(57)【要約】細胞培養物を増殖させるための装置（１０）は、可撓性膜（１２）に付けられたアンカー（１４）と、細胞が付着するアンカーステム（１６）とを含む。トラフ（４６）および少なくとも１つの通路（５２）を有する治具（１８）が可撓性膜（１２）に隣接して配置される。三次元的な細胞構築物を増殖させ、力学的に馴化する方法は、可撓性膜（１２）を屈曲するための手段（２０）により可撓性膜（１２）およびアンカーステム（１４）をトラフ（４６）の中に引き入れることによって開始される（工程１１４）。細胞が供給され（工程１１６）、そしてアンカーステム（１６）に付着させられる（工程１１８）。可撓性膜（１２）がトラフ（４６）内から遊離され（工程１２０）、これにより、アンカーステム（１６）に付着した細胞の三次元構造物（３４）が得られる。細胞はこの三次元構築物内に増殖する（工程１３０）。構造物（３４）および／または構築物は、細胞の力学的馴化のためのひずみ処理にさらすことができる（工程１３２）。
2004515237.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞培養物を増殖させるための方法であって、
アンカーステムが延伸しているアンカーを可撓性膜の第１面に取り付ける工程、
トラフを有する治具を可撓性膜の第２面に隣接するように配置する工程、
膜を治具内のトラフの中に引き入れる工程、
細胞を可撓性膜に供給する工程、
細胞をアンカーステムに付着させる工程、
可撓性膜をトラフから遊離する工程、および
細胞を増殖させる工程
を含む、方法。
【請求項２】
ひずみ処理を可撓性膜に加える工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
使用者にひずみ処理を規定させる工程をさらに含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
少なくとも１つの組織切片をアンカーステムに接合する工程と、供給された細胞を組織切片に付着させる工程とをさらに含む、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
少なくとも１つのセンサーをアンカー、アンカーステムおよび／または細胞に取り付ける工程と、少なくとも１つのセンサーからのシグナルを収集する工程と、シグナルを処理する工程とをさらに含む、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
処理されたシグナルに基づいてひずみ処理を改変する工程をさらに含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
電気的刺激をアンカーおよび／またはアンカーステムに加える工程をさらに含む、請求項２に記載の方法。
【請求項８】
少なくとも１つのセンサーをアンカー、アンカーステムおよび／または細胞に加える工程、
少なくとも１つのセンサーからシグナルを収集する工程、
シグナルを処理する工程、および
処理されたシグナルに基づいて、加えられた電気的刺激を改変する工程、
をさらに含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
アンカーおよび取り付けられたアンカーステムおよび細胞を可撓性膜から除去する工程、
アンカーを試験装置に装填する工程、および
細胞を試験する工程、
をさらに含む、請求項２に記載の方法。
【請求項１０】
アンカーおよび取り付けられたアンカーステムおよび細胞を可撓性膜から除去する工程、および
アンカーを被移植体内に付着させる工程、
をさらに含む、請求項２に記載の方法。
【請求項１１】
細胞を可撓性膜に供給する前に細胞をゲルマトリックスと混合する工程をさらに含む、請求項２に記載の方法。
【請求項１２】
ひずみ処理を加える工程には、可撓性膜を予め決定された位置で変形させる工程が含まれる、請求項２に記載の方法。
【請求項１３】
細胞培養物を増殖させるための方法であって、
アンカーステムを有するアンカーを可撓性膜の第１面に取り付ける工程、
トラフを有する治具を可撓性膜の第２面に隣接するように配置する工程、
膜を治具内のトラフの中に引き入れる工程、
ゲルマトリックスを可撓性膜に供給する工程、
ゲルマトリックスを少なくとも部分的に固化させる工程、
可撓性膜をトラフから遊離する工程、
細胞をゲルマトリックスに供給する工程、および、
細胞を増殖させる工程、
を含む方法。
【請求項１４】
ひずみ処理を可撓性膜に加える工程をさらに含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
細胞培養物を増殖させるための装置であって、
第１面および第２面を有する可撓性膜、
可撓性膜の第１面に取り付けられたアンカー、
