(57)【要約】本発明は、核酸分子を共有結合する方法、および、分子クローニング法を提供する。該方法は、トポイソメラーゼおよびＤＮＡリガーゼによる、フランキングまたはベクター核酸分子の、核酸挿入分子への連続的または同時ライゲーションを提供する。該方法は、核酸分子の指向的および非指向的共有結合的接続およびクローニングを提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸挿入分子を、第一および第二の核酸フランキング分子に共有結合させて、ライゲーションされた分子を形成する方法であって、
ここで、該挿入分子の各末端は５’−ヒドロキシル基を含み、該第一および第二のフランキング分子の各々の一端のみが、共有結合したトポイソメラーゼポリペプチドを含み、
その共有結合によって、該第一のフランキング分子と第二のフランキング分子の間に位置した該挿入分子を含むライゲーションされた分子を形成できる条件下で、該挿入分子および該フランキング分子をインキュベートするステップを含む方法。
【請求項２】
核酸挿入分子を、第一および第二の核酸フランキング分子に共有結合させて、ライゲーションされた分子を形成する方法であって、
（Ａ）一端は５’−ヒドロキシル基を含み、他端は５’−リン酸基を含む挿入分子と、一端のみが共有結合したトポイソメラーゼポリペプチドを含む該第一のフランキング分子とを、その共有結合によって該第一のフランキング分子に隣接して位置する該挿入分子を含むライゲーションされた核酸を形成できる条件下で、インキュベートするステップと、
（Ｂ）該ライゲーションされた核酸から５’−リン酸基を除去することが可能な条件下で、ステップ（Ａ）の該ライゲーションされた核酸をホスファターゼと共にインキュベートするステップと、
（Ｃ）ステップ（Ｂ）の産物を、一端のみが共有結合したトポイソメラーゼポリペプチドを含む該第二のフランキング分子と、その共有結合によって該第一のフランキング分子と該第二のフランキング分子の間に位置した該挿入分子を含むライゲーションされた分子を形成できる条件下で、インキュベートするステップと
を含む方法。
【請求項３】
核酸挿入分子を、第一および第二核酸フランキング分子に共有結合させて、ライゲーションされた分子を形成する方法であって、
該挿入分子の一端は５’−ヒドロキシル基を含み、他端は５’−リン酸基を含み、該第一のフランキング分子の一端のみが、共有結合したトポイソメラーゼポリペプチドを含み、該第二のフランキング分子の一端がリガーゼ基質部位を含むことを特徴とし、
その共有結合によって該第一のフランキング分子と該第二のフランキング分子の間に位置した該挿入分子を含むライゲーションされた分子を形成できる条件下で、該挿入分子と該フランキング分子とをインキュベートするステップを含む、方法。
【請求項４】
該第一および該第二核酸フランキング分子は、それぞれ左および右ベクターアームを含み、よって、該挿入分子は、該左ベクターアームおよび該右ベクターアームによりフランキングされている請求項１、２または３の方法。
【請求項５】
該左および右ベクターアームは各々、挿入分子に接続していない自由な末端を含み、
該ベクターアームの自由な末端を、互いに、核酸リガーゼにより媒介するライゲーション、相補的配列アニーリング、トポイソメラーゼ媒介ライゲーション、インビトロでの部位特異的組換え、インビボでの部位特異的組換え、およびインビボでの相同組換えからなる群から選択した方法により接続するステップをさらに含むことを特徴とする請求項４の方法。
【請求項６】
（Ａ）５’−ヒドロキシル基を一端に、５’−リン酸基を他端に含む核酸挿入分子と、共有結合したトポイソメラーゼポリペプチドを一端のみに含み、他端にライゲーション基質部位を含む鎖状クローニングベクターとを、その共有結合によって該鎖状クローニングベクターおよび該挿入分子を含むライゲーションされた環状ベクターが形成されるのに十分な条件下で、インキュベートするステップと、
（Ｂ）ステップ（Ａ）のライゲーションされた環状ベクターを宿主細胞に形質転換するステップと
を含む、分子クローニング法。
【請求項７】
（Ａ）各末端が５’−ヒドロキシル基を含む核酸挿入分子と、各々の一端のみが共有結合したトポイソメラーゼを含み、他端はクローニング基質部位を含む第一および第二鎖状アームとを、その共有結合によって該第一鎖状アームと第二鎖状アームの間に位置した該挿入分子を含むライゲーションされた分子が形成されるのに十分な条件下で、インキュベートするステップと、
（Ｂ）ステップ（Ａ）のライゲーションされた挿入分子を宿主細胞に形質転換するステップと
を含む、分子クローニング法。
【請求項８】
該クローニング基質部位は、ｃｏｓ部位、ＬＩＣ部位およびｌｏｘＰ部位からなる群から選択される、請求項７の方法。
【請求項９】
該クローニング基質部位はｌｏｘＰであり、該インキュベートステップは、部位特異的組換えによって該ライゲーションされた分子を含む環状プラスミドが形成されるに十分な条件下で、ｌｏｘＰ部位を含む環状プラスミドとＣｒｅリコンビナーゼと共に、該ライゲーションされた分子をインビトロでインキュベートするステップをさらに含み、該ライゲーションされた分子を含む該環状プラスミドにより、宿主細胞を形質転換する、請求項７の方法。
【請求項１０】
該クローニング基質部位はｌｏｘＰであり、該形質転換ステップは、部位特異的組換えによって該細胞内に該ライゲーションされた分子を含む環状プラスミドが形成されるに十分な条件下で、ｌｏｘＰ部位を含む環状プラスミドを含む宿主細胞を、該ライゲーションされた分子により形質転換するステップをさらに含み、ここで、該細胞はＣｒｅリコンビナーゼを発現することを特徴とする、請求項７の方法。
【請求項１１】
該クローニング基質部位は環状プラスミドベクターとの相同組換え部位であり、該形質転換ステップは、相同組換えによって該宿主細胞内に該ライゲーションされた分子を含む環状プラスミドが形成されるに十分な条件下で、該ライゲーションされた分子を、環状プラスミドベクターを含む宿主細胞に形質転換するステップをさらに含み、ここで、該環状プラスミドベクターは該ライゲーションされた分子との相同組換え部位を含み、該宿主細胞はｒｅｃＡ＋であることを特徴とする請求項７の方法。
【請求項１２】
該第一鎖状アームは、一端のみに、共有結合したトポイソメラーゼを含む左λアームを含み、第二鎖状アームは、一端のみに、共有結合したトポイソメラーゼを含む右λアームを含む、請求項７の方法。
【請求項１３】
（Ａ）一端は５’−ヒドロキシル基を含み、他端は５’−リン酸基を含む核酸挿入分子と、一端のみが共有結合したトポイソメラーゼポリペプチドを含み、他端はクローニング基質部位を含む第一鎖状アームとを、その共有結合によって、ライゲーションされた挿入断片／第一鎖状アーム分子を形成できる条件下で、インキュベートするステップと、
（Ｂ）５’−リン酸を欠失した該ライゲーションされた挿入断片／第一鎖状アームを含む産物を形成できる５’−リン酸基を除去することが可能な条件下で、ステップ（Ａ）の該ライゲーションされた挿入断片／第一鎖状アーム分子を、ホスファターゼと共にインキュベートするステップと、
（Ｃ）ステップ（Ｂ）の該産物を、一端のみが共有結合したトポイソメラーゼポリペプチドを含み、他端はクローニング基質部位を含む第二鎖状ベクターアームと共に、共有結合によって、該第一および該第二鎖状ベクターアーム間に位置した該挿入分子を含むライゲーションされた分子を形成できる条件下で、インキュベートするステップと、
（Ｄ）ステップ（Ｃ）のライゲーションされた分子を宿主細胞に形質転換するステップと
を含む、分子クローニング法。
【請求項１４】
該クローニング基質部位は、ｃｏｓ部位、ＬＩＣ部位、およびｌｏｘＰ部位からなる群から選択される、請求項１３の方法。
【請求項１５】
該クローニング基質部位はｌｏｘＰであり、該ライゲーションされた分子はさらに、部位特異的組換えによって該ライゲーションされた分子を含む環状プラスミドを形成するのに十分な条件下で、ｌｏｘＰ部位を含む環状プラスミドとＣｒｅリコンビナーゼと共に、インビトロでインキュベートされ、該ライゲーションされた分子を含む該環状プラスミドは宿主細胞に形質転換される、請求項１３の方法。
【請求項１６】
該クローニング基質部位はｌｏｘＰであり、該形質転換ステップは、部位特異的組換えによって、該ライゲーションされた分子を、ｌｏｘＰ部位を含む環状プラスミドを含む宿主細胞に、該細胞内に該ライゲーションされた分子を含む環状プラスミドを形成するのに十分な条件下で、形質転換するステップをさらに含み、該細胞はＣｒｅリコンビナーゼを発現する、請求項１３の方法。
【請求項１７】
該クローニング基質部位は、環状プラスミドベクターとの相同組換え部位であり、該形質転換ステップは、該ライゲーションされた分子を、環状プラスミドベクターを含む宿主細胞に、相同組換えによって該宿主細胞内に該ライゲーションされた分子を含む環状プラスミドを形成するに十分な条件下で、形質転換するステップをさらに含み、該環状プラスミドベクターは相同組換え部位を含み、該宿主細胞はｒｅｃＡ＋である、請求項１３の方法。
【請求項１８】
該第一鎖状アームは、一端に、共有結合したトポイソメラーゼポリペプチドを含む左λアームを含み、第二鎖状アームは、一端に、共有結合したトポイソメラーゼポリペプチドを含む右λアームを含む、請求項１３の方法。
【請求項１９】
（Ａ）一端は５’−ヒドロキシル基を含み、他端は５’−リン酸基を含む核酸挿入分子と、
一端のみが共有結合したトポイソメラーゼポリペプチドを含み、他端はクローニング基質部位を含む第一鎖状アームと、
