(57)【要約】本発明は、核酸試験アッセイのための核酸抽出の迅速（１０〜１５分）、簡単、柔軟性があり、そして効率的な方法を記載する。この方法は以下の基本的な段階を有する。それは：ｉ）複数の固体状粒子を用いてキレート剤の存在下で細胞を機械的に破壊し、しかる後にii）ＮＡＴアッセイの妨害物質存在及び／又は活性を調節する段階である。この方法は様々な生物試料に対して適用可能であり且つ微生物に対して万能である。何故なら、当業者がそれを用いて、標的のウィルス、細菌、細菌胞子、真菌、寄生生物又は他の真核細胞、例えば動物及びヒトの細胞を含む試験試料から核酸を抽出することができるからである。【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸試験（NAT）アッセイのための調製物における試料の微生物細胞又はウィルス粒子から核酸を放出せしめるための方法であって：
ａ）微生物細胞もしくはウィルス細胞粒子を、７５μｍ〜２０００μｍの直径サイズを有する固体溶解用粒子(solid lysing particles)によって形成された微粒子勾配の存在する溶液中で、細胞のもしくはウィルスの溶解物を獲得するために、当該微生物細胞もしくはウィルス粒子を溶解せしめるの十分な機械的な力を適用することによって中断し、核酸などの細胞成分を当該溶液中へと放出せしめ；そして
ｂ）NATアッセイ妨害物質の存在及び／又は活性を調節する、
段階を含んで成る方法。
【請求項２】
前記微粒子勾配が、７５μｍ〜１５００μｍの直径サイズを有する固体溶解用粒子によって形成されている、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記微粒子勾配が、７５μｍ〜１２００μｍの直径サイズを有する固体溶解用粒子によって形成されている、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記NATアッセイ妨害物質を調節する段階が、
ａ）試料及び／もしくは溶解物から出た妨害物質を取り除くこと；
ｂ）試料及び／もしくは溶解物中の妨害物質の希釈をすること；
ｃ）試料及び／もしくは溶解物中の妨害物質を不活性化せしめること；又は
ｄ）これらの任意の組み合わせ、
のいずれかによって行われている、請求項１、２又は３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記妨害物質を除去する段階が、試料又は溶解物から出た妨害物質を吸着する段階である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記妨害物質を除去する段階が、微生物細胞もしくはウィルス粒子もしくは細胞成分を密度勾配により精製する段階である、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記妨害物質を除去する段階が、微生物細胞もしくはウィルス粒子もしくは細胞成分を遠心及び洗浄をする段階又はその段階の繰り返しである、請求項４に記載の方法。
【請求項８】
前記妨害物質を不活性化する段階が、試料又は溶解物を加熱する段階である、請求項４に記載の方法。
【請求項９】
前記加熱段階が、温度約５５℃〜約１００℃且つ約１５秒〜約１５分の加熱時間を含んで成る、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記微粒子勾配が、７５μｍ〜１２００μｍの直径サイズを有する固体溶解用粒子によって形成されている、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記微粒子勾配が不連続であり、そして１５０μｍ〜２１２μｍの直径サイズを有する固体溶解用粒子及び７１０μｍ〜１１８０μｍの直径サイズを有する固体溶解用粒子によって形成されている、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記粒子が球形である、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記固形粒子がジルコニウムからなる、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記固形粒子がシリカからなる、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
粒子：試料の比(w／w)が約４：１〜約１：２である、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
前記溶液がキレート剤を含んで成る、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記キレート剤が１〜５mMのEDTAを含んで成る、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記溶液が緩衝剤を含んで成る、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
前記緩衝溶液が１０〜５０mMのトリス−HCl(pH.８．０)を含んで成る、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記試料が、ウィルス、細菌細胞、酵母細胞、真菌細胞、寄生生物細胞、動物細胞、及び／又はヒトの細胞を含んで成る、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
前記細胞が酵母細胞であり、そして前記微粒子勾配が７１０〜１１８０μｍの直径サイズを有する固体溶解用粒子によって形成されている、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記細胞が細菌細胞であり、そして前記微粒子勾配が１５０〜２１２μｍの直径サイズを有する固体溶解用粒子によって形成されている、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
前記微生物がウィルスであり、そして前記微粒子勾配が７５〜１０６μmの直径サイズを有する固体溶解用粒子によって形成されている、請求項２０に記載の方法。
【請求項２４】
前記微粒子勾配が、２以上の、直径サイズ範囲を有する固体溶解用粒子によって形成されており、第１の範囲は１５０〜２１２μｍであり、そして第２の範囲は７１０〜１１８０μｍである、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
前記段階ａ）が５分以内で行われている、請求項１〜２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
試料の微生物細胞又はウィルス粒子から核酸を放出せしめるための製品であって、それは、７５μｍ〜２０００μｍの直径サイズを有する固体溶解用粒子によって形成された微粒子勾配を含んで成る製品。
【請求項２７】
前記微粒子勾配が、７５〜１５００μｍの直径サイズを有する固体溶解用粒子によって形成されている、請求項２６に記載の製品。
【請求項２８】
前記微粒子勾配が、７５〜１２００μｍの直径サイズを有する固体溶解用粒子によって形成されている、請求項２６に記載の製品。
【請求項２９】
前記微粒子勾配が不連続であり、そして１５０μｍ〜２１２μｍの直径サイズを有する固体溶解用粒子及び７１０μｍ〜１１８０μｍの直径サイズを有する固体溶解用粒子によって形成されている、請求項２６に記載の製品。
【請求項３０】
前記固形粒子がジルコニウムからなる、請求項２６〜２９のいずれか１項に記載の製品。
【請求項３１】
前記固形粒子がシリカからなる、請求項２６〜２９のいずれか１項に記載の製品。
【請求項３２】
体積１０μＬ〜５００μＬの試料と共に使用される、０．０２ｇ〜０．２ｇの前記固形粒子を含んで成る、請求項２６〜２９のいずれか１項に記載の製品。
【請求項３３】
キレート剤を更に含んで成る、請求項２６〜２９のいずれか１項に記載の製品。
【請求項３４】
前記キレート剤が、１〜５mMのEDTA最終濃度を達成する量において存在する、請求項３３に記載の製品。
【請求項３５】
緩衝剤を更に含んで成る、請求項２６〜３４のいずれか１項に記載の製品。
【請求項３６】
前記緩衝溶液が、１０〜５０mMのトリス−HCl（pH８．０）を含んで成る、請求項３５に記載の製品。
【請求項３７】
前記細胞が酵母細胞であり、そして前記微粒子勾配が７１０〜１１８０μｍの直径サイズを有する固体溶解用粒子によって形成されている、請求項２６に記載の製品。
【請求項３８】
前記細胞が細菌細胞であり、そして前記微粒子勾配が１５０〜２１２μｍの直径サイズを有する固体溶解用粒子によって形成されている、請求項２６に記載の製品。
【請求項３９】
前記微粒子勾配が、７５〜１０６μｍの直径サイズを有する固体溶解用粒子によって形成されている、ウィルス粒子の核酸を放出せしめるための請求項２６に記載の製品。
【請求項４０】
前記微粒子勾配が１５０μｍ〜２１２μｍの直径サイズを有する固体溶解用粒子及び７１０μｍ〜１１８０μｍの直径サイズを有する固体溶解用粒子によって形成されている、請求項２６に記載の製品。
【請求項４１】
１５０μｍ〜２１２μｍの直径サイズを有する粒子と７１０μｍ〜１１８０μｍの直径サイズを有する粒子の比（w／w）が４：１である、請求項１１又は２４に記載の方法。
【請求項４２】
１５０μｍ〜２１２μｍの直径サイズを有する粒子と７１０μｍ〜１１８０μｍの直径サイズを有する粒子の比（w／w）が４：１である、請求項２９又は４０に記載の方法。
【請求項４３】
NATアッセイ妨害物質を結合する又は吸着する物質を更に含んで成る、請求項２６〜４０のいずれか１項に記載の製品。
【請求項４４】
前記物質が活性炭である、請求項４３に記載の製品。
【請求項４５】
前記吸着段階が活性炭により行われている、請求項５又は１０〜２５のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
発明の背景
微生物から核酸を単離するための古典的な方法
分子生物学の出現と共に、核酸の検出に基づく診断方法の数は増えつつある。核酸増幅技術は分子生物学における代表的な有用な道具である。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の発見以来、微生物の検出及び同定をするために適切な、核酸を単離するための様々なプロトコルが記載されてきた。しかし、これらのプロトコルの大部分は、時間がかかり且つ往々にして毒性化学物質を使用する必要がある。加えて、プロトコルは各微生物種に対してティラーメードである必要がある。即ち、真菌のための溶解プロトコルは、グラム陰性細菌、又は寄生生物、又は菌胞子などに対して適切でないであろう。更に、これらのプロトコルは多くの段階を要し、試料〜試料又は持起（Carry-over）による汚染の危険性が増える。
【０００２】
Huguesら（Method in Microbiology, 1971, vol. 5B, Academic Press, New York）は、生物学的に活性を有する画分を調製するために微生物を崩壊せしめるための有効な方法を総説している。この方法は、所定のサイズの試料を処理するかあるいは複数の試料を適切な時間内で処理でき、所望の核酸がその完全性を維持したままであるその能力に依存するだろう。細胞を破壊する古典的物理方法としては、機械的な細胞崩壊（破砕及び粉砕、ウェットミルによる処理、超音波処理、油圧剪断、凍結加圧）、液体又は水力学的な剪断（フレンチプレス、チャイコフプレス、ホモジナイザー、ウェットミル、バイブレーションミル、フィルター、超音波による崩壊）及び固相剪断（粉砕、ヒューグースプレス）が挙げられる。細胞崩壊の化学的な方法のねらいの大部分は、膨圧の効果により細胞が漏れやすい状態になるかあるいは破裂するようにするため細胞壁もしくは細胞膜又はその両方を改変することである。方法としては、浸透圧、乾燥及び抽出、自己溶解、細胞壁合成の阻害をすること、細胞壁に対する酵素攻撃、バクテリオファージ及び他の溶解因子、及び電離放射線が挙げられる。
【０００３】
