(57)【要約】本発明は、式（Ｉ）（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４は独立にＨ又はＣ１−Ｃ６−アルキルである）の少なくとも１つの成分の使用に関する。本発明はまた、医学的目的のための式（Ｉ）の化合物の使用にも関する。2004504313.tif 000010
【特許請求の範囲】
【請求項１】
立体異性体として純粋な形態又は立体異性体の混合物としての式Ｉ：
【化１】
2004504313.tif 000007
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４は互いに独立にＨ又はＣ１−Ｃ６−アルキルである）
の化合物。
【請求項２】
Ｒ１がＨ又はＣＨ３であり、Ｒ２がＨ又はＣＨ３であり、Ｒ３がＣＨ３であり、Ｒ４がＨ又はＣＨ３である、請求項１に記載の式Ｉの化合物。
【請求項３】
請求項１に記載の式Ｉの化合物の製造方法であって、式ＩＩＩ：
【化２】
2004504313.tif 000008
（式中、Ｒ１〜Ｒ４は上記に特定した意味を有する）のトコトリエノールキノンを触媒の存在下で反応させて式Ｉの化合物を得ることを含む、製造方法。
【請求項４】
式ＩＩＩのトコトリエノールキノンを、式ＩＩ：
【化３】
2004504313.tif 000009
（式中、Ｒ１〜Ｒ４は上記に特定した意味を有する）のトコトリエノールを酸化することにより製造する、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
酸化剤がＣｅ（ＩＶ）塩又はＦｅ（ＩＩＩ）塩である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
式ＩＩのトコトリエノールを、有機溶媒中で式ＩＩＩのトコトリエノールキノンに酸化する、請求項４又は５に記載の方法。
【請求項７】
前記触媒がアルカリ金属炭酸塩である、請求項３〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
食品栄養補助剤としての請求項１又は２に記載の式Ｉの化合物の使用。
【請求項９】
医学的用途のための請求項１又は２に記載の式Ｉの化合物。
【請求項１０】
動脈硬化症、血栓症及び心筋梗塞を含む心血管障害などの高コレステロール血症に関連する障害を治療及び／もしくは予防するため、又は癌を治療及び／もしくは予防するための医薬品の製造のための、請求項１又は２に記載の式Ｉの化合物の使用。
【請求項１１】
ヒトにおいて血漿コレステロールレベルを低下させるための医薬品の製造のための、請求項１又は２に記載の式Ｉの化合物の使用。
【請求項１２】
哺乳動物又は鳥類において血漿コレステロールレベルを低下させるための医薬品の製造のための、請求項１又は２に記載の式Ｉの化合物の使用。
【請求項１３】
少なくとも１種の請求項１又は２に記載の式Ｉの化合物及び少なくとも１種の製薬上適合可能なビヒクルを含む医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
循環中のコレステロールの蓄積並びに高含量の飽和脂肪酸及びコレステロールを含む食事の結果としての血漿中のコレステロール及びＬＤＬコレステロールの高いレベルは、冠状動脈疾患の発生と相関している。これは、先進国における死亡の最も頻繁な原因の一つである。高コレステロール血症はまた、動脈硬化症、肝臓癌、黄色腫及びその他の多くの疾病の発生に原因的な役割を果たしている。
【０００２】
