(57)【要約】水溶液中で化合物の多成分塩を調製する方法は、最初に少なくとも弱酸を選択する段階、次に少なくとも第１の弱塩基を選択する段階、水溶液を形成するために水中で等モル量の弱酸を弱塩基と混合する段階、この溶液に少なくとも第２の弱塩基を加える段階、及び、最後に多成分塩混合物をもたらすためにこの水溶液を混ぜる段階を含む。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
水溶液中で化合物の多成分塩を調製する方法であって、
ａ）少なくとも弱酸を選択する段階と、
ｂ）少なくとも第１の弱塩基を選択する段階と、
ｃ）水溶液を形成するために水中で等モル量の前記弱酸を前記弱塩基と混合する段階と、
ｄ）前記溶液に少なくとも１つの追加の弱塩基を加える段階と、
ｅ）多成分塩混合物をもたらすために前記水溶液を混ぜる段階と、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
前記弱酸は、５よりも低い溶液のｐＨを得るために前記第１の弱塩基と混合されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記追加の弱塩基が前記溶液に加えられ、前記溶液のｐＨは、６よりも低いままであることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項４】
塩基が薬剤活性材料であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項５】
塩基が化粧材料であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項６】
塩基が栄養材料であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記追加の弱塩基は、前記第１の弱塩基と等モル量で前記溶液に加えられることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項８】
水溶液中で化合物の多成分塩を調製する方法であって、
ａ）少なくとも弱塩基を選択する段階と、
ｂ）少なくとも第１の弱酸を選択する段階と、
ｃ）水溶液を形成するために水中で等モル量の前記第１の弱酸を前記弱塩基と混合する段階と、
ｄ）前記溶液に少なくとも１つの追加の弱酸を加える段階と、
ｅ）多成分塩混合物をもたらすために前記水溶液を混ぜる段階と、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項９】
前記第１の弱酸は、５よりも低い溶液のｐＨを得るために前記弱塩基と混合されることを特徴とする請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記追加の弱酸が前記溶液に加えられ、前記溶液のｐＨは、６よりも低いままであることを特徴とする請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記追加の弱酸は、前記第１の弱酸と等モル量で前記溶液に加えられることを特徴とする請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
水溶液中でポリアミンの多成分塩を調製する方法であって、
ａ）少なくとも弱酸を選択する段階と、
ｂ）少なくとも第１の弱塩基を選択する段階と、
ｃ）水溶液を形成するために水中で等モル量の前記酸を前記塩基と混合する段階と、
ｄ）前記溶液にポリアミンを加える段階と、
ｅ）多成分ポリアミン塩混合物をもたらすために、前記水溶液を透明になるまで撹拌する段階と、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項１３】
