(57)【要約】ヒト起源の細胞を含む哺乳動物細胞からなる組織における血管形成を、インビトロまたはインビボで調節する方法を記載する。また、創傷治癒および／または組織再生を増大する方法および瘢痕形成を制限する方法も記載する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物細胞からなる組織における血管形成を調節する方法であって、
（Ａ）少なくとも１つの細胞におけるＰＴＴＧ１遺伝子発現および／または内因性ＰＴＴＧ１タンパク質機能を阻害し、組織におけるｂＦＧＦ産生および／または分泌が阻害され、それによって組織の血管形成が阻害されること、または
（Ｂ）少なくとも１つの細胞におけるＰＴＴＧ１遺伝子発現および／または内因性ＰＴＴＧ１タンパク質機能を増大し、組織におけるｂＦＧＦ産生および／または分泌が増大され、それによって組織の血管形成が増大されること、
によって、少なくとも１つの細胞におけるＰＴＴＧ１遺伝子発現および／または内因性ＰＴＴＧ１タンパク質機能を調節する、
ことを含む上記方法。
【請求項２】
ＰＴＴＧ１特異的アンチセンスオリゴヌクレオチドを細胞に送達することによって血管形成を阻害することをさらに含む請求項１の方法。
【請求項３】
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＳＳＣＡ、８１８２、サイクリックＡＭＰ反応性成分、エストロゲン反応性成分、インシュリン反応性成分、ＳＰ１およびＧＣボックスからなる群から選択されるＰＴＴＧ１プロモーター中の制御領域に特異的に結合する請求項２の方法。
【請求項４】
内因性ＰＴＴＧ１タンパク質分子上のＳＨ３結合部位への特異的結合を阻止することにより、ＳＨ３介在シグナル伝達を妨害することによって血管形成を阻害することをさらに含む請求項１の方法。
【請求項５】
細胞性取り込み増強物質と複合体を形成したポリヌクレオチドであるＰＴＴＧカルボキシ末端関連ポリヌクレオチドを含む組成物を、ポリヌクレオチドが細胞に入り、それによってｂＦＧＦの産生および／または分泌が阻害されるのに充分な量と条件下で、細胞に送達することによって血管形成を阻害することをさらに含む請求項１の方法。
【請求項６】
組織はヒト細胞からなる請求項１の方法。
【請求項７】
組織は悪性の組織であり、血管形成は（Ａ）によって阻害される請求項１の方法。
【請求項８】
組織は網膜の組織であり、血管形成は（Ａ）によって阻害される請求項１の方法。
【請求項９】
組織は腎臓血管の組織であり、血管形成は（Ａ）によって阻害される請求項１の方法。
【請求項１０】
組成物がインビボで細胞に送達されるように、組成物を哺乳動物被験体に投与することをさらに含む請求項５の方法。
【請求項１１】
ポリヌクレオチドはＤＮＡまたはＤＮＡ類縁体である請求項５の方法。
【請求項１２】
ポリヌクレオチドはアンチセンスオリゴヌクレオチドである請求項５の方法。
【請求項１３】
ポリヌクレオチドはタンパク質核酸である請求項５の方法。
【請求項１４】
組成物は、プロモーターを含む発現ベクターをさらに含み、ＰＴＴＧカルボキシ末端関連ポリヌクレオチドは、転写単位中でプロモーターに機能的に連結している請求項５の方法。
【請求項１５】
ポリヌクレオチドはＰＴＴＧカルボキシ末端ペプチドをコードする請求項１４の方法。
【請求項１６】
ポリヌクレオチドは、
（Ａ）（配列番号９）、（配列番号１６）または（配列番号１７）のアミノ酸配列を有するペプチド、
（Ｂ）（Ａ）のいずれかと少なくとも約６０％の配列相同性を有する哺乳動物ＰＴＴＧ−Ｃペプチド、および
（Ｃ）少なくとも１５の連続的アミノ酸残基からなり、内因性ＰＴＴＧ発現および／またはＰＴＴＧ機能をダウンレギュレートするように機能する（Ａ）または（Ｂ）のペプチド断片、
よりなる群から選択される哺乳動物ＰＴＴＧ−Ｃペプチドをコードするヌクレオチド塩基配列を規定する請求項１５の方法。
【請求項１７】
（Ｃ）のペプチド断片はプロリンリッチな領域を含む請求項１６の方法。
【請求項１８】
ポリヌクレオチドは、
（Ａ）（配列番号１０）、（配列番号１８）または（配列番号１９）、
（Ｂ）（Ａ）のいずれかの縮重コード配列、
（Ｃ）（Ａ）または（Ｂ）のいずれかに相補的な配列、または
（Ｄ）（Ａ）、（Ｂ）または（Ｃ）のいずれかの少なくとも４５の連続的ヌクレオチドを含むポリヌクレオチド断片、
からなるヌクレオチド配列を有する請求項１６の方法。
【請求項１９】
プロモーターおよびポリヌクレオチドを含む発現ベクターからなる組成物を細胞に送達することによって組織における血管形成を阻害することであって、該ポリヌクレオチドは、哺乳動物ＰＴＴＧ−Ｃペプチドをコードする第１のＤＮＡセグメントを含み、該ポリヌクレオチドは転写単位内でプロモーターに機能的に連結しており、該ＰＴＴＧ−Ｃペプチドは、
（Ａ）（配列番号９）、（配列番号１６）または（配列番号１７）のアミノ酸配列を有するペプチド、
（Ｂ）（Ａ）のいずれかと少なくとも約６０％の配列相同性を有する哺乳動物ＰＴＴＧ−Ｃペプチド、および
（Ｃ）少なくとも１５の連続的アミノ酸残基を有し、内因性ＰＴＴＧ発現および／またはＰＴＴＧ機能をダウンレギュレートするように機能する（Ａ）または（Ｂ）のペプチド断片、
よりなる群から選択され、
該発現ベクターは、ＰＴＴＧ−Ｃペプチドが細胞内で発現されるように、細胞に入るのに充分な量と条件下で、細胞性取り込み増強物質と複合体を形成しており、こうしてｂＦＧＦ産生および／または分泌が阻害される、
ことをさらに含む請求項１の方法。
【請求項２０】
（Ｃ）のペプチド断片はプロリンリッチな領域を含む請求項１９の方法。
【請求項２１】
ポリヌクレオチドは、取り込み増強および／または移入能力のあるペプチドセグメントをコードする第２のＤＮＡセグメントをさらに含む請求項１９の方法。
【請求項２２】
発現ベクターがインビボで細胞に送達されるように、治療の必要な哺乳動物被験体に組成物を投与することをさらに含む請求項１９の方法。
【請求項２３】
細胞に入るのに充分な量と条件下で細胞性取り込み増強物質と複合体を形成しているＰＴＴＧカルボキシ末端ペプチドまたはその生理学的に機能性の断片を含む組成物を、細胞に送達することによって組織における血管形成を阻害し、こうしてｂＦＧＦの産生および／または分泌が阻害される、
ことをさらに含む請求項１の方法。
【請求項２４】
該取り込み増強物質はポリ陽イオン性脂質物質である請求項２３の方法。
【請求項２５】
該取り込み増強物質は、細胞性取り込み増強および／または移入能力のあるペプチドセグメントを含む請求項２３の方法。
【請求項２６】
（Ａ）（配列番号９）、（配列番号１６）または（配列番号１７）のアミノ酸配列を有するペプチド、
（Ｂ）（Ａ）のいずれかと少なくとも約６０％の配列相同性を有する哺乳動物ＰＴＴＧ−Ｃペプチド、および
（Ｃ）少なくとも１５の連続的アミノ酸残基を有し、内因性ＰＴＴＧ発現および／またはＰＴＴＧ機能をダウンレギュレートするように機能する（Ａ）または（Ｂ）のペプチド断片、
よりなる群から選択されるＰＴＴＧ−Ｃペプチドを含む組成物を、細胞に送達することによって血管形成を阻害することであって、
該発現ベクターは、ＰＴＴＧ−Ｃペプチドが細胞内で発現されるように、細胞に入るのに充分な量と条件下で、細胞性取り込み増強物質と複合体を形成しており、こうしてｂＦＧＦ産生および／または分泌が阻害される、
ことをさらに含む請求項１の方法。
【請求項２７】
（Ｃ）のペプチド断片はプロリンリッチな領域を含む請求項２６の方法。
【請求項２８】
ＰＴＴＧ−Ｃペプチドがインビボで細胞に送達されるように、治療の必要なヒト被験体に組成物を投与することをさらに含む請求項２６の方法。
【請求項２９】
取り込み増強物質はポリ陽イオン性脂質物質を含む請求項２６の方法。
【請求項３０】
取り込み増強物質は、細胞性取り込み増強および／または移入能力のあるペプチドセグメントを含む請求項２６の方法。
【請求項３１】
プロモーターおよびポリヌクレオチドを含む発現ベクターからなる組成物を細胞に送達することによって、組織における血管形成を増大することであって、該ポリヌクレオチドは、哺乳動物ＰＴＴＧ１ペプチドをコードする第１のＤＮＡセグメントを含み、該ポリヌクレオチドは転写単位内でプロモーターに機能的に連結しており、該ＰＴＴＧ１ペプチドは、
（Ａ）（配列番号２）、（配列番号４）または（配列番号１４）のアミノ酸配列を有するペプチド、および
（Ｂ）（Ａ）のいずれかと少なくとも約６０％の配列相同性を有する哺乳動物ＰＴＴＧ１ペプチド、
よりなる群から選択され、
該発現ベクターは、ＰＴＴＧペプチドが細胞内で過剰発現されるように、細胞に入るのに充分な量と条件下で、細胞性取り込み増強物質と複合体を形成しており、こうしてｂＦＧＦ産生および／または分泌が増大される、
ことをさらに含む請求項１の方法。
【請求項３２】
ポリヌクレオチドは、取り込み増強および／または移入能力のあるペプチドセグメントをコードする第２のＤＮＡセグメントをさらに含む請求項３１の方法。
【請求項３３】
発現ベクターがインビボで細胞に送達されるように、治療の必要な哺乳動物被験体に組成物を投与することをさらに含む請求項３１の方法。
【請求項３４】
細胞に入るのに充分な量と条件下で細胞性取り込み増強物質と複合体を形成しているＰＴＴＧ１ペプチドまたはその生理学的に機能性の断片を含む組成物を、細胞に送達することによって組織における血管形成を増大し、こうしてｂＦＧＦの産生および／または分泌が増大される、
ことをさらに含む請求項１の方法。
【請求項３５】
取り込み増強物質はポリ陽イオン性脂質物質である請求項３４の方法。
【請求項３６】
取り込み増強物質は、細胞性取り込み増強および／または移入能力のあるペプチドセグメントを含む請求項３５の方法。
【請求項３７】
（Ａ）（配列番号２）、（配列番号４）または（配列番号１４）のアミノ酸配列を有するペプチド、および
（Ｂ）（Ａ）のいずれかと少なくとも約６０％の配列相同性を有する哺乳動物ＰＴＴＧペプチド、
よりなる群から選択されるＰＴＴＧ１ペプチドを含む組成物を送達することによって血管形成を増大することであって、
該発現ベクターは、ＰＴＴＧ１ペプチドが細胞内で発現されるように、細胞に入るのに充分な量と条件下で、細胞性取り込み増強物質と複合体を形成しており、こうしてｂＦＧＦ産生および／または分泌が増大される、
ことをさらに含む請求項１の方法。
【請求項３８】
ＰＴＴＧペプチドがインビボで細胞に送達されるように、治療の必要なヒト被験体に組成物を投与することをさらに含む請求項３７の方法。
【請求項３９】
取り込み増強物質はポリ陽イオン性脂質物質を含む請求項３７の方法。
【請求項４０】
取り込み増強物質は、細胞性取り込み増強および／または移入能力のあるペプチドセグメントを含む請求項３７の方法。
【請求項４１】
組織は血管の組織であり、血管形成は（Ｂ）によって増大される請求項１の方法。
【請求項４２】
組織は脳血管の組織であり、血管形成は（Ｂ）によって増大される請求項１の方法。
【請求項４３】
請求項１の方法を含み、受傷組織における血管形成は（Ｂ）によって増大される、創傷治癒および／または組織再生を増大する方法。
【請求項４４】
受傷組織は肝臓の組織である請求項４３の方法。
【請求項４５】
請求項１の方法を含み、組織は瘢痕組織であり、当該組織において血管形成は（Ａ）によって阻害される、瘢痕形成を制限する方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の背景）
本出願全体を通して、種々の文献は括弧で参照される。本発明に関する分野の技術の現状をより詳細に説明するために、これらの文献の開示内容はその全体が、参照することにより本明細書に組み込まれる。
【０００２】
（１．発明の分野）
本発明は、医療技術、特に、哺乳動物細胞からなる組織における血管形成を調節する方法に関する。
【０００３】
（２．関連技術）
下垂体腫瘍形質転換遺伝子（ＰＴＴＧ）は、下垂体腫瘍および造血系と結腸の新生物で高度に発現されている（ザング（Ｚｈａｎｇ， Ｘ．）ら、「ヒト下垂体腫瘍形質転換遺伝子（ＰＴＴＧ）の構造、発現および機能」、Ｍｏｌ． Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ． １３：１５６−６６ ［１９９９ａ］；ザング（Ｚｈａｎｇ， Ｘ．）ら、「下垂体腺腫における下垂体腫瘍形質転換遺伝子（ＰＴＴＧ）発現」、Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ． Ｍｅｔａｂ． ８４：７６１−６７ ［１９９９ｂ］；ヒーネイ（Ｈｅａｎｅｙ， Ａ．Ｐ．）ら、「結腸直腸腫瘍における下垂体腫瘍形質転換遺伝子」、Ｌａｎｃｅｔ ３５５：７１２−１５ ［２０００］；ドミングエ（Ｄｏｍｉｎｇｕｅｚ， Ａ．）ら、「ラットｐｔｔｇのヒト同族体であるｈｐｔｔｇは造血系新生物で過剰発現される。ｈＰＴＴＧの転写活性化機能の証拠」、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ １７：２１８７−９３ ［１９９８］；サエズ（Ｓａｅｚ， Ｃ．）ら、「ｈｐｔｔｇは下垂体腺腫と他の原発性上皮新生物で過剰発現される」、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ １８：５４７３−６ ［１９９９］）。ＰＴＴＧ１は、多くの正常なヒト組織では低レベルで発現される（チェン（Ｃｈｅｎ． Ｌ．）ら、「ヒト下垂体腫瘍形質転換遺伝子（ｈＰＴＴＧ）ファミリーの同定：分子構造、発現、および染色体局在化」、Ｇｅｎｅ ２４８：４１−５０ ［２０００］；ヒーネイ（Ｈｅａｎｅｙ Ａ．Ｐ．）ら、［２０００］）。
【０００４】
ＰＴＴＧ発現レベルは、下垂体腫瘍と結腸直腸腫瘍の侵襲性と正相関（ザング（Ｚｈａｎｇ， Ｘ．）ら、［１９９９ｂ］；ヒーネイ（Ｈｅａｎｅｙ Ａ．Ｐ．）ら、［２０００］）し、エストロゲンにより誘導される（ヒーネイ（Ｈｅａｎｅｙ Ａ．Ｐ．）ら、「プロラクチノーマ病因におけるエストロゲン誘導下垂体腫瘍形質転換遺伝子（ＰＴＴＧ）の早期関与と繊維芽細胞増殖因子発現」、Ｎａｔ． Ｍｅｄ． ５：１３１７−２１ ［１９９９］）。腫瘍細胞では、ＰＴＴＧ  ｍＲＮＡとタンパク質発現は細胞サイクル依存性であり、Ｇ２／Ｍ期にピークに達する」（ユー（Ｙｕ， Ｒ．）ら、「下垂体腫瘍形質転換遺伝子（ＰＴＴＧ）は胎盤ＪＥＧ−３細胞分裂と生存を制御する：生きた細胞イメージングからの証拠」、Ｍｏｌ． Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ． １４：１１３７−１１４６ ［２０００］）。ＰＴＴＧ作用の機構は、はっきりしていない。ＰＴＴＧは繊維芽細胞増殖因子分泌をアップレギュレート（ザング（Ｚｈａｎｇ， Ｘ．）ら、［１９９９ａ］）し、ＤＮＡ転写をトランス活性化する」（ドミングエ（Ｄｏｍｉｎｇｕｅｚ， Ａ．）ら、［１９９８］；ワング（Ｗａｎｇ， Ｚ．）ら、下垂体腫瘍形質転換遺伝子（ＰＴＴＧ）トランス活性化および形質転換活性」、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７５：７４５９−６１ ［２０００］）。
【０００５】
ＰＴＴＧは、セキュリン（ｓｅｃｕｒｉｎ）タンパク質をコードし、その発現は、細胞形質転換を引き起こし、塩基性繊維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）の産生を誘導し、インビトロおよびインビボでエストロゲンにより制御され、染色分体分離を阻害する（ペイ（Ｐｅｉ， Ｌ．）とメルメド（Ｍｅｌｍｅｄ Ｓ．）、「下垂体腫瘍形質転換遺伝子の単離と性状解析」、Ｍｏｌ． Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ． １１：４３３−４４１ ［１９９７］；ザング（Ｚｈａｎｇ， Ｘ．）ら、「ヒト下垂体腫瘍形質転換遺伝子（ＰＴＴＧ）の構造、発現、および機能」、Ｍｏｌ． Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ． １３：１５６−１６６ ［１９９９ａ］；ヒーネイ（Ｈｅａｎｅｙ Ａ．Ｐ．）ら、「プロラクチノーマ病因におけるエストロゲン誘導下垂体腫瘍形質転換遺伝子（ＰＴＴＧ）の早期関与と繊維芽細胞増殖因子発現」、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ． ５：１３１７−１３２１ ［１９９９］；ゾウ（Ｚｏｕ， Ｊ．）ら、「形質転換と腫瘍発生に関与する脊椎動物姉妹染色分体分離インヒビターの同定」、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８５：４１８−４２２ ［１９９９］）。
【０００６】
染色分体分離の制御を乱すことにより、ＰＴＴＧ過剰発現はまた、異数性（すなわち、正常の染色体数より１つまたは数個の染色体が多いかまたは少ない細胞）を引き起こす（ゾウ（Ｚｏｕ， Ｊ．）ら、［１９９９］；ユウ（Ｙｕ， Ｒ．）ら、［２０００］）。分裂中期の最後にセキュリンは、後期促進複合体により分解され、セパリン（ｓｅｐａｒｉｎ）の緊張性阻害を解放し、これは次に、コヘジン（ｃｏｈｅｓｉｎ）（姉妹染色分体を一緒に保持するタンパク質）の分解を仲介する。非分解性ＰＴＴＧの過剰発現は、染色分体分離を中断し（ゾウ（Ｚｏｕ， Ｊ．）ら、［１９９９］）、ＰＴＴＧの過剰発現は、アポトーシスを引き起こし有糸分裂を阻害する（ユウ（Ｙｕ， Ｒ．）ら、［２０００］）。ＰＴＴＧのセキュリン機能は、ＰＴＴＧが正常な増殖細胞でも発現されていることを示唆する。成体動物とヒトでは、ＰＴＴＧ  ｍＲＮＡは睾丸（急速に分裂する生殖体を含有する臓器）に最も多い（ザング（Ｚｈａｎｇ， Ｘ．）ら、［１９９９ａ］；ワング（Ｗａｎｇ， Ｚ．）ら、［２０００］）。
【０００７】
ＰＴＴＧ遺伝子ファミリーは、染色体５ｑ３３上に位置する、ヒトＰＴＴＧ１を含む高い配列相同性を有する少なくとも３つの遺伝子を含有する（プレザント（Ｐｒｅｚａｎｔ， Ｔ．Ｒ．）ら、「ヒトプロト癌遺伝子ｈＰＴＴＧのイントロンの無い同族体は下垂体腫瘍で発現される：ｈＰＴＴＧファミリーの証拠」。Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ． Ｍｅｔａｂ． ８４：１１４９−５２ ［１９９９］）。マウスＰＴＴＧは、ヒトＰＴＴＧ１と６６％のヌクレオチド塩基配列相同性を共有し、形質転換能力も示す（ワング（Ｗａｎｇ， Ｚ．）とメルメド（Ｍｅｌｍｅｄ Ｓ．）、「マウス下垂体腫瘍形質転換遺伝子（ＰＴＴＧ）とそのプロモーターの性状解析」、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ ［印刷中：２０００］）。点突然変異がプロリンリッチな領域に導入された時の、インビトロ形質転換、インビボ腫瘍発生、およびトランス活性化により証明されるように、ＰＴＴＧ１の形質転換活性に決定的に重要なタンパク質Ｃ末端の近くでプロリンリッチな領域が同定された（ザング（Ｚｈａｎｇ， Ｘ．）ら、［１９９９ａ］）。プロリンリッチなドメインは、ＳＨ３結合部位として機能して、タンパク質チロシンキナーゼのシグナル伝達を仲介することがある（ポーソン（Ｐａｗｓｏｎ， Ｔ．）、「タンパク質モジュールとシグナル伝達ネットワーク」、Ｎａｔｕｒｅ ３７３：５７３−５８０ ［１９９５］；クリヤン（Ｋｕｒｉｙａｎ， Ｊ．）とコウバーン（Ｃｏｗｂｕｒｎ， Ｄ．）、「真核生物シグナル伝達におけるモジュラーペプチド認識ドメイン」、Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｂｉｏｍｏｌ． Ｓｔｒｕｃｔ． ２６：２５９−２８８ ［１９９７］）。
【０００８】
乳癌と卵巣癌は、ホルモン依存性悪性腫瘍のモデルである。エストロゲンとプロゲステロンは、特異的核受容体を介して作用し、乳腺と卵巣組織の正常な成長およびこれらの分化機能に必要である。古典的エストロゲン長−エストロゲン受容体（ＥＲ）相互作用と、その後のエストロゲン応答性成分へのＥＲ結合による遺伝子転写の制御以外に、現在は、転写調節が膜ＥＲにより仲介されることが明らかになっている（レビン（Ｌｅｖｉｎ Ｅ．Ｒ．）、「原形質膜エストロゲン受容体の細胞機能」、ＴＥＭ １０：３７４−７７ ［１９９９］）。この作用は、細胞外シグナル制御キナーゼ／分裂促進因子活性化タンパク質キナーゼ経路（ＥＲＫ／ＭＡＰＫ）のようなサイトゾルシグナル伝達の修飾を必要とする。
【０００９】
乳癌と卵巣癌では、これらのシグナル伝達作用を介する分子機構がはっきり解明されていないが、エストロゲンとプロゲスチン刺激細胞サイクル進行の主要な下流標的としてｃ−ｍｙｃとシクリンＤ１が同定されている。シクリンの量を制御する以外に、特異的ＣＤＫインヒビター（例えば、ｐ２１）の動員がエストロゲンにより障害され、エストロゲンに制御される追加のまだ不明の成分が、哺乳動物上皮細胞増殖と分化のレギュレーターのようである（サザーランド（Ｓｕｔｈｅｒｌａｎｄ， Ｒ．Ｌ．）ら、「エストロゲンとプロテスチンは細胞サイクル進行を制御する」、Ｊ． Ｍａｍｍａｒｙ Ｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌ． Ｎｅｏｐｌａｓｉａ ３：６３−７２ ［１９９８］）。
【００１０】
いくつかの研究が、いくつかの遺伝子（クレアチンキナーゼＢ、ｃ−ｍｙｃ、レチノイン酸受容体α、熱ショックタンパク質２７を含む）のエストロゲン応答性の付与における、ＳＰ１と半部位ＥＲＥの関与を記載した（ウー−ペング（Ｗｕ−Ｐｅｎｇ Ｘ．）ら、「ラットクレアチンキナーゼＢ遺伝子のエストロゲン制御を仲介する部位の限定」、Ｍｏｌ． Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ． ６：２３１−２４０ ［１９９２］；ヅビク（Ｄｕｂｉｋ， Ｄ．）とシュー（Ｓｈｉｕ， Ｒ．）、「ｃ−ｍｙｃ癌遺伝子発現のエストロゲン活性化の機構」、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ７：１５８７−１５９４ ［１９９２］）。半部位ＥＲＥとＳＰ１のこの共同相互作用が最近、プロゲステロン受容体で開示された（ペトクス（Ｐｅｔｘ， Ｌ．）とナルヅリ（Ｎａｒｄｕｌｌｉ， Ａ．Ｍ．）、「Ｓｐ１結合部位とエストロゲン応答成分半部位はヒトプロゲステロン受容体Ａプロモーターの制御に関与する」、Ｍｏｌ． Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ． １４：９７２−８５ ［２０００］）。複合プロモーターに関して、ＥＲＥは一般に多くのコピーで乱され、他の転写因子の結合モチーフ内に入れられる（ポーター（Ｐｏｒｔｅｒ， Ｗ．）ら、「転写因子Ｓｐ１とエストロゲン受容体との機能的相乗作用」、Ｍｏｌ． Ｅｎｄｏ． １１：１５６９−８０ ［１９９７］）。マウスとヒトＰＴＴＧプロモーター上のＳＰ１部位は、トランス活性化活性に決定的に重要であり、ＳＰ１成分の突然変異性破壊または既知のＳＰ１オリゴとの競合が、ＰＴＴＧプロモーター活性の最大９０％の喪失を引き起こすことが証明されている（ワング（Ｗａｎｇ， Ｚ．）らとメルメド（Ｍｅｌｍｅｄ Ｓ．）、「ＳＰ１は細胞形質転換中の下垂体腫瘍形質転換遺伝子（ＰＴＴＧ）プロモーターを活性化する」、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ［２０００］；カカー（Ｋａｋａｒ Ｓ．Ｓ．）、ヒト下垂体腫瘍形質転換遺伝子（ＰＴＴＧ）のプロモーターの分子クローニング、遺伝子構成および同定」、Ｇｅｎｅ ２４０：３１７−３２４ ［１９９９］）。
【００１１】
多くの固形腫瘍において、腫瘍の血管分布は予後と反比例し、ｂＦＧＦとＶＥＧＦ発現が予後を予測させることが報告されている（タカハシ（Ｔａｋａｈａｓｈｉ Ｙ．）ら、「血管内皮増殖因子とその受容体ＫＤＲの発現は、ヒト結腸癌の血管分布、転移、および増殖に比例する」、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ５５：３９６４−６８ ［１９９５］）。乳癌における血管形成の定量は、独立の予後因子として使用することができる（ウェイドナー（Ｗｅｉｄｎｅｒ， Ｎ．）ら、「腫瘍血管形成：早期乳癌における新しい重要な独立の予後因子」、Ｊ． Ｎａｔｌ． Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ． ８４：１８７５−１８８７ ［１９９２］；ホラク（Ｈｏｒａｋ， Ｅ．Ｒ．）ら、「乳癌の結節転移と生存の指標としての血小板／内皮細胞接着分子抗体により測定した血管形成」、Ｌａｎｃｅｔ ３４０：１１２０−１１２４ ［１９９２］）。腫瘍増殖、進行、および転移が血管へのアクセスに依存するのみでなく、子宮頸部上皮内新生組織形成ＩＩ（ＣＩＮＩＩ）からＣＩＮＩＩＩの場合のように、軽度異形成からの移行の間に、「血管形成スイッチ」が活性化され、組織血管形成表現型の変化が組織学的組織移行の前に起きることが明らかである（ハナハン（Ｈａｎａｈａｎ， Ｄ．）とフォークマン（Ｆｏｌｋｍａｎ， Ｊ．）、「腫瘍発生中の血管形成スイッチのパターンと出現機構」、Ｃｅｌｌ ８６：３５３−６４ ［１９９６］）。
【００１２】
既存の血管からの新しい血管の形成に至る血管形成のイベントの順序は、高度に制御され（ジャイン（Ｊａｉｎ， ＲＫ）ら、「定量血管形成測定法：進歩と問題」、Ｎａｔ Ｍｅｄ． ３：１２０３−１２０８ ［１９９７］；ダーランド（Ｄａｒｌａｎｄ ＤＣ）とダモア（Ｄ’Ａｍｏｒｅ ＰＡ）、１９９９  「血管成熟：血管成長が成熟する」、Ｊ． Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ． １０３：１５７−１５８ ［１９９９］）、血管内皮細胞による血管基底膜の溶解と新しい管腔と周皮細胞の形成を含む。腫瘍関連血管形成の間に、癌細胞によるまたは間接マクロファージ刺激による血管形成因子の持続的産生は、異常制御未成熟血管増殖を引き起こす（フォークマン（Ｆｏｌｋｍａｎ， Ｊ．）とシング（Ｓｈｉｎｇ， Ｙ．）、「血管形成」、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６７：１０９３１−１０９３４ ［１９９２］）。多くのインビトロとインビボ測定法は、血管形成の研究に有用である（例えば、ジャイン（Ｊａｉｎ， ＲＫ）ら、［１９９７］；アウアバッハ（Ａｕｅｒｂａｃｈ， Ｒ．）ら、「血管形成の測定法：総説」、Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｔｈｅｒ． ５１：１−１１ ［１９９１］）。
【００１３】
いくつかのサイトカインや増殖因子（塩基性繊維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）および血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）を含む）は、パラクリン作用モードでインビボの血管形成を調節する（ビクファルビ（Ｂｉｋｆａｌｖｉ， Ａ．）ら、「繊維芽細胞増殖因子−２の生物学的役割」、Ｅｎｄｏｃｒ． Ｒｅｖ． １８：２６−４５ ［１９９７］；フェッララ（Ｆｅｒｒａｒａ， Ｎ．）とデービス−シミス（Ｄａｖｉｓ−Ｓｍｙｔｈ， Ｔ．）、「血管内皮増殖因子の生物学」、Ｅｎｄｏｃｒ Ｒｅｖ １８：４−２５ ［１９９７］）。サイトゾル画分中のｂＦＧＦとＶＥＧＦレベルは腫瘍内血管形成に大きく関連する。（「ヒト原発性乳癌における血管形成因子血管内皮細胞増殖因子、酸性および塩基性繊維芽細胞増殖因子、腫瘍増殖因子−１、血小板由来内皮細胞増殖因子、胎盤増殖因子、およびプレイオトロピンの発現とその血管形成との関係」、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５７：９６３−６９ ［１９９７］；リンダーホルム（Ｌｉｎｄｅｒｈｏｌｍ， Ｂ．）ら、「血管内皮増殖因子は結節陰性乳癌において高い予測価値がある」、Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｏｎｃｏｌ． １６：３１２１−２８ ［１９９８］）。ｂＦＧＦとＶＥＧＦは血管形成に対して相乗作用を有し、ｂＦＧＦは、オートクリンおよびパラクリン作用を介してＶＥＧＦの内皮細胞発現を調節する（セゲッチ（Ｓｅｇｈｅｚｚｉ， Ｇ．）ら、繊維芽細胞増殖因子−２（ＦＧＦ−２）は、生成している毛細管の内皮細胞中の血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）発現を誘導する：血管形成に寄与するオトクリン機構」、Ｊ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． １４１（７）：１６５９−７３ ［１９９８］）。
【００１４】
ＰＴＴＧはｂＦＧＦ  ｍＲＮＡとタンパク質分泌を制御し、この機能は、保存されたＣ末端Ｐ−Ｘ−Ｘ−Ｐモチーフを必要とする（ザング（Ｚｈａｎｇ， Ｘ．）ら、［１９９９ａ］）。また、ラット下垂体ｐｔｔｇは、インビボとインビトロでエストロゲンにより制御され、ラット下垂体ｐｔｔｇ  ｍＲＮＡの最大の誘導は、ｂＦＧＦ、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）誘導、および下垂体血管形成に一致して、下垂体形質転換（正常細胞から肥大／過形成細胞へ）の早期にインビボで起きた（ヒーネイ（Ｈｅａｎｅｙ Ａ．Ｐ．）ら、［１９９９］）。
【００１５】
ＰＴＴＧ１過剰発現に関連する新生物細胞増殖および／または形質転換を阻害することができる方法、および特に、エストロゲン感受性新生物（例えば、乳癌および卵巣癌）の治療に有用な方法に対するニーズがある。これらのおよび他の利点は、本明細書に記載の本発明により提供される。
【００１６】
（発明の要約）
本発明は、血管形成を調節するのに有用な組成物と方法に関する。ＰＴＴＧペプチド、ＰＴＴＧカルボキシ末端ペプチドを含む組成物、または第１のＰＴＴＧカルボキシ末端ペプチドセグメントと第２の細胞性取り込み増強ペプチドセグメントとを含有するキメラもしくは融合タンパク質を含む組成物が含まれる。本発明はまた、ＰＴＴＧペプチドコードポリヌクレオチド、ＰＴＴＧカルボキシ末端関連ポリヌクレオチド、例えばＰＴＴＧ−ＣペプチドまたはアンチセンスＰＴＴＧ特異的またはＰＴＴＧ−Ｃ関連オリゴヌクレオチドをコードするポリヌクレオチドを含む組成物に関する。また本発明には、ＰＴＴＧ遺伝子またはＰＴＴＧ−Ｃ関連ポリヌクレオチド（ＰＴＴＧペプチドまたはＰＴＴＧ−Ｃペプチドをコードする核酸を含む）を含有する発現ベクターを含む組成物が含まれる。本発明のＰＴＴＧペプチドまたはＰＴＴＧ−Ｃペプチドおよび本発明のＰＴＴＧコードまたはＰＴＴＧ−Ｃ関連ポリヌクレオチドは、新生物細胞増殖および／または形質転換を阻害するための医薬組成物、薬剤の製造において有用であり、本発明のＰＴＴＧ特異的アンチセンスオリゴヌクレオチド、ＰＴＴＧペプチド、ＰＴＴＧ−Ｃペプチド、またはＰＴＴＧコードもしくはＰＴＴＧ−Ｃ関連ポリヌクレオチドを含有する。
【００１７】
本発明においてまた、他の細胞成分から単離することができるＰＴＴＧペプチド、ＰＴＴＧカルボキシ末端（ＰＴＴＧ−Ｃ）ペプチドおよびＰＴＴＧコードもしくはＰＴＴＧ−Ｃ関連ポリヌクレオチドも提供される。本発明のペプチドは、抗ＰＴＴＧ抗体を産生するための免疫原として生物測定法において、およびそのようなペプチドおよび／または抗体を含有する治療用組成物において有用である。また、本発明のＰＴＴＧコードまたはＰＴＴＧ−Ｃ関連ポリヌクレオチドの実施態様を含有し、それぞれ本発明のＰＴＴＧペプチドまたはＰＴＴＧ−Ｃペプチドを発現する哺乳動物細胞を含む、トランスジェニック非ヒト哺乳動物が提供される。
【００１８】
特に、この組成物と方法は、インビトロであってもインビボであっても、哺乳動物細胞からなる組織において血管形成を調節する本発明の方法において有用である。本発明の方法は、（Ａ）少なくとも１つの細胞におけるＰＴＴＧ１遺伝子発現および／または内因性ＰＴＴＧ１タンパク質機能を阻害することによって、組織におけるｂＦＧＦ産生および／または分泌が阻害され、それによって組織の血管形成が阻害される、または（Ｂ）少なくとも１つの細胞におけるＰＴＴＧ１遺伝子発現および／または内因性ＰＴＴＧ１タンパク質機能を増大することによって、組織におけるｂＦＧＦ産生および／または分泌が増大され、それによって組織の血管形成が増大され、少なくとも１つの細胞におけるＰＴＴＧ１遺伝子発現および／または内因性ＰＴＴＧ１タンパク質機能を調節することに関する。
【００１９】
ＰＴＴＧ１タンパク質は、ｂＦＧＦの発現、即ち、重要な血管形成アクチベーターであるｂＦＧＦの産生および／または分泌をさらに仲介するため、本発明の方法はまた悪性腫瘍組織における血管形成を阻害することを包含する。ｂＦＧＦおよびＶＥＧＦを含む血管形成アクチベーターは、ほとんどのヒト癌細胞により発現され分泌される（プレート（Ｐｌａｔｅ Ｋ．Ｈ．）ら、Ｎａｔｕｒｅ ３５９：８４５−４８ ［１９９２］；シュルツ−ヘクター（Ｓｃｈｕｌｔｚ−Ｈｅｃｔｏｒ， Ｓ．）とハガエ（Ｈａｇｈａｙｅｇｈ， Ｓ．）、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５３：１４４４−４９ ［１９９３］；ヤマナカ（Ｙａｍａｎａｋａ， Ｙ．）ら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５３：５２８９−９６ ［１９９３］；ブエンシング（Ｂｕｅｎｓｉｎｇ， Ｓ．）ら、Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． １５：２３３１−３４ ［１９９５］）。本明細書に記載するように、本発明のＰＴＴＧ−Ｃペプチドは、哺乳動物細胞細胞によるｂＦＧＦ産生を劇的に低下させ、本発明の方法において、本発明のＰＴＴＧ−Ｃペプチドは、腫瘍増殖および網膜症に必須である新しい血管の増殖を障害することができることを示す。他方、および本明細書に記載されるように、ＰＴＴＧ１の過剰発現は、インビトロおよびインビボにおいて、血管形成活性を増大する。故に、血管形成を調節する方法は、低下した血管形成が悪性腫瘍または網膜症等において有益である状態を処置するため、および外科患者または損傷した創傷治癒能力の患者（例えば糖尿病患者）における増大した創傷治癒および／または組織再生のためまたは心臓血管もしくは脳血管性虚血（例えば心臓発作または拍動犠牲者において）を治療するため等に有益である状態を処置するために有用である。故に、本発明はまた、創傷治癒および／または組織再生を増大する方法に関する。
【００２０】
幾つかの実施態様において、本発明の方法は、血管形成を阻害することを通して、ＰＴＴＧカルボキシ末端関連ポリヌクレオチドを哺乳動物細胞に送達し、ＰＴＴＧの内因性発現と機能とを阻害し、それによって組織における血管形成を阻害する、または、血管形成を増大することを通して、ＰＴＴＧペプチドコードポリヌクレオチドが組織の細胞に送達される、遺伝子ベースの処理に関する。
【００２１】
血管形成を調節する方法の有用な遺伝子ベースの実施態様は、ＰＴＴＧカルボキシ末端ペプチドをコードする配列もしくはＰＴＴＧ１ペプチドをコードするポリヌクレオチド配列をそれぞれ規定するか、または縮重配列を規定するか、またはこれらのいずれかに相補的な配列を規定する塩基配列を含むＰＴＴＧ−Ｃ関連ポリヌクレオチドを含む組成物を、細胞に送達することを含む。この方法において好ましくは細胞性取り込み増強物質と複合体を形成したポリヌクレオチドは、細胞に入って、ｂＦＧＦの産生および／または分泌を調節し、故に組織における血管形成を調節するのに充分な量と条件下で、送達される。
【００２２】
あるいは、血管形成を調節する方法の有用なペプチドベースの実施態様は、好ましくは細胞性取り込み増強物質と複合体を形成した、ＰＴＴＧ１ペプチド、またはＰＴＴＧ−Ｃカルボキシ末端ペプチド（ＰＴＴＧ−Ｃ）、またはこれらのいずれかの生物学的に機能性の断片を含む組成物を、細胞に入って、血管形成を（機能性ＰＴＴＧペプチドの送達を経て）増大する、または血管形成を（機能性ＰＴＴＧ−Ｃペプチドの送達を経て）阻害するのに充分な量と条件下で、哺乳動物細胞に送達することを含む。
【００２３】
本発明の方法はまた、血管形成を阻害することを通して、任意のＰＴＴＧ特異的ゲノム配列またはｍＲＮＡ配列（スプライス変種を含む）を標的として、機能性ＰＴＴＧタンパク質の発現を防止するように選択することができるアンチセンスオリゴヌクレオチドである、ＰＴＴＧ１特異的アンチセンスオリゴヌクレオチドを、興味ある組織の哺乳動物細胞に送達することにより行われる。あるいはこの方法は、細胞中の内因性ＰＴＴＧタンパク質分子上のＳＨ３結合部位への特異的結合を阻止することにより、ＳＨ３介在シグナル伝達を妨害することにより、行うことができる。あるいはこの方法は、ＳＳＣＡ、８１８２、サイクリックＡＭＰ反応性成分、エストロゲン反応性成分、インシュリン反応性成分、ＳＰ１およびＧＣボックス等のＰＴＴＧプロモーターにおいて同定されていた幾つかの制御領域のいずれかに指向するアンチセンスオリゴヌクレオチドを標的とすることによってＰＴＴＧ発現を阻害することによって行うことができる。
【００２４】
また、ＰＴＴＧタンパク質に、またはさらに詳しくはＰＴＴＧ−Ｃペプチドに特異的に免疫反応する抗体が提供される。本発明の抗体は、ＰＴＴＧ−Ｃペプチドに特異的に結合する。これらの抗ＰＴＴＧ−Ｃ特異的抗体は、ある試料（例えば、組織試料、生体液、ウェスタンブロットなど）に存在するＰＴＴＧタンパク質またはＰＴＴＧ−Ｃペプチドのレベルを測定するための測定法において有用である。抗体はまた、粗細胞抽出物などからＰＴＴＧタンパク質またはＰＴＴＧ−Ｃペプチドを精製するのに使用することができる。さらにこれらの抗体は、インビボでのＰＴＴＧタンパク質の生物作用に対抗またはこれを補足するのに治療的に有効と考えられる。すなわちこの抗体は、哺乳動物Ｔリンパ球の活性化を阻害するのに有用である。
また、本発明の方法の実施を促進する有用なキットが産生される。
【００２５】
（発明の詳細な説明）
本発明は、哺乳動物細胞（特に限定されないが、結腸、Ｔリンパ球、乳房組織、または卵巣組織由来の細胞を含む）のＰＴＴＧ１介在新生物細胞増殖および／または形質転換を阻害する方法に関する。細胞は、上皮細胞、血管細胞、白血球細胞および任意の他の型の哺乳動物細胞を含む。
【００２６】
本発明の方法の目的において、哺乳動物細胞は、任意の哺乳動物（例えば非ヒト霊長類、ラット、マウス、ウサギ、モルモット、ハムスター、ウシ、ブタ、ヒツジ、ウマ、イヌ、ネコ、厚皮動物など）に由来するヒトまたは非ヒト起起源の細胞である。哺乳動物細胞は、インビボ、すなわち哺乳動物被験体またはヒト被験体内にあっても、またはインビトロ、すなわち細胞は培養細胞でもよい。
【００２７】
本発明の目的において「新生物細胞増殖」には、哺乳動物被験体または細胞培養物の新生物（悪性または良性）、過形成、細胞学的異形成および／または前癌状態細胞の成長または増殖がある。過形成細胞成長または増殖には、例えば良性の前立腺過形成で一般的にあるような、組織中の正常配置で正常細胞数の異常な増殖または増加がある。細胞学的異形成および／または前癌状態細胞の成長または増殖には、核型が異常であるが組織内では非悪性の腫瘍細胞の、細胞数の増加がある。例としては、一部の前立腺過形成／異形成および頚部過形成／異形成がある。
【００２８】
新生物細胞成長および／または増殖、すなわち異常に構成された組織には、悪性および非悪性の新生物がある。悪性新生物には、任意の組織で起きる原発性、再発性、および／または転移癌（例えば、下垂体、視床下部、肺、腎臓、副腎、尿管、膀胱、尿道、乳房、前立腺、睾丸、頭蓋、脳、脊椎、胸郭、腹膜、卵巣、子宮、胃、肝臓、大腸、結腸、直腸、骨、リンパ系、皮膚、または被験体の任意の他の臓器もしくは組織で発生する、癌腫、肉腫、リンパ腫、中皮腫、黒色腫、神経膠腫、腎芽細胞腫、神経膠芽細胞腫、乏突起細胞腫、星状細胞腫、上衣細胞腫、原始神経外胚葉腫、異型髄膜腫、悪性髄膜腫、または神経芽腫）がある。
【００２９】
新生物細胞増殖および／または形質転換を阻害する本発明の方法の一部の遺伝子ベースの実施態様において、ＰＴＴＧカルボキシ末端関連ポリヌクレオチドを含む本発明の組成物が、細胞に送達される。「ＰＴＴＧカルボキシ末端関連」ポリヌクレオチドは、ＰＴＴＧ、特にＰＴＴＧ１の３’コード領域に特異的な配列を規定する、塩基（例えば、アデニン［Ａ］、チミン［Ｔ］、ウラシル［Ｕ］、グアニン［Ｇ］、および／またはシトシン［Ｃ］）の連続的配列を有するポリヌクレオチドである。３’末端は、未変性のＰＴＴＧをコードするｃＤＮＡコード配列のほぼ中央から、停止コドンの最後まで延びる。ＰＴＴＧカルボキシ末端関連ポリヌクレオチドは、後に詳述するように、哺乳動物ＰＴＴＧタンパク質（すなわち、ＰＴＴＧ−Ｃペプチド）のカルボキシ末端部分をコードする配列、またはそのＰＴＴＧ特異的断片、もしくは縮重コード配列、もしくはこれらのいずれかに相補的な配列でもよい。
【００３０】
ある好適な実施態様において本発明の組成物は、核酸構築体（例えば、プラスミドまたはウイルス発現ベクター）を含有し、これは、センスまたはアンチセンス配向でポリヌクレオチドを含有し、ここからＰＴＴＧ特異的ｍＲＮＡ転写体が細胞中で発現される。別の好適な実施態様において、核酸構築体は、哺乳動物ＰＴＴＧカルボキシ末端（ＰＴＴＧ−Ｃ）ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有し、これは、本明細書に記載の任意のＰＴＴＧ−Ｃペプチドまたはその機能性断片でもよい。特に「ＰＴＴＧ−Ｃ」は、本明細書において「ＰＴＴＧ１−Ｃ」と同義である。さらに別の好適な実施態様において核酸構築体は、本明細書に記載の哺乳動物ＰＴＴＧ２ペプチドをコードするポリヌクレオチドを、センス配向で含有する。
【００３１】
組成物はまた、適宜１つ以上のヘルパープラスミドまたはウイルスを含有してもよい。プラスミドまたはウイルス発現ベクターは、転写単位中にポリヌクレオチドに機能的に連結したプロモーター領域を含む核酸構築体である。
【００３２】
本明細書においてプロモーター領域は、機能的に連結しているＤＮＡの転写を制御するＤＮＡのセグメントを意味する。プロモーター領域は、ＲＮＡポリメラーゼ認識、結合および転写開始に充分な特異的配列を含む。さらにプロモーター領域は、ＲＮＡポリメラーゼの認識、結合および転写開始を調節する配列を含む。これらの配列は、ｃｉｓ作用性でも、ｔｒａｓ作用性因子に応答性でもよい。制御の性質に依存して、プロモーターは構成性または制御性でもよい。本発明での使用が企図されるプロモーターの例には、ＳＶ４０早期プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、マウス乳癌ウイルス（ＭＭＴＶ）ステロイド誘導性プロモーター、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）プロモーターなどがある。
【００３３】
本明細書において「発現」とは、ポリ核酸が転写されてｍＲＮＡになり、翻訳されてペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質になる過程を意味する。ポリ核酸がゲノムＤＮＡから得られるなら、発現は、適切な真核宿主細胞または生物が選択されるなら、ｍＲＮＡのスプライシングを含んでよい。
【００３４】
本明細書において「機能的に連結」という用語は、制御性およびエフェクターヌクレオチド配列（例えば、プロモーター、エンハンサー、転写および翻訳停止部位、および他のシグナル配列）との、ＤＮＡの機能的関係を意味する。例えばプロモーターへのＤＮＡの機能的連結は、ＤＮＡを特異的に認識し、結合し、かつ転写するＲＮＡポリメラーゼにより、プロモーターからそのようなＤＮＡの転写が開始されるような、ＤＮＡとプロモーターとの物理的および機能的関係を意味する。従って「機能的に連結」とは、転写単位内で、プロモーター配列が、コード配列の上流（すなわち、その５’）に位置し、コード配列は、プロモーターに対して３’であり、またはプロモーターに対して３’である遺伝子または読みとり枠の配列内にあり、かつ発現はそれにより調和して制御されることを意味する。プロモーターとコード配列の両方とも、５’から３’へ配向しており、従ってインビトロで、すべての必要な酵素、転写因子、補助因子、アクチベーター、および反応物質の存在下で、好ましい物理的条件（例えば、適当なｐＨと温度）で、転写が起きることができる。これは、任意の特定の細胞中で、条件が転写を促進することを意味しない。例えば、異なる組織からの異種細胞型では、組織特異的プロモーターからの転写は好ましくない。
【００３５】
「核酸」という用語は、リボ核酸（ＲＮＡ）またはデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）を包含し、ＤＮＡは相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）またはゲノムＤＮＡ（例えば、ＰＴＴＧタンパク質をコードする遺伝子）でもよい。「ポリヌクレオチド」は、リボシルまたはデオキシリボシル残基の間でホスホジエステル結合により形成される「骨格」を含有する核酸を包含する。ポリヌクレオチドはまた、核酸類似体、例えば当該分野で公知の代替結合を有するポリヌクレオチドを含む。例としては、ホスホロチオエート結合（例えば、ホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチド；Ｓ−オリゴヌクレオチド）、混合ホスホロチオエートとホスホジエステル結合（例えば、Ｓ−Ｏ−オリゴデオキシヌクレオチドとホスホジエステル／ホスホロチオエート２’−Ｏ−メチル−オリゴリボヌクレオチド；ゾウ（Ｚｈｏｕ， Ｗ．）ら、「ホスホロチオエート関連の副作用が低下した第２世代アンチセンス物質としての混合骨格オリゴヌクレオチド」、Ｂｉｏｏｒｇ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． Ｌｅｔｔ． ８（２２）：３２６９−７４ ［１９９８］）、メチルホスホネート−ホスホジエステル修飾（ＭＰ−Ｏ−オリゴヌクレオチド；ザオ（Ｚｈａｏ， Ｑ．）ら、「アンチセンスホスホジエステル、ホスホロチオエートおよび混合ホスホロチオエートとメチルホスホネートオリゴヌクレオチドの細胞結合と取り込みの比較」、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓ． Ｄｅｖ． ３（１）：５３−６６ ［１９９３］）、またはモルホリノオリゴヌクレオチド（例えば、シュマジュク（Ｓｃｈｍａｊｕｋ， Ｇ．）ら、「異なる骨格を有するアンチセンスオリゴヌクレオチド。スプライシング経路の改変と取り込みの効率」、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７４（３１）：２１７８３−８９ ［１９９９］）がある。
【００３６】
またポリヌクレオチドには、Ｎ−（２−アミノエチル）グリシン残基を含む偽型ペプチドまたはポリアミド骨格を有する核酸類似体、すなわちペプチド核酸（ＰＮＡ）が含まれる（例えば、ニールセン（Ｎｉｅｌｓｅｎ， Ｐ．Ｅ．）、「ペプチド核酸：新しい遺伝子治療薬への道」、Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． Ｔｏｘｉｃｏｌ． ８６（１）：３−７ ［２０００］；スーメッツ（Ｓｏｏｍｅｔｓ， Ｕ．）ら、「ペプチド核酸のアンチセンス的性質」、Ｆｒｏｎｔ． Ｂｉｏｓｃｉ． ４：Ｄ７８２−８６ ［１９９９］；タイラー（Ｔｙｌｅｒ， Ｂ．Ｍ．）ら、「ニューロテンシン受容体を標的とし腹腔内投与したペプチド核酸は脳血液関門を通過し、遺伝子発現を特異的に低下させる」、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９６（１２）：７０５３−５８ ［１９９９］）。
