(57)【要約】本願において、その生体膜（ＭＰＳ）の物理的状態の持続的遺伝子改変によって病原微生物から非毒性微生物を生成する方法を記載する。したがって、感染の発生時に、これらの形質転換微生物において、それらが宿主（例えば、高等真核生物、特に哺乳動物のターゲット細胞、およびより具体的にはヒト細胞）に感染し、または動物感染のモデルにおいてそれらを注入することによって、熱ショック（ストレス）遺伝子の発現およびコードタンパク質（ストレスタンパク質またはＨＳＰ）の蓄積、および他の種特異的遺伝子産物の蓄積、制御がＭＰＳの改変の結果として変化する。特に、その制御がシグナル伝達経路によって仲介される遺伝子にも言及する。したがって、この方法の結果として、病原体はワクチン製造に用いることができる非毒性（弱毒性、生微生物）になった。【特許請求の範囲】
【請求項１】
病原微生物を非毒性微生物に形質転換する方法であって、それらが接触する宿主細胞の生体膜の改変された物理的および／または動的状態を誘発させるために前記病原体において遺伝子改変を誘発するステップを含む方法。
【請求項２】
宿主細胞がマクロファージであり、または、一般に、高等真核生物、特に哺乳動物、より具体的にはヒトの別のタイプの細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
膜の変化した状態が病原体中で以下の効果、すなわちストレスタンパク質の合成の低下、膜脂質組成の変化、膜タンパク質／脂質比の変化、膜相状態、物理的組成、および透過性の変化の少なくとも１つをひき起こす、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
遺伝子改変が以下の主要なステップ、すなわちプロモーターの制御下に遺伝子を含有するベクターの構成であって、該プロモーターは、かかるベクターが挿入される病原体の膜の物理的および／または動的状態を改変することが可能である、タンパク質産物の発現を制御すること；かかるベクターによる病原体の遺伝子形質転換；かかるベクターによるタンパク質産物の発現、により得られる、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
ベクターが、ストレス遺伝子、不飽和化酵素遺伝子、毒性遺伝子、その産物が膜結合タンパク質である遺伝子、その活性化がシグナル伝達経路によって仲介される遺伝子からなる群において選択される少なくとも１つの遺伝子を含有するように構成される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
その活性化がシグナル伝達経路によって仲介される遺伝子が、ｃ−ｆｏｓ、ｆｏｓ  Ｂ、ｊｕｎＢ、ｊｕｎＤである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
タンパク質産物が、Δ１２不飽和化酵素遺伝子、Δ９不飽和化酵素遺伝子、Δ６不飽和化酵素遺伝子、他の不飽和化酵素遺伝子、膜内在性タンパク質をコードする遺伝子からなる群において選択される少なくとも１つの遺伝子をかかるベクターに挿入することによって得られる、請求項４に記載の方法。
【請求項８】
タンパク質産物が膜と直接的または間接的に相互作用可能である、請求項４に記載の方法。
【請求項９】
直接的効果が膜内在性タンパク質による、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
間接的効果が、膜の脂肪酸およびリン脂質の不飽和化のレベルを改変する酵素による、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
間接的効果が、膜のタンパク質／脂質比を変化させるタンパク質の直接効果による、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
直接的効果が、膜の透過性を変化させるタンパク質による、請求項８に記載の方法。
【請求項１３】
膜の熱相転移特徴を変化させるタンパク質による、請求項８に記載の方法。
【請求項１４】
病原微生物が、厳密細胞内細菌、条件的細胞内細菌、真菌類および寄生虫、および非細胞内病原体からなる群において選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
病原微生物が、肺炎およびトラコーマ症、コクシエラ・バーネッティイ、エールリキア・シャフェンシス、リケッチアなどのクラミジア種；レジオネラ・ニューモフィラ、結核菌、Ｍ．マリヌム、Ｍ．レプレ、などのマイコバクテリア、ノカルジア種（菌種）、バルトネラ種、ブルセラ種、フランシセラ・ツラレンシス、リステリア・モノサイトゲネス、サルモネラ種、シゲラ（赤痢菌）種；ボレリア・ブルグドルフェリ（ライム病）、トレポネーマ・パリダム、カンピロバクター、ヘモフィルス・インフルエンザ、クレブシエラ・ニューモニエ、レプトスピラ・インタロガンス、ナイセリア種、スタヒロコッカス、ストレプトコッカス・ピオゲネス、Ｓ．アガラクティエ、Ｓ．ニゥモニエ、エルシニア、バシラス・アンスラシス；アスペルギルス・フミガツス、カンジダ種、クリプトコッカス・ネオフォルマンス、ヒストプラスマ・カプスラツム、ニューモシスティス・カリニ、赤痢アメーバ、レーシュマニア種、熱帯熱マラリア原虫および三日熱マラリア原虫、トキソプラズマ原虫、トリパノソーマ・クルーズの群において選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
ネズミチフス菌、Ｍ．マリヌム、およびＨ．カプスラツムの中から選択される弱毒化非毒性病原微生物の製造のための方法であって、以下のステップ、すなわちベクターの構成；病原体の感染時に下流遺伝子の発現を制御するプロモーターの制御下に、以下の遺伝子、すなわちシアノバクテリア・シネコシステス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ）ＰＣＣ６８０３  Δ１２不飽和化酵素遺伝子または毒性Ｈ．カプスラツムＧ２１７Ｂ菌株のΔ９不飽和化酵素、酵母菌（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、またはＨ．カプスラツム（ｃａｐｓｕｌａｔｕｍ）Δ９不飽和化酵素遺伝子、または原核あるいは真核生物の他の不飽和化酵素遺伝子、または前記生体膜の物理的および／または動的状態の動揺をひき起こす膜内在性タンパク質をコードする他の遺伝子の１つを発現する，かかるベクターによる病原体の形質転換；挿入遺伝子の過剰発現によって特徴づけられる方法。
【請求項１７】
プロモーターがダウン菌株の上方制御されたプロモーターである、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
毒性菌株において約１００であり、遺伝子改変菌株において約１７０である単離外側膜のタンパク質／脂質比によって特徴づけられる請求項１６〜１７に記載の方法で得られるサルモネラ菌。
【請求項１９】
遺伝子改変菌株が４０％増大する単離外側膜のタンパク質／脂質比によって特徴づけられる請求項１６〜１７に記載の方法によって得られるＭ．マリヌム。
【請求項２０】
請求項１に記載の方法によって得られ、その毒性メカニズムが弱毒化されるが完全に免疫応答性であることを特徴とする病原微生物。
【請求項２１】
医療用途に使用される、請求項１に記載の方法によって得られる改変微生物。
【請求項２２】
ワクチンを製造する、請求項１に記載の方法によって得られる改変微生物。
【請求項２３】
ワクチンを製造する、請求項２０〜２２に記載の改変微生物の使用。
【請求項２４】
適切な賦形剤および添加剤と併せた、請求項１に記載の有効な量の改変微生物を活性成分として含有するワクチン。
【請求項２５】
病原微生物が、肺炎およびトラコーマ症、コクシエラ・バーネッティイ、エールリキア・シャフェンシス、リケッチアなどのクラミジア種；レジオネラ・ニューモフィラ、結核菌、Ｍ．マリヌム、Ｍ．レプレ、などのマイコバクテリア、ノカルジア種（菌種）、バルトネラ種、ブルセラ種、フランシセラ・ツラレンシス、リステリア・モノサイトゲネス、サルモネラ種、シゲラ（赤痢菌）種；ボレリア・ブルグドルフェリ（ライム病）、トレポネーマ・パリダム、カンピロバクター、ヘモフィルス・インフルエンザ、クレブシエラ・ニューモニエ、レプトスピラ・インタロガンス、ナイセリア種、スタヒロコッカス、ストレプトコッカス・ピオゲネス、Ｓ．アガラクティエ、Ｓ．ニゥモニエ、エルシニア、バシラス・アンスラシス；アスペルギルス・フミガツス、カンジダ種、クリプトコッカス・ネオフォルマンス、ヒストプラスマ・カプスラツム、ニューモシスティス・カリニ、赤痢アメーバ、レーシュマニア種、熱帯熱マラリア原虫および三日熱マラリア原虫、トキソプラズマ原虫、トリパノソーマ・クルーズ；および関連組合せを含む群において選択される、請求項２４に記載のワクチン。
【請求項２６】
