(57)【要約】癌（例えば、乳癌）の治療および診断のための組成物および方法を開示する。組成物は、１つ以上の胸部腫瘍タンパク質、その免疫原性部分、またはこのような部分をコードするポリヌクレオチドを含み得る。あるいは、治療組成物は、胸部腫瘍タンパク質を発現する抗原提示細胞、またはこのようなタンパク質を発現する細胞に特異的なＴ細胞を含み得る。このような組成物は、例えば、乳癌のような疾患の予防および処置のために用いられ得る。サンプル中の胸部腫瘍タンパク質またはこのようなタンパク質をコードするｍＲＮＡを検出することに基づく診断方法もまた提供される。
2004505611.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者における癌細胞の存在を決定するための方法であって、該方法は、以下の工程：
（ａ）　該患者から生物学的サンプルを得る工程；
（ｂ）　該生物学的サンプルを、第１のポリヌクレオチドにハイブリダイズする第１のオリゴヌクレオチドと接触させる工程であって、該第１のポリヌクレオチドは、配列番号７３、配列番号７４、および配列番号７６に示されるポリヌクレオチドからなる群より選択される、工程；
（ｃ）　該生物学的サンプルを、第２のオリゴヌクレオチドと接触させる工程であって、該第２のオリゴヌクレオチドは、配列番号１、３、５〜７、１１、１３、１５、１７、１９〜２４、３０、３２、および７５からなる群より選択される、第２のポリヌクレオチドにハイブリダイズする、工程；
（ｄ）　該サンプルにおいて、該オリゴヌクレオチドの少なくとも１つにハイブリダイズするポリヌクレオチドの量を検出する工程；ならびに
（ｅ）　該オリゴヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドの量を、所定のカットオフ値と比較し、そして、そこから、該患者における癌の存在または非存在を決定する、工程、
を包含する、方法。
【請求項２】
患者における癌細胞の存在または非存在を決定するための方法であって、該方法は、以下の工程：
（ａ）　該患者から生物学的サンプルを得る工程；
（ｂ）　該生物学的サンプルを、第１のオリゴヌクレオチドと接触させる工程であって、該第１のオリゴヌクレオチドは、配列番号７３、配列番号７４、および配列番号７６に示されるポリヌクレオチドからなる群より選択される第１のポリヌクレオチドにハイブリダイズする、工程；
（ｃ）　該生物学的サンプルを、第２のオリゴヌクレオチドと接触させる工程であって、該第２のオリゴヌクレオチドは、配列番号７５に示される、第２のポリヌクレオチドにハイブリダイズする、工程；
（ｄ）　該生物学的サンプルを、第３のオリゴヌクレオチドと接触させる工程であって、該第３のオリゴヌクレオチドは、配列番号５、配列番号６、および配列番号７に示されるポリヌクレオチドからなる群より選択される、第３のポリヌクレオチドにハイブリダイズする、工程；
（ｅ）　該生物学的サンプルを、第４のオリゴヌクレオチドと接触させる工程であって、該第４のオリゴヌクレオチドは、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、および配列番号２４に示されるポリヌクレオチドからなる群より選択される、第４のポリヌクレオチドにハイブリダイズする、工程；
（ｆ）　該生物学的サンプルにおいて、該オリゴヌクレオチドの少なくとも１つにハイブリダイズするポリヌクレオチドの量を検出する工程；ならびに
（ｇ）　該オリゴヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドの量を、所定のカットオフ値と比較し、そして、そこから、該患者における癌の存在または非存在を決定する、工程、
を包含する、方法。
【請求項３】
患者における癌細胞の存在を検出するための方法であって、該方法は、以下の工程：
（ａ）　該患者から生物学的サンプルを得る工程；
（ｂ）　該生物学的サンプルを、第１のオリゴヌクレオチドと接触させる工程であって、該第１のオリゴヌクレオチドは、マンマグロビンおよびリポフィリンＢからなる群より選択される第１のポリヌクレオチドにハイブリダイズする、工程；
（ｃ）　該生物学的サンプルを、第２のオリゴヌクレオチドと接触させる工程であって、該第２のオリゴヌクレオチドは、ＧＡＢＡπ（Ｂ８９９Ｐ）、Ｂ７２６Ｐ、Ｂ５１１Ｓ、Ｂ５３３Ｓ、Ｂ３０５Ｄ、およびＢ３１１Ｄからなる群より選択される、第２のポリヌクレオチドにハイブリダイズする、工程；
（ｄ）　該サンプルにおいて、該オリゴヌクレオチドの少なくとも１つにハイブリダイズするポリヌクレオチドの量を検出する工程；ならびに
（ｅ）　該オリゴヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドの量を、所定のカットオフ値と比較し、そして、そこから、該患者における癌の存在または非存在を決定する、工程、
を包含する、方法。
【請求項４】
患者における癌細胞の存在を決定するための方法であって、該方法は、以下の工程：
（ａ）　該患者から生物学的サンプルを得る工程；
（ｂ）　該生物学的サンプルを、第１のオリゴヌクレオチドと接触させる工程であって、該第１のオリゴヌクレオチドは、配列番号７３および配列番号７４に示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖からなる群より選択される第１のポリヌクレオチドにハイブリダイズする、工程；
（ｃ）　該生物学的サンプルを、第２のオリゴヌクレオチドと接触させる工程であって、該第２のオリゴヌクレオチドは、配列番号７５に示される第２のポリヌクレオチドまたはその相補鎖にハイブリダイズする、工程；
（ｄ）　該生物学的サンプルを、第３のオリゴヌクレオチドと接触させる工程であって、該第３のオリゴヌクレオチドは、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号６、および配列番号７に示されるポリヌクレオチド、またはその相補鎖からなる群より選択される、第３のポリヌクレオチドにハイブリダイズする、工程；
（ｅ）　該生物学的サンプルを、第４のオリゴヌクレオチドと接触させる工程であって、該第４のオリゴヌクレオチドは、配列番号１１に示されるポリヌクレオチド、またはその相補鎖からなる群より選択される、第４のポリヌクレオチドにハイブリダイズする、工程；
（ｆ）　該生物学的サンプルを、第５のオリゴヌクレオチドと接触させる工程であって、該第５のオリゴヌクレオチドは、配列番号１３、配列番号１５、および配列番号１７に示されるポリヌクレオチド、またはその相補鎖からなる群より選択される、第５のポリヌクレオチドにハイブリダイズする、工程；
（ｇ）　該生物学的サンプルを、第６のオリゴヌクレオチドと接触させる、工程であって、該第６のオリゴヌクレオチドは、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、および配列番号２４に示されるポリヌクレオチド、またはその相補鎖からなる群より選択される、第６のポリヌクレオチドにハイブリダイズする、工程；
（ｈ）　該生物学的サンプルを、第７のオリゴヌクレオチドと接触させる工程であって、該第７のオリゴヌクレオチドは、配列番号３０に示される第７のポリヌクレオチド、またはその相補鎖にハイブリダイズする、工程；
（ｉ）　該生物学的サンプルを、第８のオリゴヌクレオチドと接触させる工程であって、該第８のオリゴヌクレオチドは、配列番号３２に示される第８のポリヌクレオチド、またはその相補鎖にハイブリダイズする、工程；
（ｊ）　該生物学的サンプルを、第９のオリゴヌクレオチドと接触させる工程であって、該第９のオリゴヌクレオチドは、配列番号７６に示される第９のポリヌクレオチド、またはその相補鎖にハイブリダイズする、工程；
（ｋ）　該生物学的サンプルにおいて、工程（ｂ）〜（ｊ）のいずれか１つのハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドを検出し、そして該オリゴヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドの量を、所定のカットオフ値と比較する、工程、
を包含し、ここで、所定のカットオフ値を超える、工程（ｂ）〜（ｊ）のいずれか１つにおけるハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドの存在は、該患者の生物学的サンプルにおける癌細胞の存在を示す、方法。
【請求項５】
患者における癌細胞の存在を決定するための方法であって、該方法は、以下の工程：
（ａ）　該患者から生物学的サンプルを得る工程；
（ｂ）　該生物学的サンプルを、第１のオリゴヌクレオチドおよび第２のオリゴヌクレオチドと接触させる工程であって；
ｉ．　ここで、該第１のオリゴヌクレオチドおよび該第２のオリゴヌクレオチドは、それぞれ、第１のポリヌクレオチドおよび第２のポリヌクレオチドにハイブリダイズし；
ｉｉ．　ここで、該第１のポリヌクレオチドおよび第２のポリヌクレオチドは、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号３０、配列番号３２、および配列番号７６に示されるポリヌクレオチドからなる群より選択され；ならびに
ｉｉｉ．　ここで、該第１のポリヌクレオチドは、該第２のポリヌクレオチドに対するヌクレオチド配列に下線が付される、工程；
（ｃ）　生物学的サンプルにおいて、該ハイブリダイズした第１のオリゴヌクレオチドおよび該ハイブリダイズした第２のハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドを検出する工程；ならびに
（ｄ）　該ハイブリダイズした第１のオリゴヌクレオチドおよび該ハイブリダイズした第２のオリゴヌクレオチドの量を、所定のカットオフ値と比較する工程；
を包含し、ここで、該所定のカットオフ値を超える、該ハイブリダイズした第１のオリゴヌクレオチドまたは該ハイブリダイズした第２のオリゴヌクレオチドの量は、該患者の生物学的サンプルにおける癌細胞の存在を示す、方法。
【請求項６】
患者における癌細胞の存在または非存在を決定するための方法であって、該方法は、以下の工程：
（ａ）　該患者から生物学的サンプルを得る工程；
（ｂ）　該生物学的サンプルを、第１のオリゴヌクレオチドおよび第２のオリゴヌクレオチドと接触させる工程であって；
ｉ．　ここで、該第１のオリゴヌクレオチドおよび該第２のオリゴヌクレオチドは、それぞれ、第１のポリヌクレオチドおよび第２のポリヌクレオチドにハイブリダイズし；
ｉｉ．　ここで、該第１のポリヌクレオチドおよび該第２のポリヌクレオチドは、共に、検出される癌細胞の組織特異的ポリヌクレオチドであり；ならびに
ｉｉｉ．　ここで、該第１のポリヌクレオチドは、該第２のポリヌクレオチドに対するヌクレオチド配列に下線が付される、工程；
（ｃ）　該生物学的サンプルにおいて、該第１のハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドおよび該第２のハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドを検出する工程；ならびに
（ｄ）　該オリゴヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドの量を、所定のカットオフ値と比較する工程；
を包含し、ここで、該所定のカットオフ値を超えるハイブリダイズした第１のオリゴヌクレオチドまたはハイブリダイズした第２のオリゴヌクレオチドの存在は、該患者の生物学的サンプルにおける癌細胞の存在を示す、方法。
【請求項７】
患者における癌細胞の存在を検出するための方法であって、該方法は、以下の工程：
（ａ）　該患者から生物学的サンプルを得る工程；
（ｂ）　該生物学的サンプルを第１の対と比較する工程であって、該第１の対は第１のオリゴヌクレオチドおよび第２のオリゴヌクレオチドを含み、ここで、該第１のオリゴヌクレオチドおよび該第２のオリゴヌクレオチドは、それぞれ、第１のポリヌクレオチドおよびその相補鎖にハイブリダイズする工程；
（ｃ）　該生物学的サンプルを第２のオリゴヌクレオチド対と比較する工程であって、該第２の対は第３のオリゴヌクレオチドおよび第４のオリゴヌクレオチドを含み、ここで、該第３のオリゴヌクレオチドおよび第４のオリゴヌクレオチドは、それぞれ、第２のポリヌクレオチドおよびその相補鎖にハイブリダイズし、そして、ここで、該第１のポリヌクレオチドは、該第２のポリヌクレオチドに対するヌクレオチド配列に無関係である、工程；
（ｄ）　該第１のポリヌクレオチドおよび該第２のポリヌクレオチドを増幅する工程；ならびに
（ｅ）　第１のポリヌクレオチドおよび該増幅した第２のポリヌクレオチドを検出する工程；
を包含し、ここで、該増幅した第１のポリヌクレオチドまたは該増幅した第２のポリヌクレオチドの存在は、該患者における癌細胞の存在を示す、方法。
【請求項８】
前記生物学的サンプルが、血液、血清、リンパ節、骨髄、痰、尿、および腫瘍生検サンプルからなる群より選択される、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記生物学的サンプルが、血液、リンパ節、および骨髄からなる群より選択される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記リンパ節が前哨リンパ節である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記癌が、前立腺癌、乳癌、結腸癌、卵巣癌、肺癌、頭部および頸部の癌、リンパ腫、白血病、黒色腫、肝癌、胃癌、腎癌、膀胱癌、膵癌、および子宮内膜癌からなる群より選択される、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記第１のポリヌクレオチドおよび前記第２のポリヌクレオチドが、マンマグロビン、リポフィリンＢ、ＧＡＢＡπ（Ｂ８９９Ｐ）、Ｂ７２６Ｐ、Ｂ５１１Ｓ、Ｂ５３３Ｓ、Ｂ３０５Ｄ、およびＢ３１１Ｄからなる群より選択される、請求項６または７に記載の方法。
【請求項１３】
前記第一のポリヌクレオチドおよび前記第二のポリヌクレオチドが、以下：
配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号３０、配列番号３２、および配列番号７６、
に記載されるポリヌクレオチドからなる群から選択される、請求項６および７に記載の方法。
【請求項１４】
前記オリゴヌクレオチドが、配列番号３３〜３５および６３〜７２に記載されるオリゴヌクレオチドからなる群から選択される、請求項６または７に記載の方法。
【請求項１５】
前記第一の増幅されたポリヌクレオチドおよび前記第二のポリヌクレオチドの検出工程が、放射標識を検出する工程および発蛍光団を検出する工程からなる群から選択される工程を包含する、請求項６または７に記載の方法。
【請求項１６】
前記検出工程が、分画化工程を包含する、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記第一および第二のオリゴヌクレオチドが、イントロンに広がるオリゴヌクレオチドである、請求項６または７に記載の方法。
【請求項１８】
前記イントロンに広がるオリゴヌクレオチドが、配列番号３６〜６２に記載されるオリゴヌクレオチドからなる群から選択される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記増幅された第一または第二のポリヌクレオチドの前記検出が、該増幅された第一または第二のポリヌクレオチドを、標識したオリゴヌクレオチドプローブと接触させる工程を包含し、ここで該標識されたオリゴヌクレオチドプローブが、中程度にストリンジェントな条件下で、前前記第一または第二のポリヌクレオチドにハイブリダイズする、請求項７に記載の方法。
【請求項２０】
前記標識されたオリゴヌクレオチドプローブが、放射標識および発蛍光団からからなる群から選択される検出可能な部分を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項２１】
該オリゴヌクレオチドプライマーをハイブリダイズする前に、前記生物学的サンプルから、前記癌細胞を富化させる工程をさらに包含する、請求項１〜７に記載の方法。
【請求項２２】
前記生物学的サンプルから前記癌細胞を富化する工程が、細胞捕獲および細胞枯渇からなる群から選択される方法論によって達成される、請求項１〜７に記載の方法。
【請求項２３】
前記細胞捕獲が、免疫捕獲によって達成され、該免疫捕獲は、以下の工程：
（ａ）抗体を、該癌細胞の表面に吸着させる工程；および
（ｂ）該抗体吸着癌細胞を、該生物学的サンプルの残りから分離する工程、
を包含する、方法。
【請求項２４】
前記抗体が、以下：
ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ１０、ＣＤｌｌｂ、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２４、ＣＤ２５、ＣＤ２９、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３６、ＣＤ３８、ＣＤ４１、ＣＤ４５、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ５６、ＣＤ６６Ｂ、ＣＤ６６ｅ、ＨＬＡ−ＤＲ、ＩｇＥおよびＴＣＲαβ、
からなる群から選択される抗原に指向される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記抗体が、胸部腫瘍抗原に指向される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
前記抗体が、モノクローナル抗体である、請求項２３〜２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記抗体が、磁気ビーズに結合された、請求項２３に記載の方法。
【請求項２８】
前記抗体が、四量体抗体複合体で処方される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２９】
細胞枯渇が、以下：
（ａ）赤血球と白血球とを架橋する工程；および
（ｂ）該架橋された赤血球と白血球とを、前記生物学的サンプルの残りから分画化する工程、
を包含する方法によって達成される、請求項２３に記載の方法。
【請求項３０】
前記精製工程が、以下：逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）、逆ＰＣＲ、ＲＡＣＥ、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、Ｑｂｅｔａ　レプリカーゼ、等温増幅、鎖移動増幅（ＳＤＡ）、ローリング連鎖反応（ＲＣＰ）、環状プローブ反応（ＣＰＲ）、転写ベースの増幅系（ＴＡＳ）、核酸配列ベースの増幅（ＮＡＳＢＡ）および３ＳＲからなる群から選択されるポリヌクレオチド増幅方法論によって達成される、請求項７に記載の方法。
【請求項３１】
患者の生物学的サンプル中の癌細胞を検出するための組成物であって、該組成物は、以下：
（ａ）第一のオリゴヌクレオチド；および
（ｂ）第二のオリゴヌクレオチド、
を含み、ここで、該第一のオリゴヌクレオチドおよび該第二のオリゴヌクレオチドは、それぞれ、第一のポリヌクレオチドおよび第二のポリヌクレオチドにハイブリダイズし；ここで、該第一のポリヌクレオチドは、ヌクレオチド配列において、該第二のポリヌクレオチドとは関係せず；ここで、第一のポリヌクレオチドおよび該第二のポリヌクレオチドは、検出される癌細胞の組織特異的ポリヌクレオチドであり；ここで、該第一のポリヌクレオチドおよび該第二のポリヌクレオチドは、該癌細胞の組織型の相補的組織特異的ポリヌクレオチドであり；そしてここで、該第一のポリヌクレオチドおよび該第二のポリヌクレオチドが、以下：　配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号３０、配列番号３２、および配列番号７６、
に記載のポリヌクレオチドからなる群から選択される、組成物。
【請求項３２】
前記オリゴヌクレオチドが、配列番号３３〜７２に開示されるようなオリゴヌクレオチドからなる群から選択される、請求項３１に記載の組成物。
【請求項３３】
患者の生物学的サンプル中の癌細胞を検出するための組成物であって、該組成物は、以下：
（ａ）第一のオリゴヌクレオチド対；および
（ｂ）第二のオリゴヌクレオチド対、
を含み、ここで、該第一のオリゴヌクレオチド対および該第二のオリゴヌクレオチド対は、それぞれ、第一のポリヌクレオチド（または、その相補体）および該第二のポリヌクレオチド（または、その相補体）にハイブリダイズし；ここで、該第一のポリヌクレオチドは、ヌクレオチド配列において、該第二のポリヌクレオチドとは関係せず；ここで、該第一のポリヌクレオチドおよび該第二のポリヌクレオチドは、検出される癌細胞の組織特異的ポリヌクレオチドであり；ここで、該第一のポリヌクレオチドおよび該第二のポリヌクレオチドは、該癌細胞の組織型の相補的組織特異的ポリヌクレオチドであり；そしてここで、該第一のポリヌクレオチドおよび該第二のポリヌクレオチドが、以下：
配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号３０、配列番号３２、および配列番号７６、
に記載のポリヌクレオチドからなる群から選択される、組成物。
【請求項３４】
前記オリゴヌクレオチドが、配列番号３３〜７２に開示されるようなオリゴヌクレオチドからなる群から選択される、請求項３３に記載の組成物。
【請求項３５】
組成物であって、該組成物は、配列番号３３〜７２に記載されるオリゴヌクレオチドからなる群から選択されるオリゴヌクレオチドを含む、１５ヌクレオチドと１００ヌクレオチドとの間のオリゴヌクレオチドプライマーまたはプローブを含む、組成物。
【請求項３６】
