(57)【要約】エネルギー−可逆的アシル複合体、中間体、及び関連組成物を開示する。好ましい態様では、このような組成物の例は、式（Ａ）及び（Ｂ）を含む。
2004535379.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）：
【化１】
2004535379.tif 000015
〔式中、
Ｒ1及びＲ2は、Ｈ、ＣＨ3、Ｃ2〜Ｃ10アルキル、Ｃ2〜Ｃ10アルケニル又はＣ2〜Ｃ10アルキニル（それぞれが置換されていても非置換であってもよく、直鎖であっても分岐鎖であってもよい）；Ｃ2〜Ｃ10ヘテロアルキル、Ｃ2〜Ｃ10ヘテロアルケニル又はＣ2〜Ｃ10ヘテロアルキニル及び−（ＣＲ15Ｒ16）p−Ｄからなる群より独立して選択され、
ここで、Ｒ15及びＲ16は、Ｈ、ＣＨ3、Ｃ2〜Ｃ10アルキル、Ｃ2〜Ｃ10アルケニル又はＣ2〜Ｃ10アルキニル（それぞれが置換されていても非置換であってもよく、直鎖であっても分岐鎖であってもよい）；及びＣ2〜Ｃ10ヘテロアルキル、Ｃ2〜Ｃ10ヘテロアルケニル又はＣ2〜Ｃ10ヘテロアルキニルからなる群より独立して選択され；
ｐは、１〜約１２の正の整数であり；
Ｄは、−ＳＨ、−ＯＨ、Ｘ2、−ＣＮ、−ＯＲ19、ＮＨＲ20、
【化２】
2004535379.tif 000016
（式中、
Ｒ17は、Ｈ、ＣＨ3又はＸ3であり；
Ｒ18は、Ｈ、Ｃ1〜Ｃ4アルキル又はベンジルであり；
Ｒ19は、Ｈ、Ｃ1〜4アルキル、Ｘ2又はベンジルであり；
Ｒ20は、Ｈ、Ｃ1〜10アルキル又は−Ｃ（Ｏ）Ｒ21であり、
ここで、Ｒ21は、Ｈ、Ｃ1〜4アルキル又はアルコキシ、ｔ−ブトキシ又はベンジルオキシであり；
Ｘ2及びＸ3は、独立して選択されるハロゲンである）
の中から選択され、
Ｒ3は、Ｈ、ＣＨ3、又は−Ｃ（＝Ｏ）（ＣＲ15Ｒ16）ｗ−Ｄであり、
（ここでｗは、０又は１〜約１２の整数であり、Ｄは、Ｈであるか又はＲ1及びＲ2に関する記述とおりである）
Ｊは、Ｏ、ＮＨ又はＳであり；
Ｒ4、Ｒ5、及びＲ6は、Ｈ、ＣＨ3、Ｃ2〜Ｃ10アルキル、Ｃ2〜Ｃ10アルケニル又はＣ2〜Ｃ10アルキニル（それぞれが置換されていても非置換であってもよく、直鎖であっても分岐鎖であってもよい）；Ｃ2〜Ｃ10ヘテロアルキル、ヘテロアルケニル又はヘテロアルキニル及びハロゲンからなる群より独立して選択され；
Ｚは、ＮＲ7Ｒ8又は
【化３】
2004535379.tif 000017
であり、
式中、
Ｒ7は、Ｈ、ＣＨ3、Ｃ2〜Ｃ10アルキル、アルケニル又はアルキニル（置換されていても非置換であってもよく、直鎖であっても分岐鎖であってもよい）；Ｃ2〜Ｃ10ヘテロアルキル、ヘテロアルケニル又はヘテロアルキニル、又は−（ＣＲ23Ｒ24）ｑアリール、又はＲ8の中から選択され、
ここで、Ｒ23及びＲ24は、Ｈ及びＣ1〜Ｃ10アルキルからなる群より独立して選択され；
ｑは、１〜約６の整数であり；
Ｒ8は、（ＣＲ9Ｒ10）n−ＮＲ22−Ｒ11、（ＣＲ9Ｒ10）n−ＣＨ2−ＮＨＣ（Ｏ）Ｒ26及び（ＣＲ9Ｒ10）n−ＣＨ2−Ｅからなる群より選択され、
（ここで、Ｒ9及びＲ10は、Ｈ、ＣＨ3、Ｃ2〜Ｃ10アルキル、Ｃ2〜Ｃ10アルケニル又はＣ2〜Ｃ10アルキニル（それぞれが置換されていても非置換であってもよく、直鎖であっても分岐鎖であってもよい）；Ｃ2〜Ｃ10ヘテロアルキル、Ｃ2〜Ｃ10ヘテロアルケニル又はＣ2〜Ｃ10ヘテロアルキニル及びハロゲンからなる群より独立して選択され；
Ｒ26は、Ｈ、ＣＨ3、Ｏ−ｔ−ブチル、Ｏ−ベンジルであり；
Ｅは、ＯＨ、ＳＨ又はＯ−Ｃ（Ｏ）Ｒ27（式中、Ｒ27は、Ｃ1〜Ｃ6アルキル、ベンジル又はフェニルである）であり；
Ｒ22は、Ｈ又はＣＨ3であり；
ｎは、１〜約１０の正の整数であり；
Ｒ11は、Ｈ又は−Ｌ−Ｂ（式中、Ｌはリンカーであり；Ｂは、第１の活性部分、反応基部分又はポリマーである）であり、
Ｒ25は、Ｈ、−Ｃ（Ｏ）−Ｒ28又は−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−Ｒ29（式中、Ｒ28は、Ｃ1〜Ｃ6アルキル又はベンジルであり；Ｒ29は、ＣＨ3、ｔ−ブチル又はベンジルである）であり、
Ｘ1は、Ｏ、ＮＨ、又はＳであり；
Ａは、Ｈ又は第２の活性部分である〕
を含む、化合物。
【請求項２】
Ｚが、ＮＲ7Ｒ8である、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
Ｒ8が、−ＣＨ2−ＣＨ2−ＮＨ2である、請求項２に記載の化合物。
【請求項４】
Ｒ8が、（ＣＲ9Ｒ10）n−ＮＲ22−Ｒ11である、請求項２に記載の化合物。
【請求項５】
Ｌ−Ｂが、マレイミジル基又はＮ−ヒドロキシスクシンイミジル基を含む、請求項１に記載の化合物。
【請求項６】
Ｒ11が、ポリアルキレンオキシド残基を含む、請求項４に記載の化合物。
【請求項７】
前記ポリアルキレンオキシド残基が、ポリエチレングリコールである、請求項６に記載の化合物。
【請求項８】
前記ポリエチレングリコールが、約２，０００〜約２００，０００ダルトンの数平均分子量を有する、請求項７に記載の化合物。
【請求項９】
Ｒ11が、コラーゲン、グリコサミノグリカン、ポリ（−アスパラギン酸）、ポリ（−Ｌ−リシン）、ポリ（−乳酸）、ポリ−Ｎ−ビニルピロリドン並びにポリ（−乳酸）及びポリ（−グリコール酸）のコポリマーからなる群のメンバーを含む、請求項４に記載の化合物。
【請求項１０】
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、及びＲ6が、Ｈ、ＣＨ3及びＣＨ3ＣＨ2からなる群より独立して選択される、請求項１に記載の化合物。
【請求項１１】
Ｒ7が、ＣＨ3ＣＨ2であり；Ｒ8が、−（ＣＲ9Ｒ10）n−ＮＲ22−Ｒ11であり；そしてＲ9及びＲ10が、Ｈであり；ｎが、２であり；Ｘ1が、Ｏ、Ｓ又はＮＨである、請求項４に記載の化合物。
【請求項１２】
Ｒ7が、ＣＨ3ＣＨ2であり；Ｒ8が、−（ＣＲ9Ｒ10）n−ＮＲ22−Ｒ11であり、そしてＲ9及びＲ10が、Ｈである、請求項４に記載の化合物。
【請求項１３】
前記第２の活性部分が、Ｘ1Ａ1又はＸ1Ａ2からなる群のメンバーを含み、
ここで、Ｘ1Ａ1は、アミノ酸、アミノ酸誘導体、ペプチド、ペプチド誘導体、及びセリンプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、エステラーゼ、リパーゼ、又は活性部位セリン若しくはシステインを含む他の酵素の基質又は基質類縁体からなる群より選択される基質又は基質類縁体であり；
Ｘ1Ａ2は酵素である、
請求項１に記載の化合物。
【請求項１４】
Ｘ1Ａ1が、下記式
【化４】
2004535379.tif 000018
〔式中、Ｒ12及びＲ13は、独立してＨ又は電子供与基又は電子吸引基であり、Ｗは、ＣＨ又はＮである〕
の一部である、請求項１３に記載の化合物。
【請求項１５】
Ａ2が、セリンプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、エステラーゼ、リパーゼ及び活性部位セリン又はシステインを含む酵素からなる群より選択される酵素である、請求項１３に記載の化合物。
【請求項１６】
Ｊが、Ｏであり、Ｒ2が、Ｈであり、Ｒ7が、ＣＨ3ＣＨ2であり；Ｒ8が、−（ＣＲ9Ｒ10）n−ＮＲ22−Ｒ11であり、Ｒ9及びＲ10が、Ｈであり、ｎが、２である、請求項１４に記載の化合物。
【請求項１７】
Ｘ1Ａ2が、活性部位セリン又はシステインを有する酵素である、請求項１５に記載の化合物。
【請求項１８】
Ｘ1Ａ2が、血液凝固因子である、請求項１１に記載の化合物。
【請求項１９】
酵素が、プラスミン、ウロキナーゼ、及び組織プラスミノーゲンアクティベーターからなる群より選択される、請求項１１に記載の化合物。
【請求項２０】
Ｘ1Ａ1が、酵素と相互に作用することができる、アミノ酸、ペプチド、基質又は基質類縁体である、請求項１３に記載の化合物。
【請求項２１】
前記アミノ酸が、イソロイシン、フェニルアラニン、チロシン、リシン、アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グルタミン及びアスパラギンからなる群より選択される、請求項２０に記載の化合物。
【請求項２２】
【化５】
2004535379.tif 000019
2004535379.tif 000020
〔式中、ＰＥＧは約２，０００〜約２００，０００の分子量を有するポリエチレングリコールであり；
ｍＡｂはモノクローナル抗体である〕
からなる群より選択される、請求項１に記載の化合物。
【請求項２３】
前記モノクローナル抗体が、トラスツズマブである、請求項２２に記載の化合物。
【請求項２４】
Ｌ−Ｂが、マレイミジル基又はＮ−ヒドロキシスクシンイミジル基を含む、請求項１に記載の化合物。
【請求項２５】
請求項１に記載の化合物の薬学的に許容し得る塩。
【請求項２６】
Ｂが第１の活性部分である、請求項１に記載の化合物の有効量を、このような処置を必要としている哺乳動物に投与することを含む、処置方法。
【請求項２７】
前記哺乳動物への投与後、請求項１に記載の化合物をエネルギー源に曝露することをさらに含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記エネルギー源が、３４０〜７００nmの範囲の波長を有する白色光である、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記エネルギー源が、３５０〜４２０の範囲の波長を有する白色光である、請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
前記エネルギー源が、マイクロ波、超音波、電波エネルギー、γ放射線、放射能、紫外線及び赤外線からなる群より選択される、請求項２７に記載の方法。
【請求項３１】
複合体を調製する方法であって、式（IV）：
【化６】
2004535379.tif 000021
〔式中、
Ｒ1及びＲ2は、Ｈ、ＣＨ3、Ｃ2〜Ｃ10アルキル、Ｃ2〜Ｃ10アルケニル又はＣ2〜Ｃ10アルキニル（それぞれが置換されていても非置換であってもよく、直鎖であっても分岐鎖であってもよい）；Ｃ2〜Ｃ10ヘテロアルキル、Ｃ2〜Ｃ10ヘテロアルケニル又はＣ2〜Ｃ10ヘテロアルキニル及び−（ＣＲ15Ｒ16）p−Ｄからなる群より独立して選択され、
ここで、Ｒ15及びＲ16は、Ｈ、ＣＨ3、Ｃ2〜Ｃ10アルキル、Ｃ2〜Ｃ10アルケニル又はＣ2〜Ｃ10アルキニル（それぞれが置換されていても非置換であってもよく、直鎖であっても分岐鎖であってもよい）；及びＣ2〜Ｃ10ヘテロアルキル、Ｃ2〜Ｃ10ヘテロアルケニル又はＣ2〜Ｃ10ヘテロアルキニルからなる群より独立して選択され；
ｐは、１〜約１２の正の整数であり；
Ｄは、−ＳＨ、−ＯＨ、Ｘ2、−ＣＮ、−ＯＲ19、ＮＨＲ20、
【化７】
2004535379.tif 000022
の中から選択され：
ここで、
Ｒ17は、Ｈ、ＣＨ3又はＸ3であり；
Ｒ18は、Ｈ、Ｃ1〜4アルキル又はベンジルであり；
Ｒ19は、Ｈ、Ｃ1〜4アルキル、Ｘ2又はベンジルであり；
Ｒ20は、Ｈ、Ｃ1〜10アルキル又は−Ｃ（Ｏ）Ｒ21（式中、Ｒ21は、Ｈ、Ｃ1〜4アルキル又はアルコキシ、ｔ−ブトキシ又はベンジルオキシである）であり；
Ｘ2及びＸ3は、ハロゲンから独立して選択され；
Ｒ3は、Ｈ、ＣＨ3、又は−Ｃ（＝Ｏ）（ＣＲ15Ｒ16）ｗ−Ｄ、であり、
（ここで、ｗは、０であるか、又は１〜約１２の整数であり、Ｄは、Ｈ又はＲ1及びＲ2に関して上述したとおりである）
Ｊは、Ｏ、ＮＨ又はＳであり；
Ｒ4、Ｒ5及びＲ6は、Ｈ、ＣＨ3、Ｃ2〜Ｃ10アルキル、Ｃ2〜Ｃ10アルケニル又はＣ2〜Ｃ10アルキニル（それぞれが置換されていても非置換であってもよく、直鎖であっても分岐鎖であってもよい）；Ｃ2−Ｃ10ヘテロアルキル、ヘテロアルケニル又はヘテロアルキニル及びハロゲンからなる群より独立して選択され；
Ｒ7は、Ｈ、ＣＨ3及びＣ2〜Ｃ10アルキルの中から選択され；
