(57)【要約】生物学的、化学的、および生化学的構成単位を含む生体分子の微小アレイを統合する多層の微小アレイシステム。多層の微小アレイは、適切な基板の種々の部分を生体分子で保護するかまたはパターン転写するために、ソフトリソグラフィー技術およびゴム弾性膜を用いて形成される。付加的な層を、パターン転写された生体分子を引き続くパターン転写またはアレイ溶液の添加から分離、層別、または保護する種々の通り穴を持つ膜を用いて形成する。
2004515776.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
基板、下層膜、及び上層膜を有する多層微小アレイにおいて、前記下層まくは貫通孔を有し、前記下層膜は前記基板をシールしており、前記上層膜は前記下層膜を覆っており、そして前記上層膜は溜めを規定する少なくとも１個の貫通孔を有することを特徴とする多層微小アレイ。
【請求項２】
前記上層膜の前記溜めが前記下層膜の複数の貫通孔を囲む、請求項１に記載の微小アレイ。
【請求項３】
前記下層膜の前記溜めが９６穴、３８４穴、１５３６穴マイクオタイタープレートのフットプリントを有する、請求項１に記載の微小アレイ。
【請求項４】
前記上層膜の前記溜めが６穴、１２穴、２４穴、９６穴、３８４穴、または１５３６穴マイクロタイタープレートのフットプリントを有する、請求項１に記載の微小アレイ。
【請求項５】
さらに生体分子のパターン化されたアレイを有する基板を含む、請求項１に記載の微小アレイ。
【請求項６】
前記生体分子が細胞、タンパク質、および核酸からなる群から選ばれる、請求項５に記載の微小アレイ。
【請求項７】
前記下層膜の前記貫通孔が約１μｍ〜１ｍｍの直径を有する、請求項１に記載の微小アレイ。
【請求項８】
前記下層膜の前記貫通孔が約１μｍ２〜１ｍｍ２の断面積を有する、請求項１に記載の微小アレイ。
【請求項９】
前記下層膜の前記貫通孔が約３μｍ〜５００μｍの直径を有する、請求項１に記載の微小アレイ。
【請求項１０】
前記下層膜の前記貫通孔が約９μｍ２〜約２５０，０００ μｍ２の断面積を有する、請求項１に記載の微小アレイ。
【請求項１１】
前記上層膜の前記溜めが約０．５ ｍｍ〜約３６ ｍｍの直径を有する、請求項１に記載の微小アレイ。
【請求項１２】
前記上層膜の前記溜めが約１．７ ｍｍ〜約５ ｍｍの直径を有する、請求項１に記載の微小アレイ。
【請求項１３】
前記上層膜の前記溜めが約０．２５ ｍｍ２〜１２９６ ｍｍ２の断面積を有する、請求項１に記載の微小アレイ。
【請求項１４】
前記下層膜層がゴム弾性材料で形成される、請求項１に記載の微小アレイ。
【請求項１５】
前記ゴム弾性材料がＰＤＭＳである、請求項１４に記載の微小アレイ。
【請求項１６】
前記上層膜がＰＤＭＳで形成される、請求項１に記載の微小アレイ。
【請求項１７】
さらにＳＡＭを含み、該ＳＡＭが基板の上面に形成される、請求項１に記載の微小アレイ。
【請求項１８】
前記ＳＡＭがアルカンチオールで形成される、請求項１７に記載の微小アレイ。
【請求項１９】
パターン形成された微小アレイを有する基板、及び当該パターン形成された基板を覆う膜を含む多層微小アレイであって、前記膜が、前記基板上のパターン形成された微小アレイを囲む溜めを有することを特徴とする微小アレイ。
【請求項２０】
前記パターン形成された前記アレイが生体分子を含む、請求項１９に記載の微小アレイ。
【請求項２１】
前記生体分子が、細胞、タンパク質、および核酸からなる群から選ばれる、請求項２０に記載の微小アレイ。
【請求項２２】
前記下層膜の前記貫通孔が約１μｍ〜１ｍｍの直径を有する、請求項１９に記載の微小アレイ。
【請求項２３】
前記下層膜の前記貫通孔が約１μｍ２〜１ｍｍ２の断面積を有する、請求項１９に記載の微小アレイ。
【請求項２４】
前記下層膜の前記貫通孔が約３μｍ〜約５００μｍの直径を有する、請求項１９に記載の微小アレイ。
【請求項２５】
前記下層膜の前記貫通孔が約９μｍ２〜約２５０，０００ μｍ２の断面積を有する、請求項１９に記載の微小アレイ。
【請求項２６】
前記上層膜の前記溜めが約０．５ ｍｍ〜約３６ ｍｍの直径を有する、請求項１９に記載の微小アレイ。
【請求項２７】
前記上層膜の前記溜めが約１．７ ｍｍ〜約５ ｍｍの直径を有する、請求項１９に記載の微小アレイ。
【請求項２８】
前記上層膜の前記溜めが約０．２５ ｍｍ２〜１２９６ ｍｍ２の断面積を有する、請求項１９に記載の微小アレイ。
【請求項２９】
前記膜がゴム弾性材料で形成される、請求項１９に記載の微小アレイ。
【請求項３０】
前記ゴム弾性材料がＰＤＭＳである、請求項２９に記載の微小アレイ。
【請求項３１】
さらにＳＡＭを含み、当該ＳＡＭが基板上に形成される、請求項３０に記載の微小アレイ。
【請求項３２】
前記ＳＡＭがアルカンチオールで形成される、請求項３１に記載の微小アレイ。
【請求項３３】
パターンを規定する貫通孔を有する第１の膜を通して基板上に生体分子をパターン転写し、そして当該第１の膜の上面を第２の膜で覆うことを含んで成る多層微小アレイを形成する方法において、当該第２の膜は、パターン転写された生体分子を囲む溜めを規定する複数の貫通孔を有することを特徴とする方法。
【請求項３４】
基板、および当該基板の表面を覆うゴム弾性膜を有する多層微小アレイシステムであって、当該膜は下層および上層を有し、当該下層は微小孔を形成する複数の貫通孔を有し、当該微小孔は当該膜の下層の貫通孔の側面により規定され、そして該微小孔の底は前記基板の上面により規定され、そして前記膜の上層は前記下層の複数の微小孔を囲む溜めを形成する貫通孔を有することを特徴とする多層微小アレイ。
【請求項３５】
前記上層膜の前記溜めが前記下層膜の複数の貫通孔囲む、請求項３４に記載の微小アレイ。
【請求項３６】
前記下層膜の前記溜めが９６穴、３８４穴、または１５３６穴のマイクロタイタープレートのフットプリントを有する、請求項３４に記載の微小アレイ。
【請求項３７】
前記上層膜の前記溜めが６穴、１２穴、２４穴９６穴、３８４穴、または１５３６穴マイクロタイタープレートのフットプリントを有する、請求項３４に記載の微小アレイ。
【請求項３８】
さらに生体分子のパターン転写されたアレイを有する基板を含む、請求項３４に記載の微小アレイ。
【請求項３９】
前記生体分子が、細胞、タンパク質、および核酸からなる群から選ばれる、請求項３８に記載の微小アレイ。
【請求項４０】
前記下層膜の前記貫通孔が約１μｍ〜１ｍｍの直径を有する、請求項３に記載の微小アレイ。
【請求項４１】
前記下層膜の前記貫通孔が約１μｍ２〜１ｍｍ２の断面積を有する、請求項３４に記載の微小アレイ。
【請求項４２】
前記下層膜の前記貫通孔が約３μｍ〜約５００μｍの直径を有する、請求項３４に記載の微小アレイ。
【請求項４３】
前記下層膜の前記貫通孔が約９μｍ２〜約２５０，０００ μｍ２の断面積を有する、請求項３４に記載の微小アレイ。
【請求項４４】
前記上層膜の前記溜めが約０．５ ｍｍ〜約３６ ｍｍの直径を有する、請求項３４に記載の微小アレイ。
【請求項４５】
前記上層膜の前記溜めが約１．７ ｍｍ〜ら約５ ｍｍの直径を有する、請求項３４に記載の微小アレイ。
【請求項４６】
前記上層膜の前記溜めが約０．２５ ｍｍ２〜１２９６ ｍｍ２の断面積を有する、請求項３４に記載の微小アレイ。
【請求項４７】
前記下層膜層がゴム弾性材料で形成される、請求項３４に記載の微小アレイ。
【請求項４８】
前記ゴム弾性材料がＰＤＭＳである、請求項４７に記載の微小アレイ。
【請求項４９】
前記上層膜層がＰＤＭＳで形成される、請求項３４に記載の微小アレイ。
【請求項５０】
さらにＳＡＭを含み、当該ＳＡＭが基板の上面に形成される、請求項３４に記載の微小アレイ。
【請求項５１】
前記ＳＡＭがアルカンチオールで形成される、請求項５０に記載の微小アレイ。
【請求項５２】
下層および上層を有するゴム弾性膜を含む多層微小アレイシステムであって、当該膜の当該下層は微小孔を有し、そして当該膜の当該上層は、当該下層部分の複数の微小孔を囲む溜めを形成する貫通孔を有することを特徴とする多層微小アレイシステム。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明は、生物学的、化学的、生化学的構成単位を含む生体分子のアレイを統合するための多層アレイシステムに関する。