前記ポリアミンは、前記第１の弱塩基と等モル量で前記溶液に加えられることを特徴とする請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
請求項１２に記載の方法で生成されることを特徴とする、ポリアミンの多成分塩混合物。
【請求項１５】
前記ポリアミンは、キトサンであることを特徴とする請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
前記酸は、ジ−、トリ−、及び、テトラ−カルボン酸を含むポリカルボン酸、アスパラギン酸、グルタミン酸、アスコルビン酸、コハク酸、グルタル酸、及び、クロロゲン酸から成る群から選択されることを特徴とする請求項１２に記載の方法。
【請求項１７】
前記第１の塩基は、グルコサミン、マンノサミン、ガラクトサミン、カフェイン、ナイアシンアミド、及び、ベンズアミドから成る群から選択されることを特徴とする請求項１２に記載の方法。
【請求項１８】
前記酸は、１つよりも多い酸性陽子を有する化合物から選択されることを特徴とする請求項１２に記載の方法。
【請求項１９】
前記酸は、薬剤活性材料であることを特徴とする請求項１２に記載の方法。
【請求項２０】
前記酸は、アスコルビン酸であることを特徴とする請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記酸は、化粧材料であることを特徴とする請求項１８に記載の方法。
【請求項２２】
前記酸は、栄養材料であることを特徴とする請求項１８に記載の方法。
【請求項２３】
前記酸は、５よりも低い溶液のｐＨを得るために前記第１の塩基と混合されることを特徴とする請求項１２に記載の方法。
【請求項２４】
前記ポリアミンが前記溶液に加えられ、前記溶液のｐＨは、６よりも低いままであることを特徴とする請求項１２に記載の方法。
【請求項２５】
水溶液中でポリアミンの多成分塩を調製する方法であって、
ａ）少なくとも弱酸を選択する段階と、
ｂ）少なくとも第１の弱塩基を選択する段階と、
ｃ）水溶液を形成するために水中で等モル量の前記酸を前記塩基と混合する段階と、
ｄ）前記溶液にポリアミンを加える段階と、
ｅ）多成分ポリアミン塩混合物をもたらすために、前記水溶液を透明になるまで撹拌する段階と、
ｆ）前記多成分塩混合物を用いて創傷を治療する段階と、
を含むことを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（技術分野）
本発明は、キトサンを含む化合物の塩、及び、この塩を調製する方法に関する。特に、塩を調製する方法及び得られる生成塩は、製剤、化粧品、及び、栄養物の分野での応用を含む種々の用途に用いることができる。
【０００２】
（背景技術）
キトサンは、生態系に見られる豊富な天然グルコサミン多糖類であるキチン（Ｃ８Ｈ１３ＮＯ５）ｎの脱アセチル化生成物である。特に、キチンは、カニ、ロブスター、及び、エビのような甲殻類の殻に見られる。この化合物はまた、海洋動物性プランクトンの外骨格、蝶及びテントウムシのような特定の昆虫の翅、及び、酵母、キノコ、及び、他の菌類の細胞壁内に見られる。
構造レベルでは、キトサンは、大部分がポリグルコサミンであり、一般にキチンのアルカリ加水分解により調製される。脱アセチル化の程度は、通常、７０〜９８％の範囲である。脱アセチル化アミノ基は、約６よりも低いｐＨではプロトン化し、従って正の電荷に反応してキトサンポリマーを水溶性にする。この特性はまた、キトサン化合物の高い正電荷密度をもたらす。
【０００３】
