(57)【要約】本発明は、１つ以上の非天然ポリペプチドを含む修飾ウイルスであって、前記ポリペプチドが各々１つ以上の結合部分を含む１つ以上のフレームワーク部分を含み、前記ポリペプチドが哺乳動物の宿主細胞の原形質および核内において前記結合部分のためのリガンドがない場合に維持されるコンホメーションで発現することができ、当該コンホメーションが前記結合部分が引き続き前記リガンドと結合することを可能とし、さらに前記ポリペプチドが核膜を通って輸送可能であり、前記修飾ウイルスが前記結合部分により付与される改変された屈性を有する当該修飾ウイルス、および、治療、特に腫瘍細胞またはその他のガン性細胞に対する療法におけるそのようなウイルスの使用に関する。
2004504062.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
１つ以上の非天然ポリペプチドを含む修飾ウイルスであって、前記ポリペプチドが各々１つ以上の結合部分を含む１つ以上のフレームワーク部分を含み、前記ポリペプチドが哺乳動物の宿主細胞の原形質および核内において前記結合部分のためのリガンドがない場合に維持されるコンホメーションで発現することができ、当該コンホメーションが前記結合部分が引き続き前記リガンドと結合することを可能とし、さらに前記ポリペプチドが核膜を通って輸送可能であり、前記修飾ウイルスが前記結合部分により付与される改変された屈性を有する、当該修飾ウイルス。
【請求項２】
アデノウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノ随伴ウイルス、レオウイルス科、ピコルナウイルス科、パルボウイルス科、パポバウイルス科およびカリチウイルス科からなる群から選択されるウイルスから誘導される、請求項１に記載の修飾ウイルス。
【請求項３】
ヒトアデノウイルスから誘導される、請求項１または２に記載の修飾ウイルス。
【請求項４】
ヒトアデノウイルス血清型５から誘導される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の修飾ウイルス。
【請求項５】
前記非天然ポリペプチドが野生型ウイルスのウイルスタンパク質成分と置換するか、それに組込まれるか、またはそれと融合タンパク質を形成する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の修飾ウイルス。
【請求項６】
前記非天然ポリペプチドおよび／または非天然ポリペプチドを含むウイルス成分タンパク質が細胞環境中で可溶性である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の修飾ウイルス。
【請求項７】
非天然ポリペプチドまたは非天然ポリペプチドを含むウイルス成分タンパク質の３０％より多くが、非天然ポリペプチドまたは非天然ポリペプチドを含むウイルス成分タンパク質を発現する細胞の細胞溶解産物の可溶性フラクション中に存在する、請求項６に記載の修飾ウイルス。
【請求項８】
前記ウイルスタンパク質成分がアデノウイルスファイバータンパク質である、請求項５〜７のいずれか１項に記載の修飾ウイルス。
【請求項９】
前記非天然ポリペプチドが、野生型ファイバーノブまたはその細胞結合ドメインが除去されるように、アデノウイルスファイバータンパク質中に組込まれる、請求項８に記載の修飾ウイルス。
【請求項１０】
前記非天然ポリペプチドが、該非天然ポリペプチドが組込まれているか、または前記非天然ポリペプチドに置換されるウイルス成分タンパク質の天然の構造または機能を模倣する１つ以上のさらなる要素を含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載の修飾ウイルス。
【請求項１１】
前記非天然ポリペプチドがジスルフィド結合を含まない、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の修飾ウイルス。
【請求項１２】
非天然ポリペプチドが１つ以上のα螺旋構造を含む、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の修飾ウイルス。
【請求項１３】
前記非天然ポリペプチドが細胞質内での生産的折り返しおよびその後の細胞核中への輸送が可能な抗体から誘導されるフレームワーク部分を含む、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の修飾ウイルス。
【請求項１４】
前記フレームワーク部分がさらなる抗体のＣＤＲから誘導される１つ以上の結合部分を含む、請求項１３に記載の修飾ウイルス。
【請求項１５】
前記非天然ポリペプチドが、組合せタンパク質またはアフィボディであるか、またはこれらを含む、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の修飾ウイルス。
【請求項１６】
前記非天然ポリペプチドが細菌レセプターから誘導される１つ以上のフレームワーク部分を含む、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の修飾ウイルス。
【請求項１７】
前記非天然ポリペプチドが、１つ以上の螺旋状バンドルおよび／またはこれらのバンドルを接続する１つ以上のループの内部に存在する１つ以上の結合部分を含む、請求項１〜１２または１６のいずれか１項に記載の修飾ウイルス。
【請求項１８】
前記非天然ポリペプチドが、ブドウ球菌タンパク質Ａからの免疫グロブリン結合Ｚドメインまたはブドウ球菌タンパク質Ｇからの免疫グロブリン結合ドメインＧから誘導される１つ以上のフレームワーク部分を含む、請求項１６に記載の修飾ウイルス。
【請求項１９】
前記非天然ポリペプチドが、非天然三量体形成モチーフを含む１つ以上のフレームワーク部分を含む、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の修飾ウイルス。
【請求項２０】
前記非天然ポリペプチドが、ヒト肺サーファクタントタンパク質Ｄからのネック領域ペプチドを含む１つ以上のフレームワーク部分を含む、請求項１９に記載の修飾ウイルス。
【請求項２１】
２つ以上の異なる非天然ポリペプチドを含む、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の修飾ウイルス。
【請求項２２】
標的細胞を結合する第１の非天然ポリペプチドと、生産細胞または許容細胞を結合する第２の非天然ポリペプチドとを含む、請求項２１に記載の修飾ウイルス。
【請求項２３】
前記非天然ポリペプチドが、当該非天然ポリペプチドの結合部分を修飾ウイルスから切断することを可能にする場所に位置する切断部位を含む、請求項１〜２２のいずれか１項に記載の修飾ウイルス。
【請求項２４】
前記ウイルスが、前記非天然ポリペプチドを含む修飾ウイルス成分および対応する未修飾ウイルス成分、例えば野生型ファイバーおよび修飾ファイバーを含む、請求項１〜２３のいずれか１項に記載の修飾ウイルス。
【請求項２５】
前記非天然ポリペプチドが細胞特異性リガンドに結合可能な結合部分を含み、当該リガンドは随意に、前立腺特異性膜抗原、ＥＧＦレセプター、Ｈｅｒ−２／Ｎｅｕ、ＶＥＧＦレセプター、ＣＤ２２、ｇｐ１２０、ＭＨＣ／ペプチドコンプレックス、または増殖性細胞、腫瘍細胞、またはウイルス感染細胞上で発現または存在する膜構造または表面分子であることができる、請求項１〜２４のいずれか１項に記載の修飾ウイルス。
【請求項２６】
１つ以上の所望の治療的遺伝子または核酸分子の挿入のための部位をさらに含む、請求項１〜２５のいずれか１項に記載の修飾ウイルス。
【請求項２７】
シトシンデアミナーゼおよび／またはウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼをコード化している導入遺伝子を、別個の遺伝子として、あるいは二元機能融合遺伝子として共に含む、請求項２６に記載の修飾ウイルス。
【請求項２８】
別の血清型からの同等の成分と交換されるか、事前形成された抗体による野生型ウイルスへの前記ウイルスの結合が減少するように修飾されるウイルス成分をさらに含む、請求項１〜２７のいずれか１項に記載の修飾ウイルス。
【請求項２９】
前記ウイルス成分がヘキソンタンパク質である、請求項２８に記載の修飾ウイルス。
【請求項３０】
請求項１〜２５のいずれか１項で定義される非天然ポリペプチドを含む、修飾ウイルスタンパク質。
【請求項３１】
請求項１〜３０のいずれか１項で定義される修飾ウイルスまたはウイルスタンパク質を含む細胞。
【請求項３２】
