(57)【要約】メタロプロテイナーゼ阻害剤、特にＭＭＰ１２の阻害剤として有用な、式中、ｚが−Ｏ−または−Ｓ−である式Ｉの化合物。【特許請求の範囲】
【請求項１】
式Ｉ：
【化１】
2004523581.tif 000031
[式中、
Ｘは、ＮＲ１、Ｏ、Ｓから選択され；
Ｙ１とＹ２は、独立に、Ｏ、Ｓから選択され；
Ｚは、Ｏ、Ｓから選択され；
Ａは、直接結合、(Ｃ１−６)アルキル、(Ｃ１−６)ハロアルキル、またはＮ、Ｏ、Ｓ、ＳＯ、ＳＯ２から選択されるヘテロ基を１つ含む もしくはＮ、Ｏ、Ｓ、ＳＯ、ＳＯ２から選択されるヘテロ基を２つ含み かつそれらは少なくとも２つの炭素原子によって隔てられている(Ｃ１−６)ヘテロアルキルから選択され；
Ｒ１は、Ｈ、(Ｃ１−３)アルキル、ハロアルキルから選択され；
Ｒ２とＲ３は、独立に、Ｈ、ハロゲン(好ましくはフッ素)、アルキル、ヘテロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、アルキルアリール、アルキル−ヘテロアリール、ヘテロアルキル−アリール、ヘテロアルキル−ヘテロアリール、アリール−アルキル、アリール−ヘテロアルキル、ヘテロアリール−アルキル、ヘテロアリール−ヘテロアルキル、アリール−アリール、アリール−ヘテロアリール、ヘテロアリール−アリール、ヘテロアリール−ヘテロアリール、シクロアルキル−アルキル、ヘテロシクロアルキル−アルキル、アルキル−シクロアルキル、アルキル−ヘテロシクロアルキルから選択され；
Ｒ４は、Ｈ、ハロゲン(好ましくはフッ素)、(Ｃ１−３)アルキル、またはハロアルキルから選択され；
Ｒ２とＲ３は、それぞれ独立に、アルキル、ヘテロアルキル、アリール、ヘテロアリール、ハロ、ハロアルキル、ヒドロキシ、アルコキシ、ハロアルコキシ、チオール、アルキルチオール、アリールチオール、アルキルスルホン、ハロアルキルスルホン、アリールスルホン、アミノスルホン、Ｎ−アルキルアミノスルホン、Ｎ,Ｎ−ジアルキルアミノスルホン、アリールアミノスルホン、アミノ、Ｎ−アルキルアミノ、Ｎ,Ｎ−ジアルキルアミノ、アミド、Ｎ−アルキルアミド、Ｎ,Ｎ−ジアルキルアミド、シアノ、スルホンアミノ、アルキルスルホンアミノ、アリールスルホンアミノ、アミジノ、Ｎ−アミノスルホン−アミジノ、グアニジノ、Ｎ−シアノ−グアニジノ、チオグアニジノ、２−ニトロ−エテン−１,１−ジアミン、カルボキシ、アルキル−カルボキシ、ニトロ、カルバメートから選択される１個もしくはそれ以上の(好ましくは１個の)基で、任意に置換され得；
任意に、Ｒ２とＲ３は、結合して７個以下の環原子を含む環を形成するか、またはＲ２とＲ４は、結合して７個以下の環原子を含む環を形成するか、またはＲ３とＲ４は、結合して７個以下の環原子を含む環を形成し得；
Ｒ５は、７個以下の環原子を含む、１、２、もしくは３個の環構造を含む単環式、二環式、もしくは三環式の基であり、該環構造は、独立に、シクロアルキル、アリール、ヘテロシクロアルキル、またはヘテロアリールから選択され、またそれぞれの環は、独立に、ハロゲン、ヒドロキシ、アルキル、アルコキシ、ハロアルコキシ、アミノ、Ｎ−アルキルアミノ、Ｎ,Ｎ−ジアルキルアミノ、アルキルスルホンアミノ、アルキルカルボキシアミノ、シアノ、ニトロ、チオール、アルキルチオール、アルキルスルホニル、ハロアルキルスルホニル、アルキルアミノスルホニル、カルボキシレート、アルキルカルボキシレート、アミノカルボキシ、Ｎ−アルキルアミノ−カルボキシ、Ｎ,Ｎ−ジアルキルアミノ−カルボキシ{置換基中の何れのアルキル基も、それ自身任意に、ハロゲン、ヒドロキシ、アルコキシ、ハロアルコキシ、アミノ、Ｎ−アルキルアミノ、Ｎ,Ｎ−ジアルキルアミノ、Ｎ−アルキルスルホンアミノ、Ｎ−アルキルカルボキシアミノ、シアノ、ニトロ、チオール、アルキルチオール、アルキルスルホニル、Ｎ−アルキルアミノスルホニル、カルボキシレート、アルキルカルボキシ、アミノカルボキシ、Ｎ−アルキルアミノカルボキシ、Ｎ,Ｎ−ジアルキルアミノカルボキシ、カルバメートから選択される、１個もしくはそれ以上の置換基によって置換されている}から独立に選択される、１個もしくはそれ以上の置換基によって、任意に置換されており；
Ｒ５は、二環式もしくは三環式の基である場合は、それぞれの環構造は、次の環構造に、直接結合によって、または−Ｏ−、(Ｃ１−６)アルキル、(Ｃ１−６)ハロアルキル、(Ｃ１−６)ヘテロアルキル、(Ｃ１−６)アルケニル、(Ｃ１−６)アルキニル、スルホン、ＣＯ、もしくはＳによって結合しているか、または次の環構造に縮合しており；
ここで
ＸがＮＲ１であり、Ｒ１がＨであり、Ｙ１がＯであり、Ｙ２がＯであり、ＺがＯであり、Ｒ２がメチルであり、Ｒ３がＨであり、Ｒ４がＨであり、そしてＡが直接結合であるとき、Ｒ５は、ｐ−クロロ−フェニル、ｏ−メトキシフェニル、ｐ−メトキシ−フェニル、３,４−ジクロロフェニル、ｏ−ニトロフェニル、ｐ−ニトロフェニル、２−メトキシ−４−アミノフェニル、２−メトキシ−５−フルオロフェニル、またはｐ−ベンジルオキシフェニルではなく；
ＸがＮＲ１であり、Ｒ１がＨであり、Ｙ１がＯであり、Ｙ２がＯであり、ＺがＯであり、Ｒ２がフェニルであり、Ｒ３がＨであり、Ｒ４がＨであり、そしてＡが直接結合であるとき、Ｒ５は、ｐ−クロロ−フェニルではない]の化合物、またはその薬学的に許容される塩もしくは in vivo で加水分解され得るエステル。
【請求項２】
ＸがＮＲ１であり、Ｙ１およびＹ２の少なくとも一方がＯであり、Ｒ１が、Ｈ、(Ｃ１−３)アルキル、または(Ｃ１−３)ハロアルキルである、請求項１に記載の式Ｉの化合物、またはその薬学的に許容される塩もしくは in vivo で加水分解され得るエステル。
【請求項３】
Ｒ２が、Ｈ、アルキル、ヒドロキシアルキル、アルコキシアルキル、アリールオキシ アルキル、アミノアルキル、シクロアルキル−アルキル、アルキル−シクロアルキル、アリールアルキル、アルキルアリール、アルキル−ヘテロアリール、ヘテロアルキル、ヘテロシクロアルキル−アルキル、アルキル−ヘテロシクロアルキル、ヘテロアリール−アルキル、ヘテロアルキル−アリールである、請求項１もしくは２の何れかに記載の式Ｉの化合物、またはその薬学的に許容され得る塩もしくは in vivo で加水分解され得るエステル。
【請求項４】
Ｒ３とＲ４が、それぞれ独立に、Ｈ、メチルから選択される、請求項１から３の何れかに記載の式Ｉの化合物またはその薬学的に許容される塩もしくは in vivo で加水分解され得るエステル。
【請求項５】
Ｒ５が、１、２、もしくは３個の、所望により置換された、アリールもしくはヘテロアリールの、５員環もしくは６員環を含む、請求項１から４の何れかに記載の式Ｉの化合物またはその薬学的に許容される塩もしくは in vivo で加水分解され得るエステル。
【請求項６】
Ｒ５が、２個もしくは３個の、所望により置換された環構造を含む、二環式もしくは三環式の基である、請求項１から５の何れかに記載の式Ｉの化合物、またはその薬学的に許容される塩もしくは in vivo で加水分解され得るエステル。
【請求項７】
式 II：
【化２】
2004523581.tif 000032
[式中、
Ｇ１とＧ２は、それぞれ、シクロアルキル、アリール、ヘテロシクロアルキル、またはヘテロアリールから独立に選択される、７個以下の環原子を含む単環式の環構造であり、それぞれの環は、独立に、ハロゲン、ヒドロキシ、ハロアルコキシ、アミノ、Ｎ−アルキルアミノ、Ｎ,Ｎ−ジアルキルアミノ、シアノ、ニトロ、アルキル、アルコキシ、アルキル スルホン、ハロアルキル スルホン、アルキルカルバメート、アルキルアミド{置換基中の何れのアルキルも、それ自身任意に、ハロゲン、ヒドロキシ、アミノ、Ｎ−アルキルアミノ、Ｎ,Ｎ−ジアルキルアミノ、シアノ、ニトロ、アルコキシ、ハロアルコキシ、アリールオキシ、ヘテロアリールオキシ、カルバメートから選択される、１個もしくはそれ以上の基で置換され得る}から独立に選択される、１個もしくは２個の置換基によって、任意に置換され；
ＺはＯまたはＳであり；
Ｂは、直接結合、Ｏ、(Ｃ１−６)アルキル、(Ｃ１−６)ヘテロアルキルから選択され；
Ｒ２は、Ｈ、(Ｃ１−６)アルキル、ハロアルキル、ヒドロキシアルキル、アルコキシアルキル、アミノアルキル、(Ｎ−アルキルアミノ)アルキル、(Ｎ,Ｎ−ジアルキルアミノ)アルキル、アミドアルキル、チオアルキルから選択されるか、またはＲ２は、式 III：
【化３】
2004523581.tif 000033
ＣとＤは、独立に、直接結合、Ｈ、(Ｃ１−Ｃ６)アルキル、(Ｃ１−Ｃ６)ハロアルキル、またはＮ、Ｏ、またはＳから選択される１もしくは２個のヘテロ原子を含み、かつ２つのヘテロ原子が存在する場合は、それらが少なくとも２つの炭素原子で隔てられている(Ｃ１−Ｃ６)ヘテロアルキルから選択され；
Ｇ３は、シクロアルキル、アリール、ヘテロシクロアルキル、またはヘテロアリールから独立に選択される、７個以下の環原子を含む単環式の環構造であり、該環は、任意に、ハロゲン、ヒドロキシ、アミノ、Ｎ−アルキルアミノ、Ｎ,Ｎ−ジアルキルアミノ、シアノ、ニトロ、アルキル、アルコキシ、アルキル スルホン、ハロアルキル スルホン、またはハロゲン、ヒドロキシ、アミノ、Ｎ−アルキルアミノ、Ｎ,Ｎ−ジアルキルアミノ、シアノ、ニトロ、アルコキシ、ハロアルコキシから選択される１個もしくはそれ以上の基で置換されたアルキルから独立に選択された、１個または２個の置換基によって、任意に置換されており；
任意に、Ｒ２は、ハロ、ハロアルキル、ヒドロキシ、アルコキシ、ハロアルコキシ、アミノ、アミノアルキル、Ｎ−アルキルアミノ、Ｎ,Ｎ−ジアルキルアミノ、(Ｎ−アルキルアミノ)アルキル、(Ｎ,Ｎ−ジアルキルアミノ)アルキル、アルキルスルホン、アミノスルホン、Ｎ−アルキルアミノ−スルホン、Ｎ,Ｎ−ジアルキルアミノ−スルホン、アミド、Ｎ−アルキルアミド、Ｎ,Ｎ−ジアルキルアミド、シアノ、スルホンアミノ、アルキル−スルホンアミノ、アミジノ、Ｎ−アミノスルホン−アミジノ、グアニジノ、Ｎ−シアノ−グアニジノ、チオグアニジノ、２−ニトログアニジノ、アルコキシカルボニル、カルボキシ、アルキルカルボキシ、カルバメートで置換され；
Ｒ３とＲ４は、独立に、Ｈまたは(Ｃ１−３)アルキルから選択され；
任意に、Ｒ２とＲ３が結合して７個以下の環原子を含む環を形成するか、またはＲ２とＲ４が結合して７個以下の環原子を含む環を形成するか、またはＲ３とＲ４が結合して７個以下の環原子を含む環を形成する]の化合物、またはその薬学的に許容される塩もしくは in vivo で加水分解され得るエステル。
【請求項８】
Ｂが、直接結合であるか、またはＯである、請求項７に記載の式 II の化合物、またはその薬学的に許容される塩もしくは in vivo で加水分解され得るエステル。
【請求項９】
Ｒ２が、Ｈ、(Ｃ１−６)アルキル、アリール−(Ｃ１−６)アルキル、またはヘテロアリール−(Ｃ１−６)アルキル｛これらの置換基はハロ、ハロアルキル、ヒドロキシ、アルコキシ、ハロアルコキシ、アミノ、アミノアルキル、Ｎ−アルキルアミノ、Ｎ,Ｎ−ジアルキルアミノ、(Ｎ−アルキルアミノ)アルキル、(Ｎ,Ｎ−ジアルキルアミノ)アルキル、アルキルスルホン、アミノスルホン、Ｎ−アルキルアミノ−スルホン、Ｎ,Ｎ−ジアルキルアミノ−スルホン、アミド、Ｎ−アルキルアミド、Ｎ,Ｎ−ジアルキルアミド、シアノ、スルホンアミノ、アルキル−スルホンアミノ、アミジノ、Ｎ−アミノスルホン−アミジノ、カルボキシ、アルキルカルボキシ、アルコキシカルボニル、カルバメートで任意に置換されている｝から選択される、請求項７もしくは８の何れかに記載の式 II の化合物、またはその薬学的に許容される塩もしくは in vivoで加水分解され得るエステル。
