(57)【要約】本発明は、ウイルスベクターを使用する、細胞の効率的な形質導入のための方法およびそれに関連する組成物を提供する。形質導入の効率は、形質導入されるべき細胞を、その細胞表面を結合する１以上の分子と接触させることによって、増大される。細胞表面結合分子との接触は、ウイルスベクターと細胞との間の接触の前か、後か、または同時に生じ得る。形質導入ベクターは、目的の遺伝子を発現するように構築され得、形質導入された細胞が治療剤および予防剤として使用されることを可能にする。【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞の安定な形質導入のための方法であって、該方法は、該細胞を、レンチウイルスベクターおよび少なくとも１つの細胞表面結合分子と接触させる工程を包含し、ここで、該細胞の７５％より多くが、約１４日後に安定に形質導入されている、方法。
【請求項２】
前記細胞をレンチウイルスベクターと接触させる前記工程が、該細胞を少なくとも１つの細胞表面結合分子と接触させる工程の前に生じる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記細胞をレンチウイルスベクターと接触させる前記工程が、該細胞を少なくとも１つの細胞表面結合分子と接触させる工程と同時に生じる、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記細胞をレンチウイルスベクターと接触させる前記工程が、該細胞を少なくとも１つの細胞表面結合分子と接触させる工程の後で生じる、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
レンチウイルスベクターと接触させる前記工程が、１回より多く生じる、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記細胞が、初代細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記細胞表面結合分子が、抗体、リガンドまたは細胞表面分子である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記レンチウイルスベクターが、ｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖ、ｖｉｆ、ｖｐｒ、ｖｐｕ、ｔａｔまたはｒｅｖの遺伝子に由来する、少なくとも１つのシス作用性のヌクレオチド配列を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記配列が、発現されないか、またはｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖ、ｖｉｆ、ｖｐｒ、ｖｐｕ、ｔａｔまたはｒｅｖの遺伝子のフラグメントもしくは変異体である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記レンチウイルスベクターが、ＨＩＶ由来のベクターである、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記レンチウイルスベクターが、偽型のベクターである、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記偽型のベクターが、水疱性口内炎ウイルスＧのエンベロープタンパク質を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記細胞が、造血細胞である、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記造血細胞が、ＣＤ４陽性細胞である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記造血細胞が、リンパ球である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記リンパ球が、ＣＤ４陽性細胞またはＣＤ８陽性細胞である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記造血細胞が、ＣＤ３４陽性細胞である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１８】
前記造血細胞が、造血幹細胞である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１９】
前記少なくとも１つの細胞表面結合分子が、ＦＬＴ−３リガンド、ＴＰＯおよびＫｉｔリガンド、またはこれらの機能的アナログである抗体から選択される分子を含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
前記少なくとも１つの細胞表面結合分子が、ＦＬＴ−３リガンド、ＴＰＯおよびＫｉｔリガンド、またはこれらの機能的アナログである抗体から選択される分子を含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
前記細胞が、樹状細胞または樹状細胞に分化し得る細胞である、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
前記少なくとも１つの細胞表面結合分子が、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４およびＴＮＦαを含む組成物；ＧＭ−ＣＳＦおよびインターフェロンα；またはこれらの機能的アナログである抗体から選択される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記少なくとも１つの細胞表面結合分子が、ＣＤ３抗体およびそのフラグメント、ＣＤ２８抗体およびそのフラグメント、ならびに前記抗体およびそのフラグメントの組み合わせからなる群より選択される、請求項１４に記載の方法。
【請求項２４】
前記少なくとも１つの細胞表面結合分子が、被覆されたビーズに固定化されたＣＤ３抗体とＣＤ２８抗体との組み合わせを含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記細胞を、成長および／または増殖をもたらす条件下で培養する工程をさらに包含する、請求項３または４に記載の方法。
【請求項２６】
前記条件が、細胞表面結合分子またはサイトカインとのインキュベーションをさらに包含する、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記サイトカインが、インターロイキン−２である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記培養する工程が、約７日間にわたる、請求項２５に記載の方法。
【請求項２９】
前記培養する工程が、約１４日間にわたる、請求項２５に記載の方法。
【請求項３０】
前記細胞を、レンチウイルスベクターと接触させる前記工程が、約２４時間にわたり、そして必要に応じて少なくとも１回繰り返される、請求項３に記載の方法。
【請求項３１】
前記レンチウイルスベクターが、５００未満のＭＯＩで存在する、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３２】
遺伝物質を生きた被験体に導入するための細胞であって、該細胞は、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法によって形質導入される、細胞。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（技術分野）
本発明は、ウイルスベクターを用いた細胞の効率的かつ安定な形質導入のための、方法およびそれに関する組成物に関する。この方法は、形質導入される細胞を、この細胞表面に結合する１つ以上の分子を接触させることによって、形質導入の効率を増大する。この接触工程は、細胞へのウイルスベクターの導入の前、後、または同時に生じ得る。本発明はまた、他の適用（ベクターによって生じる核酸の発現または生きた生物体の治療を含む）における安定に形質導入された細胞の使用に関する。
【０００２】
（背景技術）
「トランスフェクション（Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）」とは、概して、細胞への遺伝物質の導入のための技術をいい、この技術は、生物学における分子循環（ｒｅｖｏｌｕｔｉｏｎ）および組み換え循環に大きく寄与している。高等真核生物細胞での使用のためのトランスフェクション技術の例としては、リン酸カルシウム沈殿、ＤＥＡＥデキストラン処理、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、リポフェクション、ウイルス感染、ならびに多くの科学的教科書および学術誌に見出される他の技術が挙げられる。
【０００３】
トランスフェクション技術のなかでも、ウイルス感染の使用は、ウイルスが細胞へその遺伝物質を導入する天然に存在する手段が、目的の核酸分子を細胞に移入するのに利用されるという点で独特である。このような技術のために改変されそして適用されるウイルスの例としては、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、単純疱疹ウイルス、およびレトロウイルスが挙げられる。概して、目的の核酸分子は、ウイルスゲノムにクローニングされ得る。ウイルスゲノムの複製およびパッケージングの際、得られたウイルス粒子は、ウイルス進入機構を介して、目的の核酸を細胞に送達し得る。
【０００４】
一般に、ウイルスゲノムはまず、目的の核酸の付与（添加）の前に、核酸操作によって複製欠損にされる。得られたウイルスゲノム、またはウイルスベクターは、ウイルス粒子のアセンブリおよび細胞からの放出を完了するために、ヘルパーウイルスまたはパッケージングシステムの使用を必要とする。ウイルスベクターまたはウイルス粒子を用いて、目的の遺伝物質を細胞に移入する場合、この技術は「形質導入（ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ）」と呼ばれる。従って、一般に、細胞を「形質導入する（ｔｒａｎｓｄｕｃｅ）」とは、遺伝物質を細胞に移入するためにウイルスベクターまたはウイルス粒子を用いることである。
【０００５】
形質導入技術のなかでも、レトロウイルスの使用は、哺乳動物細胞の遺伝子改変のための興味深い題材であった。特に興味深いのは、遺伝的欠損および他の疾患を処置するために細胞に遺伝物質を導入するように改変されたレトロウイルスの使用である。このアプローチの例は、レトロウイルスベクターおよびレンチウイルスベクターが熱心な研究の対象である、造血系の細胞の場合にみられる。
【０００６】
例えば、Ｍｏｖａｓｓａｇｈらは、活性化Ｔ細胞の細胞周期に対する研究からの結果を含むことによって、レトロウイルス媒介形質導入の効率を増大させる企図についての彼らの研究を考察している。その結果、彼らの結果は、形質導入の間の活性な細胞分裂に依存する。この研究はまた、マウスの腫瘍レトロウイルスの使用、および形質導入の前の細胞の有意な前刺激のための要件に限定されている。
【０００７】
Ｊｕｎｅら（ＷＯ９６／３４９７０）は、Ｔ細胞トランスフェクションを増大するための手段としてＴ細胞刺激の使用を記載している。活性化された細胞または刺激された細胞でのＴ細胞形質導入に対する他の研究としては、以下の研究が挙げられる：Ｄｏｕｇｌａｓら、Ｈｏｏｉｊｂｅｒｇら、Ｏｎｏｄｅｒａら、Ｋｌｅｂｂａら、Ｂａｒｒｙら、およびＵｎｕｔｍａｚら。不幸にも、この研究では、約６５％より大きい形質導入効率を実証したものはなかった。
【０００８】
Ｃｏｓｔｅｌｌｏらは、Ｈｕｍａｎ  Ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  Ｖｉｒｕｓ−１（ＨＩＶ−１）レンチウイルスベクターを用いた、刺激Ｔ細胞および非刺激Ｔ細胞の両方の形質導入を記載している。彼らは、刺激された初代Ｔ細胞で、ほぼ最大１７％の効率、そして非刺激Ｔ細胞で１９％未満の効率でしかなかったことを、観察した。彼らはまた、ＨＩＶ−１アクセサリータンパク質の存在を含むことによって、刺激されたＴ細胞において、効率を３６％以下までしか増大できないという限定された能力に気付いた。
【０００９】
Ｃｈｉｎｎａｓａｍｙらはまた、非刺激Ｔ細胞およびマイトジェン刺激Ｔ細胞の両方におけるＨＩＶ−１アクセサリータンパク質の存在下での形質導入の効率の増大を記載している。Ｍｏｖａｓｓａｇｈらと同様に、Ｃｈｉｎｎａｓａｍｙらは、レンチウイルスベクターでの形質導入の前に長時間、血液リンパ球を前刺激した。Ｃｈｉｎｎａｓａｍｙらは、形質導入の３日後、９６％より大きい形質導入効率を最初に観察した。安定に形質導入された細胞のパーセンテージは、形質導入の２週後、７１．２％に減少した。Ｈａａｓらはまた、マーカー遺伝子（緑色蛍光タンパク質）を発現し得るレンチウイルスベクターで形質導入した細胞において、一過性の形質導入、および「偽性形質導入（ｐｓｅｕｄｏｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ）」を観察した。形質導入の３日後でさえ、形質導入された初代ＣＤ３４＋臍帯血細胞におけるマーカー遺伝子の不完全な発現に基づいて、大きい（１０％を超える）一過性形質導入が検出された。一過性形質導入によるこのような発現は、形質導入後７日でさえ、約５％で検出可能のままであった。形質導入後約１０日後でやっと、一過性形質導入からの発現は、マーカーなしのベクターで形質導入された細胞における発現に酷似した。
