(57)【要約】本発明では、胚性の膵臓上皮、すい臓の島細胞、脂肪細胞、および腸内陰窩細胞において特異的に発現されるＤ５２遺伝子ファミリー（ｐＤ５２）の新規機能のみならず、ｐＤ５２またはｐＲＡ００６を同定およびコードするポリヌクレオチドも開示される。また、本発明は、中枢神経系および末梢神経系のみならず、すい臓の島細胞のサブセットや眼においても特異的に発現されるＲＡ００６遺伝子ファミリー（ｐＲＡ００６の新規機能を開示する。本発明は、すい臓機能障害（例えば糖尿病、高血糖、および異常グルコース耐性）、肥満症、脂肪過多症、摂食障害（神経性過食症、拒食症）、悪質液（消耗症）のような代謝障害または代謝症候群および神経変性疾患、および他の疾患および障害の治療、軽減および（または）予防のような、ｐＤ５２またはｐＲＡ００６の発現に関連する障害のための組成物を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｐＤ５２またはｐＲＡ００６遺伝子ファミリーまたはそのコード化されたポリペプチドまたは断片または当該核酸分子の変異型または当該ポリペプチドまたは抗体、ｐＤ５２またはｐＲＡ００６遺伝子ファミリーの核酸分子を認識するアプタマーまたは他の受容体または薬剤メーカーのためにコードされたポリペプチドの核酸分子の使用法。
【請求項２】
核酸分子が脊椎動物Ｄ５２核酸であり、特に ヒトＤ５２核酸（GenBank アクセッション番号 S８２０８１または AAB３６４７６）または ヒトＲＡ００６相同体核酸（GenBank アクセッション番号 CAB５3688）、または相補配列、またはその断片またはその変異型である請求項１の使用法。
【請求項３】
当該核酸分子が下記である場合の請求項１または２の組成物。
（a）２２oC にて０．２ x SSC および０．１％SDS（ドデシル硫酸ナトリウム）を含む溶液において、配列認識番号２または配列認識番号４のアミノ酸配列をコードする配列認識番号１または配列認識番号３の核酸分子の相補鎖に対してハイブリタイズする場合、
（b）  核酸分子（a）に対して縮重する場合、
（c）  少なくとも８５％、望ましくは 少なくとも９０％、より望ましくは 少なくとも９５％、より望ましくは 少なくとも９８％および９９．６％までに 配列識別番号２または 配列識別番号４に同一であるポリペプチドをコードする核酸分子、または
（d）  （a）〜（c）の核酸分子と異なり、当該突然変異体がコードされたポリペプチドにおいて改変、削除、複製または早期停止の原因となるような突然変異による核酸分子。
【請求項４】
核酸分子が DNA 分子、特に cDNA またはゲノム DNA である請求項１〜３の任意の１項の使用法。
【請求項５】
核酸分子が、胚性の膵臓上皮、すい臓の島細胞のサブセット、脂肪細胞、および腸内陰窩細胞において発現されるｐＤ５２タンパク質または相同体タンパク質をコードするか、または核酸分子が、中枢神経系および末梢神経系のみならず、すい臓の島細胞や眼においても発現されるｐＲＡ００６タンパク質または相同体タンパク質をコードするような、請求項１〜４の任意の１項の使用法。
【請求項６】
当該核酸分子が修飾核酸分子である、請求項１〜５の任意の１項の使用法。
【請求項７】
当該組換え核酸分子がベクター、特に発現ベクターである請求項６の使用法。
【請求項８】
当該ポリペプチドが組換えポリペプチドである請求項１〜５の任意１項の使用法。
【請求項９】
当該ポリペプチドが融合ポリペプチドである請求項８の使用法。
【請求項１０】
当該核酸分子が ハイブリダイゼーション プローブ、プライマーおよびアンチセンスオリゴヌクレオチドから選択される請求項１〜７の任意の１項の使用法。
【請求項１１】
診断目的に対する請求項１〜１０の任意の１項の使用法。
【請求項１２】
治療目的に対する請求項１〜１０の任意の１項の使用法。
【請求項１３】
神経変性疾患のみならず、代謝障害、特に脂肪および（または）炭水化物代謝に関連する障害の診断、監視、予防または治療のための薬剤の製造に対する請求項１〜１２の任意の１項の使用法。
【請求項１４】
細胞、細胞塊、器官および（または）被験者における代謝障害または代謝症候群、例えば、すい臓機能障害（例えば糖尿病、高血糖、および異常グルコース耐性）、肥満症、脂肪過多症、摂食障害（神経性過食症、拒食症）、悪質液（消耗症）、および神経変性疾患などの治療、軽減 および（または）予防に対する、検出および（または）検証のための請求項１３の使用法。
【請求項１５】
核酸分子またはそのコードされたポリペプチドまたは断片または当該核酸分子の変異型または当該ポリペプチドまたは抗体、ｐＤ５２またはｐＲＡ００６遺伝子ファミリーの核酸分子を認識するアプタマーまたは他の受容体または、遺伝子の機能を監視および（または）制御するために請求項１〜１０項の任意の１項において定義されたように、それらによってコードされたポリペプチド、および（または）ｐＤ５２またはｐＲＡ００６ポリペプチドによって影響および（または）修飾された遺伝子産物の使用法。
【請求項１６】
核酸分子またはそのコードされたポリペプチドまたは断片または当該核酸分子の変異型または当該ポリペプチドまたは抗体、ｐＤ５２またはｐＲＡ００６遺伝子ファミリーの核酸分子を認識するアプタマーまたは他の受容体または、ｐＤ５２またはｐＲＡ００６ポリペプチドとの相互作用する能力を持つ物質を識別するために請求項１〜１０項の任意の１項において定義されたように、それらによってコードされたポリペプチドの使用法。
【請求項１７】
ｐＤ５２またはＲＡ００６ポリペプチドの修飾発現を示す非ヒト遺伝子組換え動物。
【請求項１８】
ｐＤ５２またはｐＲＡ００６ポリペプチドの発現が増大または減少した請求項１７の動物。
【請求項１９】
ｐＤ５２またはＲＡ００６ポリペプチドの修飾発現を示す組換え宿主細胞。
【請求項２０】
ヒト細胞である請求項１９の細胞。
【請求項２１】
哺乳動物代における謝障害または代謝症候群、特にすい臓機能障害に関与する（ポリ）ペプチドを同定する方法は下記の通りである。
（a）ｐＤ５２またはＲＡ００６ポリペプチドまたはその断片を用い、当該試験用（ポリ）ペプチドの結合を可能にする条件下、試験用（ポリ）ペプチドの回収に接触するステップ。
（b）  結合しない試験用（ポリ）ペプチドを除去するステップ、および
（c）  当該ｐＤ５２またはｐＲＡ００６ポリペプチドまたはその断片に結合する試験用（ポリ）ペプチドを識別するステップ。
【請求項２２】
ｐＤ５２またはＲＡ００６ポリペプチド ポリペプチドまたはその断片の結合標的および薬剤との相互作用を調整する薬剤をスクリーニングする方法は下記のステップから成る。
（a）  下記から成る混合物をインキュベートするステップ。
（aa）  ｐＤ５２またはＲＡ００６ポリペプチドまたはその断片；
（ab）  当該ｐＤ５２またはＲＡ００６ポリペプチドまたはその断片の結合標的および薬剤；および
（ac）  候補薬剤
下記参照の親和性にて当該ｐＤ５２またはＲＡ００６ポリペプチドまたはその断片が特異的に当該結合標的と薬剤に結合する条件下；
（b）  （候補）薬剤偏向親和性を決定するため、当該結合標的に対する当該ｐＤ５２またはＲＡ００６ポリペプチドまたはその断片の結合親和性を検出する；および
（c）  （候補）薬剤偏向親和性とリファレンス親和性間の差異を確定するステップ。
【請求項２３】
医薬用に許容できるキャリアおよび（または）希釈剤を有する、請求項２１の方法によって識別された（ポリ）ペプチド、または請求項２２の方法によって識別された薬剤を含む組成物を産生する方法。
【請求項２４】
当該組成物が、代謝障害または代謝症候群、例えば、すい臓機能障害（例えば糖尿病、高血糖、および異常グルコース耐性）、肥満症、脂肪過多症、摂食障害（神経性過食症、拒食症）、悪質液（消耗症）、および神経変性疾患、および他の疾病および障害の予防、軽減または治療のための医療品組成物である、請求項２３の方法。
【請求項２５】
すい臓機能障害（例えば糖尿病、高血糖、および異常グルコース耐性）、肥満症、脂肪過多症、摂食障害（神経性過食症、拒食症）、悪質液（消耗症）のような代謝障害または代謝症候群および神経変性疾患、および他の疾患および障害の治療、軽減および（または）予防のための医薬品組成物の調製のための請求項２１の方法によって同定された（ポリ）ペプチドの使用法または請求項２３の方法によって同定された薬剤に使用方法。
【請求項２６】
ｐＤ５２またはＲＡ００６遺伝子産物を過剰発現または低発現する非ヒト動物の準備（preparation）のためのｐＤ５２またはＲＡ００６遺伝子ファミリーまたはその断片の核酸分子の使用法。
【請求項２７】
下記の最低１つを備えたキット。
（aa）  ｐＤ５２またはＲＡ００６核酸分子、またはその断片；
（b）  （a）の核酸を含むベクター；
（c）  （a）の核酸分子または（b）のベクターを含む宿主細胞；
（d）  （a）の核酸分子によってコードされたポリペプチド；
（e）  （a）の核酸分子によってコードされた融合ポリペプチド；
（f）  （a）の核酸分子または（d）または（e）のポリペプチド（に対する）抗体、アプタマーまたは別の受容体、および
（g）  （a）の核酸分子の抗センス オリゴヌクレオチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、胚性の膵臓上皮、すい臓の島細胞、脂肪細胞、および腸内陰窩細胞において特異的に発現されるＤ５２遺伝子ファミリーおよびそれによってコードされたポリペプチドの核酸配列に関するものであり、および中枢神経系および末梢神経系のみならず、すい臓の島細胞のサブセットや眼においても特異的に発現されるＲＡ００６遺伝子ファミリーおよびそれによってコードされたポリペプチドの核酸配列にも関するものである。本発明は、疾患および障害の診断、試験、予防、および治療におけるこれらの核酸およびポリペプチドの使用法に関するものであり、限定するものではないが、糖尿病、脂肪過多症のような代謝障害、および神経変性疾患などを含むすい臓の疾患および障害がその例として挙げられる。
【０００２】
本発明に記載したタンパク質は、限定するものではないが、以下に記載した参照のように、ヒトＤ５２タンパク質に対して有意な相同性を示す。
【０００３】
哺乳動物のＤ５２タンパク質ファミリーのメンバーは、細胞増殖の制御因子としての役割を果たすシグナル伝達分子であることが現在わかっている。ヒトＤ５２（N8 タンパク質、Genbank アクセッション番号 S82081）は、胸腺癌および肺腺癌において過剰発現されることがわかっている（例えば、Byrne らの1995, Cancer Res.55:2896-2903 および Chen らの1996, Oncogene１２（4）:741-51 を参照）。ヒトＤ５２の高度に保存された相同分子種が、マウス（Genbank アクセッション番号 U44426）、ウサギ（SPTREMBL アクセッション番号 Q95212）、およびウズラ（Genbank アクセッション番号 Y07757）からクローニングされている。ウサギＤ５２相同体 CSPP28（SPTREMBLアクセッション番号Q95212）とは、胃壁細胞のコリン刺激作用に応答してリン酸化される、２８kDA のカルシウム感受性リンタンパク質である（例えば、Parente らの1996、J. Biol. Chem.２７１:20096-20101 を参照）。ウズラにおいては、Ｄ５２相同体 R10 である２３kDaの細胞質タンパク質が、いくつかの胚組織で検出されている。R10 タンパク質には、そのアミノ末端の端部にロイシンジッパー添加領域が含まれており、それによって容易にホモ二量体を形成することができる（例えば、Proux らの1996、271（48）:30790-30797 を参照）。通常、Ｄ５２タンパク質ファミリーのメンバーは、高度に保存された特有のコイルドコイルのドメインを有し、タンパク質間の相互作用およびアミノ末端およびカボキシル末端に位置する PEST ドメインを関与する機能を示唆する（例えば、Byrne らの1996、Genomics35（3）:523-532 を参照）。ヒト胸腺癌関連のＤ５３タンパク質は、ヒトＤ５２に対して５２％同一であることが予想される。胸腺癌断面の原位置ハイブリッド形成法は、Ｄ５２遺伝子が癌細胞、特に胸腺癌および肺腺癌において発現されたことを明らかにしている（例えば、Byrne らの1995、Cancer Res.55（13）:2896-2903、2903、およびChen らの1996、Oncogene12（4）：741-51 を参照）。ヒト D54 タンパク質のクローニングでは、Ｄ５２様転写物における選択的コーディング配列の使用を示している。Ｄ５２遺伝子ファミリー内の選択的スプライシングは、コードされたイソ型のタンパク質間の相互作用機能をある程度変質する役割を果たす（例えば、Nourse らの1998、Biochim. Biophys. Acta1443（1-2）:155-168; International Application WO99/51379 を参照）。
【０００４】
Ｄ５２タンパク質ファミリーメンバーが、数種の癌および腫瘍（malignomas）と関連していることはわかっているが、肥満症および糖尿病のような代謝疾患の調節における機能との関連は従来の技術には記載されていない。興味深いことには、Ｄ５２の発現が、肥満したマウスの脂肪組織においては５.2 倍も上方制御されていることがわかっている。その例は Nadler らの2000、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.97（21）:11371-11376 を参照。本発明では、すい臓の成長、脂肪細胞の分化に関与するＤ５２遺伝子ファミリーの新規機能が記載されており、これらの機能は腸内幹細胞のマーカーとして用い得る。
【０００５】
胚性の膵臓上皮、すい臓の島細胞、および腸内陰窩細胞、および分子自体において特異的に発現される分子をコードするポリヌクレオチドの同定により、糖尿病を含むすい臓の疾患および障害を調査研究および（または）調節する新しい可能性が提示される。Ｄ５２タンパク質に関連する分子の同定により、すい臓疾患、脂肪過多症などの代謝障害の診断、治療、および予後において有用な新規組成物を提供することで当分野における要望に応えることができる。
【０００６】
本発明に記載したＲＡ００６タンパク質では、胎児の腎臓組織から分離された仮想ヒトタンパク質に対して有意な相同性を示す（Genbank アクセッション番号 CAB53688）。疾患および障害、例えば、限定するものではないが、すい臓（例えば糖尿病）、および関連疾患および障害（例えば脂肪過多症）、および神経変性疾患などの調節における機能は従来の技術において記載されていない。本発明には、中枢神経系および末端神経のみならず、すい臓や眼の成長にも関与するＲＡ００６遺伝子ファミリーの新規機能が記載されている。
