(57)【要約】本出願は、Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）調節性シグナル伝達経路が、細胞成長の有糸分裂期中に抑制解除されるように改変されたＳｚ．ポンベ酵母細胞を開示する。酵母細胞を作製するのに使用される構築物をコードする単離された核酸分子、ＧＰＣＲ経路を研究するため、およびかかる経路において影響を及ぼす化合物を単離するための当該細胞および核酸分子の使用についても開示する。
2004515238.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）細胞成長の有糸分裂期中に抑制解除されるＧタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）調節性シグナル伝達経路、
（ｉｉ）該ＧＰＣＲ調節性シグナル伝達経路により媒介されるシグナルをレポートするレポーター系
を含むシゾサッカロマイセス・ポンベ（Ｓｚ．ポンベ）酵母細胞であって、
（ａ）該ＧＰＣＲが異種性であり、かつ／または
（ｂ）該レポーター系は、レポーター遺伝子およびプロモーターを含み、該レポーター遺伝子は、該プロモーターに作動可能に連結され、該プロモーターは、該ＧＰＣＲにより調節可能であり、該レポーター遺伝子および該プロモーターの少なくとも１つは、異種性である酵母細胞。
【請求項２】
前記ＧＰＣＲ調節性シグナル伝達経路は、栄養制御経路の崩壊により、細胞成長の有糸分裂期中に抑制解除される、請求項１に記載の酵母細胞。
【請求項３】
前記酵母細胞は、アデニル酸シクラーゼ欠損性である、請求項１または２に記載の酵母細胞。
【請求項４】
前記酵母細胞は、突然変異ｐａｔ１遺伝子を含むか、または内因性ｐａｔ１遺伝子が欠失された、先行の請求項のいずれかに記載の酵母細胞。
【請求項５】
前記レポーター系は、レポーター遺伝子およびプロモーターを含み、該レポーター遺伝子は、該プロモーターに作動可能に連結され、該プロモーターは、前記ＧＰＣＲにより調節可能であり、該レポーター遺伝子および該プロモーターの少なくとも１つは、異種性である、請求項１ないし４のいずれか１項に記載の酵母細胞。
【請求項６】
前記レポーター遺伝子は、異種性である、請求項５に記載の酵母細胞。
【請求項７】
前記ＧＰＣＲは、哺乳動物ＧＰＣＲである、先行の請求項のいずれかに記載の酵母細胞。
【請求項８】
前記酵母細胞は、異種またはキメラＧタンパク質サブユニットを含む、先行の請求項のいずれかに記載の酵母細胞。
【請求項９】
前記キメラＧタンパク質サブユニットは、Ｇα移植体である、請求項８に記載の酵母細胞。
【請求項１０】
前記Ｇα移植体は、以下の移植体：
Ｇαｑ（配列番号１７）
Ｇαｓ（配列番号１６）
Ｇαｏ（配列番号１８）
Ｇαｉ２（配列番号１９）
Ｇαｉ３（配列番号２０）
Ｇαｚ（配列番号２１）
Ｇα１２（配列番号２２）
Ｇα１３（配列番号２３）
Ｇα１４（配列番号２４）、および
Ｇα１６（配列番号２５）
から選択される、請求項９に記載の酵母細胞。
【請求項１１】
前記レポーター系は、酵母接合フェロモンのそのＧＰＣＲへの結合により調節される、請求項５に記載の酵母細胞。
【請求項１２】
前記酵母接合フェロモンは、Ｐ因子フェロモンである、請求項１１に記載の酵母細胞。
【請求項１３】
前記レポーター系は、ｓｘａ２プロモーター、またはその相同体もしくは類似体に作動可能に連結される、請求項１２に記載の酵母細胞。
【請求項１４】
前記レポーター系は、前記酵母細胞の染色体に組み込まれる、先行の請求項のいずれかに記載の酵母細胞。
【請求項１５】
前記酵母細胞は、安定な接合型を有する、先行の請求項のいずれかに記載の酵母細胞。
【請求項１６】
前記酵母細胞は、ｒｇｓ１欠損性である、先行の請求項のいずれかに記載の酵母細胞。
【請求項１７】
前記酵母細胞は、ｐｍｐ１欠損性である、先行の請求項のいずれかに記載の酵母細胞。
【請求項１８】
前記酵母細胞は、ｓｘａ２欠損性である、先行の請求項のいずれかに記載の酵母細胞。
【請求項１９】
前記内因性ｓｘａ２遺伝子の少なくとも一部が欠失された、請求項１８に記載の酵母細胞。
【請求項２０】
前記レポーター遺伝子は、欠失ｓｘａ２遺伝子を置換する、請求項１９に記載の酵母細胞。
【請求項２１】
前記レポーター遺伝子は、オロチジン−５’−リン酸デカルボキシラーゼ（Ｓｚ．ポンベ  ｕｒａ４遺伝子の産物）、β−ガラクトシダーゼ（細菌ｌａｃＺ遺伝子の産物）、β−ラクタマーゼ、エクオリン、グリーン蛍光タンパク質、またはルシフェラーゼをコードする、先行の請求項のいずれかに記載の酵母細胞。
【請求項２２】
寄託番号ＮＣＹＣ２９８４として寄託されたシゾサッカロマイセス・ポンベ株ＪＹ５４６である酵母細胞。
【請求項２３】
前記酵母は、前記レポーター系のＧＰＣＲ調節性発現に対する影響に関してアッセイする１つまたはそれ以上の化合物、またはアッセイする１つまたはそれ以上のペプチドもしくはタンパク質をコードするＤＮＡ分子をさらに含む、先行の請求項のいずれかに記載の酵母細胞。
【請求項２４】
前記酵母細胞は、前記または各ペプチドもしくはタンパク質をコードする１つまたはそれ以上のプラスミドを含む、請求項２３に記載の酵母細胞。
【請求項２５】
ペプチドまたはタンパク質をコードする前記ＤＮＡは、チアミン調節性ｎｍｔ１プロモーターの制御下で転写される、請求項２４に記載の酵母細胞。
【請求項２６】
前記ペプチドまたはタンパク質は、ランダム配列のものである、請求項２３または請求項２４に記載の酵母細胞。
【請求項２７】
前記酵母細胞は、前記ＧＰＣＲとしてオーファン受容体を発現し、前記レポーター系は、該オーファン受容体により調節可能である、先行の請求項のいずれかに記載の酵母細胞。
【請求項２８】
外因性レポーター遺伝子に作動可能に連結されたｓｘａ２プロモーター、またはその相同体もしくは類似体を含む単離された核酸分子。
【請求項２９】
前記レポーター系は、オルチジン−５’−リン酸デカルボキシラーゼ（Ｓｚ．ポンベ  ｕｒａ４遺伝子の産物）、β−ガラクトシダーゼ（細菌ｌａｃＺ遺伝子の産物）、β−ラクタマーゼ、エクオリン、グリーン蛍光タンパク質、またはルシフェラーゼをコードする、請求項２８に記載の単離された核酸分子。
【請求項３０】
Ｇαｑ（配列番号１７）
Ｇαｓ（配列番号１６）
Ｇαｏ（配列番号１８）
Ｇαｉ２（配列番号１９）
Ｇαｉ３（配列番号２０）
Ｇαｚ（配列番号２１）
Ｇα１２（配列番号２２）
Ｇα１３（配列番号２３）
Ｇα１４（配列番号２４）、および
Ｇα１６（配列番号２５）
から選択される核酸配列、または遺伝暗号における縮重により、該配列の１つまたは複数と異なる核酸配列を有するＧα移植体をコードする単離された核酸分子。
【請求項３１】
ＧＰＣＲ調節性活性を研究するための、
（ａ）  （ｉ）細胞成長の有糸分裂期中に抑制解除されるＧタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）調節性シグナル伝達経路、
（ｉｉ）該ＧＰＣＲ調節性シグナル伝達経路により媒介されるシグナルをレポートするレポーター系
を含むシゾサッカロマイセス・ポンベ（Ｓｚ．ポンベ）酵母細胞、または
（ｂ）請求項２８ないし３０のいずれか１項に記載の単離された核酸分子
の使用。
【請求項３２】
請求項１ないし３１のいずれか１項に記載の酵母細胞または単離されたＤＮＡ分子の使用を含むアッセイ。
【請求項３３】
ＧＰＣＲ調節性活性に対する化合物の影響を決定する方法であって、
（ｉ）  （ａ）細胞成長の有糸分裂期中に抑制解除されるＧタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）調節性シグナル伝達経路、
（ｂ）該ＧＰＣＲ調節性シグナル伝達経路により媒介されるシグナルをレポートするレポーター系
を含むシゾサッカロマイセス・ポンベ（Ｓｚ．ポンベ）酵母細胞を供給し、
（ｉｉ）該化合物を、該酵母細胞に導入し、そして
（ｉｉｉ）該レポーター系の産出量を表示する
工程を含む方法。
【請求項３４】
前記オーファンＧＰＣＲの、前記レポーター系を調節する能力に影響を及ぼす化合物を特定するための、請求項２７に記載の酵母細胞の使用。
【請求項３５】
ＧＰＣＲ調節性経路の構成成分の調節因子または突然変異体を特定するための、
（ｉ）細胞成長の有糸分裂期中に抑制解除されるＧタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）調節性シグナル伝達経路、
（ｉｉ）該ＧＰＣＲ調節性シグナル伝達経路により媒介されるシグナルをレポートするレポーター系
を含むシゾサッカロマイセス・ポンベ（Ｓｚ．ポンベ）酵母細胞の使用。
【請求項３６】
ＧＰＣＲ調節性シグナル伝達経路を調整する試薬を特定する方法であって、
（ｉ）  （ａ）細胞成長の有糸分裂期中に抑制解除されるＧタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）調節性シグナル伝達経路、
（ｂ）該ＧＰＣＲ調節性シグナル伝達経路により媒介されるシグナルをレポートするレポーター系
を含むサッカロマイセス・ポンベ（Ｓｚ．ポンベ）酵母細胞を供給し、
（ｉｉ）該酵母細胞内でランダムペプチドを産生し、そして
（ｉｉｉ）産生されたレポーター活性の量を測定すること
を含む方法。
【請求項３７】
請求項３３または請求項３６に記載の方法により同定される、ＧＰＣＲ活性を調整することが可能な化合物。
【請求項３８】
Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）が細胞シグナル伝達経路に共役されるかどうかを決定する方法であって、
（ｉ）細胞成長の有糸分裂期中に抑制解除されるＧタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）調節性シグナル伝達経路、
（ｉｉ）該ＧＰＣＲ調節性シグナル伝達経路により媒介されるシグナルをレポートするレポーター系
を含むシゾサッカロマイセス・ポンベ（Ｓｚ．ポンベ）酵母細胞のリガンド非依存性レポーター系産出量を、機能性ＧＰＣＲを欠如した参照細胞の該レポーター系産出量と比較することを含む方法。
【請求項３９】
（ｉ）細胞成長の有糸分裂期中に抑制解除されるＧタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）調節性シグナル伝達経路であって、該ＧＰＣＲは、存在しないか、そうでなければ非機能的にさせられているＧＰＣＲ調節性シグナル伝達経路、
（ｉｉ）該ＧＰＣＲ調節性シグナル伝達経路により媒介されるシグナルをレポートするレポーター系
を含むシゾサッカロマイセス・ポンベ（Ｓｚ．ポンベ）酵母細胞。
【請求項４０】
請求項１ないし３０、および請求項３９のいずれか１項に記載の酵母細胞または単離された核酸分子を含むアッセイキット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本出願は、Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）の活性を研究するのに使用され得る改変酵母細胞に関する。使用する酵母細胞は、レポーター遺伝子−プロモーター構築物を含有するシゾサッカロマイセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）（Ｓｚ．ポンベ）である。本発明は、上記レポーター遺伝子−プロモーター構築物をコードする単離された核酸、ならびにアッセイにおける上記酵母細胞および核酸分子の使用に関する。
【０００２】
ＧＰＣＲは、哺乳動物および酵母を含めた真核生物すべてにおいて重要な種類の受容体であり、ホルモンシグナルおよび感覚シグナルの細胞機構への伝達を担う（Ｂａｌｄｗｉｎ， １９９４に概説されている）。かかる受容体は、細胞外Ｎ末端および細胞質Ｃ末端を有する７回膜貫通ドメインを含む共通構造を有する。ＧＰＣＲは通常、Ｇα、Ｇβ、およびＧγサブユニットから構成されるヘテロ三量体Ｇタンパク質に共役している。受容体にリガンドが結合することで、Ｇタンパク質の変化が刺激され、ここでＧαサブユニットに結合されたグアノシン二リン酸（ＧＤＰ）が、グアノシン三リン酸（ＧＴＰ）に交換される。立体配座変化が付随することにより、Ｇβγ二量体からのＧα−ＧＴＰの解離が生じ、それらのいずれかが、エフェクタータンパク質の活性を調整し、細胞挙動の変化をもたらすことができる。
