(57)【要約】ウシカゼインの酵素加水分解物から上記カゼインの一次配列において明確に同定することができる配列を有するデカペプチドを単離した。合成化学によっても調製されるこのデカペプチドは、濃度依存様式で昆虫細胞系ＩＰＬＢ−Ｓｆ−２１の成長に影響を与える。上記デカペプチドおよびカゼイン配列中に２倍存在するトリペプチドは、デカペプチドよりもさらに明白に作用し、同様に作用は濃度依存性である。したがって、これらのペプチドを化学的に定義された無血清細胞培地の添加物として有利に使用することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）アミノ酸配列ＨＱＰＨＱＰＬＰＰＴのペプチド、
ｂ）  ａ）に記載の配列中の１つまたは複数のアミノ酸残基がアミノ酸残基に置換されたペプチド、
ｃ）  ａ）またはｂ）に記載の配列中の１つまたは複数のアミノ酸残基が化学修飾されているペプチド、
ｄ）  ａ）、ｂ）、またはｃ）に記載の配列中の１つまたは複数のアミノ酸残基が欠失または挿入されているペプチド、
ｅ）  成長促進作用を損ねるさらなるアミノ酸残基を含まないか、またはこれらが容易に切断される、ａ）、ｂ）、またはｄ）に記載のペプチドを含む融合タンパク質
から選択される、真核細胞培養物の成長を促進する作用を有するペプチド。
【請求項２】
ｂ）に記載のペプチドの場合、相同性は、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、又は９５％である請求項１記載のペプチド。
【請求項３】
ｄ）に記載のペプチドの場合、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、又は７つのアミノ酸残基が欠失している請求項１記載のペプチド。
【請求項４】
ペプチドＨＱＰである請求項３記載のペプチド。
【請求項５】
ｃ）に記載のペプチドにおいて、Ｎ末端の前記アミノ酸残基は、アシル基を有する請求項１記載のペプチド。
【請求項６】
前記ペプチドにおいて、Ｎ末端の前記アミノ酸残基は、アシル基を有する、請求項４記載のペプチド。
【請求項７】
前記アシル基は、アセチル基である請求項５または請求項６記載のペプチド。
【請求項８】
天然のカゼイン供給源から単離されたか、化学合成されたか、または遺伝子操作によって調製された請求項１〜７のいずれか１項記載のペプチド。
【請求項９】
請求項１のｅ）に記載の融合タンパク質をコードするＤＮＡ配列。
【請求項１０】
請求項９記載のＤＮＡ配列を含む組換え発現ベクター。
【請求項１１】
請求項９記載のＤＮＡ配列または請求項１０記載の発現ベクターで形質転換またはトランスフェクトされている原核細胞または真核細胞。
【請求項１２】
請求項１１記載の細胞を適切な培地で成長させ、前記融合タンパク質を前記細胞または培地から獲得し、前記さらなるアミノ酸残基を切断する請求項１のａ）、ｂ）、またはｄ）記載のペプチドの調製方法。
【請求項１３】
請求項１〜８のいずれか１項記載のペプチドを使用した真核細胞培養物の成長方法。
【請求項１４】
請求項１〜８のいずれか１項記載のペプチドを、培地１ｍｌあたり０．１μｇ〜１０μｇの範囲の濃度で使用する請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
前記細胞は、昆虫細胞系ＩＰＬＢ−Ｓｆ−２１である請求項１３または請求項１４記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
緒言
有益な組換えタンパク質の生物工学的産生のための真核細胞培養物の使用が増加している。このような細胞のほとんどの培地は組成が複雑で、その多くがウシ胎児血清（ＦＣＳ）をさらに添加する必要がある。培地での血清の使用により、種々の問題が起こり、かつ費用がかかるので、血清成分に代わる安価で定義された添加物により、細胞培養ベースの生物工学プロセスが有意に改良される。（組換え）タンパク質の生物工学的産生のために、例えば、とりわけ昆虫細胞、ＢＨＫ（ベビーハムスター腎）細胞、ＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣）細胞、ＨＥＫ（ヒト腎臓上皮）細胞が使用されている。
【０００２】
真核細胞用の培地中には、成長促進添加物として頻繁にタンパク質加水分解物および天然タンパク質抽出物が含まれる。しかし、その活性についての知識は非常に限られており、有効成分は未知であり、成長に影響を与えるその役割も未知である。ウシカゼインの酵素加水分解物は頻繁に使用されている昆虫細胞系ＩＰＬＢ−Ｓｆ２１（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）の培養物に対して成長促進作用を有することがすでに示されている。しかし、酸性加水分解の場合、この作用は完全に喪失する。
【０００３】
本発明の問題は、概して加水分解物の成長促進作用を担うカゼイン加水分解物のペプチド成分を同定し、化学的に定義された添加物の形態で培地（例えば、昆虫細胞培養物）に利用可能な成分を作製することである。
【０００４】
したがって、請求項１によれば、本発明は、
ａ）アミノ酸配列ＨＱＰＨＱＰＬＰＰＴのペプチド、
