(57)【要約】Ｔ細胞受容体をコードするポリヌクレオチド並びにこれらのポリヌクレオチドの組成物および使用方法が提供される。本発明は、少なくとも１つのＴ細胞受容体またはそれらの断片をコードするポリヌクレオチド、これらのポリヌクレオチドをコートしたコア担体および被験体におけるＴ細胞介在疾患の治療方法を含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリヌクレオチドをコートしたコア担体であって、該ポリヌクレオチドが少なくとも１つのＴ細胞受容体（ＴＣＲ）のコーディング配列を含み、該コーディング配列がｉｎ ｖｉｖｏでレシピエント細胞において転写および翻訳されてリフォールドされたＴＣＲ分子が提供され得るように制御要素に作動的に連結したコア担体。
【請求項２】
ＴＣＲ分子がα鎖およびβ鎖を含む請求項１記載のコア担体。
【請求項３】
ＴＣＲ分子がγ鎖およびδ鎖を含む請求項１記載のコア担体。
【請求項４】
ＴＣＲ分子を発現するＴ細胞が自己免疫障害に優先的に関与する請求項１から３のいずれか１項記載のコア担体。
【請求項５】
自己免疫障害が多発性硬化症、乾癬、関節リウマチおよび狼瘡からなる群より選択される請求項４記載のコア担体。
【請求項６】
コア担体が金またはタングステンを含んでなる請求項１から５のいずれか１項記載のコア担体。
【請求項７】
請求項１から６のいずれか１項記載のコア担体および薬学的に許容し得る賦形剤を含む医薬組成物。
【請求項８】
Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）のＣＤＲ２超可変領域のコーディング配列を含むポリヌクレオチドでコートされたコア担体であって、該コーディング配列がｉｎ ｖｉｖｏでレシピエント細胞において転写および翻訳されてＣＤＲ２ペプチドが提供され得るように制御要素に作動的に連結し、該ＣＤＲ２が自己免疫障害に優先的に関与するＴ細胞に由来するコア担体。
【請求項９】
担体が金またはタングステンを含んでなる請求項８記載のコア担体。
【請求項１０】
請求項８または９のいずれか１項記載のコートされたコア担体および薬学的に許容し得る賦形剤を含む医薬組成物。
【請求項１１】
ＣＤＲ１およびＣＤＲ３からなる群より選択されるＴＣＲ超可変領域のコーディング配列を含有する第２ポリヌクレオチドをさらに含む、請求項８記載のコア担体。
【請求項１２】
担体が金またはタングステンを含んでなる請求項１１記載のコア担体。
【請求項１３】
自己免疫障害が多発性硬化症、乾癬、関節リウマチおよび狼瘡からなる群より選択される、請求項８から１２のいずれか１項記載のコア担体。
【請求項１４】
少なくとも１つのＴ細胞受容体（ＴＣＲ）のコーディング配列を含むポリヌクレオチドを含有する固形粒子状医薬組成物であって、該コーディング配列がｉｎ ｖｉｖｏでレシピエント細胞において転写および翻訳されてリフォールドされたＴＣＲ分子が提供され得るように制御要素に作動的に連結した固形粒子状医薬組成物。
【請求項１５】
ＴＣＲ分子がα鎖およびβ鎖を含む請求項１４記載の組成物。
【請求項１６】
ＴＣＲ分子がγ鎖およびδ鎖を含む請求項１４記載の組成物。
【請求項１７】
ＴＣＲ分子を発現するＴ細胞が自己免疫障害に優先的に関与する請求項１４から１６のいずれか１項記載の組成物。
【請求項１８】
自己免疫障害が多発性硬化症、乾癬、関節リウマチおよび狼瘡からなる群より選択される請求項１７記載の組成物。
【請求項１９】
組成物が約０．１から２５０μｍの平均粒子直径および約０．１から２５ｇ／ｃｍ３の範囲の密度を有する粒子の均一集団を含んでなる、請求項１４から１８のいずれか１項記載の組成物。
【請求項２０】
Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）のＣＤＲ２超可変領域のコーディング配列を含むポリヌクレオチドを含有する固形粒子状医薬組成物であって、該コーディング配列がｉｎ ｖｉｖｏでレシピエント細胞において転写および翻訳されてＣＤＲ２ペプチドが提供され得るように制御要素に作動的に連結し、該ＣＤＲ２が自己免疫障害に優先的に関与するＴ細胞に由来する固形粒子状医薬組成物。
【請求項２１】
ＣＤＲ１およびＣＤＲ３からなる群より選択されるＴＣＲ超可変領域のコーディング配列を含有する第２ポリヌクレオチドをさらに含む、請求項２０記載の組成物。
【請求項２２】
自己免疫障害が多発性硬化症、乾癬、関節リウマチおよび狼瘡からなる群より選択される請求項２０または２１のいずれか１項記載の組成物。
【請求項２３】
組成物が約０．１から２５０μｍの平均粒子直径および約０．１から２５ｇ／ｃｍ３の範囲の密度を有する粒子の均一集団を含んでなる、請求項２０から２２のいずれか１項記載の組成物。
【請求項２４】
少なくとも１つのＴ細胞受容体（ＴＣＲ）のコーディング配列を含み、該コーディング配列がｉｎ ｖｉｖｏで被験体のレシピエント細胞において転写および翻訳されてリフォールドされたＴＣＲ分子が提供され得るように制御要素に作動的に連結するポリヌクレオチドを含むベクターの、天然形態の該ＴＣＲを発現するＴ細胞に対する交差反応性免疫応答を誘発するための医薬の製造における使用であって、該医薬が該被験体への経皮注入に適する粒子状医薬である使用。
【請求項２５】
約０．５から５μｍの名目上のサイズを有する担体粒子が該ベクターでコートされて該粒子状医薬を提供する、請求項２４記載の使用。
【請求項２６】
担体粒子が金またはタングステンを含んでなる請求項２５記載の使用。
【請求項２７】
医薬が固形粒子状医薬組成物である請求項２４記載の使用。
【請求項２８】
該組成物が約０．１から２５０μｍの平均粒子直径および約０．１から２５ｇ／ｃｍ３の範囲の密度を有する粒子の均一集団を含んでなる、請求項２７記載の使用。
【請求項２９】
Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）のＣＤＲ２超可変領域のコーディング配列を含み、該コーディング配列がｉｎ ｖｉｖｏで被験体のレシピエント細胞において転写および翻訳されてＣＤＲ２ペプチドが提供され得るように制御要素に作動的に連結するポリヌクレオチドを含むベクターの、天然形態の該ＴＣＲを発現するＴ細胞に対する交差反応性免疫応答を誘発するための医薬の製造における使用であって、ＣＤＲ２が自己免疫障害に優先的に関与するＴ細胞に由来するものであり、かつさらに、該医薬が該被験体への経皮注入に適する粒子状医薬である使用。
【請求項３０】
約０．５から５μｍの名目上のサイズを有する担体粒子が該ベクターでコートされて該粒子状医薬を提供する、請求項２９記載の使用。
【請求項３１】
担体粒子が金またはタングステンを含んでなる請求項３０記載の使用。
【請求項３２】
医薬が固形粒子状医薬組成物である請求項２９記載の使用。
【請求項３３】
該組成物が約０．１から２５０μｍの平均粒子直径および約０．１から２５ｇ／ｃｍ３の範囲の密度を有する粒子の均一集団を含んでなる、請求項３２記載の使用。
【請求項３４】
Ｔ細胞介在疾患の治療方法であって、それらを必要とする被験体に有効量の請求項１から１３のいずれか１項のコア担体を投与し、それにより該被験体の細胞においてポリヌクレオチドを発現させてＴ細胞受容体（ＴＣＲ）分子またはＣＤＲ２ペプチドを、該Ｔ細胞介在疾患に介在するＴ細胞が発現する天然ＴＣＲに対する交差反応性免疫応答を誘導するのに十分な量提供する方法。
【請求項３５】
Ｔ細胞介在疾患の治療方法であって、それらを必要とする被験体に有効量の請求項１４から２３のいずれか１項の固形粒子状医薬組成物を投与し、それにより該被験体の細胞においてポリヌクレオチドを発現させてＴ細胞受容体（ＴＣＲ）分子またはＣＤＲ２ペプチドを、該Ｔ細胞介在疾患に介在するＴ細胞が発現する天然ＴＣＲに対する交差反応性免疫応答を誘導するのに十分な量提供する方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明は、一般には、Ｔ細胞受容体をコードするポリヌクレオチド、そのようなポリヌクレオチドを含有する組成物、およびそれらの使用方法に関する。特に、本発明は、少なくとも１種類のＴ細胞受容体分子をコードするポリヌクレオチドまたはそれらの断片、そのようなポリヌクレオチドを含有する粒子状医薬組成物、および被験体においてＴ細胞介在疾患を治療する方法であって、本発明の粒子状医薬組成物を投与してそのＴ細胞受容体を発現するＴ細胞の特定の集団に対する交差反応免疫応答を誘発すること記載の方法に属する。
【０００２】
背景
近年、針およびシリンジを用いる筋肉内注射（Ｗｏｌｆｆ ｅｔ ａｌ． （１９９０） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４７：１４６５：１４６８）または皮内注射（Ｒａｚ ｅｔ ａｌ． （１９９４） ＰＮＡＳ ＵＳＡ ９１：９５１９−９５２３）によるプラスミドＤＮＡの直接注射が報告されている。ＢｉｏｌｉｓｔｉｃＲと呼ばれる別のアプローチ、すなわち、粒子介在ＤＮＡ送達は、針無しデバイスを用いてＤＮＡ被覆微視的金ビーズを上皮細胞内に直接送達する（Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ． （１９９０） ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８７：９５６８−９５７２）。このように、核酸被覆微粒子を標的組織内に送達する粒子介在技術を含めて、免疫のために核酸を送達するのに幾つかの送達技術を用いることができる。（例えば、共同所有される、１９９９年２月２日出願の米国特許第５，８６５，７９６号を参照）。粒子介在核酸免疫技術は、ナノグラム量のＤＮＡの上皮送達の後に液性及び細胞性Ｔリンパ球免疫応答の両者を誘発することが示されている。Ｐｅｒｔｍｅｒ ｅｔ ａｌ． （１９９５） Ｖａｃｃｉｎｅ １３：１４２７−１４３０。そのような粒子介在送達技術が他のタイプの核酸接種と比較されており、顕著に優れていることが見出されている。Ｆｙｎａｎ ｅｔ ａｌ． （１９９５） Ｉｎｔ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ １７：７９．８３、Ｆｙｎａｎ ｅｔ ａｌ． （１９９３） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９０：１１４７８−１１４８２、およびＲａｚ ｅｔ ａｌ． （１９９４） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９１：９５１９−９５２３。
【０００３】
無傷の皮膚内に、およびそれを介して、制御された用量の固形薬物含有粒子を送達するのに針なしシリンジの使用を伴う新規経皮注射システムも記載されている。特に、共有のＢｅｌｌｈｏｕｓｅらの米国特許第５，６３０，７９６号は、超音波気流に乗せられた医薬粒子を送達する針なしシリンジを記載する。この針なしシリンジ（別名、「ＰｏｗｄｅｒＪｅｃｔＲ 針なしシリンジ装置」）は、粉末化薬物化合物および組成物の経皮送達、生活細胞内への遺伝物質の送達（例えば、遺伝子治療）並びに皮膚、筋肉、血液またはリンパへの生物薬剤の送達に用いられる。針なしシリンジは、手術と共に、器官表面、固形腫瘍および／または外科的空洞（例えば、腫瘍床または腫瘍切除後の空洞）に薬物および生物薬剤を送達するのにも用いられる。実質的に固形の粒子形態に適切に調製することができる医薬を、そのような装置を用いて、安全かつ容易に送達することができる。
【０００４】
ある針なしシリンジは、一般には、破裂性の膜を有する伸長管状ノズルを含み、この破裂性の膜は最初はノズルを貫通する通路を閉鎖し、かつノズルの上端に実質的に隣接して配置される。送達しようとする治療薬の粒子はこの破裂性の膜に連接して配置され、膜を破裂させるのに十分な気圧を膜の上流側に印加し、かつそれらの下流端から送達するためにノズルを貫通する超音波気流（医薬粒子を含有する）を生成する加圧手段を用いて送達される。このようにして、粒子を針なしシリンジからマッハ１からマッハ８の送達速度で送達することができ、この速度は破裂性の膜の破裂によって容易に得ることができる。
【０００５】
別の針なしシリンジ構成は、一般に、超音波気流に乗せられる医薬粒子を有する代わりに休止「反転」位置（ダイアフラムが医薬粒子を収容するための凹面を下流面に提示する）と活動「外転」位置（ダイアフラムの上流面に印加されている超音波衝撃波の結果としてダイアフラムが下流面上で外に向かって凸である）との間を移動可能である双安定性ダイアフラムがノズルの下流端に設けられていることを除いて、上記と同じ構成要素を含む。このようにして、ダイアフラムの凹面内に収容される医薬粒子がそれらの経皮送達のために標的皮膚または粘膜表面に向けて高速初期速度で装置から放出される。
【０００６】
上記針なしシリンジ構成を用いる経皮注射は、一般に０．１から２５０μｍの範囲のおおよそのサイズを有する粒子を用いて行う。約２５０μｍを上回る粒子をこの装置から送達することもできるが、この上限はそのサイズの粒子が皮膚細胞に厄介な損傷を与える点である。搬送された粒子が貫入する実際の距離は粒子径（例えば、大まかな球状粒子幾何を仮定した名目上の粒子直径）、粒子密度、粒子が皮膚表面に激突する初期速度、並びに皮膚の密度および動力学的粘度に依存する。針なし注射において用いるための標的粒子密度は一般に約０．１から２５ｇ／ｃｍ３の範囲であり、注入速度は一般に約１５０から３，０００ｍ／秒の範囲である。
【０００７】
発明の要約
本発明は、特定のＴ細胞介在疾患または障害を治療するために脊椎動物被験体の免疫に関連する方法および組成物を提供し、ここで、それらの組成物はＴ細胞受容体（ＴＣＲ）またはそれらの関連断片をコードするポリヌクレオチドを含有し、そのＴＣＲは自己免疫障害のようなＴ細胞介在障害に優先的に関与する特定のＴ細胞上に見出される（それによって発現される）。
【０００８】
したがって、本発明の主な目的は単離されたポリヌクレオチドを提供することであり、ここで、そのポリヌクレオチドは少なくとも１つのＴ細胞受容体（ＴＣＲ）のコーディング配列を含み、そのコーティング配列はｉｎ ｖｉｖｏでレシピエント細胞において転写および翻訳されて適切に折り畳まれた（例えば、リフォールドされた）ＴＣＲ分子をもたらすことができるように制御要素に作動可能に連結されている。この単離ポリヌクレオチドは、脊椎動物被験体において天然形態のＴＣＲを発現するＴ細胞に対する交差反応性免疫応答を誘発するための医薬の製造において用いられる。この医薬は、経皮粒子注入技術を用いて被験体に投与するのに適する粒子状医薬品である。したがって、一態様においては、この医薬はコア担体をポリヌクレオチドでコートすることによって形成される。別の態様においては、この医薬はポリヌクレオチドを含有する固形の粒子状医薬組成物である。特定の態様においては、このポリヌクレオチドはα鎖およびβ鎖を含有するＴＣＲ分子をコードする。別の態様においては、このポリヌクレオチドはγ鎖およびδ鎖を含有するＴＣＲ分子をコードする。本発明のＴＣＲコーディングポリヌクレオチドは、ＴＣＲを発現するＴ細胞が、例えば多発性硬化症、乾癬、関節リウマチおよび狼瘡を含む、自己免疫障害に優先的に関与することに基づいて選択される。
【０００９】
ＴＣＲ断片のコーディング配列、例えば、ＴＣＲのＣＤＲ２超可変領域のコーディング配列を含む単離ポリヌクレオチドを提供することも本発明の主な目的であり、ここで、ＣＤＲ２は自己免疫障害に優先的に関与するＴ細胞に由来するものである。この単離ポリヌクレオチドは、脊椎動物被験体において天然形態のＴＣＲを発現するＴ細胞に対する交差免疫応答を誘発するための医薬の製造において用いられる。この医薬は、経皮粒子注入技術を用いて被験体に投与するのに適する粒子状医薬品である。したがって、一態様においては、この医薬はコア担体をポリヌクレオチドでコートすることによって形成される。別の態様においては、この医薬はポリヌクレオチドを含有する固形の粒子状医薬組成物である。特定の態様においては、第２ポリペプチドも医薬中に提供され、ここで、この第２医薬は少なくとも１つのさらなるＴＣＲ超可変領域のコーディング配列、例えば、ＣＤＲ１および／またはＣＤＲ３ペプチドのコーディング配列を含む。好ましくは、ＴＣＲまたはそれらの断片を発現するＴ細胞は自己免疫障害（例えば、多発性硬化症、乾癬、関節リウマチおよび狼瘡）に優先的に関与する。