【請求項１０】
Ｒ３とＲ４の何れかがＨである、請求項７から９の何れか１つに記載の式 II の化合物 またはその薬学的に許容される塩もしくは in vivo で加水分解され得るエステル。
【請求項１１】
Ｇ１とＧ２が、それぞれ、アリールまたはヘテロアリールから独立に選択される、環構造が６個以下の環原子を有する、任意に置換された単環式の基である、請求項７から１０の何れか１つに記載の式 II の化合物、またはその薬学的に許容される塩 もしくは in vivo で加水分解され得るエステル。
【請求項１２】
、Ｇ１が、ハロゲン、ヒドロキシ、ハロアルコキシ、アミド、アミノ、Ｎ−アルキルアミノ、Ｎ,Ｎ−ジアルキルアミノ、シアノ、アルキル、ハロアルキル、アルコキシ{置換基中の何れのアルキル基も、それ自身任意に、ハロゲン、ヒドロキシ、アミノ、Ｎ−アルキルアミノ、Ｎ,Ｎ−ジアルキルアミノ、アルコキシ、ハロアルコキシ、シアノ、カルバメートから選択された１個もしくはそれ以上の基で置換されている}で置換されている、請求項１１に記載の式 II の化合物、またはその薬学的に許容される塩もしくは in vivo で加水分解され得るエステル。
【請求項１３】
請求項１に記載の式Ｉの化合物、または請求項７に記載の式 II の化合物、またはそれらの薬学的に許容される塩もしくは in vivo で加水分解され得るエステルと、薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
【請求項１４】
温血動物に、治療上効果的な量の式Ｉもしくは II の化合物またはその薬学的に許容される塩もしくは in vivo で加水分解され得るエステルを投与することを含む、メタロプロテイナーゼ介在疾患もしくは状態の処置方法。
【請求項１５】
１もしくはそれ以上のメタロプロテイナーゼによって介在される疾患もしくは状態の処置に使用する薬剤の製造における、式Ｉもしくは II の化合物、またはそれらの薬学的に許容される塩もしくは in vivo で加水分解され得るエステルの使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、メタロプロテイナーゼの阻害に有用な化合物、特にこれらの化合物を含む医薬組成物と、その使用に関する。
【０００２】
本発明の化合物は、１もしくはそれ以上のメタロプロテイナーゼの阻害剤である。メタロプロテイナーゼは、近年急激にその数が増加しているプロテイナーゼ(酵素)のスーパーファミリーである。構造的および機能的な考察に基づいて、これらの酵素は、N.M. Hooper (1994) FEBS Letters 354:1-6 で記載されたように、ファミリーとサブファミリーに分類される。メタロプロテイナーゼの例は、コラゲナーゼ(ＭＭＰ１、ＭＭＰ８、ＭＭＰ１３)、ゼラチナーゼ(ＭＭＰ２、ＭＭＰ９)、ストロメライシン(ＭＭＰ３、ＭＭＰ１０、ＭＭＰ１１)、マトリライシン(ＭＭＰ７)、メタロエラスターゼ(ＭＭＰ１２)、エナメライシン(ＭＭＰ１９)、ＭＴ−ＭＭＰ(ＭＭＰ１４、ＭＭＰ１５、ＭＭＰ１６、ＭＭＰ１７)のような、マトリックスメタロプロテイナーゼ(ＭＭＰ)；ＴＮＦコンバターゼ(ＡＤＡＭ１０、ＴＡＣＥ)のような、セクレターゼおよびシェダーゼを含むレプロリシン、アダマライシン、またはＭＤＣファミリー；コラーゲン前駆体加工・処理プロテイナーゼ(ＰＣＰ)のような酵素を含むアスタシン・ファミリー；およびアグリカナーゼのような他のメタロプロテイナーゼ、エンドセリンコンバターゼファミリー、およびアンジオテンシンコンバターゼファミリーを含む。
【０００３】
メタロプロテイナーゼは、胎児の発育、骨形成、月経周期間の子宮の再構成のような、組織の再構成を含む、多血性の生理学的疾病過程に重要であると信じられている。これは、メタロプロテイナーゼが、コラーゲン、プロテオグリカン、フィブロネクチンのような広範囲のマトリックス基質の開裂を行い得ることに基づく。メタロプロテイナーゼはまた、腫瘍壊死因子(ＴＮＦ)のような生物学的に重要な細胞の媒介物の加工・処理または分泌；および親和性の低いＩｇＥ受容体ＣＤ２３のような、生物学的に重要な膜タンパク質(より完全なリストは N. M. Hooper et al., (1997) Biochem J. 321:265-279 参照のこと)の翻訳後のタンパク質分解過程または切断において、重要であると信じられている。
【０００４】
メタロプロテイナーゼは、多くの疾患もしくは状態と関連している。１もしくはそれ以上のメタロプロテイナーゼの活性の阻害は、これらの疾患もしくは状態、例えば：関節の炎症(特にリウマチ性関節炎、骨関節炎、痛風)、胃腸管の炎症(特に炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎、胃炎)、皮膚の炎症(特に乾癬、湿疹、皮膚炎)のような様々な炎症性およびアレルギー性疾患；腫瘍の転移または浸潤；骨関節炎のような細胞外マトリックスの無制御の分解；骨の再吸収性疾患(骨粗鬆症、ページェット病)；侵入性血管新生と関連した疾患；糖尿病、歯周病(歯肉炎など)と関連した、コラーゲンの再構築の亢進；角膜の潰瘍、皮膚の潰瘍、手術後の状態(結腸の吻口など)、皮膚の創傷治癒；中枢および末梢神経系の髄鞘を破壊する疾患(多発性硬化症など)；アルツハイマー病；再狭窄、アテローム性動脈硬化症などの心血管疾患において観察される、細胞外マトリックスの再構成；喘息；鼻炎；および慢性閉塞性肺疾患(ＣＯＰＤ)において、十分有益であり得る。
【０００５】
ＭＭＰ１２はまた、マクロファージ・エラスターゼまたはメタロエラスターゼとして知られており、これは初めに、マウスにおいて、Shapiroらによってクローニングされ[1992, Journal of Biological Chemistry 267: 4664]、そしてヒトにおいて、同じグループによって 1995年にクローニングされた。ＭＭＰ−１２は、活性化されたマクロファージにおいて優先的に発現され、喫煙者由来の肺胞マクロファージから [Shapiro et al, 1993, Journal of Biological Chemistry, 268: 23824]、そしてアテローム性硬化症の病変部における泡沫細胞中で [Matsumoto et al, 1998, Am J Pathol 153: 109]、分泌されることが示されている。ＣＯＰＤのマウスのモデルは、６月間、１日当たり２本、週６日 タバコの煙で負荷をかけたマウスをベースとしている。野生型のマウスは、該処置の後肺気腫にかかった。ＭＭＰ１２ノックアウトマウスが該モデルで試験した場合、肺気腫にほとんどかからなかった。このことは、ＭＭＰ−１２がＣＯＰＤの病理変化におけるキーエンザイムであることを強く示している。ＣＯＰＤ(肺気腫および気管支炎)におけるＭＭＰ１２のようなＭＭＰの役割は、Anderson and Shinagawa, 1999, Current Opinion in Anti-inflammatory and Immunomodulatory Investigational Drugs 1(1): 29-38 において論じられている。近年では、ヒトの頚動脈プラーク Kangavari において、喫煙がマクロファージの浸潤およびマクロファージに誘導されるＭＭＰ−１２の発現を増大させることが見出されている [Matetzky S, Fishbein MC et al., Circulation 102:(18), 36-39 Suppl. S, Oct 31, 2000]。
【０００６】
ＭＭＰ１３、またはコラゲナーゼ３は、胸部腫瘍から得たｃＤＮＡライブラリーから初めてクローン化された [J. M. P. Freije et al., (1994) Journal of Biological Chemistry 269(24):16766-16773]。広範囲の組織由来のＲＮＡのＰＣＲ−ＲＮＡ分析は、胸部繊維腺腫、正常もしくは休止乳腺、胎盤、肝臓、卵巣、子宮、前立腺、耳下腺または乳癌細胞腺(Ｔ４７−Ｄ、ＭＣＦ−７、ＺＲ７５−１)では発見されなかったことから、ＭＭＰ１３の発現が胸部癌に限定されることを示した。観察の結果、ＭＭＰ１３は、形質転換した表皮のケラチン生成細胞 [N. Johansson et al., (1997) Cell Growth Differ. 8(2):243-250]、扁平上皮細胞癌 [N. Johansson et al., (1997) Am. J. Pathol. 151(2):499-508]、および表皮細胞の腫瘍 [K. Airola et al., (1997) J. Invest. Dermatol. 109(2):225-231]において検出された。これらの結果は、ＭＭＰ１３が形質転換した上皮細胞によって分泌され、特に胸部癌病変や、皮膚の発癌における悪性の上皮細胞成長において観測されるような、転移に関連している細胞外マトリックスの分解と、細胞−マトリックス相互作用に関与し得ることを示唆する。
【０００７】
近年発表されたデータは、ＭＭＰ１３が、他の結合組織の入替え(turnover)に役割を果たすことを示唆している。例えば、タイプIIコラーゲンの分解において、ＭＭＰ１３の基質特異性と優先性に一致して [P. G. Mitchell et al., (1996) J. Clin. Invest. 97(3):761-768; V. Knauper et al., (1996) The Biochemical Journal 271:1544-1550]、ＭＭＰ１３は、一次骨形成と骨格の再構築の間に [M. Stahle-Backdahl et al., (1997) Lab. Invest. 76(5):717-728; N. Johansson et al., (1997) Dev. Dyn. 208(3):387-397]；リウマチ性関節炎や骨関節炎のような破壊的関節疾患において [D. Wernicke et al., (1996) J. Rheumatol. 23:590-595; P. G. Mitchell et al., (1996) J. Clin. Invest. 97(3):761-768; O. Lindy et al., (1997) Arthritis Rheum 40(8):1391-1399]；および人工股関節の無菌状態の緩和の間に [S. Imai et al., (1998) J. Bone Joint Surg. Br. 80(4):701-710]、ある役割を果たすとの仮説が提示されている。ＭＭＰ１３はまた、慢性的に炎症を起こしている歯肉組織の粘膜の上皮細胞に局在する [V. J. Uitto et al., (1998) Am. J. Pathol 152(6):1489-1499] ことから、成人の慢性歯周炎および慢性的な損傷を受けているコラーゲン・マトリックスの再構成 [M. Vaalamo et al., (1997) J. Invest. Dermatol. 109(1):96-101] に関係している。
【０００８】
ＭＭＰ９(ゼラチナーゼ Ｂ；９２ｋＤａ タイプ IV コラゲナーゼ；９２ｋＤａ ゼラチナーゼ)は、始めに単離され、クローン化され、１９８９年に配列決定された、分泌性タンパク質である(S.M. Wilhelm et al., (1989) J. Biol Chem. 264(29): 17213-17221、訂正の発表 J. Biol Chem. (1990) 265(36): 22570)。ＭＭＰ９の近年のレビューは、このプロテアーゼについての詳細な情報と参考文献の、優れた情報源である：T.H. Vu and Z. Werb (1998) (Matrix Metalloproteinases (1998) W.C. Parks and R.P. Mecham 編  pp115-148.  Academic Press. ISBN 0-12-545090-7)。下記の事項は、T.H. Vu & Z. Werb (1998) によるレビューから引用する。
