(57)【要約】例えば、元になるマスター・アレーを調製し複製することにより、および／または再生することができる再利用可能なアッセイアレーを提供することにより、実質的に同一な特異的結合性リガンドプローブアレーを作製するためのシステム。一つの実施形態において、本システムは、ａ）固定化されたアドレス・リガンドを有するマスター・アレー表面、ｂ）アドレス・リガンドに相補的な結合性領域、標的リガンドに相補的な結合性領域、および接合体をアッセイアレーの表面中またはその上に移送することにおける使用のための第三リガンドを有し、アドレスおよびその相補的なリガンドと共にまたはそれらの解離の際に用いることができる多リガンド接合体、の調製および使用を含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
特異的結合性リガンドプローブアレーを複製するためのシステムであって、該システムは：
ａ）その上に固定化された複数のアドレス・リガンドを有する支持体表面を含むマスター・アレー；
ｂ）それぞれの多リガンド接合体が（ｉ）コア；（ｉｉ）相補的な態様でマスター・アレーの特異的なアドレス・リガンドと結合するように選択されたリガンドを含む、少なくとも１分子の第一リガンド結合性領域；（ｉｉｉ）相補的な態様で標的リガンドと結合するように選択されたリガンドを含む、少なくとも１分子の第二リガンド結合性領域；および（ｉｖ）少なくとも１分子の第三リガンド、を含み、ここで該第一リガンド結合性領域、第二リガンド結合性領域、および第三リガンドはコアに結合されている、複数の多リガンド接合体；および
ｃ）複製アレー用の支持体表面を含むアッセイアレー支持体、
を含む。
【請求項２】
アドレス・リガンド、並びに第一および第二結合性リガンドがそれぞれ独立に核酸を含む請求項１に記載のシステム。
【請求項３】
さらに、アドレス・リガンドおよびマスター・アレー支持体表面に結合されている連結剤を含む請求項１に記載のシステム。
【請求項４】
連結剤がマイクロビーズを含む請求項３に記載のシステム。
【請求項５】
第一リガンド結合性領域、第二リガンド結合性領域、および第三リガンドが独立に多リガンド接合体コアに結合されている請求項１に記載のシステム。
【請求項６】
第三リガンドがビオチン誘導体を含む請求項１に記載のシステム。
【請求項７】
第三リガンドが重合性基を含む請求項１に記載のシステム。
【請求項８】
重合性基がアクリル基およびビニル基からなる群から選択される請求項７に記載のシステム。
【請求項９】
アッセイアレー支持体がさらに第三リガンドのための結合部位を含む請求項１に記載のシステム。
【請求項１０】
第三リガンドが結合性リガンドを含み、結合部位が第三リガンドに対して特異的な結合相手の分子を含む請求項９に記載のシステム。
【請求項１１】
特異的結合性リガンドプローブアレーを複製するための方法であって、該方法は：
ａ）その上に固定化された複数のアドレス・リガンドを有する支持体表面を含むマスター・アレーを用意し；
ｂ）それぞれの多リガンド接合体が（ｉ）コア；（ｉｉ）相補的な態様でマスター・アレーの特異的なアドレス・リガンドと結合するように選択されたリガンドを含む、少なくとも１分子の第一リガンド結合性領域；（ｉｉｉ）相補的な態様で標的リガンドと結合するように選択されたリガンドを含む、少なくとも１分子の第二リガンド結合性領域；および（ｉｖ）少なくとも１分子の第三リガンドを含み、該第一リガンド結合性領域、第二リガンド結合性領域、および第三リガンドがコアに結合されている、複数の多リガンド接合体を用意し；
ｃ）第一リガンド結合性領域を相補的アドレス・リガンドに結合させることにより、多リガンド接合体をマスター・アレーに結合させ；
ｄ）複製アレーのための支持体表面を含むアッセイアレー支持体を用意し；
ｅ）アッセイアレー支持体を、結合された多リガンド接合体がアッセイアレー支持体に結合することを可能とするのに適する条件下で、十分にマスター・アレーに近接させ；および
ｆ）アッセイアレー支持体が回収され且つ利用されることを可能とするのに適する条件下で、結合された相補的なアドレス・リガンドと第一リガンド結合性領域を解離すること、
を含む方法。
【請求項１２】
第三リガンドがビオチン誘導体を含む請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
第三リガンドが重合性基を含む請求項１１に記載の方法であって、該方法はさらに第三リガンドを反応させてポリマー・フィルムを形成する段階を含む方法。
【請求項１４】
重合性基がビニル基およびアクリル基から選択される請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
アドレス・リガンド、並びに第一および第二結合性リガンドがそれぞれ独立に核酸を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１６】
マスター・アレーが、さらに、アドレス・リガンドおよびマスター・アレー支持体表面に結合された連結剤を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１７】
連結剤がマイクロビーズを含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
アッセイアレー支持体がさらに第三リガンドのための結合部位を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１９】
第三リガンドが結合性リガンドを含み、結合部位が第三リガンドに対して特異的な結合相手の分子を含む請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
特異的結合性リガンドプローブアレーを複製するためのシステムであって、該システムは：
ａ）その上に固定化された複数のアドレス・リガンドを有する支持体表面を含むマスター・アレー；
ｂ）それぞれの多リガンド接合体が（ｉ）コア；（ｉｉ）相補的な態様で特異的な標的リガンドおよび特異的なアドレス・リガンドに結合するように選択されたリガンドを含む、少なくとも１分子の第二リガンド結合性領域；および（ｉｉｉ）少なくとも１分子の第三リガンド、を含み、ここで該第二リガンド結合性領域、および第三リガンドがコアに結合されている、複数の多リガンド接合体；および
ｃ）複製アレー用の支持体表面を含むアッセイアレー支持体、
を含むシステム。
【請求項２１】
アドレス・リガンド、並びに第一および第二結合性リガンドがそれぞれ独立に核酸を含む請求項２０に記載のシステム。
【請求項２２】
第三リガンドがビオチン誘導体を含む請求項２０に記載のシステム。
【請求項２３】
第三リガンドが結合性リガンドおよび重合性基からなる群から選択される請求項２０に記載のシステム。
【請求項２４】
重合性基がビニル基およびアクリル基から選択される請求項２３に記載のシステム。
【請求項２５】
再利用可能アレーの形態をとる複製可能アレーを調製するためのシステムであって、該システムは：
ａ）各光ファイバーがファイバーの遠位末端に位置する支持体表面を有する複数の光ファイバーを含むマスター・アレー；および
ｂ）それぞれのオリゴヌクレオチド結合性領域が特異的な態様で標的リガンドと結合するように選択されたオリゴヌクレオチド配列を含む、複数のオリゴヌクレオチド結合性領域、
を含むシステム。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本出願は、米国を除くすべての国を指定して、２００１年７月９日付けで米国国内企業、サーモディクス（ＳｕｒＭｏｄｉｃｓ，Ｉｎｃ．）の名前でＰＣＴ国際特許出願として出願されている。
【０００２】
技術分野
本発明は、既知の空間的配置における核酸および他のリガンドなどの特異的結合性リガンドの固定化に関する。別の態様において、本発明は、こうした核酸を組み込むオリゴヌクレオチド・アレーなどの固形支持体に関する。なお別の態様において、本発明は光反応性基、こうした基により誘導された分子および／または表面、およびこうした基によるこうした分子の支持体表面への結合に関する。
【０００３】
発明の背景
より一般には「ＤＮＡチップ」および「遺伝子（Ｇｅｎｅ）チップ」（アフィメトリックス（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ，Ｉｎｃ．）の登録商標）として知られるオリゴヌクレオチドプローブアレーの開発は、過去数年で顕著な進歩を遂げてきているし、尚且つますます大きくなる注目と高まる重要性の中核となってきている。例えば、Ｓｔｉｐｐ，Ｄ．，Ｆｏｒｔｕｎｅ，ｐ．５６、Ｍａｒｃｈ　３１、１９９７を参照すること。また、Ｂｏｒｍａｎ，Ｓ．，Ｃ＆ＥＮ，ｐ．４２，Ｄｅｃｅｍｂｅｒ９，１９９６，ａｎｄ　Ｔｒａｖｉｓ，Ｊ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ　Ｎｅｗｓ　１５１：１４４〜１４５（１９９７）を参照すること。これらの２−または３−ｃｍの四角チップは、数万〜数十万の固定化オリゴヌクレオチドを含有でき、数千の協調遺伝子の挙動を研究者が初めて目撃することを可能とする。ＤＮＡチップは、独特の遺伝子発現パターンを観察し、薬物治療の成功をきちんと読取り、患者の遺伝子構造に基づき薬剤を彼らに合わせ、遺伝子を配列化し、遺伝子医薬の分野における研究を行うことに対して有用である。また、「Ｍｉｃｒｏｃｈｉｐ　Ａｒｒａｙｓ　Ｐｕｔ　ＤＮＡ　ｏｎ　ｔｈｅ　Ｓｐｏｔ」，Ｒ．Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｓｃｉｅｎｃｅ　２８２（５３８８）：３９６〜３９９，１６　Ｏｃｔｏｂｅｒ　１９９８；ａｎｄ　「Ｆｏｍｅｎｔｉｎｇ　ａ　Ｒｅｖｏｌｕｔｉｏｎ，ｉｎ　Ｍｉｎｉａｔｕｒｅ」，Ｉ．Ａｍａｔｏ，Ｓｃｉｅｎｃｅ　２８２（５３８８）：４０２〜４０５，１６　Ｏｃｔｏｂｅｒ　１９９８を参照すること。
【０００４】
一般に、オリゴヌクレオチドプローブアレーは、情報リッチ形式において正確な位置での特定のオリゴヌクレオチド配列を表示する。使用において、蛍光標識核酸標的のハイブリッド形成パターンは、標的に対する一次構造情報を得るために用いられる。この形式は、病原体識別、法医学用途、ｍＲＮＡ発現の監視およびデノボ配列決定を含む広範囲な核酸配列解析問題に応用することができる。例えば、Ｌｉｐｓｈｕｔｚ，Ｒ．Ｊ．，ｅｔ　Ａｌ．，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　１９（３）：４４２〜４４７（１９９５）を参照すること。こうしたアレーは、時々、数万の、または数十万の個別プローブさえも担持することを必要とされる。チップは、また、どこにおいても細胞当り１〜１０，０００の複製レベルで発現することができる配列を検出するために、広範囲の感受性を提供することを必要とされる。
【０００５】
多様な方法が、オリゴヌクレオチドプローブアレーの製造および／または使用のために開発されてきた。例えば、固相支持体上での大規模な化学的多様性創造のための合成戦略を記載しているＷｅａｖｅｒ，ｅｔ　ａｌ．（ＷＯ９２／１００９２）を参照すること。このシステムは、光指向で空間的にアドレス可能なパラレル化学合成を達成するために、固相化学、光不安定性保護基および写真平版を用いる。マスクの適正な順序および化学逐次反応を用いて、オリゴヌクレオチドの確定セットを、それぞれ、アレー表面上の事前確定位置に構築することができる。
【０００６】
この技術を用いて、アフィメトリックス（カリフォルニア州、サンタクララ）は、固形支持体上の単分子、二本鎖のオリゴヌクレオチドのライブラリーを開発してきた。例えば、４〜１００ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドを含有するアレーを記載している米国特許第５，７７０，７２２号を参照すること。アレーは、固形支持体、任意のスペーサ、第一オリゴヌクレオチド、第一に相補的である第二オリゴヌクレオチド、および柔軟性リンカーまたはプローブを含む。記載されるライブラリーは、二本鎖ＤＮＡに結合するタンパク質、ＲＮＡまたは他の分子などの受容体についてのスクリーニングに有用である。アフィメトリックスにより開発された別のアレーは、米国特許第５，８３７，８３２号に記載されている。この文献は、シリカチップ上にオリゴヌクレオチド・プローブの高密度アレーを作製するための方法を記載している。オリゴヌクレオチド・プローブは９〜２０のヌクレオチド長であり、直接固形支持体上に合成される。アレーは対照配列のセクションに相補的であるオリゴヌクレオチド・プローブを含む。
【０００７】
シンテニ（Ｓｙｎｔｅｎｉ）（カリフォルニア州、パロアルト）は、ポリリシンをスライドガラスに塗布し、続いてｃＤＮＡを被覆スライド上に印刷することによりｃＤＮＡのアレーを作製し、次に、アレーはＤＮＡをポリリシンで架橋するためにＵＶ光にさらされる。次に、未反応ポリリシンは無水コハク酸との反応により遮断される。「遺伝子発現マイクロアレー」（ＧＥＭ（商標））と呼ばれるこれらのアレーは、正常細胞から調製されるｍＲＮＡを蛍光染料で標識化し、次に異常細胞からのｍＲＮＡを異なる色の蛍光染料で標識化することにより用いられる。これらの二つの標識化ｍＲＮＡ分子は、同時にマイクロアレーに塗布され、そこで、それらは競合的に固定化ｃＤＮＡ分子に結合する。この２色符号化技術は、２細胞試料間の遺伝子発現の相違を識別するために用いられる（Ｈｅｌｌｅｒ，Ｒ．Ａ．，ｅｔ　ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９４：２１５０〜２１５５（１９９７））。
【０００８】
少なくとも一つのグループ、カンター（Ｃａｎｔｏｒ）ら（米国特許第５，７９５，７１４号）は、診断補助品の大規模製造に有用であると言われるプローブのアレーを複製するための方法を記載している。この特許は、以下の段階を含む固形支持体上の一本鎖プローブのアレーを複製するための方法を含む：
ａ）それぞれが３’末端で長さＣの不変配列および５’末端で長さＲの可変配列を含む核酸アレーを合成し；
ｂ）アレーを第一固形支持体に固定し；
ｃ）それぞれが不変配列に対して相補的である配列を含む核酸セットを合成し；
ｄ）セットの核酸をアレーにハイブリッド形成させ；
ｅ）アレーの可変配列を鋳型として用いてセットの核酸を酵素的に伸長させ；
ｆ）伸長された核酸のセットを変性させ；そして
ｇ）変性されたセットの核酸を第二固形支持体に固定化して一本鎖プローブの複製アレーを生成する。
【０００９】
別個の主題に関して、本発明の指定代理人は、以前から、光化学、詳しくは、例えば、ポリマーおよび他の分子を支持体表面に結合させるための光反応基の使用に関する多様な用途を記載してきた。例えば、米国特許第４，７２２，９０６号、第４，９７９，９５９号、第５，２１７，４９２号、第５，５１２，３２９号、第５，５６３，０５６号、第５，６３７，４６０号、および第５，７１４，３６０号および国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ９６／０８７９７号（ウイルス不活性化皮膜）、第ＰＣＴ／ＵＳ９６／０７６９５号（毛細血管内皮化）、および第ＰＣＴ／ＵＳ９７／０５３４４号（連鎖移動剤）を参照すること。
【００１０】
現在までの種々の開発にも拘わらず、例えば、オリゴヌクレオチドプローブアレーを形成するための、核酸の多様な支持体材料上への固定化を改善する方法および試薬に対する必要性が残ったままである。明白に必要とされることは、正確で感度のよい製品を維持しながら、費用効率が高く効率的な態様で特異的結合性リガンド（例えば、核酸）アレーを複製的に調製するための新規な改善された方法および試薬である。
【００１１】
発明の概要
本発明は、一つの実施形態において、例えば、元の「マスター」アレーを調製し複製することにより、実質的に同一の空間的配置にある特異的結合性リガンド（例えば、核酸）プローブアレーを作製するためのシステムを提供する。別の実施形態において、本発明は再生することができる再利用可能なアッセイアレーを提供する。本方法は、別個に且つ個々にそれぞれのプローブアレーを新たに調製する従来の方法と対比することができる。加えて、本発明は、マスター・アレーにより樹立される空間的配置を維持するマスター・アレーの複製を可能とする。本発明の方法は、それらの複製品を提供するために、従来のアレーに用いられるように適応させることができるが、しかし、好ましくは、本明細書において記載される態様において、こうした目的のために特に設計されたマスター・アレー（および他の成分）と共に用いられる。
【００１２】
好ましい実施形態において、本発明はアッセイアレーを再現良く調製するための方法およびシステムを提供し、該システムは：
ａ）その上に固定化される複数のアドレス・リガンドを有する支持体表面を含むマスター・アレー；
ｂ）それぞれの多リガンド接合体が（ｉ）コア；（ｉｉ）相補的な態様でマスター・アレーの特異的なアドレス・リガンドに結合するように選択されたリガンドを含む、少なくとも１分子の第一リガンド結合性領域（ｉｉｉ）相補的な態様で特徴的な標的リガンドに結合するように選択されたリガンドを含む、少なくとも１分子の第二リガンド結合性領域、および（ｉｖ）少なくとも１分子の第三リガンドを含み、ここで該第一リガンド結合性領域、第二リガンド結合性領域、および第三リガンドがコアに結合されている、複数の多リガンド接合体；および
ｃ）支持体表面および第三リガンドを結合するための結合相手を含むアッセイアレー支持体、
を含む。
【００１３】
好ましくは、アドレス・リガンドはパターン化され、場合により無作為な態様の形態をとるマスター・アレー上に固定化される。好ましい実施形態において、多リガンド接合体の第一リガンド結合性領域および第二リガンド結合性領域は、核酸配列を含む。この実施形態において、第二リガンド結合性領域は、試料中で検出しようとする標的核酸配列に相補的である核酸配列を含む。場合により、アドレス・リガンドは無作為な態様で固定化され、各アドレス・リガンドの正確な位置は、アドレス・リガンドがマスター・アレー支持体表面上に固定化されてから確定される。
【００１４】
あるいは、本発明はアッセイアレーを再現良く調製するための方法およびシステムを提供し、該システムは：
ａ）その上に固定化される複数のアドレス・リガンドを有する支持体表面を含むマスター・アレー；
ｂ）それぞれの多リガンド接合体が（ｉ）コア；（ｉｉ）相補的な態様でアドレス・リガンドおよび特徴的な標的リガンドに結合するように選択されるリガンドを含む、少なくとも１分子の第二リガンド結合性領域および（ｉｉｉ）少なくとも一つの分子の第三リガンドを含み、該第二リガンド結合性領域、および第三リガンドがコアに結合されている複数の多リガンド接合体；および
ｃ）支持体表面および第三リガンドを結合するための結合相手を含むアッセイアレー支持体、
を含む。
【００１５】
