(57)【要約】本発明の特徴は、単離チトクロームＰ４５０ポリペプチド類及び核酸分子類、並びにこれらの分子類を含有する発現ベクター類及び遺伝子組換え植物類である。また、本発明の特徴は、遺伝子組換え植物内の植物病原体によってひき起こされる疾患に対する抵抗性のレベルを増大させる方法、変化化合物類、例えば水酸化化合物類を生成するための方法、及びイソプレノイド化合物類を生成するための方法におけるかかる分子類の使用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
イソプレノイド化合物を生成するための方法であって、
（ａ）イソプレノイド合成酵素を含む第１の組換えタンパク質及びチトクロームＰ４５０ポリペプチドを含む第２の組換えタンパク質を発現するために適した条件下に宿主細胞を培養し、ここで前記第１及び第２の組換えタンパク質が前記宿主細胞によって正常には生成されないイソプレノイド化合物の形成を触媒するステップと：
（ｂ）前記イソプレノイド化合物を回収するステップと、
を含む前記方法。
【請求項２】
前記チトクロームＰ４５０ペプチドが、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のアミノ酸配列を含むポリペプチド、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３のアミノ酸配列を含むポリペプチド、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５のアミノ酸配列を含むポリペプチド、及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７のアミノ酸配列を含むポリペプチドからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記宿主細胞が、アセチルトランスフェラーゼ、メチルトランスフェラーゼ、及び脂肪アシルトランスフェラーゼからなる群から選択される第３の組換えタンパク質を更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記宿主細胞が内因性又は組換えチトクローム還元酵素を発現する、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記宿主細胞が酵母細胞、細菌細胞、昆虫細胞、又は植物細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
組換えイソプレノイド合成酵素及び組換えチトクロームＰ４５０ポリペプチドを発現する宿主細胞。
【請求項７】
前記宿主細胞が組換えアセチルトランスフェラーゼ、組換えメチルトランスフェラーゼ、又は組換え脂肪アシルトランスフェラーゼを更に発現する、請求項６に記載の宿主細胞。
【請求項８】
前記宿主細胞が内因性又は組換えチトクローム還元酵素を発現する、請求項６に記載の宿主細胞。
【請求項９】
前記宿主細胞が酵母細胞、細菌細胞、昆虫細胞、及び植物細胞からなる群から選択される、請求項６に記載の宿主細胞。
【請求項１０】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３のアミノ酸配列と８０％の同一性を有する単離チトクロームＰ４５０ポリペプチド。
【請求項１１】
前記ポリペプチドがＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のアミノ酸配列を含む、請求項１０に記載のポリペプチド。
【請求項１２】
前記ポリペプチドがＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３のアミノ酸配列を含む、請求項１０に記載のポリペプチド。
【請求項１３】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７のアミノ酸配列と８５％の同一性を有する単離チトクロームＰ４５０ポリペプチド。
【請求項１４】
前記ポリペプチドがＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５のアミノ酸配列を含む、請求項１３に記載のポリペプチド。
【請求項１５】
前記ポリペプチドがＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７のアミノ酸配列を含む、請求項１３に記載のポリペプチド。
【請求項１６】
前記ポリペプチドがＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１のアミノ酸配列と９７％の同一性を有する単離チトクロームＰ４５０ポリペプチド。
【請求項１７】
前記ポリペプチドがＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１のアミノ酸配列を含む、請求項１６に記載のポリペプチド。
【請求項１８】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１のアミノ酸配列と８０％の同一性を有するポリペプチドをコード化する単離チトクロームＰ４５０核酸分子。
【請求項１９】
前記核酸分子がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１を含む、請求項１８に記載の単離核酸分子。
【請求項２０】
前記核酸分子がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３を含む、請求項１８に記載の単離核酸分子。
【請求項２１】
前記核酸分子がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１を含む、請求項１８に記載の単離核酸分子。
【請求項２２】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７のアミノ酸配列と８５％の同一性を有するポリペプチドをコード化する単離チトクロームＰ４５０核酸分子。
【請求項２３】
前記核酸分子がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５を含む、請求項２２に記載の単離核酸分子。
【請求項２４】
前記核酸分子がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７を含む、請求項２２に記載の単離核酸分子。
【請求項２５】
前記核酸がチトクロームＰ４５０ポリペプチドをコード化する、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯＳ：２、４、６、８、又は１２に記載された配列の補体のいずれか１つに対してきわめて厳格な条件下に特異的にハイブリッド形成する単離核酸分子。
【請求項２６】
請求項１８〜２１及び請求項２２〜２４のいずれか１つの単離核酸分子からなる群から選択される単離核酸分子を含むベクター。
【請求項２７】
請求項１８〜２１及び請求項２２〜２４のいずれか１つの単離核酸分子からなる群から選択される単離核酸分子を含む宿主細胞。
【請求項２８】
請求項１８〜２１及び請求項２２〜２４のいずれか１つの単離核酸分子からなる群から選択される単離核酸分子を含む植物又は植物成分。
【請求項２９】
植物又は植物成分に対し耐病性を付与するための方法（ｐｒｏｃｅｓｓ）であって、該方法（ｍｅｔｈｏｄ）が、
（ａ）形質転換植物細胞を産生する前記植物細胞における機能的なプロモーターに操作可能に結合された請求項１８〜２１及び請求項２２〜２４のいずれか１つの単離核酸分子からなる群から選択される核酸分子を含む導入遺伝子を植物細胞に導入するステップと；
（ｂ）前記形質転換植物細胞から植物又は植物成分を再生し、核酸分子が前記植物又は植物成分において発現し、それによって前記植物又は植物成分に対し耐病性を付与するステップと、
を含む前記方法。
【請求項３０】
宿主細胞においてチトクロームＰ４５０ポリペプチドを生成する方法であって、
（ａ）請求項２７の宿主細胞を提供するステップと；
（ｂ）前記チトクロームＰ４５０ポリペプチドをコード化する前記単離核酸分子を発現するための条件下に前記細胞を培養するステップと；
（ｃ）前記チトクロームＰ４５０酵素を回収するステップと、
を含む前記方法。
【請求項３１】
変化化合物を生成するための方法であって、水酸化、酸化、脱メチル化、メチル化、又は前記化合物の前記酵素活性のいずれかの組合せを可能にする条件下に請求項１０〜１５のいずれか１つの単離ポリペプチドと前記化合物を接触させ、前記変化化合物を回収するステップを含む前記方法。
【請求項３２】
請求項１０〜１５のいずれか１つの単離ポリペプチドを含む水酸化剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、チトクロームＰ４５０類（Ｐ４５０ｓ）及びその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
チトクロームＰ４５０類は、多数の宿主組織内生物（ｅｎｄｏｂｉｏｔｉｃｓ）及び何千もの生体異物の酸化の役割を果たす酸化酵素のスーパーファミリーを包含する。また、植物において、チトクロームＰ４５０類は創傷治癒、耐害虫性、シグナル伝達、及び抗菌・抗真菌活性における重要な役割を果たす。
キャプシジオール（ｃａｐｓｉｄｉｏｌ）は、ＵＶへの曝露（例えば、非特許文献１参照）及び微生物による感染（例えば、非特許文献２、非特許文献３、非特許文献４参照）を含めて、種々の環境刺激に応答して多くのナス科の種により産生される二環式のジヒドロキシル化セスキテルペンである。これは真菌誘発に応答してタバコにおいて産生される一次抗生物質又はフィトアレキシンであり、その炭化水素前駆体、５−エピ−アリストロシェーヌ（５−ｅｐｉ−ａｒｉｓｔｏｌｏｃｈｅｎｅ）（図１）経由のイソプレノイド経路由来である。５−エピ−アリストロシェーヌ形成に次第に至る生合成酵素類の一部が研究されており（例えば、非特許文献５参照）、特に挙げられるのが、５−エピ−アリストロシェーヌ合成酵素（ＥＡＳ）である（例えば、非特許文献６、非特許文献７、非特許文献８、非特許文献９参照）。ＥＡＳは、５−エピ−アリストロシェーヌへのジホスホン酸ファルネシル（ＦＰＰ）の環化を触媒することによってセスキテルペン代謝に炭素を関係づける。しかし、本発明までは、５−エピ−アリストロシェーヌのキャプシジオールへの変換の役割を果たす酵素（類）はまだ完全に同定され、特徴づけられていなかった。
【０００３】
タバコ（例えば、非特許文献１０参照）及びピーマン（例えば、非特許文献１１参照）における以前の各研究による生化学的証拠は、５−エピ−アリストロシェーヌのキャプシジオールへの酸化が２つのステップの工程で起こり、水酸化ステップの１つは構成的であり、もう１つはエリシター誘導性チトクロームＰ４５０によって仲介されることを示した（図１）。１−デオキシキャプシジオールは天然資源から単離されているため（例えば、非特許文献１２参照）、ホワイトヘッド（Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ）ら（非特許文献１０参照）は、この中間体の生合成がおそらく対応する水酸化酵素の病原体誘発によるものであると推測した。したがって、彼らは１−デオキシキャプシジオールを調製し、対照又は非誘発タバコ細胞培養物に与えたときのこの化合物のキャプシジオールへの適度の転換を報告した。これは更に、放射標識５−エピ−アリストロシェーヌが対照培養物ではなくエリシター誘導性細胞培養物に与えたときにのみキャプシジオールに転換するという彼らの所見によって裏づけられた。したがって、ホワイトヘッドら（非特許文献１０参照）は、１−デオキシキャプシジオールを生成するＣ３での５−エピ−アリストロシェーヌの水酸化の役割を果たす３−水酸化酵素は病原体／エリシター誘導性であるが、キャプシジオールを生成するＣ１での１−デオキシキャプシジオールの水酸化に役割を果たす１−水酸化酵素は構成的であると結論づけた。星野ら（非特許文献１１参照）は、アラキドン酸誘発ピーマン果実及び実生のミクロソーム調製物における３−水酸化酵素活性を直接測定することによってホワイトヘッドら（非特許文献１０参照）の所見に付け加えた。これらの測定法は、ミクロソーム調製物で５−エピ−アリストロシェーヌをインキュベートし、その後に薄層クロマトグラフィ（ＴＬＣ）分離及びガスクロマトグラフィ（ＧＣ）の組合せによって生成される１−デオキシキャプシジオールの量を測定することで構成された。それらの証拠は、５−エピ−アリストロシェーヌの１−デオキシキャプシジオールへの転換がＮＡＤＰＨとＯ2の両方に依存し、１−デオキシキャプシジオールの試験内蓄積がＰ４５０アンタゴニスト一酸化炭素（非特許文献１３参照）、アンシミドール（非特許文献１４参照）、及びケトコナゾール（非特許文献１５参照）によって抑止されることを示した。
【０００４】
最近の結果は、５−エピ−アリストロシェーヌの水酸化がキャプシジオール生合成における重要な制御ステップであることを示している。タバコ細胞培養物におけるキャプシジオール生合成の誘発剤としてのジャスモン酸メチルの有効性を評価する試験において、マンジュアーノ−チャベス（Ｍａｎｄｕｊａｎｏ−Ｃｈａｖｅｚ）ら（非特許文献１６参照）は、このフィトアレキシンの適度の蓄積がＥＡＳの強力な誘発を伴うことを報告した。この結果は、セスキテルペン触媒反応前後のステップが制限的であることを暗示した。５−エピ−アリストロシェーヌの１−デオキシキャプシジオールへの転換率を測定する生体内アッセイを用いることによって、水酸化活性のきわめて制限的な誘発が、真菌誘発処理細胞におけるものに対してジャスモン酸メチルで処理した細胞において確認された。この結果は、キャプシジオール生合成における潜在的に制限的なステップとしての水酸化反応を示した。
【非特許文献１】
バック（Ｂａｃｋ）ら著、Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．１９９８年、３８９：８９９〜９０４頁
【非特許文献２】
モロット（Ｍｏｌｏｔ）ら著、Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｔ  Ｐａｔｈｏｌ．、１９８１年、３７９〜３８９頁
【非特許文献３】
スターリ（Ｓｔｏｌｌｅ）ら著、Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ、１９８８年、７８：１１９３〜１１９７頁
【非特許文献４】
ケラー（Ｋｅｌｌｅｒ）ら著、Ｐｌａｎｔａ、１９９８年、２０５：４６７〜４７６頁
【非特許文献５】
チャペル（Ｃｈａｐｐｅｌｌ）著、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１９９５年、４６：５２１〜５４７頁
【非特許文献６】
フェーゲリ（Ｖｏｅｇｅｌｉ）とチャペル（Ｃｈａｐｐｅｌｌ）著、Ｐｌａｎｔ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．、１９８８年、８８：１２９１〜１２９６頁
【非特許文献７】
バック（Ｂａｃｋ）とチャペル（Ｃｈａｐｐｅｌｌ）著、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、１９９６年、９３：６８４１〜６８４５頁
【非特許文献８】
マチス（Ｍａｔｈｉｓ）ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１９９７年、３６：８３４０〜８３４８頁
【非特許文献９】
スタークス（Ｓｔａｒｋｓ）ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９９７年、２７７：１８１５〜１８２０頁
【非特許文献１０】
ホワイトヘッド（Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ）ら著、Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１９８９年、２８：７７５〜７７９頁
【非特許文献１１】
星野（Ｈｏｓｈｉｎｏ）ら著、Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１９９５年、３８：６０９〜６１３頁
【非特許文献１２】
ワトソン（Ｗａｔｓｏｎ）ら著、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｍｓ．、１９８３年、１１：５８９頁
【非特許文献１３】
大村（Ｏｍｕｒａ）と佐藤（Ｓａｔｏ）著、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、１９６４年、２３９：２３７０〜２３７８頁
【非特許文献１４】
クールボー（Ｃｏｏｌｂａｕｇｈ）ら、Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．、１９７８年、６２：５７１〜５７６頁
【非特許文献１５】
