(57)【要約】本発明は、一般に新しい機能的プロテインＳアッセイおよび凝固時間を延長する外因性プロテインＳの能力に基づくキットに関する。本アッセイ手段において、試験血漿サンプルは、プロテインＳ欠乏血漿で希釈され、続いて、精製された組織因子または組み換え体の組織因子（ｐＴＦまたはｒＴＦ）、精製された天然のリン脂質または合成のリン脂質（ｐＰＬまたはｓＰＬ）および活性化プロテインＣ（ＡＰＣ）またはプロテインＣ活性化因子（ＰＣＡ）が添加される。次いで、凝固時間が測定され、そして標準曲線または正常なコントロールと比較される。
2004528534.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
血漿サンプル中のプロテインＳ活性を測定するための方法であって、以下の工程：
（ａ）試験血漿のサンプルを、ＰＳ欠乏血漿、組織因子（ＴＦ）、リン脂質（ＰＬ）、カルシウムおよび活性化プロテインＣ（ＡＰＣ）と混合し、そして該サンプルの凝固時間を測定する工程；ならびに
（ｂ）既知のプロテインＳ活性の範囲を有する血漿サンプルの凝固時間から得られる標準曲線と（ａ）における測定値とを比較する工程、
を包含する方法。
【請求項２】
血漿サンプル中のプロテインＳ活性を測定するための方法であって、以下の工程：
（ａ）プロテインＳ活性の範囲を有する血漿サンプルを、ＰＳ欠乏血漿、組織因子（ＴＦ）、リン脂質（ＰＬ）および活性化プロテインＣ（ＡＰＣ）と混合し、凝固時間を測定することによって、標準曲線を作成し、プロテインＳ活性に対する凝固時間をプロッティングする工程；
（ｂ）該試験血漿のサンプルを、ＰＳ欠乏血漿、ＴＦ、ＰＬ、カルシウムおよびＡＰＣと混合し、そして該血漿サンプルの凝固時間を測定する工程；ならびに
（ｃ）（ａ）において作成された標準曲線に対して（ｂ）における測定値を比較する工程、
を包含する方法。
【請求項３】
血漿サンプル中のプロテインＳ活性を測定する方法であって、以下の工程：
（ａ）試験血漿のサンプルを、ＰＳ欠乏血漿、組織因子（ＴＦ）、リン脂質（ＰＬ）、カルシウムおよびプロテインＣの活性化因子（ＰＣＡ）と混合し、そして該サンプルの凝固時間を測定する工程；ならびに
（ｂ）（ａ）における測定値を、既知のプロテインＳ活性の範囲を有する血漿サンプルの凝固時間から得られる標準曲線と比較する工程、
を包含する方法。
【請求項４】
血漿サンプル中のプロテインＳ活性を測定する方法であって、以下の工程：
（ａ）プロテインＳ活性の範囲を有する血漿サンプルを、ＰＳ欠乏血漿、組織因子（ＴＦ）、リン脂質（ＰＬ）、カルシウムおよびプロテインＳの活性化因子（ＰＣＡ）と混合し、凝固時間を測定することによって、標準曲線を作成し、プロテインＳ活性に対する、凝固時間をプロッッティングする工程；
（ｂ）該試験血漿のサンプルを、ＰＳ欠乏血漿、ＴＦ、ＰＬおよびＰＣＡと混合し、そして該血漿サンプルの凝固時間を測定する工程；ならびに
（ｃ）（ｂ）における測定値を、（ａ）において作成された標準曲線と比較する工程、を包含する方法
【請求項５】
前記ＴＦが組換え体である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記組換えＴＦがウサギＴＦである、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記ＴＦが、哺乳動物細胞から精製される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記ＰＬが、合成物である請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記ＰＬが、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＰＣ）、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−Ｌ−セリン（ＰＳ）、および１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＰＥ）を含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
ＰＣ：ＰＳ：ＰＥのモル比が、約３：約４：約５である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記活性化プロテインＣが、トロンビンによって本アッセイの前に活性化された、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１２】
前記活性化プロテインＣが、ヘビ毒によって本アッセイの前に活性化された、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１３】
前記活性化プロテインＣが、組換えプロテインＣに由来する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１４】
前記ＰＳ欠乏血漿、ＴＦおよびＡＰＣのうちの１つ以上が、ウシ、ブタおよびウサギからなる群から選択される哺乳動物供給源に由来する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１５】
前記ＰＳ欠乏血漿、ＴＦおよびＡＰＣのうちの１つ以上が、ヒトに由来する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
検量曲線の変動が、２時間の期間に対して３％未満の変動計数（ＣＶ）を有する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
検量曲線のバリエーションが、８時間の期間に対して３％未満の変動計数（ＣＶ）を有する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
検量曲線のバリエーションが、２週間の期間に対して３％未満の変動計数（ＣＶ）を有する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
前記アッセイが、３％未満の実行内変動係数（ＣＶ）を有する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
前記測定工程が、発色性である請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法
【請求項２１】
前記測定工程が、分光光度法である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
既知のプロテインＳ活性を有する正常なコントロール血漿サンプルの凝固時間を測定する工程およびこの凝固時間を工程（ａ）および工程（ｂ）における凝固時間と比較する工程をさらに包含する、請求項１または３に記載の方法。