請求項１〜２９のいずれか１項で定義される修飾ウイルスのための許容細胞であって、前記修飾ウイルスを増殖するために培養できる、当該許容細胞。
【請求項３３】
請求項１〜２９のいずれか１項で定義される修飾ウイルスを細胞培養で産生する方法であって、
ｉ）ウイルスを遺伝学的に修飾して１つ以上の非天然ポリペプチドを含む修飾ウイルスを産生する段階であって、前記ポリペプチドが各々１つ以上の結合部分を含む１つ以上のフレームワーク部分を含み、前記ポリペプチドが哺乳動物の宿主細胞の原形質および核内におい前記結合部分のためのリガンドがない場合に維持されるコンホメーションで発現することができ、当該コンホメーションが前記結合部分が引き続き前記リガンドと結合することを可能とし、さらに前記ポリペプチドが核膜を通って輸送することができ、前記修飾ウイルスが前記結合部分により付与された改変屈性を有する、当該段階、
ｉｉ）前記修飾ウイルスで許容細胞を感染させる段階、
ｉｉｉ）前記細胞を培養してウイルスを産生する段階、および
ｉｖ）産生された修飾ウイルスを、収集、および任意に、精製する段階、
を含む当該方法。
【請求項３４】
請求項１〜２９のいずれか１項で定義される修飾ウイルスの複製を調節する方法であって、
ｉ）切断部位が、細胞感染に必要な結合部位と、結合部分が一部となっている組換えウイルス成分の残部との間に位置するように修飾ウイルスを構成する段階、および、
ｉｉ）前記結合部分を前記ウイルス成分から切断でき、それにより組換えウイルスがさらなる感染サイクルを受けないようにできる切断物質または切断手段に前記組換えウイルスを接触させる段階、
を含む当該方法。
【請求項３５】
ウイルスのベクターの調製用いる非天然ポリペプチドの適性を、細胞系中におけるその溶解度を求めることにより決定する方法。
【請求項３６】
ｉ）前記非天然ポリペプチドまたは前記非天然ポリペプチドを含むウイルス成分タンパク質を許容細胞中で発現させる段階、
ｉｉ）細胞を溶解して細胞溶解産物を産生する段階、
ｉｉｉ）細胞溶解産物の可溶性および不溶性フラクションを分離する段階、
ｉｖ）細胞溶解産物の可溶性および不溶性フラクションを、前記非天然ポリペプチドまたは前記非天然ポリペプチドを含むウイルス成分タンパク質の含有量について分析する段階、および
ｖ）可溶性および不溶性フラクション中の前記非天然ポリペプチドまたは前記非天然ポリペプチドを含むウイルス成分タンパク質の相対含有量を比較する段階、
を含む請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
請求項１〜２５のいずれか１項で定義される非天然ポリペプチドまたは請求項３０で定義される修飾ウイルスタンパク質の溶解性をアッセイする方法であって、
ｉ）前記非天然ポリペプチドまたは前記非天然ポリペプチドを含むウイルス成分タンパク質を許容細胞中で発現させる段階、
ｉｉ）細胞を溶解して細胞溶解産物を産生する段階、
ｉｉｉ）細胞溶解産物の可溶性および不溶性フラクションを分離する段階、
ｉｖ）細胞溶解産物の可溶性および不溶性フラクションを、前記非天然ポリペプチドまたは前記非天然ポリペプチドを含むウイルス成分タンパク質の含有量について分析する段階、および、
ｖ）可溶性および不溶性フラクション中の前記非天然ポリペプチドまたは前記非天然ポリペプチドを含むウイルス成分タンパク質の相対含有量を比較する段階、
を含む当該方法。
【請求項３８】
治療で使用される、請求項１〜２９のいずれか１項に記載の修飾ウイルス。
【請求項３９】
腫瘍細胞または増殖細胞の治療用薬物の調製における、請求項１〜２９のいずれか１項に記載の修飾ウイルスの使用。
【請求項４０】
請求項１〜２９のいずれか１項に記載の修飾ウイルスと、薬学的に許容できる担体または賦形剤を含む医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（技術分野）
本発明は、遺伝子治療での使用に適する新規な組換えウイルスに関する。そのような組換えウイルスは改変された屈性を示し、これは１つ以上の非天然ポリペプチドが１つ以上のウイルス成分中へ組込まれるか、そのような成分が非天然ポリペプチドによって置換されることにより付与される。これらの非天然ポリペプチドは、機能性ビリオン粒子へのポリペプチドの封入を可能にするためにオリジナルのウイルス成分の構造を模倣する要素を含み得る。これらの非天然ポリペプチドは、非天然のリガンド結合機能（すなわち、改変された屈性）をそのようなビリオン粒子に付与する要素を含むことともできる。本質的に、本発明で用いられる非天然ポリペプチドは、哺乳動物宿主細胞の核またはサイトゾル中でのそれらの正確な折り返しおよびその後の核膜を通っての輸送を可能にする１次および２次のアミノ酸構造を有している。そのような構造により、無傷の非天然結合機能を有する機能性組換えビリオン粒子の集合が可能になり、従って改変された屈性が可能になる。
【０００２】
（背景技術）
臨床遺伝子治療は１９８９年に導入された。その時点での目的は、患者の欠陥細胞中への健康な遺伝子のｉｎ ｖｉｔｒｏ導入および処理した細胞を患者へ注入して戻すことにより免疫系における遺伝子欠陥を修正することであった。その時以来、遺伝子治療の適応および考えられる分子的使用は劇的に増大した。その導入から１０年後の今日、例えば、血管疾患、癌、炎症性疾患およびＨＩＶのような感染症の治療に遺伝子治療の利用を想定できる。
【０００３】
現在、しかしながら、遺伝子治療はヒトの医学においては未だ有用な方法ではない。１つの主要な理由は、遺伝子治療では、患者に投与することができ、さらに意図した細胞だけを標的にする遺伝子キャリアすなわちベクター中に、遺伝子のパッケージングが送達される必要があるということである。今までのところ、そのようなベクターは、信頼できる形で利用可能になっていない。
【０００４】
ウイルスのいくつかのクラスが遺伝子治療用ベクターと見なされてきており、アデノウイルス、レトロウイルス、レンチウイルスおよびアデノ随伴ウイルスが最も一般的に用いられている。
【０００５】
遺伝子治療用に理想的なベクターは、全身的に投与でき、さらに所望の遺伝物質を所望の細胞または組織に特異的に送達するものであろう。しかしながら、ヒトの遺伝子治療用途に現在検討されているウイルスは広い屈性を有しており、人体中にある多くの種々のタイプの細胞に感染し得る。これによりウイルスベクターの潜在的な安全性が限定され、全身的投与用にそれら用いることは禁止される。この理由のため、選択された細胞にのみ感染し得る標的化ウイルスベクターの開発は、遺伝子治療の究極の目的とされてきた。
【０００６】
遺伝子治療用途のために最も広く調査されたベクター群の１つはアデノウイルスである。ヒトアデノウイルスは、６つ血球凝集群（Ａ−Ｆ）に分類され、各血球凝集群は種々の血清型にさらに再分類される。全体として、４０以上の異なるヒトアデノウイルス血清型が存在する。ヒトの遺伝子治療に最も頻繁に用いられてきたアデノウイルスは、血球凝集群Ｃに属するアデノウイルス型５（Ａｄ５）である。
【０００７】
アデノウイルス（Ａｄ）は包膜を持たないＤＮＡウイルスであり、直径６０〜８５ｎｍの正２０面体構造である。
【０００８】
アデノウイルスのカプシドは、２５２個のカプソマー、２４０個のヘキソンおよび１２個ペントンからなる（Ｇｉｎｓｂｅｒｇら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ， ２８， ２７８−８３（１９６６））。ヘキソンとペントンは、３つのウイルスタンパクに由来する。ヘキソンは、それぞれ９６７個のアミノ酸の３つの同一のタンパク質、すなわちポリペプチドＩＩからなる。ペントンは、カプシドに結合したベースと、該ペントンベースに非共有結合的に結合しておりこれから突出したファイバーとを含む。タンパク質ＩＸ、ＶＩおよびＩＩＩａもアデノウイルスの外被中に存在し、ウイルスのカプシドを安定化していると考えられている。
【０００９】
細胞結合は、２０面体の頂点でビリオンに固定されたファイバータンパク質を通して生じる。ファイバータンパク質は、無損傷ビリオンの集合および解放には必要ではない。ビリオンの集合は、感染細胞の核内で生じる。
【００１０】
ファイバータンパク質は、ファイバーポリペプチド（すなわち、アデノウイルスポリペプチドＩＶ）のホモ三量体であり、以下の機能的に異なる３つの部分を含んでいる。すなわち、ファイバーをビリオン中のペントンベースに非共有結合的に固定し、および核局在化シグナルをさらに含んでいるＮ末端尾部、１５程度のアミノ酸ファイバーシャフトモチーフの可変反復からなるシャフトドメイン、（例えば、Ａｄ３においては２２回、Ａｄ２およびＡｄ５においては６回反復される）、細胞のＡｄレセプターと結合するリガンドを含んでいるＣ末端球状ドメイン、すなわちノブ（Ｃｈｒｏｂｏｚｅら、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，（１９９５）， ｐ． １６３−２００）。ノブは、ファイバー三量体形成についても機能的に原因となる（すなわち、三量体形成モチーフを含んでいる）。