固形物粒子を伴うかあるいは伴わないで細胞を破壊するいくつかの方法、及びそれに関連する核酸を放出せしめるための物理的撹拌が記載されてきた。その例としては、Amocoの細胞中断装置（米国特許第５，５６７，０５０号）及びQbiogeneのFast Prep（登録商標）装置（米国特許第５，５６７，０５０号）が挙げられる。しかし、これらの特許においては、操作の数が減らされてはいない。細胞を溶解せしめるために用いられうる類似の振動型ビーズミルを用いる市販の装置としては、B. Braun Biotech (Allentown, PA, USA）のMicro-Dismembrator II及びBioSpec (Bartlesville, O.K, USA）のMini-Bead Beaterが挙げられる。しかし、この種類の装置を用いる刊行物に記載の多くの方法には、溶解段階の後に、更なる核酸精製段階が必要となる（Millerら、1999, Appl. Env. Microbiol. vol. 65.: pp. 4715〜4724; Cornejoら、1998, Appl. Env. Microbiol. vol. 64: pp. 3099〜3101）。加えて、多くのプロトコルは、機械的な細胞溶解を促すために溶原性化学物質の存在に依存している。これらの方法の主たる欠点とは、使用された化学物質が往々にして、ＰＣＲにおけるデタージェントドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）法などのその後の生物学的方法に悪影響を及ぼすことである。
【０００４】
臨床標本中に存在する微生物からの核酸の放出及び精製をより簡単にするための製造者による改良が近年有意に進行している。しかし、研究者にとっては、多量の商業上入手可能な核酸抽出キットの選択をすることは難かしい。これらのキットは、核酸試験（ＮＡＴ）をするための多種多様な標的微生物を含む様々な試験試料の調製において性能の変動を示す。これらのキットは総核酸回収率、操作段階の数及び必要な時間が異なる。実施例２には８つの異なる商標上入手可能なＤＮＡ抽出キットと本発明の方法との比較を示している。速さ、ＤＮＡの総回収率及び操作段階の数に関しての結論としては、以下に記載の試料調製方法が最良のプロトコルであった。
【０００５】
簡単、迅速、万能且つ多用途である新規抽出方法
本発明中に記載の方法は迅速万能細胞溶解及び核酸調製（ＲＵＣＬＡＮＡＰ）プロトコルである。これは、簡単で、柔軟且つ効率的なプロトコルにおいておよそ１０〜１５分を要する。本発明の基礎となる事象の主たる系列は、最初にキレート剤の存在下で固形粒子を用い機械的に細胞を溶解せしめること、しかる後に、増幅反応の場合に用いられるポリメラーゼに対して阻害性の物質を調節すること又はＮＡＴアッセイの他の段階に対して妨害性の物質を調節することである。前記妨害物質は試験試料中に存在しそして／又は細胞の溶解により溶解物中へと放出される。大部分の用途について、核酸の更なる精製は不要である。かかる調節は、試料もしくは溶解物中のＮＡＴ妨害物質を加熱、吸着、凍結、除去もしくは希釈することなどによって行うことができうる。この方法の利点とは、簡単で、迅速、効率的、万能（全ての微生物種で有効）且つ低コストなことである。
【０００６】
本発明以前は、細胞を溶解せしめるために熱が用いられ（米国特許第５，３７６，５２７号）、細胞を溶解せしめるために粒子での撹拌が用いられ（米国特許第５，５６７，０５０号及び４，２９５，６１３号及び世界特許ＷＯ０２／１０３３３）、有機溶媒中での粒子による撹拌が細胞を溶解せしめるために用いられ（米国特許第５，６４３，７６７号）、そして粒子による撹拌が、核酸に対するアクセス性を供するために即に溶解せしめた細胞に対して適用されていた（米国特許第５，９４２，４２５号）。本発明以前は、事象の特定の系列（キレートバッファー中、粒子による撹拌、しかる後のＰＣＲ妨害物質の熱による不活性化）が、分子生物学のためのＤＮＡを調製するために適用されていた。しかし、より以前のこれらの方法において、細胞の溶解は主に沸とう段階により供された熱に主に依存する以外に、機械的な力には依存してはいなかった。例えば、Chelex（登録商標）におけるボルテックス段階、弱イオン交換マトリックス、しかる後の試料の沸とうの組み合わせを用いるものもある（Kesslerら、1997, J. Clin. Microbiol, vol. 35: pp. 1592〜1594; Drakeら、1996, Food Res. Int. vol. 29: pp. 451〜455; Yoshimiら、1993, Acta Pathol. Jap. vol. 43: pp. 790〜791）。全ての場合において、二価の陽イオンを封鎖するため、及びＰＣＲを妨害する化合物を結合せしめるためにのみChelex（登録商標）と試料とを混合する非常に短かいvortex段階が行われ（Singer-Samら、1989, Amplification vol. 3: p11); しかも細胞溶解が、加熱段階（全ての微生物、特に細菌の胞子及び酵母細胞に対しては万能ではない）中に達成されていた。本発明の実施例１９で明らかにされているように、ＰＣＲプロトコル中の加熱段階は、マイコバクテリウム・スメグマチス（Mycobacterium smegmatis）を溶解せしめることに対して十分であるとはいえない。
【０００７】
特許公報ＷＯ９９／１５６２１には機械的に細菌又は酵母を溶解せしめる方法が記載されている。ここにおいて、細菌又は酵母を含んで成る液体試料は、容器中に粒子と共に置かれている。その粒子は、細菌のために９０〜１５０μｍ、即ち１００μｍを有し、そして巨大なものは酵母のために４００〜６００μｍ、即ち５００μｍを有する。この方法はＳ．エピデルミジス（S. epiderumidis）及びＣ．アルビカンス（C. albicans）の約６０％がボルテックスの８分後に溶解するので至適ではない。
【０００８】
特許公報ＷＯ００／０５３３８には細胞を溶解せしめるための「磁気」ボルテックス方法が開示されている。細胞を機械的に破壊するために２つ以上のサイズの粒子が用いられている。より大きな方の粒子は磁場に反応する物質（即ち、鉄）からなり、一方で、より小さい方の粒子は非磁性ビーズである。巨大ビーズは磁気装置を作動させることによって運動し、そして試料が巨大ビーズと小ビーズとの間で破砕される。より小さい方のビーズは大きい方のビーズによって動かされている。小ビーズと標的細胞とのサイズ比は、幾分小さく（５０／１）、一方で、巨大ビーズと小ビーズとのサイズ比は比較的大きい（４０／１）。従って、巨大ビーズはそれらと小ビーズ間で標的細胞を破砕し、そして細胞成分を溶出液中に遊離せしめる機能を有する。更に、この適用により溶出率及びそこから得られた核酸の完全性の「定量的」評価のみが供される。電気泳動ゲルのみでこの方法の結果を示される。核酸に対して行われる更なる増幅方法は、高いレベルでの溶解傾向及び再現性が要求される非常に慎重を期する方法である。ＷＯ００／０５３３８は、全体的に、開示された「磁気」ボルテックス法によりこのような高い水準を達成することに関しては触れられていない。
【０００９】
特許公報ＷＯ０２／１０３３３には、様々な技術に対して適合されうる方法が記載されている。その様々な技術とは即ち、超音波処理、機械ボルテックス及び磁気ボルテックスである。この方法は：ａ）処理される試料の総重量に対する粒子重量が５０〜１００％、ｂ）（２つのサイズの粒子が用いられる場合には）大きい方の粒子の直径に対する小さい方の粒子の直径の比率が５０％以下、ｃ）９〜２０分の溶解時間、ｄ）粒子の動きに関連し且つそれ自体は溶解に関わらないガラスビーズの数が７未満であること；並びにｅ）ｄ）におけるのと同じ役割を持つが、しかし磁気ボルテックスのためのものである鉄ビーズの数が５〜１５であること、からなる群から選択されるパラメーターを３つ以上含んで成る。重ねて、前記溶解粒子はＷＯ９９／１５６２１（小さい方は細菌のために９０〜１５０μｍ、即ち１００μｍであり、そして大きい方は酵母のために４００〜６００μｍ、即ち５００μｍ）におけるのと同じサイズを有する。粒子サイズの混合が用いられている場合は比較的長い溶解時間と共に、より大きな粒子サイズ比率（５０％以上）が好まれる。超音波処理以外、他の撹拌技術には、小さい粒子を運動せしめるために存在している巨大非溶解用粒子が必要になる。これら、大きい粒子によりビーズマトリックスが一層かさばりそして溶解物との接触面での凹凸が生じ、デッドボリュームが増え、それ故に溶解物のピペッティングによる回収が一層困難になる。
【００１０】
Jaffeらによる刊行物（J. Clin. Microbiol, 2000, vol. 38: pp. 3407〜3412）には、体積０．５mLの細菌試料中で１．０ｇの１００μｍガラスビーズ及び０．２５ｇのChelex−100を使用し機械的に細胞を破壊して核酸を放出せしめ、更に加熱段階が続く方法が開示されている。しかしながら、この方法は、「Chelexによるビーズビーティング」と呼ばれているが所定の種、即ち、メチシリン耐性Ｓ．アウレウス（S. aureus)（MASA）に対しては、感度が、破壊するのがより容易な他の細菌、例えばグラム陰性の種に対して許容できるとしても、感度を欠く。全ての微生物から核酸を効率的に回収するために、ビーズのサイズを変えこの方法の感度及び汎用性（「万能性」）を高めることに関する提案はない。更に、この方法は臨床試料では試験されていない。
【００１１】
１９９９年にシカゴで開催された第９９回ＡＳＭ総会（要約Ｃ−４８１）で、本発明者は、本発明の方法及びキット（その時は、IDI DNA抽出キットと呼んだ）と他の８種類のキットで行った比較試験の結果を開示した（実施例２を参照のこと）。細胞を溶解せしめることに関するプロトコル及びそれに関わる成分の詳細は示さなかった。
【００１２】
前記ＲＵＣＬＡＮＡＰ法は微生物に対して万能である。何故なら、当業者はそれを用い、ウィルス、細菌、細菌の胞子、真菌、寄生生物又は他の真核細胞、例えば動物及びヒトの細胞から核酸を抽出できるからである。基本的ＲＵＣＬＡＮＡＰプロトコルは汎用性が高い。何故なら、用いられる臨床試料の種類に基づき、試料中に存在する微生物の濃度を希釈又は濃縮する目的、及び／もしくは粗製の核酸を抽出する目的、及び／もしくはＮＡＴアッセイの、試料−特異的妨害物質（Wilson. Applied Env. Microbiol, 1997, vol. 63: pp. 3741〜3751）を調節（不活性化、吸着、希釈又は除去）する目的のために、容易に適合せしめることができるからである。ＲＮＡの遺伝子解析をするために、ＲＵＣＬＡＮＡＰによる核酸の抽出をする前に試料に対してＲＮＡａｓｅ阻害物質が加えられて良い。完全長ＲＮＡの更なる精製は、例えばＲＴ−ＰＣＲによるその後の増幅及び検出のために欠かすことができない（実施例１８を参照のこと）。
【００１３】
この方法の用途は様々である。それは即ち、この方法を用いることで微生物核酸が首尾良く調製される試料としては、微生物培養ブロス、陽性血液培養物、寒天培地上で増殖した微生物コロニーの懸濁、並びに様々な生物試料の例えば、血液、血しょう、濃縮血しょう板、尿、脳脊髄流体、羊膜流体、胎便、創傷滲出物、排泄物、鼻腔スワブ、咽頭スワブ、肛門スワブ、膣スワブ、膣／肛門スワブ、直腸スワブ及びウシの乳が挙げられる。ＲＵＣＬＡＮＡＰ法によるストレプトコッカス・アグラクチアエ（Streptococcus agalactiae）の溶解効率は、生菌数測定により測定した場合９９．９９％であると見積もられた（実施例５を参照のこと）。様々な標本と詳細な試料調製プロトコルは、実施例２〜１２，１５及び１７〜２０を参照のこと。この方法はスケールアップ又はスケールダウン、及び自動化のために改変もできる。
【００１４】
生物標本の取り扱いにおける関心事項の１つは安全性である。感染因子を含む臨床試料を加熱することは試料をより安全にとり扱うための１つの好適な方法である。米国特許第５，３７６，５２７号には、マイコバクテリウム・ツベロクロシス（Mycobacterium・tuberculosis）の溶菌難細胞を非感染性にするのに十分な熱の溶菌有効量が記載されている。我々は、ＲＵＣＬＡＮＡＰ法の細胞溶解段階と加熱段階とを組み合わせることが多くの臨床試料の取り扱いをより安全することにも気が付いた。加熱及び／又は凍結段階も試験試料の取り扱いをより安全にするためにＲＵＣＬＡＮＡＰの前に行われても良い。
【発明の開示】
【００１５】
発明の概要
本発明の目的は細胞、即ち微生物細胞もしくはウィルスから核酸を迅速に調製をするための万能な方法及び製品又はキットを供することであり、前記方法は：
Ａ．生物試料を７５μｍ〜２０００μｍの公称直径サイズを有する固体粒子（solid particles）によって形成された微粒子勾配（granulometric gradient）中に置き；
Ｂ．前記混合物を、十分な機械的な力に委ね、細胞壁及び細胞膜を中断し、ＮＡＴアッセイの妨害物質の存在及び／又は活性を調節する段階に更に委ねられる細胞成分及び亜細胞（ミトコンドリア）成分を放出せしめる、
ことを含んで成る。
【００１６】
即ち、前記粒子は１００μｍ超及び１５００μｍ未満の公称直径サイズを有する。好適な実施態様において、粒子は本質的に、１５０μｍ〜約１２００μｍで様々であり、即ち１５０μｍ超及び１１８０μｍ以下の公称直径サイズからなる。
【００１７】