ラーデマッハー（Ｒａｄｅｍａｃｈｅｒ）著、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．ＰＬａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２０００年、３８１：２８５〜２９４頁
【非特許文献１６】
マンジュアーノ−チャベス（Ｍａｎｄｕｊａｎｏ−Ｃｈａｖｅｚ）ら著、Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｍ．Ｂｉｏｏｐｈｙｓ．、２０００年、３８１：２８５〜２９４頁
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
１つの態様において、本発明の特徴は、いくつかの単離チトクロームＰ４５０ポリペプチド類（ＣＹＰ７１Ｄ２０、ＣＹＰ７１Ｄ２１、ＣＹＰ７３Ａ２７、ＣＹＰ７３Ａ２８、及びＣＹＰ９２Ａ５、並びにこれらのポリペプチド類と実質的同一性を有するＰ４５０類など）、及びこれらのＰ４５０類をコード化する単離核酸分子類である。
各関連態様において、本発明の特徴は、本発明の単離核酸分子を含むベクター（発現ベクターとしての）及び単離核酸分子又はベクターを含む細胞（例えば、アグロバクテリウム又は大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）などの原核細胞、又は哺乳動物、昆虫、酵母菌、又は植物細胞などの真核生物の細胞）である。
更に別の態様において、本発明の特徴は、本発明の核酸分子を含む遺伝子組換え植物又は遺伝子組換え植物成分であり、ここで核酸分子は遺伝子組換え植物又は遺伝子組換え植物成分において発現する。好ましくは、遺伝子組換え植物又は遺伝子組換え植物成分は被子植物（例えば、単子葉植物又は双子葉植物）である。好ましい実施の形態において、遺伝子組換え植物又は遺伝子組換え成分はナス科、トウモロコシ、イネ、又はアブラナ科植物又はそれらの成分である。本発明は更に、遺伝子組換え植物又は遺伝子組換え成分により産生される種子、又はそれらの子孫を含む。
別の態様において、本発明の特徴は、遺伝子組換え植物における植物病原体によりひき起こされる疾患に対する抵抗性のレベル増大を提供する方法である。この方法は、（ａ）遺伝子組換え植物細胞のゲノム内に組込まれ、植物細胞における発現のために配置された本発明の核酸分子を含む遺伝子組換え植物細胞を産生するステップと；（ｂ）核酸分子が遺伝子組換え植物において発現し、それによって遺伝子組換え植物が植物病原体によってひき起こされる疾患に対する抵抗性のレベル増大が提供される遺伝子組換え植物を植物細胞から成長させるステップとを含む。
別の態様において、本発明の特徴は、変化化合物を生成する方法であって、化合物の水酸化、酸化、脱メチル化、又はメチル化を可能にし、変化化合物を回収する条件下に本明細書中に開示された１つ又は複数の単離ポリペプチド類と化合物を接触させるステップを含む方法である。
【０００６】
更に別の態様において、本発明の特徴は、本明細書中に開示された単離ポリペプチド類のいずれかを含む水酸化剤である。
更に別の実施の形態において、本発明の特徴は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２（ＣＹＰ７１Ｄ２０）、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４（ＣＹＰ７１Ｄ２１）、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６（ＣＹＰ７３Ａ２７）、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８（ＣＹＰ７３Ａ２８）、又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２（ＣＹＰ９２Ａ５）に記載された配列のいずれか１つの補体に対してきわめて厳密な条件下に特異的にハイブリッド形成する単離核酸分子であって、かかる核酸分子はチトクロームＰ４５０ポリペプチドをコード化する。
別の態様において、本発明の特徴は、組換えイソプレノイド合成酵素及び組換えチトクロームＰ４５０を発現する宿主細胞である。好ましい実施の形態において、宿主細胞は更に、独立して、又は組合せて、組換えアセチルトランスフェラーゼ、メチルトランスフェラーゼ、又は脂肪アシルトランスフェラーゼを発現する。他の好ましい実施の形態では、宿主は内因性又は組換えチトクロム還元酵素を発現する。好ましくは、宿主細胞は酵母細胞、細菌細胞、昆虫細胞、又は植物細胞である。
【０００７】
関連態様において、本発明の特徴は、イソプレノイド化合物を生成するための方法であって、（ａ）イソプレノイド合成酵素及びチトクロームＰ４５０が発現し、細胞によって正常には生成されないイソプレノイド化合物の形成を触媒する条件下に組換えイソプレノイド合成酵素及び組換えチトクロームＰ４５０を発現する細胞を培養するステップと；（ｂ）イソプレノイド化合物を回収するステップとを含む方法である。好ましい実施の形態において、宿主細胞は更に、組換えアセチルトランスフェラーゼ、組換えメチルトランスフェラーゼ、又は組換え脂肪アセチルトランスフェラーゼを発現する。他の好ましい実施の形態では、宿主細胞は内因性又は組換えチトクローム還元酵素を発現する。好ましくは、宿主細胞は酵母細胞、細菌細胞、昆虫細胞、又は植物細胞である。
更に別の態様において、本発明の特徴は、上記の方法によって生成されるイソプレノイド化合物である。
「Ｐ４０ポリペプチド」、「チトクロームＰ４５０」、又は「Ｐ４５０」によって、ヘム結合性ドメインを含有し、例えば、本明細書中に記載された標準の方法に従い４５０ｎｍでＣＯ吸収スペクトルピークを示すポリペプチドが意味される。このようなＰ４５０類は、ヒドロキシラーゼ活性、二重ヒドロキシラーゼ活性、脱メチラーゼ活性、又はオキシダーゼ活性を含み得るがこれに限定されない。かかる各酵素活性は当業界において周知の方法を用いて測定される。
「ポリペプチド」によって、長さ又は翻訳後修飾（例えば、グリコシル化又はリン酸化）に関係なく、アミノ酸の鎖が意味される。
「実質的に同一」によって、基準アミノ酸配列（例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯＳ：１、３、５、７、及び１１で示されるアミノ酸配列）又は核酸配列（例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯＳ：２、４、６、８、及び１２でそれぞれ示される核酸配列）に対して少なくとも８０又は８５％、好ましくは９０％、より好ましくは９５％、及び最も好ましくは９７％、又は９８％の同一性を示すポリペプチド又は核酸が意味される。ポリペプチド類では、比較配列の長さは一般に少なくとも１６個のアミノ酸、好ましくは少なくとも２０個のアミノ酸、より好ましくは少なくとも２５個のアミノ酸、及び最も好ましくは３５個のアミノ酸となる。核酸では、比較配列の長さは一般に少なくとも５０個のヌクレオチド、好ましくは少なくとも６０個のヌクレオチド、より好ましくは少なくとも７５個のヌクレオチド、及び最も好ましくは１１０個のヌクレオチドとなる。
配列同一性は一般的に、配列解析ソフトウェア（例えば、ジェネティックス・コンピュータ・グループの配列解析ソフトウェアパッケージ、ウィスコンシン大学バイオテクノロジーセンター（１７１０  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ａｖｅｎｕｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ５３７０５）、ＢＬＡＳＴ、又はＰＩＬＥＵＰ／ＰＲＥＴＴＹＢＯＸプログラム）を用いて測定される。このようなソフトウェアでは、類似性の程度を指定することによって同一又は類似の配列を種々の置換基、欠損、及び／又は他の変更に対応させる。保存的な置換基は一般的に、以下の基内の置換基を含む：グリシンアラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン；セリン、スレオニン；リシン、アルギニン；及びフェニルアラニン、チロシン。
【０００８】
「単離ポリペプチド」によって、自然にそれに伴う成分から分離されているＰ４５０ポリペプチド（例えば、ＣＹＰ７１Ｄ２０（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）、ＣＹＰ７１Ｄ２１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）、ＣＹＰ７３Ａ２７（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）、ＣＹＰ７３Ａ２８（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７）、又はＣＹＰ９２Ａ５（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１）ポリペプチド）が意味される。一般的に、ポリペプチドは、それが少なくとも６０重量％でタンパク質及び自然に結合する自然発生の有機分子を含まないときに単離される。好ましくは、調製物は少なくとも７５重量％、より好ましくは少なくとも９０重量％、最も好ましくは少なくとも９９重量％のＰ４５０ポリペプチドである。単離Ｐ４５０ポリペプチドは、例えば、天然資源（例えば、植物細胞）からの抽出によって；Ｐ４５０ポリペプチドをコード化する組換え核酸の発現によって；又はタンパク質を化学的に合成することによって得ることができる。純度は、適切な方法、例えば、カラムクロマトグラフィ、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、又はＨＰＬＣ分析によって測定することができる。
「から由来」又は「から得られる」によって、自然発生の配列（例えば、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、合成、又はそれらの組合せ）の配列から単離されること、又はその配列を有することが意味される。
【０００９】
「単離核酸分子」によって、核酸分子、例えば、本発明の核酸分子が由来する生物の自然発生ゲノムにおいて核酸分子に隣接する核酸配列から自由なＤＮＡ分子が意味される。したがって、この用語は、例えば、ベクターに；自律的に複製するプラスミド又はウイルスに；又は原核生物あるいは真核生物のゲノムＤＮＡに組込まれている；又は他の配列とは無関係に個別の分子（例えば、ＰＣＲ又は制限酵素消化によって生成されるｃＤＮＡ又はゲノムあるいはｃＤＮＡフラグメント）として存在する組換えＤＮＡを含む。「単離核酸分子」という用語も追加のポリペプチド配列をコード化するハイブリッド遺伝子の一部である組換えＤＮＡを含む。
「特異的にハイブリッド形成する」によって、核酸配列が少なくとも低い厳密性の条件下に、好ましくは高い厳密性の条件下にＤＮＡ配列にハイブリッド形成が可能であることが意味される。例えば、高い厳密性の条件としては、約５０％ホルムアミド、０．１ｍｇ／ｍｌ分断サケ精子ＤＮＡ、１％ＳＤＳ、２Ｘ  ＳＳＣ、１０％デキストラン硫酸中約４２℃下、約２Ｘ  ＳＳＣ、１％ＳＤＳ中約６５℃下の第１の洗浄後、約０．１Ｘ  ＳＳＣ中約６５℃下の第２の洗浄によるハイブリッド形成が挙げられる。あるいは、高い厳密性の条件としては、約５０％ホルムアミド、０．１ｍｇ／ｍｌ分断サケ精子ＤＮＡ、０．５％ＳＤＳ、５Ｘ  ＳＳＰＥ、１Ｘデンハルト液中約４２℃下のハイブリッド形成後、２Ｘ  ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中室温下の２回の洗浄、及び０．２Ｘ  ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中５５〜６０℃下の２回の洗浄が挙げられる。ハイブリッド形成条件の厳密性の減少は、洗浄温度の低下及び／又は塩の高濃度での洗浄を含み得る。例えば、低い厳密性の条件としては、４０℃下、２Ｘ  ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中の洗浄が挙げられる。
「形質転換細胞」によって、組換えＤＮＡ法を用いて、Ｐ４５０ポリペプチドをコード化するＤＮＡ分子（本明細書中で用いられる）が（又は祖先に）導入されている細胞が意味される。
【００１０】
「発現のために配置された」によって、ＤＮＡ分子が転写及び配列の翻訳を指示する（すなわち、例えば、Ｐ４５０ポリペプチド、組換えタンパク質、又はＲＮＡ分子の生成を促進する）ＤＮＡ配列に隣接して配置されることが意味される。
「レポーターＤＮＡ」によって、その発現が検定され得る遺伝子が意味され、このような遺伝子は、β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）、ルシフェラーゼ、クロラムフェニコールアセチル基転移酵素（ＣＡＴ）、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、β−ガラクトシダーゼ、除草剤耐性遺伝子、及び抗生物質耐性遺伝子を含むがこれに限定されない。
「発現制御領域」によって、転写を指示するのに十分な最小限の配列が意味される。本発明に含まれるのは、細胞、組織、又は器官特異的遺伝子発現のために調節可能なプロモーター依存遺伝子発現を与えるために十分であるプロモーター要素、又は外部シグナル又は薬剤によって誘発性である要素（例えば、光、病原体、創傷、ストレス、又はホルモン誘発性要素、又はサリチル酸（ＳＡ）あるいは２，２−ジクロロイソニコチン酸（ＩＮＡ）など化学誘発剤）であり、このような要素は自然遺伝子の５’領域又は３’領域に配置され、又は導入遺伝子作成物に操作され得る。
「操作可能に結合される」によって、遺伝子及び制御配列が、適切な分子（例えば、転写性活性化タンパク質）が制御配列が結合される場合に遺伝子発現を可能にするようなやり方で結合されることが意味される。
【００１１】
「植物細胞」によって、半透性膜によって結合された自己増殖性細胞が意味され、一般的にはプラスミドを含有するものである。このような細胞も、更に増殖が望まれる場合は細胞壁を必要とする。本明細書中で用いられる植物細胞は、藻類、ラン藻類、種子類、懸濁培養液、胚、成長点領域、カルス組織、葉、根、苗条、配偶体、胞子体、花粉、及び小胞子を含むがこれに限定されない。
「植物成分」によって、完全な植物又は植物細胞から得られる部分、セグメント、又は器官が意味される。実例としての植物成分は、体細胞胚、葉、幹、根、花、巻髭、果実、若枝、及び根茎を含むがこれに限定されない。
「導入遺伝子」によって、策略を用いて細胞内に挿入され、一般的にはゲノム、例えば、その細胞から発育する生物の細胞核又は植物細胞小器官のゲノムの一部分となる小片のＤＮＡが意味される。このような導入遺伝子は、遺伝子組換え生物と部分的又は完全に非相同的（すなわち外来）である遺伝子を含み、又は生物の内因性遺伝子と類似した遺伝子を示し得る。
【００１２】
「遺伝子組換え」によって、策略を用いて挿入され、その細胞から発育する生物のゲノムの一部となるＤＮＡ配列を含む細胞が意味される。本明細書中で用いられる遺伝子組換え生物は、一般に遺伝子組換え植物であり、ＤＮＡ（導入遺伝子）は策略を用いて細胞核又は植物細胞小器官のゲノムに挿入される。本発明による遺伝子組換植物は、１つ又は複数の操作された形質を含有し得る。
「病原体」によって、生植物組織のその感染が植物組織における疾患反応を誘発する生物が意味される。このような病原体は、細菌、マイコプラズマ、真菌類、昆虫類、線中類、ウイルス類、及びウイロイド類を含むがこれに限定されない。これらの病原体によってひき起こされる植物疾患は、アグリオス（Ａｇｒｉｏｓ）著、植物病学（Ｐｌａｎｔ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ）、第３版（１９８８年、アカデミック  プレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ）社（ニューヨーク））、第１１〜１６章に記載されている。
「抵抗性のレベル増大」によって、対照植物（例えば、非遺伝子組換え植物）に対する抵抗性のレベルよりも本発明の遺伝子組換え植物（例えば、細胞又はそれらの種子）における疾患誘発性病原体に対する高レベルの抵抗性が意味される。好ましい実施の形態において、本発明の遺伝子組換え植物における抵抗性のレベルは、対照植物の抵抗性よりも少なくとも２０％（また好ましくは３０％又は４０％）高い。他の好ましい実施の形態では、疾患誘発性病原体に対するレベルは、対照植物よりも５０％高く、６０％高く、より好ましくは更に７５％又は９０％高く、対照植物と比べ１００％まで抵抗性のレベルを上回ることが最も好ましい。抵抗性のレベルは従来の方法を用いて測定される。例えば、病原体に対する抵抗性のレベルは、遺伝子組換え植物類の物理的特徴及び特性（例えば、植物の高さや重量、又は疾患の症状、例えば、病変進展の遅延、病変サイズの縮小、葉の萎れや彎曲、水浸漬点、及び細胞の変色を比較することによって）を比較することによって測定し得る。