アンカーから延伸するアンカーステム、
トラフが可撓性膜の第２面に隣接して配置されている治具、および、
可撓性膜をトラフの中に引き入れ、かつ可撓性膜をトラフから遊離するための手段、を含み、そして、
可撓性膜が治具の中に引き入れられ、細胞がアンカーステムに付着し、かつ可撓性膜が治具から遊離される、装置。
【請求項１６】
アンカーが第１の構成部材および第２の構成部材を有し、第１の構成部材および第２の構成部材のそれぞれが可撓性膜に取り付けられ、そして、
アンカーステムが、アンカーの第１の構成部材から延伸する第１の部分と、アンカーの第２の構成部材から延伸する第２の部分とを有する、請求項１５に記載の装置。
【請求項１７】
アンカーステムの第１の部分がアンカーステムの第２の部分に対して直径方向の反対側に位置する、請求項１６に記載の装置。
【請求項１８】
アンカーが環状であり、かつ可撓性膜の外縁部に取り付けられ、そして、
アンカーステムが環状である、請求項１５に記載の装置。
【請求項１９】
可撓性膜を治具の中に引き入れ、かつ可撓性膜を治具から離すための手段が、トラフと流体連通している治具内の少なくとも１つの通路と流体連通している吸引である、請求項１５に記載の装置。
【請求項２０】
トラフが矩形状である、請求項１５に記載の装置。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の背景
１．発明の分野
本発明は組織工学に関し、より詳細には、細胞の三次元構築物の作製およびそのような構築物の力学的馴化に関する。
【０００２】
２．関連技術の説明
筋肉、骨、腱、靱帯および軟骨に由来する結合組織は力学的負荷に応答する。多くのタイプの装置が、静的または周期的なひずみを細胞に加えるために開発されている。このような装置には、マトリックス基質に固定された往復運動するアーム、伸展性の膜上で増殖させた細胞に置かれる重り、および伸展性基質上の細胞が静的に伸張させられる強制フレームが挙げられる。
【０００３】
本発明者らによって考えられたある種の装置では、静的または周期的な張力または圧縮が、変形可能な基質上で増殖させられた培養細胞に加えられる。基質の変形は、ソレノイドバルブおよびタイマーにより制御される圧力によって調節される。そのような装置の１つの実施形態において、吸引が、その表面に腱細胞が付着するポリスチレン面を下向きに変形させるために使用される。細胞は、細胞骨格タンパク質のその合成を改変させることによって応答する。この装置は、静的または周期的のいずれかである規定された持続期間、頻度および振幅を有するひずみ処理をもたらすコンピューター制御された装置に発展した。可撓性底の培養プレート上で細胞の容易な増殖を可能にする培養プレートがこの装置とともに使用されている。この装置は、フレックスセル・インターナショナル・コーポレイション（Ｆｌｅｘｃｅｌｌ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）により提供されるＦｌｅｘｅｒｃｅｌｌ（登録商標）Ｓｔｒａｉｎ Ｕｎｉｔ（ＦＳＵ）として知られている。このＦＳＵにより、張力、圧縮、および流体誘導性のせん断ストレスの形態で調節されたひずみを細胞に与える様々な装置が制御される。これらのタイプのひずみは、多数の細胞が生体における自然な環境で感じる広範囲のひずみタイプを包含する。この装置により、細胞力学として知られている新しい研究分野が開拓され、そして市場において広く使用される標準的な器具および培養プレートが提供されている。例えば、米国特許第６，２１８，１７８号、同第６，０４８，７２１号および同第５，５１８，９０９号参照のこと。
【０００４】
フレックスセル・インターナショナル・コーポレイション（Ｆｌｅｘｃｅｌｌ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）による研究は、静止を伴う周期的なひずみの特定の処理（例えば、１Ｈｚ、１％の基質の伸長、８時間／日、３日間）に付された細胞が、基質に付着および延展し、かつ流体流動による除去に抵抗する能力の増大を伴って応答することを示している。フレックスセル・インターナショナル・コーポレイション（Ｆｌｅｘｃｅｌｌ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）は、細胞に基づくこの順応化応答を「力学的馴化」と呼んでいる。異なる順応化処理は、マトリックスに付着し、延展し、接着する細胞の能力；配置された三次元マトリックスを組織化する細胞の能力；自然のマトリックスを発現する細胞の能力；あるレベルの細胞分裂を維持する細胞の能力；そして一般的には、生化学的および生物力学的に正常である自然の表現型を維持する細胞の能力を含む、細胞における異なる順応化応答を生じさせることが理論上考えられる。
