(57)【要約】本発明は、Ｂｅｔａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ、テンサイ起源の単離された遺伝子に関し、この単離された遺伝子は、ストレス状態に対する応答に関連する。この遺伝子は、高塩濃度を有する選択培地中で増殖し得る形質転換された酵母細胞を用いる、機能的選抜手順においてスクリーニングされたテンサイｃＤＮＡライブラリーから単離された。遺伝子の１つは、テンサイカゼインキナーゼのα−サブユニットであり、１つは、テンサイジヒドロオロターゼであり、１つは、テンサイ翻訳開始因子１Ａであり、そして他の２つは、未知のタンパク質タイプの遺伝子である。単離された植物遺伝子の全ては、酵母細胞にストレス耐性エンハンサーとして機能的であり、従って、トランスフェクトされた場合、生物に対してストレス耐性を付与し得る。これらの遺伝子は、塩、乾燥、寒さまたは霜による浸透圧性ストレスのようなストレス状態に耐性の作物を提供するために使用され得る。【特許請求の範囲】
【請求項１】
植物におけるストレス耐性を増強させるためのＢｅｔａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ核酸の使用法であって、酵母細胞に対してストレス耐性を付与することを特徴とする該Ｂｅｔａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ核酸の発現を包含する、Ｂｅｔａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ核酸の使用法。
【請求項２】
前記酵母細胞がＮａ＋感受性酵母株ＪＭ２６に由来する、請求項１に記載のＢｅｔａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ核酸の使用法。
【請求項３】
前記Ｂｅｔａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ核酸が前記酵母細胞に対して浸透圧性ストレス耐性または酸化ストレス耐性を付与する、植物に対して浸透圧性ストレス耐性または酸化ストレス耐性を増強させるための、請求項１または２に記載のＢｅｔａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ核酸の使用法。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の植物において浸透圧性ストレス耐性または酸化ストレス耐性を増強させるためのＢｅｔａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ核酸の使用法であって、ここで、該Ｂｅｔａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ核酸は、以下の核酸：
（ａ）配列番号１〜５のいずれか、またはその相補物として与えられるＤＮＡ配列を含有する核酸、
（ｂ）配列番号１〜５のいずれか、またはその相補物に対応するＲＮＡ配列を含有する核酸、
（ｃ）高ストリンジェンシー条件下で、核酸（ａ）または核酸（ｂ）に対して特異的にハイブリダイズする核酸、
（ｄ）配列番号６として与えられるアミノ酸配列に対して少なくとも９３％同一であるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする核酸、
（ｅ）配列番号７として与えられるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする核酸、
（ｆ）配列番号８として与えられるアミノ酸配列に対して少なくとも８９％同一であるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする核酸、
（ｇ）配列番号９として与えられるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％同一であるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする核酸、
（ｈ）配列番号１０として与えられるアミノ酸配列に対して少なくとも６５％同一であるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする核酸、
（ｉ）配列番号６〜１０のいずれかとして与えられるアミノ酸配列を含有するタンパク質をコードする核酸、
（ｊ）配列番号１〜５のいずれかとして与えられるＤＮＡ配列によってコードされるタンパク質の、免疫学的に活性なフラグメントおよび／または免疫学的に機能的なフラグメントをコードする核酸、
（ｋ）遺伝コードの結果として配列番号１〜５のいずれかとして与えられる核酸に対して縮重している核酸か、または（ａ）〜（ｊ）のいずれかにおいて規定される核酸に対して縮重している核酸、
（ｌ）生物の間でのコドン使用頻度の相違の結果として配列番号６〜１０のいずれかとして与えられるタンパク質をコードする核酸から多様化している核酸か、または（ａ）〜（ｊ）のいずれかにおいて規定される核酸から多様化している核酸、
（ｍ）対立遺伝子の間での相違の結果として配列番号６〜１０のいずれかとして与えられるタンパク質をコードする核酸から多様化している核酸か、または（ａ）〜（ｊ）のいずれかにおいて規定される核酸から多様化している核酸、ならびに
（ｎ）該核酸が、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたは合成ＤＮＡであることを特徴とする、（ａ）〜（ｍ）いずれか１つにおいて規定される核酸、
から選択される、Ｂｅｔａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ核酸の使用法。
【請求項５】
植物におけるストレス耐性を増強させるための方法であって、該植物の細胞、組織または一部における、請求項４に記載されるいずれかの核酸の発現または発現の変更を包含する、方法。
【請求項６】
植物におけるストレス耐性を増強させるための方法であって、該植物の細胞、組織または一部における、カゼインキナーゼαサブユニットをコードする核酸の発現または発現の変更を包含する、方法。
【請求項７】
請求項６に記載の方法であって、ここで、前記核酸が、請求項４に記載されるカゼインキナーゼαサブユニット、またはそのホモログ、オーソログもしくはパラログをコードする、方法。
【請求項８】
植物におけるストレス耐性を増強させるための方法であって、該植物の細胞、組織または一部における、ジヒドロオロターゼをコードする核酸の発現または発現の変更を包含する、方法。
【請求項９】
請求項８に記載の方法であって、ここで、前記核酸が、請求項４に記載されるジヒドロオロターゼ、またはそのホモログ、オーソログもしくはパラログをコードする、方法。
【請求項１０】
植物におけるストレス耐性を増強させるための方法であって、該植物の細胞、組織または一部における、翻訳開始因子１Ａをコードする核酸の発現または発現の変更を包含する、方法。
【請求項１１】
請求項１０に記載の方法であって、ここで、前記核酸が、請求項４に記載される翻訳開始因子１Ａ、またはそのホモログ、オーソログもしくはパラログをコードする、方法。
【請求項１２】
植物におけるストレス耐性を増強させるための方法であって、配列番号４もしくは配列番号５によって示される核酸またはそれらのホモログ、オーソログもしくはパラログの発現または発現の変更を包含する、方法。
【請求項１３】
請求項５〜１２のいずれか１項に記載の方法であって、ここで、前記核酸の前記発現が、プロモーターの制御下で生じる、方法。
【請求項１４】
請求項５〜１３のいずれか１項に記載の方法であって、ここで、前記ストレスが、浸透圧性ストレスである、方法。
【請求項１５】
請求項１４に記載の方法であって、ここで、前記浸透圧性ストレスが、塩によって引き起こされる、方法。
【請求項１６】
請求項１４に記載の方法であって、ここで、前記浸透圧性ストレスが、乾燥によって引き起こされる、方法。
【請求項１７】
請求項１４に記載の方法であって、ここで、前記浸透圧性ストレスが、霜によって引き起こされる、方法。
【請求項１８】
請求項１４に記載の方法であって、ここで、前記浸透圧性ストレスが、寒さによって引き起こされる、方法。
【請求項１９】
請求項５〜１８のいずれか１項に記載の方法であって、ここで、前記方法が、収量の増加をもたらす、方法。
【請求項２０】
単離された核酸であって、植物に対して浸透圧性ストレス耐性もしくは酸化ストレス耐性を増強するためのタンパク質か、あるいはそのようなタンパク質の免疫学的に活性なフラグメントおよび／または免疫学的に機能的なフラグメントをコードし、以下の核酸：
（ａ）配列番号１〜５のいずれか、またはその相補物として与えられるＤＮＡ配列を含有する核酸、
（ｂ）配列番号１〜５のいずれか、またはその相補物に対応するＲＮＡ配列を含有する核酸、
（ｃ）高ストリンジェンシー条件下で核酸（ａ）または核酸（ｂ）に対して特異的にハイブリダイズする核酸、
（ｄ）配列番号６として与えられるアミノ酸配列に対して少なくとも９３％同一であるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする核酸、
（ｅ）配列番号７として与えられるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする核酸、
（ｆ）配列番号８として与えられるアミノ酸配列に対して少なくとも８９％同一であるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする核酸、
（ｇ）配列番号９として与えられるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％同一であるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする核酸、
（ｈ）配列番号１０として与えられるアミノ酸配列に対して少なくとも６５％同一であるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする核酸、
（ｉ）配列番号６〜１０のいずれかとして与えられるアミノ酸配列を含有するタンパク質をコードする核酸、
（ｊ）配列番号１〜５のいずれかとして与えられるＤＮＡ配列によってコードされるタンパク質の、免疫学的に活性なフラグメントおよび／または免疫学的に機能的なフラグメントをコードする核酸、
（ｋ）遺伝コードの結果として配列番号１〜５のいずれかとして与えられる核酸に対して縮重している核酸か、または（ａ）〜（ｊ）のいずれかにおいて規定される核酸に対して縮重している核酸、
（ｌ）生物の間でのコドン使用頻度の相違の結果として配列番号６〜１０のいずれかとして与えられるタンパク質をコードする核酸から多様化している核酸か、または（ａ）〜（ｊ）のいずれかにおいて規定される核酸から多様化している核酸、
（ｍ）対立遺伝子の間での相違の結果として配列番号６〜１０のいずれかとして与えられるタンパク質をコードする核酸から多様化している核酸か、または（ａ）〜（ｊ）のいずれかにおいて規定される核酸から多様化している核酸、ならびに
（ｎ）該核酸が、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたは合成ＤＮＡであることを特徴とする、（ａ）〜（ｍ）いずれか１つにおいて規定される核酸、
の１つから選択される、核酸。
【請求項２１】
請求項２０に記載の核酸と特異的にハイブリダイズする、少なくとも１５個連続するヌクレオチド長の核酸分子。
【請求項２２】
請求項２０に記載の核酸を特異的に増幅する、少なくとも１５個連続するヌクレオチド長の核酸分子。
【請求項２３】
請求項２０に記載の核酸配列を含有する、ベクター。
【請求項２４】
請求項２３に記載のベクターであって、前記核酸配列が原核生物宿主細胞および／または真核生物宿主細胞において該配列の発現を可能にする１以上の制御配列に作動可能に連結されている発現ベクターである、ベクター。
【請求項２５】
請求項２０に記載の核酸分子または請求項２３もしくは２４に記載のベクターを含有する、宿主細胞。
【請求項２６】
請求項２５に記載の宿主細胞であって、ここで、該宿主細胞は、細菌細胞、昆虫細胞、真菌細胞、酵母細胞、植物細胞または動物細胞である、宿主細胞。
【請求項２７】
請求項２０に記載の核酸、あるいはそのホモログまたは誘導体、あるいはその免疫学的に活性なフラグメントおよび／または免疫学的に機能的なフラグメントによってコード可能され得る、単離されたポリペプチド。
【請求項２８】
請求項２７に記載のポリペプチドであって、配列番号６〜１０のいずれかとして与えられるアミノ酸配列、あるいはそれらのホモログまたは誘導体、あるいはそれらの免疫学的に活性なフラグメントおよび／または免疫学的に機能的なフラグメントを有する、ポリペプチド。
【請求項２９】
請求項２７または２８に記載のポリペプチドを産生するための方法であって、該ポリペプチドの発現を可能にする条件で請求項２５または２６に記載の宿主細胞を培養する工程、および該培養物から産生されたポリペプチドを回収する工程を包含する、方法。
【請求項３０】
請求項２７もしくは２８または該ポリペプチドの特異的なエピトープに記載のポリペプチドを特異的に認識する抗体。
【請求項３１】
改変された植物細胞、植物組織もしくは植物を産生するための方法であって、該植物細胞内もしくは該植物組織内に、または該植物の器官内に、請求項２７もしくは２８に記載のポリペプチドを直接的に導入する工程を包含する、方法。
【請求項３２】
請求項２７もしくは２８に記載のポリペプチドの発現をもたらすための方法であって、１以上の制御配列に作動可能に連結された請求項２０に記載の核酸分子または請求項２３もしくは２４に記載のベクターを、植物細胞のゲノム内へ安定に導入する工程を包含する、方法。
【請求項３３】
トランスジェニック植物細胞、植物組織または植物を産生するための方法であって、該植物細胞、植物組織または植物において、発現可能な形式で請求項２０に記載の核酸を導入する工程、または請求項２３もしくは２４に記載のベクターを導入する工程を包含する、方法。
【請求項３４】
植物細胞、組織または植物において、浸透圧性ストレス耐性または酸化ストレス耐性を増強させるための方法であって、該植物の細胞、組織または器官内へ請求項５〜１３のいずれか１項に記載されるいずれかの核酸を導入する工程を包含する、方法。
【請求項３５】
請求項３２〜３４のいずれか１項に記載の方法であって、前記植物細胞から植物を再生させる工程をさらに包含する、方法。
【請求項３６】
請求項２０に記載の核酸を含有するトランスジェニック植物細胞であって該核酸が、植物細胞または請求項３３に記載の方法によって入手可能なトランスジェニック植物細胞における該核酸の転写および／または発現を可能にする調節エレメントに作動可能に連結されている、トランスジェニック植物細胞。
【請求項３７】
請求項３６に記載のトランスジェニック植物細胞であって、ここで、請求項２０に記載の前記核酸が該植物細胞のゲノム内へ安定に組み込まれている、トランスジェニック植物細胞。
【請求項３８】
請求項３６もしくは３７に記載の植物細胞、または請求項３５に記載の方法によって入手可能なトランスジェニック植物を含有する、トランスジェニック植物またはトランスジェニック植物組織。
【請求項３９】
対応する野生型植物と比較して、ストレス（好ましくは、浸透圧性ストレスまたは酸化ストレス）に対する増強した耐性を示す、請求項３８に記載のトランスジェニック植物。
【請求項４０】
請求項３８または３９に記載の植物の収穫可能な部分。
【請求項４１】
種子、葉、果実、幹培養物、根茎および鱗茎からなる群から選択される、請求項４０に記載の植物の収穫可能な部分。
【請求項４２】
請求項３８〜４１のいずれか１項に記載の植物または植物の部分のいずれかに由来する、子孫。
【請求項４３】
請求項２７または２８に記載のポリペプチドと相互作用するタンパク質を同定および入手するための方法であって、請求項２７または２８に記載のポリペプチドが使用されるスクリーニングアッセイを包含する、方法。
【請求項４４】
請求項４３に記載の方法であって、ベイトとして請求項２７または２８に記載のポリペプチドを、そしてプレイとしてｃＤＮＡライブラリーが使用されるツーハイブリッドスクリーニングアッセイを包含する、方法。
【請求項４５】
請求項２７または２８に記載のポリペプチドと、請求項４３または４４に記載の方法によって入手可能な相互作用するタンパク質パートナーとの間の相互作用を調節するための方法。
【請求項４６】
請求項２７または２８に記載のポリペプチドと相互作用する化合物を同定および入手するための方法であって、以下の工程：
（ａ）ツーハイブリッド系を提供する工程であって、ここで、請求項２７または２８に記載のポリペプチド、および請求項４３または４４に記載の方法によって入手可能な相互作用するタンパク質パートナーが発現される、工程、
（ｂ）該化合物を、（ａ）において規定される発現されたポリペプチドによって形成される複合体と相互作用させる工程、ならびに、
（ｃ）該化合物と、該ポリペプチドまたは（ａ）において規定される発現されたポリペプチドによって形成される複合体との相互作用の測定を実施する工程、を包含する、方法。
【請求項４７】
請求項２７または２８に記載のポリペプチドに特異的に結合する化合物または化合物の混合物を同定するための方法であって、以下の工程：
（ａ）複合体形成を可能にするために適切な条件下で、請求項２７または２８に記載のポリペプチドを該化合物または化合物の混合物と混合する工程、および、
（ｂ）複合体形成を検出する工程であって、ここで、複合体の存在が、該ポリペプチドに特異的に結合する化合物または化合物の混合物を同定する、工程、
を包含する、方法。
【請求項４８】
植物においてストレス耐性を増強させる因子としての、請求項４６または４７に記載の方法を使用して同定された化合物または化合物の混合物の使用法。
【請求項４９】
収量を増加させるための、請求項２０に記載の核酸、請求項２３または２４に記載のベクター、請求項２７または２８に記載のポリペプチドの使用法。
【請求項５０】
根、葉または種子のような植物のいずれかの部分であり得る植物の成長を刺激するための、請求項２０に記載の核酸分子、請求項２３または２４に記載のベクター、請求項２７または２８に記載のポリペプチドの使用法。
【請求項５１】
少なくとも、請求項２０に記載の核酸、請求項２３もしくは２４に記載のベクター、請求項２７もしくは２８に記載のポリペプチドまたは請求項３０に記載の抗体を含有する、診断組成物。
【請求項５２】
１ｍＭの塩イオンより高い塩含量を有する土壌上で栽培するための、請求項３１もしくは３２に記載の方法によって入手可能な植物または請求項３８もしくは３９に記載の植物の使用法。
【請求項５３】
植物の開花の過程を制御するための方法であって、該植物の細胞、組織または部分において配列番号６によって示されるカゼインキナーゼαサブユニットをコードする核酸を発現させるかまたは該核酸の発現を変更する工程を包含する、方法。
【請求項５４】
植物の開花の過程を制御するための、配列番号６によって示されるカゼインキナーゼαサブユニットをコードする核酸の使用法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、植物分子生物学の分野、より詳細には、例えば、Ｎａ＋またはＬｉ＋のようなイオンによって引き起こされる無機塩毒性のようなストレス状況に対する耐性の表現型を、真核生物細胞または生物に付与し得る、テンサイ遺伝子およびテンサイタンパク質の使用に関連する。
【０００２】
（発明の背景）
土壌塩分は、植物農業について最も重要な非生物ストレスの１つであり、従って、作物の塩耐性を遺伝的に改良する実用的な目的のために、ストレス耐性遺伝子を同定および単離することは有用とされる。
【０００３】
他の２つの主要な非生物ストレス（乾燥および寒さ）は、塩のストレスと密接に関連する。塩のストレスによって調節される多くの遺伝子はまた、乾燥のストレスまたは寒さのストレスに応答性であり（Ｚｈｕ、１９９７）、従って、これらの遺伝子は、ストレス耐性の遺伝的な改良について特に興味深い。
【０００４】
植物が塩のストレスに対して応答することによる分子機構は、解明され始めている（Ｈａｓｅｇａｗａら、２０００ａ）。液胞および形質膜でのナトリウムトランスポーターは、それぞれＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓのＮＨＸ１遺伝子（Ｇａｘｉｏｌａら、１９９２、Ａｐｓｅら、１９９９）およびＳＯＳ１遺伝子（Ｓｈｉら、２０００）の産物として同定され、塩耐性の重要な決定因子として記載されてきた。
【０００５】
植物におけるストレス耐性を遺伝的に改良する目的のために、導入された場合に、ストレス耐性を速やかに付与し得るストレス耐性遺伝子を使用することは重要である。これらの遺伝子の作用は、ストレス耐性の分子機構のために必要である、他の経路に関連した事象または他の成分に依存し得ない。ストレスを加えられた生物において重要なストレス因子を同定し得るが、これらの遺伝子がまた、異種の宿主において単離およびトランスフェクトされた場合、その異種の宿主においてストレス耐性の増強に寄与するかどうかの疑問は残る。
【０００６】
（テンサイ（遺伝子）およびストレス）
Ｂｅｔａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ  Ｌ．（Ｃｈｅｎｏｐｏｄａｃｅａｅ、テンサイ）は、他の植物（例えば、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）と比較した場合、いくぶんストレス耐性の植物であることが知られている。テンサイは、いくぶん塩および乾燥に対して比較的ストレス耐性といわれる。より困難な条件において成長するためのテンサイの能力の原因である遺伝子は、解明され始めている。研究中の遺伝子が耐性の誘導に関わり得る最初の徴候は、ストレス条件下でのその発現の増加である。例として、Ｍａｔｔｈｉａｓら（１９９６）は、塩のストレスが、成熟したテンサイの葉においてＶ型Ｈ＋ＡＴＰａｓｅの発現の増加を誘導することを示した。ベタイン（浸透圧保護剤（ｏｓｍｏｐｒｏｔｅｃｔａｎｔ））もまた、塩分および乾燥に応答して多くのビート植物によって蓄積される。さらに、テンサイにおいて、テンサイのグリシンベタインの合成においてコミッティング（ｃｏｍｍｉｔｔｉｎｇ）段階を触媒するコリンモノオキシゲナーゼの発現もまた、Ｃｈｅｎｏｐｏｄａｃｅａｅにおける浸透圧性ストレスにより誘導される。葉におけるｍＲＮＡレベルは、４００ｍＭの塩で３〜７倍に増加し、そして非誘導性のレベルまで戻った（Ｒｕｓｓｅｌ、１９９８）。上述のように、ストレス状況に応答するためのいくつかの代替的な経路が存在し、従って、おそらく多くの異なる遺伝子がストレス応答に関連する。
