(57)【要約】本発明は、分割エンベロープウイルス調製物（ウイルスはＲＳＶまたはＰＩＶである）を含むワクチン製剤、そのようなワクチン製剤の製造方法、ならびに疾病の予防または治療における前記ワクチン製剤の使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
分割エンベロープウイルス調製物を含むワクチン製剤であって、該ウイルスがＲＳＶまたはＰＩＶである、上記製剤。
【請求項２】
分割エンベロープウイルス調製物が、ウイルス膜断片、ウイルス膜エンベロープタンパク質、ウイルス基質、および核タンパク質を含む、請求項１に記載のワクチン製剤。
【請求項３】
上記のワクチン用調製物が、インフルエンザウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、パラインフルエンザウイルス、メタニューモウイルス（ｍｅｔａｐｎｅｕｍｏｖｉｒｕｓ）、麻疹ウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、エプスタイン−バーウイルス、ヘルペスウイルス、サイトメガロウイルス、デング熱ウイルス、黄熱病ウイルス、ダニ媒介脳炎ウイルス、日本脳炎ウイルス、風疹ウイルス、東部、西部およびベネズエラウマ脳脊髄炎ウイルス、およびヒト免疫不全ウイルスからなる群より選択される別の分割ウイルスをさらに含む、請求項１または２に記載のワクチン製剤。
【請求項４】
１種以上の残留する分割剤をさらに含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載のワクチン製剤。
【請求項５】
残留する分割剤が、ラウレス（ｌａｕｒｅｔｈ）９、ＮａＤＯＣ、サルコシル（Ｓａｒｃｏｓｙｌ）類、Ｔｗｅｅｎ ８０ＴＭ、およびＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００ＴＭからなる群より選択される、請求項４に記載のワクチン製剤。
【請求項６】
残留する分割剤がＮａＤＯＣまたはサルコシルである、請求項５に記載のワクチン製剤。
【請求項７】
安定化剤をさらに含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載のワクチン製剤。
【請求項８】
安定化剤が界面活性剤である、請求項７に記載のワクチン製剤。
【請求項９】
界面活性剤が、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート（ＴＷＥＥＮ８０ＴＭ）、ｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール（ＴＲＩＴＯＮ Ｘ１００ＴＭ）、もしくはポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテルの単独またはそれらの混合物である、請求項８に記載のワクチン製剤。
【請求項１０】
ワクチンが鼻腔内送達されるように製剤化されている、請求項１〜９のいずれか１項に記載のワクチン製剤。
【請求項１１】
ワクチンが筋肉内または皮下送達されるように製剤化されている、請求項１〜９のいずれか１項に記載のワクチン製剤。
【請求項１２】
ワクチンが、経皮（ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ）、皮内、上皮内または皮膚を通した（ｔｒａｎｓｃｕｔａｎｅｏｕｓ）経路によって送達されるように製剤化されている、請求項１〜８のいずれか１項に記載のワクチン製剤。
【請求項１３】
ワクチンが皮内送達用に製剤化されている、請求項１２に記載のワクチン製剤。
【請求項１４】
アジュバントをさらに含む、請求項１〜１３のいずれか１項に記載のワクチン製剤。
【請求項１５】
アジュバントがポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテルである、請求項１４に記載のワクチン製剤。
【請求項１６】
アジュバントがＴＨ１細胞応答の選択的刺激剤である、請求項１４に記載のワクチン製剤。
【請求項１７】
ＴＨ１細胞応答の選択的刺激剤が、３Ｄ−ＭＰＬ、ＱＳ２１、ＱＳ２１とコレステロールの混合物、ＣｐＧオリゴヌクレオチド、およびそれらの組合せを含むアジュバントの群から選択される、請求項１６に記載のワクチン製剤。
【請求項１８】
アジュバントが、コレステロール、サポニンおよびＬＰＳ誘導体を含む小胞性アジュバント製剤である、請求項１７に記載のワクチン製剤。
【請求項１９】
キャリアーをさらに含む、請求項１〜１８のいずれか１項に記載のワクチン製剤。
【請求項２０】
請求項１〜１９のいずれか１項に記載のワクチン製剤の製造方法であって、下記工程（ａ）〜（ｃ）：
（ａ）　ＰＩＶまたはＲＳＶエンベロープウイルスを分割すること、
（ｂ）　場合により、分割したエンベロープウイルス調製物を安定化剤と混合すること、
（ｃ）　場合により、分割したエンベロープウイルス調製物をアジュバントと混合すること、
を含む、上記方法。
【請求項２１】
分割ウイルス調製物が安定化剤と混合されており、該安定化剤がポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート（ＴＷＥＥＮ ８０ＴＭ）、ｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール（ＴＲＩＴＯＮ Ｘ１００ＴＭ）、およびポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテルからなる群より選択される少なくとも１種の界面活性剤を含んでなる、請求項２０に記載のワクチン製剤の製造方法。
【請求項２２】
ワクチン製造における分割ＲＳＶまたは分割ＰＩＶワクチン調製物の使用。
【請求項２３】
疾病の予防または治療用のワクチン製剤の製造における、分割ＲＳＶまたは分割ＰＩＶワクチン調製物の使用。
【請求項２４】
（ａ）　分割ＲＳＶまたは分割ＰＩＶエンベロープウイルス調製物、および（ｂ）　鼻腔内送達装置を含んでなる、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の鼻腔内ワクチン製剤の送達用キット。
【請求項２５】
請求項１〜１９のいずれか１項に記載の分割ワクチン製剤を含んでなる鼻腔内送達装置。
【請求項２６】
ＰＩＶまたはＲＳＶが原因で起こる疾病にかかりやすい、または該疾病にかかっている哺乳動物を保護または治療する方法であって、有効量の請求項１〜１９のいずれか１項に記載のワクチンを投与することを含んでなる、上記方法。
【請求項２７】
ワクチンが皮内または鼻腔内経路により投与される、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
鼻腔内または皮内送達用ワクチン製剤の製造における、分割ＲＳＶまたは分割ＰＩＶワクチン調製物の使用。
【請求項２９】
ワクチン製剤が免疫原性を有する、請求項１〜２８のいずれか１項に記載の製剤、方法、使用、キットまたは装置。
【請求項３０】
ワクチン製剤がセロポジティブおよびセロネガティブ両個体において免疫原性を有する、請求項３０に記載の製剤、方法、使用、キットまたは装置。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、新規なワクチン製剤、該ワクチンの製造方法、ならびに疾患の予防または治療における該ワクチンの使用に関する。特に、本発明は、分割（ｓｐｌｉｔ）エンベロープウイルス調製物を含むワクチンに関する。
【０００２】
エンベロープウイルスとは、ウイルスのコアが脂質に富んだ外膜で覆われているウイルスのことであり、その外膜にはウイルスタンパク質が含まれている。
【０００３】
特定の実施形態において、本発明のワクチン製剤の分割エンベロープウイルスは、呼吸器合胞体ウイルス（ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｃｉｔｉａｌ ｖｉｒｕｓ： ＲＳＶ）またはパラインフルエンザウイルス（ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓ： ＰＩＶ）に由来するものである。ＲＳＶを例にとって具体的に説明する。
【０００４】
ヒト呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）はパラミクソウイルス科のメンバーで、特に乳幼児において、下部気道疾患を引き起こす。最近の報告によれば、ＲＳＶは成人、特に初老の人々にとっても重大な病原体となることが示唆される。
【０００５】
ＲＳＶは、１１のメッセンジャーＲＮＡ（それぞれが単一のポリペプチドをコードしている）をコードする１５，２２２ヌクレオチドの非分節（−）鎖リボ核酸（ＲＮＡ）ゲノムをもつエンベロープウイルスである。１１のタンパク質のうち３つは膜貫通表面タンパク質、すなわち、Ｇタンパク質（付着）、Ｆタンパク質（融合）およびＳＨタンパク質である。１つのタンパク質はビリオン基質タンパク質（Ｍ）であり、３つのタンパク質はヌクレオキャプシドの成分（Ｎ、ＰおよびＬ）であり、そして２つのタンパク質は非構造タンパク質（ＮＳ１およびＮＳ２）である。さらに２つのタンパク質Ｍ２−１およびＭ２−２が存在する。ＲＳＶには抗原的に区別される２つのサブグループがあり、サブグループＡおよびＢと呼ばれている。これらサブグループのウイルス株の特性を調べたところ、大きな差異はＧタンパク質にあって、Ｆタンパク質は保存されていることがわかった。
【０００６】
呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）はある季節に限って突然発生し、温帯では冬に、熱帯では雨期にピークとなる。
【０００７】
小児では、重症の下部気道疾患の主な原因がＲＳＶである。細気管支炎で入院している子供の４０〜５０％、肺炎で入院している子供の２５％は、ＲＳＶ感染が直接の原因で入院していると推定される。通常、一次ＲＳＶ感染には１才未満の乳児がかかり、２才までに９５％の子供が過去に感染したという血清学的証拠を有し、成人になると１００％の集団がそうである。
【０００８】
乳幼児においては、感染が約４０％の症例で上部気道から下部気道へと進行しており、その臨床的徴候は細気管支炎または肺炎のそれである。２ヶ月から６ヶ月までの乳児は重症のＲＳＶ感染症（主として、呼吸不全）を発症する危険が最も高い。しかし、心臓や肺の病気をかかえている子供（年齢を問わない）、早産児、および免疫無防備状態の幼児も同様に重大な合併症を起こす危険がある。
【０００９】
症状を呈する再感染が生涯を通じて起こり、ＲＳＶは成人（特に初老の人）でも重要な病原体となることが次第に明らかになってきた。
【００１０】