この実施形態において、第一リガンド結合性領域の使用は必要とされない。この実施形態により、第二リガンド結合性領域は、マスター・アレーのアドレス・リガンドに相補的であるだけでなく、試料中に存在すると疑われる標的リガンドに対しても相補的である。この実施形態により作製されるアッセイアレーの核酸配列は、マスター・アレーのアドレス・リガンドに相補的である。必要ならば、この実施形態により作製されるアッセイアレーは複製されて、元のマスター・アレーの複製を作製することができる。好ましくは、第三リガンドは結合リガンドおよび重合性基から選択される。
【００１６】
アドレスおよび標的リガンドが両方とも核酸配列である本発明の対応する好ましい方法は以下の段階を含む：
ａ）上述のマスター・アレーを用意し；
ｂ）それらそれぞれの第一リガンド結合性領域がマスター・アレーの相補的なアドレス・リガンドにハイブリッド形成することを可能とすることにより、そこに多リガンド接合体を結合させ；
ｃ）アッセイアレー支持体を、結合された多リガンド接合体がアッセイアレー支持体に結合することを可能とするのに適する条件下で、マスター・アレーに十分近接させ、
ｄ）アッセイアレー支持体が回収且つ利用されることを可能とするのに適する条件下で、ハイブリッド形成した相補的核酸配列を解離させる。
【００１７】
得られるアッセイアレーは、そこに複数の多リガンド接合体を結合させた、好ましくはなおその上にマスター・アレーにより樹立されたパターンにおいて存在する第三リガンドを有するアッセイアレー支持体を含む。
【００１８】
多リガンド接合体が重合性基（例えば、第三リガンドに加えて、または第三リガンドの代わりに）を含む別の実施形態において、多リガンド接合体は、マスター・アレーのアドレスにより樹立される空間的配置を保持しながら、得られる重合化層が支持され、そして用いられること、例えば、アッセイアレー支持体に移送されることを可能とするように十分な高分子裏当てを形成するために、それらの基を現場で重合することによりマスター・アレー表面上でそれらの配向位置に維持することができる。
【００１９】
多リガンド接合体が第二リガンド結合性領域および第三リガンドのみ（すなわち、第一リガンド結合領域は全く存在しない）を含み、アドレス・リガンドおよび標的リガンドが両方とも核酸であるなお別の実施形態において、本方法は、以下の段階を含む：
ａ）上述のマスター・アレーを用意し；
ｂ）それらそれぞれの第二リガンド結合性領域をマスター・アレーの相補的なアドレス・リガンドにハイブリッド形成させることを可能とすることにより、そこに多リガンド接合体を結合させ；
ｃ）アッセイアレー支持体を、結合された多リガンド接合体をアッセイアレー支持体に結合させることを可能とするために適する条件下で、マスター・アレーに十分近接させ、
ｄ）アッセイアレー支持体が回収され、且つ用いられることを可能とするために適する条件下で、ハイブリッド形成した相補的核酸配列を解離する。
【００２０】
一旦アッセイアレー支持体に移送されると、次に、第二リガンド結合性領域は、試料中の１以上の標的リガンドの絶対的または相対的な量での存在を測定するために従来方式において用いることができる。第二リガンド結合領域の順序および配置はあらかじめ決められ、本明細書において述べられる複製法の過程で保持される。例えば、得られるアッセイアレーは、例えば、あらゆる標的リガンドが結合し検出されることを可能とするために適する条件下で、標的リガンドを含有すると思われる試料とアレーを接触させることにより、従来方式において用いることができる。他の態様において、本発明は、こうしたシステムを用いる方法；キットまたは１以上の成分の組合せを含む、こうしたシステムにおける使用のための種々の成分；および本発明の方法により形成されるアッセイアレーを提供する。
【００２１】
詳細な説明
本発明は、核酸アレーなどの特異的結合性リガンド・アレーを再現良く調製するための方法およびシステムを提供する。本明細書において用いられる「核酸」には、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、または一般に塩基対を形成するかまたは相補的化学構造体とハイブリッド形成する能力を有する化学主鎖により結合される塩基を意味するあらゆる配列などの高分子が挙げられる。本用語には、オリゴヌクレオチド、ヌクレオチド、またはポリヌクレオチド配列、およびそれらの断片または部分が含まれる。核酸は、あらゆる適する形態において、例えば、天然源から単離されるか、組み換え的に作製されるか、または人工的に合成されて提供することができ、一本鎖または二本鎖であることが可能であり、センスまたはアンチセンス・ストランドを示すことが可能である。本発明は特に核酸（およびハイブリッド形成を介して特異的に「結合する」それらの能力）に関して記載する一方で、本発明が免疫学的な結合対または他のリガンド／抗リガンド結合対などの他の特異結合性リガンドに対する適用を有することは理解される。
【００２２】
次に用語「オリゴヌクレオチド」は、例えば、固形物支持核酸合成などの現在での技術上利用可能な技術を用いて、またはＤＮＡ複製あるいは逆転写などを用いて調製される、一般に短鎖（例えば、約１００ヌクレオチド長未満、一般的には２０〜５０ヌクレオチド長）の核酸配列を指す用語「核酸」と交換可能で用いられる。オリゴヌクレオチドの正確なサイズは、オリゴヌクレオチドの究極の機能または用途によって順番に確定する多くの要因に応じて決まる。
【００２３】
本明細書において用いられる「標的リガンド」または「標的」は、試料中に含有されると疑われ、本発明の方法またはシステムにおいて検出されおよび／または定量化される核酸配列などのリガンドを指す。一つの実施形態において、核酸は試料中に検出されようとする遺伝子または遺伝子断片を含む。
【００２４】
用語「試料」はその最も広い意味において用いられる。本用語は、標本または菌株（例えば、微生物菌株）、および生体試料を含む。
【００２５】
本明細書において用いられる用語「相補的」または「相補性」は、ポリヌクレオチド（すなわち、オリゴヌクレオチドまたは標的核酸などのヌクレオチドの配列）に関連して用いられる場合、ワトソンおよびクリック（Ｗａｔｓｏｎ　ａｎｄ　Ｃｒｉｃｋ）によって開発された塩基対合則により相関付けられる配列を指す。例えば、配列「Ｔ−Ｇ−Ａ」に対して、相補的配列は「Ａ−Ｃ−Ｔ」である。相補性は、核酸塩基の一部のみが塩基対合則に従って適合する「部分的」であることが可能である。あるいは、核酸間の「完全な」または「全体の」相補性があることは可能である。核酸ストランド間の相補性の程度は、核酸ストランド間のハイブリッド形成の効率および強度に影響を及ぼす。
【００２６】
用語「相補的」または「相補性」は、核酸以外の分子に関連して用いられる場合、特定結合対の構成員である分子などの結合相手と結合することができる分子を指す。
【００２７】
用語「ハイブリッド形成」は相補的核酸の対合に関連して用いられる。ハイブリッド形成およびハイブリッド形成の強度（すなわち、核酸間の結合力）は、核酸間の相補性の程度、組み込まれる条件の厳しさ、形成されたハイブリッドの融点（Ｔｍ）、および核酸内のＧ：Ｃ比などの要因により影響を受ける。
【００２８】
アッセイアレーに関連して本明細書において用いられる用語「結合部位」は、特定のリガンドが上に結合される領域を指す。以下により詳細に記載されるように、結合部位は、好ましくは、多リガンド接合体との結合を形成するための特定結合対の構成員である分子を含有する。
【００２９】
一つの実施形態において、本発明は、そのパターンがあらゆる適する技術により制御されおよび／または確定することができる複数のアドレス・リガンドをその上に固定化したマスター・アレーを提供する。その後、複数の多リガンド接合体を含む組成物は、多リガンド接合体の結合領域がマスター・アレー支持体上の相補的なアドレス・リガンドに結合することを可能とするために適する条件下で、マスター・アレーとの結合距離に持ち込まれる。好ましい実施形態において、多リガンド接合体は特異的結合対の構成員を含む第三リガンドを包含する。この実施形態において、第三リガンドは、得られる接合複合体をアッセイアレー支持体に移すのに役立つ。結合された接合分子を含有するマスター・アレーを、アッセイアレー支持体に近づける。次に、アッセイアレー支持体は、多リガンド接合体の第三リガンドと結合するために利用できる結合部位を含有する。アッセイアレー支持体の結合部位は、多リガンド接合体上の対応する結合性リガンドに結合し、こうして、マスター・アレー／多リガンド接合体／アッセイアレー支持体の形態をとる一時的な「サンドイッチ」構造を形成する。
【００３０】
「サンドイッチ」構造が形成できたら、次に、マスター・アレーのアドレス・リガンドと多リガンド接合体の相補的リガンド間の塩基対は、アッセイアレーが結合された多リガンド接合体と共に除去されることを可能とするために、解離することができる。接合体は、マスター・アレー表面に対するそれらの最初の結合により設定された空間位置取りに対応する空間関係において結合し、それによって、標的リガンドの位置が維持され決定されることを可能とする。次に、マスター・アレーは繰り返して再使用することができ、同じようなやり方で追加のアッセイアレーを提供することができる。別の態様において、本発明は、一般のマスター・アレーを再製するかまたは１以上のアッセイアレーを連続的に複製することにより形成される、複数の実質的に同一のアッセイアレーを提供する。
【００３１】
なお別の態様において、本発明は、例えば、アッセイアレー表面が光ファイバー・アレーの形態をとって提供される、マスター・アレーを最初に調製するかまたは再製するための必要性なしで、再使用可能な核酸アレーを直接調製するための方法およびシステムを提供する。一つのこうした実施形態において、それぞれのファイバーは、検出可能な状況でその相補的核酸にハイブリッド形成するように適応された核酸を提供される。こうした実施形態における使用のために適するファイバー・アレーは、例えば、その開示が本明細書において参考のために包含されるＫ．Ｍｉｃｈａｅｌ　ｅｔ　ａｌ．，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ　Ｃｈｅｍ．７０（７）：１２４２（１９９８）に記載されている。
【００３２】
次に、本発明のアッセイアレーは、好ましくは、生体試料中の多種多様な核酸を検出するように適応される。その使用の過程において、アッセイアレーは、標的リガンドがアッセイアレー上のそれらの対応結合性領域補体に対してハイブリッド形成することを可能とするために適する条件下で、１以上の標的リガンドを含有していると思われる試料にさらすことができる。アッセイアレー上の標的核酸の存在または不在は、選択された信号形成および検出システムにより測定することができる。こうした検出方法は技術上公知である。
【００３３】
本発明のシステムは、例えば、核酸プローブ密度、使い易さ、再現性、感受性、正確性、および低減コストなどの特性の最適組合せを含み、現下の方法に対する多くの利点を提供する。本発明は、例えば、現在写真平板法に依存している商業方法よりも一層高い核酸プローブ密度を提供する。一つの実施形態において、こうしたプローブ密度は、写真平板光システムの波長よりもさらに小さいマイクロビーズの使用によって達成される。さらに、本発明は、例えば、現在写真平板的にまたは固相合成を通して利用可能であるものよりも、一層長い（且つ従って結合に関してさらに特定的である）核酸の使用によって改善されたアッセイ特定性を提供することができる。
【００３４】
さらに、本発明によるアッセイアレーは、従来のアレー・リーダーと共に用いられて、例えば、固定化アレーの面密度に応じて多様な標的核酸能力を提供することができる。本発明のシステムは、また、高密度アレー・スライドの製造コストの有意な低減を提供することができる。マスター・アレーを調製するコストは、それ自体、例えば、パターン化沈積およびアドレス核酸配列の固定化の使用を通して、また場合によりマイクロビーズの使用によって低減させることができる。
【００３５】
本明細書における記載から見られるように、本発明は、あらゆる数の複製アッセイアレーを組立てるために広く多様にわたる多リガンド接合体と共に用いることができる万能「マスター・アレー」を提供するプローブアレーを複製するための改善された方法を提供する。マスター・アレーの万能的な性質は、特定のアッセイアレーに対する特異性を特に有さないアドレス・リガンドによって提供される。むしろ、アドレス・リガンドは、あらゆる数の特異的な多リガンド接合体と共に用いられて、所定の標的リガンド、または標的リガンド系を検出するためのプローブを含有する独特の複製アッセイアレーを組み立てることができる。このようにして、マスター・アレーはあらゆる数の複製アッセイアレー創造のための空間的配置を提供する。
【００３６】
マスター・アレー
本発明により、マスター・アレーはその上に固定化された複数のアドレス・リガンドを有する支持体表面を含む。アドレス・リガンドは、直接または間接的にマスター・アレー支持体表面上に固定化することができる。アドレス・オリゴヌクレオチドの直接固定化は、アドレス・オリゴヌクレオチド、マスター・アレーの支持体表面、または両方の誘導体化により達成される。間接的固定化は、以下にさらに詳しく記載されるように、アドレス・オリゴヌクレオチドを表面に結合するための結合剤の使用を含む。
【００３７】
マスター・アレーの支持体表面は、あらゆる適する材料から製造されて、安定性、寸法、形状、および表面平滑などの望ましい特性の最適組合せを提供する。好ましい材料は核酸のハイブリッド形成を妨害すべきではなく、且つ高い量の核酸の非特異的結合にさらすべきではない。適する材料には、生体または非生体、有機性または非有機性物質が含まれる。例えば、マスター・アレーはあらゆる適するプラスチックまたはポリマー、シリコン、ガラス、セラミック、または金属から製造することができると共に、固形物、樹脂、ゲル、剛体フィルム、または可撓性膜の形態をとって提供することができる。適するポリマーにはポリスチレン、ポリメタクリル酸（アルキル）、ポリ（ビニルベンゾフェノン）、ポリカーボネート、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリアミド、およびフッ化ビニリデン樹脂などが挙げられる。好ましい材料にはガラスおよびシリコンが挙げられる。
【００３８】
マスター・アレーの寸法は、作製しようとするアッセイアレーの寸法、および所期のアドレス・オリゴヌクレオチドの多様性の規模などの要因に基づき決定される。好ましくは、マスター・アレーは、約０．５ｃｍ〜約７．５ｃｍ長間、および約０．５ｃｍ〜約７．５ｃｍ間、好ましくは約１ｃｍ〜約２ｃｍ幅間の平面寸法で提供される。アレーは、また、顕微鏡用スライド（例えば、約７．５ｃｍ×約２．５ｃｍの寸法を有する）などの他の支持体上に単一でまたは多数で置くことができる。当業者は、本明細書の教示を考えると、特定用途用のマスター・アレーの寸法を容易に適応させることができよう。マスター・アレーは、例えば、毛細管、膜、ウエハー、ピンまたは針を含むあらゆる適する立体配置をとって提供することができる。加えて、以下にさらに詳しく記載されるように、マスター・アレーは１以上の光ファイバーの形態をとって提供することもできる。
【００３９】
アドレス・オリゴヌクレオチドは、直接的にまたはリンカーを介してマスター・アレー支持体表面に結合される。一つの実施形態において、アドレス・オリゴヌクレオチドは、１以上の反応基をマスター・アレー表面、オリゴヌクレオチド、または両方のいずれかに提供するかおよび／またはそれらにより誘導体化されることにより、直接、支持体表面に結合される。別の実施形態において、アドレス・オリゴヌクレオチドは、リンカーの使用を通してマスター・アレー支持体表面に間接的に結合される。この実施形態において、マスター・アレー支持体表面は、次にそこに結合されるオリゴヌクレオチドを有する連結マイクロビーズなどの複数のリンカーで被覆される。従って、連結マイクロビーズと組合せて用いられる場合、マスター・アレー支持体表面は、好ましくは、地形的な不揃いが連結マイクロビーズの半径よりも小さくなるように（例えば、でこぼこはマスター・アレーの連結マイクロビーズ直径の５０％未満である）、十分な平滑さを提供される。
【００４０】
本明細書において用いられる用語「アドレス・オリゴヌクレオチド」は、マスター・アレー上に固定化されて本発明における使用のための鋳型アレーを提供する核酸配列を指すために用いられる。従って、鋳型は、複製アッセイアレーがマスター・アレーにより設定される位置情報を用いて創造されることを可能とするアドレス配列の順序付けアレーである。アドレス・オリゴヌクレオチドは、試験しようとする生体試料中に潜在的に存在する標的核酸配列と非相補的であるように選択される。結果として、アドレス・オリゴヌクレオチドは、塩基対を形成しないか、またはさもなければ試験しようとする特定の生体試料中に見出されるあらゆる標的核酸とハイブリッド形成せず、それによって背景または擬陽性の読み込みの可能性を避けるかまたは最小化すると期待される。オリゴヌクレオチドは、同時にアッセイアレーにより検出しようとする標的核酸（例えば、自然発生の）配列に対する実質的な相補性を避けながら、マスター・アレー上の「アドレス」の適する多様性を提供する十分な長さで提供される。好ましくは、これらのアドレス・オリゴヌクレオチドは、１０〜１００ヌクレオチド長、および最も好ましくは２０〜５０ヌクレオチド長の間である。
【００４１】
本明細書において用いられる用語「固定化される」は、アドレス・オリゴヌクレオチドが本明細書における目的のために十分に安定なやり方において支持体表面に結合されることを意味する。こうした結合は、他の適する安定な結合も考慮されるが、好ましくは共有結合である。適する結合は本明細書における教示から明白である。
【００４２】
本発明により、マスター・アレー表面上へのアドレス・オリゴヌクレオチドの沈積は、例えば、直接結合または連結剤（例えば、連結マイクロビーズ）を通しての間接的な結合によることを含めて、あらゆる適するやり方で達成される。例えば、アドレス・オリゴヌクレオチドが次にマスター・アレーに結合されようとするマイクロビーズに結合される場合、沈積は、マイクロビーズ比重がアドレス・オリゴヌクレオチドを運搬する個々のマイクロビーズをマスター・アレー表面に接触させることを引き起こす比重ベースの方法により、達成することができる。この沈積はマスター・アレー上に順序付けられるがしかし不規則なパターンを形成する。好ましくは、マイクロビーズは光反応性表面機能を提供するために処理される。次に、得られた表面は、光反応性基を活性化し、アドレス・オリゴヌクレオチドを担持するマイクロビーズとマスター・アレー支持体表面間の結合形成を生じるために適する条件下で照射される。
【００４３】
