(57)【要約】本発明は、細胞表面エピトープに結合し、多価形態では、リンパ系腫瘍細胞を含めて細胞の死滅を生起しまたは導き、一価形態では、免疫抑制を生起しまたはリンパ球の活性化を阻害する、ポリペプチド組成物に関する。本発明はさらに、該ポリペプチドをコードする核酸、該ポリペプチドの製造方法、細胞を死滅させる方法、患者の免疫を抑制する方法、該ポリペプチドを含む医薬、診断及び多価組成物並びにキット、該ポリペプチドの使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト細胞の表面上に発現された抗原に対する結合特異性を有するヒト組成の抗体に基づく抗原結合ドメインを含むポリペプチドを含有する組成物であって、２以上の前記抗原結合ドメインを有する多価ポリペプチドで前記抗原を発現する細胞を処理すると、細胞毒性物質も免疫学的メカニズムも死滅に要しない方法で、前記細胞の死滅が生起しまたは導かれる、前記組成物。
【請求項２】
１μＭ以下のＫｄでヒトＨＬＡ ＤＲと結合する抗体に基づく抗原結合ドメインを含むポリペプチドを含有する組成物であって、２以上の前記抗原結合ドメインを有する多価ポリペプチドでＨＬＡ ＤＲを発現する細胞を処理すると、細胞毒性物質も免疫学的メカニズムも死滅に要しない方法で、前記細胞の死滅が生起しまたは導かれる、前記組成物。
【請求項３】
ヒトＨＬＡ ＤＲと特異的に結合するヒト組成の抗体に基づく抗原結合ドメインを複数含む多価ポリペプチドを含有する組成物であって、前記多価ポリペプチドでＨＬＡ ＤＲを発現する細胞を処理すると、細胞毒性物質も免疫学的メカニズムも死滅に要しない方法で、前記細胞の死滅が生起しまたは導かれ、前記抗原結合ドメインはそれぞれが１μＭ以下のＫｄでヒトＨＬＡ ＤＲと結合するものである、前記組成物。
【請求項４】
ヒトＨＬＡ ＤＲと特異的に結合するヒト組成の抗体に基づく抗原結合ドメインを複数含む多価ポリペプチドを含有する組成物であって、前記多価ポリペプチドでＨＬＡ ＤＲを発現する細胞を処理すると、細胞毒性物質も免疫学的メカニズムも死滅に要しない方法で、前記細胞の死滅が生起しまたは導かれ、前記多価ペプチドは活性化リンパ系細胞を死滅させるための１００ ｎＭ以下のＥＣ５０を有する、前記組成物。
【請求項５】
１μＭ以下のＫｄでヒトＨＬＡ ＤＲと結合する抗体に基づく抗原結合ドメインを少なくとも１つ含むポリペプチドを含有する組成物であって、前記抗原結合ドメインは、ヒトＨＬＡ ＤＲの少なくとも１つのエピトープと結合する能力により組換え抗体ライブラリーからヒト組成のＶＬ及びＶＨドメインを単離することを含む方法で単離されたものであり、２以上の前記抗原結合ドメインを有する多価ポリペプチドでＨＬＡ ＤＲを発現する細胞を処理すると、細胞毒性物質も免疫学的メカニズムも死滅に要しない方法で、前記細胞の死滅が生起しまたは導かれる、前記組成物。
【請求項６】
抗原結合ドメインの単離方法が、さらに
ａ． ＶＬ及びＶＨドメインの一方または両方のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列の少なくとも１つの変異体のライブラリーを作製し、
ｂ． １μＭ以下のＫｄでヒトＨＬＡ ＤＲと結合する能力により変異体ライブラリーからＶＬ及びＶＨドメインを単離する、
各ステップを含む、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
多価ポリペプチドが、正常細胞を死滅させるためのＥＣ５０の５分の１以下の変態細胞を死滅させるためのＥＣ５０を有する、請求項１〜６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項８】
多価ポリペプチドが、活性化されていない細胞を死滅させるためのＥＣ５０の５分の１以下の活性化された細胞を死滅させるためのＥＣ５０を有する、請求項１〜６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項９】
多価ポリペプチドが、５０ ｎＭ以下の変態細胞を死滅させるためのＥＣ５０を有する、請求項１〜６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１０】
多価ポリペプチドが、１０ ｎＭ以下のリンパ系腫瘍細胞を死滅させるためのＥＣ５０を有する、請求項１〜６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１１】
多価ポリペプチドが、活性化されたリンパ系細胞を死滅させる、請求項１〜６及び８のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１２】
活性化されたリンパ系細胞が、Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫、Ｂ細胞リンパ腫、Ｂ細胞急性リンパ性白血病、バーキットリンパ腫、ホジキンリンパ腫、ヘアリーセル白血病、急性骨髄性白血病、Ｔ細胞リンパ腫、Ｔ細胞非ホジキンリンパ腫、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病及び多発性骨髄性白血病から選択される疾患を示すリンパ系腫瘍細胞である、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
活性化されたリンパ系細胞が、Ｐｒｉｅｓｓ、ＧＲＡＮＴＡ−５１９、ＫＡＲＰＡＳ−４２２、ＫＡＲＰＡＳ−２９９、ＤＯＨＨ−２、ＳＲ−７８６、ＭＨＨ−ＣＡＬＬ−４、ＭＮ−６０、ＢＪＡＢ、ＲＡＪＩ、Ｌ−４２８、ＨＤＬＭ−２、ＨＤ−ＭＹ−Ｚ、ＫＭ−Ｈ２、Ｌ１２３６、ＢＯＮＮＡ−１２、ＨＣ−１、ＮＡＬＭ−１、Ｌ−３６３、ＥＯＬ−１、ＬＰ−１、ＲＰＭＩ−８２２６及びＭＨＨ−ＰＲＥＢ−ｌ細胞系から選択された細胞系からのものである、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１４】
多価ポリペプチドが、ＫＡＲＰＡＳ−４２２、ＤＯＨＨ−２、ＳＲ−７８６、ＭＨＨ−ＣＡＬＬ−４、ＭＮ−６０、ＨＤ−ＭＹ−Ｚ、ＮＡＬＭ−ｌ及びＬＰ−１から選択された少なくとも１種のリンパ系腫瘍細胞系の細胞を死滅させるための１００ ｎＭ以下のＥＣ５０を有する、請求項１〜６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１５】
多価ポリペプチドが、ＫＡＲＰＡＳ−４２２、ＤＯＨＨ−２、ＭＮ−６０、ＮＡＬＭ−ｌ及びＬＰ−１から選択された少なくとも１種のリンパ系腫瘍細胞系の細胞を死滅させるための５０ ｎＭ以下のＥＣ５０を有する、請求項１〜６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１６】
多価ポリペプチドが、ＬＧ２及びＰｒｉｅｓｓから選択された少なくとも１種のＢ細胞リンパ芽球細胞系の細胞を死滅させるための１０ ｎＭ以下のＥＣ５０を有する、請求項１〜６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１７】
細胞がＭＨＣクラスＩＩ分子を発現する非リンパ系細胞である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１８】
抗原結合ドメインがＨＬＡ−ＤＲのβ鎖に結合する、請求項１〜６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１９】
抗原結合ドメインがＨＬＡ−ＤＲのβ鎖の第１ドメインに結合する、請求項１８に記載の組成物。
【請求項２０】
抗原結合ドメインが、ＤＲ１−０１０１、ＤＲ２−１５０２１、ＤＲ３−０３０１、ＤＲ４Ｄｗ４−０４０１、ＤＲ４Ｄｗ１０−０４０２、ＤＲ４Ｄｗ１４−０４０４、ＤＲ６−１３０２、ＤＲ６−１４０１、ＤＲ８−８０３１、ＤＲ９−９０１２、ＤＲｗ５３−Ｂ４＊０１０１及びＤＲｗ５２−Ｂ３＊０１０１からなる群から選択された１種以上のＨＬＡ−ＤＲタイプに結合する、請求項１〜６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２１】
抗原結合ドメインが少なくとも５種の異なる前記ＨＬＡ−ＤＲタイプに結合する、請求項２０に記載の組成物。
【請求項２２】
抗原結合ドメインがＶＨドメイン及びＶＬドメインの組合せを含み、該組合せはＭＳ−ＧＰＣ−１、ＭＳ−ＧＰＣ−６、ＭＳ−ＧＰＣ−８、ＭＳ−ＧＰＣ−１０、ＭＳ−ＧＰＣ−８−１、ＭＳ−ＧＰＣ−８−６、ＭＳ−ＧＰＣ−８−９、ＭＳ−ＧＰＣ−８−１０、ＭＳ−ＧＰＣ−８−１７、ＭＳ−ＧＰＣ−８−１８、ＭＳ−ＧＰＣ−８−２７、ＭＳ−ＧＰＣ−８−６−２、ＭＳ−ＧＰＣ−８−６−１９、ＭＳ−ＧＰＣ−８−６−２７、ＭＳ−ＧＰＣ−８−６−４５、ＭＳ−ＧＰＣ−８−６−１３、ＭＳ−ＧＰＣ−８−６−４７、ＭＳ−ＧＰＣ−８−１０−５７、ＭＳ−ＧＰＣ−８−２７−７、ＭＳ−ＧＰＣ−８−２７−１０及びＭＳ−ＧＰＣ−８−２７−４１から選択されるクローンの１つに見られるものである、請求項１〜６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２３】
抗原結合ドメインがＨｕＣＡＬ ＶＨ２及びＨｕＣＡＬ Ｖλ１の組合せを含み、ＶＨ ＣＤＲ３、ＶＬ ＣＤＲ１及びＶＬ ＣＤＲ３は、ＭＳ−ＧＰＣ−１、ＭＳ−ＧＰＣ−８、ＭＳ−ＧＰＣ−１０、ＭＳ−ＧＰＣ−８−１、ＭＳ−ＧＰＣ−８−６、ＭＳ−ＧＰＣ−８−９、ＭＳ−ＧＰＣ−８−１０、ＭＳ−ＧＰＣ−８−１７、ＭＳ−ＧＰＣ−８−１８、ＭＳ−ＧＰＣ−８−２７、ＭＳ−ＧＰＣ−８−６−２、ＭＳ−ＧＰＣ−８−６−１９、ＭＳ−ＧＰＣ−８−６−２７、ＭＳ−ＧＰＣ−８−６−４５、ＭＳ−ＧＰＣ−８−６−１３、ＭＳ−ＧＰＣ−８−６−４７、ＭＳ−ＧＰＣ−８−１０−５７、ＭＳ−ＧＰＣ−８−２７−７、ＭＳ−ＧＰＣ−８−２７−１０及びＭＳ−ＧＰＣ−８−２７−４１から選択されるクローンの１つに見られるものである、請求項１〜６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２４】
抗原結合ドメインがＨｕＣＡＬ ＶＨ２及びＨｕＣＡＬ Ｖλ１の組合せを含み、ＶＨ ＣＤＲ３配列がコンセンサスＣＤＲ３配列：
ｎｎｎｎＲＧｎＦＤｎ
（各ｎは独立して任意のアミノ酸残基を表わす）から得られたものであり、及び／またはＶＬ ＣＤＲ３配列がコンセンサスＣＤＲ３配列：
ＱＳＹＤｎｎｎｎ
（各ｎは独立して任意のアミノ酸残基を表わす）から得られたものである、請求項１〜２３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２５】
ＶＨ ＣＤＲ３配列がＳＰＲＹＧＡＦＤＹであり、及び／またはＶＬ ＣＤＲ３配列がＱＳＹＤＬＩＲＨまたはＱＳＹＤＭＮＶＨである、請求項２４に記載の組成物。
【請求項２６】
抗原結合ドメインが、ＨｕＣＡＬ ＶＨ２及びＨｕＣＡＬ Ｖλ１の組合せを含む抗体と抗原結合について競合し、ＶＨ ＣＤＲ３配列がコンセンサスＣＤＲ３配列：
ｎｎｎｎＲＧｎＦＤｎ
（各ｎは独立して任意のアミノ酸残基を表わす）から得られたものであり、及び／またはＶＬ ＣＤＲ３配列がコンセンサスＣＤＲ３配列：
ＱＳＹＤｎｎｎｎ
（各ｎは独立して任意のアミノ酸残基を表わす）から得られたものである、請求項１〜２３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２７】
ＶＨ ＣＤＲ３配列がＳＰＲＹＧＡＦＤＹであり、及び／またはＶＬ ＣＤＲ３配列がＱＳＹＤＬＩＲＨまたはＱＳＹＤＭＮＶＨである、請求項２６に記載の組成物。
【請求項２８】
抗原結合ドメインが一般式：
ＳＧＳｎｎＮＩＧｎＮＹＶｎ
（各ｎは独立して任意のアミノ酸残基を表わす）で表わされるＶＬ ＣＤＲ１配列を含む、請求項１〜２７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２９】
ＣＤＲ１配列がＳＧＳＥＳＮＩＧＮＮＹＶＱである、請求項２８に記載の組成物。
【請求項３０】
死滅のメカニズムが、前記細胞の固有のあらかじめプログラムされたプロセスを含む、請求項１〜２９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項３１】
死滅がアポトーシスによるものではない、請求項３０に記載の組成物。
【請求項３２】
死滅が、非カスパーゼプロテアーゼの作用によるものであり、及び／または死滅がｚＶＡＤ−ｆｍｋもしくはｚＤＥＶＤ−ｆｍｋにより阻害され得ない、請求項３０に記載の組成物。
【請求項３３】
抗体に基づく抗原結合ドメインが、少なくともＦ（ａｂ’）２抗体フラグメントまたはミニ抗体フラグメントを含む多価ポリペプチドの一部である、請求項１〜３２のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項３４】
抗体に基づく抗原結合ドメインが、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ及びＦａｂフラグメントから選択される少なくとも２つの１価の抗体フラグメントを含む多価ポリペプチドの一部であり、さらに１以上の架橋成分を含む、請求項１〜３２のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項３５】
抗体に基づく抗原結合ドメインが、クラスＩｇＧ１、２ａ、２ｂ、３、４、ＩｇＡ及びＩｇＭの抗体から選択される少なくとも１つの完全な抗体を含む多価ポリペプチドの一部である、請求項１〜３２のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項３６】
抗体に基づく抗原結合ドメインが、細胞と結合する前に形成された多価ポリペプチドの一部である、請求項１〜３２のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項３７】
抗体に基づく抗原結合ドメインが、細胞と結合した後に形成された多価ポリペプチドの一部である、請求項１〜３２のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項３８】
抗原結合部位がポリマーに架橋している、請求項３または４に記載の組成物。
【請求項３９】
請求項１〜３２のいずれか１項に含まれる抗原結合ドメイン、またはその多価ポリペプチドのタンパク質コード配列を含む核酸。
【請求項４０】
請求項３９に記載の核酸及びそれに機能的に連結された転写調節配列を含むベクター。
【請求項４１】
少なくとも１つの請求項３９に記載の核酸または請求項４０に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項４２】
細胞毒性物質も免疫学的メカニズムも死滅に要しない方法で細胞の死滅を生起しまたは導く多価ポリペプチドを含む組成物の調製方法であって、請求項４１に記載の細胞を、前記核酸が多価ポリペプチドとして、またはその後の処理により多価ポリペプチド組成物を形成する少なくとも１つの抗原結合ドメインを含むポリペプチドとして、発現される条件下で培養することを含む、前記方法。
【請求項４３】
薬学的に許容される担体及び／または希釈剤で製剤化された、請求項１〜３８のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項４４】
動物の治療用の医薬製剤を調製するための請求項１〜３８のいずれか１項に記載の組成物の使用。
【請求項４５】
動物の治療用の医薬製剤を調製するための請求項３９に記載の核酸の使用。
【請求項４６】
動物の治療用の医薬製剤を調製するための請求項４１に記載の宿主細胞の使用。
【請求項４７】
動物の治療用の医薬製剤を調製するための請求項４２に記載の方法の使用。
【請求項４８】
動物がヒトである、請求項４４〜４７のいずれか１項に記載の使用。
【請求項４９】
細胞増殖性疾患を治療するための請求項４４〜４８のいずれか１項に記載の使用であって、抗体に基づく抗原結合ドメインが多価ポリペプチドの一部である、前記使用。
【請求項５０】
治療が、ＭＨＣクラスＩＩ抗原を発現する変態細胞が関与する疾患の治療である、請求項４９に記載の使用。
【請求項５１】
治療が、Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫、Ｂ細胞リンパ腫、Ｂ細胞急性リンパ性白血病、バーキットリンパ腫、ホジキンリンパ腫、ヘアリーセル白血病、急性骨髄性白血病、Ｔ細胞リンパ腫、Ｔ細胞非ホジキンリンパ腫、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病及び多発性骨髄性白血病から選択される疾患の治療である、請求項４９または５０に記載の使用。
【請求項５２】
治療が、免疫系の細胞、例えばＭＨＣクラスＩＩを発現するリンパ系細胞の望ましくない活性化を伴う疾患の治療である、請求項４４〜４８のいずれか１項に記載の使用。
【請求項５３】
治療が、慢性関節リウマチ、若年性関節炎、多発性硬化症、グレーブス病、インシュリン依存性糖尿病、ナルコレプシー、乾癬、全身性エリテマトーデス、強直性脊椎炎、移植拒絶、移植片対宿主病、橋本病、重症筋無力症、尋常性天疱瘡、糸球体腎炎、甲状腺炎、膵臓炎、インスリン炎、原発性胆汁性肝硬変、過敏性大腸疾患及びシェーグレン症候群から選択される疾患の治療である、請求項４４〜４８のいずれか１項に記載の使用。
【請求項５４】
疾患が、重症筋無力症、慢性関節リウマチ、多発性硬化症、移植拒絶及び移植片対宿主病から選択される、請求項４４〜４８のいずれか１項に記載の使用。
【請求項５５】
請求項１〜３８のいずれか１項に記載の組成物を含む診断用組成物。
【請求項５６】
請求項１〜３８のいずれか１項に記載の組成物及び１つ以上の架橋成分を含む診断用組成物。
【請求項５７】
表面上に抗原を発現する細胞を死滅させる方法であって、該細胞を請求項１〜３８のいずれか１項に記載の複数の抗原結合ドメインにより処理するステップを含み、抗体に基づく抗原結合ドメインが多価ポリペプチドの一部であり、前記死滅を生起しまたは導くのに細胞毒性物質も免疫学的メカニズムも必要としない、前記方法。
【請求項５８】
薬学的に許容される担体及び／または希釈剤で製剤化された請求項１〜３８のいずれか１項に記載の組成物により治療することができる患者を同定する方法であって、
ａ． 患者から細胞を分離し、
ｂ． 該細胞を前記組成物と接触させ、
ｃ． 該細胞の死滅または免疫抑制の程度を測定する、
ステップを含む、前記方法
【請求項５９】
薬学的に許容される担体及び／または希釈剤で製剤化された請求項１〜３８のいずれか１項に記載の組成物により治療することができる患者を同定するためのキットであって、
ａ． 請求項１〜３８のいずれか１項に記載の組成物、及び
ｂ． 前記細胞の死滅または免疫抑制の程度を測定するための手段、
を含む、前記キット。
【請求項６０】
ａ． 請求項１〜３８のいずれか１項に記載の組成物、及び
ｂ． 架橋成分、
を含むキット。
【請求項６１】
ａ． 請求項１〜３８のいずれか１項に記載の組成物、
ｂ． 検出可能な１以上の成分、及び
ｃ． （ｉ）と抗原との結合を行いかつ／または検出するための試薬及び／または溶液、
を含むキット。
【請求項６２】
細胞毒性物質と機能的に結合させた請求項１〜３８のいずれか１項に記載の組成物を含む細胞毒性組成物。
【請求項６３】
免疫原性物質と機能的に結合させた請求項１〜３８のいずれか１項に記載の組成物を含む免疫原性組成物。
【請求項６４】
細胞毒性物質または免疫原性物質と機能的に結合させた請求項１〜３８のいずれか１項に記載の組成物を細胞に接触させることを含む、細胞を死滅させる方法。
【請求項６５】
動物の治療用の医薬製剤を調製するための、細胞毒性物質または免疫原性物質と機能的に結合させた請求項１〜３８のいずれか１項に記載の組成物の使用。
【請求項６６】
１μＭ以下のＫｄでのヒトＭＨＣクラスＩＩ抗原に対する結合特異性を有する少なくとも１つの抗体に基づく抗原結合ドメインを含むポリペプチドを含有する組成物であって、前記ポリペプチドで前記抗原を発現する細胞を処理すると、免疫反応の抑制が生起するまたは導かれるものである、前記組成物。
【請求項６７】
ヒトＨＬＡ ＤＲ抗原に対する結合特異性を有する少なくとも１つの抗体に基づく抗原結合ドメインを含むポリペプチドを含有する組成物であって、前記ポリペプチドでＨＬＡ ＤＲを発現する細胞を処理すると、免疫反応の抑制が生起しまたは導かれ、前記抗原結合ドメインがＶＨドメイン及びＶＬドメインの組合せを含み、該組合せはＭＳ−ＧＰＣ−１、ＭＳ−ＧＰＣ−６、ＭＳ−ＧＰＣ−８、ＭＳ−ＧＰＣ−１０、ＭＳ−ＧＰＣ−８−１、ＭＳ−ＧＰＣ−８−６、ＭＳ−ＧＰＣ−８−９、ＭＳ−ＧＰＣ−８−１０、ＭＳ−ＧＰＣ−８−１７、ＭＳ−ＧＰＣ−８−１８、ＭＳ−ＧＰＣ−８−２７、ＭＳ−ＧＰＣ−８−６−２、ＭＳ−ＧＰＣ−８−６−１９、ＭＳ−ＧＰＣ−８−６−２７、ＭＳ−ＧＰＣ−８−６−４５、ＭＳ−ＧＰＣ−８−６−１３、ＭＳ−ＧＰＣ−８−６−４７、ＭＳ−ＧＰＣ−８−１０−５７、ＭＳ−ＧＰＣ−８−２７−７、ＭＳ−ＧＰＣ−８−２７−１０及びＭＳ−ＧＰＣ−８−２７−４１から選択されるクローンの１つに見られるものである、前記組成物。
【請求項６８】
１μＭ以下のＫｄでのヒトＭＨＣクラスＩＩ抗原に対する結合特異性を有する少なくとも１つの抗体に基づく抗原結合ドメインを含むポリペプチドを含有する組成物であって、前記抗原結合ドメインは、ヒトＭＨＣクラスＩＩ抗原に結合する能力により組換え抗体ライブラリーからヒト組成のＶＬ及びＶＨドメインを単離することを含む方法で単離されたものであり、ＭＨＣクラスＩＩを発現する細胞を前記ポリペプチドで処理すると、免疫反応の抑制が起こりまたは導かれる、前記組成物。
【請求項６９】
抗原結合ドメインの単離方法が、さらに
ａ． ＶＬ及びＶＨドメインの一方または両方のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列の少なくとも１つの変異体のライブラリーを作製し、
ｂ． １μＭ以下のＫｄでヒトＭＨＣクラスＩＩ抗原と結合する能力により変異体ライブラリーからＶＬ及びＶＨドメインを単離し、
ｃ． （任意に）少なくとも１つの別のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列によりステップ（ａ）及び（ｂ）を反復する、
ステップを含む、請求項６８に記載の組成物。
【請求項７０】
抗原結合ドメインがＨＬＡ−ＤＲに結合する、請求項６７、６８または６９に記載の組成物。
【請求項７１】
抗原結合ドメインがＨＬＡ−ＤＲのβ鎖に結合する、請求項６６または７０に記載の組成物。
【請求項７２】
抗原結合ドメインがＨＬＡ−ＤＲのβ鎖の第１ドメインのエピトープに結合する、請求項７１に記載の組成物。
【請求項７３】
細胞がリンパ系細胞である、請求項６６〜７２のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項７４】
細胞が非リンパ系細胞であり、ＭＨＣクラスＩＩ抗原を発現する、請求項６６〜７２のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項７５】
免疫応答を抑制するためのＩＣ５０が１μＭ以下である、請求項６６〜７４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項７６】
ＩＬ−２分泌を阻害するためのＩＣ５０が１μＭ以下である、請求項６６〜７４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項７７】
Ｔ細胞増殖を阻害するためのＩＣ５０が１μＭ以下である、請求項６６〜７４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項７８】
抗原結合ドメインが、ＤＲ１−０１０１、ＤＲ２−１５０２１、ＤＲ３−０３０１、ＤＲ４Ｄｗ４−０４０１、ＤＲ４Ｄｗ１０−０４０２、ＤＲ４Ｄｗ１４−０４０４、ＤＲ６−１３０２、ＤＲ６−１４０１、ＤＲ８−８０３１、ＤＲ９−９０１２、ＤＲｗ５３−Ｂ４＊０１０１及びＤＲｗ５２−Ｂ３＊０１０１からなる群から選択された１種以上のＨＬＡ−ＤＲタイプに結合する、請求項６６〜７７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項７９】
抗原結合ドメインが少なくとも５種の異なる前記ＨＬＡ−ＤＲタイプに結合する、請求項７８に記載の組成物。
【請求項８０】
抗原結合ドメインがＶＨドメイン及びＶＬドメインの組合せを含み、該組合せはＭＳ−ＧＰＣ−１、ＭＳ−ＧＰＣ−６、ＭＳ−ＧＰＣ−８、ＭＳ−ＧＰＣ−１０、ＭＳ−ＧＰＣ−８−１、ＭＳ−ＧＰＣ−８−６、ＭＳ−ＧＰＣ−８−９、ＭＳ−ＧＰＣ−８−１０、ＭＳ−ＧＰＣ−８−１７、ＭＳ−ＧＰＣ−８−１８、ＭＳ−ＧＰＣ−８−２７、ＭＳ−ＧＰＣ−８−６−２、ＭＳ−ＧＰＣ−８−６−１９、ＭＳ−ＧＰＣ−８−６−２７、ＭＳ−ＧＰＣ−８−６−４５、ＭＳ−ＧＰＣ−８−６−１３、ＭＳ−ＧＰＣ−８−６−４７、ＭＳ−ＧＰＣ−８−１０−５７、ＭＳ−ＧＰＣ−８−２７−７、ＭＳ−ＧＰＣ−８−２７−１０及びＭＳ−ＧＰＣ−８−２７−４１から選択されるクローンの１つに見られるものである、請求項６６〜７９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項８１】
抗原結合ドメインがＨｕＣＡＬ ＶＨ２及びＨｕＣＡＬ Ｖλ１の組合せを含み、ＶＨ ＣＤＲ３、ＶＬ ＣＤＲ１及びＶＬ ＣＤＲ３は、ＭＳ−ＧＰＣ−１、ＭＳ−ＧＰＣ−８、ＭＳ−ＧＰＣ−１０、ＭＳ−ＧＰＣ−８−１、ＭＳ−ＧＰＣ−８−６、ＭＳ−ＧＰＣ−８−９、ＭＳ−ＧＰＣ−８−１０、ＭＳ−ＧＰＣ−８−１７、ＭＳ−ＧＰＣ−８−１８、ＭＳ−ＧＰＣ−８−２７、ＭＳ−ＧＰＣ−８−６−２、ＭＳ−ＧＰＣ−８−６−１９、ＭＳ−ＧＰＣ−８−６−２７、ＭＳ−ＧＰＣ−８−６−４５、ＭＳ−ＧＰＣ−８−６−１３、ＭＳ−ＧＰＣ−８−６−４７、ＭＳ−ＧＰＣ−８−１０−５７、ＭＳ−ＧＰＣ−８−２７−７、ＭＳ−ＧＰＣ−８−２７−１０及びＭＳ−ＧＰＣ−８−２７−４１から選択されるクローンの１つに見られるものである、請求項６６〜７７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項８２】
抗原結合ドメインがＨｕＣＡＬ ＶＨ２及びＨｕＣＡＬ Ｖλ１の組合せを含み、ＶＨ ＣＤＲ３配列がコンセンサスＣＤＲ３配列：
ｎｎｎｎＲＧｎＦＤｎ
（各ｎは独立して任意のアミノ酸残基を表わす）から得られたものであり、及び／またはＶＬ ＣＤＲ３配列がコンセンサスＣＤＲ３配列：
ＱＳＹＤｎｎｎｎ
（各ｎは独立して任意のアミノ酸残基を表わす）から得られたものである、請求項６６〜７７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項８３】
ＶＨ ＣＤＲ３配列がＳＰＲＹＧＡＦＤＹであり、及び／またはＶＬ ＣＤＲ３配列がＱＳＹＤＬＩＲＨまたはＱＳＹＤＭＮＶＨである、請求項８２に記載の組成物。
【請求項８４】
抗原結合ドメインが、ＨｕＣＡＬ ＶＨ２及びＨｕＣＡＬ Ｖλ１の組合せを含む抗体と抗原結合について競合し、ＶＨ ＣＤＲ３配列がコンセンサスＣＤＲ３配列：
ｎｎｎｎＲＧｎＦＤｎ
（各ｎは独立して任意のアミノ酸残基を表わす）から得られたものであり、及び／またはＶＬ ＣＤＲ３配列がコンセンサスＣＤＲ３配列：