Ｘ1は、Ｏ、ＮＨ、又はＳであり；
Ａは、Ｈ又は第２の活性部分である〕
の化合物を、式（Ｖ）；
（Ｖ）Ｌ1−Ｂ1
〔式中、
Ｌ1は、式（ＩＶ）のＮＨＲ22と反応することができる官能基を含む部分であり；
Ｂ1は、ポリマー、生物学的に活性な物質及びポリマー支持体からなる群より選択される〕
の化合物と反応させることを含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の背景
本出願は、一般に、エネルギー可逆的アシル酵素に関する。特に、本出願は、シンナメート又は関連構造コア、及び組成物に新しい特性を与えるために修飾することができるさらなる反応基を有する、エネルギー可逆的アシル酵素等に関する。
【０００２】
酵素不活性化を利用する様々な方法が開示されている。酵素阻害は、酵素の長期保存を向上させるため、又は医薬品中の酵素を不活化するために使用することができる。たとえば，米国特許第５，７７０，６９９号は、不活化血液因子を製造するための酵素阻害の方法を開示している。米国特許第５，８３７，６７９号は、アシル化による血液因子の一時的な修飾によって、血液因子の半減期を延ばす方法を開示している。米国特許第４，３３７，２４４号は、不活化繊維素溶解酵素を使用して、静脈血栓症を処置する方法を報告している。
【０００３】
酵素活性は、インヒビターで調節することができる。光を用いた酵素活性の可逆的調節は、多数の報告の中心であった（Porterらの米国特許第５，１１４，８５１号及び第５，２１８，１３７号を参照されたい）。この概念には多数の利点がある。最も際立つことは、in vivo又はex vivoで光に曝露することにより、酵素活性を特異的かつ迅速に調節できることである。
【０００４】
Porterらは、米国特許第５，１１４，８５１号及び第５，２１８，１３７号で、酵素活性部位アミノ酸残基を、シンナメート（ＣＩＮＮ）誘導体に結合して、ｏ−ヒドロキシシンナメート置換エステル又は不活性なアシル酵素を形成することにより、光調節可能な酵素が得られることを開示している。光分解の時に、活性部位アミノ酸残基との結合が切断され、活性部位が露出される。Pizzoら［Ann. N. Y. Acad. Sci. 485:199-203(1986年)］は、酵素の活性部位をα−メチル−２−ヒドロキシ−４−ジエチルアミノケイ皮酸に結合することによって生じる、ｏ−ヒドロキシシンナメート置換エステルの使用について報告している。
【０００５】
その後、Porterらの報告により、阻害された酵素の、治療的潜在能力が証明された。凝固反応時間の調節は、濃度依存的かつ光分解時間依存的であった。阻害された「ケージ化」酵素を注射し、３６６nmの光を２５分間、眼に当てることによって、ウサギ角膜血管新生モデルで、異常血管のin vivo凝固を行った。Arroyoら、Thromb. Haemost. 78, 791-793(1997年)を参照されたい。米国特許第５，１１４，８５１号及び５，２１８，１３７号は、これらのシンナメート誘導体化酵素及びそれらの使用についてさらに説明している。
【０００６】
阻害された酵素の有用性は、光分解の速度及び程度の関数である。シンナメート部分と活性部位アミノ酸との間の結合切断の速度が遅ければ、有用性は限定される。多くの用途は、ほとんどのin vitro又は主用途でおよそ数秒程度、又はほとんどのin vivo用途で、せいぜい数分程度の、短時間の曝露時間を必要とする。速やかな、調節された応答時間は、ほとんどの臨床用途に不可欠であり、不安定な酵素又は血液凝固の場合のような、短時間の反応時間が不可欠なところでの使用には、特に有用である。
【０００７】
たとえば、α−キモトリプシンとｐ−ニトロ−trans−ケイ皮酸のｐ−ニトロフェニルエステルとの間のアシル酵素の形成は、Varfolomeyev, S.ら、［FEBS Lett.15:118(1971年)］によって記述されている。この酵素とカルボキシレート基との間の結合は、酵素の触媒中心におけるセリンのヒドロキシル基によって形成される［Berezin, I.ら、FEBS Lett. 8:173(1970年)］。α−トロンビンとｏ−ヒドロキシ−α−メチルケイ皮酸のエステルのトランス異性体との間のアシル酵素形成は、Turner, A.ら、J. Amer. Chem. Soc. 109:1274(1987年)によって記述されている。この酵素とカルボキシレート基との間の結合は、酵素の触媒中心におけるセリン−１９５のヒドロキシル基によって形成される（Turner, A.ら、J. Amer. Chem. Soc. 110:244(1988年)）。この化合物を露光すると脱アシル化を招く。これらの酵素の光活性化は緩徐であり、光活性化中に感知できる酵素分解が起こるような、光強度及び波長を必要とした。
【０００８】
この領域での研究は続いている。たとえば、Porterら（Photochem. Photobiol. B 38(1), 61-69(1997年)）は、精製及び固定化のために、ビオチン誘導体を、シンナメート側鎖の２位（カルボキシレート基の隣）に挿入したが、これはアビジンに結合することができた。この修飾された化合物は、光活性化可能であることも持続した。
【０００９】
迅速かつ調節可能に再活性化され得る、阻害された酵素組成物を改良するためには、ＣＩＮＮコア分子のさらなる修飾が望ましいであろう。たとえば、アシル酵素の特性（たとえば、固定化又は薬物動態学）を変える目的で、他の分子と反応するためのさらなる部位を導入し、同時に光活性化の所望の特性を維持することが望ましいであろう。本発明は、この必要性に取り組む。
【００１０】
発明の概要
本発明の目的は、速やかにかつ調節可能に再活性化され得る阻害された酵素を含む、本明細書でＺ−ＣＩＮＮ−Ｘ1−Ａと示される改良された組成物を提供することにある。
【００１１】
本発明のもう１つの目的は、本明細書で「Ｂ−Ｌ」と示される基を使用することを含む、様々な方法で誘導体化することができるＺ−ＣＩＮＮ−Ｘ1−Ａ型化合物（以下に定義する）上にさらなる部位を提供して、安定性、ターゲティング能力、又は適切な支持体への固定化等の、追加的な特性を有する本明細書でＢ−Ｌ−Ｚ−ＣＩＮＮ−Ｘ1−Ａと示される組成物を提供することにある。
【００１２】
本発明のまた別の目的は、光エネルギーの入力等の管理されたメカニズムによって酵素を活性形で放出することができる、不活化された酵素組成物（Ｂ−Ｌ−Ｚ−ＣＩＮＮ−Ｘ1−Ａ2）を生成することができる、酵素インヒビター組成物（Ｂ−Ｌ−Ｚ−ＣＩＮＮ−Ｘ1−Ａ1）を提供することにある。
【００１３】
これらの目的及び他の目的は、Ｚ−ＣＩＮＮ−Ｘ1−Ａ及び式（Ｉ）：
【００１４】
【化８】
2004535379.tif 000003
【００１５】
〔式中、Ｒ1及びＲ2は、Ｈ、ＣＨ3、Ｃ2〜Ｃ10アルキル、アルケニル又はアルキニル（置換されていても非置換であってもよく、直鎖であっても分岐鎖であってもよい）；Ｃ2〜Ｃ10ヘテロアルキル、ヘテロアルケニル又はヘテロアルキニル及び−（ＣＲ15Ｒ16）p−Ｄの中から独立して選択され、
【００１６】
ここで、Ｒ15及びＲ16は、Ｈ、ＣＨ3、Ｃ2〜Ｃ10アルキル、アルケニル又はアルキニル（置換されていても非置換であってもよく、直鎖であっても分岐鎖であってもよい）；Ｃ2〜Ｃ10ヘテロアルキル、ヘテロアルケニル又はヘテロアルキニルからなる群より独立して選択され；
【００１７】
ｐは、１〜約１２の正の整数であり；
【００１８】
Ｄは、−ＳＨ、−ＯＨ、Ｘ2、−ＣＮ、−ＯＲ19、ＮＨＲ20、
【００１９】
【化９】
2004535379.tif 000004
【００２０】
（式中、Ｒ17は、Ｈ、ＣＨ3又はＸ3であり；
【００２１】
Ｒ18は、Ｈ、Ｃ1〜Ｃ4アルキル又はベンジルであり；
【００２２】
Ｒ19は、Ｈ、Ｃ1〜4アルキル、Ｘ2又はベンジルであり；
【００２３】
Ｒ20は、Ｈ、Ｃ1〜10アルキル又は−Ｃ（Ｏ）Ｒ21であり、
【００２４】
ここで、Ｒ21は、Ｈ、Ｃ1〜4アルキル又はアルコキシ、ｔ−ブトキシ又はベンジルオキシであり；
【００２５】
Ｘ2及びＸ3は、独立して選択されるハロゲンである）
の中から選択され、
【００２６】
Ｒ3は、Ｈ、ＣＨ3、又は−Ｃ（＝Ｏ）（ＣＲ15Ｒ16）ｗ−Ｄであり、
【００２７】
ここで、ｗは、０又は１〜約１２の整数であり、Ｄは、Ｈであるか又はＲ1及びＲ2に関する記述とおりであり、
【００２８】
Ｊは、Ｏ、ＮＨ又はＳであり；
【００２９】
Ｒ4、Ｒ5、及びＲ6は、Ｈ、ＣＨ3、Ｃ2〜Ｃ10アルキル、アルケニル又はアルキニル（置換されていても非置換であってもよい、直鎖であっても分岐鎖であってもよい）；Ｃ2〜Ｃ10ヘテロアルキル、ヘテロアルケニル又はヘテロアルキニル及びハロゲンの中から独立して選択され；
【００３０】
Ｚは、ＮＲ7Ｒ8又は
【００３１】
【化１０】
2004535379.tif 000005
【００３２】
であり、
【００３３】
ここで、Ｒ7は、Ｈ、ＣＨ3、Ｃ2〜Ｃ10アルキル、アルケニル又はアルキニル（置換されていても非置換であってもよく、直鎖であっても分岐鎖であってもよい）；Ｃ2〜Ｃ10ヘテロアルキル、ヘテロアルケニル又はヘテロアルキニル、又は−（ＣＲ23Ｒ24）ｑアリール、又はＲ8の中から選択され；
【００３４】
ここで、Ｒ23及びＲ24は、独立してＨ又はＣ1〜Ｃ10アルキルであり；
【００３５】
ｑは、１〜約６の整数であり；
【００３６】
Ｒ8は、（ＣＲ9Ｒ10）n−ＮＲ22−Ｒ11、（ＣＲ9Ｒ10）n−ＣＨ2−ＮＨＣ（Ｏ）Ｒ26及び（ＣＲ9Ｒ10）n−ＣＨ2−Ｅの中から選択され、
【００３７】
ここで、Ｒ9及びＲ10は、Ｈ、ＣＨ3、Ｃ2〜Ｃ10アルキル、アルケニル又はアルキニル（置換されていても非置換であってもよく、直鎖であっても分岐鎖であってもよい）；Ｃ2〜Ｃ10ヘテロアルキル、ヘテロアルケニル又はヘテロアルキニル及びハロゲンの中から独立して選択され；
【００３８】
Ｒ26は、Ｈ，ＣＨ3，Ｏ−ｔ−ブチル，Ｏ−ベンジルであり；
【００３９】
Ｅは、ＯＨ，ＳＨ又はＯ−Ｃ（Ｏ）Ｒ27であり、
【００４０】
ここで、Ｒ27は、Ｃ1〜Ｃ6アルキル，ベンジル又はフェニルであり；
【００４１】
Ｒ22は、Ｈ又はＣＨ3であり
【００４２】
ｎは、１〜約１０の正の整数であり；
【００４３】
Ｒ11は、Ｈ又は−Ｌ−Ｂであり、
【００４４】
ここで、Ｌはリンカーであり；
【００４５】
Ｂは、たとえば、マレイミジル又はＮ−ヒドロキシスクシンイミジル等の反応基部分を含む第１の活性部分か、又はポリマーであり；
【００４６】
Ｒ25は、Ｈ，−Ｃ（Ｏ）−Ｒ28又は−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−Ｒ29であり、
【００４７】
ここで、Ｒ28は、Ｃ1〜Ｃ6アルキル又はベンジルであり；Ｒ29は、ＣＨ3，ｔ−ブチル又はベンジルであり；
【００４８】
Ｘ1は、Ｏ，ＮＨ，又はＳであり；
【００４９】
Ａは、Ｈであるか、又は本明細書でＡ1又はＡ2として示される第２の活性部分であり、Ｘ1は、Ａ1又はＡ2のいずれかの不可欠な部分であると考えられる〕
に対応する組成物を、一実施形態で提供する本発明によって実現される。
【００５０】
式（Ｉ）に対応する化合物の、Ｃｌ−、Ｂｒ−、ＨＳＯ4−等を含む、薬学的に許容し得る塩も提供する。
【００５１】
好ましい態様において、Ｂは、ポリマーであるか、天然又は合成の有機分子、タンパク質、たとえば、抗体若しくはそのフラグメント、炭水化物、核酸、脂質、又は他の天然若しくは合成の化合物である。
【００５２】
さらなる好ましい実施形態において、ＡはＡ1であり、Ｘ1Ａ1は、アミノ酸、アミノ酸誘導体、ペプチド、ペプチド誘導体等の基質又は基質類縁体か、又はセリンプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、エステラーゼ、リパーゼ、又は活性部位セリン若しくはシステインを含む他の酵素の基質又は基質類縁体である。幾つかの好ましい態様では、Ｘ1Ａ1は、
【００５３】
【化１１】