【００３７】
ポリヌクレオチドは、センスまたはアンチセンスポリヌクレオチドを含む。「ポリヌクレオチド」はまた、「オリゴヌクレオチド」を包含する。
【００３８】
本明細書においてＰＴＴＧ特異的ポリヌクレオチド配列に相補的なポリヌクレオチド配列は、ＰＴＴＧ特異的ヌクレオチド塩基配列に特異的に結合するものである。「特異的に結合する」という用語は、ポリヌクレオチド配列が、相補的塩基配列を認識し、相補的塩基対の間で水素結合を形成することにより、それと２本鎖セグメントを形成する能力を包含する。従って相補的配列は、例えばセンス配列またはコード配列に対してアンチセンス配列を含む。
【００３９】
ＰＴＴＧ−Ｃ関連ポリヌクレオチドのある実施態様またはＰＴＴＧ−２をコードするポリヌクレオチドの実施態様において、ｍＲＮＡ転写体が産生されて、これが翻訳されると翻訳生成物（例えば、ＰＴＴＧ１タンパク質、ＰＴＴＧカルボキシ末端ペプチド（ＰＴＴＧ−Ｃ）またはＰＴＴＧ２ペプチド）を産生することができるように、ポリヌクレオチドは転写単位内でセンス配向にある。
【００４０】
他の実施態様において、転写により、生理的条件下で、天然に存在するセンスＰＴＴＧ  ｍＲＮＡ分子に相補的でかつハイブリダイズ可能な転写体が得られ、そこからの翻訳を阻害または阻止するように、ＰＴＴＧ−Ｃ関連ポリヌクレオチドはアンチセンス配向にある。すなわち、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、標的ｍＲＮＡ配列に結合して、例えばＲＮａｓｅＩ消化によりｍＲＮＡの分解を誘導することにより、翻訳制御因子またはリボゾームの結合を妨害してｍＲＮＡ標的配列の翻訳を阻害することにより、または標的ｍＲＮＡを分解するかもしくは化学的に修飾する他の化学構造（例えば、リボザイム配列または反応性化学基）を含めることにより、標的ｍＲＮＡ配列を不活性化する。例えばｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡのＰＴＴＧカルボキシ末端関連ポリヌクレオチドセグメントを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＰＴＴＧ１の発現を阻害するのに有効である。
【００４１】
アンチセンスオリゴヌクレオチドを使用する遺伝子ベースの治療法は、当該分野で公知である（例えば、ライト（Ｒａｉｔ， Ａ．）ら、「ホスホロチオエート保護が最も少ないオリゴヌクレオチドと１−Ｏ−ヘキサデシルグリセロールとの３’末端結合体：放射線耐性細胞中の合成と抗ｒａｓ活性」、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ Ｃｈｅｍ．， １１（２）：１５３−６０ ［２０００］；ステントン（Ｓｔｅｎｔｏｎ， Ｇ．Ｒ．）ら、「エアゾル化したｓｙｋアンチセンスは、ｓｙｋ発現、マクロファージからのメディエーター放出、および肺感染を抑制する」、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， １６４（７）：３７９０−７ ［２０００］；スズキ（Ｓｕｚｕｋｉ， Ｊ．）ら、「アンチセンスＢｃｌ−ｘオリゴヌクレオチドは、マウス心臓同種移植片中のアポトーシスを誘導し心房新内膜形成を防止する」、Ｃａｒｄｉｏｖａｓ． Ｒｅｓ．， ４５（３）：７８３−７ ［２０００］；キム（Ｋｉｍ， Ｊ．Ｗ．）ら、「グリセロアルデヒド−３−ホスフェート脱水素酵素遺伝子のアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドは細胞増殖を阻害し、ヒト子宮頚癌細胞株でアポトーシスを誘導する」、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖ．， ９（６）：５０７−１３ ［１９９９］；ハン（Ｈａｎ， Ｄ．Ｃ．）ら、「アンチセンスＴＧＦ−ベータ１オリゴデオキシヌクレオチドによる治療は、糖尿病マウスの腎臓重量とマトリックスｍＲＮＡを低下させる」、Ａｍ． Ｊ． Ｐｈｙｓｉｏｌ． Ｒｅｎａｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．， ２７８（４）：Ｆ６２８−Ｆ６３４ ［２０００］；スカラ（Ｓｃａｌａ， Ｓ．）ら、「ヒト悪性腫瘍形成の治療候補としてのＨＭＧ１（Ｙ）タンパク質合成のアデノウイルス介在抑制」、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ．， ９７（８）：４２５６−４２６１ ［２０００］；アンテアガ（Ａｎｔｅａｇａ， Ｃ．Ｌ．）ら、「組織を標的とするアンチセンスｃ−ｆｏｓレトロウイルスベクターは、ヌードマウスで樹立された乳癌異種移植片を阻害する」、Ｃｅｎｃｅｒ Ｒｅｓ．， ５６（５）：１０９８−１１０３ ［１９９６］；ムラー（Ｍｕｌｌｅｒ， Ｍ．）ら、「卵巣癌細胞でのインスリン様増殖因子１受容体のアンチセンスホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチドダウンレギュレーション」、Ｉｎｔ． Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ， ７７（４）：５６７−７１ ［１９９８］；エンゲルハード（Ｅｎｇｅｌｈａｒｄ， Ｈ．Ｈ．）、「アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド技術：悪性脳腫瘍の治療のための使用可能性」、Ｃａｎｃｅｒ Ｃｏｎｔｒｏｌ， ５（２）：１６３−１７０ ［１９９８］；アルバレズ−サラス（Ａｌｖａｒｅｚ−Ｓａｌａｓ， Ｌ．Ｍ．）ら、「ヒトパピローマウイルス１６Ｅ６型遺伝子に対するアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドによる頚部腫瘍細胞の増殖阻害」、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖ．， ９（５）：４４１−５０ ［１９９９］；イム（Ｉｍ， Ｓ．Ａ．）ら、「神経膠腫の抗血管形成治療：アンチセンス血管内皮増殖因子の移動はインビボの腫瘍増殖を阻害する」、Ｃｅｎｃｅｒ Ｒｅｓ．， ５９（４）：８９５−９００ ［１９９９］；マエシマ（Ｍａｅｓｈｉｍａ， Ｙ．）ら、「増殖している細胞��抗原に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドとＫｉ−６７はメサンギウム細胞増殖を阻害する」、Ｊ． Ａｍ． Ｓｏｃ． Ｎｅｐｈｒｏｌ．， ７（１０）；２２１９−２９ ［１９９６］；チェン（Ｃｈｅｎ， Ｄ．Ｓ．）ら、「アンチセンスサイクリンＧ１構築体のレトロウイルスベクター介在移動はヌードマウスにおいて骨肉腫増殖を阻害する」、Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．， ８（１４）：１６６７−７４ ［１９９７］；ヒラオ（Ｈｉｒａｏ， Ｔ．）ら、「アデノウイルスベクターにより送達されるアンチセンス表皮増殖因子受容体はヒト胃癌の腫瘍増殖を阻止する」、Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． ６（５）：４２３−７ ［１９９９］；ワング（Ｗａｎｇ， Ｘ．Ｙ．）ら、「タンパク質キナーゼＣａｌｐｈａのアンチセンス阻害は、ヒト肺癌細胞中の形質転換表現型を逆転させる」、Ｅｘｐ． Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．， ２５０（１）：２５３−６３ ［１９９９］；サッコ（Ｓａｃｃｏ， Ｍ．Ｇ．）ら、「ＭＭＴＶ−ｎｅｕトランスジェニックマウスからの乳腺腫のインビトロおよびインビボのアンチセンス介在増殖阻害」、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．， ５（３）：３８８−９３ ［１９９８］；レオネッチ（Ｌｅｏｎｅｔｔｉ， Ｃ．）ら、「インビトロとマウスでのヒト黒色腫細胞上のｃ−ｍｙｃアンチセンスホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチドの抗腫瘍作用」、Ｊ． Ｎａｔｌ． Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．， ８８（７）：４１９−２９ ［１９９６］；レアード（Ｌａｉｒｄ， Ａ．Ｄ．）ら、「トランスフォーミング増殖因子アルファアンチセンス遺伝子でトランスフェクションされた肝上皮細胞中の腫瘍増殖の阻害」、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５４（１５）：４２２４−３２（１９９４年８月１日）；ヤザキ（Ｙａｚａｋｉ， Ｔ．）ら、「アンチセンスタンパク質キナーゼＣ−アルファホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチドの全身性投与による神経膠芽細胞腫Ｕ−８７の治療」、Ｍｏｌ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．， ５０（２）：２３６−４２ ［１９９６］；ホー（Ｈｏ， Ｐ．Ｔ．）ら、「悪性疾患の治療薬としてのアンチセンスオリゴヌクレオチド」、Ｓｅｍｉｎ． Ｏｎｃｏｌ．， ２４（２）：１８７−２０２ ［１９９７］；ムラー（Ｍｕｌｌｅｒ， Ｍ．）ら、「卵巣癌細胞でのインスリン様増殖因子１受容体のアンチセンスホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチドダウンレギュレーション」、Ｉｎｔ． Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ， ７７（４）：５６７−７１ ［１９９８］；エレツ（Ｅｌｅｚ， Ｒ．）ら、「ポロ様キナーゼＩ、アンチセンス腫瘍療法の新しい標的」、Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ．， ２６９（２）：３５２−６ ［２０００］；モニア（Ｍｏｎｉａ， Ｂ．Ｐ．）ら、「Ｃ−ｒａｆキナーゼを標的とするホスホロチオエートアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドの抗腫瘍活性」、Ｎａｔ． Ｍｅｄ．， ２（６）：６６８−７５ ［１９９６］）。
【００４２】
本発明の他の実施態様において、本発明の組成物は、発現ベクターに含有されていないＰＴＴＧカルボキシ末端関連ポリヌクレオチド（例えば、合成アンチセンスオリゴヌクレオチド、例えばホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチド）を含む。ｍＲＮＡを認識しこれに選択的に結合するように設計された合成アンチセンスオリゴヌクレオチドまたは他のアンチセンス化学構造体は、ＰＴＴＧコード鎖、例えば配列番号１、３、１０、１５、１８または１９（後述の表１〜６）に示すコード配列、の部分に相補的になるように構築される。本発明の方法において、ＰＴＴＧの３’コード領域の少なくとも一部の翻訳発現を防ぐことにより、アンチセンスＰＴＴＧカルボキシ末端関連ポリヌクレオチドは、新生物細胞増殖および／または形質転換の仲介に機能するＰＴＴＧタンパク質の発現を防ぐのに有用である。
【００４３】
新生物細胞増殖および／または形質転換を阻害する方法の好適な実施態様において、組成物はまた、本明細書にさらに記載する取り込み増強物質を含む。ＰＴＴＧ特異的ポリヌクレオチドと複合体を形成した取り込み増強物質を含有する本発明の組成物は、細胞膜を通過して、物理的および化学的性質により細胞の細胞質に入ることができるように設計される。さらに本組成物は、特異的細胞取り込み機構（これは、選択細胞集団内でのみ下垂体腫瘍形質転換遺伝子（ＰＴＴＧ）特異的ポリヌクレオチドを取り込む）により認識されるように標的化することにより、いくつかの選択された細胞集団にのみ送達されるように設計することができる。例えば組成物は、ある細胞型にのみ見いだされる受容体に結合する受容体アゴニストを含むことができる。
【００４４】
本発明の組成物はまた、１つ以上の薬剤学的に許容される担体を含有してもよい。本明細書において「許容される担体」は、任意の標準的薬剤担体を包含する。担体は、有機もしくは無機担体もしくは賦形剤、例えば水およびエマルジョン（例えば、水／油もしくは油／水エマルジョン）および種々の型の湿潤剤でもよい。活性成分は、輸液、錠剤、ペレット剤、カプセル剤、液剤、エマルジョン剤、懸濁剤、および使用に適した任意の他の型のための、非毒性の薬剤学的に許容される担体で調製される組成物中に含まれる。そのような担体はまた、グルコース、乳糖、アカシアゴム、ゼラチン、マンニトール、デンプンペースト、マグネシウム３ケイ酸塩、尿素、中程度の鎖長のトリグリセリド、デキストラン、通常の食塩水、リン酸緩衝化生理食塩水および製剤の製造での使用に適した他の担体を、固体、半固体、または液体型で含む。さらに、補助剤、安定剤、増粘剤、および着色剤および香料が、適宜使用できる。
【００４５】
ＰＴＴＧ特異的ポリヌクレオチド（ＰＴＴＧカルボキシ末端関連ポリヌクレオチドまたはＰＴＴＧ２をコードするポリヌクレオチドを含む）は、既知の哺乳動物ＰＴＴＧ特異的ヌクレオチド配列（例えば、ＰＴＴＧ１、ＰＴＴＧ２、ＰＴＴＧ３、またはＰＴＴＧ４配列）との、塩基配列類似性または相同性により決定される。塩基配列相同性は、例えばナショナルセンター・フォー・バイオテクノロジーインフォメーション（ＮＣＢＩ：ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／）のジーンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）データベースのようなデータベースを、パワーブラスト（ＰｏｗｅｒＢＬＡＳＴ）、キューブラスト（ＱＢＬＡＳＴ）、プサイブラスト（ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ）、ファイブラスト（ＰＨＩ−ＢＬＡＳＴ）、ギャップトまたはアンギャップトブラストのようなコンピューターアルゴリズム、またはベイヤーカレッジオブメディシン（Ｂａｙｏｒ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）サーバー（ｗｗｗ．ｈｇｓｃ．ｂｃｍ．ｔｍｃ．ｅｄｕ／ｓｅｑ＿ｄａｔａ）を介する「アライン（Ａｌｉｇｎ）」プログラムを使用して、塩基配列類似性検索を行うことにより決定される（例えば、アルトチュル（Ａｌｔｃｈｕｌ， Ｓ．Ｆ．）ら、「ギャップトブラスト（Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴ）とプサイブラスト（ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ）；新しい世代のタンパク質データベース検索プログラム」、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２５（１７）：３３８９−４０２ ［１９９７］；ザング（Ｚｈａｎｇ， Ｊ．）とマデン（Ｍａｄｄｅｎ， Ｔ．Ｌ．）、「パワーブラスト（ＰｏｗｅｒＢＬＡＳＴ）；対話型および自動配列解析および自動化のための新しいネットワークブラスト（ＢＬＡＳＴ）アプリケーション」、Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ． ７（６）：６４９−５６ ［１９９７］；マデン（Ｍａｄｄｅｎ， Ｔ．Ｌ．）ら、「ネットワークブラスト（ＢＬＡＳＴ）サーバーの応用」、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． ２６６：１３１−４１ ［１９９６］；アルトチュル（Ａｌｔｓｃｈｕｌ， Ｓ．Ｆ．）ら、「基礎的ローカルアライメント検索ツール」、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２１５（３）：４０３−１０ ［１９９０］）。
【００４６】
好ましくは、ＰＴＴＧ特異的ポリヌクレオチド配列は、少なくとも５〜３０の連続的ヌクレオチドの長さであり、さらに好ましくは少なくとも６〜１５の連続的ヌクレオチドの長さであり、最も好ましくは少なくとも７〜１０の連続的ヌクレオチドの長さである。好ましくは本発明のＰＴＴＧカルボキシ末端関連ポリヌクレオチドは、少なくとも約４５の連続的ヌクレオチドの長さである。
【００４７】
ＰＴＴＧ特異的コード配列の好適な例は、ヒトＰＴＴＧ１（ｈＰＴＴＧ１またはＰＴＴＧ１）の配列を含む。ＰＴＴＧ１ペプチドは、ヒトＰＴＴＧ１遺伝子配列、配列番号３のヌクレオチド９５〜７００位の読みとり枠によりコードされる（下の表１）。
【００４８】
表１．ｈＰＴＴＧ１遺伝子配列
2004526404.tif 000002
【００４９】
ＰＴＴＧ１の３’コード領域は、以下の１６８ヌクレオチド配列を含み、これは、以下の表２に示す配列番号３のヌクレオチド５３３〜７００位に対応する。
【００５０】
表２．ｈＰＴＴＧ１の３’コード領域の部分
2004526404.tif 000003
【００５１】
ＰＴＴＧ特異的コード配列の別の有用な例は、配列番号１のヌクレオチド２９３〜８８９位を含むラットＰＴＴＧペプチドをコードする配列である（下の表３）。
【００５２】
表３．ラットＰＴＴＧ１配列
2004526404.tif 000004
【００５３】
ラットＰＴＴＧの３’コード領域は以下の１６８ヌクレオチド配列を含有し、これは、表４に示す配列番号１のヌクレオチド７２２〜８８９位に対応する。
【００５４】
表４．ラットＰＴＴＧの３’コード領域の部分
2004526404.tif 000005
【００５５】
ＰＴＴＧ特異的コード配列の別の有用な例は、配列番号１５のヌクレオチド３０４〜８９１位を含む、マウスＰＴＴＧ１ペプチドをコードする配列である（下の表５）。
【００５６】
表５．マウスＰＴＴＧ１配列
2004526404.tif 000006
【００５７】
マウスＰＴＴＧ１の３’コード領域は、以下の１６８ヌクレオチド配列を含有し、これは、表６に示す配列番号１５のヌクレオチド７２４〜８９１位に対応する。
【００５８】
表６．マウスＰＴＴＧ１の３’コード領域の部分
2004526404.tif 000007
【００５９】
配列番号１０、１８または１９のヌクレオチド配列、縮重コード配列、またはこれらのいずれかに相補的な配列を含む本発明のＰＴＴＧ−Ｃ関連ポリヌクレオチドは、有用なＰＴＴＧカルボキシ末端関連ポリヌクレオチドを単に例示するためである。他の有用なＰＴＴＧカルボキシ末端関連ポリヌクレオチドは、少なくとも４５ヌクレオチドの長さの、配列番号１０、１８または１９のいずれかの機能性断片、縮重コード配列、またはこれらのいずれかに相補的な配列であり、その細胞内の存在は、内因性ＰＴＴＧ発現および／またはＰＴＴＧ機能（この機能は日常的なスクリーニングにより測定することができる）をダウンレギュレートするように機能することができる。
【００６０】
ゲノムＤＮＡ（染色体ウォーキングにより得られる）から決定されるヒトＰＴＴＧ２遺伝子配列（配列番号６２；ジーンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）受け入れ番号ＡＦ１１６５３８．２）を、以下の表６ａに示す。すなわち、ＰＴＴＧ特異的コード配列の別の例は、ヒトＰＴＴＧ２タンパク質のコード配列であり、これは、（配列番号６２）のヌクレオチド３８３〜３８５位の転写開始部位で開始し、（配列番号６２）のヌクレオチド９５６〜９５８位の停止コドンまで延長している。このｈＰＴＴＧ２コード配列を、表６ａで下線を引き、本明細書において配列番号６３として規定する。
【００６１】
表６ａ．ヒトＰＴＴＧ２遺伝子配列
2004526404.tif 000008
【００６２】
本明細書において「縮重」という用語は、参照核酸（例えば、配列番号１、３、１０、１５、１８、１９、６２または６３）とは、少なくとも１つのヌクレオチドが異なるが、参照核酸と同じアミノ酸をコードするコドンを意味する。例えばトリプレット「ＵＣＵ」、「ＵＣＣ」、「ＵＣＡ」および「ＵＣＧ」により特定されるコドンは、同じアミノ酸セリンをコードするため、これらは互いに縮重である。すなわち、例えば配列番号６４と同じアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドは、ｈＰＴＴＧ２コード配列配列番号６３について縮重配列を有すると言われる。
【００６３】
他の有用なＰＴＴＧ−Ｃ関連ポリヌクレオチドには、配列番号１、配列番号３、配列番号１０、配列番号１５、配列番号１８、または配列番号１９に示す配列とは配列が異なるが、細胞中で発現された時同じ表現型を与える核酸または他のポリヌクレオチドを含む。表現型が類似の核酸はまた、「機能的に同等の核酸」と呼ばれる。本明細書において「機能的に同等の核酸」という用語は、わずかな変化であり結果として配列に変化の無いことを特徴とする核酸であって、本明細書で開示し詳述したヌクレオチド配列のいずれかと比較して、実質的に同様に機能して、新生物細胞増殖および／または形質転換に関して機能的ＰＴＴＧタンパク質、または新生物細胞増殖および／または形質転換の阻害に関して機能的なＰＴＴＧ−Ｃペプチド、および／または免疫原性に関して機能的なポリペプチド生成物を産生する核酸を包含する。そのようなポリヌクレオチドは、参照配列と実質的に同じコード配列を有することができ、配列番号２、配列番号４、配列番号９、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１７に記載のアミノ酸配列、または、配列番号２、配列番号４、配列番号９、配列番号１４、配列番号１６もしくは配列番号１７を含む、より大きなアミノ酸配列をコードする。
【００６４】
他の有用なＰＴＴＧ２をコードするポリヌクレオチドは、（Ａ）基本的に（配列番号６４）のアミノ酸残基１〜１９１、または（配列番号６４）の少なくともアミノ酸残基１〜１８０を含むその機能性断片からなるペプチド；または（Ｂ）（Ａ）のいずれかと少なくとも約９５％の配列相同性を有し、かつ細胞中で発現された時、新生物細胞増殖および／または形質転換の阻害に関して、同じ表現型を与える哺乳動物ＰＴＴＧ２ペプチドを、コードする核酸または他のポリヌクレオチドを含む。これは基本的に、配列番号６４の連続的アミノ酸残基１〜１８０、配列番号６４の１〜１８１、配列番号６４の１〜１８２、配列番号６４の１〜１８３、配列番号６４の１〜１８４、配列番号６４の１〜１８５、配列番号６４の１〜１８６、配列番号６４の１〜１８７、配列番号６４の１〜１８８、配列番号６４の１〜１８９、および配列番号６４の１〜１９０からなるペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。
【００６５】
本明細書において「実質的に同じヌクレオチド配列」という用語は、参照ポリヌクレオチドと充分な同一性を有し、その結果、穏和な厳密性ハイブリダイゼーション条件下で参照ヌクレオチドにハイブリダイズするＤＮＡを意味する。他の実施態様において、参照ヌクレオチド配列として「実質的に同じヌクレオチド配列」を有するＤＮＡは、参照ヌクレオチド配列に関して、少なくとも約６０％の同一性を有する。参照ヌクレオチド配列と少なくとも７０％、さらに好ましくは少なくとも９０％、さらに好ましくは少なくとも約９５％の同一性を有するＤＮＡが、好ましい。
【００６６】
好適な実施態様において、機能的に同等の核酸は、本明細書に記載のポリペプチドまたはペプチド断片と同じであるか、保存的アミノ酸置換を有するポリペプチドまたはペプチド断片をコードするか、または配列番号２、配列番号４、配列番号９、または配列番号１４、配列番号１６、配列番号１７、または配列番号６４を含むより大きいポリペプチド、または本発明の方法の実施態様に従って、新生物細胞増殖および／または形質転換の阻害に関して、生物学的に機能的な断片である前記のいずれかの断片をコードする。例えば、保存的変化には、非極性残基の別の非極性残基による置換、荷電残基の同様の荷電残基による置換を含む。これらの変化には、タンパク質の３次構造を実質的に変化させることのない、当業者に公知のものがある。
【００６７】
有用なポリペプチドは当該分野で公知の種々の方法により産生され、例えばＰＣＲや他の類似の増幅法により、配列番号１、３、１０、１５、１８、１９、６２、６３の種々の領域に特異的なオリゴヌクレオチドプライマー、または機能的に同等のポリヌクレオチド配列を使用して行われる。種々の長さのポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドを産生するための他の合成法もまた公知である。
【００６８】
本方法の実施態様において、好適なポリヌクレオチドは、中程度にストリンジェントな、好ましくは高ストリンジェントな条件で、配列番号１、３、１０、１５、１８、１９、６２、６３、６５、６６または６８に記載の核酸配列の、実質的にすべての配列、または実質的な部分（すなわち、一般には少なくとも１５〜３０ヌクレオチド）、または相補的配列とハイブリダイズする。
【００６９】
「ストリンジェントなハイブリダイゼーション」という用語は本明細書において、ポリ核酸または他のポリヌクレオチドのアニーリングしたハイブリッド、または少なくとも部分的にアニーリングしたハイブリッドが安定である条件を意味する。当業者に公知なように、ハイブリッドの安定性はハイブリッドの融点（Ｔｍ）に反映される。一般的にハイブリッドの安定性は、ナトリウム濃度と温度の関数である。一般的にハイブリダイゼーション反応は、比較的低いストリンジェントな条件下で行われ、次に異なる（しかし高い）ストリンジェンシーで洗浄される。ハイブリダイゼーションストリンジェンシーへの参照は、そのような洗浄条件に関する。
【００７０】
本明細書において「中程度にストリンジェントなハイブリダイゼーション」という用語は、標的ＤＮＡが、標的ＤＮＡと約６０％の配列同一性もしくは相同性、好ましくは約７５％の同一性、さらに好ましくは約８５％の同一性を有する相補的核酸に結合することを可能にする条件を意味し、約９０％より大きいことが特に好ましい。好ましくは中程度にストリンジェントな条件は、５０％ホルムアミド、５×デンハルツ（Ｄｅｎｈａｒｔ’ｓ）溶液、５×ＳＳＰＥ、０．２％ＳＤＳ、４２℃でハイブリダイゼーションし、次に０．２×ＳＳＰＥ、０．２％ＳＤＳで６５℃で洗浄することと同等である。
【００７１】
本明細書において「高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション」という用語は、０．０１８Ｍ  ＮａＣｌ、６５℃で安定なハイブリッドを形成する核酸配列のみのハイブリダイゼーションを可能にする条件を意味する（０．０１８Ｍ  ＮａＣｌ、６５℃でハイブリッドが安定でないなら、本明細書において企図されるように、高ストリンジェンシー条件下で安定ではないであろう）。高ストリンジェンシー条件は、例えば、５０％ホルムアミド、５×デンハルツ溶液、５×ＳＳＰＥ、０．２％ＳＤＳ、４２℃でハイブリダイゼーションし、次に０．１×ＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳで６５℃で洗浄することにより与えられる。
【００７２】
「低ストリンジェンシーハイブリダイゼーション」という用語は、１０％ホルムアミド、５×デンハルツ溶液、６×ＳＳＰＥ、０．２％ＳＤＳ、４２℃でハイブリダイゼーションし、次に１×ＳＳＰＥ、０．２％ＳＤＳ、５０℃で洗浄することと同等の条件である。デンハルツ溶液とＳＳＰＥ（例えば、モレキュラークローニング、実験室マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）、コールドスプリングハーバーラボラトリープレス（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）を参照）は、他の適当なハイブリダイゼーション緩衝液のように、当業者に公知である。
【００７３】
ＰＴＴＧカルボキシ末端関連ポリヌクレオチドまたはＰＴＴＧをコードするポリヌクレオチドは、哺乳動物ＰＴＴＧ配列間の、比較的高い配列相同性の程度のために、細胞に関して同源でもよいが、必ずしも必要ではない。細胞に関して異種哺乳動物起源のＰＴＴＧカルボキシ末端関連ポリヌクレオチドまたはＰＴＴＧをコードするポリヌクレオチドもまた有用である。すなわち、例えば、本発明の方法において、ヒトＰＴＴＧ−Ｃをコードする配列またはＰＴＴＧ２をコードする配列は、非ヒト哺乳動物起源の細胞（例えば、マウスまたはラット細胞）中の内因性ＰＴＴＧ発現および／またはＰＴＴＧ機能をダウンレギュレートするように機能し、その逆も真である。
【００７４】
哺乳動物細胞の新生物細胞増殖および／または形質転換の阻害法の好適な実施態様において、ポリヌクレオチドは、細胞に入るのに充分な量と条件下で、細胞取り込み増強物質と複合体を形成する。本明細書において「取り込み増強」物質は、外因性ポリヌクレオチド、例えばＤＮＡセグメント、核酸類似体、もしくは核酸構築体を、真核細胞、好ましくは哺乳動物細胞およびさらに好ましくはヒト細胞への取り込みを増強するための組成物を意味する。この増強は、細胞をトランスフェクションまたは形質導入するプロセスにおいて、取り込み増強物質の非存在下でのポリヌクレオチド取り込みに対して測定される。取り込み増強物質との複合体形成は、一般に細胞内へのポリヌクレオチドの取り込みを増強し、および／または細胞質を通過する間にヌクレアーゼによるその分解を低下させる。
【００７５】
本方法の好適な実施態様において、ＰＴＴＧカルボキシ末端関連ポリヌクレオチドまたはＰＴＴＧ−ＣペプチドまたはＰＴＴＧ２をコードするポリヌクレオチドまたはＰＴＴＧ２ペプチドは、取り込み増強物質と複合体を形成する。「複合体を形成する」とは、ポリヌクレオチドまたはペプチドが、細胞取り込み増強物質および／またはその残基を含む他の成分の間の化学結合に由来する、複合体、混合物または付加物の成分もしくはメンバーであることを意味する。化学結合は、複合体の成分をその任意の部分または残基で連結する、共有結合、イオン結合、水素結合、疎水結合、またはこれらの結合型の任意の組合せの性質を有し、成分はいろいろな種類の１つ以上の残基を有することができるものを意味する。複合体のすべての成分が、他のすべての成分に結合する必要は無いが、各成分は、複合体の少なくとも１つの他の成分との少なくとも１つの化学結合を有する。成分には、特に限定されないが、極性、非極性、または界面活性の分子化合物；イオン、例えば特に限定されないが、Ｎａ＋、Ｋ＋、Ｌｉ＋、Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋、Ｆｅ２＋、Ｆｅ３＋、Ｚｎ２＋、Ｃｕ＋、Ｃｕ２＋、および／またはＮＨ４＋のような陽イオン、または特に限定されないがＣｌ−、Ｂｒ−、Ｆｌ−、ＮＯ３−、ＮＯ２−、ＨＣＯ３−、ＣＯ３２−、ＳＯ４２−、および／またはＰＯ４３−のような陰イオン；生物分子、例えばタンパク質、オリゴペプチド、ポリペプチド、オリゴヌクレオチド、核酸、核酸構築体、プラスミド、ウイルス粒子；および／または有機ポリおよびコポリマーがある。
【００７６】
ＰＴＴＧカルボキシ末端関連ポリヌクレオチドまたはＰＴＴＧ−ＣペプチドまたはＰＴＴＧ２をコードするポリヌクレオチドまたはＰＴＴＧ２ペプチドは、細胞性取り込み増強物質に直接結合できるが、必ずしも必要ではない。例えば、ポリヌクレオチドは、発現ベクターまたは他の核酸構築体中に含有され、このベクターまたは他の構築体は、本発明の目的のために、ＰＴＴＧカルボキシ末端関連ポリヌクレオチドまたはＰＴＴＧをコードするポリヌクレオチドに直接結合していないベクターまたは構築体のある残基または一部で、取り込み増強物質に結合しており、ＰＴＴＧカルボキシ末端関連ポリヌクレオチドまたはＰＴＴＧをコードするポリヌクレオチドは、まだ取り込み増強物質と「複合体を形成」しているが、化学結合により取り込み増強物質に直接結合していない。ポリヌクレオチドおよび取り込み増強物質が両方とも、同じ複合体の成分またはメンバーである限り、間接化学結合で充分である。ＰＴＴＧ−ＣまたはＰＴＴＧ２ペプチドを用いる例は、第１のＰＴＴＧ−ＣペプチドセグメントまたはＰＴＴＧ２ペプチドセグメントを、第２の細胞取り込み増強ペプチドセグメントおよび／または輸送能力のあるペプチドセグメントに連結する第３のペプチド配列である。間接的に結合した第１および第２のペプチドセグメントは、本発明の目的のために「複合体を形成」している。
【００７７】
通常ポリヌクレオチドと複合体を形成した取り込み増強物質の例は、陽イオン性脂質またはポリ陽イオン性脂質があり、これは、陽イオン性脂質またはポリ陽イオン性脂質−ＤＮＡまたはリポソーム−ＤＮＡ複合体（「リポプレックス（ｌｉｐｏｐｌｅｘｅｓ」）を形成することができる。そのようなリポプレックス（ｌｉｐｏｐｌｅｘｅｓ」は、場合により、血清アルブミンで被覆されるか、またはトランスフェクション効率をさらに増強するために、大きなコロイド的に不安定な複合体として調製される；カルシウム２陽イオン（Ｃａ２＋）の存在はまた、脂質ベースのトランスフェクション効率を増強する。（例えば、シモーズ（Ｓｉｍｏｅｓ， Ｓ．）ら、「ヒト血清アルブミンはリポプレックス（ｌｉｐｏｐｌｅｘｅｓ」によりＤＮＡトランスフェクションを増強し、血清により阻害に対する耐性を与える」、Ｂｉｏｃｈｉｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ １４６３（２）：４５９−６９ ［２０００］；ツレク（Ｔｕｒｅｋ， Ｊ．）ら、「リポプレックス（ｌｉｐｏｐｌｅｘｅｓ」のサイズを増加させる調製物は、トランスフェクションの血清結合阻害を防止する」、Ｊ． Ｇｅｎｅ Ｍｅｄ． ２（１）：３２−４０ ［２０００］；ズダム（Ｚｕｄａｍ， Ｎ．Ｊ．）ら、「陽イオン性リポソームのラメラ性とリポプレックスの調製モードはトランスフェクション効率に影響を与える」、Ｂｉｏｃｈｉｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ １４１９（２）：２０７−２０ ［１９９９］；ラム（Ｌａｍ， Ａ．Ｍ．）とクリス（Ｃｕｌｌｉｓ， Ｐ．Ｒ．）、「カルシウムは、プラスミドＤＮＡ−陽イオン性リポソーム複合体のトランスフェクション能を増強する」、Ｂｉｏｃｈｉｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ １４６３（２）：２７９−２９０ ［２０００］）。
【００７８】
本発明の組成物は、陽イオン性リポソーム、トランスフェリンまたはフシゲニック（ｆｕｓｉｇｅｎｉｃ）ペプチドまたはポリ（エチルイミン）の陰性荷電した３成分複合体を含むことができる（例えば、シモーズ（Ｓｉｍｏｅｓ， Ｓ．）ら、「ＤＮＡ、陽イオン性リポソーム、およびトランスフェリンまたはフシゲニック（ｆｕｓｉｇｅｎｉｃ）ペプチドの陰性荷電した３成分複合体による遺伝子送達」、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． ５（７）：９５５−６４ ［１９９８］）。本発明のポリヌクレオチドと複合体を形成したリポソーム性取り込み増強物質はまた、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ＦｕＧＥＮＥ６などの中に封入することができる」、（例えば、サラボラック（Ｓａｒａｖｏｌａｃ， Ｅ．Ｇ．）ら、「最適トランスフェクション活性のための異なる陽イオン性リポソーム濃度からなる安定化プラスミド−脂質粒子中のプラスミドＤＮＡの封入」、Ｊ． Ｄｒｕｇ Ｔａｒｇｅｔ ７（６）：４２３−３７ ［２０００］；ユー（Ｙｕ， Ｒ．Ｚ．）ら、「ステルス（ｓｔｅａｌｔｈ）リポソームに封入されたＨａ−ｒａｓのアンチセンスオリゴヌクレオチドインヒビターのサルでの薬物動態と組織分布」、Ｐｈａｒｍ． Ｒｅｓ． １６（８）：１３０９−１５ ［１９９９］；タオ（Ｔａｏ， Ｍ．）ら、「ヒーラ細胞中のトランスフェクション試薬、ＦｕＧＥＮＥ６−アンチセンスホスホロチオエートオリゴヌクレオチドによるヒトテロメラーゼ活性の特異的阻害」、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ ４５４（３）：３１２−６ ［１９９９］）。
【００７９】
ある実施態様において、アンチセンスオリゴヌクレオチドの取り込みはまた、生体適合性ポリマー性またはコポリマー性ナノ粒子（例えば、アルギン酸塩、アミノアルキルメタクリレート、メチルメタクリレート、ポリメチルメタクリレート、メチルアミノエチル−メタクリレート、ポリアルキルシアノアクリレート（例えば、ポリヘキシルシアノアクリレート））との複合体形成により増強される。（例えば、アイニー（Ａｙｎｉｅ， Ｉ．）ら、「アンチセンスオリゴヌクレオチドの新しい送達系の候補としてのスポンジ様アルギン酸塩ナノ粒子」、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖ． ９（３）：３０１−１２ ［１９９９］；チマー（Ｚｉｍｍｅｒ， Ａ．）、「担体としてポリヘキシルシアノアクロレートナノ粒子を用いるアンチセンスオリゴヌクレオチド送達」、Ｍｅｔｈｏｄｓ １８（３）：２８６−９５， ３２２ ［１９９９］；バートン（Ｂｅｒｔｏｎ， Ｍ．）ら、「疎水性アンチセンスオリゴヌクレオチド複合体を使用する高度に充填された担体」、Ｅｕｒ． Ｊ． Ｐｈａｒｍ． Ｓｃｉ． ９（２）：１６３−７０ ［１９９９］；ゾーベル（Ｚｏｂｅｌ， Ｈ．Ｐ．）ら、「コロイド性薬剤運搬システムとしてのアミノアルキルメタクリレートナノ粒子の評価。第ＩＩ部：アンチセンスオリゴヌクレオチドを充填したコポリマーナノ粒子の性状解析」、Ｅｕｒ． Ｊ． Ｐｈａｒｍ． Ｂｉｏｐｈａｒｍ． ４８（１）：１−１２ ［１９９９］；ファッタル（Ｆａｔｔａｌ， Ｅ．）ら、「オリゴヌクレオチドの送達のための生分解性ポリアルキルシアノアクリレートナノ粒子」、Ｊ． Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ ５３（１−３）：１３７−４３ ［１９９８］）。
【００８０】
ポリヌクレオチドと複合体を形成するための他の有用な取り込み増強物質には、星形のポリアミドアミン（ＰＡＭＡＭ）デンドリマーがある。（例えば、ヨー（Ｙｏｏ， Ｈ．）ら、「アンチセンスオリゴヌクレオチドの送達物質としてのＰＡＭＡＭデンドリマー」、Ｐｈａｒｍ． Ｒｅｓ． １６（１２）：１７９９−８０４［１９９９］；ビエリンスカ（Ｂｉｅｌｉｎｓｋａ， Ａ．Ｕ．）ら、「インビトロとインビボでの固相トランスフェクションのための膜ベースのデンドリマー／ＤＮＡ複合体の応用」、Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ ２１（９）：８７７−８７ ［２０００］；ビエリンスカ（Ｂｉｅｌｉｎｓｋａ， Ａ．Ｕ．）ら、「ポリアミドアミンデンドリマーと複合体を形成するＤＮＡ：トランスフェクションの意味」、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ． Ｃｈｅｍ． １０（５）：８４３−５０ ［１９９９］；ビエリンスカ（Ｂｉｅｌｉｎｓｋａ， Ａ．Ｕ．）ら、「星形ＰＡＭＡＭＡデンドリマーを使用してトランスフェクションしたアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはアンチセンス発現プラスミドを使用するインビトロ遺伝子発現の制御」、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２４（１１）：２１７６−８２ ［１９９６］；クコウスカ−ラタッロ（Ｋｕｂｏｗｓｋａ−Ｌａｔａｌｌｏ， Ｊ．Ｆ．）ら、「星形ポリアミドアミンデンドリマーを使用する哺乳動物細胞への遺伝物質の効率的な移動」、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９３（１０）：４８９７−９０２ ［１９９６］；デロング（Ｄｅｌｏｎｇ， Ｒ．）ら、「ポリアミドアミン星形デンドリマーとのオリゴヌクレオチドの複合体の性状解析と細胞内送達への作用」、Ｊ． Ｐｈａｒｍ． Ｓｃｉ． ８６（８）：７６２−６４ ［１９９７］）。
【００８１】
他の好適な取り込み増強物質には、リポフェクチン、リポフェクタミン、ＤＩＭＲＩＥ  Ｃ、スーパーフェクト、エフェクチン（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ））、ユニフェクチン、マキシフェクチン、ＤＯＴＭＡ、ＤＯＧＳ（トランスフェクタム；ジオクタデシルアミドグリシルスペルミン）、ＤＯＰＥ（１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン）、ＤＯＴＡＰ（１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウムプロパン）、ＤＤＡＢ（ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド）、ＤＨＤＥＡＢ（Ｎ，Ｎ−ジ−ヘキサデシル−Ｎ，Ｎ−ジヒドロキシエチルアンモニウムブロミド）、ＨＤＥＡＢ（Ｎ−ｎ−ヘキサデシル−Ｎ，Ｎ−ジヒドロキシエチルアンモニウムブロミド）、ポリブレン、またはポリ（エチレンイミン）（ＰＥＩ）、および／またはペプチド、例えばポリリジン、プロタミン、ｐＫ１７、ペプチドＫ８、およびペプチドｐ２がある。（例えば、フェルコールジュニア（Ｆｅｒｋｏｌ， Ｊｒ．）ら、米国特許第５，９７２，９００号および５，９７２，９０１号；ベイセ（Ｖａｙｓｓｅ， Ｌ．）とアーベイラー（Ａｒｖｅｉｌｅｒ， Ｂ．）、「合成ペプチドを使用するトランスフェクション：３つのＤＮＡ圧縮性ペプチドの比較と遠心分離の効果」、Ｂｉｏｃｈｉｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ １４７４（２）：２４４−５０ ［２０００］；ニー（Ｎｉ， Ｙ．Ｈ．）ら、「プロタミンは、培養ヒト肝癌細胞株中のリポソーム介在遺伝子移動の効率を増強する」、Ｊ． Ｆｏｒｍｏｓ． Ｍｅｄ． Ａｓｓｏｃ． ９８（８）：５６２−６６ ［１９９９］；バナージー（Ｂａｎｅｒｊｅｅ， Ｒ．）ら、「リポソーム遺伝子送達で使用するための新規シリーズの非グリセロールベースの陽イオン性トランスフェクション脂質」、Ｊ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． ４２（２１）：４２９２−９９ ［１９９９］；ゴドベイ（Ｇｏｄｂｅｙ， Ｗ．Ｔ．）ら、「ポリ（エチレンイミン／ＤＮＡ複合体の改良されたパッキングはトランスフェクション効率を上昇させる」、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． ６（８）：１３８０−８８ ［１９９９］；キチラー（Ｋｉｃｈｌｅｒ， Ａ．）ら、「リポスペルミン／ＤＮＡ粒子のトランスフェクション効率へのＤＮＡ複合体形成培地の影響」、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． ５（６）：８５５−６０ ［１９９８］；ビルチャー（Ｂｉｒｃｈａａ， Ｊ．Ｃ．）ら、「脂質ベースの遺伝子送達複合体の物理化学的性状解析とトランスフェクション効率」、Ｉｎｔ． Ｊ． Ｐｈａｒｍ． １８３（２）：１９５−２０７ ［１９９９］）。これらの非ウイルス細胞取り込み増強物質は、ウイルス由来のトランスフェクションまたは形質導入物質に通常関連するサイズの制限無しで、脊椎動物ゲノムへの異種移植片ＤＮＡ配列の安定な組み込みを促進するという利点を有する。
【００８２】
別の例（ウイルス性細胞性取り込み増強物質）は、アデノウイルス増強トランスフェリン−ポリリジン介在遺伝子送達系であり、これはクリエル（Ｃｕｒｉｅｌ）らにより記載され特許化されている（クリエル（Ｃｕｒｉｅｌ Ｄ．Ｔ．）ら、「トランスフェリン−ポリリジン介在遺伝子送達のアデノウイルス増強」、ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８８：８８５０−８８５４ （１９９１）。ＤＮＡの送達は、トランスフェリン受容体により仲介されるエンドサイトーシスに依存する（ワグナー（Ｗａｇｎｅｒ）ら、「細胞へのＤＮＡ取り込みのための担体としてのトランスフェリンポリ陽イオン結合体」、ＰＮＡＳ （ＵＳＡ）  ８７：３４１０−３４１４ （１９９０）。さらにこの方法は、アデノウイルスが細胞小胞（例えば、エンドソーム）を破壊し、そこに捕捉されている内容物を放出する能力に依存する。このシステムは、他の方法に対して２，０００倍も哺乳動物細胞への遺伝子送達を増強することができる。
【００８３】
ヒトＴリンパ球へのポリヌクレオチドの送達に特に有用な取り込み増強物質は、「テームド（ｔａｍｅｄ）」（すなわち、免疫不全の発病と病原性に必要な未変性のウイルス遺伝子が欠如している）ヒト免疫不全症ウイルス（ＨＩＶ）ベクターであり、これはＣＤ４分子を介する取り込みを仲介する。ＣＤ４および／または他のＴリンパ球マーカーに結合する種々のそのようなテームドウイルスベクターもまた、当該分野で公知である。
【００８４】
組成物の各成分の量は、例えば哺乳動物細胞のトランスフェクションまたは形質導入による、遺伝子修飾が最適化されるように選択される。そのような最適化は、日常的な実験以上は必要無い。ポリヌクレオチド対脂質の比は広く、好ましくは約１：１であるが、使用される脂質取り込み増強物質とポリヌクレオチドの形に依存して他の有効な比率を使用してもよい。（例えば、バナージー（Ｂａｎｅｒｊｅｅ， Ｒ．）ら、［１９９９］；ジャースケライネン（Ｊａａｓｋｅｌａｉｎｅｎ， Ｉ．）ら、「膜活性成分を有し小さい複合体サイズを有する脂質担体は、アンチセンスホスホロチオエートオリゴヌクレオチドの効率的な細胞送達に必要である」、Ｅｕｒ． Ｊ． Ｐｈａｒｍ． Ｓｃｉ． １０（３）：１８７−１９３ ［２０００］；サクライ（Ｓａｋｕｒａｉ， Ｆ．）ら、「プラスミドＤＮＡ／陽イオン性リポソーム複合体と以後の遺伝子発現の物理化学的特徴、細胞取り込みおよび細胞内輸送へのＤＮＡ／リポソーム混合比の作用」、Ｊ． Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ ６６（２−３）：２５５−６９ ［２０００］）。
【００８５】
本発明において、細胞に送達される本発明のポリヌクレオチドの適当な量は、インビボで腫瘍組織１グラム当たり約０．１ナノグラム〜約１ミリグラムであり、インビトロで５０００細胞当たり約０．１ナノグラム〜約１マイクログラムである。特定のＰＴＴＧ−Ｃ関連ポリヌクレオチド、またはＰＴＴＧ２をコードするポリヌクレオチド、および／または細胞形、および／または治療を受けている種々の哺乳動物被験体についての適当な量は、日常的な実験で決定することができる。例えば、悪性腫瘍細胞株（例えば、ＭＣＦ−７またはヒーラ）は一般に、非悪性腫瘍細胞株より効率的に、本発明のＰＴＴＧ−Ｃ関連ポリヌクレオチドによりトランスフェクションされる。また個々の癌患者の間で、ある治療処方に対して大きな変動があり、従って各患者について本発明の方法を、医師が適宜変更できることは、当業者には理解されるであろう。
【００８６】