更に好適な実施態様において、前記固体球形粒子は、２つの直径の範囲の、酸で洗浄されたガラスビーズでありその範囲とは：１つが１５０〜２１２μｍであり、もう１つが７１０〜１１８０μｍである。全ての細胞（細菌、酵母、真菌、寄生生物、動物及びヒトの細胞）又はウィルスに対して、前記ビーズは好適に４：１の比（ｗ／ｗ）で混合されており、そして１．５mLのミクロチューブあたり合計０．０５ｇのガラスビーズがある。他のビーズ比率も可能であり；例えば、酵母細胞を溶解せしめるには、前記ビーズは好適に１：１（ｗ／ｗ）以上の比で混合されており、そして１．５mLのミクロチューブあたり合計約０．０２ｇのガラスビーズがある。ウィルス粒子が溶解の標的でもある場合、もし必要又は所望ならば第３の範囲の、約７５〜１０６μｍも加えられて良い。
【００１８】
他の好適な実施態様において、生物試料及び粒子は、キレート剤を含有する緩衝溶液中にある。
【００１９】
更に好適な実施態様において、前記緩衝溶液は、１０mMのトリス−ＨＣｌ（pH８．０）からなり、そしてキレート剤は１ＭのＥＤＴＡである。
【００２０】
他の好適な実施態様において、用いられる機械的な力は、レベル７に設定された、埋込み基盤（recessed plat form）有無の水平軌道運動（horizontal orbital motion）を用いる装置（例えば、Fisher Scientific, Nepean, Ont, CanadaのGenie2型vortex）によって５分に渡り生み出されている。
【００２１】
上記の実施態様において、ＷＯ９９／１５６２１、ＷＯ００／０５５３３８及びＷＯ０２／１０３３３に記載されているような溶解用粒子の動きには関わるが溶解には関係しない（ミリメーター直径サイズのオーダーの）巨大粒子は不要である。本発明者はこれら非溶解用のより巨大なサイズの粒子に代わり、小粒子と比較的より大きなサイズの巨大粒子（≒１５０〜２１２μｍと≒７１０〜１１８０μｍ）からなる微粒子勾配を含んで成る混合物を用いている。その混合物により、使用者は溶解段階をそれ自体５分以内で且つ非溶解用巨大粒子（約２mm超の直径サイズ）など任意の機械的補助に頼ることなく行うことができる。
【００２２】
更に好適な実施態様において、機械的な力は、パワーレベル６に設定された垂直角度運動（vertical angular motion）を用いる装置（例えば、Qbiogene, Carlsbad, CA, USAのFast Prep（登録商標）ＦＰ−１２０装置）によって４５秒に渡り生み出されている。
【００２３】
他の実施態様において、固体粒子の存在下で細胞を中断するのに用いられた前記力は、超音波によって伝達されている。
【００２４】
ＮＡＴアッセイの妨害物質を調節するために好適な実施態様の１つは、混合物を約５５〜１００℃の範囲の温度で十分な時間に渡り加熱することである。
【００２５】
他の好適な実施態様において、溶解媒体はＮＡＴアッセイを妨害する物質を結合又は吸着する活性炭（チャーコール、活性チャーコール）などの物質をも含むだろう。このような成分は、ビーズ混合物に加えられるかあるいはその一部であるだろうし、そして様々な粒子サイズ、炭素で覆われた粗合成ビーズ、又は塊状の多孔性炭素ビーズを含んで成るだろう。これらの物質により、ＮＡＴアッセイの妨害物質として知られているポルフィリン及びポルフィリン様色素又は誘導体、ヘミン及びヘミン様分子、ステロイド及びステロイド様ホルモンを吸着することが可能になる。
【００２６】
ＮＡＴアッセイ妨害物質は、単に、試料を希釈することによって、もしくは、Percoll（登録商標）など密度勾配上での除去によって、もしくは吸収媒体（チャコールなど）によって、もしくは試料を凍らせることによっても調節されて良い。ＮＡＴアッセイ妨害物質を調節するための手段又は段階の組み合わせ（例えば加熱＋勾配、又は加熱＋希釈など）も本発明の範囲内である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２７】
発明の詳細な説明
本発明中に記載の迅速万能細胞溶解及び核酸調製（ＲＵＣＬＡＮＡＰ）法は、核酸の検出に基づく分子診断用途のために適切な核酸を調製するために用いられるプロトコルの中心を形成する。処理された試験試料の性質に基づき、改良が加えられて良く（下記の例を参照のこと）これは、当該方法の汎用性を裏づける。
【００２８】
注目の試料は最初、キレート剤をも含む緩衝溶液中で再懸濁されている。トリス（トリス［ヒドロキシメチル］−アミノメタン）がここでは好適な緩衝剤であり、その理由は、その緩衝力に加えて、トリスが、細菌細胞壁におけるリポポリサッカライド（ＬＰＳ）分子同士の側方相互反応を、ＬＰＳに対して強く結合した他の陽イオンを部分的に置換することによって、弱めることにも役立つからである。しかし、代わりに生化学者に公知の他の緩衝剤をも用いることができる。多くの試料種が自然に緩衝作用を受けてしまう場合；アッセイが高感度の検出を必要としなくても良い場合はどのような緩衝剤も適切ではないかも知れない。キレート剤は、ＥＤＴＡ（エチレンジアミンテトラ酢酸）が好適であり、それは二価の陽イオンをキレートする。それにより、ヌクレアーゼ酵素を、それらに必須の金属性共因子を隔離することにより阻害する。しかし、代わりに他の金属キレート剤も用いられて良い。キレート化の更なる効果は、ＬＰＳ分子同士の静電的反発力の中立化に関係する陽イオンを失わせ、膜のＬＰＳ単層部分の脱安定化をもたらすことである。確認された細胞浸透性増加は、以前はＬＰＳ、リン脂質分子によって占められていた空間が埋まることによるようだ（Escherichia coli and Salmonella: Cellular and Molecular Biology, 1996、第２版、Vol. 1、第５章、AM Press, Washington）。
【００２９】
次いで、混合物が固体粒子と接触せしめられる。前記混合物の好適な体積は約１０〜５００μＬである。代わりに、前記粒子はキレート剤を含む溶液中に前々から存在していても良い。好適な固体粒子は、１．５mLミクロチューブ中に置かれている、無菌の、酸で洗浄されたガラスビーズからなる。固体粒子は、サイズの異なる粒子の混合物であって良い。好適な混合物は、２つのサイズ範囲のビーズからなり、第１番目は１５０〜２１２μｍ（７０〜１００Ｕ．Ｓ．ふるい）、そして第２番目は７１０〜１１８０μｍ（１６〜２５Ｕ．Ｓ．ふるい）の範囲である。しかし、一般に、小ビーズ（１５０〜４２５μｍ）は細菌細胞を溶解せしめるために効率的であり、酵母細胞を効率的に溶解するにはより巨大なビーズ（７１０μｍ以上）が必要である。従って、ある特定の種類の微生物のために作られた個々のキット、製品及び方法に加えて、我々は、万能溶解用混合物を考え出した。ここにおいて、２つのサイズ範囲のビーズが４：１（ｗ／ｗ）の比で混合されており、そしてビーズの総重量はミクロチューブあたり０．０５ｇである。この混合物により効率的に酵母細胞を溶解せしめることができる（実施例２を参照のこと）。代わりに、酵母溶解用混合物において、２つのサイズ範囲のビーズが、１：１（ｗ／ｗ）の比で混合されていて、ミクロチューブあたりのビーズ総重量は０．０２ｇである。細胞を溶解せしめるために適切であることが発見されている他の粒子としては、Ottawa砂及びジルコニアビーズが挙げられる（がそれらには限定されない）。
【００３０】
任意の理論に束縛されることなく、我々は、７５〜約２０００μｍ（即ち７５〜１５００、更に７５〜１２００）の範囲の直径サイズを有する粒子の微粒子勾配を用いることで、より良い溶解が可能になると考えている。このことは、様々な異なるサイズを有する粒子が存在すること（勾配）による。その勾配により細胞中断するために好ましい有効衝突表層が増え、そしてデッドボリュームが減ることによって、溶解物の回収率が高まる。細菌及び酵母として様々なサイズ及び形態を有する様々な微生物の全てを溶解をせしめるために、我々は、２つの不連続的な微粒子勾配（１５０〜２１２μｍと７１０〜８１０μｍ）を組み合わせることが特に効率的且つ都合が良いことを発見した（実施例１を参照のこと）。他で言われる巨大非溶解用粒子（ＷＯ９９／１５６２１，ＷＯ００／０５５３３８及びＷＯ０２／１０３３３）と溶解用のより小さな粒子の勾配とを混合することも本発明と共に用いられて良い。
【００３１】
次に、ウィルス、細菌、真菌、寄生生物、動物及びヒトの核酸は、機械的な作用による細胞中断によって放出される。機械的な作用は、Fisher ScientificのGenie２型ボルテックスを用いてパワーレベル７で１〜５分に渡り、ミクロチューブに対して水平軌道運動を適用すること（ボルテックスを掛けること）によって供されうる。細胞を破壊するための代わりの方法とは、QbiogeneのFast Prep（登録商標）ＦＰ１２０装置をパワーレベル６に設定して４５秒に渡り用いることである。超音波発生装置などの他の装置は、細胞を破壊する十分な機械的エネルギーを適用するためには適切である。
【００３２】
最後の段階は、調製物を加熱することによってＮＡＴアッセイの潜在的な妨害物質を調節又は中立化することを伴う。用いられる温度は、５５〜１００℃で様々であって良く、好適には、本プロトコルは９５℃を使う。加熱時間は、試料によって、数秒〜１５分まで様々であり、通常の時間は２〜５分である。加熱は、ある種類の試料に対しては絶対必要ではないが、万能プロトコルは好適に、核酸抽出の最大性能を引き出すためにこの段階を伴う。
【００３３】
試料の性質によって、精製もしくは濃縮もしくは希釈段階が細胞溶解の前後いずれかにつけ加えられて良い。前記段階としては：浮遊密度分離（例えばPercoll（登録商標）による、実施例４，９、及び１０を参照のこと）、ろ過、限外ろ過、遠心及び／もしくは洗浄、超遠心、炭素もしくは他の吸着物質上での固相吸着、クロマトグラフィー、磁性粒子上での捕捉、凍結などが挙げられるが、これらに限定はされない。これらの段階は全て往々にして生物試料中に存在するＮＡＴアッセイの妨害物質を調節する目的がある。ＲＵＣＬＡＮＡＰ処理標本を凍結することにより、いくつかの場合においては感度が向上することが示されており；凍結することは、核酸増幅の妨害を回避する手段であることが知られている（Toyeら、1998, J. Clin. Microbiol, vol. 36: pp 2356〜2358; Templetonら、2001, Int. J. of STD & AIDS, vol. 12: pp. 793〜796）。
【００３４】
撹拌時間、及びビーズ同士の体積の比、試料の総体積及び容器の総体積は、選定の撹拌技術（磁気、機械、超音波処理）により適合せしめられて良い全てのパラメータでありうる。粒子による溶解を至適化するための戦略の例は、ＷＯ９９／１５６２１、ＷＯ００／０５３３８及びＷＯ０２／１０３３３中に見出される。至適化は、溶解の効率及び後に行われるＮＡＴアッセイの感度をモニタリングすることによって、所定の種類の容器及び撹拌技術に対しても行われて良い。
【００３５】
特に断わらない限り、引用した参考文献の内容は、単に参照することによってのみ本明細書中に組み込まれているものとみなされる。
【００３６】
実施例の一覧
実施例１：ＲＵＣＬＡＮＡＰの中心プロトコル。
【００３７】
実施例２：ＲＵＣＬＡＮＡＰと微生物培地から迅速にＤＮＡを抽出するための８種類の市販のキットとの比較。
【００３８】
実施例３：Ｓｈｉｇａ毒素生産細菌を検出するためのＲＵＣＬＡＮＡＰの使用。
【００３９】
実施例４：ＲＵＣＬＡＮＡＰを用いることでの、ＰＣＲ増幅のための血小板濃縮物の調製。
【００４０】
実施例５：肛門、膣、及び膣／肛門を組み合わせた標本におけるＢ群ストレプトコクチ（streptococci）を検出するためのＲＵＣＬＡＮＡＰの使用。
【００４１】
実施例６：尿の試料からＳ．サプロフィチカス（S. saprophyticus）を直接検出するためのＲＵＣＬＡＮＡＰの適用。
【００４２】
実施例７：血液試料中のカンジダ・アルビカンス（Candida albicans）、大腸菌（Escherichia coli）及びスタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）の検出。
【００４３】
実施例８：臨床試料からのヒトＤＮＡを抽出するためのＲＵＣＬＡＮＡＰ。
【００４４】
実施例９：バチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）内生胞子に対するＲＵＣＬＡＮＡＰの効果。
【００４５】
実施例１０：ＲＵＣＬＡＮＡＰを用いてのウシの乳中の細菌の検出。
【００４６】
実施例１１：鼻腔スワブ中のスタフィロコッカス・アウレウスを検出するためのＲＵＣＬＡＮＡＰの使用。
【００４７】
実施例１２：ＲＵＣＬＡＮＡＰを用いての糞便試料からのバンコマイシン耐性エンテロコクチ（enterococci）の直接検出。