一端はリガーゼ基質部位を含み、他端はクローニング基質部位を含む第二鎖状アームとを、その共有結合によって該第一鎖状アームと第二鎖状アーム間に位置した該挿入分子を含むライゲーションされた分子を形成できる条件下で、インキュベートするステップと、
（Ｂ）ステップ（Ａ）のライゲーションされた分子を宿主細胞に形質転換するステップと
を含む、分子クローニング法。
【請求項２０】
該クローニング基質部位はｃｏｓ部位、ＬＩＣ部位、およびｌｏｘＰ部位からなる群から選択する、請求項１９の方法。
【請求項２１】
該クローニング基質部位はｌｏｘＰであり、該インキュベートステップは、部位特異的組換えによって該ライゲーションされた分子を含む環状プラスミドを形成するに十分な条件下で、該ライゲーションされた分子を、ｌｏｘＰ部位を含む環状プラスミドとＣｒｅリコンビナーゼと共に、インビトロでインキュベートするステップをさらに含み、該ライゲーションされた分子を含む該環状プラスミドは、宿主細胞に形質転換される、請求項１９の方法。
【請求項２２】
該クローニング基質部位はｌｏｘＰであり、該形質転換ステップは、ｌｏｘＰ部位を含む環状プラスミドを含む宿主細胞に、部位特異的組換えによって該細胞内に該ライゲーションされた分子を含む環状プラスミドを形成するに十分な条件下で、該ライゲーションされた分子を形質転換するステップをさらに含み、該細胞はＣｒｅリコンビナーゼを発現する、請求項１９の方法。
【請求項２３】
該クローニング基質部位は環状プラスミドベクターとの相同組換え部位であり、該形質転換ステップは、相同組換えによって該宿主細胞内に該ライゲーションされた分子を含む環状プラスミドを形成するのに十分な条件下で、環状プラスミドベクターを含む宿主細胞に該ライゲーションされた分子を形質転換するステップをさらに含み、該環状プラスミドベクターは相同組換え部位を含み、該宿主細胞はｒｅｃＡ＋である、請求項１９の方法。
【請求項２４】
該第一鎖状アームは、一端のみに、共有結合したトポイソメラーゼポリペプチドを含む左λアームを含み、第二鎖状アームは、一端にリガーゼ基質部位を含む右λアームを含む、請求項１９の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
［技術分野］
本発明は、核酸分子を共有結合する方法、および、核酸分子の分子クローニング法に関する。
【０００２】
［発明の背景］
組換え核酸分子の構築には、２つの酵素ステップが必要である。第一に、部位特異的制限エンドヌクレアーゼによる消化またはＰＣＲ増幅を使用して、末端の規定された鎖状核酸分子を作成する。第二に、鎖状分子を、その末端において、リガーゼ酵素の存在下で共有結合する。唯ひとつのステップのみが必要とされる、または、制限エンドヌクレアーゼまたはリガーゼを使用としない核酸分子の共有結合およびクローニング法は、伝統的な組換え核酸分子の構築法よりも有利であろう。
【０００３】
［発明の概要］
本発明の目的は、核酸分子を共有結合的に接続する方法の提供である。本発明のさらなる目的は、核酸分子のクローニング法の提供である。本発明のこれおよび他の目的は、下記した実施形態の１つ以上により提供される。
【０００４】
本発明の１つの実施形態は、核酸挿入分子を、第一および第二の核酸フランキング分子に共有結合して、ライゲーションされた分子を形成する方法を提供する。該方法は、挿入分子およびフランキング分子を、その共有結合によってライゲーションされた分子を形成できる条件下でインキュベートすることを含み、ここで、挿入分子は、第一のフランキング分子と第二のフランキング分子の間に位置する。挿入分子の各末端は、５’−ヒドロキシル基を含む。第一および第二のフランキング分子の各々の一端のみが、共有結合したトポイソメラーゼポリペプチドを含む。
【０００５】
本発明の別の実施形態は、核酸挿入分子を、第一および第二の核酸フランキング分子に共有結合して、ライゲーションされた分子を形成する方法を提供する。該方法は、挿入分子（ここで、挿入分子の一端は５’−ヒドロキシル基を含み、他端は５’−リン酸基を含む）を、第一のフランキング分子（ここで、第一のフランキング分子の一端のみが、共有結合したトポイソメラーゼポリペプチドを含む）と共にインキュベートすることを含む。インキュベートは、その共有結合によって、ライゲーションされた核酸を形成できる条件下で実施し、挿入分子は、第一のフランキング分子に隣接して位置する。このライゲーションされた核酸を、ライゲーションされた核酸から５’−リン酸基を除去できる条件下で、ホスファターゼと共にインキュベートする。ライゲーションされた核酸を、第二のフランキング分子と共にインキュベートする。第二のフランキング分子の一端のみが、共有結合したトポイソメラーゼポリペプチドを含む。インキュベートは、共有結合によって、ライゲーションされた分子を形成できる条件下で実施し、挿入分子は、第一のフランキング分子と第二のフランキング分子の間に位置する。
【０００６】
本発明のさらに別の実施形態において、核酸挿入分子を、第一および第二核酸フランキング分子に共有結合して、ライゲーションされた分子を形成する方法を提供する。該方法は、挿入分子およびフランキング分子を、共有結合的接続によって、ライゲーションされた分子を形成できる条件下でインキュベートすることを含み、挿入分子は第一のフランキング分子と第二のフランキング分子の間に位置する。挿入分子の一端は５’−ヒドロキシル基を含み、他端は５’−リン酸基を含む。第一のフランキング分子の一端のみが、共有結合したトポイソメラーゼポリペプチドを含み、第二のフランキング分子の一端が、リガーゼ基質部位を含む。
【０００７】
第一および第二核酸フランキング分子はいずれも、一対の左ベクターアームおよび右ベクターアームを含むことができる。さらに、挿入断片に共有結合していないベクターアームの末端は、互いに、核酸リガーゼにより媒介されるライゲーション、相補的配列アニーリング、トポイソメラーゼにより媒介されるライゲーション、インビトロでの部位特異的組換え、インビボでの部位特異的組換え、およびインビボでの相同組換えからなる群から選択した方法により、共有結合的または非共有結合的に結合できる。
【０００８】
本発明のさらに別の実施形態において、分子クローニング法を提供する。該方法は、一端に５’−ヒドロキシル基を、他端に５’−リン酸基を含む核酸挿入分子、および、鎖状クローニングベクターをインキュベートすることを含む。鎖状クローニングベクターは、一端のみに、共有結合したトポイソメラーゼポリペプチドを、他端にライゲーション基質部位を含む。インキュベートは、共有結合的接続によってライゲーションされた環状ベクターが形成されるに十分な条件下で実施する。ライゲーションされた環状ベクターを宿主細胞に形質転換する。
【０００９】
本発明の別の実施形態は、分子クローニング法を提供する。該方法は、核酸挿入分子（ここで、挿入分子の各末端は５’−ヒドロキシル基を含む）を、第一および第二鎖状アーム（ここで、第一および第二鎖状アームの各々の一端のみが、共有結合したトポイソメラーゼを含み、他端はクローニング基質部位を含む）と共にインキュベートすることを含む。インキュベートは、その共有結合によって、ライゲーションされた挿入分子が形成されるに十分な条件下で実施し、ここでの挿入分子は、第一鎖状アームと第二鎖状アームの間に位置する。ライゲーションされた挿入分子を宿主細胞に形質転換する。
【００１０】
本発明のさらに別の実施形態は、分子クローニング法を提供する。核酸挿入分子（ここで、挿入分子の一端は５’−ヒドロキシル基を含み、他端は５’−リン酸基を含む）および第一鎖状アーム（ここで、第一鎖状アームの一端のみが、共有結合したトポイソメラーゼを含み、他端はクローニング基質部位を含む）を共にインキュベートする。インキュベートは、その共有結合によってライゲーションされた核酸を形成できる条件下で実施し、挿入分子は、第一鎖状アームに隣接して位置する。ライゲーションされた核酸を、ライゲーションされた核酸から５’−リン酸基を除去できる条件下で、ホスファターゼと共にインキュベートする。ライゲーションされた核酸は、第二鎖状ベクターアーム（第二鎖状ベクターアームの一端のみが、共有結合したトポイソメラーゼポリペプチドを含み、他端はクローニング基質部位を含む）と共にインキュベートされる。インキュベートは、共有結合によってライゲーションされた挿入分子を形成できる条件下で実施し、挿入分子は、第一鎖状ベクターアームと第二鎖状ベクターアームの間に位置する。ライゲーションされた挿入分子を宿主細胞に形質転換する。本発明のさらに別の実施形態において、核酸挿入分子（ここで、挿入分子の一端は、５’−ヒドロキシル基を含み、他端は５’−リン酸基を含む）、第一鎖状アーム（ここで、第一鎖状アームの一端のみが、共有結合したトポイソメラーゼポリペプチドを含み、他端はクローニング基質部位を含む）、第二鎖状アーム（ここで、第二鎖状アームの一端はリガーゼ基質部位を含み、他端はクローニング基質部位を含む）をインキュベートすることを含む、分子クローニング法を提供する。インキュベートは、その共有結合的接続によって、ライゲーションされた核酸分子を形成できる条件下で実施し、挿入分子は、第一鎖状アームと第二鎖状アームの間に位置する。ライゲーションされた挿入分子は宿主細胞に形質転換される。
【００１１】
クローニング基質部位は、ｃｏｓ部位、ＬＩＣ部位、およびｌｏｘＰ部位からなる群から選択できる。
【００１２】
クローニング基質がｌｏｘＰである場合、該方法は、ｌｏｘＰ部位を含む環状プラスミドとＣｒｅリコンビナーゼと共に、インビトロで、ライゲーションされた挿入分子をインキュベートすることをさらに含む。インキュベートは、部位特異的組換えによって、ライゲーションされた挿入分子を含む環状プラスミドを形成するに十分な条件下で実施する。ライゲーションされた挿入分子を含む環状プラスミドを宿主細胞に形質転換する。