【０００５】
体内の組織環境内の細胞は三次元マトリックス内に存在している。これらのマトリックスは、それら自身の特定の解剖学的、物質的構造および生物力学性質を有している。組織が発達するに従い、その細胞は、適度な力学的変形、ならびに、細胞外液からの拡散または血管系を通した栄養分の供給のどちらかによって供給される栄養物を要求する。インビトロでの細胞増殖を持続させることができ、かつ生物力学的環境の過酷さに耐えることができる組織工学された生体適合性材料を開発し、利用するためには、適正な構造設計物を、栄養分の供給を可能にする手段と同様に考え出さなければならない。そのような構造物は、１）細胞の接着および増殖を支援しなければならず、２）細胞の浸潤が容易でなければならず、３）動物またはヒトの体内に移植されるならば、生体適合性でなければならず、すなわち、免疫原性または抗原性が低くなければならず、４）細胞分裂、その後の分化、マトリックスの発現および分化した機能と適合し得る構造を有しなければならず、５）生物産物および／または細胞の回収を可能にする構造を有しなければならず、６）化学的に安定でなければならず、７）入手、成形、製造および滅菌が容易でなければならず、そして８）安価でなければならない。
【０００６】
発明の要約
本発明の目的は、順応させた細胞表現型を獲得するために、そして細胞を刺激して、自身の組織化されたマトリックスをインビトロまたはエクスビボで合成させるために細胞をインビトロで力学的に馴化するための装置、技術および方法を提供することである。このような装置、技術および方法により、１）操作された細胞構築物を、器官の機能的な一部として、または完全に機能的な器官として身体内に挿入することができるようになり、そして２）自身のマトリックス内または合成もしくは生合成されたマトリックス構造物内に播種するために細胞を調製することができ、その結果、身体内の既存の組織が増強または修復され得るようになる。
【０００７】
本発明は、細胞、マトリックスまたは構築物をインキュベーションし、栄養供給し、そして力学的、電気的および／または生化学的に馴化するための無菌の装置を含む、細胞構築物を増殖させ、力学的に馴化するための方法および装置を含む。
【０００８】
細胞培養物を増殖させるための本発明による装置は可撓性膜を含む。アンカーが可撓性膜の周縁部に付けられる。アンカーステムがアンカーから延伸するアンカーステムは、細胞が付着し得る自由な部分を含む。治具が、可撓性膜に隣接して配置される。治具は、可撓性膜の隣りに配置されたトラフと、少なくとも１つの通路とを含む。可撓性膜を屈曲するための手段もまた提供される。そのような手段は、例えば、少なくとも１つの通路と流体連通している吸引源などである。
【０００９】
好ましくは、可撓性膜はウエルタイプの培養プレートの可撓性膜である。ウエルは、可撓性膜、アンカー、アンカーステムおよび治具を収容する。治具は、自身とウエルの底（例えば、ガスケット付きの膜）との間に空間が形成されるように配置される。吸引源はその空間と流体連通しており、空間は少なくとも１つの通路と流体連通している。
【００１０】
装置は、細胞培養物を増殖させ、そして細胞培養物の三次元構築物を力学的に馴化するために使用される。可撓性膜およびそれと一緒になったアンカーステムは、吸引源からの吸引を加えることによってトラフの中に引き入れられる。可撓性膜がトラフの中に引き入れられているときに、細胞が可撓性膜に供給される。細胞がアンカーステムに付着すると、吸引が解放され、可撓性膜がトラフ内から遊離される。その結果、アンカーステムに付着している細胞の三次元構造物が得られる。構造物の細胞を三次元構築物内に増殖させることができる。
【００１１】
構造物および／または構築物は、構造物および／または構築物を力学的に馴化するためのひずみ処理に付される。該ひずみにより、身体内で遭遇するひずみがシミュレートされる。ひずみ処理は、吸引源を使用して加えられる。吸引の付加および解放によって、可撓性膜はひずみにさらされ、それにより、可撓性膜上の細胞はひずみにさらされる。加えられたひずみは、治具の形態に依存して二軸性または一軸性であり得る。
【００１２】
本発明は、皮膚、筋肉、骨、椎間板、腱、靱帯などの結合組織の構築物；腸、肝臓、膵臓、脾臓、胸腺などの非結合組織の構築物；あるいは眼、生殖器官、リンパ節などの臓器または他の臓器もしくはその一部の構造物になることが定められている細胞を増殖させ、力学的に馴化するために使用することができる。
【００１３】
例えば、血管を含む血管補綴物の中に接種される予定の内皮細胞または平滑筋細胞を、操作された基質に対して迅速に付着および延展させ、そして加えられた筋力、反応性の基礎的力、振動または流動のひずみ等のインビボでの加えられた力による脱離に抵抗するように、増殖させ、力学的に馴化することができる。
