(57)【要約】本明細書には、新規な蛍光誘導体試薬が記載されている。この試薬は、アルデヒドまたはケトン官能基を含む生体分子に結合するのに適している。本明細書にはまた、誘導体試薬でサンプルを処理する方法が記載されている。この試薬は、詳細には、電気泳動ゲルにおいて、糖タンパク質（グリコプロテイン）（ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ）または糖ペプチド（グリコペプチド）（ｇｌｙｃｏｐｅｐｔｉｄｅ）、核酸およびリポポリサッカライド（リポ多糖類）（ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）を標識するために有用である。
2004510767.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の式の化合物
【化１】
2004510767.tif 000029
であって、ここで、置換基Ｒ１およびＲ２は、組み合わせる場合に、５または６員環芳香族環を含む第１の芳香族環系を形成し、該第１の芳香族環系は、必要に応じて１以上のヘテロ原子Ｎ、Ｏ、またはＳを組み込み、そして必要に応じて１または２のさらなる縮合芳香族環を組み込み、該縮合芳香族環は、各々、必要に応じて１以上のヘテロ原子を組み込み；該第１の芳香族環系は、必要に応じて、ハロゲン、Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−６アルコキシ、Ｃ１−６ペルフルオロアルキル、Ｃ１−６アルキルアミノ、Ｃ２−１２ジアルキルアミノ、スルホ、カルボキシ、ヒドロキシ、アミノ、ニトロ、シアノ、アリール、またはそれらの任意の組合せ、あるいは共有結合した反応性基−Ｌ−Ｚによって置換され；かつ
置換基Ｒ３およびＲ４は、組み合わせられる場合、５または６員環芳香族環を含む第２の芳香族環系を形成し、該第２の芳香族環系は、必要に応じて１〜３のさらなるヘテロ原子Ｎ、Ｏ、またはＳ、あるいはオキソ、チオオキソ、スルホン、またはアミノ官能基
を組み込み、そして必要に応じて１または２のさらなる縮合芳香族環を組み込み、該縮合芳香族環自体は、前述のように、必要に応じて１以上のヘテロ原子を組み込み、該第２の芳香族環系は、独立して、必要に応じて、ハロゲン、Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−６アルコキシ、Ｃ１−６ペルフルオロアルキル、Ｃ１−６アルキルアミノ、Ｃ２−１２ジアルキルアミノ、スルホ、カルボキシ、ヒドロキシ、アミノ、ニトロ、シアノ、アリール、またはそれらの任意の組合せ、あるいは共有結合した反応性基−Ｌ−Ｚによって置換され；
あるいは、Ｒ２およびＲ３は、組み合わせる場合に、該第１および第２の芳香族環系に二重に縮合するさらなる５または６員環の架橋環を形成し、該架橋環は、飽和または不飽和の炭素−炭素結合における炭素原子の組合せを含み、そして必要に応じて、Ｏ、ＮまたはＳ原子の１つを含み、該架橋環の該炭素および窒素原子は、必要に応じてＣ１−６アルキルによって、または−Ｌ−Ｚによって置換され；ここで、
各Ｌは、独立して、Ｃ、Ｎ、Ｏ、ＰおよびＳからなる群から選択される１〜２０の非水素原子を有する共有単結合、または共有結合連結であり、ここで、安定な化学結合の組合せは、必要に応じて、炭素−炭素結合、炭素−窒素結合、窒素−窒素結合、炭素−酸素結合、炭素−イオウ結合、リン−酸素結合、リン−窒素結合、またはそれらの組合せである、単結合、芳香族結合またはヘテロ芳香族結合を含み、
各Ｚは、独立して、アルデヒドまたはケトンと反応し共有結合を形成し得る官能基であり、
ＸはＯＨまたは−ＮＨ−Ｑ−Ｒ５であり、ここで
Ｑ部分は、電子吸引性結合基である安定な二価のラジカルであり；
Ｒ５は、Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−６アルコキシ、Ｃ１−６アルキルアミノまたは−Ｌ−Ｚである、
化合物。
【請求項２】
前記第１の芳香族環系が縮合環を含まない、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
前記第２の芳香族環系が２つの縮合環を含む、請求項１に記載の化合物。
【請求項４】
前記第１の芳香族環系が縮合環を含まない、請求項３に記載の化合物。
【請求項５】
前記第１および第２の芳香族環系上の前記置換基が、独立して、独立して同じかまたは異なる、Ｈ、ハロゲン、アルコキシ、イオウ、または１以上の−Ｌ−Ｚである、請求項４に記載の化合物。
【請求項６】
前記第２の芳香族環系上の前記唯一の非水素置換基が、−Ｌ−Ｚである、請求項５に記載の化合物。
【請求項７】
前記第２の芳香族環系上の前記唯一の非水素置換基が、Ｆ、ＣｌまたはＢｒであるハロゲンである、請求項５に記載の化合物。
【請求項８】
前記第１の芳香族環系上の前記置換基が、水素、ハロゲン、イオウ、または−Ｌ−Ｚである、請求項５に記載の化合物。
【請求項９】
Ｘが−ＮＨ−ＱＲ５であり、かつ該Ｑ部分が、カルボニル（−（Ｃ＝Ｏ）−）、チオカルボニル（−（Ｃ＝Ｓ）−）、スルホニル（−（ＳＯ２）−）またはホスホリル（−（ＰＯ２）−）である電子吸引性結合基である、請求項４に記載の化合物。
【請求項１０】
Ｘが、−ＮＨ−ＱＲ５であり、かつ該Ｑ部分が、カルボニル（−（Ｃ＝Ｏ）−）、チオカルボニル（−（Ｃ＝Ｓ）−）、またはスルホニル（−（ＳＯ２）−）である電子吸引性結合基である、請求項５に記載の化合物。
【請求項１１】
Ｒ５は−Ｌ−Ｚであり、ここで、Ｌは単結合であるか、あるいはＬは、置換または非置換のポリメチレン、アリーレン、アルキルアリーレン、アリーレンアルキル、またはアリールチオ共有結合である、請求項１０に記載の化合物。
【請求項１２】
Ｌは単結合であるか、あるいはＬは、Ｃ３−６ペルフルオロアルキルであるポリメチレン結合であるか、またはフェニレンであるアリーレン結合であり、かつＺは、カルボニルヒドラジド、ヒドラジド、スルホニルヒドラジドまたはチオカルボニルヒドラジドである、請求項１１に記載の化合物。
【請求項１３】
Ｘは−ＮＨ−Ｑ−Ｒ５であり、かつＲ５は−Ｌ−Ｚであり、ここで、Ｚは−ＮＲ６−ＮＨ２（ヒドラジド）、−ＮＲ６（Ｃ＝Ｏ）ＮＲ７ＮＨ２（セミカルバジド）、−ＮＲ６（Ｃ＝Ｓ）ＮＲ７ＮＨ２（チオセミカルバジド）、−（Ｃ＝Ｏ）ＮＲ６ＮＨ２（カルボニルヒドラジド）、−（Ｃ＝Ｓ）ＮＲ６ＮＨ２（チオカルボニルヒドラジド）、−（ＳＯ２）ＮＲ６ＮＨ２（スルホニルヒドラジド）、−ＮＲ６ＮＲ７（Ｃ＝Ｏ）ＮＲ８ＮＨ２（カルバジド）、−ＮＲ６ＮＲ７（Ｃ＝Ｓ）ＮＲ８ＮＨ２（チオカルバジド）または−Ｏ−ＮＨ２（ヒドロキシルアミン）であり、ここで、各Ｒ６、Ｒ７およびＲ８は独立してＨまたはＣ１−６アルキルである、請求項５に記載の化合物。
【請求項１４】
Ｌは単結合であるか、あるいはＬは、Ｃ３−６ペルフルオロアルキルであるポリメチレン結合であるか、またはフェニレンであるアリーレン結合であり、かつＺは、カルボニルヒドラジド、ヒドラジド、スルホニルヒドラジドまたはチオカルボニルヒドラジドであり、Ｒ６は、Ｈである、請求項１３に記載の化合物。
【請求項１５】
前記第２の芳香族環系上にただ１つの非水素置換基があり、該第２の芳香族環系上の該非水素置換基は、Ｆ、ＣｌまたはＢｒであるハロゲンである、請求項１４に記載の化合物。
【請求項１６】
前記第１の芳香族環系上にただ１つの非水素置換基かあり、該第１の芳香族環系上の該非水素置換基は、スルホ、Ｆ、ＣｌまたはＢｒであるハロゲン、および第２の−Ｌ−Ｚから選択され、該第２の−Ｌ−Ｚについて、Ｌは、共有単結合であり、かつＺはカルボニルヒドラジドまたはスルホニルヒドラジドである、請求項１５に記載の化合物。
【請求項１７】
式の化合物：
【化２】
2004510767.tif 000030
であって、Ｑは、カルボニル、チオカルボニル、またはスルホニルであり、かつＲ５は、−Ｌ−Ｚであり；Ｌは、アリーレン、Ｃ１−６ペルフルオロアルキル、または共有単結合であり；かつＺは、カルボニルヒドラジド、ヒドラジド、スルホニルヒドラジド、またはチオカルボニルヒドラジドであり；
Ｒ１１〜Ｒ１４は、独立して、Ｈ、Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−６アルコキシ、Ｃ１−６ペルフルオロアルキル、Ｃ１−６アルキルアミノ、Ｃ２−１２ジアルキルアミノ、アミノ、カルボキシ、シアノ、ハロゲン、ヒドロキシ、ニトロ、フェニル、またはスルホであり、
Ｒ２１〜Ｒ２４は、独立して、Ｈ、Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−６アルコキシ、Ｃ１−６ペルフルオロアルキル、Ｃ１−６アルキルアミノ、Ｃ２−１２ジアルキルアミノ、アミノ、カルボキシ、シアノ、ハロゲン、ヒドロキシ、ニトロ、フェニル、スルホ、または−Ｌ−Ｚである、
化合物。
【請求項１８】
Ｑがスルホニルである、請求項１７に記載の化合物。
【請求項１９】
Ｌがフェニレン、Ｃ３−６ペルフルオロアルキル、または共有単結合である、請求項１８に記載の化合物。
【請求項２０】
Ｒ１１〜Ｒ１４がＨであるか、またはＲ１１〜Ｒ１４の１つのみが、非水素であり、該非水素置換基はＦ、Ｃｌ、Ｂｒまたはアルコキシである、請求項１９に記載の化合物。
【請求項２１】
Ｒ２１〜Ｒ２４がＨであるか、またはＲ２１〜Ｒ２４の１つのみが、非水素であり、該非水素置換基はＦ、Ｃｌ、Ｂｒ、スルホまたは−Ｌ−Ｚである、請求項２０に記載の化合物。
【請求項２２】
非水素であるＲ２１〜Ｒ２４の１つがＲ２２である、請求項２１に記載の化合物。
【請求項２３】
以下
【化３】
2004510767.tif 000031
からなる群から選択される、化合物。
【請求項２４】
以下
【化４】
2004510767.tif 000032
からなる群から選択される、化合物。
【請求項２５】
サンプル内の目的の標的を染色する方法であって、該方法は、以下の式の化合物：
【化５】
2004510767.tif 000033
を含む染色溶液を、該化合物が目的の生物分子に結合するのに十分な時間の間、目的の標的を含むサンプルと混合する工程を包含し、
ここで、置換基Ｒ１およびＲ２は、組み合わせる場合に、５または６員環芳香族環を含む第１の芳香族環系を形成し、該第１の芳香族環系は、必要に応じて１以上のヘテロ原子Ｎ、Ｏ、またはＳを組み込み、そして必要に応じて１または２のさらなる縮合芳香族環を組み込み、該縮合芳香族環は、各々、必要に応じて１以上のヘテロ原子を組み込み；該第１の芳香族環系は、必要に応じて、ハロゲン、Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−６アルコキシ、Ｃ１−６ペルフルオロアルキル、Ｃ１−６アルキルアミノ、Ｃ２−１２ジアルキルアミノ、スルホ、カルボキシ、ヒドロキシ、アミノ、ニトロ、シアノ、アリール、またはそれらの任意の組合せ、あるいは共有結合した反応性基−Ｌ−Ｚによって置換され；かつ
置換基Ｒ３およびＲ４は、組み合わせられる場合、５または６員環芳香族環を含む第２の芳香族環系を形成し、該第２の芳香族環系は、必要に応じて１〜３のさらなるヘテロ原子Ｎ、Ｏ、またはＳ、あるいはオキソ、チオオキソ、スルホン、またはアミノ官能基
を組み込み、そして必要に応じて１または２のさらなる縮合芳香族環を組み込み、該縮合芳香族環自体は、前述のように、必要に応じて１以上のヘテロ原子を組み込み、該第２の芳香族環系は、独立して、必要に応じて、ハロゲン、Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−６アルコキシ、Ｃ１−６ペルフルオロアルキル、Ｃ１−６アルキルアミノ、Ｃ２−１２ジアルキルアミノ、スルホ、カルボキシ、ヒドロキシ、アミノ、ニトロ、シアノ、アリール、またはそれらの任意の組合せ、あるいは共有結合した反応性基−Ｌ−Ｚによって必要に応じて置換され；
あるいは、Ｒ２およびＲ３は、組み合わせる場合に、該第１および第２の芳香族環系に二重に縮合するさらなる５または６員環の架橋環を形成し、該架橋環は、飽和または不飽和の炭素−炭素結合における炭素原子の組合せを含み、そして必要に応じて、Ｏ、ＮまたはＳ原子の１つを含み、該架橋環の該炭素および窒素原子は、必要に応じてＣ１−６アルキルによって、または−Ｌ−Ｚによって置換され；ここで、
各Ｌは、独立して、Ｃ、Ｎ、Ｏ、ＰおよびＳからなる群から選択される１〜２０の非水素原子を有する共有単結合、または共有結合連結であり、安定な化学結合の組合せは、必要に応じて、炭素−炭素結合、炭素−窒素結合、窒素−窒素結合、炭素−酸素結合、炭素−イオウ結合、リン−酸素結合、リン−窒素結合、またはそれらの組合せである、単結合、芳香族結合またはヘテロ芳香族結合を含み、各Ｚは、独立して、アルデヒドまたはケトンと反応し共有結合を形成し得る官能基であり、
ＸはＯＨまたは−ＮＨ−Ｑ−Ｒ５であり、ここで
Ｑ部分は、電子吸引性結合基である安定な二価のラジカルであり；
Ｒ５は、Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−６アルコキシ、Ｃ１−６アルキルアミノまたは−Ｌ−Ｚである、
方法。
【請求項２６】
請求項２５に記載の方法であって、ここで、該化合物は、式：
【化６】
2004510767.tif 000034
を有し、
ここで、Ｑが、カルボニル、チオカルボニルまたはスルホニルであり、Ｒ５は−Ｌ−Ｚであり；Ｌは、アリーレン、Ｃ１−６ペルフルオロアルキル、または共有単結合であり；かつＺは、カルボニルヒドラジド、ヒドラジド、スルホニルヒドラジド、またはチオカルボニルヒドラジドであり；
Ｒ１１〜Ｒ１４は、独立して、Ｈ、Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−６アルコキシ、Ｃ１−６ペルフルオロアルキル、Ｃ１−６アルキルアミノ、Ｃ２−１２ジアルキルアミノ、アミノ、カルボキシ、シアノ、ハロゲン、ヒドロキシ、ニトロ、フェニル、またはスルホであり、
Ｒ２１〜Ｒ２４は、独立して、Ｈ、Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−６アルコキシ、Ｃ１−６ペルフルオロアルキル、Ｃ１−６アルキルアミノ、Ｃ２−１２ジアルキルアミノ、アミノ、カルボキシ、シアノ、ハロゲン、ヒドロキシ、ニトロ、フェニル、スルホ、または−Ｌ−Ｚである、
方法。
【請求項２７】
目的の前記標的は、ペプチド、タンパク質、核酸、またはリポ多糖類である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
目的の前記標的は、グリコペプチド、糖タンパク質、またはリポ多糖類であり、かつ該方法は、前記サンプルに酸化剤を添加する工程をさらに包含する、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
前記酸化剤が過ヨウ素酸塩である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記サンプルが、糖タンパク質またはグリコペプチド以外のタンパク質またはペプチドを含み、かつ前記化合物が以下
【化７】
2004510767.tif 000035
からなる群から選択される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
目的の前記標的は、デオキシリボ核酸であり、かつ前記方法が、前記サンプルに脱プリン剤を添加する工程をさらに包含する、請求項２６に記載の方法。
【請求項３２】
前記脱プリン剤がＨＣｌである、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
請求項３１に記載の方法であって、前記サンプルがデオキシリボ核酸以外の核酸を含み、かつ前記化合物が、以下
【化８】
2004510767.tif 000036
からなる群から選択される、
方法。
【請求項３４】
目的の前記標的が細胞内にある、請求項３１に記載の方法。
【請求項３５】
前記化合物について、Ｑがスルホニルである、請求項２６に記載の方法。
【請求項３６】
目的の前記標的が、固体または半固体マトリックス内にある、請求項２６に記載の方法。
【請求項３７】
前記固体または半固体マトリックスが、ゲルまたはブロットである、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記化合物について、Ｌがフェニレン、Ｃ３−６ペルフルオロアルキルまたは共有単結合である、請求項３５に記載の方法。
【請求項３９】