【００１１】
各シャフト反復は、βシートを形成する２つの３アミノ酸領域と、天然の伸展されたファイバーシャフトのターンを構成する２つのアミノ酸領域とを有している。三量体化細胞結合領域の結晶構造が決定され、他のアンチパラレルβサンドイッチと異なる独自のトポロジーを示す（Ｘｉａら、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ２： １２５９−１２７０，（１９９３））。ビリオンのペントンベースへのファイバーの結合は、無細胞系中でも生じ得、すなわち、ファイバーはファイバーレスビリオンに結合し得る（Ｂｏｕｄｉｎら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ， １１６： １５８−６０４，（１９８２））。
【００１２】
例えば、屈性または細胞結合を改変することにより、アデノウイルスベクターの特性を修飾するため、アデノウイルスファイバーを修飾するための努力（例えば、組換えファイバータンパク質を産生）がなされ、従来技術において報告されている。
【００１３】
アデノウイルスファイバータンパク質は、活性のあるウイルス粒子を産生するために保持されなければならないいくつかの生物学的機能を果たす。以下のファイバーの特徴は、機能的な修飾ファイバータンパク質の構成における鍵となる重要性を有するものと考えられている。
【００１４】
ｉ）パラレルなホモ三量体を形成する能力。この機能は、野生型ファイバーノブのＮ末端アミノ酸配列により仲介される。
【００１５】
ｉｉ）ペントンベースに結合してペントンカプソマーを形成する能力。この機能は野生型ファイバーの尾部により仲介される。
【００１６】
ｉｉｉ）標的細胞へ付着するための細胞結合リガンドを発現する能力。天然の状況において、この機能は（細胞のＡｄレセプターに結合する）野生型ファイバーノブにより仲介される。
【００１７】
ｉｖ）ウイルス形成に不可欠な、感染細胞の核内への輸送能力。この機能は、主として野生型ファイバーの尾部により仲介されるが、これに限らない。
【００１８】
アデノウイルスの屈性を改変しようとするこれまでの試みは、ファイバーおよびノブの遺伝子修飾を伴っていた。しかしながら、このやり方は、あまり成功しなかった。主たる問題は、ファイバーの三量体形成を妨げることなく屈性を変え得る新規なリガンドを機能的コンテクスト中に組入れることであった。例えば、短いペプチドリガンドがノブのＣ末端的に付加され（Ｍｉｃｈａｅｌら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ， ２： ６６０−８，（１９９５））、ノナペプチドがノブ「ループ」の１つに導入された（Ｄｍｉｔｒｉｅｖら、Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．， ７２（１２）：９７０６−９７１３（１９９８））。しかしながら、細胞結合および三量体形成を保つために必要な３つのファイバーサブユニット間の相互作用のために、ノブは非常に複雑な構造を有している。従って、ノブはわずかのアミノ酸の挿入を許容するのみであり、機能的な遺伝学的に再標的化されたアデノウイルスファイバーを構成する一般的な方法は、現在まで全く存在していない。
【００１９】
新しいリガンドをアデノビリオンの他の部分に導入する試みもなされてきた。ＦＬＡＧテトラアミノ酸モチーフをＡｄペントンに導入することによって、通常Ａｄで感染されていない細胞をＡｄの標的とすることが可能なことが明らかになった。再標的化は、一方の特異性がＦＬＡＧペプチドに対して向けられ、他方が新しい標的細胞に対して向けられる二重特異性抗体で標的化することによって達成された（Ｗｉｃｋｈａｍら、Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．， ７０： ６８３１−６８３８，（１９９６））。
【００２０】
遺伝子治療のための効率的な組換えウイルスの生産において遭遇し、以前は未対応であった問題は、宿主細胞の核およびサイトゾル内での発現持の組換え成分の機能的な複製を確実にすることである。これは、特に、設計されるべき野生型ウイルスが、例えばアデノウイルスにおけるように、複製の間のこれらの細胞内局在化において成分発現を用いる場合に問題になる。折り返されたタンパク質構造、とりわけ機能的に正しいコンホメーションを維持するためにシステインブリッジ中のジスルフィド結合に依存している構造、例えば、抗体に由来する構造は、組換えウイルス成分の一部として核およびサイトゾルの還元性環境内で発現される場合に、不正折り返しおよび非機能的にされ得る。従って、これらの細胞コンパートメント内のウイルス成分として発現される場合の機能的なコンホメーションを維持できるタンパク質構造に対する満たされずかつ以前は評価されていなかったニーズが当該技術分野において存在し、その構造が包含または支持する結合機能は、とりわけ結合が望まれるリガンドが不在の場合に、結合機能を保持するようなものである。
【００２１】
従って、ヒトの遺伝子治療のための組換え再標的化アデノウイルス（Ａｄ−ウイルス）の構成において有用なアデノウイルスファイバーの遺伝子工学と関連した主要な問題がある。これらの問題は、とりわけ重要であると見みなされている。なぜならば、より多くの患者が、他のどのようなタイプのベクターでよりも、アデノウイルスベクターで処置されてきたからである（Ｔｒａｐｎｅｌｌら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， ５： ６１７−６２５（１９９４））。本発明は、遺伝子治療のための遺伝的に再標的化されたウイルス構成におけるそのような問題を回避することに照準をあわせてあり、そこではウイルス成分タンパク質中へ新しい細胞結合リガンドを導入することによって新しいウイルス屈性が達成されている。
【００２２】
（発明の開示）
本明細書中に記載の本発明は、天然の細胞結合ドメインを除去またはアブレーション（例えば、ブロッキングまたは不活化）、さらにはこれを外部細胞結合リガンドおよび外部の三量体形成モチーフを含む非天然ポリペプチドで交換ないしは付加することにより促進された新しい屈性を備える機能性組換えアデノウイルスファイバータンパク質の産生に部分的に関連する。
【００２３】
ＷＯ９９／４１３５９でＣｕｒｉｅｌらが、ＷＯ９８／５４３４６でＷｉｃｋｈａｍらが、さらにはＵＳ５，８８５，８０８でＳｐｏｏｎｅｒおよびＥｐｅｎｅｔｏｓが、屈性が改変された組換えウイルスの産生を目的とした、アデノウイルス成分への種々の修飾を開示している。これらの開示のいずれも、本発明により解決された問題である、宿主細胞の核およびサイトゾル中の機能性非天然ウイルス成分の発現に関連する問題に対する解決策、あるいはこの問題への対処または問題としての認識さえ提供するものではない。
【００２４】
従って、１つの局面おいて、本発明は非天然ポリペプチドを含む修飾ウイルスを提供し、前記ポリペプチドが各々１つ以上の結合部分を含む１つ以上のフレームワーク部分を含み、前記ポリペプチドが哺乳動物の宿主細胞の原形質および核内において、前記結合部分のためのリガンドがない場合に維持されるコンホメーションで発現することができ、前記コンホメーションが前記結合部分が引き続き前記リガンドと結合することを可能とし、さらに前記ポリペプチドが核膜を通って輸送可能であり、前記修飾ウイルスは前記結合部分により付与された改変された屈性を有している。
【００２５】
本発明による「修飾された」ウイルスは、従って、天然（すなわち、野生型）のウイルスと異なるウイルスである。一般的に言えば、ウイルス成分が天然すなわち野生型（すなわち、修飾されていない）の成分に関して構造的に改変されるように、あるいは天然すなわち野生型フォーム中に存在しない構造的な成分または特徴がウイルスに付加されるように、ウイルスは修飾される。有利には、本発明によれば、成分の特性または挙動が改変される。言い換えると、修飾ウイルスは、未修飾の（天然／野生型）ウイルスと機能的に異なる（例えば、改変された屈性を示す）。上で論じたように（さらに、以下でも論じるように）、ウイルスは遺伝子工学技術を用いて簡便に修飾される。従って、本発明による修飾ウイルスは、有利には組換えウイルスである。
【００２６】