【００１３】
クローニング基質部位がｌｏｘＰである場合、該方法はさらに、ライゲーションされた挿入分子を、ｌｏｘＰ部位を含む環状プラスミドを含む宿主細胞（該細胞はＣｒｅリコンビナーゼを発現している）に形質転換することを含み得る。形質転換は、部位特異的組換えによって細胞内にライゲーションされた挿入分子を含む環状プラスミドを形成するに十分な条件下で実施する。
【００１４】
クローニング基質部位が環状プラスミドベクターとの相同組換え部位である場合、形質転換ステップは、ライゲーションされた挿入分子を、環状プラスミドベクターを含む宿主細胞に形質転換することをさらに含む。環状プラスミドベクターは、ライゲーションされた挿入分子との相同組換え部位を含み、宿主細胞はｒｅｃＡ＋である。形質転換は、相同組換えによって、宿主細胞内にライゲーションされた挿入分子を含む環状プラスミドを形成するに十分な条件下で実施する。
【００１５】
第一鎖状アームは、一端のみに、共有結合したトポイソメラーゼを含む左λアームを含むことができる。第二鎖状アームは、一端のみに、共有結合したトポイソメラーゼを含む右λアームを含むことができる。
【００１６】
本明細書に使用したような「結合」または「結合している」なる語は、ある核酸の別の核酸への、或いは、核酸の一端の、核酸の別の末端への、共有結合および非共有結合的付着の両方を意味する。「共有結合的」結合は、リン酸結合を介する、核酸鎖の一端の、核酸鎖の別の末端への付着、或いは、一方または両方の鎖上でのリン酸結合を介する、二本鎖核酸の一端の、別の二本鎖末端への付着を意味する。「非共有結合的」結合は、一本鎖領域の互いに対するアニーリングを介する、核酸の一端の、別の末端への付着を意味し、すなわち、リン酸結合はこの実施形態においては全く生じない。
【００１７】
「ライゲーション」または「ライゲーションされた」は、１つ以上の核酸分子の２つの末端の共有結合を意味する。
【００１８】
「相補的アニーリング」は、１つ以上の核酸の相補領域のアニーリングまたは塩基対形成、従って、塩基対間の水素結合および他の非共有結合的相互作用を意味する。
【００１９】
「トポイソメラーゼ」は、核酸分子の少なくとも一端に共有結合的に結合でき、以下に記載したように、その鎖を別の鎖にライゲーションできるポリペプチドである。本発明に記載のトポイソメラーゼは、Ｉ型トポイソメラーゼを含む。
【００２０】
「に結合」は、核酸分子へのトポイソメラーゼポリペプチドの共有結合を意味する。
【００２１】
「核酸分子」は、特記しない限り、二本鎖核酸を意味する。
【００２２】
「一端のみ」は、核酸分子の一端におけるトポイソメラーゼポリペプチドの存在を意味し、ここでの核酸分子は２つの末端を含む。
【００２３】
「部位」なる語は、核酸を修飾する酵素、例えばリガーゼまたは制限酵素による修飾を受けやすい（すなわちその基質である）、連続した配列のヌクレオチド、例えば１〜１００塩基長、通常５〜２５塩基長、例えば８〜１６塩基長を示すものである。
【００２４】
本明細書に使用したような「クローニング基質部位」は、核酸配列の共有結合的または非共有結合的接続用または組換え用の核酸分子上に存在する部位である。クローニング基質部位の例は、ｃｏｓ部位、ＬＩＣ部位、部位特異的組換え部位、例えばλ付着エレメントまたはｌｏｘＰ部位、相同組換え部位、およびライゲーション基質部位を含む。
【００２５】
本明細書に使用したような「ライゲーション基質部位」は、ＤＮＡリガーゼなどのリガーゼ酵素の存在下で、別の核酸分子に共有結合できるようになる、本発明の核酸分子上に存在する部位である。
【００２６】
本明細書に使用したような「ベクターアーム」または「鎖状アーム」は、鎖状核酸分子であり、好ましくは、バクテリオファージまたはプラスミドゲノムの一部または断片である。
【００２７】
「指向的」クローニングは、方法におけるステップを選択することにより、別の核酸分子にクローニングする時、または２つの他の核酸分子の間にクローニングする時、所望の方向の特定の核酸分子を得ることができる、クローニング法を意味し、本明細書に使用したような「方向」は、特定のオープンリーディングフレームまたは特定の制御領域または既知配列に関して５’→３’を意味し得る。従って、例えば、挿入分子は、転写に関して５’−３’方向を有するオープンリーディングフレームを含み得、挿入分子は、ライゲーションされた（クローニング）分子が、５’から３’に、左ベクターアーム、５’挿入断片３’、右ベクターアームを含むように、左ベクターアームと右ベクターアームの間に指向的にクローニングし得る。「非指向的」クローニングは、挿入断片が、例えば、いずれかの方向の２つのアームの間に出現する、ライゲーションされた分子を生じるクローニング法を意味する。
【００２８】
［発明の詳細な説明］
挿入ポリヌクレオチド分子
挿入ポリヌクレオチド分子は、単離および精製二本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＲＮＡ、または二本鎖ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド核酸を含む。挿入分子は、全長分子でも全長分子の断片でもよい。さらに、挿入分子は、天然に存在し得る、すなわち自然に見られるものでも、組換えたものでもよい。
【００２９】
好ましくは、挿入ポリヌクレオチドは、タンパク質および脂質などの他の成分を含まないように単離されている。挿入ポリヌクレオチドは、細胞により作成し単離しても、例えば、自動合成器またはＰＣＲなどの増幅法を使用して実験室で合成してもよい。挿入ポリヌクレオチドをＰＣＲにより調製する場合、挿入断片は、３’−プライマーおよび５’−プライマーを含む一対のプライマーを使用して作成する。３’−プライマーおよび５’−プライマーの両方共、５’−ヒドロキシル基を含むことができ、両端に５’−ヒドロキシル基（５’−ＯＨ）を有する挿入断片を作成できる。別法として、プライマーの１つは、５’−ヒドロキシル基を含み得、１つは５’−リン酸基を含むことができ、一端に５’−ＯＨ基を、他端に５’−リン酸基（５’−Ｐ）を有する挿入断片を作成できる。所望により、３’−プライマーおよび５’−プライマーの両方が５’−リン酸基を含むことができ、よって両端上に５’−Ｐ基を有する挿入断片を作成できる。
【００３０】
挿入分子にフランキングする分子
挿入ポリヌクレオチド分子は、二本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＲＮＡ、および二本鎖ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド分子などの、数種類の分子に共有結合的に接続できる。好ましくは、挿入ポリヌクレオチド分子は、プラスミドまたはバクテリオファージの鎖状アームなどの、ベクター分子またはベクター分子群に共有結合的に接続している。挿入分子のライゲーションに適したベクターは、λ挿入ベクター、例えばλＺＡＰＲＩＩベクター、ＺＡＰエクスプレスＲベクター、λＺＡＰＲ−ＣＭＶベクター（ストラタジーン）、λｇｔ１０、およびλｇｔ１１を含むが、これ限定されない、バクテリオファージλなどのバクテリオファージを含む。λ置換ベクター、例えばλＦＩＸＲＩＩベクター、λＤＡＳＨＲＩＩベクター、およびλＥＭＢＬ３およびλＥＭＢＬ４（ストラタジーン）もベクターとして使用できる。
【００３１】
原核および真核鎖状プラスミドの両方をベクターとして使用できる。例えば、Ｍｅｉｎｈａｒｄｔら（１９９７）Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．４７：３２９〜３６；Ｆｕｋｕｈａｒａ（１９９５）ＦＥＭＳ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．１３１：１〜９；Ｈｉｎｎｅｂｕｓｃｈ＆Ｔｉｌｌｙ（１９９３）Ｍｏｌ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１０：９１７〜２２参照。例えば、大腸菌のプラスミドプロファージＮ１５は、適切な鎖状プラスミドベクターである。Ｒｙｂｃｈｉｎ＆Ｓｖａｒｃｈｅｖｓｋｙ（１９９９）Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３３：８９５〜９０３参照。
【００３２】
ベクター核酸ポリヌクレオチド、例えばバクテリオファージおよびプラスミドは、当分野で公知の方法に従って、これらのエレメントを有する細胞から単離および精製できる。例えば、分子クローニング：実験マニュアル（Ｓａｍｂｒｏｏｋら編、コールドスプリングハーバー研究所プレス、コールドスプリングハーバー、１９８９）およびＡｕｓｕｂｅｌ（分子生物学の現在のプロトコール）（Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、ニューヨーク、１９８７））参照。さらに、多くのバクテリオファージおよびプラスミドベクターが市販で入手できる。バクテリオファージまたはプラスミド核酸は、必要であれば、消化したバクテリオファージまたはプラスミド核酸が挿入分子と適合性であるような適切な制限酵素を用いた切断により調製できる。
【００３３】