皮内、筋内、静脈内、粘膜内、経鼻、経膣、経口、および経直腸投与されるように調製される、請求項２４〜２５に記載のワクチン。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、その生体膜の持続的遺伝子改変によって病原微生物から非毒性微生物を生成する方法に関する。具体的には、本発明の方法は、ワクチン製造のために用いることができる改変病原体を得るために膜の物理的状態および／または動的状態の改変を提供する。本発明は、こうして得られるワクチンにも関する。
【０００２】
（以下の説明において用いられる用語）
ＭＰＳ：膜の物理的状態
【０００３】
クローニングベクター：宿主においてトランスフェクトされると複製を可能にする全遺伝情報を含有するＤＮＡ分子。
【０００４】
不飽和化酵素遺伝子：飽和脂肪酸のアシル鎖の特異的部位（Δ６、Δ９、Δ１２等）における二重結合を誘発し、不飽和脂肪酸（ＵＦＡ）を形成する不飽和化酵素をコードする遺伝子。
【０００５】
示差走査熱量測定：生体膜のサーモトロピックな挙動を試験する方法である。生体膜の温度がその液体成分（または特異的脂質頭部基および脂肪アシル鎖を有するドメイン）の液晶相転移へのゲルの温度によって上昇すると、炭化水素鎖の移動性は増大し、熱吸収の対応する上昇が生じる。ゲル−液体脂質相転移は通常、微生物の成長温度以下またはその前後に完了する。高温熱転移は一般にタンパク質変性に起因し、脂質転移とは対照的に、非可逆性である。
【０００６】
遺伝子発現：この用語は、それによって微生物が中間分子、ｍＲＮＡを介して特異的遺伝子によってコードされたタンパク質を合成する全体の過程を示す。
【０００７】
熱ショック遺伝子（ストレス遺伝子）：細胞を温度の急上昇および／または種々のストレス形態に曝露すると急速に転写活性化される遍在性遺伝子。ストレスによる誘導性は、これらのコード配列のプロモーター領域における特異的シスエレメント（例えば、熱ショックエレメント、ＨＳＥ）の存在によって得られる。
【０００８】
熱ショックタンパク質（ＨＳＰまたはストレスタンパク質）：ストレスへの曝露後の細胞によって急速に蓄積される熱ショック遺伝子のタンパク質生成物およびその機能としては、新生ポリペプチドの適切な折畳みの割当、変性タンパク質（誤った折畳み）のターゲティング、ミトコンドリアおよび葉緑体機能の保護、ｍＲＮＡ成熟、ＭＰＳを保護するためのそれらの膜内への挿入等が挙げられる。
【０００９】
膜内在性（または内因性）タンパク質：リン脂質二重層の疎水性領域と部分的または全体的に相互作用し、界面活性剤によってのみ膜から抽出できる膜タンパク質。
【００１０】
マクロファージ：血液、リンパ球、および他の組織中に存在する細胞。それらの機能は食細胞であり、病原体を破壊する。一部のマクロファージはＢリンパ球およびＴリンパ球の活性の役割を果たす。
【００１１】
膜：真核生物および原核生物の細胞、細胞小器官（例えば、ミトコンドリア、葉緑体、小胞体、核等）を取囲み、その中に膜内因性タンパク質または関連タンパク質が存在する脂質バリヤー（リン脂質、糖脂質、およびステロール）によって構成される半透性バリヤー。すべての膜は、本発明に記載された遺伝子操作の結果としてＭＰＳにおける細胞特異的変化を受ける。
【００１２】
膜流動性：膜内の分子の相対拡散運動を説明する広く用いられているが主観的な用語。膜は平面状の、非対称構造であり、その特性は擬液相には比べものにならないため粘性ではなく流動性が用いられる。流動性なる用語は、脂質が液晶層状相にある機能的膜に見られる側方拡散、分子のゆらぎ、および鎖の変形の印象を伝えることを意味する。
【００１３】
膜組成：膜内の分子または分子ドメインの運動移動。膜組成は常磁性プローブの動きを測定し、ＥＳＲまたはＮＭＲスペクトルから組成パラメータを計算することによって数量化することができる。
【００１４】
非層状相：水溶媒中の脂質の非二重層配列。これらは六方晶系（ＨＩ）配列または逆位六方晶系（ＨＩＩ）配列であり；ＨＩ相は膜内ではめったに見られない。
【００１５】
ＰＣＲ：（ポリメラーゼ連鎖反応）：特殊な耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを用いてターゲット遺伝子の配列を補完する特異的オリグヌクレオチドプライマーの使用によって試験管内で大量の特異的ヌクレオチド配列を合成する方法。
【００１６】
ｐＧ１３：Ｍ．マリナム（Ｍ．ｍａｒｉｎｕｍ）プロモーターの転写制御下に大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）遺伝子を含有するプラスミド（ｐＧ１３と呼ばれ、ａｃｃ．＃ＡＦ０９２８４２）。ｐＧ１３はＭ．マリナムおよび結核菌（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）の両方において見られるσ７０様プロモーターであり、そのマクロファージにおける誘導はミコバクテリアｈｓｐ６０プロモーターで見られる誘導より約４０倍高い。
【００１７】
ｐＮｉｒ：嫌気生活で活性化する細菌タンパク質ＦＮＲによって制御される大腸菌のｐＮｉｒＢプロモーターを含有する生体内で嫌気的に誘導可能なプラスミド（ダンスタン（Ｄｕｎｓｔａｎ）ら、１９９９年）。
【００１８】
プロモーター：ＲＮＡポリメラーゼが転写を開始する特異的ＤＮＡ領域。プロモーター領域は酵素ＲＮＡポリメラーゼの認識部位を含有する。
【００１９】
シグナル伝達経路：物理的（例えば、温度、モル浸透圧濃度）または化学的（例えば、ホルモン）形態から他へのシグナルの変換。細胞生物学において、この用語は化学因子の膜または細胞受容体との相互作用によって開始される経時的過程、または結果的に１つまたは複数の特異的細胞反応を生じる膜に対する物理的影響（例えば、この制御下の配列の遺伝子転写活性）を指す。
【００２０】
形質転換：所定のタンパク質をコードする遺伝子のクローニングを必要とするＤＮＡ改変法によりタンパク質を得る方法であって、ここでクローニングは、そのタンパク質をコードする遺伝子の単離、精製、およびシークエンシングを意味する。クローニングされると、ヌクレオチド配列を適切な発現ベクターに挿入することができ、得られたＤＮＡ改変分子を微生物に導入することができ、その中で遺伝子は宿主ＤＮＡで同時に複製される。
【００２１】
毒性遺伝子：これらの遺伝子は、宿主に対して毒性の分子（毒素）または宿主ニッチ内の細胞内病原体の生存に絶対必要なタンパク質生成物をコードする遺伝形質と定義される。したがって、これらの形質をコードする一部の遺伝子は、種々の形態のストレスなど物理的および／または環境的変化に応答して制御される可能性がある。
【背景技術】
【００２２】
熱ショック反応、またはストレス反応は、十分に研究された恒常性細胞反応の１つであり、多様な環境的ストレスおよび／または病的状態に応答して細胞機能性の維持に主に関与する。この反応は、ストレスタンパク質をコードする遺伝子の転写の急増によって仲介される（非特許文献１）。ストレス遺伝子のｍＲＮＡにおけるかかる増大、およびＨＳＰの相対細胞内蓄積は、他の形態のストレスへのその後の曝露または病的状態等の保護とともに、耐熱性の獲得と関係があることが一般に明らかにされている（非特許文献２；非特許文献３）。温度変動の一次センサ（類）、および一般に他の形態のストレスに対して、膜に局在していることが明らかにされている（非特許文献４；非特許文献５；非特許文献６；非特許文献７；非特許文献８；非特許文献９；非特許文献１０）。さらに、最近の研究では、急激な温度変化または他の形態のストレスへの曝露が、脂質およびタンパク質の膜成分の物理的再組成を規定し（非特許文献１１）、その後にＭＰＳの変化を保障する特異的遺伝子反応が生じることが示されている。したがって、特に熱ショック遺伝子に対するＭＰＳの変化と遺伝子発現の制御とのクロストークが存在する。われわれは、熱ストレスの一次ターゲットとして膜の重大な役割に対して注目し、膜内の脂質／タンパク質の相互作用がＨＳ遺伝子の転写制御をいかに適切に決定するか理解を試みた。このような分子の相互作用は、特殊な方法で、結果的にストレス制御遺伝子が転写活性化する物理的および化学的シグナルの環境から経時的過程への変換において決定的に関与することが示されている。言い換えると、一部のＨＳＰと膜の特定領域（ドメイン）との相互作用は、膜の物理的状態（全体的な相状態、組成、透過性等）の状態を再構築する。われわれは、遺伝子発現の特異性が、生物学的および物理学的環境制御シグナルおよび種々の形態のストレスを正確に感知する以上の膜ドメインの不均等な分布によって得られることを示した。以上の試験は、生体膜の機能に関するわれわれの見方を全面的に変えた。われわれは、膜の組成、組織、および物理的状態が、急性熱ストレスおよび病的状態時の細胞反応において中心的かつ決定的な役割を果たすことを提案した（非特許文献１０）。
【００２３】
適切なＭＰＳを担う薬剤のうち、われわれは、その酵素活性によって膜のリン脂質組成を制御する不飽和化酵素について述べる。不飽和化酵素は、ＳＦＡに二重結合を導入し、ＵＦＡを形成する酵素である。ＳＦＡ／ＵＦＡ比は、全細胞の適切なＭＰＳを決定する重要な因子の１つである（非特許文献１２）。最近、誘導性ＨＳＰの合成が、以下を含む多くの因子の急激かつ局所の変化によって制御されることが示されている：
・膜の脂質組成
・膜の脂質／タンパク質相互作用
・膜の脂質動態（ＭＰＳ変化）（非特許文献１３、非特許文献１４）。