ＲＳＶ感染はほとんど必ずといっていいほど成人では過小診断されており、このことは、一部には、ＲＳＶ感染が子供の病気であると考えられていることによる。その結果、成人では、呼吸器疾患の原因を究明する目的でこのウイルスの証拠が捜し求められることはない。さらに、大多数の成人がそうであるように、このウイルスに対してある程度の部分免疫をもつ個人から採取された鼻腔分泌物中にＲＳＶを見つけ出すことは困難である。若者から中年までの成人は一般的に、ＲＳＶに感染すると、長引く風邪に似た症状を呈する。中年を過ぎた人々は、インフルエンザと事実上区別がつかない長期の呼吸器症候群を発症する可能性があり、これは肺炎をはじめとする下部気道症状を伴うことのある上部気道症状を呈する。施設に入所している初老の人々にとっては特に重大である。なんとなれば、彼らは感染しやすい多くの個体が一団となって生活しているからである。そのような集団（その多くは複数の医学的問題を抱えており、こうしたことがこの病気の経過をより重症にする可能性がある）の中で感染の広がりをくい止めるのは容易ではない。
【００１１】
さらに、成人および集団で生活している健康な初老の人々が入院する原因としてＲＳＶ感染の影響を調べている最近の研究によれば、こうした集団での重症の下部気道疾患におけるＲＳＶ感染の重大な役割が指摘されている。ＲＳＶは、成人を結果的に入院させることとなる重症の下部気道疾患を引き起こす、最も一般的な４種の病原体のうちの１つとなっている。また、初老の人々における重症のＲＳＶ感染は養護施設や突発的状況に限らないことも実証されている。それどころか、ＲＳＶ感染は集団で居住している初老の人々においては重症疾患の予測可能な原因となる。インフルエンザＡによる入院と同様に、ＲＳＶ感染に関係した入院は、長期の病院滞在によって証明されるように、かなりの死亡率、高い集中治療室での入院率、および高い人工呼吸器装着率と関係している。
【００１２】
これらの研究は、乳幼児、成人、および集団で居住している健康な初老の人や施設に入所している初老の人において、ＲＳＶ感染の重大な合併症を予防することができる有効なワクチンが医療上および経済上必要であることを示している。同様の考えはＰＩＶについてもあてはまる。
【００１３】
本発明は、分割エンベロープウイルス調製物を含むワクチン製剤であって、該ウイルスが呼吸器合胞体ウイルスまたはパラインフルエンザウイルスである、上記製剤を提供する。
【００１４】
好ましくは、このワクチン製剤は製薬上許容される賦形剤をさらに含有する。
【００１５】
本発明のワクチン製剤は、分割され得るエンベロープウイルスに由来するものである。このエンベロープウイルスは、ヒトまたは動物由来のウイルスを含めて、さまざまな起源に由来するものであってよい。好ましくは、ウイルスは、ＲＳＶＡ、ＲＳＶＢ、ＰＩＶ １、ＰＩＶ ２またはＰＩＶ ３である。ウイルスが動物由来である場合、起源はウシに由来するのが好ましい。ウイルスが例えばウシ由来のように動物に由来するものである場合は、そのウイルスを組換えウイルスとすることが好ましい。
【００１６】
本発明のワクチン製剤は、インフルエンザウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、パラインフルエンザウイルス、メタニューモウイルス（ｍｅｔａｐｎｅｕｍｏｖｉｒｕｓ）、麻疹ウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、エプスタイン−バーウイルス、ヘルペスウイルス、サイトメガロウイルス、デング熱ウイルス、黄熱病ウイルス、ダニ媒介脳炎ウイルス、日本脳炎ウイルス、風疹ウイルス、東部、西部およびベネズエラウマ脳脊髄炎ウイルス、およびヒト免疫不全ウイルスからなる群より選択される別の分割ウイルスを含んでいてもよい。
【００１７】
本発明のワクチン製剤は、疾病に対する更なる保護を与えるため、病原体由来の１種以上の抗原を分割調製物と組み合わせて含むことができる。適当な抗原は、分割調製物に由来する必要はなく、例えば、上に挙げたウイルスおよび肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）のような呼吸器疾患を引き起こす病原体に由来する抗原が含まれる。
【００１８】
本発明のワクチン製剤は、好ましくは、送達後に該エンベロープウイルスに対する防御免疫応答を刺激することができるものである。
【００１９】
ウイルスを分割するには、感染性（野生型もしくは弱毒化された）または非感染性（例えば、不活化された）全ウイルス粒子を、一般的には（必ずしもそうではないが）界面活性剤からなる分割剤（ｓｐｌｉｔｔｉｎｇ ａｇｅｎｔ）を破砕濃度で用いて破砕または断片化することにより行う。分割されるウイルスは、２種以上の異なるウイルス由来の免疫原性エレメントをもつキメラな組換えウイルスであってもよい。こうした破砕により、ウイルスの完全性（ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ）を変えるような、あらゆるウイルスタンパク質の完全なまたは部分的な可溶化が起こる。
【００２０】
好ましくは、分割ウイルスは、本発明に従ってＰＩＶまたはＲＳＶに分割剤を接触させてウイルスのエンベロープを完全に破砕することにより得られる。他のウイルスタンパク質も完全にまたは部分的に可溶化されることが好ましい。分割した後ではウイルスの完全性が失われて、そのウイルスは非感染性になるが、このことは適当なｉｎ ｖｉｔｒｏタイトレーションアッセイで評価することができる。いったん破砕されると、一般的に、ウイルスのエンベロープタンパク質はインタクトな全ウイルス粒子とはもはや会合しない。好ましくは、他のウイルスタンパク質も完全にまたは部分的に可溶化され、したがって、分割した後ではインタクトな全ウイルス粒子とは会合しないか、部分的にしか会合しない。
【００２１】
分割剤がウイルスエンベロープおよびウイルスタンパク質に及ぼす効果は、本明細書に記載するような、分割したウイルスおよびウイルスタンパク質のショ糖クッション実験での移動と、ウェスタンブロット分析および電子顕微鏡検査による可視化によって追跡することができる。
【００２２】
本発明による分割（スプリット）ワクチンの調製には、分割剤とウイルス脂質分の一部または大部分を除去する追加のステップが含まれていてもよい。さらに、分割エンベロープウイルスの調製方法は、いくつかの異なる濾過および／またはその他の分離ステップ、例えば、超遠心分離、限外濾過、ゾーン遠心分離、およびクロマトグラフィーの各ステップを様々に組み合わせて含んでいてもよく、場合により、分割の前または後に不活化ステップを、例えばホルムアルデヒドまたはβ−プロピオラクトンまたはＵＶ処理を用いて、行ってもよい。分割方法はバッチ法、連続法または半連続法として実施することができる。
【００２３】
本発明による分割（スプリット）ワクチンは、一般的には、膜断片および膜エンベロープタンパク質、ならびにウイルス基質タンパク質や核タンパク質のような非膜タンパク質を、重大な意味をもつ全ウイルス粒子を存在させないで、含有する。本発明の分割ワクチンは通常、ウイルス構造タンパク質の大半または全部を含んでいるが、それらは必ずしも全ウイルス粒子中に存在するときと同じ割合ではない。好適な分割ウイルス調製物はウイルス構造タンパク質の全体の少なくとも半分、好ましくは全部を含んでいる。一方、サブユニットワクチンは本質的に１種または２，３種の高度に精製されたウイルスタンパク質からなるものである。例えば、サブユニットワクチンは、ワクチン接種後に所望のウイルス中和抗体の誘導に関与することがわかっている精製されたウイルス表面タンパク質を含有する。
【００２４】
本発明においては、非イオン性およびイオン性の界面活性剤だけでなく、その他の各種試薬も分割剤として使用することができる。本発明のもとで有用な分割剤の例としては、次のものを挙げることができる：
１．胆汁酸およびその誘導体。胆汁酸には、コール酸、デオキシコール酸、ケノデオキシコール酸、リトコール酸、ウルソデオキシコール酸、ヒオデオキシコール酸、および前記胆汁酸のグリコ−、タウロ−、アミドプロピル−１−プロパンスルホン酸−、アミドプロピル−２−ヒドロキシ−１−プロパンスルホン酸誘導体、またはＮ，Ｎ−ビス（３Ｄグルコノアミドプロピル）デオキシコールアミドのような誘導体が含まれる。具体的な例はデオキシコール酸ナトリウム（ＮａＤＯＣ）である；
【００２５】
２．非イオン性界面活性剤、例えば、オクトキシノール類（ＴｒｉｔｏｎＴＭ系列）、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート（Ｔｗｅｅｎ ８０ＴＭ）などのポリオキシエチレンエーテル類、および一般式（Ｉ）：
（Ｉ）　ＨＯ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ａ−Ｒ
［式中、ｎは１〜５０であり、Ａは結合または−Ｃ（Ｏ）−であり、ＲはＣ１−５０アルキルまたはフェニルＣ１−５０アルキルである］
で表されるポリオキシエチレンエーテルもしくはエステル類、ならびにこれらの２種以上の組合せ。具体的な例はＴｗｅｅｎ ８０ＴＭ、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００ＴＭ、およびラウレス９である；
【００２６】
３．アルキルグリコシドまたはアルキルチオグリコシド、ここで、アルキル鎖はＣ６〜Ｃ１８、典型的にはＣ８〜Ｃ１４であり、糖部分は任意のペントースもしくはヘキソース、または異なる結合（例えば、１→６、１→５、１→４、１→３、１−２）を有するそれらの組合せである。アルキル鎖は飽和でも不飽和でもよく、かつ／また分岐していてもよい；
【００２７】
４．上記３の誘導体、ここで、１個以上のヒドロキシル基、好ましくは６ヒドロキシル基が修飾されており、例えば、エステル、エトキシレート、スルフェート、エーテル、カーボネート、スルホスクシネート、イセチオネート、エーテルカルボキシレート、第４級アンモニウム化合物などに修飾される；
【００２８】
５．アシル糖、ここで、アルキル鎖はＣ６〜Ｃ１８、典型的にはＣ８〜Ｃ１２であり、糖部分は任意のペントースもしくはヘキソース、または異なる結合（例えば、１→６、１→５、１→４、１→３、１−２）を有するそれらの組合せである。アシル鎖は飽和でも不飽和でもよく、かつ／また分岐していてもよい；
【００２９】
６．構造Ｒ−Ｎ，Ｎ−（Ｒ１，Ｒ２）−３−アミノ−１−プロパンスルホネートのスルホベタイン類、ここで、ＲはＣ６〜Ｃ１８、典型的にはＣ８〜Ｃ１６のアルキル鎖またはアリールアルキル鎖である。アルキル鎖Ｒは飽和でも不飽和でもよく、かつ／また分岐していてもよい。Ｒ１およびＲ２はＣ１〜Ｃ４、典型的にはＣ１のアルキル鎖である；
【００３０】
７．構造Ｒ−Ｎ，Ｎ−（Ｒ１，Ｒ２）−グリシンのベタイン類、ここで、ＲはＣ６〜Ｃ１８、典型的にはＣ８〜Ｃ１６のアルキル鎖である。アルキル鎖は飽和でも不飽和でもよく、かつ／また分岐していてもよい。Ｒ１およびＲ２はＣ１〜Ｃ４、典型的にはＣ１のアルキル鎖である；