配列番号３３〜７２に記載されるオリゴヌクレオチドからなる群から選択されるオリゴヌクレオチドプライマーまたはプローブを含む、請求項３５に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の技術分野）
本発明は、一般に、癌診断の分野に関する。より詳細には、本発明は、癌の検出のための方法、組成物およびキットに関し、この検出は、オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションおよび／または増幅を使用し、癌細胞を含むことが疑われる生物学的サンプルにおける２以上の組織特異的ポリヌクレオチドを同時に検出する。
【０００２】
（発明の背景）
癌は、依然として、世界中の重要な健康上の問題である。従来の癌処置レジメンの失敗は、一般に、疾患診断の遅延に一部起因し得る。有意な進歩が癌診断の分野でなされてきたが、依然として、癌細胞の存在の早期で信頼性の高くかつ高感度な決定を可能にする、改善された検出方法の必要性が存在する。
【０００３】
乳癌は、米国の女性の間の死亡率が肺癌に次いで２番目であり、毎年１８０，０００人より多くの女性が罹患し、そして年に約４０，０００〜５０，０００人の死亡を生じる。北米の女性について、生涯で乳癌を発症する可能性は、８分の１である。
【０００４】
この疾患の管理は、現在、早期の診断（慣用的なスクリーニング手段を介する）および積極的な処置の組み合わせに依存し、その処置は、種々の処置の１以上（例えば、手術、放射線療法、化学療法およびホルモン療法）を含み得る。特定の乳癌についての処置過程は、しばしば、種々の予後パラメーター（特異的な腫瘍マーカーの分析を含む）に基づいて選択される。例えば、Ｐｏｒｔｅｒ−Ｊｏｒｄａｎら、Ｂｒｅａｓｔ　Ｃａｎｃｅｒ　８：７３−１００（１９９４）を参照のこと。しかし、確立されたマーカーの使用は、しばしば、理解が困難な結果を導き；そして乳癌患者に観察される高い死亡率は、この疾患の診断において改善が必要とされることを示す。
【０００５】
Ｈｅｒ２／ｎｅｕに標的化される乳癌処置に対する免疫療法アプローチの近年の導入は、治療的な抗体およびＴ細胞ワクチンならびにこの疾患の診断のための標的としての、さらなる乳癌特異的遺伝子を同定する有意な動機付けを提供した。この目的のために、マンマグロビン（ｍａｍｍａｇｌｏｂｉｎ）が、現在までに発見されている最も乳癌特異的な遺伝子の１つとして同定されており、乳癌の約７０〜８０％において発現される。この高度に組織特異的な分布に起因して、マンマグロビン遺伝子発現の検出は、リンパ節組織における微小転移病変を同定するため、およびより近年では、既知の一次病変および転移性病変を有する乳癌患者の末梢血中の循環乳癌細胞を検出するために使用されている。
【０００６】
マンマグロビンは、ウサギユテログロビン（ｕｔｅｒｏｇｌｏｂｉｎ）およびラットステロイド結合タンパク質サブユニットＣ３のホモログであり、そして高度にグリコシル化される低分子量タンパク質である。Ｗａｔｓｏｎら、Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．５６：８６０−５（１９９６）；Ｗａｔｓｏｎら、Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．５９：３０２８−３０３１（１９９９）；Ｗａｔｓｏｎら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ　１６：８１７−２４（１９９８）。そのホモログとは対照的に、マンマグロビンは、乳癌特異的であることが報告されており、そして過剰発現が、胸部腫瘍生検（２３％）、一次および転移性胸部腫瘍（約７５％）において記載されており、それと共に、転移性乳癌患者由来の９１％のリンパ節においてマンマグロビンのｍＲＮＡ発現の検出が報告されている。Ｌｅｙｇｕｅら、Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１８９：２８−３３（１９９９）およびＭｉｎら、Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．５８：４５８１−４５８４（１９９８）。
【０００７】
マンマグロビン発現は乳癌の一般的特徴ではないので、この遺伝子単独の検出は、全ての乳癌の信頼性の高い検出を可能にするには不十分であり得る。従って、当該分野で必要とされていることは、例えば、リンパ節および骨髄における微小転移の検出の感度および信頼性を改善するための、ならびに／または末梢循環中の足場非依存性細胞の認識のための、２以上の乳癌特異的遺伝子の検出を使用する方法である。
【０００８】
本発明は、組織特異的ポリヌクレオチド（特に、腫瘍特異的ポリヌクレオチド）の同定に有用な方法、ならびに疾患に罹患している患者における癌細胞の検出およびモニタリングのための方法、組成物およびキットを提供することによって、これらの目的および他の関連する目的を達成する。
【０００９】
（発明の要旨）
特定の実施形態によって、本発明は、１以上の組織特異的ポリヌクレオチドを同定するための方法を提供し、これらの方法は、以下の工程を包含する：（ａ）遺伝子サブトラクション（ｇｅｎｅｔｉｃ　ｓｕｂｔｒａｃｔｉｏｎ）を行って、目的の組織由来のポリヌクレオチドのプールを同定する工程；（ｂ）ＤＮＡマイクロアレイ分析を行って、この目的のポリヌクレオチドのプールの第１のサブセットを同定する工程であって、ここで、この第１のサブセットの各メンバーポリヌクレオチドは、コントロール組織と比較した場合に、この目的の組織において少なくとも２倍過剰発現される、工程；および（ｃ）この第１のサブセット中のポリヌクレオチドに対して定量的ポリメラーゼ連鎖反応分析を行って、ポリヌクレオチドの第２のサブセットを同定する工程であって、このポリヌクレオチドは、コントロール組織と比較して少なくとも２倍過剰発現される、工程。好ましい遺伝子サブトラクションは、ディファレンシャルディスプレイおよびｃＤＮＡサブトラクションからなる群より選択され、そして本明細書中以下にさらに詳細に記載する。
【００１０】
本発明の代替的な実施形態は、目的の組織における一致する組織特異的発現プロフィールおよび／または相補的な組織特異的発現プロフィールを示す、ポリヌクレオチドのサブセットを同定する方法を提供する。このような方法は、以下の工程を包含する：（ａ）ＤＮＡマイクロアレイおよび定量的ＰＣＲからなる群より選択される発現分析を行って、第１のポリヌクレオチドを同定する工程であって、この第１のポリヌクレオチドは、コントロール組織と比較した場合に、目的の組織において少なくとも２倍過剰発現される、工程；および（ｂ）ＤＮＡマイクロアレイおよび定量的ＰＣＲからなる群より選択される発現分析を行って、第１のポリヌクレオチドを同定する工程であって、この第１のポリヌクレオチドは、コントロール組織と比較した場合に、目的の組織において少なくとも２倍過剰発現される、工程。
【００１１】
本発明のさらなる実施形態は、患者における癌細胞の存在を検出するための方法を提供する。このような方法は、以下の工程を包含する：（ａ）この患者から生物学的サンプルを得る工程；（ｂ）この生物学的サンプルに第１のオリゴヌクレオチド対を接触させる工程であって、ここで、第１のオリゴヌクレオチド対のメンバーは、中程度にストリンジェントな条件下で、それぞれ、第１のポリヌクレオチドおよびその相補体にハイブリダイズする、工程；（ｃ）この生物学的サンプルに第２のオリゴヌクレオチド対を接触させる工程であって、ここで、第２のオリゴヌクレオチド対のメンバーは、中程度にストリンジェントな条件下で、それぞれ、第２のポリヌクレオチドおよびその相補体にハイブリダイズし、そしてこの第１のポリヌクレオチドは、ヌクレオチド配列において第２のポリヌクレオチドに対して無関係である、工程；（ｄ）第１のポリヌクレオチドおよび第２のポリヌクレオチドを増幅する工程；および（ｅ）増幅された第１のポリヌクレオチドおよび増幅された第２のポリヌクレオチドを検出する工程であって；ここで、増幅された第１のポリヌクレオチドまたは増幅された第２のポリヌクレオチドの存在は、患者中の癌細胞の存在を示す、工程。
【００１２】
いくつかの実施形態によって、この増幅された第１のポリヌクレオチドおよび／または第２のポリヌクレオチドの検出には、分画工程（例えば、ゲル電気泳動のような）が先行し得る。あるいは、またはさらに、この増幅された第１のポリヌクレオチドおよび／または第２のポリヌクレオチドの検出は、標識されたオリゴヌクレオチドプローブのハイブリダイゼーションによって達成され得、このプローブは、中程度にストリンジェントな条件下で、第１または第２のポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズする。オリゴヌクレオチド標識は、放射標識したヌクレオチドの組み込みまたは蛍光標識の組み込みによって達成され得る。
【００１３】
特定の好ましい実施形態において、特定の組織型の細胞が、検出工程の前の生物学的サンプルから富化され得る。富化は、細胞捕捉および細胞枯渇からなる群より選択される方法によって達成され得る。例示的な細胞捕捉方法としては、免疫捕捉（ｉｍｍｕｎｏｃａｐｔｕｒｅ）が挙げられ、そして以下の工程を含む：（ａ）組織特異的細胞の表面に対する抗体を、その生物学的サンプル中の細胞に吸着させる工程；（ｂ）抗体が吸着した組織特異的細胞を、その生物学的サンプルの残りの部分から分離する工程。例示的な細胞枯渇は、赤血球および白血球のクロスリンク（ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋｉｎｇ）、それに続く、クロスリンクした細胞を除去するための分画工程によって達成され得る。
【００１４】
本発明の代替的な実施形態は、患者における癌の存在または非存在を決定するための方法を提供し、この方法は、以下の工程を包含する：（ａ）この患者から得られた生物学的サンプルに、胸部腫瘍タンパク質をコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを接触させる工程；（ｂ）そのオリゴヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡのような）のレベルを、そのサンプル中で検出する工程；および（ｃ）そのオリゴヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドのレベルを所定のカットオフ値と比較し、そこからその患者における癌の存在または非存在を決定する工程。特定の実施形態において、ｍＲＮＡの量は、例えば、上記に言及したポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（または、このようなポリヌクレオチドの相補体）にハイブリダイズする少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプライマーを使用する、ポリメラーゼ連鎖反応を介して検出される。他の実施形態において、ｍＲＮＡの量は、上記に言及したポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（または、このようなポリヌクレオチドの相補体）にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブを使用する、ハイブリダイゼーション技術を使用して検出される。
【００１５】
関連の局面において、患者における癌の進行をモニターするための方法が提供され、この方法は、（ａ）患者から得た生物学的サンプルを、胸部腫瘍タンパク質をコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズするオリゴヌクレオチドと接触させる工程；（ｂ）このサンプルにおいてオリゴヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドの量を検出する工程；（ｃ）後の時点でこの患者から得られた生物学的サンプルを使用して工程（ａ）および（ｂ）を繰り返す工程；ならびに（ｄ）工程（ｃ）において検出されたポリヌクレオチドの量を、工程（ｂ）において検出された量と比較し、それからこの患者における癌の進行をモニターする工程を包含する。
【００１６】
本発明の特定の実施形態は、この第１のポリヌクレオチドおよび第２のポリヌクレオチドを増幅する工程がポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって達成されることを提供する。
【００１７】
特定の実施形態において、検出される癌細胞は、前立腺癌、乳癌、結腸癌、卵巣癌、肺癌、頭および首の癌、リンパ腫、白血病、黒色腫、肝臓癌、胃癌、腎臓癌、膀胱癌、膵臓癌および子宮内膜癌からなる群より選択され得る。本発明のなおさらなる実施形態は、生物学的サンプルが血液、リンパ節および骨髄からなる群より選択されることを提供する。リンパ節は、前哨リンパ節であり得る。
【００１８】
本発明の特定の実施形態において、第１のポリヌクレオチドが、マンマグロビン（ｍａｍｍａｇｌｏｂｉｎ）、リポフィリンＢ（ｌｉｐｏｐｈｉｌｉｎ　Ｂ）、ＧＡＢＡπ（Ｂ８９９Ｐ）、Ｂ７２６Ｐ、Ｂ５１１Ｓ、Ｂ５３３Ｓ、Ｂ３０５ＤおよびＢ３１１Ｄからなる群より選択される。他の実施形態は、第２のポリヌクレオチドがマンマグロビン、リポフィリンＢ、ＧＡＢＡπ（Ｂ８９９Ｐ）、Ｂ７２６Ｐ、Ｂ５１１Ｓ、Ｂ５３３Ｓ、Ｂ３０５ＤおよびＢ３１１Ｄからなる群より選択されることを提供する。
【００１９】
本発明の代替の実施形態は、患者における癌の存在または非存在を検出すための方法を提供し、この方法は、（ａ）患者から得た生物学的サンプルを、マンマグロビンおよびリポフィリンＢからなる群より選択されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする第１のポリヌクレオチドと接触させる工程；（ｂ）この生物学的サンプルを、ＧＡＢＡπ（Ｂ８９９Ｐ）、Ｂ７２６Ｐ、Ｂ５１１Ｓ、Ｂ５３３Ｓ、Ｂ３０５ＤおよびＢ３１１Ｄからなる群より選択されるポリヌクレオチド配列にハイブリダイズする第２のオリゴヌクレオチドと接触させる工程；（ｃ）このサンプルにおいて、これらのオリゴヌクレオチドの少なくとも１つにハイブリダイズするポリヌクレオチドの量を検出する工程；ならびに（ｄ）このオリゴヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドの量を、所定のカットオフ値と比較して、それからこの患者における癌の存在または非存在を決定する工程を包含する。
【００２０】
特定の実施形態に従って、オリゴヌクレオチドは、配列番号３３〜７２に提示されるオリゴヌクレオチドのような、本明細書中に開示されるオリゴヌクレオチドから選択され得る。他の実施形態によって、このオリゴヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドの量は、ポリメラーゼ連鎖反応を使用して決定される。あるいは、オリゴヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドの量は、ハイブリダイゼーションアッセイを使用して決定され得る。
【００２１】
本発明のなお他の実施形態は、患者における癌細胞の存在または非存在を決定するための方法を提供し、この方法は、（ａ）患者から得た生物学的サンプルを、配列番号７３および配列番号７４に示されるポリヌクレオチドまたはそれらの相補体からなる群より選択されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする第１のポリヌクレオチドと接触させる工程；（ｂ）この生物学的サンプルを、配列番号７５に示されるポリヌクレオチドまたはその相補体にハイブリダイズする第２のオリゴヌクレオチドと接触させる工程；（ｃ）この生物学的サンプルを、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号６、および配列番号７に示されるポリヌクレオチドまたはそれらの相補体からなる群より選択されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする第３のオリゴヌクレオチドと接触させる工程；（ｄ）この生物学的サンプルを、配列番号１１に示されるポリヌクレオチドまたはその相補体からなる群より選択されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする第４のオリゴヌクレオチドと接触させる工程；（ｅ）この生物学的サンプルを、配列番号１３、配列番号１５および配列番号１７に示されるポリヌクレオチドまたはその相補体からなる群より選択されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする第５のオリゴヌクレオチドと接触させる工程；（ｆ）この生物学的サンプルを、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、および配列番号２４に示されるポリヌクレオチドまたはそれらの相補体からなる群より選択されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする第６のオリゴヌクレオチドと接触させる工程；（ｇ）この生物学的サンプルを、配列番号３０に示されるポリヌクレオチドまたはその相補体にハイブリダイズする第７のオリゴヌクレオチドと接触させる工程；（ｈ）この生物学的サンプルを、配列番号３２に示されるポリヌクレオチドまたはその相補体にハイブリダイズする第８のオリゴヌクレオチドと接触させる工程；（ｉ）この生物学的サンプルを、配列番号７６に示されるポリヌクレオチドまたはその相補体にハイブリダイズする第９のオリゴヌクレオチドと接触させる工程；（ｊ）このサンプルにおいて、工程（ａ）〜（ｉ）のいずれか１つのハイブリダイズされたオリゴヌクレオチドを検出する工程；ならびに（ｊ）このオリゴヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドの量を、所定のカットオフ値と比較する工程であって、ここで、所定のカットオフ値を越える、工程（ａ）〜（ｉ）のいずれか１つにおいてハイブリダイズされたオリゴヌクレオチドの存在が、この患者の生物学的サンプルにおける癌細胞の存在を示す、工程を包含する。
【００２２】
本発明の他の関連する実施形態は、患者における癌細胞の存在または非存在を決定するための方法を提供し、この方法は、（ａ）患者から得られた生物学的サンプルを第１のオリゴヌクレオチドおよび第２のオリゴヌクレオチドと接触させる工程であって、ここで、この第１のオリゴヌクレオチドおよび第２のオリゴヌクレオチドが、中程度にストリンジェントな条件下で、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号３０、配列番号３２、および配列番号７６からなる群より選択される第１のオリゴヌクレオチドおよび第２のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズし、ここで、この第１のポリヌクレオチドがこの第２のポリヌクレオチドに構造的に関連しない、工程；（ｂ）サンプルにおいて、この第１のハイブリダイズされたオリゴヌクレオチドおよび第２のハイブリダイズされたオリゴヌクレオチドを検出する工程；および（ｃ）このオリゴヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドの量を所定のカットオフ値と比較する工程であって、ここで、所定のカットオフ値を越える、ハイブリダイズされた第１のオリゴヌクレオチドまたはハイブリダイズされた第２のオリゴヌクレオチドの存在は、この患者の生物学的サンプルにおける癌細胞の存在を示す、工程を包含する。
【００２３】
本発明の他の関連の実施形態は、患者の癌細胞の存在または非存在を決定するための方法を提供し、この方法は、（ａ）患者から得た生物学的サンプルを、第１のオリゴヌクレオチドおよび第２のオリゴヌクレオチドと接触する工程であって、ここで、この第１のオリゴヌクレオチドおよび第２のオリゴヌクレオチドが、中程度のストリンジェントな条件下で、第１のオリゴヌクレオチドおよび第２のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズし、両方が検出される癌の組織特異的ポリヌクレオチドであり、ここで、この第１のポリヌクレオチドが、この第２のオリゴヌクレオチドに構造的に関連しない、工程；（ｂ）サンプルにおいてこの第１のハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドおよび第２のハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドを検出する工程；および（ｃ）このオリゴヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドの量を所定のカットオフ値と比較する工程であって、ここで、所定のカットオフ値を越える、ハイブリダイズされた第１のオリゴヌクレオチドまたはハイブリダイズされた第２のオリゴヌクレオチドの存在は、この患者の生物学的サンプルにおける癌細胞の存在を示す、工程を包含する。
【００２４】
他の関連する局面において、本発明は、さらに、本明細書中に開示される方法において有用な組成物を提供する。例示的な組成物は、２つ以上のオリゴヌクレオチドプライマー対（これらのそれぞれが、異なるポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズする）を含む。本発明の組成物に適切な例示的なオリゴヌクレオチドプライマーは、配列番号３３〜７１によって本明細書中で開示される。本発明の組成物に適切な例示的なポリヌクレオチドは、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号３０、配列番号３２、および配列番号７６に開示される。
【００２５】
