(57)【要約】【課題】進行性の慢性痴呆疾患の検出方法、所属するペプチド及び検出試薬【解決手段】本発明は定義されたペプチド、及び対照グループの前記ペプチドの濃度に対して相対的な、進行性の慢性痴呆疾患を患う患者の体液中の前記ペプチドの定量分析に関する。本発明によるペプチドは対応する遺伝子を有するタンパク質前駆体から由来していて、これは特別な方法でプロセッシングされ、場合により翻訳後修飾され、特にリン酸化されている。このペプチドの濃度又はこのペプチドに属するプロセッシングされていないタンパク質の濃度上昇は、進行性の慢性痴呆疾患を示す。この進行性の慢性痴呆疾患の検出は、このペプチド及び／又はタンパク質の同定によってだけ行うか又は組み合わせて行う。本発明はさらに進行性の慢性痴呆疾患の進行制御のため、及び予後のため、特に「Ｍｉｎｉ  Ｍｅｎｔａｌ  Ｓｃｏｒｅｓ」の補足又は代用として、ならびに進行性の慢性痴呆疾患、例えばアルツハイマー病の治療法の開発のための使用に関する。
2004532633.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
個体の生物学的試料中の少なくとも１種のマーカーペプチドを同定することにより、進行性の慢性痴呆疾患、又はこのような疾患に対する素因を検出する方法において、前記のマーカーペプチドが遺伝子バンク登録番号Ｘ１３６９４の配列又はこの配列と相同の配列から誘導されるペプチドである、進行性の慢性痴呆疾患、又はこのような疾患に対する素因を検出する方法。
【請求項２】
少なくとも１種のペプチドの相対的濃度を、対照試料中の同じペプチドの濃度と比較することにより決定し、その際、
ａ）それぞれのマーカーペプチドに対して特異的な、試料中の濃度変化を、対照試料に対して相対的に確認し、かつ
ｂ）このマーカーペプチドの有意の濃度変化を、ｂ）に記載した方法で慢性痴呆疾患についての陽性の検出結果として評価する
ことを特徴とする、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記のペプチドが、
ａ）ＤＲＯＰＮ−ペプチドであるか、又は
ｂ）登録番号Ｘ１３６９４に一致するペプチドであるか、又は
ｃ）ａ）又はｂ）に記載されたペプチドの天然に存在する対立遺伝子の誘導体であるか、又は
ｄ）ＤＲＯＰＮ−突然変異体であり、この場合、このＤＲＯＰＮ−突然変異体は、対応する突然変異していないＤＲＯＰＮ−配列と有利に最大で２個のアミノ酸が異なっているか、又は
ｅ）ｂ）又はｃ）に記載されたペプチドの一つの突然変異体であり、この場合、このアミノ酸配列はｂ）又はｃ）に記載されアミノ酸配列と最大で３０％相違しているか、又は
ｆ）ａ）〜ｅ）に対応するが、化学的に修飾されたか、又は翻訳後に修飾されたペプチドである
ことを特徴とする、請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
感度及び／又は特異性を高めるために、他の診断方法と組み合わせて実施することを特徴とする、請求項１から３までのいずれか一項記載の方法。
【請求項５】
進行性の慢性痴呆疾患が、アルツハイマー病又はそれに類縁する神経学的疾患、特にレーヴィ小体痴呆又は血管性痴呆であることを特徴とする、請求項１から４までのいずれか一項記載の方法。
【請求項６】
少なくとも１種の同定されたＤＲＯＰＮ−ペプチドが選択され、その際に、このペプチドは修飾されていない形、化学的に修飾された形又は翻訳後に修飾されて、有利にリン酸化されたペプチドとして、又はＮ末端にピログルタミン酸基を有する形で存在することを特徴とする、請求項１から５までのいずれか一項記載の方法。
【請求項７】
ペプチド濃度が疾患の陽性の検出のために、それぞれのペプチドに対して特異的な方向で、対照試料中のそれぞれのペプチドの濃度に対して相対的に向上しているか又は低下していることを特徴とする、請求項１から６までのいずれか一項記載の方法。
【請求項８】
疾患の重度の測定のために用いる、特に「Ｍｉｎｉ−Ｍｅｎｔａｌ  Ｓｔａｔｅ  Ｅｘａｍｉｎａｔｉｏｎ」（ＭＭＳＥ）の実施に代わる方法として又は補足する方法として用いるか、又は神経学的疾患の前段階、特に「ｍｉｌｄ  ｃｏｇｎｉｔｉｖｅ  ｉｍｐａｉｒｍｅｎｔ」（ＭＣＩ）の診断のため又は疾患の進行の予後のために用いることを特徴とする、請求項１から７までのいずれか一項記載の方法。
【請求項９】
生物学的試料は、脳脊髄液、血清、血漿、尿、滑液、痰、便、涙又は組織ホモジェネートであることを特徴とする、請求項１から８までのいずれか一項記載の方法。
【請求項１０】
１種又は数種のペプチドの同定を質量分析による測定方法を用いて、有利にＭＡＬＤＩ（マトリックス支援レーザー脱離及び単離）質量分析法を用いて実施することを特徴とする、請求項１から９までのいずれか一項記載の方法。
【請求項１１】
この質量分析測定による同定が、２６２７．２７１５／≧１００９．４７１６／４０３２．７５９４／４４６５．００７９／３７１８．６３６８／１７３７．８０３０／１９００．８６６４／≧９５６．４０８７／≧８９５．４１４８／７６５３．６００３／４６６２．０９５３／２０９３．９３０４／≧８９９．３９８５／≧１０８７．４８３５／１５２２．７９９１／１６３５．８８３２／１７６３．９７８１／１９１１．０４６６／３２２２．６５２１／３４３５．７６３４／１６５０．８９４１／１７９７．９６２５／３１０９．５６８０／２７９６．４０４２／≧１１１２．５８２６／≧８４４．３５６３／２５２６．２２３８／２５２８．２０３１又は３７１８．６３６８ダルトンの理論的なモノアイソトピック質量ピークの少なくとも１つ及び／又は７７３８／７８１８／７８９８／７９７８および８０５８ダルトンの実験的に測定された質量の１つを含むことを特徴とする、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
ペプチドの同定を免疫学的試験、分子生物学的試験、物理学的試験又は化学的試験を用いて行うことを特徴とする、請求項１から９までのいずれか一項記載の方法。
【請求項１３】
免疫学的試験がＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ  Ｌｉｎｋｅｄ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｓｏｒｂｅｎｔ  Ａｓｓａｙ）、放射線免疫アッセイ又はウェスタンブロットであることを特徴とする、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
１種又は数種のペプチドの同定を、本発明による使用したペプチドに結合する抗体、抗体フラグメント、ファージ粒子、ＰＮＡ又はアフィニティマトリックスを用いて実施することを特徴とする、請求項１２記載の方法。
【請求項１５】
同定の前に試料をクロマトグラフィーにより、有利に逆相クロマトグラフィーにより、さらに有利に高解像度逆相クロマトグラフィーにより分別することを特徴とする、請求項１から１４までのいずれか一項記載の方法。
【請求項１６】
同定の前に試料を沈殿反応又は液相分離によって分別することを特徴とする、請求項１から１４までのいずれか一項記載の方法。
【請求項１７】
ａ）  ＤＲＯＰＮ−ペプチドであるか、又は
ｂ）天然由来のＯＰＮ−タンパク質のＤＲＯＰＮ−誘導体、特にＸ１３６９４の誘導体であるか、又は
ｃ）ＯＰＮ−対立遺伝子のＤＲＯＰＮ−誘導体であるか、又は
ｄ）ＤＲＯＰＮ−突然変異体であり、その際、ＤＲＯＰＮ−突然変異体は有利に、突然変異していない対応するＤＲＯＰＮ−配列と最大で２個のアミノ酸が相違するか、又は
ｅ）ａ）からｄ）に相応する、化学的に修飾されたか又は翻訳後に修飾されたペプチドである、ペプチド。
【請求項１８】
神経学的疾患、特に慢性痴呆疾患、特にアルツハイマー病を検出するための抗体を獲得するため及び／又は診断試薬を開発するための請求項１７記載の少なくとも１種のＤＲＯＰＮ−ペプチドの使用。
【請求項１９】
請求項１７記載のＤＲＯＰＮ−ペプチドと結合する抗体。
【請求項２０】
神経学的疾患、特に慢性痴呆疾患、特にアルツハイマー病の診断のための、オステオポンチンに対する抗体又は請求項１９記載の抗体の使用。
【請求項２１】
所属するタンパク質及びペプチドの間接的測定及び／又は定量化のための、ＤＲＯＰＮ−ペプチド又はＯＰＮ−タンパク質に相当する核酸の使用。
【請求項２２】
ＯＰＮ−核酸の検出をノーザンブロット、逆転写酵素ＰＣＲ又は定量的ＰＣＲを使用して行う、請求項２１記載の方法の使用。
【請求項２３】
神経学的疾患、特に進行性の慢性痴呆疾患、特にアルツハイマー病のための治療法の有効性を測定するための、請求項１から１６まで、請求項１８又は請求項２０から２２までのいずれか一項記載の方法の使用。
【請求項２４】
神経学的疾患、特に慢性痴呆疾患、特にアルツハイマー病の治療又は臨床研究に適している患者を層別するための、請求項１から１６まで、又は請求項２０から２２までのいずれか一項記載の方法の使用。
【請求項２５】
ＤＲＯＰＮ−ペプチドに相当する、核酸。
【請求項２６】
ＯＰＮ−特異的アンチセンス核酸として、又はＯＰＮ−特異的リボザイムとして、又はＯＰＮ−特異的トリプレックス核酸として適している、核酸。
【請求項２７】
請求項１から１６のいずれか一項記載の方法に使用したＯＰＮ−ペプチドのアゴニスト又はアンタゴニスト。
【請求項２８】
請求項１から１６までのいずれか一項記載の方法に使用したペプチド、又は請求項２５から２７のいずれか一項記載の物質において、ペプチド、核酸、アゴニスト及びアンタゴニストが、血液−脳−隔壁及び／又は血液−髄液−隔壁を通過することができるように、これらが製剤学的方法により調製されているか又は化学的又は生物学的に修飾されている、請求項１から１６までのいずれか一項記載の方法に使用したペプチド、又は請求項２５から２７のいずれか一項記載の物質。
【請求項２９】
請求項１から１６までのいずれか一項記載の方法に使用したペプチド、又は請求項２５から２７のいずれか一項記載の物質において、これらの物質が、特別な投与経路のために最適化されているように、特に血液循環路内、胃腸管内、尿生殖路内、リンパ系内、クモ膜下腔内に投与するため、吸入のため、又は組織、例えば筋肉組織、脂肪組織、脳などへの直接的注射のために最適化されているように、製剤学的方法により調製するか又は化学的又は生物学的に修飾されている、請求項１から１６までのいずれか一項記載の方法に使用したペプチド、又は請求項２５から２７のいずれか一項記載の物質。
【請求項３０】
請求項１〜１６までのいずれか一項記載の少なくとも１種のペプチド又は請求項２５から２７までのいずれか一項記載の核酸、アゴニスト又はアンタゴニストの、医薬品又は医薬品作用物質としての使用。
【請求項３１】
神経学的疾患、特に慢性痴呆疾患、特にアルツハイマー病を予防又は治療するための医薬品を製造するための、請求項１から１６までのいずれか一項記載の少なくとも１種のペプチド、又は請求項２５から２７までのいずれか一項記載の核酸、アンタゴニスト又はアゴニストの使用。
【請求項３２】
神経学的疾患、特に慢性痴呆疾患、特にアルツハイマー病を予防又は治療するための医薬品を製造するための、ＯＰＮ−タンパク質の発現を調節する、少なくとも１種の物質の使用。
【請求項３３】
神経学的疾患、特に慢性痴呆疾患、特にアルツハイマー病を予防又は治療するための医薬品を製造するための、請求項１〜１６までのいずれか一項記載の方法において使用された少なくとも１種のペプチドと結合する物質、特に抗体、抗体フラグメント、ＰＮＡ又は親和性マトリックスの使用。
【請求項３４】
神経学的疾患、特に慢性痴呆疾患、特にアルツハイマー病の治療のための、請求項１から１６までのいずれか一項記載の方法において使用された少なくとも１種のペプチド、又は請求項２５から２７までのいずれか一項記載の核酸、アンタゴニスト又はアゴニストの使用。
【請求項３５】