2004535379.tif 000006
【００５４】
〔式中、Ｒ12及びＲ13は、Ｈ、電子供与基又は電子吸引基であり、Ｗは、共有結合である〕である。あるいは、Ａ1は、アミノ酸又はアミノ酸誘導体、ペプチド又はペプチド誘導体、又はセリンプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、エステラーゼ、リパーゼ、又は活性部位セリン又はシステインを含む他の酵素の基質又は基質類縁体である他の分子であってもよい。
【００５５】
本発明の他の態様において、Ｈ−Ｘ1Ａ2は、セリンプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、エステラーゼ、リパーゼ、又はＸ1Ａ1の置換の際に、Ｚ−ＣＩＮＮのＣ（Ｏ）に結合している式（Ｉ）のＸ1に対応する、側鎖−Ｏ、−Ｓ又は−ＮＨを有する、活性部位セリン、システイン又はリシンを含む他の酵素等の、酵素である。従って、Ｈ−Ｘ1Ａ2は、Ｚ−ＣＩＮＮに結合することによって不活性化された酵素であり、好ましくは、その酵素活性を、加水分解、又は光若しくは他のエネルギー源に曝露されることによって、再活性化させることができる。
【００５６】
本発明のまたさらなる態様では、式Ｉの反応性Ｚ部位を使用して、Ｚ−ＣＩＮＮ−Ｘ1−Ａ1組成物が誘導体化される。特に、Ｒ8が（ＣＲ9Ｒ10）−ＮＲ22−Ｒ11であり、Ｒ11がＬ−Ｂであるとき、当業者は、中でも、ＰＥＧ又は他の活性化ポリマー等のポリマーに連結されているＺ−ＣＩＮＮコアを得ることができる。
【００５７】
あるいは、必要に応じて、その後の、Ｂ基、たとえばモノクローナル抗体（ｍＡｂ）、ポリマー等の付着を実行できるように、Ｚ−ＣＩＮＮ−Ｘ1−Ａを、連結基Ｌに結合させてもよい。Ｚ−ＣＩＮＮ−Ｘ1−Ａは、たとえば、スクシンイミジル−６−［（β−マレイミドプロピオンアミド）ヘキサノエート］、エチレングリコールビス［スクシンイミジルスクシネート］、末端スクシンイミジルスクシネートを含有するビス活性化ＰＥＧ、Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミジル及び／またはマレイミドを使用して連結させることができる。その他の二官能性試薬も考えられる。次いで、Ｌ−Ｚ−ＣＩＮＮ−Ｘ1−Ａ分子を別の分子、たとえば、抗体、それらのフラグメント、核酸、脂質、又は他の天然若しくは合成の化合物を含む、タンパク質と反応させることができる。次いで、誘導体化された組成物（Ｂ−Ｌ−Ｚ−ＣＩＮＮ−Ｘ1−Ａ1）を、酵素と反応させて、酵素が不活化されているＢ−Ｌ−Ｚ−ＣＩＮＮ−Ｘ−Ａ2を形成する。
【００５８】
本発明の結果として、幾つかの利点が提供される。たとえば、これらのＺ−ＣＩＮＮ−Ｘ1−Ａ不活化組成物は、溶解性上昇、循環中の半減期増加、ターゲティング能、又は他の特徴等の、様々な有益な特性を有することができる。加えて、Ｌ−Ｚ−ＣＩＮＮ−Ｘ1−Ａ不活化組成物は、リンカーＬを介して支持材料に架橋することにより、固定することができる。支持材料は、産業上又は薬学的に好適な任意の材料、たとえば、有機ポリマー、無機ポリマー、天然ポリマー、バイオポリマー又はゼオライトであってもよく、またフィルム、膜、フィルター、ビーズ、粒子、樹脂、微粒子、又はカラムの形状であってもよい。あるいは、Ｂ−Ｌ−Ｚ−ＣＩＮＮ−Ｘ1−Ａは、親和力等のメカニズム又は活性化支持材料とのさらなるカップリング反応によって、支持体に結合させることができる。
【００５９】
アシル酵素結合は、比較的安定していてもよく、ほぼ中性のｐＨにて、暗所で加水分解を受けやすくてもよい。アシル酵素結合は、紫外線、可視光線、及び赤外線を含む光、マイクロ波、超音波、電波エネルギー又は放射能等のエネルギー源による切断を受けやすい。好ましいエネルギー源は、３４０〜７００nm、好ましくは３５０〜４２０nmの範囲の波長を有する光である。これは、たとえば、不活化されたアシル化酵素を調節可能に放出して活性な酵素に転換する手段を提供する。
【００６０】
たとえば、Ｂ−Ｌ−Ｚ−ＣＩＮＮ−Ｘ1−Ａ2に対応する本発明の化合物は、アシル酵素が最初は遊離しているか固定化支持体に結合しており、次いでエネルギーを加えて、活性な酵素を溶液中に放出させるアッセイで、使用することができる。不活化組成物は、精製方法で、また、投与時または投与直前に活性化させる治療薬として、使用することもできる。不活化酵素を、長期にわって保存し、次いで、使用時に再活性化させ、貯蔵寿命を増加させることができる。
【００６１】
本発明のさらなる態様では、本発明の組成物を調製及び使用する方法も提供する。
【００６２】
発明の詳細な説明
Ｉ．定義
本明細書で使用される用語「インヒビター」は、酵素の触媒的活性部位における残基と反応し、その活性部位に結合して触媒活性を妨げることにより、酵素を不活化させることができる化合物を意味する。
【００６３】
本明細書で使用される用語「不活化された」は、酵素の触媒的活性部位がインヒビターに共有結合していることを意味する。
【００６４】
本明細書で使用される用語「再活性化」は、共有的アシル結合が加水分解によって、又はエネルギー源によって切断され、酵素活性を回復する過程を指す。
【００６５】
用語「ケイ皮酸」は、３−フェニル−２−プロペン酸の通称または又は慣用名である。Ｚ−ＣＩＮＮ−Ｘ1−Ａ分子は、ケイ皮酸の誘導体を含む。
【００６６】
ＩＵＰＡＣ名は、合成された化合物に与えられる。
【００６７】
本発明の目的上、特に、可変要素Ｂを説明するために使用される「反応基」は、マレイミジル残基の非共有電子対（二重結合）を含むがこれに限定されない、Ｌと１つ以上の生物学的に活性な部分又はポリマーとの接合を促進することができる部分を含むと理解されるものとする。
【００６８】
本発明の目的上、用語「アルキル」、「アルケニル」及び「アルキニル」は、アルコキシ又は置換シクロアルキル等を含む、たとえば、これらの直鎖誘導体、分岐鎖誘導体、置換誘導体、シクロ誘導体を含むと理解されるものとする。「置換された」は、ハロ−、アルコキシ−、ニトロ−等を含むと理解されるものとする。
【００６９】
本発明の目的上、「分子」及び「生物学的に活性な分子」は、有機分子又は小分子のみならず、タンパク質、ペプチド等を包含すると理解されるものとする。
【００７０】
本発明の目的上、「ハロゲン」は、塩素、フッ素、臭素等を含むと理解されるものとする。
【００７１】
ＩＩ．Ｚ−ＣＩＮＮ誘導体
Ａ．Ｚ−ＣＩＮＮ
Ｚ−ＣＩＮＮをコア分子として使用して、様々な組成物を作ることができる。様々な官能基をＺ−ＣＩＮＮに導入して、その化学的性質ならびに物理的性質を修飾することができる。これらの組成物は、求核試薬又は光に対して、異なる反応性を有することもできる。幾つかの好ましい阻害された組成物は、以下のとおりに詳述される。
【００７２】
Ｚ−ＣＩＮＮコア分子は、式（ＩＩ）
【００７３】
【化１２】
2004535379.tif 000007
【００７４】
〔式中、全ての可変要素は、上の式（Ｉ）に記載のとおりである〕
に対応する。
【００７５】
式（Ｉ）及び（ＩＩ）に関する１つの好ましい実施形態では、ＺはＮＲ7Ｒ8である。さらに、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、及びＲ6は、Ｈであるか、ＣＨ3又はＣＨ2ＣＨ3等の低級アルキル基である。式（Ｉ）及び（ＩＩ）に関する、別の好ましい実施形態では、Ｒ7は、ＣＨ3ＣＨ2であり、Ｒ8は、−（ＣＲ9Ｒ10）n−ＮＲ22−Ｒ11であり、Ｒ9及びＲ10は、Ｈであり；式中、ｎは２であり；Ｒ22は、Ｈ又はＣＨ3であり；Ｘ1は、Ｏ、Ｓ又はＮである。ＪはＯであり、ＺはＮＲ7Ｒ8である、本発明のこれらの態様において、幾つかの好ましいＲ8基は、以下を含む：
【００７６】
１．（ＣＨ2）n−ＮＨ2及びその塩、たとえば−ＮＨ3＋：Ｃｌ−若しくはＢｒ−又はＨＳＯ4−等。
２．（ＣＨ2）n−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−Ｈ
３．（ＣＨ2）n−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ3
４．（ＣＨ2）n−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−ｔ−ブチル
５．（ＣＨ2）n−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−ベンジル
６．（ＣＨ2）n−ＯＨ
７．（ＣＨ2）n−ＳＨ
８．（ＣＨ2）n−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−Ｒ21；〔式中、Ｒ21はＣＨ3、Ｃ1−6アルキル又はフェニルであり；上記ｎはそれぞれ、２〜約１０、好ましくは２〜４の整数である〕。
【００７７】
本発明のまたさらなる態様では、Ｚは、置換されたピペラジンであり、それによって式（Ｉａ）：
【００７８】
【化１３】
2004535379.tif 000008
【００７９】
〔式中、全ての可変要素は、式（Ｉ）に関して、先に定義したとおりである〕
の組成物を提供する。
【００８０】
ケイ皮酸骨格酵素インヒビターは、標準技術及び当業者により入手できる試薬を使用して、合成することができる。たとえば、図１から分かるように、２−エチルアミノエチルアミン（１）等のアミンを、無水物（２）と反応して、アミド（３）を生成することができる。３は、１，３−シクロヘキサンジオン（４）と縮合し、続いて脱水して、３−アミノ−２−シクロヘキセン−１−オン（５）を生成する。触媒の存在下で５を脱水素し、３−ヒドロキシフェニルアミン（６）を生成する。加水分解で保護基を除去して７を得て、引き続きＮ−アシル化して８を得る。ＰＯＣｌ3/ＤＭＦと８との反応で、アルデヒド（９）を生成する。適切なウィティッヒ（Wittig）試薬、カルベトキシエチリデントリフェニルホスホラン（１０）と９との反応で１１を生成し、ここでアルデヒド基が２−プロペン酸エチルエステルに変換される。Ｎ−アシル基を交換して１２を得て、これをＬｉＯＨ中で加水分解して１３（ｔＢＯＣ−Ｎ−ＣＩＮＮ）を得る。式（Ｉａ）の化合物は、アミン（１）の代わりにピペラジンを使用して、同様に調製することができる。
【００８１】
図２がさらに示すとおり、１３を、４−アミノイミノフェノール（１４）等のアルコール、ジシクロヘキシルカルボジイミド、及びジメチルアミノピリジンの存在下で反応させて、エステル（１５）を形成することができる。Ｎ−保護基を、ＨＣｌの存在下で加水分解して、遊離の、プロトン化アミノ基（１６）を含む置換されたケイ皮酸エステル（酵素インヒビター）を生成することができる。図３から分かるとおり、１６は、モノマーＳＳ−ＰＥＧ（１７）とさらに反応して、ＰＥＧ−誘導体化インヒビター（１８）を生成する。
【００８２】
図４に、阻害された酵素組成物を得るための、活性部位セリンを含み、かつ４−アミノイミノフェノールに対して親和性の様々な酵素と１８との反応を図示する。
【００８３】
別の実施形態では、さらなる−Ｘ1Ａ1、部分を形成するために、他のアルコール、チオール、又はアミノ化合物、たとえば、アミノ酸、アミノ酸誘導体、ペプチド、又は他の化合物が１４の代わりに使用される。たとえば、図２に示すＤＣＩ/ＤＭＡＰ化学を介して、アミノ酸誘導体又はペプチド誘導体を、Ｎ−ＣＩＮＮ骨格（１３）に結合させる。１３と反応させる前に、ペプチド又はアミノ酸上のカルボキシル基は、許容し得る保護基で保護される。次いで、アミノ基を１３、ＤＣＩ、及びＤＭＡＰと反応させると、アミド結合が生じ、保護基が除去される。アルコール又はチオールの場合にも、同様の手順に従う。
【００８４】
