(57)【要約】個々の細胞の細胞膜の電気生理学的特性を測定するための装置は少なくとも１つの開口部を備えたプレートを含む。該開口部は表面で囲まれており、該表面は例えば加熱処理によりギガシールの形成が容易になるように修飾されている。チャンバーが該プレートに隣接している。該チャンバーは少なくとも１つの開口部と流体連通しており、且つ、電気伝導性溶液を保持するようになっている。該プレートは更に、該チャンバー中に位置する第一電極および該プレートに隣接して位置する第二電極を含む。
2004528539.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
個々の細胞の細胞膜の電気生理学的特性を測定するための装置であって、
ギガシールが形成され易いように修飾されている表面で囲まれた少なくとも１つの開口部を有するプレート、
少なくとも１つの上記開口部と流体連通しており、且つ、溶液を保持するようになっている、上記プレートに隣接したチャンバー、
上記チャンバー内に位置する第一電極、および
上記プレートに隣接して位置する第二電極
を備えてなり、
個々の細胞の細胞膜の電気生理学的特性の測定に使用する上記装置。
【請求項２】
両方の電極と電気的に接触した増幅器をさらに備える請求項１に記載の装置。
【請求項３】
細胞または細胞膜が上記開口部の表面に接着してギガシールが形成される請求項１に記載の装置。
【請求項４】
上記プレートがウェルを有し、該ウェルの一部が置換取り替え可能であるかまたは交換可能である、請求項１に記載の装置。
【請求項５】
取り替え可能な部分が開口部を有するディスクである請求項４に記載の装置。
【請求項６】
ウェルの側面部がプラスチックからなり、ウェルの底部がガラスからなる、請求項４に記載の装置。
【請求項７】
表面の修飾が、少なくとも１つの開口部を囲む表面を化学的に修飾することを含む、請求項１に記載の装置。
【請求項８】
化学的に修飾することが、プレートに物質を共有結合させることを含む、請求項７に記載の装置。
【請求項９】
物質が、開口部を囲むウェルの表面に共有結合されている、請求項１に記載の装置。
【請求項１０】
表面の修飾が、開口部を囲む表面を加熱処理により修飾することを含む、請求項１に記載の装置。
【請求項１１】
プレートがガラスからなり、加熱処理が該ガラスの軟化温度またはその温度付近にまで表面を加熱することを含む、請求項１０に記載の装置。
【請求項１２】
少なくとも１つの開口部が先細りになっている請求項１に記載の装置。
【請求項１３】
少なくとも１つの開口部がカウンターボアと貫通孔とを有する請求項１に記載の装置。
【請求項１４】
細胞が溶液中にあり且つプレートがウェルを有する請求項１に記載の装置であって、ウェルに上記溶液を入れるように構成された複数の分注器を有するマルチチャンネル液体分注システムを更に備える上記装置。
【請求項１５】
チャンバー内部を真空にするための、チャンバーに連結された真空源をさらに備える、請求項１に記載の装置。
【請求項１６】
各ウェルについて電圧値および／または電流値を測定するための電子回路を更に備える請求項１に記載の装置。
【請求項１７】
SQUID検出器を更に備える請求項１６に記載の装置。
【請求項１８】
プレートが、各々開口部を備えたウェルのアレイを有するマルチウェルプレートからなる、請求項１に記載の装置。
【請求項１９】
各々のウェルに独立してアドレス可能な自動化液体分注システムを更に備える請求項１８に記載の装置。
【請求項２０】
第一電極および第二電極を通って流れる電流を測定することにより細胞膜の電気生理学的特性を記録する請求項１に記載の装置。
【請求項２１】
少なくとも一方の電極が塩化銀の被覆を有する銀からなる請求項１に記載の装置。
【請求項２２】
溶液が電気伝導性溶液である請求項１に記載の装置。
【請求項２３】
開口部がレーザーを用いて作成される請求項１に記載の装置。
【請求項２４】
個々の細胞の細胞膜の電気生理学的特性を測定するための装置であって、
レーザーを用いて作成され、個々の細胞を受容するように加熱により修飾された開口部を備えた少なくとも１つのウェルを有するプレート、
上記開口部と流体連通しており、且つ、電気伝導性溶液を保持するようになっている、上記プレートに隣接したチャンバー、
上記チャンバー内に位置する第一電極、
上記ウェルに位置する第二電極、および
第一電極および第二電極に電気的に接触した増幅器
を備えてなり、
個々の細胞の細胞膜の電気生理学的特性を第一電極および第二電極を通って流れる電流を測定することにより記録する上記装置。
【請求項２５】
開口部がカウンターボアと貫通孔とを有する請求項２４に記載の装置。
【請求項２６】
カウンターボアが約80〜110μmの深さに穿孔されている請求項２５に記載の装置。
【請求項２７】
貫通孔が約2〜5μmの直径を有する請求項２５に記載の装置。
【請求項２８】
チャンバー内部を真空にするための、チャンバーに連結された真空源をさらに備える、請求項２４に記載の装置。
【請求項２９】
SQUID検出器を更に備える請求項２４に記載の装置。
【請求項３０】
プレートが、各々開口部を備えたウェルのアレイを有するマルチウェルプレートからなる、請求項２４に記載の装置。
【請求項３１】
各々のウェルに独立してアドレス可能な自動化液体分注システムを更に備える請求項３０に記載の装置。
【請求項３２】
プレートがウェルを有し、該ウェルの側面部がプラスチックからなり、該ウェルの底部がガラスからなる、請求項２４に記載の装置。
【請求項３３】
細胞膜の電気生理学的特性を測定するのに使用するためのウェルの一部分として機能する、開口部を有する取り外し可能なディスク。
【請求項３４】
ガラスからなる請求項３３に記載のディスク。
【請求項３５】
複数の開口部を有する請求項３３に記載のディスク。
【請求項３６】
開口部を囲む表面が化学的に修飾されている請求項３３に記載のディスク。
【請求項３７】
開口部を囲む表面が加熱処理されている請求項３３に記載のディスク。
【請求項３８】
ディスクがガラスからなり、更に、加熱処理が該ガラスの軟化温度またはその温度付近にまで上記表面を加熱することを含む、請求項３７に記載のディスク。
【請求項３９】
加熱処理がレーザー加熱を含む請求項３７に記載のディスク。
【請求項４０】
開口部がカウンターボアと貫通孔とを有する請求項３３に記載のディスク。
【請求項４１】
カウンターボアの大きさが約130μmであり、貫通孔の大きさが約2μmである、請求項40に記載のディスク。
【請求項４２】
細胞膜を有する細胞を受容するための修飾された表面を有する開口部を備えた少なくとも１つのウェルを提供するステップ、
細胞を上記開口部に沈着させ、修飾された表面により細胞とウェルとの間にギガシールを形成するステップ、および
電圧および／または電流の測定値を記録して細胞膜のイオンチャネルを評価するステップ
を含む、細胞膜のイオンチャネルを通過する電流を測定する方法。
【請求項４３】
ウェルの側面部がプラスチックからなり、ウェルの底部がガラスからなる、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
ギガシールの形成を補助するために真空源を用いて真空にするステップを更に含む、請求項４２に記載の方法。
【請求項４５】
細胞、緩衝液および試験化合物を加えるために自動化液体分注システムを用いるステップを更に含む、請求項４２に記載の方法。
【請求項４６】
表面の修飾が、開口部を囲む表面を加熱処理により修飾することを含む、請求項４２に記載の方法。
【請求項４７】
少なくとも１つのウェルがプレート上に有り、該プレートがガラスからなり、加熱処理が該ガラスの軟化温度またはその温度付近にまで上記表面を加熱することを含む、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
表面の修飾が、少なくとも１つの開口部を囲む表面を化学的に修飾することを含む、請求項４２に記載の方法。
【請求項４９】
開口部がレーザーを用いて作成される請求項４２に記載の方法。
【請求項５０】
少なくとも１つの開口部がカウンターボアと貫通孔とを有する請求項４２に記載の方法。
【請求項５１】
カウンターボアが約150〜300nmの波長を有するレーザーを用いて作成される請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
貫通孔が約150〜300nmの波長を有するレーザーを用いて作成される請求項５０に記載の方法。
【請求項５３】
開口部を有する少なくとも１つのウェルを提供するステップ、
複数の細胞を含む溶液をウェルに入れるステップ、
開口部に陽圧を加えるステップ、および
開口部に陰圧を加えて、複数の細胞のうちの１個を開口部に吸引して細胞と開口部との間にギガシールを形成するステップ
を含む、ギガシールを形成する方法。
【請求項５４】
複数の細胞のうちの１個の細胞膜のイオンチャネルを評価するために電圧および／または電流の測定値を記録するステップを更に含む、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
開口部が表面により囲まれており、該表面がギガシールの形成を補助するように修飾されている、請求項５３に記載の方法。
【請求項５６】
上記複数の細胞のうちの上記１個が良好な細胞からなる、請求項５３に記載の方法。
【請求項５７】
少なくとも１つのウェルの側面部がプラスチックからなり、少なくとも１つのウェルの底部がガラスからなる、請求項５３に記載の方法。
【請求項５８】
表面が加熱処理により修飾されている請求項５５に記載の方法。
【請求項５９】
少なくとも１つのウェルがプレート上に有り、該プレートがガラスからなり、加熱処理が該ガラスの軟化温度またはその温度付近にまで表面を加熱することを含む、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
開口部がカウンターボアと貫通孔とを有する請求項５３に記載の方法。
【請求項６１】
開口部がレーザーを用いて作成される請求項５３に記載の方法。
【請求項６２】
端部と、開口部を規定する端部内の側壁とを有する少なくとも１つのウェル、
細胞と側壁との間に高抵抗シールが形成されるようになっている開口部の側面に配置された接着剤、
ウェル内に位置しうる第一電極、および
細胞膜の電気生理学的な測定値が記録できるように、開口部内に位置する細胞の膜を横切って電圧勾配が形成されることを可能にするウェルの外部に位置しうる第二電極
を含む、生物学的材料の電気生理学的な測定を容易にする装置。
【請求項６３】
接着剤が、約600メガオーム〜約1.1ギガオームの漏洩抵抗を有する高抵抗シールを形成するように構成されている、請求項６２に記載の装置。
【請求項６４】
接着剤がシリコン系接着剤を含む、請求項６２に記載の装置。
【請求項６５】
上記ウェルを、各々端部に開口部を規定する他の複数のウェルとともに有するプレート、
各孔と流体連通しており、電気伝導性溶液を保持するようになっている該プレートに隣接したチャンバー、および
他の各ウェル内に位置しうる一組の第一電極
を更に備えてなり、
上記第二電極が該チャンバー内に設置された共通電極からなる、請求項６２に記載の装置。
【請求項６６】
各々端部を有する複数のウェルを有するプレートであって、該ウェルのうちの少なくとも一部のウェルの端部に孔が形成されており、該孔が各細胞を受容して高抵抗シールが細胞と端部との間に形成されるように構成されているプレートと、
各孔と流体連通しており、電気伝導性溶液を保持するようになっている、該プレートに隣接したチャンバーと、
共通電極と、
細胞の電気生理学的な測定値が収集できるように、孔内に位置する細胞の膜を横切って電圧勾配を形成するための、ウェル内部に位置するように構成された複数のウェル電極と