【００１０】
従って、Ｃｈｉｎｎａｓａｍｙらは、２週間後の有効性によって反映されるように、７１．２％を超える初代リンパ球の安定な形質導入（ウイルスベクターの組み込み型が、形質導入された細胞の染色体ＤＮＡに挿入された）を達成できなかった。これは、前刺激された細胞に対するサイトカインの使用には無関係であった。さらに、Ｃｈｉｎｎａｓａｍｙは、彼らが、アクセサリータンパク質（Ｖｉｆ、Ｖｐｒ、Ｖｐｕ、およびＮｅｆ）を発現しないＨＩＶベクターを用いて非刺激リンパ球を（この細胞を、形質導入後に、ＰＨＡマイトジェンおよびＩＬ−２サイトカインで後に刺激したにもかかわらず）、有意に形質導入できなかった（形質導入後１４日で３．６％のみ）ことを記載している。この結果は、非刺激細胞およびアクセサリータンパク質を含まないベクターの使用によっていくぶん改善されたが、このベクターとともに用いた刺激性プロトコールにかかわらず、刺激細胞または非刺激細胞の安定な形質導入の効率が、形質導入１４日後で７５％より大きいことは決してなかった。
【００１１】
レンチウイルスベクターを用いた安定な形質導入の頻度が低いことがまた、Ｈａｓｓらによって観察された。Ｈａｓｓらは、初代ＣＤ３４陽性臍帯血細胞を用いて、形質導入７日後、２５％未満の最大安定形質導入効率しか達成できなかった。顕著なことに、この形質導入の２５％の上限は、過度に高い感染効率（多重度）またはベクター濃度（例えば、９０００までの感染効率（ＭＯＩ）、および１０８感染単位／ｍｌまでのベクター濃度）の後でさえ、改善され得なかった。
【００１２】
Ｆｏｌｌｅｎｚｉらはまた、インターロイキン３（ＩＬ−３）、インターロイキン６（ＩＬ−６）、および幹細胞刺激因子（ＳＣＦ）を含有する３サイトカインカクテルの存在下で細胞を形質導入するために、５００という非常に高いＭＯＩを用いた。興味深いことに、このカクテルの使用により、細胞は、ヒトの臨床移植には不適切にさせられる。
【００１３】
従って、高い頻度で、ベクターを用いて細胞を安定に形質導入する、より効率的な手段が提供される必要は依然として残っている。さらに、検索ツールとして、そして治療剤としての両方の使用のために、非刺激細胞を形質導入するための、さらに効率的な手段が必要である。
【００１４】
上記の文献の引用は、前述のいずれかが関連の先行技術であることを承認するとは意図されない。これらの文献の内容に関する日付または提示に関する全ての記述は、本出願人に利用可能な情報に基づき、そしてこれらの文献の日付または内容の正確性に関していかなる承認も構成しない。
【００１５】
（発明の開示）
本発明は、ウイルスベクターおよびウイルス粒子を用いた細胞の安定な形質導入のために高度に有効な方法、およびそれに関する組成物を提供する。「安定な形質導入」とは、ウイルスベクターの組み込み型が、形質導入された細胞の染色体ＤＮＡに挿入されたことを意味する。この方法は、形質導入されるべき細胞を、この細胞表面に結合する少なくとも１つの分子と接触するように曝露する工程を包含する。この接触工程は、細胞がウイルスベクター、またはウイルス粒子に曝露される前、間、または後に生じ得る。本明細書において以降は、用語「ウイルスベクター」は、ウイルス由来の核酸の任意の形態を意味するために用いられ、そして形質導入を介して細胞に遺伝物質を移入するために用いられる。この用語は、ウイルスベクター核酸（例えば、ＤＮＡ、およびＲＮＡ）、これらの核酸のカプセル化形態、およびウイルスベクター核酸がパッケージングされたウイルス粒子を包含する。
【００１６】
本発明はまた、他の適用（このベクターに存在する核酸の発現による、有用な遺伝子産物およびタンパク質の産生、または疾患に罹患しているかもしくは罹患する危険性のある生存している被験体の治療を含む）における形質導入された細胞の使用を包含する。好ましくは、この被験体はヒトである。
【００１７】
形質導入される細胞の表面に結合する少なくとも１つの分子としては、この細胞の表面上のレセプター、マーカー、または他の認識可能部分と物理的に相互作用する任意の分子が挙げられる。基本的に、任意の細胞表面結合分子が、細胞の高い効率の形質導入に用いられ得る。本発明を理論で拘束することはないが、この細胞表面結合分子は、以下を生じ得る：ＤＮＡ組み込みに対してより受容性である宿主細胞のクロマチン；ベクター遺伝子発現に好ましい部位へのウイルスベクターの優先的な取り込み；キャプシド含有核酸の細胞質へのさらに効率的な進入；細胞膜もしくは内在性膜構造（例えば、エンドソーム）を横切るウイルスの、さらに効率的な進入；またはウイルスベクターの遺伝物質の核移入（トランスポート）のためのさらに許容的な細胞の作成。本発明の方法はまた、上記の可能性のうち複数を含み得る。また、そして上記の可能性の数および多様性から明白なように、本発明は、いずれか１つの理論には限定され得ない。代わりに、そしてヒトの治療におけるこの細胞の可能な使用にマイナスに影響することなく、処置された細胞の１００％までの安定な形質導入において、本発明の非凡な発見を考慮すれば、本発明はヒトの細胞治療の分野において新しいアプローチを切り開くことみなされるべきである。
【００１８】
全ての細胞表面結合分子ではないが、ウイルスベクターによって効率的かつ安定な形質導入が生じる。例えば、アポトーシスを誘導する細胞表面分子への結合は、細胞の効率的な形質導入を生じず、むしろ細胞死を生じる。細胞死は、細胞（例えば、腫瘍細胞）の殺傷に好ましくあり得るが、運搬（ペイロード）遺伝子または核酸配列を含むベクターでの細胞の安定な形質導入には好ましくない。好ましい細胞表面結合分子は、ウイルスベクターによる形質導入に対してさらに受容性である細胞を生じる。このような分子の例としては、特定の細胞表面レセプターまたはその部分に対する抗体、およびこのようなレセプターについてのリガンドまたは結合ドメインが挙げられる。さらに、抗体の抗原結合フラグメント（例えば、Ｆａｂ、およびＦｖフラグメント）は、本発明における使用について意図される。特異的な細胞表面レセプターに対する結合ドメインは、単一のエピトープまたは２つ以上のエピトープを含み得る。
【００１９】
本発明における使用のための細胞表面結合分子の好ましい例は、Ｔ細胞に結合し、そしてそれらをベクター形質導入に対して、さらに受容性にする、抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体である。他の好ましい細胞表面結合分子は、ＦＬＴ−３リガンド、ＴＰＯ、およびＫｉｔリガンドレセプターに対する抗体またはリガンドであり、これは、レセプターを発現する細胞（例えば、造血幹細胞）をベクター形質導入に対してさらに受容性にさせる。さらなる好ましい細胞表面結合分子は、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４レセプターに対する抗体またはリガンドであり、これは、樹状細胞またはそれらの前駆体（例えば、単球、ＣＤ３４陽性幹細胞、または樹状細胞系統上のその分化した前駆体細胞）を、ベクター形質導入にさらに受容性にする。他の細胞表面結合分子としては、別の細胞の表面に結合する細胞表面上に見出された分子が挙げられる。
【００２０】
細胞表面結合分子のさらなる例としては、ポリペプチド、核酸、炭水化物、脂質、およびイオン（全て、他の物質と必要に応じて複合体化した）が挙げられる。好ましくは、この分子は、以下のような血球の表面上に見出された因子と結合する：ＣＤ１ａ、ＣＤ１ｂ、ＣＤ１ｃ、ＣＤ１ｄ、ＣＤ２、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ６、ＣＤ７、ＣＤ８α、ＣＤ８β、ＣＤ９、ＣＤ１０、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤｗ１２、ＣＤ１３、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１５ｓ、ＣＤ１６ａ、ＣＤ１６ｂ、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２４、ＣＤ２５、ＣＤ２６、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ２９、ＣＤ３０、ＣＤ３１、ＣＤ３２、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３５、ＣＤ３６、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ３９、ＣＤ４０、ＣＤ４１、ＣＤ４２ａ、ＣＤ４２ｂ、ＣＤ４２ｃ、ＣＤ４２ｄ、ＣＤ４３、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ４５Ｒ、ＣＤ４６、ＣＤ４７、ＣＤ４８、ＣＤ４９ａ、ＣＤ４９ｂ、ＣＤ４９ｃ、ＣＤ４９ｄ、ＣＤ４９ｅ、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ５０、ＣＤ５１、ＣＤ５２、ＣＤ５３、ＣＤ５４、ＣＤ５５、ＣＤ５６、ＣＤ５７、ＣＤ５８、ＣＤ５９、ＣＤｗ６０、ＣＤ６１、ＣＤ６２Ｅ、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ６２Ｐ、ＣＤ６３、ＣＤ６４、ＣＤ６５、ＣＤ６６ａ、ＣＤ６６ｂ、ＣＤ６６ｃ、ＣＤ６６ｄ、ＣＤ６６ｅ、ＣＤ６６ｆ、ＣＤ６７、ＣＤ６８、ＣＤ６９、ＣＤｗ７０、ＣＤ７１、ＣＤ７２、ＣＤ７３、ＣＤ７４、ＣＤｗ７５、ＣＤｗ７６、ＣＤ７７、ＣＤ７９α、ＣＤ７９β、ＣＤ８０、ＣＤ８１、ＣＤ８２、ＣＤ８３、ＣＤ８４、ＣＤ８５、ＣＤ８６、ＣＤ８７、ＣＤ８８、ＣＤ８９、ＣＤ９０、ＣＤ９１、ＣＤｗ９２、ＣＤ９３、ＣＤ９４、ＣＤ９５、ＣＤ９６、ＣＤ９７、ＣＤ９８、ＣＤ９９、ＣＤ１００、ＣＤ１０１、ＣＤ１０２、ＣＤ１０３、ＣＤ１０４、ＣＤ１０５、ＣＤ１０６、ＣＤ１０７ａ、ＣＤ１０７ｂ、ＣＤｗ１０８、ＣＤｗ１０９、ＣＤ１１４、ＣＤ１１５、ＣＤ１１６、ＣＤ１１７、ＣＤ１１８、ＣＤ１１９、ＣＤ１２０ａ、ＣＤ１２０ｂ、ＣＤ１２１ａ、ＣＤ１２１ｂ、ＣＤ１２２、ＣＤ１２３、ＣＤｗ１２４、ＣＤ１２５、ＣＤ１２６、ＣＤｗ１２７、ＣＤｗ１２８ａ、ＣＤｗ１２８ｂ、ＣＤｗ１３０、ＣＤｗ１３１、ＣＤ１３２、ＣＤ１３３、ＣＤ１３４、ＣＤ１３５、ＣＤ１３６、ＣＤｗ１３７、ＣＤ１３８、ＣＤ１３９、ＣＤ１４０ａ、ＣＤ１４０ｂ、ＣＤ１４１、ＣＤ１４２、ＣＤ１４３、ＣＤ１４４、ＣＤｗ１４５、ＣＤ１４６、ＣＤ１４７、ＣＤ１４８、ＣＤｗ１４９、ＣＤ１５０、ＣＤ１５１、ＣＤ１５２、ＣＤ１５３、ＣＤ１５４、ＣＤ１５５、ＣＤ１５６、ＣＤ１５７、ＣＤ１５８ａ、ＣＤ１５８ｂ、ＣＤ１６１、ＣＤ１６２、ＣＤ１６３、ＣＤ１６４、ＣＤ１６５、ＣＤ１６６、およびＴＣＲζ。小文字（例えば、「ａ」または「ｂ」）は、複数の遺伝子産物からなるか、または構造的に関連するタンパク質のファミリーに属する、複合ＣＤ分子を示す。記号「ｗ」は、まだ完全に確認されていない推定ＣＤ分子をいう。ＣＤ分子のより完全な列挙は、Ｋｉｓｈｉｍｏｔｏ，Ｔ（編）に見出される。ＣＤ分子に対する現在の情報はまた、以下のＷｅｂ：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｓｉ．ｖｔ．ｅｄｕ／��ｍｍｕｎｏｌｏｇｙでのＡｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＷＷＷ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ／Ｊｏｕｒｎａｌにおいて、Ｓｈａｗ，Ｓ．（編）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｖｉｅｗｓに見出される。
【００２１】
より好ましいのは、リンパ球、Ｔ細胞および白血球の表面上に見出される因子に結合する分子であり、このような因子は、例えば、以下である：ＣＤ２、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ５、ＣＤ６、ＣＤ７、ＣＤ８α、ＣＤ８β、ＣＤ９、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１８、ＣＤ２５、ＣＤ２６、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ２９、ＣＤ３０、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ３９、ＣＤ４３、ＣＤ４４、ＣＤ４５Ｒ、ＣＤ４６、ＣＤ４８、ＣＤ４９ａ、ＣＤ４９ｂ、ＣＤ４９ｃ、ＣＤ４９ｄ、ＣＤ４９ｅ、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ５０、ＣＤ５３、ＣＤ５４、ＣＤ５６、ＣＤ５７、ＣＤ５８、ＣＤ５９、ＣＤｗ６０、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ６８、ＣＤ６９、ＣＤｗ７０、ＣＤ７１、ＣＤ７３、ＣＤｗ７５、ＣＤｗ７６、ＣＤ８４、ＣＤ８５、ＣＤ８６、ＣＤ８７、ＣＤ８９、ＣＤ９０、ＣＤ９４、ＣＤ９６、ＣＤ９７、ＣＤ９８、ＣＤ９９、ＣＤ１００、ＣＤ１０１、ＣＤ１０３、ＣＤ１０７ａ、ＣＤ１０７ｂ、ＣＤｗ１０８、ＣＤｗ１０９、ＣＤ１１８、ＣＤ１１９、ＣＤ１２０ｂ、ＣＤ１２１ａ、ＣＤ１２２、ＣＤｗ１２４、ＣＤｗ１２７、ＣＤｗ１２８ａ、ＣＤｗ１３０、ＣＤ１３２、ＣＤ１３４、ＣＤｗ１３７、ＣＤ１４０ａ、ＣＤ１４０ｂ、ＣＤ１４３、ＣＤ１４６、ＣＤ１４８、ＣＤ１５２、ＣＤ１５３、ＣＤ１５４、ＣＤ１５５、ＣＤ１６１、ＣＤ１６２、ＣＤ１６５、ＣＤ１６６、およびＴＣＲζ。