好ましくは、挿入分子は、挿入分子が、右λ鎖状ベクターアームと左λ鎖状ベクターアームの間に位置するように、右および左λ鎖状ベクターアームに共有結合的に接続している。λ挿入ベクターでは、左ベクターアームは、挿入部位の左に存在するλ核酸を含み得、右ベクターアームは、挿入断片の右に存在するλ核酸を含み得る。λ置換ベクターでは、左λアームは、挿入核酸により置換したい核酸の左に存在するλ核酸を含み、右λアームは、挿入核酸により置換したい核酸の右に存在するλ核酸を含む。λベクターは、核酸配列が異なり得るが、しかし、左アームは、典型的には、頭および尾遺伝子Ａ−Ｊを含み得、一方、右アームは、典型的には、λゲノムのｐＲからｃｏｓＲ部位を含み得る。
【００３４】
好ましくは、挿入断片が共有結合的に接続する、ベクターまたはフランキング分子は、鎖状分子の一端のみに共有結合的に連結したトポイソメラーゼを含む鎖状分子である。ＤＮＡまたはＲＮＡ分子の一端に結合した１つのトポイソメラーゼを有する、二本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＲＮＡ、または二本鎖ＤＮＡ／ＲＮＡ分子は、一価分子である。ＤＮＡトポイソメラーゼは、二本鎖ＤＮＡ分子の連結数（ｌｉｎｋｉｎｇ ｎｕｍｂｅｒ）の変換を触媒する。連結数は、１つのＤＮＡ鎖が、空間中で第二ＤＮＡ鎖を交差した回数である。１型トポイソメラーゼは、核酸の一方の鎖の一過的な破壊を引き起こすことにより作用する。１型トポイソメラーゼは、最初に、核酸に結合し、核酸の一方の鎖に切れ目を入れる。安定な複合体が形成され、ここでは切れ目を入れた鎖の遊離３’−リン酸末端は、酵素のチロシン残基に共有結合している。第二鎖を、第一鎖のギャップを通して引っ張り、その後、ギャップを酵素により封じる。ギャップを、最初に切れ目を入れた同じ結合で封をし得るか、または、複合体を、５’−ヒドロキシ末端を有する挿入分子などの異種核酸と合わせることができる。複合体を異種核酸と合わせる場合、組換え分子が形成される。
【００３５】
１型トポイソメラーゼは、大腸菌トポイソメラーゼＩ（Ｋｅｃｋら（１９９９）Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｔ．Ｂｉｏｌ．６：９００）、大腸菌トポイソメラーゼＩＩＩ（Ｍｏｎｄｒａｇｏｎら（１９９９）Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ　Ｆｏｌｄ．Ｄｅｓ．７：１３７３）、サッカロマイセス・セレヴィシエトポイソメラーゼＩＩＩ（Ｋｉｍら（１９９２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：１７１７８）、ヒトトポイソメラーゼＩＩＩ（Ｈａｎａｉら（１９９６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９３：３６５３）、葉緑体由来の１型トポイソメラーゼ（Ｍｕｋｈｅｒｊｅｅら（１９９４）２６９：３７９３；Ｆｕｋａｔａら（１９９１）Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（東京）１０９：１２７）、好熱性リバースジャイレース（Ｎａｄａｌら（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：５２５５；Ｓｌｅｓａｒｅｖら（１９９１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：１２３２１；Ｂｏｕｔｈｉｅｒ　ｄｅ　ｌａ　Ｔｏｕｒら（１９９１）Ｊ．Ｂａｃｔ．１７３：３９２１）、好熱性Ｄ．ａｍｙｌｏｌｙｔｉｃｕｓトポイソメラーゼＩＩＩ（Ｓｌｅｓａｒｅｖら（１９９１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：１２３２１）、およびワクシニアＤＮＡトポイソメラーゼＩ（Ｓｈｕｍａｎら（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８４：７４７８）を含むがこれに限定されない。部位特異的Ｉ型ＤＮＡトポイソメラーゼは本発明で特に有用である。部位特異的Ｉ型ＤＮＡトポイソメラーゼは、ワクシニアトポイソメラーゼおよびポックスウイルストポイソメラーゼを含む。
【００３６】
トポイソメラーゼ酵素は、ベクターまたはフランキング分子に、例えば、Ｈｅｙｍａｎら（Ｇｅｎｏｍｅ　Ｒｅｓ．（１９９９）９：３８３）の方法により共有結合的に連結できる。簡潔には、ワクシニアＤＮＡトポイソメラーゼは、共通のペントピリミジンエレメント：５’−Ｃ／ＴＣＣＴＴ−３’（配列番号１）において核酸の一方の鎖のホスホジエステル骨格を切断する。このエレメントは、ベクターまたはフランキング分子の末端に添加できる。その後、ワクシニアトポイソメラーゼを、ベクターまたはフランキング分子と共にインキュベートし、よって、トポイソメラーゼは、Ｃ／ＴＣＣＴＴ配列の下線Ｔに共有結合するようになる。所望により、エキソヌクレアーゼＩＩＩ処理などのヌクレアーゼ処理を使用して、エレメントから１つの鎖の末端を除去でき、よって、トポイソメラーゼが分子に結合した平滑末端挿入断片を形成する。
【００３７】
所望により、挿入断片を共有結合的に接続したい分子は、鎖状分子の第一の末端に、ライゲーション基質部位を含む、鎖状分子である。ライゲーション基質部位は、リガーゼ酵素により媒介される、核酸ライゲーション用の部位を含む。ライゲーション基質部位は、リガーゼ酵素の存在下で、別の核酸分子に共有結合的に接続できる平滑末端または突出末端を有する、任意の二本鎖核酸を含むことができる。好ましくは、ライゲーション基質部位は、５’−リン酸基を含み、挿入分子の一端に相補的である。ライゲーション基質部位は、例えば、二本鎖核酸分子を、平滑末端、５’−突出末端、または３’−突出末端を生じる制限酵素で切断し、核酸分子を精製することにより、作成できる。ライゲーション基質部位を含む鎖状分子と挿入分子の間のライゲーションは、バクテリオファージＴ４ＤＮＡリガーゼまたはＰｆｕＤＮＡリガーゼ（ストラタジーン）などのリガーゼ酵素の存在下で起こる。好ましくは、挿入断片が共有結合的に接続する、ベクターまたはフランキング分子は、分子の一端のみに共有結合的に連結したトポイソメラーゼ、または、鎖状分子の一端におけるライゲーション基質部位を含む、鎖状分子である。鎖状分子の第二末端は、好ましくは、ｃｏｓ部位、ＬＩＣ部位、部位特異的組換え部位（例えばｌｏｘＰ部位またはλ付着エレメント）、相同組換え部位またはライゲーション基質部位などのクローニング基質部位を含む。
【００３８】
バクテリオファージλゲノムは、ゲノムの末端にｃｏｓ部位を有する。ＬＡＭＢＤＡ　ＩＩ（Ｒｏｇｅｒ　Ｗ．Ｈｅｎｄｒｉｘ編、コールドスプリングハーバー研究所プレス）１９８３；Ｈｉｇｇｉｎｓら（１９９５）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２５２：３１；Ｈｉｇｇｉｎｓら（１９９４）ＥＭＢＯ　Ｊ．１３：６１５２；Ｃｕｅら（１９９３）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２３４：５９４；Ｃｕｅら（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　９０：９２９０参照。切断は、左ｃｏｓ部位（標準的なλ地図で定義したような）で起こり、これにより自由な末端が生じ、これをキャプシドに挿入する。核酸の挿入は、右ｃｏｓ部位に遭遇するまで続ける。切断は、右ｃｏｓ部位で起こり、第二末端を生じる。２つのｃｏｓ部位の間に含まれる任意の核酸分子をパッケージングできる。ｃｏｓ部位、ｃｏｓ部位の断片、ｃｏｓ部位の変異体、またはｃｏｓ部位の変種を含む核酸分子は、バクテリオファージλＤＮＡの調製物から単離しても、実験室で合成してもよい。ｃｏｓ部位を含む核酸分子は、挿入断片を共有結合的に接続したい分子の末端にライゲーションできる。別法として、ｃｏｓ部位は、挿入断片を共有結合的に接続したい分子の末端に、ＰＣＲなどの標準的な分子生物学クローニング技術を使用して付加できる。本発明の方法では、末端ｃｏｓ部位を含むベクターアームの遠位末端（すなわち、挿入分子に共有結合的に接続していないベクターアームの末端）は、容易に、その明確な配列のために、大腸菌宿主細胞中で互いにアニーリングできる。ｃｏｓ部位は、インビトロで室温で識別できるほどアニーリングしない。
【００３９】
ライゲーション独立的クローニング（ＬＩＣ）部位は任意のサイズであり得るが、好ましくは１２から１３ヌクレオチドまたはそれ以上である。１２〜１３ヌクレオチドより長い、例えば、２４塩基以下、または４８塩基以下またはそれ以上の長さの部位が、より効率的に作動し得る。Ａｓｌａｎｉｄｉｓおよびｄｅ　Ｊｏｎｇ（１９９０）Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．１８：６０６９参照。１２〜１３ヌクレオチド末端は、任意の核酸配列を含み得るが、しかし、好ましくは、１２〜１３ヌクレオチド末端の３’鎖のヌクレオチドの１つがアデノシンであるか、全くアデノシンではない。ＬＩＣ分子を含む核酸分子は、挿入断片を共有結合的に接続する、ベクターまたはフランキング分子の末端にライゲーションできる。別法として、ＬＩＣ部位は、挿入断片を共有結合的に接続する、ベクターまたはフランキング分子の末端に、ＰＣＲなどの標準的な分子生物学クローニング技術を使用して付加できる。
【００４０】