本発明はまた、本発明の検出方法を実行するのに適切であるキットを提供する。例示的なキットとしては、オリゴヌクレオチドプライマー対（それぞれが、異なるポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズする）を含む。特定の実施形態において、本発明に従うキットはまた、核酸ポリメラーゼおよび適切な緩衝液を含み得る。本発明のキットに適切な例示的なオリゴヌクレオチドプライマーは、配列番号３３〜７１によって本明細書中で開示される。本発明のキットに適切な例示的なポリヌクレオチドは、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号３０、配列番号３２、および配列番号７６に開示される。
【００２６】
本発明のこれらおよび他の局面は、以下の詳細な説明および添付の図面を参照して明らかとなる。本明細書中に開示されるすべての参考文献は、本明細書中にそれぞれが個々に組込まれているように、その全体が参考として援用される。
【００２７】
配列番号１は、Ｂ３０５ＤアイソフォームＡの第１のスプライス改変体についての決定されたｃＤＮＡ配列である。
【００２８】
配列番号２は、配列番号１の配列によりコードされるアミノ酸配列である。
【００２９】
配列番号３は、Ｂ３０５ＤアイソフォームＡの第２のスプライス改変体についての決定されたｃＤＮＡ配列である。
【００３０】
配列番号４は、配列番号３の配列によりコードされるアミノ酸配列である。
【００３１】
配列番号５〜７は、Ｂ３０５ＤアイソフォームＣの３つのスプライス改変体についての決定されたｃＤＮＡ配列である。
【００３２】
配列番号８〜１０は、それぞれ配列番号５〜７の配列によりコードされるアミノ酸配列である。
【００３３】
配列番号１１は、Ｂ３１１Ｄについての決定されたｃＤＮＡ配列である。
【００３４】
配列番号１２は、配列番号１１の配列によりコードされるアミノ酸配列である。
【００３５】
配列番号１３は、Ｂ７２６Ｐの第１のスプライス改変体の決定されたｃＤＮＡ配列である。
【００３６】
配列番号１４は、配列番号１３の配列によりコードされるアミノ酸配列である。
【００３７】
配列番号１５は、Ｂ７２６Ｐの第２のスプライス改変体の決定されたｃＤＮＡ配列である。
【００３８】
配列番号１６は、配列番号１５の配列によりコードされるアミノ酸配列である。
【００３９】
配列番号１７は、Ｂ７２６Ｐの第３のスプライス改変体の決定されたｃＤＮＡ配列である。
【００４０】
配列番号１８は、配列番号１７の配列によりコードされるアミノ酸配列である。
【００４１】
配列番号１９〜２４は、Ｂ７２６Ｐのさらなるスプライス改変体の決定されたｃＤＮＡ配列である。
【００４２】
配列番号２５〜２９は、それぞれ配列番号１９〜２４の配列によりコードされるアミノ酸配列である。
【００４３】
配列番号３０は、Ｂ５１１Ｓについての決定されたｃＤＮＡ配列である。
【００４４】
配列番号３１は、配列番号３０によりコードされたアミノ酸配列である。
【００４５】
配列番号３２は、Ｂ５３３Ｓについての決定されたｃＤＮＡ配列である。
【００４６】
配列番号３３は、リポフィリンＢ正方向プライマーのＤＮＡ配列である。
【００４７】
配列番号３４は、リポフィリンＢ逆方向プライマーのＤＮＡ配列である。
【００４８】
配列番号３５は、リポフィリンＢプローブのＤＮＡ配列である。
【００４９】
配列番号３６は、ＧＡＢＡ（Ｂ８９９Ｐ）正方向プライマーのＤＮＡ配列である。
【００５０】
配列番号３７は、ＧＡＢＡ（Ｂ８９９Ｐ）逆方向プライマーのＤＮＡ配列である。
【００５１】
配列番号３８は、ＧＡＢＡ（Ｂ８９９Ｐ）プローブのＤＮＡ配列である。
【００５２】
配列番号３９は、Ｂ３０５Ｄ（Ｃ形態）正方向プライマーのＤＮＡ配列である。
【００５３】
配列番号４０は、Ｂ３０５Ｄ（Ｃ形態）逆方向プライマーのＤＮＡ配列である。
【００５４】
配列番号４１は、Ｂ３０５Ｄ（Ｃ形態）プローブのＤＮＡ配列である。
【００５５】
配列番号４２は、Ｂ７２６Ｐ正方向プライマーのＤＮＡ配列である。
【００５６】
配列番号４３は、Ｂ７２６Ｐ逆方向プライマーのＤＮＡ配列である。
【００５７】
配列番号４４は、Ｂ７２６ＰプローブのＤＮＡ配列である。
【００５８】
配列番号４５は、アクチン正方向プライマーのＤＮＡ配列である。
【００５９】
配列番号４６は、アクチン逆方向プライマーのＤＮＡ配列である。
【００６０】
配列番号４７は、アクチンプローブのＤＮＡ配列である。
【００６１】
配列番号４８は、マンマグロビン正方向プライマーのＤＮＡ配列である。
【００６２】
配列番号４９は、マンマグロビン逆方向プライマーのＤＮＡ配列である。
【００６３】
配列番号５０は、マンマグロビンプローブのＤＮＡ配列である。
【００６４】
配列番号５１は、第２のＧＡＢＡ（Ｂ８９９Ｐ）逆方向プライマーのＤＮＡ配列である。
【００６５】
配列番号５２は、第２のＢ７２６Ｐ正方向プライマーのＤＮＡ配列である。
【００６６】
配列番号５３は、ＧＡＢＡ　Ｂ８９９Ｐ−ＩＮＴ正方向プライマーのＤＮＡ配列である。
【００６７】
配列番号５４は、ＧＡＢＡ　Ｂ８９９Ｐ−ＩＮＴ逆方向プライマーのＤＮＡ配列である。
【００６８】
配列番号５５は、ＧＡＢＡ　Ｂ８９９Ｐ−ＩＮＴ　ＴａｑｍａｎプローブのＤＮＡ配列である。
【００６９】
配列番号５６は、Ｂ３０５Ｄ−ＩＮＴ正方向プライマーのＤＮＡ配列である。
【００７０】
配列番号５７は、Ｂ３０５Ｄ−ＩＮＴ逆方向プライマーのＤＮＡ配列である。
【００７１】
配列番号５８は、Ｂ３０５Ｄ−ＩＮＴ　ＴａｑｍａｎプローブのＤＮＡ配列である。
【００７２】
配列番号５９は、Ｂ７２６−ＩＮＴ正方向プライマーのＤＮＡ配列である。
【００７３】
配列番号６０は、Ｂ７２６−ＩＮＴ逆方向プライマーのＤＮＡ配列である。
【００７４】
配列番号６１は、Ｂ７２６−ＩＮＴ　ＴａｑｍａｎプローブのＤＮＡ配列である。
【００７５】
配列番号６２は、ＧＡＢＡ　Ｂ８９９Ｐ　ＴａｑｍａｎプローブのＤＮＡ配列である。
【００７６】
配列番号６３は、Ｂ３１１Ｄ正方向プライマーのＤＮＡ配列である。
【００７７】
配列番号６４は、Ｂ３１１Ｄ逆方向プライマーのＤＮＡ配列である。
【００７８】
配列番号６５は、Ｂ３１１Ｄ　ＴａｑｍａｎプローブのＤＮＡ配列である。
【００７９】
配列番号６６は、Ｂ５３３Ｓ正方向プライマーのＤＮＡ配列である。
【００８０】
配列番号６７は、Ｂ５３３Ｓ逆方向プライマーのＤＮＡ配列である。
【００８１】
配列番号６８は、Ｂ５３３Ｓ　ＴａｑｍａｎプローブのＤＮＡ配列である。
【００８２】
配列番号６９は、Ｂ５１１Ｓ正方向プライマーのＤＮＡ配列である。
【００８３】
配列番号７０は、Ｂ５１１Ｓ逆方向プライマーのＤＮＡ配列である。
【００８４】
配列番号７１は、Ｂ５１１Ｓ　ＴａｑｍａｎプローブのＤＮＡ配列である。
【００８５】
配列番号７２は、ＧＡＢＡπ逆方向プライマーのＤＮＡ配列である。
【００８６】
配列番号７３は、マンマグロビンについての全長ｃＤＮＡ配列である。
【００８７】
配列番号７４は、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現されるマンマグロビン組換えポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームの決定されたｃＤＮＡ配列である。
【００８８】
配列番号７５は、ＧＡＢＡπについての全長ｃＤＮＡ配列である。
【００８９】
配列番号７６は、リポフィリンＢについての全長ｃＤＮＡ配列である。
【００９０】
配列番号７７は、配列番号７６の配列によりコードされるアミノ酸配列である。
【００９１】
（発明の詳細な説明）
上記のように、本発明は、一般に、組織特異的なポリヌクレオチドの同定に適切な方法、ならびに癌の診断およびモニタリングに適切な方法、組成物およびキットに関する。本明細書中に開示された特定の例証された方法、組成物およびキットは乳癌、特に乳癌特異的ポリヌクレオチドの同定、検出およびモニタリングに関するが、本発明は一般に広範な種々の癌および関連の過剰発現したポリヌクレオチド（例えば、前立腺癌、乳癌、結腸癌、卵巣癌、肺癌、頭頸癌、リンパ腫、白血病、黒色腫、肝癌、胃癌、腎癌、膀胱癌、膵臓癌および子宮内癌を含む）の同定、検出およびモニタリングに適用可能であることが当業者によって理解される。従って、本発明が乳癌特異的ポリヌクレオチドの同定または乳癌の検出およびモニタリングにのみ限定されないことは、明白である。
【００９２】
（組織特異的ポリヌクレオチドの同定）
本発明の特定の実施形態は、生物学的サンプル内の癌細胞の検出についての方法、組成物およびキットを提供する。これらの方法は、患者由来の生物学的サンプルから１以上の組織特異的ポリヌクレオチドを検出する工程を包含する。このポリヌクレオチドの過剰発現は、その患者の生物学的サンプル内の癌細胞の存在を示す。従って、本発明はまた、組織特異的ポリヌクレオチドの同定に適切である方法を提供する。本明細書中で使用される場合、句「組織特異的ポリヌクレオチド」または「腫瘍特異的ポリヌクレオチド」は、１以上のコントロール組織と比較して少なくとも２倍の過剰発現であるポリヌクレオチド全てを含むことが意味される。本明細書中以下にさらに詳細に議論されるように、所定のポリヌクレオチドの過剰発現は、例えば、マイクロアレイおよび／または定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ　ＰＣＲＴＭ）方法論によって評価され得る。
【００９３】
組織特異的ポリヌクレオチドを検出するための例示的方法は、以下の工程を包含する：（ａ）目的の組織由来のポリヌクレオチドのプールを同定するために遺伝子サブトラクションを実施する工程；（ｂ）目的のポリヌクレオチドの上記プールの第一のセットを同定するためにＤＮＡマイクロアレイ分析を実施する工程であって、ここで、上記第一のサブセットの各メンバーポリヌクレオチドは、上記目的の組織においてコントロール組織と比較して少なくとも２倍過剰発現される工程；および（ｃ）上記第一のサブセット中のポリヌクレオチドに定量的ポリメラーゼ連鎖反応分析をして、上記コントロール組織と比較して少なくとも２倍過剰発現されるポリヌクレオチドの第二のサブセットを同定する工程。
【００９４】
（一般的ポリヌクレオチド）
本明細書中で使用される場合、用語「ポリヌクレオチド」は一般に、ＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子のいずれかをいう。ポリヌクレオチドは、生物学的サンプル（例えば、血液サンプル、血清サンプル、リンパ節サンプル、骨髄サンプル、痰サンプル、尿サンプルおよび腫瘍生検サンプル）中に正常に見出されるように天然に存在し得る。あるいは、ポリヌクレオチドは、例えば、核酸重合反応によって合成的に誘導され得る。当業者によって認識されるように、ポリヌクレオチドは、一本鎖（コーディングまたはアンチセンス）あるいは二本鎖であり得、そしてＤＮＡ分子（ゲノム、ｃＤＮＡまたは合成）あるいはＲＮＡ分子であり得る。ＲＮＡ分子は、ＨｎＲＮＡ分子を含む。これは、イントロンを含み、そして１対１の様式でＤＮＡ分子に対応する。そしてＲＮＡ分子は、イントロンを含まない。さらなるコード配列または非コード配列は、本発明のポリペプチド内に存在し得るが、必要ではない。そしてポリヌクレオチドは、他の分子および／または支持体物質に結合し得るが、必要ではない。
【００９５】
ポリヌクレオチドは、ネイティブ配列（すなわち、腫瘍タンパク質をコードする内因性配列（例えば、胸部腫瘍またはその一部））またはこのような配列の改変体、または生物学的もしくは抗原的に機能的な等価物を含み得る。ポリヌクレオチド改変体は、以下にさらに記載されるように１以上の置換、付加、欠失および／または挿入を含み得る。用語「改変体」はまた、異種性器官の相同遺伝子を含む。
【００９６】
ポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列を比較する場合、最大一致について整列される場合にその２つの配列中のヌクレオチドまたはアミノ酸の配列が同一であるならば、以下に記載されるように２つの配列は、「同一」であるいわれる。２つの配列の間の比較は、配列類似性の局所領域を同定および比較するために比較ウインドウを超えて配列を比較することによって代表的に実施される。本明細書中で使用される場合、「比較ウインドウ」は、少なくとも約２０、通常は３０〜約７５、４０〜約５０連続する位置のセグメントをいう。ここで、２つの配列が最適に整列される後に、配列は、同数の連続する位置の参照配列と比較され得る。
【００９７】
比較のための配列の最適整列は、バイオインフォマティックスソフトウエアのＬａｓｅｒｇｅｎｅ　ｓｕｉｔｅ中のＭｅｇａｌｉｇｎプログラム（ＤＮＡＳＴＡＲ，Ｉｎｃ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を、初期設定の変数を使用して実施され得る。このプログラムは、以下の参考文献に記載されるいくつかの整列図式を具体化する。Ｄａｙｈｏｆｆ，Ｍ．Ｏ．（１９７８）Ａ　ｍｏｄｅｌ　ｏｆ　ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ　ｃｈａｎｇｅ　ｉｎ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ−Ｍａｔｒｉｃｅｓ　ｆｏｒ　ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ　ｄｉｓｔａｎｔ　ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ．Ｄａｙｈｏｆｆ，Ｍ．Ｏ．（編）Ａｔｌａｓ　ｏｆ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ａｎｄ　Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ　ＤＣ　第５巻、第３章、３４５−３４８頁；Ｈｅｉｎ　Ｊ．（１９９０）Ｕｎｉｆｉｅｄ　Ａｐｐｒｏａｃｈ　ｔｏ　Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ　ａｎｄ　Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｓ　６２６−６４５頁　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、第１８３巻、Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ；Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｄ．Ｇ．およびＳｈａｒｐ，Ｐ．Ｍ．（１９８９）ＣＡＢＩＯＳ　５：１５１−１５３；Ｍｙｅｒｓ，Ｅ．Ｗ．およびＭｕｌｌｅｒ　Ｗ．（１９８８）ＣＡＢＩＯＳ　４：１１−１７；Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，Ｅ．Ｄ．（１９７１）Ｃｏｍｂ．Ｔｈｅｏｒ　１１：１０５；Ｓａｎｔｏｕ，Ｎ．Ｎｅｓ，Ｍ．（１９８７）Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｅｖｏｌ．４：４０６−４２５；Ｓｎｅａｔｈ，Ｐ．Ｈ．Ａ．およびＳｏｋａｌ，Ｒ．Ｒ．（１９７３）Ｎｕｍｅｒｉｃａｌ　Ｔａｘｏｎｏｍｙ−ｔｈｅ　Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ　ａｎｄ　Ｐｒａｃｔｉｃｅ　ｏｆ　Ｎｕｍｅｒｉｃａｌ　Ｔａｘｏｎｏｍｙ，Ｆｒｅｅｍａｎ　Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ　Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ；Ｗｉｌｂｕｒ，Ｗ．Ｊ．およびＬｉｐｍａｎ，Ｄ．Ｊ．（１９８３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８０：７２６−７３０。
【００９８】
あるいは、比較のための配列の最適な整列は、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ（１９８１）Ａｄｄ．ＡＰＬ．Ｍａｔｈ　２：４８２の局所同定アルゴリズムによって、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ（１９７０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３の同定整列アルゴリズムによって、ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８５：２４４４の類似性についての探索方法によって、これらのアルゴリズム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　Ｓｏｆｔｗａｒｅ　Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　Ｃｏｍｐｕｔｅｒ　Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ），５７５　Ｓｃｉｅｎｃｅ　Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩにおけるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡ）のコンピューター化改良によって実施され得る。
【００９９】
配列同一性パーセントおよび配列類似性を決定するために適切なアルゴリズムの１つの好ましい例示は、ＢＬＡＳＴアルゴリズムおよびＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムであり、これらは、それぞれＡｌｔｓｃｈｕｌら（１９７７）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２およびＡｌｔｓｃｈｕｌら（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０に記載される。ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ２．０を、例えば、本明細書中に記載される変数を用いて使用して、本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドについての配列同一性パーセントを決定し得る。ＢＬＡＳＴ分析を実施するためのソフトウエアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｅｎｔｅｒ　ｆｏｒ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎを介して公的に利用可能である。１つの実例としての例示において、蓄積スコアは、ヌクレオチド配列について変数Ｍ（一致する残基の対についての報酬スコア；常に＞０）およびＮ（一致しない残基についてのペナルティースコア；常に＜０）を使用して計算され得る。アミノ酸配列について、スコア付けマトリックスを使用して、蓄積スコアを計算し得る。各方法におけるワードヒットの伸長は、以下の場合に停止される：数量Ｘによって蓄積整列スコアがその最大達成値より減少する；１以上のネガティブスコア付け残基整列の蓄積に起因して蓄積スコアが０以下になる；または、どちらかの配列の末端が到達される。ＢＬＡＳＴアルゴリズム変数Ｗ、ＴおよびＸは、整列の感度および速度を決定する。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列について）は、ワード長（Ｗ）１１、および期待値（Ｅ）１０を初期設定として使用し、そしてＢＬＯＳＵＭ６２スコア付けマトリックス（ＨｅｎｉｋｏｆｆおよびＨｅｎｉｋｏｆｆ（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８９：１０９１５を参照のこと）整列は、（Ｂ）５０、期待値（Ｅ）１０、Ｍ＝５、Ｎ＝４および両鎖の比較を使用する。
【０１００】
好ましくは、「配列同一性のパーセント」は、少なくとも２０位の比較のウインドウを越える２つの最適な整列された配列を比較することによって決定される。ここで、比較ウインドウ中のポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列の一部は、この２つの配列の最適な整列についての参照配列（付加または欠失を含まない）と比較して２０％以下、通常は５〜１５％、または１０〜１２％の付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含み得る。パーセントは、位置の数を決定する工程（ここで、同一の核酸塩基またはアミノ酸残基は、一致した位置の数を得るために両方の配列中に生じる）、一致した位置の数を参照配列（すなわち、ウインドウサイズ）中の位置の総数で除する工程、およびこれらの結果に１００を掛けて配列の同一性のパーセントを得る工程によって算出される。
【０１０１】
従って、本発明は、本明細書中に開示される配列に対して実質的な同一性を有するポリヌクレオチド配列およびポリペプチド配列を含む。例えば、これらは、本明細書中に記載される方法（例えば、以下に記載されるような標準変数を使用するＢＬＡＳＴ分析）を使用して、本発明のポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列を比較して、少なくとも５０％配列同一性、好ましくは少なくとも５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％以上の配列同一性を含む。コドン縮重、アミノ酸類似性、リーディングフレーム位置付けなどを考慮することによって、２つのヌクレオチド配列によってコードされるタンパク質の対応する同一性を決定するためにこれらの値が適切に調整され得ることを、当業者は認識する。
【０１０２】