【００４８】
実施例１３：ガラスビーズサイズの比又はビーズの総重量の変化がＲＵＣＬＡＮＡＰに及ぼす効果。
【００４９】
実施例１４：粒子サイズが溶解効率に及ぼす効果。
【００５０】
実施例１５：肛門／膣試料中に存在する潜在的な妨害物質がＰＣＲに及ぼす効果。
【００５１】
実施例１６：ＲＵＣＬＡＮＡＰに対する細菌密度の効果。
【００５２】
実施例１７：ＲＵＣＬＡＮＡＰを用いての大腸菌からの完全長ＲＮＡの抽出。
【００５３】
実施例１８：ＲＵＣＬＡＮＡＰを用いてのクリプトスポリジウム・パルバム（Cryptosporidium parvam）からのゲノムＤＮＡの抽出。
【００５４】
実施例１９：ＲＵＣＬＡＮＡＰを用いてのマイコバクテリウム・スメグマチス（Mycobacterium smegmatis）からのゲノムＤＮＡの抽出。
【００５５】
実施例２０：ＲＵＣＬＡＮＡＰを用いてのＨＩＶ−１からのＲＮＡの抽出。
【００５６】
実施例２１：ＲＵＣＬＡＮＡＰのためのジルコニアビーズの使用。
【実施例】
【００５７】
実施例
実施例１：
ＲＵＣＬＡＮＡＰの中心プロトコル。  試料（遠心後オーバーナイト培養ブロスから回収した微生物細胞、もしくは寒天培地上で増殖した微生物コロニー、もしくは臨床試料から回収した微生物細胞など）をキレート剤（１〜２５mMのＥＤＴＡ）をも含む緩衝溶液（１０〜５０mMトリスＨＣｌ、pH８．０）で再懸濁する。次いで、混合物（通常１０〜１００μＬ）を酸で洗浄した無菌のガラスビーズが入っている１．５mLのネジフタ式のコニカルミクロチューブ（V. WR. Scientific Products, Mississanga, Ont, Canada）へと移す。そこには２つのサイズのビーズがあり、第１のビーズは１５０〜２１２μｍの範囲（カタログ番号G1145, Sigma, St-Louis, MO, USA）であり、そして第２のビーズは７１０〜１１８０μｍの範囲（カタログ番号G1152, Sigma）である。万能溶解用混合物において、２種類のビーズが４：１の比（ｗ／ｗ）で混合されており、そしてビーズの総重量は０．０５ｇ／ミクロチューブである。一方で、酵母溶解用混合物の場合は、ビーズを１：１の比（ｗ／ｗ）で混合しミクロチューブあたりのビーズの総重量が０．０２ｇである。
【００５８】
次に、ウィルス、細菌、真菌、寄生生物、動物又はヒトの核酸が、細胞が機械的な作用によって中断されている場合に放出される。機械的な力は、ミクロチューブをFisher ScientificのGenie２型ボルテックス上でパワーレベル７で１〜５分に渡りボルテックス掛けすることによって供される。細胞を破壊する代わりの方法は、QbiogeneのFast Prep（登録商標）ＦＰ１２０装置をパワーレベル６にセットし４５秒に渡り用いることである。
【００５９】
最後の段階には、調製物を加熱することによってＮＡＴアッセイの潜在的な妨害物質を中立化せしめることを伴う。用いられる温度は５５℃〜１００℃で様々であるが、好適には、本プロトコルは９５℃を用いる。加熱時間は１〜１５分で様々であって良く、通常の時間は２〜５分である。
【００６０】
このプロトコルを用いることで、我々は様々な微生物から、ＰＣＲ増幅に適切な核酸を抽出できた。その微生物とは、例えば：バチルス・セレウス（Bacillus cereus）、Ｂ．サブチリス（栄養細胞及び内生胞子）、Ｂ．アントラキス（B. anthracis）（栄養細胞、内生胞子及び発芽胞子）、カンジダ・アルビカンス、カンジダ・ドゥブリニエンシス（Candida dubliniensis）、カンジダ・クルセイ（Candida krusei）、カンジダ・パラプシロシス（Candida parapsilosis）、カンジダ・トロピカリス（Candida tropicalis）、クロストリジウム・ディフィシル（Clostridium difficile）、コリネバクテリウム・アクコレンス（Corynebacterium accolens）、コリネバクテリウム・ゲニタリウム（Corynebacterium genitalium）、コリネバクテリウム・ジェイケニウム（Corynebacterium jeikeium）、コリネバクテリウム・、クシュエリ（Corynebacterium kutscheri）、コリネバクテリウム・ミヌティシマム（Corynebacterium minutissimum）、コリネバクテリウム・ストリアタム（Corynebacterium striatum）、クリトスポリジウム・パルバム（Crytosporidium parvum）、エンテロバクター・クロアカエ（Enterobacter cloacae）、エンテロコッカス・ファエカリス（Enterococcus faecalis）、エンテロコッカス・ファエシウム（Enterococcus faecium）、大腸菌、ヒト免疫不全ウィルス１（ＨＩＶ−１）、クレブシエラ・オキシトカ（Klebsiella oxytoca）、クレブシエラ・ニューモニアエ（Klebsiella pneumoniae）、メタノブレビバクター・スミチイ（Methanobrevibacter smithii）、ミクロコッカス・ルテウス（Micrococcus luteus）、マイコバクテリウム・スメグマチス、ポルフィロモナス・ジンジバリス（Porphyromonas gingivalis）、ポルフィロモナス・グラエ（Porphyromonas gulae）、シュードモナス・アルギノーサ（Pseudomonas aeruginosa）、サルモネラ・コレラエスイス（Salmonella choleraesuis）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）、セラチア・マルセセンス（Serratia marcescens）、シゲラ・ジセンテリアエ（Shigella dysenteriae）、スタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）、スタフィロコッカス・エピデルミジス（Staphylococcus epidermidis）、スタフィロコッカス・サプロフィチカス（Staphylococcus saprophyticus）、ストレプトコッカス・アグラクチエ、ストレプトコッカス・ミチス（Streptococcus mitis）、ストレプトコッカス・ミュータンス（Streptococcus mutans）、ストレプトコッカス・パラウベリス（Streptococcus parauberis）、ストレプトコッカス・ニューモニアエ（Streptococcus pneumoniae）、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Streptococcus pyogenes）、ストレプトコッカス・サリバリウス（Streptococcus salivarius）、ストレプトコッカス・サングイニス（Streptococcus sanguinis）、及びエルシニア・エンテロコルチカ（Yersinia enterocolitica）である。
【００６１】
ＲＵＣＬＡＮＡＰを用いて抽出された核酸は、−８０℃又は−２０℃で凍結保存した場合数ヶ月に渡り安定なままであり、そして繰り返し解凍されても良い（実施例３，５，１１、及び１２を参照のこと）。出発試料によっては、臨床試料に由来するＤＮＡ調製物を、４℃で保存した場合、２４時間以内にＰＣＲ増幅のために用いることができ（実施例５を参照のこと）、一方で、微生物培養物に由来するＤＮＡ調製物（４℃で保存した）は、最大で１週間に渡り使用できる。上記の保存条件の全てにおいて、ＰＣＲ感度の有意な喪失は確認されなかった。
【００６２】
実施例２：
ＲＵＣＬＡＮＡＰと微生物培養物からＤＮＡを迅速に抽出するための市販の８種類のキットとの比較。  微生物培養物からＤＮＡを迅速に単離するための市販の８種類のキットを本発明の方法と比較した。我々は以下の微生物からＤＮＡを調製するこれらのキットの効率を検証した。その微生物とは：（ｉ）大腸菌ＡＴＣＣ２５９２２（グラム陰性細菌）、（ii）Ｅ．ファエシウムＡＴＣＣ１９４３４及びＳ．アウレウスＡＴＣＣ２５９２３（グラム陽性細菌）及び（iii）Ｃ．アルビカンスＡＴＣＣ５６８８４（真菌）である。増殖の中間対数期にある培養ブロス（ＯＤ600はおよそ細菌について約０．５及び真菌について０．８）を試験試料として用いた。
【００６３】
従って、９種類の方法を、ＰＣＲのために適切なＤＮＡを４つの異なる微生物から抽出するためのそれらの能力を比較することによって評価した。以下のＤＮＡ抽出方法を製造説明書に従い実行した。
・Ｋ１：Fast RNATM blueキット（Qbiogene）；
・Ｋ２：Dynabeads（登録商標）DNA DIRECTTM (Dynal Biotech、Lake Success、NY, USA）；
・Ｋ３：NucliSens（登録商標）(Organon Teknika、bioMeerieux、Marcy I'Eetoile、France）；
・Ｋ４：GeneReleaser（登録商標）(BioVentures Inc.、Murfreesboro、TN, USA）；
・Ｋ５：High Pure（登録商標）PCR Template preparationキット（Roche、Basel、Switzerland）；
・Ｋ６：Instagene（登録商標）Matrix (Bio-Rad Laboratories、Mississauga、Ont.、Canada）；
・Ｋ７：QlAamp（登録商標）Tissueキット（Qiagen、Mississauga、Ont.、Canada）；
・Ｋ８：Fast DNATMキット（Qbiogene）；
・Ｋ９：RUCLANAP．
【００６４】
この実験のために用いたＲＵＣＬＡＮＡＰプロトコルを実施例１に記載しており、以下の条件を用いている。その条件とは：キレートバッファー＝５×ＴＥ（５０mMのトリス−ＨＣｌ、pH８．０、５mMのＥＤＴＡ）；ガラスビーズ＝万能溶解混合物；機械的作用＝ボルテックスで５分に渡りスピードレベル７で行うことである。異なる方法との間での比較を容易にするためにオリジナルのキットプロトコルに多少のささいな変更を加えた。これらの変更とは：（ｉ）中間対数期における体積１００μＬの細菌培養物を各方法と共に常に用い、そして（ii）ＤＮＡ調製物の最終体積を常に１００μＬへ調整しておいた。各方法で得られたＤＮＡ抽出物を連続的に希釈し、１０5〜１ゲノムコピー／μＬ当量に到達せしめた。
【００６５】
細菌の（１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子もしくは真菌１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の保存されている領域を、細菌もしくはＣ．アルビカンスからＤＮＡの増幅をするための標的として用いた。前記１６Ｓ ｒＲＮＡプライマーは以前の我々の特許に記載がある（配列番号１２６及び１２７、米国特許５，９９４，０６６号）。一方で、１８Ｓ ｒＲＮＡプライマーは刊行物（van Barikら、1998, J. Clin Microbiol. vol. 36: pp. 1169〜1175）に記載があった。増幅反応を２０μＬの反応混合物中で行った。その反応混合物は、５０mMのＫＣｌ、１０mMのトリス−ＨＣｌ（pH９．０）、０．１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、２．５mMのＭｇＣｌ2、各０．４μＭの選定の２つのＰＣＲプライマー、各２００μＭの４つのデオキシヌレオシド三リン酸、TaqStart（登録商標）抗体（Clontech Laboratories Inc., Palo Alto, CA, USA）と組み合わせた０．５ＵのTaq DNAポリメラーゼ（Promega, Madison, WI, USA）を含有する。潜在的に試薬混合物中に存在する混入核酸の除去を刊行物（Meierら、1993, J. Clin Biology, Vol 31: pp. 646〜652）に記載されているようにして行った。１μＬの希釈した核酸調製物を１９μＬの反応混合物中へと移し、ＤＮＡエンジンＰＴＣ−２００（登録商標）サーマルサイクラー（MJ Research Inc., Waltham, MA, USA）を用いるサーマルサイクリング（９４℃で３分、次いで３０サイクルの、変性段階のために９５℃で３０秒、アニーリング段階のために５５℃で３０秒、及び伸長段階のために７２℃で３０秒、しかる後に最終伸長段階を７２℃で２分）に委ねた。
【００６６】