医学分野で用いられるコレステロール生合成の有効な阻害剤は、アトルバスタチン、フルバスタチン、セリバスタチン、ロバスタチン、メバスタチン、プラバスタチン及びシンバスタチンなどのスタチン類である。さらに、ニンニク抽出物中に存在する活性化合物アリシン及びアホエン、チョウセンアザミ抽出物中に存在する化合物ルテオリン、及びフィブラート並びにピペリジン誘導体ＢＭ １５．７６６も、コレステロール低下作用を示す（Ｇｅｂｈａｒｄｔ， Ｒ．ら、（１９９４） Ｂｉｏｃｈｉｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ １２１３： ５７−６３； Ｇｅｂｈａｒｄｔ， Ｒ． （１９９８） Ｊ． Ｐｈａｍａｃｏｌ． Ｅｘｐ． Ｔｈｅｒａｐ． ２８６： １１２２−１１２８； Ａｕｆｅｎａｎｇｅｒ， Ｊ．ら、（１９８５） Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． ３５（６）： ９１１−９１６）。ヤシ油も、飽和脂肪酸含量が高いにもかかわらず、コレステロール低下作用によって注目されている。ヤシ油中には、トコフェロール（例えばビタミンＥ）及びトコトリエノールが存在し、この作用を担っている（米国特許第５，２１７，９９２号）。トコフェロール及びトコトリエノールは、トコフェロールが飽和側鎖を有するのに対し、トコトリエノールはリポタンパク質及び膜への結合を担う不飽和側鎖を有するという点で主に異なっている（Ｈｏｏｄ， Ｒ．Ｌ． （１９９８） Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ， ３３−４１）。それらの抗酸化活性のため、トコフェロールは筋肉、皮膚、毛髪、免疫系への酸化的損傷及び喫煙者における酸化的損傷の予防のための組成物として用いられる。さらに、これらは例えば、スモークハム及び動物用医薬において、抗腫瘍化合物として、亜硝酸トラップとして用いられる（Ｒｏｍｐｐ−Ｌｅｘｉｋｏｎ Ｃｈｅｍｉｅ ［Ｒｏｍｐｐ’ｓ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｌｅｘｉｃｏｎ］ （１９９９）， Ｇｅｏｒｇ Ｔｈｉｅｍｅ Ｖｅｒｌａｇ， Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ， ４５７２−４５７３）。しかしながら、長い間、ＬＤＬコレステロールの酸化を防止するその活性はビタミンＥに起因するとされてきたにもかかわらず、これらは脂質代謝には効果がない。対照的に、ヤシ油に存在するトコトリエノールは、血漿コレステロールレベルを低下させることができる。例えば、コレステロール合成に対するγ−トコトリエノールの阻害作用は、ＨＭＧＲの直接的ファルネシル化、又はファルネシル化タンパク質によるＨＭＧＲのフィードバック阻害に起因する（Ｇｕｔｈｒｉｅ， Ｎ．及びＫ．Ｋ． Ｃａｒｏｌｌ （１９９８）， Ｂｉｏｌ． Ｏｘｉｄａｎｔｓ ａｎｄ Ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔｓ： Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ａｎｄ Ｈｅａｌｔｈ Ｅｆｆｅｃｔｓ， Ｃｈａｍｐａｉｇｎ， ＡＯＣＳ−Ｐｒｅｓｓ， ２５７−２６４； Ｑｕｒｅｓｈｉ， Ｎ． （１９９３） Ｖｉｔａｍｉｎ Ｅ ｉｎ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｄｉｓｅａｓｅ， ２４７−２６７）。異なる独立した機構を介して作用し、従って、その作用が相加的であるγ−トコトリエノール及びロバスタチンの組合せは、さらにより有効である。コレステロール合成速度に対する活性化合物の効果を測定するために、ＨＭＧＲが阻害される場合、例えばγ−トコトリエノールにより、ＨｅｐＧ２細胞由来のミクロソーム画分��での１４Ｃ−酢酸塩の取込みの減少が起こるｉｎ ｖｉｔｒｏ試験が用いられる。
【０００３】
従って、ヤシ油及びそこに存在するトコトリエノールは、鳥類及び哺乳動物において、ＨＤＬレベルに影響することなく、血漿中のコレステロール及びＬＤＬ−コレステロールレベルに対して有利な低下作用を有する。さらに、トコトリエノールはアポリポタンパク質−Ｂレベル、また、血液中のコレステロールレベルの比率をも低下させる（Ｂｒｏｗｎら、（１９８０）， Ｊ． Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ． ２１：５０５−５１７）。米国特許第５，３１８，９９３号は、トコトリエノールの酸化後に形成され、トコトリエノールと比較して増加した活性により、ｉｎ ｖｉｔｒｏ （ＨｅｐＧ２細胞由来ミクロソーム画分における１４Ｃ−酢酸塩の取込み）及びｉｎ ｖｉｖｏ （雌鳥におけるコレステロール及びＬＤＬ−コレステロールレベル）で識別される、合成トコトリエノール類縁体の物質群、開環キノン類を記載している。