さらなる実施形態において、本発明は、本明細書に開示される１つ以上の配列に対して配列同一であるか、または相補性である種々の長さの連続するストレッチを含む単離されたポリヌクレオチドおよびポリペプチドを提供する。例えば、本発明によってポリヌクレオチドが、提供され、このポリヌクレオチドは、本明細書に開示される１つ以上の配列の少なくとも約１５、２０、３０、４０、５０、７５、１００、１５０、２００、３００、４００、５００または１０００以上連続するヌクレオチド、ならびにその間の中間の長さの全てのヌクレオチドを含む。この文脈において、「中間の長さ」とは、例えば、１６、１７、１８、１９など；２１、２２、２３、など；３０、３１、３２、など；５０、５１、５２、５３など；１００、１０１、１０２、１０３など；１５０、１５１、１５２、１５３、など；（２００〜５００；５００〜１，０００などの間の全ての整数を含む）のような、述べられた値の間の任意の長さを意味することが容易に理解される。
【０１０３】
本発明のポリヌクレオチド、またはそのフラグメントは、コード配列それ自体の長さにもかかわらず、他のＤＮＡ配列（例えば、プロモーター、ポリアデニル化シグナル、さらなる制限酵素部位、マルチクローニング部位、他のコードセグメントなど）と組み合わせられ得、その結果その長さ全体にわたってかなり変化し得る。従って、任意の長さのほとんどの核酸フラグメントが使用され得ることが考えられる。この全長は、好ましくは調製の容易さおよび意図される組み換えＤＮＡプロトコールにおける用途によって制限される。例えば、約１０，０００、約５０００、約３０００、約２，０００、約１，０００、約５００、約２００、約１００、約５０塩基対長、など（全ての中間の長さを含む）の全長を有する代表的なＤＮＡセグメントが、本発明の多くの実施において有用であることが考えられる。
【０１０４】
他の実施形態において、本発明は、本明細書において提供されるポリヌクレオチド配列に対して、中程度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得るポリヌクレオチド、またはそのフラグメント、またはその相補的な配列に関する。ハイブリダイゼーション技術は、分子生物学の当該分野において周知である。例示の目的であるが、他のポリヌクレオチドと本発明のポリヌクレオチドとのハイブリダイゼーションを試験するための適切な中程度にストリンジェントな条件としては、５×ＳＳＣ、０．５％　ＳＤＳ、１．０ｍＭ　ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）の溶液中の事前洗浄；５０℃〜６５℃、５×ＳＳＣでの、一晩のハイブリダイゼーション；続いて、０．１％ＳＤＳを含有する２×、０．５×および０．２×ＳＳＣのそれぞれを用いた２０分間、６５℃での２回の洗浄が挙げられる。
【０１０５】
さらに、遺伝子コードの縮重性の結果として、本明細書において記載されるようなポリペプチドをコードする多くのヌクレオチド配列が存在することが、当業者に理解される。これらのポリヌクレオチドのいくつかは、任意のネイティブ遺伝子のヌクレオチド配列に対して最小限の相同性を保有する。それにもかかわらず、コドン用法における差異に起因して変化するポリヌクレオチドが、本発明によって特に意図される。さらに、本明細書に提供されるポリヌクレオチド配列を含む遺伝子の対立遺伝子は、本発明の範囲内である。対立遺伝子は、１つ以上の変異（例えば、ヌクレオチドの欠失、付加、および／または置換）の結果として変更される内因性遺伝子である。得られたｍＲＮＡおよびタンパク質は、おそらく、ただし必ずしもではないが、変化した構造または機能を有する。対立遺伝子は、標準的技術（例えば、ハイブリダイゼーション、増幅、および／またはデータベース配列比較）を用いて同定され得る。
【０１０６】
（マイクロアレイ分析）
本発明の方法による検出に適切であるポリヌクレオチドは、以下にさらに詳細に記載されるように、組織および／または腫瘍関連発現（例えば、本明細書において提供される代表的なアッセイを用いて決定される場合、正常組織よりも腫瘍において少なくとも２倍大きい発現）についてｃＤＮＡのマイクロアレイをスクリーニングすることによって、同定され得る。このようなスクリーニングは、例えば、製造業者の指示に従って（そして、本質的には、Ｓｃｈｅｎａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　９３：１０６１４〜１０６１９（１９９６）およびＨｅｌｌｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　９４：２１５０〜２１５５（１９９７）に記載のように）、Ｓｙｎｔｅｎｉ　ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ（Ｐａｌｏ　Ａｌｔｏ，ＣＡ）を用いて、実施され得る。
【０１０７】
マイクロアレイは、多数の遺伝子を評価するための有効な方法であるが、その感度の限界に起因して、量の少ない遺伝子の絶対的な組織分布を正確に決定し得ないか、またはシグナル飽和に起因して、より豊富な遺伝子の過剰発現の程度を過小評価し得る。マイクロアレイ発現プロファイリングによる過剰発現を示すこれらの遺伝子について、ＴａｑｍａｎＴＭプローブ検出に基づいた定量的ＲＴ−ＰＣＲを用いてさらに分析を実施した。この分析はさらに大きいダイナミックレンジの感度を有する。この目的のために、正常および腫瘍組織、遠位転移、および細胞株のいくつかの異なるパネルを用いた。
【０１０８】
（定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応）
本発明による適切なポリヌクレオチドは、定量的ＰＣＲ方法（例えば、リアルタイムＰＣＲ方法（Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ　ＰＣＲ　ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ）など）を使用することによって、さらに特徴づけされるか、あるいは本来的に同定され得る。この方法論によって、組織および／または腫瘍のサンプル（例えば、転移性腫瘍サンプルなど）が、対応する正常組織サンプル、および／または関連しない正常組織サンプルのパネルと並べて試験され得る。
【０１０９】
リアルタイムＰＣＲ（Ｇｉｂｓｏｎら、Ｇｅｎｏｍｅ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　６：９９５〜１００１，１９９６；Ｈｅｉｄら、Ｇｅｎｏｍｅ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　６：９８６〜９９４，１９９６を参照のこと）は、増幅の間ＰＣＲ産物蓄積のレベルを評価する技術である。この技術は、多数のサンプルにおけるｍＲＮＡのレベルの定量的評価を可能にする。要するに、ｍＲＮＡは、腫瘍および正常組織から抽出され、そしてｃＤＮＡが標準的技術を用いて調製される。
【０１１０】
リアルタイムＰＣＲは、例えば、ＡＢＩ　７７００　Ｐｒｉｓｍか、またはＧｅｎｅＡｍｐ（登録商標）５７００配列決定システム（ＰＥ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ　Ｃｉｔｙ，ＣＡ）のいずれかで実施され得る。この７７００システムは、一端で５’蛍光レポーター色素を、そしてもう一方の端に３’クエンチャー色素を有する特異的プローブ（ＴａｑｍａｎＴＭ）と組み合わせて、フォワードプライマーおよびリバースプライマーを使用する。５’−３’ヌクレアーゼ活性を有するＴａｑ　ＤＮＡポリメラーゼを用いてリアルタイムＰＣＲを実施する場合、このプローブは切断され、そして蛍光の増大によって反応がモニターされることを可能にする蛍光を発光しはじめる（リアルタイム）。この５７００システムは、蛍光色素であるＳＹＢＲ（登録商標）グリーンを使用する。この蛍光色素は、７７００装置と同様、二本鎖ＤＮＡ、ならびに同じフォワードプライマーおよびリバースプローブにのみ結合する。マッチするプライマーおよび蛍光プローブは、プライマー発現プログラム（ＰＥ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ　Ｃｉｔｙ，ＣＡ）に従って設計され得る。プライマーおよびプローブの至適濃度は、当業者によって最初に決定される。コントロール（例えば、β−アクチン）プライマーおよびプローブは、例えば、Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ／Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ　Ｃｉｔｙ，ＣＡ）から市販され得る。
【０１１１】
サンプルにおける特異的ＲＮＡの量を定量するため、目的の遺伝子を含有するプラスミドを用いて標準曲線を作成する。標準曲線は、リアルタイムＰＣＲにおいて決定したＣｔ値を用いて作成する。この値は、このアッセイで使用した最初のｃＤＮＡ濃度に関係する。目的の遺伝子の１０〜１０６コピーにわたる標準希釈が一般に十分である。さらに、コントロール配列について標準曲線を作成する。これによって、比較目的で、コントロールの量に対して、組織サンプルの最初のＲＮＡ含量の標準化が可能になる。
【０１１２】
上記に従って、そしてさらに以下に記載されるように、本発明は、配列番号１、３、５〜７、１１、１３、１５、１７、１９〜２４、３０、３２、および７３〜７６に記載の配列を有する、代表的な乳房組織特異的、および／または胸部腫瘍特異的なポリヌクレオチドである、マンマグロビン（ｍａｍｍａｇｌｏｂｉｎ）、リポフィリンＢ、ＧＡＢＡπ（Ｂ８９９Ｐ）、Ｂ７２６Ｐ、Ｂ５１１Ｓ、Ｂ５３３Ｓ、Ｂ３０５Ｄ、およびＢ３１１Ｄ、癌、より詳細には、乳癌の検出において適切に使用され得る、配列番号２、４、８〜１０、１２、１４、１６、１８、２５〜２９、および３１および７７に記載のアミノ酸配列を有する、上記のポリヌクレオチドによってコードされる代表的ポリペプチド、を提供する。
【０１１３】
本明細書において開示される方法はまた、前立腺癌、乳癌、結腸癌、卵巣癌、肺癌、頭頸部癌、リンパ腫、白血病、黒色腫、肝癌、胃癌、腎癌、膀胱癌、膵臓癌、および子宮内膜癌が挙げられるがこれらに限定されない広範な癌の検出に適切であるさらなるポリヌクレオチドおよび／または代替的ポリヌクレオチドの同定を可能にする。
【０１１４】
（癌の検出方法）
一般的に、癌細胞は、患者から得られた生物学的サンプル（例えば、血液、リンパ節、骨髄、血清、精液、尿、および／または腫瘍生検）の細胞内における１つ以上のポリヌクレオチドの存在に基づいて、患者において検出され得る。言い換えれば、このようなポリヌクレオチドは、癌（例えば、乳癌など）の存在または非存在を示すマーカーとして用いられ得る。
【０１１５】
本明細書中にさらに詳細に議論されるように、本発明は、これらおよび他の関連する目的を、１つより多くのポリヌクレオチドの同時検出のための方法論を提供することによって達成し、このポリヌクレオチドの存在は、生物学的サンプルにおける癌細胞の存在の診断である。本明細書中に開示される種々の癌検出方法の各々は、共通して、１つ以上のオリゴヌクレオチドプライマーおよび／またはプローブをハイブリダイズする工程を有し、このハイブリダイゼーションは、腫瘍特異的および／または組織特異的なポリヌクレオチドの存在の実証である。意図される正確な用途に依存して、ゲノムＤＮＡのポリヌクレオチドに対して効力がない、イントロンにまたがる１つ以上のオリゴヌクレオチドを利用することが好ましく、従って、これらのオリゴヌクレオチドは、生物学的サンプル中のゲノムＤＮＡの検出を実質的に減少および／または排除する際に有効である。
【０１１６】
さらに、試験されるべき生物学的サンプルを、１つ以上の細胞捕獲方法および／または細胞枯渇方法に供することによって、これらの検出方法の感度を増大するための方法が、本明細書中に開示される。
【０１１７】
本発明の特定の実施形態において、以下の工程を用いることによって、患者における癌細胞の存在が決定され得る：（ａ）この患者から生物学的サンプルを得る工程；（ｂ）この生物学的サンプルを、第１のポリヌクレオチドにハイブリダイズする第１のオリゴヌクレオチドと接触させる工程であって、この第１のポリヌクレオチドは、配列番号７３および配列番号７４において示されるポリヌクレオチドからなる群から選択される、工程；（ｃ）この生物学的サンプルを、配列番号１、３、５〜７、１１、１３、１５、１７、１９〜２４、３０、３２、および７５からなる群から選択される第２のポリヌクレオチドにハイブリダイズする第２のオリゴヌクレオチドと接触させる工程；（ｄ）このサンプル中で、このオリゴヌクレオチドの少なくとも１つにハイブリダイズする一定量のポリヌクレオチドを検出する工程；ならびに（ｅ）このオリゴヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドの量を、予め決定したカットオフ値と比較し、そしてそれから、この患者における癌の存在または非存在を決定する工程。
【０１１８】
本発明の代替的実施形態は、以下の工程を利用して、患者における癌細胞の存在を決定する方法を提供する：（ａ）この患者から生物学的サンプルを得る工程；（ｂ）この生物学的サンプルを、第１のポリヌクレオチドにハイブリダイズする第１のオリゴヌクレオチドと接触させる工程であって、この第１のポリヌクレオチドは、配列番号７６に示される、工程；（ｃ）この生物学的サンプルを、配列番号１、３、５〜７、１１、１３、１５、１７、１９〜２４、３０、３２、および７５からなる群から選択される第２のポリヌクレオチドにハイブリダイズする第２のオリゴヌクレオチドと接触させる工程；（ｄ）このサンプル中で、このオリゴヌクレオチドの少なくとも１つにハイブリダイズする一定量のポリヌクレオチドを検出する工程；ならびに（ｅ）このオリゴヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドの量を、予め決定したカットオフ値と比較し、そしてそれから、この患者における癌の存在または非存在を決定する工程。
【０１１９】
本発明の他の実施形態は、患者における癌の存在または非存在を決定するための方法を提供する。このような方法は、以下の工程を包含する：（ａ）この患者から生物学的サンプルを得る工程；（ｂ）患者から得られたこの生物学的サンプルを、配列番号７３、配列番号７４および配列番号７６に示されるポリヌクレオチドからなる群から選択されるポリヌクレオチド配列にハイブリダイズする第１のオリゴヌクレオチドと接触させる工程；（ｃ）この生物学的サンプルを、配列番号７５に示されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする第２のオリゴヌクレオチドと接触させる工程；（ｄ）この生物学的サンプルを、配列番号５、配列番号６および配列番号７に示されるポリヌクレオチドからなる群から選択されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする第３のオリゴヌクレオチドと接触させる工程；（ｅ）この生物学的サンプルを、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３および配列番号２４に示されるポリヌクレオチドからなる群から選択されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする第４のオリゴヌクレオチドと接触させる工程；（ｆ）この生物学的サンプル中で、このオリゴヌクレオチドの少なくとも１つにハイブリダイズする一定量のポリヌクレオチドを検出する工程；ならびに（ｇ）このオリゴヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドの量を、予め決定したカットオフ値と比較し、そしてそれから、この患者における癌の存在または非存在を決定する工程。
【０１２０】
アッセイ条件下でハイブリダイゼーションを可能にするために、オリゴヌクレオチドプライマーおよびプローブは、少なくとも１０ヌクレオチド長、および好ましくは少なくとも２０ヌクレオチド長の胸部腫瘍タンパク質をコードするポリヌクレオチドの一部に対して、少なくとも約６０％、好ましくは少なくとも約７５％、およびより好ましくは少なくとも約９０％の同一性を有するオリゴヌクレオチド配列を含むべきである。好ましくは、オリゴヌクレオチドプライマーは、本明細書中に記載されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに、上記で規定されるような中程度のストリンジェント条件下でハイブリダイズする。本明細書中に記載される診断方法において有効に利用され得るオリゴヌクレオチドプライマーは、好ましくは、少なくとも１０〜４０ヌクレオチド長である、好ましい実施形態において、このオリゴヌクレオチドプライマーは、配列番号１、３、５〜７、１１、１３、１５、１７、１９〜２４、３０、３２および７３〜７６に列挙される配列を有するＤＮＡ分子のうち、少なくとも１０個連続したヌクレオチド、より好ましくは少なくとも１５個連続したヌクレオチドを含む。ＰＣＲベースのアッセイおよびハイブリダイゼーションアッセイの両方についての技術は、当該分野で周知である（例えば、Ｍｕｌｌｉｓら，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．，５１：２６３，１９８７；Ｅｒｌｉｃｈ編，ＰＣＲ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ　Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ，１９８９を参照のこと）。
【０１２１】
本発明はまた、患者における癌細胞の存在を検出するための、増幅ベースの方法を提供する。例示的な方法は、以下の工程を包含する：（ａ）生物学的サンプルを患者から得る工程；（ｂ）この生物学的サンプルを、第１のオリゴヌクレオチド対と接触させる工程であって、この第１の対は、第１のオリゴヌクレオチドおよび第２のオリゴヌクレオチドを含み、ここで、この第１のオリゴヌクレオチドおよび第２のオリゴヌクレオチドは、それぞれ、第１のポリヌクレオチドおよびその相補体にハイブリダイズする、工程；（ｃ）この生物学的サンプルを、第２のオリゴヌクレオチド対と接触させる工程であって、この第２の対は、第３のオリゴヌクレオチドおよび第４のオリゴヌクレオチドを含み、ここで、この第３および第４のオリゴヌクレオチドは、それぞれ、第２のポリヌクレオチドおよびその相補体にハイブリダイズし、そしてここで、この第１のポリヌクレオチドは、ヌクレオチド配列においてこの第２のポリヌクレオチドに対して無関係である、工程；（ｄ）第１のポリヌクレオチドおよび第２のポリヌクレオチドを増幅する工程；ならびに（ｅ）増幅された第１のポリヌクレオチドおよび増幅された第２のポリヌクレオチドを検出する工程；ここで、増幅された第１のポリヌクレオチドまたは増幅された第２のポリヌクレオチドの存在が、この患者における癌細胞の存在を示す。
【０１２２】
本発明に従う方法は、広範な種々の生物学的サンプル（例えば、血液、血清、リンパ節、骨髄、痰、尿および腫瘍生検サンプル）から得られるポリヌクレオチドの同定のために適切である。特定の好ましい実施形態において、生物学的サンプルは、血液、リンパ節または骨髄のいずれかである。本発明の他の実施形態において、リンパ節は、歩哨リンパ節であり得る。
【０１２３】
本発明の方法は、広範な種々の癌の検出において利用され得ることが明らかである。例示的な癌としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：前立腺癌、乳癌、結腸癌、卵巣癌、肺癌、頭部および頸部の癌、リンパ腫、白血病、黒色腫、肝臓癌、胃癌、腎癌、膀胱癌、膵臓癌および子宮内膜癌。
【０１２４】
本発明の特定の例示的な実施形態は、検出されるべきポリヌクレオチドが、マンマグロブリン（ｍａｍｍａｇｌｏｂｉｎ）、リポフィリンＢ、ＧＡＢＡπ（Ｂ８９９Ｐ）、Ｂ７２６Ｐ、Ｂ５１１Ｓ、Ｂ５３３Ｓ、Ｂ３０５ＤおよびＢ３１１Ｄからなる群から選択される方法を提供する。あるいは、および／またはさらに、検出されるべきポリヌクレオチドは、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号３０、配列番号３２、および配列番号７６に記載されるポリヌクレオチドからなる群から選択され得る。
【０１２５】
本発明の方法に従って使用され得る、適切な例示的なオリゴヌクレオチドプローブおよび／またはプライマーは、配列番号３３〜３５および６３〜７２によって本明細書中に開示される。ゲノムＤＮＡのバックグラウンドの検出を排除する、特定の好ましい実施形態において、このオリゴヌクレオチドは、イントロンにまたがるオリゴヌクレオチドであり得る。本明細書中に開示される種々のポリヌクレオチドの検出に適切な、例示的なイントロンにまたがるオリゴヌクレオチドは、配列番号３６〜６２に示される。
【０１２６】
意図される正確な適用に依存して、当業者は、放射性標識を検出し、そして蛍光体を検出することによって、組織特異的および／または腫瘍特異的なポリヌクレオチドの検出を選び得る。より詳細には、このオリゴヌクレオチドプローブおよび／またはプライマーは、例えば、放射性標識および／または発蛍光団のような検出可能な部分を含み得る。
【０１２７】
あるいは、またはさらに、本発明の方法はまた、組織特異的および／または腫瘍特異的ポリヌクレオチドの検出の前に、分画する工程（例えば、電気泳動によって）を包含し得る。
【０１２８】
他の実施形態において、本明細書中に記載の方法は、癌の進行のモニターに関して用いられ得る。これらの実施形態により、癌の診断に提供されるアッセイは、経時的に行われ得、そして反応性ポリペプチドまたはポリヌクレオチドのレベルの変化が評価され得る。例えば、このアッセイは、６ヶ月〜１年の期間にわたり、２４〜７２時間ごとに行われ得、それ以降は、必要時に行われ得る。一般に、癌は、検出されるポリペプチドまたはポリヌクレオチドのレベルが時間がたつにつれて増大する患者において進行している。対照的に、反応性ポリペプチドまたはポリヌクレオチドのレベルが一定のままか、または時間とともに減少しているかのいずれかである場合は、癌は進行していない。