ＰＣＲ増幅した反応混合物１０μｌを、mLあたり０．５μｇのエチジウムブロミドを含む２％アガロースゲルにおいて、１７０Ｖで３０分に渡る電気泳動により分析した。増幅産物のサイズを分子サイズ５０bpの標準ラダーとの比較によって見積った。
【００６７】
表１に示すように、ＤＮＡ回収に関する最大の効率をＫ９（本発明中で記載のＲＵＣＬＡＮＡＰ法）で達成し、次には順にＫ１，Ｋ５，Ｋ７，Ｋ６，Ｋ３，Ｋ８，Ｋ２及びＫ４で達成した。キット間での効率の差は、試験した微生物種により、０．５〜４logの範囲にある。操作段階及び必要とされる時間に基づき分析した場合、最も都合の良いキットは、５段階のプロトコルで所要１５分間のＫ９であり、それに次いでＫ２，Ｋ６，Ｋ１，Ｋ８，Ｋ４，Ｋ５，Ｋ３及びＫ７であった。これらの抽出方法は、４〜４０段階のプロトコルで、完了するまで１５〜１５０分を要する。全体的に見て、微生物から迅速にＤＮＡを抽出するための最も効率的且つ簡単な方法はＲＵＣＬＡＮＡＰであった。
【００６８】
実施例３：
Ｓｈｉｇａ毒素生産細菌を検出するためのＲＵＣＬＡＮＡＰの使用。  このアッセイをJounal of Clinical Microbiology 2002, vol 4: pp. 1436〜1440中で公開している。この刊行物中では試料調製プロトコルに関する情報を開示してはいない。Ｓｈｉｇａ毒素生産大腸菌及びシゲラ・ジセンテリアエは出血性の下痢及び溶血性の尿毒性症候群を引き起こす。現在、同定は主にＳ．ジセンテリアエ及び大腸菌抗原型Ｏ１５７：Ｈ７の表現型同定に依存している。しかし、他の抗原型の大腸菌は、１型及び／又は２型のＳｈｉｇａ毒素の生産者であることが次第に分かって来ている。各Ｓｈｉｇａ毒素遺伝子ｓｔｘ１及びｓｔｘ２中に存在する非常に良く保存されている領域を標的とするＰＣＲプライマーの２組を、それらの遺伝子の全ての変異型を増幅するために設計した（以前の我々の特許公報ＷＯ０１／２３６０４に記載されている）。第１プライマー対のオリゴヌクレオチド（配列番号１０８０及び１０８１）は、ｓｔｘ１遺伝子に由来する１８６bpの増幅産物をもたらす。このアンプリコンに関して、分子標識（配列番号１０８４）（特許公報ＷＯ０１／２３６０４）を、蛍光標識６−カルボキシ−フルオレセインを用いてのｓｔｘ１特異的検出のために設計した。第２番目のＰＣＲプライマー対のオリゴヌクレオチド（配列番号１０７８及び１０７９）は、ｓｔｘ２遺伝子に由来する１６０bpの増幅産物をもたらす。分子標識（配列番号１０８５）（特許公報ＷＯ０１／２３６０４）を、蛍光標識５−テトラクロロ−フルオレセインを用いてのｓｔｘ２の特異的検出をするために設計した。両方のプライマー対を多数のＰＣＲアッセイにおいて組み合わせている。
【００６９】
糞便試料を以下の方法で調製した。固体糞便物質に対して、無菌スワブを前記試料中に浸し、次いでＴＥバッファー（１０mMのトリスＨＣｌ、１mMのＥＤＴＡが１mL入っている１．５mLのネジフタ式ミクロチューブへと移した。スワブの首（stem）をガーゼで包みそれが壊れるまで折り曲げておき、そうすることによって、菌が付いているスワブの部分が入っているミクロチューブを閉じることができるだろう。糞便物質を溶液中で激しく１５秒以上ボルテックス掛けをすることにより再懸濁せしめた。５０μＬアリコートを、１．５mLのネジフタ式ミクロチューブ（酸で洗浄された無菌のガラスビーズ（実施例１に記載の万能溶解用混合物が入っている）へと移した。液体糞便物質に関して、５０μＬアリコートの排泄物を直接、ビーズが入っているミクロチューブへと移した。続いて、前記ミクロチューブを、Fisher ScientificのGenie２型によりスピードレベル７で５分に渡りボルテックス掛けした。素速い遠心回転の後、前記ミクロチューブを９５℃で５分に渡り加熱した。次いで、１０，０００ｇでの遠心を２分行った。上清を他のミクロチューブに移し、１．５μＬの１：１０及び１：２０希釈物をＰＣＲ反応中で用いた。抽出物は−２０℃で１週間以上に渡り、ＰＣＲ分析感度における任意の有意なロスを伴わずに保存できるだろう。
【００７０】
ＰＣＲ増幅を、０．８μＭの各プライマー（配列番号１０８０及び１０８１）、０．５μＭの各プライマー（配列番号１０７８及び１０７９）、０．３μＭの各分子標識、８mMのＭｇＣｌ2、４９０μｇ／mLのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、０．２mMのｄＮＴＰｓ（Amersham Biosciences、Uppsala、Sweden）、５０mMのトリス−ＨＣｌ、１６mMのＮＨ4ＳＯ4、１×TaqMaster（Eppendprf、Hamburg、Germany）、TaqStart（登録商標）抗体（Clontech）と組み合わされた２．５ＵのKlenTaq 1 DNAポリメラーゼ（AB Peptides, St. Louis, MO, USA）及び１．５μＬの調製された排泄物試料を２５μＬの最終反応体積において用いて行った。ＰＣＲ増幅をSmartCycler（登録商標）サーマルサイクラー（Cepheid, Sunnyvale, CA, USA）を用いて行った。最大感度及び特異性のための至適サイクル条件は、初期変性のための９５℃で６０秒、次いで４５サイクルの９５℃で１０秒、５６℃で１５秒及び７２℃で５秒の３第階からなるである。ＰＣＲ産物の検出を、分子標識がその標的に対してハイブリダイズした場合に放射する蛍光シグナルを５６℃での各アニーリング段階の最後で測定することによって、リアルタイムで行った。
【００７１】
前記アッセイは、ＰＣＲ結果の完全な関連性及び各種Ｓｈｉｇａ毒素に対して特異的な抗体を用いて行った表現型による特性決定によって示されたように、両方の毒素の検出に対して特異的であった。前記アッセイを、世界の様々な地域から単離した、１０のＯ１５７：Ｈ７大腸菌、５つの非Ｏ１５７：Ｈ７大腸菌及び４つのＳ．ジセンテリアエなど、いくつかのＳｈｉｇａ毒素生産株に対して行った。このＰＣＲアッセイの検出限界は、約１０5コロニー形成単位（CFU）／糞便物質（ｇ）であった。このアッセイの有効性を、２７人の患者から得た３８の糞便試料を試験することによって確認した。これらの試料のうち、２６個はｓｔｘ１及び／又はｓｔｘ２に関して陽性であった。培養結果と比較して、感度及び陰性適中率（negative predictive value）はどちらも１００％であった。特異性は９２％であり、そして陰性適中率は９６％であった。ＲＵＣＬＡＮＡＰは、液体又は個体排泄物の両方に対し、それらが微量の血液を含むか否かによらず有効に働いた。
【００７２】
実施例４：
ＲＵＣＬＡＮＡＰを用いることでの、ＰＣＲ増幅のための血小板濃縮物の調製。  微生物汚染は保存期間中に進行するので、血小板調製物は、微生物汚染について確認される必要がある。プライマーをｔｕｆ遺伝子断片から設計した。血小板濃縮物の１７種の主要な汚染細菌の保存されているオリゴヌクレオチド配列（２４５bp及び３６８bpの増幅産物をもたらす、以前の我々の特許公報ＷＯ０１／２３６０４に記載されている、オリゴヌクレオチド配列番号６３６，６３７，５５３及び５７５）を選定することによって、これら細菌種の検出が可能になった。前記アッセイにより効率的にゲノムＤＮＡが検出される１０４の細菌種は以前の我々の特許刊行物ＷＯ０１／２３６０４の表１４に列挙されている。
【００７３】
これらのＰＣＲ産物の検出を、二本鎖ＤＮＡに対して結合する蛍光色素のＳＹＢＲ（登録商標）Green I（Molecular Probes Inc., Eugene, OR, USA）を用いて、Light Cycler（登録商標）サーマルサイクラーにより行った。
【００７４】
各々１７の主要な汚染細菌を注射した血小板濃縮物（２５０μＬ）を、ガラスビーズ（万能溶解用混合物、実施例１を参照のこと）が入っている１．５mLのネジフタ式ミクロチューブ中６００μＬのPrecoll SIM-40（４０％のPercoll (Amercham Biosciences）及び６０％ペプトン水（BD Microbiology Systems, Cockysville, USA)）上での浮遊密度分離に委ねた。混合物を１６２００ｇで７５秒に渡り遠心した。上清を除去し、そしてペレットを１mLの０．０１Ｍリン酸緩衝塩類溶液（ＰＢＳ）（ｐＨ７．４）と反転させることによって混合した。１００００ｇで５分に渡る遠心後、上清を除去し、そしてペレットを２０μＬのＴＥ又は超純水中で再懸濁せしめた。細胞をFast Prep（登録商標）ＦＰ−１２０装置（Qbiogene）においてパワーレベル６で４５秒に渡り中断した。素速い回転の後、ミクロチューブを９５℃で２分加熱した。各調製物１μＬをＰＣＲ増幅のために用いた。
【００７５】
Light Cycler（登録商標）によるＰＣＲ産物の蛍光検出を、最終体積１５μＬの、各１．０μＭの万能プライマー及び各０．４μｍのスタフィロコッカス特異的プライマー、４．５mMのＭｇＣｌ2、０．４mg／mLのＢＳＡ、０．２mMのｄＮＴＰｓ（Amersham Biosciences）、ＰＣ２バッファー（５０mMのトリス−ＨＣｌ、３．５mMのＭｇＣｌ2、ＢＳＡ  ０．１５mg／mL、１６mMのＮＨ4（ＳＯ4）2）、TaqStartTM抗体（Clontech）と組み合わされた１．８７５ＵのKlenTaq DNAポリメラーゼ（AB Peptides）及び０．５×ＳＹＢＲ（登録商標）Green I (Molecular Probes, Inc.）を用いて行った。試薬混合物中に潜在的に存在する汚染核酸の除去を上記に記載のようにして行った。最大感度及び特異性のための至適サイクル条件は、初期の変性のための９４℃で１分、次いで、９５℃で０秒、次いで６０℃で５秒及び７２℃で９秒の３つの段階からなる４５サイクルであった。増幅を各伸長サイクルの間に蛍光のレベルを測定することによって確認し、そして増幅の後、融解曲線解析を行った。このアッセイにより、ＲＵＣＬＡＮＡＰを用いることで、血小板濃縮物の全ての優占汚染細菌に由来するＤＮＡを抽出した。分析感度試験を血小板の９の頻出汚染細菌に対して行った。その細菌とは：エンテロバクター・クロアカエ、バチルス・セレウス、サルモネラ・コレラエスイス、セラチア・マルセセンス、シュードモナス・アルギノーサ、スタフィロコッカス・アウレウス、スタフィロコッカス・エピデルミジス、大腸菌及びクレブジエラ・ニューモニアエである。これら試験した９種全ての検出限界は、＜２０CFU／mL血小板濃縮物であった。
【００７６】
実施例５：
肛門、膣、及び膣／肛門標本の組み合わせ標本中のＢ群ストレプトコクチを検出するためのＲＵＣＬＡＮＡＰの使用。  Ｂ群ストレプトコクチの迅速な検出をするための常用及びリアルタイムのＰＣＲアッセイの開発を最初、Clinical Chemistry, 2000, vol. 46: 324〜331中で公開した。その後これらのアッセイに基づく臨床研究をNew England Journal of Medicine, 2000, vol. 343: pp. 175〜179に記載した。これらの刊行物中では、試料調製プロトコルに関する情報を開示してはいない。妊娠中の女性のＢ群のストレプトコクチに関する通常のスクリーニングをするための２つのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）アッセイの効率を分娩時に調べた。肛門、膣及び膣／肛門標本の組み合わせを１１２人の妊娠中の女性から獲得し；女性５７人に関しては、羊膜が破れる前後に標本を得た。標本をＢ群のストレプトコクチに関して、（ｉ）標準的な、選択培養ブロスの培養によって、（ii）常用のＰＣＲアッセイにより、そして（iii）蛍光ＰＣＲアッセイによって、試験した。
【００７７】
これらの研究においてＤＮＡの増幅をするための臨床試料を調製するために用いた迅速溶解プロトコルは以下のとおりである。
Ａ．肛門、膣又は肛門−膣表層を採取するのに用いたBBL Culturette（登録商標）スワブ（BD Microbiology System）を３００μＬのＧＮＳ培地（８μｇ／mLのゲンタマイシン及び１５μｇ／mLのナリジクス酸を捕捉したTodd-Hewittブロス）が入っている１．５mLのネジフタ式ミクロチューブ中に挿入した。スワブの先端をチューブの周りで転がし液体を最大限吐き出させた。
Ｂ．１０μＬのアリコートを酸で洗浄した無菌のガラスビーズ（実施例１に記載の万能溶解用混合物）０．０５ｇが入っている１．５mLのネジフタ式のミクロチューブへと移し、それに４０μＬのＴＥバッファーを加えた。前記ミクロチューブをFisher ScientificのGenie２型ボルテックスによりスピード７で５分に渡りボルテックス掛けした。
Ｃ．素速い遠心回転の後、前記ミクロチューブを２分に渡り９５℃で加熱した。
Ｄ．前記混合物１．５μＬを直接ＰＣＲ反応において用いた。抽出物は−２０℃で１週間以上に渡り、ＰＣＲ分析感度における任意の有意なロスを伴わずに保存できるだろう。