【０００４】
動脈硬化症におけるトコトリエノールの予防的作用、さらには、コレステロール低下作用は、血小板凝集の阻害に基づいている。従って、トコトリエノールの投与に際して、トロンボキサンＢ２及び血小板因子ＩＶの血漿中レベルは低下する（Ｗｒｉｇｈｔら、Ａ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ ｏｎ Ｄｒｕｇｓ Ａｆｆｅｃｔｉｎｇ Ｌｉｐｉｄ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ， Ｈｏｕｓｔｏｎ， Ｔｅｘａｓ （Ｎｏｖ． １９８９）； Ｐａｐａｓ， Ａ．Ｍ． （１９９９）， ＣＲＣ， Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ， Ｆｌｏｒｉｄａ， ｐｐ． １８９−２１０）。
【０００５】
さらに、トコトリエノールは抗癌作用を有するとみなされている。従って、ヤシ油は肝臓癌の形成を防止することができる一方、脂肪組織におけるトコトリエノールの欠損は乳癌及び皮膚癌の発生率を増加させる。肝臓癌におけるトコトリエノールの抗癌作用はまた、コレステロール合成の阻害にも基づき、かくして、例えば、Ａ５４９細胞において証明された、成長阻害作用及び増殖阻害作用に基づいている（Ｈｏｏｄ， Ｒ．Ｌ． （１９９８）， Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ， ３３−５１； Ｗａｔｋｉｎｓ， Ｔ．Ｒ．ら、（１９９９）， ＣＲＣ， Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ， Ｆｌｏｒｉｄａ， ４７９−４９６； Ｂｅｎｎｉｓ， Ｆ．ら、（１９９３）， Ｉｎｔ． Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ ５５：６４０−６４５）。しかしながら、トコトリエノールの抗癌作用に関するより重要な役割は、その抗酸化特性のため、フリーラジカルトラップとして作用する６’−ＯＨ基により果たされる。さらに、トコトリエノールは、例えば、腫瘍の発達、細胞増殖及び細胞分化、血小板凝集並びにフリーラジカル放出に関与するプロテインキナーゼＣを阻害する。最後に、おそらくはｒａｓのファルネシル化を介して、その癌原性が防止される（Ｈｏｏｄ， Ｒ．Ｌ． （１９９８）， Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ， ３３−５１； Ｗａｔｋｉｎｓ， Ｔ．Ｒ．ら、（１９９９）， ＣＲＣ， Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ， Ｆｌｏｒｉｄａ， ４７９−４９６）。これらの抗癌特性のため、トコトリエノールを、タモキシフェン及びヘスペラチン（フラボノイド類）と組合せて、腫瘍予防及び腫瘍治療に有効に用いることができる（Ｈｏｏｄ， Ｒ．Ｌ． （１９９８）， Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ， ３３−５１； Ｇｕｔｈｒｉｅ， Ｎ．及びＫ．Ｋ． Ｃａｒｏｌｌ （１９９８）， Ｂｉｏｌ． Ｏｘｉｄａｎｔｓ ａｎｄ Ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔｓ， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ａｎｄ Ｈｅａｌｔｈ Ｅｆｆｅｃｔｓ， Ｃｈａｍｐａｉｇｎ， ＡＯＣＳ−Ｐｒｅｓｓ， ２５７−２６４）。
【０００６】
開環キノンは天然トコトリエノールと比較して活性の向上を示すが（米国特許第５，３１８，９９３号）、さらにより高活性な合成類縁体を提供することが本発明の課題である。
