(57)【要約】本発明は、生物学的データ、特にスペクトル、例えば核磁気共鳴（ＮＭＲ）およびその他のタイプのスペクトルなどの解析方法に関する。より具体的には、本発明は、試料スペクトルの処理方法であって、前記試料スペクトルにおける一以上の標的領域をそれぞれ主参照スペクトルにおける対応する交換領域で置き換えることによって標的置換試料スペクトルを得る工程を含み、ここで、前記交換領域は、前記標的置換試料スペクトルにおける全積分強度に占める前記交換領域の割合が、前記主参照スペクトルにおける全積分強度に占める前記交換領域の割合と同じになるように倍率変更されていることを特徴とする方法に関する。適用可能な用途は、適用された刺激のバイオマーカーもしくはバイオマーカーの組み合わせの同定方法、適用された刺激の分類、適用された刺激の診断、治療を受けている被検体の治療モニタリング、薬物療法及び／又は薬物有効性の評価、薬物の毒性副作用の検出、過剰摂取された薬物の特性決定及び／又は同定である。
2004526130.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料スペクトルの処理方法であって、
前記試料スペクトルにおける一以上の標的領域をそれぞれ主参照スペクトルにおける対応する交換領域で置き換えることによって標的置換試料スペクトルを得る工程を含み、ここで、前記交換領域は、前記標的置換試料スペクトルにおける全積分強度に占める前記交換領域の割合が、前記主参照スペクトルにおける全積分強度に占める前記交換領域の割合と同じになるように倍率変更されていることを特徴とする方法。
【請求項２】
試験試料についての試料スペクトルの処理方法であって、
（a）前記試料スペクトルにおいて、交換のための一以上の標的領域を同定する工程、
（b）前記標的領域のそれぞれに対応する一つの交換領域を含む主参照スペクトルを提供する工程、および
（c）前記標的領域それぞれを対応する交換領域で置き換えることによって標的置換試料スペクトルを得る工程
を含み、ここで、前記交換領域は、前記標的置換試料スペクトルにおける全積分強度に占める前記交換領域の割合が、前記主参照スペクトルにおける全積分強度に占める前記交換領域の割合と同じになるように倍率変更されていることを特徴とする方法。
【請求項３】
（d）前記標的置換試料スペクトルを規格化することによって規格化された標的置換試料スペクトルを得る後工程をさらに含む請求項２に記載の方法。
【請求項４】
試験試料についての試料NMRスペクトルの処理方法であって
（a）前記試料NMRスペクトルにおいて、交換のための一以上の標的領域を同定する工程、ここで、前記標的領域は、それぞれ化学シフト範囲で定義され、
（b）前記標的領域のそれぞれに対応する一つの交換領域を含む主参照NMRスペクトルを提供する工程、ここで、標的領域とそれに対応する交換領域は、同じ化学シフト範囲で定義され、
（c）前記標的領域それぞれを対応する交換領域で置き換えることによって標的置換試料NMRスペクトルを得る工程
を含み、ここで、前記交換領域は、前記標的置換試料スペクトルにおける全積分強度に占める前記交換領域の割合が、前記主参照スペクトルにおける全積分強度に占める前記交換領域の割合と同じになるように倍率変更されていることを特徴とする方法。
【請求項５】
（d）前記標的置換試料NMRスペクトルを規格化することによって規格化された標的置換試料NMRスペクトルを得る後工程をさらに含む請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記置換工程（c）において、前記標的領域それぞれを対応する交換領域で置き換えることによって標的置換試料スペクトルを得るに際し、前記交換領域が、次式：
【数１】
2004526130.tif 000014
（式中、
IYは試料スペクトルの全積分強度であり、
IY,Tkは標的領域の積分強度であり、
ICMは主参照スペクトルの全積分強度であり、
ICM,Rkは交換領域の積分強度であり、
kは1〜ntの範囲であり、
ntは標的領域の数である。）
で与えられる係数fを掛けることで倍率変更されていることを特徴とする請求項２〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法によって処理された試料スペクトル。
【請求項８】
複数の試料スペクトルの処理方法であって、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法によってそれぞれの試料スペクトルを処理することを含む方法。
【請求項９】
適用された刺激の解析方法であって、
（a）前記刺激を受けた一以上の生物それぞれに由来する一以上の試料それぞれについての一以上の試料スペクトルを提供する工程、
（b）前記刺激を受けていない一以上の生物それぞれに由来する一以上の試料それぞれについての一以上の参照スペクトルから導き出される主参照スペクトルを提供する工程、
（c）請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法を用いて、前記試料スペクトルをそれぞれ処理する工程
を含む方法。
【請求項１０】
前記適用された刺激が生体異物である請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記適用された刺激が病態である請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記適用された刺激が遺伝子改変である請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
請求項９〜１２のいずれか１項に記載の解析方法を含む、適用された刺激に対するバイオマーカーまたはバイオマーカーの組み合わせを同定する方法。
【請求項１４】
請求項１３に記載の方法によって同定されたバイオマーカーまたはバイオマーカーの組み合わせ。
【請求項１５】
請求項１３に記載の方法によって同定されたバイオマーカーを用いた、適用された刺激の診断方法。
【請求項１６】
請求項１３に記載の方法によって同定されたバイオマーカーを用いるアッセイ。
【請求項１７】
請求項９〜１２のいずれか１項に記載の解析方法を含む、適用された刺激の分類方法。
【請求項１８】
請求項９〜１２のいずれか１項に記載の解析方法を含む、適用された刺激の診断方法。
【請求項１９】
請求項９〜１２のいずれかに記載の解析方法を含む、治療を受けている被検体の治療モニタリング方法。
【請求項２０】
請求項９〜１２のいずれか１項に記載の解析方法を含む、薬物療法及び／又は薬物の有効性の評価方法。
【請求項２１】
請求項９〜１２のいずれか１項に記載の解析方法を含む、薬物の毒性副作用の検出方法。
【請求項２２】
請求項９〜１２のいずれか１項に記載の解析方法を含む、過剰摂取の薬物を特徴づける及び／又は同定する方法。
【請求項２３】
前記スペクトルがNMRスペクトルである請求項８から２２のいずれかに記載の方法。
【請求項２４】
請求項１〜２３のいずれか１項に記載の方法を実行するために動作可能なように設定されたコンピューターシステム。
【請求項２５】
適切なコンピューターシステム上で請求項１〜２３のいずれか１項に記載の方法を実行するのに適切なコンピューターコード。
【請求項２６】
適切なコンピューターシステム上で請求項１〜２３のいずれか１項に記載の方法を実行するのに適切なコンピューターコードを保持するデータキャリア。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般にケモメトリクス、メタボノミクスの分野に関するものであり、特に、例えば、核磁気共鳴（NMR）やその他のタイプのスペクトルのような化学的、生物化学的、及び生物学的データの解析方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
生物系で起こっている生物化学的過程を決定し定量化する方法の開発において重大な進歩があった。このような方法は、一般に用いられている薬物の治療計画の改善のみならず、病気の診断、予後診断及び処置、薬物の開発において価値のあるものである。
【０００３】
ヒト及び動物の体の病気（例えば癌、変性疾患、自己免疫疾患等）は、ある遺伝子の発現の変更に根本的な基礎をおいている。発現遺伝子産物であるタンパク質は、異常な細胞増殖、細胞死あるいは炎症のような作用を媒介する。これらの作用のいくつかは、直接、タンパク質-タンパク質相互作用より引き起こされる。その他は、さらなる遺伝子発現も含めた作用の引き金を引く小分子（例えば、「セカンドメッセンジャー」）上で作用するタンパク質により引き起こされる。
【０００４】
同様に、ウイルスやバクテリアのような外部からの病因により引き起こされる病態は、感染した宿主において多数の複雑な応答を引き起こす。
【０００５】
同様に、薬物投与による病気の処置により、患者において広範囲にわたる望ましい作用と望ましくない副作用が結果として起こり得る。
【０００６】
遺伝子レベルでこのようなタイプの現象に対する応答における遺伝子発現を調査する方法は、しばしば「ゲノム法」と呼ばれ、通常、DNAやRNAのような遺伝分子を検出及び／又は定量化することによって、総称してゲノムと呼ばれる生物の遺伝子の発現を検出及び定量化することに関係がある。ゲノム研究では、しばしば新しい世代の工業所有権を有する「遺伝子チップ」が利用され、これは細胞により産生された抽出mRNAに反応する遺伝子のアレイがコード化された小さな使い捨ての装置である（例えば、Klenkら、1997を参照せよ）。多くの遺伝子をチップアレイ上に配置することが可能であり、遺伝子発現のパターンまたはそこでの変化を迅速にモニターできるが、かなりコストがかかる。
【０００７】
しかしながら、遺伝子発現、あるいは摂動後の変更された遺伝子発現の生物学的結果は非常に複雑である。このことが「プロテオーム法」の開発につながった。プロテオーム法は、生物の細胞タンパク質産生量（総称して「プロテオーム」と呼ばれる）の半定量的測定に関連している（例えば、Geisow、1998を参照せよ）。プロテオーム測定では、様々な技術が利用されるが、全てに、通常、質量スペクトルのような形式の化学的特性決定法と関連した、例えば、二次元ゲル電気泳動のようなタンパク質分離法が含まれる。
【０００８】
近年、病気およびその治療に対するヒト及び動物被検体の反応は、個々の遺伝子の構造に応じて変化し得ることが認識されている。このことが「薬理ゲノム学」の分野の発達につながっている。個人の有するゲノムが特定の病気に対してどのように反応するかをより完全に理解することにより、既存の療法を洗練するばかりでなく、新療法の開発が可能になる。
【０００９】
現在のところ、ゲノム法及びプロテオーム法は、いずれも高価であり労働集約的であるが、生物学的反応を研究するための強力な道具となる潜在性を有している。方法の選択は未だに不確定である。なぜなら、注意深く研究すると、遺伝子発現のパターンとタンパク質発現のパターンとの間の相関関係が低いことが時々示されているからであるが、これはおそらく、不適切な時点で二つの技術に対するサンプリングを行ったことによるものである（例えば、Gygiら, 1999を参照せよ）。ゲノム法及プロテオーム法では、これを組み合わせたとしても、生物全体の動的代謝状態を考慮に入れていないので、生物系における統合された細胞機能を理解するのに必要な範囲の情報は未だ得られない。
【００１０】
例えば、ゲノムあるいはプロテオームの研究は、病気あるいは生体異物反応において特定の遺伝子またはタンパク質を結びつけるかもしれない。というのは、その特定の遺伝子またはタンパク質の発現レベルが変更されるからである。しかし、遺伝子またはタンパク質レベルの変化は、一時的であるかあるいは流れの弱まった下流のようなものであり、結果として、細胞及び／又は生物化学レベルでは何ら影響がない可能性がある。逆に、不適切な時点でゲノム及びプロテオームの研究のために組織をサンプリングすると、関連する遺伝子あるいはタンパク質を結果として見過ごしてしまう可能性もある。
【００１１】
それでもなお、ゲノム学やプロテオーム学における最近の進歩により、薬の開発のために新しい潜在的なターゲットを即座に識別することが可能になった。手元にある新しいターゲットを使用し、さらにコンビナトリアルケミストリーとハイスループットスクリーニングの助けを借りることで、製薬工業では、毎週、数千もの新しい候補化合物を即座に生み出し、これをスクリーニングすることが可能になっている。
【００１２】