を備えた生物学的材料の電気生理学的な測定を容易にする装置。
【請求項６７】
各孔が先細りになっている請求項６６に記載の装置。
【請求項６８】
各孔の最も狭い寸法が約１μm〜約５μmの範囲内である請求項６７に記載の装置。
【請求項６９】
各孔が、孔の壁面と細胞との間にシールが形成されるように適合された接着剤を含む、請求項６６に記載の装置。
【請求項７０】
ウェルに溶液中の細胞を入れるように構成された複数の分注器を有するマルチチャンネル液体分注システムを更に備える請求項６６に記載の装置。
【請求項７１】
ウェル電極が分注器に連結されている請求項７０に記載の装置。
【請求項７２】
チャンバー内部を真空にするための、チャンバーに連結された真空源を更に備える、請求項６６に記載の装置。
【請求項７３】
各分注器が、各ウェルに陽圧を供給できるように、ウェルとシールを形成するためのシール部材を更に有する、請求項７０に記載の装置。
【請求項７４】
各ウェルについて電圧値および／または電流値を測定するための電子回路を更に備える請求項７０に記載の装置。
【請求項７５】
液体分注システムと上記電子回路との操作を制御するためのコントローラを更に備える請求項７４に記載の装置。
【請求項７６】
共通電極に連結された電圧源を更に備える請求項６６に記載の装置。
【請求項７７】
細胞に小さな穴を作成する手段を更に備える請求項６６に記載の装置。
【請求項７８】
穴を作成するための手段が、往復運動することができる共通電極、加圧溶液、および穴形成溶液からなる群から選択される、請求項７７に記載の装置。
【請求項７９】
細胞保持手段を備えた支持手段であって、該細胞保持手段が、該細胞保持手段と細胞との間に高抵抗シールが形成されるように個々の細胞を受容するように構成されている孔を有する支持手段、
支持手段の下に配置された電気伝導性液体を蓄えるための手段、
各孔内の細胞膜を横切って電圧勾配を形成するための手段、および
細胞の電圧および／または電流の測定値を収集して記録するための手段
を備えてなる、生物学的材料のイオンチャネルの評価を容易にするための装置。
【請求項８０】
細胞と細胞保持手段との間に高抵抗シールを形成するための接着手段を更に備える請求項７９に記載の装置。
【請求項８１】
端部と、開口部を規定する端部内の側壁とを有する少なくとも１つのウェルを提供するステップ、
開口部の側壁に接着剤を配置するステップ、
細胞を上記開口部に沈着させ、そこで接着剤により細胞と側壁との間に高抵抗シールを形成するステップ、
細胞膜を横切って電位差を形成させるステップ、ならびに
電圧および／または電流の測定値を記録するステップ
を含む、細胞のイオンチャネルを通過する電流を測定する方法。
【請求項８２】
開口部を規定する側壁を有する複数のウェルを提供するステップ、各側壁に接着剤を配置するステップ、各ウェル内に細胞を沈着させるステップ、ならびに各細胞膜を横切って電位差を形成させ、電圧および／または電流の測定値を記録するステップ、を更に含む、請求項８１に記載の方法。
【請求項８３】
各々端部を有する複数のウェルを有し、該ウェルのうちの少なくとも一部のウェルの端部に孔が形成されているプレートと、該プレートに隣接しており、電解質溶液で満たされたチャンバーと、共通電極とを提供するステップ、
溶液中の細胞をウェルに分注するステップ、
ウェルとチャンバーとの間に圧力差を生じさせて細胞を孔に集め、細胞とウェルの端部との間に高抵抗シールを形成させるステップ、
ウェル内にウェル電極を配置するステップ、
共通電極と、ウェル内に配置されたウェル電極との間に電位差を生じさせるステップ、および
孔内に位置する細胞の電気生理学的な測定値を収集するステップ、
を含む、複数の細胞のイオンチャネルを通過する電流を測定する方法。
【請求項８４】
細胞とウェルの端部との間に適切なシールが形成されたか否かを試験するステップを更に含む請求項８３に記載の方法。
【請求項８５】
高抵抗シールが少なくとも約１ギガオームである請求項８３に記載の方法。
【請求項８６】
細胞とウェルの端部との間にシールを形成させるために孔内に接着剤を配置するステップをさらに含む請求項８３に記載の方法。
【請求項８７】
接着剤が約600メガオーム〜約1.1ギガオームの高抵抗シールを形成させる請求項８６に記載の方法。
【請求項８８】
細胞をウェルに分注するのと同時に細胞の電気生理学的な測定値を収集する請求項８３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は一般的に、生物学的材料の電気生理学的評価に関する。より具体的には、本発明は細胞膜中のイオンチャネルと関連した電気生理学的特性を測定および評価するための装置および技術に関する。本発明は更に、細胞膜とパッチクランププローブの表面との間にギガシールを形成させて電気生理学的特性の高スループット測定を容易にする技術に関する。
【背景技術】
【０００２】
イオンチャネルは細胞を出入りするイオンの流れを制御する。イオンチャネルは典型的にはタンパク質またはタンパク質の集合体から成っており、細胞膜を構成する脂質二重層に埋め込まれている。イオンチャネルを介して細胞膜を通過するイオンの移動は、微弱であるが測定可能な電流を引き起こすイオン電流を形成する。
【０００３】
パッチクランプ法はイオンチャネルを通過するイオン電流の測定を可能にする。パッチクランプ法は例えば、PCT国際公開WO96/13721号およびWO99/66329号（それらの全体は参照により本明細書に援用される）に記載されている。簡潔にいえば、パッチクランプ法は、膜と記録用プローブとの間に緊密なシールを形成して、その結果として細胞膜と記録用プローブとの間の「漏洩（leakage）」によるバックグラウンドイオン電流を最小化する細胞膜の能力を利用する。今日のパッチクランプ法では、マイクロピペットチップを膜に密着させて(engaged)シールを形成する。このようなシールは「ギガシール」として知られており、抵抗が高いので、細胞膜中のイオンチャネルを流れる微弱なイオン電流の正確な測定を容易にする。
【０００４】
多くのイオンチャネルが外部刺激に応答して開く「ゲート」を有している。外部刺激としては、電位、機械的または触覚的刺激、およびシグナル伝達分子が挙げられる。シグナル伝達分子は本質的には化学的刺激であり、化学的刺激に応答するイオンチャネルゲートのクラスはリガンド開閉型イオンチャネルとして当該技術分野において知られている。リガンド開閉型イオンチャネルは天然に存在するシグナル伝達分子と薬物などの合成分子シグナルとの両方に応答する。リガンド開閉型イオンチャネルのためのシグナル伝達分子の例としては、アセチルコリンおよびグリシン（神経伝達物質）、サイクリックAMP、イノシトール1,4,5トリホスフェート（IP3）、および（細胞内の）ATPが挙げられる。イオンチャンネルに関連する疾病および障害の患者の治療および処置のために有効な薬物の開発はパッチクランプアッセイにより確認されている。
【０００５】
既存の態様では、パッチクランプ法は薬物の候補についての低スループットアッセイである。主な障害は、膜とピペットのチップとの間のギガシールの形成に関するものである。ギガシールを形成するための今日の技術は手間がかかり、特別な習熟と設備を必要とする。現在のところ、熟練した電気生理学者は既存のパッチクランプ法を用いて1日に約5〜20種類の化合物しかスクリーニングできない。これに対して現代の薬物スクリーニング（例えば、パッチクランプ法ではない技術を用い、96ウェルプレート、ロボットハンドリングおよび自動データ処理により特性分析するスクリーニング）では、特定のアッセイによって1日に1000〜10000種の（またはそれ以上の）化合物をスクリーニングすることができる。
【０００６】
他の既存の電気生理学的記録方法としては、二微小電極式ボルテージクランプ法、細胞外記録法(extracellular recordings)、および「U字管」法のうちの１つが挙げられる。設備および人的な習熟という点では要求されるものは比較的少ないが、これらの技術もまた高スループットスクリーニングに対する今日の要求を満たすものではない。
【０００７】
細胞膜を横切る電圧変化を記録する光学的方法などの、他の採り得るイオンチャネル活性記録方法はより高いスループットを有している。しかしながら、これらの方法は正確性および上記の電気生理学的方法によるスクリーニングのための情報内容を欠いており、電気生理学的記録から得ることができる情報量を提供することができない。
【０００８】
従って、細胞および細胞膜の電気生理学的特性を高スループット条件で測定して評価するシステムおよび方法（例えばパッチクランプ型アッセイを行う速度を顕著に上昇させるシステムおよび方法）に対する永年の要求が存在する。
【発明の開示】
【０００９】
発明の概要
本発明は細胞および生物膜の電気生理学的特性を測定し、評価し、記録し、そして分析するための種々の装置および方法を提供する。本発明の装置および方法は、細胞膜または生物膜と開口部との間のギガシールを利用する。
【００１０】
本発明の一実施形態によれば、細胞とガラスシートまたはプレートの開口部との間のギガシールを利用する自動化イオンチャネルアッセイのための装置および方法、ならびに多くの薬物候補物質および細胞を一度に並行して処理およびスクリーニングするための装置および方法が提供される。
【００１１】
本発明の実施形態は、
個々の細胞の細胞膜の電気生理学的特性を測定するための装置であって、
ギガシールが形成され易いように修飾されている表面で囲まれた少なくとも１つの開口部を有するプレート、
少なくとも１つの上記開口部と流体連通しており、且つ、溶液を保持するようになっている、上記プレートに隣接したチャンバー、
上記チャンバー内に位置する第一電極、および
上記プレートに隣接して位置する第二電極
を備えてなり、
個々の細胞の細胞膜の電気生理学的特性の測定に使用する上記装置を包含する。
【００１２】
本発明の他の実施形態は、
個々の細胞の細胞膜の電気生理学的特性を測定するための装置であって、
レーザーを用いて作成され、個々の細胞を受容するように加熱により修飾された開口部を備えた少なくとも１つのウェルを有するプレート、
上記開口部と流体連通しており、且つ、電気伝導性溶液を保持するようになっている、上記プレートに隣接したチャンバー、
上記チャンバー内に位置する第一電極、
上記ウェルに位置する第二電極、および
第一電極および第二電極に電気的に接触した増幅器
を備えてなり、
個々の細胞の細胞膜の電気生理学的特性を第一電極および第二電極を通って流れる電流を測定することにより記録する上記装置を包含する。
【００１３】
本発明の他の実施形態は、細胞膜の電気生理学的特性を測定するのに使用するためのウェルの一部分として機能する、開口部を有する取り外し可能なディスクを包含する。
【００１４】
本発明の他の実施形態は、
細胞膜を有する細胞を受容するための修飾された表面を有する開口部を備えた少なくとも１つのウェルを提供するステップ、
細胞を上記開口部に沈着させ、修飾された表面により細胞とウェルとの間にギガシールを形成させるステップ、および
電圧および／または電流の測定値を記録して細胞膜のイオンチャネルを評価するステップ
を含む、細胞膜のイオンチャネルを通過する電流を測定する方法を包含する。
【００１５】
本発明の他の実施形態は、
開口部を有する少なくとも１つのウェルを提供するステップ、
複数の細胞を含む溶液をウェルに入れるステップ、
開口部に陽圧を加えるステップ、および
開口部に陰圧を加えて、複数の細胞のうちの１個を開口部に吸引して細胞と開口部との間にギガシールを形成するステップ
を含む、ギガシールを形成する方法を包含する。
【００１６】