好ましくは、アドレス・オリゴヌクレオチドの沈積は順序付けられるが、しかし不規則である。このようにして、アドレス・オリゴヌクレオチドは、最初の地図作成なしか、またはさもなければそれぞれ独特なアドレス・オリゴヌクレオチドの正確な位置付けを決めることなしに、マスター・アレーの表面上に置かれる。換言すれば、アドレス・オリゴヌクレオチドはマスター・アレーの表面上に置かれ、表面上に固定化され、その後マスター・アレー上のそれらの位置は公知の検出技術を用いて決定される。このようにして、本発明は、あらゆる望ましい組成物のアッセイアレーを創造するための多用途において用いることができるマスター・アレーを創造する効率的な方法を提供する。例えば、一旦マスター・アレーが組立てられ、表面が各アドレス・オリゴヌクレオチドの位置を決定するために「地図化」されると、マスター・アレーは多リガンド接合体のあらゆる選択と関連して用いられて特定の目的用のアッセイアレーを調製することができる。これは以下の検討を通して明白である。
【００４４】
マスター・アレー支持体表面に対するアドレス・オリゴヌクレオチドの直接結合は、核酸、マスター・アレーの支持体表面、または核酸および支持体表面の両方を誘導体化することにより達成することができる。核酸の修飾は、好ましくは、ワトソン−クリックの塩基対合に帰せられる核酸の機能を実質的に改変することを避けるべきである。好ましくは、核酸の修飾はその補体にハイブリッド形成する核酸配列の能力を実質的に損なわない。
【００４５】
アドレス・オリゴヌクレオチドの固定化に適する方法には、オリゴヌクレオチドの化学修飾（例えば、アミン修飾）、および高親和性結合剤（例えば、アビジン−ビオチン）による非共有結合が挙げられる。次に、マスター・アレー支持体の表面は、オリゴヌクレオチドそれ自体または適する架橋試薬により提供される対応反応基に結合するために、誘導体化することができる（例えば、カルボキシルまたはエポキシ基により）。あるいは、結合相手（例えば、ストレプトアビジン）は、直接マスター・アレー支持体表面に結合され、アドレス・オリゴヌクレオチドとマスター・アレーの支持体表面間の相互作用を可能とすることができる。他の方法には、非修飾または修飾オリゴヌクレオチドの吸着、および活性化マスター・アレー支持体表面上での可溶性プローブの熱化学的固定化を用いるインクジェットまたは「針状」印刷による支持体表面上へのオリゴヌクレオチドの固定化が挙げられる。当業者は他の技術もまた用いることが可能であることを容易に認識するであろうが、マスター・アレー支持体表面へのアドレス・オリゴヌクレオチドの直接結合に対する代表的な実施形態を今記載する。
【００４６】
核酸の修飾は、マスター・アレー支持体表面への結合を可能とするあらゆる適するやり方において達成することができる。一つの実施形態において、核酸は、マスター・アレーの表面と反応することができる少なくとも一つの反応部分を含有するように誘導体化される。あるいは、核酸は修飾塩基により合成される。技術上公知の他の技術には、ヌクレオチドの糖部分の修飾、または核酸塩基の修飾、例えば、Ｎ７−またはＮ９−デアザプリンヌクレオシドなどを用いることによるものが挙げられる。あるいは、核酸の主鎖は、反応基が修飾リン酸塩主鎖により提供される窒素中心に結合することができるように、修飾することができる（例えば、ホスホロアミダイトＤＮＡ）。本明細書における教示を考えると、当業者は容易にこれらのおよび他の標準的な核酸修飾技術を採用して、核酸配列をマスター・アレーの支持体表面に結合することができる。
【００４７】
光反応性核酸が表面に結合する一つの実施形態は、例えば、米国特許出願第０９／０２８，８０６号（１９９８年２月２４日出願、Ｇｕｉｒｅら）に記載されている。この出願は本出願の指定代理人により共通に所有され、この出願の全体の開示は本明細書において参考のために包含される。その出願に記載されているように、光活性化性核酸誘導体は、そこに結合される１以上の光反応性基を有する核酸の形態をとって、提供することができる。光反応性基は、好ましくは、核酸に沿って１以上の点で、直接または間接に共有結合的に結合される。光反応性基は核酸を支持体に結合させるために、且つその所期の化学的または生物学的機能を実質的に保持するやり方において、選択的におよび特定的に活性化することができる誘導体化核酸を提供する。この実施形態により、光反応性基の「直接」結合は、光反応性化合物が直接核酸に結合されることを意味する。他方、「間接」結合は光反応性化合物および核酸の合成または天然ポリマーなどの一般的な構造体に対する結合を指す。得られる光誘導体化核酸は、適する照射の適用により、および通常表面前処理の必要性なしで多様な基板表面に共有結合的に固定化することができる。この実施形態の方法は、１以上の光反応性基の核酸への熱化学的結合および基板表面上でのその核酸誘導体の光化学的固定化の両方を含む。
【００４８】
好ましくは、オリゴヌクレオチドは光活性化性化合物を用いてマスター・アレー表面上に固定化されて、アドレス・オリゴヌクレオチドとマスター・アレー支持体表面間の結合を形成する。これらの光活性化性化合物は、あらゆる適するやり方において、例えば、マスター・アレー支持体表面またはアドレス・オリゴヌクレオチドそれら自体により提供することができる。
【００４９】
一つの実施形態において、試薬組成物は、米国特許出願第０９／２２７，９１３号（１９９９年１月８日出願、Ｃｈａｐｐａら）に記載されているように、核酸などの生体分子の結合用の表面を修飾するために用いられる。この出願は本発明の指定代理人により共通に所有され、その全体の開示は本明細書において参考のために包含される。その出願に記載されているように、試薬組成物は、次に特定の結合反応（例えば、核酸をその相補的ストランドにハイブリッド形成すること）のために用いることができる生体分子（例えば、核酸）などの標的分子を共有結合的に結合するために用いられる。試薬組成物は、１以上の熱化学的反応性基、すなわち、温度に依存する反応速度を有する基を含む。適する基は、活性化エステル（例えば、Ｎ−オキシスクシニミド、すなわち「ＮＯＳ」）、エポキシド、アズラクトン、活性化ヒドロキシルおよびマレイミド基からなる群から選択される。場合により、および好ましくは、組成物はさらに１以上の光反応性基を含む。加えて、試薬は、熱化学的反応性および／または光反応性基がそれに対して垂れ下がることができる１以上の親水性ポリマーを含むことが可能である。光反応性基は、例えば、光などの適するエネルギー源を適用する際に、試薬分子を支持体の表面に結合させるために用いることができる。次に、熱化学的反応性基は、標的分子上の適切な相補的官能基との共有結合を形成するために用いることができる。
【００５０】
一般に、この実施形態により、試薬分子は光学基（ｐｈｏｔｏｇｒｏｕｐｓ）の活性化により最初に表面に結合される。その後オリゴヌクレオチドは、それが結合ポリマーとの結合距離中に近接することを可能とするために適する条件下で結合試薬と接触する。核酸は、結合試薬の反応基と核酸分子上の適切な官能基間の反応により、熱化学的に結合試薬に結合される。熱化学的反応基は、同じポリマー上か、または例えば表面上に共固定化される各種ポリマー上のいずれかに存在することができる。場合により、および好ましくは、標的分子は、試薬分子の基に合わせた官能基により調製されるかまたは提供される。それらの合成の間に、例えば、オリゴヌクレオチドはアミンまたはメルカプト基などの官能基により調製することができる。
【００５１】
代替実施形態において、マスター・アレーの表面はオリゴヌクレオチドの結合を可能とするためにエポキシド系試薬により修飾される。一つのこうした実施形態は、例えば、米国特許出願第０９／５２１，５４５号（２０００年３月９日出願、Ｓｗａｎら）に記載されている。この特許出願は本出願の指定代理人により共通に所有され、この出願の全体の開示は本明細書において参考のために包含される。この出願に記載されているように、エポキシド系試薬組成物は、基板の表面上への標的分子の共有結合のために用いられる。方法および試薬は、誘導体化または非誘導体化核酸のいずれかを共有結合的に固定化するために用いることができる。この実施形態において考慮されるように、誘導体化核酸の例にはアミン誘導体化核酸が含まれ、非誘導体化核酸にはエポキシド基との熱化学的反応の目的のために添加される基を有しないものが挙げられる。本方法は、試薬で支持体を被覆し、核酸アレーを印刷し、湿気の高い環境中でスライドを培養し、過剰のエポキシド基を遮断し、支持体を洗浄し、その後にそれがハイブリッド形成アッセイ用の準備が完了する段階を含む。特に、本方法は、表面を有する固形支持体を提供し；１以上のエポキシド基を含む試薬を提供すると共に、場合によりまた１以上の光反応性基を含み；支持体表面上に試薬を被覆し（例えば、光反応性基の活性化により高分子試薬を支持体表面に共有結合的に結合し）；対応する熱化学的反応基を有するバイオポリマーを提供し；およびその対応反応基を結合エポキシド基と反応させることにより、バイオポリマーを支持体に結合させる段階を含む。場合により、本方法は、さらに、残留エポキシド基を遮断する段階を含む（例えば、アミン試薬を用いて）。
【００５２】
この実施形態により、試薬は、好ましくは、親水性ポリアクリルアミド主鎖などの高分子主鎖に垂れ下がった１以上のエポキシド基（また「オキシラン」基として知られる）を提供する。場合により、試薬組成物はさらに垂れ下がった光反応性基を含む。光反応性基は、光などの適するエネルギー源を当てる際に試薬分子を支持体表面に結合するために用いることができる。次に、エポキシド基は、標的分子上の適切な官能基との共有結合を形成するために用いることができる。
【００５３】
別の実施形態において、マスター・アレーの支持体表面は、光反応性二−または多−官能価試薬を表面上に均一に分配し、その後これらの試薬を表面に結合することにより調製される。一つの実施形態において、十分な平滑さを有するシリコンチップが洗浄され、光反応性オルガノシロキサン試薬と反応する。この試薬は、例えば、市販オルガノシロキサン試薬（アミノプロピルジメチルメトキシ・シロキサンなど）をベンゾイル安息香酸の酸塩化物などの熱化学的反応性光試薬と結合させることにより、調製することができる。次に、得られる光反応性シロキサン試薬はマスター・アレー支持体のシリコン酸化物表面と反応して、光活性化性基により下塗りされた平滑な表面を提供する。得られる下塗りされた表面上の光反応性基は活性化され、オリゴヌクレオチドをリンカーによって直接または間接的にマスター・アレー支持体表面上に被覆するために用いることができる。
【００５４】
この実施形態により、複数のアドレス・オリゴヌクレオチドを含有する溶液をマスター・アレー支持体表面に塗布することができる。マスター・アレーは長波長紫外線または可視光線により照射されて、アドレス・オリゴヌクレオチドをマスター・アレー支持体表面上に光化学的に定着させる。代替実施形態において、アドレス・オリゴヌクレオチドそれら自体が光反応性である。適する光反応性基は以下にさらに詳しく検討される。場合により、パターン化沈積が必要である場合、マスクまたは適するビーズは用いることができよう。パターン化沈積はあらゆる適するやり方において達成することができる。一つの実施形態において、オリゴヌクレオチドはパターン化アレー中の基板表面上に沈積し（例えば、印刷技術を用いて）、次に、基板は適する波長の光により均一に照射することができる。別の実施形態において、オリゴヌクレオチドは基板表面上に均一に沈積し、続いてパターン化照射を行うことができる（例えば、マスキング技術を用いて）。
【００５５】
代替実施形態において、潜在反応性（例えば、光反応性）基およびリガンド吸引性（例えば、荷電性、カチオン性）基の両方を有する試薬の融解または濃溶液を用いることができる。例えば、１以上の両タイプの基（例えば、ポリビニル安息香酸のチオコリン誘導体）を含有するポリスチレン誘導体は、マスター・アレー表面上に沈積して、アドレス・オリゴヌクレオチドの固定化用の反応性表面フィルムを提供することができる。マスター・アレーの表面は照射されて平滑な光反応性表面を生成することができる。場合により、リガンド吸引性基（例えば、カチオン／チオコリン）は必要であれば除去される。
【００５６】
あるいは、アドレス・オリゴヌクレオチドは、リンカーまたは他の適するスペーサ分子の使用を通してマスター・アレー支持体表面に間接的に結合される。「リンカー」または「スペーサ分子」は、アドレス・オリゴヌクレオチドの固定化に関連して用いられる場合、固形支持体に結合されると共に、アドレス・オリゴヌクレオチドに結合される部分を指す。リンカーは、アドレス・オリゴヌクレオチドが本発明の多リガンド接合体に接触することを可能とするために、間隔をあけたやり方でアドレス・オリゴヌクレオチドをマスター・アレー支持体表面に結合させるために役立つ。
【００５７】
一つの実施形態において、リンカーはマイクロビーズの形態をとって提供され、「連結マイクロビーズ」と呼ばれる。連結マイクロビーズとしての使用に適切なビーズには、本明細書において記載されるように固形支持体上に固定化することができるあらゆる三次元構造体が含まれる。好ましくは、連結マイクロビーズは、それらがブラウン運動の影響を避けながら重力によりマスター・アレーの表面上に定着することを可能とするために十分な比重を有するように選択される。場合により、マイクロビーズは多孔質である。マイクロビーズはあらゆる適するサイズで提供することができ、ナノビーズおよびマイクロビーズは本発明において考慮される。本発明における使用に適する連結マイクロビーズは、望ましくは球状で、且つサイズにおいて均一である。また、好ましいビーズは、有機試薬と結合しやすい化学組成物、または少なくとも表面を有する。例えば、０．５ミクロン〜約５ミクロン（μ）直径間の均一なシリカ球体は、試薬を結合性リガンドの対応基に結合させるために、熱化学的反応基（例えば、エポキシ基）を含有するオルガノシロキサン試薬と反応することができる。マイクロビーズは、例えば、静電気引力、電極または磁気プローブ、または工学的ピンセットなどの技術により設置することができる。
【００５８】
本発明において考慮されているように、ビーズは事実上あらゆる不溶性または固形材料から製造することができる。例えば、ビーズは、シリカゲル、ガラス、ナイロン、樹脂、セファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）、セファローズ（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）、セルロース、磁気ビーズ、ダイナビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ）、金属表面（例えば、鋼、金、銀、アルミニウム、シリコンまたは銅）、およびプラスチック材料（例えば、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリアミド、ポリエステル、フッ化ビニリデン樹脂（ＰＶＤＦ））など、およびそれらの組合せから製造することができる。適するマイクロビーズの例は、例えば、米国特許第５，９００，４８１号（１９９９年５月４日発行、Ｌｏｕｇｈら）に記載されている。適するマイクロビーズの他の例は、例えば、蛍光性で、染色され、および／または特定の用途用に望ましい表面機能性を提供することができるラテックス・ミクロスフェアを提供するインターフェイシアル・ダイナミクス（Ｉｎｔｅｒｆａｃｉａｌ　Ｄｙｎａｍｉｃｓ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）（オレゴン州、ポートランド）から市販されている。
【００５９】
好ましくは、アドレス・オリゴヌクレオチドを含有する連結マイクロビーズは、マスター・アレー支持体表面上に間隔をあけた関係で固定化される。こうした実施形態において、ビーズ直径よりもほんのわずかだけ大きい間隔を有する編まれたスクリーンは、個別の、しかし順序付けられた構造形の表面上にマイクロビーズの沈積を促進するために、マスター・アレーの表面として用いるか、またはその表面上に位置付けることができる。
【００６０】
連結マイクロビーズは市販品から入手し、商業的に利用可能な製法および材料の使用によりオリゴヌクレオチドを担持することができる。アドレス・オリゴヌクレオチドの連結マイクロビーズへの結合は、好ましくは、オリゴヌクレオチドとビーズ間の共有結合の形成により達成される。アドレス・オリゴヌクレオチドを結合させるための方法には、アドレス・オリゴヌクレオチドを直接マスター・アレー支持体表面に結合させるために本明細書において記載されるものが含まれる。一つの好ましい実施形態において、連結マイクロビーズの表面は、熱化学的反応性基（例えば、エポキシ基）を含有するオルガノシロキサン試薬と反応する。グリシドキシプロピルトリエトキシ・シロキサンは、例えば、マイクロビーズと反応してエポキシ表面を提供することができる。次に、アドレス・オリゴヌクレオチドの５’末端は修飾されて、スペーサ上にアルキルアミン基を含有する末端を生成する。マイクロビーズ表面のエポキシシロキサンは、アドレス・オリゴヌクレオチドの末端に位置するアルキルアミンと反応し、アドレス・オリゴヌクレオチドとマイクロビーズ表面間の結合を形成する。各連結マイクロビーズは一つの独特のアドレス・オリゴヌクレオチドを含有することができる。あるいは、各連結マイクロビーズは複数の同一アドレス・オリゴヌクレオチド配列を含有することができる。
【００６１】
マイクロビーズのアレーは、場合により、その上に光反応性基およびリガンド吸引性基（例えば、第４級アミンなどのイオン性基）の両方を有するブロックコポリマーを含有する懸濁水溶液から沈積することができる。前にアドレス・オリゴヌクレオチドを担持した単分散のマイクロビーズ（例えば、直径で約１．５ミクロン〜５ミクロンの間）は、コポリマーの水溶液中の懸濁液からマスター・アレー支持体表面に塗布される。カチオン性反応基はビーズ上でオリゴヌクレオチド配列と結びつくために役立ち、一方で芳香族ブロック（例えば、オリゴスチレン）は光反応性表面と結びつき、それに結合するために役立つ。特に好ましい実施形態において、連結マイクロビーズはわずかに過剰で提供される。
【００６２】
平滑で平らな光反応性マスター・アレー支持体表面は、マスター・アレー支持体表面上に連結マイクロビーズの少なくとも単層を提供するために十分な数において、その上に固定化されたアドレス・オリゴヌクレオチド配列を有する連結マイクロビーズのスラリーにさらされる。このスラリーは、所期のアドレス・オリゴヌクレオチド配列のそれぞれとほぼ等しい数のビーズに、オリゴヌクレオチドを全く含まない多くの（例えば、少なくとも３倍の）ビーズをプラスする数から成る。オリゴヌクレオチド被覆ビーズの数は、各標的核酸−特定部位の小さな余剰性（例えば、少なくとも３倍の）を提供するために十分なものである。
【００６３】
マスター・アレーは、光学基の早期活性化を避けるために、暗所または薄暗い光の中で連結マイクロビーズを含有する溶液中において培養される。溶媒（好ましくは水性）が光反応性表面上でスラリー・プールから蒸発するので、均一寸法のビーズは、場合により本明細書において記載されるようなマイクロスクリーンを用いて間隔をとるかまたは位置付けされる、二次元的「結晶」配置に詰め込まれる。
【００６４】