前記化合物について、Ｒ１１〜Ｒ１４がＨであるか、またはＲ１１〜Ｒ１４の１つのみが、非水素であり、該非水素置換基はＦ、Ｃｌ、Ｂｒまたはアルコキシである、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記化合物について、Ｒ２１〜Ｒ２４がＨであるか、またはＲ２１〜Ｒ２４の１つのみが非水素であり、該非水素置換基は、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、スルホまたは−Ｌ−Ｚである、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記化合物について、非水素であるＲ２１〜Ｒ２４の１つがＲ２２である、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記化合物が、以下
【化９】
2004510767.tif 000037
2004510767.tif 000038
からなる群から選択される、請求項２７に記載の方法。
【請求項４３】
サンプル内の目的の標的を染色するためのキットであって、ａ）以下の式の化合物
【化１０】
2004510767.tif 000039
を含む染色溶液、
ｂ）緩衝液、
を含み、
ここで、置換基Ｒ１およびＲ２は、組み合わせる場合に、５または６員環芳香族環を含む第１の芳香族環系を形成し、該第１の芳香族環系は、必要に応じて１以上のヘテロ原子Ｎ、Ｏ、またはＳを組み込み、そして必要に応じて１または２のさらなる縮合芳香族環を組み込み、該縮合芳香族環は、各々、必要に応じて１以上のヘテロ原子を組み込み；該第１の芳香族環系は、必要に応じて、ハロゲン、Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−６アルコキシ、Ｃ１−６ペルフルオロアルキル、Ｃ１−６アルキルアミノ、Ｃ２−１２ジアルキルアミノ、スルホ、カルボキシ、ヒドロキシ、アミノ、ニトロ、シアノ、アリール、またはそれらの任意の組合せ、あるいは共有結合した反応性基−Ｌ−Ｚによって置換され；かつ
置換基Ｒ３およびＲ４は、組み合わせられる場合、５または６員環芳香族環を含む第２の芳香族環系を形成し、該第２の芳香族環系は、必要に応じて１〜３のさらなるヘテロ原子Ｎ、Ｏ、またはＳ、あるいはオキソ、チオオキソ、スルホン、またはアミノ官能基
を組み込み、そして必要に応じて１または２のさらなる縮合芳香族環を組み込み、該縮合芳香族環自体は、前述のように、必要に応じて１以上のヘテロ原子を組み込み、該第２の芳香族環系は、独立して、必要に応じて、ハロゲン、Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−６アルコキシ、Ｃ１−６ペルフルオロアルキル、Ｃ１−６アルキルアミノ、Ｃ２−１２ジアルキルアミノ、スルホ、カルボキシ、ヒドロキシ、アミノ、ニトロ、シアノ、アリール、またはそれらの任意の組合せ、あるいは共有結合した反応性基−Ｌ−Ｚによって置換され；
あるいは、Ｒ２およびＲ３は、組み合わせる場合に、該第１および第２の芳香族環系に二重に縮合するさらなる５または６員環の架橋環を形成し、該架橋環は、飽和または不飽和の炭素−炭素結合における炭素原子の組合せを含み、そして必要に応じて、Ｏ、ＮまたはＳ原子の１つを含み、該架橋環の該炭素および窒素原子は、必要に応じてＣ１−６アルキルによって、または−Ｌ−Ｚによって置換され；ここで、
各Ｌは、独立して、Ｃ、Ｎ、Ｏ、ＰおよびＳからなる群から選択される１〜２０の非水素原子を有する共有単結合、または共有結合連結であり、安定な化学結合の組合せは、必要に応じて、炭素−炭素結合、炭素−窒素結合、窒素−窒素結合、炭素−酸素結合、炭素−イオウ結合、リン−酸素結合、リン−窒素結合、またはそれらの組合せである、単結合、芳香族結合またはヘテロ芳香族結合を含み、各Ｚは、独立して、アルデヒドまたはケトンと反応し共有結合を形成し得る官能基であり、
ＸはＯＨまたは−ＮＨ−Ｑ−Ｒ５であり、ここで
Ｑ部分は、電子吸引性結合基である安定な二価のラジカルであり；
Ｒ５は、Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−６アルコキシ、Ｃ１−６アルキルアミノまたは−Ｌ−Ｚである、
キット。
【請求項４４】
酸化剤または脱プリン剤をさらに含む、請求項４３に記載のキット。
【請求項４５】
前記染色溶液中の前記化合物が式：
【化１１】
2004510767.tif 000040
を有する、請求項４４に記載のキットであって、
ここで、Ｑが、カルボニル、チオカルボニルまたはスルホニルであり、Ｒ５は−Ｌ−Ｚであり；Ｌは、アリーレン、Ｃ１−６ペルフルオロアルキル、または共有単結合であり；かつＺは、カルボニルヒドラジド、ヒドラジド、スルホニルヒドラジド、またはチオカルボニルヒドラジドであり；
Ｒ１１〜Ｒ１４は、独立して、Ｈ、Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−６アルコキシ、Ｃ１−６ペルフルオロアルキル、Ｃ１−６アルキルアミノ、Ｃ２−１２ジアルキルアミノ、アミノ、カルボキシ、シアノ、ハロゲン、ヒドロキシ、ニトロ、フェニル、またはスルホであり、
Ｒ２１〜Ｒ２４は、独立して、Ｈ、Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−６アルコキシ、Ｃ１−６ペルフルオロアルキル、Ｃ１−６アルキルアミノ、Ｃ２−１２ジアルキルアミノ、アミノ、カルボキシ、シアノ、ハロゲン、ヒドロキシ、ニトロ、フェニル、スルホ、または−Ｌ−Ｚである、
キット。
【請求項４６】
前記キットが、ＨＣＬである脱プリン剤を含む、請求項４５に記載のキット。
【請求項４７】
前記染色溶液中の前記化合物が式
【化１２】
2004510767.tif 000041
からなる群から選択される、請求項４６に記載のキット。
【請求項４８】
前記キットが、過ヨウ素酸塩である酸化剤を含む、請求項４５に記載のキット。
【請求項４９】
前記染色溶液中の前記化合物が以下
【化１３】
2004510767.tif 000042
からなる群から選択される、請求項４８に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、アルデヒド、ケトン、および類似の官能基を含む物質を標識する蛍光誘導体化試薬、ならびに糖タンパク質および糖ペプチド、核酸およびリポ多糖類、ならびに他の生体分子を標識する際のこれらの使用に関する。
【０００２】
（背景）
蛍光色素は、高度に感受性の検出試薬が所望である生物学的適用のために特に適切であることが公知である。蛍光色素は、可視の色と蛍光との両方を他の材料に与えるために、使用される。特に有用なものは、これらの標識化反応において選択性を示し、特定の物質の検出および／または同定を可能にするか、あるいはサンプルの特徴の同定を可能にする、蛍光試薬である。
【０００３】
種々の検出可能なヒドラジン、ヒドロキシルアミンおよびアミンの誘導体が、アルデヒド官能基およびケトン官能基を標識する有用性を共有することが、記載された。このような試薬のうちで最も広範に使用されるものは、ダンシルヒドラジン、フルオレセインチオセミカルバジド、種々のビオチンヒドラジド、ビオチンヒドロキシルアミン（ＡＲＰ）、および種々の芳香族アミン（２−アミノピリジン、８−アミノナフタレン−１，３，６−ジスルホン酸、１−アミノピレン−３，６，８−トリスルホン酸、２−アミノアクリドン）である（Ｈａｕｇｌａｎｄら、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ　ＰＲＯＢＥＳ，ＩＮＣ．ＨＡＮＤＢＯＯＫ　ＯＦ　ＦＬＵＯＲＥＳＣＥＮＴ　ＰＲＯＢＥＳ　ＡＮＤ　ＲＥＳＥＡＲＣＨ　ＣＨＥＭＩＣＡＬＳ，第７版，ＣＤ−ＲＯＭ，第３章およびそこに引用される参考文献（これらは、本明細書中に参考として援用される）によって記載されるように）。
【０００４】
ヒドラジン、ヒドロキシルアミンおよびアミン誘導体化試薬を利用する、炭水化物を標識する最も現在の方法は、炭水化物、特に、いわゆる「還元糖」に存在するか、またはこの炭水化物に導入されるアルデヒドを標識化することに焦点を当てた。この還元糖で形成される付加体は、水素化ホウ素またはシアノ水素化ホウ素での処理によって、さらに安定化され得る。誘導体化反応は、代表的に、クロマトグラフィー、電気泳動、沈殿、アフィニティー単離または他の手段のような分離技術に先行するか、またはこの技術の後に行われ、その後、標識された生成物の直接的かまたは間接的な検出が行われる。
【０００５】
さらに、いくつかの単純な糖および複雑な糖が、グルクロニドにおいてと同様に、カルボン酸にカップリングすることによって、誘導体化された。代表的に、アミン、ヒドラジンまたはヒドロキシルアミンで置換された標識は、求核剤として機能し、そしてカルボン酸が、カルボジイミド（例えば、エチルジメチルアミノプロピルカルボジイミド、すなわちＥＤＡＣ）のような活性化剤を使用して、エステルまたは無水物を形成することによって、最初に活性化されなければならない。キャピラリー電気泳動は、炭水化物との付加体または検出可能な誘導体（複雑な炭水化物、ならびに糖タンパク質、ガングリオシドおよび他の糖含有生体分子の加水分解によって得られる炭水化物が挙げられる）の分析のために特に有効である。各場合において糖または多糖類とこのように形成した検出可能な付加体は、それら自体が、トレーサーとして、レセプター結合のために、酵素基質としておよび他の多くの適用のために、利用され得る。
【０００６】
本発明の誘導体化試薬は、ゲルにおけるアルデヒドまたはケトンを含有する分子の検出のために記載されてきた、任意の類似の試薬の蛍光特性より優れた蛍光特性を示し、そして炭水化物、糖タンパク質、グリコゲン、リポ多糖類ならびに他のアルデヒド、ケトン、カルボン酸、またはスルホン酸を含む物質の、明るい蛍光標識を可能にする。ビオチンヒドラジド、ビオチンヒドロキシルアミンおよびジゴキシゲニンヒドラジド（これらの全ては、膜上へのブロッティングおよび二次的な検出試薬の使用を必要とする）とは異なり、本発明の試薬は、ゲル内での酸化された糖タンパク質の迅速な検出を可能にする。
【０００７】
本発明の好ましい試薬は、エピ投光器および透視機において通常使用される紫外線励起源によって、十分に励起される。これらの色素は、自己蛍光および励起光の散乱に起因して、約１５０ｎｍより高い、異常に高いストークスシフトを有し、バックグラウンドを効果的に低下させる。さらに、本発明の染色手順は、迅速かつマイルドであり、以前に利用された標識化試薬より実質的に高い感度を示し、そして単純な染色手順を使用する。
【０００８】
高度に蛍光性の生成物を与え、そして本発明の試薬に関連する、蛍光原基質のファミリーは、以前に記載された（Ｈａｕｇｌａｎｄらに対する米国特許第５，３１６，９０６号（１９９４）；Ｈａｕｇｌａｎｄらに対する米国特許第５，４４３，９８６号（１９９５）；両方が参考として援用される）。しかし、これらの公知の蛍光原基質は、酵素が作用するまでは非蛍光性であり、そして反応性官能基によって置換されて所望の標的物質を標識せず、そしてこれらの蛍光生成物は、生理学的条件下では不溶性であるように設計される。対照的に、本発明の好ましい実施形態において、非蛍光試薬は、（例えば、ゲル中または膜内で）アルデヒド部分またはケトン部分を有する生体分子と結合した場合にのみ、蛍光性となる。
【０００９】
（発明の要旨および好ましい実施形態の説明）
本発明は、アルデヒド、ケトン、カルボン酸およびスルホン酸を含む標的物質へのカップリングに適し、これによって、結合体化物質にこれらの発色団特性および蛍光特性を与える、新規な蛍光誘導体化試薬を記載する。
【００１０】
本発明の試薬は、ヒドラジドまたはヒドロキシルアミンである少なくとも１つの反応性基（Ｚ）で置換され、これが、共有結合Ｌによって、試薬の芳香族部分に結合する。
【００１１】
本発明の誘導体化試薬は、以下の式：
【００１２】
【化１４】
2004510767.tif 000003
を有し、ここで、置換基Ｒ１およびＲ２は、組み合わせられる場合に、第１の芳香族環系を形成する。第１の芳香族環系は、必要に応じて１つ以上のヘテロ原子Ｎ、Ｏ、またはＳを組み込む、５員環または６員環の芳香族環を含む。第１の芳香族環系は、各々が必要に応じて１つ以上のヘテロ原子を組み込む１つまたは２つのさらなる縮合芳香族環を、必要に応じて組み込む。第１の芳香族環系は、必要に応じて、ハロゲン、１〜６個の炭素を有するアルキル、１〜６個の炭素を有するパーフルオロアルキル、１〜６個の炭素を有するアルコキシ、スルホ、カルボキシ、ヒドロキシ、アミノ、１〜６個の炭素を有するアルキルアミノ、２〜１２個の炭素を有するジアルキルアミノ、ニトロ、シアノ、アリール、またはこれらの任意の組み合わせで置換されるか、あるいは第１の芳香族環系は、共有結合した反応性基−Ｌ＆ｓｈｙ；−Ｚによって置換される。第１の芳香族環系における代表的な非水素置換基は、ハロゲンまたはアルコキシである。試薬がハロゲンによって置換される場合には、これは代表的に、Ｆ、ＣｌまたはＢｒによって置換される。代表的に、第１の芳香族環系は、必要に応じて上記のように置換されるベンゼンまたはナフタレンである。好ましくは、第１の芳香族環系は、−Ｌ−Ｚによって１回置換されたベンゼンである。
【００１３】
置換基Ｒ３およびＲ４は、結合して、第２の芳香族環系を形成する。第２の芳香族環系は、必要に応じて、１〜３個の追加のヘテロ原子Ｎ、Ｏ、またはＳ、あるいは、オキソ、チオオキソ、スルホン、またはアミノ官能基を組み込む、５員環または６員環の芳香族を含む。第２の芳香族環は、必要に応じて、１または２個の追加の融合した芳香族環を組み込み、この融合した芳香族環は、それ自体、必要に応じて、１個以上のヘテロ原子を組み込む。第２の芳香族環系は、必要に応じて、ハロゲン、１〜６個の炭素を有するアルキル、１〜６個の炭素を有するパーフルオロアルキル、１〜６個の炭素を有するアルコキシ、スルホ、カルボキシ、ヒドロキシ、アミノ、１〜６個の炭素を有するアルキルアミノ、２〜１２個の炭素を有するジアルキルアミノ、ニトロ、シアノ、アリール、またはそれらの任意の組み合わせによって置換されるか、あるいは、第２の芳香族環系は、共有結合反応基−Ｌ−Ｚによって置換される。第１の芳香族環系における代表的な非水素置換基は、ハロゲンまたはアルコキシである。試薬がハロゲンによって置換される場合、それは、代表的には、Ｆ、ＣｌまたはＢｒによって置換される。代表的には、第２の芳香族環は、２個の融合環を組み込む。本発明の１局面において、第２の芳香族環系は、２個の融合環を組み込む。本発明の１局面において、第２の芳香族環系は、キナゾリノンまたはベンズアゾールである。本発明の別の局面において、第２の芳香族環系は、ベンズオキサゾール、ベンゾチアゾール、またはインドリン環系である。
【００１４】
１実施形態において、Ｒ２およびＲ３は、結合して、第１および第２の芳香族環系に二重に融合される追加の５員環または６員環を形成する。この実施形態において、第１の環系を第２の環系に接続する架橋は、飽和または不飽和の炭素−炭素結合、Ｏ、Ｎ、またはＳ原子の組み合わせを含む。架橋部分の炭素原子および窒素原子は、必要に応じて、１〜６個の炭素を有するアルキルまたは反応基−Ｌ−Ｚによって置換される。
【００１５】
好ましくは、本発明の試薬は、少なくとも３個の芳香族環を含み、これらの２個は、融合される。代表的には、第１の環系または第２の環系のいずれかは、２個の融合した環を構成する。代表的には、架橋部分は、存在しない。
【００１６】
Ｘ部分は、ＯＨまたは−ＮＨ−Ｑ−Ｒ５であり、ここで、Ｑ部分は、電子吸引連結基である。十分に電気的に陰性である任意の安定した二価のラジカルは、適切なＱ部分である。本発明の１局面において、Ｑ部分は、０．２０より正の一定したＨａｍｍｅｔｔシグマ定数を有する。特定の局面において、このＱ部分は、カルボニル（−（Ｃ＝Ｏ）−）、チオカルボニル（−（Ｃ＝Ｓ）−）、スルホニル（−（ＳＯ２）−）、またはホスホリル（−（ＰＯ２）−）である。本発明の好ましい局面において、Ｑは、カルボニル、チオカルボニルまたはスルホニルである。
【００１７】
Ｒ５は、１〜６個の炭素を有するアルキル、１〜６個の炭素を有するアルコキシ、１〜６個の炭素を有するアルキルアミノ、または反応基−Ｌ−Ｚである。好ましくは、Ｘは、−Ｎ−Ｑ−Ｒ５であり、Ｒ５は、−Ｌ−Ｚである。
【００１８】
Ｚは、アルデヒドまたはケトンと反応して共有結合を形成し得る官能基である。本発明の１局面において、Ｚは、脂肪族アミンまたは芳香族アミン（例えば、エチレンジアミン）、あるいは第１または第２の芳香族環系に直接共有結合したアミンである。別の実施形態において、Ｚは、−ＮＲ６−ＮＨ２（ヒドラジド）、−ＮＲ６（Ｃ＝Ｏ）ＮＲ７ＮＨ２（セミカルバジド）、−ＮＲ６（Ｃ＝Ｓ）ＮＲ７ＮＨ２（チオセミカルバジド）、−（Ｃ＝Ｏ）ＮＲ６ＮＨ２（カルボニルヒドラジド）、−（Ｃ＝Ｓ）ＮＲ６ＮＨ２（チオカルボニルヒドラジド）、−（ＳＯ２）ＮＲ６ＮＨ２（スルホニルヒドラジド）、−ＮＲ６ＮＲ７（Ｃ＝Ｏ）ＮＲ８ＮＨ２（カルバジド）、−ＮＲ６ＮＲ７（Ｃ＝Ｓ）ＮＲ８ＮＨ２（チオカルバジド）、または−Ｏ−ＮＨ２（ヒドロキシルアミン）であり、ここで、各Ｒ６、Ｒ７、およびＲ８は、独立してＨ、または１〜６個の炭素を有するアルキルであり、好ましくはＨである。本発明の１局面において、Ｚは、ヒドラジド、ヒドロキシルアミン、カルボヒドラジドまたはスルホニルヒドラジドである。好ましくは、Ｚは、カルボヒドラジドまたはスルホニルヒドラジドである。