ある好適な実施態様においてポリヌクレオチドは、当該分野で公知の適当な発現ベクター（例えばレンチウイルスベクター、またはアデノウイルスベクターなどのレトロウイルスベクター）を使用して、インビボまたはインビトロで哺乳動物細胞中に供給することができる（例えば、アンダーソン（Ａｎｄｅｒｓｏｎ， Ｗ．Ｆ．）、「癌に対する遺伝子治療スコア」、Ｎａｔ． Ｍｅｄ． ６（８）：８６２−６３ ［２０００］）。さらに、ＰＴＴＧのインビボ発現を阻害するために、ＰＴＴＧ−ＣペプチドをコードするＤＮＡのアンチセンス鎖の発現ベクターによる導入が企図される。
【００８７】
適切な発現ベクターは当該分野で公知であり、制御配列（例えば、ＤＮＡの発現を制御することができるプロモーター領域）に機能的に連結したＤＮＡを発現することができるベクターがある。すなわち発現ベクターは、組換えＤＮＡまたはＲＮＡを意味し、適切な宿主細胞に導入されると、挿入されたＤＮＡを発現する、プラスミド、ファージ、組換えウイルスまたは他のベクターである。適切な発現ベクターは、当業者に公知であり、真核細胞および／または原核細胞中で複製可能なもの、および宿主細胞ゲノム中に組み込まれるエピソームとなるものがある。
【００８８】
例えば真核生物発現ベクターには、クローン化ウシパピローマウイルスゲノム、マウスレトロウイルスのクローン化ゲノム、および真核生物カセット、例えばｐＳＶ−２ｇｐｔシステム（ムリガン（Ｍｕｌｌｉｇａｎ）とバーグ（Ｂｅｒｇ）、１９７９， Ｎａｔｕｒｅ ２７７：１０８−１１４）、オカヤマ−バーグ（Ｏｋａｙａｍａ−Ｂｅｒｇ）クローニングシステム（Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． ２：１６１−１７０， １９８２）、ｐＧＡＬ４、ｐＣＩ（例えば、ｐＣＩ−ｎｅｏ）があり、形質転換哺乳動物細胞中で目的のタンパク質の少なくとも一部の発現を実質的に確保させるジェネティクスインスチチュート（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）により記載された発現クローニングベクター（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２８：８１０−８１５， １９８５）が、利用可能である。
【００８９】
特に好適なものは、哺乳動物細胞のトランスフェクションのために、ＰＴＴＧ−ＣをコードするＤＮＡセグメントまたはＰＴＴＧ２をコードするＤＮＡセグメントのような、本発明のＰＴＴＧをコードするＤＮＡに連結できる制御成分を含有するものである。その例には、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターベースのベクター、例えばｐｃＤＮＡ１（インビトロゲン社（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．）、サンジエゴ、カリホルニア州）、ＭＭＴＶプロモーターベースのベクター、例えばｐＭＡＭＮｅｏ（クロンテク（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、パロアルト、カリホルニア州）とｐＭＳＧ（ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、ピスカタウェイ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ）、ニュージャージー州）、およびＳＶ４０プロモーターベースのベクター、例えばｐＳＶβ（クロンテク（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、パロアルト、カリホルニア州）である。反応ある実施態様において、哺乳動物細胞を異種ＰＴＴＧ特異的核酸で形質導入するのに、アデノウイルス−トランスフェリン／ポリリジン−ＤＮＡ（ＴｆＡｄｐｌ−ＤＮＡ）ベクター複合体（ワグナー（Ｗａｇｎｅｒ）ら、１９９２， ＰＮＡＳ， ＵＳＡ， ８９：６０９９−６１０３；クリエル（Ｃｕｒｉｅｌ）ら、１９９２， Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ， ３：１４７−１５４；ガオ（Ｇａｏ）ら、１９９３， Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．， ４：１４−２４）が使用される。ＴｆＡｄｐｌ−ＤＮＡ複合体において、本明細書に記載の任意のプラスミド発現ベクターが使用される。
【００９０】
さらにベクターは、多くのウイルスビリオン（例えばレトロウイルス、ヘルペスウイルス、アデノウイルス）によりパッケージングされて、「ウイルスベクター」を形成することを可能にする、適切なパッケージングシグナルを含有してもよい。
【００９１】
本明細書において「ウイルス」とは、哺乳動物細胞へのポリヌクレオチドの送達を促進することができる、任意のウイルスまたはそのトランスフェクション性断片を意味する。本明細書での使用に適したウイルスの例には、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、レトロウイルス、例えばヒト免疫不全症ウイルス、レンチウイルス、おたふくかぜウイルス、およびこれらのウイルスのいずれかのトランスフェクション性断片、および生殖細胞の細胞質による、およびそこへの放出による所望のＤＮＡセグメントの取り込みを促進する他のウイルスＤＮＡセグメント、およびこれらの混合物がある。好適なウイルスベクターは、モロニーマウス白血病ウイルスと、水疱性口内炎ウイルス糖タンパク質（ＶＳＶ−Ｇ）−モロニーマウス白血病ウイルスと呼ばれるモロニーウイルス由来のレトロウイルスベクターである。最も好適なウイルスベクターは、ＨＩＶウイルス由来の偽型（ＶＳＶ−Ｇ）レンチウイルスベクターである（ナルジニ（Ｎａｌｄｉｎｉ）ら、［１９９６］）。またおたふくかぜウイルスは、精原細胞を含む未成熟精子細胞に対する親和性があるため特に適している。上記ウイルスのすべては、これらを非病原性または抗原性を小さくするための修飾を必要することがある。しかし他の公知のウイルスベクターもまた、本発明の範囲において有用である。
【００９２】
ウイルスベースの系は、比較的高レベルの異種核酸を種々の細胞中に導入できるという利点を有する。哺乳動物細胞（例えば血管組織セグメント）中に本発明のＰＴＴＧ特異的ポリヌクレオチドを導入するのに適したウイルスベクターは、当該分野で公知である。これらのウイルスベクターには、例えば単純ヘルペスウイルスベクター（例えば、ゲラー（Ｇｅｌｌｅｒ）ら、１９８８， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２４１：１６６７−１６６９）、ワクシニアウイルスベクター（例えば、ピッチニ（Ｐｉｃｃｉｎｉ）ら、１９８７， Ｍｅｔｈ． ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ， １５３：５４５−５６３）；サイトメガロウイルスベクター（マカルスキー（Ｍｏｃａｒｓｋｉ）ら、「ウイルスベクター」中、グルツマン（Ｙ． Ｇｌｕｚｍａｎ）とヒューズ（Ｓ．Ｈ． Ｈｕｇｅｓ）編、コールドスプリングハーバーラボラトリー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、コールドスプリングハーバー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ）、ニューヨーク州、１９８８、７８−８４頁）、モロニーマウス白血病ウイルスベクター（ダノス（Ｄａｎｏｓ）ら、１９８０， ＰＮＡＳ， ＵＳＡ， ８５：６４６９）、アデノウイルスベクター（例えば、ローガン（Ｌｏｇａｎ）ら、１９８４， ＰＮＡＳ， ＵＳＡ， ８１：３６５５−３６５９；ジョーンズ（Ｊｏｎｅｓ）ら、１９７９， Ｃｅｌｌ， １７：６８３−６８９；バークナー（Ｂｅｒｋｎｅｒ）、１９８８， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ， ６：６１６−６２６；コッテン（Ｃｏｔｔｅｎ）ら、１９９２， ＰＮＡＳ， ＵＳＡ， ８９：６０９４−６０９８；グラハム（Ｇｒａｈａｍ）ら、１９９１， Ｍｅｔｈ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， ７：１０９−１２７）、アデノ関連ウイルスベクター、レトロウイルスベクター（例えば、米国特許第４，４０５，７１２号および４，６５０，７６４号を参照）などがある。特に好適なウイルスベクターは、アデノウイルスベクターとレトロウイルスベクターである。
【００９３】
本明細書において「レトロウイルスベクター」とは、２つのレトロウイルスＬＴＲの間に位置する異種遺伝子をコードする発現カセットを有する、公知の遺伝子移動プラスミドを意味する。レトロウイルスベクターは一般に、レトロウイルスベクターまたはレトロウイルスベクターを鋳型として使用して転写されるＲＮＡが、適切なパッケージング細胞株中のウイルスビリオンにパッケージングされることを可能にする、適切なパッケージングシグナルを含有する（例えば、米国特許第４，６５０，７６４号を参照）。レトロウイルスベクターには、レンチウイルスベクター、例えばＨＩＶ由来ベクターがある。
【００９４】
本発明での使用に適したレトロウイルスベクターは、例えば米国特許出願第５，２５２，４７９号、およびＷＩＰＯ公報ＷＯ９２／０７５７３、ＷＯ９０／０６９９７、ＷＯ８９／０５３４５、ＷＯ９２／０５２６６およびＷＯ９２／１４８２９（参照することにより本明細書に組み込まれる）に記載されており、これらは、そのようなレトロウイルスベクターを使用して、核酸をヒト細胞に効率的に導入する方法を記載する。他のレトロウイルスベクターには、例えばマウス乳癌ウイルスベクター（例えば、シャックルフォード（Ｓｈａｃｋｌｅｆｏｒｄ）ら、１９８８、ＰＮＡＳ， ＵＳＡ， ８５：９６５５−９６５９）などがある。
【００９５】
最も好適な実施態様は、遺伝子治療のために開発され（ナルジニ（Ｎａｌｄｉｎｉ）ら、「レンチウイルスベクターによる非分裂細胞のインビボ遺伝子送達と安定な形質導入」、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７２−２６７ ［１９９６］）、哺乳動物細胞を形質導入するのに使用される偽型レトロウイルスベクター系を使用する。この遺伝子送達系は、３プラスミド発現系により作成されたレトロウイルス粒子を使用する。この系では、パッケージング構築体は、ヒトサイトメガロウイルス（ｈＣＭＶ）前早期プロモーターを含有し、すべてのウイルスタンパク質の発現をさせる。この構築体の設計は、ウイルスパッケージング、逆転写、およびこれらの転写体の組み込みに決定的に重要なｃｉｓ作用性配列を排除する。第２のプラスミドは、異種エンベロープタンパク質（ｅｎｖ）、すなわち水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ−Ｇ）のＧ糖タンパク質をコードする。第３のプラスミドである形質導入ベクター（ｐＨＲ’）は、パッケージング、逆転写および組み込みに必要なヒト免疫不全症ウイルス（ＨＩＶ）のｃｉｓ作用性配列、ならびに異種相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）をクローニングするためのユニークな制限部位を含有する。例えば、緑の蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、増強緑の蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）、青い蛍光タンパク質、黄色の蛍光タンパク質、β−ガラクトシダーゼ、および／または別のあらかじめ選択された生成物をコードする遺伝子のような遺伝子選択マーカーは、ＨＲ’ベクターのｈＣＭＶプロモーターの下流にクローン化され、転写単位を形成するように機能的に連結される。ＶＳＶ−Ｇ偽型レトロウイルスベクター系は、異なる種からの細胞を含む広範な細胞に感染することができ、ゲノム中に組み込むことができる。一部のレトロウイルス（すなわち、ＨＩＶのようなレンチウイルス）は、非分裂細胞に感染する能力を有する。レンチウイルスは、異種ＤＮＡ配列に対する限定された能力を有し、このベクターのサイズ制限は７〜７．５キロ塩基である（ヴェルマ（Ｖｅｒｍａ， Ｉ．Ｍ．）とソミア（Ｓｏｍｉａ， Ｎ．）、「遺伝子治療−約束、問題および展望」、Ｎａｔｕｒｅ ３８９：２３９−２４２ ［１９９７］）。レンチウイルスを用いるインビボの実験は、発現が他のレトロウイルスベクターのような止まることはなく、脳、筋肉、肝臓または膵島細胞中のインビボ発現は、少なくとも６ヶ月にわたって維持され、これまで試験した中で最も長い時間である（ヴェルマ（Ｖｅｒｍａ， Ｉ．Ｍ．）とソミア（Ｓｏｍｉａ， Ｎ．）；アンダーソン（Ａｎｄｅｒｓｏｎ， ＷＦ．）、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ， Ｎａｔｕｒｅ（増刊）３９２：２５−３０ ［１９９８］）。
【００９６】
本発明において「遺伝子送達（またはトランスフェクション）混合物」は、例えば上記の有効量の取り込み増強物質と混合した適切なベクターと一緒の、センスまたはアンチセンス配向の、選択されたＰＴＴＧカルボキシ末端関連ポリヌクレオチドを意味する（例えば、クラーク（Ｃｌａｒｋ）ら、「ポリ陽イオンと陽イオン性脂質は、腫瘍細胞でのアデノウイルス形質導入とトランス遺伝子発現を増強する」、Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． ６（５）：４３７−４６ ［１９９９］）。例えば、アデノウイルス−、レトロウイルス−、レンチウイルス−介在形質導入の効率は、感染中にポリブレンのような陽イオン性脂質を含めることにより大幅に上昇する。
【００９７】
新生物細胞増殖および／または形質転換を阻害するための本発明の方法のあるペプチドベースの実施態様は、ＰＴＴＧカルボキシ末端ペプチド（これは、本明細書において「ＰＴＴＧ−Ｃ」または「ＰＴＴＧ１−Ｃ」、または「ＰＴＴＧ  Ｃ末端ペプチド」と同義である）を含む本発明の組成物を送達することを含む。
【００９８】
他のペプチドベースの実施態様において、本明細書にさらに記載のＰＴＴＧ２ペプチドが送達される。
【００９９】
「タンパク質」、「ペプチド」および「ポリペプチド」という用語は、本明細書において同義で使用される。本明細書において「ＰＴＴＧ」という用語は、以前はまた「下垂体腫瘍特異的遺伝子」（ＰＴＳＧ）タンパク質としても知られていた、ＰＴＴＧタンパク質の哺乳動物ファミリーのタンパク質メンバーを意味する。
【０１００】
インビボでＰＴＴＧ１タンパク質は、例えばヌードマウス（例えば、ＮＩＨ３Ｔ３などにトランスフェクションされた時）で腫瘍形成を誘導する能力を有することにより特徴付けられる。ＰＴＴＧタンパク質は、１次転写体の代替スプライシングにより作成されたｍＲＮＡによりコードされる天然に存在するその対立遺伝子を含有し、少なくとも１つの生物活性を保持するその断片をさらに含む。
【０１０１】
「生物学的に活性」または「機能的」という用語は、本発明のＰＴＴＧタンパク質、ペプチド、またはその断片の修飾するのに本明細書で使用される時、ＰＴＴＧに起因する少なくとも１つの機能的特徴を示すポリペプチドを意味する。例えばＰＴＴＧ１の１つの生物活性は、細胞をインビトロ（例えば、ＮＩＨ３Ｔ３など）で形質転換する能力である。ＰＴＴＧ１の別の生物活性は、本明細書に記載の哺乳動物Ｔリンパ球の活性化を調節する能力である。さらに別のＰＴＴＧ１の生物活性は、ヌードマウス（例えば、ＮＩＨ３Ｔ３細胞などにトランスフェクションされた時）で新生物細胞増殖（例えば、腫瘍発生）を誘導する能力である。
【０１０２】
一方、本発明のＰＴＴＧ−Ｃペプチド（完全長の未変性のＰＴＴＧタンパク質とは異なる）およびＰＴＴＧ２タンパク質（本明細書で初めて開示された）は、優性陰性的にＰＴＴＧ１介在トランス活性化と腫瘍発生を阻害する生物活性を有する。「優性陰性」は、例えば遺伝子の１つのコピーが突然変異表現型作用を与えると遺伝的に記載されたものと類似の優性作用を有し、シグナル伝達経路のような生物学的プロセスを防止するかまたは陰性の影響を有するという意味で陰性作用を有する。すなわち、ＰＴＴＧカルボキシ末端ペプチドとＰＴＴＧ２ペプチドは、細胞内ＰＴＴＧ１発現および／または内因性ＰＴＴＧ１機能をダウンレギュレートする能力を有する。本発明の方法は、ＰＴＴＧ−ＣまたはＰＴＴＧ２ペプチドが、ＰＴＴＧ１発現および／またはＰＴＴＧ１機能に対してその生物活性を示す特定の生化学的、遺伝的および／または生理学的機構に限定されず、そのような機構のすべてまたはいずれかは、本発明においてＰＴＴＧ−ＣまたはＰＴＴＧ２の生物活性に寄与することができる。
【０１０３】
ＰＴＴＧペプチドまたはＰＴＴＧ−Ｃペプチドの別の生物活性は、ＰＴＴＧおよび／またはＰＴＴＧ−Ｃに特異的に結合するポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の産生のための免疫原として作用する能力である。すなわち、ＰＴＴＧまたはＰＴＴＧ−Ｃをコードする本発明の核酸は、本明細書に記載の特定のＰＴＴＧタンパク質を特異的に認識（すなわち、特異的に結合）する抗体により特異的に認識されるポリペプチドをコードするであろう。そのような活性は、当業者に公知の任意の方法により測定される。例えば、ＰＴＴＧ  ｃＤＮＡによりコードされる試験ポリペプチドを使用して、抗体を産生させ、次にこれを、タンパク質に結合する能力について測定する。もし抗体が試験ポリペプチドとタンパク質に同じ親和性で結合するなら、ポリペプチドは、免疫原性について必要な生物活性を有する。
【０１０４】
インビトロでもインビトロでも、哺乳動物の乳癌または卵巣癌の新生物細胞増殖および／または形質転換を阻害する本発明の方法のある実施態様において、有用なＰＴＴＧ−Ｃペプチドはまた、より大きなＰＴＴＧ−Ｃ分子の任意の断片を包含し、この断片は、内因性ＰＴＴＧ１発現および／または内因性ＰＴＴＧ１機能をダウンレギュレートするＰＴＴＧ−Ｃの生物活性を保持している。有用なＰＴＴＧ−Ｃペプチドは好ましくは（しかし、排他的ではない）、約１５〜約６０の連続的アミノ酸残基の長さであり、ＰＸＸＰモチーフ（ここで、プロリン（Ｐ）残基の間のＸは、プロリンを含む任意のアミノ酸残基である）を有するペプチドセグメントである１つ以上のプロリンリッチな領域を含む。ＰＴＴＧ−Ｃペプチドのプロリンリッチな領域は、ＳＨ３結合部位候補である。
【０１０５】
ＰＴＴＧ１タンパク質分子のＳＨ３結合部位は、細胞内ＰＴＴＧ１発現および／またはＰＴＴＧ１タンパク質機能を阻害するための、有用な標的である。細胞内ＰＴＴＧ１発現および／または内因性ＰＴＴＧ１機能のダウンレギュレーションまたは阻害は、内因性ＰＴＴＧ１タンパク質分子上に通常存在するＳＨ３結合部位への特異的結合を阻止することにより行われ、こうして、細胞内でのＳＨ３介在シグナル伝達を妨害する。
【０１０６】
最も好ましくは、ＰＴＴＧ−Ｃペプチドは、「ｈＰＴＴＧ１」または「ＰＴＴＧ１」タンパク質と呼ぶヒトＰＴＴＧから得られる。未変性のヒトＰＴＴＧ１タンパク質は、２０２アミノ酸の長さであり、以下のアミノ酸配列を有する（下表７；ヒトＰＴＴＧ１配列  配列番号３のヌクレオチド９５〜７００位によりコードされる、および縮重配列）。ｈＰＴＴＧ１と生物活性を共有する他の哺乳動物ＰＴＴＧ分子（例えば、ラットＰＴＴＧおよびマウスＰＴＴＧ）もまた、ＰＴＴＧ１タンパク質の範疇にあると考えられる。
【０１０７】
表７．ｈＰＴＴＧ１アミノ酸配列
2004526404.tif 000009
【０１０８】
ヒトＰＴＴＧ１ペプチドはまた、配列番号４のアミノ酸配列をコードする任意の縮重コード配列によりコードされる。
好適なＰＴＴＧ−Ｃは、配列番号４のアミノ酸残基１４７〜２０２に対応するアミノ酸配列を有する（下表８；配列番号３のヌクレオチド５３３〜７００位または配列番号１０の１〜１６８位および縮重配列によりコードされる）。
【０１０９】
表８．ヒトＰＴＴＧ−Ｃアミノ酸配列。
2004526404.tif 000010
【０１１０】
配列番号４のアミノ酸残基１６３〜１７３の間には少なくとも２つのプロリンリッチな領域が存在し、そしてこれらは、配列番号９のアミノ酸残基１７〜２７に対応し、配列番号１０のヌクレオチド４９〜８１および縮重配列によりコードされる。プロリンリッチな領域は、配列番号４のアミノ酸残基１６３〜１６７および１７０〜１７３に見い出され、配列番号９のアミノ酸残基１７〜２０および２４〜２７に対応する。配列番号９の他の有用な小ペプチド断片は、新生物の細胞増殖および／または細胞の形質転換を阻害するその有効性に関して日常的な手段により試験される。
【０１１１】
ＰＴＴＧタンパク質の別の例は、下記アミノ酸配列を有するラットＰＴＴＧである（下の表９；配列番号１のヌクレオチド２９３〜８８９位および縮重配列によりコードされる）。
【０１１２】
表９．ラットＰＴＴＧアミノ酸配列。
2004526404.tif 000011
【０１１３】
ラットＰＴＴＧ−Ｃペプチドは、配列番号２のアミノ酸残基１４４〜１９９、すなわち、配列番号１６を含む（下の表１０；配列番号１のヌクレオチド７２２〜８８９位または配列番号１８の１〜１６８位及び縮重配列によりコードされる）。
【０１１４】
表１０．ラットＰＴＴＧ−Ｃアミノ酸配列。
2004526404.tif 000012
【０１１５】
配列番号１６のアミノ酸配列は、アミノ酸残基１７〜２０、２４〜２７、および３４〜３７にプロリンリッチな領域を含む（配列番号２のアミノ酸残基１６０〜１６３、１６７〜１７０、および１７７〜１８０に対応する）。
【０１１６】
ＰＴＴＧタンパク質の別の例は、下記アミノ酸配列を有するマウスＰＴＴＧである（下の表１１；配列番号１５のヌクレオチド３０４〜８９１位および縮重配列によりコードされる）。
【０１１７】
表１１．マウスＰＴＴＧアミノ酸配列。
2004526404.tif 000013
【０１１８】
マウスＰＴＴＧ−Ｃペプチドは、配列番号１４のアミノ酸残基１４１〜１９６、すなわち、配列番号１７を含む（下の表１２；配列番号１５のヌクレオチド７２４〜８９１位または配列番号１９の１〜１６８位および縮重配列によりコードされる）。
【０１１９】
表１２．マウスＰＴＴＧ−Ｃアミノ酸配列。
2004526404.tif 000014
【０１２０】
配列番号１７のアミノ酸配列は、アミノ酸残基１７〜２０にプロリンリッチな領域を含む（配列番号１４のアミノ酸残基１５７〜１６０に対応する）。
好適なＰＴＴＧ−Ｃペプチドは、以下を含む：
（Ａ）（配列番号９）、（配列番号１６）、または（配列番号１７）のアミノ酸配列を有するペプチド；または
（Ｂ）（Ａ）の配列のいずれかと少なくとも約６０％の配列相同性を有する哺乳動物ＰＴＴＧ−Ｃペプチド；または
（Ｃ）少なくとも１５の連続的アミノ酸残基を有し、内因性ＰＴＴＧ１発現および／またはＰＴＴＧ１機能をダウンレギュレートするように機能する、（Ａ）または（Ｂ）のペプチド断片。最も好ましくは、（Ｃ）の断片は、１つ以上のプロリンリッチな領域を含む。
【０１２１】
当業者であれば、他の有用なＰＴＴＧ−Ｃペプチドにおいて、ＰＴＴＧ１またはＰＴＴＧ−Ｃの生物学的活性を実質的に変質させることなく、多数の前記のＰＴＴＧ、ＰＴＴＧ１、またはＰＴＴＧ−Ｃアミノ酸配列のいずれかの残基を、他の化学的、立体的および／または電子的に類似した残基で置換できることは認識できよう。さらに配列番号２、配列番号４、配列番号９、配列番号１４、配列番号１６、または配列番号１７（例えば、スプライス変種）中と実質的に同じコード配列を含む、より大きなポリペプチド配列が企図される。
【０１２２】
ヒトＰＴＴＧ２タンパク質のアミノ酸配列（配列番号６４）は、下の表１２ａに列挙される（ジーンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）受け入れ番号ＡＦ１１６５３８．２；配列番号６３または配列番号６２のヌクレオチド３８３〜９５８位、および縮重配列によりコードされる）。
【０１２３】
表１２ａ．ｈＰＴＴＧ２アミノ酸配列。
2004526404.tif 000015
【０１２４】
好適なＰＴＴＧ２ペプチドは、（Ａ）基本的に（配列番号６４）のアミノ酸残基１〜１９１、または（配列番号６４）の少なくとも連続的アミノ酸残基１〜１８０を含むその機能性断片からなるペプチド（すなわち、配列番号６４の連続的アミノ酸残基１〜１８０、配列番号６４の１〜１８１、配列番号６４の１〜１８２、配列番号６４の１〜１８３、配列番号６４の１〜１８４、配列番号６４の１〜１８５、配列番号６４の１〜１８６、配列番号６４の１〜１８７、配列番号６４の１〜１８８、配列番号６４の１〜１８９、及び配列番号６４の１〜１９０）である。また、有用なＰＴＴＧ２ペプチドには、（Ｂ）（Ａ）の任意のペプチドと少なくとも約９５％の配列相同性を有する哺乳動物ＰＴＴＧ２ペプチドが含まれる。重要なことには、有用なペプチドは、ｈＰＴＴＧ２のプロリンリッチな領域（すなわち、ＰＸＸＰモチーフ）を含み、そしてこれらは、配列番号６４のヌクレオチド１６３〜１６６位及び配列番号６４のヌクレオチド１７０〜１７３位に見い出される。
【０１２５】
本明細書において、「実質的に同じアミノ酸配列」という用語は、本明細書に記載されるアミノ酸（「参照配列」）のいずれかに対して、少なくとも約６０％の配列相同性または同一性を有し、そして記載される参照配列により定義されるタンパク質に特有な、これらに匹敵する機能的および生物学的活性（特に新生物細胞増殖および／または形質転換またはその阻害に関して）を保持している、アミノ酸配列を意味する。さらに好ましくは、「実質的に同じアミノ酸配列」を有するタンパク質は、参照アミノ酸配列に対して、少なくとも約８０％、さらに好ましくは約９０％のアミノ酸同一性を有し、約９５％を超えるアミノ酸配列の同一性が特に好ましい。しかし、スプライス変種として生じるか、または保存的アミノ酸置換により修飾される、記載されるレベルに足りない配列同一性を含むポリペプチドもまた、本発明の範囲に包含される。配列相同性の程度は、例えばナショナルセンター・フォー・バイオテクノロジーインフォメーション（ＮＣＢＩ：ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／）のジーンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）データベースのようなデータベースを、パワーブラスト（ＰｏｗｅｒＢＬＡＳＴ）、キューブラスト（ＱＢＬＡＳＴ）、プサイブラスト（ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ）、ファイブラスト（ＰＨＩ−ＢＬＡＳＴ）、ギャップトまたはアンギャップトブラストのようなコンピューターアルゴリズム、またはベイヤーカレッジオブメディシン（Ｂａｙｏｒ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）サーバー（ｗｗｗ．ｈｇｓｃ．ｂｃｍ．ｔｍｃ．ｅｄｕ／ｓｅｑ＿ｄａｔａ）を介する「アライン（Ａｌｉｇｎ）」プログラムを使用して、アミノ酸配列類似性検索を行うことにより決定される（例えば、アルトチュル（Ａｌｔｃｈｕｌ， Ｓ．Ｆ．）ら、「ギャップトブラスト（Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴ）とプサイブラスト（ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ）；新しい世代のタンパク質データベース検索プログラム」、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２５（１７）：３３８９−４０２ ［１９９７］；ザング（Ｚｈａｎｇ， Ｊ．）とマデン（Ｍａｄｄｅｎ， Ｔ．Ｌ．）、「パワーブラスト（ＰｏｗｅｒＢＬＡＳＴ）；対話型および自動配列解析および自動化のための新しいネットワークブラスト（ＢＬＡＳＴ）アプリケーション」、Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ． ７（６）：６４９−５６ ［１９９７］；マデン（Ｍａｄｄｅｎ， Ｔ．Ｌ．）ら、「ネットワークブラスト（ＢＬＡＳＴ）サーバーの応用」、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． ２６６：１３１−４１ ［１９９６］；アルトチュル（Ａｌｔｓｃｈｕｌ， Ｓ．Ｆ．）ら、「基礎的ローカルアライメント検索ツール」、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２１５（３）：４０３−１０ ［１９９０］）。
【０１２６】
また、それぞれＰＴＴＧタンパク質またはＰＴＴＧ−Ｃペプチドという用語には、その生物学的に機能性または活性なペプチド類似体が包含される。ペプチド「類似体」という用語は、本明細書に具体的に示される配列と実質的に同一であるアミノ酸残基配列を有する任意のポリペプチドを含むが、ここでは１つ以上の残基が、機能的に類似した残基で保存的に置換されており、そしてこれらは、それぞれＰＴＴＧ（ＰＴＴＧ１またはＰＴＴＧ２）またはＰＴＴＧ−Ｃの生物学的活性（特に、本明細書に前記されているように、新生物細胞増殖および／または形質転換またはその阻害に関して、あるいは哺乳動物のリンパ細胞を免疫抑制することに関して）を模倣する能力を示す。保存的置換の例は、イソロイシン、バリン、ロイシンまたはメチオニンのような非極性（疎水性）残基を別のもので置換、一極性（親水性）残基を別のもので置換（アルギニンとリジンの間、グルタミンとアスパラギンの間、グリシンとセリンの間など）、リジン、アルギニンまたはヒスチジンのような一塩基性残基を別のもので置換、あるいはアスパラギン酸またはグルタミン酸のような一酸性残基を別のもので置換を含む。
【０１２７】
「保存的置換」という用語はまた、非誘導体化残基に代わる化学誘導体化残基の使用を含む（このようなポリペプチドが、必須の生物学的活性を示すならば）。
【０１２８】
「化学誘導体」とは、機能性側鎖の反応により化学的に誘導体化された、１つ以上の残基を有する被験ポリペプチドを意味する。このような誘導体化分子は、例えば、遊離アミノ基が誘導体化されて、アミン塩酸塩、ｐ−トルエンスルホニル基、カルボベンゾオキシ基、ｔ−ブチルオキシカルボニル基、クロロアセチル基またはホルミル基を形成している分子を含む。遊離カルボキシル基が誘導体化されて、塩、メチルおよびエチルエステルまたは他の型のエステルあるいはヒドラジドを形成してもよい。遊離ヒドロキシル基が誘導体化されて、Ｏ−アシルまたはＯ−アルキル誘導体を形成してもよい。ヒスチジンのイミダゾール窒素が誘導体されて、Ｎ−ｉｍ−ベンジルヒスチジンを形成してもよい。また、化学誘導体として、２０種の標準アミノ酸の１つ以上の天然アミノ酸誘導体を含むペプチドが含まれる。例えば、４−ヒドロキシプロリンをプロリンに置換してもよい；５−ヒドロキシリジンをリジンに置換してもよい；３−メチルヒスチジンをヒスチジンに置換してもよい；ホモセリンをセリンに置換してもよい；そしてオルニチンをリジンに置換してもよい。本発明のポリペプチドはまた、必須のＰＴＴＧまたはＰＴＴＧ−Ｃ生物学的活性が維持される限り、配列が本明細書に示されるポリペプチドの配列に対して、１つ以上の残基の付加および／または欠失のある任意のポリペプチドを含む。
【０１２９】
新生物細胞増殖および／または形質転換を阻害する本発明の方法のペプチドに基づく実施態様では、ＰＴＴＧ−Ｃペプチドを含む組成物が細胞に送達される。細胞に送達すべき本発明のＰＴＴＧ−Ｃペプチドの適切な量は、本発明により、好ましくはインビボで腫瘍組織１グラム当たり約０．１ナノグラム〜約１ミリグラム、あるいはインビトロで５０００細胞当たり約０．１ナノグラム〜約１マイクログラムの範囲である。ＰＴＴＧ−Ｃペプチドの特定の種類および／または細胞型および／または治療を受けている種々の哺乳動物被験体についての適切な量は、日常的な実験で決定することができる。
【０１３０】
標的細胞への送達及び移入の方法は、公知である。例えば、本組成物は、好ましくは（しかし必須ではなく）ＰＴＴＧ−Ｃペプチドの他に、ＰＴＴＧ−Ｃペプチドが細胞性取り込み増強物質と複合体を形成した複合体を含む。例えば、ＰＴＴＧ−Ｃペプチドは、哺乳動物細胞へのＰＴＴＧ−Ｃの送達のために、複合体中で細胞性取り込み増強および／または移入コンピテントペプチドセグメントに共有結合することができる；さらに、核内局在ペプチドをこの複合体に含ませて、ＰＴＴＧ−Ｃを核に向かわせることができる。（例えば、リン（Ｌｉｎ）ら、「生物学的活性分子を細胞内に移入させる方法」、米国特許第６，０４３，３３９号）。本明細書において使用されるとき「移入コンピテントペプチド」は、一般に約１０個〜約５０個以上のアミノ酸残基の長さのアミノ酸の配列であり、そして疎水性の脂溶性部分を持つように、その多くの（一般的には約５５〜６０％）残基が疎水性である。この疎水性部分は、シグナルペプチドの共通の主要なモチーフであり、そしてしばしば細胞から分泌されるタンパク質のシグナルペプチドの中心部分として認識される。シグナルペプチドは、細胞膜を貫通して、細胞内タンパク質を移出させることができる。本方法において有用なシグナルペプチドはまた、「移入コンピテント」である（すなわち、細胞の外側から細胞の内側へ細胞膜を貫通することができる）。
【０１３１】
好適な実施態様において、ＰＴＴＧ−ＣペプチドまたはＰＴＴＧ２ペプチドは、キメラまたは融合タンパク質の第１のＰＴＴＧ−ＣペプチドセグメントまたはＰＴＴＧ２ペプチドセグメントを形成する。キメラまたは融合タンパク質は、少なくとも第１のＰＴＴＧ−ＣペプチドセグメントまたはＰＴＴＧ２ペプチドセグメントと、第２の細胞性取り込み増強および／または移入コンピテントペプチドセグメントとを含む。キメラまたは融合タンパク質の第２のセグメントは、インビトロであろうとインビボであろうと、ハイブリッド分子を、ＰＴＴＧを過剰発現する新生物細胞に入り込ませる、シグナルペプチドのような、細胞性取り込み増強および／または移入コンピテントペプチドセグメントである。ヒト免疫不全症ウイルス（ＨＩＶ）ＴＡＴタンパク質（シュヴァルツ（Ｓｃｈｗａｒｚｅ， Ｓ．Ｒ．）ら、「インビボタンパク質形質導入：生物学的活性タンパク質のマウスへの送達」、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８５：１５６９−７２ ［１９９９］）のような、第２のペプチドセグメントは、細胞内に浸潤し、そして一旦細胞に入ると、融合タンパク質のＰＴＴＧ−ＣペプチドセグメントまたはＰＴＴＧ２ペプチドセグメントは、細胞内で活性になって、内因性ＰＴＴＧ１発現および／またはＰＴＴＧ１機能を阻害する。有用な摂取強化性ペプチドセグメントの別の例は、カポジ（Ｋａｐｏｓｉ）線維芽細胞増殖因子（Ｋ−ＦＧＦ）からのシグナルペプチドである。摂取強化性ペプチドセグメントの他の有用な例は、フェリチンペプチド、またはラクトアルブミン−αペプチド（後者は、胸部または乳房由来の細胞を標的とするのに特に有用である）からなる。しかし選択した標的哺乳動物細胞の内側に細胞膜を通って移動できる、任意の細胞性取り込み増強および／または移入コンピテントペプチドセグメントを本発明により使用することができる。キメラまたは融合タンパク質はまた、第１および第２セグメントの間に介在するセグメントであってよいリンカーセグメントのような、追加のセグメントを含んでもよい。追加のセグメントはあるいは、適宜末端セグメントであってもよい。
【０１３２】
ＰＴＴＧ−ＣまたはＰＴＴＧ２キメラまたは融合タンパク質の使用を伴う方法の実施態様において、細胞性取り込み増強および／または移入コンピテントペプチドセグメントは、取り込み増強物質であってよい。あるいは、またはさらに、細胞性取り込み増強物質は、リポフェクチン、リポフェクタミン、ＤＯＴＡＰ、およびその他の本明細書で前記した、脂質またはリポソーム取り込み増強物質であってよい。カチオン性（またはポリカチオン性）脂質またはリポソームはまた、シグナルペプチドおよび負に荷電した生物学的活性分子と、これらの成分を混合して、電荷会合させることにより、複合体を形成してもよい。アニオン性リポソームは、一般にリポソーム内に細胞に送達すべき物質を封入するために利用される。カチオン性リポソーム封入性物質を形成するための手順は、当該分野では標準的であり、当業者であれば、本発明の複合体を封入するために本明細書において容易に利用することができる。例えば、本発明のＰＴＴＧ−Ｃペプチド断片またはＰＴＴＧ２ペプチドと複合体を形成したリポソーム取り込み増強物質は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ＦｕＧＥＮＥ６などに封入することができる。
【０１３３】
インビボで哺乳動物細胞への本発明の組成物（ＰＴＴＧ−Ｃ関連ポリヌクレオチドまたはＰＴＴＧ−Ｃペプチドまたは活性断片またはＰＴＴＧ２をコードするポリヌクレオチドまたはＰＴＴＧ２ペプチドのどれかを含む）の送達に関して、本組成物は、ヒト被験者を含む治療を必要とする被験哺乳動物に、任意の従来の送達経路によって投与される。好ましくは、ＰＴＴＧ−Ｃ関連ポリヌクレオチドもしくはＰＴＴＧ２をコードするポリヌクレオチド、またはＰＴＴＧ−ＣもしくはＰＴＴＧ２ペプチド（細胞性取り込み増強および／または移入コンピテントペプチド（例えば、シグナルまたは局在ペプチド）と複合体を形成していようといまいと）が、静脈内、動脈内、腹腔内に注入されるか、または腫瘍内への直接注入により、または微量注入法により細胞内に投与される。腫瘍内への本発明の組成物の直接注入は、インビボでの乳癌または卵巣腫瘍には好ましい。従来の定位法は、腫瘍または細胞への直接注入には有用であろう。鼻内、直腸内、または膣内送達経路による投与もまた有用であろう。カテーテルまたはステントによる投与もまた、ＰＴＴＧ−Ｃ関連ポリヌクレオチドまたはＰＴＴＧ２をコードするポリヌクレオチドまたはＰＴＴＧ−ＣもしくはＰＴＴＧ２ペプチドを含む複合体を送達するのに有用であろう。
【０１３４】
他の好適な実施態様では、ＰＴＴＧ−ＣまたはＰＴＴＧ２ペプチド、またはＰＴＴＧ−Ｃ−またはＰＴＴＧ２−キメラまたは融合タンパク質を封入する、生分解性ポリマーのミクロスフェアまたはナノスフェア（例えば、ポリラクチド−コ−グリコリド；ＰＬＧＡ）の制御放出製剤が、被験哺乳動物に経口投与される。（例えば、ジュー（Ｚｈｕ， Ｇ．）ら、「注射用ポリ（ラクチド−コ−グリコリド）に封入されたタンパク質の安定化」、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １８：５２−５７ ［２０００］）。
【０１３５】
ある実施態様では、単離したおよび結晶化したＰＴＴＧ−ＣまたはＰＴＴＧ２ペプチドを、ペプチドのタンパク分解をインビボで阻害する多官能性架橋剤で架橋することができる。（ナヴィア（Ｎａｖｉａ， Ｍ．Ａ．）、「架橋タンパク質結晶を経口投与することによるタンパク質療法の方法」、米国特許第６，０１１，００１号）。
【０１３６】
哺乳動物の胸部または卵巣細胞の新生物細胞増殖および／または形質転換を阻害する方法のいくつかの有用な実施態様は、ＰＴＴＧカルボキシ末端関連ポリヌクレオチド（いくつかの実施態様では、発現ベクター中に含まれる）、またはＰＴＴＧカルボキシ末端（ＰＴＴＧ−Ｃ）ペプチドまたはその生物学的機能性断片を細胞に送達するのと同時に、またはその後に、さらに細胞障害性化学療法剤を投与することを含む。細胞内ＰＴＴＧ−Ｃペプチドの存在が、その細胞を細胞障害性化学療法剤に対して過剰感作にするため、医師は、細胞障害性化学療法剤の一般的な有効用量を、従来の用量に比較して、約１０〜１００倍低下させることができ、それによって非悪性組織に対する細胞障害性化学療法剤からの傷害を最小にすることができる。
【０１３７】
その結果、さらにＰＴＴＧカルボキシ末端関連ポリヌクレオチドまたはＰＴＴＧカルボキシ末端（ＰＴＴＧ−Ｃ）ペプチド（またはその生物学的機能性断片）を含む本発明の組成物を、インビボで被験者の細胞に送達することを特徴とする方法の他の実施態様では、抗癌薬物療法からの全身性毒性作用は、低い有効用量の細胞障害性化学療法剤での治療を受ける特定の被験者では低下する。従って、被験者にとっての生活の質および生存の見込みを改善することができる。
【０１３８】
細胞障害性化学療法剤は、特に限定されないが、パクリタキセル（タキソール）、５−フルオロウラシル、シスプラチン、カルボプラチン、メソトレキセート、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、または特に限定されないが、ブスルファン（１，４−ブタンジオールジメタンスルホネート；ミレラン（Ｍｙｌｅｒａｎ）、グラクソ・ウェルカム（Ｇｌａｘｏ Ｗｅｌｌｃｏｍｅ））、クロランブシル、シクロホスファミド、メルファラン、またはエチルエタンスルホン酸のような細胞障害性アルキル化剤を含む。細胞障害性化学療法剤は、従来法により、しかし所定の細胞障害性化学療法剤について従来の用量よりも約１０〜１００倍低い有効用量で、細胞に投与される。細胞障害性化学療法剤の投与は、生物学的活性ＰＴＴＧ−Ｃペプチドが、細胞内になお存在する限り、本発明の組成物の送達と同時であっても、またはその後であってもよい。
【０１３９】
ＰＴＴＧ（ＰＴＴＧ１）が介在する新生物細胞増殖および／または形質転換を阻害する本発明の方法では、哺乳動物細胞は、ＰＴＴＧ１タンパク質をコードする遺伝子であるＰＴＴＧ１を過剰発現する細胞である。細胞によるＰＴＴＧ１過剰発現の検出は本発明の方法の実施に必須でも必要でもないが、過剰発現を含むＰＴＴＧ１発現のレベルは、当業者には検出可能である。ＰＴＴＧ１発現の検出は、例えば、本明細書に記載される本発明の抗ＰＴＴＧ−Ｃ抗体、または他の抗ＰＴＴＧ特異的抗体を使用して、ＰＴＴＧ１タンパク質の免疫化学的測定法によって達成される。あるいは、生物的試料（例えば、組織生検材料）に存在するＰＴＴＧ特異的ｍＲＮＡの増幅を使用して、ＰＴＴＧ１発現を検出することができる。これは、ＰＴＴＧ１特異的増幅産物の存在または非存在について、増幅および増幅産物の解析の既知の分子生物学的手法によって行われる。ＰＴＴＧ１遺伝子特異的増幅産物が存在すれば、この知見は、ＰＴＴＧ１遺伝子の発現を示し、本明細書に定義される被験者における新生物の細胞内成長の存在の診断となる。しかし、陰性（ＰＴＴＧ特異的増幅産物がない）の解釈には、解析は好ましくはハウスキーピング遺伝子（例えば、β−アクチン、ホスホフルクトキナーゼ（ＰＦＫ）、グリセロアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ、またはホスホグリセリン酸キナーゼをコードする遺伝子）に特異的な核酸の対照増幅によって行われる。ハウスキーピング遺伝子の発現が試料中に検出されさえすれば、ＰＴＴＧ遺伝子発現が存在しないことは確実に容認される。使用される増幅および解析方法の感度の上昇に伴い、正常細胞分裂の検出可能なバックグラウンドから、新生物、過形成、細胞学的異形成、または前癌状態細胞の成長もしくは増殖を充分に区別するために、ハウスキーピング遺伝子の発現に対するＰＴＴＧ遺伝子発現のレベルを測定することは、ますます望ましくなっている。ＰＴＴＧ発現対ハウスキーピング遺伝子発現の比は、例えば、リアルタイムＰＣＲ法または密度計測による測定および増幅後の電気泳動バンドの解析によって求められる。ＰＴＴＧ１発現対ハウスキーピング遺伝子発現の比が、正常細胞標準範囲を超えるか、および／または異常（例えば、新生物性）細胞標準範囲に接近したら、これは、新生物、過形成、細胞学的異形成、または前癌状態細胞の成長もしくは増殖の特徴である、ＰＴＴＧ１遺伝子産物の過剰発現を示している。
【０１４０】
生物的試料中のＰＴＴＧ特異的ｍＲＮＡは、適切な増幅方法により増幅される。例えば、逆転写酵素介在ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を利用して、ＰＴＴＧ特異的核酸が増幅される。簡単に述べると、２つの酵素を増幅プロセスにおいて使用するが、試料中のＰＴＴＧ特異的ｍＲＮＡ鋳型からＰＴＴＧ特異的ｃＤＮＡを転写するために逆転写酵素を使用し、そしてｃＤＮＡを増幅してＰＴＴＧ遺伝子特異的増幅産物を生成するために、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｔａｑポリメラーゼ）およびＰＴＴＧ特異的プライマーを使用する。有限サイクルのＰＣＲの使用によって、半定量的結果が得られる。（例えば、ゲルファンド（Ｇｅｌｆａｎｄ）ら、「熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ−高温逆転写による逆転写」、米国特許第５，３１０，６５２号；５，３２２，７７０号；ゲルファンド（Ｇｅｌｆａｎｄ）ら、「温度選択的ＲＴ−ＰＣＲにおける異例のヌクレオチド置換」、米国特許第５，６１８，７０３号）。
【０１４１】
あるいは、単一酵素のＲＴ−ＰＣＲを利用して、ＰＴＴＧ遺伝子特異的核酸を増幅する。現在単一反応において逆転写とポリメラーゼ機能の両方を実行するために、単一酵素が存在する。例えば、パーキン・エルマー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）の組換えサームス・サーモフィルス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）（ｒＴｔｈ）酵素（ロシュ・モレキュラー（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ））、または他の類似酵素が市販されている。
【０１４２】
リアルタイムＲＴ−ＰＣＲを使用して、ＰＴＴＧ特異的核酸を増幅することができる。簡単に述べると、これは、ＰＴＴＧ遺伝子発現とハウスキーピング遺伝子（すなわち、正常細胞と異常（例えば、悪性腫瘍）細胞で、ほぼ同じレベルで発現される遺伝子、例えば、β−アクチン、ホスホフルクトキナーゼ、グリセロアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ、またはホスホグリセリン酸キナーゼをコードする遺伝子）の発現との比に基づく、定量的遺伝子解析である。ＰＴＴＧとハウスキーピング遺伝子の発現の比は、正常細胞と異常細胞の基準として日常的に確立されるが、この基準的発現比は、所定の試料中の「ハウスキーピング」遺伝子の発現に対するＰＴＴＧ遺伝子の発現が、「正常」であるか「上昇している」か（後者は、「過剰発現」を示し、新生物、過形成、細胞学的異形成、または前癌状態細胞の成長もしくは増殖の存在の診断である）を決定する比較に使用される。この実施態様において、この比は診断にとって重要であり、定量的遺伝子発現解析を構成する。この実施態様は、パーキン・エルマーＡＢＩプリズム７７００（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ７７００）、いわゆるライトサイクラー（Ｌｉｇｈｔ Ｃｙｃｌｅｒ）（ロシュ・モレキュラー（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ））、および／または他の類似装置のような市販の装置により行われる、いわゆるリアルタイム定量的ＰＣＲを利用する。場合により、例えば、ｒＴｔｈ酵素を利用する単一酵素ＲＴ−ＰＣＲ法をリアルタイムＰＣＲシステムに使用することができる。好ましくは、増幅および解析は、尿沈降物試料からのｍＲＮＡの自動抽出、これに続くリアルタイムＰＣＲ、およびＴａｑＭａｎまたはモレキュラービーコン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｅａｃｏｎ）プローブのようなプローブを用いる増幅産物の蛍光検出により、自動式で行われる。一般的にはこの装置は、さらに別の増幅または解析工程なしにＰＣＲ中またはその直後に、定量解析結果を提供するソフトウェアを含む。