【０００２】
発明の背景
種々の生物学的プロセスに対する影響をみるために、化合物を迅速に分析する必要がある。殆んど全ての生物活性は、細胞内のタンパク質の相互作用により調節されている。タンパク質は、細胞の触媒、運動変換器、および信号仲介者である。それらは、細胞分化、細胞成長、細胞分裂、細胞死を制御し、その環境に対する細胞の応答を仲介する。酵素学者は、酵素反応に対するより良い基板、より良い阻害剤、およびより良い触媒を長らく探し求めてきた。細胞過程を理解するためには、したがってタンパク質の活性を観測し、細胞内のタンパク質の相互作用のネットワークを決定することが必要である。
【０００３】
過去においては、生物学者に入手可能な道具では、沢山のタンパク質の相互作用を同時に観測できる分析道具が存在しなかったので、１度に１つの相互作用しか研究できなかった。かくて、タンパク質の相互作用の並行分析を可能にするシステムは、測り知れない価値があり、生物学的発見の進歩を早めるだろう。
【０００４】
さらに、有力な新薬候補化合物を迅速に分析したり、選別したりする必要がある。医薬品の発見は、特定の疾患の標的の同定、特定標的に基づく分析法の開発、分析法のバリデーション、および多数の候補を選別するための分析の最適化と自動化を伴う長い、多段階のプロセスである。種々の分析法を用いて化合物ライブラリーを高い処理量で選別後、うまく当てたバリデーションおよび化合物の最適化処置を用いる。何千もの化合物の選別を行うには、かくて数多くの化合物および分析成分試薬の並行処理を必要とする。
【０００５】
さらに、医薬発見プログラムのための先導化合物を見出すために、数多くの化合物を酵素阻害剤または受容体作動薬／拮抗薬としての活性のためにしばしば選別する。化合物の数多くのライブラリーが、そのような選別のために必要である。この分野の発展の結果として、選別のための数十万の小分子を含むコンビナトリアルライブラリーを同時に作ることが今や可能である。そのようなライブラリーを手元において、数千のこれらの新しい可能性のある新薬候補を迅速に選別する必要性が現在ますます高くなっている。
【０００６】
医薬品発見へのひとつの一般的取り組み方は、可能性のある新薬候補の治療活性を試験する生物検定で、疾患（疾患標的）を引き起こすことで示唆される巨大分子を提示することを伴う。そのような分子は、受容体、酵素、転写因子、補因子、ＤＮＡ、ＲＮＡ、成長促進因子、細胞死誘導物質、または非酵素的タンパク質およびペプチドであろう。他の取り組み方は、疾患の原因物質の代表である全細胞または生物を提示することを伴う。そのような作用物質は、バクテリアおよび腫瘍細胞システムを含む。かくて、多彩な細胞および細胞システムへの種々の新薬候補の影響を選別できることが必要である。
【０００７】
生物物質への種々の作用物質の影響または生理活性を評価する通常の方法は、標準的な微量定量プレートの使用である。たとえば、米国特許Ｎｏ．６，０８３，７６３を見よ。不幸にして微量定量プレートは、多重変数分析に拡大できない。たとえば、医薬品の様な生理的作用物質の細胞集団または培地に成長した組織への影響の評価は、通常細胞または組織集団に対する作用物質の影響に関する情報をある特定の時点でのみ提供する。さらに現在の評価技術は、一般的に１または少数の変数に関する情報を提供するだけである。
【０００８】
たとえば、候補作用物質を系統的に細胞毒性に対して試験するが、これは濃度の関数として測定されるだろう。細胞集団は処理され、処理後のある１時点または数時点での細胞生存性が測定される。かくて、細胞毒性の分析法は、一般的に細胞死の原因または時間経過に関する情報はなんら提供せず、単に細胞が死んだか生存しているかを示すにすぎない。相互作用の機構／作用物質の活性を明瞭にするためには、幾つかの変数を同時に観測可能な分析法が必要である。
【０００９】
さらに治療薬は、しばしば特定の代謝機能に対するその生理学的影響に基づいて評価される。作用物質は細胞集団または組織試料に投与され、関心のある代謝機能が作用物質の影響を評価するために分析される。この型の分析は有用な情報を提供するが、作用機構、他の代謝機能に対する影響、生理学的影響に対する時間経過、一般の細胞または組織の健康、およびその他に関する情報を提供しない。
【００１０】
有用な医薬品化合物を同定し先導化合物の性質を改良するために分子のライブラリーを選別する価値が大きいにも拘らず、これらのライブラリーを選別することは困難であり、特に「機能的」選別方法が存在しないために、これらの方法の医薬品発見および開発に対する影響力は限定的である。かくて、医薬品発見および先導化合物の開発において、複数の標的−配位子相互作用を同時に選別可能にする分析システムが依然として必要である。有望な新薬候補を試験し、生物学的および臨床的に関連性のある情報を得るために、高い処理量を有する多層式分析システムが大いに必要とされる。この必要性は、医薬品発見に限定されず、診断および臨床診断分野でも同様に関心がある。
【００１１】
分子の構造と機能との間の関係は、生物システムの研究における基本的な課題である。構造−機能の関係は、幾つかあげれば、酵素機能、細胞情報伝達、ならびに細胞制御およびフィードバック機構のような生物現象を理解するために重要である。たとえばタンパク質−受容体相互作用のような種々の分子が如何にお互いに相互作用しているかを理解することは、しばしば生物機能を理解する第一歩となる。
【００１２】
最新の医薬品発見は、しばしば構造−機能関係の研究に依存している。多くの最新の医薬品発見は、生物学的に重要な受容体に対する望ましい型の特異性を有する新規な配位子を発見することを伴う。かくて、新薬を市場に出すのに必要な時間の長さは、多数の配位子の構造−機能の関係を迅速に選別可能な分析システムがあれば大幅に短縮できるだろう。
【００１３】
一般の医薬品発見戦略において、幾つかの副戦略が開発された。出現したひとつの空間的にアドレス可能な戦略は、標準の９６孔の微量定量プレートの寸法に適合する固定化されたピン上でのペプチドライブラリーの形成を伴う。特許協力条約特許公布Ｎｏ．９１／１７２７１およびＮｏ．９１／１９８１８を見よ。両特許とも参照によりここに組み入れられている。
【００１４】
この方法は、Ｇｅｙｓｅｎらの“Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ ｆｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ Ｒｅｌｅｖａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，” Ｂｉｏｏｒｇ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ． Ｌｅｔｔ． ３： ３９７−４０４ （１９９３）に述べられている如く不連続なエピトープをまねるペプチドを同定するために、および米国特許Ｎｏ．５，２８８，５１４およびＢｕｎｉｎら、”Ｔｈｅ Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ Ｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ａ １，４−Ｂｅｎｚｏｄｉａｚｅｐｉｎｅ Ｌｉｂｒａｒｙ，” Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ Ｓｃｉ． ９１：  ４７０８−４７１２ （１９９４）  に述べられている如く、ベンゾジアゼピンライブラリーを形成するために用いられている。個々のライブラリー構成員の構造は、微量定量プレート内のピンの位置および合成を通して行われる反応工程（「合成ヒストグラム」と呼ばれる）の順序から決定される。
【００１５】