ＱＳＹＤｎｎｎｎ
（各ｎは独立して任意のアミノ酸残基を表わす）から得られたものである、請求項６６〜７７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項８５】
ＶＨ ＣＤＲ３配列がＳＰＲＹＧＡＦＤＹであり、及び／またはＶＬ ＣＤＲ３配列がＱＳＹＤＬＩＲＨまたはＱＳＹＤＭＮＶＨである、請求項８４に記載の組成物。
【請求項８６】
抗原結合ドメインが一般式：
ＳＧＳｎｎＮＩＧｎＮＹＶｎ
（各ｎは独立して任意のアミノ酸残基を表わす）で表わされるＶＬ ＣＤＲ１配列を含む、請求項６６〜８５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項８７】
ＣＤＲ１配列がＳＧＳＥＳＮＩＧＮＮＹＶＱである、請求項８６に記載の組成物。
【請求項８８】
免疫反応の抑制が、前記細胞の表面に発現される前記抗原の発現のダウンレギュレーションによりもたらされるか、または該ダウンレギュレーションにおいて現れる、請求項６６〜８５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項８９】
免疫反応の抑制が、前記細胞とその他の細胞との相互作用の阻害によりもたらされるか、または該阻害において現れ、前記相互作用が通常は免疫反応を導くものである、請求項６６〜８５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項９０】
免疫反応の抑制が、前記細胞の死滅によりもたらされるか、または該死滅において現れる、請求項６６〜８５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項９１】
前記死滅が複数の抗原結合ドメインの結合により媒介され、抗体に基づく抗原結合ドメインが多価ポリペプチドの一部であり、前記細胞の死滅を生起しまたは導くのに細胞毒性物質も免疫学的メカニズムも必要としない、請求項９０に記載の組成物。
【請求項９２】
薬学的に許容される担体及び／または希釈剤で製剤化された、請求項６６〜９１のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項９３】
動物において免疫応答を抑制するのに十分な量の請求項７５に記載の組成物を含む医薬製剤。
【請求項９４】
動物においてＩＬ−２分泌を阻害するのに十分な量の請求項７６に記載の組成物を含む医薬製剤。
【請求項９５】
動物においてＴ細胞増殖を阻害するのに十分な量の請求項７７に記載の組成物を含む医薬製剤。
【請求項９６】
動物（例えばヒト）の治療用の医薬製剤を調製するための請求項６６〜９１のいずれか１項に記載の組成物の使用。
【請求項９７】
請求項６６〜９１のいずれか１項に記載の組成物のポリペプチドのタンパク質コード配列を含む核酸。
【請求項９８】
請求項９７に記載のコード配列及びそれに機能的に連結された転写調節配列を含むベクター。
【請求項９９】
請求項９７に記載の核酸または請求項９８に記載のベクターを保持する宿主細胞。
【請求項１００】
請求項９９に記載の細胞を、前記核酸が発現される条件下で培養することを含む、免疫抑制組成物の調製方法。
【請求項１０１】
免疫系の細胞（例えばＨＬＡ ＤＲを発現するもの）の活性化を抑制する方法であって、該細胞を請求項６６〜９２のいずれか１項に記載の組成物で処理することを含む、前記方法。
【請求項１０２】
免疫系の細胞（例えばＨＬＡ ＤＲを発現するもの）の増殖を抑制する方法であって、該細胞を請求項６６〜９２のいずれか１項に記載の組成物で処理することを含む、前記方法。
【請求項１０３】
免疫系の細胞（例えばＨＬＡ ＤＲを発現するもの）によるＩＬ−２分泌を抑制する方法であって、該細胞を請求項６６〜９２のいずれか１項に記載の組成物で処理することを含む、前記方法。
【請求項１０４】
患者の免疫を抑制する方法であって、患者において免疫学的反応性のレベルを低下させるのに有効な量の請求項６６〜９２のいずれか１項に記載の組成物を患者に投与することを含む、前記方法。
【請求項１０５】
抗原（例えばＨＬＡ ＤＲ）を表面に発現する細胞を死滅させる方法であって、複数の請求項６６〜８７のいずれか１項に記載の抗原結合ドメインにより前記細胞を処理することを含んでなり、抗体に基づく抗原結合ドメインが多価ポリペプチドの一部であり、前記細胞の死滅を生起しまたは導くのに細胞毒性物質も免疫学的メカニズムも必要としない、前記方法。
【請求項１０６】
治療が、慢性関節リウマチ、若年性関節炎、多発性硬化症、グレーブス病、インシュリン依存性糖尿病、ナルコレプシー、乾癬、全身性エリテマトーデス、強直性脊椎炎、移植拒絶、移植片対宿主病、橋本病、重症筋無力症、尋常性天疱瘡、糸球体腎炎、甲状腺炎、膵臓炎、インスリン炎、原発性胆汁性肝硬変、過敏性大腸疾患及びシェーグレン症候群から選択される疾患の治療である、請求項９６に記載の使用。
【請求項１０７】
治療が、重症筋無力症、慢性関節リウマチ、多発性硬化症、移植拒絶、移植片対宿主病から選択される疾患の治療である、請求項９６に記載の使用。
【請求項１０８】
免疫系の細胞とその他の細胞との相互作用を抑制する方法であって、該細胞を請求項６６〜９２のいずれか１項に記載の組成物と接触させることを含む、前記方法。
【請求項１０９】
医薬ビジネスを行う方法であって、
（ｉ）ヒト細胞の表面に発現された抗原と結合する、１以上の抗原結合ドメインを単離し、
（ｉｉ）５０ ｎＭ以下のＥＣ５０で、前記抗原を発現する変態または活性化細胞を死滅させるが、前記死滅を生起しまたは導くのに細胞毒性物質も免疫学的メカニズムも必要としない、複数の前記抗原結合ドメインを含む多価組成物（例えば多価ポリペプチド）を生成し、
（ｉｉｉ）動物における効能及び毒性についての前記多価組成物の治療プロファイリングを行い、
（ｉｖ）増殖性疾患の治療用の該多価組成物について説明したパッケージ同封用の説明書を作成し、
（ｖ）増殖性疾患の治療用の多価組成物を販売する、
ことを含む、前記方法。
【請求項１１０】
ライフサイエンスビジネスを行う方法であって、
（ｉ）ヒト細胞の表面に発現された抗原に結合する、１以上の抗原結合ドメインを単離し、
（ｉｉ）５０ ｎＭ以下のＥＣ５０で、前記抗原を発現する変態または活性化細胞を死滅させるが、前記死滅を生起しまたは導くのに細胞毒性物質も免疫学的メカニズムも必要としない、複数の前記抗原結合ドメインを含む多価組成物（例えば多価ポリペプチド）を生成し、
（ｉｉｉ）前記多価組成物を販売する権利を第三者にライセンスし、共同開発し、または売却する、
ことを含む、前記方法。
【請求項１１１】
前記抗原結合ドメインが、
ａ． ＨＬＡ ＤＲと結合する能力により、組換え抗体ライブラリーからヒト組成のＶＬ及びＶＨドメインを単離し、
ｂ． ＶＬ及びＶＨドメインの一方または両方のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３ドメインの少なくとも１の変異体のライブラリーを作製し、
ｂ． １μＭ以下のＫｄでＨＬＡ ＤＲと結合する能力により、変異体のライブラリーからＶＬ及びＶＨドメインを単離する、
ことを含む方法により単離される、請求項１０９または１１０に記載の方法。
【請求項１１２】
医薬ビジネスを行う方法であって、
（ｉ） １μＭ以下のＫｄでヒト細胞表面に発現されたＭＨＣクラスＩＩと結合する１種以上の抗原結合ドメインを単離し、
（ｉｉ）１００ ｎＭ以下のＩＣ５０を有する免疫抑制剤である、前記抗原結合ドメインを含む組成物を生成し、
（ｉｉｉ）動物における効能及び毒性についての前記組成物の治療プロファイリングを行い、
（ｉｖ）免疫抑制療法用の前記組成物の使用について説明したパッケージ同封用の説明書を作成し、
（ｖ） 免疫抑制剤として使用するための前記組成物を販売する、
ことを含む、前記方法。
【請求項１１３】
ライフサイエンスビジネスを行う方法であって、
（ｉ） １μＭ以下のＫｄでヒト細胞表面に発現されたＭＨＣクラスＩＩと結合する１種以上の抗原結合ドメインを単離し、
（ｉｉ）１００ ｎＭ以下のＩＣ５０を有する免疫抑制剤である、前記抗原結合ドメインを含む組成物を生成し、
（ｉｉｉ）前記組成物を販売する権利を第三者にライセンスし、共同開発し、または売却する、
ことを含む、前記方法。
【請求項１１４】
前記抗原結合ドメインが、
ａ． ＨＬＡ ＤＲと結合する能力により、組換え抗体ライブラリーからヒト組成のＶＬ及びＶＨドメインを単離し、
ｂ． ＶＬ及びＶＨドメインの一方または両方のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列の少なくとも１つの変異体のライブラリーを作製し、
ｂ． １μＭ以下のＫｄでＨＬＡ ＤＲと結合する能力により、変異体のライブラリーからＶＬ及びＶＨドメインを単離する、
ことを含む方法により単離される、請求項１１２または１１３に記載の方法。
【請求項１１５】
抗原結合ドメインが、ＭＳ−ＧＰＣ−１、ＭＳ−ＧＰＣ−６、ＭＳ−ＧＰＣ−８、ＭＳ−ＧＰＣ−１０、ＭＳ−ＧＰＣ−８−１、ＭＳ−ＧＰＣ−８−６、ＭＳ−ＧＰＣ−８−９、ＭＳ−ＧＰＣ−８−１０、ＭＳ−ＧＰＣ−８−１７、ＭＳ−ＧＰＣ−８−１８、ＭＳ−ＧＰＣ−８−２７、ＭＳ−ＧＰＣ−８−６−２、ＭＳ−ＧＰＣ−８−６−１９、ＭＳ−ＧＰＣ−８−６−２７、ＭＳ−ＧＰＣ−８−６−４５、ＭＳ−ＧＰＣ−８−６−１３、ＭＳ−ＧＰＣ−８−６−４７、ＭＳ−ＧＰＣ−８−１０−５７、ＭＳ−ＧＰＣ−８−２７−７、ＭＳ−ＧＰＣ−８−２７−１０及びＭＳ−ＧＰＣ−８−２７−４１から選択されるクローンの１つに見られるＶＨドメイン及びＶＬドメインの組合せを含む、請求項１０９〜１１４のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の背景
これまで研究されたあらゆる哺乳動物は、いわゆる主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）をコードする遺伝子のクラスターを保有している。この強固にリンクされた遺伝子のクラスターは表面抗原をコードし、それらは体液及び細胞の両方を介する免疫反応の発生において中心的な役割を果たしている。ヒトにおいては、ＭＨＣによってコードされた産物はヒト白血球抗原（Ｈｕｍａｎ Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ Ａｎｔｉｇｅｎ： ＨＬＡ）と呼ばれる。ＭＨＣ遺伝子は、クラスＩからクラスＩＩＩまでの３クラスの分子をコードする領域に配置されている。
【０００２】
クラスＩ ＭＨＣ分子は、４５ ｋＤの膜貫通糖タンパク質からなり、これらは別の糖タンパク質である１２ ｋＤのβ−２ミクログロブリンと非共有結合で結合している（Ｂｒｏｗｎ ｅｔ ａｌ．， １９９３）。後者は細胞膜に挿入されず、ＭＨＣの外側にコードされる。ヒトクラスＩ分子は異なる３種のアイソタイプのものであり、ＨＬＡ−Ａ、−Ｂ及び−Ｃと命名され、別々の遺伝子座にコードされている。クラスＩ分子の組織発現は遍在的で共優性である。ＭＨＣクラスＩ分子は細胞傷害性Ｔ細胞の活性化に必要なペプチド抗原を提示する。
【０００３】
クラスＩＩ ＭＨＣ分子は、２種の膜貫通糖タンパク質、３５ ｋＤ α鎖及び２８ ｋＤ β鎖の非共有結合的に結合したヘテロダイマーである（Ｂｒｏｗｎ ｅｔ ａｌ、１９９３）。ヒトにおいては、クラスＩＩ分子は、異なる３種のアイソタイプとして存在し、ヒト白血球抗原ＤＲ（ＨＬＡ−ＤＲ）、ＨＬＡ−ＤＰ及びＨＬＡ−ＤＱと命名されている。ＤＲにおける多形性はβ鎖に限定されているが、ＤＰ及びＤＱアイソタイプにおいては両方の鎖が多形性である。クラスＩＩ分子は共優性的に発現されるが、クラスＩとは異なり、限定された組織分布を示し、それらは免疫系の細胞、例えば樹状細胞、マクロファージ、Ｂリンパ細胞、活性化Ｔリンパ球などの表面にのみ存在する。それらはさらに正常な副腎の網状帯中のヒト副腎皮質細胞上及び正常な卵巣の黄体中の顆粒膜黄体細胞上にも発現される（Ｋａｈｏｕｒｙ ｅｔ ａｌ．， １９９０）。その主要な生物学的役割は、ＣＤ４ヘルパー（Ｔｈ）リンパ細胞による認識のために、抗原性ペプチドと結合してそれらを抗原提示細胞（ＡＰＣ）の表面に存在させることである（Ｂａｂｂｉｔｔ ｅｔ ａｌ．， １９８５）。またＭＨＣ クラスＩＩ分子は、非免疫系細胞（例えば病理学的炎症反応の間にＭＨＣクラスＩＩ分子を発現する細胞）の表面にも発現され得る。そのような細胞には滑膜細胞、内皮細胞、甲状腺ストロマ細胞及び神経膠細胞が含まれる。
【０００４】
クラスＩＩＩ ＭＨＣ分子も免疫反応と関連するが、いくらか異なる産物をコードしている。そのようなものとしては、いくつかの可溶性血清タンパク質、酵素及びタンパク質、例えば腫瘍壊死因子やステロイド２１−ヒドロキシラーゼ酵素、が挙げられる。ヒトにおいては、クラスＩＩＩ分子は３種の異なるアイソタイプとして存在し、Ｃａ、Ｃ２及びＢｆと命名されている（Ｋｕｂｙ， １９９４）。
【０００５】
Ｔｈ細胞の活性化は、事実上すべての免疫反応の開始に極めて重要なイベントであって、クラスＩＩ分子によって媒介されるので、クラスＩＩ ＭＨＣはそれ自体を免疫調節の標的として提供する（Ｂａｘｅｖａｎｉｓ ｅｔ ａｌ．， １９８０； Ｒｏｓｅｎｂａｕｍ ｅｔ ａｌ．， １９８１； Ａｄｏｒｉｎｉ ｅｔ ａｌ．， １９８８）。ペプチド提示に加えて、クラスＩＩ分子はＡＰＣの生理学に影響を及ぼす様々のシグナルを伝達することができる。そのようなシグナルは、複数のクラスＩＩ分子とＴｈ細胞の抗体もしくは抗原レセプターとの相互作用によって発生し（Ｖｉｄｏｖｉｃ ｅｔ ａｌ．， １９９５ａ； Ｖｉｄｏｖｉｃ ｅｔ ａｌ．， １９９５ｂ）、Ｂ細胞の活性化及び免疫グロブリン分泌（Ｃａｍｂｉｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９９１； Ｐａｌａｃｉｏｓ ｅｔ ａｌ．， １９８３）、単球によるサイトカイン生産（Ｐａｌａｃｉｏｓ， １９８５）、ならびに補助刺激分子（Ｎａｂａｖｉ ｅｔ ａｌ．， １９９２）及び細胞接着分子（Ｍｏｕｒａｄ ｅｔ ａｌ．， １９９０）のアップレギュレーションを誘起させることができる。
【０００６】
また、クラスＩＩ結合はある種の条件下で細胞増殖停止を招いたり、細胞毒性となり得ることを示唆するいくつかの観察もある。これらの条件下における結合はポリペプチドとクラスＩＩ ＭＨＣ分子との相互作用である。後者の効果及びそれらの可能なメカニズムに関して大きな矛盾がある。ある著者は、Ｂ細胞上のクラスＩＩ分子の複合体の形成が増殖阻害をもたらすと主張しており（Ｖａｉｃｋｕｓ ｅｔ ａｌ．， １９８９； Ｋａｂｅｌｉｔｚ ｅｔ ａｌ．， １９８９）、一方、他の著者によれば、クラスＩＩ複合体の形成が細胞死をもたらす（Ｖｉｄｏｖｉｃ ｅｔ ａｌ．， １９９５ａ； Ｎｅｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ．， １９９３； Ｔｒｕｍａｎ ｅｔ ａｌ．， １９９４； Ｔｒｕｍａｎ ｅｔ ａｌ．， １９９７； Ｄｒｅｎｏｕ ｅｔ ａｌ．， １９９９）。ある実験系においては、この現象は休止Ｂ細胞のみに観察され（Ｎｅｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ．， １９９３）、あるいは別の系では活性化されたＢ細胞のみに見られた（Ｖｉｄｏｖｉｃ ｅｔ ａｌ．， １９９５ａ； Ｔｒｕｍａｎ ｅｔ ａｌ．， １９９４）。
【０００７】
これらの観察に基づいて、抗クラスＩＩモノクローナル抗体（ｍＡｂ）は長年治療薬の候補として考えられてきた。実際、この提案は、一連の動物疾病モデルにおけるマウス由来抗クラスＩＩ ｍＡｂの有益な効果によって支持されている（Ｗａｌｄｏｒ ｅｔ ａｌ．， １９８３； Ｊｏｎｋｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９８８； Ｓｔｅｖｅｎｓ ｅｔ ａｌ．， １９９０； Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．， １９９４； Ｖｉｄｏｖｉｃ ＆ Ｔｏｒｒａｌ， １９９８； Ｖｉｄｏｖｉｃ ＆ Ｌａｕｓ， ２０００）。
【０００８】
これらの初期の支持データにもかかわらず、これまで所望の細胞毒性及び親和性、殺傷効率、選択性などのその他の生物学的特性を示すヒト組成の抗ＭＨＣ クラスＩＩ ｍＡｂは記載されていない。実際、マウス由来ｍＡｂは比較的容易に誘導できるにもかかわらず、マウス由来ｍＡｂを使用した研究からは、所望の生物学的特性を有する抗体を得ることの困難性が示されている。例えば、異なるマウス抗クラスＩＩ ｍＡｂのＴ細胞阻害能力において、顕著ではあるが完全には解明されていない差異が観察されている（Ｎａｑｕｅｔ ｅｔ ａｌ．， １９８３）。さらに、ある種のマウス由来ｍＡｂをｉｎ ｖｉｖｏ適用すると、予想されなかった副作用が起こり、ときには実験用霊長類が死亡した（Ｂｉｌｌｉｎｇ ｅｔ ａｌ．， １９８３； Ｊｏｎｋｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９９１）。
【０００９】
マウス由来ｍＡｂ（キメラ及びいわゆる「ヒト化」ｍＡｂを含む）は、ヒトｍＡｂによる治療（例えばＶｏｓｅ ｅｔ ａｌ．， ２０００； Ｋａｓｈｍｉｒｉ ｅｔ ａｌ．， ２００１）と比較して、患者において有害な免疫反応（ヒト抗マウス抗体、ＨＡＭＡ）を起こす危険性が高いことは一般に認められている。この危険性は、慢性関節リウマチや多発性硬化症のような慢性疾患をマウス由来ｍＡｂで治療する場合、または例えばある種の癌の治療のような定期的な治療が必要となる場合において、大きく増加する。すなわち、ヒト免疫系を非ヒト分子に長期間暴露すると、有害な免疫反応が発生することが多い。さらに、所望の抗原に対する所望の特異性または親和性を有するマウス由来抗体を得ることは非常に難しいことが判っている（Ｐｉｃｈｌａ ｅｔ ａｌ．， １９９７）。このような観察は、マウス由来ｍＡｂによって提供される全体的な治療効果または利点を大きく減じる可能性がある。マウス由来ｍＡｂの欠点の例としては以下のものが挙げられる。第１に、マウス由来ｍＡｂは、それらが適切である症状の治療の医学的条件または期間において限定され得る。第２に、マウス由来ｍＡｂの投与量は、比較的低い親和性や治療効果を補うために比較的高くする必要があり、そのため投与量がより苛酷になるばかりでなく、免疫原性がより高くなり、おそらくは危険性も高まる。第３に、適当な治療計画におけるそのような制限ならびに高生産量を必要とする高い投与量は、治療コストを顕著に高くし、また、そのようなマウス由来ｍＡｂを商業的治療薬として開発することが不経済であることを意味する。さらに、たとえマウスｍＡｂが所望の特異性または親和性を示すことが判ったとしても、そのような所望の特徴は免疫原性の強さを減じるために必要な「ヒト化」または「キメラ化」の間に著しく損なわれてしまうことが多い （Ｓｌａｖｉｎ−Ｃｈｉｏｒｉｎｉ ｅｔ ａｌ．， １９９７）。ひとたびマウス由来ｍＡｂが「ヒト化」またはキメラ化されてしまうと、その特異性または親和性を最適化することは非常に困難である。
【００１０】
当技術分野では、ヒト治療用の医薬組成物に使用するのに適した生物学的特性を示すヒト組成の抗ＭＨＣクラスＩＩ ｍＡｂが長年求められてきた。当分野の研究者らは、最初にマウス由来ｍＡｂを同定し、次にこの非ヒト分子のヒト患者に対する免疫寛容を改善する目的で前記ｍＡｂの構造を改変する工程ステップを実施してきた（詳細についてはＪｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．， １９８６； Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．， １９８８； Ｐｒｅｓｔａ， １９９２を参照）。この改変は通常いわゆる「ヒト化」法を使用するか、ヒト−マウスキメラｍＡｂを製造することによって行われる。別の研究者らは、ヒト抗体多様性の天然のレパートリーの中から所望の特性を有するヒト抗原と結合するヒト抗体を同定しようと試みてきた。例えば、妊娠女性における胎児寛容機構を調査することにより（Ｂｏｎａｇｕｒａ ｅｔ ａｌ．， １９８７）、または天然の多様な抗体のライブラリーをパンニングすることにより（Ｓｔａｕｓｂｏｌ−Ｇｒｏｎ ｅｔ ａｌ．， １９９６； Ｗｉｎｔｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９９４）行なわれてきた。しかしながら、これまで、細胞毒性、選択性、特異性、低免疫原性及び親和性のような所望の生物学的特性を示すヒト組成の抗ＭＨＣ クラスＩＩ ｍＡｂが開示されたことはない。
【００１１】
治療の目的のためには、例えば多様な患者の集団での使用を可能とするために、ヒトクラスＩＩ ＭＨＣ分子の多くのまたは少なくとも大部分の共通の対立遺伝子形態と反応するポリペプチドが望ましい。さらに候補ポリペプチドは広範囲のリンパ系腫瘍に対して細胞毒性を示し、好ましくはそのような範囲の腫瘍細胞に共通した作用機構を介して細胞毒性を示すものである。広範囲の用途を可能にするためには、所望されるポリペプチドは、免疫系の別の成分に依存することなく、その細胞毒性効果を媒介しなければならない。治療目的のため、殆どの患者は例えば癌の治療のために標準的な化学療法または放射線療法を受けている。これらの治療の殆どは患者を免疫無防備状態に置く。従って、インタクトな免疫系に依存する付加的な治療はいずれも失敗しやすい。この根本的な問題は、免疫系を破壊する疾患、例えばＨＩＶに罹患するヒトにおいてさらに実証される。日和見感染及び悪性転換は免疫監視を逃れることができ、さらに別の合併症を引き起こし得る。
【００１２】
発明の概要
本発明の１つの態様は、ヒト細胞の表面上に発現された抗原に対する結合特異性を有するヒト組成の抗体に基づく抗原結合ドメインの少なくとも１つを含むポリペプチドを含有する組成物であって、２以上の前記抗原結合ドメインを有する多価ポリペプチドで前記抗原を発現する細胞を処理すると、細胞毒性物質も免疫学的メカニズムも死滅に要しない方法で、前記細胞の死滅が生起しまたは導かれる前記組成物に関する。好ましい実施形態においては、前記抗原はＭＨＣ抗原、好ましくはＭＨＣクラスＩＩ抗原、例えばＤＲ／ＤＰ／ＤＱまたはＤＲである。例えば、ある好ましい実施形態において、本組成物は、、１μＭ、１００ ｎＭ、１０ ｎＭまたはわずか１ ｎＭ未満のＫｄでヒトＨＬＡ ＤＲと結合する抗体に基づく抗原結合ドメインの少なくとも１つを有するポリペプチドを含む。
【００１３】
本発明の別の態様は、ヒトＨＬＡ ＤＲに対する結合特異性を有するヒト組成の抗体に基づく抗原結合ドメインを複数有する多価ポリペプチドを含む組成物を提供する。前記多価ポリペプチドでＨＬＡ ＤＲを発現する細胞を処理すると、細胞毒性物質も免疫学的メカニズムも死滅に要しない方法で、前記細胞の死滅が生起しまたは導かれる。ある好ましい実施形態において、前記抗原結合ドメインはそれぞれ１μＭ、１００ ｎＭ、１０ ｎＭまたはわずか１ ｎＭ未満のＫｄでヒトＨＬＡ ＤＲと結合する。ある好ましい実施形態において、前記多価ポリペプチドは、活性化リンパ系細胞、変態細胞及び／またはリンパ系腫瘍細胞の死滅について１００ ｎＭ、１０ ｎＭまたはわずか１ ｎＭ未満のＥＣ５０を有する。
【００１４】
本発明のさらに別の態様は、１μＭ、１００ ｎＭ、１０ ｎＭまたはわずか１ ｎＭ未満のＫｄでヒトＨＬＡ ＤＲと結合する抗体に基づく抗原結合ドメインを少なくとも１つ含むポリペプチドを含有する組成物であって、前記抗原結合ドメインはヒトＨＬＡ ＤＲの少なくとも１つのエピトープと結合する能力によって組換え抗体ライブラリーからヒトＶＬ及びＶＨドメインを単離することを含む方法により単離されたものである前記組成物を提供する。２以上の前記抗原結合ドメインを有する多価ポリペプチドでＨＬＡ ＤＲを発現する細胞を処理すると、細胞毒性物質も免疫学的メカニズムも死滅に要しない方法で、前記細胞の死滅が生起しまたは導かれる。ある実施形態においては、前記抗原結合ドメインを単離する方法は、さらに
ａ． ＶＬ及びＶＨドメインの一方または両方のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列の少なくとも１の変異体のライブラリーを作製し、
ｂ． １μＭ以下のＫｄでヒトＨＬＡ ＤＲと結合する能力により変異体ライブラリーからＶＬ及びＶＨドメインを単離する、
各ステップを含む。
【００１５】
ある好ましい実施形態においては、本組成物は、変態細胞を死滅させることについて、正常な細胞を死滅させることについてのＥＣ５０の５分の１以下、より好ましくは１０分の１以下、または１００分の１以下、さらには１０００分の１以下のＥＣ５０を有する多価ポリペプチドを含むことを特徴とし得る。
【００１６】
ある好ましい実施形態においては、本組成物は、活性化された細胞を死滅させることについて、活性化されていない細胞を死滅させることについてのＥＣ５０の５分の１以下、より好ましくは１０分の１以下、または１００分の１以下、さらには１０００分の１以下のＥＣ５０を有する多価ポリペプチドを含むことを特徴とし得る。
【００１７】
ある好ましい実施形態においては、本組成物は、変態細胞を死滅させることについて、５０ ｎＭ以下のＥＣ５０、より好ましくは１０ ｎＭ、１ ｎＭ、さらには０．１ ｎＭ未満のＥＣ５０を有する多価ポリペプチドを含むことを特徴とし得る。特定の実施形態においては、本発明の多価ポリペプチドは、活性化リンパ細胞、変態細胞及び／またはリンパ系腫瘍細胞の死滅について１００ ｎＭ、１０ ｎＭ、さらには１ ｎＭ以下のＥＣ５０を有する。
【００１８】
ある実施形態においては、本組成物は、活性化リンパ系細胞を選択的に死滅させる多価ポリペプチドを含む。例えば、そのような多価形態の本組成物は、Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫、Ｂ細胞リンパ腫、Ｂ細胞急性リンパ性白血病、バーキットリンパ腫、ホジキンリンパ腫、ヘアリーセル白血病、急性骨髄性白血病、Ｔ細胞リンパ腫、Ｔ細胞非ホジキンリンパ腫、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病及び多発性骨髄性白血病から選択される疾患を示すリンパ系腫瘍細胞である活性化リンパ系細胞を死滅させるのに使用することができる。死滅させることができる活性化リンパ系腫瘍細胞の例としては、Ｐｒｉｅｓｓ、ＧＲＡＮＴＡ−５１９、ＫＡＲＰＡＳ−４２２、ＫＡＲＰＡＳ−２９９、ＤＯＨＨ−２、ＳＲ−７８６、ＭＨＨ−ＣＡＬＬ−４、ＭＮ−６０、ＢＪＡＢ、ＲＡＪＩ、Ｌ−４２８、ＨＤＬＭ−２、ＨＤ−ＭＹ−Ｚ、ＫＭ−Ｈ２、Ｌ１２３６、ＢＯＮＮＡ−１２、ＨＣ−１、ＮＡＬＭ−１、Ｌ−３６３、ＥＯＬ−１、ＬＰ−１、ＲＰＭＩ−８２２６及びＭＨＨ−ＰＲＥＢ−ｌ細胞系が挙げられる。ある好ましい実施形態においては、本組成物は、ＫＡＲＰＡＳ−４２２、ＤＯＨＨ−２、ＳＲ−７８６、ＭＨＨ−ＣＡＬＬ−４、ＭＮ−６０、ＨＤ−ＭＹ−Ｚ、ＮＡＬＭ−ｌ及びＬＰ−１から選択されたＢ細胞リンパ腫細胞及びＴ細胞リンパ腫細胞の少なくとも１種を死滅させることについて１００ ｎＭ以下、好ましくは１０ ｎＭ未満、さらには１ ｎＭ未満のＥＣ５０を有する。場合によっては、細胞を死滅させるために、例えば２，３の名を挙げると、リポ多糖（ＬＰＳ、１０μｇ／ｍｌ）、インターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ、Ｒｏｃｈｅ、４０ ｎｇ／ｍｌ）及び／またはフィトヘマグルチニン（ＰＨＡ、５μｇ／ｍｌ）と共にインキュベートすることにより、標的細胞をさらに活性化または予備活性化する必要があるかもしれない。