【００２４】
したがって、ストレス条件下のＭＰＳの変化は、ＨＳＰが正常の合成される閾値を再決定する。
【００２５】
ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、マイコバクテリウム・マリヌム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｍａｒｉｎｕｍ）、ヒストプラスマ・カプスラツム（Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｍ）、トリパノソーマ等などの細胞内病原体は、発症時およびマクロファージや他の細胞の感染時に、ストレス遺伝子、および本願中では一般の用語で病原性遺伝子として定義される一連の種特異的遺伝子の転写活性によって遺伝子反応を誘発する。遺伝子産物は侵襲／適応のメカニズムに直接関与し、調整的に作用するとともに、宿主における疾患（病原性遺伝子）を浸潤し、複製し、誘発する病原体の能力を担う（非特許文献１５）。この巨大な調整型および一般的な遺伝子反応は、ネズミチフス菌（Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、Ｍ．マリヌムなどの細胞内病原体が宿主の免疫反応を回避する疾患を誘発することを可能にする。
【００２６】
サルモネラ症、腸チフス、結核、ヒストプラスマ症、カンジダ症、マラリア、トリパノソーマ症等など未だ根絶されていない致死的疾患の原因であるすべての細菌、真菌類、寄生虫全般、媒介物は、感染の発生時に宿主が遭遇する状態に対するそれらの反応の重要な部分としてＨＳＰを誘発する（非特許文献１５）。真核生物病原体のＨｓｐ７０および細菌Ｈｓｐ６０（ＧｒｏＥＬ）は、細胞の乾燥重量の１５％までを構成する一次媒介物である（非特許文献１６）。したがって、ストレス遺伝子および病原性に関与する遺伝子は厳密に相互接続され、遺伝子協調されている（非特許文献１６）。これらの病原性遺伝子の制御の詳細は未だ解明されていないが、これらの配列の適切な発現も感染の発生時に合成されるＨＳＰの適切な量の制御下にあることが知られている。病原体に対抗する伝統的な方法は、１つまたは少数の抗原に対する免疫反応を刺激するワクチンの使用に基づくためほとんど効果がないと考えられている。例えば、結核の原因媒介物、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）の一部の菌株は、入手可能な抗生物質に対して徐々に耐性となっている。新しい有効な非毒性抗生物質の同定には何年もの実験作業と莫大な投資が必要であるため、新しい耐性菌株に対する新しいタイプのワクチンを製造することが急務である。
【００２７】
サルモネラ菌に関して、現在のワクチンは：
・非経口的に注射可能な弱毒菌株を有するワクチン；
・非経口的に注射しうる精製細菌カプセルで製造されたワクチン；
・経口投与されるサルモネラ菌の弱毒菌株からなるＴｙ２１ワクチン、である。
【００２８】
このようなワクチンは、持続性の免疫を示すが、いくつかの不利点がある。例えば、死滅細菌で製造されるワクチンには実質的に生細胞がないこと、また弱毒ワクチンが毒性形態に復帰することがないことは未確定である。死滅生物で得られるワクチンが、ヒトに対して毒性でありうる物質、細胞、または媒介物の痕跡を含有する可能性もある。さらに、死滅細胞によるワクチンは、低レベルの保護と結合する副作用の高い発生率を示すことが多い。迅速な熱または化学処理によって得られる感染性の弱毒粒子で製造されるワクチンは、その生理的タンパク質の畳込みが改変（変性）し、自然な免疫反応を変化させる抗原を含有しうる。
【００２９】
弱毒菌株の使用を含まないワクチンは一般に、自然な免疫反応に比べて部分的および不完全な保護のみを示す単一または数種類の抗原で構成されている。
【００３０】
一般に、これは、哺乳動物全般、より一般的には高等真核生物としてヒトにおいて、感染性媒介物に対する保護の自然なメカニズムは、微生物全体およびその結合抗原すべてに対する複雑な免疫反応を含むため、結果として今日のワクチンの低い効力を招く欠点を有する。
【００３１】
著者らは現在、生理的ＭＰＳおよび病原体のストレス反応を変化させることによって、上記の副作用がないワクチン製造に利用される菌株を弱毒化することが可能であることを仮定し、実験で証明した。
【非特許文献１】
リンドクイスト（Ｌｉｎｄｑｕｉｓｔ）、１９８６年
【非特許文献２】
シンガーとリンドクイスト（Ｓｉｎｇｅｒ  ＆  Ｌｉｎｄｑｕｉｓｔ）、１９８８年
【非特許文献３】
バン・エデンとヤング（Ｖａｎ  Ｅｄｅｎ  ＆  Ｙｏｕｎｇ）、１９９６年
【非特許文献４】
カラツ（Ｃａｒｒａｔｕ）ら、１９９６年
【非特許文献５】
ホルバス（Ｈｏｒｖａｔｈ）ら、１９９８年
【非特許文献６】
ビギーとマレスカ（Ｖｉｇｈ  ＆  ｍａｒｅｓｃａ）、１９９８年
【非特許文献７】
鈴木（Ｓｕｚｕｋｉ）ら、２０００年
【非特許文献８】
ピーパー（Ｐｉｐｅｒ）ら、２０００年
【非特許文献９】
トロク（Ｔｏｒｏｋ）ら、２００１年
【非特許文献１０】
ビギーとマレスカ（Ｖｉｇｈ  ＆  ｍａｒｅｓｃａ）、１９９８年
【非特許文献１１】
スレーター（Ｓｌａｔｅｒ）ら、１９９４年
【非特許文献１２】
コシンス（Ｃｏｓｓｉｎｓ）、１９９４年
【非特許文献１３】
ビギー（Ｖｉｇｈ）ら、１９９８年
【非特許文献１４】
グロイスマンとオクマン（Ｇｒｏｉｓｍａｎ  ＆  Ｏｃｈｍａｎ）、１９９７年
【非特許文献１５】
グロイスマンとザイヤー（Ｇｒｏｉｓｍａｎ  ＆  Ｓａｉｅｒ）、１９９０年
【非特許文献１６】
ファイゲとバン・エデン（Ｆｅｉｇｅ ａｎｄ  Ｖａｎ  Ｅｄｅｎ）、１９９６年
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００３２】
本発明の目的は、微生物のＭＰＳ、特に、ネズミチフス菌、Ｍ．マリヌム、Ｈ．カプスラツム、トロパノソーマ等など細胞内病原体（例えば、細菌、真菌類、寄生虫）の持続的遺伝子改変の方法であって、その活性がシグナル伝達経路（例えば、ｃ−ｆｏｓ、ｆｏｓ  Ｂ、ｊｕｎＢ、ｊｕｎＤ、ＭＡＰキナーゼ、遺伝子）によって仲介される遺伝子を含み、そこで宿主が、マクロファージ、高等生物全般、もしくは哺乳動物またはヒトの細胞などターゲット細胞であり、その制御がＭＰＳの結果として改変される感染の発生時のかかる病原体におけるＨＳＰおよび種特異的遺伝子産物の合成および蓄積を変化させることを目的とした方法を提供することである。したがって、この改変の結果として、病原体は非毒性（弱毒性）になる。
【００３３】
別の目的は、ワクチンを製造するためのこれらの弱毒性菌株の使用である。
【００３４】
さらに別の目的は、改変病原体を含む、ヒト用、および動物全般用の新しいクラスのワクチンの開発である。
【００３５】
さらに別の目的は、シネコシステス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ）ＰＣＣ６８０３のΔ１２不飽和化酵素またはサルモネラ菌の他の不飽和化酵素または他の原核および真核微生物（例えば、酵母菌またはＨ．カプスラツムのΔ９不飽和化酵素）、またはＭＰＳの動揺（脂質相転移、透過性）をひき起こす膜内在性タンパク質をコードする遺伝子をコードする遺伝子を保有し、発現するベクターによる形質転換によって、ネズミチフス菌、Ｍ．マリヌム、Ｈ．カプスラツム等など病原性微生物の弱毒性非毒性菌株を製造するための方法である。本発明により得られる遺伝子改変によって、例えば、サルモネラ菌において、全膜（外側または内側または細胞質の膜の混合）のタンパク質／脂質比の約１００（毒性菌株）から約１７０（遺伝子改変菌株）への増大（図４）、または、例えば、Ｍ．マリヌムにおいて、その外側細胞膜の主要な脂質相転移の突然変異菌株における少なくとも４℃の低下を得ることが可能である。この方法は、非限定的実施例として以下の本願中に示した他の細胞内病原体にまで及ぶことができる。
【００３６】
さらに別の目的は、以下の発明の詳細な説明から明らかであろう。
【課題を解決するための手段】
【００３７】
本発明による方法は、例えば、最終的に特定のワクチンを得るために使用される病原体における感染中の当該遺伝子の発現（例えば、嫌気生活中、またはマクロファージまたは他の哺乳動物細胞などの細胞中、ヒトまたは動物宿主中）を推進する能力があるプロモーターを含有するベクターを作成することによって、サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら（１９８９年）によって記載された遺伝子工学技術を用いて実施することができる。次いで、改変菌株を利用して注射可能なワクチン、または経口的または経鼻的に利用可能な噴霧剤を製造することができる。
【００３８】
本発明の方法は、以下の主要なステップによって要約することができる：