【０１４３】
あるいは、転写介在増幅（ＴＭＡ）を利用して、ＰＴＴＧ遺伝子特異的核酸を増幅する。（例えば、カミサンゴ（Ｋ． Ｋａｍｉｓａｎｇｏ）ら、「転写介在増幅およびハイブリダイゼーション保護測定法によるＢ型肝炎ウイルスの定量的検出」、Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ３７（２）：３１０−１４ ［１９９９］；ヒロセ（Ｍ． Ｈｉｒｏｓｅ）ら、「転写介在増幅およびハイブリダイゼーション保護測定法によるテロメラーゼ活性の新しい測定法」、Ｃｌｉｎ． Ｃｈｅｍ． ４４（１２） ２４４６−５２ ［１９９８］）。ｃＤＮＡの増幅のためにＲＴ−ＰＣＲを利用するよりも、ＴＭＡではＰＴＴＧ特異的（標的配列）ＲＮＡを認識するプローブを使用する；次の工程において、プローブ中に組み立てたプロモーター配列から、ＲＮＡポリメラーゼは反復的にｃＤＮＡ中間体を転写し、事実上、元のＲＮＡ転写体および作成される任意の新しいコピーを、ＲＴ−ＰＣＲの感度に近い感度レベルで増幅する。この反応は、ＰＣＲのような異なる温度を通るサイクルではなく、等温（１つの温度）で起こる。
【０１４４】
他の有用な増幅方法は、逆転写酵素介在リガーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＬＣＲ）を含むが、これは、ＲＴ−ＰＣＲと類似した有用性を持つ。ＲＴ−ＬＣＲは、逆転写酵素がｍＲＮＡからｃＤＮＡを生成し、次にＤＮＡリガーゼが、標的ｃＤＮＡに結合した後、近接した合成オリゴヌクレオチドを連結することに依存する。
【０１４５】
被験体のＰＴＴＧ遺伝子特異的核酸セグメントの増幅は、本明細書に提供されるように、ＰＴＴＧ遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプライマーおよびプライマーセットを用いて達成される。
【０１４６】
場合により、高処理量解析は、複数のプライマーセット、例えば、ＰＴＴＧ遺伝子特異的核酸に対するプライマーだけでなく、追加の診断情報が得られるハウスキーピング遺伝子（対照）、またはＭＡＧもしくはテロメラーゼのような他の潜在的診断マーカー（例えば、腫瘍遺伝子）の増幅発現産物に対するプライマーも同様に利用して、当該分野では公知のＰＣＲ多重化法により達成されるであろう。（例えば、リン（Ｚ． Ｌｉｎ）ら、「多数の遺伝子座での複数の遺伝子型測定法」、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９３（６）：２５８２−８７ ［１９９６］；デメトリュー（Ｄｅｍｅｔｒｉｏｕ）ら、「肝臓新生物疾患を引き起こす遺伝子の検出のための方法とプローブ」、米国特許第５，８６６，３２９号）。
【０１４７】
ハイブリダイゼーション解析は、厳密性の適切な条件下で、相補的ヌクレオチド配列を含む１本鎖ＰＴＴＧ特異的核酸増幅産物とハイブリダイズする、１つ以上のＰＴＴＧ特異的プローブを利用する、増幅産物を解析する好ましい方法である。ハイブリダイゼーションとは、染色体ＤＮＡにおいて天然に存在する結合と類似した水素結合による、核酸の相補鎖（すなわち、センス：アンチセンス鎖、またはプローブ：標的ＤＮＡ）の相互の結合を意味する。増幅産物は、一般的にはセルロースまたはニトロセルロース膜のような基質上に沈着され、次に標識ＰＴＴＧ特異的プローブと（場合により電気泳動後に）ハイブリダイズされる。従来のドットブロット、サザン、ノーザン、もしくは蛍光インサイチュー（ＦＩＳＨ）ハイブリダイゼーションプロトコール、液中ハイブリダイゼーション、ハイブリダイゼーション保護測定法、または他の半定量もしくは定量ハイブリダイゼーション解析法は、本発明のＰＴＴＧ遺伝子特異的プローブと一緒に便利に利用される。好ましいプローブに基づくハイブリダイゼーション条件は、約３７℃の温度、約２０％のホルムアミド濃度、および約５×標準食塩クエン酸液（ＳＳＣ；２０×ＳＳＣは、３Ｍ塩化ナトリウム、０．３Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０を含有する）の塩濃度を特徴とする。このような条件により、完全な相同性を必要とすることなく、プローブ配列と実質的な類似性を有する配列の同定が可能になる。「実質的な類似性」という句は、少なくとも５０％の相同性を共有する配列を意味する。所定のプローブを標的ＤＮＡとハイブリダイズさせるために使用される厳密性レベルは、当業者であれば容易に変化させることができる。好ましくは、ハイブリダイゼーション条件は、プローブとの相同性の程度が低い配列に対して識別しながら、プローブと少なくとも約６０％の相同性を有する配列の同定を可能にするように選択される。本明細書において、「プローブ」とは、１本鎖ＤＮＡもしくはＲＮＡ、または核酸類似体である。本発明のプローブは、好ましくは７〜５００個のヌクレオチド長、さらに好ましくは１４〜１５０個のヌクレオチド長、そして最も好ましくは少なくとも５０個のヌクレオチド長である。本プローブは、適切な厳密性のハイブリダイゼーション条件下で目的のＰＴＴＧ特異的１本鎖核酸にハイブリダイズするように、その長さの少なくとも一部について、少なくとも７〜１５個の近接するヌクレオチド長のＰＴＴＧ特異的ヌクレオチド配列を含む。ＰＴＴＧ特異的ヌクレオチド配列の例は、好ましくは（しかし必須ではなく）その５’および／または３’コード領域を含む、配列番号１、３、１０、１５、１８、１９、６２、６３、６５、６６、または６８のいずれかに記載される。さらに、本発明のＰＴＴＧ特異的ヌクレオチド配列の全ｃＤＮＡコード領域、または配列番号１、３、１０、１５、１８、１９、またはこれらのいずれかに相補的なヌクレオチド配列に対応する全配列をプローブとして使用することができる。例えば、特に限定されないが、配列番号８のような本発明のオリゴヌクレオチドプライマー配列を含むプローブを、ＰＴＴＧ特異的核酸増幅産物を検出または解析するためのプローブとして使用するために標識する��とができる。本発明の単離したＰＴＴＧ−Ｃ関連ポリヌクレオチドのいずれも、プローブまたはプライマーとして使用することができる。
【０１４８】
あるいは、増幅産物を解析するための電気泳動は、従来のスラブまたは毛細管電気泳動の種々の方法のいずれかを用いて、迅速かつ高感度に行われるが、これと共に、医師は場合により、特に限定されないが、放射性核種、ＵＶ吸収またはレーザー励起蛍光を含む、核酸断片検出の任意の促進手段の利用を選択することができる。（カパーニク（Ｋ． Ｋａｐａｒｎｉｋ）ら、「レーザー励起蛍光検出を伴う毛細管電気泳動によるＩｇＥ受容体遺伝子における（ＣＡ）１８ミクロサテライトリピートの迅速検出」、Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ １９（２）：２４９−５５ ［１９９８］；イノウエ（Ｈ． Ｉｎｏｕｅ）ら、「電界強度の段階的勾配を用いる毛細管電気泳動によるＤＮＡ配列決定産物の強化分離法」、Ｊ． Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ． Ａ． ８０２（１）：１７９−８４ ［１９９８］；ドビチ（Ｎ．Ｊ． Ｄｏｖｉｃｈｉ）、「毛細管電気泳動によるＤＮＡ配列決定」、Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ １８（１２−１３）：２３９３−９９ ［１９９７］；アラカワ（Ｈ． Ａｒａｋａｗａ）ら、「レーザー励起蛍光検出を伴う毛細管電気泳動による１本鎖コンフォメーション多形の解析」、Ｊ． Ｐｈａｒｍ． Ｂｉｏｍｅｄ． Ａｎａｌ． １５（９−１０）：１５３７−４４ ［１９９７］；ババ（Ｙ． Ｂａｂａ）、「毛細管電気泳動による疾患惹起遺伝子およびＤＮＡに基づく薬物の解析。ヒトの疾患のＤＮＡ診断および遺伝子治療に向かって」、Ｊ． Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ． Ｂ． Ｂｉｏｍｅｄ． Ａｐｐｌ． ６８７（２）：２７１−３０２ ［１９９６］；チャン（Ｋ．Ｃ． Ｃｈａｎ）ら、「短い毛細管を用いるＤＮＡ断片の高速電気泳動分離」、Ｊ． Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ． Ｂ． Ｂｉｏｍｅｄ． Ｓｃｉ． Ａｐｐｌ． ６９５（１）：１３−１５ ［１９９７］）。プローブは、当該分野において公知の方法により標識することができる。
【０１４９】
本明細書において、種々の文法上の語形での「標識」、「トレーサー」、および「指示手段」という用語は、検出可能なシグナルの生成に直接または間接に関係する単一原子および分子を意味する。任意の標識または表示手段は、ＰＴＴＧ特異的プローブ、プライマー、または増幅産物、またはＰＴＴＧタンパク質、ペプチド、ペプチド断片、または抗ＰＴＴＧ抗体分子に結合させることができる。この標識は、単独で、または追加の試薬と共に使用することができる。このような標識は、これら自体当該分野において公知である。この標識は、変性することなく抗体または抗原に化学結合して、有用な免疫蛍光トレーサーである蛍光色素（染料）を形成する蛍光標識剤であってよい。免疫蛍光解析法の説明は、「道具としての抗体」、マーチャロニス（Ｍａｒｃｈａｌｏｎｉｓ）ら編、ジョン・ワイリー＆サンズ社（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｌｔｄ．）中のデルカ（ＤｅＬｕｃａ）の「免疫蛍光解析」、１８９−２３１ （１９８２）（これは、参照することにより本明細書に組み込まれる）に見い出される。特に限定されないが、ＳＹＢＲグリーンＩ、Ｙ１０−ＰＲＯ−１、チアゾールオレンジ、Ｈｅｘ（すなわち、６−カルボキシ−２’，４’，７’，４，７−ヘキサクロロフルオレセイン）、ピコグリーン、エダン（ｅｄａｎｓ）、フルオレセイン、ＦＡＭ（すなわち、６−カルボキシフルオレセイン）、またはＴＥＴ（すなわち、４，７，２’，７’−テトラクロロ−６−カルボキシフルオレセイン）を含む多様な蛍光染料のいずれも、場合により標識として使用することができる。（例えば、スケイズヴォル（Ｊ． Ｓｋｅｉｄｓｖｏｌｌ）とウエランド（Ｐ．Ｍ． Ｕｅｌａｎｄ）、「モノマー染料ＳＹＢＲグリーンＩを用いるレーザー励起蛍光検出を伴う毛細管電気泳動による２本鎖ＤＮＡの解析」、Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２３１（２０）：３５９−６５ ［１９９５］；イワハナ（Ｈ． Ｉｗａｈａｎａ）ら、「ＰＣＲ産物の内部蛍光標識法を用いる複数の蛍光ベースのＰＣＲ−ＳＳＣＰ解析」、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２１（３０）：５１０−１４， ５１６−１９ ［１９９６］）。
【０１５０】
標識はまた、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、グルコースオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼなどのような酵素であってもよい。あるいは、放射性核種が標識として利用される。基体への標識の結合、すなわち、核酸プローブ、抗体、ポリペプチド、およびタンパク質の標識法は、当該分野において公知である。例えば、本発明の抗体は、培地に提供される放射標識アミノ酸の代謝的摂取により標識することができる。例えば、ガルフレ（Ｇａｌｆｒｅ）ら、Ｍｅｔｈ． Ｅｎｚｙｍｏｌ．， ７３：３−４６ （１９８１）を参照のこと。活性化官能基によるタンパク質結合またはカップリングの従来手段は特に適用可能である。例えば、オーラミーズ（Ａｕｒａｍｅａｓ）ら， Ｓｃａｎｄ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， Ｖｏｌ． ８， 増刊． ７：７−２３ （１９７８）、ロッドウェル（Ｒｏｄｗｅｌｌ）ら， Ｂｉｏｔｅｃｈ．， ３：８８９−８９４ （１９８４）、および米国特許第４，４９３，７９５号を参照されたい。
【０１５１】
本発明のさらに別の実施態様では、本発明のＰＴＴＧポリペプチドとの特異的反応性を有する抗ＰＴＴＧ抗体が提供される。ＰＴＴＧタンパク質、ＰＴＴＧ−Ｃペプチド、またはＰＴＴＧ−Ｃの免疫原性断片を選択的または特異的に結合する抗体断片、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、またはＦ（ｖ）断片もまた、「抗体」の定義に包含される。
【０１５２】
本発明の抗体は、ＰＴＴＧポリペプチド、タンパク質またはその一部（ＰＴＴＧ−ＣペプチドまたはＰＴＴＧ−Ｃの免疫原性断片など）を抗原として使用して、当該分野において既知の方法により産生することができる。例えば、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体は、例えば、ハーロー（Ｈａｒｌｏｗ）とレーン（Ｌａｎｅ）、「抗体：実験室マニュアル」（コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）［１９８８］）（これは、参照することにより本明細書に組み込まれる）に記載されるように、当該分野において公知の方法により産生することができる。単離もしくは精製ＰＴＴＧタンパク質、ＰＴＴＧ−Ｃペプチド、および免疫原性ＰＴＴＧ−Ｃ断片は、このような特異的抗体を生成する上で免疫原として使用することができる。
【０１５３】
ＰＴＴＧタンパク質、ＰＴＴＧ−Ｃペプチド、またはそのポリペプチド類似体は、例えば、本明細書に記載される組換え発現系、沈降、ゲル濾過、イオン交換、逆相および親和性クロマトグラフィーなどを含む、種々の既知の生化学的手段により精製または単離される。他の公知の方法は、ドイッチャー（Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ）ら、「タンパク質精製へのガイド：酵素学における方法、１８２巻」、（アカデミック出版（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）、［１９９０］）（これは、参照することにより本明細書に組み込まれる）に記載されている。単離ＰＴＴＧタンパク質またはＰＴＴＧ−Ｃペプチドは、通常は天然のインビボ環境に関連する細胞成分および／または混入物を含まない。
【０１５４】
単離ＰＴＴＧ（ＰＴＴＧ１、ＰＴＴＧ２、またはＰＴＴＧ３）タンパク質またはＰＴＴＧ−Ｃペプチドもまた、化学合成することができる。例えば、合成ポリペプチドは、製造業者が提供する化学を利用して、アプライド・バイオシステムズ社（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ， Ｉｎｃ．）のモデル４３０Ａまたは４３１Ａ自動ペプチド合成機（フォスターシティー、カリホルニア州）を使用して産生することができる。あるいは、ＰＴＴＧは、天然の供給源から単離または精製することができ、そしてＰＴＴＧ−Ｃペプチドは、ＰＴＴＧから（またはキメラタンパク質から）適切なプロテアーゼを使用して単離することができる。
【０１５５】
あるいは、ＰＴＴＧ（例えば、ＰＴＴＧ１、ＰＴＴＧ２、またはＰＴＴＧ３）またはＰＴＴＧ−Ｃポリペプチドは、組換え法により誘導、例えば、本明細書に記載される本発明の方法により、ＰＴＴＧ−ＣをコードするポリペプチドまたはＰＴＴＧ２をコードするポリペプチドを発現するように遺伝子修飾された哺乳動物細胞により産生することができる。組換え法は、例えば、サムブルーク（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、上記、（１９８９）に記載されるように、公知である。本発明のＰＴＴＧまたはＰＴＴＧ−Ｃポリペプチドを調製するための手段の例は、目的のＰＴＴＧタンパク質またはＴＰ−Ｃペプチドをコードする核酸を、細菌細胞、酵母細胞、両生類細胞（すなわち、卵母細胞）、または哺乳動物細胞（本明細書に後述される本発明の哺乳動物宿主細胞など）のような適切な宿主細胞で、当該分野において公知の方法を使用して発現させ、そして発現したポリペプチドを再度公知の方法を使用して回収することである。
【０１５６】
目的の種々のＰＴＴＧ−Ｃ断片の免疫原性は、日常的なスクリーニングにより測定される。あるいは、合成ＰＴＴＧ（例えば、ＰＴＴＧ１、ＰＴＴＧ２、またはＰＴＴＧ３）またはＰＴＴＧ−Ｃポリペプチドまたはその断片を調製（市販の合成機を使用して）して、免疫原として使用することができる。アミノ酸配列は、当該分野において公知の方法により解析して、これらが、対応するポリペプチドの疎水性ドメインをコードするか、または親水性ドメインをコードするかを決定することができる。キメラ、ヒト化、ＣＤＲグラフトまたは二官能性抗体のような改変抗体もまた、当該分野において公知の方法により産生することができる。このような抗体はまた、ハイブリドーマ、化学合成または組換え法（例えば、サムブルーク（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、上記、およびハーロー（Ｈａｒｌｏｗ）とレーン（Ｌａｎｅ）、上記に記載される）により産生することができる。抗ペプチドおよび抗融合タンパク質抗体の両方とも使用することができる。（例えば、バホウス（Ｂａｈｏｕｔｈ）ら、Ｔｒｅｎｄｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． Ｓｃｉ． １２：３３８ ［１９９１］；アウスベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）ら、「分子生物学における現行プロトコール」（ジョン・ワイリーとサンズ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ）、これは、参照することにより本明細書に組み込まれる）、ニューヨーク州、［１９８９］を参照のこと）。
【０１５７】
こうして産生される抗体は、特に、組織または血管内液のような、哺乳動物（好ましくはヒト）の生物的試料中に存在するＰＴＴＧタンパク質、ＰＴＴＧ−Ｃペプチド、またはその免疫原性断片のレベルを検出するために、診断または検定の方法および系において使用することができる。これは、例えば、ＰＴＴＧ発現のレベルを測定するのに有用である。このような抗体はまた、本発明のＰＴＴＧタンパク質またはＰＴＴＧ−Ｃペプチドの免疫親和性または親和性クロマトグラフィー精製のために使用することができる。さらに、細胞の表面上または細胞内（核内など）のいずれかのＰＴＴＧタンパク質またはＰＴＴＧ−Ｃペプチドの存在を検出するための方法が、本明細書において企図されるが、この方法は、細胞をＰＴＴＧタンパク質またはＰＴＴＧ−Ｃペプチドに特異的に結合する抗体と、ＰＴＴＧタンパク質またはＰＴＴＧ−Ｃペプチドへの抗体の特異的結合が可能な条件下で接触させて、ＰＴＴＧまたはＰＴＴＧ−Ｃに結合した抗体の存在を検出し、それによって細胞の表面上または細胞内のＰＴＴＧまたはＰＴＴＧ−Ｃポリペプチドの存在を検出することを特徴とする。このようなポリペプチドの検出に関して、抗体は、インビトロ診断もしくは測定方法、またはインビボイメージング方法のために使用することができる。
【０１５８】
試料中の標的ＰＴＴＧまたはＰＴＴＧ−Ｃポリペプチドのインビトロ検出に有用な免疫学的方法は、例えば、当該分野において公知のＥＬＩＳＡ、免疫蛍光測定法（ＩＦＡ）、パンデックス（Ｐａｎｄｅｘ）微蛍光測定法、凝集測定法、フローサイトメトリー、血清診断測定法および免疫組織化学染色法を含む。例えば、検出可能なマーカーを、直接または間接的に抗体に結合させることができる。有用なマーカーは、例えば、放射性核種、酵素、蛍光原、色素原、および化学発光標識物を含む。
【０１５９】
本発明の抗ＰＴＴＧまたは抗ＰＴＴＧ−Ｃ抗体はまた、本明細書において、生存動物、ヒト、もしくは生物学的組織、またはそこから単離された液体中のＰＴＴＧ１ポリペプチドの活性を調節するための使用が企図される。従って、担体と、本発明のＰＴＴＧポリペプチドへの結合から、天然のリガンドまたは他のＰＴＴＧ結合タンパク質を阻止するのに有効な、ＰＴＴＧポリペプチドに対する特異性を有するある量の抗体を含む組成物が本明細書において企図される。例えば、細胞の表面上に存在し、そして配列番号２、４、９、１４、１６、または１７に示されるアミノ酸配列を含むＰＴＴＧポリペプチドの細胞表面エピトープのアミノ酸配列と実質的に同じアミノ酸配列を有する、ＰＴＴＧ１ポリペプチド分子のエピトープに対するモノクローナル抗体は、この目的に有用であろう。
【０１６０】
本発明はまた、本明細書に記載の本発明のＰＴＴＧ−Ｃ関連ポリヌクレオチド含有組成物を含む、リンパ球および非リンパ球細胞（例えば、胸部または卵巣細胞）を含む、トランスフェクション、形質導入、またはそれ以外の形質転換された哺乳動物宿主細胞に関する。本発明の細胞は、被験哺乳動物に含まれるか、またはインビトロで培養される。好適な実施態様には、本発明のＰＴＴＧ−Ｃ関連ポリヌクレオチドを転写単位中に含む、発現ベクターを含む哺乳動物宿主細胞が含まれる。好ましくは、この細胞により生成物が発現されるが、この生成物は、最も好ましくは（しかし必須ではなく）、ＰＴＴＧ１介在新生物性細胞増殖および／または形質転換をダウンレギュレートするように機能する、生物学的活性ＰＴＴＧ−Ｃペプチドである。適切な宿主細胞をトランスフェクション、形質導入、または形質転換するインビトロおよびインビボ方法は、一般的に当該分野で公知である。細胞をインビトロで培養する方法も公知である。トランスフェクション、形質導入、または形質転換法の例には、例えば、ウイルスベクターを利用する感染（例えば、米国特許第４，４０５，７１２号および４，６５０，７６４号を参照のこと）、リン酸カルシウムトランスフェクション（米国特許第４，３９９，２１６号および４，６３４，６６５号を参照のこと）、デキストラン硫酸トランスフェクション、電気穿孔法、リポフェクチン（例えば、米国特許第４，３９４，４４８号および４，６１９，７９４号を参照のこと）、サイトフェクション（ｃｙｔｏｆｅｃｔｉｏｎ）、微粒子衝撃などを含む。異種核酸は、場合により染色体外（すなわち、エピソームの）維持を可能にする配列を含んでもよいか、または異種ＤＮＡは、宿主のゲノムへの組み込みを引き起こしてもよい（宿主細胞における安定な維持を確保するための代替手段として）。
【０１６１】
本発明はさらに、ＰＴＴＧポリペプチド（特に、本明細書に前記される、ＰＴＴＧ−Ｃペプチドおよびその機能性断片）をコードする外因性核酸を発現できる本発明の哺乳動物細胞を含むトランスジェニック非ヒト哺乳動物を提供する。本明細書において、「外因性核酸」という用語は、宿主本来のものではないか、または本来の環境以外での宿主に（例えば、遺伝子改変ＤＮＡ作成体の一部として）存在する、核酸配列を意味する。トランスジェニック非ヒト哺乳動物を作り出す方法は、当該分野において公知である。一般的には、受精卵の前核にインビトロで外来の、すなわち異種もしくは同種のＤＮＡもしくはハイブリッドＤＮＡ分子を微量注入して、次に微量注入した受精卵を偽妊娠の雌の生殖管に移して分娩まで妊娠させる。（例えば、クリムペンフォート（Ｐ．Ｊ．Ａ． Ｋｒｉｍｐｅｎｆｏｒｔ）ら、「成熟Ｔ細胞が涸渇したトランスジェニックマウスおよびトランスジェニックマウスの作成方法」、米国特許第５，１７５，３８４号および５，４３４，３４０号；クリムペンフォート（Ｐ．Ｊ．Ａ． Ｋｒｉｍｐｅｎｆｏｒｔ）ら、「成熟リンパ球系細胞が涸渇したトランスジェニックマウス」、米国特許第５，５９１，６６９号）。あるいは、トランスジェニック非ヒト哺乳動物の産生方法は、発現ベクターを用いる雌性または雄性生殖細胞の遺伝子修飾でもよく、次にこの生殖細胞を使用して接合体を産生し、これを妊娠、分娩させる。生じる子を所望の表現型に関して選択される。これらの子は、さらに繁殖またはクローン化して、所望の表現型を持つトランスジェニック動物の追加の世代を生みだすことができる。本発明のトランスジェニック非ヒト哺乳動物は、好ましくは（しかし必須ではなく）、新生物細胞増殖および／または形質転換を阻害する方法の実施に使用するために採取できる、比較的大量のＰＴＴＧ−Ｃペプチドを産生する、ウシ、ヒツジ、ブタ、ウマなどのような大型動物である。
【０１６２】
最も好ましくは、トランスジェニック非ヒト哺乳動物は、本発明のＰＴＴＧ−Ｃペプチドが分泌される乳汁を産生する雌である。そしてＰＴＴＧ−Ｃペプチドは、この乳汁から精製される。（例えば、クリスタ（Ｃｈｒｉｓｔａ， Ｌ．）ら、「乳汁分泌トランスジェニックマウスの乳腺におけるヒト肝癌−腸−膵／膵関連タンパク質（ＨＩＰＰＡＰ）遺伝子の高発現、乳汁への分泌およびＨＩＰ／ＰＡＰレクチンの精製」、Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２６７（６）：１６６５−７１ ［２０００］；ソボレブ（Ｓｏｂｏｌｅｖ， Ａ．Ｓ．）ら、「マウスおよびヒツジ乳腺のインビボでの受容体介在性トランスフェクション」、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７３（１４）：７９２８−３３ ［１９９８］；チャン（Ｚｈａｎｇ， Ｋ．）ら、「ヒト第ＩＸ凝固因子のための乳腺特異的発現ベクターの作成およびそのヤギ乳汁への分泌発現」、Ｃｈｉｎ． Ｊ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １３（４）：２７１−６ ［１９９７］；クラーク（Ｃｌａｒｋ， Ａ．Ｊ．）、「トランスジェニック動物の乳腺における遺伝子発現」、Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． Ｓｙｍｐ． ６３：１３３−４０ ［１９９８］；ニーマン（Ｎｉｅｍａｎｎ， Ｈ．）ら、「トランスジェニックヒツジの乳腺におけるヒト第ＶＩＩＩ血液凝固因子の発現」、Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｒｅｓ． ８（３）：２３７−４７ ［１９９９］）。
【０１６３】
好適なトランスジェニック雌哺乳動物を入手するための方法は、一般的には、例えば適切なβ−ラクトグロブリンプロモーターにより調節される転写単位内に、ＰＴＴＧ−Ｃペプチドをコードするポリ核酸が、乳分泌シグナルペプチドをコードするポリヌクレオチドと、キメラとして結合している発現ベクターでのトランスフェクションを利用するものであるが、このため乳特異的発現によって、キメラポリペプチドが得られ、ここから所望のＰＴＴＧ−Ｃペプチドセグメントがタンパク質分解で取りだされて精製される。
【０１６４】
本発明はまた、新生物の細胞増殖処理用キットに関する。このキットは、新生物細胞増殖および／または形質転換を阻害する本発明の方法を実施するのに有用である。このキットは、少なくとも１つの本発明の組成物を含む材料または成分の集合である。すなわち、いくつかの実施態様では、このキットは、前記のように、ＰＴＴＧ−Ｃ関連ポリヌクレオチドおよび／またはＰＴＴＧ−Ｃペプチドを含む。他の実施態様では、このキットは基本的に、（配列番号６４）の少なくともアミノ酸残基１〜１８０を含む（配列番号６４）のアミノ酸残基１〜１９１、またはその断片よりなるペプチドのような、哺乳動物ＰＴＴＧ２ペプチドをコードするＤＮＡセグメントを含むポリヌクレオチド、例えば、（配列番号６３）よりなるポリヌクレオチドもしくはその縮重配列、またはｈＰＴＴＧ２と少なくとも約９５％の配列相同性を有する哺乳動物ＰＴＴＧ２ペプチドまたは機能性断片をコードするポリヌクレオチドを含む。あるいは、このキットは基本的に、（配列番号６４）の少なくともアミノ酸残基１〜１８０を含む（配列番号６４）のアミノ酸残基１〜１９１よりなるペプチドもしくはその断片、または（配列番号６４）の少なくともアミノ酸残基１〜１８０を含む、ｈＰＴＴＧ２と少なくとも約９５％の配列相同性を有する哺乳動物ＰＴＴＧ２ペプチドもしくはその機能性断片を含む、組成物を含んでもよい。
【０１６５】
本発明のキットに形成される成分の正確な性質は、その意図される目的に依存する。例えば、キットのいくつかの実施態様は、培養哺乳動物細胞を治療する目的のために設定される。他の実施態様は、インビボで哺乳動物細胞を治療する目的のために、すなわち治療を必要とする被験哺乳動物（例えば、悪性腫瘍の被験動物）を治療するために設定される。好適な実施態様は、乳癌または卵巣癌の治療に向けられる。最も好適な実施態様では、キットは特にヒト被験者の治療を目的として設定される。ＰＴＴＧ２ペプチドまたはＰＴＴＧ２ペプチド断片またはＰＴＴＧ２ペプチドまたは断片をコードするポリヌクレオチドを含む実施態様、キットはまた、新生物細胞増殖および／または形質転換を阻害するための組成物の使用説明書を含む。
【０１６６】
キットのいくつかの実施態様は、ＰＴＴＧカルボキシ末端関連ポリペプチドに機能的に連結した培養ＨＩＶベクターを含む組成物；およびＴリンパ球の新生物細胞増殖および／または形質転換を阻害するための該組成物の使用説明書を含む、新生物細胞増殖および／または形質転換の治療のためのキットを含む。
【０１６７】
また、本発明には、ＰＴＴＧカルボキシ末端関連ポリヌクレオチドに機能的に連結した培養ＨＩＶベクターを含む組成物；およびＴリンパ球の活性化を阻害する組成物の使用説明書を含む、免疫抑制療法のためのキットが含まれる。
【０１６８】
使用説明書がキットに含まれる。「使用説明書」は、一般的には、試薬濃度または少なくとも１つの測定法パラメーター（例えば、一般的には意図される目的のための、混合すべき試薬と試料の相対量、試薬／試料混合物の維持時間、温度、緩衝液条件など）を説明する具体的な表現を含む。
【０１６９】
場合により、キットはまた、希釈液、緩衝液、薬剤学的に許容される担体、検体容器、シリンジ、ステント、カテーテル、ピペット操作用または測定用器具、試料の濃縮、沈降、または分画用の用具、または本発明の抗体、および／またはプライマーおよび／または対照用プローブのような、他の有用な成分を含む。
【０１７０】
キットに集成される材料または成分は、その操作性および有用性を維持する任意の便利かつ適切な方法で貯蔵されて、医師に提供することができる。例えば、成分は、溶解、脱水、または凍結乾燥された形態にすることができる；これらは、室温、冷蔵温度または凍結温度で提供することができる。
【０１７１】
成分は、一般的には適切なパッケージング材料に入れられる。本明細書において、「パッケージング材料」という用語は、本発明の核酸プローブまたはプライマーなどのようなキットの内容物を収容するために使用される１つ以上の物理構造を意味する。パッケージング材料は、公知の方法によって、好ましくは無菌で混入物を含まない環境を提供するように作成される。
【０１７２】
キットに利用されるパッケージング材料は、ポリヌクレオチドに基づくか、またはペプチドに基づく系で通常使用されるものである。本明細書において、「パッケージ」という用語は、個々のキット成分を保持することができる、ガラス、プラスチック、紙、箔などのような、適切な固体マトリックスまたは材料を意味する。すなわち、例えば、パッケージは、核酸またはペプチド成分を含む適切な量の本発明の組成物を入れるために使用されるガラスバイアルであってよい。パッケージング材料は、一般に内容物および／またはキットの目的および／またはその成分を表示する外側のラベルを有する。
【０１７３】
本発明は、以下の非限定例を参照することにより、さらに詳細に説明されるが、これらは他に記載がなければ、例えば、マニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）ら、「分子クローニング：実験室マニュアル」、コールドスプリングハーバーラボラトリープレス（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク州、米国（１９８２）；サムブルーク（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、「分子クローニング：実験室マニュアル（第２版）」、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリープレス（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク州、米国（１９８９）；デービス（Ｄａｖｉｓ）ら、「分子生物学における基本的方法」、エルゼビア・サイエンス出版（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ， Ｉｎｃ．）、ニューヨーク州、米国（１９８６）；または「酵素学における方法：分子クローニング法へのガイド、第１５２巻」、バーガー（Ｓ．Ｌ． Ｂｅｒｇｅｒ）とキマール（Ａ．Ｒ． Ｋｉｍｍｅｒｌ）編、アカデミック出版（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．）、サンジエゴ、米国（１９８７）に記載されるように、標準法を用いて実行した。
【０１７４】
（例）
例１：ＰＴＴＧ  ｃＤＮＡの単離
下垂体腫瘍発生に関与する分子機構を解明するために、差別ディスプレイ（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｄｉｓｐｌａｙ）ＰＣＲを使用して、下垂体腫瘍細胞中で差別的に発現されるｍＲＮＡを同定した（例えば、ライジンガー（Ｒｉｓｉｎｇｅｒ）ら、１９９４， Ｍｏｌｅｃ． Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ， １１：１３−１８；およびクー（Ｑｕ）ら、１９９６， Ｎａｔｕｒｅ， ３８０：２４３−２４７）。ＧＣおよびＧＨ４ 下垂体腫瘍細胞株（それぞれ、ＡＴＣＣ＃ＣＣＬ−８２と＃ＣＣＬ−８２．１）、および骨原性肉腫細胞株ＵＭ１０８（ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ−１６６３）を、１０％胎児牛血清補足ＤＭＥＭ中で増殖させた。正常なスプラーグ−ドーレイ（Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ）ラットの下垂体を、新たに切り出した。アールエヌイージー（ＲＮｅａｓｙ）（登録商標）キット（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ））を使用して、製造業者の説明書に従って、組織培養細胞と下垂体組織から総ＲＮＡを抽出した。ＲＮＡ調製物中の微量のＤＮＡ汚染物質を、ＤＮａｓｅ１（ゲンハンターコーポレーション（ＧｅｎＨｕｎｔｅｒ Ｃｏｒｐｏｒｔｉｏｎ））消化により除去した。ＭＭＬＶ逆転写酵素（ゲンハンターコーポレーション（ＧｅｎＨｕｎｔｅｒ Ｃｏｒｐｏｒｔｉｏｎ））と３つの固定プライマー（ａｎｃｈｏｒｅｄ ｐｒｉｍｅｒｓ）の１つ（ゲンハンターコーポレーション（ＧｅｎＨｕｎｔｅｒ Ｃｏｒｐｏｒｔｉｏｎ））を使用して、２００ｎｇの総ＲＮＡからｃＤＮＡを合成した。作成したｃＤＮＡを、ＰＣＲディスプレイで使用した。
【０１７５】
３つの下流の固定プライマーＡＡＧＣＴ１１Ｎ（配列番号１３；ここで、ＮはＡ、Ｇ、またはＣでもよい）を、ＰＣＲディスプレイのための４０個の上流の任意のプライマーとともに使用した。１２０個のプライマー対を使用して、下垂体腫瘍対正常下垂体でｍＲＮＡ発現をスクリーニングした。逆転写反応から作成したｃＤＮＡの１０分の１を、アンプリタク（ＡｍｐｌｉＴａｑ）ＤＮＡポリメラーゼ（パーキンエルマー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ））を使用して、１０ｍＭトリス（ｐＨ８．４）、５０ｍＭ  ＫＣｌ、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２ 、０．００１％ゼラチン、２μＭ  ｄＮＴＰ、０．２μＭの各プライマー、および１μｌ［３２Ｓ］ｄＡＴＰを含有する総量２０μｌ中で増幅した。ＰＣＲサイクルは、９４℃で３０秒、４０℃で２分、７２℃で３０秒を４０サイクル行った。生成物を、６％配列決定ゲルで分離し、乾燥ゲルを、コダックフィルムに２４〜４８時間露出した。
【０１７６】
現像後、下垂体腫瘍と正常下垂体から増幅したＤＮＡ断片を比較した。下垂体腫瘍に固有のバンドをゲルから切り出し、１００μｌの水の中で沸騰させ、グリコーゲン（ゲンハンターコーポレーション（ＧｅｎＨｕｎｔｅｒ Ｃｏｒｐｏｒｔｉｏｎ））の存在下でエタノール沈殿させて、ＤＮＡを抽出した。元々のプライマーセットと同じサイクル条件（ただし、ｄＮＴＰ濃度は２０μＭに上げた）を使用してＤＮＡを再増幅した。反応生成物を、１％アガロースゲルにかけ、臭化エチジウムで染色した。ゲルからバンドを切り出し、溶出（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ））し、ＴＡベクター（インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））にクローン化し、シーケナーゼ（ユーエスビー（ＵＳＢ））を使用して配列決定した。上記ＰＣＲ測定法の１２０プライマー対を使用して、下垂体腫瘍細胞中で差別的に発現されたと思われる１１個のＤＮＡバンドを同定した。ＰＣＲ産物をプローブとして使用してノーザンブロット解析により、これらのバンドを評価した。
【０１７７】
ノーザンブロット解析のために、２０μｇの総ＲＮＡを１％アガロースゲルで分画し、ナイロン膜にブロットし、クイックハイブ（Ｑｕｉｃｋｈｙｂ）溶液（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））を使用して、ランダムプライムドプローブとハイブリダイズさせた。洗浄後、膜をコダックフィルムに６〜７２時間露光させた。ノーザンブロット解析の結果として、２つのバンドについて下垂体腫瘍特異的シグナルが検出された。ＤＮＡ配列解析により、１つの配列はインスリン誘導性増殖応答タンパク質であり、もう１つの３９６塩基対断片（固定プライマーとして５’−ＡＡＧＣＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＧ−３’［配列番号１１］、そして任意のプライマー５’−ＡＡＧＣＴＴＧＣＴＧＣＴＣ−３’［配列番号１２］を使用して増幅した）は、ジーンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）中の既知の配列と、全く相同性を示さなかった。この３９６断片は、下垂体腫瘍細胞中で約１．３ｋｂの高度に発現されたｍＲＮＡを検出したが、正常下垂体や骨原性肉腫細胞中では検出されなかった。
【０１７８】
例２：ＰＴＴＧをコードするｃＤＮＡ配列の性状解析
この下垂体腫瘍特異的ｍＲＮＡをさらに性状解析するために、ラット下垂体腫瘍から単離されたｍＲＮＡを使用してｃＤＮＡライブラリーを構築した。ポリＡ＋ＲＮＡを下垂体腫瘍ＧＨ４ 細胞から、メッセンジャーＲＮＡ単離キット（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））を使用して製造業者の説明書に従って単離し、これを使用して、ザップエクスプレス（ＺＡＰ Ｅｘｐｒｅｓｓ）ベクター（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））中でＤＮＡライブラリーを構築した。このｃＤＮＡライブラリーは、ザップエクスプレス（ＺＡＰ Ｅｘｐｒｅｓｓ）（登録商標）ｃＤＮＡ合成およびギガパック（Ｇｉｇａｐａｃｋ）ＩＩＩゴールドクローニングキット（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））を使用して、製造業者の説明書に従って構築した。３９６ｂｐの差別ディスプレイされたＰＣＲ産物（ＴＡベクター中にクローン化した）をプローブとして使用して、このライブラリーをスクリーニングした。３次スクリーニング後、ヘルパーファージを使用してインビボ切り出しにより、陽性クローンを切り出した。挿入体を含有する得られたｐＢＫ−ＣＭＶファジミドを、サザンブロット解析により同定した。エキソＩＩＩ／ムング（ＥＸＯＩＩＩ／Ｍｕｎｇ）マメヌクレアーゼ欠失キット（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））を使用して製造業者の説明書に従って、単方向ネスティッド欠失をＤＮＡ挿入体中に作成した。挿入体ＤＮＡの両方の鎖を、シーケナーゼ（ユーエスビー（ＵＳＢ））を使用して配列決定した。
【０１７９】
例１に記載の３９６ｂｐのＰＣＲ断片をプローブとして使用して、９７４ｂｐのｃＤＮＡクローン（配列番号１）を単離し性状解析した。このｃＤＮＡを、下垂体腫瘍特異的遺伝子（ＰＴＴＧ）と名付けた。ＰＴＴＧの配列は、１９９アミノ酸（配列番号２）の読みとり枠を含有する。予測される開始コドンの上流のフレーム内停止コドンの存在は、ＰＴＴＧが完全なＯＲＦを含有することを示す。これは、例３に記載の遺伝子産物のインビトロ転写とインビトロ翻訳の両方を証明することにより確認した。
【０１８０】
例３：ＰＴＴＧのインビトロ転写と翻訳
センスおよびアンチセンスＰＴＴＧ  ｍＲＮＡを、それぞれＴ３およびＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））を使用してインビトロで転写した。ＤＮａｓｅＩ消化により、過剰の鋳型を除去した。反応は、３μｌのインビトロ転写ＲＮＡ、２μｌの３５Ｓ−メチオニン（デュポン（Ｄｕｐｏｎｄ））と２０μｌの溶解物を含有する総量２５μｌ中で、３０℃で６０分行った。翻訳産物を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１５％分離ゲルと５％スタッキングゲル）により分析し、コダックフィルムに１６時間露光した。
【０１８１】
結果は、インビトロ転写したＰＴＴＧセンスｍＲＮＡの翻訳により、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で約２５ＫＤのタンパク質が得られ、ｍＲＮＡの添加が無い時またはＰＴＴＧアンチセンスｍＲＮＡを使用した時は、タンパク質は生成されないことを示した。
【０１８２】
例４：ＰＴＴＧ  ｍＲＮＡ発現のノーザンブロット解析
ジーンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）の検索とタンパク質プロフィール分析（ブラスト（ＢＬＡＳＴ）プログラム検索（ナショナルセンター・フォー・バイオテクノロジーインフォメーション（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）を使用）は、ＰＴＴＧが既知の配列と相同性が無く、コードされるタンパク質は疎水性が高く、充分に認識された機能性モチーフを有さないことを示した。ＰＴＴＧ  ｍＲＮＡの組織発現パターンを、ノーザンブロット解析により調べた。ラットの複数組織ノーザンブロットをクロンテク（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）から購入した。８つの異なるラットの組織（心臓、脳、脾臓、肺、肝臓、骨格筋、腎臓および睾丸）から１レーン当たり約２μｇのポリＡ＋ＲＮＡを、変性ホルムアルデヒド１．ｌ２％アガロースゲルにかけ、ナイロン膜に移し、ＵＶで架橋した。膜をまず、完全長ＰＴＴＧ  ｃＤＮＡプローブとハイブリダイズさせ、切り離し、ヒトβ−アクチンｃＤＮＡ対照プローブに再ハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーションは、エクスプレスハイブ（ＥｘｐｒｅｓｓＨｙｂ）ハイブリダイゼーション溶液（クロンテク（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ））中で６０℃で１時間行った。２×ＳＳＣ、０．０５％ＳＤＳ中で室温で１５分、２回洗浄し、０．１％ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中で５０℃で１５分、２回洗浄した。ＰＴＴＧプローブについて露光時間は、２４時間であり、アクチンプローブは２時間であった。
【０１８３】
ノーザン測定法の結果は、睾丸が、下垂体腫瘍細胞以外の、ＰＴＴＧ  ｍＲＮＡを発現する唯一の組織であり、睾丸発現レベルは、下垂体腫瘍細胞（２０μｇ総ＲＮＡ、６時間露光）よりはるかに低い（２μｇポリＡ＋ｍＲＮＡ、２４時間露光）ことを示す。興味深いことに睾丸転写体（約１Ｋｂ）は、下垂体腫瘍中の転写体（１．３Ｋｂ）より短く、ｍＲＮＡは睾丸中で差別的にスプライスされ、１．３Ｋｂ転写体が、下垂体腫瘍細胞に特異的であることを示している。
【０１８４】
例５：ＮＩＨ３Ｔ３繊維芽細胞中のＰＴＴＧの過剰発現
ＰＴＴＧ  ｍＲＮＡは下垂体腫瘍細胞中で過剰発現されるため、このタンパク質が細胞増殖と形質転換に影響を与えるかどうかを調べた。ＰＴＴＧの全コード領域を含有する真核生物発現ベクターを、ＮＩＨ３Ｔ３繊維芽細胞中に安定にトランスフェクションした。
【０１８５】
ＰＴＴＧの全コード領域を、ｐＢＫ−ＣＭＶ真核生物発現ベクター（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））中のフレーム内にクローン化し、カルシウム沈殿法によりＮＩＨ３Ｔ３細胞中にトランスフェクションした。トランスフェクションの４８時間後、細胞を１：１０希釈し、１ｍｇ／ｍｌ  Ｇ４１８を含有する選択培地中で２週間増殖させ、個体コロニーを単離した。各コロニーから細胞抽出物を調製し、１５％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上で分離し、ナイロン膜上にブロットした。ＰＴＴＧの最初の１７アミノ酸をエピトープ（リサーチジェネティクス（Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ））として使用して、ポリクローナル抗体を作成した。抗体を１：５０００希釈し、上記の膜と室温で１時間インキュベートした。洗浄後、膜を、西洋ワサビペルオキシダーゼ標識２次抗体で、室温で１時間インキュベートした。ハイブリダイゼーションシグナルは、増強化学発光により検出した（イーシーエル（ＥＣＬ）検出装置、アマシャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ））。
【０１８６】
ＰＴＴＧの発現レベルを、このタンパク質の最初の１７アミノ酸に対して作成した上記特異的ポリクローナル抗体を使用して、免疫ブロット分析により追跡した。各コロニーの発現レベルは変動し、より高いタンパク質レベルを発現したクローンを、さらなる分析に使用した。
【０１８７】
例６：細胞増殖へのＰＴＴＧ発現の作用
非放射性細胞増殖測定法を使用して、細胞増殖に及ぼすＰＴＴＧタンパク質過剰発現の作用を調べた（例えば、モスマン（Ｍｏｓｓｍａｎｎ， Ｔ．）、１９８３， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈ．， ６５：５５−６３；およびカルミカエル（Ｃａｒｍｉｃｈａｅｌ）ら、１９８７， Ｃｅｎｃｅｒ Ｒｅｓ．， ４７：９４３−９４６）。細胞増殖は、セルタイター（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ）９６ＴＭ非放射性細胞増殖測定キット（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ））を使用して、製造業者の説明書に従って測定した。５０００個の細胞を９６ウェルプレートに接種（各測定法で各クローンにつき６ウェル）し、３７℃で２４〜７２時間インキュベートした。各時点で、１５μｌの色素溶液を各ウェルに加え、３７℃で４時間インキュベートした。次に、１００μｌの可溶化／停止溶液を各ウェルに加えた。１時間インキュベーション後、ウェルを混合し、５９５ｎｍの吸光度をＥＬＩＳＡリーダーを使用して記録した。５９５ｎｍの吸光度は、各ウェル中の細胞数と正比例する。