【００１０】
Ｔ細胞介在疾患または障害を治療するための方法を提供することが本発明のさらなる主な目的である。この方法は、本発明の粒子状医薬のうちの１つを投与し、それによりポリヌクレオチドを被験体のレシピエント細胞において発現させ、相同性ＴＣＲを発現する特定のＴ細胞に対する交差反応性免疫応答を誘導するのに十分な量のＴＣＲ分子またはそれらの断片（例えば、ＣＤＲ２ペプチド）を提供することを伴い、ここで、それらのＴ細胞はＴ細胞障害または疾患に関連する病理に介在する。好ましくは、ＴＣＲまたはそれらの断片は自己免疫障害（例えば、多発性硬化症、乾癬、関節リウマチおよび狼瘡）に優先的に関与するＴ細胞に由来するものである。特定の態様においては、ポリヌクレオチドはα鎖およびβ鎖を含むＴＣＲ分子をコードする。別の態様においては、ポリヌクレオチドはγ鎖およびδ鎖を含むＴＣＲ分子をコードする。加えて、この医薬は１つ以上のさらなるポリヌクレオチドを含むことができ、ここで、これらのさらなるポリヌクレオチドは完全長ＴＣＲ分子またはそれらの断片（例えば、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２および／またはＣＤＲ３ペプチド）をコードすることができる。具体的な態様においては、これらのさらなるポリヌクレオチドをコア担体（例えば、金またはタングステン）にコートし、治療を受ける被験体における皮膚細胞または粘膜細胞にその担体を投与する。
【００１１】
疾患部位で優先的に発現するＴ細胞受容体型のヌクレオチド配列を同定する工程およびここで説明されるポリヌクレオチドに含めるために同定されたヌクレオチドのうちの１つ以上を選択する工程をさらに含む方法を提供することが本発明のさらに別の主な目的である。特定の態様においては、この同定は、疾患部位でＴＣＲにおいて優先的に発現するＣＤＲ２領域のヌクレオチド配列を同定し、ポリヌクレオチドに含めるために同定されたヌクレオチド配列の１つ以上を選択することを含む。
【００１２】
したがって、本発明の１側面においては、コア担体粒子が提供される。このコア担体は少なくとも１つのＴ細胞受容体（ＴＣＲ）のコーディング配列を含むポリヌクレオチドでコートされ、このＴ細胞受容体のコーディング配列はｉｎ ｖｉｖｏでレシピエント細胞においてそれが転写および翻訳されてリフォールドされたＴＣＲ分子がもたらされ得るように制御要素に作動可能に連結する。
【００１３】
本発明の関連側面においてはコア担体が提供され、ここで、このコア担体はＴ細胞受容体（ＴＣＲ）のＣＤＲ２超可変領域のコーディング配列を含むポリヌクレオチドでコートされ、このＣＤＲ２超可変領域のコーディング配列はｉｎ ｖｉｖｏでレシピエント細胞においてそれが転写および翻訳されてＣＤＲ２ペプチドをもたらし得るように制御要素に作動可能に連結し、このＣＤＲ２は自己免疫障害に優先的に関与するＴ細胞に由来するものである。
【００１４】
本発明の別の側面においては、固形の粒子状医薬組成物が提供され、ここで、その組成物は少なくとも１つのＴ細胞受容体（ＴＣＲ）のコーディング配列を含むポリヌクレオチドを含有し、このＴ細胞受容体のコーディング配列はｉｎ ｖｉｖｏでレシピエント細胞においてそれが転写および翻訳されてリフォールドされたＴＣＲ分子がもたらされ得るように制御要素に作動可能に連結する。
【００１５】
本発明の関連側面においては、固形の粒子状医薬組成物が提供され、ここで、この組成物はＴ細胞受容体（ＴＣＲ）のＣＤＲ２超可変領域のコーディング配列を含むポリヌクレオチドを含有し、このＣＤＲ２超可変領域のコーディング配列はｉｎ ｖｉｖｏでレシピエント細胞においてそれが転写および翻訳されてＣＤＲ２ペプチドをもたらし得るように制御要素に作動可能に連結し、このＣＤＲ２は自己免疫障害に優先的に関与するＴ細胞に由来するものである。
【００１６】
本発明のさらに別の側面においては、少なくとも１つのＴ細胞受容体（ＴＣＲ）のコーディング配列を有するポリヌクレオチドを含むベクターが天然形態のＴＣＲを発現するＴ細胞に対する交差反応性免疫応答を誘発するための医薬の製造において用いられ、ここで、この医薬は被験体への経皮注入に適する粒子状医薬である。このコーディング配列は、それがｉｎ ｖｉｖｏで被験体のレシピエント細胞において転写および翻訳されてリフォールドされたＴＣＲ分子をもたらし得るように制御要素に作動可能に連結する。
【００１７】
本発明の関連側面においては、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）のＣＤＲ２超可変領域のコーディング配列を有するポリヌクレオチドを含むベクターが天然形態のＴＣＲを発現するＴ細胞に対する交差反応性免疫応答を誘発するための医薬の製造において用いられ、ここで、このＣＤＲ２は自己免疫障害に優先的に関与するＴ細胞に由来するものであり、かつこの医薬は被験体への経皮注入に適する粒子状医薬である。このコーディング配列は、それがｉｎ ｖｉｖｏで被験体のレシピエント細胞において転写および翻訳されてＣＤＲ２ペプチドをもたらし得るように制御要素に作動可能に連結する。
【００１８】
本発明のさらに別の側面においては、Ｔ細胞介在疾患を治療するための方法が提供される。この方法は、そのような治療を必要とする脊椎動物被験体に、（ａ）少なくとも１つのＴ細胞受容体（ＴＣＲ）のコーディング配列を含むポリヌクレオチドでコートされたコア担体であって、このＴ細胞受容体のコーディング配列はそれがｉｎ ｖｉｖｏでレシピエント細胞において転写および翻訳されてリフォールドされたＴＣＲ分子をもたらし得るように制御要素に作動可能に連結するコア担体；または（ｂ）Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）のＣＤＲ２超可変領域のコーディング配列を含むポリヌクレオチドでコートされたコア担体であって、このコーディング配列はそれがｉｎ ｖｉｖｏでレシピエント細胞において転写および翻訳されてＣＤＲ２ペプチドをもたらし得るように制御要素に作動可能に連結し、このＣＤＲ２は自己免疫障害に優先的に関与するＴ細胞に由来するものであるコア担体、のいずれかの有効量を投与することを伴う。投与の後、このポリヌクレオチドは被験体の細胞において発現し、Ｔ細胞介在疾患に介在するＴ細胞が発現する天然ＴＣＲに対する交差反応性免疫応答を誘導するのに十分な量のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）分子またはＣＤＲ２ペプチドをもたらす。
【００１９】
本発明の関連側面においては、Ｔ細胞介在疾患を治療するための別の方法が提供される。この方法は、そのような治療を必要とする脊椎動物被験体に、（ａ）少なくとも１つのＴ細胞受容体（ＴＣＲ）のコーディング配列を有するポリヌクレオチドを含有する固形の粒子状医薬組成物であって、このＴ細胞受容体のコーディング配列はそれがｉｎ ｖｉｖｏでレシピエント細胞において転写および翻訳されてリフォールドされたＴＣＲ分子をもたらし得るように制御要素に作動可能に連結する医薬組成物；または（ｂ）Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）のＣＤＲ２超可変領域のコーディング配列を有するポリヌクレオチドを含有する固形の粒子状医薬組成物であって、このコーディング配列はそれがｉｎ ｖｉｖｏでレシピエント細胞において転写および翻訳されてＣＤＲ２ペプチドをもたらし得るように制御要素に作動可能に連結し、このＣＤＲ２は自己免疫障害に優先的に関与するＴ細胞に由来するものである医薬組成物、のいずれかの有効量を投与することを伴う。投与の後、このポリヌクレオチドは被験体の細胞において発現し、Ｔ細胞介在疾患に介在するＴ細胞が発現する天然ＴＣＲに対する交差反応性免疫応答を誘導するのに十分な量のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）分子またはＣＤＲ２ペプチドをもたらす。
【００２０】
本発明のこれらの、および他の目的、側面および態様は、ここに提供される開示に照らして当業者に容易に理解されるであろう。
【００２１】
発明の実施の形態
本発明を詳細に説明する前に、本発明が特定のＴ細胞受容体コーディング配列に限定されるものではないことが理解されるべきである。開示される方法の異なる用途を当該技術分野における特定の需要に対してあつらえることができることも理解されるべきである。ここで用いられる用語が本発明の特定の態様を説明するためだけのものであり、限定されることを意図するものでないことも理解されるべきである。
【００２２】
ここで引用されるすべての刊行物、特許および特許出願は、上述のものであろうと下記のものであろうと、参照することによりそれら全体がここに組み込まれる。
【００２３】
本明細書および添付の請求の範囲において用いられる場合、単数「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、その文脈がそれ以外を明瞭に述べていない限り、複数の対象を含むことに注意しなければならない。したがって、例えば、「ａ ｃｏｒｅ ｃａｒｒｉｅｒ」への参照は２つ以上のそのような粒子の混合物を含み、「ａ ｐａｒｔｉｃｌｅ」への参照は２つ以上の粒子の混合物を含み、「ａ ｒｅｃｉｐｉｅｎｔ ｃｅｌｌ」への参照は２つ以上のそのような細胞を含む、などである。
【００２４】
定義
他に定義されない限り、ここで用いられるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野において通常の技術を有するものが通常理解するものと同じ意味を有する。以下の用語は以下に示される通りに定義されることが意図されている。
【００２５】
「経皮」送達という用語は、皮内（例えば、真皮または表皮内）、経皮（ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ）（例えば、「経皮（ｐｅｒｃｕｔａｎｅｏｕｓ）」）および経粘膜投与、すなわち、皮膚または粘膜組織内への、またはそれらを経由しての薬剤の通過による送達を意味する。例えば、Ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ： Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｉｓｓｕｅｓ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｉｔｉａｔｉｖｅｓ， Ｈａｄｇｒａｆｔ ａｎｄ Ｇｕｙ （ｅｄｓ．）， Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ． Ｉｎｃ．， （１９８９）；Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ： Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ， Ｒｏｂｉｎｓｏｎ ａｎｄ Ｌｅｅ （ｅｄｓ．）． Ｍａｒｃｅｌ ＤｅＫｋｅｒ Ｉｎｃ．， （１９８７）；およびＴｒａｎｓｄｅｒｍａｌ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ Ｄｒｕｇｓ， Ｖｏｌｓ． １−３， Ｋｙｄｏｎｉｅｕｓ ａｎｄ Ｂｅｒｎｅｒ （ｅｄｓ．）， ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ， （１９８７）を参照のこと。したがって、この用語は、米国特許第５，６３０，７９６号に記載される粒子送達装置からの送達に加えて米国特許第５，８６５，７９６号に記載される粒子介在送達を包含する。
【００２６】
「コア担体」が意味するところは、粒子介在送達技術、例えば、米国特許第５，１００，７９２号に記載されるものを用いてＤＮＡを送達することができるように、定義された粒子径に加えて細胞膜透過に必要な運動量を達成するのに十分な高さの密度を付与するために核酸（例えば、ＤＮＡ）でコートされた担体粒子である。コア担体は、典型的には、タングステン、金、白金、鉄、ポリスチレンおよびラテックスのような材料を含む。例えば、Ｐａｒｔｉｃｌｅ Ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｆｏｒ Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ， （１９９４） Ｙａｎｇ， Ｎ． ｅｄ．， Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｎｋ．ＮＹ ｐａｇｅｓ １０−１１を参照のこと。
【００２７】
「針なしシリンジ」が意味するところは、皮膚に貫入する通常の針を用いることなく粒子状組成物を経皮的に送達する機器である。本発明で用いる針なしシリンジは本明細書全体を通して考察される。したがって、この用語は粒子送達装置を含む。
【００２８】
「抗原」が意味するところは、宿主の免疫系を刺激して細胞性抗原特異的免疫応答または体液性抗体応答を生じる１つ以上のエピトープを含む分子である。したがって、抗原にはタンパク質、ポリペプチド、抗原性タンパク質断片、オリゴ糖、多糖等が含まれる。さらに、この抗原はあらゆる公知のウイルス、細菌、寄生虫、植物、原生動物、または真菌から送達することができ、かつ微生物全体であり得る。この用語は腫瘍抗原も含む。同様に、例えばＤＮＡ免疫用途におけるもののような、抗原を発現するオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドも抗原の定義に含まれる。合成抗原、例えば、ポリエピトープ、フランキングエピトープ、および他の組換えまたは合成で誘導される抗原も含まれる（Ｂｅｒｇｍａｎｎ ｅｔ ａｌ． （１９９３） Ｅｕｒ． Ｊ， Ｉｎｖｎｕｎｏｌ． ２３：２７７７−２７８１；Ｂｅｒｇｍａｎｎ ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５７；３２４２−３２４９；Ｓｕｈｒｂｉｅｒ． Ａ． （１９９７） Ｉｍｍｕｎｏｌ． ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． ７５：４０２−４０８；Ｇａｒｄｎｅｒ ｅｔ ａｌ． （１９９８） ｌ２ｔｈ Ｗｏｒｌｄ ＡＩＤＳ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ， Ｇｅｎｅｖａ， Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ， Ｊｕｎｅ ２８−Ｊｕｌｙ ３， １９９８）。
【００２９】
「エピトープ」という用語は、一般に、特異的抗原が結合する抗原上の部位を指す。抗体応答を誘発することが可能であるエピトープの同定は、当該技術分野において公知の技術を用いて容易に達成される。例えば、Ｇｅｙｓｅｎ ｅｔ ａｌ． Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ （１９８４） ８１：３９９８−４００２（ペプチドを迅速に合成して所定の抗原における免疫原性エピトープの位置を決定する一般法）；米国特許第４，７０８，８７１号（抗原のエピトープを同定し、かつ化学的に合成するための手順）；並びにＧｅｙｓｅｎ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ （１９８６） ２３：７０９−７１５（所定の抗体に対する高親和性を用いてペプチドを同定するための技術）を参照のこと。Ｔ細胞エピトープは、一般に、Ｔ細胞応答を誘導することが可能なペプチド構造の特徴を有するものである。これに関して、Ｔ細胞エピトープがＭＨＣ分子のペプチド結合性間隙内の伸長立体配座を想定する直鎖ペプチド決定基を含むことが当該技術分野において受けいれられている（Ｕｎａｎｕｅ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ （１９８７） ２３６：５５１−５５７）。ここで用いられる場合、エピトープは、一般には、約３−５、好ましくは５−１０もしくはそれ以上のアミノ酸残基を有するペプチドである。