【０００７】
本発明者らは、驚くべきことに、γ−トコトリエノール又は開環キノンと比較して増加した活性を有する合成トコトリエノールキノン環化生成物（以後、環化生成物と呼ぶ）を提供することにより、この課題が達成されることを見出した。特に、本発明の環化生成物は、１０−６〜１０−５ Ｍ （ｍｏｌ／ｌ）という低い濃度においてさえ、有意に高い活性を示すという事実は特に驚くべきことであった。
【０００８】
本発明は特に、立体異性体として純粋な形態又は立体異性体の混合物としての式Ｉ：
【化４】
2004504313.tif 000002
（式中、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４は互いに独立にＨ又はＣ１−Ｃ６−アルキルであり；
Ｒ１は好ましくはＨ又はＣＨ３、特に好ましくはＨであり；
Ｒ２は好ましくはＨ又はＣＨ３、特に好ましくはＣＨ３であり；
Ｒ３は好ましくはＣＨ３であり、
Ｒ４は好ましくはＨ又はＣＨ３である）
の化合物に関する。さらに、Ｒ１はハロゲン、特にＣｌであってもよい。
【０００９】
Ｃ１−Ｃ６−アルキルは、メチル、エチル、ｎ−プロピル及びイソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル及びｔ−ブチル、並びにｎ−ペンチル及びｎ−ヘキシル並びにその分枝状類縁体を含む。
【００１０】
本発明は、特に式Ｉの化合物の２つのジアステレオマー（極性／非極性）及びエナンチオマーをも含む。極性ジアステレオマーは、主としてアルカンからなる溶媒混合物により、非極性ジアステレオマーよりもいくらかゆっくりとシリカゲルカラムから溶出されることにより識別される。
【００１１】
本発明はまた、触媒の存在下で、式ＩＩＩ：
【化５】
2004504313.tif 000003
（式中、Ｒ１〜Ｒ４は式Ｉで特定された意味を有する）のトコトリエノールキノンを反応させて式Ｉの化合物を得ることを含む、式Ｉの化合物の製造方法にも関する。これは、用いるトコトリエノールキノンに対応するトコトリエノールキノン環化生成物を生成する、すなわち、基Ｒ１〜Ｒ４は用いるトコトリエノールキノンにより予め決定される。
【００１２】
好ましい触媒は、アルカリ金属炭酸塩、例えば、炭酸ナトリウム及び炭酸カリウム、特に好ましくは、炭酸セシウムである。これに対し、有機溶媒、好ましくは塩化メチレンに、式ＩＩＩのトコトリエノールキノンを１０〜２００ ｇ／ｌ、好ましくは１００ ｇ／ｌの濃度で溶解し、上記触媒の１つを５〜１５ ｇ／ｌ、好ましくは１０ ｇ／ｌの濃度で溶解して反応させる。
【００１３】
前記反応を、慣行的な攪拌及び混合装置を用いて、慣行的な反応容器、好ましくはガラス反応器中で行うことができる。対応する環化生成物へのトコトリエノールキノンの完全な変換が起こるような反応時間、好ましくは１〜６時間を選択するべきである。この反応を、約１０〜１００℃、好ましくは２０〜５０℃で行う。ついで、例えばｎ−ヘプタン（出発溶液の容量に基づいて、２：１の比率で）及び１０％強度硫酸水素ナトリウム溶液（出発溶液の容量に基づいて、１：１の比率で）を添加することにより、相分離を達成することができ、環化生成物及び反応中に形成される少量のその他の成分を有機相に見出すことができる。
【００１４】
この反応溶液又は上記の有機相を、環化生成物のさらなる精製のために、例えば、硫酸ナトリウム上で乾燥させた後、蒸発により濃縮し、例えば、クロマトグラフィーによりさらに精製することができる。
【００１５】
例えば、シリカゲルカラムを用いて、少量のその他の成分から所望の生成物を分離することができる。この場合、上記のように、極性ジアステレオマーは、主としてアルカンからなる溶媒により、非極性ジアステレオマーよりもゆっくりとカラムから溶出される。この方法又は対応するクロマトグラフィー工程により、２つのジアステレオマーの部分的又は完全な分離が達成される。しかしながら、両方のジアステレオマーとも高いコレステロール低下活性を有するため、この分離が常に必要であるというわけではない。
【００１６】