【００１９】
共有結合Ｌは、直接的に（Ｌは、単結合である）または安定な化学結合の組み合わせによって、Ｚを蛍光色素に結合し、この化学結合は、必要に応じて、単結合、二重結合、三重結合または芳香族炭素−炭素結合、ならびに炭素−窒素結合、窒素−窒素結合、炭素−酸素結合、炭素−硫黄結合、リン−酸素結合、およびリン−窒素結合を含む。Ｌとして、代表的には、エーテル、チオエーテル、カルボキサミド、スルホンアミド、尿素、ウレタンまたはヒドラジン部分が挙げられる。
【００２０】
好ましいＬ部分は、Ｃ、Ｎ、Ｏ、Ｐ、およびＳからなる群から選択される１〜２０個の非水素原子を有し、これは、エーテル、チオエーテル、アミン、エステル、カルボキサミド、スルホンアミド、ヒドラジド結合および芳香族または複素芳香族結合の任意の組み合わせからなる。好ましくは、Ｌは、必要に応じて、１個または２個のヘテロ原子をを含む単一の炭素−炭素結合の組み合わせであるか、またはＬは、芳香族環を含む。Ｌの例として、置換または非置換の、ポリメチレン、アリーレン、アルキルアリーレン、アリーレンアルキル、またはアリールチオが挙げられる。１実施形態において、Ｌは、１〜６個の炭素原子を含み；別の実施形態において、Ｌは、チオエーテル結合を含む。
【００２１】
本発明の試薬は、１個以上の−Ｌ−Ｚ部分によって置換され得るが、それらは、少なくとも１個の−Ｌ−Ｚ部分によって置換され得る。好ましくは、本発明の試薬は、１個のみの−Ｌ−Ｚ部分によって置換され、より好ましくは、Ｒ５は、単なる（Ｑにおいて試薬に結合した）−Ｌ−Ｚ部分である。
【００２２】
本発明の好ましい試薬は、約２５０ｎｍより大きな励起極大値を示し、約１００ｎｍ、より好ましくは、約１５０ｎｍより大きな発光のＳｔｏｋｅｓシフトを示す。
【００２３】
本発明の１実施形態において、蛍光色素は、以下：
【００２４】
【化１５】
2004510767.tif 000004
の構造を有し、
ここで、Ｗは、（ＣＨ３）２Ｃ（イソプロピリデン）、−ＣＨ＝（メチン）、−ＣＨ２−、Ｓ、Ｏ、または−（Ｎ−Ｒ９）−であり、ここで、Ｒ９は、Ｈまたは１〜６個の炭素を有するアルキルである。Ｊは、−（Ｃ＝Ｏ）−、−（ＳＯ２）−、または−ＣＨ＝であり；そしてｎは、１または０である。Ｗが−（Ｎ−Ｒ９）−であり、Ｊが−（Ｃ＝Ｏ）−である場合、生成物は、キナゾリノン（キナゾロンともいわれる）である。Ｗが、−（Ｎ−Ｒ９）−であり、Ｊが存在しない（ｎ＝０）である場合、生成物は、ベンズイミダゾールである。ＷがＳであり、Ｊが存在しない場合（ｎ＝０）、生成物は、ベンゾチアゾールである。ＷがＯでありＪが存在しない（ｎ＝０）場合、この生成物は、ベンズオキサゾールである。ＷおよびＪが各々メチンである場合、生成物はキノリンである。Ｗがイソプロピリデンであり、Ｊが存在しない（ｎ＝０）場合、生成物はインドリンである。
【００２５】
第１の芳香族環および第２の芳香族環が、両方とも６員環であり、そして架橋部分がそれらの間に５員環または６員環を形成する場合、生成物はフェナントリジンである。代表的には、本発明の試薬はフェナントリジンであり、以下：
【００２６】
【化１６】
2004510767.tif 000005
の構造を有する。
【００２７】
本発明の別の局面において、本発明の試薬は、キナゾリノン、ベンズイミダゾール、ベンゾチアゾール、ベンズオキサゾール、キノリン、インドリン、またはフェナントリジンであり、独立して、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６パーフルオロアルキル、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、ニトロ、シアノ、またはアリール、あるいはそれらの任意の組み合わせによって１回以上置換される。
【００２８】
本発明のなお別の局面において、本発明の試薬は、キナゾリノン、ベンズイミダゾール、ベンゾチアゾール、ベンズオキサゾール、キノリンまたはインドリンに構造的に同様であるが、芳香族環の少なくとも１個が、必要に応じて少なくとも１個のヘテロ原子Ｎ、Ｏ、またはＳを組み込む少なくとも１個の追加の芳香族環に融合されるという点で、さらに改変される。
【００２９】
糖タンパク質または糖ペプチド、核酸、およびリポ多糖類を検出する際の使用のために、本発明の好ましい試薬は、以下：
【００３０】
【化１７】
2004510767.tif 000006
の式を有し、
ここで、Ｑは、カルボニル、チオカルボニル、またはスルホニルであり、好ましくはスルホニルであり、Ｒ５は、−Ｌ−Ｚである。代表的には、Ｌは、アリーレン（好ましくは、フェニレン）、パーフルオロアルキル（好ましくは、Ｃ３〜６）、または単結合の共有結合であり；そしてＺは、カルボニルヒドラジド、ヒドラジド、スルホニルヒドラジド、またはチオカルボニルヒドラジドである。置換基Ｒ１１〜Ｒ１４は、独立して、Ｈ、Ｃ１−６アルキル、Ｃ１〜６アルコキシ、Ｃ１〜６ペーフルオロアルキル、Ｃ１〜６アルキルアミノ、Ｃ２〜１２ジアルキルアミノ、アミノ、カルボキシ、シアノ、ハロゲン、ヒドロキシ、ニトロ、フェニル、またはスルホである。代表的には、Ｒ１１〜Ｒ１４は、Ｈであるか、またはＲ１１〜Ｒ１４のうちの１個のみが、水素ではなく、この非水素置換基は、好ましくは、Ｆ，Ｃｌ、Ｂｒ、またはアルコキシである。この置換基Ｒ２１〜Ｒ２４は、独立して、Ｈ、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ１〜６アルコキシ、Ｃ１〜６パーフルオロアルキル、Ｃ１〜６アルキルアミノ、Ｃ２〜１２ジアルキルアミノ、アミノ、カルボキシ、シアノ、ハロゲン、ヒドロキシ、ニトロ、フェニル、スルホ、または−Ｌ−Ｚである。代表的には、Ｒ２１〜Ｒ２４は、Ｈであるか、またはＲ２１〜Ｒ２４のうちの１個のみが、水素ではなく（好ましくは、Ｒ２２）、この非水素置換基は、好ましくは、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、スルホ、Ｌ−Ｚである。
【００３１】
（試薬−標的結合体）
アルデヒド、ケトン、カルボン酸、またはスルホン酸官能基を含む標的物質との交差カップリングの生成物は、試薬−標的結合体である。試薬−標的結合体において、蛍光色素は、共有結合Ｌ’によって標的物質（ＳＴ）に結合される。
【００３２】
結合Ｌ’の性質は、本来、本発明の試薬に対して反応性Ｚ部分を結合する結合Ｌとは異なる。Ｌ’は、代表的には、元のＬ結合を含み、Ｌ’はまた、Ｚ部分内に元々存在する原子およびそこに結合体化した官能基を組み込む。アルデヒドまたはケトンとの代表的な結合は、オキシム、アミド、ヒドラゾン、カルボヒドラゾン、チオカルボヒドラゾン、スルホニルヒドラゾン、セミカルバゾン、チオセミカルバゾン、または使用される反応性基Ｚの特有の性質を反映する同様の官能基およびそれらと結合体化したアルデヒドまたはケトンを組み込む。カルボン酸との結合は、代表的には、カルボヒドラジドまたはヒドロキサム酸といわれる。スルホン酸との結合は、代表的には、スルホニルヒドラジドまたはＮ−スルホニルヒドロキシアミンといわれる。結合Ｌ’は、試薬と標的との間の結合体化反応によて完全に形成され得るか、または後に、化学的還元によって安定化され得る。
【００３３】
アルデヒドまたはケトン官能基は、代表的には、本発明の試薬に対する結合体化の前に、標的物質上に天然に存在する。あるいは、アルデヒドまたはケトン官能基は、本発明の試薬との反応の前に、化学処理、光処理、熱処理、放射処理、または酵素処理によって、標的物質上に形成される。本発明の１局面において、標的物質は、化学酸化剤（例えば、過ヨウ素酸塩、強酸、またはオゾン）、酸化放射、光分解、または酵素酸化のような酸化条件下で処理される。カルボン酸およびスルホン酸官能基は、代表的には、標的物質内にすでに存在するが、本発明の試薬にカップリングするための特殊な条件を必要とし得る。
【００３４】
二クロム酸塩および過マンガン酸塩のような種々の化学的酸化剤は、単純なアルコールおよび複雑なアルコールを、アルデヒドまたはケトンに酸化する際に有効であるが、これらは、生体分子と共に使用される場合は刺激の強い試薬であり得、そしてアルコールをカルボン酸にまで過剰に酸化し得、このカルボン酸は、ＥＤＡＣのような補助的カップリング剤の使用なしではカップリングしない。より一般的には、酸化剤は、ビシナルグリコールまたはアミノアルコールを酸化する酸化剤である。これまでの、この型の最も一般的な試薬は過ヨウ素酸（ＨＩＯ４）かまたは過ヨウ素酸ナトリウムのようなその塩の１つである。過ヨウ素酸（塩）による酸化は、穏やかでかつ高度に選択的である。この反応の生成物（単数または複数）は、代表的には２つのアルデヒド部分を含むが、ケトンもまた適切に置換されたグリコールから形成される。引き続いて本発明の試薬により誘導体化され得る、過ヨウ素酸酸化可能なグリコールを含む分子のいくつかの例としては、以下が挙げられる：単糖類、二糖類、および多糖類；リボ核酸中の５’−末端クレオチド；セリン、トレオニンならびにブロックされていないペプチドおよびタンパク質（末端セリン残基または末端トレオニン残基を含む）；セリンまたはトレオニンを加えられたトランスファーリボ核酸；エチレングリコール、グリセロール、グリセロール１−リン酸、２−アミノアルコールおよび類似の誘導体；多くの糖タンパク質（免疫グロブリン、ペルオキシダーゼ、アビジンを含む）；種々の糖脂質、グリコスフィンゴ脂質、ガングリオシドおよびリポ多糖類；ならびに薬物、リガンドおよび天然産物（過ヨウ素酸で酸化可能なグリコールまたはアミノアルコール官能基を含む）の多数の結合体。
【００３５】
特定の炭水化物（例えば、ガラクトシド）の選択的誘導体化（およびその後の検出）のためのさらなる方法は、炭水化物のアルデヒドへの酵素で触媒された酸化を経由し、このアルデヒドは、続いて、検出可能なアミン誘導体、ヒドラジン誘導体またはヒドロキシルアミン誘導体と反応し得る。この処理は、触媒的酸化によりアルデヒド（例えば、ガラクトース残基）が得られる炭水化物に主に有効である。例えば、グルコースオキシダーゼは、グルコシドを酸化する場合にアルデヒドを生じない。この反応の適用は、ガラクトースオキシダーゼを使用する、生存細胞における細胞表面のガラクトシド含有タンパク質の高度に選択的な改変および同定である。
【００３６】
特定の他の分子は、固有のアルデヒドまたはケトンを有し、これは、自発的にかまたは適切なｐＨで穏やかな加熱により、検出可能なアミン、ヒドラジンまたはヒドロキシルアミンと反応する。アルデヒド（またはケトン）が主に環構造である還元糖およびいくつかのオリゴサッカリドに加えて、これらの反応は、薬物およびホルモン（例えば、ステロイド）のような低分子量の分子ならびに２０００未満の分子量を有する他のリガンドの誘導体化にしばしば使用されており、最も頻繁には、続いて、過剰の試薬からの分離および薄層クロマトグラフィー、ＨＰＬＣまたは電気泳動のようなクロマトグラフィー技術による分析が行われる。わずかなタンパク質（例えば、エラスチン、コラーゲン、およびリシルオキシダーゼの基質）のみが、固有のアルデヒド官能基およびケトン官能基を有しており、これにより、酸化工程なしで他のタンパク質の存在下での選択的検出が可能になる。誘導体化され得るいくつかのさらなる天然産物としては、アセトアルデヒド、グリセロアルデヒド、ジヒドロオキシアセトン、およびピルベートが挙げられるがこれらに限定されない。
【００３７】
非常に広範な種々のカルボン酸は、カルボキシレート活性化試薬と合わせて、本発明の試薬により誘導体化される。適切なカルボン酸としては、以下が挙げられる：直鎖、分岐、飽和もしくは不飽和であるか、またはさらなる脂肪族環もしくは芳香環またはさらなる置換基を含む、Ｃ１〜Ｃ３０カルボン酸；クエン酸回路中の中間体；合成ポリマー（カルボキシレートで修飾されたミクロスフェアおよび膜を含む）；アミンをブロックされた、アミノ酸、ペプチドおよびタンパク質；薬物；ＭＷ２０００未満のリガンド；ならびに選択された多糖類。ハロゲン化スルホニル（特に、塩化スルホニル）は、容易に本発明のアミン、ヒドラジンよびヒドロキシルアミンとカップリングして、安定なスルホンアミドを形成する。
【００３８】
本発明の試薬は、以下を含む多数の手段によりヌクレオチド、オリゴヌクレオチドおよび核酸を標識し得る：１）リボ核酸の５’末端の過ヨウ素酸酸化、次いでアミンまたはヒドラジンであるＺ部分へのカップリング；２）ビサルファイトにより媒介されるシトシン残基へのカップリング；３）Ｆｅｕｌｇｅｎ反応（ここでＤＮＡのデオキシヌクレオシド、デオキシヌクレオチド、またはオリゴデオキシヌクレオチドは、酸で処理されてヘミアセタールを生じ、これが次いで本発明の試薬とカップリングされる。
【００３９】
核酸の脱塩基部位（ａｂａｓｉｃ　ｓｉｔｅ）（放射線被爆、活性酸素処理および特定の他の化学的処理により形成される）は、その塩基を欠き、そしてＦｅｕｌｇｅｎ反応により形成される同じヘミアセタール結合を含む。従って、これらの脱塩基部位はまた、本発明の試薬を用いて検出される。
【００４０】
いくつかのステロイドを除いて、細胞脂質は、代表的にはアルデヒド部分もケトン部分も含まない。これらは、代表的にはアルコールまたは過酸化水素の酸化により導入される。炭素−炭素二重結合は、四酸化オスミウムのような試薬を用いてグリコールに変換され、次いで過ヨウ素酸によりアルデヒドに酸化される。炭水化物部分のアルデヒドへの過ヨウ素酸酸化により、糖の脂質結合体（例えば、リポ多糖（ＬＰＳ）、ガングリオシド、セレブロシドおよびグリコシルスフィンゴ脂質）を検出することは、より一般的である。本発明の試薬は、酸化されたＬＰＳの例外的に感受性の検出を提供する（実施例２６）。
【００４１】
それらが存在しない場合、アルデヒドおよびケトンはまた、すでにアルデヒドまたはケトンを含む外来の試薬を使用して、分子に導入される。例えば、アルデヒドは、脂肪族アミン部位において、試薬、４−ホルミル安息香酸スクシンイミジルまたは４−ホルミルフェノキシ酢酸スクシンイミジルを用いて導入される（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ　ＯＲ）。これらの試薬は、生存細胞の表面上でタンパク質を選択的に修飾し、それにより、例えば溶解およびゲル電気泳動後の、細胞表面上のペプチドおよびタンパク質の露出のトポロジーの分析が可能になる。さらに、ガラクトシドは、ＵＤＰ−ガラクトース：Ｎ−アセチルグルコサミンガラクトシルトランスフェラーゼを使用して、酵素的に標的炭水化物に転移され、そしてアルデヒドへのガラクトースオキシダーゼに触媒される酸化（Ｓｈａｐｅｒら、Ｊ．ＳＵＰＲＡＭＯＬ．ＳＴＲＵＣＴＵＲＥ　６，２９１−２９９（１９７７）に記載されるように）後に、標的炭水化物は、本発明の試薬により修飾され得る。セイヨウワサビペルオキシダーゼのような糖タンパク質は、アルデヒドに酸化され、そしてそれらの結合体は、続いて、本発明に従う種々の検出スキームにおいて使用される（実施例２８）。
【００４２】
細胞表面糖タンパク質のオリゴサッカリド成分は、多くの重要な生物学的プロセス（細胞−細胞接着からシグナル伝達まで）を調節する相互作用において役割を果たす。シアル酸は、哺乳動物の細胞表面糖タンパク質上にあるオリゴサッカリドの最も豊富な末端成分であり、そして６個の炭素の前駆体Ｎ−アセチルマンノサミンから合成される。培養物中の細胞が、Ｎ−レブリノイル−Ｄ−マンノサミンと共にインキュベートされる場合、このケトン含有単糖は、オリゴサッカリド合成経路における基質として作用し、ケトンでタグ化された細胞表面オリゴサッカリドを生じる（Ｂｅｒｔｏｚｚｉら（２０００）への米国特許第６，０７５，１３４号（参考として援用される）に記載されるように）。これらのタグ化された細胞が、次いで本発明の試薬で標識される場合、これらは、画像化かまたはフローサイトメトリーのいずれかを使用して、容易に同定されるかまたは追跡される。
【００４３】
結合体化した標的は、代表的には、２０００ダルトン未満の分子量を有する、ペプチド、タンパク質、ヌクレオシド、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、核酸、糖、多糖類、脂質、リポ多糖、ガングリオシド、薬物、ホルモンまたはリガンドである。好ましくは、結合体化した標的は、タンパク質、核酸、脂質、リポ多糖、ガングリオシド、薬物またはホルモンである。最も好ましくは、結合体化した標的は、糖タンパク質、リポ多糖、または核酸である。
【００４４】
（使用方法）
アルデヒド含有またはケトン含有の標的基質を標識するための本発明の使用は、本発明の試薬を、所望の標的を含むかまたは含むと考えられるサンプルと混合すること、試薬とサンプルとのこの混合物を、サンプル中の標的基質と試薬が共有結合結合体を形成するのに十分な時間インキュベートすることを包含し、その結果、この結合体は、検出可能な蛍光シグナルを示す。本発明の試薬の、カルボン酸含有基質およびスルホン酸含有基質との結合は、これらの官能基をアミン反応性種へ前もって活性化することを必要とする。
