(57)【要約】マクロファージ遊走阻止因子（ＭＩＦ）に対するレセプターとしてＭＨＣクラスII不変鎖ポリペプチド、Ｉｉ（また、ＣＤ７４として知られる）を使用するための方法及び組成物が公開される。これらには、局所的又は全身的に変化したＭＩＦレベルで特徴付けられる状態、特に炎症状態及びガンの治療におけるこのレセプター、並びにこのレセプターに結合する若しくはそれ以外にＣＤ７４とＭＩＦとの相互作用又はその相互作用の結果を変調させるＭＩＦのアゴニスト及びアンタゴニストを使用するための方法及び組成物を含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＭＩＦのアゴニスト又はアンタゴニストに関して化合物をスクリーニングする方法であって、ＭＨＣクラスII不変鎖（Ｉｉ）ポリペプチドを候補化合物の存在下及び非存在下でＭＩＦと接触させること、及び該候補化合物の存在下でのＭＩＦと該Ｉｉポリペプチドとの相互作用を候補化合物の非存在下でのそれらの相互作用と比較し、これにより該ＭＩＦと該Ｉｉポリペプチドとの相互作用を増強する候補化合物をＭＩＦのアゴニストとして同定し、該ＭＩＦと該Ｉｉポリペプチドとの相互作用を阻害する候補化合物をＭＩＦのアンタゴニストとして同定することを含み、ここで該Ｉｉポリペプチドは図５（配列番号２）の完全Ｉｉアミノ酸配列又はそのＭＩＦ結合性断片を含む方法。
【請求項２】
請求項１記載の方法により同定されるＭＩＦのアゴニスト又はアンタゴニスト。
【請求項３】
抗体又はその抗原結合性断片である請求項２記載のアゴニスト又はアンタゴニスト。
【請求項４】
抗体が抗ＣＤ７４抗体である請求項３記載のアゴニスト又はアンタゴニスト。
【請求項５】
モノクロナール抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体及びキメラ抗体からなる群から選択される請求項４記載の抗ＣＤ７４抗体。
【請求項６】
ＭＩＦと結合しそれによりＭＩＦの効果を媒介するＭＨＣクラスII不変鎖（Ｉｉ）ポリペプチドを表面上に含む細胞へのＭＩＦの該効果を阻害する方法であって、該細胞を該ＩｉポリペプチドへのＭＩＦの結合を阻害するＭＩＦのアンタゴニストと接触させることを含む方法。
【請求項７】
アンタゴニストが該Ｉｉポリペプチドに結合する、抗体又はその断片である請求項６記載の方法。
【請求項８】
細胞が哺乳動物中に存在し、アンタゴニストが医薬組成物として哺乳動物に投与される請求項７記載の方法。
【請求項９】
哺乳動物が、患っていない哺乳動物の正常範囲より上昇した全身性又は局所性ＭＩＦレベルにより特徴付けられる状態を患っている請求項８記載の方法。
【請求項１０】
哺乳動物が炎症性疾患を患い、アンタゴニストが該疾患の治療に有効な量で投与される請求項９記載の方法。
【請求項１１】
疾患が、敗血性ショック又は関節炎である請求項９記載の方法。
【請求項１２】
哺乳動物がガンを患っており、アンタゴニストがガンの治療に有効な量で投与される請求項８記載の方法。
【請求項１３】
ＭＩＦをＭＩＦと結合する、ＭＨＣクラスII不変鎖（Ｉｉ）ポリペプチド又はその断片であるＭＩＦのアンタゴニストと接触させることを含むＭＩＦの活性を阻害する方法。
【請求項１４】
ＭＩＦと結合するＭＨＣクラスII不変鎖（Ｉｉ）ポリペプチド又はその断片が該ポリペプチド又はその断片の可溶性形態である請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
ポリペプチド又はその断片の可溶性形態が該ポリペプチド又はその部分の細胞外結合ドメインを含む請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
阻害されるＭＩＦが哺乳動物中にあり、ＭＩＦのアンタゴニストが医薬組成物として哺乳動物に投与される請求項１３記載の方法。
【請求項１７】
哺乳動物が、患っていない哺乳動物の正常範囲より上昇した全身性又は局所性ＭＩＦレベルにより特徴付けられる状態を患っている請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
哺乳動物が炎症性疾患を患い、アンタゴニストが該疾患の治療に有効な量で投与される請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
疾患が、敗血性ショック又は関節炎である請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
該哺乳動物がガンを患っており、アンタゴニストがガンの治療に有効な量で投与される請求項１６記載の方法。
【請求項２１】
Ｉｉポリペプチド又はその断片へのＭＩＦの特異的結合を促進する条件下で、ＭＩＦと結合するＭＨＣクラスII不変鎖（Ｉｉ）ポリペプチド又はその断片とＭＩＦを含む試料とを接触させること、及び形成されたＭＩＦ：Ｉｉポリペプチド複合体又はＭＩＦ：Ｉｉポリペプチド断片複合体をＩｉポリペプチド又はその断片に結合しない材料から分離することを含むＭＩＦの精製方法。
【請求項２２】
Ｉｉポリペプチド又はその断片が、固相支持マトリックス上に固定化されている請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
Ｉｉポリペプチド又はその断片へのＭＩＦの特異的結合を促進する条件下で、ＭＩＦと結合するＭＨＣクラスII不変鎖（Ｉｉ）ポリペプチド又はその断片と試料とを接触させること、及びそれにより形成されたＭＩＦ：Ｉｉポリペプチド複合体又はＭＩＦ：Ｉｉポリペプチド断片複合体を検出することを含むＭＩＦの存在を検定する方法。
【請求項２４】
ＭＩＦと結合しそれによりＭＩＦの効果を媒介するＭＨＣクラスII不変鎖（Ｉｉ）ポリペプチドを表面上に含む細胞へのＭＩＦの該効果を減少させる方法であって、該細胞により生産される該Ｉｉポリペプチドの量を減少させるのに有効な量のアンチセンス核酸分子を該細胞へ提供することを含み、該アンチセンス核酸分子はＭＨＣクラスII不変鎖（Ｉｉ）ポリペプチドをコードする遺伝子から発現されるｍＲＮＡの部分に特異的に結合し、それによって該細胞の該ｍＲＮＡの翻訳を減少させることを特徴とする方法。