【００３１】
８．構造Ｒ−（−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−）ｎ−ＯＨのポリオキシエチレンアルキルエーテル、ここで、ＲはＣ６〜Ｃ２０、典型的にはＣ８〜Ｃ１４のアルキル鎖である。アルキル鎖は飽和でも不飽和でもよく、かつ／また分岐していてもよい。ｎは５〜３０、典型的には８〜２５である；
【００３２】
９．構造Ｒ−（Ｎ−Ｒ１）−グルカミドのＮ，Ｎ−ジアルキル−グルカミド、ここで、ＲはＣ６〜Ｃ１８、典型的にはＣ８〜Ｃ１２のアルキル鎖である。アルキル鎖は飽和でも不飽和でもよく、かつ／また分岐でも環状でもよい。Ｒ１およびＲ２はＣ１〜Ｃ６、典型的にはＣ１のアルキル鎖である。糖部分はペントースまたはヘキソースで修飾されていてもよい；
【００３３】
１０．Ｈｅｃａｍｅｇ：（６−Ｏ−（Ｎ−ヘプチル−カルバモイル）−メチル−α−Ｄ−グルコピラノシド）；
【００３４】
１１．構造Ｒ−Ｃ６Ｈ４−Ｏ−（−ＣＨ２−ＣＨ２−）ｎ−ＯＨのアルキルフェノキシポリエトキシエタノール、ここで、ＲはＣ６〜Ｃ１８、典型的にはＣ８のアルキル鎖である。アルキル鎖は飽和でも不飽和でもよく、かつ／また分岐していてもよい（ｎ＞＝３）；
【００３５】
１２．構造Ｒ，−Ｎ＋（−Ｒ１，−Ｒ２，−Ｒ３）の第４級アンモニウム化合物、ここで、ＲはＣ６〜Ｃ２０、典型的にはＣ２０のアルキル鎖である。アルキル鎖は飽和でも不飽和でもよく、かつ／また分岐していてもよい。Ｒ１、Ｒ２およびＲ３はＣ１〜Ｃ４、典型的にはＣ１のアルキル鎖である；
【００３６】
１３．サルコシル（Ｓａｒｃｏｓｙｌ）：Ｎ−ラウリルサルコシンＮａ塩；
【００３７】
１４．ＣＴＡＢ（臭化セチルトリメチルアンモニウム）またはセタブロン（Ｃｅｔａｖｌｏｎ）。
【００３８】
最も好ましいものはＮａＤＯＣとサルコシルである。分割を行うために、適切には、分割剤を室温で、例えば一夜、分割すべきウイルスとインキュベートする。適宜、分割剤を組み合わせて用いてもよい。
【００３９】
分割ワクチン調製物は、好ましくは、少なくとも１種の界面活性剤（特に、非イオン性界面活性剤でありうる）を含有する。その１種以上の界面活性剤は分割方法からの残留物であってよく、かつ／または分割した後でウイルスに添加してもよい。分割された抗原物質は非イオン性界面活性剤の存在下で安定化されると考えられるが、本発明が必ずそのケースに当てはまるとは限らないことが理解されよう。安定化剤として適する非イオン性界面活性剤には、オクトキシノール類（ＴｒｉｔｏｎＴＭ系列）、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート（Ｔｗｅｅｎ ８０ＴＭ）などのポリオキシエチレンエーテル類、および一般式（Ｉ）：
（Ｉ）　ＨＯ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ａ−Ｒ
［式中、ｎは１〜５０であり、Ａは結合または−Ｃ（Ｏ）−であり、ＲはＣ１−５０アルキルまたはフェニルＣ１−５０アルキルである］で表されるポリオキシエチレンエーテルもしくはエステル、およびこれらの２種以上の組合せが含まれる。
【００４０】
Ｔｒｉｔｏｎ系列の好ましい非イオン性界面活性剤としては、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００ （ｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール）、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１６５、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−２０５、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−３０５、またはＴｒｉｔｏｎ Ｘ−４０５ Ｔｒｉｔｏｎ Ｎ−１０１が挙げられる。特に好ましいものはＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００である。
【００４１】
好適な非イオン性界面活性剤には、さらに、上記の一般式（Ｉ）のポリオキシエチレンエーテル、特にポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル、ポリオキシエチレン−９−ステアリルエーテル、ポリオキシエチレン−８−ステアリルエーテル、ポリオキシエチレン−４−ラウリルエーテル、ポリオキシエチレン−３５−ラウリルエーテル、およびポリオキシエチレン−２３−ラウリルエーテルが含まれるが、これらに限定されない。最も好ましいポリオキシエチレンエーテルはポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル（ラウレス ９）である。ポリオキシエチレンラウリルエーテルの別名がＣＡＳ登録に載っている。ポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテルのＣＡＳ登録番号は９００２−９２−０である。ポリオキシエチレンラウリルエーテルなどのポリオキシエチレンエーテルはＭｅｒｃｋ ｉｎｄｅｘ（１２版：エントリー７７１７、Ｍｅｒｃｋ ＆ Ｃｏ． Ｉｎｃ．， Ｗｈｉｔｅｈｏｕｓｅ Ｓｔａｔｉｏｎ， Ｎ．Ｊ．， ＵＳＡ； ＩＳＢＮ ０９１１９１０−１２−３）に記載されている。ラウレス ９はエチレンオキシドをドデシルアルコールと反応させることにより形成され、平均９個のエチレンオキシド単位をもっている。
【００４２】
好ましくは最終ワクチン製剤に含まれる安定化用界面活性剤の最終濃度は０．００１〜２０％の範囲、より好ましくは０．０１〜１０％、最も好ましくは約２％（ｗ／ｖ）までである。１種以上の界面活性剤が存在する場合、これらは一般的に最終製剤中にそれぞれが約２％までの濃度で存在し、通常はそれぞれが約１％までの濃度、好ましくはそれぞれが約０．６％までの濃度、より好ましくはそれぞれが約０．２％または０．１％までの微量で存在する。本発明のワクチン製剤には界面活性剤の任意の混合物を存在させることができる。
【００４３】
エンベロープウイルスは、血清または無血清法により適当な細胞基体上で複製させることにより生産することができる。組織培養で増えるウイルスは、例えば、ＭＲＣ−５、ＷＩ−３８、ＨＥｐ−２などのヒト細胞、ＡＧＭＫ、Ｖｅｒｏ、ＬＬｃ−Ｍｋ２、ＬＬｃ−Ｍｋ２、ＦＲｈＬ、ＦＲｈＬ−２などのサル細胞、ＭＤＢＫなどのウシ細胞、ＭＤＣＫなどのイヌ細胞、ニワトリ胚性繊維芽細胞などの一次細胞、またはワクチン用ウイルスの生産に適する他の細胞タイプ（上記の細胞系に由来するクローンを含む）で生産することができる。
【００４４】
分割ワクチン調製物は、製薬上許容される賦形剤と組み合わせることが好ましい。使用する製薬上許容される賦形剤は、ワクチン製造の分野で慣用のものであってよい。所与のワクチン製剤で用いる賦形剤は、互いに適合性で、しかも組成物の必須成分とも適合するものである。そして、諸成分の性能、もし存在するのであれば活性物質の性能、を損なうような相互作用がまったく起こらないようにする。当然、賦形剤はすべて無毒性で、ヒトに使用するのに十分な純度のものでなければならない。適当な賦形剤の例は当技術分野で周知である。
【００４５】
ワクチン製剤はまた、キャリアーおよび／または免疫刺激剤でありうるアジュバントを含むことが好ましい。アジュバントは分割方法からの残存物であっても、かつ／または分割した後でウイルスに添加してもよい。本発明のワクチンで使用するのに適したアジュバントは当技術分野で周知である。
【００４６】
かくして、本発明のさらなる態様は、アジュバントと組み合わせた、分割呼吸器合胞体ウイルスまたは分割パラインフルエンザウイルスのワクチン調製物を含むワクチン製剤、を提供する。好ましくは、この製剤は製薬上許容される賦形剤をも含有する。
【００４７】
使用に適したアジュバントの形態は、通常、ワクチンの投与手段に依存する。本発明のワクチン調製物は、該ワクチンを以下の経路で投与することによって、疾病にかかりやすい、または該疾病にかかっている哺乳動物を保護または治療するために使用することができる：
（ａ） 粘膜経路（例えば、経口、バッカル、小腸、膣、直腸または鼻腔内経路）
（ｂ） 非経口送達（例えば、筋肉内もしくは皮下投与）、または
（ｃ） 経皮（ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ）、皮内、上皮内もしくは皮膚を通しての（ｔｒａｎｓｃｕｔａｎｅｏｕｓ）送達。
本発明はそのような治療および保護方法にも及ぶものである。
【００４８】
本発明のワクチン調製物は、場合により、上記した経路の組合せにより投与することもできる。
【００４９】
粘膜経路による送達
痛みを伴う注射の必要性や、それに関連した「針への恐怖」ゆえの患者の応諾に与えるマイナスの影響を回避できることを別にしても、鼻腔内法などによる粘膜へのワクチン接種には興味がもてる。その理由は、動物では、抗原の粘膜投与が多くの病原体の侵入経路である粘膜表面において防御応答を効率よく引き出せるとわかったからである。さらに、鼻腔内ワクチン接種のような粘膜ワクチン接種は、鼻粘膜だけでなく生殖器粘膜などの離れた粘膜部位でも粘膜免疫を引き出しうることが提起されている。
【００５０】
本発明に従う鼻腔内投与は、液滴、スプレーまたは乾燥粉末形態で行うことができる。ネブライザー投与またはエーロゾル投与が可能なワクチン製剤も本発明の一部を構成する。腸溶性製剤（例えば、経口投与のための胃液抵抗性（ｇａｓｔｒｏ ｒｅｓｉｓｔａｎｔ）カプセル剤・顆粒剤、経直腸もしくは経膣投与のための坐剤、およびバッカルもしくは経口投与のためのブリスター剤も本発明の一部を構成する。
【００５１】
本発明のワクチンの投与の好ましい粘膜経路は、鼻腔内経路によるものである。
【００５２】
鼻腔内送達のための適当なアジュバントはどれも、適切な形態（溶液、非小胞性の溶液、懸濁液、粉末など）で使用することができる。好ましいアジュバントとしては国際公開ＷＯ ９９／５２５４９に例示されているものがあり、この文献の全内容を参照により本明細書に含めるものとする。好適なアジュバントには、Ｔｗｅｅｎ ８０ＴＭ、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００ＴＭ、ラウレス ９等の非イオン性界面活性剤、およびこれらの組合せが含まれるが、これらに限らない。
【００５３】
非イオン性界面活性剤はリピドＡの無毒性誘導体のような免疫刺激剤と組み合わせることが有利であり、かかるリピドＡ誘導体としては、モノホスホリルおよびジホスホリルリピドＡの無毒性誘導体、例えば、３−脱−Ｏ−アシル化モノホスホリルリピドＡ（３Ｄ−ＭＰＬ）および３−脱−Ｏ−アシル化ジホスホリルリピドＡを含めて、米国特許第４，９１２，０９４号および英国特許第２，２２０，２１１号に記載されるものが含まれる。好ましい組合せは３Ｄ−ＭＰＬと組み合わせたラウレス−９である。上記の免疫刺激剤は非イオン性界面活性剤を含まない製剤にも適宜使用することができる。