本発明による修飾ウイルスは、どのようなウイルスからも、とりわけ遺伝子治療用ウイルスベクターの原料として用い得るどのようなウイルスからでも誘導し得る。代表的なウイルス科としては、アデノウイルス、レトロウイルス、レンチウイルスおよびアデノ随伴ウイルスが含まれ、とりわけアデノウイルス科またはレオウイスル科、ピコルナウイルス科、パルボウイルス科、パポバウイルス科およびカリシウイルス科のような宿主細胞ウイルス構造成分が核またはサイトゾル中で合成および／また集合されるウイルスファミリーのメンバーが含まれる。好ましい局面では、本発明の修飾ウイルスは、アデノウイルスの修飾された形、とりわけヒトアデノウイルスタイプ、より詳細にはヒトアデノウイルス５型である。
【００２７】
本明細書中で定義される「非天然ポリペプチド」は、２つ以上のアミノ酸のポリペプチド配列であり、その完全な配列は、野生型ウイルスのアミノ酸配列中、より詳細には設計されるべき野生型ウイルス成分タンパク質中に見出されない。
【００２８】
本発明の特定の好ましい実施形態においては、「非天然ポリペプチド」は、天然に生じない、すなわち、合成的または人工的に構成または調製されるという意味で非天然とすることもできる。
【００２９】
本発明によれば、細胞内環境での発現後の非天然ポリペプチドのコンホメーション、およびより重要には細胞外環境でのそのコンホメーションも、所望のリガンド、例えば、レセプターまたは修飾ウイルスについての標的細胞の外表面上で発現された他の分子に結合できるようなものであるべきである。
【００３０】
上で言及したように、本発明によれば有利には、非天然ポリペプチドは、哺乳動物細胞の細胞質中で発現された場合に、ポリペプチドの結合部分のためのリガンドが不在の場合に維持され得るコンホメーションを有する。従って、そのようなコンホメーションは、安定なコンホメーションである。言い換えると、細胞質中での発現と同時に、そしてポリペプチドが核内に輸送されて、ウイルス粒子中に組込まれるか集合される場合に、ポリペプチドは細胞質中で維持されるコンホメーションを取る。さらに、コンホメーションは、ポリペプチドの結合部分が、それらのリガンドにさらされた場合にこれに結合できるようなものである。
【００３１】
従って、本発明の非天然ポリペプチドの重要な特徴は、哺乳動物細胞の細胞質またはサイトゾル中での正確な折り返し、すなわち結合部分の機能性が保持されるようにする３次つまり３次元構造を取り得ることである（すなわち、結合部分がそれらのリガンドに対する活性を保持すること）。言い換えると、結合部分はそのリガンドへの機能的結合が可能なままである。
【００３２】
組換えタンパク質の溶解性はそれらの正確な折り返しの優れた指標であると考えられる。従って、本発明の非天然ポリペプチドは、結合部分の機能性、コンホメーションの安定性および集合したビリオンの一部を形成する能力だけでなく、非天然ポリペプチド、または非天然ポリペプチドを含有またはこれから構成されるウイルス成分タンパク質が発現される細胞内での溶解性に基づいて有利に選ばれ得る。例えば、組換えファイバータンパク質は、真核（例えば、昆虫）細胞中でのそれらの総発現および決定された細胞溶解産物の可溶性フラクション中で回収された割合について試験され得る。
【００３３】
本発明者らは、バキュロウイルス感染させた昆虫細胞中の組換えタンパク質として発現されたファイバー・リガンド融合構成の表現型分析により、それらの溶解性が生育可能な組換えアデノウイルスの回収と相関関係にあることを示すことを見出した。従って、本発明の任意の非天然ポリペプチド、あるいは、非天然ポリペプチド、例えばファイバー・リガンド融合構成、を含有またはこれからなるウイルス成分は、その溶解性ならびにウイルス例えばアデノウイルスのゲノム内への対応する遺伝子の再挿入に先がけての、組換えタンパク質としての標的細胞接着を特徴とすることが好ましい。
【００３４】
従って、本発明により、前記非天然ポリペプチドが、非天然ポリペプチドまたは非天然ポリペプチドを含むウイルス成分タンパク質の溶解性アッセイを用いて選択される修飾ウイルスも提供される。非天然ポリペプチドは、非天然ポリペプチドまたは非天然ポリペプチドを含むウイルス成分タンパク質の２５％より多く、好ましくは３０％より多く、より好ましくは５０％より多くさらには７０％が、非天然ポリペプチドまたは非天然ポリペプチドを含むウイルス成分タンパク質を発現している細胞の細胞溶解産物の可溶性フラクション中に存在するように選択される。適切なアッセイが本明細書中の実施例中に記載されており、必要な改変を加えて他の細胞発現システムに適用し得る。本明細書中において、非天然ポリペプチドまたは細胞環境中で可能な前記非天然ポリペプチドを含むウイルス成分は、これらの限界、すなわちポリペプチドの少なくとも２５〜３０％が細胞溶解産物の可溶性フラクション中に存在する場合に、そのポリペプチドは「可溶性」と見なされることを踏まえて解釈されるべきである。
【００３５】
従って、さらなる局面によれば、ウイルスのベクターの調製における非天然ポリペプチド（例えば、組換えウイルス融合タンパク質）の使用の妥当性を、細胞系中におけるその溶解性を求めることにより決定する方法が本発明により提供される。より詳細には、非天然ポリペプチドまたは本発明の修飾ウイルスタンパク質成分の溶解性をアッセイする方法が提供され、この方法は、ｉ）前記非天然ポリペプチドまたは前記非天然ポリペプチドを含むウイルス成分タンパク質を許容細胞中で発現させる段階と、ｉｉ）細胞を溶解して細胞溶解産物を産生する段階と、ｉｉｉ）細胞溶解産物の可溶性および不溶性フラクションを分離する段階と、ｉｖ）細胞溶解産物の可溶性および不溶性フラクションを、前記非天然ポリペプチドまたは前記非天然ポリペプチドを含むウイルス成分タンパク質の含有量について分析する段階と、ｖ）可溶性および不溶性フラクションの前記非天然ポリペプチドまたは前記非天然ポリペプチドを含むウイルス成分タンパク質の相対含有量を比較して溶解性を求める段階と、を含む。
【００３６】
本発明の結合部分のためのリガンドは、結合部分、言い換えると結合部分が結合するように設計または選択されたリガンドに対応するリガンドと見なし得る。従って、リガンドは結合部分に結合することができる。従って、リガンドおよびその結合部分は、親和性結合対のメンバーと見なすことができ、リガンドは結合部分にとっての結合パートナーである。
【００３７】
従って、結合部分は、所望のリガンドに対する結合特異性を有し、すなわちそれに特異的に結合することができる。「結合特異性」すなわち「特異的に結合する」とは、結合部分が、非標的分子またはリガンドへの結合の仕方とは区別される仕方で所望の（すなわち「標的」）リガンドに結合できることを意味する。従って、結合部分は、非標的分子に結合もしないし、非標的分子への無視し得るないしは（標的リガンドと比較して）大幅に減少した、例えばバックグラウンドの、結合も示さない。従って、結合部分は標的リガンドを明確に認識している。
【００３８】
従って、結合部分のこの結合特異性により、修飾ウイルスを選択的に標的とすることが可能になる。言い換えると、結合部分は、修飾ウイルスが所望のすなわち「標的」細胞に結合できるように設計または選択し得る。結合部分は、標的細胞によりまたは、例えば細胞表面上で発現されるリガンドに結合するものを設計選択し得る。
【００３９】
従って、リガンドは、任意の所望のリガンドとすることができ、有利には、内部で修飾ウイルスの発現が達成されることが望まれる標的細胞の表面で発現される分子である。従って、リガンドは、細胞表面レセプター、または細胞表面抗原とし得る。リガンドは、タンパク質またはポリペプチド分子とするのが便利であるが、任意の分子的性質、例えば脂質または炭水化物としてもよい。
【００４０】
このように、修飾ウイルスは、それが誘導される天然（野生型）ウイルスが結合しない所望の標的細胞に結合するように修飾するか、または天然型ウイルスよりも限定された結合特性を有するように修飾、言い換えれば、天然型ウイルスが結合する標的細胞のより広い母集団からの選択されたまたは特定の標的細胞のサブセットまたは型にのみ結合するように修飾し得る。従って、ウイルスの屈性は改変される。それゆえ、「改変された屈性」とは、修飾ウイルスが示す標的細胞結合特異性が改変されている、すなわちそれから修飾ウイルスが誘導される野生型ウイルスの結合特異性とは異なることを意味する。
【００４１】
一般に、本発明による非天然ポリペプチドは、少なくとも１つのフレームワーク部分と、１つ以上の結合部分とを含み、他のウイルス成分と相互作用して機能性かつ感染性のビリオン粒子を形成できる。機能性ビリオン粒子の一部を形成する能力は、非天然ポリペプチド自身により他のウイルス成分への結合をもたらす非天然ポリペプチド内の１つ以上の配列、あるいは、ビリオン集合プロセスにおいて非天然ポリペプチドが含まれるウイルス成分の存在により容易にし得る。