【請求項２５】
Ｉｉポリペプチドを含む細胞が哺乳動物中にあり、該アンチセンス核酸分子が医薬組成物として哺乳動物に投与される請求項２４記載の方法。
【請求項２６】
アンチセンス核酸分子がオリゴヌクレオチドの形態で哺乳動物に投与される請求項２５記載の方法。
【請求項２７】
アンチセンス核酸分子が細胞において該アンチセンス核酸分子を発現する組換え構築物の形態で哺乳動物に投与される請求項２５記載の方法。
【請求項２８】
哺乳動物が、患っていない哺乳動物の正常範囲より上昇した全身性又は局所性ＭＩＦレベルにより特徴付けられる状態を患っている請求項２５記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明分野
本発明は、マクロファージ遊走阻止因子（ＭＩＦ）レセプターとしてＭＨＣクラスII不変鎖ポリペプチド、Ｉｉ（また、ＣＤ７４として知られる）使用のための方法及び組成物に関するものであって、局所的又は全身的に変化するＭＩＦレベルで特徴付けられる状態、特に炎症状態及びガンの治療のための方法において、このレセプターの使用、並びにこのレセプターに結合する又はそれ以外のＣＤ７４とＭＩＦとの相互作用又はそのような相互作用の結果を変調させるＭＩＦのアゴニスト及びアンタゴニストの使用のための方法及び組成物を含む。
【０００２】
技術の背景
記述された最初のサイトカイン活性であるマクロファージ遊走阻止因子（ＭＩＦ）は、先天性及び適応性免疫応答の重要な調節因子として見れらることがわかってきた1-3。ＭＩＦは、単一の遺伝子によりコードされ、結晶化研究は、ＭＩＦを新規たんぱく質ホールド及び構造のスーパーファミリーに定義することを示した4。ＭＩＦによる生物活性は、ほぼ３０年前に最初に記述されたにもかかわらず、細胞生理及び免疫におけるＭＩＦの正確な役割に関する情報は、ごく最近現れてきたに過ぎない1-9,18。ＭＩＦは、マクロファージやＴ細胞の活性化そして敗血症ショック、関節炎、及び他の炎症状態の進行において中心的に関与している2。また、ガンとも結びついている32。
【０００３】
ＭＩＦは、自然及び獲得性免疫の発現と重要な関係がある。ＭＩＦはさまざまな細胞より放出されマクロファージ18、Ｔ細胞6そして繊維芽細胞7の活性化又は増殖応答に必須の因子である。ＭＩＦの遊走効果は、ｐ４４／ｐ４２（ＥＲＫ−１／２）マイトジェン活性化たんぱく質（ＭＡＰ、mitogen-activated protein）キナーゼカスケードに関与するオートクライン／パラクライン活性化経路を経て進行する7。ＭＩＦ−／−マウスは、高度にエンドトキシンショックに耐性であり3、そしてＭＩＦの免疫中和は、敗血症ショック25そして遅延型過敏症26、関節炎27そして糸球体腎炎28のようなさまざまな免疫性炎症症状に対する予防を与える。細胞でのＭＩＦの働きはまた多くの特徴を見せる。これらには、グルココルチコイド誘導免疫抑制での全逆調節活動（counter-regulatory action）5,6、ＥＲＫ−１／２活性化持続性パターン（a sustained pattern）の誘導7そしてｐ５３−依存性アポトーシスの機能的拮抗6を含む。
【０００４】
ＭＩＦの前炎症特性は、グルココルチコイドの免疫抑制効果を逆調節する能力と結びついている5,6、そしてその細胞との相互反応はレセプターを基礎とする活性化機構を必要とするか7,8、又は特別な細胞内活性化様式を反映している9と推測されている。多くのインビトロ又はインビボの研究は、細胞表面レセプターの関与によるＭＩＦ働きとが一致している、しかしながら、候補レセプターの同定に向けた進捗の欠如が、特別な細胞内活性化様式9かあるいはＭＩＦのトートメラーゼ活性の潜在的な生物学的役割2,21かのどちらかなのかの興味を刺激している。また、ＭＩＦが、イソメラーゼとしての機能を有するかもしれないこともわかっている4。
【０００５】
ＭＨＣクラスII関連不変鎖、Ｉｉ（ＣＤ７４）10、小胞体からゴルジへのＭＨＣクラスIIたんぱく質のプロセッシング及び輸送で重要な役割を果たすことが確立されている10。ほとんどのＩｉは、クラスII結合部位上に搭載された抗原ペプチドとしてクラスII複合体から解離している。全細胞内Ｉｉのおおよそ２−５％は、また細胞表面上で発現しており17、そこでＴ細胞活性化のためのアクセサリー分子として機能することが示されている11。Ｉｉは免疫細胞活性化のためのシグナリング及びアクセサリー機能において以前に示唆されている11-13。
【０００６】
Ｈｕｍｐｈｒｅｙｓ等の米国特許Ｎｏ．  ５，５５９，０２８は、組換え細胞での野生型及び変異型Ｉｉの発現のための遺伝子構造を公開している。Ｈｕｍｐｈｒｅｙｓ等の米国特許Ｎｏ．５，７２６，０２０は、Ｉｉ  ｍＲＮＡ分子とハイブリダイズするオリゴヌクレオチド及び発現可能な逆遺伝子構造を公開及び特許請求している。
【０００７】
発明の概要
本発明は、クラスII関連不変鎖ポリペプチドＩｉ（又はＣＤ７４）10がＭＩＦの細胞レセプターであるという同定、発現クローニングの使用そして機能解析に一部分基づく。故に、ＭＩＦは、タイプII膜たんぱく質であるＩｉの細胞外ドメインに結合し、Ｉｉは、ＭＩＦ誘導細胞活性化そして／又は、たとえば細胞外シグナル関連キナーゼ（ＥＲＫ）−１／２ＭＡＰキナーゼカスケードを経たシグナリングや細胞増殖を含む表現型の変化のために必要である。本発明の関連では、サイトカインとしてのＭＩＦ活性化のための機構やＩｉの本来のリガンドとしての同定を提供する、これは、以前に免疫細胞の活性化のためのシグナリング及びアクセサリー機能において示唆されている。
【０００８】