図５は、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド及びマレイミドを含有するヘテロ二官能性試薬と（１６）との反応によって、Ｎ−ＣＩＮＮ−ＡＰ（２０）のマレイミド誘導体を調製するための、一般的スキームである。１６のアミノ基は、ＳＭＰＨ（スクシンイミジル−６−［β−マレイミドプロピオンアミド］ヘキサノエート；Pierce）等の（他端のマレイミド基をさらなる反応に利用できる）試薬と反応する。多数の似した試薬、たとえば二官能性ＮＨＳ、二官能性ＰＥＧ、又は似の化合物が利用できる。当業者は、必要以上の実験をせずに、Ｚ−ＣＩＮＮ骨格をキャリヤー基（carrier group）に結合させるのに適した連結試薬を選択することができるであろう。制限するためではなく、例を挙げて説明する目的上、使用することが可能なリンカーの非限定的リストには、所望のＢ基のＺ−ＣＩＮＮコアへの結合を促進する、スクシンイミド、マレイミド、イミドエステル、２−イミノチオラン、ヒドラジド、無水マレイン酸、アジ化合物、無水シトラコン酸、グルタルアルデヒド等が含まれる。
【００８５】
図６は、Ｍａｌ−Ｌ−Ｎ−ＣＩＮＮ−ＡＰ（２０）をＳＨ修飾抗体と反応させて、抗体−Ｌ−Ｎ−ＣＩＮＮ−ＡＰ（２１）を形成できることを示す図である。２１を遊離の酵素と反応させて、酵素が阻害されている、抗体−Ｌ−Ｎ−ＣＩＮＮ−酵素（２２）を形成することができる。２２を光又は他のエネルギー源で処理して、遊離の酵素を再生することができる。ＳＨ修飾抗体を、通例の試薬を使用して〜ｐＨ７で調製し、Ｍａｌ−Ｌ−Ｎ−ＣＩＮＮ−ＡＰを〜ｐＨ７で僅かに余分に加える。遊離の試薬を、限外濾過又はサイズ排除クロマトグラフィで分離する。他の実施形態では、図６に記載のスキームに従い、必要に応じて反応性連結基を変えて、ＳＨ修飾抗体以外の部分を使用する。
【００８６】
Ｂ．酵素活性の阻害
式Ｉにより明示されるとおり、Ｘ1Ａは、活性部分を含んでもよい。Ｂの一部である第１の活性部分と区別するために、式Ｉでは、この活性部分を「第２」と呼び、さらに詳しく後述する。従って、Ｘ1Ａ2は、多数のプロテアーゼ又はエステラーゼのような、触媒的活性部位にセリン又はシステイン残基を有する酵素等の、生物学的に活性な部分であってもよい。酵素Ｈ−Ｘ1Ａ2は、Ｚ−ＣＩＮＮ−Ｘ1−Ａ1、酵素の基質又は基質類縁体と特異的に反応することができる。遷移状態が形成され、そこで酵素がアシル結合における脱離基と取って代わり、阻害されたアシル酵素が、Ｚ−ＣＩＮＮと酵素の間で形成され、本明細書でＺ−ＣＩＮＮＸ1−Ａ2として示される。アシル結合が加水分解又は光分解によって切断されるとき、阻害された酵素が再活性化され、その活性を回復することができる。
【００８７】
代表的な酵素（Ｈ−Ｘ1−Ａ2）は、キモトリプシン、トリプシン、アクロシン、凝固因子、たとえばトロンビン、ＶＩＩａ、ＩＸａ、Ｘａ、ＸＩａ又はＸＩＩａ、カテプシンＧ、繊維素溶解経路タンパク質、たとえば、プラスミン、組織プラスミノーゲンアクティベーター、ウロキナーゼ、ストレプトキナーゼ、及び補体タンパク質、たとえば、Ｃ３/Ｃ５コンベルターゼ、補体因子Ｉ、及び補体因子Ｄ等の、セリンプロテイナーゼ（プロテアーゼ）である。
【００８８】
他の代表的な酵素としては、カテプシンＢ、パパイン、及びブロメライン等のシステインプロテイナーゼ、ならびにリパーゼ及びエステラーゼ、たとえば、アセチルコリンエステラーゼエステラーゼなどがある。
【００８９】
好ましいセリンプロテイナーゼとしては、キモトリプシン、トリプシン、トロンビン、プラスミン、アクロシン、凝固因子ＩＸａ、Ｘａ、ＸＩａ、及びＸＩＩａ、プラスミノーゲンアクティベーター、血漿カリクレイン、組織カリクレイン、ウロキナーゼ、プラスミン、膵臓エラスターゼ、及び白血球エラスターゼなどがある。インヒビターは、標的特異的であることが好ましい。たとえば、イミダゾール誘導体は、α−キモトリプシンの良好な基質であることが知られている。F. Markwardtら、Pharmazie 29:333(1974年)；G.Wagnerら、Pharmazie 28:293(1973年)；J. Sturzebecherら、Acta Biol. Med. Germ. 35:1665(1976年)；P. Walsmann, Folia Haematol, Leipzig 109:75(1982年)；V. Valentyら、Biochem. Biophys. Res. Comm. 88:1375(1979年)；及びF. Markwardtら、Acta Biol. Med. Germ 28:19(1972年)は、酵素活性部位セリンの安定なカルボン酸エステルをもたらす化合物を記述している。研究されてきた他のインヒビターとしては、酵素と反応して安定なスルホン酸エステル又はリン酸エステルを生成する化合物などがある（R. Lauraら、Biochemistry 19:4859(1980年)；S. Wong and E. Shaw, Arch. Biochem. Biophys. 161:536(1974年)参照)。ホスホン酸エステルのペプチド誘導体も使用されている(J. Oleksyszyn and JC Powers, Biochemistry 15:485(1991年)）。
【００９０】
あるいは、Ａは、本明細書でＡ1と示す部分であってもよい。好ましいＸ1Ａ1基は、
【００９１】
【化１４】
2004535379.tif 000009
【００９２】
〔式中、Ｒ12及びＲ13は、電子供与基又は電子吸引基であり、Ｗは、Ｎ又はＣＨである〕を含むか、あるいはＸ1Ａ1は、アミノ酸又はアミノ酸誘導体、ペプチド又はペプチド誘導体、又は、酵素で切断することができ、結果として、アシル酵素のように、酵素がシンナモイル部分に結合するに至る、他の活性部位セリン又はシステインを含むセリンプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、又はエステラーゼ等の酵素の基質又は基質類縁体である。
【００９３】
Ｚ−ＣＩＮＮ−Ｘ1Ａ1は、上記酵素のインヒビターを示す。好ましいインヒビターの中で、ｐ−ニトロフェニルが脱離基（Ｘ1Ａ1）であるものが、キモトリプシン等の酵素との、アシル酵素の作製に使用するのに好適である。４−アミノイミノフェニル又は４−グアニジノフェニルのいずれかが脱離基であるインヒビターが、トロンビン、プラスミン、凝固因子ＩＸａ、Ｘａ、ＸＩａ、ＸＩＩａ等の凝固酵素、又は組織プラスミノーゲンアクティベーター、ウロキナーゼ、及びトリプシンとの、アシル酵素の作製に使用するのに好適である。アミノ酸又はアミノ酸誘導体、ペプチド又はペプチド誘導体、又は他の基質又は基質類縁体が脱離基であるものは、たとえば、プロテアーゼ、リパーゼ、エステラーゼ等を含む、活性部位にセリン又はシステインを含む様々な酵素と反応する。
【００９４】
Ｃ．Ｚ−ＣＩＮＮ骨格の誘導体
多数の異なる分子を、本発明のＺ−ＣＩＮＮ骨格に付けることができる。以下の式（ＩＩＩ）を参照されたい。
【００９５】
【化１５】
2004535379.tif 000010
【００９６】
〔式中、全ての可変要素は、先に定義したとおりである）。
【００９７】
一態様では、溶解性又は循環半減期を増大するために、部分を付けることができる。たとえば、活性化されたポリエチレングリコール（ＰＥＧ）又はポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）を、Ｚ−ＣＩＮＮコア分子に付けることができる。とりわけポリ（エチレングリコール）−Ｎ−スクシンイミジルカルボネート及びその誘導体について記述している米国特許第４，１７９，３３７号全般及び米国特許第５，６１２，４６０号を参照されたい。Harrisら、ポリ（エチレングリコール）化学及び生化学的応用（Poly(ethylene glycol) Chemistry and Biological Applications）,1997年ACSも参照されたい。前述のそれぞれの内容を、参照により本明細書に援用する。図３を参照しながら、一般に、活性化ｍＰＥＧ（たとえば、ＳＳ−ｍＰＥＧ5000，Shearwater Polymers, Inc.）を、〜ｐＨ７．０で６０分間、１６と反応させる。余分のＳＳ−ｍＰＥＧをグルシルグリシンで失活させ、ＰＥＧ−Ｎ−ＣＩＮＮ−ＡＰ（１８）を、周囲温度にて、ｐＨ６．５〜７．０で約１２〜１６時間、活性なセリンプロテアーゼと反応させて、ＰＥＧ−Ｎ−ＣＩＮＮ−アシル酵素（１９）を得る。この複合体は、薬学的に許容し得る溶液の一部として含まれてもよく、このような治療を必要としている患者に投与することができる。必要なとき、この複合体を光で活性化して、本来の酵素を放出させる。活性化ＰＥＧ又は使用される他のポリマーの具体的なタイプは、技術者の個々のニーズ及び所望の最終生成物によることを、当業者は十分理解するであろう。ほとんどの市販されている活性化ポリマーは、必要以上の実験をせずにここで使用できると考えられる。
【００９８】
さらに詳細には、本発明のポリマー複合体を形成するためには、Ｒ11は、ポリマーを含んでもよい。たとえば、ポリアルキレンオキシド（ＰＡＯ）等のポリマー、又は似した生物学的に許容し得るポリマーを、当業者に知られている条件どおりに、活性化形に変換する。従って、末端ポリマーヒドロキシル末端基（すなわちα及びω末端ヒドロキシル基）の一方又は両方を、Ｒ11、及び必要に応じて、別の活性な基又はターゲティング基の一部として、Ｚ−ＣＩＮＮに共有結合することが可能な同一（ホモ−）又は異なる（ヘテロ−）反応性官能基に変換する。他の実質的に非抗原性のポリマーは、同様に「活性化される」か又は官能化される。ＰＡＯ系ポリマーの代わりとして、他の実質的に非抗原性又は事実上非抗原性の材料、たとえば、コラーゲン、グリコサミノグリカン、ポリアスパラギン酸、ポリ−Ｌ−リシン、ポリ乳酸、ポリ乳酸−ポリグリコール酸コポリマーを含む前述のコポリマー、ポリ−Ｎ−ビニルピロリドン、親水性ポリマーに架橋したコラーゲン又は任意の他の好適な非反応性ポリマー、たとえば、ポリエチレンアルコールを使用することができる。特に好ましいポリマー基は、一官能性又は二官能性活性化ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）系ポリマーである。
【００９９】
あらゆる分子量範囲のポリマー基が使用できる。好ましいポリマー分子量は、２，０００〜２００，０００ダルトンである。より好ましい分子量範囲は、５，０００〜５０，０００ダルトンである。最も好ましいポリマー分子量範囲は、１２，０００〜４０，０００ダルトンである（数平均）。
【０１００】
別の実施形態では、第１の活性分子（Ｂ）を、Ｌ−Ｚ−ＣＩＮＮ−Ｘ1Ａ1に付ける。たとえば、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）等のタンパク質を、Ｚ−ＣＩＮＮ−Ｘ1Ａ1に結合することができる。たとえば、１６を、ＮＨＳ及びＭａｌ（Pierce Chemical Co.）の両者を含む二官能性試薬と、ｐＨ〜７．０で１時間反応させ、２０（Ｍａｌ−Ｌ−Ｎ−ＣＩＮＮ−ＡＰ）を得る。余分のＮＨＳ−Ｍａｌ試薬をグルシルグリシンで失活させる。次いで、２０を、周囲温度にてｐＨ７．０で２時間、ＳＨ修飾抗体と反応させ、２１（ｍＡｂ−Ｌ−Ｎ−ＣＩＮＮ−ＡＰ）を得る。限外濾過又はゲル濾過クロマトグラフィで、２１から余分の試薬２０を除去し、次いで、ｐＨ６．５で約１２〜１６時間、セリンプロテアーゼと反応させて、２２（ｍＡｂ−Ｌ−Ｎ−ＣＩＮＮ−アシル酵素）を得ることができる。２２（Ｂ−Ｌ−Ｎ−ＣＩＮＮ−Ｘ1Ａ2）を、ｍＡｂを含む部位に向け、次いで光活性化により活性なセリンプロテアーゼを放出させることができる。
【０１０１】
Ｒ11のＬ−Ｂに対応する反応基試薬の非限定的リストには、マレイミド、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル化合物、イミドエステル、２−イミノチオラン、ヒドラジド、無水マレイン酸等が含まれ、これらは、たとえばPierce Chemicalから市販されている。前述のリストは、例を挙げて説明するために作成されたに過ぎない。いったん、反応基を結合したならば、標準的な結合技術を使用して、Ｌ−Ｚ−ＣＩＮＮ−Ｘ1−Ａ1を、ターゲティングｍＡｂ等の所望の分子（Ｂ）に結合することができる。好適な分子の非限定的リストには、粒子上に、結合／固定化することができる部分を含む、抗体、それらのフラグメント、一本鎖結合性抗体等、たとえば、ハーセプチン（Herceptin）（登録商標）（トラスツズマブ（trastuzumab））、その他のモノクローナル抗体、たとえば、細胞表面抗原、マウスモノクローナル抗体、タンパク質、核酸、レクチン、脂質、炭水化物、ＰＡＯ、グリコサミノグリカン、ポリ−アスパラギン酸、ポリ−Ｌ−リシン、ポリビニルピロリドン、コラーゲン、ペプチド、ホルモン、受容体のリガンド等に対するもの等が含まれる。