しかしながら、実際には、これらの候補化合物のうちのほんの数個のみが、例えば、前臨床及び臨床開発にさらに持ち込まれるにすぎない。それ故、最も見込みのある候補化合物を同定することが重要であり、これは通常、臨床研究のための選定の前に、有効性や毒性によって判断される。しかしながら、これらの選定プロセスは不完全であり、多くの薬が、有効性の欠如及び／又は毒性作用のために臨床試験で落とされる。他の薬が、認知されていない薬理ゲノム学的反応を有するサブグループの患者にのみ効果的であるために、全体として失敗することもあり得る。開発プロセスの後期段階における薬の「消耗(attrition)」または損失を減らすための新たな方法を、例えば、化合物の選定の効率を最大にしかつ消耗速度を最小にするように設計された解析技術の開発及び応用を通じて見出すことが大いに必要とされている。
【００１３】
ゲノム法及びプロテオーム法は、化合物の選定においては有用な助けとなる一方で、相当な制約がある。例えば、ゲノム法及びプロテオーム法は、最終的には毒物学的な機構に対する深遠な洞察を与え、病気についての新たな代理バイオマーカーを与え得るが、現在のところ、ゲノム的あるいはプロテオーム的知見を古典的な細胞のあるいは生物化学的な指針あるいは終点と関係づけることは非常に難しい。このことに対する一つの単純な理由は、現在の技術及びアプローチでは、薬物暴露に対する時間的応答の相関関係が難しいことにある。さらなる難題がin vitro細胞系の研究で生じる。これらの難点は、化合物の代謝が毒性作用の必要条件になっている多くの既知の場合に特に重要であり、標的の器官が一次代謝の場所になっていない場合に特に当てはまる。このことは、in situでの化学的（例えば酵素的）修飾の何らかの局面が活性のために要求されるプロドラッグの場合、特に当てはまる。
【００１４】
ゲノム学やプロテオーム学により提供される情報を増やし、補うことを目指した新しい「メタボノミクス」的なアプローチが提唱された。「メタボノミクス」は、従来、「病態生理学的な刺激または遺伝子改変に対する生物系のマルチパラメトリック代謝応答の定量的測定」と定義される（例えば、Nicholsonら、1999を参照せよ）。この概念は、まず第一に生物流体、細胞、及び組織の代謝組成を研究するための1HNMRスペクトルの応用から生じ、パターン認識（PR）、エキスパートシステム、及び複雑なNMRから生じる代謝データのセットを解釈し分類するためのその他の化学的情報ツールを利用する研究から生じた。メタボノミクス法は、最終的に生物の動的代謝構造全体を決定する潜在性を有している。
【００１５】
病理学的状態あるいは生体異物は、薬理学的レベルでのみ作用し、それ故、直接、遺伝子の調節および発現に影響を与えることができない。その代わり、重大な病気あるいは毒物学的影響は、遺伝子スイッチとは完全に関係がない。例えば、in vivoでのエタノール曝露は多くの遺伝子のスイッチをオンにするが、こうした遺伝子発現の事象により、酒酔いは説明されない。このような場合には、ゲノム法及びプロテオーム法は、有効ではなさそうである。しかしながら、全ての病気または薬で誘起される病態生理学的な摂動は、直接の化学反応か、あるいは代謝を制御している重要な酵素または核酸に結合することによって、結果として、内因性生物化学物質の割合、濃度、結合または流束に撹乱をもたらす。もし、これらの撹乱が十分な大きさをもっていれば、作用は生物全体の効率的な機能化に影響を及ぼす結果となる。生物流体においては、代謝産物はその内部の細胞及び組織と動的平衡にあり、したがって、毒物傷害後に起こる、あるいは病気の結果として起こる生物全体の組織における異常な細胞過程は、生物流体組成の変化に反映される。
【００１６】
生物から分泌された流体、生物から排出された流体、あるいは生物由来の流体（「生物流体」）は、生物化学的状態に対して独特の視点を与えてくれる。というのは、所与の生物流体の組成は、流体の生産及び分泌に密接にかかわる細胞の機能の結果だからである。例えば、ある特定の流体の組成は、例えば、生体異物、病気、及び／又は遺伝子改変の結果として、器官の機能（あるいは機能障害）に関する詳細な生物化学的情報を伝達することができる。同様に、生物の組織の組成及び条件は、生物の生物化学的状態の指標でもある。生物流体の例としては、例えば、尿、血漿、乳等が含まれる。
【００１７】
生物流体は、外部からの刺激に応答して代謝産物プロフィールにしばしば非常に微妙な変化を示す。これは、生体の細胞系が、例えば、細胞傷害性の攻撃に直面した場合に、ホメオスタシス（内部環境の恒久性）を保とうとするからである。これを達成する一つの手段が、生物流体の組成を調整することである。それ故、細胞のホメオスタシスが保たれているときでも、病気あるいは毒性に対する微妙な応答は、変更された生物流体の組成として表現される。しかしながら、食事の変化、日ごとの変化およびホルモンの変化も、生物流体の組成に影響する可能性があり、もし、正しい生物化学的推論がその解析から引き出せるのであれば、これらの影響を区別することは明らかに重要である。
【００１８】
生物流体の解析に対して最も成功するアプローチの一つは、NMRスペクトルの利用である（例えば、Nicholsonら、1989を参照せよ）。同様に、無傷の組織は、マジックアングルスピニング1HNMRスペクトルを用いて、首尾よく解析される（例えば、Mokaら、1998；Tomlinsら、1998を参照せよ）。
【００１９】
生物流体のNMRスペクトルは、生物流体の由来となる生物の代謝のフィンガープリントおよびプロフィールを与えてくれる。こうした代謝のフィンガープリントやプロフィールは、特徴として、病気、毒性過程、あるいは遺伝子改変によって変化する。例えば、NMRスペクトルは、一つまたはそれ以上の生体異物に対して別個にあるいは組み合わせて、また、健康な動物（比較参照）と病気の動物、あるいは未改変の動物（比較参照）と遺伝子改変動物に対して、投与前および投与後の様々な時間に、生物の様々な状態について集めることができる。
【００２０】
例えば、薬についての望ましくない有毒な副作用の評価において、各化合物あるいは同類の化合物により、毒性過程の部位及び基礎的機構に関する情報を与えてくれる生物流体における内因性代謝産物の濃度及びパターンに特徴的な変化が生じる。生物流体の1HNMR解析により、実験ラットにおける器官特異的毒性の新規代謝マーカーがうまく発見され、こうした「調査的」役割において、解析的生物化学技術としてのNMRは勝っている。しかしながら、多くの経路を表現している何百もの化合物がしばしば同時に測定され得るので、生物流体のNMRスペクトルでのバイオマーカーの情報は非常に微妙であり、この毒性傷害に対する全体的なメタボノミクス的反応が損傷をうまく特徴づけている。
【００２１】
全ての生物学的流体及び組織は、それ自身に特有の物理化学的性質を有しており、かかる性質が、有効に用いられるNMR実験のタイプに影響する。複雑な生物学的混合物を研究するためにNMRスペクトルを使う一つの主な利点は、最小の試料の調合（通常、5−10％のD2Oを加えるのみ）でしばしば測定が可能であり、生物学的試料全体について詳細な解析的プロフィールを得ることが可能であることである。試料の体積は小さく、標準プローブに対しては典型的には0.3から0.5 mL、マイクロプローブに対してはわずか3μLである。簡単なNMRスペクトルを取得することは、フローインジェクション技術を使うと早くて効率が良い。水のNMR共鳴を抑止することが常に必要である。
【００２２】
多くの生物流体は化学的に安定ではなく、こうした理由から、その収集及び貯蔵には注意が必要である。例えば、赤血球における細胞の溶解は容易に起こり得る。もし十分な量のD2Oが加えられたら、ある1HNMR共鳴がH/D交換により消失することもあり得る。生物流体試料の凍結乾燥によりアセトンのような揮発成分が失われることもある。生物流体は微生物汚染される傾向がある。特に尿のような殺菌した条件下で収集するのが困難な流体はそうである。多くの生物流体は、正常であるにせよ病気の状態かあるいは器官の損傷が原因であるにせよ、かなりの量の活性酵素を含み、多くの酵素は採取後の生物流体の組成を変えるかもしれない。こうした汚染の影響を最小にするために、試料は十分に凍結して保存すべきである。通常、抗微生物剤として作用するように尿の収集時にアジ化ナトリウムを加える。内因性の金属イオン（例えば、Ca2+、Mg2+、及びZn2+）やキレート剤（例えば、特にグルタミン酸塩、システイン、ヒスチジン、及びアスパラギン酸塩のような遊離のアミノ酸及びクエン酸塩）に結合させるために、金属イオンやキレート剤（例えば、EDTA）を加えると、NMRスペクトルが変更される及び／又は増強される。
【００２３】
全ての場合、解析の問題には、通常、潜在的に干渉される非常に複雑なマトリックス中での「微量」の検体の検出が含まれる。それ故、生物流体あるいは組織であり得る特定の生物マトリックス中での特定の類の興味ある検体に対して、適切な解析技術を選択することが重要である。高分解能NMRスペクトル（特に1H NMR）が特に適切であるように思われる。この分野で1H NMRスペクトルを使う主な利点は、方法の速度（5分から10分でスペクトルが得られる）と、要求される試料が最小であることと、以上代謝産物がNMR実験の検出限界以上存在しかつ非交換性水素原子を含むことのみを条件として、その構造タイプとは無関係に生物流体における全ての異常代謝産物に対して非選択的検出器となることとにある。患者の臨床状態が迅速な診断を必要とする可能性があり、さらにその状態が非常に急速に変化する可能性があり、それに対応して施される治療に迅速な変化がなされなければならないような作業分野においては、この速度の利点がきわめて重要である。
【００２４】
体液のNMRの研究は、理想的には、最大の分散と感度を得るのに利用できる最も強い磁場で行うべきであり、たいていの1H NMRの研究は、400 MHzかそれ以上で行われている。入手できる分光計の周波数が新しく増えるごとに、生物流体において分解できる共鳴の数も増え、このことはいくつかの帰属の問題を解決しなければならないという影響を与えるが、また新しい問題も引き起こされる。さらに、血漿や胆汁のような生物流体に存在する組織化されたマクロ分子の領域での小さな分子の区分及び結合に起因して生じるスペクトル解釈の重要な問題がまだある。全てのこうした複雑さにより、診断能力及び技術の潜在性が減縮される必要はないが、生物学的変動の問題及び診断の確実さに対する変動の影響が明らかとなる。
【００２５】
生物流体のスペクトルの情報量は非常に多く、たいていの生物流体の1H NMRスペクトルの完全な帰属は通常は不可能である（市販されている最も高い周波数の900 MHzのNMRスペクトルを用いてすらそうである）。しかしながら、帰属の問題は、生物流体のタイプによりかなり変わる。ある流体ではほぼ一定の組成及び濃度を有し、これらにおいては、NMRシグナルの大多数は帰属される。これに対して、尿の組成は非常に変動しやすく、NMRで検出可能な代謝産物の濃度の範囲が非常に変動する。その結果、完全な解析はずっと難しくなる。一次元（1D）NMRスペクトルの検出限界（多くの代謝産物では800 MHzでおよそ100 nM）に近い量で存在するこれらの代謝産物は、NMRスペクトルの帰属の深刻な問題を引き起こす。（完全な用語としては、検出限界はおよそ4 nmolであり、例えば、0.5mLの試料体積において、250 g/molの化合物が1μgである。）NMRの現在の技術水準においてさえも、感度、線幅、分散及びダイナミックレンジの問題のため、例えば、体液中のホルモン、タンパク質、あるいは核酸のような多くの重要な生物化学的物質を検出することはまだ可能ではなく、この分野の研究は、技術によって制約を受け続けている。それに加え、生物流体のNMRスペクトルを収集することは、相対的な水の強度、試料の粘度、タンパク質の量、脂質の量、低分子量のピークの重なりによって複雑となり得る。
【００２６】
通常、1H NMRスペクトルを帰属するためには、本物の材料のスペクトルとの比較がなされるか及び／又は試料に本物の参照となる規準を標準量加えることにより比較がなされる。さらに帰属を確認するためには、通常、例えば、二次元（2D）NMR法、とりわけCOZY（相関スペクトル）、TOCSY（全相関スペクトル）、またHMBC（ヘテロ核多重結合相関）、HSQC（ヘテロ核単一量子コヒーレンス）及びHMQC（ヘテロ核多重量子コヒーレンス）のような逆検出へテロ核相関法、2D J−分解（JRES）法、スピンエコー法、緩和エディティング、拡散エディティング（1D NMR及び拡散編集されたTOCSYのような2D NMRを含む）、及び多重量子フィルターリングを含む他のNMR法の適用が求められる。生物流体において見出される広い範囲の代謝産物及び生体分子に対する詳細な1H NMRスペクトルデータは出版されており（例えば、Lindonら、1999を参照せよ）、補足的情報は、データを編集したいくつかの文献から入手できる（例えば、Fan、1996； Szeら、1994を参照せよ）。