したがって、本発明の１つの態様は、ＣＤ７４に結合するＭＩＦのポジティブ又はネガティブモジュレーターを同定するための化合物又はＣＤ７４への結合に結びついた活性をスクリーニングするための方法に関する。最初の例では、そのような方法には、試験化合物の存在下及び非存在下でのＭＩＦとＭＨＣクラスII不変鎖（Ｉｉ）ポリペプチドとの接触、そして試験化合物の存在下でのＭＩＦとＩｉポリペプチドの結合相互作用と試験化合物の非存在下でのそれらの相互作用との比較：を含む生化学（すなわち、無細胞の）結合試験を含む、そこで、ＭＩＦとＩｉポリペプチドとの相互作用をポジティブに変調させる化合物がＭＩＦ結合活性の増強剤として同定され、ＭＩＦとＩｉポリペプチドとの相互作用をネガティブに変調させる化合物はＭＩＦ結合活性の阻害剤として同定される。そのように同定された増強剤は、ＭＩＦの候補治療用アゴニスト又増強剤であり、一方そのように同定された阻害剤は、ＭＩＦの候補治療用アンタゴニスト又阻害剤である。たとえば、試験化合物は、ＩｉポリペプチドへのＭＩＦの結合性（たとえば、相互作用の親和性を増加）を強化してもよいし、それによってＭＩＦとＩｉポリペプチドの相互作用を増強してもよい。そのような増強剤は、それゆえ、ＭＩＦのアゴニスト又は増強剤として同定され、そして、内在性又は外来性ＭＩＦと独立に又は結びついて、そのような増大を必要とする対象でのＭＩＦの効果を増強のための候補治療薬として同定される。
【０００９】
他に、Ｉｉポリペプチドへの結合でＭＩＦと競合又はそれ以外にＩｉポリペプチドとＭＩＦとの相互作用を阻害する試験化合物は、ＭＩＦのアンタゴニストととして同定され、そしてそのような拮抗効果を必要とする対象でのＭＩＦの効果を中和する候補治療薬として同定される。この生化学結合試験では、Ｉａポリペプチドは、完全なＩａ配列又はそのＭＩＦ結合断片を含みそしてその分析では、組換え的に調製されたＭＩＦとＩｉペプチドで好都合に実施され、１つは、場合により固相支持体に固定化され、そして１つ（又は、抗体のようなその結合相手）は、ＭＩＦ：Ｉｉ結合相互作用の検出及び測定を促進するために標識される。
【００１０】
第２の態様は、結合試験は、典型的には細胞表面上で、細胞（原核細胞又は真核細胞）によって発現されたＣＤ７４（天然又はＩｉ発現のための遺伝子工学の結果としてのどちらか）を含む細胞結合試験であってもよく、そしてそのＭＩＦ結合が、試験化合物の存在下又は非存在下で検出そして測定される。上述の生化学又は無細胞系試験で、試験化合物存在下でのＭＩＦと細胞提示Ｉｉポリペプチドの結合相互作用と試験化合物非存在下でのそれらの相互作用とが比較され、そこで、ＭＩＦとＩｉポリペプチドとの相互作用をポジティブに変調させる化合物（すなわち、それらの親和性を増加させる）が、ＭＩＦ結合活性の増強剤として同定され、そしてＭＩＦとＩｉポリペプチドとの相互作用をネガティブに変調させる化合物（すなわち、それらの親和性を減少させる）は、ＭＩＦ結合活性の阻害剤として同定される。そのように同定された増強剤は、ＭＩＦの候補治療用アゴニスト又増強剤であり、一方そのように同定された阻害剤は、ＭＩＦの候補治療用アンタゴニスト又阻害剤である。
【００１１】
第３の態様では、細胞試験は、シグナリング試験である、これは、細胞内シグナリングカスケードの活性が、試験化合物の存在下又は非存在下のどちらかでＭＩＦが細胞提示ＣＤ７４ポリペプチドに接触する前後で測定される。好ましくは、シグナリング試験は、ＥＲＫ−１／２活性化試験である。Ｉｉポリペプチドとの相互作用を経てＭＩＦのシグナリング活性をポジティブに変調させる試験化合物は、ＭＩＦシグナリング活性増強剤として同定され、そして、Ｉｉポリペプチドとの相互作用を経てＭＩＦのシグナリング活性をネガティブに変調させる化合物は、ＭＩＦシグナリング活性阻害剤として同定される。そのように同定された増強剤は、ＭＩＦの候補治療用アゴニスト又増強剤であり、一方そのように同定された阻害剤は、ＭＩＦの候補治療用アンタゴニストである。
【００１２】
第４の態様では、細胞試験は、細胞活性又は細胞表現型試験である、これは、標的細胞の活性又は表現型が、試験化合物の存在下又は非存在下のどちらかでＭＩＦが細胞提示ＣＤ７４ポリペプチドに接触する前後で測定される。好ましくは、活性又は表現型試験は、細胞増殖試験又はｐ−５３依存性アポトーシスの機能的拮抗効果に対する試験である。Ｉｉポリペプチドとの相互作用を経てＭＩＦにより仲介される選ばれた細胞活性又は表現型変化をポジティブに変調させる試験化合物は、ＭＩＦ細胞活性増強剤として同定され、そして、Ｉｉポリペプチドとの相互作用を経てＭＩＦにより仲介される選ばれた細胞活性又は表現型変化をネガティブに変調させる化合物は、ＭＩＦ細胞活性阻害剤として同定される。そのように同定された増強剤は、ＭＩＦの候補治療用アゴニスト又増強剤であり、一方そのように同定された阻害剤は、ＭＩＦの候補治療用アンタゴニストである。
【００１３】
本発明は、上記方法のいずれかにより同定されたアゴニストを含むＭＩＦの増強剤又はＭＩＦのアンタゴニストを含む阻害剤をまた提供する。
【００１４】
そのようなアゴニスト又はアンタゴニストの１つの形は、抗ＣＤ７４抗体のような抗体又はその抗原結合断片である。抗ＣＤ７４抗体及びそのＣＤ７４結合断片は、技術的に周知である。たとえば、抗ＣＤ７４抗体は、従来の方法で作成されるモノクロナール抗体でもよいし又ヒト、ヒト化又はキメラ抗体でもよい。
【００１５】
本発明の別の態様は、その表面上にＭＩＦと結合しそれゆえＭＩＦの効果を仲介するＭＨＣクラスII不変鎖（Ｉｉ）ポリペプチドを含む細胞のＭＩＦの効果を阻害する方法に関するものである。この方法は、ＭＩＦのアンタゴニスト又は他の阻害剤と細胞との接触を含む；アンタゴニスト又は阻害剤が、最初の実施例では、ＩｉポリペプチドへのＭＩＦの結合を；第２実施例では、ＭＩＦ：Ｉｉ相互作用により始まるシグナリングを；第３実施例では、ＭＩＦ：Ｉｉ相互作用により左右される細胞活性、代謝又は表現型の変化を阻害する。これら方法のいづれにおいて、アンタゴニスト又は阻害剤は、Ｉｉポリペプチドに結合する抗体又はその断片であってもよい。他に、阻害剤は、細胞表面上でＭＩＦに結合する又はＩｉとの相互作用によってＭＩＦとＩａポリペプチドの相互作用（又はそのような相互作用の細胞結果）を阻害する可溶性Ｉｉポリペプチド又はその可溶性ＭＩＦ結合断片でもよい。ある場合には、Ｉｉポリペプチドを含む細胞が、哺乳動物に存在しアンタゴニスト又は他の阻害剤が、医薬組成物で哺乳動物に投与される。この方法から利益を得る哺乳動物は、以下のような状態を患っていない哺乳動物で見られる正常レベルを超えて局所的又は全身的に上昇したＭＩＦレベルによって特徴付けられる状態又は疾患を患っている哺乳動物である。そのような場合、アンタゴニスト又は阻害剤は、状態や疾患を治療するために効果的な量を投与される。たとえば、哺乳動物は、ガンや炎症の疾患を患っていてもよいし、そしてアンタゴニスト又は阻害剤は、ガンや炎症の疾患を治療するために効果的な量を投与される。たとえば、炎症疾患は、敗血症ショックや関節炎でもよい。