【０００７】
中枢神経系および末梢神経系のみならず、すい臓の島細胞のサブセットや眼においても特異的に発現される分子をコードするポリヌクレオチドの同定により、糖尿病および肥満症などの膵臓の疾病および障害を調査研究する機会が提示される。さらに、本同定により、中枢神経系や末端神経のみならず、眼にも影響をおよぼす疾患および障害を調査研究する機会も提示される。ＲＡ００６タンパク質に関連する分子の同定により、疾患および障害、例えば、限定するものではないが、すい臓（例えば、糖尿病）、および関連疾患および障害（例えば、脂肪過多症）、および神経変性疾患の診断、治療、および予後において有用である新規組成物を提供することで当分野における要望に応えることができる。
【０００８】
発明の要旨
本発明は、胚性の膵臓上皮、すい臓の島細胞、脂肪細胞、および腸内陰窩細胞において特異的に発現されるＤ５２様タンパク質（以下にｐＤ５２と命名した）を特徴とし、Ｄ５２タンパク質ファミリーのタンパク質に対して類似性を有することによって特徴づけられる。また、本発明は中枢神経系および末梢神経系のみならず、すい臓の島細胞のサブセットや眼においても特異的に発現されるＲＡ００６様タンパク質を特徴とし、仮想ヒトタンパク質に対して類似性を有することによっても特徴づけられる。
【０００９】
よってＤ５２またはＲＡ００６タンパク質および核酸分子 コーディングは、脊椎動物種、例えば哺乳動物または鳥から入手可能である。特に好適なのは、ヒトＤ５２核酸（Genbank アクセッション番号 S82081 または AAB３6476）または ヒトＲＡ００６相同体核酸またはそれによってコードされたポリペプチド（GenBank アクセッション番号 CAB５3688）である。また、特に 好適なのは、ニワトリＤ５２（図１: 配列識別番号１および２）またはＲＡ００６（図６: 配列識別番号３および４）の核酸およびそれによってコードされたポリペプチドである。従って、本発明には、配列識別番号２または４においてそれぞれ示したアミノ酸配列を有する、実質上精製されたｐＤ５２またはＲＡ００６ポリペプチドに特徴がある。本発明の一実施態様では、ｐＤ５２またはｐＲＡ００６をコードする、単離かつ実質上精製されたポリヌクレオチドに特徴がある。特定の実施形態においては、ポリヌクレオチドは配列識別番号１または 配列識別番号３のヌクレオチド配列である。また、本発明は、配列識別番号１または配列識別番号３の補体またはその変異体から成るポリヌクレオチド 配列に関するものでもある。加えて、本発明では、ストリンジェントな条件下において配列識別番号１または 配列識別番号３にハイブリダイズするポリヌクレオチド配列にも特徴がある。本発明では、さらに、ポリペプチド、オリゴヌクレオチド、ペプチド核酸（PNA）、モルホリノ核酸（morpholinonucleic acid）、固定核酸（LNA）、断片、その一部またはアンチセンス分子、およびｐＤ５２またはｐＲＡ００６をコードするポリヌクレオチドから成る発現ベクターおよび宿主細胞を含む核酸配列に特徴がある。また、本発明では、ｐＤ５２またはｐＲＡ００６に対して 特異的に結合する抗体、および実質上精製されたｐＤ５２またはｐＲＡ００６ から成る医薬品組成物に特徴がある。また、本発明では、ｐＤ５２またはｐＲＡ００６のアゴニスト およびアンタゴニストの使用に特徴がある。
【００１０】
発明の簡単な説明
本タンパク質、ヌクレオチド配列、および方法について以下に説明するが、説明した特定の装置、プロトコル、細胞株、ベクターおよび試薬に本発明が限定されるものではなく、改変し得ることは当然のことながら共通認識とする。また、本詳細書で使用する専門用語は特定の実施例を説明する目的で用いたものに過ぎず、特許請求の範囲にのみ限定される本発明の範囲を限定することを意図するものではないことも当然のことながら共通認識とする。
【００１１】
請求の範囲および明細書中で用いている単数形の「或る」および「その（この）」の表記は、文脈から明らかにそうでないとされる場合を除いて複数のものを指す場合もあることに注意しなければならない。従って、例えば「宿主細胞」は複数の宿主細胞も含んで言及し、「抗体」は、１つ以上の抗体および当業者に公知の抗体等価物についても言及しており、その他に関しても同様に言及するものとする。本明細書中で用いる全ての専門用語および科学用語は、特に定義されている場合を除き、当業者に一般に理解されている意味と同じ意味を有する。本明細書中に記載する方法および材料に類似または 等価な方法および材料は、本発明の実践または検査で用いることができるが、好適な方法、装置、および材料をここに記載した。本明細書で言及する全ての刊行物は、本発明に関連し得る刊行物中で報告されている細胞株、ベクターおよび方法論について説明および開示する目的で、ここに引用することをもって本明細書の一部となす。本明細書のいかなる開示内容も、本発明が先行技術の効力によってこのような開示に対して先行する権利を与えられていないことを認めるものではない。
【００１２】
発明
本発明は、Ｄ５２様タンパク質およびＲＡ００６様タンパク質の新規機能の同定に基づくものである。本発明では、ｐＤ５２タンパク質が胚性の膵臓上皮、すい臓の島細胞、脂肪細胞において特異的に発現され、腸内陰窩細胞をマークすること、およびｐＲＡ００６タンパク質が中枢神経系および末梢神経系のみならず、すい臓の島細胞のサブセットや眼においても特異的に発現されることが記載されている。本発明は、ｐＤ５２またはｐＲＡ００６をコードするポリヌクレオチド およびポリヌクレオチドおよび（または） ポリペプチドから成る組成物に基づくものであり、また、代謝疾患、例えば糖尿病および肥満症のような脂肪および（または）炭水化物代謝を含む細胞に関連する疾患および障害、および神経変性疾患などの診断、試験、予防、または治療に対するこれらの組成物の使用法にも基づくものである。
【００１３】
本発明のニワトリｐＤ５２またはＲＡ００６をコードする核酸は、胚の膵芽において発現される遺伝子のホールマウント原位置スクリーンを通して、膵臓組織 cDNA ライブラリ （６日目） からの DeveloGen のクローン RA290 およびクローンＲＡ００６のそれぞれにおいて先ず識別された。
【００１４】
一実施例では、本発明には、胚性の膵臓上皮、すい臓の島細胞、脂肪細胞、および腸内陰窩細胞において特異的に発現されるＤ５２様タンパク質、配列識別番号２のアミノ酸配列を備えているポリペプチドが包含されるが、その符号は図１Ｂにおいて順番の１文字コードを使用した。ｐＤ５２は、その長さが218 のアミノ酸である。オープン・リーディングは、ヌクレオチド221 において ATP 開始コドンを発端とし、ヌクレオチド874において TAA 終止コドンで終了することが識別された（図２に太字で示した）。推定非翻訳領域、開始コドンからの上流領域および終結コドンからの下流領域には図中において下線が引かれている。１.本発明のタンパク質の計算分子量は23662.2 ドルトン、および理論的な pI は４.89 である。
【００１５】
予測アミノ酸配列は、公的に利用可能である GenBank データベースにて検索した。配列データベースの検索において、ｐＤ５２が、ウズラ（Coturnix coturnix japonica） R10 タンパク質（SPTREMBL- アクセッション番号: P79700; GenBank アクセッション番号 Y07757） およびヒトＤ５２（N8 タンパク質; SWISSPROT アクセッション番号: P55327; GenBank アクセッション番号 S82081）と相同性を有することが例えば見出された。具体的には、ｐＤ５２とウズラ R10 タンパク質は９４％の同一性を共有し、ｐＤ５２とヒトタンパク質Ｄ５２（N8 腫瘍発現促進遺伝子）は８４％の同一性を共有し、その発端はｐＤ５２のアミノ酸40 〜215が挙げられる。加えて、Ｄ５２に対して相同性を持つ配列が、ゼブラフィッシュ（Danio、Genbank アクセッション番号 BE558124）、線虫 （Genbank アクセッション番号 P55326）、およびキイロショウジョウバエ （Genbank アクセッション番号 AAF57690）において確認されている。
【００１６】
相同性に基づくと、ｐＤ５２タンパク質および各相同性タンパク質またはペプチドは少なくともある程度の活性を共有することが可能である。
【００１７】
複数配列アライメントは、本発明のタンパク質（ライン２、Ｄ５２＿ヒヨコ）を、ヒトＤ５２タンパク質（ライン４、標識済「Ｄ５２＿ヒト」; マウス（ライン３、「Ｄ５２＿マウス」）、およびウズラ（ライン１、「Ｄ５２＿ウズラ」）のような異なる種から取り出した関連タンパク質配列と比較する ClustalW （1.7） 分析において、ライン４に記載した本発明のタンパク質と共に図２に示した。
【００１８】
本発明のタンパク質は、SignalPep および PSort 検索プロトコルを用いて、その他のデータベースに対して検索した。本発明のＤ５２タンパク質は、細胞質に位置する可能性が高く、アミノ末端信号配列を有さないようである。
【００１９】
さらなる実施例においては、本発明には、中枢神経系および末梢神経系のみならず、すい臓の島細胞のサブセットや眼においても特異的に発現されるＲＡ００６様タンパク質、配列識別番号４アミノ酸配列から成るポリペプチドが包含されるが、その符号は図６Ｂにおいて順番の１文字コードを使用した。ｐＲＡ００６は、その長さが162 のアミノ酸である。オープン・リーディングは、ATP 開始コドンを発端とし、TGA 終止コドンで終了することが識別された（図６Ａに示した）。本発明のタンパク質の計算分子量は１8373.89 ドルトン、および理論的な pI は８.４９である。
【００２０】
予測アミノ酸配列は、公的に利用可能である GenBank データベースにて検索した。配列データベースの検索においては、ｐＲＡ００６と相同性を有する仮想ヒトタンパク質（Genbank アクセッション番号 CAB53688）、およびヒト EST （Genbank アクセッション番号 AL536254）、マウス EST （Genbank アクセッション番号 AA048465）、ゼブラフィッシュ EST （Genbank アクセッション番号 AW280893）、ウシ EST （Genbank アクセッション番号 BE479822）が例えば見出された。相同性に基づくと、pRA006 タンパク質および各相同性タンパク質またはペプチドは、少なくともある程度の活性を共有することが可能である。
【００２１】
BlastP 検索の結果を、本発明のタンパク質（「ヒヨコ」） を関連ヒトタンパク質配列（「ヒト」）と比較して図７に示した。ヒト仮想１８．５kDa タンパク質は、ニワトリＲＡ００６タンパク質に対して８１％相同性を持つ。
【００２２】
本発明のタンパク質は、SignalPep および PSort 検索プロトコルを用いて、その他のデータベースに対して検索した。本発明のＲＡ００６タンパク質は、細胞質に位置する可能性が高く、N 末端信号 配列を有さないようようである。
発現
本発明に記載のＤ５２タンパク質を用いた原位置ハイブリッド形成法実験は、５日目の ヒヨコ 胚（図３Ａ、Ｂ、およびＣ）上および切断された膵芽組織（図３Ｄ、Ｅ）上のホールマウントで行った。そのハイブリダイゼーションは、本発明のＤ５２転写物が胚性の膵臓上皮（pe、図３）に限って発現され、その周辺の間充織においては発現されないことを示す。
【００２３】
ヒト十二指腸（図４Ａ）およびヒトすい臓（図４Ｂ）を用いるハイブリダイゼーション実験は、腸の陰窩細胞（図４Ａ）およびすい臓膵島細胞（図４Ｂ）における本発明のタンパク質の特定の発現を示す。
【００２４】
図５は、種々の前脂肪細胞の細胞株におけるＤ５２発現の RT-PCR 分析を示す。Ｄ５２は、検査したすべての前脂肪細胞の細胞株において発現されたが、単一性線維芽細胞の細胞（NIH3T3）には非存在である。図６の下位パネルには、cDNA サンプルの健全性を制御するためのアクチンを描写した。
【００２５】
本発明に記載のＲＡ００６タンパク質を使用する原位置ハイブリッド形成法実験は、４日目（図８Ａ）および５日目のニワトリ胚 （図８ＢおよびＣ）、および切断された膵芽組織（図８ＤおよびＥ）および切断神経組織のホールマウント上で行なった。本ハイブリダイゼーションは、本発明の転写物がすい臓の島細胞（図８ＤおよびＥ）のサブセットに限って発現されることを示す。
【００２６】
神経管および背根神経節（図８Ｆ）の断面上で行なったハイブリダイゼーションでは、背根神経節のみならず、神経管の外側領域においても本発明のＲＡ００６転写物の特定発現を示す。
【００２７】
本発明には、ｐＤ５２またはｐＲＡ００６変異体も包含される。好適なｐＤ５２またはｐＲＡ００６変異型は、少なくとも８０％、およびより望ましくは９０％のアミノ酸配列類似性を、ｐＤ５２またはｐＲＡ００６アミノ酸配列（それぞれ配列識別番号２または配列識別番号４）に対して有する。最も好適なｐＤ５２またはｐＲＡ００６変異型は、少なくとも９５％のアミノ酸配列類似性を、配列識別番号１または 配列識別番号３に対してそれぞれ有する。
【００２８】
本発明には、ｐＤ５２またはｐＲＡ００６をコードするポリヌクレオチドも包含される。それ故に、ｐＤ５２またはｐＲＡ００６のアミノ酸配列をコードする任意の核酸配列を用いて、ｐＤ５２またはｐＲＡ００６を発現する組換え分子を生成することができる。特定の実施例では、本発明には、図１Ａに示した核酸配列 配列識別番号１または図６Ａに示した配列識別番号３から成るポリヌクレオチドが包含される。当業者にとっては当然のことながら、遺伝暗号の縮重の結果、ｐＤ５２またはｐＲＡ００６をコードする多数のヌクレオチド配列（一部は既知であり天然の遺伝子のヌクレオチド配列に対して最小の相同性を有する）を産生することが可能である。したがって本発明では、可能コドン選択に基づいた組み合わせの選択によって作製し得るような、ありとあらゆる可能性のあるヌクレオチド配列変異体が考慮されている。この組み合わせは、天然のｐＤ５２またはｐＲＡ００６のヌクレオチド配列に適用されるような標準トリプレット遺伝暗号に従って作製されるものであり、このような変異は全て特異的に開示されているものと考慮される。ｐＤ５２またはｐＲＡ００６およびその変異体をコードするヌクレオチド配列は、望ましくは好適に選択されたストリンジェントな条件下で天然のｐＤ５２のヌクレオチド配列に対してハイブリダイズ可能ではあるが、ｐＤ５２またはｐＲＡ００６をコードするヌクレオチド配列、または実質上異なるコドンの使用法を有する誘導体を産生することは有益であり得る。宿主が特定のコドンを利用する頻度に基づいて、特定の真核または原核宿主に発生するペプチドの発現率を高めるようにコドンを選択することが可能である。コードされたアミノ酸配列を変えることなくｐＤ５２またはｐＲＡ００６およびその誘導体をコードするヌクレオチド配列を実質上変更する別の理由には、天然の配列から作製される転写物より好ましい、例えば半減期が長いなどの特性を有する RNA 転写物の作製がある。本発明には、ｐＤ５２またはｐＲＡ００６およびその誘導体をコードする DNA 配列またはその部分を全て合成化学によって産生することも包含される。作製後にこの合成配列を、当分野で良く知られた試薬を用いて、種々の入手可能な発現ベクターおよび細胞系の何れの中にも挿入可能である。さらに、合成化学を用いて、ｐＤ５２またはｐＲＡ００６またはその任意の部分をコードする配列の中に突然変異体を導入することも可能である。