【０００３】
ＧＰＣＲは、主要な器官系すべての生理機能を制御し、治療および診断の進歩にとって重要な標的であり、ほぼすべての主要な医薬品市場で臨床的に成功を収めている薬剤を提供している。約２００種の十分にキャラクタライズされたＧＰＣＲの多くは、少なくとも１つの薬剤、およびＧＰＣＲに作用する市販の薬剤の約６０％に関連し、世界規模で年間売上２７０億ドルを提供する。別の約１００種のＧＰＣＲが存在するが、それらに関するリガンドは、いまだ同定されていない。これらのいわゆる「オーファン」受容体は、重要な薬剤標的となる多くのものを含む可能性がある。ヒトゲノムの解析は、キャラクタライズすることが必要な別の５００種のオーファンＧＰＣＲがおそらく存在することを示している。したがって、ＧＰＣＲを標的とした薬剤リードを開発することへの関心は高い。
【０００４】
新規薬剤の同定へのアプローチの１つは、ＧＰＣＲに関するハイスループットスクリーン（ＨＴＳ）の開発である。たいていの場合で、標的ＧＰＣＲは、受容体の活性化が細胞挙動の変化を引き起こすように、宿主系で発現される。続いて、スクリーニングは、天然リガンドの作用を模倣する（アゴニスト）か、または受容体を阻止する（アンタゴニスト）、薬剤リードを特定することができる。真核細胞はすべて、ＧＰＣＲを含み、それぞれはＨＴＳに適応させることができるが、これを実施するのに必ずしも実用的ではなく、たいていのスクリーンは、限られた範囲の宿主系を使用する。これらには、哺乳動物細胞、カエルメラノサイト、昆虫細胞、および酵母が含まれる。各系は、その利点と欠点とを有する。例えば、哺乳動物細胞は、ヒトＧＰＣＲを研究するのには明白な選択であると思われ得るが、哺乳動物細胞は、取り扱うには困難かつ高価であり、スクリーンは、研究されるＧＰＣＲに密接に関連した受容体の本来の存在により複雑となる場合がある。関連受容体の存在はまた、カエルメラノサイトおよび昆虫細胞を含むスクリーンを複雑にし得る。これらの問題は、酵母には当てはまらず、多くが、ヒトＧＰＣＲをスクリーニングするための代用の宿主として、この比較的簡素な細胞を用いる方向へ向いてきている。
【０００５】
Ｇタンパク質共役受容体は、酵母で既知である。したがって、酵母（例えば、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）（Ｓ．セレビシエ））は、ＧＰＣＲ調節性シグナル伝達系を研究するのに使用されてきた。酵母細胞は、低コストで、かつ高レベルの産生を伴って容易に操作することができることから特に好適である。細菌と異なり、酵母は、受容体機能に影響を及ぼし得る真核生物の翻訳後修飾を実施する可能性を有する（Ｒｅｉｌａｎｄｅｒ ａｎｄ Ｗｅｉｂ， １９９８）。酵母および高等真核生物における翻訳活性化のメカニズムは非常に類似し得る。例えば、酵母上流活性化部位（ＵＡＳ）および幾つかの翻訳活性化因子は、それらの哺乳動物等価物の活性と非常に類似した活性を有することが見出されている（Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．， １９８８）。
【０００６】
酵母系で実施された多くの研究は、Ｓ．セレビシエにおけるものであった。Ｓ．セレビシエでの細胞内シグナル伝達機構への外因性ＧＰＣＲの共役について記載する多くの報告が存在する。これらとしては、ヒトβ２−アドレナリン作動性（Ｋｉｎｇ ｅｔ ａｌ．， １９９０）、ラットソマトスタチン（Ｐｒｉｃｅ ｅｔ ａｌ．， １９９５； Ｂａｓｓ ｅｔ ａｌ．， １９９６）、ラットアデノシンＡ２Ａ（Ｐｒｉｃｅ ｅｔ ａｌ．， １９９６）、ヒト成長ホルモン放出ホルモン（Ｋａｊｋｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．， １９９７）、ヒトリゾホスファチジン酸（Ｅｒｉｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， １９９８）、ヒトホルミルペプチド受容体様−１（Ｋｌｅｉｎ ｅｔ ａｌ．， １９９８）、ヒトＣ５ａ化学誘引物質（Ｋｌｅｉｎ ｅｔ ａｌ．， １９９８； Ｂａｒａｎｓｋｉ ｅｔ ａｌ．， １９９９）、キノコフェロモン（Ｏｌｅｓｎｉｃｋｙ ｅｔ ａｌ．， １９９９）、ヒトソマトスタチンＳＳＴ２（Ｂｒｏｗｎ ｅｔ ａｌ．， ２０００）、ヒトソマトスタチンＳＳＴ５（Ｂｒｏｗｎ ｅｔ ａｌ．， ２０００）、ヒトセロトニン５−ＨＴ１Ａ（Ｂｒｏｗｎ ｅｔ ａｌ．， ２０００）、ヒトセロトニン５−ＨＴ１Ｄ（Ｂｒｏｗｎ ｅｔ ａｌ．， ２０００）、ヒトメラトニンＭＬ１Ｂ（Ｂｒｏｗｎ ｅｔ ａｌ．， ２０００）、ヒトプリン作動性Ｐ２Ｙ１ （Ｂｒｏｗｎ ｅｔ ａｌ．， ２０００）、ヒトプリン作動性Ｐ２Ｙ２（Ｂｒｏｗｎ ｅｔ ａｌ．， ２０００）、ヒトアデノシンＡ２Ｂ（Ｂｒｏｗｎ ｅｔ ａｌ．， ２０００）、ヒトＵＤＰ−グルコース（Ｃｈａｍｂｅｒｓ ｅｔ ａｌ．， ２０００）、ヒトプロテアーゼ活性化受容体（Ｓｗｉｆｔ ｅｔ ａｌ．， ２０００）、ヒトムスカリン様Ｍ１（Ｅｒｌｅｎｂａｃｈ ｅｔ ａｌ．， ２００１）、ヒトムスカリン様Ｍ３（Ｅｒｌｅｎｂａｃｈ ｅｔ ａｌ．， ２００１）、ヒトムスカリン様Ｍ５（Ｅｒｌｅｎｂａｃｈ ｅｔ ａｌ．， ２００１）、およびヒトバソプレシンＶ２（Ｅｒｌｅｎｂａｃｈ ｅｔ ａｌ．， ２００１）が挙げられる。
【０００７】
しかしながら、ＧＰＣＲすべてが、Ｓ．セレビシエにおいてシグナル伝達機構に共役するわけではない。共役することができない受容体は通常報告されないが、ヒトＧＰＣＲの４０％程度がＳ．セレビシエで機能的ではない。
【０００８】
分裂酵母サッカロマイセス・ポンベ（Ｓｚ．ポンベ）は、代替的な遺伝的に扱いやすい真核生物として一般になり、それはＳ．セレビシエと系統学的に離れているだけでなく、その細胞および分子生物学の幾つかの局面で、高等真核細胞により密接に似ている（Ｒｅｉｌａｎｄｅｒ ａｎｄ Ｗｅｉｂ， １９９８； Ａｌｌｓｈｉｒｅ ｅｔ ａｌ．， １９８７）。したがって、Ｓｚ．ポンベは、出芽酵母の魅力ある代替物を提供するようである。不運にも、これまでに報告されたＳｚ．ポンベにおいてシグナル伝達機構に外因性ＧＰＣＲを共役させる試みは、全て失敗に終わっている。受容体は発現されるものの、それらは酵母において分子内シグナル伝達機構に共役することができないように見える。例としては、バクテリオロドプシン（Ｈｉｌｄｅｂｒａｎｄｔ ｅｔ ａｌ．， １９９３）、ヒトドパミンＤ２Ｓ（Ｓａｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９９４）、ヒトニューロキニンＮＫ２（Ａｒｋｉｎｓｔａｌｌ ｅｔ ａｌ．， １９９５）、およびヒトβ２−アドレナリン作動性（Ｆｉｃｃａ ｅｔ ａｌ．， １９９５）が挙げられる。
【０００９】
この出願は、細胞内シグナル伝達機構に外因性ＧＰＣＲを共役させるために、したがって、外因性受容体の活性に影響を及ぼすアゴニストおよびアンタゴニストに関するハイスループットスクリーニングに適切な株を生成するために、例えば改変を用いてＳｚ．ポンベを操作し得る方法について記載する。
【００１０】
Ｓｚ．ポンベのような分裂酵母は、２つの別個の成長周期を有する。第１に、分裂酵母は、半数体細胞が分裂により単純に分裂する正常な栄養周期または有糸分裂周期を有する。第２に、分裂酵母は、減数分裂周期を有する。減数分裂周期では、酵母細胞は、第２の酵母細胞と接合し、二倍体細胞を形成する。次に、二倍体細胞は減数分裂および芽胞形成を受け、４つの半数体芽胞を形成する。かかる芽胞は、非常に快活であり、減数分裂周期は通常、酵母の環境条件がもはや有糸分裂の成長を支持しない場合に誘発される。例えば、Ｓｚ．ポンベにおける減数分裂周期は通常、窒素飢餓によって誘発される。
【００１１】
Ｓｚ．ポンベにおける接合は、拡散性接合フェロモンの相反作用により制御される。Ｍ細胞（接合型マイナスの）は、接合用のＰ細胞（接合型プラス）を調製するＭ因子を放出する一方で、Ｐ細胞は、接合用のＭ細胞を刺激するＰ因子を放出する。標的細胞の表面上のそれらの受容体へのフェロモンの結合により、細胞内シグナル伝達経路が活性化され、遺伝子転写のパターンの変化が引き起こされ、接合用の細胞が調製される。フェロモンにより誘導される応答としては、細胞周期のＧ１停止、凝集の増加、および接合突起を有する細胞（ｓｈｍｏｏ）を形成するための細胞の伸長が挙げられる。Ｍ因子およびＰ因子フェロモンが結合するＭ受容体およびＰ受容体は、Ｇタンパク質共役受容体の例である。受容体へのフェロモンの結合時に、Ｇαサブユニットが放出される。これは、多くの哺乳動物細胞での場合とまったく同様に、Ｓｚ．ポンベ細胞内でのシグナル伝達において正の役割を有する。これは、Ｇαサブユニットが負の調節因子であるＳ．セレビシエと対照的である。したがって、Ｓｚ．ポンベ系は、哺乳動物のような高等真核生物におけるＧＰＳＲにより密接に類似すると考えることができる。
【００１２】
適切に改変されたＳｚ．ポンベは、ＧＰＣＲ経路の構成成分を同定するために、ＧＰＣＲ経路における突然変異体を特定するために、およびＧＰＣＲ調節性シグナル伝達経路を刺激または阻害する化合物を特定するために、ＧＰＣＲを研究するための良好なモデルであることがここで理解されよう。
【００１３】
Ｓｚ．ポンベは、Ｓ．セレビシエよりも高い細胞壁透過性を有すると思われる。これは、大きいリガンドまたは複雑なリガンドを有する受容体の研究において非常に貴重であることが判明し得る。
【００１４】
本発明の第１の態様は、
（ｉ）細胞成長の有糸分裂期中に抑制解除されるＧタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）調節性シグナル伝達経路、
（ｉｉ）上記ＧＰＣＲ調節性シグナル伝達経路により媒介されるシグナルをレポートするレポーター系
を含むシゾサッカロマイセス・ポンベ（Ｓｚ．ポンベ）酵母細胞であって、
（ａ）上記ＧＰＣＲが異種性であり、かつ／または
（ｂ）上記レポーター系は、レポーター遺伝子およびプロモーターを含み、上記レポーター遺伝子は、上記プロモーターに作動可能に連結され、上記プロモーターは、上記ＧＰＣＲにより調節され、上記レポーター遺伝子および上記プロモーターの少なくとも１つは、異種性である、酵母細胞を提供する。
【００１５】
ＧＰＣＲ調節性シグナル伝達機構の構成成分の幾つかの発現は、有糸成長期中のＳｚ．ポンベにおいて通常抑圧され、細胞成長の有糸分裂期中のシグナル伝達を研究するために、この抑圧を解除することが必要である。ＧＰＣＲ調節性シグナル伝達機構を抑制解除する方法について以下で議論する。
【００１６】
細胞成長の有糸分裂期中に抑制解除されるＧＰＣＲ調節性シグナル伝達経路を維持することで、ＧＰＣＲを研究するのにＳｚ．ポンベを使用できることを発見した。すなわち、細胞は、例えばレポーター遺伝子の転写を増加または減少させるためのＧＰＣＲに対する適切なリガンドの結合を可能にするために、有糸分裂期中に活性化される１つまたはそれ以上のシグナル伝達構成成分を有する。
【００１７】
酵母細胞は一般に、有糸成長中にＧＰＣＲ調節性経路を抑制解除するための１つまたはそれ以上の突然変異を含むであろう。栄養制御経路は、この目的で突然変異を崩壊させることができる。
【００１８】