【０１８８】
３つの独立した実験を行った。ＰＴＴＧタンパク質を発現する３Ｔ３細胞の細胞増殖速度（テトラゾリウムのホルマザンへの細胞変換により測定した）は、ｐＣＭＶベクター単独を発現する３Ｔ３細胞と比較して２５〜５０％抑制され、ＰＴＴＧタンパク質は細胞増殖を阻害することを示した（データは示していない）。
【０１８９】
例７：形態形質転換とＮＩＨ３Ｔ３細胞の軟寒天増殖のＰＴＴＧ誘導
ＰＴＴＧタンパク質の形質転換性は、マンスレーヤー（ｍａｎｓｌａｙｅｒ）培養で細胞増殖巣を形成する能力と、軟寒天で非足場依存性増殖を示す能力により証明される（表１）。初代下垂体細胞は、複数の型の細胞の混合物であり、インビトロでは複製しないため、ＮＩＨ３Ｔ３細胞を使用した。軟寒天測定法（シュワブ（Ｓｃｈｗａｂ）ら、１９８５， Ｎａｔｕｒｅ ３１６：１６０−１６２）では、６０ｍＭの組織培養プレートを５ｍｌの軟寒天（２０％、２×ＤＥＥＭ、５０％ＤＥＥＭ、１０％胎児牛血清、２０％２．５％寒天、融解し、４５℃で合わせた）で被覆した。培地に懸濁した２ｍｌの細胞を、４ｍｌの寒天混合物と一緒にし、この混合物の１．５ｍｌを各プレートに加えた。細胞を、１０４ 細胞／プレートの密度で蒔き、１４日間インキュベートした後、コロニー数を数え、写真を取った。少なくとも４０細胞からなるコロニーのみを計測した。表１に示す値は、三重測定の平均±ＳＥＭである。
【０１９０】
表１３．ＰＴＴＧ  ｃＤＮＡ構築体でトランスフェクションしたＮＩＨ３Ｔ３細
胞によるコロニー形成
2004526404.tif 000016
【０１９１】
結果は、ＮＩＨ３Ｔ３親細胞とｐＣＭＶベクターでトランスフェクションした３Ｔ３細胞が軟寒天上でコロニーを形成しないが、ＰＴＴＧでトランスフェクションした３Ｔ３細胞は大きいコロニーを形成することを示す。さらに、ＰＴＴＧタンパク質を過剰発現している細胞では、細胞増殖巣の形質転換が観察されるが、ＰＴＴＧ挿入体の無いｐＣＭＶベクターを発現する細胞は、親３Ｔ３細胞と同様の形態を示した。
【０１９２】
例８：ＰＴＴＧがインビボで腫瘍発生であるかどうかを調べるための測定法
ＰＴＴＧがインビボで腫瘍発生であるかどうかを調べるために、ＰＴＴＧでトランスフェクションした３Ｔ３細胞を無胸腺ヌードマウスに皮下注射した。ＰＴＴＧまたはｐＣＭＶベクターのみでトランスフェクションした細胞の３×１０５ 個の細胞を、ＰＢＳに再懸濁し、ヌードマウスの皮下に注射した（各群５匹）。３週間目の最後に屠殺した動物から腫瘍を切り出し、重量を測定した。注射したすべての動物は、３週間以内に大きい腫瘍（１〜３グラム）を示した。結果を下の表１４に示す。ベクターのみでトランスフェクションした細胞を注射したマウスは、腫瘍を発生しなかった。これらの結果は、ＰＴＴＧがインビボで強力な形質転換遺伝子であることを明確に示す。
【０１９３】
表１４：ＰＴＴＧ  ｃＤＮＡ発現ベクターでトランスフェクションしたＮＩＨ３
Ｔ３細胞によるインビボ腫瘍発生
2004526404.tif 000017
【０１９４】
例９：ヒト癌細胞株はＰＴＴＧを発現する
種々のヒト細胞株中のＰＴＴＧの発現パターンを、複数のヒト癌細胞株ノーザンブロット（クロンテク（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ））を使用して調べた。試験した具体的な細胞株を下の表１５に示す。
【０１９５】
表１５．試験したヒト癌細胞株
2004526404.tif 000018
【０１９６】
上記表３に示した８つの細胞株のそれぞれから約２μｇのポリＡ  ＲＮＡを、変性ホルムアルデヒド１．２％アガロースゲルの各レーンにのせ、変性ゲル電気泳動により分離して無傷であることを確認し、ノーザンブロッティングにより電荷修飾したナイロン膜に移し、ＵＶ照射により固定した。レーン１〜８は、それぞれ前骨髄性白血病ＨＬ−６０、ヒーラ細胞株Ｓ３、ヒト絨毛性骨髄性白血病Ｋ−５６２、リンパ芽球性白血病ＭＯＬＴ−４、バーキットリンパ腫Ｒａｊｉ、結腸直腸腺腫ＳＷ４８０、肺癌Ａ５４９、および黒色腫Ｇ３６１からのＲＮＡを含有した。９．５、７．５、４．４、２．４および１．３５ｋｂのＲＮＡサイズマーカーの線は、ブロットの左端にインクで示し、サイズ標準物質として使用し、方向を示すために膜の左下に切り目を入れた。放射能標識したヒトβ−アクチンｃＤＮＡを、異なるバッチのポリＡ  ＲＮＡの一致のための対照プローブとして使用した。すべてのレーン中の２．０ｋｂの単一の対照バンドは確認のためである。
【０１９７】
サムブルーク（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）らが記載（その関連部分は、参照することにより本明細書に組み込まれる）したようにエクスプレスハイブ（ＥｘｐｒｅｓｓＨｙｂ）ハイブリダイゼーション溶液（クロンテク（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ））中で、ブロットに、完全長ラットＰＴＴＧ  ｃＤＮＡプローブ（配列番号１；９７４ｂｐ）を６０℃で１時間プローブ結合させた。サムブルーク（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、「分子クローニング：実験室マニュアル（第２版）」、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリープレス（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク州（１９８９）を参照されたい。次にブロットを、２×ＳＳＣ、０．０５％ＳＤＳ中で室温で１５分で２回洗浄し、０．１％ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中で５０℃で１５分で２回洗浄した。残りの実験法のさらなる詳細は、ペイ（Ｐｅｉ， Ｌ．）とメルメド（Ｍｅｌｍｅｄ Ｓ．）中に見いだされる（その関連部分は、参照することにより本明細書に組み込まれる）（ペイ（Ｐｅｉ， Ｌ．）とメルメド（Ｍｅｌｍｅｄ Ｓ．）、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ ４：４３３−４４１ ［１９９７］を参照されたい）。
【０１９８】
上記のようにノーザンブロット解析で試験した、特にリンパ腫、白血病、黒色腫および肺癌を含むすべての細胞は、ヒトＰＴＴＧ（すなわち、ＰＴＴＧ１）の発現を示した。
【０１９９】
例１０：ヒトＰＴＴＧ  ｃＤＮＡの分子クローニング
全ラットＰＴＴＧコード領域の放射能標識ｃＤＮＡ断片をプローブとして使用して、ヒト胎児肝ｃＤＮＡライブラリー（クロンテク（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、パロアルト（Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ）、カリホルニア州）を、マニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）らが記載したようにスクリーニングした（マニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）ら、「分子クローニング」、コールド・スプリング・ハーバー・プレス（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）、１９８９）。陽性のクローンからのｃＤＮＡ挿入体を、プラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ−ＳＫ（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ラホヤ（Ｌａ Ｊｏｌｌａ）、カリホルニア州）中にサブクローニングし、シーケナーゼ（Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ）キット（ユーエスバイオケミカル社（Ｕ．Ｓ． Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｒｐ．）、クリーブランド、オハイオ州）を使用して、配列解析に付した。
【０２００】
陽性クローン中に、６０６ｂｐを含有する完全な読みとり枠が見つかった。読みとり枠のヌクレオチド配列とラットＰＴＴＧのコード領域のヌクレオチド配列との相同性は、８５％である。この読みとり枠の翻訳産物とラットＰＴＴＧタンパク質とのアミノ酸配列比較は、７７％の同一性と８９％の相同性を示す。これらのクローンから得られるｃＤＮＡは、ラットＰＴＴＧのヒト同族体である。このライブラリーからは、より高い相同性を示す他のｃＤＮＡ断片は検出されなかった。
【０２０１】
例１１：ヒトＰＴＴＧ  ｍＲＮＡの組織分布
手術時に採取し液体窒素で凍結した、正常ヒト下垂体（ゾイオンリサーチ社（Ｚｏｉｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｃ．）、ウォーチェスター（Ｗｏｒｃｈｅｓｔｅｒ）、マサチューセッツ州）と新鮮なヒト下垂体腫瘍から、トリゾール試薬（Ｔｒｉｚｏｌ Ｒｅａｇｅｎｔ）（ギブコビーアールエル（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）、ゲーサーズバーグ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ）、メリーランド州）を使用して、総ＲＮＡを調製した。１％アガロースゲル電気泳動に、２０ｍｇの総ＲＮＡを使用した。正常な成人および胎児組織から、ならびに悪性腫瘍細胞株からのＲＮＡブロット（クロンテク（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、パロアルト（Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ）、カリホルニア州）を、完全なコード領域を含有する放射能標識したヒトｃＤＮＡ断片とハイブリダイズさせた。各細胞株から単離したＲＮＡを、ナイロン膜（アマシャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）、アーリントンハイツ（Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ Ｈｅｉｇｈｔｓ）、イリノイ州）に移し、放射能標識プローブと、６×ＳＳＣ、２×デンハルツ溶液、０．２５％ＳＤＳ中で、５５℃で一晩ハイブリダイズさせた。膜を、それぞれ室温で１５分、２回洗浄し、次に０．５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで６０℃で２０分洗浄し、オートラジオグラフィーを行った。オートラジオグラフィーは、コダックバイオメックス−エムアール（ＢＩＯＭＥＸ−ＭＲ）フィルム（イーストマンコダック（Ｅａｓｔｍａｎ Ｋｏｄａｋ）、ローチェスター（Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ）、ニューヨーク州）を使用して、強化スクリーンを用いて行った。ブロットを、蒸留水中で９５℃で２０分洗浄して切り離して、以後のプローブ結合用とした。
【０２０２】
ノーザンブロット解析の結果は、ＰＴＴＧが、ヒト胎児組織の肝臓で発現され、脳、肺および腎臓では発現されないことを示した。さらにＰＴＴＧは、正常なヒト成体組織の睾丸で強く発現され、胸腺で中程度に発現され、結腸と小腸で弱く発現される。脳、心臓、肝臓、肺、筋肉、卵巣、胎盤、腎臓、および膵臓では、ノーザン解析により全く発現が検出されなかった。
【０２０３】
いくつかのヒト癌細胞株中のＰＴＴＧの発現をまた、ノーザンブロットで分析した。調べたすべての癌細胞で、ＰＴＴＧは強く発現されていた。試験したヒト腫瘍細胞株を、下記の表１６に列挙する。
【０２０４】
表１６．試験したヒト腫瘍細胞株
2004526404.tif 000019
【０２０５】
例１２：正常下垂体および下垂体腫瘍におけるヒトＰＴＴＧ発現
ＲＴ−ＰＣＲを以下のように行った。５ｍｇの総ＲＮＡを１００ＵのＲＮａｓｅフリーＤＮａｓｅＩで室温で１５分処理した。ＤＮａｓｅＩを、６５℃で１５分インキュベートして不活性化した。次に試料を、オリゴ−ｄＴプライマーとスーパースクリプトＩＩ（ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩ）逆転写酵素（ギブコビーアールエル（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）、ゲーサーズバーグ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ）、メリーランド州）を使用する逆転写のために使用した。逆転写後、試料を、ｈＰＴＴＧ特異的プライマーとヒトシクロフィリン−Ａ特異的プライマーを内部対照として使用して、ＰＣＲスーマーミックス（ＰＣＲ ＳｕｐｅｒＭｉｘ）（ギブコビーアールエル（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）、ゲーサーズバーグ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ）、メリーランド州）を用いるＰＣＲ増幅に付した。
【０２０６】
ノーザンブロット解析は、ＰＴＴＧの発現レベルは、正常下垂体でも下垂体腫瘍でも非常に低いことを示した。従って比較ＲＴ−ＰＣＲを使用して、正常下垂体と下垂体腫瘍でのＰＴＴＧの発現を定量的に調べた。この試験の結果は、試験したほとんどの下垂体腫瘍（機能していない腫瘍、ＧＨ分泌性腫瘍、およびプロラクチノーマを含む）で、ＰＴＴＧの発現レベルは、正常下垂体より高いことを示した。
【０２０７】
例１３：ヒトＰＴＴＧのＮＩＨ３Ｔ３細胞への安定なトランスフェクション
ｈＰＴＴＧ  ｃＤＮＡの完全なコード領域を、哺乳動物発現ベクターｐＢＫ−ＣＭＶ（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ラホヤ（Ｌａ Ｊｏｌｌａ）、カリホルニア州）中に読みとり枠でサブクローニングし、リポフェクタミン（ギブコビーアールエル（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）、ゲーサーズバーグ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ）、メリーランド州）により製造業者のプロトコールに従って、ＮＩＨ３Ｔ３繊維芽細胞中にトランスフェクションした。トランスフェクションの２４時間後、細胞を連続希釈し、１ｍｇ／ｍｌＧ４１８を含有する選択培地中で２週間増殖させた。個々のクローンを単離し、選択培地中で維持した。ｈＰＴＴＧトランスフェクション細胞株とブランクベクターｐＢＫ−ＣＭＶをトランスフェクションした対照細胞から、総ＲＮＡを単離した。ノーザンブロットを行って、トランスフェクション細胞株中のｈＰＴＴＧの過剰発現を確認した。これらの細胞株を、以後の細胞増殖測定法ならびにインビトロとインビボの形質転換測定法で使用した。
【０２０８】
例１４：細胞増殖測定法
細胞増殖測定法は、セルタイター（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ）９６非放射性細胞増殖測定法キット（プロメガメディシン（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）、ウィスコンシン州）を使用して、製造業者のプロトコールに従って行った。５，０００個の細胞を９６ウェルプレートに接種し、３７℃で２４〜７２時間インキュベートした。各測定法で各クローンにつき８つのウェルを使用した。各時点で、１５ｍｌの色素溶液を各ウェルに加え、細胞を３７℃で４時間インキュベートした。インキュベーション後、１００μｌの可溶化／停止溶液を各ウェルに加え、プレートを室温で一晩インキュベートした。ＥＬＩＳＡリーダーを使用して５９５ｎｍで吸光度を測定した。
【０２０９】
対照とｈＰＴＴＧ過剰発現ＮＩＨ３Ｔ３細胞を使用して、この測定法を行った。結果は、ＰＴＴＧ発現ベクターでトランスフェクションした細胞の増殖が、ブランクベクターでトランスフェクションした細胞と比較して３０〜４５％低下したことを示した。これらの結果は、ＰＴＴＧタンパク質が細胞増殖を阻害することを明確に示している。
【０２１０】
例１５：インビトロとインビボの形質転換測定法
（ａ）インビトロ形質転換測定法
対照とｈＰＴＴＧトランスフェクション細胞を、軟寒天中で非足場依存性増殖について試験した。３ｍｌの軟寒天（２０％の２×ＤＭＥＭ、５０％ＤＭＥＭ、１０％胎児牛血清、および２０％の２．５％寒天、４５℃で融解し混合した）を、３５ｍｍの組織プレートに加えた。１０，０００個の細胞を１ｍｌの軟寒天と混合し、各プレートに加え、コロニーが計測できるまで２週間インキュベートし、写真を取った。
【０２１１】
（ｂ）インビボ形質転換測定法
ブランクベクターを含有する５×１０５ 個の細胞またはｈＰＴＴＧ発現細胞を、ヌードマウスに注入した。注入の２週間後マウスを屠殺し、注入部位の近くに形成された腫瘍を調べた。
【０２１２】
ＰＴＴＧ発現ベクターで安定にトランスフェクションされたＮＩＨ３Ｔ３細胞を、非足場依存性増殖測定法で試験すると、これらの細胞は、軟寒天上で大きなコロニー形成を示し、ＰＴＴＧタンパク質の形質転換能力を示していた。
【０２１３】
ＮＩＨ３Ｔ３細胞をヌードマウスに注入すると、これらは、注入後２週間以内にインビボの腫瘍形成を引き起こした。これらのデータは、ヒトＰＴＴＧはラットＰＴＴＧのように、強力形質転換遺伝子であることを示す。
【０２１４】
例１６：ＰＴＴＧ−Ｃ末端ポリペプチドによる細胞形質転換／腫瘍形成の阻害
細胞株：ＮＩＨ３Ｔ３細胞を、１０％胎児牛血清を補足した高グルコース（４．５ｇ／ｌ）ＤＭＥＭ（ギブコビーアールエル（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ））中で維持した。ヒーラ細胞を、１０％胎児牛血清（ＦＢＳ）を補足した低グルコース（１ｇ／ｌ）ＤＭＥＭ（ギブコビーアールエル（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ））中で維持した。Ｔ−４７ＤとＭＣＦ−７細胞を、１０％胎児牛血清（ＦＢＳ）と０．０１ｍｇ／ｍｌウシインスリン（シグマ（Ｓｉｇｍａ））を補足した高グルコース（１ｇ／ｌ）ＤＭＥＭ（ギブコビーアールエル（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ））中で維持した。すべての細胞株は、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）から得られた。
【０２１５】
ヒトおよび変異体ＰＴＴＧのＮＩＨ３Ｔ３への部位特異的突然変異誘発と安定なトランスフェクション。野生型ヒトＰＴＴＧポリペプチド（ｗｔＰＴＴＧ）のプロリンリッチなドメイン上の点突然変異を、ＰＣＲベースの部位特異的突然変異誘発により作成した。点突然変異を引き起こして、ｗｔＰＴＴＧタンパク質中でアミノ酸配列の変化Ｐ１６３Ａ、Ｓ１６５Ｑ、Ｐ１６６Ｌ、Ｐ１７０Ｌ、Ｐ１７２ＡおよびＰ１７３Ｌを引き起こす２つの合成オリゴヌクレオチド、５’−ＧＡＴＧＣＴＣＴＣＣＧＣＡＣＴＣＴＧＧＧＡＡＴＣＣＡＡＴＣＴＧ−３’（配列番号５）および５’ＴＴＣＡＣＡＡＧＴＴＧＡＧＧＧＧＣＧＣＣＣＡＧＣＴＧＡＡＡＣＡＧ−３’（配列番号６）を使用して、ｐＢｌｕｅ−Ｓｃｒｉｐｔ−ＳＫベクター（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））中にクローン化されたＰＴＴＧ  ｃＤＮＡを増幅した。次に、増幅した突然変異ｃＤＮＡ（ｍｕｔＰＴＴＧ）を哺乳動物発現ベクターｐＣＩ−ｎｅｏ（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ））中にクローン化した。トランスフェクション細胞中のｍｕｔＰＴＴＧの過剰発現は、ノーザン解析とＲＴ−ＰＣＲ、次に直接配列解析により確認した。ｗｔＰＴＴＧとｍｕｔＰＴＴＧをｐＣＩ−ｎｅｏ中にサブクローニングし、ベクターを使用して、ザング（Ｚｈａｎｇ， Ｘ．）ら、［１９９９ａ］が記載したようにＮＩＨ３Ｔ３細胞をトランスフェクションした。
【０２１６】
トランス活性化測定法。ｗｔＰＴＴＧ  ｃＤＮＡを、ｐＧＡＬ４（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））とフレーム内に融合し、ｐＧＡＬ４−ｗｔＰＴＴＧと呼び、欠失と突然変異分析の鋳型として使用した；ｍｕｔＰＴＴＧ  ｃＤＮＡはまた、ｐＧＡＬ４とフレーム内に融合し、ｐＧＡＬ４−ｍｕｔＰＴＴＧと呼んだ。ｐＧＡＬ４−ＶＰ１６を陽性対照として使用した。実験プラスミドを、ｐＬＵＣとｐＣＭＶ−β−Ｇａｌ（内部対照として）とともに、同時トランスフェクションした。細胞溶解物を、トランスフェクションの４８時間前に調製し、既に記載されているように（ワング（Ｗａｎｇ， Ｚ．）とメルメド（Ｍｅｌｍｅｄ， Ｓ．）、［２０００］；サムブルーク（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、「分子クローニング：実験室マニュアル（第２版）」、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリープレス（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク州、１０．２．１−１０．２．６ ［１９８９］）ルシフェラーゼ活性について測定した。
【０２１７】
野生型および変異体ヒトＰＴＴＧ  Ｃ末端ポリペプチドのための発現ベクターの構築
ｗｔＰＴＴＧおよびｍｕｔＰＴＴＧ  Ｃ末端ポリペプチド発現ベクターを作成するために、ｗｔＰＴＴＧとｍｕｔＰＴＴＧ  ｃＤＮＡの内部ＸｂａＩ部位およびこれらのｃＤＮＡの３’部分を、ＸｂａＩとＮｏｔＩ部位を介してｐＣＩ−ｎｅｏ（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、マジソン、ウィスコンシン州）中にクローン化した。これらのクローンでは、完全長ＰＴＴＧのＭ１４７のＡＴＧが開始ｃＤＮＡ使用されて、完全長ｗｔＰＴＴＧのヌクレオチド１４７〜２０２位に対応する５６アミノ酸残基のポリペプチドが作成される。
【０２１８】
ヒトＰＴＴＧ  Ｃ末端ペプチドの腫瘍細胞への安定なトランスフェクション。
野生型および変異体ヒトＰＴＴＧ  Ｃ末端発現構築体を、リポフェクチン（ギブコビーアールエル（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ））を用いて製造業者のプロトコールに従って、ヒーラ、ＭＣＦ−７およびＴ４７−Ｄ細胞中にトランスフェクションした。トランスフェクションの２４時間後、細胞を連続希釈し、Ｇ４１８（１ｍｇ／ｍｌ）で２週間選択した。個々のクローンを単離し、選択培地（１０％ＦＢＳと前述のようにＧ１４８［１ｍｇ／ｍｌ］を含有する各高または低グルコース）で維持し、トランスフェクションされた細胞から総ＲＮＡを抽出した。野生型と突然変異ＰＴＴＧ−Ｃ末端を、ＲＴ−ＰＣＲにより２つの合成オリゴヌクレオチド（１つはベクターｐＣＩ−ｎｅｏからの５’−非翻訳領域に特異的な、５’−ＧＧＣＴＡＧＡＧＴＡＣＴＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＣ−３’（配列番号７）で、他はＰＴＴＧ１  ｃＤＮＡの３’−翻訳領域に特異的な、５’−ＣＴＡＴＧＴＣＡＣＡＧＣＡＡＡＣＡＧＧＴＧＧＣＡＡＴＴＣＡＡＣ−３’（配列番号８））を使用して確認し、次に、直接配列決定を行った。
【０２１９】
インビトロコロニー形成とインビボ腫瘍発生。ＮＩＨ３Ｔ３安定トランスフェクション体を、ザング（Ｚｈａｎｇ， Ｘ．）ら、［１９９９ａ］に記載のようにインビボで試験した。トランスフェクションした細胞を、軟寒天中でザング（Ｚｈａｎｇ， Ｘ．）ら、［１９９９ａ］に記載のように非足場依存性増殖について試験した。ヒーラ細胞を３週間インキュベートし、ＭＣＦ−７（乳癌）とＴ−４７Ｄ（乳癌）細胞を２週間インキュベートした。腫瘍発生のインビボ測定のために、１×１０７ 個のＭＣＦ−７安定トランスフェクション体を、５００μｌのマトリゲル（ＭＡＴＲＩＧＥＬ）基底膜マトリックス（ベクトンディッキンソン（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）、ベッドフォード（Ｂｅｄｆｏｒｄ）、マサチューセッツ州）中に再懸濁し、ヌードマウスに皮下注射した（各群について３匹のマウス）。４週間後、動物の写真を取り、腫瘍を切り出し重量を測定した。
【０２２０】
調整培地中の塩基性繊維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）のＥＬＩＳＡ。ヒーラ細胞培地中の塩基性繊維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）濃度を、クアンチキンＨＳヒトＦＧＦ基礎免疫測定法キット（Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ ＨＳ Ｈｕｍａｎ ＦＧＦ Ｂａｓｉｃ Ｉｍｍｕｏａｓｓａｙ Ｋｉｔ）（アールアンドディーシステムズ（Ｒ ＆ Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、ミネアポリス、ミネソタ州）を使用して製造業者のプロトコールに従って測定した。細胞（１×１０５ ）を１００ｍｍの細胞培養プレートに蒔いた。７２時間後、培地を採取し、２００ｍｌをＥＬＩＳＡ測定法のために使用した。
【０２２１】
腫瘍誘導に及ぼす野生型ヒトＰＴＴＧと変異体ＰＴＴＧ過剰発現の作用。野生型ＰＴＴＧを過剰発現するＮＩＨ３Ｔ３細胞は、非足場依存性増殖測定法で大きいコロニーを形成し、無胸腺ヌードマウスに注入すると腫瘍を形成し、一方プロリンリッチな領域中の点突然変異（Ｐ１６３Ａ、Ｐ１７０Ｌ、Ｐ１７２ＡおよびＰ１７３Ｌ）はコロニーと腫瘍の形成を阻害することが、すでに証明された（ザング（Ｚｈａｎｇ， Ｘ．）ら、［１９９９ａ］）。各トランスフェクション体細胞株中のｗｔＰＴＴＧとｍｕｔＰＴＴＧ（Ｐ１６３Ａ、Ｓ１６５Ｑ、Ｐ１６６Ｌ、Ｐ１７０Ｌ、Ｐ１７２ＡおよびＰ１７３Ｌ）の過剰発現は、ノーザン解析とＲＴ−ＰＣＲ次に直接配列解析により確認した（データは示していない）。
【０２２２】
さらに、無胸腺ヌードマウス中に注入した過剰発現ＰＴＴＧトランスフェクション体は、すべての注入動物で２週間以内に腫瘍形成を引き起こした。３群のそれぞれの５匹のマウスに、（１）対照細胞株（ｐＧＡＬ４ベクター単独でトランスフェクションした）；（２）野生型ＰＴＴＧ過剰発現（ｗｔＰＴＴＧ）；または（３）変異体ＰＴＴＧ過剰発現（ｍｕｔＰＴＴＧ［Ｐ１６３Ａ、Ｓ１６５Ｑ、Ｐ１６６Ｌ、Ｐ１７０Ｌ、Ｐ１７２ＡおよびＰ１７３Ｌ］）でトランスフェクションした、３×１０５ のＮＩＨ３Ｔ３細胞を、皮下注射した。２週間後、マウスを屠殺し、腫瘍を切り出し重量を測定した。対照トランスフェクション体またはｍｕｔＰＴＴＧトランスフェクション体を注入したマウスでは、腫瘍は出現しなかった。しかしｗｔＰＴＴＧを有するトランスフェクション細胞を注入したマウスは、例外無しに腫瘍を生成した。腫瘍の重量は、４７０〜１５００ｍｇの範囲であった（表１７）。
【０２２３】
表１７．無胸腺ヌードマウスにおけるＰＴＴＧ発現ＮＩＨ３Ｔ３細胞による腫瘍形成
2004526404.tif 000020
【０２２４】
ＰＴＴＧは転写活性化を示す。ベクターｐＧＡＬ４単独（陰性対照）は、ルシフェラーゼ（ｌｕｃ）レポーターを活性化せず、既知の活性化ドメインＶＰ１６は、レポーター活性を約２８倍有意に上昇させた。ｐＧＡＬ４−ｗｔＰＴＴＧは、トランス活性化性を示し、レポーター活性を約２２倍誘導した（図１）。
【０２２５】
ｐＧＡＬ４−ｍｕｔＰＴＴＧ（突然変異したプロリン領域［Ｐ１６３Ａ、Ｓ１６５Ｑ、Ｐ１６６Ｌ、Ｐ１７０Ｌ、Ｐ１７２ＡおよびＰ１７３Ｌ］の転写活性、ｗｔＰＴＴＧの他の点突然変異、ならびに別の欠失（ｄ）はまた、表１８に示すように試験した。表１８では、記載のプラスミドを、ｐＬｕｃおよびｐＣＭＶ−β−ＧａｌＴとともにＮＩＨ３Ｔ３細胞中に同時トランスフェクションし、β−ｇａｌを内部対照としてルシフェラーゼ測定を行った。各値は、２つの独立した実験からの３つずつのウェル（±ＳＥＭ）を示す；ｗｔＰＴＴＧによるトランス活性化を１００％とした。ｐＧＡＬ４−ｍｕｔＰＴＴＧは、ｐＧＡＬ４−ｗｔＰＴＴＧと比較して約９５％のトランス活性化を示し、こうしてトランス活性化のためのｗｔＰＴＴＧプロリンリッチなモチーフの重要性を確認した。
【０２２６】
表１８．ｈＰＴＴＧ変異体のトランス活性化
2004526404.tif 000021
【０２２７】
ヒトＰＴＴＧ  Ｃ末端ペプチド発現は細胞形質転換を阻止する。上記したようにトランス活性化、形質転換および腫瘍形成におけるプロリンリッチな領域の決定的に重要な役割は、ＰＴＴＧがＳＨ３介在シグナル伝達を介して機能することを意味する。ヒトＰＴＴＧ１タンパク質がＳＨ３関連シグナルカスケードを仲介するなら、これはおそらく、それぞれ上流および下流シグナル分子と相互作用する少なくとも２つの機能性ドメインを含有する。１つのみのそのような機能性ドメインを含有する変異体タンパク質は、優性陰性的に作用して、野生型タンパク質機能を阻害し、シグナル伝達を破壊する可能性がある。
【０２２８】
この仮説に基づき、Ｎ末端アミノ酸残基１〜１４６が欠如した末端切断型ＰＴＴＧ１突然変異ペプチドを、ヒト癌細胞中に導入した。完全長タンパク質の残基１４７〜２０２に対応するＰＴＴＧ−ＣペプチドをＣＭＶプロモーターの制御下で発現する発現構築体を使用した。このポリペプチドはプロリンリッチなドメイン（残基１６３〜１７３；ザング（Ｚｈａｎｇ， Ｘ．）ら、［１９９９ａ］）を含有し、コード配列がグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）に融合した時、これは、適当な分子量を有する無傷のタンパク質として大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）中で発現された（データは示していない）。変異体発現ベクターｐＣＩｎｅｏ−ｍｕｔＰＴＴＧ（突然変異プロリン領域［Ｐ１６３Ａ、Ｓ１６５Ｑ、Ｐ１６６Ｌ、Ｐ１７０Ｌ、Ｐ１７２ＡおよびＰ１７３Ｌ］ならびに対照としての空のベクターｐＣＩ−ｎｅｏ単独は、ヒーラ、ＭＣＦ−７、およびＴ−４７Ｄヒト癌細胞株中に安定にトランスフェクションされた。
【０２２９】
野生型ＰＴＴＧカルボキシ末端ペプチド（ＰＴＴＧ−Ｃ）、いくつかのプロリン残基で突然変異したＰＴＴＧＣ末端（ＰＴＴＧ−Ｃｐｍ；突然変異したプロリン残基［Ｐ１６３Ａ、Ｓ１６５Ｑ、Ｐ１６６Ｌ、Ｐ１７０Ｌ、Ｐ１７２ＡおよびＰ１７３Ｌ］）を発現するトランスフェクション体、およびベクター（Ｖ）を単離した。各トランスフェクション株の発現は、発現ベクターの５’−非翻訳領域に対するプライマーとＰＴＴＧ  ｍＲＮＡの３’−翻訳領域に対するプライマーとを使用して、ＲＴ−ＰＣＲを行い、次に直接配列解析して確認した（図２Ａ、２Ｂおよび２Ｃ）。これらの３つの安定にトランスフェクションされた細胞株の形質転換能力を非足場依存性増殖測定法で試験し、ＰＴＴＧ−Ｃｐｍ細胞が大きいコロニーを形成することが観察され、同じ発現ベクターを含有するが野生型もしくは変異体Ｃ末端ポリペプチドを欠如した対照Ｖ細胞と同じであった。各トランスフェクション細胞株を、３つの異なるプレートに入れた。ヒーラを２１日目に、そしてＴ−４７ＤとＭＣＦ−７を１４日目にスコアを付けた。６０またはそれ以上の細胞からなるコロニーのスコアを付けた。しかしＰＴＴＧ−Ｃを発現する細胞により形成されるコロニーの数とサイズは、著しく低下していた（ｐ＜０．０１）（図３）。表１９（下記）は、各型の癌細胞について軟寒天コロニー形成を要約する。
【０２３０】
表１９．軟寒天中のＰＴＴＧ１  Ｃ末端（ＰＴＴＧ−Ｃ）および変異体ＰＴＴＧ  Ｃ末端（ＰＴＴＧ−Ｃｐｍ）発現細胞によるコロニー形成
2004526404.tif 000022
【０２３１】
ヒトＰＴＴＧ  Ｃ末端ポリペプチドを発現するＭＣＦ−７乳癌細胞はインビボで腫瘍を発生しない。安定にトランスフェクションされたＭＣＦ−７乳癌細胞株を、無胸腺ヌードマウスの皮下に注射した（５００μｌのマトリゲル基底膜マトリックス中１×１０７ 細胞／マウス）。４週間後、マウスの写真を取り、死亡させ、腫瘍を切り出し、重量を測定した。対照ベクターのみでトランスフェクションした細胞を注射した３匹のマウスは、４週間で目に見える腫瘍が発生したが、ＰＴＴＧ−Ｃでトランスフェクションした細胞を注射したマウスは腫瘍を発生しなかった。剖検では、ＰＴＴＧ−Ｃでトランスフェクションした細胞を投与されたマウスでは、皮下または他の末梢腫瘍形成は存在しないことが確認された。ＰＴＴＧ−Ｃｐｍでトランスフェクションした細胞を注射された３匹のマウスも、４週間後に腫瘍が発生し、これは、対照ベクターでトランスフェクションされた細胞を注射されたマウス中に出現したものと同じ大きさであり、突然変異ＰＴＴＧ−Ｃ−末端ポリペプチドは、内因性ＰＴＴＧ機能を阻害する能力を失ったことを示している（表２０）。
【０２３２】
表２０．無胸腺ヌードマウスにおけるＰＴＴＧ−Ｃを発現するＭＣＦ−７乳癌細胞による腫瘍形成
2004526404.tif 000023
【０２３３】
これらの結果は、ＰＴＴＧ  Ｃ末端ペプチドの過剰発現が、癌細胞のインビトロ細胞形質転換とエクスビボ腫瘍増殖能力を失わせたことを示す。また、これらのプロリン残基の点突然変異を含有するＰＴＴＧ  Ｃ末端ペプチドは、インビボの形質転換活性または腫瘍形成活性を妨害できなかったため、ここでプロリンリッチな領域の重要性がさらに確認された。
【０２３４】
ＰＴＴＧ−ＣペプチドによるｂＦＧＦ分泌とＰＲＬ発現の抑制。野生型ヒトＰＴＴＧ−Ｃ末端ペプチドを発現する細胞は、軟寒天上のコロニー形成能力が顕著に低下し、インビボで固形腫瘍増殖を誘導性することもできなかったため、ヒーラトランスフェクション体でｂＦＧＦの発現を試験した。酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）を行って、ヒーラトランスフェクション体の７２時間培養物から得られた調整培地中のｂＦＧＦレベルを調べた。図４に示すように、ＰＴＴＧ−Ｃ  ＤＮＡでトランスフェクションした細胞から得られた調整培地中では、ベクターのみおよびＰＴＴＧ−Ｃｐｍでトランスフェクションした細胞から得られた調整培地と比較して、ｂＦＧＦレベルが顕著に低下しており、ＰＴＴＧカルボキシ末端ペプチドの存在に起因するｂＦＧＦ分泌の抑制を示した。
【０２３５】
固形腫瘍の増殖速度は、血管形成の活性化と新しい血管の動員に正比例するため、これは、本発明において、新しい血管増殖の能力が、本発明のＰＴＴＧ−Ｃペプチドにより障害され、こうしてインビボの新生物細胞増殖と腫瘍増殖をできなくする追加の機構を提供することを示す。実験的腫瘍は、血管形成が無いと１または２ｍｍ以上には増殖できない（フォークマン（Ｆｏｌｋｍａｎ， Ｊ．）、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ． Ｊ． Ｍｅｄ． ２８５：１１８２−１１８６ ［１９７１］；フォークマン（Ｆｏｌｋｍａｎ， Ｊ．）とクラーグスバーン（Ｋｌａｇｓｂｕｒｎ， Ｍ．）（１９８７） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３５：４４２−４４７ ［１９８７］）。この試験で使用したヒト癌細胞株は、顕著な固形腫瘍（直径＞２ｍｍ）を形成し、活発な血管形成を示した。
【０２３６】
さらに、これらの結果は、ｂＦＧＦ分泌の低下により、例えばプロラクチン（ＰＲＬ）発現のようなｂＦＧＦ介在経路の発現が変化したため、追加のホルモン制御カスケードが、本発明のＰＴＴＧ−Ｃペプチドに影響を受けることがあることを意味する。例えば、ラットプロラクチン（ＰＲＬ）−および成長ホルモン（ＧＨ）分泌ＧＨ３細胞中の同じヒト野生型ＰＴＴＧ−Ｃ末端ペプチド（配列番号４のアミノ酸残基１４７〜２０２）の発現は、対照ベクター単独でトランスフェクションしたラットＧＨ３細胞、または突然変異ＰＴＴＧ１  Ｃ末端断片（Ｐ１６３Ａ、Ｓ１６５Ｑ、Ｐ１６６Ｌ、Ｐ１７０Ａ、Ｐ１７２ＡおよびＰ１７３Ｌ、データは示していない）を発現するＧＨ３細胞と比較して、顕著に低下したＰＲＬプロモーター活性（約１６倍の低下）、ＰＲＬ  ｍＲＮＡ発現（約１０倍の低下）、およびプロラクチンタンパク質発現（約７２倍の低下）を示した。さらに、ＰＴＴＧ−Ｃ末端を発現するＧＨ３細胞では、ＧＨ  ｍＲＮＡ（約１３倍の増加）とタンパク質（約３７倍の増加）で補償的増加が観察された。これらの観察結果は、ＧＨ３細胞中で発現されたＰＴＴＧカルボキシ末端ペプチドが、ＰＲＬ遺伝子発現を抑制しＧＨ発現を増強することにより、ホルモン分泌パターンを変化させることを証明している。
【０２３７】
例１７：正常細胞と白血病Ｔリンパ球中のＰＴＴＧの発現
細胞培養。健常ヒト成人の新鮮な末梢静脈血からの単核細胞の陽性選択により、Ｔリンパ球を調製した。ある実験では、アメリカ赤十字の匿名のドナーのロイコパック（ｌｅｕｋｏｐａｃｋ）調製物を使用した。単核血液細胞を、リンホプレップ（Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｏ）（登録商標）キット（ニコメッドファーマ社（Ｎｙｃｏｍｅｄ Ｐｈａｒｍａ ＡＳ）、オスロ、ノルウェー）を使用して、勾配遠心分離により単離した。ロイコパック（ｌｅｕｋｏｐａｃｋ）調製物を使用した時、単離した単核細胞をまず１０％ＤＭＳＯを補足した９０％胎児牛血清（ＦＢＳ）中で凍結させた。これらの細胞を融解し、洗浄し、１０％ＦＢＳを補足したＲＰＭＩ１６４０培地中で増殖させた。ヒトジューカット（Ｊｕｒｋａｔ）白血病Ｔ細胞とヒトＨＬ−６０前骨髄球白血病細胞を、同じ培地中で増殖させた。
【０２３８】
免疫磁性ビーズ（ダイナル（Ｄｙｎａｌ）ＣＤ２（登録商標）セレクション（ＣＥＬＬｅｃｔｉｏｎ）（登録商標）キット、ダイナル社（Ｄｙｎａｌ ＡＳ）、オスロ、ノルウェー）を使用して、２重Ｔ細胞選択を行い、細胞を、固定化抗ヒトモノクローナルＣＤ３抗体（ファーミンゲンインターナショナル（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）、ベクトンディッキンソン社（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ Ｃｏ．））を含有するシャーレ中で培養することにより、さらに活性化した。抗体固定化は、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）中１ｍｌの抗ＣＤ３溶液（１０μｇ／ｍｌ）を満たした新鮮な６０ｍｍのプラスチックシャーレの９０分のインキュベーション（３７℃）により行った。Ｔ細胞の単離と活性化の間、製造業者が提供するキットのプロトコールを使用した。ある実験では、植物性血球凝集素（ＰＨＡ、５μｇ／ｍｌ、ギブコビーアールエル（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ））を使用して、休止Ｔ細胞を活性化した。各実験において、細胞を三重測定の蛍光色素標識抗ＣＤ３／ＣＤ１９／ＣＤ４５抗体（カルタグラボラトリーズ社（Ｃａｌｔａｇ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｉｎｃ．）、バーリンゲーム（Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ）、カリホルニア州）を用いて標識して、次にフローサイトメトリー（ベクトンディッキンソン（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）ファクスキャン（ＦＡＣＳｃａｎ））を使用する試験により、細胞集団中の抗ＣＤ３標識Ｔ細胞の相対量をチェックした。実験では、９５〜９７％のＴ細胞と０〜０．０５％のＢ細胞を含有する試料を使用した。細胞はまた、細胞活性化開始後０時間から始めて、ヒドロコーチゾン２１−ヘミスクシネートのナトリウム塩（０．１〜１μＭ、シグマ（Ｓｉｇｍａ）、セントルイス、ミズーリ州）、シクロスポリンＡ（１μｇ／ｍｌ、カルビオケム（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）、サンジエゴ、カリホルニア州）、ＴＧＦベータ１（１０ｎｇ／ｍｌ、アールアンドディーシステムズ社（Ｒ ＆ Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．）、ミネアポリス、ミネソタ州）、アフィジコリン（１μｇ／ｍｌ、カルビオケム（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ））、ノコダゾール（５００ｎｇ／ｍｌ、カルビオケム（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ））で処理した。ディソルバンツ（ｄｉｓｓｏｌｖａｎｔｓ）（０．１％Ｃ２Ｈ５ＯＨ（アフィジコリン）と０．２％ＤＭＳＯ（ノコダゾール））についての対照実験は、ＰＴＴＧ  ｍＲＮＡ発現への影響の証拠を示さなかった。
【０２３９】
ノーザンブロット解析。トリゾール試薬（ＴＲＩｚｏｌ Ｒｅａｇｅｎｔ）（ギブコビーアールエル（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）、グランドアイランド（Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ）、ニューヨーク州）を使用して、総ＲＮＡを単離した；ＲＮＡ（Ｔ細胞について約５μｇ、ジューカット（Ｊｕｒｋａｔ）細胞について約２０μｇ）を、１％アガロース−ホルムアルデヒドゲルで電気泳動し、ハイボンド−Ｎ膜（アマシャムインターナショナル（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）、英国）にブロットした。膜をＵＶ架橋させ、６８℃でクイックハイブ（Ｑｕｉｃｋｈｙｂ）溶液（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ラホヤ（Ｌａ Ｊｏｌｌａ）、カリホルニア州）で１時間プレハイブリダイズさせ、次にランダムプライムした３２Ｐ標識ヒトＰＴＴＧ  ｃＤＮＡ（２×１０６ ｃｐｍ／ｍｌ）および超音波処理し変性させたサケ精子ＤＮＡ（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））を補足した同じ溶液中で６８℃で３時間ハイブリダイズさせた。ＩＬ−２  ｍＲＮＡ発現を調べると、ＩＬ−２  ｃＤＮＡプローブ（４５７塩基対のサイズ）のＰＣＲ調製物についてオリゴヌクレオチドセンスとアンチセンスプライマーの配列は、すでに報告された通りであった（ブッチ（Ｂｕｔｃｈ， ＡＷ）ら、「胚中心芽細胞によるサイトカイン発現」、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５０：３９−４７ ［１９９３］）。シクロフィリンｃＤＮＡプローブは、アンビオン社（Ａｍｂｉｏｎ， Ｉｎｃ．）（オースチン、テキサス州）から得た。膜を、１×ＳＳＣと０．１％ＳＤＳ中で室温で２回洗浄し（各回２０分）、次に０．２×ＳＳＣと０．１％ＳＤＳ中で６０℃で１回洗浄（３０分）した。洗浄後、膜をＸ線フィルム（コダック（Ｅａｓｔｍａｎ Ｋｏｄａｋ）、ローチェスター（Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ）、ニューヨーク州）に一晩露光した。
【０２４０】
ウェスタンブロット解析。細胞をエッペンドルフチューブに採取し、使用前に１％トリトンＸ−１００、１ｍＭフェニルメチルスルホニルフロリド（ＰＭＳＦ）、１μｇ／ｍｌアプロチニン、２ｍＭロイペプチンを補足した溶解緩衝液（５０ｍＭヘペス、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ、１０ｍＭ  Ｎａ４Ｐ２Ｏ７、１００ｍＭ  ＮａＦ、２ｍＭ  オルトバナジウム酸ナトリウム、ｐＨ７．４）中で、氷上で１５分溶解した。溶解した細胞上清中のタンパク質濃度を測定し、５０μｇのタンパク質を含有するアリコートを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ試料緩衝液で希釈し、５分沸騰させ、冷却し、遠心分離し、１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離した。タンパク質を、ＰＶＤＦイモビロン−Ｐ膜（ミリポア（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、ベッドフォード（Ｂｅｄｆｏｒｄ）、マサチューセッツ州）上に移した。膜を、ヒトＰＴＴＧポリペプチド断片に対するポリクローナルウサギ抗血清（１：３，０００希釈）で４℃で一晩インキュベートし、次にペルオキシダーゼ結合２次抗体（サンタクルツバイオテクノロジー（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、サンタクルツ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）、カリホルニア州）とインキュベートした。ＥＣＬウェスタンブロッティング検出試薬（アマシャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ））を使用して、ブロットを視覚化した。
【０２４１】
ＦＡＣＳ解析。細胞サイクルパターンを調べるために、細胞を遠心分離してペレットにし、冷（４℃）リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、１ｍｌのＰＢＳに再懸濁し、次に細胞固定のために２ｍｌの冷メタノールをゆっくり加えた。
【０２４２】
５００μｌのヨウ化プロピジウム（５００μｇ／ｍｌ ＰＢＳ）を１μｌのリボヌクレアーゼＡ（１０単位／μｌ）とともに加え、細胞懸濁物をボルテックス混合した。４℃で１時間インキュベーション後、細胞試料を、ベクトンディッキンソン（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）ファクスキャン（ＦＡＣＳｃａｎ）でフローサイトメトリーにより解析した。解析領域は、少なくとも１０，０００イベントである。次に、これらのデータについてモドフィット（Ｍｏｄｆｉｔ）ソフトウェアでマキントッシュコンピューターを使用して、細胞サイクル解析を行った。
【０２４３】