本発明の一実施形態の技術上の利点は、ギガシールの形成を容易にする装置が提供される点である。かかる装置は、イオン電流の測定のためのシグナル検出および増幅を向上させる。更に、かかる装置は薬物候補物質の高スループットスクリーニングを増強するという特性を提供する。加えて、開示発明の装置および部品を組み立てる方法が開示される。
【００１７】
本発明の一実施形態の技術上の利点は、細胞膜を通過するイオン電流の測定を容易にするために細胞膜と記録用プローブとの間に電気抵抗のあるギガシールを形成する新規な方法が提供される点である。更に、細胞膜に密着させる該プローブの表面を化学的および物理的に修飾する方法が開示される。ギガシールの形成を容易にする表面修飾としては、限定するものではないが、（１）特定の時間の加熱処理、（２）脂質分子の共有結合、および（３）接着剤様物質の塗布が挙げられる。一実施形態では、かかる修飾は既存のパッチクランプ型実験と共に用いられ、高スループットスクリーニング操作を容易にするために用いることもできる。
【００１８】
本発明の一実施形態の技術上の利点は、イオンチャネルを高スループットの様式でスクリーニングするための新規な方法が提供される点である。かかるスクリーニング技術ではギガシールが利用され得る。
【００１９】
本発明の一実施形態の技術上の利点は、アッセイ可能なホールセルパッチの数が現行の8時間あたり5〜20個から1日あたり200〜2000個（またはそれ以上）に増加するという点である。
【００２０】
本発明の他の目的、構成、および技術上の利点は、本明細書の詳細な説明の解釈および添付図面からより一層明らかになるであろう。
【００２１】
発明の実施の形態
以下の詳細な記載は添付図面について言及するものである。本発明の精神および範囲から逸脱することなく他の実施形態が可能であるとともにその実施形態を改変することができる。従って、以下の詳細な記載は本発明を限定することを意図するものではない。本発明の範囲は添付する請求の範囲により規定される。
【００２２】
以下の記載の便利のために、以下の用語説明を用いる。しかしながら、これらの説明は例示を目的とするものでしかない。これらは、明細書全体にわたって記載または言及されている通りにその用語を限定することを意図するものではない。むしろこれらの説明は、本明細書に記載され特許請求されている用語のあらゆる更なる側面および／または例を包含することを意図している。
【００２３】
本明細書中で用いられる「生物膜」という用語は、全細胞（ホールセル）に見られるような細胞膜であり、脂質二重層および他の合成ポリマー膜のような人工膜をも包含する。
【００２４】
本明細書中で用いられる「電気生理学的特性」という用語は、細胞、細胞膜または他の生物膜の測定される電気生理学的特性である。これらの特性は細胞膜に存在するイオンチャネルと関連するイオン電流、電圧または磁場を用いて測定される。このような測定はシグナル伝達分子のような内因性因子の存在（または不存在）下で行うことができる。このような測定はまた、スクリーニング条件において候補薬物分子または試験化合物のような外因性因子の存在（または不存在）下で行うこともできる。電気生理学的特性の測定には、内因性または外因性因子の存在下で、細胞膜を横切る電位またはイオンチャネルを通過するイオン移動の速度を測定することをも包含される。電気生理学的特性という用語は、生物膜に存在するイオンチャネルを通過するイオンの種類の特徴をも包含することがある。
【００２５】
「電気伝導性溶液」はイオンまたは電解質を含む溶液である。イオンは、カチオンまたはアニオンのような正電荷または負電荷を有する荷電した原子または分子である。カチオンの例としては、限定するものではないが、ナトリウム (Na+)、カリウム (K+)、リチウム (Li+)、および他の一価カチオン、カルシウム (Ca2+)、マグネシウム (Mg2+)、および他の二価カチオンが挙げられる。アニオンの例としては、限定するものではないが、塩化物イオン (Cl-)、ヨウ化物イオン (I-)、および他のハロゲン化物イオンが挙げられる。
【００２６】
「イオンチャネル」は細胞膜を包含する脂質二重層に埋め込まれた膜貫通タンパク質またはタンパク質の集合体である。イオンチャネルは細胞に出入りするイオンの流れを制御する。イオンチャネルは、例えば特異的なイオンのみ細胞膜を通過させるなどの、特異性を示すことがあり得る。更にまた、種々の疾病および障害は、特定のイオンおよびそれに対応するチャネル（例えばK-チャネルまたはNa-チャネル）と密接に関連している。イオンチャネルを介して細胞膜を通過するイオンの移動は、微弱であるが測定可能な電流を引き起こすイオン電流を形成する。従って、同一の細胞または細胞膜が異なるイオンの存在下または不存在下で異なる電気生理学的特性を示すことが有る。例えば、電気生理学的測定値は、分子シグナルの存在および濃度のようなパラメーターに敏感なだけでなく、存在するイオンの種類にも敏感である。更にまた、細胞膜中のイオンチャネルの開口を誘導するために電圧を加えることができる。
【００２７】
「実験変数」という用語は、例えば温度、実験の所要時間（電流測定の所要時間など）、シグナル検出の方法および印加電圧のような実験者により制御される因子を意味する。これらの因子は実験によって実験者が変更することができ、そのような変更が特定の実験の結果に影響を与えることがある。他の実験変数としては、スクリーニング条件でのイオン（緩衝剤を含む）、分子シグナル、または薬物候補物質の、存在および濃度が挙げられる。他の実験変数には、実験系に存在する細胞の種類および数が包含される。
【００２８】
「イオン電流」はイオンチャネルを通過するイオンの流れである。イオン電流は電解質溶液中のイオンの移動を指す場合もある。電解質溶液中で電流が流れる場合は、電荷はアニオンおよびカチオンの両方の移動により運ばれ得る。電解質溶液中の溶媒は水であることが多いが、非水性電解質溶液が当業者に知られており、それらは本発明の範囲内である。
【００２９】
「パッチクランプマイクロチャンバー」は、単一の統合された装置にてギガシールが形成される生物膜の電気生理学的特性を測定するための装置である。加えて、一実施形態では、僅かなシグナルの増幅および／または処理を、この単一の統合された装置において行うことができる。
【００３０】
「ギガシール」または「高抵抗シール」は、シール不良に起因する「漏洩」によるバックグラウンドイオン電流が最小であるパッチクランプシールである。好ましい実施形態では、ギガシールは約１ギガオーム（１ＧΩ）よりも大きい高抵抗シールである。他の実施形態では、ギガシールは約１ギガオーム（１ＧΩ）〜約100ギガオーム（100ＧΩ）の高抵抗シールである。他の実施形態では、ギガシールは約１ギガオーム（１ＧΩ）〜約50ギガオーム（50ＧΩ）の高抵抗シールである。他の実施形態では、ギガシールは約１ギガオーム（１ＧΩ）〜約10ギガオーム（10ＧΩ）の高抵抗シールである。他の実施形態では、ギガシールは約１ギガオーム（１ＧΩ）〜約5ギガオーム（5ＧΩ）の高抵抗シールである。
【００３１】
「プロトン」はその唯一の電子が脱離した水素原子である。水溶液中では、プロトンは水分子と会合しており、正しくは「ヒドロニウムイオン」またはH3O+と呼ばれる。これらの用語は混同されることが多く、開示された文章、特にpHの議論においてそのままになっている。断りのない限り、プロトンおよびヒドロニウムイオンの用語は本明細書において交換可能に用いられる。
【００３２】
本明細書で開示される装置および方法は、イオンチャネル関連疾患に対して有効な薬物または他の治療薬の発見および評価のために有用である。「治療薬」（例えば薬物またはプロドラッグ）は、疾患または症状の予防または治療を促進するのに有効な任意の化合物またはその製剤である。「疾患または症状の予防または治療を促進するのに有効」とは、臨床上適切な様式で投与したときに、症候の改善、治癒、寿命の延長、生活の質の向上、または他の効果のような有益な効果が、少なくとも統計的に有意な割合の患者について、特定の種類の疾患または症状の治療に通じた医師により一般的に陽性であると認められることとなる場合を指す。
【００３３】
イオンチャネルおよびイオンチャネルの機能に関連する疾患としては、心臓血管の分野（例えば高血圧症および心不整脈）、疼痛（局所麻酔薬）、糖尿病、てんかん、不安などが挙げられる。これらの疾患または疾患のファミリーの各々は、特定のイオンチャネルと関連している傾向がある。一実施形態では、本発明は、イオンチャネル関連疾患の治療のための薬物候補物質を同定およびスクリーニングするための高スループット実験を容易にする装置および方法を提供する。
【００３４】
以下の詳細な記載は添付図面について言及するものである。本発明の精神および範囲から逸脱することなく他の実施形態が可能であるとともにその実施形態を改変することができる。
【００３５】
図１は本発明の一実施形態による電気生理学的特性を測定するための装置を示す。この装置は、一対の電極３と４を分離するのに用いられる誘電体バリア２を利用する。該誘電体バリアは任意の構成または形態（例えばプレート、ディスクまたはシート）であってよく、また、別の構造内に組み込まれていてもよく、例えばウェルまたはチャンバーの底部、側面部または上面部であってよい。このように、誘電体２の主たる機能は電極３と４とを分離することである。誘電体２は細胞６を受容するための開口部５を有する。該開口部の成形および作成には種々の方法を用いることができる。例えば、レーザードリル技術を用いて各ウェルの底部に小さな円錐形の穴を開けることができる。一実施形態では、開口部の直径は約1μm〜約5μmの範囲、好ましくは2μmである。
【００３６】
細胞６に1つ以上の孔を開けて、測定装置7を用いて電流値または電圧値を収集し記録する。本発明の一実施形態では、誘電体（または複数の誘電体）は、複数の細胞を複数のウェル（一度に１個の細胞）中で並行して評価できるように複数の開口部および複数の電極を有する。
【００３７】
誘電体バリアは種々の異なる材料（例えばガラスまたはプラスチック）から構成することができる。良好な電気絶縁性を有するガラスがパッチクランプ測定に有用である。さらにまた、イオンのようにチャネルの挙動を改変し得る物質がガラスから漏れ出すのを防止することが有用である。ガラスの他の重要な側面は、良好な細胞接着性、高い抵抗率、低い誘電率、レーザードリル技術への適合性、均一な厚さ、および良好な平面度である。
【００３８】
本発明の一実施形態によれば、ホウケイ酸ガラスが本発明に用いられる。ホウケイ酸ガラスは化学的に耐久性が有り、約700℃まで変形に対して安定であり、優れた光学的特性を有している。このように、このガラスは平滑で平らな、厚さが最小のガラスのシートが必要とされる場合に使用するのに好適である。使用可能なホウケイ酸ガラスのタイプは、Erie Scientific CompanyのD263ガラスである。該ガラスの情報はhttp://www.eriesci.com/products&services/CustomGlass/D263-tech.html（その全体が参照により本明細書に援用される）で見ることができる。あるいは、他のケイ酸塩ガラスまたはその他の種類のガラスを使用することもできる。
【００３９】
他の実施形態では、ソーダ石灰ガラスをパッチクランプマイクロチャンバーのプレート部分に使用することができる。例えば、平らで均一で平滑なガラスシートを得る方法を用いて、このガラス（またはホウケイ酸ガラス）から顕微鏡のスライドカバースリップを作成することができる。
【００４０】
あるいは、本発明の更なる実施形態ではシリカ基板が用いられる。半導体工業で商業的に使用されるシリコンウエハは空気酸化により天然の酸化物層を有している。このようなチップおよび表面は、ケイ酸塩ガラスと同様の方法を用いて官能化することができるという高品質の平滑シリカ表面の利点を提供する。
【００４１】