次に、この順序付けられた配置は、例えば、乾燥状態において照射してマスター・アレー支持体表面上の光反応性基と連結マイクロビーズ上の有機基（殆どがオリゴヌクレオチド）間の炭素−炭素結合を形成することにより、定位置に「固定化する」ことができる。比重により光反応性表面上に定着したビーズのパターン化アレーは、長波紫外線または可視光線による照射によって表面に光化学的に固定することができる。この照射は、次にアドレス・オリゴヌクレオチドとの結合を形成する光反応性オルガノシロキサン試薬を活性化する。場合により、一旦配列された連結マイクロビーズがマスター・アレー支持体表面に光結合されたならば、非結合ブロックコポリマーはマスター・アレーからすすぎ洗いすることができる。このすすぎ洗いは、ビーズの周りに位置するがしかしそれらの上に固定化されないオリゴヌクレオチド配列による次の妨害（例えば、ハイブリッド形成の間に）を除去する。
【００６５】
どの形態のリンカーの使用も本発明において必要とされないが、本発明におけるマイクロビーズの使用は、マスター・アレーの表面上に固定化されるアドレス・オリゴヌクレオチドの増大密度、マスター・アレーの表面上にアドレスの個別位置を形成するためのアドレス・オリゴヌクレオチドの順序付けられた間隔、およびマスター・アレー表面上の各個別位置でのアドレス・オリゴヌクレオチド沈積物の増大密度（１より大きいアドレス・オリゴヌクレオチドが各リンカーと関連して提供される場合）などの利点の組合せを提供する。
【００６６】
本発明の一般的なマスター・アレーは、それぞれが個別の位置またはアドレスにあって、その表面上に固定される多数のアドレス・リガンドを含む。この意味合いで用いられる用語「アドレス」は、そこに結合されるリガンド（例えば、オリゴヌクレオチド）が特定され、区別されることを可能とするために十分識別可能である支持体表面上の空間的に確定された位置を指す。この固定化された結晶性アレーの結果として、その表面上に多数の独特な「アドレス」を含有するマスター・アレーが提供される。
【００６７】
この種類のマスター・アレー支持体表面は、好ましくは、少なくとも第一表面を有する平面的で非多孔質固形支持体の形態をとって提供される。複数の異種アドレス・オリゴヌクレオチドは、１００異種オリゴヌクレオチド／ｃｍ２を超え、好ましくは１０００異種オリゴヌクレオチド／ｃｍ２を超える密度での固形支持体の第一表面に結合することができ、それぞれの異種オリゴヌクレオチドは、異なる所定の領域中の固形支持体の表面に結合し、異なる確定配列を有すると共に、少なくとも４ヌクレオチド長、および好ましくは少なくとも１０ヌクレオチド、およびさらに好ましくは３０ヌクレオチド長である。
【００６８】
好ましい実施形態において、マスター・アレーは、それぞれが他の領域から物理的に分離された所定の領域に位置付けられ、固形支持体の第一表面に結合される少なくとも１，０００、さらに好ましくは少なくとも１０，０００の異種アドレス・オリゴヌクレオチドを含む。各オリゴヌクレオチドの多部位に対する選択を考えると、単一アレー中のオリゴヌクレオチド部位の全体数は、多くの場合、１０，０００を超えることができる。
【００６９】
本発明の好ましい実施形態において、マスター・アレー支持体表面は、特定のアドレスがマスター・アレー上の複数の空間確定位置に現れるように、その上に固定化される余剰のアドレス・オリゴヌクレオチドを含有する。この余剰性の結果として、特定のアドレス・オリゴヌクレオチドに対して相補的な配列を含有する特定の多リガンド接合体は、マスター・アレー上の複数の位置のいずれにも結合することができる。マスター・アレー上のあらゆる特定アドレスのこの余剰性は、試料内の対応標的核酸の検出用アッセイの感受性および正確度を増大させるのに役立つ。例えば、一つの実施形態において、マスター・アレーは、１〜１００、好ましくは２〜１０の間の異なる位置で支持体表面に固定化されるアドレス配列を含有する。こうした好ましい実施形態において、余剰のアドレスと結合する標的核酸の検出は、マスター・アレー上の多くの異なる位置で行われる。
【００７０】
一旦アドレス・オリゴヌクレオチドがマスター・アレーの表面上に固定化されると、次にそれぞれの固定化されたアドレス・オリゴヌクレオチドの空間的に確定された位置は確定することができる。各アドレス・オリゴヌクレオチドの位置を確定するための適する方法には、アレーに対する蛍光標識された相補的配列の連続添加、続いて各添加の間のすすぎおよび走査を含む蛍光ハイブリッド形成が挙げられる。それぞれのアドレス・オリゴヌクレオチド配列に相補的な蛍光標識化オリゴヌクレオチドは利用可能であるか、または一般的に相互に識別可能であることが知られるいくつかの（例えば、１０以上）異なる蛍光化合物の内一つを含有するように合成することができる。複数の（例えば、１０）異なるオリゴヌクレオチドは調製することができ、それぞれが表面上のアドレス配列に相補的な異なる公知の配列を有すると共に、それぞれが対応する識別可能な蛍光体を有する。標識化プローブは同時に表面に塗布され、例えば、５５℃で３０分にわたりハイブリッド形成することができる。次に、表面はすすがれ、走査されてそれぞれ１０の配列の位置を識別する。次に、１０配列の別のセットは表面にハイブリッド形成され、走査されて第二セットの１０配列を識別する。この過程はすべてのアドレスが識別されるまで続けられ、その後マスター・アレーは、例えば、２分間にわたり沸騰水中に浸漬することによりハイブリッド形成されたオリゴヌクレオチドから剥ぎ取られ、複製アッセイアレーを調製するために用いられる。当業者は他の検出方法も用いることができることを容易に認識するであろう。
【００７１】
好ましくは、本発明のアドレス・オリゴヌクレオチドは、直接または間接的にそこに共有結合的に結合される１以上の垂れ下がった潜在的反応性（好ましくは光反応性）基を含む。光反応性基は本明細書において定義され、好ましい基は十分に安定であり、それらがこうした特性を保持する条件下で保存される。例えば、その開示が本明細書において参考のために包含される、米国特許第５，００２，５８２号を参照すること。電磁スペクトルの種々の部分に反応する潜在的反応性基を選択することができ、それらは特に好ましいスペクトルの紫外線および可視部分に反応する（本明細書において「光反応性」と呼ばれる）。
【００７２】
光反応性基は特定の適用外部刺激に反応して、例えば、同じかまたは異なる分子によって提供されるような隣接化学構造体に対して得られる共有結合的結合により活性化学種生成を行う。光反応性基は、保存条件下でそれらの共有結合を変わらずに保持する分子中の原子基であるが、しかし、それらは外部エネルギー源により活性化されると他分子と共有結合を形成する。
【００７３】
光反応性基は、遊離基および特定のナイトレン、カルベン、および電磁エネルギーを吸収する際の励起状態のケトンなどの活性化学種を生成する。光反応性基は電磁スペクトルの種々の部分に反応的であるように選択することが可能であると共に、例えば、スペクトルの紫外線および可視部分に反応的である光反応性基は好ましく、本明細書において時に「光化学基」または「光学基」と呼ばれることが可能である。
【００７４】
アセトフェノン、ベンゾフェノン、アントラキノン、アントロン、およびアントロン様複素環（すなわち、１０−位にＮ、Ｏ、またはＳを有するものなどのアントロンの複素環式類似物）、またはそれらの置換（例えば、環置換）誘導体などの光反応性アリールケトンは好ましい。好ましいアリールケトンの例には、アクリドン、キサントン、およびチオキサントン、およびそれらの環置換誘導体を含むアントロンの複素環式誘導体が挙げられる。特に好ましいものは、約３６０ｎｍより大きい励起波長を有するチオキサントン、およびその誘導体である。
【００７５】
こうしたケトンの官能基は、それらが本明細書において記載される活性化／不活性化／再活性化サイクルを容易に行うことができるので好ましい。ベンゾフェノンは、それが三重項状態へのシステム間交差を行う励起一重項状態の初期形成による光化学励起が可能であるので、特に好ましい光反応性部分である。励起三重項状態は、水素原子の引き抜き（例えば、支持体表面から）により炭素−水素結合中にはめ込むことができ、こうしてラジカル対を生成する。ラジカル対の連続的な崩壊は新規の炭素−炭素結合の形成をもたらす。反応性結合（例えば、炭素−水素）が結合形成に利用可能でない場合、ベンゾフェノン基の紫外線誘発励起は可逆的であると共に、分子はエネルギー源を除去すると基底状態エネルギーレベルに戻る。ベンゾフェノンおよびアセトフェノンなどの光活性化性アリールケトンは、これらの基が水中で多再活性化を受け易く、従って増大した被覆効率を提供するものであるから、特に重要なものである。
【００７６】
アジドは好ましいクラスの光反応性基を構成し、フェニル・アジドおよび特に４−フルオロ−３−ニトロフェニル・アジドなどのアリールアジド（Ｃ６Ｒ５Ｎ３）、ベンゾイル・アジドおよびｐ−メチルベンゾイル・アジドなどのアシル・アジド（−Ｏ−ＣＯ−Ｎ３）、アジド蟻酸エチル、アジド蟻酸フェニルなどのアジド蟻酸塩（−Ｏ−ＣＯ−Ｎ３）、ベンゼンスルホニル・アジドなどのスルホニル・アジド（−ＳＯ２−Ｎ３）、およびジフェニル・ホスホリル・アジドおよびジエチル・ホスホリル・アジドなどのホスホリル・アジド（ＲＯ）２ＰＯＮ３を含む。ジアゾ化合物は別のクラスの光反応性基を構成し、ジアゾメタンおよびジフェニルジアゾメタンなどのジアゾアルカン（−ＣＨＮ２）、ジアゾアセトフェノンおよび１−トリフルオロメチル−１−ジアゾ−２−ペンタノンなどのジアゾケトン（−ＣＯ−ＣＨＮ２）、ジアゾ酢酸ｔ−ブチルおよびジアゾ酢酸フェニルなどのジアゾ酢酸塩（−Ｏ−ＣＯ−ＣＨＮ２）、およびアルファ・ジアゾアセト酢酸ｔ−ブチルなどのベータ−ケト−アルファ−ジアゾ酢酸塩（−ＣＯ−ＣＮ２−ＣＯ−Ｏ−）を含む。他の光反応性基には、３−トリフルオロメチル−３−フェニルジアジリンなどのジアジリン（−ＣＨＮ２）、およびケテンおよびジフェニルケテンなどのケテン（−ＣＨ＝Ｃ＝Ｏ）が挙げられる。
【００７７】
光反応性基の活性化の際に、試薬分子は互いに、および／または光反応性基の残基を通しての共有結合により材料表面に共有結合的に結合する。代表的な光反応性基、および活性化の際のそれらの残基は以下のように示される。
【００７８】
光反応性　　　　　　　　　　　　基
アリールアジド　　　　　　　　　アミン
アシルアジド　　　　　　　　　　アミド
アジド蟻酸塩　　　　　　　　　　カルバミン酸塩
スルホニルアジド　　　　　　　　スルホンアミド
ホスホリルアジド　　　　　　　　ホスホラミド
ジアゾアルカン　　　　　　　　　新規Ｃ−Ｃ結合
ジアゾケトン　　　　　　　　　　新規Ｃ−Ｃ結合およびケトン
ジアゾ酢酸塩　　　　　　　　　　新規Ｃ−Ｃ結合およびエステル
ベータ−ケト−アルファ−　　　　新規Ｃ−Ｃ結合およびベータ−
ジアゾ酢酸塩　　　　　　　　　　ケトエステル
脂肪族アゾ　　　　　　　　　　　新規Ｃ−Ｃ結合
ジアジリン　　　　　　　　　　　新規Ｃ−Ｃ結合
ケテン　　　　　　　　　　　　　新規Ｃ−Ｃ結合
光活性化ケトン　　　　　　　　　新規Ｃ−Ｃ結合およびアルコール
【００７９】
本発明の光活性化性核酸は、それにより光反応性基が反応して核酸を表面に固定化することができる炭素−水素結合を有するあらゆる表面に適用することができる。適切な基板の例には、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリ（塩化ビニル）、ポリカーボネート、ポリ（メタクリル酸メチル）、パリレンおよびガラスまたは他の無機表面を前処理するために用いられる多数のオルガノシランのあらゆるものが挙げられるがそれらに限定されない。光活性化性核酸はアレー中の表面上に印刷され、次に、均一な照射により光活性化されてそれらを特定のパターンにおいて表面に固定化することができる。それらは、また、連続的に表面に均一に塗布され、次に、一連のマスクを通しての照射により光活性化されて特定の配列を特定の領域中に固定化することができる。こうして、各種のマスクを通しての多照射およびそれぞれの光結合段階後の非結合光−核酸を除去するための注意深い洗浄による、特定の光誘導体化核酸の多連続塗布は、固定化核酸のアレーを調製するために用いることができる。光活性化性核酸は、また、塗布および光固定化により表面上に均一に固定化することができる。
【００８０】
マスクは技術上公知であり、不透明材料層により選択的に被覆された透明支持体材料の形態をとって提供することができる。一般に、マスクは、バリア材をかぶせられた基板表面の一部からの光子照射を遮るために所定の基板に貼り付けられる空間的に割り当てられたバリア材である。こうしたマスクは、基板の基調になる部分を活性化光との接触から遮断する。適するマスクは、例えば、米国特許第５，８３１，０７０号（１９９８年１１月３日、Ｐｅａｓｅら）に検討されている。不透明材料部分は、基板表面上に所期の正確なパターンをとる不透明材料を残して除去することができる。マスクは、マスター・アレー支持体表面に極めて近接させその上に画像化されるか、またはそれと直接接触させられる。マスク中の「開口部」は、核酸、およびマイクロビーズなどの望ましい部分を結合することが望ましい基板上の部分に対応する。一部の実施形態において、マスクは多照射用に位置を変えることができる。あるいは、多マスクを用いることが可能である。
【００８１】
多リガンド接合体
本発明は、さらに、複数の活性（例えば、結合性または重合性）領域を含有する多リガンド接合体を含む。多リガンド接合体は、そこに第一リガンド結合性領域、第二リガンド結合性領域、および第三リガンドを結合させたコアを含む。第一および第二リガンド結合性領域は、好ましくは核酸であるが、一方で第三リガンドは、好ましくは核酸以外の部分である。好ましくは、第三リガンドは結合性リガンドまたは重合性基を含む。あるいは、多リガンド接合体は、そこに第二リガンド結合性領域、および第三リガンドを結合させたコアを含む。この実施形態において、第二リガンド結合性領域は、アドレス・リガンドおよび試料中に検出しようとする標的リガンドの両方に対して相補的である。多リガンド接合体は、マスター・アレーにより設定された鋳型を用いることができる接合体を担り、本明細書において記載されるような１以上の複製アッセイアレーを作製する。
【００８２】
多リガンド接合体のコアは、第一および第二リガンド結合性領域、ならびに第三リガンドの結合のための面を提供する。コアは、本明細書において記載されるように、懸濁性粒子または可溶性分子を含む。適する懸濁粒子にはマイクロビーズが挙げられる。あるいは、コアは、好ましくは可溶性である分子部分を含む。本明細書において用いられるように、多リガンド接合体のコアがマイクロビーズの形態をとって提供される場合、マイクロビーズは「移送マイクロビーズ」と呼ばれる。
【００８３】
一つの実施形態において、コアは移送マイクロビーズの形態をとって提供される。本発明の多リガンド接合体を調製することにおいて有用なマイクロビーズは、「連結マイクロビーズ」に関して上述したものと同じ多様性をとることができる。好ましいビーズは、望ましくは、水のそれよりも大きい比重を持ち球状で均一なサイズを有する。また、好ましいビーズは化学組成物、または少なくとも有機試薬と結合し易い表面を有する。例えば、約０．５ミクロン〜約２０ミクロン間、好ましくは約１ミクロン〜約１０ミクロン間、さらに好ましくは約１ミクロン〜約５ミクロン（μ）直径間の均一なシリカ球は、試薬を結合性リガンドの対応基に結合させるために、熱化学的反応基（例えば、エポキシ基）を含有するオルガノシロキサン試薬と反応することができる。
【００８４】
本発明における使用のための適切な移送マイクロビーズには、本明細書において記載されるように、第一リガンド結合性領域、第二リガンド結合性領域、および第三リガンドに結合されることが可能であるあらゆる三次元構造体が挙げられる。好ましくは、移送マイクロビーズは水より大きい比重を有して、ビーズがアドレス・オリゴヌクレオチドと多リガンド接合体の第一結合性領域間のハイブリッド形成のためにマスター・アレーの表面に近接することを可能とする。移送マイクロビーズはあらゆる適するサイズにおいて提供することができると共に、マイクロビーズのみならずナノビーズも本発明において考慮される。
【００８５】
本発明において考慮されるように、ビーズは事実上あらゆる不溶性または固形材料から製造することができる。例えば、ビーズは、シリカゲル、ガラス、ナイロン、ワング（Ｗａｎｇ）樹脂、メリフィールド（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ）樹脂、セファデックス、セファローズ、セルロース、磁気ビーズ、ダイナビーズ、金属表面（例えば、鋼、金、銀、アルミニウム、シリコンおよび銅）、プラスチック材料（例えば、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリアミド、ポリエステル、および二フッ化ビニリデン樹脂（ＰＶＤＦ））など、およびそれらの組合せから製造することができる。適するマイクロビーズの例は、例えば、米国特許第５，９００，４８１号（１９９９年５月４日発行、Ｌｏｕｇｈら）に記載されている。適するマイクロビーズの他の例は、例えば、インターフェイシアル・ダイナミクス（オレゴン州、ポートランド）から市販されている。
【００８６】
別の実施形態において、コアは分子コアの形態をとって提供される。好ましくは、分子コアは可溶性である。適する分子コアには、多機能性ポリマーまたは多官能性単量体分子が挙げられる。多機能性ポリマーの例には、直鎖または分岐鎖のポリマーまたはデンドリマーが挙げられる。適する多官能性単量体分子の例には、塩化シアヌル、ホモシステイン、システイン、リジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、およびセリンなどが挙げられる。
【００８７】
一つの実施形態において、本発明の多リガンド接合体は、さらに、第一リガンド結合性領域を含む。好ましい実施形態において、第一リガンド結合性領域は核酸、好ましくはオリゴヌクレオチドを含む。オリゴヌクレオチドは、マスター・アレーのアドレス・リガンドを含む不規則配列に対する相補的配列を調製することにより第一結合性領域用に選択される。一旦アドレス・リガンドの配列が知られると、第一リガンド結合性領域の配列は、最初に標準ワトソン−クリック塩基対合則を用いてアドレス・オリゴヌクレオチドに対する相補的な核酸配列を確定し、次に確定された核酸配列を合成することにより調製される。この調製は、技術上公知のあらゆる適する方法を用いて、例えば固相ＤＮＡ合成によって達成することができる。一旦第一結合性領域に対するオリゴヌクレオチドが合成されてしまうと、各オリゴヌクレオチドの末端は、必要な場合に、スペーサ上にアルキルアミン基を含有するように修飾することができる。
【００８８】
オリゴヌクレオチドの長さは、望ましいハイブリッド形成の強度および動力学のために最適化される。通常、第一リガンド結合性領域の長さは２０〜５０ヌクレオチド範囲内にある。好ましくは、第一リガンド結合性領域の長さは、マスター・アレー上のアドレス・リガンドの長さに基づき選択される。好ましい実施形態において、第一結合性領域の配列は、相互、または試験しようとする試料中に存在している有意な確率を持つあらゆる公知の天然の遺伝子配列および／または遺伝子断片のどちらに対しても相補的でない。結果として、第一結合性領域オリゴヌクレオチド配列は、マスター・アレー支持体表面上に固定化されるそれらそれぞれの相補的アドレス・オリゴヌクレオチド配列とのみハイブリッド形成する。これにより、アッセイアレー支持体表面上の空間的に確定された位置に多リガンド接合体を置くことの原因となる第一リガンド結合性領域、と試験試料中で選別される標的核酸配列間の交差反応性（例えば、交差ハイブリッド形成）を避ける。