【００２２】
細胞表面に結合しかつ本発明における使用に適した、さらなる抗体および分子は、Ｌｉｎｓｃｏｔｔ’ｓ  Ｄｉｒｅｃｔｏｒｙ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ、第１１版、２０００年１月、発行者：Ｗ．Ｄ．Ｌｉｎｓｃｏｔｔ，Ｐｅｔａｌｕｍａ，ＣＡ（この文献は、この文献が完全に示されるかのように、参考として本明細書によって援用される）に開示される。しかし、本発明のいくつかの実施形態において、この細胞表面結合分子は、サイトカインではない。
【００２３】
本発明は、細胞のベクター形質導入を促進する可溶性細胞表面結合分子の使用によって実施形態され得るが、他の好ましい実施形態は、固定化された細胞表面結合分子の使用を含む。好ましくは、この固定化された分子は、抗体である。あるいは、固定化は、細胞表面結合分子を発現する他の細胞の使用を介し得る。造血幹細胞の効率的な形質導入のための好ましい方法は、形質導入の間に分化することなく幹細胞の維持を促進するリガンドをそれらの表面上に発現する、骨髄間質細胞を含むことである。刺激する細胞はネイティブ細胞に限定されないが、任意の細胞が操作されて、形質導入に対する正確な刺激を提供するために適切な細胞表面結合分子を発現し得る。
【００２４】
少なくとも１つの分子が細胞表面に結合する能力を増大または強化するさらなる分子もまた、含まれ得る。例えば、特異的な細胞表面レセプターに対する（一次）抗体の可溶性形態が、細胞表面に既に結合した一次抗体を架橋し得る二次抗体と組み合わせて、使用され得る。
【００２５】
当然、任意の細胞が、本発明の実施に使用され得る。好ましくは、形質導入されるべきである細胞は、真核生物細胞である。より好ましくは、その細胞は、初代細胞である。しかし、細胞株もまた、本発明の方法を用いて形質導入され得、そして多くの場合、細胞株は、より簡単に形質導入され得る。１つの好ましい実施形態において、形質導入されるべきである細胞は、初代リンパ球（例えば、Ｔリンパ球）もしくはマクロファージ（例えば、単球マクロファージ）であるか、またはこれらの細胞のいずれかに対する前駆体（例えば、造血幹細胞）である。形質導入に関して好ましい他の細胞は、一般的に造血系の細胞であるか、またはより一般的には、造血によって形成される細胞ならびに造血系の細胞が形成される幹細胞および血球機能と関連する細胞である。このような細胞としては、造血によって形成される顆粒球およびリンパ球ならびに多能性のリンパ性幹細胞および多能性の骨髄性幹細胞が挙げられる。血球機能と関連する細胞としては、免疫幹細胞の機能を補助する細胞（例えば、樹状細胞、内皮細胞、単球およびランゲルハンス細胞のような、抗原提示細胞）が挙げられる。好ましい実施形態において、その細胞は、Ｔリンパ球（すなわち、Ｔ細胞）（例えば、ＣＤ４マーカーおよびＣＤ８マーカーを発現するＴリンパ球）である。
【００２６】
特に好ましい実施形態において、その細胞は、初代ＣＤ４＋  Ｔリンパ球または初代ＣＤ３４＋造血幹細胞である。しかし、本発明における使用のためのウイルスベクターが、（以下に議論するように）水疱性口内炎ウイルスエンベロープＧタンパク質を用いて偽型にされ得る場合、任意の細胞が、本発明の方法を介して形質導入され得る。このような細胞としては、神経膠星状細胞、皮膚線維芽細胞、上皮細胞、ニューロン、樹状細胞、リンパ球、免疫応答と関連する細胞、血管内皮細胞、腫瘍細胞、腫瘍血管内皮細胞、肝細胞、肺細胞、骨髄細胞、抗原提示細胞、間質細胞、脂肪細胞、筋細胞、膵細胞、腎細胞、卵子または精母細胞（例えば、トランスジェニック動物を作製するため）、生殖細胞系に寄与する細胞、胚性多能性幹細胞もしくはその前駆体、血小板および赤血球のような無核細胞を含む血球などが挙げられるが、これらに限定されない。好ましくは、細胞は、真核生物の多細胞種（例えば、単細胞の酵母細胞とは対照的な細胞）であり、そしてなおより好ましくは、哺乳動物起源（例えば、ヒト細胞）である。
【００２７】
形質導入されるべきである細胞は、単一の実体として存在し得るか、または細胞の大きな集団の一部であり得る。このような「細胞の大きな集団」は、例えば、細胞培養物（混合されているかまたは純粋であるかのいずれか）、組織（例えば、上皮組織、間質組織または他の組織）、器官（例えば、心臓、肺、肝臓、胆嚢、膀胱、眼、および他の器官）、器官系（例えば、循環器系、呼吸器系、胃腸系、泌尿器系、神経系、外皮系または他の器官系）、胚盤胞、胚性幹細胞、胎児由来の細胞（例えば、遺伝的障害／遺伝的疾患の処置のため、またはトランスジェニック動物を作製するため）、疾患組織（例えば、腫瘍または感染部位）、または生物（例えば、鳥類、哺乳動物、海洋生物、魚類、植物など）を含み得る。好ましくは、標的化される器官／組織／細胞は、循環器系の器官／組織／細胞（例えば、心臓、血管、および血液を含むが挙げられるが、これらに限定されない）、呼吸器系の器官／組織／細胞（例えば、鼻、咽頭、喉頭、気管、気管支、細気管支、肺など）、胃腸系の器官／組織／細胞（例えば、口組織および口腔組織、咽頭、食道、胃、腸、唾液腺、膵臓、肝臓、胆嚢などを含む）、乳房系の器官／組織／細胞（例えば、胸部上皮細胞および組織中の支持細胞）、泌尿器系の器官／組織／細胞（例えば、腎臓、尿管、膀胱、尿道など）、神経系の器官／組織／細胞（脳および脊髄、ならびに眼のような特別な感覚器官が挙げられるが、これらに限定されない）および外皮系の器官／組織／細胞（例えば、皮膚）である。
【００２８】
さらにより好ましくは、形質導入されるべきである細胞は、心臓の細胞、血管（腫瘍血管および感染組織または疾患組織と関連する血管を含む）の細胞、骨髄の細胞、血液の細胞、脳の細胞、リンパ組織の細胞、リンパ節の細胞、脾臓の細胞、肺の細胞、肝臓の細胞、胆嚢の細胞、膀胱の細胞および眼の細胞からなる群より選択される。本発明の１つの特定の実施形態において、細胞は、使用が意図された宿主に対して自系であるが、宿主に対して部分的に適合しないかもしくは完全に適合しない同種異系の細胞、または宿主に対して異種性でさえある細胞もまた、使用され得る。さらに、任意の所定の宿主生物（関連する生物群または種（例えば、ヒト））における使用に適した万能のドナー細胞が、形質導入され得る。本発明のこの後者の実施形態は、細胞、組織、または器官の移植において特に重要であり、その形質導入される細胞の供給源が、移植の結果に重要であり得る。
【００２９】
本発明の方法による形質導入のための別の好ましい細胞は、腫瘍細胞であるか、疾患細胞であるか、またはその遺伝子的構成もしくは同じ生物中に存在する他の細胞の遺伝子的構成に起因して時間が経てば異常になる危険性のある細胞である。後者の実施形態は、本発明の形質導入細胞が予防において使用されることを可能にする。乳癌は、予後指標が、疾患が後で起こる前の早期の遺伝的介入として本発明の形質導入細胞を用いて処置することを可能にする、疾患プロセスの１つの例である。しかし、本発明の方法はまた、疾患が検出された後の乳癌の治療的処置に使用され得る。癌治療における本発明のさらなる適用は、多く、そして当業者は、本明細書中に示される本発明を、過度の実験なしに多くの型の癌の治療に対して使用し得る。
【００３０】
例としてであり、本発明を限定するわけではないが、１つの適用は、エストロゲン依存性である乳癌における適用である。エストロゲン依存性乳癌中の癌細胞は、エストロゲンレセプターに結合する抗体またはリガンドを治療的ウイルスベクターと組合わせて使用することによって、優先的に形質導入される。例えば、このベクターは、腫瘍阻害遺伝子（例えば、ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子）を含み得る。従って、形質導入された細胞は、ガンシクロビル（ヘルペスチミジンキナーゼによって活性化され得るプロドラッグ）の添加によって、選択的に殺傷され得る。腫瘍阻害遺伝子および対応するプロドラッグのさらなる例は多数であり、そして当該分野で周知であり、そして過度の実験なしに当業者によって選択され得る。本発明の形質導入方法の適用と組合わせた活性可能なプロドラッグの使用は、他の腫瘍型に広範に適用され得、そして上記の例は、本発明を、成長または増殖についてホルモン依存性であるかまたはいくつかの可溶性因子依存性である腫瘍に限定しない。
【００３１】
例えば、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ陽性腫瘍細胞は、エストロゲン依存性ではなく、予後指標としては不十分である。なぜなら、このような細胞を含む非エストロゲン依存性腫瘍は、エストロゲンアンタゴニストであるタキソールのような薬剤を用いた処理に対して非常に耐性であるからである。本発明に対して好ましい実施形態は、例えば、骨髄移植プロトコールにおいて、腫瘍で汚染した細胞の形質導入の間にウイルスベクター調製物を用いてＨｅｒ−２／ｎｅｕまたはヒレグリンに結合する抗体または他の分子を含むことである。あるいは、形質導入は、腫瘍部位に直接なされ得るか、または腫瘍形成を調節するベクターを用いてインビボで血管内でなされ得る。
【００３２】
本発明のなお別の実施形態は、単独または腫瘍細胞を標的化することと組合わせて、腫瘍脈管構造を標的化することである。Ｓｔ  Ｃｒｏｉｘら（その文献は、この文献が完全に示されるかのように、参考として本明細書によって援用される）は、ＳＡＧＥ分析によって、正常内皮細胞と比較して腫瘍内皮細胞中に特異的に過剰発現される遺伝子を同定した。これらの遺伝子のうちの多くは、細胞表面分子（例えば、Ｔｈｙ−１細胞表面抗原またはＥｎｄｏ１８０レクチン）をコードする。アップレギュレートされた細胞表面因子の全てが、本発明の細胞表面結合分子によって結合されて、効率的で安定な遺伝子導入に対する刺激を提供し得る。従って、腫瘍治療に対するアプローチは、腫瘍脈管構造に選択的に結合するが正常な内皮細胞に結合しない細胞表面結合分子の存在下で、治療的ウイルスベクターを用いて腫瘍内皮細胞を形質導入した後に、この腫瘍内皮細胞を殺傷することによってこの腫瘍脈管構造を破壊することである。
【００３３】
本発明のなお別の実施形態は、腫瘍中で抗腫瘍遺伝子の発現を選択的に促進するが正常脈管内皮細胞中ではこの抗腫瘍遺伝子の発現を促進しないウイルスベクターの中に、エレメント（例えば、プロモーターまたはｍＲＮＡ上のシス作用性安定化エレメント／シス作用性分解エレメント）を組み込むことによる、腫瘍脈管構造における抗腫瘍遺伝子の選択的発現である。このような方法は、エキソビボ、インビトロ、またはインビボで生じ得る。腫瘍脈管内皮細胞が標的化される場合、治療のための好ましい方法はインビボである。あるいは、例えば、骨髄移植のために汚染している腫瘍細胞を骨髄から一掃することが目的である場合、治療のための好ましい方法は、エキソビボまたはインビトロで生じる。
【００３４】
さらに、インビボ使用は、疾患状態に限定されず、正常細胞を形質導入するために使用され得る。例えば、本発明は、骨髄において造血幹細胞をインビボで形質導入するために使用され得る。抗体または他の細胞表面結合分子（例えば、ＦＬＴ−３リガンド、ＴＰＯおよびＫｉｔリガンド、またはこれらの機能的アナログ、あるいは細胞表面結合分子を発現する間質細胞）の任意の組合わせが、高効率の骨髄形質導入のために、骨髄中への直接的な注射の際に、ベクターと共に添加され得る。用語「機能的アナログ」は、本発明の細胞表面結合分子の細胞表面結合活性を保持する任意の分子をいう。このような機能的アナログとしては、ＦＬＴ−３リガンド、ＴＰＯおよびＫｉｔリガンドのフラグメント；１つ以上のアミノ酸置換、アミノ酸付加、またはアミノ酸欠失を含む、ＦＬＴ−３リガンド分子、ＴＰＯ分子およびＫｉｔリガンド分子；ならびに細胞表面結合分子の細胞表面結合活性を模倣する抗体が挙げられる。
【００３５】
上記に対する代替のアプローチは、ウイルスベクターの産生細胞として骨髄間質細胞を使用し、そのようにして、ベクター調製物としてではなく細胞治療を介して、ベクターおよび細胞表面結合分子を提供することである。別の例は、皮下注射の間にベクターと共に、ＣＤ３抗体およびＣＤ２８抗体の機能的アナログ、またはＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４の機能的アナログをそれぞれ添加することによる、Ｔ細胞または樹状細胞の形質導入である。皮下組織中のリンパ液は、標的化組織の効率的な形質導入のためにリンパ節にベクターおよび刺激剤を排出する。
【００３６】
本発明は、形質導入される細胞の精製が、必要に応じて、必須とはならないという利点を含む。目的の細胞型を主とした形質導入は、結合される細胞表面部分の選択によって達成され得る。従って、例えば、血球の混合集団において、ＣＤ３を発現する細胞（例えば、特定のＴ細胞）の形質導入は、ＣＤ３特異的抗体がその細胞と相互作用するために使用される場合、増強される。このことは、集団中の他の細胞型（例えば、ＣＤ３を発現しない顆粒球および単球）よりも優先して生じる。
【００３７】
本発明はまた、所望される場合、精製された細胞型または単離された細胞型の形質導入を含む。精製された細胞型または単離された細胞型の使用は、より高い形質導入効率（これは、形質導入される細胞と比較してより高いベクター濃度に起因する）のようなさらなる利点を提供する。
【００３８】