パッチクランプマイクロチャンバー部品を構成するのに好適な他の材料としては、限定するものではないが、ポリマー表面が挙げられる。ポリマー表面の活性化は、UV/オゾンまたはプラズマプロセスを用いて行うことができる。またポリマー表面の活性化としては、イオンおよび電子衝撃により生じるポリマー表面における新しい化学官能基の作成が挙げられる。該プロセスはポリマー表面のぬれ性を高めるために有効であるとともに、ポリマー基板の荷電した二極性脂質膜の親和性を高めるためにも有効である。
【００４２】
本発明はマルチチャンネルのパッチクランプ実験を行うための装置および方法を提供する。図２は、本発明の一実施形態による、そのような電気生理学的測定装置10の正面斜視図を示している。装置10は、（ウェルのアレイを有する）マルチウェルプレートを挿入することができる一対の入口14および16を有するハウジング12から構成される。本発明の一実施形態にしたがって使用することができるマルチウェルプレートの１つのタイプは、プラスチックのボディと固体ガラス底部とを有するマルチウェルプレートである。このようなプレートの一例は、Whatman Polyfiltronicsから市販されているモデル番号7706-2375である。該プレートのうちの1枚は細胞を含んでいてよく、一方で、もう１枚のプレートは細胞を有するプレートに移される溶液を保持する。入口14および16の上方に位置するものは、装置10の操作を制御するための制御ボタン18のセットである。例えば制御ボタン18は、マルチウェルプレートのウェルに細胞を分注する、圧力差をかける、電圧勾配を作り出す、種々の測定された電気生理学的パラメーターを表示する、などのために用いることができる。評価後は、マルチウェルプレートをハウジング12から取り出して廃棄してよい。
【００４３】
図3は本発明の一実施形態による装置10の断面図である。入口14は、図4に示す複数のウェル24を有するマルチウェルプレート22を保持するための、一般的には開放された内室20に通じている（同様の内室が入口16と通じている）。プレート22が内室20内に置かれるときは、該プレートは共通電極28を有するチャンバー26に保持される。使用時には、チャンバー26は電解質溶液で満たされており、本明細書に記載するように共通電極28に電圧を加えることによりウェル24の各々にある開口部を通って電流が提供される。共通電極28は、共通電極28に電流を提供するための適当な電子回路を有する制御ユニット29に接続されている。
【００４４】
分注装置を用いて各ウェル中に化合物を分注する。例えば、内質20の上方に、複数の分注チップ32を有するマルチウェル分注装置30が配置されている。各分注チップ32は、制御ユニット29内のリザーバにつながっているライン34に接続されている。こうして細胞が懸濁された溶液を各分注チップ32に供給することができ、次いでその分注チップが溶液中の細胞（数百〜数千の細胞）をプレート22のウェル24に供給する。
【００４５】
各ウェル中で試験される各細胞または細胞膜の電気生理学的特性を測定するために電極および電子回路が備えられている。例えば各分注チップ32は更に、共通電極28からのリターン電流の経路を提供するウェル電極36を含む。他の実施形態では、該電極は分注チップと分離しており、例えば、ウェルの側面部に組み込まれていてよく、また、ウェルの側面部または端部(end)上の薄膜電極であってよい。各ウェル電極36は制御ユニット29内の電子回路と連結されており、ウェル24内の各開口部中に沈着された細胞の細胞膜を横切って電圧勾配が形成される。更に、制御ユニット29は各細胞膜について電圧および電流の変化を測定および記録するのに好適な電子回路を含む。
【００４６】
該装置はまた、ウェルまたはチャンバーを排水する能力、およびギガシールの形成を容易にするために陽圧または低真空を維持する能力を有していてもよい。各ウェル24の開口部から内部に細胞を捕捉するために、各ウェル22とチャンバー26との間に圧力差を付与する。細胞をウェルに分注する一方で、下記の通りにギガシールの形成を補助するためにチャンバー26を僅かに陽圧または僅かに陰圧に圧力調整することができる。これは、各分注チップ32の各々を通して陽圧を付与するか、またはチャンバー26内を真空にすることにより行うことができる。制御ユニット29はこの真空を制御することができる。
【００４７】
制御ユニット29は更に、電気生理学的特性を記録し記憶するための好適な電子回路を含む。制御ユニット29は、このデータを、将来使用するために、別のコンピューターまたは他の記憶装置に電子的に移転することを可能にする好適な入力ポートおよび出力ポートを含んでいてよい。
【００４８】
更にまた、制御ユニット29を用いて、プレート22が入口14内に挿入された後に、分注チップ32をウェル24中に降下させることもできる。分注チップ32を降下させてから、制御ユニット29を用いて、上記のように溶液中の細胞をウェル24の各々に分注することができる。操作が完了したら、制御ユニット29を用いて、入口14からプレート22を自動的に排出することができる。そうすれば該プレートを取り出して廃棄することができる。
【００４９】
図５は、本発明の一実施形態による電気生理学的測定装置の他の実施形態を図示する。装置38は複数のウェル44を有するマルチウェルプレート42を保持するための内部を有するハウジング40を備える。図示の便宜のために、3つのウェルのみを示す。しかしながら、装置38は多様なウェル構造を有するように構成することができることが理解されよう。一例においては、ウェルは深さ約800μm、直径約2mmである。更に、プレート42は水平である必要はなく他の向きに置かれていてよい。プレート42の下には、電解質溶液を保持するためのチャンバー46が配置されている。チャンバー46内には、金属プレートで構成された共通電極48が往復運動できるように(reciprocatably)配置されている。電極48は、本明細書に記載するように、細胞膜を横切って電圧勾配が形成され得るように適当な電子回路と接続される。
【００５０】
プレート42の上方には複数の分注チップ52を有するマルチウェル分注装置50が配置されている。分注装置50は、プレート42が装置38内に挿入された後に分注チップ52がウェル44内に挿入されるように構成されている。分注チップ52は、本明細書に記載のようにウェル44に圧力差がかかったときに分注チップ52とウェル44との間を密閉するためのシール54を含んでいてよい。各分注チップ52は更にウェル電極56を含む。こうして、細胞または細胞膜の電気生理学的特性の測定を行うときに共通電極48とウェル電極56との間に電圧勾配が形成され得る。電極56は更に、図5に記載のように、適当な電子回路と接続されて、電圧および電流の測定値を収集して記録できるようになっている。
【００５１】
各ウェル44の端部は、共通電極48とウェル電極56との間に電流の経路を提供する、先細りになった貫通開口部 (through opening) 58を備える。このような構成により、細胞60は分注装置50を用いてウェル44内に分注され得る。細胞60は電気伝導性の溶液として分注される。チャンバー46はまた、各ウェル44中の細胞の細胞膜を横切って電圧勾配が形成されるように電気伝導溶液で満たされていてもよい。
【００５２】
図6〜9は本発明の実施形態による装置38の使用方法を図示する。図6は、図5に示すスクリーニング装置のウェルのうちの1つにある開口部を図示する、一実施形態のより詳細な図を示す。溶液中の細胞60は分注装置38を用いて各ウェル44中に分注される。共通電極48は、貫通開口部58の各々に対応する複数の開口部62を備える。最初に、共通電極48を、開口部62が貫通開口部58とずれるようにシフトさせることができる。このとき、ウェル44中の溶液はチャンバー46内に流入することはないであろう。
【００５３】
図7に示すように、開口部62と貫通開口部58とが整列するように電極48を平行移動させる。これにより、ウェル44中の溶液はチャンバー46内に流入する。更に、図示するように、細胞60のうちの1つが貫通開口部58の端部に引き寄せられるように圧力差を形成させてもよい。このような圧力差は、分注チップ52から陽圧を供給することにより、および／または、チャンバー46内を真空にすることにより形成され得る。圧力の大きさは、細胞60と貫通開口部58の側面部との間に形成されるシールの種類に応じて変化し得る。例えば、細胞60と貫通開口部58の側壁との間に高抵抗シールが形成されるように、貫通開口部58の側面部は接着剤様物質を任意に含んでいてよい。そのような接着剤は図中では参照番号64により示されている。また、細胞60と貫通開口部58の側壁との間にギガシールが形成されるように、圧力差を形成させることができる。任意に、電極間に電圧差を形成させて電位差を生じさせることにより、適切なシールが形成されたか否かを確認することができる。適切なシールが形成されていない場合は、ギガシールを有していないウェルを検討から除外する。
【００５４】
図8に示すように、電極48を平行移動させて、貫通開口部58の下に伸びた細胞60の底部に穴をあけることができる。従って、一実施形態では、図9に示すように共通電極48が元の位置に戻り電圧勾配が加えられると、細胞60の内部が共通電極48と同じ電位におかれ得る。
【００５５】
本発明の任意の実施形態においては、高抵抗シールまたはギガシールにより包囲された細胞壁部分を切断して「貫入パッチ（penetrated patch）」が形成される。これは、例えばプレートに隣接して配置されたカッターを用いることにより実現することができる。当該カッターにより、ウェルの端部の下方に突き出した細胞に1つ以上の開口部 (opening) を切除または形成することができる。共通電極は、当該カッターとして機能するように構成されてもよい。細胞の内部は共通電極の１つと同じ電位に置かれ得る。あるいは、圧力または電気パルスを用いて、または、Nystatinもしくは他の抗生物質を含む開口部形成溶液を用いることにより、細胞の底部に穴を開けることができる。更に、電極48をカッターとして使用する替わりの方法として、装置38は大きな圧力パルスを用いて細胞60の底部を破壊するか、または、Nystatin溶液を用いて細胞60の底部に穴を形成させることができる。
【００５６】
図9に示す位置では、電気生理学的特性の測定を、電圧勾配を形成させて細胞膜のイオンチャネルを通過する電流を測定することにより行うことができる。このように、装置38を用いることにより、複数の細胞または細胞膜を並行して高スループットで評価することができる。測定を行った後は、プレート42を取り出して廃棄することができる。
【００５７】
図10は本発明の測定装置のいずれかに使用できるマルチウェルプレート66の一実施形態を示す。プレート66は「上」端70および「底」端72を有するプレートボディ68から構成される。該プレートボディには複数のウェルが形成されており、各ウェルは上端70において開放されている。更に、図11に示すように、各ウェル74は「底」端76を有している。底端76がガラスで構成されていながら、プレートボディがプラスチックで構成されていてよい。例えば、ガラスシートがポリスチレン製の96ウェルプレートの底部に接着されていてよい。このために、プレート66は比較的安価に製造することができ、使用後に廃棄することができる。
【００５８】
図11A〜11Fは、本発明の測定装置のいずれかに使用することができるマルチウェルプレート66の実施形態をより詳細に示す。図11Aは、図11のマルチウェルプレートのウェル74の、細部Aで示したより詳細な図を示す。図11Bは、図11Aのウェル74の、細部Bで示したより詳細な図を示す。図11Cは、図11のマルチウェルプレートのウェル74のうちの１つの断面図である。図11Dは、図11Cのウェルにある貫通開口部の、細部Dで示したより詳細な図である。図11Eは、図11Dの貫通開口部の、細部Ｅで示したより詳細な図である。