【００２７】
例えば、様々な代謝病や毒性過程を研究するために、生物流体に1H NMRスペクトルをうまく応用することは、現在ではよく確立されており、器官特異的毒性に対する多くの新規な代謝マーカーが見出されている（例えば、Nicholsonら、1989； Lindonら、1999を参照せよ）。例えば、尿のNMRスペクトルは、損傷が腎臓か肝臓に起こっている状況において、識別可能であるように変更される。毒物損傷の場所となる器官を区別する特異的な識別可能な変化が観察できることが示されている。腎臓の皮質のような器官の特定の部分に焦点を絞ることも可能であり、都合の良い場合は、皮質のまさに局部的な部分に焦点を絞ることさえ可能である。最終的には、尿における変化の生物化学的解釈に基づき、生体異物の毒性の生物化学的機構を推論することが可能である。主に腎臓毒素、肝臓毒素ばかりでなく、精巣毒素、ミトコンドリア毒素、筋肉毒素を含めた広い範囲の毒素が調査されている。
【００２８】
しかしながら、組織や生物流体の一次元及び二次元NMRスペクトルからの生化学的情報を理解する上で限界となる因子は、その複雑さである。こうした複雑な多変数のデータを調査する最も効率の良い方法は、コンピューターベースの「パターン認識」（PR）法及びエキスパートシステムと組み合わせて、1D及び2DのNMRのメタボノミクス的アプローチを用いることである。これらの統計的手段は、現在、ゲノム学やプロテオーム学の分野で仕事をしている人により探索されているものに似ている。
【００２９】
パターン認識（PR）とはデータ解析の方法に適用される一般用語であり、多くのパラメーターを数学的に減らすことにより、試験仮説ばかりでなく科学的仮説を生み出すのに使うことができる。
【００３０】
PR法は、「監視されたもの」と「監視されていないもの」に都合良く分類される。監視されていない方法は、例えば、生体異物の個性や性質、あるいはその作用の様式にかかわらず、その他の独立した知識を参照せずデータを解析するのに使われる。
【００３１】
監視されていないパターン認識の方法の例としては、主成分解析（PCA）、階層的クラスター解析（HCA）、及び非線形マッピング（NLM）が含まれる。
【００３２】
最も有用で容易に適用できる監視されていないPR技術の一つは、主成分解析（PCA）である（例えば、Sharaf、1986を参照せよ）。主成分（PCs）とは、スタートになる変数と適切な重量係数との線形結合から生み出される新しい変数である。これらPCsの性質は、次のようになる。（i）それぞれのPCは全ての他のPCsに直交する（相関がない）。（ii）第一のPCがデータセット（情報量）の分散(variance)の最大の部分を含み、それに続くPCsはそれ相応のよりわずかな量の分散を含む。
【００３３】
データ行列Xは、それぞれ試料を規定する行と、それぞれ特定スペクトル記述子を定義する列とからなり、X=TLt（ここでtは転置を表す）であるようなスコア行列(scores matrix)Tとローディング行列(loadings matrix)Lから成るとみなすことができる。共分散行列Cはデータ行列Xから計算される。共分散行列の固有値及び固有ベクトルは、対角化により決定される。固有値ベクトルのプロット（主成分PCs）における座標は、「スコア」と表し、スコア行列Tを含む。固有ベクトルの係数は、「ローディング」と表し、ローディング行列Lを含み、PCsに対し記述子として寄与する。
【００３４】
従って、情報量からみると、最初の二つまたは三つのPCスコアのプロットにより、それぞれ、二次元または三次元におけるデータセットの「最も良い」表現が得られる。最初の二つの主成分のスコアPC1、PC2のプロットは、しばしば「スコアプロット」と呼ばれ、二次元におけるデータの最大の情報量を与える。このようなPCマップは、毒性機構に基づき各器官に作用する薬及び毒素に対する固有のクラスター化挙動を視覚化するために使うことができる。もちろん、クラスター化情報はより低級のPCsにあるかもしれないが、これらも調査される。
【００３５】
この簡単なメタボノミクス的アプローチにおいては、未知の毒性を有する化合物で処理された動物由来の試料を、対照の動物及び毒素で処理した動物から得た、NMR生成代謝データのデータベースと比較する。既知の作用を有する試料と比較したPRマップ上のその位置を観測することにより、未知の毒素をしばしば分類できる。しかしながら、時間に関連する損傷の発達及びNMRで検出される生化学的性質における会合シフト(associated shift)により、毒物学的データはしばしばもっと複雑である。元来のn次元のNMRメタボノミクス空間において生体異物の影響を比較することも、いっそう厳しい。
【００３６】
もうひとつの監視されていないパターン認識の方法である階層的クラスター解析により、例えば、NMRスペクトルにおける特定の帰属されたピークに対するシグナルの強度のようなNMR記述子により定義される座標を有するある多次元空間において、お互いに「近い」ことにより類似しているデータポイントのグループ化が可能になる。「類似行列」Sは要素sij=1-rij/rijmaxから構成される。ここで、rijは点iと点jの間の点間距離（例えば、ユークリッド点間距離）であり、rijmaxは全ての点の中の最大点間距離である。最も遠く離れた点の組は、rijがrijmaxに等しくなるので０に等しいsijを有する。逆に最も近い点の組は、１に近い最大のsijを有する。
【００３７】
類似行列は、最も近い点の組に対して走査される。点の組はそれらの間隔で報告され、そして二つの点は消去され、単一の結合点により置き換えられる。このプロセスが反復して繰り返され、最後にただ一つの点が残る。最隣接法（単一連結法としても知られる）、最遠隔法、重心法（重心連結、増分連結、中央値連結、群平均連結、及び柔軟連結変動を含む）を含めた数々の異なった方法が、クラスターがどのように結合するかを決定するのに使われる。
【００３８】
報告された連結性は、それから樹形図（クラスター化の視覚化を可能にする木のような図）としてプロットされ、樹形図は試料−試料連結性対間隔の増加（あるいは同等に、対類似性減少）で示される。樹形図は、様々なクラスター間の距離に比例した枝の長さを有するという性質があり、それ故、一つの試料を次の試料に連結する枝の長さは、その類似性の尺度となっている。このようにして、類似のデータポイントは、アルゴリズム的に識別される。
【００３９】
非線形マッピング（NLM）は、元来の多次元空間における全ての点の間の距離の計算を含む。これに続いて、試料点がランダムな位置かあるいは先の主成分解析により決定された値に置かれた二次元または三次元における点のマップが構築される。最小二乗法の規準が、低次元のマップにおける試料点を動かすのに使われ、低次元空間における点間距離が高次元空間における点間距離に適合する。それ故、非線形マッピングは、真の点間距離に対する近似であるが、元来の多次元空間において近い点は、二次元あるいは三次元空間においても近い（例えば、Brownら、1996；Farrantら、1992を参照せよ）。
【００４０】
これに代わる方法として、自動分類方法を開発するために、NMRデータの解析に対して「監視された」アプローチを用いることが効率的であることが証明されている。ここで、NMRのメタボノミクス的データの「トレーニングセット」は、各試料の「クラス」を正しく予想する統計的モデルを構築するのに使われる。そして、このトレーニングセットは、コンピューターをベースとしたモデルの信頼性を決定するために、独立したデータ（「テストセット」）を用いてテストされる。こうしたモデルは、時々「エキスパートシステム」と呼ばれるが、異なった数学的手順の範囲に基づくものである。監視された方法では、次元を減らしたデータセット（例えば、最初のいくつかの主成分）を使うことができるが、典型的には、完全な次元の減らされていないデータを使う。全ての場合、こうした方法により、例えば、代謝の影響からみた生体異物のそれぞれのクラスなどを特徴づけ、分離する多変量境界を定量的に記述することが可能となる。例えば、適合の良さに置かれるべき確率の水準など任意の予想に対して、信頼限界を得ることが可能である（例えば、Sharaf、1986を参照せよ）。予想モデルの信頼性は、解析から選択された試料を省き、クロス確認を用いることによってもチェックできる。
【００４１】
エキスパートシステムは、様々な有用な出力を生み出すために作用する。例えば、（i）「正常」か「異常」かの試料の分類（これは連続フローインジェクションNMRスペクトルを用いた分光計の自動化の制御おいて有用な手段である）、（ii）ある場合には毒物作用の機構も分類されるが、毒物に対する標的器官と組織内の作用の場所の分類、（iii）病理学的病態あるいは研究中の特定の化合物についての毒性作用のバイオマーカーの識別などである。例えば、試料は単一の毒性のクラスに属する、多数の毒性のクラスに属する（標的器官が一つ以上）、あるいはどのクラスにも属さない、に分類される。後者の場合には、トレーニングセットモデルに基づき正常性（比較参照）からの逸脱していることが示されるが、トレーニングセットでモデル化された毒性の類と異なる代謝の影響を有している（未知の毒性タイプ）。（ii）の下では、毒性よりもむしろ臨床医学（例えば、薬の効き目）における決定を支持するためにシステムが作製され得る。
【００４２】
監視されたパターン認識法の例としては、以下のものが含まれるが、以下に簡潔に記述するにとどめる。類解析の柔軟独立モデル（SIMCA）（例えば、Wold、1976を参照せよ）、部分最小二乗解析（例えば、Wold、1966；Joreskog、1982；Frank、1984を参照せよ）、線形ディスクリミナント解析（LDA）（例えば、Nilson、1965を参照せよ）、K−近接解析（KNN）（例えば、Brownら、1996を参照せよ）、人口神経ネットワーク（ANN）（例えば、Wasserman、1989；Ankerら、1992；Hare、1994を参照せよ）、確率的神経ネットワーク（PNNs）（例えば、Parzen、1962；Bishop、1995；Speckt、1990；Broomheadら、1988；Patterson、1996を参照せよ）、規則帰納法（例えば、Quinlan、1986を参照せよ）、及びBayesian法（例えば、Bretthorst、1990を参照せよ）。
【００４３】
NMR試料の迅速な処理能力（第一世代のフローインジェクションシステムでは、一日あたり、一分光計あたり300以上の試料）が改善されるにつれて、メタボノミクスデータベースの大きさも増しているので、例えば、判断の境界における柔軟性が増すことが可能な「ファジーな論理」のような技術を用いたより微妙なエキスパートシステムが必要になっている。
【００４４】
パターン認識法は、例えば、複雑なNMRデータを含めたメタボノミクスデータの解析に適用されており、いくらか成功している（例えば、Anthonyら、1994；Anthonyら、1995；Beckwith-Hallら、1998；Gartlandら、1990a；Gartlandら、1990b；Gartlandら、1991；Holmesら、1998a；Holmesら、1998b；Holmesら、1992；Holmesら、1994；Spraulら、1994；Tranterら、1999を参照せよ）。
【００４５】
メタボノミクス法の有用性は十分確立されているが、解析方法の改良に対する要求は強く残っている。代謝変動はしばしば微妙であり、特にデータ（例えば、NMRスペクトル）が非常に複雑なときは、特定のアナライトの検出のために強力な解析方法が要求される。
【００４６】
本発明の一つの目的は、メタボノミクス法の一部として、そのような代謝変動を検出するためのデータ解析方法を提供することである。
【発明の開示】
【００４７】
本発明の一つの側面は、例えば、核磁気共鳴（NMR）やその他のタイプのスペクトルのような化学的、生物化学的及び生物学的データの解析のための改良方法に関する。
【００４８】
本発明の一つの態様は、試料スペクトルの処理方法であって、
前記試料スペクトルにおける一以上の標的領域をそれぞれ主参照スペクトル(master control spectrum)における対応する交換領域(replacement region)で置き換えることによって標的が置換された試料スペクトル(標的置換試料スペクトルという)を得る工程を含み、ここで、前記交換領域は、前記標的置換試料スペクトルにおける全積分強度に占める前記交換領域の割合(fraction)が、前記主参照スペクトルにおける全積分強度に占める前記交換領域の割合と同じになるように倍率変更されている(倍率がかけられている、scaled)ことを特徴とする方法に関する。