−適切なプロモーターの制御下に遺伝子の発現（構成的または誘導性）、およびタンパク質産物の関連産生を制御する各特異的病原微生物の適切なベクターの構成であって、前記タンパク質が、病原体、例えば、膜脂質の脂肪アシル鎖内の飽和レベルを改変する酵素の膜を改変することが可能であり、または膜内在性タンパク質の膜を転位置させ、細胞膜の既存のリポタンパク質複合体と相互作用させることが可能であり；ベクターは、例えば、Δ９不飽和化酵素またはΔ１２不飽和化酵素遺伝子、または他の不飽和化酵素遺伝子あるいは膜内在性タンパク質またはそれらの誘導体をコードする遺伝子を含有しうる；
−上記の各病原微生物の特異的ベクターによる毒性菌株（病原体）の遺伝子形質転換；
−病原体の膜と直接的（内在性タンパク質）または間接的（不飽和化酵素）に相互作用可能なタンパク質産物の発現。
【００３９】
ストレス遺伝子、不飽和化酵素、膜内在性タンパク質、および／または毒性遺伝子、および／またはシグナル経路の転写に対する影響を検証する試験管内試験（例えば、ノーザンブロットによる）を毒性病原体で行うことができる。
【００４０】
こうして得られた非毒性菌株を、有効な量で活性成分として利用されるために周知の方法により加工し、ワクチンを製造することができる。
【００４１】
本発明による改変病原菌株を用いたワクチンの調製は、熟練者によって行うことができる。賦形剤、補助剤、および、例えば、皮内、筋内、静脈内、経粘膜、経膣、経口、経直腸、経鼻投与に用いることができる他の従来の薬剤を含有するワクチンを製造する方法を構成することが可能である。
【００４２】
この遺伝子的方法は、特にすべての細胞内病原体、原核生物および真核生物に適用可能であるが、細胞外病原体を除外することはない。本発明の方法を適用するために用いることができる病原体の例は、完全ではないが本リストに示されたものである：
【００４３】
＊厳密細胞内細菌：クラミジア種（肺炎およびトラコーマ症、コクシエラ・バーネッティイ、エールリキア・シャフェンシス、リケッチア）。
【００４４】
＊条件的細胞内細菌：レジオネラ・ニューモフィラ、マイコバクテリア（結核菌、Ｍ．レプレ）、ノカルジア種（菌種）、バルトネラ種、ブルセラ種、フランシセラ・ツラレンシス、リステリア・モノサイトゲネス、サルモネラ種、シゲラ（赤痢菌）種。
【００４５】
＊他の細菌：
ボレリア・ブルグドルフェリ（ライム病）、トレポネーマ・パリダム、カンピロバクター、ヘモフィルス・インフルエンザ、クレブシエラ・ニューモニエ、レプトスピラ・インタロガンス、ナイセリア種、スタヒロコッカス、ストレプトコッカス・ピオゲネス、Ｓ．アガラクティエ、Ｓ．ニゥモニエ、エルシニア、バシラス・アンスラシス。
【００４６】
＊真菌類：アスペルギルス・フミガツス、カンジダ種、クリプトコッカス・ネオフォルマンス、ヒストプラスマ・カプスラツム、ニューモシスティス・カリニ。
【００４７】
＊寄生虫：赤痢アメーバ、レーシュマニア種、熱帯熱マラリア原虫および三日熱マラリア原虫、トキソプラズマ原虫、クルーズトリパノソーマ。
【００４８】
さまざまな種類の病原体の組合せおよび／または混合が、本発明の範囲内で可能である。
【００４９】
本発明による方法により、変化されたＭＰＳ、および宿主、すなわちマクロファージ、または、一般に、高等真核生物、特に哺乳動物、より具体的にはヒトの別のタイプの細胞でありうる宿主と結合すると病原体における合成ＨＳＰの量の減少を得ることが可能である。
ＨＳＰの量の減少は、ＭＰＳの動揺によって制御され、すなわち、本発明に記載された方法によって誘発され、例として、以下の変化を意味しうる：
・膜の脂質組成、
・膜内のタンパク質と脂質の比
・膜の透過性および熱相転移
【発明の効果】
【００５０】
したがって、本発明によるＭＰＳの遺伝子改変は、（病原体が相互作用し、それが感染する宿主細胞によって内部に取り入れられるとき）病原体によって直面するストレス条件下に、ストレス（熱ショックまたはｈｓ）遺伝子が正常に転写される新しい（異なる）ストレス閾値を確立する。したがって、ＭＰＳの改変は、改変されていない抗原の全セットとともに、生理学的および免疫学的な形質転換受容性状態に病原体を「凍結」する。改変病原体は、感染時に、適切な時間に、病原体の宿主に存在する状態への適応の過程に関与し、その侵襲、増殖、および最終的に疾患をひき起こすことを可能にする適切な量の特異的タンパク質を合成することが不可能である。改変病原体は、宿主の状態への適合能力が低下し、したがって、疾患が起こることがない。
【００５１】
この方法によって、弱毒化病原体の抗原は構造的に改変されず、したがって病原体は完全に形質転換受容性である。さらに、これらの改変細胞内病原体は、宿主の免疫反応を回避するために必要な遺伝的および明確な種特異的なプログラム（例えば、新しい特異的抗原およびタンパク質）を適切に誘発することができない。したがって、本発明の方法により、それらの毒性メカニズムが弱毒化されているが完全に形質転換受容性の病原体の菌株の製造が可能である。こうして得られた、生きた弱毒化ワクチンは、細胞内病原体からの最良の保護を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５２】
本発明の特定の実施形態により、われわれは実施例において、ネズミチフス菌、Ｍ．マリヌム、およびＨ．カプスラツムの非毒性菌株の製造およびそれらのワクチン製造のための使用に対する主要なステップを記載している。ネズミチフス菌、Ｍ．マリヌム、およびＨ．カプスラツムなど弱毒化非毒性菌株の製造は、シネコシステス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ）ＰＣＣ６８０３のΔ１２不飽和化酵素遺伝子、またはサルモネラ菌あるいは他の原核生物および真核生物の他の不飽和化酵素遺伝子（例えば、Ｈ．カプスラツムまたは酵母菌（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）Δ９不飽和化酵素等）、または病原体のＭＰＳの動揺をひき起こすことが可能である膜内在性タンパク質をコードする他の遺伝子を保有するベクターによる対応する病原微生物の形質転換によって得ることが可能である。特に、細胞膜（外側および内側または細胞質、核、ミトコンドリア等）に介在する膜内在性タンパク質は、既存のタンパク質／脂質比を変化させ、それによって、所定の温度範囲で適切に機能する膜の能力と密接に結合したそれらの透過性および熱相転移特徴を改変する。このような改変は、ＳＦＡ／ＵＦＡ比の変化によるこれらのパラメータを改変する不飽和化酵素の酵素活性によって測定されるものと同様の効果によって、膜内在性タンパク質をコードする外因性遺伝子の発現の結果として、ＭＰＳの散在性または限局性の改変をひき起こす。
【００５３】
この方法は以下のステップを含む：
・その産物が病原体のＭＰＳを直接的または間接的に改変する遺伝子を含有する所定の病原媒介物の適切なベクターの構成；
・病原細菌、ネズミチフス菌の毒性菌株のシアノバクテリア・シネコシステス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ）ＰＣＣ６８０３のΔ１２不飽和化酵素遺伝子による遺伝子形質転換、病原体、例えば、ダウン（Ｄｏｗｎｓ）菌株の上方制御されたプロモーターの感染期中の下流遺伝子の発現を推進するプロモーターの制御下にΔ９不飽和化酵素遺伝子を含有するプラスミドによる毒性Ｈ．カプスラツムＧ２１７Ｂ菌株（Ｇ２１７Ｂ：ＡＴＣＣ２６０３６、アメリカンタイプカルチャーコレクション（メリーランド州、ロックビル））の遺伝子形質転換。
・Δ１２またはΔ９不飽和化酵素遺伝子または他の不飽和化酵素遺伝子あるいは膜内在性タンパク質をコードする遺伝子の過剰発現；
・酵素不飽和化酵素活性；
・タンパク質産物の膜への転位置；
・酵素活性および／または膜内タンパク質の挿入を経たＭＳＰの変化。
【００５４】
記載された方法で得られる改変は、ストレス遺伝子の発現パターンの変化、および毒性および／または宿主に存在する状態への適合に関与する遺伝子の原因となり、ＭＰＳの制御下にシグナル伝達経路によって制御される病原体および／または遺伝子の細胞生存および毒性に関係するものなど他の遺伝子の発現パターンの変化を誘発する。ＭＰＳの動揺および遺伝子発現の変化は、マクロファージ感染中および感染の動物モデルにおけるネズミチフス菌およびＨ．カプスラツムの毒性の喪失に関連している。こうして得られる弱毒化菌株は、ネズミチフス菌およびＨ．カプスラツムの毒性菌株に対する免疫保護を誘発する。
【００５５】
本発明の方法で得られる結果は、限局的または散在性にＭＰＳを変化させる不飽和化酵素遺伝子または膜タンパク質を過剰発現する遺伝学的に得られる膜の動揺、またはＭＰＳを動揺させる分子による膜の処理が、適切な量のストレスタンパク質を蓄積するサルモネラ菌、Ｍ．マリヌム（および他の原核生物および真核生物の細胞内病原体）の能力の大幅な改変をひき起こすことを示す。
【００５６】
こうして得られる膜の動揺は、遺伝子形質転換される菌株を用いてマクロファージ細胞系（Ｊ７７４）またはマウスマクロファージ、あるいは他の細胞を感染させ、または感染に対して感受性の動物またはヒトにおいて感染させると、サルモネラ菌、Ｍ．マリヌム、およびＨ．カプスラツムの毒性（および他の病原体の毒性）の持続的な喪失をひき起こす。
【００５７】