【０００９】
ＭＭＰ９の発現は、一般的に、トロホブラスト、破骨細胞、好中球、マクロファージを含む幾つかの細胞のタイプに制限される。しかし、それらの発現は、同じおよび他の細胞タイプにおいて、成長因子またはサイトカインに細胞が曝されることを含めて、幾つかのメディエータによって誘発される。これらは、しばしば炎症応答の発生に関するものと同じメディエータである。他の分泌されたＭＭＰと同様に、ＭＭＰ９は、不活性な酵素前駆体として放出され、続いて切断され、酵素的に活性な酵素を形成する。この in vivo での活性化に要するプロテアーゼは、知られていない。活性なＭＭＰ９と不活性な酵素のバランスは、さらに天然に生じたタンパク質である、ＴＩＭＰ−１(メタロプロテイナーゼ−１の組織阻害剤)との相互作用によって調節される。ＴＩＭＰ−１は、ＭＭＰ９のＣ末端領域に結合し、ＭＭＰ９の触媒ドメインの阻害を引き起こす。ＭＭＰ９前駆体の誘発発現のバランス、前駆体の活性なＭＭＰ９への切断、およびＴＩＭＰ−１の存在が組み合わさって、局所に存在する触媒的に活性なＭＭＰ９の量を決定する。タンパク質分解的に活性なＭＭＰ９は、ゼラチン、エラスチン、および野生型のタイプ IV コラーゲンおよびタイプＶコラーゲンを含む基質を攻撃し；野生型のタイプＩコラーゲン、プロテオグリカン、またはラミニンに対して活性を持たない。
【００１０】
様々な生理学的な、および病理学的なプロセスにおいて、ＭＭＰ９の役割に関わるデータは増大している。生理学的な役割は、胚の着床の初期段階における、子宮の上皮を通じての胚のトロホブラストの浸潤；骨の成長と発達における幾つかの役割；および炎症性の細胞の、血管から組織への移動を含む。
【００１１】
ＭＭＰ−９の放出は、酵素免疫アッセイを用いて測定され、別の集団からのものと比べて、処置していない喘息由来の体液およびＡＭ上清において、有意に増加している [Am. J. Resp. Cell & Mol. Biol., Nov 1997, 17 (5):583-591]。また、増大したＭＭＰ９発現は、特定の別の病状においても観測されている。そのことによって、ＭＭＰ９は、例えばＣＯＰＤ、関節炎、腫瘍の転移、アルツハイマー病、多発性硬化症、急性の環状動脈症状、例えば心筋梗塞などを引き起こすアテローム性硬化症におけるプラーク破裂、のような疾病過程において、ＭＭＰ９が関係している。
【００１２】
ＭＭＰ−８(コラゲナーゼー２、好中球コラゲナーゼ)は、マトリックスメタロプロテイナーゼのファミリーの５３ｋＤａの酵素であり、好中球において優先的に発現される。近年の研究では、ＭＭＰ−８が、他の細胞、例えば骨関節炎の軟骨細胞においても発現されることが示されている [Shlopov et al, (1997) Arthritis Rheum, 40:2065]。好中球によって生産されるＭＭＰは、組織の再構成を引き起こし得、従って、ＭＭＰ−８をブロックすることは、例えば肺などの繊維性疾患において、また肺気腫のような破壊性疾患において、有益な効果を有する。ＭＭＰ−８はまた、骨関節炎において、増大するように制御されることが見出されており、このことは、ＭＭＰ−８をブロックすることが、該疾患において有益であり得ることも示している。
【００１３】
ＭＭＰ−３(ストロメライシン−１)は、マトリックスメタロプロテイナーゼのファミリーの５３ｋＤａの酵素である。ＭＭＰ−３の活性は、炎症性歯肉から摘出された腺維芽細胞において、示されており [Uitto V. J. et al, (1981) J. Periodontal Res., 16:417-424]、酵素のレベルが歯肉疾患の重症度に関連している [Overall C. M. et al, (1987) J. Periodontal Res., 22:81-88]。ＭＭＰ−３はまた、様々な慢性の潰瘍において、基底ケラチノサイトによって生産されている [Saarialho-Kere U. K. et al, (1994) J. Clin. Invest., 94:79-88]。ＭＭＰ−３のｍＲＮＡおよびタンパク質は、増殖しつつある表皮部位に当たる損傷末端から遠位で、基底ケラチノサイトの近くで検出された。ＭＭＰ−３は、従って、表皮の治療を妨げる。数人の研究者が、リウマチ性および骨関節炎の患者から得た滑液中で、コントロールに比べ、ＭＭＰ−３が一貫して高いことを示してる [Walakovits L. A. et al, (1992) Arthritis Rheum., 35:35-42; Zafarullah M. et al, (1993) J. Rheumatol., 20:693-697]。これらの研究は、ＭＭＰ−３の阻害剤が、細胞外マトリックスの分解を伴う疾患、リンパ球の浸潤による炎症を引き起こす疾患、または組織の機能に必要な構造的完全性を損なう疾患を処置すると考える基礎を提供する。
【００１４】
メタロプロテイナーゼ阻害剤の幾つかは既知である(例えば Beckett R.P. and Whittaker M., 1998, Exp. Opin. Ther. Patents, 8(3):259-282 によるＭＭＰ阻害剤のレビュー参照)。化合物の異なるクラスによって、様々なメタロプロテイナーゼを阻害するための活性と選択性の程度が異なり得る。
【００１５】
Whittaker M. et al (1999, Chemical Reviews 99(9):2735-2776) は、広範囲の既知のＭＭＰ阻害剤化合物をレビューしている。彼らは、有効なＭＭＰ阻害剤が、亜鉛結合基もしくはＺＢＧ(活性部位の亜鉛イオン(II)にキレートし得る官能基)、酵素のバックボーンと水素結合相互作用する少なくとも１つの官能基、および酵素のサブサイトと有効な van der Waals 相互作用を行う１もしくはそれ以上の側鎖を必要とすると述べている。既知のＭＭＰ阻害剤における亜鉛結合基は、カルボン酸基、ヒドロキサム酸基、スルフヒドリル、またはメルカプトなどを含む。例えば、Whittaker M. et al らは、下記のＭＭＰ阻害剤を検討している：
【化１】
2004523581.tif 000002
上記の化合物は、臨床的な開発に入った。該化合物は、メルカプトアシル亜鉛結合基、Ｐ１の位置でのトリメチルヒダントイニルエチル基、およびロイシニル−ｔｅｒｔ−ブチルグリシニル バックボーンを有する。
【００１６】
【化２】
2004523581.tif 000003
上記の化合物は、メルカプトアシル亜鉛結合基と、Ｐ１の位置にイミド基を有する。
【００１７】
【化３】
2004523581.tif 000004
上記の化合物は、関節炎の処置のために開発された。該化合物は、非ペプチド性サクシニル ヒドロキサメート亜鉛結合基、およびＰ１の位置にトリメチルヒダントイニルエチル基を有する。
【００１８】
【化４】
2004523581.tif 000005
上記の化合物は、コラゲナーゼを阻害するフタルイミド誘導体である。該化合物は、非ペプチド性スクシニル ヒドロキサメート亜鉛結合基、およびＰ１に環状イミド基を有する。Whittaker M. et al はまた、Ｐ１に環状イミド基を、そして様々な亜鉛結合基(スクシニルヒドロキサメート、カルボン酸、チオール基、リンをベースとした基)を有する別のＭＭＰ阻害剤を検討している。
【００１９】
【化５】
2004523581.tif 000006
上記の化合物は、ＭＭＰ８およびＭＭＰ９のよい阻害剤であることが分かっている(国際特許出願 WO9858925, WO9858915)。これらは、ピリミジン−２,３,４−トリオン亜鉛結合基を有する。
【００２０】
下記の化合物は、ＭＭＰ阻害剤として既知ではない。
Lora-Tamayo, M et al (1968, An. Quim 64(6): 591-606) は、強力な抗がん剤として、下記の化合物の合成を記載している。
【化６】
2004523581.tif 000007
【００２１】
チェコ特許第 151744 号(19731119) および第 152617 号(1974022) は、下記の化合物の合成と抗痙攣活性を記載している。
【化７】
2004523581.tif 000008
【００２２】
米国特許第 3529019 号(19700915) は、中間体として用いられる下記の化合物を記載している。
【化８】
2004523581.tif 000009
【００２３】
ＰＣＴ特許出願番号 WO 00/09103 は、下記の化合物(４７頁表Ａ、化合物番号８１および８３)を含む、視覚障害を処置するのに有用な化合物を記載している。
【化９】
2004523581.tif 000010
【００２４】
我々は、メタロプロテイナーゼの阻害剤であり、ＭＭＰ類、例えばＭＭＰ−１２の阻害に特に興味深い新しいクラスの化合物を見出している。該化合物は、既知のメタロプロテイナーゼ阻害剤では見られない金属結合基を有するメタロプロテイナーゼ阻害剤である。特に、我々は、強力なＭＭＰ１２阻害剤であり、かつ望ましい活性プロフィールを有する化合物を見出している。本発明の化合物は有益な活性、選択性、および／または薬物動態学的特性を有する。
【００２５】
本発明のメタロプロテイナーゼ阻害化合物は、金属結合基および１個もしくはそれ以上の別の官能基もしくは側鎖を含む。該化合物は、金属結合基が、式(ｋ)：
【化１０】
2004523581.tif 000011
[式中、
Ｘは、ＮＲ１、Ｏ、Ｓから選択され；
Ｙ１とＹ２は、独立に、Ｏ、Ｓから選択され；
Ｒ１は、Ｈ、アルキル、ハロアルキルから選択され；
上記の何れのアルキルも、直鎖もしくは分枝であり得；
上記の何れのアルキルも、好ましくは(Ｃ１−７)アルキルであり、最も好ましくは(Ｃ１−６)アルキルである] を有することを特徴とする。
【００２６】
メタロプロテイナーゼ阻害化合物は、メタロプロテイナーゼ(例えばＭＭＰの１つ)の活性を阻害する化合物である。非限定的な実施例によって、阻害化合物は、in vitro において、０.１−１００００nMの範囲のＩＣ５０を示し得、好ましくは０.１−１０００nMのＩＣ５０を示し得る。
【００２７】
金属結合基は、酵素の活性部位中の金属イオンに結合し得る官能基である。例えば、金属結合基は、ＭＭＰ阻害剤中の亜鉛結合基であり、活性部位の亜鉛(II)イオンをキレート化する。式(ｋ)の金属結合基は、５員環構造をベースとし、好ましくはヒダントイン基であり、最も好ましくは、５位で置換された１−Ｈ,３−Ｈ−イミダゾリジン−２,４−ジオンである。
【００２８】
本発明の第１の態様において、我々は、式Ｉ：
【化１１】
2004523581.tif 000012
[式中、
Ｘは、ＮＲ１、Ｏ、Ｓから選択され；
Ｙ１とＹ２は、独立に、Ｏ、Ｓから選択され；
Ｚは、Ｏ、Ｓから選択され；
Ａは、直接結合、(Ｃ１−６)アルキル、(Ｃ１−６)ハロアルキル、またはＮ、Ｏ、Ｓ、ＳＯ、ＳＯ２から選択されるヘテロ基を１つ含む もしくはＮ、Ｏ、Ｓ、ＳＯ、ＳＯ２から選択されるヘテロ基を２つ含み かつそれらは少なくとも２つの炭素原子によって隔てられている(Ｃ１−６)ヘテロアルキルから選択され；
Ｒ１は、Ｈ、(Ｃ１−３)アルキル、ハロアルキルから選択され；