【００３０】
ここで「自己抗原（ａｕｔｏａｎｔｉｇｅｎ）」という用語と交換可能に用いられる「自己抗原（ｓｅｌｆ ａｎｔｉｇｅｎ）」という用語は、すなわち免疫応答の間に認識され得る分子を意味し、通常はその個体の一部である。これは、通常は個体の環境の一部ではない、外来（ｆｏｒｅｉｇｎ）の、すなわち外来（ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ）の抗原とは対称的である。各々の自己免疫障害は自己抗原を指向する免疫応答を特徴とする。通常、自己抗原に対する活発な免疫応答はなく、症状は現れない。自己抗原に対する免疫応答の発生で自己免疫障害が発症し得る。自己免疫障害は、それに対して免疫応答が生じる特定の自己抗原に応じて臨床的に異なる症状を提示する。この免疫応答は結果として自己抗原を含む構造の破壊を生じ、それはその構造の正常な機能の喪失を伴うその構造の喪失であり、これが自己免疫障害の症状を生じる。
【００３１】
「ペプチド」は、２つ以上のサブユニットアミノ酸、アミノ酸類似体、または他のペプチド模倣体を有する化合物を指すのにその最も広範な意味で用いられる。これらのサブユニットはペプチド結合または他の結合、例えば、エステル、エーテル等によって連結することができる。ここで用いられる場合、「アミノ酸」という用語は、グリシンおよびＤもしくはＬ光学異性体の両者を含む天然および／または非天然の、または合成のアミノ酸、並びにアミノ酸類似体およびペプチド模倣体のいずれかを指す。３以上のアミノ酸を有するペプチドは、そのペプチド鎖が短い場合、通常オリゴペプチドと呼ばれる。ペプチド鎖が長い場合、そのペプチドは、典型的には、ポリペプチドまたはタンパク質と呼ばれる。
【００３２】
「核酸分子」および「ポリヌクレオチド」という用語は交換可能に用いられ、あらゆる長さのヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチドのいずれかの重合形態、またはそれらの類似体を指す。ポリヌクレオチドはあらゆる三次元構造を有することができ、既知であろうと未知であろうと、あらゆる機能を発揮し得る。ポリヌクレオチドの非限定的な例には、遺伝子、遺伝子断片、エクソン、イントロン、伝令ＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、転移ＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、リボザイム、ｃＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、分岐ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、あらゆる配列の単離ＤＮＡ、あらゆる配列の単離ＲＮＡ、核酸プローブ、およびプライマーが含まれる。
【００３３】
ポリヌクレオチドは、典型的には、４つのヌクレオチド塩基：アデニン（Ａ）；シトシン（Ｃ）；グアニン（Ｇ）；およびチミン（Ｔ）（ポリヌクレオチドがＲＮＡである場合にはチミン（Ｔ）の代わりにウラシル（Ｕ））の特定の配列で構成される。したがって、ポリヌクレオチド配列という用語はポリヌクレオチド分子の線形表示である。この線形表示を、中央処理ユニットを有するコンピュータ内のデータベースにインプットし、バイオインフォマッティクス用途、例えば、機能的ゲノミクスおよび相同性検索に用いることができる。
【００３４】
「ベクター」は、遺伝子配列を標的細胞に移送することが可能なあらゆる部分である（例えば、ウイルスベクター、非ウイルスベクター、粒子状担体、およびリポソーム）。「プラスミド」ベクターは、宿主細胞において自己複製が可能である染色体外遺伝要素である。典型的には、「ベクター構築物」、「発現ベクター」、および「遺伝子転移ベクター」は、目的の遺伝子の発現を指向することが可能であり、かつ遺伝子配列を標的細胞に移送することができるあらゆる核酸構築物を意味する。したがって、この用語にはウイルスベクターの他にクローニングおよび発現ビヒクルが含まれる。
【００３５】
「コーディング配列」、すなわち、選択されたポリペプチドを「コード」する配列は、適切な調節要素（または「制御要素」）の制御の下に置かれたとき、ｉｎ ｖｉｖｏでポリペプチドに転写（ＤＮＡの場合）および翻訳（ｍＲＮＡの場合）される核酸分子である。コーディング配列の境界は５’（アミノ）末端の開始コドンおよび３’（カルボキシ）末端の翻訳終止コドンによって決定される。コーディング配列には、これらに限定されるものではないが、ウイルス由来のｃＤＮＡ、原核もしくは真核生物ｍＲＮＡ、ウイルス由来のゲノムＤＮＡまたは原核生物ＤＮＡ、および合成ＤＮＡ配列さえ含まれる。転写終止配列はコーディング配列の３’側に位置することができる。コーディング配列の転写および翻訳は、典型的には、「制御要素」によって調節され、これには、これらに限定されるものではないが、転写プロモーター、転写エンハンサ要素、シャイン・ダルガノ配列、転写終止シグナル、ポリアデニル化配列（翻訳終止コドンの３’側に位置する）、翻訳の開始を最適化するための配列（コーディング配列の５’側に位置する）、並びに翻訳終止配列が含まれる。
【００３６】
「プロモーター」は、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの転写を指向するヌクレオチド配列である。プロモーターには、誘発性プロモーター（このプロモーターに作動可能に連結するポリヌクレオチド配列の発現はアナライト、補因子、調節タンパク質等によって誘導される）、抑制性プロモーター（このプロモーターに作動可能に連結するポリヌクレオチド配列の発現はアナライト、補因子、調節タンパク質等によって抑制される）、構成性プロモーター、および選択的プロモーター（このプロモーターに作動可能に連結するポリヌクレオチドの発現は特定の組織型においてのみ生じる）が含まれ得る。「プロモーター」または「制御要素」という用語には全長プロモーター領域およびこれらの領域の機能的（例えば、転写または翻訳の制御）セグメントが含まれることが意図されている。
【００３７】
「単離ポリヌクレオチド」分子は、自然状態でその分子が見出される生物全体から分離および分別された核酸分子；または自然状態で通常それに伴う配列の全体もしくは一部が欠けている核酸分子；または自然状態で存在するままであるが、それに関して異種の配列（以下に定義される）を有する配列である。配列は、それが源の分子の特定の領域、そのｃＤＮＡ、それらの相体と同じであるかもしくは実質的に同じ塩基対配列を有する場合、または以下に説明されるように配列同一性を示す場合に分子から「誘導」される。
【００３８】
「作動可能に連結する」は、そのように説明される構成要素がそれらの通常の機能を発揮するように構成される要素の配置を指す。したがって、（例えば、目的の抗原をコードする）コーディング配列に作動可能に連結する所定のプロモーターは、適切な酵素が存在するとき、そのコーディング配列の発現を達成することが可能である。プロモーターおよび他の制御要素は、それらがそれらの発現を指向するように機能する限り、コーディング配列に隣接する必要はない。例えば、翻訳されてはいないが転写されている介在配列がプロモーター配列とコーディング配列との間に存在していてもよく、そのプロモーター配列は依然としてコーディング配列に「作動可能に連結する」と考えることができる。
【００３９】
核酸分子を説明するのにここで用いられる「組換え」はゲノム、ｃＤＮＡ、半合成、または合成起源のポリヌクレオチドを意味し、これらは、その起源または取り扱いのため、（１）自然状態でそれが会合するポリヌクレオチドの全てもしくは一部とは会合することがなく；および／または（２）自然状態でそれが連結するもの以外のポリヌクレオチドと連結する。「組換え」という用語は、タンパク質またはポリペプチドに関して用いられる場合、組換えポリヌクレオチドの発現によって産生されるポリペプチドを意味する。
【００４０】
核酸およびアミノ酸「配列同一性」を決定するための技術も当該技術分野において公知である。典型的には、そのような技術は、遺伝子のｍＲＮＡのヌクレオチド配列の決定および／またはそれらによってコードされるアミノ酸配列の決定、並びにこれらの配列と第２のヌクレオチドもしくはアミノ酸配列との比較を含む。一般には、「同一性」は、それぞれ、２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の正確なヌクレオチド−ヌクレオチドまたはアミノ酸−アミノ酸対応を指す。２つ以上の配列（ポリヌクレオチドまたはアミノ酸）を、それらの「同一性パーセント」を決定することによって比較することができる。２つの配列の同一性パーセントは、核酸配列であろうとアミノ酸配列であろうと、より短い配列の長さで除して１００倍した２つの整列化配列間の正確な一致の数である。核酸配列のおおよその整列は、Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ， Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ ２：４８２−４８９ （１９８１）の局所相同性アルゴリズムによって得られる。このアルゴリズムは、Ｄａｙｈｏｆｆ， Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ， Ｍ．Ｏ． Ｄａｙｈｏｆｆ ｅｄ．， ５ ｓｕｐｐｌ． ３：３５３−３５８， Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ， Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ， Ｄ．Ｃ．， ＵＳＡによって開発され、Ｇｒｉｂｓｋｏｖ， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １４（６）：６７４５−６７６３ （１９８６）によって規準化された採点行列を用いることによってアミノ酸配列に適用することができる。配列の同一性パーセントを決定するこのアルゴリズムの例示的実施は、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ（Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）によって「ＢｅｓｔＦｉｔ」ユーティリティ・アプリケーションにおいて提供されている。この方法のデフォルトのパラメータは、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐａｃｋａｇｅ Ｐｒｏｇｒａｍ Ｍａｎｕａｌ， Ｖｅｒｓｉｏｎ ８ （１９９５）（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩから入手可能）に記載されている。本発明の脈絡において同一性パーセントを確立する好ましい方法は、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｅｄｉｎｂｕｒｇが著作権を有し、Ｊｏｈｎ Ｆ． Ｃｏｌｌｉｎｓ ａｎｄ Ｓｈａｎｅ Ｓ． Ｓｔｕｒｒｏｋによって開発され、かつＩｎｔｅｌｌｉＧｅｎｅｔｉｃｓ， Ｉｎｃ．（Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ、ＣＡ）によって販売されているプログラムのＭＰＳＲＣＨパッケージを用いることである。この一組のパッケージから、デフォルトのパラメータを採点表に用いる場合にＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムを用いることができる（例えば、ギャップ・オープン・ペナルティ（ｇａｐ ｏｐｅｎ ｐｅｎａｌｔｙ）１２、ギャップ・エクステンション・ペナルティ（ｇａｐ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ｐｅｎａｌｔｙ）１、およびギャップ６）。生成したデータから、「Ｍａｔｃｈ」値が「配列同一性」を反映する。配列間の同一性パーセントまたは類似性を算出するのに適する他のプログラムが当該技術分野において一般に公知であり、例えば、��の整列プログラムはデフォルト・パラメータで用いられるＢＬＡＳＴである。例えば、以下のデフォルト・パラメータを用いてＢＬＡＳＴＮおよびＢＬＡＳＴＰを用いることができる：遺伝子コード＝標準；フィルター＝なし；鎖＝両方；カットオフ＝６０；期待値＝１０；マトリックス＝ＢＬＯＳＵＭ６２；記述＝５０配列；ソート＝ＨＩＧＨ ＳＣＯＲＥ；データベース＝非冗長、ＧｅｎＢａｎｋ＋ＥＭＢＬ＋ＤＤＢＪ＋ＰＤＢ＋ＧｅｎＢａｎｋ ＣＤＳ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎｓ＋Ｓｗｉｓｓ ｐｒｏｔｅｉｎ＋Ｓｐｕｐｄａｔｅ＋ＰＤＲ。これのプログラムの詳細は以下のインターネット・アドレスで見出すことができる：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｇｏｖ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ＢＬＡＳＴ。
【００４１】
あるいは、相同領域間に安定な二重鎖を形成する条件下でのポリヌクレオチドのハイブリダイゼーションと、それに続く一本鎖特異的ヌクレアーゼ（１種類もしくは複数種類）での消化および消化された断片のサイズ決定によって相同性を決定することができる。２つのＤＮＡ、または２つのポリペプチド配列は、それらの配列が、上記方法を用いる決定で、分子の定義された長さにわたって少なくとも約８０％〜８５％、好ましくは少なくとも約９０％、最も好ましくは少なくとも約９５％〜９８％の配列同一性を示すとき、互いに「実質的に相同」である。ここで用いられる場合、実質的に相同は指定されたＤＮＡまたはポリペプチド配列に対して完全な同一性を示す配列をも指す。実質的に相同であるＤＮＡ配列は、例えばそのシステムについて定義される厳密な条件下での、サザンハイブリダイゼーション実験において同定することができる。例えば、厳密なハイブリダイゼーション条件は５０％ホルムアミド、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液、５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳおよび１００μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡを含むことができ、かつ洗浄条件は３７℃で２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳとそれに続く６８℃で１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳを含むことができる。適切なハイブリダイゼーション条件の定義は当該技術分野の技術の範囲内にある。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ、前出；ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ、前出；Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ、前出を参照のこと。
【００４２】
ここで用いられる場合、「アジュバント」という用語は薬物、抗原、ポリヌクレオチド、ベクター等の作用を増強するあらゆる物質を指す。常に明瞭に述べられるものではないが、野生型または精製ペプチドアジュバント（例えば、組換えで産生されたもの、またはそれらの変異体）に類似する生物学的活性を有する分子およびこれらの分子をコードする核酸が本発明の精神および範囲内で用いられることが意図される。
【００４３】
ここで用いられる場合、「治療する」または「治療」という用語には以下のいずれもが含まれる：感染または再感染の予防；症状の低減または除去；および病原体の減少または完全な排除。治療は予防的（感染前）または治療的（感染後）になすことができる。
【００４４】