キトサンはまた、無害で生物学的適合性及び生物分解性を有することに加え、科学文献には、止血性、抗菌性、及び、他の生物医学的な特性を有すると報告されている。例えば、「Ｒｅｖ  Ｍａｃｒｏｍｏｌ．  Ｃｈｅｍ  Ｐｈｙｓ」、Ｃ４０、６９〜８３（２０００年）、Ｇ．Ｓｋｊａｋ−Ｂｒａｅｋ、Ｔ．Ａｎｔｈｏｎｓｅｎ、Ｐ．Ｓａｎｆｏｒｄ編「キチンとキトサン」、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ（１９８８年）、及び、Ｒ．Ｍｕｚｚａｒｅｌｌｉ、Ｃ．Ｊｅｕｎｉａｕｘ、Ｇ．Ｗ．Ｇｏｏｄａｙ編「自然界及び科学技術におけるキチン」、Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ（１９８６年）を参照することができる。
【０００４】
キトサンを経口投与及び静脈内投与した場合の生物学的適合性は、動物を用いて評価されている。キトサンのＬＤ５０は、マウスで１６ｇ／Ｋｇを超えており、これは、ショ糖に対するものよりも高い。ＬＤ５０は、従来、投与された動物の５０％を殺すことになる、物質の半数致死量として定義されており、その投与量は、体重のグラム又はキログラム当たりで与えられる物質の量、又は、単位体表面積当たりの量で計算される。例えば、「テーバーの医学百科辞典」第１８版１０８５頁を参照することができる。キトサンの止血性はまた、科学文献において「Ａｎｎ．  Ｔｈｏｒ．  Ｓｕｒｇ．」、３５、５５〜６０（１９８３年）、及び、「Ｊ  Ｏｒａｌ  Ｍａｘｉｌｌｏｆ  Ｓｕｒｇ．」、４９、８５８〜８６３（１９９１年）のような論文で評価されている。
【０００５】
しかし、近年において、研究者の注目は、キトサン化合物の生物医学的応用に向けられている。この点に関して、現在、製薬及び健康産業におけるキトサンの使用について評価されているところである。例えば、「Ｐｈａｒｍ  Ｒｅｓ．」、１５、１３２６〜１３３１（１９９８年）に、医薬品でのキトサンの使用が報告されている。製薬産業での賦形剤としてのキトサンの使用もまた、「Ｐｈａｒｍ  Ｒｅｓ．」、１５、１３２６〜１３３１（１９９８年）、及び、「Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ．Ｉｎｄ  Ｐｈａｒｍ．」、２４、９７９〜９９３（１９９８年）において調査されている。
【０００６】
キトサンの抗菌性は、ストレプトコッカス種、黄色ブドウ球菌、表皮ブドウ球菌、溶血性ブドウ球菌、シュードモナス種、エシェリキア種、プロテウス種、クレブシエラ種、セラチア種、アシノバクター種、エンテロバクター種、及び、シトロバクター種を含む、「グラム」陽性菌及び「グラム」陰性菌に対して報告されている。例えば、Ｖ．Ｃｒｅｓｃｅｎｚｉ、及び、Ｓ．Ｓ．Ｓｔｉｖａｌａ編「工業多糖類：生物医学的及び生物工学的進歩」におけるＭｕｚｚａｒｅｌｌｉ他の論文、「Ｇｏｒｄｏｎ  ａｎｄ  Ｂｒｅａｃｈ」の７７〜８８頁（１９９０年）、及び、「Ａｎｔｉｍｉｃｒ．  Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈ」、３４、２０１９〜２０２４（１９９０年）を参照することができる。
キトサンはまた、規則的に配列したコラーゲン束を含む組織の修復を促すと文献に説明されている。例えば、「Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ」、９、２４７〜２５２（１９８８年）を参照することができる。更に、キトサン繊維から作られた不織布も開発されている。例えば、「Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｐｌａｓｔｉｃ  Ｓｕｒｇ．」、１０、６６〜７６（１９８７年）を参照することができる。
【０００７】
更に、キチン及びキトサン誘導体の抗癌作用に関する研究もなされている。例えば、「Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．  Ｒｅｓ」、１５１、４０３〜４０８（１９８６年）、及び、「Ｃｈｅｍ．  Ｐｈａｒｍ」、３６、７８４〜７９０（１９８８年）を参照することができる。キトサンは、更に、「ワクチン」、４、１５１〜１５６（１９８６年）、及び、日本キチン学会のＳ・トクラ編「生命科学におけるキチン誘導体」（１９９２年）におけるＫ・ニシムラの論文では、効果的な免疫調整剤として報告されている。
