(57)【要約】デキストリンおよびデンプンを含む発酵性の糖からＬ（＋）−ラクテートを生産するための好熱性微生物バチルス・コアグランス株ＳＩＭ−７  ＤＳＭ  １４０４３である。培養温度は５３〜６５℃が最適である。発酵物中のＬ（＋）−ラクテートの最終濃度は１２％であり、収率は９５％である。この微生物株の培養は、器具および培地の高温滅菌なしで可能である。発酵性の糖源として穀類粉末を使用すると、この微生物株に必要な無機物および窒素塩は穀類中に存在する化合物で賄われる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
微生物バチルス・コアグランス  ＳＩＭ−７  ＤＳＭ１４０４３株。
【請求項２】
請求項１に記載の微生物によって発酵性の糖およびその混合物からＬ（＋）−ラクテートを生産する方法であって、前記微生物株を５３〜６５℃の間の温度で培養し、発酵培地はデキストリンとデンプンとを含む部分的に発酵性の糖と、他の栄養素を含むことを特徴とする方法。
【請求項３】
５７℃の温度で前記微生物株の培養を実施することを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項４】
器具および培地の高温滅菌なしで前期微生物株の培養を実施することを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項５】
穀類の粉末を発酵性の糖源として使用することを特徴とする請求項２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はバイオテクノロジーの分野に属し、微生物合成による光学的に純粋なＬ（＋）−ラクテートの生産に利用可能である。
【背景技術】
【０００２】
Ｌ（＋）−ラクテートの微生物合成はホモ乳酸発酵に基づいており、発酵したヘキソース（例えば、グルコースやガラクトース）１分子から２分子のラクテートを生じる。純粋なＬ（＋）−ラクテートの工業的化学合成は現在までに解明されておらず、したがって、この化合物の微生物合成に代わる方法は存在しない。Ｌ（＋）−ラクテートの微生物合成では、エネルギー消費効率の観点から、器具および発酵培地の高温滅菌ステップなしの発酵方法の構築に好適な微生物株の培養可能な最高温度は重要である。
【０００３】
乳酸桿菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）の種に基づいた現在利用可能な方法では、培養温度は、無菌でない条件下で富栄養培地での培養が進んでも好熱性微生物による雑菌混入が排除されない、４５℃を超えない（非特許文献１）。バチルス・コアグランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏａｇｕｌａｎｓ）ＴＢ／０４に基づいた方法では、最適培養温度は５２℃である（非特許文献２）。この場合に不都合な点は、糖濃度が高い（７．５％より高い）場合にプロセスが阻害され、工業規模でのこの株の使用が困難になることである。
【０００４】
本発明のプロトタイプは、微生物株バチルス・コアグランス  ＤＳＭ  ５１９６である（特許文献１）。この微生物に基づいた方法では、最適培養温度は５２℃である。糖の開始濃度を２０％までにしてこの微生物を培養することが可能である。しかし、この微生物は、増殖培地中のグルコースまたはスクロースの７０％しかラクテートに変換することができず、これは現在の工業的方法（８５〜９０％）よりも低い。さらに、バチルス・コアグランス  ＤＳＭ  ５１９６は、デンプンを加水分解できず、別の技術的プロセス中で安価な原料としてのデンプンの前処理（液化および糖化）が必要とされる。
【０００５】
【特許文献１】米国特許第５０７９１６４号；Ｃ１２Ｐ  ７／５６、Ｃ１２Ｒ  １／０７; Jungbunzlauer Aktiengesellschaft, 1992
【非特許文献１】J.H. Litchfield; In Advances in Applied Microbiology, Neidleman S.L. ed, Vol. 42, pp 45-95, 1996
【非特許文献２】T.Payot, Z.Chemaly, F.Fick Enzyme and Microbial Technology, 24, pp 191-199
【非特許文献３】Watanabe, K., Kitamura, K., Suzuki, Y (1996) Appl. Environ. Microbiol. 62: 2066-2073