【００７８】
培養に基づき、１１２人の女性中３３人からの膣／肛門組み合わせ標本がＢ群のストレプトコクチに関して陽性であった（コロニー形成率２９．５％）。２つのＰＣＲアッセイで、これら３３人の女性のうち３２人からの標本においてＢ群ストレプトコッカスのコロニー形成を確認した。即ち、１つの陰性ＰＣＲ結果とは膜の破裂後に得た試料であった。培養の結果との比較をした場合、両ＰＣＲアッセイの感度は９７％でありしかも、陰性適中率は９８．８％であった。２つのＰＣＲアッセイの特異性及び陽性適中率はどちらも１００％であった。結果を得るために要する時間の長さは、蛍光ＰＣＲアッセイに関して３０〜４５分、常用のＰＣＲアッセイに関して１００分であり、そして培養法に関しては３６時間以上であった。
【００７９】
代わりに、上記のプロトコルを以下の態様でも用いた。
Ａ．肛門、膣又は肛門−膣表層を採取するのに用いたBBL Culturette（登録商標）スワブ（BD Microbiology System）をＴＥバッファー１mLが入っている１．５mLのネジフタ式ミクロチューブ中に挿入した。スワブの首をガーゼで包みそれが壊れるまで折り曲げ、そうすることによって、菌が付いているスワブの部分が入っているミクロチューブを密封できるだろう。
Ｂ．細胞を溶液中で１５秒以上激しくボルテックス掛けをすることにより再懸濁せしめた。５０μＬアリコートを酸で洗浄した無菌のガラスビーズ（実施例１に記載の万能溶解用混合物）０．０５ｇが入っている１．５mLのネジフタ式のミクロチューブへと移した。前記ミクロチューブをFisher ScientificのGenie２型ボルテックスによりスピード７で５分に渡りボルテックス掛けした。
Ｃ．素速い遠心回転の後、前記ミクロチューブを２分に渡り９５℃で加熱した。
Ｄ．前記混合物１．５μＬを直接ＰＣＲ反応において用いた。
【００８０】
ＲＵＣＬＡＮＡＰ法によるストレプトコッカス・アガラクチアエを溶解せしめる効率を生菌数計測によって測定した場合、９９．９９％と見積った。
【００８１】
実施例６：
尿試料からＳ．サプロフィチカスを直接検出するためのＲＵＣＬＡＮＡＰの適用。  このアッセイをJournal of Clinical Microbiology, 2000, vol. 38: pp. 3280〜3284中で公開している。この刊行物中では試料調製プロトコルに関する情報を開示してはいない。スタフィロコッカス・サプロフィチカスは、若く、性的に活発な女性の外来患者における急性尿路感染症（ＵＴＩ）に伴い最も頻繁に出現する微生物のうちの１つである。生化学的特性に基づく常用の同定法により効率的にＳ．サプロフィチカスを同定することができるが、これらの方法の迅速さについては改善を要する。尿試料から迅速且つ直接的にこの細菌を同定することは、臨床微生物診療所においてＳ．サプロフィチカスの診断を加速せしめるために有用であるだろう。Ｓ．サプロフィチカスの特異的検出をするためのＰＣＲに基づくアッセイを開発して来た。Ｓ．サプロフィチカスに対して特異的な３８０bpのアービトラリープライムＰＣＲ増幅産物の配列を決定し、そして１組のＳ．サプロフィチカス特異的ＰＣＲ増幅プライマー（特許公報ＷＯ０１／２３６０４の配列番号１２０８及び１２０９）を設計するために使用した。アンプリコン解析をするための、標準アガロースゲル電気泳動を用いるＰＣＲアッセイは、４９のグラム陽性細菌種及び３１のグラム陰性細菌種に由来するＤＮＡで試験した場合、Ｓ．サプロフィチカスに対して特異的であった。このアッセイでは、地球上の様々な地域に由来する、試験した６０のＳ．サプロフィチカスの全ての株からＤＮＡを効率的に増幅することもできた。このアッセイを尿試料からの直接検出をするために適合せしめた。
【００８２】
尿試料から核酸を放出させるため、細菌細胞を迅速に溶解せしめるのに用いたプロトコルは以下のとおりである。それは：様々な量のＳ．スプロフィチカス細胞を注射した５００μＬの尿試料を、酸で洗浄した無菌のガラスビーズ（実施例１に記載の万能溶解用混合物）が０．０５ｇ入っているネジフタ式のミクロチューブへと移した。１５８００ｇで５分に渡り遠心した後、上清を捨て、そしてペレットを１mLのＰＢＳで洗浄した。更なる、１５８００ｇで５分に渡る遠心の後、その上清を捨てた。次いで、５０μＬのＴＥ又はＰＢＳをチューブへと加え、そしてFisher ScientificのGenie２型ボルテックスによりスピードレベル７で５分に渡りボルテックス掛けをすることによって再懸濁及び溶解せしめた。次に、９５℃で２分の加熱段階を行った。調製した尿試料１μｌを直接ＰＣＲ反応に加えた。ＲＵＣＬＡＮＡＰ処理した尿試料により達成した分析感度レベルは、０．３〜１．４CFU／４０サイクルの増幅を伴うＰＣＲ反応、であった。対照的に、ＰＣＲに対して直接加えた注射された尿試料（処理ナシ）は７００〜８００CFU／ＰＣＲの検出限界であった。Ｓ．サプロフィチカスを特異的に検出するためのこのＰＣＲアッセイは簡単且つ迅速（尿標本調製のために要する約１０分を含む、約９０分）である。
【００８３】
実施例７：
血液試料中のカンジダ・アルビカンス、大腸菌及びスタフィロコッカス・アウレウスの検出。  真菌及び細菌の核酸を感染血液から検出する手順を考え出した。血液は、多量の有力なＰＣＲ妨害物質を含んでいるので、ＲＵＣＬＡＮＡＰプロトコルの前に迅速に洗浄をすることが要求される。様々な量の細菌及び真菌細胞を注射した血液試料（１mL）を、万能溶解又は酵母溶解するためのガラスビーズ（実施例１）が入っている１．５mLのミクロチューブに加えた。次いで３回の逐次洗浄を前記チューブに対して１mLのＴＥバッファーを添加して素速く混合し、そして遠心段階（２１０００ｇで１分に渡る）及び各洗浄の間に吸引により上清の除去をすることによって行った。最後の洗浄の後に、素速い遠心回転を行い、そして残留液を、穏和な吸引によって除去した。１２．５μｌの５×ＴＥバッファーをビーズに対して加え、次いで細胞をFast Prep（登録商標）ＦＰ−１２０装置においてパワーレベル６で４５秒に渡り中断せしめた。素速い遠心回転後、ミクロチューブを９５℃で２分加熱し、そして素速く遠心した。調製物２〜４μＬをＰＣＲ増幅のために用いた。以前の我々の特許公報ＷＯ０１／２３６０４に記載した種特異的ＰＣＲアッセイを用いて、我々は以下の検出限界を達成した。それは：大腸菌に関して４０CFU／mL血液、スタフィロコッカス・アウレウスに関して３０CFU／mL血液、及びカンジダ・アルビカンスに関して５０CFU／mL血液であった。最後の加熱段階を省くことにより感度のロスがもたらされた。これは、洗浄した血液試料中に依然として存在するＰＣＲ妨害物質を加熱することによって首尾良く除去できることを裏づけている。
【００８４】
実施例８：
臨床試料からのヒトＤＮＡを抽出をするためのＲＵＣＬＡＮＡＰ。  我々の目標は微生物由来のＤＮＡを検出することだが、ヒトＤＮＡをも実施例３〜７，１１，１２，１５及び１７に記載の臨床試料から抽出している。例えば、β−グロブリン遺伝子に対して特異的なプライマー（Swanら、1999, J. Clin. Microbiol. vol. 37: pp. 1030-1034）を用いて、我々は、実施例１２に記載のように、ＲＵＣＬＡＮＡＰによる処理をした直腸スワブ中においての１１〜１０4コピーのこのヒト遺伝子標的を検出できうる。
【００８５】
ＲＵＣＬＡＮＡＰは遺伝学目的のために有用であるのみならず、サンプリング手順の効率を確認するのにも有用である。個々の試料の検証は、サンプリングするために用いたスワブ上に乗っているヒトＤＮＡを測定し、そして規定域値と結果を測定することによって確認できる。
【００８６】
実施例９：
バチルス・サブチリスの内生胞子に対するＲＵＣＬＡＮＡＰの効果。  細菌内生胞子からのＤＮＡの回収が記載されて来たが、ＰＣＲ感度を妨害するような、激しく切断されたＤＮＡをもたらす退屈な方法が多くの研究で用いられている（Kuskeら、1998, Appl. Environ. Microbiol. vol. 64: pp. 2463〜2472）。これらの著者が、ビーズ粉砕ホモジネーションは、細菌内生胞子調製物からＤＮＡを抽出するための唯一の有効な方法であったことを証明した。ここで我々は、ＲＵＣＬＡＮＡＰの胞子に対する有効性を証明する。
【００８７】
内生胞子を濃縮して精製するための以下のプロトコルをBelgraderらの方法（Analytical Chemistry 1999, vol. 71: pp. 4232〜4236）を基に適合せしめた。胞子形成培地中（Methods for General and Molecular Bacteriology, 1994, American Society for Microbiology, Washington, DCにおけるHoltとKrieg, Ennichment and Isolation）で増殖したバチルス・サブチリスの培養物５０mLをボルテックスに掛け、次いで２５mLの体積２つに分けた。２５００ｇで２０分に渡る遠心後、ペレットを５mLの無菌蒸留水で３回洗浄し、各洗浄では２５００ｇで１０分に渡る遠心を行った。最終ペレットを、５０mMのＮａＣｌ、１００mMのＥＤＴＡ（pH６．９）４mL中で再懸濁せしめた。リゾチームを最終濃度１mg／mLで添加し、混合物を３０℃で９０分に渡りインキュベートした。上記のように更なる２回の洗浄後、ペレットを５％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、１mL中で再懸濁せしめた。
【００８８】
次に、２５０μＬの上記の内生胞子懸濁を、１．５mLのネジフタ式ミクロチューブ中６００μＬのPercoll SIM-40 (４０％のPercoll及び６０％のペプトン）上での浮遊密度分離に委ねた。混合物を７５０ｇで１５分に渡り遠心した。ペレットを２５０μＬの無菌水で３回洗浄し、各洗浄につき９３００ｇで２分に渡る遠心を行った。最終ペレットを１００μＬの無菌蒸留水中で再懸濁せしめた。最終的に精製された胞子懸濁を連続１／１０希釈し、１×１０-8の最終係数にした。各希釈物１００μＬを細菌数を計測するために血液寒天プレート上へかあるいは、内生胞子数を計測するために血球計上のいずれかへと置いた。最終的に精製された内生胞子の懸濁は１．７３×１０10内生胞子／mLからなり、それは、５．７×１０9CFU／mLに対応する。
【００８９】
ＲＵＣＬＡＮＡＰアッセイを内生胞子溶解のために以下の方法で適合せしめた。体積１００μＬの精製した内生胞子の各連続希釈物を９３００ｇで５分遠心し、そのペレットを４０μＬのＴＥバッファー中で再懸濁せしめ、そしてガラスビーズ（万能溶解用混合物、実施例１を参照のこと）が入っている１．５mLのネジフタ式チューブへと移した。内生胞子をFast Pnep（登録商標）FP-120装置によりパワーレベル６で４５秒に渡り中断せしめた。素速い遠心回転の後、このミクロチューブを９５℃で５分に渡り加熱した。その後、溶解した物質の１／１０希釈物１００μＬを、内生胞子溶解をアッセイをするために血液寒天プレート上へと置いた。ＲＵＣＬＡＮＡＰによるバチルス・サブチリスの溶解効率を溶解処理の前及び後に行ったCFU計測に基づき、９８．８％と見積った。
【００９０】
１／１０希釈の溶解物質１μＬをＰＣＲ増幅のために用いた。プライマー（配列番号６４３及び６４４）を用いる万能細菌検出のためのＰＣＲアッセイを、以前の我々の特許公報ＷＯ０１／２３６０４に記載している。
【００９１】
未処理の内生胞子で決定された検出限界は、１．３×１０5〜１．７×１０6内生胞子／mLの幅にあり、一方でＲＵＣＬＡＮＡＰで溶解せしめた内生胞子の検出限界は、１．３×１０3〜１．７×１０4内生胞子／mL（約１００倍良い）の幅にあった。各ＰＣＲ反応チューブにおいて、未処理の内生胞子に関する検出限界３２０〜４３４０に比較して、３〜４３の検出限界でＲＵＣＬＡＮＡＰ処理内生胞子を検出できるであるだろう。ＲＵＣＬＡＮＡＰ前に胞子懸濁の更なる濃縮をすることにより、検出限界をCFU／mLについてより低くすることが可能である。
【００９２】
実施例１０：
ＲＵＣＬＡＮＡＰを用いてのウシ乳中の細菌の検出。  臨床乳腺炎はカンジダ症の乳牛における共通の疾患であり；浮汁を分泌するウシの約１／５がその生涯において臨床乳腺炎の症状を１つ以上有する。各場合のコストは１５０〜２００＄CANと見積もられるので、カナダの日常産業に対するロスは大まかに４４００万＄CAN／年と見積られ；米国においては、約１．８億＄であると見積られている。最も共通する細菌乳腺炎病原体はスタフィロコッカスｓｐ．、ストレプトコッカスｓｐ．、及び大腸菌（coliforms）である（Sargeantら、1998, Can. Vet J. vol. 39: pp. 33〜38）。我々は、ウシ乳中の細菌を検出するために、ＲＵＣＬＡＮＡＰ法に基づくプロトコルを設計した。
