(57)【要約】同族遺伝子組換え技術によって臨床的に分離されたミコバクテリウム結核菌から生じるｐｈｏＰ遺伝子中の突然変異体の構造はマウス骨髄大食細胞（マクロファージ）においてその菌力を減少する。さらに、ｐｈｏＰ突然変異体は実験マウスモデルにおいてその菌力を減じる。前記ｐｈｏＰ突然変異体はマクロファージとマウスの両方において除去されることなく生き残ることができる。ｐｈｏＰ突然変異体を接種したマウスはミコバクテリウム結核菌感染に対して保護される。ｐｈｏＰ遺伝子またはｐｈｏＰによって調節された遺伝子を不活性化させたミコバクテリヤの突然変異体はヒトおよび動物結核菌に対するワクチンならびに他の病原体に対する遺伝子組換えワクチンの候補である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｐｈｏＰ遺伝子を不活性化させ、菌力を弱めることを特徴とするミコバクテリウム菌株。
【請求項２】
哺乳動物の大食細胞（マクロファージ）において菌力を減少させることを特徴とする請求項１に記載のミコバクテリウム結核菌株。
【請求項３】
実験マウスモデルにおける菌力を減少させることを特徴とする請求項１に記載のミコバクテリウム結核菌株。
【請求項４】
ｐｈｏＰの突然変異体が大食細胞（マクロファージ）ならびにマウスの両方において除去されることなく生き続けられ得ることを特徴とするミコバクテリウム結核菌株。
【請求項５】
ｐｈｏＰ遺伝子を不活性化させ、ミコバクテリウム結核菌の菌力に含まれる種々の遺伝子を変質させることを特徴とするミコバクテリウム結核菌株。
【請求項６】
ｐｈｏＰ遺伝子を不活性化させ、ミコバクテリウム結核感染に対してマウスを保護することを特徴とするミコバクテリウム結核菌株。
【請求項７】
ｐｈｏＰ遺伝子の不活性化によって、ヒト結核菌に対するワクチンとして使用することを特徴とするミコバクテリウム菌株。
【請求項８】
ｐｈｏＰ遺伝子の不活性化によって、動物結核菌に対するワクチンとして使用することを特徴とするミコバクテリウム菌株。
【請求項９】
ｐｈｏＰ遺伝子の不活性化によって、他の病原菌に対する考え得るワクチンとして使用することを特徴とするミコバクテリウム菌株。
【請求項１０】
ｐｈｏＰの制御された遺伝子の不活性化によって、ヒト結核菌に対する考え得るワクチンとして使用することを特徴とするミコバクテリウム菌株。
【請求項１１】
ｐｈｏＰの制御された遺伝子の不活性化によって、動物結核菌に対するワクチンとして使用することを特徴とするミコバクテリウム菌株。
【請求項１２】
ｐｈｏＰの制御された遺伝子の不活性化によって、他の病原菌に対する考え得るワクチンとして使用することを特徴とするミコバクテリウム菌株。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は微生物学の分野に属するもので、ミコバクテリウム結核菌の菌力の減少およびｐｈｏＰ遺伝子の不活性による結核菌に対する保護に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
結核菌を処理するための遺伝子手段の最近の発展は我々に特殊な遺伝子の突然変異体を形成することを容認する。
【０００３】
サルモネラ菌のような他の細胞内病原菌微生物において、ｐｈｏＰ遺伝子が菌力に含まれることが示されている。この遺伝子の不活性化はヒトのサルモネラ症に対するワクチンとして研究された弱毒化し突然変異体を形成することを我々に許した。
【０００４】
ヒトに単離されたミコバクテリウム結核菌複合体の菌株における我々の以前の研究結果（サラゴサ大学）はおそらく非常に有毒である菌株がｐｈｏＰ遺伝子のようなミコバクテリウム結核菌ゲノムに記録された遺伝子の制御において変質を現わすことを示した。
【０００５】
ミコバクテリウム結核菌力におけるｐｈｏＰ遺伝子の関連性を研究するために、遺伝子が臨床的単離において不活性化され、そして我々は大食細胞（マクロファージ）およびマウスにおいて増殖する能力および生き続ける能力を研究した。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的はｐｈｏＰ遺伝子を不活性化させることによりその菌力を弱めると共に、哺乳動物の大食細胞（マクロファージ）における菌力を減少し、ｐｈｏＰの突然変異体が、大食細胞（マクロファージ）ならびにマウスの両方において除去されることなく生き続けるミコバクテリウム結核菌株を提供することにある。
【０００７】
本発明において、同族遺伝子組換え技術により臨床的に単離されたミコバクテリウム結核菌から生じるｐｈｏＰ遺伝子中の突然変異体の構造はマウス骨髄大食細胞（マクロファージ）においてその菌力を減じる。更にｐｈｏＰ突然変異体は実験マウスモデルにおいてその菌力を減少させる。前記ｐｈｏＰ突然変異体は大食細胞（マクロファージ）とマウスの双方において除去されることなく生き残ることができる。ｐｈｏＰ突然変異体を接種したマウスはミコバクテリウム結核菌感染に対して保護される。ｐｈｏＰ遺伝子またはｐｈｏＰにより調節された遺伝子を不活性化させたミコバクテリアの突然変異体はヒト及び動物結核菌に対するワクチン並びに他の病原菌に対する遺伝子組換えワクチンとなる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