【請求項２３】
血漿サンプル中のプロテインＳ（ＰＳ）の機能的活性を測定するためのキットであって、該キットが、ＰＳ欠乏血漿、組織因子（ＴＦ）、リン脂質（ＰＬ）、カルシウムおよび／または活性化プロテインＣ（ＡＰＣ）を含む１つ以上の容器を含む、キット。
【請求項２４】
血漿サンプル中のプロテインＳ（ＰＳ）の機能的活性を測定するためのキットであって、該キットが、ＰＳ欠乏血漿、組織因子（ＴＦ）、リン脂質（ＰＬ）、カルシウムおよび／またはプロテインＣ活性化因子（ＰＣＡ）を含む１つ以上の容器を含む、キット。
【請求項２５】
標準曲線を作成するための約１００％のプロテインＳを含む較正血漿をさらに含む、請求項２３または２４に記載のキット。
【請求項２６】
約４０〜５０％の間のプロテインＳを含む正常なコントロール血漿をさらに含む、請求項２３または２４に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、プロテインＳが、外因性組織因子、リン脂質、および活性化プロテインＣの存在下で血漿の凝固時間を延長する能力に基づいた機能的プロテインＳアッセイおよび機能的プロテインＳ方法を提供する。
【０００２】
（発明の背景）
プロテインＳは、約２日間の半減期で約２５μｇ／ｍｌの濃度で血漿中を循環するビタミンＫ依存性抗凝固タンパク質である。正常な血漿において、６０％のプロテインＳは、高い親和性で、１：１の割合で非共有結合的にＣ４ｂ結合タンパク質（Ｃ４ｂ−ＢＰ）に結合する。Ｃ４ｂ−ＢＰに結合したプロテインＳは、不活性である。残りの４０％のプロテインＳは、血漿中に遊離タンパク質として存在し、そして細胞膜表面上で活性化プロテインＣ（ＡＰＣ）に対するコファクターとして作用する生理学的に活性な抗凝固性形態であると考えられる。ＡＰＣは、特定のタンパク質分解性切断を介して凝固促進因子（ｐｒｏｃｏａｇｕｌａｎｔ  ｆａｃｔｏｒ）Ｖ（ＦＶａ）および凝固促進因子ＶＩＩＩ（ＦＶＩＩＩａ）の活性形態を分解し、これによってトロンビンの生成を減少し、そして凝固時間を延長する。プロテインＳは、ＡＰＣに結合し、そしてコファクターとして作用し、そしてＶａ因子およびＶＩＩＩａ因子の切断速度を増加する。プロテインＳはまた、Ｘａ因子およびＶａ因子に結合し、それ故、プロトロンビン活性化を減ずることによってプロトロンビン複合体に対する直接阻害効果を働かせる。
【０００３】
プロテインＳ欠乏症は、遺伝性または後天性であり得る。後天性欠乏症は、妊娠中、経口の抗凝固剤治療、経口避妊薬使用、肝臓疾患、新生児、および他の臨床的な状態において観察され得る。なぜならば、プロテインＳは、ビタミンＫ依存性タンパク質であるので、その濃度は、経口の抗凝固剤を用いる処置の間に減少するからである。２日間の半減期に関しては、プロテインＳレベルの減少速度は、数時間の半減期を有する、プロテインＣおよび因子ＶＩＩよりもはるかに遅い。総プロテインＳについての代表的な正常範囲は、７０〜１４０％である。２５μｇ／ｍｌを平均濃度として考えると、これは、１５〜３５μｇ／ｍｌの範囲に対応する。プロテインＳレベルは、エストロゲンのような性ホルモンによって影響され得る。閉経前の女性は、男性および閉経後の女性よりも低い値を有する。総プロテインＳおよび遊離プロテインＳの有意に低い平均値は、妊娠した女性（２５μｇ／ｍｌ〜１５μｇ／ｍｌ）および経口避妊薬を使用している女性（２５μｇ／ｍｌ〜１８μｇ／ｍｌ）において見出される。後天性プロテインＳ欠乏症および先天性プロテインＳ欠乏症は、血液抗凝固能力の減少に起因して、血栓症（例えば、深部静脈血栓症）の増加した危険性に関連する。遺伝的プロテインＳ欠乏症としては、家族性の栓友病が挙げられる。
【０００４】
最近、プロテインＳ欠乏症を３つの型へ下位分類することは、１９９２年にｔｈｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｎ  Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｈａｅｍｏｓｔａｓｉｓ（ＩＳＴＨ）のＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｓｔａｎｄａｒｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅによって推奨された。Ｉ型は、機能的プロテインＳ活性の減少に伴う、総プロテインＳおよび遊離タンパク質の低いレベルによって特徴づけられる。ＩＩ型は、機能的プロテインＳ活性の減少に伴う、総プロテインＳおよび遊離プロテインＳの正常なレベルによって特徴づけられる。ＩＩＩ型は、機能的プロテインＳ活性の減少に伴う、正常なレベルの総プロテインＳおよび低レベルの遊離プロテインＳによって特徴づけられる。
【０００５】
抗原性（免疫学的）アッセイは、抗体および／または手段に依存して、総プロテインＳまたは遊離プロテインＳのいずれかの濃度を測定する。プロテインＳについての機能的アッセイは、プロテインＳの生物学的活性を測定する。Ｃ４ＢＰに結合したプロテインＳは、抗凝固活性を有していないので、ＡＰＣに対するコファクターとして作用し得る遊離プロテインＳの濃度を知ることが、重要である。遊離プロテインＳは、いくつかの方法において定量的に測定され得、例えば、Ｃ４ＢＰプロテインＳ複合体は、ポリエチレングリコールを用いて沈殿され得、そしてその上清中の遊離プロテインＳの濃度が、測定され得る。あるいは、遊離プロテインＳは、固定化されたＣ４ＢＰ（例えば、マイクロプレートのウェルに結合したＣ４ＢＰ）を用いて遊離プロテインＳを捕獲し、そして抗体を用いて定量することによって直接測定され得る（Ｃｏａｌｉｚａ（登録商標）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓ−Ｆｒｅｅ  Ａｓｓａｙ，Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｘ−Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｃｏｍｐａｎｙ  ＳｐＡ，Ｍｉｌａｎ  Ｉｔａｌｙ）。
【０００６】
プロテインＳ活性は、常に血漿サンプル中のプロテインＳレベルと相関するわけではない。例えば、抗原性の方法を用いて得られた遊離プロテインＳ濃度は、Ｉ型およびＩＩＩ型を有する患者についての機能的活性とはよく相関するが、多数の理由が原因でＩＩ型プロテインＳ欠乏症とは相関しない。第１に、抗原性アッセイは、完全にカルボキシル化（活性）された形態の遊離プロテインＳおよび非カルボキシル化（不活性）形態の遊離プロテインＳの両方を測定する。第２に、機能的プロテインＳアッセイは、血漿中の遊離形態および複合体形態の両方の存在によって複雑化される。従って、抗原性アッセイは、機能的プロテインＳのレベルを過大評価し得る。例えば、ワルファリンを受けている患者由来の血漿の抗原性アッセイは、機能的アッセイを用いて得られる値よりも高い値を与える。それ故、機能的アッセイおよび抗原性アッセイの両方が、プロテインＳ欠乏症についての血栓症の疾患のリスク（すなわち、欠乏プロテインＳレベルおよび／または欠乏プロテインＳ活性）のある患者をスクリーニングするために実行されることが、重要である。