神経学的疾患、特に慢性痴呆疾患、特にアルツハイマー病を患う患者において、請求項１から６までのいずれか一項記載の方法において使用されたペプチド又は請求項２５記載の核酸の濃度を治療的に調節する方法。
【請求項３６】
ＯＰＮ−ペプチド、ＤＲＯＰＮ−ペプチド又はＯＰＮ−核酸の濃度を低下させる、請求項３５記載の方法。
【請求項３７】
ＯＰＮ−タンパク質、ＤＲＯＰＮ−ペプチド又はＯＰＮ−核酸の濃度を向上させる、請求項３５記載の方法。
【請求項３８】
患者に、
ａ）ＯＰＮ−タンパク質又はＤＲＯＰＮ−ペプチドと結合する抗体を投与するか、又は
ｂ）ＯＰＮ−タンパク質又はＤＲＯＰＮ−ペプチドの発現を抑制するために、アンチセンス−核酸、トリプレックス−核酸又はリボザイムを投与するか、又は
ｃ）ＯＰＮ−タンパク質のプロセッシングを阻害する物質を投与するか、又は
ｄ）請求項１から１６までのいずれか一項記載の方法に使用されたＯＰＮ−ペプチドのアンタゴニストを投与する、請求項３６記載の方法。
【請求項３９】
患者に、
ａ）ＯＰＮ−タンパク質又はＤＲＯＰＮ−ペプチドを投与するか、又は
ｂ）ＯＰＮ−タンパク質又はＤＲＯＰＮ−ペプチドをコードする核酸を投与するか、又は
ｃ）ＯＰＮ−タンパク質のプロセッシングを促進する物質を投与するか、又は
ｄ）請求項１から１６までのいずれか一項記載の方法で使用されたＯＰＮ−ペプチドのアゴニストを投与する、請求項３７記載の方法。
【請求項４０】
請求項１から１６までのいずれか一項記載の方法で使用された少なくとも１種のペプチドの発現を抑制するかまたは増大させることができる物質を同定するためのスクリーニング方法。
【請求項４１】
請求項１から１６までのいずれか一項記載の方法で使用された少なくとも１種のペプチドと結合するレセプター又はインヒビターを同定するためのスクリーニング方法。
【請求項４２】
請求項１から１６までのいずれか一項記載の方法で使用された少なくとも１種のペプチドと結合するアゴニスト又はアンタゴニストを同定するためのスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、進行性の慢性痴呆疾患またはこのような疾患の素因（veranlagung）の検出方法、特に痴呆の重度を測定するための「Ｍｉｎｉ  Ｍｅｎｔａｌ  Ｓｃｏｒｅｓ」の決定法の代用法又は補足法に関する。このために患者の体液中の、又は他の試料中の所定のペプチド濃度が測定される。さらに、本発明は、進行性の慢性痴呆疾患の存在及び／又は程度を決定するために探し出されたペプチドにも関する。
【０００２】
さらに、本発明は検出試薬、例えば抗体及び核酸などにも関し、これらの検出試薬によってこのペプチドもしくは相応する核酸を検出することができる。さらに、本発明は、ＯＰＮ、ＯＰＮ−ペプチド、ＯＰＮ−抗体、ＯＰＮ−核酸、ＯＰＮ−タンパク質−アンタゴニスト又はＯＰＮ−タンパク質−アゴニスト、ＯＰＮ−ペプチド−アゴニスト又はＯＰＮ−ペプチド−アンタゴニストを内容とする、神経学的疾患、特にアルツハイマー病の治療及び予防のための薬剤学的使用にも関する。さらに、本発明は、神経学的疾患、特にアルツハイマー病の調査のための臨床的研究に関与するのに適している、前記の疾患を示す患者を調査する方法にも関する。
【背景技術】
【０００３】
痴呆疾患は先進国において平均余命の向上によって増加する問題である。痴呆疾患は大部分は治癒不能であり、患者の長期間続く介護が必要となる。この患者のほぼ半数が入院による看護がなされている。痴呆症状を伴うような疾患を含めて６０以上の痴呆疾患が公知である。
【０００４】
しかしながら、この中でも約６５％はアルツハイマー病（Ａｌｚｈｅｉｍｅｒｓｃｈｅ  Ｋｒａｎｋｈｅｉｔ，  ＡＤ，  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ）に該当し、従ってこの診断及びこの治療は重要性が高い。アルツハイマー病の他に、特に次の非アルツハイマー病が公知である：血管性痴呆、レーヴィ小体痴呆、ビンスヴァンガー痴呆ならびに他の疾患の付随作用としての痴呆性疾患、例えばパーキンソン病、ハンチントン病、ピック病、ゲルストマン−シュトロイスラー−シャインガー病、クロイツフェルト−ヤコブ病などである。
【０００５】
アルツハイマー病は神経変性疾患であり、この神経変性疾患は次の症状により特徴付けられる：精神的能力の低下、錯乱状態及び自己存続機能及び自己看護機能の低下。特に、著しく制限された短期記憶はアルツハイマー病に特徴的であり、患者のかなり過去の記憶、例えば自己の幼少時の記憶はこの疾患によってあまり侵害されない。形態学的には脳内の変化が生じ、この変化は特にアミロイド沈着及び神経細胞の変性の形で表される。この形態学的変化は、患者の死後に組織学的に診断することができ、この疾患の今日まで唯一確かな証明である。この組織病理学的診断は、「Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ  ｔｏ  Ｅｓｔａｂｌｉｓｈ  ａ  Ｒｅｇｉｓｔｒｙ  ｆｏｒ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ」（ＣＥＲＡＤ）が規定した基準に基づいている。アルツハイマー病の診断のためには、現時点で次の基準に基づく診断システムが使用される：「Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ，１０ｔｈ  ｒｅｖｉｓｉｏｎ」（ＩＣＤ−１０）、「Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｉｃ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ」の「Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  ａｎｄ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｍｅｎｔａｌ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ，  ４ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ」（ＤＳＭ−ＩＶ）及び「Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｖｅ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ」  ＮＩＮＣＤＳ−ＡＤＲＤＡにより作成された「Ｗｏｒｋ  Ｇｒｏｕｐ  ｃｒｉｅｒｉａ」。
【０００６】
これらのシステムは、アルツハイマー病の診断を下すために一連の神経心理学的試験を使用するが、しかしながらこれらは客観的に測定可能な臨床パラメーターではない。特に重要なのはこの疾患の重度の現在の状態を把握することであり、これは例えば「Ｍｉｎｉ  Ｍｅｎｔａｌ  Ｓｃｏｒｅｓ」の決定により行うことができる。この「Ｍｉｎｉ  Ｍｅｎｔａｌ  Ｓｃｏｒｅ」は心理学的試験の「Ｍｉｎｉ  Ｍｅｎｔａｌ  Ｓｔａｔｅ  Ｅｘａｍｉｎａｔｉｏｎ」用いて測定される。それにより、特に、この疾患の進行及び状況により行われる治療の有効性を観察することが可能となっている。しかしながら、Ｃｌａｒｋ  ｅｔ  ａｌは例えばアルツハイマー病の進行を測定するために、この「Ｍｉｎｉ  Ｍｅｎｔａｌ  Ｓｃｏｒｅｓ」の決定は証明の確かさにおいて限定的であることを示した、それというのもこのスコアの高さには著しい測定不正確性及び著しい変化が生じるためである［１］。従って、進行性の慢性痴呆疾患、例えばアルツハイマー病の疾患の進行を決定するために、「Ｍｉｎｉ  Ｍｅｎｔａｌ  Ｓｃｏｒｅ」を補足するか又はそれに代わることができる信頼できる臨床的に測定可能なパラメータを準備することが医学的にも、ひいては経済的にも重要である。
【０００７】
現在のところ、アルツハイマー病を治療するための根元的治療法は提供されていない。この疾患は単に症候的、例えば神経伝達物質、例えばアセチルコリンの投与により治療されている。さらに、可能な治療ストラテジーは、現在のところ酸化防止剤、ラジカルスカベンジャー、カルシウムチャネルブロッカー、抗炎症性物質、セクレターゼインヒビター、抗アミロイド抗体などの投与ならびにアミロイド−ペプチドに対する免疫化が試されている。しかしながら、今までこの疾患の根元的治療は可能となっていない。
【発明の目的】
【０００８】
本発明の根底をなす課題は、アルツハイマー病診断時に先行技術の欠点を回避し、かつ早期でかつ高い信頼性で適用可能な、慢性痴呆疾患、特にアルツハイマー病の診断方法を提供することであった。
【０００９】
この診断によって初めてアルツハイマー病の新規の治療法が可能となる。
【発明の概要】
【００１０】
定義：
登録番号Ｘ１３６９４に一致するＯＰＮ−タンパク質又はペプチド：
核酸配列Ｘ１３６９４から誘導されるペプチドはＯＰＮ−タンパク質ともいわれ、ＯＰＮ−タンパク質の全ての天然由来の対立遺伝子、突然変異体及び多形ならびに組織特異的に発現されたＯＰＮ−変異体が含まれる。特に、疾患に基づき又は神経学的疾患の結果として、特に慢性痴呆疾患、特にアルツハイマー病によって生じるＯＰＮ−変異体も含まれる。シグナル配列を含むかもしくは含まないＯＰＮ−タンパク質、ＯＰＮ−タンパク質のまだプロセッシングされていないプロ−フォーム、ならびに既にプロセッシングされたＯＰＮ−タンパク質、可溶性ＯＰＮ−タンパク質及び膜に位置するＯＰＮ−タンパク質が含まれ、その場合、この膜に位置するＯＰＮ−タンパク質は膜内外アミノ酸配列を介して細胞膜又は器官膜と結合することができ、同様に、翻訳後修飾によって、例えばグリコシル−ホスファチジル−イノシトール（ＧＰＩ）−アンカーを介しても結合することができる。さらに、ＯＰＮ−配列の変異体は、択一的スプライシング、択一的翻訳開始点及び翻訳停止点、ＲＮＡ−エディティング、択一的翻訳後修飾により、ならびに他の天然由来のメカニズムによって生じるＯＰＮ−タンパク質変異体も含める。
【００１１】
ＤＲＯＰＮ−ペプチド：
以後、ＯＰＮ−ペプチド及びＯＰＮ−ペプチド−変異体をＤＲＯＰＮ（「Ｄｅｍｅｎｔｉａ  Ｒｅｌａｔｅｄ  Ｏｓｔｅｏｐｏｎｔｉｎ」）ペプチドと表す。ＤＲＯＰＮ−ペプチドは冒頭に記載したＯＰＮ配列Ｘ１３６９４から誘導される。また、ＤＲＯＰＮ−ペプチドはオステオポンチンについての他の遺伝子バンク登録物、例えばＡＦ０５２１２４、Ｊ０４７６５、Ｍ８３２４６、ＮＭ＿０００５８２、Ｕ２０７５８又は将来的には場合によりさらに付加される他のＯＰＮ登録物からも誘導することができる。この場合に、ＯＰＮ−タンパク質−配列は場合により番号Ｘ１３６９４の遺伝子バンク登録物の配列とは異なることも可能であり、例えば現在のところ遺伝子バンク登録物のＡＦ０５２１２４、Ｊ０４７６５及びＮＭ＿０００５８２がこの場合である。ＯＰＮ配列登録物は「遺伝子バンク」とは異なる配列データバンクにも存在することがある。従って、ＤＲＯＰＮ−ペプチド及びＯＰＮ−タンパク質は、配列データバンクの「Ｇｅｎｅ  Ｂａｎｋ」の受入番号Ｘ１３６９４の登録物に相当するＯＰＮ−タンパク質の配列と正確に一致する必要はない。さらに、ＤＲＯＰＮ−ペプチドは２個の点突然変異されたアミノ酸、２個の欠失されたアミノ酸又は２個の付加的に内部に挿入されたアミノ酸、ならびにＮ末端及び／又はＣ末端の延長部を含むこともできる。この場合にはしかしながらＯＰＮ−タンパク質配列からなる少なくとも８個のアミノ酸が含まれなければならない。Ｎ末端又はＣ末端の延長部として、ＯＰＮ−タンパク質中のこの配列位置でのＯＰＮ−タンパク質配列中に存在するようなアミノ酸だけが挙げられる。さらに、天然由来のＯＰＮ−多形から及び天然由来のＯＰＮ−突然変異から誘導されるペプチドは、ＯＰＮ−タンパク質配列（Ｘ１３６９４）と少なくとも７０％の一致を示す場合にＤＲＯＰＮ−ペプチドと言われる。ＤＲＯＰＮ−ペプチドは翻訳後修飾を有する、例えばリン酸化又はＮ末端のピログルタミン酸−残基を有し、及び／又は化学的に修飾された形、有利にペプチド−酸化物として存在することもできる。例えばＤＲＯＰＮ−１０はリン酸化されていないペプチドとしても、リン酸化されたペプチドとしても同定された。ＤＲＯＰＮ−１０は、例えば、リン酸基なしで又は１個、２個、３個、４個又は５個のリン酸基を有している。