鎖状分子の第二末端がＬＩＣ部位を含む場合、ライゲーションされた挿入断片／ベクター分子の各末端にＬＩＣ末端を含む、ライゲーションされた挿入断片／ベクター分子が形成される。その後、挿入断片は、すぐに使用できるＬＩＣベクターに接続できる。Ａｓｌａｎｉｄｉｓら（１９９４）ＰＣＲ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ａｐｐｌ．４：１７２；Ａｓｌａｎｉｄｉｓおよびｄｅ　Ｊｏｎｇ（１９９０）Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．１８：６０６９参照。簡潔には、ライゲーションされた挿入断片／ベクター分子は、ｄＡＴＰの存在下で、例えばＰｆｕＤＮＡポリメラーゼでの処理にかける。ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＣＴＰの非存在下で、ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼの３’→５’エキソヌクレアーゼ活性により、ライゲーションされた挿入断片／ベクター分子の３’末端から１２から１３個の核酸が除去される。この活性は、最初のアデニンに遭遇するまで継続する。これにより、すぐに使用できるＬＩＣベクターの一本鎖尾に相補的な５’伸張一本鎖尾を有する、ライゲーションされた挿入断片／ベクター分子が生じる。ライゲーションされた挿入断片／ベクター分子は、さらなる酵素を処理を行なうことなく、すぐに使用できるＬＩＣベクターにアニーリングする。
【００４１】
鎖状分子の第二末端はさらに、相同組換え部位または部位特異的組換え部位を含むことができる。相同組換えは、核酸の相同配列間で生じる組換え事象である。相同組換えに関与する酵素は、基質として任意の対の相同的配列を使用できるが、いくつかの種類の核酸配列が、他の配列よりも好ましくあり得る。相同組換え部位は、環状プラスミドなどのクローニングベクターの核酸配列に相同的である核酸配列を含む。該部位を、相同組換えによりクローニングベクターに挿入（または組込み）でき、これにより、核酸配列は挿入または置換するか、または、核酸配列は共に欠失する。
【００４２】
相同組換えプラスミドクローニングベクターを作成するために、目的のライゲーションされた挿入断片／ベクター上に存在する部位に実質的に相同である、相同組換え核酸部位を含む、プラスミドクローニングベクターを調製する。実質的に相同な核酸配列は、ライゲーションされた挿入断片／ベクター配列とプラスミドクローニングベクターの間で十分な相同組換えを提供する、十分な核酸配列相同性を共有する、核酸配列である。十分な核酸配列相同性は、ライゲーションされたベクター／挿入断片の相同組換えおよび組込みが生じた、プラスミドクローニングベクターの検出を可能とする頻度で、相同組換えを提供する量である。実質的に相同な核酸配列は、核酸配列中に、好ましくは、約６０％から１００％の核酸配列相同性、より好ましくは約７５％から１００％の相同性を有する領域を共有する。相同組換え部位は、２つ以上のコピーで、プラスミドクローニングベクターに存在し得る。プラスミドクローニングベクター中の相同組換え部位は、ライゲーションされた挿入断片／ベクター分子を用いた相同組換えを行なうに十分な長さである。典型的には、各相同組換え部位は、少なくとも３０、７５、１００、１５０、２５０、５００または１０００塩基対である。ライゲーションされた挿入断片／ベクター配列は、これらの実質的に相同な組換え部位を、５’および３’末端の両方に含む。ライゲーションされた挿入断片／ベクター配列を、プラスミドクローニングベクターを含む大腸菌などの宿主細胞に形質転換する。好ましくは、宿主細胞はＲｅｃＡ＋である。ＲｅｃＡは、大腸菌のｒｅｃＡ遺伝子座の産物であり、組換えに関与するタンパク質である。
【００４３】
上記の相同組換えに加えて、酵素の支持する部位特異的組込み系が当分野で公知であり、クローニングベクター分子中の予め決定した位置に、ライゲーションされた核酸挿入断片／ベクター分子を組み込むのに適用できる。部位特異的組換えは、特定の対または配列の間の組換え事象である。組換え事象は、組換え事象に必要な短い相同配列を含む、特異的な核酸配列を含む。組換え事象に関与する酵素は、この特定の対の標的配列のみに作用する。かかる酵素の支持する組込み系の例は、Ｃｒｅリコンビナーゼ／ｌｏｘＰ標的系を含む（例えば、ＢａｕｂｏｎｉｓおよびＳａｕｓｅｒ（１９９３）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．２１：２０２５；およびＦｕｋｕｓｈｉｇｅおよびＳａｕｅｒ、（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８９：７９０５に記載）。ｌｏｘＰ部位（クロスオーバーの遺伝子座）は、８塩基対の非対称スペーサー領域だけ離れた、２つの１３塩基対逆方向反復配列を含む。
【化１】
2004503207.tif 000002
【００４４】
本発明のｌｏｘＰ部位は、部位特異的組換えを生じるように機能する、この配列の変種および変異体を含む。Ｃｒｅは、ｌｏｘＰ部位間の分子内および分子間部位特異的組換えを媒介する、バクテリオファージＰ１由来の３８ｋＤａリコンビナーゼタンパク質である。Ｓａｕｅｒ（１９９３）Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ．２２５：８９０。ｌｏｘＰ部位は、非対称ヌクレオチド配列であり、同じＤＮＡ分子上の２つのｌｏｘ部位は、互いに対して、同じまたは逆の方向を有し得る。米国特許第４，９５９，３１７号参照。２つのｌｏｘＰ部位が、核酸分子上で同じ方向で存在する場合、ｌｏｘＰ部位間の組換えにより、２つのｌｏｘＰ部位の間に位置する核酸セグメントは欠失し、生じた最初の核酸分子の末端間が接続する。欠失核酸分子は、環状の核酸分子を形成する。最初の核酸分子および環状核酸分子は、各々、単一のｌｏｘＰ部位を含む。２つのｌｏｘＰ部位が、同じ核酸分子上で逆の方向で存在する場合、組換えにより、２つのｌｏｘＰ部位の間に位置する核酸セグメントのヌクレオチド配列は反転する。さらに、２つのｌｏｘＰ部位が２つの核酸セグメントの各々に存在する場合、ｌｏｘＰ部位に近接する核酸セグメントの相互交換が生じ得る。
【００４５】
共有結合的に接続する方法
各々の末端に５’−ＯＨ基を、または一端に５’−ＯＨを他端に５’−リン酸基を含む、挿入ポリヌクレオチド分子を、非指向的または指向的共有結合的接続が行なわれるように、フランキングポリヌクレオチド分子に共有結合的に接続できる。挿入ポリヌクレオチド分子が各末端に５’−ＯＨ基を有する場合、フランキングポリヌクレオチド分子への、挿入の非指向的共有結合的接続が生じる。例えば、各末端に５’−ＯＨ基を有する挿入ポリヌクレオチド（Ｉ）を、各々一端のみにトポイソメラーゼポリペプチドが共有結合的に接続した、例えば左ベクターアーム（ＬＶＡ）および右ベクターアーム（ＲＶＡ）などのフランキング分子に共有結合的に接続している場合、結果は、非指向的な分子の共有結合的接続である。ＬＶＡ、ＲＶＡおよび挿入分子を共に、そのトポイソメラーゼにより媒介される共有結合的接続によって、共有結合的に接続した核酸分子が形成されるに十分な条件下でインキュベートし、ここでの挿入分子は、ＬＶＡとＲＶＡの間に位置する。４つの異なる共有結合的に接続した産物（ライゲーションされた挿入断片／ベクター分子）が生じる。ＬＶＡ−Ｉ−ＬＶＡ、ＲＶＡ−Ｉ−ＲＶＡ、ＬＶＡ−Ｉ−ＲＶＡ、およびＲＶＡ−Ｉ−ＬＶＡ。ＬＶＡ−Ｉ−ＲＶＡおよびＲＶＡ−Ｉ−ＬＶＡ産物のみが、生存可能な複製コンピテント実体である。挿入ポリヌクレオチドが一端に５’−ＯＨ基を有し、他端に５’−リン酸基を有する場合、フランキングポリヌクレオチド分子への挿入の指向的共有結合的接続が生じ得る。例えば、挿入ポリヌクレオチドを、各々一端のみに、共有結合したトポイソメラーゼを含む、ＬＶＡおよびＲＶＡなどのフランキング分子に共有結合的に接続する場合、分子の指向的共有結合的接続が生じ得る。第一ベクターアーム、例えばＬＶＡは、トポイソメラーゼにより媒介される共有結合的接続によってライゲーションされた核酸分子を形成するのに十分な条件下で、ＬＶＡおよび挿入分子を共にインキュベートすることにより、５’−ＯＨ末端で挿入分子に共有結合的に接続し、ここでの挿入分子は、ＬＶＡに隣接して位置し、ＬＶＡ−Ｉ−リン酸を作成する。挿入断片の５’−リン酸末端は、ＬＶＡまたはＲＶＡにライゲーションできない。なぜなら、ＬＶＡまたはＲＶＡは３’−リン酸を有し、これは、トポイソメラーゼポリペプチドが、ＬＶＡおよびＲＶＡに接続する部位であるからである。ＬＶＡ−Ｉ−５’−リン酸を、ライゲーションされた核酸から５’−リン酸基を除去できる条件下でホスファターゼで処理すると、ＬＶＡ−Ｉ−５’−ＯＨ分子が生じる。その後、ＬＶＡ−Ｉ−５’−ＯＨ分子を、トポイソメラーゼの共有結合的接続によってライゲーションされた分子を形成できる条件下で、ＬＶＡ−Ｉ−５’−ＯＨ分子をＲＶＡと共にインキュベートすることにより、ＲＶＡに共有結合的に接続して、ＬＶＡ−Ｉ−ＲＶＡを形成し、ここでの挿入分子はＲＶＡとＬＶＡの間に位置する（ライゲーションされた挿入断片／ベクター分子）。
【００４６】
別法として、一端に５’−ＯＨ基および他端に５’−リン酸基を含む挿入ポリヌクレオチドを、指向的に、一端のみにトポイソメラーゼポリヌクレオチドを含むフランキング核酸分子に、および、一端にライゲーション基質部位を含む第二のフランキング分子に共有結合的に接続できる。例えば、挿入分子は、トポイソメラーゼポリペプチドを一端のみに含む、ＬＶＡなどのフランキング核酸分子に、および、例えば、ライゲーション基質末端を一端に含むＲＶＡに共有結合的に接続できる。挿入ＬＶＡ、およびＲＶＡは、ライゲーションされた核酸を形成するのに十分な条件下で、トポイソメラーゼ媒介接続およびリガーゼ媒介接続により共有結合的に接続し、ここでの挿入分子はＬＶＡとＲＶＡの間に位置し、ＬＶＡ−Ｉ−ＲＶＡ（ライゲーションされた挿入断片／ベクター分子）を形成する。この反応は１ステップで起こり得る。