【００１９】
ある実施形態においては、本組成物の多価形態はＭＨＣクラスＩＩ分子を発現する非リンパ系細胞を死滅させるのに使用することができる。
【００２０】
ある実施形態においては、本組成物の抗原結合ドメインの１つ以上はＨＬＡ−ＤＲのβ鎖に結合し、例えば抗原結合ドメインはＨＬＡ−ＤＲのβ鎖の第１ドメインに結合する。
【００２１】
別のある実施形態においては、本組成物の抗原結合ドメインの１つ以上はＨＬＡ−ＤＲのα鎖に結合し、例えば抗原結合ドメインはＨＬＡ−ＤＲのα鎖の第１ドメインに結合する。
【００２２】
ある好ましい実施形態においては、本組成物の抗原結合ドメインは、ＤＲ１−０１０１、ＤＲ２−１５０２１、ＤＲ３−０３０１、ＤＲ４Ｄｗ４−０４０１、ＤＲ４Ｄｗ１０−０４０２、ＤＲ４Ｄｗ１４−０４０４、ＤＲ６−１３０２、ＤＲ６−１４０１、ＤＲ８−８０３１、ＤＲ９−９０１２、ＤＲＷ５３−Ｂ４＊０１０１及びＤＲＷ５２−Ｂ３＊０１０１からなる群から選択された１種以上のＨＬＡ−ＤＲタイプに結合する。好ましい実施形態においては、本組成物の抗原結合ドメインは広範なＤＲ反応性を提供し、すなわち所与の組成物の抗原結合ドメインは前記ＨＬＡ−ＤＲタイプの少なくとも５種のもののエピトープに結合する。ある実施形態においては、本組成物のポリペプチドの抗原結合ドメインは、ヒト集団の少なくとも６０パーセント、より好ましくはヒト集団の少なくとも７５パーセント、さらに好ましくは８５パーセントに関して、ＨＬＡ−ＤＲ発現細胞と結合するように、複数のＨＬＡ−ＤＲタイプと結合する。
【００２３】
ある実施形態においては、本組成物の抗原結合ドメインはＶＨドメイン及びＶＬドメインの組合せを含み、該組合せはＭＳ−ＧＰＣ−１、ＭＳ−ＧＰＣ−６、ＭＳ−ＧＰＣ−８、ＭＳ−ＧＰＣ−１０、ＭＳ−ＧＰＣ−８−１、ＭＳ−ＧＰＣ−８−６、ＭＳ−ＧＰＣ−８−９、ＭＳ−ＧＰＣ−８−１０、ＭＳ−ＧＰＣ−８−１７、ＭＳ−ＧＰＣ−８−１８、ＭＳ−ＧＰＣ−８−２７、ＭＳ−ＧＰＣ−８−６−２、ＭＳ−ＧＰＣ−８−６−１９、ＭＳ−ＧＰＣ−８−６−２７、ＭＳ−ＧＰＣ−８−６−４５、ＭＳ−ＧＰＣ−８−６−１３、ＭＳ−ＧＰＣ−８−６−４７、ＭＳ−ＧＰＣ−８−１０−５７、ＭＳ−ＧＰＣ−８−２７−７、ＭＳ−ＧＰＣ−８−２７−１０及びＭＳ−ＧＰＣ−８−２７−４１から選択されるクローンの１つに見られるものである。
【００２４】
ある実施形態においては、本組成物の抗原結合ドメインはＨｕＣＡＬ ＶＨ２及びＨｕＣＡＬ Ｖλ１の組合せを含み、ＶＨ ＣＤＲ３、ＶＬ ＣＤＲ１及びＶＬ ＣＤＲ３は、ＭＳ−ＧＰＣ−１、ＭＳ−ＧＰＣ−８、ＭＳ−ＧＰＣ−１０、ＭＳ−ＧＰＣ−８−１、ＭＳ−ＧＰＣ−８−６、ＭＳ−ＧＰＣ−８−９、ＭＳ−ＧＰＣ−８−１０、ＭＳ−ＧＰＣ−８−１７、ＭＳ−ＧＰＣ−８−１８、ＭＳ−ＧＰＣ−８−２７、ＭＳ−ＧＰＣ−８−６−２、ＭＳ−ＧＰＣ−８−６−１９、ＭＳ−ＧＰＣ−８−６−２７、ＭＳ−ＧＰＣ−８−６−４５、ＭＳ−ＧＰＣ−８−６−１３、ＭＳ−ＧＰＣ−８−６−４７、ＭＳ−ＧＰＣ−８−１０−５７、ＭＳ−ＧＰＣ−８−２７−７、ＭＳ−ＧＰＣ−８−２７−１０及びＭＳ−ＧＰＣ−８−２７−４１から選択されるクローンの１つに見られるものである。
【００２５】
別の好ましい実施形態においては、抗原結合ドメインは、アミノ酸残基の付加、欠失及び／または置換により本発明の親の抗原結合ドメインから修飾されているが、親の抗原結合ドメインの本発明による特性は維持されるか、該特性の１以上は改良されているものである。このような修飾は、限定するものではないが、クローニングを目的とした親の抗原結合ドメインをコードする核酸配列の修飾、抗原結合親和性及び／または特異性の改良または修飾を目的としたＣＤＲ領域の修飾（１以上の異なる抗原結合ドメインからの対応するＣＤＲ配列による親の抗原結合ドメインの１以上のＣＤＲ領域の交換など）、ならびに検出及び／または精製を目的としたペプチド配列の付加を含み得る。付加、欠失及び／または置換を生じさせる所与の親抗原結合ドメインにおける位置を特定し、前記アプローチを設計及び実施して前記の付加、欠失及び／または置換を行ない、修飾された抗原結合ドメインが親の抗原結合ドメインと比較して前記特性を維持しているか、または１以上の改良された特性を示すかどうかを試験またはアッセイすることは、当業者が容易に行える範囲である。さらに、当業者であれば、修飾された抗原結合ドメインのコレクションまたはライブラリーを設計し、構築し、スクリーニングして、親の抗原結合ドメインと比較して前記特性を維持している、または１以上の改良された特性を示す１つ以上の抗原結合ドメインを同定することが可能であろう。ある例においては、本発明の任意の抗原結合ドメインに含まれるＨｕＣＡＬ ＶＨドメインの最初のアミノ酸残基は、発現構築物に応じてＥまたはＱであるが、これはＱまたはＥによりそれぞれ置換されていてもよい。本発明により修飾された抗原結合ドメインのコレクションまたはライブラリーを設計し、構築し、スクリーニングして抗原結合ドメインを最適化するのに好適な領域は、ＣＤＲ領域を含み、最も好ましくはＶＨ及びＶＬドメインのＣＤＲ３、ＶＬドメインのＣＤＲ１及びＶＨドメインのＣＤＲ２を含むものである。
【００２６】
ある実施形態においては、抗原結合ドメインは、ＨｕＣＡＬ ＶＨ２及びＨｕＣＡＬ Ｖλ１の組合せを含み、ここでＶＨ ＣＤＲ３配列はコンセンサスＣＤＲ３配列：
ｎｎｎｎＲＧｎＦＤｎ
（各ｎは独立して任意のアミノ酸残基を表わす）から得られたものであり、及び／またはＶＬ ＣＤＲ３配列はコンセンサスＣＤＲ３配列：
ＱＳＹＤｎｎｎｎ
（各ｎは独立して任意のアミノ酸残基を表わす）から得られたものである。例えば、ＶＨ ＣＤＲ３配列はＳＰＲＹＧＡＦＤＹであり、及び／またはＶＬ ＣＤＲ３配列はＱＳＹＤＬＩＲＨまたはＱＳＹＤＭＮＶＨである。
【００２７】
ある実施形態においては、本発明の抗原結合ドメインは、ＨｕＣＡＬ ＶＨ２及びＨｕＣＡＬ Ｖλ１の組合せを含む抗体と抗原結合について競合し、ここでＶＨ ＣＤＲ３配列はコンセンサスＣＤＲ３配列：
ｎｎｎｎＲＧｎＦＤｎ
（各ｎは独立して任意のアミノ酸残基を表わす）から得られたものであり、及び／またはＶＬ ＣＤＲ３配列はコンセンサスＣＤＲ３配列：
ＱＳＹＤｎｎｎｎ（各ｎは独立して任意のアミノ酸残基を表わす）から得られたものである。例えば、ＶＨ ＣＤＲ３配列はＳＰＲＹＧＡＦＤＹであり、及び／またはＶＬ ＣＤＲ３配列はＱＳＹＤＬＩＲＨまたはＱＳＹＤＭＮＶＨである。
【００２８】
ある好ましい実施形態においては、抗原結合ドメインは一般式：
ＳＧＳｎｎＮＩＧｎＮＹＶｎ
（各ｎは独立して任意のアミノ酸残基を表わす）で表わされるＶＬ ＣＤＲ１配列を含む。
例えばＣＤＲ１配列はＳＧＳＥＳＮＩＧＮＮＹＶＱである。
【００２９】
好ましい実施形態においては、本組成物の多価形態による死滅のメカニズムは、前記細胞の固有のあらかじめプログラムされたプロセスを含む。例えば、前記死滅はアポトーシスによるものではない。本組成物による死滅は、非カスパーゼプロテアーゼの作用によるものであり得、及び／またはｚＶＡＤ−ｆｍｋまたはｚＤＥＶＤ−ｆｍｋにより阻害されない死滅であり得る。
【００３０】
ある好ましい実施形態においては、抗体に基づく抗原結合ドメインは、少なくともＦ（ａｂ’）２抗体フラグメントまたはミニ抗体フラグメントを含む多価ポリペプチドの一部である。
【００３１】
ある好ましい実施形態においては、抗体に基づく抗原結合ドメインは、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ及びＦａｂフラグメントから選択される少なくとも２個の１価抗体フラグメントを含む多価ポリペプチドの一部を含み、さらに１以上の架橋成分を含む。
【００３２】
ある好ましい実施形態においては、抗体に基づく抗原結合ドメインは、クラスＩｇＧ１、２ａ、２ｂ、３、４、ＩｇＡ及びＩｇＭの抗体から選択される少なくとも１つの完全な抗体を含む多価ポリペプチドの一部である。
【００３３】
ある好ましい実施形態においては、抗体に基づく抗原結合ドメインは、前記細胞に結合する前に形成された多価ポリペプチドの一部である。
【００３４】
ある好ましい実施形態においては、抗体に基づく抗原結合ドメインは、前記細胞に結合した後に形成された多価ポリペプチドの一部である。
【００３５】
ある好ましい実施形態においては、抗原結合部位がポリマーに架橋している。
【００３６】
本発明の別の態様として、上記の抗原結合ドメインのような抗原結合ドメイン、またはその多価ポリペプチドをコードする配列を含む核酸を提供する。例えば、ある実施形態においては、該核酸は、ヒト細胞の表面上に発現された抗原に対して結合特異性を有するヒト組成の抗体に基づく抗原結合ドメインの少なくとも１つを含むポリペプチドのコード配列を含み、該ポリペプチドの多価形態で該抗原を発現する細胞を処理すると、細胞毒性物質も免疫学的メカニズムも死滅に要しない方法で、前記細胞の死滅が生起しまたは導かれる。ある実施形態においては、前記核酸は、、１μＭ、１００ ｎＭ、１０ ｎＭまたはわずか１ ｎＭ以下のＫｄでヒトＨＬＡ ＤＲの少なくとも１つのエピトープと結合する抗体に基づく抗原結合ドメインの少なくとも１つを含むポリペプチドのコード配列を含む。
【００３７】
ある実施形態においては、前記核酸は、ヒトＨＬＡ ＤＲに対する結合特異性を有するヒト組成の抗体に基づく抗原結合ドメインを複数含むポリペプチドのコード配列を含み、前記多価ポリペプチドでＨＬＡ ＤＲを発現する細胞を処理すると、細胞毒性物質も免疫学的メカニズムも死滅に要しない方法で、前記細胞の死滅が生起しまたは導かれる。好ましい実施形態においては、前記抗原結合ドメインはそれぞれ１μＭ、１００ ｎＭ、１０ ｎＭまたはわずか１ ｎＭ以下のＫｄでヒトＨＬＡ ＤＲ上のエピトープと結合する。
【００３８】
ある実施形態においては、前記核酸は、ヒトＨＬＡ ＤＲに対する結合特異性を有するヒト組成の抗体に基づく抗原結合ドメインを複数含む多価ポリペプチドのコード配列を含み、前記多価ポリペプチドでＨＬＡ ＤＲを発現する細胞を処理すると、細胞毒性物質も免疫学的メカニズムも死滅に要しない方法で、前記細胞の死滅が生起しまたは導かれる。好ましくは、前記多価ポリペプチドは、活性化リンパ系細胞、変態細胞及び／またはリンパ系腫瘍細胞の死滅について１００ ｎＭ、１０ ｎＭまたはわずか１ ｎＭ以下のＥＣ５０を有する。
【００３９】
本発明の別の態様によれば、例えば上記したような本発明核酸のいずれか１つのコード配列及びそれに機能的に連結された転写調節配列を含むベクターが提供される。
【００４０】
本発明のさらに別の態様によれば、少なくとも１つの本発明の核酸または本発明のベクターを含む宿主細胞が提供される。本発明の別の態様によれば、細胞毒性物質も免疫学的メカニズムも死滅に要しない方法で、細胞の死滅を生起しまたは導く多価組成物の調製方法であって、前記核酸が複数の抗原結合ドメインを含むポリペプチドとして、またはその後に処理されて多価組成物を形成する少なくとも１つの抗原結合ドメインを含むポリペプチドとして発現される条件下で、前記宿主細胞を培養することを含む前記方法が提供される。
【００４１】
本発明の別の態様によれば、薬学的に許容される担体及び／または希釈剤で製剤化された本発明のポリペプチドまたは核酸組成物の形態が提供される。本発明は、具体的には、動物、特にヒトの治療用製剤を調製するためのそのような組成物の使用を意図するものである。
【００４２】
そのような医薬組成物は、望ましくない細胞増殖を有する症状の治療、特にＭＨＣクラスＩＩ抗原を発現する変態細胞が関与する疾患の治療に使用することができる。例えば、前記製剤は、Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫、Ｂ細胞リンパ腫、Ｂ細胞急性リンパ性白血病、バーキットリンパ腫、ホジキンリンパ腫、ヘアリーセル白血病、急性骨髄性白血病、Ｔ細胞リンパ腫、Ｔ細胞非ホジキンリンパ腫、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病、多発性骨髄性白血病及びＢ細胞前駆体白血病から選択される疾患の治療に使用することができる。
【００４３】
そのような医薬製剤は、望ましくない免疫細胞の活性化を伴う疾患、例えば慢性関節リウマチ、若年性関節炎、多発性硬化症、グレーブス病、インシュリン依存性糖尿病、ナルコレプシー、乾癬、全身性エリテマトーデス、強直性脊椎炎、移植拒絶、移植片対宿主病、橋本病、重症筋無力症、尋常性天疱瘡、糸球体腎炎、甲状腺炎、膵臓炎、インスリン炎、原発性胆汁性肝硬変、過敏性大腸疾患及びシェーグレン症候群から選択される疾患の治療に使用することができる。
【００４４】
本発明の別の態様によれば、本発明のポリペプチドまたは核酸組成物を含む診断用組成物が提供される。ある実施形態においては、該診断用組成物は、ポリペプチド組成物及び１つ以上の架橋成分を含む。
【００４５】
本発明のさらに別の態様よれば、細胞を本発明の多価ポリペプチド組成物と接触させるステップを含む、細胞の表面上に抗原を発現する細胞を死滅させる方法が提供される。
【００４６】
本発明の別の態様によれば、薬学的に許容される担体及び／または希釈剤で製剤化された多価ポリペプチド組成物により治療することができる患者を同定する方法であって、
ａ． 患者から細胞を分離し、
ｂ． 該細胞を前記組成物と接触させ、
ｃ． 該細胞の死滅または免疫抑制の程度を測定する、
ステップを含む前記方法が提供される。
【００４７】
本発明はまた、薬学的に許容される担体及び／または希釈剤で製剤化された本組成物により治療することができる患者を同定するためのキットであって、
ａ． 多価ポリペプチド組成物、及び
ｂ． 前記細胞の死滅または免疫抑制の程度を測定するための手段、
を含む前記キットが提供される。
【００４８】
ある実施形態においては、前記キットは多価ポリペプチド組成物及び架橋成分を含む。別の実施形態においては、前記キットは、
ａ． 多価ポリペプチド組成物、
ｂ． 検出可能な１以上の成分、及び
ｃ． （ｉ）と抗原との結合を行いかつ／または検出するための試薬及び／または溶液、
を含む。
【００４９】
本発明の別の態様によれば、細胞毒性物質と機能的に結合させた多価ポリペプチド組成物を含む細胞毒性組成物が提供される。
【００５０】
本発明のさらに別の態様によれば、免疫原性物質と機能的に結合させた多価ポリペプチド組成物を含む免疫原性組成物が提供される。
【００５１】
本発明の別の態様によれば、細胞毒性物質または免疫原性物質と機能的に結合させた多価ポリペプチド組成物を細胞に接触させることを含む、細胞を死滅させる方法が提供される。
【００５２】
本発明の別の態様によれば、ヒトＨＬＡ ＤＲのβ鎖を発現する細胞の望ましくない増殖／活性化を伴う疾患の重篤度を軽減するためにヒトを治療する方法であって、本発明の多価ポリペプチドを該患者に投与することを含む前記方法が提供される。ある実施形態においては、前記疾患は、例えば、Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫、Ｂ細胞リンパ腫、Ｂ細胞急性リンパ性白血病、バーキットリンパ腫、ホジキンリンパ腫、ヘアリーセル白血病、急性骨髄性白血病、Ｔ細胞リンパ腫、Ｔ細胞非ホジキンリンパ腫、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病、多発性骨髄性白血病及びＢ細胞前駆白血病から選択されるリンパ系細胞の望ましくない増殖／活性化を伴うものである。
【００５３】
本発明の別の態様によれば、動物の治療用の医薬製剤を製造するための細胞毒性物質または免疫原性物質と機能的に結合させた多価ポリペプチド組成物の使用が提供される。
【００５４】
好ましい実施形態によれば、前記ポリペプチドは、ＭＨＣクラスＩＩ分子を発現するリンパ系細胞または非リンパ系細胞に対するものである。後者のタイプの細胞は例えば炎症及び／または自己免疫疾患の病理部位において生じ、例えば滑膜細胞、内皮細胞、甲状腺ストロマ細胞及び神経膠細胞であり、あるいはＭＨＣクラスＩＩ分子を発現することができる遺伝的に改変された細胞も含まれ得る。
【００５５】
好ましくは、前記ポリペプチドはリンパ系腫瘍細胞に対するものである。より好ましくは、Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫、Ｂ細胞リンパ腫、Ｂ細胞急性リンパ性白血病、バーキットリンパ腫、ホジキンリンパ腫、ヘアリーセル白血病、急性骨髄性白血病及びＢ細胞前駆体白血病から選択される疾患を示すリンパ系腫瘍細胞である。最も好ましくは、ＧＲＡＮＴＡ−５１９、Ｐｒｉｅｓｓ、ＫＡＲＰＡＳ−４２２、ＤＯＨＨ−２、ＭＨＨ−ＣＡＬＬ−４、ＭＮ−６０、ＢＪＡＢ、Ｌ−４２８、ＢＯＮＮＡ−１２、ＥＯＬ−１、ＭＨＨ−ＰＲＥＢ−ｌ及びＭＨＨ−ＣＡＬＬ−２細胞系から得られた細胞系からのリンパ系腫瘍細胞である。
【００５６】
ある実施形態においては、前記ポリペプチドは、ＨＬＡ−ＤＲ分子のα鎖中の少なくとも１つのエピトープに結合する。そのような実施形態においては、ポリペプチドは好ましくはＨＬＡ−ＤＲのα鎖の第１ドメイン中の少なくとも１つのエピトープに結合するものであり、第１ドメインは該鎖のＮ−末端ドメインである。例えば、前記ポリペプチドは、ＨＬＡ−ＤＲのα鎖のＧｌｕ５５からＴｙｒ７９までの範囲のαヘリックス内の少なくとも１つのエピトープに結合するように選択することができる。
【００５７】
別の実施形態においては、前記ポリペプチドは、ＨＬＡ−ＤＲ分子のβ鎖中の少なくとも１つのエピトープに結合する。好ましくは、前記ポリペプチドは、ＨＬＡ−ＤＲのβ鎖の第１ドメイン中の少なくとも１つのエピトープに結合するものであり、第１ドメインは該鎖のＮ−末端ドメインである。
【００５８】
ある実施形態においては、前記ポリペプチドにより誘導される標的細胞の死滅のメカニズムは、前記細胞の固有のあらかじめプログラムされたプロセスを含む。好ましくは、前記ポリペプチドは、アポトーシスによる細胞死のメカニズムではない死滅メカニズムを誘導する。
【００５９】
好ましい実施形態においては、前記ポリペプチドは、例えば、カスパーゼではないプロテアーゼの作用による、カスパーゼ非依存性メカニズムである死滅メカニズムを誘導する。
【００６０】
別の実施形態においては、多価組成物は、クラスＩｇＧ１、２ａ、２ｂ、３、４、ＩｇＡ及びＩｇＭから選択された少なくとも１つの完全な抗体を含む。
【００６１】
別の実施形態においては、多価組成物は、少なくとも１つのＦ（ａｂ’）２抗体フラグメントまたはミニ抗体フラグメントを含む。
【００６２】
好ましい実施形態においては、多価組成物は、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ及びＦａｂフラグメントから選択された少なくとも２個の１価抗体フラグメントを含み、さらに１以上の架橋成分を含む。
【００６３】
本発明はまた、ヒトＨＬＡ ＤＲに対する結合特異性を有する抗体に基づく抗原結合ドメインを少なくとも１つ含むポリペプチドを含む組成物であって、前記ポリペプチドと前記エピトープとの結合は免疫応答の抑制を起こしまたはそれを導き、前記抗原結合ドメインはＶＨドメイン及びＶＬドメインの組合せを含み、該組合せはＭＳ−ＧＰＣ−１、ＭＳ−ＧＰＣ−６、ＭＳ−ＧＰＣ−８、ＭＳ−ＧＰＣ−１０、ＭＳ−ＧＰＣ−８−１、ＭＳ−ＧＰＣ−８−６、ＭＳ−ＧＰＣ−８−９、ＭＳ−ＧＰＣ−８−１０、ＭＳ−ＧＰＣ−８−１７、ＭＳ−ＧＰＣ−８−１８、ＭＳ−ＧＰＣ−８−２７、ＭＳ−ＧＰＣ−８−６−２、ＭＳ−ＧＰＣ−８−６−１９、ＭＳ−ＧＰＣ−８−６−２７、ＭＳ−ＧＰＣ−８−６−４５、ＭＳ−ＧＰＣ−８−６−１３、ＭＳ−ＧＰＣ−８−６−４７、ＭＳ−ＧＰＣ−８−１０−５７、ＭＳ−ＧＰＣ−８−２７−７、ＭＳ−ＧＰＣ−８−２７−１０及びＭＳ−ＧＰＣ−８−２７−４１から選択されるクローンの１つに見られるものである前記組成物を提供する。
【００６４】
本発明の別の免疫抑制組成物は、１μＭ、１００ ｎＭ、１０ ｎＭまたはわずか１ ｎＭ以下のＫｄでのヒトＭＨＣクラスＩＩ抗原に対する結合特異性を有する少なくとも１つの抗体に基づく抗原結合ドメインを含むポリペプチドを含有し、ヒトＭＨＣクラスＩＩ抗原を発現する細胞を前記ポリペプチドで処理すると、例えば、好ましくは１μＭ、１００ ｎＭ、１０ ｎＭまたはわずか１ ｎＭ以下のＩＣ５０で、免疫反応の抑制を起こしまたはそれを導くものである。
【００６５】
本発明の別の免疫抑制組成物は、１μＭ、１００ ｎＭ、１０ ｎＭまたはわずか１ ｎＭ以下のＫｄでのヒトＭＨＣクラスＩＩ抗原に対する結合特異性を有する少なくとも１つのヒト組成の抗体に基づく抗原結合ドメインを含むポリペプチドを含み、前記抗原結合ドメインはヒトＭＨＣクラスＩＩ抗原に結合する能力による組換え抗体ディスプレーライブラリーからのヒトＶＬ及びＶＨドメインの単離を含む方法により単離されたものであり、ヒトＭＨＣクラスＩＩ抗原を発現する細胞を前記ポリペプチドで処理すると、免疫反応の抑制が起こりまたはそれが導かれるものである。
【００６６】
本発明の免疫抑制組成物は、さらに
ａ． ＶＬ及びＶＨドメインの一方または両方のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３ドメインの少なくとも１つの変異体のライブラリーを作製し、
ｂ． １μＭ以下のＫｄでヒトＭＨＣクラスＩＩ抗原に結合する能力により変異体のライブラリーからＶＬ及びＶＨのドメインを単離する、
ステップにより単離された抗原結合ドメインを使用して生成することができる。
【００６７】
好ましい実施形態においては、前記免疫抑制組成物の抗原結合ドメインはＨＬＡ−ＤＲに結合し、好ましくはＨＬＡ−ＤＲのβ鎖に結合し、より好ましくはＨＬＡ−ＤＲのβ鎖の第１ドメインに結合する。
【００６８】
ある好ましい実施形態においては、前記免疫抑制組成物は免疫応答の抑制について１μＭ、１００ ｎＭ、１０ ｎＭまたはわずか１ ｎＭ以下のＩＣ５０を有する。
【００６９】
ある好ましい実施形態においては、前記免疫抑制組成物は、ＩＬ−２分泌の阻害について１μＭ、１００ ｎＭ、１０ ｎＭまたはわずか１ ｎＭ以下のＩＣ５０を有する。
【００７０】
ある好ましい実施形態においては、前記免疫抑制組成物は、Ｔ細胞増殖の阻害について１μＭ、１００ ｎＭ、１０ ｎＭまたはわずか１ ｎＭ以下のＩＣ５０を有する。
【００７１】
ある好ましい実施形態においては、前記免疫抑制組成物は、ＤＲ１−０１０１、ＤＲ２−１５０２１、ＤＲ３−０３０１、ＤＲ４Ｄｗ４−０４０１、ＤＲ４Ｄｗ１０−０４０２、ＤＲ４Ｄｗ１４−０４０４、ＤＲ６−１３０２、ＤＲ６−１４０１、ＤＲ８−８０３１、ＤＲ９−９０１２、ＤＲｗ５３−Ｂ４＊０１０１及びＤＲｗ５２−Ｂ３＊０１０１からなる群から選択された１種以上のＨＬＡ−ＤＲタイプのエピトープに結合する抗原結合ドメインを有し、好ましい実施形態においては、抗原結合ドメインが前記ＨＬＡ−ＤＲタイプ（例えばｐａｎ−ＤＲ）の少なくとも５種に結合する。
【００７２】
ある実施形態においては、抗原結合ドメインを有する前記免疫抑制組成物は、ＶＨドメイン及びＶＬドメインの組合せを含み、該組合せはＭＳ−ＧＰＣ−１、ＭＳ−ＧＰＣ−６、ＭＳ−ＧＰＣ−８、ＭＳ−ＧＰＣ−１０、ＭＳ−ＧＰＣ−８−１、ＭＳ−ＧＰＣ−８−６、ＭＳ−ＧＰＣ−８−９、ＭＳ−ＧＰＣ−８−１０、ＭＳ−ＧＰＣ−８−１７、ＭＳ−ＧＰＣ−８−１８、ＭＳ−ＧＰＣ−８−２７、ＭＳ−ＧＰＣ−８−６−２、ＭＳ−ＧＰＣ−８−６−１９、ＭＳ−ＧＰＣ−８−６−２７、ＭＳ−ＧＰＣ−８−６−４５、ＭＳ−ＧＰＣ−８−６−１３、ＭＳ−ＧＰＣ−８−６−４７、ＭＳ−ＧＰＣ−８−１０−５７、ＭＳ−ＧＰＣ−８−２７−７、ＭＳ−ＧＰＣ−８−２７−１０及びＭＳ−ＧＰＣ−８−２７−４１から選択されるクローンの１つに見られるものである。
【００７３】
ある実施形態においては、抗原結合ドメインを有する前記免疫抑制組成物は、ＨｕＣＡＬ ＶＨ２及びＨｕＣＡＬ Ｖλ１の組合せを含み、ＶＨ ＣＤＲ３配列はコンセンサスＣＤＲ３配列：
ｎｎｎｎＲＧｎＦＤｎ
（各ｎは独立して任意のアミノ酸残基を表わす）から得られたものであり、ＶＬ ＣＤＲ３配列はコンセンサスＣＤＲ３配列：
ＱＳＹＤｎｎｎｎ
（各ｎは独立して任意のアミノ酸残基を表わす）から得られたものである。例えば、ＶＨ ＣＤＲ３配列はＳＰＲＹＧＡＦＤＹであり、及び／またはＶＬ ＣＤＲ３配列はＱＳＹＤＬＩＲＨまたはＱＳＹＤＭＮＶＨである。
【００７４】
ある実施形態においては、前記免疫抑制組成物の前記抗原結合ドメインは、一般式：
ｎｎｎｎＲＧｎＦＤｎ
（各ｎは独立して任意のアミノ酸残基を表わす）で表されるＶＨ ＣＤＲ３配列、及び一般式：
ＱＳＹＤｎｎｎｎ
（各ｎは独立して任意のアミノ酸残基を表わす）で表されるＶＬ ＣＤＲ３配列を有する抗体による抗原結合と競合する。
【００７５】
ある実施形態においては、前記免疫抑制組成物の抗原結合ドメインが一般式：            ＳＧＳｎｎＮＩＧｎＮＹＶｎ
（各ｎは独立して任意のアミノ酸残基を表わす）で表わされるＶＬ ＣＤＲ１配列を含む。例えばそのＣＤＲ１配列はＳＧＳＥＳＮＩＧＮＮＹＶＱである。
【００７６】
ある実施形態においては、本発明の免疫抑制組成物は、（ａ）前記ポリペプチドが結合する抗原の発現のダウンレギュレーション、または（ｂ）前記細胞と他の細胞との相互作用（通常は免疫応答を導く）の阻害、のうちの１以上により免疫応答を抑制する。
【００７７】
本発明の別の態様によれば、本発明の免疫抑制ポリペプチドのコード配列を含む核酸が提供される。ある実施形態においては、該核酸は、例えばコード配列及びそれに機能的に連結された転写調節配列を含むベクターの一部として提供することができる。本発明の核酸及びベクターは、例えば免疫抑制組成物を製造するために使用し得る宿主細胞の一部として提供することができる。
【００７８】
本発明の別の態様によれば、リンパ細胞の活性化及び／または増殖を抑制する方法であって、該細胞を本発明の免疫抑制ポリペプチドと接触させることを含む方法が提供される。
【００７９】
本発明はまた、１μＭ以下のＫｄでのヒトＭＨＣクラスＩＩ抗原に対する結合特異性を有する抗体に基づく抗原結合ドメインを含むポリペプチドを、動物における免疫応答を抑制し、動物におけるＩＬ−２分泌を阻害し、及び／または動物におけるＴ細胞増殖を阻害するのに十分な量で含む医薬製剤を提供する。
【００８０】
本発明の別の態様によれば、１ μＭ以下のＫｄでのヒトＭＨＣクラスＩＩ抗原に対する結合特異性を有する抗体に基づく抗原結合ドメインを含むポリペプチドの、例えばヒトである動物の治療用の医薬組成物の製造における使用を提供する。
【００８１】
本発明の免疫抑制医薬製剤は、免疫系の細胞によるＩＬ−２分泌を抑制するために使用することができる。例えば、そのような製剤は、患者における免疫学的反応性のレベルを低下させるのに十分な量で患者に投与することができる。
【００８２】
本発明のさらに別の態様によれば、リンパ細胞によるＩＬ−２分泌を抑制する方法であって、前記細胞を本発明の免疫抑制ポリペプチドと接触させることを含む方法が提供される。