また、キトサンの食品への使用は、「Ｐｒｏｃ  Ｃｈｉｍ  Ａｅｒｏｓｏｌ  Ｓｅｌ」、２８、５〜８（１９８７年）、「Ｓｈｉｐｉｎ  Ｋｅｘｕｅ」（北京）、８７、６〜９（１９８７年）、及び、「Ａｎ  Ａｓｏｃ  Ｑｕｉｍ  Ａｒｇｅｎｔ」、８６、１〜４（１９９８年）に報告されている。
【０００８】
最後に、キトサンの特性を改善するために、Ｇ．Ｓｋｊａｋ−Ｂｒａｅｋ、Ｔ．Ａｎｔｈｏｎｓｅｎ、Ｐ．Ｓａｎｆｏｒｄ編「キチンとキトサン」、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ（１９８８年）、Ｒ．Ｍｕｚｚａｒｅｌｌｉ、Ｃ．Ｊｅｕｎｉａｕｘ、Ｇ．Ｗ．Ｇｏｏｄａｙ編「自然界及び科学技術におけるキチン」、Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ（１９８６年）、リグビーに付与された「十分に品質等級を下げた脱アセチル化キチン及びその生成方法」という名称の米国特許第２，０４０，８７９号、及び、同じくリグビーに付与された「フィルム及びフィラメントの調製方法とその製品」という名称の米国特許第２，０４０，８８０号において、多数のキトサン塩が報告されている。
【０００９】
しかし、キトサンの研究で探求された全ての研究経路にもかかわらず、キトサンが塩基性ｐＨの性質を有するために、キトサン分子の化学的性質を大幅に変化させることなくキトサン及び他の塩基性化合物の塩を作ることは困難であることが証明されている。例えば、スズキ他に付与された米国特許第４，９７１，９５６号は、キトサンを修飾して適切な水溶性の形態を作り出すことが困難であることを説明し、水不溶性の形態が治療の応用には非実用的であることを開示している。
【００１０】
既に述べたように、キトサンは、本質的に塩基性の天然ポリマーである。約６．３よりも低いｐＨでは、ポリマー内のアミンがプロトン化した状態になり、水溶性のキトサンをもたらす。キトサンポリマーが低ｐＨでプロトン化した状態で、塩基性化合物を加えてｐＨを６．５よりも高くすることにより、それを脱プロトン化することができる。従って、キトサンの溶解性を変化させることなく塩基性化合物を加えたり又は塩基性化合物をキトサンと反応させたりすることは実際的ではないと思われる。これは、塩基性化合物を用いて任意の水溶性キトサン塩を調製する能力を制限する。更に、本質的に塩基性の薬剤活性化合物がいくつか存在し、従って、それらのキトサンによるデリベリは実用的ではないと思われる。
【００１１】
従って、キトサンの多成分水溶性塩に対する必要性が存在し、それは、次に上述の製薬、化粧品、及び／又は、栄養材料の用途に用いることができる。更に、キトサンの多成分水溶性塩を合成する方法が必要とされている。また、個々の化学構造を変更することなく又は共有結合を用いることなく容易に溶解性にすることができない他の製薬、化粧品、及び、栄養材料の多成分水溶性塩に対する必要性が存在する。本発明の目的は、そのような混合物及び方法を提供することである。
【００１２】
（発明の開示）
水溶液中で化合物の多成分塩を調製する方法は、最初に少なくとも弱酸を選択する段階、次に少なくとも第１の弱塩基を選択する段階、水溶液を形成するために水中で等モル量の弱酸を弱塩基と混合する段階、この溶液に少なくとも第２の弱塩基を加える段階、及び、最後に多成分塩混合物をもたらすためにこの水溶液を混ぜる段階を含む。
【００１３】
（発明を実施するための最良の形態）