【０００７】
いくつかの機能的プロテインＳ活性アッセイにおいて、ＡＰＣに対するコファクターとしての遊離プロテインＳの効果が、測定される。これらのアッセイは、主に凝固測定性（ｃｏａｇｕｌｏｍｅｔｒｉｃ）であり、そしてＡＰＣによるＦＶａおよびＦＶＩＩＩａの分解の結果としての遊離プロテインＳ活性に起因する凝固時間の延長を測定する。遊離プロテインＳ活性についてのＡＰＣコファクター方法は、伝統的に、以下に記載される、プロトロンビン時間（ＰＴ）、活性化部分的トロンボプラスチン時間（ＡＰＴＴ）、およびＸａ因子ベースの方法を含んでいる。加えて、遊離プロテインＳはまた、Ｖａ因子、Ｘａ因子およびＶＩＩＩ因子への直接結合を介して、ＡＰＣ非依存抗凝固活性を働かせる。プロテインＳのＡＰＣ非依存抗凝固活性のアッセイが、開発されており、ここで、凝固時間は、ポリクローナルプロテインＳ抗体の存在下および非存在下で測定される。
【０００８】
プロテインＳ機能的アッセイは、プロトロンビン時間（ＰＴ）に基づき得る。プロテインＳのコファクター活性は、Ｖａ因子およびＶＩＩＩａ因子のＡＰＣ依存分解について確認される。もともと、精製されたプロテインＳの特徴づけのために方法が、開発され、これに続いて、後に血漿中のプロテインＳを測定するための機能的試験が開発された（Ｗａｌｋｅｒ（１９８４）Ｓｅｍ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈｅｍｏｓｔ．１０：１３１−３８）。プロテインＳ活性は、血漿サンプルをプロテインＳ欠乏血漿と混合すことによって測定される。ＡＰＣの抗凝固活性に対するプロテインＳの刺激効果は、外因性ＡＰＣまたは外因性プロテインＣ活性化因子（ＰＣＡ）の添加および添加なしでの血漿サンプルへのトロンボプラスチン（組織因子）およびカルシウムイオンの添加に続いて、凝固時間を観察することによって測定される。ＰＣＡは、Ａｇｋｉｓｔｒｏｄｏｎ  ｃｏｎｔｏｒｔｒｉｘ由来のヘビ毒から単離され得、これは、商標名Ｐｒｏｔａｃ（登録商標）Ｃ（Ｐｅｎｔａｐｈａｒｍ，Ｂａｓｌｅ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）で知られる。４０〜５０秒の分解能により、０〜１００％の間のプロテインＳを得られる。
【０００９】
あるいは、プロテインＳ機能的アッセイは、外因性ＡＰＣまたは外因性ＰＣＡに起因する活性化部分トロンボプラスチン時間（ＡＰＴＴ）の延長に基づき得る。
【００１０】
標準的なＡＰＴＴ反応は、表面活性剤（例えば、カオリン、シリカ、エラグ酸）および血漿サンプルに対するリン脂質調製物の添加によって開始し、これによって、因子ＸＩの最大限の活性化を達成する。次いで、カルシウムが、凝固カスケードを活性化するために添加され、そして凝固塊形成についての時間が測定される。
【００１１】
ＡＰＣ耐性アッセイ（例えば、ＣＯＡＴＥＳＴおよびＣＯＡＴＥＳＴ  Ｆ）において、２つのＡＰＴＴ反応が実行され、１つはＡＰＣ（またはＰＣＡ）の存在においてそして他方はその非存在下において、実行される。この結果は、凝固時間の延長またはＡＰＣ（またはＰＣＡ）の存在下もしくは非存在下、いずれかでの凝固時間の間の比として計算され得る。ＡＰＣ（またはＰＣＡ）の添加なしでのＡＰＴＴ反応は、正常範囲２５〜４０秒の正常範囲内であるべきである。
【００１２】
しかし、今日まで、公知の全てのアッセイについてのカットオフ値は、研究室、装置、試薬操作および他の予備分析の変数の間で変化する。この理由のために、ＡＰＴＴアッセイおよびＰＴアッセイは、正常なコントロールサンプルが平行して行われることを、典型的に必要とする。このような場合において、患者サンプルの凝固時間および／または凝固時間延長は、正常なコントロールサンプルまたは公知のプロテインＳ含有量のサンプルと比較される。
【００１３】
他のプロテインＳアッセイは、ＦＸａベースの方法を含み、ここで、凝固は、カルシウムイオンおよびリン脂質の存在下で、Ｘａ因子によって誘発される。もともと、希釈されていない血漿が使用された（Ｃｏｍｐ（１９８４）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．７４：２０８２〜２０８８）。これは、後に、血漿中のプロトロンビンレベルによる干渉を最小化する方法によって置換され、試験血漿の希釈を可能にし、そして０から１００％の間のプロテインＳの１００秒に近い分解能を提供する（Ｗｉｅｓｅｌら、（１９９０）Ｔｈｒｏｍｂ．Ｒｅｓ．５８：４６１〜４６８）。この方法の１つの改良型において、試験血漿中の遊離プロテインＳは、始めに不溶化モノクローナルプロテインＳ抗体上に吸収される（Ｄ’Ａｎｇｅｌｏら、（１９８８）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．８１：１４４５〜１４５４）。因子Ｘａはまた、精製された成分を利用して、このシステムにおけるトリガーとして使用されている（Ｄａｈｌｂａｃｋ（１９８６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６１：１２０２２〜１２０２７）。
【００１４】
プロトロンビン時間方法は、米国特許第５，７２６，０２８号に記載される。このアッセイは、Ｔｈｒｏｍｂｏｒｅｌ  Ｓ（登録商標）（ヒト胎盤由来の組織因子／リン脂質調製物）およびプロテインＣ活性化因子を使用する。サンプル中の内因性プロテインＣは、プロテインＣ活性化因子によって活性化され、そしてプロテインＳと活性ＡＰＣ／プロテインＳ複合体を形成する。凝固は、カルシウムイオンの添加によって誘導され、そして生じたＡＰＣ／プロテインＳ複合体は、凝固塊形成を遅延する。
【００１５】
しかし、一般に利用可能なこのアッセイおよび他のアッセイは、組織因子およびリン脂質の粗製抽出物を使用する。加えて、このアッセイにおいてもまた使用される活性化プロテインＣは、粗製プロテインＣ活性化因子（例えば、ヘビ毒活性化因子）を用いてプロテインＣを含む血漿サンプルを活性化することによって、得られる。これらの粗製試薬中に存在する不純物の結果として、伝統的なプロテインＳ機能的アッセイは、乏しい再現性、低い感度および不安定性を欠点としてもつ。
【００１６】