【００４２】
本発明の非天然ポリペプチドは、標的分子と相互作用し得る任意のウイルス成分タンパク質に取って代わるか、またはこれに組込み得る。修飾された（例えば、組換え）ウイルス成分は、ウイルス成分自身の保持されている天然構造の性質により、または非天然ポリペプチドおよびその中に含まれる任意の構造の組込みにより付与された新しい構造による細胞結合機能を有している。本発明の好ましい局面において、非天然ポリペプチドは、野生型ウイルスタンパク質成分、例えばアデノウイルスファイバータンパク質、の中に導入または組込まれ、あるいはそれと融合タンパク質を形成し、特に好ましくは、野生型ファイバーノブ（または、少なくともその細胞結合ドメイン）が除去（すなわち、交換）されるように組込まれる。
【００４３】
しかしながら、代替実施形態においては、野生型ファイバーノブ（またはその細胞結合ドメイン）が保持され、そしてさらなる、すなわち付加的な、細胞結合ドメインが、非天然ポリペプチドの結合部分によって付加され得る。改変されたウイルス屈性が修飾ウイルス中に存在するように、細胞結合機能が、設計されるべき野生型ウイルスの機能から改変されることが本発明の特徴である。野生型ファイバーノブ（またはその細胞結合ドメイン）が保持される場合には、この改変された屈性は、その野生型ノブ／細胞結合ドメインを修飾して天然または野生型細胞結合機能を不活性化または阻止することによって達成できる（または円滑にできる）。
【００４４】
以下で論じるように、特定の状況下では、改変された屈性の発現と同時に制御（例えば、一時的制御）を示し得る修飾ウイルスを構成または設計することが望ましいことがある。従って、そのような修飾ウイルスにおいては、改変された屈性を付与する非天然ポリペプチドを提供することに加えて、野生型ファイバーノブまたはその細胞結合ドメインを保持することによって天然または野生型屈性が保持し得る。例えば、これは、例えば誘導性制御要素（例えば、プロモーター）からの野生型アデノウイルスファイバー遺伝子の制御された発現による、修飾ウイルス中の野生型結合機能の付加的な存在により当該技術分野において公知の従来の細胞系中での修飾ウイルスの増殖にとって望ましい。
【００４５】
野生型屈性は、付加的野生型ウイルス成分遺伝子の発現制御（例えば防止）によって、あるいは発現後には、非天然ポリペプチドにより付与された改変屈性が発現され得るように、野生型ノブ／ドメインを除去または不活性化することにより、所望時にアブレーションし得る。従って、本発明による「改変された屈性」は、「潜在的な」改変屈性、すなわち、改変屈性を発現する潜在力、を含む。これには、野生型屈性に付加される改変屈性も含まれる。
【００４６】
上で言及したように、本発明の修飾ウイルスは、好ましくは遺伝子工学技術を用いて調製され、本発明の好ましい実施形態においては、非天然ポリペプチドは、ウイルスタンパク質成分との融合タンパク質の一部として、好ましくはアデノウイルスファイバータンパク質との融合タンパク質の一部として提供される。そのような融合タンパク質、より一般的には、そのような修飾ウイルス成分タンパク質は、本発明の別個の局面を表すものである。本発明のこの局面の好ましい実施形態においては、修飾ウイルス成分は、上で定義されるような非天然ポリペプチドを含む修飾アデノウイルスファイバータンパク質である。
【００４７】
そのような非天然ポリペプチドを調製し、それらをウイルスまたはウイルス成分中に導入するための技術は当該技術分野において公知であり、文献中に広く記載されている。従って、本発明による修飾ウイルスまたはウイルス成分として発現され得る遺伝子配列を調製または構成するために、例えば分子生物学または遺伝子工学技術が容易に利用可能である。以下の実施例中で説明されるように、アデノウイルスファイバータンパク質のような、ウイルス成分タンパク質をコード化している核酸分子またはヌクレオチド配列は、非天然ポリペプチドをコード化しているヌクレオチド配列を導入するため、例えばアデノウイルスファイバータンパク質および非天然ポリペプチドのすべてまたは一部を含む融合タンパク質をコード化するために修飾できる。
【００４８】
本発明の非天然ポリペプチドが組込まれるウイルス成分、またはそれが置き換わる成分に応じて、本発明による非天然ポリペプチドは、機能性ビリオン粒子の集合を容易にするように、ウイルス成分の天然の構造または機能を模倣する（すなわち、ウイルス成分の機能的同等物である）さらなる要素を随意的に含み得る。本発明による修飾アデノウイルスファイバーの場合、ビリオン集合、特にカプシド集合についてのアデノウイルスファイバーの機能上の完全性は、ヒト肺サーファクタントタンパク質Ｄのネック領域から誘導された螺旋状アミノ酸モチーフのような外部アミノ酸三量体形成モチーフの存在により保たれる（Ｈｏｐｐｅら、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ， ３４４： １９１−１９５（１９９４））。この三量体形成モチーフおよび当該技術分野において公知の他の三量体形成モチーフは、ファイバーシャフト中に機能的に設計でき、ノブレスファイバー（ｋｎｏｂ−ｌｅｓｓ　ｆｉｂｅｒ）を作り出すためにファイバー三量体形成シグナルとして作用できる。例えば、修飾ウイルス中への封入に適した三量体形成モチーフは、ＷＯ９８／５４３４６およびＷＯ９９／５４３５９に記載されている。本発明の好ましい実施形態においては、非天然ポリペプチド中に存在する非天然三量体形成モチーフ存在は、ヒト肺サーファクタントＤからのネック領域ペプチドである。
【００４９】
以下の実施例において説明するように、任意のそのような付加的または外部のモチーフが、「リンカー」配列によってウイルス中に組込まれることが便利または必要なことがある。リンカー配列への付着による、ＤＮＡまたはアミノ酸配列組込みのためのそのような構成手法は当該技術分野において公知であり、タンパク質／遺伝技術者の慣用技術の範囲内である。
【００５０】
本明細書中で定義される「フレームワーク部分」は、核およびサイトゾル細胞環境中で機能性（例えば、折り返された）構造（すなわちコンホメーション）を保持するポリペプチド（例えば、タンパク質）構造である。そのような機能上の構造は、フレームワーク部分に付着または組込まれている結合部分が、リガンドが不在の場合にリガンド結合構造を保持することを可能にする。これにより、例えば、再集合されたビリオンがひとたび細胞環境を離れたら、リガンドへのその後の結合が容易になる。
【００５１】
従って、フレームワーク部分は「分子骨格」構造の１つの型と見なすことができ、これはそのリガンドへの結合を可能にする適切な提示すなわちコンホメーションに結合部分を支持または「保持する」ためのフレームワークを提供する。フレームワーク部分は、サイトゾル中の安定な構造を可能にする分子内相互作用も提供する。従って、フレームワーク部分は、タンパク質またはポリペプチド分子とすることができ、これは特定のコンホメーションまたは構造を取り、さらに特定の領域における修飾、例えば、アミノ酸配列の付加、挿入、欠失もしくは置換、またはポリペプチド配列の挿入を許容する。
【００５２】
従って、本明細書中で定義される「結合部分」は、本発明のフレームワーク部分に付着またはその一部をなすポリペプチド構造であり、それが一部をなす非天然ポリペプチドが宿主細胞の核およびサイトゾル中で発現した後に、所望の（標的）リガンドについての結合機能を保持する。
【００５３】
結合部分は、隣接または非隣接のアミノ酸配列とすることができ、標的リガンドに結合部位を提供すると見なし得る。従って、結合部分は、タンパク質またはポリペプチド分子、例えば表面領域、例えば多数の「表面」アミノ酸残基により提供し得る。
【００５４】
本発明の特定の好ましい実施形態においては、フレームワークおよび結合部分は起源が異なってもよく、例えば、所望の結合部分を所望のフレームワークに「グラフト」すなわち連結することにより、異なるソース（例えば、異なるタンパク質）から得られたまたは誘導されたものであることができる。他の好ましい実施形態においては、以下で説明されるように、結合部分は、タンパク質「フレームワーク」構造内で、フレームワークタンパク質の特定の領域または残基を修飾することにより作ることができる。そのような実施形態においては、フレームワーク部分は、「一定」すなわち未修飾残基により表され、結合部分は、「可変」すなわち修飾残基により表され得る。
【００５５】