【００１４】
別の例として、培養された軟骨細胞を、被移植体の組織内に組み込まれ、かつ膝関節、股関節または他の関節における関節軟骨における圧縮荷重の過酷さに耐え得るマトリックスを発現するように馴化することができる。
【００１５】
本発明は、患者に由来する細胞が収集され、培養され、力学的に馴化され、そして修復もしくは置換を必要とする臓器に、または臓器内に移植されるマトリックスに直接に播種され得る病院内の中核的部署で使用することができる。
【００１６】
好適な実施態様の詳細な説明
本発明の完全な理解は、全体を通して同じ参照符号により同じ部分が示される添付された図面と一緒に理解したときに下記の説明から得られる。
下記の説明のために、「上方」、「下方」、「右」、「左」、「垂直」、「水平」、「上部」、「底部」およびそれらの派生語の各用語は、本発明が図面において向けられているように本発明に関連するものとする。しかし、本発明は、逆のことが明示的に規定される場合を除き、様々な代わりの変化形および工程系列を取り得ることを理解しなければならない。添付された図面に例示され、そして下記の明細書に記載される特定の装置およびプロセスは本発明の単なる例示的な実施形態であることもまた理解しなければならない。従って、本明細書中に開示される実施形態に関連する特定の大きさおよび他の物理的特性を限定として見なしてはならない。
【００１７】
図１〜図３を参照した場合、細胞培養物を増殖させるための本発明による装置１０は、可撓性膜１２、アンカー１４、アンカーステム１６、治具１８、そして可撓性膜１２を屈曲するための手段２０を含む。
【００１８】
可撓性膜１２は、第１または上方面２２と、第２または下方面２４とを有する。好ましくは、可撓性膜１２はウエルタイプの培養プレートの可撓性の底部である。典型的な６ウエル培養プレートは、それぞれのウエル４２に１つで、６つの可撓性膜１２を有する。可撓性膜１２およびウエル４２は好ましくは透明である。例えば、可撓性膜１２は、細胞を付着させるために、典型的であるように試薬で処理されていない、ＢｉｏＦｌｅｘ（登録商標）Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｐｌａｔｅ ｗｅｌｌ（フレックスセル・インターナショナル・コーポレイション（Ｆｌｅｘｃｅｌｌ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）による）の可撓性の底部の膜であり得る。
【００１９】
アンカー１４は、可撓性膜１２の第１面２２に対して、２１において取り付けられるか、または、捕らえられる。アンカー１４は、シリコーンゴム配合物または他の同様な接着剤もしくは結合材を使用して可撓性膜１２に取り付けることができる。好ましくは、アンカー１４は第１の構成部材２８および第２の構成部材３０を含む。第１の構成部材２８および第２の構成部材３０はそれぞれが、可撓性膜１２の第１面２２に、好ましくは直径方向の対向する位置において取り付けられる。
【００２０】
アンカーステム１６がアンカー１４から延伸しているが、可撓性膜１２には捕らえられていない。従って、アンカーステム１６は、細胞が構造物３４（図１０を参照のこと）として付着することができ、かつ構造物に増殖することができる自由な部分３２を有する。アンカー１４と同様に、アンカーステム１６は、互いに直径方向の反対側にある第１の部分３８および第２の部分４０を好ましくは含む。アンカーステム１６の第１の部分３８はアンカー１４の第１の構成部材２８から延伸し、アンカーステム１６の第２の部分４０はアンカー１４の第２の構成部材３０から延伸する。この形態において、アンカーステム１６の対向する部分３８および部分４０に付着した細胞は互いの方向に向かって増殖し、その後で混じり、連続的な構築物を形成する。
【００２１】
あるいは、図４および図５を参照した場合、アンカー１４’およびアンカーステム１６’は環状であり得る。１つまたは複数の構成部材がアンカー１４’を形成することができる。同様に、１つまたは複数の切片がアンカーステム１６’を形成することができる。例えば、アンカー１４’は、可撓性膜に捕らえられたときに環状形状を形成する四分円に構成された４つの構成部材を含むことができる。アンカーステム１６’が同様に構成される。この場合、アンカー１４’は円形の可撓性膜１２の外縁部に取り付けられる。この形態では、細胞は、実質的に円形に付着する。細胞は、隣接する細胞と混合し、中心に向かって増殖し、その後で他の細胞と中心部で混合し、連続的な構築物を形成する。
【００２２】