Ｒ２とＲ３は、独立に、Ｈ、ハロゲン(好ましくはフッ素)、アルキル、ヘテロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、アルキルアリール、アルキル−ヘテロアリール、ヘテロアルキル−アリール、ヘテロアルキル−ヘテロアリール、アリール−アルキル、アリール−ヘテロアルキル、ヘテロアリール−アルキル、ヘテロアリール−ヘテロアルキル、アリール−アリール、アリール−ヘテロアリール、ヘテロアリール−アリール、ヘテロアリール−ヘテロアリール、シクロアルキル−アルキル、ヘテロシクロアルキル−アルキル、アルキル−シクロアルキル、アルキル−ヘテロシクロアルキルから選択され；
Ｒ４は、Ｈ、ハロゲン(好ましくはフッ素)、(Ｃ１−３)アルキル、またはハロアルキルから選択され；
Ｒ２とＲ３は、それぞれ独立に、アルキル、ヘテロアルキル、アリール、ヘテロアリール、ハロ、ハロアルキル、ヒドロキシ、アルコキシ、ハロアルコキシ、チオール、アルキルチオール、アリールチオール、アルキルスルホン、ハロアルキルスルホン、アリールスルホン、アミノスルホン、Ｎ−アルキルアミノスルホン、Ｎ,Ｎ−ジアルキルアミノスルホン、アリールアミノスルホン、アミノ、Ｎ−アルキルアミノ、Ｎ,Ｎ−ジアルキルアミノ、アミド、Ｎ−アルキルアミド、Ｎ,Ｎ−ジアルキルアミド、シアノ、スルホンアミノ、アルキルスルホンアミノ、アリールスルホンアミノ、アミジノ、Ｎ−アミノスルホン−アミジノ、グアニジノ、Ｎ−シアノ−グアニジノ、チオグアニジノ、２−ニトロ−エテン−１,１−ジアミン、カルボキシ、アルキル−カルボキシ、ニトロ、カルバメートから選択される１個もしくはそれ以上の(好ましくは１個の)基で、任意に置換され得；
任意に、Ｒ２とＲ３は、結合して７個以下の環原子を含む環を形成するか、またはＲ２とＲ４は、結合して７個以下の環原子を含む環を形成するか、またはＲ３とＲ４は、結合して７個以下の環原子を含む環を形成し得；
Ｒ５は、７個以下の環原子を含む、１、２、もしくは３個の環構造を含む単環式、二環式、もしくは三環式の基であり、該環構造は、独立に、シクロアルキル、アリール、ヘテロシクロアルキル、またはヘテロアリールから選択され、またそれぞれの環は、独立に、ハロゲン、ヒドロキシ、アルキル、アルコキシ、ハロアルコキシ、アミノ、Ｎ−アルキルアミノ、Ｎ,Ｎ−ジアルキルアミノ、アルキルスルホンアミノ、アルキルカルボキシアミノ、シアノ、ニトロ、チオール、アルキルチオール、アルキルスルホニル、ハロアルキルスルホニル、アルキルアミノスルホニル、カルボキシレート、アルキルカルボキシレート、アミノカルボキシ、Ｎ−アルキルアミノ−カルボキシ、Ｎ,Ｎ−ジアルキルアミノ−カルボキシ{置換基中の何れのアルキル基も、それ自身任意に、ハロゲン、ヒドロキシ、アルコキシ、ハロアルコキシ、アミノ、Ｎ−アルキルアミノ、Ｎ,Ｎ−ジアルキルアミノ、Ｎ−アルキルスルホンアミノ、Ｎ−アルキルカルボキシアミノ、シアノ、ニトロ、チオール、アルキルチオール、アルキルスルホニル、Ｎ−アルキルアミノスルホニル、カルボキシレート、アルキルカルボキシ、アミノカルボキシ、Ｎ−アルキルアミノカルボキシ、Ｎ,Ｎ−ジアルキルアミノカルボキシ、カルバメートから選択される、１個もしくはそれ以上の置換基によって置換されている}から独立に選択される、１個もしくはそれ以上の置換基によって、任意に置換されており；
Ｒ５が二環式もしくは三環式の基である場合、それぞれの環構造は、次の環構造に、直接結合によって、または−Ｏ−、(Ｃ１−６)アルキル、(Ｃ１−６)ハロアルキル、(Ｃ１−６)ヘテロアルキル、(Ｃ１−６)アルケニル、(Ｃ１−６)アルキニル、スルホン、ＣＯ、もしくはＳによって結合しているか、または次の環構造に縮合しており；
上記の何れのヘテロアルキルも、Ｎ、Ｏ、Ｓ、ＳＯ、ＳＯ２から独立に選択される、１もしくはそれ以上のヘテロ基(ヘテロ基は、ヘテロ原子もしくはヘテロ原子群である)を含むヘテロ原子置換アルキルであり；
上記の何れのヘテロシクロアルキルまたはヘテロアリールも、Ｎ、Ｏ、Ｓ、ＳＯ、ＳＯ２から独立に選択される、１もしくはそれ以上のヘテロ基を含み；
上記の何れのアルキル、アルケニル、またはアルキニル基も、直鎖もしくは分枝であり得、別記しない限り、上記の何れのアルキル基も、好ましくは(Ｃ１−７)アルキルであり、最も好ましくは(Ｃ１−６)アルキルであり；
ここで
ＸがＮＲ１であり、Ｒ１がＨであり、Ｙ１がＯであり、Ｙ２がＯであり、ＺがＯであり、Ｒ２がメチルであり、Ｒ３がＨであり、Ｒ４がＨであり、そしてＡが直接結合であるとき、Ｒ５は、ｐ−クロロ−フェニル、ｏ−メトキシフェニル、ｐ−メトキシフェニル、３,４−ジクロロフェニル、ｏ−ニトロフェニル、ｐ−ニトロフェニル、２−メトキシ−４−アミノフェニル、２−メトキシ−５−フルオロフェニル、またはｐ−ベンジルオキシフェニルではなく；
ＸがＮＲ１であり、Ｒ１がＨであり、Ｙ１がＯであり、Ｙ２がＯであり、ＺがＯであり、Ｒ２がフェニルであり、Ｒ３がＨであり、Ｒ４がＨであり、そしてＡが直接結合であるとき、Ｒ５は、ｐ−クロロ−フェニルではない]の化合物を提供する。
【００２９】
式Ｉの好ましい化合物は、下記：
ＸがＮＲ１である；
Ｙ１およびＹ２の少なくとも一方がＯである；
特にＹ１およびＹ２の両方がＯである；
Ｒ１が、Ｈ、(Ｃ１−３)アルキル、(Ｃ１−３)ハロアルキルである；
特にＲ１がＨである；
Ｒ２が、Ｈ、アルキル、ヒドロキシアルキル、アルコキシアルキル、アリールオキシ アルキル、アミノアルキル、シクロアルキル−アルキル、アルキル−シクロアルキル、アリールアルキル、アルキルアリール、アルキル−ヘテロアリール、ヘテロアルキル、ヘテロシクロアルキル−アルキル、アルキル−ヘテロシクロアルキル、ヘテロアリール−アルキル、ヘテロアルキル−アリールである；
特に、Ｒ２が、アルキル、アミノアルキル、アルキル−ヘテロアリール、アルキル−ヘテロシクロアルキル、またはヘテロアリール−アルキルである；
Ｒ３ および／または Ｒ４が、Ｈである；
Ｒ３ および／または Ｒ４が、メチルである；
Ｒ５が、１、２、もしくは３個の任意に置換されたアリールもしくはヘテロアリールの５員環もしくは６員環を含む；
Ｒ５が、２もしくは３個の任意に置換された環構造を含む、二環式もしくは三環式の基である；
の何れかを１つもしくはそれ以上適応した化合物である。
【００３０】
特に好ましい式Ｉの化合物は、式中、Ｒ５が、２もしくは３個の任意に置換された環構造を含む二環式もしくは三環式の基である。
【００３１】
本発明のさらに好ましい化合物は、式 II：
【化１２】
2004523581.tif 000013
[式中、
Ｇ１とＧ２は、それぞれ、シクロアルキル、アリール、ヘテロシクロアルキル、またはヘテロアリールから独立に選択される、７個以下の環原子を含む単環式の環構造であり、それぞれの環は、独立に、ハロゲン、ヒドロキシ、ハロアルコキシ、アミノ、Ｎ−アルキルアミノ、Ｎ,Ｎ−ジアルキルアミノ、シアノ、ニトロ、アルキル、アルコキシ、アルキル スルホン、ハロアルキル スルホン、アルキルカルバメート、アルキルアミド{置換基中の何れのアルキルも、それ自身任意に、ハロゲン、ヒドロキシ、アミノ、Ｎ−アルキルアミノ、Ｎ,Ｎ−ジアルキルアミノ、シアノ、ニトロ、アルコキシ、ハロアルコキシ、アリールオキシ、ヘテロアリールオキシ、カルバメートから選択される、１個もしくはそれ以上の基で、任意に置換され得る}から独立に選択される、１個もしくは２個の置換基によって、置換され；
ＺはＯまたはＳであり；
Ｂは、直接結合、Ｏ、(Ｃ１−６)アルキル、(Ｃ１−６)ヘテロアルキルから選択され；
Ｒ２は、Ｈ、(Ｃ１−６)アルキル、ハロアルキル、ヒドロキシアルキル、アルコキシアルキル、アミノアルキル、(Ｎ−アルキルアミノ)アルキル、(Ｎ,Ｎ−ジアルキルアミノ)アルキル、アミドアルキル、チオアルキルから選択されるか、またはＲ２は、式 III：
【化１３】
2004523581.tif 000014
ＣとＤは、独立に、直接結合、Ｈ、(Ｃ１−Ｃ６)アルキル、(Ｃ１−Ｃ６)ハロアルキル、またはＮ、Ｏ、またはＳから選択される１もしくは２個のヘテロ原子を含み、かつ２つのヘテロ原子が存在する場合は、それらが少なくとも２つの炭素原子で隔てられている(Ｃ１−Ｃ６)ヘテロアルキルから選択され；
Ｇ３は、シクロアルキル、アリール、ヘテロシクロアルキル、またはヘテロアリールから独立に選択される、７個以下の環原子を含む単環式の環構造であり、該環は、任意に、ハロゲン、ヒドロキシ、アミノ、Ｎ−アルキルアミノ、Ｎ,Ｎ−ジアルキルアミノ、シアノ、ニトロ、アルキル、アルコキシ、アルキル スルホン、ハロアルキル スルホン、またはハロゲン、ヒドロキシ、アミノ、Ｎ−アルキルアミノ、Ｎ,Ｎ−ジアルキルアミノ、シアノ、ニトロ、アルコキシ、ハロアルコキシから選択される１個もしくはそれ以上の基で置換されたアルキルから独立に選択された、１個または２個の置換基によって、任意に置換されており；
任意に、Ｒ２は、ハロ、ハロアルキル、ヒドロキシ、アルコキシ、ハロアルコキシ、アミノ、アミノアルキル、Ｎ−アルキルアミノ、Ｎ,Ｎ−ジアルキルアミノ、(Ｎ−アルキルアミノ)アルキル、(Ｎ,Ｎ−ジアルキルアミノ)アルキル、アルキルスルホン、アミノスルホン、Ｎ−アルキルアミノ−スルホン、Ｎ,Ｎ−ジアルキルアミノ−スルホン、アミド、Ｎ−アルキルアミド、Ｎ,Ｎ−ジアルキルアミド、シアノ、スルホンアミノ、アルキル−スルホンアミノ、アミジノ、Ｎ−アミノスルホン−アミジノ、グアニジノ、Ｎ−シアノ−グアニジノ、チオグアニジノ、２−ニトログアニジノ、アルコキシカルボニル、カルボキシ、アルキルカルボキシ、カルバメートで置換され；
Ｒ３とＲ４は、独立に、Ｈまたは(Ｃ１−３)アルキルから選択され；
任意に、Ｒ２とＲ３が結合して７個以下の環原子を含む環を形成するか、またはＲ２とＲ４が結合して７個以下の環原子を含む環を形成するか、またはＲ３とＲ４が結合して７個以下の環原子を含む環を形成し；
上記の何れのヘテロアルキルも、Ｎ、Ｏ、Ｓ、ＳＯ、ＳＯ２から独立に選択される、１個もしくはそれ以上のヘテロ基(ヘテロ基は、ヘテロ原子もしくはヘテロ原子群である)を含むヘテロ原子置換アルキルであり；
上記の何れのヘテロシクロアルキルまたはヘテロアリールも、Ｎ、Ｏ、Ｓ、ＳＯ、ＳＯ２から独立に選択される、１個もしくはそれ以上のヘテロ基を含み；
上記のアルキル、アルケニル、またはアルキニルは、直鎖もしくは分枝であり得；
別記しない限り、上記の何れのアルキルも、好ましくは(Ｃ１−７)アルキルであり、最も好ましくは、(Ｃ１−６)アルキルである]の化合物である。
【００３２】
好ましい式 II の化合物は、以下：
Ｂが、直接結合またはＯである；
Ｒ２が、Ｈ、(Ｃ１−６)アルキル、アリール−(Ｃ１−６)アルキル、または任意に、ハロ、ハロアルキル、ヒドロキシ、アルコキシ、ハロアルコキシ、アミノ、アミノアルキル、Ｎ−アルキルアミノ、Ｎ,Ｎ−ジアルキルアミノ、(Ｎ−アルキルアミノ)アルキル、(Ｎ,Ｎ−ジアルキルアミノ)アルキル、アルキルスルホン、アミノスルホン、Ｎ−アルキルアミノ−スルホン、Ｎ,Ｎ−ジアルキルアミノ−スルホン、アミド、Ｎ−アルキルアミド、Ｎ,Ｎ−ジアルキルアミド、シアノ、スルホンアミノ、アルキル−スルホンアミノ、アミジノ、Ｎ−アミノスルホン−アミジノ、カルボキシ、アルキルカルボキシ、アルコキシカルボニル、カルバメートで置換されたヘテロアリール−(Ｃ１−６)アルキルである；
Ｒ３およびＲ４が、それぞれＨである；
Ｇ１およびＧ２が、それぞれ、独立にアリールまたはヘテロアリールから選択される、任意に置換された６個以下の環原子を含む環構造を有する単環式の基である；