【００４５】
生じた試薬−標的結合体の特徴（存在、位置、強度、励起スペクトルおよび発光スペクトル、蛍光偏光、蛍光寿命、光退色速度、および蛍光シグナルの他の物理的特性を含む）を使用して、サンプルの特徴または部分を、検出、区別、選別、定量および／または分析し得る。本発明の試薬は、必要に応じて、１つ以上のさらなる検出試薬（好ましくは検出可能に異なる蛍光特徴を有する）と組合わせて使用される。
【００４６】
（アルデヒドまたはケトンを含む選択された標的基質）
ホルムアルデヒド
アセトン
ベンズアルデヒド
開環形態の還元糖および多糖
ステロイド
ケト酸
アルデヒド含有またはケトン含有の薬物
アルデヒド含有またはケトン含有の環境汚染物質
アルデヒド含有またはケトン含有の有機物
酸で処理されたデオキシリボ核酸
酸化された糖
酸化された多糖
酸化されたグリコール
酸化された糖タンパク質
酸化された糖脂質
酸化されたグリコサミノグリカン
酸化されたリボ核酸
酸化された生物学的細胞
タンパク質の酸化されたＮ−末端セリン残基
タンパク質の酸化されたＮ−末端トレオニン残基。
【００４７】
（カルボン酸またはスルホン酸を含有する選択された標的物質）
ステロイド
カルボン酸
カルボン酸またはスルホン酸含有薬物
カルボン酸またはスルホン酸含有環境汚染物質
カルボン酸またはスルホン酸含有有機物
脂肪酸
カルボキシル化糖
ポリマー
生物学的細胞
タンパク質。
【００４８】
（染色溶液）
典型的に、本発明の試薬がアルデヒドまたはケトンを検出するために使用される場合、これは、染色溶液、好ましくは、サンプルおよび意図される使用に適合性の水溶液または水性の混和性溶液の形態で使用される。生物学的サンプルについて、細胞形態学または生理学の最小の摂動が所望される場合、この染色溶液は準じて選択される。溶液アッセイについて、この染色溶液は、好ましくは、標的物質の本来の立体配置を乱さない。
【００４９】
染色溶液は典型的に、水溶液または水性の混和性溶液の形態で使用されるが、この染色溶液は、典型的に、第１に、水混和性有機溶媒（例えば、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ））、低級アルコール（例えば、メタノールまたはエタノール）にこの試薬を溶解することによって調製される。このストック溶液は、典型的に、約５０倍以上の濃度で調製され、これは最終染色溶液において使用され、次いで、水溶液または緩衝溶液で１倍以上に希釈され、その結果この試薬は、有効量で存在する。必要に応じて、この試薬は、第１に、１００％ＤＭＦに溶解され、次いで、緩衝液で希釈される。染色溶液は、典型的に、さらなる処方物成分（例えば、酸、緩衝剤、無機塩、極性有機溶媒、酸化防止剤、およびイオンキレート剤）をさらに含む。
【００５０】
染色溶液のｐＨは、緩衝剤を含めることによって必要に応じて改変される。サンプル中の標的物質と適合性の任意の緩衝剤が、染色溶液に含めるために適切である。
【００５１】
一実施形態において、緩衝剤は、いわゆる「Ｇｏｏｄ」緩衝液の１つである。「Ｇｏｏｄ」緩衝液としては、ＢＥＳ（Ｎ，Ｎ−ビス［２−ヒドロキシエチル］−２−アミノエタンスルホン酸；２−［ビス（２−ヒドロキシエチル）アミノ］エタンスルホン酸、ＢＩＣＩＮＥ（Ｎ，Ｎ−ビス［２−ヒドロキシエチル］グリシン）、ＣＡＰＳ（３−［シクロヘキシルアミノ］−１−プロパンスルホン酸）、ＥＰＰＳ（Ｎ−［２−ヒドロキシエチル］ピペラジン−Ｎ’−［３−プロパンスルホン酸］）、ＨＥＰＥＳ（（Ｎ−［２−ヒドロキシエチル］ピペラジン−Ｎ’−［２−エタンスルホン酸］）、ＭＥＳ（２−［Ｎ−モルホリノ］エタンスルホン酸）、ＭＯＰＳ（３−［Ｎ−モルホリノ］プロパンスルホン酸）、ＰＩＰＥＳ（ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス［２−エタンスルホン酸］；１，４−ピペラジンジエタンスルホンサン）、ＴＡＰＳ（Ｎ−トリス［ヒドロキシメチル］メチル−３−アミノプロパンスルホン酸；（［２−ヒドロキシ−１，１−ビス（ヒドロキシメチル）エチル］アミノ−１−プロパンスルホン酸）、ＴＥＳ（Ｎ−トリス［ヒドロキシメチル］メチル−２−アミノエタンスルホン酸；２−（［２−ヒドロキシ−１，１−ビス（ヒドロキシメチル）エチル］アミノ）エタンスルホン酸）、またはＴＲＩＣＩＮＥ（Ｎ−トリス［ヒドロキシメチル］メチルグリシン；Ｎ−［２−ヒドロキシ−１，１−ビス（ヒドロキシメチル）エチル］グリシン）が挙げられる。
【００５２】
他の好ましい緩衝剤としては、ギ酸塩、クエン酸塩、酢酸塩、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）−Ｎ’−（２−スルホエチル）ピペラジン、イミダゾール、Ｎ−（２−ヒドロキシエチルピペラジン）−Ｎ’−２−エタンスルホン酸、酢酸トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、またはトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンヒドロクロリドが挙げられる。好ましい実施形態において、緩衝剤は、ＭＥＳ、酢酸ナトリウム、または酢酸、好ましくは酢酸である。緩衝剤または緩衝剤の混合物は、典型的に、２０ｍＭ〜５００ｍＭ、好ましくは２５ｍＭ〜１００ｍＭの濃度で染色溶液中に存在する。緩衝剤が酢酸である場合、約１％〜６％、より好ましくは約３％の濃度で存在する。
【００５３】
染色溶液の特に有利な組成において、この染色溶液は、さらに無機塩を含む。有利な無機塩は、電気泳動ゲル中の糖タンパク質を染色する場合、低いバックグラウンドシグナルを示す染色処方物を生成する。特に有用な安価な塩としては、染色溶液中に、１〜５０％の濃度で存在する、塩化ナトリウム、硫酸アンモニウム、塩化マグネシウム、酢酸マグネシウム、塩化亜鉛、硫酸マグネシウムおよびグルクロン酸マグネシウムが挙げられる。好ましい実施形態において、無機塩は、塩化ナトリウムまたは塩化マグネシウムであり、より好ましくは塩化マグネシウムである。
【００５４】
試薬の有効量は、所望の標的と合わせられた際に検出可能な蛍光応答を提供するのに十分な試薬の量である。溶液中の試薬濃度は、サンプル中の標的と接触し、かつシグナルを与えるのに十分な量の標的と結合するのに十分でなければならないが、多すぎる試薬は、バックグラウンド蛍光またはゲルにおけるスペックリングの問題を生じる。染色溶液の最適な濃度および組成は、サンプルの性質（物理的特性、生物学的特性、生化学的特性および生理学的特性を含む）、試薬−標的相互作用の性質（標的の部位への試薬の輸送速度を含む）、ならびに行われる分析の性質により決定され、そして、以下の実施例に記載される手順と同様の標準的な手順を使用して決定され得る。
【００５５】
標的物質がカルボン酸またはスルホン酸官能基を含む場合、この官能基は、標的物質の特性に基づいて、本発明の試薬を含む染色溶液と合わされる前に、まず活性化されなければならない。典型的なカルボジイミド（例えば、ＥＤＡＣまたはジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ））は、カルボン酸を活性化するために使用され、一方、スルホン酸は、最も頻繁に、標準的な手段によってそれらのスルホニルクロリドの形成を必要とする。カルボン酸およびスルホン酸の試薬付加物は、典型的に、標的物質を特徴付けするために使用されるか、または結合体は、蛍光トレーサーとして使用される。カルボン酸またはスルホン酸は、ゲルまたは溶液中で染色された場合に安定な付加物を形成せず、従って、アルデヒドまたはケトンからそれらを区別する。
【００５６】
染色溶液の一実施形態において、化合物は、上記の式ＸＸＸを有する。好ましい実施形態において、この染色溶液は、下記の化合物５、２０、２１および２３、より好ましくは、化合物５、２０および２３からなる群から選択される化合物を含む。
【００５７】
（サンプルタイプ）
目的の標的は、必要に応じて、生物学的構造体（例えば、生物体または生物体の別個の単位）内に封入されるか、溶液（生物学的構造体を含む溶液を含む）中で遊離しているか、固体または半固体材料中またはその上に固定されるか、あるいは生物学的構造体から（例えば、溶解細胞、組織、生物体または小器官から）抽出される。
【００５８】
本発明の１つの局面において、この標的は生物学的構造体であり、そして必要に応じて細胞または組織である。典型的に、所望の標的を含むサンプルは、液体供給源から直接得られる水溶液または水性混和性溶液であるか、または生物学的構造体が評価のために入れられた個体材料（有機または無機）もしくは増殖培地、または緩衝溶液からの洗浄物として存在する。
【００５９】
本発明の１つの局面において、サンプルは、生物学的流体（分離されたかまたは濾過されていない生物学的流体（例えば、尿、脳脊髄液、血液、リンパ液、組織ホモジネート、間質液、細胞抽出物、粘液、唾液、痰、便、生理学的分泌物または他の類似の流体）を含む）から得られる。あるいは、サンプルは、環境的供給源（例えば、土壌、水または空気）から；または産業的供給源（例えば、廃液流、廃液源、または供給ライン、または製造ロットから採取される）から得られる。産業的供給源はまた、発酵培地（例えば、生物学的反応器または食餌発酵プロセス（例えば、醸造））、または食物（例えば、肉、穀物、食品、卵または乳製品）を含む。
【００６０】
さらに別の実施形態において、サンプルは、固体または半固体のマトリクスであり、そして目的の標的はこのマトリクス上またはこの中に存在する。本発明の１つの局面において、マトリクスは膜である。別の局面において、マトリクスは、タンパク質または核酸の分離および特徴付けのために使用されるような電気泳動ゲルである。別の局面において、マトリクスはシリコンチップ、ガラス繊維、またはガラススライドであり、目的の標的は、このチップ、線維またはスライドに、アレイにおけるように固定される。さらに別の局面において、マトリクスは、ポリマー性微粒子であり、そして標的は、この微粒子の表面に固定される。
【００６１】
サンプルの供給源およびタイプ、ならびに試薬の使用は、試薬の特徴、従って、どの試薬が特定のサンプルを染色するために最も有用であるかを決定する。試薬−標的複合体または試薬結合体の蛍光が、持続性の高強度照射（例えば、顕微鏡）を使用して検出される場合、一般に使用される試薬（例えば、フルオレセイン）より低い光退色速度を有する試薬が、特に生きた細胞における使用のために好ましい。試薬が細胞膜またはゲルを透過するべきである場合、より透過性の試薬が好ましい。細胞膜を迅速かつ容易に透過する試薬は、必ずしも迅速にゲルを透過するとは限らない。
【００６２】
本発明の１つの局面において、サンプルはまた、酸化条件（例えば、強酸（Ｆｅｕｌｇｅｎ反応）、酸化反応、酸化酵素、および化学的酸化試薬）に暴露される。サンプルは、典型的に、このサンプルを酸化剤と合わせることによって、酸化条件に供される。典型的に、酸化剤は、染色溶液と合わされる前に、サンプルに添加される。本発明の１つの局面において、酸化剤は、核酸上にアルデヒドを生成する脱プリン剤である。好ましくは、脱プリン剤は、ＨＣｌである。本発明の別の局面において、酸化剤は過ヨウ化物である。
【００６３】
（試薬−標的複合体の形成）
サンプルは、試薬と標的との間の接触を容易にする任意の手段によって染色溶液と合わされる。この接触は、サンプルが溶液である場合と同様に、簡単な混合によって生じ得る。あるいは、染色溶液は、サンプルに添加されそして得られた合わせられた混合物は、試薬−標的結合体を形成するのに十分な時間インキュベートされる。染色溶液は、マトリクスをふるい分けるかもしくは緩衝液を流す液体分離媒体（例えば、電気泳動液）中、化学的適合性沈降または浮遊密度勾配（例えば、ＣｓＣｌを含む）中、または不活性マトリクス（例えば、ブロット、ゲル、試験片、または任意の他の固体もしくは半固体支持体）上で、標的と接触し得る。適切な支持体としてはまたｈ、ポリマー性微粒子（常磁性微粒子を含む）、ポリアクリルアミドおよびアガロースゲル、ニトロセルロースフィルター、光ファイバ、コンピューターチップ（例えば、シリコンチップ）、天然および合成の膜、リポソームおよび化学的適合性ヒドロゲル、ならびにガラス（光学フィルターを含む）、ならびに他のシリカベースの支持体およびプラスチック支持体が挙げられ得るが、これらに限定されない。試薬は、必要に応じて、ゲル電気泳動またはキャピラリー電気泳動、勾配遠心分離、または他の分離工程の前、分離の間またはサンプルが分離を受けた後に、サンプルと合わされる。あるいは、試薬は、予備成形ゲル電気泳動、キャピラリー電気泳動、または予備形成密度もしくは沈降勾配におけるのと同様に、サンプルの添加の前にキャピラリー中の不活性マトリクスまたは溶液と合わせられる。あるいは、試薬−標的結合体の形成は、有機合成のために使用されるような媒体中で生じる。
【００６４】
標的が生物学的構造に封入される場合、サンプルは、代表的には試薬とインキュベートされる。試薬溶液の添加に際し、いくつかの試薬は生物学的構造を迅速にかつ完全に透過し得るが、この生物学的構造に試薬を輸送するために適切な任意の他の技術はまた、サンプルを問題の試薬と結合する正当な方法である。いくつかの細胞は、それらの細胞膜の透過性に関係なく細胞膜を横切って試薬を活性に輸送する（例えば、生物によるエンドサイトーシスまたは摂取、あるいは他の取り込み機構）。細胞膜を横切って試薬を輸送するための適切な人為的手段としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：界面活性剤、酵素またはアデノシン３リン酸のような化学剤の作用；レセプターまたは輸送タンパク質の媒介する取り込み；リポソームまたはアルギナートヒドロゲル；食作用；小孔形成タンパク質；マイクロインジェクション；エレクトロポレーション；低浸透圧ショック；あるいは、最小限の物理的破壊（例えば、掻き取り（ｓｃｒａｐｅ　ｌｏａｄｉｎｇ）、パッチクランプ法、または、試薬でコートされたかもしくは試薬の存在下の固体粒子を用いるボンバードメント）。好ましくは、インタクトな構造が所望される場合、染色法は、細胞の生存率、および細胞または細胞内膜の整合性の最小限の破壊を引き起こす。あるいは、特に、病原性生物が存在することが予想される場合は、細胞は、慣用的な組織化学手順または細胞化学手順で固定され、そして処理される。固定された後でさえ本発明の試薬と交差反応する遊離アルデヒド基が残存するので、アルデヒド定着液（例えば、アクロレインまたはグルタルアルデヒド）が避けられるべきことは十分に理解されるべきである。しかし、本発明の方法は、パラフィン包埋組織、および１０％緩衝化ホルマリンのような固定化機構に適合性である。
【００６５】
サンプルは、フルオレセイン試薬−標的結合体を形成するために十分な時間にわたって試薬と結合される。標的がゲル中またはブロット上に存在する場合、サンプルは、洗浄後にバックグラウンドに対する高シグナル比を与えるために要求される時間にわたって試薬と結合される。特定の試薬を用いた最適染色は、個々の試料および試料培地の物理的性質および化学的性質、ならびに評価される性質に依存する。最適時間は、通常、経時的な試料の分解を避け、かつ上記試薬に起因するすべてのその他の蛍光シグナルを最小にしながら、最高の標的特異的シグナルを達成するために、用いられている濃度の上記試薬に必要な最小時間である。本発明の試薬が誘導体化試薬として合成的に用いられる場合、混合のための最適時間は、代表的には、実験により決定されるとき、共有結合付加物の最高収率を形成するために必要な最小時間である。好適な収率は、共有結合付加物の定量的形成である。
【００６６】
好ましくは、生物学的標本とともに用いられるとき、上記試薬は、この試薬の操作パラメーター内で、標的の生物学的活性に最適な温度で試料と組み合わせられる（通常０℃〜６０℃の間で、より高い温度で試薬の安定性が減少する）。インビトロアッセイには、この試薬は、代表的には、ほぼ室温で（２３℃）試料と組み合わせられる。
【００６７】
本発明の方法は、種々の適用で標的分子を標識するために有用であり、これには、電気泳動ゲル；薄層クロマトグラム；ブロット、チップ、ストリップおよびその他の表面上に存在する標的；フローサイトメトリー、ＨＰＬＣ、キャピラリー電気泳動、および微小流動デバイスのようなフローシステムに存在する標的；およびマルチウェルプレート中の溶液中が含まれ、自動化された方法による高スループットスクリーニングを容易にする。いくつかの事例では、標的物質は、分離技法の前に本発明の試薬で標識される。あるいは、標的物質は、本発明の試薬で標識される前に、電気泳動ゲル中または表面上におけるように、最初に分離される。