Ｓｚ．ポンベ細胞にＧＰＣＲ調節性シグナル伝達経路を接合させて、抑制解除させるために、Ｓｚ．ポンベ細胞を飢餓させることが通常必要である。有糸成長中に存在する比較的高レベルの細胞質ｃＡＭＰは、栄養分が制限的になるにつれ減少し、これが、性発達を誘発する助けとなる。アデニル酸シクラーゼ（これは、ＡＴＰをｃＡＭＰに変換する）を欠如した株は、細胞質ｃＡＭＰを有さないが、合理的には十分に成長する。これらの株は、性発達に関して抑制解除され、有糸成長中の接合フェロモンに応答する。したがって、好ましくは、酵母細胞は、アデニル酸シクラーゼ欠損性である。より詳細には、アデニル酸シクラーゼをコードするｃｙｒ１遺伝子が、例えばＤＮＡ配列の挿入により、物理的または機能的に除去あるいは崩壊される。挿入ＤＮＡ配列は、利便性がよければなんでもよいが、本発明の好ましい実施形態では、挿入ＤＮＡ遺伝子は、レポーター遺伝子を包含し得る。以下で議論するように、ｕｒａ４遺伝子が一例である。ｃｒｙ１遺伝子は、Ｊｏｈｎ Ｄａｖｅｙ ａｎｄ Ｏｌａｆ Ｎｉｅｌｓｅｎによる論文で詳細に議論されている（Ｄａｖｅｙ ａｎｄ Ｎｉｅｌｓｅｎ， １９９４）。シグナル伝達機構の栄養制御を迂回する他の方法が利用可能であり、それらを用いて、本発明の細胞においてＧＰＣＲ調節性シグナル経路を抑制解除してもよい。これは、性分化を抑圧する効果を有する任意の遺伝子の突然変異を含むことができる。かかる遺伝子としては、ｐａｔ１遺伝子を含む、性分化を抑圧する特定のプロテインキナーゼをコードするものが挙げられる。栄養制御を迂回し、ＧＰＣＲ調節性シグナル伝達経路を抑制解除するためのこの遺伝子中の突然変異の使用について記載されている（Ｄａｖｅｒｙ ａｎｄ Ｎｉｅｌｓｅｎ， １９９４）。
【００１９】
上述のように、Ｄａｖｅｙ ａｎｄ Ｎｉｅｌｓｅｎ（１９９４）は、性分化およびフェロモン応答に関与した突然変異体の特定について開示している。温度感受性ｐａｔ１突然変異体（ｐａｔ１−１１４）は、Ｍ因子に応答した、有糸成長の停止を可能にする。アデニル酸シクラーゼ遺伝子（ｃｒｙ１）中の突然変異も研究された。著者等は、かかる突然変異を有する細胞が、フェロモンに非感受性となるか、またはフェロモンに適応されるようになる点で問題を有することを示した、論文の著者等により特定された認識問題が、サッカロマイセス・セレビシエでの類似した状況と比較して、異種Ｓｚ．ポンベ系では実用上の困難を提示しないことを今回見出した。具体的には、突然変異ｃｙｒ１および異種ＧＰＣＲまたは適切な異種レポーター遺伝子を含有するＳｚ．ポンベ細胞は、脱感作を伴う重大な問題を有さないことを見出した。
【００２０】
レポーター系は、シグナル伝達を様々な方法で測定することを可能にする。例えば、適切なレポーター系としては、シグナル伝達構成成分の会合または解離（例えば、刺激されたＧＰＣＲとのタンパク質の会合、Ｇβγサブユニットのようなネガティブ調節因子からのＧαサブユニットの解離が挙げられる）、セカンドメッセンジャー（例えば、Ｃａ２＋動員、サイクリックＡＭＰレベルの変化、ＧＴＰ加水分解、リン脂質加水分解）、シグナル伝達構成成分の修飾（例えばＭＡＰキナーゼ、ＭＡＰキナーゼキナーゼ、またはＭＡＰキナーゼキナーゼキナーゼのリン酸化のような）、または遺伝子の転写の変更が挙げられる。遺伝子の転写は、直接的に（例えば、ｍＲＮＡ発現は、ノーザンブロットにより検出され得る）、または間接的に（例えば、タンパク質産物は、特徴的な染色または固有の活性により測定され得る）測定することができる。
【００２１】
好ましくは、酵母は、ＧＰＣＲ調節性シグナル伝達経路により調節されるプロモーターに作動可能に連結された異種レポーター遺伝子、または内因性レポーター遺伝子をコードする核酸分子を含む。作動可能に連結されるとは、プロモーターがレポーター遺伝子の転写を誘導することが可能なように、異種レポーター遺伝子、または内因性レポーター遺伝子が、プロモーターに連結されることを意味する。
【００２２】
レポーター遺伝子は、検出可能な遺伝子産物をコードする任意の核酸配列であってもよい。遺伝子産物は、ｍＲＮＡまたはアンチセンスＲＮＡのような非翻訳ＲＮＡ産物であってもよい。かかる非翻訳ＲＮＡは、ＰＣＲ、ノーザンブロットまたはサザンブロットのような、当該技術分野で既知の技法により検出され得る。あるいは、レポーター遺伝子は、タンパク質またはペプチドのようなポリペプチド産物をコードしてもよい。ポリペプチドは、免疫学的に、またはその生物学的活性を用いて、検出され得る。レポーター遺伝子は、当該技術分野で既知の任意のものであり得る。レポーター遺伝子は、天然遺伝子である必要はなく、この意味での「遺伝子」という用語は、任意の天然遺伝子との一致を含蓄するものと解釈されるべきではない。本発明で有用なレポーター遺伝子は、特定の天然遺伝子と同じものであってもよいが、非コード配列に関して（例えば、１つまたはそれ以上の天然に存在するイントロンが存在しなくてもよく）、あるいはコード配列に関して、特定の天然遺伝子と異なってもよい。
【００２３】
レポーター遺伝子は、酵母細胞を、例えば栄養要求性により選択することを可能にするタンパク質をコードし得る。例えば、レポーター遺伝子は、オロチジン−５’−リン酸デカルボキシラーゼをコードするｕｒａ４遺伝子であってもよい。ｕｒａ４遺伝子は、ウラシルの生合成に関与する酵素をコードし、ポジティブ選択およびネガティブ選択の両方を提供する。ｕｒａ４を発現する細胞のみが、ウラシルの非存在下で成長することができ、ここで適切な酵母株が使用される。ｕｒａ４遺伝子産物が５−フルオロオロチン酸（ＦＯＡ）を毒性産物へ変換するため、ｕｒａ４を発現する細胞は、ＦＯＡの存在下では死亡する。ｕｒａ４を発現しない細胞は、培地にウラシルを添加することで維持することができる。選択過程の感受性は、ｕｒａ４遺伝子産物の競合阻害剤である６−アザウラシルを含有する培地を使用することで調節することができる。ｈｉｓ３遺伝子（これは、イミダゾールグリセロール−リン酸デヒドラターゼをコードする）もまた、栄養選択を可能とするレポーター遺伝子としての使用に適切である。ｈｉｓ３を発現する細胞のみが、ヒスチジンの非存在下で成長することができ、ここでは適切な酵母株が使用される。
【００２４】
レポーター遺伝子は、酵母を発色アッセイで使用するのを可能にするタンパク質をコードし得る。例えば、レポーターは、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）由来のｌａｃＺ遺伝子であってもよい。これは、β−ガラクトシダーゼ酵素をコードする。これは、ラクト−スのようなβ−ガラクトシド糖の加水分解を触媒する。酵素の酵素活性は、様々な特殊基質、例えばＸ−ｇａｌ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトシド）、またはｏ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシドを用いてアッセイしてもよく、これらの基質は、分光光度計、蛍光光度計、または発光光度計を用いて、レポーター酵素活性をアッセイすることを可能にする。
【００２５】
当該技術分野で既知のグリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードする遺伝子もまた、レポーター遺伝子として使用され得る。
【００２６】
レポーター遺伝子はまた、細胞、または細胞抽出物に、光を発生させることが可能なタンパク質をコードしてもよい。例えば、レポーター遺伝子は、ルシフェラーゼをコードしてもよい。ルシフェラーゼレポーター遺伝子は、当該技術分野で既知である。ルシフェラーゼレポーター遺伝子は通常、ホタル（フォチノウス・ピラリス（Ｐｈｏｔｉｎｏｕｓ ｐｙｒａｌｉｓ））、またはウミシイタケ（レニラ・レニフォルミス（Ｒｅｎｉｌｌａ ｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）に由来する。ルシフェラーゼ酵素は、酸素およびＭｇ２＋の存在下で、Ｄ−ルシフェリンおよびＡＴＰを用いた反応を触媒し、結果として発光をもたらす。ルシフェラーゼ反応は、光産出量（ｏｕｔｐｕｔ）を測定する発光分光計を用いて定量化される。前記アッセイはまた、より高い感受性を有し、より長期の持続性の光反応を提供する反応における補酵素Ａを包含し得る。
【００２７】
光の発生を可能にする代替的形態の酵素はエクオリンであり、これは当該技術分野で既知である。
【００２８】
最も好ましくは、レポーター遺伝子は、β−ラクタマーゼをコードする。このレポーター遺伝子は、例えばｌａｃＺを上回るある種の利点を有する。哺乳動物細胞または酵母細胞においてバックグラウンド活性が存在せず、それはコンパクトであり（２９ｋＤａ）、それはモノマーとして機能し（テトラマーであるｌａｃＺと対比して）、良好な酵素活性を有する。これは、ＦＲＥＴベースの膜透過性細胞内捕捉蛍光基質であるＣＣＦ２／ＡＭを使用し得る。ＣＣＦ２／ＡＭは、セファロスポリンコアによりフルオレセインに連結された７−ヒドロキシクマリンを有する。インタクトな分子では、クマリンの励起は、フルオレセインに対して効果的なＦＲＥＴを生じ、緑色蛍光をもたらす。β−ラクタマーゼによるＣＣＦ２の切断は、２つの色素の空間的分離をもたらし、ＦＲＥＴを崩壊し、蛍光得顕微鏡を用いて観察すると細胞は緑色から青色に変化する。切断産物の保持により、青色が、時間をかけて発色するのが可能となり、例えば細胞１つ当たり５０個の酵素分子という低い検出限界を付与する。この結果は、高感度でアッセイすることが可能なレポーター分子をもたらす。それはまた、細胞または試料の可視的検査による結果を可能にする能力を可能にする。
【００２９】
ＧＰＣＲ調節性プロモーターの制御下にあるレポーター遺伝子を含む核酸分子はさらに、当該技術分野で既知の上流活性化配列（ＵＡＳ）、終結配列、および／または分泌配列のような１つまたはそれ以上のさらなる調節要素を含んでもよい。分泌配列は、レポーター遺伝子の産物が酵母細胞から確実に分泌されるために使用され得る。
【００３０】
好ましくは、プロモーターは、酵母接合フェロモンのＧＰＣＲへの結合により調節可能である。酵母接合フェロモンは特に、Ｐ因子フェロモンであり得る。これは、Ｐ因子フェロモンが比較的産生しやすいため、特に好ましい。
【００３１】
プロモーターは好ましくは、ＧＰＣＲにより調節される内因性Ｓｚ．ポンベプロモーターである。しかし、プロモーターは内因性である必要はない。特定の異種プロモーターは、非常に調節可能であることが見出されてもよく、あるいは例えばＡｏｎｏ， ｅｔ ａｌ． （１９９４）に記載されるようにＴＲボックスモチーフを含むことにより調節可能であるように操作されてもよい。
【００３２】
より好ましくは、プロモーターは、ｓｘａ２プロモーター、またはその相同体もしくは類似体である。相同体もしくは類似体とは、ｓｘａ２プロモーターをコードする核酸配列に対する１つまたはそれ以上の変化を含み得るが、ｓｘａ２プロモーターと同じ機能的活性を維持するプロモーターを意味する。ｓｘａ２プロモーターが野生型細胞に取り付けられたｓｘａ２遺伝子は、野生型細胞で、Ｃ末端ロイシン残基の除去によりＰ因子を不活性化するカルボキシペプチダーゼをコードする（Ｌａｄｄｓ ｅｔ ａｌ．， １９９６）。ＧＰＣＲ調節性レポーターの構築のためのｓｘａ２プロモーターの使用は、Ｐ因子フェロモンが結合する当該プロモーターがＰ因子受容体（ＧＰＣＲ）によりしっかりと調節されるため好適である。ｓｘａ２プロモーターのたった１つのコピーが野生型細胞に存在する。したがって、天然に存在するｓｘａ２プロモーターおよびその関連ｓｘａ２遺伝子を除去し、それをｓｘａ２プロモーターの転写制御下にあるレポーター遺伝子を有する構築物と置換することが可能である。このプロモーター−レポーター構築物は、酵母細胞の染色体に組み込まれてもよい。
【００３３】
酵母細胞の染色体に、プロモーター−レポーター遺伝子構築物を組み込むことは、その後に既知数のレポーター遺伝子が各細胞内に見出されることから好適である。プロモーター−レポーター遺伝子構築物がプラスミド上に配置される場合、プラスミドのコピー数が相当変化し得て、一定でないことから、各細胞中のレポーター遺伝子の数は、変化し得る。
【００３４】
例えば少なくとも部分的にｓｘａ２遺伝子を欠失することで、内因性ｓｘａ２遺伝子を不活性化することにより、Ｐ因子を用いてＧＰＣＲを刺激する場合のアッセイの感受性を改善することができる。カルボキシペプチダーゼの不活性化が、ＧＰＣＲを刺激するのに使用され得るＰ因子の不活性化を減らすためである。レポーター遺伝子は、例えば融合タンパク質を形成するために、任意の残存するｓｘａ２遺伝子に連結させてもよい。あるいは、完全ｓｘａ２遺伝子を欠失させて、その場所にレポーター遺伝子を挿入してもよい。