【００２９】
さらに本発明に包含されるのは、種々のストリンジェントな条件下で、請求項に記載のヌクレオチド配列、特に配列番号２または配列番号４またはその補遺で示される配列にハイブリダイズ可能なポリヌクレオチド配列である。ハイブリダイゼーション条件は、Wahl, G. M. および S.L. Berger （1987, Methods Enzymol.152:399-407） および Kimmel, A. R. （1987, Methods Enzymol.152:507-511）で教示されたように、核酸結合複合体またはプローブの溶解温度（Tm）に基づいており、定義されたストリンジェントでの使用が可能である。望ましくは、ストリンジェントな条件下のハイブリダイゼーションとは、１時間１x SSC および０．１％SDS（ドデシル硫酸ナトリウム）を用いて５０℃にて、望ましくは５５℃にて、より望ましくは６２℃にて、および最も望ましくは６８℃にて、特に１時間０．２x SSC および０．１％ SDS（ドデシル硫酸ナトリウム）中で５０℃にて、望ましくは５５℃にて、より望ましくは６2oC にて、および最も望ましくは６８℃にて洗浄後、正のハイブリダイゼーションシグナルが認められることを意味する。
【００３０】
本発明に包含されているｐＤ５２またはｐＲＡ００６をコードする変異核酸配列には、異なるヌクレオチドの欠損、挿入、または代替が含まれており、同一物または機能に同等なＲＡ００６をコードするポリペプチドを結果としてもたらす。コードされたタンパク質には、サイレント変化を産生し、機能的に等価なｐＤ５２またはｐＲＡ００６をもたらすアミノ酸残基の欠損、挿入または代替が含まれ得る。計画的アミノ酸置換は、ｐＤ５２またはｐＲＡ００６の生物学的活性が保持される限りにおいて、残基の極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性、および（または）両親媒性特性の類似性を基に行い得る。例えば、負に帯電したアミノ酸にはアスパラギン酸およびグルタミン酸が含まれ; 正に帯電したアミノ酸にはリジンおよびアルギニンが含まれ; および類似の親水性値を持つ非荷電極性ヘッドグループを有するアミノ酸には、ロイシン、イソロイシン、およびバリン; グリシンおよびアラニン; アスバラギンおよびグルタミン; セリンおよびトレオニン; フェニルアラニンおよびチロシンが含まれ得る。
【００３１】
また本発明の範囲内には、ｐＤ５２またはｐＲＡ００６をコードする遺伝子の対立遺伝子も含まれている。本明細書で使用されているように、「対立遺伝子」または「対立遺伝子配列」は、核酸配列において少なくとも１つの突然変異から生じ得る遺伝子の代替形態である。対立遺伝子は、構造または機能が変異し得るかどうかわからない変異 mRNAsまたはポリペプチドを結果としてもたらし得る。対立遺伝子を誘発する一般の突然変異性変化は通常、ヌクレオチドの自然欠損、付加、または置換に帰する。これらの各変化は、単独、またはその他の変化と共に、所定の配列内で１回以上生じ得る。
【００３２】
当分野で公知であり、一般に入手可能なDNA シーケンシングのための方法を用いて、本発明の任意の実施例を実行することが可能である。ｐＤ５２またはｐＲＡ００６をコードする核酸配列は、部分的ヌクレオチド配列を利用したり、当分野で周知の種々の方法を使用することによって伸長させ、プロモーターおよび調節要素などの上流配列を検出することができる。例えば、使用し得る方法の１つである「制限部位 PCR 法」は、ユニバーサル プライマーを用いて既知の遺伝子座に対して近傍する未知の配列を読み出す方法である（Sarkar, G. （1993） PCR Methods Applic.2:318-322）。逆 PCR 法も、既知の領域に基づいた分岐プライマーを用いて配列を増幅または伸長するために使用することが可能である（Triglia、T. らの Nucleic Acids Res.１6:8186）。プライマーは、オリゴ４.06 プライマー分析ソフトウェア（ミネソタ州プリモス市の National Biosciences Inc.）、または別の適切なプログラムを用いて、望ましくは長さが２２〜３０ヌクレオチド、GC 含有率が５０％以上、およびto 温度約６８〜７２℃の標的配列にアニールするようにデザインすることが可能である。
【００３３】
使用可能な別の方法としては、キャプチャ PCR 法があり、これにはヒトおよび酵母菌人工染色体 DNA における既知の配列に近傍する DNA 断片の PCR 増幅が含まれる（Lagerstrom、M. らの PCR Methods Applic.１:111〜119）。未知の配列を読み出すために使用可能な別の方法としては、Parker、J. D. らの方法が挙げられる（1991; Nucleic Acids Res.１9:3055-3060）。加えて、PCR 法、ネステッドプライマー、およびPROMOTERFINDER ライブラリを用いて、ゲノム DNA の中に入ることが可能である（カリフォルニア州の Clontech、Palo Alto）。このプロセスは、ライブラリをスクリーニングすることを回避し、イントロン接合部およびエキソン接合部を見つけるのに有用である。
【００３４】
完全長 cDNA をスクリーニングする際には、より大きな cDNA を含むようにサイズ選択されたライブラリを使用することが望ましい。また、ランダム プライム ライブラリには、遺伝子の５′領域を含む多くの配列が含まれているので望ましい。ランダム プライム ライブラリの使用は、オリゴ d（T）ライブラリが完全長 cDNA を産しない状況において特に望ましい。ゲノムライブラリは、5′および３′非転写調節領域への配列の伸長に対して有用であり得る。市販のキャピラリー電気泳動システムを用いて、シークエンシング産物または PCR 産物のサイズを分析したり、またはそのヌクレオチド配列を確認することができる。
【００３５】
本発明の他の実施例では、ｐＤ５２またはｐＲＡ００６または融合タンパク質またはその機能的等価物をコードするポリヌクレオチド配列またはその断片は、適切な宿主細胞内でｐＤ５２またはｐＲＡ００６の発現を誘導するために、組換え DNA 分子内で使用することが可能である。遺伝暗号固有の縮重により、実質的に同じあるいは機能的に等価のアミノ酸配列をコードする別の DNA 配列を産生することができ、これらの配列はｐＤ５２またはｐＲＡ００６をクローン化および発現するために利用することが可能である。当事者にとっては当然なことだが、非天然コドンを有するｐＤ５２またはｐＲＡ００６がコードするヌクレオチド配列を産生することは有益であろう。例えば、特定の真核宿主または原核宿主によって好適とされるコドンは、タンパク質の発現率を高めるため、または、例えば天然配列から生成された転写物の半減期よりも長い半減期などの好ましい特性を有する組換え RNA 転写を産生するために、選択することが可能である。本発明のヌクレオチド配列は、種々の目的でｐＤ５２またはｐＲＡ００６のコードする配列を変えるために、当分野で公知の方法を使用して組換えることができ、この目的には、遺伝子産物のクローン化、処理、および（または）発現などが含まれるが、これらに限定されるものではない。遺伝子断片および合成オリゴヌクレオチドのランダムなフラグメンテーションおよび PCR 再アセンブリによる DNA シャフリングを用い、ヌクレオチド配列を遺伝子操作することが可能である。例えば、部位特異的変異誘導を用いて、新規制限部位を挿入、グリコシル化のパターンを改変、コドン優先の変更、スプライス変異体の産生、または突然変異の導入、等々を行い得る。
【００３６】
本発明の他の実施例では、天然の核酸配列、修飾核酸配列またはｐＤ５２またはｐＲＡ００６をコードする組換え核酸配列を異種配列に連結反応させ、融合タンパク質をコードすることができる。例えば、ペプチドライブラリをｐＤ５２またはｐＲＡ００６活性のインヒビターに対してスクリーニングする際には、市販の抗体によって認識できるキメラｐＤ５２またはｐＲＡ００６タンパク質をコードすることは有用であろう。また、ｐＤ５２またはｐＲＡ００６が異種部分から切断および精製され得るようにするため、融合タンパク質が、ｐＤ５２またはｐＲＡ００６のコードする配列と異種タンパク質配列との間にある切断部位を含むように遺伝子操作することが可能である。他の実施例によれば、当分野で周知の化学的方法を用いて、ｐＤ５２またはｐＲＡ００６をコードする配列の全部または一部を合成することが可能である（Caruthers, M.H.らの（1980） Nucl. Acids Res. Symp. Ser.７:215-223, Horn, T.らの（1980）Nucl. Acids Res. Symp. Ser.７:225-232 を参照）。別法として、化学的方法を用いてタンパク質自体またはその一部を産生することが可能である。例えば、種々の固相技術を用いてペプチド合成を行うことができ（Roberge, J. Y.らの（1995）Science２69:202-204）、例えば ABI４31A ペプチド シンセサイザ（Perkin Elmer）を用いて自動合成を達成することが可能である。さらに、ｐＤ５２またはｐＲＡ００６のアミノ酸配列またはその任意の一部は、直接合成中に変異させることができ、および（または）変異型ポリペプチドを産生するために、化学的方法を使用して、別のタンパク質またはその任意の一部から得た配列と結合させることも可能である。
【００３７】
生物学的に活性なｐＤ５２またはｐＲＡ００６を発現するために、ｐＤ５２またはｐＲＡ００６をコードするヌクレオチド配列または機能的な等価物を好適な発現ベクターに挿入することができ、その発現ベクターとは、挿入されたコーディング配列の転写および翻訳に必要な要素を含むベクターを指す。当業者に周知の方法を用いて、ｐＤ５２またはｐＲＡ００６をコードする配列と、好適な転写および翻訳調節要素とを含む発現ベクターを構築することが可能である。これらの方法には、生体外組換え DNA 技術、合成技術、および生体内遺伝子組換え技術が含まれる。その技術は、Sambrook, J. らの（1989） Molecular Cloning、A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Press, Plainview, N.Y.、および Ausubel, F. M. らの（1989） Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, N.Y. に記載されている。
【００３８】
種々の発現ベクターと宿主系を利用して、ｐＤ５２またはｐＲＡ００６をコードする配列を保持および発現することが可能である。発現ベクターと宿主系には、組換えバクテリオファージ、プラスミドまたはコスミド DNA 発現ベクターで形質転換させた細菌や、酵母菌発現ベクターで形質転換させた酵母菌や、ウィルス発現ベクター（例えばバキュロウィルス）に感染した昆虫細胞系や、ウィルス発現ベクター（例えばカリフラワー モザイク ウィルス CaMV またはタバコ モザイク ウィルス TMV）または細菌発現ベクター（例えば Ti または pBR322 プラスミド）で形質転換させた植物細胞系、または動物細胞系の微生物などが含まれているが、これらに限定されるものではない。「調節要素」または「調節配列」は、転写および翻訳を行なうために宿主細胞タンパク質と相互作用する、ベクター・エンハンサー、プロモーター、５′および３′非翻訳領域の非翻訳領域である。利用されたベクターシステムおよび宿主にもよるが、構成型プロモーターおよび誘導型プロモーターなどの幾つかの適切な転写および翻訳要素を使用することが可能である。例えば、細菌系においてクローニングを行なう場合、BLUESCRIPT ファージミドのハイブリッド lacZ プロモーターのような誘導型プロモーター（カリフォルニア州ラ・ホヤの Stratagene）または PSPORT1 プラスミド（Gibco BRL）などを使用することが可能である。バキュロウィルス ポリヘドリン プロモーターは昆虫細胞において使用することが可能である。植物細胞のゲノム（例えば、熱ショックである RUBISCO; および保管タンパク質遺伝子など）または植物ウィルス（例えば、ウィルスプロモーターおよびリーダー配列）に由来するプロモーターおよびエンハンサーは、ベクターにクローニングすることが可能である。哺乳動物の細胞系では、哺乳動物の遺伝子または哺乳動物のウィルスからのプロモーターが望ましいとされる。の非翻訳領域をコードする配列の複数のコピーを含む細胞株を生成する必要がある場合には、SV40 または EBV6 に基づいたベクターが、適切な選択可能マーカーと共に使用することが可能である。
【００３９】
細菌系では、多数の発現ベクターが EBV6 の使用目的に応じて選択することが可能である。例えば、多量のｐＤ５２またはｐＲＡ００６が抗体の誘発のために必要とされる場合は、容易に精製される融合タンパク質の高レベル発現を誘導するベクターを使用することが可能である。そのようなベクターには、限定されるものではないが、多機能大腸菌クローニングおよび発現ベクター、例えば BLUESCRIPT ファージミド（Stratagene 社）、PIN ベクター （Van Heeke およびSchuster （1989）、J. Biol. Chem.264:5503-5509） または PGEX ベクター （Promega、Madison、Wis.）が含まれる。酵母菌、サッカロミセス セレビジエにおいて、α因子、アルコール オキシダーゼ、および PGH などの構成型プロモーターまたは誘導型プロモーターを含むいくつかのベクターを使用することが可能である。論評に関しては、前出の Ausubel ら、および Grant らの（1987） Methods Enzymol１53:516-544 を参照。
【００４０】