【００４９】
本発明の一つの実施形態は、試験試料についての試料スペクトルの処理方法であって、
（a）前記試料スペクトルにおいて、交換のための一以上の標的領域を同定する工程、
（b）前記標的領域のそれぞれに対応する一つの交換領域を含む主参照スペクトルを提供する工程、および
（c）前記標的領域それぞれを対応する交換領域で置き換えることによって標的置換試料スペクトルを得る工程
を含み、ここで、前記交換領域は、前記標的置換試料スペクトルにおける全積分強度に占める前記交換領域の割合が、前記主参照スペクトルにおける全積分強度に占める前記交換領域の割合と同じになるように倍率変更されていることを特徴とする方法に関する。
【００５０】
本発明の一つの実施形態においては、本発明の方法には、
（d）前記標的置換試料スペクトルを規格化する(normalizing)ことによって規格化された標的置換試料スペクトルを得る後工程がさらに含まれる。
【００５１】
本発明の一つの実施形態は、試験試料についての試料NMRスペクトルの処理方法であって
（a）前記試料NMRスペクトルにおいて、交換のための一以上の標的領域を同定する工程、ここで、前記標的領域は、それぞれ化学シフト範囲で定義され、
（b）前記標的領域のそれぞれに対応する一つの交換領域を含む主参照NMRスペクトルを提供する工程、ここで、標的領域とそれに対応する交換領域は、同じ化学シフト範囲で定義され、
（c）前記標的領域それぞれを対応する交換領域で置き換えることによって標的置換試料NMRスペクトルを得る工程
を含み、ここで、前記交換領域は、前記標的置換試料スペクトルにおける全積分強度に占める前記交換領域の割合が、前記主参照スペクトルにおける全積分強度に占める前記交換領域の割合と同じになるように倍率変更されていることを特徴とする方法に関する。
【００５２】
本発明の一つの実施形態においては、本発明の方法は、
（d）前記標的置換試料NMRスペクトルを規格化することによって規格化された標的置換試料NMRスペクトルを得る後工程をさらに含む。
【００５３】
本発明の一つの実施形態においては、前記置換工程（c）において、前記標的領域がそれぞれ対応する交換領域で置換されるとによって標的置換試料スペクトルを得るに際し、前記交換領域が、次式：
【数１】
2004526130.tif 000003
（式中、
IYは試料スペクトルの全積分強度であり、
IY,Tkは標的領域の積分強度であり、
ICMは主参照スペクトルの全積分強度であり、
ICM,Rkは交換領域の積分強度であり、
kは1〜ntの範囲であり、
ntは標的領域の数である。）
で与えられる係数(factor)fを掛けることで倍率変更されている。
【００５４】
本発明の別の態様は、本発明の方法により処理された試料スペクトルに関する。
【００５５】
本発明の別の態様は、複数の試料スペクトルの処理方法であって、本発明の方法により前記試料スペクトルをそれぞれ処理することを含む方法に関する。
【００５６】
本発明の別の態様は、適用された刺激の解析方法であって、
（a）前記刺激を受けた一以上の生物それぞれに由来する一以上の試料それぞれについての一以上の試料スペクトルを提供する工程、
（b）前記刺激を受けていない一以上の生物それぞれに由来する一以上の試料それぞれについての一以上の参照スペクトルから導き出される主参照スペクトルを提供する工程、
（c）請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法を用いて、前記試料スペクトルをそれぞれ処理する工程
を含む方法に関する。
【００５７】
一つの好ましい実施形態においては、適用された刺激は生体異物(xenobiotic)である。一つの好ましい実施形態においては、適用された刺激は病態(disease state)である。一つの好ましい実施形態においては、適用された刺激は遺伝子改変である。
【００５８】
本発明の別の態様は、本明細書に記載したような適用された刺激の解析方法を含む、適用された刺激に対するバイオマーカーまたはバイオマーカーの組み合わせの同定方法に関する。
【００５９】
本発明の別の態様は、そのような方法により同定されたバイオマーカーまたはバイオマーカーの組み合わせに関する。
【００６０】
本発明の別の態様は、そのような方法により同定されたバイオマーカーを用いた、適用された刺激の診断方法に関する。
【００６１】
本発明の別の態様は、このような方法により同定されたバイオマーカーを用いるアッセイに関する。
【００６２】
本発明の別の態様は、本明細書で記載したような適用された刺激の解析方法を含む、適用された刺激の分類方法に関する。
【００６３】
本発明の別の態様は、本明細書で記載したような適用された刺激の解析方法を含む、適用された刺激の診断方法に関する。
【００６４】
本発明の別の態様は、本明細書で記載したような受けた刺激の解析方法を含む、治療を受けている被検体の治療モニタリング方法に関する。
【００６５】
本発明の別の態様は、本明細書で記載したような受けた刺激の解析方法を含む、薬物療法及び／又は薬物の有効性の評価方法に関する。
【００６６】
本発明の別の態様は、本明細書で記載したような適用された刺激の解析方法を含む、薬物の毒性副作用の検出方法に関する。
【００６７】
本発明の別の態様は、本明細書で記載したような適用された刺激の解析方法を含む、過剰摂取の薬物を特徴づける及び／又は同定する方法に関する。
【００６８】
一つの好ましい実施形態においては、スペクトルはNMRスペクトルである。
【００６９】
本発明の別の態様は、本発明の方法を実行するために動作可能なように設定されたコンピューターシステムに関する。
【００７０】
本発明の別の態様は、本発明の方法を実行するのに適切なコンピューターコードに関する。
【００７１】
本発明の別の側面は、適切なコンピューターシステム上で本発明の方法を実行するのに適切なコンピューターコードを保持するデータキャリアに関する。
【００７２】
当業者により認識されるように、本発明の一つの態様の特徴及び好ましい実施形態は、本発明の別の態様にも関連する。
【００７３】
発明の詳細な説明
本発明は、一般にケモメトリクス、メタボノミクスの分野に関するものであり、より詳しくは、特にスペクトルのような生物学的データの解析方法に関する。
【００７４】
生物学的データ
本発明の方法は、例えば、スペクトル、特に、化学的及び生物化学的（即ち、分子）研究において有用なタイプの分光学及び分光計を用いて生み出されたスペクトルのような化学的、生物化学的、及び生物学的データに適用できる。
【００７５】
本明細書に記載した方法により、スペクトルデータのより強力な解析が容易になる。例えば、本発明の方法により、固有でない(non-specific)及び／又は無関係なスペクトルのバックグラウンドから生じる興味ある事象に関連したスペクトル変化の同定が可能になる。
【００７６】
生物の研究に関して、興味ある事象とは、例えば、適用された刺激である。ここで使われる「適用された刺激」という用語は、研究下にある刺激に関するものであり、研究下の生物に適用されるか、あるいは存在し、対照生物には適用されず、また存在しない刺激である。適用された刺激の例としては、以下に限定されないが、生体異物、病態、及び遺伝子改変が含まれる。
【００７７】
ここで使われる「生体異物」という用語は、生物に投与される、あるいは生物がさらされる物質（例えば、化合物、組成物）に関するものである。一般に生体異物とは通常、生物に存在しないか、あるいは、通常、生物に存在するが、投与後に得られるレベルでは存在しない化学的、生物化学的、あるいは生物学的な分子である。生体異物の例としては、薬物、調合された薬及びその成分、農薬、除草剤、食物に存在する物質（例えば、動物に投与される工場化合物）、及び環境に存在する物質が挙げられる。
【００７８】
ここで使われる「病態」という用語は、生物の正常な健康な状態からの逸脱に関するものである。病態の例としては、バクテリア、ウイルス、寄生虫による感染、あらゆる形態の癌、変性疾患（例えば、関節炎、多発性硬化症）、外傷（例えば、損傷の結果として）、器官不全（糖尿病など）、心血管疾患（例えば、アテローム性動脈硬化、血栓症）、及び遺伝子組成により引き起こされる遺伝性疾患（例えば、鎌状細胞貧血）が挙げられる。
【００７９】
ここで使われる「遺伝子改変」という用語は、生物の遺伝子組成(genetic composition)の変更に関するものである。遺伝子改変の例としては、ある生物に別の種から遺伝子を組み込むこと、生物に存在する遺伝子のコピーの数を増やすこと、生物から遺伝子を取り除くこと、生物における遺伝子を非機能的にすることが含まれる。
【００８０】
本発明の方法の適用に適切なスペクトルを与える分光学のタイプの例としては、以下に限定されないが、例えば、マイクロ波分光学、遠赤外分光学、赤外分光学、Raman及び共鳴Raman分光学、可視分光学、紫外分光学、遠紫外（あるいは真空紫外）分光学、X線分光学、旋光分散、円偏光二色性（例えば、紫外、可視、及び赤外）、メスバウアー(Mossbauer)分光学、原子吸収及び発光分光学、紫外蛍光及び燐光分光学、核磁気共鳴（NMR）、電子常磁性共鳴（EPR）、MRI（磁気共鳴イメージング）を含む磁気共鳴を含む全ての領域での電磁気スペクトル；イオン化法のバリエーション、電子インパクト、化学イオン化、熱スプレー、電子スプレー、マトリックスの助けを借りたレーザー脱離イオン化（MALDI）、誘導結合プラズマを含む質量分光分析；セクター検出、四極子検出、イオントラップ、飛行時間、及びフーリエ変換を含む検出法が挙げられる。
【００８１】
特に好ましいクラスの分光学の一つが、核磁気共鳴（NMR）である。そのような方法の例としては、例えば、シングルパルス、水ピーク飽和、CMPG（即ち、核スピン緩和時間に基づいて修正）のようなスピンエコー、拡散修正(diffusion-edited)などの一次元スペクトル；J分解（JRES）、NOESY、COZY、TOCSY及びその変形のような1H-1H相関法、1Hをヘテロ核（例えば、13C、15N、19F及び31Pを含む）に相関させる方法、HETCORのような直接検出法、1H-13CHMQC、HSQC、HMBCのようなのような逆検出法のような二次元スペクトル；多くの変形を含み、例えば、HMQC-TOCSY、NOESY-TOCSYのような二次元法の組み合わせである三次元スペクトルを含む一次元、二次元、及び三次元NMRが含まれる。これらのNMR分光学の技術は全て、異方性組成により特徴づけられる組織や栄養素のような等方性液体以外の試料を研究するために、マジック角回転と組み合わせることができる。
【００８２】
異なったタイプの二つあるいはそれ以上のスペクトルから形成される複合スペクトルも用いられる。
【００８３】
本発明の方法は、研究下にある特定の試料について獲得したあるいは記録したスペクトルに適用される。試料は特定のタイプの分光学と相性が良ければ任意の形態でよく、それ故、必要に応じて、気体、液体、液晶、ゲル、あるいは固体の中の一つかあるいはその組み合わせを含み、生物学的起源を有する試料を含む均一あるいは不均一なものであってよい。
【００８４】
そのような試料の例としては、例えば、生物全体（生きていても、死んでいても、例えば、生きているヒト、細菌の培養物）、生物の一部（例えば、組織試料、器官、葉）、腫瘍のような病理学的組織、組織ホモジェネート（例えば、肝臓のミクロソームの断片）、生物あるいは生物の一部から作られた抽出物（過塩素酸抽出物のような組織試料抽出物）、生物あるいは生物の一部から作られた浸剤（例えば、紅茶、中国の伝統的ハーブ薬）、スフェロイドのようなin vitro組織、特定の細胞型の懸濁液（例えば、肝細胞）、生物からの排泄物、分泌物、あるいは放出物（特に流体）、投与され回収される物質（例えば、透析流体、肺吸引流体）、病理学の機能として発達する物質（例えば、嚢胞、水疱）、細胞培養の上清のような生物起源のものが挙げられる。
【００８５】
流体試料の例としては、例えば、尿、（胆嚢）胆汁、血漿、全血、脳脊髄液、乳、唾液、粘液、汗、胃液、膵液、精液、前立腺液、精嚢液、精漿、羊水、胎水、卵胞液、滑液、房水、腹水、嚢胞液、疱疹液、ならびに細胞懸濁液及びそのの抽出物が挙げられる。
【００８６】
組織試料の例としては、肝臓、腎臓、前立腺、脳、消化管、血液、骨格筋、心筋、リンパ系、骨、軟骨、及び再生性組織が挙げられる。
【００８７】
その他の試料の例としては、空気（例えば、排気）、空気の凝縮液あるいは抽出物、水（例えば、海水、地下水、例えば工場からの廃水）、食品産業からの液体（例えば、ジュース、ワイン、ビール、その他のアルコール飲料、紅茶、牛乳）、固形状の食品試料（例えば、チョコレート、ペースト、フルーツの皮、バナナのような果物や野菜の身、葉、料理されたあるいは生の肉等）が挙げられる。