【００１２】
化学的に修飾された又は翻訳後修飾されたペプチド：
化学的に修飾された又は翻訳後修飾されたペプチドは、Ｄ−アミノ酸からならびにＬ−アミノ酸から、同様にＤ−アミノ酸とＬ−アミノ酸との混合物からなることもでき、かつ天然由来であるか又は組み換えにより製造されるか又は化学的に合成することもできる。さらに、このペプチド中には非通常のアミノ酸、つまり２０種の標準アミノ酸には属さないアミノ酸を含有することもできる。非通常のアミノ酸の例としては特に次のものである：アルファ−アミノ酪酸、ベータ−アミノ酪酸、ベータ−アラニン、ベータ−アミノイソ酪酸、ノルバリン、ホモセリン、ノルロイシン、ガンマ−アミノ酪酸、チオプロリン、４−ヒドロキシプロリン、アルファ−アミノアジピン酸、ジアミノ酪酸、４−アミノ安息香酸、ホモシステイン、アルファ−アミノペニシラン酸、ヒスタミン、オルニチン、グリシン−プロリンジペプチド、ヒドロキシリシン、プロリン−ヒドロキシプロリンジペプチド、シスタチオニン、エチオニン、セレノ−システイン。翻訳後修飾又は化学的修飾としては、特にアミノ酸配列の次の構造による修飾である：ペプチド配列中のシステインに遊離システインの結合、メチル基、アセチル基、ファルネシル基、ビオチニル基、ステアリル基、パルミチル基、リポイル基、Ｃ−マンノシル基、リン基及びスルフェート基、グリコシル化、アミノ化、脱アミノ化、プログルタミン酸、シトルリンなどが可能である。
【００１３】
核酸：
核酸として、ＤＮＡ、ＲＮＡ及びＤＮＡ−ＲＮＡ−ハイブリッド分子は天然に由来するものか又は合成又は組み換えにより製造されたものであると見なされる。さらに、化学的に修飾された核酸、生体内で高い安定性を示す修飾されたヌクレオチド、例えばホスホロチオエートも含める。このように安定化された核酸は、リボザイム技術、アンチセンス技術及びトリプレックス核酸技術の適用時にも既に使用される。
【００１４】
有意性
有意の概念は統計的な有意性の概念の使用の範囲内で用いられる。この特許明細書において、９０％以下、有利に９５％以下、さらに有利に９９％以下の誤り確率が有意と定義される。
【００１５】
感度：
感度としては、疾患に関する診断において陽性の診断結果が得られた病気の患者、つまり診断が疾患であると示した患者の割合であると定義される。
【００１６】
特異性：
特異性としては、疾患に関する診断において陰性の診断結果が得られた健康な患者、つまり診断が疾患ではないと示した患者の割合であると定義される。
【００１７】
意外にも、アルツハイマー病を患う患者の体液試料中で、特に脳脊髄液中では、特定のペプチドの濃度が、対照試料中のその濃度に比較して相対的に高く変化しているため、アルツハイマー病の検出が可能であることが見出された。対照グループ中の濃度と比較したこのペプチドの濃度の変化は、アルツハイマー病の疾患の存在を示し、従って高い感度及び高い特異性での疾患の検出に適している。従って、患者を通常のＯＰＮ−又はＤＲＯＰＮ−ペプチド濃度に調節する目的でＯＰＮ−タンパク質又はＤＲＯＰＮ−ペプチド濃度を調節することは、治療的に使用することもできる。
【００１８】
前記課題の解決のために、本発明は、個体の生物学的試料中の、遺伝子バンク登録番号Ｘ１３６９４の配列から誘導される１種又は数種のＤＲＯＰＮ−ペプチド又はＯＰＮ−ペプチドの同定により、神経学的疾患、特に慢性痴呆疾患、特にアルツハイマー病又はこのような疾患の素質を検出する方法に関する。これらのＤＲＯＰＮ−ペプチド又はＯＰＮ−ペプチドが疾患との因果関係があることから出発することができるため、本発明はアルツハイマー病又はそれに類似の神経学的疾患の治療のためのその使用も対象とする。
【００１９】
前記課題の解決のために、本発明は、患者の生物学的試料中の少なくとも１種のマーカーペプチドを検出することで、神経学的疾患、特に進行性の慢性痴呆疾患、特にアルツハイマー病を検出する方法を提供する。
【００２０】
このために医学的診断において多様な解決策が可能でありかつ通常である：
一つは、一般的にマーカーペプチドの存在に関して調査することができ、このマーカーペプチドの存在又は不在が疾患の診断を可能とする。
【００２１】
他の通常の診断ストラテジーの場合には、まず最初に対象の場合と診断すべき疾患を患う患者の場合に通常存在するこのマーカーペプチド濃度を測定し、この測定値を用いて頻繁に「カット−オフ−ポイント」と呼ばれる、健康と見なされるグループと、病気であると見なされるグループとを隔てる限界値を算定する。病気の個体においてそれぞれのマーカーペプチドの濃度が低下した場合に、それぞれのマーカーペプチドのこの測定値はカット−オフ−ポイントを下回る全ての個体は疾患であると診断される。病気の個体においてそれぞれのマーカーペプチドの濃度が上昇した場合に、それぞれのマーカーペプチドのこの測定値はカット−オフ−ポイントを上回る全ての個体は疾患であると診断される。それぞれのマーカーペプチドについて個々に測定されたカット−オフ−ポイントは、つまり健康な個体と病気の個体との明らかな区別を可能にする。
【００２２】
他の診断ストラテジーの場合には、対照試料中のマーカーペプチドの濃度と比較して、患者の試料中のマーカーペプチドのそれぞれのマーカーペプチドに対して特異的な濃度上昇又は濃度低下を測定し、マーカーペプチドの有意の濃度変化をこの疾患の陽性の検出結果として評価する。この場合に、所定のＤＲＯＰＮ−ペプチドに対して根本的に、アルツハイマー病患者の場合にだけペプチド濃度の上昇が起きるか、又はこのＤＲＯＰＮ−ペプチドに対して根本的にアルツハイマー病患者の場合にだけペプチド濃度の減少が起きることができる。定義されたＤＲＯＰＮ−ペプチドについて、対照グループと比較して、個々のアルツハイマー病患者の場合に高いＤＲＯＰＮ−ペプチド濃度が、及び他のアルツハイマー病患者の場合に低いＤＲＯＰＮ−ペプチド濃度が同時に生じることはできない。
【００２３】
本発明による有利なマーカーは、配列表において記載されており、配列番号１〜３１に相当するＤＲＯＰＮ−１〜ＤＲＯＰＮ−３１として挙げられている。ＤＲＯＰＮ−ペプチドの配列は、図１及び表１にも記載されている。ＤＲＯＰＮ−ペプチドのそれぞれの配列番号の分類は、表１に記載されている。
【００２４】
本発明による方法は、神経変性疾患、特にアルツハイマー病の場合にその濃度が変化し、かつこの疾患が早期段階で既に、例えば「Ｍｉｎｉｍａｌ  Ｃｏｇｎｉｔｉｖｅ  Ｉｍｐａｉｒｍｅｎｔｓ」（ＭＣＩ）の存在でも示されるか、又は高い疾患リスクを早期に示すことができる特異的バイオマーカーを検出する方法である。これは、この疾患の診断のために確かな臨床的マーカーを適用するために重要である。
【００２５】
有利に、試料中のＤＲＯＰＮ−ペプチドの濃度も、複数の所定のＤＲＯＰＮ−ペプチドが出現する特徴パターンも同様に、この疾患の重度と関連していることができる。従って、この新規のマーカーは、アルツハイマー病の治療法の開発及びそれに付随する制御を可能にする、それというのもこの経過及び場合により治療法に基づき生じる治癒成果又は疾患の進行の抑制を測定できるためである。アルツハイマー病の有効な治療法は、現在のところ不可能であり、アルツハイマー病疾患の確実な検出方法の提供の緊急性を強調されている、それというのもこの疾患の確実な検出が治療法の開発の前提条件であるためである。
【００２６】
ＤＲＯＰＮ−ペプチドの検出は、さらに、アルツハイマー病の新規の治療方法を開発するための臨床研究の範囲内で、高い特異性で、アルツハイマー病を患うが他の疾患を患っていない患者だけを選択することを可能にする。このことは、有効な研究結果を得るために重要である。誤ってアルツハイマー病患者として診断された患者は、アルツハイマー病治療の研究結果の質に不利な影響を及ぼす。さらに、ＤＲＯＰＮ−ペプチドの検出は、患者の層別を可能にし、それにより、所定のアルツハイマー病治療ストラテジー又は臨床的研究にとって特に適切であるアルツハイマー病患者のサブグループを適切に選択できる。
【００２７】
アルツハイマー病患者の場合に、健康な個体と比較してＤＲＯＰＮ−ペプチドの濃度が明らかに変化している。本発明の他の観点は、従って、アルツハイマー病患者の場合のＤＲＯＰＮ−濃度を通常の濃度にすることでもある。この方法は、アルツハイマー病又は類似する神経学的疾患の治療法に使用することができる。ＯＰＮ−タンパク質又はＤＲＯＰＮ−ペプチドの濃度が高い場合には、これらの物質の濃度を、例えばＯＰＮ−タンパク質又はＤＲＯＰＮ−ペプチドに特異的な抗体又はＯＰＮ−特異的−アンチセンス−核酸、リボザイム又はトリプレックス−核酸又はＤＲＯＰＮ−ペプチド−アンタゴニスト、ＯＰＮ−タンパク質−アンタゴニストの治療的投与によって低下させることができる。治療法のために、ＯＰＮ−タンパク質の生体固有の発現又はＯＰＮ−タンパク質からＤＲＯＰＮ−ペプチドへのプロセッシングを抑制する物質を投与することもできる。ＯＰＮ−タンパク質又はＤＲＯＰＮ−ペプチドの不足が疾患原因である場合には、ＯＰＮ−タンパク質、ＤＲＯＰＮ−ペプチド、ＤＲＯＰＮ−ペプチド−アゴニスト又はＯＰＮ−タンパク質−アゴニストの治療的投与を行うことができる。ＯＰＮ−タンパク質からＤＲＯＰＮ−ペプチドへのプロセッシングに影響する物質も治療的に使用することができる。図１から見られるように、例えばＤＲＯＰＮ−４及びＤＲＯＰＮ−１０は２個の塩基性アミノ酸（リシン及びアルギニンが）により相互に区別され、このようないわゆる「二塩基性配列」は、タンパク質から生物学的活性のペプチドへのプロセッシングの際に重要な役割を担うプロテアーゼの攻撃点であることが多い。もちろん、多様な治療ストラテジーの組み合わせも可能であり、場合によっては有効である。
【００２８】
本発明は、神経学的疾患、特にアルツハイマー病の治療の目的で、ＯＰＮ−タンパク質及びＤＲＯＰＮ−ペプチドの濃度を直接的又は間接的に調節するための、ＯＰＮ−タンパク質、ＤＲＯＰＮ−ペプチド、ＤＲＯＰＮ−ペプチド−アゴニスト及びＤＲＯＰＮ−アンタゴニスト、ＯＰＮ−タンパク質−アゴニスト及びＯＰＮ−タンパク質−アンタゴニスト、アンチ−ＯＰＮ−タンパク質−抗体及びアンチ−ＤＲＯＰＮ−ペプチド−抗体の使用でもある。抗体とは別に、抗体フラグメント、抗体融合タンパク質、又は他のＯＰＮ−タンパク質又はＤＲＯＰＮ−ペプチドに選択的に結合する他の物質を使用することもできる。前記のタンパク質及びペプチドとは別に、前記のタンパク質及びペプチドの融合タンパク質を使用することもできる。さらに、本発明は、前記のタンパク質及びペプチドの発現を調節するアンチセンス−核酸、トリプレックス−核酸及びリボザイムを使用することでもある。さらに、本発明は、前記のタンパク質の活性を調節するアゴニスト及びアンタゴニストでもある。
【００２９】
本発明の他の実施形態は、医薬調製物又は血液−脳−隔壁及び／又は血液−髄液−隔壁を有効に通過することができるように記載されたペプチド及び核酸を化学的に修飾することである。それにより、これらは特に治療的用途に適している。これを達成するために、例えばＤＲＯＰＮ−ペプチド、ＯＰＮ−タンパク質、核酸、アゴニスト又はアンタゴニストは、これらが例えば親油性になり、クモ膜下腔内へ侵入しやすくなるように修飾される。これは、疎水性分子成分の導入によるか、又はこの物質を疎水性の物質、例えばリポソーム中に「パッケージング」することにより達成することができる。さらに、例えば、クモ膜下腔内へ侵入しやすくするか、もしくは反対にクモ膜下腔から外に出にくくするペプチド配列をこのペプチド、タンパク質、核酸、アゴニスト又はアンタゴニストに接合することもできる。