カナマイシン抵抗遺伝子を導入することにより、ミコバクテリウム結核菌ｐｈｏＰ遺伝子を不活性化したベクターを生成した。該ベクターはミコバクテリウム結核菌の臨床分離集団に形質変換され、不活性化ｐｈｏＰ遺伝子を有する菌株を得た。これらの構造の詳細はサラゴサ大学のミコバクテリウム遺伝学グループおよびパリのパスツール研究所のユニットナイト・デ・ジェネテイケ・ミコクテリエンヌの１９９８年ないし１９９９年の研究所ワークブック（ｔｈｅ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｗｏｒｋｂｏｏｋｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｙｅａｒｓ  １９９８−１９９９  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｇｒｏｕｐ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｚａｒａｇｏｇａ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ａｎｄ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅ  ｄｅ  Ｇｅｎｅｔｉｑｕｅ  Ｍｙｃｏｃｔｅｒｉｅｎｎｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｐａｓｔｅｕｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｉｎ  Ｐａｒｉｓ）に現れている。
【０００９】
ミコバクテリウム結核菌ｐｈｏＰ突然変異体は、フランス国、７５７２４パリ、セデックス１５、ドクター・ロー通り２８のパリ（１−２６２２）のパスツール研究所（ｔｈｅ  Ｐａｓｔｅｕｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｐａｒｉｓ（１−２６２２），２８，ｒｕｅ  ｄｕｅ  Ｄｒ．Ｒｏｕｘ，７５７２４  Ｐａｒｉｓ  Ｃｅｄｅｘ  １５，Ｆｒａｎｃｅ）の培養コレクションに２０００年１１月２７日に委託された。
【００１０】
ミコバクテリウム結核菌を研究しかつそれをマウス骨髄の大食細胞培養において７日間ミコバクテリウム結核菌のｐｈｏＰ菌株の突然変異体と比較したとき、突然変異体が哺乳動物マクロファージにそれ自体複製することができないことを観察した。１４日間突然変異体の培養を継続したとき、それが生き続けることを観察した。
【００１１】
マウスに突然変異体菌株を感染させた後、病原菌が３週間後または６週間後のいずれも増殖しないことを観察したが、バクテリヤの数は最初の接種したものに関連して、脾臓、肝臓または肺において減少しなかった。
【００１２】
大食細胞（マクロファージ）およびマウスにおけるミコバクテリウム結核菌のｐｈｏＰ菌株による実験の結果は２０００年のサラゴサ大学のミコバクテリウム遺伝学グループおよびパリのパスツール研究所のユニットナイト・デ・ジェネテイケ・ミコクテリエンヌの研究所ワークブックに現れている。
【００１３】
これらの結果にマウス保護研究を加える。ミコバクテリウム結核菌ｐｈｏＰ突然変異体を皮下に接種させた。８週間後、マウスはミコバクテリウム結核菌Ｈ３７Ｒｖが静脈内に感染された。感染の４週間後のバクテリヤの再カウントは、ｐｈｏＰ突然変異体がＢＣＧワクチン制御に比較し得る有効性によりミコバクテリウム結核菌の増殖に対して保護することを明らかに示した。実験の結果は２００１年ないし２００２年のパリのパスツール研究所のユニットナイト・デ・ジェネテイケ・ミコクテリエンヌのワークブックに現れている。
【００１４】
図１はミコバクテリウム結核菌Ｈ３７Ｒｖ感染に対するミコバクテリウム結核菌ｐｈｏＰ突然変異体の保護を示している。
【００１５】
Ｂａｌｂ／ｃマウスにはＢＣＧ結核菌に対する制御ワクチンまたはミコバクテリウム結核菌ｐｈｏＰ突然変異体のワクチン候補のいずれかの１０７ 集団形成単位（ＣＦＵ'ｓ）が皮下に接種された。
【００１６】
８週間後、マウスはミコバクテリウム結核菌Ｈ３７Ｒｖ（１０７ ＣＦＵ'ｓ）が静脈内で感染された。
【００１７】
感染後４週間、動物は殺されそして脾臓（図１Ａ）および肺（図１Ｂ）において、ＣＦＵ'ｓをカウントした。各値は幾何学的平均＋／−ＳＥＭ．［ｓｉｃ］を示している。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１Ａ】ミコバクテリウム結核菌Ｈ３７Ｒｖ感染に対するミコバクテリウム結核菌ｐｈｏＰ突然変異体の保護を脾臓について示す図である。
【図１Ｂ】ミコバクテリウム結核菌Ｈ３７Ｒｖ感染に対するミコバクテリウム結核菌ｐｈｏＰ突然変異体の保護を肺について示す図である。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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