【００８８】
試料は、例えば、上述したような流体の濃縮物のようなものでもよい。
【００８９】
生物である試料、あるいは生物から引き出される試料については、生物は一般には原核生物（例えば、細菌）かあるいは真核生物（例えば、原生生物、菌類、植物、動物）である。
【００９０】
生物は藻や原生動物であってもよい。
【００９１】
生物は、植物、被子植物、双子葉植物、単子葉植物、裸子植物、針葉樹、イチョウ、ソテツ、シダ、ツクシ、ヒカゲノカズラ科シダ、ゼニゴケ、あるいはコケであってもよい。
【００９２】
生物は、脊索動物、無脊椎動物、刺皮動物（例えば、ヒトデ、キタムラサキウニ、クモヒトデ）、節足動物、環形動物（体節に分かれた虫）（例えば、ミミズ、ゴカイ、ヒル）、軟体動物（例えば、イカ、タコのような頭足動物）、斧足類動物（例えば、カキ、ムール貝、ハマグリ）、腹足動物（例えば、カタツムリ、ナメクジ）、線虫類（回虫）、扁形動物（渦虫）（例えば、プラナリア、吸虫、サナダムシ）、刺胞動物（例えば、クラゲ、イソギンチャク、サンゴ）、あるいは海綿動物（例えば、海綿）であってもよい。
【００９３】
生物は、節足動物、昆虫（例えば、カブト虫、チョウ、ガ）、唇脚類節足動物（ムカデ類）、倍脚類（ヤスデ）、甲殻類（例えば、エビ、カニ、ロブスター）、あるいはクモ形類動物（例えば、クモ、サソリ、ダニ）であってもよい。
【００９４】
生物は、脊索動物、脊椎動物、哺乳類、鳥類、爬虫類（例えば、ヘビ、トカゲ、ワニ）、両生類（例えば、カエル、ヒキガエル）、小骨の多い魚類（例えば、サケ、ツノガレイ、ウナギ、肺魚）、軟骨魚類（例えば、サメ、エイ）、あるいは下顎のない魚類（例えば、ヤツメウナギ、メクラウナギ）であってもよい。
【００９５】
生物は、哺乳類、胎盤哺乳類、有袋類（例えば、カンガルー、ウオンバット）、単孔類（例えば、カモノハシ）、げっ歯類（例えば、テンジクネズミ、ハムスター、ラット、ネズミ）、ネズミ科（例えば、ネズミ）、鳥類（例えば、鳥）、犬科（例えば、犬）、猫科（例えば、猫）、馬科（例えば、馬）、豚科（例えば、豚）、羊科（例えば、羊）、牛科（例えば、牛）、霊長類、類人猿（例えば、サル、類人猿）、サル（例えば、マーモセット、ヒヒ）、類人猿（例えば、ゴリラ、チンパンジー、オラウータン、テナガザル）、あるいはヒトであってよい。
【００９６】
さらに、生物は、いかなる形態であってもよく、例えば、胞子、種子、卵、幼虫、さなぎ、あるいは胎児であってもよい。
【００９７】
スペクトル交換
スペクトルはしばしば、それに続く解析の威力及び／又は正確さを妨害する及び／又は減少させる特徴（例えば、ピーク、ノイズスパイク、ベースラインの人為的影響など）を有する。これらの特徴のいくつかは、特定のタイプのスペクトルの人為的影響、スペクトルの取得の方法、外因性不純物等である。しかしながら、よりしばしば、これらのスペクトルの特徴は、研究下の試料に偶発的でなくまた意図的でなく存在する化学種である。それに続くスペクトルの解析の威力と効率を改善するためには、そのような種と関連するスペクトルのそれらの部分を同定し、適切に処理することが有益である。さらに、意図的にではなく導入されたスペクトルの特徴を、同定し、適切に処理する必要がある。
【００９８】
例えば、メタボノミクス的研究において、研究中の生物から得た試料が多数の代謝産物のスペクトル的証拠を示すことがあるが、そのうちのいくつかは、適用された刺激についての有益な情報をほとんどあるいは全く与えず、それに続くデータ解析を妨害する。例えば、薬物やその代謝産物に帰属するスペクトルのピークは、しばしば、投薬された生物のメタボノミクス的記述を支配するが、その同定及びレベルの重要性は、時々、第二義的である。
【００９９】
一般に、代謝産物は三つのクラスのどれか一つに分類される：
(A) そのレベルが適用される刺激によってかなり変化する内因性代謝産物。このタイプの単一の代謝産物は、典型的には、バイオマーカーと呼ばれる。いくつかのまたはもっと多くの代謝産物のレベルが変化する（増えるか減るかのどちらか）ようなさらに複雑な場合には、代謝産物群はバイオマーカーの組み合わせと呼ばれる。例えば、尿中でクレアチンレベルとともにタウリンが増えることは、肝臓の損傷に対する一般的マーカーとなる。もっと複雑な例としては、腎臓に近い細管のS3部分における損傷を引き起こす毒素は、尿中のグルコース、アミノ酸、及び有機酸を増やし、トリカルボン酸サイクルの中間体を減らす。
【０１００】
(B) そのレベルが適用される刺激に影響されない内因性代謝産物。
【０１０１】
(C) 試料に出現し、生体異物自体あるいはその代謝産物から生じる代謝産物。例えば、パラセタモールは、尿中では主としてパラセタモール硫酸塩及びパラセタモールグルクロニドコンジュゲートとして見られる。いくつかの場合には、変化していないパラセタモールが見られることがある。もちろん、これらの代謝産物は、適用された刺激が生体異物を含む場合にのみ存在する。
【０１０２】
クラスBに分類される代謝産物及びクラスCに分類される多くのこれらの代謝産物、即ち、バイオマーカーでもバイオマーカー組み合わせでもないものは、ここでは「妨害シグナル」と総称され、これらは、しばしば、適用された刺激に対する生物の反応についての情報をほとんど与えず、その一方、刺激を受けた生物のメタボノミクス的記述を支配し、妨害する。
【０１０３】
特定の代謝産物があろうがなかろうが、あるいは特定の代謝産物の候補であろうがなかろうが、妨害シグナルは、研究中の適用された刺激に関する既知のデータからしばしば決定することができる。例えば、特定の化合物、または特定の下部構造を有する化合物の代謝に関する莫大な量の一般の知識がある。しばしば、妨害シグナル及びそれに関連したスペクトルの特徴は、熟練者により、目で容易に識別され得る。しかしながら、もし、容易に識別されない新しいスペクトルの特徴が観測されたら、これらの特徴のもとになる関連する化合物を分離し、例えば、液体クロマトグラフィーをNMRや質量分光分析と組み合わせるといった既知の方法を用いて特性決定することができる。
【０１０４】
いくつかの方法においては、これらの妨害シグナルに関連したスペクトル部分は削除される。しかしながら、いくつかの研究からのデータ（例えば、異なった生体異物、異なった病態を用いる等）を比較し、組み合わせると、このようなスペクトル部分は、組み合わせたデータセットにおける全てのスペクトルから効率的に消去される。消去された領域は、全スペクトル領域の大部分を包含し、スペクトルの組み合わされたセットの情報量がかなり減少し、それにより、次に適用されるパターン認識法の威力及び効率が低下する。
【０１０５】
いくつかの既知の方法においては、スペクトルの削除部分は、その削除されたスペクトルデータを例えばゼロ強度値で置き換える（「ゼロ充填」）、任意のあるいは予め決められた定数強度値で置き換える（「定数充填」）、ランダム強度値で置き換える（「ランダム充填」）、データセット全体から計算される平均強度値で置き換える（「平均充填」）、あるいは主成分解析に基づく強度値で置き換える（「主成分充填」）ことにより「充填される」。
【０１０６】
しかしながら、これらのスペクトル領域を単に消去する、あるいは消去して、その後、充填するよりもむしろ、これらのスペクトル領域を、意味のあるデータ、例えば、正常なあるいは対照となるスペクトル（例えば、生物の研究の場合、正常なあるいは対照となる生物に関するスペクトル）から得た対応する倍率変更したスペクトル領域で置き換える「スペクトル交換」法を用いることが望ましい。その後の規格化により、ある意味で妨害の特徴（例えば、ピーク）が含まれない場合にピーク強度がもつであろう値にピーク強度を倍率変更することで、データ内容がさらに改善され得る。
【０１０７】
それ故、上述したようなメタボノミクス的理由であるにせよ、他の理由であるにせよ、スペクトルは本明細書で記載したような「スペクトル交換」の追加的工程を経る。一般に、スペクトル交換は、特定のタイプのスペクトルに関連する通常の前処理（例えば、シグナル平均化、フーリエ変換、ベースライン補正など）も含めたスペクトルの取得後に行われるが、それに続く解析の前に行われる。
【０１０８】
本発明の一つの態様は、試料スペクトルにおける一以上の標的領域をそれぞれ対応する主参照スペクトルの交換領域で置き換えることによって、標的置換試料スペクトルを得ることを含む試料スペクトルの処理方法に関する。ここで、前記交換領域は、前記標的置換試料スペクトルにおける全積分強度に占める前記交換領域の割合が、前記主参照スペクトルにおける全積分強度に占める前記交換領域の割合と同じになるように倍率変更されている。
【０１０９】
従って、本発明の一つの実施形態は、試験試料についての試料スペクトルの処理方法に関し、この方法は、
(a) 前記試料スペクトルにおいて、交換のための一つまたはそれ以上の標的領域を同定する工程、
(b) 前記標的領域のそれぞれに対応する一つの交換領域を含む主参照スペクトルを提供する工程、および
(c) 前記標的領域をそれぞれ対応する交換領域で置き換えることによって標的置換試料スペクトルを得る工程
を含み、ここで、前記交換領域は、前記標的置換試料スペクトルにおける全積分強度に占める前記交換領域の割合が、前記主参照スペクトルにおける全積分強度に占める前記交換領域の割合と同じになるように倍率変更されている。
【０１１０】
好ましい実施例においては、本方法にはさらに、
(d) 前記標的置換試料スペクトルを規格化し、規格化された標的置換試料スペクトルを得る工程
が含まれる。
【０１１１】
本発明の別の実施形態は、試験試料についての試料NMRスペクトルの処理方法に関し、この方法は、
(a) 前記試料NMRスペクトルにおいて、交換のための一以上の標的領域を同定する工程、ここで、前記標的領域はそれぞれ化学シフト範囲により定義され、
(b) 前記標的領域それぞれに対応する一つの交換領域を含む主参照NMRスペクトルを提供する工程、ここで、標的領域とそれに対応する交換領域は、同じ化学シフト範囲により定義され、および
(c) 前記標的領域それぞれを対応する交換領域で置き換えることによって標的置換試料NMRスペクトルを得る工程、ここで、前記交換領域は、前記標的置換試料スペクトルにおける全積分強度に占める前記交換領域の割合が、前記主参照スペクトルにおける全積分強度に占める前記交換領域の割合と同じになるように倍率変更されている、
を含む。
【０１１２】
好ましい実施形態においては、この方法はさらに、
(d) 前記標的置換試料NMRスペクトルを規格化することによって、規格化された標的置換試料NMRスペクトルを得る工程、
を含む。
【０１１３】
それぞれの上記の方法において、工程（b）は工程（a）の前、あるいは後のどちらで行ってもよいことに注意されたい。
【０１１４】
ここで使われる「試料スペクトル」という用語は、研究中の試料から得られるスペクトルに関する。もし、いくつかの試料スペクトルがあれば、典型的にはそのような場合には、それぞれは別個に処理される。
【０１１５】
試料スペクトルは、程度の差こそあれ、試料の組成を表している。一般に、試料は、n次元の物体(object)として一般化され、そこでは、それぞれの軸あるいは次元に沿った座標は、個々の化学種あるいは生物化学種の濃度となっている。同様に、試料もそのスペクトルによってn次元の物体yとして表現することができ、そこでは、それぞれの軸あるいは次元に沿った座標（y1,y2,y3,・・・yi）は、それぞれのデータポイントでのスペクトル強度（あるいは同等のパラメーター）である。例えば、1D NMRスペクトルに対しては、y1、y2、y3はそれぞれ異なった化学シフトでのシグナル強度を表すことができる。単に統計的物体として扱われるので、この段階ではスペクトルの特徴（例えば、ピーク、特徴、ライン）を帰属させる必要はない。
【０１１６】
試料スペクトルセットYはny個の試料スペクトルから形成され、それぞれyi（ここでiは1からnyまで）と表記され、また、それぞれは記述子yij（ここでjは1から記述子の総数までの範囲である）を有する。それぞれの試料スペクトルiは、全積分強度IYiを有し、それは次式で与えられる。
【数２】
2004526130.tif 000004
上述したように、標的領域とは、試料スペクトルにおいて置換(交換)されるべき一以上のスペクトル領域である。試料スペクトルにおける一以上の標的領域はそれぞれ、主参照スペクトルの対応する適切に倍率変更された交換領域で置き換えられる。i番目の試料スペクトルの標的領域は、ti,kと表記される。ここでkは1からntまでであり、ntは標的領域数である。メタボノミクス的研究において、標的領域は、典型的には上述したように相関が低い代謝産物に関係する、あるいはこれを反映する。