好ましくは、Ｇ１は、ハロゲン、ヒドロキシ、ハロアルコキシ、アミド、アミノ、Ｎ−アルキルアミノ、Ｎ,Ｎ−ジアルキルアミノ、シアノ、アルキル、ハロアルキル、アルコキシ{置換基中の何れのアルキルも、それ自身任意にハロゲン、ヒドロキシ、アミノ、Ｎ−アルキルアミノ、Ｎ,Ｎ−ジアルキルアミノ、アルコキシ、ハロアルコキシ、シアノ、カルバメートから選択される、１個もしくはそれ以上の基によって置換され得る}で置換されている；
の１つもしくはそれ以上を適応した化合物である。
【００３３】
例えば、本発明の特定の化合物は、式 II：
[式中、Ｂは直接結合またはＯであり；
ＺはＯまたはＳであり；
Ｒ２は、Ｈ、(Ｃ１−６)アルキル、アリール−(Ｃ１−６)アルキル、または任意に、ハロ、ハロアルキル、ヒドロキシ、アルコキシ、ハロアルコキシ、アミノ、アミノアルキル、Ｎ−アルキルアミノ、Ｎ,Ｎ−ジアルキルアミノで置換されているヘテロアリール−(Ｃ１−６)アルキルから選択され；
Ｒ３とＲ４は、それぞれＨであり；
Ｇ１とＧ２は、それぞれ、アリールまたはヘテロアリールから独立に選択される、６個以下の環原子を含む環構造を有する単環式の基であり；
好ましくは、Ｇ１は、ハロゲン、ヒドロキシ、ハロアルコキシ、アミド、アミノ、Ｎ−アルキルアミノ、Ｎ,Ｎ−ジアルキルアミノ、シアノ、アルキル、ハロアルキル、アルコキシ{置換基中の何れのアルキルも、それ自身任意に、ハロゲン、ヒドロキシ、アミノ、Ｎ−アルキルアミノ、Ｎ,Ｎ−ジアルキルアミノ、アルコキシ、ハロアルコキシ、シアノ、カルバメートで置換され得る}で置換されている]の化合物を含む。
【００３４】
Ｒ２における適切な基は、下記：
【化１４】
2004523581.tif 000015
を含む。
【００３５】
Ｒ５における適切な基は、下記：
【化１５】
2004523581.tif 000016
を含む。
【００３６】
式Ｉの化合物における特定の置換基と置換基の数は、立体的に望ましくない組合せを避けるように選ばれることが理解されるであろう。
各々の例示された化合物は、本発明の特定かつ独立の態様である。
【００３７】
式Ｉの化合物に光学活性な中心が存在する場合、我々は、本発明の個々の特定の具体的態様として、全ての個々の光学活性形と、それらの組み合わせ、および対応するラセミ体を開示している。ラセミ体は、既知の方法(Advanced Organic Chemistry：第３版：著者 J. March, p104-107 参照)、例えば、便宜な光学活性補助分子種を有するジアステレオマー誘導体を形成した後、分離し、さらに該補助分子種を切断することを含む方法を用いて個々の光学活性形に分離され得る。
【００３８】
本発明による化合物は、１個またはそれ以上の不斉に置換された炭素原子を含み得ることが理解されるであろう。式Ｉの化合物における１個またはそれ以上の不斉中心(キラル中心)の存在は、立体異性体を生じ得、各々の場合において、本発明は、エナンチオマーおよびジアステレオマーを含む全ての立体異性体と、ラセミ体を含むその混合物に及ぶと理解されるべきである。
【００３９】
式Ｉの化合物に互変異性体が存在する場合、我々は、本発明の個々の特定の具体的態様として、全ての個々の互変異性体の形態とこれらの組み合わせを開示する。
【００４０】
前述で概略したように、本発明の化合物はメタロプロテイナーゼの阻害剤、特にＭＭＰ１２の阻害剤である。式Ｉの化合物における上記の適応症は、それぞれ本発明の独立かつ特定の具体的態様を表す。
【００４１】
本発明の特定の化合物は、特にＭＭＰ１３ および／または ＭＭＰ９ および／またはＭＭＰ８ および／または ＭＭＰ３の阻害剤として使用する化合物である。
【００４２】
本発明の化合物は、望ましい選択的なプロフィールを示す。我々は理論的考察によって拘束される意図を有しないが、本発明の化合物は、何れのＴＡＣＥの阻害活性に関しても、上記の適応症の何れか一つに選択的な阻害を示すと考えられ、非限定的実施例によれば、すべてのＴＡＣＥ阻害活性について１００−１０００倍の選択性を示す。
【００４３】
本発明の化合物は、薬学的に許容され得る塩として提供してもよい。これらは、酸付加塩、例えば塩酸塩、臭化水素酸塩、クエン酸塩、マレイン酸塩、およびリン酸や硫酸と形成される塩を含む。別の態様において、適切な塩は、塩基性塩、例えばナトリウム塩、カリウム塩などのアルカリ金属塩、例えばカルシウム塩、マグネシウム塩などのアルカリ土類金属塩、例えばトリエチルアミンなどの有機アミン塩である。
【００４４】
本発明の化合物はまた、 in vivo で加水分解されるエステルとして提供してもよい。これらは、ヒトの体内で加水分解されて親化合物となる、薬学的に許容され得るエステルである。該エステルは、例えば試験動物に、試験する化合物を静脈に投与し、次に試験動物の体液を調べることによって同定し得る。適切な in vivo で加水分解され得るカルボキシのエステルは、メトキシメチルを含み、ヒドロキシのエステルは、ホルミルおよびアセチル、特にアセチルを含む。
【００４５】
メタロプロテイナーゼ阻害剤である本発明の化合物(式Ｉまたは II の化合物)、またはその薬学的に許容され得る塩、またはその in vivo で加水分解し得るエステルを、ヒトを含む哺乳類の治療上の処置(予防的処置を含む)に使用するためには、通常、医薬組成物として標準的な製薬手段に従って製剤される。
【００４６】
従って、別の態様において、我々は、本発明の化合物(式Ｉまたは式 II の化合物)、またはその薬学的に許容され得る塩、またはその in vivo で加水分解され得るエステルと、薬学的に許容され得る担体を含む医薬組成物を提供する。
【００４７】
本発明の医薬組成物は、処置が望まれる疾患もしくは状態に対して、例えば経口、局所、非経腸、口内、鼻、膣、または直腸への投薬による、または吸入による等の、標準的な方法で投薬し得る。これらの目的のために、本発明の化合物は、例えば、錠剤、カプセル、水溶液または油溶液、懸濁液、乳剤、クリーム、軟膏、ゲル、鼻用スプレー、坐薬、微粉砕した粉末、または吸入用エアゾールの形態で、および非経腸(静脈、筋肉、または点滴)の使用のための、滅菌処理した水溶液または油溶液または懸濁液、または滅菌処理した乳剤の形態で、当業界で既知の方法によって処方され得る。
【００４８】
本発明の化合物に加え、本発明の医薬組成物はまた、上記の１またはそれ以上の疾患もしくは状態を処置する際に、重要な１個またはそれ以上の薬理学的薬剤を含んでもよく、またはそれと共に(同時または連続して)投薬してもよい。
【００４９】
本発明の医薬組成物は、通常ヒトに投与され、例えば一日の用量、０.５から７５mg／kg体重(好ましくは０.５から３０mg／kg体重)が服用される。１日の用量は、必要があれば分割して服用されてもよく、投与を受けた本化合物の正確な量と投与経路は、当業界で既知の方針に従って、処置すべき患者の体重、年齢、性別に依存し、かつ処置すべき特定の疾患もしくは状態に依存する。
典型的な単位投与系は、約１mgから５００mgの本発明の化合物を含む。
【００５０】
従って、さらなる態様において、我々は、ヒトもしくは動物の体の治療的処置方法において使用するための、または治療薬として使用するための、式Ｉの化合物またはその薬学的に許容される塩もしくは in vivo で加水分解可能なエステルを提供する。我々は、１もしくはそれ以上のメタロプロテイナーゼが介在する疾患もしくは状態の処置における使用を開示する。特に、我々は、ＭＭＰ１２ および／または ＭＭＰ１３ および／または ＭＭＰ９ および／または ＭＭＰ８ および／または ＭＭＰ３ および／または アグリカナーゼが介在する疾患もしくは状態の処置における使用を；特にＭＭＰ１２またはＭＭＰ９が介在する疾患もしくは状態の処置における使用を；最も特定的にはＭＭＰ１２が介在する疾患もしくは状態の処置における使用を開示する。
【００５１】
特に、我々は、ヒトもしくは動物の体の治療的処置方法において使用するための、または治療薬として使用するための、式 II の化合物または薬学的に許容される塩もしくは in vivo で加水分解可能なエステルを提供する(例えばＭＭＰ１２ および／または ＭＭＰ１３ および／または ＭＭＰ９ および／または ＭＭＰ８ および／または ＭＭＰ３；特にＭＭＰ１２またはＭＭＰ９；最も特定的にはＭＭＰ１２が介在する疾患もしくは状態の処置における使用)。
【００５２】
さらなる態様において、我々は、温血動物に、治療上効果的な量の式Ｉの化合物、またはその薬学的に許容される塩もしくは in vivo で加水分解され得るエステルを、投与することを含む、メタロプロテイナーゼ介在疾患もしくは状態の処置方法を提供する。我々はまた、１もしくはそれ以上のメタロプロテイナーゼが介在する疾患もしくは状態の処置に使用するための、医薬の製造における、式Ｉもしくは式 II の化合物、またはその薬学的に許容される塩もしくは in vivo で加水分解され得るエステルの使用を開示する。
【００５３】
メタロプロテイナーゼ介在疾患もしくは状態は、喘息、鼻炎、慢性閉塞性肺疾患(ＣＯＰＤ)、関節炎(例えばリウマチ性関節炎や骨関節炎)、アテローム性硬化症および再狭窄、癌、浸潤および転移、組織破壊を伴う疾患、人工股関節の弛み、歯周病、繊維性疾患、梗塞および心臓病、肝臓繊維症および腎臓繊維症、子宮内膜症、細胞外マトリックスの破壊に関する疾患、心不全、大動脈瘤、ＣＮＳ関連疾患、例えばアルツハイマー病や多発性硬化症(ＭＳ)など、および血液疾患を含む。
【００５４】
本発明の化合物の製法
本発明の別の態様において、下記のような式Ｉもしくは II の化合物またはその薬学的に許容される塩もしくは in vivo で加水分解し得るエステルの製造方法を提供する。関連の出発物質の多くは、市販されているか、既知の方法で合成され得るか、または科学文献中で見出され得る。
【００５５】
(ａ)式Ｉ[式中、Ｙ１とＹ２は、それぞれＯであり、ＺはＯであり、そしてＸとＲ５は式Ｉで記載した通りである]の化合物は、式 VI：
【化１６】
2004523581.tif 000017
[式中、Ｋは脱離基(例えばクロライド、またはスルホネート エステル)であり；
Ｒ５は式Ｉで記載した通りである]の化合物を、式 VII：
【化１７】
2004523581.tif 000018
[式中、Ｇはスルフヒドリル(ＳＨ)、またはヒドロキシルであり；
Ｘは式Ｉで記載した通りである]の化合物と反応させることによって、製造され得る。該反応は、好ましくは塩基、例えばジエチル イソプロピル アミン、または炭酸セシウムなどの存在下で、かつ適切な溶媒、例えばＤＭＦの存在下で行われる。
【００５６】
あるいは、本化合物は、同様の方法で、式 VI [式中、Ｋはスルフヒドリル(ＳＨ)またはヒドロキシルである]の化合物と、式 VII [式中、Ｇは脱離基を表す]の化合物を反応させることによって、製造され得る。
【００５７】
(ｂ)式Ｉ[式中、Ｙ１とＹ２はそれぞれＯであり、ＸはＮＲ１(Ｒ１＝Ｈ)であり、ＺはＳまたはＯであり、そしてＲ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５は、式Ｉで記載した通りである]の化合物は、式 VIII：
【化１８】
2004523581.tif 000019
[式中、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、およびＡは、式Ｉで記載した通りである]の化合物を、アンモニウム塩およびシアン化物塩と、プロトン性溶媒中で、好ましくは過剰の炭酸アンモニウム塩およびシアン化カリウムの存在下で、エタノール中で、密封反応器中で、４０−８０℃で、４−２４時間反応させることによって製造され得る。
【００５８】
式 VIII のケトンは、式 IX：
【化１９】
2004523581.tif 000020
[式中、Ｒ５とＡは、式Ｉで記載した通りである]のアルコールまたはチオールを、式Ｘ：