【００８９】
好ましい実施形態において、多リガンド接合体の第二リガンド結合性領域は、また、核酸好ましくはオリゴヌクレオチドを含む。オリゴヌクレオチドは、最初に本発明により組立てられるアッセイアレーにより検出しようとする標的リガンド（例えば、遺伝子および／または遺伝子断片）を選択することにより第二結合性領域に対して選択される。検出しようとするこれらの遺伝子および／または遺伝子断片の配列は公知であり得るか、または技術上周知の技術（例えば、サンガー（Ｓａｎｇｅｒ）ジデオキシ法、ＰＣＲ配列化、など）を用いて確定することが可能である。一旦標的核酸の配列がわかったら、第二リガンド結合性領域の配列は、最初に標準ワトソン−クリック塩基対合則を用いて標的核酸に対する相補的な核酸配列を確定し、次に確定された核酸配列を合成することにより調製される。この調製は、技術上公知のあらゆる適する方法を用いて、例えば固相ＤＮＡ合成によって達成することができる。一旦第二結合性領域が選択されてしまうと、各オリゴヌクレオチドの末端は、必要な場合に、スペーサ上にアルキルアミン基を含有するように修飾することができる。
【００９０】
第一リガンド結合性領域と同様に、第二リガンド結合性領域用のオリゴヌクレオチドの長さは、望ましいハイブリッド形成の強度および動力学のために、好ましくは１０〜１００ヌクレオチド範囲、さらに好ましくは２０〜５０ヌクレオチド範囲内に最適化される。好ましくは、第二結合性領域の配列は、マスター・アレー上のアドレス・リガンド、または多リガンド接合体の第一リガンド結合性領域のいずれかとの交差ハイブリッド形成などの交差反応性を避けながら、試料中の特定標的リガンドに対する十分な特定性を提供するために選択される。
【００９１】
代替の実施形態において、第二リガンド結合性領域は、マスター・アレーのアドレス・リガンド、および試料中に検出しようとする標的リガンドに相補的であるように選択される。この実施形態において、第二リガンド結合性領域の配列は、本発明により組立てられるアッセイアレーにより検出しようとする標的リガンド（例えば、遺伝子および／または遺伝子断片）を選択することにより確定される。第二リガンド結合性領域の配列は、上述のように、ワトソン−クリック塩基対合則を用いて標的核酸に対する相補的な核酸配列を確定し、次に確定された核酸配列を合成することにより調製される。次に、この実施形態におけるアドレス・リガンドは、標的リガンドに対して実質的に相補的である配列を含むように組立てられる。この実施形態により、第二リガンド結合性領域がマスター・アレーのアドレス・リガンドとハイブリッド形成するので、第一リガンド結合性領域との多リガンド接合体を提供するための必要性は全くない。
【００９２】
多リガンド接合体は、生体試料中に見出されるあらゆる望ましい標的核酸に相補的であり、従ってそれとハイブリッド形成すると共に、公知のまたは確定できる配列を有するオリゴヌクレオチドを含むように組立てることができる。一つの実施形態において、本発明の多リガンド接合体の種々の第二リガンド結合性領域は、生体試料中に見出される種々の標的核酸に相補的である多様なオリゴヌクレオチドを含むことができる。
【００９３】
代替の実施形態において、多リガンド接合体の第二結合性領域は、得られるアッセイアレーが自然発生遺伝子の特定系列の標的核酸を位置付けるように組立てられる。この特定実施形態の一つの例は、嚢胞性線維症の５０〜６０の知られた標的配列に相補的な第二結合性領域を含有する多リガンド接合体のセットであろう。こうして、得られるアッセイアレーは、それがこの障害とのみ結合すると知られるかまたは疑われる配列の存在を検出するように組立てられるであろう。
【００９４】
多リガンド接合体の第三リガンドは、多リガンド接合体を本発明により調製されるアッセイアレーに移送する分子である。一つの実施形態において、一旦多リガンド接合体が所期のアドレス位置でマスター・アレーにハイブリッド形成してしまうと、第三リガンドは、マスター・アレーにより設定される核酸の位置的配置を維持しながら、多リガンド接合体がアッセイアレーに移送されることを可能とする。好ましくは、第三リガンドは結合性リガンドまたは重合性基として提供される。
【００９５】
一つの実施形態において、第三リガンドは結合性リガンドである。本明細書において用いられる「結合性リガンド」は、結合相手に結合することができるあらゆるリガンドを意味する。好ましくは、結合性リガンドは、相補的結合性部分と結合することができる特異的な結合性対の構成員である。本発明において考慮されるように、結合性リガンドは、共有または非共有結合を通して別の分子または高分子に対する高親和性を有する生物学的または合成分子である。好ましくは、結合性リガンドは、それが一般的な官能基に共有結合的に反応するかまたは非共有結合的に結合することを可能とする、官能性化学基（第一級アミン、スルフヒドリル基、またはアルデヒド基など）、エピトープ（抗体）、ハプテンまたはリガンドを含有する（自然にかまたは修飾によるかのいずれかで）。例えば、第三リガンドがアビジンまたはストレプトアビジンを含む場合、多リガンド接合体は、ビオチンまたはイミノ−ビオチンなどのビオチン誘導体により被覆される表面に結合することができる。結合性構成員は逆転させることができる、例えば、ビオチン被覆ビーズはストレプトアビジン被覆固形支持体に結合することができることは理解される。本発明における使用のために考慮される他の特異的結合性対には、ハプテン（ジゴキシゲン、２，４−ジクロロフェノキシ酢酸、トリニトロフェニル）および高親和性抗体、ホルモン−受容体、酵素−阻害剤、および抗体−抗原などが挙げられる。
【００９６】
一つの実施形態において、第三リガンドはビオチン−ポリ（アルキレンオキシド）アミン誘導体の形態をとって提供される。こうした誘導体は、例えば、ビオチンのＮ−オキシスクシニミドエステルを、同じコアまたはマイクロビーズ上に置かれようとするオリゴヌクレオチド誘導体とほぼ同じ分子長のポリ（酸化エチレン）ジアミンと反応させることにより調製することができる。
【００９７】
第三リガンドは、直接的に、またはリガンドが立体障害（例えば、移送マイクロビーズに対するリガンドの近接により生ずる立体障害）を起さないことを可能とするようなやり方において、スペーサの使用により間接的に多リガンド接合体のコアまたは移送マイクロビーズに結合することができる。換言すれば、第三リガンドを結合するためのスペーサの使用は、リガンドがコアまたは移送マイクロビーズの表面から十分な距離をとって、それがその所期の機能を実行する、例えば、アッセイアレー表面上に含有される対応結合相手と重合するかまたは結合し得ることを確実にする。
【００９８】
本明細書において用いられる、第三リガンドのコアへの結合のための「スペーサ」は、第三リガンドの機能または反応性を妨害しない空間的な関係において、第三リガンドのコアへの結合を可能とする分子である。適するスペーサには、ポリエチレン・グリコール、ならびにアクリルアミド、ビニルピロリドン、および炭水化物などの水可溶性二−または多−官能性モノマーが挙げられる。好ましくは、こうした水可溶性二−または多−官能性モノマーはオリゴマーまたはポリマーを含む。好ましい実施形態において、スペーサは、例えば、結合性領域が立体障害のないことを可能とする十分な長さの親水性スペーサ、例えば、ポリエチレン・グリコールスペーサを含む。
【００９９】
一つの実施形態において、本発明の多リガンド接合体はさらに重合性基を含む。本明細書において用いられる「重合性基」は、適する条件下で、重合、比較的単純な分子が結合して高分子または鎖様分子を形成する化学反応を行うことができる分子を指す。多リガンド接合体の第三リガンドは、例えば、接合体がマスター・アレー上の所定の位置にありながら安定なフィルムに形成されることを可能とするために、重合性基の形態をとって提供することができる。
【０１００】
適する重合性基の例には、ビニル、アクリル、マレイン、イタコン、不飽和脂肪酸、および他のエチレン性およびアセチレン性不飽和炭化水素基などの遊離基生成物が挙げられる。好ましい実施形態において、重合性基は追加モノマーおよび他の試薬（例えば、開始剤）の存在下で付加重合を行うように適応されて、安定フィルムを形成する。重合は、水性遊離基溶液重合、熱への曝露、高エネルギー照射、超音波、紫外線照射、および水可溶性または膨潤性ポリマーを生成するためのイオン重合触媒を含むあらゆる適する反応を介して行うことができる。さらに、基の重合は塩基触媒水素移動重合を介して行うことができる。本記載を考えると、当業者は、こうした基がリガンドを他のモノマーと、次にそれらの対応接合体と共重合させて完全な高分子構造体、例えば、次にアッセイアレー支持体表面として用いるかまたはそこに移送することができるフィルム裏当ての形態をとるように用いることができるやり方を理解するであろう。
【０１０１】
この実施形態において、一旦マスター・アレーのアドレス・オリゴヌクレオチドが、それぞれ、多リガンド接合体のそれらそれぞれの第一結合性領域とハイブリッド形成してしまうと、重合性基は、試薬および当業者の技能内の条件を用いて反応しポリマーフィルムの形成を可能とすることができる。重合性基は、マスター・アレーにより確定されるそれらそれぞれの位置を実質的に維持しながら、フィルム裏当てに共重合される。フィルムは、それが各「アドレス」の空間的に確定された位置を維持するために十分安定である（例えば、自己支持性）ように存在するか、または場合により安定化（例えば、ゲル化か、別の層を積層するか、またはさもなければ固形化する）させて用いることができる。同時にまたはその後、この高分子裏当ては、接合体の所期の配向性を維持するやり方において、アッセイアレー表面に移送されるか、またはさもなければその中に組み込むことができる。
【０１０２】
本発明により、多リガンド接合体の個々のリガンドは、あらゆる適するやり方および／または順序において、例えば、個別にまたは一緒に（例えば、直鎖配列において、且つ単一の位置または複数の位置で）コア原子または分子に結合することができる。例えば、一つの実施形態において、リガンドは、例えば同様の反応条件下で、同時にコアに結合される。場合により、第三リガンドとして役立つリガンドは、マスター・アレーのアドレス・オリゴヌクレオチドと多リガンド接合体により提供される相補的オリゴヌクレオチド間のハイブリッド形成後にコアに結合される。この実施形態において、第三リガンドは別個の試薬として存在するが、しかし、第三リガンドの結合は第一および第二結合性領域と同じかまたは同様の反応条件下で行うことができる。なお別の実施形態において、各リガンドは別個の反応の別個の条件下でコアに結合される。
【０１０３】
これらリガンドの多リガンド接合体のコアへの結合の配列は、本発明に対して決定的であるとは考えられず、個々の活性（例えば、結合性）領域がそれらの特定補体を結合することに対して利用可能である限り、それらは任意の順序でコアにまたは互いに結合することができる。特に好ましい実施形態において、各個別の結合性領域は、表面上の複数の位置で、個別にコアに結合される。
【０１０４】
一つの実施形態において、エポキシ−ガラス表面は、その後第一および第二リガンド結合性領域、ならびに第三リガンドと反応する移送マイクロビーズの表面上で形成される。この実施形態において、グリシドキシプロピルトリエトキシ・シロキサンは、公表されている反応条件（「Ｇｒａｆｔｉｎｇ　Ｒａｔｅｓ　ｏｆ　Ａｍｉｎｅ−Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｚｅｄ　Ｐｏｌｙｓｔｙｒｅｎｅｓ　ｏｎｔｏ　Ｅｐｏｘｉｄｉｚｅｄ　Ｓｉｌｉｃａ　Ｓｕｒｆａｃｅｓ，」Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，３３：１１０５〜１１０７（２０００）を参照すること）下でガラスマイクロビーズと反応して、エポキシ−ガラス表面を提供する。それぞれがスペーサ上でアルキルアミン基により末端処理された本発明の三つの結合性領域は、ビーズの表面上でエポキシ基と容易に結合することができる。
【０１０５】
第一および第二オリゴヌクレオチド結合性領域はあらゆる適する方式において移送マイクロビーズに結合することができ、例えば、アルキルアミン末端処理された核酸は合成され、熱化学的に結合することができる。上述のように、第一結合性領域はマスター・アレー支持体表面上に固定化されるアドレス・オリゴヌクレオチドに対して相補的であるオリゴヌクレオチドを含むが、一方で、第二結合性領域は試験しようとする試料中に存在すると疑われるかまたは知られる選択された標的核酸に対して相補的である。上述のように、第一リガンド結合性領域の配列は、好ましくは、互いに、または生体試料中に存在する有意な確率を持つあらゆる公知の天然の遺伝子配列および／または遺伝子断片のどちらに対しても相補的でない。
【０１０６】
一つの実施形態において、第一および第二リガンド結合性領域は、アルキルアミン核酸誘導体の形態をとって提供され、第三リガンドはビオチン・ヒドラジドの形態をとって提供される。コアは光反応性ポリ−Ｎ−オキシスクシニミド（ポリＮＯＳ）またはエポキシド表面を与えられるマイクロビーズとして提供される。アルキルアミン誘導体およびビオチン・ヒドラジドはコアの表面と反応して、結合性リガンドおよび第三リガンドの結合を可能とする。あるいは、５’−ＯＨオリゴヌクレオチドおよびアリルアミン・オリゴヌクレオチド誘導体は、第一および第二リガンド結合性領域として用いられ、第三リガンドは、可溶性分子核としての三塩化トリアジンと共に、ビオチン・ヒドラジド（結合性リガンド）またはアリルアミン（重合性基、パターン化フィルムの現場形成用）として提供される。
【０１０７】
代替の実施形態において、第三リガンドは、多リガンド接合体のコアに結合されるよりはむしろ溶液において提供される。この実施形態において、第三リガンドは、マスター・アレーのアドレス・オリゴヌクレオチドとその相補的な多リガンド接合体の第一結合性領域とのハイブリッド形成後に組み込まれる。従って、この実施形態において、第三リガンドは、多リガンド接合体の結合後、且つアッセイアレーがマスター・アレーとの結合距離に近接させられる前に、マスター・アレー上に形成される複合体中に組み込まれる。好ましくは、第三リガンドの追加は第一および第二結合性領域のそれとは異なる反応条件を必要とはせず；むしろ、第三リガンドの追加は同じ条件下で行うことができる。
【０１０８】
好ましい実施形態において、第三リガンドは光反応化学を用いて多リガンド接合体に結合される。この実施形態において、マイクロビーズの表面は、例えば、光反応性化合物との反応用の表面を調製するためにオルガノシロキサンにより前処理される。この実施形態において、第三リガンドは、次に光反応性基に結合される親水性スペーサに結合される。光反応性基は、スペーサ（結合性リガンドに結合される）と多リガンド接合体のコア間の結合形成を可能とする。
【０１０９】
第三リガンドは、好ましくは、コアが懸濁性粒子または可溶性分子を含もうが含むまいが、コアに共有結合的に結合される。一つの実施形態において、第三リガンド誘導体には、多リガンド接合体のコアの上に見出されるかまたは置かれる標的基との共有結合を形成するために選択される反応性基が含まれる。例えば、コアはエポキシまたは活性エステル基を含有することが可能であり、第三リガンドはアミンまたはヒドラジド基を含有することが可能であり；これら二つのクラスの反応性基は、水性でわずかにアルカリ性の状態中に一緒に置かれる場合、反応して共有結合を形成する。コアが例えば懸濁性粒子を含む場合、ビオチン−ポリ（アルキレンオキシド）アミン誘導体は、光反応性基およびＮ−オキシスクシニミド（ＮＯＳ）エステル基を含有する可溶性コポリマーと反応するであろう（他の二つのリガンドまたはリガンド結合性領域のアミン含有誘導体であろうように）。この多リガンド接合誘導体はコア粒子に光化学的に結合されるであろう。
【０１１０】
代替の実施形態において、本発明がマスター・アレーの表面上に固定化され、アドレス・オリゴヌクレオチドに共有結合的に結合される多孔質連結マイクロビーズの使用を含む場合、多リガンド接合体のコアとしての移送マイクロビーズは必要とされない。この実施形態において、多孔質連結マイクロビーズはマスター・アレーの表面上に固定化され、それぞれの多孔質連結マイクロビーズはその表面に結合される複数のアドレス・オリゴヌクレオチドを有することができる。この実施形態により、多リガンド接合体は、アドレス・オリゴヌクレオチドに相補的な第一結合性領域、生体試料中に見出される標的リガンドに相補的な第二結合性領域、および結合性リガンドを含む第三リガンドを包含する。多リガンド接合体は、好ましくは、移送マイクロビーズを含まず、むしろ化学的（例えば、分子の）コアを含む。
【０１１１】
複数の多リガンド接合体はマスター・アレーに塗布され、マスター・アレーのアドレス配列と多リガンド接合体内に含有されるその相補的なオリゴヌクレオチドとのハイブリッド形成を可能とするために適する条件下で培養される。当業者は、アドレス・オリゴヌクレオチドと第一結合性領域とのハイブリッド形成のための温度、塩濃度、および緩衝液組成の適する条件を確定できる。ハイブリッド形成条件およびそれらを適用するための方法の検討に関しては、ｐａｇｅｓ３〜１５，６２〜６６，７３〜１１２，Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ　Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｈａｍｅｓ　ａｎｄ　Ｈｉｇｇｉｎｓ，ｅｄｓ．（１９８５）を参照すること。その開示は本明細書において参考のために包含する。
【０１１２】
アッセイアレー支持体
本発明のアッセイアレー支持体は、多リガンド接合体の第三リガンドのための結合性部位により好ましくは被覆される支持体表面を含む。アッセイアレー支持体は、マスター・アレーを用いて組立てられようとする複製アレーに対する支持体を提供する。
【０１１３】
アッセイアレー支持体はあらゆる適する材料から製造されて、寸法安定性、形状、および平滑さなどの特性の最適組合せを提供する。アッセイアレーを組立てることにおける使用のための適する材料には、マスター・アレーそれ自体に有用であると記載されたものが挙げられ、好ましくはシリコンおよびガラスが挙げられる。特に好ましい実施形態において、アッセイ支持体は、約０．５ｃｍ〜約７．５ｃｍ長間、および約０．５ｃｍ〜約７．５ｃｍ間、好ましくは約１ｃｍ〜約２ｃｍ幅の平面寸法で提供される。好ましくは、アッセイアレー支持体は、直接的空間関係を提供するために、マスター・アレーに見合う寸法のものである。
【０１１４】