精製されたＴ細胞が形質導入される場合、少なくとも１つの分子が、好ましくは、Ｔ細胞上に見出される細胞表面分子に結合する。このような細胞表面分子の例としては、ＣＤ３、ＣＤ２８、ＣＤ２５、ＣＤ７１、およびＣＤ６９が挙げられる。これらの細胞表面分子に結合する分子の例としては、これらの細胞表面分子を認識する抗体およびモノクローナル抗体が挙げられ、これらの抗体およびモノクローナル抗体のうちの多くは、市販されるか、または過度の実験なしに標準的な技術を用いて容易かつ慣用的に調製される。ＣＤ４＋細胞またはＣＤ８＋細胞の形質導入のための好ましい実施形態において、ＣＤ３および／またはＣＤ２８を認識するモノクローナル抗体が使用され得る。市販されるこのような抗体の例としては、ＣＤ３についてＯＫＴ３、そしてＣＤ２８についてＣＤ２８．２が挙げられる。これらの抗体分子は、可溶性形態で使用され得るか（必要に応じて他の分子によって後で架橋される）、またはビーズもしくは他の固体表面などの上に固定化形態で使用され得る。本発明の特に好ましい実施形態において、抗体は、容器の表面上に固定化され、例えば、ウイルスベクター媒介形質導入のために使用される組織培養用のウェル、プレート、またはバッグの壁に固定化される。理論に束縛されないが、細胞が付着または接触する表面上での固定化抗体の使用は、その細胞表面上での細胞表面相互作用の局所濃度を増大させ得る。
【００３９】
造血幹細胞が形質導入される場合、ＦＬＴ−３リガンド、ＴＰＯ（トロンボポイエチンまたは巨核球増殖および発生因子（Ｍｅｇａｋａｒｙｏｃｙｔｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  Ｆａｃｔｏｒ））、またはＫｉｔリガンドの造血幹細胞レセプターに特異的な抗体が、細胞表面結合分子として使用され得る。あるいは、幹細胞陽性細胞マーカー（ＣＤ３４またはＡＣ１３３が挙げられるが、これらに限定されない）に対する抗体が、使用され得る。化合物または組成物を含むリガンドが細胞表面結合分子として使用される場合、全ての天然のリガンド（タンパク質、リガンドまたは異種タンパク質に結合するリガンドを含む）が、可溶性形態または固定化形態のいずれかで使用され得る。固定化形態としては、直接的または間接的（例えば、アビジン／ビオチンを用いて）な、マイクロビーズへの付着が挙げられる。
【００４０】
あるいは、リガンドは、ウイルスベクターのウイルスエンベロープ中で発現され得、必要に応じて、キメラタンパク質もしくは融合タンパク質の形態で発現され得、そして／または１つ以上の他のタンパク質と（共有結合的または非共有結合的に）複合体化され得る。このような実施形態において、細胞表面結合分子は、細胞を形質導入するための単一組成物として、ウイルスベクターと組合わせて呈される。ウイルスエンベロープ中で発現され得る細胞表面結合分子のさらなる例としては、上記に列挙した多数の表面因子が挙げられる。
【００４１】
他の好ましい細胞表面結合分子（例えば、抗体またはそのフラグメント）は、ＮｏｔｃｈもしくはＤｅｌｔａの造血幹細胞レセプターに結合する分子、またはＮｏｔｃｈタンパク質もしくはＤｅｌｔａタンパク質自体に結合する分子、または異種タンパク質に結合するＮｏｔｃｈもしくはＤｅｌｔａのリガンドに結合する分子である。ＤｅｌｔａおよびＮｏｔｃｈは、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ発生において広範な種々の細胞運命の決定に影響を与える、細胞表面タンパク質をコードする。ＤｅｌｔａおよびＮｏｔｃｈの脊椎動物ホモログは、正常な胚発生に必須である。Ｄｅｌｔａホモログは、造血の調節に重要に関与している。可溶性形態のホモログであるＤｅｌｔａ−Ｓｅｒｒａｔｅ−ｌａｇ２（ＤＳＬ）は、原始造血前駆体の拡大を増強する。造血増殖因子（インターロイキン−３（ＩＬ−３）、顆粒球コロニー刺激因子（すなわち、Ｇ−ＣＳＦ）または顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＳＣＦ）を含む）と組合わせた場合、ＤＳＬは、原始造血前駆体の拡大を促進し、そして同時に、この原始前駆体が、ＩＬ−３単独に対して応答性であるより成熟した前駆体細胞へと分化するのを阻害した（Ｈａｎらを参照のこと）。ＤＳＬは、おそらく、造血細胞において発現されるＮｏｔｃｈレセプターを活性化することによって作用し、通常の造血増殖因子に対して応答する細胞の能力を、細胞分化を選択的にブロックするが増殖シグナルをブロックしないことによって調節する（ＨａｎおよびＭｏｏｒｅ，Ｂｌｏｏｄ  １９９９を参照のこと）。従って、ＤｅｌｔａホモログおよびＮｏｔｃｈホモログ、これらのホモログに対して機能的アナログである抗体は、細胞（特に、造血幹細胞）の７５％より高い効率的なベクター形質導入を達成する際の使用のための、さらに好ましい細胞表面結合分子である。
【００４２】
本発明は、開示される方法における使用のための、ウイルスベクターおよびこのウイルスベクターを含む組成物を包含する。このベクターは、好ましくはレトロウイルス（レトロウイルス科）ベクターであり、より好ましくはレンチウイルスベクターである。他のレトロウイルスベクター（例えば、オンコウイルスベクターおよびマウスレトロウイルスベクター）もまた、使用され得る。さらなるベクターが、他のＤＮＡウイルス、またはその生活環のある時点の間にそのゲノムをＤＮＡに変換し得るウイルスから誘導され得る。好ましくは、このウイルスは、アデノウイルス科、パルボウイルス科、ヘパドナウイルス科（Ｈｅｐａｎｄａｖｉｒｉｄａｅ）（通常は、ヘパドナウイルス科に分類されない、δ型肝炎ウイルスおよびＥ型肝炎ウイルスを含む）、パポバウイルス科（ポリオーマウイルス科およびパピローマウイルス科を含む）、ヘルペスウイルス科、およびポックスウイルス科由来のウイルスである。
【００４３】
レトロウイルス科（すなわち、レトロウイルス）のさらなるウイルスは、オンコウイルス亜科、スプマウイルス亜科、スプマウイルス属、レンチウイルス亜科、およびレンチウイルスの属または亜科のウイルスである。オンコウイルス亜科のＲＮＡウイルスは、望ましくは、ヒトＴリンパ球向性ウイルス１型もしくはヒトＴリンパ球向性ウイルス２型（すなわち、ＨＴＬＶ−１またはＨＴＬＶ−２）、またはウシ白血球ウイルス（ＢＬＶ）、鳥類白血症−肉腫ウイルス（例えば、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）、鳥類骨髄芽球症ウイルス（ＡＭＶ）、鳥類赤芽球症ウイルス（ＡＥＶ）、およびラウス随伴ウイルス（ＲＡＶ；ＲＡＶ−０〜ＲＡＶ−５０））、哺乳動物Ｃ型ウイルス（例えば、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭｕＬＶ）、ハーベイ（Ｈａｒｖｅｙ）マウス肉腫ウイルス（ＨａＭＳＶ）、エーベルソンマウス白血病ウイルス（Ａ−ＭｕＬＶ）、ＡＫＲ−ＭｕＬＶ、ネコ白血病ウイルス（ＦｅＬＶ）、サル肉腫ウイルス、細網内皮症ウイルス（ＲＥＶ）、脾臓壊死ウイルス（ＳＮＶ））、Ｂ型ウイルス（例えば、マウス乳腺癌ウイルス（ＭＭＴＶ））、およびＤ型ウイルス（例えば、マソン−ファイザーサルウイルス（ＭＰＭＶ）および「ＳＡＩＤＳ」ウイルス）である。
【００４４】
レンチウイルス亜科のＲＮＡウイルスは、望ましくは、ヒト免疫不全症ウイルス１型またはヒト免疫不全症ウイルス２型（すなわち、ＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２（ここで、ＨＩＶ−１は、以前は、リンパ節症随伴ウイルス３（ＨＴＬＶ−ＩＩＩ）および後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）関連ウイルス（ＡＲＶ）と称されていた））、またはＡＩＤＳもしくはＡＩＤＳ様疾患で同定され、かつこれらの疾患に関連する、ＨＩＶ−１もしくはＨＩＶ−２に関連する別のウイルスである。頭文字「ＨＩＶ」または用語「ＡＩＤＳウイルス」または「ヒト免疫不全ウイルス」は、総称して、これらのＨＩＶウイルス、ならびにＨＩＶ関連ウイルスおよびＨＩＶ随伴ウイルスをいうために本明細書に使用される。さらに、レンチウイルス亜科のＲＮＡウイルスは、好ましくは、ビスナウイルス／マエディウイルス（例えば、ヒツジに感染する）、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、ウシレンチウイルス、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、ウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）、およびヤギ関節炎−脳炎ウイルス（ＣＡＥＶ）である。
【００４５】
特に好ましいレンチウイルスベクターは、ＨＩＶ由来のベクター、より好ましくはＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２またはこれらのキメラの組み合わせ由来のベクターである。当然、異なる血清型のレトロウイルス（特に、ＨＩＶ）が、本発明における使用のためのベクターを調製するために、単独または組合わせて使用され得る。本発明の好ましいベクターは、野生型ウイルスに存在するが「基本」のレンチウイルスベクター中に存在しない、シス作用性エレメントを含む。「基本」のレンチウイルスベクターは、ＬＴＲならびに５’リーダー配列およびｇａｇコード配列中のパッケージング配列を最小限で含むが、「基本」のレンチウイルスベクターはまた、必要に応じて、Ｒｅｖ依存性様式でベクターＲＮＡの核輸送を促進するＲＲＥエレメントを含み得る。好ましいベクターは、細胞への形質導入効率を増強するヌクレオチド配列をさらに含む。
【００４６】
このようなベクターの例は、ｇａｇおよびｐｏｌの完全配列を含むベクターであるｐＮ２ｃＧＦＰである。別の例は、ｐｏｌ中の配列約４５５１〜５０９６位（この位置は、Ｃ．Ｅ．Ｂｕｃｋｌｅｒ、ＮＩＡＩＤ、ＮＩＨ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤによって厚意によって提供された、登録番号Ｍ１９９２１、ＨＩＶＮＬ４３  ９７０９ｂｐのｐＮＬ４−３配列からの参照位置である）を含むベクターである。しかし、ベクター形質導入効率を向上させ得る、ｗｔ−ＨＩＶ由来の任意のシス作用性配列が、使用され得る。本発明を介して効率的な形質導入を可能にするベクターの他の例は、米国特許第５，８８５，８０６号に記載されるｃｒ２ＨＩＶ構築物である。
【００４７】
形質導入効率を有意に増大させるには不十分である以前に同定された配列が、形質導入効率を増大させ得る中央ＤＮＡフラップ（ｆｌａｐ）（ｐＮＬ４−３の４７５７位〜４９３５位に対応する、ｐＬＡＩ３の４７９３位〜４９７１位の１７８塩基対のフラグメント）としてＺｅｎｎｏｕら（２０００）によって記載された。本発明は、この小さなフラグメントが形質導入効率を増大させるには不十分であるが、より大きな５４５塩基対のフラグメント（ｐＮＬ４−３の４５５１位〜５０９６位）またはこれを含むさらにより大きなフラグメントが、本発明の一部として形質導入を増大させ得たという発見を含む。
【００４８】
本発明において使用され得るウイルスベクター構築物のさらなる例は、米国特許第５，８８５，８０６号（この文献は、この文献が完全に示されるかのように、参考として本明細書によって援用される）に見出される。この特許第５，８８５，８０６号中の構築物は、細胞を効率的に形質導入するベクターの範囲を限定しない、単なる例示である。その代わり、この構築物は、本発明を用いた使用のためのウイルスベクターが、野生型ウイルス由来の最小配列を含み得るか、または野生型ウイルスのほぼ全ゲノムまでの配列を含み得るが、複製および／または疾患の生成に必要とされる必須の核酸配列を排除し得るということのさらなる指標を、当業者に提供する。細胞の効率的な形質導入のために必要とされる配列を正確に決定するための方法は、慣用的であり、そして当該分野で周知である。例えば、ウイルス配列を「基本」ベクターに戻す系統的な組込み、またはＨＩＶ（例えば、ｃｒ２ＨＩＶ）ゲノムの実質的に全体を含むベクターから配列を欠失させることが、慣用的であり、そして当該分野で周知である。
【００４９】
さらに、他のウイルス骨格由来の配列を目的のウイルスベクター（例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ））に配置することもまた、当該分野で周知である。使用される実際のウイルスベクター、それにコードされる種々の補助タンパク質、およびそれに存在する配列に拘わらず、ウイルス遺伝物質は、これらのタンパク質または配列が特定の細胞型において形質導入効率を増加する場合、そのベクターまたはヘルパーゲノムに残され得る。特定の遺伝物質がベクターまたはヘルパーゲノムのいずれかにその配列を組み込むことによって形質導入効率を増加するか否かを決定するために、多くの慣用的なスクリーニングが利用可能である。本発明の好ましい実施形態は、ベクターまたはヘルパーゲノムのいずれにおいても補助タンパク質を含まない。しかし、この好ましさは、補助タンパク質および他の配列がベクターまたはヘルパーゲノムのいずれかに残されて形質導入効率を増加する本発明の実施形態を、排除しない。
【００５０】