【００８３】
上記本発明の方法は、例えば、免疫反応性のレベルを低下させるために有効な量の本発明の免疫抑制ポリペプチドを患者に投与することにより、ヒトの免疫抑制のために使用することができる。
【００８４】
本発明はさらに、少なくとも１種の本発明のポリペプチド及び／または核酸を含む診断用組成物に関し、該組成物は任意にさらに診断を行うためのバッファーなどの試薬を含む。
【００８５】
好ましい実施形態においては、前記診断用組成物は、少なくとも１つの成分で架橋された本発明のポリペプチドを含む。そのような成分は、例えばＦＬＡＧペプチドエピトープ（Ｈｏｐｐ ｅｔ ａｌ．， １９８８； Ｋｎａｐｐｉｋ ａｎｄ Ｐｌｕｅｃｋｔｈｕｎ， １９９４）のような、ポリペプチド上に存在するエピトープを認識する抗体、あるいはシステインまたはリシンに存在するような求核性アミノ酸側鎖と反応する二官能性化合物（Ｋｉｎｇ ｅｔ ａｌ．， １９９４）であり得る。ポリペプチドを架橋するための方法は当業者にはよく知られている。
【００８６】
少なくとも１種の本発明の核酸及び／またはその変異体を含む診断用組成物も意図される。
【００８７】
さらに、本発明は少なくとも１種の本発明のポリペプチド及び架橋成分を含むキットに関する。
【００８８】
また本発明は、（ｉ）本発明のポリペプチド、（ｉｉ）検出可能な１以上の成分、及び（ｉｉｉ）（ｉ）と抗原との結合を行いかつ／または検出するための試薬及び／または溶液を含むキットに関する。
【００８９】
本発明はさらに、少なくとも１種のポリペプチドを含み、少なくとも２つの抗原結合ドメインを含む多価組成物に関する。
【００９０】
本発明のさらに別の態様によれば、
（ｉ）ヒト細胞の表面に発現された抗原に結合する、１以上の抗原結合ドメインを単離し、
（ｉｉ）５０ ｎＭ以下のＥＣ５０で、変態または活性化した細胞を死滅させるが、前記死滅を生起しまたは導くのに細胞毒性物質も免疫学的メカニズムも必要としない、複数の前記抗原結合ドメインを含む多価組成物を生成し、
（ｉｉｉ）動物における効能及び毒性についての前記多価組成物の治療プロファイリングを行い、
（ｉｖ）増殖性疾患の治療用の該多価組成物について説明したパッケージ同封用の説明書を作成し、
（ｖ）増殖性疾患の治療用の多価組成物を販売すること、
を含む医薬ビジネスを行う方法を提供する。
【００９１】
本発明はまた、
（ｉ）ヒト細胞の表面に発現された抗原に結合する、１以上の抗原結合ドメインを単離し、
（ｉｉ）５０ ｎＭ以下のＥＣ５０で、変態または活性化した細胞を死滅させるが、前記死滅に細胞毒性物質も免疫学的メカニズムも必要としない、複数の前記抗原結合ドメインを含む多価組成物を生成し、
（ｉｉｉ）前記多価組成物を販売する権利を第三者にライセンスし、共同開発し、あるいは売却すること、
を含むライフサイエンスビジネスを行う方法を提供する。
【００９２】
そのような実施形態においては、前記抗原結合ドメインは、
ａ． ＨＬＡ ＤＲのエピトープに結合する能力により、組換え抗体ディスプレーライブラリーからヒト組成のＶＬ及びＶＨドメインを単離し、
ｂ． ＶＬ及びＶＨドメインの一方または両方のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３ドメインの少なくとも１の変異体のライブラリーを作製し、
ｃ． １μＭ以下のＫｄでＨＬＡ ＤＲのエピトープに結合する能力により、変異体のライブラリーからＶＬ及びＶＨドメインを単離する、
ことを含む方法により単離することができる。
【００９３】
本発明により企図される別のビジネス方法は、
（ｉ） １μＭ以下のＫｄでヒト細胞表面に発現されたＭＨＣクラスＩＩに結合する１種以上の抗原結合ドメインを単離し、
（ｉｉ）１００ ｎＭ以下のＩＣ５０を有する免疫抑制剤である、前記抗原結合ドメインを含む組成物を生成し、
（ｉｉｉ）動物における効能及び毒性についての前記多価組成物の治療プロファイリングを行い、
（ｉｖ）免疫抑制療法用の前記組成物の使用について説明したパッケージ同封用の説明書を作成し、
（ｖ） 免疫抑制剤として使用するための前記多価組成物を販売する、
ことを含む。
【００９４】
本発明はまた、
（ｉ） １μＭ以下のＫｄでヒト細胞表面に発現されたＭＨＣクラスＩＩに結合する１種以上の抗原結合ドメインを単離し、
（ｉｉ）１００ ｎＭ以下のＩＣ５０を有する免疫抑制剤である、前記抗原結合ドメインを含む組成物を生成し、
（ｉｉｉ）前記組成物を販売する権利を第三者にライセンスし、共同開発し、あるいは売却する、
ことを含むライフサイエンスビジネスを行う方法を提供する。
【００９５】
本明細書で使用する用語「ペプチド」は、ペプチド結合により結合した複数の、すなわち２個以上のアミノ酸からなる分子をいうものである。
【００９６】
用語「タンパク質」は、ペプチドの少なくとも一部が、１以上のペプチド鎖内及び／またはそれらの間で一次、二次、三次あるいは四次構造を形成することにより所定の三次元構造を有するか獲得し得るペプチドをいう。この定義は、天然または少なくとも部分的に人工的なタンパク質、並びに完全なタンパク質の断片もしくはドメインを包含するが、ただし、そのような断片もしくはドメインは上記のような所定の三次元構造を獲得することができなければならない。
【００９７】
用語「ポリペプチド」は、ペプチド及び／またはタンパク質を示すのに使用され、相互に交換可能に使用される。さらに、用語「ポリペプチド」及び「タンパク質」は、前後関係から認められる場合、別々の軽鎖及び重鎖を有する免疫グロブリンポリペプチドのような複数鎖タンパク質複合体を含む。
【００９８】
この文脈においては、「少なくとも１つの抗体に基づく抗原結合ドメインを含むポリペプチド」は、免疫グロブリン（もしくは抗体）またはそのフラグメントをいう。抗体ドメインなどに関し、用語「フラグメント」は、免疫グロブリンの抗原結合部分を保持する免疫グロブリンのフラグメントをいう。本発明の機能的な免疫グロブリンフラグメントは、Ｆｖ（Ｓｋｅｒｒａ ａｎｄ Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ， １９８８）、ｓｃＦｖ（Ｂｉｒｄ ｅｔ ａｌ．， １９８８； Ｈｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．， １９８８）、ジスルフィド結合したＦｖ（Ｇｌｏｃｋｓｈｕｂｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９９２； Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．， １９９３）、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、または免疫グロブリンもしくは機能的免疫グロブリンフラグメントの可変ドメインを含む、当業者に周知のその他のフラグメントであり得る。
【００９９】
１つの鎖からなるポリペプチドの例は一本鎖Ｆｖ抗体フラグメントであり、複数鎖からなるポリペプチドの例はＦａｂ抗体フラグメントである。
【０１００】
本明細書で使用する用語「抗体」は、特記しない限り、抗体分子及び種々の抗体由来分子の両方を指すために広く使用する。そのような抗体由来分子は、少なくとも１の可変領域（重鎖または軽鎖可変領域）を含むものであり、例えば上記のようなフラグメント、並びに個々の抗体軽鎖、個々の抗体重鎖、抗体鎖とその他の分子間のキメラ融合物などが挙げられる。
【０１０１】
免疫グロブリン分子の「抗原結合部位」は、その分子の、抗原と特異的に結合するのに必要な部分をいう。抗原結合部位は、好ましくは１μＭ以下のＫｄ、より好ましくは１００ ｎＭ、１０ ｎＭ、あるいはさらに場合によっては１ ｎＭ未満のＫｄで抗原と結合する。抗原と特異的に結合するとは、その抗原に対して、他の抗原に対する結合よりも有意に高い親和性で抗原と結合することを包含することを意図するものである。
【０１０２】
抗原結合部位は、重（「Ｈ」）鎖及び軽（「Ｌ」）鎖のＮ−末端可変（「Ｖ」）領域のアミノ酸残基によって形成される。重鎖及び軽鎖のＶ領域内にある高度に多様な部分は、「フレームワーク領域、すなわち「ＦＲ」」として知られる保存された隣接部分に挟まれる「超可変領域」と称する。すなわち、用語「ＦＲ」は、天然において免疫グロブリン内の超可変領域の間で及びそれに隣接して見出されるアミノ酸配列を指すものである。抗体分子においては、軽鎖の３つの超可変領域及び重鎖の３つの超可変領域が三次元空間にそれぞれ相対的に配置されて抗原結合表面を形成している。抗原結合表面は、結合する抗原の三次元表面に対し相補的であり、前記軽鎖及び重鎖の３つの超可変領域は「相補性決定領域（ＣＤＲ）」と呼ばれる。
【０１０３】
本出願においては、「価」とは、本発明のポリペプチドが有する抗原結合部位の数をいう。従って、二価のポリペプチドは、２つの結合部位を有するポリペプチドをいう。用語「多価ポリペプチド」は、ポリペプチドの二価、三価、四価などの形態を包含する。
【０１０４】
本明細書に使用する「多価組成物」は、例えば、多価ポリペプチドのような少なくとも２つの抗原結合ドメインを有するポリペプチドを含む組成物を意味する。好ましくは、前記少なくとも２つの抗原結合ドメインは近接した位置にあり、そのため完全な免疫グロブリン分子中に含まれる結合部位の互いの相対的な構造配置を模擬するものである。多価組成物の例は、完全な免疫グロブリン分子（例えばＩｇＧ、ＩｇＡもしくはＩｇＭ分子）あるいはその多価フラグメント（例えばＦ（ａｂ’）２）である。さらに、２以上の多価組成物（例えば２以上の完全な免疫グロブリン分子）から、例えば架橋により、より高い価数の多価組成物を形成することができる。しかし、多価組成物は、例えばミニ抗体におけるような自己結合または架橋により、２以上の一価免疫グロブリンフラグメントからも形成され得る。
【０１０５】
従って、「抗体に基づく抗原結合ドメイン」は、抗体の構造的特徴の少なくともいくらか、例えば少なくとも１つのＣＤＲ配列を保持する抗原結合部位を形成する１またはそれ以上のポリペプチドをいう。ある好ましい実施形態においては、抗体に基づく抗原結合ドメインが、例えば３つのＣＤＲ領域及び散在するフレームワーク領域のような、可変ドメインと考えるに十分な構造を含む。抗体に基づく抗原結合ドメインは、ＶＨまたはＶＬの配列に対応する単一のポリペプチド鎖により、あるいはＶＨ及びＶＬ配列の分子間または分子内結合によって形成され得る。
【０１０６】
用語「組換え抗体ライブラリー」は、抗原結合ドメインの変化に富むライブラリーをいう。例えばこの用語は、例えば生物学的粒子のようなディスプレイパッケージであって、それぞれが（ａ）粒子表面上に少なくとも１の抗原結合ドメインを発現するための遺伝子情報、及び（ｂ）複製する能力を粒子に与えるための遺伝子情報を有する、ディスプレイパッケージのコレクションを包含する。例えば、パッケージは、抗原結合ドメインを含む融合タンパク質をディスプレイすることができる。融合タンパク質の抗原結合ドメイン部分は、抗原結合ドメインがディスプレイパッケージと接触する標的エピトープに結合することを可能とするような形でディスプレイパッケージによって提示される。ディスプレイパッケージは、一般的には、非常に大きな変化に富む抗体ライブラリーのサンプリングを可能とする系に由来する。ディスプレイパッケージは、例えば、増殖性のある細菌細胞、細菌胞子及び細菌ウイルスに由来するものとすることができる。
【０１０７】
本発明の典型的な実施形態においては、ディスプレイパッケージは被験抗原結合ドメインのアミノ酸配列を含むペプチド融合外殻タンパク質を含むファージ粒子である。すなわち、ペプチド融合外殻タンパク質のライブラリーをコードする、複製可能なファージベクター、特にファージミド（本明細書で定義するもの）のライブラリーを生成し、適当な宿主細胞を形質転換するために使用する。キメラタンパク質から形成されたファージ粒子は、特定のファージ粒子に結合した抗原結合部位の、標的エピトープに特異的に結合する能力に基づいた親和性選択により分離することができる。好ましい実施形態においては、ライブラリーの個々のファージ粒子は、そのパッケージの表面にディスプレイされたペプチド融合外殻タンパク質をコードする、対応するファージミドのコピーを含む。本発明の変化に富むペプチドライブラリーを生成するためのファージの例としては、Ｍ１３、ｆ１、ｆｄ、Ｉｆ１、Ｉｋｅ、Ｘｆ、Ｐｆ１、Ｐｆ３、λ、Ｔ４、Ｔ７、Ｐ２、Ｐ４、φＸ−１７４、ＭＳ２及びｆ２が挙げられる。
【０１０８】
用語「ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の少なくとも１つの変異体のライブラリーを作製する」とは、ライブラリーのメンバーが、例えばＦＲ配列ではなく、ＣＤＲ配列中の１以上の変化により異なる、変異体抗原結合部位のライブラリーを作製するプロセスをいう。そのようなライブラリーは、選択された抗原結合部位からの１以上のＣＤＲ配列のランダムまたは半ランダム突然変異誘発によって作製することができる。
【０１０９】
本明細書で使用する「ヒト組成の抗体に基づく抗原結合ドメイン」は、好ましくは、少なくとも抗体ＶＨドメイン及び抗体ＶＬドメインを含むポリペプチドであって、免疫グロブリン配列を含むタンパク質配列のデータベースにおける相同性サーチにおいて、ＶＨ及びＶＬドメインの両方について、ヒト由来の免疫グロブリンドメインが最も高い配列同一性をもってヒットするポリペプチドを意味する。そのような相同性サーチは、例えば、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎで利用可能な配列データベースにアクセスし、「ｂｌａｓｔｐ」ルーチンを使用して「ＢａｓｉｃＢＬＡＳＴ」サーチを行うことによる、ＢＬＡＳＴサーチとすることができる。さらにＡｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．， （１９９０） Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２１５：４０３−４１０も参照されたい。好ましくは、そのような組成は、ヒト受容者に投与したときに、それに対する有害な免疫反応を生じないものである。ある好ましい実施形態においては、本発明のヒト組成の抗原結合ドメインは、活性化ヒトＢ細胞からクローン化され得るようなネイティブヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域を含むが、必ずしもネイティブヒト抗体のＣＤＲのすべてを含む必要はない。
【０１１０】
本明細書において使用する用語「ミニ抗体フラグメント」は、少なくとも２の抗原結合ドメインであってドメインのそれぞれに融合する自己結合ドメインにより多量体化されたものを含む多価抗体フラグメントを意味し（Ｐａｃｋ， １９９４）、例えば、自己結合ダイマー化ドメインにそれぞれ融合した２つのｓｃＦｖフラグメントを含むダイマーである。特に好ましいダイマー化ドメインとしては、ロイシンジッパー（Ｐａｃｋ ａｎｄ Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ， １９９２）またはヘリックス−ターン−ヘリックスモチーフ（Ｐａｃｋ ｅｔ ａｌ．， １９９３）に由来するものが挙げられる。
【０１１１】
本明細書において使用する「活性化された細胞」または「活性化細胞」は、休止状態ではない、対象となる一定の集団の細胞を意味する。活性化は、マイトジェン（例えばリポ多糖、フィトヘマグルチニン）またはサイトカイン（例えばインターフェロンγ）によって誘発され得る。好ましくは、前記活性化は、腫瘍変質の間に起こる（例えばエプスタイン−バーウイルスによるもの、あるいは自然発生によるもの）ものである。好ましくは、活性化細胞は、細胞表面上で発現されたＭＨＣクラスＩＩ分子の特徴、及び増大した細胞サイズ、細胞分裂、ＤＮＡ複製、ＣＤ４５またはＣＤ１１の発現及び免疫グロブリンの生成／分泌などの１以上の別の特徴を特徴とするものである。
【０１１２】
本明細書において使用する「活性化されていない細胞」または「非活性化細胞」は、休止しており、分裂していない、対象となる集団の細胞を意味する。活性化されていない細胞としては、健常なヒトの血液から精製されるような休止期のＢ細胞が挙げられる。そのような細胞は、好ましくは、細胞表面上に発現されるＭＨＣクラスＩＩ分子を欠いていることあるいはその低下したレベル、及び増大した細胞サイズ、細胞分裂、ＤＮＡ複製、ＣＤ４５またはＣＤ１１の発現及び免疫グロブリンの生成／分泌などの１以上の別の特徴を欠いていることあるいはその低下したレベルを特徴とするものである。
【０１１３】
本明細書において使用する用語「ＥＣ５Ｏ」は、細胞死滅のような応答あるいは効果の最大の５０％をもたらす本発明の多価形態の組成物の濃度を意味する。
【０１１４】
「５分の１以下のＥＣ５０」は、活性化細胞の５０％を死滅させるために必要な、本発明の少なくとも１種のポリペプチドを含む多価組成物の濃度が、非活性化細胞を死滅させるのに必要な多価組成物の濃度の５分の１以下であることを意味する。好ましくは、非活性化細胞の５０％を死滅させるのに必要な濃度は、多価組成物の治療上適当な濃度では得られないものである。最も好ましくは、ＥＣ５０値は下記の実施例に記載された試験において決定される。
【０１１５】
用語「免疫抑制」は、放射線照射により、あるいは代謝拮抗剤、抗リンパ球血清または特定の抗体の投与によるような、免疫反応を防止しまたは減少させることをいう。
【０１１６】
用語「免疫反応」または「免疫応答」は、免疫系あるいは免疫系の一部を形成する細胞（リンパ球、顆粒球、マクロファージなど）の抗原刺激に対するの任意の反応をいい、限定するものではないが、抗体産生、細胞性免疫及び免疫寛容が挙げられる。
【０１１７】
本明細書で使用する、免疫抑制についての用語「ｌＣ５０」は、例えばＩＬ２分泌の阻害、ＩＬ２発現のダウンレギュレーションまたは細胞増殖の速度の低下により現れる免疫反応の阻害のような、最大の反応または効果の５０％をもたらす本発明の組成物の濃度をいう。
【０１１８】
細胞を死滅させる方法についての「細胞毒性物質」の用語は、補体依存性のメカニズムをいう。同様に、細胞を死滅させる方法についての用語「免疫学的メカニズム」は、マクロファージ依存性及び／または好中球依存性の細胞の死滅をいう。
【０１１９】
「リンパ系細胞」は、細胞系または細胞に言及するのに使用する場合、その細胞系または細胞がリンパ系の系統に由来することを意味する。「リンパ系細胞」は、Ｂ及びＴリンパ球系統の細胞及びマクロファージ系統の細胞を含む。
【０１２０】
「非リンパ系細胞でありＭＨＣクラスＩＩ分子を発現する」細胞は、例えば病理的炎症応答の間にＭＨＣクラスＩＩ分子を発現するリンパ系細胞以外の細胞である。例えば、そのような細胞としては、滑膜細胞、内皮細胞、甲状腺ストロマ細胞、神経膠細胞が挙げられ、またＭＨＣクラスＩＩ分子を発現することができる遺伝的に改変された細胞もまた含まれる。
【０１２１】
用語「アポトーシス」、及び「アポトーシス活性」は、核及び細胞質の凝結、クロマチン凝集、原形質膜微絨毛の喪失、リボソーム、形態が無傷のミトコンドリア及び核物質を含む膜結合ベシクル（アポトーシス体）への細胞質と核の分配、染色体ＤＮＡの分解、ミトコンドリア機能の喪失などの形態学的及び生化学的特徴の１以上を伴う哺乳動物における細胞死の形態をいう。アポトーシスは非常に厳格な時間的経過をたどり、プロテアーゼの特定のグループであるカスパーゼにより引き起こされる。アポトーシス活性は、例えば、細胞生存性アッセイ、アネキシンＶ染色あるいはカスパーゼ阻害アッセイにより判定し測定することができる。アポトーシスは、実施例Ｈに記載するような抗ＣＤ９５などの架橋抗体を使用して誘発することができる。
【０１２２】
本明細書において使用する用語「ＨＬＡ−ＤＲのα鎖の第１ドメイン」は、ＭＨＣクラスＩＩ ＤＲ分子のα鎖のＮ−末端ドメインを意味する。
【０１２３】
本明細書において使用する用語「ＨＬＡ−ＤＲのβ鎖の第１ドメイン」は、ＭＨＣクラスＩＩ ＤＲ分子のβ鎖のＮ−末端ドメインを意味する。
【０１２４】
用語「あらかじめプログラムされた固有のプロセス」は、いったん開始されると細胞内のメカニズムの自律的なカスケードをたどるプロセスであって、そのプロセスを完結するのに、細胞の環境からの別の補助を何ら必要としないプロセスをいう。
【０１２５】
本明細書において使用する用語「ＨｕＣＡＬ」は、Ｋｎａｐｐｉｋ ｅｔ ａｌ． （２０００）により記載されたような完全に合成的なヒトのコンビナトリアル抗体ライブラリーをいう。
【０１２６】
免疫グロブリン分子に関して本明細書に使用される用語「可変領域」は、免疫学の実務にある通常の技術者がその用語に与える通常の意味を有する。抗体重鎖及び抗体軽鎖はいずれも「可変領域」及び「定常領域」に分けることができる。可変領域と重鎖領域との間の区分点は、抗体構造について記載する標準的なテキスト、例えばＫａｂａｔ ｅｔ ａｌ “Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ： ５ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ” Ｕ．Ｓ． Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ， Ｕ．Ｓ． Ｇｏｖｅｒｎｍｅｎｔ Ｐｒｉｎｔｉｎｇ Ｏｆｆｉｃｅ （１９９１）を参照することにより当業者であれば容易に決定することができるであろう。
【０１２７】
本明細書において使用する用語「ＣＤＲ３」は、抗体のＶＨ及びＶＬドメインまたはそのフラグメントの第３の相補性決定領域であって、ＶＨ ＣＤＲ３が位置９５〜１０２（１００ａ〜１００ｚとして挙げた位置１００の後に可能な挿入）をカバーし、ＶＬ ＣＤＲ３が位置８９〜９６（９５ａ〜９６ｃとして挙げた位置９５の後に可能な挿入）をカバーするものをいう（Ｋｎａｐｐｉｋ ｅｔ ａｌ．， ２０００を参照）。
【０１２８】
本明細書において使用する用語「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」は、互いに少なくとも６０％相同なヌクレオチド配列が通常は互いにハイブリダイズしたままとなるハイブリダイゼーション及び洗浄の条件をいう。好ましくは、該条件は、互いに少なくとも６５％、より好ましくは少なくとも７０％、さらに好ましく少なくとも７５％相同な配列が通常は互いにハイブリダイズしたままとなるものである。そのようなストリンジェントな条件は当業者に知られたものであり、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ． （１９８９）， ６．３．１−６．３．６に記載されている。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の非限定的な好ましい例は、６ ｘ 塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）中で約４５℃でのハイブリダイゼーションとその後の０．２ ｘ ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳ中５０〜６５℃での１回以上の洗浄である。
【０１２９】
「タンパク質コード配列」あるいは特定のポリペプチドまたはペプチドを「コードする」配列は、適当な調節配列の制御下に置かれた場合、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで転写（ＤＮＡの場合）され、ポリペプチドに翻訳（ｍＲＮＡの場合）される核酸配列である。コード配列の境界は５’（アミノ）末端の開始コドン及び３’（カルボキシ）末端の翻訳停止コドンによって規定される。コード配列には、限定するものではないが、原核生物または真核生物のｍＲＮＡからのｃＤＮＡ、原核生物または真核生物のＤＮＡからのゲノムＤＮＡ配列、さらには合成ＤＮＡ配列が挙げられる。転写終結配列は通常コード配列の３’側に位置する。
【０１３０】
同様に、「コードする」は、その文脈から明らかでない場合は、その用語が通常使用されるように、ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列、並びに阻害性アンチセンス分子に転写されるＤＮＡ配列を意味する。
【０１３１】
本明細書において使用する用語「トランスフェクション」は、核酸を介する遺伝子導入による、例えば発現ベクターのような異種核酸の受容細胞中への導入を意味する。「一過性のトランスフェクション」とは、外来ＤＮＡがトランスフェクト細胞のゲノムに組み込まれない場合、例えばエピソームＤＮＡがｍＲＮＡに転写されタンパク質に翻訳される場合をいう。核酸構築物が娘細胞に引き継がれる場合、細胞は該核酸構築物により「安定にトランスフェクトされた」ものである。
【０１３２】
「発現ベクター」は、所望のタンパク質をコードするＤＮＡを発現するのに使用される複製可能なＤＮＡ構築物であり、（１）遺伝子発現において調節的な役割を有する物質、例えばプロモーター、オペレーターまたはエンハンサー、これが機能的に連結した（２）所望のタンパク質（例えば本発明のポリペプチド）をコードし、ｍＲＮＡに転写されてタンパク質に翻訳されるＤＮＡ配列、ならびに（３）適当な転写及び翻訳開始及び終結配列の組合せを含む転写ユニットを含むものである。プロモーター及びその他の調節エレメントの選択は、一般に意図される宿主細胞により変更される。一般に、組換えＤＮＡ技術に有用な発現ベクターは「プラスミド」の形態であることが多く、プラスミドとはそのベクターの形態では染色体に結合しない環状の二本鎖ＤＮＡループをいう。本明細書においては、プラスミドがベクターの最も一般的に使用される形態であるという理由から、「プラスミド」及び「ベクター」は互換的に使用される。しかしながら、本発明においては、同等な機能を果たし、今後当分野で知られることになるようなその他の形態の発現ベクターも包含する趣旨である。
【０１３３】
発現ベクターにおいて、転写または翻訳を制御する調節エレメントは一般に、哺乳動物、微生物、ウイルスまたは昆虫の遺伝子に由来するものとすることができる。通常は複製起点により与えられる、宿主中で複製する能力、及び形質転換体の認識を容易にする選択遺伝子をさらに組込むことができる。レトロウイルス、アデノウイルスなどのようなウイルスに由来するベクターも使用することができる。
【０１３４】
「転写調節配列」は、開始シグナル、エンハンサー、プロモーターなどの、それが機能的に連結したタンパク質コード配列の転写を誘発または制御するＤＮＡ配列を指すために本明細書全体に使用する一般的な用語である。組換え遺伝子は、その遺伝子の天然の形態の転写を制御する配列と同じまたは場合によっては異なる転写調節配列の制御下に置くことができることは理解されるであろう。
【０１３５】
２つのＤＮＡ領域間の関係について記載する場合の「機能的に連結された」は、単に両者が互いに機能的に関連していることを意味するものである。例えば、プロモーターまたはその他の転写調節配列は、それがコード配列の転写を制御する場合、該コード配列に機能的に連結されているものである。
【０１３６】
本明細書において使用する用語「融合タンパク質」は、当分野で理解されているものであり、２以上の異なるタンパク質に由来するアミノ酸配列からなる単鎖タンパク質として少なくとも最初に発現されるキメラタンパク質をいう。例えば、融合タンパク質は融合遺伝子の遺伝子産物である。