【００１６】
より特別には、本発明の１つの態様は、ＭＩＦの活性を阻害する方法である、この方法は、ＭＩＦに結合するＭＨＣクラスII不変鎖（Ｉｉ）ポリペプチド又はその断片とＭＩＦとの接触すること：を含む。ＭＩＦに結合するＭＨＣクラスII不変鎖（Ｉｉ）の断片は、ポリペプチドの可溶性形態、特にこのタイプII膜貫通ポリペプチドの細胞外結合ドメインを含む可溶性形態であってもよい。いくつかの場合、阻害されるＭＩＦは、哺乳動物内にありそしてＩｉポリペプチド又はその断片は、医薬組成物で哺乳動物に投与される。哺乳動物が、ガン又は、敗血症ショック又は関節炎のような炎症性疾患を患っている場合、Ｉｉポリペプチド又はその断片が、その疾患を治療するために効果的な量を投与される。更なる例では、ＭＩＦアンタゴニスト又は阻害剤が、感染性疾患を治療するために効果的な量を投与される、そこには、感染性病原（ウイルス、細菌、真菌、又は特に寄生虫であろうとなかろうと）から誘導されるＭＩＦ（配列相同性によって明らかにされる）に進化的に関連する疾患性ＭＩＦ又はポリペプチドが、局所的、全身的に又は宿主：病原体境界面に存在する。
【００１７】
本発明のさらに他の態様には、Ｉｉポリペプチド又はその断片へのＭＩＦの特異的結合を促進する条件下でのＭＩＦに結合するＭＨＣクラスII不変鎖（Ｉｉ）ポリペプチド又はその断片とＭＩＦを含む試料との接触、及びそれにより形成されたＭＩＦ：Ｉｉポリペプチド複合体をＩｉポリペプチド又はその断片に結合していないものから分離すること：を含むＭＩＦの精製の方法に関するものである。この方法ではＩｉポリペプチドは、固相支持担体に固定されてもよい。本発明はまた、Ｉｉポリペプチド又はその断片へのＭＩＦの特異的結合を促進する条件下でのＭＩＦに結合するＭＨＣクラスII不変鎖（Ｉｉ）ポリペプチド又はその断片と試料との接触、及びそれにより形成されたＭＩＦ：Ｉｉポリペプチド又はＭＩＦ：Ｉｉポリペプチド断片複合体のいずれを検出すること：を含むＭＩＦの存在を分析する方法を提供する。
【００１８】
本発明により提供されるさらなる他の方法は、ＭＩＦに結合し、それゆえＭＩＦの効果を仲介するＭＨＣクラスII不変鎖（Ｉｉ）ポリペプチド又はその断片を表面上に含む細胞へのＭＩＦの効果を減少させる方法である。この方法は、細胞により生産されるＩｉポリペプチドの量を減少させるために効果的な量でアンチセンス核酸分子を細胞に与えることを含む。アンチセンス核酸分子は特にＭＨＣクラスII不変鎖（Ｉｉ）ポリペプチドをコードする遺伝子から発現されるｍＲＮＡの部分に結合し、それゆえ細胞でのｍＲＮＡの翻訳を減少させ、最終的に細胞表面上のＩｉポリペプチドのレベルを減少させる。この方法においては、Ｉｉポリペプチドを含む細胞は、哺乳動物で、たとえば以下のような状態又は疾患を患っていない哺乳動物の正常レベルを超えた局所的又は全身的に上昇したＭＩＦレベルにより特徴付けられる状態又は疾患を患っている哺乳動物であってもよい。たとえば、哺乳動物は、ガンまたは敗血症ショック又は関節症のような炎症性疾患を患っていてもよい。そのような場合、アンチセンス核酸は、その状態や疾患を治療するための効果的な量で医薬組成物で投与される。
【００１９】
詳細な説明
次の略号がここで使われる：Ａｌｅｘａ−ＭＩＦ：Ａｌｅｘａ４８８−ＭＩＦ結合物、ＥＲＫ：細胞外シグナル制御キナーゼ、Ｉｉ：ＭＨＣクラスII関連不変鎖（ＣＤ７４）、ＩＦＮγ：インターフェロンγ、ｍＡＢ：モノクロナール抗体、ＭＩＦ：マクロファージ遊走阻止因子。
【００２０】
発現クローニング及び機能分析に使用するために、我々はＭＩＦの細胞レセプターとしてクラスII関連不変鎖、Ｉｉ（ＣＤ７４）10を同定した。ＭＩＦはII型膜たんぱく質であるＩｉの細胞外ドメインと結合する、そしてＩｉは、たとえばＥＰＫ−１／２  ＭＡＰキナーゼカスケードや細胞増殖の活性化を含むＭＩＦ誘導性細胞効果に必要である。これらのデータが、サイトカインとしてのＭＩＦの活性に関する機構を提供しＩｉの天然のリガンドとしてそれを同定させた、これは以前に免疫細胞活性化のためのシグナルリング及びアクセサリー機能において示唆されていた11-13。我々は、標準的な方法で組換えＭＩＦに蛍光色素Ａｌｅｘａ４８８14を結合させ、結合物の生物活性の保持を証明し（図．１Ａ、Ｂ）、ＭＩＦへの応答が知られている細胞タイプのパネルで結合実験を実施した。例証のために、フローサイトメトリーを使用して、我々はヒト単球細胞株、ＴＨＰ−１の表面へのＡｌｅｘａ−ＭＩＦの高親和性結合を観察した。この結合活性は、インターフェロンγ（ＩＦＮγ）での単球の活性化により誘導され、過剰の未標識ＭＩＦの添加により競合される（図．１Ｃ）。４℃での共焦点顕微鏡及びＩＦＮγ処理単球の直接的視覚化は、Ａｌｅｘａ−ＭＩＦの細胞表面結合及び細胞結合Ａｌｅｘａ−ＭＩＦが３７℃への温度シフトで内部化することを示した。増加した濃度のＡｌｅｘａ−ＭＩＦでなされた定量結合研究は、２つの明白なクラスの細胞表面レセプターを示した（図．１Ｅ）。高親和性結合活性は、３．７×１０-8ＭのＫｄ及び細胞当り３．１×１０4結合部位、そして低親和性結合は、３．５×１０-7ＭのＫｄ及び細胞当り４．９×１０4部位を示した。
【００２１】