本発明の方法で用いる式ＩＩＩのトコトリエノールキノンを、記載された本発明の方法から出発する合成方法、式ＩＩ：
【化６】
2004504313.tif 000004
（式中、Ｒ１〜Ｒ４は式Ｉで特定された意味を有する）の対応するトコトリエノールからの酸化反応において調製することができる。得られるトコトリエノールキノンの基Ｒ１〜Ｒ４は、用いるトコトリエノールにより予め決定される。トコトリエノールは、合成的に調製するか、又は天然資源から単離することができる（Ｋｈｏｒ Ｈ．Ｔ．及びＪ．Ｙ． Ｌａｉ （１９９１）， Ｂｉｏｌｏｇｉｃ Ｏｘｉｄａｎｔｓ ａｎｄ Ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔｓ， ＡＯＣＳ Ｐｒｅｓｓ， ２６７−２７３； Ｇｏｈ Ｓ．Ｈ．ら、（１９９１） Ｂｉｏｌｏｇｉｃ Ｏｘｉｄａｎｔｓ ａｎｄ Ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔｓ， ＡＯＣＳ Ｐｒｅｓｓ， ２７４−２８３； Ｑｕｒｅｓｈｉ Ｎ． （１９９３）， Ｖｉｔａｍｉｎ Ｅ ｉｎ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｄｉｓｅａｓｅ， ２４７−２６７）。セリウム（ＩＶ）塩又はＦｅ（ＩＩＩ）塩、好ましくは硝酸アンモニウムセリウム（ＩＶ）又は硝酸アンモニウム鉄（ＩＩＩ）から選択される酸化剤の水溶液を、例えば、トコトリエノール１モルあたり２〜５ ｍｏｌ、好ましくは、２〜３ ｍｏｌの酸化剤の濃度で添加することにより、トコトリエノールをトコトリエノールキノンに転化させる。反応は、０．５〜８時間、好ましくは１時間の反応時間、室温にて、全て慣行的な反応容器中で行うことができる。
【００１７】
上記の本発明の反応は、さらに好ましくは不活性ガス雰囲気下、例えば、窒素下で行う。
【００１８】
本発明はまた、食品栄養補助剤としての式Ｉの化合物の使用にも関する。すなわち、本発明の環化生成物を、食品及び飲料中に存在させるか、又は食前、食中もしくは食後に、例えば、他の栄養補助剤との組合せ調製物として消費させることができる。
【００１９】
本発明はさらに、医学的使用のための式Ｉの化合物を含む。
【００２０】
本発明の環化生成物は、鳥類及び哺乳動物、特にヒトにおける血漿コレステロールレベルを低下させるための医薬品及び栄養補助剤の製造において使用することができる。かくして、本発明の医薬品は、ヒト医学及び獣医学に使用され、本発明の環化生成物に基づいて、高コレステロール血症に関連する疾患の治療に用いることができる医薬品を製造することができる。さらに、本発明の医薬品を、そのような障害の予防に用いることもできる。
【００２１】
前記作用は、おそらく、コレステロール生合成の速度決定酵素である３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリルＣｏＡリダクターゼ（ＨＭＧＲ）に対する本発明の環化生成物の阻害活性に基づくものである。
【００２２】
さらに、前記環化生成物は、癌を治療及び予防するための医薬品及び食品栄養補助剤の製造に用いることができる。
【００２３】
本発明はまた、製薬上活性な量の、少なくとも１種の本発明の式Ｉの化合物及び少なくとも１種の製薬上適合可能なビヒクルを含む医薬組成物にも関する。このビヒクルは、所望の剤形で独立して、固体又は液体の形態中に存在させることができる。好ましいビヒクルは、スターチ、ラクトース、スクロース及び食用油である。
【００２４】
本発明の医薬品及び食品栄養補助剤は、他の活性化合物と前記環化生成物との組成物又は組合せ調製物をも含む。有利には、結果として、個々の活性化合物の用量を減少させることができる。
【００２５】