アンカー１４および／またはアンカーステム１６は、ナイロン、絹、綿、ポリエステル、ウレタンまたは他の同様な材料などの材料から組み立てることができる。材料は固体および／または網目状であってもよい。アンカー１４および／またはアンカーステム１６は種々の材料からなる一連の層状物であってもよい。アンカーステム１６は、細胞の付着を改善するために、酸性試薬または塩基性試薬で処理することができる。アンカーステム１６は、アンカーステム１６に吸収されるか、または共有結合的に結合されるマトリックスペプチドおよび／またはマトリックスタンパク質でさらに処理することができる。
【００２３】
組織切片３６（図１０を参照のこと）をアンカーステム１６に接合させることができる。組織切片３６は任意の天然の組織であり、例えば、骨、腱、靱帯、筋肉または血管であり得る。その後、細胞を、アンカーステム１６の代わりに組織切片３６に付着させることができる。この形態により、組織全体または組織の一部の構築が容易になる。組織切片３６は複数の組織を含むことができる。例えば、骨−靱帯−骨の移植片を使用して、損傷した前十字靱帯を置換するための構築物を増殖させることができる。また、例えば、骨切片をアンカーステム１６の部分３８または部分４０の一方に結合させることができ、筋肉切片をアンカーステム１６のもう一方の部分３８または部分４０に結合させることができ、そして腱細胞を供給された細胞として使用することができる。従って、手、足、脚、肩または他の任意の部位における損傷した屈筋腱または伸筋腱を置換するために、骨−腱−筋肉の構築物を増殖させ、力学的に馴化することができる。
【００２４】
次に、図１〜図３および図６を参照すると、治具１８が、可撓性膜１２の第２面２４に隣接して配置される。可撓性膜１２が治具１８の上面４４上に静止するように治具１８を培養プレートのウエル４２内にはめ込むために円筒状にすることができる。
【００２５】
トラフ４６が、可撓性膜１２の第２面２４に隣接するように治具１８において規定される。トラフ４６は、細胞がアンカーステム１６に付着したとき、構造物３４の所望する形状を作るために任意の所望する形状にすることができる。例えば、トラフ４６は、例えば、矩形４６、円形４６’（図４を参照）、らせん形４６”（図５を参照のこと）、長手の帯形、正方形、管形、球形または円盤形である構造体３４を形成させるために成形することができる。具体的な例として、長手の帯形を、腱または靱帯を増殖させるために使用することができ、管形を、血管を増殖させるために使用することができ、あるいは球形または円盤形を、皮膚または角膜の切片を増殖させるために使用することができる。
【００２６】
図１および図３を参照した場合、可撓性膜１２を屈曲するための手段２０は、好ましくは、可撓性膜１２および治具１８を収容する培養プレートのウエル４２を含む。ウエル４２はガスケット付き膜４８に置かれ、それにより空間５０をガスケット付き膜４８と治具１８との間に規定する。治具１８は、トラフ４６および空間５０と流体連通している少なくとも１つの通路５２、好ましくは、複数の通路５２、を含む。空間５０はまた吸引源５４と流体連通している。吸引源５４からの吸引が、細胞構築物３４の形成および細胞または構築物の力学的馴化を助けるために治具１８の下部に加えられる。可撓性膜１２を屈曲するための手段２０はコントローラー５６（図１１を参照のこと）によって制御することができる。
【００２７】
図７および図８を参照すると、細胞培養物の三次元構築物を増殖させ、かつ力学的に馴化するための本発明による方法は、工程１１０において、アンカーステム１６が延伸するアンカー１４を可撓性膜１２の第１面２２に取り付けることによって開始される。組織切片３６を、工程１１１において、アンカーステム１６に接合させることができる。トラフ４６および少なくとも１つの通路５２を有する治具１８が、工程１１２において、可撓性膜１２の第２面２４に隣接して配置され、トラフ４６が可撓性膜１２に接するようにされる（図３を参照のこと）。可撓性膜１２およびそれと一緒になっているアンカーステム１６が、工程１１４において、トラフ４６の中に引き込まれる（図９を参照のこと）。工程１１６において、可撓性膜１２がトラフ４６の中に引き込まれているところに、細胞が可撓性膜１２に供給される。細胞は、工程１１８において、アンカーステム１６または組織切片３６に付着させられる（一部の細胞は可撓性膜１２に付着し得る）。細胞がアンカーステム１６に付着すると、可撓性膜１２は、工程１２０において、トラフ４６内から遊離する。この結果、アンカーステム１６または組織切片３６に付着している細胞の三次元構造物３４が得られる（図１０を参照のこと）。
【００２８】