それ故、必要に応じて、患者の結果を正常者からの結果と比較する必要のない、再現性のある、感度が高くかつ安定であり、そして、機能的なプロテインＳアッセイが必要である。
【００１７】
（発明の要旨）
本発明は、一般的に、新しい機能的プロテインＳアッセイ、および内因性プロテインＳが外因性ＰＣＡまたはＡＰＣへ応答して凝固時間を延長させる能力に基づくキットに関連する。アッセイ手段において、試験血漿サンプルは、プロテインＳ欠乏正常血漿で希釈され、続いて、精製された組織因子または組換え組織因子（ｐＴＦまたはｒＴＦ）、精製された天然のリン脂質または合成のリン脂質（ｐＰＬまたはｓＰＬ）を添加され、そして精製プロテインＣまたは組換えプロテインＣ（ｐＡＰＣまたはｒＡＰＣ）あるいは精製プロテインＣ活性化因子または組換えプロテインＣ（ｐＰＣＡまたはｒＰＣＡ）および適切な塩を用いてか、または用いないで活性化される。次いで、外因性ＰＣＡまたはＡＰＣに起因する凝固時間の延長が、測定され、そしてこれは、試験サンプル中のプロテインＳ活性を示す。患者のサンプルについて得られた凝固時間の延長は、正常な血漿凝固の標準曲線と比較され得る。不十分な凝固時間の延長は、プロテインＳ欠乏症を示す。
【００１８】
ＴＦは組換え体（例えば、ウサギまたはヒト）であっても精製されたもの（例えば、ウサギ脳またはヒト胎盤由来）であってもよい。このＴＦは、好ましくはｒＴＦである。好ましくは、ＴＦは、プロテインＳアッセイ試薬に添加する前にＰＬで再脂質化される。
【００１９】
ＰＬは合成であっても、精製されたもの（例えば、植物源由来、または動物源の移植物由来）であってもよい。ＰＬは、好ましくはｓＰＬである。好ましい実施形態において、ＰＬは、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＰＣ）、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−Ｌ−セリン（ＰＳ）、および１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＰＥ）を含む。ＰＣ：ＰＳ：ＰＥは、好ましくは約３：約４：約５のモル比である。
【００２０】
ＡＰＣは、好ましくはｒＡＰＣである。外因性ＡＰＣが使用される場合、これは、好ましくは、適切な酵素を用いたタンパク質分解による外因性プロテインＣの活性によって誘導される。好ましい酵素は、プロテインＣを別にして、凝固系において任意の他の因子を活性せず、さもなくば影響しない酵素である。特に好ましいものは、トロンビンである。ヘビ（例えば、Ａｇｋｉｓｔｒｏｄｏｎ  ｃｏｎｔｏｒｔｒｉｘ  ｃｏｎｔｏｒｔｒｉｘ、Ａｇｋｉｓｔｒｏｄｏｎ  ｂｉｌｉｎｅａｔｕｓ、またはＡｇｋｉｓｔｒｏｒｏｎ  ｈａｌｙｓ  ｈａｌｙｓ）の毒由来のプロテインＣ活性化因子もまた、好ましい。
【００２１】
凝固時間が、色素形成として観察される実施形態において、例えば、ＰＳ−コファクター活性によって影響される凝固カスケードの成分のための色素形成基質が、色素形成の測定を容易にするためにトロンビンに添加され得る。
【００２２】
ＰＳ欠乏血漿、ＴＦ、およびＡＰＣは、好ましくは哺乳動物源（例えば、ウシ、ブタ、ウサギ、またはヒト）に由来する。ＰＬは、好ましくは、植物源または動物源に由来し、そして市販されている。
【００２３】
別の局面において、本発明は、ＰＳ欠乏血漿を含む容器ならびにｐＴＦまたはｒＴＦ；およびｐＰＬまたはｓＰＬ；およびＡＰＣまたはＰＣＡを含む１つ以上の容器をを有する、ＰＳの機能的活性を測定するためのキットを提供する。このキットはまた、標準曲線を調製するための較正血漿または既知のプロテインＳ活性を有するコントロールの血漿サンプルを含む。
【００２４】
（好ましい実施形態の説明）
本発明は、ＰＴベースのアッセイにおいて、外因性ＡＰＣまたはＰＣＡに応じて、内因性タンパク質Ｓの、凝固時間を延長する能力を基にする、敏感な機能性タンパク質Ｓ（ＰＳ）アッセイを提供する。従って、ＴＦ、ＰＬ、カルシウム、およびＰＣＡまたはＡＰＣを、患者サンプルのアリコートに加え、凝固時間を観測する。この凝固時間を、既知のタンパク質Ｓ活性を有する血漿サンプルの凝固時間の標準曲線と比較する。精製されたＰＬまたは合成ＰＬ、精製されたＴＦまたは組換えＴＦ、および精製された活性化ＡＰＣの使用によって、試薬の感度、再現性および特異性の最適化が考慮に入れられる。
【００２５】
従来の機能性タンパク質Ｓアッセイは、脳粉末抽出物由来のＴＦならびに植物および動物供給源由来の粗ＰＬの使用を含む（米国特許第５，７２６，０２８号）。しかし、内因性タンパク質Ｓは、これら試薬を使用する場合、凝固時間を有意に延長し得ず、これら試薬は、タンパク質Ｓレベルにしばしば鈍感である。本発明において、アッセイ試薬は、タンパク質Ｓ活性の測定に対して特異的に感受性であり、従って、以下において、ひとまとめにして、タンパク質Ｓ（ＰＳ）試薬とよぶ。
【００２６】
好ましいＰＳ試薬の内容物および試薬の濃度範囲を、表１に示す。このＰＳ試薬は、精製された活性化タンパク質Ｃもしくは組換え活性化タンパク質Ｃ（ｐＡＰＣもしくはｒＡＰＣ）、精製されたＰＬ（ｐＰＬ）もしくは合成ＰＬ（ｓＰＬ）および精製されたＴＦ（ｐＴＦ）または組換えＴＦ（ｒＴＦ）を含み、活性および感受性におけるロットごとの変動を避ける。好ましい実施形態において、アッセイは、精製されたＡＰＣ、ｒＴＦおよびｓＰＬを含む。ｓＰＬおよび組換えＴＦの使用によって、供給源（例えば、脳粉末）由来の汚染を回避し、より容易で、そしてより制御可能な製造プロセスを提供する。開示されたアッセイによって必要とされる、ＰＳ試薬中のＴＦの量およびＰＬの量は、従来のＰＴアッセイに対して必要とされる量よりも少ない。
【００２７】
ＡＰＣは、ヘビ毒活性化剤（例えば、Ｐｒｏｔａｃ（登録商標））を用いて内因性または外因性血漿タンパク質Ｃを活性化することにより生成され得るが、それは時間がかかり、そしてまた不十分なまたは変動するＡＰＣ活性化（例えば、ロットごとに）を生じ得る。あるいは、外因性タンパク質Ｃが、実施例４に記載されるように、トロンビンを使用して活性化し得る。
【００２８】
好ましくは、本発明のＰＳ試薬は、精製されたＡＰＶを含み、外部の活性化プロセスを排除し、アッセイを簡易化する。精製されたＡＰＣ（ｐＡＰＣ）の使用によって、ＡＰＣレベルが、アッセイごとに一定であることを保証する。適切なｐＡＰＣは、例えば、ヒト、ウシ、ブタ、ウマおよびウサギのような、任意の哺乳動物の供給源から精製され得る。
【００２９】
あるいは、タンパク質Ｃ活性化剤（ＰＣＡ）は、アッセイに使用され、内因性タンパク質Ｃを活性化する。ＰＣＡの濃度は、血漿中の凝固時間の適切な延長が、外因性ＰＣＡによって生じるように選択される。凝固時間の適切な延長（ＰＣＡ非存在下における凝固時間と比較する場合）は、使用される器具の型に基づいて、通常の血漿からの有意な差異を検出可能にする時間である。好ましくは、延長時間は、少なくとも約２５％、５０％、または７５％、特に好ましくは、少なくとも約１００％または約２００％である。