【００５４】
本発明のさらなる実施形態において、アジュバントはＡＤＰ−リボシル化トキシンまたはその突然変異体である。かかるトキシンの例として、大腸菌由来のＨｅａｔ Ｌａｂｉｌｅ Ｔｏｘｉｎ （ＬＴ）、その突然変異体（例えばＬＴＲ１９２Ｇ）、およびこれらのトキシンの断片（例えばガングリオシド結合性成分（ＬＴＢ））がある。
【００５５】
本発明のワクチンを鼻腔内に投与するのに適した装置はスプレー装置である。好適な鼻スプレー装置はＢｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｐｆｅｉｆｆｅｒ ＧｍＢＨおよびＶａｌｏｉｓから販売されている。
【００５６】
鼻腔内使用に適したスプレー装置は、その性能が使用者によって加えられる圧力に左右されないものである。圧閾値（ｐｒｅｓｓｕｒｅ ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ）装置が特に有用である。なぜなら、閾値圧に達したときだけノズルから液体が放出されるからである。こうした装置によって、液滴の大きさが一定している噴霧を容易に達成することができる。本発明とともに使用するのに適した圧閾値装置は当技術分野で公知であり、例えば、ＷＯ ９１／１３２８１およびヨーロッパ特許第３１１ ８６３ Ｂ号に記載されている。現在、かかる装置はＰｆｅｉｆｆｅｒ ＧｍＢＨから市販されており、また、Ｂｏｍｍｅｒ， Ｒ． Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｎａｓａｌ ｄｒｕｇ ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｅｕｒｏｐｅ， Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ １９９９， ｐ２６−３３にも記載されている。
【００５７】
好ましい鼻腔内装置は１〜５００μｍの範囲の液滴（液体として水を用いて測定）をもたらすものである。１０μｍより小さいと吸い込む危険があるため、１０μｍ未満の液滴を約５％以下にすることが望ましい。
【００５８】
本発明のワクチンとともに使用するのにさらに好ましい鼻腔内送達系の特徴は２用量（ｂｉ−ｄｏｓｅ）送達である。２用量装置は、それぞれの鼻孔に投与するために、１回のワクチン量を２つの小用量に分けて含有するものである。
【００５９】
本発明は、さらなる態様において、本発明に係るワクチン製剤を含む、本明細書に記載する鼻腔内投与装置を含んでなるか、または、鼻腔内投与装置および該装置とともに使用する別のワクチン製剤を含んでなる医薬キットを提供する。本発明はまた、本発明の分割ワクチン製剤を含む鼻腔内送達装置を提供する。
【００６０】
本発明のこの態様は、必ずしも液体製剤のスプレー送達に限らない。本発明のワクチンは他の形態で投与することもでき、例えば粉末として投与してもよい。
【００６１】
本発明のワクチンは、経口経路により投与することもできる。そのような場合において、製薬上許容される賦形剤は、アルカリ緩衝液、腸溶性カプセル、マイクロ顆粒（ｍｉｃｒｏｇｒａｎｕｌｅ）を含むこともでき、かつ／またはブリスターの形態をとることもできる。
【００６２】
本発明のワクチンは、経膣経路により投与することもできる。そのような場合において、製薬上許容される賦形剤は、乳化剤、ポリマー（例えばＣＡＲＢＯＰＯＬ（登録商標））、および膣クリームや膣坐剤における他の公知の安定化剤を含むこともできる。本発明のワクチンは、直腸経路により投与することもできる。そのような場合において、製薬上許容される賦形剤は、直腸坐剤を製造するための技術分野において公知であるロウおよびポリマーを含むこともできる。
【００６３】
非経口経路
さらに、本発明のワクチンは、非経口的に送達しうる（例えば、筋肉内投与または皮下投与）。この状況においては、ＴＨ−１応答の選択的刺激剤であるアジュバントが好ましい。
【００６４】
免疫応答は、大きく２つのカテゴリーに、すなわち、液性（抗体）免疫応答または細胞性免疫応答（ＣＴＬ、ヘルパーＴ細胞、ＮＫ細胞）に分類することができる。マウスとヒトの両方において、機能的に識別しうるヘルパーＴ（Ｔｈ）細胞サブセット、すなわちＴｈ１およびＴＨ２細胞として知られるものが、それらが産生するサイトカインのパターンによって特徴付けられている。液性免液応答および細胞性免疫応答は、歴史的に、ＴＨ−２型応答およびＴｈ−１型応答にそれぞれ関連付けられてきた。これら２種類の対立するタイプをとる特異的な細胞の免疫応答は、様々な病原体に対する保護に関与する異なるエフェクター機構を説明するための有用なモデルを提供する。Ｔｈ１が優勢な応答は、感染因子（細胞内病原体を含む）の根絶に有効である。Ｔｈ２応答は、細胞外型の病原体に対しての保護に貢献する。
【００６５】
Ｔｈ１型とＴｈ２型の免疫応答の区別は絶対的なものではない。現実には、個体は、Ｔｈ１が優勢であるまたはＴｈ２が優勢であるというように説明される免疫応答を示しうる。ヘルパーＴ細胞がＴｈ１／Ｔｈ２の二分の原因となる機構は、初めマウスにおいて記載され、これは、Ｍｏｓｍａｎｎらが、Ｔｈ細胞を抗原によって刺激して、限定的かつ類型的なパターンのサイトカインを産生させた際に示された（Ｍｏｓｍａｎｎ， Ｔ．Ｒ． ａｎｄ Ｃｏｆｆｍａｎ， Ｒ．Ｌ． （１９８９） 「ＴＨ１細胞およびＴＨ２細胞：リンホカイン分泌の異なるパターンが異なる機能特性に結びついている（ＴＨ１ ａｎｄ ＴＨ２ ｃｅｌｌｓ： ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｐａｔｔｅｒｎｓ ｏｆ ｌｙｍｐｈｏｋｉｎｅ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ｌｅａｄ ｔｏ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ．）」 Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， ７， ｐ１４５−１７３）。マウスの系において、Ｔｈ１はＩＦＮ−γなどのサイトカインを産生し、抗体依存型の細胞傷害性および遅延型過敏性の活性化を促進する。Ｔｈ１細胞は、ＩｇＧ２ａ抗体産生の調節にも関与している。Ｔｈ２マウス細胞はＩＬ−４およびＩＬ−５などのサイトカインを産生し、液性応答の調節、より具体的にはＩｇＧ１およびＩｇＥアイソタイプの調節に関与する。
【００６６】
特定のワクチンアジュバントが、Ｔｈ１型またはＴｈ２型応答のいずれかを刺激するのに特に適切であることが知られている。従来、ワクチン接種後または感染後における免疫応答のＴｈ１：Ｔｈ２バランスを最もよく示すものとしては、Ｔリンパ細胞によるＴｈ１またはＴｈ２サイトカイン産生の測定値、および／または抗原特異的な抗体アイソタイプの測定値（例えば、マウスにおけるＩｇＧ２ａ：ＩｇＧ１比）が含まれる。
【００６７】
このように、Ｔｈ１型のアジュバントとは、ワクチン抗原特異的Ｔ細胞集団を刺激して高レベルのＴＨ１型サイトカインを産生させるものである。このアジュバントは、マウスにおいてＴｈ１型アイソタイプ（例えばＩｇＧ２ａ）に関連する抗原特異的免疫グロブリン応答も誘導する。
【００６８】
ＴＨ１細胞応答を選択的に刺激することができるアジュバントが、国際公開ＷＯ ９４／００１５３およびＷＯ ９５／１７２０９に記載されている。
【００６９】
３−脱−Ｏ−アシル化モノホスホリルリピドＡ（３Ｄ−ＭＰＬ）はそのようなアジュバントの１つである。このアジュバントは英国特許第２２２０２１１号（Ｒｉｂｉ）から公知である。化学的には、このアジュバントは４、５または６位がアシル化された鎖を有する３−脱−Ｏ−アシル化モノホスホリルリピドＡの混合物であり、Ｃｏｒｉｘａ Ｍｏｎｔａｎａにより製造されている。好ましい形態の３−脱−Ｏ−アシル化モノホスホリルリピドＡがヨーロッパ特許第０ ６８９ ４５４ Ｂ１号（ＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ Ｂｅｅｃｈａｍ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ ＳＡ）に開示されている。
【００７０】
好ましくは、３Ｄ−ＭＰＬの粒子は、０．２２ミクロンの膜を通過させてろ過滅菌することが可能な程度に十分に小さいものである（ヨーロッパ特許第０ ６８９ ４５４号中に記載）。３Ｄ−ＭＰＬは、１回用量あたり１０μｇ〜１００μｇ、好ましくは２５〜５０μｇの範囲の量で存在し、この場合、抗原は、通常、１回用量あたり２〜５０μｇの範囲で存在する。
【００７１】
その他の好ましいアジュバントは、キラヤ・サポナリア・モリーナ（Ｑｕｉｌｌａｊａ Ｓａｐｏｎａｒｉａ Ｍｏｌｉｎａ）樹皮由来のＨＰＬＣ精製画分であるＱＳ２１を含む。このアジュバントは、場合により３−脱−Ｏ−アシル化モノホスホリルリピドＡ（３Ｄ−ＭＰＬ）とともに、場合によりキャリアーとともに、混合することができる。
【００７２】
ＱＳ２１の製造方法が米国特許第５，０５７，５４０号に開示されている。
【００７３】
ＱＳ２１を含む非反応原性アジュバント製剤が従前に記載されている（国際公開ＷＯ ９６／３３７３９）。ＱＳ２１とコレステロールとを含むそのような製剤が抗原と一緒に製剤化された場合に、成功的なＴＨ１刺激性アジュバントであることが示されている。このように、本発明の一部を構成するワクチン組成物は、ＱＳ２１とコレステロールとの組合せを含んでもよい。
【００７４】
さらに、ＴＨ１細胞応答の選択的刺激剤であるアジュバントには、免疫調節性オリゴヌクレオチド（例えば、国際公開ＷＯ ９６／０２５５５に開示されているような非メチル化ＣｐＧ配列）が含まれる。
【００７５】
異なるＴＨ１刺激性アジュバントの組合せ、例えば前記したようなアジュバントの組合せもまた、ＴＨ１細胞応答の選択的刺激剤であるアジュバントを提供するものとして意図される。例えば、ＱＳ２１は３Ｄ−ＭＰＬとともに製剤化することができる。ＱＳ２１：３Ｄ−ＭＰＬの比率は、通常、１：１０〜１０：１、好ましくは１：５〜５：１、およびしばしば実質的に１：１のオーダーである。最適な相乗効果を得るための好ましい範囲は、３Ｄ−ＭＰＬ：ＱＳ２１比が２．５：１〜１：１である。
【００７６】