【００６８】
（付加的な試薬）
本発明の方法は、必要に応じて、サンプル混合物、染色溶液、または合わされた混合物と同時または順次に合わされる１つ以上の付加的な試薬をさらに含む。付加的な試薬は、必要に応じて、標的または他の被分析物と共存してそれらの検出を増強する検出試薬である。付加的な試薬は、必要に応じて、サンプル混合物の他の成分または特徴の同定のために有用であるように選択される（例えば、ポリ（アミノ酸）染色（ｓｔａｉｎ）、核酸染色、脂質または炭水化物についての染色、またはｐＨ指示薬）。あるいは、付加的な試薬は、サンプル混合物の特定の成分（例えば、抗体または抗体結合体）についてプローブするように、サンプル混合物の特定の部分と相互作用するように設計された検出試薬である。ここで、試薬−標的結合体および検出試薬の空間的な一致が、付加的な試薬もまた標的と結合していることを示す。
【００６９】
付加的な試薬はまた、検出可能な応答を生成するための手段を組み込む。検出可能な応答は、直接の観察または器具使用のいずれかにより認識され得る試験系におけるパラメーターの変化または出現を意味する。このような検出可能な応答としては、代表的には、色、蛍光、反射率、ｐＨ、化学発光、赤外スペクトル、磁気特性、放射能、光散乱、Ｘ線散乱、または電子リッチ生成物の沈殿の変化または出現が挙げられる。検出可能な応答を提供するための適切な手段としては、可視または蛍光染料、化学発光試薬、酵素作用の際に可視または蛍光沈殿物を生成する酵素基質（例えば、ジアミノベンジジンに対する西洋ワサビペルオキシダーゼの作用、または標識チラミド（ｔｙｒａｍｉｄｅ）に対する酵素作用）、可視または蛍光標識微粒子、金属（例えば、コロイド金、または銀含有試薬）、または試薬に対する光の作用により放出されるシグナル（例えば、光分解、またはジアミノベンジジンに対する光の作用により活性化されるケージ化発蛍光団）または放射性シグナルが挙げられるが、これらに限定されない。付加的な試薬の検出可能なシグナルは、本発明の結合体の光学シグナルと同時または順次に検出される。
【００７０】
本発明の１つの実施形態では、付加的な検出試薬は、重複するスペクトル特徴を示すように選択される。これにより試薬−標的結合体と検出試薬との間でエネルギー転移が発生し、延長されたストークスシフトを示す標識化された標的を生じる。あるいは、付加的な検出試薬は、いくつかまたは全ての標的の標識化がクエンチングを示すように、試薬−標的結合体と共存する。
【００７１】
有用なさらなる検出試薬の１つのクラスは、蛍光核酸染料である。種々の適切な核酸染料が当該分野で公知であり、これらとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：チアゾールオレンジ、エチジウムホモダイマー、エチジウムブロミド、ヨウ化プロピジウム、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３２５８、およびＤＡＰＩ。さらなる有用な核酸染料は、国際出願　ＷＯ９３／０６４８２、ＤＩＭＥＲＳ　ＯＦ　ＵＮＳＹＭＭＥＴＲＩＣＡＬ　ＣＹＡＮＩＮＥ　ＤＹＥＳ（９３年４月１日公開）またはＷＯ９４／２４２１３、ＣＹＣＬＩＣ　ＳＵＢＳＴＩＴＵＴＥＤ　ＵＮＳＹＭＭＥＴＲＩＣＡＬ　ＣＹＡＮＩＮＥ　ＤＹＥＳ（９４年１０月２７日公開）；Ｙｕｅら、１９９４に対する米国特許第５，３２１，１３０号；またはＹｕｅら、１９９５に対する米国特許第５，４１０，０３０号（全て本明細書中に参考として援用される）に記載される。本発明の試薬とともに適切な核酸染料を使用することは、所望の標的および核酸（例えば、ＤＮＡおよびＲＮＡ）の同時観察または逐次観察を可能にする。
【００７２】
有用なさらなる検出試薬の別のクラスは、蛍光タンパク質染料である。種々の適切なタンパク質染料が当該分野で公知であり、これらとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：国際出願ＷＯ００／２５１３９、ＬＵＭＩＮＥＳＣＥＮＴ　ＰＲＯＴＥＩＮ　ＳＴＡＩＮＳ　ＡＮＤ　ＴＨＥＩＲ　ＭＥＴＨＯＤ　ＯＦ　ＵＳＥ（２０００年５月４日公開）またはＨａｕｇｌａｎｄら，１９９７に対する米国特許第５，６１６，５０２号（参考として援用される）に記載されるもの。選択された好ましい蛍光タンパク質染料は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）により登録商標ＳＹＰＲＯ　ＲＥＤ、ＳＹＰＲＯ　ＯＲＡＮＧＥ、ＳＹＰＲＯ　ＲＯＳＥ、ＳＹＰＲＯ　ＲＯＳＥ　ＰＬＵＳ、およびＳＹＰＲＯ　ＲＵＢＹのもとで市販される。本発明の試薬とともに適切なタンパク質染料を使用することは、サンプル中に存在する所望の標的および総タンパク質の同時観察または逐次観察を可能にする。
【００７３】
有用なさらなる検出試薬のさらなるクラスは、蛍光標識抗体、レクチンまたはアビジン、特に、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ　ＰＲＯＢＥＳ，ＩＮＣ．，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲから市販されるＯＲＥＧＯＮ　ＧＲＥＥＮ染料またはＡＬＥＸＡ　ＦＬＵＯＲ染料で標識されたものである。
【００７４】
１つの実施形態において、さらなる試薬は、検出可能な標識を有する特異的結合対のメンバーを含む。代表的な特異的結合対は、表１に示される。
【００７５】
【表１】
2004510767.tif 000007
さらなる検出試薬を酵素結合体とともに用いて、さらなる試薬の検出可能な応答を位置決定する。酵素媒介技術は、特異的結合対の間の誘引を利用して、種々の分析物を検出する。一般に、酵素媒介技術は、特異的結合対または一連の特異的結合対の１つのメンバーに結合させた酵素を試薬として使用して、その対またはその一連の対の相補的メンバーを検出する。最も単純な場合では、１つの特異的結合対のメンバーのみが用いられる。特的結合対の１つのメンバーは分析物（すなわち、分析が目的とされる物質）である。酵素をその対の他方の（相補的な）メンバーに結合させて、相補的な結合対を形成する。あるいは、複数の特異的結合対が、分析物、相補的結合対またはその両方に対して逐次連結され得、分析物と、特異的結合複合体に挿入された相補的結合対の検出可能な酵素との間に挿入された一連の特異的結合対となる。
【００７６】
さらなるクラスの好ましい検出試薬としては、標識抗体、イオン指示薬（Ｎａ＋指示薬、Ｃａ＋指示薬、またはｐＨ指示薬を含む）、細胞小器官染料、細胞生存率指示薬または化学的反応染料が挙げられる。
【００７７】
（照射および観察）
染色後または染色中の任意の時点で、サンプルは、その試薬を励起し得る波長の光で照射されて、検出可能な光学応答を生じ、そして光学応答を検出するための手段で観察される。本発明の染料化合物を照射するために有用である機器としては、携帯型紫外線ランプ、水銀アークランプ、キセノンランプ、レーザーおよびレーザーダイオードが挙げられるがこれらに限定されない。これらの照射源は必要に応じて、レーザースキャナー、蛍光マイクロプレートリーダー、標準もしくはミニ蛍光測定器、またはクロマトグラフ検出器と一体化される。
【００７８】
検出可能な光学応答とは、観察または機器のいずれかによって検出可能である、光学シグナルの変化または発生を意味する。代表的には、検出可能な応答は、蛍光変化（例えば、蛍光の強度、励起もしくは発光波長分布、または蛍光寿命、蛍光偏光、またはそれらの組み合わせの変化）である。標準または予想される応答と比較した、染色の程度および／または位置は、サンプルが所定の特徴を有するか否か、およびその程度を示す。
【００７９】
光学的応答を、必要に応じて、目視によるか、または以下のデバイス：ＣＣＤカメラ、ビデオカメラ、写真フィルム、レザー走査型デバイス（ｌａｓｅｒ−ｓｃａｎｎｉｎｇ　ｄｅｖｉｃｅｓ）、フルオロメーター、フォトダイオード、量子カウンター、エピ蛍光顕微鏡（ｅｐｉｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅｓ）、走査顕微鏡、フローサイトメーター、蛍光マイクロプレートリーダーのいずれかを用いることによるか、またはシグナルを増幅するための手段（例えば、光電子増倍管）により、検出する。このサンプルが、フローサイトメーターを用いて試験される場合、サンプルの試験は、必要に応じて、これらの蛍光応答に従ってサンプルの部分を選別することを含む。
【００８０】
光学的応答の存在は、必要に応じて、試験サンプル中の分析物の存在を同定するために用いられる。あるいは、検出可能な光学応答は、定量され、そしてサンプル混合物中の標的の濃度を測定するために用いられる。定量は、代表的には、用意された標準または検量線に対する光学的応答の比較により行われる。代表的には、測定した光学的応答は、電気泳動ゲルまたは膜の中の標的の既知濃度の標準希釈から得た応答と比較される。一般に、検量線は、精確な測定が所望される場合に作成されなければならない。あるいは、検量線は、所望される試薬−標的複合体に対して標準化されている参照色素または染色した粒子との比較により作成される。
【００８１】
１つの局面において、染色した電気泳動ゲルを用いて、複合体サンプル混合物の比較を分析し、さらに、このような混合物中の特定の標的の相対量を決定する。
【００８２】
（比較／弁別アッセイ）
本発明の方法は、以下のアッセイをさらに包含する：２つのサンプルまたは同じサンプルの２つのアリコートを、本発明の試薬を用いて各々処理し、次いで、各サンプルおよび／またはアリコートの光学的応答を比較する。
【００８３】
本方法の１つの局面では、各アリコートは、同じ起源のサンプル由来である。しかし、１つのアリコートが１つの試薬を用いて処理されるかまたは１つの条件に曝露される一方で、別のアリコートはコントロールとして用いられる。本方法の別の局面では、各サンプルは、異なる組成物を有し、そしてこのサンプルは、両サンプルが本発明の試薬を用いて処理された後に比較される。本発明のさらなる局面では、このサンプルは、細胞および組織の場合、多分散系であり、そして標的は、空間的に分解（ｒｅｓｏｌｖｅ）される。このサンプルを、必要に応じて、酸化状態に曝露し、酸または酵素を用いて処理した後、染色液を添加する。さらに、各サンプルを、必要に応じて、染色液を用いる処理の前または後に分離工程に供する。
【００８４】
本方法のより抜きの実施形態は、以下を包含する：
・２つの処理したサンプルの成分の電気泳動移動度を比較して、サンプル中の差異を強調表示すること。
・粘膜グラム陰性細菌の表面に曝露されるリポオリゴサッカリドを検出することにより、グラム陽性細菌とグラム陰性細菌とを区別すること（実施例２６を参照のこと）。
・グリコシダーゼにより処理したタンパク質を適切な陰性コントロールと比較すること。
・ガラクトースオキシダーゼにより処理したタンパク質を適切な陰性コントロールと比較すること。
・官能化糖結合体により処理した細胞を適切な陰性コントロールと比較すること。
・（フォイルゲン反応による処理の後）ＤＮＡ含量に基づいて細胞を弁別すること。
・酸化状態に供した細胞表面タンパク質を、酸化されていない内在タンパク質から弁別すること。
・正常な細胞と腫瘍細胞とを弁別すること。
・グリコシル化アルブミンを、非グリコシル化アルブミンから区別すること。
・糖質含量における差異により（必要に応じて、フローサトメトリー）血球の型を弁別すること。
【００８５】
（キット）
本発明の試薬の用途の簡便性に起因して、本発明の試薬は、選択した標的の標識のキットの処方に有用であり、このキットは、１つ以上の試薬（好ましくは、ストック溶液）、所望の標的を標識または検出するための試薬の用途に関する指示書を含み、そして、必要に応じて、標的標準および他の成分（例えば、無機塩、緩衝液、または洗浄液）を含む。１つの実施形態では、本発明のキットは、本発明の試薬のストック溶液および１つ以上のさらなるキット構成要素を含む。
【００８６】
さらなるキット構成要素は、限定することなく、酸、緩衝剤、無機塩、極性溶媒、ならびに陽性コントロールおよび陰性コントロールから選択され得る。さらなるキット構成要素は、純粋な組成物としてか、または１つ上のさらなるキット構成要素を含む水溶液として存在する。任意のまたは全てのキット構成要素は、必要に応じて、さらに、緩衝液を含む。さらなるキット構成要素が、無機塩である場合、これは、代表的には、ナトリウム塩またはマグネシウム塩である。
【００８７】
本発明の１つの局面では、キットは、酸化剤（好ましくは過酸化塩）、有機溶媒中の本発明の試薬のストック溶液、さらに無機塩を含む緩衝溶液、分子量標準、および、必要に応じて、蛍光総タンパク質染色であるさらなる検出試薬を含む。好ましくは、染色溶液中の化合物は、式ＸＸＸである。本発明の別の局面では、キット中の染色溶液は、化合物５、２０、２１、または２３；好ましくは、５、２０、または２３を含む。
【００８８】
以下の実施例は、本発明の実施を例示するために提供する。これらの実施例は、本発明の範囲全体を限定または規定する意図はない。
【００８９】
（実施例１．化合物１の調製）
【００９０】
【化１８】
2004510767.tif 000008
アントラニルアミド（０．２ｍｏｌ）および２−ニトロベンズアルデヒド（０．２２ｍｏｌ）を、無水エタノール（ＥｔＯＨ，１Ｌ）に溶解する。このＥｔＯＨ溶液に、ｐ−トルエンスルホン酸一水和物（ＴｓＯＨ，０．０１ｍｏｌ）を添加する。この反応混合物を室温で２時間攪拌し、次いで、アントラニルアミドが完全に消費するまで還流する。この反応混合物を室温まで冷却し、そしてさらなる精製なしで次の工程の反応に直接使用する。
【００９１】
（実施例２．化合物２の調製）
【００９２】
【化１９】
2004510767.tif 000009
実施例１において調製した粗製の化合物１（０．２ｍｏｌ）の溶液に、２，３−ジクロロ−５，６−ジシアノ−１，４−キノン（ＤＤＱ，０．２１ｍｏｌ）を室温でゆっくりと添加する。この反応混合物を、化合物１が完全に消費するまで室温で攪拌する。この反応混合物を、減圧下で濃縮し、そして濾過して得られる沈殿物を集める。残余のＤＤＱおよび２，３−ジクロロ−５，６−ジシアノ−１，４−ジヒドロキノンが完全に除去されるまで、この粗製固体を、冷却した１：１のＥｔＯＨ／ベンゼンで洗浄する。この粗製物質を、さらに再結晶して（ＥｔＯＨ／エチルエーテルから）、所望の生成物（５１ｇ）を得る。
【００９３】
（実施例３．化合物３の調製）
【００９４】
【化２０】
2004510767.tif 000010
テトラヒドロフラン（５００ｍＬ）中の化合物２（０．１ｍｏｌ）の溶液に、塩化スズ（ＩＩ）（０．５ｍｏｌ）を室温でゆっくりと添加する。この反応混合物を、化合物２が完全に消費するまで５０〜６０℃に加熱する。この溶液を、砕氷／２ＭのＨＣｌに慎重に注ぎ、そして濾過して得られた固体を集める。この粗製固体を水に懸濁し、そしてＮａＨＣＯ３でｐＨ８．０〜９．０まで中和する。得られた懸濁液を濾過して、固体を得る。この粗製物質を、水で洗浄し、乾燥し、そして再結晶して、所望の生成物（２４ｇ）を得る。
【００９５】
（実施例４．化合物４の調製）
【００９６】
【化２１】
2004510767.tif 000011
Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ，５０ｍＬ）中の化合物３（１０ｍｍｏｌ）の溶液に、４−フルオロスルホニルベンゾイルクロリド（１１ｍｍｏｌ）を室温でゆっくりと添加する。この反応混合物を、化合物３が完全に消費するまで室温で攪拌する。次いで、この溶液を、砕氷／水に慎重に注ぎ、そして濾過して得られる固体を集める。この粗製固体をＤＭＦに再溶解し、そしてエチルエーテルで沈殿させる。この可溶化／沈殿プロセスを２回繰り返し、所望の生成物（３．８ｇ）を得る。
【００９７】
（実施例５．化合物５の調製）
【００９８】
【化２２】
2004510767.tif 000012
無水ヒドラジンのメタノール溶液（５０ｍｍｏｌ，５ｍＬ）に、化合物４のＤＭＦ溶液（５ｍｍｏｌ，５ｍＬ）をゆっくりと添加する。この反応混合物を、化合物４が完全に消費するまで室温で攪拌する。この溶液を、減圧下で濃縮し、水に注ぎ、そして濾過して得られる固体を集める。この粗製固体を、ＤＭＦに再溶解し、そして水で沈殿させる。この可溶化／沈殿プロセスを、残余ヒドラジンが完全に除去されるまで繰り返す（ニンヒドリン噴霧法によるＴＬＣ検出）。この粗製物質を、ＥｔＯＨから再結晶して、黄色／緑色の蛍光を有する所望の生成物（１．８ｇ）を得る。
【００９９】
（実施例６．化合物６の調製）
【０１００】
【化２３】
2004510767.tif 000013
化合物３のＴＨＦ懸濁液（０．５ｍｍｏｌ，５ｍＬ）に、チオホスゲン（５ｍｍｏｌ，５ｍＬ）をゆっくりと添加する。この反応混合物を、化合物３が完全に消費するまで加熱還流する。得られた溶液を減圧下でエバポレートし、そしてこの残渣をエーテルで洗浄する。この粗製固体を、さらなる精製なしで次の工程の反応に直接使用する。