【００３０】
組織因子（ＴＦ；トロンボプラスチンとも呼ばれる）は、ＰＴベースのアッセイにおいて、血液凝固を引き起こす原因となるタンパク質である。その組織因子は、最適な活性のためにリン脂質小胞中に組み込まれなければならない膜貫通タンパク質である。組換えＴＦ（ｒＴＦ）は、例えば、ヒト、ウシ、ブタ、ウマのような、哺乳動物供給源から得られ得る。好ましいＴＦは、米国特許第５，８５８，７２４号または同第６，１００，０７２号（その内容は、参考として本明細書中に援用される）に記載されるような、組換えウサギＴＦである。例えば、組換えＴＦは、インビトロでの転写および翻訳によって得られ得る。あるいは、天然の精製されたＴＦが使用され得る。ＴＦは、実施例２で提供される方法に従って精製され得る。好ましい実施形態において、ＰＳ試薬は、ｓＰＬで再脂質化されたｒＴＦを用いて調製される。
【００３１】
合成リン脂質（ｓＰＬ）は、例えば、標準的な方法を使用した有機合成によって、調製し得る。本発明のｓＰＬは、好ましくは以下の３つの脂質の混合物である：１，２−ジオレイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＰＣ）、１，２−ジオレイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−Ｌ−セリン（ＰＳ）、および１，２−ジオレイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＰＥ）。好ましい実施形態において、ＰＣ：ＰＳ：ＰＥのモル比は。約３：約４：約５である。
【００３２】
タンパク質Ｓアッセイの前のＴＦの再脂質化のために使用されるｓＰＬは、押出し法によって調製された。この方法においては、ＰＬを、２つの異なる膜（孔のサイズ、０．４５μｍおよび０．１μｍ）に強制的に通し、または膜を通して、押出し、そして、脂質小胞またはミセルを形成するために、連続的および反復的に０．１μｍ膜に強制的に通す。あるいは、ＰＬを、界面活性剤可溶化プロセスによって処理し得、ここでＰＬが界面活性剤中に溶解されて、ゆるい脂質小胞またはミセルを形成する。次いで、精製されたＴＦまたは組換えＴＦを加え、小胞の中に組み込ませる。次いで、その界面活性剤を除去し、それによって小胞は、収縮または縮み、ＴＦは、ＰＬ分子間にインターカレートされる。それによって、ＴＦは、小胞の外部に露出される。
【００３３】
本発明のタンパク質Ｓアッセイは、試験血漿、ＰＳ欠損血漿、因子希釈液ならびにＴＦ、ＰＬおよびＡＰＣまたはＰＬＡを含むＰＳアッセイ試薬を共に混合することを含む（例えば、実施例５を参照のこと）。潜在的な分析介入は、ＰＳ欠損血漿および因子希釈液で約２０倍に試験サンプルを希釈することによって最小にし、そのアッセイがタンパク質Ｓに対して特異的であるようにする。アッセイの結果は、５％〜１５０％のタンパク質Ｓ活性の範囲にわたって、直線的である。較正曲線の変動は小さく、２週間の期間にわたって、３％未満の変動係数（ＣＶ）である。このアッセイは再現性があり、正常なサンプルについては、１回のアッセイ内のＣＶは３％未満であり、アッセイ間のＣＶは５％未満であり、異常なサンプルについては（３０％ＰＳ未満）、１回のアッセイ内のＣＶは５％未満であり、アッセイ間のＣＶは８％未満である（図１）。
【００３４】
アッセイの特異性は、正常サンプルまたは患者サンプルにおける機能性ＰＳと遊離の抗原性ＰＳとの間のよい相関によって、実証された（傾き＝０．９７１、切片＝−０．１０７、およびｒ＝０．９３２）（図２）。遊離のＰＳの濃度を決定するための抗原性アッセイを、標準的な方法に従って実行した（例えば、Ｃｏａｌｉｚａ）。機能性および抗原性タンパク質Ｓアッセイによって、ＡＰＣ耐性サンプルにおける同等のタンパク質Ｓ回収を得た。これは、ＡＰＣ耐性が、機能的アッセイに干渉しないことを示す。
【００３５】
凝固時間の延長は、種々の方法で測定され得る（例えば、光度測定によるまたは発色測定による）。凝固を発色にて測定する場合、タンパク質Ｓ活性によって影響される凝固カスケードの成分に対する基質を、アッセイに加え得る。例示的な発色基質は、トロンビンに対する基質である（例えば、Ｈ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｐｉｐ−Ａｒｇ−ｐＮＡ−２ＨＣｌ；ＭＷ  ６２５．６；Ｓ−２２３８、Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｘ）。
【００３６】
高い感度、高い特異性、高い再現性および高い単純性は、このアッセイを、当該分野で公知の（例えば、先天的なタンパク質Ｓ欠損または獲得されたタンパク質Ｓ欠損に対するスクリーニングのための）方法に従う凝集分析器（例えば、ＩＬ  ＣｏａｇｕｌａｔｉｏｎまたはＥＬＥＣＴＲＡ  Ｓｙｓｔｅｍ、Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）の自動化にとって適切にする。さらに、このアッセイは、較正曲線を使用して、タンパク質Ｓ活性を決定することを可能にする。
【００３７】
（実施例）
（実施例１：押出しによるリン脂質の調製）
ＰＬミセルを押出しによって調製した。この方法では、まずＰＬを緩衝化生理食塩水に懸濁し、大きな多重層の小胞を得る。次いで、小胞溶液（例えば、０．５〜１．０ｍｌ）を０．４５μｍポリカーボネート膜に通し、そして０．１μｍポリカーボネート膜に６回繰り返して通す。結果は、一様の同じ大きさの単層小胞で、直径約１００ｎｍである。押出しプロセスを、例えば、ＬｉｐｏｓｏＦａｓｔ−１００  Ｅｘｔｒｕｄｅｒ（Ａｖｅｓｔｉｎ，Ｉｎｃ．，Ｏｔｔａｗａ，Ｃａｎａｄａ）を使用して、行う。ＬｉｐｏｓｏＦａｓｔ−１００は、６００ＰＳＩまでの圧縮気体（例えば、窒素）を使用して、サンプルシリンダーに圧力をかけ、出発材料を強制的に膜に通す、中型の圧力押出し器である。次いで、押出されたＰＬをＴＦに加え、これは、脂質小胞の外側に付着する。
【００３８】
押出しを、標準的な方法に従って、または製造業者の推奨（例えば、以下に示すように、ｈｔｔｐ：／／ｔｆ７．ｏｒｇ／ｍｅｔｈｏｄｓ．ｈｔｍｌ−Ｊａｍｅｓ  Ｈ．Ｍｏｒｒｉｓｓｅｙ，Ｄｅｐｔ．ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｉｌｌｉｎｏｉｓ  ａｔ  Ｕｒｂａｎａ−Ｃｈａｍｐａｉｇｎ，Ｕｒｂａｎａ，ＩＬ  ６１８０１，ＵＳＡ）に従って、実行し得る：
１．ガラス試験管中に、２．６μＭの全リン脂質（ＰＬ）を分配する。