本発明において使用されるウイルスベクターはまた、「偽型」形成を生じ得、ここでは、異なるウイルスによる細胞の同時感染が、１つのウイルスのゲノムを含む子孫ビリオンを産生し、その１つのウイルスのゲノムが、別のウイルスの１以上のエンベロープタンパク質を含む外層内にカプセル化されている。この現象は、「偽型」ビリオン中に目的のウイルスベクターをパッケージングするために使用されており、これは、その目的のウイルスベクターおよび別のウイルスの少なくとも１つのエンベロープタンパク質または細胞表面分子をコードする遺伝物質の両方を、パッケージング細胞に同時トランスフェクトまたは同時感染させることによる。米国特許第５，５１２，４２１号を参照のこと。このような混合ウイルスは、使用される１以上の異種エンベロープタンパク質に対する抗血清によって中和され得る。偽型形成において一般に使用される１つのウイルスは、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）であり、これは、ラブドウイルスである。偽型化の使用は、使用される異種ウイルスのウイルス侵入機構のエレメントを含むことによって、ウイルスの宿主細胞範囲を拡大する。
【００５１】
本発明の使用のためのウイルスベクターおよびＶＳＶの偽型化は、ヌクレオカプシドにカプセル化されたウイルスベクター核酸を含むウイルス粒子を生じ、このヌクレオカプシドは、ＶＳＶ  Ｇタンパク質を含む膜によって囲まれている。このヌクレオカプシドは、好ましくは、そのウイルスベクターと通常に関連するタンパク質を含む。周辺ＶＳＶ  Ｇタンパク質を含む膜は、そのウイルスベクターをパッケージングするために使用された細胞から出て行く際に、ウイルス粒子の部分を形成する。パッケージング細胞の例は、米国特許第５，７３９，０１８号に記載される。本発明の好ましい実施形態において、ウイルス粒子は、ＨＩＶから誘導され、そしてＶＳＶ  Ｇタンパク質によって偽型化される。ＶＳＶ  Ｇタンパク質を含む偽型化されたウイルス粒子は、両栄養性ウイルスウイルスベクターよりも高い効率で、多くの異なる細胞型を感染し得る。宿主細胞の範囲は、哺乳動物種および非哺乳動物種の両方（例えば、ヒト、げっ歯類、魚類、両生類および昆虫類）を含む。
【００５２】
本発明の形質導入方法における使用のためのウイルスベクターはまた、そのウイルスに存在するプロモーターの制御下またはそのベクターに導入された異種プロモーターの制御下に、１以上の核酸配列を含みそしてこれを発現する。プロモーターはさらに、厳密に制御された遺伝子発現のためにそのオペロンに隣接するように、隔離エレメント（例えば、赤血球ＤＮＡｓｅ高感受性部位）を含み得る。好ましいプロモーターとしては、ＨＩＶ−ＬＴＲ、ＣＭＶプロモーター、ＰＧＫ、Ｕ１、エプスタインバーウイルス由来のＥＢＥＲ転写単位、ｔＲＮＡ、Ｕ６およびＵ７が挙げられる。Ｐｏｌ  ＩＩプロモーターが好ましいが、Ｐｏｌ  ＩＩＩプロモーターもまた使用され得る。組織特異的プロモーターもまた、好ましい実施形態である。例えば、βグロビン遺伝子座制御領域エンハンサーならびにαおよびβグロビンプロモーターは、赤血球および赤血球系細胞における組織特異的発現を提供し得る。別のさらに好ましい実施形態は、そのプロモーターに関連するシス作用性配列を使用することである。例えば、米国特許第５，８１４，５００（参考として本明細書中に援用される）に示されるように、Ｕ１遺伝子を使用して、アンチセンス遺伝子発現を増強し得、ここで、非プロモーター配列を使用して、標的のスプライシングされたＲＮＡに、そのアンチセンス分子またはリボザイム分子を標的化する。
【００５３】
もちろん、ウイルス由来の任意のシス作用性ヌクレオチド配列が、本発明のウイルスベクターに組み込まれ得る。特に、レトロウイルスゲノム中に見出されるシス作用性配列が好ましい。例えば、ｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖ、ｖｉｆ、ｖｐｒ、ｖｐｕ、ｔａｔまたはｒｅｖ遺伝子由来のシス作用性ヌクレオチド配列が、本発明のウイルスベクターに組み込まれ、形質導入効率をさらに増加し得る。好ましくは、シス作用性配列は、発現されるポリペプチドをコードしないか；遺伝子変更（例えば、翻訳開始部位の欠失）に起因してポリペプチドまたはその一部として発現されないか；大きいポリペプチドの一部またはフラグメントのみをコードするか；またはネイティブ配列からの１以上の置換、付加または欠失を含む変異体配列である。シス作用性配列の例は、ＨＩＶ  ｐｏｌ遺伝子内に同定されたｃＰＰＴ（中央ポリプリン領域）配列である。
【００５４】
本発明のウイルスベクター中のその１以上の核酸配列は、そのベクターが由来するウイルス中に見出され得るか、または異種配列であり得る。配列は、好ましくは、目的の遺伝子産物をコードする全長または部分配列である。このような配列または遺伝子産物は、好ましくは、細胞中で生物学的効果を生じ得る、生物学的に活性な因子である。このような因子の例として、タンパク質、リボ核酸、酵素、輸送体または他の生物学的に活性な分子が挙げられる。
【００５５】
１つの好ましい実施形態において、この因子は、タンパク質（例えば、毒素、転写因子、増殖因子またはサイトカイン、構造タンパク質、または細胞表面分子）である。このタンパク質は、機能が全く同定されていない１以上のドメインを含み得、そして形質導入された細胞に対して同種であり得る。さらに、このタンパク質は、形質導入される細胞において存在しないか、欠損しているか、または変更されているものであり得る。あるいは、このタンパク質は、トランスドミナントネガティブ変異体またはデコイであり、形質導入された細胞において天然のタンパク質がその通常の活性を生じるのを妨げ得る。
【００５６】
例えば、核酸配列は、形質導入された細胞中で発現されたＲＮＡまたは発現されるべきＲＮＡを結合、切断および破壊するリボザイムをコードし得る。あるいは、核酸配列は、特定の核酸配列を標的とし、そしてその分解を生じるように設計された、アンチセンス分子をコードし得る。ベクターに含まれる配列は、形質導入された細胞において、過剰発現され得るか、誘導発現され得るか、あるいは細胞またはウイルスの調節性転写制御下にあり得る。意図される用途に依存して、異種配列は、形質導入された細胞についてのマーカーを含む任意の所望のタンパク質をコードし得る。このようなマーカーとしては、特定の耐性表現型のような選択マーカー（例えば、ネオマイシン、ＭＤＲ−１（Ｐ−糖タンパク質）、Ｏ６−メチルグアニン−ＤＮＡ−メチルトランスフェラーゼ（ＭＧＭＴ）、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）、アルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＡＬＤＨ）、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）およびシトシンデアミナーゼ）が挙げられる。総説については、Ｋｏｃら（参考として本明細書に援用される）を参照のこと。
【００５７】
本発明の方法において、形質導入される細胞は、ウイルスベクターの適用の前、後または同時に、細胞表面に結合する少なくとも１つの分子との接触に曝される。例えば、細胞は、形質導入されるウイルスベクターが存在する前、後、またはその存在下で、ＣＤ３抗体およびＣＤ２８抗体（培養ディッシュの表面上にコーティングされているか、または培養物中に存在するビーズ上に固定化されている）を有する培地で培養され得る。好ましくは、細胞は、ウイルスベクターの最初の接触後のみかまたは最初の接触時のみに、固定化されたＣＤ３抗体および／またはＣＤ２８抗体に曝される。これらの条件下では、細胞は、ウイルスベクターでの実際の形質導入前に、細胞表面結合分子に曝されない。細胞表面結合分子との接触がウイルスベクターへの細胞の曝露（形質導入）後に生じる実施形態において、その接触は、好ましくは、形質導入の３日以内、より好ましくは、形質導入後１〜２日以内に行う。
【００５８】
ウイルスベクターとの細胞のインキュベーションは、使用される条件および材料に依存して、異なる長さの時間で行い得る。インキュベーション時間に影響を及ぼす因子としては、使用される細胞、ベクターおよびＭＯＩ（感染多重度）、細胞表面に結合させるために使用される分子および量、その分子が固定化されているかまたは溶解されているか否か、およびその分子がどのように固定化または溶解されているか、ならびに所望の形質導入効率のレベル、が挙げられる。好ましくは、インキュベーションは、約８時間〜約７２時間であり、より好ましくは、約１２時間〜約４８時間である。特に好ましい実施形態において、インキュベーションは、約２４時間であり、必要に応じて一度繰り返される。
【００５９】
形質導入される細胞とウイルスベクターとの間の接触は、細胞型に依存して、少なくとも１回行うが、その接触は、１回より多く行い得る。例えば、ＣＤ３４陽性幹細胞の高効率の形質導入は、ベクターでの複数回の形質導入によって達成されている。本発明の好ましい方法は、細胞表面結合分子（例えば、ＣＤ３抗体および／またはＣＤ２８抗体またはＦＬＴ−３リガンド、ＴＰＯまたはＫｉｔリガンド）と組み合わせてウイルスベクターを同時に導入し、そして形質導入後約１日間〜約８日間の間に培地を交換することを回避することである。より好ましくは、培地は、形質導入後３日間交換されない。形質導入は、その条件が、細胞または細胞を含む生物に有意に有害なプロセスを伴わずに可能である限り、進行され得る。このような使用のための細胞表面結合タンパク質のさらなる例としては、本明細書上記のタンパク質が挙げられる。
【００６０】
同様に、使用されるＭＯＩは、約１〜約４００、好ましくは、５００未満である。一般に、好ましいＭＯＩは、約２〜約５０である。より好ましくは、ＭＯＩは、約１０〜約３０であるが、約１〜約１０、約２０、約３０または約４０の範囲も意図される。より好ましくは、約２０のＭＯＩである。さらに、細胞当たりのウイルスベクターのコピー数は、少なくとも１つであるべきである。しかし、細胞当たり多くのベクターのコピーもまた、上記の方法と共に使用され得る。細胞当たりのコピーの好ましい範囲は、約１〜約１００である。より好ましいコピー数は、ベクターの形質導入から生じる治療効果、予防効果または生物学的効果、あるいは最も効率的な形質導入を提供する、最小のコピー数である。
【００６１】
治療適用または予防適用のために、より好ましいコピー数は、細胞または細胞を含む生物に対して有意に有害でなく、細胞によって許容される最大のコピー数である。細胞当たりの最小コピー数および最大コピー数の両方は、形質導入される細胞および存在し得る他の細胞に依存して変化する。最適なコピー数は、慣用的な方法を使用して、当業者によって容易に決定される。例えば、細胞を、漸増濃度または感染多重度で形質導入する。次いで、これらの細胞を、コピー数、治療効果または生物学的効果について、および形質導入された細胞またはそれらを含む宿主に対する有害な効果（例えば、安全性および毒性）について分析する。
【００６２】
インビトロでのウイルスベクターとのインキュベーション後、細胞は、種々の時間、細胞表面結合分子の存在下で培養され得、その後、それらの細胞は、形質導入効率について分析されるか、さもなければ、使用される。あるいは、細胞は、細胞増殖を生じる任意の条件下で培養され得る（例えば、インターロイキン−２（ＩＬ−２）とのインキュベーション、または細胞表面結合分子、およびその後ＩＬ−２とのインキュベーション）。形質導入後のインキュベーションは、任意の期間で行われ得るが、好ましくは、約１日から約７日〜１０日である。より長い期間（例えば、約１４日）もまた使用され得るが、細胞増殖に対して有害な期間は、好ましくない。細胞をウイルスベクターとのインキュベーションの前に細胞表面結合分子と共に培養する、本発明の実施形態において、培養時間は、約２４時間〜約７２時間の範囲であり得、最も好ましくは、２４時間である。
【００６３】
このような形質導入前の培養は、当該分野で教示されるように、例えば、形質導入の前のサイトカインおよび／またはマイトジェンでの細胞の刺激と比較され得る。本発明は、このような刺激の回避から生じる利点を含む。例えば、刺激は、増殖を介して細胞数を拡大し、刺激前よりも刺激後により多くの細胞を生じる。この拡大された細胞のセットの形質導入は、さらにより多くのウイルスベクターおよび関連する形質導入材料（例えば、容器、培地、サイトカインなど）を必要とし、関連するコストを増加する。さらに、細胞の刺激は、さらなる適用に対して細胞の質に影響する。Ｍｏｖａｓｓａｇｈらは、３日間の形質導入前刺激の使用が、形質導入およびさらなる培養後のＴ細胞レパートリーの多様性の悪化を生じたことを記載する。さらに、形質導入前刺激は、活発に分裂していない細胞の形質導入から獲得され得る利点を排除する。
【００６４】
本発明を用いて観察された形質導入の効率は、約７５％〜１００％である。好ましくは、その効率は、少なくとも約７５％〜９０％である。本発明のより好ましい実施形態は、形質導入効率が、少なくとも約９０％〜１００％の場合である。最も好ましい実施形態は、少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％および１００％の形質導入効率を有する。
【００６５】
上記に加え、形質導入された細胞は、研究において、あるいは、生存中の被験体の疾患状態の処置または予防のために使用され得る。研究使用の例は、Ｕｎｕｔｍａｚらによって記載される構造−機能研究である。形質導入された細胞の治療的使用としては、生存中の生物へのそれらの細胞の導入が挙げられる。例えば、ＨＩＶに感染したかまたは感染する危険性のある個体から単離した未刺激初代Ｔ細胞を、本発明の方法を使用してベクター（米国特許第５，８８５，８０６号に記載のような）によって最初に形質導入し得、その後、その形質導入された細胞をその個体に注入し戻す。あるいは、細胞は、ウイルスベクターに存在する異種配列の発現に直接使用され得る。
【００６６】