【００４７】
上記のライゲーションされた挿入断片／ベクター分子を作成した後、２つのベクターアームを、互いに、共有結合的に付着したトポイソメラーゼポリペプチドまたはライゲーション基質部位に遠位な末端で（すなわちその自由な末端で）、環状分子が形成されるような多くの方法により、非共有結合的または共有結合的に接続できる。例えば、ライゲーションされた挿入断片／ベクター分子の末端は、末端が、リガーゼ媒介ライゲーションまたは相補的配列アニーリングにより接続できるように、リガーゼ基質部位または相補的核酸配列を含むことができる。さらに、ライゲーションされた挿入断片／ベクター分子の末端が５’−ＯＨ基を含む場合、ポリヌクレオチドの両端にトポイソメラーゼポリペプチドを含むポリヌクレオチドを使用して、末端を、トポイソメラーゼ媒介ライゲーションにより接続できる。例えば、米国特許第５，７６６，８９１号参照。さらに、ライゲーションされた挿入断片／ベクター分子の末端がインビトロまたはインビボでの部位特異的組換え部位またはインビボでの相同組換え部位を含む場合、ライゲーションした挿入断片／ベクター分子は、同じ組換え部位を含む環状プラスミドに組換えできる。
【００４８】
指向的および非指向的な核酸分子の共有結合的接続法は、例えば、末端標識、リガンドタグ、および分子クローニングに有用である。
【００４９】
分子クローニング法
各末端に５’−ＯＨ基を、または、一端に５’−ＯＨを他端に５’−リン酸基を含む、挿入ポリヌクレオチド分子を、非指向的または指向的クローニングが行なわれるように、ベクター分子にクローニングできる。
【００５０】
非指向的クローニングは、分子の両端に５’−ＯＨ基を含むポリヌクレオチド挿入分子を核酸ベクターにクローニングすることにより達成できる。例えば、各末端に５’−ＯＨ基を有する挿入ポリヌクレオチド（Ｉ）を、左ベクターアーム（ＬＶＡ）および右ベクターアーム（ＲＶＡ）などのベクターにクローニングでき、ここでの各ベクターアームは、ベクターアームの一端のみに共有結合的に接続したトポイソメラーゼポリペプチドを有する。結果は、分子の非指向的な共有結合的接続である。好ましくは、ＬＶＡおよびＲＶＡ分子は、分子の他端に、ｃｏｓ部位、ＬＩＣ部位、ｌｏｘＰ部位、相同組換え部位、部位特異的組換え部位、または、リガーゼ基質部位などのクローニング基質部位を有する。ＬＶＡ、ＲＶＡおよび挿入分子を、分子のトポイソメラーゼ媒介共有結合的接続によって、ライゲーションされた核酸が形成されるに十分な条件下で共にインキュベートし、ここでの挿入分子はＬＶＡとＲＶＡの間に位置する。４つの異なる共有結合的に接続した産物、ＬＶＡ−Ｉ−ＬＶＡ、ＲＶＡ−Ｉ−ＲＶＡ、ＬＶＡ−Ｉ−ＲＶＡ、およびＲＶＡ−Ｉ−ＬＶＡ（ライゲーションされた挿入断片／ベクター分子）が生じる。ＬＶＡ−Ｉ−ＲＶＡおよびＲＶＡ−Ｉ−ＬＶＡ産物のみが、生存可能な複製コンピテント実体である。
【００５１】
指向的クローニングは、分子の一端に５’−ＯＨ基を、他端に５’−リン酸基を含むポリヌクレオチド挿入分子を、核酸ベクターにクローニングすることにより達成できる。例えば、一端に５’ＯＨ基を有し、他端に５’−リン酸基を有する挿入ポリヌクレオチド（Ｉ）を、鎖状クローニングベクターにクローニングでき、ここでの鎖状クローニングベクターは、一端に共有結合的に接続したトポイソメラーゼポリペプチドおよび他端にライゲーション基質部位を有する。挿入ポリヌクレオチド、鎖状クローニングベクター、およびリガーゼを、共に、その共有結合的接続によって、ライゲーションされた環状ベクター（ライゲーションされた挿入断片／ベクター分子）が形成されるに十分な条件下でインキュベートする。その後、環状ベクターを宿主細胞に形質転換できる。
【００５２】
指向的クローニングはまた、一端に５’−ＯＨ基を、他端に５’−リン酸基を有する挿入ポリヌクレオチドを、ベクターにクローニングすることにより達成でき、ここでのベクターは、例えば、トポイソメラーゼポリペプチドを一端に、クローニング基質部位を他端に含む、２つのベクターアーム分子を含む。例えば、第一ベクターアームのＬＶＡを、ＬＶＡおよび挿入分子を共に、トポイソメラーゼ媒介共有結合的接続によって、ライゲーションされた核酸分子が形成されるに十分な条件下でインキュベートすることにより、５’−ＯＨ末端で挿入分子に共有結合的に接続し、ここでの挿入分子はＬＶＡに隣接して位置し、ＬＶＡ−Ｉ−リン酸を作成する。挿入断片の５’−リン酸末端は、ＬＶＡまたはＲＶＡにライゲーションできない。なぜなら、トポイソメラーゼポリペプチドは、５’−リン酸でＬＶＡおよびＲＶＡに接続しているからである。ＬＶＡ−Ｉ−５’−リン酸を、ライゲーションされた核酸から５’−リン酸基を除去できる条件下で、ホスファターゼで処理すると、ＬＶＡ−Ｉ−５’−ＯＨ分子が得られる。その後、ＬＶＡ−Ｉ−５’−ＯＨ分子を、ＬＶＡ−Ｉ−５’−ＯＨ分子をＲＶＡと共に、トポイソメラーゼ共有結合的接続によってライゲーションされた分子を形成できる条件下でインキュベートすることにより、ＲＶＡに共有結合的に接続して、ＬＶＡ−Ｉ−ＲＶＡを形成し、ここで、挿入分子はＲＶＡとＬＶＡの間に位置する（ライゲーションされた挿入断片／ベクター分子）。好ましくは、クローニング基質部位は、ｃｏｓ部位、ＬＩＣ部位、ｌｏｘＰ部位、相同組換え部位、部位特異的組換え部位、またはライゲーション基質部位である。
【００５３】
別法として、指向的クローニングは、一端に５’−ＯＨ基を、他端に５’−リン酸基を含む挿入ポリヌクレオチド、および、２つのベクター分子を用いて達成できる。１つのベクター分子は、トポイソメラーゼポリヌクレオチドを一端のみに、クローニング基質部位を他端に含む。他のベクター分子は、ライゲーション基質部位を一端に、クローニング基質部位を他端に含む。挿入断片、トポイソメラーゼポリペプチドを一端に、クローニング基質部位を他端に含むＬＶＡなどの第一ベクター分子、並びに、ライゲーション基質部位を一端に、クローニング基質部位を他端に含むＲＶＡなどの第二ベクター分子を、ライゲーションされた核酸を形成するに十分な条件下で、トポイソメラーゼ媒介接続およびリガーゼ媒介接続により共有結合的に接続し、ここでの挿入分子は、ＬＶＡとＲＶＡベクター分子の間に位置する（ライゲーションされた挿入断片／ベクター分子）。好ましくは、クローニング基質部位はｃｏｓ部位、ＬＩＣ部位、ｌｏｘＰ部位、相同組換え部位、部位特異的組換え部位、またはライゲーション基質部位を含む。
【００５４】
ライゲーションされた挿入断片／ベクター分子がｃｏｓ部位を各末端に含む場合、鎖状分子を直接宿主細胞に形質転換できる。ライゲーションされた挿入断片／ベクター分子がＬＩＣ末端を各末端に含む場合、ＬＩＣ末端を、ＬＩＣ適合性末端をもつ環状プラスミドベクターにアニーリングできる。環状分子を宿主細胞に形質転換できる。ライゲーションされた挿入断片／ベクター分子が両端にｌｏｘＰ部位を含む場合、ライゲーションされた挿入断片／ベクター分子を、Ｃｒｅリコンビナーゼの存在下においてインビトロで環状プラスミドに組換えできる。その後、組換え環状プラスミドを、宿主細胞に形質転換できる。別法として、ｌｏｘＰ部位を分子の両端に有する、ライゲーションされた挿入断片／ベクター分子を、部位特異的組換えに適したプラスミドを有する大腸菌などの宿主細胞に直接形質転換できる。宿主細胞はｒｅｃＡ＋でもｒｅｃＡ−でもよく、好ましくはｒｅｃＡ−である。共有結合的に接続した挿入断片／ベクター分子が各末端に相同組換え部位を含む場合、共有結合的に接続した挿入断片／ベクター分子を、相同組換えに適したプラスミドを有する適切な宿主細胞に直接形質転換できる。
【００５５】
共有結合的に接続した挿入断片／ベクターを、原核または真核細胞に形質転換できる。好ましくは、共有結合的に接続した挿入断片／ベクターを、大腸菌などの細菌細胞などの原核宿主細胞に形質転換する。ライゲーションされた挿入断片／ベクター分子の宿主細胞への形質転換は、当分野で公知の任意の方法により実施できる。宿主細胞の形質転換法は、ＳａｍｂｒｏｏｋらおよびＡｕｓｕｂｅｌに見出し得、トランスフェクション、化学的形質転換、電気穿孔法、およびリポフェクションを含むがこれに限定されない。バクテリオファージλベクターを本発明に従って使用する場合、ライゲーションされた挿入断片／λベクターをインビトロでパッケージングでき、その後、ＸＬ１−Ｂｌｕｅ大腸菌などの宿主細胞にトランスフェクトできる。Ｓａｍｂｒｏｏｋら参照。
【００５６】
以下は、単に例示のために提供し、上記の広義に記載した本発明の範囲を限定するものではない。この開示に引用した全ての文献を参考として本明細書に取込む。
【００５７】
［実施例］
実施例１
一価トポイソメラーゼ結合ＤＮＡを使用した、分子間ライゲーションおよび分子クローニング
挿入核酸分子、例えばＰＣＲ産物は、ＰＣＲにより、５’−プライマーおよび３’−プライマーからなるプライマーセットを使用して作成できる。２つのベクター核酸分子、例えば、左ベクターアームおよび右ベクターアームは、トポイソメラーゼ酵素（ＴＯＰＯ）が、核酸分子の一端のみに共有結合して、一価トポイソメラーゼベクター分子を形成するように調製する。挿入分子を作成するためのＰＣＲプライマーを、各５’−末端にヒドロキシル基またはリン酸基を有するように合成できる。ヒドロキシル基は、トポイソメラーゼ結合ＤＮＡへのライゲーションを可能とするが、リン酸基はかかるライゲーションを妨げる。
【００５８】