可撓性膜１２を変形させる手段２０が吸引源５４を含む好ましい実施形態において、吸引が治具１８の下部に加えられるとき、工程１１４において、空気が少なくとも１つの通路５２を介して排気され、そして可撓性膜１２およびアンカーステム１６がトラフ４６に向かって変形する。十分な吸引が加えられたとき、可撓性膜１２はトラフ４６の中に引き込まれ、トラフ４６の形状に類似した形態を取る（図９を参照のこと）。この状態で、可撓性膜１２は、工程１１６において細胞を収容するための適切な容器を形成し、そして工程１１８において細胞がアンカーステム１６に付着するまで細胞を保持する。細胞は、種々の構造物３４を形成させるために、アンカーステム１６の予め決められた位置に供給することができる。細胞が工程１１８において自身を支え得る構造体３４を作製したとき、吸引が工程１２０において解放され、そして可撓性膜１２は、アンカーステム１６に接着した細胞の所望する三次元構造物３４を伴ってその自然の状態に戻る（図１０を参照のこと）。
【００２９】
加えられる吸引の初発の処理および継続期間は、細胞が工程１１８においてアンカーステム１６に付着するために要する時間に依存して変化させることができる。可撓性膜１２に導入される吸引の継続期間およびレベルは、Ｆｌｅｘｅｒｃｅｌｌ（登録商標）Ｓｔｒａｉｎ Ｕｎｉｔ（ＦＳＵ）または類似するコントローラー装置５６によって調節することができる。加えられる吸引レベルにより、可撓性膜１２およびアンカーステム１６が工程１１４においてトラフ４６の中にどのくらい引き込まれるかが決定される。少なくとも１つの通路５２を治具１８に設置することにより、可撓性膜１２のどの領域が変形させられるかが決定される。例えば、治具１８の一方の側面の近くに存在する通路５２は、可撓性膜１２をそのような領域において変形させる。少なくとも１つの通路５２のサイズは、構造物３４の形状を規定することを助ける。従って、三次元細胞構造物３４の構造、サイズおよび容量を調節することができる。
【００３０】
三次元細胞構造物３４を形成させるために、工程１１６において、細胞を単独またはゲルマトリックス中において、可撓性膜１２に供給することができる。あるいは、ゲルマトリックスを単独で、工程１１２において引き込まれた可撓性膜１２に供給することができる。ゲルマトリックスが最初に細胞を伴わずに供給されるとき、ゲルマトリックスは、工程１２４において固化され、または少なくとも部分的に固化させられ（すなわち、重合させられ）、その後、工程１２６において、可撓性膜１２がトラフ４６内から離される。その後、工程１２８において、細胞がゲルマトリックスに供給される。
【００３１】
任意の組織に由来するマトリックスを、細胞が接種され得るゲルマトリックスの出発源として使用することができる。ゲルマトリックスは、腱、靱帯、皮膚、骨、軟骨または他の同様な組織などの結合組織の酸抽出物であり得る。他の材料をゲルマトリックスとして使用することができ、これには、コラーゲンゲル、ポリグリコール酸、ポリ乳酸、アガロース、アルギン酸塩、シリコーンゲルまたはウレタンゲルが含まれる。
【００３２】
酸抽出物が使用される際、所望する場合には、最終的なイオン強度が細胞の生存、および、原繊維へのマトリックス重合に対応するように、その酸溶液を塩基で中和することができる。ゲルマトリックスが結合組織の酸抽出物であるとき、その酸組成は、好ましくは、約０．５Ｍ酢酸／水である。しかし、他の濃度および酸配合物を使用することができる。塩溶液を含む他の抽出溶液を使用することができる。マトリックス溶液の濃度は、より粗いゲルまたは緻密なゲルを形成させるために使用者によって制御することができる。
【００３３】
工程１３０において、細胞は、三次元構築物を形成させるために増殖させられる。ゲルマトリックスに生息する細胞はゲルマトリックスを再構築して、細胞自身のマトリックスを産生し、それによりマトリックスの強度を増大させる。マトリックスへの接合に加えて、細胞はまた、アンカー１４および／またはアンカーステム１６に直接的に接合することができる。この状況において、細胞はアンカー１４および／またはアンカーステム１６に付着し、力をアンカー１４および／またはアンカーステム１６に加える。その際、細胞はゲルマトリックスを再構築または再造形し、これにより、ゲルマトリックスのみがアンカーステム１６に接着した場合よりも大きい一体性および強度を有する構築物が得られる。
【００３４】
工程１３２において、細胞が増殖している間、または三次元構築物が形成された後、可撓性膜１２は、可撓性膜１２に付着した細胞または構築物にひずみ処理を加えるために変形させられる。ひずみ処理は、細胞または構築物を力学的に馴化するために、工程１３２において可撓性膜１２に加えられる。細胞構造物３４の形成の場合のように、吸引源５４からの吸引が、可撓性膜１２を治具１８へと引き込むために治具１８の下部に加えられる。吸引は、可撓性膜１２をその最初の状態に遊離するために解放される。可撓性膜１２の変形および遊離は、可撓性膜１２上におけるアンカーステム１６に付着した構造物または構築物（すなわち、細胞）に加えられるひずみに転換される。加えられたひずみは、例えば、静止時または活動時における身体内の正常な活動により生じるひずみをシミュレートするために、静的（例えば、変形した状態で可撓性膜を変形させ、保つこと）、または周期的（例えば、可撓性膜を繰り返し変形させ、遊離すること）であり得る。ひずみ処理は、所望するように使用者によって規定することができ、かつ調節することができる。