【０００７】
（本発明の要旨）
本発明において、５つの新規な遺伝子がＢｅｔａ  ｖｕｌｇａｒｉｓから単離され、そして酵母細胞に形質転換された。全てのこれらの遺伝子は、酵母細胞においてストレス耐性を誘導し、そしてカゼインキナーゼαサブユニット（ＢｖＣＫ２Ａという）、ジヒドロオロターゼ（ＢｖＤＨＯという）、翻訳開始因子１Ａ（ＢｖｅＩＦ−１Ａという）、および２つの他の未知のタンパク質（さらにＢｖ１２０およびＢｖ２０Ｌｉという）をコードする。
【０００８】
予想に反して、本発明者らは、酵母中に形質転換した場合、これらのテンサイ遺伝子が、この異種の生物にストレス（特にＮａ＋ストレス）に対する耐性を与え得ることを示した。これらの酵母クローンのいくつかの驚くほど強力な表現型、ならびにこれらの遺伝子が、単離された位置および異種のバックグラウンドにおいてストレス耐性のエンハンサーとして作用するという事実は、これらの遺伝子を、補助的な化合物を必要とせずに、目的の任意の生物においてストレス耐性を誘導するための非常に魅力的な手段にさせる。単離および酵母細胞にトランスフェクトされた場合、酵母細胞中の浸透圧性ストレス耐性を増強させるこれらの遺伝子の能力は、これらを（他の）ストレス応答の作用を担うことが知られるが、単離された形態において使用されなかった他のテンサイ遺伝子と明らかに区別される。本発明のこれらの新規なテンサイ遺伝子の１つは、カゼインキナーゼのサブユニットをコードする。植物カゼインキナーゼサブユニットについて初めて開示することは、驚くべきことであり、そしてカゼインキナーゼのα触媒性サブドメインが塩のストレス応答において機能を発揮することは、さらに驚くべきことであった。本明細書中には、テンサイプロテインキナーゼＣＫ２（以前は、カゼインキナーゼＩＩ）の触媒性αサブユニットの１つをコードするｃＤＮＡクローン（ＢｖＣＫＡ２）が記載される。ＢｖＣＫＡ２は、酵母のＮａＣｌに対する耐性を増大させる。さらに、テンサイにおけるＢｖＣＫＡ２の発現が、塩のストレスによって誘導されることが、本明細書中に示される。
【０００９】
さらに、それぞれテンサイのジヒドロオロターゼおよび翻訳開始因子１Ａとしての他の２つの遺伝子の同定は、非常に驚くべきことであった。なぜなら、植物ストレス分野の現在の技術水準において、ストレス耐性誘導因子のようなこのようなタンパク質の機能についての証拠が存在しないからである。
【００１０】
さらに、単離された遺伝子の２つが、ホモログが見い出され得なかったポリペプチドをコードしたことは驚くべきことであった。従って、これらの遺伝子は、異種の生物にストレスに対する耐性を付与するタンパク質の新規なタイプをコードする新規なタイプの遺伝子と考えられ得る。
【００１１】
本発明の全てのこれらの遺伝子は、発現可能なベクターの形式においてクローニングされ、そして植物においてトランスフェクトされた場合、そのトランスジェニック植物に対して、農学的に興味深い特徴を与え得る。
【００１２】
ＮａＣｌストレスに関する新規な植物遺伝子を同定するために、本発明者らは、酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅを用いる、既に利用されているストラテジー（Ｓｅｒｒａｎｏ、１９９６）を採用した。本発明者らは、塩のストレス下のテンサイからｃＤＮＡライブラリーを構築し、そしてこれを塩感受性酵母株中でスクリーニングした。酵母細胞中で発現される植物遺伝子のこのスクリーニングについての合理性は、酵母の塩耐性の分子機構のいくつかが、植物細胞の分子機構と同様であると考えられることである（Ｓｅｒｒａｎｏ、１９９６、Ｈａｓｅｇａｗａら、２０００ｂ）。テンサイは、比較的塩性の作物であり（Ｍａｒｓｃｈｎｅｒ、１９９５）、テンサイは、モデル植物Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓよりも耐塩性遺伝子のよりよい供給源であり得る。
【００１３】
従って、本発明は、配列番号６〜１０において与えられるようなアミノ酸配列を有する異なる５つのポリペプチドをコードする、配列番号１〜５において与えられるようなヌクレオチド配列を有する新規な５つのＢｅｔａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ遺伝子を具体化する。
【００１４】
本発明はさらに、配列番号１〜５における上述のような配列の少なくとも一部を含有する、ベクターまたは宿主細胞もしくは生物に関する。
【００１５】
さらに本発明の別の好ましい実施形態において、目的の生物（好ましくは、植物、酵母または細菌）に対してストレス耐性を付与する方法が提供され、その方法は、その生物において５つのテンサイ遺伝子の少なくとも１つの導入を包含する。
【００１６】
（発明の詳細な説明）
本発明の基礎となる問題の１つは、塩もしくは乾燥および／またはストレス条件（例えば、寒さ、冷却および凍結のストレスまたは酸化ストレス）によって引き起こされる、浸透圧性ストレスのようなストレス条件を被る生物のストレス耐性を増強させるために使用され得る遺伝子を提供することである。
【００１７】
本発明は、上記記載の問題に対する解決法を提供し、そして特許請求の範囲において特性付けられた以下の実施形態において開示される。
【００１８】
解決法は、Ｂｅｔａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ（ストレス耐性作物）が起源である遺伝子のセットを提供することによって達成され、この遺伝子のセットは、単離され、そしてこれは、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにストレス条件に対する耐性を付与する（例えば、Ｎａ＋感受性酵母株ＪＭ２６にストレス耐性を付与する遺伝子である）。これらの遺伝子が、全て同一の植物に由来するという事実に加えて、これらは、塩感受性酵母変異体に別々に形質転換された場合、全て塩耐性の表現型を示した。このようにすることによって、これら遺伝子の全ては、ストレス耐性の単独のエンハンサーとして作用した。予想に反して、これらの遺伝子は、カゼインキナーゼαサブユニット、ジヒドロオロターゼ、翻訳開始因子１Ａのような非常に異なる推定上の機能を有するタンパク質をコードし、そしてこれらのいくつかは、未知のタイプの機能でさえある。これらの遺伝子のいくつかが酵母中で示した非常に強力な塩耐性の表現型のような他の特徴、およびこれらの遺伝子のいくつかが酵母中の選択的なスクリーニング手順においてしばしば単離されるという事実は、ストレス耐性エンハンサーとしてのこれらの遺伝子の有効性および効率に寄与する。この遺伝子のセットは、当業者に目的の生物をストレス状況に対して耐性にさせるためにその生物を遺伝的に変えることを可能にする。例えば、作物の栽培について、作物の多くが、塩、乾燥または寒さのようなストレス条件に対して感受性であり、開示された遺伝子は、収穫量の減少および経済的利益の減少の問題を解決させるための可能性を提供する。この遺伝子のセットの各遺伝子は、細胞中にこれらの遺伝子の少なくとも１つを導入することによって、当業者に、細胞の運命ならびに／または植物の発育ならびに／または、植物の形態学および／もしくは生化学および／もしくは生理学を変更することを可能にする。
【００１９】
カゼインキナーゼＣＫ２（以前は、ＣＫＩＩ）は、セリン−トレオニンプロテインキナーゼであり、遍在しそして真核生物の間で高く保存される（Ｇｌｏｖｅｒ、１９９８）。それは、２つの触媒性のサブユニット（αまたはα’）および２つの調節性のサブユニット（β）から構成され、α２β２構造を採用するために四量体化する。プロテインキナーゼＣＫ２は、核内および細胞質の画分内の両方に局在化し、ここで、それが異なる細胞性機能に関わる種々の基質をリン酸化する。酵母において、ＣＫ２は、必須であり、そして以下の少なくとも４つの生物学的なプロセスのために必要である：凝集、細胞周期の進行、細胞極性およびイオンの恒常性。植物において、ＣＫ２が、細胞周期の調節（Ｅｓｐｕｎｙａら、１９９９）、植物成長の光調節（Ｌｅｅら、１９９９）および概日時計機能（Ｓｕｇａｎｏら、１９９８、Ｓｕｇｇａｎｏら、１９９９）に関与することが提案されている。植物カゼインキナーゼαサブユニットの異所性の発現とストレスとの間の関連は、全般にこれまでに証明されていない。
【００２０】
従って、本発明は、配列番号１として示され、さらにカゼインキナーゼα触媒性サブユニットをコードするクローン１５４として言及され、さらにＢｖＣＫＡ２として言及され、そして塩感受性酵母細胞において塩耐性を増強し得る、新規のテンサイの核酸に関連する。ヌクレオチド位置２０２で開始し、そして１２０３で停止する、オープンリーディングフレームは、配列番号６において示されるＢｖＣＫＡ２アミノ酸配列をコードする。
【００２１】
さらに、テンサイジヒドロオロターゼのような遺伝子の１つの同定は、非常に驚くべきことであった。なぜなら、植物ストレス分野の現在の技術水準において、ストレス耐性誘導因子としてのこのような酵素の機能についての証拠が存在しないからである。
【００２２】
従って、本発明は、配列番号２において示され、さらに、ジヒドロオロターゼをコードするクローン３５として言及され、さらにＢｖＤＨＯとして言及され、そして塩感受性酵母細胞において塩耐性を増強し得る、新規のテンサイの核酸に関連する。ヌクレオチド位置１９９で開始し、そして１２３６で停止する、オープンリーディングフレームは、配列番号７において示されるＢｖＤＨＯアミノ酸配列をコードする。
【００２３】
さらに、単独でストレス耐性エンハンサーとして機能する、テンサイの翻訳開始因子１Ａの単離は、非常に驚くべきことであった。細胞が、翻訳能力を変えるために転写因子のリン酸化を変化させることによってストレスに対して応答することは、公知であるが、生物においてトランスフェクトされた場合、翻訳因子が、それ自身で、その生物内でストレス耐性を増強することに寄与し得ることを、初めて示すことができた。
【００２４】
従って、本発明は、配列番号３として示され、さらに翻訳開始因子１Ａをコードするクローン７６として言及され、さらに塩感受性酵母細胞において塩耐性を増強し得るＢｖｅＩＦ−１Ａとして言及される、新規のテンサイの核酸に関連する。ヌクレオチド位置８８で開始し、そして５２１で停止する、オープンリーディングフレームは、配列番号８において示されるＢｖｅＩＦ−１Ａアミノ酸配列をコードする。
【００２５】
未知の機能を有するポリペプチドをコードされる２つの他の核酸は、酵母中でストレス耐性を付与することが見い出された。
【００２６】
従って、本発明は、配列番号４として示され、さらに未知のタンパク質をコードするクローン１２０として言及され、さらに塩感受性酵母細胞において塩耐性を増強し得るＢｖ１２０として言及される、新規のテンサイの核酸に関連する。ヌクレオチド位置２９で開始し、そして４９９で停止する、オープンリーディングフレームは、配列番号９に示されるＢｖ１２０アミノ酸配列をコードする。
【００２７】
さらに、本発明は、配列番号５として示され、さらに未知のタンパク質をコードするクローン２０Ｌｉとして言及され、さらに塩感受性酵母細胞において塩耐性を増強し得るＢｖ２０Ｌｉとして言及される、新規のテンサイの核酸に関連する。ヌクレオチド位置１で開始し、そして８７９で停止する、オープンリーディングフレームは、配列番号１０において示されるＢｖ２０Ｌｉアミノ酸配列をコードする。
【００２８】
本発明の第１の局面は、上述のように、ＮａＣｌ誘導性のテンサイの葉に由来するｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング、そして引き続く５つのテンサイ遺伝子の単離の手順である。塩のストレスに対する植物の応答に関連されるテンサイタンパク質の同定のための機能的なアプローチが続く。この目的のために、ＮａＣｌ誘導性のｃＤＮＡ発現ライブラリーは、実施例１および実施例３において記載されるようにテンサイの葉から構築され、そしてＮａ＋感受性酵母変異株ＪＭ２６（実施例２を参照のこと）を、過剰発現の際に酵母塩耐性が増強するテンサイｃＤＮＡについてスクリーニングするために使用した。この酵母変異体の増殖は、通常、大部分の作物種の成長を害する濃度と同様のＮａＣｌ濃度（１５０ｍＭ）で阻害される。このスクリーニング手順は、実施例４において記載される。ｃＤＮＡ挿入物を含むプラスミドｐＹＰＧＥ１５を用いて１００，０００の個々の細胞を形質転換した後、コロニーをプールして、１５０ｍＭのＮａＣｌの存在下で増殖するそれらの能力について選択した（実施例４を参照のこと）。ポジティブなクローンの内の４つを、クローン１５４、クローン３５、クローン７６およびクローン１２０と命名した。
【００２９】
酵母のクローン１５４、クローン３５、クローン７６およびクローン１２０は、明らかな塩耐性の表現型を有し、そして表現型は、再現性が高かった：１５０ｍＭのＮａＣｌ下でのコントロール酵母細胞は、少しも増殖せず、そして挿入物１５４、３５、７６または１２０を過剰発現する酵母細胞は、増殖した。塩耐性酵母クローンの選択の間、クローン３５および７６は、それぞれ２回および３回ずつ選択され、このことは塩のストレスを加えられたテンサイの葉におけるこれらのクローンの大量の存在を示唆する。
【００３０】
同一の選択的なスクリーニングの手順をまた、Ｌｉ＋に耐性の酵母細胞を選択するために実施した。テンサイｃＤＮＡライブラリーの形質転換の後、コロニーをプールして、実施例４中に記載されるようにメチオニンを用いない２０ｍＭのＬｉＣｌの存在下で増殖するそれらの能力について選択した。ポジティブなクローンの１つを、２０Ｌｉと命名した。クローン２０Ｌｉは、強力なＬｉ＋耐性の表現型を示した。
【００３１】
強力な表現型の定義は、滴下試験（ｄｒｏｐ  ｔｅｓｔ）の実験に基づく。飽和した培養物のいくつかの希釈溶液（１：１０、１：１００、１：１０００）を、作製し、そしてこれらを、選択培地（１５０ｍＭのＮａＣｌ＋メチオニン、またはメチオニンを含まない２０ｍＭのＬｉＣｌ）上で増殖させた。強力な表現型は、アッセイされた希釈溶液の全てにおいて十分に増殖したそれらのクローンである（例えば、ＮａＣｌに対してクローン３５、７６、１２０およびＬｉＣｌに対してクローン２０Ｌｉ）。クローン１５４は、酵母中でこのような非常に強力な表現型を有さなかった。なぜなら、第１希釈溶液（１：１０）のみが、選択培地中で増殖し得たからである。空のプラスミドを発現するコントロール細胞は、選択培地内で全く増殖しなかった。
【００３２】
従って、本発明の第１の実施形態は、酵母細胞に対してストレス耐性を付与するＢｅｔａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ遺伝子の少なくとも１つの発現を包含する、生物におけるストレス耐性の誘導のための方法に関連する。
【００３３】
別の実施形態において、本発明は、植物においてストレス耐性を増強するためのＢｅｔａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ核酸の使用に関連し、この使用は、その核酸が酵母細胞（例えば、Ｎａ＋感受性酵母株ＪＭ２６に由来する酵母細胞）に対してストレス耐性を付与するとして特性付けられる、該Ｂｅｔａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ核酸の発現を包含する。
【００３４】
さらなる実施形態において、本発明は、生物における浸透圧性ストレスの耐性の誘導のための方法であり、この方法は、酵母細胞に対して、塩のストレス耐性または乾燥のストレス耐性または霜のストレス耐性のような、浸透圧性ストレス耐性または酸化ストレス耐性を付与する、Ｂｅｔａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ遺伝子の少なくとも１つの発現を包含する。
【００３５】
本明細書で使用される場合、語句「ストレス耐性の誘導」とは、「ストレス耐性の強化」と同じ意味を有し、したがってこれらの語句は互いに交換可能に用いら得る。
【００３６】
選択されたクローンの全ては、以下により詳細に記載される。可能な相同物を発見するため、（推定上の）ＯＲＦのアミノ酸配列を、ＢｌａｓｔＰ  ２．０．１０プログラム（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、１９９７）を用いて行う、相同性検索に供した。
【００３７】
クローン１５４中に存在するプラスミドのｃＤＮＡ挿入物は、３９．４ｋＤの予測分子量を有する、３３３アミノ酸のポリペプチド（配列番号６）をコードする９９９塩基対のオープンリーディングフレームを有する１５２７塩基対のｃＤＮＡ（配列番号１）を含む。ＢｖＣＫＡ２と名付けられたこのポリペプチドは、Ｚｅａ  ｍａｙｓ由来プロテインキナーゼＣＫ２（ＺＭＣＫＡ２）の触媒サブユニットの１つ（α鎖２）と９１．６％の同一性を有する。ＢｖＣＫＡ２は、真核生物プロテインキナーゼの１１の典型的なサブドメイン（Ｈａｎｋｓら、１９９５）およびＣＫ２触媒サブユニットの特徴である保存的アミノ酸残基の全てを含む（図１）。触媒部位に存在する１７０−ＤＷＧ−１７２は、ＣＫ２αサブユニットにとって不変のフィンガープリントパターンである（Ｎｉｅｆｉｎｄら、１９９８）。また、ＢｖＣＫＡ２の中には、必須の触媒リシン（６３−Ｋ）および高度な塩基性領域（６９−ＫＫＫＫＩＫＲ−７５）がある。クローン３５中に存在するプラスミドのｃＤＮＡ挿入物は、４０．８ｋＤの予測分子量を有する３４５アミノ酸のポリペプチド（配列番号７）をコードする１０３５塩基対のオープンリーディングフレームを有する１７４３塩基対のｃＤＮＡ（配列番号２）を含む。ＢｖＤＨＯと名付けられたこのポリペプチドは、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ由来プロテインジヒドロオロターゼの前駆体と７９％の同一性を有し、そしてジャガイモのジヒドロオロターゼと８１％の同一性を有する（ＷＯ０１１８１９０、ＷＯ０１１４５６９）。クローン７６中に存在するプラスミドのｃＤＮＡ挿入物は、１７ｋＤと予測分子量を有する１４４アミノ酸のポリペプチド（配列番号８）をコードする４３２塩基対のオープンリーディングフレームを有する６４３塩基対のｃＤＮＡ（配列番号３）を含む。ＢｖｅＩＦ−１Ａと名付けられたこのポリペプチドは、Ｏｎｏｂｒｙｃｈｉｓ  ｖｉｃｉｉｆｏｌｉａ（普通のイガマメ）由来の真核生物翻訳開始因子１Ａ（ｅｌＦ−１Ａまたは、以前はｅｉＦ−４Ｃとして知られていたもの）の前駆体と８８％の同一性を有する。クローン１２０中に存在するプラスミドのｃＤＮＡ挿入物は、１８．５ｋＤの予測分子量を有する、Ｂｖ１２０と名付けられた１５６アミノ酸のポリペプチド（配列番号９）をコードする４６８塩基対のオープンリーディングフレームを有する８４５塩基対のｃＤＮＡ（配列番号４）を含む。クローン２０Ｌｉ中に存在するプラスミドのｃＤＮＡ挿入物は、３４．５ｋＤの予測分子量を有する２９２アミノ酸のポリペプチド（配列番号１０）をコードする８７６塩基対の推定オープンリーディングフレームを有する８７９塩基対のｃＤＮＡ（配列番号５）を含む。Ｂｖ２０Ｌｉと名付けられたこのポリペプチドは、機能が記載されていないＡｒａｂｉｓｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａのゲノムクローンから予測されるタンパク質と５９％の同一性を有する。
【００３８】
従って、さらなる実施形態において、本発明は、植物において浸透圧ストレス耐性または酸化ストレス耐性を強化するためのＢｅｔａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ核酸の使用に関し、ここで上記のＢｅｔａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ核酸は、以下の内の一つから選択される：
（ａ）配列番号１〜５のいずれかとして与えられるＤＮＡ配列またはその相補体を含む核酸、
（ｂ）配列番号１〜５のいずれかに対応するＲＮＡ配列またはその相補体を含む核酸、
（ｃ）高いストリンジェンシー条件下で（ａ）または（ｂ）に記載の核酸に対し特異的にハイブリダイズする核酸、
（ｄ）配列番号６に与えられるアミノ酸配列に対し、少なくとも９３％、好ましくは少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする核酸、
（ｅ）配列番号７に与えられるアミノ酸配列に対し、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８２％、８５％、または９０％、より好ましくは少なくとも９５％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする核酸、
（ｆ）配列番号８に与えられるアミノ酸配列に対し、少なくとも８９％、好ましくは９０％、９２％、９５％または９６％、より好ましくは９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする核酸、
（ｇ）配列番号９に与えられるアミノ酸配列に対し、少なくとも７５％、好ましくは８０％、８５％または９０％、より好ましくは９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする核酸、
（ｈ）配列番号１０に与えられるアミノ酸配列に対し、少なくとも６５％、好ましくは７０％、７５％、８０％、８５％または９０％、より好ましくは９５％、９６％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする核酸、
（ｉ）配列番号６〜１０のいずれかとして与えられるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする核酸、
（ｊ）配列番号１〜５のいずれかとして与えられるＤＮＡ配列によってコードされる免疫学的に活性なタンパク質および／またはこのタンパク質の機能的フラグメントをコードする核酸、
（ｋ）遺伝コードの結果として、配列番号１〜５のいずれかとして与えられる核酸に縮重される核酸、または（ａ）〜（ｊ）のいずれかに規定される核酸に縮重される核酸、
（ｌ）生物体の間のコドン利用における差異の結果として、配列番号６〜１０のいずれかとして与えらるタンパク質をコードする核酸から分岐する核酸、または（ａ）〜（ｊ）のいずれかとして規定される核酸から分岐する核酸、
（ｍ）対立遺伝子の間の差異の結果として、配列番号６〜１０のいずれかとして与えらるタンパク質をコードする核酸から分岐する核酸、または（ａ）〜（ｊ）のいずれかに規定される核酸から分岐する核酸、および
（ｎ）上記の核酸が、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたは合成ＤＮＡであることで特徴付けられる（ａ）〜（ｍ）のいずれか１つとして規定される核酸