【００５９】
本発明の実施形態にしたがって、異なる幾何学的形状を有する幾つかの異なる種類の孔が用いられる。一実施形態（図11E）では、約30μmの直径を有し、その直径が狭まって直径約2〜5μmの貫通孔(through hole) 80になっている、円錐形の開口部78である。各々の底端76には、細胞を受容する開口部78が形成される。開口部78のテーパ角度および貫通孔80の大きさは、細胞の種類および平均的な細胞のサイズに応じてギガシールを最適化するために変化させてよく、例えば、テーパ角度は約１°〜90°であり得る。本発明の一実施形態では、細胞は約8μm〜80μmの平均直径を有する。別の実施形態では、細胞は約8μm〜12μm、或いは10μm〜12μmの平均直径を有する。
【００６０】
本発明の一実施形態では、貫通開口部78を形成するための１つの技術はレーザードリル法または関連する技術を用いるものである。レーザードリル法は、集束(focused)レーザーエネルギーを材料に反復してパルス照射し、貫通孔が形成されるまで層ごとに気化させる方法である。この方法により、「ポップされた（popped）」または「打撃ドリルにより穿孔された(percussion drilled)」孔として知られているものが形成される。材料および材料の厚さによっては、ポップされた孔は直径が1μmほどの小ささにもなり得る。より大きな孔（直径100μmよりも大きいもの）が必要であれば、一度材料を貫通させた後にレーザーを、所望の直径に沿って、作業している片に対して移動させることができる。最終的には、高品質の孔を作成するための迅速で効率的な方法となる。好ましくは、紫外レーザーを用いてこれらの孔を作成するのであるが、赤外レーザーを使用することもできる。更に、レーザードリル法を自動化して、孔の穴あけをより精密で正確なものにすることができる。
【００６１】
図11Fでは、プレート90にある開口部85は形状が実質的にあまり円錐形ではなく、表面に対して垂直に引いた線から数度しかずれていない。開口部85は更に、「大」端部（”large” end）86および「小」端部（”small” end）87を有しており、各々がそれぞれ異なる直径97および99を有しているという点により特徴付けられる。本発明の一実施形態では、開口部85は、大きな側86において約7〜9μm、小さな側87において約1〜3μmの直径を有する。この実施形態では、図11Fにおけるガラスプレートの厚さ91は約100μmである。
【００６２】
本発明の一実施形態では、図1に示すように、円錐形の開口部の大きい方の端部が細胞に密着し(engage)、小さい方の端部がチャンバーに向けて開放されている。本発明の他の実施形態では、大端部と小端部とが逆向きであるために開口部の小さい方の端部が細胞に密着する。
【００６３】
図12は本発明の他の実施形態を示しており、この場合は孔がカウンターボアと貫通孔との二段階で構成されている。比較的大きな（約80〜100μmの直径102を有する）開口部であるカウンターボア（または止まり穴）100は、マスクを用いて100〜120μmの厚さのガラスディスク105の途中までドリルで穿孔して、100μmの厚さのガラスに約80〜100μmの深さ101になるようにする。あるいはカウンターボア100は、マスクを用いずにドリルで穿孔される。続いて、第二の僅かに円錐形をした「貫通孔」115を、カウンターボアの穴の底に残った約15〜20μmのガラスに約2μmの直径を有するように穿孔する。この実施形態におけるレーザードリルで穿孔された孔は僅かに先細りになっており、2〜5°の角度を有する。この僅かな先細りはレーザードリル法によるものである。細胞120は、カウンターボアよりはかなり小さいが貫通孔の開口部よりは大きく、ギガシールが形成されるときは貫通孔上に位置する。
【００６４】
上述の通り、一実施形態ではカウンターボア100および貫通孔115はレーザーを用いて穿孔される。カウンターボア100のためのレーザーは193nmの波長を有しており、貫通孔115のためのレーザーは248nmの波長を有している。あるいは、レーザーはカウンターボア100および貫通孔115の両方のために約150〜300nmの波長を有する。孔を穿孔するのに用いられる波長は用いられるガラス（またはその他の材料）の種類により決定される。ガラスには248nmを充分に吸収しないものがあり、その場合は193nmのレーザーを使用することができる。他の実施形態では、カウンターボア100および貫通孔115の両方が同一の波長のレーザー（例えば248nmのレーザー）を用いて穿孔され得る。同一のレーザーを用いる場合は、異なるマスクを用いてレーザービームの直径を変えることができる。
【００６５】
図13Aは、本発明の一実施形態によるマルチウェルプレート（例えば複合96ウェルプレート）の他の実施形態の斜視図を示す。ガラスプレートまたはシート125は、複数の開口部を有する。開口部は、本明細書に記載された方法のいずれかを用いて作成することができる。プラスチック130（例えばシリコンエラストマー）の層もまたより大きな孔のアレイを有しており、それがガラスプレートに載せられているかまたは接着されていてよい。得られたガラス／プラスチック複合体は本発明の実施によるマルチウェルプレートを構成する。
【００６６】
図13Bは、試験用真空固定具（vacuum fixture）をも示す、本発明の一実施形態による、ガラスプレートおよびプラスチックシートを含むマルチウェルプレートの分解図である。図13Bはまた、真空固定具135を更に含む低部チャンバー (lower chamber) をも示す。
【００６７】
図13Cは、本発明の一実施形態によるマルチウェルプレートの１つのウェル121の拡大斜視図を示す。ウェル121は、開口部140を有するガラスプレートまたはシート125に接着されたプラスチック層130を備える。開口部140はカウンターボアおよび貫通孔からなっていてもよい。従って、ウェル121の側面部はプラスチック130からなり、ウェル121の底面部はガラスプレートまたはシート125からなる。
【００６８】
図13Dは、本発明の一実施形態による１つのウェル121の別の拡大斜視図を示す。ウェル121のこの「隠れ線表示」図は、上部開口部145と底部開口部150とを有する貫通孔をより明確に示す。この場合も、ウェル121の側面部はプラスチック130からなり、ウェル121の底面部はガラスプレートまたはシート125からなる。
【００６９】
図14は、本発明の一実施形態によるパッチクランプマイクロチャンバーの１つの実施形態を示す。該装置は細胞210を含む溶液205を受容するためのウェル200を有する。一実施形態では、ウェルは更に塩化銀で被覆された銀からなる電極215を備える。図14では該電極はプレート220上に載っているように描かれているが、本明細書において記載するように、該電極はウェルの側壁225に接続されていてもよいし、または他の実施形態では、図3に示すように液体分注システムの一部分であってもよい。図14によるパッチクランプマイクロチャンバーは更に、第二電極235とともに電気伝導性の緩衝溶液を保持するチャンバー230を備える。本発明の一実施形態では、該チャンバーの底部は開口部245を検査するための窓240を有する。開口部245は個々の細胞210を受容するので、本明細書に記載のように個々の細胞210について測定が行われる。このような測定により、細胞または細胞膜の電気生理学的特性を測定することができ、ピペットに基づくイオンチャネル記録のために設計された市販のパッチクランプ記録用電子機器（例えばAxon InstrumentsまたはHEKA Elektronikにより製造されたシステム）を用いて記録される。
【００７０】
図14について更に言及すると、パッチクランプマイクロチャンバーは、マイクロチャンバー内部の緩衝溶液の圧力を制御するための該チャンバーから延びたチューブ250をさらに備えていてよい。一実施形態では、真空源255がチューブ250を介してマイクロチャンバーに連結されておりチャンバー内部を真空にする（例えば-1〜-5 kPaまたは-1〜-2 kPa）。真空（または陰圧）により細胞が開口部245に吸引されて、ギガシールの形成を補助する。
【００７１】
他の実施形態では、同じチューブから陽圧を加える。そのような圧力差により清浄緩衝液を開口部から吹き込み、細胞が開口部に近づくまで開口部から異物(debris)を遠ざけることによって、開口部内への細胞の沈着および細胞膜と開口部222を囲む表面との間のギガシールの形成が容易になる。あるいは、細胞を添加するときに開口部を通してウェルに陽圧を加えることができる。図14には、セル電極215と235との間の比較的短い距離、および、入力シグナルを増幅して強いシグナル出力265をもたらす増幅器260もまた明示されている。
【００７２】
図14に示されるパッチクランプマイクロチャンバーは1個または複数個の細胞を受容するためのウェルを有する。一実施形態では、パッチクランプマイクロチャンバー装置のウェルの容量は最小のものであって、試験化合物の取り扱いおよび細胞の生存のための必要最小限のものである。例えばウェルの容量は約300μLであって、ウェルの底部は直径数ミクロンの開口部を有する。
【００７３】
パッチクランプマイクロチャンバーはさらに、溶液中の細胞をウェル中に入れるように構成された分注器を有する液体分注システムを備えることができる。この場合は、例えば自動ロボットを用いてウェルに細胞を供給することができる。ウェル内に位置し得る第一電極が備えられている。ウェル電極は、自動ロボットにより電極の配置および取り出しが制御されるように１つ以上の分注器と連結されていてよい。各分注器はウェルとシールを形成するためのシール部材を含んでいてよく、そうすれば各ウェルに陽圧を加えることができる。あるいは、液体分注システムはアドレス可能なウェルのアレイに液体を分注することができる。このときウェルの各々は自動液体分注システムにより独立してアドレス可能である。該ウェルは、分注システムが個々のウェルを特定して、特定のウェルに特定の細胞（または細胞型）を入れることができるようにアドレスすることができる。
【００７４】
他の実施形態では、パッチクランプマイクロチャンバーは細胞を受容するための複数のウェルを有するプレートを備える。複数のウェルを有するパッチクランプマイクロチャンバーは更に、電気伝導性緩衝溶液を保持するのに用いられる、各開口部に隣接して配置された共通チャンバーを備えていてよい。一実施形態では、共通電極が該チャンバー内に配置されているとともに、ウェル内に位置して、開口部内に細胞の細胞膜を横切って電圧勾配を形成することができる複数のウェル電極を備えている。こうして、複数の細胞または細胞膜の電気生理学的特性を同時に測定することができる。他の実施形態では、個々のウェルがそれぞれに別個のチャンバーを有している。
【００７５】
本発明の他の実施形態によれば、溶液中の細胞を各々のウェル中に入れるように構成されていてよい複数の分注器を有するマルチチャネル液体分注システムが提供される。こうして、各ウェルに、例えば自動ロボットを用いて細胞を供給することができる。本発明の一実施形態では、ウェル電極は、自動ロボットにより電極の配置および取り出しが制御されるように分注器と連結されていてよい。各分注器はウェルとシールを形成するためのシール部材を含んでいてよく、そうすれば各ウェルに陽圧を加えることができる。
【００７６】