【化２０】
2004523581.tif 000021
[式中、Ｒ２は式Ｉで記載した通りである]のハロケトン、および過剰の塩基で処理することによって、簡便に製造される。
本発明の化合物は、例えば、下記のアッセイにより評価され得る。
【００５９】
単離した酵素のアッセイ
例えばＭＭＰ１２、１３を含むマトリックスメタロプロテイナーゼのファミリー
ヒトのリコンビナントのＭＭＰ１２触媒ドメインを、Parkar A.A. et al, (2000), Protein Expression and Purification, 20:152 に記載された通りに発現し、精製し得る。精製した酵素は、下記のように活性の阻害剤をモニターするのに用い得る：
ＭＭＰ１２(５０ng/ml 最終濃度)を、アッセイ緩衝液(０.１Ｍ ＮａＣｌ、２０ｍＭ ＣａＣｌ２、０.０４０ｍＭ ＺｎＣｌ、および０.０５％(ｗ／ｖ) ブリジ ３５を含む０.１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ(ｐＨ ７.３))中で、合成基質：Ｍａｃ−Ｐｒｏ−Ｃｈａ−Ｇｌｙ−Ｎｖａ−Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ｄｐａ−ＮＨ２を用いて、阻害剤の存在下もしくは非存在下で、室温で、３０分間インキュベートする。活性は、λex ３２８nm、λem ３９３nmの蛍光を測定することによって決定する。パーセント阻害は下記のように計算する：
％阻害は、 [蛍光阻害剤添加−蛍光バックグラウンド] を、[蛍光阻害剤非添加−蛍光バックグラウンド] で割ったものと等しい。
【００６０】
ヒトのリコンビナントのＭＭＰ１３前駆体は、Knauper らに記載されたように発現し精製し得る [V. Knauper et al., (1996) The Biochemical Journal 271:1544-1550 (1996)]。精製した酵素は、下記のように活性の阻害剤をモニターするのに使い得る：
２１℃で、１mM アミノフェニル水銀酸(ＡＰＭＡ)を用いて、精製したＭＭＰ１３前駆体を２０時間活性化する；活性化したＭＭＰ１３(アッセイ当たり１１.２５ｎｇ)は、３５℃で、アッセイ緩衝液(０.１Ｍ ＮａＣｌ、２０mM ＣａＣｌ２、０.０２mM ＺｎＣｌ、０.０５％(ｗ／ｖ) ブリジ３５を含む ０.１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ(ｐＨ７.５))中で、合成基質７−メトキシクマリン−４−イル)アセチル.Ｐｒｏ.Ｌｅｕ.Ｇｌｙ.Ｌｅｕ.Ｎ−３−(２,４−ジニトロフェニル)−Ｌ−２,３−ジアミノプロピオニル.Ａｌａ.Ａｒｇ.ＮＨ２ を用いて、阻害剤の存在下または非存在下で、４−５時間インキュベートする。活性は、λex ３２８nm、λem ３９３nmの蛍光を測定することによって決定する。パーセント阻害は下記のように計算する：
％阻害は、 [蛍光阻害剤添加−蛍光バックグラウンド] を、[蛍光阻害剤非添加−蛍光バックグラウンド] で割ったものと等しい。
同様のプロトコルは、特定のＭＭＰに最適の基質と緩衝液の条件、例えば C. Graham Knight et al.,  (1992) FEBS Lett. 296(3):263-266 で記載されたような条件を用いて、発現し単離したプロＭＭＰに使い得る。
【００６１】
例えばＴＮＦコンバターゼを含むアダマライシン(adamalysin)・ファミリー
本化合物がプロＴＮＦαコンバターゼを阻害することができるかは、K. M. Mohler et al., (1994) Nature 370:218-220 に記載されたように、ＴＨＰ−１の膜から得られた、一部精製し単離した酵素のアッセイを用いて評価され得る。精製した酵素の活性とその阻害は、試験化合物の存在下または非存在下、アッセイ緩衝液(０.１％(ｗ／ｖ)トリトン Ｘ−１００および２mM ＣａＣｌ２を含む５０mM Ｔｒｉｓ ＨＣｌ(ｐＨ７.４))中の、基質４',５'−ジメトキシフルオレセイニル Ｓｅｒ.Ｐｒｏ.Ｌｅｕ.Ａｌａ.Ｇｌｎ.Ａｌａ.Ｖａｌ.Ａｒｇ.Ｓｅｒ.Ｓｅｒ.Ｓｅｒ.Ａｒｇ.Ｃｙｓ(４−(３−スクシンイミド−１−イル)−フルオレセイン)−ＮＨ２を用いて、一部精製した酵素を２６℃で１８時間インキュベートすることによって決定される。阻害の量は、λex ４９０nm、λem ５３０nmを用いた他は、ＭＭＰ１３と同様に決定される。基質は、下記のように合成される。基質のペプチド部分は、Ｆｍｏｃ−アミノ酸とＯ−ベンズトリアゾール−１−イル−Ｎ,Ｎ,Ｎ',Ｎ'−テトラメチルウロニウム ヘキサフルオロリン酸(ＨＢＴＵ)をカップリング試薬として用いることを含む標準的な方法によって、少なくとも４倍または５倍過剰のＦｍｏｃ-アミノ酸とＨＢＴＵを用いて、手動または自動ペプチド合成装置のどちらかで、Ｆｍｏｃ−ＮＨ−リンク−ＭＢＨＡ−ポリスチレン樹脂で合成した。Ｓｅｒ１とＰｒｏ２を二重にカップリングした。下記の側鎖の保護方法を用いた；Ｓｅｒ１(But)、Ｇｌｎ５(Trityl)、Ａｒｇ８,１２(Pmc またはPbf)、Ｓｅｒ９,１０,１１(Trityl)、Ｃｙｓ１３(Trityl)。合成終了後、Ｎ末端のＦｍｏｃ保護基は、Ｆｍｏｃ−ペプチジル−樹脂をＤＭＦで処理することによって除いた。得られたアミノ−ペプチジル−樹脂は、１.５−２当量の４',５'−ジメトキシフルオレセイン−４(５)−カルボン酸 [Khanna & Ullman, (1980) Anal Biochem. 108:156-161] (ＤＭＦ中のジイソプロピルカルボジイミドと１−ヒドロキシベンゾトリアゾールで予め活性化した)で、１.５−２時間７０℃で処理することによって、アシル化した。ジメトキシフルオレセイニル−ペプチドは、水とトリエチルシランを各々５％ずつ含む、トリフルオロ酢酸で処理することによって脱保護し、同時に樹脂から切断した。ジメトキシフルオレセイニル−ペプチドを、溶媒を留去し、ジエチルエーテルでトリチュレートし、濾過することによって単離した。単離したペプチドは、ジイソプロピルエチルアミンを含むＤＭＦ中で、４−(Ｎ−マレイミド)−フルオレセインと反応させ、生成物をＲＰ−ＨＰＬＣによって精製し、最後に酢酸水溶液から凍結乾燥法によって単離した。生成物は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳとアミノ酸分析によって特性決定した。
【００６２】
天然基質
アグリカンの分解の阻害剤としての、本発明の化合物は、例えば E. C. Arner et al., (1998) Osteoarthritis and Cartilage 6:214-228; (1999) Journal of Biological Chemistry, 274 (10), 6594-6601 の開示に基づく方法と、そこで記載された抗体を用いて評価され得る。コラゲナーゼに対して阻害剤として作用する化合物の活性は、T. Cawston and A. Barrett (1979) Anal. Biochem. 99:340-345 に記載されたように決定され得る。
【００６３】
活性に基づく細胞／組織におけるメタロプロテイナーゼ活性の阻害
ＴＮＦコンバターゼのような膜シェダーゼを阻害する薬剤としてのテスト
本発明の化合物がＴＮＦαの生成の細胞内の加工・処理を阻害することができるかは、本質的に、ＴＨＰ−１細胞において、ＥＬＩＳＡを用いて、K. M. Mohler et al., (1994) Nature 370:218-220 に記載されたように、放出されたＴＮＦを検出することによって評価され得る。類似の方法で、N. M. Hooper et al., (1997) Biochem. J. 321:265-279 に記載されたような他の膜分子の加工・処理またはシェディングを、適切な細胞株と、シェッドタンパク質を検出するための適切な抗体を用いてテストし得る。
【００６４】
細胞性侵潤を阻害する薬剤としてのテスト
浸潤アッセイにおいて、本発明の化合物が細胞の転移を阻害することができるかは、A. Albini et al., (1987) Cancer Research 47:3239-3245 に記載されたように決定され得る。
【００６５】
全血液のＴＮＦシェダーゼ活性を阻害する薬剤としてのテスト
本発明の化合物がＴＮＦα生成を阻害することができるかは、ＴＮＦαの放出を刺激するために、ＬＰＳを用いたヒトの全血液アッセイにおいて評価する。ボランティアから得たヘパリン処理した(１０単位／ml)ヒトの血液を、溶媒(ＲＰＭＩ １６４０＋炭酸水素イオン、ペニシリン、ストレプトマイシン、グルタミン)で、１：５に希釈し、試験化合物２０μｌ(３組)と、ＤＭＳＯまたは適当な賦形剤中で、加湿(５％ＣＯ２／９５％空気)インキュベーター中で、３０分間３７℃でインキュベートした後、２０μｌのＬＰＳ(E. coli. 0111:B4; 最終濃度１０μｇ／ml)を加える(１６０μｌ)。各アッセイは、溶媒のみ(６ウェル／プレート)と、または標準として既知のＴＮＦα阻害剤とインキュベートした、希釈した血液のコントロールを含む。次いで、プレートは３７℃で６時間インキュベートし(加湿インキュベーター)、遠心分離し(２０００rpm、１０分間；４℃)、血漿を採取し(５０−１００μｌ)、９６ウェルプレート中で−７０℃で保存し、次にＴＮＦαの濃度をＥＬＩＳＡによって分析する。
【００６６】
in vitro での軟骨の分解を阻害する薬剤としてのテスト
本発明の化合物がアグリカンまたは軟骨のコラーゲン構成成分の分解を阻害することができるかは、本質的に K. M. Bottomley et al., (1997) Biochem J. 323:483-488 に記載されたように評価し得る。
【００６７】
薬物動態学テスト
本発明の化合物のクリアランス性とバイオアベイラビリティーを評価するために、ex vivo での薬物動態学テストを、上記の合成基質アッセイ、あるいはＨＰＬＣもしくはマス・スペクトル分析を利用して行った。これは、化合物のクリアランス速度を、種間で推定するために用いられ得る一般的なテストである。動物(例えばラット、マーモセット)は、化合物の可溶性の製剤(２０％ w/v ＤＭＳＯ、６０％ w/v ＰＥＧ４００など)で、静脈でまたは経口で投与され、その後の時点(例えば５、１５、３０、６０、１２０、２４０、４８０、７２０、１２２０分)で、血液の試料を適切な容器から１０Ｕへパリン採る。次に遠心分離にかけて血漿のフラクションを得て、血漿タンパク質をアセトニトリル(最終濃度８０％ w/v)で沈殿させた。−２０℃で３０分間遠心分離にかけて血漿タンパク質を沈殿させ、上清のフラクションを、Savant speed vac を用いて乾固するまで蒸発させる。沈殿物をアッセイ緩衝液中で再構成し、次に合成基質アッセイを用いて、化合物の含有量を分析する。要するに、化合物濃度−応答曲線を評価中の化合物について作製する。再構成した血漿抽出物の連続希釈液の活性を評価し、元の血漿試料中に存在する化合物の量を、全血漿の希釈倍数を算入して、該濃度−応答曲線を用いて計算する。
【００６８】
in vivo での評価
抗ＴＮＦ薬としてのテスト