【００１３】
「精製抗体」によって、少なくとも６０重量％の、自然に結合するタンパク質を含まない自然発生の有機分子である抗体が意味される。好ましくは、調製物は少なくとも７５重量％、より好ましくは９０重量％、最も好ましくは少なくとも９９重量％の抗体、例えば、後天性の抵抗性ポリペプチド特異的抗体である。精製Ｐ４５０抗体は、例えば、組換え生成されたＰ４５０ポリペプチド及び標準の方法を用いるアフィニティークロマトグラフィによって得ることができる。
「特異的に結合する」によって、Ｐ４５０を認識し結合するが、試料中、例えば、ＣＹＰ７１Ｄ２０、ＣＹＰ７１Ｄ２１、ＣＹＰ７３Ａ２７、ＣＹＰ７３Ａ２８、又はＣＹＰ９２Ａ５などのＰ４５０タンパク質を自然に含む生物学的試料中の他の分子を実質的に認識、結合することがない抗体が意味される。
本発明の他の特徴及び利点は、その好ましい実施の形態の以下の説明、及び特許請求の範囲から明らかであろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
キャプシジオールは、種々の環境刺激に応答して一部のナス科の種により産生される二環式のジヒドロキシル化セスキテルペンである。これは真菌誘発に応答してタバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ）において産生される一次抗菌化合物であり、５−エピ−アリストロシェーヌからのイソプレノイド経路を経由して形成される。この化合物の形成ための生合成経路の多くは、そのジヒドロキシル化形態のキャプシジオールへのアリルセスキテルペン５−エピ−アリストロシェーヌの転換に役割を果たす酵素を除き解明されている。
【００１５】
したがって、５−エピ−アリストロシェーヌヒドロキシラーゼ活性の生体内アッセイを開発し、これを用いて、Ｐ４５０酵素の十分に特徴づけられた２つの阻害剤、アンシミドール及びケトコナゾールによる用量依存の活性阻害を明らかにした。ヘム結合ドメインを含めてほとんどのＰ４５０酵素内で見出される十分に保存されたドメインにデザインされた変性オリゴヌクレオチドプライマーを用いて、４つの特徴的なＰ４５０ファミリー（ＣＹＰ７１、ＣＹＰ７３、ＣＹＰ８２、及びＣＹＰ９２）を表すｃＤＮＡフラグメントを、ＰＣＲを用いてエリシター処理細胞からｍＲＮＡに対して調製されるｃＤＮＡライブラリから増幅させた。次いで、ＰＣＲフラグメントを用いて完全長ｃＤＮＡ（ＣＹＰ７１Ｄ２０（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）及びＤ２１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）、ＣＹＰ７３Ａ２７（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）及びＡ２８（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８）、ＣＹＰ８２Ｅ１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０）、及びＣＹＰ９２Ａ５（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２））を単離し、次にこれらを用いて、対応するｍＲＮＡが、異なる誘発パターンにもかかわらず、すべてエリシター処理細胞内で誘発されたことを明らかにした。
【００１６】
以下、タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ）からの一部のＰ４５０のクローニングについて説明する。
Ｐ４５０アンタゴニストによる５−エピ−アリストロシェーヌのキャプシジオールへの転換の阻害
間接的アッセイを用いて、ＥＡＳ活性（図２）、ＦＰＰからの５−エピ−アリストロシェーヌの形成を触媒する十分に特徴づけられたセスキテルペンシクラーゼ活性（図１）に対して、エリシター誘導細胞培養内の５ＥＡＨ活性の詳細な誘発時間経過を測定した。ＥＡＳ及び５ＥＡＨのためのアッセイを用いることによって、ＥＡＳ活性は対照細胞培養内では検出可能ではなく、３時間以内に有意に誘発され、エリシター処理の１５〜１８時間以内に最大レベルに達する。ＥＡＳ酵素活性と同様に、５ＥＡＨ活性は対照細胞培養内ではごくわずかであった。しかし、８時間の明らかな遅延期（ｌａｇ  ｐｈａｓｅ）後、ヒドロキシラーゼ活性の急速な誘発が細胞培養へのエリシター添加後１０〜１５時間に確認され、１８時間で最大に達した後、次の８時間にわたり１０〜２０％徐々に減少した。
セルラーゼ及び異なる濃度のアンシミドール又はケタコマゾールで処理したタバコ細胞懸濁培養液を、その後の３時間のインキュベーション期間中に外来供給［3Ｈ］標識５−エピ−アリストロシェーヌを放射標識キャプシジオールへ転換させる細胞の能力を測定する１２時間前に予備インキュベートした（図３）。５ＥＡＨの明らかな活性が、２５μＭアンシミドール又はケタコナゾールのいずれかによる約５０％阻害の用量依存的に阻害され、７５μＭアンシミドールによって８０％以上、１００μＭによって９５％以上が阻害された（図３Ａ及びＢ）。重要なことに、組換えＥＡＳの試験内活性もエリシター処理細胞培養内のＥＡＳの誘発も、１００μＭの高い濃度でのアンシミドールによっては有意に影響されることはなかった（図３Ａ）。ケトコナゾールもＥＡＳの試験管内活性に影響するとは思われない。しかし、エリシター処理細胞抽出物内のシクラーゼ活性の誘導能は、５０μＭを超える濃度でのケトコナゾールによって阻害された（図３Ｂ）。したがって、Ｐ４５０型反応の阻害剤としてのケトコナゾールの特異性を、これらの実験条件下に５０μＭの濃度で、又はそれ以下で評価すべきである。
【００１７】
エリシター誘導性チトクロームＰ４５０ｃＤＮＡの単離
候補Ｐ４５０ｃＤＮＡを単離するための２段階方法は以下のとおりであった。テンプレート及び変性ＰＣＲプライマーとしてのエリシター誘導細胞からｍＲＮＡに対して調製された方向性ｃＤＮＡを用いてＰＣＲストラテジーを最初に行った（図４）。分類学界上の多数の科からのチトクロームＰ４５０の配列整列を用いて、一連の変性プライマーが調製される保存領域を識別した（図４Ａ及びＢ）。クローニング実験では、ヘム結合ドメイン（ＧＲＲＸＣＰ（Ａ／Ｇ））（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７及び２８）に調製されるプライマー及びＴ７ベクタープライマーを利用した反応から４５０〜５５０ｂｐの生成物が予想された（図４Ｃ）。反応生成物の混合物をショットガンクローン化し、クローン化ＰＣＲフラグメントの約１００個を配列決定した。配列決定したＤＮＡの約半分は、ＢｌａｓｔＸデータベース検索によって示されたＰ４５０酵素に典型的なサイン配列を含み、これらはＣＹＰ７１クラス、ＣＹＰ７３クラス、ＣＹＰ９２クラス、及びＣＹＰ８２クラスの典型的な植物Ｐ４５０ファミリーメンバーに対応した。これらＰＣＲフラグメントのそれぞれを別々の実験で複数回単離した。また、われわれはこれらＰ４５０ファミリーメンバーの完全長ｃＤＮＡを単離した。表１は、Ｐ４５０ファミリーメンバーの各完全長ｃＤＮＡの類似性及び同一性の遺伝子銀行データベースにおける最も近いファミリーメンバーのものとの比較である。また、図８は、一部のテルペンチトクロームＰ４５０のアミノ酸アラインメントを示す。各アラインメントはマックベクター（ＭＡＣＶＥＣＴＯＲ）ソフトウェアスイートのアルゴリズムを用いることによって行った。
【００１８】
【表１】
2004532014.tif 000002
【００１９】
各クローン化フラグメントを第２のステップで用いて、ｃＤＮＡライブラリから完全長クローンを単離した。ＣＹＰ７１及びＣＹＰ７３遺伝子フラグメントによるハイブリッド形成によってｃＤＮＡライブラリをスクリーニングすることによって、４個の完全長ｃＤＮＡ、２個のＣＹＰ７１Ｄ、及び２個のＣＹＰ７３Ａを得た。前者のクローンはＣＹＰ７１Ｄ２０及びＣＹＰ７１Ｄ２１で示され、後者はＣＹＰ７３Ａ２７及びＣＹＰ７３Ａ２８で示された。他の２個のｃＤＮＡフラグメントは、遺伝子銀行データベースにおいてすでに見出されるタバコｃＤＮＡ、ＣＹＰ８２Ｅ１及びＣＹＰ９２Ａ３に対応した。これら２個のｃＤＮＡを利用可能な配列情報の助けを借りてデザインされた特異的プライマーを用いてクローン化し、完全長ｃＤＮＡを増幅した。
【００２０】
エリシター誘導細胞におけるチトクロームＰ４５０ｍＲＮＡの誘導
セスキテルペン代謝におけるＰ４５０の生化学的役割を関連づけるために、ＲＮＡブロット分析を用いて、対照及びエリシター処理細胞におけるチトクロームＰ４５０クローン及びＥＡＳの４個すべてをコードするｍＲＮＡの定常状態レベルを測定した（図５）。Ｐ４５０の全４個のｍＲＮＡが、互いに対して、及びＥＡＳｍＲＮＡに対してわずかに異なる時間経過で迅速かつ一時的に誘導された。例えば、ＣＹＰ７３Ａ２７は、ＥＡＳのそれと同様の誘導パターンを示し、最大限のｍＲＮＡレベルが誘発後９〜１２時間に生じた。ＥＡＳｍＲＮＡは実験の全体を通じて高いままであったが、ＣＹＰ７３Ａ２７ｍＲＮＡはエリシター処理後２４時間の細胞内でごくわずかであった。対照的に、ＣＹＰ７１ＤｍＲＮＡはＥＡＳｍＲＮＡよりも急速に誘導され、誘発後６〜９時間にその最大限に達し、ＥＡＳｍＲＮＡレベルが依然きわめて高いと１２時間まで低下していた。
【００２１】
５−エピ−アリストロシェーヌヒドロキシラーゼとしてのＣＹＰ７１Ｄ２０の機能的同一性
機能的同一性を種々のＰ４５０ｃＤＮＡに帰するために、ＣＹＰ７１Ｄ２０、ＣＹＰ８２Ｅ１、及びＣＹＰ９２Ａ５の完全長ｃＤＮＡを酵母発現ベクターｐＹｅＤＰ６０に挿入し（アーバン（Ｕｒｂａｎ）ら著、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ、１９９０年、７２：４６３〜４７２頁；ポムポン（Ｐｏｍｐｏｎ）ら著、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．、１９９６年、２７２：５１〜６４頁）、組込みシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉｎａ）チトクローム還元酵素遺伝子を含有する酵母菌系であるＷＡＴ１１（ポムポン（Ｐｏｍｐｏｎ）ら著、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．、１９９６年、２７２：５１〜６４頁；アーバン（Ｕｒｂａｎ）ら著、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、１９９７年、２７２：１９１７６〜１９１８６頁）におけるそれぞれの発現を測定した。ＣＹＰ７３Ａ２７ｃＤＮＡの操作には、適切な細胞内ターゲティングに干渉し得る一部の親水性残基を有する異常に長いＮ末端のため、余分の改変を必要とした（ネーデルキナ（Ｎｅｄｅｌｋｉｎａ）ら著、Ｐｌａｎｔ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１９９９年、３９：１０７９〜１０９０頁）。したがって、この異常なリーダー配列を酵母内で十分に発現することが以前に明らかにされた（ファーレンドルフ（Ｆａｈｒｅｎｄｏｒｆ）とディクソン（Ｄｉｘｏｎ）著、Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．、１９９３年、３０５：５０９〜５１５頁；ポムポン（Ｐｏｍｐｏｎ）ら著、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．、１９９６年、２７２：５１〜６４頁）桂皮酸４−ヒドロキシラーゼであるＣＹＰ７３Ａ１の膜固着配列と置換した。これらすべての発現は、グルコース抑制性、ガラクトース誘導性のＧＡＬ１０−ＣＹＣ１プロモーターの制御下であり（グアレンテ（Ｇｕａｒｅｎｔｅ）ら著、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、１９８２年、７９：７４１０〜７４１４頁）、発現を親ｐＹｅＤＰ６０ベクター（対照）のみで形質転換された酵母と比較した。
【００２２】
約１６時間のガラクトースによる誘導後、対照細胞及び種々のＰ４５０作成物を含有する細胞を収集し、それぞれから調製されたミクロソームを全般のＰ４５０発現についてＣＯ−差分光法によって分析した（小村（Ｏｍｕｒａ）と佐藤（Ｓａｔｏ）著、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、１９６４年、２３９：２３７０〜２３７８頁）。ＣＹＰ７１Ｄ２０（図６Ａ）及びＣＹＰ９２Ａ５（図６Ｂ）の作成物を含有する細胞から調製されたミクロソームは両方ともピークが４５０ｎｍでの特徴的なＣＯ差スペクトルを示し、コード化タンパク質がそれらのヘム補因子によって適切に集合していることを示した。ヘム結合タンパク質に対する９１ｍＭ-1・ｃｍ-1の吸光係数を用いることによって（小村（Ｏｍｕｒａ）と佐藤（Ｓａｔｏ）著、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、１９６４年、２３９：２３７０〜２３７８頁）、約１０７ｐｍｏｌのＣＹＰ７１Ｄ２０及び２６８ｐｍｏｌのＣＹＰ９２Ａ５が総酵母タンパク質のミリグラム当たりの酵母中に発現した。
５−エピ−アリストロシェーヌ及び１−デオキシキャプシジオールは両方ともキャプシジオールと同じ滞留時間で唯一の生成物に代謝した。その不在によって明らかであるが、デオキシキャプシジオールとほぼ同じ滞留時間を有する反応生成物は５−エピ−アリストロシェーヌインキュベーションにおいて検出可能ではなかった（図７）。それぞれの反応生成物との真正のキャプシジオールの同時注入によって、キャプシジオールと同一の１６．２分の滞留時間を有する単一のＧＣピークが生じた。別々の反応生成物の質量スペクトルパターンは、キャプシジオール標準のパターンと同一であった（ＥＩＭＳ  ｍ／ｚ２３６、２２１、２０３、１８５、１７５、１６３、１５７、１３３、１２１、１０７、９３、７９、６７、５５、４３、４１）。
【００２３】
本研究の図２及び図３に示した生体内アッセイのデータは、５−エピ−アリストロシェーヌの転換が少なくとも１つの誘導性チトクロームＰ４５０仲介反応によって触媒されることを示している。
更に、本明細書中に記載されるいずれかのチトクロームＰ４５０ポリペプチド類は、イソプレノイド化合物上の少なくとも２つの遠位部位にヒドロキシル基を組入れることができる１つ又は複数のヒドロキシラーゼ活性を含み得る。これらのヒドロキシル基の添加は、例えば、連続的に、ヒドロキシル基を最初に一方の部位に、次いで他方に、どちらかの順番で添加することによって行うことができる。更に、かかるヒドロキシラーゼは変異して、唯一の部位で基質をヒドロキシル化し、あるいは、それらのヒドロキシル化活性に対する立体化学的特異性を提供するそれらの能力を制限し得る。
【００２４】
上述した実験は、以下の材料と方法を用いることによって行った。
化学薬品
標準の実験試薬をベクトン・ディッキンソン・マイクロバイオロジー・システムズ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）社（メリーランド州、スパークス）、フィッシャー・バイオテック（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）社（ニュージャージー州、フェアローン）、及びシグマ・ケミカル・カンパニー（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ）（ミズーリ州、セントルイス）から購入した。
生物学的材料及び誘導処理
Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ  ｃｖ．ＫＹ１４植物及び細胞懸濁培養液を用いた。細胞懸濁培養液を改変Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ−Ｓｈｏｏｇ（フェーゲリ（Ｖｏｅｇｅｌｉ）とチャペル（Ｃｈａｐｐｅｌｌ）著、Ｐｌａｎｔ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．、１９８８年、８８：１２９１〜１２９６頁）中に維持した。それらの増殖のごく早期における培養液（３日齢）をすべての実験に用いた。指示時点で、細胞を収集し、真空ろ過によって培地から分離し、−８０℃で保存した。
真菌エリシター、セルロース（トリコデルマ ビリディ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｖｉｒｉｄｅ、タイプＲＳ、オノズカ（Ｏｎｏｚｕｋａ））、又はｐａｒａｃｉｔｉｃｅｉｎ（オーダナヒュー（Ｏ’Ｄｏｎｏｈｕｅ）ら著、Ｐｌａｎｔ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１９９５年、２７：５７７〜５８６頁）を指示濃度で添加することによって行った。ｐａｒａｃｉｔｉｃｅｉｎは、カルボキシ末端ヒスチジン精製タグを含有する組換えｐａｒａｃｉｔｉｃｅｉｎタンパク質を過剰発現する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞から精製した。