【０１２９】
特定のインビボ診断アッセイは、腫瘍に対して直接行われ得る。１つのこのようなアッセイは、腫瘍細胞を結合薬剤と接触させる工程を包含する。次いで、この結合した結合薬剤は、レポーター基を介して直接的または間接的に検出され得る。このような結合薬剤はまた、組織学的適用において用いられ得る。あるいは、ポリヌクレオチドプローブがこのような適用内で用いられ得る。
【０１３０】
上記のように、感度を改善するために、複数の胸部腫瘍タンパク質マーカーが所定のサンプル内でアッセイされ得る。本明細書中で提供される異なるタンパク質に特異的な結合薬剤が１つのアッセイ内で組み合わされ得ることは明らかである。さらに、複数のプライマーまたはプローブが同時に用いられ得る。腫瘍タンパク質マーカーの選択は、最適感度を生じる組み合わせを決定するための慣用的な実験に基づき得る。さらに、または代わりに、本明細書中に提供される腫瘍タンパク質についてのアッセイは、他の公知の腫瘍抗原についてのアッセイと組み合わされ得る。
【０１３１】
（細胞富化）
本発明の他の局面において、細胞捕捉技術は、本明細書中に開示される種々の検出方法論の感度を改善するために、ポリヌクレオチド検出の前に用いられ得る。
【０１３２】
例示的な細胞富化方法論は、細胞表面マーカーに対する特異的モノクローナル抗体もしくは４量体抗体複合体でコーティングされた免疫磁性ビーズを用い、この方法論は、サンプル中の癌細胞を最初に富化するか、もしくはサンプル中の癌細胞をポジティブに選択するために用いられ得る。種々の市販のキットが用いられ得る。これらのキットとしては、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ　Ｅｎｒｉｃｈ（Ｄｙｎａｌ　Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｏｓｌｏ、Ｎｏｒｗａｙ）、ＳｔｅｍＳｅｐＴＭ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，ＢＣ）、およびＲｏｓｅｔｔｅＳｅｐ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）が挙げられる。当業者は、他の容易に利用可能な方法論およびキットが適切に用いられて、所望の細胞集団が富化またはポジティブに選択され得ることを認識する。
【０１３３】
Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ　Ｅｎｒｉｃｈは、正常上皮組織および新生物上皮組織上で発現された２つの糖タンパク質膜抗原に特異的なｍＡｂでコーティングされた磁性ビーズを含む。このコーティングされたビーズをサンプルに添加し得、次いで、このサンプルを磁石に接触させ得、それによりこのビーズに結合した細胞を捕捉し得る。所望でない細胞は洗い流され、磁石により単離された細胞は、ビーズから溶出され、さらなる分析において用いられる。
【０１３４】
ＲｏｓｅｔｔｅＳｅｐは、血液サンプルから直接細胞を富化するために用いられ得、そして種々の所望でない細胞を標的とし、そしてサンプル中に存在する赤血球（ＲＢＣ）上のグリコホリンＡにそれらを架橋して、ロゼットを形成する４量体の抗体のカクテルからなる。Ｆｉｃｏｌｌ上で遠心分離すると、標的とした細胞は、遊離のＲＢＣとともにペレットを形成する。
【０１３５】
枯渇カクテルにおける抗体の組み合わせは、どの細胞が除去され、そして同時にどの細胞が回収されるかを決定する。利用可能な抗体としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ１０、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２４、ＣＤ２５、ＣＤ２９、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３６、ＣＤ３８、ＣＤ４１、ＣＤ４５、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ５６、ＣＤ６６Ｂ、ＣＤ６６ｅ、ＨＬＡ−ＤＲ、ＩｇＥ、およびＴＣＲαβ。さらに、本発明において、胸部腫瘍抗原に特異的なｍＡｂが開発され得、そして同様な様式で用いられ得ることが意図される。例えば、腫瘍特異的細胞表面抗原に結合するｍＡｂは、磁性ビーズに結合体化され得るか、または４量体抗体複合体に処方され得、そしてサンプルから転移性の胸部腫瘍細胞を富化するか、またはポジティブに選択するために用いられ得る。
【０１３６】
一旦サンプルが富化されるか、またはポジティブに選択されると、細胞はさらにアッセイされ得る。例えば、これらの細胞は、溶解され得、そしてＲＮＡが単離され得る。次いで、ＲＮＡは、本明細書中に記載のようにリアルタイムＰＣＲアッセイにおいて胸部腫瘍特異的多重プライマーを用いてＲＴ−ＰＣＲ分析に供され得る。
【０１３７】
本発明の別の局面において、細胞捕捉技術は、リアルタイムＰＣＲとともに用いられて、胸部腫瘍抗原を発現する転移性細胞の検出のためのより感度の高いツールを提供し得る。骨髄サンプル、末梢血サンプル、および少量の針吸引サンプル中の乳癌細胞の検出は、乳癌患者における診断および予後のために望ましい。
【０１３８】
（プローブおよびプライマー）
上記のように、および本明細書中でさらに詳細に記載されるように、本発明に従う特定の方法、組成物およびキットは、癌の検出のために２以上のオリゴヌクレオチドプライマー対を利用する。このような核酸プローブが目的の配列に特異的にハイブリダイズする能力により、これらの核酸プローブは生物学的サンプル中の相補的配列の存在を検出する際に有用になる。
【０１３９】
あるいは、他の実施形態において、本発明のプローブおよび／またはプライマーは、核酸ハイブリダイゼーションを介した検出のために用いられ得る。このようにして、検出されるポリヌクレオチドの１５ヌクレオチドの長さの連続する配列と同じ配列を有するか、またはこの配列に相補的な、少なくとも約１５ヌクレオチドの長さの連続する配列の配列領域を含む核酸セグメントが特定の有用性を見出すことが意図される。より長い連続する同一の配列または相補的な配列、例えば、約２０、３０、４０、５０、１００、２００、５００、１０００の配列（全ての中間の長さを含む）および全長までの長さの配列すらもまた、特定の実施形態において有用である。
【０１４０】
検出されるポリヌクレオチドに同一またはこのポリヌクレオチドに相補的な、１０〜１４、１５〜２０、３０、５０、または１００〜２００ヌクレオチド程度（中間の長さも同様に含む）の連続するヌクレオチドのストレッチからなる配列領域を有するオリゴヌクレオチドプライマーは、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲＴＭ）のような増幅反応において使用するためのプライマーとして特に意図される。これは、例えば、血液、リンパ節および骨髄のような異なる生物学的サンプルにおいて、ポリヌクレオチドを分析することを可能にする。
【０１４１】
約１５〜２５ヌクレオチド長のプライマーを使用することにより、安定かつ選択的な二重鎖分子の形成が可能になる。１５塩基を超える長さのストレッチにわたって連続する相補的配列を有する分子が一般に好ましいが、ハイブリッドの安定性および選択性を増大するために、そしてこれにより得られた特定のハイブリッド分子の質および程度を改善する。当業者は、一般に、１５〜２５の連続するヌクレオチド、または所望される場合よりさらに長い遺伝子相補的ストレッチを有するプライマーを設計することを好む。
【０１４２】
検出されるポリヌクレオチドの任意の部分から、プライマーが選択され得る。当業者がプライマーとして利用しようと考える、配列番号１、３、５〜７、１１、１３、１５、１７、１９〜２４、３０、３２、７３〜７５（それぞれ、図３〜６）および配列番号７６（リポフィリンＢ）に示される例示的ポリヌクレオチド、またはこれらの配列の任意の連続する部分、約１５〜２５ヌクレオチド長から全長配列まで（および全長配列を含む）のような配列を検討することのみが必要とされる。プライマー配列の選択は、種々の因子により支配され得る。例えば、当業者は、完全な配列の末端に対するプライマーを用いようとし得る。本明細書中に開示される例示的プライマーは、必要に応じて、目的のポリヌクレオチド全体（例えば、配列番号１、３、５〜７、１１、１３、１５、１７、１９〜２４、３０、３２、７３〜７５（それぞれ、図３〜６）および配列番号７６（リポフィリンＢ）に示される配列）の相補的ストレッチと二重鎖分子を選択的に形成するその能力のために使用され得る。
【０１４３】
本発明はさらに、配列番号３３〜７１に示される、癌の検出のための本発明の方法に従って使用され得る（本明細書中でさらに詳細に記載される）種々の例示的オリゴヌクレオチドプライマーおよびプローブのヌクレオチド配列を提供する。
【０１４４】
本発明に従うオリゴヌクレオチドプライマーは、当業者に一般に利用可能な方法（例えば、自動化オリゴヌクレオチド合成機を用いて一般に行われるように、化学的手段によりプライマーを直接合成することを含む）により慣用的に容易に調製され得る。想定される適用に依存して、当業者は、代表的には、種々の条件のハイブリダイゼーションを用いて、標的配列に対するプローブの種々の程度の選択性を達成することを望む。高い選択性を要する適用に関して、当業者は、代表的には、ハイブリッドを形成するために比較的ストリンジェントな条件を用いることを望む（例えば、当業者は、約５０℃〜７０℃の温度で、約０．０２Ｍ〜約０．１５Ｍの塩の塩濃度により提供されるような、比較的低い塩条件および／または高い温度条件を選択する）。このような選択条件は、存在するとすれば、プローブとテンプレートまたは標的鎖との間のわずかなミスマッチを許容し、そして関連する配列を単離するために特に適切である。
【０１４５】
（ポリヌクレオチド増幅技術）
ガンの検出ために本明細書に概説される具体的な実施形態の各々は、１つ以上のオリゴヌクレオチドプライマーおよび／またはプローブのハイブリダイゼーションを介する、組織および／または腫瘍特異的ポリヌクレオチドの検出において共通する。生物学的サンプル中に存在するガン細胞の相対数および／または各ガン細胞内でのポリヌクレオチドの発現レベルのような因子に依存して、検出の工程を行う前に、増幅工程を行うことが好ましい。例えば、少なくとも２つのオリゴヌクレオチドプライマーが、生物学的サンプルに由来する胸部腫瘍ｃＤＮＡの一部を増幅するためにポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に基づくアッセイにおいて利用され得る。ここで、少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプライマーは、胸部腫瘍タンパク質をコードするポリヌクレオチドに対して特異的である（すなわち、ハイブリダイズする）。その増幅されたｃＤＮＡは、必要に応じて、例えば、ゲル電気泳導のような分画工程に供され得る。
【０１４６】
多数の鋳型依存性プロセスが、サンプル中に存在する目的の標的配列を増幅するために利用可能である。最も良く知られている増幅方法の１つは、米国特許第４，６８３，１９５号、同第４，６８３，２０２号、および同第４，８００，１５９号（これらの各々は、その全体が本明細書中に参考として援用される）に詳述されるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲＴＭ）である。簡単には、ＰＣＲＴＭにおいて、標的配列の反対の相補鎖上の領域に相補的である２つのプライマー配列が調製される。過剰のデオキシヌクレオシドトリホスフェートが、ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｔａｑポリメラーゼ）とともに反応混合物中に添加される。その標的配列がサンプル中に存在する場合、そのプライマーは、その標的に結合し、そしてそのポリメラーゼにより、プライマーがその標的配列に沿って、ヌクレオチドを付加することによって伸長する。反応混合物の温度を上げることおよび下げることによって、その伸長プライマーは、標的から解離して反応産物を形成し、過剰のプライマーは、標的およびその反応産物に結合し、そしてそのプロセスが繰り返される。好ましくは、逆転写およびＰＣＲＴＭ増幅手順が、増幅されたｍＲＮＡの量を定量するために行われ得る。ポリメラーゼ連鎖反応法は、当該分野で周知である。
【０１４７】
ポリヌクレオチド増幅のための１つの好ましい方法は、ＲＴ−ＰＣＲを利用し、これにおいてＰＣＲが、逆転写と組み合わせて適用される。代表的には、ＲＮＡが生物学的サンプル（例えば、血液、血清、リンパ節、骨髄、痰、尿、および腫瘍生検サンプル）から抽出され、そして逆転写されてｃＤＮＡ分子を生成する。少なくとも１つの特異的プライマーを使用するＰＣＲ増幅は、ｃＤＮＡ分子を生成し、これは、例えば、ゲル電気泳導を使用して分離されて、可視化され得る。増幅は、患者およびガンに罹患していない個体由来の生物学的サンプル上で行われ得る。その増幅反応は、２オーダーの大きさにわたるｃＤＮＡの数倍希釈に対して行われ得る。数倍希釈の試験患者サンプルにおいて、非ガンサンプルの同じ希釈に比較して、発現の２倍以上の増大は、代表的には陽性と考えられる。
【０１４８】
種々の商業的に利用可能なキットのいずれもが、増幅工程を行うために使用され得る。１つのこのような増幅技術は、制限酵素を使用してその遺伝子の既知の領域においてフラグメントを生成する逆ＰＣＲ（Ｔｒｉｇｌｉａら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．１６：８１８６，１９８８）である。次いで、そのフラグメントは、分子内ライゲーションによって環状化され、そして既知の領域に由来する広範なプライマーを使用するＰＣＲのためのテンプレートとして使用される。代替のアプローチにおいて、部分配列に隣接する配列は、リンカー配列に対するプライマーおよび既知の領域に特異的なプライマーを用いて増幅することによって回収され得る。その増幅された配列は、代表的には、同じリンカープライマーおよびその既知の領域に特異的な二次プライマーを用いて二回目の増幅に供される。この手順に対する改変（その既知の配列から反対方向に伸長を開始する２つのプライマーを利用する）は、ＷＯ９６／３８５９１に記載される。別のこのような技術は、「ｃＤＮＡ末端の迅速増幅」または「ＲＡＣＥ」として公知である。この技術は、既知の配列の５’および３’である配列を同定するために、ｐｏｌｙＡ領域またはベクター配列にハイブリダイズする内部プライマーおよび外部プライマーの使用を含む。さらなる技術には、捕捉ＰＣＲ（Ｌａｇｅｒｓｔｒｏｍら、ＰＣＲ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ａｐｐｌｉｃ．１：１１１−１９、１９９１）およびウォーキングＰＣＲ（Ｐａｒｋｅｒら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．１９：３０５５−６０，１９９１）が含まれる。増幅を利用する他の方法は、全長ｃＤＮＡ配列を得るためにも利用され得る。
【０１４９】
増幅のための別の方法は、Ｅｕｒ．Ｐａｔ．Ａｐｐｌ．Ｐｕｂｌ．Ｎｏ．３２０，３０８（その全体が本明細書において特に参考として援用される）に開示されるリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲと呼ばれる）である。ＬＣＲにおいて、２つの相補的なプローブ対が調製され、そして標的配列の存在下で、各対は、それらが隣接するように、標的の反対側の相補鎖に結合する。リガーゼの存在下において、その２つのプローブ対は、単一のユニットを形成するために連結する。ＰＣＲＴＭと同様に、温度サイクリングによって、結合したリガンドユニットは、その標的から解離し、次いで、過剰のプローブ対のライゲーションのための「標的配列」として作用する。米国特許第４，８８３．７５０号（その全体が参考として本明細書に援用される）は、標的配列に対してプローブ対を結合するためのＬＣＲに類似する代替の増幅方法を記載する。
【０１５０】
ＰＣＴ国際特許出願公開ＰＣＴ／ＵＳ８７／００８８０（その全体が参考として本明細書に援用される）に記載されるＱｂｅｔａ　Ｒｅｐｌｉｃａｓｅもまた、本発明においてなお別の増幅方法として使用され得る。この方法において、標的の複製的配列に相補的な領域を有するＲＮＡの複製的配列が、ＲＮＡポリメラーゼの存在下でサンプルに添加される。そのポリメラーゼは、次いで検出され得る複製的配列を複写する。
【０１５１】
制限エンドヌクレアーゼおよびリガーゼが、制限部位の１つの鎖のヌクレオチド５’−［α−チオ］トリホスフェートを含有する標的分子の増幅を達成するために使用される等温増幅法（Ｗａｌｋｅｒら、１９９２、その全体が本明細書中に参考として援用される）もまた、本発明における核酸の増幅において有用であり得る。
【０１５２】
鎖置換増幅（ＳＤＡ）は、多数回の鎖置換および合成（すなわち、ニックトランスレーション）を含む核酸の等温増幅を行う別の方法である。修復連鎖反応（ＲＣＲ）と呼ばれる同様の方法は、本発明において有用であり得る増幅の別の方法であり、増幅のために標的化された領域にわたる数種のプローブをアニーリングすること、および、続いて、４つの塩基のうちの２つのみが存在する修復反応を包含する。他の２つの塩基は、簡単な検出のためのビオチン化誘導体として添加され得る。同様のアプローチがＳＤＡにおいて使用される。
【０１５３】
配列はまた、環状プローブ反応（ＣＰＲ）を使用して検出され得る。ＣＰＲにおいて、非標的ＤＮＡの３’および５’配列およびその標的タンパク質特異的ＲＮＡの内部または「中間」配列を有するプローブが、サンプル中に存在するＤＮＡにハイブリダイズする。ハイブリダイゼーションの際、その反応は、ＲＮａｓｅＨで処理され、そしてそのプローブの産物は、消化後に放出されるシグナルを生成することによって明確な産物として同定される。そのオリジナルのテンプレートは、別のサイクリングプローブにアニーリングし、そしてその反応が繰り返される。このようにして、ＣＰＲは、標的遺伝子特異的に発現された核酸に対するプローブのハイブリダイゼーションによって生成されたシグナルを増幅することを包含する。
【０１５４】
Ｇｒｅａｔ　Ｂｒｉｔａｉｎ　Ｐａｔ．Ａｐｐｌ．Ｎｏ．２２０２３２８およびＰＣＴ／ＵＳ８９／０１０２５（これらの各々はその全体が参考として本明細書中にて援用される）に記載されるなお他の増幅法は、本発明に従って使用され得る。前者の出願では、「改変された」プライマーは、ＰＣＲ様のテンプレートおよび酵素依存的合成において使用される。そのプライマーは、捕捉部分（例えば、ビオチン）および／または検出部分（例えば、酵素）で標識することによって改変され得る。後者の出願では、過剰の標識されたプローブがサンプルに添加される。標的配列の存在下で、そのプローブが結合し、そして触媒により切断される。切断後、その標的配列が過剰のプローブによって結合されるようにインタクトのまま放出される。その標識されたプローブの切断は、その標的配列の存在の指標である。
【０１５５】
他の核酸増幅手順には、転写ベースの増幅システム（ＴＡＳ）（Ｋｗｏｈら、１９８９；ＰＣＴ国際特許出願公開ＷＯ８８／１０３１５、その全体が本明細書中で参考として援用される）が含まれ、これには、核酸配列ベースの増幅（ＮＡＳＢＡ）および３ＳＲが含まれる。ＮＡＳＢＡでは、核酸が、サンプルの標準的なフェノール／クロロホルム抽出、熱変性、溶解緩衝液での処理、およびＤＮＡおよびＲＮＡの単離のためのミニスパンカラム、またはＲＮＡの塩化グアニジウム抽出による増幅のために調製され得る。これらの増幅技術には、その標的配列に特異的な配列を有するプライマーのアニーリングが含まれる。ポリマー化後、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドは、ＲＮａｓｅＨで消化され、一方、二本鎖ＤＮＡ分子が、再び熱変性される。いずれかの場合において、その単一鎖ＤＮＡは、第二の標的特異的プライマーの付加およびその後のポリマー化によって完全に二本鎖にされる。次いで、その二本鎖ＤＮＡ分子は、Ｔ７またはＳＰ６のようなポリメラーゼによって多重に転写される。等温サイクリック反応において、そのＲＮＡは、ＤＮＡに逆転され、そしてＴ７またはＳＰ６のようなポリメラーゼによって再び転写される。得られた産物は、短縮型であろうと完全型であろうと、標的特異的配列を示す。
【０１５６】
その全体が本明細書によって参考として援用される、欧州特許出願番号３２９，８２２は、一本鎖ＲＮＡ（「ｓｓＲＮＡ」）、ｓｓＤＮＡ、および二本鎖ＤＮＡ（「ｄｓＤＮＡ］）（これらは、本発明に従って使用され得る）を周期的に合成する工程を包含する、核酸増幅プロセスを開示する。ｓｓＲＮＡは、第一のプライマーオリゴヌクレオチドのための第一のテンプレートであり、これは、逆転写酵素（ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ）によって伸長される。次いで、このＲＮＡは、生じたＤＮＡ：ＲＮＡ二本鎖から、リボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅＨ、ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれかとの二本鎖におけるＲＮＡに特異的であるＲＮａｓｅ）の作用によって、除去される。生じたｓｓＤＮＡは、第二のプライマーのための第二のテンプレートであり、これはまた、そのテンプレートに対する相同性に対して、ＲＮＡポリメラーゼプロモーター（Ｔ７　ＲＮＡプロモーターによって例示される）５’の配列を含む。次いで、このプライマーは、ＤＮＡポリメラーゼ（Ｅ．ｃｏｌｉのＤＮＡポリメラーゼＩの大きい「クレノウ」フラグメントによって例示される）によって伸長され、二本鎖ＤＮＡ（「ｄｓＤＮＡ」）分子として生じ、プライマー間の元のＲＮＡの配列と同一の配列を有し、そしてさらに、一端でプロモーター配列を有する。このプロモーター配列は、適切なＲＮＡポリメラーゼによって使用されて、ＤＮＡの多くのＲＮＡコピーを作製し得る。次いで、これらのコピーは、再びサイクルに入って、非常に迅速な増幅を生じ得る。酵素の適切な選択によって、この増幅は、各サイクルでの酵素の添加なしに等温的になされ得る。このプロセスの周期的な性質に起因して、開始配列は、ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれかの形態であるように選択され得る。