高コレステロール血症に関連する疾病を治療及び予防するための医薬品を製造するための環化生成物の使用にとって好ましいのは、組成物又は組合せ調製物である。そのような組合せ調製物には、類似した機構又は異なる機構に基づく阻害活性を有するため、有効性の増加が期待されるＨＭＧＲのその他の阻害剤を含んでもよい。従って、本発明の組成物は、さらなる活性化合物として、例えば、アトルバスタチン、フルバスタチン、セリバスタチン、ロバスタチン、メバスタチン、プラバスタチン、シンバスタチン、ＳＲＩ−６２３２０、プロブコール、ナイアシン（ニコチン酸）、アリシン、アホエン、ルテオリン、ＢＭ １５．７６６、イソフラボン、クルクミン、フィトステロール、ｎ−３ ＰＵＦＡ、プロバイオティックス及びコレステロールを低下させるフィブラート並びにその誘導体及びコンジュゲートを、個々に、又は組合せて含んでもよい。癌を治療及び予防するための医薬品を製造するための本発明の環化生成物の使用にとって好ましいのは、ヘスペラチンなどの活性化合物タモキシフェン及びフラボノイド類を含む組成物又は組合せ調製物である。
【００２６】
本発明の医薬品、組成物及び組合せ調製物は、経腸投与及び非経口投与のための錠剤、顆粒剤、粉末剤、糖衣錠、トローチ剤、ペレット、カプセル剤、坐剤、ゲル剤、溶液、乳剤及び懸濁液の形態であってもよい。さらに、本発明の化合物を、皮膚適用のためのゲル、ローション及びクリーム中に存在させることもできる。前記環化生成物を、食品及び飲料中に栄養補助剤又は上記形態での他の栄養補助剤との組合せ調製物として存在させることもできる。γ−トコトリエノール環化生成物は、０．５〜２０００ ｍｇ／日の用量（より高いか、又はより低いものであってもよい）で投与することができる。その正確な用量及び治療パターンは患者の状態、障害の重篤度及び過程、並びにこの障害に対する患者の素因に依存し、治療する医師によって好適かつ正確に確立されるであろう。同様に、動物用医薬品における使用にも適用される。
【００２７】
本発明を以下の非限定的な実施例及び添付の図面を参照して、より詳細に説明する。
【００２８】
図面の簡単な説明
（図面の簡単な説明については下記参照）
以下の実施例は本発明の化合物の合成を説明するものであるが、それを限定するものではない。
【００２９】
実施例
実施例１：γ−トコトリエノールキノン環化生成物（Ｒ１がＨであり、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４が各々ＣＨ３である式Ｉの化合物）の合成
Ｒ−γ−トコトリエノール（γ−Ｔ３、１００．０ ｇ／０．２４ ｍｏｌ）を、ディスク攪拌器、冷却器、滴下漏斗及び温度計を備えた６ ｌ容ガラスフラスコ中、Ｎ２雰囲気下で、分析等級エタノール（４８００ ｍｌ）に溶解した。蒸留水（４００ ｍｌ）に溶解した硝酸アンモニウムセリウム（ＩＶ）（３０７．２ ｇ／０．５６ ｍｏｌ）を、室温にて上記溶液に添加した。この混合物を室温にて１時間攪拌し、ＴＬＣサンプルを取り出した。これにより、Ｒ−γ−トコトリエノールの完全な変換を示した。
【００３０】
次いで、この溶液をｎ−ヘプタン（８００ ｍｌ）及び蒸留水（８０００ ｍｌ）の間で分離させた。各相を分離し、水相をｎ−ヘプタン（８００ ｍｌ）でもう１回抽出した。有機相を合わせ、蒸留水（２０００ ｍｌ）で２回洗浄した。相分離の改善のため、２回目の洗浄中に分析等級の酢酸（約３ ｍｌ／約０．０５ ｍｏｌ）を添加した。次いで、有機相を硫酸ナトリウム上で乾燥させた。回転式エバポレーター上で乾燥するまで蒸発させることにより、γ−トコトリエノールキノン（１０４．５ ｇ）を得た。これをさらに以下のように反応させた。
【００３１】
γ−トコトリエノールキノン（１０４．５ ｇ）、炭酸セシウム（ＣＳ２ＣＯ３、１０．０ ｇ／０．０３ ｍｏｌ）及び塩化メチレン（ＣＨ２Ｃｌ２、１０００ ｍｌ）を、冷却器、ディスク攪拌器及び温度計を備えた４ ｌ容ガラス反応器に、Ｎ２雰囲気下で添加し、混合物を還流しながら攪拌した。５時間後、ＴＬＣサンプルを取得した。これにより、実質的な変換を示したが、少量の夾雑成分も示された。
【００３２】
ｎ−ヘプタン（２０００ ｍｌ）及び１０％強度硫酸水素ナトリウム（１０００ ｍｌ／０．８３ ｍｏｌ）を添加し、該混合物を比較的高い回転速度で短時間に攪拌した。次いで、相を分離し、有機相を蒸留水（１０００ ｍｌ）で２回洗浄した。次いで、有機相を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、さらに回転式エバポレーター上で蒸発により乾燥させたところ、γ−トコトリエノールキノン環化生成物が得られた（１００．７ ｇ）。