図15は、本発明の一実施形態による、ガラスディスクを有するパッチクランプマイクロチャンバーの一実施形態を示す。該装置は細胞320を含む溶液310を受容するためのウェル300を備える。該ウェルは更に、開口部340を備えた、チャンバー350からウェルを分離するガラスディスク330を備える。電極は、例えば図14に示すような複数の方法で構成されていてよい。ガラスディスク330はマイクロチャンバーに適合し、1つ以上の開口部340を備えている。本発明の一実施形態では、ガラスディスク330はマイクロチャンバーから取り外すことができ、他のマイクロチャンバーまたはそのアレイに使用することができる。一実施形態では、真空源360がチューブ370を介して該マイクロチャンバーに接続されており、チャンバー内を真空にすることができる。このような真空により開口部340内に細胞が沈着され易くなり、高抵抗シールが形成される。
【００７７】
レーザードリルで穿孔されたガラスプレートまたはシートの開口部を囲む表面は、細胞膜とウェル中の開口部の表面との間の高抵抗シールの形成が促進されるように修飾されていてよい。このような修飾としては、限定するものではないが、ガラスプレートを加熱すること（例えばオーブンによる焼成）、開口部222を囲むプレートの表面に接着剤様物質を接着させること、または、開口部222を囲むプレートの表面に脂質を共有結合させること、が挙げられる。あるいは、ウェルに開口部を穿孔する前にプレートの表面を本明細書に記載のように修飾することができる。
【００７８】
一実施形態では、実験の前にガラス、ガラスディスク、シートまたはプレートを、例えば該ガラスの軟化温度の近くまたはその温度にまでガラスを（例えばオーブンによる焼成により）加熱することにより、加熱処理する。ガラスの軟化温度とは、ガラスが脆性固体のように振る舞うことを止めて液体のように流動し始める、ガラスが十分な粘性を喪失する温度である。例えば、ホウケイ酸ガラスは736℃の軟化温度を有しているため、加熱処理は700℃にて3〜10分間行うことができる。加熱温度および時間は更に、孔の幾何学的形状、寸法（例えばカウンターボアの深さ、貫通孔の円錐角など）、ガラスの種類、およびガラスの厚さによって変化し得る。ガラスは外部の熱源から加熱されるために、またガラスは開口部付近で最も薄いために、加熱処理は開口部を囲む表面を修飾する効果を有する。ガラスを加熱することによりギガシールの質が向上する。ある例では、図12に示されるようなレーザードリルにより穿孔されたカウンターボアおよび貫通孔を備えた実際に用いたパッチクランプマイクロチャンバーは、加熱前に抵抗を測定したところ約725MΩであった。加熱後は、抵抗値は10GΩの高い値であった。加熱処理または焼成の後、ガラスを直ちにパッチクランプ実験のためのマイクロチャンバーに組み込むことができる。
【００７９】
ガラスの軟化温度は例えば次の方法を用いて測定することができる。該方法は“http://enterprise.astm.org/PAGES/C338.htm”（参照によりその全体を援用する）において知得することができる；
１．この試験方法は、所定の許容誤差を伴う名目的には直径0.65mm、長さ235mmのガラスの丸型繊維が、その長さの上部100mmを5＋1℃／分の速度で所定の加熱炉中で加熱したときに自重により1mm／分の速度で伸長する温度を測定することによりガラスの軟化点を測定することを包含する。
【００８０】
２．この標準法は、それを使用するに際して何らかの安全上の問題がある場合にその問題点の全てを解決することを意図するものではない。適切な安全性および健康上の措置を講じることならびに使用前の規制による制限の適用を決定することは、この標準法の使用者の責任である。
【００８１】
本発明の一実施形態では、開口部を囲むプレートの表面は、該開口部を囲む側壁または表面に接着剤様の物質を塗布することにより修飾される。このことは例えば、接着剤様物質を含むリザーバ中にマルチウェルプレートの底部を浸漬し、続いて該プレートを揺らすかまたはプレートの一方の面に小さな圧力を加えることで過剰の接着剤を除去することにより行うことができる。同様に、接着剤様物質を塗布するための他の既知の技術を使用してもよい。ウェル中に分注されると、細胞は各ウェルの壁面と緊密にシールされた接触面（ギガシール）を形成して、電気生理学的特性を測定することができる。接着剤用物質としてはシリコンに基づく接着剤、ワセリン／パラフィンに基づく組成物などが挙げられる。このような接着剤用物質は好ましくは化学的に不活性なソフトグリース様の物質である。これによって貫通開口部の表面に細胞が付着してギガシールを形成することが可能になる。一実施形態では、約600メガオーム〜約1.1ギガオームの漏洩抵抗を有するシールが形成される。
【００８２】
本発明の他の実施形態では、接着剤様物質または脂質の表面コーティングを、開口部を囲む側壁または表面上に配置することができる。こうして、各細胞と各ウェルの開口部との間に高抵抗シールが形成される個々のウェル中に細胞を入れることにより、複数の細胞を同時にスクリーニングすることができる。複数のシール形成を可能にすることにより複数のシールが形成されると、電気生理学の技術を用いて複数の細胞を同時に評価する場合に高スループットなスクリーニングが容易になる。
【００８３】
図16は、本発明の一実施形態における、ガラスなどのプレート表面への脂質の共有結合による連結を示す。細胞膜は脂質二重層を含む。脂質二重層の両方の層はリン脂質分子から成っており、各々は極性の「頭部」と非極性の「尾部」とを有している。水中では、リン脂質分子はその極性頭部が周囲の水性環境に面し、第二層の極性末端は細胞質ゾルの水性環境に曝されるように整列している。各層の非極性末端は接触しており、細胞膜の「内部」を構成している。
【００８４】
表面へのリン脂質層の結合は、共有結合または非共有結合により達成することができる。例えば、ガラス表面を官能化することができ；例えば当業者に既知の方法を用いてシリカおよびガラス表面にアミノ-シラン部分を連結することにより反応性を付与することができる。
【００８５】
修飾された表面に共有結合するのに好適な種々の官能基を有する脂質は、例えばAvanti Polar Lipids, Inc.から市販されている。本発明のある側面では、本発明における修飾された表面に結合させるために、このような官能基化された脂質を使用することができる。例えば表面上に固定された分子に官能基化された分子を共有結合させる方法は当業者に知られている。
【００８６】
本発明の一実施形態では、好適な脂質上の好適な相補的官能基として、求核基および炭素求電子基が挙げられる。「求核基」および「求電子基」の用語は、合成および／または物理有機化学における通常の意味を有する。炭素求電子基としては、炭素自体よりも大きなポーリングの電気陰性度を有する任意の原子または基により置換された1種以上のアルキル、アルケニル、アルキニルまたは芳香族（sp3、sp2、またはsp-混成）炭素原子が挙げられる。好ましい炭素求電子基の例としては、限定されるものではないが、カルボニル（特にアルデヒドおよびケトン）、オキシム、ヒドラゾン、エポキシド、アジリジン、アルキルハライド、アルケニルハライド、およびアリールハライド、アシル、スルホナート（アリール、アルキルなど）が挙げられる。炭素求電子基の他の例としては電子吸引性基と電子的に共役した不飽和炭素が挙げられ、例えばα,β-不飽和ケトン中のβ-炭素またはフッ素置換されたアリール基中の炭素原子である。一般的に、炭素求電子基は炭素求核基を含む相補的な求核基による攻撃を受けやすい。その場合、求核基と求電子基との間に新しい共有結合が形成されるように、攻撃性の求核基が炭素求電子基に電子対を付与する。
【００８７】
本発明の一実施形態では、好適な炭素求電子基として、カルボニル、エポキシド、アジリジン、環状硫酸塩およびスルファミド酸塩(sulfamidates)、ならびにアルキルハライド、ビニルハライドおよびアリールハライドが挙げられる。本発明のある一実施形態では、好適な求核基として、第一級および第二級アミン、チオール、チオール酸、およびチオエーテル、アルコール、アルコキシドが挙げられる。これらの求核基は、好ましい炭素求電子基と組み合わせて用いた場合に、典型的にはホーミングペプチド (homing peptides)とスカフォールド (scaffold) との間にヘテロ原子結合（C-X-C）（ここで、Xは酸素または窒素のようなヘテロ原子である）を形成する。
【００８８】
本発明の他の実施形態では、リン脂質が、光により活性化されたときにガラスプレートまたは他の基材と結合するのに好適な光反応性(photolabile)の官能基を含んでいてよい。
【００８９】
アミンまたは活性化されたカルボニル官能基（例えばN-ヒドロキシスクシニル（NHS）エステル）を有するリン脂質は、相補的な官能基を有する表面に連結され得る。例えば、アミンを有する脂質はNHSエステル基を有する表面と、アミド結合を形成しつつ反応するであろう。同様にして、NHSエステルを有する脂質はアミンを有する脂質と、この場合もまた同時にアミド結合を形成しつつ、反応するであろう。相補的な官能基の置換(permutation)の選択は、細胞型、他の成分の存在などの実際の実験条件に依存する。本発明の１つの有利な形態は、パートナーを連結するためのモジュールアプローチである。共有結合を形成することができる他の相補的な炭素求電子基および求核基を当業者は想定することができ、それらは本発明の範囲に属する。例えば、チオール（-SH）官能基を有するリン脂質は、チオール（-SH）を有する表面にもジスルフィド結合の形成により連結され得る。
【００９０】
図16について更に言及するが、ガラス表面600は、既知の方法を用いてアミノシラン620により官能基化され得る水酸基610を有している。当該技術分野で知られた他の方法によって他の反応性基をガラス表面に固定化することができる。官能基化された脂質に連結するのに好適な他の官能基化されたガラス表面は、アルデヒド、エポキシド、マレイミド、ニッケルキレート、ストレプトアビジン、ビオチン、チオールなどを含む。
【００９１】
図16に示されるアミノシランは5つの-CH2-基を有する炭化水素リンカーを有するが、当業者は実際のリンカーの長さは変化し得ることを理解するであろう。図16では、アミノシランの末端は、相補的な求電子官能基650を有する脂質分子640に共有結合するのに好適なアミノ基630である。結果として起こる連結により新しい共有結合660が生じる。この表面の化学反応により、ガラス表面上で脂質分子が高密度になる。
【００９２】
図17は、本発明の一実施形態による、パッチクランプ装置における開口部720を囲む表面710への脂質分子700の共有結合を示す。この実施形態では、各脂質分子の一方の末端が表面に付着しており、他方の末端は細胞膜と自由に相互作用できるようになっている。本発明の一実施形態では、そのような共有結合により結合された層が膜になっていてもよい。こうして、表面と細胞との間にギガシールが形成される。
【００９３】
孔を囲む表面にリン脂質を選択的に結合することができる。本発明の一実施形態では、脂質を共有結合する前にプレートまたは基材に孔をレーザードリルにより穿孔することができる。次に、光反応性の官能基を用いて脂質を選択的に連結することができる。プレートまたはディスクの他の領域は光マスクすることができる。
【００９４】
液体による化学的処理を用いて細胞膜のポリマー表面に対する親和性を高めることもできる。一例は苛性ソーダ溶液への曝露である。アルカリ溶液はポリマーの表面においてエステル基を加水分解して濡れ性を高めると共に、荷電した二極性脂質膜に対する表面の親和性をも高める。
【００９５】
本明細書に開示されるパッチクランプ装置の種々の実施形態には、圧力制御システムが含まれる。図18AおよびBは、例えば圧力制御システムを用いる、本発明の一実施形態によるギガシールの形成を示す。ガラスプレート800は開口部810を備えている。該開口部の幾何学的形状は本明細書に開示されたいずれのタイプのものであってもよい。上部チャンバーを細胞を含む溶液840で満たしながら底部チャンバーに陽圧820を加える。特定のいかなる理論にも束縛されることなく、そのような条件は、孔から細胞を含有するウェルに向かって外向き830に発散される、清浄細胞内液の膨張領域または「バブル(bubble)」を形成する効果を有する。微小流体の特性(micro fluidic properties) がある場合は、清浄流体の膨張バブルが乱れることなく形成される。実験によれば、清浄液体は、その後細胞が開口部に密着したときに起こるギガシールの形成に影響を与えることなく、孔を通って流動できることが示された。