【００３０】
本発明は、前記の治療薬の、多様な経路、例えば静脈内注射として、経口投与可能な物質として、吸入可能なガス又はエアゾールとしての投与、又はクモ膜下腔内への直接的注射の形又は筋肉、脂肪脳などの組織への直接的注射の形での投与でもある。それにより、生物学的利用性を高め、かつこの治療薬の有効性を高めることができる。例えば、経口投与したペプチド又はタンパク質は、耐酸性カプセルにより胃中でのタンパク質分解から保護できる。著しく疎水性の物質は、適当な製剤学的処理によってより親水性にすることができ、従って例えば静脈内注射用により適するようにすることができる。
【００３１】
本発明の他の実施形態は、ＤＲＯＰＮ−ペプチド又はＯＰＮ−タンパク質と選択的に結合するレセプターを同定するための、ＤＲＯＰＮ−ペプチド又はＯＰＮ−タンパク質の使用である。このレセプターも、アゴニスト又はアンタゴニストの投与によって調節することができ、このことは神経学的疾患、特にアルツハイマー病の治療のために有効である。
【００３２】
ＯＰＮ−生物学
ＯＰＮは破骨細胞及び骨細胞により合成され［２］、骨中に取り込まれる。免疫組織学的にはオステオポンチンは発達する骨のミネラリゼーション区域中で検出される［３］。さらに、これは多様な生物学的液体、例えば尿及び乳中にも存在し、かつ活性化Ｔ−細胞［４，５］ならびに転移腫瘍細胞、皮膚及び大動脈の弾性繊維、筋細胞、血管内皮細胞、マクロファージ及びグリア細胞［６］によって発現される。脳脊髄液中でのＯＰＮの検出は今まで記載されておらず、従って、髄液中のＯＰＮの濃度及び存在に関する知識は新規である。
牛乳からのウシのＯＰＮは２８箇所のリン酸化（セリンに２７箇所及びトレオニンに１箇所）、３箇所のＯ−グリコシル化を有し、かつＮ−グリコシル化は有していない［７］。骨から単離されたラットのＯＰＮは、１３箇所のリン酸化（セリンに１２箇所及びトレオニンに１箇所）を有し及びさらにスルフェート基を含有する［８］。組み換えＯＰＮはチロシンで自己リン酸化されていることができる。牛乳からのウシのＯＰＮ中の及び骨からのラットのＯＰＮ中のリン酸基の数の差異は、恐らく異なる組織から由来することが原因であり、種からのものではない、それというのもこのリン酸化箇所は今まで配列決定されたＯＰＮバリエーションにおいて極めて強く保存されているためである［７］。Ｓｏｒｅｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌはさらに、リン酸化がほぼ１００％までであり、つまりリン酸化されている全ての箇所は、常に完全に１００％までリン酸化されていることを確認している［７］。脳脊髄液中のＯＰＮが今回初めて検出され、これは文献中には今まで記載されていなかった。興味深いことに、この場合に、脳脊髄液中に同じ配列を有するが異なる数のリン酸化を有するＤＲＯＰＮ−ペプチドが同じ試料中に出現し、このことは異なる体液中のＯＰＮについての今までの知識では期待できず、新規の種類であることが示された。さらに、今までオステオポンチン−タンパク質だけが生物学的試料中に検出され、オステオポンチンペプチドフラグメントは検出されていなかった。骨の補修の際に、ネズミの場合に高いオステオポンチンｍＲＮＡ−濃度が出現する［９］。年齢とオステオポンチン−発現との関係は明確ではない、それというのも、異なる研究の結果は高齢の試験動物を若年の試験動物と比較した場合、高いＯＰＮ−発現も低いＯＰＮ−発現も記載されているためである［２、９、１０］。
【００３３】
ＯＰＮの機能の一つは、恐らくカルシウム沈着プロセスの範囲内で結晶成長の調節であり、この場合にＯＰＮはカルシウムの結晶化に関して増進するようにも、阻害するようにも作用できる。アテローム性動脈硬化症の場合には、該当する血管壁のカルシウム沈着の他に、細胞外マトリックスの補修が生じる。オステオポンチンは有利にカルシウム沈着した範囲内で免疫組織学的に検出可能であり［１１］、かつこの場合にマクロファージ及び平滑筋細胞により発現される。オステオポンチンは血管のカルシウム沈着の調節に利用されていると考えられる［１１］。恐らく、オステオポンチンが作用する方向は、翻訳後修飾、特にそのリン酸化に関するオステオポンチンの微細環境及び状態に依存する［７］。Ｅｋ−Ｒｙｌａｎｄｅｒ  ｅｔ  ａｌは、例えば脱リンしたＯＰＮがもはや破骨細胞−付着を促進しないことを明らかにした［１２］。ＯＰＮの脱リンは、ヒドロキシアパタイト−結晶形性に関するＯＰＮの阻害的活性を低下させ、このことはＯＰＮのリン酸化の機能的意味を示している［１３］。ＯＰＮは尿中の結晶成長を阻害し、尿結石の発生を予防する。しかしながら、本発明者の結果は、上記の結果とは異なり、リン酸化されたＤＲＯＰＮ−ペプチドも、対応するリン酸化されていないＤＲＯＰＮ−ペプチドも、同じようにその濃度上昇によって痴呆−マーカーとして使用できることが示された。本発明によるこのマーカーは、従って、その構造的修飾に関するＯＰＮフラグメントにとって期待されたような相応するものではないようなフラグメントである。オステオポンチンはさらに細胞−細胞−相互作用及び細胞−マトリックス−相互作用を媒介し、それにより免疫細胞、骨細胞及び腫瘍細胞から生物内の異なる箇所への指向性の移行（ホーミング）が制御される。さらに、オステオポンチンはＣＤ４４、広範囲に発現されるトランスメンブレンタンパク質と相互作用する［４、５］オステオポンチンの他に、ビトロネクチン及びヒアルロン酸はＣＤ４４の他のリガンドである。ＣＤ４４−オステオポンチン−相互作用は細胞の走化性を引き起こし、ＣＤ４４−ヒアルロン酸−相互作用は同型細胞集合を引き起こす。生体内ではオステオポンチンの星状膠細胞に関する走化活性が検出できた［１４］。オステオポンチン欠乏マウスは、創傷治癒及び免疫応答の制御における障害を示した［１５］。さらに、マクロファージがヒト腫瘍細胞付近及び壊死性腫瘍領域内で、ならびに脳の虚血領域内で大量のオステオポンチン−タンパク質及びｍＲＮＡを発現し、従ってオステオポンチンは創傷治癒の際のマトリックス再編成において重要な機能を有していることを示すことができた。
【００３４】
オステオポンチンは血管平滑筋細胞及び内皮細胞の付着及び移行を促進する。グリオームの場合にはＶＥＧＦ（血管内皮増殖因子「Ｖａｓｃｕｌａｒ  Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ」）を介して特にオステオポンチン及びそのレセプターのアルファ  Ｖ  ベータ  ３−インテグリンが誘導され、それによりおそらく血管形成が誘導されている。進行性の慢性痴呆疾患ではない卒中発作の場合には、ＯＰＮ  ｍＲＮＡの
上昇を見ることができた［１６］。
【００３５】
本発明による方法により検出された痴呆は、有利に進行性の慢性痴呆疾患、例えばアルツハイマー病である。今までに、本発明によるペプチド及びペプチドフラグメントの濃度変化は多様な痴呆疾患、例えばアルツハイマー病又は血管性痴呆の場合に検出することができた。このことから、本発明によるペプチドはアルツハイマー病及びその類縁する神経学的疾患の検出のため及び治療のために用いることができると推測することができる。この方法の実施形態は、早期の時点、例えば「Ｍｉｎｉｍａｌ  Ｃｏｇｎｉｔｉｖｅ  Ｉｍｐａｉｒｍｅｎｔ」（ＭＣＩ）で、すでに痴呆性疾患が測定される。
【００３６】
この同定は有利に、遺伝子バンク登録番号Ｘ１３６９４のＯＰＮ−タンパク質の所定のペプチドフラグメントに関する、つまりＯＰＮ−タンパク質の部分配列を含むか又はＯＰＮ−タンパク質自体を含むペプチドに関して集中する。このペプチド（ペプチドフラグメント）は「痴呆に関連するオステオポンチン」（ＤＲＯＰＮ）−ペプチドとして表され、以後ＤＲＯＰＮ−１〜ＤＲＯＰＮ−３１と表す。ＯＰＮ−タンパク質とＤＲＯＰＮ−１〜ＤＲＯＰＮ−３１との関係は図１に示されている。このペプチドの測定された配列は配列表中に記載されている。このＯＰＮ−フラグメントは自然に天然で生じ、いままでに文献には記載されていなかった。このフラグメントは、プロテアーゼ、例えばトリプシンの添加により試験管内でのタンパク質分解により生じるような、文献にしばしば記載されているペプチドとは異なっている。このフラグメントは従って新規の今までに公知でない物質である。このペプチドを、まず最初に逆相クロマトグラフィーによって生物学的試料から濃縮し、精製し、引き続き質量分析法を用いて付随する他のペプチドと分離し、その結果このＤＲＯＰＮ−ペプチドを引き続き配列決定することができた。
【表１】
2004532633.tif 000003
【００３７】
＊  ｒ１はアミノ酸２６〜１９のＯＰＮ−タンパク質の配列又は配列の一部に相当する配列であり、その際、ｒ１はＯＰＮ−タンパク質のアミノ酸２７から出発して、０〜８個のアミノ酸長さであることができる。同様に、ｒ２もアミノ酸３５〜４２のＯＰＮタンパク質配列か又はその一部であり、その際、ｒ２はＯＰＮ−アミノ酸３４から出発して０〜８個のアミノ酸長さであることができる。他のペプチド鎖ｒ３〜ｒ１４は前記した概要に相応して構成されていて、その際、ｒ３は最大でＯＰＮ−２２１〜２０８に、ｒ４は最大でＯＰＮ−２３０〜２４６に、ｒ５は最大でＯＰＮ−２３３〜２０８に、ｒ６は最大でＯＰＮ−２４２〜２４６に、ｒ７は最大でＯＰＮ−２５３〜２４９に、ｒ８は最大でＯＰＮ−２６２〜３１４に、ｒ９は最大でＯＰＮ−２７０〜２４９に、ｒ１０は最大でＯＰＮ−２７９〜３１４に、ｒ１１は最大でＯＰＮ−２８９〜２４９に、ｒ１２は最大でＯＰＮ−２９８〜３１４に、ｒ１３は最大でＯＰＮ−３０２〜２４９に、及びｒ１４は最大でＯＰＮ−３１１〜３１４に相当する。
【００３８】
＊＊  ＤＲＯＰＮ−１０については、リン酸化されていないＤＲＯＰＮ−１０ペプチドに対してさらに、実験により１、２、３、４又は５個のリン酸基を有するペプチドが相応して高い質量に基づいて同定することができた。この場合に実験的に測定されたＤＲＯＰＮ−１０の質量は、７７３８／７８１８／７８９８／７９７８及び８０５８ダルトンであった。一リン酸化ペプチドのＤＲＯＰＮ−１０の場合のリン酸基の可能な位置は既に決定することができた。リン酸基１個を有するＤＲＯＰＮ−１０の場合のリン酸基の予想される位置は、ＯＰＮ−配列の位置２９１にあるセリンであり、リン酸基２個を有するＤＲＯＰＮ−１０の場合のリン酸基の予想される位置は、セリン２７５及びセリン２９１であり、リン酸基３個を有するＤＲＯＰＮ−１０の場合のリン酸基の予想される位置は、セリン２７０、セリン２７５及びセリン２９１である。リン酸基４個又は５個を有するＤＲＯＰＮ−１０の場合のリン酸基の正確な位置は、現在のところ不明である。
【００３９】
＊＊＊  ＤＲＯＰＮ−２９はＮ末端修飾としてピログルタミン酸を有する。
【００４０】
適当なペプチド
このペプチドは翻訳後修飾の形又は化学的修飾の形で存在することができ、これは特にその質量に関して、従って質量分析による同定に関して、及びクロマトグラフィー、例えば逆相クロマトグラフィーの場合の溶出挙動に関して影響を及ぼす。特に、このペプチドはリン酸化されて、グリコシル化されて、硫酸化されて、アミノ化されて、酸化されて又はＮ末端のピログルタミン酸基などを有した形で調査すべき試料中に存在していることができる。
【００４１】
このペプチドは、特に、ＯＰＮ−タンパク質の配列からその配列の最大でも３０％まで相違する場合にＯＰＮ−ペプチド、もしくはＤＲＯＰＮ−ペプチドとして見なされる。この場合に、ＯＰＮ−タンパク質配列から３０％より多くの相違が生じない限り、点突然変異、欠失、挿入及びＮ末端及び／又はＣ末端の延長が許容される。
【００４２】