植物発現ベクターが使用される事例においては、Ｄ５２またはｐＲＡ００６をコードする配列の転写は、例えば、CaMV 由来の35S および19S プロモーターのようなウィルスプロモーター単独、または TMV （Takamatsu, N. （1987） EMBO J.6:307-311）由来のオメガリーダー配列との組み合わせ、または RUBISCO の小サブユニットまたは熱ショック プロモーターのような植物プロモーター（Coruzzi, G. らの（1984） EMBO J.3:1671-1680、Broglie, R. らの（1984） Science224:838-843、および Winter, J. らの（1991） Results Probl. Cell Differ.17:85-105）によって促進されることが可能である。これらの構成物は、直接 DNA 形質転換または病原体媒介性の形質移入によって、植物細胞内に導入することが可能である。そのような技術は、幾つかの一般に入手できる論評に記載されている（例えば、『マグローヒル科学技術年鑑』（The McGraw Hill Yearbook of Science and Technology （1992） McGraw Hill New York NY のHobbs, S.または Murry, L. E. ページ番号191-196 を参照）。
【００４１】
昆虫システムもｐＤ５２またはｐＲＡ００６を発現するために使用することが可能である。例えば、昆虫システムの１つでは、オートグラファ カリフォルニア ニュークレアの多面性ウィルス（AcNPV）がベクターとして使用され、ハスモンヨウ近似種（Spodoptera frugiperda）細胞または ウワバ（Trichoplusia）の幼虫における外来遺伝子を発現している。ｐＤ５２またはｐＲＡ００６をコードする配列は、ポリヘドリン遺伝子などのウィルスの不必須領域にクローニングされ、ポリヘドリン プロモーターの制御下に置くことが可能である。ｐＤ５２またはｐＲＡ００６の首尾良い挿入は、ポリヘドリン遺伝子を不活性にし、外殻タンパク質に欠ける組換えウィルスを産生する。その場合、組換えウィルスを用いて、ｐＤ５２またはｐＲＡ００６が発現され得る ウワバ（Trichoplusia）の幼虫の ハスモンヨウ近似種（S. frugiperda）細胞を感染することが可能である（Engelhard, E.K.らの （1994） Proc. Nat. Acad. Sci.91:3224-3227）。
【００４２】
哺乳動物の宿主細胞においては、いくつかのウィルスベースの発現系を利用することが可能である。発現ベクターとしてアデノウィルスを用いる場合、ｐＤ５２またはｐＲＡ００６をコードする配列は、後発プロモーターおよび３連リーダー配列から成るアデノウィルス転写と翻訳複合体に連結反応されることが可能である。ウィルス ゲノムの非必須 E1 または E3 領域への挿入により、感染した宿主細胞においてｐＤ５２またはｐＲＡ００６を発現する能力のある生ウィルスを得ることが可能である （Logan, J. および Shenk, T. （1984） Proc. Natl. Acad. Sci.81:3655-3659）。加えて、ラウス肉腫ウィルス（RSV）エンハンサーのような転写エンハンサーを用いて、哺乳動物の宿主細胞における発現を高めることが可能である。
【００４３】
特定の開始シグナルを用いて、ｐＤ５２またはｐＲＡ００６をコードする配列をより効果的に翻訳することも可能である。そのようなシグナルには、ATG 開始コドンおよび近傍する配列が含まれる。所望であれば、ATG 開始コドンを含む外来性翻訳調節シグナルを提供することも可能である。外来性の翻訳要素および開始コドンは、天然および合成の両方を含めた様々な起源の産物であり得る。発現の効率は、文献 （Scharf、D. らの（1994） Results Probl. Cell Differ.２0:125-162）に記載されたように、使用される特定の細胞系に対して適切なエンハンサーを包括することによって高めることが可能である。
【００４４】
長期にわたる、組換えタンパク質の高歩留産生のためには、安定した発現が望ましい。例えば、安定してｐＤ５２またはｐＲＡ００６を発現する細胞株は、複製発現因子および（または）内在性発現因子のウィルス起源を含み、選択可能マーカー遺伝子を同一ベクター上または別個のベクター上に含み得る発現ベクターを使用して、形質転換することが可能である。 ベクターを導入後、安定的に形質転換された細胞の選択を行なった。安定的に形質転換された細胞のクローンは、その細胞型に適した組織培養技術を用いて増殖することが可能である。形質転換細胞株、例えば単純ヘルペス・ウィルス・チミジン・キナーゼ遺伝子 （Wigler, M.らの （1977） Cell１1:223-32）およびアデニン・ホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子（Lowy, I. らの （1980） Cell22:817-23）を回収するためには、任意数の選択システムを使用することが可能である。それらの遺伝子はそれぞれ、tk-細胞または aprt-細胞において用いることができる。また、代謝拮抗物質、抗生物質または除草剤の耐性は、その選択基準として用いることができ、例としてはメトトレキセートに耐性を与える dhfr （Wigler, M. らの（1980） Proc. Natl. Acad. Sci.７7:3567-70）、アミノグリコシッド ネオマイシンおよび G-418 に耐性を与える npt （Colbere-Garapin, F.らの（1981） J. Mol. Biol.１50:1-14）、およびクロルスルフロン（chlorsulfuron）とホスフィノトリシン アセチルトランスフェラーゼ（phosphinotricin acetyltransferase）にそれぞれ耐性を与える als または pat （前出の Murry）などが挙げられる。追加の選択可能遺伝子、例えば、細胞がトリプトファンの代替としてインドールを利用することを可能にする trpB、または細胞がヒスチジンの代替としてヒスチノルを利用することを可能にする hisD などは（Hartman、S. C.およびR. C. Mulligan （1988） Proc. Natl. Acad. Sci.85:8047-51）に記載されている。最近、可視マーカーは好評を博しており、アントシアニン、β-グルクロニダーゼおよびその基質GUS、ルシフェラーゼおよびその基質ルシフェリンなどのマーカーは、形質転換体を同定するためだけではなく、特定のベクター系に依存する一過性または安定したタンパク質発現を定量化するために広範に使用されている（Rhodes、C. A. らの（1995） Methods Mol. Biol.55:121-131）。
【００４５】
対象の遺伝子の存在および（または）発現は、適切な方法によって確認することができる。これらの手順には、DNA-DNA または DNA-RNA ハイブリダイゼーション、核酸またはタンパク質の検出および（または）数量化のための膜系、溶液ベース、またはチップベースの技術を含むタンパク質生物学的試験法または免疫学的アッセイが含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００４６】
ｐＤ５２またはｐＲＡ００６をコードするポリヌクレオチド配列の存在は、プローブ、またはｐＤ５２またはｐＲＡ００６をコードするポリヌクレオチドの部分またはその断片を用いて、DNA-DNA または DNA-RNA ハイブリッド形成法、または増幅によって検出することが可能である。核酸の増幅基調アッセイは、オリゴヌクレオチドの使用、またはｐＤ５２またはｐＲＡ００６をコードする DNA または RNA を含んだ形質転換体を検出するためにｐＤ５２またはｐＲＡ００６をコードする配列に基づいたオリゴマーに関与する。本詳細書で使用された「オリゴヌクレオチド」または「オリゴマー」は、最低約１０ヌクレオチド、および約６０ほどのヌクレオチド、望ましくは約１5〜30 ヌクレオチド、およびより望ましくは 約２０〜２５ヌクレオチドの核酸配列を言及し、プローブまたはアンプリマーとして使用されることが可能である。
【００４７】
タンパク質に固有のポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体のどちらかを用いるｐＤ５２またはｐＲＡ００６の発現を検出および計測のためのさまざまなプロトコルは、当分野で周知である。実施例には、酵素免疫測定（吸着）法（ELISA）、放射免疫測定（RIA）、および蛍光細胞分析分離装置（FACS）が含まれる。ｐＤ５２またはｐＲＡ００６上の２つの非干渉エピトープに反応するモノクローナル抗体を用いた、2 部位モノクローナルベースのイムノアッセイが望ましいが、競合結合アッセイを用いることもできる。これらを含めた他の測定法は、Hampton、R. らの（ミネソタ州セントポール市、1990; Serological Methods, Laboratory Manual, APS Press）および Maddox、D. E. らの（1983; J. Exp. Med.158:1211-1216）の諸所に記載されている。
【００４８】
多岐にわたる標識技術および抱合技術が当業者に知られており、種々の核酸およびアミノ酸測定法において使用することが可能である。ｐＤ５２またはｐＲＡ００６をコードするポリヌクレオチドに関連する配列を検出するための、標識されたハイブリダイゼーション プローブまたは PCR プローブを生成する方法には、オリゴ標識化、ニックトランスレーション、末端標識化、または標識されたヌクレオチドを用いる PCR 増幅が含まれる。
【００４９】
あるいは、ｐＤ５２またはｐＲＡ００６をコードする配列、または その任意の一部分を mRNA プローブの産生のためのベクターにクローニングすることも可能である。このようなベクターは、当分野で周知であり、市販もされており、T7、T3、または SP6 および標識ヌクレオチドのような適切な RNA ポリメラーゼを追加することによって、生体外 RNA プローブの合成に使用することが可能である。このような手順は、市販されている種々のキット（ミシガン州カラマズーの Pharmacia & Upjohn 社）、Promega （ウィスコンシン州マディソン）、および U.S. Biochemical Corp.（オハイオ州クリーブランド）を用いて実行することが可能である。
【００５０】
使用可能な好適レポーター分子または標識には、基質、補助因子、阻害剤、磁力粒ばかりではなく、放射性核種、酵素、蛍光剤、化学発光剤、または発色剤も含まれる。
【００５１】
ｐＤ５２またはｐＲＡ００６をコードするヌクレオチド配列を用いて形質転換した宿主細胞は、細胞培地からのタンパク質の回収および発現に適した条件下で培養することが可能である。組換え細胞によって産生されたタンパク質は、使用される配列および（または）ベクターによるが、分泌または細胞内に含有せしめることが可能である。当業者であれば理解し得るように、ｐＤ５２またはｐＲＡ００６をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを、原核細胞膜または真核細胞膜を透過するｐＤ５２またはｐＲＡ００６の直接分泌を誘導するシグナル配列を含むように設計することが可能である。別の組換え構造を用いて、ｐＤ５２またはｐＲＡ００６をコードする配列を、水溶性タンパク質の精製を促進するポリペプチドドメインをコードするヌクレオチド配列に結合することが可能である。そのような精製を促進するドメインには、固定化金属上での精製を可能にするヒスチダイン トライトファン分子などの金属キレート ペプチド、固定化免疫グロブリン上の精製を可能にするタンパク質 A ドメイン、および FLAG 伸長・親和性精製システム（Immunex Corp., Seattle, Wash.）で利用されるドメインなどが含まれるが、これらによって限定されるものではない。精製 ドメインとｐＤ５２またはｐＲＡ００６との間にある XA 因子またはエンテロキナーゼ（腸活素）（カリフォルニア州のサンディエゴ市の Invitrogen 社）に対して特異的であるような切断可能リンカー配列の包括を用いて、精製を促進することが可能である。そのような単一発現ベクターは、ｐＤ５２またはｐＲＡ００６を含む融合タンパク質の発現、チオレドキシンまたはエンテロキナーゼ（腸活素）切断部位に先行する、6 ヒスチダイン残基をコードする核酸を提供する。エンテロキナーゼ（腸活素）切断部位は、融合タンパク質からｐＤ５２またはｐＲＡ００６を精製する手段を提供する一方、ヒスチダイン残基は、Porath, J. らの（1992）, Prot. Exp. Purif.3:263-281 に記載されたとおり IMIAC （固定化金属イオン親和性クロマトグラフィー）上での精製を促進する。融合タンパク質を含むベクターの論考は、Kroll, D. J. らの（1993; DNA Cell Biol.１2:441-453）に提供されている。組換え産生に加えてｐＤ５２またはｐＲＡ００６の断片は、固相技術 （Merrifield J. （1963） J. Am. Chem. Soc.85:2149-2154）を用いてペプチド合成を誘導することによって産生することが可能である。タンパク質合成は、手動または自動の何れの技術によっても実行することが可能である。自動合成は、例えば Applied Biosystems の４31A ペプチド シンセサイザ（Perkin Elmer）を用いて行なうこと可能である。ｐＤ５２またはｐＲＡ００６の種々の断片は、完全長分子を産生するために、化学的方法を使用して、個別に化学的な合成および結合を行なうことが可能である。
【００５２】
診断および治療
本発明のタンパク質は、膵臓上皮に存在すると推定される膵島細胞およびすい臓幹細胞のような、すい臓細胞において特異的に発現される。ｐＤ５２は、さらに十二指腸の腸内陰窩に存在している成体幹細胞ｊにおいて発現され、繊維芽細胞の前脂肪細胞への分化にも関与する。ＲＡ００６はさらに、中枢神経系および末梢神経系のみならず、眼においても発現される。つまり、本発明の核酸およびタンパク質は、特定の細胞型を同定するための識別用のマーカーとして有用である。さらに、本発明の核酸およびタンパク質は、例えば、限定するものではないが、糖尿病および肥満症のような代謝障害および機能障害、および神経変性疾病、および特に上記細胞型に関連する疾患や障害に関連する診断用途および治療用途において有用である。従って本発明のタンパク質は、診断マーカーとして、および（または）エフェクター分子のための標的、例えば小分子として、糖尿病および（または）肥満症およびその他の代謝障害およびその他の疾患の治療において有用である。
【００５３】