【０１３７】
本明細書において使用する「増殖する」及び「増殖」は、有糸分裂を行っている細胞をいう。
【０１３８】
細胞の「増殖速度」は、細胞の増殖の速度及び細胞の分化の状態を示すものである。
【０１３９】
用語「細胞増殖性疾患」は、周囲の組織とは異なる形態学的外観を有することが多い、悪性及び良性の変態細胞の集団をいう。
【０１４０】
本明細書において使用する「変態細胞」は、無制限な増殖状態に自然発生的に転換した細胞をいい、すなわち培養において無限に分裂して増殖する能力を獲得したものである。変態細胞は、その増殖制御の喪失に関し、新生物形成、未分化及び／または過形成のような用語で特徴付けられ得る。
【０１４１】
本明細書において使用する「不死化細胞」は、化学的及び／または組換え手段により、培養において無限に分裂して増殖する能力を有するように改変された細胞をいう。
【０１４２】
本明細書において使用する用語「動物」は、哺乳動物をいい、好ましくはヒトのような哺乳動物をいう。同様に、本発明の方法により処置される「患者」または「被験者」は、ヒトまたはヒト以外の動物を意味し得る。
【０１４３】
本発明の方法によれば、前記ペプチドは薬学的に許容される組成物中のものとして投与することができる。一般的には、モノクローナル抗体、抗体フラグメント及びペプチド用の薬学的に許容される担体は当業者によく知られている。本明細書で使用する用語「薬学的に許容される担体」には、あらゆる及び任意の溶媒、分散媒体、コーティング、抗細菌剤及び抗真菌剤、等張化剤及び吸収遅延剤などが含まれる。好ましい実施形態においては、活性成分の生物学的活性の有効性を阻害せず、投与される濃度が宿主に対して過度に有毒ではない担体媒体である。投与は任意の適当な方法で行うことができ、皮下及び非経口投与が挙げられ、好ましくは非経口投与である。非経口投与の例としては、静脈内、動脈内、筋肉内及び腹腔内投与が挙げられ、好ましくは静脈内投与である。
【０１４４】
注射の用途に適当な医薬剤形は、滅菌水溶液または分散液、及び滅菌注射溶液または分散液の用時調製用の滅菌粉末である。いずれの場合においても、前記剤形は滅菌されたものでなければならず、容易に注射器により投与できる程度の流体でなければならない。また製造及び貯蔵の条件下で安定でなければならず、細菌や真菌などの微生物による汚染作用に対して保護されなければならない。前記担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えばグリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコールなど）、それらの適当な混合物及び植物油などの溶媒または分散媒体とすることができる。適当な流動性は、例えば、レシチンのようなコーティング剤の使用、分散液の場合は必要な粒子サイズを維持すること、界面活性剤の使用等により維持することができる。微生物の作用の防御は、例えば、パラベン類、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどの種々の抗細菌剤及び抗真菌剤により得ることができる。多くの場合、例えば糖、塩化ナトリウムなどの等張剤を含むことが望ましい。注射可能な組成物の長期間にわたる吸収は、例えば、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンのような吸収遅延剤を組成物中に使用することにより得られる。
【０１４５】
滅菌注射溶液は、活性化合物、例えば本発明のポリペプチドを必要量、必要に応じて上記に挙げたような種々のその他の成分とともに適当な溶媒に加え、その後滅菌濾過することにより製造される。一般に、分散液は、ベースとなる分散媒を含む滅菌ビヒクルに、上記の挙げたものから選択される必要なその他の成分とともに種々の滅菌活性成分を加えることにより調製される。滅菌注射溶液を調製するための滅菌粉末の場合、好ましい製造方法は真空乾燥及び凍結乾燥法であり、これにより活性成分と任意の付加的な所望成分の予め濾過滅菌した溶液からそれらの粉末を得ることができる。
【０１４６】
経口投与用には、本発明のポリペプチドに賦形剤を加え、非摂取用の口内洗浄剤および歯磨剤の形態で使用してもよい。口内洗浄剤は、必要量の活性成分をホウ酸ナトリウム溶液（Ｄｏｂｅｌｌ’ｓ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）のような適当な溶媒に加えることにより調製することができる。また、ゲル、ペースト、粉末、スラリーなどの歯磨剤中に活性成分を分散させることもできる。水、結合剤、研磨剤、香味剤、発泡剤、湿潤剤などを含み得るペースト状の歯磨剤に治療上有効な量の活性成分を加えることもできる。
【０１４７】
本発明の組成物は、中性の状態あるいは塩の形態で配合することができる。薬学的に許容される塩は、酸付加塩（タンパク質の遊離アミノ基により形成されたもの）を含み、これは例えば塩酸またはリン酸のような無機酸あるいは酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸のような有機酸で形成される。遊離のカルボキシル基から形成される塩も、例えば、水酸化ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、鉄のような無機塩基、及びイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカインなどの有機塩基から得ることができる。
【０１４８】
水溶液による非経口投与については、例えば、必要な場合には溶液を適当に緩衝化する必要があり、まず液体希釈剤を十分な生理食塩水またはグルコースにより等張化する。これらの特定の水溶液は、静脈内、筋肉内、皮下及び腹腔内投与に特に適している。この場合、使用できる滅菌水性媒体は本明細書の開示に照らして当業者に理解され得るであろう。例えば、１回の投与量を１ ｍｌの等張ＮａＣｌ溶液に溶解し、１０００ ｍｌの皮下注入液に加えるかあるいは注入に推奨される部位に注射する（例えば、”Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ” １５ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ， ｐａｇｅｓ １０３５−１０３８および１５７０−１６８０参照）。治療対象の被験者の症状によっては投与量をいくらか変更することが必要な場合がある。いずれにしても、投与の責任者が個々の被験者に適当な投与量を決めることになる。さらに、ヒトへの投与に関しては、製剤はＦＤＡ Ｏｆｆｉｃｅ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ ｓｔａｎｄａｒｄｓにより要求される、無菌性、発熱源性、一般的安全性及び純度の基準を満たす必要がある。
【０１４９】
製剤化後、溶液は、投与製剤に適した方法で、治療上有効な量で投与することができる。製剤は、注射溶液、薬剤放出カプセルなどのような種々の投与形態で容易に投与することができる。
【０１５０】
本明細書に使用される用語「予防的または治療的」処置は、医学的症状を有する宿主に投与することをいう。症状が現れる前に投与する場合はその処置は予防であり（すなわち、宿主を腫瘍形成から防御する）、発病の後に投与される場合、その処置は治療である（すなわちすでに存在する腫瘍を死滅させる）。
【０１５１】
少なくとも１種の本発明ポリペプチドの多価組成物は、化学療法のような付加的な手段をさらに必要とすることなく、治療を受ける患者の免疫学的副作用を制限して、活性化された細胞、好ましくはリンパ系腫瘍細胞の細胞死を引き起こすことができる。さらに、本発明のポリペプチドを含む多価組成物は、標的抗原上の少なくとも１のエピトープに結合する能力を有しているが、１つの分子上に複数のエピトープ結合部位が組合せられていてもよい。好ましくは、本発明のポリペプチドを含む多価組成物は、活性化された細胞に対し、活性化されていない細胞と比較して、少なくとも５倍、より好ましくは１０倍高い死滅活性を示す。この活性化細胞に対するより高い活性は、非活性化細胞と比較して、活性細胞に対するＥＣ５０が少なくとも５分の１であること、あるいは同じタンパク質濃度で使用した場合の、非活性化細胞と比較して活性細胞の死滅率がより高いことにより表される。後者の尺度によれば、本発明のポリペプチドを所定のポリペプチド濃度で含む多価組成物は、活性化細胞の少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも８０％を死滅させるが、本発明のポリペプチドを同じ濃度で含む多価組成物は同じインキュベーション条件下で、非活性化細胞の１５％未満、好ましくは１０％未満しか死滅させない。ＥＣ５０値及び死滅活性率を決定するためのアッセイ条件は以下に記載する。
【０１５２】
詳細な説明
以下の実施例は、本発明を例示するものである。
【０１５３】
実施例
参考文献が明示されていないバッファー、溶液、手順はいずれも標準的なテキスト、例えばＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ （１９９７ ａｎｄ １９９９）またはＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， １９８９に記載されているものである。特に記載がない材料はいずれもＳｉｇｍａ， Ｄｅｉｓｅｎｈｏｆｅｎ， ＤＥまたはＭｅｒｃｋ， Ｄａｒｍｓｔａｄｔ， ＤＥより購入したものであるか、または入手先が引用文献に示されているものである。ハイブリドーマ細胞系ＬＢ３．１及びＬ２４３は、ＬＧＣ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ， Ｍｉｄｄｌｅｓｅｘ， ＵＫより入手し、８Ｄ１抗体に関するデータはＤｒ． Ｍａｔｙａｓ Ｓａｎｄｏｒ， Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｍｉｃｈｉｇａｎ， Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩ， ＵＳＡより寄贈された。
【０１５４】
１． ヒト抗原の作製
ヒト組成の細胞傷害性抗原結合ドメインを同定できたことを示すため、まず、精製された形でのヒト抗原、すなわちＰｒｉｅｓｓ細胞からのヒトＭＨＣクラスＩＩ ＤＲタンパク質（ＤＲＡ＊０１０１／ＤＲＢ１＊０４０１）（Ｇｏｒｇａ ｅｔ ａｌ．， １９８４； Ｇｏｒｇａ ｅｔ ａｌ．， １９８６； Ｇｏｒｇａ ｅｔ ａｌ．， １９８７； Ｓｔｅｒｎ ｅｔ ａｌ．， １９９２）を以下のように作製した。
【０１５５】
まず、Ｐｒｉｅｓｓ細胞（ＥＣＡＣＣ， Ｓａｌｉｓｂｕｒｙ， ＵＫ）を標準的な条件下でＲＰＭＩ及び１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）中で培養し、１％ＮＰ−４０（ＢＤＨ， Ｐｏｏｌｅ， ＵＫ）、２５ ｍＭヨードアセトアミド及び１ ｍＭフェニルメチルスルフォニルフルオリド（ＰＭＳＦ）並びにプロテアーゼインヒビターのキモスタチン、アンチパイン、ペプスタチンＡ、大豆トリプシンインヒビター及びロイペプチン各１０ ｍｇ／ｌを含むリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）（ｐＨ ７．５）２００ ｍｌ中に、１０１０個の細胞を溶解した。この溶解液を１００００ ｘ ｇ（３０分間、４℃）で遠心分離し、得られた遠心上清に５％デオキシコール酸ナトリウム、５ ｍＭヨードアセトアミド及び上記プロテアーゼインヒビター各１０ ｍｇ／ｌを含む水溶液４０ ｍｌを加えて、さらに２時間（４℃）１００，０００ ｘ ｇで遠心分離した。非特異的に結合する物質や内在性抗体を取り除くため、得られた遠心上清をＰＭＳＦで０．２ ｍＭとし、０．２ ｍｌ／分の流速でウサギ血清Ａｆｆｉｇｅｌ−１０カラム（５ ｍｌ：ウサギ血清（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ， Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ， ＭＡ， ＵＳＡ）を、製造者の説明書に従って体積比３：１でＡｆｆｉｇｅｌ−１０（ＢｉｏＲａｄ， Ｍｕｎｉｃｈ， ＤＥ）とインキュベートし、洗浄して作製した）、その後Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗカラム（２ ｍｌ； Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に終夜（４℃）通過させた。
【０１５６】
次に、前処理した溶解液をマウス抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体ＬＢ３．１（ハイブリドーマ細胞系ＬＢ３．１の遠心上清をＰｒｏｔｅｉｎ Ｇ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いたアフィニティクロマトグラフィーにかけて得た）（Ｓｔｅｒｎ ｅｔ ａｌ．， １９９３）と結合させたＰｒｏｔｅｉｎ Ｇ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗビーズ ５ ｍｌと軽く混合しながら、４℃で終夜バッチとしてインキュベートし、これを小さなカラムに移し、以下の３つの溶液を使って十分に洗浄した：（１）５０ ｍＭトリス塩酸（ｐＨ ８．０）、１５０ ｍＭ塩化ナトリウム、０．５％ＮＰ−４０、０．５％デオキシコール酸ナトリウム、１０％グリセロール及び０．０３％アジ化ナトリウムを含む溶液１００ ｍｌ（流速０．６ ｍｌ／分）、（２）５０ ｍＭトリス塩酸（ｐＨ ９．０）、０．５Ｍ塩化ナトリウム、０．５％ＮＰ−４０、０．５％デオキシコール酸ナトリウム、１０％グリセロール及び０．０３％アジ化ナトリウムを含む溶液２５ ｍｌ（流速０．９ ｍｌ／分）、（３）２ ｍＭトリス塩酸（ｐＨ ８．０）、１％オクチル−β−Ｄ−グルコピラノシド、１０％グリセロール及び０．０３％アジ化ナトリウムを含む溶液２５ ｍｌ（流速０．９ ｍｌ／分）。
【０１５７】
さらに、ＭＨＣクラスＩＩ ＤＲタンパク質（ＤＲＡ＊０１０１／ＤＲＢ１＊０４０１）を、５０ ｍＭジエチルアミン／塩酸（ｐＨ １１．５）、１５０ ｍＭ ＮａＣｌ、１ ｍＭ ＥＤＴＡ、１ ｍＭ ＥＧＴＡ、１％オクチル−β−Ｄ−グルコピラノシド（Ａｌｅｘｉｓ Ｃｏｒｐ．， Ｌａｕｓｅｎ， ＣＨ）、１０％グリセロール、１０ ｍＭヨードアセトアミド及び０．０３％アジ化ナトリウムを含む溶液１５ ｍｌを用いて流速０．４  ｍｌ／分で溶出した。得られた画分８００μｌを１ Ｍトリス塩酸（ｐＨ ６．８）、１５０ ｍＭ ＮａＣｌ及び１％オクチル−β−Ｄ−グルコピラノシドを含む溶液１００μｌで直ちに中和した。ＭＨＣタンパク質を溶解液から取り除けるまで、ＬＢ３．１結合Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗビーズと共に溶解液のインキュベーションを繰り返した。ＭＨＣクラスＩＩ ＤＲタンパク質の純粋な溶出画分（ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析）をプールし、３０ｋＤａ分子量カットオフでＶｉｖａｓｐｉｎ 濃縮器（Ｇｒｅｉｎｅｒ， Ｓｏｌｉｎｇｅｎ， ＤＥ）を用いて１．０〜１．３ｇ／ｌに濃縮した。同じＶｉｖａｓｐｉｎ濃縮器を用いて、上記ＭＨＣクラスＩＩ ＤＲ調製物約１ｍｇを１％オクチル−β−Ｄ−グルコピラノシドを含むＰＢＳで再び緩衝化し、このタンパク質をＢＩＡｃｏｒｅ ＣＭ５チップに直接結合させた。
【０１５８】
２． ＨｕＣＡＬのスクリーニング
２．１． 序
最近明らかにされた新規の概念（Ｋｎａｐｐｉｋ ｅｔ ａｌ．， ２０００）に基いて、ヒト抗体ライブラリーから、ヒト抗原（ＤＲＡ＊０１０１／ＤＲＢ１＊０４０１）に対するヒト組成の特定の抗原結合抗体フラグメント（ＭＳ−ＧＰＣ−１、ＭＳ−ＧＰ−６、ＭＳ−ＧＰＣ−８及びＭＳ−ＧＰＣ−１０）を同定した。ここで、合計４９の異なるフレームワークを生じるコンセンサスフレームワークは、ヒト免疫反応に広く使われるＶＨ及びＶＬの各サブファミリーを表す。これらのマスター遺伝子は、タンパク質凝集を促進するような好ましくない残基を考慮してこれを除去し、遺伝子の模型組成を導く特有の制限部位を作製するように設計した。ＨｕＣＡＬ−ｓｃＦｖにおいて、４９のマスター遺伝子のＶＨ−ＣＤＲ３及びＶＬ−ＣＤＲ３をコードする領域は、いずれもランダムなものであった。
【０１５９】
２．２． ファージミドのレスキュー、ファージの増幅及び精製
大腸菌ＴＧ−１中のファージミドによるファージディスプレイベクターｐＭＯＲＰＨ１３＿ｓｃＦｖ（図１１参照）にクローン化した、ＨｕＣＡＬ−ｓｃＦｖ（Ｋｎａｐｐｉｋ ｅｔ ａｌ．， ２０００）ライブラリーを３４ μｇ／ｍｌクロラムフェニコール及び１％グルコースを含む２ ｘ ＴＹ培地（２ ｘ ＴＹ−ＣＧ）中で増幅させた。ＯＤ６００＝約０．５として３７℃でヘルパーファージに感染させ（ＶＣＳＭ１３）、遠心分離し、３４ μｇ／ｍｌクロラムフェニコール、５０ μｇ／ｍｌカナマイシン及び０．１ ｍＭ ＩＰＴＧを含む２ ｘ ＴＹ培地に再懸濁させた後、３０℃で終夜細胞増殖させた。ファージは遠心上清よりＰＥＧ沈殿させ（Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．， １９９８）、２０％グリセロールを含むＰＢＳに再懸濁させ、−８０℃で保存した。２回のパンニングの間に以下のとおりファージ増幅を行った。対数増殖期のＴＧ１−細胞を溶出したファージに感染させ、１％グルコース及び３４ μｇ／ｍｌクロラムフェニコールを加えたＬＢ寒天培地に塗布した。３０℃で終夜インキュベートした後、コロニーを削り取り、ＯＤ６００＝０．５として上記のとおりヘルパーファージを加えた。
【０１６０】
２．３． 手動固相パンニング
ＭＨＣ−クラスＩＩ／ＤＲＡ＊０１０１／ＤＲＢ１＊０４０１（上記のとおり作製）をＰＢＳに溶解し、ＭａｘｉＳｏｒｐＴＭマイクロタイタープレート（Ｎｕｎｃ， Ｒｏｓｋｉｌｄｅ， ＤＫ）のウェルに塗布した（２ μｇ／ウェル）。ＰＢＳ中の５％無脂肪粉乳でブロッキングを行い、上記の如く精製した１ｘ１０１２〜５ｘ１０１２個のＨｕＣＡＬ−ｓｃＦｖファージを２０℃で１時間にわたって加えた。数回洗浄を行った後、１００ ｍＭトリエチルアミンによるｐＨ溶出、さらに１Ｍトリス塩酸（ｐＨ ７．０）による中和を行い、結合ファージを溶出した。上記のように各パンニングの間にファージ増幅を行いながら、３回のパンニングを行った。
【０１６１】
２．４． 固相／全細胞混合パンニング
２回目に１０ ｍｌのＦａｌｃｏｎチューブで１０％ＦＣＳを含むＰＢＳ１ ｍｌ中、１ｘ１０７〜５ｘ１０７個のＰｒｉｅｓｓ細胞を使って全細胞パンニングを行った以外は、２．２及び２．３に記載のとおり３回のパンニング及びファージ増幅を行った。ファージ調製物と２０℃で１時間インキュベートした後、この細胞懸濁液を遠心分離（２０００ｒｐｍ、３分間）し、非結合ファージを取り除き、細胞をＰＢＳ１０ ｍｌで３回洗浄し、各洗浄ごとに上記のように遠心分離を行った。特異的に細胞に結合したファージを１００ ｍＭ塩酸によるｐＨ 溶出で溶出した。あるいは、トリエチルアミン処理（１００ ｍＭ）及び中和処理の後、懸濁液に大腸菌を直接加えて、結合ファージを増幅することもできる。
【０１６２】
２．５． ＨＬＡ−ＤＲ結合ｓｃＦｖフラグメントの同定
３回の固相パンニング（２．３）または固相／全細胞混合パンニング（２．４）によって得られたクローンを、Ｐｒｉｅｓｓ細胞と細胞表面上のＨＬＡ−ＤＲとの結合についてＦＡＣＳ分析を行うことによってスクリーニングした。ｓｃＦｖを発現させるために、ｓｃＦｖフラグメントをＸｂａＩ／ＥｃｏＲＩを介して発現ベクターとしてのｐＭｘ７＿ＦＳにクローン化した（図１２参照）。発現条件は以下の実施例３．２に示すとおりである。
【０１６３】
１０６個のＰｒｉｅｓｓ細胞アリコートを４℃で９６穴マイクロタイタープレートのウェルに移した。ブロッキングバッファー（５％ＦＣＳを含むＰＢＳ）に溶解したｓｃＦｖを６０分間にわたって加え、抗ＦＬＡＧ Ｍ２抗体（Ｋｏｄａｋ）（５０００倍に希釈）、続いてポリクローナルヤギ抗マウスＩｇＧ抗体−Ｒ−フィコエリスリンコンジュゲート（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ， Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ， ＰＡ， ＵＳＡ， Ｃａｔ． Ｎｏ．１１５−１１６−１４６， Ｆ（ａｂ’）２ フラグメント）（２００倍に希釈）を用いて検出した。細胞は保存のため４℃で４％パラホルムアルデヒドに固定した。ＦＡＣＳ−Ｃａｌｉｂｕｒ（ＢＤ Ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｍｅｔｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ， Ｓａｎ Ｊｏｓｅ， ＣＡ， ＵＳＡ）を用いて各アッセイごとに１０４事象を回収した。
【０１６４】
５００を超える推定結合物質のうちわずか１５のみがＰｒｉｅｓｓ細胞に特異的に結合することが同定された。これらのクローンを、さらに以下のとおり死滅活性について分析した。表１は、これによって特定されたクローンであるＭＳ−ＧＰＣ−１、ＭＳ−ＧＰＣ−６、ＭＳ−ＧＰＣ−８及びＭＳ−ＧＰＣ−１０の配列特性を示す。表に示したＶＨファミリー、ＶＬファミリー及びＣＤＲ３は、記載されたとおり（Ｋｎａｐｐｉｋ ｅｔ ａｌ．， ２０００）、ＨｕＣＡＬコンセンサスに基いた抗体遺伝子であり、ＶＨ及びＶＬ ＣＤＲの配列を表１に示し、ＶＨドメイン及びＶＬドメインの全配列は図１５に示す。
【０１６５】
３． Ｆａｂフラグメントの作製
３．１． ｓｃＦｖからＦａｂへの変換
Ｆａｂフラグメント抗原結合ポリペプチドであるＭＳ−ＧＰＣ−１−Ｆａｂ、ＭＳ−ＧＰ−６−Ｆａｂ、ＭＳ−ＧＰＣ−８−Ｆａｂ及びＭＳ−ＧＰＣ−１０−Ｆａｂは、以下のとおりそれぞれ対応するｓｃＦｖフラグメントから作製した。ｓｃＦｖフラグメントの重鎖及び軽鎖の可変ドメインは共にｐＭｘ９＿Ｆａｂにクローン化し（図１３）、重鎖可変ドメインはＭｆｅＩ／ＳｔｙＩ断片として、κ軽鎖の可変ドメインはＥｃｏＲＶ／ＢｓｉＷＩ断片としてクローン化した。λ鎖はまず、対応するｐＭＯＲＰＨ１３＿ｓｃＦｖベクターを鋳型としてＰＣＲプライマーＣＲＴ５（５’プライマー）及びＣＲＴ６（３’プライマー）を用いて増幅した。このときＣＲＴ６は特有のＤｒａＩＩＩ制限エンドヌクレアーゼ部位を導入する。
【０１６６】
ＣＲＴＳ： ５’ ＧＴＧＧＴＧＧＴＴＣＣＧＡＴＡＴＣ ３’
ＣＲＴ６： ５’ ＡＧＣＧＴＣＡＣＡＣＴＣＧＧＴＧＣＧＧＣＴＴＴＣＧＧＣＴＧＧＣＣＡＡＧＡＡＣＧＧＧＴＴＡ ３’
ＰＣＲ産物は、ＥｃｏＲＶ／ＤｒａＩＩＩで切断し、ｐＭｘ９＿Ｆａｂにクローン化した（図１３参照）。Ｆａｂ軽鎖は、ポリクローナルヤギ抗マウスＩｇＧ抗体−Ｒ−フィコエリスリンコンジュゲート（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ， Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ， ＰＡ， ＵＳＡ， Ｃａｔ． Ｎｏ １０９−１１６−０８８， Ｆ（ａｂ’）２ フラグメント）（２００倍に希釈）で検出することができた。
【０１６７】
３．２． 大腸菌におけるＨｕＣＡＬ抗体フラグメントの発現及び精製
ｐＭｘ７＿ＦＳまたはｐＭｘ９＿ＦａｂからのｓｃＦｖ及びＦａｂフラグメントの大腸菌細胞（ＪＭ８３）でのそれぞれの発現は、３４ μｇ／ｍｌクロラムフェニコールを加えた２ ｘ ＴＹ培地１Ｌ中で行った。０．５ ｍＭ ＩＰＴＧ（ｓｃＦｖ）または０．１ ｍＭ ＩＰＴＧ（Ｆａｂ）による誘導の後、２２℃で１２時間細胞増殖させた。Ｆｒｅｎｃｈ Ｐｒｅｓｓ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｐｅｃｔｒｏｎｉｃ， Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ， ＮＹ， ＵＳＡ）により、細胞ペレットを２０ ｍＭリン酸ナトリウム、０．５Ｍ ＮａＣｌ及び１０ ｍＭイミダゾール（ｐＨ ７．４）中に溶解した。細胞破砕物を遠心分離で取り除いた後、透明遠心上清を０．２μｍ孔径のフィルターで濾過してから、Ｓｔｒｅｐｔａｃｔｉｎマトリックスを用いて、供給者（ＩＢＡ ＧｍｂＨ， Ｇｏｔｔｉｎｇｅｎ， ＤＥ）の精製条件に従いＳＴＲＥＰタグ精製を行った。Ｒｈｅｉｎｎｅｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９６）に記載されたとおりに、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）による精製を行った。較正標準を用いながらＳＥＣにより見かけ上の分子量を測定し、場合によっては液体クロマトグラフィーおよび質量分析の組合せ（ＴｏｐＬａｂ ＧｍｂＨ， Ｍａｒｔｉｎｓｒｉｅｄ， ＤＥ）により確認した。
【０１６８】
４． 抗体フラグメントの最適化
ＨＬＡ−ＤＲ結合抗体フラグメントの特定の生物学的特性を最適化するため、Ｆａｂフラグメントの一つであるＭＳ−ＧＰＣ−８−Ｆａｂを使って、親ＶＬ λ１鎖を、ＨｕＣＡＬライブラリーからのＣＤＲ３においてランダム化されたλ鎖λ１〜３全部のプールに置き換えることによりＦａｂ抗体フラグメントのライブラリーを構築した（Ｋｎａｐｐｉｋ ｅｔ ａｌ．， ２０００）。
【０１６９】
ＦａｂフラグメントＭＳ−ＧＰＣ−８−Ｆａｂ（３．１参照）をｐＭｘ９＿Ｆａｂ＿ＧＰＣ−８からＦａｂフラグメントのファージディスプレイのためのファージミドベクターであるｐＭＯＲＰＨ１８＿ＦａｂにＸｂａＩ／ＥｃｏＲＩを介してクローン化し、ｐＭＯＲＰＨ１８＿Ｆａｂ＿ＧＰＣ−８を作製した（図１４参照）。特有のＤｒａＩＩＩ制限エンドヌクレアーゼ部位を含むλ鎖のプール（Ｋｎａｐｐｉｋ ｅｔ ａｌ．， ２０００）を、ＮｓｉＩ及びＤｒａＩＩＩで切断した。ｐＭＯＲＰＨ１８＿Ｆａｂ＿ＧＰＣ−８にクローン化した（図１４におけるｐＭＯＲＰＨ１８＿Ｆａｂ＿ＧＰＣ−８のベクターマップ参照）。
【０１７０】
２回目にコーティングした抗原濃度を１２ ｎｇ／ウェルに低減した以外は、２．３に記載のとおり、得られたＦａｂ最適化ライブラリーをＭＨＣ−クラスＩＩのＤＲＡ１＊０１０１／ＤＲＢ１＊０４０１（上記のとおり作製）に対する２回のパンニングによりスクリーニングした。２．５に記載のとおりＦＡＣＳで最適化クローンを同定した。これらのクローンのうち７つのクローン、ＭＳ−ＧＰＣ−８−１、ＭＳ−ＧＰＣ−８−６、ＭＳ−ＧＰＣ−８−９、ＭＳ−ＧＰＣ−８−１０、ＭＳ−ＧＰＣ−８−１７、ＭＳ−ＧＰＣ−８−１８及びＭＳ−ＧＰＣ−８−２７をさらに特性決定し、開始フラグメントであるＭＳ−ＧＰＣ−８に見られるような細胞死滅活性を示した。表１に、ＭＳ−ＧＰＣ−８−１、ＭＳ−ＧＰＣ−８−６、ＭＳ−ＧＰＣ−８−９、ＭＳ−ＧＰＣ−８−１０、ＭＳ−ＧＰＣ−８−１７、ＭＳ−ＧＰＣ−８−１８及びＭＳ−ＧＰＣ−８−２７の配列特性を示す。表に示したＶＨファミリー、ＶＬファミリー及びＣＤＲ３は、記載されたように（Ｋｎａｐｐｉｋ ｅｔ ａｌ．， ２０００）、ＨｕＣＡＬコンセンサスベースの抗体遺伝子を表す。ＭＳ−ＧＰＣ−８−６、ＭＳ−ＧＰＣ−８−１０、ＭＳ−ＧＰＣ−８−１７及びＭＳ−ＧＰＣ−８−２７のＶＨドメイン及びＶＬドメインの全配列を図１５に示す。