なお別の実施形態において、多アレーは単一アッセイアレー支持体上に複製することができる。この実施形態において、１以上のマスター・アレーは、アッセイアレー支持体上の確定面において個々の複製アレーを創造するために用いられる。得られるアッセイアレーは単一支持体表面上に多プローブアレーを含有し、各アレーの組成は、要望通りに特定の用途のために合わすことができる。
【０１１５】
本明細書において用いられる「結合性部位」は、多リガンド接合体の第三リガンドを結合することができるアッセイアレーの表面上の部分を指す。好ましくは、結合性部位は、共有結合的または非共有結合的な態様で、相補的結合性部分、例えば多リガンド接合体の第三リガンドと結合することができる特異的結合性対の構成員を含む。適する特定の結合性対は、多リガンド接合体の第三リガンドに関して本明細書において記載される。当業者は、多リガンド接合体の組成およびアッセイアレーの所期の用途に基づき適する結合性部位を選択することができる。
【０１１６】
個々のアッセイアレー支持体の表面は、配向された接合体層の結合を容易にするために前処理することができる。好ましい実施形態において、アッセイアレーは、洗浄され、磨かれ、処理されて平滑な酸化シリコン表面を提供するシリコンチップの形態をとって提供される。次に、酸化シリコン表面は、オルガノシロキサン試薬により処理されて（本明細書において記載されるように）、平滑な光活性化性表面を提供することができる。
【０１１７】
一つの実施形態において、本発明のアッセイアレー支持体は、多リガンド接合体の第三リガンドとの結合を形成するために利用可能な結合性の相手分子により被覆することができる。アッセイアレー支持体表面は、表面を光活性化性化合物（例えば、光反応性シロキサン試薬）により被覆して、表面に光反応性を与えることによって調製することができる。その後、アッセイアレー支持体表面は結合性の相手分子（例えば、アビジン）を含有する溶液にさらすことができ、その溶液は結合性の相手とアッセイアレーの表面間の結合形成を可能とするために照射される。場合により、アッセイアレーの表面は、結合性相手に対する曝露の前および／または後に、例えば、界面活性剤（例えば、ビオチン・トリブロックコポリマー）を用いて皮膜で保護されて、試験試料中に見出される分子のアッセイアレー支持体表面への非特定結合を防止する。
【０１１８】
好ましい実施形態において、結合相手はアッセイアレー支持体表面上に単層の形態をとって提供される。場合により、結合相手は、三次元層、例えば、十分な厚さ、例えば約２０ミクロン（μ）厚さまでのアビジン−ヒドロゲル複合材の形態をとって提供することができる。三次元層の厚さは、用いられるポリマーの分子量、ポリマーの膨潤性（例えば、親水性）、および適用材料の量（例えば、濃度および体積）などの要因に応じて決まる。適する厚さは、約０．１μ〜約２０μ、好ましくは約０．５μ〜約１０μ、さらに好ましくは約０．５μ〜約５μである。こうした構造体は、例えば、光反応性アッセイアレー表面に、アビジンに光反応性ヒドロゲル（例えば、ベンゾイルベンズアミドプロピル・メタクリルアミドとビニルピロリドンまたはアクリルアミドとのコポリマー）をプラスした溶液を担持させ、湿っている間に照射することにより得ることができる。
【０１１９】
別の好ましい実施形態において、結合相手は、寸法的に安定なアッセイアレー支持体表面に塗布される光ポリマーの薄いフィルムにより提供される。高表面密度（例えば、０．１ｐモル／ｍｍ２）の高親和性リガンド基（例えば、ビオチン）を含有する保護用界面活性剤の自己組織化単層膜が、光反応性表面に塗布される。次に、単層界面活性剤膜は表面に光結合され、あらゆる非結合界面活性剤はすすがれて分離される。皮膜で保護されたリガンド担持表面は、高親和性結合相手分子（例えば、ｘ−アビジン）により飽和され、あらゆる余剰な結合相手はすすがれて分離される。適する高親和性結合相手分子には、例えば、ｘ−アビジン膜、または高親和性抗体（例えば、抗ジゴキシゲニン）が挙げられる。
【０１２０】
場合により、システムには、さらに、例えば相補的でハイブリッド形成されたオリゴヌクレオチド（例えば、マスター・アレーのアドレス・オリゴヌクレオチドおよび多リガンド接合体により担持されるその相補的なオリゴヌクレオチド）を解離することにおける使用のための試薬または他の機構を含む、他の成分もまた挙げられる。例えば、ハイブリッド形成されたＤＮＡを解離するための適する機構には、システムの温度、ｐＨ、または塩濃度を変更する技術または試薬が挙げられる。当業者は、ハイブリッド形成されたＤＮＡを解離し、本明細書において本発明を達成するためにこうした機構を適用することができよう。
【０１２１】
場合により、システムには、さらに、核酸標的の特定アドレスへのハイブリッド形成を検出するために市販されている走査器（例えば、モレキュラー・ダイナミクス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｄｙｎａｍｉｃｓ）から市販されている共焦点蛍光顕微鏡）が含まれる。
【０１２２】
方法
別の態様において、本発明は核酸アレーを再現良く調製するための方法を提供し、該方法は：
ａ）支持体表面を有するマスター・アレーを提供し；
ｂ）パターン化アレーの形態をとるマスター・アレー支持体表面上に複数のアドレス・リガンドを固定化し；
ｃ）固定化されたアドレス・オリゴヌクレオチドのパターンを確定し；
ｄ）各多リガンド接合体が（ｉ）コア；（ｉｉ）相補的な態様でマスター・アレーのアドレス・リガンドに結合するように選択されたリガンドを含む、少なくとも一つの分子の第一リガンド結合性領域（ｉｉｉ）相補的な態様で特異的な標的リガンドに結合するように選択されたリガンドを含む、少なくとも一つの分子の第二リガンド結合性領域、および（ｉｖ）少なくとも一つの分子の第三リガンドを含み、該第一リガンド結合性領域、第二リガンド結合性領域、および第三リガンドがコアに結合されている、複数の多リガンド接合体を用意し；
ｅ）各アドレス・リガンドが多リガンド接合体のその相補的な第一リガンド結合性領域を結合することを可能とするために適する条件下で、多リガンド接合体をマスター・アレー支持体表面と接触させ、培養し；
ｆ）アッセイアレー支持体表面を提供し；
ｇ）接合体がマスター・アレー上のそれらのパターンに対応するパターンにおいてアッセイ支持体に移送されることを可能とするために適する条件下で、結合された多リガンド接合体をアッセイ支持体表面と接触させ；そして
ｈ）接合体が所期のパターンでアッセイ支持体表面上に残ることを可能とするやり方において、第一リガンド結合性領域をマスター・アレー支持体から解離する、
ことを含む。
【０１２３】
別の態様において、本発明は核酸アレーを複製可能なように調製するための方法を提供し、該方法は：
ａ）支持体表面を有するマスター・アレーを用意し；
ｂ）パターン化アレーの形態をとるマスター・アレー支持体表面上に複数のアドレス・リガンドを固定化し；
ｃ）固定化されたアドレス・オリゴヌクレオチドのパターンを確定し；
ｄ）各多リガンド接合体が（ｉ）コア；（ｉｉ）相補的な態様で特異的なアドレス・リガンドおよび特異的な標的リガンドに結合するように選択されたリガンドを含む、少なくとも一つの分子の第二リガンド結合性領域および（ｉｉｉ）少なくとも一つの分子の第三リガンドを含み、ここで該第二リガンド結合性領域および第三リガンドがコアに結合されている、複数の多リガンド接合体を用意し；
ｅ）各アドレス・リガンドが多リガンド接合体のその相補的な第二リガンド結合性領域を結合することを可能とするために適する条件下で、多リガンド接合体をマスター・アレー支持体表面と接触させ、培養し；
ｆ）アッセイアレー支持体表面を提供し；
ｇ）接合体がマスター・アレー上のそれらのパターンに対応するパターンにおいてアッセイ支持体に移送されることを可能とするために適する条件下で、結合された多リガンド接合体をアッセイ支持体表面と接触させ；そして
ｈ）接合体が所期のパターンでアッセイ支持体表面上に残ることを可能とするやり方において、第二リガンド結合性領域をマスター・アレー支持体から解離する、
段階を含む。
【０１２４】
場合により、本方法は、さらに、第二アッセイアレーを調製するために、段階ｈ）で製造されたアッセイアレー支持体表面を用いる段階を含む。多リガンド接合体の第二セットは、元のマスター・アレーと実質的に同一の複製品である第二アッセイアレーを生成するために用いられる。多リガンド接合体の第二セットは、本明細書における教示により組立てることができる。この実施形態において、第二アッセイアレーの核酸配列は、元のマスター・アレーの核酸配列に対して実質的に同一である。
【０１２５】
好ましい実施形態において、マスター・アレー支持体表面上へのアドレス・リガンドの固定化は不規則であり、各アドレスの位置は、アドレス・リガンドが表面上に固定化されてから後に確定される。好ましくは、アドレス・リガンド、第一リガンド結合性領域、および第二リガンド結合性領域は核酸配列であり、第三リガンドは結合性リガンドまたは重合性基を含む。使用において、３以上のリガンドを担持する多リガンド接合体のコアは同じ数で混合され、緩衝水溶液中に懸濁することができる。この懸濁液は、試料中に検出されることが期待される標的核酸の特徴的なオリゴヌクレオチド配列に相補的なオリゴヌクレオチド配列を担持する各移送マイクロビーズの余剰分（マスター・アレー上のマイクロビーズのハイブリッド形成能力を超える）を含有することができる。
【０１２６】
マスター・アレー表面は多リガンド接合体の選択された混合物のこの懸濁液で溢れさせることができると共に、固形状ハイブリッド形成はほぼ平衡まで進行させることを可能とすることができる。次に、余剰の多リガンド接合体は、すすぎ洗いによりハイブリッド形成したマスター・アレーから回収され、結合された接合体は、アッセイアレー上において、共重合されて安定な裏当てを形成するか（第三リガンドが重合性基を含む場合）、または対応する結合相手に結合する（第三リガンドが結合性リガンドを含む場合）ことができるかのいずれかである。次に、マスター・アレーは反復複製法に利用可能である。
【０１２７】
マスター・アレーは繰り返し用いられて、次に、例えば湿気のあるまたは乾燥した状態において、包装され、保存され、輸送することができる対応するアッセイアレーを調製することができる。その包装から外されると、アッセイアレーは走査器による日常のハイブリッド形成アッセイ・プロトコルにおいてすぐに使用できる。さらに、本発明は用途の広いマスター・アレーを提供する−マスター・アレーは、実質的に同一のアレーを創造するため、またはアレーの機能を変更するため（例えば、ユーザーが試料中に検出しようとする標的核酸を変更することができるように、標的核酸の特徴的なオリゴヌクレオチド配列に相補的なオリゴヌクレオチド配列を変更するため）に使用し、再使用することができる。
【０１２８】
当業者は、本記載から考えて、市販されているマイクロアレーが、それら自体が本発明のマスター・アレーとして用いられ、１回以上複製されて対応するアッセイアレーを形成することができるやり方を理解するであろう。この場合において、市販されているアレーの個々の核酸は、それらの元の特異性とは無関係に、それぞれが単なるアドレス配列として考えられ、あらゆる望ましい特定性のアッセイアレーを提供するために本明細書において記載されるやり方で用いることができる。ユーザーは各アドレスの配列を確定し、本明細書における教示を用いて多リガンド接合体の第一結合性リガンドを組立てることができる。
【０１２９】
なおさらなる態様において、詳しくは第三リガンドが結合性リガンドの形態をとって提供される場合、本発明は以下を含むサンドイッチ・アレーを提供する：
ａ）その上に固定化された複数のアドレス・リガンドを有する支持体表面を含むマスター・アレー；
ｂ）各多リガンド接合体が（ｉ）各分子が相補的な態様でマスター・アレーの特異的なアドレス・リガンドに結合するように選択されたリガンドを含む第一リガンド結合性領域の分子、（ｉｉ）各分子が相補的なやり方で特徴的な標的リガンドに結合するために選択されるリガンドを含む第二リガンド結合性領域の分子、および（ｉｉｉ）少なくとも一つの分子の第三リガンドの、をそこに結合したコアを含み、ここで該第一リガンド結合性領域がマスター・アレー上に固定化される対応アドレス・リガンドに結合されている、複数の多リガンド接合体；および
ｃ）アッセイアレーの結合部位が多リガンド接合体の対応する結合性リガンドに結合される第三リガンドに対する結合部位により被覆される支持体表面を含むアッセイアレー支持体。
【０１３０】
場合により、サンドイッチ・アレーは、さらに、マスター・アレーの表面上に固定化される連結マイクロビーズを含み、連結マイクロビーズはそこに複数のアドレス・オリゴヌクレオチドを結合させる。
【０１３１】
キット
なお別の代替実施形態において、本発明は、再現良く核酸アレーを調製するための１以上の成分を含む対応キットを提供し、キット成分は以下からなる群から選択される：
ａ）その上に固定化された複数の「アドレス」リガンドを有する支持体表面を含むマスター・アレーであって、リガンドはパターン化アレーの形態をとる；
ｂ）各多リガンド接合体が（ｉ）各分子が相補的な態様でマスター・アレーの特異的なアドレス・リガンドに結合するように選択されたリガンドを含む第一リガンド結合性領域の分子、（ｉｉ）各分子が相補的な態様で特徴的な標的リガンドに結合するように選択されたリガンドを含む第二リガンド結合性領域の分子、および（ｉｉｉ）第三リガンドの少なくとも一つの分子、を結合したコアを含む複数の多リガンド接合体；
ｃ）第三リガンドに対する結合部位により被覆される複製アレー用の支持体表面を含むアッセイアレー支持体。
【０１３２】
場合により、本発明のキットは、さらに、適切なｐＨレベルを提供するための適する緩衝液、およびハイブリッド形成のための塩濃縮物などの、本明細書において記載されるアッセイを行うための試薬を含む。キットは、さらに、マスター・アレー上のアドレス・オリゴヌクレオチドの位置、およびアッセイアレー上のハイブリッド形成標的核酸の存在を確定するためのアレー・リーダーを含む。
【０１３３】
再利用可能な核酸アレー
なお別の代替実施形態において、本発明は、再利用可能な核酸アレーの形態をとって複製可能なアレーを直接的に調製するための方法およびシステムを提供する。この実施形態において、核酸がそれに固定化される表面は光ファイバー・アレーにより提供され、マスター・アレー支持体表面はファイバーそれら自体の遠位末端により提供される。場合により、および好ましくは、マイクロ・ウエル（ｍｉｃｒｏ−ｗｅｌｌｓ）は光ファイバーの遠位末端中にエッチングされる。
【０１３４】
こうした実施形態において、従来の光ファイバー束は、試料中の多様な標的核酸を検出するための特定の結合性アレー・バイオセンサー・システムとしての使用のために適応させることができる。商業的な供給源は、何千もの（例えば、３，０００〜１００，０００）六方密構造の個々に被覆された光ファイバーを含む、光イメージング・ファイバー束を提供する。アレー中の各ファイバーは、ファイバーの一端から他端までそれ自身の単離された光信号を伝送する。個々の特定結合性リガンドは各ファイバーの一端に結合することができると共に、他端は機能的に光信号分析器（例えば、ＣＣＤカメラ）に接続される。
【０１３５】
ファイバー束のアッセイ末端（特定結合性リガンドを含有する）は、未知の標的および光アッセイ・システムの他の必要な試薬（もしもあれば）を含有する試料溶液にさらされる。光信号パターンは、画像解析システムを用いて、束の他端で記録され、解析される。
【０１３６】
出願人は、標的配列の相補的なオリゴヌクレオチド結合性領域が、あらゆる適するやり方で、例えば、直接的に、または可逆的または非可逆的に結合された連結分子またはマイクロビーズのいずれかによって、光アッセイアレー表面に結合することができることを見出してきた。次に、オリゴヌクレオチド結合性領域の究極の位置が確定され（例えば、光手段およびアッセイにより）、好ましくは制御され（例えば、再利用可能なアドレス領域の使用により）、場合により平らな表面上に複製する（例えば、可逆リンカーの使用により）ことができる。
【０１３７】
一つの好ましい実施形態において、システムは複数の多リガンド接合体を含み、各多リガンド接合体は、ａ）対応するアドレス・リガンドと結合するように適応される第一オリゴヌクレオチド結合性領域、およびｂ）標的核酸の特徴的なオリゴヌクレオチド配列（例えば、遺伝子および／または遺伝子断片）に相補的な第二オリゴヌクレオチド結合性領域の分子を含む。アドレス・リガンドは、直接的か、またはリンカーまたはマイクロビーズの使用によるかのいずれかで、マスター・アレーの遠位末端上に固定化される。次に、多リガンド接合体はそれぞれのアドレスされたファイバーに既知の検体特異的なリガンドを担持させる。束中のファイバー上の検体特定リガンドのセットは任意に変更できる。
【０１３８】
別の実施形態において、オリゴヌクレオチド結合性領域の結合は、マイクロビーズを用いて達成される。この実施形態において、マイクロビーズは、それがオリゴヌクレオチド結合性領域に結合されるように調製される。次に、マイクロビーズおよび結合性領域はアッセイアレー支持体表面に結合される。マイクロビーズの結合は、例えば、アビジン−ビオチンなどのあらゆる適する結合性対を用いて達成することができる。代替実施形態において、光反応性試薬はマイクロビーズをアッセイアレー支持体表面に結合するために用いることができる。アドレス・オリゴヌクレオチドのマイクロビーズへの結合、およびマイクロビーズのマスター・アレー表面への結合は、本明細書において記載されるあらゆる適する方法を用いて達成することができる。
【０１３９】
場合により、システムはさらに画像解析器を含む。この実施形態において、ファイバー束は、一端で、これらの多センサー（例えば、ファイバー）からの信号を収集し情報を処理する光センサーに接続される。
【０１４０】
こうした方法において、本発明は、ユーザーがそれぞれ特定の用途用に核酸アレーの機能を変更することができる再利用可能な核酸アレーを提供する。例えば、リンカーまたはマイクロビーズはイミノビオチンにより被覆することができ、マスター・アレー支持体表面はビオチンにより被覆することができる。こうしてリンカーまたはマイクロビーズは可逆的にアッセイアレー支持体表面に結合することができる。リンカーまたはマイクロビーズは、より低いｐＨによってリンカーまたはマイクロビーズがアッセイアレー支持体表面と解離してしまうように、ｐＨを変更することにより解離することができる。
【０１４１】
一つの実施形態において、マイクロ・ウエルは、当該技術分野において公知の技術を用いて、各光ファイバーの遠位末端中にエッチング処理を施すことができる。例えば、湿式化学エッチング手順は、選択的に個々のファイバーのコアにエッチング処理を施すために用いることができる。この技術は、コアとファイバーのクラッド材間のエッチング速度の違いを活用する。エッチング時間を制御することにより、当業者は、高密度で順序付けられた、公知の形状のマイクロ・ウエルアレーおよびウエル体積が得られるやり方を理解するであろう。ウエル構築物は予備成形想定ファイバーにより確定される。各マイクロ・ウエルがそれ自身の光ファイバーの末端で得られるので、各ウエルは個々のセンサーとして役立つことができる。好ましくは、エッチングされたマイクロ・ウエルの直径は、そこでの接続に用いられる個々の連結マイクロビーズのそれよりもわずかに大きい。