医薬品発見で使用される上述の方法に加えて、幾つかの傾向が医薬品発見のための細胞基盤の分析法への関心をかきたてている。細胞基盤の選別は、これらの分析法が選別の処理量を増加しかつ費用を低減するために微小にできるので、標的バリデーションから先導医薬品発見までの時間を短縮する可能性を提供する。標的生物学に関する情報は、標的機能に対する特定の、しばしば微妙な影響に対する分析法の開発を勇気付ける。たとえば、細胞基盤分析法は、イオンチャンネル動力学のモジュレーター、受容体作動薬効率のアロステリック制御剤およびタンパク質相互作用を選別するのに使用されてきた。不幸にして、これらの分析法は、モジュレーターの結合位置が不明かも知れないので、通常の配位子置換または生化学的方法を用いて形式を定めるのが困難である。
【００１６】
生物学、化学および計装の進歩により、細胞機能の光学的表示機の開発のための使い易い道具が提供された。これらの道具の多くは、生体細胞の標的機能の直接的検出を可能にする。これらの道具の大抵のものは、蛍光または発光レポーター分子を採用し、受容体、イオンチャンネルおよび細胞内酵素を含む大概の標的に対する細胞基盤分析法を可能にする。これらの道具の例は、吸着分析法、蛍光強度分析法、蛍光共鳴エネルギー転移（“ＦＲＥＴ”）分析法、蛍光偏光分析法、発光分析法を含む。これらの新規の光学的分析法は、医薬品発見のための選別において生体細胞の使用を促進する。
【００１７】
高処理量選別（“ＨＴＳ”）のための一般的な治療標的は、酵素、細胞表面受容体、核受容体、イオンチャンネル、信号形質導入タンパク質、細胞表面糖タンパク質およびプロテオグリカンである。これらの標的と相互作用する化合物は、通常ｉｎ ｖｉｔｒｏで生化学分析法を用いて同定される。
【００１８】
配位子相互作用は標的の生物環境で生じるので、改変された哺乳動物細胞システムを用いた細胞基盤分析法は、最も生物学的に関連の深い情報を与える。これは、２次的細胞性事象を同時に観測するための機会を提供する。かくて、現在入手可能な数多くの新規の細胞基盤分析法ゆえに、これらの細胞基盤分析法との関連で使用できる多層式アレイシステムが必要である。本発明は、この必要性と取り組み、特に細胞基盤分析法に使用可能な高密度アレイを提供する。
【００１９】
これらの分析法および他の通常の分析法、同様にＨＴＳ、たとえばＤＮＡ分析、遺伝子発現プロファイリング、単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ’ｓ）の遺伝地図作成、ならびに酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）およびその他は、生物分子のアレイ化に依存している。
最近の進歩で、フォトリソグラフィーの技術、化学および生物学が結合した結果、基板の表面に生化合物の大きな集合をアレイ化できる。米国特許Ｎｏ．５，１４３，８５４ならびに特許協力条約特許公布Ｎｏ．９０／１５０７０およびＮｏ．９２／１００９２を参照のこと。これらは夫々、引用により本明細書に組み入れられている。
【００２０】
標的オリゴヌクレオチドのパターンを形成するためにフォトリソグラフィー同様“Ｇｅｎｅｃｈｉｐ”技術は（米国特許Ｎｏ．５，５９９，６９５を見よ）、分析法の実施方法を革新した。ロボットスポッティングシステムは、分析法開発のために表面に核酸および他の物質のアレイを「プリント」するために開発された。不幸にして、フォトリソグラフィーおよびロボットアレイシステムは両方共高価な設備を必要とする。さらに、フォトリソグラフィーに必要な処理条件が多くの生化学および生物物質としばしば相容れない。
【００２１】
ロボットスポッティングシステムは、均質液体と用いた時は良く働くが、細胞に直接パターン転写を試みた時には効率良く働かない。シルクスクリーン印刷およびインクジェット印刷は生物アレイの形成において近年大いに有望である事を示しているが、微細分解能を有するパターンを形成することは出来ないため困っている。１００μｍ以下の分解能を得ることは、これらの技術では困難である。
【００２２】
これらの困難にもかかわらず、タンパク集積は、生物学研究者が高処理量分析法を実施できる有望な道具を提供する。タンパク集積のための種々の概念が提案されている。最も一般的なのは、ｃＤＮＡのアレイがｍＲＮＡを捕集する方法に類似の方法で、特定のタンパク質に結合するモノクローナル抗体のアレイからなる。Ａｒｅｎｋｏｖ，Ｐ．ら、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ２０００， ２７８， ｐｐ． １２８−１３１を見よ。他の取り組み方は、タンパク質を結合する薬品のアレイの使用を含む。このようなアレイはタンパク質を単離するために使用されているが、タンパク質間の相互作用を観測するために有益なアレイシステムは未だ存在しない。
【００２３】
かくて、細胞基盤分析法、リソグラフィー、およびタンパク集積を含む最近の進歩を使用でき、有利に利用できる多層アレイシステムが必要である。非常に小さな容積で繰り返し、正確な分析選別を実施できる多変数分析法が必要である。複数の標的と配位子が新しい薬理、診断、実験または他の有用な作用物質として同定できる新しいシステムは、新薬候補化合物のような多数の作用物質に対して、細胞またはタンパク質のような多数の標的を迅速に選別するためにアレイの上にアレイを重ねた分析システムと同様に、この必要を満たす。
【００２４】
本発明は、標準微量滴定プレート、たとえば６穴、１２穴、２４穴、９６穴３８４穴、または１５３６穴マイクロタイタープレート、マイクロタイタープレート読取装置およびマイクロタイタープレートロボットシステムとの関連で使用できる多層アレイ分析システムを提供する。本発明は、ＨＴＳ、タンパク質−タンパク質相互作用の研究、細胞基盤分析法、および他の既知の生物分析法で使用できる新規の多層アレイシステムを提供する。さらに、本発明は、ソフトリソグラフィー法を用いて、すなわち直径約１００ミクロンの場所に細胞のパターン転写を行って、細胞のミクロパターン転写を行う多層アレイを提供する。
【００２５】
発明の要約
本発明は、多層微細アレイとそのアレイの調製方法もまた同様に提供する。アレイは、化学または生化学物質だけでなく、タンパク質、核酸、細胞、抗体、酵素、糖タンパク質、プロテオグリカン、および他の生物材料からなることができる。本発明は、医薬品発見および臨床診断の応用に特に有用である。バイオアレイは、生物システム、たとえばその疾患状態または医薬品の効果、に関する多量の資料を提供する。
【００２６】
これらのアレイは、医薬品発見に通常用いられる高処理量の選別方法、たとえばロボットシステムに統合できる。さらに該アレイは、現在の分析法の構成、たとえば例として６穴、１２穴、２４穴、９６穴、３８４穴、１５３６穴プレート、または９，６００穴マイクロタイタープレートさえも扱うように設計される、検知システムおよびロボットシステムなどのために開発されたシステムを利用するように設計できる。本発明は、現在使用されている微量定量プレート構成に限定されるものではなく、今日の工業的標準を利用するために必要な構成を提供し、また新規の構成を設計するための自由度も同様に提供する。
【００２７】
本発明は、ソフトリソグラフィー技術およびゴム弾性膜を用いて、タンパク質または細胞のような生体分子で基板をパターン転写する多層アレイシステムを提供する。多層の生体分子をパターン転写するかおよび／または多層のゴム弾性膜を利用することにより、多層は達成される。
ゴム弾性膜の第１層を、基板に生体分子をパターン転写するために使う。該膜は、それを通して生体分子をパターン転写する通り穴を有する。第２膜を第１膜の上に置く、または他の選択肢として、第１膜を除去し、第２膜を直接基板上に置く。第２膜は、第１膜の微小孔を含む液溜りを規定する通り穴（すなわち基板上にパターン転写された構成単位）を有する。
【００２８】
多層アレイシステムにタンパク質をパターン転写する能力は、それを標準微小孔プレートに加えることにより特定のタンパク質を分析する既存の当業界の方法に大幅な改善を提供する。タンパク質を微小孔プレートの表面に単に置いた時に、タンパク質は非特異性に吸着し、変性し、そしてその活性を失う。本発明はこの問題を基板、好ましくはＳＡＭ、の上にタンパク質を配列することにより克服する。かくて、タンパク質はその天然の配置および活性を維持できる。