さらに、本発明の一つの実施形態は、植物または植物群においてストレス耐性を強化するための方法であって、この方法は、上記の植物または植物群の細胞、組織または部分において上記に記載された核酸の少なくとも一つの発現を包含する。
【００３９】
また、既に本発明に従って核酸を既に発現した植物について、本発明の別の実施形態は、上記の植物におけるストレス耐性を変更するための方法であって、この方法は上記の植物中の細胞、組織または部分における本発明の核酸の発現の変更を包含する。
【００４０】
興味深い実施形態において、本発明は、生物体（例えば植物）におけるストレス耐性の誘導のための方法に関し、この方法はカゼインキナーゼαサブユニット（例えば、上記の生物体の細胞、組織または一部における植物カゼインキナーゼαサブユニット）をコードする核酸の発現または発現の変更を包含する。より好ましくは、本発明は、生物体（例えば、植物、酵母、または細菌）への、浸透圧、塩、Ｎａ＋またはＬｉ＋に対するストレス耐性の誘導のための方法に関し、この方法は植物カゼインキナーゼαサブユニット（例えば、砂糖大根のカゼインキナーゼαサブユニットまたはその相同体もしくはオルソログ）の発現を包含する。好ましい実施形態において、本発明は、植物（例えば、コメ）におけるＮａ＋耐性の誘導のための方法に関し、この方法は砂糖大根のカゼインキナーゼαサブユニットの発現を包含する。
【００４１】
本発明の興味深い実施形態において、上記の植物カゼインキナーゼαサブユニットは、配列番号１および６で表される。
【００４２】
別の実施形態に従って、本発明は、植物の開花過程の制御するためのカゼインキナーゼの使用に関する。本発明者らは、驚くべきことに、カゼインキナーゼαサブユニット（例えば、本発明によって同定された砂糖大根カゼインキナーゼαサブユニット）の過剰発現が日光とは独立に、開花過程への影響を有することを発見した。
【００４３】
本発明は従って、植物の開花過程を制御するための方法に関し、この方法は植物の細胞、組織または上記の一部においてカゼインαサブユニット（例えば、配列番号６で表される）をコードする核酸の発現または発現の変更を包含する。
【００４４】
従って、本発明はまた植物の開花過程を制御するためのカゼインαサブユニット（例えば、配列番号６で表される）をコードする核酸の使用に関する。
【００４５】
さらに、本発明の好ましい実施形態は、生物体（例えば、植物）においてストレス耐性を強化するための方法に関し、この方法は上記の生物体もしくは植物の細胞，組織または一部においてジヒドロオロターゼをコードする核酸の発現または発現の変更を包含する。
【００４６】
より好ましくは、本発明は、生物体（例えば、植物、酵母、または細菌）における、浸透圧、塩、Ｎａ＋またはＬｉ＋に対するストレス耐性の誘導のための方法に関し、この方法は植物ジヒドロオロターゼ（例えば、砂糖大根の、またはそれらの相同体もしくはオルソログまたはパラログ（ｐａｒａｌｏｇｕｅ）ジヒドロオロターゼ）の発現を包含する。好ましい実施形態において、本発明は、植物（例えば、コメ）に対するＮａ＋耐性の誘導のための方法に関し、この方法は、砂糖大根のジヒドロオロターゼの発現を包含する。本発明の興味深い実施形態において、上記のジヒドロオロターゼは、配列番号２および７によって表わされる。別の実施形態において本発明は、生物体（例えば植物）においてストレス耐性の誘導のための方法に関し、この方法は上記の生物体の細胞、組織または一部における翻訳開始因子１Ａをコードする核酸の発現または発現の変更の方法を包含する。より好ましくは、本発明は、生物体（例えば、植物、酵母、または細菌）における、浸透圧、塩、Ｎａ＋またはＬｉ＋に対するストレス耐性の誘導のための方法に関し、この方法は植物転写開始因子１Ａ（例えば、砂糖大根、またはそれらの相同体、オルソログもしくはパラログの転写開始因子１Ａ）の発現を包含する。本発明の好ましい実施形態は、植物（例えばコメ）におけるＮａ＋耐性の誘導のための方法に関し、この方法は砂糖大根の転写開始因子１Ａの発現を包含する。本発明の興味深い実施形態において、上記の転写開始因子１Ａは、配列番号３および８で表わされる。
【００４７】
別の実施形態において、本発明は、植物におけるストレス耐性を強化するための方法に関し、この方法は配列番号４もしくは５によって表わされる核酸、またはその相同体、オルソログもしくはパラログの核酸の発現または発現の変更を包含する。
【００４８】
本発明はまた、以下の群から選択される免疫学的に活性なタンパク質および／またはこのようなタンパク質の機能的フラグメントをコードする単離された核酸に関し：
（ａ）配列番号１〜５のいずれかとして与えられるＤＮＡ配列またはその相補体を含む核酸、
（ｂ）配列番号１〜５のいずれかに対応するＲＮＡ配列またはその相補体を含む核酸、
（ｃ）高いストリンジェンシー条件下で（ａ）または（ｂ）に規定されるヌクレオチド配列に対し、特異的にハイブリダイズする核酸、
（ｄ）配列番号６に与えられるアミノ酸配列に対し、少なくとも９３％、好ましくは少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする核酸、
（ｅ）配列番号７に与えられるアミノ酸配列に対し、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８２％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする核酸、
（ｆ）配列番号８に与えられるアミノ酸配列に対し、少なくとも８９％、好ましくは少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする核酸、
（ｇ）配列番号９に与えられるアミノ酸配列に対し、少なくとも７５％、好ましくは少なくとも７８％、８０％、８５％、８７％、８９％、９１％、９３％、９６％、９５％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする核酸、
（ｈ）配列番号１０に与えられるアミノ酸配列に対し、少なくとも６５％、好ましくは少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を有するタンパク質の少なくとも一部をコードする核酸、
（ｉ）配列番号６〜１０のいずれかとして与えられるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする核酸、
（ｊ）配列番号１〜５のいずれかとして与えられるＤＮＡ配列によってコードされる免疫学的に活性なタンパク質および／またはこのタンパク質の機能的フラグメントをコードする核酸、
（ｋ）遺伝コードの結果として、配列番号１〜５のいずれかとして与えられる核酸に縮重される核酸、または（ａ）〜（ｊ）のいずれかとして規定される核酸に縮重される核酸、
（ｌ）生物体の間のコドン利用における差異の結果として、配列番号６〜１０のいずれかとして与えらるタンパク質をコードする核酸から分岐する核酸、または（ａ）〜（ｊ）のいずれかとして規定される核酸から分岐する核酸、
（ｍ）対立遺伝子の間の差異の結果として、配列番号６〜１０のいずれかとして与えられるタンパク質をコードする核酸から分岐する核酸、または（ａ）〜（ｊ）のいずれかに規定される核酸から分岐する核酸、および
（ｎ）上記の核酸が、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたは合成のＤＮＡであることで特徴付けられる（ａ）〜（ｍ）のいずれか１つとして規定される核酸
酵母における相同体を有するため、クローン１５４（配列番号１）を、さらなる特性付けのために選んだ。多くの情報は、酵母およびその他の生物体（例えば、酵母ＣＫ２サブユニットの変異体）におけるＣＫ２について、利用できる。
【００４９】
砂糖大根ゲノム中のＢｖＣＫＡ２の存在を確認し、そしてこの植物種におけるＣＫ２触媒サブユニットをコードする遺伝子の数を評価するために、本発明者らは、サザンブロット分析を行った。実施例８に記載されるように、本発明者らは、ＢｖＣＫＡ２のＯＲＦを含むフラグメントを用いてゲノムの砂糖大根ゲノムＤＮＡを初めにハイブリダイズした（図２Ａ）。ゲノムＤＮＡを消化するために使用される制限エンドヌクレアーゼに影響されないすべてのレーンにおけるいくつかのハイブリダイゼーションフラグメントの存在は、ＣＫＡ２が砂糖大根における多コピー型（ｍｕｌｔｉｃｏｐｙ）遺伝子ファミリーのメンバーであることを示唆する。本発明者らが用いたハイブリダイゼーションプローブは、触媒サブユニットの異なるアイソフォームをコードする遺伝子を含む、ＣＫ２ファミリーのすべてのメンバーを認識し得る。より特異的なプローブが、ハイブリダイゼーションに使用された場合、ＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ消化による２つのバンド、およびＥｃｏＲＩ消化による１つのバンドのみが、検知され得る（図２Ｂ）。このことは、砂糖大根におけるＣＫ２触媒サブユニットをコードする２つの非常に密接に関連した遺伝子の存在を示唆し得る。
【００５０】
酵母にストレス耐性を賦与するＢｖＣＫＡ２遺伝子の機能性を確認するために、酵母ＣＫ２変異体の相補性を、実証した（実施例６）。
【００５１】
酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおいて、ＣＫ２は、増殖のために必須であり、関連する２つの触媒サブユニットをコードする、２つの重複遺伝子、ＣＫＡ１およびＣＫＡ２が存在する（Ｐａｄｍａｎａｂｈａら、１９９０）。ＹＤＨ８は、熱感受性ｃｋａ２サブユニット（ｐＤＨ８）を有するプラスミドを保有する、ｃｋａ１／ｃｋａ２二重変異酵母株である。ＢｖＣＫＡ２が、ＹＤＨ８株の熱感受性表現型を抑圧し得るか否かを決定するために、本発明者らは、プラスミドｐＹＰＧＥ１５＋ＢｖＣＫＡ２を用いてＹＤＨ８細胞を形質転換した。ＹＤＨ８株は、許容温度の２５℃でのみ増殖し得るが、ＢｖＣＫＡ２を過剰発現するＹＤＨ８は、２５℃および３７℃で増殖し得た（図３）。ＢｖＣＫＡ２はまた、ｃｋａ１，２変異株の表現型の他の特質（凝集など）を補完し得た（データは示さない）。最後に、ｐＤＨ８プラスミドが取り出され、そして細胞が、ＢｖＣＫＡ２のみを発現した場合、この植物酵素は、２５℃および３７℃における酵母の増殖を支持し得た（データは示さない）。これらの結果は、ＢｖＣＫＡ２がＣＫ２の酵母触媒サブユニットを機能的に置換し得ることを、明瞭に示唆し、そしてこれは、ＣＫ２が、両方の生物体において関連する過程を調節していることを示唆し得る。
【００５２】
ＢｖＣＫＡ２遺伝子のクローニングを例示する、本発明のこれらの局面に従って、本発明は、本発明の核酸と特異的にハイブリダイズする少なくとも１５ヌクレオチド長の核酸分子を言及する。
【００５３】
関連する好ましい実施形態において、本発明はまた、本発明の核酸を特異的に増幅する少なくとも１５ヌクレオチド長の核酸分子にを言及する。
【００５４】
本発明の別の好ましい実施形態は、上記に規定された核酸の配列を含むベクター（例えば、発現ベクター）であり、ここで、核酸配列は、原核生物および／または真核生物の宿主細胞において上記の配列の発現を可能にする１つ以上の制御配列に対し作動可能的に連結される。
【００５５】
本発明のさらなる関連する実施形態は、上記に規定される核酸分子または上記に規定されるベクターを含む宿主細胞であり、このような宿主細胞は、例えば、細菌細胞、昆虫細胞、真菌細胞、植物細胞または動物細胞が挙げられる。
【００５６】
ＢｖＣＫＡ２遺伝子の機能性はまた、実施例７に記載されるＮａＣｌを有する培地におけるＮａ＋感受性酵母株ＪＭ２６（実施例２）の増殖の実証によって確認された。
【００５７】
ＣＫ２の非必須β制御サブユニットの欠損体（ｄｅｆｅｃｔｉｖｅ）である、この酵母変異株は、Ｎａ＋およびＬｉ＋に対する過敏症の表現形を示す（Ｂｉｄｗａｉら、１９９５、Ｎａｄａｌら、１９９９ｂ）。砂糖大根触媒α２サブユニット（ＢｖＣＫＡ２）および、実施例５において記載されたようにクローン化された酵母触媒サブユニット（ＳｃＣＫＡ２）の１つの、両方の過剰発現は、ＪＭ２６酵母細胞のＮａ＋耐性を高めた（図４）。これは、Ｎａ＋耐性におけるＣＫ２の特異的な効果を示す。ＢｖＣＫＡ２を過剰発現する酵母細胞の高められたＮａ＋耐性はまた、液体培養において実証され得る。
【００５８】
上記で言及される砂糖大根遺伝子の過剰発現の機能的効果はまた、恐らく、これらの遺伝子によって産生されるまたは合成的方法によって生成される単離されるポリペプチドの適用によっても獲得され得る。
【００５９】
従って、本発明はまた、上記に記載されるような本発明の核酸によってコードされ得る、単離されたポリペプチド、もしくはその相同体またはその誘導体、あるいはその免疫学的に活性なフラグメントおよび／またはその機能的フラグメントに関し、このポリペプチドは、好ましくは配列番号６−１０のいずれかとして与えられるアミノ酸配列、もしくはその相同体またはその誘導体、あるいはその免疫学的に活性なフラグメントおよび／またはその機能的フラグメントとして与えられるアミノ酸配列を有する。
【００６０】
本発明の関連する好ましい実施形態はまた、上記で言及されるようなポリペプチドを生成するための方法であり、この方法は、ポリペプチドの発現を許容する条件下での、上記で言及されるような宿主細胞の培養すること、および培養液からの産生されたポリペプチドの回収することを包含する。
【００６１】
砂糖大根遺伝子の発現において見られる機能的効果はまた、これらの遺伝子によって生成されるポリペプチドに結合するタンパク質によって影響され得る。従って、さらに別の好ましい実施形態において、本発明は、上記で言及されるようなポリペプチドまたは上記のポリペプチドの特定のエピトープを特異的に認識する抗体に関する。
【００６２】
ＢｖＣＫＡ２により賦与される塩耐性の機構が、イオンホメオスタシスの調節に起因するかどうかを調査するために、Ｎａ＋およびＫ＋の存在下で増殖中の細胞におけるこれらのイオンの細胞内レベル（表１）を、実施例７に記載されるように決定した。ＢｖＣＫＡ２の発現は酵母細胞におけるＮａ＋およびＫ＋含有量を有意に変化しなかったことを、、決定した。
【００６３】
【表１】
2004524015.tif 000002
酵母において、ＣＫ２（ＣＫＢ１）のβ調節サブユニットにおける変異体は、Ｎａ＋およびＬｉ＋に対し非常に感受性であることが示されてきた（Ｂｉｄｗａｉら、１９９５、Ｎａｄａｌら、１９９９ａ）。本発明の１つの局面は、酵母のみならず、植物ＣＫ２α触媒サブユニットの過剰発現もまた、酵母のＮａ＋に対する耐性を高めることである。ＣＫ２活性の減少が、ＮａＣｌに対する感受性を増大する（ｃｋｂ１酵母変異体）のみならず、塩耐性を改良するＣＫ２活性もまた増大するので、ＣＫ２は、酵母における塩耐性の重要な決定因子となることが可能である。しかしながら、ＣＫ２が酵母の塩耐性を制御し得る機構は知られていない。最近、発表されたデータは、ＣＫ２が酵母におけるＮａ＋流出についての主要な決定因子であるＥＮＡ１  ＡＴＰａｓｅの転写を制御したことを示唆する（ＴｅｎｅｙおよびＧｌｏｖｅｒ、１９９９）。本発明の局面の１つは、ＢｖＣＫＡ２によって賦与される塩耐性が、これらの細胞におけるＮａ＋ホメオスタシスの調節と関係ないことが実証されたので、これとは反対の教示をする。さらに、ＢｖＣＫＡ２の過剰発現は、Ｎａ＋流出に関与する主要な２つの輸送システム（ＥＮＡ１−４  ＡＴＰアーゼおよびＮａ＋／Ｈ＋対向輸送機構ＮＨＡ１）を欠損するＪＭ２６酵母変異体の塩耐性を改良することが、示された。さらに、細胞内Ｎａ＋およびＫ＋の測定は、コントロールとＣＫＡ２過剰発現細胞との間に有意な差異を示さなかった（表１）。空胞Ｎａ＋／Ｈ＋対向輸送機構ＮＨＸを欠損する酵母細胞はまた、ＣＫＡ２を過剰発現した場合、ＮａＣｌを有する培地において増殖の改善を示し、このことはＣＫ２が空胞の隔離を通してＮａ＋の細胞質レベルを変えるという可能性を除外する（データは示さない）。これに従って、Ｎａｄａｌら（１９９９ｂ）は、酵母ｃｋｂ１変異体の塩感受性がナトリウムの流れの欠損に起因しないことを示した。これらの著者らは、ＣＫ２が、リン酸化によって塩感受性である細胞機構の重要な構成要素のＮａ＋感受性を減少し得ると仮定した。多くの基質（転写因子、タンパク質キナーゼおよびトポイソメラーゼを含む）が推定上のＣＫ２リン酸化部位を有することが見出されているので（Ｇｒｅｉｎら、１９９９）、このような塩毒性の推定上の標的を見つけることは難しい。
【００６４】
ＢｖＣＫＡ２が、塩ストレスに対する砂糖大根植物の応答に関与することを確かめるために、ＮａＣｌへの種々の曝露時間に対するＢｖＣＫＡ２  ｍＲＮＡの蓄積を分析した。ＣＫＡ２特異的プローブを使用するＲＮＡゲルブロットは、ＢｖＣＫＡ２  ｃＤＮＡのサイズに対応する唯一のバンド（１．５ｋｂ）を示した。図５に示されるように、ＢｖＣＫＡ２  ｍＲＮＡは、ＮａＣｌ処理の時間に伴い蓄積され、そして２４時間目に最大量に達した。増加量は、コントロール植物と比較して約３倍であった。ストレス耐性に関与する遺伝子の検索に使用される砂糖大根ｃＤＮＡライブラリーはまた、ＮａＣｌを用いて２４時間処理された植物から得られたことに注目することは興味深い。
【００６５】
ＢｖｅＩＦ−１Ａが塩ストレスに対する酵母細胞の応答に関与することを確かめるために、タンパク質へのフェニルアラニンの取り込みを測定した。本発明者らは、塩ストレス条件下においてＢｖｅＩＦ−１ＡをコードするｃＤＮＡを用いて形質転換した酵母細胞におけるフェニルアラニンの取り込みが、空のベクターによって形質転換された細胞より高いことを、観察した（実施例１２）。これらの結果は、ｅｌＦ−１ａが、ストレス耐性に対し直接的に関与することを実証する。さらに、これらの結果は、このｃＤＮＡ（配列番号Ｎｒ．３に従う）の過剰発現が、塩ストレス条件下における翻訳を改善し得ることを示す。
【００６６】
これらの新しい知見は、翻訳開始因子がストレス耐性を改善することを示す初めての証拠であるため、非常に興味深い。
【００６７】
本発明の砂糖大根遺伝子は、相同な酵母中にトランスフェクトされる場合、これにストレス耐性を賦与することが示された。
【００６８】
さらに、本発明の砂糖大根遺伝子は、植物に、トランスフェクトされる場合、これにストレス耐性を賦与することが示された（実施例１０）。
【００６９】
これらの遺伝子のさらなる作物学的な興味深い適用は、好ましくない（ｕｎｆｕｎａｔｅ）成長条件に対するさらなる耐性を作物植物に与えるために、これらの遺伝子を作物植物にトランスフェクトすることである。イネ植物は、イネ植物に対し塩耐性を賦与し得る、本発明の少なくとも１つの砂糖大根遺伝子（実施例９）を用いてトランスフェクトされ得る。この適用は、土壌中の灌漑用水に由来する塩の堆積および蓄積によって引き起こされる、ひどく灌漑された土地でのコメの産出高の減少に対する解決を与える。
【００７０】
本発明の上記で言及された局面に従って、植物内（ｉｎ  ｐｌａｎｔａ）のストレス状況に対する生理的な応答における砂糖大根遺伝子の記載される効果について、本発明はまた、トランスジェニック植物、植物細胞または植物組織の産生のための方法に関し、この方法は、上記で規定されたような発現可能な形態またはベクターとして、上記で規定されたような核酸分子の上記の植物、植物細胞または植物組織への導入を包含する。
【００７１】
さらに、変更された植物、植物細胞または植物組織の産生のための方法は、本発明の範囲内であり、この方法は、本発明のポリペプチドを上記の植物の細胞、組織または器官への直接的な導入を包含する。
【００７２】
さらなる実施形態において、本発明は、植物細胞、組織または植物におけるストレス耐性を強めるための方法に関し、この方法は、上記で言及された任意の核酸の上記の植物の上記の植物細胞、組織または器官への導入を包含する。
【００７３】
さらに、本発明は、好ましい実施形態において上記で言及されたポリペプチドの発現を達成するための方法を提供し、この方法は、上記で規定されるような１つ以上の制御配列またはベクターと必要に応じて作動可能的に連結され、植物細胞のゲノム中に安定する、本発明の核酸の導入を包含する。さらに関連する実施形態は、本発明は、上記の方法を提供し、この方法は、上記植物細胞から植物を再生することをさらに包含する。
【００７４】
さらなる実施形態において、本明細書に開示される本発明は、トランスジェニック植物細胞に関し、上記に記載される方法によって入手できる、植物細胞またはトランスジェニック植物細胞中の上記の核酸の転写および／または発現を許可する調節要素と作動可能的に連結される本発明の核酸配列を含有する。さらに、このトランスジェニック植物細胞は、そのゲノムに安定に統合された本発明の格さんを有し得る。また、トランスジェニック植物または植物細胞は、本発明の範囲内であり、上記に記載されるような植物細胞を含有し、そして、さらに、このトランスジェニック植物は、ストレス、好ましくは浸透圧ストレス（例えば、塩）、Ｎａ＋ストレス、Ｌｉ＋ストレス、干ばつストレス、低温ストレスまたは凍結ストレスあるいは酸化ストレスに対し、対応する野生型植物と比較して増大した耐性を示し得る。本発明の関連する実施形態は、このような植物の収穫できる部分であり、これは、種、葉、果実、花茎節培養（ｓｔｅｍ  ｃｕｌｔｕｒｅ）、根茎および鱗茎あるいは上記に記載された任意の植物または植物の一部に由来する子孫（ｐｒｏｇｅｎｙ）からなる群より選択され得る。
【００７５】
本発明の砂糖大根遺伝子はそれらの相同的な生育環境に機能的に制限されないことが実証されたので、本発明の範囲はまた、生物体におけるストレス耐性を変更するための方法に関し、この方法は、上記の生物体の細胞、組織または一部における本発明の核酸の発現または発現の変更を包含する。
【００７６】
当業者により公知ように、塩ストレスに関与する多くの遺伝子はまた、他のストレス状況に対する応答に関与する。従って、本発明はまた、トランスジェニック細胞、トランスジェニック植物、または他のトランスジェニック生物体を生成するための上記で言及された方法に関し、ここで、上記のストレスは、浸透圧ストレス、塩ストレス、干ばつストレス、凍結ストレスもしくは低温ストレス、または酸化ストレスであり得る。
【００７７】
本発明の最も実用的な適用として、新規の技術が、形質転換された生物体に対する有益な効果をもたらすために使用され得る。従って、最も好ましい実施形態において、本発明は、上記で言及された任意の方法に従う方法に関し、収穫の増加を導く上記の方法、およびさらに、上記の核酸の発現が、プロモーターの制御下において生じる方法に関する。上記のプロモーターは、構成プロモーターまたは誘導性プロモーターであり得る。この場合、遺伝子の細胞特異的発現、組織特異的発現または器官特異的発現が求められるとき、細胞特異的プロモーター、組織特異的プロモーターまたは器官特異的なプロモーターが、使用される。本発明の方法において使用され得るプロモータの実施例の網羅的な、しかし非制限的なリストが、表４に提供される。  酵母に関しては、概日時計の調節に関与するＣＣＡ１（Ｓｕｇａｎｏら、１９９９）のような転写因子、または光誘導性遺伝子の発現を調節するＧＢＦ１（ＤｏｎａｌｄおよびＣａｓｈｍｏｒｅ  １９９０）を含む、植物ＣＫ２に対する多くの相互作用パートナーが、推論されてきた。興味深いことに、塩ストレスによって誘導される２つのタンパク質キナーゼ、ＡＴＰＫ１９およびＡＴＰＫ６、もまた推定ＣＫ２リン酸化部位を含む（Ｍｉｚｏｇｕｃｈｉら、１９９５）。