ＰＣＲ挿入分子の、例えば２つのベクターアームへの非指向的ライゲーションでは、両方のＰＣＲプライマーが５’−ヒドロキシル基を有する。ＰＣＲによる挿入断片は、ベクターアームとライゲーションされ、４つの異なるライゲーション産物を形成できる。１）左ベクターアーム（ＬＶＡ）−挿入分子（１）−左ベクターアーム（ＬＶＡ）；２）右ベクターアーム（ＲＶＡ）−挿入分子（Ｉ）−右ベクターアーム（ＲＶＡ）；３）ＬＶＡ−Ｉ−ＲＶＡ；および４）ＲＶＡ−Ｉ−ＬＶＡ。ＬＶＡ−Ｉ−ＲＶＡおよびＲＶＡ−Ｉ−ＬＶＡのみが、生存可能な複製コンピテント実体を生じる（図１）。
【００５９】
ＰＣＲ挿入分子の、例えば左および右ベクターアームへの指向的ライゲーションでは、一方のＰＣＲプライマーは５’−ヒドロキシル基を有し、他方のＰＣＲプライマーは５’−リン酸基を有する。ＰＣＲにより作成した挿入分子を作成し、最初に、１つのベクターアーム、例えばＬＶＡにライゲーションして、ＬＶＡ−Ｉ−５’−リン酸分子を作成する。この分子の５’−リン酸末端は、ＬＶＡまたはＲＶＡにライゲーションできない。なぜなら、ＴＯＰＯが結合するベクターアーム部位は３’−リン酸を含むからである。その後、この分子を脱リン酸化して、ＬＶＡ−Ｉ−５’−ＯＨを作成する。その後、ＬＶＡ−Ｉ−５’−ＯＨ分子を他のベクターアーム（ＲＶＡ）にライゲーションして、ＬＶＡ−Ｉ−ＲＶＡ（図２）を作成する。一端、上記のライゲーションされた挿入断片／ベクター分子を作成すると、２つのベクターアームを、互いに、共有結合的に付着したトポイソメラーゼポリペプチドに遠位な末端で（すなわちその自由な末端で）、環状分子が形成されるような多くの方法により、非共有結合的または共有結合的に接続できる。かかる方法は、例えば、リガーゼ酵素媒介ライゲーション、相補的配列アニーリング、トポイソメラーゼ媒介ライゲーション、インビトロまたはインビボでの部位特異的組換え、または、インビボでの相同組換えを含む。
【００６０】
実施例２
トポイソメラーゼおよびリガーゼ酵素を使用した指向的分子クローニング
核酸挿入は、例えば、一対のＰＣＲプライマーを使用して作成し、ここでの一方のプライマー（Ｐ１）は、その５’−末端にヒドロキシル基を有し（ＯＨ−Ｐ１）、他方のプライマー（Ｐ２）は、その５’−末端にリン酸基を有する（Ｐ２−Ｐ）（図３参照）。挿入分子はＰＣＲにより作成する。鎖状ベクター核酸は、一端に結合したＴＯＰＯを有するように調製し（一価ＴＯＰＯ結合核酸分子）、鎖状ベクター核酸の他端は、リガーゼ酵素により媒介される、ライゲーション（３’−ＯＨ）用の基質を含む。１回のインキュベートで、ＰＣＲのよる挿入断片を、ＴＯＰＯ媒介ライゲーションにより、鎖状ベクター核酸のＴＯＰＯ末端に、およびリガーゼ酵素媒介反応を介して鎖状ベクター核酸の他端にライゲーションできる。ライゲーション産物は、適切な宿主細胞に形質転換する。トポイソメラーゼおよびＤＮＡリガーゼの両方により媒介されるクローニング事象は非指向的である。ＰＣＲプライマーの５’末端におけるヒドロキシルまたはリン酸基により、挿入断片の指向性が決まる。
【００６１】
トポイソメラーゼおよびリガーゼ媒介ライゲーションを含む第二のアプローチは、例えばＰＣＲによる挿入断片の作成を含む。ＰＣＲを使用して挿入断片を作成する場合、一対のＰＣＲプライマー（ここで、一方は、その５’末端にヒドロキシル基（ＨＯ−Ｐ１）を有し、他方は、その５’末端にリン酸基を有する（Ｐ２−Ｐ））（図４参照）。２つのベクター核酸アームなどのベクターは、１つのベクターアームが一端に結合したＴＯＰＯ（一価ＴＯＰＯ結合ＤＮＡ分子）を有し、他のベクターアームが一端にライゲーション用の基質を有するように調製できる。一回のインキュベートで、ＰＣＲによる挿入断片を、ＴＯＰＯ末端を有する１つのベクターアームに、ＴＯＰＯ媒介ライゲーションを介してライゲーションし、すぐにライゲーションできる末端を有する他のベクターアームに、リガーゼ酵素媒介反応を介してライゲーションする。ライゲーション産物を適切な宿主細胞に形質転換する。トポイソメラーゼおよびＤＮＡリガーゼの両方により媒介されるクローニング事象は非指向的である。ＰＣＲプライマーの５’末端におけるヒドロキシルまたはリン酸基により、指向性が決まる。その後、２つのベクターアームの他の末端を、上記の任意の方法により接続する。このクローニング法を使用して、ＲＶＡ−Ｉ−ＲＶＡまたはＬＶＡ−Ｉ−ＬＶＡからなるライゲーション産物は形成されるべきではないが、いくらか生じる場合、かかるライゲーション産物は、その後複製および増殖はできない。
【００６２】
実施例３
トポイソメラーゼおよびｃｏｓ末端を使用した分子クローニング
トポイソメラーゼおよびｃｏｓ末端を使用した分子クローニング法はベクターを含み得、ここで該ベクターは２つのベクターアームからなり得、各アームは、１つのＴＯＰＯ末端および１つのｃｏｓ末端からなる。ｃｏｓは、バクテリオファージλの末端に存在する粘着末端を意味する。ＰＣＲによる挿入断片などの挿入断片は、５’−ＯＨ末端を含むプライマーを使用して作成できる。ＰＣＲによる挿入断片は、ＤＮＡトポイソメラーゼにより、２つのベクターアームのＴＯＰＯ末端にライゲーションできる（図５参照）。ＬＶＡ−Ｉ−ＬＶＡまたはＲＶＡ−Ｉ−ＲＶＡの生じるライゲーション事象は、その後、増殖できない。ライゲーション産物は、適切な宿主に形質転換できる。ベクターアームの遠位末端は、その明確な配列から、大腸菌宿主細胞で互いに容易にアニーリングする、末端ｃｏｓ部位を含む。ｃｏｓ部位は、インビトロでは室温でアニーリングしない。
【００６３】
このクローニング法は、指向的または非指向的であり得る。非指向的クローニングの場合、挿入断片は５’−ヒドロキシル末端を含み、例えば、１回の反応で２つのベクターアームにライゲーションできる。指向的クローニングでは、挿入断片は、例えば、ＰＣＲにより作成でき、ここで、一方のＰＣＲプライマーは５’−ヒドロキシル基を有し、他方のＰＣＲプライマーは５’−リン酸基を有する。従って、得られたＰＣＲによる挿入断片は、１つの５’−ヒドロキシル末端および１つの５’−リン酸末端を含む。挿入断片は、最初にＴＯＰＯ結合末端を含む左ベクターアームにライゲーションし、その後、挿入断片の５’−リン酸を脱リン酸化し、その後、ＴＯＰＯ結合末端を含む右ベクターアームに連続的にライゲーションする（図６）。
【００６４】
挿入断片のベクターへのライゲーション産物は、インビトロで、その末端に２つのｃｏｓ配列を有する、鎖状分子である。それは大腸菌などの宿主に、環状分子よりも効率的に形質転換する。
【００６５】
実施例４
トポイソメラーゼおよびＬＩＣ末端を使用した分子クローニング
トポイソメラーゼおよびＬＩＣ末端を使用した分子クローニング法は、２つのベクターアームなどのベクターを含み、各々１つのＴＯＰＯ末端および１つのＬＩＣ末端からなる。ＰＣＲによる挿入断片などの挿入断片は、２つの５’−ＯＨ末端を含むプライマーを使用して作成できる。ＰＣＲによる挿入断片を、ＤＮＡトポイソメラーゼにより、２つのベクターアームのＴＯＰＯ末端にライゲーションできる（図７参照）。ＬＶＡ−Ｉ−ＬＶＡまたはＲＶＡ−Ｉ−ＲＶＡを生じるライゲーション事象は、その後、増殖できない。ベクターアームの遠位末端は、ＬＩＣ適合性末端を含むプラスミドに容易にアニーリングする、末端ＬＩＣ部位を含む。
【００６６】
このクローニング法は、指向的または非指向的であり得る。非指向的クローニングの場合、５’−ヒドロキシル末端を含む挿入断片は、例えば２つのベクターアームに１回の反応でライゲーションできる。指向的クローニングでは、挿入断片は、例えば、ＰＣＲにより作成でき、ここで、一方のＰＣＲプライマーは５’−ヒドロキシル基を有し、他方のＰＣＲプライマーは５’−リン酸基を有する。従って、生じるＰＣＲによる挿入断片は、１つの５’−ヒドロキシル末端および１つの５’−リン酸末端を含む。挿入断片は、最初に、ＴＯＰＯ結合末端を含む左ベクターアームにライゲーションし、続いて、挿入断片の５’−リン酸を脱リン酸化し、その後、ＴＯＰＯ結合末端を含む右ベクターアームに連続的にライゲーションする（図８）。
【００６７】
実施例５
λベクターへの分子クローニング
ベクターは、λＤＮＡベクターアーム（左λアーム（ＬＬＡ）と称する）および右λアーム（ＲＬＡ）を含み得る。ＰＣＲにより作成された挿入断片などの挿入断片を、指向的または非指向的にλベクターアームにライゲーションできる。非指向的クローニングの場合、ＰＣＲによる挿入断片は、５’−ヒドロキシルＰＣＲプライマーを使用して作成できる。挿入断片は、２つのλベクターアームに１回の反応でライゲーションできる。ＬＬＡ−Ｉ−ＬＬＡまたはＲＬＡ−Ｉ−ＲＬＡを生じるライゲーション事象はその後、増殖できない。指向的クローニングでは、一方のＰＣＲプライマーは５’−ヒドロキシル末端を有し、他方のＰＣＲプライマーは５’−リン酸末端を有する。従って、ＰＣＲによる挿入断片は、１つの５’−ヒドロキシル末端および１つの５’−リン酸末端からなる。挿入断片は、図９に示したように、脱リン酸化ステップを間に置いて、２つのλベクターアームに連続的にライゲーションできる。ライゲーションされたλ作成物はインビトロでパッケージングでき、ＸＬ１−Ｂｌｕｅ大腸菌などの宿主細胞にトランスフェクトできる。目的の挿入断片を含む環状プラスミドＤＮＡは、例えばＺＡＰ技術（ストラタジーン）を使用してλベクターから救出（レスキュー）できる。
【００６８】
実施例６
鎖状プラスミドＤＮＡ分子への分子クローニング