【００３５】
好ましくは、使用する酵母細胞は、安定な接合型を示す。Ｓｚ．ポンベにおける接合型は、ｍａｔ１遺伝子座を占める情報により決定される。ｍａｔ１−Ｐｃおよびｍａｔ１−Ｐｍ遺伝子を有する、ｍａｔ１−Ｐセグメントを含む半数体細胞は、「＋」「Ｐまたはプラス」であり、ｍａｔ１−Ｍｃおよびｍａｔ１−Ｍｍをコードするｍａｔ１−Ｍを有するものは、「−」（Ｍまたはマイナス）である。ｍａｔ１−Ｐｃおよびｍａｔ１−Ｍｃの発現は、フェロモンおよびそれらの受容体をコードする遺伝子を発現するのに必要とされ、したがってフェロモン伝達系を樹立する。４つのｍａｔ１遺伝子はすべて、減数分裂に必要とされる。２つのさらなる接合遺伝子座であるｍａｔ２およびｍａｔ３が存在し、ここでＰおよびＭ情報は、蓄積されるが発現されない。野生型ホモタリック株では、ｍａｔ２およびｍａｔ３にある情報が、ｍａｔ１遺伝子座に頻繁に移行され、およそ三世代に１回ごとに接合型を転換する。したがってかかる株の培養は通常、接合型（ＰおよびＭ）の両方の混合物である。正常なヘテロタリック株でさえも、比較的不安定である。安定な接合型を有する株は、ｍａｔ２およびｍａｔ３遺伝子座を欠失させることで、あるいは転換機構を突然変異させることで生成することができ、安定な接合表現型を示す酵母細胞を産生することができる（Ｄａｖｅｙ， １９９８）。
【００３６】
刺激に対する連続曝露は、シグナル伝達経路の脱感作を引き起こす。幾つかのメカニズムが、脱感作過程に寄与することが知られている。脱感作に関与するタンパク質をコードする遺伝子中での選択突然変異は、過感受性および刺激に対する非適応性をもたらす。これは、ハイスループットスクリーンで株を使用する場合に好適であり得る。
【００３７】
酵母細胞は、ｒｇｓ１欠損性であってもよい。ｒｇｓ１を欠如した株、またはＲｇｓ１（ｒｇｓ１遺伝子の産物）活性が減少した株は、フェロモン刺激に対して過感受性である（Ｗａｔｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， １９９９）。
【００３８】
酵母細胞はまた、ｐｍｐ１欠損性であってもよい。ｐｍｐ１遺伝子は、ＭＡＰＫを脱リン酸化する二重特異性ホスファターゼをコードする。このホスファターゼを欠如した株は、ＧＰＣＲ用のリガンドによる細胞の刺激後に応答の増加を示す。
【００３９】
ＧＰＣＲは、天然に存在する酵母フェロモン受容体であり得る。あるいは、受容体は、置換されてもよく、あるいはそのほかに、別の細胞由来の異種受容体を含有してもよい。ＧＰＣＲが異種性である場合、ＧＰＣＲは、Ｓｚ．ポンベ以外の任意の種由来であってもよい。ＧＰＣＲは、植物種または動物種、特に経済的に有意な非ヒト哺乳動物を含む哺乳動物由来であってもよい。しかしながら、本発明の最も重要な態様の１つでは、それは、ヒトＧＰＣＲである。ＧＰＣＲは、本発明を用いて研究することが望ましい任意のＧＰＣＲであり得る。例えば、酵母細胞は、オーファン受容体を発現してもよい。すなわち、未知の特異的活性を有するが、他のＧＰＣＲ受容体に対するその相同性により特定された受容体である。酵母細胞は、当該技術分野で既知の技法を用いて、かかるオーファン受容体を産生するように改変させてもよい。例えば、適切なプロモーターおよび調節配列に操作可能に連結したオーファン受容体をコードする核酸配列を有するプラスミドを、酵母細胞に挿入してもよい。受容体は、Ｓｚ．ポンベで機能するシグナル配列を含むように改変させてもよい。適切なシグナル配列としては、Ｍａｍ２、Ｍａｐ３のシグナル配列、およびＳ．ポンベ細胞により分泌される他の遺伝子産物のシグナル配列が挙げられる。野生型異種ＧＰＣＲがＳｚ．ポンベで機能性となり得ない場合、それはこの目的で突然変異させてもよい。さらに、Ｓｚ．ポンベ細胞は、機能的形態で内因性ＧＰＣＲを発現してもよい。
【００４０】
Ｓｚ．ポンベ細胞は、ＧＰＣＲにより活性化され、ほかの酵母細胞内シグナル伝達機構と相互作用することができるＧタンパク質を含まなくてはならない。内因性Ｓｚ．ポンベＧαサブユニット（Ｇｐａ１）は、細胞内シグナル伝達機構に異種受容体を共役させることが可能であり得る。しかしながら、異種またはキメラＧタンパク質サブユニット（単数または複数）を産生するように、Ｓｚ．ポンベ細胞を操作する必要があり得る。少なくとも１６個のＧαサブユニットが哺乳動物では同定されており、所定のＧＰＣＲは通常、たった１つのＧαサブユニットまたはＧαサブユニットの小サブセットを活性化する。Ｇαサブユニットのアミノ末端およびカルボキシ末端は、有意な相同性を共有しないが、なされ得る一般化が幾つか存在する。例えば、アミノ末端は、Ｇβγサブユニットと関連して、およびＮ末端ミリストリル化により膜と関連して複雑となっている。受容体との相互作用は、それらの受容体に共役することができないＧαサブユニットの５個のＣ末端残基を欠如した突然変異体としてカルボキシ末端を含むと考えられ（例えば、Ｈｉｒｓｃｈ ｅｔ ａｌ．， １９９１を参照）、ＧαサブユニットのＣ末端領域に基づいたペプチドが、受容体に結合する（Ｈａｍｍ ｅｔ ａｌ．， １９８８； Ｐａｌｍ ｅｔ ａｌ．， １９９０； Ｒａｓｅｎｉｃｋ ｅｔ ａｌ．， １９９４）。キメラＧαサブユニットとの連動はさらに、受容体特異性を付与する際にＣ末端残基にとって非常な重要な役割を支持する（Ｖｏｙｎｏ−Ｙａｓｅｎｅｔｓｋａｙａ ｅｔ ａｌ．， １９９４； Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．， １９９５）。したがって、Ａ１アデノシン受容体は本来、Ｇｉにより共役するが、Ｃ末端のＧｑの４つの残基がＧｉ２のものと交換されたＧαキメラにより共役することができ（Ｃｏｎｋｌｉｎ ｅｔ ａｌ．， １９９３）、ＳＳＴ３ソマトスタチン受容体は、Ｇｓにより共役しないが、Ｇｓの最後の５つの残基を、Ｇｉ２由来もので置換することで、アデニル酸シクラーゼに共役させることができる（Ｋｏｍａｔｓｕｚａｋｉ ｅｔ ａｌ．， １９９７）。
【００４１】
幾つかの報告は、異種的に発現されるＧＰＣＲは、Ｓ．セレビシエにおいて細胞内シグナル伝達機構に共役することができることを実証している。これらの受容体のいくつかは、ラットソマトスタチン（Ｐｒｉｃｅ ｅｔ ａｌ．， １９９５）、ラットＡ２Ａアデノシン（Ｐｒｉｃｅ ｅｔ ａｌ．， １９９６）、ヒトリゾホスファチジン酸（Ｅｒｉｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， １９９８）、およびヒトＵＤＰ−グルコース（Ｃｈａｍｂｅｒｓ ｅｔ ａｌ．， ２０００）に関するものを含む、内因性Ｇαサブユニット（ＧＰＡ１遺伝子によりコードされる）と相互作用することができる。ヒト成長ホルモン放出ホルモンの受容体を含む幾つかの他の受容体は、Ｓ．セレビシエＧｐａ１と共役しない（Ｋａｊｋｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．， １９９７）。細胞内シグナル伝達機構へのこれらの受容体の共役を達成するために、Ｓ．セレビシエＧαサブユニットは、哺乳動物Ｇαサブユニットで置換するか、あるいは酵母ＧαサブユニットのＣ末端領域を哺乳動物Ｇαサブユニットの等価領域で置換したキメラＧαサブユニットで置換することができる。キメラＧαサブユニットの使用の多くの例が利用可能である（Ｐｒｉｃｅ ｅｔ ａｌ．， １９９５； Ｂａｓｓ ｅｔ ａｌ．， １９９６； Ｋａｊｋｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．， １９９７； Ｋｌｅｉｎ ｅｔ ａｌ．， １９９８； Ｂａｒａｎｓｋｉ ｅｔ ａｌ．， １９９９； Ｓｗｉｆｔ ｅｔ ａｌ．， ２０００）。幾つかの例では、キメラＧαの産生は、内因性酵母ＧαサブユニットのＣ末端からの５つほどの残基を、哺乳動物Ｇαサブユニットからの等価残基で置換することを含み得る。かかる構築物はときには、「Ｇα移植体（ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ）」と呼ばれる。Ｓ．セレビシエにおけるＧα移植体の使用について記載する報告が幾つか存在する（Ｏｌｅｓｎｉｃｋｙ ｅｔ ａｌ．， １９９９；Ｂｒｏｗｎ ｅｔ ａｌ．， ２０００； Ｃｈａｍｂｅｒｓ ｅｔ ａｌ．， ２０００； Ｅｒｌｅｎｂａｃｈ ｅｔ ａｌ．， ２００１）。
【００４２】
内因性Ｓｚ．ポンベＧαサブユニットに基づくＧα移植体の使用は、異種ＧＰＣＲの共役を改善するのに使用され得る。Ｇα移植体とＧβγサブユニットとの間の正確な化学量論的関係を保証するために、天然Ｓｚ．ポンベＧα遺伝子（ｇｐａ１）の染色体コピーを、Ｇα移植体をコードする等価構築物で置換する必要があり得る。しかしながら、他のプロモーターからの発現が、受容体へのＧαサブユニットの共役に適合性である可能性も高い。Ｇα移植体を含む本発明の酵母細胞、および当該移植体をコードする核酸を含有するプラスミド、コスミド等のようなベクターは、本発明に含まれる。
【００４３】
酵母細胞はさらに、ペプチドまたはタンパク質が、レポーター系のＧＰＣＲ調節性活性に対する影響に関してアッセイされ得るように、１つまたはそれ以上のペプチドまたはタンパク質をコードするプラスミドのような１つまたはそれ以上の核酸分子を含んでもよい。あるいは、レポーター系活性に対する化合物の影響を決定するために、１つまたはそれ以上の他の化学化合物を添加してもよい。
【００４４】
好ましくは、酵母細胞は、酵母細胞におけるプラスミドの選択を可能にする栄養要求性マーカーを含有する。ｌｅｕ１突然変異は、１つのかかるマーカーを提供し、細胞成長を、ロイシンの添加依存性、またはｌｅｕ１遺伝子を含有するプラスミドの導入依存性とさせる。類似した突然変異もまた、他の栄養分（ヒスチジン、リシンおよびアルギニンを含む）の生合成に関与した遺伝子になされ得る。かかるマーカーとしては、ａｄｅ１、ａｄｅ６、ａｒｇ３、ＣＡＮ１、ｈｉｓ３、ｈｉｓ７、およびｕｒａ４が挙げられ、それらすべてが当該技術分野で既知である。
【００４５】
アッセイされるべきペプチドまたはタンパク質をコードする核酸を含むプラスミドは、１つまたはそれ以上のプロモーター、終結およびプロセシングシグナル配列を含んでもよい。適切なプロモーターとしては、チアミン抑圧性ｎｍｔ１プロモーターが挙げられる。これは、チアミンの存在により抑圧される。他の適切なプロモーターとしては、ａｄｈ１およびｆｂｐ１が挙げられ、これらは当該技術分野で既知である。
【００４６】
プラスミドはまた、プラスミドがＳｚ．ポンベ細胞で複製することが可能であるために、酵母自己複製配列（ＡＲＳ）を含有してもよい。
【００４７】
酵母細胞への挿入前に細菌系内でプラスミドを複製させるために、アンピシリンまたはテトラサイクリン耐性遺伝子のような１つまたはそれ以上の細菌選択マーカーとともに、細菌複製起点（ｏｒｉ）もまた含まれてもよい。さらに、プラスミドは、所定のペプチドまたはタンパク質をコードする核酸配列を挿入することが可能であるように、１つまたはそれ以上の制限エンドヌクレアーゼ部位を含んでもよい。最も好ましくは、ペプチドまたはタンパク質をコードする核酸配列は、ランダムであり、かつ／または立体配座ライブラリーの形態であってもよい。かかるライブラリーは当該技術分野で既知である。これは、所定のペプチド調節因子を特定するために、ランダムペプチドの産生を可能にする。これはまた、種々のペプチドを含む酵母細胞のライブラリーを産生するのを可能にする。
【００４８】
既知のペプチドまたはタンパク質をコードする１つまたはそれ以上の核酸配列を細胞に導入してもよい。これは、例えば哺乳動物ＧＰＣＲ調節性経路が酵母細胞内で再構成されるのを可能にする。
【００４９】
株はさらに、Ｓｚ．ポンベの二倍体株をより安定にさせるのを助長するａｄｅ６突然変異を含有してもよい。これは、酵母の二倍体株が望ましい場合に有用である。
【００５０】
上述のＳｚ．ポンベに対する改変が、細胞になされる必ずしも唯一の改変であることを意図しない。特定の状況に系を適応させることが必要な場合、さらなる改変がなされ得る。
【００５１】