【００９３】
乳試料を最初に３７℃で６時間に渡りインキュベートした。ウシの乳から核酸を抽出するために、Percoll（登録商標）浮遊密度勾配を用いるプロトコルには、実施例４に記載のように、１５０〜２１２μｍのサイズの総重量０．０１ｇのガラスビーズを単独で用いた。スタフィロコッカス・アウレウスかあるいはストレプトコッカス・アガラクチアエに対する培養によって陽性の乳試料の８０〜１００％を、我々の、これら２つの細菌種を標的とする種特異的ＰＣＲアッセイ（実施例１１及び５にそれぞれ記載されているアッセイ）により検出した。
【００９４】
実施例１１：
鼻腔スワブ中のスタフィロコッカス・アウレウスを検出するためのＲＵＣＬＡＮＡＰの使用。  Martineauらによって記載されたＰＣＲアッセイ（2000, J. Antimicrob. Chemother. vol. 46: pp. 527〜534）の１つを、鼻腔スワブからスタフィロコッカスを検出するために、核酸を抽出するためのＲＵＣＬＡＮＡＰを用いて行った。用いたプロトコルは以下のとおりである。それは：
Ａ．鼻の粘膜を採取するのに用いたBBL Culturette（登録商標）スワブ（BD Microbiology System）を１．５mg／mLのＢＳＡを補択した３００μＬのＴＥバッファーが入っている１．５mLのネジフタ式ミクロチューブ中に挿入した。スワブの頭部をガーゼで包みそしてそれが壊れるまで折り曲げ、そうすることによってスワブの菌がついている部分が入っているミクロチューブを密封できるであるだろう。
Ｂ．細胞を溶液中で、ボルテックス掛けをすることにより再懸濁せしめ、５０μＬのアリコートを、酸で洗浄した無菌のガラスビーズ（実施例１に記載の万能溶解用混合物）０．０５ｇが入っている１．５mLのネジフタ式のミクロチューブへと移した。前記ミクロチューブをFisher ScientificのGenie２型ボルテックスによりスピード７で５分に渡りボルテックス掛けした。
Ｃ．素速い遠心回転の後、前記ミクロチューブを２分に渡り９５℃で加熱した。
Ｄ．素速い遠心回転の後、２μＬの混合物を直接、最初はMartineauらによって記載された（1998, J. Clin. Microbiol. vol. 36: pp. 618〜623）スタフィロコッカス・アウレウス特異的ＰＣＲアッセイを用いるＰＣＲ反応で用いた。抽出物は−８０℃で数ヶ月に渡り、ＰＣＲ感度における任意の有意なロスを伴うことなく保存できるであるだろう。
【００９５】
このＰＣＲアッセイでの予備研究において、８１の鼻腔スワブをＲＵＣＬＡＮＡＰプロトコルを用いて処理した。合計で３６の試料がスタフィロコッカス・アウレウスに関して培養陽性であり、そのうち３５試料を、我々のＰＣＲアッセイを用いて９７．２％の感度で検出した。鼻腔試料中に存在するＰＣＲ妨害物質を除去するためには加熱段階を欠かすことができなかった。
【００９６】
実施例１２：
ＲＵＣＬＡＮＡＰを用いての糞便試料からバシコマイシン耐性エンテロコクチの直接検出。  院内バンコマイシン耐性エンテロコクチ（ＶＲＥ）の発生の発生率増加は、ヒトからヒトへの伝染を予防するために、ＶＲＥがコロニーを形成した患者を早期に同定することは重要性であるということの証明となる。排泄物又は直腸試料からＶＲＥの検出をするための常用の培養法も信頼性があるが、完了するまでに２〜４日以上を要する。それ故に、我々は、糞便試料からＶＲＥを直接、迅速に検出するための代替方法として、キャプチャープローブバイブリダイゼーションと組み合わせた、ＰＣＲに基づくアッセイの使用を模索した。後者を２０００年１月にケベック市で院内ＶＲＥが発生した間に収集した。
【００９７】
５３３の排泄物又は直腸スワブに由来する糞便物質を（ｉ）選択的寒天培地を用いる標準的な培養方法及び（ii）キャプチャープローブハイブリダイゼーションと組み合わせた我々のＰＣＲアッセイによって分析した。前記ＰＣＲアッセイを、実施例３で記載した方法に類似する態様でＲＵＣＬＡＮＡＰ法で調製した糞便物質から直接行った。排泄物に関して、スワブを試料に浸し、次いで、１mLのＴＥバッファーが入っている１．５mLのネジフタ式ミクロチューブ中に挿入した。スワブの首先端をガーゼで包みそれが壊れるまで折り曲げ、そうすることによって、菌が付いている綿棒の部分が入っているミクロチューブを密封できるであるだろう。直腸スワブを同じ方法で１．５mLのネジフタ式ミクロチューブへと直接移した。糞便物質を溶液中で激しく１分に渡りボルテックス掛けすることによって再懸濁せしめた。５０μＬのアリコートを、酸で洗浄した無菌のガラスビーズ（実施例１に記載の万能溶解用混合物）０．０５ｇが入っている１．５mLのネジフタ式のミクロチューブへと移した。その後前記ミクロチューブをFisher ScientificのGenie２型ボルテックスによりスピード７で５分に渡りボルテックス掛けした。素速い遠心回転の後、前記ミクロチューブを２分に渡り９５℃で加熱した。次いで２μＬの１：２．５、１：５及び１：１０希釈物をＰＣＲ反応中で用いた。抽出物は−８０℃で数ヶ月に渡り、ＰＣＲ感度における任意の有意なロスを伴うことなく保存できるだろう。
【００９８】
ｖａｎＡ及びｖａｎＢに対して特異的なプライマー対からなる多重ＰＣＲアッセイを開発し、そしてそれぞれｖａｎＡ及びｖａｎＢアンプリコンを標的とする２つのキャプチャープローブを用いるＰＣＲ後ハイブリダイゼーションと組み合わせた。この多重ＰＣＲアッセイで用いたプライマー及びプローブを、以前の我々の特許ＷＯ０１／２３６０４の実施例２３に記載している。
【００９９】
２９の標本は、培養に基づき、ＶＲＥに関して陽性（全てエンテロコッカス・ファエシウム）であった。２９の培養陽性標本のうち２８がＰＣＲにより検出された。培養陽性標本の（ｉ）２６がｖａｎＡに関して陽性でありそして（ii）２つがｖａｎＡ及びｖａｎＢの両方に関して陽性であった。培養陰性標本のうちで、ＰＣＲにより更なる１つのｖａｎＡ陽性標本及び１０のｖａｎＢ陽性標本が検出された。全体的に、多重ＰＣＲアッセイは、９６．６％の感度及び９７．９％の特異性を有した。ＲＵＣＬＡＮＡＰ抽出に基づくこのアッセイは、糞便試料からＶＲＥを検出するためのスクリーニング試験を確実にし且つ迅速にする。
【０１００】
実施例１３：
ガラスビーズサイズの比又は、ビーズの総重量の変化がＲＵＣＬＡＮＡＰに対して及ぼす効果。  ａ）ガラスビーズサイズの比、又はｂ）万能溶解用混合物中で用いられるビーズの総重量の変更がＰＣＲ検出の感度に対する効果を有するかどうかを検証するために、次のような実験を計画して行った。最初に異なるビーズの比を比較した。万能溶解用混合物において、小ビーズ（１５０〜２１２μｍ）：巨大ビーズ（７１０〜１１８０μｍ）の比は、４：１であり、１．５mLの反応チューブあたり、４０mgの小ビーズ＋１０mgの巨大ビーズがある。他のビーズ比を比較のために試験し、ビーズの総重量を５０mgに維持した。
・３．５：１．５（３５mgの小ビーズ＋１５mgの巨大ビーズ）
・４：１（４０mgの小ビーズ＋１０mgの巨大ビーズ、万能混合物）
・４．５：０．５（４５mgの小ビーズ＋５mgの巨大ビーズ）
【０１０１】
次に、小／巨大ビーズの比及び総ビーズ重量を様々な組み合わせで比較した。
・１：１（１０mgの小ビーズ＋１０mgの巨大ビーズ、合計２０mg）
・２．５：１（２５mgの小ビーズ＋１０mgの巨大ビーズ、合計３５mg）
・４：１（４０mgの小ビーズ＋１０mgの巨大ビーズ、合計５０mg、万能混合物）
・５．５：１（５５mgの小ビーズ＋１０mgの巨大ビーズ、合計６５mg）
【０１０２】
最後に、小ビーズのみ、様々な総重量：２０mg、３５mg、５０mg及び６５mgを試験した。
【０１０３】
体積５０mLの、ストレプトコッカス・アガラクチアエＡＴＣＣ１３８１３の中間対数期培養物の連続１０倍希釈物を様々なビーズの混合物に対して添加した。ミクロチューブをFisher scientificのGenie２型ボルテックスによりスピードレベル７で５分に渡りボルテックス掛けした。素速い遠心回転後、ミクロチューブを９５℃で２分に渡り加熱した。次いで、１．５μＬの混合物をＰＣＲ反応で直接用いた。そのＰＣＲ反応は実施例５に記載した。
【０１０４】
上記の試験したビーズ比及び重量に関して、分析感度における有意な差はなかった。
【０１０５】
実施例１４：
粒子サイズが溶解効率に及ぼす効果。  粒子サイズが溶解効率に対して及ぼす効果についても、カンジダ・アルビカンス、大腸菌、エンテロコッカス・ファエカリス、スタフィロコッカス・アウレウス及びミクロコッカス・ルテウスにより試験した。
【０１０６】
細菌を血液寒天上３７℃で一晩増殖せしめた。酵母をSabouraud上３０℃で一晩増殖させしめた。細胞をＰＢＳ中で、１０8細胞／mL（Dade Behring比濁計（Deerfield, IL, USA）上で酵母に関して０．２３の読み値、及び細菌に関して０．０８の読み値）を達成するように再懸濁せしめた。
【０１０７】
粒子サイズが微生物細胞の溶解効率に対して及ぼす効果を検証するために、様々な種類及びサイズの固体粒子を試験した。その粒子とは：シグマの０．２ｇガラスビーズ（＜１０６μｍ、１５０〜２１２μｍ、２１２〜３００μｍ、４２５〜６００μｍ又は７１０〜１１８０μｍ）、先のガラスビーズサイズの全ての混合物０．２ｇ、又は０．２ｇのOttawa砂である。
【０１０８】
酵母に関しては、最も大きい粒子（７１０〜１１８０μｍ）並びにビーズの全サイズの混合物を用いた場合に、最適の分析感度を得た。次に良い結果を砂で、そして中間サイズのビーズによって達成した。
【０１０９】
細菌に関しては、１５０〜２１２μｍの小サイズのビーズ並びに全サイズのビーズの混合物が最適な結果をもたらした。重ねて、砂は効率が低かった。
【０１１０】
この結果によって、微生物細胞を効率的に溶解せしめるためには、全サイズのビーズを使用するかあるいは約７１０〜１１８０μｍ以内の幅と１５０〜２１２μｍ以内の幅で選択した２つ以上のサイズのビーズを使用する必要があることが示唆された。これらのサイズ（それらの全範囲又は２つの一層特異的な範囲）は溶解法のより良い再現性をOttawa砂よりももたらすだろう。何故なら、砂はロットごとに変わり、最終的に細胞を溶解せしめる効率に影響を及ぼし、そして最終的には、ＮＡＴアッセイの分析感度にも影響を及ぼすからである。
【０１１１】
実施例１５：
肛門／膣試料中に存在する潜在的な妨害物質がＰＣＲに及ぼす効果。  Ｂ群ストレプトコクチ（ＧＢＳ）を検出するためのＲＵＣＬＡＮＡＰの使用を実施例５に記載した。ＰＣＲを妨害する可能性を有する多くの物質は、妊娠中の女性が出産する直前にサンプリングした肛門、膣、又は組み合わせ膣／肛門の試料中に見出される。これらの物質としては、尿、羊膜流体、臍帯に由来する血液、膣分泌物、胎便、排泄物及び潤滑物（Johnson & Johnson, Markham, Ont., CanadaのＫ−Ｙ（登録商標）ゼリー）が挙げられる。それらの妨害可能性を評価するために、スワブを各これらの純粋な物質の試料いくつかに浸し、実施例５の最後に記載したＲＵＣＬＡＮＡＰプロトコルを行った。次いで、ＧＢＳリアルタイムＰＣＲアッセイを１００コピーの内部コントロール鋳型（Keら、2000, Clin. Chem. vol. 46: pp 324〜331）の存在下で、処理した試料（超純水中純粋又は希釈１：１）１．５μＬで行った。妨害作用の評価を、各これら妨害物質の存在下で内部コントロールによって放射された蛍光とネガティブコントロール（妨害物質を加えなかった）とを比較することによって行った。試験した全ての物質に関して、リアルタイムＰＣＲ蛍光シグナルはネガティブコントロールのシグナルと等しく、これは、ＲＵＣＬＡＮＡＰ手順により様々なＰＣＲ妨害物質を効率的に調節できることを示している。
【０１１２】
実施例１６：
細菌密度のＲＵＣＬＡＮＡＰに対する効果。  細菌密度がＲＵＣＬＡＮＡＰの効率に対して影響を及ぼすのかどうかを特定するために、２つのプロトコルを試験した。第一番目のプロトコルにおいて、細菌試料に対して連続希釈を、ＲＵＣＬＡＮＡＰでの溶解を行う前に行った。一方、第二のプロトコルでは、細菌の希釈を行わなかったが、溶解した物質に対する希釈を行った。寒天プレート上で一晩増殖せしめたスタフィロコッカスアウレウスを用いて、ＰＢＳ中で細菌懸濁を調製し、１０8細菌／mLを達成するように較正することによって出発試料を得た。
【０１１３】
懸濁の１／１０ずつの連続希釈をＰＢＳ中で、１０3細菌／mLを達成するまで行った。体積１００μｌの、初期の懸濁又は各１０倍希釈物をサイズ１５０〜２１２＋７１０〜１１８０μｍ（万能溶解用混合物、実施例１を参照のこと）のビーズと混合した。この混合物をFast Prep（登録商標）ＦＰ−１２０装置に置き、スピード６で４５秒に渡り振とうした。初期の懸濁（１０8細菌／mL）に由来する溶解物質をＴＥバッファー中で最終希釈係数１／１０００００を達成するまで連続的に希釈（１０倍希釈）していった。ＰＣＲをユニバーサルプライマー（以前の我々の特許ＷＯ０１／２３６０４に由来する。実施例１２に記載した）により、１μＬの溶解試料（又は希釈溶解試料）を用いて行った。