三重測定のマウス抗ＣＤ３／ＣＤ１９／ＣＤ４５蛍光色素標識抗体による細胞標識は、製造業者のプロトコール（カルタグラボラトリーズ社（Ｃａｌｔａｇ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｉｎｃ．）、バーリンゲーム（Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ）、カリホルニア州）を使用して行った。１５μｌのカルタグ（Ｃａｌｔａｇ）３重抗体を１００μｌの細胞懸濁物に加え、次に１８０μｌのＰＢＳを加えて静かに混合した。チューブを暗所で室温で１５分インキュベートし、カルライズ（Ｃａｌ−Ｌｙｓｅ）溶解液（カルタグラボラトリーズ社（Ｃａｌｔａｇ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｉｎｃ．））を使用して細胞を固定し、３分の脱イオン水で洗浄し、遠心分離してペレットとし、１ｍｌの冷ＰＢＳに再懸濁した。ベクトンディッキンソン（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）ファクスキャン（ＦＡＣＳｃａｎ）を使用してフローサイトメトリーを行った。
すべての実験は少なくとも３回繰り返し、代表的な実験の結果を以下に示す。
【０２４４】
ＰＴＴＧ発現は、Ｔ細胞活性化によりアップレギュレートされた。Ｔ細胞活性化は、Ｔリンパ球と抗原提示細胞との複雑な相互作用が必要であることは公知である（クラブツリー（Ｃｒａｂｔｒｅｅ ＧＲ）、クリプストーン（Ｃｌｉｐｓｔｏｎｅ ＮＡ）、「Ｔリンパ球の原形質膜と核の間のシグナル伝達」、Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｂｉｏｃｈｅｍ． ６３：１０４５−１０８３ ［１９９４］）。主要組織適合遺伝子複合体とのＴ細胞受容体の相互作用は、Ｔ細胞活性化のための最も重要なシグナルを生成させるが、ここではある接着性相互作用ならびに同時刺激性分子が特に重要である。Ｔ細胞表面分子は、２つの方法で同時刺激シグナルを与えるようである：ＴＣＲ／ＣＤ３複合体により生成される第２メッセンジャー（例えば、ＣＤ２）により定量的に、またはＴＣＲ／ＣＤ３複合体が生成するものとは異なる細胞内生化学的シグナルを生成することにより定性的（例えば、ＣＤ２８）に。陽性Ｔ細胞のために我々が使用した方法は、抗ＣＤ２被覆免疫磁性ビーズへのＴ細胞結合と次に抗ＣＤ３被覆プレート中の細胞培養である。免疫磁性ビーズ自体は、Ｔ細胞を活性化することができなかった（ＰＴＴＧ  ｍＲＮＡ発現と細胞サイクルの増加は観察されなかった）が、Ｔ細胞の同時刺激物質として機能することができた。この示唆するところの間接的説明は、細胞ソーターを使用して単離したＴ細胞は、固定化抗ＣＤ３抗体でもＰＨＡでも活性化できなかったという我々の観察結果（この試験にはデータは示していない）かも知れない。
【０２４５】
休止ヒトＴ細胞をＴ細胞分裂促進因子ＣＤ３抗体で処理した後、Ｔ細胞は、順にＳ期とＧ２／Ｍ期に入ることにより証明されるように、増殖を始めた（図５）。ＰＴＴＧ  ｍＲＮＡ発現は、休止Ｔ細胞中ではほとんど存在しなかったが、Ｓ期とＧ２／Ｍ期の細胞の割合が多くなると、劇的に増加した。休止Ｔリンパ球細胞を別々の分裂促進因子（植物性血球凝集素［ＰＨＡ］）で刺激すると、Ｔ細胞増殖とＴ細胞発現について同様の経時変化が見られた（データは示していない）。３日間のＰＨＡ刺激後のＴ細胞増殖とＰＴＴＧ発現は同様に、５μｇ／ｍｌまでのＰＨＡ濃度に依存した（図６）。より高濃度のＰＨＡは、Ｓ期をさらに増加させたが、Ｇ２／Ｍ期は減少させ、ＰＴＴＧ発現にはまったく影響がなかった。
【０２４６】
ＩＬ−２は最も重要な早期Ｔ細胞活性化遺伝子である（クラブツリー（Ｃｒａｂｔｒｅｅ ＧＲ）、クリプストーン（Ｃｌｉｐｓｔｏｎｅ ＮＡ）、「Ｔリンパ球の原形質膜と核の間のシグナル伝達」、Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｂｉｏｃｈｅｍ． ６３：１０４５−１０８３ ［１９９４］；ワイス（Ｗｅｉｓｓ Ａ．）、「Ｔリンパ球活性化」、ポール（Ｐａｕｌ ＷＥ）編、「基礎免疫学（Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）」、第３版中、ニューヨーク州：ラーベンプレス社（Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ， Ｌｔｄ．）、［１９９３］ ｐｐ． ４６７−４９７；クロンケ（Ｋｒｏｎｋｅ， Ｍ．）ら、「シクロスポリンＡはｍＲＮＡ転写のレベルでＴ細胞増殖因子遺伝子発現を阻害する」、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ １９８４， ８１：５２１４−５２１８ ［１９８４］）。
【０２４７】
遅い時期にアップレギュレートされたＰＴＴＧ発現に対して、インターロイキン２（ＩＬ−２）発現は、早期に、細胞増殖の前に上昇した（図７）。ＩＬ−２発現はまず、細胞がＳまたはＧ２／Ｍ期に入るかなり前に、固定化した抗ＣＤ３抗体適用により誘導した６時間後に上昇し、この期のＩＬ−２発現は細胞増殖に依存しないことを示している。この時、ＰＴＴＧ  ｍＲＮＡ発現もＳ期の有意な量も見られなかった。別の期のＩＬ−２上昇発現は、Ｔ細胞活性化の開始後、Ｔ細胞が増殖し初めてから、４８時間後に起きた。この時、相当量のＰＴＴＧ  ｍＲＮＡとＳ期およびＧ２／Ｍ期の細胞が観察され、これはＩＬ−２  ｍＲＮＡが増殖するＴ細胞によりすでに産生されたことを意味する。
【０２４８】
細胞内シクロスポリンＡ結合タンパク質でもあるハウスキーピング遺伝子であるシクロフィリンはまた、Ｔ細胞をＰＨＡで活性化すると、増加した（図８）。シクロフィリンは、細胞内シクロスポリンＡ結合タンパク質として機能することは公知である（クラブツリー（Ｃｒａｂｔｒｅｅ ＧＲ）、クリプストーン（Ｃｌｉｐｓｔｏｎｅ ＮＡ）、「Ｔリンパ球の原形質膜と核の間のシグナル伝達」、Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｂｉｏｃｈｅｍ． ６３：１０４５−１０８３ ［１９９４］）。シクロフィリンは、ポリペプチド基質中のプロリン残基のシス−トランス異性体化の触媒に関与する、ペプチジルプロリル−シス−トランスイソメラーゼ活性を有する。この酵素活性は、おそらく活性型への不活性なシグナル伝達中間体の正しい折り畳みを触媒することにより、Ｔ細胞シグナル伝達カスケードにおいて重要な役割を果たす。しかし、この単純化モデルは、シクロスポリンＡ作用の主要な機構ではないという強硬な主張がある。シクロスポリンＡ−シクロフィリン複合体は、転写因子ＮＦ−ＡＴ（核因子−活性化Ｔ細胞）の核エントリーを制御することにより、カルシネウリン（ｃａｌｃｉｎｅｕｒｉｎ）（カルシウム／カルシウム−制御セリン／スレオニンタンパク質ホスファターゼ）の作用を阻止することができ、これによりＴ細胞特異的ＩＬ−２遺伝子発現が制御される。（クラブツリー（Ｃｒａｂｔｒｅｅ ＧＲ）、クリプストーン（Ｃｌｉｐｓｔｏｎｅ ＮＡ）、「Ｔリンパ球の原形質膜と核の間のシグナル伝達」、Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｂｉｏｃｈｅｍ． ６３：１０４５−１０８３ ［１９９４］）。我々は、ＰＨＡ誘導性Ｔ細胞活性化の後に、シクロフィリンｍＲＮＡ発現のレベルが大きく上昇していることを見いだし、これは、休止Ｔ細胞がより高いシクロフィリンレベルを有しているため、活性化Ｔ細胞が、休止Ｔ細胞よりシクロスポリンＡの作用に対してより感受性であることを示している。
【０２４９】
両方のＩＬ−２（クラブツリー（Ｃｒａｂｔｒｅｅ）、クリプストーン（Ｃｌｉｐｓｔｏｎｅ）［１９９４］）とＰＴＴＧ（カカー（Ｋａｋａｒ ＳＳ）、「分子クローニング、ゲノム構成、およびヒト下垂体腫瘍形質転換遺伝子のプロモーターの同定」、Ｇｅｎｅ ２４０：３１７−３２４ ［１９９９］）遺伝子プロモーターは、ＡＰ−１結合領域を含有することが知られており、これは、これらの２つの遺伝子の発現の共通のレギュレーターの存在を示唆する。また、公知の免疫抑制剤シクロスポリンＡは、ＩＬ−２遺伝子抑制を介してＴリンパ球に対するその阻害作用を示し、これがＴ細胞中のＤＮＡ合成の阻害に至ることが認められている（クラブツリー（Ｃｒａｂｔｒｅｅ ＧＲ）とクリプストーン（Ｃｌｉｐｓｔｏｎｅ ＮＡ） ［１９９４］；クロンケ（Ｋｒｏｎｋｅ， Ｍ．）ら、「シクロスポリンＡはｍＲＮＡ転写のレベルでＴ細胞増殖因子遺伝子発現を阻害する」、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ １９８４， ８１：５２１４−５２１８ ［１９８４］）。
【０２５０】
糖質コルチコイドは（シクロスポリンＡとは）異なる細胞内受容体を有するが、これらは、Ｔ細胞でのＩＬ−２とインターフェロン−ガンマ産生を抑制し、ＩＬ−４の産生を促進することも証明されている（クレリシ（Ｃｌｅｒｉｃｉ Ｍ）、トラバトニ（Ｔｒａｂａｔｔｏｎｉ Ｄ）、ピコニ（Ｐｉｃｏｎｉ Ｓ）ら、「ヒト免疫不全症ウイルスの進行におけるコルチゾール／抗コルチゾールの不均衡の可能な役割」、Ｐｓｓｙｃｈｏｎｅｕｒｏｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ ２２、増刊、１：Ｓ２７−Ｓ３１ ［１９９７］）。糖質コルチコイドの作用について既に記載されている別の機構は、Ｔ細胞アポトーシスの誘導に基づく。（シドロウスキー（Ｃｉｄｌｏｗｓｋｉ ＪＡ）ら、「免疫系における糖質コルチコイド誘導アポトーシスの生化学と分子生物学」、Ｒｅｃｅｎｔ Ｐｒｏｇ Ｈｏｒｍ Ｒｅｓ． ５１：４５７−４９０ ［１９９６］）。我々は、ヒドロコーチゾンによる、ＰＴＴＧ  ｍＲＮＡ発現とＳ期とＧ２／Ｍ期のＴ細胞の量の両方の、用量依存性阻害を見いだしたが、低用量（最終濃度２０ｎＭ）では、このステロイドホルモンは、これらの指標をわずかに上昇させた。免疫抑制剤ヒドロコーチゾン（図９）とシクロスポリンＡ（図１０）は、ＰＨＡ刺激Ｔ細胞増殖とＰＴＴＧ発現を阻害した。シクロスポリンＡの阻害作用ははるかに強く、ヒドロコーチゾン作用は、低用量ではわずかに刺激性であり、１００ｎＭより高い濃度では阻害性であった。これらの結果は、ＰＴＴＧ発現がＴ細胞増殖に関連することをさらに示した。一般に、非常に高濃度の存在下でも、一部のＰＴＴＧ発現とＴ細胞サイクリングが観察され、一方シクロスポリンＡは、はるかに強くＴ細胞機能を抑制する。ヒドロコーチゾンは、ジューカット（Ｊｕｒｋａｔ）白血病Ｔ細胞株中で、ＰＴＴＧ発現を阻害しなかったことも注意されたい（後述）。
【０２５１】
白血病細胞中のＰＴＴＧ発現。ヒト白血病細胞株ＨＬ−６０とジューカット（Ｊｕｒｋａｔ）は、Ｓ期の細胞の存在により示されるように、ＣＤ３またはＰＨＡの無い１０％ＦＢＳ補足ＲＰＭＩ１６４０培地中で増殖する（図１１）。ＨＬ−６０とジューカット（Ｊｕｒｋａｔ）細胞中のＰＴＴＧ  ｍＲＮＡの豊富さは、ＰＨＡまたはＣＤ３抗体による活性化Ｔ細胞中のものに匹敵した。使用した３つの免疫抑制剤（シクロスポリンＡ、ヒドロコーチゾン、およびＴＧＦ−β１）の中で、シクロスポリンＡのみが、正常Ｔ細胞とジューカット（Ｊｕｒｋａｔ）Ｔ細胞中でＰＴＴＧ  ｍＲＮＡ発現と細胞サイクリングに対して同様に作用し、ヒドロコーチゾンとＴＧＦ−β１の作用は、これらの２つの実験モデルのそれぞれに特異的であった。
【０２５２】
細胞サイクル依存性ＰＴＴＧ発現。我々は、ＰＴＴＧ  ｍＲＮＡ発現が、細胞サイクル依存性であり、腫瘍細胞株のＧ２／Ｍでピーク発現があることを証明した。我々は、Ｔ細胞中の細胞サイクルへのＰＴＴＧ発現の同様の依存性を見いだした。この依存性は、正常Ｔ細胞（図１２）ではジューカット（Ｊｕｒｋａｔ）Ｔ細胞白血病株（図１３）より、はるかに強かった。正常Ｔ細胞とジューカット（Ｊｕｒｋａｔ）Ｔ細胞中のＳ期の細胞の量とＰＴＴＧ  ｍＲＮＡ発現のレベル中の明らかにされた変化の方向は、大体同じであったが、これらの変化は、おそらくジューカット（Ｊｕｒｋａｔ）細胞の不死性とＰＴＴＧの高基礎レベルのために、悪性ジューカット（Ｊｕｒｋａｔ）Ｔ細胞中で、より低いことがわかった。
【０２５３】
我々は、Ｔ細胞のＣＤ３抗体誘導活性化が、シクロスポリンＡ、ヒドロコーチゾン、アフィジコリン（Ｓ期インヒビター）またはノコダゾール（Ｇ２／Ｍ期ブロッカー）により異なる程度に阻害され、一方ＴＧＦ−β１（１０ｎｇ／ｍｌ最終濃度）が、ＰＴＴＧ  ｍＲＮＡにもＳ期またはＧ２／Ｍ期の細胞の量にも大きな作用を示さない（図１２）ことを見いだした。同時に、新鮮な１％または１０％ＦＢＳも植物性血球凝集素（ＰＨＡ）とホルボール−１２−メリステート−１３−アセテート（ＰＭＡ）の混合物［すなわち、ＰＨＡ＋ＰＭＡ混合物］も、ジューカット（Ｊｕｒｋａｔ）Ｔ細胞中のＰＴＴＧレベルを大きく上昇させず、この混合物はこれをさらに低下させた。比較のためにジューカット（Ｊｕｒｋａｔ）Ｔ細胞を使用して、これらをＰＨＡ＋ＰＭＡで処理し、これは、１％ＦＢＳ補足培地中で４８時間培養後、ジューカット（Ｊｕｒｋａｔ）Ｔ細胞について分裂促進作用のために使用した。Ｓ期細胞の量の変化はまた、ＰＴＴＧ  ｍＲＮＡ発現のレベルの変化に平行していた。シクロスポリンＡとＴＧＦ−β１は、ＰＴＴＧ  ｍＲＮＡレベルとＳ期ジューカット（Ｊｕｒｋａｔ）細胞の量の両方を低下させ、ヒドロコーチゾンは１０μＭの最終濃度で使用してもこれらの指数を変化させなかった（データは示していない）。
【０２５４】
ＴＧＦ−β１は、細胞機能へのその双方向性作用（細胞標的の性質とその処理条件に強く依存する細胞増殖を含む）について公知である。同時に、ジューカット（Ｊｕｒｋａｔ）Ｔ細胞を使用した時、我々は、ＰＴＴＧ  ｍＲＮＡ発現と細胞サイクリングのＴＧＦ−β１惹起阻害を検出した。この作用は、培地に加えた新鮮なＦＢＳの存在下では観察されなかった（データは示していない）が、ＰＨＡ＋ＰＭＡ混合物によるジューカット（Ｊｕｒｋａｔ）細胞の処理後にのみ見られた。
【０２５５】
これらの結果は、ＰＴＴＧの発現が正常Ｔ細胞中で容易に制御可能であることを示す。これは、非特異的（ＰＨＡ）および特異的（抗ＣＤ３抗体）Ｔ細胞アクチベーターの両方によって、高レベルまで誘導され、この誘導は、公知の免疫抑制剤であるシクロスポリンＡとヒドロコーチゾンにより阻害することができる。予備データは、ＰＴＴＧ  Ｃ末端領域をコードするＤＮＡによるＰＨＡ活性化Ｔ細胞のトランスフェクションは、Ｓ期細胞の量と細胞サイクルのＧ２／Ｍ期の蓄積の低下を引き起こすことを示したことは、重要である。
【０２５６】
興味深いことに、ヒドロコーチゾンは、Ｔ細胞機能の研究に広く使用されているジューカット（Ｊｕｒｋａｔ）Ｔ細胞株中でのＰＴＴＧ発現を阻害せず、他の免疫モジュレーターであるＴＧＦ−β１は、正常Ｔ細胞中のＰＴＴＧ発現に影響を与えなかったが、ジューカット（Ｊｕｒｋａｔ）細胞中ではこれを低下させた。すなわち、ジューカット（Ｊｕｒｋａｔ）Ｔ細胞株中で機能するＰＴＴＧの研究の結果は、おそらく悪性腫瘍細胞中のＰＴＴＧ癌遺伝子の高い基礎レベルの発現のために、正常Ｔ細胞について直接適用できない。
【０２５７】
正常Ｔ細胞とジューカット（Ｊｕｒｋａｔ）Ｔ細胞株はまた、細胞サイクルインヒビター（アフィジコリンとノコダゾール）の作用に対して異なる感受性を有した。アフィジコリンは、ジューカット（Ｊｕｒｋａｔ）細胞をＳ期で停止させてＧ２／Ｍ期期の量を減少させたが、ＰＴＴＧ  ｍＲＮＡレベルの有意な変化は観察されなかった（データは示していない）。ノコダゾールは、これらの細胞をＧ２／Ｍ期で停止させ、Ｓ期の細胞は、その存在下であまり検出されず、ジューカット（Ｊｕｒｋａｔ）細胞のノコダゾール処理後に、ＰＴＴＧ  ｍＲＮＡ発現の一部の増加が観察された。おそらく、正常Ｔ細胞は、細胞サイクルインヒビターの毒性作用に対してより感受性であり、その存在下でＰＴＴＧｍＲＮＡレベルとサイクリング細胞の量の両方が低下した。
【０２５８】
本明細書に記載の結果は、ＰＴＴＧの標的化とＰＴＴＧ発現が、抗新生物治療法と免疫抑制治療法の両方に有用であることを示す。
【０２５９】
本発明は、特定の作用機構に限定も依存もしないが、正常なＴ細胞活性化中のＰＴＴＧ  ｍＲＮＡ誘導と平行したＳ期の上昇は、ＰＴＴＧ細胞形質転換作用の機構がその過剰発現にあり、その結果、姉妹染色分体分離と異数性に対する制御ミスではなく細胞サイクリングを上昇させることを意味する。
【０２６０】
例１８：乳房腫瘍と卵巣腫瘍組織中のＰＴＴＧ１発現
患者と組織。乳房腫瘍（ｎ＝１３）と卵巣腫瘍（ｎ＝１５）の別々の試料を、切除術後の連続的非選択患者から得て、液体窒素中に浸漬して−７０℃に保存したか、または分析のために１０％ホルマリン中に固定した。正常乳房（ｎ＝１４）と卵巣（ｎ＝９）剖検組織は、メリーランド大学（ボルチモア（Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ））の発生疾患のための脳と組織バンク（Ｂｒａｉｎ ＆ Ｔｉｓｓｕｅ Ｂａｎｋｓ ｆｏｒ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ）から得た（平均±ＳＥＭ年齢：４４±７．２才）。２８の腫瘍組織のうちの２５と２３の正常組織のうちの２０から、非分解ＲＮＡを得て、さらなる分析のために使用した。乳癌の１２症例（平均±ＳＥＭ年齢：６０±３．５才）と卵巣癌の１３症例（平均±ＳＥＭ年齢：５６±４．９才）（表２１）を調べた。組織学的評価は、病理学者が独立に記録した。
【０２６１】
細胞培養。ＡＴＣＣから得られたＭＣＦ−７（乳癌）、ＭＤＡ−ＭＢ２３１（エストロゲン受容体［ＥＲ］陰性乳癌細胞）とＳＫＯＶ−３（卵巣癌）細胞を、１０％ＦＣＳを有するフェノールレッドを含まないＤＭＥＭ中で維持し、デキストラン被覆活性炭（ＣＳＳ）で３日間前処理した後、既に記載されている（ヒーネイ（Ｈｅａｎｅｙ Ａ．Ｐ．）ら、［１９９９］）ようにジエチルスチルベストロール（１０−８Ｍと１０−１０Ｍ）、およびＩＣＩ−１８２７８０（トクリス（Ｔｏｃｒｉｓ））（１０−７Ｍと１０−８Ｍ）で４８時間処理した。
【０２６２】
ノーザンブロット解析。細胞培養物（〜３×１０７ 細胞）と切り出した組織から、トリゾル（ＴＲＩｚｏｌ）で総ＲＮＡを抽出した。ＪＥＧ−３絨毛癌細胞から得られたＲＮＡを、ＰＴＴＧ１発現の陽性対照とした。電気泳動したＲＮＡをハイボンド（Ｈｙｂｏｎｄ）−Ｎナイロン膜（アマシャムインターナショナル（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）、バッキンガムシャー（Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ）、英国）に移し、既に記載されている（ヒーネイ（Ｈｅａｎｅｙ Ａ．Ｐ．）ら、［１９９９］）ようにヒトＰＴＴＧ  ｃＤＮＡと６８℃でハイブリダイズさせた。ＰＴＴＧ  ｍＲＮＡ発現を、β−アクチン発現に対して標準化し、同じ個体（８つの乳房症例）からの一致した正常粘膜に対する増加倍数として、または正常乳房（ｎ＝１３）と卵巣組織（ｎ＝７）中で測定した平均ＰＴＴＧ／アクチン比として表した。
【０２６３】
ウェスタンブロット解析。ＲＩＰＡ緩衝液（ヒーネイ（Ｈｅａｎｅｙ Ａ．Ｐ．）ら、［１９９９］）を使用して、乳房および卵巣組織からタンパク質を調製し、ローディング緩衝液中で変性させ、可溶性タンパク質（ブラッドフォード測定法により５０μｇ）を電気泳動（１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により分離し、ＰＶＤＦ膜（アマシャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ））に移し、ＰＢＳ−０．０５％ツイーン溶液中の５％脱脂乳中でインキュベートし、次にＰＴＴＧに対する抗体（１：５０００）とβ−アクチンに対する抗体（１：２５００；シグマ（Ｓｉｇｍａ））とインキュベートした。ブロットを洗浄し、適当な西洋ワサビペルオキシダーゼ結合抗ＩｇＧとインキュベートさせ、洗浄し、次に複合体をＥＣＬ化学発光検出により視覚化した。
差は、適宜ＡＮＯＶＡまたは対応のないｔ検定により評価した。
【０２６４】
結果
ＰＴＴＧ１は乳房腫瘍と卵巣腫瘍で過剰発現される。ＰＴＴＧ  ｍＲＮＡ発現の増加は、正常乳房または卵巣組織と比較して、それぞれ乳癌１２症例のうちの１２と卵巣癌１３症例のうちの１２（乳癌は２．５±０．３倍の増加；卵巣癌は３．５±０．６倍の増加）で観察された。最も高いＰＴＴＧ  ｍＲＮＡ発現は、乳癌または卵巣に限局された腫瘍（乳房腫瘍は１．９±０．３５倍の増加卵巣腫瘍は３．２±１．０倍の増加を示した）と比較して、周りのリンパまたは血管構造中に浸潤した乳房腫瘍および卵巣腫瘍で、検出された（乳房腫瘍は３．５±０．４５倍の増加；卵巣腫瘍は３．８±０．７倍の増加を示した）が、この差は乳房腫瘍では統計的に有意ではなかった（ｐ＝０．０３）。
【０２６５】
表２１．乳癌と卵巣癌におけるＰＴＴＧ１発現
2004526404.tif 000024
卵巣腫瘍
2004526404.tif 000025
【０２６６】
この研究のほとんどの閉経後の女性からの乳房腫瘍と卵巣腫瘍中の、ＰＴＴＧのエストロゲン制御とその過剰発現は、パラドックスに思えるかも知れない。しかしエストロゲンは、閉経前および閉経後の女性の重要な増殖因子であり、ホルモン依存性乳癌の罹患率は、乳癌の頻度と同様に、年齢とともに上昇する。閉経後は、末梢組織が、腫瘍増殖を刺激するのに充分な濃度のエストラジールを産生して、ＥＲ陽性の乳房腫瘍の閉経後女性の約８０％が、抗エストロゲン治療に応答し、アジュバントタモキシフェンは、閉経後女性の標準的治療法である（ウェイドナー（Ｗｅｉｄｎｅｒ， Ｎ．）ら、「腫瘍血管形成：早期乳癌の新しい重要な独立した予測因子」、Ｊ． Ｎａｔｌ． Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ． １９９２； ８４：１８７５−８７ ［１９９２］）。
【０２６７】
エストロゲンは乳癌と卵巣癌細胞のＰＴＴＧ１発現をインビトロで制御し、腫瘍エストロゲン受容体発現と相関する。エストロゲン（ジエチルスチルベストロール  １０−８〜１０−１０Ｍ）は、ＭＣＦ−７乳癌細胞（図１５ａ；ｐ＜０．０１）および卵巣癌細胞（図１５ｂ、挿入図）中のＰＴＴＧ１  ｍＲＮＡ発現の約２〜９倍の増加を誘導した。ＰＴＴＧ１のエストロゲン介在誘導は、抗エストロゲンＩＣＩ−１８２７８０（１０−７Ｍ〜１０−８Ｍ）と同時インキュベートすることにより、部分的に阻害または阻止された（図１５、ｐ＜０．０１）。ＰＴＴＧ１  ｍＲＮＡ発現は、エストロゲンによるエストロゲン受容体（ＥＲ）陰性ＭＤＡ−ＭＢ２３１乳癌細胞の治療後に、変化せず（データは示していない）、エストロゲン介在ＰＴＴＧ１  ｍＲＮＡ誘導のためのＥＲの動員を確認している。
【０２６８】
ＰＴＴＧはｂＦＧＦ分泌を制御（ペイ（Ｐｅｉ， Ｌ．）とメルメド（Ｍｅｌｍｅｄ Ｓ．）、「下垂体腫瘍形質転換遺伝子（ＰＴＴＧ）の単離と性状解析」、Ｍｏｌ． Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ． １１：４３３−４４１ ［１９９７］）し、ｂＦＧＦはＮＩＨ３Ｔ３繊維芽細胞中のＰＴＴＧを制御する。従って、ここで観察されたＩＣＩ−１８２７８０によるエストロゲン誘導性ＰＴＴＧの不完全な抑制は、その作用が抗エストロゲンにより変わらない培地由来増殖因子のせいかも知れない。乳癌と卵巣癌は、その起源が上皮であり、正常と腫瘍組織の間質／上皮成分が異なる可能性があるため、その解釈には注意する必要がある。間質は細胞性が乏しいため、そして試料の総ＤＮＡまたはＲＮＡ含量にほとんど寄与しない（オー−ウィーバー（Ｏｒｒ−Ｗｅａｖｅｒ， Ｔ．Ｌ．）、「姉妹を分離する困難さ」、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８５：３４４−３４５ ［１９９９］）ため、正常乳房組織での発現と比較して、ノーザンブロット解析およびウェスタンブロット解析を使用する乳房腫瘍および卵巣腫瘍における豊富なＰＴＴＧ発現の検出は、適切と思われ、他の研究（オー−ウィーバー（Ｏｒｒ−Ｗｅａｖｅｒ， Ｔ．Ｌ．）、［１９９９］）により証明される。
【０２６９】
例１９：ＰＴＴＧ−Ｃは細胞障害性抗癌剤による治療に対して癌細胞を過剰感作する
癌細胞中のＰＴＴＧ−Ｃ（ｗｔＰＴＴＧ  Ｃ末端）の同時発現は、ＰＴＴＧ介在シグナル伝達を破壊し、軟寒天中のコロニー形成とヌードマウス中のインビボの腫瘍形成を妨害する（前述の例１６を参照）。さらに、癌細胞（例えば、特に限定されないが、乳癌および卵巣癌細胞）中のＰＴＴＧ−Ｃの発現は、パクリタキセル（タキソール（Ｔａｘｏｌ））のような細胞障害性抗癌剤による治療に対して細胞を過剰感作する。例えば図１６と１７は、パクリタキセルによるｗｔＰＴＴＧ  Ｃ末端トランスフェクションＭＣＦ−７の治療（安定なトランスフェクション）は、対照ベクターでトランスフェクションした細胞中でコロニー形成を阻害するのに必要な用量（１０−９Ｍ）より低い用量（１０−１１〜１０−１０Ｍ）で、コロニー形成を阻害した。（図１６と１７）。
【０２７０】
例２０：ＰＴＴＧによる血管形成の調節
材料：ラットテイルコラーゲンＩ型は、シグマケミカル（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ）（セントルイス、ミズーリ州）から得られ、改変ボイデンチャンバーとトランスウェルズ（Ｔｒａｎｓｗｅｌｌｓ）（登録商標）は、コーニングコスター（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｃｏｓｔｅｒ）（ケンブリッジ、マサチューセッツ州）から得られた。ヒトの組換え抗ｂＦＧＦ抗体と免疫前ヤギＩｇＧは、アールアンドディーシステムズ（Ｒ ＆ Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）（ミネアポリス、ミネソタ州）から購入し、増殖因子低下マトリゲル基底膜マトリックス（ジーエフアールマトリゲル（ＧＦＲ Ｍａｔｒｉｇｅｌ））はベクトンディッキンソン（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）（ベッドフォード、マサチューセッツ州）から得て、受精ホワイトレッグホーンニワトリ卵は、チノバレイランチャーズ（Ｃｈｉｎｏ Ｖａｌｌｅｙ Ｒａｎｃｈｅｒｓ）（アルカジア（Ａｒｃａｄｉａ）、カリホルニア州）から得られた。すべての化学品は、入手できる最も高い市販のグレードである。
細胞培養。ＮＩＨ３Ｔ３細胞を、１０％子ウシ血清（ＢＣＳ）と抗生物質を補足した低グルコースＤＭＥＭ（ギブコビーアールエル（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ））で培養した。ＨＵＶＥＣ（クロネティクス（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ）、サンジエゴ、カリホルニア州）を、ＥＧＭ中で販売業者の説明書に従って増殖させ、すべての実験について１０継代未満まで増殖させた。
【０２７１】
既に記載されている（ザング（Ｚｈａｎｇ， Ｘ．）ら、「ヒト下垂体腫瘍形質転換遺伝子（ＰＴＴＧ）の構造、発現および機能」、Ｍｏｌ． Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ． １３：１５６−１６６ ［１９９９］）ように、野生型、変異体ｈＰＴＴＧ、またはベクター単独を発現する安定にトランスフェクションされたＮＩＨ３Ｔ３細胞（２×１０６ ）を、１００ｍｍのゼラチン化プレートに蒔いた。ウェスタンブロット解析は、野生型ＰＴＴＧと変異体ＰＴＴＧトランスフェクション細胞の両方で、等量のＰＴＴＧタンパク質が発現されることを確認した。２４時間後、維持培地を、１０ｍｌの無血清ＤＭＥＭで置換し、細胞をさらに４８時間インキュベートした。この調整培地（ＣＭ）を次に、野生型ｈＰＴＴＧ（ＷＴ−ｈＰＴＴＧ−ＣＭ）、変異体ｈＰＴＴＧ（Ｍ−ｈＰＴＴＧ−ＣＭ）、およびベクター単独（Ｃ−ＣＭ）でトランスフェクションしたＮＩＨ３Ｔ３細胞、および非トランスフェクションＮＩＨ３Ｔ３細胞（Ｎ−ＣＭ）から採取し、各ＣＭ型は、無菌の０．２μｍ孔径フィルターで別々にろ過して、細胞破片を除去し、次にさらに試験するまで保存した。
【０２７２】
ｂＦＧＦ  ＥＬＩＳＡ。調整培地（１ｍｌ）をスピードバック（Ｓｐｅｅｄ Ｖａｃ）（サバント（Ｓａｖａｎｔ）、ファーミングデール（Ｆａｒｍｉｎｇｄａｌｅ）、ニューヨーク州）で凍結乾燥し、１００ｍｌのリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）に再懸濁し、ｂＦＧＦ濃度を測定した（クアンチキンＨＳヒトＦＧＦ基礎免疫測定法キット（Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ ＨＳ Ｈｕｍａｎ ＦＧＦ Ｂａｓｉｃ Ｉｍｍｕｏａｓｓａｙ Ｋｉｔ）、アールアンドディーシステムズ（Ｒ ＆ Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ））。
【０２７３】
内皮細胞増殖測定法。ＨＵＶＥＣを４８ウェルのゼラチン化培養プレート上に約５０００細胞／ウェルで２４時間蒔いた。次に、培地を、前述のトランスフェクションまたは非トランスフェクションＮＩＨ３Ｔ３細胞の培養物から得られた等量のＣＭで置換した。陽性対照として、ＤＭＥＭを１ｎｇ／ｍｌの組換えヒトｂＦＧＦで強化し、陰性対照として、無血清ＤＭＥＭを使用した。各ＣＭ中のｂＦＧＦの活性を調べるために、まず１００ｎｇ／ｍｌの抗ｂＦＧＦ抗体と免疫前ヤギＩｇＧを各ＣＭに加えた。４８時間後、ＨＵＶＥＣ細胞をトリプシン処理し、コールターカウンター（コールターエレクトロニクス（Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ）、ハイアレア（Ｈｉａｌｅａｈ）、フロリダ州）で計測した。すべての実験は、三重測定で行った。
【０２７４】
傷害移動測定法。傷害測定法は、すでに記載された（サトウ（Ｓａｔｏ， Ｙ）とリフキン（Ｒｉｆｋｉｎ， ＤＢ）、「塩基性繊維芽細胞増殖因子のオートクリン活性：内皮細胞移動、プラスミノーゲンアクチベータ合成、およびＤＮＡ合成の制御」、Ｊ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． １０７：１１９９−１２０５ ［１９８８］）ものを若干修飾して行った。３５ｍｍのゼラチン化培養プレートのＨＵＶＥＣのコンフルエンス単層を、カミソリの刃で押して細胞シートを切ってプレートにマークして傷をつけた。刃を静かに一方に動かして、シートの一部を除去する。次に、細胞をＰＢＳで２回洗浄する。上記のトランスフェクションした３Ｔ３細胞由来ＣＭを適用し、ＨＵＶＥＣをＣＭ中でさらに１６時間インキュベートした。次に細胞を、無水メタノールで固定し、ギムザ染色し、写真を取った。接眼グリッドを有する顕微鏡下で、切断端から１００μＭ×２５００μＭ切片で細胞を計測して、移動を定量した。値は、３つのランダムな視野からの平均を示す。すべての実験は、三重測定で繰り返した。
【０２７５】
改変ボイデンチャンバー測定法。移動はまた、すでに記載された（リーブズレイ（Ｌｅａｖｅｓｌｅｙ ＤＩ）ら、「インテグリンベータ１−およびベータ３−介在内皮細胞移動は、明確なシグナル伝達機構を介して開始される」、Ｊ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． １２１：１６３−１７０ ［１９９３］）ものを若干修飾して、６．５ｍｍ、８．０μｍのトランスウェルズ（Ｔｒａｎｓｗｅｌｌｓ）（登録商標）を用いて測定した。ポリカーボネート膜を０．１％ゼラチン（３７℃で１時間）被覆した。６００μｌの各ＣＭ試料を、下のチャンバーに入れ、３７℃で３０分インキュベートした。増殖因子を含まない培地中で１６時間培養したサブコンフルエントなＨＵＶＥＣを採取し、洗浄し、無血清ＤＭＥＭ（１００μｌ）中に再懸濁し、上のチャンバーに入れた。２４時間後、膜の上の面から綿棒ですべての非移動細胞を取り出し、下の面の移動細胞を無水メタノールで固定し、ギムザ染色し、写真を撮った。定量分析のために、次に染色細胞を１０％酢酸で抽出し、吸光度を５９５ｎｍで測定した。
【０２７６】
管形成測定法。ＨＵＶＥＣの毛細管様構造形成の測定は、市販のジーエフアールマトリゲル（ＧＦＲ Ｍａｔｒｉｇｅｌ）を用いて行った。２４ウェルプレートを、３００μｌのジーエフアールマトリゲル（ＧＦＲ Ｍａｔｒｉｇｅｌ）（１１ｍｇ／ｍｌ）で被覆し、３７℃で３０分インキュベートしてゲル化を促進した。５００μｌアリコートの試料ＣＭに懸濁したＨＵＶＥＣを各ウェルに加え、最終培養物を約５×１０４ 細胞／ウェルとした。２４時間インキュベーション後、位相差顕微鏡により管形成測定を評価し、スポットカラーデジタルカメラ（ダブリューヌスバウム社（Ｗ． Ｎｕｈｓｂａｕｍ， Ｉｎｃ．）、マクヘンリー（ＭｃＨｅｎｒｙ）、イリノイ州）で写真を取った。デジタル画像を、ＮＩＨ画像ソフトウェアで縮小して、既に記載されている（ウォジタ（Ｗｏｊｔａ， Ｊ．）ら、「肝細胞増殖因子は、ヒトケラチン細胞中の血管内皮細胞増殖因子とプラスミノーゲンアクチベータインヒビター−１と、ヒト内皮細胞中の血管内皮増殖因子様ｆｌｋ−１の発現を上昇させる」、Ｌａｂ Ｉｎｖｅｓｔ． ７９：４２７−４３８ ［１９９９］）ように、画素数を計測した。すべての実験は、三重測定で繰り返した。
【０２７７】
漿尿膜（ＣＡＭ）測定法。各ＣＭのインビボの血管形成活性を調べるために、受精受精ホワイトレッグホーンニワトリ卵を、加湿孵卵器中でＣＯ２ 無しで３７℃でインキュベートした（ブルークス（Ｂｒｏｏｋｓ， ＰＣ）ら、「血管形成の研究のための１０日令のニワトリ胚モデルの使用」、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ． １２９：２５７−２６９ ［１９９９］）。３日間インキュベーション後、殻に丸い窓を開け、３ｍｌのアルブミンを取り出して、ＣＡＭを殻から離した。ＷＴ−ｈＰＴＴＧ、Ｍ−ｈＰＴＴＧ、ベクターでトランスフェクションした３Ｔ３細胞とトランスフェクションしていない３Ｔ３細胞からの１０ｍｌのＣＭを、（スピードバック（ＳｐｅｅｄＶａｃ））で別々に凍結乾燥し、再度１００μｌのＰＢＳに再懸濁した。５μｌ  ＰＢＳ中１μｇのｂＦＧＦを陽性対照として使用し、同様に濃縮した無血清ＤＭＥＭを陰性対照として使用した。９日目に、濃縮ＣＭ、または陽性もしくは値後対照の５μｌを、０．５ｍｇのラットテイルコラーゲン１型スポンジに適用した。次に、試料をしみこませたスポンジをＣＭＡの上に置いた。１３日目に、殻の窓を注意深く拡大し、スポンジと周りのＣＭＡ領域の写真を取った。定量分析のために、コラーゲンスポンジに入る血管の数を、立体顕微鏡で２５×の倍率で計測した。各試料について３つの卵を使用し、実験は三重測定で繰り返した。
【０２７８】
統計解析。統計解析はスチューデントｔ検定を使用して行った。すべてのＰ値は両側であり、０．０５未満を有意であるとした。
【０２７９】
結果
調整培地中のｂＦＧＦ濃度。
ｈＰＴＴＧはｂＦＧＦ分泌を制御する（ザング（Ｚｈａｎｇ， Ｘ．）ら、「ヒト下垂体腫瘍形質転換遺伝子（ＰＴＴＧ）の構造、発現および機能」、Ｍｏｌ． Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ． １３：１５６−１６６ ［１９９９］）ため、我々は、無血清培地中で４８時間培養後、安定にトランスフェクションされた細胞（約２×１０６ ）から得られた調整培地中のｂＦＧＦ濃度を測定した（図１８）。ＷＴ−ｈＰＴＴＧトランスフェクション体から採取したＣＭ中のｂＦＧＦ濃度は１０．５±０．５６ｐｇ／ｍｌであり、他のトランスフェクション細胞株から得られたＣＭ中のｂＦＧＦレベル（［ｐｇ／ｍｌ］  Ｍｕｔ−ｈＰＴＴＧ、３．３±０．２７；Ｃｔｒ−ベクター、２．３±０．７２；正常３Ｔ３細胞  ３．３±０．５６；ｐ＜０．０１）より顕著に高い。ｍｕｔ−ｈＰＴＴＧ、Ｃｔｒ−ベクターでトランスフェクションした３Ｔ３細胞および正常３Ｔ３細胞からのＣＭ中のｂＦＧＦ濃度は異ならなかった。ＣＭ採取時の総細胞数とタンパク質濃度は、各独立の細胞株またはトランスフェクション体について同様であった。
【０２８０】
内皮細胞増殖測定法。ＨＵＶＥＣを各ＣＭ中で４８時間培養し、次に細胞数を測定した（図１９）。予測されるように、すべての細胞株から得られたＣＭは、無血清ＤＭＥＭと比較して増殖活性を示した。ＷＴ−ｈＰＴＴＧでトランスフェクションした細胞からのＣＭは、Ｍｕｔ−ｈＰＴＴＧ、ベクターで形質転換したおよび正常３Ｔ３細胞からのＣＭより有意（ｐ＜０．０１）に高い細胞増殖を誘導した。各ＣＭへの抗ｂＦＧＦ抗体の添加は、増殖活性を抑制した：６２％、ＷＴ−ｈＰＴＴＧ−ＣＭ；４３％、Ｍ−ｈＰＴＴＧ−ＣＭ；４４％、Ｃ−ＣＭ；および４９％、Ｎ−ＣＭ。しかし、ヤギ抗ｂＦＧＦ抗体を加えた後の細胞増殖は、無血清ＤＭＥＭ単独中よりさらに高かった。ＨＵＶＥＣの増殖は、免疫前ヤギＩｇＧを各ＣＭに加えても変化せず、誘導された増殖はｂＦＧＦにより仲介されたことを確認した。
【０２８１】
傷害測定法とボイデンチャンバー測定法における内皮細胞移動。傷害治癒測定法と改変ボイデンチャンバー測定法を使用して、内皮細胞増殖と移動を試験した。傷害測定法では（図２０）、１００μｍ分の増加でマークしたグリッドで、非傷害領域に移動したＨＵＶＥＣの数を計測して、移動を定量した。ＷＴ−ｈＰＴＴＧ−ＣＭ中でインキュベートした（４８時間）ＨＵＶＥＣは、Ｍｕｔ−ＰＴＴＧ、ベクター単独または非トランスフェクション３Ｔ３細胞を含む、他の細胞株からのＣＭでインキュベートしたＨＵＶＥＣより、遠くにかつたくさん移動した。ヤギ抗ｂＦＧＦ抗体は、すべての細胞株中の活性を抑制したが、免疫前ヤギＩｇＧは影響がなかった。改変ボイデンチャンバー測定法を使用して、ＷＴ−ｈＰＴＴＧトランスフェクション体からの調整培地は、膜孔を介するＨＵＶＥＣ細胞移動を誘導した（図２１；ｐ＜０．０１）。トランスフェクションまたは非トランスフェクションＮＩＨ３Ｔ３細胞を下のチャンバーに蒔き、ＨＵＶＥＣを上のチャンバーに膜と、同時培養で同様の結果が得られた（データは示していない）。抗ｂＦＧＦ抗体は、傷害測定法で観察されたものと同様に、すべての細胞株で移動活性を抑制した。ＷＴ−ｈＰＴＴＧ−ＣＭ、Ｍ−ｈＰＴＴＧ−ＣＭ、Ｃ−ＣＭおよびＮ−ＣＭの抗ｂＦＧＦ抗体による抑制作用は、同じオーダーであり、５５％、４０％、４３％および３９％であった。ＣＭ介在血管形成に及ぼす抗ｂＦＧＦ抗体の阻害作用は、他の細胞株から得られたＣＭより、ＷＴ−ｈＰＴＴＧ−ＣＭでより明白であった。すなわち、ＷＴ−ｈＰＴＴＧ−ＣＭの血管形成活性は、中和ｂＦＧＦ抗体により阻害される。中和ｂＦＧＦ抗体の添加は、ｗｔＰＴＴＧトランスフェクション細胞からのＣＭの血管形成作用を完全に逆転することはなく、一部のＰＴＴＧ指令血管形成はおそらく、他のＣＭ由来因子に起因することを意味する。
【０２８２】
Ｍ−ｈＰＴＴＧ−ＣＭ〜Ｃ−ＣＭおよびＮ−ＣＭを使用して、同様の血管形成活性が観察され、これらはすべて、ＷＴ−ｈＰＴＴＧ−ＣＭにより仲介される血管形成活性より有意に低く、ＷＴ−ｈＰＴＴＧ−ＣＭが強い血管形成活性を誘導することを示している。これらの結果はまた、ＰＴＴＧペプチドのＰＴＴＧカルボキシ末端のプロリンリッチなドメインは、形質転換活性のみならず、ＰＴＴＧ介在血管形成性についても重要である。
【０２８３】
管形成測定法。マトリゲル（Ｍａｔｒｉｇｅｌ）は、ＨＵＶＥＣ接着と分化を調べるのに有用である。マトリゲル（Ｍａｔｒｉｇｅｌ）自体は、ＨＵＶＥＣの差別的活性を誘導するため、我々はジーエフアール材料を使用して、マトリゲル自体からの増殖因子の作用を低下させた。図２２Ａに示すように、ＨＵＶＥＣはジーエフアール材料に接着すると、これらは、互いに整列して、ＣＭ中の差別的活性の影響下で、毛管網に似た管を形成した。ＨＵＶＥＣ管形成測定の定量分析（デネカンプ（Ｄｅｎｅｋａｍｐ Ｊ．）、「総説論文：癌治療の標的としての血管形成、新血管増殖および血管病態生理学」、Ｂｒ Ｊ Ｒａｄｉｏｌ． ６６：１８１−１９６ ［１９９３］）は、他の細胞株から得られたＣＭでＨＵＶＥＣをインキュベートした時に観察されたものと比較して、ＷＴ−ｈＰＴＴＧ−ＣＭが、ＨＵＶＥＣ管形成測定を増強することを明らかにした（図２２Ｂ；ｐ＜０．０１）。毛細管形成に似た形態変化は、抗ｂＦＧＦ抗体を各ＣＭに添加することにより抑制された。ＷＴ−ｈＰＴＴＧ−ＣＭ、Ｍ−ｈＰＴＴＧ−ＣＭ、Ｃ−ＣＭおよびＮ−ＣＭの抗ｂＦＧＦ抗体の抑制作用は、７４％、５８％、５７％、および６２％であった。
【０２８４】
ＨＵＶＥＣ細胞の管形成の測定結果は、ＷＴ−ｈＰＴＴＧ−ＣＭが強い血管形成活性を誘導することを、さらに証明した。Ｍ−ｈＰＴＴＧ−ＣＭ〜Ｃ−ＣＭおよびＮ−ＣＭを使用して、同様の血管形成活性が観察され、これらはすべて、ＷＴ−ｈＰＴＴＧ−ＣＭにより仲介される血管形成活性より有意に低いため、ＰＴＴＧのプロリンリッチなドメインは、形質転換活性のみならず、ＰＴＴＧ介在血管形成性についても重要であるようである。
【０２８５】
ＣＡＭ測定法。ＰＴＴＧ介在血管形成活性はまた、インビボでＣＡＭ測定法により調べた。ヒヨコのＣＡＭは、すでに存在する血管からの新しい血管の発生を誘導するための理想的な微小環境を与える。我々は、ＷＴ−ｈＰＴＴＧでトランスフェクションした細胞からのＣＭが、ＣＡＭ上にスポーク車輪様の外観を誘導することを観察し、この作用は、他の細胞株から得られたＣＭで観察されたものより顕著であった。９日令のヒヨコ卵の胚を使用して、インビボでＣＡＭの血管増殖を試験した。試料をしみこませたコラーゲンスポンジをＣＡＭ上にのせ、４日間のインキュベーション後、周りのコラーゲンスポンジの血管新生を評価した。図２３に示すように、ＷＴ−ｈＰＴＴＧ−ＣＭをあらかじめしみこませたスポンジの適用は、スポーク車輪様の外観を誘導し、これは、他のＣＭにしみこませたスポンジの適用とのＣＡＭ血管形成より明瞭であった。コラーゲンスポンジに入る検出可能な血管の数を立体顕微鏡下で数えると、予測されたように、トランスフェクションおよび非トランスフェクションＮＩＨ３Ｔ３細胞から得られたすべてのＣＭ試料は、無血清ＤＭＥＭ単独より強い血管形成応答を誘導した（ｐ＜０．０１）。
【０２８６】
ＷＴ−ｈＰＴＴＧ−ＣＭを含むスポンジのＣＡＭへの適用は、最も高い血管形成活性を誘導した（ｐ＜０．０１）が、組換えｂＦＧＦ（１μｇ／卵）をＣＡＭに加えるとさらに高い血管形成活性が観察された。インビトロ測定法に比較して、ＷＴ−ｈＰＴＴＧ由来ＣＭ中にしみこませたスポンジの定量的血管形成活性は、添加したｂＦＧＦ（１μｇ／卵）中にしみこませたしたスポンジの適用後に観察されたものより弱かった。しかし、組換えペプチドをしみこませたスポンジとＣＭをしみこませたスポンジのｂＦＧＦバイオベイラビリティは、異なり、この差を説明しているかも知れない。
【０２８７】
例２１：ＰＴＴＧ２過剰発現はＰＴＴＧ１生物活性を阻害する
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）。表２２に示す拡張高忠実度ＰＣＲシステム（Ｅｘｐａｎｄｅｄ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ）（ロシュモレキュラーバイオケミカルズ（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）、インディアポリス、インディアナ州）またはアドバンテージゲノミックポリメラーゼミックス（Ａｄｖａｎｔａｇｅ Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｍｉｘ）（クロンテク（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、パロアルト（Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ）、カリホルニア州）、およびプライマー（ギブコ（Ｇｉｂｃｏ）、グランドアイランド（Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ）、ニューヨーク州）を用いて、ＰＣＲを行った。
【０２８８】
表２２．ＰＣＲプライマー。センス（Ｆ）とアンチセンス（Ｒ）配向からのＰＣＲプライマー配列を列記する。導入した制限酵素部位に下線を引いてある。
2004526404.tif 000026
2004526404.tif 000027
【０２８９】
ＰＴＴＧ遺伝子ファミリーメンバーの放射線ハイブリッド（ＲＨ）マッピング。Ｇ３  ＲＨマッピングパネル（リサーチジェネティクス（Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）、フンツビル（Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ）、アラバマ州）を、ＰＴＴＧプライマーを用いて、（プレザント（Ｐｒｅｚａｎｔ， Ｔ．Ｒ．）ら、「ヒトプロト癌遺伝子ｈＰＴＴＧのイントロンの無い同族体は下垂体腫瘍で発現される：ｈＰＴＴＧファミリーの証拠」、Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ． Ｍｅｔａｂ． ８４：１１４９−１１５２ ［１９９９］）に記載のように、９４℃で３０秒、５６℃で３０秒、７２℃で３０秒（ＰＴＴＧ３、ＰＴＴＧ４）または２．５分（ＰＴＴＧ２−４）を４０サイクル行って増幅した。結果を、連鎖決定のために、スタンフォードヒトゲノムセンター（Ｓｔａｎｆｏｒｄ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｃｅｎｔｅｒ）ウェブサイトに、電子的に提出した。配列決定によりＰＴＴＧの関連性を確認した。
【０２９０】
ＰＴＴＧ３。個々のＵＭＢ６１からの胸腺ＤＮＡから増幅した３４ａ／６０１ｂ  ＰＣＲ産物を配列決定した。次に、遺伝子特異的プライマー（３−８８Ｆ／３−４３４Ｒ）を設計して、Ｇ３ＲＨパネルから推定ＰＴＴＧ３配列を増幅した。
【０２９１】
ＰＴＴＧ４。共通のプライマーＣ１０６Ｆ／Ｃ５２５Ｒは、以前ＰＴＴＧ２とＰＴＴＧ３について陰性であったＧ３ＲＨパネルでｃＤＮＡサイズの生成物を増幅した。これらのＰＣＲ産物をゲル単離（キアエックスＩＩ（ＱＩＡＥＸＩＩ）、キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）、バレンシア（Ｖａｌｅｎｃｉａ）、カリホルニア州）し、配列決定した。次に、Ｇ３ＲＨパネルをＰＴＴＧ４特異的プライマー（４−７Ｆ／４−２８２Ｒ）を用いて増幅した。
【０２９２】
染色体局在化の確認。染色体４（ＮＡ１０１１５）、５（ＮＡ１０１１４）、８（ＮＡ１０１５６Ｂ）、または１１（ＮＡ１０９２７Ａ）とチャイニーズハムスターＤＮＡ（ＮＡ１０６５８）を含有するハムスター−ヒトモノクロモソームＤＮＡを、コリエル医学研究所（Ｃｏｒｉｅｌｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）（カムデン（Ｃａｍｄｅｎ）、ニュージャージー州）から得た。１０ｎｇのＤＮＡを、３−８８Ｆ／３−４３４Ｒ（ＰＴＴＧ３）または４−７Ｆ／４−２８２Ｒ（ＰＴＴＧ４）で増幅した。１０μｇのＤＮＡを、サザンブロット解析のためにＢａｍＨＩで消化した。
【０２９３】