本発明の望ましい治療を目的とした用途は、例えば下記が挙げられるが、これらに限定されるものではない: （i）タンパク質治療、（ii）小分子薬剤標的、（iii）抗体標的（治療、診断、薬剤標的と細胞毒性抗体）、（iv）診断および（または）予後マーカー、（v）遺伝子療法（遺伝子導入と遺伝子除去）、（vi）研究ツール、および（vii）生体外および生体内における組織再生（これらの組織に由来する組織および細胞型を含む全ての組織および細胞型の再生）。
【００５４】
本発明の核酸およびタンパク質は、種々の疾患および障害に関係する治療目的および障害において有用である。例えば、これらに限られるものではないが、本発明のｐＤ５２様タンパク質またはｐＲＡ００６様タンパク質をコードする cDNA は、遺伝子療法に有用であり、本発明のｐＤ５２様タンパク質またはｐＲＡ００６様タンパク質は、それを必要とする被験者に投与された場合に有用である。例証として、本発明の組成物は、例えば、限定するものではないが、肥満症および糖尿病のような代謝障害およびその他の疾患および障害に苦しむ患者の治療に対して有効性を有するであろう。本発明のｐＤ５２様タンパク質またはｐＲＡ００６様タンパク質をコードする新規核酸、またはその断片は、核酸またはタンパク質の存在または量が算定されるべき診断用途においてもさらに有用であり得る。
【００５５】
さらに、本発明の新規物質に対して免疫特異的に結合する抗体を治療または診断方法において使用することも可能である。
【００５６】
例えば一実施態様においては、アンタゴニストとして直接的に、またはｐＤ５２またはｐＲＡ００６を発現する細胞や組織に薬剤をもたらす標的または輸送機構として間接的に、ｐＤ５２またはｐＲＡ００６に特異な抗体を用いることができる。その抗体は、当分野で周知の方法を用いて生成することが可能である。このような抗体には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、一本鎖、Fab 断片、および Fab 発現ライブラリによって産生された断片が含まれるが、これらに限定されるものではない。中和抗体（即ち二量体の形成を抑制する抗体）は特に治療用に好適である。
【００５７】
抗体の産生のためには、ヤギ、ウサギ、ラット、マウス、ヒト、その他を含む種々の宿主は、免疫抗原性の特性を有するｐＤ５２またはｐＲＡ００６または断片またはそのオリゴペプチドを注入することによって免疫化することが可能である。宿主の種によるが、種々のアジュバントを用いて、免疫応答を高めることが可能である。このようなアジュバント（免疫賦活剤）には、フロイントアジュバントと、水酸化アルミニウムなどのミネラルゲルアジュバントと、リゾレシチン、プルロニックポリオル、ポリアニオン、ペプチド、油性乳剤、キーホールリンペットヘモシニアン、ジニトロフェノールなどの界面活性剤とがあるが、これらに限定されるものではない。ヒトに使用されるアジュバントの中では、BCG （カルメット‐ゲラン杆菌）およびコリネバクテリウム パルヴムが特に望ましい。ｐＤ５２またはｐＲＡ００６に対する抗体を誘導するために用いるペプチド、断片またはオリゴペプチドは、少なくとも約５のアミノ酸からなり、より望ましくは少なくとも約１0 のアミノ酸からなるアミノ酸配列を有するものが望ましい。ｐＤ５２またはｐＲＡ００６アミノ酸の短い伸長部は、キメラ分子に対して産生されたキーホールリンペットヘモシニアンおよび抗体などの、別のタンパク質の伸長部と融合することが可能である。
【００５８】
ｐＤ５２またはｐＲＡ００６に対するモノクローナル抗体は、抗体分子を産生する任意の技術を用いて、培養液内の連続した細胞株によって調製することが可能である。これらには、ハイブリドーマ技術、ヒト B 細胞ハイブリドーマ技術、および EBV ハイブリドーマ技術（Keohler、G. らの （1975） Nature２56:495-497; Kozbor、D. らの （1985）J. Immunol. Methods８1:31-42; Cote、R. J. らの Proc. Natl. Acad. Sci.８0:2026-2030; Cole、S. P. らの （1984）Mol. Cell Biol.６2:109-120）が含まれるが、それらに限定されるものではない。加えて、「キメラ抗体」を産生するために開発された技術、好適な抗原特異性および生物学的活性を有する分子を得るためにマウス抗体遺伝子のヒト抗体遺伝子に対するスプライシングを使用することが可能である （Morrison, S. L. らの （1984） Proc. Natl. Acad. Sci.８1:6851-6855; Neuberger, M. S. et al （1984） Nature３12:604-608; Takeda, S. らの （1985） Nature３14:452-454）。あるいは、一本鎖抗体を産生するために記述された技術を適用し、当分野で周知の方法を使用して、pＤ５２またはｐＲＡ００６特異性の一本鎖抗体を産生することが可能である。関連特異性を有するが、固有イディオタイプ成分の一部でもある抗体は、ランダムな組み合わせの免疫グロブリンライブラリからのチェーンシャフリングによって生成することが可能である（Burton、D. R. （1991） Proc. Natl. Acad. Sci.８8:11120-3）。抗体の産生は、リンパ球集団における生体内の産生の誘導によって、または組換え免疫グロブリンライブラリのスクリーニングまたは文献に開示されているような高特異結合試薬パネルのスクリーニングによっても行なうことが可能である（Orlandi, R. らの （1989） Proc. Natl. Acad. Sci.８6:3833-3837、Winter, G. らの （1991） Nature３49:293-299）。
【００５９】
ｐＤ５２またはｐＲＡ００６のための特異結合部位を有する抗体を産生することも可能である。例えば、そのような断片には、抗体分子のペプシン消化によって産生できる F（ab'）2 断片、および F（ab'）2 のスルフィド架橋を還元することによって生成できる Fab 断片が含まれるが、それらに限定されるものではない。あるいは、Fab 発現ライブラリを作製することによって、所望の特異性を有するモノクローナル Fab 断片の迅速かつ容易な同定を行なうことができる（Huse, W. D. らの（1989） Science２54:1275-1281）。
【００６０】
本発明の別の実施例では、ｐＤ５２またはｐＲＡ００６をコードするポリヌクレオチドまたはその断片またはアンチセンス分子を治療目的で使用することが可能である。一実施態様において、ｐＤ５２またはｐＲＡ００６をコードするアンチセンス分子は、mRNA の転写を阻止することが望ましい状況において使用することが可能である。具体的には、pＤ５２またはｐＲＡ００６をコードするポリヌクレオチドに補遺的な配列を利用して細胞を形質転換することができる。このようにアンチセンス分子を用いてｐＤ５２またはｐＲＡ００６活性を調節すること、または遺伝子機能を調節することができる。今このような技術は当分野では周知であり、センスまたはアンチセンスのオリゴマーまたは大きな断片を、ｐＤ５２またはｐＲＡ００６をコードする配列のコード領域または制御領域に沿ったさまざまな位置から設計することが可能である。レトロウィルス、アデノウィルス、ヘルペスまたはワクチニア ウィルス、または種々の細菌プラスミドに由来する発現ベクターを用いて、ヌクレオチド配列を標的器官、組織または細胞集団に送達することが可能である。当業者に周知の方法を用いて、ｐＤ５２またはｐＲＡ００６をコードする遺伝子のポリヌクレオチドに補遺的なアンチセンス分子を発現する組換えベクターを構築することが可能である。これらの技術は、Sambrook ら（前出）および Ausubel ら（前出）の両方の文献に記載されている。ｐＤ５２またはｐＲＡ００６をコードする遺伝子は、ハイレベルのポリヌクレオチドを発現する発現ベクターまたはｐＤ５２またはｐＲＡ００６をコードするその断片を用いて、細胞または組織を形質転換することによって、オフにすることがでる。そのような構成物を用いて、翻訳不可能なセンス配列またはアンチセンス配列を細胞に導入することが可能である。DNA への組み込みが不在の場合でさえ、そのようなベクターは、RNA 分子が内在性ヌクレアーゼ（核酸分解酵素）によって使用不可能になるまで、継続して RNA 分子を転写することが可能である。一過性の発現は、非複製ベクターによって１ヶ月以上持続することが可能であり、さらに適切な複製要素がそのベクター系の一部である場合には、より長く持続することが可能である。
【００６１】
上述のように、プロモーター、エンハンサー、イントロンなどのｐＤ５２またはｐＲＡ００６をコードする遺伝子の制御領域に対して、アンチセンス分子、DNA、RNA、または PNA を設計することによって遺伝子発現を修飾することができる。転写開始部位（例えば始動部位から -10 と +10 の間）由来のオリゴヌクレオチドが望ましい。同様に、「三重らせん」塩基対の形成方法を用いて抑制が可能となる。三重らせん対合が有用であるのは、三重らせん対合は、ポリメラーゼ、転写因子または調節分子の結合に対して二重らせんが充分に開くような能力を阻害するためである。三重らせん DNA を用いる最近の治療の進歩は文献に記載されている（Gee, J. E. らの （1994） In; Huber, B. E. and B. I. Carr, Molecular and Immunologic Approaches, Futura Publishing Co., Mt. Kisco, N. Y.）。アンチセンスもまた、転写物のリボソームに対する結合を防止することによって、mRNA の翻訳を阻止する目的でデザインすることが可能である。
【００６２】
酵素性 RNA 分子であるリボザイムは、RNA の特異的切断を触媒するために使用することが可能である。リボザイム作用のメカニズムは、内ヌクレオチド結合分解性の切断に先立つ相補的標的 RNA へのリボザイム分子の配列特異性ハイブリダイゼーションに関与している。使用できる実施例には、pＤ５２またはｐＲＡ００６をコードする配列の内ヌクレオチド結合分解性の切断を特異的且つ効果的に触媒する組換え型のハンマーヘッド型リボザイム分子が含まれる。任意の潜在的 RNA 標的内の特異性リボザイム切断部位は、GUA、GUU、およびGUC 配列を含めたリボザイム切断部位に対する標的分子をスキャンすることによって、初めに同定する。ひとたび同定すると、標的遺伝子の領域に対応し、切断部位を含む１5〜20 リボヌクレオチド間の短い RNA配列は、オリゴヌクレオチドを機能不全にするような二次構造機能に対して評価することが可能となる。候補標的の適合性の評価も、リボヌクレアーゼ保護アッセイを用いて相補的オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションの実施容易性をテストすることによって行うことができる。
【００６３】
本発明のアンチセンスおよびリボザイムは、核酸分子合成のために当分野で知られている任意の方法を用いて調製することが可能である。これらの方法には、固相フォスフォアミダイト化合合成のようなオリゴヌクレオチドを化学的に合成する技術が含まれる。或いは、pＤ５２またはｐＲＡ００６をコードするDNA配列の生体外および生体内転写によってRNA分子を産生し得る。このような DNA 配列は、T7 または SP6 のような好適なRNA ポリメラーゼ プロモーターを用いて、種々のベクターに組み込むことが可能である。あるいは、アンチセンス RNA を構成的または誘導的に合成するこれら cDNA 構成物は、細胞株、細胞または組織内に導入することができる。RNA 分子を修飾して、細胞内の安定性および半減期を向上することが可能である。可能な修飾には、分子の５′末端および（または）３′末端でのフランキング配列の追加、または ホスホロチオネートの使用、または分子の背骨連鎖内のホスホジエステラーゼ連鎖ではなく２′O-メチルが含まれるが、それらに限定されるものではない。さらに、 核酸背骨は、PNA 産生における場合のように、ペプチド背骨によって修飾（例えば置換）することも可能である。さらに、アセチル系、メチル系、チオ系および同様にアデニン、シチジン、グアニン、チミン、および（または）ウリジンの修飾された形態のみならず、イノシン、クエオシン、およびワイブトシンのような非従来型塩基も使用することが可能であるが、それらは内在性エンドヌクレアーゼによって容易に認識されるものではない。
【００６４】
ベクターを細胞または組織に導入するための多数の方法を利用することが可能であり、それらの方法は生体内、生体外、および生体内外交通の使用に等しく適している。生体内外交通治療では、ベクターは、患者から採取した幹細胞内に導入し、同一患者に自家移植で戻すためにクローン増殖することが可能である。形質移入およびリポソーム注入による送達は、当分野で周知である方法用いて達成することが可能である。上記の治療方法はいずれも、例えば、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ウサギ、サル、および最も望ましくはヒトなどの哺乳動物を含めた、好適な被験体に適用することが可能である。
【００６５】
本発明の追加実施例は、上述した任意の治療効果対して、医薬用に許容できるキャリアと併せて、医薬品組成物の投与に関するものである。そのような医薬品組成物には、Ｄ５２核酸またはＲＡ００６核酸、ｐＤ５２またはｐＲＡ００６、ｐＤ５２またはｐＲＡ００６に対する抗体、ＰＤ５２またはｐＲＡ００６の擬態、アゴニスト、アンタゴニスト、または阻害剤から選択された活性成分が含まれ得る。本組成物は単独で投与することができるが、少なくとも１つの安定化化合物などの他剤と共に投与することもでき、その場合には、例えば生理食塩水、緩衝生理食塩水、デキストロースおよび水など（これらに限定されない）の消毒した生物学的に適合な医薬品キャリアを用いて投与ができる。本組成物は単独で患者に投与することができるが、他剤、薬剤またはホルモンと共に投与することも可能である。本発明に用いられる医薬品組成物は、幾つもの経路によって投与することができ、その経路には経口、静脈内、筋肉内、動脈内、骨髄内、クモ膜下腔内、心室内、経皮、皮下、腹腔内、鼻腔内、腸内、局所、舌下または直腸があるが、これらに限定されるものではない。
【００６６】
その活性成分に加えて、これらの医薬品組成物は、医薬用に使用することができる、活性化合物の製剤への処理を促進する、賦形剤および助剤を備えている好適な医薬用に許容できるキャリアを包含し得る。および投与に関する技術の詳細は、Remington's Pharmaceutical Sciences （ペンシルベニア州イーストンの Maack Publishing Co.）の最新版を参照。経口投与用の医薬品組成物は、当分野で公知の医薬用に許容できるキャリアを使用して、経口投与に好適な投与量で製剤することができる。このようなキャリアを用いると、患者による摂取のために、医薬品組成物を錠剤、丸薬、糖衣錠、カプセル、液剤、ゲル剤、シロップ剤、スラリー、懸濁液、その他に製剤することが可能となる。