本発明はまた、種々の細胞基盤の分析法に後に使用される特定の空間パターンにパターン転写した細胞の微小アレイを提供する。
【００２９】
発明の詳細な記述
本発明は、多層アレイシステムを指向している。図１および図２に示される如く、基部または基板層３を、生体分子８を基板層３にパターン転写／沈着するためのマスクとして使用する貫通孔９を有する第１層１で覆う。生体分子８は、化学的、生化学的、または生物学的起源のものであろう。マスク層１は、遮蔽層に通り穴９の配置により規定されるパターン転写されたアレイ中の基板３上に生体分子８の沈着を行わせるステンシルとして働く。
【００３０】
多層アレイシステムの適切な基板３は、本質的に高分子、金属、セラミックス、酸化物、その他を含む膜と共に使用できる如何なる物質でも良い。それは、アレイがその上で形成され、またはそれでアレイを支持できる如何なる表面でも良い。基板は、無機、有機、複合材または高分子起源の物であろう。典型的な物質は、ガラス、シリコンウェハー、融解シリカ、平らな表面に支持された金属フィルム（金、銀、銅、白金等）、ポリスチレン、ポリメチルアクリレート、およびポリカーボネートである。基板は、アレイ形成を支持し、便宜を図り、触媒し、促進するためにさらに修飾されるだろう。そうしてこの際、吸着、化学反応、または物理的相互作用が修飾された表面の構成単位とアレイ構成単位との間で起こるだろう。
【００３１】
好ましい基板表面は、不活性および／または非特異的反応によるタンパク質のような生体分子の吸着に抵抗できるものである。非特異的吸着は、それが関心事の特定の生体分子を固定化し、および／または特定の場所に生体分子を固定化する能力を阻害するであろうから、避けるべきである。基板の表面は、タンパク質吸着に便宜を図ったりまたは細胞性付着に抵抗したりするような特定の界面特性を示すように修飾されるだろう。特に好ましい具体例に従い、基板物質としての金と、チオール、スルフィド、またはジスルフィドのような少なくとも１個の硫黄含有官能基を有する分子種との組み合わせが選択される。
【００３２】
金とそのような硫黄含有官能基との間の相互作用は良く研究された科学であり、そのような硫黄含有機能性の非限定的、代表的で例証的な表が、参照によりここに組み入れられている、”Ｓｅｌｆ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ ｔｏ ｔｈｅ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｕｒｆａｃｅｓ： Ｓｅｌｆ−Ａｓｓｅｍｂｌｅｄ Ｍｏｎｏｌａｙｅｒｓ， Ｗｅｔｔｉｎｇ ａｎｄ Ｐｈｙｓｉｃａｌ−Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｓｏｌｉｄ−Ｌｉｑｕｉｄ Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ，” ｂｙ Ｇ．Ｗ． Ｗｈｉｔｅｓｉｄｅｓ ａｎｄ Ｐａｕｌ Ｅ．Ｌａｉｂｉｎｉｓ， Ｌａｎｇｍｕｉｒ， ６， ８７ （１９９０），と題する論文に見られるだろう。
【００３３】
基板は、また表面に化学的または物理的形態を含むだろう。物理的形態は、表面のくぼみ、突起、または両方の組み合わせに対応する。化学的、物理的形態は、如何なる望ましい形式にも合致するように設計されるだろう。たとえば、基板は、６穴、１２穴、２４穴、９６穴、３８４穴、または１，５３６穴マイクロタイタープレートなどのような標準的マイクロタイタープレートの微小孔に対応するフットプリントを持つくぼみを有し得る。
【００３４】
「フットプリント」は、形態の類似の周期性（形態間の距離）を有することを意味する。たとえば、１，５３６穴マイクロタイタープレートフットプリントでくぼみ又は突起を有する基板は、１，５３６穴マイクロタイタープレートの微小孔と同距離間隔で置かれた１，５３６のくぼみまたは突起を有するでろう。典型的に、９６穴プレートは隣の微小孔との間に約１ ｃｍの距離があり；３８４穴プレートは隣の微小孔との間に約０．５ ｃｍの距離があり；そして１，５３６穴プレートは隣の微小孔との間に約０．２５ ｃｍの距離がある。
【００３５】
パターン転写された生体分子８は、当業界で知られた通常のアレイ製作技術により形成される。通常の技術、たとえばロボットアレイ製作、シルクスクリーン印刷、およびインクジェット印刷、が用いられる。ソフトリソグラフィー技術は、米国特許Ｎｏ．５，５１２，１３１、Ｎｏ．５，７７６，７４８およびＮｏ．５，９７６，８２６に述べられている。
生体分子アレイの製作にソフトリソグラフィー技術を使用する利点は、これらの技術が生体材料と両立することである。すなわち多くの生体材料に有害な溶剤や紫外線を使用しないので、これらの技術はタンパク質および細胞をパターン転写するのに比類なく適している。
【００３６】
さらに、ソフトリソグラフィー技術は、約１μｍ〜約１ ｍｍの範囲の形態寸法といった、非常に小さな寸法で生体物質のパターンの製作および反復が可能である。さらに、ソフトリソグラフィー技術は、通常の微小製作技術に比較して設備投資額が小さいので、コストが低く、かつ材料そのもののコストも低い。さらに、ソフトリソグラフィー技術は、ＳＡＭのパターン転写および非特異性吸着に抵抗するチオールとの生物特異性配位子の組み合わせを可能にする。
【００３７】
ソフトリソグラフィー技術の共通構成単位は、転写または複写すべき形態を含む高分子鋳型または膜である。パターン転写の構成単位を、原版上に液状高分子先駆体を流し込み、硬化させて固体とし、それを原版から除去して製造する。図３は、通り穴９を有するゴム弾性膜１の形成を描写する。通り穴９は、原版１０上の突起２により形成される。液状高分子を、原版上の突起の上面を覆わないように、突起の高さよりもやや低目になるように流し込む。膜１を原版１０から剥がし、基板３の上に置く。生体分子を、膜１をマスクとして用いて基板３上にパターン転写する。図４は、通り穴の代わりに、微小孔４を有するゴム弾性膜１の形成を描写する。微小孔４を突起２を有する原版により形成する。液状高分子を、原版上の突起の上面を完全に覆うように流し込む。膜１を原版１０から剥がし、基板３上に任意に載せる。
【００３８】
好ましくは、ゴム弾性膜である遮蔽層１を、基板上に沈着する転写材料に対するマスクとして用いる。さらにゴム弾性膜を、基板上に化学実体を転写するためのスタンプとして使用できる。スタンプとして使用する時に、ゴム弾性膜を突起を有するように作る。これらの突起は、膜の突起していない部分が基板に接触せず、したがってこれらの部分に化学実体を転写しない基板との接触により、基板に化学実体を転写する。
【００３９】
好ましくは、膜パターン転写は、パターン転写された表面を形成するために使用される。アレイを製作するもの、これだけに限定するものではないがたとえばインクジェットは、タンパク質、細胞、核酸または化学実体のような生体分子を基板上に載せるのに使用される。通り穴を有する膜を、パターン転写された生体分子の望ましいアレイ／配置を製造するためのマスクとして使用する。さらに、膜パターン転写は、膜を「活性化」から保護すべき場所を遮蔽するために使用する。
【００４０】
膜パターン転写は、溶液中の反応物から基板表面の１部分を保護し、一方（膜の通り穴により暴露された）表面の残りの部分を化学、生化学、または生物反応のための反応物に暴露する。これらの反応は膜の通り穴を経由する試薬の運搬により達成される。これらの反応は、活性化反応、接合、分子識別、共有結合の生成、イオン相互作用、結合（すなわち、配位子−基板）事象、触媒反応、疎水性相互作用、親和性（すなわち、抗原−抗体）相互作用、ハイブリダイジェーション、水素結合生成、などであろう。
【００４１】