【００９６】
通常の健常細胞は死細胞または罹患細胞よりも高いタンパク質含量を有しているので、細胞破片および死細胞よりも密度が高い。健常細胞はより高密度であるから、死細胞または罹患細胞よりも速く沈む。健常細胞とほぼ同じ程度に高密度であってよい細胞の凝集塊は、健常または「良好な(good)」単一の細胞よりも、重量に対する流体力学的抗力の比が大きく、これもまたよりゆっくりと沈む傾向がある。清浄液体830のバブルが膨張することにより、細胞破片および細胞凝集塊は「良好な」細胞よりもより遠くに運び去られる。したがって、「バブル」は、細胞の集合が底に沈む間に、細胞破片および細胞塊を「良好な」細胞よりも孔からより遠くに運び去ることができる。
【００９７】
適当な構成が確立されたのちに（図18B）、吸引または陰圧850を加えて、清浄液体の「バブル」をしぼませる。バブルがしぼむにつれて、「良好な」細胞860が細胞破片および細胞塊よりも先に孔に吸引される。こうして、ギガシールが確実に形成され、「良好な」細胞はバブル860の内側に留まる。一方で、死細胞または罹患細胞および細胞破片はバブル850の外側に留まる。
【００９８】
次の段階的なプロトコールは、本明細書に開示されるパッチクランプ装置のいずれかを用いて確実にギガシールを形成するために使用することができるプロトコールの例である。第一にパッチクランプチャンバーを装着し、電極を適切に組み込む。第二に、約100μLの細胞を5百万個／mLにて上部ウェルに分注する。ここで該ウェルには予め約10μLのリンガー溶液（ピペットの内部の溶液）が加えてある。第三に、圧力を底部チャンバーに加える。一実施形態では、10mLのシリンジを用いて圧力を加える。このシリンジを10mLから5mLに圧縮すると約14psiの圧力になる。次にプランジャーを開放する。プランジャーは一般的に、約0.3psiである9.8mLにまでゆっくりと戻る。第四に、1分間待つ。これまでの実験により細胞は一般的に1分間で落ち着くことが示されていることから、1分間が待つ時間の長さの好適な例である。第五に、-5kPaの圧力にて吸引を行う。
【００９９】
上記の手順およびパラメーターは特定の細胞および他の実験上の可変条件に合わせて最適化してよい。ギガシール形成の高い成功率はこの手順により達成することができ；80％の全体的な成功率が達成できる。他の実施形態では、本発明の装置および技術により、マルチウェルプレートのウェル中で細胞と開口部との間にギガシールが形成され易くなる。
【０１００】
本発明は更にイオンチャネルアッセイのスクリーニングを自動化するための方法を提供し、多くの化合物および多くの細胞を一度に並行して処理することを可能にする。本発明は例えばCHO、Jurkat、HEK、およびhERGである天然の細胞系を利用することができる。本発明は、スループットが高められた同一の実験において、複数の標的に対して同一の化合物をスクリーニングすることを可能にする。
【０１０１】
マルチチャンネルにより、複数の標的イオンチャネルに対して同一の薬物分子を同一の実験においてスクリーニングすることが可能となる。薬物発見用ツールとして用いた場合、本発明を用いて薬物がイオンチャネルの良好なモジュレーターであるか否かを決定することができる。本発明は最大限の柔軟性と各ウェルの構成成分の制御を可能にする。該装置では、細胞型、薬物候補物質、緩衝液、イオン濃度などの各ウェルの成分が、行おうとしている実験に応じて異なっていてもよい。
【０１０２】
本発明は、イオンチャネルを「バイオセンサー」として使用することを可能にする。薬物は、開閉型イオンチャネルに直接作用する以外に、細胞内の他の分子標的に作用することができ、また、イオンチャネル活性に作用することができる。本明細書で開示された装置および方法を用いた電気生理学的特性の測定により観察される効果は、薬物活性の機構と相関している場合が有るとともに、例えば特定の薬物の有効性などのように薬物の濃度という観点から定量化できる場合がある。このような正確な測定は、薬物の候補をお互いに比較または区別する場合に有用である。
【０１０３】
本発明の一実施形態では、特定のイオンチャネルの速度論的挙動を変化させる細胞内のタンパク質キナーゼおよびホスファターゼの薬物誘発調節を、本明細書で開示される装置および方法を用いる高度に正確な電気生理学的アッセイにより検出し記録することができる。更に、幾つかの細胞系を用いて、特定のキナーゼ、ホスファターゼに対する同一の薬物の影響、イオンチャネルのリン酸化反応、およびチャネル自体に対する薬物の影響を評価することができる。
【０１０４】
他の実施形態では、該装置を用いて正確なpH変化を測定することができる。プロトン開閉型（proton-gated）イオンチャネルはプロトン(H+、または代わりにヒドロニウムイオン(H3+O))のみに対して選択的である。このようなプロトン選択的イオンチャネルは天然のpHメーターである。なぜなら、異なるイオン濃度を有する2種類の溶液をイオンチャネルのような選択性膜で分離した場合、濃度を電位差として測定することができるからである。更にまた、このような差異が存在する場合、イオンは不均衡を解消するように移動するであろう。この流動はイオン電流として観察することができる。
【０１０５】
ある市販されているpHメーターは、使用している半透性ガラス膜が他のイオン例えばナトリウムイオン（Na+）により干渉を受けるので、正確さに欠ける。プロトンイオンチャネルはプロトンに対して選択的であるので、イオンチャネルに基づくpHメーターは当該技術分野における既存の状況を改善するものである。このように本発明は、微小な生理機能測定器の代替物として働くことができる。
【０１０６】
本発明の他の実施形態では、本明細書に開示される装置および方法を用いて薬物発見のための「プロトンバイオセンサー」を構築することができる。特定の薬物が細胞内に導入されると細胞内のpHが変化することがある。更に他の実施形態では、該装置自体が、例えば薬物が細胞膜を通過できない場合に、pHメーターとして機能し得る。この場合は、測定されたpH変化はウェル中の溶液のpHに対応する。
【０１０７】
本発明の1回の実験からの電気生理学的情報の出力は、本質的に同時に記録された複数のパラメーターを包含し得る。本発明の技術はまた、細胞の細胞質を透析することを可能にする。それにより、細胞内液から特定のイオンを導入または除去して細胞内液の組成を調節することが可能となる。この方法により、実験で細胞の細胞質を透析して、他の種類のチャネルを排除しながらチャネルのうちの1種類を評価することができる。これにより１つのチャネルを、他を排除しながら最適化できる。更に、電気生理学的方法は高度な選択性を有しており、単一のチャネル分子の活性を記録することが可能である。本発明の技術はまた、高度な時間的分解能（ミリ秒以下の範囲）を有しており、すぐに失活するNaチャネルのような幾つかのイオンチャネルの標的に対して有用である。
【０１０８】
イオンチャネルを通過するイオン電流は数ピコアンペア（pA）のオーダーであるから、正確に測定するのが困難である。本発明の一実施形態では、セル電極と増幅器との間の距離を比較的短く（例えば数ミリメートル）することにより電気的なノイズのピックアップを最小化する。本発明の一実施形態では、ウェルの内部の電極をチップに接続させるのに必要十分な距離である。こうして、チップに基づく増幅器はpAの信号をmVの信号に明晰に変換することができる。共通のマルチチャンネルデータ収集ボードはこの信号を困難なく収集することができる。
【０１０９】
更に他の側面では、各ウェルについて電圧値および／または電流値を測定するための電子回路が提供される。液体分注システムおよび該電子回路の操作を制御するためのコントローラもまた提供される。更に、電圧勾配を形成するために共通電極に電圧源が接続される。
【０１１０】
別の実施形態では、本発明は複数の細胞のイオンチャネルを通過する電流を測定する方法を提供する。この方法は、それぞれ端部を有する複数のウェルを備えたプレートを利用する。ウェルのうち少なくとも一部のウェルは端部に開口部が形成されており、チャンバーはプレートの下方に配置され、かつ電解質溶液で満たされている。共通電極もチャンバー内に配置されている。このような構成で細胞をウェル内の溶液中に分注する。ウェルとチャンバーとの間に圧力差を設けることで細胞を開口部に集めて、細胞とウェルの端部との間に高抵抗シールを生じさせる。各ウェル内に位置する共通電極とウェル電極の間に電位差を設ける。開口部内に位置する細胞または細胞膜から電気生理学的特性の測定値を得る。このように、複数の細胞を平行して評価することで高スループットスクリーニングシステムを作り出すことができる。あるいは、細胞をチャンバー内に沈着させ、次いで細胞のほんの一部分が開口部内にあるように開口部内に引き入れる。次いでチャンバー内に伸びている細胞の一部分を貫通して、先に記載したようにして測定値を得ることができる。
【０１１１】
本発明はさらに、細胞のイオンチャネルを通過する電流を測定する方法を提供する。この方法は、端部と、ウェルの端部を貫通する開口部を形成する端部内の側壁とを有する少なくとも１つのウェルを利用する。接着剤様物質を開口部の側壁上に配置し、１つ以上の細胞を開口部内に沈着させる。細胞と開口部を形成する側壁との間に高抵抗シールを形成するために接着剤を使用する。次に細胞膜を横切って電位差を形成させ、電圧および／または電流の測定値を収集して記録する。こうして、かかる方法により、電気生理学的測定を正確なものにするのに十分な高抵抗シールが形成される。更に、そのような技術により、シリコンおよび窒化物ではなくプラスチックまたはガラスにより構築された単純で安価なマルチウェルプレート、またはガラス製の多目的プレートを使用することができる。
【０１１２】
スクリーニング実験を行うための手順の一例は標的イオンチャネルを細胞系で発現させることである。測定される必要が有るのはウェルあたり1個の細胞のみであるが、各ウェルはこれらの細胞のうちの数個を受容するように構成される。プレートは細胞内液を有するチャンバー上に置かれる。該チャンバー中に配置される共通電極は、溶液が各ウェルから下方に流れることができるように移動することができる金属プレートから成っていてよい。更に、1つ以上の共通電極を使用できるということが理解されるであろう。例えば２つまたは３つの共通電極を使用することができる。僅かな圧力を各ウェルに加えるか、または真空にすることにより、細胞が貫通開口部を塞ぐことができ、それにより開口部を封鎖することができる。かかる手順では、細胞が各ウェルの端部の孔と高抵抗シールを形成できるようになるには約1〜3分間かかるだろう。
【０１１３】
次に該金属プレートを移動させて戻して、加えられた圧力により各ウェルを通り抜けた、細胞の下部分に穴を開けることができる。あるいは、圧力パルスまたは穴あけ溶液(perforation solution)を用いて細胞に穴を開けることができる。他の代替方法としては、エレクトロポーレーションにより細胞を貫通させることができる。細胞の下部分に穴を開けたら、システムは電気生理学的特性を高スループットに記録できる状態にある。
【０１１４】
適切なシールが形成された場合、約-70mVの電圧差の電圧が、細胞内電極（金属プレートからなる共通電極）とウェル中に配置された各々のニードルとの間に形成される。この例では、基準を細胞の外部に定義しているので電圧は負である。