【０１０２】
さらなる具体例を以下に記載する：
ターゲティング剤（以下を含むがこの限りではない）：
・多少の能力で、細胞又は腫瘍細胞を標的とする抗体；
・マウス、ラット、ヒト、サル、キメラ構築物等を含む哺乳動物起源のモノクローナル抗体（ｍＡｂ）；
・一本鎖抗体；
これらの抗体は、細菌、植物、酵母、動物、哺乳動物の乳（マウス、ヤギ、ヒツジ、ブタ、ウシ等）、及びマウス、ラット、ヒト、ハムスター等を含む動物細胞培養で発現され得る；
・天然及び組み換えの両成長因子、並びに細胞表面上の受容体に結合する成長因子のペプチド分画（ＥＧＦ、ＶＥＧＦ、ＦＧＦ、ＩＬＧＦ−Ｉ、ＩＬＧＦ−ＩＩ、ＴＧＦ）；
・天然又は組み換えの両インターフェロン、及び細胞表面上の受容体に結合するインターフェロンのペプチド分画（ＩＦＮ−α、β、及びγ）及びインターフェロン作用薬；
・天然又は組み換えのいずれかの、サイトカイン、及び受容体細胞表面に結合するサイトカインのペプチド分画（ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＴＮＦ等）；
・細胞表面受容体に結合する、天然、組み換え、又は合成のいずれかのペプチド；
・細胞表面受容体に結合する、天然、組み換え、又は合成のいずれかのホルモン（エストロゲン、プロエストロゲン）；
・細胞表面受容体に結合する、天然、組み換え、又は合成のいずれかの代謝産物（アミノ酸、糖、ビタミン、ヌクレオチド、ヌクレオシド）；
・腫瘍細胞表面に結合する、天然又は組み換えのいずれかの、レクチン；
・リン酸化若しくは非リン酸化のいずれかの糖ペプチド（ＭＤＰ、ＭＴＰ、ＤＤＰ、ＤＴＰ）又は糖−ペプチド−脂質ターゲティング剤（モノホスホリル−リピドＡ、ジホスホリル−リピドＡ、ＤＰＧ−ＤＤＰ、ＤＰＧ−ＤＴＰ、等）；
・ポリエチレングリコールポリマー及び誘導体（２，０００〜＞２００，０００ダルトン）；
・ポリ−アスパラギン酸、グルタミン酸又はポリ−リシンアミノ酸ポリマー、又はこれらの若しくは他のアミノ酸の混合物；
・細胞表面酵素のインヒビター（ペプチド又は化学物質；共有結合又は非共有結合）（マトリックスメタロプロテイナーゼインヒビター、チロシンキナーゼインヒビター、セリンプロテアーゼインヒビター、カゼインキナーゼインヒビター、プラスミノーゲンアクティベーターインヒビター）；及び
・グルコサミノグリカン及びデキストラン。
【０１０３】
当業者には自明であろうが、具体的に記載されていないが、上記カテゴリーに含まれるターゲティング剤も、本発明の範囲内である。
【０１０４】
従って、本発明の一態様において、好ましいＲ11置換基は、生体物質に対する抗体等のタンパク質であり、これは潜在的酵素活性の局在化を促進し、その後光又は他のエネルギー源によって放出することができる。
【０１０５】
Ｄ．Ｚ−ＣＩＮＮ誘導体を固定するための担体及び支持体。
合成ポリマー、天然ポリマー及びバイオ合成ポリマーを含む、様々な有機又は無機材料のいずれかで作製された支持体上に、阻害された酵素のＺ−ＣＩＮＮコア分子複合体を含む式（Ｉ）の化合物を固定することができる。これらは、カラム、フィルム、膜、ビーズ、粒子、微粒子、及びフィルターの形態であってもよい。
【０１０６】
固定は、一般に、コアインヒビター分子（たとえば１６、Ｎ−ＣＩＮＮ−ＡＰ）の側鎖と支持材料との間の、共有結合、イオン結合、又は親和力結合の形成によって達成される。たとえば、アルデヒド基又は反応性酸基を含む支持材料を使用することもできる。一例において、遊離のアルデヒド基を含むアガロースビーズ（アルデヒド−アガロース（Aldehyde-Agarose）；Sigma）を、ｐＨ〜７．０で１６に加えて、Ｂｅａｄ−Ｎ−ＣＩＮＮ−ＡＰを形成する。余分の試薬を洗い流し、次いで固定されたインヒビターを、周囲温度にて、ｐＨ６．５で１２〜１６時間、セリンプロテアーゼと反応させて、固定されたアシル酵素を得ることができ、これを光で再活性化させてセリンプロテアーゼを得ることができる。もう１つの例では、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル基を含むアガロースビーズ（シグマ（Sigma））を１６に加え、上記のとおりに処理する。もう１つの例では、親和力結合を利用して、プロテインＡ−アガロース（Protein A-Agarose）（Sigma又はOncogene）をｐＨ７で２２に加え、穏やかに揺り動かすことによって９０分間混合し、遠心分離によって分離する。このビーズを数回洗浄して、未結合の物質を除去し、次いで上記のとおりに酵素を結合するために使用し、露光後、酵素活性を放出することができる。これらのタイプの結合は当業者の知識の範囲内であり、当該技術分野で利用できる標準技術を使用して容易に遂行することができる。
【０１０７】
ＩＩＩ．アシル結合の切断
シンナメートコア分子と、式（Ｉ）で「Ｘ1Ａ2」として示される治療に役立つ部分との間の共有結合性アシル結合は、エネルギー入力後、溶液中で自然に、又は調節された速度で、起こる加水分解で切断することができる。光（紫外、可視、又は赤外）、超音波、マイクロ波放射、電波エネルギー及び放射性崩壊を含む様々なエネルギー形態を使用することができる。光が最も好ましい。光は、放射の波長、期間、又はエネルギーを変えることにより、容易にかつ選択的に調節することができる。好ましいエネルギー源は、３００〜４２０nm、最も好ましくは３５０nm〜４００nmの範囲の波長を有する光である。
【０１０８】
酵素と酵素インヒビターとの間のアシル結合は、中性のｐＨにて暗所で加水分解を受けやすくてもよい。加水分解の速度は、ｐＨの変化によって調節することができる。その半減期は、数秒から数日まで変化することができる。シンナメート環上の置換されたアミノ基は、Ｚ−ＣＩＮＮ−アシル酵素結合に安定性を与え、これは好ましくはｐＨ７．０で＞２４時間持続する。これは、加水分解速度が２０〜９０分であるようにデザインされる、キング（King）（米国特許第５，７７０，６９９号）により報告された、アシル酵素結合と対照的である。この安定性のため、シンナメート系インヒビターは、阻害された酵素が光で活性化されるまで水性系で阻害されたままであることを必要とする治療用途に有用である。従って、Ｚ−ＣＩＮＮ−アシル酵素は、必要に応じて、光活性化がなくてもin vivoで酵素を放出するプロドラッグ担体の役割も果たす。
【０１０９】
Ｚ−ＣＩＮＮ−Ｘ1−Ａ2酵素の再活性化は、光エネルギーによって促進される。エネルギー入力は、アシル酵素結合の加水分解及び活性な酵素の放出につながるＺ−ＣＩＮＮ部分の立体構造変化を引き起こす。数秒から数分までの範囲の再活性化時間に好ましいエネルギー源は、３００〜４２０nmの波長を有する。再活性化の程度は、不活化酵素の性質、環境、並びにエネルギー源のタイプ及び強度のような因子によって異なる。たとえば、不活化トロンビンは、白色光を約２０秒間当てることによって容易に再活性化させることができる。
【０１１０】
フォーカスランプ又はレーザーのような、外付け可視光源等の手段で、エネルギー源を導入することができる。その先端から光を放射する光ファイバーカテーテルは、光を標的に送達することができる。他の実施形態では、マイクロ波照射、電波照射、超音波、放射性物質の放射、紫外線照射、又は赤外線照射の形態で、エネルギー源を導入することができる。
【０１１１】
ＩＶ．使用／処置の方法
本明細書に開示の化合物は、多くの用途を有する。薬学的に重要な１つの一般的用途は、体内のある特定の構造に対する酵素をターゲットするために、シンナメート骨格の二官能性態様を使用する。これらの構造は、腫瘍細胞上にあることもあり、血塊等の細胞外にあることもある。別の使用は、ある用途で最初は必要または望ましくない酵素を阻害し、手順の後期に酵素を再活性化することである。光、超音波、又は他のエネルギー源を当てて、阻害された酵素とインヒビターとの間のアシル結合を切断することにより、不活化酵素を再活性化させることができる。別の用途は、溶液中の、阻害された酵素の安定性又は循環寿命を増加することである。このような処置を必要としている哺乳動物に投与される本化合物の量は、もちろん患者のニーズ及び投与される酵素又は治療薬によって異なる。投与量は、非複合酵素に関して判明している量に基づき、その哺乳動物を申し分なく処置するのに十分であろうと考えられる。
【０１１２】
従って、本発明の化合物は、当業者に知られているような、薬学的に許容し得る製剤の一部として、たとえば非経口用、すなわち静脈内用、又は経口用の剤形の一部として、投与される。
【０１１３】
本化合物は、標的とされる酵素の溶液をインヒビターと平衡化し、次いで溶液を洗い落としてから、エネルギー入力後、遊離の酵素を放出することにより、精製、特に、所与の条件で、固定され、標的分子と選択的に結合する精製に使用することができる。たとえば、「Ａ」位に４−アミノイミノフェノールを含む化合物は、固定して、溶液からトロンビンを単離するために使用することができるであろう。
【０１１４】
本化合物は、診断用アッセイで使用することができる。診断用アッセイは、手作業であっても自動化していてもよく、研究室でもキットの形態でも有用である。
【０１１５】
Ｖ．合成方法
本発明の別の態様では、本明細書に記載の複合体を調製する方法を提供する。幾つかの好ましい方法は、式（ＩＶ）：
【０１１６】
【化１６】
2004535379.tif 000011
【０１１７】
〔式中、全ての可変要素は、式（Ｉ）に関して定義したとおりであり、Ｒ′7は、Ｈ、ＣＨ3及びＣ2〜Ｃ10アルキルから選択される〕
の化合物と、式（Ｖ）
（Ｖ）Ｌ1−Ｂ1
【０１１８】
〔式中、Ｌ1は、式（ＩＶ）のＮＨ2と反応することができる官能基を含む部分であり；
【０１１９】
Ｂ1は、ポリマー、ｍＡｂ又はフラグメント等の生物学的に活性な物質、ポリマー支持体等である〕
とを、式（ＶＩ）
【０１２０】
【化１７】
2004535379.tif 000012
【０１２１】
〔式中、Ｌ1′は、（ＩＶ）と（Ｖ）との反応後のＬ1の残基を示す〕
に対応する複合体を形成するのに十分な条件で反応させることを含む。本発明の目的上、「十分な条件」は、以下の実施例に記載の条件のみならず、たとえば所望の最終生成物の獲得と関連した温度、好適な試薬、溶剤等も含まれると理解されるものとする。
【０１２２】
本発明の幾つかの特に好ましい化合物を、以下の実施例及び図に記載する。たとえば、化合物１６、１８、２０及び２１を参照されたい。
【０１２３】
本明細書に開示されている化合物及びそれらの使用方法は、以下の非限定的実施例によってさらに理解することができる。
【０１２４】
ＶＩ．実施例
当業者に自明であろうが、本発明の多くの修飾及び変更は、その精神及び範囲から逸脱することなく行うことができる。以下に記載の具体的な実施形態は、例として提供されているに過ぎず、本発明は添付の請求の範囲の語句、ならびにこのようなクレームに与えられる均等物の全範囲のみによって制限される。
【０１２５】
実施例１  ３−［２−ヒドロキシ−４−（エチル）（２−ブチルオキシカルバミドエチル）−アミノ］フェニル−２−メチル−２−プロペン酸（１３）の合成
工程１．（２−エチルアミノエチルカルバミン酸１，１−ジメチルエチルエステル）（３）の合成