ＭＩＦの同定のために、我々はＩＦＮγ活性化ＴＨＰ−１単球からのｃＤＮＡを調製しラムダＺＡＰ−ＣＭＶベクターで哺乳動物の発現ライブラリーを構築した15。合計１．５×１０7の組換え体を示すライブラリーのアリコートが、ＭＩＦに対してはほとんど検出できない結合活性を示すことを以前に我々が証明したＣＯＳ−７にトランスフェクトされた、そしてトランスフェクタントがＡｌｅｘａ−ＭＩＦ結合に関してフローサイトメトリーで分析された。陽性染色細胞が、細胞採取操作により単離されそして集められたｃＤＮＡクローンは、増幅され、細胞採取のさらなるラウンド実施のためにＣＯＳ−７細胞に再度トランスフェクトされた（図．２Ａ）。４ラウンドの選択後、単一コロニーが大腸菌で調製され、２５０コロニーが任意に分析にために拾い上げられた。≧１．６ｋＢの挿入ｃＤＮＡを有する５０クローンをシークエンスし１０個が３１−４１ｋＤのII型膜貫通たんぱく質のＩｉ（ＣＤ７４）であるクラスII関連不変鎖をコードしていることを観察した16。単離されたクローンは全長に関して異なっていたが、それぞれはセンス方向で完全な細胞外及び膜貫通ドメインをコードしていた。
【００２２】
Ｉｉが、ＭＩＦに対する細胞表面結合たんぱく質であることを確認するために、Ｉｉ発現プラスミドでトランスフェクトされたＣＯＳ−７細胞へのＡｌｅｘａ−ＭＩＦの結合を調べた（図．２Ｃ）。結合は、過剰の未標識ＭＩＦ（データは示していない）及びたんぱく質の細胞外部分に対して向けられた抗Ｉｉモノクロナール抗体により阻害された。抗Ｉｉモノクロナール抗体は、またＩＦＮ−γ刺激ＴＨＰ−１単球へのＡｌｅｘａ−ＭＩＦの結合を阻害した。ＴＨＰ−１単球へのＡｌｅｘａ−ＭＩＦ結合の抗Ｉｉモノクロナール抗体による阻害は、顕著であるが、部分的であり、Ｉｉがスキャッチャード分析（図．１Ｅ）によって示されるＭＩＦに対する細胞表面レセプター２つのクラスの１つを表すという解釈と一致する。転写と翻訳の連動した網状赤血球溶解物システムにより調製された［35Ｓ］−Ｉｉたんぱく質はインビトロでＭＩＦに結合し、そして主要な結合エピトープは、Ｉｉ細胞外ドメインに含まれる４０アミノ酸領域に局在化していた（図．２Ｄ）。
【００２３】
典型的なシステムでのＩｉへのＭＩＦ結合の機能的重要性を証明するために、我々は様々なＩｉ発現細胞での細胞増殖及びＥＲＫ−１／２活性化を刺激するためのＭＩＦ活性を調べた。我々は、ＩｉトランスフェクトＣＯＳ−７細胞のＥＲＫ−１／２リン酸化でのＭＩＦ媒介増加、及びドース依存的（dose-dependent）抗Ｉｉモノクロナール抗体媒介減少を観察した（図．３）。しかしながら、我々はＩｉ遺伝子のトランスフェクションと関係なしにこのサル上皮細胞株へのＭＩＦの増殖効果を検出できなかった（データは示していない）。我々はその後、高レベルのＩｉを発現するヒトＲａｊｉ  Ｂ細胞株でのＥＲＫ−１／２活性化およびその下流にある増殖応答を誘導するためのＭＩＦ活性を調べた19。ＭＩＦは静止期のＲａｊｉ細胞のＥＲＫ−１／２リン酸化を刺激し、２つの抗Ｉｉモノクロナール抗体がＭＩＦのこの刺激効果を阻害する（図．４Ａ、Ｂ）。注目すべきは、ＥＲＫ−１／２リン酸化への抗Ｉｉの効果が、これら細胞のＭＩＦ刺激増殖の著しい減少と関係していることである（図．４Ｃ）。加えて、免疫システムの外側にある細胞のＭＩＦ−Ｉｉ刺激経路の役割を確認した。ＭＩＦはマウスの初代繊維芽細胞の寿命を延ばし、そしてＭＩＦの細胞分裂誘起効果及びＥＲＫ−１／２シグナル伝達カスケードの誘導は、この細胞タイプにおいてもっとも特徴的である7。繊維芽細胞は、低レベルのＩｉを発現し、我々は抗Ｉｉが培養繊維芽細胞でのＭＩＦのＥＲＫ−１／２リン酸化及び細胞分裂誘起効果の両方を阻害することを観察した（図．４Ｄ及びデータは示していない）。
【００２４】
先の実験において、我々は生物活性な、125Ｉ放射性標識ＭＩＦを調製することがかなり困難であることを経験し、そしてたんぱく質がビオチン結合で用いられるｐＨ条件には不安定であることを観察した。対照的に、低モル濃度でのＡｌｅｘａ  ４８８によるＭＩＦの修飾では、ヒト単球上のＭＩＦレセプターを同定でき、そして細胞表面ＭＩＦレセプターとしてＩｉの発現クローニングできる完全に生物活性なたんぱく質を作製した。これらのデータは、クラスIIたんぱく質の輸送における役割の外でのＩｉの我々の理解を著しく拡大し、Ｂ及びＴ細胞の生理学におけるＩｉのアクセサリーシグナル機能を述べている最近の研究を支持した10-13。
【００２５】
さらなるたんぱく質がＭＩＦ媒介活性には関与するらしいけれども、これらの発見は長く求められていたＭＩＦレセプターへの最初の洞察を提供する。たとえば、ＭＩＦのようにＩｉはホモ３量体で23、Ｉｉの細胞内ドメインは３０−４６アミノ酸からなる、これは使用される２つの同位相の開始コドンに依存する16。単球にコードされるＩｉは、Ｔ細胞増殖応答を増強することが示されておりＩｉのこのアクセサリー機能は、ＩｉとＣＤ４４間の特異的コンドロチン硫酸依存性相互作用と結びついている11。我々は、Ｉｉ発現細胞でのＥＲＫ−１／２リン酸化への抗ＣＤ４４の阻害効果を観察したが、ＭＩＦ結合を観察しなかった。これは、ＭＩＦ結合ＩｉがＣＤ−４４媒介ＭＡＰキナーゼ活性化のための促進リガンドであるという推論と一致する。ＣＤ４４は高度に多様形態のＩ型膜貫通糖たんぱく質であり24、ＣＤ４４はＩｉへのＭＩＦ結合による下流の結果のあるものを媒介するらしい。
【００２６】
たとえば、ＭＩＦ−Ｉｉ相互作用の阻害剤やアンタゴニストを供与することによるＭＩＦ−Ｉｉ相互作用で誘導されるシグナル伝達経路の干渉は、しばしばＭＩＦへの細胞性免疫や活性化応答への新規なアプローチを提供する。これに関する活性試薬（アゴニスト及びアンタゴニスト並びに他の阻害剤）は、ＭＩＦレベルの局所的又は全身的変化で典型とされる状態及び疾患での治療利用を予測させる。
【００２７】