【０１１７】
主参照スペクトルは単一のスペクトルであってよく、ここでは「参照スペクトル」と呼ぶが、より好ましくは、二つ以上の参照スペクトルから計算される平均スペクトルである。スペクトルが生物と関連する場合、主参照スペクトルは、対照(参照)となる生物からの単一スペクトルであってよく、ここでは「参照スペクトル」と呼ぶが、より好ましくは、二以上の参照スペクトルから計算される平均スペクトルである。参照スペクトルは、単一の対照生物から得てもよいが、より好ましくは、二以上の対照生物から得られる。生物の研究に関して、対照生物には、研究中の刺激は適用されない、あるいは存在しない。
【０１１８】
例えば、参照スペクトルのセットCは、nc個の参照スペクトルから形成することができ、それぞれciと表記され、記述子cijを有し、ここでjは1〜記述子の数の間である。主参照スペクトルcMは記述子cMjを有し、次式で計算される。
【数３】
2004526130.tif 000005
主参照スペクトルは全積分強度ICMを有し、それは次式で与えられる。
【数４】
2004526130.tif 000006
主参照NMRスペクトルは、標的領域のそれぞれに対応する一つの交換領域を含む。ここで使われる「交換領域」という用語は、試料スペクトルの標的領域に対応する主参照スペクトルの部分に関する。例えば、もしスペクトルが1D NMRスペクトルであり、特定の標的領域が、試料NMRスペクトルにおいてδ7.2〜7.7と定義される場合、対応する交換領域も、主参照NMRスペクトルにおいてδ7.2〜7.7と定義される。
【０１１９】
それぞれの交換領域は、前記標的置換試料スペクトルにおける全積分強度に占める前記交換領域の割合が、前記主参照スペクトルにおける全積分強度に占める前記交換領域の割合と同じになるように倍率変更されている。例えば、もし、交換領域が主参照スペクトルにおける全積分強度の2％であったとしたら、やはり交換領域は標的置換試料スペクトルにおける全積分強度の2％を占めなければならない。
【０１２０】
例えば、積分強度IYの試料スペクトルが積分強度ITの１個の標的領域を有する場合を考える。スペクトルの残りの部分の積分強度は、IY-ITである。主参照スペクトルは積分強度ICMを有し、その交換領域は積分強度IRを有する。主参照スペクトルにおける全積分強度に占める交換領域の割合は、IR/ICMである。交換領域に係数(factor)fを掛けることで倍率変更すると、倍率変更された交換領域は、積分強度fIRを有する。標的置換スペクトルは、今や、積分強度IY-IT+fIRを有する。
【０１２１】
倍率係数fは、標的置換試料スペクトルにおける全積分強度に占める、倍率変更された交換領域（強度fIR）の割合（fIR/[fIR+IY-IT]）が、主参照スペクトルにおけるもとの交換領域の割合（IR/ICM）と同じになるように選択される。すなわち、fIR/[fIR+IY-IT]= IR/ICMである。この等式を再整理すると次式が得られる。
【数５】
2004526130.tif 000007
積分強度IYの試料スペクトルが、積分強度がそれぞれIT1、IT2の二つの標的領域を有する場合を考える。スペクトルの残りの部分の積分強度は、IY-IT1-IT2である。主参照スペクトルは積分強度ICMを有し、そのそれぞれの交換領域は、それぞれ積分強度IR1、IR2を有する。主参照スペクトルにおける全積分強度に占める第一及び第二の交換領域の割合は、それぞれIR1/ICM、IR2/ICMである。第一の交換領域は係数f1を掛けることで倍率変更され、従って、倍率変更された第一の交換領域は積分強度f1IR1を有する。第二の交換領域は係数f2を掛けることで倍率変更され、従って、倍率変更された第二の交換領域は積分強度f2IR2を有する。標的置換スペクトルは、今や積分強度IY-IT+f1IR1+f2IR2を有する。
【０１２２】
倍率係数f1及びf2は、それぞれ標的置換試料スペクトルにおける全積分強度に占める倍率変更された交換領域（強度はそれぞれf1IR1、f2IR2）の割合（それぞれf1IR1/[IY-IT+f1IR1+f2IR2]及びf2IR2/[IY-IT+f1IR1+f2IR2]）が、主参照スペクトルにおけるもとの交換領域の割合（それぞれIR1/ICM、IR2/ICM）と同じになるように選択される。これにより二つの連立方程式、f1IR1/[IY-IT+f1IR1+f2IR2]=IR1/ICM、f2IR2/[IY-IT+f1IR1+f2IR2]=IR2/ICMが得られ、これから次式を得る。
【数６】
2004526130.tif 000008
一般的な場合、i番目の試料スペクトル（Yi）についての標的領域はti,kと表記され、対応する交換領域はrkと表記され、いずれの場合もkは1からntの範囲であり、ここでntは標的領域の数である。
【０１２３】
ti,kと表記されるi番目の試料スペクトルのk番目の標的領域に対する積分強度IYi,Tkは次式で計算される：
【数７】
2004526130.tif 000009
（ここで、和はその標的領域の記述子jを超える）。
【０１２４】
同様にrkと表記される主参照スペクトルの交換領域（i番目の試料スペクトルのk番目の標的領域ti,kに対応）に対する積分強度は、次式で計算される：
【数８】
2004526130.tif 000010
（ここで、和はその交換領域の記述子jを超える）。
【０１２５】
従って、上記の例を一般化すると、多くの標的領域がある場合、i番目の試料スペクトルに対する倍率係数は次式で与えられることが示される：
【数９】
2004526130.tif 000011
（式中、
IYiは試料スペクトル（交換前）の全積分強度であり、
IYi,Tkは問題となっている標的領域の積分強度であり、
ICMは主参照スペクトルの全積分強度であり、
ICM,Rkは問題となっている交換領域の積分強度であり、
kは1から標的領域の数ntまでの範囲である。）。
【０１２６】
従って、標的領域yi,kを対応する交換領域rkで交換するのに先立ち、交換領域は上記の係数fiを掛けることで倍率変更される（即ち、掛け算がなされる）。このようにして、それぞれの試料スペクトル及びそのそれぞれの標的領域に対して、積分強度IYi,Rkの標的領域yi,kは、積分強度fiICM,Rkの交換領域rkで置き換えられる。
【０１２７】
任意ではあるが、好ましい方法の第四の工程は、標的置換試料スペクトルを規格化し、「規格化された標的置換試料スペクトル」を得ることを含む。規格化は、典型的には、標的置換試料スペクトルを倍率変更して単位全積分強度を得ること、即ち、標的置換試料スペクトルの全積分強度で1を割った係数を掛けることで倍率変更することにより達成され、したがって次式で表され得る：
【数１０】
2004526130.tif 000012
（ここでyijRは標的置換試料スペクトルの記述子を表し、yijR,Nは規格化された標的置換試料スペクトルの記述子を表す）。
【０１２８】
一旦、上述したようにスペクトルが処理されると、さらにスペクトルの特定のタイプにふさわしい解析がなされる。例えば、Pressら、1983に記述されたものも含めて、様々な既知の解析方法が用いられる。
【０１２９】
例えば、NMRスペクトルに対しては、主成分解析（PCA）のような従来のパターン認識法を適用することができる。例えば、標的置換スペクトルを使い、PCAを行うことが好ましく、規格化された標的置換スペクトルを使えば、さらに好ましい。同様に、標的置換領域を「欠測値(missing data)」として扱うことは、好ましい、あるいは好ましくない。
【０１３０】
実施
本発明の方法は、好都合なことに、例えば、適切にプログラムされたコンピューターシステムを用いて、電子的に行うことができる。
【０１３１】
従って、本発明の一つの態様は、本発明の方法を実行するために動作可能なように設定されているコンピューターまたは連結されたコンピューターのようなコンピューターシステムまたは装置に関するものである。
【０１３２】
本発明の別の態様は、適切なコンピューターシステム上で本発明の方法を実行するのに適切なコンピューターコードに関するものである。
【０１３３】
一つの実施形態においては、本発明は、コンピューター上でプログラムを実行するときに、本発明の方法を実行するように適合させたコンピュータープログラム手段を備えたコンピュータープログラムに関する。
【０１３４】
本発明の別の側面は、適切なコンピューター上で本発明の方法を実行するのに適切なコンピューターコードを保持するデータキャリアに関するものである。
【０１３５】
一つの実施形態においては、本発明は、上述したように、コンピューター読み取り可能媒体上に具体化された(embodied)コンピュータープログラムに関するものである。
【０１３６】
データキャリア及びコンピューター読み取り可能媒体の例としては、チップ媒体（例えば、ROM、RAM、フラッシュメモリー（例えば、メモリースティック（登録商標）、コンパクトフラッシュ（登録商標）、スマートメディア（登録商標））、磁気ディスク媒体（例えば、フロッピーディスク、ハードドライブ）、光ディスク媒体（例えば、コンパクトディスク（CD）、デジタル多目的ディスク（DVD）、磁気−光ディスク）、及び磁気テープ媒体が挙げられる。
【０１３７】
NMRスペクトルの処理
データの取得及び初期の前処理の後、それに続く解析（例えば、パターン認識）を適用する前に、データに対して、ここで記述した「スペクトル交換」工程を含む追加の前処理がなされる。
【０１３８】
NMRスペクトルは、典型的には取得した後、デジタル化された形態で扱われる。従来の（デジタル）スペクトルの前処理方法はよく知られており、適用可能であれば、シグナル平均化、フーリエ変換（及びその他の変換方法）、位相補正、ベースライン補正、スムージングなどが含まれる（例えば、Lindonら、1980を参照せよ）。
【０１３９】
現代の分光学的手法により、しばしば、高いあるいは非常に高い分解能のスペクトルの収集が可能となっている。デジタルの形態では、単純なスペクトル（例えば、シグナル強度対エネルギーあるいは周波数といった関数）でさえも、何万のデータポイントでないにせよ、何千ものデータポイントを有する。実際上の計算法のため、また、pH変動、区画化といった物理的効果を補正するためにある程度シグナルを平均化するために、データを減縮あるいは圧縮し、データポイント数を少なくすることが、しばしば望ましい。
【０１４０】
例えば、典型的1H NMRスペクトルはシグナル強度対周波数として記録される。1H核からのNMRシグナルは化学シフトと呼ばれるこの軸上の特徴的な位置を有する。これは参照シグナルの周波数に対する観測された周波数である。これを観測された周波数で割ると、化学シフトは次元がなくなり、百万分の一（ppm）として与えられ、記号δによって表される。簡潔のために、この軸は化学シフト軸と呼ばれる。1H NMRスペクトルに対しては、これはδ0からδ10の範囲である。約10-4から10-3 ppmの典型的な周波数の分解能では、デジタル形態のスペクトルは10,000から100,000のデータポイントを含む（典型的には2の16乗、64k乗、あるいは65536乗）。
【０１４１】
上述したように、例えば、約10から100の因子で、このデータを1000の記述子に圧縮することがしばしば望ましい。
【０１４２】
例えば、あるアプローチでは、化学シフト軸δは「分割され」、特定の長さの「バケット」や「ビン」になる。δ0からδ10の範囲にわたる1-D 1H NMRスペクトルに対しては、0.04のバケット長Δδを用いると、例えば、δ10.0-9.96、δ9.96-9.92、δ9.92-9.88のような250のバケットが生じる。与えられたバケット内のシグナル強度は平均化されるか、あるいは積分され、得られた値が報告される。このようにして、例えば、100,000の元来のデータポイントを有するスペクトルが、例えば、250のデータポイントを有する同等の表現に圧縮される。
【０１４３】
同様のアプローチが2-Dスペクトル、3-Dスペクトル等に適用できる。2-Dスペクトルに対しては、「バケット」のアプローチは「パッチ」に拡張される。3-Dスペクトルに対しては、「バケット」のアプローチは「ボリューム」に拡張される。例えば、両方の軸でδ0からδ10の範囲にわたる2-D 1H NMRスペクトルに対しては、Δδ0.1×Δδ0.1のパッチを使うと、10,000のパッチが生じる。このようにして、約108の元来のデータポイントを有するスペクトルが、104のデータポイントを有する同等なスペクトルに圧縮される。
【０１４４】