本発明のさらなる態様は、レポーター遺伝子に作動可能に連結された、シゾサッカロマイセス・ポンベにおいてＧタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）調節性シグナル伝達経路により調節可能なプロモーターを含む単離された核酸分子を提供する。プロモーターは、ｓｘａ２プロモーターまたは、レポーター遺伝子に作動可能に連結したその相同体もしくは類似体であることが好ましい。ｓｘａ２プロモーターおよび／またはレポーター遺伝子は上述したようなものであってよい。
【００５２】
疑念を解消するために、この文脈では、レポーター遺伝子とは、天然に存在するｓｘａ２遺伝子ではない任意の検出可能な遺伝子を意味する。
【００５３】
本発明のさらなる態様は、ＧＰＣＲ調節性活性を研究するための、
（ｉ）細胞成長の有糸分裂期中に抑制解除されるＧタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）調節性シグナル伝達経路、
（ｉｉ）上記ＧＰＣＲ調節性シグナル伝達経路により媒介されるシグナルをレポートするレポーター系、または
（ｉｉｉ）上記に定義するような単離された核酸分子
を含むシゾサッカロマイセス・ポンベ（Ｓｚ．ポンベ）酵母細胞の使用を提供する。
【００５４】
本発明のさらなる態様は、
（ｉ）細胞成長の有糸分裂期中に抑制解除されるＧタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）調節性シグナル伝達経路、
（ｉｉ）上記ＧＰＣＲ調節性シグナル伝達経路により媒介されるシグナルをレポートするレポーター系、または
（ｉｉｉ）上記に定義するような単離されたＤＮＡ分子
を含むシゾサッカロマイセス・ポンベ（Ｓｚ．ポンベ）酵母細胞の使用を含むアッセイを提供する。
【００５５】
本発明はまた、ＧＰＣＲ調節性活性に対する化合物の影響を決定する方法であって、
（ｉ）  （ａ）細胞成長の有糸分裂期中に抑制解除されるＧタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）調節性シグナル伝達経路、
（ｂ）上記ＧＰＣＲ調節性シグナル伝達経路により媒介されるシグナルをレポートするレポーター系
を含むシゾサッカロマイセス・ポンベ（Ｓｚ．ポンベ）酵母細胞を供給し、
（ｉｉ）上記化合物を、上記酵母細胞に導入し、そして
（ｉｉｉ）例えば上記酵母細胞により産生されるレポーター遺伝子産物の量を決定することにより、レポーター系の産出量を表示する
工程を含む方法を提供する。
【００５６】
レポーター遺伝子産物の量、または他のレポーター系の産出量は、化合物を有さない対照酵母と比較され得る。
【００５７】
本発明はまた、受容体として機能する化合物を特定するための、
（ａ）細胞成長の有糸分裂期中に抑制解除されるＧタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）調節性シグナル伝達経路、
（ｂ）上記ＧＰＣＲ調節性シグナル伝達経路により媒介されるシグナルをレポートするレポーター系
を含むシゾサッカロマイセス・ポンベ（Ｓｚ．ポンベ）酵母細胞の使用に関する。上記化合物は、受容体にとって天然リガンドであってもよく、あるいはアゴニストまたはアンタゴニスト（または部分的アゴニストもしくは部分的アンタゴニスト）であってもよい。かかる化合物は、受容体の、ＧＰＣＲ調節性シグナル伝達経路を調節する能力に影響を及ぼす。したがって、本発明は、オーファン受容体の、プロモーターを調節する能力に影響を及ぼす化合物を特定するための、オーファンＧＰＣＲを有するかかる酵母細胞の使用を含む。
【００５８】
上述のような酵母細胞は、ＧＰＣＲ調節性経路の調節因子または突然変異体を特定するのに使用され得る。
【００５９】
本発明はまた、ＧＰＣＲ調節性シグナル伝達経路を調整する試薬を特定する方法であって、
（ｉ）  （ａ）細胞成長の有糸分裂期中に抑制解除されるＧタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）調節性シグナル伝達経路、
（ｂ）上記ＧＰＣＲ調節性シグナル伝達経路により媒介されるシグナルをレポートするレポーター系
を含むシゾサッカロマイセス・ポンベ（Ｓｚ．ポンベ）酵母細胞を供給し、
（ｉｉ）上記酵母細胞内でランダムペプチドを産生し、そして
（ｉｉｉ）例えば酵母細胞により産生されたレポーター遺伝子産物の量を測定することにより、レポーター系の産出量を表示すること
を含む方法を提供する。
【００６０】
本発明のさらなる態様は、本発明による方法により同定されるＧＰＣＲ調節性活性を調整することが可能な化合物を提供する。上記に定義するような酵母細胞または単離された核酸分子を含むアッセイキットもまた提供される。
【００６１】
Ｍ細胞は、Ｐ因子接合フェロモン（ｍａｐ２遺伝子によりコードされる）を通常発現しない。Ｐ因子は、Ｎ末端シグナル配列および成熟フェロモンの４つのタンデムコピーを含有する前駆体として始めに合成される２３個のアミノ酸の未改変ペプチドである。シグナル配列は、分泌経路へと前駆体を方向付けた後に失われ、続いて前駆体は、個々のサブユニットへとプロセシングされた後、培地へと放出される。フェロモンペプチドの単一コピーを含有し、ｎｍｔ１プロモーターの制御下で発現されるプラスミドベースのｍａｐ２構築物が調製されている。このプラスミドを有するレポーター株は、チアミンを含まない培地で成長させるとＰ因子を分泌し、これが、細胞により産生されるＰ因子が同じ細胞で発現されるフェロモン受容体を刺激する酵母細胞におけるオートクライン応答を誘発する。
【００６２】
したがって、本発明のさらなる態様は、かかる構築物を含有する酵母細胞を提供する。Ｐ因子配列を、続いて培地へと分泌される代替的ペプチド配列で置換することが可能となるように、構築物内に制限部位を提供してもよい。この構築物にランダム配列を導入することにより、各個体が異なるペプチドを放出する酵母株のライブラリーが産生され、ランダムペプチドを、オートクライン誘導物質として作用するそれらの能力に関してアッセイすることが可能となる。
【００６３】
本発明の細胞株、および本発明で有用な細胞株を、「レポーター株」と称してもよい。
【００６４】
本発明の別の特徴は、本発明が、リガンドの非存在下でさえも細胞内シグナル伝達機構にＧＰＣＲが共役されるかどうかを決定する方法を提供することである。かかる方法は、天然リガンドが知られていない場合のオーファンＧＰＣＲを研究するのに特に有用である。この方法は、リガンド非依存性受容体系応答が、共役受容体を有する匹敵する細胞における場合よりも、共役受容体を欠如した細胞において高いといういまだに説明のつかない観察に基づいている。
【００６５】
したがって、本発明のこの態様によれば、Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）が細胞シグナル伝達経路に共役されるかどうかを決定する方法であって、
（ｉ）細胞成長の有糸分裂期中に抑制解除されるＧタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）調節性シグナル伝達経路と、
（ｉｉ）上記ＧＰＣＲ調節性シグナル伝達経路により媒介されるシグナルをレポートするレポーター系と
を含むシゾサッカロマイセス・ポンベ（Ｓｚ．ポンベ）酵母細胞のリガンド非依存性レポーター系産出量を、機能性ＧＰＣＲを欠如した参照細胞の上記レポーター系産出量と比較することを含む方法、を提供する。
【００６６】
参照細胞は、それ自体が本発明の別の態様を形成し、一般に、
（ｉ）細胞成長の有糸分裂期中に抑制解除されるＧタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）調節性シグナル伝達経路であって、上記ＧＰＣＲは、存在しないか、そうでなければ非機能的にさせられているＧＰＣＲ調節性シグナル伝達経路と、
（ｉｉ）上記ＧＰＣＲ調節性シグナル伝達経路により媒介されるシグナルをレポートするレポーター系と
を含むシゾサッカロマイセス・ポンベ（Ｓｚ．ポンベ）酵母細胞である。
【００６７】
レポーター系は、研究下にある細胞中のＧＰＣＲがシグナル伝達経路に共役される場合、研究下にある細胞由来の活性よりも、参照細胞由来の活性が高いことを示す産出量を付与すると予測される。
【００６８】
本発明の各態様の好ましい特徴は、必要に応じて変更を加えて、各他の態様に関するものである。
【００６９】
ここで本発明は、以下の図を参照して、単なる例として説明される。
【００７０】
方法
全ての操作は、標準的な方法によるものであった（概説に関してＤａｖｅｙ ｅｔ ａｌ．， １９９５を参照）。試薬は、一般的な実験室供給業者から得られ、製造業者の推奨に従って使用した。別記しない限り、Ｐｗｏ  ＤＮＡポリメラーゼ（ピロコッカス・ウォエセイ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｗｏｅｓｅｉ）由来、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍにより供給）は、３’−５’エキソヌクレアーゼ（プルーフリーディング）活性を有し、増幅中の誤りの導入を低減するため、Ｐｗｏ  ＤＮＡポリメラーゼを用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を実施した。ＴＡＱポリメラーゼ（サームス・アクアチクム（Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ）由来、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍにより供給）を、ランダム配列を含有するプライマーを用いたＰＣＲに使用した。
【００７１】
以下で特定する酵母株は単なる例である。他の適切な株は、当該技術分野で既知の技法を用いて容易に同定または産生することができる。
【００７２】
酵母株
ＪＹ２７１は、ｈ−，ｃｒｙｌ：：ｕｒａ４，ａｄｅ６−Ｍ２１６，ｌｅｕｌ−３２，ｕｒａ４−Ｄ１８であり、ＪＺ３００に等価性である（Ｍａｅｄａ ｅｔ ａｌ．， １９９０）。これは、Ｍ細胞であるが、安定でなく、接合型を転換することができる。ｃｙｒ１遺伝子（アデニル酸シクラーゼをコードする）は、ｕｒａ４遺伝子（ｐＤＡＣ５）の挿入により崩壊され、成長のためにアデニンおよびロイシンを必要とする細胞を生じた。
【００７３】
ＪＹ３３０は、ｍａｔ１−Ｐ，Δｍａｔ２／３：：ＬＥＵ２−，ｌｅｕｌ−３２である。ｍａｔ２−Ｐおよびｍａｔ３−Ｍドナー接合カセットは、ＬＥＵ２の挿入により欠失され（Ｋｌａｒ ａｎｄ Ｍｉｇｌｉｏ， １９８６）、続いてＬＥＵ２−単離体が同定された（Ｋｌａｒ ａｎｄ Ｂｏｎａｄｕｃｅ， １９９１）。
【００７４】
ＪＹ４４４は、ｍａｔ１−Ｍ，Δｍａｔ２／３：：ＬＥＵ２−，ｌｅｕ−３２，ｕｒａ４−Ｄ１８であり、成長のためにロイシンおよびウラシルを必要とする安定なＭ細胞である。
【００７５】
ＪＹ２７１中のｃｒｙｌ遺伝子を崩壊するのに使用されるｕｒａ４カセットを、標準的な技法により除去して、ＪＹ２７１Ｂを創出した。ＪＹ２７１Ｂは、ｈ−，ｃｒｙｌ−Ｄ５１，ａｄｅ６−Ｍ２１６，ｌｅｕｌ−３２，ｕｒａ４−Ｄ１８である。これは、Ｍ細胞であるが、安定でなく、接合型を転換することができる。ｃｒｙ１遺伝子（アデニル酸シクラーゼ）は崩壊される。前記細胞は、成長のためにアデニン、ロイシンおよびウラシルを必要とする。
【００７６】
ＪＹ２７１Ｂを、ＪＹ３３０と交雑させて、ＪＹ３６１を生成した。ＪＹ３６１は、ｍａｔ１−Ｐ，Δｍａｔ２／３：：ＬＥＵ２−，ｌｅｕ１−３２，ａｄｅ６−Ｍ２１６，ｕｒａ４−Ｄ１８，ｃｙｒ１−Ｄ５１である。これは、安定なＰ細胞であり、ここではｃｙｒ１遺伝子（アデニル酸シクラーゼ）は崩壊される。前記細胞は、成長のためにアデニン、ロイシンおよびウラシルを必要とする。
【００７７】
ＪＹ３６１をＪＹ４４４と交雑させて、ＪＹ４８６を生成した。ＪＹ４８６は、ｍａｔ１−Ｍ，Δｍａｔ２／３：：ＬＥＵ２−，ｌｅｕ１−３２，ａｄｅ６−Ｍ２１６，ｕｒａ４−Ｄ１８，ｃｙｒ１−Ｄ５１である。これは、安定なＭ細胞であり、ここではｃｙｒ１遺伝子（アデニル酸シクラーゼ）は崩壊される。前記株は、成長のためにアデニン、ロイシンおよびウラシルを必要とする。