本発明の化合物が ex vivo でＴＮＦα阻害剤となり得るかは、ラットにおいて評価される。要点は、オスの Wistar Alderley Park (AP) ラット(１８０−２１０ｇ)のグループに、化合物を(ラット６匹)、または薬剤の賦形剤を(ラット１０匹)、適切な経路、例えば経口(p.o.)、腹腔内(i.p.)、皮下(s.c.)で投与する。９０分後、ラットをＣＯ２濃度を上げて殺し、５単位のヘパリン ナトリウム／ml 血液へ、後大静脈を介して採血する。血液試料はすぐに氷上に置き、４℃で２０００rpm、１０分間遠心分離し、ＬＰＳで刺激したヒトの血液によるＴＮＦα生産への効果を、次に分析するために、得られた血漿を−２０℃で凍らせた。ラットの血漿の試料を解凍し、９６Ｕウェルプレート中のフォーマット・パターンのセットに、各試料を１７５μｌずつ加える。５０μｌのヘパリン処理したヒトの血液を、各ウェルに加え、混合し、プレートを３７℃で３０分間インキュベート(加湿インキュベーター)する。ＬＰＳ(２５μｌ；最終濃度１０μｇ／ml)を、ウェルに加え、さらに５.５時間インキュベーションを続ける。コントロール・ウェルを、２５μｌの溶媒のみでインキュベートする。次に、プレートを２０００rpmで１０分間遠心分離し、２００μｌの上清を９６ウェルプレートに移し、次にＥＬＩＳＡによってＴＮＦの濃度を分析するために、−２０℃で凍らせた。
【００６９】
提供されたソフトウェアによって、データの分析は、各化合物／用量に対して計算された：
【数１】
2004523581.tif 000022
【００７０】
抗関節炎薬としてのテスト
抗関節炎薬としての本発明の化合物の活性は、D. E. Trentham et al., (1977) J. Exp. Med. 146,:857 で記載された通りに、コラーゲン誘発関節炎(ＣＩＡ)で試験する。このモデルでは、酸に可溶な天然型タイプ II コラーゲンが、フロイント不完全アジュバントで投薬したときに、ラットにおいて多発性関節炎を引き起こす。同条件下で、マウスと霊長類で関節炎を誘発するために使い得る。
【００７１】
抗癌剤としてのテスト
本発明の化合物の抗癌剤としての活性は、本質的に I. J. Fidler (1978) Methods in Cancer Research 15:399-439 で記載されたように、Ｂ１６細胞株を用いて(B. Hibner et al., Abstract 283 p75 10th NCI-EORTC Symposium, Amsterdam 1998年6月16日−19日に記載)、評価され得る。
【００７２】
抗肺気腫薬としてのテスト
化合物の抗肺気腫薬としての活性は、本質的に Hautamaki et al (1997) Science, 277: 2002 に記載された通りに評価され得る。
【００７３】
本発明は、下記の実施例によって例示されるが、本発明を限定するものではない。
一般的な分析方法：
１Ｈ−ＮＭＲスペクトルは、Varian UnityInova 400MHzまたは Varian Mercury-VX 300M
Hzinstrument の何れかで記録された。クロロホルム−ｄ(δＨ 7.27 ppm)、ジメチルス
ルホキシド−ｄ６(δＨ 2.50 ppm)、またはメタノール−ｄ４(δＨ 3.31 ppm)の溶媒のピークの中心を、内部標準として用いた。低解像度質量スペクトルを、APCI ionization chamber を備えた Agilent 1100 LC-MS system で得た。
【実施例】
【００７４】
実施例１
【化２１】
2004523581.tif 000023
５−(ビフェニル−４−イルオキシメチル)−５−エチル−イミダゾリジン−２,４−ジオン
４−ヒドロキシ−ビフェニル(８４mg、０.５mmol)を、乾燥アセトン(２.５ml)中の１−ブロモ−２−ブタノン(０.０５５ml、０.５５mmol)と無水炭酸カリウム(９５mg、０.６９mmol)に添加した。
【化２２】
2004523581.tif 000024
混合物を２時間常温で撹拌し、酢酸エチル(２.５ml)で希釈した。上清を蒸発させた。得られた油を炭酸アンモニウム(２９０mg、３.０mmol)およびシアン化カリウム(７９mg、１.２mmol)と共に、５０％エタノール(３ml)中で、７５℃で、一晩、密封容器中で撹拌した。飽和塩化アンモニウム(水性、２ml)と共に生じた溶液を酢酸エチル(２０ml)、エーテル(１０ml)および水(１５ml)で純化した。有機相をさらに一度水(１０ml)で洗浄し、ヘプタンと共に蒸発させ、表題化合物(１１２mg、０.３６mmol)を白色固体として収率７２％で得た。
1HNMR (300 MHz, DMSO-d6): δ 10.57 (1H, bs); 8.00 (1H, s); 7.63-7.58 (4H, m); 7.43 (2H, m); 7.01 (2H, d); 4.07 (2H, dd); 1.67 (2H, m); 0.86 (3H, t).
LC-MS (APCI) m/z311.1  (MH+).
【００７５】
実施例２
一般式
【化２３】
2004523581.tif 000025
の化合物を、実施例１に記載の方法により合成した。
【００７６】
【表１】
2004523581.tif 000026
【００７７】
【表２】
2004523581.tif 000027
【００７８】
【表３】
2004523581.tif 000028
(1)：ＮＭＲデータについては、実験の部を参照のこと。
【００７９】
５−[１−(ビフェニル−４−イルオキシ)−エチル]−５−メチル−イミダゾリジン−２,４−ジオン
LC-MS (APCI) m/z311.2  (MH+).
５−(４'−シアノ−ビフェニル−４−イルオキシメチル)−５−エチル−イミダゾリジン−２,４−ジオン
LC-MS (APCI) m/z336.2  (MH+).
５−(４'−クロロ−ビフェニル−４−イルオキシメチル)−５−メチル−イミダゾリジン−２,４−ジオン
LC-MS (APCI) m/z331.2 (MH+).
５−(４'−シアノ−ビフェニル−４−イルオキシメチル)−５−メチル−イミダゾリジン−２,４−ジオン
LC-MS (APCI) m/z322.2 (MH+).
５−(４'−シアノ−ビフェニル−４−イルオキシメチル)−５−ｔｅｒｔ−ブチル−イミダゾリジン−２,４−ジオン
LC-MS (APCI) m/z364 (MH+).
５−(４'−シアノ−ビフェニル−４−イルオキシメチル)−５−フェニル−イミダゾリジン−２,４−ジオン
LC-MS (APCI) m/z384 (MH+).
５−メチル−５−[４−(４−トリフルオロメチル−フェノキシ)−フェノキシメチル]−イミダゾリジン−２,４−ジオン
LC-MS (APCI) m/z381.4  (MH+).
５−(４−シアノ−フェノキシメチル)−５−(３−メトキシ−フェニル)−イミダゾリジン−２,４−ジオン
LC-MS (APCI) m/z338.2  (MH+).
５−(４−シアノ−フェノキシメチル)−５−(３−ブロモ−フェニル)−イミダゾリジン−２,４−ジオン
LC-MS (APCI) m/z386.1 (MH+).
【００８０】
５−(４−シアノ−フェノキシメチル)−５−フェニル−イミダゾリジン−２,４−ジオン
LC-MS (APCI) m/z308.1 (MH+).
５−(４−ブロモ−フェノキシメチル)−５−(３−メトキシ−フェニル)−イミダゾリジン−２,４−ジオン
LC-MS (APCI) m/z393.1 (MH+).
５−(４−ブロモ−フェノキシメチル)−５−(３−ブロモ−フェニル)−イミダゾリジン−２,４−ジオン
LC-MS (APCI) m/z442.9 (MH+).
５−(４−ブロモ−フェノキシメチル)−５−フェニル−イミダゾリジン−２,４−ジオン
LC-MS (APCI) m/z363.1 (MH+).
５−(４−メトキシ−フェノキシメチル)−５−(３−メトキシ−フェニル)−イミダゾリジン−２,４−ジオン
LC-MS (APCI) m/z343.2(MH+).
５−(４−メトキシ−フェノキシメチル)−５−(３−ブロモ−フェニル)−イミダゾリジン−２,４−ジオン
LC-MS (APCI) m/z393.2 (MH+).
５−(４−メトキシ−フェノキシメチル)−５−フェニル−イミダゾリジン−２,４−ジオン
LC-MS (APCI) m/z313.2 (MH+).
５−(４−メチル−フェノキシメチル)−５−(３−メトキシ−フェニル)−イミダゾリジン−２,４−ジオン
LC-MS (APCI) m/z327.1 (MH+).
５−(４−メチル−フェノキシメチル)−５−(３−ブロモ−フェニル)−イミダゾリジン−２,４−ジオン
LC-MS (APCI) m/z377.1 (MH+).
５−(４−メチル−フェノキシメチル)−５−フェニル−イミダゾリジン−２,４−ジオン
LC-MS (APCI) m/z297.1 (MH+).
５−フェノキシメチル−５−(３−メトキシ−フェニル)−イミダゾリジン−２,４−ジオン
LC-MS (APCI) m/z313.2 (MH+).
５−フェノキシメチル−５−(３−ブロモ−フェニル)−イミダゾリジン−２,４−ジオン
LC-MS (APCI) m/z363 (MH+).
５−フェノキシメチル−５−フェニル−イミダゾリジン−２,４−ジオン
LC-MS (APCI) m/z283.2 (MH+).
６−(４−クロロ−フェノキシ)−１,３−ジアザ−スピロ[４,４]ノナン−２,４−ジオン
LC-MS (APCI) m/z281  (MH+).
【００８１】
５−メチル−５−[(４−チオフェン−２−イル−フェノキシメチル)−イミダゾリジン−２,４−ジオン
１−(４−チエン−２−イルフェノキシ)アセトン(１１４mg、０.４９mmol)、シアン化ナトリウム(４０mg、０.８１mmol)、炭酸アンモニウム(２２２mg、２.８５mmol)水(５ml)およびエタノールを混合し、８０℃で１０時間加熱した。冷却後、反応混合物を水で処理し、固体を濾過し、乾燥させ、１０５mgの生成物を得た。
LC-MS (APCI) m/z303 (MH+).
1H NMR (DMSO-d6): δ 1.31 (3H, s); 3.95, 4.10 (2H, abq, J=9.8 Hz); 6.95 (2H, d); 7.08 (1H, dd); 7.37 (1H, d); 7.45 (1H, d); 7.55 (2H, d); 8.03 (1H, s).
【００８２】
原料物質は、以下のように調製した。
１−(４−ヨードフェノキシ)アセトン
４−ヨードフェノール(４.９ｇ、２２mmol)を炭酸カリウム(４.７ｇ、３３mmol)、クロロアセトン(４.５ml、５５mmol)およびアセトンと共に１８時間還流撹拌した。反応混合物を水(１００ml)に注ぎ、酢酸エチル(３ｘ５０ml)で抽出し、抽出物をブライン洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させ、蒸発させた。残渣をフラッシュ・クロマトグラフィーで精製し、ジクロロメタンで抽出した。
LC-MS (APCI) m/z275 (MH+).
1H NMR (CDCl3): δ 2.26 (3H, s); 4.51 (2H, s); 6.65 (2H, d); 7.57 (2H, d).
【００８３】
１−(４−チエン−２−イルフェノキシ)アセトン
１−(４−ヨードフェノキシ)アセトン(１９２mg、０.６９mmol)を、チオフェン−２−ボロン酸(１０２mg、０.７９mmol)、ジクロロメタンとの[１,１'−ビス(ジフェニルホスフィノ)フェロセン]ジクロロパラジウム(ＩＩ)錯体(１：１)(３６mg)、ジメチルホルムアミド(１２ml)および酢酸アンモニウム(１３５mg)で処理し、一緒に８０℃で３時間撹拌した。冷却後、反応混合物を希塩酸で処理し、酢酸エチルに抽出した。生成物をフラッシュ・クロマトグラフィーによりシリカ上で精製し、５０％酢酸エチル：イソへキサンで抽出し、１１４mgの生成物を得た。
LC-MS (APCI) m/z232 (MH+).