【０１７１】
抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体フラグメントの最適化したＦａｂ形態であるＭＳ−ＧＰＣ−８−６及びＭＳ−ＧＰＣ−８−１７は、開始ＭＳ−ＧＰＣ−８に比べ特性が向上していた。例えば、最適化抗体のＥＣ５０は、１５〜２０及び５〜２０ ｎＭ（ＭＳ−ＧＰＣ−８ではその濃度を二価の架橋Ｆａｂダイマーの濃度で表した場合２０〜４０ｎＭ）となった。ＭＳ−ＧＰＣ−８−６及びＭＳ−ＧＰＣ−８−１７のＭＨＨ−ＣＡＬＬ ４細胞に対する最大死滅能はそれぞれ７６％と７８％（ＭＳ−ＧＰＣ−８は６５％）となった。
【０１７２】
さらに最適化するため、ＭＳ−ＧＰＣ−８（ＭＳ−ＧＰＣ−８−１０及びＭＳ−ＧＰＣ−８−２７を含む）由来の一群の抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体フラグメントのＶＬ ＣＤＲ１領域をトリヌクレオチド特異的変異誘発を用いたカセット変異誘発法により最適化した（Ｖｉｒｎｅｋａｓ ｅｔ ａｌ．， １９９４）。簡単に述べると、ランダムな６つの位置を含むＶＩ１ ＣＤＲ１ライブラリーのカセットを合成し（全変動性： ７．４３ ｘ １０６）、ＶＩ１フレームワークにクローン化した。このＣＤＲ１ライブラリーをＥｃｏＲＶ及びＢｂｓＩで消化し、ＣＤＲ１ライブラリーを含む断片をｐＭＯＲＰＨ１８＿Ｆａｂにおける上記ＭＳ−ＧＰＣ−８由来のＦａｂ抗体フラグメントのλ軽鎖に（上記のように）連結し、ＥｃｏＲＶ及びＢｂｓＩで消化した。得られたライブラリーを上記のようにスクリーニングした。１０個のクローンがＨＬＡ ＤＲに特異的に結合したことにより上記のように同定され（ＭＳ−ＧＰＣ−８−６−２、ＭＳ−ＧＰＣ−８−６−１９、ＭＳ−ＧＰＣ−８−６−２７、ＭＳ−ＧＰＣ−８−６−４５、ＭＳ−ＧＰＣ−８−６−１３、ＭＳ−ＧＰＣ−８−６−４７、ＭＳ−ＧＰＣ−８−１０−５７、ＭＳ−ＧＰＣ−８−２７−７、ＭＳ−ＧＰＣ−８−２７−１０及びＭＳ−ＧＰＣ−８−２７−４１）、開始フラグメントであるＭＳ−ＧＰＣ−８、ＭＳ−ＧＰＣ−８−１０及びＭＳ−ＧＰＣ−８−２７に見られるような細胞死滅活性を示した。表１に、ＭＳ−ＧＰＣ−８−６−２、ＭＳ−ＧＰＣ−８−６−１９、ＭＳ−ＧＰＣ−８−６−２７、ＭＳ−ＧＰＣ−８−６−４５、ＭＳ−ＧＰＣ−８−６−１３、ＭＳ−ＧＰＣ−８−６−４７、ＭＳ−ＧＰＣ−８−１０−５７、ＭＳ−ＧＰＣ−８−２７−７、ＭＳ−ＧＰＣ−８−２７−１０及びＭＳ−ＧＰＣ−８−２７−４１の配列特性を示す。表に示したＶＨファミリー、ＶＬファミリー及びＣＤＲ３は、記載されたように（Ｋｎａｐｐｉｋ ｅｔ ａｌ．， ２０００）、ＨｕＣＡＬコンセンサスベースの抗体遺伝子を表し、ＭＳ−ＧＰＣ−８−６−１３、ＭＳ−ＧＰＣ−８−１０−５７及びＭＳ−ＧＰＣ−８−２７−４１のＶＨドメイン及びＶＬドメインの全配列を図１５に示す。
【０１７３】
これら１０個のクローンから、実施例１０に記載のとおり細胞死滅のＥＣ５０が著しく向上した４個のＦａｂフラグメントを選択した（ＭＳ−ＧＰＣ−８−６−２、ＭＳ−ＧＰＣ−８−６−１３、ＭＳ−ＧＰＣ−８−１０−５７及びＭＳ−ＧＰＣ−８−２７−４１）。表１は、ＣＤＲ１領域で最適化したクローンの配列を示す。
【０１７４】
最適化手順により、最適化工程で作製した抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体フラグメントの生物学的効力が高まっただけでなく、物理的特性、すなわち抗体フラグメントのＨＬＡ−ＤＲタンパク質に対する親和性も実質的に向上した。例えば、ＭＳ−ＧＰＣ−８のＦａｂ形態及びその最適化派生物の親和性を、実施例７に従い、表面プラズモン共鳴装置（Ｂｉａｃｏｒｅ， Ｕｐｓａｌａ， Ｓｗｅｄｅｎ）を用いて測定した。ＶＬ ＣＤＲ３の最適化後、ＭＳ−ＧＰＣ−８の親Ｆａｂの親和性が３４６ ｎＭから約６０ ｎＭへと１００倍以上向上し、ＶＬ ＣＤＲ３＋１の最適化後には、親和性が一桁のナノモルレベル（３〜９ ｎＭの範囲）にまでさらに向上した（表２）。
【０１７５】
５． ＩｇＧの生成
５．１． ＨｕＣＡＬ免疫グロブリン発現ベクターの構築
重鎖は、以下のようにクローン化した。ｐｃＤＮＡ３．１＋（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のマルチクローニング部位を取り除き（ＮｈｅＩ／ＡｐａＩ）、リーダー配列（ＮｈｅＩ／ＥｃｏＲＩ）、ＶＨドメイン（ＥｃｏＲＩ／ＢｌｐＩ）及び免疫グロブリン定常領域（ＢｌｐＩ／ＡｎａＩ）の連結のために、ＨｕＣＡＬ設計に使われた制限部位と一致するスタッファー（ｓｔｕｆｆｅｒ）を挿入した。上記リーダー配列（ＥＭＢＬ Ｍ８３１３３）はコザック配列を備えていた（Ｋｏｚａｋ， １９８７）。ヒトＩｇＧ１（ＰＩＲ Ｊ００２２８）、ＩｇＧ４（ＥＭＢＬ Ｋ０１３１６）及び血清ＩｇＡ１（ＥＭＢＬ Ｊ００２２Ｏ）の定常領域は、約７０塩基の長さの重複オリゴヌクレオチドに分割した。ＨｕＣＡＬ設計と一致しない制限部位を取り除くため、サイレント変異を導入した。上記オリゴヌクレオチドをオーバラップエクステンションＰＣＲでスプライシングした。
【０１７６】
軽鎖は、以下のようにクローン化した。ｐｃＤＮＡ３．１／Ｚｅｏ＋（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のマルチクローニング部位を２個の異なるスタッファーで置き換えた。κスタッファーにより、κリーダー（ＮｈｅＩ／ＥｃｏＲＶ）、ＨｕＣＡＬ−ｓｃＦｖ Ｖκドメイン（ＥｃｏＲＶ／ＢｓｌＷＩ）及びκ鎖定常領域（ＢｓｉＷＩ／ＡｐａＩ）の挿入のための制限部位が得られた。λスタッファーにおける対応する制限部位は、ＮｈｅＩ／ＥｃｏＲＶ（λリーダー）、ＥｃｏＲＶ／ＨｐａＩ（Ｖλドメイン）及びＨｐａＩ／ＡｎａＩ（λ鎖定常領域）である。κリーダー（ＥＭＢＬ Ｚ０００２２）及びλリーダー（ＥＭＢＬ Ｌ２７６９２）はともにコザック配列を備えていた。上記ヒトκ鎖（ＥＭＢＬ Ｊ００２４１）及びλ鎖（ＥＭＢＬ Ｍ１８６４５）の定常領域は、上記のようにオーバラップエクステンションＰＣＲで構築した。
【０１７７】
５．２． ＩｇＧ発現ＣＨＯ細胞の生成
すべての細胞を５％ＣＯ２を含む加湿雰囲気下、供給者が推奨する培地中に３７℃で維持した。ＣＨＯ−Ｋ１（ＣＲＬ−９６１８）はＡＴＣＣから入手し、ＩｇＧの重鎖および軽鎖の発現ベクターの等モル混合液で共トランスフェクトした。二重耐性トランスフェクタントを６００ μｇ／ｍｌのＧ４１８及び３００ μｇ／ｍｌのゼオシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で選択してから、限界希釈を行った。単一クローンの上清のＩｇＧ発現を抗原捕獲ＥＬＩＳＡで評価した。１０％ Ｕｌｔｒａ−ｌｏｗ ＩｇＧ−ＦＣＳ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を添加したＲＰＭＩ−１６４０培地で陽性クローンを増殖させた。上清のｐＨ を８．０に調節し、滅菌濾過した後、該溶液を標準プロテインＡカラムクロマトグラフィー（Ｐｏｒｏｓ ２０Ａ， ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）にかけた。
【０１７８】
抗ＨＬＡ−ＤＲ抗原結合ドメインのＩｇＧ形態は、上記抗体フラグメントに比べて向上した特性を示している。これらの向上した特性として、親和性（実施例７）及び死滅効率（実施例９、１０及び１４）が挙げられる。
【０１７９】
６． ＨＬＡ−ＤＲ特異性アッセイ及びエピトープマッピング
ＨｕＣＡＬライブラリーから選択した抗原結合ドメインが、レセプター架橋による細胞死滅という観点からはこれまで知られていなかった、主に対立遺伝子間に保存されるヒトＭＨＣ ＩＩレセプターのＮ末端ドメインの結合部位に特異的に結合することを示すため、その結合特異性を評価し、結合エピトープの特性決定を行った。
【０１８０】
Ｆａｂ抗体フラグメントであるＭＳ−ＧＰＣ−８−２７−７、ＭＳ−ＧＰＣ−８−２７−１０、ＭＳ−ＧＰＣ−８−６−１３、ＭＳ−ＧＰＣ−８−２７−４１、ＭＳ−ＧＰＣ−８−６−４７、ＭＳ−ＧＰＣ−８−１０−５７、ＭＳ−ＧＰＣ−８−６−２７、ＭＳ−ＧＰＣ−８及びＭＳ−ＧＰＧ−８−６は、ＨＬＡ−ＤＲタンパク質に対する結合特異性を示したが、非ＨＬＡ−ＤＲタンパク質に対しては示さなかった。ＨｕＣＡＬライブラリーから選択したＦａｂフラグメントの下記の抗原、すなわちＨＬＡ−ＤＲタンパク質（ＤＲＡ＊０１０１／ＤＲＢ１＊０４０１；実施例１のように作製）、ＢＳＡ、テストステロンＢＳＡ、リゾチーム及びヒトアポトランスフェリンを含む関連しない一群の非ＨＬＡ−ＤＲタンパク質との反応性を分析した。空のウェル（Ｐｌａｓｔｉｃ）を使って陰性対照とした。ＰＢＳ（Ｎｕｎｃ−ＭａｘｉＳｏｒｐ ＴＭ）中、ＭＨＣ ＩＩ抗原を１ μｇ／ウェルで一晩にわたって被覆し、その他の抗原（ＢＳＡ、テストステロンＢＳＡ、リゾチーム、アポトランスフェリン）は１０ μｇ／ウェルで使用した。翌日、ウェルを５％無脂肪乳で１時間ブロッキングし、続いて各抗体（抗ＭＨＣ ＩＩ−Ｆａｂ及び関連しないＦａｂ（Ｍａｃ１−８Ａ））を１００ｎｇ／ウェルで１時間インキュベートした。ＰＢＳで洗浄後、ＴＢＳ（５％ ｗ／ｖ無脂肪粉乳及び０．０５％ｖ／ｖ Ｔｗｅｅｄ２０を添加）で１００００倍に希釈したペルオキシダーゼ標識抗ヒトＩｇＧ−Ｆ（ａｂ’）２を各ウェルに１時間加えた。最終洗浄をＰＢＳで行った後、基質ＰＯＤ（Ｒｏｃｈｅ）を加えた。ＥＬＩＳＡリーダーを用いて３７０ｎＭで発色を測定した。
【０１８１】
抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体フラグメントであるＭＳ−ＧＰＣ−８−２７−７、ＭＳ−ＧＰＣ−８−２７−１０、ＭＳ−ＧＰＣ−８−６−１３、ＭＳ−ＧＰＣ−８−２７−４１、ＭＳ−ＧＰＣ−８−６−４７、ＭＳ−ＧＰＣ−８−１０−５７、ＭＳ−ＧＰＣ−８−６−２７、ＭＳ−ＧＰＣ−８及びＭＳ−ＧＰＣ−８−６は、これらの抗体フラグメントをＨＬＡ−ＤＲ由来抗原を加えてインキュベートしたことにより得られた平均蛍光強度が対照に比べはるかに高いことから明らかなように（図１ａ）、いずれもＨＬＡ−ＤＲに対する高い特異性を示した。同様の実験で、ＦａｂフラグメントであるＭＳ−ＧＰＣ−１、ＭＳ−ＧＰＣ−６、ＭＳ−ＧＰＣ−８及びＭＳ−ＧＰＣ−１０は、ＤＲＡ＊０１０１／ＤＲＢ１＊０４０１（上記のとおり作製）、並びにＤＲＡ＊０１０１及びＤＲＢ１＊０４０１の各Ｎ末端ドメインを含み、残りがマウスクラスＩＩ ＩＥｄ相同体由来の分子を含むキメラＤＲ−ＩＥ（Ｉｔｏ ｅｔ ａｌ．， １９９６）のいずれにもに結合することがわかった（図１ｂ）。
【０１８２】
本発明の抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体フラグメント及びＩｇＧの広範なＤＲ反応性を示すため、ＭＳ−ＧＰＣ−１、ＭＳ−ＧＰＣ−６、ＭＳ−ＧＰＣ−８及びＭＳ−ＧＰＣ−１０のｓｃＦｖ形態並びにＭＳ−ＧＰＣ−８、ＭＳ−ＧＰＣ−８−１０−５７、ＭＳ−ＧＰＣ−８−２７−５１及びＭＳ−ＧＰＣ−８−６−１３のＩｇＧ形態を、それぞれがヒト集団においてもっとも頻繁に現れるＤＲ対立遺伝子の１つの同型接合体である（ＥＣＡＣＣ， Ｓａｌｉｓｂｕｒｙ， ＵＫ）より入手したエプスタイン−バーウィルスで形質転換したＢ細胞系のパネルに対する反応性について試験した（細胞系及び対立遺伝子を図２に示す）。上記抗体フラグメントは、それぞれＤＲＢ３＊０１０１、ＤＲＢ４＊０１０１、ＤＰ０１０３／０４０２、ＤＰ０２０２／０２０１及びＤＱ０２０１／０６０２分子を発現するＤＲＢ１：Ｌ１０５．１、Ｌ２５７．６、Ｌ２５．４、Ｌ２５６．１２及びＬ２１．３以外のヒトクラスＩＩのアイソタイプを発現するためにトランスフェクトした一連のＬ細胞（Ｋｌｏｈｅ ｅｔ ａｌ．， １９８８）に対する反応性についても評価した。
【０１８３】
様々なＭＨＣクラスＩＩ分子を発現する細胞系のパネルに対する抗原結合フラグメントの反応性が、例えば、Ｏｔｔｅｎ ｅｔ ａｌ． （１９９７）に記載の方法のような免疫蛍光法により示された。各抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体フラグメントが保持するＭ２タグに対する２次試薬としての抗ＦＬＡＧ−Ｍ２抗体、及び染色試薬としてのフルオレセイン標識ヤギ抗マウスＩｇ（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ， Ｔｏｒｒｅｙ Ｐｉｎｅ， ＣＡ， ＵＳＡ）を用いて、２ ｘ １０５個の細胞に対する染色を行った。細胞を、抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体フラグメントの濃度を２００ ｎＭとし４℃で６０分間インキュベートした後、２次、３次抗体を製造者により定められた濃度で用いた。ＩｇＧ形態については、２次抗体を使用せず、ＩｇＧをＦＩＴＣ標識マウス抗ヒトＩｇＧ４（Ｓｅｒｏｔｅｃ， Ｏｘｆｏｒｄ， ＵＫ）を用いて検出した。インキュベートする毎に細胞を洗浄した。最後に、細胞を洗浄して、ＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒ（ＢＤ Ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｍｅｔｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ， Ｓａｎ Ｊｏｓｅ， ＣＡ， ＵＳＡ）を用いて分析を行った。
【０１８４】
図２は、ｓｃＦｖフラグメントであるＭＳ−ＧＰＣ−１、ＭＳ−ＧＰＣ−６、ＭＳ−ＧＰＣ−８及びＭＳ−ＧＰＣ−１０並びにＩｇＧ形態のＭＳ−ＧＰＣ−８、ＭＳ−ＧＰＣ−８−１０−５７、ＭＳ−ＧＰＣ−８−２７−５１及びＭＳ−ＧＰＣ−８−６−１３が、試験したＤＲＢ１アロタイプすべてと反応することを示す。この結果は、すべての抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体フラグメントがキメラＤＲ−ＩＥと反応するという結果とともに、すべての選択した抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体フラグメントが単形態性ＤＲα鎖の細胞外第１ドメインまたはＤＲβ鎖の細胞外第１ドメイン上の単形態性のエピトープを認識することを示唆している。
【０１８５】
その後、さらにＨＬＡ−ＤＲ上の結合ドメインが知られているマウス抗体との競合結合を検討することにより、ＭＳ−ＧＰＣ−８−１０−５７及びＭＳ−ＧＰＣ−８−２７−４１の結合ドメインの位置決定を試みた。マウス抗体のＬ２４３及びＬＢ３．１はα１ドメインに、１−１Ｃ４及び８Ｄ１はβ１ドメインに、１０Ｆ１２はβ２ドメインに結合することが知られている（Ｖｉｄｏｖｉｃ ｅｔ ａｌ．， １９９５ｂ）。この目的のために、最初にＩｇＧ４形態のＭＳ−ＧＰＣ−８−１０−５７またはＭＳ−ＧＰＣ−８−２７−４１、Ｆａｂ形態のＭＳ−ＧＰＣ−８−１０−５７またはＦａｂ形態のＧＰＣ−８及び関連しない対照抗体とともにＤＲ発現細胞系（ＬＧ−２）をインキュベートするアッセイを開発した。次にマウス抗体を加え、マウス抗体を検出した。ＭＳ−ＧＰＣ−８−１０−５７またはＭＳ−ＧＰＣ−８−２７−４１の結合部位がマウス抗体の結合と重複する場合は、マウス抗体の検出が減少することが予想される。
【０１８６】
ＩｇＧ４形態のＧＰＣ−８−２７−４１及びＭＳ−ＧＰＣ−８−１０−５７並びにＦａｂ形態のＭＳ−ＧＰＣ−８−１０−５７の結合が実質的に１−１Ｃ４及び８Ｄ１の結合を阻害したが（平均蛍光強度が＞９０％減少）、Ｌ２４３、ＬＢ３．１及び１０Ｆ１２並びに対照はわずかな影響を受けたにすぎなかった。Ｆａｂ形態のＭＳ−ＧＰＣ−８は１−ｌＣ４の結合を約５０％減少させ（平均蛍光強度は２４４から１１８に低下）、８Ｄ１の結合を完全に消失させ、Ｌ２４３、ＬＢ３．１及び１０Ｆ１２または対照の結合はわずかな影響を与えたにすぎなかった。関連しない対照抗体は、いずれの結合にも影響を全く与えなかった。このように、ＭＳ−ＧＰＣ−８−１０−５７及びＭＳ−ＧＰＣ−８−２７−４１は対立ＨＬＡ−ＤＲ分子中に高度に保存されるβ１ドメインエピトープを認識しているようである。
【０１８７】
染色の手順はすべて氷上で行った。ヒトＢリンパ芽球系細胞系ＬＧ−２の１ ｘ １０７個の細胞を２％ ＦＣＳ及び３５ μｇ／ｍｌモルモットＩｇＧを含むＰＢＳ（以下「ＦＡＣＳバッファー」）中で２０分間プレブロッキングした。これらの細胞をそれぞれ約３．３ ｘ １０６個の細胞を含むＡ、Ｂ及びＣの３つの等しい部分に分け、これらをＡ） ３５ μｇのＩｇＧ４形態のＭＳ−ＧＰＣ−８−１０−５７またはＭＳ−ＧＰＣ−８−２７−４１、Ｂ） ３５ μｇのＦａｂ形態のＭＳ−ＧＰＣ−８−１０−５７またはＦａｂ形態のＭＳ−ＧＰＣ−８、そしてＣ）陰性対照として３５ μｇの関連しないＩｇＧ４抗体にそれぞれ加えて、９０分間インキュベートした。続いて、Ａ、Ｂ及びＣをそれぞれ５．５ ｘ １０５個の細胞を含む６つの等しい部分に分け、各バイアルに以下のマウス抗体、１）精製ｍＩｇＧ、２）Ｌ２４３、３）ＬＢ３．１、４）１−１ Ｃ４、５）８Ｄ１、６）１０Ｆ１２を２ μｇずつ加え、３０分間インキュベートした。次に、ＰＢＳ ４ ｍｌを各バイアルに加え、バイアルを３００ ｇで８分間遠心分離にかけた。最終濃度が２０ μｇ／ｍｌのヤギ抗マウスＩｇ−ＦＩＴＣコンジュゲートの１〜２５倍希釈液を含む５０ μｌのＦＡＣＳバッファー（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ， Ｔｏｒｒｅｙ Ｐｉｎｅｓ， ＣＡ， ＵＳＡ）に細胞ペレットを再懸濁した。細胞は遮光しながら３０分間インキュベートした。その後、細胞を４ ｍｌのＰＢＳで洗浄し、上記のように遠心分離を行い、フローサイトメーターで分析するため、５００μｌのＰＢＳに再懸濁した（ＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒ， ＢＤ Ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｍｅｔｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ， Ｓａｎ Ｊｏｓｅ， ＣＡ， ＵＳＡ）。
【０１８８】
ＰｅｐＳｐｏｔ法（ＵＳ ６０４０４２３； Ｈｅｉｓｋａｎｅｎ ｅｔ ａｌ．， １９９９）を用いて、さらにＭＳ−ＧＰＣ−８−１０−５７に対する結合エピトープを同定した。簡単に述べると、固相ペプチド合成スポッティング法（ＷＯ ００／１２５７５）により、セルロース膜上に７３個の重複した１５アミノ酸長ペプチドのアレイを合成した。これらのペプチド配列は、ＨＬＡ−ＤＲ４Ｄｗ１４、ＨＬＡ−ＤＲＡ１＊０１０１（残基１〜８１）及びＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０４０１（残基２〜９２）のα１ドメイン及びβ１ドメインの配列にそれぞれ由来し、２個のアミノ酸で重複している。次に、そのようなアレイを０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳ（以下「ＰＢＳ−Ｔ」）に浸して、５％ ＢＳＡを含むＰＢＳ−Ｔを用いて室温で３時間ブロッキングを行い、続いてＰＢＳ−Ｔで３回洗浄した。さらに、作製したアレイをＩｇＧ形態のＧＰＣ−８−１０−５７の５ ｍｇ／ｌ溶液を含む１％ ＢＳＡ／ＰＢＳ−Ｔ ５０ｍｌを用いて室温で９０分間インキュベートした。そして結合後、膜をＰＢＳ−Ｔで３回洗浄し、続いて１％ ＢＳＡ／ＰＢＳ−Ｔで５０００倍に希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ヒト軽鎖抗体と室温で１時間インキュベートした。最後に、ＰＢＳ−Ｔで膜を３回洗浄し、Ｘ線フィルム上における化学発光検出により全ての結合を測定した。ヤギ抗ヒト軽鎖抗体の非特異的結合の対照として、ＰＢＳ−Ｔ（２回）、水、ＤＭＦ、水、８Ｍ尿素含有水溶液、１％ ＳＤＳ、０．５％ ＤＴＴ、５０％エタノール溶液、１０％酢酸含有水（以上各３回）及び最後にメタノール（２回）で室温にて３０分間別々に洗浄を行うことによりペプチドアレイを取り除いた。膜を再びブロッキングし、洗浄し、西洋ワサビペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ヒトＩ軽鎖抗体とインキュベートし、上記のように現像した。
【０１８９】
７． 抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体及び抗体フラグメントの親和性
本発明の抗ＨＬＡ抗体フラグメントの優れた結合性を示すため、プラズモン共鳴の原理を使用した標準的な機器を用いて、ヒトＭＨＣクラスＩＩ ＤＲタンパク質（ＤＲＡ＊０１０１／ＤＲＢ１＊０４０１）に対する結合親和性を測定した。驚くべきことに、本発明の特定のＩｇＧ形態の抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体フラグメントについてナノモル未満のレベルの親和性が得られた。例えば、ＩｇＧ形態のＭＳ−ＧＰＣ−８−２７−４１、ＭＳ−ＧＰＣ−８−６−１３及びＭＳ−ＧＰＣ−８−１０−５７の親和性は、それぞれ０．３、０．５及び０．６ ｎＭと測定された（表３ａ）。また、ＣＤＲ１及びＣＤＲ３軽鎖領域で成熟したＦａｂ形態の親和性として、２〜８ ｎＭの範囲の高い親和性が見られた（表３ｂ）。ＣＤＲ３軽鎖領域のみにおいて成熟したＦａｂ形態は４０〜１００ ｎＭの範囲の親和性を示し（表３ｃ）、非最適化ＨｕＣＡＬ抗原結合ドメインのＦａｂフラグメントでさえもμＭ未満レベルの親和性を示した（表３ｄ）。ＣＤＲ３の最適化後、Ｋｏｎは中程度の増加のみ（２倍）が見られ（抗体最適化プロセスを通じてＫｏｎは１ｘ１０５ Ｍ−１ｓ−１のオーダーでほぼ一定であった）、一方Ｋｏｆｆが大きく減少したのは最適化プロセスの驚くべき特徴であり、非最適化Ｆａｂ、ＣＤＲ３最適化Ｆａｂ、ＣＤＲ３／ＣＤＲ１最適化Ｆａｂ及び本発明のＩｇＧ形態の抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体フラグメントについて、それぞれ１００ ｓ−１、１０ ｓ−１、１ ｓ−１及び０．１ ｓ−１未満であった。
【０１９０】
本発明の抗ＨＬＡ抗体フラグメントの親和性を以下のように測定した。すべての測定は、ＨＢＳバッファー（２０ ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ ７．４）中、流速２０μｌ／分、２５℃でＢＩＡｃｏｒｅ ３０００装置（Ｂｉａｃｏｒｅ ＡＢ， Ｓｗｅｄｅｎ）を用いて行った。ＭＨＣクラスＩＩ ＤＲタンパク質（実施例１において作製）を１００ ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ ４．５）で５０〜１００ ｍｇ／ｍｌの濃度に希釈し、標準的なＥＤＣ−ＮＨＳ化学結合法でＣＭ５チップ（Ｂｉａｃｏｒｅ ＡＢ）に結合し、続いて製造者の指示どおりにエタノールアミン処理を行った。ＭＨＣ−ＩＩの塗布密度は５００〜４０００ ＲＵに調節した。５種の異なる濃度で異なる抗体を注入し、Ｂｉａｃｏｒｅ装置の標準ソフトを用いて親和性を測定した。結合表面の再生は１０ ｍＭグリシン（ｐＨ ２．３）及び７．５ ｍＭ水酸化ナトリウムを用いて行った。
【０１９１】
８． 抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体及び抗体フラグメントの多価死滅活性
細胞死滅に対する価数の効果を示すため、本発明の抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体フラグメントの一価、二価及び多価の組成物を用いて、ＧＲＡＮＴＡ−５１９細胞に対し細胞死滅アッセイを行った。ＨｕＣＡＬライブラリーからの抗ＨＬ１−ＤＲ抗体フラグメントは、抗ＦＬＡＧ−Ｍ２−ｍＡｂとともにインキュベートすることにより架橋して二価の組成物を形成した場合、一価組成物（抗体フラグメント濃度が２００ ｎＭのとき５〜３０％死滅）に比べ、はるかに高い細胞傷害活性（抗体フラグメント濃度が２００ ｎＭのとき６０〜９０％死滅）を示した（図３）。抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体フラグメントを加えることなく、細胞系のみで、または抗ＦＬＡＧ−Ｍ２−ｍＡｂのみの存在下でインキュベートした場合、細胞生存性によって測定されるような細胞毒性は示されなかった。抗ＦＬＡＧ−Ｍ２−ｍＡｂを加えていない、ＩｇＧ４形態（天然では二価）の抗体フラグメントであるＭＳ−ＧＰＣ−８、ＭＳ−ＧＰＣ−８−６−１３、ＭＳ−ＧＰＣ−８−１０−５７及びＭＳ−ＧＰＣ−８−２７−４１を５０ ｎＭで用いる以外は上記のとおり細胞処理を行った場合、４時間のインキュベート後、それぞれ７６％、７８％、７８％及び７３％の死滅効率が示された。
【０１９２】
また、さらに高価数の抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体フラグメントはさらに細胞生存性を大きく減少させることが観察された。ＩｇＧ形態の抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体フラグメントを含むインキュベーション混合液にタンパク質Ｇを加えると、形成された多価の複合体は、二価のＩｇＧ形態のみを有する抗ＨＬ４−ＤＲ抗体フラグメントのインキュベーションで形成した二価の組成物に比べ、さらに細胞生存性を減少させた。
【０１９３】
ＨｕＣＡＬライブラリーから選択した抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体フラグメントの死滅効率をＨＬＡ−ＤＲ陽性腫瘍細胞系ＧＲＡＮＴＡ−５１９（ＤＳＭＺ， Ｇｅｒｍａｎｙ）で試験した。加熱により不活性化した２．５％ ＦＢＳ（Ｂｉｏｗｈｉｔｔａｋｅｒ Ｅｕｒｏｐｅ， ＢＥ）、２ ｍＭ Ｌ−グルタミン、１％非必須アミノ酸、１ ｍＭピルビン酸ナトリウム及び０．１ ｍｇ／ｍｌカナマイシンを添加したＲＰＭＩ１６４０培地（ＰＡＡ， Ｇｅｒｍａｎｙ）中、２００ ｎＭ抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体フラグメントとともに２ ｘ １０５個の細胞を６％ ＣＯ２下３７℃で４時間インキュベートした。１００ ｎＭの二価の架橋抗ＦＬＡＧ−Ｍ２−ｍＡｂを加えて、各抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体フラグメントを、一価の抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体フラグメントまたは二価の組成物としての活性化腫瘍細胞を死滅する能力について試験した。６％ ＣＯ２下３７℃で４時間インキュベートした後、トリパンブルー染色を行い、残った生存細胞数を測定して細胞生存性を測定した（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， １９９７）。