NMRスペクトルのそのような処理のソフトウエアは、例えば、AMIX（Analysis of MIXture, V2.5,Bruker Analytik, Rheinstetten,Germany）として市販されている。
【０１４５】
しばしば、あるスペクトル領域は、本当の診断上の情報を伝達しない、あるいは矛盾する生物化学的情報を伝達することがあるので、詳細な解析を行う前にこれらの「余分な」領域を取り除くことが、しばしば有用である。最も単純なアプローチでは、データポイントが消去される。別の単純な方法では、余分な領域のデータはゼロ値で置き換えられる。
【０１４６】
例えば、他の分子と比較した水のダイナミックレンジの問題が原因で、水の共鳴（δ4.7付近）は抑えられる。しかしながら、水の抑圧における小さな変動が残り、これらの変動が好ましくないことに解析を複雑にし得る。同様に、水の抑圧における変動は交差飽和により尿素のシグナル（δ5.5付近）にも影響を与える。それ故、例えば、約δ4.5から6.0（例えば、δ4.52から6.00）の特定のスペクトル領域を消去することは、しばしば有益である。
【０１４７】
特定の代謝産物は、病態生理学的プロセスとは関係のない強い度合いの生理学的変動（例えば、日変化、食事に関連した変動）を示す。そのような変動は好ましくないことに解析を複雑にし、より関連する詳細を覆い隠してしまう。それ故、そのような化合物に関連するスペクトル領域を消去することが有益である。しかしながら、後期の（例えば、パターン認識）解析でこれらの影響を分離することは、しばしば可能である。
【０１４８】
生体異物（例えば、薬）及びその代謝産物により、生体異物により誘起される条件（例えば、病理学）に直接相関しない大きなシグナルがしばしば生じる。それ故、そのような化合物と関連するスペクトル領域を消去することが、しばしば有益である。
【０１４９】
一般には、NMRデータはデータ行列として扱われる。典型的には、行列中のそれぞれの行は個々の試料に相当し（しばしば、「データベクトル」と呼ばれる）、列への記入事項(entry)は、例えば、特定のδまたはΔδでの特定のデータポイントのスペクトル強度である（しばしば、「記述子」と呼ばれる）。
【０１５０】
例えば、欠測値に対処する、転換する、倍率変更する、重みをかけるなどのように、データを前処理することは、しばしば有益である。
【０１５１】
とにかく可能であれば、例えば、列の値のギャップのような欠測値は避けるべきである。しかしながら、もし必要なら、そのような欠測値は、例えば、列の平均値（「平均充填」）、ランダムな値（「ランダム充填」）、または主成分解析に基づく値（「主成分充填」）により、置き換えられるか、または「充填される」。これらの異なったアプローチのそれぞれは、それに続くPR解析に異なった影響を与える。
【０１５２】
記述子座標軸の「転換」は有益であり得る。そのような転換の例としては、規格化及び平均中心化が含まれる。
【０１５３】
「規格化」は試料−試料の変動を取り除くために使われる。多くの規格化のアプローチが可能であり、解析における任意のいくつかのポイントにしばしば適用できる。通常、規格化は、余分のスペクトル領域が取り除かれた後に、適用される。あるアプローチでは、それぞれのスペクトルは、係数1/Aで規格化される（倍率変更される）。ここで、Aはスペクトルに対する全ての記述子の絶対値の和である。このようにして、それぞれのデータベクトルは、同じ長さ、具体的には1となる。例えば、特定のスペクトルにおけるそれぞれのバケットに対する強度の絶対値の和が1067であれば、この特定のスペクトルに対するそれぞれのバケットの強度は、1/1067を掛けることで倍率変更される。
【０１５４】
［平均中心化］は解釈を簡単にするのに使われる。通常、それぞれの記述子に対して、全ての試料に対する記述子の平均値が差し引かれる。このようにして、記述子の平均は原点に一致し、全ての記述子は、ゼロで「中心化」される。例えば、全てのスペクトルに対して、δ10.0-9.96の平均強度が1.2単位であれば、全てのスペクトルに対するδ10.0-9.96の強度は、1.2単位減らされる。
【０１５５】
「単位分散（UV, unit variance）スケーリング」では、データは等しい分散となるように倍率変更することができる。通常、それぞれの記述子の値は1/StDevの倍率がかけられる。ここで、StDevは全ての試料に対する記述子の標準偏差である。例えば、全てのスペクトルに対して、δ10.0-9.96での標準偏差が2.5単位であれば、全てのスペクトルに対するδ10.0-9.96での強度は、1/2.5すなわち0.4の倍率がかけられる。単位分散スケーリングは、「雑音の多い」データの影響を減らすのに使われる。例えば、生物流体におけるいくつかの代謝産物は、いかなる病態生理学的プロセスとも関係のない強い度合いの生理学的変化（例えば、日変化、食事に関する変化）を示す。単位分散スケーリングをしないと、これらの雑音となる代謝産物が、それに続く解析を支配してしまう。
【０１５６】
「対数スケーリング」は、データが明確な歪曲(スキュー)を有しているとき及び／又はデータが例えば数オーダーのように広い範囲わたるとき、解釈を助けるのに使われる。通常、それぞれの記述子に対して、値はその値の対数で置き換えられる。例えば、δ10.0-9.96での強度は、全てのスペクトルに対し、δ10.0-9.96での強度の対数に置き換えられる。
【０１５７】
「等値域(equal range)スケーリング」では、それぞれの記述子は、全ての試料に対するその記述子の値域で割られる。このようにして、全ての記述子は同じ値域、すなわち1を有する。例えば、全てのスペクトルに対してδ10.0-9.96での最大値が87単位、最小値が1であれば、値域は86単位となり、全てのスペクトルに対するδ10.0-9.96での強度は86単位で割られる。しかしながら、この方法は、異常値のポイントの存在に対して敏感である。
【０１５８】
「自動スケーリング」では、それぞれのデータベクトルは、平均中心化され単位分散の倍率変更が行われる。それぞれの記述子が等しく重みをかけられ、NMR記述子の場合は、大きいピークも小さいピークも等しい重要度で扱われるので、この技術は非常に有益である。これは、NMRではまだ検出できるが、非常に低レベルで存在する代謝産物に対して重要である。
【０１５９】
データの監視されたスケーリング方法もいくつか知られている。これらのうちのいくつかは、クラス間を区別するパラメーター（例えば、記述子）の能力の尺度をもたらし、分離を引き伸ばすことにより、分類を改善するのに使うことができる。
【０１６０】
例えば、「分散重みづけ」においては、単一のパラメーター（例えば、記述子）の分散重みは、クラス内分散の和に対するクラス間分散の比率として計算される。大きな値は、この変数がクラス間を区別していることを意味する。例えば、試料が二つのクラス（例えば、トレーニングセット）に分類されることが分かっていれば、それぞれの記述子の平均及び分散を調べることは可能である。もし、記述子が全く異なった平均値を有しており、分散が小さければ、その記述子によりクラスを分離するのがうまくいく。
【０１６１】
「特徴重みづけ」は、分散重みづけのより一般的な記述であり、これにおいては、それぞれの記述子の平均及び標準偏差が計算されるばかりでなく、Fisher重みのような他のよく知られた重み係数が使われる。
【０１６２】
偽のあるいは不規則なデータ（「異常値」）は、代表値ではなく、好ましくは同定され、除去される。不規則データ（「異常値」）に対する共通の理由としては、位相補正不良、ベースライン補正不良、化学シフト参照不良、水抑制不良、細菌汚染、生物流体のpHのシフト、毒素あるいは病気で誘起される生物化学的応答、及び生体異物に対する特異体質応答が挙げられる。
【０１６３】
異常値は用いられる解析方法に応じて、異なった方法で同定される。例えば、主成分解析（PCA）を用いるとき、複製群の残りから遠く離れたところに位置する少数の試料は、目で異常値と同定できる。PCAに対するより客観的な識別の手段は、一変量統計で使われるよく知られたスチューデントT検定の多変量バージョンであるHotellingのT検定を使うことである。任意の与えられた試料に対して、T2値を計算することができ、これは、試料の選ばれた比率（例えば、95％）が通常存在する範囲内で、標準値と比較される。実質的にこの限界外のT2値を有する試料は、異常値としてフラグを立てることができる。また、SIMCAやPNNsのようなより洗練された監視された方法を用いるときも、類似の方法が用いられる。信頼水準（例えば、95％）が選定され、この限界を超える信頼値に対応する多変量空間の領域が決定される。この領域はいくつかの異なった方法でグラフ的に表示することができる（例えば、PCAスコアプロット上に臨界T2楕円をプロットする等）。高い信頼領域の外に落ちる試料はいずれも、潜在的な異常値であるとしてフラグが立てられる。通常、そのような試料は、モデルから取り除く前に、範囲外にある性質の原因を決定するために詳細に調べられる。
【０１６４】
応用
上述したように、本発明の方法は、化学的、生物化学的、及び生物学的データの解析に用いられる。
【０１６５】
メタボノミクス的方法は、本発明の方法と結合して、診断、予後診断、病気の処置のための、また生体異物化合物の利点と副作用を理解するための強力な手段を提供し、それにより、現在用いられている薬物の治療計画の改善のみならず、薬物開発プロセスの助けとなる。
【０１６６】
例えば、本発明の方法と共に用いるメタボノミクス的方法の応用としては、以下に限定されないが、異常性／問題の早期検出、鑑別診断（病気の分類）、予後（未来の結果の予想）、治療モニタリング、感染症の進行の識別、分類、決定及び感染症の処置のモニタリング、薬物療法及び薬物有効性の臨床評価、薬物及びモデル化合物の毒性副作用の検出（例えば、薬の開発プロセスにおいて、臨床試験において）、特異体質の毒性の調査、過剰摂取に使われた薬の特性決定及び同定、代謝病（例えば、先天的な代謝の異常）の分類、特定評価、及び診断、病気のトランスジェニック動物モデルの品質管理の改善、病気のトランスジェニックモデルの設計の助け、及び病気及び／又は組織もしくは器官の損傷の新しい生物化学的マーカーの探索が挙げられる。
【０１６７】
本発明の方法と共に用いられるメタボノミクス的方法は、上述したものも含めた様々なゲノム学、薬理ゲノム学、及びプロテオーム学の代替あるいは補助として使われる。
【０１６８】
本発明の方法と共に用いられるメタボノミクス的方法は、（既知のあるいは新規な）遺伝子型及び／又は表現型を識別するために、また生物の表現型あるいは遺伝子型を決定するために使われる。これは、適切な処置の選択の助けとなり、あるいは薬の開発プロセスにおけるその関連性の評価を可能にする。例えば、病気の状態、感染した状態、あるいは処置を受けている個人のパネル状のメタボノミクス的データが作製されると、個人のグループの応答プロフィールを示すことができ、これは、二以上のサブグループに区別することができ、病気の状態あるいは処置に対する応答の対立遺伝子の基礎が存在することを示す。例えば、特定の表現型は、ある薬物を用いた処置に対しては感受性がないが、別の表現型は処置に感受性があるかもしれない。逆に、ある表現型は、代謝に失敗したため、毒性を示すことがあり、それ故、薬が排泄され、その薬は、別の表現型では、こうした効果を示さず安全であるかもしれない。例えば、メタボノミクス的方法は、生物のアセチル化状態を決定するのに使われる。薬物代謝の「早い」及び「遅い」アセチル化に対応して、二つの表現型がある。表現パターンの検査は、尿だけに基づき（即ち、生体異物を投与せず）、あるいはアセチル化に対する潜在性を有する生体異物（例えば、グラクトサミン）を投与した後の尿に基づき達成される。類似の方法も、例えば、シトクロムP450の多形性などの他の酵素多形性のような他の差異を決定するのに使われる。
【０１６９】
本発明の方法と共に用いられるメタボノミクス的方法は、例えば、一以上の遺伝子が取り除かれ、機能しないようにさせられた「ノックアウト動物」において、あるいは一以上の遺伝子が同じまたは異なった種から組み込まれた「ノックイン」動物において、あるいはアルツハイマー病のモデルとしてのマウスの脳におけるベータアミロイドタンパク質の過剰発現という結果に終わるモデルのような遺伝子の複製の数が増えた動物において、遺伝子改変の生物化学的結果を研究することにも使われる。遺伝子は細菌種、植物種、動物種の間で移動させることができる。
【０１７０】
包括的な「生態学的」系において、ゲノム的、プロテオーム的、及びメタボノミクス的データセットを組み合わせることにより、摂動を生じたin vivo機能の全体的評価が可能になる。
【０１７１】