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、公知の類似する方法の記載よりも高い温度で増殖してラクテートを生産でき、高い開始糖濃度に対して耐性を有し、デンプンを加水分解でき、発酵性単糖類およびデンプンのどちらかまたは両方からのＬ（＋）−ラクテート生産に適した、微生物の好熱性株である。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の目的は、過熱した、微生物の分解特性を備える穀類（コムギ）から単離した微生物の好熱性株バチルス・コアグランス  ＳＩＭ−７  ＤＳＭ１４０４３である。コムギを製粉し、デンプンを液化した。生じた１８〜２０％の糖含有率を有する加水分解物を６０℃で集積培養として使用した。標準的な微生物学的方法を使用して、さらに微生物株の選択を行った。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
培養上および形態上の特徴
微生物株バチルス・コアグランス  ＳＩＭ−７  ＤＳＭ  １４０４３のコロニーは、円形突起状で、光沢があり、透明で、滑らかな表面、乾燥組成、直径２〜３ｍｍである。長いグラム陽性の棒状細胞は連鎖を形成する。細胞は運動性を有し、末端付近に楕円形の内性胞子を形成する。
【０００９】
生理学的および生化学的特徴
この微生物株は、単糖類のグルコース、マンノース、ガラクトース、フルクトース、および二糖類のスクロース、マルトース、セロビオースで増殖する。多糖類からは、この微生物株はデンプンで増殖する。カゼインおよびゼラチンを分解することはできない。この微生物株は、発酵性の代謝をする。これは、ＣＯ2を生成せずにグルコースおよびデンプンを発酵してＬ（＋）−ラクテートにする。Ｄ（−）−ラクテートの形成はない。酸素耐性である。カタラーゼ陽性でチトクロームＣ陰性である。インドール形成能力はない。
【００１０】
増殖温度
この微生物株は、６５℃までの温度で増殖し、胞子の生存能力は８５℃で少なくとも４０分間は保持される。これの培養最適温度は５７℃であり、デンプンを含めた発酵性の糖を高純度レベルのＬ（＋）−ラクテートに変換し、代謝された糖からの収率は９５％になる。これは、既に報告されている他の株の場合よりも５〜１０℃高い、６５℃までの温度で増殖してＬ（＋）−ラクテートを生産することができる。
【００１１】
本発明の目的としての微生物株の同定
代謝活動のパターンに基づいたＢｉｏｌｏｇ  Ｉｎｃ．社のグラム陽性微生物同定システム（ＧＰ２  ＭｉｃｒｏＰｌａｔｅ）、データベースＧＰ  Ｄａｔａｂａｓｅ（リリース４．０１Ａ）を使用することによって、ＳＩＭ−７株は、最も高い確率（９９％）でバチルス・サーモグルコシダシウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｉｕｓ）種であると同定された。しかし、これらのデータはＳＩＭ−７株の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子配列データ（Ｇｅｎｅ  Ｂａｎｋ登録番号ＡＦ３４６８９５）と矛盾していた。ジーンバンクのデータは、ＳＩＭ−７株に最も近い類縁体である、全１４６４ヌクレオチドのうち２カ所の差異を有するバチルス種  ＨＣ１５株（ＡＣ２５２３２９）、６カ所の差異を有するバチルス・コアグランス  ＮＣＤＯ  １７６１（Ｘ６０６１４）、７カ所の差異を有するバチルス・コアグランス  ＩＡＭ  １２４６３（Ｄ１６２６７）、８カ所の差異を有するバチルス・コアグランス  ＪＣＭ２２５７（Ｄ８３１３）を示唆している。
【００１２】
これに対して、バチルス・サーモグルコシダシウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｉｕｓ）（ＡＢＯ２１１９７）は試験した１３１ヌクレオチドが異なっている。ワタナベ博士ら（非特許文献３）は、１つの分解の遺伝子オリゴ−１，６−グルコシダーゼのヌクレオチド配列を、バチルス・サーモグルコシダシウス  ＫＰ１００６株およびバチルス・コアグランス  ＡＴＣＣ  ７０５０株で比較した。これらのタンパク質の全体的な類似度は５９％であった（非特許文献３）。
【００１３】