【０１０１】
（実施例７．化合物７の調製）
【０１０２】
【化２４】
2004510767.tif 000014
無水ヒドラジンのＤＭＦ溶液（５ｍｍｏｌ，０．５ｍＬ）に、化合物６のＤＭＦ溶液（０．５ｍｍｏｌ，０．５ｍＬ）をゆっくりと添加する。この反応混合物を、化合物６が完全に消費するまで室温で攪拌する。この溶液を、水に注ぎ、そして濾過して、得られる固体を集める。この粗製固体をＤＭＦに再溶解し、そして水で沈殿させる。この可溶化／沈殿プロセスを、この残余ヒドラジンが完全に除去されるまで繰り返す。この粗製物質を、ＥｔＯＨから再結晶して、青色の蛍光を有する所望の生成物（１．８ｇ）を得る。
【０１０３】
（実施例８．化合物８の調製）
【０１０４】
【化２５】
2004510767.tif 000015
化合物８を、５−ニトロアントラニルアミドおよびサリチルアルデヒド（ｓａｌｉｃｙａｌｄｅｈｙｄｅ）を使用して、化合物１と同様に調製する。
【０１０５】
（実施例９．化合物９の調製）
【０１０６】
【化２６】
2004510767.tif 000016
化合物９を、化合物２の手順のように、化合物８の酸化によって調製する。
【０１０７】
（実施例１０．化合物１０の調製）
【０１０８】
【化２７】
2004510767.tif 000017
化合物１０を、化合物３の手順のように、化合物８の還元によって調製する。化合物１０は、緑色の蛍光を示す。
【０１０９】
（実施例１１．化合物１１の調製）
【０１１０】
【化２８】
2004510767.tif 000018
濃塩酸（１０ｍＬ）中の化合物１０（０．１ｍｍｏｌ）の冷却懸濁液に、反応温度を０〜５℃に維持しながら、９５％ＮａＮＯ２（０．１１）をゆっくりと添加する。この反応混合物を、化合物１０が完全に消費するまで室温で攪拌する。この反応混合物を、過剰の亜硝酸についてヨウ素デンプン紙で検査し、次いで、この亜硝酸を少量の尿素の添加によって破壊する。得られる溶液を、次の反応に直接使用する。
【０１１１】
（実施例１２．化合物１２の調製）
【０１１２】
【化２９】
2004510767.tif 000019
上記で調製した粗製化合物１１（０．１ｍｏｌ）の溶液に、５Ｍの水性塩化スズ（ＩＩ）（０．３ｍｏｌ，濃ＨＣｌ中）を室温でゆっくりと添加する。この反応混合物を、化合物１１が完全に消費するまで室温で攪拌する。この反応混合物を水で希釈し、そして濾過して、得られる沈殿物を得、これを水で繰り返し洗浄して、残余塩化スズを除去する。得られる固体を水に懸濁させ、そしてＮａＨＣＯ３で中和する（ｐＨ７．０〜７．５）。この混合物を濾過して沈殿物を集め、この沈殿物をさらに水で洗浄する。この固体を乾燥し、そしてＥｔＯＨから再結晶して、緑色蛍光を有する所望の生成物（６７ｍｇ）を得る。
【０１１３】
（実施例１３．化合物１３の調製）
【０１１４】
【化３０】
2004510767.tif 000020
アントラニル酸（１０ｍｍｏｌ）および２−ヒドロキシベンズアルデヒド（１２ｍｍｏｌ）を、ポリリン酸（１０ｍＬ）に溶解する。この反応混合物を、４〜６時間６０〜７０℃に加熱する。次いで、この溶液を室温まで冷却し、そして氷／水に注ぐ。得られる沈殿物を濾過によって集め、そして水で洗浄する。この粗製物質を、５：１のクロロホルム／酢酸エチルで溶出するシリカゲルカラム上でさらに精製して、所望の生成物（１．２ｇ）を得る。
【０１１５】
（実施例１４．化合物１４の調製）
【０１１６】
【化３１】
2004510767.tif 000021
無水ヒドラジンのメタノール溶液（５ｍｍｏｌ，５ｍＬ）に、化合物１３のメタノール溶液（１ｍｍｏｌ，５ｍＬ）をゆっくりと添加する。次いで、この反応混合物を、化合物１３が完全に消費するまで５０〜６０℃に加熱する。次いで、この溶液を減圧下で濃縮し、水に注ぎ、そして濾過して得られる固体を集める。この粗製固体をＤＭＦに溶解させ、そして水で沈殿させる。この可溶化／沈殿プロセスを、残余ヒドラジンが完全に除去されるまで繰り返す。この粗製物質を酢酸エチルから再結晶して、青色蛍光を有する所望の生成物（１．８ｇ）を得る。
【０１１７】
（実施例１５．化合物１５の調製）
【０１１８】
【化３２】
2004510767.tif 000022
化合物１５を、化合物３およびヘキサフルオログルタル酸無水物を使用して、化合物４についての手順のように調製する。
【０１１９】
（実施例１６．化合物１６の調製）
【０１２０】
【化３３】
2004510767.tif 000023
化合物１５のメタノール溶液（１ｍｍｏｌ，２５ｍＬのＭｅＯＨ）に、０．１ｍＬの濃硫酸を添加する。この反応混合物を、化合物１５が完全に消費するまで５０〜６０℃に加熱する。得られる溶液を減圧下で濃縮し、水に注ぎ、そして濾過して得られる固体を集める。この粗製固体を、ｐＨが６．０〜７．０になるまで水で洗浄し、そしてクロロホルム／メタノールの勾配混合物で溶出するシリカゲルカラム上で精製する。
【０１２１】
（実施例１７．化合物１７の調製）
【０１２２】
【化３４】
2004510767.tif 000024
無水ヒドラジンのメタノール溶液（５ｍｍｏｌ，５ｍＬ）に、化合物１６のメタノール溶液（１ｍｍｏｌ，５ｍＬ）をゆっくりと添加する。この反応混合物を、化合物１６が完全に消費するまで室温で攪拌する。得られる溶液を減圧下で濃縮し、水に注ぎ、そして濾過して得られる固体を集める。この粗製固体をメタノールに再溶解し、そして水で沈殿させる。この可溶化／沈殿プロセスを、残余ヒドラジンが完全に除去されるまで繰り返す。この粗製物質を、酢酸エチルから再結晶して、緑色の蛍光を示す所望の生成物（２１３ｍｇ）を得る。
【０１２３】
（実施例１８．化合物２０〜３４の調製）
化合物２０〜３４を、表２に示される手順に従って調製する。
【０１２４】
【表２】
2004510767.tif 000025
2004510767.tif 000026
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（実施例１９．ＳＤＳポリアクリルアミドゲルにおける糖タンパク質の検出）
目的のタンパク質を、標準的な手順に従い、４％　Ｔ、２．６％　Ｃのスタッキングゲル（ｐＨ６．８）および１５％　Ｔ、２．６％　Ｃの分離ゲル（ｐＨ８．８）を用いてＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離した。％Ｔは、総モノマー濃度（アクリルアミド＋架橋剤）であり、１００ｍＬあたりのグラムで表わされ、％Ｃは、クロスリンカー（例えば、Ｎ，Ｎ’−メチレン−ビス−アクリルアミド、Ｎ，Ｎ’−ジアクリロイルピペラジン、または他の適切な薬剤）の割合（％）である。電気泳動後、ゲルを５０％メタノール中で３０分間、３％酢酸中で５分間（２回交換）、次いで３％酢酸中に調製された１％過ヨウ素酸中で３０分間、インキュベートした。代替の酸化剤としては、クロム酸、過マンガン酸塩、四酢酸鉛、ビスマス酸ナトリウム、酢酸マンガン、またはフェニルヨード酢酸塩が挙げられ得る。次いで、ゲルを１０分間、３％酢酸中で洗浄し（４回）、そして５μＭ化合物５、３％酢酸、２％ジメチルホルムアミドおよび０．２５Ｍ塩化マグネシウムの溶液中で３０〜１２０分間インキュベートした。この塩は省略してもよいが、染色強度が減少される。他の塩が塩化マグネシウムの代わりに使用され得、これらとして塩化ナトリウムおよび硫酸マグネシウムが挙げられる。この試薬を用いた標識の後、ゲルを３％酢酸中で５分間リンスした（２回）。糖タンパク質を、３００ｎｍＵＶトランスイルミネーターを用いて可視化し得た。タンパク質は、透明なバックグラウンドに緑色の発光バンドとして現れた（化合物５で標識したα１−酸性糖タンパク質に対する蛍光励起／発光スペクトルは図１に与えられる）。
【０１２５】
（実施例２０．等電点電気泳動ゲル中の糖タンパク質の検出）
等電点電気泳動（ＩＥＦ）は、異なる化学特性を有しｐＨ勾配を生じる種々のプレキャストゲルおよび実験室で調製されたゲルを用いて実施され得る。この場合、Ｍｕｌｔｉｐｈｏｒ　ＩＩ電気泳動ユニット（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）を用い製造者の説明書に従って、１５００ボルト−時間、Ａｍｐｈｏｌｉｎｅ　ＰＡＧプレートを用いて水平に泳動した。もう１つの代替方法では、１ｍｍＩＥＦ変性スラブゲルを、９Ｍ尿素、２％　ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、および２％両性電解質キャリアを含む４％　Ｔ、２．６％　Ｃのポリアクリルアミドゲルマトリクスを用いて成形した。電気泳動を、アノードバッファーおよびカソードバッファーとしてそれぞれ１０ｍＭリン酸および１００ｍＭ水酸化ナトリウムを用いて、Ｍｕｌｔｉｐｈｏｒ　ＩＩ電気泳動ユニットで１５００ボルト−時間実施した。ゲル中の糖タンパク質の発光染色を、５０％メタノール中に３０分間、３％酢酸中で５分間（２回交換）、次いで３％酢酸中の１％過ヨウ素酸中に３０分間、このゲルを浸すことにより実施した。次いでゲルを、３％酢酸中で１０分間洗浄し（４回）、次いで５μＭ化合物２３、３％酢酸、２％ジメチルホルムアミド、および０．２５Ｍ塩化マグネシウムの溶液中で３０〜１２０分間インキュベートした。次いでゲルを、水でそれぞれ１時間リンスし（２回交換）、そして３００ｎｍのＵＶ光源を用いた照射により可視化した。糖タンパク質は、透明のバックグラウンドに緑色の発光バンドとして現れた。
【０１２６】
（実施例２１．二次元ゲル中の糖タンパク質の検出）
マウス３Ｔ３繊維芽細胞溶解物のタンパク質混合物を８Ｍ尿素、２％　ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、２％両性電解質キャリア、１００ｍＭジチオトレイトール、０．１％ドデシル硫酸ナトリウム、１２．５ｍＭ　Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）中に溶解した。約５０μｇのタンパク質を、９Ｍ尿素、２％　ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、および２％両性電解質キャリアを含む４％　Ｔ、２．６％　Ｃのポリアクリルアミドゲルマトリクスからなる直径１ｍｍ、長さ２０ｃｍの等電点電気泳動ゲルにアプライした。ゲルを、アノードバッファーおよびカソードバッファーとしてそれぞれ１０ｍＭリン酸および１００ｍＭ水酸化ナトリウムを用いて、１８００ボルト−時間、垂直方向に泳動した。等電点電気泳動ゲルを、０．３Ｍ　Ｔｒｉｓ塩基、０．０７５Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、３％　ＳＤＳ、０．０１％ブロモフェノールブルー中で２０分間インキュベートした。次いで等電点電気泳動ゲルを、厚さ１ｍｍ、２０ｃｍ×２０ｃｍ、１２．５％　Ｔ、２．６％　Ｃのポリアクリルアミドゲル（３７５ｍＭ　Ｔｒｉｓ塩基（ｐＨ８．８）含有）の上部に置いて、そしてＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動を、カソード電極バッファーが５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ、３８４ｍＭグリシン、４％ドデシル硫酸ナトリウム、ｐＨ８．８であり、一方アノード電極バッファーが２５ｍＭ　Ｔｒｉｓ、１９２ｍＭグリシン、２％ドデシル硫酸ナトリウム，ｐＨ８．８であることを除いて標準的な手順に従って実施した。二次元電気泳動後、ゲルを５０％メタノール中で３０分間、３％酢酸中で５分間（２回）、次いで３％酢酸中の１％過ヨウ素酸中で３０分間インキュベートした。次いでゲルを、３％酢酸中で１０分間洗浄し（４回）、次いで５μＭ化合物５、３％酢酸、２％ジメチルホルムアミド、および０．２５Ｍ塩化マグネシウムの溶液中で３０〜１２０分間インキュベートした。ゲルをｄｄＨ２Ｏ中で１０〜１５分間リンスし、そして３００ｎｍＵＶトランスイルミネーターを用いて可視化した。糖タンパク質は、透明なバックグラウンドに緑色の発光スポットとして現れた。このサンプル中の大部分の糖タンパク質が、５．５未満の等電点を有することが観察された。
【０１２７】
（実施例２２．二次元ゲル中のグリコシル化タンパク質および非グリコシル化タンパク質の連続二色検出）
二次元ゲル電気泳動を、実施例２１に記載されるように実施した。さらに糖タンパク質の検出を、同じ方式で実施した。緑色の蛍光糖タンパク質からのシグナルを、５２０ｎｍバンドパスフィルターを用いた標準的なＣＣＤカメラに基く画像化システムを用いて集めた。糖タンパク質の検出後、ＳＹＰＲＯ　ＲＵＢＹタンパク質ゲル染色（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、Ｏｒｅｇｏｎ）を用い、染料中で３〜２０時間インキュベートし、次いで７％酢酸、１０％メタノール中で３０分間インキュベートすることにより、このゲルを染色した。グリコシル化タンパク質および非グリコシル化タンパク質からのオレンジ色のシグナルを、６００ｎｍバンドパスフィルターまたは６１０ｎｍロングパスフィルターを用いた標準的なＣＣＤカメラに基く画像化システムを用いて集めた。
【０１２８】
（実施例２２ａ．二次元ゲル中のグリコシル化および非グリコシル化タンパク質の二色検出）
あるいは、まず二次元ゲルをＳＹＰＲＯ　ＲＵＢＹタンパク質ゲル染色を用いて染色した後に、化合物５を用いて糖タンパク質を検出し得た。両方の試薬は、３００ｎｍＵＶ照射により励起されたが、これらの最大発光は８０ｎｍ異なる。標準的なＵＶトランスイルミネーターを用いた照射において、グリコシル化タンパク質は緑色で現れたが、非グリコシル化タンパク質は、オレンジ色で現れた。標準的なＣＣＤカメラに基く画像化システムを用いて、この２つのシグナルを、化合物５からのシグナルを集めるための５２０ｎｍバンドパスフィルターおよびＳＹＰＲＯタンパク質ゲル染色からのシグナルを集めるための６４０ｎｍバンドパスフィルターを別々に用いて画像化し得た。
【０１２９】
（実施例２３．ＰＶＤＦメンブレンまたはニトロセルロースメンブレンに電気ブロットされた糖タンパク質の検出）
目的のタンパク質をＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動により分離し、そして標準的な手順を用いてＰＤＶＦメンブレンまたはニトロセルロールメンブレンに転写した。ドットブロッティングまたはスロットブロッティングの後に、メンブレンを風乾し、その後の染色工程時のタンパク質の損失を最小化させた。その後、このメンブレンを、５０％メタノール（ＰＶＤＦメンブレン用）または１０％メタノール（ニトロセルロースメンブレン用）中に３０分間、３％酢酸中に５分間（２回）、次いで３％酢酸中の１％過ヨウ素酸中に３０分間浸した。次いでブロットを３％酢酸中で５〜１０分間洗浄した（３回または４回）。次いでブロットを、５μＭ化合物５、３％酢酸、２％ジメチルホルムアミド、および０．２５Ｍ塩化マグネシウムの溶液中で３０〜１２０分間インキュベートした。このメンブレンをｄｄ−Ｈ２Ｏ中でそれぞれ５分間ずつ４回インキュベートした。このメンブレンを風乾し、そしてその後、反射性または透過性の３００ｎｍＵＶ光源を用いた可視化した。糖タンパク質は、薄青または緑色のバックグラウンドに明るい緑色の発光バンドとして現れた。緑色の蛍光糖タンパク質からのシグナルを５２０ｎｍバンドパスフィルターを用いた標準的なＣＣＤカメラに基く画像化システムを用いて集めた。ＰＶＤＦメンブレン上のグリコシル化タンパク質および非グリコシル化タンパク質の連続二色検出を、１０％メタノール、７％酢酸の溶液に１０分間、メンブレン表面を下に向けて浮かべ、続いてＳＹＰＲＯ　ＲＵＢＹブロット染色により１５分間表面を染色することにより達成した。このメンブレンを、表面を下に向けて水で５分間、３回洗浄した。このメンブレンを風乾させた。総タンパク質からの蛍光シグナルを、５２０ｎｍロングパスフィルターを用いた標準的なＣＣＤカメラに基く画像化システムを用いて検出した。非グリコシル化タンパク質および糖タンパク質の代替的な二色検出は、６４０ｎｍロングパスフィルターを用いて集められたＳＹＰＲＯ　Ｒｕｂｙ染色に起因するオレンジ色の蛍光シグナルにより達成され、化合物５で染色された糖タンパク質に起因する緑色のシグナルを、５２０ｎｍバンドパスフィルターを用いて集めた。あるいは、電気ブロットされたタンパク質を含むＰＶＤＦメンブレンを、上述のように、ＳＹＰＲＯ　ＲＵＢＹタンパク質ブロット染色により染色し、続いて化合物５で染色し、そして上述のように連続二色染色を達成した。
【０１３０】
（実施例２４．脱グリコシル化酵素を用いた移動度シフトゲル分析、および総タンパク質の可視化のためのＳＹＰＲＯ　ＲＵＢＹタンパク質ゲル染色またはグリコシル化タンパク質の検出のための本発明の試薬のいずれかを用いた検出）