「脊椎動物被験体」が意味するところは脊索動物亜門（ｓｕｂｐｈｙｌｕｍ ｃｏｒｄａｔａ）のあらゆるメンバー、特には、制限することなく、ヒトおよび他の霊長類を含む哺乳動物である。この用語は特定の年齢を示すことがない。したがって、成体および新生個体の両者がカバーされることが意図される。
【００４５】
発明の一般的な概要
本発明を詳細に説明する前に、本発明が特定の製剤またはプロセス・パラメータ（これら自体が当然、多種多様なものでありうる）に限定されるものではないことは理解されるべきである。本明細書中で用いられる専門用語は本発明の特定の態様を説明するためだけのものであり、それらに限定されることを意図するものではないことも理解されるべきである。
【００４６】
細胞介在免疫応答においては、特定のタンパク質（例えば、抗原）が主要組織適合複合体（「ＭＨＣ」）と会合するときにそれらのタンパク質と結合することが可能であるＴリンパ球（Ｔ細胞）が介在し、典型的には、抗原提示細胞（「ＡＰＣ」、例えば、樹状細胞またはマクロファージ）が介在する。このＡＰＣは抗原をより小さいサイズの断片に消化し、それをＡＰＣのＭＨＣに結合してその表面上に提示する。
【００４７】
Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）はＴ細胞の表面上に存在する二重鎖タンパク質であり、ＡＰＣによって提示されるペプチド−ＭＨＣ複合体を認識し、かつそれと結合する構造的に可変性の抗原特異的受容体を構成する。２つの公知のタイプのＴＣＲ、すなわちＴＣＲ２（「α」および「β」鎖で構成される）およびＴＣＲ１（「γ」および「δ」鎖で構成される）が存在する。αおよびγ鎖は、各々、可変（「Ｖ」）領域、連結（「Ｊ」）領域および定常（「Ｃ」）領域に分けられる。βおよびδ鎖は、各々、Ｖ、ＪおよびＣ領域を有し、かつＶおよびＪの間に配置される多様性（「Ｄ」）領域も有する。９５％を上回るＴＣＲはαβ鎖二量体であり、これに対して約５％がγδ鎖二量体である。
【００４８】
ＴＣＲは膨大な多様性をもって発現し、各々のＴＣＲは１つもしくは少数のＭＨＣ−ペプチド複合体に特異的である。ＴＣＲの選択性はＶ、ＤおよびＪ領域の多くの組合せに起因し、これはＶ、ＤおよびＪ領域の遺伝子間の連結部における無作為な超可変性によって増幅される。この多様性のため、様々な数的命名法が生じている。広範に受け入れられているものはＣｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ． （１９８８） ＥＭＢＯ Ｊ． ７（１２）：３７４５−３７５５によって記載されるシステムであり、このシステムでは（本発明において特に対象とする）β鎖のＶ領域のアミノ酸（「ＡＡ」）が、ＡＡ９２位を有するものと指定される保存システインから開始してＮ末端に向けて数的に減じる方向にカウントされる。Ｖαにおける対応する保存システインは、このシステムにおいてはＡＡ９０位を有するものと指定される。ＴＣＲは３つの相補性決定領域：Ｖ領域のＮ末端に向けて位置するＣＤＲ１；Ｖ領域の幾らか中央に位置するＣＤＲ２（一般には、およそアミノ酸３５の保存ＷＹフレームワークから出発してＣ末端に向けて第１２〜第２５もしくは第２６アミノ酸を含む）；およびＶ（Ｄ）Ｊ連結にまたがって位置するＣＤＲ３を有する。
【００４９】
蓄積された証拠も、特定のタンパク質上のエピトープに特異的なＴＣＲが自己免疫障害を引き起こす一因となることを示唆する。例えば、ミエリン塩基性タンパク質（ＢＰ）は多発性硬化症の病因となり得る。動物においては、ＴＣＲα鎖可変遺伝子およびβ鎖可変遺伝子の限られたセットがＢＰに特異的なＴＣＲによって用いられ（例えば、Ａｃｈａ−Ｏｒｂｅａ ｅｔ ａｌ． （１９９８） Ｃｅｌｌ ５４：２６３−２７３を参照）、これらの領域またはそれらのＴＣＲ可変領域に共通の配列を有する合成ペプチドに向けられたモノクローナル抗体は、実験的な自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）の臨床徴候を示す動物の防御および治療の両者が可能である。
【００５０】
加えて、細胞介在免疫応答を誘導するワクチンが自己免疫障害のようなＴ細胞介在応答に立ち向かう上で重要な戦略を代表する。自己免疫障害を治療する現在のアプローチは、免疫系全体に影響を及ぼし、したがって望ましくない副作用をもたらす治療薬の投与を含む。現行のＴ細胞ワクチン療法は、患者の病的状態の軽減をもたらす上で、限られた有用性が立証されているのみである。幾つかのグループが、（１）組換え法により産生される全Ｔ細胞受容体（例えば、ＷＯ ９９／６０１１９およびＷＯ ９９／６０１２０を参照）；（２）ＴＣＲのペプチド断片、特には、ＴＣＲの第２相補性決定領域（ＣＤＲ２）を含む断片（例えば、両者ともＶａｎｄｅｒｂａｒｋの米国特許第５，６１４，１９２号および第５，７７６，４５９号を参照）；または（３）ＴＣＲの可変領域をコードする構築物のＤＮＡ−心臓毒注射（例えば、Ｓｔｅｉｎｍａｎらの米国特許第５，９３９，４００号を参照）のいずれかを用いてＴ細胞受容体（ＴＣＲ）ワクチンを開発しようと試みてきた。これらの方法は一貫した免疫応答を示していない。
【００５１】
本発明は、Ｔ細胞受容体またはそれらの断片をコードするポリヌクレオチド；これらのポリヌクレオチドでコートしたコア担体；これらのポリヌクレオチドで作製した粒子状組成物；およびこれらのポリヌクレオチドを含む医薬組成物を、例えば核酸（例えば、ＤＮＡ）ワクチンとして用いるＴ細胞介在疾患の治療方法を、提供する。これらのポリヌクレオチドによってコードされるＴＣＲは、好ましくは、１つ以上の自己免疫障害に関連する特異的ＴＣＲである。
【００５２】
したがって、本発明は、特定の自己免疫障害、例えば、多発性硬化症、乾癬、関節リウマチ、狼瘡等の効率的な治療方法であって、疾患病変部に多数存在しているか、またはそこで過剰発現されるＴ細胞（例えば、特異的なＶ−ベータ受容体型）に対する抑制性免疫応答（例えば、液性および／または細胞性）を誘導することによる方法を含む。これらの過剰発現したＴＣＲをまず同定し、これらの特異的ＴＣＲの全体またはそれらの可変領域をコードするポリヌクレオチドを次に構築する。さらに、公知のＴＣＲワクチンとは異なり、本発明のポリヌクレオチドはＴ細胞受容体全体をコードすることができ、これらのポリヌクレオチドによってコードされるＴ細胞受容体の構成鎖は、好ましくは、ｉｎ ｖｉｖｏでそれらの二量体配列にリフォールドされる。
【００５３】
本発明のポリヌクレオチドは、例えば、トランスフェクションにより、またはそれらのポリヌクレオチドを粒子上にコートしてそのコートされた粒子を細胞に投与することにより、ｉｎ ｖｉｔｒｏでまたはｉｎ ｖｉｖｏで、細胞に導入することができる。あるいは、下記および国際公開ＷＯ ９８／１０７５０（これは参照することにより本明細書に組み込まれる）の開示においてより詳細に考察されるように、本発明のポリヌクレオチドは粒子状（例えば、粉末）形態で提供することができる。
【００５４】
本発明の利点には、以下に限定されるものではないが、（ｉ）疾患部位、またはその近傍での免疫原性ＴＣＲのｉｎ ｖｉｖｏ産生；（ｉｉ）生体外で正確に折り畳まれたＴ細胞受容体を大量に産生する必要性の排除；（ｉｉ）より小さいタンパク質よりも免疫原性であるより大きなタンパク質をコードするポリヌクレオチドを投与することによる免疫原性の増加；（ｉｉｉ）細胞介在免疫応答の一貫性の改善；（ｉｖ）Ｔ細胞受容体介在疾患、例えば、自己免疫障害に通常関与する経路の誘発および（ｖ）過剰発現したＴ細胞型に対するワクチン接種によるＴ細胞介在疾患の治療が含まれる。
【００５５】
Ｔ細胞受容体介在疾患
本明細書中に記載される組成物および方法は広く様々なＴ細胞受容体介在疾患、例えば、自己免疫障害の治療において有用である。自己免疫障害は、罹患個体において生来見出される自己抗原上のエピトープに対する細胞傷害性免疫応答を特徴とする。その個体の免疫系は、それら特定の自己抗原を提示する細胞および組織に向けられた炎症カスケードを活性化する。個体自身の免疫系によって攻撃された抗原、組織、細胞型、または器官の破壊が、疾患の症状を生じる。
【００５６】
臨床的に重要な自己免疫障害には、例えば、関節リウマチ、多発性硬化症、若年型糖尿病、全身性エリテマトーデス、自己免疫ブドウ膜網膜炎、自己免疫血管炎、水疱性類天疱瘡、重症筋無力症、自己免疫甲状腺炎、すなわち橋本病、シェーグレン症候群、肉芽腫性睾丸炎、自己免疫卵巣炎、クローン病、サルコイドーシス、リウマチ性心臓炎、強直性脊椎炎、グレーブズ病、および自己免疫血小板減少性紫斑症が含まれる。例えば、Ｐａｕｌ， Ｗ．Ｅ． （１９９３） 「基礎免疫学（Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）」， 第３版， Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， 第３０章， ｐｐ． １０３３−１０９７；およびＣｏｈｅｎ ｅｔ ａｌ． （１９９４） 「自己免疫障害モデル（Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｍｏｄｅｌｓ）」， Ａ Ｇｕｉｄｅｂｏｏｋ， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， １９９４を参照のこと。
【００５７】
自己免疫障害は、典型的には、特異的ＴＣＲの存在量の増加に関連する。したがって、治療しようとする病的状態が、本明細書中で説明される組成物および方法において用いられるＴＣＲ配列の選択を決定する。炎症性疾患に関連するＴＣＲの同定は、そのような特定のＴＣＲを有するＴ細胞の前炎症性応答を阻害する治療の利用を可能にする。あらゆる所定の自己免疫障害において優先的に発現する他の特異的ＴＣＲ（例えば、ＴＣＲ全体またはＣＤＲ２領域のような可変領域）の同定は、当該技術分野において公知の方法を用いて、例えば、配列分析または一本鎖高次構造多型（ＳＳＣＰ）によって実施できることがここでの教示から明らかである。（例えば、Ｙａｍａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ． （１９９２） Ｉｎｔ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ４：１２１９；Ｙａｍａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ （１９９６） Ｈｕｍ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ４８：２３を参照）。ＴＣＲを同定する他の方法には、試験抗原に応答するＴ細胞の可変領域高次構造を決定するｉｎ ｖｉｔｒｏ抗原ベースのアッセイが含まれる。これらのアッセイでは、当該技術分野において公知の方法を用いて、抗原全体または選択された免疫優性ペプチドを利用することができる。
【００５８】
個別の疾患に応じて、様々な組織を関連ＴＣＲの同定に使用できることも本明細書中の教示から明らかであろう。ＭＳのような神経性疾患については、脳プラークまたは脳脊髄液をＴ細胞の供給源として用いることができる。同様に、重症筋無力症については、筋肉、胸腺組織またはアセチルコリン受容体に対して応答性のＴ細胞を用いることができる。関節リウマチについては、滑液を用いることができる。
【００５９】
さらに、自己免疫障害において過剰発現する多くの特異的ＴＣＲが従来同定されてきている。例えば、関節リウマチに罹患した被験体においては、ヒト熱ショックタンパク質６０および／またはＩＩ型コラーゲン（ＣＩＩ）に特異的なＴＣＲが過剰発現するようである。関節リウマチは、複数の系に影響を及ぼすが主として複数の関節に影響を及ぼす炎症性自己免疫障害である。この疾患には、滑膜および他の関節構造の炎症、筋萎縮、骨の侵食および粗化、並びに関節表面上でのパンヌス（血管結合組織炎症性膜）の形成が伴う。関節リウマチは、一般には、非常に痛みを伴い、しばしば、重度に衰弱させるものである。
【００６０】
同様に、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）およびプロテオリピドタンパク質（ＰＬＰ）に対して応答性のＴ細胞が、多発性硬化症の患者の脳脊髄液および血液において見出されている。ＭＳは慢性中枢神経系疾患であり、脳および脊髄の最も一般的な脱髄性障害である。Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．， 「脱髄性疾患の免疫学的態様（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ａｓｐｅｃｔｓ ｏｆ ｄｅｍｙｅｌｉｎａｔｉｎｇ ｄｉｓｅａｓｅｓ）」 Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １０：１５３−１８７ （１９９２）を参照のこと。多発性硬化症の患者から得たＴ細胞株は、残基８４〜１０６にあるＨＬＡ−ＤＲ２拘束性エピトープを認識する（Ｏｔａ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３４６：１８３−１８７ （１９８９））。加えて、Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １７３：１９ （１９９１）は、多発性硬化症Ｔ細胞によって認識される残基８７〜１０６にあるエピトープを同定した。
【００６１】
糖尿病患者においても特定のＴ細胞受容体が過剰発現するようである。糖尿病患者由来のＴ細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ増殖は、３８ｋＤベータ細胞顆粒タンパク質によって刺激されるようである（Ｒｏｅｐ ｅｔ ａｌ． （ｌ９９０） Ｎａｔｕｒｅ ３４５：６３２−６３４）。さらに、糖尿病患者におけるＴ細胞がインシュリンを自己抗原として認識し得ることの幾つかの証拠が存在する。（ＭｃＩｎｅｒｎｅｙ ｅｔ ａｌ． Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｒｅｓ Ｃｌｉｎ Ｐｒａｃｔ． （２０００） Ｍａｒ；４７（３）：１５１−６８）。
【００６２】
このように、特定の疾患においては１種類以上の特異的ＴＣＲがより多数存在しているようである。これらのＴＣＲの同定は抗ＴＣＲ核酸（例えば、ＤＮＡ）ワクチンの設計および多様なＴ細胞介在疾患の治療方法を可能にする。
【００６３】
ポリヌクレオチド
本発明のポリヌクレオチドは全ＴＣＲ分子またはそれらの断片、特には、可変領域の断片のコーディング配列を含む。好ましくは、この配列は、投与によって天然ＴＣＲを提示する（コードする）Ｔ細胞に対する抑制性の交差反応性免疫応答を誘導するのに十分なものである。これらのポリヌクレオチドは１種類以上のＴＣＲ分子またはそれらの断片を含むように製剤化することができる。したがって本発明のポリヌクレオチドは、幾つかの場合においては、各々が同じエピトープを認識するか、異なるエピトープを認識するか、または異なるエピトープ−ＭＨＣの組合せを認識するような複数のＴＣＲコーディング配列を含むことが望ましいであろう。
【００６４】