マーカーペプチド（ＤＲＯＰＮ−ペプチド及びＯＰＮ−ペプチド）の濃度変化は疾患の重度と共に及び神経学的疾患、特に進行性の慢性痴呆疾患、特にアルツハイマー病の期と相関することから出発することができる。従って、本発明の実施形態において、このマーカーペプチドの測定は、この疾患の重度及び期を測定するために、特に「Ｍｉｎｉ−Ｍｅｎｔａｌ  Ｓｔａｔｅ  Ｅｘａｍｉｎａｔｉｏｎ」（ＭＭＳＥ）の実施に代わる方法として又は補足する方法として用いられることが予想される。本発明の実施形態において、さらに、このマーカーペプチドの測定は神経学的疾患の前段階、特に「Ｍｉｌｄ  Ｃｏｇｎｉｔｉｖｅ  Ｉｍｐａｉｒｍｅｎｔ」（ＭＣＩ）の測定のために、又はこの疾患の進行の予後のために用いられることが予想される。
【００４３】
場合により使用された対照試料は、多様な対照からのプール試料であることができる。この調査すべき試料は、プール試料であることもでき、その際、陽性の結果の場合に単一試験が行われる。
【００４４】
適切な生物学的試料
生物学的試料は有利に（ヒト）脳脊髄液（Ｌｉｑｕｏｒ  ｃｅｒｅｂｒｏｓｐｉｎａｌｉｓ，  ＣＳＦ）であるか又は血清、血漿、尿、便、涙、痰、滑液などのような試料である。これらは、特に選択された検出方法（質量分析法、ＥＬＩＳＡなど）の感度に依存する。血清、血漿及び尿は特に重要である、それというのもこれらの試料材料は標準検査の場合でも頻繁にかつ患者に多大な労力をかけずに得られるためである。ホモジェナイズドした組織試料も場合により使用することができる。
【００４５】
従って、本発明のもう一つの実施形態の場合には、調査すべき試料の準備のために例えばバイオプシーの範囲内で得られたヒト組織試料から組織ホモジェネートを製造することも想定される。この組織を、例えば手動ホモジェナイザー、超音波ホモジェナイザー又は電気駆動のホモジェナイザー、例えばＵｌｔｒａｔｕｒｒａｘを用いて破砕し、引き続き当業者に公知の方法で、例えば０．１〜０．２Ｍの酢酸を含有する酸性の水溶液中で１０分間乾燥させる。引き続き、この抽出物にそれぞれの検出方法、例えば質量分析による試験を行う。この試料は通常の方法で準備することができる、例えば場合により希釈又は濃縮及び貯蔵することができる。
【００４６】
診断薬の製造のためのＤＲＯＰＮ−ペプチドの使用
さらに本発明は、神経学的疾患、特に慢性痴呆疾患、特にアルツハイマー病の診断のための少なくとも１種の本発明によるＤＲＯＰＮ−ペプチド又はＯＰＮ−タンパク質の使用、ならびにそのＤＲＯＰＮ−ペプチド−特異的結合特性に基づきこれらの疾患の検出のための診断試薬の開発のために適している抗体又は他の抗原の獲得のためのＤＲＯＰＮ−ペプチドの使用にも関する。同様に、本発明は、このペプチドと特異的に結合するか、又は反対にＤＲＯＰＮ−ペプチドをその表面に提示しかつ結合パートナー、例えばＯＰＮ−タンパク質又はＤＲＯＰＮ−ペプチドのレセプターを同定することが可能となるファージ粒子の獲得のためのＤＲＯＰＮ−ペプチドの使用にも関する。
【００４７】
ＤＲＯＰＮ−ペプチドのための検出方法
本発明の範囲内で、ＤＲＯＰＮ−ペプチドの検出のために多様な方法を使用することができる。このために、ＤＲＯＰＮ−ペプチドを患者の試料中で特異的に検出できる全ての方法が適している。適当な方法は、特に物理学的方法、例えば質量分析又は液体クロマトグラフィー、分子生物学的方法、例えば逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）又は免疫学的検出技術、例えば「Ｅｎｚｙｍｅ  ｌｉｎｋｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  ａｓｓａｙｓ」（ＥＬＩＳＡ）である。
【００４８】
物理学的検出方法
本発明の実施形態は、本発明によるペプチドを定性的又は定量的に示すことができる物理学的方法を使用することである。この方法には、特に質量分析、液体クロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィー、ＮＭＲ（核磁気共鳴）分析などが属する。この場合に試験すべき試料から定量的測定結果を、神経学的疾患、特に慢性痴呆疾患、有利にアルツハイマー病を患う患者の集団と、対照集団とから得られた測定値と比較する。この結果から、神経学的疾患、特に慢性痴呆疾患、特にアルツハイマー病の存在及び／又はこの疾患の重度を導き出すことができる。
【００４９】
本発明の有利な実施形態の場合には、試料中のペプチドを、同定の前にクロマトグラフィーにより分離する、有利に逆相クロマトグラフィーにより分離する、特に有利に高分解能逆相−高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）を用いて試料中のペプチドを分離する。本発明のもう一つの実施形態は、試料の分別のために、沈殿剤、例えば硫酸アンモニウム、ポリエチレングリコール、トリクロロ酢酸、アセトン、エタノールなどを用いて沈殿反応を実施することである。こうして得られたフラクションは個々にそれぞれの検出法にかけられ、例えば質量分析試験にかけられる。本発明の他の実施形態は液相抽出の使用である。このために、試料を、例えば有機溶剤、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）と水性塩溶液とからなる混合物と混合する。この物理学的特性に基づき、試料の測定すべき内容物は有機相中に濃縮され、他のものは水相中に濃縮され、相互に分離し、引き続きさらに分析することができる。
【００５０】
逆相クロマトグラフィー
本発明の特に有利な実施形態は、ヒト脳脊髄液中のペプチドを分離するために、特にＣ１８逆相クロマトグラフィーカラムを使用して、トリフルオロ酢酸とアセトニトリルとからなる展開剤を用いる逆相クロマトグラフィーを包含する。例えば、それぞれのフラクションを集め、これは使用する展開剤の体積のそれぞれ１／１００を含む。こうして得られたフラクションを質量分析、例えばＭＡＬＤＩ−質量分析（マトリックス−支援レーザー脱離−イオン化）を用いて、アセトニトリル、水、トリフルオロ酢酸及びアセトンからなる混合物中に溶かした、Ｌ（−）フコースとアルファ−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸とからなるマトリックス溶液を使用して分析し、所定の質量の存在を確認しかつシグナル強度を定量化する。この質量は、本発明によるペプチドのＤＲＯＰＮ−１〜ＤＲＯＰＮ−３１の質量に相当する。
【００５１】
質量分析
本発明による有利な実施形態に場合には、１種又は数種のペプチドの同定を質量分析により測定する、有利にＭＡＬＤＩ（Ｍａｔｒｉｘ−ａｓｓｉｓｔｅｄ−ｌａｓｅｒ−ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ−ａｎｄ−ｉｏｎｉｓａｔｉｏｎ）質量分析で行うことができる。この場合、質量スペクトルによる測定はさらに有利に、それぞれ相応するペプチドの理論的なモノアイソトピック質量を用いて算定した少なくとも１つの次の質量シグナルを有する。この場合、実験誤差及び自然のアイソトープ分布に基づく理論的なモノアイソトピック質量の軽微な偏差が生じることがある。さらに、ＭＡＬＤＩ−質量測定の場合には、この測定方法に基づき、ペプチドにプロトンが加わり、それによりこの質量は１Ｄａだけ高まる。次の質量は、適当なソフトウェアー（この場合にＧＰＭＡＷ  ４．０２）を用いて計算した同定されたペプチドの理論的なモノアイソトピック質量に相当する。この理論的なモノアイソトピック質量は、試料中で単独で又は組合わさった形で出現することがある。ＤＲＯＰＮ−１＝２６２７．２７１５／ＤＲＯＰＮ−２≧１００９．４７１６／ＤＲＯＰＮ−３＝４０３２．７５９４／ＤＲＯＰＮ−４＝４４６５．００７９／ＤＲＯＰＮ−５＝３７１８．６３６８／ＤＲＯＰＮ−６＝１７３７．８０３０／ＤＲＯＰＮ−７＝１９００．８６６４／ＤＲＯＰＮ−８≧９５６．４０８７／ＤＲＯＰＮ−９≧８９５．４１４８／ＤＲＯＰＮ−１０＝７６５３．６００３／ＤＲＯＰＮ−１１＝４６６２．０９５３／ＤＲＯＰＮ−１２＝２０９３．９３０４／ＤＲＯＰＮ−１３≧８９９．３９８５／ＤＲＯＰＮ−１４≧１０８７．４８３５／ＤＲＯＰＮ−１５＝１５２２．７９９１／ＤＲＯＰＮ−１６＝１６３５．８８３２／ＤＲＯＰＮ−１７＝１７６３．９７８１／ＤＲＯＰＮ−１８＝１９１１．０４６６／ＤＲＯＰＮ−１９＝３２２２．６５２１／ＤＲＯＰＮ−２０＝３４３５．７６３４／ＤＲＯＰＮ−２１＝１６５０．８９４１／ＤＲＯＰＮ−２２＝１７９７．９６２５／ＤＲＯＰＮ−２３＝３１０９．５６８０／ＤＲＯＰＮ−２４＝２７９６．４０４２／ＤＲＯＰＮ−２５≧１１１２．５８２６、ＤＲＯＰＮ−２６≧８４４．３５６３／ＤＲＯＰＮ−２７＝２５２６．２２３８／ＤＲＯＰＮ−２８＝２５２８．２０３１／ＤＲＯＰＮ−２９＝３７１８．６３６８／ＤＲＯＰＮ−３０＝４１４９．７９９５及びＤＲＯＰＮ−３１＝４０３６．７１５４ダルトン。記号≧（大きいか又は等しい）はこの場合、該当するＤＲＯＰＮ−ペプチドに対して任意に大きな質量が可能であるのではなく、単にこのペプチドの末端に付加的に存在することができるアミノ酸に基づいて生じる質量であると解釈される。このペプチドの末端には任意のアミノ酸が付加的に存在できるのではなく、この配列位置のＯＰＮ−タンパク質の配列に基づき存在することができるようなアミノ酸が存在できる。
【００５２】
ＤＲＯＰＮ−ペプチドの配列の質量分析測定
この実施形態をさらに実際に適用する場合には、検出結果の他の検証は、質量に一致するペプチドの同一性を測定し、その際にＯＰＮ−タンパク質から誘導することができるペプチドシグナルをもっぱら考慮することにより可能でありかつ推奨される。この検証は、有利に質量分析法を用いて、例えばＭＳ／ＭＳ−分析を用いてペプチドシグナルの同定によって行われる［１７］。
【００５３】
本発明の方法により、ＯＰＮ−タンパク質（ＤＲＯＰＮ−ペプチド）の新規の特異的ペプチドが同定され、その重要性も認識された。このＤＲＯＰＮ−ペプチド及びその誘導体は、この場合にＤＲＯＰＮ−１〜ＤＲＯＰＮ−３１で表される。この配列は配列表に記載されている。ＤＲＯＰＮ−ペプチドのＤＲＯＰＮ−２、−８、−９、−１３、−１４、−２５及びＤＲＯＰＮ−２６はＮ末端及び／又はＣ末端に、所属するＯＰＮペプチドの相応する配列に応じて付加的なアミノ酸を含有することができる。本発明は、非修飾の形、化学的に修飾した形又は翻訳後修飾した形の組み換え又は合成により製造したＤＲＯＰＮ−ペプチドならびに生物学的試料から単離したＤＲＯＰＮ−ペプチドでもある。この場合に、ＤＲＯＰＮ−ペプチドが少なくとも８個のアミノ酸を有し、このアミノ酸がペプチド配列の中でその同一性及びその位置においてＯＰＮ−タンパク質と一致する場合に限り、２箇所の点突然変異ならびに他の相違も可能である。
【００５４】
分子生物学的検出技術
最後に、本発明は、ＤＲＯＰＮ−ペプチドに対応する核酸、及び特に本発明によるＤＲＯＰＮ−ペプチドに対応する核酸、及び所属するＯＰＮ−タンパク質及びペプチドの間接的測定及び定量化のためのその使用でもある。その中には、例えばコードされない配列、例えばｍＲＮＡの５′−又は３′−非翻訳領域である核酸、及び特異的ハイブリダイゼーション試験のためにＯＰＮの核酸配列との十分な配列一致を示す、従って所属するタンパク質、特にＤＲＯＰＮ−ペプチドの間接的な検出に適している核酸も含まれる。
【００５５】
これについての実施例は、患者の組織試料、例えばバイオプシー試料を獲得し、遺伝子バンク登録番号Ｘ１３６９４を有する遺伝子に一致するか又は相同のＯＰＮ−類似物に一致するＲＮＡ−転写物の濃度を測定することである。この場合、調査すべき試料からの定量的測定結果（強度）を、アルツハイマー病を患う患者の集団及び対照集団の場合に得られた測定値と比較する。定量化のために、例えば逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）、定量的リアルタイムＰＣＲ（ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭＥ（Ｒ）  ７７００  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ，  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，  ＣＡ，  ＵＳＡ）、インサイトゥハイブリダイゼーション又はノーザンブロットのような方法は当業者に公知のように使用できる。この結果から慢性痴呆疾患、有利にアルツハイマー病の存在及び／又はその重度を推論することができる。