組織と細胞株。凍結組織は、正常ヒト下垂体（ゾイオンダイアグノスティクス（Ｚｏｉｏｎ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）、ニューヨーク、ニューヨーク州；ナショナル神経研究試料バンク（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｓｐｅｃｉｍｅｎ Ｂａｎｋ）、ロサンゼルス、カリホルニア州）と胸腺（ＵＭＢ６１）、正常乳房組織と卵巣組織（メリーランド大学（ボルチモア（Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ）、メリーランド州）の発生疾患のための脳と組織バンク（Ｂｒａｉｎ ＆ Ｔｉｓｓｕｅ Ｂａｎｋｓ ｆｏｒ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ））を含んだ。細胞株は、アメリカンタイプカルチャーコレクション（マナサス（Ｍａｎａｓｓａｓ）、バージニア州）またはフィリップ・ケーフラー（Ｐｈｉｌｌｉｐ Ｋｏｅｆｆｌｅｒ）博士から得た。下垂体腫瘍は、シーダーズサイナイメディカルセンター（Ｃｅｄａｒｓ−Ｓｉｎａｉ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｅｎｔｅｒ）（ロサンゼルス、カリホルニア州）のＧＣＲＣから得て、結腸癌、乳房腫瘍および卵巣腫瘍試料は、病理学教室から得て、すべて施設のガイドラインに従った。
【０２９４】
ＲＮＡとＤＮＡ単離。組織または細胞ペレットを、（プレザント（Ｐｒｅｚａｎｔ， Ｔ．Ｒ．）ら、「ヒトプロト癌遺伝子ｈＰＴＴＧのイントロンの無い同族体は下垂体腫瘍で発現される：ｈＰＴＴＧファミリーの証拠」、Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ． Ｍｅｔａｂ． ８４：１１４９−１１５２ ［１９９９］）に記載のように、ＲＮＡ単離用のトリゾール（ＴＲＩＺＯＬ）試薬（ギブコ（Ｇｉｂｃｏ））中でホモジナイズした。トリゾール（ＴＲＩＺＯＬ）界面からＤＮＡを単離し、プロテイナーゼＫで再抽出し、フェノール／クロロホルムとエタノールで沈殿させたか、またはキアアンプ（ＱＩＡａｍｐ）組織キット（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）、バレンシア（Ｖａｌｅｎｃｉａ）、カリホルニア州）でさらに精製した。
【０２９５】
プライマー伸長分析。ＰＴＴＧ−１−４  ｃＤＮＡを、ＤＮａｓｅ処理ＲＮＡ（増幅グレードＤＮＡａｓｅＩ、ギブコ（Ｇｉｂｃｏ）またはロシュ（Ｒｏｃｈｅ）から；スーパースクリプトＩＩ（ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩ）、ギブコ（Ｇｉｂｃｏ）から）から逆転写し、プライマーＣ１０６Ｆ／Ｃ５２５ＲまたはＣ１２４Ｆ／Ｃ４８１Ｒで増幅した。クロンテク（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）複数組織パネルｃＤＮＡ（成人パネルＩとＩＩ、胎児パネルＩ）とマラソンレースレディ（Ｍａｒａｔｈｏｎ ＲＡＣＥ−ｒｅａｄｙ）下垂体ｃＤＮＡのために、ネステッド（ｎｅｓｔｅｄ）ＰＣＲ反応（Ｃ１０６Ｆ／Ｃ５２５Ｒプライマー、次にＣ１２４Ｆ／Ｃ４８１Ｒプライマー）を使用した。融解したシープラーク（ＳｅａＰｌａｑｕｅ）アガロース（エフエムシープロダクツ（ＦＭＣ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）、ロックランド（Ｒｏｃｋｌａｎｄ）、メイン州）中の〜１ｎｇのＰＣＲ産物を、６μｌのプライマー伸長混合物｛サーモシーケナーゼ（ＴｈｅｒｍｏＳｅｑｕｅｎａｓｅ）酵素、１×緩衝液および０．５μｌの［アルファ−３３Ｐ］ｄｄＡＴＰ（アマシャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）、ピスカタウェイ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ）、ニュージャージー州）、５ｐｍｏｌプライマーＣ２３３Ｒ、および２．５μＭのｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびＴＴＰ（ギブコ（Ｇｉｂｃｏ））を含む｝に加えた。９５℃で１５秒、６２℃で３０秒、７２℃で１分を４０サイクル後、反応物をホルムアミド色素で変性させ、８％配列決定ゲル（ナショナルダイアグノスティクス（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）、アトランタ、ジョージア州）で電気泳動し、コダックバイオマックス（Ｋｏｄａｋ ＢｉｏＭａｘ）ＭＲフィルムでオートラジオグラフィーを行った。ＰＴＴＧ３のＣ２３３Ｒプライムした配列決定ラダーはサイズマーカーである。陰性対照は、−ＲＴ反応物（腫瘍と組織）またはＰＣＲ水ブランク（クロンテク（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）ｃＤＮＡ）である。デンシトメトリー分析は、パブリックドメインＮＩＨイメージ１．６１プログラム（ＮＩＨにより開発され、ｒｓｂ．ｉｎｆｏ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｎｉｈ−ｉｍａｇｅで入手できる）を使用して、マキントッシュコンピューター上で行った。
【０２９６】
配列決定分析。  ５’染色体歩行（クロンテク（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ））は、一次ＰＣＲのためにＣ５２５／ＡＰ１プライマーを使用し、２次ＰＣＲのためにプライマーＡＰ２を２−３０６Ｒ（ＰＴＴＧ２）、３−４３Ｒ（ＰＴＴＧ）またはＣ２３３Ｒ（ＰＴＴＧ４）とともに使用した。３’染色体歩行は、一次ＰＣＲのためにＡＰ１＋２−１４Ｆ（ＰＴＴＧ２）、３−８８Ｆ（ＰＴＴＧ３）、または４−７Ｆ（ＰＴＴＧ４）を、２次増幅のためにＡＰ２＋プライマーＣ１０６Ｆ（ＰＴＴＧ２）またはＣ１２４Ｆ（ＰＴＴＧ３，４）を使用した。ＰＣＲ産物を、ゲル単離（キアエックスＩＩ（ＱＩＡＥＸＩＩ）、キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ））し、ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ（インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、カールスバッド、カリホルニア州）中にクローン化した。［アルファ−３３Ｐ］ｄｄＡＴＰ（アマシャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ））とのサーモシーケナーゼ（ＴｈｅｒｍｏＳｅｑｕｅｎａｓｅ）反応物を、６％アクリルアミド／８．３Ｍ尿素ゲル（ナショナルダイアグノスティクス（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ））で電気泳動し、コダックバイオマックス（Ｋｏｄａｋ ＢｉｏＭａｘ）ＭＲフィルムに露光した。ＧＣＧプログラム（マジソン、ウィスコンシン州）を使用して配列を組み立て、リピートマスカー（ＲｅｐｅａｔＭａｓｋｅｒ）（ワシントン大学、ベイラーカレッジオブメディシン配列ユーティリティーズ（Ｂａｙｌｏｒ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｕｔｉｌｉｔｉｅｓ）ウェブサイト）を用いて、繰り返し成分について分析した。
【０２９７】
マッピング近似転写開始部位。ＰＴＴＧ１−３ＭＲの５’末端をＲＴ−ＰＣＲ実験によりしぼりこんだ。反応物は、ゲノムＤＮＡ（陽性対照）と、ＲＴ有り（試験試料）またはＲＴ無し（陰性対照）でＲＮＡ処理した、ＤＮａｓｅ処理した正常下垂体を含んだ。ＰＴＴＧ１のために、下流プライマーはＣ２３３Ｒであり、上流プライマーは、Ｇ１−２５３Ｆ、−２４５Ｆ、−２１３Ｆ、−１４５Ｆ、−１１５Ｆおよび−８３Ｆである。Ｇ１−２１３Ｆ／Ｃ２３３ＲとＧ１−１４５Ｆ／Ｃ２３３Ｒについて予測されたサイズのＰＣＲ産物を配列決定した。ＰＴＴＧ２のために、下流プライマーは２−３０６Ｒであり、上流プライマーはＧ２−６２Ｆ、−５３Ｆ、−４９Ｆおよび２−１４Ｆである。ＰＴＴＧ３のために、下流プライマーは３−４３４Ｒ、および上流プライマーはＧ３−３３Ｆと３−８８Ｆである。
【０２９８】
サザンブロット。〜５μｇのＢａｍＨＩ消化ゲノムＤＮＡを、ＴＢＥ中０．８％アガロースで電気泳動し、ハイボンド（Ｈｙｂｏｎｄ）Ｎ＋（アマシャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ））膜（サムブルーク（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、「分子クローニング：実験室マニュアル（第２版）」、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリープレス（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク州 ［１９８９］）に移し、６８℃で２時間ハイブリダイズさせた（クイックハイブ（Ｑｕｉｃｋ−Ｈｙｂ）、ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））。プローブは、ランダムプライム標識（ラドプライム（ＲａｄＰｒｉｍｅ）、ギブコ（Ｇｉｂｃｏ）；［アルファ−３２Ｐ］ｄＣＴＰ、ニューイングランドヌクレア（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｎｕｃｌｅａｒ）、ボストン、マサチューセッツ州）したＰＴＴＧ１−３  ＰＣＲ産物（−５Ｆ／６５３Ｒ）の混合物である。厳密性の高い洗浄は、６０℃の０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳを含有した。ブロットを、コダックバイオマックス（Ｋｏｄａｋ ＢｉｏＭａｘ）ＭＲフィルムに露光した。染色体１７（ブラッグ（Ｍ． Ｂｒａｇｇ）からの供与）のＳＴＳマーカーＤ１７Ｓ３３からのプローブＨＨＨ２０２を、標準化のために使用した。
【０２９９】
ノーザンブロット。１０μｇの総ＲＮＡを、モルホリノプロパンスルホン酸緩衝液と６％ホルムアルデヒドを含有する１％アガロースで電気泳動（サムブルーク（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、［１９８９］）し、ハイボンド（Ｈｙｂｏｎｄ）Ｎ＋（アマシャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ））に移し、クイックハイブ（Ｑｕｉｃｋ−Ｈｙｂ）溶液（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））中でＰＴＴＧ１−３プローブ混合物とハイブリダイズさせ、上記のサザンブロットのように洗浄した。ランダムプライム標識１８Ｓ  ｃＤＮＡ（アンビオン（Ａｍｂｉｏｎ）、ヒューストン、テキサス州）を、ローディング標準化のために使用した。
【０３００】
ｐＴａｒｇｅＴプラスミド。ＰＴＴＧコード配列をＰＣＲ増幅し、ＰＴＴＧ１−２について−５Ｆ／６５３Ｒと、ＰＴＴＧ３について−５Ｆ／Ｇ３−６７９Ｒを使用して、ｐＴａｒｇｅＴ（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、マジソン、ウィスコンシン州）中にＴＡクローン化した。鋳型は、ＰＴＴＧ１−ｃＤＮＡクローン９Ｃ（ザング（Ｚｈａｎｇ， Ｘ．）ら、「ヒト下垂体腫瘍形質転換遺伝子（ＰＴＴＧ）の構造、発現および機能」、Ｍｏｌ． Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ． １３：１５６−１６６ ［１９９９］）、ＰＴＴＧ２−ＮＡ１０１１５（コリエル研究所（Ｃｏｒｉｅｌｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ））、ＰＴＴＧ３−Ｇ３  ＲＨパネルメンバー＃６（リサーチジェネティクス（Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ））である。ＰＴＴＧ２ΔＣは、プライマー対Ｇｅｎｅ２−Ｃｔａｉｌ．Ｆ／−Ｃｔａｉｌ．ＲによりｐＴａｒｇｅＴ−ＰＴＴＧ２をＰＣＲ突然変異誘発し、次にキナーゼと細胞内連結（ラピッドリガーゼ（ＲａｐｉｄＬｉｇａｓｅ）、ロシュ（Ｒｏｃｈｅ）；ＳＵＲＥ２細胞へ形質転換、ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））により、ＰＴＴＧ２ΔＣを作成した。
【０３０１】
ｐＢＩＮＤプラスミド。ＰＴＴＧコード配列をＰＴＴＧ−Ｓ／ＰＴＴＧ−ＡＳプライマーで増幅し、ｐＣＲ２．１（インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））中にサブクローニングし、ＢａｍＨＩとＫｐｎＩで消化し、ｐＢＩＮＤ−ＧＡＬ４（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））中に指向性にクローン化した。フレーム内ＤＢＤ−ＰＴＴＧ融合体は、配列決定により確認した。後に再増幅、酵素消化、および連結により、同一のジャンクション配列を作成した。ＰＴＴＧ１は、ＰＴＴＧ１−Ｆ／ｐＢＩＮＤ−５’ＲとＢａｍＨＩを使用し；ＰＴＴＧ２はＰＴＴＧ２−Ｒ／ｐＢＩＮＤ３’ＦとＫｐｎＩを使用し；ＰＴＴＧ３はＰＴＴＧ３−５’Ｆ／ＰＴＴＧ３−Ｒ（ｐＴａｒｇｅＴ−ＰＴＴＧ３鋳型）、ＢａｍＨＩ＋ＫｐｎＩを使用し、ｐＢＩＮＤにサブクローニングした；ｐＢＩＮＤ−ＰＴＴＧ２ΔＬは、Ｇｅｎｅ２−Ｃｔａｉｌ．Ｒ／ｐＢＩＮＤ−３’ＦとＫｐｎＩを使用した。ＰＴＴＧ２ΔＳは、ＰＣＲアーチファクトとして生成した。ＡＴＧの後のヌクレオチド４６６の１塩基欠失は、ＰＴＴＧ２の１５６アミノ酸と、その後の１０のフレーム外のアミノ酸を生じさせ、ＰＸＸＰモチーフは含まない。
【０３０２】
転写活性化測定法。マキシ（Ｍａｘｉ）またはミニプレップ（ｍｉｎｉｐｒｅｐ）ＤＮＡ（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ））を、ＮＩＨ３Ｔ３細胞（リポフェクタミンプラス、ギブコ（Ｇｉｂｃｏ））中に３つずつのウェルに、少なくとも３つの実験で同時トランスフェクションした。ウェル１つにつき、ＤＮＡ濃度は、１μｇ  ｐＢＩＮＤプラスミド、０．１２５μｇレポーターｐＧ５／Ｌｕｃ、および０．１μｇ  ｐＣＭＶ／βｇａｌである。トランスフェクションの２〜３日後、ルシフェラーゼ測定のために細胞質抽出物を調製し（レイ（Ｒａｙ， Ｄ．Ｗ．）ら、「白血病阻害因子（ＬＩＦ）は副腎皮質刺激ホルモン産生細胞株中のプロオピオメラノコルチン（ＰＯＭＣ）発現を刺激する。ＳＴＡＴ経路の役割」、Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． ９７：１８５２−１８５９ ［１９９６］）、これをβ−ガラクトシダーゼ（インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））に対して標準化した。実験の平均±ＳＥＭを、一元配置ＡＮＯＶＡ、ベンフェローニの（Ｂｅｎｆｅｒｒｏｎｉ’ｓ）多重比較検定、およびプリズム（Ｐｒｉｓｍ）３．０解析ソフトウェアにより解析した。
【０３０３】
転写阻害測定法。２．５μｇの競合プラスミド［ｐＴａｒｇｅＴプラスミド（挿入体対照無し、またはＰＴＴＧ１−３挿入体）、またはｐＣＩ−ｎｅｏプラスミド（ＰＴＴＧ１−Ｃ’ＷＴ、−Ｃ’Ｍｕｔ）］を、０．５μｇのｐＢＩＮＤプラスミド、０．１２５μｇのｐＧ５／Ｌｕｃ、および０．１μｇのｐＣＭＶ／βｇａｌとともに、ＮＩＨ３Ｔ３細胞の３つのウェルのそれぞれに、同時トランスフェクションした。１：５希釈のｐＴａｒｇｅＴ−ＰＴＴＧ２は、０．５μｇのプラスミドと２．０μｇのｐＴａｒｇｅＴを、総濃度２．５μｇの競合ＤＮＡ混合物で使用した。溶解物を採取し、上記のように、ルシフェラーゼとβ−ガラクトシダーゼ活性について測定した。ある実験では、リン酸緩衝化生理食塩水（ギブコ（Ｇｉｂｃｏ））中に採取した後、半分の細胞からＤＮＡを調製し、遠心分離し、トリゾール（ＴＲＩＺＯＬ）（ギブコ（Ｇｉｂｃｏ））中に再懸濁した。界面からＤＮＡを単離し、「ドットブロット」分析のために変性させ、ＬａｃＺとプローブ結合させた。
【０３０４】
結果：ＰＴＴＧ遺伝子ファミリーの同定
ＰＴＴＧ１とＰＴＴＧ２：５ｑ３３上のＰＴＴＧ１の染色体位置（ザング（Ｚｈａｎｇ， Ｘ．）ら、「ヒト下垂体腫瘍形質転換遺伝子（ＰＴＴＧ）の構造、発現および機能」、Ｍｏｌ． Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ． １３：１５６−１６６ ［１９９９ａ］）と４ｐ１２のイントロンの無いＰＴＴＧ２の発見と局在化（プレザント（Ｐｒｅｚａｎｔ， Ｔ．Ｒ．）ら、「ヒトプロト癌遺伝子ｈＰＴＴＧのイントロンの無い同族体は下垂体腫瘍で発現される：ｈＰＴＴＧファミリーの証拠」、Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ． Ｍｅｔａｂ． ８４：１１４９−１１５２ ［１９９９］）が記載されている。遺伝子特異的オリゴヌクレオチド（ＧＳＯ）を用いてＰＣＲ−ＥＬＩＳＡを使用して、ＰＴＴＧ２が、脾臓、肝臓および白血球で低レベルで転写されることが証明された（プレザント（Ｐｒｅｚａｎｔ， Ｔ．Ｒ．）ら、［１９９９］）。ＰＴＴＧ２  ｍＲＮＡは、異なる下垂体腫瘍サブタイプで、総ＰＴＴＧのかなりの比率を含有した。ＰＴＴＧ２のゲノムＤＮＡを配列決定する過程で、２つの追加のＰＴＴＧファミリーメンバーが発見された。
【０３０５】
ＰＴＴＧ３：症例対照を調べる時、我々は、３７のホモ接合性配列変化を含有する異常な「ＰＴＴＧ２」配列を見いだした（プレザント（Ｐｒｅｚａｎｔ， Ｔ．Ｒ．）ら、［１９９９］）。これが第３の（イントロンの無い）ＰＴＴＧ遺伝子であるかどうかを、推定ＰＴＴＧ３配列に特異的なＰＣＲプライマーを用いてＧ３  ＲＨマッピングパネルを増幅することにより試験した。ヒトＰＴＴＧ３ゲノム配列（配列番号６５；ジーンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）受け入れ番号ＡＹ０２８４７１）を、以下の表２３に記載する。下線の配列（配列番号６６）（ヌクレオチド３３９〜３４１位の転写開始部位で始まり、ヌクレオチド９４５〜９４７位の停止コドンまで伸長する）は、ｈＰＴＴＧ３タンパク質のコード配列である（配列番号６７）。
【０３０６】
表２３．ｈＰＴＴＧ３遺伝子配列
2004526404.tif 000028
【０３０７】
（配列番号６６）によりコードされる対応するＰＴＴＧ３アミノ酸配列を以下の表２４に示す。
【０３０８】
表２４．ｈＰＴＴＧ３アミノ酸配列
2004526404.tif 000029
【０３０９】
ＰＴＴＧ３は、染色体８ｑ２２上のマーカーＳＨＧＣ−１２８３３から１５ｃＲａｄｓに位置し、ＬＯＤスコアは１０．４７である。この染色体位置は、ヒト第８染色体のみを含有するハムスター／ヒトハイブリッド株からのＤＮＡを使用して、サザンブロット解析（後述）およびＰＣＲ解析（示していない）により確認した。
【０３１０】
ＰＴＴＧ２とＰＴＴＧ３の読みとり枠を、染色体歩行と配列解析により決定した。我々の以前の研究（プレザント（Ｐｒｅｚａｎｔ， Ｔ．Ｒ．）ら、［１９９９］）からのＰＣＲとＧＳＯプライマーは、ＰＴＴＧ３  ｃＤＮＡよりＰＴＴＧ１およびＰＴＴＧ２に対して相同性が大きい。コードされるタンパク質は、ＰＴＴＧ１タンパク質と９０％同一であり、両方のＰＸＸＰモチーフが保存されている。これらのファミリーメンバーは、げっ歯類ＰＴＴＧタンパク質よりＰＴＴＧ１タンパク質に対して、全体的相同性が大きい（図２４）。しかしＰＴＴＧ２は、配列番号６３のヌクレオチド５３４位に＋Ｔ挿入を有し、これは読みとり枠を変化させて、１９１アミノ酸の推定の末端切断型タンパク質（配列番号６４）を与え、アミノ酸１７９で終わるＰＴＴＧ１タンパク質に対して相同性を有する。（チェン（Ｃｈｅｎ， Ｌ．）ら、「ヒト下垂体腫瘍形質転換遺伝子（ｈＰＴＴＧ）ファミリーの同定：分子構造、発現および染色体位置」、Ｇｅｎｅ ２４８：４１−５０ ［２０００］）中のＰＴＴＧ２の配列は、＋Ｔ挿入を含まないため、我々の配列とは異なる。我々のＰＴＴＧ２部分コード配列は、ジーンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）から受け入れ番号ＡＦ１１６５３８．１で入手でき、配列は確認されている。
【０３１１】
ｈＰＴＴＧ２、ｈＰＴＴＧ３およびｈＰＴＴＧ４ゲノム配列のセグメントは、ｈＰＴＴＧ１読みとり枠配列と高い相同性を有する（配列番号３のヌクレオチド９５〜７００位）。特に配列番号３のヌクレオチド９９位で始まるように整列すると、配列番号６２のヌクレオチド３８７〜１０６５位でｈＰＴＴＧ２と；配列番号６５のヌクレオチド３４３〜１０１９位とｈＰＴＴＧ３と；および配列番号６８のヌクレオチド４１８〜１０９１位でｈＰＴＴＧ４と、高い相同性がある。
【０３１２】
ＲＴ−ＰＣＲ実験を行って、ＰＴＴＧ２とＰＴＴＧ３の読みとり枠が完全に転写されるかどうかを決定した。オリゴ（ｄＴ）プライムＰＴＴＧ２  ｃＤＮＡは、正常な下垂体から、ＡＴＧ転写開始部位から−３２、−４９、および−５３（しかし、−６２からではない）で始まる上流プライマーを用いて増幅され、ＰＴＴＧ３  ｃＤＮＡは、ＡＴＧ転写開始部位から−３３で始まる上流プライマーを用いて増幅される。すなわち、両方の遺伝子が転写され、おそらく翻訳される。
【０３１３】
ＰＴＴＧ１の転写開始部位の位置を、同様に決定した。ＲＴ−ＰＣＲ産物を正常下垂体から、ＡＴＧ転写開始部位から−８３、−１１５、−１４５、−２１３、および−２４５（しかし、−２５３からではない）で始まる上流プライマーを用いて、得た。−２１３／Ｃ２３３Ｒと−１４５／Ｃ２３３Ｒ  ＲＴ−ＰＣＲ産物について配列を確認した。興味深いことに、ヒトＰＴＴＧのこの転写領域は、ラットＰＴＴＧプロモーターと重複する。（ペイ（Ｐｅｉ， Ｌ．）、「ラット下垂体腫瘍形質転換遺伝子中の複数のタンパク質の結合部位を含有するエンハンサー成分のゲノム構築と同定」、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７３：５２１９−５２２５ ［１９９８］）。
【０３１４】
６つのエキソンと５つのイントロンの我々のＰＴＴＧ１遺伝子構造（ザング（Ｚｈａｎｇ， Ｘ．）ら、［１９９９ａ］）は、（チェン（Ｃｈｅｎ， Ｌ．）ら ［２０００］）のものとは異なる。チェン（Ｃｈｅｎ）ら（２０００）は、イントロン１／エキソン２ジャンクションにまたがるプローブを使用して、伸長産物を配列決定することなく、プライマー伸長分析と、ＲＮＡｓｅ保護を使用した；彼らは、ＰＴＴＧ１  ｍＲＮＡが、ＡＴＧ転写開始部位の−３７ヌクレオチド上流で始まると結論した。従ってチェン（Ｃｈｅｎ）ら（２０００）のプロモーターは、イントロン１を含有する。我々の実験室では、イントロンを含まないＲＴ−ＰＣＲ産物を一貫して増幅した。
【０３１５】
ＰＴＴＧ４：すべての３つのＰＴＴＧ  ｃＤＮＡの発現を同時に区別するために、我々は、プライマー伸長分析をできる領域を同定し、我々がＰＴＴＧ３を発見した個体から得られたゲノムＤＮＡを用いて、ＲＴ−ＰＣＲ（Ｃ１０６Ｆ／Ｃ５２５Ｒ）とプライマー伸長反応（Ｃ２３３Ｒ）のための新しいＰＣＲ「共通の」プライマーを試験した。表２５は、ヒトＰＴＴＧ４偽遺伝子とフランキングゲノム配列を示す（配列番号６８；ジーンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）受け入れ番号ＡＹ０２８４７３）。
【０３１６】
表２５．ｈＰＴＴＧ４配列
2004526404.tif 000030
【０３１７】
複合配列（配列番号６８）は、ＰＴＴＧ２とＰＴＴＧ３の配列の両方と異なる１６８ヌクレオチドの１２を有した。これらの驚くべき結果は、２つの可能性を示唆した：ＰＴＴＧ２および／またはＰＴＴＧ３の対立遺伝子のいずれかまたは両方が、複数の配列変化を有する；または追加のイントロンの無いＰＴＴＧ同族体が存在する。
【０３１８】
これらの仮説を検証するために、我々は、新しいプライマーＣ１０６Ｆ／Ｃ５２５Ｒを用いて放射線ハイブリッド（ＲＨ）パネルマッピングを再増幅し、以前はＰＴＴＧ２とＰＴＴＧ３について陰性であった７つのパネルメンバーで、１２ヌクレオチドの変化の１１と同一の配列を見いだした。すなわち、イントロンの無いＰＴＴＧ４遺伝子の存在が確認され、この遺伝子は、ＰＴＴＧファミリーの他の遺伝子とは異なる遺伝子座にマッピングされる。ＰＴＴＧ４特異的プライマーを用いるＲＨマッピングは、これを染色体１１ｑ１２−１３に局在化させた（ＬＯＤスコア１４．００、マーカーＤ１１Ｓ４２０５から１４ｃＲｓ）。これは、ＡＴＧ転写開始部位を含む、ＰＴＴＧ１のエキソン２との相同性が欠如しているため、追加の配列データは、ＰＴＴＧ４が偽遺伝子であることを示す。さらに、６７３ｂｐの重複でＰＴＴＧ１と全体で８９％の相同性があるにもかかわらず、長い読みとり枠は見つからなかった。
【０３１９】
図２５は、ＰＴＴＧファミリーのゲノム構造を示す。ＰＴＴＧ３とＰＴＴＧ４は、その横に直接繰り返し構造が位置し、ＰＴＴＧ１  ｍＲＮＡのポリ（Ａ）テイルに対応する位置でポリ（Ａ）の短いストレッチを含有する点で、古典的なイントロンの無い遺伝子のようである（ブロシウス（Ｂｒｏｓｉｕｓ， Ｊ．）「すべての範疇のＲＮＡは、新規遺伝子または制御成分として適合し得る逆配列（ｒｅｔｒｏｓｅｑｕｅｎｃｅｓ）を生じさせる」、Ｇｅｎｅ ２３８：１１５−１３４ ［１９９９］）。ＰＴＴＧ３の横にライン１（Ｌｉｎｅ１）ファミリー繰り返し構造が位置し、ＰＴＴＧ４はＬＴＲに囲まれている。ＰＴＴＧ２は、１ｋｂ以上離れたＬ２ｂ繰り返し構造を有し、ポリ（Ａ）の痕跡が無いレトロポゾン（ｒｅｔｒｏｐｏｓｏｎ）的特徴と多様なカルボキシ末端をコードする配列の欠如は、ＰＴＴＧ２のレトロトランスポジション（ｒｅｔｒｏｔｒａｎｓｐｏｓｉｔｉｏｎ）イベントについて高齢であることを反映しているかも知れない。
【０３２０】
ＰＴＴＧファミリーメンバーは、４つの異なる染色体に局在化し、異なる組織特異的発現パターンを有する。ＰＴＴＧ３は、プレザント（Ｐｒｅｚａｎｔ， Ｔ．Ｒ．）ら（プレザント（Ｐｒｅｚａｎｔ， Ｔ．Ｒ．）ら、「ヒトプロト癌遺伝子ｈＰＴＴＧのイントロンの無い同族体は下垂体腫瘍で発現される：ｈＰＴＴＧファミリーの証拠」、Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ． Ｍｅｔａｂ． ８４：１１４９−１１５２ ［１９９９］）で言及されており、次にチェン（Ｃｈｅｎ， Ｌ．）ら（チェン（Ｃｈｅｎ， Ｌ．）ら、「ヒト下垂体腫瘍形質転換遺伝子（ｈＰＴＴＧ）ファミリーの同定：分子構造、発現および染色体位置」、Ｇｅｎｅ ２４８：４１−５０ ［２０００］）により記載された。ＰＴＴＧ１−３の報告された染色体局在化の小さな差（５ｑ３３対５ｑ３５．１、４ｐ１２対４ｐ１５．１、８ｑ２２対８ｑ１３．１）は、おそらく方法の差が原因であろう（本明細書で使用されたＲＨマッピングに対して、チェン（Ｃｈｅｎ， Ｌ．）らが使用したＦＩＳＨ）。さらに許容される（ｐｅｒｍｉｓｓｉｖｅ）ＰＣＲ条件下で、第１１染色体上のｍｅｎ１を動原体とする、ＰＴＴＧ４偽遺伝子が本明細書で記載される。本明細書に記載の染色体割り当ては、サザンブロット解析により確認された。
【０３２１】
正常組織でのＰＴＴＧファミリーの発現パターン。  標準化ＲＴ−ＰＣＲ産物のプライマー伸長分析は、ＰＴＴＧ１と、３つのイントロンの無いＰＴＴＧ２、ＰＴＴＧ３およびＰＴＴＧ４遺伝子の発現とを区別する。図２６は、ほとんどの胎児および成体組織中でＰＴＴＧ１が主要な型であるが、成体の睾丸、胸腺、保存、結腸、胎盤および脳と胎児肝臓のみが、ノーザンブロットで検出可能なＰＴＴＧ  ｍＲＮＡを有することを示す（ザング（Ｚｈａｎｇ， Ｘ．）ら、［１９９９ａ］）。我々は、ＰＴＴＧ２  ｍＲＮＡの比率は、結腸、白血球、肝臓および心臓で最も高く、ＰＴＴＧ３は、結腸、前立腺、膵臓および腎臓で最も高いことを見いだした。ＰＴＴＧ４はあまり転写されない。デンシトメトリー分析から得られるように、４つのＰＴＴＧ  ｃＤＮＡの相対的比率は、グラフで示される（図２６）。
【０３２２】
我々は使用したプライマー伸長法は、ＰＣＲに基づくものであり、クロンテク（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）ｃＤＮＡは非常に希薄（０．２ｎｇ／μｌ）であるため、ＰＴＴＧ発現が低いほとんどの組織（ザング（Ｚｈａｎｇ， Ｘ．）ら、［１９９９ａ］）では、ネステッド（ｎｅｓｔｅｄ）反応が必要であった。従ってこれらの結果は、試料内の遺伝子ファミリーメンバーの相対的発現を示している。
【０３２３】
ＰＴＴＧ１  ｍＲＮＡは、９つの胎児組織とほとんどの成体組織中で最も高い比率の総ＰＴＴＧ  ｍＲＮＡを含有する。ＰＴＴＧがノーザンブロットにより検出可能なある組織については、新しいファミリーメンバーもまた発現される：脾臓と結腸中のＰＴＴＧ２，および結腸中のＰＴＴＧ３。ＰＴＴＧ２および／またはＰＴＴＧ３  ｃＤＮＡもまた、いくつかの組織中で検出可能であり、ＰＴＴＧ発現は低い（ｗｂｃ、乳房、卵巣中の両方の遺伝子；肝臓と心臓中のＰＴＴＧ２、腎臓、前立腺および膵臓中のＰＴＴＧ３）。ＰＴＴＧ４は、あまり転写されず、またフレーム内ＡＴＧコドンが欠如しているため、偽遺伝子と思われる。
【０３２４】
ＰＴＴＧ２とＰＴＴＧ３  ｍＲＮＡの組織分布パターンは、（チェン（Ｃｈｅｎ， Ｌ．）ら ［２０００］）に記載のものとは異なる。これらの結果は、ＰＴＴＧ２：（＋）脾臓と結腸、および（−）胸腺、およびＰＴＴＧ３：（−）脾臓、胸腺、睾丸、卵巣、小腸についての我々の結果と一致するが、ＰＴＴＧ２：（＋）前立腺、睾丸、卵巣、小腸、および（−）ｗｂｃ、およびＰＴＴＧ３：（＋）卵巣腫瘍のみ、および（−）前立腺、結腸、ｗｂｃについては一致しない。この差は、両グループともクロンテク（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）ノーザンブロットまたは対応する複数の組織パネルを使用したため、単に異なるＲＮＡの起源によるものではなく、形態の差による可能性がある。例えば、ノーザンブロット解析で使用されたＰＴＴＧ２オリゴヌクレオチドプローブは、ｍＲＮＡサイズの情報が提供されていないため、無関係の遺伝子を検出するかも知れない。また、彼らの研究のＰＴＴＧ２とＰＴＴＧ３  ＲＴ−ＰＣＲについて使用された各プライマー対の１つの配列は、我々の測定とは異なる。ＰＴＴＧ３ノーザンブロットを用いた彼らの陰性結果は、そのアンチセンスオリゴヌクレオチドプローブの３つの配列の差による可能性がある。
【０３２５】
癌におけるＰＴＴＧファミリーの発現パターン。  我々は、結腸癌、乳癌および卵巣癌で観察されたＰＴＴＧ  ｍＲＮＡの５〜１０倍の増加へのＰＴＴＧファミリーメンバーの相対的寄与を評価した。プライマー伸長測定法は、標準化ＲＴ−ＰＣＲ産物を使用した（プライマー伸長中で同様の量のｃＤＮＡ産物を使用して）。図２７Ａは、正常な結腸中ではＰＴＴＧ１が主要な型であるが、ＰＴＴＧ２とＰＴＴＧ３も転写されることを示す。しかしＰＴＴＧ１  ｍＲＮＡの比率は、一致した正常組織試料と比較して、５つの結腸腫瘍で選択的に増加した（図２８）。すなわち、原発性結腸新生物では、癌細胞株と同様に、ＰＴＴＧ  ｍＲＮＡの増加は、ほとんどＰＴＴＧ１による。
【０３２６】
ＰＴＴＧ１  ｍＲＮＡはまた、白血病細胞株（ｎ＝３、示していない）、乳癌（ｎ＝４、図２７Ｂ）、および卵巣癌（ｎ＝５、図２７Ｃ）で、主要な分子種であった。ＰＴＴＧ１  ｍＲＮＡは、卵巣癌中の高レベルのＰＴＴＧ発現に最も寄与するものであり、図２７Ｃに示すように５つの腫瘍のうちの４つで総ＰＴＴＧ  ｍＲＮＡの＞９５％を占めた。ＰＴＴＧ１  ｍＲＮＡは、比率的に卵巣癌と乳癌の両方で最も多く発現されるファミリーメンバーである。ＰＴＴＧ３転写体は、正常乳房では検出されなかったが、４つの乳房腫瘍のうち２つで中程度に発現された。低レベルのＰＴＴＧ２  ｃＤＮＡは、正常乳房と４つの乳房腫瘍で同様であった。ＰＴＴＧ２とＰＴＴＧ３  ｃＤＮＡは、５つの卵巣癌すべてで検出されたが、その比率は、正常卵巣対照より高くはなかった。チェン（Ｃｈｅｎ， Ｌ．）ら ［２０００］とは異なり、ＰＴＴＧ３は正常卵巣中で高い比率で発現されているため、我々は、ＰＴＴＧ３の卵巣腫瘍特異的発現パターンを観察できず、５つの卵巣腫瘍のうちの４つと卵巣癌細胞株ＳＫＯＶ３（示していない）は、ほとんどＰＴＴＧ１転写体を発現した。
【０３２７】
下垂体腺腫のプライマー伸長結果を、図２９に要約する。２４の腺腫のうちの１５でＰＴＴＧ２  ｃＤＮＡが容易に検出できたが、２４の腫瘍のうちの５つでのみＰＴＴＧ３が弱く発現された。プロラクチノーマの優先的ＰＴＴＧ１発現は、エストロゲンによる制御のせいかも知れない。（ヒーネイ（Ｈｅａｎｅｙ Ａ．Ｐ．）ら、「プロラクチノーマ病因におけるエストロゲン誘導下垂体腫瘍形質転換遺伝子（ＰＴＴＧ）の早期関与と繊維芽細胞増殖因子発現」、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ． ５：１３１７−１３２１ ［１９９９］）。他の下垂体腫瘍サブタイプ中のＰＴＴＧ２  ｍＲＮＡの高い比率は、これらの腺腫の全体に良性の結果に関連しているかも知れない。
表２６は、ＰＴＴＧファミリーメンバーの染色体局在、相同性および発現パターンを要約する。
【０３２８】
表２６  ヒトＰＴＴＧ遺伝子ファミリー。相同性：同一のヌクレオチド（ｎｔ）配列またはアミノ酸（ａａ）配列；ｈＰＴＴＧ１との類似性：保存的アミノ酸変化。染色体遺伝子座は放射線ハイブリッド（ＲＨ）マッピングにより決定した。発現パターンは図２６〜２９中のプライマー伸長分析からの結果を要約する。
2004526404.tif 000031
【０３２９】
癌でのＰＴＴＧ遺伝子増幅の欠如。ＰＴＴＧ遺伝子ファミリーメンバーが、結腸新生物および癌細胞株中で再配列されるか、および／または増幅されるかどうかを、サザンブロット解析を使用して調べた。まず、ハムスター／ヒトモノクロモソームハイブリッドからのＤＮＡを用いて、ＢａｍＨＩはコード領域の外を消化し、４つのＰＴＴＧ遺伝子の区別可能なバンドを与えることを確認した（図３０Ａ）。ＰＴＴＧ  ｍＲＮＡ発現の少なくとも５〜１０倍の増加にもかかわらず、隣接正常組織試料と比較して、一致する結腸腫瘍の３つの対で、染色体増幅も再配列も観察されなかった（図３０Ｂ）。
【０３３０】
骨髄性細胞株ＨＬ−６０（クロンテク（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）癌ＲＮＡパネル中でＰＴＴＧを豊富に発現する）は、ＰＴＴＧ１遺伝子座のすぐ近傍にある染色体領域５ｑ１１−ｑ３１（３１）の間質欠失がある（ザング（Ｚｈａｎｇ， Ｘ．）ら、［１９９９ａ］）。この欠失は、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）と急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）で観察される（ミテルマン（Ｍｉｔｅｌｍａｎ， Ｆ．）ら、「ヒト新生物中の周期性染色体再配列の区切り点地図」、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ．， １５：特別号、［１９９７年４月号］；ホリガン（Ｈｏｒｒｉｇａｎ， Ｓ．Ｋ．）ら、「５ｑ３１上の悪性骨髄疾患中の腫瘍抑制遺伝子の９つの候補の最小区間の確定と同定」、Ｂｌｏｏｄ ９５：２３７２−２３７７ ［２０００］）。我々は、ＰＴＴＧ１サイズのＢａｍＨＩ制限断片の用量が、下垂体上皮細胞株ＬＬ２４と比較して、２つのリンパ細胞株（ＨＬ−６０とＫＧ−１）で低下していることを見いだした（図３０Ｃ）。第１７染色体からの単一の遺伝子プローブを用いてハイブリダイズした同じブロットを、下に示す。これらの細胞株の対応するノーザンブロットを、図３０Ｄに示す。
【０３３１】
ＰＴＴＧファミリーの機能解析
転写活性化。ＰＴＴＧ１タンパク質は、酵母と哺乳動物２ハイブリッド系で転写アクチベーターである（ドミングエ（Ｄｏｍｉｎｇｕｅｚ， Ａ．）ら、「ラットＰＴＴＧのヒト同族体であるＰＴＴＧは造血系新生物で過剰発現される。ＰＴＴＧの転写活性化機能の証拠」、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ １７：２１８７−２１９３ ［１９９８］；ワング（Ｗａｎｇ， Ｚ．）とメルメド（Ｍｅｌｍｅｄ， Ｓ．）、「下垂体腫瘍形質転換遺伝子（ＰＴＴＧ）トランス活性化および形質転換活性」、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７５：７４５９−７４６１ ［２０００］）。ＰＴＴＧ１、ＰＴＴＧ２およびＰＴＴＧ３のトランス活性化機能を、哺乳動物の２ハイブリッド系で比較した。ＰＴＴＧ１と融合したキメラＧＡＬ４  ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）は、ＤＢＤ対照プラスミドによるトランスフェクションと比較して、ルシフェラーゼレポータープラスミドの発現の５４倍の増加を引き起こした。ＰＴＴＧ２とＰＴＴＧ３挿入体は、ルシフェラーゼ発現のそれぞれ１．８倍と５．５倍の増加を誘導した。従って、ＰＴＴＧ２とＰＴＴＧ３は、ＰＴＴＧ１と相同性が高いが、そのコード配列は、もし発現されると、インビボで異なる生物学的機能を有するかも知れない。ＰＴＴＧ２は、その異なるカルボキシ末端で、少なくとも転写活性を有する。全カルボキシ末端をコードするセグメント（ＰＴＴＧΔＬ）の欠失は、ＰＴＴＧのトランス活性化を２６倍上昇させ、この領域が転写に阻害性であり、一方ＰＸＸＰモチーフの欠如したより短い末端切断型（ＰＴＴＧ２ΔＳ）は転写活性が無いことを意味する。３つの実験の結果を図３１に示す。
【０３３２】
ＰＴＴＧ２はＰＴＴＧ１トランス活性化を阻害する。  ＰＴＴＧ２および／またはＰＴＴＧ３がＰＴＴＧ１の優性陰性インヒビターかどうかを試験した。５倍モル過剰のＰＴＴＧ含有プラスミド（ＤＢＤドメイン無し）を、トランス活性化測定法のために、ＣＭＶプロモーターに転写制御される両方のプラスミドを用いて同時トランスフェクションした。図３２Ａは、ＰＴＴＧ２の過剰発現が、ＰＴＴＧ１によるトランス活性化を強力に阻害することを示す（４８％の低下、ｐ＜０．００１）。ＰＴＴＧ２はまた、ＶＰ１６、ＰＴＴＧ３およびＰＴＴＧ２を含有するＤＢＤプラスミドについてトランス活性化を阻害するため、この阻害は用量依存性であり、遺伝子特異的ではない（図３２Ｂ）。これに対して、ＰＴＴＧ１の過剰発現は、ＰＴＴＧ２のトランス活性化機能の低下を逆転させない。
【０３３３】
トランス活性化活性に必要なカルボキシ末端中の２つのＳＨ３結合ドメインにより阻害が仲介されるかどうかを調べるために、ＰＴＴＧ１の野生型と変異体Ｃ末端断片を、競合測定法で試験した。ＰＴＴＧ１の野生型Ｃ末端のみが、トランス活性化を弱く低下させた。これは、ＰＴＴＧ２のユニークなＣ末端が、トランス活性化阻害に関与し、末端切断型ＰＴＴＧ２タンパク質（ａａ１〜１７９；免疫細胞蛍光により確認された［示していない］）をコードする変異体ＰＴＴＧ２は、ＰＴＴＧ１トランス活性化をもう阻害しなかったことを意味する（図３２Ｂ）。
【０３３４】
ＰＴＴＧタンパク質は、核に局在化（チエン（Ｃｈｉｅｎ， Ｗ．）とペイ（Ｐｅｉ， Ｌ．）、「新規結合因子は、下垂体腫瘍形質転換遺伝子産物の核移動とトランス活性化機能を促進する」、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７５：１９４２２−１９４２７ ［２０００］；ユー（Ｙｕ， Ｒ．）ら、「下垂体腫瘍形質転換遺伝子（ＰＴＴＧ）は胎盤ＪＥＧ−３細胞の分裂と生存を制御する：生きた細胞イメージングからの証拠」、Ｍｏｌ． Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ． １４：１１３７−１１４６ ［２０００］）し、そこで染色体分離に参加する（ゾウ（Ｚｏｕ， Ｊ．）ら、「形質転換と腫瘍発生に関与する脊椎動物姉妹染色分体分離インヒビターの同定」、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８５：４１８−４２２ ［１９９９］）。ＰＴＴＧタンパク質はまた、転写アクチベーターとして機能する。（ドミングエ（Ｄｏｍｉｎｇｕｅｚ， Ａ．）ら、「ラットＰＴＴＧのヒト同族体であるＰＴＴＧは造血系新生物で過剰発現される。ＰＴＴＧの転写活性化機能の証拠」、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ １７：２１８７−２１９３ ［１９９８］；ワング（Ｗａｎｇ， Ｚ．）とメルメド（Ｍｅｌｍｅｄ， Ｓ．）、「下垂体腫瘍形質転換遺伝子（ＰＴＴＧ）トランス活性化および形質転換活性」、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７５：７４５９−７４６１ ［２０００］）。ＰＴＴＧ遺伝子ファミリーの機能的性状解析を始めるために、ＰＴＴＧ２とＰＴＴＧ３によりコードされる読みとり枠を、哺乳動物細胞中のトランス活性化機能について試験した。９０％のアミノ酸同一性にもかかわらず、ＰＴＴＧ３タンパク質は、ＰＴＴＧ１より１０倍低いトランス活性化能を有し、これはおそらく、本明細書で前記した、マウスＰＴＴＧ１の構造／機能分析により、トランス活性化に決定的に重要であることが証明された残基中のアミノ酸の差（Ｅ１７５Ｋ、Ｄ１２４Ｇ）によるものであろう。
【０３３５】
コードされるＰＴＴＧ２タンパク質は、１７９アミノ酸についてＰＴＴＧ１タンパク質と９０％同一であるが、そのカルボキシ末端は、追加の１２アミノ酸について相同性ではない。ＰＴＴＧ２タンパク質は、Ｐ１４５、Ｓ１６５、Ｅ１７５に対応するマウスＰＴＴＧ中で同定される決定的に重要な残基とヒトＰＴＴＧ１中のアミノ酸１２３〜１３０を保持するため、この異なるカルボキシ末端が、トランス活性化活性の３０倍上昇の原因である可能性がある。異なるカルボキシ末端をコードする変種ＰＴＴＧ転写体は、トランス活性化機能と形質転換能力を失なったため、カルボキシ末端領域はマウスＰＴＴＧ機能にとって決定的に重要である。ＰＴＴＧ２のカルボキシ末端セグメントの除去は、トランス活性化機能の２６倍の上昇を引き起こし、これはＰＴＴＧ２のこの領域がトランス活性化に対して阻害作用を有することを意味する。
【０３３６】
我々は、ＰＴＴＧ２および／またはＰＴＴＧ３タンパク質が、ＰＴＴＧ１タンパク質のトランス活性化機能を阻害するかどうかを試験した。これらの遺伝子を過剰発現するプラスミドを、ＤＢＤプラスミドと比較して５倍モル過剰の「遊離の」ＰＴＴＧ遺伝子を使用して、トランス活性化測定法で同時トランスフェクションした。ＰＴＴＧ２の過剰発現は、ＰＴＴＧ１トランス活性化活性をほとんど半分に低下させ、ＰＴＴＧ３は、この系でまったく効果はなかった。ＰＴＴＧ２による阻害は用量依存性であり、複数の実験で異なるＤＮＡ調製物で再現された。我々は、ＰＴＴＧ２過剰発現はまた、ＰＴＴＧ３とＰＴＴＧ２および無関係の遺伝子ＶＰ１６のトランス活性化活性も阻害することを見いだした。予想外にも、遊離のＰＴＴＧ１の過剰発現は、ＤＢＤ−ＰＴＴＧ１のトランス活性化活性を増強した。ＶＰ１６、ＰＴＴＧ２およびＰＴＴＧ３のトランス活性化活性は変化しなかったため、この増強は、遺伝子特異的であった。１つの解釈は、ＰＴＴＧ１が、トランス活性化中にオリゴマーを形成することである。
【０３３７】
野生型ＰＴＴＧ１−Ｃ末端過剰発現は、ＰＴＴＧ１トランス活性化に対してほんのわずかの作用を有するのみであるため、ＰＴＴＧ２により引き起こされたトランス活性化の大きな低下は、明らかに２つを超えるＳＨ３結合ドメインを必要とする。我々は、末端切断型ＰＴＴＧ２をコードするプラスミドを作成して、ＰＴＴＧ２タンパク質の顕著なカルボキシ末端テイルが、優性陰性阻害作用に関与するかどうかを試験した。変異体ＰＴＴＧ２タンパク質の過剰発現（免疫細胞蛍光により確認された；示していない）は、ＰＴＴＧ１によるトランス活性化を阻害しない。従ってＰＴＴＧ２の阻害機能は、その異なるカルボキシ末端に依存する。
【０３３８】
ＰＴＴＧファミリーは、２つの意味で他の癌遺伝子ファミリーとは異なる。第１に、ほとんどの癌（結腸、乳房、卵巣および骨髄系統）でＰＴＴＧ１のみが過剰発現される。これは、複数の同族体がプロト癌遺伝子であるｒａｓやｍｙｃとは対照的であるが、その活性化は組織特異的癌に対応するかも知れない。ＰＴＴＧファミリーの第２の特徴は、その異なる同族体が、反対の細胞内機能を有することである。ＰＴＴＧ１は転写を活性化するが、ＰＴＴＧ２は、特異的ではないが用量依存性にトランス活性化を阻害する。この阻害ドメインは、異なるＰＴＴＧ２カルボキシ末端にマッピングされる。本発明は、特定の分子機構に依存しないが、いくつかのモデル（例えば、転写機構への非生産的結合、転写因子の隔離、または不活性なヘテロダイマーの形成）がこの転写阻害を説明できるかも知れない。試験したすべて腫瘍の中で、あまり転移しない下垂体腫瘍が、比例的に高いレベルの発現を有することに注意されたい。
【図面の簡単な説明】
【図１】
トランスフェクションの４８時間後のｐＧＡＬ４、ｐＧＡＬ４−ＶＰ１６，ｐＧＡＬ−４−ｗＰＴＴＧ、またはｐＧＡＬ４−ｍｕｔＰＴＴＧにより仲介される、トランスフェクションしたＮＩＨ−３Ｔ３細胞中のトランス活性化を例示する。細胞溶解物タンパク質を、ルシフェラーゼとβ−ｇａｌ発現について測定した。ｐＧＡＬ４は陰性対照として使用し、ｐＧＡＬ４−ＶＰ１６は陽性対照として使用した。
【図２】
トランスフェクションした腫瘍細胞中のＰＴＴＧ−ＣとＰＴＴＧ−Ｃｐｍ発現を示す。図２Ａは、ＣＭＶプロモーター（黒い棒）の制御下での、配列番号４のアミノ酸残基１４７−２０２（すなわち、配列番号９）に対応するヒトＰＴＴＧ１タンパク質のＣ末端ペプチド（ＰＴＴＧＣ）の発現構築体を例示する。ＰＸＸＰは、ＰＴＴＧ−Ｃのプロリンリッチな領域である。突然変異発現ベクター（ＰＴＴＧ−Ｃｐｍ）は、点突然変異Ｐ１６３Ａ、Ｓ１６５Ｑ、Ｐ１６６Ｌ、Ｐ１７０Ｌ、Ｐ１７２ＡおよびＰ１７３Ｌを含有した。図２Ｂは、ヒーラ細胞（上のパネル）、Ｔ−４７Ｄ細胞（真ん中のパネル）、およびＭＣＦ−７細胞（下のパネル）のＲＴ−ＰＣＲ産物の１％アガロースゲルであり、ＰＴＴＧ−ＣとＰＴＴＧ−Ｃｐｍ発現を示す。ＲＴの存在下（＋）または非存在下（−）で行った逆転写の生成物を、ＰＣＲ反応の鋳型として使用した。図２Ｃは、ＲＴ−ＰＣＲ後の直接配列解析の代表的配列決定ゲルであり、各トランスフェクション体中のＰＴＴＧ−ＣとＰＴＴＧ−Ｃｐｍの発現を示す。矢印は、ヌクレオチド変化を示す。
【図３】
軟寒天上でＰＴＴＧ−ＣまたはＰＴＴＧ−Ｃｐｍ発現ベクターでトランスフェクションしたヒーラ細胞（上の段）、Ｔ−４７Ｄ細胞（真ん中の段）、およびＭＣＦ−７細胞（下の段）のコロニー形成を示す。「ベクター（左の列）」は、ベクターｐＣＩ−ｎｅｏ単独でトランスフェクションした細胞を示し、「ＰＴＴＧ−Ｃ」（真ん中の列）は、ＰＴＴＧ−Ｃ末端をコードするｃＤＮＡを含有するベクターｐＣｉ−ｎｅｏでトランスフェクションした細胞を示し、「ＰＴＴＧ−Ｃｐｍ」（右の列）は、変異体ＰＴＴＧ  Ｃ末端ｃＤＮＡ（Ｐ１６３Ａ、Ｓ１６５Ｑ、Ｐ１６６Ｌ、Ｐ１７０Ｌ、Ｐ１７２ＡおよびＰ１７３Ｌ）を含有するベクターｐＣＩ−ｎｅｏでトランスフェクションした細胞を示す。
【図４】
ＰＴＴＧ−Ｃペプチドを発現するヒーラ細胞によるｂＦＧＦ分泌の抑制を示す。７２時間培養したトランスフェクション体から得られる調整培地中のｂＦＧＦの、ＥＬＩＳＡで測定した濃度。「ベクター」（２つの最も左の棒）は、ベクターｐＣＩ−ｎｅｏ単独でトランスフェクションした細胞により調整した培地を示し、「ＰＴＴＧ−Ｃ」（３つの真ん中の棒）は、ｗｔＰＴＴＧ−Ｃ末端をコードするｃＤＮＡを含有するベクターｐＣＩ−ｎｅｏでトランスフェクションした細胞により調整した培地を示し、「ＰＴＴＧ−Ｃｐｍ」（３つの最も右の棒）は、変異体ＰＴＴＧ  Ｃ末端ｃＤＮＡ（Ｐ１６３Ａ、Ｓ１６５Ｑ、Ｐ１６６Ｌ、Ｐ１７０Ｌ、Ｐ１７２ＡおよびＰ１７３Ｌ）を含有するベクターｐＣＩ−ｎｅｏでトランスフェクションした細胞により調整した培地を示す。