【００７８】
ＪＹ４８６中のｓｘａ２遺伝子を、ｕｒａ４＋カセットを用いて崩壊させて、ＪＹ５２２を生成した。ｓｘａ２遺伝子の操作は、以下に詳述する。崩壊カセットは、ＪＤ８８３由来のＮｃｏＩ〜ＢａｍＨＩ断片であった。ＪＹ５２２は、ｍａｔ１−Ｍ，Δｍａｔ２／３：：ＬＥＵ２−，ｌｅｕ１−３２，ａｄｅ６−Ｍ２１６，ｕｒａ４−Ｄ１８，ｃｙｒ１−Ｄ５１，ｓｘａ２：：ｕｒａ４＋である。これは、安定なＭ細胞であり、ここではｃｙｒ１遺伝子（アデニル酸シクラーゼ）は崩壊される。ｓｘａ２遺伝子（セリンカルボキシペプチダーゼをコードする）もまた崩壊される。前記株は、成長のためにアデニンおよびロイシンを必要とする。
【００７９】
ＪＹ５２２中の崩壊ｓｘａ２遺伝子を、ｓｘａ２＞ｌａｃＺレポーターで置換して、ＪＹ５４６を生成した。ｓｘａ２＞ｌａｃＺレポーター構築物は、ＪＤ９５４由来である。ＪＹ５４６は、ｍａｔ１−Ｍ，Δｍａｔ２／３：：ＬＥＵ２−，ｌｅｕ１−３２，ａｄｅ６−Ｍ２１６，ｕｒａ４−Ｄ１８，ｃｙｒ１−Ｄ５１，ｓｘａ２＞ｌａｃＺである。これは、安定なＭ細胞であり、ここではｃｙｒ１遺伝子（アデニル酸シクラーゼ）は崩壊される。株は、ｓｘａ２遺伝子座に組み込まれたｓｘａ２＞ｌａｃＺレポーターを有し、フェロモン刺激に応答してｌａｃＺを発現する。前記株は、成長のためにアデニンおよびロイシンおよびウラシルを必要とする。
【００８０】
ＪＹ５２２中の崩壊ｓｘａ２遺伝子をまた、ｓｘａ２＞ｕｒａ４レポーターでも置換して、ＪＹ６０３を生成した。ｓｘａ２＞ｕｒａ４レポーター構築物は、ＪＤ９２９由来である。ＪＹ６０３は、ｍａｔ１−Ｍ，Δｍａｔ２／３：：ＬＥＵ２−，ｌｅｕ１−３２，ａｄｅ６−Ｍ２１６，ｕｒａ４−Ｄ１８，ｃｙｒ１−Ｄ５１，ｓｘａ２＞ｕｒａ４であり、安定なＭ細胞である。ｃｙｒ１遺伝子（アデニル酸シクラーゼ）は崩壊される。これは、ｓｘａ２遺伝子座に組み込まれたｓｘａ２＞ｕｒａ４レポーターを有し、フェロモン刺激に応答してｕｒａ４を発現する。前記株は、成長のためにアデニンおよびロイシンを必要とする。
【００８１】
ｓｘａ２＞レポーター株の構築
図１および図２は、ｓｘａ２遺伝子およびプロモーターを操作するのに使用する方法を要約している。
【００８２】
ｓｘａ２  ＯＲＦをまず、１．８ｋｂのＳｚ．ポンベｕｒａ４＋カセットで置換した（Ｇｒｉｍｍ ｅｔ ａｌ．， １９８８）。センスプライマーＪＯ７６０（ｇｇｇｇｇｇｔａｃＣＡＴＧＧＣＴＡＧＡＡＡＴＣＣＧＣＣＡＴＴＧＴＧＴＧ；小文字は、ｓｘａ２に相補的でないが、そのオリゴヌクレオチドは、ＫｐｎＩ部位［ｇｇｔａｃ＊Ｃ］およびＮｃｏＩ部位［ｃ＊ＣＡＴＧＧ］を含み、そこでは消化により、染色体配列に完全に相同的な末端が残る）、およびアンチセンスプライマーＪＯ６８３（ＣＴＴＣＴＣＧＴＡＡＡＧＧＣＡＣＡＴＴＧＡＣＧＧ、位置２０４３にあるＢａｍＨＩ部位のすぐ下流の領域）を用いてＰＣＲにより、完全ｓｘａ２遺伝子座を増幅させた。得られたＰＣＲ産物を、ｐＳＰ７２（Ｐｒｏｍｅｇａ）のＫｐｎＩおよびＢａｍＨＩ部位にクローニングして、ＪＤ８０８（ｓｘａ２遺伝子座（配列番号３１）を有するｐＳＰ７２）を生成した。ＪＯ７４６（ＴＧＡＡＡＡＧＡＧＡＧＡＣＡＡＴＧ、ｓｘａ２用のＡＴＧ開始コドンのすぐ上流の領域に相補的なアンチセンスプライマー）、およびＪＯ７４５（ＴＡＡＡＡＧＴＴＴＡＡＴＡＴＣ、ｓｘａ２用のＴＡＡ終止コドンを含む領域に相補的なセンスプライマー）とともに、これをＰＣＲ用の鋳型として使用して、産物を、ｕｒａ４＋カセットに（ＪＤ８５７、すなわちｓｘａ２の崩壊に適切な構築物（配列番号３２）を有するｐＳＰ７２を生成するために）か、あるいはｌａｃＺ  ＯＲＦ（ＪＤ９５４、すなわちｓｘａ２＞ｌａｃＺレポーター構築物（配列番号３３）を有するｐＳＰ７２を生成するために）またはｕｒａ４  ＯＲＦ（ＪＤ９２９、すなわちｓｘａ２＞ｕｒａ４レポーター構築物（配列番号３４）を有するｐＳＰ７２）のいずれかに相当するＰＣＲ産物に連結させる。ｌａｃＺ  ＯＲＦは、センスプライマーＪＯ６６０（ＡＴＧＣＡＧＣＴＧＧＣＡＣＧＡＣＡＧＧＴＴＴＣＣＣＧＡＣ、ＡＴＧ開始コドン、および隣のｌａｃＺ  ＯＲＦの２５塩基を含む）、およびアンチセンスプライマーＪＯ６６１（ＴＴＴＴＴＧＡＣＡＣＣＡＧＡＣＣＡＡＣＴＧＧＴＡＡＴＧＧＴＡＧＣ、ｌａｃＺ  ＯＲＦの３’末端に相補的であるが、終止アンチコドンを欠如している）を用いた増幅により調製した。ｕｒａ４  ＯＲＦは、センスプライマーＪＯ８２８（ＡＴＧＧＡＴＧＣＴＡＧＡＧＴＡＴＴＴＣ、ＡＴＧ開始コドン、および隣のｕｒａ４  ＯＲＦの１６塩基を含む）、およびアンチセンスプライマーＪＯ７５９（ＡＴＧＣＴＧＡＧＡＡＡＧＴＣＴＴＴＧＣ、ｕｒａ４  ＯＲＦの３’末端に相補的であるが、終止アンチコドンを欠如している）を用いた増幅により調製した。
【００８３】
ＪＹ４８６（ｃｒｙｌを欠如した接合安定性Ｍ細胞）を、ｓｘａ２：：ｕｒａ４＋構築物に相当するＮｃｏＩ−ＢａｍＨＩ断片（ＪＤ８５７から単離）で形質転換し、安定なＵｒａ４＋形質転換体を始めにＰＣＲでスクリーニングし、ｓｘａ２遺伝子座の置換をサザンブロットにより確認した（図２）。次に、正確なｓｘａ２：：ｕｒａ４＋崩壊体（ＪＹ５２２）を、ｓｘａ２＞ｌａｃＺレポーターに相当するＮｃｏＩ−ＢａｍＨＩ断片（ＪＤ９５４から単離）、またはｓｘａ２＞ｕｒａ４レポーターに相当するＮｃｏＩ−ＢａｍＨＩ断片（ＪＤ９２９から単離）で形質転換した。安定なＵｒａ−形質転換体を、５’−フルオロオルチン酸の存在下で成長するそれらの能力により選択し（Ｂｏｅｋｅ ｅｔ ａｌ．， １９８７）、ｓｘａ２遺伝子座でのレポーター構築物の相同組込みを、ＪＹ５４６（ｓｘａ２＞ｌａｃＺ）、およびＪＹ６０３（ｓｘａ２＞ｕｒａ４）に関してサザンブロットで確認した。サザンブロット分析は、ＰｖｕＩＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化したゲノムＤＮＡ、およびｓｘａ２の５’非翻訳領域に相当するプローブで実施した。
【００８４】
Ｇα移植体の構築物
これは、当該技術分野で既知の技法を用いて着手した。ｇｐａ１（配列番号１、配列番号１５）由来ＳｐｅＩ−ＰｓｔＩ断片を、プラスミドｐＫＳ−Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）のＳｐｅＩ部位およびＰｓｔＩ部位にクローニングした。この３２４ｂｐの断片は、Ｇｐａ１の最後の２４個の残基、およびｇｐａ１遺伝子の３’非翻訳領域からの２５０塩基対を有する。次に、Ｇｐａ１のＣ末端にある残基に所望の変化を施したオリゴヌクレオチドプライマーを用いた一連のポリメラーゼ連鎖反応用の鋳型として、得られたクローン（ＪＤ１６４７）を使用した。各反応は、アンチセンスプライマーＪＯ１３５４（ＴＡＧＡＴＴＧＴＴＧＧＡＣＡＴＡＡＴＣＧＴＡＴＣＴＴＧＡＡＣＧＧ、ｇｐａ１のイニシエーターＡＴＧに対して位置１２０６〜位置１１７５の領域に相補的）、ならびにＧｐａ１オープンリーデングフレームのすぐ下流の領域に所望の変化を導入し、かつそれに相補的な適切なセンスプライマー；すなわち、Ｇαｑ移植体に関してはＪＰ１３４４（ｇａａｔａｔａａｔｃｔｔｇｔｔＴＡＧＡＴＧＡＡＴＴＴＴＴＣＣＴＴＡＡＣ、小文字は、Ｓｚ．ポンベＧｐａ１の最後の５つの残基をＥＹＮＬＶへ変更した）、Ｇαｓ移植体に関してはＪＯ１３４５（ｃａａｔａｔｇａａｃｔｔｃｔｔＴＡＧＡＴＧＡＡＴＴＴＴＴＣＣＴＴＡＡＣ、Ｇｐａ１の最後の５つの残基をＱＹＥＬＬに変更した）、Ｇαｏ移植体に関してはＪＯ１３４６（ｇｇａｔｇｃｇｇａｃｔｔｔａｔＴＡＧＡＴＧＡＡＴＴＴＴＴＣＣＴＴＡＡＣ、Ｇｐａ１の最後の５つの残基をＧＣＧＬＹに変更した）、Ｇαｉ２移植体に関してはＪＯ１３４７（ｇａｔｔｇｃｇｇａｃｔｔｔｔｔＴＡＧＡＴＧＡＡＴＴＴＴＴＣＣＴＴＡＡＣ、Ｇｐａ１の最後の５つの残基をＤＣＧＬＦに変更した）、Ｇαｉ３移植体に関してはＪＯ１３４８（ｇａａｔｇｃｇｇａｃｔｔｔａｔＴＡＧＡＴＧＡＡＴＴＴＴＴＣＣＴＴＡＡＣ、Ｇｐａ１の最後の５つの残基をＥＣＧＬＹに変更した）、Ｇαｚ移植体に関してはＪＯ１３４９（ｔａｔａｔｔｇｇａｃｔｔｔｇｃＴＡＧＡＴＧＡＡＴＴＴＴＴＣＣＴＴＡＡＣ、Ｇｐａ１の最後の５つの残基をＹＩＧＬＣに変更した）、Ｇα１２移植体に関してはＪＯ１３５０（ｇａｔａｔｔａｔｇｃｔｔｃａａＴＡＧＡＴＧＡＡＴＴＴＴＴＣＣＴＴＡＡＣ、Ｇｐａ１の最後の５つの残基をＤＩＭＬＱに変更した）、Ｇα１３移植体に関してはＪＯ１３５１（ｃａａｃｔｔａｔｇｃｔｔｃａａＴＡＧＡＴＧＡＡＴＴＴＴＴＣＣＴＴＡＡＣ、Ｇｐａ１の最後の５つの残基をＱＬＭＬＱに変更した）、Ｇα１４移植体に関してはＪＯ１３５２（ｇａａｔｔｔａａｔｃｔｔｇｔｔＴＡＧＡＴＧＡＡＴＴＴＴＴＣＣＴＴＡＡＣ、小文字は、Ｇｐａ１の最後の５つの残基をＥＦＮＬＶに変更した）、およびＧα１６移植体に関してはＪＯ１３５３（ｇａａａｔｔａａｔｃｔｔｃｔｔＴＡＧＡＴＧＡＡＴＴＴＴＴＣＣＴＴＡＡＣ、Ｇｐａ１の最後の５つの残基をＥＩＮＬＬに変更した）を使用した。
【００８５】
ＰＣＲ産物を配列決定して、正確な変更がなされていることを確認した後、ＰＣＲ産物を使用して、ＪＤ１６４５（ｐＳＰ７１−Ｇａｐ１）からの等価なＳｐｅＩ−ＰＳｔＩ断片を置換した。ＪＤ１６４５は、位置−６７６（イニシエーターＡＴＧに対して）にあるＥｃｏＲＩ部位から位置１９３８にあるＢｇｌＩＩ部位までの完全ｇｐａ１配列を有する。これにより、一連の改変ｇａｐ１配列を含有するプラスミド；すなわち、ＪＤ１６４９（Ｇαｑ移植体配列番号１７、０３）、ＪＤ１６５０（Ｇαｓ移植体配列番号１６、０２）、ＪＤ１６５１（Ｇαｏ移植体配列番号１８、０４）、ＪＤ１６５２（Ｇαｉ２移植体配列番号１９、０５）、ＪＤ１６５３（Ｇαｉ３移植体配列番号２０、０６）、ＪＤ１６５４（Ｇαｚ移植体配列番号２１、０７）、ＪＤ１６５５（Ｇα１２移植体配列番号２２、０８）、ＪＤ１６５６（Ｇα１３移植体配列番号２３、０９）、ＪＤ１６５７（Ｇα１４移植体配列番号２４、１０）、およびＪＤ１６５８（Ｇα１６移植体配列番号２５、１１）が生成された。種々のＧα移植体用のコード領域は、ＥｃｏＲＩ−ＢｇｌＩＩ断片として単離して、それを別個に使用して、酵母株ＪＹ１１７０を形質転換した。ＪＹ１１７０は、ｍａｔｌ−Ｍ，Δｍａｔ２／３：：ＬＥＵ２−，ｌｅｕ３２，ａｄｅ６−Ｍ２１６，ｕｒａ４−Ｄ１８，ｃｙｒｌ−Ｄ５１，ｍａｍ２−Ｄ１０，ｇｐａ１：：ｕｒａ４＋，ｓｘａ２＞ｌａｃＺである。これは、標準的なＪＹ５４６レポーター株の誘導体であるが、それはｍａｍ２遺伝子（Ｐ因子受容体をコードする）を欠如しており、ｇｐａ１遺伝子を、ｕｒａ４＋カセットの挿入により崩壊した。Ｕｒａ−形質転換体を、フルオロオロチン酸により選択し、サザンブロット分析を用いて、ｇｐａ１遺伝子座でのＧα移植体構築物の組込みを確認した。これにより、ｍａｍ２フェロモン受容体を欠如するが、組み込まれたＧα移植体を有する、一連のＳｚ．ポンベｓｘａ２＞ｌａｃＺレポーター株；すなわち、ＪＹ１１６５（Ｇαｑ移植体）、ＪＹ１１５７（Ｇαｓ移植体）、ＪＹ１１５８（Ｇαｏ移植体）、ＪＹ１１５９（Ｇαｉ２移植体）、ＪＹ１１６０（Ｇαｉ３移植体）、ＪＹ１１６１（Ｇαｚ移植体）、ＪＹ１１６２（Ｇα１２移植体）、ＪＹ１１６３（Ｇα１３移植体）、ＪＹ１１６４（Ｇα１４移植体）、およびＪＹ１１６７（Ｇα１６移植体）が生成された。
【００８６】
オートクラインシグナル伝達用ペプチドの生成
Ｍ細胞は、Ｐ因子接合フェロモン（ｍａｐ２遺伝子によりコードされる）を通常発現しない。Ｐ因子は、Ｎ末端シグナル配列および成熟フェロモンの４つのタンデムコピーを有する前駆体として始めに合成される２３個のアミノ酸の未改変ペプチドである。シグナル配列は、分泌経路へと前駆体をターゲッティングした後に失われ、続いて前駆体は、個々のサブユニットへとプロセシングされた後、培地へと放出される。図３〜図６に概要的に示したフェロモンペプチドの単一コピーを含有し、チアミン調節性ｎｍｔ１プロモーターの制御下で発現されるプラスミドベースのｍａｐ２構築物を調製した。
【００８７】