本発明の方法は、環境汚染物質の影響（例えば、廃水解析、動物の数の研究、無脊椎動物、海洋生物の研究）及び植物における生体異物の刺激と遺伝子変化の影響の調査を含めた他の応用においても有用である。
【実施例】
【０１７２】
以下の実施例は、単に本発明を説明するために提供されたものであり、ここで記述したように、発明の範囲を限定することは意図されていない。
【０１７３】
本発明の方法は、そのNMRスペクトルへの適用において実証される。それでもなお、本発明の方法は、上述したような他のタイプのスペクトルに対しても同様に適用できる。
【０１７４】
75個のスペクトルから成るスペクトルデータセットをシミュレートした。これらのスペクトルは、五匹の動物からなる三つの群（A1-A5、A6-A10、及びA11-A15）にすいて五つの時点（T1、T2、T3、T4、及びT5）で取ったスペクトルである。第一の動物群（A1-A5）は対照動物である。第二の動物群（A6-A10）は投薬された動物である。第三の動物群（A11-A15）は、やはり投薬された動物であるが、異なっている（例えば、異なった薬物／毒素を用いている、あるいは同じ薬物／毒素でも異なった量である）。
【０１７５】
データセットはPARAFACモデルを用いて作製した（例えば、Bro、1997を参照せよ）。このモデルにおいては、得られたスペクトルは、図１に示した四つのベーススペクトル（A、B、C、及びDと表記）の線形結合であり、そこでは、化学シフト（スペクトルビン(spectral bin)数により表現される）は、x軸に沿っており、スペクトル強度はy軸に沿っている。それぞれのベーススペクトルの寄与は、以下で議論する二つの対応する係数である動物係数と時間係数により決定される。
【０１７６】
動物係数（AFA、AFB、AFC、及びAFDと表記）は図２に示されるが、ここでは、動物番号（A1-A15）はx軸に沿っており、動物係数はy軸に沿っている。従って、それぞれのベーススペクトル及び動物に対して、例えば、ベーススペクトルB、動物7に対してはAFB-A7といったように動物係数がある。
【０１７７】
時間係数（TFA、TFB、TFC、及びTFDと表記）は図３に示されるが、ここでは、時点（T1-T5）はx軸に沿っており、時間係数はy軸に沿っている。従って、それぞれのベーススペクトル及び時点に対して、例えば、ベーススペクトルB、時点3に対してはTFB-T3といったように時間係数がある。
【０１７８】
例えば、動物番号7（A7）に対する時点3（T3）でのスペクトルは、四つのベーススペクトル（A、B、C、D）の線形結合であり、それぞれの係数が（AFA-A7*TFA-T3）、（AFB-A7*TFB-T3）、（AFC-A7*TFC-T3）、及び（AFD-A7*TFD-T3）である。
【０１７９】
例えば、動物番号6（A6）に対する五つの時点（T1-T5）でのスペクトルは、それぞれ曲線（i）、（ii）、（iii）、（iv）及び（ｖ）として図４に示されている。スペクトル（i）はA6-T1に対してである。スペクトル（ii）はA6-T2に対してである。スペクトル（iii）はA6-T3に対してである。スペクトル（iv）はA6-T4に対してである。そしてスペクトル（ｖ）はA6-T5に対してである。（X）とマークされたこれらのピークは、スペクトル交換の対象である（以下参照）。（Y）とマークされたピークは、適用された刺激に対する動物の応答に関連した内因性代謝産物である。
【０１８０】
対照動物（A1-A5）に対しては、動物係数AFB、AFC、及びAFDはすべて非常に小さい（約0.05以下）が、動物係数AFAは大きく、ほぼ定数（約0.5）である。それ故、対照動物に対するスペクトルは、ベーススペクトルAにより支配される。ベーススペクトルAに対する時間係数TFAも全ての時点についてほぼ定数（約0.45）である．それ故、定性的には（本当の対照群で予期されるとおり）、対照動物に対するすべてのスペクトルは非常に類似している。主参照スペクトルは、この場合、全ての25個の対照スペクトル（５匹の動物、５時点）の平均であるが、図４に示されている。
【０１８１】
第二の群の動物（A6-A10）に対しては、動物係数AFDは非常に小さい（約0.05以下）が、動物係数AFAは約0.5であり、動物係数AFB及びAFCは約1.0である。それ故、第二の群の動物に対するスペクトルは、ベーススペクトルA、B、及びCに支配される。ベーススペクトルAに対する時間係数TFAも全ての時点についてほぼ定数（約0.45）であるが、ベーススペクトルBに対する時間係数TFBは約0.1から約0.65の間で変わり、時点3でピークに達し、ベーススペクトルCに対する時間係数TFCは約0.1から約0.55の間で変わり、時点4でピークに達する。それ故、定性的には、第二の群の動物に対するスペクトルは、ベーススペクトルAに類似するが、異なった量のベーススペクトルB及びCがそこに重ね合わされている。
【０１８２】
第三の群の動物（A11-A15）に対しては、動物係数AFB及び動物係数AFCは非常に小さい（約0.05以下）が、動物係数AFAは約0.5であり、動物係数AFDは約1.0である。それ故、第三の群の動物に対するスペクトルは、ベーススペクトルA及びDに支配される。ベーススペクトルAに対する時間係数TFAも、全ての時点についてほぼ定数（約0.45）であり、ベーススペクトルDに対する時間係数TFDは、約0.1から約0.75の間で変わり、時点4でピークに達する。それ故、定性的には、第三の群の動物に対するスペクトルは、ベーススペクトルAに類似するが、異なった量のベーススペクトルDがそこに重ね合わされている。
【０１８３】
上述したように、ベーススペクトルAは対照動物に対するスペクトルを表す（投薬された動物に対するスペクトルにも存在するが）。本実施例の目的のために、ベーススペクトルBは、定性的には投与された薬物／毒素の代謝産物を表し（即ち、妨害シグナル）、ベーススペクトルC及びDは、定性的には二つの異なる薬物／毒素投与計画に対する動物応答の異なったバイオマーカーまたはバイオマーカーの組み合わせを表す。
【０１８４】
従来の解析を用いて、妨害シグナルに関連する（即ち、ベーススペクトルBにおける）スペクトル領域を標的領域として同定し（本実施例ではスペクトルビン番号15-26と47-58を含む）、これらのスペクトル領域におけるデータを全てのスペクトルから消去した。得られた「消去された」スペクトルを再規格化し、主成分解析により解析した。
【０１８５】
得られたスコアプロット（PC2対PC1）は図７に示してある。データポイントの二つの群が明白に（対照集団から）分離されており、それは具体的に言うと、A6-A10、T2及びA6-A10、T3である。データポイントの二つの群は部分的に分離され、それは具体的に言うと、A6-A10、T1及びA6-A10、T4である。データポイントのいくつかの群は分離されず、それは具体的に言うと、A6-A10、T5及びA11-A15、T1-5である。
【０１８６】
本発明の方法を用いて、標的領域、即ち妨害シグナルと関連する（即ちベーススペクトルBにおける）スペクトル領域を同定した（本実施例では、スペクトルビン番号15-26と47-58を含む）。主参照スペクトルは、25個の対照動物スペクトルの平均として計算した（主参照スペクトルは図４に示してある）。動物6-10に対する全てのスペクトルにおける標的領域を、主参照スペクトル由来の対応する倍率変更された交換領域で置き換えた。得られた標的置換スペクトルを再規格化し、規格化された標的置換スペクトルを得た。
【０１８７】
このプロセスの二つの実施例を図５（動物番号6、時点2、A6、T2でのスペクトルに対する）及び図６（動物番号6、時点3、A6、T3でのスペクトルに対する）に示してある。それぞれの場合、スペクトル（i）は交換前のもとのスペクトル、スペクトル（ii）はスペクトル交換後のスペクトル、スペクトル（iii）は再規格化後のスペクトル（ii）である。垂直点線で示したように、第一の標的領域（T-I）はスペクトルビン番号15-26を含み、第二の標的領域（T-II）はスペクトルビン番号47-58を含む。数値パラメーターは以下の表にまとめてある。
【表１】
2004526130.tif 000013
得られた規格化され標的置換スペクトルは、それから主成分解析により解析した。ある解析では、置換された領域は「欠測値」として扱われ（PCA解析における従来の方法）、得られたスコアプロット（PC2対PC1）は図８に示してある。データポイントの九つの群が、明白に（対照集団から）分離され、それは具体的に言うと、A6-A10、T1-5及びA11-A15、T1-4である。データポイントの一つの群は分離せず、それは具体的に言うと、A11-A15、T5である。
【０１８８】
別の解析では、置換された領域は「欠測値」としては扱われず、得られたスコアプロット（PC2対PC1）は図９に示してある。データポイントの八つの群が明白に（対照集団から）分離され、それは具体的に言うと、A6-A10、T1-4及びA11-A15、T1-4である。データポイントの一つの群は部分的に分離され、それは具体的に言うと、A6-A10、T5である。データポイントの一つの群は分離されず、それは具体的に言うと、A11-A15、T5である。
【０１８９】
図８及び図９においてA11-A16データが明白に分離すること（具体的に言うとA11-A15、T1-4）は、図７においてその分離が不足していることと比較しても分かるように、特に、そうしなければ失われていたであろう情報を検索することにおいて、本発明の方法の有効性を実証するものである。
【０１９０】
参考文献
発明及び発明が関係する技術の状態をより完全に記述し、開示するために、数々の特許及び刊行物を先に引用した。これらの参考文献に対する完全な引用を以下に示す。それぞれの個々の文献が具体的に別個に参照により本文に組み込まれることが示されるのと同じ程度まで、これらの文献はそれぞれ、参照により全体が本開示に組み込まれる。
【０１９１】
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【図面の簡単な説明】
【０１９２】
【図１】図１は、実施例において模擬データを作製するのに使用したA、B、C、及びDと表記された四つのベーススペクトルを示すグラフである。
【図２】図２は、実施例において模擬データを作製するのに使用したAFA、AFB、AFC及びAFDと表記された四つの動物係数を示すグラフである。
【図３】図３は、実施例において模擬データを作製するのに使用したTFA、TFB、TFC及びTFDと表記された四つの時間係数を示すグラフである。
【図４】図４は、主参照スペクトルのみならず、それぞれ（i）、（ii）、（iii）、（iv）及び（ｖ）と表記された五つの時点（T1-T5）における動物番号6（A6）に対するスペクトルを示すグラフである。
【図５】図５は、動物番号6に対する時点2（A6、T2）における（i）交換前の元来のスペクトル、（ii）スペクトル交換後のスペクトル、（iii）再規格化後のスペクトル（ii）を示すグラフである。
【図６】図６は、動物番号6に対する時点3（A6、T3）における（i）交換前の元来のスペクトル、（ii）スペクトル交換後のスペクトル、（iii）再規格化後のスペクトル（ii）を示すグラフである。
【図７】図７は、試料スペクトルの主成分解析後のスコアプロット（主成分1対主成分2）を示すグラフであり、ここで、妨害シグナルと関連するスペクトル領域は、全てのスペクトルから消去してある。
【図８】図８は、規格化された標的置換スペクトルの主成分解析後のスコアプロット（主成分1対主成分2）を示すグラフであり、ここで、置換された領域は、「欠測値」として扱われる。
【図９】図９は、規格化された標的置換スペクトルの主成分解析後のスコアプロット（主成分1対主成分2）を示すグラフであり、ここで、置換された領域は、「欠測値」として扱われない。
【図１】
2004526130.tif 000015
【図２】
2004526130.tif 000016
【図３】
2004526130.tif 000017
【図４】
2004526130.tif 000018
【図５】
2004526130.tif 000019
【図６】
2004526130.tif 000020
【図７】
2004526130.tif 000021
【図８】
2004526130.tif 000022
【図９】
2004526130.tif 000023
【国際公開パンフレット】
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2004526130.tif 000089
2004526130.tif 000090
【国際調査報告】
2004526130.tif 000091
2004526130.tif 000092