実施例に記載された遺伝子的方法は、ネズミチフス菌およびＨ．カプスラツムなど非毒性菌株の製造を可能にし、それによってこれらの病原体に対するワクチンの開発が可能となる。この技術は、原核生物または真核生物のいずれかの他の細胞内病原体（上記のリストを参照）に適用し、他の弱毒化菌株を得て他のワクチンを開発することができる。
【００５８】
以下の実施例および図面は本発明を十分に示すために提示されており、その範囲を制限するものと考えるべきではない。
【実施例１】
【００５９】
シアノバクテリア・シネコシステス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ）ＰＣＣ６８０３の全Δ１２不飽和化酵素遺伝子（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎ．１）は、ＰＣＲによってクローン化され、嫌気生活で誘導性大腸菌ＰＮｉｒプロモーターの制御下にｐＮｉｒベクター（図１）に挿入されており（ダンスタン（Ｄｕｎｓｔａｎ）ら、１９９９年）、野生型毒性ネズミチフス菌株を形質転換するために用いられた。下流遺伝子の発現を推進しうる他のプロモーターが、通常の増殖またはマクロファージの感染中および感染に対して感受性の動物において、ＰＮｉｒの代わりになりうる。
【００６０】
形質転換された菌株は、ｐＮｉｒで遺伝子的および持続的に改変された微生物であり、嫌気生活で、高レベルのコードタンパク質（図３）に翻訳される高レベルのΔ１２不飽和化酵素ｍＲＮＡを過剰発現する。Δ１２不飽和化酵素遺伝子は、少なくとも４７℃まで高レベルのタンパク質（ＳＥＱ ＩＤ Ｎ．２）をコードする（図２）。
【００６１】
内側、外側、および全体の膜を記載された通り（ヤノフ（Ｊａｎｏｆｆ）ら、１９７９年）サルモネラ菌から単離した。単離サルモネラ菌の全膜の脂質含量を、内部標準としてヘプタデカン酸を用いたＧＣ分析によって測定した。膜タンパク質用に修正されたローリー（Ｌｏｗｒｙ）の方法（ペーターソン（Ｐｅｔｅｒｓｏｎ）、１９８３年）によってタンパク質濃度を測定した。図４は、対照および形質転換されたサルモネラ菌細胞における全膜のタンパク質／脂質比の測定値を示す。Δ１２不飽和化酵素遺伝子の外因性発現および全膜におけるそのタンパク質産物の局在は、膜のＰ／Ｌ比の大幅な増大をひき起こし、少なくとも６０％の増大により、膜の不安定化およびシグナルの変化が測定され、これが熱ショック遺伝子の転写をひき起こし、おそらく他の遺伝子の転写をひき起こす。
【００６２】
単離されたサルモネラ菌の外側膜のタンパク質分析
外側膜タンパク質のＳＤＳ  ＰＡＧＥ分析は、ｐＮｉｒに比べてｐＮｉｒ：：Δ１２菌株におけるタンパク質の量の有意な増大を示す（クーマシーゲル、図５）。シネコシステス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ）のΔ１２抗体を用いたウエスタンブロット分析では、ｐＮｉｒ菌株においては検出できないｐＮｉｒ：：Δ１２の外側膜画分における不飽和化酵素の存在が立証される（ウエスタンブロット、図６）。陽性対照として、シネコシステス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ）の全細胞抽出物を適用した（Ｓｙｎ．）。追加のタンパク質バンドレベルの大幅な増大が、Δ１２不飽和化酵素の過剰発現の結果として検出された（クーマシーゲル、図５）。さらにタンパク質バンドを質量分析によって特徴づけるとともに、サルモネラ菌の２つの熱ショックタンパク質、ｌｂｐＡおよびｌｂｐＢ（小さなＨＳＰファミリーの膜）からなることがわかった。
【００６３】
質量分析によるｐＮｉｒ：：Δ１２菌株の外側膜でのｓＨＳＰの同定
ゲル中で同定されるタンパク質をさらに特徴づけるために、サルモネラ菌（ｐＮｉｒ：：Δ１２）の外側膜調製物からクーマシーブルー染色１Ｄゲルバンドを切断した（ＭＷ：＜２０ｋＤａ）。ゲルバンドをゲル内消化プロトコルにかけた（７時間、３７℃下にトリプシン０．１μｇを用いた後、（ＤＴＴでの）還元、およびＣｙｓスルフヒドリル基の（ヨード酢酸で）アルキル化を行った）。トリプシンペプチドの抽出後、ゲルからの消化、Ｃ１８ＺｉｐＴｉｐ上の精製を行い、結果として生じる分離されていない混合物をジヒドロキシ安息香酸マトリックス中のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦによって分析した。ＭＡＬＤＩ分析に基づき、ＭＳ−Ｆｉｔデータベース検索で混合物から以下の２つのタンパク質を同定した：
ショックタンパク質ｌｂｐＢ（サルモネラ・エンテリカ、ＮＣＢＩ＃（０３．２６．２００２）；１６７６２５１４、ＭＷ：１６ｋＤａ）。このヒットにより、同定タンパク質の４０％をカバーする確認されたｍ／ｚ値の３０％が同定された。この同定はさらに、上記タンパク質のＩＴＬＡＬＡＧＦＲ、［４７−５５］としてＭＳ−Ｔａｇデータベース検索によって確認されるＭＨ＋＝９６１．６５のＰＳＤスペクトルによって確認された（図５）。
ショックタンパク質ｌｂｐＡ（サルモネラ・エンテリカ、ＮＣＢＩ＃（０３．２６．２００２）；１６７６２５１３、ＭＷ：１６ｋＤａ）。このヒットにより、同定タンパク質の４０％をカバーする確認されたｍ／ｚ値の３５％が同定された。この同定はさらに、上記タンパク質のＮＦＤＬＳＰＬＹＲ、［３−１１］としてＭＳ−Ｔａｇデータベース検索によって確認されるＭＨ＋＝１１２４．５８のＰＳＤスペクトルによって確認された（図５）。
【００６４】
膜透過性の関数として生体内で測定される膜機能性の動揺
図７は、フェニルナフチルアミン（ＮＰＮ）の蛍光の変化を示す。ＮＰＮは、水性環境下で弱く蛍光する無電荷の親油性色素であるが、細胞膜におけるなど非極性の疎水性環境下では蛍光は大幅に増大する。外側膜の透過性障害の結果として、ＮＰＮは次第に膜を標識し、その蛍光を増大させる（ツチド（Ｔｓｕｃｈｉｄｏ）ら、１９８９年）。広い温度範囲（２５°〜５５℃）で、Δ１２不飽和化酵素タンパク質の過剰産生は、膜の不安定化をひき起こし、結果として、プラスミドのみを含有する細胞に比べて形質転換された細胞の外側膜の持続的な漏れやすさが生じる。漏れやすさ増大の影響は、２５°〜４０℃できわめて顕著であるが、より高い熱ショック温度では存在しない。明らかに、４２〜４５℃以上では、膜の熱誘発性崩壊は、より低い温度で検出されるタンパク質／リン脂質の不均衡によって生じる膜の崩壊よりも優勢となる。図８は、図７の同じデータを用いて、２５°〜４０℃でΔ１２不飽和化酵素形質転換されたサルモネラ菌株における外側膜の透過性の上昇を誘発することによる膜結合Δ１２不飽和化酵素の過剰産生の影響を示す（細胞は３０℃下に増殖させた）。
【００６５】
示差走査熱量測定
サルモネラ菌外側膜のサーモトロピックな挙動に対するシネコシステス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ）Δ１２−不飽和化酵素の過剰産生の影響を、示差走査熱量測定（ＤＳＣ）によって試験した。１０°〜６５℃の温度範囲では、１つの主な吸熱ピークが第１のアップスキャンで確認され、これは第２のアップスキャンでも繰り返し出現したが、いくつかの主な吸熱ピークは高い温度範囲（６５°〜１１１℃）で出現した。高い温度範囲での吸熱ピークは第２のアップスキャンでは認められず、これはこれらのピークが不可逆性のタンパク質の変性に由来することを示す結果である。１５°〜４５℃の温度範囲での可逆性の吸熱ピークは、膜脂質の相転移に対応する（図９）。転移の中央値は、ｐＮｉｒ菌株およびｐＮｉｒ：Δ１２菌株から単離された外側膜について、それぞれ、３４．１℃および３０．８℃であった（図１０）。これらの結果は、Δ１２不飽和化酵素の過剰産生が、細胞の外側膜における一部の脂質ドメインの転移温度を顕著に低下させることを示す。
【００６６】
Δ１２不飽和化酵素タンパク質の過剰発現によるＭＰＳの動揺は、熱ショック遺伝子（ストレス遺伝子ＤｎａＫ）（図１１、１２）およびＧｒｏＥＬ（図１３、１４）の発現の最適な温度をリセットし、３０℃〜４７℃のＨＳＰの蓄積パターン、および宿主細胞（マクロファージおよび哺乳動物）に存在する対立する状態の顕著な変化を示す。図１５は、３０℃または３７℃下に増殖させ、異なる温度でストレスを与えた細胞の熱ショック条件下のＤｎａＫ  ｍＲＮＡ蓄積の数量化を示す。不飽和化酵素遺伝子を過剰発現する細胞は、ｍＲＮＡの顕著に異なる形態の蓄積を示す（野性型細胞のものと正反対のパターン）。データは図１１のゲル分析から得られたものである。
【００６７】
図１６は、サルモネラ菌の遺伝子改変細胞のＤｎａＫ（ｈｓｐ７０）およびｌｂｐＢ（ｈｓｐ１７）ｍＲＮＡの蓄積パターンの同様のパターンを示すノーザンブロットを示し、いずれの遺伝子も４５℃のストレス温度では誘発することはないが、３０℃では発現する。野生型細胞は正反対の挙動を示す。シネコシステス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ）Δ１２−不飽和化酵素の過剰産生は、われわれの実験条件下では適切な基質の欠如のため細胞内で酵素的に不活性であり、それ自体、膜の脂質二重層に挿入し、サルモネラ菌におけるＨＳＲの再設定をひき起こす。実質的に高い膜タンパク質含量、すなわち不均衡なタンパク質／リン脂質比が形質転換された細胞の膜において確認された。追加の証拠として、不飽和化酵素形質転換細胞は適切に膜外タンパク質を適応させることができず、非ストレス条件下でもそれらの外側膜における熱相転移特徴の変化および透過性の大幅な上昇を示す。不均衡な膜組成（一次イベント）は、一部の脂質ドメインの相転移温度、および小さなＨＳＰのファミリーメンバー、ｌｂｐＡおよびｌｂｐＢの外側膜の関連の変化を含めて、複雑な代償的メカニズムの引き金となる。その結果、ＨＳＰの発現パターンは大幅に縮小し、これが次には感受性の宿主に遭遇すると、改変菌株の適応の適切なメカニズムに影響を与える。