またＭＩＦとクラスII不変鎖ポリペプチドＩｉ間の特異的結合相互作用は、細胞表面Ｉｉを提示している細胞に希望の標識物又は毒物を濃縮するための“トロイの木馬型”ビークルとして標識化ＭＩＦ試薬の使用に都合よい。簡単には、希望の標識物又は毒物が、ＭＩＦリガンドと結合（たとえば、共有結合により）され、次にこの修飾ＭＩＦリガンドが、細胞表面局在化Ｉｉを提示している細胞に提供され、クラスII不変鎖ポリペプチドはこれに結合し、修飾ＭＩＦリガンドの内部化を引き起こし、ゆえに作用細胞に特異的標識化又は毒性化を引き起こす。Ｉｉ提示細胞は、インビトロ又はインビボで修飾ＭＩＦリガンドにさらされ、後者の場合にはＩｉ提示細胞は、患者内で特異的に特定化又は毒性化されるかもしれない。多種多様な診断用及び治療用試薬が、ＭＩＦリガンド（生物学的に活性なＭＩＦ全長又はそのＩｉ結合断片、又は前述のどちらかの突然変異体、及び特に生物学的に不活性に及び／又は標識物又は毒性物へより都合よく結合するように適合させたような突然変異体）に有利的に共役され得る。ＭＩＦに結合させる典型的な望ましい試薬は、ドキソルビシン、メトトレキサート、タキソールなどのような化学治療薬；重金属又は放射性核種のような細胞毒製試薬又は蛍光分子のような検出可能標識物を錯体化できるＤＴＰＡのようなキレーター；外毒素のような毒物などを含む。
【実施例】
【００２８】
方法
ＭＩＦ及び抗体
ヒト組換えＭＩＦは先に記述されているように大腸菌の発現システムから精製され22、製造業者のプロトコール（Molecular Probes, Eugene OR）によりＡｌｅｘａ  ４８８に結合された14。マトリクス−補助レーザー脱離イオン化質量分析（Kompact probe/SEQ, Kratos Analytical Ltd, Manchester, UK）により決定されたＭＩＦホモ３量体に対する色素リガンドの平均比は、１：３であった。抗ヒトＩｉモノクロナール抗体（クローンＬＮ２及びＭ−Ｂ７４１）は、ファルミンゲン（PharMingen、(San Jose CA)）から得られた。
【００２９】
フローサイトメトリー、スキャッチャード分析、及び共焦点顕微鏡
ＴＨＰ−１細胞（２．５×１０5細胞／ml）がＩＦＮγ（１ng／ml、R&D Systems、Minneapolis、MN）を含む又は含まないＤＭＥＭ／１０％ＦＢＳ中で７２時間培養された。洗浄後、５×１０5細胞は、０．１mlの培地に再懸濁され、２００ngのＡｌｅｘａ−ＭＩＦとともに４℃で４５分間培養された。その後、細胞は氷冷ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で洗浄されフローサイトメトリー分析（FACSalibur、Becton Dickinson、San Jose、CA）に供された。選択された実験では、ＴＨＰ−１単球又はＣＯＳ−７トランスフェクタントが、Ａｌｅｘａ−ＭＩＦと一緒に５０μg／mlの抗Ｉｉモノクロナール抗体又はアイソタイプのコントロールモノクロナール抗体とともに培養された。スキャッチャード分析では、３個のＩＦＮγ処理ＴＨＰ−１細胞（１×１０6）試料がＡｌｅｘａ−ＭＩＦ（ＭＩＦ３量体として計算して０−１．５μＭ）を伴うＰＢＳ／１％ＦＢＳ中で４℃、４５分間培養され、冷ＰＢＳ／１％ＦＢＳで３回洗浄され、そしてセルクエストソフトウェア−（CellQuest Software、Becton Dickinson、San Jose、CA）29を使用してフローサイトメトリーで分析された。特異的結合曲線は、全結合（過剰の未標識ＭＩＦの存在下で測定された）から非特異的結合を差し引くことにより計算された。細胞へのＡｌｅｘａ−ＭＩＦ結合の共焦点蛍光顕微鏡は、ＬＳＭ  ５１０レーザースキャニング装置（Carl Zeiss、Jena Germany）で成された。ＴＨＰ−１細胞は、７２時間ＩＦＮγと共に培養され、ＰＢＳ／１％ＦＢＳで３回洗浄され、その後２ng／μlのＡｌｅｘａ−ＭＩＦ又は５０ng／μlの未標識ｒＭＩＦ＋Ａｌｅｘａ−ＭＩＦで３０分間染色された。
【００３０】
ｃＤＮＡライブラリーの構築、発現及び細胞ソーティング
ｃＤＮＡは、ＩＦＮγ活性化ＴＨＰ−１単球のポリ（Ａ）＋ＲＮＡから調製され、ラムダＺＡＰ−ＣＭＶベクター（Stratagene、La Jolla、CA）にクローン化され、そしてＤＮＡのアリコート（２．５μg／ml）が１５×１０6ＣＯＳ−７細胞にＤＥＡＥ−デキストラン法30でトランスフェクトされた。トランスフェクト細胞は、４℃で４５分間Ａｌｅｘａ−ＭＩＦと共に培養され、洗浄されそして陽性染色細胞がＭｏｆｌｏ細胞ソーター（Cytomation、Fort Collins、CO）で単離された。典型的な実施は、１．５×１０7細胞／mlが注入され、１×１０4細胞／秒の流速で分析された。回収は一般には≧９０％である。プラスミドＤＮＡは分別された細胞からＥａｓｙ  ＤＮＡキット（Invitrogen、Carlsbad、CA）で抽出され、更なる増幅のために大腸菌ＸＬ−１０  ｇｏｌｄ（Stratagene、La Jolla、CA）に形質転換された。精製プラスミドＤＮＡはそれからさらなるソーティングで回すためにＣＯＳ−７細胞に再トランスフェクトされた。４回の細胞ソーティング後、２５０の単一コロニーが任意に拾い上げられ、挿入サイズがＰＣＲにより分析された。＞１．６Ｋｂの挿入物を有するコロニーが個々にＣＯＳ−７細胞に形質転換され、ＭＩＦ結合活性がフローサイトメトリーで再分析された。
【００３１】
インビトロ転写及び翻訳
鋳型として全長のＩｉ  ｃＤＮＡクローンを使用して、３つの不完全（１−７２ａａ、１−１０９ａａ、１−１４９ａａ）及び１つの完全（１−２３２ａａ）Ｉｉ産物がＰＣＲにより作製されｐｃＤＮＡ  ３．１／Ｖ５−ＨｉｓＴＯＰＯ発現ベクター（Invitrogen）にサブクローニングされた。典型的なＩｉ  ｃＤＮＡクローンの完全ヌクレオチド配列及びそれがコードする推定Ｉｉポリペプチドの形式は、図５に提供される。ベクター構造の保証は自動ＤＮＡシークエンシングにより確認され、その後その構造物がＴＮＴ網状赤血球溶解物システム（Promega、MadisonWI）を使用した連動した転写及び翻訳のための鋳型として使用された。固定化ＭＩＦへの［35Ｓ］−標識Ｉｉの結合は、ＴＮＴプロトコールの推奨どおりに、室温で３時間のインキュベーションにより評価された。