【０１９４】
細菌タンパク質であるタンパク質Ｇの連続希釈物とプレインキュベートして作製したＩｇＧ形態のＭＳ−ＧＰＣ−８−１０−５７及びＭＳ−ＧＰＣ−８−２７−４１の多価形態に対して、ＫＡＲＰＡＳ−４２２細胞を用いて上記の実験を繰り返した。タンパク質Ｇは、ＩｇＧ抗体に対して高い親和性及び２ヶ所の結合部位を有し、効果的にこれらを架橋して総結合価数４を与える。タンパク質Ｇとのプレインキュベートを行わず、ＩｇＧのみを用いた対照では、約５５％の細胞が死滅し、一方タンパク質ＧとプレインキュベートしたＩｇＧを用いた細胞死滅では、ＩｇＧ抗体／タンパク質Ｇの分子比が〜６（２８．５ｋＤのタンパク質Ｇの分子量に基く）のとき最高で約７５％になった。ＩｇＧ抗体／タンパク質Ｇ分子比がこれより高いか低いときは、純粋なＩｇＧ抗体の細胞死滅効率に近づいた。
【０１９５】
９． 抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体フラグメントの死滅効率
ＨＬＡ−ＤＲ分子を発現するその他の腫瘍細胞系に対する抗ＨＬＡ−ＤＲ架橋抗体フラグメントの死滅効率を測定するための実験を実施例８と同様に行った。４時間のインキュベート後ＭＳ−ＧＰＣ−８架橋Ｆａｂ形態により５０％以上の細胞死滅を示す腫瘍細胞系は、ＭＨＨ−ＣＡＬＬ４、ＭＮ ６０、ＢＪＡＢ、ＢＯＮＮＡ−１２であり、それぞれＢ細胞急性リンパ性白血病、Ｂ細胞急性リンパ性白血病、バーキットリンパ腫及びヘアリーセル白血病を表す。抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体フラグメントＭＳ−ＧＰＣ−１、ＭＳ−ＧＰＣ−６及びＭＳ−ＧＰＣ−１０の架橋Ｆａｂ形態を用いると、上記の腫瘍細胞系に対して、架橋抗ＦＬＡＧ−Ｍ２−ｍＡｂを用いて二価物質として形成した場合と同様の細胞傷害性活性を示した。
【０１９６】
実施例８に記載した方法を用いて、Ｐｒｉｅｓｓ細胞に対する各架橋二価抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体フラグメントの最大死滅能を測定した。ＭＳ−ＧＰＣ−１、ＭＳ−ＧＰＣ−６、ＭＳ−ＧＰＣ−８及びＭＳ−ＧＰＣ−１０に見られた最大死滅能は、それぞれ８３％、８８％、８４％及び８８％と測定された。実施例４に従い生成した抗体フラグメントは、上記のように抗ＦＬＡＧ−Ｍ２−ｍＡｂを用いて架橋した場合、ＧＲＡＮＴＡ及びＰｒｉｅｓｓ細胞に対しても同様に向上した死滅能を示した（表４）。
【０１９７】
１０． ヒト組成の抗ＨＬＡ−ＤＲ−ＩｇＧ抗体の死滅効率
対応するマウス抗体（Ｖｉｄｏｖｉｃ ｅｔ ａｌ．， １９９５ｂ； Ｎａｇｙ ＆ Ｖｉｄｏｖｉｃ， １９９６； Ｖｉｄｏｖｉｃ ＆ Ｔｏｒａｌ， １９９８）と比べ、驚くべきことに、本発明の特定のＩｇＧ形態の抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体フラグメントの死滅効率が大きく向上していることがわかった（表５）。５０ ｎＭとした以外は実施例８及び９記載の方法に従い、本発明の特定のＩｇＧ形態の抗体フラグメントの死滅効率の測定を繰り返した（３回から５回の複製実験で、各実験で細胞数を２回測定）。５０ ｎＭだけの最終濃度を適用すると、ＩｇＧの抗体フラグメントＭＳ−ＧＰＣ−８、ＭＳ−ＧＰＣ−８−６−１３、ＭＳ−ＧＰＣ−８−１０−５７及びＭＳ−ＧＰＣ−８−２７−４１は、実施例１１で測定されるように１０蛍光単位より高いレベルでＨＬＡ−ＤＲ抗原を発現する２４個のヒト腫瘍細胞系のパネルのそれぞれ１６、２２、１９及び２０からの細胞の５０％超を死滅させた。２種のマウス抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体Ｌ２４３（Ｖｉｄｏｖｉｃ ｅｔ ａｌ．， １９９５ｂ）及び８Ｄ１（Ｖｉｄｏｖｉｃ ＆ Ｔｏｒａｌ， １９９８）でｍＡｂの最終濃度を有意に高くして（２００ ｎＭ）細胞を処理すると、２４のＨＬＡ−ＤＲ発現細胞系のうち１３及び１２のみでそれぞれ細胞生存性が生存細胞５０％というレベル未満に低下した。ＭＨＨ−ＰＲＥＢ１細胞系は、蛍光単位１０より高いレベルでＨＬＡ−ＤＲ抗原を発現するが、上記の抗体がいずれも有意な細胞生存性の低下を誘発することができないため、除外して２４細胞系のパネルの一つとして考慮しなかった。このことはさらに実施例１２で述べる。
【０１９８】
実際に、濃度を有意に増加させた場合でも、２００ ｎＭで２種のマウス抗体は本発明のＩｇＧ形態の抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体フラグメントに比べ、有意に低い死滅効率を示した。マウス抗体に比べ、本発明のＩｇＧ形態のヒト抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体フラグメントは低濃度で細胞死滅の全体的な増強を示すのみならず、異なる細胞系の間での死滅効率の変動が少なかった。死滅変動係数は、マウス抗体では６２％（平均死滅率％ ＝ ４９ ＋／− ３１％（ＳＤ））を超えるのに比べ、本実施例におけるヒト抗体では３２％（平均死滅率％ ＝ ６８ ＋／− ２２％（ＳＤ））であった。この結果は、ロジスティック回帰モデルをｌｏｇ（平均ＨＬＡ−ＤＲ発現）に対する平均死滅パーセンテージにあてはめた、ＨＬＡ発現による死滅効率の効果についての統計的調整により裏付けられた（図４）。マウス抗体の至適曲線がヒトの場合に比べ常に低いだけでなく、ヒト抗体データの残差における変動（１６％）に比べ、マウス抗体データからの残差にはより大きな変動（ＳＤ＝２８％）が見られた。
【０１９９】
１１． ヒト抗原に対する抗原結合ドメインの活性化細胞対非活性化細胞の死滅選択性
ヒト末梢Ｂ細胞を用いて、ヒト抗ＨＬＡ−ＤＲ−ｍＡｂを介した細胞死滅が細胞活性化に依存することを示した。ヘパリン化静脈血５０ ｍｌをＨＬＡ−ＤＲタイプの健康な供与者から採取し、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．； １９９９）に記載のとおりにＦｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ Ｇｒａｄｉｅｎｔ Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎ （Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ−１０７７； Ｓｉｇｍａ）を用いて新鮮な末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を単離した。Ｂ細胞単離キット及びＭＡＣＳ ＬＳ＋／ＶＳ＋カラム （Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ， Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて、製造者のガイドラインに従い、約５ ｘ １０７個のＰＢＭＣから精製したＢ細胞（末梢血白血球の約５％）を得た。非Ｂ細胞が成功裏に枯渇したことを単離したＢ細胞（ＨＬＡ−ＤＲ陽性及びＣＤ１９陽性）のアリコートのＦＡＣＳ分析により検証した。標準的な手順、例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．； １９９９）に記載のものを用いて、市販の抗体（ＢＤ Ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｍｅｔｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ， Ｓａｎ Ｊｏｓｅ， ＣＡ， ＵＳＡ）で二重染色分析を行った。１０％ ＦＣＳ（Ｂｉｏｗｈｉｔｔａｋｅｒ Ｅｕｒｏｐｅ， ＢＥ）、２ ｍＭ Ｌ−グルタミン、１％非必須アミノ酸、１ ｍＭピルビン酸ナトリウム及び０．１ ｍｇ／ｍｌカナマイシンを添加したＲＰＭＩ−１６４０培地（ＰＡＡ， Ｇｅｒｍａｎｙ）中６％ＣＯ２下３７℃で３日間インキュベートすることにより、２５倍に希釈したＰｏｋｅｗｅｅｄ マイトジェン（ＰＷＭ）（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ， Ｃａｔ． Ｎｏ． １５３６０−０１９）での刺激により細胞が活性化する能力について単離したＢ細胞のアリコートを試験した。活性化の成功は、細胞表面上のＨＬＡ−ＤＲ発現のＦＡＣＳ分析で検証した（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．； １９９９）。
【０２００】
非活性化細胞に対し、１０％の代わりに２．５％の加熱により不活性化したＦＣＳを添加した上記の培地または上記の培地のみにそれぞれ５０ ｎＭずつＩｇＧ形態のＭＳ−ＧＰＣ−８−１０−５７、ＭＳ−ＧＰＣ−８−２７−４１またはマウスＩｇＧ １０Ｆ１２（Ｖｉｄｏｖｉｃ ｅｔ ａｌ．， １９９５ｂ）を加えて上記のように活性化した１ ｘ １０６個／ｍｌのＢ細胞をインキュベートし、活性化細胞または非活性化細胞の死滅選択性を示した。６％ＣＯ２下３７℃での１時間または４時間のインキュベートの後、生存細胞のフルオロセインジアセテート染色（ＦＤＡ）及び死細胞のヨウ化プロピジウム染色（ＰＩ）を行い、蛍光顕微鏡（Ｌｅｉｃａ， Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて標準的手順（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， １９９７）により緑（ＦＤＡ）及び赤（ＰＩ）の蛍光発光細胞数を測定し、細胞生存性を測定した。
【０２０１】
Ｂ細胞の活性化が細胞死滅に必要なことが示された。抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体との１時間のインキュベート後の非活性化細胞においては、培地中の生存細胞の数は、ＭＳ−ＧＰＣ−８−１０−５７（ＩｇＧ）、ＭＳ−ＧＰＣ−８−２７−４１（ＩｇＧ）、１０Ｆ１２及び培地のみの場合について、インキュベート前細胞密度の８１％、１１７％、１２６％及び９６％にそれぞれ対応した。これに対し、インキュベート１時間後の生存活性化Ｂ細胞の数は、ＭＳ−ＧＰＣ−８−１０−５７（ＩｇＧ）、ＭＳ−ＧＰＣ−８−２７−４１（ＩｇＧ）、１０Ｆ１２及び培地のみの場合について、インキュベート前細胞密度の２３％、４２％、８３％及び６６％にそれぞれ対応した。４時間のインキュベート後では、ＭＳ−ＧＰＣ−８−１０−５７（ＩｇＧ）、ＭＳ−ＧＰＣ−８−２７−４１（ＩｇＧ）、１０Ｆ１２及び培地のみの場合について、インキュベート前細胞密度の７８％、８３％、９５％及び９７％が非活性化細胞においては生存可能であり、一方、活性化細胞では、細胞密度がＭＳ−ＧＰＣ−８−１０−５７（ＩｇＧ）、ＭＳ−ＧＰＣ−８−２７−４１（ＩｇＧ）、１０Ｆｌ２及び培地のみの場合について、それぞれインキュベート前細胞密度の２３％、２４％、５３％及び６７％に低下した。
【０２０２】
１２． ＭＨＨ−ＰｒｅＢ１細胞系に対する抗ＨＬＡ抗体フラグメントの死滅活性
表５から明らかなとおり、本発明の架橋抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体フラグメントまたはＩｇＧが、ＨＬＡ−ＤＲを発現する特定の腫瘍細胞系を有意なレベルで容易に死滅させないことがわかった。安定した細胞系として確立しているものの、この培養における細胞が充分に活性化されなかったためという仮説を立てた。そこで、ＨＬＡ−ＤＲ分子の細胞表面上における発現の増加を活性化の指標として、以下のとおりＭＨＨ−ＰｒｅＢ１細胞系の活性を刺激するための実験を行うことにした。
【０２０３】
非付着性増殖ＭＨＨ−ＰｒｅＢ１細胞を、１０％ ＦＣＳ、２ ｍＭ Ｌ−グルタミン、１％非必須アミノ酸、１ ｍＭピルビン酸ナトリウム及び１ｘカナマイシン（すべてＧｉｂｃｏ ＢＲＬ及びＢｉｏ Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ） を含むＲＰＭＩ培地で培養した。アリコートを、リポ多糖類（ＬＰＳ、１０ μｇ／ｍｌ）、ガンマインターフェロン（ＩＦＮ−γ、Ｒｏｃｈｅ、４０ ｎｇ／ｍｌ）及びフィトヘマグルチニン（ＰＨＡ、５ μｇ／ｍｌ）と１日インキュベートして活性化し、ＨＬＡ−ＤＲ分子の発現を増加させた。ＨＬＡ−ＤＲ分子の細胞表面上の発現を、ＦＩＴＣ標識ｍＡｂ Ｌ２４３（ＢＤ Ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｍｅｔｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ， Ｓａｎ Ｊｏｓｅ， ＣＡ， ＵＳＡ）を使ったフローサイトメトリーでモニターした。ＬＰＳ、ＩＦＮ−γ及びＰＨＡ存在下においてＭＨＨ−ＰｒｅＢ１を１日インキュベートすることにより、ＨＬＡ−ＤＲ表面密度が２倍に増加した（平均蛍光強度が１９０から３９０に変化した）。細胞死滅は、濃度を低くした（２．５％）ＦＣＳを含む上記の培地中で４時間行った。非活性化及び活性化細胞の各アリコートで最終抗体濃度３３００、５５０、９２、１５、２．５、０．４２及び０．０７ ｎＭを含むＩｇＧ形態のＭＳ−ＧＰＣ−８−２７−４１及びＭＳ−ＧＰＣ−８−１０−５７の濃度系列を採用した。生存細胞は、トリパンブルーの排除により顕微鏡で同定した。非活性化細胞の生存性は採用した最高抗体濃度まで抗体の影響を受けなかったのに対し、活性化ＭＨＨ−ＰｒｏＢ１細胞では、細胞生存性が抗体濃度の増加とともに著しく減少した（図５）。
【０２０４】
１３． ｅｘ ｖｉｖｏ慢性リンパ性白血病細胞に対するヒト組成の抗ＨＬＡ−ＤＲ ＩｇＧ抗体の死滅効率
慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）患者１０名から単離され、精製されたＢ細胞を用いて、本発明のＩｇＧ形態の抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体フラグメントが、臨床的に関連する細胞を死滅する効能を示すことをｅｘ ｖｉｖｏアッセイで示した。標準的な手順（Ｂｕｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．， １９９９）に従い、１０名の関連のないＣＬＬ患者からＢ細胞を単離し、精製した（試料はＰｒｏｆ Ｈａｌｌｅｋ， Ｌｕｄｗｉｇ Ｍａｘｉｍｉｌｌｉａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｍｕｎｉｃｈの好意により分譲された）。２ ｘ １０５個の細胞をＩｇＧ形態の抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体フラグメントＭＳ−ＧＰＣ−８、ＭＳ−ＧＰＣ−８−１０−５７またはＭＳ−ＧＰＣ−８−２７−４１の１００ ｎＭで処理し、実施例８及び９と同様に４時間または２４時間インキュベートした。抗体で処理する前にＣＤ４０リガンドを表面上に発現するＨｅＬａ細胞を加えて３日間インキュベートして細胞培養の一連の複製を作成し、活性化した（Ｂｕｈｍａｎｎ ａｔ ａｌ．， １９９９）。対照としては、マウスＩｇＧ １０Ｆ１２（Ｖｉｄｏｖｉｃ ｅｔ ａｌ．， １９９５ｂ）を用いるか、全く抗体を用いなかった。各実験について細胞生存性を実施例１２に記載のように測定した。
【０２０５】
驚くべきことに、このような多様な患者試料を通じても、本発明のＩｇＧ形態の抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体フラグメントは、非常に効率的で均一な死滅を示した。わずか４時間のみの処理で、３つすべてのヒトＩｇＧ抗体で細胞生存性が対照に比べ有意に減少した。２４時間後では、細胞の３３％のみが生存性を維持した（図６）。Ｂｕｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ． （１９９９）に従い、さらに前記ｅｘ ｖｉｖｏ細胞を刺激すると、ヒト抗体を加えてわずか４時間培養した後でも死滅速度が増加し、すべての患者試料及び本発明の抗体フラグメントに対して平均してわずか２４％の細胞のみが生存していることがわかった。
【０２０６】
１４． 抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体フラグメントのＥＣ５０の測定
ＨｕＣＡＬライブラリーから選択した抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体フラグメントの特定の形態の、細胞傷害性マウス抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体に比べて、より高い５０％有効濃度（ＥＣ５０）値が細胞死滅アッセイにおいて示された（表６）。
【０２０７】
ＨｕＣＡＬライブラリーから選択した抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体フラグメントのＥＣ５０値を、ＨＬＡ−ＤＲ陽性細胞系ＰｒｉｅｓｓまたはＬＧ２（ＥＣＡＣＣ， Ｓａｌｉｓｂｕｒｙ， ＵＫ）を用いて推定した。加熱により不活性化した２．５％ ＦＢＳ（Ｂｉｏｗｈｉｔｔａｋｅｒ Ｅｕｒｏｐｅ， ＢＥ）、２ ｍＭ Ｌ−グルタミン、１％非必須アミノ酸、１ ｍＭピルビン酸ナトリウム及び０．１ ｍｇ／ｍｌカナマイシンを添加したＲＰＭＩ−１６４０培地（ＰＡＡ， Ｇｅｒｍａｎｙ）中に、二価の抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体フラグメントの連続希釈物とともに２ ｘ １０５個の細胞を６％ＣＯ２下３７℃で４時間インキュベートした。Ｆａｂ抗体フラグメントの連続希釈物として、適切な濃度のＦａｂフラグメント及び抗ＦＬＡＧ−Ｍ２抗体を予備混合して抗ＨＬ４−ＤＲ抗体フラグメントの二価組成物を生成した。ここに挙げられた濃度は、ＩｇＧ及びＦａｂのＥＣ５０値が比較できるように二価組成物としての濃度を示す。
【０２０８】
二価抗体フラグメントとの６％ＣＯ２下３７℃で４時間インキュベートの後、フルオロセインジアセテート染色を行い、残った生存細胞数を測定することにより（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， １９９７）、細胞生存性を測定した。標準的な統計ソフトを用いて、非線形ロジスティック回帰曲線を複製データポイント及び各抗体フラグメントの推定ＥＣ５０値に当てはめた。
【０２０９】
抗ＦＬＡＧ−Ｍ２抗体を用いて架橋した場合、ＨｕＣＡＬライブラリーから選択したＦａｂフラグメントであるＭＳ−ＧＰＣ−１、ＭＳ−ＧＰＣ−８及びＭＳ−ＧＰＣ−１０（実施例４）は、一価フラグメントの濃度として表して１２０ ｎＭ未満のＥＣ５０値を示し、これは抗ＦＬＡＧ Ｍ２標識した二価の架橋（Ｆａｂ）ダイマーでは、６０ ｎＭのＥＣ５０値に相当する（図７ａ）。抗ＦＬＡＧ Ｍ２抗体を用いて架橋した場合、ＣＤＲ３領域内での親和性について最適化した抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体フラグメント（実施例４）は、５０ ｎＭ未満のさらに向上したＥＣ５０値、すなわち二価の架橋フラグメントでは２５ ｎＭを示し（図７ｂ）、ＣＤＲ１領域内の親和性についてさらに最適化したものは３０ ｎＭ（二価フラグメントでは１５ ｎＭ）未満のＥＣ５０値を示した。これに対し、細胞傷害性マウス抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体８Ｄ１（Ｖｉｄｏｖｉｃ ＆ Ｔｏｒａｌ， １９９８）及びＬ２４３（Ｖｉｄｏｖｉｃ ｅｔ ａｌ， １９９５ｂ）は、同じアッセイ中でそれぞれ３０ ｎＭ及び４０ ｎＭを超えるＥＣ５０値を示した（図７ｃ）。
【０２１０】
驚くべきことに、マウス抗体に比べ、本発明のＩｇＧ形態の特定の抗体フラグメントは、約１．５のオーダーの大きさでＥＣ５０値が向上した（図７ｄ）。例えば、ＩｇＧ形態のＭＳ−ＧＰＣ−８−１０−５７及びＭＳ−ＧＰＣ−８−２７−４１は、それぞれ１．２ ｎＭ及び１．２ ｎＭのＥＣ５０を示した。さらに、親和性についての最適化を行っていないにもかかわらず、ＩｇＧ形態のＭＳ−ＧＰＣ−８は１０ ｎＭ未満のＥＣ５０値を示した。
【０２１１】
実施例１１及び１２に示したとおり、非活性化細胞（それぞれ正常末梢Ｂ細胞及びＭＨＨ−ＰｒｅＢ細胞）の死滅効率は非常に低かった。５０ ｎＭのＩｇＧ形態のＭＳ−ＧＰＣ−８−１０−５７及びＭＳ−ＧＰＣ−８−２７−４１で処理後、正常末梢Ｂ細胞のそれぞれ７８％及び８３％が４時間後も生存していた。さらに、いずれかのＩｇＧ抗体の濃度が５０ ｎＭであるときのみ、実質的に１００％の生存性がＭＨＨ−ＰｒｅＢ１細胞に見られた。実際、５０％未満への細胞生存性レベルの低下は、適度な濃度範囲（０．１〜３００ ｎＭ）のＩｇＧまたは二価の架橋Ｆａｂ形態の本発明の抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体フラグメントを用いた場合、これらの非活性化細胞では達成できなかった。従って、非活性化細胞型のＥＣ５０値は、非最適化Ｆａｂ形態の値（架橋二価フラグメントでは約６０ ｎＭのＥＣ５０値）よりも少なくとも５倍高いことが推定され、ＶＨＣＤＲ３最適化ＦａｂのＥＧ５０値（架橋二価フラグメントでは約２５ ｎＭ）並びにＩｇＧ形態のＭＳ−ＧＰＣ−８−１０−５７（約１．２ ｎＭ）及びＭＳ−ＧＰＣ−８−２７−４１（約１．２ ｎＭ）よりも少なくともそれぞれ１０倍及び１００倍高いことが推定される。
【０２１２】
１５． 細胞死滅のメカニズム
上記の実施例では、活性化細胞を死滅させるためには特定の多価抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体フラグメントのみを必要として細胞死が起きることが示された。細胞死を引き起こすには、細胞傷害性物質または免疫学的メカニズムをこの他に必要としないため、細胞死は、活性化細胞の生得的な予めプログラムされたメカニズムを介して起きることが示された。アポトーシスのメカニズムは、予めプログラムされた細胞死のプロセスとして広く理解されている。本発明のヒト抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体フラグメントに曝露された活性化細胞の死滅メカニズムが、当業者の間で「アポトーシス」として理解されているものとは異なっているということを示唆する、特定の細胞死滅特性が観察されたということは驚くべきことである。例えば、観察した細胞死滅速度は、免疫細胞のアポトーシスに関して報告されている速度（約１０〜１５時間； Ｔｒｕｍａｎ ｅｔ ａｌ．， １９９４）より有意に高いようであった。非アポトーシス性メカニズムにより細胞死滅メカニズムが進行したことを示すために２つの実験を行った。
【０２１３】
まず、アネキシン−Ｖ−ＦＩＴＣ及びヨウ化プロピジウム（ＰＩ）染色法を使用して細胞死をアポトーシス性または非アポトーシス性に区別した。すなわちアポトーシスを起こしている細胞、「アポトーシス性細胞」（アネキシン−Ｖ陽性／ＰＩ陰性）は、壊死性（「死亡」）（アネキシン−Ｖ陽性／ＰＩ陽性）及び完全に機能する細胞（アネキシン−Ｖ陰性／ＰＩ陰性）から区別できる。アネキシン−Ｖ及びＰＩアッセイの製造者により推奨される手順を用いて、２００ ｎＭ抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体フラグメントＭＳ−ＧＰＣ−８を加えるかまたは加えないで、加熱により不活性化した２．５％ＦＣＳ（Ｂｉｏｗｈｉｔｔａｋｅｒ Ｅｕｒｏｐｅ， ＢＥ）、２ ｍＭ Ｌ−グルタミン、１％非必須アミノ酸、１ ｍＭピルビン酸ナトリウム及び０．１ ｍｇ／ｍｌカナマイシンを添加したＲＰＭＩ−１６４０培地（ＰＡＡ， ＤＥ）中で１００ ｎＭの架橋抗ＦＬＡＧ−Ｍ２−ｍＡｂとともに１ ｘ １０６個／ｍｌのＰｒｉｅｓｓ細胞を６％ＣＯ２下３７℃でインキュベートした。アポトーシス性細胞培養を対照として得るため、上記の培地中に１０ μｇ／ｍｌのタンパク質Ｇで架橋した５０ μｇ／ｍｌのアポトーシス誘導抗ＣＤ９５−ｍＡｂ−ＤＸ２（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ， Ｔｏｒｒｅｙ Ｐｉｎｅ， ＣＡ， ＵＳＡ）とともに１ ｘ １０６個／ｍｌのＰｒｉｅｓｓ細胞を６％ＣＯ２下３７℃でインキュベートして、アポトーシスを誘導した。様々なインキュベート時間で（１分間、１５分間、６０分間、３時間、５時間）、２００μｌの試料を採取し、２回洗浄し、製造者のプロトコルに従い、アネキシン−Ｖ結合バッファーを用いてアネキシン−Ｖ−ＦＩＴＣ（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ， Ｔｏｒｒｅｙ Ｐｉｎｅ， ＣＡ， ＵＳＡ）及びＰＩで染色した。細胞の各群のアネキシン−Ｖ−ＦＩＴＣ及びＰＩ染色量を、ＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒ（ＢＤ Ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｍｅｔｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ， Ｓａｎ Ｊｏｓｅ， ＣＡ， ＵＳＡ）を用いて分析した。
【０２１４】
架橋抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体フラグメントによって誘導された細胞死は、抗ＣＤ９５アポトーシス誘導抗体または抗ＦＬＡＧ−Ｍ２−ｍＡｂのみとインキュベートした細胞培養のパターンとは有意に異なる細胞死のパターンを示す。抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体フラグメント／抗ＦＬＡＧ−Ｍ２−ｍＡｂ処理細胞の死細胞のパーセンテージ（アネキシン−Ｖ陽性／ＰＩ陽性染色によって測定した）は、抗ＣＤ９５抗体または対照細胞よりもはるかに早く増加した（図８ａ）。これに対し、架橋抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体フラグメントまたは対照細胞に比べ、抗ＣＤ９５抗体処理細胞のアポトーシス性細胞のパーセンテージ（アネキシン−Ｖ陽性／ＰＩ陰性染色により測定）は、より早く増加した（図８ｂ）。
【０２１５】