本発明において用いるために選択されるヌクレオチド配列は、公知の供給源から、例えば、所望の遺伝子またはヌクレオチド配列を含む細胞から標準技術を用いてそれを単離することによって得ることができる。同様に、ヌクレオチド配列は、当該技術分野において周知である標準的なポリヌクレオチド合成法を用いて合成により生成することができる。例えば、Ｅｄｇｅ ｅｔ ａｌ． （１９８１） Ｎａｔｕｒｅ ２９２：７５６−７６２；Ｎａｍｂａｉｒ ｅｔ ａｌ． （１９９４） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２３．：１２９９−１３０１；Ｊａｙ ｅｔ ａｌ． （１９８４） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２５９：６３１１−６３１７を参照のこと。一般には、合成オリゴヌクレオチドは、前出のＥｄｇｅらおよびＤｕｃｋｗｏｒｔｈ ｅｔ ａｌ． （１９８１） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ９：１６９１−１７０６によって記載されるホスホトリエステル法、またはＢｅａｕｃａｇｅ ｅｔ ａｌ． （１９８１） Ｔｅｔ． Ｌｅｔｔｓ． ２２：１８５９、およびＭａｔｔｅｕｃｃｉ ｅｔ ａｌ． （１９８１） Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． １０３：３１８５によって記載されるホスホロアミダイト法のいずれかによって製造することができる。合成オリゴヌクレオチドは、商業的に入手可能な自動化オリゴヌクレオチド合成機を用いて製造することもできる。したがって、ヌクレオチド配列は特定のアミノ酸配列に適切なコドンを有するように設計することができる。一般には、目的とする宿主における発現に好ましいコドンを選択する。標準法によって製造した重複オリゴヌクレオチドから完全な配列を構築し、完全なコーディング配列に組み上げる。例えば、Ｅｄｇｅら（前出）；Ｎａｍｂａｉｒら（前出）およびＪａｙら（前出）を参照のこと。
【００６５】
本明細書で用いる核酸配列を得るための別の方法は組換え手段によるものである。すなわち所望のヌクレオチド配列を、それを担持するプラスミドから標準的な制限酵素および手順を用いて切り出すことができる。部位特異的ＤＮＡ開裂は、適切な制限酵素を用いて、当該技術分野において一般に理解されそのうちの特定のものが商業的に入手可能な制限酵素の製造者によって指定される条件下で処理することによって、実施する。所望であれば、標準技術を用いるポリアクリルアミドゲルまたはアガロースゲル電気泳動によって、開裂した断片のサイズ分離を行うことができる。
【００６６】
制限開裂断片は、４種類のデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）の存在下で、大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）ＤＮＡポリメラーゼＩ（Ｋｌｅｎｏｗ）大断片で標準技術を用いて処理することによって平滑化することができる。このＫｌｅｎｏｗ断片は、例え４種類のｄＮＴＰが存在するとしても、５’一本鎖オーバーハングを充填する一方で突出３’一本鎖を消化する。所望であれば、そのオーバーハングの性質によって決定付けられる制限内で１種類もしくは数種類の選択されたｄＮＴＰのみを供給することにより、選択的修復を行うことができる。Ｋｌｅｎｏｗ処理の後、その混合物を、例えばフェノール／クロロホルムで、抽出し、エタノール沈殿させることができる。適切な条件下でのＳ１ヌクレアーゼまたはＢＡＬ−３１での処理はあらゆる一本鎖部分の加水分解を生じる。
【００６７】
特異的核酸分子を単離するためのさらに別の都合の良い方法は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によるものである。Ｍｕｌｌｉｓ ｅｔ ａｌ． （１９８７） Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． １５５：３３５−３５０。この技術は、ＤＮＡの所望の領域を複製するのにＤＮＡポリメラーゼ、通常は熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを用いる。複製しようとするＤＮＡの領域を、所望のＤＮＡの反対の末端および反対の鎖に相補的な指定配列のオリゴヌクレオチドによって特定し、複製反応を開始させる。この第１回の複製産物はそれ自体が次の複製のテンプレートであり、したがって、繰り返される連続した複製サイクルが、用いられるプライマー対によって範囲が定められるＤＮＡ断片の幾何学的増幅を生じる。また、この方法により、ＤＮＡ産物の末端へのヌクレオチド配列の手軽な付加が、オリゴヌクレオチドプライマーにそれらの追加配列を組み込むことによって可能になる（例えば、ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ， Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ， Ｉｎｎｉｓ ｅｔ ａｌ． （ｅｄｓ） Ｈａｒｃｏｕｒｔ Ｂｒａｃｅ Ｊｏｖａｎｏｖｉｃｈ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ， ＮＹ （１９９４）を参照）。各々の増幅反応に用いられるＰＣＲ条件は経験的に決定される。幾つかのパラメータが反応の成功を左右する。それらとしては、アニーリング温度および時間、伸長時間、Ｍｇ２＋およびＡＴＰ濃度、ｐＨ、並びにプライマー、テンプレート、およびデオキシリボヌクレオチドの相対濃度が挙げられる。適切なＰＣＲ条件の一例は以下の実施例中に見出される。
【００６８】
自己免疫障害のような障害または疾患状態に関連する特異的ＴＣＲ分子またはＴＣＲ断片ペプチド配列、およびそれらの分子またはペプチドをコードする核酸配列は、そのいくつもが当該技術分野において公知である。特に、適切な複数のそのようなペプチドおよび核酸配列がＨｏｗｅｌｌらの米国特許第６，２０７，６４５号に開示されており、これは参照することにより本明細書に組み込まれる。これらの、および他の公知の、または容易に同定される配列を用いて、本発明の実施において用いられるＴＣＲ分子またはＴＣＲ断片ペプチドのコーディング配列を作製または抽出することができる。加えて、幾つかの場合においては、コードされたＴＣＲ分子またはＴＣＲ断片ペプチドの配列を変化させることが、その発現産物の免疫原性を高めるために有用であり得る。このために、異なるが実質的に相同の発現産物（タンパク質またはペプチド分子）が産生されるように、マイナーな変化を被験分子のコーディング配列に施すことができる。したがって、本発明は、天然ＴＣＲ配列に実質的に相同であるＴＣＲ分子またはＴＣＲ断片ペプチドのコーディング配列を含有するポリヌクレオチド、例えば、対象となる分子の全長にわたって標的とする天然ＴＣＲ分子に対する少なくとも約８０〜８５％、好ましくは少なくとも約９０％、最も好ましくは少なくとも約９５〜９８％の配列同一性を有する分子をコードするポリヌクレオチドを含む。
【００６９】
したがって、ひとたび所望のＴＣＲ分子および／またはＴＣＲペプチド断片のコーディング配列が調製または単離されると、そのような配列をあらゆる適切なベクターまたはレプリコンにクローン化することができる。多くのクローニングベクターが当業者に公知であり、適切なクローニングベクターの選択は好みの問題である。他の配列へのライゲーションは当該技術分野において公知の標準手順を用いて行う。
【００７０】
以下に詳細に説明されるように、選択されたヌクレオチド配列をプロモーターのような調節配列の制御下に置き、それにより、所望のタンパク質をコードする配列を、この発現構築物を含むベクターで形質転換した宿主組織においてＲＮＡに転写させることができる。
【００７１】
プロモーターに加えて、送達されたヌクレオチド配列によってコードされるタンパク質配列の発現の調節を可能にする他の調節配列を付加することが望ましい場合がある。適切なさらなる調節配列は当業者に公知であり、その例には調節化合物の存在を含む化学的または物理的刺激に応答してコーディング配列の発現をオンまたはオフにするものが含まれる。他のタイプの調節要素、例えば、エンハンサー配列がベクター中に存在していてもよい。
【００７２】
発現ベクターを構築し、特定のコーディング配列を、適切な調節配列を有するベクター中に、制御配列に対するそのコーディング配列の位置および方向がその制御配列の「制御」の下で転写される（すなわち、ＲＮＡポリメラーゼが制御配列にてＤＮＡ分子に結合し、コーディング配列を転写する）ように配置する。目的とする特定のタンパク質をコードする配列の改変がこの目的を達成するのに望ましいことがあり得る。例えば、幾つかの場合においては、制御配列に適切な方向で結合させ、すなわち読み取り枠が維持されるようにするために、配列を改変することが必要となる場合がある。ベクターに挿入する前に、制御配列および他の調節配列をコーディング配列にライゲートしてもよい。あるいは、制御配列および適切な制限部位を既に含む発現ベクターにコーディング配列を直接クローン化することができる。
【００７３】
一般には、当該方法において用いられる核酸分子は、コーディング領域を適切な制御配列および、任意に、サイトカインまたは他の免疫増強ポリペプチドをコードする補助的ヌクレオチド配列と共に含む。この核酸分子は、一般には、レシピエント細胞における転写および翻訳を指令するのに必要な要素を含むベクターの形態で調製する。
【００７４】
ポリヌクレオチドの投与
本明細書で説明されるポリヌクレオチドおよび補助物質はあらゆる適切な方法によって投与することができる。以下に説明される好ましい態様においては、本発明のポリヌクレオチドは、それらをコア担体粒子上にコートした後、そのコートされた粒子を被験体または細胞に投与することによって投与する。しかしながら、ウイルスベクターを用いて、または非ウイルス系、例えば、ネイキッド核酸送達を用いて、ＴＣＲをコードするポリヌクレオチドを送達することもできる。
【００７５】
ウイルスベクター
幾つかのウイルスベースの系が遺伝子送達に用いられてきた。例えば、レトロウイルス系が公知であり、ウイルスの遺伝子の全てを発現するがｐｓｉ配列として知られるパッケージングシグナルの欠損のためにそれ自体のゲノムをパッケージングできない組み込まれた欠損プロウイルス（「ヘルパー」）を有するパッケージング株が一般に用いられる。したがって、この細胞株は空のウイルス殻を産生する。ヘルパーに加えて、末端反復配列（ＬＴＲ）として知られるウイルスの複製およびパッケージングのためにシス位で必要とする配列を含有するウイルスベクターを含むパッケージング株から産生株を誘導することができる。目的とする遺伝子をこのベクターに挿入し、レトロウイルスヘルパーによって合成されるウイルス殻にパッケージングすることができる。次に、この組換えウイルスを単離し、被験体に送達する（例えば、米国特許第５，２１９，７４０号を参照）。代表的なレトロウイルスベクターとしては、以下に限定されるものではないが、例えば米国特許第５，２１９，７４０号（これは参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されている、ＬＨＬ、Ｎ２、ＬＮＳＡＬ、ＬＳＨＬおよびＬＨＬ２ベクターのようなベクターの他に、ここで説明される改変Ｎ２ベクターのようなこれらのベクターの誘導体が含まれる。レトロウイルスベクターは当該技術分野において周知の技術を用いて構築することができる。例えば、米国特許第５，２１９，７４０号；Ｍａｎｎ ｅｔ ａｌ． （１９８３） Ｃｅｌｌ ３３：１５３−１５９を参照のこと。
【００７６】
アデノウイルスベースの系が遺伝子送達用に開発されており、これらはここで説明されるＴＣＲポリヌクレオチドの送達に適する。ヒトアデノウイルスは、受容体媒介型エンドサイトーシスによって細胞に侵入する二重鎖ＤＮＡウイルスである。これらのウイルスは、それらは増殖および操作が容易であり、かつｉｎ ｖｉｖｏおよびｉｎ ｖｉｔｒｏで広範な宿主範囲を示すため、遺伝子導入に特に適する。例えば、アデノウイルスは造血、リンパ系および骨髄起源のヒト細胞に感染することができる。さらに、アデノウイルスは複製中の標的細胞に加えて静止期細胞にも感染する。宿主ゲノム内に組み込まれるレトロウイルスとは異なり、アデノウイルスは染色体外に存在し続け、したがって、挿入性突然変異誘発に伴う危険性が最小化される。このウイルスは高力価で容易に産生され、かつ安定であることから精製および保存が可能である。複製能を有する形態においてさえ、アデノウイルスは低レベルの罹患率のみを生じ、ヒト悪性腫瘍を伴うことがない。したがって、これらの利点を利用するアデノウイルスベクターが開発されている。アデノウイルスベクターおよびそれらの使用の説明については、例えば、Ｈａｊ−Ａｈｍａｄ ａｎｄ Ｇｒａｈａｍ （１９８６） Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ５７：２６７−２７４；Ｂｅｔｔ ｅｔ ａｌ． （１９９３） Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６７：５９１１−５９２１；Ｍｉｔｔｅｒｅｄｅｒ ｅｔ ａｌ． （１９９４） Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ５：７１７−７２９；Ｓｅｔｈ ｅｔ ａｌ． （１９９４） Ｊ． Ｖｉｒｏｌ， ６８：９３３−９４０；Ｂａｒｒ ｅｔ ａｌ． （１９９４） Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １：５１−５８；Ｂｅｒｋｎｅｒ， Ｋ．Ｌ． （１９８８） ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ６：６１６−６２９；Ｒｉｃｈ ｅｔ ａｌ． （１９９３） Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ４：４６１−４７６を参照のこと。
【００７７】
アデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶ）も本明細書で説明されるポリヌクレオチドの投与に用いることができる。ＡＡＶベクターは、限定するものではないがＡＡＶ−１、ＡＡＶ−２、ＡＡＶ−３、ＡＡＶ−４、ＡＡＶ−５、ＡＡＶＸ７等を含むあらゆるＡＡＶ血清型から誘導することができる。ＡＡＶベクターは、全体的または部分的に欠損した１つ以上のＡＡＶ野生型遺伝子、好ましくはｒｅｐおよび／またはｃａｐ遺伝子を有しているが、１つ以上の機能的フランキング逆末端反復（ＩＴＲ）配列を保持するものであってよい。機能的ＩＴＲ配列は、一般には、ＡＡＶビリオンの救済、複製およびパッケージングに必要であると考えられている。したがって、ＡＡＶベクターは、ウイルスの複製およびパッケージングのためにシス位でそれらの配列（例えば、機能的ＩＴＲ）を少なくとも含む。ＩＴＲは野生型ヌクレオチド配列である必要はなく、その配列が機能的救済、複製およびパッケージングをもたらす限り、ＩＴＲは例えばヌクレオチドの挿入、欠失または置換によって、変更されていてもよい。
【００７８】
ＡＡＶ発現ベクターは、公知の技術を用いて、転写の方向に作動的に連結した構成成分として、転写開始領域、目的とするＤＮＡおよび転写終結領域を含む制御要素を少なくとも提供するように構築される。これらの制御要素は哺乳動物細胞において機能的であるように選択される。その結果得られる、作動的に連結した構成要素を含む構築物は、機能的ＡＡＶ ＩＴＲ配列（５’および３’で）結合されている。適切なＡＡＶ構築物は当該技術分野において周知の技術を用いて設計することができる。例えば、米国特許第５，１７３，４１４号および第５，１３９，９４１号；国際公報ＷＯ ９２／０１０７０（１９９２年１月２３日公開）およびＷＯ ９３／０３７６９（１９９３年３月４日公開）；Ｌｅｂｋｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ． （１９８８） Ｍｏｌｅｃ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． ８：３９８８−３９９６；Ｖｉｎｃｅｎｔ ｅｔ ａｌ． （１９９０） Ｖａｃｃｉｎｅｓ ９０ （Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）；Ｃａｒｔｅｒ， Ｂ．Ｊ． （１９９２） Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３：５３３−５３９；Ｍｕｚｙｃｚｋａ， Ｎ． （１９９２） Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５８：９７−１２９；Ｋｏｔｉｎ， Ｒ．Ｍ． （１９９４） Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ５：７９３−８０１；Ｓｈｅｌｌｉｎｇ ａｎｄ Ｓｍｉｔｈ （１９９４） Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １：１６５−１６９；およびＺｈｏｕ ｅｔ ａｌ． （１９９４） Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １７９：１８６７−１８７５を参照のこと。