【００３３】
ジアステレオマーの分離：
この生成物を、Ｂｉｏｔａｇｅ社から入手したフラッシュ１５０シリカゲルカラムを介して完全にクロマトグラフィーに供した。用いた移動相は６％酢酸エチルのｎ−ヘプタン溶液であった。主要な画分（ＴＬＣモニタリングによる）を回転式エバポレーター上で乾燥するまで蒸発させた後、γ−トコトリエノールキノン環化生成物（０．１２ ｍｏｌ； ４９．４ ｇ）を得た。最終生成物のＴＬＣにより、２種のジアステレオマーのみが示され、微量副生成物は示されなかった。ジアステレオマーの分離：それぞれが２つのジアステレオマーのうちの一方のみを含む、２つの近接するクロマトグラフィー画分も、回転式エバポレーター上で乾燥するまで蒸発させた。結果として、非極性ジアステレオマー（０．８２ ｇ； ＲＦ値：０．３９ （移動相：３０％ ＭＴＢ／ｎ−ヘプタン）；旋光度［α］２５Ｄ：＋２．０ｏ （ｃ ＝ １、エタノール））及び極性ジアステレオマー（０．８６ ｇ； ＲＦ値：０．３５ （移動相：３０％ ＭＴＢ／ｎ−ヘプタン）；旋光度［α］２５Ｄ：−４０．０ｏ （ｃ ＝ １、エタノール））が得られた。
【００３４】
２つのジアステレオマーの１３Ｃ−ＮＭＲデータ（ＣＤＣｌ３／ＤＭＳＯ−ｄ６ １：４）：δ ｐｐｍでの化学シフト（ＴＭＳ）、多重度（Ｓ ＝ シングレット、Ｄ ＝ ダブレット、Ｔ ＝ トリプレット、Ｑ ＝ カルテット）。
【００３５】
ジアステレオマー１：
2004504313.tif 000005
【００３６】
ジアステレオマー２：
2004504313.tif 000006
【００３７】
ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）分析
ＧＣ分析を、５０ ｍ ＣＰ−Ｓｉｌ ５／ＣＢカラム（Ｃｈｒｏｍｐａｃｋ社製）上で行った。温度プログラム：１５０℃、３分−１５℃／分−３００℃、４５分。インジェクター：２８０℃。検出器（ＦＩＤ）：３００℃。
【００３８】
ＴＬＣ条件：
− ＴＬＣプレート：シリカゲル６０
− 移動相：３０％メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル／ｎ−ヘプタン
− スプレー試薬：硫酸セリウム（ＩＶ）−モリブデンリン酸。
【００３９】
実施例２：ＨｅｐＧ２細胞におけるコレステロール合成の測定（Ｆａｈｒｎｅｒ， Ｊ．ら、Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２１３： １０６７−１０７３ （１９９３）； Ｇｅｂｈａｒｄｔ， Ｒ．， Ｌｉｐｉｄｓ ２８： ６１３−６１９ （１９９３）； Ｐｉｌｌ， Ｊ．ら、Ｚ． Ａｎａｌ． Ｃｈｅｍ． ３３２： ５１２−５１３ （１９８５）を参照）
試験物質によるコレステロール生合成に対する効果を検出するため、ＨｅｐＧ２細胞培養物を用いた。これらの細胞を、２ ｍＭゲンタミン、１０％ウシ胎仔血清、４０ Ｕ／ｍｌのストレプトマイシン及び５０ Ｕ／ｍｌのペニシリンを含むＤＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ社製， Ｅｇｇｅｎｓｔｅｉｎ， Ｇｅｒｍａｎｙ）において、３５ ｍｍの６穴細胞培養インキュベーションディッシュ中で、コンフルエントな状態になるまで培養した。使用前に凍結細胞を培養し、１週間継代した。次いで、コンフルエントな細胞を、試験物質と共に、無血清Ｗｉｌｌｉａｍｓ Ｍｅｄｉｕｍ Ｅ中で３７℃にて４時間インキュベートした。その後、１４Ｃ−酢酸（１８．５ ｋＢｑ／ｍｌ； ０．５μＣｉ／ｍｌ）を該溶液に添加した。試験物質はＤＭＳＯ中に希釈し、特定の濃度で用いた。さらに２時間後、培地を除去し、細胞を生理食塩水で２回洗浄し、蒸留水に移して、高周波数超音波（２０秒、段階３）によりホモジェナイズした。
【００４０】