【００７８】
従って、本発明の好ましい実施形態は、スクリーニングアッセイを含む本発明のポリペプチドに相互作用するタンパク質の同定および獲得のための方法であり、ここで本発明のポリペプチドが使用される。この方法は、例えばツーハイブリッドスクリーニングアッセイを包含し得、ここで本発明のポリペプチドはおとり（ｂａｉｔ）として、およびｃＤＮＡライブラリーはえさ（ｐｒｅｙ）として使用され得る。
【００７９】
また、本発明のポリペプチドと上記に記載される方法により得られる相互作用タンパク質パートナーとの間の相互作用の調節のための方法は、本発明の範囲内である。さらに、本発明は、本発明のポリペプチドと相互作用する化合物を同定し、獲得するための方法を具体化し、この方法は以下の工程を包含する：
（ａ）ツーハイブリッド系を提供する工程であって、ここで本発明のポリペプチドおよび上記に記載される方法により得られる相互作用タンパク質パートナーが、発現される工程、
（ｂ）上記の化合物を、ａ）において規定される発現ポリペプチドによって形成される複合体と相互作用させる工程、
（ｃ）上記の化合物の上記のポリペプチドまたは（ａ）に規定される発現ポリペプリドによって形成される複合体との相互作用の測定を行う工程。
【００８０】
さらに、本発明は、本発明のポリペプチドに特異的に結合する化合物または化合物の混合物を同定するための方法を具体化し、この方法は、以下を包含する：
（ａ）複合体の形成を許容する適当な条件下で、本発明のポリペプチドを、上記の化合物または化合物の混合物と合わせる工程、および、
（ｂ）複合体形成を検知する工程であって、ここで複合体の存在は、上記のポリペプチドに特異的に結合する化合物または化合物の混合物を同定する工程。
【００８１】
本発明のポリペプチドのこれらの相互作用パートナーが、これらのポリペプチドの機能性において協調し得るので、本発明はまた、この方法によって同定された化合物または化合物の混合物の、生物におけるストレス耐性を増強する因子としての使用を具体化する。
【００８２】
従って、本発明は、このに規定されるような本発明の核酸分子の使用、本発明のベクターの使用、収量を増加させるかまたは植物増殖を刺激するための本発明のポリペプチドの使用を具体化する。詳細には、本発明は、植物の収穫し得るいかなる部分（例えば、根、葉、種子など）の収量を増加させる機会を提供する。
【００８３】
作物の農業的成功にとって、ストレス環境に対抗し得ることは重要である。それゆえ、重要な作物をストレス耐性遺伝子の存在に関してスクリーニングするために本発明の遺伝子またはポリペプチドを使用することは有用であり得る。従って、本発明は、少なくとも本発明の核酸、本発明のベクター、本発明のポリペプチドまたは本発明の抗体を含む、診断組成物に関する。
【００８４】
正常植物増殖条件において、典型的には１ｍＭより低濃度のＮａ＋が存在することが記載されている。それゆえ、本発明は、このに規定されるような方法によって得られる植物を使用するための可能性または１ｍＭイオンを上回る塩含有量を有する土壌で栽培するための本発明の植物を提供する。多くの実験において、塩耐性植物が約４０ｍＭから約４００ｍＭのＮａ＋を有する条件において増殖し得ることが示された。
（定義および実施形態の詳述）
当業者は、本明細書中に記載される発明が、特に記載されるもの以外の他の発明の改変物および変異物に供されることを認識している。本明細書中に記載される本発明は、このような改変体および変異物の全てを含むことが、理解される。本発明はまた、本明細書において（個々にまたは集団で）言及されるかもしくは示されるこのような工程、特徴、組成物、および化合物の全て、ならびにこの工程およびこの特徴のいずれかもしくはそれより多くの、任意のまたはすべての組み合わせを包む。
【００８５】
本明細書を通じ、他に必要としない限り、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、および改変（例えば、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」）は、示された整数もしくは工程、または整数もしくは工程の群を含括するが、任意の他の整数もしくは工程、または整数もしくは工程の群を除かないことを含むことが理解される。
【００８６】
本明細書中に使用される場合、用語「由来する」は、特定の整数または整数の群が特定の種にもともとは由来するが、特定の供給源から直接に得られる必要はないことを示すと理解される。
【００８７】
用語「タンパク質」、「ペプチド」または「オリゴペプチド」とは、本明細書中において使用される場合、任意の長さのポリマー形態にあるアミノ酸をいう。この用語としてはまた、公知のアミノ酸修飾（例えば、ジスルフィド結合形成、システイニル化、酸化、グルタチオン化、メチル化、アセチル化、ファルネシル化、ビオチン化、ステアロイル化（ｓｔｅａｒｏｙｌａｔｉｏｎ）、ホルミル化、脂肪酸付加、リン酸化、硫酸化、ユビキチン化、ミリストイル化、パルミトイル化、ゲラニルゲラニル化、環状化（例えば、ピログルタミン酸形成）、酸化、脱アミノ化、脱水素化、脱アミノ化、脱水、グリコシル化（例えば、ペント−ス、ヘキソースアミン、Ｎ−アセチルヘキソースアミン、デオキシヘキソース、ヘキソース、シアル酸など）、アシル化および放射標識（例えば、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃ、３２Ｐ、３３Ｐ、３Ｈ）ならびに天然には存在しないアミノ酸残基、Ｌ−アミノ酸残基およびＤ−アミノ酸残基が挙げられる。
【００８８】
本発明のタンパク質の「ホモログ（ｈｏｍｏｌｏｇｕｅ）」または「ホモログ（ｈｏｍｏｌｏｇ）」は、このタンパク質に関して１つ以上のその機能的特性を変化させることなく（特に、生成産物の活性を減少させることなく）同族である、このタンパク質に対するアミノ酸の置換、欠失、および／または付加を含む、これらのペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、タンパク質および酵素である。例えば、このタンパク質のホモログは、このタンパク質の生物活性アミノ酸配列改変体からなる。このようなホモログを生成するために、このタンパク質中に存在するアミノ酸は、同様の特性（例えば、疎水性、親水性、疎水性モーメント、抗原性、α−ヘリックス構造またはβ−シート構造を形成するかあるいは壊す傾向など）を有するアミノ酸によって置換され得る。アミノ酸の物理的特性および化学的特性の総説は、表２に示される。
【００８９】
【表２】
2004524015.tif 000003
相同性の２つの特定形態である、オーソロガス（ｏｒｔｈｏｌｏｇｏｕｓ）およびパラロガス（ｐａｒａｌｏｇｏｕｓ）は、遺伝子の先祖関係を記述するために使用される進化的な概念である。用語「パラロガス」は、パラロガスな遺伝子を導く、種のゲノム内での遺伝子複製に関係する。用語「オーソロガス」は、先祖関係に起因する、異なる生物における相同な遺伝子に関係する。よって、本発明はまた、本発明の遺伝子およびタンパク質の、ホモログ（ｈｏｍｏｌｏｇｕｅｓ）、パラログ（ｐａｒａｌｏｇｕｅｓ）、およびオーソログ（ｏｒｔｈｏｌｏｇｕｅｓ）に関係する。本発明の遺伝子およびタンパク質の、パラログまたはオーソログは、本発明の配列またはタンパク質と、先に規定されたように厳密に企図される「ホモログ」よりも低いパーセントの配列同一性を有し得る。
【００９０】
本発明のタンパク質の置換改変体は、このタンパク質アミノ酸配列において少なくとも１つの残基が取り除かれ、そして異なる残基がその位置に挿入されるタンパク質である。アミノ酸置換は、代表的には、単一残基の置換であるが、ポリペプチド上に位置する機能的束縛に依存してクラスター化され得る；挿入は、通常は、約１〜１０アミノ酸残基のオーダーであり、そして欠失は、約１〜２０残基の範囲である。好ましくは、アミノ酸置換は、前出に記載されるような保存的アミノ酸置換を含む。
【００９１】
本発明のタンパク質の挿入的アミノ酸配列改変体は、１つ以上のアミノ酸残基がこのタンパク質内の予め決定された位置に導入されるタンパク質である。
【００９２】
挿入は、アミノ末端の融合および／またはカルボキシ末端の融合、ならびに単一または複合のアミノ酸の、配列内挿入を含み得る。一般的に、アミノ酸配列内の挿入は、アミノ末端融合物またはカルボキシ末端融合物より少なく、約１〜１０残基のオーダーである。アミノ末端融合またはカルボキシ末端融合のタンパク質もしくはペプチドの例としては、以下が挙げられる；酵母ツーハイブリッド系において使用される転写アクチベーターの結合ドメインまたは活性化ドメイン、ファージのコートタンパク質、（ヒスチジン）６−タグ、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ、プロテインＡ、マルトース結合タンパク質、ジヒドロ葉酸還元酵素、Ｔａｇ・１００エピトープ（ＥＥＴＡＲＦＱＰＧＹＲＳ）、ｃ−ｍｙｃエピトープ（ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ）、ＦＬＡＧ（登録商標）−エピトープ（ＤＹＫＤＤＤＫ）、ｌａｃＺ、ＣＭＰ（カルモジュリン結合ペプチド）、ＨＡエピトープ（ＹＰＹＤＶＰＤＹＡ）、プロテインＣエピトープ（ＥＤＱＶＤＰＲＬＩＤＧＫ）およびＶＳＶエピトープ（ＹＴＤＩＥＭＮＲＬＧＫ）。
【００９３】
本発明のタンパク質の欠失改変体は、このタンパク質のアミノ酸配列からの１つ以上のアミノ酸の除去によって特徴付けられる。
【００９４】
本発明のタンパク質のアミノ酸改変体は、当該分野において周知の、ペプチド合成技術（例えば、固相ペプチド合成技術など）を用いて、または組換えＤＮＡ操作によって、容易に作成され得る。置換改変体、挿入改変体、または欠失改変体として明白な、改変体タンパク質を生成するためのＤＮＡ配列の操作は、当該分野において周知である。例えば、既知配列を有するＤＮＡ内の予め決定された位置に、（例えば、Ｍ１３変異誘発、Ｔ７−Ｇｅｎインビトロ変異誘発キット（ＵＳＢ、Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ、ＯＨ）、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ  Ｓｉｔｅ  Ｄｉｒｅｃｔｅｄ変異誘発キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）、ＰＣＲを介する部位指向性変異誘発プロトコール、または他の部位指向性変異誘発プロトコールによる）置換変異を作成する技術は、当業者にとって周知である。置換改変体、挿入改変体、または欠失改変体として明白な、改変体タンパク質を生成するためのＤＮＡ配列の操作の別の代替は、例えば、（Ｐａｌｍｇｒｅｎ  １９９７；Ｙｏｏｎら  １９９６）によって記載されるような、キメラＲＮＡ／ＤＮＡオリゴヌクレオチドによって達成され得る標的化インビボ遺伝子改変を含む。
【００９５】
本発明のタンパク質の「誘導体」は、そのペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、タンパク質、および酵素であり、このポリペプチドの天然に存在する形態のアミノ酸配列と比較し、さらに天然に存在するアミノ酸残基、グリコシル化によって変化されたアミノ酸残基、アシル化されたアミノ酸残基、または天然には存在しないアミノ酸残基を含み得る。あるいは、またはさらに、誘導体は、このポリペプチドの天然に存在する形態のアミノ酸配列と比較して、１つ以上の非アミノ酸置換（例えば、共有結合または非共有結合によってアミノ酸配列に結合したレポーター分子または他のリガンド（例えば、その検出を促進するためにそこに結合されるレポーター分子））を含み得る。タンパク質の誘導体は、由来するタンパク質の生物学的活性または酵素学的活性を保持する。
【００９６】
「免疫学的に活性」に関しては、分子またはその特定フラグメント（例えば、エピトープまたはハプテン）が、抗体によって認識される（すなわち抗体に結合する）ことが意味される。
【００９７】
本発明の文脈においては、前出の規定のように、本発明のテンサイ（ｓｕｇａｒ  ｂｅｅｔ）ポリペプチドまたはそのホモログ、誘導体、もしくはフラグメントのいずれの、ホモログ、誘導体、および／または免疫学的に活性なフラグメントがまた、含まれる。
【００９８】
「抗体」としては、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、合成抗体、または重鎖ラクダ抗体、ならびに抗体のフラグメント（例えば、Ｆａｂフラグメント、ＦｖフラグメントまたはｓｃＦｖフラグメントが挙げられる。モノクローナル抗体は、以前に記載されるような技術（例えば、ＬｉｄｄｌｅおよびＣｒｙｅｒ（１９９１））によって調製され、これは、免疫された動物に由来するマウス骨髄腫細胞の脾臓細胞への融合を含む。さらに、分子またはそのフラグメントに対する、抗体またはそのフラグメントは、例えば、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ（１９８８）に記載されるような方法を使用することによって得られ得る。小ペプチド（例えば、本発明のタンパク質のフラグメント）に対して指向される抗体の場合、このペプチドは、一般的に、動物への免疫の前に、キャリアタンパク質と連結される。このようなタンパク質キャリアとしては、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、オボアルブミンおよび破傷風毒素が挙げられる。キャリアタンパク質は、動物の免疫応答を増強し、そしてＴ細胞レセプター結合部位に対するエピトープを提供する。用語「抗体」はさらに、その誘導体（例えば、標識された抗体）を含む。抗体標識としては、アルカリホスファターゼ、ＰＫＨ２、ＰＫＨ２６、ＰＫＨ６７、フルオレセイン（ＦＩＴＣ）、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３２５８、Ｒ−フィコエリトリン（ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ）（ＰＥ）、ローダミン（ＴＲＩＴＣ）、Ｑｕａｎｔｕｍ  Ｒｅｄ、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ、Ｃｙ３、ビオチン、アガロース、ペルオキシダーゼ、金粒子（ｇｏｌｄ  ｓｐｈｅｒｅｓ）および放射標識（例えば、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃ、３２Ｐ、３３Ｐ、３Ｈ）が挙げられる。タンパク質に対する抗体に依存する分子生物学におけるツールとしては、タンパク質のゲルブロット分析、遺伝子の同定を可能にする発現ライブラリーのスクリーニング、ＥＬＩＳＡおよびＲＩＡを含むタンパク質定量方法、タンパク質の免疫アフィニティ精製、タンパク質の免疫沈降（例えば、Ｍａｇｙａｒら、（１９９７））、免疫学的局在決定が挙げられる。抗体および特にペプチド抗体の他の用途としては、タンパク質プロセシングの研究（Ｌｏｆｆｌｅｒら（１９９４）；Ｗｏｕｌｆｅら（１９９４））、タンパク質活性部位の決定（Ｌｅｒｎｅｒ（１９８２））、前駆体および翻訳後プロセシングの研究（ＢａｒｏｎおよびＢａｌｔｉｍｏｒｅ（１９８２）；Ｌｅｒｎｅｒら（１９８１）；Ｓｅｍｌｅｒら（１９８２））、タンパク質−タンパク質相互作用に関与するタンパク質ドメインの同定（Ｍｕｒａｋａｍｉら（１９９２））および遺伝子発現におけるエキソン使用頻度の研究（Ｔａｍｕｒａら（１９９１））が挙げられる。
【００９９】
前出に規定されるように本発明のテンサイポリペプチド、またはその誘導体もしくはフラグメントを認識する抗体はまた、本発明の範囲である。
【０１００】
用語「遺伝子」、「ポリヌクレオチド」、「核酸配列」、「ヌクレオチド配列」、「ＤＮＡ配列」、または「核酸分子」とは、本明細書中において使用される場合、ヌクレオチドをいい、任意の長さのポリマー形態にあるリボヌクレオチドもしくはデオキシヌクレオチドまたはその両方の組み合わせのいずれかをいう。この用語は、二本鎖および一本鎖のＤＮＡおよびＲＮＡを含む。この用語としてはまた、公知のヌクレオチド改変（例えば、メチル化、環状化、および’キャップ（ｃａｐ）’）および１つ以上の天然に存在するヌクレオチドの、アナログ（例えば、イノシン）との置換が挙げられる。ヌクレオチドの改変としては、アクリジン、アミン、ビオチン、カスケードブルー（ｃａｓｃａｄｅ  ｂｌｕｅ）、コレステロール、Ｃｙ３（登録商標）、Ｃｙ５（登録商標）、Ｃｙ５．５（登録商標）、Ｄａｂｃｙｌ、ジゴキシゲニン、ジニトロフェニル、Ｅｄａｎｓ、６−ＦＡＭ、フルオレセイン、３’−グリセロール、ＨＥＸ、ＩＲＤ−７００、ＩＲＤ−８００、ＪＯＥ、リン酸ソラレン、ローダミン、ＲＯＸ、チオール（ＳＨ）、スペーサー、ＴＡＭＲＡ、ＴＥＴ、ＡＭＣＡ−Ｓ（登録商標）、ＳＥ、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）、Ｍａｒｉｎａ  Ｂｌｕｅ（登録商標）、Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｌｕｅ（登録商標）、Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ（登録商標）、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ  Ｇｒｅｅｎ（登録商標）、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ  Ｒｅｄ（登録商標）、Ｒｈｏｄｏｌ  Ｇｒｅｅｎ（登録商標）、およびＴｅｘａｓ  Ｒｅｄ（登録商標）が挙げられる。ポリヌクレオチドバックボーンの改変としては、メチルホスホネート、２’−ＯＭｅ−メチルホスホネートＲＮＡ、ホスホロチオエート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏｒａｔｅ）、ＲＮＡ、２’−ＯＭｅＲＮＡが挙げられる。塩基改変としては、２−アミノ−ｄＡ、２−アミノプリン、３’−（ｄｄＡ）、３’ｄＡ（コルジセピン）、７−ｄｅａｚａ−ｄＡ、８−Ｂｒ−ｄＡ、８−オキソ−ｄＡ、Ｎ６−Ｍｅ−ｄＡ、塩基部位（ａｂａｓｉｃ  ｓｉｔｅ）（ｄＳｐａｃｅｒ）、ビオチンｄＴ、２’−ＯＭｅ−５Ｍｅ−Ｃ、２’−ＯＭｅ−プロピニル−Ｃ、３’−（５−Ｍｅ−ｄＣ）、３’−（ｄｄＣ）、５−Ｂｒ−ｄＣ、５−Ｉ−ｄＣ、５−Ｍｅ−ｄＣ、５−Ｆ−ｄＣ、カルボキシ−ｄＴ、変換可能なｄＡ、変換可能なｄＣ、変換可能なｄＧ、変換可能なｄＴ、変換可能なｄＵ、７−デアザ−ｄＧ、８−Ｂｒ−ｄＧ、８−オキソ−ｄＧ、Ｏ６−Ｍｅ−ｄＧ、Ｓ６−ＤＮＰ−ｄＧ、４−メチル−インドール、５−ニトロインドール、２’−ＯＭｅ−イノシン、２’−ｄｌ、Ｏ６−フェニル−ｄｌ、４−メチル−インドール、２’−デオキシネブラリン（ｄｅｏｘｙｎｅｂｕｌａｒｉｎｅ）、５−ニトロインドール、２−アミノプリン、ｄＰ（プリンアナログ）、ｄＫ（ピリミジンアナログ）、３−ニトロピロール、２−チオ−ｄＴ、４−チオ−ｄＴ、ビオチン−ｄＴ、カルボキシ−ｄＴ、Ｏ４−Ｍｅ−ｄＴ、Ｏ４−チアゾールｄＴ、２’−ＯＭｅ−プロピニル−Ｕ、５−Ｂｒ−ｄＵ、２’−ｄＵ、５−Ｆ−ｄＵ、５−Ｉ−ｄＵ、Ｏ４−トリアゾールｄＵおよび放射標識（例えば、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃ、３２Ｐ、３３Ｐ、３Ｈ）が挙げられる。この用語はまた、バックボーンが、糖以外のＮ−（２−アミノエチル）−グリシン単位からなる偽ペプチドである、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ＤＮＡアナログを包含する。ＰＮＡは、ＤＮＡの様態を模倣し、そして相補的な核酸鎖を結合する。ＰＮＡの中性的なバックボーンは、正常に達成されるより強い結合および高い特異性を生じる。さらに、ＰＮＡの独特な化学的、物理的、および生物学的特性が利用され、強力な生物分子ツール、アンチセンスおよび抗遺伝子因子、分子プローブおよび生物センサーを産生した。「組換えＤＮＡ分子」または「キメラ遺伝子」に関しては、異なる供給源に由来するＤＮＡの小片を連結することによって産生されるハイブリッドＤＮＡを意味する。「異種核酸配列」に関しては、プロモーター配列を有する天然には存在しない配列が意図される。この核酸配列は、プロモーター配列に対して異種であるが、植物宿主に対しては、同種であるか、もしくはネイティブであるか、または異種であるか、もしくは外来である。「センス鎖」とは、そのｍＲＮＡ転写物と同種である二本鎖ＤＮＡ分子の鎖をいう。「アンチ−センス鎖」は、「センス鎖」の配列に相補的な逆転した配列を含む。
【０１０１】