【０１１５】
測定値を収集する前に、各ウェルを試験してシールが形成されているか否かを決定することができる。形成されていなければ、そのウェルを「悪い」シールを有する（ギガシールを有しない）ウェルであると標識して以降の検討から除外することができる。実験のあいだにプレートを複数回試験してシール形成の安定性を再度確認することができる。小さな過分極パルスを細胞膜に与えて各ウェルを試験することができる。ギガシールを有さないウェルを以降の検討から除外することにより、リガンドは「上出来の」ウェルのみに適用されるのでリガンドが効果的に節約される。
【０１１６】
続いて、通常のパッチクランプ用電子機器を用いて1個の細胞の電圧および電流の測定値を収集し記録することができる。記録されたデータは貯蔵され、試験化合物の有効性を判断するために評価される。更に、細胞を高スループットに評価することができる。
【０１１７】
図19Aおよび19Bは、本発明の一実施形態による、イオン電流を測定するためにSQUIDを使用する２つの方法を示す。SQUIDは高感度を有する磁場センサーである。SQUIDは「超伝導量子干渉デバイス (Superconducting Quantum Interference Device)」の略語である。SQUIDを用いると、磁場の小さな変化を高い精度をもって非常に高感度に測定することができる。SQUIDの改良型もまた、磁場勾配、電圧、電流、および磁化率の測定に好適である。
【０１１８】
SQUIDの出力電圧は加えられた磁束の関数として正弦波的である。従って、その挙動は非線形であり周期的である。１周期は磁場量子Φと一致し、ここでΦ0= 2 x 10-15Wbである。電流から磁束への変換機として入力コイルを用いると、非常に高感度の電流の増幅を行うことができる。SQUIDの感度を高めるためのその他の方法は、複数のSQUIDを直列して使用することである。n個のSQUIDを位相を合わせて作動させると、出力電圧はnに比例して増大するが、SQUIDのノイズはnの平方根に比例してより遅れて増大する。
【０１１９】
本発明の一実施形態によるSQUIDの使用方法の１つは、イオンチャネルにより発生された電流をワイヤーに通過させて、それによって図19Bに示すようにSQUIDが検出する磁場を発生させることである。かかる検出器は電流の測定と電圧刺激(voltage stimulation)とをデカップリングできるという利点を有する。空圧式電気スイッチを用いて、余計な電気的なノイズを伴うことなく自動的に検出器を異なる細胞に切り替えることができる。記録装置を用いて複数のウェルを順次記録することによるなどして、多重化が実現できる。多重化とは、複数のソースに切り替えて測定値を順次サンプリングすることができるインプットを使用することを表すのに用いられる用語である。各記録装置は1個のウェルから読み取ることができる。更に、複数の記録装置により並行して多重化を行うことができる。
【０１２０】
更に、ノイズを抑えた接続のために、整列した空圧式シリンダーを用いてケーブルを適当なソケット中に機械的に差し込むことができる。検出装置とは遠く離れたところで、圧縮空気を切り替える。スイッチの場所は、ケーブルの長さを最小化するために、またケーブルのキャパシタンスおよびインダクタンスを最小化するためにも、細胞のごく近くにすることができる。
【０１２１】
本発明の一実施形態では、SQUIDを使用する他の方法は、チャネルが活性であるときに磁場を測定することである。SQUIDセンサーは、細胞の付近に置かれたときに、イオンチャネルの電流が形成する微弱な磁場を感知することができる。一実施形態では、図19Aに示すように、細胞またはSQUIDセンサーを保持する砂時計型のキャピラリーが、平らな基材またはプレート上の開口部を取り囲む。
【０１２２】
図19Aでは、SQUID装置400が、開口部420、すなわちイオン電流の経路、を取り囲むループ410により磁束の変化を検出するように構成されている。この実施形態では、SQUID装置は、2つの電極430および440ならびに測定装置450を有する回路とは独立して機能する。
【０１２３】
図19Bは、ワイヤー520を取り囲むループ510により磁束の変化を検出するように構成されているSQUID装置500を示す。本発明のこの実施形態では、SQUID装置はイオンチャネルおよび／または細胞チャンバーから物理的に切り離すことができる信号を検出する。
【０１２４】
本明細書中の方法について描写したステップは、描写および／または言及したものとは異なる順序で行うことができる。本明細書中のステップは、ステップを行い得る順序の例示に過ぎない。本明細書中のステップは所望の任意の順序で行うことができ、そのような場合であってもなお特許請求に係る発明の目的は達成される。更に、使用することが所望されないステップは、本発明の方法中のステップから取り除くことができ、そのような場合であってもなお特許請求に係る発明の目的は達成される。
【０１２５】
本明細書中に記載されている全ての特許および刊行物は、各々の特許または刊行物を個別具体的に参照により援用しようとする場合と同程度に、参照により本明細書に援用される。
【０１２６】
当業者であれば、本発明が、それらに固有のものだけでなく、記載した目的の達成ならびに結果および技術上の利点の獲得のためによく適合されているということを理解するであろう。好ましい実施形態のうちの現時点での代表例として本明細書に記載された特定のシステムおよび方法は例示であり、本発明の範囲を限定することを意図してはいない。糖得業者は、特許請求の範囲により規定される本発明の精神の範囲内に包含されるそれらの変更および他の使用を想到し得るであろう。
【０１２７】
本発明の範囲および精神から逸脱することなく本明細書に開示された発明に修飾を加え得るということは、当業者にとって一見して明らかであろう。本明細書中で好適なものとして説明のために記載された発明は、本明細書では具体的には開示していない任意の因子および限定の不存在下で実施してもよい。用いられている用語および表現は既述のための用語として用いられているのであり限定のためではなく、そのような用語および表現を使用するときに図示または記載された構成またはそれらの一部分のあらゆる等価物を排除する意図はないが、特許請求に係る発明の範囲内で種々の修飾が可能であることは認められる。このように、本発明は好ましい実施形態および最適な構成により具体的に開示されているものの、当業者は本明細書に開示された概念を修飾および変更するという手段をとることができるということ、ならびに、そのような修飾および変更が添付の特許請求の範囲により規定される本発明の範囲内にあると認められることを理解されたい。
【０１２８】
加えて、本発明の構成または態様がマーカッシュグループまたは他の選択肢のグループの形で記載されている場合は、当業者は、それによって本発明が、マーカッシュグループまたは他のグループの個々のメンバーまたはメンバーのサブグループにより記載されているということを認識するであろう。例えば、選択肢Ａ、ＢおよびＣが存在するのであれば、次の可能性が全て包含される：Ａのみ、Ｂのみ、Ｃのみ、ＡとＢ、ＡとＣ、ＢとＣ、および、ＡとＢとＣ。
【０１２９】
このように、本発明の範囲および添付の特許請求の範囲の中に、更なる実施形態が存在する。
【図面の簡単な説明】
【０１３０】
【図１】本発明の一実施形態による電気生理学的特性を測定するための装置を示す図である。
【図２】本発明の一実施形態による高スループットスクリーニング装置の正面斜視図である。
【図３】図２のスクリーニング装置の断面概略図である。
【図４】図３のスクリーニング装置と組み合わせて使用されるマルチウェルプレートの正面斜視図である。
【図５】本発明の一実施形態による電気生理学的測定装置の他の実施形態を示す図である。
【図６】図５のスクリーニング装置のウェルのうちの１つにある開口部のより詳細な図である。
【図７】本発明の一実施形態による、開口部に細胞が引き込まれた後の図６のスクリーニング装置を示す図である。
【図８】本発明の一実施形態による、貫通開口部を塞ぐ細胞の一部分を切除するように平行移動した共通電極を示す図である。
【図９】本発明の一実施形態による、電気物理学的特性の測定を行うことができる元の位置に戻ったときの共通電極を示す図である。
【図１０】本発明の一実施形態による、高スループットスクリーニング装置に使用することができるマルチウェルプレートの一実施形態の上部斜視図である。
【図１１】図１１は、図１０のマルチウェルプレートの平面図である。
【図１１Ａ】図１１Ａは図１１で示されるマルチウェルプレートの１つのウェルの、細部Ａを抜き出したより詳細な図である。
【図１１Ｂ】図１１Ｂは図１１Ａで示されるウェルの、細部Ｂを抜き出したより詳細な図である。
【図１１Ｃ】図１１Ｃは図１１で示されるマルチウェルプレートのウェルのうちの１つの断面図である。
【図１１Ｄ】図１１Ｄは図１１Ｃで示されるウェルにある貫通開口部の、細部Ｄを抜き出したより詳細な図である。
【図１１Ｅ】図１１Ｅは図１１Ｄで示される貫通開口部の、細部Ｅを抜き出したより詳細な図である。
【図１１Ｆ】図１１Ｆは図１１Ｅの形態よりも実質的により円錐形でないプレート中の貫通開口部の他の実施形態を示す図である。
【図１２】カウンターボアと貫通孔とからなる二段階の開口部を示す図である。
【図１３Ａ】図１３Ａは、本発明の一実施形態によるマルチウェルプレートの他の実施形態の斜視図である。
【図１３Ｂ】図１３Ｂは、試験用真空固定具（vacuum fixture）をも示す、本発明の一実施形態による、ガラスプレートおよびプラスチックシートを含むマルチウェルプレートの分解組立図である。
【図１３Ｃ】図１３Ｃは、本発明の一実施形態によるマルチウェルプレートの１つのウェルの拡大斜視図である。
【図１３Ｄ】図１３Ｄは、本発明の一実施形態による１つのウェルの他の拡大斜視図である。
【図１４】本発明の一実施形態によるパッチクランプマイクロチャンバーを示す図である。
【図１５】本発明の一実施形態によるガラスディスクを有するパッチクランプマイクロチャンバーを示す図である。
【図１６】本発明の一実施形態による、プレート表面への脂質の共有結合による連結を示す図である。
【図１７】本発明の一実施形態による、パッチクランプ装置における開口部付近の脂質分子の結合を示す図である。
【図１８Ａ】図１８Ａは本発明の一実施形態によるギガシールの形成を示す図である。
【図１８Ｂ】図１８Ｂは本発明の他の実施形態によるギガシールの形成を示す図である。
【図１９Ａ】図１９Ａは本発明の一実施形態によるSQUID検出器を有するパッチクランプ装置を示す図である。
【図１９Ｂ】図１９Ｂは本発明の他の実施形態によるSQUID検出器を有するパッチクランプ装置を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１１Ｄ】
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【図１１Ｅ】
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【図１１Ｆ】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１３Ｄ】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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2004528539.tif 000188
【国際調査報告】
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2004528539.tif 000190
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