従って、本発明による非天然ポリペプチドは組合せタンパク質とすることができ、これは、新規な修飾されたまたは強化された結合特性を備えた結合タンパク質を生成するために、特定のタンパク質構造のランダム化（ランダム突然変異誘発）により作られたタンパク質である。そのような合成的に構成された「人工的な」（非天然という意味において）タンパク質親和性結合分子（すなわち、特定または新規な結合機能を有するように設計されたタンパク質）が当該技術分野において公知である。
【００５６】
そのような組合せタンパク質は、様々なペプチドおよびタンパク質を出発構造として用いて調製することができる（Ｎｙｇｒｅｎ ａｎｄ Ｕｈｌｅｎ， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ， ７： ４６３−４６９， １９９７）。そのようなタンパク質は当該技術分野において公知であり、標的タンパク質のランダム突然変異誘発、例えば糸状バクテリオファージの表面でのこれらの変異型のフルライブラリーの発現、その後の所望の結合特性を示すタンパク質の選択により一般的に調製できる。この選択は一般的に、変異タンパク質と標的リガンド（結合パートナー）との間の結合反応を伴い、これは便利に固定化でき、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏで実行できる。突然変異誘発は、任意の特有のコドンによってコード化された結果として得られるアミノ酸は一般に予め決定されないが、突然変異が導入されるべき位置は一般に前もって特定されるという点でランダムである。突然変異誘発は、アミノ酸置換、欠失、または付加（例えば、挿入）を伴い得る。
【００５７】
本発明の非天然ポリペプチドとしての使用のための好ましい組合せタンパク質は、アフィボディとして当該技術分野において一般に知られているタンパク質である。本明細書中で用いられる用語「アフィボディ（ａｆｆｉｂｏｄｙ）」は、細菌レセプタータンパク質またはその結合ドメインから誘導された親和性結合分子を定義し、そこでは結合ドメインが（例えば、タンパク質／遺伝子工学により）修飾されてその結合特性を修飾（例えば改変または強化）する。有利には、アフィボディは、（天然に生じないという意味で）非天然タンパク質であり、新規な結合部位を有していることがさらに好ましい。そのようなタンパク質分子の例およびさらなる説明は、ＷＯ９５／１９３７４でなされている。
【００５８】
ファージでの表面表示のような発現系の使用により、遺伝子型と表現型との間の重要な関連がもたらされ、その特定の結合相互作用に基づいて選択され、また観察された結合特性に関与するタンパク質についてコード化する核酸を持つ自己充足型ユニットがある。これにより、その結合特性について選択された有用量のタンパク質における発現が可能になり、そのような発現は一般的に、形質転換された細菌宿主中で生じる。
【００５９】
標的リガンド（例えば、所望の細胞表面分子）に結合するその能力により選択されたタンパク質は、次に本発明の修飾ウイルスまたはウイルス成分の調製に用いることができ、より詳細には、所望の組合せタンパク質をコード化するヌクレオチド配列をそのように用いることができる。
【００６０】
タンパク質分子の組合せライブラリーを構築し、その後の所望の結合特性を有するタンパク質性結合分子を得るための技術は、当該技術分野において公知である（Ｎｙｇｒｅｎ， Ｐ． ａｎｄ Ｕｈｌｅｍ， Ｍ． Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９７）７： ４６３−４６９）。一般に、温度またはｐＨ非感受性、あるいはコンホメーション安定性のような固有の有利な特性をおそらくは有しているタンパク質分子は、「スカホールド」または「フレームワーク」として用いられ、組合せライブラリーは次に、種々の結合特性を有する分子のライブラリーを作り出すために、そのタンパク質分子のランダムであるが標的とされたアミノ酸置換（または他の突然変異）により構築される。表面残基は一般にランダム突然変異誘発のために標的とされる。
【００６１】
ファージ表示技術（Ｓｍｉｔｈら、Ｍｅｔｈ． Ｅｎｚｙｍ． ２１７， ２２８−５７， （１９９３））に加え、ライブラリー構築および選択のための他の方法としては、例えば、リボソーム表示（Ｈａｎｅｓら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ．， Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９４： ４９３７−４９４２（１９９７））、ペプチド・オン・プラスミド（Ｓｃｈａｔｚら、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，（１９９６）２６７： ８３−１０９）、ＲＮＡ−タンパク質融合（Ｒｏｂｅｒｔｓら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９４： １２２９７−１２３０２（１９９７））およびＤＮＡ−タンパク質リンケージ（ＳＴＡＢＬＥ）（Ｄｏｉら、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ， ４５７（２）： ２２７−３０，（１９９９））である。
【００６２】
適切なタンパク質フレームワークは、単に直鎖ペプチドとすることができるが、好ましくは、フレームワークは、折り返された三次元構造を有し、この構造はより高い親和性のためのポテンシャルを持ち、タンパク質分解を受けにくい。フレームワークは新規に設計できるけれども、天然に存在するタンパク質またはドメインが通常、さらなる設計用に選択される。疑念を回避するため、本明細書全体を通して、用語「タンパク質」は、タンパク質分子全体ならびにそのドメインまたはフラグメント、ポリペプチドないしはペプチドを意味するために用いられることに留意すべきである。
【００６３】
タンパク質フレームワークの選択は複数のパラメータに依存し、所望の宿主細胞（例えば、哺乳動物細胞）中で効果的に発現される能力が含まれる。タンパク質は、全体的な三次元構造を失うことなく置換（または挿入もしくは欠失等）を許容する十分に大きい領域もその表面に含むべきである。もしライブラリーが合成的に作られるのであれば。全体サイズが小さいことが前提条件である。選択されたフレームワークタンパク質が結合機能を有している場合、その相互作用に関与するアミノ酸残基は、ランダム化の標的になり得る。既知の結合特性を高めるため、または新しい特異性を備える結合分子を開発するため、ランダム化が実行できる。
【００６４】
適切なフレームワーク分子はＮｙｇｒｅｎら（前掲）が論じており、束縛された配列の環状ペプチド（そのような束縛された配列中のアミノ酸残基の数は決定的なものではなく、５以上、例えば５〜１０、あるいはそれ以上、例えば４０以上とすることができる）、Ｆｖまたは単鎖（ｓｃＦｖ）ドメインを含む免疫グロブリン様骨格、５８−残基１−ドメインブドウ球菌タンパク質Ａ（ＳＰＡ）類似物Ｚ（「Ｚドメイン」はＳＰＡのＢドメインの誘導体である）のような細菌レセプター、またはＳＰＡの他の領域ないし類似物、ＤＮＡ−結合タンパク質、特にジンクフィンガーおよびプロテアーゼインヒビターを含む。
【００６５】
特に興味深いものは細菌レセプタードメインＺである。Ｎｏｒｄらは、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ８（６）： ６０１−６０８（１９９５）で、Ｚドメインに基づいてタンパク質分子の組合せライブラリーの構築方法を記載しており、これはさまざまなフレームワーク分子に適用できる。記載された方法は、固相支持であり、ランダム化一本鎖オリゴヌクレオチドの段階的集合に基づいている。
【００６６】
結合部分を作り出すための分子内のアミノ酸配列または残基の修飾の代わりとして、結合部分は、例えば結合部分を形成または構成するポリペプチドの挿入または付加によってフレームワーク部分に導入できる。従って、結合部分はフレームワーク部分に付着させ得る。そのようなケースにおいては、結合部分は、所望の標的リガンドのための親和性結合パートナーにより提供される。
【００６７】
本発明の好ましい結合部分は、細胞表面レセプターのリガンド（すなわち結合パートナー）、抗レセプター抗体（または抗体フラグメントもしくは誘導体）、細胞特異性ペプチド、単鎖抗体（ＳｃＦｖ）、単一ドメイン抗体、およびＦｖフラグメントの補足決定領域（ＣＤＲｓ）のような抗体の最小認識単位から誘導し得るが、これに限定されない。従って、結合部分は、抗体の抗原結合部位あるいは抗体の抗原結合または認識／領域から入手または誘導でき、そのような抗体は天然または合成のものとし得る。
【００６８】