２．換気フードを使用して、窒素またはアルゴンの穏やかな流れの下で、ＰＬ混合物を乾燥する。乾燥した場合、高真空下でさらに６０分間、Ｓｐｅｅｄ−ｖａｃを行い、すべての残存クロロホルムを除去する。
３．乾燥したＰＬに２．６ｍｌの室温ＨＢＳ溶液を加え、パラフィルムで、試験管の端を覆う。室温で、１時間静置する。
４．試験管を活発にボルテックスし、ＰＬを完全に再懸濁する。結果は、乳状の一様な懸濁物であるはずである。あなたは、懸濁物を複数回（１０回程）凍結および融解させることによって再懸濁のプロセスを補助し得る。
５．０．５ｍｌの脂質懸濁物をＬｉｏｐｏｓｏｆａｓｔ  ｍａｃｈｉｎｅの２本のガラスシリンジ（０．４５μｍのフィルターを含む）のうち１本に充填し、そして、デバイスの片側のＬｕｅｒロックにそのシリンジを接着する。もう一つの（空の）シリンジを閉じ、デバイスの反対側のＬｕｅｒロックにそのシリンジを接着する。
７．充填されたシリンジを押し、その全内容物をフィルターに通し、そして、反対のシリンジに入れる。０．４５μｍを０．１μｍに変える。少なくとも全体で７回分、２本のシリンジを使用して、このプロセスを、交互に繰り返す。あなたが奇数回数のプロセスを常に使用することが不可欠であり、それによって、最終生成物は、最初に空のシリンジであったシリンジにある。これは、出発となる多層小胞が、最終生成物を汚染しないことを保証する。
８．最終生成物を除去し、全ての懸濁物が加工されるまで、残存する未加工のリン脂質懸濁物についてプロセス６および７を繰り返す。
９．最終生成物を４℃で保存する。結果は、ＨＢＳ中に全体で１ｍＭのリン脂質を含む、単層小胞（直径約１００ｎｍ）の一様な懸濁物である。
【００３９】
（実施例２：細胞溶解物からのＴＦの精製）
組織因子（ＴＦ）を、以下の方法を使用して、細胞溶解物から精製する。ＴＦを産生する細胞を、ＴＢＳで洗浄し、０．２５％  Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００、１０μｇ／ｍｌ大豆トリプシンインヒビター、および１ｍＭ  ＥＤＴＡを含むＴＢＳ中に、２×１０７／ｍｌに再懸濁する。４℃で３０分間のインキュベーションの後、細胞破片を、約５０００×ｇ、４℃で２０分間の遠心分離によって、除去する。浄化溶解物をＴＢＳで２．５倍に希釈してＴｒｉｔｏｎ濃度を０．１％に減少させ、そしてこれを、ＴＦに指向される共有結合モノクローナル抗体を含む免疫アフィニティー樹脂に通す。その樹脂ベッドを、２〜３ベッド容量のＴＢＳおよび０．１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００、２〜３容量の２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００、ならびに、最後に２〜３ベッド容量の０．５Ｍ  ＮａＣｌ、０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００で洗浄する。結合タンパクを、０．１Ｍ  グリシン、ｐＨ２．５、０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００で樹脂から溶出する。緩衝液をグリシンに交換した後に回収された画分を、適当な容積の１Ｍ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ８を用いて直ちに中和した。カラム溶出液のｐＨが変化する点のすぐ周りの画分に、ＴＦを、見出す。ＴＦを含む画分を、プールし、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ８、０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００に対して透析し、およびＴＦの小ベッド容量のＤＥＡＥ  Ｔｒｉｓａｃｒｙｌカラム（ＩＢＦ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｃｏｌｕｍｂｉａ，Ｍｄ）への結合によって濃縮する。そのＴｒｉｔｏｎ−Ｘ１００を、１０ｍＭ  ＣＨＡＰＳを含む少なくとも１０ベッド容量の２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ８で樹脂ベッドを洗浄することによって、ＣＨＡＰＳ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ．）に交換する。そのＴＦを、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ８、１０ｍＭ  ＣＨＡＰＳ中の０．５Ｍ  ＮａＣｌの単一プロセスで、溶出する。
【００４０】
（実施例３：組織因子の再脂質化）
好ましい再脂質化のプロセスは、以下の通りである：６６ｇのｓＰＬを、緩衝液中の４．４ｍｌの１００ｍＭ  ＣＨＡＰＳを用いて、再構成する。そのｓＰＬを、完全に溶解するまで、３０〜３７℃で混合した。ＰＬを、ジャケット付きのＰＶＤＦコートされた容器へ移し、そして、脂質容器を、２倍容積（４００ｍｌ）の緩衝液でリンスした。１００ｍｌの２０ｍＭ  ＣＨＡＰＳ／ＢＧＧを、ＰＶＤＦコートされた容器に加え、過剰の泡形成を避けながら、２００〜４００ＲＰＭで５〜１０分間混合した。組換えＴＦを速やかに融解し、ＰＬに加えた。残存する緩衝液を、ＴＦ／ＰＬ混合物に加えた。ＴＦ／ＰＬ混合物を、２００〜４００ＲＰＭでオーバーヘッドミキサーを使用して、２７〜３３℃で５５〜６５分間インキュベーションした。ＸＡＤ−６樹脂を、緩衝液で洗浄し、６アリコートに等分した。１つの樹脂アリコートを、真空濾過し、ＴＦ／ＰＬ混合物へ加えた。ＴＦ／ＰＬ混合物を、２７〜３３℃で２時間（＋／−１５分）、２００〜４００ＲＰＭでオーバーヘッドミキサーを使用して混合しながら、インキュベーションした。さらなる樹脂のアリコートを、ＴＦ／ＰＬ混合物に加えた。４つめのアリコートの添加後、ＴＦ／ＰＬ混合物は、２７〜３３℃で一晩、混合しているままにされた。３日目に樹脂の残存アリコートを加え、ＴＦ／ＰＬ混合物を、一連の２５０μＭ  ＮＹＴＥＸ  Ｍｅｓｈ、２〜１０および０．２２μＭフィルターを通してフィルター濾過し、１５分間混合した。４Ｌの希釈緩衝液を１Ｌの未希釈ＴＦ／ＰＬ混合物に加え、１５分間混合した。
【００４１】
（実施例３：界面活性剤を使用した組織因子再脂質化）
ＰＬ小胞にＴＦを組み込むためのこの技術は、透析可能な非イオン性界面活性剤ｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコピラノシド（オクチルグルコシド）（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ  Ｃｏｒｐ．，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を使用する（ｈｔｔｐ：／／ｔｆ７．ｏｒｇ／ｍｅｔｈｏｄｓ．ｈｔｍｌ；Ｎｅｕｅｎｓｃｈｗａｎｄｅｒら（１９９３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：２１４８９−２１４９２）（米国特許第６，２０３，８１６号（その内容は、本明細書中に参考として援用される）もまた参照のこと）。