ＳＩＭ−７株の１６Ｓ  ｒＲＮＡの遺伝子配列とオリゴ−１，６−グルコシダーゼ遺伝子の部分ヌクレオチド配列のどちらもが、明らかにバチルス・コアグランス種に関連を示す。バチルス・コアグランス  ＡＴＣＣ  ７０５０株およびバチルス・コアグランス  ＳＩＭ−７  ＤＳＭ  １４０４３株のこの遺伝子のヌクレオチド位置６４３から１２８７の間では差異は２カ所しかなく、それぞれアミノ酸Ｍｅｔ399／ＩｌｅおよびＧｌｎ402／Ｈｉｓで両方とも置換をもたらす（対応するヌクレオチド配列は、ＧｅｎｅＢａｎｋＤ７８３４２、位置１２４４でｇの代わりにａ、位置１２５３でａの代わりにｔ）。したがって、ＳＩＭ−７株は、バチルス・サーモグルコシダシウス種に対する全体の代謝的な類似性にもかかわらず、バチルス・コアグランス種の典型的ではない好熱性変異種である。また、バチルス・コアグランス  ＳＩＭ−７  ＤＳＭ  １４０４３株はβ−ガラクトシダーゼ活性を有しておらず、バチルス・コアグランス  ＤＳＭ  ５１９６株（Kirkovits ら）と異なって、ラクトースで増殖できないがガラクトースで増殖できる。上記の特性を有する微生物は、２００１年８月２日に、登録番号ＤＳＭ  １４０４３でDeutsche Sammlung fur Mikroorganismen und Zellkulturen GmbHに寄託した。
【００１４】
この微生物株の高温で増殖する能力およびデキストリンを使用する能力は、別の技術ステップとしてのデンプンの糖化を回避でき、これにより糖化に必要なグルコアミラーゼを省くことを可能にし、デンプンからラクテートを生産することを平昜にし、この方法をより安価にする。
【００１５】
部分的に液化したデンプンを５７℃の温度で発酵する場合は、培地の粘度が低くなるために混合エネルギーは減少する。数種の単糖類および二糖類を発酵する能力により、この株は糖の複合基質またはそれらの混合物からＬ（＋）−ラクテートを生産するのに有用となる。デンプン源として穀類を使用する場合は、この株が必要とする無機物および窒素化合物は、穀類に由来する化合物により大部分が賄われる。この微生物株は、成長培地中の高い開始糖濃度（１７〜２０％）に耐性があり、成長培地中のグルコースを蓄積するが培地中に乳酸カルシウムを１３〜１４％蓄積する。より高い発酵温度で乳酸カルシウムの溶解度がより高くなる結果、この方法において中和にＣａ2+が使用される場合には、乳酸カルシウムの濃度を１６０〜１７０ｇ／ｌにまで上昇させることが可能である。
【００１６】
発酵性の糖およびその混合物からＬ（＋）−ラクテートを生産する方法は、デキストリン、デンプン、および他の栄養素を含む部分的に発酵性の糖を含む培地での培養の最適温度が５７℃であるこの微生物株を、５３〜６５℃の温度範囲で培養することに基づいている。発酵の結果、得られるＬ（＋）−ラクテートの最終濃度は１２％であり、収率は９５％である。この微生物株の培養は、器具および培地の高温滅菌なしで実施する。穀類粉末を発酵の糖源として使用すると、この微生物株が培地中で必要とする無機物および窒素化合物は、穀類に由来する化合物により大部分が賄われる。
【実施例】
【００１７】
（実施例１）
好熱性微生物株バチルス・コアグランス  ＳＩＭ−７  ＤＳＭ  １４０４３の単離
この微生物株を、過熱した、微生物の分解特性を有する穀類（コムギ）から単離した。コムギの塊を粉末にして液化した。生じた１８〜２０％の糖含有率を有するデンプン加水分解物を６０℃で集積培養として使用した。この培養物を単一コロニーになるように広げて、培地を酸性化する能力を有するコロニーを選別し、次いで、ＣＯ2を生成しない、ホモ乳酸発酵能力の選択を行った。Ｌ（＋）−ラクテートの生産は、Ｌ−ラクテートデヒドロゲナーゼによって酵素的に試験した。熱耐性、酸素耐性でＬ（＋）−ラクテートを生産するコロニーのうち、バチルス・コアグランス  ＳＩＭ−７  ＤＳＭ  １４０４３の純粋菌株を単離した。
【００１８】
（実施例２）
Ｌ（＋）−ラクテートの生産
ライコムギの粉末（２８５ｇ）を１リットルの水に懸濁させ、α−アミラーゼを用いて８５℃で、ＤＥ＝２２．５までデンプンを液化した。液化したデンプンを、グルコアミラーゼを用いて６０℃で糖化した。遠心分離によって、非溶解性の繊維物質およびタンパク質を糖化したデンプンから分離した。グルコース含量が１４．８ｇ／ｌの低温殺菌した上清に０．６％までの酵母菌抽出物を加え、バチルス・コアグランス  ＳＩＭ−７  ＤＳＭ  １４０４３の発酵培地として使用した。作られた乳酸を、発酵培地に加えた炭酸カルシウムで中和した。発酵中のｐＨは５．３〜６．２の間、温度は５７℃、攪拌は１分あたり１００回転であった。これらの条件下で９８時間の発酵の後、最終濃度１２．３％のＬ（＋）−ラクテートが得られた。代謝されたグルコースからのＬ（＋）−ラクテートの収率は９５．５％であった。
【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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