【００３２】
活性測定
ＥＲＫ−１／２のドース依存的リン酸化は、先に記述された方法7に従い全ｐ４４／ｐ４２又はリン酸化ｐ４４／ｐ４２に対して向いた特異抗体を使用したウェスタンブロッティングによって測定された。ＭＩＦ媒介アポトーシス抑制が、細胞質ヒストン関連ＤＮＡ断片の免疫分析（Roche Biochemicals、Indianapolis、IN）により血清飢餓状態のマウス胚性繊維芽細胞で評価された。増殖研究は先に公開した方法7,8の改良で成された。ヒトＲａｊｉ  Ｂ細胞（American Type Tissu Culture、Rockville、MD）は、１０％ＦＢＳ／ＲＰＭＩで培養され、９６穴プレート（５００−１０００細胞／穴）に蒔かれ、そして０．５％血清／ＲＰＭＩ中での終夜培養により休止にされた。細胞は洗浄され、０．５％血清／ＲＰＭＩが置換され、そしてＭＩＦ及び抗体が示されたように加えられた。さらなる終夜培養後、１μＣｉの［3Ｈ］チミジンが加えられ、そして細胞は１２時間後に回収された。繊維芽細胞の細胞分裂誘起は、１０％ＦＢＳ／ＤＭＥＭ中で培養された、２％血清／ＤＭＥＭ中で再懸濁された、そして示されたようなｒＭＩＦ及び抗体と共に９６穴プレート（１５０細胞／穴）に蒔かれた正常ヒト肺繊維芽細胞（ＣＣＬ２１０、American Type Tissu Culture）において調べられた。アイソタイプのコントロール又は抗Ｉｉモノクロナール抗体が、５０μg／mlの終濃度で加えられた。増殖はＤＮＡへの［3Ｈ］チミジンの終夜取り込み後５日で評価された。
【００３３】
本発明の当業者には周知のように、本発明の多くの改良及び変更が上記教示の観点から可能である。従って本発明が、ここで特に記述された以外で実行されるかもしれないことは解される。
【００３４】
【表１】
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【００３５】
個々の刊行物及び特許出願のそれぞれが、特異的にそして個別に引用されてきたように明細書に記述された全ての刊行物及び特許出願が同範囲でここの参照資料で示される。本発明への背景のディスカッションが、本発明の事情を説明するためにここに挙げられている。そのような説明は、先に記載されたいずれの態様の優先日においても、言及された素材のいずれもが、公開、周知又は世界のいづこかでの優先技術又は共通した一般知識の一部分であるということを認めるものではない。
【００３６】
本発明はその特異的な実施態様と結びついて記述されているが、さらなる改善は可能であり、そして、本出願は、全てのバリエーション、使用又は、一般的には発明の本質に従い、そして発明が関係する技術内での常習的な実施又は周知内にあるような、そして先に述べた本質的な特徴に当てはまるような本公開からの逸脱を含む発明の適合化をカバーするように意図されるものであることは理解されよう。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１Ａ】図１は、ＴＨＰ−１単球へのＭＩＦ高親和性結合を例証する。ａ、Ａｌｅｘａ−ＭＩＦは、リン化ｐ４４／ｐ４２又は全ｐ４４／ｐ４２に対する特異的抗体を使用した細胞溶解物のウェスタンブロットにより視覚化されたｐ４４／ｐ４２  （ＥＲＫ−１／２）ＭＡＰキナーゼカスケードの活性化により評価したドース依存的ＭＩＦの生物活性の保持全体を示す。
【図１Ｂ】図１は、ＴＨＰ−１単球へのＭＩＦ高親和性結合を例証する。ｂ、血清飢餓により誘導されたｐ５３依存性アポトーシスの抑制（ＣＭ：完全培地、ＳＦＭ：無血清培地）を示す。ＭＩＦ又はＡｌｅｘａ−ＭＩＦは、５０ng／mlで加えられる。データは、３つのウェルの平均±標準偏差を示し、３回の独立実験を代表する。さらなるＡｌｅｘａ−結合による元来の構造の保持の証拠が、気質としてＬ−ドーパクロムメチルエステルを使用したＭＩＦのトートメラーゼ活性の測定により与えられている25。Ａｌｅｘａ−ＭＩＦ対未共役ＭＩＦのトートメラーゼ活性に違いはないことが観察された（Ａｌｅｘａ−ＭＩＦ：ΔＯＤ４７５＝０．２７５ｓｅｃ-1μg-1たんぱく質、対ｒＭＩＦ：ΔＯＤ４７５＝０．２９０  ｓｅｃ-1μ-1；Ｐ＝ＮＳ）。
【図１Ｃ】図１は、ＴＨＰ−１単球へのＭＩＦ高親和性結合を例証する。ｃ、フローサイトメトリーの分析は、ＴＨＰ−１単球へのＡｌｅｘａ−ＭＩＦの結合が、ＩＦＮ−δ処理により著しく増強されたことを示す。Ａｌｅｘａ−ＭＩＦ結合に対する競合が、１μg／mlの未標識ｍｒＭＩＦの存在下でなされた。
【図１Ｄ】図１は、ＴＨＰ−１単球へのＭＩＦ高親和性結合を例証する。ｄ、共焦点顕微鏡によるＴＨＰ−１単球へのＡｌｅｘａ−ＭＩＦ結合の直接的な視覚化。ＴＨＰ−１細胞は、カバースリップ上で増殖され、ＩＦＮγ（１ng／ml）で７２時間培養され、Ａｌｅｘａ−ＭＩＦ（左パネル）又はＡｌｅｘａ−ＭＩＦ＋過剰の未標識ｒＭＩＦ（右パネル）で染色された。細胞結合Ａｌｅｘａ−ＭＩＦは１５分間で４°から３７°へシフトした細胞では急速に内部化された。倍率：６３０×。
【図１Ｅ】図１は、ＴＨＰ−１単球へのＭＩＦ高親和性結合を例証する。ｅ、ＩＦＮγ活性化ＴＨＰ−１単球へのＡｌｅｘａ−ＭＩＦの結合特性。差し込み図は、スキャッチャード分析で変換された結合データを示す、これは、２つの別個の結合活性；１つはＫｄ＝３．７×１０-8ｍ、残りはＫｄ＝３．５×１０-5を示し、データは３回の独立実験を代表する。
【図２Ａ】図２は、ＩｉがＭＩＦの細胞表面結合たんぱく質であることを示す。ａ、ＣＯＳ−７細胞トランスフェクタントの蛍光標示式細胞分取操作の連続サイクルは、ＭＩＦ結合活性の濃縮化を示す。
【図２Ｂ】図２は、ＩｉがＭＩＦの細胞表面結合たんぱく質であることを示す。ｂ、線図は、Ｉｉ（３５ｋＤａアイソフォーム）の構造、及びＭＩＦ結合活性を有する１０個の代表的なｃＤＮＡクローンのうちの３個を示す。ＩＣ、ＴＭ及びＥＣは細胞内、膜貫通及び細胞外ドメインである。Ｍ１及びＭ１７は別の２つの翻訳開始部位をいう。