このアッセイにおいて、糖タンパク質を、グリコシダーゼ酵素と共にインキュベートし、そしてＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動を用いて未消化のタンパク質と比較した。脱グリコシル化を、市販のキット（例えば、Ｐｒｏｚｙｍｅ　Ｇｌｙｃｏｐｒｏ　Ｄｅｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ　ｋｉｔ（Ｐｒｏｚｙｍｅ　Ｉｎｃ、Ｓａｎ　Ｌｅａｎｄｒｏ、ＣＡ））を用いた標準的な方法により実施した。代表的に、これらのキットは、Ｎ結合グリカンを除去するためのＰＮＧａｓｅＦ、Ｏ結合グリカンを除去するためのエンド−Ｏ−グリコシダーゼ、およびシアル酸残基を除去するためのシアリダーゼＡを含む。コントロールの未消化タンパク質を、標準的な１３％ＳＤＳポリアクリルアミドゲルのレーンに充填し、グリコシダーゼとインキュベーションした後の対応するタンパク質も同様に充填した。適切な試験タンパク質としては、α１−酸性糖タンパク質、西洋ワサビベルオキシダーゼ、ウシフェツイン；オボアルブミンおよびＰＨＡ−Ｍレクチンが挙げられる。ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動を、標準的な手順により実施した。連続二色染色を実施例２２に記載されるように実施した。緑色の蛍光糖タンパク質からのシグナルを、５２０ｎｍバンドパスフィルターを用いた標準的なＣＣＤカメラに基く画像化システムを用いて集めた。糖タンパク質の検出後、このゲルを、ＳＹＰＲＯ　ＲＵＢＹタンパク質ゲル染色（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、Ｏｒｅｇｏｎ）を用い、染色液中にゲルを３〜２０時間インキュベートし、次いでゲルを７％酢酸、１０％メタノール中で３０分間インキュベートすることにより染色した。グリコシル化タンパク質または非グリコシル化タンパク質からのオレンジ色のシグナルを、６００ｎｍバンドパスフィルターまたは６１０ｎｍロングパスフィルターを用いた標準的なＣＣＤカメラに基く画像化システムを用いて集めた。グリコシダーゼに曝さなかった場合、糖タンパク質であるα１−酸性糖タンパク質、西洋ワサビペルオキシダーゼ、フェツイン、オボアルブミン、およびＰＨＡ−Ｍレクチンを両方の染色により検出した。グリコシダーゼ処理後、α１−酸性糖タンパク質、フェツイン、オボアルブミン、およびＰＨＡ−Ｍは、ＳＹＰＲＯ　ＲＵＢＹタンパク質ゲル染色により検出されるような顕著な移動度のシフト、および本発明の試薬による染色の減少（これは、糖質基が開裂したことを示す）を示した。しかし、西洋ワサビペルオキシダーゼは、実質的な移動度のシフトを示さなかったが、化合物５による染色は、西洋ワサビペルオキシダーゼが有意な量の糖質基を含むことを示した。このタンパク質は、本研究で用いられたグリコシダーゼによる開裂に対して耐性があるα−（１，３）−フコシル化アスパラギンＮ−アセチルグルコサミン結合を含んだ。従って、化合物５の使用は、移動度シフトアッセイで用いられたグリコシダーゼに対して感受性の糖タンパク質を同定し、糖タンパク質の糖質基の構造について重要な情報を提供した。
【０１３１】
（実施例２５．ろ過プレートにおける糖タンパク質の検出）
タンパク質添加の前に、９６ウェルＭｉｌｌｉｐｏｒｅ　ＭｕｌｔｉＳｃｒｅｅｎろ過プレートの個々のウェル中の疎水性メンブレン（膜）を、メタノールで湿らせ、次いで製造業者（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）の指示に従って、真空マニホールドを用いて、７％酢酸によってリンスした。０．２〜１０００ｎｇ／ｍｍ２のオボアルブミンを、減圧を加えることなく、個々のウェルに添加する。このプレートを３０〜６０分間インキュベートし、その後真空にしてタンパク質を除く。次いで、このろ過プレートを風乾させ、そしてウェルを５０％メタノール中で３０分間、２回交換した３％酢酸中で５分間、次いで１％の過ヨウ素酸含有３％酢酸中で３０分間インキュベートする。次いでウェルを３％酢酸中でリンスし、そして５μＭの化合物５、３％酢酸、２％ジメチルホルムアミド、および０．２５Ｍ塩化マグネシウムの溶液中で３０分間インキュベートする。色素溶液を、ピペッティングしてウェルから取り出し、そして２００μＬの３％酢酸を添加して、３〜４回ピペッティングして未結合の色素を除く。ろ過プレートを、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ　ＨＴＳ７０００マイクロプレートリーダーまたは類似のデバイスを用いて引き続き読み取る。３００ｎｍの励起（ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ）フィルターおよび５３０ｎｍの放出（ｅｍｉｓｓｉｏｎ）フィルターを選択する。このプレートの上面を通じて測定する。装置のソフトウェアは、各ウェルの色素由来のシグナルの蛍光強度に相当するデジタル値を提供する。
【０１３２】
（実施例２６．ＳＤＳポリアクリルアミドゲルにおけるリポポリサッカライドの検出）
１〜４０００ナノグラムの範囲にわたるＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ血清型０５５：Ｂ５リポポリサッカライドの階段希釈物を、１５％Ｔ、２．６％Ｃポリアクリルアミドゲルを用いるＳＤＳゲル電気泳動によって分離した。このゲルを連続して、５０％メタノールに３０分間、２回交換した３％酢酸に５分間、次いで１％過ヨウ素酸含有３％酢酸中に３０分間、浸漬する。ゲルを３％酢酸中で４×５分リンスし、次いで、５μＭの化合物５、３％酢酸、２％ジメチルホルムアミド、および０．２５Ｍ塩化マグネシウムの溶液中で３０分間インキュベートする。その後、このゲルを３％酢酸中で５分間リンスし、そして３００ｎｍのＵＶトランスイルミネーターに置いた。分離したリポポリサッカライド（リポ多糖類）は、明緑色蛍光バンドとして表れ、バックグラウンドのシグナルはほとんどないか全くなかった。化合物５が細菌のリポポリサッカライド（リポ多糖類）を検出する能力を、アルカリ銀ジアミンベースの染色（Ｓｉｌｖｅｒ　Ｓｔａｉｎ　Ｐｌｕｓ，Ｂｉｏ−Ｒａｄ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）のものと比較した。アルカリ銀ジアミン染色を染色したのは、これがリポポリサッカライドを検出する能力に関して、酸性硝酸銀染色、亜鉛イミダゾール染色、ＳＹＰＲＯ　ＯＲＡＮＧＥ染色およびＳＹＰＲＯ　ＲＵＢＹタンパク質ゲル染色より優れているからである。ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動後、化合物５を用いて、２〜８ｎｇ程度の少量の添加された総リポポリサッカライドの検出が可能であったが、一方銀染色法では、２５０〜１０００ｎｇでないと検出され得ない。化合物５を用いる場合、リポポリサッカライドの検出のための線形ダイナミックレンジは、添加物質２〜４０００ｎｇに伸びた（ｒ２＝０．９９０１）。Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ（血清型１０）またはＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＥＨ１００（ＲＡ変異体）由来のリポポリサッカライドを評価したときに、同様の結果が、得られた。リポポリサッカライドは代表的におよそ２０のバンドに分かれること、および個々の成分の検出感度は、化合物５を用いた場合実質的に１ｎｇ以下であったことに注意すべきである。リポポリサッカライド（粘膜のグラム陰性細菌で発現される主な糖脂質）は、同様の手順で検出され得、そしてグラム陽性菌およびグラム陰性菌を識別する手段を提供し得る。
【０１３３】
（実施例２７．ＰＶＤＦ膜上にスロットブロットしたグリコーゲンの検出）
グリコーゲンの階段希釈物を脱イオン水または他の適切な溶液（例えば、７％酢酸または２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ　ＨＣｌ、ｐＨ６．８，５００ｍＭ　ＮａＣｌ）中に調製した。ドットブロットのために、１〜５μＬの容積のグリコポリマーを、ピペッターを用いて、０．４μｍの孔サイズの湿潤したＰＶＤＦ膜に滴下した。スロットブロッティング（ｓｌｏｔ−ｂｌｏｔｔｉｎｇ）を、Ｂｉｏ−Ｄｏｔ　ＳＦ真空装置（Ｂｉｏ−Ｒａｄ　ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を用いて実施した。スロットブロッティングのために、メタノール、次いで１００μＬ／ウェルのｄｄ−Ｈ２Ｏを用いて膜を再水和し、サンプルを膜（メンブレン）に滴下し（２００μＬ／ウェル）、ウェルを６００μＬの７％酢酸／１０％メタノールで２回、６００μＬのｄｄ−Ｈ２Ｏ
で２回リンスした。ドットブロットまたはスロットブロッティング後、膜を風乾させて、引き続く染色工程の間のポリマーの損失を最小限にした。この膜を引き続き、５０％メタノール中に３０分間、２回交換した３％酢酸中に５分間、次いで１％の過ヨウ素酸含有３％酢酸中に３０分間浸漬する。ブロットを３％酢酸中で４×５分リンスし、次いで５μＭの化合物５、３％酢酸、２％ジメチルホルムアミド、および０．２５Ｍ塩化マグネシウムの溶液中で３０〜１２０分間インキュベートする。この膜を、４回交換したｄｄ−Ｈ２Ｏ中で各５分間インキュベートした。この膜を風乾させて、引き続き反射性または透過性３００ｎｍ　ＵＶ光原を用いて見た。スポットしたグリコーゲンは、わずかな蛍光青色バックグラウンドの上で緑の蛍光バンドとして現れた。検出限界は、代表的に４〜８ｎｇのグリコーゲンであり、そして検出の線形ダイナミックレンジは、添加物質１６〜２５０ｎｇに伸びた（ｒ２＝０．９５８）。デンプン、キチン、セルロースおよびペクチンのような他のグリコポリマーは、類似の方法を用いて検出可能であるはずである。コンドロイチン−４−硫酸で実施した平行実験は、このグリコサミノグリカンに対する検出感度がかなり乏しく、検出限界は添加物質１６μｇ付近であることを示す。これは、予期されないことである。なぜなら、コンドロイチン硫酸、ヒアルロン酸、デルマタン硫酸、アルギネート、フコイダン（ｆｕｃｏｉｄａｎ）、カラギナン、およびケラタン硫酸のようなグリコサミノグリカンは、従来の過ヨウ素酸シッフ手順（Ｓｃｈｉｆｆ’ｓ　ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ）では染色に乏しいことが公知であるからである。
【０１３４】
（実施例２８．糖タンパク質（グリコプロテイン）のプレ誘導化、その後のＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動）
西洋ワサビペルオキシダーゼのようなグリコプロテインを１００ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）（過ヨウ素酸ナトリウム１０ｍＭ含有）中で５ｍｇ／ｍＬに希釈し、次いでこのサンプルを２時間暗野でインキュベートする。次いでこのサンプルを１０μＭの化合物５、６％酢酸、４％ジメチルホルムアミド、および０．５Ｍ塩化マグネシウムの溶液中で２倍に希釈し、３０分〜２時間インキュベートする。その後、このタンパク質サンプルを十分量の氷冷アセトンに加えて、８０％アセトン溶液を作成する。氷上での１０分間のインキュベート後、卓上微小遠心分離器を用いて、このサンプルを１４，０００×Ｇで遠心分離する。この上清を廃棄し、そしてペレットを標準的ＳＤＳサンプル緩衝液に再懸濁する。このサンプルを１００℃に加熱し、室温に冷却し、次いで１３％Ｔ、２．６％Ｃ　ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルに添加する。電気泳動は、標準的方法で実施し、次いでゲルを３００ｎｍのＵＶトランスイルミネーター上に置く。グリコプロテイン（糖タンパク質）は、このゲル中で緑の蛍光として現れる。
【０１３５】
（実施例２９．ポリアクリルアミドゲル電気泳動後のＤＮＡの特異的検出）
２００ｎｇで開始するＨａｅ　ＩＩＩ切断φＸ１７４ＲＦ　ＤＮＡの２倍階段希釈、および５００ｎｇで開始するリボソームＲＮＡの２倍階段希釈を、ネイティブなローディング緩衝液（５％グリセロール）中で調製し、９５℃で熱変性し、氷上で急速氷冷し、０．７５ｍｍ厚の５％Ｔ、５％Ｃ　ポリアクリルアミドゲル上にロードし、そして標準手順によって。６０ボルトで、８９ｍＭ　Ｔｒｉｓボラート、２ｍＭ　ＥＤＴＡ、ｐＨ８．３（ＴＢＥ緩衝液）中で３〜４時間の電気泳動によって分離した。電気泳動後、ゲルを５０％メタノール中で３０分間インキュベートし、次いで５Ｍ　ＨＣｌ中で室温で２０分間インキュベートした。ゲルを３％酢酸中で５分間インキュベートし、次いで５μＭの化合物２３、３％酢酸、２％ジメチルホルムアミド、および０．２５Ｍ塩化マグネシウム中で３０〜１２０分間インキュベートした。次いでゲルを３％酢酸でリンスし、３００ｎｍの　ＵＶトランスイルミネーターに置いた。この方法によって１ｎｇのＤＮＡは、緑色蛍光バンドとして容易に検出された。対照的に、リボソームＲＮＡ（５００ｎｇ）は、この方法では検出されなかった。引用された標識手順は、組織学的Ｆｅｕｌｇｅｎ反応に基づく、ここでは、ＨＣｌによる加水分解がデオキシリボースのアルデヒド基を開放し、そしてまた細胞中のＤＮＡの選択的検出に用いられ得る。電気泳動で分離されたＤＮＡ分子量標準の強度プロフィールが、化合物５を用いて、図７に示される。
【０１３６】
（実施例３０．ポリアクリルアミドゲル電気泳動後のＤＮＡおよびＲＮＡの両方の検出）
ＤＮＡおよびＲＮＡの階段希釈を調製し、実施例２９に記載のように電気泳動に供する。次いでゲルを１００ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液ｐＨ４．５（１Ｍ重硫酸ナトリウム、１０μＭ化合物５含有）中でインキュベートする。ゲルを３７℃で２４時間インキュベートする。シトシン残基を６−スルホ−シトシン残基に変換して、次いで化合物５をアミノ基転移反応で取り込む。ゲルを、３％酢酸中で５分インキュベートし、次いで、３００ｎｍ　ＵＶトランスイルミネーター上に置く。ＤＮＡおよびＲＮＡの両方は、淡青色の蛍光バックグラウンド上で緑の蛍光バンドとして現れる。
【０１３７】
（実施例３１．酸化したＨＲＰ結合体化二次抗体を用いるチューブリンの免疫検出）
一定量の広範な分子量標準（３００ｎｇ／タンパク質バンド）中で調製したウシ脳チューブリンの約１〜２０００ｎｇを１ゲルレーンあたりに添加し、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離した。これには、標準方法により、４．２５％Ｔ、２．６％Ｃスタッキングゲル（ｐＨ６．８）および１３％Ｔ、２．６％Ｃ分離ゲル（ｐＨ８．８）を利用した。標準法によってＰＶＤＦ膜にゲルを移した。ブロットを続けて、各、改変Ｔｒｉｓ緩衝化生理食塩水平衡緩衝液（ＭＴＢＳ；５０ｍＭ　Ｔｒｉｓベース、１５０ｍＭ　ＮａＣｌ、ｐＨ７．５）中で１０分間３回インキュベートし、次いで０．２％Ｔｗｅｅｎ−２０および０．５％ポリ（ビニルアルコール）（ＰＶＡ；３０，０００−７０，０００Ｄａ，Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ）含有ＭＴＢＳ中で６０分間インキュベートした。モノクローナル抗チューブリン抗体（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）を、ＭＴＢＳ／Ｔｗｅｅｎ−２０／ＰＶＡ中で１：５００に希釈し、そしてブロットをこの溶液中で一晩インキュベートした。次いでブロットをそれぞれ１０分間ＭＴＢＳ／Ｔｗｅｅｎ−２０／ＰＶＡ中で４回リンスした。次いでブロットをＭＴＢＳ／Ｔｗｅｅｎ−２０／ＰＶＡ中で調製した酸化西洋ワサビペルオキシダーゼ結合体化二次抗体の１：１０，０００希釈中で６０分間インキュベートした。５ｍｇ／ｍＬのタンパク質結合体を１００ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ４．５（１０ｍＭ過ヨウ素酸ナトリウム含有）中で暗野で２時間インキュベートすることにより結合体の酸化を達成した。この反応を膜への添加の前の希釈工程によって終止した。二次抗体でのインキュベーション後、ブロットを、４回交換したＭＴＢＳ／Ｔｗｅｅｎ−２０／ＰＶＡ中でそれぞれ５分間インキュベートし、次いで５μＭの化合物５、３％酢酸、２％ジメチルホルムアミド、および０．２５Ｍ塩化マグネシウム中でインキュベートした。この膜を３％酢酸中で１０分間リンスし、そしてＬｕｍｉ−Ｉｍａｇｅｒ　ＣＣＤベースのコンピューター化画像分析システム（Ｒｏｃｈｅ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）を用いて蛍光シグナルを可視化した。チューブリンは、コンピューターモニター上の黒い背景に対して白いバンドとして現れる。