【００７９】
アジュバント
幾つかの態様においては、本発明はあらゆる適切なアジュバントまたはアジュバントの組合せと共に有効に用いられる。例えば、適切なアジュバントには、限定されるものではないが、アルミニウム塩（ミョウバン）から形成されるアジュバント、例えば、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、硫酸アルミニウム等；水中油型および油中水型エマルジョン製剤、例えば、完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）および不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）；細菌細胞壁成分から形成されるアジュバント、例えば、リポ多糖を含有するアジュバント（例えば、リピドＡまたはモノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）、Ｉｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ． （１９８５） Ｔｅｔ． Ｌｅｔｔ． ２６：ｌ５４５−ｌ５４８）；トレハロースジミコレート（ＴＤＭ）、および細胞壁骨格（ＣＷＳ）；熱ショックタンパク質またはそれらの誘導体；ジフテリア毒素（ＤＴ）、百日咳毒素（ＰＴ）、コレラ毒素（ＣＴ）、大腸菌熱不安定性毒素（ＬＴ１およびＬＴ２）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）内毒素Ａ、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）外毒素Ｓ、バチルス・セレウス（Ｂ． ｃｅｒｅｕｓ）細胞外酵素、バチルス・スフェリクス（Ｂ． ｓｐｈａｅｒｉｃｕｓ）毒素、クロストリディウム・ボツリナム（Ｃ． ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）Ｃ２およびＣ３毒素、クロストリディウム・リモサム（Ｃ． ｌｉｍｏｓｕｍ）細胞外酵素に加えて、クロストリディウム・パーフリンゲンズ（Ｃ． ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）、クロストリディウム・スピリフォルマ（Ｃ． ｓｐｉｒｉｆｏｒｍａ）およびクリストリディウム・ディフィシル（Ｃ． ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）からの毒素、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）ＥＤＩＮ、ＣＲＭ１９７のようなＡＤＰリボシル化細菌毒素変異体、非毒性ジフテリア毒素変異体を含むＡＤＰリボシル化細菌毒素（例えば、Ｂｉｘｌｅｒ ｅｔ ａｌ． （１９８９） Ａｄｖ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． Ｂｉｏｌ． ２５１：１７５；およびＣｏｎｓｔａｎｔｉｎｏ ｅｔ ａｌ． （１９９２） Ｖａｃｃｉｎｅを参照）；サポニンアジュバント、例えば、Ｑｕｉｌ Ａ（米国特許第５，０５７，５４０号）、またはサポニンから生成される粒子、例えば、ＩＳＣＯＭ（免疫刺激性複合体）；ケモカインおよびサイトカイン、例えば、インターロイキン（例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−１２等）、インターフェロン（例えば、γインターフェロン）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、デフェンシン１または２；ＲＡＮＴＥＳ、ＭＩＰ１−α、およびＭＩＰ−２等；ムラミルペプチド、例えば、Ｎ−アセチル−ムラミル−Ｌ−トレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチル−ノルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン（ｎｏｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミル−Ｌ−アラニン−２−（１’−２’−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミン（ＭＩＰ−ＰＥ）等；ＣｐＧファミリーの分子、ＣｐＧジヌクレオチド、およびＣｐＧモチーフを含む合成オリゴヌクレオチドから誘��されるアジュバント（例えば、Ｋｒｉｅｇ ｅｔ ａｌ． Ｎａｔｕｒｅ （１９９５） ３７４：５４６、Ｍｅｄｚｈｉｔｏｖ ｅｔ ａｌ． （１９９７） Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ９：４−９、およびＤａｖｉｓ ｅｔ ａｌ． Ｊ． Ｉｎｍｕｎｏｌ． （１９９８） １６０：８７０−８７６を参照）、例えば、ＴＣＣ ＡＴＧ ＡＣＧ ＴＴＣ ＣＴＧ ＡＴＧ ＣＴ（配列番号１）およびＡＴＣ ＧＡＣ ＴＣＴ ＣＧＡ ＧＣＧ ＴＴＣ ＴＣ（配列番号２）；並びに合成アジュバント、例えば、ＰＣＰＰ（ポリ［ジ（カルボキシラトフェノキシ）ホスファゼン）（Ｐａｙｎｅ ｅｔ ａｌ． Ｖａｃｃｉｎｅｓ （１９９８） １６：９２−９８）が含まれる。このようなアジュバントは幾つかの販売業者、例えば、Ａｃｃｕｒａｔｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ；Ｒａｂｉ Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｈａｍｉｌｔｏｎ、ＭＴ；ＧＩＢＣＯ；Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＭＯから商業的に入手可能である。
【００８０】
アジュバントは個別に送達してもよく、または２種類以上のアジュバントの組合せで送達してもよい。これに関して、組み合わせたアジュバントは免疫応答の促進において相加的または相乗的な効果を有する。相乗効果は、２種類以上のアジュバントを組み合わせることによって達成される結果が個別に投与したときに各アジュバントにより達成される結果を単に加えることで予想されるものよりも大きいことである。
【００８１】
通常の医薬調製品
アジュバント成分の添加の有無にかかわらず、本発明のポリヌクレオチドを含有する調製品の製剤化は標準的な医薬製剤化学および方法論（それらは全て当業者が容易に利用可能なものである）を用いて行うことができる。例えば、１種類以上の核酸分子（例えば、ＴＣＲコーディング配列を含むプラスミド）を含む組成物を１種類以上の薬学的に許容し得る賦形剤またはビヒクルと組み合わせて液体調製品を得ることができる。
【００８２】
補助物質、例えば、湿潤剤もしくは乳化剤、ｐＨ緩衝化物質等が賦形剤またはビヒクル中に存在していてもよい。これらの賦形剤、ビヒクルおよび補助物質は、一般には、その組成物を与えられる個体において免疫応答を誘導せず、かつ過度の毒性なしに投与することができる製薬用物質である。薬学的に許容し得る賦形剤には、以下に限定されるものではないが、例えば、水、生理食塩水、ポリエチレングリコール、ヒアルロン酸、グリセロールおよびエタノール等の液体が含まれる。薬学的に許容し得る塩には、例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、硫酸塩等のような無機酸塩；および酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩、安息香酸塩等のような有機酸塩が含まれていてもよい。必須ではないが、特にペプチド、タンパク質等の分子をワクチン組成物に含めようとする場合に、それらに対する安定化剤として機能する薬学的に許容し得る賦形剤を調製品が含むことも好ましい。ペプチドの安定化剤としても作用する適切な担体の例には、限定されることなく、医薬品等級のデキストロース、スクロース、ラクトース、トレハロース、マンニトール、ソルビトール、イノシトール、デキストラン等が含まれる。他の適切な担体には、これも限定されることなく、デンプン、セルロース、リン酸ナトリウムもしくはリン酸カルシウム、クエン酸、酒石酸、グリシン、高分子量ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、およびそれらの組み合わせが含まれる。薬学的に許容し得る賦形剤、ビヒクルおよび補助物質の詳細な考察はＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＳＣＩＥＮＣＥＳ （Ｍａｃｋ Ｐｕｂ． Ｃｏ．， Ｎ．Ｊ． １９９１）（これは参照することにより本明細書に組み込まれる）にみられる。
【００８３】
核酸の取込みおよび／または発現を促進する特定の物質（「トランスフェクション促進剤」）、例えば、ブピバカイン、心臓毒およびスクロースのような促進物質、並びに核酸分子の送達に慣用されるリポソームまたは脂質調製物のようなトランスフェクション促進ビヒクルを、組成物に含めることもできる。アニオン性および中性リポソームが核酸分子の送達に広く利用可能であり、かつ公知である（例えば、Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ， （１９９０） ＲＰＣ Ｎｅｗ Ｅｄ．， ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓを参照）。カチオン性脂質調製物も核酸分子の送達に用いるための周知のビヒクルである。適切な脂質調製物には、ＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎＴＭの商品名で入手可能なＤＯＴＭＡ（Ｎ−［１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド）、およびＤＯＴＡＰ（１，２−ビス（オレイルオキシ）−３−（トリメチルアンモニオ）プロパン）が含まれる。例えば、Ｆｅｌｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ． （１９８７） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ， ＵＳＡ ８４：７４１３−７４１６；Ｍａｌｏｎｅ ｅｔ ａｌ． （１９８９） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８６：６０７７−６０８１；米国特許第５，２８３，１８５号および第５，５２７，９２８号、並びに国際公報ＷＯ ９０／１１０９２、ＷＯ ９１／１５５０１およびＷＯ ９５／２６３５６を参照のこと。これらのカチオン性脂質は、中性脂質、例えば、ＤＯＰＥ（ジオレイルホスファチジルエタノールアミン）と共に用いることが好ましい。上記脂質またはリポソーム調製品に加えることができるさらなるトランスフェクション促進組成物には、スペルミン誘導体（例えば、国際公報ＷＯ ９３／１８７５９を参照）並びに膜透過性化合物、例えば、ＧＡＬＡ、グラミシジンＳおよびカチオン性胆汁酸塩（例えば、国際公報ＷＯ ９３／１９７６８を参照）が含まれる。
【００８４】
あるいは、本発明の核酸分子を粒子状担体に封入し、それに吸着させ、またはそれと結合させることができる。適切な粒子状担体には、ポリメチルメタクリレートポリマーから誘導されるものの他に、ポリラクチドおよびポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコリド）から誘導されるＰＬＧ微粒子が含まれる。例えば、Ｊｅｆｆｅｒｙ ｅｔ ａｌ． （１９９３） Ｐｈａｒｍ． Ｒｅｓ． １０：３６２−３６８を参照のこと。他の粒子系およびポリマー、例えば、ポリリジン、ポリアルギニン、ポリオルニチン、スペルミン、スペルミジンのようなポリマーに加えてこれらの分子のコンジュゲートを用いることもできる。
【００８５】
したがって、製剤化されたワクチン組成物は、典型的には、目的のＴＣＲ分子をコードする配列を含有するポリヌクレオチドを、免疫学的応答を高めるのに十分な量で含む。適切な有効量は当業者が容易に決定することができる。そのような量は慣用される試験によって決定することができる比較的広範な範囲内にある。例えば、１μｇという少なさのＤＮＡを用いて免疫応答が得られているが、他の投与においては最大２ｍｇのＤＮＡが用いられている。ゲノム断片を含有するポリヌクレオチドの有効用量は約１０μｇ〜１０００μｇの範囲内にあると一般に考えられるが、この範囲を上回る用量および下回る用量も有効であることが見出される場合がある。このように、これらの組成物は約０．１％〜約９９．９％のポリヌクレオチド分子を含み得る。
【００８６】
通常の医薬調製物の投与
上記医薬調製物の投与は、治療の過程を通して継続的に、または断続的に、１用量で達成することができる。送達は、最も典型的には、液体組成物および粒子状組成物を含有する液体懸濁液用の通常の針およびシリンジによるものであろう。加えて、様々な液体ジェット・インジェクタが当該技術分野において公知であり、本発明の組成物の投与に用いることができる。最も有効な投与の手段および投与量を決定する方法は当業者に公知であり、送達ビヒクル、治療の組成物、標的細胞、および治療を受ける被験者に応じて変わるだろう。主治医によって選択される用量レベルおよびパターンで１回および複数回投与を実施することができる。送達されるポリヌクレオチド構築物が２以上のＴＣＲ配列を担持できることを理解するべきである。あるいは、また各々が１以上のＴＣＲ分子を発現する別々の構築物を本明細書で説明されるように被験者に送達することもできる。
【００８７】
さらに、本発明の方法によって送達されるポリヌクレオチドを他の適切な組成物および治療と組み合わせることも意図されている。例えば、被験者における免疫応答を増強するため、本明細書で説明される組成物および方法は補助物質（例えば、アジュバント）、例えば、薬理学的作用物質、サイトカイン等をさらに含むことができる。補助物質は、例えば、タンパク質または他の巨大分子として、本明細書で説明される核酸ワクチンの投与と同時に、その前に、またはそれに続いて投与することができる。また核酸分子組成物は、当業者に公知の方法を用いて、被験者に直接投与することもでき、または、あるいは、ｅｘ ｖｉｖｏで被験者から誘導した細胞に送達することもできる。
【００８８】
粒子
一実施形態においては、コア担体粒子を用いてポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡワクチン）および／またはアジュバントを送達する。そのような核酸調製物を送達するための粒子介在法は当該技術分野において公知である。したがって、ひとたび調製されて適切に精製されると、上記核酸分子を、当該技術分野において公知の様々な技術を用いてコア担体粒子（例えば、コア担体）にコーティングすることができる。コア担体は、適切な粒子介在送達装置からの細胞内送達に典型的に用いられる粒径の範囲の適切な密度を有する材料から選択される。最適担体粒径は、もちろん、標的細胞の直径に依存するだろう。
【００８９】
本発明の目的には、タングステン、金、白金およびイリジウム担体粒子を用いることができる。タングステンおよび金粒子が好ましい。タングステン粒子は直径０．５〜２．０μｍの平均サイズで容易に入手することができる。このような粒子は粒子加速送達法において用いるのに最適な密度を有し、かつＤＮＡでの高度に効率的なコーティングを可能にするが、タングステンは特定の細胞型に対して潜在的に毒性であり得る。金粒子または微晶性金（例えば、Ｅｎｇｅｌｈａｒｄ Ｃｏｒｐ．、Ｅａｓｔ Ｎｅｗａｒｋ、ＮＪから入手可能な金粉末Ａ１５７０）も本発明の方法で用途が見出されるだろう。金粒子はサイズの均一性（Ａｌｐｈａ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓから１〜３μｍの粒径で入手可能、またはＤｅｇｕｓｓａ、Ｓｏｕｔｈ Ｐｌａｉｎｆｉｅｌｄ、ＮＪから０．９５μｍを含む一連の粒径で入手可能）および毒性の低下をもたらす。