非鹸化可能脂質画分（ステロール画分）への１４Ｃ−酢酸の取込みを、以下の方法により測定した：１．４ ｍｌのホモジェネートを、ＥｔＯＨ中、２．８ ｍｌの０．５ Ｍ ＫＯＨと共に、振とうしながら７０℃にて１時間インキュベートした。この混合物の２．１ ｍｌを、Ｅｘｔｒｅｌｕｔ（登録商標）カラム（Ｍｅｒｃｋ社製， Ｄａｒｍｓｔａｄｔ）に供した。中性で親油性の非鹸化可能物質は、１０ ｍｌのｎ−ヘプタンにより、３０分後にシンチレーションバイアル中に溶出された。１０ ｍｌのシンチレーション溶液（Ｕｌｔｉｍａ Ｇｏｌｄ（登録商標）， Ｐａｃｋａｒｄ， Ｍｅｒｉｄｅｎｔ， Ｃｏｎｎｅｃｔｉｃｕｔ）を添加した後、シンチレーションカウンターで、サンプル中の１４Ｃ活性を測定した。示された測定値は、試験溶液あたり３枚の独立した培養ディッシュの平均であると理解される。用いた参照値は、試験物質の非存在下での１４Ｃ−酢酸の取込みであり、これを１００％に設定した。
【００４１】
実験結果：
実施例２に特定された方法で、以下の物質を試験した：Ｒ−γ−トコトリエノール；γ−トコトリエノールキノン；α−トコトリエノールキノン；γ−トコトリエノールキノン環化生成物の極性ジアステレオマー、γ−トコトリエノールキノン環化生成物の非極性ジアステレオマー、γ−トコトリエノールキノン環化生成物のラセミ体。結果を図１〜６に示す。図中に与えられる値は、それぞれ、３つの独立した測定値の平均に相当する。これらを、対照として等量のＤＭＳＯを添加した時の、細胞への１４Ｃ−酢酸の取込みに基づく相対的単位で表す。５ ｘ １０−６ Ｍの濃度のＲ−γ−トコトリエノールは１４Ｃ−酢酸取込みを約２０％阻害し、また５ ｘ １０−５ Ｍ以上の濃度では１４Ｃ−酢酸取込みの最大約５０％の顕著な阻害を引き起こす（図１）。γ−及びα−トコトリエノールキノンは、１０−５ Ｍの濃度からのみ有意であるが、１４Ｃ−酢酸取込みの約７０〜７５％の阻害を引き起こす（図２及び３）。γ−トコトリエノールキノン環化生成物の極性及び非極性ジアステレオマーの双方、並びに２つのジアステレオマーの混合物（１：１）は、１０−６ Ｍの濃度においてでさえ、１４Ｃ−酢酸取込みの有意な２０〜３０％阻害を引き起こし、５ ｘ １０−５ Ｍの濃度で約５０％阻害を引き起こす（図４、５及び６）。すなわち、１０−６ Ｍの範囲の濃度における本発明の環化生成物は、γ−トコトリエノール及びγ−トコトリエノールキノンよりもかなり活性が高い。
【図面の簡単な説明】
【図１】Ｒ−γ−トコトリエノールの濃度を上昇させた時のＨｅｐＧ２細胞中への１４Ｃ−酢酸の取り込みを示す。
【図２】γ−トコトリエノールキノンの濃度を上昇させた時のＨｅｐＧ２細胞中への１４Ｃ−酢酸の取り込みを示す図である。
【図３】α−トコトリエノールキノンの濃度を上昇させた時のＨｅｐＧ２細胞中への１４Ｃ−酢酸の取り込みを示す図である。
【図４】環化生成物の極性ジアステレオマー（式中、Ｒ１はＨであり、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４は各々ＣＨ３である）（γ−トコトリエノールキノン環化生成物）に対するＨｅｐＧ２細胞中への１４Ｃ−酢酸の取り込みを示す図である。
【図５】環化生成物の非極性ジアステレオマー（式中、Ｒ１はＨであり、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４は各々ＣＨ３である）（γ−トコトリエノールキノン環化生成物）の濃度を上昇させた時のＨｅｐＧ２細胞中への１４Ｃ−酢酸の取り込みを示す図である。
【図６】環化生成物のジアステレオマー混合物（式中、Ｒ１はＨであり、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４は各々ＣＨ３である）（γ−トコトリエノールキノン環化生成物）の濃度を上昇させた時のＨｅｐＧ２細胞中への１４Ｃ−酢酸の取り込みを示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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