【００４２】
この方法において、ＰＬおよびＴＦは、ともにオクチルグルコシドに溶解し、混合したミセルを形成する。オクチルグルコシドは高い臨界ミセル濃度（ＣＭＣ＝２０〜２５ｍＭ）を有するので、透析により溶液から容易に除去され得る。オクチルグルコシドが透析されるにつれて、リン脂質は、ユニラメラ小胞へと構成される。ＴＦは、その単一の膜貫通ドメインが原因でこれらの小胞中に埋まるので、タンパク質のＣ末端近くに位置する。代表的には、約５０〜８０％のＴＦ分子がこれらの小胞において外側に面する。残りのＴＦ分子は、内側に面し、従って、第ＶＩＩ／ＶＩＩａ因子と相互作用することができない（Ｎｅｕｅｎｓｃｈｗａｎｄｅｒら（１９９３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：２１４８９−２１４９２）。界面活性剤が夾雑していない、再脂質化ＴＦを得るために、Ｔｒｉｔｏｎではなく、ＣＨＡＰＳまたはオクチルグルコシドのような透析可能な界面活性剤を含むＴＦストック溶液を使用することが好ましい。水溶液中のＰＬは、酸素化に供される。この理由のために、一旦ＴＦが再脂質化されると、代表的には、これらは、約２週間または３週間以内に使用されなければならない（いくつかの適用については、より古いＴＦ調製物が良好な結果のためになお使用され得る。しかし、このような適用は、酸素化したリン脂質を含み得ることに注意のこと）。
【００４３】
大部分の適用については、ＴＦ活性は、小胞が２０  ｍｏｌ％以下のホスファチジルセリンを含む場合に最大であり、従って、通常は、このレベルを超える理由はない。可溶性組織因子（ｓＴＦ）はリン脂質に組み込むことができないことに注意のこと；リン脂質において、使用されるのであれば、膜貫通ドメインは、インタクトである。ブランクの小胞は、単に、プロトコルにおいてＴＦを省くことにより作製され得る。
【００４４】
（オクチルグルコシド中のリン脂質溶液の調製）
１．各サンプルに対して、所望の極性比のＰＬ（例えば、３０％  ＰＣ、４０％  ＰＳ、５０％  ＰＥ）（Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄ，Ａｌａｂａｓｔｅｒ，Ａｌａｂａｍａ）を使用して、２．６μＭの総ＰＬをガラス製試験管中に分配する。
【００４５】
２．アルゴンまたは窒素の穏やかな流れの下でＰＬ混合物を乾燥させる。可能であれば、試験管を、ＰＬが試験管の側面に薄膜を形成するような角度に設定する。
【００４６】
３．試験管が乾いたら、確実に残りのクロロフォルムが除去されるように、高真空下でさらに６０分間ｓｐｅｅｄ−ｖａｃに供する。
【００４７】
４．乾燥して下に落ちたＰＬの試験管に、４００μｌの新たに調製したＯＧ／ＨＢＳ溶液（ＨＢＳ（１００ｍＭ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ／ＮａＯＨ緩衝液、ｐＨ７．５、０．０２％（ｗ／ｖ）アジ化ナトリウム（ＲＴ））中の１００ｍＭ  ｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコピラノシド）を添加する。乾燥して下に落ちたＰＬを完全に溶解させるために、激しくボルテックスで攪拌する。
【００４８】
（再脂質化手順）
５．４００μｌのＰＬ／オクチルグルコシド溶液を含む試験管に、所望の量の膜ＴＦ（好ましくは、ＣＨＡＰＳまたはオクチルグルコシド中に溶解させる）および十分量のＨＢＳＡ（０．１％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミンを含有するＨＢＳ）を添加して、最終容量を１ｍｌにする。ＰＬ対ＴＦの代表的なモル比は、８７００：１であり、５０，０００：１程度の高さおよび３，０００：１程度の低さが使用され得る。最終容量は、１ｍｌである。
【００４９】
６．十分に混合し、室温（ＲＴ）にて３０分間サンプルをインキュベートする。
【００５０】
７．サンプルを室温にて、３回ＨＢＳを交換して透析する（各２４時間、計７２時間）。最終生成物を４℃にて保存する。
【００５１】
最終生成物は、約２．６ｍＭリン脂質を含む、約１ｍｌの再脂質化ＴＦである。透析からの回収率は１００％でなくてもよいので、これらの量はおおよそであるに過ぎない。利用可能なＴＦおよび総ＰＬの正確な濃度は、曝されたＴＦの分析（ＶＩＩａアミド分解活性（ａｍｉｎｏｄｏｌｙｔｉｃ  ａｃｉｔｉｖｉｔｙ）のＴＦ誘導性増加を測定することにより、第ＶＩＩａ因子を用いて力価測定する）およびＰＬ含有量の分析を行うこと（Ｎｅｕｅｎｓｃｈｗａｎｄｅｒら）により決定され得る。
【００５２】
（実施例４：活性化プロテインＣの調製）
好ましい実施形態において、ＡＰＣは、標準的な方法に従うプロテインＣのトロンビンを用いた活性化により誘導される。例えば、ヒト胎盤由来の凍結プロテインＣ画分（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ＵｐＪｏｈｎ）を濾過し、ＨＰＣ−４モノクローナル抗体（ヒトプロテインＣに特異的）（Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｃｏｍｐａｎｙ）が結合したＡｆｆｉｇｅｌカラムを用いてアフィニティー精製する。このアフィニティー精製したＰＣを、Ａｆｆｉｇｅｌ  ＨＰＣ−４カラムから溶出し、再び限外濾過する。ＳＰ  Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｃ−５０精製したトロンビンを、精製ＰＣに添加して、ＰＣを活性化する（ＡＰＣ）。このＡＰＣをＳＰ−Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｃ−５０に通し、トロンビンを除去する。ＣａＣｌ２およびＢＳＡを、精製ＡＰＣを含有する溶出物に添加する。
【００５３】
（実施例５：プロテインＳアッセイ）