【００２５】
生体内５−エピ−アリストロシェーヌヒドロキシラーゼアッセイ及び阻害試験
５−エピ−アリストロシェーヌヒドロキシラーゼ活性を、完全細胞による［3Ｈ］−５−エピ−アリストロシェーヌの細胞外キャプシジオールへの取込みとして測定した。［3Ｈ］−５−エピ−アリストロシェーヌは、過剰な［１−3Ｈ］二リン酸ファルネシル（１μＭ、２０．５Ｃｉ／ｎｍｏｌ）を組換え５−エピ−アリストロシェーヌ合成酵素でインキュベートすることによって生成した（バック（Ｂａｃｋ）ら著、Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．、１９９４年、３１５：５２７〜５３２頁；リーシング（Ｒｉｓｉｎｇ）ら著、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、２０００年、１２２：１８６１〜１８６６頁）。反応物からのヘキサン抽出可能放射能を少量のシリカで処理し、液体シンチレーションカウンティングによって放射性５−エピ−アリストロシェーヌの収量を定量化する前にすべてのファルネソール又は残留ＦＰＰを除去した。ヘキサン溶剤を静かなＮ2ガス流下に除去し、乾燥残留物をアセトン中で再溶解した。次いで、対照及びエリシター処理細胞を、細胞及び培地試料を収集する前のインキュベーション時間経過中のいくつかの時点で３時間、［３Ｈ］−５−エピ−アリストロシェーヌ（２．５ｎＭで約１００，０００ｄｐｍ）でインキュベートした。細胞外培養培地中のキャプシジオールの検出及び定量化を以前報告されたように行い（チャペル（Ｃｈａｐｐｅｌｌ）ら著、Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１９８７年、２６：２２５９〜２２６０頁）、キャプシジオールに取込まれた放射能の量を測定した。これらの測定のために、ＴＬＣによって試料を分離し、キャプシジオールに対応する帯域をシンチレーションカウンティング用のプレートからかき集めた。
【００２６】
細胞培養物又は酵素アッセイ混合物に直接、Ｐ４５０阻害剤のアンシミドール（クールボー（Ｃｏｏｌｂａｕｇｈ）ら著、Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．、１９７８年、６２：５７１〜５７６頁；星野（Ｈｏｓｈｉｎｏ）ら著、Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１９９５年、３８：６０９〜６１３頁）及びケトコナゾール（星野（Ｈｏｓｈｉｎｏ）ら著、Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１９９５年、３８：６０９〜６１３頁；ラーデマッハー（Ｒａｄｅｍａｃｈｅｒ）著、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２０００年、５１：５０１〜５３１頁）を添加することによって阻害試験を行った。［3Ｈ］−５−エピ−アリストロシェーヌ添加前に１２時間、セルロース（０．５μｇ／ｍｌ）の存在下、及びアンシミドール又はケトコナゾールの指示濃度で細胞培養物をインキュベートした。更に３時間インキュベートした後、細胞及び培地を収集した。細胞外キャプシドに取込まれた放射能の量を上述したように測定した。これら阻害剤の二次効果を評価するために、収集細胞内の誘導性セスキテルペンシクラーゼ活性のレベルを（フェーゲリ（Ｖｏｅｇｅｌｉ）ら著、Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．、１９９０年、９３：１８２〜１８７頁）に従い、並びに指示濃度のアンシミドール及びケトコナゾールでインキュベートした精製組換えＥＡＳ（バック（Ｂａｃｋ）ら著、Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．、１９９４年、３１５：５２７〜５３２頁）による試験管内アッセイで測定した。
【００２７】
すべての実験をいくつかの独立試験で繰り返した。示した絶対値は約５０％実験間で変動し得るが、傾向及び時間経過は全体を通じて一定であった。
エリシター誘導ｃＤＮＡライブラリの構成
ろ過によって細胞を収集する前の６時間、真菌エリシター（０．５μｇセルラーゼ／ｍｌ）で細胞培養物をインキュベートした。Ｔｒｉｚｏｌ（ライフ・テクノロジーズ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅ）社（メリーランド州、ロックヴィル））を用いて、製造元の指示に従い全ＲＮＡが抽出されるまで、細胞を−８０℃で凍結保存した。２ラウンドのオリゴ（ｄＴ）セルロースカラムクロマトグラフィ（ライフ・テクノロジーズ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅ）社（メリーランド州、ロックヴィル））によってポリ（Ａ）+ＲＮＡを精製した。その後に、ＵＮＩ−ＺＡＰ  ＸＲライブラリキット（ストラトジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）社（カリフォルニア州、ラ  ホヤ）を用い、製造元の指示に従いｃＤＮＡ合成及びライブラリ構成を行った。
【００２８】
ＰＣＲクローニングストラテジー
ベクター特異的Ｔ３プライマー及びＴ７プライマーとの変性正プライマー及び逆プライマーの種々の組合せを用いてエリシター誘導ｃＤＮＡライブラリからチトクロームＰ４５０ｃＤＮＡフラグメントを増幅した。７０℃で１０分間、加熱変性の後、フェノール／クロロホルム抽出、エタノール沈降、及び無菌脱イオン水５００μｌ中に再懸濁することによってエリシター誘導ｃＤＮＡライブラリ（３ｘ１０6ｐｆｕ／μｌ）の５００μｌ一定分量からテンプレートＤＮＡを調製した。５０ｍＭ  ＫＣｌ；１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ  ８．８；１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ2；２００μＭの各ｄＮＴＰ；２μｌのテンプレートＤＮＡ；２０ｐｍｏｌの各正逆プリマー；及び１単位のＴａｑポリメラーゼ（ライフ・テクノロジーズ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅ）社（メリーランド州、ロックヴィル））を含有する容量５０μｌ中で増幅反応を行った。反応物を９４℃で２分間予熱した後、９４℃で１分間、３５サイクルの変性、５０℃で１分３０秒間のアニーリング、及び７２℃で２分間の重合を行った。７２℃での１０分間の延長によって反応を完了した。反応生成物の一定分量をアガロースゲル分画によってＤＮＡ生成物について試験し、ｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙベクター（プロメガ（ウィスコンシン州、マジソン））に直接結合した。予想サイズ範囲内に挿入ＤＮＡを含有する結果として生じる組換えプラスミドをＴ７プライマー及びＳｐ６プライマーを用いて配列決定した。
【００２９】
ＤＮＡ配列決定
ＢＩＧＤＹＥＴＭターミネーターサイクル配列決定キット（パーキン−エルマー（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）社（マサチューセッツ州、ウェレスレイ））を用いてすべてのＤＮＡ配列決定反応を行い、配列が自動化ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ３１０遺伝子アナライザー（アプライドバイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）社（カリフォルニア州、フォスターシティ））で読まれた。ＭＡＣＶＥＣＴＯＲ（オックスフォードモレキュラー（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ）社（ウィスコンシン州、マジソン））を用いてＤＮＡ配列情報のコンピュータ評価を行った。
【００３０】
ｃＤＮＡライブラリスクリーニング
ジゴギシゲニン標識プローブでｃＤＮＡライブラリをスクリーニングした。遺伝子特異的正（５’−ＧＧＣＧＧＡＧＡＡＴＴＴＧＴＣＣＴＧＧＡＡＴＧＴＣＡＴＴＴＧＧＴＴＴＡＧ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３））プライマー及び逆（５’−ＧＴＡＣＡＡＴＡＧＴＧＡＧＧＴＴＧＡＣＡＡＴＧ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４））プライマーを用いてｐＧＥＭ−ｄｅｇ６．４クローンから増幅したＡ２５８ｂｐＤＮＡ；及び特異的正（５’−ＧＧＴＧＧＴＴＧＴＧＡＡＴＧＣＡＴＧ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５））プライマー及び逆（５’−ＴＴＡＴＧＣＡＧＣＡＡＴＡＧＧＣＴＴＧＡＡＧＡＣＡ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６））プライマーによるｐＢＫＳ−ＣＹＰＢ３．８４３クローンから増幅した３７４ｂｐＤＮＡフラグメントを用いて、ＣＹＰ７１Ｄについてスクリーニングした。ＰＣＲ  ＤＩＧラベリングミックス（ロシュモレキュラーバイオケミカルズ（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）社（インディアナ州、インディアナポリス））を用いてジゴキシゲニン−１１−ｄＵＴＰで各プローブを標識し、１５０ｍｍプレート当たり約１０，０００ＰＦＵでプレーティングしたｃＤＮＡライブラリのプラークリフトにハイブリッド形成し、製造元の指示（ロシュモレキュラーバイオケミカルズ（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）社（インディアナ州、インディアナポリス））に従いＤＩＧ検出システムによりハイブリッド形成を検出した。強力なハイブリッド形成を示すプラークをプラーク精製し、製造元の勧告（ストラトジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）社（カリフォルニア州、ラ  ホヤ）に従いそれらのプラスミド形態に自動サブクローンし、次いで上述したようにＤＮＡ配列決定を行った。
【００３１】
ＲＮＡ分析
総ＲＮＡの１０μｇ一定分量を用いてＲＮＡゲルブロット分析を行った。試料緩衝液（１ｘＭＯＰＳ、５０％ホルムアミド、１６％ホルムアルデヒド、３０％グリセロール、及び３％臭化エチジウム）中で１５分間、７０℃でＲＮＡ試料を加熱変性し、１ｘＭＯＰＳ及び１８．１％ホルムアルデヒドを含有する１．２％アガロースゲル上でサイズ分画した。ｒＲＮＡバンドのゲルを目視確認することによって試料添加の均一性を測定した。次いで、ＲＮＡをＺｅｔａプローブナイロン膜（バイオ−ラッドラボラトリーズ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）社（カリフォルニア州、ヘラクレス）へ導入し、製造元の勧告に従ってハイブリッド形成した。ハイブリッド形成前に、［32Ｐ］−ｄＣＴＰ（プライム−イットキット、ストラットジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）社（カリフォルニア州、ラ  ホヤ）で完全長ｃＤＮＡプローブを標識した。ハイブリッド形成後、室温で１回、２ｘＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中で膜を洗浄した後、４２℃及び６５℃で０．２ｘＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中で連続的に洗浄した。ホスホイメージャー（モレキュラーダイナミックス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ）社、モデル４４５ＳＩ）でハイブリッド形成を検出した。
【００３２】
発現ベクターの構成
Ｐ４５０ｃＤＮＡのコード領域をｐＹｅＤＰ６０発現ベクターにクローン化した（アーバン（Ｕｒｂａｎ）ら著、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、１９９０年、２７２：１９１７６〜１９１８６頁；ポムポン（Ｐｏｍｐｏｎ）ら著、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．、１９９６年、２７２：５１〜６４頁）。翻訳開始部位（ＡＴＧ）の上流又は停止コドン（ＴＡＡ又はＴＧＡ）の下流のいずれかでこれらの配列を含有するＰＣＲプリマーを経由して適切なＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲＩ、及びＳｓｔＩ制限部位（下線部）を導入した。ＣＹＰ７１Ｄ２０ｃＤＮＡを増幅するために用いたプライマーは、５’−ＧＧＧＧＧＡＴＣＣＡＴＧＣＡＡＴＴＣＴＴＣＡＧＣＴＴＧＧＴＴＴＣＣ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７）及び５’−ＣＧＧＧＧＡＡＴＴＣＴＴＡＣＴＣＴＣＧＡＧＡＡＧＧＴＴＧＡＴＡＡＧＧ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８）であり；ＣＹＰ８２Ｅ１ｃＤＮＡについては、５’−ＣＣＣＧＧＡＴＣＣＡＴＧＴＡＴＣＡＴＣＴＴＣＴＴＴＣＴＣＣＣ−３−’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９）及び５’−ＧＧＧＧＡＡＴＴＣＴＣＡＡＴＡＴＴＧＡＴＡＡＡＧＣＧＴＡＧＧＡＧＧ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０）であり；ＣＹＰ９２Ａ３ｃＤＮＡについては５’−ＣＣＣＧＧＡＴＣＣＡＴＧＣＡＡＴＣＣＴＴＣＡＧＣＴＴＧＧＴＴＴＣＣ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１）及び５’−ＧＧＧＧＡＧＣＴＣＴＣＡＣＴＣＧＣＡＡＧＡＡＧＡＴＴＧＡＴＡＡＧＧ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２）であった。ＣＹＰ７３Ａ２７の膜固着セグメントの修飾のためにヒンジ領域までのＣＹＰ７３Ａ１（ＧｅｎＥＭＢＬ  Ｚ  １７３６９）のＮ末端配列をコードする２つの長いオーバーラップ（下線部）プライマー５’−ＧＣＣＡＴＴＡＴＣＧＧＣＧＣＡＡＴＡＣＴＡＡＴＣＴＣＣＡＡＡＣＴＣＣＧＣＧＧＴＡＡＡＡＡＡＴＴＣＡＡＧＣＴＣＣＣＡＣＣＴＧＧＴＣＣＡＡＣＡＧＣＡＧＴＣ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３）及び５’−ＧＧＧＧＧＡＴＣＣＡＴＧＧＡＣＣＴＣＣＴＣＣＴＣＡＴＡＧＡＡＡＡＡＡＣＣＣＴＣＧＴＣＧＣＣＴＴＡＴＴＣＧＣＣＧＣＣＡＴＴＡＴＣＧＧＣＧＣＡＡＴＡＣＴＡ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４）を用いて、異常なＮ末端による細胞内ターゲティングの可能な問題を回避し（ネーデルキナ（Ｎｅｄｅｌｋｉｎａら、１９９９年）；両方の増幅に用いた逆プリマーは５’−ＧＧＧＧＡＧＣＴＣＴＴＡＴＧＣＡＧＣＡＡＴＡＧＧＣＴＴＧＡＡＧＡＣ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２５）であった。ＣＹＰ７１Ｄ２０及びＣＹＰ７３Ａ２７は完全長ｃＤＮＡテンプレートを用いて増幅したが、ＣＹＰ８２Ｅ１及びＣＹＰ９２Ａ５はｃＤＮＡライブラリテンプレートから直接増幅した。増幅は、１ｘＰｆｘ増幅緩衝剤；１ｍＭ  ＭｇＳＯ４；３００μＭの各ｄＮＴＰ；１０ｎｇのテンプレートＤＮＡ；２０ｐｍｏｌの各正逆プリマー；及び１．２５単位のＰＬＡＴＩＮＵＭ（登録商標）Ｐｆｘポリメラーゼ（ライフ・テクノロジーズ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅ）社（メリーランド州、ロックヴィル））を含有する５０μｌ反応物中で行った。反応物を９４℃で２分間予熱した後、９４℃で１５秒間、３５サイクルで変性し、５５℃で３０秒間アニーリングし、６８℃で１．５分間伸長した。ＰＣＲ生成物をｐ���ＥＮ−Ｔ  ＥＡＳＹベクター（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）社、ウィスコンシン州、マジソン）に結合し、ｐＹｅＤＰ６０ベクターにサブクローン化した。結果として生じる作成物をＰＣＲ及びＤＮＡ配列決定によって確認した。