当業技術で公知のように、酸と塩基が結合すると中和反応の一部として塩が形成される。二酸及び三酸塩基の場合、及び、二塩基及び三塩基酸の場合は、相互の中和の程度が異なってもよく、それぞれ塩基性、中性、又は、酸性の塩を生じる。ポリアミンのような化合物の水溶性多成分塩を合成する方法が本発明により発見され、本方法は、多成分塩を生成するために酸を水中で少なくとも２つの塩基と反応させる段階を含み、この塩基の１つは、ポリアミン化合物であることが望ましく、塩基の数は、用いる酸の種類（すなわち、酸性度又はｐＨ）に依存する。代替実施形態においては、そのような塩基は、モノアミンを含むことができるであろう。更に、水溶性多成分キトサン塩を合成する方法は、多成分キトサン塩を生成するために酸を水中で少なくとも２つの塩基と反応させる段階を含み、この塩基の１つはキトサンであり、塩基の数は、用いる酸の種類（すなわち、酸性度又はｐＨ）に依存する。本方法は、いかなる共有結合も作り出すことなくキトサンの機能性を向上させる。得られる化合物は、次に、皮膚創傷を治療するため、及び、皮膚の病気を治療及び予防するために使用することができる。
詳細には、本方法は、何ら共有結合を作り出すことなく、又は、いずれの反応物の化学的性質をも大きく変えることなく（結合の変化なし）、２つ又はそれ以上の塩基を水溶液中で架橋酸（２つの塩基分子間の酸性分子）と混合する段階を含む。本出願の目的に対しては、「共有結合」という用語は、電子が２つの原子核により共有される時に起こる結合を意味するものとする。
【００１４】
望ましい態様においては、本方法により、最初に酸（例えば、ジカルボン酸）１モルが塩基（例えば、モノアミン）１モルと混合されて、次に第２の塩基（例えば、キトサン又は塩基性薬物分子）と混合され、多成分水溶性塩混合物、キトサンの場合は多成分水溶性キトサン塩が形成される。
同様な方法で、最初に塩基１モルを水中で酸１モルと混合して、次に別の酸と混合し、架橋塩基と共に多成分水溶性塩混合物を形成してもよい。これらの方法で調製されたキトサン塩は、溶液の酸性度又はｐＨが約６よりも低く、望ましくは約５．０よりも低く維持されている限りは水溶性のままである。
【００１５】
化合物の多官能多成分塩は、この手法により生成することができ、このような化合物を上述の用途に用いることができる。望ましい態様においては、本発明の方法に弱酸を用いるべきである。少なくとも本出願の目的に対しては、強酸は、水中で完全に解離してＨ＋及び陰イオンを生じるものであることが認識されるべきである。一方、弱酸は、水中で部分的に解離してＨ＋及び陰イオンを生じる。弱酸は、本出願の目的に対しては、ＨＣｌ、Ｈ２ＳＯ４、ＨＮＯ３、ＨＣｌＯ４、ＨＢｒ、及び、ＨＩを除く、それ以外の酸により例示的に示すことができる。このような弱酸としては、例えば、有機酸、１つよりも多い酸性陽子を有する酸性化合物、及び、薬剤活性化合物が含まれる。本発明の方法で有用な弱酸は、例えば、ジ−、トリ−、及び、テトラ−カルボン酸のようなポリカルボン酸、アスパラギン酸、グルタミン酸、アスコルビン酸、コハク酸、グルタル酸、及び、クロロゲン酸から選択することができる。このリストは、本発明の範囲を限定するものではない。望ましい態様においては、このような酸は、１つよりも多い酸性陽子を有する化合物から選択される。
【００１６】
望ましい態様においては、本発明の方法に弱塩基を用いるべきである。本出願の目的に対しては、強塩基は、ＯＨ−イオン及び陽イオンに完全に解離する。弱塩基は、完全な解離によってＯＨ−イオンを供給するものではない。しかし、それらは、水と反応してＯＨ−イオンをもたらす。周期表のＩ族及びＩＩ族の水酸化物を除けば、他の全ての塩基は一般に弱塩基である。このような塩基としては、例えば、モノアミン及びポリアミンが含まれる。本発明の方法で有用な塩基は、例えば、グルコサミン、マンノサミン、ガラクトサミン、カフェイン、ナイアシンアミド、及び、ベンズアミドから選択することができる。このリストは、本発明の範囲を限定するものではない。このような酸及び塩基は、モノマー、ポリマー、化粧材料、栄養材料、及び、薬剤活性材料とすることができる。
【００１７】