「コード配列」または「オープンリーディングフレーム」もしくは「ＯＲＦ」は、適切な調節配列の制御下に置かれた場合、すなわち、このコード配列またはＯＲＦが発現可能な形式にある場合、ｍＲＮＡに転写され得るヌクレオチド配列および／またはポリペプチドに翻訳され得るヌクレオチド配列として定義される。ＯＲＦのこのコード配列は、５’翻訳開始コドンおよび３’翻訳終止コドンによって結合される。コード配列またはＯＲＦとしては、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、組換えヌクレオチド配列、合成的に製造されたヌクレオチド配列またはゲノムＤＮＡが挙げられ得るが、これらに限定されない。このコード配列またはＯＲＦは、核酸配列を干渉することによって中断され得る。本質的には同じタンパク質をコードするが、異なる供給源から単離された遺伝子およびコード配列は、実質的に多様な核酸配列からなり得る。相互的に、実質的に多様な核酸配列は、本質的に同じタンパク質の発現に影響を与えるように設計され得る。この核酸配列は、例えば、所定の遺伝子の異なる対立遺伝子の存在の結果であり、または遺伝子コードの縮重もしくはコドン使用頻度における差異の結果である。よって、表３に示されるように、アミノ酸（例えば、メチオニンおよびトリプトファン）は、単一コドンによってコードされ、一方、他のアミノ酸（例えば、アルギニン、ロイシン、およびセリン）はそれぞれ、６つまでの異なるコドンから翻訳され得る。好ましいコドン使用頻度における差異は、以下に図示される；Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ（細菌）、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ、Ｍ．ｓａｔｉｖａ（２つの双子葉植物）およびＯｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ（単子葉植物）。これらの例は、（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｋａｚｕｓａ．ｏｒ．ｊｐ／ｃｏｄｏｎ）から展開された。１つの例を挙げれば、コドンＧＧＣ（グリシンに対して）は、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓにおいては最も頻繁に使用されるコドンであり（３６．２％）、Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａにおいては二番目に頻繁に使用されるコドンであるが、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａおよびＭ．ｓａｔｉｖａのおいてはかなり低い頻度で使用される（それぞれ、９％および８．４％）。グリシンをコードする４つの可能なコドン（表３を参照）のうち、このＧＧＣコドンは、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓおよびＯｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａにおいて最も好ましく使用される。しかし、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａにおいて、これは、ＧＧＡ（およびＧＧＵ）コドンであるが、Ｍ．ｓａｔｉｖａのおいては、これは、ＧＧＵ（およびＧＧＡ）コドンである。対立遺伝子改変体はさらに、単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）ならびに小さな挿入／欠失の多型（ＩＮＤＥＬ；ＩＮＤＥＬのサイズは、しばしば１００ｂｐ未満である）を含むとして定義される。ＳＮＰおよびＩＮＤＥＬは、ほとんどの生物の天然に存在する多型系統において、最も大きなセットの配列改変体を形成する。それらは、遺伝子のマッピング、ならびに遺伝子および遺伝子機能の発見の際に手助けとなる。それらはさらに、増殖速度、植物サイズおよび植物収量、植物成長力、疾患耐性、ストレス耐性などのプロセスの決定に関与する遺伝子座（例えば、植物遺伝子）の同定する際に手助けとなる。
【０１０２】
【表３】
2004524015.tif 000004
多数の技術は、現在、ＳＮＰおよび／またはＩＮＤＥＬを同定するために利用可能であり、（ｉ）ＰＣＲに続く変性高性能液体クロマトグラフィー（ＤＨＰＬＣ；例えば、Ｃｈｏら  １９９９）；（ｉｉ）高忠実度ＰＣＲと組み合わせた定常的変性剤キャピラリー電気泳動（ＣＤＣＥ）（例えば、Ｌｉ−Ｓｕｃｈｏｌｅｉｋｉら  １９９９）；（ｉｉｉ）変性グラジエントゲル電気泳動（例えば、ＦｉｓｃｈｅｒおよびＬｅｒｍａｎ  １９８３）；（ｉｖ）マトリクス支援レーザー脱離／イオン化飛行時間質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ；例えば、Ｒｏｓｓら  ２０００）；（ｖ）リアルタイム蛍光モニタリングＰＣＲアッセイ（例えば、Ｔａｐｐら  ２０００）；（ｖｉ）ＡｃｒｙｄｉｔｅＴＭゲル技術（例えば、Ｋｅｎｎｅｙら  １９９８）；（ｖｉｉ）サイクルジデオキシフィンガープリンティング（ＣｄｄＦ；例えば、Ｌａｎｇｅｍｅｉｅｒら  １９９４）；（ｖｉｉｉ）一本鎖コンフォメーション多型（ＳＳＣＰ）分析（例えば、Ｖｉｄａｌ−ＰｕｉｇおよびＭｏｌｌｅｒ  １９９４）および（ｉｘ）小配列決定（ｍｉｎｉ−ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）プライマー伸長反応（例えば、Ｓｙｖａｎｅｎ  １９９９）が挙げられる。前出の（ｉ）の改変である「Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ｉｎｄｕｃｅｄ  Ｌｏｃａｌ  Ｌｅｓｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｇｅｎｏｍｅｓ」（ＴＩＬＬＩＮＧ；ＭｃＣａｌｌｕｍら  ２０００ａ，ｂ）の技術はまた、例えば、興味深い表現型を示す化学的に変異誘発された植物個体において変更された遺伝子を迅速に同定するために適用され得る。
【０１０３】
「ハイブリダイゼーション」は、実質的に相同性の相補的なヌクレオチド配列を互いにアニールする工程である。ハイブリダイゼーション工程は、完全に溶液中で生じ得、すなわち、両方の相補的な核酸が溶液中にある。このような工程に基づく分子生物学におけるツールとしては、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ；およびそれに基づく全ての方法）、差し引きハイブリダイゼーション、ランダムプライマー伸長、ヌクレアーゼＳ１マッピング、プライマー伸長、逆転写、ｃＤＮＡ合成、ＲＮＡのディファレンシャルディスプレイ、およびＤＮＡ配列決定が挙げられる。ハイブリダイゼーション工程はまた、マトリクス（例えば、磁性ビーズ、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅビーズまたは任意の他の樹脂）に固定化された相補的な核酸の１つを用いて生じ得る。このような工程に基づく分子生物学におけるツールとしては、ポリ（Ａ＋）ｍＲＮＡの単離を含む。ハイブリダイゼーション工程は、さらに、固体支持体（例えば、ニトロセルロース膜もしくはナイロン膜）に固定化されるか、または例えば、ケイ質ガラス支持体に、例えば、写真平版によって固定化された相補的な核酸の１つを用いて生じ得る（後者は、核酸アレイもしくはマイクロアレイとしてか、または核酸チップとして知られる）。このような工程に基づく分子生物学のツールとしては、ＲＮＡおよびＤＮＡのゲルブロット分析、コロニーハイブリダイゼーション、プラークハイブリダイゼーション、インサイチュハイブリダイゼーションおよびマイクロアレイハイブリダイゼーションを包含する。ハイブリダイゼーションを生じさせるために、核酸分子を、一般的に、熱的もしくは化学的に変性して、二本鎖を２本の一本鎖に融解し、および／または一本鎖の核酸由来のヘアピンもしくは他の二次構造を除去する。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは、条件（例えば、温度、塩濃度およびハイブリダイゼーション緩衝液の組成）によって影響される。ハイブリダイゼーションのための高度にストリンジェントな条件は、高温および／または低塩濃度（ＮａＣｌおよびＮａ３−シトレートを含有する塩）および／またはハイブリダイゼーション緩衝液中のホルムアミドの含有および／またはハイブリダイゼーション緩衝液中の化合物（例えば、ＳＤＳ（界面活性剤））の濃度の低減および／またはハイブリダイゼーション緩衝液からの化合物（例えば、硫酸デキストランもしくはポリエチレングリコール（分子の凝集を促進する））の排除を包含する。慣用的なハイブリダイゼーション条件は、例えば、（Ｓａｍｂｒｏｏｋら  １９８９）に記載されるが、当業者は、多数の異なるハイブリダイゼーション条件が、既知の相同性もしくは予想される相同性の機能および／または核酸配列の長さにおいて設計され得ることを理解する。特異的にハイブリダイズするとは、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることを意図する。十分に低いストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、前出に規定される本発明のＤＮＡ配列に対して異種である核酸を単離するために特に好ましい。この異種性に寄与する要素は、対立性、遺伝コードの縮重および上述に議論されるように好ましいコドンの使用頻度における差異を含む。
【０１０４】
従って、本発明はまた、任意のハイブリダイゼーションの方法において既に規定したように、本発明のテンサイのポリペプチド、それらのホモログ、誘導体および／または免疫学的なフラグメントをコードする、本発明のＤＮＡ配列の使用に関する。本発明はさらにまた、本発明のＤＮＡ配列にハイブリダイズするＤＮＡ配列に関する。
【０１０５】
本発明中に規定されるようなＤＮＡ配列は、介在配列によって中断され得る。「介在配列」とは、本発明のＤＮＡ配列を包含するコード配列を中断するか、または本発明のＤＮＡ配列を包含するＤＮＡ配列の表現可能な形式を中断する、任意の核酸配列を意味する。介在配列の除去は、このコード配列またはこの発現可能な形式を回復させる。介在配列の例としては、イントロン、移動可能なＤＮＡ配列（例えば、トランスポゾン）およびＤＮＡタグ（例えば、Ｔ−ＤＮＡ）が挙げられる。「移動可能なＤＮＡ配列」とは、組換え現象の結果として移動され得る任意のＤＮＡ配列を意味する。
【０１０６】
好ましくは、植物起源の、細胞、組織または器官においてタンパク質の発現をもたらすために、タンパク質が、例えば、マイクロインジェクションもしくは衝撃の手段によってこの細胞に直接的に導入され得るか、または代替的に、このタンパク質をコードする単離される核酸分子が、発現可能な形式で、この細胞、組織もしくは器官内に導入され得る。
【０１０７】
好ましくは、本発明のＤＮＡ配列は、本発明のテンサイのポリペプチドまたはそのホモログもしくは誘導体あるいは前出に規定されるようにその免疫学的に活性なポリペプチド、またはそのホモログもしくは誘導体をコードする、コード配列またはオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含有する。
【０１０８】
「ベクター」または「ベクター配列」とは、ＤＮＡ配列を意味し、これらは、形質転換によって生物中に導入され得、そしてこの生物内で安定に維持され得る。ベクターの維持は、例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅまたはＳｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅの培養物中で可能である。他のベクター（例えば、ファージミドおよびコスミドベクター）は、細菌および／またはウイルス中で維持および増殖され得る。ベクター配列は、一般に、制限酵素によって認識される独特な部位のセットであるマルチプルクローニングサイト（ＭＣＳ）（ここで、１つ以上の非ベクター配列が挿入され得る）を包含する。
【０１０９】
従って、「非ベクター配列」とは、ベクター内に含まれるＭＣＳの１つ以上の部位中に組込まれるＤＮＡ配列を意味する。
【０１１０】
挿入される非ベクター配列のための発現可能な形式の生成を可能にする適切な調節配列を包含するという観点において、「発現ベクター」は、ベクターのサブセットを形成し、従って、この非ベクター配列によってコードされるタンパク質の発現を可能にする。発現ベクターは、当該分野において公知であり、細菌（例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、真菌（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）、昆虫細胞（例えば、バキュロウイルス発現ベクター）、動物細胞（例えば、ＣＯＳ細胞またはＣＨＯ細胞）および植物細胞（例えば、ジャガイモウイルスのＸベースの発現ベクター（例えば、Ｖａｎｃｅら  １９９８−ＷＯ９８４４０９７を参照のこと））を含む、生物におけるタンパク質の発現（遺伝子の発現）を可能にする。本発明は、明らかに、前出で規定されるように、本発明のテンサイのポリペプチド、それらのホモログ、誘導体および／または免疫学的に活性なフラグメントをコードする、非ベクターＤＮＡ配列を含有する、任意のベクターまたは発現ベクターを包含する。
【０１１１】
生物学的な系における（発現）ベクター媒介性タンパク質産生に対する代替として、化学的なタンパク質合成が、適用され得る。合成ペプチドは、液相または固相において作製され得る。しかし、固相ペプチド合成（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ、１９６３）は、最も一般的な方法であり、そして直鎖状のペプチド鎖を生成するための連続的なアミノ酸の付加に関する。固相ペプチド合成は、３工程から構成されるサイクルを含む：（ｉ）成長するペプチド鎖のカルボキシル末端のアミノ酸の、固体支持体または樹脂への固定化；（ｉｉ）成長するペプチド鎖に付加されるべきアミノ酸の活性化、カップリングおよび脱保護から構成される工程である鎖のアセンブリ；ならびに（ｉｉｉ）樹脂からの完全なペプチド鎖の回収およびアミノ酸側鎖からの保護基の除去に関わる切断。固相ペプチド合成における一般的なアプローチは、アミノ酸のアミノ末端保護基として、Ｆｍｏｃ／ｔＢｕ（９−フルオレニルメチルオキシカルボニル／ｔ−ブチル）およびＢｏｃ（ｔ−ブチルオキシカルボニル）を含む。アミノ酸側鎖の保護基は、メチル（Ｍｅ）、ホルミル（ＣＨＯ）、エチル（Ｅｔ）、アセチル（Ａｃ）、ｔ−ブチル（ｔ−Ｂｕ）、アニシル、ベンジル（Ｂｚｌ）、トリフルオロアセチル（Ｔｆａ）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＯＮＳｕ、ＯＳｕ）、ベンゾイル（Ｂｚ）、４−メチルベンジル（Ｍｅｂ）、チオアニジル（ｔｈｉｏａｎｉｚｙｌ）、チオクレシル（ｔｈｉｏｃｒｅｓｙｌ）、ベンジルオキシメチル（Ｂｏｍ）、４−ニトロフェニル（ＯＮｐ）、ベンジルオキシカルボニル（Ｚ）、２−ニトロベンゾイル（ＮＢｚ）、２−ニトロフェニルスルフェニル（ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌｓｕｌｐｈｅｎｙｌ）（Ｎｐｓ）、４−トルエンスルホニル（Ｔｏｓｙｌ、Ｔｏｓ）、ペンタフルオロフェニル（Ｐｆｐ）、ジフェニルメチル（Ｄｐｍ）、２−クロロベンジルオキシカルボニル（Ｃｌ−Ｚ）、２，４，５−トリクロロフェニル、２−ブロモベンジルオキシカルボニル（Ｂｒ−Ｚ）、トリフェニルメチル（Ｔｒｉｔｙｌ、Ｔｒｔ）、および２，５，７，８−ペンタメチル−クロマン（ｃｈｒｏｍａｎ）−６−スルホニル（Ｐｍｃ）を含む。鎖のアセンブリの間、ＦｍｏｃまたはＢｏｃは、除去されて、成長する鎖に結合したアミノ酸残基の活性化したアミノ末端を生じる。次のアミノ酸のカルボキシル末端は、高い反応性のエステルへの変換によって（例えば、ＨＢＴＵによって）活性化される。現在の技術（例えば、ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ９０５０  ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｍｏｄｅｌ  ４３１Ａ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ）を用いて、５０残基までの直鎖状ペプチドが、作製され得る。多数の指針が、生物学的な系における使用のために適切なペプチドを作製するために入手可能であり、（ｉ）困難なアミノ酸（例えば、ｃｙｓ、ｍｅｔ、ｔｒｐ（ペプチド合成中に容易に酸化されるおよび／または分解される））またはａｒｇの使用の制定；（ｉｉ）疎水性のアミノ酸（ペプチドの可溶性を損ない得る）の最小化；ならびに（ｉｉｉ）アミノ末端のグルタミン酸（ピログルタミン酸へと環化し得る）の防護を含む。
【０１１２】
「発現可能な形式」とは、単離された核酸分子が、構成的にか、あるいは、細胞内または細胞外のシグナル（例えば、環境の刺激もしくはストレス（分裂促進剤、酸素欠乏、低酸素、温度、塩、光、脱水、など））または化学的な化合物（例えば、ＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド）または例えば、抗生物質（テトラサイクリン、アンピシリン、リファンピシン、カナマイシン）、ホルモン（例えば、ジベレリン、オーキシン、サイトカイニン、グルココルチコイド、ブラシノステロイド、エチレン、アブシジン酸など）、ホルモンアナログ（ヨード酢酸（ＩＡＡ）、２，４−Ｄ、など）、金属（亜鉛、銅、鉄など）、またはデキサメタゾンなどによる誘導に従うかのいずれかによって、ｍＲＮＡへと転写されるおよび／またはタンパク質を産生するように翻訳されるために適切な形態であることを意味する。当業者に公知であるように、機能的なタンパク質の発現はまた、１つ以上の翻訳後修飾（例えば、糖化、リン酸化、脱リン酸化）、または１つ以上のタンパク質−タンパク質相互作用などを必要とし得る。全てのこのような過程は、用語「発現可能な形式」の範囲内に含まれる。
【０１１３】
好ましくは、植物起源の、特定の細胞、組織、または器官における、好ましいタンパク質の発現は、このタンパク質をコードする単離された核酸分子（例えば、ｃＤＮＡ分子、ゲノム遺伝子、合成オリゴヌクレオチド分子、ｍＲＮＡ分子またはオープンリーディングフレーム）をこの細胞、組織または器官に誘導および発現させることによってもたらされる。ここで、この核酸分子は、プロモーター、好ましくは、植物で発現可能なプロモーター、および終止配列を含有する、適切な調節配列と作動可能に関連して配置される。
【０１１４】
「調節配列」は制御ＤＮＡ配列をいい、このＤＮＡ配列は、それらが連結されるコード配列の発現に影響を与える必要がある。このような制御配列の性質は、宿主生物体に依存して異なる。原核生物では、制御配列は一般的に、プロモーター、リボソーム結合部位およびターミネーターを含む。真核生物では一般的に、制御配列は、プロモーター、ターミネーター、およびエンハンサーまたはサイレンサーを含む。用語「制御配列」は、最少で、その存在が発現のために必要なすべての成分を含むことを意図し、そしてまた特異的な遺伝子がいつ、どのくらい、そしてどこで発現するかを決定するさらなる有利な成分もまた含み得る。
【０１１５】
「プロモーター」に対する本明細書中の参照は、その広範な前後関係で理解され、そして古典的な真核生物のゲノム遺伝子由来の転写調節配列を含む。転写調節配列には、正確な転写開始に必要とされるＴＡＴＡボックスが挙げられ、これは、ＣＣＡＡＴボックス配列および発生刺激および／または外部刺激に応答する遺伝子発現または、組織特異的様式で遺伝子発現を変更する、さらなる調節エレメント（すなわち、上流の活性化配列、エンハンサーおよびサイレンサー）を含むかまたは含まない。
【０１１６】
本明細書中の調節配列はまた、プロモーター、エンハンサー、サイレンサー、イントロン配列、３’ＵＴＲおよび／または５’ＵＴＲ領域、タンパク質および／またはＲＮＡ安定化エレメントを含む任意の群のいずれかをいう。
【０１１７】
用語「プロモーター」はまた、古典的な原核生物遺伝子の転写調節配列を含み、この場合、プロモーターが−３５ボックス配列および／または−１０ボックス転写調節配列を含み得る。
【０１１８】
用語「プロモーター」はまた、細胞、組織または器官内で核酸分子の発現を与えるか、活性化するかまたは増強する、合成分子または融合分子または誘導体を説明するために使用される。
【０１１９】
プロモーターは、プロモーターが作動可能に接続される核酸分子の発現をさらに増強するためならびに／または空間的な発現および／もしくは時間的な発現を変更するための一つ以上の特異的調節エレメントのさらなるコピーを含み得る。このような調節エレメントは、例えば、銅、グルココルチコイド、デキサメタゾン、テトラサイクリン、ジベレリン、ｃＡＭＰ、アブシジン酸、オーキシン、創傷、エチレン、ジャスモン酸またはサリチル酸に応答して核酸分子の発現を駆動するための異種プロモーター配列、あるいは特定の細胞、組織もしくは器官（例えば、成長点、葉、根、胚、花、種子または果実）に核酸分子の発現を与えるための異種プロモーター配列に隣接するように配置され得る。本発明に関して、プロモーターは、好ましくは、植物発現可能プロモーター配列である。しかし、非植物細胞（例えば、細菌、酵母細胞、昆虫細胞、および動物細胞）内でも機能するか、または単独で機能するプロモーターは、本発明から除外されない。「植物発現可能」が意味することは、プロモーター配列に付加されるかまたはその中に含まれている任意のさらなる調節エレメントを含むプロモーター配列が、植物細胞、組織または器官、好ましくは単子葉植物または双子葉植物の細胞、組織または器官内での発現を少なくとも誘導するか、与えるか、活性化するかまたは増強し得ることである。
【０１２０】
プロモーター配列に関して、本明細書中で使用される場合、用語「植物作動可能」および「植物において作動可能」は、植物発現可能プロモーター配列と等価であるとして理解されるべきである。
【０１２１】
本発明の文脈において、「調節されるプロモーター」または「調節可能なプロモーター配列」は、必要に応じて特定の条件下で、特定の細胞、組織、または細胞の器官、あるいは植物の細胞、組織または器官の群において構造遺伝子に発現を与え得るプロモーターであるが、一般的には全ての条件下で植物全体に渡って発現を与えるわけではない。したがって、調節可能なプロモーター配列は、例えば、化学的化合物または他の誘発剤による遺伝子発現の誘導に続いて、特定の条件セット下で、植物内あるいは植物全体に渡って、特定の位置で作動可能に接続される遺伝子に対して発現を与えるプロモーター配列であり得る。
【０１２２】
好ましくは、本発明の実行において使用される調節可能なプロモーターは、植物内での特定の位置で、構成的にかまたは誘導後かのいずれかで発現を与えるが、任意の環境の下で植物全体に発現を与えるというわけではない。このようなプロモーターの範囲内に含まれるものは、細胞特異的プロモーター配列、組織特異的プロモーター配列、器官特異的プロモーター配列、細胞周期特異的遺伝子プロモーター配列、誘導性プロモーター配列、およびいずれの時点でも植物の特定の部分において発現を与えるように（例えば、転移遺伝因子（Ａｃ、Ｄｓ、Ｓｐｍ、Ｅｎまたは他のトランスポゾン）内への上記の構成的プロモータの組み込みにより）改変された構成的プロモーター配列である。当業者は、「誘導性プロモーター」が、発生刺激、化学的な刺激、環境的な刺激、または物理的な刺激に応答して、その転写活性を増加または誘導するプロモーターであることを知っている。同様に、当業者は、「構成的プロモーター」は、生物体（好ましくは植物）のほとんど（すべての部分である必要はない）を通じて、成長および発生のほとんど（すべての段階である必要はない）の間の、転写的に活性なプロモーターであることを理解している。
【０１２３】