膜パターン形成又は膜パターン転写において、パターン形成又は膜パターン転写の構成単位は当業者に知られた如何なる適切な材料であっても良く、好ましくは、参照によりここに組み入れられている、Ｋｕｍａｒらの「表面での微小スタンプパターンの形成およびその誘導物」という米国特許Ｎｏ．５，５１２，１３１に記述されている如きエラストマーで形成されている。他の典型的エラストマーは、参照によりここに組み入れられており、米国特許Ｎｏ．５，６９１，０１８ （Ｋｅｌｌｅｙら）に開示されている。特に好ましいシリコンエラストマーは、ポリジメチルシロキサン（“ＰＤＭＳ”）である。典型的なＰＤＭＳ膜は、Ｍｉｄｌａｎｄ， ＭｉｃｈｉｇａｎのＤｏｗ Ｃｈｅｍｉｃａｌ 社からＳｙｌｇａｒｄという商標で販売されている初期重合体から型に取られたものを含む。好ましいＳｙｌｇａｒｄ初期重合体は、Ｓｙｌｇａｒｄ １８２、Ｓｙｌｇａｒｄ １８４およびＳｙｌｇａｒｄ １８６である。
【００４２】
ＰＤＭＳ層の好ましい鋳型の取り方は、原版へのエラストマーの紡ぎ被覆を含む（Ｄｕｆｆｙら、Ａｄｖ． Ｍａｓｔｅｒ，１１，Ｎｏ．７（１９９９）参照）。Ｋｕｍａｒら（米国特許Ｎｏ． ５，５１２，１３１）により記述されている他の適切な鋳型の取り方は、エラストマー先駆体をパターン上に注ぎ込むことを含む。原版表面上の突起の高さは、膜の最大の厚み（典型的に３〜１００μｍの厚み）を規定する。ＰＤＭＳ膜は、硬化後原版から除去される。
【００４３】
図１および２に示す如く、多数の通り穴９を有するＰＤＭＳ膜１は、材料、たとえば生体分子８または生体分子を含む溶液が、それを通して基板３上に沈着できるマスクとして使用される。ＰＤＭＳ膜は、ステンシルまたはマスクを形成するために基板にシールされる。この文脈での「シーリング」は、表面と接触させられるだろうが、表面にシールできない他の硬いまたは柔軟なマスクの操作とは区別されるべきである。
【００４４】
この文脈での「シーリング」は、膜が基板表面と接触し、液が遮蔽された表面に当てられた時に、液はマスクの通り穴と見当の合った遮蔽表面の部分のみと接触でき、液はマスクの下を通らずにマスクの固体部分によって覆われた基板表面の遮蔽部分に接触することを意味する。ＰＤＭＳ膜と基板表面をお互いに接触させる時に、シーリングは大した圧力をかけずに本質的に接触した瞬間に起こり、そうして圧力を維持しなくともシーリングを維持できる。シーリングは可逆的である。すなわち、膜は剥がすことにより基板表面から除去でき、そうして同じまたは異なる基板表面に再利用できる。厚い膜の方がより頑丈であり、より薄い膜よりも多数回再利用できる。さらに、シーリングは膜表面のプラズマ酸化により恒久的なものにできる。
【００４５】
いかなる生体分子、化学実体、または生化学分子も、パターンにアレイできる。典型的な生体分子は、タンパク質、核酸、および細胞である。生体分子は、当業者に知られた方法ですでに述べた基板の表面に固定化されるだろう。好ましくは、固定化は生物分子を損じない技術を用いて実施される。当業者に知られた典型的な方法は、親和力捕獲、共有誘導体化、たとえば、３−エチル−１−［Ｎ，Ｎ−ジメチル−（３−アミノプロピル）］−カルボジイミド（”ＥＤＣ”）とＮ−ヒドロキシ琥珀酸イミド（”ＮＨＳ”）との直接結合、および膜固着、ストレプトアビジン−ビオチンの使用、ニッケルキレート化、その他を含む。
【００４６】
他の化学または生化学種と反応するために表面を活性化できる化学種もまた表面でパターン転写されるだろう。たとえば、自己集合した単一層（ＳＡＭ）は、金表面基板上にパターン転写できる。生体分子をパターン転写することに加えて、基板は基板表面およびアレイ構成単位が相互作用できる領域ならびに出来ない領域の両方を含むようにパターン転写されるだろう。たとえば、微小密着印刷が、疎水性と親水性の領域が形成されるＳＡＭをパターン転写するために使用されるだろう。
【００４７】
ＳＡＭは、特別の表面に対して特定の反応性を有する官能基を持つ分子を用いて典型的に形成される。分子の残りは、典型的には注文されたアレイを形成するために単一層で隣接分子と相互作用する炭化水素鎖である。種々の特徴を有する単一層は、ＳＡＭの端末で種々の官能基を有することにより製造されるだろう。たとえば、一般的に疎水性、親水性、疎細胞性、親細胞性、疎生物性、親生物性であるＳＡＭが形成される。特定の結合親和性を有するそのようなＳＡＭは、特定のおよび予め決定されたパターンで細胞、タンパク質、または他の生物材料を接着または反発するパターン転写されたＳＡＭの製造を可能にするために製造できる。Ｓｉｎｇｈｖｉらへの米国特許Ｎｏ．５，９７６，８２６は、ＳＡＭ表面の誘導およびパターン転写に関するものであり、参照によりここに組み入れられている。
【００４８】
好ましいＳＡＭは、金表面にアルカンチオール［Ｘ−ＣＨ２（ＣＨ２）ｎＳＨ］、（一端にチオールまたはＳＨ基を有する炭化水素および端末に（“Ｘ”で代表される）官能基）、により形成される。”Ｘ”基は、−ＣＨ３、−ＯＨ、−ＣＮ、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ２、−ＮＨ２、−ＮＯ２、−ＳＯ３−、−ＳＯ２−、−Ｏ−ＳＯ３−２、−ＰＯ３２−、−ＰＯ３Ｈ−、−ＰＯ４３−、−ＰＯ３Ｈ２、−ＣＯＯＨ、−ＣＯＯ−、−（ＣＦ２）Ｐ−ＣＦ３（ここでｐ＝１〜２０）および２−イミダゾール、また同様に−ＣＯＯＲ、−ＮＲ２、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ２、ここにＲはＣ１〜Ｃ４、であろう。さらに、“Ｘ”基は、表面に沈着した細胞と相互作用するために接近できるならば、端末にある必要はない。
【００４９】
かくて、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−、−Ｃ（Ｏ）ＮＨＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｓ）ＮＨ−、−Ｒ−Ｓ−Ｒ、−Ｒ−Ｓ−Ｓ−Ｒ−および−Ｒ−Ｏ−Ｒ−基は、使用されるであろう親細胞官能基に属する。ＳＡＭはまた、表面を疎細胞性にするために使用されるであろう。親細胞性または疎細胞性物質は、表面をより親細胞性または疎細胞性にするためにＳＡＭを被覆するために使用されるであろう。ＳＡＭは、その上に他の層を作る基盤を提供し、その表面の性質は望ましいように修飾されるであろう。
【００５０】
ＳＡＭは、表面とチオールとの間の金属−硫黄結合の形成および引き続く炭化水素鎖結晶の密充填により作られる。Ｘ基を変更することにより、ＳＡＭは望ましい界面特性、すなわち濡れ、接着、生物両立性など、を有するように操作される。たとえば、ＣＦ３の頭基を有するＳＡＭはテフロン表面のように振舞うし、一方ＣＯＯＨの頭基を有するＳＡＭは、ガラス表面の濡れ特性を示す。かくて、ＳＡＭは表面に高分子、タンパク質、または細胞による吸着に対する抵抗性または受容性を付与することができる。さらに、ＳＡＭはまたその天然の配置および活性を維持するタンパク質をアレイ化できる。微量定量プレートの表面に直接置かれたタンパク質は、非特異的に吸着し、変性し、およびＳＡＭ上にパターン転写されたタンパク質に比較してその活性を減ずる。
【００５１】
最も好ましくは、表面は、金表面または基板の金被覆表面上のＳＡＭである。疎細胞性のための好ましいＳＡＭは、それらが金へのタンパク質の非特異的吸着を防止するための頑丈で良く特徴付けられた方法を提供するので、オリゴ（エチレングリコール）（“ＯＥＧ”）基を端末としたアルカンチオールである。ＯＥＧ基を端末に付けたＳＡＭは、その生物不活性のために有用である。ＯＥＧ端末を有するＳＡＭの使用は、ＳＡＭに対する「試験」タンパク質および細胞の非特異的結合を排除するので、バックグラウンドノイズを減少する。
【００５２】
本発明はまた、多層アレイシステムが基板上にパターン転写された細胞を利用する具体例も指向する。細胞のパターン転写されたアレイを利用する多層アレイシステムは、現在入手可能なものより細胞基盤の分析においてより高い処理量を提供できる。たとえば、本発明は、９６孔のプレートの標準孔の面積（約２０ ｍｍ２）に、２，０００以上のアレイ構成単位（たとえば細胞、タンパク質など）をパターン転写できる高密度の細胞パターン転写を提供する。