【実施例２】
【００６８】
膜の動揺は、ベンジルアルコール（ＢＡ）など薬剤による化学処理によっても得ることができる。これにより熱ショック（ＤｎａＫおよびＧｒｏＥＬ）遺伝子の発現レベルと同様またはより高い効果が生じるが、その効果は一時的であり、以下の実施例によりそれが説明される。
【００６９】
使用した濃度（５０ｍＭまで）は、サルモネラ菌の増殖に対する毒性作用を示さない（図１７）。図１８は、ＢＡの濃度５０ｍＭでは、細胞を３０℃で増殖させると４２℃でＤｎａＫの蓄積レベルが大幅に増大することを示す。これらの結果は、不飽和化酵素遺伝子を過剰発現する遺伝子的に得られ、またはＢＡによる化学処理によって得られる膜の動揺が、適切な量のストレスタンパク質を蓄積するサルモネラ菌の能力の重要な変化を決定することを示す。しかし、
・遺伝子的に生成される膜の動揺（実施例１参照）は、マクロファージ細胞系（Ｊ７７４、図１９）を感染させるために用いると、サルモネラ菌の毒性の完全かつ持続的な喪失をひき起こし；
・ＢＡによるサルモネラ菌の処理は、成長培地からＢＡを除去し、膜の生理的再構成のために一時的にのみマクロファージを感染させるその能力を低下させる（図２０）。
【００７０】
［実施例２．１］
シアノバクテリア・シネコシステス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ）ＰＣＣ６８０３の全Δ１２不飽和化酵素遺伝子が、ｐＧ１３プロモーターの制御下にｐＧ１３ベクターにクローン化され（図２１）（バーカー（Ｂａｒｋｅｒ）ら、１９９８年、１９９９年）、野生型毒性Ｍ．マリヌム菌株に形質転換された。下流遺伝子の発現を推進しうる他のプロモーターが、通常の増殖またはマクロファージの感染中および感染に対して感受性の動物において、ＰＮｉｒの代わりになりうる。形質転換された菌株は、ｐＧ１３Δ１２ベクターで遺伝子的および持続的に改変した微生物であり、高レベルのコードタンパク質、Δ１２不飽和化酵素遺伝子に翻訳されるΔ１２不飽和化酵素ｍＲＮＡの上昇レベルを示す。形質転換された細胞におけるΔ１２不飽和化酵素ｍＲＮＡの発現は図２２に示されている。シネコシステス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ）ＰＣＣ６８０３Δ１２不飽和化酵素遺伝子の誘導および発現は細胞の増殖に影響することはない（図２３）。Δ１２不飽和化酵素タンパク質の誘導および過剰発現は、約４０％のｐＧ１３プロモーターの制御下にシネコシステス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ）ＰＣＣ６８０３のΔ１２不飽和化酵素遺伝子を含有するｐＧ１３Δ１２で形質転換されたＭ．マリヌムの全膜画分のタンパク質／脂質比の増大を決定する（図２４）。図２５は、ｐＧ１３プロモーターの制御下にシネコシステス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ）ＰＣＣ６８０３のΔ１２不飽和化酵素遺伝子を含有するｐＧ１３Δ１２で形質転換したＭ．マリヌムの生存は確認されないが、対照細胞の増殖は予想通り回復することを示す。
【実施例３】
【００７１】
Ｈ．カプスラツムの毒性Ｇ２１７Ｂ菌株の全Δ９不飽和化酵素遺伝子が、真菌Ｈ．カプスラツムのダウン（Ｄｏｗｎｓ）菌株の上方制御されたΔ９不飽和化酵素プロモーターの制御下に（ガルガノ（Ｇａｒｇａｎｏ）ら、１９９５年）ｐＷＵ４４ベクターでクローかされ（ウッズ（Ｗｏｏｄｓ）とゴールドマン（Ｇｏｌｄｍａｎ）、１９９３年）、Ｈ．カプスラツムの毒性Ｇ２１７Ｂ菌株を形質転換するために用いられている。このような改変菌株はＤ３と命名されている。他のプロモーターが、通常の増殖またはマクロファージあるいは動物の感染中のいずれかに下流遺伝子を発現する能力を有するこのようなプロモーターの代わりになりうる。こうして形質転換された菌株は、最終的に高レベルの対応するタンパク質に翻訳される高レベルのΔ９不飽和化酵素ｍＲＮＡを過剰発現する遺伝子的に改変された微生物である。Δ９不飽和化酵素タンパク質の過剰発現によるＭＰＳの動揺は、熱ショック遺伝子（例えば、ｈｓｐ７０）の発現の最適な温度を改変し、３４℃〜４２℃でＨＳＰの蓄積パターン、および宿主細胞（マクロファージおよび哺乳動物）に存在する対立する状態の顕著な変化を示す（図２６）。これらの結果により、不飽和化酵素遺伝子の過剰発現によって遺伝子的に得られる膜の動揺、またはＭＰＳを限局的または散在性に変化させる膜タンパク質が、適切な量のストレスタンパク質を蓄積するＨ．カプスラツムの能力（および他の原核生物および真核生物の細胞内および細胞外病原体の能力）の顕著な変化をひき起こすということに同意が得られる。こうして得られる膜の動揺は、Ｂａｌｂ  ＣＤ−１１マウスの頸骨から得られたマクロファージを感染させるために用いると、遺伝子形質転換されたＨ．カプスラツムの毒性の完全かつ持続的な喪失をひき起こす。図２７は、Ｄ３菌株がマウスのマクロファージ内では増殖しえないことを示す。５ｘ１０７／ｍｌの濃度で高い毒性のＧ２１７Ｂ菌株の酵母菌を注入したＢａｌｂ  ＣＤ−１１マウスは５日以内に死亡するが、遺伝子改変され弱毒化されたＤ３菌株の同量の酵母菌細胞を注入したマウスは少なくとも４５日生存する。さらに、かかるマウスは、４５日後に毒性Ｇ２１７Ｂ菌株を投与した場合、少なくとも６０％の生存率を示す（図２８）。
【図面の簡単な説明】
【００７２】
【図１】ｐＮｉｒプロモーターの制御下にｐＮｉｒプラスミドの制限部位Ｎｄｅｌへのシネコシステス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ）ＰＣＣ６８０３のΔ１２不飽和化酵素遺伝子（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎ．１）（目録番号Ｘ５３５０８、ＣｙａｎｏＢａｓｅ  ｈｔｔｐ／／ｗｗｗ．Ｋａｚｕｓａ．ｏｒ．ｊｐ／ｃｙａｎｏ／）（パネルＢ）を含有するベクター（パネルＡ）。Ｎｄｅｌ制限部位は適切なプライマー（ｄｅｓＡ−Ｎｄｅｌ３  ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎ．３およびｄｅｓＡ−Ｎｄｅｌ５  ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎ．４）（パネルＣ）を用いたＰＣＲによって生成された。ＦＮＲは、嫌気生活における細菌によって誘発されるＦＮＲタンパク質のＤＮＡ結合部位であり、ＰＮｉｒプロモーターからの下流転写を活性化する。
【図２】ノーザンブロットによって示された、３７℃下、および３７℃から４１℃、４５℃、および４７℃への熱ショック後の１５分にネズミチフス菌におけるシアノバクテリアＰＣＣ６８０３のΔ１２不飽和化酵素遺伝子の発現。内因性Δ１２不飽和化酵素ｍＲＮＡは、空のベクターのみ（ｐＮｉｒ）で形質転換された細胞において測定不可能である。
【図３】嫌気生活Δ１２不飽和化酵素遺伝子中に発現し、または空のベクター（ａ＝Ｏ２中で遅延対数期まで増殖したネズミチフス菌（ｐＮｉｒ）、ｂ＝Ｏ２中で遅延対数期まで増殖したネズミチフス菌（ｐΔ１２）、ｃ＝Ｏ２なしで２０時間増殖したネズミチフス菌（ｐＮｉｒ）、ｄ＝Ｏ２なしで２０時間増殖したネズミチフス菌（ｐΔ１２））を含有する溶解サルモネラ菌調製物の沈降物画分から精製されたタンパク質抽出物（タンパク質の７および１５μｇ）の変性ゲル。矢印はΔ１２不飽和化酵素を示す。Δ１２不飽和化酵素タンパク質は細菌溶解物の可溶性画分中で同定不可能である。細胞は酸素中で遅延増殖期まで増殖して酸素を枯渇させ（嫌気生活）、または嫌気生活で増殖する。
【図４】ｐＮｉｒ：：Δ１２作成物−ｄｅｓまたはｐＮｉｒのみを含有するサルモネラ菌の全膜中のタンパク質／脂質比の変化。
【図５】クーマシーゲル：サルモネラ菌外側膜タンパク質のＳＤＳ  ＰＡＧＥ（１７％）。細胞は３０℃下に増殖した。ウエスタンブロット：ｐＮｉｒ：：Δ１２作成物またはｐＮｉｒのみを含有するサルモネラ菌の外側膜画分中のΔ１２−不飽和化酵素の同定。
【図６】シネコシステス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ）Δ１２−不飽和化酵素の抗体を２０００倍希釈で用いた。陽性対照としてシネコシステス全細胞抽出物を適用した（Ｓｙｎ．）。
【図７】ｐＮｉｒ：：Δ１２作成物−ｄｅｓまたはｐＮｉｒのみを含有するサルモネラ菌中の膜透過性の変化。膜タンパク質Δ１２不飽和化酵素の過剰産生は、２５°〜４０℃のΔ１２形質転換サルモネラ菌株（３０℃下に増殖した細胞）中の外側膜透過性の上昇を誘発する。