図１を参照されたい。Ｎ−エチルエチレンジアミン（１）２５ｇ（０．２８mol）を、乾燥した５００ml丸底フラスコに入れた。ＣａＨからの蒸留によって事前に乾燥させたＴＨＦ  ２５０mlを、カニューレで加えた。フラスコをアルゴン条件下に置き、氷浴中で２０分間冷却した。乾燥した滴下ロートにＴＨＦ  ５０mlを入れ、これにジ−tert−ブチルジカルボネート（２）２９．３ml（０．１３mol）を加えた。この混合物を、撹拌したアミンにゆっくり滴加した。添加完了後、この反応混合物を氷浴から取り出し、一晩、撹拌して周囲温度に到達させた。揮発性物質を回転蒸発で除去した。飽和ＮａＣｌ（５０ml）を加え、得られたものを４×１００mlの酢酸エチルで抽出した。合わせた有機分画を、Ｎａ2ＳＯ4で一晩乾燥させた。乾燥剤を濾過で除去し、揮発性物質を回転蒸発で除去して、２−エチルアミノエチルカルバミン酸１，１−ジメチルエチルエステル（３；２７．５５ｇ、０．１５mol）を得た。この物質を、それ以上精製せずに使用した。
【０１２６】
工程２．（２−（エチル）（３−シクロヘキサ−２−エン−１−オン）アミノエチルカルバミン酸１，１−ジメチルエチルエステル）（５）の合成
ベンゼン２００mlを、５００ml丸底フラスコ内の２−エチルアミノエチルカルバミン酸、１，１−ジメチルエチルエステル（３）２７．５ｇ（０．１５mol）に加えた。ディーン−スタークトラップ（Dean-Stark trap）及びコンデンサーを、フラスコに装備した。この混合物をアルゴン下で還流させ、１，３−シクロヘキサンジオン（４）１８ｇ（１．１当量）を、一度に加えた。ベンゼン／水層、全量約７５mlを、トラップから取り出した。トラップをアセトンですすぎ、短時間乾燥させ、速やかに元に戻し、用時活性化した４Ａモレキュラーシーブスを充填し、反応を一晩続行させた。反応をアルゴン下で周囲温度に冷却した。揮発性物質を回転蒸発で除去し、静置したとき固化することもある、赤橙色の油状物を得た。この物質（２−（エチル）（３−シクロヘキサ−２−エン−１−オン）アミノエチルカルバミン酸１，１−ジメチルエチルエステル；５）を、それ以上精製せずに使用した。
【０１２７】
工程３．（２−（エチル）（２−ヒドロキシフェニル）アミノエチルカルバミン酸１，１−ジメチルエチルエステル）（６）の合成
未精製の２−（エチル）（３−シクロヘキサ−２−エン−１−オン）アミノエチルカルバミン酸１，１−ジメチルエチルエステル（５）０．１５molに、ＣａＨから用時蒸留したＣＨ3ＣＮ  ３００mlを加えた。この混合物をアルゴン下で還流させ、酢酸水銀、Ｈｇ（ＡｃＯ）2、１．１当量を一度に加えた。この懸濁液を、アルゴン下、還流状態で、一晩撹拌した。反応は、濃い赤紫色溶液への変色、紫色沈澱物及び元素状のＨｇを伴った。この反応混合物を、アルゴン下、周囲温度に冷却させ、次いで遠沈管に移し、３０００ｒｐｍで１０分間、遠心分離した。上澄溶液を除去して合わせた。さらにＣＨ3ＣＮを遠沈管に加えた；固体沈澱物を再懸濁し、及び上述のとおりに遠心分離した。先に得られたものと一緒に上澄をプールした。揮発性物質を回転蒸発で除去した。濃紫色の単離物を、最少量のクロロホルムとともに分液ロートに移し、得られた溶液を、水層のｐＨが約７になるまで５％ＮａＨＣＯ3で洗浄した。有機層を除去し、クロロホルムでさらに２回抽出し、続いて酢酸エチルで３回抽出した。有機分画を合わせ、Ｎａ2ＳＯ4で乾燥させ、回転蒸発で揮発性物質を除去した。このようにして得られた未精製の物質は、アルゴン下、−８０℃で数日まで、保存することができる。シリカ６８０ｇを脱色炭１３４ｇと混合し、ヘキサンでスラリー化し、充填物約１９０mmが入った１００mmガラスカラムに注ぎ込んだ。未精製の単離物を、最少量のクロロホルム（３×５０ml）で負荷した。酢酸エチル／ヘキサン：１．５リットル、２０％；１．５リットル、３０％；１．５リットル、４０％；１リットル、５０％を使用して、７〜１０ｐｓｉで溶離を実施した。分画をプールし、揮発性物質を回転蒸発で除去すると、僅かに黄色っぽい油状物が残った。この物質（２−（エチル）（２−ヒドロキシフェニル）アミノエチルカルバミン酸１，１−ジメチルエチルエステル；６）は、この時点で、空気及び光に対する感受性と一致する挙動を示すため、しかるべく扱わなければならない。これは、アルゴン下、−２０℃で、１ヶ月間、首尾よく保存された。収量：８．７８ｇ（２段階で２１％）。
【０１２８】
工程４．（３−（エチル）（２−アセチルアミノエチル）アミノフェノール）（８）の合成
脱気した酢酸エチル（７５ml）を、２−（エチル）（２−ヒドロキシフェニル）アミノエチルカルバミン酸１，１−ジメチルエチルエステル（６）５．５ｇ（１９．６mmol）に加えた。これに、３Ｎ  ＨＣｌ  ５０mlを加え、この反応混合物を周囲温度で一晩撹拌した。３０％ＥｔＯＡｃ／ヘキサンを使用して、ＴＬＣ分析を実施した。この反応混合物を分液ロートに移し、１Ｎ  ＨＣｌ  ２×４０mlで抽出した。プールした水層を回転式蒸発装置にかけ、揮発性物質を除去した。水を加え（約５０ml）、２サイクルの回転蒸発で除去した。得られた油状物をドライアイスで凍結し、真空下に置き、次いで自然に温めて、全ての揮発性物質を除去した。得られたぱりぱりした物質（７）は、それ以上精製せずに使用し、空気および水分のない状態に保った。この単離物に、乾燥ピリジン（７５ml）をカニューレで加えた。フラスコを旋回させて、この物質を溶解した。無水酢酸（１．２当量）をシリンジで加え、この反応混合物をアルゴン下、周囲温度で撹拌した。１０％メタノール／クロロホルムを使用して、ＴＬＣ分析を実施した。反応完了後、ピリジンを回転蒸発で除去し、残留物を１０％ＮａＯＨ  １００mlで処理し、アルゴン下で一晩撹拌した。この反応混合物を１Ｎ  ＨＣｌでｐＨ９に調節し、酢酸エチル４×７５mlで抽出した。合わせた有機層を水で、次いでブラインで（各１回）洗浄し、Ｎａ2ＳＯ4で予備乾燥し、次いでＭｇＳＯ4で一晩乾燥させた。濾過で溶液を回収し、揮発性物質を回転蒸発で除去した。この物質を、シリカを用いたフラッシュクロマトグラフィで精製し（５％メタノール／クロロホルムにより負荷し；上記３．３、６．６、及び９．９％溶剤、各１５０mlで溶離した）、３−（エチル）（２−アセチルアミノエチル）アミノフェノール（８）を得た。収量は４．２ｇ（９６％）であった。
【０１２９】
工程５．（２−ヒドロキシ−４−（エチル）（２−アセチルアミノエチル）アミノベンズアルデヒド）（９）の合成
慎重に乾燥したフラスコに無水ＤＭＦ（１５ml）を入れ、アルゴン下、氷中で冷却した。オキシ塩化リン、ＰＯＣｌ3、１．５ml（１．１５当量）を、撹拌した溶液にゆっくり滴加した。添加完了後、フラスコを氷浴から取り出し、周囲温度に到達させた。これは、黄色への変色を伴った。フラスコを、４０℃の湯浴中で１時間、加温した。これを、熱から外し、いったん周囲温度で、３−（エチル）（２−アセチルアミノエチル）アミノフェノール（８；３．２ｇ、１４mmol）のＤＭＦ溶液を滴下ロートで加えた。添加完了後、フラスコを４０℃の湯浴に戻し、一晩撹拌した。この反応混合物を０℃に冷却し、１０％ＮａＯＨ  ２５mlを加え、混合物を周囲温度まで温めさせ、次いで４０℃の湯浴に入れた。さらにＮａＯＨを加えて、ｐＨ＞１０を達成した。水（５０ml）を加えた。１５分後、フラスコを湯浴から取り出し、１Ｎ  ＨＣｌでｐＨを５〜５．５に調節した。この混合物を分液ロートに移し、酢酸エチル４×１００mlで抽出した。プールした有機分画を水で洗浄し（１×７５ml）、Ｎａ2ＳＯ4で予備乾燥し、次いでＭｇＳＯ4で一晩乾燥させた。濾過で溶液を回収し、揮発性物質を回転蒸発で除去して、粗生成物を得た（２．９ｇ）。この物質を、シリカ、４５×１５０mmカラムを用い、各２００mlの２．５％、５％、及び１０％のメタノール／クロロホルムで溶離するフラッシュクロマトグラフィで精製した。（２−ヒドロキシ−４−（エチル）（２−アセチルアミノエチル）アミノベンズアルデヒド）（９）の精製収量は１．５２ｇ（４５％）であった。
【０１３０】
工程６．（３−［２−ヒドロキシ−４−（エチル）（２−アセチルアミノエチル）アミノ］フェニル−２−メチルプロペン酸エチルエステル）（１１）の合成。
２−ヒドロキシ−４−（エチル）（２−アセチルアミノエチル）アミノベンズアルデヒド（９；１．５８ｇ、６．３mmol）を、脱気したベンゼン（５０ml）が入っているフラスコに入れた。カルベトキシ（エチリデン）トリフェニルホスホラン（１０；１．０５当量）を加え、反応混合物をアルゴン下で一晩撹拌した。反応混合物から、揮発性物質を回転蒸発で除去し、次いでフラッシュクロマトグラフィ（シリカ、９５mm×４５mm）で精製し（２．５％メタノール／クロロホルム２５０ml；５％メタノール／クロロホルム１５０ml；及び１０％メタノール／クロロホルム１５０mlで溶離する）、３−［２−ヒドロキシ−４−（エチル）（２−アセチルアミノエチル）アミノ］フェニル−２−メチルプロペン酸エチルエステル（１１）を得た。収量は定量的であった。
【０１３１】
工程７．（３−［２−ヒドロキシ−４−（エチル）（２−tert−ブチルオキシカルバミドエチル）−アミノ］フェニル−２−メチルプロペン酸エチルエステル）（１２）の合成
３−［２−ヒドロキシ−４−（エチル）（２−アセチルアミノエチル）アミノ］フェニル−２−メチルプロペン酸エチルエステル（１１；２．０ｇ、６mmol）を、無水ＴＨＦ（３０ml）に溶解した。ジ−ｔ−ブチルジカルボネート（２；３当量）及びジメチルアミノピリジン（０．１当量）を加え、この反応混合物を７５℃に加熱した。反応完了を判定するために、ＴＬＣ分析（シリカ、５％メタノール／クロロホルム）を使用した；３．５時間後、反応が終了していると確認された。溶液を周囲温度まで冷却させ、無水メタノールで反応体積を倍加させ、ヒドラジン（３当量）をシリンジで滴加した。反応混合物を、アルゴン下で一晩撹拌させた。この溶液を、分液ロート内のＣＨ2Ｃｌ2  １００mlに注ぎ入れ、水（１００ml）を加えた。この混合物を振とうし、分離させ；１Ｎ  ＨＣｌを慎重に加え、加えるごとに十分に振とうすることによって、この水層をｐＨ４．５に調節した。水層は濁っていたが、無色であった。完全に洗浄した後、層を分離し、ｐＨ７．８〜８．０のＮａＨＣＯ3水溶液で有機層を洗浄した。ＭｇＳＯ4上で一晩撹拌することにより、有機層を乾燥させた。濾過で溶液を回収し、揮発性物質を回転蒸発で除去した。シリカを用いたフラッシュクロマトグラフィで、１５％酢酸エチル／ヘキサン４００ml及び３０％酢酸エチル／ヘキサン３００mlを使用して、この物質を精製し、３−［２−ヒドロキシ−４−（エチル）（２−tert−ブチルオキシカルバミドエチル）アミノ］フェニル−２−メチルプロペン酸エチルエステル（１２）を得た。収量は１．７ｇ（７２％）であった。
【０１３２】
工程８．３−［２−ヒドロキシ−４−（エチル）（２−tert−ブチルオキシカルバミドエチル）−アミノ］フェニル−２−メチルプロペン酸（１３）の合成
３−［２−ヒドロキシ−４−（エチル）（２−tert−ブチルオキシカルバミドエチル）アミノ］フェニル−２−メチルプロペン酸エチルエステル（１２；７５９mg、１．９mmol）をエタノール（１０ml）中に取った。１０％（ｗ／ｖ）ＬｉＯＨ  ５mlを加え、この反応混合物を、アルゴン下で４０℃に加熱した。６時間後、反応を完了し、ＴＬＣで確認した。この混合物を周囲温度に冷却し、１Ｎ  ＨＣｌでｐＨを５〜６に調節し、エーテル（４×５０ml）中に抽出し；合わせた有機層を飽和ＮＨ4＋Ｃｌ−で洗浄し、ＣａＳＯ4で一晩乾燥させた。濾過で溶液を回収し、揮発性物質を回転蒸発で除去して、３−［２−ヒドロキシ−４−（エチル）（２−tert−ブチルオキシカルバミドエチル）アミノ］フェニル−２−メチルプロペン酸（１３）を得た。この物質は、それ以上精製せずに使用した。収量は５０９mg（７４％）であった。
【０１３３】
実施例２  ３−［２−ヒドロキシ−４−（エチル）アミノエチル）アミノ］フェニル−２−メチルプロペン酸４−アミノイミノフェニルエステル塩酸塩（１６；Ｎ−ＣＩＮＮ−ＡＰ）の調製
工程１．３−［２−ヒドロキシ−４−（エチル）（２−tert−ブチルオキシカルバミドエチル）アミノ］−フェニル−２−メチルプロペン酸４−アミノイミノフェニルエステル塩酸塩（１５；ｔＢＯＣ−Ｎ−ＣＩＮＮ−ＡＰ）の合成