【０１１４】
２つのプロトコルの間での有意な差異はなかった。これは、少なくともここで試験した範囲では、試験試料中の細菌集団の密度が溶解効率に対して有意な影響を及ぼすことはないことを示唆している。
【０１１５】
実施例１７：
ＲＵＣＬＡＮＡＰを用いての大腸菌からの全長ＲＮＡ抽出。  ＲＵＣＬＡＮＡＰを用いることで、ｃＤＮＡ合成及びＲＴ−ＰＣＲによる増幅のために適切なＲＮＡを細菌細胞から抽出できうることを証明するためにこの実験を計画した。ＲＵＣＬＡＮＡＰを、ＲＮａｓｅ阻害物質を添加することによってＲＴ−ＰＣＲのために適合せしめた。体積５０μＬの中間対数増殖期の大腸菌ＡＴＣＣ２５９２２の培養ブロス（Ｏ．Ｄ．600＝０．５）を、ビーズの万能混合物が入っている１．５mLミクロチューブ中で遠心し、そして細胞ペレットを、４０Ｕの組み換えリボヌクレアーゼ阻害物質（ＲＮａｓｉｎ（登録商標）、Promega）を含む５０μＬの５×ＴＥバッファー中で再懸濁せしめた。次いで、基本的なＲＵＣＬＡＮＡＰプロトコル（実施例１）を万能溶解用混合物を用いて行った。溶解物の連続１０倍希釈をＴＥバッファーにおいて行った。
【０１１６】
次に、希釈した溶解物１０μＬを１０μＬの消化バッファー（２０mMのトリス−ＨＣｌ、pH８．０、５mMのＭｇＣｌ2、０．２mMのＣａＣｌ2）と混合し、そして３７℃で１分に渡り、１０ＵのＤＮａｓｅＩ（ＲＮａｓｅ−フリー、Roche）もしくは０．１４ＵのＲＮａｓｅＡ（ＤＮａｓｅ−フリー、Qiagen）もしくはＤＮａｓｅＡ及びＤＮａｓｅＩの両方のいずれかと共にかあるいは酵素を全く伴わずインキュベートした。全ての条件を試験した後に９５℃で５分の不活性化段階を行った。次いで、１μＬの処理した溶解物をＲＴ−ＰＣＲ反応又はＰＣＲ反応へと加えた。
【０１１７】
Platinum（登録商標）Ｔａｑを伴うSuperscript（登録商標）One-Step PCR（Invitrogen, Carsbad, CA, USA）を製造説明書に従って最終体積５０μＬで行った。逆転写及びＰＣＲの両方の段階を逐次、同じ反応チューブ中で行った。ｔｕｆ遺伝子を標的とし且つエスケリキア属に対して特異的なプライマー（特許ＷＯ０１／２３６０４における配列番号１６６１及び１６６５）を用いた。ｃＤＮＡ合成を５０℃で３０分のインキュベーション、しかる後に９４℃で２分の初期変性段階で達成した。その後のＰＣＲ増幅に関しては、９４℃で１５秒、５６℃で３０秒及び７２℃で３０秒の４０サイクルを行い、しかる後に７２℃で２分の最終伸長を行った。この増幅された混合物をゲル電気泳動（０．５μｇ／mLのエチジウムプロミドを含む、ＴＢＥ中２％のアガロースにて）で分離し、２５４nmのＵＶ照射下で視覚化した。
【０１１８】
試験した酵素の有効性を評価するために、上記と同じ条件を用いるＰＣＲを酵素処理した試料で並行して行った。ＤＮＡａｓｅＩ処理により、全てのＤＮＡが首尾良く分解されていた。その理由は、増幅可能な産物が検出されなかったからである。
【０１１９】
ＤＮＡａｓｅＩ処理した溶解物（ＲＮＡのみ）のRT-PCRの検出限界は、反応あたり約１０CFUであった。ＲＮａｓｅＡ及びＤＮａｓｅＩの両方で処理した試料からはシグナルが検出されず、従って、ＲＮＡが最初に溶出物中に存在していたことは確かである。従って、当業者は、ＲＵＣＬＡＮＡＰは、ｃＤＮＡの合成をするために首尾良く用いることができる全長ＲＮＡを細菌細胞から単離するための簡単且つ効率的な方法であると断言できる。
【０１２０】
実施例１８：
ＲＵＣＬＡＮＡＰを用いてのクロストリジウム・パルバムからのゲノムＤＮＡの抽出。  ＲＵＣＬＡＮＡＰの万能性を更に、寄生生物クリプトスポリジウム・パルバムから粗製のゲノムＤＮＡを獲得することによって証明した。卵母細胞を遠心及び５０μＬの５×ＴＥバッファー中での再懸濁によって回収した。次に、基本的なＲＵＣＬＡＮＡＰプロトコル（実施例１）を酵母ビーズ混合物を用いて行った。粗製調製物の１０倍希釈物１μＬを、プライマーとして以前の我々の特許公報ＷＯ０１／２３６０４に由来する配列番号７９８−８００及び８０４−８０６を用いて、伸長因子１遺伝子を特異的に増幅するための鋳型とした。期待したＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動によって検出した。
【０１２１】
実施例１９：
ＲＵＣＬＡＮＡＰを用いてのマイコバクテリウム・スメグマチスからのゲノムＤＮＡの抽出。  ＲＵＣＬＡＮＡＰの万能性の他の例は、溶解せしめるのが難かしいマイコバクテリウム・スメグマチスからの粗製のゲノムＤＮＡの単離である。Robsonらは、（米国特許５，３７６，５２７）に、マイコバクテリアの細胞溶解は、細菌を溶解させるのに有効な量の熱に、２〜２０分の範囲でさらすことによって達成されて良いことを示している。続いて、ＤＮＡを更にフェノール／クロロホルム抽出及びエタノール沈澱によって精製した。これはＲＵＣＬＡＮＡＰ法よりもかなり煩わしい。そしてまた、この方法は、十分に増殖する前の臨床試料から直接検出をするために十分な感度がないことを結果が示された。いくつかのマイコバクテリウム種に関しては、ＰＣＲプロトコル中の加熱段階は、増幅可能な標的ＤＮＡを放出せしめるのに十分であったが、この素速い方法は試験したマイコバクテリウム種の全てに対しては万能ではなかった。
【０１２２】
基本的ＲＵＣＬＡＮＡＰプロトコルを万能溶解用混合物（実施例１）と共に用いた。コロニーから調製したＭ．スメグマチスのＰＢＳ中０．５MacFarland懸濁から出発して、細胞（５０μＬ）を２１０００ｇで５分に渡る遠心によって回収し、上清を捨て、そしてペレットを５０μＬの５×ＴＥバッファー中で再懸濁せしめた。ＲＵＣＬＡＮＡＰ後、粗製溶解物の連続１０倍希釈物１μＬを、以前の我々の特許公報ＷＯ０１／２３６０４（配列番号５６６及び５６７）に記載のプライマー対を用いて、ａｔｐＤ遺伝子を特異的に増幅するための鋳型とした。未溶解細胞懸濁もＰＢＳで連続１０倍希釈をし、そして１０-5及び１０-6希釈物から１００μＬを血液寒天プレート上に置き、３重にし、生菌数を計測した。未溶解細胞懸濁の希釈物各１μＬもＰＣＲアッセイの鋳型として用いた。
【０１２３】
未溶解細胞懸濁を３．１×１０4CFU／μＬと計測した。３．１×１０4CFU／ＰＣＲ反応を含む試験した最低希釈物を含め、未処理細胞懸濁の希釈物全てから、標準的なアガロースゲル電気泳動により増幅されたＤＮＡが検出されることはなかった。他方、ＲＵＣＬＡＮＡＰ処理したＭ．スメグマチス細胞を、３CFU／ＰＣＲ反応の検出限界で検出した。マイコバクテリウム細胞を処理することで、検出が１００００倍以上向上した。従って、ＲＵＣＬＡＮＡＰは、溶解せしめるのが難しいマイコバクテリウム・スメグマチスを検出する迅速且つ感度の高い方法である。
【０１２４】
実施例２０：
ＲＵＣＬＡＮＡＰを用いてのＨＩＶ−１からのＲＮＡ抽出。  基体的ＲＵＣＬＡＮＡＰプロトコルの変更を、ヒト１型免疫欠損ウィルス（ＨＩＶ−１）からＲＮＡ抽出し、Organon TeknikaのNucliSens HIV QTアッセイのＲＮＡ抽出法との比較するために計画した。この商業上入手可能なキットは、ヒト血清及び血しょう中のＨＩＶ−１Ｒを定量的に測定する。ＲＮＡ抽出方法は、Boomらの方法（J. Clin. Microbiol, 1990, vol. 28: pp 495〜503）に由来する。効率的ではあるが、このアッセイは細心の注意が必要であり、時間がかかり（数時間）そして毒性物質のチオシアン酸グアニジンの使用を要する。
【０１２５】
即知のＨＩＶ−１ウィルス量のヒト血しょう５００μＬから出発して、両方のＲＮＡ抽出法を比較した。NucliSense HIV QTアッセイを製造説明書に記載があるとおりに行った。ＲＵＣＬＡＮＡＰのために、リボヌクレアーゼ阻害物質のＲＮａｓｉｎ（登録商標）（Promega）を５００Ｕを試料に対して加えた。２１０００ｇで５分の遠心後、ペレットを１mLの１０mMトリス−ＨＣｌ（pH８．０）で洗浄した。同じ条件での他の遠心段階及び上清を除去した後、以下のものを加えた。それは：０．２ｇのビーズ（１０６μｍ及びより微細な、カタログ番号Ｇ−４６４９、Sigma；推定上７５μｍ〜１０６μｍ）、２０μＬのＲＮＡ較正溶液（下記参照のこと）、１０μＬの１％トリトンＸ−１００溶液、及び４０ＵのＲＮａｓｉｎである。ウィルスをFast Prep（登録商標）ＦＰ−１２０装置においてパワーレベル６で４５秒に渡り中断せしめた。次に、最後の素速い回転を１００００ｇで２分に渡り行った。
【０１２６】
いずれかの方法により獲得した抽出ＲＮＡの増幅及び検出を、製造説明書に従いNucliSens Reader (Organon Teknika）により行った。増幅のために用いた技術はＮＡＳＢＡ（核酸配列に基づく増幅）であり、それは、３つの酵素の同時活性化に依存する。その酵素とは：ＡＭＶ−ＲＴ（鳥類骨髄芽細胞症ウィルス（Avian Myoblastsis Virus）逆転酵素）、ＲＮａｓｅＨ及びＴ7ＲＮＡポリメラーゼである。標的ＲＮＡ配列の及び較正ＲＮＡ配列（３つの人工コントロールＲＮＡ）のコピーをファージＴ7ポリメラーゼによって、二本鎖Ｔ7ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを有する中間体ＤＮＡ分子を介して合成した。産物の検出は電気化学発光（ＥＣＬ）技術に依存する。
【０１２７】
どちらのウィルスＲＮＡ方法を用いても、類似レベルの回収率を達成でき、これは、ＲＵＣＬＡＮＡＰの万能性を示す。更にＲＵＣＬＡＮＡＰは、NucliSence HIV QTアッセイのＲＮＡ抽出法を使用するよりも一層迅速、且つ簡単である。万能混合物１５０〜２１２μｍ：７１０〜１１８０μｍ（４：１）を、それ自体で使用するかあるいはウィルス粒子を溶解せしめるために適合（より小さな粒子、即ち７５〜１０６μｍの範囲の粒子を加えることによって、巨大ビーズの比率を下げることによって又は、小粒子（約１５０μｍ以下、即ち１００μｍ以下）のみの個別の組成物を供することによって）させることができうる。
【０１２８】
実施例２１：
ＲＵＣＬＡＮＡＰのためのジルコニアビーズの使用。  基本的ＲＵＣＬＡＮＡＰプロトコルを万能溶解混合物（実施例１）と共に、又は０．０５ｇの１００μｍジルコニア／シリカビーズ（カタログ番号１１０７９１０１ｚ、BioSpec）と共に用いた。ミクロチューブ中にビーズを伴わないネガティブコントロールも行った。コロニーから調製したスタフィロコッカス・アウレウスＡＴＣＣ２５９２３のＰＢＳ中、０．５MacFarland懸濁から出発し、細胞（１００μＬ）を２１０００ｇで５分に渡る遠心によって回収し、上清を捨て、そしてペレットを１００μＬの５×ＴＥバッファー中で再懸濁せしめた。ＲＵＣＬＡＮＡＰ後、３つの異なる条件で獲得した粗製溶解物の連続１０倍希釈物（１０0〜１０5）１μＬをMartineauらによって記載されたＳ．アウレウス特異的アッセイ（2000, J. Antimicrob. Chemother vol. 46: pp. 527〜534）における鋳型として用いた。標準的なアガロースゲル電気泳動によって増幅を確認した。未溶解細胞懸濁もＰＢＳで連続１０倍希釈し、そして１０-5及び１０-6希釈物から１００μＬを血液寒天プレート上に置き、３重にし、CFU数を測定した。
【０１２９】
未溶解細胞懸濁は３．１×１０4CFU／μＬと計測された。ネガティブコントロール（ビーズなし）の検出限界は３５０CFU／ＰＣＲ反応であった。対照的に、ＲＵＣＬＡＮＡＰ処理（ガラスビーズ又はジルコニア／シリカビーズの万能混合物のいずれかを用いて）したＳ．アウレウス細胞の検出限界は、３．５CFU／ＰＣＲ反応であった。スタフィロコッカスの細胞をＲＵＣＬＡＮＡＰ処理することで、核酸検出を１００倍以上向上せしめることができ、そして、異なる種類及びサイズのビーズと適合されて良い。
【０１３０】
本発明は、本明細書中で先に好適な実施態様により先に記載しているが、それは添付の特許請求の範囲に規定されているように、本発明の精神及び特徴から出発することなく変更を加えることができる。
【表１】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004535207.tif 000048
【国際調査報告】
2004535207.tif 000049
2004535207.tif 000050
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