【００３３】
酵母発現試験
検証ｐＹｅＤＰ６０−Ｐ４５０ｃＤＮＡ作成物を、Ｐ．アーバン（Ｕｒｂａｎ）博士（Ｃｅｎｔｒｅ  ｄｅ  Ｇｅｎｅｔｉｑｕｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｉｒｅ、ＣＮＲＳ（フランス、Ｇｉｆ−ｓｕｒ−Ｙｖｅｔｔｅ）により提供された、Ｗ３０３−１Ｂ菌系（ＭＡＴａ；ａｄｅ２−１；ｈｉｓ３−１１；ｌｅｕ２−３、−１１２；ｕｒａ３−１；ｃａｎR；ｃｙｒ+）の誘導体である酵母ＷＡＴ１１系に導入した。内在性ＮＡＤＰＨ−チトクロームＰ４５０還元酵素（ＣＰＲ１）部位は、ＷＡＴ１１系におけるシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）からのＮＡＤＰＨチトクロームＰ４５０還元酵素であるＡＴＲ１で置換されている（ポムポン（Ｐｏｍｐｏｎ）ら著、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．、１９９６年、２７２：５１〜６４頁；アーバン（Ｕｒｂａｎ）ら著、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、１９９７年、２７２：１９１７６〜１９１８６頁）。酵母をＹＰＡＤ（１ｇ／ｌ酵母抽出物；１ｇ／ｌペプトン；２０ｇ／ｌグルコース；２００ｍｇ／ｌアデニン）液体培地中で一夜、３０℃下に振とう機で増殖させた。培養物を０．５〜１．５のＡ600で収集した。４℃で５分間、２，５００ｘｇでの遠心分離によって細胞を収集し、氷冷無菌ｄＨ2Ｏ中に再懸濁した。細胞を再び上記のようにペレット化し、１Ｍソルビトール中に再懸濁した。酵母懸濁液４０μｌを予備冷却した０．５ｍｌ管中で０．５〜１μｇのプラスミドＤＮＡ（＜５μｌ  ｄＨ2Ｏ）と混合し、０．２ｃｍの電極ギャップを有する冷却したキュベットに移した。１．５ｋＶ、２５μＦ、及び２００オームで１パルスをエッペンドルフエレクトロポレーター（モデル２５１０）によって供給した。ＹＰＡＤ／１Ｍソルビトール５００μｌの混合液を直ちにエレクトロポレートした細胞に添加した。細胞を３０℃で１時間回復させ、次いでＳＧＩプレート（１ｇ／ｌｂａｃｔｏｃａｓａｍｉｎｏ酸；７ｇ／ｌ酵母窒素塩基；２０ｍｇ／ｌトリプトファン；及び２０ｇ／ｌ寒天）上に伸ばした。形質転換コロニーが３０℃でのインキュベーション３〜６日後に出現した。組換えプラスミドを無作為に選択した酵母コロニー上で直接行ったＰＣＲアッセイによって確認した。
【００３４】
発現試験のために、１つのコロニーをＳＧＩ培地（１ｇ／ｌｂａｃｔｏｃａｓａｍｉｎｏ酸；７ｇ／ｌ酵母窒素塩基；２０ｇ／ｌグルコース；２０ｍｇ／ｌトリプトファン）に添加し、３０℃で約２４時間増殖させた。この培養物の一定分量をＹＰＧＥ（１０ｇ／バクトペプトン；１０ｇ／ｌ酵母抽出物；５ｇ／ｌグルコース；及び３重量％エタノール）２５０ｍｌに１：５０で希釈し、すべてのグルコースが消費されるまで細胞を増殖させた。２００μｌの一定分量の培養物を１．５ｍｌ管に配置し、ＤＩＡＳＴＩＸ検尿試薬ストリップ（バイエル（Ｂａｙｅｒ）、インディアナ州、エルクハート）を３０秒間挿入し、グルコース濃度を示す比色変化を観察することによってグルコースの非存在を判定した。ガラクトース５ｇ（最終濃度２％）の添加によって誘導を開始した。培養物を３０℃で更に１６時間維持した後、１０分間、７，０００ｘｇでの遠心分離によって細胞を収集した。ペレット化細胞をＴＥＳ緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ、７．５；１ｍＭ  ＥＤＴＡ；０．６Ｍソルビトール）１００ｍｌで洗浄した。上記のように細胞を遠心分離し、ＴＥＳ−Ｍ（１０ｍＭ  ２−メルカプトエタノールを補充したＴＥＳ）１００ｍｌ中に再懸濁し、室温で１０分間インキュベートした。酵母細胞を再び１０分間、７，０００ｘｇで遠心分離し、ペレットを２．５ｍｌ抽出緩衝液（１％ウシ血清アルブミン、画分Ｖ；２ｍＭ  ２−メルカプトエタノール；１ｍＭフッ化フェニルメチルスルホニル、すべてＴＥＳ中に溶解）中に再懸濁した。細胞懸濁液の表面をすくい取るまでガラスビード（直径０．５ｍｍ、バイオスペックプロダクツ（Ｂｉｏｓｐｅｃ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）社（オクラホマ州、バートルズビル）を添加した。低温室で１０分間、氷上で３０秒間隔で分けた３０秒間隔で手で攪拌することによって手動で破壊した細胞壁を破壊した。細胞抽出物を５０ｍｌ遠心分離管に移し、ガラスビードを抽出緩衝液５ｍｌで３回洗浄し、洗浄液を最初の細胞抽出物でプールした。４℃で１０分間、１０，０００ｇでのディファレンシャル遠心分離によってミクロソームを調製し、細胞細片を除去した後、４℃で７０分間、１００，０００ｘｇで遠心分離し、ミクロソームペレットをＴＥＧ−Ｍ緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５；１ｍＭ  ＥＤＴＡ；２０％グリセロール；及び１．５ｍＭ  ２−メルカプトエタノール）１．５ｍｌ中に再懸濁し、その後に分析されるまで−８０℃で凍結保存した。
【００３５】
ＣＯ差スペクトル
５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５；１ｍＭ  ＥＤＴＡ；及び２０％グリセロール１．６ｍｌ中に懸濁したミクロソーム０．４ｍｌを用いて、Ｆｅ2+・ＣＯｖｓ．Ｆｅ2+差分光法（小村（Ｏｍｕｒａ）と佐藤（Ｓａｔｏ）著、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、１９６４年、２３９：２３７０〜２３７８頁）を行った。少量の還元剤、二チオン酸ナトリウムを添加し、混合物を２つのキュベット間に分配した。パーキン・ラムダ１８ＵＶ／可視分光計で４００〜５００ｎｍでベースラインを記録した。次いでＣＯを１分間、試料キュベットに泡立たせ、差スペクトルを再び記録した。９１ｍＭ-1・ｃｍ-1の吸光度に基づき機能的Ｐ４５０の量を推定した。
【００３６】
５−エピ−アリストロシェーヌ−１、３−ヒドロキシラーゼアッセイ
体積１００μｌのポリエチレン管０．５ｍｌ中で５−エピ−アリストロシェーヌ、３−ヒドロキシラーゼアッセイを行った。ヘキサン中に溶解した５−エピ−アリストロシェーヌ又は１−デオキシキャプシジオールを管に添加し、３０℃で開放管のインキュベーションによって有機溶剤を除去した。反応混合物を添加する前に、５−エピ−アリストロシェーヌ及び１−デオキシキャプシジオールをジメチルスルホキシド２μｌ中に再懸濁した。ミクロソームタンパク質を添加し、最終濃度を１ｍｇ／ｍｌにした１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５中で反応を行った。２ｍＭ  ＮＡＤＰＨの添加によって反応を開始した。これらのアッセイにおける５−エピ−アリストロシェーヌ及び１−デオキシキャプシジオールの最終濃度は２０〜５０μＭであった。３０℃での異なる長さの時間のインキュベーション後、２つの容量の酢酸エチルで反応物を抽出した。有機抽出物を濃縮し、５−エピ−アリストロシェーヌ（ホワイトヘッド（Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ）ら著、Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１９８９年、２８：７７５〜７７９頁；リージング（Ｒｉｓｉｎｇ）ら著、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、２０００年、１２２：１８６１〜１８６６頁）、１−デオキシキャプシジオール（ホワイトヘッド（Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ）ら著、Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１９９０年、２９：４７９〜１８２頁）、及びキャプシジオール（ホワイトヘッド（Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ）ら著、Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１９８７年、２６：１３６７〜１３６９頁；ミラート（Ｍｉｌａｔ）ら著、Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１９９１年、３０：２１７１〜２１７３頁）の標準品と一緒にＧＣ及びＧＣ−ＭＳによって評価した。ヒューレット−パッカードＨＰ−５キャピラリーカラム（３０ｍｘ０．２５ｎｍ、厚さ０．２５μｍ相）及びＦＩＤを備えたＨＰ５８９０ＧＣによって、以前に報告されているように（リージング（Ｒｉｓｉｎｇ）ら著、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、２０００年、１２２：１８６１〜１８６６頁）、ＧＣ分析をルーチン的に行った。ＧＣ−ＭＳ分析は、Ｖａｒｉａｎ３４００ガスクロマトグラフ及びＦｉｎｎｉｇａｎ  ＩＮＣＯＳ  ５０四重極型質量選択的検出器を用いて、ケンタッキー大学質量分析科で行った。ＧＣにはＪ＆Ｗ  ＤＢ−５ｍｓキャピラリーカラム（１５ｍｘ０．２５ｎｍ、厚さ０．２５μｍ相）が備えられ、キャリヤガス（１０ｐｓｉ）としてＨｅで実行した。スプリットレス注入を注入口の温度２８０℃で行った。カラム温度を１分間、４０℃で維持し、次いで毎分１０℃で２８０℃に上昇させた。ＧＣカラムによる分離後、試料を直接、電子衝突イオン化源に導入した。質量スペクトルを１秒で４０〜４４０Ｄａからスキャニングして７０ｅＶで得た。
【００３７】
チトクロームＰ４５０の製造
本明細書中に記載した標準の分子法を用いて、配列をコードする追加のチトクロームＰ４５０の単離は容易に達成される。例えば、開示されたいずれかのアミノ酸配列の全部又は一部を用いて、Ｐ４５０変性オリゴヌクレオチドプローブ（すなわち、所定のアミノ酸配列に対する可能なすべてのコード配列の混合物）を容易にデザインすることができる。これらのオリゴヌクレオチド類は、いずれかのＤＮＡ鎖及びＰ４５０ヌクレオチド配列の適切な部分の配列に基づくとみられる。このようなプローブをデザインし、調製するための一般の方法は、例えば、アズベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）ら著、２０００年、分子生物学における最新プロトコール、ワイリー・インターサイエンス（Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ）、ニューヨーク、及びベルガー（Ｂｅｒｇｅｒ）とキメル（Ｋｉｍｍｅｌ）著、分子クローニング法の手引き、１９８７年、アメリカン・プレス（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｒｅｓｓ）、ニューヨークに示されている。これらのオリゴヌクレオチド類は、Ｐ４５０相補配列へのハイブリッド形成能を有するプローブとしての、又は種々の増幅法、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）用のプライマーとしてのいずれかのそれらの使用によって、Ｐ４５０遺伝子単離に有用である。
【００３８】
ハイブリッド形成法及びスクリーニング法は当業者には公知であり、例えば、アズベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）ら（上掲）；ベルガー（Ｂｅｒｇｅｒ）とキメル（Ｋｉｍｍｅｌ）（上掲）；チェン（Ｃｈｅｎ）ら著、Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．、１９９５年、３２４：２５５ページ；及びサムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら著、分子クローニング：実験マニュアル、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）、ニューヨークに記載されている。望まれる場合は、組換えＤＮＡライブラリーのスクリーニング用に異なるオリゴヌクレオチドプローブの組合せを用いることができる。オリゴヌクレオチド類は当業界において周知の方法を用いて検出可能に標識することができ、これらを用いて組換えＤＮＡライブラリからのフィルタレプリカを探索することができる。組換えＤＮＡライブラリは、当業界において公知の方法、例えば、アズベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）ら（上掲）において記載された方法によって調製され、又は市販源から得ることができる。
【００３９】
上述したように、Ｐ４５０オリゴヌクレオチド類をポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）増幅クローニングストラテジーにおけるプライマーとしても用いることができる。ＰＣＲ法は当業界において公知であり、例えば、ＰＣＲテクノロジー、エーリッヒ（Ｅｈｌｉｃｈ）、編、ストックトン・プレス（Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ）、ロンドン、１９８９年；ＰＣＲプロトコール：方法と応用の手引き、イニス（Ｉｎｎｉｓ）ら著、編、アカデミック・プレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ）社（ニューヨーク）、１９９０年；及びアズベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）ら（上掲）に記載されている。プライマーは、例えば、増幅フラグメント（本明細書中に記載）の５’末端及び３’末端における適切な制限部位を含めることによって、増幅生成物の適切なベクターへのクローニングを可能にするように任意選択でデザインされる。望まれる場合は、ＰＣＲ「ＲＡＣＥ」法、すなわちｃＤＮＡ末端の急速増幅を用いてＰ４５０遺伝子を単離することができる（例えば、イニス（Ｉｎｎｉｓ）ら（上掲）を参照）。この方法によって、Ｐ４５０配列に基づくオリゴヌクレオチドプライマーは３’及び５’方向に配向され、これらを用いてオーバーラップＰＣＲフラグメントを生成する。これらのオーバーラップ３’及び５’末端ＲＡＣＥ生成物は組み合わされて完全な完全長ｃＤＮＡを生成する。この方法はイニス（Ｉｎｎｉｓ）ら（上掲）；及びフローマン（Ｆｒｏｈｍａｎ）ら著、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８５：８９９８頁（１９９８年）に記載されている。
Ｐ４５０をコード化する配列を確認するための別の方法が、モーガン（Ｍａｕｇｈａｎ）ら（Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．、１９９７年、３４１：１０４〜１１１１頁）及びクラーク（Ｃｌａｒｋ）ら（Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１９９７年、３３：８７５〜８８５頁）において示されている。
【００４０】
有用なＰ４５０配列は、適切な生物から単離することができる。本明細書中に開示されるＰ４５０ポリペプチドとの配列の相関性の確認は、種々の従来の方法によって、例えば、その配列をデータベースに見出される周知のＰ４５０配列と比較することによって行うことができる。
Ｐ４５０ポリペプチド発現
Ｐ４５０ポリペプチド類は、適切な発現媒体内のＰ４５０ＤＮＡ（例えば、本明細書中に記載されたＰ４５０ｃＤＮＡのいずれか１つ）の全部又は一部による、又は生体内のＰ４５０ポリペプチドの発現を増大させるために操作されたプラスミド作成物による適切な宿主細胞の形質転換によって生成することができる。
分子生物学の分野における熟練者には、広範囲の発現系のいずれかを用いて組換えタンパク質を提供し得ることが明らかであろう。使用される正確な宿主細胞は本発明には重要ではない。Ｐ４５０タンパク質は、原核生物の宿主、例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＴＢ１、又は真核生物の宿主、例えば、酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、昆虫細胞、哺乳動物細胞（例えば、ＣＯＳ１又はＮＩＨ  ３Ｔ３細胞）、又は、藻類、樹種、観賞植物種、温帯果実種、熱帯果実種、野菜種、マメ科種、単子葉植物類、双子葉植物類を含むがこれに限定されない多くの植物細胞のいずれか、又は商業的あるいは農業的に重要ないずれかの植物において生成することができる。適切な植物宿主の特定の例としては、針葉樹類、ベチュニア、トマト、ジャガイモ、タバコ、ブドウ、シロイヌナズナ、レタス、ヒマワリ、アブラナ、アマ、ワタ、サトウダイコン、セロリ、ダイズ、アルファルファ、ウマゴヤシ、ハス、リョクトウ、キュウリ、ニンジン、ナス、カリフラワー、セイヨウワサビ、アサガオ、ポプラ、クルミ、リンゴ、アスパラガス、ブドウ、イネ、トウモロコシ、キビ、タマネギ、オオムギ、カモガヤ、カラスムギ、ライムギ、タバコ、及びコムギが挙げられるが、これらに限定されない。