本発明の好ましい１実施形態において、ワクチン製剤は、コレステロール、サポニンおよびＬＰＳ誘導体を含む小胞性アジュバント製剤を含んでなる。その際、好ましいアジュバント製剤は、単膜小胞であって、コレステロールを含み、脂質２重層、好ましくはジオレオイルホスファチジルコリンを含む脂質二重層を有し、この場合、サポニンおよびＬＰＳ誘導体は該脂質二重層と結合しているか、またはその中に埋まっていることを特徴とする、前記小胞を含んでなる。より好ましくは、上記アジュバント製剤は、サポニンとしてＱＳ２１、ＬＰＳ誘導体として３Ｄ−ＭＰＬを含み、この場合、ＱＳ２１：コレステロールの比率は１：１〜１：１００（ｗ／ｗ）、最も好ましくは１：５（ｗ／ｗ）である。そのようなアジュバント製剤が、ヨーロッパ特許第０ ８２２ ８３１ Ｂ号に記載されており、その開示内容は参照により本明細書に組み入れるものとする。
【００７７】
好ましくは、本発明に係るワクチン組成物中にはキャリアーも存在する。キャリアーは、水中油型エマルジョン、脂質構造物（例えば、リポソームもしくはミセル）、またはアルミニウム塩（例えば、リン酸アルミニウムもしくは水酸化アルミニウム）であってよい。
【００７８】
好ましい水中油型エマルジョンは、代謝可能な油（例えば、スクアレン、αトコフェロールおよびＴｗｅｅｎ ８０）を含む。さらに水中油型エマルジョンは、スパン８５および／またはレシチンおよび／またはトリカプリリンを含んでもよい。
【００７９】
特に好ましい態様において、本発明に係るワクチン組成物中の抗原は、３Ｄ−ＭＰＬおよびミョウバンと組み合わせる。
【００８０】
ヒトへの投与の場合、通常、１回用量あたり、ＱＳ２１と３Ｄ−ＭＰＬはワクチン中、１μｇ〜２００μｇ、例えば１０〜１００μｇ、好ましくは１０μｇ〜５０μｇの範囲で存在する。通常、水中油は、２〜１０％のスクアレン、２〜１０％のαトコフェロール、および０．３〜３％のＴｗｅｅｎ ８０を含む。好ましくは、スクアレン：αトコフェロールの比率は、より安定したエマルジョンが得られるように、１以下である。スパン８５も１％のレベルで存在しうる。いくつかのケースにおいては、本発明のワクチンは安定化剤をさらに含むのが有利でありうる。
【００８１】
非毒性水中油エマルジョンは、好ましくは、水性キャリアー中に、非毒性油（例えば、スクアランまたはスクアレン）、乳化剤（例えばＴｗｅｅｎ ８０）を含む。水性キャリアーは、例えば、リン酸緩衝生理食塩水であってよい。
【００８２】
水中油型エマルジョンの形態でＱＳ２１、３Ｄ−ＭＰＬおよびトコフェロールを含む特に強力なアジュバント製剤が、国際公開ＷＯ ９５／１７２１０に記載されている。
【００８３】
経皮（ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ）、皮内、上皮内または皮膚を通した（ｔｒａｎｓｃｕｔａｎｅｏｕｓ）経路
本発明は、皮膚に適用した場合に（例えば、経皮、皮内、上皮内または皮膚を通した送達により）ウイルス抗原に対する免疫応答を誘導するためにも使用することができる。皮膚への適用には、限定するものではないが、パッチ剤（国際公開ＷＯ９７／４８４４０、ＷＯ９８／２８０３７、ＷＯ９９６４５８０）、クリーム剤、エレクトロポレーションによる送達、および圧縮ガス等によるバリスティック送達が含まれる。パッチ剤は、場合により、皮膚の構造完全性を傷つける装置を含みうる。
【００８４】
皮内送達は、ヒトにおいて、例えば、従来からある皮内注射技法である「マントー法」により達成することができる。この方法は、皮膚を洗浄するステップ、次いで片方の手で皮膚をひっぱり、細いゲージの注射針（２６〜３１ゲージ）の斜角面を上へ向けた注射針を１０〜１５°の間の角度で挿入するステップとを含む。いったん注射針の斜角面が挿入されたら、注射針の胴部を押し下げ、さらにわずかに圧力を加えながら皮膚下でそれを持ち上げるように前方へ進める。次に、液体を非常にゆっくりと注入することにより、皮膚表面に水膨れまたは隆起を形成させ、その後ゆっくりと針を抜いた。
【００８５】
皮内送達のために本発明のワクチンとともに任意の適切なアジュバントを使用することができる。好ましくは、アジュバントは、ＭＰＬ、ＱＳ２１およびコレステロールを含む。好ましくは、皮内アジュバントは、非経口投与に関して上記したコレステロール、サポニンおよびＬＰＳ誘導体を含む小胞性アジュバント製剤を含んでなる。経皮送達用ワクチンは、ＡＤＰ−リボシル化トキシンまたはその突然変異体をアジュバントとして添加することができる。
【００８６】
上記ワクチン接種経路のいずれにも好適である上記アジュバントはいずれも、任意の他の経路による使用にも好適であり、そのようなアジュバントの組合せは具体的かつ個々に本発明に含まれる。
【００８７】
本発明の製剤は予防と治療の両目的に使用することができる。したがって、本発明は、感染症、特にＰＩＶもしくはＲＳＶ感染、またはかかる感染に関連する疾患にかかりやすい、またはかかっている哺乳動物を治療する方法を提供する。本発明の方法は、有効量の本発明に係るワクチン製剤を哺乳動物へ投与することを含む。本発明の別の態様では、医療に使用するための本明細書に記載されるワクチンを提供する。
【００８８】
ワクチン製剤については、Ｎｅｗ Ｔｒｅｎｄｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ ｉｎ Ｖａｃｃｉｎｅｓ， Ｖｏｌｌｅｒら編， Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐａｒｋ Ｐｒｅｓｓ， Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ， Ｍａｒｙｌａｎｄ， Ｕ．Ｓ．Ａ． １９７８に概説されている。
【００８９】
ワクチンは適切な投与計画、例えば１回量または２回量の投与計画、で送達することができる。ワクチンはナイーブ集団と感作集団に使用することが可能である。
【００９０】
鼻腔内（ＩＮ）送達が行われる場合、本発明では、より好ましくは、ワクチン製剤がアジュバントを含有し、かつ／または該製剤がＲＳＶまたはＰＩＶへの曝露によってすでに感作された個体に投与される。
【００９１】
本発明はさらに、ワクチン製剤の製造方法であって、
（ａ）　エンベロープウイルスを分割すること、
（ｂ）　場合により、分割したエンベロープウイルス調製物を安定化剤と混合すること、
（ｃ）　場合により、分割したエンベロープウイルス調製物をアジュバント（キャリアーおよび／または免疫刺激剤）と混合すること、
を含んでなる上記方法に関する。
【００９２】
好ましくは、該ウイルスはＲＳＶまたはＰＩＶである。好ましくは、上記方法はステップ（ａ）および（ｂ）、ステップ（ａ）および（ｃ）、またはステップ（ａ）、（ｂ）および（ｃ）を含んでなる。好ましくは、安定化剤はポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート（ＴＷＥＥＮ ８０ＴＭ）、ｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール（ＴＲＩＴＯＮ Ｘ１００ＴＭ）、およびポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテルからなる群より選択される少なくとも１種の界面活性剤を含有する。
【００９３】
必要に応じて、この方法で製造したワクチンをキャリアーと混合する。
【００９４】
本発明について以下の実施例および図面を用いて説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００９５】
実施例１．　分割ウイルスの作製
種々のウイルス科に属するエンベロープウイルスを界面活性剤などの分割剤の添加により分割した。この分割を評価するには、ショ糖勾配またはショ糖クッションでの分割ウイルスの移動とＳＤＳ−ＰＡＧＥ／ウェスタンブロット分析による可視化により特徴づけし、また、分割ウイルス産物を電子顕微鏡で直接検査する。
【００９６】
この実施例に記載する分割ウイルスには、様々なエンベロープウイルス科の代表的なウイルスが含まれている。例えば、パラミクソウイルス科（呼吸器合胞体ウイルスＡおよびＢ、パラインフルエンザウイルス−３、流行性耳下腺炎ウイルス、および麻疹ウイルス）、トガウイルス科（風疹ウイルス）、およびヘルペスウイルス科（エプスタイン−バーウイルス、サイトメガロウイルス、または単純ヘルペスウイルス）のメンバーについて検討する。
【００９７】
ウイルス粒子を破砕（分割）するには、無細胞ウイルス調製物に可溶化濃度の界面活性剤のような分割剤を添加する。特に、界面活性剤として胆汁酸やアルキルグリコシドを使用する。界面活性剤を単独でまたは各種組み合わせて添加し、インキュベートしてこの方法を完結させる。すべてのウイルスを、電子顕微鏡で評価を行うまで保存した。
【００９８】
効果的に分割されたかを評価するには、初めに、ショ糖勾配またはクッションによる遠心分離を行う。簡単に述べると、界面活性剤で処理したサンプルと未処理のサンプルをショ糖勾配／クッション遠心分離にかけ、画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで分析する。可溶性画分中のあらゆるタイプのウイルス粒子タンパク質が移動することで、効果的に分割されたことがわかる。ショ糖−ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析で効果的に分割されたと思われるサンプルを電子顕微鏡検査でさらに分析する。サンプルは標準的な陰性染色法を用いて可視化する。
【００９９】
ＲＳＶおよびＰＩＶに対して以下の具体的な分割実験を実施した。
【０１００】
１．１　細胞培養条件
ヒト野生型ＲＳＶ／Ａ／ＬｏｎｇおよびＰＩＶ−３を、定常的無血清法でＶＥＲＯ細胞内にて複製させた。感染に先立って、ＶＥＲＯ細胞を集密状態になるまで４日間増殖させた。各ウイルスに次のウイルス生産条件を適合させた：３７℃で、ＲＳＶ／Ａに対してはＭＯＩ ０．０３、４日間、ＰＩＶ−３に対してはＭＯＩ ０．０１、５日間。収穫日に、細胞を溶解し、安定化剤を添加した後で細胞溶解液を回収し、直ちに−７０℃で保存した。
【０１０１】
１．２　ウイルスの精製
１，０００×ｇで１０分間遠心分離して清澄化した後、ＰＥＧ６０００沈澱により上清からウイルス粒子をペレット化した。このペレットをＴｒｉｓ ５０ｍＭ−ＮａＣｌ ５０ｍＭ−ＭｇＳＯ４ ２ｍＭ ｐＨ７．５バッファー中に懸濁し、続いてベンゾナーゼ処理を行った。この溶液を５００ｋＤ ＡＧＴ膜で５倍容量のリン酸緩衝溶液に対して限外濾過し、続いて５倍容量のリン酸バッファー ｐＨ７．５に対してダイアフィルトレーションを実施した。
【０１０２】
インタクトなウイルス粒子が生産され、本明細書に記載する電子顕微鏡検査（ＥＭ）およびショ糖クッションでの遠心分離により確認された。タンパク質の濃度を測定した。
【０１０３】
１．３　ウイルスの分割
無細胞ウイルス調製物に分割剤を添加してウイルス粒子を分割した。
【０１０４】