【００８４】
以下の化合物を、５−メチル−５−[(４−チエン−２−イルフェノキシ)メチル]イミダゾリジン−２,４−ジオンの合成で記載したようにして調製した。
５−メチル−５−(４'−(トリフルオロメチル−ビフェニル−４−イルオキシメチル)−イミダゾリジン−２,４−ジオン
LC-MS (APCI) m/z365 (MH+).
1H NMR (DMSO-d6): δ 1.46 (3H, s); 4.05, 4.22 (2H, ABq, J=9.9 Hz); 7.04 (2H, d); 7.61 (2H, d); 7.04, 7.61 (4H, ABq, J=9.8 Hz).
５−(４'−(メトキシ−ビフェニル−４−イルオキシメチル)−５−メチル−イミダゾリジン−２,４−ジオン
LC-MS (APCI) m/z326 (MH+).
５−(４'−(フルオロ−ビフェニル−４−イルオキシメチル)−５−メチル−イミダゾリジン−２,４−ジオン
LC-MS (APCI) m/z315 (MH+).
1H NMR (DMSO-d6): δ 1,45 (3H, s); 4.02, 4.20 (2H, abq, J=9.9 Hz); 6.99 (2H, d); 7.12 (2H, t); 7.50 (2H, d); 7.55 (2H, dd).
Ｎ−[４'−(４−メチル−２,５−ジオキソ−イミダゾリジン−４−イルメトキシ)−ビフェニル−３−イル]−アセトアミド
LC-MS (APCI) m/z354 (MH+).
1H NMR (DMSO-d6): δ 1.46 (3H, s); 2.14 (3H, s); 2.15 (1H, s); 4.05, 4.20 (2H, abq, J=9.6 Hz); 7.00 (2H, d); 7.28-7.40 (3H, m); 7.46 (1H, bd); 7.53 (2H, d); 7.78-7.81 (1H, m).
５−(３'−(メトキシ−ビフェニル−４−イルオキシメチル)−５−メチル−イミダゾリジン−２,４−ジオン
LC-MS (APCI) m/z327 (MH+).
1H NMR (DMSO-d6): δ 1.45 (3H, s); 3.83 (3H, s); 4.04, 4.20 (2H, abq, J=9.6 Hz); 6.85 (1H, dd); 6.99 (2H, d); 7.08 (1H, m); 7.12 (1H, d); 7.30 (1H, t); 7.53 (2H, d).
【００８５】
５−エチル−５−(４'−(メトキシ−ビフェニル−４−イルオキシメチル)−イミダゾリジン−２,４−ジオン
LC-MS (APCI) m/z341 (MH+).
1H NMR (DMSO-d6): δ 0.48 (3H, t); 1.56-1.74 (2H, m); 3.77 (3H, s); 3.97, 4.11 (2H, abq, J=10.0 Hz); 6.94-7.00 (4H, m); 7.49-7.54 (4H, m); 7.97 (1H, s); 10.71 (1H, brs).
５−エチル−５−(４'−(トリフルオロメチル−ビフェニル−４−イルオキシメチル)−イミダゾリジン−２,４−ジオン
LC-MS (APCI) m/z378 (MH+).
1H NMR (DMSO-d6): δ 0.83 (3H, t); 1.66 (2H, oct); 4.01, 4.14 (2H, abq, J=9.8 Hz); 7.04 (2H, d); 7.67 (2H, d); 7.75 (2H, d); 7.84 (2H, d); 8.01 (1H, s); 10.75 (1H, bs).
５−エチル−５−(３'−(メトキシ−ビフェニル−４−イルオキシメチル)−イミダゾリジン−２,４−ジオン
LC-MS (APCI) m/z340 (MH+).
1H NMR (DMSO-d6): δ 0.83 (3H, t); 1.65 (2H, oct); 3.76 (3H, s); 3.97, 4.10 (2H, abq, J=9.7 Hz); 6.93-6.99 (3H, m); 7.49-7.53 (3H, m); 7.99 (1H, s); 10.74 (1H, bs).
５−エチル−５−(４'−(トリフルオロメトキシ−ビフェニル−４−イルオキシメチル)−イミダゾリジン−２,４−ジオン
LC-MS (APCI) m/z395 (MH+).
1H NMR (DMSO-d6): δ 0.84 (3H, t); 1.56-1.74 (2H, m); 4.00, 4.13 (2H, abq, J=10.9 Hz); 7.01 (2H, d); 7.40 (2H, d); 7.61, 7.72 (4H, abq, J=8.9 Hz); 7.79 (1H, s); 10.72 (1H, bs).
５−エチル−５−[(４−チオフェン−２−イル−フェノキシメチル)−イミダゾリジン−２,４−ジオン
LC-MS (APCI) m/z317 (MH+).
1H NMR (DMSO-d6): δ 0.82 (3H, t); 1.54-1.74 (2H, m); 3.97, 4.12 (2H, abq, J=10.0 Hz); 6.95 (2H, d); 7.08 (1H, dd); 7.37 (1H, dd); 7.44 (1H, dd); 7.55 (2H, d); 7.98 (1H, s); 10.67 (1H, s).
【００８６】
５−フェニル−５−(４'−(トリフルオロメチル−ビフェニル−４−イルオキシメチル)−イミダゾリジン−２,４−ジオン
LC-MS (APCI) m/z426 (MH+).
1H NMR (DMSO-d6): δ 4.21, 4.62 (2H, abq, J=10.1 Hz); 7.10 (2H, d); 7.38-7.47 (3H, m); 7.61-7.69 (4H, m); 7.76, 7.84 (4H, abq, J=8.8 Hz); 8.76 (1H, s); 10.92 (1H, bs).
５−ｔｅｒｔ−ブチル−５−(４−ピリジン−３−イル−フェノキシメチル)−イミダゾリジン−２,４−ジオン
LC-MS (APCI) m/z340 (MH+).
1H NMR (DMSO-d6): δ 1.02 (9H, s); 4.15, 4.36 (2H, abq, J=9.9 Hz); 7.10 (2H, d); 7.70-7.75 (3H, m); 8.08 (1H, s); 8.39 (1H, dd); 8.65 (1H, dd); 9.00 (1H, s).
５−ｔｅｒｔ−ブチル−５−(４'−メトキシ−ビフェニル−４−イルオキシメチル)−イミダゾリジン−２,４−ジオン
LC-MS (APCI) m/z368 (MH+).
1H NMR (DMSO-d6): δ 1.01 (9H, s); 3.76 (3H, s); 4.10, 4.31 (2H, abq, J=9.7 Hz); 6.95-7.01 (4H, dd); 7.48-7.55 (4H, dd); 8.05 (1H, s); 10.59 (1H, bs).
５−ｔｅｒｔ−ブチル−５−(３'−トリフルオロメチル−ビフェニル−４−イルオキシメチル)−イミダゾリジン−２,４−ジオン
LC-MS (APCI) m/z406 (MH+).
1H NMR (DMSO-d6): δ 1.01 (9H, s); 4.14, 4.35 (2H, abq, J=9.6 Hz); 7.06 (2H, d); 7.65-7.69 (4H, m); 7.89 (1H, s); 7.93 (1H, t); 8.08 (1H, s); 10.65 (1H, s).
５−ｔｅｒｔ−ブチル−５−(４'−トリフルオロメチル−ビフェニル−４−イルオキシメチル)−イミダゾリジン−２,４−ジオン
LC-MS (APCI) m/z407 (MH+).
1H NMR (DMSO-d6): δ 1.03 (9H, s); 4.15, 4.36 (2H, abq, J=10.0 Hz); 7.07, 7.68 (4H, abq, J=8.9 Hz); 7.76, 7.84 (4H, abq, J=8.9 Hz); 8.08 (1H, s); 10.67 (1H, s).
５−(ビフェニル−４−イルオキシメチル)−５−ピリジン−４−イル−イミダゾリジン−２,４−ジオン
LC-MS (APCI) m/z360 (MH+).
1H NMR (CD3OD): δ 4.41, 4.71  (2H, ABq, J=9.7 Hz); 7.02 (2H, d); 7.28 (1H, t); 7.39 (2H, t); 7.55 (2H, d); 8.14 (2H, d); 8.81 (2H, d).
【００８７】
実施例３
一般式
【化２４】
2004523581.tif 000029
の化合物を、実施例１に記載の方法により合成した。
【表４】
2004523581.tif 000030
(1)：ＮＭＲデータについては、実験の部を参照のこと。
【００８８】
５−[(１,１'−ビフェニル−４−イルチオ)メチル]−５−メチルイミダゾリジン−２,４−ジオン
LC-MS(APCI) m/z313 (MH+).
1H NMR (DMSO-d6): δ 1.36 (3H, s); 3.28 (2H, s); 7.34 (1H, t); 7.44 (4H, t); 7.60 (2H, d); 7.64 (2H, d); 7.97 (1H, s); 10.74 (1H, bs).
【００８９】
開始材料は、以下のように調製した。
１−(１,１'−ビフェニル−４−イルチオ)プロパン−２−オン
１−[(４−ブロモフェニル)チオ]プロパン−２−オン(３５７mg、１.４６mmol)を、フェニルボロン酸(２３１mg、１.８９mmol)、ジクロロメタンとの[１,１'−ビス(ジフェニルホスフィノ)フェロセン]ジクロロパラジウム(ＩＩ)錯体(１：１)(３６mg)、トルエン(２０ml)、メタノール(７.５ml)、飽和炭酸ナトリウム溶液(３.５ml)で処理し、一緒に８０℃で１８時間撹拌した。冷却後、反応混合物を希塩酸で処理し、酢酸エチルに抽出した。生成物をフラッシュ・クロマトグラフィーによりシリカ上で精製し、２５％酢酸エチル：イソへキサンで抽出し、２７７mgの生成物を得た。
GC/MS m/z: 242 [M +].
1H NMR (CDCl3): δ 2.33 (3H, s); 3.73 (2H, s); 7.37 (1H, s); 7.42-7.48 (4H, m); 7.54-7.59 (4H, m).
【００９０】
以下の化合物を、５−[(１,１'−ビフェニル−４−イルチオ)メチル]−５−メチルイミダゾリジン−２,４−ジオンの合成で記載したようにして調製した。
４'−{[(４−メチル−２,５−ジオキソイミダゾリジン−４−イル)メチル]チオ}−１,１'−ビフェニル−４−カルボニトリル
開始材料である４'−[(２−オキソプロピル)チオ]−１,１'−ビフェニル−４−カルボニトリルを、１−(１,１'−ビフェニル−４−イルチオ)プロパン−２−オンの合成で記載したように調製した。
1H NMR (DMSO-d6): δ 1.37 (3H, s); 3.30 (2H, s); 7.45, 7.67 (4H, abq, J=7.5 Hz); 7.88 (4H, q); 7.99 (1H, s); 10.75 (1H, bs).
【００９１】
５−メチル−５−[({４'−[(トリフルオロメチル)オキシ]−１,１'−ビフェニル−４−イル}チオ)メチル]イミダゾリジン−２,４−ジオン
開始材料である１−({４'−[(トリフルオロメチル)オキシ]−１,１'−ビフェニル−４−イル}チオ)プロパン−２−オンを、１−(１,１'−ビフェニル−４−イルチオ)プロパン−２−オンの合成で記載したように調製した。
LC-MS(APCI) m/z非常に弱い 397 (MH+).
1H NMR (DMSO-d6): δ 1.33 (3H, s); 3.29 (2H, s); 7.42-7.45 (4H, m); 7.61 (2H, d); 7.77 (2H, d); 7.99 (1H, s); 10.75 (1H, s).
【国際公開パンフレット】
2004523581.tif 000034
2004523581.tif 000035
2004523581.tif 000036
2004523581.tif 000037
2004523581.tif 000038
2004523581.tif 000039
2004523581.tif 000040
2004523581.tif 000041
2004523581.tif 000042
2004523581.tif 000043
2004523581.tif 000044
2004523581.tif 000045
2004523581.tif 000046
2004523581.tif 000047
2004523581.tif 000048
2004523581.tif 000049
2004523581.tif 000050
2004523581.tif 000051
2004523581.tif 000052
2004523581.tif 000053
2004523581.tif 000054
2004523581.tif 000055
2004523581.tif 000056
2004523581.tif 000057
2004523581.tif 000058
2004523581.tif 000059
2004523581.tif 000060
2004523581.tif 000061
2004523581.tif 000062
2004523581.tif 000063
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2004523581.tif 000070
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2004523581.tif 000079
2004523581.tif 000080
2004523581.tif 000081
2004523581.tif 000082
2004523581.tif 000083
【国際調査報告】
2004523581.tif 000084
2004523581.tif 000085
2004523581.tif 000086
2004523581.tif 000087
2004523581.tif 000088