「弱いプロモーター」によって、一般的に、低いレベルでのコード配列の発現を駆動するプロモーターを意図している。「低いレベル」によって、約１／１０，０００の転写物〜約１／１００，０００の転写物、〜約１／５００，００００の転写物のレベルを意図している。逆に、「強いプロモーター」は、高いレベル、または約１／１０の転写物〜約１／１００の転写物〜約１／１，０００の転写物で、コード配列の発現を駆動する。
【０１２４】
用語「細胞特異的」は、発現が、特定の細胞または細胞型（好ましくは植物起源）において優勢であるにもかかわらず、前記の細胞または細胞型において必ずしも排他的ではないことを示すと理解されるべきである。
【０１２５】
同様に、用語「組織特異的」は、発現が、特定の組織または組織型（好ましくは植物起源）において優勢であるにもかかわらず、前記の組織または組織型において必ずしも排他的ではないことを示すと理解されるべきである。
【０１２６】
同様に、用語「器官特異的」は、発現が、特定の器官（好ましくは植物起源）において優勢であるにもかかわらず、前記の器官において必ずしも排他的ではないことを示すと理解されるべきである。「根特異的」は、プロモーターが植物の根だけで発現し、他の組織では発現しないことを意味する。
【０１２７】
「根優先的」によって、異種ヌクレオチド配列の発現が、根において最も大量であるが、植物内の他の場所でも低い発現レベルを有し得ることを意図する。異種ヌクレオチド配列の発現のいくらかのレベルが、他の植物組織型で生じるが、主根、側根および不定根を含む根において最も大量に発現が生じる。
【０１２８】
「根」によって、根冠、頂端分裂組織、原表皮、基本分裂組織、前形成層、内皮、皮質、維管束皮質、表皮などを含む、根の構造の任意の部分を意図する。
【０１２９】
用語「細胞周期特異的」は、発現が、優勢に周期的であり、一つ以上の細胞周期において生じるが、連続的な段階を必要としないにもかかわらず、細胞周期（好ましくは植物起源）において必ずしも排他的でないことを意図すると理解されるべきである。
【０１３０】
プロモーター配列の調節制御下、またはプロモーター配列に作動可能に接続された核酸分子の配置は、発現がプロモーター配列によって制御されるような、前記核酸分子の位置決めを意味する。プロモーターは通常、必須ではないが、プロモーターが調節する核酸分子の転写の開始部位の上流、または５’末端、および２ｋｂ以内に位置付けられる。異種プロモーター／構造遺伝子の組み合わせ構築物において、一般的には、これはプロモーターと天然の設定（すなわち、プロモーターが由来する遺伝子）においてこのプロモーターが制御する遺伝子との間の距離とほぼ同じ遺伝子転写開始部位からの距離でプロモーターを位置付けすることが好ましい。当該分野で公知であるように、この距離のいくつかのバリエーションは、プロモーター機能の損失なく適応され得る。同様に、その制御下に配置される異種遺伝子に対する調節配列エレメントの好ましい位置付けは、天然の設定（すなわち、これが由来する遺伝子）においてのエレメントの位置付けによって規定される。さらに、当該分野で公知であるように、この距離のいくつかのバリエーションもまた、生じ得る。
【０１３１】
「発現」は、細胞自体または無細胞系におけるタンパク質配列またはヌクレオチド配列の産生を意味する。これは、産物をコードするＤＮＡからの、ＲＮＡ産物への転写、転写後の修飾および／またはタンパク質産物またはポリペプチドへの翻訳、ならびに可能な翻訳後修飾を含む。
【０１３２】
「作動可能に連結された」は、近位をいい、このように記載される成分は、意図された様式でそれらが機能することを可能にする関係にある。コード配列の発現が制御配列に適合する条件下で達成されるように、コード配列に「作動可能に連結された」制御配列が、連結される。制御配列がプロモーターである場合、二本鎖核酸が好ましくは使用されるということが、当業者には明らかである。
【０１３３】
本発明の遺伝子構築物での使用に適したプロモーターの例としては、とりわけ、表４に列挙されたものが挙げられる。表４で列挙されたプロモーターは、例示のみの目的で提供され、本発明は、本明細書において提供される表によって限定されない。
【０１３４】
構成的プロモーターまたは植物全体での発現を誘導するプロモーターの場合、このような配列が、表４に列挙した一つ以上の組織特異的プロモーターに由来するヌクレオチド配列、あるいは、組織特異性を与える一つ以上の上述の組織特異的誘導性プロモーター由来のヌクレオチド配列の付加によって改変されることが好ましい。例えば、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターは、以前に記載されたように（Ｅｌｌｉｓら、１９８７）、嫌気的に調節される根特異的発現を与えるトウモロコシのＡｄｈ１プロモーター配列の付加によって改変され得る。別の実施例は、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターをトウモロコシのグリシンリッチタンパク質ＧＰＲ３遺伝子（ＦｅｉｘおよびＷｕｌｆｆ  ２０００−ＷＯ００１５６６２）のエレメントに融合させることによって、根特異的遺伝子発現または根での大量な遺伝子発現発現を与えることを記載する。このような改変は、当業者による慣用的な実験によって達成され得る。
【０１３５】
用語「ターミネーター」は、転写の終結を合図する転写単位の末端のＤＮＡ配列をいう。ターミネーターは、ポリアデニル化シグナルを含む３’非翻訳ＤＮＡ配列であり、このポリアデニル化シグナルは、一次転写物の３’末端へのポリアデニル化配列の付加を促進する。ウイルス、酵母、カビ、細菌、昆虫、鳥、哺乳動物および植物由来の細胞におけるターミネーター活性は公知であり、そして文献に記載されている。これらは、細菌、真菌、ウイルス、動物および／または植物から単離され得る。
【０１３６】
本発明の遺伝子構築物での使用に特に適したターミネーターの例としては、とりわけ、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓのノパリン合成（ＮＯＳ）遺伝子のターミネーター、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓのオクトピン合成（ＯＣＳ）遺伝子のターミネーター配列、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）３５Ｓ遺伝子のターミネーター配列、Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａのＡＤＰグルコースピロホスホリラーゼのターミネーター配列（ｔ３’Ｂｔ２）、Ｚｅａ  ｍａｙｓのゼイン遺伝子のターミネーター配列、ｒｂｃｓ−１Ａ遺伝子のターミネーターおよびｒｂｃｓ−３Ａ遺伝子のターミネーター配列が挙げられる。
【０１３７】
当業者は、本発明を実施するのに有用なさらなるプロモーターおよびターミネーターを容易に提供することができる。
【０１３８】
【表４】
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本発明の文脈において、遺伝子またはタンパク質の「異所性発現」または「異所性過剰発現」は、天然の条件下では通常存在しない、この遺伝子またはタンパク質の発現パターンおよび／または発現レベルを与える。異所発現が、キメラ遺伝子を産生するために単離した相同プロモーターもしくは異種プロモーターにこのタンパク質をコードするコード配列を作動可能に連結する工程、および／または組換え遺伝子複製もしくは遺伝子増殖効果を産生するためにそのタンパク質自体の単離したプロモーター（すなわち、この天然でこのタンパク質の発現を推進する単離されていないプロモーター）にそのコード配列を作動可能に連結する工程を包含する多くの方法によって達成され得る。
【０１３９】
「異所性発現」は、遺伝子の過剰発現を生じ得るだけでなく、「発現のダウンレギュレーション」も生じ得る（例えば、発現がもたらされた場合の植物における相同遺伝子の発現のダウンレギュレーション）。
【０１４０】
「異種性同時発現」とは、２つ以上の遺伝子またはタンパク質の異種性発現または異種性過剰発現を意味する。同じかまたは（より好ましくは）異なるプロモーターが、この遺伝子またはタンパク質の発現を与えるために用いられる。
【０１４１】
好ましくは、本発明の文脈中に用いられるプロモーター配列が、前に規定されるように、本発明のテンサイポリペプチドまたはそれらのホモログ、誘導体、および／もしくは免疫学的に活性なフラグメントのうちの１つをコードする、コード配列またはオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）に作動可能に連結されている。
【０１４２】
本明細書中に使用される場合、「発現のダウンレギュレーション」とは、遺伝子発現のレベルおよび／または活性遺伝子産物のレベルおよび／または遺伝子産物活性のレベルを低下することを意味する。発現の減少は、例えば、プロモーター配列に対してそのセンス配向（同時抑制を生じる場合）もしくはアンチセンス配向での、コード配列またはそれらの部分の付加によって、またさらに、例えば挿入変異誘発（例えば、Ｔ−ＤＮＡ挿入もしくはトランスポゾン挿入）または以下：例えば、ＡｎｇｅｌｌおよびＢａｕｌｃｏｍｂｅ  １９９８（ＷＯ９８３６０８３）、Ｌｏｗｅら、１９８９（ＷＯ９８５３０８３）、Ｌｅｄｅｒｅｒら  １９９９（ＷＯ９９１５６８２）もしくはＷａｎｇら、１９９９（ＷＯ９９５３０５０）によって記載された遺伝子サイレンシング戦略によって達成され得る。遺伝子発現をサイレンシングしようとする遺伝的構築物は、プロモーター配列に対してセンス配向および／またはアンチセンス配向で、その中にこの遺伝子のヌクレオチド配列（またはそれらの１つ以上の部分）を有し得る。遺伝子発現をダウンレギュレートするための別の方法は、例えばＡｔｋｉｎｓら、１９９４（ＷＯ９４０００１２）、Ｌｅｎｅｅら、１９９５（ＷＯ９５０３４０４）、Ｌｕｔｚｉｇｅｒら、２０００（ＷＯ００００６１９）、Ｐｒｉｎｓｅｎら、１９９７（ＷＯ９７１３８６５）およびＳｃｏｔｔら、１９９７（ＷＯ９７３８１１６）に記載されたリボソームの使用を包含する。
【０１４３】
調節（活性遺伝子産物のレベルまたは遺伝子産物活性のレベルを低下することを含む）は、この遺伝子産物、そのホモログ、アナログ、誘導体、および／または免疫学的に活性なフラグメントに、細胞、組織、または生物を投与することによってかまたは曝すことによって達成され得る。免疫調節は、活性遺伝子産物および／または遺伝子産物活性のレベルをダウンレギュレーションし得る技術の別の例であり、かつ細胞、組織、器官、または生物に対してかまたはその中に、その遺伝子産物に対する抗体を投与するか、または曝露するか、または発現させる工程を包含する（ここでこの遺伝子産物および／または遺伝子産物活性のレベルが、調節される）。そのような抗体は、「植物体」、単鎖抗体、ＩｇＧ抗体、および重鎖ラクダ抗体ならびにそれらのフラグメントを含む。
【０１４４】
調節（活性遺伝子産物のレベルまたは遺伝子産物活性のレベルを低下することを含む）は、さらにまた、この遺伝子産物またはその活性のインヒビターまたはアクチベーターに、細胞、組織、器官、または生物を投与する工程または曝す工程によって達成され得る。そのようなインヒビターまたはアクチベーターとしては、タンパク質（例えば、プロテイナーゼおよびキナーゼを含む）および上記の本発明に従って同定される化合物が挙げられる。
【０１４５】
本発明の文脈において、用語「アゴニスト」とは、プロタゴニストまたはアンタゴニスト（すなわち、正および負の効果のいずれかを有し得、エンハンサーまたはインヒビターまたはモジュレーターでも有り得る）のいずれかであり得る物質をいう。
【０１４６】
本発明の文脈において、上部に定義された本発明のテンサイ遺伝子の発現のダウンレギュレーションが、考えられる。本発明はさらに、本発明のテンサイポリペプチドの活性のレベルのダウンレギュレーションを含む（それによって本発明のテンサイポリペプチドが前出のように定義された）。
【０１４７】
「細胞の運命および／または植物発生および／または植物形態学および／または生化学および／または生理学」とは、植物の１つ以上の発生学的特徴および／または形態学的特徴および／または生化学的特徴および／または生理学的特徴が、本明細書中に記載された発明に関する１つ以上の工程の実施によって変化されることを意味する。
【０１４８】
「細胞の運命」とは、植物発生または細胞プロセスの間に（従って、特に、細胞周期の間または細胞周期プロセスの結果として）産生される特定の細胞の細胞型または細胞性特徴をいう。
【０１４９】
「植物発生」または用語「植物発生特徴」または類似の用語は、本明細書中に使用される場合、植物細胞（特に、その中で先祖細胞が発生するような特定の組織型または器官型）の発生運命の決定に関与する、植物の任意の細胞性プロセスを意味すると解釈されるべきである。植物発生に関連する細胞性プロセスは、当業者に公知である。そのようなプロセスとしては、例えば、形態発生、光形態発生（ｐｈｏｔｏｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｓｉｓ）、苗条の発生、根の発生、栄養発生、生殖発生、幹の伸長、開花および細胞運命の決定に関与する調節機構（特に細胞周期を含むプロセスまたは調節プロセス）が挙げられる。
【０１５０】
「植物形態学」または用語「植物形態学的特徴」または類意の用語が、本明細書中に使用される場合、当業者によって、任意の１つ以上の構造的特徴またはそれらの構造的特徴の組み合わせを含む、植物の外観を示すと理解される。そのような構造的特徴は、任意の細胞、細胞の組織もしくは細胞の器官もしくは細胞の群、または植物の組織もしくは器官（数多くの中の、根、幹、葉、苗条、葉柄、トリコーム、花、花弁、柱頭、花柱、雄ずい、花粉、胚珠、種子、胚、内乳、種皮、アリューロン、繊維、果実、形成層、木部、心材、柔組織、通気組織、篩エレメント、篩部、または維管束組織、）の  形、大きさ、数、位置、色、質感（ｔｅｘｔｕｒｅ）、配置、および模様（ｐａｔｔｅｒｎａｔｉｏｎ）を含む。
【０１５１】
「植物生化学」または用語「植物生化学的特徴」または類似の用語は、本明細書中に使用される場合、当業者によって、一次代謝および二次代謝ならびにそれらの産物（例えば、植物によって産生されるデンプン、糖、タンパク質、ペプチド、酵素、ホルモン、増殖因子、核酸分子、セルロース、へミセルロース、カロース、レクチン、繊維、色素（例えば、アントシアニン）、ビタミン、ミネラル、微量養分、または多量要素（ただしこれらに限定されない）のような、任意の低分子、高分子、または化合物を含む）を含む、植物の代謝的プロセスおよび触媒的プロセスを示すと理解される。
【０１５２】
「植物生理学」または用語「植物生理学的特徴」または類似の用語は、本明細書中に使用される場合、発生的プロセス（数ある中で、例えば、成長、伸長および分化、有性発生、有性生殖、種子の設置、種子発生、穀類の充実、無性生殖、細胞分裂、休眠、発芽、明順応、光合成、葉伸長、繊維産生、二次成長、または木部産生）；外部より適用された因子（例えば、金属、化学物質、ホルモン、増殖因子、環境および環境ストレス因子（数ある中で、例えば、無酸素、低酸素、高温、低温、脱水、明かり、昼の長さ、洪水、塩、重金属））に対する植物の応答（この外的に適用された因子に対する植物の付加的な応答を含む）を含む、植物の機能的プロセスを示すと理解される。
【０１５３】
「ストレス」または「環境的ストレス」とは、干魃、塩、脱水、高温、低温、凍結、浸水、創傷、機械的ストレス、酸化的ストレス、オゾン、高照射重金属、栄養不足、毒性化学物質、病原体（ウイルス、細菌、真菌、昆虫、および線虫を含む）およびそれらの組み合わせを含み得るが、これらに限定されない、環境中に存在するエレメントによって引きおこされる状況である。
【０１５４】
「浸透性ストレス」とは、細胞中の浸透性ポテンシャル（ｏｓｍｏｔｉｃ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ）を変化させる任意の種類のストレスである。例えば、浸透性ストレスが、干魃または塩または霜によって引き起こされ得る。
【０１５５】
「非環境的ストレス」とは、生物由来のエレメントまたは因子によって引き起こされる状況（例えば、遺伝子欠損）である。
【０１５６】
本明細書中に使用される場合、「ストレス耐性」とは、ストレスの中で成長しかつバイオマスを産生する能力、ストレスの後、成長を再開しかつバイオマスを産生する能力、およびストレスの中で生存する能力を示す。用語「ストレス耐性」はまた、ストレスの中で、ストレスのない状況下と類似した発生のプログラムを、実行する植物の能力を含む（例えば、ストレス状況下で、ストレスの与えられていない状況下に類似するように、休眠から発芽への変化および栄養期から生殖期への変化をさせる）。さらにまた、浸透性ストレス（トレハロースなど）に対して保護をする遺伝子はまた、酸化的ストレスに対しても保護する（Ｂｅｎａｒｏｕｄｊら、２００１）ことが示された。従って、当業者は、単離された遺伝子が、本明細書中でトランスフェクトされた際に、宿主生物に塩耐性を与える場合、それがまた、酸化的ストレス耐性も与え得ると推定できる。酸化的ストレスは、高光照射と組み合わされた低温ストレスの状態、またはオゾンストレスの状態で、病原体感染もしくは創傷の結果としての壊死の場合、シネセンス（ｓｃｅｎｅｓｃｅｎｃｅ）の場合、または、特定の除草剤（アトラジンまたはパラコート）の適用によって生じる。多くの浸透保護材の機能が、実際に知られておらず、かつ例えば、マンニトールもまた酸素ラジカルのスカベンジャーとして機能することが示されているので、酸化的ストレスもまた浸透ストレスの場合に生じることが推定され得る。
【０１５７】
植物組織または細胞へと組換えＤＮＡを導入する手段としては、ＣａＣｌ２を用いた形質転換およびそのバリエーション（特に以前に記載された方法（Ｈａｎａｈａｎ、１９８３））、プロトプラストへのＤＮＡの直接の取り込み（Ｋｒｅｎｓら、１９８２；Ｐａｓｚｋｏｗｓｋｉら、１９８４）、プロトプラストへのＰＥＧ媒介取り込み（Ａｒｍｓｔｒｏｎｇら、１９９０）、微小粒子の衝撃（ｍｉｃｒｏｐａｒｔｉｃｌｅ  ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ）、エレクトロポレーション（Ｆｒｏｍｍら、１９８５）、ＤＮＡのマイクロインジェクション（Ｃｒｏｓｓｗａｙら、１９８６；Ｆｒｏｍｍら、１９８５）、組織外植片または細胞の微小粒子衝撃（Ｃｈｒｉｓｔｏｕら、１９８８）、核酸を用いた組織の吸引ろ過、また植物の場合には、本質的に記載された、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍから植物組織へのＴ−ＤＮＡ媒介移入（Ａｎら、１９８５；Ｄｏｄｄｓ  １９８５；Ｈｅｒｒｅｒａ−Ｅｓｔｒｅｌｌａら、１９８３ａ；Ｈｅｒｒｅｒａ−Ｅｓｔｒｅｌｌａら、１９８３ｂ）が挙げられるが、これらに限定されない。単子葉植物の形質転換のための方法が、当該分野において周知であり、そしてＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介形質転換（Ｃｈｅｎｇら、１９９７−ＷＯ９７４８８１４；Ｈａｎｓｅｎ  １９９８−ＷＯ９８５４９６１、Ｈｉｅｉら、１９９４−ＷＯ９４００９７７；Ｈｉｅｉら、１９９８−ＷＯ９８１７８１３；Ｒｉｋｉｉｓｈｉら、１９９９−ＷＯ９９０４６１８；Ｓａｉｔｏら、１９９５−ＷＯ９５６７２２）、微小発射体衝撃（ｍｉｃｒｏｐｒｏｊｅｃｔｉｌｅ  ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ）（Ａｄａｍｓら、１９９９−ＵＳ５９６９２１３；Ｂｏｗｅｎら、１９９８−ＵＳ５７３６３６９；Ｃｈａｎｇら、１９９４−ＷＯ９４１３８２２；Ｌｕｎｄｑｕｉｓｔら、１９９９−ＵＳ５８７４２６５／ＵＳ５９９０３９０；ＶａｓｉｌおよびＶａｓｉｌ  １９９５−ＵＳ５４０５７６５；Ｗａｌｋｅｒら、１９９９−ＵＳ５９５５３６２）、ＤＮＡ取り込み（Ｅｙａｌら、１９９３−ＷＯ９３１８１６８）、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ細胞のマイクロインジェクション（ｖｏｎ  Ｈｏｌｔ  １９９４−ＤＥ４３０９２０３）および超音波処理（Ｆｉｎｅｒら、１９９７−ＵＳ５６９３５１２）が挙げられる。
【０１５８】
細胞の微小粒子衝撃では、微小粒子が、形質転換細胞を産生するために細胞へと推進される。任意の適切な弾道性細胞形質転換法および装置が、本発明の実施において用いられ得る。例示的装置および手順が、Ｓｔｏｍｐら（米国特許第５１２２４６６号）ならびにＳａｎｆｏｒｄおよびＷｏｌｆ（同第４９４５０５０号）によって開示されている。弾道性形質転換手順を用いる場合、遺伝子構築物は、形質転換される細胞中で複製し得るプラスミドを組み込み得る。
【０１５９】
そのような系における使用に適する微小粒子の例としては、１〜５μｍ金球体が挙げられる。そのＤＮＡ構築物は、任意の適切な技術（例えば、沈殿）によって微小粒子上に沈着され得る。
【０１６０】
植物全体が、当該分野において周知の手順に従って、形質転換またはインフェクトされた細胞から再生され得る。器官形成または胚形成のいずれかによって続くクローンの増殖を可能とする植物組織は、本発明の遺伝子構築物で形質転換され得、そして植物全体は、そこから再生される。選択される特定の組織は、形質転換される特定の種について利用可能であり、それに最も適する、クローンの増殖系に依存して変化する。例示的標的組織としては、葉のディスク（ｌｅａｆ  ｄｉｓｋ）、花粉、胚、子葉、胚軸、大配偶体、カルス組織、規在の分裂組織（すなわち、頂端分裂組織、腋芽、および根の分裂組織）および誘導された分裂組織（例えば、子葉分裂組織および胚軸分裂組織）が挙げられる。
【０１６１】
本明細書中に使用される場合、用語「器官形成」とは、苗条および根が、分裂組織の中心から連続的に成長するプロセスを意味する。
【０１６２】
本明細書中に使用される場合、用語「胚形成」とは、苗条および根が、体細胞または配偶子のいずれかから、協調した様式で（連続的とは異なる）一緒になって成長するプロセスを意味する。
【０１６３】
好ましくは、本発明の方法に従って産生される植物は、遺伝子配列によってトランスフェクトまたは形質転換されるか、あるいはあらゆる分野で認識される手段（数ある中で、例えば、微小発射体衝撃、マイクロインジェクション、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介形質転換（「花浸漬」形質転換法を含む；（ＢｅｃｈｔｏｌｄおよびＰｅｌｌｅｔｉｅｒ  １９９８；Ｔｒｉｅｕら、２０００））、プロトプラスト融合、またはエレクトロポレーション）によるタンパク質の導入を受けやすい。最も好ましくは、この植物は、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介形質転換によって産生される。