【図８】ｐＮｉｒ：：Δ１２作成物−ｄｅｓまたはｐＮｉｒのみを含有するサルモネラ菌中の膜透過性の変化。データセットは図７と同じであり、２セットの値間の比として示されている。
【図９】示差走査熱量計によって試験された外側膜のサーモトロピックな挙動に対するシネコシステス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ）Δ１２−不飽和化酵素の過剰産生のＤＳＣ効果。第１および第２の加熱スキャンの生データ。第１の加熱スキャンの規準化データ。膜は３０℃下に増殖した細胞から単離された。
【図１０】図９のピークのＤＳＣ主要シグナルが増幅され、示されている。
【図１１】ノーザンブロットによる、ｐＮｉｒ：：Δ１２作成物−ｄｅｓまたはｐＮｉｒのみを含有するサルモネラ菌中のＤｎａＫ（ｈｓｐ７０）遺伝子の発現。細胞は３０℃下に増殖され、３７℃、３９℃、および４３℃下に１５分間、熱ショックが与えられた。
【図１２】ノーザンブロットによる、ｐＮｉｒ：：Δ１２作成物−ｄｅｓまたはｐＮｉｒのみを含有するサルモネラ菌中のＤｎａＫ（ｈｓｐ７０）遺伝子の発現。細胞は３７℃下に増殖され、４１℃、４３℃、４５℃、および４７℃下に１５分間、熱ショックが与えられた。
【図１３】ノーザンブロットによる、−ｄｅｓまたはｐＮｉｒのみを有するｐＮｉｒ：Δ１２作成物を含有するサルモネラ菌中のＧｒｏＥＬ遺伝子（ｈｓｐ６０）の発現。細胞は３０℃下に増殖され、３７℃、３９℃、および４３℃下に１５分間、熱ショックが与えられた。
【図１４】ノーザンブロットによる、−ｄｅｓまたはｐＮｉｒのみを有するｐＮｉｒ：Δ１２作成物を含有するサルモネラ菌中のＧｒｏＥＬ遺伝子（ｈｓｐ６０）の発現。細胞は３７℃下に増殖され、４１℃、４３℃、４５℃、および４７℃下に１５分間、熱ショックが与えられた。
【図１５】ｐＮｉｒ：Δ１２作成物−ｄｅｓまたはｐＮｉｒのみを含有するサルモネラＤｎａＫ誘導の数量化。データは図１１および１２のものである。
【図１６】ノーザンブロットによる（Δ１２）ｐＮｉｒ：：Δ１２作成物またはＮｉｒ（ｐＮｉｒ；対照）を含有するサルモネラ菌中のＤｎａＫ（ｈｓｐ７０）およびｌｂｐＢ（ｈｓｐ１７）遺伝子の発現を示すノーザンブロット。細胞は３０℃下に増殖され、４５℃下に１５分間、熱ショックが与えられた。
【図１７】（ａ〜ｃ）ベンジルアルコールの毒性曲線。ネズミチフス菌の増殖に対する濃度上昇（５〜８０ｍＭ）ベンジルアルコール（ＢＡ）への３０分曝露の影響。
【図１８】ｐＮｉｒ：Δ１２作成物−ｄｅｓまたはｐＮｉｒのみまたは５０ｍＭ  ＢＡによる処理を含有するサルモネラ菌ＤｎａＫ誘導の発現（ノーザンブロット）。
【図１９】（ａ〜ｆ）マクロファージ感染に対するｐＮｉＲ：Δ１２作成物−ｄｅｓまたはｐＮｉｒのみ（毒性菌株）によるネズミチフス菌の形質転換の影響。マクロファージを３０分まで１：１のマクロファージ／サルモネラ菌比（ＭΦ／Ｓ．ｔｈ．１：１）に感染させた。マクロファージの溶解後、サルモネラ菌を回収し、一定分量を寒天上にプレーティングし、生存を測定した。遺伝子改変された細胞はもはや毒性ではない。
【図２０】（ａ〜ｅ）５０ｍＭ  Ｂａによるネズミチフス菌の処理およびマクロファージ感染に対するその影響。マクロファージを６０分までサルモネラ菌（ＭΦ／Ｓ．ｔｈ．１：１）に感染させた。マクロファージの溶解後、サルモネラ菌を回収し、一定分量を寒天上にプレーティングし、生存を測定した。初期ショック後、細胞は細胞を再構成することによって回復する。
【図２１】ｐＧ１３プロモーターの制御下にシネコシステス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ）ＰＣＣ６８０３のΔ１２不飽和化酵素遺伝子（ＤｅｓＡ）を含有するベクターｐＧ１３Δ１２。
【図２２】シネコシステス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ）のΔ１２不飽和化酵素遺伝子を含有するｐＧ１３Δ１２で形質転換したＭ．マリヌム中のΔ１２不飽和化酵素遺伝子の発現。対照細胞中の発現は検出されない。
【図２３】ｐＧ１３プロモーターの制御下にシネコシステス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ）ＰＣＣ６８０３のΔ１２不飽和化酵素遺伝子を含有するｐＧ１３およびｐＧ１３Δ１２で形質転換したＭ．マリヌムの増殖。
【図２４】Ｍ．マリヌムの全膜中のタンパク質／脂質比の変化およびｐＧ１３プロモーターの制御下にシネコシステス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ）ＰＣＣ６８０３のΔ１２不飽和化酵素遺伝子を含有するｐＧ１３Δ１２による形質転換。
【図２５】ｐＧ１３プロモーターの制御下にシネコシステス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ）ＰＣＣ６８０３のΔ１２不飽和化酵素遺伝子を含有するｐＧ１３Δ１２により形質転換されたＭ．マリヌムの生存は確認されないが、対照細胞の増殖は予想通り回復する。
【図２６】遺伝子改変されたＨ．カプスラツム（ｃａｐｓｕｌａｔｕｍ）毒性菌株（Ｄ３）のｈｓｐ７０遺伝子の転写の変化（ノーザンブロット）。
【図２７】Ｈ．カプスラツム（ｃａｐｓｕｌａｔｕｍ）の毒性Ｇ２１７Ｂ菌株と改変Ｄ３のマウスマクロファージにおける細胞内増殖能の比較。Ｄ３菌株はマクロファージ内で増加する。
【図２８】毒性Ｇ２１７Ｂ菌株および非毒性Ｄ３を接種し、次いで通常の毒性Ｇ２１７Ｂ菌株に曝露したマウスの生存曲線。
【図１】
2004535184.tif 000002
【図２】
2004535184.tif 000003
【図３】
2004535184.tif 000004
【図４】
2004535184.tif 000005
【図５】
2004535184.tif 000006
【図６】
2004535184.tif 000007
【図７】
2004535184.tif 000008
【図８】
2004535184.tif 000009
【図９】
2004535184.tif 000010
【図１０】
2004535184.tif 000011
【図１１】
2004535184.tif 000012
【図１２】
2004535184.tif 000013
【図１３】
2004535184.tif 000014
【図１４】
2004535184.tif 000015
【図１５】
2004535184.tif 000016
【図１６】
2004535184.tif 000017
【図１７】
2004535184.tif 000018
【図１８】
2004535184.tif 000019
【図１９】
2004535184.tif 000020
【図２０】
2004535184.tif 000021
【図２１】
2004535184.tif 000022
【図２２】
2004535184.tif 000023
【図２３】
2004535184.tif 000024
【図２４】
2004535184.tif 000025
【図２５】
2004535184.tif 000026
【図２６】
2004535184.tif 000027
【図２７】
2004535184.tif 000028
【図２８】
2004535184.tif 000029
【国際公開パンフレット】
2004535184.tif 000030
2004535184.tif 000031
2004535184.tif 000032
2004535184.tif 000033
2004535184.tif 000034
2004535184.tif 000035
2004535184.tif 000036
2004535184.tif 000037
2004535184.tif 000038
2004535184.tif 000039
2004535184.tif 000040
2004535184.tif 000041
2004535184.tif 000042
2004535184.tif 000043
2004535184.tif 000044
2004535184.tif 000045
2004535184.tif 000046
2004535184.tif 000047
2004535184.tif 000048
2004535184.tif 000049
2004535184.tif 000050
2004535184.tif 000051
2004535184.tif 000052
2004535184.tif 000053
2004535184.tif 000054
2004535184.tif 000055
2004535184.tif 000056
2004535184.tif 000057
2004535184.tif 000058
2004535184.tif 000059
2004535184.tif 000060
2004535184.tif 000061
2004535184.tif 000062
2004535184.tif 000063
2004535184.tif 000064