本出願の目的に対しては、「薬剤活性材料」、「薬剤」、「薬剤化合物」、及び、「製薬材料」という用語の各々は、薬物、及び、医薬用及び治療用製品と同様に、強壮剤、栄養補助食品、ビタミン、及び、脱臭剤などのような補助的製品を意味するものとする。
本出願の目的に対しては、「栄養材料」という用語は、植物又は動物の生命及び成長に必要不可欠な任意の元素又は化合物のそれ自体か、又は、化学又は触媒反応により変形させたものを意味するものとする。例えば、このような材料は、タンパク質、炭水化物、及び、脂肪と同様に、ビタミン、ミネラル、酸素、及び、水を含むことができる。
【００１８】
本出願の目的に対しては、「化粧材料」という用語は、皮膚に適用されてその外観を改善し、皮膚又はその付属物を清浄化、柔軟化、又は、保護するための液体、半液体、ペースト、又は、粉末の形態をした任意の調製品を意味するものとする。化粧材料の例としては、以下に限定されないが、動物性脂肪（ラノリン）、植物油、ワックス、アルコール、表面活性剤、ＵＶ遮断剤、フェニレン・ジアミン、クロルヒドロキシアルミニウム、ＦＤＣ有機染料、タルク、精油、無機顔料、クロロフィリン、ニトロセルロース・ラッカー、及び、ステロイド・ホルモンが含まれる。
【００１９】
種々の実施形態のいくつかを含め、本発明を以下の実施例により更に説明する。しかし、このような実施例は、決して本発明の精神又は範囲を限定するようには解釈されないものである。各実施例に対して、ｐＨは、米国カリフォルニア州フラートン所在のベックマン・インストルメンツ・インコーポレーテッドから入手可能な「ベックマン２９５」を用いて測定された。
【００２０】
実施例１
米国ミズーリ州セントルイス所在のシグマ・ケミカル・カンパニーから入手されたコハク酸（０．３４４ｇ、０．００２９モル）が、同じくシグマ・ケミカルから入手されたナイアシン・アミド（０．３５６ｇ、０．００２９モル）と６０ｍｌのＨ２Ｏ（２０．８℃でｐＨ３．８１）中で混合された。溶液は、３０分間撹拌され、米国ワシントン州レドモンド所在のバンソン・インコーポレーテッドから入手されたキトサン（０．５ｇ、脱アセチル化度７８．８％、０．００２９モル）がこの溶液に加えられた。溶液は３時間撹拌され、キトサン・ナイアシンアミド・コハク酸塩の透明な溶液（２１．４℃でｐＨ４．３０）が得られた。
【００２１】
実施例２
コハク酸（０．３４４ｇ、０．００２９モル）が、シグマ・ケミカルから入手されたベンズアミド（０．３５３ｇ、０．００２９モル）と６０ｍｌのＨ２Ｏ（２０．３℃でｐＨ３．０２）中で混合された。溶液は３０分間撹拌され、その時点でベンズアミドは溶液中に完全に溶解した。この溶液にキトサン（０．５ｇ、脱アセチル化度７８．８％、０．００２９モル）が加えられ、３時間撹拌されてキトサン・ベンズアミド・コハク酸塩の透明な溶液（２１．３℃でｐＨ４．２０、）が得られた。
【００２２】
実施例３
アスコルビン酸ナイアシンアミド（０．８７ｇ、０．００２９モル）（「Ｊ  Ａｍｅｒ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．」、６７、１１８４〜１１８５（１９４５年）に掲載のＣ．Ｗ．Ｂａｉｌｅｙ他の論文により以前に報告されているように、等モル量のナイアシンアミド（シグマ・ケミカル）とアスコルビン酸（シグマ・ケミカル）とを混合することにより調製）が、６０ｍｌのＨ２Ｏ（２０．９℃でｐＨ３．８５）中に溶解された。この溶液は１０分間撹拌され、キトサン（０．５ｇ、脱アセチル化度７８．８％、０．００２９モル）が溶液に加えられた。溶液は３時間撹拌され、キトサン・ナイアシンアミド・アスコルビン酸塩の透明な溶液（２１．４℃でｐＨ４．６２）が得られた。
【００２３】
実施例４：薬剤への応用
キトサン・ナイアシンアミド・アスコルビン酸による加速創傷治癒