次に、不可逆性カスパーゼ３阻害剤であるｚＤＥＶＤ−ｆｍｋ及び広域スペクトルカスパーゼ阻害剤であるｚＶＡＤ−ｆｍｋ（ともにＢｉｏＲａｄ， Ｍｕｎｉｃｈ， ＤＥ）を用いて、カスパーゼ活性を阻害した。アポトーシスのメカニズムは、カスパーゼ活性によって特徴付けられ、抗ＨＬＡ−ＤＲ媒介による細胞死にカスパーゼが不必要であるなら、これらのカスパーゼ阻害剤がない場合と比較して、阻害剤の存在下で細胞死を起こす細胞の生存性に変化がないという仮説を立てた。加熱により不活性化された２．５％ ＦＣＳ（Ｂｉｏｗｈｉｔｔａｋｅｒ Ｅｕｒｏｐｅ， ＢＥ）、２ ｍＭ Ｌ−グルタミン、１％非必須アミノ酸、１ ｍＭピルビン酸ナトリウム及び０．１ ｍｇ／ｍｌカナマイシンを添加したＲＰＭＩ−１６４０培地（ＰＡＡ， ＤＥ）中に１８０μＭから１０ ｍＭの範囲の２種のカスパーゼ阻害剤の連続希釈物とともに２ ｘ １０５個のＰｒｉｅｓｓ細胞を６％ＣＯ２下３７℃で３時間プレインキュベートした。２００ ｎＭのヒト抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体フラグメントＭＳ−ＧＰＣ−８及び１００ ｎＭの架橋抗Ｍ２−ｍＡｂを加えることによりＨＬＡ−ＤＲ媒介による細胞死を誘導した。抗ＣＤ９５抗体誘導アポトーシス性細胞培養を阻害剤活性の対照とした（Ｄｒｅｎｏｕ ｅｔ ａｌ．， １９９９）。さらに６％ ＣＯ２下３７℃で４時間及び２４時間インキュベートした後、トリパンブルー染色を行い、非染色細胞数を計数することにより細胞生存性を測定した。予測したとおり、抗ＨＬＡ−ＤＲ処理細胞培養の細胞生存性は、カスパーゼ阻害剤の存在により有意に変化せず、一方、抗ＣＤ９５抗体処理によって誘導した細胞死は、カスパーゼ阻害剤を加えてプレインキュベートした細胞培養で有意に減少した。この結果は、ＨＬＡ−ＤＲ媒介による細胞死が、ｚＤＥＶＤ−ｆｍまたはｚＶＡＤ−ｆｍｋで阻害することができるカスパーゼタンパク質分解酵素とは独立した非アポトーシス性メカニズムに由来するという我々の仮説を支持している。
【０２１６】
１６． ＨＬＡ−ＤＲ特異抗体を用いたｉｎ ｖｉｖｏ癌療法
ここでは、ヒト組成の抗原結合ドメインを癌治療のための治療薬として好適に用いることができることを示す。ＳＣＩＤ、ヌードまたはＲａｇ−１ノックアウトなどの免疫無防備状態のマウスに対象のＤＲ＋ヒトリンパ腫または白血病細胞系を接種する。腫瘍細胞の接種量は通常１匹につき１ ｘ １０６から１ ｘ １０７個で、試験対象腫瘍ごとに決定し、皮下注射（ｓ．ｃ．）または静脈注射（ｉ．ｖ．）で投与する。マウスは、上記のように作製した本発明のＩｇＧ形態のＭＳ−ＧＰＣ−８、ＭＳ−ＧＰＣ−８−１０−５７、ＭＳ−ＧＰＣ−８−２７−４１またはその他の抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体フラグメントでｉ．ｖ．または ｓ．ｃで５日間にわたり１〜２５ ｍｇ／ｋｇの用量で治療した。抗ＨＬＡ−ＤＲ治療マウス及び対照未治療マウスの生存を治療終了後８週間までモニターした。ｓ．ｃ．接種マウスにおける腫瘍の進行を、腫瘍表面積を測定することによってさらに定量した。８０％までの抗ＨＬＡ−ＤＲ治療マウスに有意な生存延長が実験中に見られ、実験終了時に５０％までのマウス生存が見られた。ｓ．ｃ．接種かつ未治療マウスでは、腫瘍の表面積が２〜３ｃｍ２に達していたが、抗ＨＬＡ−ＤＲ治療した動物の腫瘍表面積は有意に小さかった。
【０２１７】
１７． ＩＬ−２分泌減少により測定した抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体フラグメントの免疫抑制
不死化Ｔ細胞からのＩＬ−２分泌を測定するアッセイで本発明の特定の抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体フラグメントが実質的な免疫調節性を示すことが見られたのは驚きであった。このアッセイでＩｇＧ形態の抗体フラグメントであるＭＳ−ＧＰＣ−８−６−１３、ＭＳ−ＧＰＣ−８−１０−５７及びＭＳ−ＧＰＣ−８−２７−４１はナノモル未満のレベルのＩＣ５０値と実質的に１００％の最大阻害率で非常に強い免疫抑制性を示した（図９ａ）。特に驚くべきことは、本発明の抗体フラグメントの特定の一価組成物が同じアッセイで、ＩＬ−２分泌を強く阻害できることが見られたことであった。例えば、Ｆａｂ形態のＶＨＣＤＲ３選択抗体フラグメント及びＶＬＣＤＲ３／ＶＬＣＤＲ１最適化抗体フラグメントは、低い一桁のナノモルレベルのＩＣ５０値及びほぼ１００％の最大阻害率を示した（図９ｂ）。対照のＩｇＧ抗体及びＦａｂフラグメントと比較して、本発明の他の一価抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体フラグメントは、該アッセイで有意な免疫抑制性を示した（表７）。
【０２１８】
抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体フラグメントの免疫調節性を、半最大量の抗原刺激の条件でＤＲトランスジェニック抗原提示細胞（ＡＰＣ）によって刺激したハイブリドーマ細胞系Ｔ−Ｈｙｂ １からのＩＬ−２分泌を測定することにより検討した。ＯｐｔｉＥＩＡマウスＩＬ−２キット（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ， Ｔｏｒｒｅｙ Ｐｉｎｅ， ＣＡ， ＵＳＡ）による標準的ＥＬＩＳＡ法によってＩＬ−２分泌を検出し測定した。ＡＰＣは、標準的手順に従って非免疫化キメラ０４０１−ＩＥトランスジェニックマウスの脾臓から単離した（Ｉｔｏ ｅｔ ａｔ．， １９９６）。１．５ ｘ １０５個のＡＰＣを、１０％ ＦＣＳ、２ ｍＭ Ｌ−グルタミン、１％非必須アミノ酸、１ ｍＭピルビン酸ナトリウム及び０．１ ｇ／ｌカナマイシン（すべてＧｉｂｃｏ ＢＲＬ及びＰＡＡ）を含むＲＰＭＩ培地に、９６穴プレートの０．２ ｍｌウェル中で加えた。鶏卵のオボアルブミンを最終濃度２００ μｇ／ｍｌで加え、上記の培地を最終容量１００μｌとし、細胞をこの抗原と６％ ＣＯ２下３７℃で３０分間インキュベートした。抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体フラグメントをさまざまな濃度（一般的には０．１〜２００ ｎＭの範囲）で各ウェルに加え、プレートを６％ ＣＯ２下３７℃で１時間インキュベートし、上記培地に２ ｘ １０５個のＴ−Ｈｙｂ−１細胞を加え、最終容量２００μｌとした。２４時間のインキュベート後、上清１００μｌをＩＬ−２ Ｃａｐｔｕｒｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙ （ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ， Ｔｏｒｒｅｙ Ｐｉｎｅ， ＣＡ， ＵＳＡ）を予め塗布したＥＬＩＳＡプレート（Ｎｕｎｃ−Ｉｍｍｕｎｏ Ｐｌａｔｅ ＭａｘｉＳｏｒｐ ｓｕｒｆａｃｅ， Ｎｕｎｃ， Ｒｏｓｋｉｌｄｅ， ＵＫ）に移し、ＯｐｔｉＥＩＡ Ｍｏｕｓｅ ＩＬ−２キットを用いて製造者の指示に従いＩＬ−２量を定量し、Ｖｉｃｔｏｒ Ｖリーダー（Ｗａｌｌａｃ， Ｆｉｎｌａｎｄ）を用いてプレートを読んだ。分泌されたＩＬ−２（ｐｇ／ｍｌ）をキットに含まれるＩＬ−２標準を用いて較正した。
【０２１９】
Ｔ細胞ハイブリドーマ系Ｔ−Ｈｙｂ１を、胸腺腫系ＢＷ−５１４７（ＡＴＣＣ）のＴ細胞レセプター陰性変異株及び鶏卵のオボアルブミンで予め免疫化したキメラ０４０１−ＩＥトランスジェニックマウスからのリンパ節細胞の融合により確立した（Ｉｔｏ ｅｔ ａｌ．， １９９６）。クローンＴ−Ｈｙｂ１が抗原特異刺激に反応してＩＬ−２を多く分泌したため、これをアッセイのために選択した。
【０２２０】
１８． Ｔ細胞増殖により測定したＨＬＡ−ＤＲ特異抗体を用いた免疫抑制
抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体フラグメントの免疫調節性がＴ細胞増殖を測定するアッセイにおいても見られた。ＩｇＧ形態のＭＳ−ＧＰＣ−８−１０−５７及びＭＳ−ＧＰＣ−８−２７−４１のＴ細胞増殖阻害のＩＣ５０値は、それぞれ１１ ｎＭ及び２０ ｎＭであった（図１０）。抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体フラグメントを、以下のとおり試験し、ＲＡ関連ペプチド結合部位とのキメラマウス−ヒトクラスＩＩトランスジーンをもつマウスの抗原感作リンパ節細胞に対する増殖Ｔ細胞の反応を阻害し、マウスクラスＩＩ分子を欠損させた（Ｍｕｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９９０； Ｗｏｏｄｓ ｅｔ ａｌ．， １９９４； Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌ． ２， ７．２１； Ｉｔｏ ｅｔ ａｌ．， １９９６）。ここでは、免疫化はｉｎ ｖｉｖｏで行われているが、阻害及び読み出しはｅｘ ｖｉｖｏである。ＲＡ関連分子の結合部位を有するＭＨＣ クラスＩＩ分子ＤＲＢ＊０４０１を発現するトランスジェニックマウスは市販のものを入手した。これらのマウスは、マウスＭＨＣクラスＩＩを欠損し、従ってすべてのＴｈ反応は単一のヒトＲＡ関連ＭＨＣクラスＩＩ分子を介している（Ｉｔｏ ｅｔ ａｌ．， １９９６）。これらのトランスジェニックマウスは、ヒトクラスＩＩアンタゴニストを試験するためのモデルとなる。
【０２２１】
鶏卵のオボアルブミンによって予め免疫したキメラ０４０１−ＩＥトランスジェニックマウス（Ｔａｃｏｎｉｃ， ＵＳＡ）のリンパ節から単離したキメラＴ細胞及び抗原提示細胞を用いて測定したＴ細胞増殖について、抗ＨＬＱ−ＤＲ抗体フラグメント及びそのＩｇＧ形態の阻害効果を標準的手順に従って試験した（Ｉｔｏ ｅｔ ａｔ．， １９９６）。１．５ ｘ １０５個の細胞を、オボアルブミン（ウェルにつき３０ μｇ、半最大刺激濃度）及び試験対象の抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体フラグメントまたはＩｇＧ形態の連続希釈物（０．１ ｎＭ〜２００ ｎＭ）の存在下、９６−穴組織培養プレートの０．２ ｍｌのウェルで、２ ｍＭ Ｌ−グルタミン及び０．１ｇ／ｌカナマイシンを含む無血清ＨＬ−１培地を加えて３日間インキュベートした。培養の最後の１６時間の間に３Ｈ−メチルチミジン（１μＣｉ／ウェル）の取り込みにより抗原特異的な増殖を測定する（Ｆａｌｃｉｏｎｉ ｅｔ ａｌ．， １９９９）。細胞を回収し、シンチレーションカウンターを用いて３Ｈの取り込みを測定する（ＴｏｐＣｏｕｎｔ， Ｗａｌｌａｃ， Ｆｉｎｌａｎｄ）。抗ＨＬＩ ＤＲ抗体フラグメント及びＩｇＧ形態での処理におけるＴ細胞増殖の阻害は、抗原を含む対照ウェルとの比較により観察してもよい。
【０２２２】
１９． 癌治療に有用なポリペプチドの選択
最も適切なタンパク質／ペプチドを選択してさらに実験を行い、癌治療のための治療用組成物への使用の適性を試験するために、さらにデータを収集する。各ＩｇＧ形態の抗ＨＬＡ抗原抗体フラグメントのこのようなデータとしては、結合親和性、複数の腫瘍細胞系のパネルについてのＥＣ５０値で測定されるｉｎ ｖｉｔｒｏ死滅効率及び細胞傷害性、ｉｎ ｖｉｔｒｏで推定される最大細胞死滅率、並びにｉｎ ｖｉｖｏ動物モデルから得られる腫瘍減少データ及びマウス生存データが挙げられる。
【０２２３】
最も高い親和性、最も低い死滅ＥＣ５０値、最も高い最大細胞死滅率及び各腫瘍細胞系について最も広く、最良の腫瘍減少データ及び／または最良のマウス生存データを示したＩｇＧ形態の抗ＨＬＡ抗原抗体フラグメントを選択してさらに実験することができる。このような実験としては、例えば、動物における治療プロファイリング及び毒性学並びにヒトにおけるフェーズＩ臨床試験を挙げることができる。
【０２２４】
２０． 免疫系疾患の治療に有用なポリペプチドの選択
最も適切なタンパク質／ペプチドを選択してさらに実験を行い、免疫系疾患治療のための治療用組成物への使用の適性を試験するために、さらにデータを収集する。一価抗体フラグメントまたはＩｇＧ形態の抗ＨＬＡ抗原抗体フラグメントに関するこのようなデータには、親和性、反応性、特異性、ＩＬ−２分泌及びＴ細胞増殖の阻害についてのＩＣ５０値、またはＥＣ５０値で測定されるｉｎ ｖｉｔｒｏ死滅効率及びｉｎ ｖｉｔｒｏ及び移植拒絶及び移植片対宿主病のＤＲトランスジェニックモデルで推定される最大細胞死滅率が挙げられる。
【０２２５】
最も低いＥＣ５０値、最も高い親和性、最も高い死滅、最良の特異性及び／またはＴ細胞増殖もしくはＩＬ−２分泌の最大阻害、並びに適切なモデルにおける移植拒絶及び／または移植片対宿主病の阻害に高い効能を示す、抗体フラグメントまたはＩｇＧ形態の抗ＨＬＡ抗原抗体フラグメントを選択してさらに実験することができる。このような実験としては、例えば、動物における治療プロファイリング及び毒性学並びにヒトにおけるフェーズＩ臨床試験を挙げることができる。
【０２２６】
【表１】
2004515214.tif 000002
2004515214.tif 000003
【０２２７】
【表２】
2004515214.tif 000004
2004515214.tif 000005
【０２２８】
【表３】
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2004515214.tif 000007
【０２２９】
【表４】
2004515214.tif 000008
【０２３０】
【表５】
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2004515214.tif 000010
【０２３１】
【表６】
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【０２３２】
【表７】
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【０２３３】
参考文献
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2004515214.tif 000014
2004515214.tif 000015
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【図面の簡単な説明】
【図１】
ａ． 抗ＨＩＡ−ＤＲ抗体フラグメントの特異性： ＭＳ−ＧＰＣ−８−２７−７、ＭＳ−ＧＰＣ−８−２７−１０、ＭＳ−ＧＰＣ−８−６−１３、ＭＳ−ＧＰＣ−８−２７−４１、ＭＳ−ＧＰＣ−８−６−４７、ＭＳ−ＧＰＣ−８−１０−５７、Ｍ５−ＧＰＣ−８−６−２７、ＭＳ−ＧＰＣ−８及びＭＳ−ＧＰＣ−８−６の、ＨＬＡ−ＤＲタンパク質、陰性対照タンパク質（ＢＳＡ、テストステロン−ＢＳＡ、リゾチーム及びヒトアポトランスフェリン）、及び空のマイクロタイタープレートウェル（プラスチック）への結合。特異性は標準的なＥＬＩＳＡ法を使用して評価した。
ｂ． ＨｕＣＡＬライブラリーから単離された抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体フラグメントＭＳ−ＧＰＣ−１、６、８及び１０の、ＨＬＡ−ＤＲタンパク質、マウス−ヒトキメラＨＬＡタンパク質及び陰性対照タンパク質（リゾチーム、トランスフェリン、ＢＳＡ及びヒトβ−グロブリン）に対する特異性。特異性は標準的なＥＬＩＳＡ法を使用して評価した。関係のない抗体フラグメント（ｉｒｒ．ｓｃＦｖ）を対照として使用した。
【図２】
抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体フラグメント（ＭＳ−ＧＰＣ−１、６、８及び１０）、ならびにＭＳ−ＧＰＣ−８、ＭＳ−ＧＰＣ−８−１０−５７、ＭＳ−ＧＰＣ−８−２７−４１及びＭＳ−ＧＰＣ−８−６−１７のＩｇＧ形態の、ＭＨＣクラスＩＩ分子を発現する種々の細胞系に対する反応性。標準的な免疫蛍光法を使用して検出された抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体フラグメントまたはＩｇＧと特定の細胞系との間の反応性に関し、「＋」は強い反応性を表し、「＋／−」は弱い反応性を表し、「−」は反応性が検出されなかったことを示す。
【図３】
トリパンブルー染色により評価された、１価または架橋抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体フラグメントの存在下での癌細胞の生存性。ＧＲＡＮＴＡ−５１９細胞の生存性は、架橋剤としての抗ＦＬＡＧ Ｍ２ ｍＡｂの存在下または非存在下で抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体フラグメント（ＭＳ−ＧＰＣ−１、６、８及び１０）と４時間インキュベートした後に評価した。
【図４】
マウス抗体の２００ ｎＭ溶液による処理と比較して改善された、ＩｇＧ形態の本発明のヒト抗体フラグメントの５０ ｎＭ溶液処理の死滅効率を示す表５のデータの散布図及び至適ロジスティック曲線。白丸はマウス抗体Ｌ２４３及び８Ｄ１で処理された細胞系のデータを表し、黒丸はヒト抗体ＭＳ−ＧＰＣ−８、Ｍ５−ＧＰＣ−８−２７−４１、ＭＳ−ＧＰＣ−８−１０−５７及びＭＳ−ＧＰＣ−８−６−１３で処理された細胞系のデータを表す。ヒト（実線）及びマウス（破線）ｍＡｂ細胞死滅データの至適ロジスティック曲線は、マウスｍＡｂでは２００ ｎＭの最終濃度で処理されたにもかかわらず、それに対して５０ ｎＭでのヒトｍＡｂによる処理が全体的に優れていることを示している。
【図５】
活性化及び非活性化細胞の死滅。ＭＨＨ−ＰＲＥＢ−ｌ細胞は、リポ多糖、インターフェロン−γ及びフィトヘマグルチニンで活性化し、その後抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体フラグメントＭＳ−ＧＰＣ−８−１０−５７及びＭＳ−ＧＰＣ−８−２７−４１のＩｇＧ形態の０．０７〜３３００ ｎＭとともに４時間インキュベートした。対照の非活性化ＭＨＨ−ＰＲＥＢ−ｌ細胞においては生存性は失われていない。
【図６】
患者から単離したＣＬＬ細胞に対する、対照（抗体なし、非反応性マウスＩｇＧ：ライトグレー）、及び抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体フラグメントのヒト（ＭＳ−ＧＰＣ−８、ＭＳ−ＧＰＣ−８−１０−５７及びＭＳ−ＧＰＣ−８−２７−４１：ダークグレー）のＩｇＧ形態の死滅効率。左図は、４時間（ｈ４）及び２４時間（ｈ２４）のインキュベート後の抗体に対する、１０人の患者から得た休止期細胞培養物からの生存性データのボックスプロットを示す。右図は、４時間（ｈ４）及び２４時間（ｈ２４）のインキュベート後の抗体に対する、６人の患者から得た活性化細胞培養物からの生存性データのボックスプロットを示す。
【図７】
本発明の特定の抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体フラグメントについての濃度依存的な細胞生存性。縦軸は、抗体フラグメントのそれぞれについて得られたレプリカデータについてのロジスティック非線形回帰により算定されたＥＣ５０値を示す。
ａ）架橋二価抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体Ｆ（ａｂ）フラグメントダイマーＭＳ−ＧＰＣ１０ （○、実線）、ＭＳ−ＧＰＣ−８（△、破線）、及びＭＳ−ＧＰＣ−１（＋、点線）の死滅曲線。
ｂ） 架橋二価抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体Ｆ（ａｂ）フラグメントダイマーＭＳ−ＧＰＣ−８−１７（○、実線）、マウスＩｇＧ ８Ｄ１（△、破線）、及びＬ２４３（＋、点線）の死滅曲線。
ｃ）架橋二価抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体Ｆ（ａｂ）フラグメントダイマーＧＰＣ−８−６−２（△、破線）、マウスＩｇＧ ８Ｄ１（○、実線）、及びＬ２４３（＋、点線）の死滅曲線。
ｄ）ヒト抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体フラグメントＭＳ−ＧＰＣ−８−１０−５７（＋、点線）、ＭＳ−ＧＰＣ−８−２７−４１（×、一点鎖線）、マウスＩｇＧ ８Ｄ１（○、実線）、及びＬ２４３（△、破線）の死滅曲線。濃度はすべて二価の物質（ＩｇＧまたは架橋Ｆ（ａｂ）ダイマー）のｎＭで表す。
【図８】
ａ． Ｐｒｉｅｓｓ細胞を、抗ＦＬＡＧ Ｍ２ ｍＡｂを使用して架橋した抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体フラグメントＭＳ−ＧＰＣ−８とインキュベートすると、抗ＣＤ９５ ｍＡｂを使用してアポトーシスに誘導されたＰｒｉｅｓｓ細胞の培養よりも迅速な細胞死滅が見られる。アネキシンＶ／ＰＩ染色法において、アネキシンＶ陽性及びＰＩ陽性染色によって壊死細胞が識別される。
ｂ． Ｐｒｉｅｓｓ細胞を、抗ＦＬＡＧ Ｍ２ ｍＡｂを使用して架橋した抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体フラグメントＭＳ−ＧＰＣ−８とインキュベートすると、抗ＣＤ９５ ｍＡｂを使用して誘導されたＰｒｉｅｓｓ細胞のアポトーシス性培養と比較してアポトーシスのメカニズムを示す証拠はほとんど認められない。アネキシンＶ／ＰＩ染色法において、アネキシンＶ陽性及びＰＩ陰性染色によってアポトーシス細胞が識別される。
【図９】
ａ． Ｔ−ハイブリドーマ細胞からのＩＬ−２分泌の阻害を測定するアッセイを使用した、抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体フラグメント、ＭＳ−ＧＰＣ−８−１０−５７、ＭＳ−ＧＰＣ−８−２７−４１及びＭＳ−ＧＰＣ−８−６−１３のＩｇＧ形態の免疫抑制性。
ｂ． Ｔ−ハイブリドーマ細胞からのＩＬ−２分泌の阻害を測定するアッセイを使用した、抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体フラグメント、ＭＳ−ＧＰＣ−８−２７−４１及びＭＳ−ＧＰＣ−８−６−１９の一価Ｆａｂ形態の免疫抑制性。
【図１０】
Ｔ細胞増殖の阻害を測定するアッセイにおける、抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体フラグメントＭＳ−ＧＰＣ−８−１０−５７及びＭＳ−ＧＰＣ−８−２７−４１のＩｇＧ形態の免疫抑制性。
【図１１】
ｓｃＦｖファージディスプレイベクターｐＭＯＲＰＨ１３＿ｓｃＦｖのベクターマップ及び配列。
ベクターｐＭＯＲＰＨ１３＿ｓｃＦｖは、繊維状ファージの遺伝子ＩＩＩタンパク質のＣ−末端ドメインとＨｕＣＡＬ ｓｃＦｖとの融合物をコードする遺伝子を含むファージミドベクターである。図１１には、モデルｓｃＦｖ遺伝子（ＶＨ１Ａ及びＶλ３の組合せ（Ｋｎａｐｐｉｋ ｅｔ ａｌ．， ２０００）を含むベクターを示す。
元のＨｕＣＡＬマスター遺伝子（Ｋｎａｐｐｉｋ ｅｔ ａｌ．， ２０００、その中の図３を参照）は、それらの本来のＮ−末端、第１のアミノ酸としてＱ（＝ＣＡＧ）を有するＶＨ１Ａ、ＶＨ１Ｂ、ＶＨ２、ＶＨ４及びＶＨ６から構築された。ＶＨ３及びＶＨ５は第１のアミノ酸としてＥ（＝ＧＡＡ）を有する。ベクターｐＭＯＲＰＨ１３＿ｓｃＦｖは、ＶＨ鎖に融合した短いＦＬＡＧペプチド配列（ＤＹＫＤ）を含み、従ってこのベクター中の、そしてそれから直接誘導されるＨｕＣＡＬ ＶＨ鎖はいずれも最初の位置にＥ（＝ＧＡＡ）を有する（例えば、ｐＭｘ７＿ＦＳベクターにおいて、図１２を参照）。
【図１２】
ｓｃＦｖ発現ベクターｐＭｘ７＿ＦＳ＿５Ｄ２のベクターマップ及び配列。
発現ベクターｐＭｘ７＿ＦＳ＿５Ｄ２は、ＶＨ−ＣＨ１がＦＬＡＧタグ（Ｈｏｐｐ ｅｔ ａｌ．， １９８８； Ｋｎａｐｐｉｋ ａｎｄ Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ， １９９４））とＳＴＲＥＰタグＩＩ（ＷＳＨＰＱＦＥＫ）（ＩＢＡ ＧｍｂＨ， Ｇｏｔｔｉｎｇｅｎ， Ｇｅｒｍａｎｙ、Ｓｃｈｍｉｄｔ ａｎｄ Ｓｋｅｒｒａ， １９９３； Ｓｃｈｍｉｄｔ ａｎｄ Ｓｋｅｒｒａ， １９９４； Ｓｃｈｍｉｄｔ ｅｔ ａｌ．， １９９６； Ｖｏｓｓ ａｎｄ Ｓｋｅｒｒａ， １９９７参照）との組合せに融合される場合、ＨｕＣＡＬ ｓｃＦｖフラグメント（図１２では、ベクターが「５Ｄ２」と呼ばれる「ダミーの」抗体フラグメントをコードする遺伝子を含む）の発現を導く。
【図１３】
Ｆａｂ発現ベクターｐＭｘ９＿Ｆａｂ＿ＧＰＣ８のベクターマップ及び配列。
発現ベクターｐＭｘ９＿Ｆａｂ＿ＧＰＣ８は、ＶＨ−ＣＨ１がＦＬＡＧタグ（Ｈｏｐｐ ｅｔ ａｌ．， １９８８； Ｋｎａｐｐｉｋ ａｎｄ Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ， １９９４））とＳＴＲＥＰタグＩＩ（ＷＳＨＰＱＦＥＫ）（ＩＢＡ ＧｍｂＨ， Ｇｏｅｔｔｉｎｇｅｎ， Ｇｅｒｍａｎｙ、Ｓｃｈｍｉｄｔ ａｎｄ Ｓｋｅｒｒａ， １９９３； Ｓｃｈｍｉｄｔ ａｎｄ Ｓｋｅｒｒａ， １９９４； Ｓｃｈｍｉｄｔ ｅｔ ａｌ．， １９９６； Ｖｏｓｓ ａｎｄ Ｓｋｅｒｒａ， １９９７参照）との組合せに融合される場合、ＨｕＣＡＬ Ｆａｂフラグメント（図１３では、ベクターがＦａｂフラグメントＭＳ−ＧＰＣ８を含む）の発現を導く。
ｐＭｘ９＿Ｆａｂベクターにおいては、ｓｃＦｖフラグメントからクローン化されたＨｕＣＡＬ Ｆａｂフラグメント（図１１の図面の説明を参照）は、ＶＨ鎖に融合した短いＦＬＡＧペプチド配列（ＤＹＫＤ）を有しておらず、このベクター中の、そしてそれから直接誘導されるＨｕＣＡＬ ＶＨ鎖はいずれも最初の位置にＱ（＝ＣＡＧ）を有する。
【図１４】
ＦａｂファージディスプレイベクターｐＭＯＲＰＨ１８＿Ｆａｂ＿ＧＰＣ８のベクターマップ及び配列。
ベクターｐＭＯＲＰＨ１８の誘導体は、繊維状ファージの遺伝子ＩＩＩタンパク質のＣ−末端ドメインとＨｕＣＡＬ抗体のＶＨ−ＣＨ１鎖との融合物をコードする遺伝子を含むファージミドベクターである。さらにこのベクターは別にコードされるＶＬ−ＣＬ鎖を含む。図１４には、ＦａｂフラグメントＭＳ−ＧＰＣ−８を含むベクターを示す。
ｐＭＯＲＰＨ１８＿Ｆａｂベクターにおいては、ｓｃＦｖフラグメントからクローン化されたＨｕＣＡＬ Ｆａｂフラグメント（図１１の図面の説明を参照）は、ＶＨ鎖に融合した短いＦＬＡＧペプチド配列（ＤＹＫＤ）を有しておらず、このベクター中の、そしてそれから直接誘導されるＨｕＣＡＬ ＶＨ鎖はいずれも最初の位置にＱ（＝ＣＡＧ）を有する。
【図１５】
ＭＳ−ＧＰＣ−１、ＭＳ−ＧＰＣ−６、ＭＳ−ＧＰＣ−８、ＭＳ−ＧＰＣ−１０、ＭＳ−ＧＰＣ−８−６、ＭＳ−ＧＰＣ−８−１０、ＭＳ−ＧＰＣ−８−１７、ＭＳ−ＧＰＣ−８−２７、ＭＳ−ＧＰＣ−８−６−１３、ＭＳＧＰＣ−８−１０−５７及びＭＳ−ＧＰＣ−８−２７−４１のＶＨ及びＶＬドメインのアミノ酸配列。
図１５中の配列は、元のＨｕＣＡＬマスター遺伝子（Ｋｎａｐｐｉｋ ｅｔ ａｌ．， ２０００、その中の図３参照）中で構築されるＶＨのアミノ酸１を示す。本明細書に記載したように、ｓｃＦｖ構築物中、ＶＨのアミノ酸１は常にＥであり（図１１の図面の説明を参照）、また本明細書に記載したように、Ｆａｂ構築物中、ＶＨのアミノ酸１は常にＱである（図１３の図面の説明を参照）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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