【００９０】
金またはタングステン粒子にＤＮＡまたはＲＮＡをコーティングまたは沈殿させるのに多数の方法が公知であり、かつ記述されている。大部分のそのような方法は、一般に、予め決定された量の金またはタングステンをプラスミドＤＮＡ、ＣａＣｌ２およびスペルミジンと組み合わせる。生じた溶液をコーティング手順の間、連続的に攪拌し、反応混合物の均一性を確実なものとする。核酸の沈殿の後、コーティングされた粒子を適切な膜に移して使用前に乾燥させ、粒子送達装置において用いるためにサンプルモジュールもしくはカセットの表面上にコーティングするか、または送達カセット内に充填することができる。
【００９１】
ペプチドアジュバント（例えば、サイトカイン）を適切なコア担体、例えば、金またはタングステンにコーティングすることもできる。例えば、これら２つの成分を単に経験的に決定される比で混合することにより、硫酸アンモニウム沈殿もしくは当業者に馴染みのある他の溶媒沈殿法により、または担体粒子へのペプチドの化学カップリングによりペプチドをコア担体に結合させることができる。Ｌ−システイン残基の金へのカップリングが従来記述されている（Ｂｒｏｗｎら， Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ ９：２７１−３１１ （１９８０））。他の方法には、例えば、ペプチド抗原を無水エタノール、水、またはアルコール／水混合物に溶解し、その溶液をある量の担体粒子に添加した後、攪拌しながら空気または窒素流下でその混合物を乾燥させることが含まれる。あるいは、真空下で遠心分離することによってペプチド抗原をコア担体上で乾燥させることができる。ひとたび乾燥すると、コーティングされた粒子を適切な溶媒（例えば、酢酸エチルまたはアセトン）に再懸濁させ、（例えば、超音波処理によって）粉砕して実質的に均一な懸濁液を得ることができる。
【００９２】
コーティングされた粒子の投与
それらを形成した後、本発明のポリヌクレオチドでコーティングされ、かつ場合によってはアジュバントを含むコア担体粒子を、経皮注入（例えば、ペプチド介在送達）技術を用いて被験者に送達する。
【００９３】
経皮注入送達に好適な様々な粒子送達装置が当該技術分野において公知であり、その全てが本発明の実施における使用に適する。現在の装置設計は、標的細胞に向けてコーティングされた担体粒子を推進させるのに爆発性、電気的または気体放出を用いる。コーティングされたコア担体粒子は、それら自体を可動担体シートに離脱可能に付着させるか、またはそれに沿って気流が通過し、その表面から粒子を持ち上げ、かつ標的に向かってそれらを推進させる表面に除去可能に付着させることができる。気体放出装置の一例が米国特許第５，２０４，２５３号に記載されている。爆発型装置は米国特許第４，９４５，０５０号に記載されている。電気放出型粒子加速装置の一例は米国特許第５，１２０，６５７号に記載されている。ここで用いるのに好適な別の電気放出装置が米国特許第５，１４９，６５５号に記載されている。これらの特許の全ての開示は参照することによりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
【００９４】
これらのコーティングされた粒子を、投与処方に適合する様式で、かつ所望の免疫応答を誘導するのに有効であろう量で治療しようとする被験者に投与する。核酸分子の場合には一般に１用量当たり０．００１〜１００．０μｇ、より典型的には０．０１〜１０．０μｇの核酸分子の範囲にあり、ペプチドまたはタンパク質分子の場合には１μｇ〜５ｍｇ、より典型的には１〜５０μｇのペプチドである、送達しようとする組成物の量は治療しようとする被験者に依存する。必要とされる正確な量は、免疫される個体の年齢および一般的な状態並びに選択される特定のヌクレオチド配列またはペプチドに加えて、他の要因に依存して変わるだろう。適切な有効量は、本明細書を読むことで当業者が容易に決定することができる。
【００９５】
したがって、ポリヌクレオチドの有効量は免疫される被験者において適切な免疫応答を誘導するのに十分な量であり、常套的な試行によって決定することができる比較的広範な範囲内に収まるだろう。好ましくは、コーティングされた粒子は、治療を受ける被験者において免疫応答（例えば、Ｔ細胞活性化）を誘導するために適切なレシピエント細胞に送達される。
【００９６】
粒子状組成物
あるいは、選択された目的のＴＣＲをコードするポリヌクレオチドを固体の粒子状医薬組成物として製剤化することができる。より特には、目的のＴＣＲ配列を担持する核酸分子を含有する粒子の製剤化を、全てが合理的に熟練した技術者が容易に利用可能である標準的な医薬製剤化学および方法論を用いて行うことができる。例えば、核酸分子を１種類以上の薬学的に許容し得る賦形剤またはビヒクルと組み合わせてワクチン組成物を提供することができる。補助物質、例えば、湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝物質等が賦形剤またはビヒクル中に存在していてもよい。これらの賦形剤、ビヒクルおよび補助物質は、一般には、それら自体がその組成物を摂取する個体において免疫応答を誘導することがなく、かつ過度の毒性なしに投与することができる医薬品である。
【００９７】
薬学的に許容し得る賦形剤には、これらに限定されるものではないが、液体、例えば、水、生理食塩水、ポリエチレングリコール、ヒアルロン酸、グリセロールおよびエタノールが含まれる。薬学的に許容し得る塩には、例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、硫酸塩などのような鉱酸塩；および酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩、安息香酸塩などのような有機酸の塩が含まれていてもよい。必須ではないが、特にはペプチド、タンパク質または他の任意の作用物質に対する、安定化剤として機能する薬学的に許容し得る担体を組成物が含みうることも好ましい。ペプチドの安定化剤としても作用する適切な担体の例には、限定されることがないが、医薬グレードのデキストロース、スクロース、ラクトース、トレハロース、マンニトール、ソルビトール、イノシトール、デキストラン等が含まれる。他の適切な担体には、これも限定されることがないが、デンプン、セルロース、リン酸ナトリウムもしくはカルシウム、クエン酸、酒石酸、グリシン、高分子量ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、およびそれらの組合せが含まれる。薬学的に許容し得る賦形剤、担体、安定化剤および他の補助物質の詳細な考察はＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＳＣＩＥＮＣＥＳ （Ｍａｃｋ Ｐｕｂ． Ｃｏ．， Ｎ．Ｊ． １９９１）（これは参照することにより本明細書に組み込まれる）において入手可能である。
【００９８】
製剤化された組成物は、上記で定義されるように、免疫学的応答を誘導するのに十分な量の、目的のＴＣＲ分子をコードするポリヌクレオチド量を含むだろう。適切な有効量は当業者が容易に決定することができる。そのような量は比較的広範な範囲、一般には、約０．１μｇ〜２５ｍｇまたはそれ以上のＴＣＲコーディングポリヌクレオチドの範囲内に収まるだろうし、具体的な適切な量は常套的な試行によって決定することができる。これらの組成物は約０．１％〜約９９．９％のポリヌクレオチドを含むことができる。アジュバントが組成物に含まれる場合、またはこれらの方法が粒子状アジュバント組成物を提供するのに用いられる場合、アジュバントは上述の適切な量で存在するだろう。次に、標準技術を用いて、例えば、単純な蒸発（風乾）、真空乾燥、噴霧乾燥、凍結乾燥（ｆｒｅｅｚｅ ｄｒｙｉｎｇ）（凍結乾燥（ｌｙｏｐｈｉｌｉｚａｔｉｏｎ））、噴霧−凍結乾燥、噴霧コーティング、沈殿、超臨界液体粒子形成等によって組成物を粒子として調製する。所望であれば、共通に所有される国際公開第ＷＯ ９７／４８４８５号（これは参照することにより本明細書に組み込まれる）に記載される技術を用いて、生じた粒子の密度を高めることができる。
【００９９】
使用前に粒子をパッケージングすることができる１回単位投与量または多用量容器は、ＴＣＲコーディングポリヌクレオチドおよび／または選択されたアジュバントを含有する適切な量の粒子（例えば、ＴＣＲワクチン組成物）を封入する密閉容器を含むことができる。粒子状組成物は無菌製剤としてパッケージングすることができ、したがって、密閉容器は本発明の方法において使用するまでその製剤の無菌性が維持されるように設計することができる。所望であれば、容器を粒子送達装置における直接使用に適応させることができる。このような容器は、カプセル、ホイルポーチ（ｆｏｉｌ ｐｏｕｃｈｅｓ）、サシェイ（ｓａｃｈｅｔｓ）、カセット等の形態をとることができる。適切な粒子送達装置は本明細書で上述されている。
【０１００】
粒子をパッケージングする容器は、組成物を識別し、かつ関連する投与情報を提供するため、さらにラベル表示されていてもよい。加えて、容器は政府機関、例えば、食品医薬品局によって規定される形態の通告をラベル表示することができ、その通告は連邦法下でのその機関による、ヒトに投与するためのそこに収容される抗原、アジュバント（またはワクチン組成物）の製造、使用または販売の認可を示す。
【０１０１】
次いで、経皮注入技術を用いて（ＴＣＲポリヌクレオチドおよび／または選択されたアジュバントを含む）粒子状組成物を投与することができる。好ましくは、粒子状組成物は粉末注入法によって送達され、例えば、共通に所有される国際公開第ＷＯ ９４／２４２６３号、第ＷＯ ９６／０４９４７号、第ＷＯ ９６／１２５１３号、および第ＷＯ ９６／２００２２号（これらは全て参照することにより本明細書に組み込まれる）に記載されるもののような針なしシリンジ系から送達されるだろう。
【０１０２】
そのような装置からの粒子の送達は、典型的には、一般に０．１〜２５０μｍの範囲、好ましくは約１０〜７０μｍの範囲のおおよそのサイズを有する粒子で行われる。約２５０μｍを上回る粒子もそれらの装置から送達することができ、この上限はそのサイズの粒子が望ましくない損傷を皮膚細胞に与えるであろう点である。送達される粒子が標的表面を貫入するだろう実際の距離は、粒径（例えば、大まかな球状粒子幾何を仮定した名目上の粒子直径）、粒子密度、粒子がその表面と激突する初期速度、並びに標的とされる皮膚組織の密度および運動学的速度に依存する。これに関して、針なし注入における使用に最適の粒子密度は、一般には約０．１〜２５ｇ／ｃｍ３、好ましくは約０．９〜１．５ｇ／ｃｍ３の範囲であり、注入速度は一般には約１００〜３，０００ｍ／秒の範囲、またはそれ以上である。適切な気圧で、１０〜７０μｍの平均直径を有する粒子をノズルを通して駆動気流の超音速に匹敵する速度で加速することができる。
【０１０３】
所望であれば、これらの粒子送達装置は、目的の抗原および／または選択されたアジュバントを含む適切な投与量の粒子を含有する、予め充填した状態で提供することができる。この充填済装置を密閉容器にパッケージングすることができ、さらにそれに上述のようにラベル表示することができる。
【０１０４】
したがって、上記方法は、約１０〜約２５０μｍ、好ましくは約１０〜約１５０μｍ、最も好ましくは約２０〜約６０μｍの範囲のサイズ；並びに約０．１〜約２５ｇ／ｃｍ３の範囲の粒子密度、および約０．５〜約３．０ｇ／ｃｍ３、もしくはそれ以上のかさ密度を有する粒子を含んでなる粒子状医薬（「粉末」）を得るのに用いることができる。「粉末」という用語は、本明細書で用いられる場合、経皮注入技術によって、例えば、針なしシリンジ装置を用いて脊椎動物被験者に送達することができる実質的に固体の粒子からなる組成物を指す。粉末を構成する粒子は、平均粒径、平均粒子密度、粒子形態（例えば、粒子の空気力学的形状および粒子の表面の特徴）および粒子貫入エネルギー（Ｐ．Ｅ．）を含むがこれらに限定されるものではない多数のパラメーターに基づいて特徴付けることができる。粒径、粒子密度および形態は、その固形粒子状医薬組成物が経皮注入に好適な粉末であるように選択される。加えて、本発明の粒子状医薬を構成する粒子は、経皮注入技術によって送達される粉末に好適な基線貫入エネルギーを示すべきである。
【０１０５】
粉末の平均粒径は広範に変化してもよく、一般には約０．１〜約２５０μｍ、例えば約１０〜約１００μｍ、より典型的には約２０〜約７０μｍの範囲であろう。しかしながら、粉末は実質的に均一な平均粒径の粒子を含むことが好ましい。これに関して、粉末の平均粒径は、通常の技術、例えば、顕微鏡技術（粒子を直接に、かつ統計的にグループ化するのではなく個別にサイズ決定する）、ガス吸着、透過率、光不明瞭化または飛行時間を用いて、質量平均空気力学的直径（ＭＭＡＤ）として測定することができる。所望であれば、平均粒径を確認するのに自動化粒径カウンターを用いることができる（例えば、Ａｅｒｏｓｉｚｅｒ、Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｃｏｕｎｔｅｒ、ＨＩＡＣ Ｃｏｕｎｔｅｒ、またはＧｅｌｍａｎ Ａｕｔｏｍａｔｉｃ Ｐａｒｔｉｃｌｅ Ｃｏｕｎｔｅｒ）。
【０１０６】
本発明の固形粒子状医薬組成物（医薬）は、好ましくは、被験者への、典型的には角質層または経粘膜（ｔｒａｎｓｍｕｃｏｓａｌ ｍｅｍｂｒａｎｅ）を横切る、高速経皮注入に適するサイズを有する粒子を含んでなる粉末であろう。したがって、これらの粒子の平均質量空気力学的直径（ＭＭＡＤ）は約０．１〜約２５０μｍの範囲であろうが、実際には、ＭＭＡＤは約１０〜約１００μｍ、好ましくは、約１０〜約７０μｍまたは約２０〜約７０μｍであり得る。一般には、これらの粒子は非常に狭幅のサイズ分布を有し、粒子の１０重量％未満がＭＭＡＤの５μｇ＋／−範囲の外側にある直径を有し、すなわち、粒子の１０％未満がＭＭＡＤより少なくとも５μｍ上回るか、またはＭＭＡＤより少なくとも５μｍ下回る直径を有するだろう。好ましくは、粒子の５重量％以下がＭＭＡＤを５μｍ以上上回る直径を有する。また好ましくは、粒子の５重量％以下がＭＭＡＤを５μｍ以上下回る直径を有する。
【０１０７】
実際の粒子密度、すなわち、「絶対密度」は、公知の定量技術、例えば、ヘリウムピクノメトリー等を用いて容易に確認することができる。あるいは、本発明による粉末の密度を評価するのにエンベロープ（「タップ」または「バルク」）密度測定を用いることができる。本発明によって生産される粉末のエンベロープ密度は、一般には、０．５〜２５ｇ／ｃｍ３、好ましくは、０．８〜１．５ｇ／ｃｍ３である。
【０１０８】
エンベロープ密度情報は不規則なサイズおよび形状を有する物体の密度の特徴付けにおいて特に有用である。エンベロープ密度は物体の体積で割ったその質量であり、その体積にはその細孔および小腔のものが含まれるが隙間空間は排除される。エンベロープ密度を決定する多数の方法が当該技術分野において公知であり、これにはワックス浸漬、水銀置換、水吸収および見かけの比重技術が含まれる。多数の適切な装置、例えば、Ｍｉｃｒｏｍｅｒｉｔｉｃｓ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ Ｃｏｒｐ．から入手可能なＧｅｏＰｙｃＴＭ Ｍｏｄｅｌ １３６０もエンベロープ密度の決定に利用可能である。サンプル医薬組成物の絶対密度とエンベロープ密度との差は、そのサンプルの総空隙パーセントおよび比細孔体積に関する情報を提供する。
【０１０９】
粒子の形態、特には、粒子の空気力学的形状は標準光学顕微鏡を用いて容易に評価することができる。本粉末を構成する粒子は実質的に球状の、または少なくとも実質的に楕円状の空気力学的形状を有することが好ましい。これらの粒子は、棒もしくは針状粒子の存在を回避するため、３以下の軸比を有することも好ましい。またこれらの同じ顕微鏡的技術は、粒子表面の特徴、例えば、表面空隙の量および程度または空隙率の程度を評価するのに用いることもできる。
