１０ｍｌを加えて、１１７ボルトで３０秒間プローブ超音波処理を施した。次いで、エマルジョンを、５％ＰＶＡ溶液に投入し、９５００ｒｐｍで５分間均質化した。次いで、ホモジェネートを、２％イソプロパノール溶液に投入し、１時間攪拌した。カプセルを遠心分離によって収集し、ヘキサンで３回、次いで脱イオン水で１回洗浄し、Virtis Benchtop凍結乾燥機を使用して凍結乾燥して、カンファーおよび炭酸アンモニウム核を除去した。
【００４６】
例４：寸法分布
Horiba LA 910粒子寸法計測機（Horiba Instrument)とCoulter Multisizer IIによる静的光散乱を使用、比較して、カプセルの寸法分布を測定した。
【００４７】
例５：走査電子顕微鏡観察（ＳＥＭ）
走査電子顕微鏡写真（Amray model 1830D SEM）を、冷凍乾燥されたカプセルについて撮影した。カプセルは、両面電気テープを備える金属スタブ上に装着した。カプセルは金で被覆を施し、ＳＥＭで観察した。
【００４８】
例６：インビトロ音響調査
冷凍乾燥されたカプセルを計量して、音響窓を備えた１００ｍｌ特製容器に入れて、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）溶液５０ｍｌを加えた。次いで、この懸濁液を音響装置内に設置して、２．２５、５、７．５、１０ＭＨｚの異なる中心周波数を有するトランスデューサを用いて音波処理した。音響強調は、Lab Viewを用いて分析した。最初の３０分間で得られた測定値から、用量反応曲線を、０ｍｇ／ｍｌ〜１２μｇ／ｍｌの範囲で構築した。
【００４９】
例７：インビボ音響調査
すべてのインビボ調査は、重量範囲が２．０〜５．０ｋｇの両性のニュージランド白ウサギを用いて行った。ウサギは、０．６５ｍｇ／ｍｌの塩酸ケタミン（Ketaset、Avco）と塩酸キシラジン（Gemimi）の筋肉注射によって鎮静化させた。各実験の後に、ペントバルビタール（Beuthanasia）の致死量を投与してウサギを犠牲にした。用剤は、注入に先立って計量し、生理食塩水に懸濁させた。用剤は、カテーテルをつけた耳静脈から１８番針を使用して注射した。注射直後に、注射口を５ｃｃの生理食塩水で洗浄した。腎臓のパワードップラーイメージングを、腹部スキャンを使用して実施した。
【００５０】
インビボ用量反応曲線を、異なるウサギについて構築した。実験の前に外科的に露出させた、腎動脈下の抹消大動脈の回りに、注文製作のSilex１０ＭＨｚカフトランスデューサ（cuff transducer）を配置した。この配置は、呼吸運動からの干渉とノイズを減少させた。パルスドップラー装置（SDD 600；Vingmed Sound、Oslo、Norway）によって四辺形の音響出力を記録した。コントラスト強調（ｄＢ単位）は、記録したデータ、すなわちパワーの経時変化から公知の技法によって計算した。
【００５１】
例８：ＲＧＤペプチドによるマイクロカプセルの被覆
乾燥させたマイクロカプセル（１００ｍｇ）を、５ｍｇの１‐エチル‐３‐（ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）（ＣＯＯＨ基のモル比：１：１）、Ｎ‐ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）１４ｇ（ＥＤＣに対して１：２モル比）、緩衝液（０．１Ｍ ＭＥＳ、０．３Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ６．５）１０ｍｌの中で混合して、１５分間攪拌する。次いで、ＲＧＤペプチド（１５０ｇ）を添加し、２４次間攪拌した。マイクロカプセルを脱イオン水で３回洗浄して、凍結乾燥した。
【００５２】
例９：細胞培養
ＮＢ２Ａマウスの神経芽細胞腫細胞を、９０％ＤＭＥＭ、１０％ＦＢＳ、２ｍＭのＬ‐グルタミンを含む、生育培地を使用して培養した。３日ごとにこの培地を交換し、細胞を分割した。実験は、通路１０の細胞上で実施した。
【００５３】
例１０：マイクロカプセル付着
それぞれの１２ウエル細胞培養プレート内で、３ｍｌの成長媒体と共に細胞を培養した。３日後、細胞は融合し、生育培地を交換した。次いで、細胞をハンクス液（Hank's salt solution）で洗浄し、ＲＧＤペプチドを含むか、または含まないＰＬＧＡを濃度０．５ｍｇ／ｍｌで生育培地に懸濁したマイクロカプセルを含む改変した培地と置換した。次いで、細胞を、０、１、および６時間培養した。それぞれの設定時間後に、培地を除去して、細胞を再びハンクス液で洗浄した。
次いで、Wesco Verta 7000シリーズ顕微鏡下で細胞を観察した。顕微鏡とインタフェースされた、Olympus DP11ディジタルカメラを使用して、倍率６２５倍でディジタル画像を撮影した。
【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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