本実施例は、本発明により生成した化合物の１つがラットモデルにおいて創傷治癒を加速する能力を示すものである。尚、本明細書においてその全内容が引用により組み込まれる「Ａｒｃｈ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ  Ｒｅｓ．」、２９０（補遺）、Ｓ１〜Ｓ１１（１９９８年）掲載のＪ．Ｍ．Ｄａｖｉｄｓｏｎの論文、「Ｊ  Ａｌｔｅｒｎ  Ｃｏｍｐｌ  Ｍｅｄ．」、２、２７１〜２７７（１９９６年）掲載のＪ．Ｐ．Ｈｅｇｇｅｒｓ他の論文、及び、「Ｗｏｕｎｄｓ」、３、２１３〜２２０（１９９１年）掲載のＪ．Ａ．Ｈｏｋａｎｓｏｎ他の論文には、そのような試験プロトコルが説明されている。
【００２４】
詳細には、体重がそれぞれ２００〜３００ｇの１２匹のシロラット（オス６匹／メス６匹）を麻酔し（９０ｍｇ／Ｋｇ塩酸ケタミン及び１０ｍｇ／Ｋｇキシラジン）、背面領域全体を剃毛した。回転皮膚剥離装置（デルマトーム）を用いて、１ｃｍ２の創傷を２つが背骨の両側に１つづつ背面皮膚上に作られた。２０ｍｌの水にキトサン（０．４ｇ）を加えることによりｐＨを５．６に調節された試験化合物（実施例３のキトサン・ナイアシンアミド・アスコルビン酸）に片側の一方の傷が曝された。この材料は、使用される前に「ワットマン」定性濾紙を用いて濾過され凍結乾燥された。この化合物は、傷全体を覆うことにより局所的に付加された。各動物の他方の創傷は、外因性治療材料のない滅菌パッドで覆い、未治療対照として役立たせた。対照及び試験材料は、毎日一度交換の上付加された。
【００２５】
二酸化炭素吸入により、４匹のラット（オス２匹／メス２匹）が４８、９６、及び、１６８時間で犠牲にされた。創傷の大きさは、治療前（時間０）、及び、上述の各時点で測定された。傷全体を含む断面は、最初の創傷の縁から始め、２．５ｍｍの区分で創傷の幅に亘って進められる要領で切断された。「画像−プロ・プラス」ソフトウェアのバージョン３．０（メディア・サイバネティックス製）を用いる顕微鏡画像の形態計測解析により、創傷の３つの区域（縁、中央、及び、それらの中点）の上皮の厚さが測定された。創傷内のこれらの部位の平均厚さから、部位全体の創傷治癒が判断された。
【００２６】
４８時間のデータ点では、試験部位の平均上皮厚さ４０．９±５．８μｍ（平均±標準誤差）に対し、対照の創傷部位の平均上皮厚さは、１６．９±４．５μｍであった（ｐ＜０．０５）。９６時間のデータ点では、この上皮厚さは、試験及び対照部位に対してそれぞれ、８０．１±７．１μｍ、及び、３３．４±５．５μｍであった（ｐ＜０．０５）。１６８時間での最終データ点では、試験部位の上皮化が対照部位に比較して相当に大きく、上皮の厚さは、それぞれ、１２１．９±１１．１μｍ及び６８．９±４．１μｍであることが明らかになった（ｐ＜０．０５）。
【００２７】
試験及び対照部位での上皮化の割合が時間に対してプロットされ、その結果が図１に示されている。試験部位での上皮化の割合は、対照部位でのそれよりも大きく、対照に比較して、試験化合物の存在による創傷治癒を実証した。グラフ上のデータ点間の線の勾配に基づくと、対照部位に比較して試験部位では上皮化の割合が９３％増大した。特に、２日目及び４日目の試験サンプルによる再上皮化の割合は、対照サンプルによる再上皮化の割合の２倍よりも大きかった。
本発明は、その好ましい実施形態に特に関連して詳細に説明されたが、特許請求の範囲で示された本発明の精神及び範囲を逸脱することなく、その実施形態に対して多くの変更、追加、及び、削除を為すことができる点を理解すべきである。
【図面の簡単な説明】
【図１】
本発明の方法により生成したキトサン混合物を用いた創傷治癒のラットモデルにおける「再上皮化の割合」を示すグラフである。
【図１】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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