【図２Ｃ】図２は、ＩｉがＭＩＦの細胞表面結合たんぱく質であることを示す。ｃ、Ｉｉ−発現細胞へのＭＩＦ結合のフローサイトメトリー分析。Ｉｉトランスフェクト対コントロールベクタートランスフェクトＣＯＳ−７細胞へのＡｌｅｘａ−ＭＩＦの結合増強（左パネル）、抗Ｉｉ  モノクロナール抗体（クローンＬＮ２）対アイソタイプのモノクロナール抗体コントロール（ｃｏｎ  ｍＡｂ）と共に培養されたＩｉトランスフェクトＣＯＳ−７細胞へのＡｌｅｘａ−ＭＩＦの結合阻害（中央パネル）、抗Ｉｉモノクロナール抗体（クローンＬＮ２）対アイソタイプのモノクロナール抗体コントロールと共に培養されたＩＦＮγ刺激ＴＨＰ−１単球へのＡｌｅｘａ−ＭＩＦの結合増強（右パネル）。示されたデータは、少なくとも３回の独立実験を代表する。抗Ｉｉモノクロナール抗体は、ＬＮ２（ファルミンゲン（PharMingen）、蛋白質のＣ末端、細胞質外６０アミノ酸内にあるエピトープと反応する。
【図２Ｄ】図２は、ＩｉがＭＩＦの細胞表面結合たんぱく質であることを示す。ｄ、ＭＩＦはインビトロでＩｉの細胞外ドメインと結合する。［35Ｓ］−Ｉｉたんぱく質が、様々な長さのＩｉ断片をコードしたプラスミドを用い連動した転写と翻訳反応で調整された。たんぱく質−たんぱく質相互作用は、ＭＩＦで予め覆われた９６穴プレートの結合放射活性を測定することで評価された（実験当りｎ＝６穴）。示されたデータは３回の実験の代表で、ＭＩＦ結合が、Ｉｉの１−１４９または１−２３２（全長）アミノ酸断片を発現するベクターとは強固な結合であるのに対し、Ｉｉの１−７２または１−１０９アミノ酸断片を発現するベクターとはひどく危ういものであることを示した。
【図３Ａ】図３はＣＯＳ−７細胞でのＥＰＫ−１／２（ｐ４４／ｐ４２）リン酸化のＭＩＦ刺激のＩｉ媒介を例証する。ａ、ＥＰＫ−１／２リン酸化は、Ｉｉベクター（ＣＯＳ−７／Ｉｉ）またはコントロールベクター（ＣＯＳ−７／Ｖ）でトランスフェクトされたＣＯＳ−７細胞においてＭＩＦにより誘導される。細胞は、２．５時間、未処理または様々なドースのｒＭＩＦで処理され、ウェスタンブロットによりリン酸化ｐ４４／ｐ４２及び全ｐ４４／ｐ４２に関して分析された。
【図３Ｂ】図３はＣＯＳ−７細胞でのＥＰＫ−１／２（ｐ４４／ｐ４２）リン酸化のＭＩＦ刺激のＩｉ媒介を例証する。ｂ、抗Ｉｉモノクロナール抗体によるＭＩＦ誘導性ＥＰＫ−１／２リン酸化のドース依存的阻害がある。ＣＯＳ−７細胞は、Ｉｉベクターでトランスフェクトされ、様々なドースの抗Ｉｉ  モノクロナール抗体（クローンＬＮ２）またはアイソタイプのコントロールモノクロナール抗体の存在下で２．５時間、５０ng／ml  ＭＩＦで刺激された。コントロール実験では、抗Ｉｉは、添加ＭＩＦの不在下ではＥＰＫ−１／２リン酸化に効果を示さなかった（データは示していない）。
【図４Ａ】図４は、ＭＩＦ誘導リン酸化のウェスタンブロットを例証する。ａ、ドース依存的にＭＩＦは、リン酸化ｐ４４／ｐ４２のウェスタンブロットで視覚化されるようにヒトＲａｊｉ  Ｂ細胞のＥＰＫ−１／２リン酸化を刺激する。
【図４Ｂ】図４は、ＭＩＦ誘導リン酸化のウェスタンブロットを例証する。ｂ、また抗Ｉｉモノクロナール抗体によりＲａｊｉ  Ｂ細胞のＭＩＦ誘導性ＥＰＫ−１／２リン酸化の阻害がある。Ｒａｊｉ  Ｂ細胞は、Ｉｉベクターでトランスフェクトされ、各々５０μg／mlで加えられた２つの抗Ｉｉ  モノクロナール抗体、−Ｂ７４１又はＬＮ２、またはアイソタイプのコントロールモノクロナール抗体（Ｃｏｎ  Ａｂ）の存在下で２．５時間、５０ng／ml  ＭＩＦで刺激された。
【図４Ｃ】図４は、ＭＩＦ誘導リン酸化のウェスタンブロットを例証する。ｃ、抗Ｉｉは、3Ｈチミジン取り込みにより定量化されるＭＩＦ誘導性細胞増殖を阻害する。
【図４Ｄ】図４は、ＭＩＦ誘導リン酸化のウェスタンブロットを例証する。ｄ、また抗Ｉｉは、ヒト繊維芽細胞のＭＩＦ誘導性増殖を阻害する。抗体は、終濃度５０μg／mlで加えられる。示された結果は３回の分析の平均±標準偏差で、少なくとも３回の別個の実験の代表である。抗Ｉｉ抗体は、添加ＭＩＦの不在下では細胞増殖に効果を示さなかった（データは示していない）。
【図５】図５は、全ヌクレオチド配列（配列番号１）及びStrubin, Mらで報告されるようにヒトＩｉポリペプチド（ＨＬＡ−ＤＲ抗原関連不変鎖ｐ３３  ［ジーンバンクアクセッションＮｒ．Ｘ００４９７  Ｍ１４７６５］）ｍＲＮＡの最長の翻訳アミノ酸配列（８  ｎｔで始まる；配列番号２）を示す。ＨＬＡ−ＤＲ抗原関連不変鎖のｍＲＮＡ全配列は、珍しい膜貫通極性を有するポリペプチドを示す。EMBO J., 3, 869-872(1984)。
【図１Ａ】
2004532839.tif 000007
【図１Ｂ】
2004532839.tif 000008
【図１Ｃ】
2004532839.tif 000009
【図１Ｄ】
2004532839.tif 000010
【図１Ｅ】
2004532839.tif 000011
【図２Ａ】
2004532839.tif 000012
【図２Ｃ】
2004532839.tif 000013
【図２Ｄ】
2004532839.tif 000014
【図３Ａ】
2004532839.tif 000015
【図３Ｂ】
2004532839.tif 000016
【図４Ａ】
2004532839.tif 000017
【図４Ｂ】
2004532839.tif 000018
【図４Ｃ】
2004532839.tif 000019
【図４Ｄ】
2004532839.tif 000020
【図５】
2004532839.tif 000021
【国際公開パンフレット】
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2004532839.tif 000023
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【国際調査報告】
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