【００６７】
経口用の医薬品の製剤は、活性化合物の固形賦形剤との組み合わせを介して得られるが、オプションとして、得られた混合物を粉砕し、好適な助剤を加えた後にその顆粒混合物の処理を行ない、所望であれば、錠剤または糖衣錠の核を得ることもできる。好適な賦形剤としては、炭水化物またはタンパク質の充填剤、ラクトース（乳糖）、サッカロース（蔗糖）、マニトール,またはソルビトールを含む糖など; トウモロコシ、小麦、米、ポテト、または他の植物からのでんぷん;  メチルセルロース、ハイドロキシプロピルメチル-セルロース、またはナトリウム カルボキシメチルセルロースなどのセルロース; アラビアおよびトラガカントを含むゴム;およびゼラチンおよびコラーゲンなどのタンパク質などが挙げられる。所望であれば、相互リンクされたポリビニール ピロリドン、寒天、アルギン酸など、またはアルギン酸ナトリウムなどのその塩などのような崩壊剤または可溶化剤を加えることが可能である。糖衣錠核は、濃縮砂糖水などのような好適なコーティングと共に使用することができ、そのコーティングには、アラビア産ゴム、タルク、ポリビニールピロリドン、carbopol ゲル、ポリエチレングリコール、および（または）チタニウム酸化物、漆液、および好適な有機溶剤または混合溶剤を含み得る。製品を識別するためや、活性化合物の量（投薬量）を特徴付けるために、色素または顔料を錠剤または糖衣錠コーティングに添加することができる。経口剤として使用できる医薬品製剤には、ゼラチン製のソフトで密封されたカプセルおよびグリセロームまたはソルビトールのようなコーティングのみならず、ゼラチン製の押しバメ式カプセルも含まれている。押しバメ式のカプセルには、ラクトース（乳糖）またはでんぷん、滑剤など、タルクまたはステアリン酸マグネシウムなどのような充填剤または結着剤、そしてオプションとして安定剤などと混合された活性成分が含まれ得る。ソフトカプセルの場合に活性化合物は、脂肪油、液体,または液体ポリエチレングリコールなどの好適な液剤物に、安定剤の有無に係わらず溶解または懸濁することができる。
【００６８】
非経口的投与に好適な医薬品は、水溶液中、望ましくは、ハンク溶液、リンゲル溶液、または緩衝生理食塩水のような、生理学的に適合性のある緩衝液中でで製剤することが可能である。水溶性注射剤の懸濁液には、カルボキシルメチル セルロース ナトリウム、ソルビトール、またはデキストランなどの懸濁液の粘度を増大させる物質を保持し得る。加えて、活性化合物の懸濁液は、適切な油質の注射用懸濁液として調製することが可能である。好適な脂肪親和性溶剤または媒介物には、ごま油のような脂肪油、またはオレイン酸エチルまたはトリグリセリド（中性脂肪）のような合成脂肪酸エステル、またはリポソームなどが含まれる。オプションとして、懸濁液には、高度に濃縮された溶液の調製を可能にするために、化合物の溶解度を増大させる好適な試薬または安定剤も保持させることができる。
【００６９】
局所投与または鼻用投与用の場合には、浸透される特定の障壁に対して適切な浸透剤を製剤おいて使用する。そのような浸透剤は当分野で公知である。
【００７０】
本発明の医薬品組成物は、当分野で周知であるような方法で製造することができ、それらの手段としては、従来の混合、溶解、造粒、糖衣錠製造、研和、乳化、カプセル化、取り込み、または凍結乾燥工程などがあげられる。本医薬品成分は、塩として供給することが可能であり、多くの酸と共に形成することができ、例としては、塩酸、硫酸、酢酸、乳酸、酒石酸、リンゴ酸、琥珀酸などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。その他の事例における好適な調製は、下記のいずれかを含む凍結乾燥粉末であり得る:１〜50 mM ヒスチダイン、０．１〜２％サッカロース（蔗糖）、および２〜７％マニトール、pH 範囲４．５〜５．５。尚、これらは使用前に緩衝液と結合させるものとする。本医薬品組成物が調製された後には、適切な容器に充填し、適応条件の治療のために標識する。ｐＤ５２またはｐＲＡ００６の投与に対する標識には、投与の量、頻度、および方法が明記される。
【００７１】
本発明に好適な医薬品組成物には、活性成分が所望の目的を達成するために有効な量で含有されているような成分が含まれる。有効投与量の決定は、当業者の能力の範囲内で行うものとする。任意の化合物に対する初期の治療の有効投薬量は、細胞培養アッセイ、例えば preadipoctic 細胞株の細胞培養アッセイにおいて、または動物モデル、通常マウス、ウサギ、イヌまたはブタなどにおいて推定することができる。動物モデルはまた、好適な濃度範囲および投与経路を決定するためにも使用することが可能である。次にはこのような情報を用いて、ヒトに対する有益な投与量および投与経路を決定することができる。治療に有効な投与量とは、特定の状態を治療するために有効である活性成分の量、例えば、ｐＤ５２またはｐＲＡ００６またはその断片、およびｐＤ５２またはｐＲＡ００６ の抗体の量を参照する。治療有効度および（can）毒性は、細胞培養または動物実験における標準的な医療品手法によって決定することができ、その例としては、ED50（集団の５０％の治療的有効量）および LD50（集団の５０％の致死量）などが挙げられる。治療効果と毒性効果の間の投与量の比は、治療指数であり、LD50/ED50 比率として表すことができる。高い治療指数を示す医薬品組成物が望ましい。細胞培養アッセイおよび動物実験から得たデータは、ヒト用のさまざまな投与量の製剤に使用する。そのような組成物に含まれる投与量は、毒性を殆ど持たない ED50 を含む循環濃度の範囲内にあることが望ましい。投与量は、投与量の採用元（dosage from employed）、患者の感受性、および投与の経路によって、この範囲内で変わる。正確な投与量は、治療を必要とする被験者に関する要因を考慮して、現場の医師が決定することになる。投与量および投与法は、十分なレベルの活性部を提供するため、または所望の効果を維持するように調節する。配慮されるべき要因には、疾患の重症度、患者の身体全体の健康状態、患者の年齢、患者の体重および性別、食習慣、投与の時間と頻度、薬剤の組み合わせ、反応感受性、および治療に対する耐性と反応が含まれる。長時間効果のある医薬品組成物は、特定の製剤の半減期およびクリアランス率にもよるが、３〜４日毎、１週間毎、または２週間毎に１回の間隔で投与することが可能である。通常の投与量は、投与経路にもよるが、約 0.1〜100,000 マイクログラムと異なり、合計投与量は約１グラムまでとする。特定の投与量および送達の方法に関する指針は文献に記載されており、当分野の実務者はそれを利用することができる。当業者は、タンパク質または阻害剤用の製剤とは異なったヌクレオチド用製剤を用いる。同様に、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの送達も、特定の細胞、状態、位置などに対して特異的なものとなる。
【００７２】
別の実施例では、ｐＤ５２またはｐＲＡ００６を特異的に結合する抗体は、ｐＤ５２またはｐＲＡ００６の発現によって特徴付けられる状態または疾患の診断、またはｐＤ５２または pRA006、アゴニストまたはインヒビターで治療を受けている患者をモニターするためのアッセイに用いられる。診断目的に有用な抗体は、上記の治療で記載した方法と同様の様式で調製することが可能である。pＤ５２またはｐＲＡ００６の診断アッセイには、抗体および標識を利用してヒトの体液、または細胞や組織の抽出物にあるｐＲＡ００６を検出する方法が含まれる。抗体は、その修飾の有無に拘わらず使用することができ、その結合性の共有、非共有に拘わらずにレポーター分子で結合して標識化することができる。当分野で周知の種々のレポーター分子を使用することが可能であり、そのいくつかのレポーター分子を上記した。
【００７３】
ｐＤ５２またはｐＲＡ００６を測定するための ELISA、RIA、および FACS を含む種々のプロトコルは、当分野では周知であり、改変または異常レベルのｐＤ５２またはｐＲＡ００６発現を診断する基準を提供する。ｐＤ５２またはｐＲＡ００６発現の正常値または標準値は、複合体の形成に適した条件下で、正常な哺乳動物から、望ましくはヒトから採取した体液または細胞をｐＤ５２またはｐＲＡ００６に対する抗体と結合させて確定する。標準複合体形成量は、種々の方法によって定量化できるが、測光的な手段を用いることが望ましい。生検細胞の制御サンプルおよび疾患サンプル中に発現したｐＤ５２またはｐＲＡ００６の量を標準値と比較する。標準値と被験体の値の偏差は、疾患の診断のためのパラメータを確定する。
【００７４】
別の実施例によれば、ｐＤ５２またはｐＲＡ００６をコードするポリヌクレオチドを診断目的に使用することが可能である。使用可能なポリヌクレオチドには、オリゴヌクレオチド配列、アンチセンス RNA および DNA 分子、および PNA が含まれる。ポリヌクレオチドを用いて、ｐＤ５２またはｐＲＡ００６の発現と相関関係にあり得る生検組織内の遺伝子発現を検出し、定量化することができる。診断アッセイを用いて、ｐＤ５２またはｐＲＡ００６の不在、存在および過剰発現を区別すること、および治療介入中にｐＤ５２またはｐＲＡ００６レベルの調節を監視することが可能である。
【００７５】
一実施形態では、ｐＤ５２またはｐＲＡ００６または近縁の分子をコードするゲノム配列を含むポリヌクレオチド配列を検出することが可能な PCR プローブを用いたハイブリダイゼーションを使用して、ｐＤ５２またはｐＲＡ００６をコードする核酸配列を同定することが可能である。プローブの特異性（その作成が高特異領域または低特異領域のいずれなのかによって変わる）、およびハイブリダイゼーションのストリンジェンシー、または増幅（高、中、または低）は、プローブの同定するものがｐＤ５２またはｐＲＡ００６をコードする天然配列のみなのか、対立遺伝子なのか、それとも関連する配列であるのかどうかを決定する。プローブはまた、関連する配列の検出に用いることも可能であり、配列をコードする任意のｐＤ５２またはｐＲＡ００６からのヌクレオチドの少なくとも５０％を含んでいることが望ましい。本発明のハイブリダイゼーションプローブは、 DNA あるいは RNA であり得て、配列識別番号１または 配列識別番号３のヌクレオチド配列、またはプロモーター、エンハンサーエレメント、および天然ｐＤ５２またはｐＲＡ００６遺伝子のイントロンを含むゲノム配列に由来する。ｐＤ５２またはｐＲＡ００６をコードする DNA に対して特異的なハイブリダイゼーションプローブ産生の手段には、ｐＤ５２またはｐＲＡ００６またはｐＤ５２またはｐＲＡ００６の誘導体を mRNA プローブの産生のためのベクターにコードする核酸配列のクローニングが含まれる。当分野で知られかつ市販されているそのようなベクターを用いて、適切な RNA ポリメラーゼおよび適切に標識されたヌクレオチドを追加する手段によって、生体外 RNA プローブを合成することが可能である。ハイブリダイゼーションプローブは、種々のレポーター集団によって標識することができ、その例としては３2P または３5S などの放射性核種、またはアビジン結合系やビオチン結合系を介してプローブに結合されたアルカリホスファターゼなどの酵素標識などが挙げられる。
【００７６】
Ｄ５２またはＲＡ００６に特異的なポリヌクレオチド配列は、Ｄ５２またはＲＡ００６の発現に関連する状態または疾患の診断のために使用することが可能である。 そのような状態または疾患の実施例には、糖尿病を含む膵臓の疾患および障害が含まれるが、それらに限定されるものではない。Ｄ５２またはＲＡ００６に特異的なポリヌクレオチド配列を用いて、糖尿病を含む膵臓の疾患および障害に対して治療を受けている患者の進歩状況を監視することが可能である。ポリヌクレオチド配列は、変異Ｄ５２またはＲＡ００６の発現を検出するために患者の生検から採取した体液または組織を利用して、サザン法、ノーザン法、ドットブロット法またはその他の膜ベースの技術、および PCR 法、またはディップスティック法、ピンアッセイ、ELISA アッセイまたはチップアッセイにおいて使用することができる。このような定量方法または定性方法は当分野で公知である。
【００７７】
特定の実施形態では、Ｄ５２またはＲＡ００６をコードするヌクレオチド配列は、肥満症のほかに、上記のような関連障害もまた含む種々の代謝疾患および障害の活性化または誘発を検出する測定法において有用であり得る。ヌクレオチド配列は、標準法で標識化されることが可能であり、ハイブリダイゼーション複合体の形成に好適な条件下で、患者から採取した体液または組織の試料に添加することが可能である。好適なインキュベーション期間の後、その試料を洗浄して、そのシグナルを定量化し、標準値と比較する。試料におけるｐＤ５２またはｐＲＡ００６をコードするヌクレオチド配列の変異レベルの存在は、関連疾病の存在および（または）重症度を示すものである。このような測定法を用いても、動物研究、臨床試験、または個々の患者の治療の監視において、特定の治療上の療法の有効性を評価することが可能である。
【００７８】
ｐＤ５２またはｐＲＡ００６の発現に関連する疾患の診断に対する基準を提供するため、発現に対する正常概要または標準概要を確定する。これを達成するには、ハイブリダイゼーションまたは増幅に好適な条件下で、動物またはヒトの正常な被験者から抽出した体液または細胞を、ｐＤ５２またはｐＲＡ００６をコードする配列またはその断片と結合させることがでる。標準ハイブリダイゼーションの定量化は、正常な被験体から得た値を、既知量の実質的に精製されたポリヌクレオチドを使用する実験から得た値に対して比較することによって行なうことができる。正常試料から得た標準値は、疾患の徴候を示す患者から得た試料から得た値と比較することが可能である。標準値と被験体値との間の偏差を用いて疾患の存在を確定する。一旦疾患の存在が確定されて治療プロトコルが開始されると、ハイブリダイゼーションアッセイを通常ベースで繰り返して、患者の発現レベルが正常な患者に観察されるレベルへ近づき始めたかどうかを評価することができる。連続アッセイから得られた結果を用いて、数日から数ヶ月の期間にわたる治療の効果を示すことが可能である。
【００７９】