【００５３】
生体分子８のアレイを形成後（たとえば、図６を参照）、上部膜１を基板３上に置く（図７）。膜の配置は以下のようにする：膜への通り穴をアレイパターン転写で直接見当を合わせる（図７参照）；アレイのある構成単位のみ見当を合わせる（図８参照）；またはパターン転写された構成単位のどれも見当を合わせない；あるいはアレイの全部もしくは幾つかの構成単位を部分的にのみ見当を合わせる（たとえば、各パターンの半分だけ見当を合わせる）（図１０参照）。
【００５４】
他の選択肢として、アレイ化プロセス後に第２の（異なる）膜を用いる代わりに、アレイを形成するためにマスクとして使用された膜を基板上に残す。この具体例において、膜マスクの貫通孔は、明らかに直接アレイパターンに見当を合わせる。下部の１番目の膜の貫通孔を取り巻く溜めを規定する貫通孔を有する第２の膜は、第１の膜の上面に載せられるだろう。もし膜がアレイ化後に残されるなら、非特異性タンパク質結合故のバックグラウンド「ノイズ」を減少するために、タンパク質抵抗表面処理により膜を処理することが好ましい。
【００５５】
ＰＤＭＳ膜はゴム弾性があり柔軟なので、基板表面に置かれると、基板の輪郭に合致する。膜は基板を密封するので、液を後から微小孔９または溜め５（図１および２）に添加することが出来る。そのような液は膜の各微小孔または溜めに収容され、隣接する開口部から水力学的に隔離されるだろう。述語「微小孔」は、パターン転写された表面の上面に形成する構造は、底（基板の上面により規定され）および側面（膜の貫通孔の側面で規定される）からなることを意味する。他の選択肢として、膜は膜自身によって形成された「微小孔」を有するだろう。すなわち通り穴を有する代わりに、膜は膜内のへこみによって形成される微小孔を有する。図４参照。
【００５６】
この具体例は膜上に直接生体分子をパターン転写することが望ましい時、および基板上でのパターン転写が不要な時に有用である。述語「溜め」は、上部膜層の貫通孔である。溜めの直径（開口部が円形の時）または断面積（開口部が円形でない時、たとえば楕円、四角、長方形、その他）は、微小孔の寸法に丁度一致するものから、複数の微小孔を含むまたは全アレイを含む開口部を有するもの迄にわたる寸法で変化できる。好ましくは、溜めの直径または断面積は、１個の微小孔のそれよりも大きいだろう。より好ましくは、溜めは、標準のマイクロタイタープレート、たとえば６穴、１２穴、２４穴、９６穴、３８４穴、１５３６穴プレートの微小孔の寸法に対応する直径または断面積を有する。
【００５７】
好ましい具体例において、上部の膜層４（図１または２）は、下部の膜層１の上面を密封する。膜４は、有機、無機、高分子、および複合材を含む多くの異なる材料から製造されるだろう。硬い材料が膜４を調製するために使用されるだろうが、好ましい材料は柔軟性および弾性の特徴を有する高分子である。最も好ましくは、膜４はＰＤＭＳのようなゴム弾性の膜である。多層アレイシステムが通常の微量定量プレート読取装置またはアレイと共に使用される時には、膜４は取扱いを容易にするために硬い構造である。好ましい硬い材料は、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリメチルメタアクリレート、またはガラスを含む。
【００５８】
膜４（図１および２）は、少なくとも１個の溜めを含む。溜め５の寸法は、如何なる数の微小孔９をも暴露するように変化する。開口部の周期性（２個の隣接する開口部の間の距離）６は、約１μｍ程度の小ささであろう。多数の膜を使用するなら、各膜の開口部の寸法および周期性はお互いに同じまたは異なるであろう。膜の厚さは約１μｍから１ｃｍまで変化し得る。もし膜を再利用するなら、膜は好ましくは５０μｍより厚い。
【００５９】
図１および２は、貫通孔の複数のアレイを含む膜４を描写する。この貫通孔は、最初の膜層１の貫通孔を通して生体分子８をパターン転写することにより作られた微小アレイの周りの溜め５を規定する。図２は、３個の微小孔を取り囲む溜め５を描写する。上部膜の溜めは、望ましい数の微小孔を取り囲むために如何なる寸法でも良い。かくて、たとえば、もし溜めを６孔プレートの微小孔の寸法に合わせることが望ましいなら、液溜りは約３６ ｍｍの直径を有するだろう。また、１２穴プレートの微小孔の寸法に合う溜めは、約２４ ｍｍの直径を有するだろう。９６穴プレートまたは１５３６穴プレート配置を用いる高密度アレイでは、溜めは直径約５ ｍｍ（９６孔プレート）または約１．７ ｍｍ（１５３６孔プレート）であろう。
【００６０】
かくて本発明の微小アレイは、微小孔および溜めの如何なる望ましい配置または寸法にも適応できるように設計できることは明白である。１具体例において、最初の膜の貫通孔または微小孔は、直径約１μｍ〜約１ｍｍ（断面積約１μｍ２〜約１ ｍｍ２）であり、および液溜りは直径約１．７ ｍｍ〜約５ ｍｍ（断面積２．９ ｍｍ２〜約２５ ｍｍ２）である。他の具体例において、最初の膜の貫通孔は、直径約３μｍ〜約５００μｍ（断面積９μｍ２〜約２５０，０００μｍ２）である。
【００６１】
パターン転写したアレイを製造するための貫通孔の配置および溜めの配置は、無限のアレイ変数を含むように変化する。たとえば、図１１はパターン転写されたある構成単位のみを取り囲む液溜りを有する最上部のＰＤＭＳ膜の使用を描写する。図１１において、液溜りは４個のパターン転写された構成単位を取り囲む。この典型的な配置により、各液溜りにおいて異なる反応または分析を遂行できる。さらに、アレイは全て同じ生体分子からなるだろうし、または全てのアレイは異なる生体分子もしくはその中間の如何なる変化からなるだろう。
【００６２】
本発明の１具体例は、多層のアレイシステムが１枚のゴム弾性膜に統合されている多層アレイシステムを指向する。この具体例において、好ましいゴム弾性膜はＰＤＭＳである。図５は膜の下層に微小孔１を有し、複数の微小孔を重ね合わせた上層に溜め２を有するＰＤＭＳ膜の製作を描写する。例７は典型的多層アレイ膜の形成を議論する。原版はゴム弾性膜の望ましい貫通孔に対応する位相的形態を有して作られる。エラストマーは原版上に紡がれ、硬化後、剥がされる。
【００６３】
膜はそれから反転され、適切な基板上に置かれる。好ましい基板は上で議論されている。膜はその下層に微小孔を持つ配置を好ましくは有する。この時、微小孔の側面は膜の貫通孔の壁により規定され、および微小孔の底は基板の上面により規定される。好ましくは、膜の上層の貫通孔は下層の多数の微小孔を取り囲む溜めを形成する。好ましい具体例において、上方の溜めは通常のマイクロタイタープレート、たとえば、６穴、１２穴、２４穴、９６穴、３８４穴、または１５３６穴のマイクロタイタープレートに合致するフットプリントを有する。
【００６４】
他の選択肢として、下層の微小孔は完全にエラストマーで形成され、そうして底、微小孔の側面も同様に、エラストマーにより規定される。この具体例において、生体分子の微小アレイは膜を通して基板上にパターン転写され、または膜が下層の貫通孔の代わりに微小孔を有する場合には、生体分子はエラストマーにより形成された微小孔の底の上に直接パターン転写される。好ましい生体分子は、上に議論されている。
【００６５】
本発明は、配置の異なる貫通孔を有する多数の膜の連続使用をも提供する。１個の貫通孔配置を有する膜を使用する代わりに、多数の膜が多数のアレイを形成するために使われる。プロセスの各工程で、異なるアレイ構成単位が基板上にパターン転写されるだろう。１枚の膜に１個のアレイを形成後、ある特定のアレイ構成単位のみを暴露するために第２の膜が、（最初の膜を含んでいる）最初のアレイの上に置かれる。これにより他のアレイの中に１個のアレイを形成する。図１２は、多数の膜の連続的使用例を描写する。一般的に、最初の膜を基板の上面に置く。最初の膜をステンシルとして使用し、材料を貫通孔中の基板上に沈着する。
【００６６】