【０１５７】
本明細書中でその全体が参考として援用されるＰＣＴ公開特許出願番号ＷＯ８９／０６７００は、標的一本鎖ＤＮＡ（「ｓｓＤＮＡ」）に対するプロモーター／プライマー配列のハイブリダイゼーションに基づいた核酸配列増幅スキーム、それに続くこの配列の多くのＲＮＡコピーの転写を開示する。このスキームは、周期的ではない。すなわち、新しい温度が、生じたＲＮＡ転写物から生成されない。他の増幅方法は、当業者に周知の「ＲＡＣＥ」（Ｆｒｏｈｍａｎ、１９９０）および「一面（ｏｎｅ−ｓｉｄｅ）ＰＣＲ」（Ｏｈａｒａ、１９８９）を含む。
【０１５８】
（癌の検出のための組成物およびキット）
本発明はさらに、上記の診断方法のいずれかにおける使用のためのキットを提供する。このようなキットは、代表的には、診断アッセイの実行のために必要な２つ以上の成分を含む。この成分は、化合物、試薬、容器および／または装置であり得る。例えば、キット内の１つの容器は、乳癌タンパク質に特異的に結合するモノクローナル抗体またはそのフラグメントを含み得る。このような抗体またはフラグメントは、上記のような支持体材料に付着されて提供され得る。１つ以上のさらなる容器は、アッセイにおいて使用される構成要素（例えば、試薬または緩衝液）を封入する。このようなキットはまた、あるいは、抗体結合の直接的または間接的な検出のために適切なレポーター基を含む、上記のような検出試薬を含む。
【０１５９】
本発明はまた、本発明の検出方法の実行のために適切なキットを提供する。例示的なキットは、その各々が別個のポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド対を含む。特定の実施形態において、本発明に従ったキットはまた、核酸ポリメラーゼおよび適切な緩衝液を含み得る。本発明のキットのために適切な、例示的なオリゴヌクレオチドプライマーは、配列番号３３〜７１によって本明細書中に開示される。本発明のキットに適切な例示的なオリゴヌクレオチドプライマーは、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号３０、配列番号３２、およびリポフィリンＢに開示される。
【０１６０】
あるいは、キットは、生物学的なサンプル中の乳癌タンパク質をコードするｍＲＮＡのレベルを検出するために設計され得る。このようなキットは一般に、乳癌タンパク質をコードするポリペプチドにハイブリダイズする、上記のような少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプローブまたはプライマーを含む。このようなオリゴヌクレオチドが、例えば、ＰＣＲまたはハイブリダイゼーションアッセイにおいて使用され得る。このようなキット内に存在し得るさらなる成分は、第二のオリゴヌクレオチドおよび／もしくは診断試薬、または乳癌タンパク質をコードするポリヌクレオチドの検出を容易にするための容器を含む。
【０１６１】
他の関連する局面において、本発明はさらに、本明細書中に開示された方法において有用な組成物を提供する。例示的な組成物としては、その各々が別個のポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズする、２つ以上のオリゴヌクレオチドプライマー対を含む。本発明の組成物のために適切な例示的なオリゴヌクレオチドプライマーは、配列番号３３〜７１によって本明細書中に開示される。本発明の組成物に適切な例示的なポリヌクレオチドは、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号３０、配列番号３２、およびリポフィリンＢに開示される。
【０１６２】
以下の実施例は、例示のために提供され、限定のためではない。
【０１６３】
（実施例）
（実施例１）
（ディファレンシャルディスプレイ）
本実施例は、乳癌において過剰発現するポリヌクレオチドを富化するためのディファレンシャルディスプレイの使用を開示する。
【０１６４】
ディファレンシャルディスプレイを、文献（例えば、その全体が本明細書によって参考として援用される、Ｌｉａｎｇ，Ｐら、Ｓｃｉｅｎｃｅ　２５７：９６８７−９７１（１９９３）を参照のこと）中に記載のように、以下の改変と共に実施した：（ａ）ＰＣＲ増幅産物を、銀染色ゲル上で可視化した（ｂ）組織の遺伝的に適合した対を使用して、多型改変体を除外した（ｃ）ｃＤＮＡの２つの異なる希釈を、テンプレートとして使用して、任意の希釈の影響を除外した（その全体が本明細書によって参考として援用される、Ｍｏｕ，Ｅ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ　Ｂｉｏｐｈｙ　Ｒｅｓ　Ｃｏｍｍｕｎ．１９９：５６４−５６９（１９９４）を参照のこと）。
【０１６５】
（実施例２）
（ｃＤＮＡサブトラクションライブラリーの調製）
本実施例は、乳癌特異的なポリヌクレオチドが富化された、乳癌ｃＤＮＡサブトラクションライブラリーの調製を開示する。
【０１６６】
ｃＤＮＡライブラリーサブトラクションを、いくつかの改変と共に、記載されたように実行した。その全体が本明細書によって参考として援用される、Ｈａｒａ，Ｔ．ら、Ｂｌｏｏｄ　８４：１８９−１９９（１９９４）を参照のこと。３つの乳癌のプールから作製した、乳癌ライブラリー（トレーサー）を、乳癌特異的な遺伝子を同定するために、正常な乳房ライブラリー（ドライバー）で差し引いた。より最近の差し引きは、共通の遺伝子をより効率的に差し引くために、１つの「免疫学的」組織（例えば、脾臓、リンパ節、またはＰＢＭＣ）に沿った重要な組織上の強調と共に、ドライバーとして６〜１０の正常組織を使用して、腫瘍におけるリンパ球浸潤由来のｃＤＮＡの除去において評価した。この乳癌特異的な差し引かれたｃＤＮＡライブラリーを、以下のように作製した：ドライバーｃＤＮＡライブラリーをＥｃｏＲＩ、ＮｏｔＩ、およびＳｆｕＩ（ＳｆｕＩは、ベクターを切断する）で消化し、ＤＮＡポリメラーゼクレノウフラグメントで満たした。フェノール−クロロホルム抽出およびエタノール沈殿の後、ＤＮＡをＰｈｏｔｏｐｒｏｂｅビオチンで標識してＨ２Ｏに溶解させた。トレーサーｃＤＮＡライブラリーを、ＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩで消化し、フェノール−クロロホルムで抽出し、Ｃｈｒｏｍａ　ｓｐｉｎ−４００カラムを通し、エタノールで沈殿させ、そしてハイブリダイゼーションのために６８℃で２０時間（長時間ハイブリダイゼーション（ＬＨ））ドライバーＤＮＡと混合した。次いで、この反応混合物を、合計４回のストレプトアビジン処理、続くフェノール／クロロホルム抽出に供した。差し引いたＤＮＡを沈殿し、そして再びドライバーＤＮＡと６８℃２時間のハイブリダイゼーション（短時間ハイブリダイゼーション（ＳＨ））に供した。ビオチン化二本鎖ＤＮＡの除去後に、差し引いたｃＤＮＡを、クロラムフェニコール耐性ｐＢＣＳＫ＋のＢａｍＨＩ／ＸｈｏＩ部位に連結し、そしてＥｌｅｃｔｒｏＭａｘ　Ｅ．ｃｏｌｉ　ＤＨ１０Ｂ細胞にエレクトロポレーションによって形質導入して、差し引いたｃＤＮＡライブラリーを生成した。多くはない乳癌特異的遺伝子をクローニングするために、ドライバーｃＤＮＡライブラリーとこれら多くのｃＤＮＡとを有するトレーサーｃＤＮＡライブラリーを初期サブトラクションから差し引くことによって、ｃＤＮＡライブラリーサブトラクションを反復した。これは、これら多くの配列の欠失および多くはない配列を含むサブトラクションライブラリーの生成を生じた。
【０１６７】
差し引かれたｃＤＮＡライブラリーを分析するために、プラスミドＤＮＡを、１００〜２００の独立したクローンから調製した。これらのクローンは、差し引きされたライブラリーから無作為に選択され、そしてＤＮＡ配列決定によって、特徴付けられた。決定されたｃＤＮＡおよび単離されたｃＤＮＡについての予測アミノ酸配列を、最も新しいＧｅｎｂａｎｋデータベースおよびヒトＥＳＴデータベースを使用して公知の配列と比較した。
【０１６８】
（実施例３）
（ＰＣＲサブトラクション）
本実施例は、胸部腫瘍特異的ポリヌクレオチドを富化するためのＰＣＲサブトラクションを開示する。
【０１６９】
ＰＣＲサブトラクションを、実質的に文献に記載されるように実施した。Ｄｉａｔｃｈｅｎｋｏ，Ｌ．ら、Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ．９３：６０２５−６０３０（１９９６）およびＹａｎｇ，Ｇ．Ｐ．ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ　ａｃｉｄ　Ｒｅｓ．２７：１５１７−２３（１９９９）（これらの全体が参考として本明細書中に援用される）を参照のこと。簡単には、この型のサブトラクションは、２つの異なるアダプターを制限酵素消化したテスター（胸部腫瘍）ｃＤＮＡサンプルの異なるアリコートに連結し、それに続いてこれらのテスターを過剰なドライバー（アダプターなし）と別々に混合することによって作用する。この第一のハイブリダイゼーションは、一本鎖テスター特異的ｃＤＮＡの正規化をもたらし、これは、ハイブリダイゼーションの二番目の反応速度論に起因する。次いで、これらの別個のハイブリダイゼーション反応を変性なしに混合し、そして第二のハイブリダイゼーションを行ない、標的分子；異なるアダプターの両方を含む二本鎖ｃＤＮＡフラグメントを産生する。２回のＰＣＲを行い、これは標的集団分子（正規化されたテスター特異的ｃＤＮＡ）の対数的増幅をもたらすが、他のフラグメントは、増幅しないかまたは直線的様式で増幅したのみのいずれかであった。実施したサブトラクションは、正常乳房のプールを差し引かれた胸部腫瘍のプールおよびＰＢＭＣ、脳、膵臓、肝臓、小腸、胃、心臓および腎臓を含む正常組織のプールを差し引かれた胸部腫瘍のプールを含んだ。
【０１７０】
ｃＤＮＡ合成の前に、ＲＮＡを、ＲＮａｓｉｎ（Ｐｒｏｍｅｇａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）存在下で、ＤＮａｓｅＩ（Ａｍｂｉｏｎ）で処理し、ＤＮＡの夾雑物を除去した。リアルタイムＰＣＲ組織パネルにおける利用のためのｃＤＮＡを、ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩ逆転写酵素（Ｇｉｂｃｏ　ＢＲＬ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ）を含む２５μｌのＯｌｉｇｏ　ｄＴ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｂｅｉｍ）プライマーを使用して調製した。
【０１７１】
（実施例４）
（乳房特異的抗原を使用する胸部腫瘍の検出）
乳房特異的抗原Ｂ５１１ＳおよびＢ５３３Ｓの単離および特徴づけは、米国特許出願０９／３４６，３２７（１９９９年７月２日出願）に開示される。この開示は、その全体が参考として本明細書中に援用される。Ｂ５１１Ｓについて決定したｃＤＮＡ配列を、配列番号３０に示し、対応するアミノ酸配列を、配列番号３１に示す。Ｂ５３３Ｓについて決定されたｃＤＮＡ配列を、配列番号３２に示す。乳房特異的抗原Ｂ７２６Ｐの単離および特徴づけは、米国特許出願０９／２８５，４８０（１９９９年４月２日出願）および同０９／４３３，８２６（１９９９年１１月３日出願）に開示され、この開示は、その全体が参考として本明細書中に援用される。
【０１７２】
Ｂ７２６Ｐのスプライシング改変体について決定したｃＤＮＡ配列を、配列番号１３、１５、１７および１９〜２４に示し、対応するアミノ酸配列を、配列番号１４、１６、１８および２５〜２９に示す。
【０１７３】
乳房特異的抗原Ｂ３０５Ｄ（ＡおよびＣを形成する）の単離および特徴づけは、米国特許出願０９／４２９，７５５（１９９９年１０月２８日出願）に記載されており、この開示はその全体が参考として本明細書中に援用される。Ｂ３０５ＤアイソフォームＡおよびＣについて決定したｃＤＮＡ配列を、配列番号１、３および５〜７に示し、対応するアミノ酸配列を、配列番号２、４および８〜１０に示す。
【０１７４】
乳房特異的抗原Ｂ３１１Ｄの単離および特徴づけは、米国特許出願０９／２８９，１９８（１９９９年４月９日出願）に記載されており、この開示はその全体が参考として本明細書中に援用される。Ｂ３１１Ｄについて決定したｃＤＮＡ配列を、配列番号１１に示し、対応するアミノ酸配列を配列番号１２に示す。
【０１７５】
マンマグロビンについてのｃＤＮＡ配列を図４および５に示し、ＧＡＢＡπについてのｃＤＮＡ配列を、図６に示し、そしてそれぞれ配列番号７３〜７５に開示する。
【０１７６】
乳房特異的抗原リポフィリンＢの単離および特徴付けは、米国特許出願０９／７８０，８４２（２００１年２月８日出願）に記載されており、この開示は、その全体が参考として本明細書中に援用される。リポフィリンＢについて決定したｃＤＮＡ配列を、配列番号７６に示し、対応するアミノ酸配列を、配列番号７７に示す。リポフィリンＢのいくつかの配列改変体のヌクレオチド配列がまた、米国特許出願０９／７８０，８４２に記載される。
【０１７７】
（実施例５）
（マイクロアレイ分析）
本実施例は、正常乳房組織サンプルと比較した場合に、胸部腫瘍組織サンプルにおいて、少なくとも２倍は過剰発現されるポリヌクレオチドを同定するためのマイクロアレイ分析の使用を開示する。
【０１７８】
目的のポリヌクレオチドのｍＲＮＡの発現を以下のように実施した。異なる遺伝子についてのｃＤＮＡを上記のように調製し、そしてスライドガラス（Ｉｎｃｙｔｅ，Ｐａｌｏ　Ａｌｔｏ，ＣＡ）上に整列させた。次いで、整列したｃＤＮＡを、Ｃｙ３またはＣｙ５で蛍光標識した第一鎖ｃＤＮＡ（胸部腫瘍由来のｐｏｌｙＡ＋　ＲＮＡから得た）、正常乳房および正常組織と他の腫瘍（その全体が本明細書中で参考として援用されるＳｈａｌｏｎ，Ｄら、Ｇｅｎｏｍｅ　Ｒｅｓ．６：６３９〜４５（１９９６）に記載されている）の１：１混合物を用いてハイブリダイズした。代表的には、Ｃｙ３（プローブ１）を胸部腫瘍由来のｃＤＮＡに結合させ、そしてＣｙ５（プローブ２）を正常乳房組織または他の正常組織に結合させた。両方のプローブを、チップ上で不死化遺伝子特異的ｃＤＮＡと競合させ、洗浄し、次いでハイブリダイゼーションの程度を決定するために個々のＣｙ３およびＣｙ５の蛍光の蛍光強度をスキャンした。データをＧＥＭＴＯＯＬＳソフトウェア（Ｉｎｃｙｔｅ，Ｐａｌｏ　Ａｌｔｏ，ＣＡ）（Ｃｙ３／Ｃｙ５の比によって正常組織と比較されるべき胸部腫瘍の過剰発現パターンを可能にする）を使用して解析した。蛍光強度はまた、個々の遺伝子の発現レベルに関連した。
【０１７９】
ＤＮＡマイクロアレイ分析を、主にスクリーニング道具として使用して、ディファレンシャルディスプレイ、ｃＤＮＡライブラリーおよびＰＣＲサブトラクションから回収されたｃＤＮＡの組織／腫瘍特異性を決定し、その後、定量的ＲＴ−ＰＣＲ、ノーザンブロッティング、および免疫組織化学によるより厳密な解析を行った。マイクロアレイ分析を、２つのマイクロチップ上で実施した。合計で３６０３の差し引かれたｃＤＮＡテンプレートおよび１９７のディファレンシャルディスプレイテンプレートを評価し、定量的ＰＣＲによるさらなる解析のため４０の候補を同定した。これらの候補のうちいくつかを、好ましい組織特異性プロファイル（Ｂ３０５Ｄ、Ｂ３１１Ｄ、Ｂ７２６Ｐ、Ｂ５１１ＳおよびＢ５３３Ｓを含む）に基づいて選択し、胸部腫瘍および／または正常乳房　対　他の正常組織におけるそれらの過剰発現プロファイルを示した。これらの遺伝子の発現が、胸部腫瘍および／または乳房組織に対する高度の特異性を示すことが明らかであった。さらに、これらの遺伝子は、多くの場合、相補的発現プロファイルを有する。
【０１８０】
また、２つの公知の乳房特異的遺伝子、マンマグロビンおよびγ−アミノ酪酸Ａ型レセプターのπサブユニット（ＧＡＢＡπ）を、マイクロアレイ分析に供した。マンマグロビンのｍＲＮＡ発現は、胸部腫瘍を含む乳房組織の増殖においてアップレギュレーションされることが以前に記載されている。Ｗａｔｓｏｎら、Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．、５６：８６０〜５（１９９６）；Ｗａｔｓｏｎら、Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．、５９：３０２８〜３０３１（１９９９）；Ｗａｔｓｏｎら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ．１６：８１７〜２４（１９９８）（これらは、その全体が参考として本明細書中に援用される）を参照のこと。ＧＡＢＡπ　ｍＲＮＡレベルを、胸部腫瘍において過剰発現した。以前の研究は、膀胱におけるその過剰発現、ならびに前立腺および肺におけるある程度の過剰発現を実証した（Ｈｅｄｂｌｏｍら、Ｊ　Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：１５３４６〜１５３５０（１９９７））が、以前の研究では、胸部腫瘍での増大したレベルは示されていなかった。
【０１８１】
（実施例６）
（定量的リアルタイムＰＣＲ分析）
本実施例は、正常な胸部組織サンプルと比較して、胸部腫瘍組織サンプルにおいて少なくとも２倍過剰発現するポリヌクレオチドのマイクロアレイ同定を確認するための定量的リアルタイムＰＣＲの使用を開示する。
【０１８２】
本明細書において実施例５で開示されたマイクロアレイ分析により同定されたポリヌクレオチドの腫瘍特異性および／または組織特異性を、定量的ＰＣＲ分析によって確認した。胸部転移、胸部腫瘍、良性胸部障害および正常な胸部組織を、他の正常組織および腫瘍と共に、定量的（リアルタイム）ＰＣＲにおいて試験した。これを、ＡＢＩ　７７００　ＰｒｉｓｍまたはＧｅｎｅＡｍｐ（登録商標）５７００　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｓｙｓｔｅｍ（ＰＥ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ　Ｃｉｔｙ，ＣＡ）のいずれかにおいて実施した。７７００システムは、順方向プライマーおよび逆方向プライマーを、この順方向プライマーとこの逆方向プライマーとの間の配列にアニーリングするように設計された特異的プローブと組み合わせて使用する。このプローブを、その５’末端で蛍光レポーター色素と結合体化し、そして他方の３’末端で消光剤色素（ＴａｑｍａｎＴＭ）と結合体化した。ＰＣＲの間、Ｔａｑ　ＤＮＡポリメラーゼ（その５’−３’ヌクレアーゼ活性を有する）はプローブを切断し、これにより蛍光を発し始め、蛍光の増加によって反応をモニターすることを可能にする（リアルタイム）。Ｈｏｌｌａｎｄら，Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　Ｕ　Ｓ　Ａ．８８：７２７６−７２８０（１９９１）。５７００システムは、二本鎖ＤＮＡに対してのみ結合する蛍光色素であるＳＹＢＲ（登録商標）グリーン（Ｓｃｈｎｅｅｂｅｒｇｅｒら，ＰＣＲ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ａｐｐｌ．４：２３４−８（１９９５））、ならびに７７００機器と同じ順方向プライマーおよび逆方向プライマーを使用した。プローブは必要とされなかった。一致するプライマーおよび蛍光プローブを、Ｐｒｉｍｅｒ　Ｅｘｐｒｅｓｓ　ｐｒｏｇｒａｍ（ＰＥ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ　Ｃｉｔｙ，ＣＡ）に従って、各遺伝子について設計した。
【０１８３】
【表１】
2004505611.tif 000003
定量的ＰＣＲにおいて、マンマグロビン（ｍａｍｍａｇｌｏｂｉｎ）、ＧＡＢＡπ、Ｂ３０５Ｄ　Ｃ形態、Ｂ３１１Ｄ、Ｂ５１１Ｓ、Ｂ５３３ＳおよびＢ７２６Ｐについての順方向プライマーについて使用された濃度は、それぞれ、９００、９００、３００、９００、９００、３００および３００ｎＭであった。逆方向プライマーについて、これらはそれぞれ、３００、９００、９００、９００、３００、９００および９００ｎＭであった。このようにして生成されたプライマーおよびプローブを、リアルタイムＰＣＲにおいて、汎用熱サイクルプログラム（ｕｎｉｖｅｒｓａｌ　ｔｈｅｒｍａｌ　ｃｙｃｌｉｎｇ　ｐｒｏｇｒａｍ）で使用した。これらを滴定し、チェッカー盤アプローチを使用して最適濃度を決定した。標的腫瘍由来のｃＤＮＡのプールを、この最適化プロセスにおいて使用した。反応を、２５μｌ容量で実施した。すべての場合において、最終プローブ濃度は１６０ｎＭであった。ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＧＴＰは、０．２ｍＭであり、そしてｄＵＴＰは、０．４ｍＭであった。Ａｍｐｌｉｔａｑ　ｇｏｌｄおよびＡｍｐｅｒａｓｅ　ＵＮＧ（ＰＥ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ　Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を、１回の反応あたり０．６２５ユニットおよび０．２５ユニットで使用した。ＭｇＣｌ２は、５ｍＭの最終濃度であった。微量のグリセロール、ゼラチン、およびＴｗｅｅｎ　２０（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍ　Ｃｏ，Ｓｔ　Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を添加して、反応を安定化させた。各反応は、２μｌの希釈テンプレートを含んだ。上記のように調製されたＲＴ反応からのｃＤＮＡを、目的の遺伝子について１：１０で希釈し、そしてβ−アクチンについて１：１００で希釈した。β−アクチン（ＰＥ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ　Ｃｉｔｙ，ＣＡ）についてのプライマーおよびプローブを、同様の様式で使用して、サンプル中のβ−アクチンの存在を定量した。ＳＹＢＲ（登録商標）グリーンアッセイの場合、反応混合物（２５μｌ）は、２．５μｌのＳＹＢＲグリーン緩衝液、２μｌのｃＤＮＡテンプレート、ならびに目的の遺伝子についての順方向プライマーおよび逆方向プライマー（各々２．５μｌ）を含んだ。この混合物はまた、３ｍＭ　ＭｇＣｌ２、０．２５ユニットのＡｍｐＥｒａｓｅ　ＵＮＧ、０．６２５ユニットのＡｍｐｌｉｔａｑ　ｇｏｌｄ、０．０８％グリセロール、０．０５％ゼラチン、０．０００１％Ｔｗｅｅｎ　２０および１ｍＭ　ｄＮＴＰ混合物を含んだ。両方の形式において、４０サイクルの増幅を実施した。