図２を参照されたい。３−［２−ヒドロキシ−４−（エチル）（２−tert−ブチルオキシカルバミドエチル）−アミノ］フェニル−２−メチルプロペン酸（１３）（５０９mg；１．４mmol）を、無水ピリジンに溶解した。ジシクロヘキシルカルボジイミド（１．２当量）、４−アミノイミノメチルフェノール塩酸塩（１４；１．１当量）及びジメチルアミノピリジン（０．０５当量）を加え、アルゴン下、周囲温度で１２〜１６時間撹拌した。この反応混合物を、中間有孔度の焼結ガラスフィルターを通過させ、揮発性物質を回転蒸発で除去した。単離物を５％メタノール／クロロホルム中に取り、濾過し、上記のとおりに揮発性物質を除去した。未精製の物質、１５、を、シリカを用いたフラッシュクロマトグラフィで精製した（５％メタノール／クロロホルム３mlで負荷し、５％メタノール／クロロホルム１００ml；１０％メタノール／クロロホルム７５ml；１５％メタノール／クロロホルム７５ml；及び２０％メタノール／クロロホルム２００mlで溶離した）。収量は４４８mg（６６％）であった。
【０１３４】
工程２．３−［２−ヒドロキシ−４−（エチル）アミノエチル）アミノ］フェニル−２−メチルプロペン酸４−アミノイミノフェニルエステル塩酸塩（１６；Ｎ−ＣＩＮＮ−ＡＰ）の合成
３−［２−ヒドロキシ−４−（エチル）（２−tert−ブチルオキシカルバミドエチル）アミノ］フェニル−２−メチルプロペン酸４−アミノイミノフェニルエステル塩酸塩（１５；１２mg、２５μmol）を、３Ｎ  ＨＣｌ  １．２ml中に懸濁し、周囲温度で３時間転回することによって混合し、ｔ−ＢＯＣ基を放出して、３−［２−ヒドロキシ−４−（エチル）アミノエチル）アミノ］フェニル−２−メチルプロペン酸４−アミノイミノフェニルエステル塩酸塩（１６；Ｎ−ＣＩＮＮ−ＡＰ）を生成した。３時間後、反応混合物を３Ｎ  ＮａＯＨで中和し、最終ｐＨ７．０とした。この物質を直ちに使用し、その時、水性溶液に可溶性であったこと以外は、さらに特性決定しなかった。
【０１３５】
実施例３  ｍＰＥＧ5000−Ｎ−ＣＩＮＮ−ＡＰ（１８）の調製
図３及び４を参照されたい。ｍＰＥＧ5000−ＳＳ（２Ｍ４Ｒ０Ｈ０１；Shearwater Polymers）を以下のとおりに使用した。１０mMリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．２）１ml中の、３−［２−ヒドロキシ−４−（エチル）アミノエチル）アミノ］フェニル−２−メチルプロペン酸４−アミノイミノフェニルエステル塩酸塩（１６；２．５mg、６．５μmol；ｐＨ７．０〜７．４）を、乾燥ｍＰＥＧ5000−ＳＳ（１７；３８．３mg、７．５μmol）に加えた。周囲温度で１時間後、水１００μl中の７５μＭのグルシルグリシンを加えることにより反応を停止させた。この物質（ｍＰＥＧ5000−ＮＨ−ＣＩＮＮ−ＡＰ；１８）を、３時間以内に、トロンビン及びｔＰＡ等のセリンプロテアーゼとの阻害反応のために使用した。
【０１３６】
実施例４  Ｒ−ＮＨ−ＣＩＮＮ−ＡＰ誘導体を用いたトロンビンの阻害
Ｒは−ｔＢＯＣ、−Ｈ2＋、又はｍＰＥＧ5000である。ヒト・トロンビンを、Ｒ−ＮＨ−ＣＩＮＮ−ＡＰインヒビターで以下のとおりに修飾した：５０mMクエン酸ナトリウム緩衝液、３mM  ＣａＣｌ2、７％コリドン（ｐＨ７．０）中のトロンビン（６００単位；〜３．５nmol）を、Ｒ−Ｎ−ＣＩＮＮ−ＡＰインヒビター３．５〜３５nmolと、周囲温度にて暗所で１２〜１８時間、反応させた。トロンビン活性を、赤色光（「暗」）下、及び歯科用ライトからの青色光に１０秒間曝露した後に測定し、３０℃でＳ−２２３８（diaPharma）を使用してアッセイした。阻害率を、１００−暗活性として算出した。暗活性は、［活性暗÷活性対照］×１００として算出した。光再活性化は、活性光÷活性対照として算出した。以下は、代表的な結果である。
【０１３７】
【表１】
2004535379.tif 000013
【０１３８】
Ｒ−ＮＨ−ＣＩＮＮ−ＡＰ化合物は、親化合物ＣＩＮＮ−ＡＰと同様に、トロンビンを阻害した。アシル−トロンビンの全てを青色光で再活性化することができ、Ｒ−ＮＨ−ＣＩＮＮ−ＡＰを作るための修飾は、分子が異性化してアシル酵素から遊離の酵素を放出する能力に影響を及ぼさないことが分かった。陽電荷を含む、ＮＨ3−ＣＩＮＮ−ＡＰは、低いモル比では、効果の低いインヒビターのようであった。５０００ダルトンの線状ｍＰＥＧ分子を含む、ｍＰＥＧ5000−ＮＨ−ＣＩＮＮ−ＡＰは、トロンビン阻害を実行するために、より高い濃度を必要とした。以上の結果から、光可逆的、共有結合的インヒビターの効果を失うことなく、分子の他の部分を変更できることが分かった。光再活性化は、本質的同一のものとなり、Ｒ−ＮＨ−ＣＩＮＮ−アシル−トロンビン分子は青色光エネルギーを吸収して異性化し、シス立体配置を生じて、活性なトロンビンを放出することが分かった。
【０１３９】
実施例５  Ｒｚ−ＮＨ−ＣＩＮＮ−ＡＰ誘導体を用いた組織プラスミノーゲンアクティベーター（ｔＰＡ）の阻害
Ｒｚは、−ｔＢＯＣ、−Ｈ2＋、又はｍＰＥＧ5000である。ヒトｔＰＡ（Activase、Genentech Inc.、ロット番号Ｅ９０３４Ａ）を、トロンビンの代わりにＲｚ−ＮＨ−ＣＩＮＮ−ＡＰインヒビターで修飾したことを除いて実施例４の手順を繰り返した。反応は、以下のとおりに実行した：１０mMｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１３０mM  ＮａＣｌ、（ｐＨ７．４）中のｔＰＡ（０．８３nmol）を、Ｒ−ＮＨ−ＣＩＮＮ−ＡＰインヒビター０．８３〜８．３nmolと、暗所で周囲温度にて１２〜１８時間反応させた。活性は、Ｓ−２２８８（diaPharma）を使用して、実施例４のとおりに算出した。結果を以下に示す。
【０１４０】
【表２】
2004535379.tif 000014
【０１４１】
Ｒｚ−ＮＨ−ＣＩＮＮ−ＡＰ化合物は、親化合物ＣＩＮＮ−ＡＰと同様に、ｔＰＡを阻害する。全てのアシル−ｔＰＡを青色光で再活性化することができ、Ｒ−ＮＨ−ＣＩＮＮ−ＡＰを作るための修飾は、分子が異性化してアシル酵素から遊離の酵素を放出する能力に影響を及ぼさないことが分かった。陽電荷を含む、ＮＨ3−ＣＩＮＮ−ＡＰは、低いモル比では、効果の低いインヒビターのようであった。以上の結果から、光可逆的、共有結合的インヒビターの効果を失うことなく、分子の他の部分を変更できることが分かった。光再活性化は、本質的に同一のものとなり、Ｒ−ＮＨ−ＣＩＮＮ−アシル−ｔＰＡ分子は青色光エネルギーを吸収して異性化し、シス立体配置を生じて、活性なｔＰＡを放出することが分かった。
【０１４２】
実施例６  マレイミドリンカー（２０）を用いたＮ−ＣＩＮＮ−ＡＰの調製
Ｎ−ＣＩＮＮ−ＡＰ（１６；１０μmol、１ml）を、ＤＭＳＯ  ０．５ml及び２００mMリン酸ナトリウム（ｐＨ７．４）０．５ml中のＳＭＰＨ（スクシンイミジル−［β−マレイミドプロピオンアミド］ヘキサノエート；Pierce、#22363）１１．４μmolと、周囲温度にて２時間、反応させた。２時間後、この反応混合物を氷上に置き、未反応のＮＨＳを１００mMグルシルグリシン０．０５mlで失活させた。最終生成物（２０）は、２時間以内に使用し、さらなる特性決定はしなかった。
【０１４３】
実施例７  抗体−リンカー−Ｎ−ＣＩＮＮ−ＡＰ（２１）の調製
モノクローナル抗体、ハーセプチン（Herceptin）（登録商標）（トラスツズマブ、Genentech）を、リン酸−ＮａＣｌ緩衝液（ｐＨ７）中５mg／mlで調製した。ＳＡＴＡ（Ｎ−スクシンイミジル  Ｓ−アセチルチオアセテート；Pierce）を、ＤＭＳＯに溶解し、２０倍モル濃度過剰を、このタンパク質に加え、１時間反応させた。ヒドロキシルアミンＨＣｌ（Pierce；０．５Ｍ、ｐＨ７．０まで中和）を６０〜９０分間加え、リン酸−ＮａＣｌ緩衝液中で緩衝化したＤ−ＳＡＬＴ  ポリアクリルアミド脱塩カラム（Pierce）を用いたクロマトグラフィで、抗体を低分子量物質と分離した。エルマン（Ellman）の試薬（Pierce）を使用して、抗体へのチオールの組み込み（抗体−ＳＨ）を測定した。組み込まれた−ＳＨ基より２倍モル濃度過剰の２０を、ｐＨ７．４及び周囲温度で２時間、抗体−ＳＨに加え、２１を得た。抗体含有分画（２１）を、上記のＤ−ＳＡＬＴカラムで、過剰の２０と分離した。
【０１４４】
実施例８  抗体−リンカー−Ｎ−ＣＩＮＮ−酵素（２２）の調製
２１を、周囲温度にてｐＨ７．０で１２〜１６時間、トロンビン（４００U/ml；Enzyme Research Labs）と混合して２２を形成し、リン酸−ＮａＣｌ緩衝液で３回洗浄しておいたプロテインＡ−アガロースビーズ（Oncogene）に結合することによって、２２を遊離の酵素と分離した。穏やかに９０分間混合した後、ビーズを遠心分離で３回洗浄し、未結合酵素を含む上澄を除去した。０．５mM  Ｓ−２２３８（Chromogenix）を含むｐＨ８．３のアッセイ緩衝液中に、このビーズを懸濁し、３０℃で６分間アッセイした。次いで、プロライト（ProLite）歯科用ライトからの青色光を、１０秒間、ウェルに向け、アッセイをさらに６分間続けた。光に曝露したとき、Ｓ−２２３８切断率が７〜８倍上昇し、遊離のトロンビンが溶液中への放出を示した。
【０１４５】
実施例９  抗体−ＰＥＧ−Ｎ−ＣＩＮＮ−ＡＰ（２３）の調製
５０mMリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）中のＮ−ＣＩＮＮ−ＡＰ（１６、２．４μmol、１．０ml）と、ＷＦＩ  １ml中のＰＥＧ3400−（ＳＰＡ）2（ＰＥＧスクシンイミジルプロピオネート；Shearwater Polymers,Inc）４．８μmolとを、周囲温度で１時間、反応させた。以下のとおりに、ＳＰＡ−ＰＥＧ−Ｎ−ＣＩＮＮ−ＡＰを、ヤギ抗−ウサギＩｇＧ（Calbiochem、４０１３１１）と直ちに反応させた：ＳＰＡ−ＰＥＧ−Ｎ−ＣＩＮＮ−ＡＰ  １０．６nmolと、抗体２．６nmolとを、周囲温度にてｐＨ７．０で２時間、反応させた。この反応混合物を氷上に置き、余分のＳＰＡを１００mMグルシルグリシン０．０５mlで失活させた。この生成物は、２時間以内に使用し、さらなる特性決定はしなかった。
【０１４６】
実施例１０  抗体−ＰＥＧ−Ｎ−ＣＩＮＮ−アシル−トロンビン（２４）の調製及びアッセイ
抗体−ＰＥＧ−Ｎ−ＣＩＮＮ−ＡＰ（２３）と、トロンビン（４００U/ml；Enzyme Research Labs）とを、周囲温度にてｐＨ７．０で１６時間混合した。次いで、抗体−アシル酵素複合体を、その抗原に結合して活性な酵素を放出する力についてテストした。標準手順書に従って、ウサギＩｇＧ（Calbiochem）をポリスチレンプレートに結合させた。次いで、このプレートをＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ  ２０／ＢＳＡ（Sigma）で２時間ブロックし、ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ  ２０で徹底的に洗浄して、余分のタンパク質を除去した。次いで、ヤギ抗−ウサギ抗体−ＰＥＧ−Ｎ−ＣＩＮＮ−アシル−トロンビン（２４）を、プレート上のウサギＩｇＧに、周囲温度にて２時間結合させた。次いで、このプレートをＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ  ２０で５回洗浄して、あらゆる未結合の抗体−トロンビン又は遊離のトロンビンを除去した。実施例８に記載のＳ−２２３８クロモジェニックアッセイを使用して、このプレートを、トロンビン活性についてアッセイした。１０秒の光活性化後、Ｓ−２２３８切断率は５倍上昇し、トロンビンの溶液中への放出が示された。
【０１４７】
実施例１１〜１３
ターゲティング剤としてのマウスｍＡｂｓ
以下の実施例は、特異的マウスｍＡｂ−ＡＺ−ＣＩＮＮ複合体調製、及び治療適応症ごとのターゲティング剤としてのそれらの有用性に関する詳細を提供する。