【００３５】
一軸性のひずみ処理により、細胞または構築物を変形させるために、治具１８は、ＦＳＵと一緒に使用されるアークタンギュラー（ａｒｃｔａｎｇｕｌａｒ）搭載支柱であり得る。可撓性膜１２の第２面２４と接触するアークタンギュラー搭載支柱の面は、（培養ウエル４２において）層をなす可撓性膜１２の寸法と一致するように湾曲した最短の側面を有する矩形である。アークタンギュラー搭載支柱の長い側面は、支柱の長い側面とウエル４２の外辺部との間の隙間を対向する極を残す。吸引が可撓性膜１２に加えられたとき、可撓性膜１２は、その２つの対向する極において下向きに変形する。この結果、２つの極の間の可撓性膜１２に加えられる一軸性のひずみが得られ、これは、２つの極の間に付着している構造物または構築物（すなわち、細胞）に加えられる一軸性のひずみに転換される。アークタンギュラー搭載支柱の面は、可撓性膜１２が支柱の面に沿って滑るのを容易にするために滑らかにすることができる。
【００３６】
環状のアンカー１４’および環状のアンカーステム１６’が使用されるとき、円形の搭載支柱が使用される。円形の搭載支柱は、可撓性膜１２よりも小さい寸法である。この場合、吸引が加えられたとき、等しい二軸性のひずみが細胞または構築物に加えられる。
【００３７】
可撓性膜１２は、ガス交換、栄養分混合、そして構造物または構築物（すなわち、細胞）の中への培地およびガスの拡散を増大させるために、構造物または構築物の周りの栄養補給培地を意図的に撹乱するように特定の位置で変形させることができる。これは、周期的、間欠的または連続的な様式で可撓性膜１２の下向きおよび上向きの作動を調節することによって達成することができる。治具１８内の少なくとも１つの通路５２の位置、および、吸引源５４が装置１０に接続されている様式により、可撓性膜１２が変形させられる様式が規定される。この場合、ウエル４２の壁により境界されるチャンバー、ウエル４２の上面（図示せず。）、および可撓性膜１２は、可撓性膜１２がバルブとして作用するバイオリアクターを構成する。
【００３８】
アンカー１４および／またはアンカーステム１６は、電気的シグナルの通過を可能にする材料（１つまたは複数）から構成することができる。あるいは、電気伝導性材料５８をアンカー１４および／またはアンカーステム１６に取り付けることができる（図１１を参照のこと）。いずれの場合でも、供給源６０（図１１を参照のこと）からの電気的パルスを、工程１３４において、アンカー１４および／またはアンカーステム１６に、そしてそれにより構造物または構築物（すなわち、細胞）に制御様式で加えることができる。同様に、磁気的パルスを、工程１３４において、アンカー１４および／またはアンカーステム１６に、そしてそれにより構造物または構築物（すなわち、細胞）に制御様式で加えることができる。
【００３９】
センサー６２を、工程１３６において、アンカー１４、アンカーステム１６および／または構造物または構築物（すなわち、細胞）に取り付けることができる（図１１を参照のこと）。これらのセンサー６２からのシグナルは工程１３８において収集され、そして構造物または構築物（すなわち、細胞）の発育、すなわち、細胞の遊走およびリモデリング、構造的再構築、細胞分裂、マトリックスの発現、シグナル分子の分泌、細胞およびマトリックスの収縮、電気的パルセーション、ｐＨ変動ならびに細胞死を含む代謝的な変化および活性を細胞が受けているという意味での発育をモニターするために、制御装置５６または別の装置によって工程１４０において処理される（図１１を参照のこと）。
【００４０】
処理されたシグナルは、例えば、ソフトウエアプログラムを使用して、工程１４２において解釈され得る。加えられたひずみ（張力、圧縮および／またはせん断）、電気的パルスもしくは磁気的なパルス、または構造物もしくは構築物（すなわち、細胞）を取り囲む培地の化学的性質を、解釈された処理後のシグナルに基づいて、工程１４４において、制御装置５６を使用して調節することができる。このフィードバックモニターリングおよび増殖特性の調節は、増殖中の細胞において所望する結果を達成することに援助する。
【００４１】