【０１３８】
（実施例３２．化合物５の赤色放射染色への変換）
グリコシル化したおよびグリコシル化していないタンパク質分子量標準の混合物を含有するＳＤＳポリアクリルアミドゲルを、実施例１９に記載のように化合物５で処理した。このゲルを３％酢酸中で１０分間インキュベートし、次いで３％酢酸、０．００１％ＳＤＳ中で調製したＳＹＰＲＯ　ＲＥＤタンパク質ゲル染色（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、Ｏｒｅｇｏｎ）の１：５０００希釈中でインキュベートした。このゲルを９０分間染色液中でインキュベートし、次いで３％酢酸で手短にリンスした。ＵＶトランスイルミネーターを用いて、グリコプロテインは、明赤色バンドとして現れ、グリコシル化されていないタンパク質は、染色がかすかであった。化合物５からの緑色シグナルが実質的に減じたことが、５２０ｎｍバンド通過フィルターを用いて明らかになった。レーザーゲルスキャナー（例えば、Ｆｕｊｉ　ＦＬＡ−３０００（Ｆｕｊｉ　Ｆｉｌｍ　Ｃｏ．，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ））上のゲルの分析により、５３２ｎｍの第二高調波発生レーザーを用いて、このタンパク質がＳＹＰＲＯ　ＲＥＤ色素でかなり不均一に標識されたことが表された。理論によって束縛されることは望まないが、本実施例は、化合物５がＵＶ照射を吸収し、そしてそれをＳＹＰＲＯ　ＲＥＤ色素にトランスファーする（ここでは、それは実質的に長い波長（６４０ｎｍ）で放射される）ことを実証する。これにより、グリコプロテイン検出システムの効果的なＳｔｏｋｅ（ストーク）変移が２４５ｎｍ〜３５０ｎｍに増大する。
【０１３９】
（実施例３３．転写膜にエレクトロブロットした糖タンパク質のエドマン配列決定：）
目的の糖タンパク質を、電気泳動に供し、引き続いて、ポリ（ビニリデンジフルオリド）膜に転写し、そして実施例２７の記載されるように染色する。標的タンパク質を同定した後、バンドを鋭い剃刀を用いて切り出す。内在タンパク質配列決定のために、標的タンパク質を、膜から切り出し、インサイチュタンパク質分解切断（３７℃にて３時間および１００　ｍＭ　ＮＨ４ＨＣＯ３、ｐＨ８．３中の１０％アセトニトリル、３％Ｔｗｅｅｎ−８０の存在下）に供する。次いで、得られたフラグメントを、超小径（ｍｉｃｒｏ−ｂｏｒｅ）逆相ＨＰＬＣにより分離する。選択したピーク画分を、自動エドマン分解により分析する。エドマン配列決定に供した糖タンパク質は、優れた初期および反復配列決定収率を有する高品質スペクトルを生成することが予想される。
【０１４０】
（実施例３４．転写膜にエレクトロブロットした糖タンパク質の同定に基づくマトリクス補助レーザー脱離質量分析）
目的の糖タンパク質を、電気泳動に供し、引き続いて、ポリ（ビニリデンジフルオリド）膜に転写し、そして実施例２７の記載されるように染色する。標的タンパク質を同定した後、バンドを鋭い剃刀を用いて切り出す。次いで、バンドを、２５ｍＭ重炭酸アンモニウム、ｐＨ７．８、１０％メタノール中で５分間で、３回洗浄し、そして乾燥させた。乾燥後、バンドを、１〜２ｍｍ２に切り、そして消化緩衝液（５　ｍＭ重炭酸アンモニウム、ｐＨ　７．８（１％オクチルβ−グルコシドおよび１０％メタノールを添加））中の２０μｇ／ｍＬトリプシン中でインキュベートした。トリプシン消化混合物の十分な量を、膜の四角片を覆うように添加した。タンパク質を室温で５〜６時間消化し、次いで、２７〜２８℃で一晩インキュベートした。ペプチドを、ギ酸：エタノール（１：１）を用いて抽出し、次いで、凍結乾燥した。凍結乾燥後、ペプチドを、マトリクス補助レーザー脱離イオン化質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＭＳ）による分析のために水に再懸濁した。等溶量のペプチド消化物を、α−シアノ−４−ヒドロキシ桂皮酸マトリクス（７０％アセトニトリル／Ｈ２Ｏ中に１０ｍｇ／ｍＬ）と混合した。この混合物を、サンプルプレート上にスポットし、そして分析の前に風乾した。ＭＡＬＤＩ−ＭＳ分析を、Ｖｏｙａｇｅｒ　Ｍａｓｓ　Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ（ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ　ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ，Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）において行った。器機を、サブスタンスＰ（１３４７．７Ｄａ）およびインスリン（５７３１．４Ｄａ）を用いて較正した。トリプシン処理したタンパク質から得られたペプチド質量を用いて、ワールドワイドウェブ（ｗｗｗ．ｍａｎｎ．ｅｍｂｌ−ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ．ｄｅ）上で利用可能なペプチド検索エンジンを使用して、ＥＭＢＬペプチドデータベースを検索した。タンパク質は、良好なペプチド配列カバレージ（ｃｏｖｅｒａｇｅ）を用いて用意に同定されることが予想されれた。
【０１４１】
（実施例３５．オリゴサッカリドプロファイリング）
糖タンパク質（例えば、α１酸−糖タンパク質（５０〜５００μｇ））を、５μＬの１％ＳＤＳ、０．５Ｍ　２−メルカプトエタノール、０．１Ｍ　ＥＤＴＡ中に調製し、そして室温にて３０分間インキュベートした。次いで、サンプルを、４０μＬの０．２Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．６）を用いて希釈し、そして完全に混合した。サンプルを、沸騰した水浴中で加熱し、次いで、室温まで冷却した。５μＬの７．５％　Ｎｏｎｉｄｅｔ　Ｐ−４０を添加し、サンプルを混合し、そして５μＬ　ＰＮＧａｓｅ　Ｆ（１．０単位）を添加する。チューブを、完全に混合し、次いで、３７℃にて２０時間インキュベートした。次いで、１６５μＬの冷エタノールを添加し、そしてサンプルを少なくとも１時間氷上でインキュベートした。サンプルを１０，０００ｇで室温にて２分間遠心分離する。放出されたグリカンを含む上清を収集し、そして遠心真空エバポレーターを用いて乾燥させる。乾燥したグリカンを、２０μＬの５μＭ化合物３５、３％酢酸、２％ジメチルスルホキシド中に再懸濁し、そして３７℃にて１６時間インキュベートする。シアノ水素化ホウ素ナトリウムを、必要に応じて、この反応混合物に添加し得る。サンプル混合物を、遠心真空エバポレーター中で、約１時間乾燥する。何回かの加熱が、ＤＭＳＯを気化させるために必要とされるが、４５℃を超える温度は、避けるべきである。乾燥したサンプルを、グリセロール−水（１：４、ｖ／ｖ）中に溶解する。誘導体化したオリゴサッカリドを、１４ｃｍ長の３０％　Ｔ、２．６％Ｃポリアクリルアミドゲル上で分離し、そして電気泳動を、標準プロトコル（ゲルおよび緩衝液からＳＤＳを除く）を用いて行う。本発明の試薬のスルホン化バージョンは、この適用に好ましい。なぜならば、これらが中性かつ弱い電荷のグリカンに負電荷を与えるからである。しかし、一般に、２アミノアクリドン誘導体グリカンと共に用いられる場合、Ｔｒｉｓボレートゲル緩衝液系は、非スルホン化試薬を中性グリカンの検出に用いることを可能にする。電気泳動後、緑の蛍光バンドを、目視、写真、ＣＣＤカメラベースの画像化により、可視化され得る。
【０１４２】
（実施例３６：細胞中のＤＮＡの細胞化学的検出）
ＭＲＣ−５ヒト肺線維芽細胞、ＮＩＨ−３Ｔ３マウス線維芽細胞、およびウシ肺動脈内皮細胞を、培養物から取り出し、そして温リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）（ｐＨ７．４）を用いて２回洗浄した。次いで、細胞を冷１００％エタノールを用いて−２０℃にて１０分間固定し、ＰＢＳを用いて２回洗浄し、そして２５℃にて３０分間、５Ｎ塩酸中でインキュベートした。次いで、サンプルを、ＰＢＳ中で２回洗浄し、そして５μＭの化合物５、３％酢酸、２％ジメチルホルムアミド、０．２５Ｍ塩化マグネシウム中で、２５℃にて１２０分間、遮光してインキュベートした。サンプルを、３％酢酸中で２回洗浄し、そしてグリセロールベースの固定培地中で固定した後、観察のためにパラフィンワックスを用いて密封した。
【０１４３】
蛍光顕微鏡観察を、１００ワット水銀光源を備えるＮｉｋｏｎ　Ｅｃｌｉｐｓｅ　８００正立顕微鏡を用いて行った。蛍光シグナルの可視化を、３２０−４００ｎｍの間の励起波長を有するフィルタおよび５００−５６０ｎｍの間の波長を有する発光フィルタを用いて達成した。画像を、ＭｅｔａＭｏｒｐｈソフトウェア（Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ　Ｉｍａｇｉｎｇ　Ｃｏｒｐ）を用いて制御されるＭｉｃｒｏＭａｘ　１３００　ＹＨＳ，１２　ビットデジタルカメラ（Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ．）を用いて獲得した。顕微鏡観察は、酸処理細胞における、区別可能な核の緑の蛍光シグナルを示し、そして未処理細胞においてはシグナルを示さなかった。高倍率では、点状のシグナルを観察した。このシグナルは、ミトコンドリアＤＮＡを示し得る。
【０１４４】
（実施例３７：プラスチック包埋組織中のポリサッカリドの細胞化学的検出）
アルデヒドブロックを、亜鉛素酸を用いて、実施例３６に記載されるように行う。あるいは、チオセミカルバジドブロック（１ｍｇ／ｍＬメチルセロソルブ：酢酸、９５：５）を代わりに用いてもよい。この場合、サンプルをブロッキング溶液中で２５℃にて３０分間インキュベートする。次いで、サンプルを、蒸留水中で１０分間リンスし、次いで、１％過ヨウ素酸を用いて、１０分間処理する。サンプルを、蒸留水中で５分間洗浄し、次いで、５μＭ化合物５、３％酢酸、２％ジメチルホルムアミド、および０．２５Ｍ塩化マグネシウム中で、１５〜２０分間染色する。次いで、サンプルを、蒸留水中で５分間リンスし、風乾し、そして標準的方法を用いて固定する。ポリサッカリド（例えば、グリコゲン）は、蛍光顕微鏡によって、明るい緑として観察される。
【０１４５】
（実施例３８：試薬−デキストラン結合体の調製）
約２０個のカルボン酸基を有するカルボキシメチルデキストラン（平均ＭＷ７０，０００）の溶液を水中にデキストランを溶解させることにより調製する。この溶液のｐＨを、１０ｍｇ／ｍＬの最終濃度に対して６．０に調整した。得られた溶液を、５等量のエチルジメチルアミノプロピルカルボジイミド（ＥＤＣＡ）を用いて、撹拌しながら、室温にて１５分間処理する。次いで、溶液に、１等量の化合物５を添加し、そして反応混合物を一晩撹拌する。次いで、溶液をエタノール中に注ぎ、そして得られた残渣を、ｐＨ７のリン酸緩衝液、次いで水に対する大規模な透析により、未結合の化合物５から分離する。結合体化デキストランを凍結乾燥して、蛍光トレーサーとして有用である緑色蛍光固体を得た。
【０１４６】
上記の発明は、例証および例示の手段として詳細に記載されているが、多くの改変、置換、および変更が、添付の特許請求の範囲に記載される本発明の精神および範囲から逸脱することなく可能であることが理解される。
【０１４７】
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は、化合物５で標識されたα１−酸糖タンパク質についての蛍光励起／発光スペクトルである。約７．５μｇのタンパク質を、１３％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルに装填し、そして標準的な手順によって、電気泳動に供した。化合物５での標識化（実施例１９において記載されるように）の後に、得られる蛍光バンドを切り取り、そして２ｍｍ×１０ｍｍの石英キュベット内にプレートした。化合物５の大きなストークスシフトが、プレキャストポリアクリルアミドゲルに対する支持体として通常使用されるプラスチックバッキングの青色蛍光発光から、分光的に分離可能であり、そして赤色蛍光タンパク質染色物の発光から分光的に分離可能であり、グリコシル化タンパク質および非グリコシル化タンパク質の、ゲル内およびブロット上での複数色検出を可能にする。
【図２】
図２は、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分離され、そして化合物５または非特異的全タンパク質染色（ＳＹＰＲＯ　ＲＵＢＹタンパク質ゲル染色）のいずれかで標識された、タンパク質混合物の強度特性である。（Ａ．）化合物５での糖タンパク質の標識化。（Ｂ．）ＳＹＰＲＯ　ＲＵＢＹタンパク質ゲル染色でのタンパク質の染色。評価したタンパク質は、以下である：Ａ）α２−マクログロブリン（１８０ｋＤａ、グリコシル化）、Ｂ）ホスホリラーゼｂ（９７ｋＤａ、非グリコシル化）、Ｃ）グルコースオキシダーゼ（８２ｋＤａ、グリコシル化）、Ｄ）ウシ血清アルブミン（６６ｋＤａ、非グリコシル化）、Ｅ）α１−酸糖タンパク質（４２ｋＤａ、グリコシル化）、Ｆ）カルボニックアンヒドラーゼ（２９ｋＤａ、非グリコシル化）、Ｇ）アビジン（８ｋＤａ、グリコシル化）、Ｈ）リゾチーム（１４ｋＤａ、非グリコシル化）。糖タンパク質は、化合物５を使用して、非グリコシル化タンパク質の最小の非特異的染色で、ゲル内で直接、選択的に標識され得る。
【図３】
図３は、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動および化合物５での染色の後の糖タンパク質検出の感度および線形ダイナミック範囲である：（Ａ．）α１−酸糖タンパク質（Ｂ．）アビジン。α１−酸糖タンパク質は、４０％の炭水化物を含む糖タンパク質であり、一方でアビジンは、１０％の炭水化物を含む糖タンパク質である。１ｎｇ以下の各糖タンパク質が検出され得、そして検出の線形ダイナミック範囲は、３桁を超える。酸フクシンスルファイトを使用する、従来の過ヨウ素酸シッフ（ＰＡＳ）検出は、ほんの３８ｎｇの糖タンパク質の、３０倍のみの線形ダイナミック範囲での検出を可能にする。
【図４】
図４は、化合物５を使用して検出された、タンパク質の脱グリコシル化の移動度シフト分析である：（Ａ．）エンドグリコシダーゼでの処理前の、α１−酸糖タンパク質の電気泳動移動度プロフィールのライン追跡。（Ｂ．）エンドグリコシダーゼに曝露した後の、同じタンパク質の電気泳動移動度プロフィールのライン追跡。糖タンパク質からの炭水化物残渣の酵素的除去は、化合物５を使用する染色の損失を生じ、従って、タンパク質の存在下での炭水化物についての検出の特異性を実証する。
【図５】
図５は、化合物５を用いて検出した、電気泳動により分離したＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ血清型０５５：Ｂ５リポ多糖類の強度プロフィールである。本発明の試薬は、以前に公開されたリポ多糖類染色法（例えば、ゲルの銀染色または亜鉛−イミダゾール逆染色（２００〜１０００ｎｇのリポ多糖類を必要とする）あるいはジゴキシゲニンヒドラジドに基づく免疫ブロッティング手順（３０ｎｇのリポ多糖類を必要とする））より優れた実質的な改善を提示する。
【図６】
図６は、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動後のリポ多糖類検出の感度および線形ダイナミック範囲である。検出は、２ｎｇから４０００ｎｇ間で線形であり（Ｒ２＝０．９９０１）、リポ多糖類検出の最も通常のゲルに基づく方法およびブロットに基づく方法の感度を１５〜５００倍超える。検出の線形ダイナミック範囲は、同様に、標準的な方法より改善され、他の方法に関する１０〜３０倍の範囲と比較して、３桁にわたる。
【図７】
図７は、化合物５を使用して、電気泳動によって分離したＤＮＡ分子量標準の強度プロフィールである。（実施例２９に記載されるように）。リボソームＲＮＡを装填したレーンは、化合物５で標識されなかった。酸で処理した１ｎｇ未満のＤＮＡが検出され得、従って、エチジウムブロマイドに匹敵する検出感度を提供した。エチジウムブロマイドとは異なり、この手順は、５００ｎｇのｒＲＮＡさえも検出しない。
【図１】
2004510767.tif 000043
【図２】
2004510767.tif 000044
【図３】
2004510767.tif 000045
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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2004510767.tif 000141
【国際調査報告】
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