分析を行うかまたは反応を各微小孔で進行させる。膜を除去する。第２の膜を基板の上に置く。この第２の膜の開口部の寸法および周期性は、第２の沈着、分析、または反応が以前にパターン転写された構成単位の直上、部分的に上、または重なることなく起こるようにする。この膜の配置および材料沈着プロセスは必要回数繰り返される。最後のアレイが形成された時、他の膜は一緒に分析される一連のアレイ構成単位を形成するか、またはパターン転写された構成単位を分離するためにアレイの上に置かれる。
【００６７】
本発明により企画される多層アレイの配置数は、無限である。１具体例において、上部膜にある溜めの寸法、配置、および周期性は、基板上にパターン転写されたアレイのそれらと合致する。たとえば、１００個の貫通孔を有する最初の膜は、基板上に１００個の異なるタンパク質をパターン転写するためのマスクとして使用される。反応は、次いで膜の通り穴および基板の上面により形成された１００個の微小孔の夫々で行われる。
【００６８】
この具体例の他の例は、マスク膜を通して基板上に１００個の異なるタンパク質をパターン転写後、第１の膜と全く同じフットプリントを有する第２の膜が、より深い微小孔を形成するために第１の膜の上面に置かれる時に起こる。他の選択肢として、パターン転写のために使用された第１の膜は除去されるだろう、そうして同じフットプリントを有する他の膜がパターン転写された基板上に置かれる。さらに、細胞のパターン転写は、貫通孔の代わりに、微小孔を有する第１の膜上で達成される。同じフットプリントを持つ貫通孔を有する第２の膜は、第１の膜の上面に置かれる。
【００６９】
他の具体例において、上部膜の溜めは、複数のアレイ構成単位を取り囲み、同時に複数の分析を可能にする。この具体例を、図１２に描写する。典型的なアレイは、標準の６穴、１２穴、２４穴、９６穴、３８４穴、または１５３６穴マイクロタイタープレートのフットプリント（貫通孔の寸法、配置、および周期性を孔と調整する）を持つ多数の上部膜を有する。図１３は、上部膜が９６孔のフットプリントを有する多層アレイシステムを描写する。たとえば、９６ ｘ １００の貫通孔を持つ第１の膜を、９６組の１００個の異なる生体分子を基板上にパターン転写するのに用いる。
【００７０】
９６個の貫通孔を持つ第２の膜を、パターン転写された基板／第１膜の組み合わせの上面に置く。第２の膜の９６個の貫通孔の夫々は、第１の膜の１組の１００個の貫通孔を取り囲む溜めを形成する。かくて、第２の膜の９６個の溜めは夫々、下層膜の１００個の異なる貫通孔を取り囲む。換言すれば、各溜めは１組の１００個のパターン転写されたタンパク質を取り囲む。これにより、１００個の異なるタンパク質が９６個の異なる反応で分析される。
【００７１】
第３の具体例において、異なる貫通孔を有する膜を、多層アレイを形成するために使用する。図１２は、典型的な多変数アレイを描写する。この図で第２、第３、および第４の膜は、全て異なる貫通孔の配置を有する。
図１４は、位相的にパターン転写された基板および膜を含む本発明の他の具体例である。この具体例は多くのプロセスで使用できるが、特に細胞生理学で有用である。位相的にパターン転写された基板は、へこみまたは突起を有する基板により生じる。典型的には、へこみは基板表面の微小孔を表す。好ましい微小孔は、約１μｍ３（すなわち１０−１５Ｌ）から１ ｍＬの液容積を保持できる。
【００７２】
他の好ましい具体例において、貫通孔を有する第１の膜を、基板上に１００個の異なる生体分子をパターン転写するために使用する。下部のパターン転写された生体分子を取り囲む溜めを規定する貫通孔を有する第２の膜を、第１の膜の上面に置く。反応は各溜めで行われる。全体の多層アレイシステムの寸法は十分小さいので、６穴、１２穴、２４穴、９６穴、３８４穴、または１５３６穴プレートのような通常のマイクロタイタープレートの微小孔内に置くことができる。さらなる反応は、次いで微量定量プレートの孔の中で達成される。
【００７３】
基板上の突起または位相形態は、当業者に知られた方法を用いて調製される。基板は高分子性の複製、シリコンもしくはガラス上にパターン転写されたフォトレジストであろうし、または好ましくは、ＰＤＭＳパターン転写構成単位である。種々のソフトリソグラフ技術は、ＰＤＭＳ膜または使用すべき他のレプリカを調製するために使用されるだろう。典型的な技術は、レプリカモールディング、毛細管内微小モールディング、溶媒補助微小モールディング、および転写モールディングを伴う。上に議論したレプリカモールディングは、形成されるべきパターンの鏡像に対応する表面レリーフを含む原版に対してＰＤＭＳ先駆体を鋳型にとることを伴う。
【００７４】
毛細管内微小モールディングは、基板に対してＰＤＭＳ原版を置くことを伴う。原版の突起のみが基板に接触するので、毛細管の網状組織が形成される。これらの毛細管は高分子先駆体で満たされ、そうして架橋されて固体になる。これは、ＰＤＭＳ上にパターンの陰画レプリカである構造を持つ基板をもたらす。溶媒補助モールディングは、溶媒で柔らかくした高分子に対してＰＤＭＳを刷り込むことにより高分子レプリカを形成することを伴う。転写モールディングは、液状高分子先駆体でＰＤＭＳ鋳型のレリーフパターンを満たし、基板の表面に転写し、これをあとで固体と架橋することを伴う。
【００７５】
前述の具体例および以下の例は、多くの可能性のある多層アレイの幾つかを代表するにすぎない。これらの例は、発明を限定することを意味するものではなく、沢山の多層アレイの組み合わせを製造する方法を説明するために含まれている。
【００７６】
実施例
実施例１． パターン転写された基板および１枚のＰＤＭＳ膜
シリコンまたはガラスの上に支持された金の薄膜を、微小密着印刷に用いる（“μＣＰ”）。ＰＤＭＳスタンプにヘキサデカンチオールの１〜３％（ｗ／ｖ）エタノール溶液でインキを付ける。ＰＤＭＳスタンプを金薄膜と接触して置いた時に、スタンプ上の突起のみが金属と接触する。ヘキサデカンチオールはスタンプから表面に移動して、ヘキサデカンチオレートのＳＡＭを形成する。スタンプを除去後、金薄膜を１％のＨＯ（ＯＣＨ２ＣＨ２Ｏ）６（ＣＨ２）１１ＳＨを含むエタノール性溶液で洗う。このチオールは、金表面の部分を修飾する（それを疎細胞性にする）が、一方μＣＰはしなかった。表面をエタノールで洗い、緩やかな窒素気流中で乾燥する。
【００７７】
修飾された金基板を、次いで〜１０μ／ｍＬのフィブロネクチン（または細胞外基質タンパク質として一般的に知られている他のタンパク質）を含む緩衝液（典型的にリン酸塩緩衝生理食塩水）中に漬ける。タンパク質は選択的に疎水性域（すなわちヘキサデカンチオール修飾表面）に吸着する。タンパク質は、オリゴエチレングリコール修飾表面に吸着しない。開口部の望ましい寸法と周期性を有する膜を、小孔のアレイを形成するためにパターン転写された表面の上面に置く。多層アレイをかくて創造した。基板上にパターン転写されたタンパク質は、第１のアレイを提供し、第２のアレイはパターン転写されたタンパク質の周りの液溜りを規定する上部の膜により形成される。
【００７８】
たとえば、３Ｔ３およびＭＤＣＫ細胞のような細胞の懸濁液を各孔に加えるだろう。細胞はタンパク質吸着域の上面にのみパターン転写する。細胞性のパターン転写後、分析を各孔で行う。
各孔の底がパターン転写された後、パターン転写された構成単位を損じることなく残すために、膜は除去されるだろう。または膜は基板上に残され、そうして形成された微小孔を利用することにより分析を行うであろう。
【００７９】
例２． パターン転写された細胞を利用する多層アレイシステム
図１４は、細胞生物学において有用な多層アレイシステムの１具体例を描写する。基板は（これはＰＤＭＳ膜であることも出来る）、微小孔を形成する突起を有する。ＰＤＭＳ膜をこの基板の上面に置く。図１４において、上部の膜は多数の微小孔を取り囲む液溜りを規定する通り穴を有する。すなわち、上部膜の通り穴は、断面表面積により規定されるより直径がより大きい、すなわちより広い開口部を有する。
【００８０】