本発明の範囲内で、ホルモン、抗体、Ｔ細胞レセプター、アフィボディおよび種々のタンパク質ライブラリーから同定されたリガンドを含む、任意の形のペプチドまたはポリペプチドから誘導された結合部分も考えられる。
【００６９】
上で言及したように、非天然ポリペプチドの重要な特徴は、結合部分の結合機能が保持されるように、コンホメーションが哺乳動物細胞の細胞質および核内に維持されることである。上でさらに言及したように、これは、哺乳動物細胞の細胞質および核内で正確な折り返しを維持する非天然ポリペプチドを提供することによって達成される。そのような正確な折り返しは、コンホメーションのためにジスルフィド結合に依存しない（すなわち、ジスルフィド結合を含まない）非天然ポリペプチドを用いることにより達成できることが見出されている。以下でより詳細に論じるように、本発明による非天然ポリペプチドのより好ましい特徴は、α螺旋構造の存在である。
【００７０】
ＷＯ９５／１９３７４にはいくつかのフレームワークタンパク質が記載されており、これらは、そのコンホメーションのためにＳ−Ｓ結合に依存しないという有利な特徴を共有している。そのようなフレームワークタンパク質は、本発明によるフレームワーク部分として有用である。これらには、ブドウ球菌タンパク質Ａ（ααα型）、タンパク質Ｇ（ＩｇＧ結合部分、ββαββ型）、タンパク質Ｌ（ββαββ型）、およびタンパク質Ｇ（ＨＳＡ結合部分、ααα型）のような細菌レセプターのドメインが含まれる。本発明によるフレームワーク部分は、様々な細菌レセプター、例えば表１に列記されるものから誘導されるが、これらに限定されるものではない。
【００７１】
【表１】
2004504062.tif 000003
【００７２】
本発明によるフレームワーク部分は、細菌レセプターからの構造に限定されない。本発明において、しばしばα螺旋コイルと呼ばれ、種々のソース（Ｃｏｈｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６３： ４８８−４８９（１９９４）、Ｈａｒｂｕｒｙら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６２： １４０１−１４０７（１９９３））から公知になっている他のポリペプチドも有用である。これらのペプチド中でフレームワークを作り上げているコイルは、特徴的に配置された疎水性残基を含むアミノ酸配列の反復から構成される。α螺旋コイルの構造は、安定性のために分子内または分子間ジスルフィドブリッジに依存しない。α螺旋コイルの例は、ヒト肺サーファクタントタンパク質Ｄからのネック領域ペプチド、スペクトリンスーパーファミリーのメンバー、ロイシンジッパーおよびインフルエンザウイルス中のヘマグルチニンの部分である。
【００７３】
本発明による非天然ポリペプチドのソースとして特に好ましいものは、３−ヘリックスバンドルファミリーのメンバー（例えば、ブドウ球菌タンパク質ＡのＺドメインにより例示されるようなもの）である。
【００７４】
従って、１つの実施形態においては、本発明による非天然ポリペプチドは、細菌レセプターに由来するドメインの構造に基づくフレームワーク部分を含む。本発明のフレームワーク部分の好ましい構造は、アルファ−アルファ−アルファ（ααα）−３へリックスバンドルまたはベータ−ベータ−アルファ−ベータ−ベータ（ββαββ）構造クラスに由来またはこれに基づいている。α−螺旋コイルファミリー、特に２−、３−または４−螺旋コイルファミリーのいずれかのメンバーも好ましい。
【００７５】
本発明の実施形態において、結合部分が、１つ以上の螺旋状バンドルおよび／またはこれらのバンドルを接続する１つ以上のループの内部に存在することが想定される。
【００７６】
本発明のさらなる好ましい実施形態においては、フレームワーク部分は、ブドウ球菌タンパク質Ａ、連鎖球菌タンパク質Ｇまたはペプトストレプトコッカス・マグヌスタンパク質Ｌに由来するドメインの構造に基づく。
【００７７】
本発明のさらなる特に好ましい実施形態においては、フレームワーク部分は、ブドウ球菌タンパク質Ａからの免疫グロブリン結合Ｚドメインの誘導体である（Ｎｏｒｄら、前出．）。
【００７８】
そのような実施形態においては、結合部分は、上で論じたような組合せタンパク質設計により作り出せる。他の実施形態においては、選択されたドメインまたはタンパク質（例えば、Ｚドメイン）は、本発明の非天然ポリペプチドとして野生型フォームにおいて使われ得る。
【００７９】
上で言及したように、例えば、Ｚドメインの表面位置残基を標的とした組合せタンパク質設計により、ライブラリーを構築することができ、これからＺドメインアフィボディと名づけられる新規な誘導体（すなわち、新規な結合分子）を、所望の標的リガンドを結合することによって選択できる（Ｈａｎｓｓｏｎら、Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ４： ２３７−５２（１９９９））。
【００８０】
好ましいＺドメインをベースとする非天然ポリペプチドは、以下のアミノ酸配列を含み得る。
【００８１】
ＶＤＮＫＦＮＫＥＸＸＸＡＸＸＥＩＸＸＬＰＮＬＮＸＸＱＸＸＡＦＩＸＳＬＸＤＤＰＳＱＳＡＮＬＬＡＥＡＫＫＬＮＤＡＱＡＰＫ ［ＳＥＱ． ＩＤ Ｎｏ．： ４５］
および
ＶＤＮＫＦＮＫＥＸＸＸＡＸＸＥＩＸＸＸＸＸＸＸＸＸＱＸＸＡＦＩＸＳＬＸＤＸＸＸＸＳＡＮＬＬＡＥＡＫＫＬＮＤＡＱＡＰＫ ［ＳＥＱ． ＩＤ． Ｎｏ．： ４６］
式中、Ｘは任意のアミノ酸でもある。
【００８２】
上記のポリペプチドにおいては、保存された（すなわち、指定された）アミノ酸残基は、フレームワーク部分を構成していると見なすことができ、可変の残基Ｘは、共に結合部分を提供していると見なすことができる。
【００８３】
さらに、宿主細胞の核およびサイトゾル中での非天然ポリペプチドの発現後に結合部分によるリガンド結合のために必要とされるコンホメーションが保持されるならば、本発明によるフレームワーク部分はそれらの安定性についてαヘリックスに依存する必要がない。そのようなフレームワークは、例えば、当該技術分野において公知の特定の抗体およびその誘導体から誘導されたフレームワークを含み、これは構造を保持するためにジスルフィドブリッジの存在を必要とせず、従って、宿主細胞の核またはサイトゾル中で組換えウイルス成分の一部として発現され、その一方機能性コンホメーションを保持し、所望のリガンドについての結合部分として機能する。本発明の範囲内の他の抗体構造には、構造的に関連するシステイン残基がアラニン残基と交換されており、かつ抗体の結合特異性を保持する抗体構造が含まれる。
【００８４】
付加的なフレームワーク部分、例えば、抗体（例えば、モノクローナル抗体）およびウイルス成分への遺伝子融合の構成またはその修飾を考慮した単鎖型式に変換された抗体から誘導された配列が、本発明の範囲内で想定される。抗体由来フレームワーク部分が用いられそのようなケースでは、上記での記載と同様に、結合部分は、タンパク質／遺伝子工学技術（例えば、特定のアミノ酸残基を修飾することによる）によって作り出せ、あるいは結合部分は抗体フレームワークに導入（例えば、連結またはグラフト）できる。
【００８５】
所望の結合活性を付与する抗体フラグメントは、生産的折り返しが可能、すなわち付着または組込まれた結合部分を細胞質内およびその後のウイルス集合が起きる細胞核中への輸送において保持できるフレームワーク部分内へ所望の屈性を有する抗体の相補性決定ループまたは領域（ＣＤＲｓ）をグラフトすることにより、結合部分として用い得る。言い換えると、結合部分は抗体のＣＤＲとし得る。
【００８６】
さらに、本発明によれば、特定の抗体構造フレームワークは、例えば抗体ベースまたは由来の結合部分、例えば特異性決定ループ（ＣＤＲｓ）と共に用いることができ、結果として再標的化ウイルス成分の構成に適した抗体の有向構成となる。
【００８７】
抗体フレームワークは、もしそれが細胞質中およびその後の細胞核内への輸送において生産的折り返しが可能ならば、本発明によるフレームワーク部分として（例えば、結合部分としてＣＤＲループを受け入れるため）用い得る。ジスルフィド結合を持たないモノクローナル抗体からの単鎖Ｆｖフラグメントが生産されている（Ｐｒｏｂａら、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， ２７５： ２４５−５３，（１９９８））。そのようなＳｃＦｖ抗体は、それらが上記の機能的基準を満たすのであれば、本発明に従ってフレームワーク部分で用い得る。結合部分は、ＳｃＦｖ抗体自身の結合部位とすることもできるし、あるいは上で論じたようにさらに設計し得る。
【００８８】