【０１６４】
「実生（ｓｅｅｄｉｎｇ）」とは、種子発芽の後に成熟胚から生じる若い植物である。
【０１６５】
「細胞の分化」とは、細胞が、特定の機能に関連する特徴的な特徴を発生することだと理解される。ほとんどの分化は非可逆的である。
【０１６６】
植物、酵母、糸状菌、または糸状真菌のＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介形質転換またはアグロリスティック形質転換（ａｇｒｏｌｉｓｔｉｃ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）は、核への形質転換ベクター配列（Ｔ−ＤＮＡと呼ばれる）の一部の移入およびこの真核生物のゲノム中でのこのＴ−ＤＮＡの組み込みに基づく。
【０１６７】
「Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ」とは、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅのメンバー、より好ましくは、ＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍまたはＲｈｉｚｏｂａｃｔｅｒｉｕｍおよび最も好ましくは、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓを意味する。
【０１６８】
「Ｔ−ＤＮＡ」、または移植されたＤＮＡとは、Ｔ−ＤＮＡ境界に隣接した形質転換ベクターの一部を意味し、これは、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｖｉｒ遺伝子の活性化の後、Ｔ−ＤＮＡ境界にニックを入れられ、そして一本鎖ＤＮＡとして原核生物細胞の核に移入される。
【０１６９】
本明細書中に使用される場合、「Ｔ−ＤＮＡ境界」、「Ｔ−ＤＮＡ境界領域」、または「境界領域」とは、右のＴ−ＤＮＡ境界（ＲＢ）または左のＴ−ＤＮＡ境界（ＬＢ）のいずれかを意味する。そのような境界は、境界の側面に位置するＴ−ＤＮＡの一部としての境界内部領域および／または境界の側面に位置するベクター骨格の一部としての境界外部領域の側面に配置されたコア配列を備える。このコア配列は、オクトピン型ベクターの場合で２２ｂｐおよびノパリン型ベクターの場合で２５ｂｐを含む。右の境界領域および左の境界領域におけるコア配列は、不完全な繰り返しを形成する。境界コア配列は、少なくともＶｉｒＤ１およびＶｉｒＤ２からなるＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍニック複合体（ｎｉｃｋｉｎｇ  ｃｏｍｐｌｅｘ）による認識およびプロセシングのために必要不可欠である。Ｔ−ＤＮＡの側面に配置するコア配列は、このＴ−ＤＮＡの移入を促進するのに十分である。しかし、このコア配列の側面に単独で配置されたこのＴ−ＤＮＡを含む形質転換ベクターを用いる形質転換の効率は、低い。境界内部および外部領域は、Ｔ−ＤＮＡ移入の効率を調節することが知られている（Ｗａｎｇら、１９８７）。Ｔ−ＤＮＡ移入を増強する１つのエレメントは、特徴づけられかつ右の境界外部領域中に存在し、そしてオーバードライブ（ｏｖｅｒｄｒｉｖｅ）と呼ばれる（Ｐｅｒａｌｔａら、１９８６；ｖａｎ  Ｈａａｒｅｎら、１９８７）。
【０１７０】
「Ｔ−ＤＮＡ形質転換ベクター」または「Ｔ−ＤＮＡベクター」とは、各々、少なくとも右および左の境界コア配列からなる右および左のＴ−ＤＮＡ境界の側面に配置されたＴ−ＤＮＡ配列を包含し、そして任意の真核生物細胞の形質転換に用いられる任意のベクターを意味する。
【０１７１】
「Ｔ−ＤＮＡベクター骨格配列」または「Ｔ−ＤＮＡ骨格配列」とは、Ｔ−ＤＮＡ境界の外側、より詳細には、境界コアの不完全な繰り返しのニック部位の外側に存在する、Ｔ−ＤＮＡ含有ベクターの全てのＤＮＡを意味する。
【０１７２】
本発明は、真核生物細胞のゲノム中のベクター骨格組み込み部が最小化されるかまたは非存在となるような、最適化されたＴ−ＤＮＡベクターを含む。「最適化されたＴ−ＤＮＡベクター」とは、真核生物細胞のゲノムへのベクター骨格配列の移入を減少させるかまたは全くなくすかのいずれかのために設計されたＴ−ＤＮＡベクターを意味する。そのようなＴ−ＤＮＡベクターは、当業者に公知であり、そして以前に記載されたそれらを含む（Ｈａｎｓｏｎら、１９９９、Ｓｔｕｉｖｅｒら、１９９９−ＷＯ９９０１５６３）。
【０１７３】
本発明は、明白に、バイナリー形質転換ベクター、スーパーバイナリー（ｓｕｐｅｒ−ｂｉｎａｒｙ）形質転換ベクター、同時組み込み形質転換ベクター、Ｒｉ由来形質転換ベクターを含む任意のＴ−ＤＮＡベクター、およびアグロリスティック形質転換に用いられるＴ−ＤＮＡを保有するベクターにおいて、前に定義されたＤＲＥ結合因子ＤＢＦ１をコードする本発明のＤＮＡ配列、そのホモログ、誘導体、または免疫学的に活性なフラグメントの包含を考慮する。
【０１７４】
「バイナリー形質転換ベクター」とは、以下を含むＴ−ＤＮＡ形質転換ベクターを意味する：少なくとも１つの目的の遺伝子および／または形質転換される真核生物細胞中で活性な少なくとも１つの選択マーカーを含むＴ−ＤＮＡ領域；ならびにＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉおよびＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ中で活性な複製起点ならびにＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉおよびＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ中での選択のためのマーカーを少なくとも含むベクター骨格領域。あるいは、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ中でのバイナリー形質転換ベクターの複製は、別々のヘルパープラスミドの存在に依存する。バイナリーベクターｐＧｒｅｅｎおよびヘルパープラスミドｐＳｏｕｐは、例えばＨｅｌｌｅｎｓら、２０００に記載されるような系またはインターネットサイトｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐｇｒｅｅｎ．ａｃ．ｕｋ．で利用可能な系の例を形成する。
【０１７５】
バイナリー形質転換ベクターのＴ−ＤＮＡ境界は、オクトピン型もしくはノパリン型Ｔｉプラスミドまたはそれらの両方から誘導され得る。バイナリーベクターのＴ−ＤＮＡは単に、ヘルパープラスミドと組み合わせて真核生物細胞に移入される。また、植物の同時形質転換に効率的な複数のバイナリーベクターＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ株も、当該分野において公知である（ＢｉｄｎｅｙおよびＳｃｅｌｏｎｇｅ  ２０００−ＷＯ００１８９３９）。
【０１７６】
「ヘルパープラスミド」とは、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ中に安定して維持されるプラスミドを意味し、そして少なくとも、Ｔ−ＤＮＡの移入を可能にするために必要なｖｉｒ遺伝子のセットを保有している。このｖｉｒ遺伝子のセットは、オクトピン型もしくはノパリン型Ｔｉプラスミドのいずれか、またはそれらの両方から誘導され得る。
【０１７７】
「スーパーバイナリー形質転換ベクター」を有するとは、ベクター骨格領域中に超有毒のＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ株Ａ２８１のＴｉプラスミドｐＴｉＢｏ５４２のｖｉｒ領域をさらに保有するバイナリー形質転換ベクターを意味する（Ｈｉｅｉら、１９９４−ＥＰ０６０４６６２、Ｈｉｅｉら、１９９５−ＥＰ０６８７７３０）。スーパーバイナリー形質転換ベクターは、ヘルパープラスミドと組み合わせて用いられる。
【０１７８】
「同時組み込み形質転換ベクター」とは、少なくとも以下を含むＴ−ＤＮＡベクターを意味する：
少なくとも１つの目的の遺伝子および／または植物中で活性な少なくとも１つの選択マーカーを含むＴ−ＤＮＡ領域；ならびにＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉおよびＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ中で活性な複製起点およびＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉおよびＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ中での選択のためのマーカー、およびＴ−ＤＮＡの移入を可能とするために必要なｖｉｒ遺伝子のセットを少なくとも含むベクター骨格領域。
【０１７９】
Ｔ−ＤＮＡ境界およびこのＴ−ＤＮＡベクターのこのｖｉｒ遺伝子のセットは、オクトピン型もしくはノナピン型Ｔｉプラスミドのいずれかかまたはその両方から誘導され得る。
【０１８０】
「Ｒｉ誘導植物形質転換ベクター」とは、Ｔ−ＤＮＡ境界がＴｉプラスミドから誘導されるバイナリー形質転換ベクターを意味し、このバイナリー形質転換ベクターは、必要なｖｉｒ遺伝子のセットを保有する「ヘルパー」Ｒｉプラスミドと組みあわせて用いられる。
【０１８１】
本明細書中に使用される場合、用語「選択マーカー遺伝子」または「選択マーカー」または「選択のためのマーカー」は、それが発現する細胞に、ある表現型を与えて、本発明の遺伝子構築物またはその誘導体でトランスフェクトまたは形質転換された細胞の同定および／または選択を容易にする任意の遺伝子を含む。本明細書中に意図される適切な選択マーカー遺伝子としては、数ある中で、アンピシリン耐性遺伝子（Ａｍｐｒ）、テトラサイクリン耐性遺伝子（Ｔｃｒ）、細菌性カナマイシン耐性遺伝子（Ｋａｎｒ）、ホスフィノスリシン耐性遺伝子、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子（ｎｐｔＩＩ）、ハイグロマイシン耐性遺伝子、β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）遺伝子、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子、緑色蛍光タンパク質（ｇｆｐ）遺伝子（Ｈａｓｅｌｏｆｆら、１９９７）およびルシフェラーゼ遺伝子が挙げられる。
【０１８２】
「アグロリスティック」、「アグロリスティック形質転換」、または「アグロリスティック移入」とは、本明細書中において、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介形質転換およびバイオリスティック（ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ）ＤＮＡ送達の特徴を組み合わせた形質転換方法を意味する。このように、Ｔ−ＤＮＡを含む標的プラスミドは、ＶｉｒＥ２を伴うかまたは伴わないＶｉｒＤ１およびＶｉｒＤ２の植物的産生を可能とするＤＮＡ／ＲＮＡと同時送達される（ＨａｎｓｅｎおよびＣｈｉｌｔｏｎ  １９９６；Ｈａｎｓｅｎら、１９９７、ＨａｎｓｅｎおよびＣｈｉｌｔｏｎ  １９９７−ＷＯ９７１２０４６）。
【０１８３】
「外来性ＤＮＡ」とは、組換え技術によって宿主のゲノム中に導入される任意のＤＮＡ配列を意味する。この外来性ＤＮＡは、例えば、発現可能なフォーマットで選択マーカーを含むＴ−ＤＮＡ配列のような、Ｔ−ＤＮＡ配列またはその一部を含む。外来性ＤＮＡはさらに、上に規定したような介在ＤＮＡ配列も含む。
【０１８４】
「植物細胞」は、任意の植物由来であり、かつ培養物中に単一の細胞、細胞群、またはカルスとして存在する任意の細胞を含む。植物細胞はまた、培養物中にあるかまたは天然で生育中の、発達中の植物または成熟した植物中の任意の細胞でもあり得る。
【０１８５】
「植物（ｐｌａｎｔ）」または「植物（ｐｌａｎｔｓ）」は、スーパーファミリーＶｉｒｉｄｉｐｌａｎｔａｅに属する全ての植物種を含む。本発明は、任意の植物に適用可能であり、数ある中で、特に、以下：
【０１８６】
【化１】
2004524015.tif 000013
ヒユ、アーティチョーク、アスパラガス、ブロッコリー、メキャベツ、キャベツ、キャノーラ、人参、カリフラワー、セロリ、コラードの若葉（ｃｏｌｌａｒｄ  ｇｒｅｅｎ）、アマ、ケール、レンズマメ、脂肪種子のナタネ、オクラ、玉ねぎ、ジャガイモ、米、ダイズ、ワラ、テンサイ、蔗糖、ヒマワリ、トマト、カボチャ、および茶を含むリストより選択される、飼料（ｆｏｄｄｅｒ）豆類もしくは飼草豆類、観賞植物、食用穀類、樹木、または灌木を含む単子葉植物および双子葉植物、あるいは上に詳述された任意の植物の種または上記の種のいずれかの、組織、細胞、もしくは器官培養物に適用可能である。
【０１８７】
「穀類」は、食用穀物（例えば、オートムギ、大麦、ライ麦、小麦、米、および、コーン等の栄養豊富な穀物のため栽培されるイネ科に属する植物）を有する穀物植物を包含する。
【０１８８】
「酵母ツーハイブリッドアッセイ（ｙｅａｓｔ  ｔｗｏ  ｈｙｂｒｉｄ  ａｓｓａｙ）」とは、多くの真核生物転写因子が、２つのドメイン（ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢ）および活性化ドメイン（ＡＤ））を備え、この２つのドメインが、物理的に分離された場合（すなわち、共有結合の破壊）標的遺伝子の発現を実現しないという観察に基づくアッセイを意味する。２つのタンパク質（ＤＢに融合されたその一方のタンパク質およびＡＤに融合されたその他方のタンパク質が物理的に相互作用し得る）は、転写因子のＤＢドメインおよびＡＤドメインが再結合して、標的遺伝子の発現を生じる。酵母ツーハイブリッドアッセイにおける標的遺伝子は、通常、β−ガラクトシダーゼ遺伝子のようなレポーター遺伝子である。従って、酵母ツーハイブリッドアッセイにおけるタンパク質パートナーの間の相互作用は、レポーター遺伝子産物の活性を測定することによって定量され得る（ＢａｒｔｅｌおよびＦｉｅｌｄｓ  １９９７）。あるいは、哺乳動物のツーハイブリッドシステム（例えば、キメラ緑色蛍光タンパク質をコードするレポーター遺伝子（Ｓｈｉｏｄａら、２０００）を含む）が、用いられ得る。なお別の代替物は、例えばレポーター遺伝子としてＨＩＳを用いる細菌性ツーハイブリッドシステムからなる（Ｊｏｕｎｇら、２０００）。
【０１８９】
用語「配列のフラグメント」または「配列の一部」とは、示された元の配列の短縮された配列を意味する。この短縮された配列（核酸配列またはタンパク質配列）は、長さが広範に変化し得；最小のサイズは、ある配列に、示された元の配列と少なくとも１つの同等の機能および／または活性を提供するのに十分なサイズの配列であるが、その最大のサイズは、必要不可欠ではない。いくつかの適用において、最大のサイズは、通常、元の配列の所望の活性および／または機能を提供するために必要とされるサイズより実質的に大きくない。代表的には、その短縮されたアミノ酸は、約５〜約３３３アミノ酸長（ｎｕｉｎ  ｌｅｎｇｔｈ）の範囲にある。しかし、より代表的には、その配列は、約３３３アミノ酸長の最大値であり、好ましくは、約３３０アミノ酸の最大値である。少なくとも約１０、１２、もしくは１５のアミノ酸、または２５、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、最大値である約３００もしくは３２５までのアミノ酸の配列を選択することが、通常、所望される。例えば、この短縮された核酸は、それがコードするアミノ酸フラグメントと長さが一致する。
【０１９０】
この化合物（単数または複数）は、例えば、サンプル（例えば、細胞抽出物（例えば、植物、動物、または微生物由来））中に含まれ得る。さらに、これらの化合物は、当該分野において公知であり得るが、従来、細胞周期を相互作用するタンパク質を抑制または活性化し得ることは、知られていない。この反応混合物は、細胞を含まない抽出物でも、細胞培養物もしくは組織培養物を含んでもよい。本発明のための適切な設定は、当業者に公知であり、そしてそれらは、一般的に、例えば、以前に記載されている（Ａｌｂｅｒｔｓら、１９９４（特に、１７章））。多くの化合物は、例えば、反応混合物、培養培地に添加され得るか、または細胞中に注入され得る。
【０１９１】
化合物（単数または複数）を含むサンプルが、本発明の方法で同定される場合、アゴニストとして作用し得る化合物を含むとして同定されている元のサンプルから、それらのいずれかの化合物を単離することが可能であるか、または例えばそのサンプルが多くの異なる化合物からなる場合、実施者は、サンプル当たりの異なる化合物の数を減少させるために、元のサンプルをさらに細分化し得、そして元のサンプルの細分化を伴うその方法を繰り返し得ることが可能である。サンプルの複雑さに起因して、上記の工程は、好ましくは本発明の方法に従い同定されるサンプルが、限定された数または１つの物質のみを含むまで、複数回、実施され得る。好ましくは、このサンプルは、物質または類似の化学的特性および／もしくは物理的特性を含み、そして最も好ましくは、この物質は、同一である。好ましくは、上記の方法またはその改変に従い同定された化合物は、さらに、植物栽培または植物細胞および組織の培養における適用に適する形態に処方される。
【０１９２】
本発明は、さらに、以下の限定をしない図および例を参照して記載される。
【０１９３】
（実施例）
（実施例１：植物材料）
テンサイの種子（Ｂｅｔａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ  ｖａｒ．ＤＩＴＡ）を、砂とバーミキュライトの混合物（１：１重量／重量）を含むポットに蒔いた。その植物を、温室条件（最低限の１２時間光周期を刺激するための補助照明を用いて、２０℃で８時間、２５℃で１６時間）下で育てた。その植物を、栄養液（２．４ｇ／ｌ  Ｃａ（ＮＯ３）２・４Ｈ２Ｏ、１ｇ／ｌ  ＫＮＯ３、１ｇ／ｌ  ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．３ｇ／ｌ  ＫＨ２ＰＯ４、５．６ｍｇ／ｌ  Ｆｅ−ｑｕｅｌａｔｅ（Ｋｅｌａｎｔｒｅｎ，Ｂａｙｅｒ）、１．１ｍｇ／ｌ  ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、３．３ｍｇ／ｌ  ＭｎＯ４・Ｈ２Ｏ、０．３ｍｇ／ｌ  ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、３．８ｍｇ／ｌ  Ｈ３ＢＯ３、０．１８ｍｇ／ｌ  （ＮＨ４）６Ｍｏ７・４Ｈ２Ｏを含む）で定期的に灌水した。ｃＤＮＡライブラリーの作製のため、３週間齢の植物を、収穫前の２４時間にわたって，２００ｍＭ  ＮａＣｌで灌水した。ノーザンブロット分析のため、植物を２５０ｍＭ  ＮａＣｌで灌水し、そして葉を図５の説明に示すように、異なる時間において収穫した。コントロールを同様に処理したが、ＮａＣｌ溶液の代わりに、Ｈ２Ｏを培養物に供給した。
【０１９４】
（実施例２：酵母株および培養条件）
Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株ＪＭ２６（ＭＡＴａ  ｌｅｕ２−３，１１２  ｕｒａ３−１  ｔｒｐ１−１，ａｄｅ２−１  ｈｉｓ３−１１，１５  ｃａｎ  １−１００，ｅｎａ  １−４：：ＨＩＳ３，ｎｈａ１：：ＴＲＰ１）（Ｊ．Ｍ．Ｍｕｌｅｔ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｄａｄ  Ｐｏｌｉｔｅｃｎｉｃａ  ｄｅ  Ｖａｌｅｎｃｉａ，Ｉｎｓｔｉｔｕｔｏ  ｄｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉａ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｙ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｄｅ  Ｐｌａｎｔａｓ）によって提供された）を、テンサイｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングおよびＣＫＡ２  ｃＤＮＡクローンの特徴付けに使用した。ＪＭ２６株は、Ｎａ＋ポンプＡＴＰアーゼおよびＮａ＋／Ｈ＋対向輸送体をそれぞれコードする、遺伝子ＥＮＡ１−４およびＮＨＡ１のヌル変異を含むＷ３０３．１Ａ（Ｗａｌｌｉｓら  １９８９）の誘導体であり、Ｎａ＋ポンプＡＴＰアーゼおよびＮａ＋／Ｈ＋対向輸送体は、酵母のナトリウム突出のほとんどの原因である（Ｇａｒｃｉａｄｅｂｌａｓら  １９９３，Ｂａｎｕｅｌｏｓら  １９９８）。ＣＫ２温度感受性変異体株ＹＤＨ８（ＭＡＴａ  ｃｋａ１−Δ１：：ＨＩＳ  ３  ｃｋａ２−Δ１：：ＴＲＰ−１  ａｄｅ２−１０１ｏｃｈｒｅ  ｈｉｓ３−Δ２００  ｌｅｕ２−Δ１  ｌｙｓ２−８０１ａｍｂｅｒ  ｔｒｐ１−Δ１  ｕｒａ  ３−５２［ｐＤＨ８：ＬＥＵ２  ｃｋａ２−８］）は、Ｃ．Ｖ．Ｃ．Ｇｌｏｖｅｒ博士（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｇｅｏｒｇｉａ）の親切な贈り物であった（Ｈａｎｎａら  １９９５）。
【０１９５】
酵母を、最小合成グルコース培地（ＳＤ）かまたは栄養分のある培地（ＹＰＤ）のいずれかにおいて増殖させた。ＳＤ培地は、２％のグルコース、アミノ酸を含まない０．７％の酵母窒素ベース、および５０ｍＭコハク酸を含み、その培地を、示したような、ＴｒｉｓでｐＨ５に調整し、必要なアミノ酸［１００μｇ／ｍｌ  ロイシン、３０μｇ／ｍｌ  アデニン、１００μｇ／ｍｌ  メチオニン］をプラスした。ＹＰＤ培地は、１％の酵母抽出物、２％のＢａｃｔｏペプトン、および２％のグルコースを含んだ。培地に、示したように、ＮａＣｌを補充した。固体培地は、２％の細菌学グレードの寒天を含んだ。
【０１９６】
（実施例３：塩ストレスによって誘導されたテンサイｃＤＮＡライブラリーの構築）
方向性ｃＤＮＡを、塩処理したテンサイ植物の葉から調製された、ポリ（Ａ）＋ＲＮＡを使用して合成した（ｃＤＮＡ合成キット、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）。ｃＤＮＡをファージλＰＧ１５ベクター中に連結させ、Ｇｉｇａｐａｃｋ  ＩＩＩ  ｇｏｌｄ  ｐａｃｋａｇｉｎｇ  ｅｘｔｒａｃｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を使用してパッケージ化した。このファージは、切除可能な発現プラスミドｐＹＰＧＥ１５（選択マーカーとしてＵＲＡ３）を挿入されており、この発現プラスミドは、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉと酵母との両方の相補のために直接的に有効である（Ｂｒｕｎｅｌｌｉ  および  Ｐａｌｌ，１９９３）。プラスミドｃＤＮＡライブラリーを、ｃｒｅ−ｌｏｘリコンビナーゼ系（Ｂｒｕｎｅｌｌｉ  および  Ｐａｌｌ，１９９３）によって、λＰＧ１５から回収した。