不動態化剤、たとえば血清アルブミン、βカゼイン、ヒドロゲル（たとえば、より低分子量のポリヒドロキシエチルメタクリレート）を含む水溶液を、１ ｍｇ／ｍＬの溶液濃度で、膜−基板構造につける。不動態化剤は底面の膜の上面のみを被覆するので、水溶液は微小孔の底を濡らさない。表面張力のため、不動態化剤は上部の基板のみを被覆する。かくて、この例では、不動態化剤は上部のＰＤＭＳ膜のみを被覆する。細胞を含む媒地が次いで構造物に添加される。細胞は、不動態化剤で被覆されなかった膜／基板複合体の全域に吸着する。かくて、この図において、最上層のＰＤＭＳ膜で遮蔽されなかった基板層の微小孔のみが、吸着した細胞を有する。
【００８１】
例３． 多層アレイシステムを用いるＳＡＭ上へのタンパク質のパターン転写
ＣＯＯＨ端末を持つＳＡＭ基板を下記の如く形成した。基板を、エタノール中に全部で２ ｍＭのチオール濃度のＨＳ（ＣＨ２）１０ＣＯＯＨ： ＨＳ（ＣＨ２）１１（ＣＨ２Ｏ）３ＯＨ（“ＯＥＧ”）の５：９５混合物に漬ける。９６孔微量定量プレートに合致するフットプリントを有する膜を基板上に置いた。各孔を緩衝液で満たした。ついで０．２ Ｍ ＥＤＣおよび ０．０５ Ｍ ＮＨＳのカップリング剤の水溶液（ｐＨ ７．０）を、ＣＯＯＨ端末基を活性化するために、全部の基板／微小孔に添加した。反応を室温で２０〜３０分間進行させた。タンパク質を次いで各孔に添加した。タンパク質はカルボン酸端末を有するＳＡＭ（「活性化」ＳＡＭ）にのみ架橋した。反応を室温で４時間進行させた。タンパク質に対する抗体を用いて、孔の底へのタンパク質の付着を確認した。
【００８２】
例４． 典型的な多層微小アレイ
金表面基板を、ＳＡＭを形成するためにＣＯＯＨ端末チオールで処理する。ＳＡＭを次いで、ＥＤＣ／ＮＨＳで処理する。９６孔プレートの孔に対応する位置に中心を置く各「微小アレイ」の９６ｘ（１０ｘ１０）（直径１００ μｍ）の通り穴を含むＰＤＭＳ膜をＳＡＭ上に密封する。ＰＤＭＳ膜を不活性物質（不動態化剤）で処理して、タンパク質の吸着に抵抗性をもたせる。タンパク質溶液（たとえば、ライブラリーからの１００個の異なるタンパク質）を、インクジェットのような普通のアレイ化役を用いて（膜は１００μｍの通り穴により規定された）「暴露された」ＣＯＯＨ端末金表面に転写する。
【００８３】
１００個の異なるタンパク質を各アレイ内にパターン転写し、９６孔プレートのフットプリント上に１００個の異なるタンパク質の９６個の同一微小アレイを形成する。８ｘ１２アレイ（各列１２個の通り穴が８列）上に、９ ｍｍ間隔で、９６個の通り穴（直径５ ｍｍ）のアレイを含む硬いプラスチック片の位置を調整し、下部の膜により規定された９６個の微小アレイに密封する。１００個の異なるタンパク質について９６の別々の分析を、５ ｍｍの孔の夫々で実施する。図１３はこの配置を描写する。
【００８４】
例５． パターン転写に用いられた膜の除去を伴う典型的な多層アレイシステム
１００個のタンパク質溶液を暴露されたＣＯＯＨ端末金表面に転写後、上例を実施するが、最初の膜を除去し、次いで９ ｍｍ間隔で配置した８Ｘ１２（９６）の直径５ ｍｍの孔を含むゴム弾性膜により置換する。硬いプラスチック片の位置を次いで調整し、この膜に密封する。
【００８５】
例６． 多層アレイシステムを用いる分析
１００個の異なるキナーゼ基板（通常キナーゼタンパク質自身）を９６孔フットプリント上の１０ｘ１０アレイに９６回パターン転写する。ＰＤＭＳ膜を１００個のキナーゼの各アレイの周りに液漏れの無い密封を形成するために使用する。キナーゼと９６個の異なる新薬候補の混合物を含む９６の異なる溶液を、同じ１００個の基板を含む９６個の異なる孔に添加する。基板のリン酸化、そうしてそれ故キナーゼ−基板相互作用に対する各医薬品の影響を、抗体検出により観測した。効果的な医薬品すなわち「ヒット作」をリン酸化の阻害により決定する。
【００８６】
例７． １枚のゴム弾性膜でのアレイの製作
図１６に描写する如く、原版はシリコンウェハー上にフォトレジスト材料の層を紡いで製作する。９６孔のフットプリントを有するマスクをフォトレジスト層上に置く。このマスクされた層を、最初のフォトレジスト層に９６孔パターン転写を製造するために、紫外光に暴露する。フォトレジスト材料の第２の層を、最初の層の上に紡ぎ出す。好ましい微小アレイ配置を作るために通り穴のパターンを有するマスクを第２のフォトレジスト層の上面に置き、紫外光に暴露する。未架橋のフォトレジストが作り出される。
【００８７】
ＰＤＭＳを、フォトレジストの第２層の微小アレイパターンに対応する通り穴を持つ下部を有するＰＤＭＳ膜を形成するために、レジストの第２層よりも若干低い高さで原版に紡ぎ出す。ＰＤＭＳ膜は、最初のフォトレジスト層の９６孔フットプリントに対応する液溜りを持つ上部を有する。他の選択肢として、通り穴の代わりに、微小孔を形成するために、フォトレジスト原版を完全に覆うためにＰＤＭＳを原版上に紡ぎ出す。結果のＰＤＭＳ膜は、フォトレジストの第２の層の微小アレイのパターンに対応する通り穴に代わる微小孔を有する。ＰＤＭＳ膜を次いで原版から剥がし、金のような適切な基板に密封する。
【００８８】
例８． 生物特異性配位子を持つＳＡＭの微小アレイ
図１５は、ガラスまたはシリコンのような基礎となる基板３を有する微小アレイを描写する。金属被覆１２、たとえば金、銀、白金、パラジウム、または合金を、基板３の上面に置く。ＳＡＭ１１を金属被覆１２の上面に形成する。ＳＡＭ１１は、不活性チオール１３ｂで希釈した生物特異性配位子１３ａを有する。配位子の希釈は、ＳＡＭへの生体分子の非特異的結合により引き起こされるバックグラウンドノイズの減少を助ける。ゴム弾性膜１をＳＡＭの上面に置く。膜１は貫通孔を有する。タンパク質６は、貫通孔を通してＳＡＭ上にパターン転写される。第２の膜４を最初の膜１の上に置く。膜４の通り穴は、多数のパターン転写されたタンパク質６を取り囲む液溜りを規定する。
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は、多層アレイシステムの概略横断面図である。図の１ａは、微小孔を規定する膜を描写する。図１ｂは、アレイの間の隙間を規定する膜を描写する。
【図２】
図２は、多層アレイシステムの概略の平面図である。
【図３】
図３は、原版上にある突起により規定される貫通孔を有するＰＤＭＳ膜の形成を描写する。
【図４】
図４は、原版上にある突起により規定される微小孔を有するＰＤＭＳ膜の形成および基板上への任意の配置を描写する。
【図５】
図５は、単一ＰＤＭＳ膜システムの多層アレイ形成の概略である。
【図６】
図６は、パターン転写したアレイの概略例解である。この特定の例において、生体分子の１２のアレイが基板上にパターン転写されている。
【図７】
図７は、下の基板上の固定生体分子のパターン転写されたアレイに直接対応する貫通孔を有する膜の概略である。
【図８】
図８は、下の基板上にパターン転写されたアレイの１部を保護するが、一方アレイ構成単位の他の部分を暴露する貫通孔を有する膜を描写する概略である。
【図９】
図９は、下にパターン転写され、配列された構成単位の全部を保護するが、パターン転写された構成単位を持たない基板部分を暴露する膜を描写する概略である。
【図１０】
図１０は、各パターン転写されたアレイの半分を保護する膜を描写する概略である。
【図１１】
図１１は、パターン転写された構成単位部分のみを暴露する、パターン転写された基板の上に置かれたＰＤＭＳ膜を描写する。これにより、異なる分析が上部の膜の通り穴により規定される各溜めで達成できる。
【図１２】
図１２は、基板上のアレイにパターン転写する多数の膜を使用する多層アレイシステムを描写する。
【図１３】
図１３は、上部の膜の溜めが９６穴プレートのフットプリントを有する多層アレイを描写する。
【図１４】
図１４は、織られた基板および膜を採用した多層アレイシステムを描写する。上に出た部分を不動態化剤で被覆し、この部分への細胞の付着を制限する。これにより、微小孔への細胞の沈着を可能にし、基板の周辺部を細胞が付かない状態に保つ。
【図１５】
図１５は、生物特異性配位子を有するＳＡＭを採用した微小アレイを描写する。
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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