ＨＩＶの治療または予防の一部として使用される場合、ベクターは、抗ＨＩＶ適用に適応された毒素または他の抗ウイルス剤をコードし得る。あるいは、ベクターは、ＨＩＶを標的化するように設計された薬剤（例えば、ｔａｔ、ｒｅｖ、ｎｅｆ、ｖｐｕまたはｖｐｒ遺伝子のトランスドミナントネガティブ変異体）をコードし得る。他の適用において、形質導入された細胞は、適切なグロビン遺伝子を発現するよう修正され、鎌状赤血球貧血またはサラセミアを処置し得る。免疫細胞もまた形質導入され、それらの免疫機能、抗原に対するそれらの応答、または他の細胞とのそれらの相互作用を調節し得る。当業者は、本発明の形質導入法についての上記の使用、ならびに当該分野で公知の他の使用および適用を認識する。
【００６７】
（発明の実施の形態）
本発明は、約７５％よりも高い効率でのウイルスベクターによる細胞の安定な形質導入のための方法、およびそれに関連する組成物に関する。安定に形質導入された細胞は、形質導入後約７日〜１０日後、必要に応じて、約１４日後で、一過的に形質導入された細胞または偽形質導入された細胞と区別され得る。これらの方法は、細胞表面に結合する少なくとも１つの分子を、その形質導入される細胞に接触させることが、安定な形質導入の効率を増加するという事実に関する。驚くことに、この接触工程は、形質導入工程の後に行ってもよい。より驚くことに、最も高いレベルの安定な形質導入は、形質導入を最初に行い、その後、固定化された細胞表面結合分子と接触させた場合に、観察された。
【００６８】
本発明の方法は、細胞表面結合分子との接触と組み合わせた、ウイルスベクターでの形質導入工程を包含する。上記のように、接触は、ベクターでの形質導入前、形質導入後または形質導入と同時に行ってもよい。本発明は、任意の細胞、および任意の細胞表面結合分子の使用に広く適用可能である。本発明の方法と共に使用するための細胞としては、未刺激の初代細胞が挙げられ、これは、インビボ供給源および細胞株から新鮮に単離されているものであり、それらの細胞株は、増殖中の状態でそれらの細胞を維持する因子の存在下で種々の時間、事前に培養されたものであってもよい。細胞株を使用する場合、これらは、本発明の方法による形質導入の前に、刺激因子の非存在下で最初に培養され得る。
【００６９】
初代細胞の場合、これらを、インビボ供給源から最初に得、その後、必要に応じて、特定の細胞型について選択する。例えば、初代ＣＤ４＋Ｔ細胞および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞を使用する場合、末梢血（ＰＢ）サンプルまたは臍帯血（臍帯供給源由来の「ＣＢ」）サンプルを最初に得て、その後、ＣＤ４＋細胞型および／またはＣＤ８＋細胞型について富化する。標準的な磁気ビーズ陽性選択、プラスチック接着陰性選択、および／または他の当該分野で認識されている標準的な技術を使用して、混入しているＰＢ細胞からＣＤ４＋細胞および／またはＣＤ８＋細胞を単離し得る。単離された細胞型の純度は、標準的な技術を使用する免疫表現型決定およびフローサイトメトリーによって決定され得る。
【００７０】
単離後、これらの初代細胞は、本発明の方法で使用され、約７５％より高い効率でウイルスベクターを用いて形質導入され得る。本発明は、目的の異種遺伝物質を発現し得るＨＩＶ−１ベースのベクターで形質導入された初代リンパ球（例えば、Ｔ細胞）を用いて、最も有利に使用される。別の好ましい使用は、初代造血幹細胞（例えば、ＣＤ３４陽性細胞）を用いる。異種遺伝物質が、疾患を処置または予防するためにインビボで使用される治療産物または予防産物であるかあるいはそれらをコードする場合、その形質導入された初代細胞は、インビボ環境（例えば、患者）に導入し戻される。従って、本発明は、遺伝子欠損と闘うことによってかまたはウイルス感染を標的化することによって疾患を処置または予防するための遺伝子治療における、形質導入された細胞の使用を意図する。
【００７１】
本発明はまた、以下のための細胞の効率的な形質導入における使用に意図される：遺伝子の機能の決定、哺乳動物細胞における遺伝子の効率的な発現、目的の遺伝子について機能的にスクリーニングするための遺伝子ライブラリー（ｃＤＮＡライブラリー、および遺伝アンチセンスライブラリーまたはリボザイムライブラリー）の発現、タンパク質−タンパク質またはタンパク質−核酸のツーハイブリッド様検出ストラテジーにおける使用、遺伝子マッピングアプローチ、マイクロアレイまたはタンパク質アレイを用いる高スループット遺伝子スクリーニング分析、あるいはＳＡＧＥ、プロテオミクスおよび他の機能的分析方法を使用する研究。
【００７２】
混合集団における初代細胞の形質導入のために、上記の単離／精製工程は、使用されない。代わりに、形質導入される細胞を、その細胞型に見出される少なくとも１つの適切な細胞表面結合分子または部分を選択し、およびその部分に結合し得る１以上の分子を調製することによって、標的化する。細胞表面部分は、レセプター、マーカー、または標的化される細胞の表面上の他の認識可能なエピトープであり得る。一旦選択されると、その部分と相互作用する分子（例えば、特異的抗体）が、本発明の方法における使用のために調製され得る。
【００７３】
例えば、ＣＤ４＋細胞および／またはＣＤ８＋細胞は、最初に精製され、次いで、固定化されたＣＤ３抗体およびＣＤ２８抗体の使用と共に本発明の方法によって形質導入されるか、あるいは、同じ抗体を使用することによって、末梢血細胞（ＰＢＣ）または末梢血単核細胞（ＰＢＭＮＣ）のような混合集団の一部として形質導入される。単離または精製するのが困難であり得る、全白血球集団における造血幹細胞は、固定化されたＣＤ３４抗体の使用によって混合集団で形質導入され得る。
【００７４】
本発明の細胞表面結合分子は、形質導入される細胞の表面に見出される任意の部分を標的化しそして結合し得る。好ましくは、これらの部分は、細胞表面上のレセプター、マーカーあるいは他のタンパク質因子または非タンパク質因子の一部として見出される。これらの部分としては、細胞表面結合分子によって認識されるエピトープが挙げられる。これらのエピトープとしては、ポリペプチド配列、炭水化物、脂質、核酸、イオンおよびそれらの組み合わせを含むエピトープが挙げられる。
【００７５】
細胞表面結合分子の例としては、抗体またはその抗原結合フラグメント、および細胞表面レセプターに対するリガンドまたは結合ドメインが挙げられる。細胞表面結合分子は、それ自体で、ポリペプチド、核酸、炭水化物、脂質またはイオンであり得る。好ましくは、この分子は、抗体またはそのフラグメント（例えば、ＦａｂフラグメントまたはＦｖフラグメント）である。より好ましくは、この分子は、可溶性形態で使用されず、むしろ固体媒体（例えば、ビーズ（それらと共に、形質導入される細胞が培養され得る）、組織培養ディッシュ、バッグまたはプレートの表面（その上で、形質導入される細胞が培養され得る）上に固定化される。ＣＤ４＋細胞またはＣＤ８＋細胞の形質導入のための好ましい実施形態において、ＣＤ３および／またはＣＤ２８を認識するモノクローナル抗体が、ウイルスベクターの存在下で、細胞培養バッグ中で使用され得る。
【００７６】
本発明は、その開示された方法の一部として使用するための細胞表面結合分子を含む組成物を包含する。例示的な組成物は、その分子および形質導入されるウイルスベクターを（必要に応じて、形質導入される細胞の存在下で）含む。ウイルスベクターは、任意の供給源に由来し得るが、好ましくは、レトロウイルスベクターに由来し得る。より好ましくは、これらは、レンチウイルスベクターである。特に好ましいレンチウイルスベクターは、ヒト免疫不全症ウイルス（ＨＩＶ）に由来するウイルス（最も好ましくは、ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、またはそれらのキメラの組み合わせ）のベクターである。もちろん、異なるウイルスベクターが、本発明の方法の使用によって同じ細胞内に同時に形質導入され得る。例えば、１つのベクターは、複製欠損性または条件的に複製するレトロウイルスベクターであり得、一方、第２のベクターは、その第１のベクターが複製／パッケージングされそして増幅されるのを可能にする、パッケージング構築物であり得る。種々のウイルス補助タンパク質がウイルスベクターによってコードされなければならない場合、それらは、細胞に形質導入されるベクターの任意の１つの中に存在し得る。あるいは、ウイルス補助タンパク質が、形質導入に使用されるウイルス粒子中のそれらの存在によって、形質導入プロセス中に存在し得る。このようなウイルス粒子は、有効量の補助タンパク質を同時にパッケージングし、形質導入効率の増加を生じ得る。好ましい実施形態において、ウイルスベクターは、１以上の補助タンパク質をコードしない。
【００７７】
本発明の形質導入方法における使用のためのウイルスベクターはまた、プロモーターの制御下に１つ以上の核酸配列を含み得、かつその核酸配列を発現し得る。本発明の１つの実施形態において、核酸配列は、発現の際に、形質導入される細胞における遺伝的欠損を緩和または矯正する、遺伝子産物をコードする。別の実施形態において、その核酸配列は、ウイルス感染を予防または処置し得る遺伝的抗ウイルス薬剤をコードするかまたは構成する。「遺伝的抗ウイルス薬剤」により、遺伝物質によりコードまたは構成される、任意の物質が意味される。そのような薬剤の例が、米国特許第５，８８５，８０６号に提供される。それらの薬剤としては、ウイルスタンパク質を阻害することにより機能する薬剤（例えば、逆転写酵素またはプロテアーゼ）；標的部位にウイルス因子が結合することを競合することにより機能する薬剤；または例えばリボザイムおよびアンチセンス構築物の場合、分解のためにウイルス薬剤を直接標的化することにより機能する薬剤が、挙げられる。遺伝的抗ウイルス薬剤の他の例としては、アンチセンス、ＲＮＡデコイ（ｄｅｃｏｙ）、トランスドミナント変異体、インターフェロン、毒素、ＲＮＡスプライシングを調節もしくは改変する核酸、免疫原、およびリボザイム（例えば、「ハンマーヘッド」型およびその外部ガイド配列（ＥＧＳ）媒介形態）が、挙げられる。
【００７８】
あるいは、ウイルスベクターは、形質導入された細胞についてのマーカーをコードし得る。図および以下に提示される例において、グリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）が、ＣＤ４＋細胞に形質導入されたウイルスベクターによりコードされるマーカーである。他のマーカーとしては、上記に列挙されるマーカーが挙げられる。ＧＦＰの検出は、（そのベクターで形質導入されただけでなく、ＦＡＣＳ分析により検出され得るレベルまでＧＦＰを機能的に発現し得た）機能的に形質導入された細胞の数を同定するために作用し得る。その検出が、形質導入された細胞の実際の数を示さないかもしれないことに留意すべきである。なぜなら、いくつかの細胞は、そのベクターで形質導入されたが、ＦＡＣＳ検出において使用される限界未満のレベルでＧＦＰを発現し得るからである。
【００７９】
トランスフェクション効率を検出するための別のアプローチは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いることである。例えば、ＴａｑＭａｎ  ＰＣＲが、形質導入された細胞において安定に組み込まれたウイルスベクターの実際のコピー数を決定するために使用され得る。
【００８０】
形質導入されるべき細胞は、細胞表面結合分子と接触する前、接触した後、または接触と同時のいずれかに、そのウイルスベクターと接触するように曝露され得る。従って、その細胞は、まずそのベクターに一定時間曝露され得、その後、その細胞表面結合分子が導入され得る。そのような細胞は、細胞周期に入るようには意図的には刺激されていない、新たに単離されたかまたは新たに調製された、初代細胞であり得る。あるいは、その細胞は、まずその細胞表面結合分子に一定時間曝露され得、その後、そのウイルスベクターと接触され得る。そのベクターと接触された後、過剰のベクターは好ましくは除去されず、そしてその細胞は、細胞成長および／または細胞増殖を導く条件下で培養され得る。そのような条件は、その細胞表面結合分子または他の刺激因子／活性化因子（例えば、Ｔ細胞の場合は、サイトカインおよびリンホカイン）の存在下であり得る。あるいは、過剰のベクターが、接触の後でありかつさらなる培養の前に、除去され得る。
【００８１】
本発明の別の実施形態は、ウイルスベクターおよび細胞表面結合分子の両方が同時に存在するもとで、細胞を培養することである。そのような細胞は、好ましくは、以前に刺激されていない。一定時間の後、その細胞は、成長誘導条件または増殖誘導条件（例えば、細胞表面結合分子または他の刺激因子／活性化因子が継続して存在すること）のもとで、培養される。あるいは、過剰のベクターが、さらなる培養の前に除去され得る。
【００８２】
ウイルスベクターと細胞表面結合分子投与との上記の任意の組み合わせにおいて、そのベクターとのインキュベーションが、必要に応じて少なくとも１回反復され得る。そのベクターとの接触はまた、１回よりも多く（例えば、２回、３回、４回、またはそれ以上）反復され得る。
【００８３】