【図５】
分裂促進因子である抗ＣＤ３抗体で処理した正常ヒト成人Ｔ細胞中のＰＴＴＧ  ｍＲＮＡ発現を示す。Ｔ細胞を単離し、抗ＣＤ３抗体で７２時間刺激した。ＰＴＴＧ  ｍＲＮＡ  ＰＴＴＧをノーザンブロッティングで測定し、Ｓ期またはＧ２／Ｍ期の細胞のパーセントをＦＡＣＳにより測定した。
【図６】
分裂促進因子である植物性血球凝集素（ＰＨＡ）で処理した正常ヒト成人Ｔ細胞中のＰＴＴＧ  ｍＲＮＡ発現を示す。Ｔ細胞を単離し、上昇する濃度のＰＨＡで７２時間刺激した。ＰＴＴＧ  ｍＲＮＡをノーザンブロッティングで測定し、Ｓ期またはＧ２／Ｍ期の細胞のパーセントをＦＡＣＳにより測定した。
【図７】
分裂促進因子であるＣＤ３抗体で処理した正常ヒト成人Ｔ細胞中のＩＬ−２  ｍＲＮＡ発現を示す。Ｔ細胞を単離し、抗ＣＤ３抗体で７２時間刺激した。ＩＬ−２  ｍＲＮＡ  ＰＴＴＧをノーザンブロッティングで測定し、Ｓ期またはＧ２／Ｍ期の細胞のパーセントをＦＡＣＳにより測定した。
【図８】
分裂促進因子である抗ＣＤ３抗体で処理した正常ヒト成人Ｔ細胞中のシクロフィリン  ｍＲＮＡ発現を示す。Ｔ細胞を単離し、抗ＣＤ３抗体で４８時間刺激した。シクロフィリン  ｍＲＮＡ  ＰＴＴＧをノーザンブロッティングで測定した。
【図９】
ＰＴＴＧ  ｍＲＮＡ発現とヒドロコーチゾンを示す。ＰＨＡ（５μｇ／ｍｌ）刺激正常ヒト成人Ｔ細胞をヒドロコーチゾンで７２時間処理した。ＰＴＴＧ  ｍＲＮＡをノーザンブロッティングで測定し、Ｓ期またはＧ２／Ｍ期の細胞のパーセントをＦＡＣＳにより測定した。
【図１０】
ＰＴＴＧ  ｍＲＮＡ発現とシクロスポリンを示す。ＰＨＡ（５μｇ／ｍｌ）刺激正常ヒト成人Ｔ細胞をシクロスポリンで７２時間処理した。ＰＴＴＧ  ｍＲＮＡをノーザンブロッティングで測定し、Ｓ期またはＧ２／Ｍ期の細胞のパーセントをＦＡＣＳにより測定した。
【図１１】
白血病細胞中のＰＴＴＧ  ｍＲＮＡ発現を例示する。循環するヒト白血病ＨＬ−６０細胞（１）、ジューカット（Ｊｕｒｋａｔ）Ｔ細胞（２）、休止細胞（３）、ＰＨＡ（５μｇ／ｍｌ）刺激細胞、（４）抗ＣＤ３刺激細胞、および（５）正常ヒト成人Ｔ細胞のＰＴＴＧ  ｍＲＮＡ値と細胞サイクルを測定した。
【図１２】
Ｔ細胞中のＰＴＴＧ  ｍＲＮＡ発現と細胞サイクルを示す。Ｔ細胞を以下の条件で処理し、ＰＴＴＧ  ｍＲＮＡとＳ期のパーセントを比較した。（１）休止細胞；（２）ＰＨＡ（５μｇ／ｍｌ）刺激；（３）抗ＣＤ３刺激；（４）抗ＣＤ３＋ヒドロコーチゾン（１００ｎＭ）；（５）抗ＣＤ３＋シクロスポリンＡ（１μｇ／ｍｌ）；（６）抗ＣＤ３＋アフィジコリン（１μｇ／ｍｌ）；（７）抗ＣＤ３＋ノコダゾール（５００ｎｇ／ｍｌ）；（８）抗ＣＤ３＋ＴＧＦ−β１（１０ｎｇ／ｍｌ）。
【図１３】
ヒトジューカットＴ細胞白血病株中のＰＴＴＧ  ｍＲＮＡ発現。ジューカットＴ細胞を、後述のように処理した。（１）１％ＦＢＳ補足培地中で４８時間維持した細胞；（２）新鮮な１％ＦＢＳ補足培地に培地交換した後の細胞；（３）１０％ＦＢＳ補足培地に培地交換した後の細胞；（４）１％ＦＢＳ中の植物性血球凝集素（ＰＨＡ；１μｇ／ｍｌ）＋ホルボール−１２−メリステート−１３−アセテート（ＰＭＡ；５０ｎｇ／ｍｌ）；（５）（ＰＨＡ＋ＰＭＡ）＋シクロスポリンＡ（１μｇ／ｍｌ）；（６）（ＰＨＡ＋ＰＭＡ）＋ＴＧＦ−β１（１０ｎｇ／ｍｌ）。
【図１４】
代表的ノーザンブロッット（上のパネル）とウェスタンブロット（下のパネル）解析を示し：（図１４ａ）正常組織（Ｎ）および乳癌（Ｔ；ｎ＝１２）組織；および（図１４ｂ）正常組織（Ｎ）および卵巣癌（Ｔ；ｎ＝１３）組織を比較し、ＰＴＴＧ１  ｍＲＮＡとＰＴＴＧ１タンパク質の発現を示す。ＰＴＴＧ１またはβ−アクチンについて［α−３２Ｐ］ｄＣＴＰプローブを用いるハイブリダイゼーション、または抗ＰＴＴＧ１抗体（１：５０００）を用いるブロッティングは、隣接の正常組織と比較して、乳癌および卵巣癌のＰＴＴＧ過剰発現を示した。ＪＥＧ−３絨毛癌細胞は、陽性対照とした。左端、分子サイズ；右端、ｍＲＮＡ産物の位置。
【図１５】
エストロゲンによるインビトロのＰＴＴＧ１の制御を示す。完全長ＰＴＴＧ−プロモーターで一過性にトランスフェクションした（図１５ａ）ＭＣＦ−７細胞と（図１５ｂ）ＳＫＯＶ−３細胞を、活性炭で精製した血清（ＣＳＳ）で前処理した血清を含有する培地（白い棒）、１０％ＦＢＳ（ＷＳ）を含有する培地を添加する前（黒い棒）、またはＣＳＳと添加エストロゲン（ジエチルシチルベストロール  １００８〜１０−１０Ｍ）（Ｅ）を含有する培地（影の棒）中で、抗エストロゲン有りまたは無し（影の棒）でインキュベートした（ＩＣＩ−１８２７８０  １０−７〜１０−８Ｍ）（ＡＥ）。ＰＴＴＧ１  ｍＲＮＡをβ−アクチンについて標準化した。各棒は、３つの別々の実験からの６つのプレートの平均±ＳＥＭである。統計解析はＡＮＯＶＡにより行った。
【図１６】
ｗｔ−ｈＰＴＴＧ  Ｃ末端ペプチドが、寒天中のコロニー形成を阻害し、乳癌細胞をタキソールに対して感作することを示す。ベクター単独（ａ，ｂ，ｃ，ｄ）またはｗｔ−ｈＰＴＴＧ  Ｃ末端をコードするＤＮＡを含有するベクター（ｅ，ｆ，ｇ，ｈ）でトランスフェクションしたＭＣＦ−７細胞（約５，０００）を、ビヒクルのみ（ａ，ｅ）またはタキソール１０−１１Ｍ（ｂ，ｆ）、１０−１０Ｍ（ｄ，ｇ）または１０−９Ｍ（ｄ，ｈ）を含有する寒天中に入れた（倍率×２００）。
【図１７】
ビヒクルのみまたはタキソール（１０−１１Ｍ〜１０−１０Ｍ）で処理（１０日）後の、寒天中のベクターでトランスフェクションしたおよびベクター＋ｗｔ−ｈＰＴＴＧ  Ｃ末端ＤＮＡでトランスフェクションしたＭＣＦ−７細胞により形成されたコロニーの数を示す。
【図１８】
トランスフェクションおよび非トランスフェクションＮＩＨ−３Ｔ３細胞から得られた調整培地中のｂＦＧＦ濃度を示す。野生型ＰＴＴＧ、変異体ｈＰＴＴＧまたはベクター単独でトランスフェクションしたかまたは非トランスフェクションＮＩＨ−３Ｔ３細胞を、無血清ＤＭＥＭ中で４８時間インキュベートし、調整培地のアリコートを集めた。ｂＦＧＦ濃度を、ＥＬＩＳＡにより測定した。ＷＴ、ＷＴ−ｈＰＴＴＧ−ＣＭ；Ｍ、Ｍｕｔ−ｈＰＴＴＧ−ＣＭ；Ｃ、Ｃ−ＣＭ；Ｎ，Ｎ−ＣＭ。示したデータは、３つの別々の実験からの平均±ＳＤである。＊、ｐ＜０．０１対ＷＴ−ｈＰＴＴＧ−ＣＭ。
【図１９】
内皮細胞増殖を示す。トランスフェクションしたかまたは非トランスフェクションＮＩＨ−３Ｔ３細胞から得られた５００ｍｌの調整培地中で、４８ウェル培養プレート上でＨＵＶＥＣを培養した。４８時間のインキュベーション後細胞数を測定した。記載した結果は、３つの別々の実験からの平均±ＳＤである。左から右へ：Ｄ、無血清ＤＭＥＭ；Ｆ、ＤＭＥＭ中１ｎｇ／ｍｌ  ｂＦＧＦ；ＷＴ、ＷＴ−ｈＰＴＴＧ−ＣＭ；Ｍ、Ｍ−ｈＰＴＴＧ−ＣＭ；Ｃ、Ｃ−ＣＭ；Ｎ、Ｎ−ＣＭ。ｐ＜０．０１対 ＊無血清ＤＭＥＭ、＊＊ＷＴ−ｈＰＴＴＧ−ＣＭ、＊＊＊各調整培地単独。
【図２０】
傷害測定法におけるＨＵＶＥＣの移動を示す。ＨＵＶＥＣの傷害単層を、調整培地の各アリコートに１６時間暴露した。次に、移動した細胞を固定し、染色し、写真を撮った。（Ａ）ＷＴ−ｈＰＴＴＧ−ＣＭ中の移動ＨＵＶＥＣの代表的写真を示す。ａ、調整培地単独；ｂ、調整培地＋１００ｎｇ／ｍｌ抗ｂＦＧＦ抗体。（Ｂ）移動ＨＵＶＥＣの定量。３つの視野の０．１×２．５ｍｍ領域内の細胞数を、カミソリの刃で付けた元々のマークを起点として使用して計測した。示した結果は、３つの別々の実験からの視野当たりの細胞の平均数±ＳＤである。ａ、対照；ｂ、ＷＴ−ｈＰＴＴＧ−ＣＭ；ｃ、Ｍ−ｈＰＴＴＧ−ＣＭ；ｄ、Ｃ−ＣＭ；ｅ、Ｎ−ＣＭ；白丸、ＤＭＥＭ中１ｎｇ／ｍｌ  ｂＦＧＦ；白三角、無血清ＤＭＥＭ；黒丸、調整培地単独；黒三角、調整培地＋１００ｎｇ／ｍｌ抗ｂＦＧＦ抗体；黒四角、調整培地＋１００ｎｇ／ｍｌ免疫前ヤギＩｇＧ。
【図２１】
Ａは、改変ボイデンチャンバー測定法中のＨＵＶＥＣの移動を示す。試料調整培地を、改変ボイデンチャンバーの下のチャンバーに入れ、ＨＵＶＥＣを上のチャンバーに加えた。２４時間のインキュベーション後、非移動細胞を取り出し、膜の孔（８μｍ）を通過した細胞をギムザ染色し、写真を撮った。（Ａ）各実験条件下で代表的膜からの移動したＨＵＶＥＣの顕微鏡写真。ａ、無血清ＤＭＥＭ；ｂ、ＤＭＥＭ中１ｎｇ／ｍｌ  ｂＦＧＦ；対照；ｃ、ＷＴ−ｈＰＴＴＧ−ＣＭ；ｄ，ＷＴ−ｈＰＴＴＧ−ＣＭ＋１００ｎｇ／ｍｌ抗ｂＦＧＦ抗体；ｅ、ＷＴ−ｈＰＴＴＧ−ＣＭ＋１００ｎｇ／ｍｌ免疫前ヤギＩｇＧ；ｆ、Ｍ−ｈＰＴＴＧ−ＣＭ；ｇ、Ｃ−ＣＭ；ｈ、Ｎ−ＣＭ。
Ｂは、移動した細胞の定量を示す。染色した細胞を１０％酢酸で抽出し、抽出溶液の吸光度を測定した。示したデータは、３つの別々の実験の平均±ＳＤである。Ｄ、無血清ＤＭＥＭ；Ｆ、ＤＭＥＭ中１ｎｇ／ｍｌ  ｂＦＧＦ；ＷＴ、ＷＴ−ｈＰＴＴＧ−ＣＭ；Ｍ，Ｍ−ｈＰＴＴＧ−ＣＭ；Ｃ、Ｃ−ＣＭ；Ｎ、Ｎ−ＣＭ。ｐ＜０．０１対 ＊ＤＭＥＭ、＊＊ＷＴ−ｈＰＴＴＧ−ＣＭ、＊＊＊各調整培地（ＣＭ）単独。
【図２２】
マトリゲル上のＨＵＶＥＣの管形成を示す。試料調整培地中に懸濁しＧＦＲマトリゲルに蒔いた５×１０４ のＨＵＶＥＣは、２４ウェル培養プレートを厚く被覆した。２４時間インキュベーション後、位相差顕微鏡で写真を取った。図２２Ａは、管形成ＨＵＶＥＣの顕微鏡写真を示す。各実験条件の代表的な写真を示す。ａ、無血清ＤＭＥＭ；ｂ、ＤＭＥＭ中１ｎｇ／ｍｌ  ｂＦＧＦ；ｃ、ＷＴ−ｈＰＴＴＧ−ＣＭ；ｄ，ＷＴ−ｈＰＴＴＧ−ＣＭ＋１００ｎｇ／ｍｌ抗ｂＦＧＦ抗体；ｅ、ＷＴ−ｈＰＴＴＧ−ＣＭ＋１００ｎｇ／ｍｌ免疫前ヤギＩｇＧ；ｆ、Ｍ−ｈＰＴＴＧ−ＣＭ；ｇ、Ｃ−ＣＭ；ｈ、Ｎ−ＣＭ。図２２Ｂは、管形成の定量を示す。管の長さは、「材料と方法」に記載のように定量した。３つの別々の実験の平均ピクセル数±ＳＤを表す。左から右へ：Ｄ、無血清ＤＭＥＭ；Ｆ、ＤＭＥＭ中１ｎｇ／ｍｌ  ｂＦＧＦ；ＷＴ、ＷＴ−ｈＰＴＴＧ−ＣＭ；Ｍ、Ｍ−ｈＰＴＴＧ−ＣＭ；Ｃ、Ｃ−ＣＭ；Ｎ、Ｎ−ＣＭ。ｐ＜０．０１対 ＊ＤＭＥＭ、＊＊ＷＴ−ｈＰＴＴＧ−ＣＭ、＊＊＊各調整培地（ＣＭ）単独。
【図２３】
調整培地に対するＣＡＭの血管反応を示す。コラーゲンスポンジ中の試験試料、陽性対照または陰性対照を、９日令のヒヨコ胚のＣＡＭにのせた。４日後、ＣＡＭの写真を取った。（Ａ）１３日令のヒヨコ胚の代表的ＣＡＭの写真。ａ、無血清ＤＭＥＭ；ｂ、ＤＭＥＭ中１ｎｇ／ｍｌ  ｂＦＧＦ；ｃ、ＷＴ−ｈＰＴＴＧ−ＣＭ；ｄ，ＷＴ−ｈＰＴＴＧ−ＣＭ；ｅ、Ｃ−ＣＭ；ｆ、Ｎ−ＣＭ。（Ｂ）誘導された血管の定量。コラーゲンスポンジ中に入っている血管の数を、立体顕微鏡で計測した。示したデータは、３つの別々の実験の平均±ＳＤである。：Ｄ、無血清ＤＭＥＭ；Ｆ、ＢＰＳ中１ｎｇ／ｍｌ  ｂＦＧＦ；ＷＴ、ＷＴ−ｈＰＴＴＧ−ＣＭ；Ｍ、Ｍ−ｈＰＴＴＧ−ＣＭ；Ｃ、Ｃ−ＣＭ；Ｎ、Ｎ−ＣＭ。ｐ＜０．０１対 ＊ＰＢＳ、＊＊ＷＴ−ｈＰＴＴＧ−ＣＭ。
【図２４】
ＰＴＴＧ遺伝子ファミリーの保存を示す。コードされたＰＴＴＧタンパク質を、相同性を示すために整列させる。ＰＸＸＰモチーフと高度に保存された領域に下線を引く。星印は、同じアミノ酸を示し、ダッシュは、整列を維持するために入れる。略号：ｈ−ヒト、ｍ−マウス、ｒ−ラット。
【図２５】
ヒトＰＴＴＧ遺伝子ファミリーのゲノム構造を示す。イントロンの無いＰＴＴＧ同族体であるＰＴＴＧ２−４は、ＰＴＴＧ１のｃＤＮＡの下に示して、相対的サイズと共通の特徴を示す。ＰＴＴＧ２とＰＴＴＧ３はそれぞれ、ＰＴＴＧ４が欠如したフレーム内ＡＴＧを含有する。逆転位（ｒｅｔｒｏｔｒａｎｓｐｏｓｉｔｉｏｎ）イベントに関連するフランキング繰り返し成分を示す。
【図２６】
正常ヒト胎児と成体組織中のＰＴＴＧのプライマー伸長解析を例示する。ＰＴＴＧ  ｃＤＮＡは、ネステッドＰＣＲによりクロンテク（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）の胎児複数組織パネル（ａ）、および成体複数組織パネルＩとＩＩ（ｂ）から増幅し、プライマー伸長解析に付して、ＰＴＴＧ遺伝子ファミリーメンバーの相対的比率を決定した。上：オートラジオグラム；下：密度計測の結果。
【図２７】
正常および新生物結腸（図２７Ａ）、乳房（図２７Ｂ）、および卵巣（図２７Ｃ）中のヒトＰＴＴＧのプライマー伸長解析を示す。ＰＴＴＧ  ＲＴ−ＰＣＲ産物を標準化し、プライマー伸長解析に付してＰＴＴＧ１−４の相対的発現レベルを決定した。パネル：（Ａ）対の正常組織と５人の患者から得られた腫瘍性結腸組織からのＰＴＴＧ  ｃＤＮＡ、（Ｂ）正常および腫瘍性乳房、（Ｃ）正常および腫瘍性卵巣組織。Ｔ＝腫瘍、Ｎ＝正常組織。
【図２８】
隣接する正常結腸細胞と比較した図２７Ａ中の５つの結腸腫瘍の細胞中の相対的ＰＴＴＧ  ｍＲＮＡ発現を示す。
【図２９】
下垂体腫瘍中のヒトＰＴＴＧのプライマー伸長解析を示す。ヒトの下垂体腺腫または正常下垂体からの標準化ＰＴＴＧ  ｃＤＮＡを使用するプライマー伸長反応を、密度測定により解析し、グラフで示す。正常下垂体試料は、２つの死体解剖後の生検と、１８の正常下垂体のプールからのｃＤＮＡ（クロンテク（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ））を含んだ。腫瘍サブタイプ：ＮＦ−非機能性；ホルモン分泌性：ＰＲＬ−プロラクチン、ＧＨ−成長ホルモン、ＡＣＴＨ−副腎皮質刺激ホルモン、ＬＨ／ＦＳＨ−黄体形成ホルモンと卵胞刺激ホルモン、ａｓｕ−アルファサブユニットについて免疫陽性。３つの混合腫瘍は、以下のホルモンについて免疫陽性であった：Ｔ−４９：ＦＳＨ／ＬＨ／ＡＣＴＨ、Ｔ−５２：ＧＨ／ＰＲＬ／ａｓｕ、Ｔ−５６：ＰＲＬ／ＡＣＴＨ。
【図３０】
ＰＴＴＧ遺伝子の染色体局在化を示す。Ａは、ハムスター／ヒトのモノクロモソームハイブリッド細胞株からのＢａｍＨＩ消化ＤＮＡのサザンブロット解析を示し、これは電気泳動し、ＰＴＴＧ  ｃＤＮＡプローブを用いてサザンブロット解析に付し、ヒトゲノムＤＮＡ中の各ハイブリダイズするバンドの起点を同定した。Ｂは、３つの結腸腫瘍と一致する正常組織とからのＰＴＴＧ１−３  ＰＣＲ産物とプローブ結合させた、ＢａｍＨＩ消化ヒトゲノムＤＮＡのサザンブロット解析を示す。各レーンの対は、異なる患者から得られた。Ｔ＝腫瘍、Ｎ＝正常組織。Ｃは、癌細胞株中のＰＴＴＧ遺伝子ファミリーメンバーのサザンブロット解析を示す。ＢａｍＨＩ消化ゲノムＤＮＡを電気泳動し、ＰＴＴＧ１  ｃＤＮＡとＰＴＴＧ２とＰＴＴＧ３ゲノムＰＣＲ産物のプローブ混合物を用いて、サザンブロット解析に付した。細胞株は：ＨＬ−６０、ＪＥＧ３、ＫＧ１、ＩＬ２４およびＭＢ２３１である。染色体１７プローブであるＨＨＨ２０２へのハイブリダイゼーションを以下に示す。Ｄは、癌細胞株中のＰＴＴＧのノーザンブロッッティング解析を示す。Ｄ中の細胞株のノーザンブロット解析：ＨＬ−６０、ＪＥＧ３、ＫＧ１、ＬＬ２４およびＭＢ２３１は、ＰＴＴＧ（上）または１８Ｓ  ｃＤＮＡ（下）とプローブ結合した。
【図３１】
ヒトＰＴＴＧ１、ＰＴＴＧ２およびＰＴＴＧ３により仲介される転写活性化を示す。ＧＡＬ４−ＤＢＤプラスミド：ｐＢＩＮＤ（挿入体対照無し）、ｐＢＩＮＤ−ＰＴＴＧ１、−ＰＴＴＧ２、−ＰＴＴＧ２ΔＳ、−ＰＴＴＧ２ΔＬ、または−ＰＴＴＧ３を、本明細書に記載のように、トランス活性化測定法のためにＮＩＨ３Ｔ３細胞中にトランスフェクションした。ＰＴＴＧ２ΔＬは、末端切断型ＰＴＴＧ２をコードし、アミノ酸１７９の後の分岐性カルボキシ末端テイルが欠如している。ＰＴＴＧΔＳは、コドン１５６の後にフレームシフト変異を有し、これは、フレーム外の１０アミノ酸を有しＰＸＸＰドメインの無い末端切断型タンパク質を与える。ルシフェラーゼレベルは、β−ガラクトシダーゼ活性に対して標準化した。結果は、３つの別々の実験からの平均±ＳＥＭを示す。
【図３２】
ＰＴＴＧの過剰発現によるトランス活性化の阻害を示す。Ａは、ＰＴＴＧ１トランス活性化機能がＰＴＴＧ２の過剰発現により阻害されることを示す。ＰＴＴＧ１−３およびＰＴＴＧ１カルボキシ末端（ＳＨ３ドメインの野生型または変異型）、または末端切断型（ＰＴＴＧ２ΔＣ）、対照ｐＴａｒｇｅＴプラスミド（挿入体無し）を過剰発現する５倍過剰のプラスミドを、本明細書に記載のように、ｐＢＩＮＤ−Ｇ１、ｐＧ５／ＬｕｃおよびｐＣＭＶ／Ｂｇａｌを有するＮＩＨ３Ｔ３細胞中に同時トランスフェクションした。ルシフェラーゼレベルを、ベータ−ガラクトシダーゼ活性に対して標準化し、ｐＴａｒｇｅＴプラスミドとの同時トランスフェクションに対するパーセント対照として表した。結果は、少なくとも３つの実験からの平均±ＳＥＭである。Ｃ’＝カルボキシ末端。Ｂは、ＶＰ１６、ＰＴＴＧ３およびＰＴＴＧ２のトランス活性化機能は、ＰＴＴＧ２の過剰発現により阻害されることを示す。ＰＴＴＧ１−３または対照ｐＴａｒｇｅＴプラスミド（挿入体無し）を過剰発現する５倍過剰のプラスミドを、トランス活性化プラスミドでＮＩＨ３Ｔ３細胞中に同時トランスフェクションし、上記のように測定した。結果は、三重測定からの平均±ＳＥＭである。ＰＴＴＧ１に対して、トランス活性化活性は：ＶＰ１６（３３１％）、ＰＴＴＧ３（１５．４％）、ＰＴＴＧ２（９．８７％）、ｐＢＩＮＤ対照プラスミド（４．６５％）。
【図１】
2004526404.tif 000032
【図２】
2004526404.tif 000033
2004526404.tif 000034
【図３】
2004526404.tif 000035
【図４】
2004526404.tif 000036
【図５】
2004526404.tif 000037
【図６】
2004526404.tif 000038
【図７】
2004526404.tif 000039
【図８】
2004526404.tif 000040
【図９】
2004526404.tif 000041
【図１０】
2004526404.tif 000042
【図１１】
2004526404.tif 000043
【図１２】
2004526404.tif 000044
【図１３】
2004526404.tif 000045
【図１４】
2004526404.tif 000046
【図１５】
2004526404.tif 000047
【図１７】
2004526404.tif 000048
【図１９】
2004526404.tif 000049
2004526404.tif 000050
【図２０】
2004526404.tif 000051
2004526404.tif 000052
【図２１】
2004526404.tif 000053
2004526404.tif 000054
【図２２】
2004526404.tif 000055
2004526404.tif 000056
【図２３】
2004526404.tif 000057
【図２５】
2004526404.tif 000058
【図２６】
2004526404.tif 000059
2004526404.tif 000060
2004526404.tif 000061
【図２７】
2004526404.tif 000062
【図２８】
2004526404.tif 000063
【図２９】
2004526404.tif 000064
2004526404.tif 000065
2004526404.tif 000066
2004526404.tif 000067
【図３０】
2004526404.tif 000068
【図３１】
2004526404.tif 000069
2004526404.tif 000070
【国際公開パンフレット】
2004526404.tif 000071
2004526404.tif 000072
2004526404.tif 000073
2004526404.tif 000074
2004526404.tif 000075
2004526404.tif 000076
2004526404.tif 000077
2004526404.tif 000078
2004526404.tif 000079
2004526404.tif 000080
2004526404.tif 000081
2004526404.tif 000082
2004526404.tif 000083
2004526404.tif 000084
2004526404.tif 000085
2004526404.tif 000086
2004526404.tif 000087
2004526404.tif 000088
2004526404.tif 000089
2004526404.tif 000090
2004526404.tif 000091
2004526404.tif 000092
2004526404.tif 000093
2004526404.tif 000094
2004526404.tif 000095
2004526404.tif 000096
2004526404.tif 000097
2004526404.tif 000098
2004526404.tif 000099
2004526404.tif 000100
2004526404.tif 000101
2004526404.tif 000102
2004526404.tif 000103
2004526404.tif 000104
2004526404.tif 000105
2004526404.tif 000106
2004526404.tif 000107
2004526404.tif 000108
2004526404.tif 000109
2004526404.tif 000110
2004526404.tif 000111
2004526404.tif 000112
2004526404.tif 000113
2004526404.tif 000114
2004526404.tif 000115
2004526404.tif 000116
2004526404.tif 000117
2004526404.tif 000118
2004526404.tif 000119
2004526404.tif 000120
2004526404.tif 000121
2004526404.tif 000122
2004526404.tif 000123
2004526404.tif 000124
2004526404.tif 000125
2004526404.tif 000126
2004526404.tif 000127
2004526404.tif 000128
2004526404.tif 000129
2004526404.tif 000130
2004526404.tif 000131
2004526404.tif 000132
2004526404.tif 000133
2004526404.tif 000134
2004526404.tif 000135
2004526404.tif 000136
2004526404.tif 000137
2004526404.tif 000138
2004526404.tif 000139
2004526404.tif 000140
2004526404.tif 000141
2004526404.tif 000142
2004526404.tif 000143
2004526404.tif 000144
2004526404.tif 000145
2004526404.tif 000146
2004526404.tif 000147
2004526404.tif 000148
2004526404.tif 000149
2004526404.tif 000150
2004526404.tif 000151
2004526404.tif 000152
2004526404.tif 000153
2004526404.tif 000154
2004526404.tif 000155
2004526404.tif 000156
2004526404.tif 000157
2004526404.tif 000158
2004526404.tif 000159
2004526404.tif 000160
2004526404.tif 000161
2004526404.tif 000162
2004526404.tif 000163
2004526404.tif 000164
2004526404.tif 000165
2004526404.tif 000166
2004526404.tif 000167
2004526404.tif 000168
2004526404.tif 000169
2004526404.tif 000170
2004526404.tif 000171
2004526404.tif 000172
2004526404.tif 000173
2004526404.tif 000174
2004526404.tif 000175
2004526404.tif 000176
2004526404.tif 000177
2004526404.tif 000178
2004526404.tif 000179
2004526404.tif 000180
2004526404.tif 000181
2004526404.tif 000182
2004526404.tif 000183
2004526404.tif 000184
2004526404.tif 000185
2004526404.tif 000186
2004526404.tif 000187
2004526404.tif 000188
2004526404.tif 000189
2004526404.tif 000190
2004526404.tif 000191
2004526404.tif 000192
2004526404.tif 000193
2004526404.tif 000194
2004526404.tif 000195
2004526404.tif 000196
2004526404.tif 000197
2004526404.tif 000198
2004526404.tif 000199
2004526404.tif 000200
2004526404.tif 000201
2004526404.tif 000202
2004526404.tif 000203
2004526404.tif 000204
2004526404.tif 000205
2004526404.tif 000206
2004526404.tif 000207
2004526404.tif 000208
2004526404.tif 000209
2004526404.tif 000210
2004526404.tif 000211
2004526404.tif 000212
2004526404.tif 000213
2004526404.tif 000214
2004526404.tif 000215
2004526404.tif 000216
2004526404.tif 000217
2004526404.tif 000218
2004526404.tif 000219
2004526404.tif 000220
2004526404.tif 000221
2004526404.tif 000222
2004526404.tif 000223
2004526404.tif 000224
2004526404.tif 000225
2004526404.tif 000226
2004526404.tif 000227
2004526404.tif 000228
2004526404.tif 000229
2004526404.tif 000230
2004526404.tif 000231
2004526404.tif 000232
2004526404.tif 000233
2004526404.tif 000234
2004526404.tif 000235
2004526404.tif 000236
2004526404.tif 000237
2004526404.tif 000238
2004526404.tif 000239
2004526404.tif 000240
2004526404.tif 000241
2004526404.tif 000242
2004526404.tif 000243
2004526404.tif 000244
2004526404.tif 000245
2004526404.tif 000246
2004526404.tif 000247
2004526404.tif 000248
2004526404.tif 000249
2004526404.tif 000250
2004526404.tif 000251
2004526404.tif 000252
2004526404.tif 000253
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004526404.tif 000254
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004526404.tif 000255
2004526404.tif 000256
2004526404.tif 000257
2004526404.tif 000258
2004526404.tif 000259
2004526404.tif 000260
2004526404.tif 000261
2004526404.tif 000262
2004526404.tif 000263
2004526404.tif 000264
2004526404.tif 000265
2004526404.tif 000266
2004526404.tif 000267
2004526404.tif 000268
2004526404.tif 000269
2004526404.tif 000270
2004526404.tif 000271
2004526404.tif 000272
2004526404.tif 000273
2004526404.tif 000274
2004526404.tif 000275
2004526404.tif 000276
2004526404.tif 000277
2004526404.tif 000278
2004526404.tif 000279
2004526404.tif 000280
2004526404.tif 000281
2004526404.tif 000282
2004526404.tif 000283
2004526404.tif 000284
2004526404.tif 000285
2004526404.tif 000286
2004526404.tif 000287
2004526404.tif 000288
2004526404.tif 000289
2004526404.tif 000290
2004526404.tif 000291
2004526404.tif 000292
2004526404.tif 000293
2004526404.tif 000294
2004526404.tif 000295
2004526404.tif 000296
2004526404.tif 000297
2004526404.tif 000298
2004526404.tif 000299
2004526404.tif 000300
2004526404.tif 000301
2004526404.tif 000302
2004526404.tif 000303
2004526404.tif 000304
2004526404.tif 000305
2004526404.tif 000306
2004526404.tif 000307
2004526404.tif 000308
2004526404.tif 000309
2004526404.tif 000310
2004526404.tif 000311
2004526404.tif 000312
2004526404.tif 000313
2004526404.tif 000314
2004526404.tif 000315
2004526404.tif 000316
2004526404.tif 000317
2004526404.tif 000318
2004526404.tif 000319
2004526404.tif 000320
2004526404.tif 000321
2004526404.tif 000322
2004526404.tif 000323
2004526404.tif 000324
2004526404.tif 000325
2004526404.tif 000326
2004526404.tif 000327
2004526404.tif 000328
2004526404.tif 000329
2004526404.tif 000330
2004526404.tif 000331
2004526404.tif 000332
2004526404.tif 000333
2004526404.tif 000334
2004526404.tif 000335
2004526404.tif 000336
2004526404.tif 000337
2004526404.tif 000338
2004526404.tif 000339
2004526404.tif 000340
2004526404.tif 000341
2004526404.tif 000342
2004526404.tif 000343
2004526404.tif 000344
2004526404.tif 000345
2004526404.tif 000346
2004526404.tif 000347
2004526404.tif 000348
2004526404.tif 000349
2004526404.tif 000350
2004526404.tif 000351
2004526404.tif 000352
2004526404.tif 000353
2004526404.tif 000354
2004526404.tif 000355
2004526404.tif 000356
2004526404.tif 000357
2004526404.tif 000358
2004526404.tif 000359
2004526404.tif 000360
2004526404.tif 000361
2004526404.tif 000362
2004526404.tif 000363
2004526404.tif 000364
2004526404.tif 000365
2004526404.tif 000366
2004526404.tif 000367
2004526404.tif 000368
2004526404.tif 000369
2004526404.tif 000370
2004526404.tif 000371
2004526404.tif 000372
2004526404.tif 000373
2004526404.tif 000374
2004526404.tif 000375
2004526404.tif 000376
2004526404.tif 000377
2004526404.tif 000378
2004526404.tif 000379
2004526404.tif 000380
2004526404.tif 000381
2004526404.tif 000382
2004526404.tif 000383
2004526404.tif 000384
2004526404.tif 000385
2004526404.tif 000386
2004526404.tif 000387
2004526404.tif 000388
2004526404.tif 000389
2004526404.tif 000390
2004526404.tif 000391
2004526404.tif 000392
2004526404.tif 000393
2004526404.tif 000394
2004526404.tif 000395
2004526404.tif 000396
2004526404.tif 000397
2004526404.tif 000398
2004526404.tif 000399
2004526404.tif 000400
2004526404.tif 000401
2004526404.tif 000402
2004526404.tif 000403
2004526404.tif 000404
2004526404.tif 000405
2004526404.tif 000406
2004526404.tif 000407
2004526404.tif 000408
2004526404.tif 000409
2004526404.tif 000410
2004526404.tif 000411
2004526404.tif 000412
2004526404.tif 000413
2004526404.tif 000414
2004526404.tif 000415
2004526404.tif 000416
2004526404.tif 000417
2004526404.tif 000418
2004526404.tif 000419
2004526404.tif 000420
2004526404.tif 000421
2004526404.tif 000422
2004526404.tif 000423
2004526404.tif 000424
2004526404.tif 000425
2004526404.tif 000426
2004526404.tif 000427
2004526404.tif 000428
2004526404.tif 000429
2004526404.tif 000430
2004526404.tif 000431
2004526404.tif 000432
2004526404.tif 000433
2004526404.tif 000434
2004526404.tif 000435
2004526404.tif 000436
2004526404.tif 000437
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004526404.tif 000438
2004526404.tif 000439
2004526404.tif 000440
2004526404.tif 000441
2004526404.tif 000442
2004526404.tif 000443
2004526404.tif 000444
2004526404.tif 000445
2004526404.tif 000446
2004526404.tif 000447
2004526404.tif 000448
2004526404.tif 000449
2004526404.tif 000450
2004526404.tif 000451
2004526404.tif 000452
2004526404.tif 000453
2004526404.tif 000454
2004526404.tif 000455
2004526404.tif 000456
2004526404.tif 000457
2004526404.tif 000458
2004526404.tif 000459
2004526404.tif 000460
2004526404.tif 000461
2004526404.tif 000462
2004526404.tif 000463
2004526404.tif 000464
2004526404.tif 000465
2004526404.tif 000466
2004526404.tif 000467
2004526404.tif 000468
2004526404.tif 000469
2004526404.tif 000470
2004526404.tif 000471
2004526404.tif 000472
2004526404.tif 000473
2004526404.tif 000474
2004526404.tif 000475
2004526404.tif 000476
2004526404.tif 000477
2004526404.tif 000478
2004526404.tif 000479
2004526404.tif 000480
2004526404.tif 000481
2004526404.tif 000482
2004526404.tif 000483
2004526404.tif 000484
2004526404.tif 000485
2004526404.tif 000486
2004526404.tif 000487
2004526404.tif 000488
2004526404.tif 000489
2004526404.tif 000490
2004526404.tif 000491
2004526404.tif 000492
2004526404.tif 000493
2004526404.tif 000494
2004526404.tif 000495
2004526404.tif 000496
2004526404.tif 000497
2004526404.tif 000498
2004526404.tif 000499
2004526404.tif 000500
2004526404.tif 000501
2004526404.tif 000502
2004526404.tif 000503
2004526404.tif 000504
2004526404.tif 000505
2004526404.tif 000506
2004526404.tif 000507
2004526404.tif 000508
2004526404.tif 000509
2004526404.tif 000510
2004526404.tif 000511
2004526404.tif 000512
2004526404.tif 000513
2004526404.tif 000514
2004526404.tif 000515
2004526404.tif 000516
2004526404.tif 000517
2004526404.tif 000518
2004526404.tif 000519
2004526404.tif 000520
2004526404.tif 000521
2004526404.tif 000522
2004526404.tif 000523
2004526404.tif 000524
2004526404.tif 000525
2004526404.tif 000526
2004526404.tif 000527
2004526404.tif 000528
2004526404.tif 000529
2004526404.tif 000530
2004526404.tif 000531
2004526404.tif 000532
2004526404.tif 000533
2004526404.tif 000534
2004526404.tif 000535
2004526404.tif 000536
2004526404.tif 000537
2004526404.tif 000538
2004526404.tif 000539
2004526404.tif 000540
2004526404.tif 000541
2004526404.tif 000542
2004526404.tif 000543
2004526404.tif 000544
2004526404.tif 000545
2004526404.tif 000546
2004526404.tif 000547
2004526404.tif 000548
2004526404.tif 000549
2004526404.tif 000550
2004526404.tif 000551
2004526404.tif 000552
2004526404.tif 000553
2004526404.tif 000554
2004526404.tif 000555
2004526404.tif 000556
2004526404.tif 000557
2004526404.tif 000558
2004526404.tif 000559
2004526404.tif 000560
2004526404.tif 000561
2004526404.tif 000562
2004526404.tif 000563
2004526404.tif 000564
2004526404.tif 000565
2004526404.tif 000566
2004526404.tif 000567
2004526404.tif 000568
2004526404.tif 000569
2004526404.tif 000570
2004526404.tif 000571
2004526404.tif 000572
2004526404.tif 000573
2004526404.tif 000574
2004526404.tif 000575
2004526404.tif 000576
2004526404.tif 000577
2004526404.tif 000578
2004526404.tif 000579
2004526404.tif 000580
2004526404.tif 000581
2004526404.tif 000582
2004526404.tif 000583
2004526404.tif 000584
2004526404.tif 000585
2004526404.tif 000586
2004526404.tif 000587
2004526404.tif 000588
2004526404.tif 000589
2004526404.tif 000590
2004526404.tif 000591
2004526404.tif 000592
2004526404.tif 000593
2004526404.tif 000594
2004526404.tif 000595
2004526404.tif 000596
2004526404.tif 000597
2004526404.tif 000598
2004526404.tif 000599
2004526404.tif 000600
2004526404.tif 000601
2004526404.tif 000602
2004526404.tif 000603
2004526404.tif 000604
2004526404.tif 000605
2004526404.tif 000606
2004526404.tif 000607
2004526404.tif 000608
2004526404.tif 000609
2004526404.tif 000610
2004526404.tif 000611
2004526404.tif 000612
2004526404.tif 000613
2004526404.tif 000614
2004526404.tif 000615
2004526404.tif 000616
2004526404.tif 000617
2004526404.tif 000618
2004526404.tif 000619
【国際調査報告】
2004526404.tif 000620
2004526404.tif 000621
2004526404.tif 000622
2004526404.tif 000623
2004526404.tif 000624