これは、当該技術分野で既知の技法を用いて着手した。このプラスミドを含有するレポーター株は、チアミンを含まない培地で成長させるとＰ因子を分泌し（ｎｍｔ１プロモーターは、オンである）、これが、株におけるオートクライン応答を誘発する。構築物内の制限部位により、Ｐ因子配列を、続いて培地へと分泌される代替的ペプチド配列で置換することが可能となる（図７Ａおよび図７Ｂ）。この構築物にランダム配列を導入することにより、各個体が異なるペプチドを放出する株のライブラリーが産生される。これにより、フェロモン受容体または別のＧＰＣＲに結合することが可能なリガンドを同定することが可能となる。
【００８８】
レポーター遺伝子構築物の発現および用途
ｓｘａ２＞ｕｒａ４レポーター構築物の実証
この構築物を有するＪＹ６０３酵母細胞を、ウラシルを欠如したＤＭＭ培地上に、細胞の集密層（各プレート上に１０７個の細胞）として広げた。紙ディスクを細胞の乾燥表面上に置いて、種々の量のＰ因子を含有する分取量を各ディスクに添加した。プレートを２９℃で３日間インキュベートした。図８Ａは、細胞がウラシルの非存在下では通常成長することができないが、Ｐ因子がｓｘａ２＞ｕｒａ４レポーターの発現を誘導し、ディスク周辺での細胞の成長を可能にすることを示している。ハローは、１００ユニットのＰ因子を含有するディスク周辺で最大である。
【００８９】
これはまた、図４でも実証されるが、但し、種々の濃度のＰ因子を含有する一連のプレートを使用した。プレートにはすべて、同じ数の酵母細胞（プレート１つ当たり約２，０００個の細胞）を与えた。細胞は、ウラシルの非存在下では通常成長することができないが、Ｐ因子がｓｘａ２＞ｕｒａ４レポーターの発現を誘導して、細胞はコロニーを形成し得る。０．１または１．０ユニット／ｍｌを含有するプレート上ではコロニーは存在しないが、少なくとも１０ユニット／ｍｌでＰ因子を有するプレート上ではコロニーを形成する。
【００９０】
図８Ｂは、ウラシルおよび５−フルオロオルチン酸（ＦＯＡ）を含有するプレートを示す。ｕｒａ４を発現しない細胞は、これらのプレート上では通常成長することができるが、ｕｒａ４を発現する細胞は、ＦＯＡを有毒な化合物に変換し、死滅する。Ｐ因子を含有するディスク周辺での非成長の明確なハローが存在する。ハローは、１００ユニットのＰ因子を含有するディスク周辺で最大である。
【００９１】
突然変異体の特定
ｓｘａ２＞ｕｒａ４レポーター系により、突然変異体の特定が可能である。細胞は、ランダムに突然変異誘発させることができ、０．１ユニット／ｍｌでＰ因子を含有するプレート上に広げて、細胞を刺激に対してより感受性にさせる突然変異を同特定する。図１０は、これらの突然変異の２つを示す。このアプローチはまた、図１１に示すようにシグナル伝達経路の調節に関与する様々なタンパク質の突然変異形態を同定するのに使用することができる。
【００９２】
ｓｘａ２＞ｕｒａ４レポーティング株をランダムに突然変異誘発させた後、ウラシルを欠如するが、０．１ユニット／ｍｌでＰ因子を含むプレート上に広げた。野生型細胞は、少なくとも１０ユニット／ｍｌの濃度でＰ因子を必要とするため、これらのプレート上では通常成長することができない。シグナル伝達に対する感受性が増加し、かつ今や低レベルのＰ因子で成長することが可能な多数の突然変異体を特定した。これらの突然変異体のうち２つを、ｒｇｓ１およびｐｍｐ１としてキャラクタライズした。ｐｍｐ１突然変異体は、Ｐ因子を欠如するプレート上では成長しないが、非常に低レベルのＰ因子上で成長する。これは、ｐｍｐ１突然変異体が高感受性突然変異体であることを実証する。対照的に、ｒｇｓ１突然変異体は、Ｐ因子の非存在下でさえも成長し、ｒｇｓ１突然変異体が構成的レスポンダーである（すなわち、ｒｇｓ１突然変異体は、リガンドによる刺激の非存在下でレポーター遺伝子を発現する）ことを示す。
【００９３】
出願人等は、変更された特性を有する突然変異形態のタンパク質を単離するために、クローニングしたｒｇｓ１遺伝子を突然変異させて、機能突然変異体（正常なＲｇｓ１タンパク質に対して増加した活性を有する）またはドミナントネガティブ突然変異体（同じ細胞で正常なＲｇｓ１タンパク質の活性を阻害する不活性突然変異体）のいずれかを獲得した単離体に関してスクリーニングした。
【００９４】
オートクラインシグナル伝達
本発明者等は、Ｐ因子前駆体をコードするｍａｐ２遺伝子型を、それがＰ因子の単一コピー（「モノＰ」）を含有するように改変させた。これを、Ｐ因子の発現がチアミン抑圧性ｎｍｔプロモーターの制御下にあるようにプラスミドにクローニングさせた。プラスミドを、Ｐ因子を通常産生しないが、Ｐ因子に応答することが可能なＭ細胞に導入した。ウラシルを欠如するが、チアミンを含有しないかまたは５μＭチアミンを含有するプレート上に、細胞を広げた（図１２参照）。チアミンはＰ因子の発現および放出を誘導し、細胞のオートクラインシグナル伝達をもたらした。これは、ｓｘａ２＞ｕｒａ４レポーターの発現をもたらす。
【００９５】
ｌａｃＺレポーター
ｓｘａ２＞ＬａｃＺレポーター株を、様々な量Ｐ因子の存在下で成長させた。放出されるβ−ガラクトシダーゼの量を、ｏ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシドを用いて、およびＯＤ４２０での産物の量を測定することでアッセイした。図１３は、経時的に、および濃度を増加させながら、Ｐ因子を添加する効果を示す。濃度依存性アッセイは、フェロモン添加の１６時間後に測定した。
【００９６】
ヒトＧＰＣＲの共役
一例として、コルチコトロフィン放出ホルモン（ＣＲＨ、コルチコトロフィン放出因子またはＣＲＦとしても知られている）用のヒト受容体を、Ｇｐａ１または様々なＧα移植体のいずれかを有するＳｚ．ポンベｓｘａ２＞ｌａｃＺレポーター株で発現させた。酵母株を、ｎｍｔ１プロモーターの制御下にＣＲＨ受容体（配列番号２８および配列番号１４を参照）１α型を置いたプラスミドであるｐＲＥＰ３Ｘ：ＣＲＨ−Ｒ１（配列番号３０）で形質転換した。形質転換体をチアミンの非存在下で成長させて（受容体の発現を可能とするために）、続いて１０−６ＭのＣＲＨに暴露させた（対照細胞は、ＣＲＨを欠如した溶媒に暴露させた）。放出されるβ−ガラクトシダーゼの量を、ｏ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシドを用いて１６時間後にアッセイした（図１４）。内因性Ｇｐａ１では、低レベルの共役が観察されたが、これは、Ｇαｓ移植体およびＧα１６移植体では有意に改善された。
【００９７】
ＣＲＨは、身体のストレス軸（ｓｔｒｅｓｓ ａｘｉｓ）の主要な調節因子である４１残基のペプチドである。ＣＲＨは、幾つかの機能を有するものの、その最も良くキャラクタライズされた役割は、ＣＲＨ−Ｒ１αにより媒介される効果である、ストレスに対する下垂体−副腎応答を開始する際に存在する（Ｖａｌｅ ｅｔ ａｌ．， １９８１）。この受容体は通常、Ｇαｓを通じて機能し、アデニル酸シクラーゼの活性化、およびｃＡＭＰレベルの増加をもたらす（Ｇｉｇｕｅｒｅ ｅｔ ａｌ．， １９８２； Ｂｉｌｅｚｉｋｊｉａｎ ａｎｄ Ｖａｌｅ， １９８３； Ｇｒａｍｍａｔｏｐｏｕｌｏｓ ｅｔ ａｌ．， １９９６）。観察されるＧαｓ移植体に対する共役は、哺乳動物細胞でのＣＲＨ−Ｒ１α受容体の活性と一致している。Ｇα１６は、広範囲のＧＰＣＲと相互作用することが知られている（Ｍｉｌｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．， １９９６）。
【００９８】
出芽酵母Ｓ．セレビシエにおけおるシグナル伝達機構へのヒトＣＲＨ受容体の共役についての報告はなく、したがって、本明細書中に報告するＳｚ．ポンベレポーター株との直接的な比較は可能でない。しかしながら、ＣＲＨに類似したペプチドリガンドがＳ．セレビシエ細胞の表面にある受容体へ接近することが不可能である（Ｂａｒａｎｓｋｉ ｅｔ ａｌ．， １９９９）ことがおそらく意義深い。Ｃ５ａ化学誘引物質受容体は、受容体とリガンドが両方とも同じ細胞で発現される場合に、Ｓ．セレビシエで機能的であるが、そのリガンド（７４残基のペプチド）のよってのみ刺激することができる。Ｃ５ａリガンドがＳ．セレビシエの細胞壁を横断することができないことから、かかるオートクライン刺激が必要とされる。
【００９９】
Ｓｚ．ポンベもまた、細胞壁により取り囲まれているが、その細胞壁は、Ｓ．セレビシエを取り囲む細胞壁と非常に異なる構造を有し（概説として、Ｏｓｕｍｉ， １９９８； Ｓｍｉｔｓ ｅｔ ａｌ．， １９９９を参照）、ジフテリア毒素による中毒のこれまでの研究は、上記の２つが全く異なる透過性特性を有することを実証した。コリネバクテリウム・ジフテリエ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ）のある種の株により分泌されるジフテリア毒素は、基質としてＮＡＤを用いて、真核細胞アミノアシルトランスフェラーゼＩＩ（ＥＦ−２）のＡＤＰリボシル化を触媒する。この反応は、真核生物に対するその毒性の基礎を形成する。中毒には、エンドサイトーシスによる内部移行後に、毒素が細胞質に侵入することが必要である。研究により、Ｓ．セレビシエ（Ｍｕｒａｋａｍｉ ｅｔ ａｌ．， １９８２）、およびＳｚ．ポンベ（Ｄａｖｅｙ， １９９１）でのタンパク質合成に対するジフテリア毒素の影響が研究された。Ｓｚ．ポンベ細胞は、毒素に対して感受性があったが、無傷Ｓ．セレビシエ細胞は、その影響に対して耐性であった。対照的に、Ｓ．セレビシエスフェロプラスト（細胞壁を酵素的に除去した細胞）は、毒素に対して感受性があり、毒素が無傷細胞に侵入することができないのは、毒素が細胞壁を通過することができないことに起因することを示唆した。ジフテリア毒素は、酵素的に活性なＮ末端Ａ断片（分子量２４，０００ダルトン）、および明白な酵素活性を有さないが、毒素には必要であるＣ末端Ｂ断片（分子量３９，０００ダルトン）から構成されるヘテロ二量体である。
【０１００】
Ｓｚ．ポンベにおける細胞壁の明らかに大きな透過性は、大きいリガンドまたは複雑なリガンドを有する受容体の研究には非常に貴重であり得て、かかる状況ではＳ．セレビシエの使用を上回る利点を提供することができる。
【０１０１】
リガンドの非存在下での受容体の共役の証明
オーファンＧＰＣＲ用の利用可能なリガンドの欠如は、かかる受容体がシグナル伝達機構に共役されることを確認するのを困難とする。したがって、通常受容体を刺激するリガンドが活性であると同定される確実性なしで、ハイスループットスクリーンが実施される。本発明者等は、ＧＰＣＲがそのリガンドの非存在下でさえも細胞内シグナル伝達機構に共役されるかどうかを示すことができるＳｚ．ポンベレポーター株の興味深い特徴を観察した。かかる知見が、ハイスループットスクリーンを実施する前に確実性を作る。この特徴の例を図１５に示す。正常なＰ因子フェロモン受容体を発現するＳｚ．ポンベｓｘａ２＞ｌａｃＺレポーター株をＰ因子に暴露させると、β−ガラクトシダーゼのリガンド依存性誘導が存在する。予想通り、Ｐ因子受容体を欠如した類似の株は、ｓｘａ２＞ｌａｃＺレポーターのリガンド依存性誘導を示すことはできない。しかしながら、ｓｘａ２＞ｌａｃＺレポーターのリガンド非依存性発現（すなわち、Ｐ因子の非存在下で観察されるβ−ガラクトシダーゼ活性のレベル）は、Ｐ因子受容体を有する株よりもＰ因子受容体を欠如した株においてかなり高い。Ｐ因子受容体を欠如した株でヒトＣＲＨ−Ｒ１α受容体を発現すると、ｓｘａ２＞ｌａｃＺレポーターのリガンド非依存性発現は減少して、Ｐ因子受容体を含有する株で観察されるレベルへと戻る。この株ではＰ因子受容体が存在しないため、Ｐ因子の添加は、ｓｘａ２＞ｌａｃＺレポーターのさらなる発現を誘導することはできない。
【０１０２】
この観察は、特定のレポーター系、あるいはＣＲＨ−Ｒ１α受容体のいずれかに限定されず、続いてＳｚ．ポンベシグナル伝達機構に共役されることがわかっている多くの他のＧＰＣＲで観察された。この影響に関する分子的説明は得られないが、それは、受容体の、ヘテロ三量体Ｇタンパク質を隔絶し、下流エフェクタータンパク質（複数可）の不適切な活性化を防止する能力を単に反映することができる。説明がなんであれ、受容体の、β−ガラクトシダーゼのリガンド非依存性発現を減少させる能力は、Ｓｚ．ポンベシグナル伝達機構に共役するその能力を反映すると思われる。