【００５６】
免疫学的検出方法
本発明の他の有利な実施形態によると、ＤＲＯＰＮ−ペプチド又はＯＰＮ−タンパク質の同定は免疫学的検出システム、有利にＥＬＩＳＡ（「ｅｎｚｙｍｅ  ｌｉｎｋｅｄ  ｉｍｍｕｎｏ  ｓｏｒｂｅｎｔ  ａｓｓａｙ」）を使用して実施することができる。この場合に、この免疫学的検出は少なくとも１つのＤＲＯＰＮ−ペプチド又はＯＰＮ−タンパク質をとらえる。この特異性を高めるために、さらに有利に、いわゆる「サンドイッチＥＬＩＳＡ」を使用することができ、この場合にＤＲＯＰＮ−ペプチドの検出は、同じ分子内の異なるエピトープを認識する２つの抗体の特異性に依存する。しかしながら、ＤＲＯＰＮ−ペプチド又はＯＰＮ−タンパク質の検出のためには他のＥＬＩＳＡ−システム、例えば直接的又は拮抗的ＥＬＩＳＡを使用することもできる。同様に他のＥＬＩＳＡ類似の検出技術、例えばＲＩＡ（ラジオイムノアッセイ、「ｒａｄｉｏ  ｉｍｍｕｎｏ  ａｓｓａｙ」）、ＥＩＡ（エンザイムイムノアッセイ、Ｅｎｚｙｍｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）、ＥＬＩ−スポットなども免疫学的検出システムとして適している。定量化のための標準として、生物学的試料から単離された、組み換えにより製造された又は化学的に合成されたＤＲＯＰＮ−ペプチド又はＯＰＮ−タンパク質を使用することができる。１種又は数種のＤＲＯＰＮ−ペプチドの同定は、例えば一般にＤＲＯＰＮ−ペプチド又はＯＰＮ−タンパク質に結合する抗体を用いて行うことができる。このような検出に適当な他の方法は、特にウェスタンブロット、免疫沈降法、ドット−ブロット（Ｄｏｔ−Ｂｌｏｔ）、プラズモン共鳴スペクトル分析（ＢＩＡＣＯＲＥ（R）  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅ，  Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＡＢ，  Ｕｐｐｓａｌａ，  Ｓｃｈｗｅｄｅｎ）、ファージ粒子、ＰＮＡｓ（ペプチド核酸）、アフィニティマトリックス（例えばＡＢＩＣＡＰ−Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅ，  ＡＢＩＯＮ  Ｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ  ｆｕｅｒ  Ｂｉｏｗｉｓｓｅｎｓｃｈａｆｔｅｎ  ｕｎｄ  Ｔｅｃｈｎｉｋ  ｍｂＨ，  Ｊｕｅｌｉｃｈ，  Ｄｅｕｔｓｃｈｌａｎｄ）などである。一般に、特異的検出システムを構築することができる全ての物質／分子は検出試薬として適している、それというのもＤＲＯＰＮ−ペプチド又はＯＰＮ−タンパク質に特異的に結合するためである。
ＤＲＯＰＮ−ペプチド及びアンチ−ＤＲＯＰＮ−ペプチド抗体の獲得
本発明によるもう一つの実施形態は、当業者に公知の組み換え発現システム、クロマトグラフィー法及び化学的合成プロトコルを使用してＤＲＯＰＮ−ペプチドを獲得することである。こうして得られたＤＲＯＰＮ−ペプチドは、特にそれぞれのＤＲＯＰＮ−ペプチドの定量化のための標準として又はＤＲＯＰＮ−ペプチド−抗体の製造のための抗体として使用することができる。ＤＲＯＰＮ−ペプチドを単離しかつ獲得するための当業者に公知の適当な方法には、ペプチドの組み換え発現が属する。ＤＲＯＰＮ−ペプチドの発現のために、特に細胞システム、例えばバクテリア、例えばＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、酵母細胞、例えばＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、昆虫細胞、例えばＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ  （Ｓｆ−９）細胞、又はほ乳類細胞、例えば「Ｃｈｉｎｅｓｅ  Ｈａｍｓｔｅｒ  Ｏｖａｒｙ」（ＣＨＯ）細胞を使用することができる。これらの細胞は「Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ」（ＡＴＣＣ）から得ることができる。ＤＲＯＰＮ−ペプチドの組み換え発現のために、例えばＤＲＯＰＮ−ペプチドをコードする核酸配列を、適当な調節する核酸配列、例えばプロモーター、抗生物質選択マーカーなどと組み合わせて、分子生物学的方法で発現ベクター内へ挿入する。このために適したベクターは、例えばＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社のベクターｐｃＤＮＡ３．１である。こうして得られたＤＲＯＰＮ−ペプチド発現ベクターを次に適当な細胞内へ例えばエレクトロポレーションにより導入することができる。こうして製造されたＤＲＯＰＮ−ペプチドはＣ末端又はＮ末端でペプチドの異種配列、例えばポリ−ヒスチジン配列、へマグルチン−エピトープ（ＨＡ−ｔａｇ）、又はプロモーター、例えばマルトース結合性タンパク質、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、又はタンパク質ドメイン、例えばＧＡＬ−４  ＤＮＡ−結合ドメイン又はＧＡＬ４−活性化ドメインと融合することができる。ＤＲＯＰＮ−ペプチドを化学的合成によって製造することは、例えばメリフィールド−固相−合成プロトコルに従って、多様な製造元から入手可能である自動合成装置を使用して行うことができる。
【００５７】
本発明のもう一つの実施形態は、生物学的試料から又は組み換え発現システムの細胞媒体又は細胞溶解産物からＤＲＯＰＮ−ペプチドを、例えば逆相クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過、等電点電気泳動などを用いるか、又は分取免疫沈降、硫酸アンモニウム沈殿、有機溶剤を用いた抽出などの他の方法を用いて単離することである。本発明のもう一つの実施形態は、ＤＲＯＰＮ−ペプチドを使用してモノクローナル抗体又はポリクローナル抗体を獲得することである。抗体の獲得は、通常の当業者に公知の方法で行う。有利な実施形態は、ＤＲＯＰＮ−ペプチド特異的抗体の製造及び獲得であり、特に有利な実施形態は、ネオ−エピトープ、つまりＤＲＯＰＮ−ペプチドにだけ存在するがＯＰＮ−タンパク質中には存在しないエピトープを認識するＤＲＯＰＮ−ペプチド特異的抗体の製造である。このようなアンチ−ＤＲＯＰＮ−ペプチド−抗体はＯＰＮ−タンパク質の存在でＤＲＯＰＮ−ペプチドを特異的に免疫学的に検出することができる。ポリクローナル抗体は実験動物、例えばマウス、ラット、ウサギ又はヤギの免疫化によって製造することができる。モノクローナル抗体は、例えば試験動物、例えばマウス又はラットを免疫化し、引き続きハイブリドーマ技術を使用して、又は組み換え試験バッチ、例えば抗体バンク、例えばＨｕＣＡＬＯ（Ｒ）−抗体バンク（ＭｏｒｐｈｏＳｙｓ社，  Ｍａｒｔｉｎｓｒｉｅｄ，  Ｄｅｕｔｓｃｈｌａｎｄ）用いて、又は他の当業者に公知の組み換え製造方法を用いて得ることができる。抗体は抗体フラグメントの形でも、例えばＦａｂ−フラグメント又はＦａｂ２−フラグメントなどの形でも使用することができる。
【００５８】
ＤＲＯＰＮ−ペプチド決定による治療法開発及び監視
もう一つの適用例は、神経学的疾患、特に慢性痴呆疾患、特にアルツハイマー病に対する開発途中にある治療法の有効性を評価するための前記したＤＲＯＰＮ−ペプチド又はＯＰＮ−タンパク質の定量的又は定性的測定である。本発明は、この疾患、特にアルツハイマー病の治療法の開発のための臨床的研究にとって適当な患者を同定するためにも使用することができる。この場合には、試験すべき試料からの定量的測定結果と、対照集団及び患者のグループで得られた測定値とを比較する。この結果から、治療法の有効性、もしくは臨床的研究に対する患者の適性を導き出すことができる。この有効性試験ならびに治療法及び臨床的研究にとって適した患者の選択は、効果的な使用及び治療法の開発のために特に重要であり、今までアルツハイマー病については信頼することができる臨床的に測定可能なパラメーターは提供されていない［１８］。
【００５９】
ＯＰＮ−タンパク質、ＤＲＯＰＮ−ペプチド及びこれらの物質の発現及び生物学的利用性を調節する抗原の治療的有効性の試験
これについての実施例は、セルラインを培養し、これをＯＰＮ−タンパク質、ＤＲＯＰＮ−ペプチド又はＯＰＮ−タンパク質の発現を促進する物質を用いて処理するか、又はＯＰＮ−タンパク質からＤＲＯＰＮ−ペプチドへのプロセッシングを促進する物質、例えば「二塩基性配列モチーフ」を認識するプロテアーゼを用いて処理することである。それにより、神経学的疾患、特にアルツハイマー病との関連でＯＰＮ−タンパク質及びＤＲＯＰＮ−ペプチドの生物学的特性を測定することができる。融合タンパク質及び融合ペプチド、例えばセルライン中への融合タンパク質の輸送を促進するペプチド配列を有する融合タンパク質もセルラインの処理のために使用することができる。可能な融合パラメーターの例は、ＨＩＶ−ＴＡＴ−配列又はアンテナペディア−配列などである。同様にセルラインを発現ベクターでトランスフェクションし、この発現ベクターはトランスフェクションされた細胞によってＯＰＮ−タンパク質又はＤＲＯＰＮ−ペプチドの直接的又は間接的発現を引き起こすこの発現ベクターは特にＤＲＯＰＮ−ペプチド又はＯＰＮ−タンパク質をコードすることができる。同時にＤＲＯＰＮ−ペプチド及び／又はＯＰＮ−タンパク質を用いたトランスフェクションも実施することもできる。また、適当なセルラインを、アンチ−ＯＰＮ−タンパク質−抗体又はアンチ−ＤＲＯＰＮ−ペプチド−抗体又はＯＰＮ−タンパク質の発現を抑制する核酸、例えばＯＰＮ−アンチセンス−核酸、ＯＰＮ−トリプレックス−核酸又はＯＰＮ−ｍＲＮＡに結合するリボザイムで処理することもできる。特別に、神経学的モデルシステムとしてＯＰＮとの関係で適していると考えられるセルラインを、このような試験に用いることもできる。この試験のための読み出し装置として、特に処理された細胞の増殖速度、その物質交換活性、細胞のアポトーシス速度、細胞モルホロジーの変化、細胞独自のタンパク質又はレポーター遺伝子の発現又は細胞死のためのマーカーとしてのサイトソル性細胞成分の放出を測定する試験を使用することができる。他の試験システムとして、神経学的疾患用のモデルとして、特にアルツハイマー病用のモデルとして適している実験動物、例えばマウス又はラットの適当な株を使用し、この実験動物は、ＤＲＯＰＮ−ペプチド又はＯＰＮ−タンパク質の濃度の調節を目的とする治療ストラテジーの有効性を調査するために用いられる。さらに、この実験動物中では、タンパク質及びペプチド、例えばＯＰＮ−タンパク質又はＤＲＯＰＮ−ペプチドも調査され、この場合に、このペプチド及びタンパク質は場合により、血液−脳−隔壁及び／又は血液−髄液−隔壁を有効に通過できるように調剤学的に調製することができる。製剤学的調整方法として、特にリポソーム−パッケージングタンパク質及びペプチド、トランスポートペプチド、例えばＨＩＶ−ＴＡＴ−配列などと共有結合で融合したか、又は共有結合でなく会合したタンパク質及びペプチドを使用することができる。さらに、ペプチド及びタンパク質は、親水性の特性を維持し、従って細胞内へ容易に侵入できるように化学的に修飾されていることもできる。水溶液中に難溶性であるペプチドは逆に親水性にされるように修飾され、かつ例えば静脈内に注射可能な治療薬として使用することもできる。経口投与すべき敏感な物質を胃内で保護するために耐酸性のカプセルを使用することもできる。