【００４１】
このような細胞は以下を含む広範囲の出所から入手可能である：アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）（メリーランド州、ロックランド）；又は多くの種子会社、例えば、Ｗ．アトリー・バーピー・シード社（Ｗ．Ａｔｌｅｅ  Ｂｕｒｐｅｅ  Ｓｅｅｄ  Ｃｏ．）（ペンシルべニア州、ワーミンスター）、パーク・シード社（Ｐａｒｋ  Ｓｅｅｄ  Ｃｏ．）（サウスカロライナ州、グリーンウッド）、ジョニー・シード社（Ｊｏｈｎｎｙ  Ｓｅｅｄ  Ｃｏ．）（メイン州、アルビオン）、又はノースラップ・キング・シーズ社（サウスカロライナ州、ハーストビル）。有用な宿主細胞の説明及び出所は、ヴァシル（Ｖａｓｉｌ）Ｉ．Ｋ．著、植物の細胞培養及び体細胞遺伝学、第Ｉ、第ＩＩ、第ＩＩＩ巻実験手順及びそれらの応用、アカデミック・プレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ）、ニューヨーク、１９８４年；ディクソン（Ｄｉｘｏｎ），Ｒ．Ａ．著、植物細胞培養−−実践的アプローチ、ＩＲＬプレス（Ｐｒｅｓｓ）、オックスフォード大学、１９８５年；グリーン（Ｇｒｅｅｎ）ら著、植物細胞及び細胞培養、アカデミック・プレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ）、ニューヨーク、１９８７年；及びガッサー（Ｇａｓｓｅｒ）とフレリー（Ｆｒａｌｅｙ）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４４：１２９３頁、（１９８９年）においても見出される。
【００４２】
原核生物の発現のために、原核生物の宿主内に発現をひき起こす能力を有するシグナルを制御するように操作可能に結合したベクター上でＰ４５０ポリペプチドのＤＮＡコード化を行う。望まれる場合は、コード配列は、その５’末端において、発現タンパク質の宿主細胞のペリプラズム空間に分泌をひき起こし、それによってタンパク質の回収及びその後の精製を促進する能力を有する周知のシグナル配列のいずれかをコード化する配列を含み得る。最も頻繁に用いられる原核生物は種々の菌株の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）であるが、しかし、他の微生物の菌株も使用できる。複製開始点、選択可能なマーカー類、及び微生物宿主と適合性の種由来の制御配列を含有するプラスミドベクターが用いられる。このようなベクターの例は、パウウェルズ（Ｐｏｕｗｅｌｓ）ら（上掲）又はアズベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）ら（上掲）において見出される。一般的に用いられる原核生物の制御配列（「調節要素」とも呼ばれる）は、本明細書中では、任意選択で作動遺伝子と共に、リボソーム結合部位配列と一緒に転写開始用のプロモーターを含むように定義されている。タンパク質発現を方向づけるために一般的に用いられるプロモーターとしては、β−ラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）、ラクトース（ｌａｃ）、トリプトファン（Ｔｒｐ）（ゲデル（Ｇｅｄｄｅｌ）ら著、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、８：４０５７頁（１９８０年））、及びｔａｃプロモーター系、並びにｌａｍｂｄａ由来Ｐ．ｓｕｂ．Ｌプロモーター及びＮ−遺伝子リボソーム結合部位（シマタケ（Ｓｉｍａｔａｋｅ）ら著、Ｎａｔｕｒｅ、２９２：１２８頁（１９８１年））が挙げられる。
【００４３】
Ｐ４５０製造のための１つの特定の細菌発現系は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｐＥＴ発現系（ノバジェン（Ｎｏｖａｇｅｎ））である。この発現系によって、Ｐ４５０のＤＮＡコード化が発現を可能にするようにデザインされた方向づけでｐＥＴベクターに挿入される。Ｐ４５０遺伝子はＴ７調節シグナルの制御下にあるため、Ｐ４５０発現は宿主細胞におけるＴ７  ＲＮＡポリメラーゼの発現の誘導に依存する。これは通常、ＩＰＴＧ誘導に応答してＴ７  ＲＮＡポリメラーゼを発現する宿主菌株を用いて達成される。製造されると、次いで組換えＰ４５０は、例えば、本明細書中に記載される、当業界において周知の標準の方法に従って単離される。
【００４４】
Ｐ４５０製造のための別の細菌発現系は、ｐＧＥＸ発現系（ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ））である。この系では、機能的遺伝子生成物の精製及び回収が迅速である融合タンパク質としての遺伝子又は遺伝子画分の高レベルの発現のためにデザインされたＧＳＴ遺伝子融合系が使用される。興味の対象となるＰ４５０は、日本住血吸虫からのグルタチオンＳ−トランスフェラーゼタンパク質のカルボキシル末端に融合され、グルタチオンセファロース４Ｂを用いてアフィニティクロマトグラフィによって細菌ライセートから容易に精製される。融合タンパク質はグルタチオンによる溶出によって温和な条件下に回収することができる。融合タンパク質からのグルタチオンＳ−トランスフェラーゼドメインの切断は、このドメインの上流の部位特異的プロテアーゼの認識部位の存在によって促進される。例えば、ｐＧＥＸ−２Ｔプラスミドにおいて発現されるタンパク質は、Ｘａ因子によって切断され得る。
真核生物のＰ４５０を発現するために有用な他の原核生物系は、クッパー（Ｃｏｏｐｅｒ）（Ｍｕｔａｔ．Ｒｅｓ．、２０００年、４５４：４５〜５２頁）及びドング（Ｄｏｎｇ）ら（Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．、１９９６年、３２７：２５４〜２５９頁）によって記載されている。また、チトクローム還元酵素と組み合わせたチトクロームＰ４５０の原核生物発現を増強するためのストラテジーが、ポーター（Ｐｏｒｔｅｒ）ら（Ｄｒｕｇ．Ｍｅｔａｂ．Ｒｅｖ．、１９９９年、３１：１５９〜１７４頁）において記載されている。
【００４５】
真核生物の発現のために、形質転換又は形質移入の方法及びＰ４５０の発現のための媒体の選択は、選択される宿主系によって決まる。多数の生物、例えば、べーカーの酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの形質転換及び形質移入の方法は、例えば、アズベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）ら（上掲）；ヴァイスバッハ（Ｗｅｉｓｓｂａｃｈ）とヴァイスバッハ（Ｗｅｉｓｓｂａｃｈ）著、植物分子生物学の方法、アカデミック・プレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ）、１９８９年；ゲルビン（Ｇｅｌｖｉｎ）ら著、植物分子生物学マニュアル、クルウェル・アカデミック・パブリッシャーズ（Ｋｌｕｗｅｒ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ）、１９９０年；キンドル（Ｋｉｎｄｌｅ），Ｋ．著、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ａｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、８７：１２２８頁（１９９１年）；及びバイオラッド（ＢｉｏＲａｄ）（カリフォルニア州、ヘラクレス）テクニカル社報＃１６８７（バイオリスティック・パーティクル・デリバリー・システムズ（Ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ  Ｐａｒｔｉｃｌｅ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）において記載されている。発現媒体は、例えば、クローニング・ベクター：実験マニュアル（Ｐ．Ｈ．パウウェルズ（Ｐｏｕｗｅｌｓ）ら、１９８５年、増補、１９８７年）；ガッサー（Ｇａｓｓｅｒ）とフレリー（Ｆｒａｌｅｙ）（上掲）；クローンテク（Ｃｌｏｎｔｅｃ）分子生物学カタログ（分子生物学者のためのツール、カタログ１９９２／９３年、カリフォルニア州、パロアルト）；及び上記の引例において示されているものから選択することができる。
【００４６】
１つの好ましい真核生物発現系は、ｐＭＡＭｎｅｏ発現ベクター（クローンテク（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ）を形質移入されたマウス３Ｔ３線維芽細胞の宿主細胞である。ｐＭＡＭｎｅｏは、デキサメタゾン誘導性ＭＭＴＶ−ＬＴＲプロモーターに結合されたＲＳＶ−ＬＴＲエンハンサー、哺乳動物系における複製を可能にするＳＶ４０の複製開始点、選択可能なネオマイシン遺伝子、及びＳＶ４０スプライシング及びポリアデニル化部位を提供する。Ｐ４５０のＤＮＡコード化は発現を可能にするようにデザインされた方向づけでｐＭＡＭｎｅｏベクターに挿入される。次いで、組換えＰ４５０は以下に述べるように単離される。ｐＭＡＭｎｅｏ発現媒体と組み合わせて用いられる他の好ましい宿主細胞としては、ＣＯＳ細胞及びＣＨＯ細胞（ＡＴＣＣ目録番号はそれぞれ、ＣＲＬ１６５０及びＣＣＬ６１）が挙げられる。
【００４７】
あるいは、望まれる場合は、Ｐ４５０は安定に形質移入された哺乳動物細胞ラインによって製造される。哺乳動物細胞の安定形質移入に適した多くのベクターが一般に入手可能であるが、例えば、パウウェルズ（Ｐｏｕｗｅｌｓ）ら（上掲）を参照；このような細胞ラインを作成するための方法も、例えば、アズベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）ら（上掲）において利用可能である。１つの実施例において、Ｐ４５０をコード化するｃＤＮＡは、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）遺伝子を含む発現ベクターにクローン化される。プラスミドの組込み、したがって、宿主細胞染色体へのＰ４５０コード化遺伝子は、細胞培養培地における０．０１〜３００μＭのメトトレキセートの包含によって選択される（アズベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）ら、（上掲））。この優位な選択は、大部分の細胞型で行うことができる。組換えタンパク質発現は、形質移入遺伝子のＤＨＦＲ仲介増幅によって増大させることができる。遺伝子の増幅を有する細胞ラインを選択するための方法は、アズベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）ら（上掲）において記載されており；このような方法は一般に、メトトレキセートの濃度を徐々に増大させることを含む培地における培養の拡大を含む。この目的のために用いられるＤＨＦＲ含有発現ベクターとしては、ｐＣＶＳＥＩＩ−ＤＨｒＦ及びｐＡｄＤ２６ＳＶ（Ａ）が挙げられる（アズベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）ら、（上掲）に記載）。上記の宿主細胞のいずれか、又は、好ましくは、ＤＨＦＲ欠乏性ＣＨＯ細胞ライン（例えば、ＣＨＯ  ＤＨＦＲ細胞、ＡＴＣＣ目録番号ＣＲＬ９０９６）が宿主細胞の中で安定な形質移入細胞ライン又はＤＨＦＲ仲介遺伝子増幅のＤＨＦＲ選択のために好ましい。
【００４８】
チトクロームＰ４５０は昆虫細胞においても製造することができ、このような細胞としては、ハスモンヨウ近似種（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）（ＳＦ）−９、ＳＦ−２１、又はキイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ（ＳＬ−２）細胞が挙げられるがこれに限定されない。Ｐ４５０製造のために、昆虫細胞には一般的に、バキュロウィルス、例えば、かかるタンパク質の発現カセット、例えば、１〜１０の感染効率でチトクロームＰ４５０を含有する、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ核多角体病ウイルス（ＡｃＭＮＰＶ）を感染させる。感染細胞は一般に標準の分子生物学的方法を用いてタンパク質を回収する前の２４〜４８時間に標準の昆虫細胞培養培地において培養される。
更に、本明細書中に記載したチトクロームＰ４５０のいずれかを酵母、例えば、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓにおいて製造することができる。Ｐ４５０を製造するために、酵母細胞は、例えば、ＡＯＸ１又はホスホグリセリン酸キナーゼ遺伝子プロモーターなどのプロモーター、発現されるＰ４５０遺伝子、及びターミネーターを含有する発現カセットで形質転換される。このような発現カセットは、複製開始点を含有し、又は酵母ゲノムＤＮＡに組込むことができる。発現カセットは一般に、酢酸リチウム形質転換又はスフェロプラストの使用によって導入される。有効な形質転換細胞を選択するために、例えば、導入発現カセットを有する酵母を増殖させることのみ可能な最小培地上に酵母をプレーティングする。
【００４９】
また、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ発現系を用いた酵母における組換えタンパク質の発現が、米国特許第５，７４１，６７４号及び同第５，６７２，４８７号に記載されている。
Ｐ４５０は、安定に形質移入された植物細胞ライン又は遺伝子導入植物によって製造することもできる。このような遺伝子操作植物は、以下に述べるような種々の商業的及び農業的用途に有用である。重要なことには、本発明は、裸子植物及び被子植物に適用可能であり、新しい又は改善された形質転換又は再生方法に容易に適用可能となろう。
植物細胞の安定な形質移入又は遺伝子導入植物の確立に適した多くのベクターが一般に入手可能であり；このようなベクターはパウエルズ（Ｐｏｕｗｅｌｓ）ら（上掲）、ヴァイスバッハ（Ｗｅｉｓｓｂａｃｈ）とヴァイスバッハ（Ｗｅｉｓｓｂａｃｈ）（上掲）、及びゲルビン（Ｇｅｌｖｉｎ）ら（上掲）に記載されている。このような細胞ラインを構成するための方法は、例えば、ヴァイスバッハ（Ｗｅｉｓｓｂａｃｈ）とヴァイスバッハ（Ｗｅｉｓｓｂａｃｈ）（上掲）、及びゲルビン（Ｇｅｌｖｉｎ）ら（上掲）に記載されている。一般的に、植物発現ベクターとしては、（１）５’及び３’調節配列の転写制御下のクローン化Ｐ４５０遺伝子、及び（２）優位な選択可能なマーカーが挙げられる。このような植物発現ベクターは、望まれる場合は、プロモーター調節領域（例えば、誘導性又は構成的発現を与えるもの、又は環境的、あるいは発生的に調節され、又は病原体、あるいは創傷誘導性、又は細胞あるいは組織特異的発現を与えるもの）、転写開始部位、リボソーム結合部位、ＲＮＡプロセシングシグナル、転写終止部位、及び／又はポリアデニル化シグナルを含むこともできる。
【００５０】
本発明のＰ４５０ＤＮＡ配列は、望まれる場合は、種々の方法で他のＤＮＡ配列と組み合わせることができる。本発明のＰ４５０配列は、通常、Ｐ４５０と結合した遺伝子配列の全部又は一部と共に使用することができる。その構成部分において、Ｐ４５０をコード化するＤＮＡ配列は、宿主細胞において転写及び翻訳を促進する能力を有する転写開始制御領域を有するＤＮＡ作成物において組み合わされる。
一般に、これらの作成物は、本明細書中に記載されたＰ４５０の製造のために提供される植物における調節領域機能を含む。Ｐ４５０の読み取り枠コード、又はその機能的フラグメントは、その５’末端でＰ４５０構造的遺伝子、例えば、ＣＹＰ７１Ｄ２０（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）又はＣＹＰ７１Ｄ２１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）遺伝子の５’上流領域において自然に見出される配列などの転写開始調節領域に結合される。構成的又は誘導性調節のために提供される多数の他の転写開始領域が利用可能である。
発生的、細胞、組織、ホルモン、環境的、又は病原体誘導性発現が望まれる場合の用途のために、適切な５’上流非コード領域が他の遺伝子、例えば、種子発生中、胚発生中、葉発生中、又は病原体に応答して調節された遺伝子から得ることができる。
【００５１】
調節転写終止領域も本発明のＤＮＡ作生物において同じく得ることができる。転写終止領域は、Ｐ４５０をコード化するＤＮＡ配列又は異なる遺伝子源由来の便利な転写終止領域によって得ることができる。転写終止領域は、終止領域が由来する構造的遺伝子に対する少なくとも１〜３ｋｂの配列３’を含有することが好ましい。