【０１９７】
（実施例４：酵母に対して耐塩性を付与するｃＤＮＡクローンのスクリーニングおよび単離）
酵母における耐塩性を上昇させるテンサイｃＤＮＡについてスクリーニングするために、ｐＹＰＧＥ１５中に構築されたｃＤＮＡライブラリーを使用して、ＬｉＣｌ方法（Ｇｉｅｔｚら  １９９２）によって酵母変異株ＪＭ２６を形質転換した。ロイシンおよびアデニンを含むＳＤプレート上でウラシル原栄養性によって選択された形質転換体をプールし、そして１プレート（１２×１２ｃｍ）あたり２×１０５細胞の密度でスクリーニング培地（０．１５Ｍ  ＮａＣｌを補充した、ロイシン、アデニンおよびメチオニンを含むＳＤ）に再度プレーティングした。メチオニンを選択培地に添加し、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ中にすでに見出されたＨＡＬ２様ホモログ（Ｑｕｉｎｔｅｒｏら  １９９６、Ｇｉｌ−Ｍａｓｃａｒｅｌｌら  １９９９）の選択を回避した。あるいは、Ｌｉ＋耐性酵母細胞の選択のために、形質転換体をスクリーニング培地（２０ｍＭ  ＬｉＣｌを補充した、ロイシンおよびアデニンを含むＳＤ）上に再度プレーティングした。推定上のポジティブクローンを、同じＮａＣｌ培地またはＬｉＣｌ培地上で再スクリーニングした。
【０１９８】
確認されたＮａＣｌ耐性クローンのうちの１つであるクローン１５４をさらなる特徴付けのためについて選択した。プラスミドＤＮＡを、１５４酵母細胞（ｐＹＰＧＥ１５＋１５４）から単離し、そしてＪＭ２６に再導入し、このプラスミドＤＮＡが耐塩性を付与することを確認した。フッ素を含む酸（ｆｌｕｏｒｏｔｉｃ  ａｃｉｄ）を用いた、ＵＲＡ３をマークしたプラスミドを除くような選択は、酵母細胞の塩感受性を回復した。ｐＹＰＧＥ１５＋１５４の挿入片を、ＤＮＡ配列決定機（Ｍｏｄｅｌ  ＡＢＩ  ３７７、ＰＥ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、ダイ−プライマーサイクル配列決定法によって直接配列決定した。ＣＫ２のサブユニットα（以下を参照のこと）としての挿入片を同定した後、それをｐＹＰＧＥ１５＋ＢｖＣＫＡ２と改名した。
【０１９９】
（実施例５：酵母ＣＫＡ２遺伝子のクローニング）
Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＣＫＡ２遺伝子を、ゲノムＤＮＡからＰＣＲで単離した。増幅をＰｗｏ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）を用いて行い、そしてプライマーをゲノムクローン（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：Ｍ３３７５９）の配列に従って設計した。プライマーの配列（Ｅｃｏ  ＲＩ−Ｘｈｏ  Ｉ部位は下線を引いた）は以下の通りである：順方向プライマー５’−ＡＴＧＧＡＴＴＡＧＡＡＴＴＣＴＣＡＴＡＧＡＧＴＴＧＴＡＡＧＧＴＣＴＣＡＧＧＧ−３’（配列番号１１）および逆方向プライマー５’−ＣＣＴＣＡＧＴＴＣＴＣＧＡＧＴＴＴＡＴＡＡＡＴＧＧＡＡＡＴＣＡＧＴＧＧＴＧＧ−３’（配列番号１２）。
【０２００】
１．１ｋｂのＰＣＲ増幅産物を、Ｅｃｏ  ＲＩ−Ｘｈｏ  Ｉ消化し、そして酵母発現ベクターｐＹＰＧＥ１５中に方向性をもってクローン化した。ｐＹＰＧＥ１５＋ＳｃＣＫＡ２と名付けたこの構築物を使用して、酵母株ＪＭ２６（Ｇｉｅｔｚら  １９９２）を形質転換した。ｐＹＰＧＥ１５プラスミドに含まれる挿入片が、酵母遺伝子ＣＫＡ２であることが、配列分析によって、確認された。
【０２０１】
（実施例６：ＣＫＡ２酵母変異体の相補性研究）
カゼインキナーゼ２触媒サブユニット遺伝子（ＣＫＡ１およびＣＫＡ２）は、酵母生存に必須であるので、ｃｋ２変異体株ＹＤＨ８（ｃｋａ１  ｃｋａ２）は、触媒サブユニットの温度感受性対立遺伝子（ｃｋａ２〜８）をコードする動原体プラスミドｐＤＨ８（ＬＥＵ２マーカー）を保有する。この構築物は、細胞が３７℃の制限温度では増殖しないが、２５℃で増殖することを可能にする（Ｈａｎｎａら  １９９５）。プラスミドｐＹＰＧＥ１５＋ＢｖＣＫＡ２を形質転換によってＹＤＨ８株に導入した。その後、プラスミドを失わせるためリッチ培地で細胞を増殖させ、そしてロイシン要求性について選択することによって、プラスミドｐＤＨ８をＹＤＨ８から取り除いた。２５℃および３７℃における酵母細胞の増殖について研究した。
【０２０２】
（実施例７：耐塩性試験および細胞内イオン濃度の測定）
酵母培養物を、ロイシンおよびアデニンを含むＳＤ液体培地で予備増殖させた。飽和培養物のアリコートを希釈し（１：１０）、そして表示された濃度の塩を含むプレート上に、８×６のステンレス銅レプリカプレーター（ＳＩＧＭＡ  Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ．）で、スポット状に配置した。
【０２０３】
細胞内イオン濃度を測定するために、ロイシン、アデニン、メチオニンおよび７５ｍＭ  ＮａＣｌを加えたＳＤ中で指数関数期まで増殖させた１０ｍｌの酵母培養物（Ｓｐｅｃｔｒｏｎｉｃ  ２０Ｄ（Ｍｉｌｔｏｎ  Ｒｏｙ，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ  Ｎ．Ｙ．）で測定して、６６０ｎｍで０．７の吸光度）を遠心分離し、氷冷の１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２中での再懸濁によって３回洗浄し、１ｍｌの１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２中に最後に再懸濁した。細胞濃度を、６６０ｎｍの吸光度によって決定し、そして細胞内イオンを、濃縮したＨＣｌを０．１Ｍの最終濃度になるように添加することによって、抽出した。遠心分離による細胞片の除去後、上清中のＫ＋およびＮａ＋の濃度を、炎光発光モードにおいて原子吸光分光計（Ｖａｒｉａｎ）によって決定した。細胞内水を、以前（Ｇａｘｉｏｌａら  １９９２）に記載される通りに見積った。
【０２０４】
（実施例８：サザンブロット分析およびノーザンブロット分析）
ゲノムＤＮＡをＲｏｇｅｒｓおよびＢｅｎｄｉｃｈ（１９９４）に従って３週齢のテンサイの葉から調製した。ＤＮＡの５μｇを、適切な制限酵素で消化し、０．８％のアガロースゲルで電気泳動し、そしてナイロン膜フィルター（Ｈｙｂｏｎｄ  Ｎ＋，Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）にブロットした。膜フィルターを２つの異なった３２Ｐ標識ＤＮＡプローブでハイブリダイズした。それらのうちの１つは、ＢｖＣＫＡ２  ｃＤＮＡのコード領域を含む８８７ｂｐのＰＣＲ増幅したフラグメント（順方向プライマー、５’−ＣＧＡＡＧＣＴＣＴＣＡＣＴＧＴＴＣＡＡＴＧＧ−３’（配列番号１３）および逆方向プライマー、５’−ＧＧＡＴＧＴＧＣＣＡＴＴＧ  ＣＴＴＣＴＴＴＴＧＣ−３’（配列番号１４））に対応した。２つ目の３２３ｂｐのより特異的なフラグメント（順方向プライマー、５’−ＣＴＣＴＣＡＡＧＴＴＡＧＡＧＣＴＧＣＡＧＡ−３’（配列番号１５）および逆方向プライマー、５’−ＧＣＴＡＴＴＡＧＣＡＡＡＣＴＡＴＡＴＴＡＡＧＴＧ−３’（配列番号１６））は、ＢｖＣＫＡ２  ｃＤＮＡの３’非コード領域を含む。ハイブリダイゼーションおよび洗浄を、ＣｈｕｒｃｈおよびＧｉｌｂｅｒｔ（１９８４）に従ってハイストリンジェンシー条件下（６５℃）で行った。
【０２０５】
ノーザンブロット分析のために、全ＲＮＡを、コントロールのテンサイの葉またはＮａ＋処理（Ｄａｖｉｓら（１９９８）によって記載された通り）したテンサイの葉から単離した。３０μｇの全ＲＮＡを、２．２％のホルムアルデヒドを含む１％アガロースゲルで分離し、そしてナイロン膜フィルター（Ｈｙｂｏｎｄ  Ｎ，Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）上にブロットした。ハイブリダイゼーションを、３２３ｂｐの３’ＵＴＲ特異性プローブ（サザンブロッティングについて上記に記載した）を用いて行った。フィルターを、ＳＳＣ  ４×、０．１％  ＳＤＳで５分間、２回およびＳＳＣ  ０．４×、０．１  ＳＤＳで５分間、２回、６５℃で洗浄した。同じフィルターを、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓのα３チューブリン遺伝子（Ｌｕｄｗｉｇら  １９８７）を含む１．９  Ｅｃｏ  ＲＩフラグメントでリハイブリダイズした。ハイブリダイゼーションおよび洗浄の温度を、この異種プローブについて５５℃に下げた。
【０２０６】
（実施例９：テンサイ遺伝子でのイネ形質転換）
（酵母における耐塩性に関与するテンサイ遺伝子のイネ中での発現は、イネにおけるストレス耐性を媒介する）
単子葉植物中のテンサイのストレス耐性遺伝子のストレス耐性活性化を研究するために、プロモーターに作動可能に連結した上述の遺伝子（配列番号１〜５）を、当業者に周知の、そして以下の段落で概要を説明した標準的な形質転換手順を使用してイネにそれぞれ形質転換する。１日〜１週間以上の範囲にわたるいくらかの期間の後、芽生えを、形質転換遺伝子の発現についてチェックする。これを、器官形成培地中で芽生えを増殖させ、そしてＰＣＲまたは逆ＰＣＲによってＤＮＡまたはｍＲＮＡの存在をチェックすることによって行う。遺伝子発現の確認の後、形質転換したイネ植物を、塩、干ばつ、および低温を含むストレス状況での耐性の増強についてチェックする（ＷＯ９７／１３８４３を参照のこと）。これは、増加した量のＮａＣｌまたはＬｉＣｌを含む培地中での、形質転換したイネ植物の増殖によって行う。低温または干ばつに対する耐性の増大をまた、それぞれ、最適未満の増殖温度および最適未満の湿度のレベルで、形質転換した植物の増殖によって試験する（ＷＯ９７／１３８４３）。
【０２０７】
（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介イネ形質転換）
本発明のテンサイ遺伝子を、ベクター中にクローン化されたプロモーターに作動可能に連結し得る。これらのベクターを、エレクトロポレーションによって、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ  ＬＢＡ４４０４株またはＣ５８株に形質転換し得、そして引き続いて、形質転換された細菌細胞を適切な抗生物質を含む固体寒天培地で選択し得る。
【０２０８】
イネにおける本発明の遺伝子の発現の実証のために、イネのジャポニカ品種日本晴または台北の３０９個の成熟した乾燥種子を、皮を取り除き、滅菌し、そして２，４−ジクロロフェノキシ酢酸（２，４−Ｄ）を含む培地で発芽させる。暗所で４週間インキュベートした後、胚形成性の、胚盤由来カルスを切り出し、そして同じ培地で増殖させる。次いで、選択した胚形成カルスを、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍと一緒に共存培養（ｃｏ−ｃｕｌｔｉｖａｔｅｄ）する。共存培養したカルスを、２，４−Ｄを含む培地で４〜５週間暗所で、適切な濃度の適切な選択剤の存在下で増殖させる。この期間の間、急速に増殖する耐性カルス島が、発達する。減少した濃度の２，４−Ｄを含む培地へのこの材料の移植、および明所でのインキュベーション後、胚形成の可能性はなくなり、そして次の４〜５週間でシュートが発生する。シュートを、カルスから切り出し、そしてオーキシンを含む培地で１週間インキュベートする（シュートを培地から土壌に移植し得る）。硬化したシュートを、高い湿度、および短日で、ファイトトロン中で増殖させる。種子は、移植後、３〜５ヶ月で収穫され得る。この方法によって、単一遺伝子座形質転換体が５０％を越える割合で得られる（Ｃｈａｎら  １９９３，Ｈｉｅｉら  １９９４）。
【０２０９】
（実施例１０：Ｂｅｔａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ  ＣＫＡ２遺伝子でのＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓの形質転換）
１５４ｃＤＮＡ（ＢｖＣＫＡ２）を発現するトランスジェニック植物のＮａＣｌ耐性を研究した。
【０２１０】
Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ植物（生態型コロンビア）を、空のプラスミドｐＢＩ１２１（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）またはテンサイＣＫ２プロテインキナーゼアリスティックサブドメイン（配列番号６）を発現するｐＢＩ１２１  ＢｖＣＫＡ２のどちらかで形質転換した。ＢｖＣＫＡ２  ｃＤＮＡを、ｐＢＩ１２１のＢａｍＨＩ部位とＳａｃ  Ｉ部位との間の部位に挿入した。構築物を、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ  Ｃ５８ＲｉｆＲ  Ｒｉｆ株（Ｖａｎ  Ｌａｒｅｂｅｋｅら  １９７４）に導入した。この株を使用して、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ植物を花浸漬法によって形質転換した。
【０２１１】
植物生存に対するＮａＣｌの効果を、インビトロ実験および温室実験で決定した。
【０２１２】
（インビトロ実験）
種子を１００ｍＭまたは１２５ｍＭのＮａＣｌを含むＭＳ培地を有するプレートで増殖させた。生存を、子葉および／または本葉を展開した芽生えの数として決定した。結果を図７および図８に示す。これらの結果は、配列番号１で表される核酸配列を有するｃＤＮＡ（本発明の配列番号６で表されるアミノ酸配列を有するＢｅｔａ  ｖｕｌｇａｒｉｓカゼインキナーゼαサブユニットをコードする）でトランスフェクトしたＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ植物が、野生型植物と比較したとき、塩ストレス条件下で生存率が明らかに増加した、ということを明らかに示す。
【０２１３】
（温室実験）
植物を、土壌およびバーミキュライトの混合物（２：１）が入った鉢に植えた。植物を、以前に（Ｋａｎｈｏｎｏｕら  ２００１）記載のように生育させた。５０ｍＭ  ＮａＣｌに対して耐性のコントロール植物（野生型植物および空のプラスミドで形質転換した植物）およびＢｖＣＫＡ２を過剰発現する植物を、成熟した植物／植えた植物のパーセンテージとして決定した（表５）。乾燥重量もまた、決定した（表５）。データは、平均値±標準偏差である。
【０２１４】
【表５】
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（実施例１１：光周期と関係なく開花を制御するためのＢｖＣＫＡ２遺伝子の使用）
ＣＫ２は、開花時期を制御することに関する量的形質遺伝子座（Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ｔｒａｉｔ  ｌｏｃｉ）（ＱＴＬ）として最近記載された（Ｔａｋａｈａｓｈｉら  ２００１）。特にＣＫ２は、光周期感受性を制御することに関与するようである。
【０２１５】
本発明者らは、実施例１０に記載のトランスジェニックＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ植物の開花時期が遅れることを観察した。栽培者は、光周期に関係なく開花プロセスを制御することに関心を持っているので、この表現型は、実用的用途を有する。開花時期の遅れまたは早まりを、ＣＫ２の発現のレベルを制御することによって、または植物細胞中のＣＫ２タンパク質の活性を調節することによって、またはこのタンパク質の変異体を用いることによって、調製する。
【０２１６】
（実施例１２：ＢｖｅＩＦ−１Ａの機能的特徴付け）
Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ酵母ＪＭ２６株（Ｋａｎｈｏｎｏｕら  ２００１）を空のプラスミドｐＹＰＧＥ１５（ＢｒｕｎｅｌｌｉおよびＰａｌｌ  １９９３）または７６ｐＹＰＧＥ１５のどちらかで形質転換した。プラスミド７６ｐＹＰＧＥ１５は、翻訳開始因子ｅ−ＩＦ１ＡをコードするＢｅｔａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ  ｃＤＮＡを保有する。放射性フェニルアラニン（ｐｈｅｎｉｌａｌａｎｉｎｅ）の酵母タンパク質への取り込みを、記載された（Ｐａｓｃｕａｌ  Ａｈｕｉｒら  ２００１）とおり液体培養において決定した。実験を、３００ｍＭのＮａＣｌの存在下（ｐＹＰＧＥ１５−３００ｍＭ  ＮａＣｌ、７６ｐＹＰＧＥ１５−３００ｍＭ  ＮａＣｌ）または非存在下（ｐＹＰＧＥ１５、７６ｐＹＰＧＥ１５）で行った。結果を、図９に示す。これらの結果は、ＮａＣｌの非存在下では、ＢｖｅＩＦ−１Ａを保有するトランスジェニック酵母が空のベクターで形質転換した細胞と比較して、少ないフェニルアラニンを取り込むことを明らかに示す。これに反して、酵母細胞は過酷な塩ストレス条件下に置かれたとき、ＢｖｅＩＦ−１Ａで形質転換した酵母細胞中でより良好なタンパク質合成が起こることが明らかである。
【０２１７】
【表６】
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【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は、他のＣＫ２の触媒サブユニットを有する、ＢｖＣＫＡ２のアミノ酸アライメントである。各々のＣＫ２の登録番号および供給源は、以下の通りである：ＡｔＣＫＡ２（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ，登録番号Ｑ０８４６６）、ＺｍＣＫＡ２（Ｚｅａ  ｍａｙｓ，登録番号Ｐ２８５２３）、ＲｎＣＫＡ１（Ｒａｔｕｓ  ｎｏｒｖｅｒｇｉｃｕｓ  登録Ｐ１９１３９）、ＸＩＣＫＡ２（Ｘｅｎｏｐｕｓ  ｌａｅｖｉｓ，登録Ｐ２８０２０）およびＳｃＣＫＡ２（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  登録番号Ｐ１９４５４）。同一であるアミノ酸に、影を付けている。囲まれた領域は、ＣＫＩＩにおいて重要な保存された残基を示す。これらは、触媒部位、を形成するモチーフ７１−ＤＷＧ−７３必須である６３Ｋ、および高い塩基性である６９−ＫＫＫＫＩＫＲ−７５ドメインを含む。
【図２】
図２は、ＢｖＣＫＡ２遺伝子のサザンブロット分析を示す。ゲノムＤＮＡを、Ｂａｍ  ＨＩ（Ｂ）、Ｈｉｎｄ  ＩＩＩ（Ｈ）およびＥｃｏ  ＲＩ（Ｅ）で消化し、０．８％アガロースゲル上で分離した。次いで、そのＤＮＡを、ナイロン膜上に移し、ＵＶ架橋した。ハイブリダイゼーションを、高ストリンジェンシー条件下で、２つの放射標識されたプローブ（ＢｖＣＫＡ２  ｃＤＮＡのコード領域に含まれる８８７ｂｐのフラグメント（左のパネル）、およびＢｖＣＫＡ２  ｃＤＮＡの３’非翻訳領域に相当する３２３ｂｐのフラグメント（右のパネル））を用いて行った（実施例８参照）。
【図３】
図３は、ＢｖＣＫＡ２が、酵母の二重変異体ｃｋａ１  ｃｋａ２を補完することを示す。カゼインキナーゼ温度感受性酵母株ＹＤＨ８（ｃｋａ１  ｃｋａ２）を、プラスミドｐＹＰＧＥ１５−ＢｖＣＫＡ２（４，５，６，７）かまたは空のプラスミド（１，２，３）のいずれかで形質転換し、許容温度である２５℃（左）でかまたは温度感受性温度である３７℃（右）において増殖させた。
【図４】
図４は、ＳｃＣＫＡ２およびＢｖＣＫＡ２の過剰発現によって、酵母におけるＮａＣｌストレスに対する耐性が増加されたことを示す。酵母変異株ＪＭ２６を、空のプラスミド（ｐＹＰＧＥ１５）、あるいはＳｃＣＫＡ２またはＢｖＣＫＡ２をコードするインサートを含むプラスミドのいずれかで形質転換した。形質転換された細胞を、実施例７に記載されるように、塩耐性について試験した。示された時、プレートは、ロイシン、アデニンおよび１５０ｍＭのＮａＣｌを含むＳＤ培地を含んでいた。
【図５】
図５は、ＢｖＣＫＡ２遺伝子発現が、ＮａＣｌストレスによって上方制御されることを示す。ノーザン分析を、実施例８に記載されるように行った。ＲＮＡを、３週間齢テンサイの葉から、２５０ｍＭのＮａＣｌを加えて（＋）かまたは加えないで（−）成長をした、０時間後、３時間後、６時間後、８時間後、および２４時間後において、単離した。同じＲＮＡブロットを、ＢｖＣＫＡ２の３’ＵＴＲフラグメントとハイブリダイズさせ、そしてフィルタートランスファーのコントロールとして使用したＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ由来のα３チューブリンプローブ（ＡｔＴＵＢＡ，登録番号Ｍ１７１８９）でハイブリダイズした。ゲルローディングのコントロールは、臭化エチジウム染色を用いて行った。これは、ｒＲＮＡの３．５Ｋｂのバンドで示される。
【図６】
図６は、以下の配列を示す；配列番号１〜５：本発明の核酸のＤＮＡ配列であり、開始コドンおよびおよび終止コドンには下線を付している。配列番号６〜１０：本発明のポリペプチドのアミノ酸配列。
【図７】
図７は、クローン１５４  ｃＤＮＡ（ＢｃＣＫＡ２）を発現するトランスジェニックＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓのＮａＣｌに対する耐性のインビトロ評価を示す。
培養培地：ＭＳ、ＮａＣｌ濃度：０ｍＭ、１００ｍＭ、および１２５ｍＭ  ＮａＣｌ、調査された可変要素：本葉を持つ植物の％（Ａ）および子葉を持つ植物の％（Ｂ）、本実験の繰り返しの数：６〜８、濃度ごとの植物の数：１５０〜２００、統計分析：ＡＮＯＶＡ、信頼度：９９％。
【図８】
図８は、１００ｍＭ  ＮａＣｌを補充したＭＳ培地において成長した、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓの実生の写真を示す。その実生は、形質転換されなかったか、または空のベクターｐＢＩ１２１で形質転換されたか、またはＢｖＣＫＡ２をコードする１４５  ｃＤＮＡで形質転換されたものである。
【図９】
図９は、ＢｖｅＩＦ−１Ａでトランスフェクトされた植物のタンパク質中への、放射性フェニルアラニンの組み込みの定量化を示す。
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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