そのウイルスベクターで形質導入され得る細胞のインキュベーションは、使用される条件および材料に依存して、異なる時間の間であり得る。そのインキュベーション時間に影響を与える因子としては、使用される細胞、ベクターおよびＭＯＩ（感染多重度）、細胞表面に結合するために使用される分子および量、その分子が固定されているか否かおよびその固定方法、ならびに所望される形質導入効率のレベルが、挙げられる。本発明の好ましい実施形態において、その細胞は、Ｔリンパ球であり、そのベクターは、ＨＩＶベースのベクターであり、そのＭＯＩは、約２０であり、その細胞表面結合分子は、ビーズに固定されたＣＤ８抗体よびＣＤ２８抗体であり、そして得られる効率は、少なくとも９３％である。当業者に明らかであるように、上記の因子のうちのいくつかは直接相関するが、他のものは、逆に相関する。例えば、ＭＯＩの減少は効率のレベルをおそらく減少させるが、増加した量の細胞表面結合分子を使用する場合、効率はおそらく維持され得る。
【００８４】
ウイルスベクターと形質転換される細胞とのインキュベーションの長さは、好ましくは２４時間であり、必要に応じて、リンパ球については１回反復され、造血幹細胞については４回まで反復される。同様に、細胞がウイルスベクターのインキュベーションの前に細胞表面結合分子とともにインキュベートされる実施形態においては、そのインキュベーションは、約１２時間〜約９６時間にわたってであり得る。好ましくは、細胞表面結合分子とのインキュベーションは、ウイルスベクターと細胞を接触させることと同時に行われる。このような環境下で、その細胞表面結合分子は、ベクターが導入されるときにその細胞と接触されたままであり得る。あるいは、過剰な細胞表面結合分子が、細胞にベクターを導入する前に、その培養物からまず除去され得る。
【００８５】
そのベクターと接触させた後、その細胞は、その細胞の成長または増殖をもたらす条件下で培養される。好ましくは、その条件は、細胞表面結合分子の存在下で培養し続けられる。あるいは、その細胞は、細胞表面結合分子とともにまず培養され、その後、細胞増殖をもたらす別の因子（例えば、インターロイキン−２）を含む培地で置換される。なお別の実施形態は、過剰な細胞表面結合分子および過剰なベクターの両方を除去し、その後、成長または増殖をもたらす因子の存在下で培養し、ならびにさらなるベクター形質導入を増強することである。そのような因子としては、マイトジェン（例えば、フィトヘマグルチニン（ＰＨＡ））およびサイトカイン、増殖因子、活性化剤、細胞表面レセプター、細胞表面分子、可溶性因子、またはこれらの組み合わせ、ならびにこのような分子の活性フラグメント（単独、または別のタンパク質もしくは因子との組み合わせ）、あるいはこれらの組み合わせが、挙げられる。
【００８６】
さらなる因子の例としては、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子α（ＴＮＦ−α）、アンジオテンシン、トランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦ−β）、ＧＤＦ、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）（酸性および塩基性）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、ＰＩＧＦ、ヒト成長ホルモン（ＨＧＨ）、ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）、ヒレグリン、アンフィレグリン（ａｍｐｈｉｒｅｇｕｌｉｎ）、Ａｃｈレセプター誘導活性（ＡＲＩＡ）、ＲＡＮＴＥＳ（ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｏｎ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ，ｎｏｒｍａｌ  Ｔ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ａｎｄ  ｓｅｃｒｅｔｅｄ）、アンジオゲニン、肝細胞増殖因子、腫瘍壊死因子β（ＴＮＦ−β）、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）、アンジオポイエチン１またはアンジオポイエチン２、インスリン、インスリン増殖因子Ｉまたはインスリン増殖因子ＩＩ（ＩＧＦ−１またはＩＧＦ−２）、エフリン（ｅｐｈｒｉｎ）、レプチン、インターロイキン１（ＩＬ−１）、インターロイキン２（ＩＬ−２）、インターロイキン３（ＩＬ−３）、インターロイキン４（ＩＬ−４）、インターロイキン５（ＩＬ−５）、インターロイキン６（ＩＬ−６）、インターロイキン７（ＩＬ−７）、インターロイキン８（ＩＬ−８）、インターロイキン９（ＩＬ−９）、インターロイキン１０（ＩＬ−１０）、インターロイキン１１（ＩＬ−１１）、インターロイキン１２（ＩＬ−１２）、インターロイキン１３（ＩＬ−１３）、インターロイキン１４（ＩＬ−１４）、またはインターロイキン１５（ＩＬ−１５）、Ｇ−ＣＳＦ（顆粒球コロニー刺激因子）、ＧＭ−ＣＳＦ（顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子）、Ｍ−ＣＳＦ（マクロファージコロニー刺激因子）、ＬＩＦ（白血病阻害因子）、アンジオスタチン、オンコスタチン、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、インターフェロンα（サブタイプを含む）、インターフェロンβ、インターフェロンγ、およびインターフェロンω、ケモカイン、マクロファージ炎症性タンパク質−１α（ＭＩＰ−１α）またはマクロファージ炎症性タンパク質−１β（ＭＩＰ−β）、単球化学誘導蛋白−１（ＭＣＰ−１）または単球化学誘導蛋白−２（ＭＣＰ−２）、ＧＲＯβ、ＭＩＦ（マクロファージ遊走阻止因子）、ＭＧＳＡ（黒色腫増殖刺激活性）、αインヒビン、ＨＧＦ、ＰＤ−ＥＣＧＦ、ｂＦＧＦ、リンホトキシン、ミューラー阻害物質、ＦＡＳリガンド、骨原性タンパク質、プレイオトロフィン（ｐｌｅｉｏｔｒｏｐｈｉｎ）／ミッドカイン、毛様体神経栄養因子（ｃｉｌｉａｒｙ  ｎｅｕｔｏｒｏｐｈｉｃ  ｆａｃｔｏｒ）、アンドロゲン誘導性増殖因子、オートクライン運動性因子、ヘッジホッグ（ｈｅｄｇｅｈｏｇ）タンパク質、エストロゲン、プロゲステロン、アンドロゲン、グルココルチコイドレセプター、ＲＡＲ／ＲＸＲ、甲状腺レセプター、ＴＲＡＰ／ＣＤ４０、ＥＤＦ（赤血球分化因子）、Ｆｉｃ（増殖因子誘導性ケモカイン）、ＩＬ−１ＲＡ、ＳＤＦ、ＮＧＲリガンドまたはＲＧＤリガンド、ＮＧＦ、サイモシン−α１、ＯＳＭ、ケモカインレセプター、幹細胞因子（ＳＣＦ）、またはこれらの組み合わせが、挙げられる。当業者に明らかであるように、培養条件の選択は、形質導入された細胞およびその後にその細胞使用する意図に関する、当該分野における知識に依存する。例えば、ＩＬ−３と、ＩＬ−６と、幹細胞因子との組み合わせは、ヒト移植において使用されるべき形質導入細胞のための選択ではない。同様に、培養条件の選択は、好ましくは、細胞生存度または形質導入効率の損害のためではない。
【００８７】
好ましくは、形質導入後のインキュベーションは、約４時間にわたるか、または約１日〜約７日もしくは１０日にわたる。より好ましくは、約１６時間〜約２０時間または約４日間、約５日間もしくは約６日間にわたる。約１４日間の形質導入後インキュベーションもまた、意図される。
【００８８】
本発明を用いて観察される形質導入の効率は、約７５〜１００％である。好ましくは、この効率は、少なくとも約７５〜９０％である。本発明のより好ましい実施形態は、形質導入効率が少なくとも９０〜９５％である。最も好ましい実施形態は、少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％および１００％の形質導入効率を有する。
【００８９】
上記に加えて、形質導入された細胞は、生存被験体における疾患状態の研究においてかまたはその疾患状態の処置のために、使用され得る。本発明の一部として特に好ましいのは、目的の遺伝子産物を生成するため、または遺伝子治療の一部として生存生物中に直接導入するための、形質導入細胞の治療用途である。例えば、下記に例示されるように、初代Ｔ細胞が、単離され得、そしてウイルスベクターで形質導入され得る。成功する形質導入は、そのベクターによりコードされる遺伝子産物の生成もしくは過剰生成によってか、またはそのベクターにより付与される表現型の生成によって、示される。このように、初代Ｔ細胞は、望ましい核酸配列または有用な核酸配列を含みかつ発現し得るベクターでまず形質転換され得、その後、インビボ環境（例えば、生存被験体）に戻され得る。好ましくは、その生存被験体は、ＨＩＶ−１に罹患している個体、またはＨＩＶ−１に罹患する危険がある個体である。
【００９０】
別の実施形態において、そのＴ細胞は、宿主生物中に導入された際にそのＴ細胞を条件付きで殺傷できる遺伝子または核酸で、形質導入される。これは、プロドラッグアプローチを用いてＴ細胞を殺傷することによって移植片対宿主病を予防するために、同種異系骨髄における適用を有する。
【００９１】
あるいは、その初代細胞は、遺伝子産物が欠損しており得、そしてその欠損は、形質導入されるウイルスベクターにより矯正可能である。そのような細胞は、そのベクターによる形質導入の後、生存被験体中に再導入される。
【００９２】
従って、本発明のインビトロ適用およびエキソビボ適用の両方が、意図される。生存被験体中への移入のために、その形質導入細胞は、好ましくは、生物学的に受容可能な溶液または薬学的に受容可能な処方物中にある。このような移入は、静脈内にか、腹腔内にか、または当該分野で公知の他の注入法および非注入法によって、なされ得る。投与されるべき投与量は、種々の因子に依存して変化するが、熟練した実施者によって容易に決定され得る。公知の負荷または十分に設計された負荷がウイルスベクター中にある、本発明の多数の適用が存在し、その適用において、形質導入される遺伝物質により付与される利益は、負の効果のいかなる危険にも勝る。
【００９３】
最初に、移入される形質導入細胞の全数は、約１０４個〜約１０１０個の範囲にある。このように、１０５個、１０６個、１０７個、１０８個または１０９個の細胞が、使用され得る。この実際の数は、形質導入される細胞に依存して変化する。必要な場合は、形質導入された細胞の複数移入が、好ましい実施形態である。さらに、必要な場合は、形質導入された細胞の移入の前に宿主を馴化することが、好ましい実施形態である。馴化レジメンは、当該分野で公知であり；例は、骨髄移植のためのレジメンである。
【００９４】
ここに本発明を一般的に記載してきたが、以下の実施例に対する言及を通して、本発明がより容易に理解される。これらの実施例は、特に指示しない限り、本発明の例示のために提供され、本発明の限定であるとは意図されない。
【００９５】
（実施例Ｉ）
（初代ＣＤ４＋Ｔ細胞の調製）
ＣＤ４＋Ｔ細胞を、標準的プロトコルをわずかに改変して用いて、末梢血から単離した。より詳細には、混入している単球を、付着によって除去した。非付着細胞を、ＣＤ４＋細胞の陽性選択のために抗ＣＤ４抗体でコートした磁気ビーズの存在下に配置した。この磁気ビーズを取り出し、そしてＣＤ４＋細胞を単離した。
【００９６】
高度に精製されたＣＤ４＋細胞が９０％を超えていることを、フローサイトメトリーによって確認した。
【００９７】
（実施例ＩＩ）
（細胞表面結合分子と接触した時間を変動させた、初代ＣＤ４＋Ｔ細胞の形質導入）
（細胞表面結合前の形質導入）
初代ＣＤ４＋細胞（約５００，０００個）を、ＭＯＩが２０のｐＮ２ｃＧＦＰとともに、２４時間培養し、その後、αＣＤ３でコートしたビーズおよびαＣＤ２８でコートしたビーズを、その培養にさらに７日間添加した。図１は、ｐＮ２ｃＧＦＰのマップを含む。
【００９８】
（細胞表面結合後の形質導入）
初代ＣＤ４＋細胞（約５００，０００個）を、αＣＤ３でコートしたビーズおよびαＣＤ２８でコートしたビーズとともに２４時間培養し、その後、ＭＯＩが２０のｐＮ２ｃＧＦＰを、その培養に導入してさらに２４時間培養した。この細胞を洗浄して過剰なベクターを除去し、その後、上記ビーズを含みベクターを含まない培地中でさらに７日間インキュベートした。
【００９９】
（同時の形質導入と細胞表面結合）
初代ＣＤ４＋細胞（約５００，０００個）を、αＣＤ３でコートしたビーズおよびαＣＤ２８でコートしたビーズの存在下で、ＭＯＩが２０のｐＮ２ｃＧＦＰとともに２４時間培養した。この細胞を洗浄して過剰なベクターを除去し、その後、上記ビーズを含みベクターを含まない培地中でさらに７日間インキュベートした。
【０１００】
（必要に応じたプロトコル置換）
他のウイルスベクターで、ｐＮ２ｃＧＦＰに代えて置換し得る。さらに、過剰なベクターの除去の前に、形質導入を合計２回反復し得る。さらに、形質導入および過剰なベクターの除去の後で、αＣＤ３でコートしたビーズおよびαＣＤ２８でコートしたビーズを、インターロイキン−２（１０ｎｇ／ｍｌ）およびＰＨＡ−Ｐ（３ｍｇ／ｍｌ）により置換し得る。７日後、その培地を、インターロイキン−２（１０ｎｇ／ｍｌ）を含みＰＨＡ−Ｐを含まない培地で置換し、そしてインキュベーションをさらに７日間継続する。
【０１０１】
あるいは、αＣＤ３でコートしたビーズおよびαＣＤ２８でコートしたビーズとともに形質導入後インキュベーションを７日間行った後、細胞を洗浄し、そしてインターロイキン−２（１０ｎｇ／ｍｌ）の存在下でインキュベーションを継続する。
【０１０２】
（実施例ＩＩＩ）
（形質転換後の分析）
形質転換後でありかつインキュベーションの７日または１４日後、細胞を、ＣＤ４＋についてのフローサイトメトリーおよび／またはグリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）により分析した。
【０１０３】