2004535184.tif 000065
2004535184.tif 000066
2004535184.tif 000067
2004535184.tif 000068
2004535184.tif 000069
2004535184.tif 000070
2004535184.tif 000071
2004535184.tif 000072
2004535184.tif 000073
2004535184.tif 000074
2004535184.tif 000075
2004535184.tif 000076
2004535184.tif 000077
2004535184.tif 000078
2004535184.tif 000079
2004535184.tif 000080
2004535184.tif 000081
2004535184.tif 000082
2004535184.tif 000083
2004535184.tif 000084
2004535184.tif 000085
2004535184.tif 000086
2004535184.tif 000087
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004535184.tif 000088
【手続補正書】
【提出日】平成15年10月20日(2003.10.20)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
病原微生物を非毒性微生物に形質転換する方法であって、その産物が膜飽和脂肪酸／不飽和脂肪酸（ＳＦＡ／ＵＦＡ）またはタンパク質／脂質比を改変する遺伝子の遺伝子改変によってそれらの生体膜（ＭＰＳ）の物理的および／または動的状態を改変するステップを含む方法。
【請求項２】
生体膜の改変された物理的および／または動的状態が、感染の発生時に適切な量のストレスタンパク質を蓄積する病原体の能力を変化させる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記遺伝子改変が過剰発現である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
遺伝子改変が以下の主要なステップ、すなわちプロモーターの制御下に遺伝子を含有するベクターの構成であって、該プロモーターは遺伝子の発現を調整するものであり、その遺伝子のタンパク質産物はかかるベクターが挿入される微生物病原体の膜の物理的および／または動的状態を改変することが可能であること；かかるベクターによる病原体の遺伝子形質転換；かかるベクターによるタンパク質産物の発現、により得られる、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
そのタンパク質産物が微生物病原体の膜の物理的および／または動的状態を改変しうる遺伝子が、不飽和化酵素遺伝子、その産物が膜結合タンパク質である遺伝子からなる群において選択される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記不飽和化酵素遺伝子が、Δ１２不飽和化酵素遺伝子、Δ９不飽和化酵素遺伝子、Δ６不飽和化酵素遺伝子、他の不飽和化酵素遺伝子、膜内在性タンパク質をコードする遺伝子から選択される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記タンパク質産物が、膜脂肪酸およびリン脂質の不飽和化のレベルを改変する酵素である、請求項４に記載の方法。
【請求項８】
前記膜の物理的状態の改変が、膜の透過性の変化にある、請求項４に記載の方法。
【請求項９】
前記膜の物理的状態の改変が、膜の熱相転移特徴の変化にある、請求項４に記載の方法。
【請求項１０】
その病原微生物が、厳密細胞内細菌、条件的細胞内細菌、真菌類および寄生虫、および非細胞内病原体からなる群において選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
その病原微生物が、肺炎およびトラコーマ症、コクシエラ・バーネッティイ、エールリキア・シャフェンシス、リケッチアなどのクラミジア種；レジオネラ・ニューモフィラ、結核菌、Ｍ．マリヌム、Ｍ．レプレ、などのマイコバクテリウム、ノカルジア種（菌種）、バルトネラ種、ブルセラ種、フランシセラ・ツラレンシス、リステリア・モノサイトゲネス、サルモネラ種、シゲラ（赤痢菌）種；ボレリア・ブルグドルフェリ（ライム病）、トレポネーマ・パリダム、カンピロバクター、ヘモフィルス・インフルエンザ、クレブシエラ・ニューモニエ、レプトスピラ・インタロガンス、ナイセリア種、スタヒロコッカス、ストレプトコッカス・ピオゲネス、Ｓ．アガラクティエ、Ｓ．ニゥモニエ、エルシニア、バシラス・アンスラシス；アスペルギルス・フミガツス、カンジダ種、クリプトコッカス・ネオフォルマンス、ヒストプラスマ・カプスラツム、ニューモシスティス・カリニ、赤痢アメーバ、レーシュマニア種、熱帯熱マラリア原虫および三日熱マラリア原虫、トキソプラズマ原虫、トリパノソーマ・クルーズの群において選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
ネズミチフス菌、Ｍ．マリヌム、およびＨ．カプスラツムの中から選択される弱毒化非毒性病原微生物を製造する方法であって、以下のステップ、すなわちベクターの構成；病原体の感染時に下流遺伝子の発現を制御するプロモーターの制御下に、以下の遺伝子、すなわちシアノバクテリア・シネコシステス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ）ＰＣＣ６８０３  Δ１２不飽和化酵素遺伝子または毒性Ｈ．カプスラツムＧ２１７Ｂ菌株のΔ９不飽和化酵素、酵母菌（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、またはＨ．カプスラツム（ｃａｐｓｕｌａｔｕｍ）Δ９不飽和化酵素遺伝子、または原核あるいは真核生物の他の不飽和化酵素遺伝子、または前記生体膜の物理的および／または動的状態の動揺をひき起こす膜内在性タンパク質をコードする他の遺伝子の１つを発現する、かかるベクターによる病原体の形質転換；挿入遺伝子の過剰発現によって特徴づけられる方法。
【請求項１３】
そのプロモーターがダウン菌株の上方制御されたプロモーターである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
毒性菌株において約１００であり、遺伝子改変菌株において約１７０である単離外側膜のタンパク質／脂質比によって特徴づけられる請求項１２または１３に記載の方法で得られるサルモネラ菌。
【請求項１５】
遺伝子改変菌株が４０％増大する単離外側膜のタンパク質／脂質比によって特徴づけられる請求項１２または１３に記載の方法によって得られるＭ．マリヌム。
【請求項１６】
請求項１に記載の方法によって得られ、その毒性メカニズムが弱毒化されるが完全に免疫応答性であることを特徴とする病原微生物。
【請求項１７】
医療用途に使用される、請求項１に記載の方法によって得られる改変微生物。
【請求項１８】
ワクチンを製造する、請求項１に記載の方法によって得られる改変微生物。
【請求項１９】
ワクチンを製造する、請求項１７または１８に記載の改変微生物の使用。
【請求項２０】
適切な賦形剤および添加剤と併せた、請求項１８に記載の有効な量の改変微生物を活性成分として含有するワクチン。
【請求項２１】
その病原微生物が、肺炎およびトラコーマ症、コクシエラ・バーネッティイ、エールリキア・シャフェンシス、リケッチアなどのクラミジア種；レジオネラ・ニューモフィラ、結核菌、Ｍ．マリヌム、Ｍ．レプレ、などのマイコバクテリア、ノカルジア種（菌種）、バルトネラ種、ブルセラ種、フランシセラ・ツラレンシス、リステリア・モノサイトゲネス、サルモネラ種、シゲラ（赤痢菌）種；ボレリア・ブルグドルフェリ（ライム病）、トレポネーマ・パリダム、カンピロバクター、ヘモフィルス・インフルエンザ、クレブシエラ・ニューモニエ、レプトスピラ・インタロガンス、ナイセリア種、スタヒロコッカス、ストレプトコッカス・ピオゲネス、Ｓ．アガラクティエ、Ｓ．ニゥモニエ、エルシニア、バシラス・アンスラシス；アスペルギルス・フミガツス、カンジダ種、クリプトコッカス・ネオフォルマンス、ヒストプラスマ・カプスラツム、ニューモシスティス・カリニ、赤痢アメーバ、レーシュマニア種、熱帯熱マラリア原虫および三日熱マラリア原虫、トキソプラズマ原虫、トリパノソーマ・クルーズ；および関連組合せを含む群において選択される、請求項２０に記載のワクチン。
【請求項２２】
調製し、皮内、筋内、静脈内、粘膜内、経鼻、経膣、経口、および経直腸投与される、請求項２２または２３に記載のワクチン。
【国際調査報告】
2004535184.tif 000089
2004535184.tif 000090
2004535184.tif 000091
2004535184.tif 000092
2004535184.tif 000093
2004535184.tif 000094
2004535184.tif 000095