【００６０】
動物モデルを用いた試験の場合の読み出しパラメーターは、動物の生存時間、その挙動、その短期記憶能力及び学習能力である。実験動物用に適している記憶試験の例は、「Ｍｏｒｒｉｓ  ｗａｔｅｒ  ｍａｚｅ  ｔｅｓｔ」である。他のパラメーターとして、身体機能、例えば血液試験の測定、脳障害の測定、物質代謝試験、ＯＰＮ−タンパク質及びＤＲＯＰＮ−ペプチド及びこの疾患と関連する他のタンパク質の発現速度、ならびに組織、例えば脳の形態学的及び組織学的試験を使用することができる。
【実施例】
【００６１】
本発明を次に実施例を用いて詳細に説明する。
【００６２】
この場合に図面も参照される。
【００６３】
図１は本発明によるＯＰＮ−タンパク質と、そのＯＰＮ−タンパク質とのアライメントを示すペプチドの理論的なモノアイソトピック質量（ダルトンで表示）はソフトウェアＧＰＭＡＷ４．０２を用いて算出した。これは：ＤＲＯＰＮ−１＝２６２７．２７１５／ＤＲＯＰＮ−２≧１００９．４７１６／ＤＲＯＰＮ−３＝４０３２．７５９４／ＤＲＯＰＮ−４＝４４６５．００７９／ＤＲＯＰＮ−５＝３７１８．６３６８／ＤＲＯＰＮ−６＝１７３７．８０３０／ＤＲＯＰＮ−７＝１９００．８６６４／ＤＲＯＰＮ−８≧９５６．４０８７／ＤＲＯＰＮ−９≧８９５．４１４８／ＤＲＯＰＮ−１０＝７６５３．６００３／ＤＲＯＰＮ−１１＝４６６２．０９５３／ＤＲＯＰＮ−１２＝２０９３．９３０４／ＤＲＯＰＮ−１３≧８９９．３９８５／ＤＲＯＰＮ−１４≧１０８７．４８３５／ＤＲＯＰＮ−１５＝１５２２．７９９１／ＤＲＯＰＮ−１６＝１６３５．８８３２／ＤＲＯＰＮ−１７＝１７６３．９７８１／ＤＲＯＰＮ−１８＝１９１１．０４６６／ＤＲＯＰＮ−１９＝３２２２．６５２１／ＤＲＯＰＮ−２０＝３４３５．７６３４／ＤＲＯＰＮ−２１＝１６５０．８９４１／ＤＲＯＰＮ−２２＝１７９７．９６２５／ＤＲＯＰＮ−２３＝３１０９．５６８０／ＤＲＯＰＮ−２４＝２７９６．４０４２／ＤＲＯＰＮ−２５≧１１１２．５８２６／ＤＲＯＰＮ−２６≧８４４．３５６３／ＤＲＯＰＮ−２７＝２５２６．２２３８／ＤＲＯＰＮ−２８＝２５２８．２０３１／ＤＲＯＰＮ−２９＝３７１８．６３６８／ＤＲＯＰＮ−３０＝４１４９．７９９５及びＤＲＯＰＮ−３１＝４０３６．７１５４ダルトンである。質量分析計で実際に同定された質量は、自然のアイソトープ分布に基づき、ならびに最大５００ｐｐｍのわずかな測定誤差に基づき、理論的なモノアイソトピック質量から変動する。さらに、全てのペプチドの測定された質量は、使用したＭＡＬＤＩ−測定法に基づき、１プロトンの質量（＝１ダルトン）だけ高くなっている。さらに、１〜５個のリン酸基を有するＤＲＯＰＮ−１０ペプチド−変異体に対して、実験的に同定することができ、かつ決定することができた。この場合に、実験的に決定されたＤＲＯＰＮ−１０についての質量は：７７３８／７８１８／７８９８／７９７８及び８０５８ダルトンであり、この場合ＤＲＯＰＮ−１０の質量は順番にリン酸基の質量分だけそれぞれ高くなる。
【００６４】
図２は、脳脊髄液からのＤＲＯＰＮ−ペプチドの分離及び濃縮のための、実施例２による逆相クロマトグラフィーを用いた溶出プロフィールを示す。
【００６５】
図３は、実施例２によるヒトの脳脊髄液から逆相クロマトグラフィーを行った後に、ＤＲＯＰＮ−１０の実施例３によるＭＡＬＤＩ−質量分析測定により得られたスペクトルを示す。ＤＲＯＰＮ−１０はアミノ酸２４９〜３１４のＯＰＮ−配列に一致する。図３Ａはリン酸化されていない形のＤＲＯＰＮ−１０のＭＡＬＤＩ−質量分析図を示す。ＤＲＯＰＮ−１０の質量−ピークは矢印でマークしてある。図３Ｂは１個のリン酸基を含有するＤＲＯＰＮ−１０変異体のＭＡＬＤＩ−質量分析図を示す。ＤＲＯＰＮ−１０＋１×ホスフェートの質量−ピークは矢印でマークしてある。
【００６６】
図４は相対的に定量化するＭＳ法としてＭＡＬＤＩにより得られたデータを示す。試料は多様な量の異なる標準ペプチドを混ぜ、標準シグナルならびに代表的な試料シグナルの強度を測定した。標準の全てのシグナル−強度は濃度０．６４μＭ（＝１）の場合のシグナル強度に規格化した。各ペプチドは、シグナル強度と濃度との間で個々の典型的な関係を示し、これについてはこの図中で曲線の上昇によって読み取ることができる。
【００６７】
図５は本発明によるリン酸基を有するペプチドのＤＲＯＰＮ−１０実施例４によるＭＳ／ＭＳ−フラグメントスペクトルを示す。
【００６８】
上側のトレース：測定の生データ。
【００６９】
下側のトレース：１個のリン酸基を有するＤＲＯＰＮ−１０の、変換し、デコンボリューションした質量分析。
【００７０】
このピークパターンは１個のリン酸基を有するＤＲＯＰＮ−１０に対して特徴的であった。ＤＲＯＰＮ−１０はアミノ酸２４９〜３１４のＯＰＮ−配列に一致する。
【００７１】
図６は、対照患者と比較した、アルツハイマー病患者のＤＲＯＰＮ−５、ＤＲＯＰＮ−１０及びＤＲＯＰＮ−２０の濃度の定量的比較のための「箱ヒゲ図」を表し、その際、ＤＲＯＰＮ−１０については、リン酸基を有していないか、１個、２個、３個及び４個のリン酸基を有するペプチドについての箱ヒゲ図を示した。これらの図は、積分したＭＡＬＤＩ−質量分析法による信号強度の比較を「箱ヒゲ図」の形で示した。
【００７２】
図７は、「サンドイッチＥＬＩＳＡ」で測定した脳脊髄液中のＯＰＮ−タンパク質の濃度に対して箱形図（Ｂｏｘｐｌｏｔ）として表した測定結果を示す。この図の右側の部分はアルツハイマー病の患者の試料の結果を示し、この図の中央の部分は血管痴呆の患者の試料の結果を示し、この図の左側の部分は対照グループの結果を示す。
【００７３】
（実施例１）  ＤＲＯＰＮ−ペプチドの測定のための脳脊髄液の取得
髄液又は脳脊髄液（Ｌｉｑｕｏｒ  ｃｅｒｅｂｒｏｓｐｉｎａｌｉｓ）は４っの脳室中及びクモ膜下腔中に含まれる液体であり、この液体は特に側脳室の脈絡叢中に形成される。脳脊髄液の採取はたいていは腰椎穿刺により、まれに後頭下穿刺又は脳室穿刺により行う。脳脊髄液の採取のための腰椎穿刺（脊髄穿刺）の場合に、脊髄クモ膜下腔の穿刺時に第３と第４腰痛の間又は第４と第５腰椎の間に長い中空針を穿刺し、髄液を得る。引き続きこの試料を１０分間２０００×ｇで遠心分離し、上澄液をマイナス８０℃で貯蔵する。
【００７４】
（実施例２）  ＤＲＯＰＮ−ペプチドの質量分析測定のための脳脊髄液（ＣＳＦ）中のペプチドの分離
ＣＳＦ中のＯＰＮ−ペプチドを質量分析により検出するために、この実施例ではペプチド内容物の分離が必要である。この試料の前処理は、本発明によるペプチドを濃縮し、測定に障害となり得る成分を分離するために用いられる。分離方法としては、逆相クロマトグラフィーが実施される。この場合に、多様なＲＰ−クロマトグラフィー樹脂及び溶離剤が同様に適している。次に、Ｖｙｄａｃ社のサイズ４ｍｍ×２５０ｍｍのＣ１８逆相クロマトグラフィーを用いたＯＰＮ−ペプチドの分離を例示する。次の組成の展開剤を使用した：展開剤Ａ：：トリフルオロ酢酸０．０６％（ｖ／ｖ）、展開剤Ｂ：トリフルオロ酢酸０．０５％（ｖ／ｖ）、アセトニトリル８０％（ｖ／ｖ）。このクロマトグラフィーを３３℃でＡｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社のＦｌｕｓｓｚｅｌｌｅ  Ｍｉｃｒｏを備えたＡｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社のＨＰ−ＣｈｅｍＳｔａｔｉｏｎ  １１００を使用して行った。試料としてヒトの脳脊髄液を使用した。髄液４４０μｌを水で１６５０μｌに希釈し、ｐＨを２〜３に調節し、この試料を１０分間１８０００×ｇで遠心分離し、引き続きこうして準備した試料１５００μｌをクロマトグラフィーカラムで分離した。このクロマトグラフィー条件は次のようであった：０分の時点で展開剤Ｂ５％、１〜４５分の時点で展開剤Ｂ濃度を５０％まで連続的に上昇させる、４５〜４９分の時点で展開剤Ｂ濃度を１００％まで連続的に上昇させる、引き続き５３分の時点まで緩衝液Ｂを１００％で保持する。クロマトグラフィーの開始後１０分にそれぞれ０．５ｍｌまでの９６のフラクションの採取を開始した。ここに記載した試験条件下で製造した脳脊髄液試料のこのクロマトグラムを図２に示した。
【００７５】
（実施例３）  ＭＡＬＤＩ−質量分析法を用いたペプチドの質量の測定
質量分析のために、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−質量分析計（マトリックス支援レーザー脱離−イオン化法）においてペプチドの陽イオンスペクトルをプロットした。適当なＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−質量分析計は、ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ（Ｖｏｙａｇｅｒ−ＤＥ，  Ｖｏｙａｇｅｒ−ＤＥ  ＰＲＯ  ｏｄｅｒ  Ｖｏｙａｇｅｒ−ＤＥ  ＳＴＲ）又はＢｒｕｋｅｒ  Ｄａｌｔｏｎｉｋ  Ｂｒｅｍｅｎ（ＢＩＦＬＥＸ）により製造した。試料の調製のために、試料を、一般に有機酸からなるマトリックス物質と混合する。ペプチド用に適している典型的なマトリックス物質は、３，５−ジメトキシ−４−ヒドロキシクエン酸、α−シアノ−４−ヒドロキシクエン酸及び２，５−ジヒドロキシ安息香酸である。本発明によるＤＲＯＰＮ−ペプチドの測定のために、凍結乾燥し、逆相クロマトグラフィーにより得られた当量の相応する５００μｌのヒト脳脊髄液を使用した。このクロマトグラフィー処理した試料をマトリックス溶液１５μｌ中に溶かした。このマトリックス溶液は、例えばアセトニトリル、水、トリフルオロ酢酸及びアセトンからなる体積比４９：４９：１：１の溶剤混合物中に溶かしたα−シアノ−４−ヒドロキシクエン酸１０ｇ／ｌ及びＬ（−）フコース１０ｇ／ｌを有する。この溶液から０．３μｌをＭＡＬＤＩ−キャリアプレート上に移し、乾燥した試料をＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ  ＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓのＭＡＬＤＩ−質量分析計Ｖｏｙａｇｅｒ−ＤＥ  ＳＴＲで分析した。この測定は「Ｄｅｌａｙｅｄ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ」ＴＭを用いて「Ｌｉｎｅａｒ  Ｍｏｄｅ」で行った。本発明によるＤＲＯＰＮ−ペプチドのなかの一つを測定する例を図３に示した。
【００７６】
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−質量分析は、ペプチド、例えば本発明によるＤＲＯＰＮ−ペプチドの定量化のために、このペプチドが質量分析計の動的測定範囲内にあり、それにより検出器飽和が避けられる濃度で存在する場合に使用することができる。脳脊髄液中の本発明によるＤＲＯＰＮ−ペプチドの測定に対して、マトリックス１μｌ当たり３３．３μｌの髄液当量濃度の場合がこれに該当する。各ペプチドに対して、質量シグナルと濃度との間の特異的な割合が存在し、このことはＭＡＬＤＩ−質量分析が有利にペプチドの相対的定量化のために使用できることを意味している。この状況は図４に示されている。試料を多様な量の異なる標準ペプチドと混ぜる場合に、標準シグナルならびに試料シグナルの強度を測定することができる。例えば図４は相対的に定量化するＭＳ法としてのＭＡＬＤＩ−測定を示す。標準の全てのシグナル−強度は濃度０．６４μＭ（＝１）の場合のシグナル強度に規格化した。各ペプチドは、シグナル強度と濃度との間で個々の典型的な関係を示し、これについては曲線の上昇によって読み取ることができる。
【００７７】
（実施例４）  ＤＲＯＰＮ−ペプチドの質量分析による同定