【０１８４】
サンプル中の特定のｃＤＮＡ（従って、最初のｍＲＮＡ）の量を定量するために、目的の遺伝子を含むプラスミドを使用した各実行について、検量線を作成した。検量線を、アッセイに使用された最初のｃＤＮＡ濃度と関連する、リアルタイムＰＣＲで決定されたＣｔ値を使用して作成した。２０〜２×１０６コピーの範囲の目的遺伝子の基準希釈（ｓｔａｎｄａｒｄ　ｄｉｌｕｔｉｏｎ）を、この目的のために使用した。さらに、一定量のβ−アクチンに対する正規化を可能にするために、２００ｆｇ〜２０００ｐｇの範囲のハウスキーピング遺伝子β−アクチンについて検量線を作成した。これにより、各遺伝子で観察される過剰発現レベルの評価が可能となった。
【０１８５】
遺伝子Ｂ３１１Ｄ、Ｂ５３３ＳおよびＢ７２６Ｐを、以下からなる２つの異なるパネルにおいて、上記で表１において示されるプライマーおよびプローブを使用し、上記のような定量的ＰＣＲにおいて評価した：（ａ）胸部腫瘍、胸部正常および正常組織；ならびに（ｂ）胸部腫瘍転移（主に、リンパ節）。パネル（ａ）についてのデータを、３つすべての遺伝子について図１に示す。この３つの遺伝子は、同一の胸部組織発現プロフィールを示した。しかし、遺伝子発現の相対的レベルは、各場合において非常に異なった。一般的にＢ３１１Ｄは、Ｂ５３３Ｓよりも低いレベルで発現され、そしてこの両方とも、Ｂ７２６Ｐよりも少なかったが、３つすべてが胸部組織に制限されていた。従って、定量的ＰＣＲによって、３つすべての遺伝子について、正常胸部組織と胸部腫瘍との間で示差的な発現が存在すること、および約５０％の胸部腫瘍が、これらの遺伝子を過剰発現することが確認された。乳癌に由来する遠位転移のパネルにおいて試験される場合、３つすべての遺伝子は１４／２１の転移と反応し、そして同様のプロフィールを提示した。３つすべての遺伝子はまた、図２においてＢ５３３Ｓについて示されたように、腫瘍の病理学的段階の関数として発現レベルの増加を示した。
【０１８６】
マンマグロビンは、ウサギのウテログロビンおよびラットのステロイド結合タンパク質サブユニットＣ３のホモログであり、そして高度にグリコシル化された低分子量タンパク質である。そのホモログとは対照的に、マンマグロビンは、胸部特異的であることが報告されており、そして転移性乳癌患者由来の９１％のリンパ節におけるマンマグロビンｍＲＮＡ発現の検出の報告と共に、胸部腫瘍生検（２３％）ならびに原発性および転移性の胸部腫瘍（約７５％）における過剰発現が記載されている。しかし、上記のようなマイクロアレイおよび定量的ＰＣＲによるマンマグロビン遺伝子発現のより綿密な分析（パネル（ａ）および（ｂ）、ならびに他の腫瘍および正常組織ならびにさらなる胸部腫瘍のパネル）により、皮膚および唾液腺における有意なレベルでの発現と共に、食道および気管におけるはるかに低レベルでの発現が示された（以下の表２に示される）。
【０１８７】
【表２】
2004505611.tif 000004
胸部特異的遺伝子Ｂ５１１Ｓは、胸部腫瘍と正常胸部組織上ではマンマグロビン（ｍａｍｍａｇｌｏｂｉｎ）に対して異なる反応性のプロフィールを有するが、マンマグロビンと同じ正常組織のサブセットと反応した。ＰＳＯＲＴ分析によって、Ｂ５１１Ｓは、９０アミノ酸のＯＲＦを有することおよびマンマグロビンの場合のように分泌タンパク質であることが示された。Ｂ５１１Ｓは、膜貫通ドメインの証拠を有さなかったが、切断可能なシグナル配列を含み得る。マンマグロビンは、遠位転移性胸部腫瘍２４個のうち１４個、胸部腫瘍４２個のうち３１個を検出し、そして正常な胸部組織と比較して、腫瘍および転移において１０倍の過剰発現を示した。マンマグロビン発現に関しては本質的に陰性であった試験した他の陰性の正常組織および腫瘍に対して、正常な胸部組織において少なくとも３００倍の過剰発現が存在した。Ｂ５１１Ｓは、胸部腫瘍４２個のうち３３個および遠位転移２４個のうち１４個を検出したが、Ｂ５１１Ｓとマンマグロビンとの組合せは、胸部腫瘍４２個のうち３８個および転移性病変２４個のうち１７個を検出することが予想される（表２、上記）。Ｂ５１１Ｓおよびマンマグロビンの定量的な発現レベルはまた、これら２つの遺伝子に関して観察されたマイクロアレイプロフィールに従って、類似した範囲であった。マンマグロビンと付加的であった他の遺伝子を、表３に示す。
【０１８８】
【表３】
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Ｂ３０５Ｄは、正常組織（正常胸部組織を含む）と比較して、胸部腫瘍、前立腺腫瘍、正常前立腺組織および精巣において高度に過剰発現されたことが示された。Ｂ３０５Ｄの異なるスプライス改変体が、最も豊富な形態Ａおよび形態Ｃで同定されたが、試験した全ては、定量的ＰＣＲにおいて類似の組織プロフィールを有する。Ａ形態およびＣ形態は、それぞれ、３２０アミノ酸および３８５アミノ酸のＯＲＦを含む。Ｂ３０５Ｄは、ＰＳＯＲＴによって、一連のアンキリン反復を含むＩＩ型膜タンパク質であることが予想された。胸部腫瘍においてＢ３０５Ｄと補完性であることが示される既知遺伝子は、ＧＡＢＡπであった。この遺伝子は、ＧＡＢＡＡレセプターファミリーのメンバーであり、ファミリーの他のメンバーと３０〜４０％のアミノ酸相同性を有するタンパク質をコードし、そしてノーザンブロット分析によって肺、胸腺および前立腺において低めのレベルで過剰発現され、子宮において高度に過剰発現されることが示された。胸部組織におけるその発現は、以前に記載されていない。ニューロン組織において認識可能な発現を有することは、他のＧＡＢＡＡレセプターと対照的である。この遺伝子の組織発現プロファイリングは、この遺伝子が、Ｂ３０５Ｄ遺伝子と逆の関係で胸部腫瘍において過剰発現されることを示した（表３）。ＧＡＢＡπは、腫瘍２５個のうちの１５個および転移２１個のうちの６個（マンマグロビンによっては見落とされた４個の腫瘍および５個の転移を含む）を検出した。対照的に、Ｂ３０５Ｄは、胸部腫瘍２５個のうちの１３個および転移２１個のうちの８個（これもまた、マンマグロビンによっては見落とされた３個の腫瘍および２個の転移を含む）を検出した。ちょうどＢ３０５ＤおよびＧＡＢＡπの組合せは、胸部腫瘍２５個のうちの２２個および転移２１個のうちの１４個を同定すると予想される。胸部転移を検出する場合のＢ３０５ＤおよびＧＡＢＡπとマンマグロビンとの組合せを、上記の表３ならびに図３Ａおよび３Ｂに示す。この組合せは、胸部転移２１個のうちの２０個ならびに胸部腫瘍２５個のうちの２５個を検出した（これは、３つ全ての遺伝子に対して同じパネル上で評価された）。これらの３つの遺伝子に関して陰性であった１つの胸部転移は、Ｂ７２６Ｐに関して強く陽性であった（図３Ａおよび３Ｂ）。
【０１８９】
循環している腫瘍細胞の存在を評価するために、免疫捕獲（細胞捕獲）方法を、ＲＴ−ＰＣＲ分析の前に上皮細胞について最初に富化するために使用した。上皮細胞表面上の２つの糖タンパク質に対する特異的なモノクローナル抗体を用いてコーティングされた免疫磁気ポリスチレンビーズを、この目的のために使用した。このような富化手順は、表４に示されるように、ポリＡ＋　ＲＮＡの直接的な単離と比較した場合、検出感度を増加させた（約１００倍）。
【０１９０】
【表４】
2004505611.tif 000006
マンマグロビン陽性細胞（ＭＢ４１５）を、種々の濃度中に全血にスパイクし、次いで、上皮細胞富化または血液からの直接的な単離のいずれかを用いて摘出した。富化手順を用いて、マンマグロビンｍＲＮＡは、直接的な単離が使用された場合よりもはるかに低いレベルで検出され得ることが見られた。転移性乳癌を有する患者由来の全血サンプルを、引続いて免疫磁気ビーズを用いて処理した。次いで、ポリＡ＋　ＲＮＡを単離し、ｃＤＮＡを調製し、そして２つの遺伝子特異的プライマー（表１）および蛍光プローブ（ＴａｑｍａｎＴＭ）を用いて定量的ＰＣＲ中で実行させた。乳癌組織において観察されるように、補完性がまた、乳癌由来の循環している腫瘍細胞の検出において見出された。また、マンマグロビンＰＣＲは、正常な血液サンプルと比較した場合、転移性乳癌患者由来の血液サンプルの高い割合において（２０／３２）（低いレベルではあるが）循環している腫瘍細胞を検出したが（表５）、現在までに試験されたいくつかの他の遺伝子はさらに、この検出率を増加した。これには、Ｂ７２６Ｐ、Ｂ３０５Ｄ、Ｂ３１１Ｄ、Ｂ５３３ＳおよびＧＡＢＡπが挙げられる。転移性乳癌患者由来の血液サンプルにおけるマンマグロビンの検出レベルは、おそらく、本研究における上皮マーカー特異的富化の使用に起因して、より少ない血液容積を試験しているのにもかかわらず、以前に記載されたものよりも高い（６２対４９％）。試験した遺伝子全ての組み合わせは、サンプル３２個のうち２７個が、これらの遺伝子の１つ以上によって陽性であったことを示す。
【０１９１】
【表５】
2004505611.tif 000007
さらなる研究において、マンマグロビン、ＧＡＢＡπ、Ｂ３０５Ｄ（Ｃ形態）およびＢ７２６Ｐに特異的なプライマーならびに特異的なＴａｑｍａｎプローブを、異なる組み合わせで使用して、リアルタイムＰＣＲを用いて胸部転移（Ｂ．ｍｅｔ）サンプルおよび胸部腫瘍（Ｂ．ｔｕｍｏｒ）サンプルにおけるその合わされたｍＲＮＡ発現プロフィールを分析した。マンマグロビン、Ｂ３０５Ｄ（Ｃ形態）およびＢ７２６Ｐに対して使用した順方向および逆方向プライマーならびにプローブを、表１に示す。ＧＡＢＡπに対して使用した順方向プライマーおよびプローブを、表１に示し、逆方向プライマーは、以下である：
ＴＴＣＡＡＡＴＡＴＡＡＧＴＧＡＡＧＡＡＡＡＡＡＴＴＡＧ−ＴＡＧＡＴＣＡＡ（配列番号５１）。以下の表６に示されるように、マンマグロビン、ＧＡＢＡπ、Ｂ３０５Ｃ（Ｃ形態）およびＢ７２６Ｐの組み合わせは、胸部腫瘍サンプル２２個のうち２２個を検出することが見出され、５サンプルにおいて発現の増加が見られた（＋＋によって示す）。
【０１９２】
【表６】
2004505611.tif 000008
特異的プライマーの添加によるメッセージシグナルの増加がさらに、４つの腫
瘍サンプル（Ｂ．ｍｅｔ　３１６Ａ、Ｂ．ｍｅｔ　３１７Ａ、Ｂ．ｔｕｍｏｒ　８１ＤおよびＢ．ｔｕｍｏｒ　２０９Ａ）を用いる１プレート実験において実証された。
【０１９３】
胸部腫瘍サンプルおよび正常組織サンプルのパネルにおけるマンマグロビン、ＧＡＢＡπ、Ｂ３０５Ｄ（Ｃ形態）およびＢ７２６Ｐの組み合わせの発現がまた、Ｔａｑｍａｎプローブアプローチの代わりにＳＹＢＲ緑色検出系を用いるリアルタイムＰＣＲを用いて検出された。この系を用いて得た結果を、図７に示す。
【０１９４】
（実施例７）
（乳癌患者の末梢血における定量的ＰＣＲ）
この研究において評価した既知遺伝子は、マンマグロビンおよびγアミノ酪酸Ａ型レセプターπサブユニット（ＧＡＢＡπ）であった。乳癌において過剰発現される新規遺伝子を同定するために、本発明者らは、改良されたバージョンのディファレンシャルディスプレイＲＴ−ＰＣＲ（ＤＤＰＣＲ）技術（Ｌｉａｎｇら、Ｓｃｉｅｎｃｅ　２５７：９６７−９７１（１９９３）；Ｍｏｕら、Ｂｉｏｃｈｅｍ　Ｂｉｏｐｈｙ　Ｒｅｓ　Ｃｏｍｍｕｎ．１９９：５６４−５６９（１９９４））；ｃＤＮＡライブラリー抽出方法（Ｈａｒａら、Ｂｌｏｏｄ　８４：１８９−１９９（１９９４））およびＰＣＲサブトラクション（Ｄｉａｔｃｈｅｎｋｏら、Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　Ｕ　Ｓ　Ａ．、９３：６０２５−６０３０（１９９６）；Ｙａｎｇら、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．２７：１５１７−２３（１９９９））を使用した。
【０１９５】
ディファレンシャルディスプレイは、Ｂ３０５ＤおよびＢ３１１Ｄと称する２つのｃＤＮＡフラグメントの回収をもたらした（Ｈｏｕｇｈｔｏｎら、Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．４０：Ａｂｓｔｒａｃｔ＃２１７，３２−３３（１９９９））。Ｂ５１１ＳおよびＢ５３３Ｓは、ｃＤＮＡライブラリーサブトラクションアプローチ（原稿準備中）を使用して単離した２つのｃＤＮＡフラグメントであるが、Ｂ７２６Ｐ　ｃＤＮＡフラグメントは、ＰＣＲサブトラクションに由来した（Ｊａｉｎｇら、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ａｍｅｒ　Ａｓｓｏｃ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．４０：Ａｂｓｔｒａｃｔ＃２１６，３２（１９９９）；Ｘｕら、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ａｍｅｒ　Ａｓｓｏｃ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．４０：Ａｂｓｔｒａｃｔ＃２１１５，３１９（１９９９）；およびＭｏｌｅｓｈら，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ　ｏｆ　Ａｍｅｒ　Ａｓｓｏｃ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．４１：Ａｂｓｔｒａｃｔ＃４３３０，６８１（２０００）。
【０１９６】
３つの新規な遺伝子、Ｂ３１１Ｄ、Ｂ５３３ＳおよびＢ７２６Ｐは、定量的ＰＣＲ分析により同一の乳房組織発現プロフィールを示した。これらの遺伝子を、以下からなる２つの別個のパネルに対する定量的ＰＣＲにおいて評価した：（ａ）胸部腫瘍、乳房正常組織および正常な組織、ならびに（ｂ）胸部腫瘍転移の群（主にリンパ節）。使用するプライマーおよびプローブを表１に示す。パネル（ａ）についてのデータを、３つすべての遺伝子について図２に示す。概して、発現プロフィールは同等であり、そして同じランクにあるが、発現のレベルは、かなり異なる。Ｂ３１１Ｄは一般に、Ｂ５３３Ｓよりも低いレベルで発現され、そしてその両方が、Ｂ７２６Ｐより低いが、３つすべてが、乳房組織に限定された。３つすべての配列を使用して、Ｇｅｎｂａｎｋデータベースに対して検索した。Ｂ３１１Ｄ配列およびＢ５３３Ｓ配列の両方が、異なる反復配列を含み、そしていずれについてもＯＲＦは同定されていない。Ｂ７２６Ｐは新規な遺伝子であり、ｍＲＮＡスプライシングは、いくつかの異なる推定ＯＲＦを生じる。
【０１９７】
この定量的ＰＣＲにより、正常な乳房組織と胸部腫瘍との間に異なるｍＲＮＡが存在し、胸部腫瘍の約５０％がこれらの遺伝子を過剰発現することが、確認された。乳癌に由来する一群の遠隔転移に対して試験した場合、３つすべての遺伝子が、転移２１個のうちの１４個と反応し、そして類似するプロフィールを示した（データ示さず）。興味深いことに、前立腺癌群に対して試験した場合、３つすべての遺伝子が、前立腺腫瘍２４個のうちの同じ３つを同定したが、乳房よりも大いに低い発現レベルであった。この群の遺伝子は、Ｂ５３３Ｓについて示されるのと同様にその腫瘍の病理学的段階の関数として、漸増レベルの発現を示した。
【０１９８】
マイクロアレイおよび定量的ＰＣＲによるマンマグロビン遺伝子発現のより厳密な分析は、皮膚および唾液腺において有意なレベルの発現を示し、そして食道および気管において大いに低いレベルの発現を示した。Ｂ５１１Ｓは、マンマグロビンと比較した場合に胸部腫瘍および正常乳房組織に対してわずかに異なる反応性プロフィールを有したが、マンマグロビンと類似する正常組織の部分集合と反応した。マンマグロビンは、遠隔転移性胸部腫瘍２４個のうちの１４個を検出し、胸部腫瘍４２個のうちの３１個を検出し、そして正常な乳房組織と比較した場合に、腫瘍および転移において１０倍過剰発現を示した。正常乳房組織対他のネガティブな正常組織および試験した腫瘍において、少なくとも３００倍のマンマグロビン過剰発現が存在した。Ｂ５１１Ｓは、胸部腫瘍４２個のうちの３３個および遠隔転移２４個のうちの１４個を検出した。Ｂ５１１Ｓとマンマグロビンとの組み合わせは、胸部腫瘍４２個のうちの３８個および転移性病変２４個のうちの１７個を検出すると推測される。Ｂ５１１Ｓおよびマンマグロビンの発現の定量レベルもまた、これらの２つの遺伝子について観察されたマイクロアレイプロフィールと一致して、類似した範囲にあった。
【０１９９】
特定の遺伝子が、マンマグロビンの発現プロフィールを補完した（すなわち、マンマグロビンが発現しなかった腫瘍において発現することが示された）。Ｂ３０５Ｄは、正常な組織（正常な乳房組織を含む）と比較した場合に、胸部腫瘍、前立腺腫瘍、正常な前立腺組織および精巣において、高度に過剰発現された。Ｂ３０５Ｄの異なるスプライス改変体を、最も豊富である形態Ａおよび形態Ｃを用いて同定した。試験したすべての形態は、定量的ＰＣＲにおいて類似の組織プロフィールを有した。このＡ形態およびＣ形態は、それぞれ、３２０アミノ酸のＯＲＦおよび３８５アミノ酸のＯＲＦを含む。胸部腫瘍において、Ｂ３０５Ｄと相補的であることが示された公知の遺伝子は、ＧＡＢＡπであった。この組織発現プロフィールは、ニューロン組織においてかなりの発現を代表的に有する、他のＧＡＢＡＡレセプターと対照的である。さらなる知見は、この遺伝子の組織発現プロフィールが、この遺伝子が、Ｂ３０５Ｄ遺伝子に逆比例して胸部腫瘍において過剰発現されることを示したことであった（表３）。ＧＡＢＡπは、腫瘍２５個のうちの１５個および転移２１個のうちの６個を検出し、これらは、マンマグロビンにより見逃された４つの腫瘍および５つの転移を含んだ。対照的に、Ｂ３０５Ｄは、胸部腫瘍２５個のうちの１３個および転移２１個のうちの８個を検出し、これらはまた、マンマグロビンにより見逃された３つの腫瘍および２つの転移を含んだ。まさにＢ３０５ＤとＧＡＢＡπとの組み合わせは、胸部腫瘍２５個のうちの２２個および転移２１個のうちの１４個を同定すると推定される。この組み合わせは、３つすべての遺伝子について同じ群に対して評価された、乳房転移２１個のうちの２０個、ならびに乳癌２５個のうちの２５個を検出した。これら３つの遺伝子についてネガティブであった１つの乳房転移は、Ｂ７２６Ｐについて強くポジティブであった。
【０２００】
マイクロアレイ分析およびその後の定量的ＰＣＲの使用により、乳房組織（腫瘍および正常）ならびに正常組織の両方における乳癌遺伝子の発現を性格に決定するため、そしてそれらの診断および治療能力を評価するための、方法論が提供される。５つの新規な遺伝子および２つの既知の遺伝子を、これらの技術を使用して評価した。これらの遺伝子のうちの３つ、Ｂ３１１Ｄ、Ｂ５３３ＳおよびＢ７２６Ｐは、一致したｍＲＮＡ発現を示した。そして集合的にこのデータは、転写制御のレベルでのこれら３つの遺伝子座の一致した発現と一致する。３つすべての遺伝子が、胸部腫瘍対正常乳房組織における差次的発現を示した。そして過剰発現のレベルは、その腫瘍の病理学的段階に関連するようであった。マンマグロビンの場合、発現が、乳房組織から離れた他の組織において見出された。発現が、皮膚、唾液腺において観察され、そして気管においてかなり劣った程度に観察された。
【０２０１】
胸部腫瘍におけるＧＡＢＡπの発現もまた、新規な知見であった。マンマグロビンとともに観察されたいくつかの遺伝子の発現が相補した場合、特に２つの遺伝子、Ｂ３０５ＤおよびＧＡＢＡπが、マンマグロビン検出の診断感度を増加した。これらの３つの遺伝子の組み合わせは、評価した胸部腫瘍および転移４６個のうち４５個（９７．８％）を検出した。Ｂ７２６Ｐを含めると、２５個すべての胸部腫瘍および２１個の遠隔転移の検出が可能であった。
【０２０２】
（実施例８）
（免疫捕捉による循環する乳癌細胞の富化）
本実施例は、循環する乳癌細胞の富化のための免疫捕捉細胞捕捉方法論の使用により達成される、感度の増強を開示する。
【０２０３】
循環する腫瘍細胞の存在を評価するために、免疫捕捉方を採用して、ＲＴ−ＰＣＲ分析の前にまず、上皮細胞について富化した。上皮細胞を、免疫磁気ビーズ分離法（Ｄｙｎａｌ　Ａ．Ｓ，Ｏｓｌｏ，Ｎｏｒｗａｙ）を用いて血液サンプルから富化した。この方法は、ヒト上皮細胞の表面上の糖ポリペプチド抗原に特異的なモノクローナル抗体でコートした磁気ビーズを使用する。適切な例示的細胞表面抗原は、例えば、Ｍｏｍｂｕｒｇ，Ｆ．ら、Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．４１：２８８３〜９１（１９９７）；Ｎａｕｍｅ，Ｂ．ら、Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ．６：１０３〜１１３（１９９７）；Ｎａｕｍｅ，Ｂ．ら，Ｉｎｔ　Ｊ　Ｃａｎｃｅｒ．７８：５５６〜６０（１９９８）；Ｍａｒｔｉｎ，Ｖ．Ｍ．ら、Ｅｘｐ　Ｈｅｍａｔｏｌ．，２６：２５２〜６４（１９９８）；Ｈｉｌｄｅｂｒａｎｄｔ，Ｍ．ら、Ｅｘｐ　Ｈｅｍａｔｏｌ．２５：５７〜６５（１９９７）；Ｅａｔｏｎ，Ｍ．Ｃ．ら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　２２：１００〜５（１９９７）；Ｂｒａｎｄｔ，Ｂ．ら、Ｃｌｉｎ　Ｅｘｐ　Ｍｅｔａｓｔａｓｅｓ　１４：３９９〜４０８（１９９６）に記載され、この各々が、本明細書中にその全体が参考として援用される。この方法で単離された細胞を溶解し、そして磁気ビーズを除去した。その後、この溶解物を、Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）２５でコートした磁気ビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ）を使用して、ポリＡ＋　ｍＲＮＡ単離について処理した。キット緩衝液中でこのビーズを洗浄した後、ビーズ／ポリＡ＋　ＲＮＡサンプルを、最終的に１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ　ＨＣｌ（ｐＨ　８）に懸濁し、そして逆転写に供した。その後、遺伝子特異的なプライマーおよびプローブを使用して、このＲＮＡをリアルタイムＰＣＲに供し、反応条件は、本明細書中で上記に概説したとおりであった。β−アクチン含量もまた決定し、そして正規化のために使用した。正常なサンプルの平均＋３標準偏差よりも大きい（目的の遺伝子　コピー）／（β−アクチンｎｇ）であるサンプルを、ポジティブであると見なした。血液サンプルに対するリアルタイムＰＣＲを、もっぱらＴａｑｍａｎＴＭ手順であるが５０サイクルまで延長して使用して、実施した。