【０１４２】
例えば、一つの実施形態において、結合された１以上のオリゴヌクレオチド結合性領域を有する複数のマイクロビーズを含有する溶液は、光ファイバー束の表面に添加される。好ましくは、オリゴヌクレオチド結合性領域は、検出および／または定量化しようとする標的核酸に対して相補的である。個々の連結マイクロビーズは、溶液が放置されて光ファイバー束の表面から蒸発するので、各マイクロ・ウエル中に不規則に定着する。場合により、および光反応性化合物がこの実施形態に関連して用いられる場合、光ファイバーは、連結マイクロビーズが各光ファイバーの表面に光結合することを可能とするように照射される。場合により、次に、余剰のマイクロビーズはファイバー束の表面から洗浄される。
【０１４３】
例えば、ファイバーの遠位末端上へのビーズまたはオリゴヌクレオチド結合性領域の固定化は、マイクロ・ウエル内で、ウエル表面との結合を形成するための光活性化性化合物を用いて達成することができる。一つの実施形態において、光ファイバーのウエル表面は光反応性シロキサン試薬により被覆され、その後、遊離（すなわち、非結合の）オリゴヌクレオチド結合性領域を含有する溶液はウエル表面に塗布される。次に、溶液は照射され、光反応性基を活性化し、オリゴヌクレオチド結合性領域とウエル表面間の結合形成をもたらす。照射はファイバーを通過してウエル中に活性化光を通すことにより達成される。
【０１４４】
上述のように、ファイバー束のそれぞれ個々のファイバーは、一端でエッチングされてマイクロビーズ用の凹面容器を提供することができる。光反応性オルガノシロキサン試薬は、アミノプロピルジメチル・メトキシ・シロキサンなどの市販されているオルガノシロキサン試薬を、ベンゾイル安息香酸の酸塩化物などの熱化学的反応性光試薬と結合させることにより調製することができる。光反応性シロキサン試薬は、画像解析器束中のエッチングされた光ファイバーの凹面シリコン・オキシド表面と反応する。代替実施形態において、各マイクロ・ウエルはｘ−アビジンにより被覆されてビオチンと反応する表面を創造する。この実施形態において、マイクロビーズはビオチンまたはイミノビオチン誘導体により被覆される。本明細書において記載されるように、あらゆる特異的結合性対はこうした結合に適する。
【０１４５】
好ましくは、連結マイクロビーズは球形であり、個々の光ファイバーのそれとほぼ等しい（またはわずかに小さい）直径のものである。本発明の連結マイクロビーズは、例えば、ガラス、ポリスチレン、ポリビニルベンゾフェノン、フォトポリシロキサン被覆ガラスを含むあらゆる適する材料から製造される。好ましくは、マイクロビーズは水のそれよりも大きい比重を有し、有機試薬との結合を受けやすい化学組成物を有する。
【０１４６】
オリゴヌクレオチド誘導体は、本明細書においてさらに詳しく記載されるように、公表され商業的に用いられる方法により合成することができる。オリゴヌクレオチド配列の長さは、所期のハイブリッド形成強度および速度のために最適化される（通常２０〜５０ヌクレオチド範囲内）。オリゴヌクレオチド配列は、選択される標的核酸に対して相補的である。
【０１４７】
「アドレス・オリゴヌクレオチド」誘導体は、光ファイバー末端用のエポキシ活性化連結マイクロビーズに結合することができる。好ましい実施形態において、例えば、ほぼファイバー直径の均一なシリカ球は、本発明においてオリゴヌクレオチド誘導体のアミン基に結合するために有用な熱化学的反応性基（例えば、エポキシ基）を含有する市販のオルガノシロキサン試薬と反応する。グリシドキシプロピルトリエトキシ・シロキサンは、公表されている反応条件下でガラス・マイクロビーズと反応してエポキシ・ガラス表面を提供する。本発明のアドレス・オリゴヌクレオチド誘導体は、スペーサ上でアルキルアミン基が末端部をなしており、連結マイクロビーズの表面上のエポキシ基と容易に結合する。
【０１４８】
エッチングされた光反応性光ファイバーの束は、連結マイクロビーズのスラリーにさらされ（ファイバー当り少なくとも一つのタイプのアドレス・オリゴヌクレオチドを提供するために十分な数で）、各マイクロビーズはその表面上に固定化されたアドレス・オリゴヌクレオチド配列を有する。好ましくは、一つのオリゴヌクレオチド結合性領域は各光ファイバー・ウエルに結合される。この実施形態において、マスター・アレーは再利用可能である。このスラリーは、所期のアドレス・オリゴヌクレオチド配列それぞれとほぼ等しい数のビーズから成る。オリゴヌクレオチド配列を提供するビーズの数は、好ましくは、それぞれの標的核酸特定部位の余剰性（少なくとも３倍）を提供するために十分なものである。溶媒（好ましくは水性）が暗所または薄明かりの中において光反応性表面上でスラリー・プールから蒸発するので、均一サイズのビーズはファイバーの順序付けられた配置中の末端で凹面ポケット中に残る。次に、オリゴヌクレオチド配列を提供する連結マイクロビーズは、乾燥状態での照射により「固定化」されて、光ファイバー表面上の光反応性基とアドレス・オリゴヌクレオチド・ビーズ上の有機基（大抵はオリゴヌクレオチド）間の炭素−炭素結合を形成する。余剰のマイクロビーズはシステムからすすぎ洗いされる。
【０１４９】
得られる光ファイバー束は、そのファイバーの一端上に標的核酸配列に相補的なオリゴヌクレオチドの安定で順序付けられた配置を有し、次に、オリゴヌクレオチド配列の位置は、本明細書において詳しく記載されるように、各添加の間におけるすすぎ洗いおよびアレーのリーディングを伴う、アレーに対する蛍光標識された相補的な配列の逐次的な添加を含む従来の蛍光ハイブリッド形成法により確定することができる。
【０１５０】
一つの好ましい実施形態において、相補的配列は蛍光体により標識される。それぞれの配列に相補的な蛍光標識オリゴヌクレオチドは合成され、それぞれは相互に識別することができるいくつかの（例えば、１０の内１）異なる蛍光化合物を含有する。従って、各オリゴヌクレオチドは、公知の配列および公知の識別可能な標識を有する。それぞれが表面上のオリゴヌクレオチド配列に相補的な異なる公知の配列、および類似の数の識別可能な蛍光体の内一つを有するいくつかのオリゴヌクレオチドは、同時に表面に塗布され、５５℃で３０分間にわたりハイブリッド形成される。
【０１５１】
次に、表面はすすぎ洗いされ、解析されてそれぞれの配列の位置を識別する。次に、配列の別のセットは表面にハイブリッド形成され、走査されて配列の第二セットを識別する。この方法はすべての位置が識別されるまで続けられ、その後マスター・アレーは沸騰水中に２分間浸漬することにより剥がされる。次に、それは試料中の標的核酸の存在を検出するために使える状態にある。
【０１５２】
使用において、マスター・アレーは、複数の標的核酸配列（例えば、遺伝子および／または遺伝子断片）を含有する試験溶液にさらされる。試験溶液は蛍光標識を介して標識化されて、結果の視覚化を可能とする。試験溶液は、オリゴヌクレオチド結合性領域が試料内に含有される標的核酸にハイブリッド形成することを可能とするような条件下で培養される。次に、非結合溶液はマスター・アレーからすすぎ洗いされる。ハイブリッド形成された核酸配列は上述のアレー・システムのＣＣＤカメラを用いて視覚化される。
【０１５３】
アッセイアレーは０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含有するリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ）により洗浄され、次に、４ＸＳＣＣ（０．６Ｍ　ＮａＣｌ、０．０６Ｍクエン酸塩、ｐＨ７．０）、０．１％（ｗ／ｖ）ラウロイルサルコシン、および０．０２％（ｗ／ｖ）ドデシル硫酸ナトリウムからなるハイブリッド形成緩衝液により５５℃で３０分間にわたり遮断される。アレー上に固定化されたオリゴヌクレオチド・プローブの一つに相補的な配列を有するＤＮＡを含有する試料は、ファイバーの支持体表面に塗布され、シールされたハイブリッド形成室において５５℃で１時間にわたり培養される。次に、支持体表面は５５℃で５分間にわたり０．１％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）を含有する２ＸＳＳＣにより洗浄され、その後、標的ＤＮＡ上の別の配列に相補的である蛍光標識検出プローブの５０ｆモルが支持体表面に塗布され、５５℃で１時間にわたり培養される。次に、支持体表面は５５℃で５分間にわたり０．１％ＳＤＳを含有する２ＸＳＳＣで洗浄され、続いて０．１ＸＳＳＣで洗浄され、次に、乾燥されると共に、蛍光パターンが画像解析機器により記録される。
【０１５４】
当業者は、本発明が特定のファイバー束と一体化した多様なオリゴヌクレオチド配列を提供することができることを理解するであろう。一つの実施形態において、例えば、ファイバー・ウエル（ｗｅｌｌｓ）は個々に特定の結合剤により被覆される。別の実施形態において、ファイバー・ウエルは同時に一般的な結合剤（例えば、イミノビオチン）により被覆される。この実施形態において、ファイバー・ウエルは、それぞれが一般的な結合剤（例えば、ｘ−アビジン）に対する補体を含有する特定の結合剤マイクロビーズの混合物から負荷を受ける。
【０１５５】
場合により、システムには、さらに、画像解析システム、例えば、関連ソフトウエアを備えたＣＣＤカメラが含まれる。得られるアッセイアレーは従来のやり方で用いることができる、例えば、アッセイアレーは標準的なアレー・リーダーにより読むことができるが、一方でマスター・アレーは再利用されて上述の段階の一部またはすべてを繰り返すことによりさらに多いアッセイアレーを調製することができる。
【０１５６】
本発明は分子認識に関与するあらゆる分子化学種に適用することができることは当業者に明白である。検討は本発明の核酸適用に関する詳細を提供してきたが、一方で本発明はそのように限定されない。
【０１５７】
本明細書において参照されまたは引用されたすべての特許、特許出願、仮出願、および出版物は、それらが本明細書の明示的教示と矛盾しない範囲でそれらの全体を参考のために包含する。
【０１５８】
以下は本発明を実行するための手順を説明する実施例である。これらの実施例は限定するとして解釈されるべきではない。すべての百分率は重量により、すべての溶媒混合物割合は特記のない限り体積による。
【０１５９】
実施例
実施例１
塩化４−ベンゾイルベンゾイル（ＢＢＡ−Ｃｌ）（化合物Ｉ）の調製
４−ベンゾイル安息香酸（ＢＢＡ）１．０ｋｇ（４．４２モル）を、還流凝縮器および頂部攪拌器を備える乾燥５リットルモートン（Ｍｏｒｔｏｎ）フラスコに添加し、続いて塩化チオニル６４５ｍｌ（８．８４モル）およびトルエン７２５ｍｌを添加した。次に、ジメチルホルムアミド３．５ｍｌを添加し、混合物を４時間にわたり還流で熱した。冷却後、溶媒を減圧下で除去し、残留塩化チオニルを３Ｘ５００ｍｌのトルエンを用いて３回の蒸発により除去した。生成物を１：４トルエン：ヘキサンから再結晶化して、真空オーブン中で乾燥後９８８ｇ（９１％収率）を得た。生成物融点は９２〜９４℃であった。８０ＭＨｚ（１ＨＮＭＲ（ＣＤＣｌ３））での核磁気共鳴（ＮＭＲ）分析は所期の生成物：芳香族プロトン７．２０〜８．２５（ｍ，９Ｈ）と合致していた。すべての化学シフト値はテトラメチルシラン内部標準からのｐｐｍ低磁場である。最終化合物を、例えば、実施例３に記載されているように光活性化性ポリマーの合成において用いられるモノマーの調製における使用のために保存した。
【０１６０】
実施例２
Ｎ−（３−アミノプロピル）メタクリルアミド塩酸塩（ＡＰＭＡ）（化合物ＩＩ）の調製
ＣＨ２Ｃｌ２１０００ｍｌ中の１，３ジアミノプロパン１９１０ｇ（２５．７７モル）溶液を、１２リットルモートン・フラスコに添加し、氷浴上で冷却した。次に、炭酸ｔ−ブチルフェニル１０００ｇ（５．１５モル）、ＣＨ２Ｃｌ２２５０ｍｌの溶液を、反応温度を１５℃未満に保持する速度で滴状に添加した。添加後、混合物を室温に暖め、２時間攪拌した。反応混合物をＣＨ２Ｃｌ２９００ｍｌおよび氷５００ｇで希釈し、続いて２．２ＮのＮａＯＨ２５００ｍｌを緩やかに添加した。溶液が塩基性であることを確認する試験後、生成物を分液漏斗に移し、有機層を除去し、抽出物＃１としてとっておいた。次に、水性留分をＣＨ２Ｃｌ２３Ｘ１２５０ｍｌにより抽出し、各抽出分を別個の留分として保管した。４有機抽出物を、留分＃１から始めて留分＃４までを通して、単一の０．６ＮのＮａＯＨ１２５０ｍｌ部により継続的に洗浄した。この洗浄手順を新鮮０．６ＮのＮａＯＨ１２５０ｍｌ部により二度目を繰り返した。次に、有機抽出物を混合し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥した。一定重量までの濾過および蒸発により、さらなる精製なしで用いられるＮ−モノ−ｔ−ブトキシカルボニル−１，３−ジアミノプロパン８２５ｇを得た。
【０１６１】
ＣＨＣｌ３１０２０ｍｌ中の無水メタクリル酸８０６ｇ（５．２３モル）溶液を、頂部攪拌器を備える１２リットルモートン・フラスコ中に入れ、氷浴上で冷却した。フェノチアジン６０ｍｇを阻害剤として添加し、続いてＣＨＣｌ３８２５ｍｌ中のＮ−モノ−ｔ−ブトキシカルボニル−１，３−ジアミノプロパン８２５ｇを滴状に添加した。反応温度をいつも１０℃未満に保持するように、添加速度を調整した。添加完了後、氷浴を除去し、混合物を放置して一夜にわたり攪拌した。生成物を２４００ｍｌの水で希釈し、分液漏斗に移した。徹底した混合後、水層を除去し、有機層を２ＮＮａＯＨ２４００ｍｌにより洗浄し、水層は塩基性であることを確認した。次に、有機層をＮａ２ＳＯ４上で乾燥し、濾過して乾燥剤を除去した。ＣＨＣｌ３溶媒の一部を、生成物および溶媒の混合重量がほぼ３０００ｇになるまで減圧下で除去した。次に、攪拌されたＣＨＣｌ３溶液中へのヘキサン１１．０リットルの緩やかな添加により、所期の生成物を沈殿させた。生成物を濾過により単離し、固形物をヘキサン９００ｍｌおよびＣＨＣｌ３１５０ｍｌで２回すすぎ洗いした。固形物の徹底的な乾燥により、ＤＳＣによる融点８５．８℃のＮ−［Ｎ’−（ｔ−ブチルオキシカルボニル）−３−アミノプロピル］−メタクリルアミドを得た。ＮＭＲ分光計での分析は所期の生成物に対応していた：１ＨＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）アミドＮＨ’ｓ６．３０〜６．８０、４．５５〜５．１０（ｍ、２Ｈ）、ビニル・プロトン５．６５、５．２０（ｍ、２Ｈ）、Ｎ隣接メチレン２．９０〜３．４５（ｍ、４Ｈ）、メチル１．９５（ｍ、３Ｈ）、残留メチレン１．５０〜１．９０（ｍ、２Ｈ）、およびｔ−ブチル１．４０（ｓ、９Ｈ）。
【０１６２】
３ツ口、２リットル丸底フラスコに頂部攪拌器およびガス噴霧管を備えた。メタノール７００ｍｌをフラスコに添加し、氷浴上で冷却した。攪拌しながら、ＨＣｌガスをほぼ５リットル／分の速度で計４０分間にわたり溶媒中に泡立たせた。最終ＨＣｌ／ＭｅＯＨ溶液のモル濃度はフェノールフタレインを指示薬として用いる１ＮのＮａＯＨでの滴定により８．５Ｍであると測定された。Ｎ−［Ｎ’−（ｔ−ブチルオキシカルボニル）−３−アミノプロピル］−メタクリルアミド９００ｇ（３．７１モル）を、頂部攪拌器およびガス出口アダプタを備える５リットルモートン・フラスコに添加し、続いてメタノール溶媒１１５０ｍｌを添加した。一部の固形物はこの溶媒体積と共にフラスコ中に残存した。フェノチアジン３０ｍｇを抑制剤として添加し、続いて８．５ＭのＨＣｌ／ＭｅＯＨ溶液６５５ｍｌ（５．５７モル）を添加した。固形物をガス放出により緩やかに溶解したが、反応は発熱的でなかった。混合物を室温で一夜にわたり攪拌して完全な反応を確保した。次に、あらゆる固形物を濾過により除去し、追加フェノチアジン３０ｍｇを添加した。次に、溶媒を減圧下で除去し、得られる固形残留物を減圧下の蒸発により３Ｘの１０００ｍｌで共沸蒸留した。最終的に、生成物を還流イソプロパノール２０００ｍｌ中に溶解し、酢酸エチル４０００ｍｌを攪拌しながら緩やかに添加した。混合物を放置して緩やかに冷却し、一夜にわたり４℃に保存した。化合物ＩＩを濾過により単離し、一定重量まで乾燥し、ＤＳＣによる融点１２４．７℃を有する６３０ｇの収量物を得た。ＮＭＲ分光計での分析は所期の生成物に対応していた：１ＨＮＭＲ（Ｄ２Ｏ）ビニル・プロトン５．６０、５．３０（ｍ、２Ｈ）、アミドＮ隣接メチレン３．３０（ｔ、２Ｈ）、アミンＮ隣接メチレン２．９５（ｔ、２Ｈ）、メチル１．９０（ｍ、３Ｈ）、および残留メチレン１．６５〜２．１０（ｍ、２Ｈ）。最終化合物を、例えば実施例３に記載されるように、光活性化性ポリマーの合成に用いられるモノマー調製の使用のために保存した。
【０１６３】
実施例３
Ｎ−［３−（４−ベンゾイルベンズアミド）プロピル］メタクリルアミド（ＢＢＡ−ＡＭＰＡ）（化合物ＩＩＩ）の調製
実施例２に記載される一般的な方法により調製された化合物ＩＩ１２０ｇ（０．６７２モル）を、頂部攪拌器を備えた乾燥２リットル３ツ口丸底フラスコに添加した。フェノチアジン２３〜２５ｍｇを阻害剤として添加し、続いてクロロホルム８００ｍｌを添加した。懸濁液を氷浴上で１０℃未満に冷却し、実施例１に記載される一般的な方法により調製された化合物Ｉ１７２．５ｇ（０．７０５モル）を固形物として添加した。次に、クロロホルム５０ｍｌ中のトリエチルアミン２０７ｍｌ（１．４８５モル）を１〜１．５時間帯にわたり滴状に添加した。氷浴を除去し、室温での攪拌を２．５時間にわたり続けた。次に、生成物を０．３ＮのＮａＣｌ６００ｍｌおよび０．０７ＮのＨＣｌ３００ｍｌで２回で洗浄した。硫酸ナトリウム上での乾燥後、クロロホルムを減圧下で除去し、重合を防止するために各再結晶化においてフェノチアジン２３〜２５ｍｇを用いて４：１トルエン：クロロホルムから生成物を２回再結晶化した。化合物ＩＩＩの一般的な収率は９０％であり、融点は１４７〜１５１℃であった。ＮＭＲ分光計での分析は所期の生成物に対応していた：１ＨＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）芳香族プロトン７．２０〜７．９５（ｍ、９Ｈ）、アミドＮＨ６．５５（幅のあるｔ、１Ｈ）、ビニルプロトン５．６５，５．２５（ｍ、２Ｈ）、アミドＮ’ｓ隣接メチレン３．２０〜３．６０（ｍ、４Ｈ）、メチル１．９５（ｓ、３Ｈ）、および残留メチレン１．５０〜２．００（ｍ、２Ｈ）。最終化合物を、例えば実施例６に記載されるように、光活性化性ポリマーの合成における使用のために保存した。
【０１６４】
実施例４
Ｎ−スクシニミジル６−マレイミドヘキサノエート（ＭＡＬ−ＥＡＣ−ＮＯＳ）（化合物ＶＩ）の調製