ベクターは、Ｎ１５などの鎖状プラスミドのベクターアームを含み得る。ＰＣＲにより作成された挿入断片などの挿入断片は、指向的または非指向的に、プラスミドベクターアームにライゲーションできる。非指向的クローニングの場合、ＰＣＲによる挿入断片は、５’−ヒドロキシルＰＣＲプライマーを使用して作成できる。挿入断片は、一回の反応で２つのプラスミドベクターアームにライゲーションできる（図１０）。ＬＶＡ−Ｉ−ＬＶＡまたはＲＶＡ−Ｉ−ＲＶＡを生じるライゲーション事象は、その後、増殖できない。指向的クローニングでは、一方のＰＣＲプライマーは５’−ヒドロキシル末端を有し、他方のＰＣＲプライマーは５’−リン酸末端を有する。従って、ＰＣＲによる挿入断片は、１つの５’−ヒドロキシル末端および１つの５’−リン酸末端からなる。挿入断片は、図１１に示したように、脱リン酸化ステップを間に置いて、２つのプラスミドベクターアームに連続的にライゲーションできる。鎖状ＤＮＡは、大腸菌に直接形質転換できる。別法として、ライゲーションされたプラスミド作成物はインビトロでパッケージングでき、ＸＬ１−Ｂｌｕｅ大腸菌などの宿主細胞にトランスフェクトできる。目的の挿入断片を含むＤＮＡは、例えばＺＡＰ技術（ストラタジーン）を使用して、ベクターから救出できる。
【００６９】
ベクターはまた、一端に、共有結合したトポイソメラーゼポリペプチド、および、他端に、ライゲーション基質部位からなる、鎖状プラスミドベクターを含むことができる（図４参照）。一端に５’−ＯＨ基および他端に５’−リン酸基を含む挿入分子とベクターの、トポイソメラーゼ媒介ライゲーションおよびリガーゼ酵素媒介ライゲーションに十分な条件下でのインキュベートにより、挿入分子を含むライゲーションされた環状プラスミドが生じる。プラスミドは宿主細胞に形質転換できる。
【００７０】
実施例７
トポイソメラーゼおよび部位特異的組換えを使用した分子クローニング
ベクターは、１つのＴＯＰＯ末端および１つのｌｏｘＰ末端を含む、ベクターアームを含むことができる。ｌｏｘＰ部位は、Ｃｒｅ部位特異的組換えタンパク質の存在下で、第二ｌｏｘＰ部位と組換えできる。ＰＣＲにより作成された挿入断片などの挿入断片は、２つのベクターアームのＴＯＰＯ末端にライゲーションできる。該クローニングは指向的または非指向的であり得る。非指向的クローニングの場合、ＰＣＲによる挿入断片などの挿入断片は、各々５’−ヒドロキシル末端を含むＰＣＲプライマーから作成できる。２つの５’−ＯＨ末端を含む挿入断片は、２つのベクターアームに１回の反応でライゲーションできる（図１２）。指向的クローニングでは、挿入断片は、例えばＰＣＲにより作成でき、ここで、一方のＰＣＲプライマーは、５’−ヒドロキシル末端を含み、他方のＰＣＲプライマーは５’リン酸末端を含み、これにより、１つの５’−ヒドロキシル末端および１つの５’リン酸末端を含む挿入断片が生じる。挿入断片は、図１３に示したように、脱リン酸化ステップを間に置いて、２つのベクターアームに連続的にライゲーションできる。ライゲーションされた産物は、鎖状分子の各末端にｌｏｘＰ部位を含む。鎖状分子は、インビトロで、例えばＣｒｅリコンビナーゼを使用して、またはインビボで、例えば精製Ｃｒｅリコンビナーゼを発現する大腸菌宿主およびｌｏｘＰ部位を有するプラスミドへの形質転換により、環状組換えプラスミドに組換えできる。
【００７１】
実施例８
トポイソメラーゼおよびインビボでの相同組換えを使用した分子クローニング　インビボでの相同組換えを活用して、目的のライゲーションされた挿入断片／ベクターを、環状プラスミドベクターに導入できる。相同的配列が、目的のライゲーションされた挿入断片／ベクターにフランキングし、プラスミドクローニングベクターの配列に実質的に同一である。目的のライゲーションされた挿入断片／ベクターを、ライゲーションされた挿入断片／ベクターにフランキングする相同配列とプラスミドクローニングベクター中の相同配列の間の相同組換えを介して、選択したプラスミドクローニングベクターに組換える。例えば、３０、７５、１００、１５０、２００、２５０、５００、または１０００塩基対の相同ベクター配列を有するＰＣＲプライマーを合成し、該ＰＣＲプライマーを使用して、目的のライゲーションされた挿入断片／ベクターにフランキングする相同ベクター配列を有するライゲーションされた挿入断片／ベクターを作成することにより、各末端に相同配列の付着した挿入断片を作成できる。末端に相同配列を有するライゲーションされた挿入断片／ベクター分子も、トポイソメラーゼ結合相同配列エレメントを調製し、各末端上に相同配列エレメントを有する挿入断片を作成するために、図１４および１５に概略を示したようなＴＯＰＯクローニングスキームを使用することにより作成できる。ＴＯＰＯライゲーションされたアームを含むＰＣＲにより増幅された挿入断片を、クローニングベクターを含む宿主細胞に形質転換でき、ここで相同組換えが生じ得る。効率的なインビボでの相同組換えのために、ｒｅｃＡ＋宿主株を使用できる。内因性エキソヌクレアーゼ活性による分解から鎖状挿入断片を保護するために、挿入断片の末端を、エキソヌクレアーゼ消化事象を阻害または禁止するために修飾できる。
【００７２】
部位特異的なインビボでの組換えを達成するために、λ付着部位を、上記の相同配列の代わりに使用できる。このシナリオでは、λ付着部位は、目的のライゲーションされた挿入断片／ベクターにフランキングし、これは、上記のＰＣＲおよびＴＯＰＯクローニングスキームに従って作成する。フランキングしているλ付着部位をもつライゲーションされた挿入断片／ベクターを、λ付着部位を有するクローニングベクターを含む宿主細胞に形質転換する。宿主細胞内では、その後、ライゲーションされた挿入断片／ベクターを部位特異的を、ライゲーションされた挿入断片／ベクターにフランキングしているλ付着部位と、プラスミドクローニングベクター中の該部位の間の、プラスミドクローニングベクターに組み込むことができる。
【００７３】
［他の実施形態］
他の実施形態も上記の特許請求の範囲内である。
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は、各々一端上にのみトポイソメラーゼポリペプチドを含む、右ベクターアームおよび左ベクターアームへの、各々の末端上に５’−ＯＨ基を有する挿入分子の、非指向的な共有結合的接続を示す。
【図２】
図２は、各々一端上にのみトポイソメラーゼポリペプチドを含む、右ベクターアームおよび左ベクターアームへの、一端に５’−ＯＨ基を有し、他端に５’−リン酸基を有する挿入分子の、指向的な共有結合的接続を示す。
【図３】
図３は、一端上にのみトポイソメラーゼポリペプチドを含む左ベクターアーム、および、一端上にライゲーション基質部位を含む右ベクターアームへの、一端に５’−ＯＨを有し他端に５’−リン酸基を有する挿入分子の、指向的共有結合的接続を示す。
【図４】
図４は、鎖状ベクター分子への、一端に５’−ＯＨを有し他端に５’−リン酸基を有する挿入分子の、指向的クローニングを示す。鎖状ベクター分子は、一端上にのみトポイソメラーゼ分子を、他端にライゲーション基質部位を含む。
【図５】
図５は、各々トポイソメラーゼポリペプチドを一端のみに含み、他端にクローニング基質部位であるｃｏｓを含む、右ベクターアームおよび左ベクターアームへの、各末端上に５’−ＯＨ基を有する挿入分子の、非指向的クローニングを示す。
【図６】
図６は、一端のみにトポイソメラーゼポリペプチドを、他端にクローニング基質であるｃｏｓを含むベクター分子への、一端に５’−ＯＨ基を有し他端に５’−リン酸基を有する挿入分子の、指向的クローニングを示す。
【図７】
図７は、各々一端上にのみトポイソメラーゼポリペプチドを含み他端にクローニング基質部位であるＬＩＣを含む、右ベクターアームおよび左ベクターアームへの、各末端上に５’−ＯＨ基を有する挿入分子の非指向的クローニングを示す。
【図８】
図８は、一端のみにトポイソメラーゼポリペプチドを含み、他端に基質クローニング基質部位のＬＩＣを含むベクター分子への、一端に５’−ＯＨ基を有し他端に５’−リン酸基を有する挿入分子の指向的クローニングを示す。
【図９】
図９は、λベクターアームの一端のみにトポイソメラーゼポリペプチドを含むベクター分子への、一端に５’−ＯＨ基を有し、他端に５’−リン酸基を有する挿入分子の指向的クローニングを示す。
【図１０】
図１０は、各々トポイソメラーゼポリペプチドを一端のみに含む右プラスミドアームおよび左プラスミドアームへの、各末端上に５’−ＯＨ基を有する挿入分子の非指向的クローニングを示す。
【図１１】
図１１は、一端のみにトポイソメラーゼポリペプチドを含むベクター分子への、一端に５’−ＯＨ基を有し、他端に５’−リン酸基を有する挿入分子の指向的クローニングを示す。
【図１２】
図１２は、各々一、端のみにトポイソメラーゼポリペプチドを含み、他端にクローニング基質部位のｌｏｘＰ部位を含む、右ベクターアームおよび左ベクターアームへの、各末端に５’−ＯＨ基を有する挿入分子の非指向的クローニングを示す。
【図１３】
図１３は、一端のみにトポイソメラーゼポリペプチドを含み、他端にクローニング基質部位のｌｏｘＰ部位を含むベクター分子への、一端に５’−ＯＨ基を有し、他端に５’−リン酸基を有する挿入分子の指向的クローニングを示す。
【図１４】
図１４は、各々一端のみにトポイソメラーゼポリペプチドを含み、他端に相同組換え部位であるクローニング基質部位を含む、右ベクターアームおよび左ベクターアームへの、各末端に５’−ＯＨ基を有する挿入分子の非指向的クローニングを示す。
【図１５】
図１５は、一端のみにトポイソメラーゼポリペプチドを含み、他端に相同組換え部位であるクローニング基質部位を含むベクター分子への、一端に５’−ＯＨ基を有し、他端に５’−リン酸基を有する挿入分子の指向的クローニングを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【国際公開パンフレット】
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