分割を有効なものとするためには、界面活性剤をその臨界ミセル濃度（ｃｍｃ）より高い濃度で使用する必要がある。全ての界面活性剤はそのｃｍｃ濃度より高い最終濃度で使用した。Ｄ／Ｐ比（界面活性剤／タンパク質比）を検討した。Ｄ／Ｐ比≧２５のときに分割がうまくいった。Ｄ／Ｐ比は２５以上とすることが好ましい。
【０１０５】
次の界面活性剤を２％の濃度で使用してウイルス粒子を分割した：デオキシコール酸ナトリウム、サルコシル、プランタケア（Ｐｌａｎｔａｃａｒｅ）およびラウレス９。
【０１０６】
分割後、この溶液を処方用バッファー（ＰＯ４ １０ｍＭ／ＮａＣｌ １５０ｍＭ ｐＨ７．５）に対して透析して過剰の界面活性剤を除いた。
【０１０７】
分割方法を以下にまとめて記載する。
【０１０８】
2004510747.tif 000002
【０１０９】
１．４　分割ウイルスの特徴づけ
出発ウイルスの完全性および分割の質を３０％ショ糖クッションでの超遠心分離（ＴＬ１００ Ｂｅｃｋｍａｎローターを使って５０，０００ｒｐｍで１時間）により判定した。画分を特異的なウェスタンブロットアッセイと電子顕微鏡検査により分析し、これらの画分の一部に対して感染力のタイトレーションを行った。
【０１１０】
１．４．１　超遠心分離
遠心チューブに３０％ショ糖溶液（４５０μｌ）を半分まで満たした後、分析すべきサンプル（４５０μｌ）をこのショ糖クッションの上に穏やかにかつ慎重に載せ、その後Ｂｅｃｋｍａｎ ＴＬ１００ローターで５０，０００ｒｐｍ、＋４℃にて１時間、遠心分離を実施した。遠心分離後、チューブを３つの部分に分けてドレインした。上部相（３００μｌ）を「上清」と呼ぶ。中間相（３００μｌ）はサンプルとショ糖クッションとの境界相であり、ここでは「中間」と呼ぶ。下部相（３００μｌ）は完全なウイルスに対して遠心分離を行ったときの再懸濁ペレットを含むボトム液であり、ここでは「ペレット」と呼ぶ。
これら３つの画分をさらに分析した。
【０１１１】
１．４．２　ウェスタンブロット分析
この分析によりウイルスの完全性を調べることができ（ペレット画分が陽性）、また、分割の効力を判定することができる（好ましくは、エンベロープタンパク質のような構造タンパク質の全部または大部分について上清画分が陽性）。
【０１１２】
特定のウイルスタンパク質を特徴づけるために特異的抗体を使用した。
【０１１３】
ＲＳＶ−Ａの場合は、非分割および分割画分を、抗Ｆタンパク質（表面タンパク質）、抗Ｇタンパク質（表面タンパク質）、抗Ｎタンパク質（ヌクレオキャプシド）、および抗Ｍタンパク質（基質）含量について分析した。
【０１１４】
ＰＩＶ−３の場合は、非分割および分割画分を、そのＨＮタンパク質含量についてモノクローナル抗体を用いて、またＦ、Ｍ、ＨＮタンパク質含量についてはポリクローナル抗体を用いて分析した。
【０１１５】
１．４．３　分割の基準
分割を行う前のペレット画分中に試験した４種全てのタンパク質に対する陽性のウェスタンブロット（ＷＢ）シグナルが存在し、かつ他の２つの画分中にシグナルが存在しなければ、そのウイルス調製物にはインタクトな完全ウイルスが含まれていることとなる。
【０１１６】
エンベロープが破砕され、かつエンベロープタンパク質が上清および／または中間画分に検出されたとき、その分割は有効であると見なした。ＲＳＶの場合は、例えばＦまたはＧがＳまたはＭ画分において検出されたときに、分割は有効であるとした。好ましくは、ＦおよびＧは実質的にＳおよび／またはＭ層に検出されて、ペレットには検出されない。
【０１１７】
１．５　結果のまとめ
ＲＳＶＡについての結果を図１〜４に示す。
全てのウェスタンブロットの結果において、「Ｓｐｌｉｔ−Ｏ」は分割する前のウイルスを意味する。「Ｓ」、「Ｍ」および「Ｐ」は、それぞれ、ショ糖クッションでの超遠心分離後に取得された「上清」、「中間」および「ペレット」サンプルをさす。レーンは左から右へ番号を付けた。容量はＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上に載せたサンプル量をさす。
【０１１８】
図１は、ｍＡｂ Ｂ４（抗Ｆ）でプローブした分割ＲＳＶＡのウェスタンブロットを示す。
上のパネル：
2004510747.tif 000003
下のパネル：
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【０１１９】
図２は、抗Ｍモノクローナル抗体でプローブした分割ＲＳＶＡのウェスタンブロットを示す。
上のパネル：
2004510747.tif 000005
下のパネル：
2004510747.tif 000006
【０１２０】
図３は、抗Ｇモノクローナル抗体でプローブした分割ＲＳＶＡのウェスタンブロットを示す。
上のパネル：
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下のパネル：
2004510747.tif 000008
【０１２１】
図４は、抗Ｎモノクローナル抗体でプローブした分割ＲＳＶＡのウェスタンブロットを示す。
上のパネル：
2004510747.tif 000009
下のパネル：
2004510747.tif 000010
【０１２２】
ＦおよびＧタンパク質に関して、分割後の中間および上清画分にシグナルが存在し、かつペレット画分にはバンドがほとんど存在しなければ、そのウイルスエンベロープは完全に破砕されたことになる。ＮおよびＭタンパク質に関しては、全ての画分にシグナルが存在すれば、これらのタンパク質が分割調製物中に存在することを示す。これらの結果からは、試験した４種全ての界面活性剤がＲＳＶＡウイルスの分割をもたらすことがわかる。
【０１２３】
全画分における４種全てのタンパク質に対するシグナルの分析、特に中間および上清画分における分割後のＮおよびＭタンパク質に対する比較可能なシグナルの分析から、試験した条件において、ＮａＤＯＣとサルコシルはウイルスの分割をもたらすだけでなく、全てのウイルス構造を破壊して構造および非構造タンパク質を可溶化することができることがわかる。
【０１２４】
同様の結果が分割ＰＩＶの場合にも得られた。
【０１２５】
ＮａＤＯＣとサルコシルは全てのウイルスに使える好適な分割剤である。
【０１２６】
１．６　ｉｎ ｖｉｔｒｏウイルスタイトレーション
分割後にウイルスの完全性が失われることから、そのウイルスは非感染性となる。成功したＲＳＶＡおよびＰＩＶ３破砕の分析は、分割後のウイルス力価が１０６ｌｏｇまたはそれ以上低下することにより示される。
【０１２７】
１．７　電子顕微鏡検査による分析
電子顕微鏡検査による分析は、コントラスト剤としてホスホタングステン酸Ｎａを用いて標準的な２段階陰性染色法により行った（ＨａｙａｔおよびＭｉｌｌｅｒ， １９９０， Ｎｅｇａｔｉｖｅ Ｓｔａｉｎｉｎｇ， ＭｃＧｒａｗ， Ｈｉｌｌ編）。グリッド（格子）を検査して、この材料の分割パターンを評価した。
【０１２８】
非分割ウイルス調製物と、ＮａＤＯＣまたはサルコシルで分割したＲＳＶＡおよびＰＩＶ３ウイルス調製物の電子顕微鏡検査による分析は、ウェスタンブロット分析で得られた観察を支持するものである。結果を示すために、ＲＳＶのデータを示す。図５は、分割前のＲＳＶＡウイルスを示す。図６および図７は、それぞれＮａＤＯＣまたはサルコシルで分割したＲＳＶ／Ａを示す。
【０１２９】
非分割ウイルス（インタクトな完全ウイルス）は、比較的よく保存されたまたは軽度の損傷を受けたウイルス粒子と若干の無定形物質を含んでいた。ＮａＤＯＣまたはサルコシルで分割したウイルスは、さまざまな程度に集合した無定形の物質が不均一に広がっている外観を示し、ウイルスエンベロープまたは核タンパク質起源からの識別可能な構造体がほとんど認められなかった。同様のデータがＰＩＶにおいて得られた。
【０１３０】
実施例２．　分割（スプリット）ワクチンのマウスにおける免疫原性
分割したＲＳＶおよび／またはＰＩＶ調製物をマウスにワクチン接種するための免疫原として使用して、これらの調製物の免疫原性を評価した。簡単に説明すると、８週齢の雌マウスを分割ワクチン調製物で免疫する。非経口、粘膜およびＩＤ経路の免疫も調べる。アジュバントは投与経路に応じて変化する。すべてのケースにおいて、アジュバントを添加してない対照も含める。数週間の間隔で２回投与する。
【０１３１】
最後に投与してから２週間後に、動物を犠牲にして血液、脾細胞、および／または鼻洗浄液を採取する。マウス血清をウイルス特異的ＥＬＩＳＡアッセイで試験することにより、血清中のウイルス特異的体液性免疫応答を評価する。さらに、抗体応答のアイソタイプ様相をアイソタイプ特異的アッセイで調べる。血清中の中和抗体の存在は、特異的なウイルス中和アッセイを用いて評価する。関連する局所免疫応答の誘導は、鼻洗浄液中の中和抗体をアッセイするか、あるいは鼻洗浄液中のウイルス特異的ＩｇＡをアッセイすることにより評価することができる。
【０１３２】
ウイルス特異的細胞性免疫応答の誘導は、回収した脾細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ刺激、および細胞増殖の測定（トリチウム標識チミジンの取り込み）、および／または刺激した細胞からのＩＬ−５およびＩＦＮγの分泌により評価する。
【０１３３】
この実験における変動要因の影響は、分割（スプリット）製剤により誘発された応答の質および強さに特別の注意を払うことで評価することができる。例として分割ＲＳＶについて試験した。
【０１３４】
２．１　分割ＲＳＶ製剤
以下の一連の実験は、分割ＲＳＶが、筋肉内（ＩＭ）、鼻腔内（ＩＮ）、または皮内（ＩＤ）経路で投与したとき、強力な免疫応答を引き出すことを示すものである。小児（ナイーブ）集団または初老（感作）集団のいずれかの免疫状態をより正確に反映させるために、感作動物または未感作動物において免疫原性を評価し、両集団での免疫原性を実証した。
【０１３５】
第１セットの実験では、８週齢の雌Ｂａｌｂ／ｃマウスを用いて、ＩＭまたはＩＮ経路で投与される分割ＲＳＶ調製物の免疫原性を試験した。初回感作を行うため、３×１０５プラーク形成単位（ｐｆｕ）の生存ＲＳＶウイルスを６０μｌの容量（２×３０μｌ）で鼻腔内に投与した。初回感作から３週間後、動物にＲＳＶ分割抗原をワクチン接種した。ＲＳＶ分割産物の数量化は、ＲＳＶ Ｆタンパク質特異的ＥＬＩＳＡ（分割産物中に含まれるＦタンパク質を組換えＦＧタンパク質標準品に対して数量化する）に基づいていた。Ａグループのマウスは、１００μｌ中に４．２μｇのＦタンパク質を含有するＲＳＶ分割抗原を２１日間隔で２回、筋肉内経路により投与して免疫した。Ｂグループのマウスは、１００μｌ中に５０μｇのＡｌ（ＯＨ）３アジュバントとともに４．２μｇのＦタンパク質を含有するＲＳＶ分割抗原を２１日間隔で２回、筋肉内経路により投与して免疫した。Ｃグループのマウスは、１回目として６０μｌ中に２．７μｇのＦタンパク質を含有するＲＳＶ分割抗原を、２１日後に２回目として６０μｌ中に４μｇのＦタンパク質を含有するＲＳＶ分割抗原を鼻腔内経路により投与して免疫した。最後に投与してから２週間後に全ての動物を犠牲にして、免疫応答を評価検討した。