ヒト血漿サンプルを、標準曲線と比較して、プロテインＳ活性について試験した。このアッセイを、以下のように行った：９部の新たに採血した静脈血を、１部のクエン酸三ナトリウム中に集め、赤血球を標準的な方法により除去した。４μｌの血漿サンプルを、２５μｌのＰＳ除去血漿（プロテインＳを人為的に除去した１．０ｍｌのヒト血漿）と混合し、凍結乾燥し、１．０ｍｌ  Ｈ２Ｏ、５１μｌの因子希釈物（０．８５％  塩化ナトリウム、０．１％  アジ化ナトリウムおよび８０μｌのＰＳアッセイ試薬（１５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（酸を含まない）、１８ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ナトリウム、５ｇ／ｌ  ウシ血清アルブミン、１４０ｍＭ  塩化ナトリウム、１０ｍＭ  塩化カルシウム、０．００６７％  ナトリウムｏｍａｄｉｎｅ、５０μＭ  シプロフロキサシン、０．０６６７％ポリブレン、３００ｎｇ／ｌ  組換えウサギ組織因子、１２．５μＭ合成リン脂質（ＰＣ／ＰＳ／ＰＥ  ３：４：５、例えば、９．６６μＭ  ＰＣ、１２．９μＭ  ＰＳ、１６．１μＭ  ＰＥ）、４ｍｇ／１  活性化ヒトプロテインＣ；ｐＨ７．５）に再懸濁し、凝固測定機器または分光光度計を用いて、凝固時間を測定した。
【００５４】
多くの任意の凝固測定機器を使用して、試験を実施し得、凝固時間を測定し得る（例えば、ＡＣＬ、ＡＣＬ  Ｆｕｔｕｒａ、またはＥＬＥＣＴＲＡ；Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｌｅｘｉｎｇｔｏｎ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）。使用される機械の型に依存して、較正曲線を作成し得、別の較正曲線が精製されなければならない前に多くのサンプルを測定するために使用し得る。この測定機器は、プログラムされて、較正血漿（凝固因子レベルが既知であり、約１００％のプロテインＳを含む血漿）およびプロテインＳ除去血漿（約０％のプロテインＳを含む）の種々の混合物から較正曲線を作成し得る。２つの溶液は、曲線の２つのエンドポイントとして作用し、曲線上の中間点が２つの血漿の異なる相対量を混合し、その凝固時間を測定することにより作成される。例えば、プロテインＳ除去血漿を用いた較正血漿の段階希釈により、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％または約９０％のプロテインＳ活性を有する血漿サンプルが生成され得る。一旦較正曲線サンプルが測定されると、凝固時間  対  プロテインＳ濃度がグラフにされる。次いで、試験サンプルの凝固時間を測定し、曲線に対して読み取って、プロテインＳの活性を得る。定性的コントロールサンプルとして、予め決定されたプロテインＳ活性を有するプロテインＳコントロール血漿は、確実にアッセイが正確に行われるように、サンプルの隣で一緒に測定される。
【００５５】
データ分析を、器具類の仕様書に従って行う。例えば、ＡＣＬ機器、ＡＣＬ  Ｆｕｔｕｒａ機器またはＥＬＥＣＴＲＡ機器を使用して、活性の％として機器により自動的に結果を報告させる。各実験機関は、そこで独自の正常範囲を確立しなければならない。ＡＣＬ  Ｆｕｔｕｒａ機器またはＥＬＥＣＴＲＡ機器に関しては、一旦較正実行が完了し、標準曲線が作成されると、この機器は、将来の患者の実行のためにこの較正を保存する。
【００５６】
ＰＳ試薬成分の最適濃度および適切な濃度範囲は、表Ｉに示される。実測値に対する第Ｖ因子のライデン変異（Ｌｅｉｄｅｎ  ｍｕｔａｔｉｏｎ）（ＡＰＣ−Ｒ）のあり得る影響を避けるために、正常範囲外の結果を有する患者サンプルは、プロテインＳ除去血漿を用いて、手動で１：２希釈され、再アッセイされるべきである。次いで、結果が２倍される。
【００５７】
【表Ｉ】
2004528534.tif 000003
例示的な較正曲線または標準曲線を、図１に示す。患者の血漿サンプルを試験し、機能的プロテインＳレベルを、患者サンプルの凝固時間と、曲線上の値とを比較することにより、較正曲線から読み取った。凝固時間の長期化は、試験サンプル中のプロテインＳ活性に比例した。
【００５８】
３つの凝固測定機器の性能比較を表ＩＩに示す。この実験において、通常のコントロール血漿を、プロテインＳコントロール血漿に対して実行し、プロテインＳの％を実行内および実行間の両方に対して決定する。ＡＣＬシステムと、ＡＣＬ  Ｆｕｔｕｒａシステムと、ＥＬＥＣＴＲＡシステムとの間の相関は、それぞれ、１．０１、１．０２および１．０３の傾きを示した。３つの機械全てが、１０％と１５０％との間で、ＰＳ活性についての線形性を達成した。これらの結果は、このアッセイの正確性および再現性を実証する。
【００５９】
【表ＩＩ】
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表ＩＩＩは、種々の疾患を有する患者由来の血漿サンプルに対する、本発明の方法と、免疫グロブリンアッセイとの比較を示す。列２は、ＡＣＬ３０００機器で行われた本発明のプロテインＳアッセイを示す。列３は、Ｆｕｔｕｒａ機器で行われた本発明の簡便プロテインＳアッセイを示す。列４は、ＡＣＬ３０００機器で行われたプロテインＳアッセイ（ウシＴＦを利用する）を示す。列５は、ＩＬ  ＴｅｓｔＴＭ  Ｆｒｅｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓキット（Ｌａｔｅｘ−ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ）を用いた結果を示す。列６は、Ｃｏａｌｉｚａ（登録商標）試験キットを用いた結果を示す。列７は、列３マイナス列２において得られた値の間の差異を示す。列８は、列５マイナス列２において得られた値の差異を示す。列１０は、列６マイナス列２について得られた値の間の差異を示す。列１１は、列６マイナス列５における値の差異を示す。
【００６０】
【表ＩＩＩ】
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（等価物）
本発明は、本発明の趣旨および本質的特徴から逸脱することなく、他の特定の形態で具体化され得る。従って、前述の実施形態は、本明細書中に記載の発明を限定するのではなく、全ての局面で例示であるとみなされるべきである。
【図面の簡単な説明】
付随の図面と一緒に読む場合、前述の目的および他の目的、本発明の特徴および利点、ならびに発明それ自体が、以下の好ましい実施形態の説明からより完全に理解される。ここで：
【図１】
図１は、例示的な検量曲線を示す。
【図２】
図２は、機能的アッセイを用いて得られたＰＴ測定値と抗原性アッセイを用いて得られたＰＴ測定値との間の比較を示す。
【図１】
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【図２】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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