官能化モノマーを以下のやり方で調製し、実施例６に記載されるように用いてポリマーの主鎖上に活性化エステル基を導入した。６−ヘキサン酸１００ｇ（０．７６２モル）を頂部攪拌器および乾燥管を備える３ツ口３リットルフラスコ中の酢酸３００ｍｌ中に溶解した。無水マレイン酸７８．５ｇ（０．８０１モル）を酢酸２００ｍｌ中に溶解し、６−アミノヘキサン酸溶液に添加した。沸騰水浴上で加熱しながら混合物を１時間攪拌し、白色固形物の生成をもたらした。室温での一夜にわたる冷却後、固形物を濾過により収集し、ヘキサン２Ｘ５０ｍｌによりすすぎ洗いした。乾燥後、（Ｚ）−４−オキソ−５−アザ−２−ウンデセン酸の一般的な収量は１５８〜１６５ｇ（９０〜９５％）であり融点は１６０〜１６５℃であった。ＮＭＲ分光計での分析は所期の生成物に対応していた：１ＨＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）アミド・プロトン８．６５〜９．０５（ｍ、１Ｈ）、ビニル・プロトン６．１０、６．３０（ｄ、２Ｈ）、窒素隣接メチレン２．８５〜３．２５（ｍ、２Ｈ）、カルボニル隣接メチレン２．１５（ｔ、２Ｈ）、および残留メチレン１．００〜１．７５（ｍ、６Ｈ）。
【０１６５】
（Ｚ）−４−オキソ−５−アザ−２−ウンデセン酸１５０．０ｇ（０．６５４モル）、無水酢酸６８ｍｌ（７３．５ｇ、０．７２１モル）、およびフェノチアジン５００ｍｇを、頂部攪拌器を備える２リットル３ツ口丸底フラスコに添加した。トリエチルアミン９１ｍｌ（０．６５３モル）、およびテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）６００ｍｌを添加し、混合物を攪拌しながら熱して還流した。計４時間の還流後、暗色混合物を６０℃未満に冷却し、水３リットル中の１２ＮのＨＣｌ２５０ｍｌ中に注いだ。混合物を室温で３時間にわたり攪拌し、次に、濾過パッド（セライト（Ｃｅｌｉｔｅ）５４５、テネシー州、ジャクソンのＪ．Ｔ．ベーカー（Ｂａｋｅｒ））を通して濾過して固形物を除いた。濾液をクロロホルム４Ｘ５００ｍｌで抽出し、混合抽出物を硫酸ナトリウム上で乾燥した。重合を防止するためのフェノチアジン１５ｍｇの添加後、溶媒を減圧下で除去した。６−マレイミドヘキサン酸を、２：１ヘキサン：クロロホルムから再結晶化し、融点８１〜８５℃を有する一般的な収量７６〜８３（５５〜６０％）を得た。ＮＭＲ分光計での分析は所期の生成物に対応していた：１ＨＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）マレイミド・プロトン６．５５（ｓ、２Ｈ）、窒素隣接メチレン３．４０（ｔ、２Ｈ）、カルボニル隣接メチレン２．３０（ｔ、２Ｈ）、および残留メチレン１．０５〜１．８５（ｍ、６Ｈ）。
【０１６６】
６−マレイミドヘキサン酸２０．０ｇ（９４．７ｍモル）をアルゴン雰囲気下でクロロホルム１００ｍｌ中に溶解し、続いてオキサリル・クロライド４１ｍｌ（０．４７モル）を添加した。室温での２時間にわたる攪拌後、最後の余剰オキサリル・クロライドを除去するために用いられる追加クロロホルム４Ｘ２５ｍｌにより減圧下で溶媒を除去した。酸塩化物をクロロホルム１００ｍｌ中に溶解し、続いてＮ−ヒドロキシスクシニミド１２ｇ（０．１０４モル）およびトリエチルアミン１６ｍｌ（０．１１４モル）を添加した。室温で一夜にわたる攪拌後、生成物を水４Ｘ１００ｍｌで洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥した。溶媒の除去によりさらなる精製なしで用いられる生成物２４ｇ（８２％）を得た。ＮＭＲ分光計での分析は所期の生成物に対応していた：１ＨＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）マレイミド・プロトン６．６０（ｓ、２Ｈ）、窒素隣接メチレン３．４５（ｔ、２Ｈ）、スクシニミジル・プロトン２．８０（ｓ、４Ｈ）、カルボニル隣接メチレン２．５５（ｔ、２Ｈ）、および残留メチレン１．１５〜２．００（ｍ、６Ｈ）。最終化合物を、例えば実施例６に記載されるように、光活性化性ポリマーの合成における使用のために保存した。
【０１６７】
実施例５
官能化モノマーの調製：Ｎ−スクシニミジル６−メタクリルアミドヘキサノエート（ＭＡ−ＥＡＣ−ＮＯＳ）（化合物Ｖ）
官能化モノマーを以下のやり方で調製し、ポリマーの主鎖上に活性化エステル基を導入するために用いた。
【０１６８】
６−アミノカプロン酸４．００ｇ（３０．５ｍモル）を、乾燥管を備える乾燥丸底フラスコ中に入れた。次に、無水メタクリル酸５．１６ｇ（３３．５ｍモル）を添加し、混合物を室温で４時間にわたり攪拌した。得られた濃厚油をヘキサンにより３回にわたり粉砕し、残留油をクロロホルム中に溶解し、続いて硫酸ナトリウム上で乾燥した。
【０１６９】
濾過および蒸発後、生成物の一部をクロロホルム溶媒系中の１０％メタノールを用いるシリカゲル・フラッシュ・クロマトグラフィーにより精製した。適切な留分を組合せ、フェノチアジン１ｍｇを添加し、溶媒を減圧下で除去した。ＮＭＲ分光計での分析は所期の生成物に対応していた：１ＨＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）カルボン酸プロトン７．８０〜８．２０（ｂ、１Ｈ）、アミド・プロトン５．８０〜６．２５（ｂ、１Ｈ）、ビニル・プロトン５．２０および５．５０（ｍ、２Ｈ）、窒素隣接メチレン３．００〜３．４５（ｍ、２Ｈ）、カルボニル隣接メチレン２．３０（ｔ、２Ｈ）、メチル基１．９５（ｍ、３Ｈ）、および残留メチレン１．１０〜１．９０（ｍ、６Ｈ）。
【０１７０】
６−メタクリルアミドヘキサン酸３．０３ｇ（１５．２ｍモル）をドライ・クロロホルム３０ｍｌ中に溶解し、続いてＮ−ヒドロキシスクシニミド１．９２ｇ（１６．７ｍモル）および１，３−ジシクロヘキシルカルボジイミド６．２６ｇ（３０．４ｍモル）を添加した。反応物を室温で１夜にわたり乾燥雰囲気下で攪拌した。次に、固形物を濾過により除去し、一部をシリカゲル・フラッシュ・クロマトグラフィーにより精製した。クロロホルム溶媒を用いて非極性不純物を除去し、続いてクロロホルム溶媒中の１０％テトラヒドロフランを用いて所期の生成物を溶離した。適切な留分をプールし、フェノチアジン０．２ｍｇを添加し、溶媒を減圧下で蒸発した。少量の１，３−ジシクロヘキシル尿素を不純物として含有するこの生成物を、さらなる精製なしで用いた。ＮＭＲ分光計での分析は所期の生成物に対応していた：１ＨＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）アミド・プロトン５．６０〜６．１０（ｂ、１Ｈ）、ビニル・プロトン５．２０および５．５０（ｍ、２Ｈ）、窒素隣接メチレン３．０５〜３．４０（ｍ、２Ｈ）、スクシニミジル・プロトン２．８０（ｓ、４Ｈ）、カルボニル隣接メチレン２．５５（ｔ、２Ｈ）、メチル１．９０（ｍ、３Ｈ）、および残留メチレン１．１０〜１．９０（ｍ、６Ｈ）。最終化合物を、本明細書において記載される光活性化性ポリマーの合成における使用のために保存した。
【０１７１】
実施例６
アクリルアミド、ＢＢＡ−ＡＰＭＡ、およびＭＡＬ−ＥＡＣ−ＮＯＳのコポリマー（感光性ＰＡ−ポリＮＯＳ）の調製
本発明の光活性化性コポリマーを以下のやり方で調製した。アクリルアミド４．２９８ｇ（６０．５ｍモル）をテトラヒドロフラン５７．８ｍｌ中に溶解し、続いて実施例３に記載される一般的な方法により調製された化合物ＩＩＩ０．２１９ｇ（０．６３ｍモル）、実施例４に記載される一般的な方法により調製された化合物ＩＶ０．４８３ｇ（１．５７ｍモル）、Ｎ、Ｎ、Ｎ’、Ｎ’−テトラメチルエチレンジアミン（ＴＥＭＥＤ）０．０５８ｍｌ（０．３９ｍモル）、および２，２’−アゾビスイソブチロニトリル（ＡＩＢＮ）０．１５４ｇ（０．９４ｍモル）を溶解した。溶液をヘリウム噴霧器により３分間にわたり脱酸素化し、続いてアルゴン噴霧器によりさらなる３分間にわたり脱酸素化した。次に、密閉容器を６０℃で一夜にわたり加熱して重合を完遂した。固形生成物を濾過により単離し、濾過ケーキをＴＨＦおよびＣＨＣｌ３で徹底的にすすぎ洗いした。生成物を３０℃で真空オーブン中において乾燥して白色固形物５．３４ｇを得た。ＮＭＲ分析（ＤＭＳＯ−ｄ６）により、２．７５ｐｐｍでのＮ−オキシスクシニミド（ＮＯＳ）基の存在が確認され、光学基負荷はポリマーの０．１１８ｍモルＢＢＡ／ｇであることが測定された。ＭＡＬ−ＥＡＣ−ＮＯＳはこの反応において２．５モル％の重合性モノマーを構成して化合物ＶＩ−Ａを得た。
【０１７２】
５モル％の化合物ＩＶを有するポリマーを調製するために上述の手順を用いた。アクリルアミド３．８４９ｇ（５４．１ｍモル）をＴＨＦ５２．９ｍｌ中に溶解し、続いて実施例３に記載される一般的な方法により調製された化合物ＩＩＩ０．２１３ｇ（０．６１ｍモル）、実施例４に記載される一般的な方法により調製された化合物ＩＶ０．９３８ｇ（３．０４ｍモル）、ＴＥＭＥＤ０．０５３ｍｌ（０．３５ｍモル）およびＡＩＢＮ０．１４２ｇ（０．８６ｍモル）を溶解した。得られた固形物、化合物ＶＩ−Ｂは、上述のように単離される場合、０．１０１ｍモルＢＢＡ／ポリマーｇのホト基負荷を有する生成物４．９３５ｇを与えた。
【０１７３】
１０モル％の化合物ＩＶを有するポリマーを調製するために、上述の手順を用いた。アクリルアミド３．２４１ｇ（４５．６ｍモル）をＴＨＦ４６．４ｍｌ中に溶解し、続いて実施例３に記載される一般的な方法により調製された化合物ＩＩＩ０．１７９ｇ（０．５１ｍモル）、実施例４に記載される一般的な方法により調製された化合物ＩＶ１．５７９ｇ（５．１２ｍモル）、ＴＥＭＥＤ０．０４７ｍｌ（０．３１ｍモル）およびＡＩＢＮ０．１２６ｇ（０．７７ｍモル）を溶解した。得られた固形物、化合物ＶＩ−Ｃは、上述のように単離される場合、０．０９８ｍモルＢＢＡ／ポリマーｇの光学基負荷を有する生成物４．７５８ｇを与えた。
【０１７４】
２．５モル％の化合物ＩＶおよび２モル％の化合物ＩＩＩを有するポリマーを調製するために、上述の手順に類似した手順を用いた。アクリルアミド１６．４３ｇ（２３１．５ｍモル）；実施例３に記載される一般的な方法により調製された化合物ＩＩＩ１．７０ｇ（４．８５ｍモル）；実施例４に記載される一般的な方法により調製された化合物ＩＶ１．８７ｇ（６．０６ｍモル）；およびＴＨＦ（２２２ｍｌ）を、丸底フラスコ中において室温でアルゴン噴霧器により攪拌した。ＴＥＭＥＤ０．２４ｍｌ（２．１４ｍモル）、およびＡＩＢＮ０．５８ｇ（３．５１ｍモル）を反応物に添加した。次に、反応物をアルゴン雰囲気下で４時間にわたり還流した。得られた固形物、化合物ＶＩ−Ｄは、上述のように単離される場合、０．２３ｍモルＢＢＡ／ポリマーｇの光学基負荷を有する生成物１９．４ｇを与えた。
【０１７５】
実施例７
多リガンド接合体の合成
多リガンド接合体を以下のように調製した。懸濁水溶液中の１０重量％マイクロビーズを含有する、ポリスチレンマイクロビーズ（１μｍ直径）（インディアナ州、カーメルのバングズ・ラブズ、プロラボ（Ｐｒｏｌａｂｏ，Ｂａｎｇｓ　Ｌａｂｓ）から入手、製品番号Ｋ１００）の分取標本２００μｌを、脱イオン水２００μｌ中のポリマー１．０ｍｇを含有する感光性ＰＡ−ポリＮＯＳ（上記実施例６に記載されるように調製された）の溶液と混合した。溶液を室温で１時間にわたり混合した。
【０１７６】
室温で１時間にわたる混合後、ダイマックス（Ｄｙｍａｘ）ランプ（インターナショナル・ライト放射計上の１０ｎｍ帯域通過フィルターにより３３５ｎｍで測定されて２５ｍジュール／ｃｍ２）を用いて、懸濁液を混合しながら２分間にわたり照射する。次に、マイクロビーズを、脱イオン水２ｍｌを用いて１５，０００ｒｐｍで１５分間にわたる遠心分離およびリン酸緩衝液（ＰＢＳ、ｐＨ７．５）中での再懸濁により２回洗浄した。
【０１７７】
次に、洗浄されたビーズを、それぞれが３’末端で第一級アミンを含有するように修飾された二つのオリゴヌクレオチド配列、および０．０５Ｍリン酸緩衝液ｐＨ７．５中のビオシチン（１０μＭ）の混合物を含有する溶液により培養する。第一オリゴヌクレオチド配列は、マスター・アレー上に提供された特異的なアドレス・オリゴヌクレオチドの既知の配列に対する補体である。第一オリゴヌクレオチドを５μＭで２０−ｍｅｒとして提供する。第一オリゴヌクレオチドを、本発明において用いようとする特異的なアドレス・オリゴヌクレオチドの配列を最初に確定することにより合成する。次に、アドレス・オリゴヌクレオチドの補体をワトソン−クリックの塩基対合則を用いて確定する。相補的配列が確定できたら、第一オリゴヌクレオチドを、標準核酸合成技術、例えば、固相合成を用いて合成する。
【０１７８】
第二オリゴヌクレオチド配列は、試験試料中に存在すると疑われる標的核酸の公知の配列に相補的な分析的配列である。第二オリゴヌクレオチドを１０μＭで３０ｍｅｒとして提供する。第二オリゴヌクレオチドを、本発明のプローブアレーを用いて検出しようとする特定の標的リガンドの配列を最初に確定することにより合成する。標的リガンドに対する補体をワトソン−クリックの塩基対合則を用いて確定する。一旦相補的配列を確定すると、第二オリゴヌクレオチドを、標準核酸合成技術を用いて合成する。
【０１７９】
マイクロビーズ懸濁液を室温で一夜にわたりオリゴヌクレオチドにより培養する。一夜にわたる培養後、ビーズをリン酸緩衝液（ＰＢＳ、ｐＨ７．５）の分取標本１ｍｌにより２回洗浄し、次に、用いられるまで４℃で保存する。それぞれが独特のアドレスおよび分析的配列を有する一連の多リガンド接合体を、プローブアレーを複製するためのこのやり方で作製する。
【０１８０】
実施例８
離間エポキシ化モノマー（化合物ＶＩＩ）の合成
クロロホルム３ｍｌに対してイソシアナートエチルメタクリレート（１．０ｍｌ、７．０４ｍモル）、グリシドール（０．５０ｍｌ、７．５１ｍモル）およびトリエチルアミン（５０μｌ、０．２７ｍモル）を添加する。反応物を室温で一夜にわたり攪拌した。生成物をシリカゲル・カラム上で精製し、構造をＮＭＲにより確認した。収量は２９３ｍｇ（１８％収率）であった。
【０１８１】
実施例９
アクリルアミド、ＢＢＡ−ＡＰＭＡ、およびメタクリル酸グリシジルのコポリマー（感光性ＰＡ−ポリエポキシド）（化合物ＶＩＩＩ）の調製
アクリルアミド（７．１ｇ、９９．３５ｍモル）、ＢＢＡ−ＡＰＭＡ（０．４１４ｇ、１．１８ｍモル）および２，２’−アゾビス（２−メチルブチロニトリル）（「ＶＡＺＯ６７」、０．２６２ｇ、１．４ｍモル）を、ＴＨＦ１０８ｍｌ中に溶解した。この溶液に、メタクリル酸グリシジル２．４ｍｌ（１７．７ｍモル）を添加した。溶液を４分間にわたりヘリウムで、次にアルゴンで４分間にわたり散布し、次に堅く栓をし、混合しながら一夜にわたり６１℃で加熱した。ポリマーを濾過により収集し、次にメタノール中に懸濁し混合した。その後それを再度濾過により収集し、クロロホルムで洗浄し、次に真空オーブン中において３０℃で乾燥した。
【０１８２】
実施例１０
ポリエポキシドにより被覆された顕微鏡用スライドの調製
ソーダ石灰ガラス顕微鏡用スライド（ニューハンプシャー州、ポーツマスのエリー・サイエンティフィック（Ｅｒｉｅ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ））を、１分間にわたり、それぞれがアセトン中１％のｐ−トリルジメチルクロロシラン（Ｔ−シラン）およびＮ−デシルジメチルクロロシラン（Ｄ−シラン、ペンシルバニア州、ブリストルのユナイテイッド・ケミカル・テクノルジーズ（Ｕｎｉｔｅｄ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ））の混合物に浸すことによりシラン処理を行った。空気乾燥後、スライドを１２０℃で１時間にわたりオーブン中で硬化した。次に、スライドをアセトンで洗浄し、続いて蒸留水に浸した。スライドをさらに５〜１０分間にわたりオーブン中で乾燥した。
【０１８３】
化合物ＶＩＩＩ（実施例９）をシラン処理されたスライド上に噴霧し、次に、これらを、湿っている間にダイマックス（Ｄｙｍａｘ）ランプ（インターナショナル・ライト放射計上の１０ｎｍ帯域通過フィルターにより３３５ｎｍで測定されて２５ｍジュール／ｃｍ２）を用いて照射し、水で洗浄し、乾燥した。
【０１８４】
実施例１１
感光性−ポリエポキシド被覆スライドによるマイクロアレーの調製
アミノ化または非アミノ化いずれかのオリゴヌクレオチドを、チップメーカー（ＣｈｉｐＭａｋｅｒ）２マイクロアレー・スポッティング・ピン（テレコム・インターナショナル（Ｔｅｌｅｃｈｅｍ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ））を位置付けるためにＸ、Ｙ、Ｚ動作制御器を用いて、０．１５Ｍリン酸緩衝液中８μＭでスライド上に印刷した。スライドを、実施例１０におけるような感光性−ポリエポキシド、同じ手順による感光性ＰＡ−ポリＮＯＳ、または公表された方法（米国特許第５，０８７，５２２号、Ｂｒｏｗｎ　ｅｔ　ａｌ．，「Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｆｏｒ　Ｆａｂｒｉｃａｔｉｎｇ　Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ　ｏｆ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｓａｍｐｌｅｓ，」およびそこに引用された文献を参照すること）によるポリリシンのいずれかにより被覆した。
【０１８５】
印刷されたエポキシドおよびＮＯＳスライドを室温および７５％相対湿度で一夜にわたり培養した。印刷されたポリリシンスライドを公表された手順により処理した。スライドを走査して固定化された捕捉オリゴヌクレオチドのＣｙ３蛍光を測定し、次に、４１℃で一夜にわたり捕捉オリゴヌクレオチドに相補的であるＣｙ５−標識オリゴヌクレオチド（１ｐモル／スライド）とハイブリッド形成した。スライドをレーザー走査器により走査してハイブリッド形成オリゴヌクレオチドの蛍光強度を測定した。アミン−シラン・スライドにより固定化された捕捉オリゴヌクレオチドの量が低いので、それらはハイブリッド形成されなかった。
【０１８６】
【化１】
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【０１８７】
【化２】
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【０１８８】
【化３】
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（式中、ｘ＝０．１〜５モル％、ｙ＝２〜３０モル％、およびｚ＝６５〜９７．９モル％）
【０１８９】
本発明の好ましい実施形態が記載されてきたが、一方で、本発明の精神および添付クレームの範囲から逸脱することなく、種々の変更、適合および修飾がそこでなされ得ることは理解されるべきである。
【国際公開パンフレット】
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2004509323.tif 000076
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004509323.tif 000077
【国際調査報告】
2004509323.tif 000078
2004509323.tif 000079
2004509323.tif 000080
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