【０１３６】
この実験の結果を図８〜１８にまとめて示す。免疫応答を評価するために用いた最初の免疫リードアウト（ｒｅａｄ ｏｕｔ）は、ワクチン接種動物の血清中に存在する総ＲＳＶ ＦＧ特異的免疫グロブリン（Ｉｇ）またはＦＧ特異的ＩｇＧアイソタイプ（ＩｇＧ１およびＩｇＧ２Ａ）を測定するＥＬＩＳＡアッセイであった。これらのアッセイでは、９６ウェルディッシュに組換えＲＳＶ ＦＧ抗原をコーティングし、動物の血清を連続希釈してコーティングしたウェルに加える。結合した抗体を検出するには、ビオチン化抗マウスＩｇ、ＩｇＧ１またはＩｇＧ２Ａを添加し、次いでペルオキシダーゼとコンジュゲートさせたストレプトアビジンで増幅する。ＯＰＤＡ基質を加え、続いて２Ｎ Ｈ２ＳＯ４で処理し、４９０ｎｍで光学密度（ＯＤ）を測定することにより結合抗体を定量する。ＳｏｆｔＭａｘ Ｐｒｏソフトウェア（４パラメーター式を使用）から抗体力価を算出し、ＥＵ／ｍｌで表す。
【０１３７】
ＥＬＩＳＡアッセイに加えて、免疫感作によって引き出された免疫応答の質をさらに特徴づけるために中和アッセイを行った。この中和アッセイでは、動物血清の２倍希釈物を、９６ウェルの組織培養ディッシュにおいて、ＲＳＶ／Ａウイルス（３０００ｐｆｕ）およびモルモット補体とともに３７℃で１時間インキュベートした。各ウェルにＨｅｐ−２細胞（１０４個／ウェル）を直接添加し、このプレートを３７℃で４日間インキュベートした。上清を吸引し、各ウェルに市販のＷＳＴ−１溶液を加えた。プレートを３７℃でさらに１８〜２４時間インキュベートした。ＯＤを４５０ｎｍでモニターし、タイトレーションを直線回帰分析により分析した。力価は未感染細胞について観察された最大ＯＤの５０％減少をもたらす血清希釈率の逆数として記録した。
【０１３８】
図８は、総Ｉｇ ＥＬＩＳＡリードアウトを用いて得られた結果を示す。感作マウスにおいては、分割ＲＳＶ抗原を筋肉内（Ａ、Ｂグループ）または鼻腔内（Ｃグループ）経路で２回投与してワクチン接種することにより、強力な抗ＦＧ抗体応答が誘導された。ＩＭワクチン接種については、Ａｌ（ＯＨ）３アジュバントを添加した場合に、免疫応答の大きさが上昇する傾向があった。
【０１３９】
詳細には、図８は、生きているＲＳＶで感作し、次に分割ＲＳＶを筋肉内（ＩＭ）または鼻腔内（ＩＮ）経路で投与して免疫したマウスにおける抗ＦＧ抗体（ＥＬＩＳＡ）力価（２回目のワクチン接種後）を示す。Ａグループには４．２μｇずつの分割ＲＳＶをＩＭ経路で２回投与した。Ｂグループにはミョウバンアジュバントを加えて４．２μｇずつの分割ＲＳＶをＩＭ経路で２回投与した。Ｃグループにはそれぞれ２．７μｇと４．０μｇの分割ＲＳＶをＩＮ経路で２回投与した。
【０１４０】
図９は、図８のサンプルに対する中和アッセイの結果を示す。これらの感作動物においては、分割ＲＳＶ産物をＩＭまたはＩＮのいずれかで２回投与してワクチン接種することにより強力なウイルス中和抗体応答が誘導され、ＥＬＩＳＡリードアウトから示されるように、ミョウバンアジュバントを添加した群において免疫応答が増強される同様の傾向が見られた。
【０１４１】
詳細には、図９は、生きているＲＳＶで感作し、次に分割ＲＳＶを筋肉内（ＩＭ）または鼻腔内（ＩＮ）経路で投与して免疫したマウスにおける抗ＲＳＶ／Ａ中和抗体力価（２回目のワクチン接種後）を示す。Ａグループには４．２μｇずつの分割ＲＳＶをＩＭ経路で２回投与した。Ｂグループにはミョウバンアジュバントを加えて４．２μｇずつの分割ＲＳＶをＩＭ経路で２回投与した。Ｃグループにはそれぞれ２．７μｇと４．０μｇの分割ＲＳＶをＩＮ経路で２回投与した。
【０１４２】
図１０は、図８および図９のサンプルにおけるアイソタイプ分析の結果を示す。鼻腔内感作した動物では、ＩｇＧ２ａ：ＩｇＧ１の比が、未感作マウスで得られた後に示すデータ（図１４）と比べて増加しており、このことは、マウスが生きているウイルスで感作される（すなわち、初老集団における自然な状況）と、Ｔｈ１様応答のほうに向かう傾向があることを示唆している。
【０１４３】
詳細には、図１０は、生きているＲＳＶで感作し、次に分割ＲＳＶを筋肉内（ＩＭ）または鼻腔内（ＩＮ）経路で投与して免疫したマウスにおける抗ＦＧ ＩｇＧアイソタイプ（ＥＬＩＳＡ）応答（２回目のワクチン接種後）を示す。Ａグループには４．２μｇずつの分割ＲＳＶをＩＭ経路で２回投与した。Ｂグループにはミョウバンアジュバントを加えて４．２μｇずつの分割ＲＳＶをＩＭ経路で２回投与した。Ｃグループにはそれぞれ２．７μｇと４．０μｇの分割ＲＳＶをＩＮ経路で２回投与した。
【０１４４】
図１１は、１回の抗原投与の後でさえ、感作集団では分割ＲＳＶによるＩＭまたはＩＮワクチン接種に応答して強い免疫応答が生起することを示す。したがって、感作集団において、分割ＲＳＶはＩＭまたはＩＮワクチン接種後に高力価の抗体応答を引き出すことができる強力な免疫原となる。
【０１４５】
詳細には、図１１は、生きているＲＳＶで感作し、次に分割ＲＳＶを筋肉内（ＩＭ）または鼻腔内（ＩＮ）経路で投与して免疫したマウスにおける抗ＦＧ抗体（ＥＬＩＳＡ）力価（１回目のワクチン接種後）を示す。Ａグループには４．２μｇずつの分割ＲＳＶをＩＭ経路で２回投与した。Ｂグループにはミョウバンアジュバントを加えて４．２μｇずつの分割ＲＳＶをＩＭ経路で２回投与した。Ｃグループにはそれぞれ２．７μｇと４．０μｇの分割ＲＳＶをＩＮ経路で２回投与した。Ｄグループには感作のみを施して、ワクチン接種を行わなかった−このグループについて報告された抗体力価は、感作後２１日目の時点におけるものである。
【０１４６】
第２の一連の実験では、未感作マウスを用いて、抗原用量とアジュバント添加が分割ＲＳＶ産物の免疫原性に及ぼす効果を立証した。マウスに、１００μｌ中に４．２μｇ（高用量）または０．４２μｇ（低用量）のＦタンパク質を含有する分割ＲＳＶ抗原をＩＭ経路で投与して免疫した。両抗原用量の分割ＲＳＶのＩＭ経路用製剤を、アジュバントを添加しないで、またはアジュバントとして５０μｇのＡｌ（ＯＨ）３、もしくはヨーロッパ特許第０８２２８３１号に記載されている、コレステロール、３ｄＭＰＬ、およびＱＳ２１を含む小胞性アジュバント製剤（本明細書では「ＤＱ ３ＤＭＰＬ」と称する）を添加して、投与した。対照グループは、１００μｌ中に３．４μｇのＦタンパク質を含有する精製した完全ＲＳＶウイルスをＩＭ経路で投与した。各製剤の２回目の投与（４．２μｇのＦタンパク質を含む調製物を投与した精製完全ウイルス群を除き、１回目の投与とすべて同じ条件）は、ＩＭ経路により３０日後に行われた。最後の投与から２週間後にすべての動物を犠牲にして、免疫応答を評価検討した。
【０１４７】
図１２はこれらの動物におけるＦＧ特異的Ｉｇ応答の概要を示す。ＤＱ／３ＤＭＰＬアジュバントを加え、ＩＭ経路で投与した場合に、高用量または低用量いずれかのＦタンパク質を用いて免疫した動物において強力な免疫応答が誘導された。より低いレベルの抗体が、ミョウバンアジュバントを加えた製剤、またはアジュバントを加えていない製剤をＩＭ経路で投与した場合に誘導された。すべてのケースにおいて、低い抗原用量は、高い抗原用量と比較して、より低い抗体レベルを誘導するという明らかな用量応答性がみとめられた。高用量の完全ウイルスによって誘導された抗体レベルは、ＤＱ／３ＤＭＰＬアジュバントを加えた低用量の分割ＲＳＶにより誘導されたものと同様であった。
【０１４８】
詳細には、図１２は、分割ＲＳＶを筋肉内（ＩＭ）経路で投与して免疫した未感作マウスにおける抗ＦＧ抗体（ＥＬＩＳＡ）力価（２回目のワクチン接種後）を示す。Ａグループにはそれぞれ０．４２μｇの分割ＲＳＶを２回投与した。Ｂグループにはミョウバンアジュバントを加えてそれぞれ０．４２μｇの分割ＲＳＶを２回投与した。ＣグループにはＤＱ／３ＤＭＰＬアジュバントを加えてそれぞれ０．４２μｇの分割ＲＳＶを２回投与した。Ｄグループにはそれぞれ４．２μｇの分割ＲＳＶを２回投与した。Ｅグループにはミョウバンアジュバントを加えてそれぞれ４．２μｇの分割ＲＳＶを２回投与した。ＦグループにはＤＱ／３ＤＭＰＬアジュバントを加えてそれぞれ４．２μｇの分割ＲＳＶを２回投与した。Ｇグループにはそれぞれ３．４μｇおよび４．２μｇの精製した完全ＲＳＶウイルスを２回投与した。
【０１４９】
図１２のサンプルに対してウイルス中和リードアウトを使用した場合に同様の結果が得られた（図１３）。図１３は、分割ＲＳＶを筋肉内（ＩＭ）経路で投与して免疫した未感作マウスにおける抗ＲＳＶ／Ａ中和抗体力価（２回目のワクチン接種後）を示す。Ａグループにはそれぞれ０．４２μｇの分割ＲＳＶを２回投与した。Ｂグループにはミョウバンアジュバントを加えてそれぞれ０．４２μｇの分割ＲＳＶを２回投与した。ＣグループにはＤＱ／３ＤＭＰＬアジュバントを加えてそれぞれ０．４２μｇの分割ＲＳＶを２回投与した。Ｄグループにはそれぞれ４．２μｇの分割ＲＳＶを２回投与した。Ｅグループにはミョウバンアジュバントを加えてそれぞれ４．２μｇの分割ＲＳＶを２回投与した。ＦグループにはＤＱ／３ＤＭＰＬアジュバントを加えてそれぞれ４．２μｇの分割ＲＳＶを２回投与した。Ｇグループにはそれぞれ３．４μｇおよび４．２μｇの精製した完全ＲＳＶウイルスを２回投与した。
【０１５０】
これらの製剤によって誘導されたＩｇＧアイソタイプの分析（図１４）により、アジュバントを加えていない製剤およびミョウバンアジュバントを加えた製剤は未感作マウスにおいて典型的ＴＨ２様応答を誘導するのに対して、ＤＱ／３ＤＭＰＬを加えた製剤では、高いＩｇＧ２ａ：ＩｇＧ１比を有する、よりＴＨ１に似た応答への変化を生じる。このことは、アジュバントを加えていない製剤またはミョウバンアジュバントを加えた製剤を用いてワクチン接種した感作動物において見られるプロフィールと類似している（図１０）。このように、未感作マウスでは、分割ＲＳＶをＩＭ経路でワクチン接種することにより、アジュバント添加により増強しうる強力な抗体応答を誘導する。
【０１５１】
詳細には、図１４は、分割ＲＳＶを筋肉内（ＩＭ）経路で投与して免疫した未感作マウスにおける抗ＦＧ ＩｇＧアイソタイプ（ＥＬＩＳＡ）応答（２回目のワクチン接種後）を示す。Ａグループにはそれぞれ０．４２μｇの分割ＲＳＶを２回投与した。Ｂグループにはミョウバンアジュバントを加えてそれぞれ０．４２μｇの分割ＲＳＶを２回投与した。ＣグループにはＤＱ／３ＤＭＰＬアジュバントを加えてそれぞれ０．４２μｇの分割ＲＳＶを２回投与した。Ｄグループにはそれぞれ４．２μｇの分割ＲＳＶを２回投与した。Ｅグループにはミョウバンアジュバントを加えてそれぞれ４．２μｇの分割ＲＳＶを２回投与した。ＦグループにはＤＱ／３ＤＭＰＬアジュバントを加えてそれぞれ４．２μｇの分割ＲＳＶを２回投与した。Ｇグループにはそれぞれ３．４μｇおよび４．２μｇの精製した完全ＲＳＶウイルスを２回投与した。
【０１５２】