糖尿病を含むすい臓の疾患および障害に関して、個人の生検組織における比較的大きい量の転写物の存在は、疾患の発生に対する素因を示すか、または実際に臨床的症状が現れる前に疾患を検出する手段を提供することができる。この種のより明確な診断により、医療の専門家が予防手段または積極的な早期治療を施し、膵臓の疾病および障害の発達またはさらなる進行を防止することが可能となる。ｐＤ５２またはｐＲＡ００６をコードする配列からデザインされたオリゴヌクレオチドの診断上の追加用途は、PCR 法の使用に関与し得る。このオリゴマーは、化学的に合成するか、酵素的に生成するか、または組換えソースから産生することが可能である。オリゴマーは望ましくは２つのヌクレオチド配列から構成され、1つはセンス方向（５′.fwdarw.３′）、他の１つアンチセンス方向（３′.rarw.５′）で、特定遺伝子または条件の識別のために、最適化された条件下で用いられる。また２つの同一のオリゴマー（ネスト化したオリゴマーのセット、または縮重オリゴマーの集積）を、あまりストリンジェントでない条件下で用い、近縁の DNA 配列またはRNA 配列の検出あるいは（または）定量化を行なうことができる。
【００８０】
ｐＤ５２またはｐＲＡ００６の発現を定量するために使用可能な方法には、放射標識またはビオチン ヌクレオチド、調節核酸の相互増幅、および実験結果が補間された標準曲線などが含まれる（Melby, P.C. らの （1993） J. Immunol Methods,１59:235-244; Duplaa, C. らの （1993） Anal. Biochem.２12:229-236）。複数サンプルの定量速度を加速するには、目的のオリゴマーが種々の希釈液中に存在し、そして分光光度法または非色応答が迅速な定量に関与するような状態にある、ELSA 形態のアッセイを実行することができる。
【００８１】
本発明の別の実施例によれば、Ｄ５２またはＲＡ００６に特異的な核酸配列を用いても、天然のゲノム配列をマッピングするために有用であるハイブリダイゼーションプローブ生成することが可能である。その配列は、特定の染色体にマッピングするか、または公知の方法を使用して染色体の特定領域にマッピングすることが可能である。このような技術には、FISH、FACS、または酵母人工染色体、細菌人工染色体、細菌 P1 構築または単一染色体 cDNA ライブラリのような人工染色構造があり、Price, C. M. （1993） Blood Rev.７:127-134, および Trask, B.J. （1991） Trends Genet.７:149-154. FISH （Verma らによって記述されているとおり、（1988） ヒト Chromosomes: Manual of Basic Techniques, Pergamon Press, New York, N.Y.）などの文献で論評されているように、他の物理的な染色体のマッピング技術および遺伝地図データと相関することが可能である。遺伝地図データの例は、1994 Genome Issue of Science （265:1981f）に見出すことができる。物理的染色体地図上のｐＤ５２またはｐＲＡ００６をコードする遺伝子の位置と、特定の疾患または特定の疾患に対する素因との間にある相関性は、遺伝子の疾病に関連する DNA の領域を画定するのに役立ち得るものである。
【００８２】
本発明のヌクレオチド配列を用いて、健常者、保有者、または感染者の三者間における遺伝子配列の相違を検出することが可能である。確定した染色体マーカーを用いた染色体標本および結合分析などの物理的マッピング技術の原位置ハイブリッド形成法を用いて、遺伝地図を拡張することができる。マウスのような別の哺乳動物種の染色体上への遺伝子の配置は、多くの場合、特定のヒト染色体の数またはアームが未知の場合でさえも、関連するマーカーを明らかにすることが可能である。新配列は、物理的マッピングによって、染色体アーム、またはその部分に指定することができる。これは、位置クローニングまたはその他の遺伝子発見技術を用いて疾病遺伝子を探索する研究者にとって貴重な情報を提供する。一旦疾患または症候群が、例えば AT〜11q22-23 （Gatti, R.A. らの（1988） Nature３36:577-580）などの特定ゲノム領域への遺伝的結合によって大まかに位置決めがされると、その領域に対してマッピングする全ての配列は、さらなる究明用の関連遺伝子または調節遺伝子に相当することになる。本発明のヌクレオチド配列を用いて、転座、反転などに起因する、健常者、保有者、感染者の三者間における染色体位置の相違を検出することができる。
【００８３】
本発明の別の実施例では、ｐＤ５２または pRA006、触媒作用断片または免疫原断片またはそのオリゴペプチドを用いて、あらゆる薬剤スクリーニング技術を利用して化合物のライブラリをスクリーニングすることができる。このようなスクリーニングで用いた断片は、溶液中に遊離していても、固体支持物に付着していても、細胞表面上にあっても、または細胞内にあっても構わない。ｐＤ５２またはｐＲＡ００６とテストされる薬剤との間の結合複合物の形成は測定することができる。
【００８４】
使用可能な別の薬剤スクリーニング技術は、公開 PCT 出願番号 WO84/03564 に記載されているように、目的タンパク質に対して好適な結合親和性を有する化合物の高処理能力スクリーニングを提供する。この方法においては、ｐＤ５２またはｐＲＡ００６に対して適用されたように、多数の異なる小さな試験用化合物、例えばペプチドまたは低分子重量有機化合物をプラスチックピンまたはその他の表面上などの固体基質上で合成する。試験用化合物は、ｐＤ５２またはｐＲＡ００６またはその断片と反応せしめ、洗浄する。次に、結合されたｐＤ５２またはｐＲＡ００６を、当分野で周知の方法によって検出する。精製されたｐＤ５２またはｐＲＡ００６はまた、前記の薬剤スクリーニング技術において使用できるように、プレート上へ直接被覆することもできる。あるいは、非中和抗体を用いてペプチドを捕捉し、ペプチドを固体支持物上に固定することもできる。別の実施例では、競合薬スクリーニングアッセイを用いることができ、このアッセイ中では、ｐＤ５２またはｐＲＡ００６を結合する能力を持つ中和抗体が、ｐＤ５２またはｐＲＡ００６結合用の試験化合物と特異的に競合する。この方法では抗体を用いて、ｐＤ５２またはｐＲＡ００６と１つ以上の抗原決定因子を共有する全てのペプチドの存在を検出することができる。別の実施例では、pＤ５２またはｐＲＡ００６をコードするヌクレオチド配列は、その新規技術が既知のヌクレオチド配列の特性、例えば、限定するものではないが、トリプレット遺伝暗号および特異的塩基対の相互作用などを含む特性に依存する限り、今後開発される任意の分子生物学技術においてでも使用することができる。
【００８５】
下記の実施例は、本発明を説明するために提供されており、本発明を限定するものではない。
【００８６】
実施例
I. DPd6 ニワトリの cDNA ライブラリ構造
ニワトリ DPd6 の cDNA ライブラリは、６日目のニワトリ胚から採取した背側膵芽を使用して構築したものである。凍結組織はホモジナイズかつ溶解した。Brinkmann POLYTRON homogenizer PT-3000 （Brinkman Instruments, Westbury, N.J.）をグラニジウム イソチオシアネート溶液において使用した。溶解物に遠心力５．７M CsCl 以上をかける。Beckman SW28 ローター、Beckman L8-70M 超遠心分離機 （Beckman Instruments、Fullerton、Calif.）使用。１８時間、25,000 rpm、室温。RNA を、4.7 pH 酸フェノールで抽出し、０．３ M 酢酸ナトリウムと容積２.5 のエタノール沈殿させ、無 RNA 水で再懸濁し、３７℃にて Dnase 処理した。以前の通り RNA を４．７ pH 酸フェノールで繰返し抽出し、酢酸ナトリウムおよびエタノールで沈殿させた。その後、Micro-FastTrack２.０mRNA 分離キット（Invitrogen、Groningen、Netherlands）を使用して mRNA を単離し、cDNA ライブラリを構築するために使用した。mRNAs の取り扱いは、SUPERSCRIPT cDNA synthesis and plasmid cloning system （Cat. #18248-013.Gibco/BRL）の推奨プロトコルに従って行なった。DH10B 宿主細胞への形質転換に続いて、単一コロニーを摘出し、PCR 法を用いてクローン化された cDNA インサートを増幅した。単一 cDNA インサートを代表する PCR 法によって増幅された断片を、その後に生体外転写し、Digoxygenin 標識 RNA プローブ（Roche）を生成した。RNA プローブをホールマウントで原位置スクリーンにおいて使用して初期のニワトリ胚におけるそれぞれの遺伝子産物の発現を確定した。膵臓上皮組織における印象的な発現のおかげで、ニワトリＤ５２様またはＲＡ００６様遺伝子を含むプラスミドｐＲＡ２９０およびｐＲＡ００６を識別した。
II. 原位置ハイブリッド形成法および RT-PCR 分析
当業者であれば周知の標準プロトコルおよび以前に説明した（例えば、Pelton, R.W. らの（1990） Development１１０,０９−６２０、Belo, J.A. らの（1997） Mech. Dev.６８,４5-57）（図３、４、および８を参照）に従って原位置ハイブリッド形成法を実行した。trizol （Life Technologies、Karlsruhe、Germany）を用いて全 RNA 細胞培養の分離を行なった。逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応プロトコルは以前に記載されている（Dohrmann、C. E. らの （1996） Dev. Biol.１75、108-117）（図５を参照）。
【００８７】
III. 分離および cDNA クローンのシークエンシング
REAL PREP９６ウェルのプラスミド分離キット（Catalog #26173、QIAGEN）を用いて、プラスミド DNA を細胞から開放し精製した。このキットは、多重試薬ディスペンサーを使用した９６ウェルブロックにおいて、９６個のサンプルの同時精製を可能にした。 下記の変更を除いてメーカーの推奨するプロトコルを使用した。変更（i）: 細菌を１ml の消毒した Terrific Broth （Catalog #22711、LIFE TECHNOLOGIESTM, Gaithersburg, Md, USA）でカルベニシリンを２５mg/L で、グリセロームを０．４％で用いて培養した。変更（ii）: 接種後、培養を１９時間インキュベートした後、細胞を０．３ｍｌ溶解バッファで溶解した。変更（iii）: イソプロパノール沈殿に続いて、プラスミド DNA ペレットを０．１ｍｌの蒸留水で再懸濁した。プロトコルの最終ステップの後、サンプルを４℃にて保管する９６ウェル ブロックに移した。cDNA を GATC Biotech AG （Konstanz、Germany）によって、当業者であれば既知の標準プロトコルに従って配列せしめた。
IV. cDNA クローンの相同性の検索およびその演繹タンパク質
リーディング・フレームを決定した後に、本発明のヌクレオチド配列から演繹したアミノ酸配列のみならず、本発明のヌクレオチド配列も、GenBank、SwissProt、BLOCKS、および Pima II のようなデータベースに対する問い合わせ配列として使用した。以前に識別され注釈された配列を含むこれらのデータベースで、相同性（類似性）の領域を検索した。使用したのは BLAST（Basic Local アライメントSearch Toolの略語、Altschul S.F. （1993） J. Mol. Evol.３6:290-300; Altschul、S.F. らの（1990） J. Mol. Biol.２15:403-10）である。BLAST は、ヌクレオチドおよびアミノ酸配列両方のアライメントを産生し、配列類似性を決定した。ローカル特性をもつアライメントのおかげで、BLAST は、完全なマッチの決定において、または 相同体真核（細菌）または原核（動物、カビ、植物）の起源の識別に特に有用である。ここに引用として取り込まれた Smith らの（1992, Protein Engineering５:35-51）において説明されたような他のアルゴリズムは、一次配列パターンおよび二次構造ギャップのペナルティーを取り扱う場合に使用された。BLASTの方法は、Karlin らの（前出）で詳細に説明したように、ここに引用として取り込まれ、問い合わせ配列とデータベース配列との間のマッチを検索した。BLAST によって、発見された任意のマッチの統計的な重要性が評価され、重要性をもつユーザ選択限界を満足するマッチのみが報告された。本出願において、限界値はヌクレオチドに対して１0〜25、およびペプチドに対して１0-14 と設定された。ヌクレオチド配列は、GenBank データベースの霊長類、げっ歯類、および他の哺乳動物の配列に対して検索され、それから同一クローンからの演繹アミノ酸配列が、GenBank の機能的タンパク質データベースの哺乳動物、脊椎、真核生物の相同性に対して検索された。
【００８８】
V.ｐＤ５２またはｐＲＡ００６コード化ポリヌクレオチドの完全長への伸長または調節配列の復元
完全長ｐＤ５２コード化またはｐＲＡ００６コード化核酸配列（それぞれ 配列識別番号1 または 配列識別番号３）を用い、部分的ヌクレオチド配列を全長に拡張するため、またはゲノム ライブラリから５′または３′イントロンまたは他の調節配列を取得するために、オリゴヌクレオチド プライマーをデザインする。単一プライマーを合成してアンチセンス方向における伸長を開始し、他を合成してセンス方向における配列を伸長する。プライマーを用い、領域目的に対して新規ヌクレオチド配列、未知ヌクレオチド配列を含む既知の配列「outward」生成 amplicons の伸長を促進する。初期プライマーは、オリゴ４.０６プライマー分析ソフトウェア（National Biosciences）、または別の適切なプログラムを用いて、ヌクレオチド長が２２〜３０となるように、GC 含有率が５０％以上を有するように、および温度約６８〜７２℃で標的配列にアニールするように cDNA からデザインされた。ヘアピン二量化をもたらすようなヌクレオチドは避けた。元の選択された cDNA ライブラリ、またはヒトゲノム ライブラリを用い、配列を伸長した。後者（ヒトゲノム ライブラリ）は５′上流領域を取得するために最も有用である。より多くの伸長または所望の必要な場合は、追加プライマー セットをデザインして既知領域を伸長する。XL-PCR キット（Perkin Elmer）の指示に従い、充分に酵素および反応混合液を攪拌することによって、高い忠実度増幅が得られた。４０ pmol  の各プライマーおよび推奨濃度の他の全ての組成物キットの準備を発端として、Peltier thermal cycler （Peltier thermal cycler （PTC200; M.J. Research、Watertown、Mass.）および下記のパラメータを用いて、PCR 法を実行した。