構造内の細胞が好適な構築物内へと増殖し、そして所望するように力学的に馴化されると、工程１４６において、アンカー１４を可撓性膜１２から除去することができる。アンカー１４は、アンカーステム１６を介してアンカー１４に取り付けられている生成構築物を引き続き取扱うために使用することができる。例えば、アンカー１４を使用して、構築物を、工程１４８において、張力荷重試験装置または圧縮荷重試験装置などの試験装置内に装填することができる。その後、工程１５０において、試験手順を構築物に適用することができる。別の例として、可撓性膜１２からの除去（工程１４６）の後または細胞の試験（工程１５０）の後、工程１５２において、アンカー１４を被移植体内に取り付けることができる。アンカー１４およびアンカーステム１６が被移植体内に固定されるためには、アンカー１４およびアンカーステム１６の材料は特別な再吸収性の物質でなければならない。このような物質は、被移植体組織内への構築物の組み込みを容易にするために設計することができる。被移植体内に固定されると、アンカー１４および／またはアンカーステム１６は、さらなる生体フィードバック制御およびシグナルモニターリングのためのキャリアとして使用することができる。例えば、アンカー１４および／またはアンカーステム１６は、マトリックス分子、サイトカイン、成長因子、インサートを有するウイルスＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、オリゴヌクレオチド、または、完全な遺伝子（被移植体組織内への組み込みを達成するために役立つように構築物または周囲組織の成長過程に影響を及ぼす遺伝子移入用）、に対する担体として使用することができる。
【００４２】
具体的な例として、使用において、ＢｉｏＦｌｅｘ（登録商標）Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｐｌａｔｅが、ＦＳＵに取り付けられたガスケット付きベースプレートに置かれる。ＦＳＵは、加えられる吸引により可撓性膜１２が下方向に変形され得るが、大気圧に戻すことにより、可撓性膜１２がその変形していない状態に解除されるように、制御された陰圧および陽圧をベースプレートに与える。ＦＳＵは、バルブを制御し、従って、ＢｉｏＦｌｅｘ（登録商標）Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｐｌａｔｅに対する圧力を制御するソフトウエアを伴うマイクロプロセッサーである。可撓性膜１２を特定の方法で能動的に屈曲することを可能にするプログラムを設定することができ、その結果、細胞の三次元構造物３４が培養される増殖培地が可撓性膜１２の作用によって送液されるようになる。細胞の三次元構造物３４は培地流路の中央部に置かれる。可撓性膜１２が下方向に引き込まれると、培地は下に流れて、マトリックスを通過する。可撓性膜１２が上方向に動くと、流体は上方向に流れて、マトリックスを通過する。このプログラムは、細胞に対する栄養物の拡散を増大させるために、そして同様に、細胞分裂およびマトリックスの発現を単独で、または増大した栄養物の流れとの相乗作用で刺激するためには重要であり得る力学的な摂動をもたらすためにも、所与の頻度および振幅で繰り返すことができる。
【００４３】
前記の説明は本発明の好ましい実施形態を詳細に示しているが、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、様々な改変、付加および変化をそのような実施形態に対して行い得ることが当業者により理解される。
【図面の簡単な説明】
【図１】
細胞培養物を増殖させ、かつ力学的に馴化するための、本発明による装置の前面透視図
【図２】
図１に示された装置の上面図
【図３】
図２の線ＩＩＩ−ＩＩＩに沿って得られる断面図
【図４】
細胞培養物を増殖させ、かつ力学的に馴化するための、本発明による装置の別の実施形態の上面図
【図５】
細胞培養物を増殖させ、かつ力学的に馴化するための、本発明による装置のさらに別の実施形態の上面図
【図６】
図１に示された装置における治具の前面透視図
【図７】
本発明による一般的な方法を例示するフローダイアグラム
【図８】
図７に示されたフローダイアグラムの続きである
【図９】
図２の線ＩＩＩ−ＩＩＩに沿って得られる断面図であって、可撓性膜がトラフの中に引き込まれている断面図
【図１０】
図２の線ＩＩＩ−ＩＩＩに沿って得られる断面図であって、細胞構造物が組織切片に付着している断面図
【図１１】
図２の線ＩＩＩ−ＩＩＩに沿って得られる断面図であって、概略的な全体構成を示す断面図
【図７】
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【図８】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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