【０１４８】
実施例１１  肺癌
Ａ．抗体−リンカー−ＣＩＮＮ−酵素の調製及びその使用
５０mMリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）中のＮ−ＣＩＮＮ−ＡＰ（１６、２．４μmol、１．０ml）を、ＤＭＳＯに溶解したＮＨＳ−ＰＥＧ3400−ＭＡＬ（Shearwater Polymers, Inc.、ＮＨＳ−Ｍａｌ−３４００）４．８μmolと反応させた。この反応混合物を、周囲温度で２時間、揺り動かした。１００mMグルシルグリシン１００μlを加えることにより、反応を停止させた。Ｍａｌ−ＰＥＧ3400−Ｎ−ＣＩＮＮ−ＡＰは、２時間以内に使用し、さらなる特性決定はしなかった。
【０１４９】
Ｂ．抗体−ＰＥＧ−Ｎ−ＣＩＮＮ−アシル−トロンビンの調製
マウスモノクローナル抗体、ＢＲ１１０（Hellstromら、米国特許第５，８４０，８５４号）を、リン酸−ＮａＣｌ緩衝液（ｐＨ７）中５mg／mlに希釈した。ＳＡＴＡ（Ｎ−スクシンイミジル  Ｓ−アセチルチオアセテート；Pierce）を、ＤＭＳＯに溶解し、２０倍モル過剰をこのタンパク質に加え、１時間反応させた。ヒドロキシルアミンＨＣ１（Sigma；０．５Ｍ、ｐＨ７．０に中和）を６０〜９０分間加え、リン酸−ＮａＣｌ緩衝液で緩衝化させたＤ−ＳＡＬＴ  Ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ脱塩カラム（Pierce）を用いたクロマトグラフィで、抗体を低分子量物質と分離した。エルマン（Ellman）の試薬（Pierce）を使用して、マウス抗体へのチオールの組み込み（抗体−ＳＨ）を決定した。組み込まれたＳＨ基より２倍モル過剰のＭａｌ−ＰＥＧ3400−Ｎ−ＣＩＮＮ−ＡＰを、ｐＨ７．４及び周囲温度で２時間、ＢＲ１１０−ｍＡｂ−ＳＨに加え、ＢＲ１１０−ｍＡｂ−Ｓ−Ｍａｌ−ＰＥＧ3400−Ｎ−ＣＩＮＮ−ＡＰを得た。５０mMリン酸ナトリウム（ｐＨ６．５）及び１５０mM  ＮａＣｌで緩衝化させたＤ−ＳＡＬＴカラム（Pierce）を用いて、抗体含有分画（ＢＲ１１０−ｍＡｂ−Ｓ−Ｍａｌ−ＰＥＧ3400−Ｎ−ＣＩＮＮ−ＡＰ）を、余分のＭａｌ−ＰＥＧ3400−Ｎ−ＣＩＮＮ−ＡＰと分離した。セントリコン（Centricon）ＹＭ−３０膜を使用して、抗体−薬剤（ＢＲ１１０−ｍＡｂ−Ｓ−Ｍａｌ−ＰＥＧ3400−Ｎ−ＣＩＮＮ−ＡＰ）を、５mg／mlタンパク質に濃縮し、滅菌濾過した（０．２２μｍフィルター；Gelman Sciences、Supor Acrodisc 25）。ＢＲ１１０−ｍＡＢ−Ｓ−Ｍａｌ−ＰＥＧ−Ｎ−ＣＩＮＮ−ＡＰと、トロンビン（４００U/ml；Enzyme ResearchLabs）とを、周囲温度にてｐＨ７．０で１６時間、混合した。次いで、この抗体−アシル酵素複合体を遊離のトロンビンと分離し、セントリコン（Centricon）ＹＭ−１００膜を使用して、５mg／mlタンパク質に濃縮し、滅菌濾過した（０．２２μｍフィルター；Gelman Sciences、Supor Acrodisc 25）。
【０１５０】
Ｃ．ＢＲ１１０−ｍＡｂ−Ｓ−Ｍａｌ−ＰＥＧ３４００−Ｎ−ＣＩＮＮ−アシル−トロンビンによるヒト肺癌の処置
ＭＡｂ  ＢＲ１００は、ヒト肺、結腸及び乳房の腫瘍細胞の細胞表面上に存在する６６−ｋＤａ糖タンパク質に対するマウスｍＡｂである。ヒト肺癌細胞系Ｈ２９８７を、記述（米国特許第５，８４０，８５４号）どおりに細胞培養で増殖させた。１×１０７細胞／マウスを、ヌードマウスに皮下移植した。腫瘍が１５０〜２００mm3のサイズに達したとき、ＢＲ１１０−ｍＡｂ−Ｓ−Ｍａｌ−ＰＥＧ3400−Ｎ−ＣＩＮＮ−アシル−トロンビンを使用して、以下のとおりに腫瘍を処置した；ＢＲ１１０−ｍＡｂ−Ｓ−Ｍａｌ−ＰＥＧ3400−Ｎ−ＣＩＮＮ−アシル−トロンビン１．０mg（〜２７nmolのトロンビンが共有結合しているｍＡｂタンパク質１mg）を、尾静脈から腫瘍マウスに静脈内注射した。６時間後、ＢＲ１１０−ｍＡｂ−Ｓ−Ｍａｌ−ＰＥＧ3400−Ｎ−ＣＩＮＮ−アシル−トロンビンを投与されたマウスを、ケタミン／ロムパン（Rompun）混合物で麻酔した。１６Ｇの針を使用して、皮膚に穴を作り、１mmの光ファイバー・プローブを腫瘍まで挿入した。この腫瘍を、約０．５mW/cm2のエネルギーを有する白色光に５分間曝露した。他の処置群は、光処置を受けなかった。薬剤の光活性化を防止するために、注射後７２時間、全てのマウスを「赤色光」下に置き、次いで通常の明／暗周期に戻した。光処置を受けた群の腫瘍はは直ちに縮小し（７日で＞５０％）、壊死した。ＢＲ１１０−ｍＡｂ−Ｓ−Ｍａｌ−ＰＥＧ3400−Ｎ−ＣＩＮＮ−アシル−トロンビンで処置したが、光刺激を受けなかった腫瘍は、はるかに遅いペースで収縮し、２８日に、１００mm３より小さかった。抗体及び遊離の（連結していない）薬剤を受けた群は、腫瘍増殖を示し、２８日までに、マウスは死亡するか又は＞８００mm３の腫瘍を有するかのいずれかであった。
【０１５１】
実施例１２  結腸癌
Ａ．抗体−リンカー−ＣＩＮＮ−アシル−トロンビンの調製
実施例１１Ａで上述したとおりに、Ｍａｌ−ＰＥＧ3400−Ｎ−ＣＩＮＮ−ＡＰを調製した。
【０１５２】
Ｂ．抗体−ＰＥＧ−Ｎ−ＣＩＮＮ−アシル−トロンビンの調製
ヒト結腸癌細胞上に存在する４５ｋＤａの糖タンパク質に対するマウスｍＡｂであるＭＡｂ  Ａ７を、ＢＲ１１０−ｍＡｂの代わりに使用して、Ａ７−ｍＡｂ−Ｓ−Ｍａｌ−ＰＥＧ3400−Ｎ−ＣＩＮＮ−アシル−トロンビンを生じさせたこと以外は、実施例１１Ｂの手順を繰り返した。
【０１５３】
Ｃ．Ａ７−ｍＡｂ−Ｓ−Ｍａｌ−ＰＥＧ3400−Ｎ−ＣＩＮＮ−アシル−トロンビンによるヒト結腸癌の処置
ヒト結腸癌細胞系ＬＳ−１８０を、記述（Kinuyaら、J. Nucl. Med. 42: 596-600(2001年)）どおりに、細胞培養で増殖させた。１×１０７細胞／マウスを、ヌードマウスに皮下移植した。腫瘍が１５０〜２００mm3のサイズに達したとき、Ａ７−ｍＡｂ−Ｓ−Ｍａｌ−ＰＥＧ3400−Ｎ−ＣＩＮＮ−アシル−トロンビンを使用して、以下のとおりに腫瘍を処置した；Ａ７−ｍＡｂ−Ｓ−Ｍａｌ−ＰＥＧ3400−Ｎ−ＣＩＮＮ−アシル−トロンビン１．０mg（〜２７nmolのトロンビンが共有結合している、ｍＡｂタンパク質１mg）を、尾静脈から腫瘍マウスに静脈内注射した。６時間後、Ａ７−ｍＡｂ−Ｓ−Ｍａｌ−ＰＥＧ3400−Ｎ−ＣＩＮＮ−アシル−トロンビンを投与されたマウスを、ケタミン／ロムパン（Rompun）混合物で麻酔した。１６Ｇの針を使用して、皮膚に穴を作り、１mmの光ファイバー・プローブを腫瘍まで挿入した。この腫瘍を、約０．５mW/cm2のエネルギーを有する白色光に５分間曝露した。他の処置群は、光処置を受けなかった。薬剤の光活性化を防止するために、注射後７２時間、全てのマウスを「赤色光」下に置き、次いで通常の明／暗周期に戻した。光処置を受けた群の腫瘍はは直ちに縮小し（７日で＞５０％）、壊死した。Ａ７−ｍＡｂ−Ｓ−Ｍａｌ−ＰＥＧ3400−Ｎ−ＣＩＮＮ−アシル−トロンビンで処置したが、光刺激を受けなかった腫瘍は、はるかに遅いペースで収縮し、２８日に、１００mm３より小さかった。抗体及び遊離の（連結していない）薬剤を受けた群は、腫瘍増殖を示し、２８日までに、マウスは死亡するか又は＞８００mm３の腫瘍を有するかのいずれかであった。
【０１５４】
実施例１３  乳癌
Ａ．抗体−リンカー−ＣＩＮＮ−アシル−トロンビンの調製
上述のとおりに、Ｍａｌ−ＰＥＧ3400−Ｎ−ＣＩＮＮ−ＡＰを調製した。
【０１５５】
Ｂ．抗体−ＰＥＧ−Ｎ−ＣＩＮＮ−アシル−トロンビンの調製
ヒト乳癌細胞上に存在する汎癌腫糖タンパク質に対するマウスｍＡｂであるＭＡｂ  ＮＲ−ＬＵ−１０を、ＢＲ１１０−ｍＡｂの代わりに使用して、ＮＲ−ＬＵ−１０Ｓ−Ｍａｌ−ＰＥＧ3400−Ｎ−ＣＩＮＮ−アシル−トロンビンを生じさせたこと以外は、実施例１１Ｂの手順を繰り返した。
【０１５６】
Ｃ．ＮＲ−ＬＵ−１０ｍＡｂ−Ｓ−Ｍａｌ−ＰＥＧ3400−Ｎ−ＣＩＮＮ−アシル−トロンビンによるヒト乳癌の処置
記述（Burakら、Nucl. Med. Biol. 25:633-637(1998年)）どおりに、ヒト乳癌異種移植片を調製した。異種移植片をヌードマウスに皮下移植した。腫瘍が１５０〜２００mm3のサイズに達したとき、ＮＲ−ＬＵ−１０ｍＡｂ−Ｓ−Ｍａｌ−ＰＥＧ3400−Ｎ−ＣＩＮＮ−アシル−トロンビンを使用して、以下のとおりに腫瘍を処置した；ＮＲ−ＬＵ−１０ｍＡｂ−Ｓ−Ｍａｌ−ＰＥＧ3400−Ｎ−ＣＩＮＮ−アシル−トロンビン１．０mg（〜２７nmolのトロンビンが共有結合している、ｍＡｂタンパク質１mg）を、尾静脈から腫瘍マウスに静脈内注射した。６時間後、ＮＲ−ＬＵ−１０ｍＡｂ−Ｓ−Ｍａｌ−ＰＥＧ3400−Ｎ−ＣＩＮＮ−アシル−トロンビンを投与されたマウスを、ケタミン／ロムパン（Rompun）混合物で麻酔した。１６Ｇの針を使用して、皮膚に穴を作り、１mmの光ファイバー・プローブを腫瘍まで挿入した。この腫瘍を、約０．５mW/cm2のエネルギーを有する白色光に５分間曝露した。他の処置群は、光処置を受けなかった。薬剤の光活性化を防止するために、注射後７２時間、全てのマウスを「赤色光」下に置き、次いで通常の明／暗周期に戻した。光処置を受けた群の腫瘍は直ちに縮小し（７日で＞５０％）、壊死した。ＮＲ−ＬＵ−１０ｍＡｂ−Ｓ−Ｍａｌ−ＰＥＧ3400−Ｎ−ＣＩＮＮ−アシル−トロンビンで処置したが、光刺激を受けなかった腫瘍は、はるかに遅いペースで縮小し、２８日に、１００mm3より小さかった。抗体及び遊離の（連結していない）薬剤を受けた群は、腫瘍増殖を示し、２８日までに、マウスは死亡するか又は＞８００mm3の腫瘍を有するかのいずれかであった。
【０１５７】
本出願に記載の様々な出版物、特許、特許出願及び公開された出願は、参照により本明細書に援用する。
【図面の簡単な説明】
【０１５８】
【図１】（３−［２−ヒドロキシ−４−（エチル）（２−tert−ブチルオキシカルバミドエチル）アミノ］フェニル−２−メチル−２−プロペン酸エチルエステル）（１２）の合成を説明する図である。
【図２】（３−［２−ヒドロキシ−４−（エチル）アミノエチル）−アミノ］フェニル−２−メチル−２−プロペン酸４−アミノイミノフェニルエステル塩酸塩）（Ｎ−ＣＩＮＮ−ＡＰ）（１６）の合成を説明する図である。
【図３】ｍＰＥＧ5000−Ｎ−ＣＩＮＮ−ＡＰ（１８）の調製を説明する図である。
【図４】ｍＰＥＧ5000−Ｎ−ＣＩＮＮ−ＡＰ（１８）及び酵素の反応による、誘導体化された、阻害された酵素（１９）の調製を説明する図である。
【図５】（１６）と、スクシンイミジル−６−［（β−マレイミドプロピオン−アミド）ヘキサノエート］との反応による、Ｎ−ＣＩＮＮ−ＡＰ（２０）のマレイミド誘導体、Ｍａｌ−Ｌ−Ｎ−ＣＩＮＮ−ＡＰの調製を説明する図である。
【図６】ＳＨ−修飾タンパク質と（２０）との反応によって、抗体−Ｌ−Ｎ−ＣＩＮＮ−ＡＰ（２１）を調製し、続いて酵素との反応によって、抗体−Ｍａｌ−Ｌ−Ｎ−ＣＩＮＮ−酵素（２２）を得る方法を説明する図である。
【図１】
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【図４】
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【図６】
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【国際公開パンフレット】
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2004535379.tif 000073
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004535379.tif 000074
2004535379.tif 000075
【国際調査報告】
2004535379.tif 000076
2004535379.tif 000077