本発明によるＤＲＯＰＮ−ペプチドの定量化のために、実施例２による脳脊髄液の逆相クロマトグラフィーにより得られたフラクション中のペプチドの分析すべき質量シグナルが実際に本発明によるＤＲＯＰＮ−ペプチドであることが保証されなければならない。
【００７８】
そのフラクション中の本発明によるペプチドの同定はｎａｎｏＳｐｒａｙ−ＭＳ／ＭＳで行う［１７］。この場合に、質量分析器中のＤＲＯＰＮ−ペプチド−イオンはその固有のｍ／ｚ（質量／電荷）値を用いて当業者に公知の方法で質量分析器中で選択される。この選択されたイオンは、引き続き衝突ガス、例えばヘリウム又は窒素を用いた衝突エネルギーの供給により断片化され、生じたＤＲＯＰＮ−ペプチドの断片が質量分析器の組み込まれた分析ユニット内で検出され、相応するｍ／ｚ−値が決定される（タンデム−質量分析の原理）［１９］。このペプチドの断片化挙動が、例えば５０ｐｐｍの質量精度の場合に、ＯＰＮ−タンパク質の配列が登録されている配列データバンク内をコンピュータを用いて検索する方法［２０］を使用して、本発明によるＤＲＯＰＮ−ペプチドの明確な同定を可能にする。特別な場合には、質量分析による分析は、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ−Ｓｃｉｅｘ社，ＵＳＡのＱｕａｄｒｕｐｏｌ−ＴＯＦ−Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔモデル「ＱＳｔａｒ−Ｐｕｌｓａｒ」を用いて行った。例示的なＭＳ／ＭＳフラグメントスペクトルは図５に示してある。
【００７９】
（実施例５）  患者の試料と比較する対照試料中の相対的濃度の比較のためのＤＲＯＰＮ−ペプチドの質量分析による定量化
２２２の臨床的試料、つまり８２の対照試料とアルツハイマー病を患う患者の１３０の試料について、実施例１及び２による試料準備の後に続いて、実施例３による本発明によるＤＲＯＰＮ−ペプチドのＭＡＬＤＩ−質量分析を実施した。例示的なＭＡＬＤＩ−シグナル強度は、「箱ひげ図」の形で図６Ａ〜６Ｃに視覚化した。図６中に示した「箱ひげ図」は、アルツハイマー病患者の２９〜４５試料ならびに１３〜４４の対照試料を用いて試験ごとにそれぞれ実施した質量値に基づく。全体で４回の試験を実施した。図示した「箱ひげ図」は、対照における多様なＤＲＯＰＮ−ペプチドの積分したＭＡＬＤＩ−質量分析によるシグナル強度と、アルツハイマー病患者の試料中のＭＡＬＤＩ−シグナル強度との比較を可能にする。この場合、「箱部」、つまり図６Ａ〜６Ｃのグラフ中の角柱部は、それぞれのＭＡＬＤＩ−シグナル強度の５０％が存在するＭＡＬＤＩ−シグナル強度の領域であり、この「箱部」から上方及び下方へ伸びている線状部（「ひげ部」）は、それぞれ、最大のシグナル強度を示す測定値の２５％が存在する領域（上方の４分位値）を示すか、もしくは最低のシグナル強度を示す測定値の２５％が存在する領域（下方の４分位値）を示す。角柱部中の実線は中央値を表し、角柱部中の点線は平均値を表す。
【００８０】
（実施例６）  患者の試料及び対照試料のヒトの脳脊髄液中の、「酵素結合免疫吸着検定法」（ＥＬＩＳＡ）を用いたＯＰＮ−タンパク質の定量化。
【００８１】
進行性の慢性痴呆疾患を患う患者の２０の脳脊髄液試料及び対照の個体の１２の試料を、インキュベーション緩衝液（ＮａＣｌ  １４０ｍＭ、ＫＣｌ  ２．７ｍＭ、ＫＨ２ＰＯ４  １．２ｍＭ、Ｎａ２ＨＰＯ４  ８ｍＭ、ウシ血清アルブミン１％、Ｔｗｅｅｎ  ２０  ０．０５％）で１：５０に希釈し、こうして希釈した試料１００μｌを、これをアンチ−ヒト−ＯＰＮ−抗体Ｏ１７（ウサギ免疫グロブリンＧ）で被覆したＥＬＩＳＡ−プレートに二倍値で載せ、３７℃で１時間インキュベーションした。洗浄緩衝液（リン酸塩緩衝液中Ｔｗｅｅｎ  ２０  ０．０５％）２００μｌでそれぞれ７回洗浄した後、酵素のホースラディッシュペルオキシダーゼで共有結合している二次抗体を１００μｌ（キャビティ毎）をインキュベーション緩衝液中で１μｇ／ｍｌの濃度で４℃でインキュベートし、引き続き洗浄緩衝液で新たに９回洗浄し、基質として基質緩衝液（Ｎａ２ＨＰＯ４  ５０ｍＭ、クエン酸２０ｍＭ、ｐＨ５．０）中のテトラメチルベンジジン（ＴＭＢ、Ｓｉｇｍａ）０．２ｍｇ／ｍｌの溶液を添加し、室温で３０分間空気遮断下でインキュベーションした。キャビティ当たり停止溶液（０．５Ｍ  Ｈ２ＳＯ４）１００μｌを添加することにより酵素反応を停止させ、引き続きＴＥＣＡＮ社のモデルＳＵＮＲＩＳＥの分光光度計で４５０ｎｍでの吸光を測定した。組み換えＯＰＮを用いて製造した公知の濃度の標準列を、平行してＥＬＩＳＡで測定し、これを定量化のために使用した。ＥＬＩＳＡにとって使用した全ての試薬はＩＢＬ  Ｈａｍｂｕｒｇ社から入手した。標準の公知の濃度を用いて算定した脳脊髄液試料中のＯＰＮ−濃度を図７の箱型図の形で記載した。各箱部は中央線として統計的中央値を用いたデータ点の５０％を包含する。箱部の上側及び下側の線はデータ個体群の±２５％についての限界を示す。上側の箱部の上方にある線は「Ｕｐｐｅｒ  Ｑｕａｒｔｉｌｅ  ＵＱ」として表され、下側の箱の下側の線は「Ｌｏｗｅｒ  Ｑｕａｒｔｉｌｅ  ＬＱ」として表される。四分位数間距離「Ｉｎｔｅｒｑｕａｒｔｉｌｅ  Ｄｉｓｔａｎｃｅ  （ＩＱＤ）」は下方の四分位数から上方の四分位数までの距離を表す。箱部の上側及び下側に接続した線は、最小値までの距離、もしくは最大値までの距離を表す。このことから、異常値として認識されるデータ点が識別される。データ点の値がＷ＞ＵＱ＋１．５＊ＩＱＤ又はＷ＜ＬＱ−１．５＊ＩＱＤである場合がこのケースである。
【００８２】
この明細書中の見出しは、テキストの構造化のために決められているにすぎない。この見出しは、記載した内容を制限したり又は限定することにはならない。全ての実施例は、発明思想を詳細に説明するものであるが、本発明の範囲を限定するものではない。
【参考文献】
【００８３】
2004532633.tif 000004
2004532633.tif 000005
【図面の簡単な説明】
【００８４】
【図１Ａ】
ＤＲＯＰＮ−ペプチドと、そのＯＰＮ−タンパク質とのアライメントを示す図である。
【図１Ｂ】
図１Ａの続きである。
【図２】
脳脊髄液からＤＲＯＰＮ−ペプチドを分離しかつ濃縮するための逆相クロマトグラフィーの結果を示すチャートである。
【図３】
ＤＲＯＰＮ−１０の例の質量分析測定（ＭＡＬＤＩ）の結果を示すチャートである。
【図４】
相対的に定量化する質量分析法としてのＭＡＬＤＩの結果を示すグラフである。
【図５】
リン酸基を有するペプチドのＤＲＯＰＮー１０の例のＭＳ／ＭＳ−フラグメントスペクトルを示すチャートである。
【図６Ａ】
対照患者と比較したアルツハイマー病患者のＤＲＯＰＮ−５、ＤＲＯＰＮ−１０及びＤＲＯＰＮ−２０の濃度の定量的比較のための「箱ヒゲ図（「Ｂｏｘ−Ｗｈｉｓｋｅｒ−Ｐｌｏｔｓ」）」である。
【図６Ｂ】
図６Ａの続きである。
【図６Ｃ】
図６Ｂの続きである。
【図７】「サンドイッチＥＬＩＳＡ」を用いた脳脊髄液中のＯＰＮ−タンパク質濃度の測定。
【図１Ａ】
2004532633.tif 000006
【図１Ｂ】
2004532633.tif 000007
【図２】
2004532633.tif 000008
【図３】
2004532633.tif 000009
【図４】
2004532633.tif 000010
【図５】
2004532633.tif 000011
【図６Ａ】
2004532633.tif 000012
【図６Ｂ】
2004532633.tif 000013
【図６Ｃ】
2004532633.tif 000014
【図７】
2004532633.tif 000015
【国際公開パンフレット】
2004532633.tif 000016
2004532633.tif 000017
2004532633.tif 000018
2004532633.tif 000019
2004532633.tif 000020
2004532633.tif 000021
2004532633.tif 000022
2004532633.tif 000023
2004532633.tif 000024
2004532633.tif 000025
2004532633.tif 000026
2004532633.tif 000027
2004532633.tif 000028
2004532633.tif 000029
2004532633.tif 000030
2004532633.tif 000031
2004532633.tif 000032
2004532633.tif 000033
2004532633.tif 000034
2004532633.tif 000035
2004532633.tif 000036
2004532633.tif 000037
2004532633.tif 000038
2004532633.tif 000039
2004532633.tif 000040
2004532633.tif 000041
2004532633.tif 000042
2004532633.tif 000043
2004532633.tif 000044
2004532633.tif 000045
2004532633.tif 000046
2004532633.tif 000047
2004532633.tif 000048
2004532633.tif 000049
2004532633.tif 000050
2004532633.tif 000051
2004532633.tif 000052
2004532633.tif 000053
2004532633.tif 000054
2004532633.tif 000055
2004532633.tif 000056
2004532633.tif 000057
2004532633.tif 000058
2004532633.tif 000059
2004532633.tif 000060
2004532633.tif 000061
2004532633.tif 000062
2004532633.tif 000063
2004532633.tif 000064
2004532633.tif 000065
2004532633.tif 000066
2004532633.tif 000067
2004532633.tif 000068
2004532633.tif 000069
2004532633.tif 000070
2004532633.tif 000071
2004532633.tif 000072
2004532633.tif 000073
2004532633.tif 000074
2004532633.tif 000075
2004532633.tif 000076
2004532633.tif 000077
2004532633.tif 000078
2004532633.tif 000079
2004532633.tif 000080
2004532633.tif 000081
2004532633.tif 000082
2004532633.tif 000083
2004532633.tif 000084
2004532633.tif 000085
2004532633.tif 000086
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004532633.tif 000087
2004532633.tif 000088
【国際調査報告】
2004532633.tif 000089
2004532633.tif 000090
2004532633.tif 000091
2004532633.tif 000092
2004532633.tif 000093
2004532633.tif 000094
2004532633.tif 000095
2004532633.tif 000096
2004532633.tif 000097
2004532633.tif 000098