ステップ１：９４℃にて１分間 （初期変性）
ステップ２：６５℃にて１分間
ステップ３：６８℃にて６分間
ステップ４：９４℃にて１５秒間
ステップ５：６５℃にて１分間
ステップ６：６８℃にて７分間
ステップ７：ステップ４〜６をさらに１５サイクル繰返す
ステップ８：９４℃にて１５秒間
ステップ９：６５℃にて１分間
ステップ１０：６８℃にて７〜１５分間
ステップ１１：ステップ８〜１０を１２サイクル繰返す
ステップ１２：７２o℃にて８分間
ステップ１３：４℃にて保持
５〜１０マイクロリットルの反応混合物を、低濃度（約０．６〜０．８％）のアガロースミニゲル上で電気泳動法によって解析し、どの反応が配列の伸長に成功したかを決定した。最も大きな産生物を保持すると思われた領域を選択して、ゲルから除去した。さらなる精製には、QIAQUICK DNA 精製キット（QIAGEN）などのような商業用ゲル抽出方法が必要とされる。DNA の回収後、クレノウ酵素を用い、一本鎖、ヌクレオチド張出部をトリムし、再連結反応およびクローニングを促進する鈍端を作った。エタノール沈殿の後、産生物を13 マイクロリットルの連結反応バッファに再溶解し、１マイクロリットルの T4-DNA リガーゼ （１５単位）および1 マイクロリットルの T4 ポリヌクレオチド キナーゼを加え、そして混合物を室温で２〜３時間または１６℃で一晩インキュベートした。適格大腸菌細胞（４０マイクロリットルの適切な 培地中）を３マイクロリットルの連結反応 混合物で形質転換し、８０マイクロリットルの SOC 媒体（前出のSambrook らの）で培養せしめた。３７℃にて１時間インキュベーションした後、全形質転換混合液を、2x 炭水化物を含む Luria Bertani （LB）-寒天（前出のSambrook らの）上にプレートする。次の日、各プレートから幾つかのコロニーをランダムに摘出し、適切な市販の消毒済９６ウェル マイクロタイター プレートの個別ウェルに配置された１50 マイクロリットルの液体 LB/2x 炭水化物媒体で培養する。 次の日、一晩培養された５マイクロリットルの各培養を 無償毒９６ウェル プレートに移し、１：１０に水で希釈後、５マイクロリットルの各サンプルを PCR 法配列に移す。PCR 法増幅は、４単位の rTth DNA ポリメラーゼ、ベクター プライマー、および１つまたは両方の伸長反応に使用された遺伝子特定プライマーを含む１８マイクロリットルの濃縮 PCR 法反応混合液（3.3x）を各ウェルに加える。増幅は、下記の条件を用いて実行する:
ステップ１:９４℃にて６０秒間
ステップ２:９４℃にて２０秒間
ステップ３:５５℃にて３０秒間
ステップ４:７２℃ にて９０秒間
ステップ５: ステップ２〜４をさらに２９サイクル繰返す
ステップ６:７２℃にて１８０秒間
ステップ７:４℃にて保持
PCR 法反応のアリコットを分子量マーカーと共に寒天ゲル剤上で実行する。PCR 産物の寸法を元の部分的 cDNA  に比較し、適切なクローンを選択し、プラスミドに連結反応して配列する。
【００８９】
VI. ハイブリダイゼーションプローブの標識および使用
配列識別番号１または配列識別番号３から取り出したハイブリダイゼーションプローブを用いて、cDNA、ゲノム DNA、または mRNAs をスクリーニングする。約２０塩基対から成るオリゴヌクレオチドの標識について特に記載するが、より大きなcDNA 断片に対しても実質的には同手順を用いる。オリゴヌクレオチドを、OLIGO4.06 プライマー分析ソフトウェア（National Bioscience）のような最新式のソフトウェアを用いてデザインし、50 pmol  の各オリゴマーおよび２50 マイクロ Ci の[.gamma.-32P] アデノシン三リン酸（Amersham） および T4 ポリヌクレオチドキナーゼ （DuPont Nen（r）, Boston, Mass.）とを組み合わせることにより標識する。標識したオリゴヌクレオチドは、SEPHADEX G-25 超細繊分子樹脂カラム（Pharmacia & Upjohn）を用いて十分に精製する。毎分１07 カウントの各センス オリゴヌクレオチドおよびアンチセンス オリゴヌクレオチドを含む部分を、（Ase I, Bgl II, EcoRI, Pst I, Xba１, or Pvu II; DuPont NEN（r））の１つの膜で消化されたヒトゲノム DNA の典型的膜ベースのハイブリダイゼーション解析において用いる。各消化物から得た DNA は、０．７％アガロースゲル上で分画してナイロン膜（NYTRAN PLUS membrane, Schleicher & Schuell, Durham, N.H.）に移す。スクリーニングハイブリダイゼーションは４０℃にて１６時間かけて行う。非特異的シグナルを取り除くため、最大０．１ ｘ クエン酸食塩水（SSC）および０．５％ドデシル硫酸ナトリウムの一層ストリンジェントな条件の下、ブロットを順次室温にて洗浄する。XOMAI AR オートラジオグラフィー フィルム （Kodak Rochester, N.Y.）をブロットに晒した後、またはブロットを PHOSPHOIMAGER （Molecular Dynamics, Sunnyvale, Calif.）に 数時間置いた後にオートラジオグラ  VII. アンチセンス分子
ｐＤ５２コード化配列またはｐＲＡ００６コード化配列またはその一部に対するアンチセンス分子を用い、生体内または生体外の天然ｐＤ５２またはｐＲＡ００６の発現を抑制する。約２0 塩基対を含むアンチセンス オリゴヌクレオチドの使用は、特に記載するが、より大きな cDNA 断片に使用される手順と本質的に同一である。オリゴヌクレオチドを用いて、天然ｐＤ５２またはｐＲＡ００６の発現を阻害する。相補的オリゴヌクレオチドは、プロモーターがｐＤ５２コード化転写物またはｐＲＡ００６コード化転写物の翻訳に対して、上流非翻訳配列に結合することを防止することによって、またはリボソームを結合からを防止することによって、転写を抑制するために使用される。
【００９０】
VIII.ｐＤ５２またはｐＲＡ００６の発現
ｐＤ５２またはｐＲＡ００６の発現は、cDNA を適切なベクターにサブクローニングし、そのベクターを宿主細胞に形質転換することによって達成される。この場合、以前に cDNA ライブラリの生成に使用された、クローニング ベクターである PSPORT１が、ｐＤ５２またはｐＲＡ００６を大腸菌において発現するために使用される。クローニング部位の上流である本ベクターには、62-ガラクトシダーゼに対するプロモーター、続いてアミノ末端 Met を含む配列、およびそれに続く β-ガラクトシダーゼの７つの残基が含まれる。これらの８つの残基の直後に続くのは、転写に有用なバクテリオファージ プロモーター、および多数のユニークな制限部位を含むリンカーである。標準方法を使用する IPTG を有する単離形質転換細菌株の誘発は、β-ガラクトシダーゼの最初の８つの残基から成る融合タンパク質、約５〜15 のリンカー残基、および全長タンパク質を産生する。シグナル残基は、活性化のため下記のアッセイで直接使用することができる細菌の成長培地中にｐＤ５２またはｐＲＡ００６の分泌物を誘導する。
【００９１】
IX.ｐＤ５２またはｐＲＡ００６特定抗体の産生
PAGE 電気泳動法（前出の Sambrook）または他の精製技術を用いて実質上精製されたｐＤ５２またはｐＲＡ００６を用いて、標準プロトコルでウサギを免疫化して抗体を産生する。配列識別番号2 または 配列識別番号４から演繹されたアミノ酸配列をDNASTARソフトウェア（DNASTAR Inc）を用いて解析し、免疫原性の高い領域を決定し、対応するオリゴポリペプチドを合成して、これを用いて当業者に周知の方法で抗体を生産する。Ｃ 末端に近傍するエピトープ、または親水性領域内のエピトープなどの適切なエピトープの選択については 前出の Ausubel ら、その他によって説明されている。
【００９２】
通常は、オリゴペプチドの長さは約１5 残基であり、Fmoc 化学反応を用いる Applied Biosystems４31A peptide synthesizer４31A を用いて合成し、N-マレイミドベンゾイル-N-ヒドロキシスクシンイミドエステル（MBS、前出の Ausubel）を用いた反応によってキーホールリンペットヘモシニアン（KLH, Sigma, St. Louis, Mo.） に結合せしめる。完全フロイントアジュバントにおいてオリゴペプチド-KLM 複合体を用いてウサギを免疫化する。得られた抗血清の抗ペプチド活性に対する検査は例えば、ペプチドをプラスチックに結合し、１％BSA を用いてブロッキング処理し、ウサギ抗血清と反応させて洗浄し、そして放射性ヨウ化されたヤギ抗ウサギ IgG と反応して行なう。
【００９３】
ｐＤ５２またはｐＲＡ００６または生物学的に活性なその断片を、１２５ｌ ボルトンハンター試薬 （Bolton らの （1973） Biochem. J.１33:529）で標識する。マルチウェルプレートのウェルに予め配置された候補分子を、標識されたｐＤ５２またはｐＲＡ００６でインキュベートし、洗浄し、そして標識されたｐＤ５２またはｐＲＡ００６複合体を有する全てのウェルをアッセイする。異なる濃度のｐＤ５２またはｐＲＡ００６を使用して得たデータを用いて、数値、親和性の値、およびｐＤ５２またはｐＲＡ００６の候補分子との会合値を計算する。本明細書において開示した全ての刊行物および特許を言及することをもって本明細書の一部となす。
【００９４】
本発明の方法およびシステムの種々の修正および改変は当業者に当然のことであり、本発明の範囲および精神から逸脱しない限り行い得るものとする。本発明について説明するにあたり特定の好適実施例に関連して説明を行ったが、本発明の範囲が、そのような特定の実施例に不当に制限されるべきではないことは当然のことながら共通認識とする。実際に、分子生物学または関連分野の専門家には明らかな、本明細書に記載されている本発明の実施方法の様々な改変は、特許請求の範囲内にあるものとする。
【図面の簡単な説明】
【００９５】
【図１】ニワトリＤ５２。
【００９６】
【図１Ａ】ニワトリＤ５２のＤ５２様タンパク質をコードする核酸配列（配列識別番号1）。５′および３′非翻訳領域には下線が引かれ、始動コドンおよび終止コドンは太字で示した。
【００９７】
【図１Ｂ】図１Ａに示したコーディング配列によってコードされたタンパク質の配列（配列識別番号２）。ヒヨコＤ５２様タンパク質において予想されたコイルドコイル ドメインは太字で示した。
【００９８】
【図２】アミノ酸配列アライメント間の本発明のｐＤ５２タンパク質（ライン２; 配列識別番号２）、ヒト腫瘍タンパク質Ｄ５２（N8-腫瘍発現促進遺伝子）（ライン４、SWISSPROT アクセッション番号 P55327、GenBank アクセッション番号 S82081に対して同一; ヒト N8 タンパク質の長イソ型のヒト腫瘍タンパク質Ｄ５２は最初１８４アミノ酸に対して同一、２４８アミノ酸、SPTREMBL アクセッション番号 Q9UCX8、図示せず） マウスｍＤ５２タンパク質（ライン３、SPTREMBL アクセッション番号 Q62393、GenBank アクセッション番号 U44426 に対して同一）、および日本ウズラ（C. coturnix japonica） N10 タンパク質（ライン１、SPTREMBL アクセッション番号 P79700）。アライメントは、ClustalW （1.7） ソフトウェア （Thompson、J.D.、1997、Nucleic Acids  Research、24:4876-4882）の複数配列アライメントプログラムを用いて産生した。
【図３】本発明のｐＤ５２様タンパク質に対する原位置ハイブリッド形成法の成果。図３Ａ、Ｂ、Ｃは、ヒヨコ 胚（５日目）上のホールマウント原位置ハイブリッド形成法を示す。lb ＝ 肺芽、pb ＝ 膵芽、m ＝ 中腎、li ＝ 肝臓原基、dpb ＝ 背側膵芽、vbp ＝ 腹側膵芽、図３ＤおよびＥは、膵芽組織断面上の原位置ハイブリッド形成法を示す。pe ＝ 膵臓上皮、du ＝ 十二指腸、is ＝ 島細胞。
【００９９】
【図４】本発明のｐＤ５２様タンパク質に対する原位置ハイブリッド形成法の成果。図４Ａはヒト十二指腸、矢印は陰窩細胞を指す。図４Ｂはヒトすい臓、is ＝ 島細胞。
【０１００】
【図５】種々の前脂肪細胞の細胞株における本発明のｐＤ５２様タンパク質の RT-PCR 分析。図５、レーン１は分子量マーカー、レーン２は、テンプレートコントロールなし（Con）、レーン３は NIH3T3 （正常線維芽細胞）、レーン４〜７は前脂肪細胞（preadipoctes）、レーン４は3T3-F442A、レーン５は3T3-L1、レーン６は TA1、レーン７は HIB-IB）、およびレーン８は分子量マーカーを、それぞれ示す。下位パネルは、各試料における cDNA の健全性を制御するための処置に対して分析された同一 サンプルを描写する。
【０１０１】
【図６Ａ】ニワトリ RA006RA006 様タンパク質をコードする核酸配列（配列識別番号3）。５′および３′非翻訳領域には下線が引かれ、始動コドンおよび終止コドンは太字で示した。
【０１０２】
【図６Ｂ】図６Ａに示したコーディング配列によってコードされたタンパク質の配列（配列識別番号４）。
【０１０３】
【図７】本発明のｐＲＡ００６タンパク質（ライン１; 配列識別番号４） および仮想ヒトタンパク質（Genbank アクセッション番号 CAB53688; SPTREMBL アクセッション番号 Q9UFZ0）間のアミノ酸配列アライメント。BlastP 検索結果を示した。参照: Altschul らの1990, Basic local alignment search too, J. Mol. Biol.215:403-410
【０１０４】
【図８】本発明のＲＡ００６様タンパク質に対する原位置ハイブリッド形成法の成果。図８Ａ、Ｂ、Ｃは、ヒヨコ 胚（Ａ：４日目；ＢおよびＣ：５日目）上のホールマウント原位置ハイブリッド形成法を示す。図８Ｄ、Ｅ、およびＦは、膵芽組織断面上の原位置ハイブリッド形成法を示す。
【図１Ａ】
2004535797.tif 000002
【図１Ｂ】
2004535797.tif 000003
【図２】
2004535797.tif 000004
【図６Ａ】
2004535797.tif 000005
【図６Ｂ】
2004535797.tif 000006
【図７】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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