【０１１０】
したがって、本発明の固形粒子状医薬組成物は、約０．１〜２．５ｇ／ｃｍ３、好ましくは約０．８〜約１．５ｇ／ｃｍ３の範囲のエンベロープ密度を有する粒子を含んでなる粉末であることが好ましい。顕微鏡下で観察するとき、個々の粒子の形状は変化し得るが、粒子は好ましくは実質的に球状である。平均アスペクト比（長軸：短軸の比）は、典型的には３：１〜１：１、例えば、２：１〜１：１である。最も好ましくはアスペクト比は１：１であり、したがって、粒子は実質的に球状である。
【０１１１】
粒子貫入エネルギーは多数の通常の技術、例えば、金属化膜Ｐ．Ｅ．試験を用いて確認することができる。金属化膜材料（例えば、アルミニウムの３５０Å層が片面に堆積されている１２５μｍポリエステルフィルム）を、粉末を針なしシリンジ（例えば、Ｂｅｌｌｈｏｕｓｅらに対して付与された米国特許第５，６３０，７９６号に記載される針なしシリンジ）から約１００〜３０００ｍ／秒の初期速度で打ち込む基体として用いる。この金属化膜を、金属コーティング側を上に向けて適切な表面上に置く。
【０１１２】
粉末を充填した針なしシリンジを、そのスペーサーを膜に接触させて置いた後、発射する。適切な溶媒を用いて残留する粉末を金属化膜表面から除去する。その後、金属化膜の走査にＢｉｏＲａｄ Ｍｏｄｅｌ ＧＳ−７００画像濃度計を用いて貫入エネルギーを評価し、ＳＣＳＩインターフェースを備え、かつＭｕｌｔｉＡｎａｌｙｓｔソフトウェア（ＢｉｏＲａｄ）およびＭａｔｌａｂソフトウェア（Ｒｅｌｅａｓｅ ５．１、Ｔｈｅ ＭａｔｈＷｏｒｋｓ， Ｉｎｃ．）がロードされたパーソナルコンピュータを用いて濃度計の読み取り値を評価する。濃度計の透過率または反射率法のいずれかを用いてなした濃度計走査を処理するのにプログラムを用いる。噴霧コーティング粉末の貫入エネルギーは、同じサイズの再処理マンニトール粒子と同等であるか、それよりも良好でなければならない（共通に所有される国際公開第ＷＯ ９７／４８４８５号（これは参照することにより本明細書に組み込まれる）の方法に従って凍結乾燥、圧縮、粉砕およびふるい分けされたマンニトール粒子）。
【０１１３】
粒子状組成物の投与
それらの形成に続き、粒子状組成物（例えば、粉末）を適切な経皮注入技術を用いて脊椎動物被験者の組織に経皮的に送達することができる。目的の物質の経皮送達に好適な様々な粒子送達装置が当該技術分野において公知であり、本発明の実施における用途が見出されるだろう。特に好ましい粒子送達技術は、固形薬物含有粒子を制御された用量で無傷の皮膚および組織内に、およびそれを通して打ち込むのに針なしシリンジを用いる。例えば、針なしシリンジ（「ｔｈｅ ＰｏｗｄｅｒＪｅｃｔ（登録商標）ｎｅｅｄｌｅｌｅｓｓ ｓｙｒｉｎｇｅ ｄｅｖｉｃｅ」としても知られている）を記載するＢｅｌｌｈｏｕｓｅらに付与された米国特許第５，６３０，７９６号を参照のこと。他の針なしシリンジの構成が当該技術分野において公知であり、本明細書で説明される。
【０１１４】
治療上有効な量の、本明細書で説明される粉末化分子を含有する組成物は、上述の粒子送達装置により、あらゆる適切な標的組織に送達することができる。例えば、これらの組成物は筋肉、皮膚、脳、肺、肝臓、脾臓、骨髄、胸腺、心臓、リンパ、血液、軟骨、膵臓、腎臓、胆嚢、胃、腸、精巣、卵巣、子宮、直腸、神経系、眼、腺および結合組織に送達することができる。核酸分子については、送達は、好ましくは、終末分化した細胞へのものであり、かつ分子がそこで発現する；しかしながら、またこれらの分子は非分化の、または部分的に分化した細胞、例えば、血液の幹細胞および皮膚線維芽細胞に送達することもできる。
【０１１５】
粉末化組成物は、その投与製剤に適合する方法で、かつ予防的および／または治療的に有効であろう量で治療しようとする被験者に投与する。送達するべき組成物の量は、一般には、治療しようとする被験者に応じて、１用量当たり０．５μｇ／ｋｇ〜１００μｇ／ｋｇの核酸分子の範囲にある。他の医薬、例えば、生理学的に活性なペプチドおよびタンパク質の用量は、一般には約０．１μｇ〜約２０ｍｇ、好ましくは１０μｇ〜約３ｍｇの範囲である。正確な必要量は、治療しようとする個体の年齢および一般的な状態、治療する状態の重篤性、送達しようとする特定の調製物、投与部位に加えて他の要因に応じて変わるだろう。適切な有効量は当業者が容易に決定することができる。
【０１１６】
したがって、本発明の粒子状組成物の「治療上有効な量」は、疾患または状態の症状の治療または予防を達成するのに十分であり、常套的な試行によって決定することができる比較的広い範囲内にあるだろう。
【０１１７】
以下は本発明を実施するための具体的な実施形態の例である。これらの例は説明の目的だけに提供されるものであり、いかなる意味においても本発明の範囲を限定しようとするものではない。
【０１１８】
実施例
用いられる数字（例えば、量、温度等）に関する精度を保証する試みがなされているが、もちろん、幾らかの実験誤差および偏差は許容されるべきである。
【０１１９】
実施例１：全ＴＣＲまたはＴＣＲ断片をコードするポリヌクレオチドを用いる核酸免疫
ＴＣＲコーディングポリヌクレオチドを用いる核酸免疫の特異性および有効性を評価するため、以下の研究を行う。
【０１２０】
自己免疫障害において過剰発現するか、またはより優勢であるＴＣＲを同定する。ＴＣＲ全体またはミエリン塩基性タンパク質（ＢＰ）もしくはＩＩ型コラーゲンを特異的に認識する可変領域断片（例えば、ＣＤＲ−２領域）をコードする構築物を作製する。これらの構築物を、Ｅｉｓｅｎｂｒａｕｎら （１９９３） ＤＮＡ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． １２：７９１−７９７に記載される技術を用いて、１〜３μｍ金粒子（Ｄｅｇｕｓｓａ Ｃｏｒｐ．、Ｓｏｕｔｈ Ｐｌａｉｎｆｉｅｌｄ、ＮＪ）上にコーティングする。簡単に述べると、ＤＮＡの金粒子への付着を、スペルミジンを含有する遠心分離管に１〜３ミクロン金粉末（Ｄｅｇｕｓｓａ）および適切な量のポリヌクレオチド（例えば、金粉末１ｍｇ当たり２μｇ）を添加することにより行う。攪拌しながらＣａＣｌ２を滴下により添加することによってポリヌクレオチドおよび金を共沈させ、その後、沈殿物を数分間静置する。この金／ＤＮＡ沈殿物を微量遠心分離機（ｍｉｃｒｏｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ）における遠心分離によって濃縮し、無水エタノールで洗浄し、適切な量のエタノールおよびポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）中に再懸濁させる。次に、その懸濁液をガラスバイアルに移し、それに蓋をし、超音波水浴に浸漬して凝集塊を分離させる。続いて、そのエタノール溶液をＴｅｆｚｅｌ（登録商標）管に注入し、遠心力を用いて金／ＤＮＡを管の側面に付着させる。その後、残留するエタノールを、小さな制御された窒素ガス流を用いて排出する。次に、窒素ガス流で管を乾燥させた後、切断してカートリッジとする。それらのカートリッジを、ＰｏｗｄｅｒＪｅｃｔ（登録商標）ＸＰ粒子送達装置で用いるまで、しっかり蓋をしたガラスシンチレーションバイアル中に乾燥剤と共に４℃で保存する。ヘリウム・パルスＰｏｗｄｅｒＪｅｃｔ（登録商標）ＸＰ粒子介在装置はすでに記述されており（米国特許第５，５８４，８０７号を参照）、ＰｏｗｄｅｒＪｅｃｔ Ｖａｃｃｉｎｅｓ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩから入手される。このワクチン接種において、各々のカートリッジは、名目上、１μｇのプラスミドＤＮＡがコーティングされた０．５ｍｇの金粒子を含む。
【０１２１】
標的自己免疫疾患（例えば、ＢＰ特異的ＴＣＲについては多発性硬化症、およびＣＩＩ特異的ＴＣＲについては関節リウマチ）の症状を示す動物を、ＰｏｗｄｅｒＪｅｃｔ（登録商標）ＸＰ粒子送達装置から送達されるポリヌクレオチドでコーティングされた金ビーズの単一ショットを用いる粒子介在送達によって免疫する。初回免疫の４週間後、動物を追加免疫する。追加免疫時（４週間）およびその２週間後（６週間）に血清を採取する。
【０１２２】
実施例２：全ＴＣＲ分子またはＴＣＲ断片ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有する粒子状医薬の特徴付けおよび評価
人工膜標的に対する効果の評価
粉末注入系の多くの態様を同時に測定する機能試験は「金属化膜」または「貫入エネルギー」（ＰＥ）試験と呼ばれている。これは、プラスチックフィルム基体によって支持される精密薄金属層に対して粒子が加えることができる損傷の定量的評価に基づいている。損傷は粒子の動力学的エネルギーおよび他の特定特徴に相関する。この試験からの応答が高いほど（すなわち、膜の損傷／破壊が大きいほど）装置が粒子に加えるエネルギーが大きい。電気抵抗変化の測定または、反射率もしくは透過率モードでの画像濃度測定のいずれかが、制御可能かつ再現可能な試験において装置または製剤性能を評価する信頼性の高い方法を提供する。
【０１２３】
この膜試験ベッドは、圧力、用量、粒径分布および材料等を含む全ての主要装置パラメーターの粒子送達変動に感受性であり、かつガスに対しては非感受性であることが示されている。現在、１２５μｍポリエステル支持体上の約３５０オングストローム厚のアルミニウムが６０バールまでで作動する試験装置に用いられている。
【０１２４】
エンジニアリング・フォーム標的に対する衝撃効果の評価
経皮注入技術によって送達されるときの（例えば、針なしシリンジ装置からの送達）粒子性能を評価する別の手段は剛性ポリメチルイミド・フォーム（Ｒｏｈａｃｅｌｌ ５ＩＩＧ、密度５２ ｋｇ／ｍ３、Ｒｏｈｍ Ｔｅｃｈ Ｉｎｃ．、Ｍａｌｄｅｎ、ＭＡ）に対する衝撃の効果を測定することである。この試験の実験の構成は金属化膜試験において用いられるものに類似する。精密カリパスを用いて貫入の深度を測定する。各々の実験について、処理されたマンニトール標準を比較として実施し、他の全てのパラメーター、例えば、装置圧力、粒径範囲等は一定に保つ。またデータは、この方法が粒径および圧力の差に感受性であることも示す。薬物の賦形剤としての処理されたマンニトール標準は前臨床実験において全身濃度を送達することが立証されており、したがってこのフォーム貫入試験における相対性能測定は実用的なｉｎ ｖｉｖｏの基盤を有する。有望な粉末は、前臨床または臨床研究における適度な性能の予測のためのマンニトールと同等か、もしくはそれより良好な貫入を示すことを期待することができる。この単純で迅速な試験は粉末の評価の相対法としての価値を有し、分離して考慮することは意図されていない。
【０１２５】
粒子摩耗試験
粒子性能のさらなる指標は、様々な候補固形粒子状医薬組成物の、高速経皮注入技術に関連する力、すなわち、静止状態の粒子を突然の高速度気流と接触させることに由来する力、粉末が針なしシリンジを通して移動するときの粒子対粒子の衝撃から生じる力、およびこれもまた粉末が装置を通して移動するときの粒子対装置の衝突から生じる力に耐える能力を試験することである。したがって、初期組成物と針なしシリンジ装置から送達された後の組成物との粒径分布の変化を測定する単純な粒子摩耗試験が考案されている。
【０１２６】
この試験は、粒子組成物を針なしシリンジに上述のように充填した後、その粒子状組成物が可溶ではない担体流体（例えば、鉱油、シリコーン油等）を含有するフラスコ内にその装置を放出することによって行う。その後、担体流体を集め、初期組成物および放出された組成物の両者における粒径分布を、適切な粒径測定装置、例えば、ＡｃｃｕＳｉｚｅｒ（登録商標）ｍｏｄｅｌ ７８０ Ｏｐｔｉｃａｌ Ｐａｒｔｉｃｌｅ Ｓｉｚｅｒを用いて算出する。装置作動後に平均質量空気力学的直径（ＡｃｃｕＳｉｚｅｒ装置による測定）の約５０％未満、より好ましくは約２０％または約１０％未満の減少を示す組成物が本明細書で説明される針なしシリンジ系における使用に好適なものと判断される。
【０１２７】
ｉｎ ｖｉｔｒｏでのヒト皮膚への送達および経表皮（ｔｒａｎｓｅｐｉｄｅｒｍａｌ）水分損失
最終的な実用により密接に匹敵する組成物性能試験のため、候補粒子組成物を採皮された（ｄｅｒｍａｔｏｍｅｄ）完全厚のヒト皮膚サンプルに注入することができる。注入後の複製皮膚サンプルを、３２℃の水、生理食塩水またはバッファーを含有する改変Ｆｒａｎｚ拡散セル上に置くことができる。拡散セル構成要素への結合を防止し、かつ皮膚の状態を維持するため、界面活性剤のような添加物を用いることができる。２種類の測定を行って皮膚における製剤の性能を評価することができる。
【０１２８】
物理的効果、すなわち、皮膚の障壁機能に対する粒子注入の効果を測定するため、経表皮水分損失（ＴＥＷＬ）を測定することができる。測定は、平衡時に（約１時間）、約１２ｍｍの煙突のように作用する拡散セルキャップの頂部に置かれたＴｅｗａｍｅｔｅｒ ＴＭ ２１０（登録商標）（Ｃｏｕｒａｇｅ ＆ Ｋｈａｚａｋａ、Ｋｏｌｎ、Ｇｅｒ）を用いて行う。粒子が大きいほど、および注入圧が高いほど、それに比例してｉｎ ｖｉｔｒｏで生じるＴＥＷＬ値は高くなり、これはｉｎ ｖｉｖｏでの結果と相関することが示されている。粒子注入により、ｉｎ ｖｉｔｒｏ ＴＥＷＬ値は粒径およびヘリウムガス圧に応じて約７〜約２７（ｇ／ｍ２ｈ）増加した。粉末なしのヘリウム注入には効果がない。ほとんどの粒径について約１時間で処理前の値に戻るＴＥＷＬによって示されるように、ｉｎ ｖｉｖｏで皮膚障壁特性は迅速に正常に戻る。最大の粒子、５３〜７５μｍについて、皮膚サンプルは１時間で５０％の回復を、および２４時間までに完全な回復を示す。
【０１２９】
これらの、および他の定性的および定量的試験は、経皮注入において用いるための本発明の粒子状医薬の物理的および機能的適合性の評価に用いることができる。必須ではないが、粒子が以下の特徴を有することが好ましい：実質的に球状（例えば、可能な限り１：１に近いアスペクト比、例えば、１．５：１）；滑らかな表面；粒子摩耗試験を用いる粒径の減少が２０％未満；可能な限り成分の真の密度に近いエンベロープ密度（例えば、約０．８ｇ／ｍｌ超）；および狭い粒径分布を伴う約２０〜７０μｍのＭＭＡＤ。これらの組成物は自由流動粉末（例えば、５０％相対湿度で８時間の保存の後、および４０％相対湿度で２４時間の保存の後に自由流動）であり得る。これらの基準の全ては上述の方法を用いて評価することができ、かつ以下の刊行物（これらは参照することによって本明細書に組み込まれる）にさらに詳述されている。Ｅｔｚｌｅｒら（１９９５） Ｐａｒｔ． Ｐａｒｔ． Ｓｙｓｔ． Ｃｈａｒａｃｔ． １２：２１７；Ｇｈａｄｉｒｉら（１９９２） ＩＦＰＲＩ Ｆｉｎａｌ Ｒｅｐｏｒｔ， ＦＲＲ １６−０３ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｓｕｒｒｅｙ， ＵＫ；Ｂｅｌｌｈｏｕｓｅ ら（１９９７）「Ｎｅｅｄｌｅｌｅｓｓ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ｄｒｕｇｓ ｉｎ ｄｒｙ ｐｏｗｄｅｒ ｆｏｒｍ， ｕｓｉｎｇ ｓｈｏｃｋ ｗａｖｅｓ ａｎｄ ｓｕｐｅｒｓｏｎｉｃ ｇａｓ ｆｌｏｗ」， Ｐｌｅｎａｒｙ Ｌｅｃｔｕｒｅ ６， ２１ｓｔ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ ｏｎ Ｓｈｏｃｋ Ｗａｖｅｓ， Ａｕｓｔｒａｌｉａ；およびＫｗｏｎら（１９９８） Ｐｈａｒｍ． Ｓｃｉ． ｓｕｐｐｌ．１ （１）， １０３。
【０１３０】
したがって、免疫応答を誘発する新規組成物が説明されている。これらの組成物の使用方法も説明されている。主題発明の好ましい実施形態が幾らか詳細に説明されているが、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の精神および範囲から逸脱することなく明白な変形をなし得ることが理解される。
【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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