同様の免疫をＩＮ経路で未感作マウスにおいて行った。この場合、マウスに１回目として２．４μｇのＦタンパク質を含有する分割ＲＳＶ抗原（送達量６０μｌ−２×３０μｌ）を投与した。３０日後に送達した２回目では、３．５μｇのＦタンパク質を含有する分割ＲＳＶ抗原をマウスに投与した。分割ＲＳＶは、アジュバントを添加しないで、またはアジュバントとして５μｇの大腸菌Ｌａｂｉｌｅ Ｔｏｘｉｎ （ＬＴ）を添加して、またはポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル０．５％（本明細書では「ラウレス９」）とともに鼻腔内投与した。対照グループは、１回目に２．０μｇのＦタンパク質を含有し、２回目に３．５μｇのＦタンパク質を含有する精製した完全ＲＳＶウイルスを鼻腔内投与して免疫した。最後のワクチン接種から２週間後に動物を犠牲にして、免疫応答を評価検討した。
【０１５３】
図１５および１６に示すように、未感作マウスにおいて抗体応答がＩＮ製剤により引き出された。ＥＬＩＳＡリードアウト（図１５）からは、ＩＮワクチン接種に対する応答がＩＭにより引き出される応答よりわずかに低くなることが示唆されるが、中和リードアウト（図１６）からは、ＬＴアジュバントを添加した分割ＲＳＶ ＩＮ製剤が、中和抗体を誘導するうえでＩＭと少なくとも同じくらいすぐれており、他の製剤もＩＭに匹敵することが示唆される。かくして、ＩＮ経路で投与された分割ＲＳＶは未感作マウスにおいても免疫原性がある。
【０１５４】
詳細には、図１５は、分割ＲＳＶを鼻腔内（ＩＮ）または筋肉内（ＩＭ）経路で投与して免疫した未感作マウスにおける抗ＦＧ抗体（ＥＬＩＳＡ）力価（２回目のワクチン接種後）を示す。Ａグループにはそれぞれ２．４μｇと３．５μｇの分割ＲＳＶをＩＮ経路で２回投与した。Ｂグループにはラウレス９アジュバントを加えてそれぞれ２．４μｇと３．５μｇの分割ＲＳＶをＩＮ経路で２回投与した。ＣグループにはＬＴアジュバントを加えてそれぞれ２．４μｇと３．５μｇの分割ＲＳＶをＩＮ経路で２回投与した。Ｄグループにはそれぞれ２．０μｇと３．５μｇの精製した完全ウイルスをＩＮ経路で２回投与した。Ｅグループには４．２μｇずつの分割ＲＳＶをＩＭ経路で２回投与した。
【０１５５】
図１６は、分割ＲＳＶを鼻腔内（ＩＮ）または筋肉内（ＩＭ）経路で投与して免疫した未感作マウスにおける抗ＲＳＶ／Ａ中和抗体力価（２回目のワクチン接種後）を示す。Ａグループには、２回に分けてそれぞれ２．４μｇと３．５μｇの分割ＲＳＶをＩＮ経路で投与した。Ｂグループには、ラウレス９アジュバントを加えた２．４μｇと３．５μｇずつの分割ＲＳＶを、２回に分けてＩＮ経路で投与した。Ｃグループには、ＬＴアジュバントを加えた２．４μｇと３．５μｇずつの分割ＲＳＶを、２回に分けてＩＮ経路で投与した。Ｄグループには、２回に分けてそれぞれ２．０μｇと３．５μｇずつの精製した完全ウイルスをＩＮ経路で投与した。Ｅグループには、４．２μｇずつの分割ＲＳＶをＩＭ経路で２回投与した。
【０１５６】
皮内（ＩＤ）経路により投与した場合のＲＳＶ分割抗原の免疫原性をモルモットで評価した。モルモットにおける正確なＩＤ注射の実行可能性を、真皮への墨汁の注入、およびその組織の組織学的検査により確認した（データ示さず）。また、初老集団において見られる免疫状態（すなわち、ＲＳＶに対して感作されている状態）のシミュレーションを試みるために、Ｈａｒｔｌｅｙ系モルモット（１グループあたり５匹）を、生きているＲＳＶウイルス（１００μｌ〜５０μｌ／ノストリル中、５×１０５ ｐｆｕをＩＮ経路で投与、グループＡ−Ｅ）または精製した完全ＲＳＶウイルス（１００μｌ中に６μｇのＦタンパク質を含有、ＩＭ経路により投与、グループＦ−Ｊ）のいずれかにより感作した。等量の２回のワクチンを、感作後２１日目と４２日目に投与した。ＡおよびＦグループには、それぞれ４．２μｇのＦタンパク質を含有する分割ＲＳＶ調製物を皮内（ＩＤ）経路で投与した。ＢおよびＧグループには、それぞれ０．８４μｇのＦタンパク質を含有する分割ＲＳＶ調製物を皮内（ＩＤ）経路で投与した。ＣおよびＨグループには、ＤＱ／３ＤＭＰＬアジュバントを加えてそれぞれ４．２μｇのＦタンパク質を含有する分割ＲＳＶ調製物を皮内（ＩＤ）経路で投与した。ＤおよびＩグループには、ＤＱ／３ＤＭＰＬアジュバントを加えてそれぞれ０．８４μｇのＦタンパク質を含有する分割ＲＳＶ調製物を皮内（ＩＤ）経路で投与した。ＥおよびＪグループには、それぞれ４．２μｇのＦタンパク質を含有する分割ＲＳＶ調製物を筋肉内（ＩＭ）経路で投与した。ワクチンの１回目の投与の３週間後、および２回目の投与の２週間後に動物から採血し、免疫応答を評価した。
【０１５７】
この実験の結果の概要を図１７および図１８に示す。図１７は、実験経過においてモルモット血清で検出されるＦＧ特異的免疫応答を示す。モルモットの試験に使用されるＦＧ特異的ＥＬＩＳＡは、ウェルが組換えＦＧでコーティングされ、動物血清を希釈してコーティングされたウェルに添加する点で、マウスにおけるＥＬＩＳＡと同様のものであった。しかしながら、このアッセイにおける結合抗体は、抗モルモットＩｇ抗体とコンジュゲートさせた西洋ワサビペルオキシダーゼにより、次いで基質を添加し、そして従前に記載されているように発色させることにより、検出される。すべてのグループにおいて、感作に対する弱い応答が観察されるが、ＩＤまたはＩＭ経路のいずれかによるワクチン接種による応答の増強をはっきりと観察することができる。応答の増強は明らかに１回目のワクチン接種時に観察され、さらなる応答の増強が、力価がプラトーに達したグループＨを除くすべてのグループにおいて２回目のワクチン接種後に明示されている。応答の規模の明らかな増大が、アジュバントを添加した場合に観察される（グループＣ、Ｄ、Ｈ、Ｉ）。抗原用量の明らかな影響は、この実験においては観察されず、アジュバントを加えなくても、ＩＤ経路で投与された１／５用量の抗原が、ＩＭ経路で投与された全量の抗原と同程度に機能する。中和データの概要を示す図１８も同様の傾向を示す。したがって、感作集団（生きているウイルスの感染によるか、または精製した完全ウイルスの投与によって感作したもの）においては、ＩＤ経路で投与された１回用量の分割ＲＳＶは強力な免疫原性があり、この応答はワクチンの２回目の投与によりさらに増強させることができる。
【０１５８】
詳細には、図１７は、分割ＲＳＶを皮内（ＩＤ）または筋肉内（ＩＭ）経路で投与して免疫した未感作モルモットにおける抗ＦＧ抗体（ＥＬＩＳＡ）力価を示す。Ａ〜Ｅグループは生きているＲＳＶウイルスで感作した。Ｆ〜Ｊグループは精製した完全ウイルスで感作した。ワクチン接種のために、ＡおよびＦグループには、それぞれ０．８４μｇの分割ＲＳＶを皮内（ＩＤ）経路で２回投与した。ＢおよびＧグループには、それぞれ４．２μｇの分割ＲＳＶを皮内（ＩＤ）経路で２回投与した。ＣおよびＨグループには、ＤＱ／３ＤＭＰＬアジュバントを加えてそれぞれ０．８４μｇの分割ＲＳＶを皮内（ＩＤ）経路で２回投与した。ＤおよびＩグループには、ＤＱ／３ＤＭＰＬアジュバントを加えてそれぞれ４．２μｇの分割ＲＳＶを皮内（ＩＤ）経路で２回投与した。ＥおよびＪグループには、それぞれ４．２μｇの分割ＲＳＶを筋肉内（ＩＭ）経路で２回投与した。
【０１５９】
図１８は、分割ＲＳＶを用いて皮内（ＩＤ）または筋肉内（ＩＭ）経路で免疫した感作モルモットにおける抗ＲＳＶ／Ａ中和抗体力価を示す。Ａ〜Ｅグループは生きているＲＳＶウイルスで感作した。Ｆ〜Ｊグループは精製した完全ウイルスで感作した。ワクチン接種のために、ＡおよびＦグループには、それぞれ０．８４μｇの分割ＲＳＶを皮内（ＩＤ）経路で２回投与した。ＢおよびＧグループには、それぞれ４．２μｇの分割ＲＳＶを皮内（ＩＤ）経路で２回投与した。ＣおよびＨグループには、ＤＱ／３ＤＭＰＬアジュバントを加えてそれぞれ０．８４μｇの分割ＲＳＶを皮内（ＩＤ）経路で２回投与した。ＤおよびＩグループには、ＤＱ／３ＤＭＰＬアジュバントを加えてそれぞれ４．２μｇの分割ＲＳＶを皮内（ＩＤ）経路で２回投与した。ＥおよびＪグループには、それぞれ４．２μｇの分割ＲＳＶを筋肉内（ＩＭ）経路で２回投与した。
【０１６０】
要約すると、これらの実験から、分割ＲＳＶ抗原はナイーブ集団と感作集団の両方において強い免疫原性を示すことが実証された。さらに、これらの実験で明らかになったことは、分割ＲＳＶの筋肉内、鼻腔内および皮内等の様々な経路による投与が可能であり、しかもすべてのケースにおいて分割ＲＳＶが免疫原性を示すことである。アジュバントの添加は、抗体応答を増強できる場合があり、さらに／あるいはＴｈ２様応答からＴｈ１様応答への応答プロフィールの変化を引き起こしうる。
【図面の簡単な説明】
【図１】
抗Ｆ抗体による分割ＲＳＶＡのウェスタンブロットを示す。
【図２】
抗Ｍ２抗体による分割ＲＳＶＡのウェスタンブロットを示す。
【図３】
抗Ｇ抗体による分割ＲＳＶＡのウェスタンブロットを示す。
【図４】
抗Ｎ抗体による分割ＲＳＶＡのウェスタンブロットを示す。
【図５】
ＥＭにより可視化されたＲＳＶ／Ａ出発材料を示す。
【図６】
ＥＭにより可視化された、ＮａＤＯＣで分割したＲＳＶ／Ａを示す。
【図７】
ＥＭにより可視化された、サルコシルで分割したＲＳＶ／Ａを示す。
【図８】
分割ＲＳＶを用いて筋肉内または鼻腔内経路により免疫した感作マウスにおける抗ＦＧ抗体（ＥＬＩＳＡ）力価（２回目の投与後）を示す。
【図９】
分割ＲＳＶを用いて筋肉内または鼻腔内経路により免疫した感作マウスにおける抗ＲＳＶ／Ａ中和抗体力価（２回目の投与後）を示す。
【図１０】
分割ＲＳＶを用いて筋肉内または鼻腔内経路により免疫した感作マウスにおける抗ＦＧ ＩｇＧアイソタイプ応答（２回目の投与後）を示す。
【図１１】
分割ＲＳＶを用いて筋肉内または鼻腔内経路により免疫した感作マウスにおける抗ＦＧ抗体（ＥＬＩＳＡ）力価（１回目の投与後）を示す。
【図１２】
分割ＲＳＶを用いて筋肉内経路により免疫した未感作マウスにおける抗ＦＧ抗体（ＥＬＩＳＡ）力価を示す。
【図１３】
分割ＲＳＶを用いて筋肉内経路により免疫した未感作マウスにおける抗ＲＳＶ／Ａ中和抗体力価を示す。
【図１４】
分割ＲＳＶを用いて筋肉内経路により免疫した未感作マウスにおける抗ＦＧ ＩｇＧアイソタイプ応答を示す。
【図１５】
分割ＲＳＶを用いて鼻腔内経路により免疫した未感作マウスにおける抗ＦＧ抗体（ＥＬＩＳＡ）力価を示す。
【図１６】
分割ＲＳＶを用いて鼻腔内経路により免疫した未感作マウスにおける抗ＲＳＶ／Ａ中和抗体力価を示す。
【図１７】
分割ＲＳＶを用いて皮内または筋肉内経路により免疫した感作モルモットにおける抗ＦＧ抗体（ＥＬＩＳＡ）力価を示す。
【図１８】
分割ＲＳＶを用いて皮内経路により免疫した感作モルモットにおける抗ＲＳＶ／Ａ中和抗体力価を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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