【０１０３】
用途
オーファンＧＰＣＲを含むＧＰＣＲに関するアゴニストおよびアンタゴニストの同定
キャラクタライズされた受容体またはオーファン受容体のいずれかを発現するレポーター株を様々なアッセイに使用して、受容体を通じてシグナル伝達に影響を及ぼすリガンドを同定することができる。アゴニストは、株において応答を誘発する一方で、アンタゴニストは、受容体を活性化することが知られているリガンドによる刺激を阻害するそれらの能力を特定することができる。ペプチドおよび小分子の両方をスクリーニングすることができ、アッセイは、使用するレポーター遺伝子に応じて、液体ベース、またはプレートベースのいずれかであってもよい。ペプチドリガンドに関するスクリーンは、ランダムペプチドのライブラリーを産生する株のオートクラインシグナル伝達を利用することができる。
【０１０４】
細胞内シグナル調節因子および活性が変更された改変調節因子の特定
細胞内応答経路の調節因子は、レポーター株におけるシグナル伝達に影響を与えるそれらの能力により特定することができる。これらのタンパク質の過剰発現は、それらがポジティブ調節因子であるかネガティブ調節因子であるかに依存して、シグナル伝達を減少または増加させる。多数の哺乳動物調節因子が、酵母中で活性であることが知られている。次に、これらのスクリーンにより特定された調節因子を突然変異誘発させることができ、レポーター株を、活性が変更された単離体を同定するのに使用することができる。例えば、機能獲得型の突然変異体は、シグナル伝達を調節する増加した能力を有する一方で、ドミナントネガティブ突然変異体は、不活性であるだけでなく、野生型調節因子の活性も阻害する。続いて、これらの突然変異体を哺乳動物系に戻して導入して、他のシグナル伝達経路を調節するそれらの能力を評価することができる。
【０１０５】
シグナル伝達を調整する試薬の特定
ランダムペプチドは、レポーター株の細胞質で発現することができ、シグナル伝達を調節するそれらの能力をアッセイすることができる。これらの「ペプタマー（ｐｅｐｔａｍｅｒｓ）」は、シグナル伝達経路からの構成成分と直接相互作用することができるか、または上述の細胞内シグナル調節因子を通じてそれらの影響を発揮し得る。スクリーンは、ペプチド調節因子に限定されず、シグナル伝達に影響を与え得る小分子も特定する。
【０１０６】
シゾサッカロマイセス・ポンベ株ＪＹ５４６は、ブダペスト条約の下で、２０００年１０月２７日に、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｙｅａｓｔ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ， Ｎｏｒｗｉｃｈ， Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍに寄託した。それには、寄託番号ＮＣＹＣ２９８４が付与された。
【図面の簡単な説明】
【図１】
ｓｘａ２遺伝子の、ｕｒａ４＋、およびｓｘａ２＞ｕｒａ４、およびｓｘａ２＞ｌａｃＺレポーター遺伝子での特定および段階的置換を示す概要図である。
【図２】
図１に概要的に示した構築物のＰｖｕＩＩおよびＨｉｎｄＩＩＩでの消化物のサザンブロットである。
【図３】
ｍａｐ２遺伝子産物の配列の概要図である。
【図４】
ｍａｐ２遺伝子産物のアミノ酸配列である。
【図５】
Ｐ因子遺伝子のたった１つのコピーを有する構築物（モノＰ構築物）の構築を示す概要図である。
【図６】
モノＰ構築物のアミノ酸配列である。
【図７Ａ】
Ｐ因子遺伝子の、ランダムペプチドをコードする核酸配列での置換を示す概要図であり、ここで「ｎ」は、未知のアミノ酸である。
【図７Ｂ】
ランダムペプチドをコードする改変Ｐ因子遺伝子産物のアミノ酸配列であり、ここで「ｎ」は、未知のアミノ酸である。
【図８】
ｕｒａ４レポーター遺伝子を用いたポジティブおよびネガティブ選択である：ａ）Ｐ因子による刺激時の、ウラシルなしでのプレート上での酵母細胞の成長、ｂ）ＦＯＡプレート上での成長阻害。酵母細胞は、１、１０、および１００ユニットのＰ因子で刺激される。
【図９】
ウラシルなしでのプレート上でのｓｘａ２＞ｕｒａ４酵母細胞の成長である。酵母細胞は、０．１〜１０００ユニット／ｍｌのＰ因子で刺激される。
【図１０】
Ｐ因子刺激に対する感受性が増大した突然変異体の特定である。ｓｘａ２＞ｕｒａ４細胞を、ウラシルを欠如させたプレート上で成長させた。
【図１１】
ｓｘａ２＞ｕｒａ４株を用いたｒｇｓ１突然変異体の特定およびキャラクタライズである。
【図１２】
ｓｘａ２＞ｕｒａ４レポーター株およびチアミン誘導性Ｐ因子構築物を用いた、Ｐ因子のチアミン誘導性発現である。
【図１３】
ｓｘａ２＞ｌａｃＺレポーター株でのβ−ガラクトシダーゼのＰ因子刺激である。
【図１４】
様々なＧα移植体を有するＳｚ．ポンベ株でのヒトＣＲＨ受容体の共役である。
【図１５】
受容体のリガンドの非存在下で受容体の共役を実証する図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
2004515238.tif 000009
【図７Ｂ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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2004515238.tif 000137
【手続補正書】
【提出日】平成15年3月20日(2003.3.20)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】請求項１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項１】
（ｉ）細胞成長の有糸分裂期中に抑制解除されるＧタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）調節性シグナル伝達経路、
（ｉｉ）細胞成長の有糸分裂期中に抑制解除される該ＧＰＣＲ調節性シグナル伝達経路により媒介されるシグナルをレポートするレポーター系
を含むシゾサッカロマイセス・ポンベ（Ｓｚ．ポンベ）酵母細胞であって、
（ａ）該ＧＰＣＲが異種性であり、かつ／または
（ｂ）該レポーター系は、レポーター遺伝子およびプロモーターを含み、該レポーター遺伝子は、該プロモーターに作動可能に連結され、該プロモーターは、該ＧＰＣＲにより調節可能であり、該レポーター遺伝子および該プロモーターの少なくとも１つは、異種性である酵母細胞。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】請求項３１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項３１】
ＧＰＣＲ調節性活性を研究するための、
（ａ）  （ｉ）細胞成長の有糸分裂期中に抑制解除されるＧタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）調節性シグナル伝達経路、
（ｉｉ）細胞成長の有糸分裂期中に抑制解除される該ＧＰＣＲ調節性シグナル伝達経路により媒介されるシグナルをレポートするレポーター系
を含むシゾサッカロマイセス・ポンベ（Ｓｚ．ポンベ）酵母細胞、または
（ｂ）請求項２８ないし３０のいずれか１項に記載の単離された核酸分子
の使用。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】請求項３３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項３３】
ＧＰＣＲ調節性活性に対する化合物の影響を決定する方法であって、
（ｉ）  （ａ）細胞成長の有糸分裂期中に抑制解除されるＧタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）調節性シグナル伝達経路、
（ｂ）細胞成長の有糸分裂期中に抑制解除される該ＧＰＣＲ調節性シグナル伝達経路により媒介されるシグナルをレポートするレポーター系
を含むシゾサッカロマイセス・ポンベ（Ｓｚ．ポンベ）酵母細胞を供給し、
（ｉｉ）該化合物を、該酵母細胞に導入し、そして
（ｉｉｉ）該レポーター系の産出量を表示する
工程を含む方法。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】請求項３５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項３５】
ＧＰＣＲ調節性経路の構成成分の調節因子または突然変異体を特定するための、
（ｉ）細胞成長の有糸分裂期中に抑制解除されるＧタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）調節性シグナル伝達経路、
（ｉｉ）細胞成長の有糸分裂期中に抑制解除される該ＧＰＣＲ調節性シグナル伝達経路により媒介されるシグナルをレポートするレポーター系
を含むシゾサッカロマイセス・ポンベ（Ｓｚ．ポンベ）酵母細胞の使用。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】請求項３６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項３６】
ＧＰＣＲ調節性シグナル伝達経路を調整する試薬を特定する方法であって、
（ｉ）  （ａ）細胞成長の有糸分裂期中に抑制解除されるＧタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）調節性シグナル伝達経路、
（ｂ）細胞成長の有糸分裂期中に抑制解除される該ＧＰＣＲ調節性シグナル伝達経路により媒介されるシグナルをレポートするレポーター系
を含むシゾサッカロマイセス・ポンベ（Ｓｚ．ポンベ）酵母細胞を供給し、
（ｉｉ）該酵母細胞内でランダムペプチドを産生し、そして
（ｉｉｉ）産生されたレポーター活性の量を測定すること
を含む方法。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】請求項３８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項３８】
Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）が細胞シグナル伝達経路に共役されるかどうかを決定する方法であって、
（ｉ）細胞成長の有糸分裂期中に抑制解除されるＧタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）調節性シグナル伝達経路、
（ｉｉ）細胞成長の有糸分裂期中に抑制解除される該ＧＰＣＲ調節性シグナル伝達経路により媒介されるシグナルをレポートするレポーター系
を含むシゾサッカロマイセス・ポンベ（Ｓｚ．ポンベ）酵母細胞のリガンド非依存性レポーター系産出量を、機能性ＧＰＣＲを欠如した参照細胞の該レポーター系産出量と比較することを含む方法。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】請求項３９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項３９】
（ｉ）細胞成長の有糸分裂期中に抑制解除されるＧタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）調節性シグナル伝達経路であって、該ＧＰＣＲは、存在しないか、そうでなければ非機能的にさせられているＧＰＣＲ調節性シグナル伝達経路、
（ｉｉ）細胞成長の有糸分裂期中に抑制解除される該ＧＰＣＲ調節性シグナル伝達経路により媒介されるシグナルをレポートするレポーター系
を含むシゾサッカロマイセス・ポンベ（Ｓｚ．ポンベ）酵母細胞。
【国際調査報告】
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