本発明による有用な植物プロモーターの例は、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）プロモーターなどのカリモウイルスプロモーターである。これらのプロモーターは大部分の植物組織において高レベルの発現を与え、これらのプロモーターの活性はウイルス性コード化タンパク質に依存しない。ＣａＭＶは３５Ｓプロモーター及び１９Ｓプロモーターの資源である。遺伝子導入植物の大部分の組織において、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターは強力なプロモーターである（例えば、オデル（Ｏｄｅｌｌ）ら著、Ｎａｔｕｒｅ，３１３：８１０頁（１９８５年）参照）。ＣａＭＶプロモーターも単子葉植物においてきわめて活性である（例えば、ドゥケイゼル（Ｄｅｋｅｙｓｅｒ）ら著、Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ、２：５９１頁（１９９０年））；寺田（Ｔｅｒａｄａ）と島本（Ｓｈｉｍａｍｏｔｏ）著、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．、２２０：３８９頁（１９９０年）参照）。更に、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターの複製によって、このプロモーターの活性を更に増大させることができる（すなわち、２〜１０倍）（例えば、ケイ（Ｋａｙ）ら著、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３６：１２９９頁（１９８７年）；オウ（Ｏｗ）ら著、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、８４：４８７０頁（１９８７年）；及びファング（Ｆａｎｇ）ら著、Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ、１：１４１頁（１９８９年）参照）。他の有用な植物プロモーターとしては、ノパリン合成酵素プロモーター（アン（Ａｎ）ら著、Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．、８８：５４７頁、（１９８８年））及びオクトピン合成酵素プロモーター（フロム（Ｆｒｏｍｍ）ら著、Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ、１：９７７頁、（１９８９年））が挙げられるが、これに限定されない。
【００５２】
一部の応用例では、適切な組織において、適切なレベル、又は適切な発生時間でＰ４５０遺伝子作成物を製造することが望ましい。この目的のために、遺伝子プロモーターの組合せがあり、その調節配列に具体化されたそれぞれその独自の明確な特徴を有し、それらは環境、ホルモン類、及び／又は発生のきっかけに応答して調節されることが示されている。これらには熱調節遺伝子発現（例えば、カリス（Ｃａｌｌｉｓ）ら著、Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．８８：９６５頁、（１９８８年）；高橋（Ｔａｋａｈａｓｈｉ）と米田（Ｋｏｍｅｄａ）著、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．、２１９：３６５頁（１９８９年）；及び高橋ら著、Ｐｌａｎｔ  Ｊ．、２：７５１頁、（１９９２年）参照）、光調節遺伝子発現（例えば、クールマイヤー（Ｋｕｈｌｅｍｅｉｅｒ）らにより記載されたエンドウマメｒｂｃＳ−３Ａ（Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ、１：４７１頁（１９８９年）；シャフナー（Ｓｃｈａｆｆｎｅｒ）とシーン（Ｓｈｅｅｎ）により記載されたトウモロコシｒｂｃＳプロモーター、（Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ、３：９９７頁、（１９９１年）；又は又はシンプソン（Ｓｉｍｐｓｏｎ）らにより記載されたエンドウマメにおいて見出されるクロロフィルａ／ｂ結合タンパク質遺伝子（ＥＭＢＯ  Ｊ．、４：２７２３頁、（１９８５年）参照）、ホルモン調節遺伝子発現（例えば、マルコッテ（Ｍａｒｃｏｔｔｅ）らにより記載されたコムギのＥｍ遺伝子からのアブシシン酸（ＡＢＡ）反応性配列（Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ、１：９６９頁、（１９８９年）；ストラウブ（Ｓｔｒａｕｂ）らにより記載されたオオムギ及びシロイヌナズナについて記載されたＡＢＡ誘導性ＨＶＡ１及びＨＶＡ２２、及びｒｄ２９Ａプロモーター（Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ、６：６１７頁、（１９９４年）、シェン（Ｓｈｅｎ）ら（Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ、７：２９５頁、（１９９４年）参照）、及び創傷誘導遺伝子発現（例えば、シーバーツ（Ｓｉｅｂｅｒｔｚ）らにより記載されたｗｕｎＩ（Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ、１：９６１頁、（１９８９年））、又は器官特異的遺伝子発現（例えば、ロシャール（Ｒｏｓｈａｌ）らにより記載された隆起特異的ストレージタンパク質遺伝子（ＥＭＢＯ  Ｊ．、６：１１５５頁、（１９８７年）；シェムターナー（Ｓｃｈｅｍｔｈａｎｅｒ）らにより記載されたトウモロコシからの２３−ｋＤａ  ｚｅｉｎ遺伝子（ＥＭＢＯ  Ｊ．、７；１２４９頁、（１９８８年）；又はバストス（Ｂｕｓｔｏｓ）らにより記載されたサヤインゲンβ−ファゼオリン遺伝子（Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ、１：８３９頁（１９８９年））；及び本明細書中に参考として援用される米国特許第０８／４７１，９８３号、同第０８／４４３，６３９号、及び同第０８／５７７，４８３号におけるチャペル（Ｃｈａｐｅｌｌ）らにより記載された病原体誘導性遺伝子発現にそれぞれ役割を果たす遺伝子プロモーターが含まれる。
植物発現ベクター類は任意選択でＲＮＡプロセシングシグナル、例えば、効率的なＲＮＡ合成及び蓄積のために重要であることが示されているイントロンを含むことができる（カリスら著、Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖ．、１：１１８３頁、（１９８７年））。ＲＮＡスプライス配列の位置は植物における導入遺伝子発現のレベルに劇的に影響する。この事実の点から見て、イントロンは導入遺伝子におけるＰ４５０コード化配列の上流又は下流に位置決めされ、遺伝子発現のレベルを調節するとみられる。
【００５３】
前記の５’調節制御配列に加えて、発現ベクター類は植物遺伝子の３’領域に一般に存在する調節制御領域も含むことができる（ソーンバーク（Ｔｈｏｒｎｂｕｒｇ）ら著、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、８４：７４４頁、（１９８７年）；アン（Ａｎ）ら著、Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ、１：１１５頁、（１９８９年））。例えば、３’ターミネーター領域はｍＲＮＡの安定性を増大させる発現ベクターに含まれる。このようなターミネーター領域の１つは、ジャガイモのＰＩ−ＩＩターミネーター領域由来であり得る。また、一般に用いられる他のターミネーターは、オクトピン又はノパリン合成酵素由来である。
植物発現ベクターは、形質転換された細胞を確認するために用いられる優位な選択可能なマーカー遺伝子も一般的に含有する。植物系の有用な選択可能な遺伝子としては、例えば、ハイグロマイシン、カナマイシン、ブレオマイシン、Ｇ４１８、ストレプトマイシン、又はスペクチノマイシンに対する抵抗性をコード化するような抗菌抵抗性遺伝子をコード化する遺伝子が挙げられる。光合成に必要とされる遺伝子も光合成欠乏性菌株における選択可能なマーカーとして用いることができる。あるいは、オワンクラゲ（ｊｅｌｌｙｆｉｓｈ  Ａｅｑｕｏｒｅａ  ｖｉｃｔｏｒｉａ）からの緑色蛍光タンパク質を選択可能なマーカーとして用いることができる（シーン（Ｓｈｅｅｎ）ら著、Ｐｌａｎｔ  Ｊ．、８：７７７頁、１９９５年；チウ（Ｃｈｉｕ）ら著、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、６：３２５頁、（１９９６年））。最後に、除草剤抵抗性をコード化する遺伝子を選択可能なマーカーとして用いることができ；有用な除草剤抵抗性遺伝子は、酵素フォスフィノスリンアセチルトランスフェラーゼをコード化し、広スペクトルの除草剤ＢＡＳＴＡ（ヘキスト（Ｈｏｅｃｈｓｔ）社（ＡＧ）（ドイツ、フランクフルト））に対する抵抗性を与えるｂａｒ遺伝子を含む。
【００５４】
選択可能なマーカーの効率的な使用は、特定の選択可能な薬剤に対する植物細胞の感受性の測定、及び形質転換細胞の、すべてではないにせよ、大部分を有効に殺傷するこの薬剤の濃度の測定によって促進される。タバコ形質転換のための抗菌剤の一部の有用な濃度としては、例えば、７５〜１００μｇ／ｍｌ（カナマイシン）、２０〜５０μｇ／ｍｌ（ハイグロマイシン）、又は５〜１０μｇ／ｍｌ（ブレオマイシン）が挙げられる。除草剤抵抗性のための形質転換体を選択するための有用なストラテジーは、例えば、ヴァシル（Ｖａｓｉｌ）ら（上掲）により記載されている。
分子生物学、特に植物分子生物学の分野における当業者には、遺伝子発現のレベルがプロモーター、ＲＮＡプロセシングシグナル、及びターミネーター要素の組合せだけではなく、選択可能なマーカー遺伝子発現のレベルを増大させるためにこれらの要素がいかに用いられるかによって左右されることが容易に理解されるであろう。
【００５５】
植物の形質転換
植物発現ベクターの構成時には、植物宿主にベクターを導入し、遺伝子導入植物を生成するためにいくつかの標準の方法が利用可能である。これらの方法としては、（１）アグロバクテリウム仲介形質転換（Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ又はＡ．ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ）（例えば、リヒテンシュタイン（Ｌｉｃｈｔｅｎｓｔｅｉｎ）とフラー（Ｆｕｌｌｅｒ）著、「遺伝子工学」、第６巻、ＰＷＪ  Ｒｉｇｂｙ編収載、１９８７年、ロンドン、アカデミック・プレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ）；及びリヒテンシュタイン（Ｌｉｃｈｔｅｎｓｔｅｉｎ），Ｃ．Ｐ．及びドレイパー（Ｄｒａｐｅｒ），Ｊ．著、「ＤＮＡクローニング」、第ＩＩ巻、Ｄ．Ｍ．Ｇｌｏｖｅｒ編収載、１９８５年、オックスフォード、ＩＲＩプレス（Ｐｒｅｓｓ）参照）、（２）粒子送達系（例えば、ゴールドン−カム（Ｇｏｒｄｏｎ−Ｋａｍｍ）ら著、Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ、２：６０３頁、（１９９０年）；又はバイオラッド（ＢｉｏＲａｄ）テクニカル社報１６８７、上掲参照）、（３）マイクロインジェクションプロトコール（例えば、グリーン（Ｇｒｅｅｎ）ら、上掲参照）、（４）ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）法（例えば、ドレイパー（Ｄｒａｐｅｒ）ら著、Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．、２３：４５１頁、（１９８２年）；又は、例えば、チャン（Ｚｈａｎｇ）とウー（Ｗｕ）著、Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．、７６：８３５頁、（１９８８年）参照）、（５）リポソーム−仲介ＤＮＡ取込み（例えば、フリーマン（Ｆｒｅｅｍａｎ）ら著、Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．、２５：１３５３頁、（１９８４年）参照）、（６）電気穿孔プロトコール（例えば、ゲルビン（Ｇｅｌｖｉｎ）ら、上掲；ドゥケイゼル（Ｄｅｋｅｙｓｅｒ）ら、上掲；フロム（Ｆｒｏｍｍ）ら著、Ｎａｔｕｒｅ、３１９：７９１頁、（１９８６年）；シーン（Ｓｈｅｅｎ）著、Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ、２：１０２７頁、（１９９０年）；又はジャング（Ｊａｎｇ）とシーン（Ｓｈｅｅｎ）著、Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ、６：１６６５頁、（１９９４年）参照）、及び（７）ボルテックス法（例えば、キンドル（Ｋｉｎｄｌｅ）、上掲参照）が挙げられる。形質転換の方法は本発明には重要ではない。効率的な形質転換が提供される方法であればすべて用いることができる。作物又は他の宿主細胞を形質転換するために利用可能な新しい方法として、それらは直接適用され得る。
【００５６】
以下は、アグロバクテリウム仲介植物形質転換の特定の方法の概略を示す例である。この方法によって、植物細胞のゲノムへ移される遺伝子を操作するための一般の工程は２つの相で行われる。第一に、クローニング及びＤＮＡ改変ステップが大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）で行われ、興味の対象となる遺伝子作成物を含有するプラスミドはアグロバクテリウムへの結合又は電気穿孔によって移される。第二に、結果として生じるアグロバクテリウム菌株を用いて植物細胞を形質転換する。したがって、全般的な植物発現ベクターのために、プラスミドはアグロバクテリウムにおける複製を可能にし、Ｅ．ｃｏｌｉにおける複製機能の高いコピー数開始点を可能にする複製開始を含有する。これにより植物へのその後の導入のためにアグロバクテリウムに移す前にＥ．ｃｏｌｉにおける導入遺伝子の容易な生成及び試験が可能となる。抵抗性遺伝子はベクター上に保有することができ、１つは細菌における選択用に、例えば、ストレプトマイシン、もう１つは植物において機能する、例えば、カナマイシン抵抗性又は除草剤抵抗性をコード化する遺伝子である。ベクター上には１つ又は複数の導入遺伝子、及びアグロバクテリウムの移行機能によって認識されると、植物へ移されることになるＤＮＡ領域の範囲を定める方向性Ｔ−ＤＮＡボーダー配列を添加するための制限エンドヌクレアーゼ部位も存在する。
別の実施例では、植物細胞はクローン化ＤＮＡが沈降される細胞タングステンマイクロプロジェクティル微粒子へ発射することによって形質転換され得る。発射用に用いられる微粒子銃装置（バイオ−ラッド）では、火薬の充填（２２口径パワー・ピストン・ツール・チャージ）又はエアー駆動型爆破薬がプラスチック製のマクロプロジェクティルを砲身の中に通す。ＤＮＡが沈降したタングステン粒子の一定分量の懸濁液をプラスチック製のマクロプロジェクティルの前面に配置する。後者は、マクロプロジェクティルが通過するには小さすぎる穴を有するアクリル停止プレートで発火する。その結果、プラスチック製のマクロプロジェクティルは停止プレートに激突し、タングステンマイクロプロジェクティルはプレートの穴を通じてそれらの標的に向かって進み続ける。本発明のために、標的は植物細胞、組織、種子、又は胚であり得る。マイクロプロジェクティル上の細胞に導入されたＤＮＡは核又は葉緑体のいずれかに組込まれる。
一般に、植物細胞の導入遺伝子の移行及び発現は今や当業者には日常的な実践的行為であり、植物における遺伝子発現試験を行い、農業的又は商業的関心の改善された植物の多様性を得るための主要な手段となっている。
【００５７】
遺伝子導入植物の再生
植物発現ベクターで形質転換された植物は、例えば、標準の植物組織培養法により単一の細胞、カルス組織、又はリーフディスクから再生させることができる。ほぼすべての植物の種々の細胞、組織、及び器官は有効に培養され、完全な植物を再生し得ることが当業界では公知であり；このような方法は、例えば、ヴァシル（Ｖａｓｉｌ）上掲；グリーン（Ｇｒｅｅｎ）上掲；ヴァイスバッハ（Ｗｅｉｓｓｂａｃｈ）とヴァイスバッハ（Ｗｅｉｓｓｂａｃｈ）上掲；及びゲルビン（Ｇｅｌｖｉｎ）ら、上掲において記載されている。