上記３つの形質導入プロトコルの比較を図２に示す。ＭＯＩが２０のｐＮ２ｃＧＦＰによる形質導入後に、ビーズに固定したＣＤ３抗体およびＣＤ２８抗体と接触させると、約９１％の効率を生じた。形質導入前にビーズと接触させると、約８９％の効率を生じ、そしてビーズ接触と形質導入とを同時に行うと、約８０％の効率を生じた。この実験において、ＣＤ４＋Ｔ細胞を、付着単球除去、ＣＤ１４  ＭＡＣＳ除去およびＣＤ４  ＭＡＣＳ濃縮によって、選択した。これらの抗体は、下記のように固定した。ベクターとの接触は、３７℃および５％  ＣＯ２にて行った。培養条件は、２％ヒト血清アルブミンを補充したＹｓｓｅｌ培地１ｍｌあたりＣＤ４＋Ｔ細胞５００，０００個であった。ＦＡＣＳ分析を、選択後７日目に行った。ＭＦは、平均蛍光を示す。
【０１０４】
異なる刺激条件を比較する、７日後実験の結果を、図３に示す。ＣＤ４＋細胞を、ＩＬ−２およびＰＨＡ−Ｐ、またはビーズに固定したＣＤ３抗体およびＣＤ２８抗体のいずれかで２４時間処理し、その後、ＭＯＩが２０のｐＮ２ｃＧＦＰで１回形質導入した。並行比較において、固定した抗体の使用により、（ＣＤ４およびＧＦＰの両方について陽性である細胞により示される）９５％を超える形質導入効率を各回生じた。比較により、ＩＬ−２およびＰＨＡによる刺激の結果は、わずか７０．２〜８４．５％の効率を生じた。ＦＡＣＳ分析を、選択後７日目に行った。
【０１０５】
図４は、選択１５日後の同様の実験の結果を示す。再度、細胞を、ＩＬ−２およびＰＨＡ−Ｐ、またはビーズに固定したＣＤ３抗体およびＣＤ２８抗体のいずれかで２４時間処理し、その後、ＭＯＩが２０のｐＮ２ｃＧＦＰで１回形質導入した。このＰＨＡ−Ｐおよびビーズを、形質導入後７日目に除去し、そしてその細胞を、選択後１５日目まで、１ｍｌあたり５００，０００個でＩＬ−２だけとともに培養した。固定した抗体を使用した後、その細胞のうち約９３％が、ＣＤ４およびＧＦＰの両方について陽性であった。ＩＬ−２およびＰＨＡで処理した細胞のうちの約７５％のみが、ＣＤ４およびＧＦＰの両方について陽性のままであった。これらの結果は、７日後に陽性として検出された細胞（図３）のうちの少数が、「偽トランスフェクション（ｐｓｅｕｄｏｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）」に起因し得たことを示す。
【０１０６】
（実施例ＩＶ）
（異なるベクターは、高効率で細胞を安定に形質導入する）
本実施例は、形質導入のために使用されるベクターの比較である。ｐＮ２ｃＧＦＰは、ｇａｇおよびｐｏｌコード配列全体を含み、一方ｐＮ１（ｃｐｔ）ＧＦＰは、４５５１〜５０９６部分（非コード）ｐｏｌ配列を含む。図５に示されるその結果から理解され得るように、両方のベクターは、ビーズに固定したＣＤ３抗体およびＣＤ２８抗体による刺激とＭＯＩが２０のベクターによる刺激を同時に行った後、非常に効率がよい初代ＣＤ４細胞の形質導入を示す。ＦＡＣＳ分析を、選択後１０日目に実施した。
【０１０７】
（実施例Ｖ）
（形質導入効率に対するＭＯＩの効果）
異なるＭＯＩの効果を図６に示す。ここで、２〜２０のＭＯＩを使用すると、形質導入効率７２．７〜８３．８％を生じた。細胞を、ビーズに固定したＣＤ３抗体およびＣＤ２８抗体に２４時間接触させ、その後、異なるＭＯＩのｐＮ１（ｃｐｔ）ｃＧＦＰで形質導入した。
【０１０８】
（実施例ＶＩ）
（ＣＤ３４陽性細胞の形質導入）
ＣＤ３４陽性細胞を、臍帯血から調製し、そしてＦＬＴ−３リガンド、ＴＰＯおよびＫｉｔリガンド（各１００ｎｇ／ｍｌ）の存在下で、ｐＮ１ｃｐｔＧＦＰで４回同時に形質導入した。これらの細胞を、長期培養（ＬＴＣ−ＩＣ）にて５週間培養し、その後、その細胞を、分析前の１０日間メチルセルロース中で培養した（結果は、培養中６週間を超える経過時間に由来する）。図７における結果は、ＣＤ３４未成熟細胞から生じる成熟ＣＤ４５陽性細胞を分析する。コントロール細胞は、有意な形質導入を示さないが、一方、ベクターで形質導入した細胞は、８８％を超える細胞がＣＤ４５およびＧＦＰ陽性を示す。
【０１０９】
（実施例ＶＩＩ）
（ＣＤ３４陽性細胞の長期形質導入）
ＣＤ３４陽性細胞を、上記のようにｐＮ１（ｃｐｔ）ＧＦＰで形質導入し、そして部分照射したＳＣＩＤマウスの骨髄に移植した。８週間後、細胞を単離し、そしてＣＤ４５保有成熟ヒト細胞およびＧＦＰ発現について、ＦＡＣＳによって分析した。その結果を、図７パネルＡ〜Ｄに示す。
【０１１０】
パネルＡは、ベクターで形質導入していないヒト細胞を移植したコントロールマウスによる結果を示す。
【０１１１】
パネルＢは、１００ｎｇ／ｍｌのＦＬＴ−３リガンド、ＴＰＯおよびＫｉｔリガンドの存在下で、４日連続してＭＯＩが５０であるｐＮ１（ｃｐｔ）ＧＦＰベクターで形質導入した細胞を移植したマウスによる結果を示す。このマウスは、形質導入の８週間後の、９６．３％の著しい形質導入効率の形質導入されたヒト細胞（ＣＤ４５陽性細胞）を示す。このマウスにおけるヒト細胞移植のレベルは、以前に報告された結果と一致して、１１．１％であった。
【０１１２】
パネルＣおよびＤは、パネルＢにおいてと同様に処理した他の２匹のマウスによる結果を示す。この結果は、高効率形質導入の再現性を確認し、８７．８％および８９．６％のＣＤ４５陽性細胞がＧＦＰ陽性でもあった。
【０１１３】
平均効率は９１．２％であり、これは、長期に安定な形質導入を反映する。
【０１１４】
（実施例ＶＩＩＩ）
（細胞表面結合分子の固定）
本実施例は、以下の実施例における使用のためにエポキシダイナルビーズにＣＤ３（Ｂ−Ｂ１１）抗体およびＣＤ２８（Ｂ−Ｔ３）抗体を直接連結することを記載する。
【０１１５】
１．０．６１８ｇのホウ酸を９５ｍｌの組織培養グレード水中に溶解することによって、０．１Ｍホウ酸溶液を調製する。十分に混合し、そして最高品質のＮａＯＨを使用して、ｐＨを９．５に調整する。最終容積を１００ｍｌにし、そして０．２μｍフィルターを介して滅菌する。容器を密封し、そして４℃で保存する。
【０１１６】
２．上記ホウ酸溶液に濃度１５０μｇ／ｍｌで抗体を添加する。Ｂ−Ｂ１１抗体およびＢ−Ｔ３抗体の両方について、ホウ酸溶液１ｍｌあたり各７５μｇ添加する。体積を合計１ｍｌにする。ホウ酸濃度は、抗体の添加後に０．０５Ｍ未満であってはならない。各１ｍｌのホウ酸／抗体溶液について、４×１０８個のＥｐｏｘｙビーズを添加する。
【０１１７】
３．回転輪上で３７℃にて２４時間インキュベートする。
【０１１８】
４．ビーズを１０分間にわたり３回、各々２２℃でビーズ洗浄培地を用いて洗浄する。このビーズ洗浄培地は、カルシウムおよびマグネシウムを含まないリン酸緩衝化生理食塩水、３％ヒト血清アルブミン、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、および０．１アジ化ナトリウムである。
【０１１９】
５．２２℃にてビーズを１回３０分間洗浄する。
【０１２０】
６．４℃で一晩洗浄する。
【０１２１】
７．新鮮なビーズ洗浄培地で置換し、ビーズを２×１０８ビーズ／ｍｌになるように再懸濁する。ＩｇＧでコートしたビーズは、４℃にて少なくとも６ヶ月安定である。
【０１２２】
（実施例ＩＸ）
（樹状細胞の形質導入）
末梢血から単球を単離し、その後、ＭＯＩが５０にてｐＮ２ｃＧＦＰを用い、２つの同時サイトカイン条件を使用して３日間連続して形質導入した。この同時サイトカイン条件は、ＧＭ−ＣＳＦ（８００単位／ｍｌ）、ＩＬ−４（５００単位／ｍｌ）およびＴＮＦ−α（１００単位／ｍｌ）、またはＧＭ−ＣＳＦ（５０００単位／ｍｌ）およびインターフェロン−α（８００単位／ｍｌ）である。図９のパネルＡは、第１のサイトカイン条件が９０．２％の効率を生じた、形質導入７日後の結果を示す。第２のサイトカイン条件下で、ベクターで形質導入した細胞は、７日後に９２．９％の効率を示す（パネルＢ）。ＣＤ８６は、樹状細胞について可能な唯一のマーカーであり、そしてＣＤ８６陰性細胞もまた樹状細胞であり得ることに留意すべきである。
【０１２３】
（参考文献）
【０１２４】
【表１】
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2004528806.tif 000003
本明細書中で引用される全ての参考文献は、以前に具体的に援用されたか否かに関わらず、その全体が本明細書によって参考として援用される。
【０１２５】
ここまで、本発明を完全に記載してきたが、本発明の精神および範囲から逸脱せずに、かつ過度な実験を要さずに、広範な等価のパラメーター、濃度、および条件内で本発明が実行され得ることが、当業者に明らかである。
【０１２６】
本発明を、その特定の実施形態と組み合わせて記載してきたが、これをさらに改変し得ることが理解される。本出願は、一般に、本発明の原理に従う本発明のいずれのバリエーション、用途または適合をもカバーすることが意図され、そしてこれらには、本発明が属する分野内で公知になるかまたは慣用的に実行され、そして本発明が上記のように添付の特許請求の範囲において示された後に本明細書中の重要な特徴に適用され得るので、本発明の開示からのこのような逸脱が含まれる。
【０１２７】
本明細書中上記および上記の特許請求の範囲において、用語「１つの」（「ａ」または「ａｎ」）の使用は、単数形を規定することに限定されない。その代わり、この用語の使用は、複数形を包含する。例えば、用語「１つの抗体（ａｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）」は、１つの単一抗体分子の単数形に限定されないが、むしろ、これらの抗体が、言及される抗体の同一コピーである限り、複数の抗体分子の存在を包含する。同様に、「１つのウイルスベクター（ａ  ｖｉｒａｌ  ｖｅｃｔｏｒ）」は、１つの単一ウイルスベクター分子または１つのウイルス粒子に限定されない。
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１Ａおよび１Ｂは、それぞれ、ｐＮ２ｃＧＦＰおよびｐＮ１ＧＦＰ（ｃＰＴ）のマップを示す。種々の制限酵素部位およびＨＩＶ由来の成分が示される。ｐＮ２ｃＧＦＰ構築物は、ＣＭＶ（サイトメガロウイルス）プロモーターに作動可能に連結されたＧＦＰコード配列を含み、従って、ＧＦＰ発現を制御する。ｐＮ１ＧＦＰ（ｃＰＴ）構築物は、上記でｐＮ１（ｃｐｔ）ＣＧＦＰとも呼ばれ、これは、ＨＩＶ  ｐｏｌ遺伝子由来のｃＰＰＴを含む。これらの構築物は、上記実施例において使用される。
【図２】
図２は、固定されたＣＤ３抗体およびＣＤ２８抗体をコーティングしたビーズを使用する、初代Ｔ細胞の形質導入の結果を示す。これらの細胞に、ビーズとの接触前にベクターを接触させたか（パネルＡ）、ベクターとの接触前にビーズを接触させたか（パネルＢ）、またはベクターおよびビーズの両方を同時に接触させた（パネルＣ）。形質導入されたベクターによってコードされるＧＦＰからの蛍光に基づくフローサイトメトリーの結果は、パネルＡ〜Ｃの細胞が、それぞれ、９０．７０％、８７．１９％および７９．１４％形質導入されたことを示す。
【図３】
図３は、ウイルスベクターとの接触前にＣＤ４＋細胞を刺激するための、ＩＬ−２およびＰＨＡ−Ｐまたはビーズ固定化ＣＤ３抗体およびＣＤ２８抗体のいずれかを使用する形質導入の比較を示す。固定化抗体の使用は、各回で９５％を超える形質導入効率を生じた。ＩＬ−２およびＰＨＡの使用は、７０．２％〜８４．５％の効率しか生じなかった。
【図４】
図４は、本発明の方法を使用する、ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞形質導入の頻度を示す。形質導入後１５日での、コントロール細胞  対  ＭＯＩ２０で緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を発現し得るベクターによって形質導入された細胞のフローサイトメトリー分析の比較は、形質導入された細胞の約９３％がまた緑色の蛍光を生じることを示した。図４は、ＩＬ−２およびＰＨＡ−Ｐまたはビーズ固定化ＣＤ３抗体およびＣＤ２８抗体のいずれかを使用する形質導入後１４日での、ＣＤ４＋細胞およびＧＦＰ＋細胞についてのＦＡＣＳ分析の結果を示す。抗体で処理した細胞の約９３％が、１４日後に安定に形質導入されたままであった。ＩＬ−２およびＰＨＡで処理した細胞の約７５％のみが、同じ時間後で安定に形質導入されたままであった。
【図５】
図５は、異なるウイルスベクターで形質導入された細胞の結果を示す。
【図６】
図６は、トランスフェクション効率に対する異なるＭＯＩの使用に由来する影響を示す。
【図７】
図７は、細胞表面結合分子の存在下でウイルスベクターでの複数回の形質導入後の、臍帯血から調製されたＣＤ３４＋細胞の安定な形質導入を示す。８８％を超える細胞が、形質導入後６週間を超えた後で陽性のままであった。
【図８】
図８、パネルＡ〜Ｄは、ＳＣＩＤ（重症複合型免疫不全）マウスに対する移植後の長期の形質導入の効率を示す。約８週間後、成熟なまま存続した、平均９１％を超える形質導入された細胞が、形質導入されたＧＦＰマーカーの発現について陽性のままであった。
【図９】
図９、パネルＡおよびＢは、７日後の樹状細胞形質導入の効率を示す。
【図２】
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【図４】
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【図７】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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