ｂ）ａ）に記載の配列中の１つまたは複数のアミノ酸残基がアミノ酸残基に置換されたペプチドであって、例えば、相同性が３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、または９５％であり得るペプチド、
ｃ）ａ）またはｂ）に記載の配列中の１つまたは複数のアミノ酸残基が化学修飾されているペプチドであって、Ｎ末端のアミノ酸残基がアセチル基などのアシル基を有し得るペプチド、
ｄ）ａ）、ｂ）、またはｃ）に記載の配列中の１つまたは複数のアミノ酸残基が欠失または挿入されているペプチドであって、例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、または７つのアミノ酸残基が欠失し得る、
ｅ）成長促進作用を損ねるさらなるアミノ酸残基を含まないか、これらが容易に切断される、ａ）、ｂ）、またはｄ）に記載のペプチドを含む融合タンパク質から選択される、真核細胞培養物の成長を促進する作用を有するペプチドに関する。
【０００５】
本発明のさらなる態様および利点、および／または好ましい実施形態は、従属クレームまたはさらなるクレームに含まれる。
【０００６】
本発明のｄ）のペプチドは、化学修飾することができるペプチドＨＱＰであり得る。例えば、Ｎ末端のアミノ酸残基はアセチル基などのアシル基を有し得る。
【０００７】
本発明のペプチドを、天然のカゼイン供給源から（例えば、ウシカゼインから）単離するか、化学合成するか、または遺伝子操作によって調製することができる。
【０００８】
本発明はさらに、本発明のｅ）に記載の融合タンパク質をコードするＤＮＡ配列、このようなＤＮＡ配列を含む組換え発現ベクター、および本発明のＤＮＡ配列または本発明の発現ベクターで形質転換またはトランスフェクトされた原核細胞または真核細胞に関する。
【０００９】
さらに、本発明は、本発明の細胞を適切な培地で成長させ、融合タンパク質を細胞または培地から獲得し、さらなるアミノ酸残基を切断する、本発明のａ）、ｂ）、またはｄ）記載のペプチドの調製方法に関する。
【００１０】
本発明は、さらに、本発明のペプチドを使用した真核細胞培養物の成長方法に関する。
【００１１】
本発明のペプチドを、培地１ｍｌあたり０．１μｇ〜１０μｇの範囲の濃度で有利に使用することができる。適切な細胞は、例えば、昆虫細胞系ＩＰＬＢ−Ｓｆ−２１の細胞である。
【００１２】
本発明を、実施例を参照して以下にさらに詳述するが、本発明はこれらによって制限されない。
【００１３】
材料と方法
細胞系および培地
ＩＰＬＢ−Ｓｆ−２１細胞（ＡＣＣ１  １９、ＤＳＭＺ、Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ， Ｇｅｒｍａｎｙ）を、Ｄｒ． Ｖｉｃｔｏｒ Ｒｏｍａｎｏｓｋｉ（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｏ ｄｅ Ｂｉｏｑｕｉｍｉｃａ ｙ Ｂｉｏｌｏｇｉａ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ， Ｆａｃｕｌｔａｄ ｄｅ Ｃｉｅｎｃｉａｓ Ｅａｃｔａｓ， Ｕｎｉｖｅｒｓｉｄａｄ Ｎａｃｉｏｎａｌ ｄｅ ｌａ Ｐｌａｔａ， Ｒｅｐｕｂｌｉｃａ Ａｒｇｅｎｔｉｎａ）から入手し、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ、ＳＩＧＭＡ， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ、ＵＳＡ）を含むＴＣ−１００培地（Ｇｉｂｃｏ／Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｎｏｇｉｅｓ， Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ， ＮＹ， ＵＳＡ）中で２８℃で保存した。
【００１４】
カゼイン加水分解物
製品名Ｎ−Ｚ  Ｃａｓｅ  Ｐｌｕｓ（注文番号Ｎ４６４２）の出発物質を、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏ． から購入した。加水分解物を、最初に、本質的に既知の様式でゲルろ過クロマトグラフィーによって異なる分子サイズの画分に分離し、凍結乾燥し、−２０℃で保存した。これらの画分を、その生物活性について試験した。次いで、活性画分を、本質的に既知の様式で、粒子サイズ７μｍのＣ１８修飾シリカゲル（孔径３００Å）を充填した寸法４×２５０ｍｍのカラムおよび０．１％トリフルオロ酢酸を含む水からアセトニトリルヘの溶媒勾配を使用した逆相高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によってさらに分画した。カラム溶出液をＵＶ吸収検出器に通過させ、異なる画分でＵＶ吸収化合物を回収した。画分を真空濃縮し、残渣を０．１％トリフルオロ酢酸を含む５００μｌの水中に取り、−２０℃で保存した。
【００１５】
本質的に既知の様式で、ＨＰＬＣ画分由来の物質の一部を、質量分析法（マトリックス支援レーザー脱離イオン化、ＭＡＬＤＩ）によって分析した。
【００１６】
明確に定義したペプチド質量を有するＨＰＬＣ画分の場合、次いで、物質のさらなる部分を、エドマン分解法によるタンパク質配列決定によって、本質的に既知の様式で特徴付けた。
【００１７】
ペプチド合成