特定の実施例において、クローン化Ｐ４５０は、ＥＡＳ４プロモーター及びノパリン合成酵素ターミネーターの制御下、及び選択可能なマーカー（例えば、カナマイシン抵抗性）を有し、アグロバクテリウムに形質転換される。ベクター含有アグロバクテリウムによるリーフディスク（例えば、タバコのリーフディスクの）形質転換は、ホルシュ（Ｈｏｒｓｃｈ）ら（Ｓｅｉｅｎｃｅ、２２７：１２２９頁、（１９８５年））によって記載されているように行う。カナマイシン含有植物組織培養培地（例えば、１００μｇ／ｍｌ）上で数週間（例えば、３〜５週間）後に推定上の形質転換体を選択する。次いで、根開始用のホルモンなしにカナマイシン抵抗性シュートを植物組織培養培地上に配置する。次いで、カナマイシン抵抗性植物を温室成長用に選択する。望まれる場合は、次いで自家受精遺伝子導入植物からの種子を土壌を欠く培地に播き、温室で成長させた。カナマイシン抵抗性子孫はホルモンフリーのカナマイシン含有培地上で表面無菌種子を播くことによって選択する。導入遺伝子の組込みについての分析は標準の方法（例えば、アズベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）ら、上掲；ゲルビン（Ｇｅｌｖｉｎ）ら、上掲参照）によって行う。
【００５８】
次いで、選択可能なマーカーを発現する遺伝子導入植物を導入遺伝子ＤＮＡの伝達について標準の免疫ブロット法及びＤＮＡ検出法によって検査した。各陽性遺伝子導入植物及びその遺伝子導入子孫は、同じ導入遺伝子で確立された他の遺伝子導入植物に比べ独特である。導入遺伝子ＤＮＡの植物ゲノムＤＮＡへの組込みは、ほとんどの場合に無作為であり、組込みの部位は導入遺伝子の発現のレベル及び組織並びに発生パターンに大いに影響し得る。したがって、多くの遺伝子導入ラインは通常、各導入遺伝子について検査され、最も適切な発現プロフィールの植物を確認し選択する。
【００５９】
遺伝子導入ラインは一般に導入遺伝子の発現のレベルについて評価される。ＤＮＡレベルでの発現を最初に測定し、発現陽性植物を確認し、定量化する。ＲＮＡ分析用の標準の方法を使用し、これには導入遺伝子ＲＮＡテンプレートのみを増幅するようにデザインされたオリゴヌクレオチドプライマーを用いるＰＣＲ増幅アッセイ、及び導入遺伝子特異的プローブを用いる溶液ハイブリッド形成アッセイが含まれる（例えば、アズベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）ら、上掲参照）。次いで、ＲＮＡ陽性植物をＰ４５０に対する特異的抗体を用いるウエスタン免疫ブロット分析によってタンパク質について分析する（例えば、アズベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）ら、上掲参照）。また、導入遺伝子特異的ヌクレオチドプローブ及び抗体をそれぞれ用いて、標準のプロトコールによるインサイツハイブリッド形成及び免疫細胞化学を行い、遺伝子導入組織内の発現の部位を局在することができる。
組換えＰ４５０がいずれかの細胞又は遺伝子導入植物（例えば、上記のとおり）において発現すると、例えば、アフィニティークロマトグラフィを用いてこれを単離することができる。１つの実施例では、抗Ｐ４５０抗体（例えば、アズベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）ら、上掲において記載されたように、又は標準の方法によって生成）をカラムに付着させ、これを用いてポリペプチドを単離することができる。アフィニティークロマトグラフィ前にＰ４５０生成細胞の溶解及び分画を標準の方法によって行うことができる（例えば、アズベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）ら、上掲参照）。単離されると、組換えタンパク質は、望まれる場合は、例えば、高性能の液体クロマトグラフィ（例えば、フィシャー（Ｆｉｓｈｅｒ）、生物化学及び分子生物学における実験方法、ｅｄｓ．、ワーク・アンド・バードン（Ｗｏｒｋ  ａｎｄ  Ｂｕｒｄｏｎ）、エルゼビア（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ）、１９８０年）によって更に精製することができる。
【００６０】
ポリペプチドの発現及び精製のこれらの一般的な方法を用いて、有用なＰ４５０画分又は類似体を生成又は単離することもできる。
使用
本発明の前記のチトクロームＰ４５０ポリペプチド類はホルモン類、脂質類、及び二次代謝物の生合成において有用であり、除草剤、殺虫剤、汚染物質などの潜在的に有害な外来化学薬品に対する植物の耐容性にも寄与する。また、かかるチトクロームＰ４５０ポリペプチド類は、昆虫に対するほか、細菌、ウイルス、及び真菌感染に対する植物の化学的防御において有用である。
植物耐病性操作
Ｐ４５０遺伝子生成物の発現用にデザインされたプラスミド作成物は、例えば、遺伝子導入植物への抗病原体特性を与える植物防御経路、例えば、ファイトアレキシンの生成を活性化するために有用である。宿主植物（例えば、タバコ）から単離されるＰ４５０遺伝子は、同じ植物、密接に関係した種、又は遠い関係にある植物種における発現のために操作することができる。例えば、Ｐ４５０遺伝子は構成的な低レベルの発現のために操作し、次いでタバコの宿主植物に形質転換することができる。あるいは、Ｐ４５０は、ジャガイモやトマトを含むがこれに限定されない他のナス科植物における発現のために操作することができる。病原体抵抗性を達成するには、有効なレベルでＰ４５０タンパク質を発現することが重要である。Ｐ４５０遺伝子の異所性発現によって植物に与えられる病原体保護のレベル評価は、従来の方法及びアッセイによって測定される。
【産業上の利用可能性】
【００６１】
産業上の応用例
本発明は、新しいイソプレノイド化合物の生成において有用な新規なイソプレノイド代謝経路を含む宿主細胞を操作することも含む。イソプレノイド合成酵素（米国特許第５，８２４，７７４号及び国際公開番号ＷＯ００／１７３２７において開示）及びチトクロームＰ４５０をコード化する遺伝子を導入することによって、アセチルトランスフェラーゼ、メチルトランスフェラーゼ、脂肪性アシルトランスフェラーゼ、又はその組合せ、種々のイソプレノイド反応生成物を改変、制御、又は操作し、それによって多数のイソプレノイド反応生成物の産生、例えば、新規なモノテルペン類、ジテルペン類、及びセスキテルペン類の産生の増強が得られる。このような化合物は、ファイトアレキシン類、殺虫剤、香水、及び抗菌剤や抗真菌剤など医薬品として有用である。
１つの実施例において、イソプレノイド合成酵素又はキメライソプレノイド合成酵素（米国特許第５，８２４，７７４号及び国際公開番号ＷＯ００／１７３２７において開示）及びＰ４５０遺伝子は、例えば、本明細書中に記載されたいずれかの方法を用いて、酵母に導入される。望まれる場合は、かかる細胞は、独立して、又は組み合わせて、アセチルトランスフェラーゼ（例えば、ウォルカー（Ｗａｌｋｅｒ）ら著、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、２０００年、１８：５８３〜５８７頁参照）、メチラーゼトランスフェラーゼ（例えば、ディーナー（Ｄｉｅｎｅｒ）ら著、Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ、２０００年、１２：８５３〜８７０頁参照）遺伝子、又は脂肪性アシルトランスフェラーゼ遺伝子、及びチトクローム還元酵素も発現し得る。次いで、標準の条件下に細胞を培養し、イソプレノイド化合物の産生を当業界において周知の方法によって検定する。更に、イソプレノイド化合物を当業界において公知の方法によって精製する。新規なイソプレノイド化合物を発現する細胞は本発明において有用とみなされる。
【００６２】
かかる方法により新規なイソプレノイドの出発原料及び最終産物を生成するための独特な方法が提供される。前記酵素のいずれか（又はその組合せ）で形質転換される原核細胞又は真核細胞のいずれかを用いることができる。更に、イソプレノイド化合物は、適切な基質による精製酵素の試験管内組合せ、又は前記の酵素及びイソプレノイド化合物の産生を駆動するのに十分な適切な基質のいずれかの組合せを発現する宿主細胞を用いる直接の発酵を含めて、当業界において周知のいくつかの方法で製造することができる。
本発明は、害虫を阻止し、又は昆虫捕食者を攻撃し得る昆虫誘引剤及び妨害物の製造にも有用であり、本発明は新規な香料及び香水の生成にも有用である。
【００６３】
他の実施の形態
前述の説明から、当業者であれば、本発明の実質的な特徴を容易に確認することができ、本発明の種々の変更や修正を種々の用法や条件に適合させることができる。したがって、他の実施の形態も請求の範囲内にある。
本明細書において言及されたすべての刊行物及び特許は、個々の刊行物又は特許が具体的に、かつ個別に参考として援用されることが指示されるのと同程度に本明細書中で参考として援用される。
【図面の簡単な説明】
【００６４】
【図１】エリシター処理タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ）細胞におけるキャプシジオールの生合成のための代替経路案を示す模式図である。５−エピ−アリストロシェーヌは、セスキテルペンシクラーゼ、５−エピ−アリストロシェーヌ合成酵素（ＥＡＳ）の作用によってＦＰＰから合成され、その後にＣ１及びＣ３でヒドロキシル化し、キャプシジオールを形成する。
【図２】セスキテルペンシクラーゼ酵素活性及びセルラーゼ処理細胞培養におけるセスキテルペンヒドロキシラーゼ活性の誘導時間経過を示すグラフである。セスキテルペンシクラーゼ（５−エピ−アリストロシェーヌ、ＥＳＡ）酵素活性は、指示時点で収集された対照（白抜き四角）細胞及びエリシター処理（黒四角）細胞から調製された抽出物において測定された。セスキテルペンヒドロキシラーゼ活性は、対照（白抜き丸）細胞及びエリシター処理（黒丸）細胞の間接アッセイを用いて測定された。細胞培養を［3Ｈ］−５−エピ−アリストロシェーヌで３時間インキュベートし、各指示時点で終えた後にアリストロシェーヌのジヒドロキシル化形態の細胞内キャプシジオールへの放射能の取り込みを定量化した（マンジュアーノ−チャベス（Ｍａｎｄｕｊａｎｏ−Ｃｈａｖｅｚ）ら著、Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．、２０００年、３８１：２８５〜１９４頁）。
【図３】アンシミドール及びケトコナゾールによる５−エピ−アリストロシェーヌヒドロキシラーゼ活性の用量依存抑制を示す一連のグラフである。細胞懸濁培養（四角）内の生体内５−エピ−アリストロシェーヌヒドロキシラーゼ活性、又は収集された細胞から調製された抽出物内のＥＡＳ酵素活性を測定する前に１２時間、セルロース（０．５μｇ／ｍＬ）の存在下及びアンシミドール（Ａ）又はケトコナゾール（Ｂ）の各指示濃度で細胞培養をインキュベートした。精製ＥＡＳ調製物の試験管内活性（バック（Ｂａｃｋ）とチャペル（Ｃｈａｐｐｅｌｌ）著、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、１９９５年、２７０：７３７５〜７３８１頁）についても、これら阻害剤の非特異的効果の追加試験として指示阻害剤濃度で測定した（丸）。
【図４Ａ】ハイライトしたＰＣＲプライマー（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯＳ：２６〜２９）のデザイン用いた保存ドメインによる一般化チトクロームＰ４５０の一次構造を示す模式図である。
【図４Ｂ】チトクロームＰ４５０ｃＤＮＡフラグメントの増幅におけるベクター特異的プライマーとの種々の組合せで用いた変性Ｐ４５０−特異的プライマー（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯＳ：３０〜３６）を示すリストである。
【図４Ｃ】（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５）に対する変性プライマーＧＲＲＸＣＰ（Ａ／Ｇ）及びＴ７ベクター特異的プライマー（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７）を用いてエリシター処理細胞から単離されたｍＲＮＡで調製した方向性ｃＤＮＡから増幅されたＰＣＲ産物を示す臭化エチジウム染色アガロースゲルのスキャン画像である。Ｔ３ベクター特異的プライマーも示されている（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８）。
【図５】エリシター処理細胞におけるＣＹＰ７１Ｄ、ＣＹＰ７３Ａ、ＣＹＰ８２Ａ、ＣＹＰ９２Ａ、及びＥＡＳ転写蓄積の誘導時間経過を示す一連のノーザンブロットである。
【図６】ＣＹＰ９２Ａ５（Ａ）ｃＤＮＡ及びＣＹＰ７１Ｄ２０（Ｂ）ｃＤＮＡを発現する酵母から単離されたミクロソーム画分の一酸化炭素（ＣＯ）の異なるスペクトルを示す一連のグラフである。酵母（ＷＡＴ１１）細胞に操作されたそれぞれのプラスミド作成物の発現は、ガラクトース処理の後、ミクロソーム調製物の単離によって誘導した。一酸化炭素の存在下（実線）及び非存在下（破線）にインキュベートしたミクロソームの異なる吸収スペクトルを測定した。
【図７】セスキテルペン基質と共にＣＹＰ７１Ｄ２０発現作成物（Ａ及びＣ）又はベクター対照ＤＮＡ（Ｂ及びＤ）を含有するＷＡＴ１１酵母細胞から単離されたミクロソームのインキュベーション時に形成される反応生成物の一連のガスクロマトグラムを示す図である。指示酵母系から単離されたミクロソームをＮＡＤＰＨの存在下（実線）又は非存在下（鎖線）に５−エピ−アリストロシェーヌ（Ａ及びＢ）又は１−デオキシキャプシジオール（Ｃ及びＤ）でインキュベートした。５−エピ−アリストロシェーヌ、１−デオキシキャプシジオール、及びキャプシジオールの同一性を質量分析によって検証した。
【図８】他の植物テルペンヒドロキシラーゼ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯＳ：３９〜４３）と共にタバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ）５−エピ−アリストロシェーヌ（セスキテルペン）ヒドロキシラーゼＮｔＣＹＰ７１Ｄ２０（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）のアミノ酸の配列比較を示す図である。ＮｒＣＹＰ７１Ａ５ｖ１（遺伝子銀行（ＧｅｎＢａｎｋ）目録番号ＣＡＡ７０５７５）は、ネロール及びゲラニオールのモノヒドロキシル化を触媒するが、ＰａＣＹＰ７１Ａ１（Ａ３５８６７）はこれらの基質のエポキシ化を触媒し（ハラハン（Ｈａｌｌａｈａｎ）ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．,、１９９４年、１２０１：９４〜１００頁）。ＭｓＣＹＰ７１Ｄ１８（ＡＡＤ４４１５０）及びＭｐＣＹＰ７１Ｄ１３（ＡＡＤ４４１５１）は環状モノテルペンであるリモネンのＣ６及びＣ３でのモノヒドロキシル化をそれぞれ触媒する（ルピエン（Ｌｕｐｉｅｎ）ら、Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．、１９９９年、３６８：１８１〜１９２頁）。ＡｔＣＹＰ７０１Ａ３（ＡＡＣ３９５０５）は、ジテルペンの酸化を伴うヒドロキシル化を含む３段階ステップ反応を触媒するカウレン（ｋａｕｒｅｎ）オキシダーゼをコード化する（ヘリウェル（Ｈｅｌｌｉｗｅｌｌ）ら著、Ｐｌａｎｔ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．、１９９９年、１１９：５０７〜５１０頁）。ペパーミント（Ｍｅｎｔｈａ  ｐｉｐｅｒｉｔａ）（ＭｐＣＹＰ７１Ｄ１３；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３９）、スペアミント（Ｍｅｎｔｈａ  ｓｐｉｃａｔａ）（ＭｓＣＹＰ７１Ｄ１８；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０）、キャットミント（Ｎｅｐｅｔａ  ｒａｃｅｍｏｓａ）（ＮｒＣＹＰ７１Ａ５ｖ１；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１）、タバコ（Ｎｉｃｔｏｔｉｎａ  ｔａｂａｃｕｍ）（ＮｔＣＹＰ７１Ｄ２０；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）、アボガド（Ｐｅｒｓｅａ  ａｍｅｒｉｃａｎａ）（ＰａＣＹＰ７１Ａ１；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４２）、及びシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）（ＣＹＰ７０１Ａ３；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３）からの配列が示されている。保存残基は陰が付けられている。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004532014.tif 000089
【国際調査報告】
2004532014.tif 000090
2004532014.tif 000091
2004532014.tif 000092
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