【０２０４】
富化手順を使用して、マンマグロビンｍＲＮＡが、直接単離を使用した場合よりも大いに低いレベルで検出可能であることが、見出された。転移性乳癌を伴う患者由来の全血サンプルを、その後、免疫磁気ビーズで処理し、その後、ポリＡ＋　ＲＮＡを単離し、ｃＤＮＡを作製し、そしてマンマグロビンに対する２つの遺伝子特異的プライマーおよび蛍光プローブ（ＴａｑｍａｎＴＭ）を使用して、定量的ＰＣＲを実施した。乳癌組織において観察されたように、相補はまた、乳癌に由来する循環する腫瘍細胞の検出においても観察された。また、マンマグロビンＰＣＲは、正常な血液サンプルと比較した場合に、低レベルであるにも関わらず、転移性乳癌からの高いパーセンテージの血液（２０個／３２個）において循環する腫瘍細胞を検出した。今日まで試験した他の遺伝子のうちのいくつかは、この検出率をさらに増加し得；これは、Ｂ７２６Ｐ、Ｂ３０５Ｄ、Ｂ３１１Ｄ、Ｂ５３３ＳおよびＧＡＢＡπを包含する。試験した遺伝子すべての組み合わせは、３２個中２７個のサンプルが、これらの遺伝子のうちの１つ以上によりポジティブであったことを示す。
【０２０５】
（実施例９）
（乳癌の多重検出）
さらなる多重リアルタイムＰＣＲアッセイを、４つの乳癌特異的遺伝子：ＬｉｐｏｐｈｉｌｉｎＢ、Ｇａｂａ（Ｂ８９９Ｐ）、Ｂ３０５Ｄ−ＣおよびＢ７２６Ｐの発現を同時に検出するために確立した。単一乳癌特異的遺伝子の発現分析に頼る検出アプローチとは対照的に、このマルチプレックスアッセイは、試験された全ての胸部腫瘍サンプルを検出し得た。
【０２０６】
このマルチプレックスアッセイを、Ｍａｍｍａｇｌｏｂｉｎの代わりにＬｉｐｏｐｈｉｌｉｎＢ発現を検出するように設計した。それらの類似する発現プロフィールに起因して、ＬｉｐｏｐｈｉｌｉｎＢは、乳癌検出のためのこの多重ＰＣＲアッセイにおいてＭａｍｍａｇｌｏｂｉｎを置換し得る。このアッセイを以下のようにして行なった：ＬｉｐｏｐｈｉｌｉｎＢ特異的プライマー、Ｂ８９９Ｐ（Ｇａｂａ）特異的プライマー、Ｂ３０５Ｄ特異的プライマー、およびＢ７２６Ｐ特異的プライマー、ならびに特異的Ｔａｑｍａｎプローブを使用して、胸部腫瘍におけるそれらの組み合わされたｍＲＮＡ発現プロフィールを分析した。これらのプライマーおよびプローブを以下に示す：
ＬｉｐｏｐｈｉｌｉｎＢ：正方向プライマー（配列番号３３）：５’ＴＧＣＣＣＣＴＣＣＧＧＡＡＧＣＴ。逆方向プライマー（配列番号３４）：５’ＣＧＴＴＴＣＴＧＡＡＧＧＧＡＣＡＴＣＴＧＡＴＣ。プローブ（配列番号３５）（ＦＡＭ−５’−３’−ＴＡＭＲＡ）：ＴＴＧＣＡＧＣＣＡＡＧＴＴＡＧＧＡＧＴＧＡＡＧＡＧＡＴＧＣＡ。
【０２０７】
ＧＡＢＡ（Ｂ８９９Ｐ）：正方向プライマー（配列番号３６）：５’ＡＡＧＣＣＴＣＡＧＡＧＴＣＣＴＴＣＣＡＧＴＡＴＧ。逆方向プライマー（配列番号３７）：５’ＴＴＣＡＡＡＴＡＴＡＡＧＴＧＡＡＧＡＡＡＡＡＡＴＴＡＧＴＡＧＡＴＣＡＡ。プローブ（配列番号３８）（ＦＡＭ−５’−３’−ＴＡＭＲＡ）：ＡＡＴＣＣＡＴＴＧＴＡＴＣＴＴＡＧＡＡＣＣＧＡＧＧＧＡＴＴＴＧＴＴＴＡＧＡ。
【０２０８】
Ｂ３０５Ｄ（Ｃ型）：正方向プライマー（配列番号３９）：５’ＡＡＡＧＣＡＧＡＴＧＧＴＧＧＴＴＧＡＧＧＧＴＴ。逆方向プライマー（配列番号４０）：５’ＣＣＴＧＡＧＡＣＣＡＡＡＴＧＧＣＴＴＣＴＴＣ。プローブ（配列番号４１）（ＦＡＭ−５’−３’−ＴＡＭＲＡ）ＡＴＴＣＣＡＴＧＣＣＧＧＣＴＧＣＴＴＣＴＴＣＴＴＣＴＧ。
【０２０９】
Ｂ７２６Ｐ：正方向プライマー（配列番号４２）：５’ＴＣＴＧＧＴＴＴＴＣＴＣＡＴＴＣＴＴＴＡＴＴＣＡＴＴＴＡＴＴ。逆方向プライマー（配列番号４３）：５’ＴＧＣＣＡＡＧＧＡＧＣＧＧＡＴＴＡＴＣＴ。プローブ（配列番号４４）（ＦＡＭ−５’−３’−ＴＡＭＲＡ）：ＣＡＡＣＣＡＣＧＴＧＡＣＡＡＡＣＡＣＴＧＧＡＡＴＴＡＣＡＧＧ。
【０２１０】
アクチン：正方向プライマー（配列番号４５）：５’ＡＣＴＧＧＡＡＣＧＧＴＧＡＡＧＧＴＧＡＣＡ。逆方向プライマー（配列番号４６）：５’ＣＧＧＣＣＡＣＡＴＴＧＴＧＡＡＣＴＴＴＧ。プローブ（配列番号４７）：（ＦＡＭ−５’−３’−ＴＡＭＲＡ）：ＣＡＧＴＣＧＧＴＴＧＧＡＧＣＧＡＧＣＡＴＣＣＣ。
【０２１１】
アッセイ条件は以下のようである：
Ｔａｑｍａｎプロトコール（７７００　Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ）：
２５μｌ最終容量中：１×緩衝液Ａ、５ｍＭ　ＭｇＣｌ、０．２ｍＭ　ｄＣＴＰ、０．２ｍＭ　ｄＡＴＰ、０．４ｍＭ　ｄＵＴＰ、０．２ｍＭ　ｄＧＴＰ、０．０１Ｕ／μｌ　ＡｍｐＥｒａｓｅ　ＵＮＧ、０．０２５μｌ　ＴａｑＧｏｌｄ、８％（ｖ／ｖ）グリセロール、０．０５％（ｖ／ｖ）ゼラチン、０．０１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０、４ｐｍｏｌの各遺伝子特異的Ｔａｑｍａｎプローブ（ＬｉｐｏｐｈｉｌｉｎＢ＋Ｇａｂａ＋Ｂ３０５Ｄ＋Ｂ７２６Ｐ）、１００ｎＭのＢ７２６Ｐ−Ｆ＋Ｂ７２６Ｐ−Ｒ、３００ｎＭのＧａｂａ−Ｒ、および５０ｎＭのＬｉｐｏｐｈｉｌｉｎＢ−Ｆ＋ＬｏｐｏｐｈｉｌｉｎＢ−Ｒ＋Ｂ３０５Ｄ−Ｒ＋Ｇａｂａ−Ｒ、鋳型ｃＤＮＡ（０．０２μｇポリＡ＋ＲＮＡに由来する）。
【０２１２】
ＬｉｐｏｐｈｉｌｉｎＢ発現を、２７個の胸部腫瘍サンプルのうち１４サンプルにおいて検出した。
【０２１３】
しかし、ＬｉｐｏｐｈｉｌｉｎＢ、Ｂ８９９Ｐ、Ｂ３０５Ｄ−ＣおよびＢ７２６Ｐについてのマルチプレックスアッセイは、２７腫瘍のうち２７腫瘍において発現シグナルを検出し、検出レベルは、大多数のサンプルで１０ｍＲＮＡコピー／１０００ｐｇアクチンを超え、そして試験された２７サンプルのうち５サンプルにおいて１００ｍＲＮＡコピー／１０００ｐｇアクチンを超えた（図８）。
【０２１４】
（実施例１０）
（多重検出最適化）
上記の多重リアルタイムＰＣＲアッセイを使用して、マンマグロビン（またはリポフィリンＢ）、Ｇａｂａ（Ｂ８９９Ｐ）、Ｂ３０５Ｄ−ＣおよびＢ７２６Ｐの発現を同時に検出した。この実施例に従って、アッセイ条件およびプライマー配列を、異なる長さの４つのＰＣＲ産物の対応する増幅を得るように最適化した。このアッセイのポジティブサンプルを、ゲル電気泳動によってさらに特徴付け得、そして目的の発現遺伝子を、検出されたアンプリコンのサイズに従って決定し得る。
【０２１５】
マンマグロビン（またはリポフィリンＢ）、Ｇａｂａ（Ｂ８９９Ｐ）、Ｂ３０５ＤおよびＢ７２６Ｐの特異的プライマーおよび特異的Ｔａｑｍａｎプローブを使用して、これらの発現を同時に検出する。この実施例において使用されるプライマーおよびプローブを以下に示す。
【０２１６】
マンマグロビン：正方向プライマー（配列番号４８）：５’ＴＧＣＣＡＴＡＧＡＴＧＡＡＴＴＧＡＡＧＧＡＡＴＧ。逆方向プライマー（配列番号４９）：５’ＴＧＴＣＡＴＡＴＡＴＴＡＡＴＴＧＣＡＴＡＡＡＣＡＣＣＴＣＡ。プローブ（配列番号５０）（ＦＡＭ−５’−３’−ＴＡＭＲＡ）：ＴＣＴＴＡＡＣＣＡＡＡＣＧＧＡＴＧＡＡＡＣＴＣＴＧＡＧＣＡＡＴＧ。
【０２１７】
ＧＡＢＡ（Ｂ８９９Ｐ）：正方向プライマー（配列番号３６）：５’ＡＡＧＣＣＴＣＡＧＡＧＴＣＣＴＴＣＣＡＧＴＡＴＧ。逆方向プライマー（配列番号５１）：５’ＡＴＣＡＴＴＧＡＡＡＡＴＴＣＡＡＡＴＡＴＡＡＧＴＧＡＡＧ。プローブ（配列番号３８）（ＦＡＭ−５’−３’−ＴＡＭＲＡ）：ＡＡＴＣＣＡＴＴＧＴＡＴＣＴＴＡＧＡＡＣＣＧＡＧＧＧＡＴＴＴＧＴＴＴＡＧＡ。
【０２１８】
Ｂ３０５Ｄ（Ｃ型）：正方向プライマー（配列番号３９）：５’ＡＡＡＧＣＡＧＡＴＧＧＴＧＧＴＴＧＡＧＧＧＴＴ。逆方向プライマー（配列番号４０）：５’ＣＣＴＧＡＧＡＣＣＡＡＡＴＧＧＣＴＴＣＴＴＣ。プローブ（配列番号４１）（ＦＡＭ−５’−３’−ＴＡＭＲＡ）ＡＴＴＣＣＡＴＧＣＣＧＧＣＴＧＣＴＴＣＴＴＣＴＴＣＴＧ。
【０２１９】
Ｂ７２６Ｐ：正方向プライマー（配列番号５２）：５’ＧＴＡＧＴＴＧＴＧＣＡＴＴＧＡＡＡＴＡＡＴＴＡＴＣＡＴＴＡＴ。逆方向プライマー（配列番号４３）：５’ＴＧＣＣＡＡＧＧＡＧＣＧＧＡＴＴＡＴＣＴ。プローブ（配列番号４４）（ＦＡＭ−５’−３’−ＴＡＭＲＡ）：ＣＡＡＣＣＡＣＧＴＧＡＣＡＡＡＣＡＣＴＧＧＡＡＴＴＡＣＡＧＧ。
【０２２０】
プライマー位置およびアッセイ条件を、異なる長さの４つのＰＣＲ産物の対応する増幅を得るために最適化した。アッセイ条件は以下のようである：
Ｔａｑｍａｎプロトコール（７７００　Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ）：
２５μｌ最終容量中：１×緩衝液Ａ、５ｍＭ　ＭｇＣｌ、０．２ｍＭ　ｄＣＴＰ、０．２ｍＭ　ｄＡＴＰ、０．４ｍＭ　ｄＵＴＰ、０．２ｍＭ　ｄＧＴＰ、０．０１Ｕ／μｌ　ＡｍｐＥｒａｓｅ　ＵＮＧ、０．０３７５μｌ　ＴａｑＧｏｌｄ、８％（ｖ／ｖ）グリセロール、０．０５％（ｖ／ｖ）ゼラチン、０．０１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０、４ｐｍｏｌの各遺伝子特異的Ｔａｑｍａｎプローブ（Ｍａｍｍａｇｌｏｂｉｎ＋Ｇａｂａ＋Ｂ３０５Ｄ＋Ｂ７２６Ｐ）、３００ｎＭのＧａｂａ−Ｒ＋Ｇａｂａ−Ｆ、１００ｎＭのＭａｍｍａｇｌｏｂｉｎ−Ｆ＋Ｒ；Ｂ７２６Ｐ−Ｆ＋Ｒ、および５０ｎＭのＢ３０５Ｄ−Ｆ＋Ｒ鋳型ｃＤＮＡ（０．０２μｇポリＡ＋ＲＮＡに由来する）。
【０２２１】
（ＰＣＲプロトコール）
５０℃２分間を１回、９５℃１０分間を１回、および９５℃１５秒間／６０°１分間／６８℃１分間を５０回。
【０２２２】
マルチプレックスアッセイにおいて設定された各プライマーは、独特の長さのバンドを生じるので、目的の４つの遺伝子の発現シグナルは、アガロースゲル分析によって個々に測定し得るか（図９を参照のこと）、または４つ全ての遺伝子の組み合わせ発現シグナルを、ＡＢＩ　７７００　Ｐｒｉｓｍ配列検出システム（ＰＥ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ　Ｃｉｔｙ，ＣＡ）でリアルタイムで測定し得る。リポフィリンＢの発現もまた、マンマグロビンの代わりに検出し得る。特定のプライマーが本明細書中に記載されているが、異なるプライマー配列、異なるプライマーまたはプローブの標識、および異なる検出系を使用して、このマルチプレックスアッセイを行ない得る。例えば、第２の蛍光発生的レポーター色素を、リアルタイムＰＣＲによって参照遺伝子の対応する検出のために組み込み得る。または、例えば、Ｔａｑｍａｎプローブアプローチの代わりに、ＳＹＢＲ　Ｇｒｅｅｎ検出系を使用し得る。
【０２２３】
（実施例１１）
（乳癌マルチプレックスアッセイのためのゲノムＤＮＡを排除しイントロン−エキソン境界に広がるプライマー対の設計および使用）
本明細書中に記載される多重リアルタイムＰＣＲアッセイは、マンマグロビン、Ｇａｂａ（Ｂ８９９Ｐ）、Ｂ３０５Ｄ−ＣおよびＢ７２６Ｐの発現を同時に検出し得る。これらの遺伝子の組み合わされた発現レベルを、ＡＢＩ　７７００　Ｐｒｉｓｍ配列検出システム（ＰＥ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ　Ｃｉｔｙ，ＣＡ）でリアルタイムで測定する。個別に発現された遺伝子をまた、ゲル電気泳動を介して異なるアンプリコンサイズに起因して、同定し得る。ＤＮａｓｅ処理していないＲＮＡに由来するサンプル（例えば、リンパ節ｃＤＮＡ）を用いてこのアッセイを使用するするため、そして低分子のＲＮＡサンプル（例えば、血液標本、腫瘍およびリンパ節吸引物由来）のためのＤＮａｓｅ処理を避けるために、イントロンに広がるプライマー対を設計して、ゲノムＤＮＡの増幅を排除し、従って非特異的シグナルおよび偽陽性シグナルを排除する。偽陽性シグナルは、ｃＤＮＡ標本におけるゲノムＤＮＡの混入によって引き起こされる。本明細書中に記載される最適マルチプレックスアッセイは、ゲノムＤＮＡの増幅を排除し、そしてＲＮＡサンプルのＤＮａｓｅ前処理の必要性を伴わずに標的遺伝子発現の特異的検出を可能にする。さらに、ゲノムの適合およびイントロン−エキソン境界の位置は、これらのプライマー組で検証され得る。
【０２２４】
マンマグロビン特異的プライマー、Ｇａｂａ（Ｂ８９９Ｐ）特異的プライマー、Ｂ３０５Ｄ特異的プライマーおよびＢ７２６Ｐ特異的プライマーおよび特異的Ｔａｑｍａｎプローブを使用して、これらの発現を同時に検出した（表７）。（イントロン−エキソン境界に広がる）プライマー位置を最適化して、ｃＤＮＡのみを検出し、そしてゲノムＤＮＡを増幅から排除する。発現された遺伝子の身元を、ゲル電気泳動によって決定した。
【０２２５】
【表７】
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プライマーの位置およびアッセイ条件を、４つのＰＣＲ産物の対応する増幅を達成するために最適化した。このアッセイ条件は、以下の通りであった：
（Ｔａｑｍａｎプロトコル（７７００　Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ））
２５μｌの最終容積中：１×緩衝液Ａ、５ｍＭ　ＭｇＣｌ　０．２ｍＭ　ｄＣＴＰ、０．２ｍＭ　ｄＡＴＰ、０．４ｍＭ　ｄＵＴＰ、０．２ｍＭ　ｄＧＴＰ、０．０１Ｕ／ＡｍｐＥｒａｓｅ　ＵＮＧ、８％（ｖ／ｖ）　グリセロール、０．０５％（ｖ／ｖ）ゼラチン、０．０１％（ｖ／ｖ）　Ｔｗｅｅｎ２０、４ｐｍｏｌのそれぞれの遺伝子特異的Ｔａｑｍａｎプローブ（マンマグロビン＋Ｂ８９９Ｐ−ＩＮＴ＋Ｂ３０５Ｄ−ＩＮＴ＋Ｂ７２６Ｐ−ＩＮＴ）、３００ｎＭのＢ３０５Ｄ−ＩＮＴ−Ｆ；Ｂ８９９Ｐ−ＩＮＴ−Ｆ，１００ｎＭのマンマグロビン−Ｆ＋Ｒ；Ｂ７２６Ｐ−ＩＮＴ−Ｆ＋Ｒ、５０ｎＭのＢ８９９Ｐ−ＩＮＴ−Ｒ；Ｂ３０５−ＩＮＴ−Ｒ、テンプレートｃＤＮＡ（０．０２μｇ　ポリＡ＋ＲＮＡを起源とする）。
【０２２６】
（ＰＣＲサイクリング条件）
５０℃、２分間を１サイクル、９５℃、１０分間を１サイクル、９５℃１分間および６８℃、１分間を５０サイクル。
【０２２７】
図１０は、リンパ節組織のパネルにおける乳癌細胞を検出するために、イントロン−エキソン境界スパニングプライマーを使用するマルチプレックスアッセイ（下のパネル）および非最適化プライマーを使用するマルチプレックスアッセイ（上のパネル）の比較を示す。この実験は、サンプル中のゲノムＤＮＡ夾雑物から生じるバックグランドの減少を、本発明のイントロン−エキソンスパニングプライマーを使用して達成することを示す。
【０２２８】
（実施例１２）
（歩哨リンパ節生検サンプルにおける転位した乳癌細胞の多重検出）
リンパ節病期分類は、適切なアジュバントホルモンおよび化学療法を決定するために重要である。従来の腋窩の解剖と対照的に、最小の後遺疾患の病期分類に関するより侵襲性でないアプローチは、歩哨リンパ節生検である。歩哨リンパ節生検（ＳＬＮＢ）は、転位の検出を改善し、そして予後値を提供する可能性があり、完全なリンパ節解剖に関連する最小の罹患率を有する治療を導く。ＳＬＮＢは、最初に腫瘍を排出する１つまたは２つのリンパ節のマッピングを実行し、従って、たいてい、転位性疾患（歩哨節）を有するようである。リンパ節の日常的な病理学的な分析は、高い偽陰性比（ｆａｌｓｅ−ｎｅｇａｔｉｖｅ　ｒａｔｅ）を生じる：病理学的陰性リンパ節を有する３分の１の女性が、再発性疾患に発達する［Ｂｌａｎｄ：Ｔｈｅ　Ｂｒｅａｓｔ：Ｓａｕｎｄｅｒｓ　１９９１］。腫瘍細胞に関するより感受性の検出技術は、ＰＴ−ＰＣＲであるが、この適用は、単一の特定のマーカーの欠失によって制限される。上記のマルチマーカーアッセイは、正常のリンパ節から生じる偽陰性を生じることなく、集団を介して癌検出の可能性を増大する。
【０２２９】
上記のように、原発性腫瘍由来のリンパ性求心性神経を、領域性のリンパ性骨盤へのドレナージが起きる前に、単一の節（歩哨リンパ節）に排出する。歩哨リンパ節を、一次病変部位に注入された色素および／または放射標識コロイドを用いて位置付け、そして歩哨リンパ節生検は、微小転位性沈着物に関する病理学的試験を可能し、従って、腋窩の病期分類は、不必要な腋窩の解剖を避け得る。結節性の微小転位を、サイトケラチンタンパク質に関して、染色（ヘマトキシリンまたはエオシン）または免疫組織化学的分析を使用して位置付け得る。免疫組織化学的染色技術は、節の不適切な切片化に起因して、小転位性病巣を見落とすことによって頻繁に偽陰性結果を生じ得る。免疫組織化学は、サイトケラチン（細網細胞）の非嫡出の発現に起因して、偽陰性結果を生じ得るか、または対応する抗原が、全ての腫瘍細胞に対して発現しない抗体Ｂｅｒ−Ｅｐ４を使用する場合、偽陰性結果を生じ得る。
【０２３０】
本明細書中に記載されるマルチプレックスアッセイは、陽性歩哨リンパ節に関するより感受性の検出を提供し得た。さらに、骨髄サンプル、末梢血および小ニードル吸引サンプルにおける乳癌細胞の検出は、乳癌患者における診断および予後に所望される。
【０２３１】
２２個の転位性リンパ節サンプル（加えて、１５個のサンプルをまた、以前に分析し、そして図３Ａに示す）を、本明細書中に記載されるイントロン−エキソン境界スパニング多重ＰＣＲアッセイを使用して分析した。この分析からの結果を、表８に要約する。２７個の原発性腫瘍をまた、分析し、そして結果を表９に示す。このアッセイを使用して試験した２０個の正常なリンパ節サンプルは、すべて陰性であった。
【０２３２】
【表８】
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【０２３３】
【表９】
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前述の結果から、本発明の特定の実施形態が、例示の目的のために本明細書中に記載されるが、種々の改変が、本発明の精神および範囲を逸脱することなく行なわれ得ることが理解される。従って、本発明は、添付の特許請求の範囲以外によって限定されない。
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は、定量ＰＣＲ（ＴａｑｍａｎＴＭ）を用いて決定される、Ｂ３１１Ｄ、Ｂ５３３Ｓ、およびＢ７２６ＰについてのｍＲＮＡ発現プロフィールを示す。略語：Ｂ．Ｔ．：胸部腫瘍；Ｂ．Ｍ．：骨髄；Ｂ．Ｒ．：乳房の整復。
【図２】
図２は、腫瘍の病理的段階に対するＢ５３３Ｓ発現の関係を示す。正常な乳房（８）由来の組織、良性の乳房障害（３）、および乳房の腫瘍の第Ｉ段階（５）、第ＩＩ段階（６）、第ＩＩＩ段階（７）、第ＩＶ段階（３）、ならびに転移（１つのリンパ節および３つの胸水）を、リアルタイムＰＣＲにおいて試験した。このデータを、試験された各グループについて平均コピー／ｎｇ　β−アクチンとして表わし、線は、算出された傾向線である。
【図３】
図３Ａおよび３Ｂは、それぞれ、Ｂ３０５Ｄ　Ｃ形態、Ｂ７２６Ｐ、ＧＡＢＡπ、およびの転移におけるマンマグロビン（ｍａｍｍａｇｌｏｂｉｎ）ならびに原発性腫瘍の遺伝子の補完性を示す。それぞれの遺伝子についてのカットオフは、陰性の正常組織の平均および３つの標準的偏差に基づく６．５７、１．６５、４．５８、および３．５６コロニー／ｎｇ　βアクチンであった。
【図４】
図４は、マンマグロビンについての全長ｃＤＮＡ配列を示す。
【図５】
図５は、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現されるマンマグロビン組換えポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームの決定されたｃＤＮＡ配列を示す。
【図６】
図６は、ＧＡＢＡπについての全長ｃＤＮＡ配列を示す。
【図７】
図７は、リアルタイムＰＣＲおよびＳＹＢＲ検出系を用いて決定された、胸部腫瘍および正常サンプル中のマンマグロビン、ＧＡＢＡπ、Ｂ３０５Ｄ（Ｃ形態）、およびＢ７２６ＰについてのｍＲＮＡ発現レベルを示す。略称：ＢＴ：胸部腫瘍；ＢＲ：乳房の整復；Ａ．ＰＢＭＣ：活性化された末梢血単核細胞；Ｒ．ＰＢＭＣ：静止状態のＰＢＭＣ；Ｔ．Ｇｌａｎｄ：甲状腺；Ｓ．Ｃｏｒｄ：脊髄；Ａ．Ｇｌａｎｄ：副腎；Ｂ．Ｍａｒｒｏｗ：骨髄；Ｓ．Ｍｕｓｃｌｅ：骨格筋。
【図８】
図８は、胸部腫瘍サンプルのパネル上で試験されたリポフィリンＢ単独とリポフィリンＢ−Ｂ８９９Ｐ−Ｂ３０５Ｄ−Ｃ−Ｂ７２６のマルチプレックスアッセイとの間の比較を示す棒グラフである。略称：ＢＴ：胸部腫瘍；ＢＲ：乳房の整復；ＳＣＩＤ：重症複合免疫不全。
【図９】
図９は、マルチプレックスリアルタイムＰＣＲアッセイにて試験された目的の腫瘍遺伝子の４つの増幅産物（マンマグロビン、Ｂ３０５Ｄ、Ｂ８９９Ｐ、Ｂ７２６Ｐ）の独特のバンドの長さを示すゲルである。
【図１０】
図１０は、リンパ節組織のパネルにおける乳癌細胞を検出するための、イントロン−エキソンに広範にわたるプライマー（パネル下）を用いたマルチプレックスアッセイと非最適化プライマー（パネル上）を用いたマルチプレックスアッセイとの比較を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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