生物学的に活性なペプチドフラグメントおよびカゼイン加水分解物由来のセグメントの一部を、Ｆｍｏｃ／ｔＢｕ法を使用した合成化学によって調製した（Ｆｉｅｌｄｓ ａｎｄ Ｎｏｂｌｅ， Ｉｎｔ． Ｊ． Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓ．， ３５， １９９２， １６１−２１４）。担体物質として、リンクリンカーを含むＰＥＧ−ポリスチレン樹脂（Ｒａｐｐ Ｐｏｌｙｍｅｒｅ， Ｔｕｂｉｎｇｅｎ）を使用した。アミノ酸誘導体Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ−Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ Ｃｏｒｐ．， Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ， ＵＳＡ）を、ベンゾトリアゾリル−１−オキシ−トリス−ピロリジノホスホニウムヘキサフルオロリン酸（ＰｙＢＯＰ）および触媒としてのＮ−メチル−モルホリン（ＮＭＭ）に結合させた。合成の最後に、ペプチドのＮ末端アミノ基を、アセトアミドとして無水酢酸のＤＭＦ溶液を使用して遮断した。トリフルオロ酢酸／水／トリエチルシラン（９０／５／５、Ｖ／Ｖ／Ｖ）混合物を使用してペプチドを脱保護し、担体から切り出し、冷ジエチルエーテル中に沈殿させ、遠心分離し、水に溶解し、凍結乾燥した。次いで、得られた粗生成物を、本質的に既知の様式で、粒子サイズ７μｍのＣ１８修飾シリカゲルを充填した１０×２５０ｍｍのカラムおよび０．１％トリフルオロ酢酸を含む水からアセトニトリルヘの溶媒勾配を使用した逆相高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって精製した。分析ＨＰＬＣは、９０％を超える純度を示した。
【００１８】
トリペプチドを、核磁気共鳴（ＮＭＲ）分光法によって分析した。
【００１９】
ペプチドおよびペプチド画分の生物活性の同定
ＩＰＬＢ−Ｓｆ−２１細胞を、２４ウェル培養プレートの各ウェル中の１ｍｌの培地（ＴＣ−１００＋１０％ＦＣＳ）中に５×１０４細胞の開始密度で蒔いた。プレートを、湿室中２７℃で２日間インキュベートした。その後２日間、培養物を、この培地と純粋なＴＣ１００培地との数回の交換によって血清添加物から隔離し、その後、種々の濃度のペプチドまたはペプチド画分を添加した。コントロール培養物を、純粋なＴＣ１００培地中で培養した。
【００２０】
４日後、細胞を慎重に掻き取ることによって回収した。培養物あたりの細胞数を、倒立顕微鏡を具備したＮｅｕｂａｕｅｒチャンバーでの計数によって同定した。Ｎｅｕｂａｕｅｒチャンバーは、２つの計数領域を有していた。各サンプルを、２つの領域それぞれにおいて３回計数した（サンプルあたり６つの値）。
【００２１】
結果
ペプチド配列
カゼインの生物学的に活性な画分の主成分を、配列ＨＱＰＨＱＰＬＰＰＴのペプチドとして同定した。
【００２２】
合成ペプチド
上記の一般的方法に従って、ペプチドＡＣ−ＨＱＰ−ＯＨ（トリペプチド）およびＡｃ−ＨＱＰＨＱＰＬＰＰＴ−ＯＨ（デカペプチド）を調製した（Ａｃはアセチルを示し、アミノ酸は標準的な一文字表記で示す）。
【００２３】
細胞成長に対する合成ペプチドの影響
表１は、ペプチドおよびＦＣＳを含まない培養物の場合の細胞収率と比較した、種々の濃度のデカペプチドＡｃ−ＨＱＰＨＱＰＬＰＰＴ−ＯＨでの処理後の細胞収率を示す。ペプチド濃度１μｇ／ｍｌで最大成長促進効果が得られた。これより高い濃度では、成長が阻害された。
【００２４】
【表１】
2004535152.tif 000002
【００２５】
カゼイン配列に２倍存在するトリペプチドＡＣ−ＨＱＰ−ＯＨの成長影響効果を、表２に示す。この細胞収率を、ペプチドおよびＦＣＳを含まない培養物の場合の細胞収率と比較して再度示す。この場合、最大成長促進効果は、ペプチド濃度０．１μｇ／ｍｌで既に達成されていた。同様に、非常に高濃度（１０μｇ／ｍｌを超える）で成長が阻害された。
【００２６】
【表２】
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【００２７】
2004535152.tif 000004
2004535152.tif 000005
なお、配列表中「ａ」はａのウムラウトがついた文字である。
【国際公開パンフレット】
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2004535152.tif 000008
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2004535152.tif 000014
2004535152.tif 000015
2004535152.tif 000016
2004535152.tif 000017
2004535152.tif 000018
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004535152.tif 000019
【国際調査報告】
2004535152.tif 000020
2004535152.tif 000021
2004535152.tif 000022
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