ポリクローナルのレパートリーからの機能性抗体の細胞内選択も達成されている（Ｇａｒｇａｎｏら、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ ４１４： ５３７−４０，（１９９７））。この選択技術は、アデノウイルスの遺伝子再標的化に適した、すなわちフレームワークおよび／または本発明による結合部分としての使用に適した抗体フラグメントの同定において有用なことがある。
【００８９】
用い得る他の抗体フレームワークとしては、軽鎖が生来欠けているラクダ抗体をベースとするもの、あるいは従来の抗体に由来する特定のＶＨ領域が含まれる。
【００９０】
細胞質中で生産的折り返しが可能な本発明による抗体フレームワークの例は、特殊な抗βガラクトシダーゼ単鎖Ｆｖフラグメントである。βガラクトシダーゼとの反応性があり細胞質中で発現可能なこの単鎖可変鎖フラグメント（ＶＫ、リンカー、ＶＨ）は、すでに記載がある（Ｍａｒｔｉｎｅａｕ ＰおよびＢｅｔｔｏｎ Ｊ−Ｍ： Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２９２， ９２１−９２９（１９９９））。従って、本発明により、この抗βガラクトシダーゼ単鎖Ｆｖフラグメント［ＳＥＱ ＩＤ． ４７．］およびこれの機能的同等な変異型をコード化する配列を含むフレームワーク部分を含む修飾ウイルスも提供される。
【００９１】
本発明は、抗体およびアフィボディ（例えば、レセプター）構造に基づくフレームワーク部分に限定されるものではなく、他の構造が感染細胞のサイトゾル／核内で発現された場合に、付着または組込まれている結合部分の結合特異性をこれらが保持できるのであれば、これらの構造を含むように拡張される。
【００９２】
２つ以上の非天然ポリペプチド、例えば異なる結合特異性を有しているものが、本発明の修飾ウイルス中に存在することができ、あるいは、非天然ポリペプチドが、２つ以上の異なる結合部分、または２つ以上の異なるフレームワーク／結合部分構成を組込み得る。
【００９３】
従って、本発明により、標的細胞と結合する第１の非天然ポリペプチドと生産細胞または許容細胞と結合する第２番の非天然ポリペプチドとを含む修飾ウイルスが提供される。
【００９４】
従って、本発明による非天然ポリペプチドは、２つ以上の異なるフレームワーク部分（フレームワーク／結合部分構成）間の遺伝子融合によって構成された二または多機能フレームワーク部分（またはフレームワーク／結合部分構成）を含む組換えウイルス成分中に存在し得る。そのようなフレームワーク部分（またはフレームワーク／結合部分構成）の使用により、例えば組換えウイルスに多重細胞標的の感染力を付与できる。
【００９５】
また、本発明による非天然ポリペプチドが切断部位を含む修飾ウイルスが本発明により提供され、前記切断部位の位置により、非天然ポリペプチドの結合部分は修飾ウイルスから、例えば、集合ビリオンと関連するファイバーの遠心端の前の結合部分に先行して切断されることが可能になる。適切な切断部位の例は、因子Ｘａ酵素またはヒトライノウイルス３Ｃプロテアーのようなプロテアーゼに感受性のある部位である。もし切断が遺伝子レベル、例えば組換えアデノウイルスゲノムの一部または全部を含む核酸分子内で実行されれば、適切な制限酵素またはリボザイムに感受性のある切断部位は、例えばウイルスが産生または標的にされる特定の細胞集団において用い得る。
【００９６】
本発明による非天然ポリペプチドは、核膜を通して輸送できる。当該技術分野において知られているように、これは宿主細胞中での複製の間のウイルス成分の本質的な特徴であり、宿主細胞内ではそのような成分の発現がサイトゾル中で起こり、さらにそのような成分の集合は、宿主細胞の核内、例えばアデノウイルス複製中で生じる。
【００９７】
本発明の非天然ポリペプチドは、二重の役割すなわち機能を果たすと見ることができ、第１には新しい結合領域を提供し（すなわち、改変された屈性を付与する）、第２にはウイルス成分として機能し、すなわち、ウイルス成分（ウイルスタンパク質、例えばウイルスカプシドタンパク質）の機能部分としての役割である。非天然ポリペプチドは従って、ウイルスタンパク質に寄与またはその一部として機能し得る。言い換えると、非天然ポリペプチドは、ウイルス粒子の構成または集合において、構造的役割または機能を果たし得る。
【００９８】
本発明の修飾ウイルスを含むかこれにより感染している細胞も、本発明の範囲に入る。そのような細胞は、細胞タイプがウイルスのすみかとなるか増殖させられるのであれば、任意の起源とし得る。しかしながら一般的に、そのような細胞は哺乳動物細胞であろう。そのような細胞は、膜成分（例えば、膜タンパク質）で形質移入することができ、この膜成分は、修飾ウイルスによる細胞の感染を可能にし、従って、例えば当該技術分野において公知の従来の細胞系における増殖がウイルスの改変屈性により妨げられる場合に、特定の細胞系において非天然屈性を有するウイルスの増殖を可能にする。
【００９９】
非天然ポリペプチド、あるいは修飾されたウイルス成分タンパク質または本発明の修飾ウイルスをコード化している核酸分子も想定される。修飾ウイルスの増殖または修飾ウイルスのさらなる設計のために、そのような核酸分子、あるいは非天然ポリペプチドをコード化しているヌクレオチド配列、または修飾ウイルス成分タンパク質ないしは本発明の修飾ウイルスを含むベクターも、本発明の範囲内に含まれる。
【０１００】
さらなる局面においては、本発明により、本発明による修飾ウイルスを細胞培養において産生する方法が提供される。１つの実施形態においては、この方法は以下の段階を含む。すなわち、ウイルスを遺伝学的に修飾して非天然ポリペプチドを含む修飾（例えば組換え）ウイルスを産生する段階であって、前記ポリペプチドは、各々が１つ以上の結合部分を含む１つ以上のフレームワーク部分を含み、前記ポリペプチドは、ヒト宿主細胞の細胞質および核内で発現可能であり、そこで前記結合部分のためのリガンドが無い場合にコンホメーションを取りかつ維持し、それにより前記結合部分はその後に前記リガンドと結合することが可能になり、さらに前記ポリペプチドは、核膜を通って輸送することができ、前記組換えウイルスは、前記結合部分により付与された改変屈性を有する段階と、そのようなウイルスで許容細胞を感染させる段階と、前記細胞を培養してウイルスを（例えば、十分に高い力価で）産生する段階と、産生された修飾ウイルスを、収集、および任意に、精製する段階である。
【０１０１】
Ａｄベクターは、許容細胞について複製可能または不能にできる。腫瘍療法の場合には、複製可能Ａｄには、腫瘍内で複製および拡散できるという潜在的な利点がある（Ｍｉｌｌｅｒら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ， ３： ５５７−５５９）。これは理論上、複製不能ベクターにより得られるものよりも選択されたエフェクター機構の増大という結果になり得る。さらに、感染性ウイルスは、感染細胞を損傷し得る抗ウイルス性免疫応答を喚起することによるだけでなく、感染細胞中での細胞変性効果によって抗腫瘍効果に寄与し得る。
【０１０２】
コンピテントな修飾ウイルスの複製を制御する手段が遺伝子治療用途において利用可能であることが望ましい。
【０１０３】
修飾アデノウイルスの複製を制御する他の手段は、本発明の範囲内にある。例えば、本発明による修飾ウイルスは、誘発性プロモーターまたは遺伝要素の制御の下で存在するウイルス複製に必要なウイルスタンパク質をコード化している遺伝子を含み得る。例えば、アデノウイルスプレ末端タンパク質（ｐＴＰ）は、ドキシサイクリンの存在下でｐＴＰが発現されるだけになるように、テトラサイクリン応答転写アクチベーター（ｔｒＴＡ）の調節の下に存在し得る。代わりに、本発明による修飾ウイルスは、ＤＮＡ合成−アポトーシス調節経路に欠陥がある細胞中でウイルスが複製だけするように、ゲノムへの修飾を含み得る。
【０１０４】
便利なことには、これは、本発明の修飾ウイルスにおいて、結合部分の上流、または結合部分の修飾ウイルスからの切断を可能にする、例えばファイバーシャフトと結合部分との間の任意の位置に配置された切断部位のさらなる特徴を導入することによって達成できる。
【０１０５】
従って、さらなる局面においては、本発明により、以下の段階を含む修飾ウイルスの複製を調節する方法が提供される。すなわち、切断部位（例えば、酵素または化学物質切断に感受性がある部位）が、細胞感染に必要な結合部位と、結合部分が一部となっている組換えウイルス成分の残部との間に位置するように修飾ウイルスを構成する段階と、前記結合部分を前記ウイルス成分から切断でき、それによって組換えウイルスがさらなる感染サイクルを受けないようにできる切断物質または切断手段（例えば、酵素、化学物質、または光不安定切断部位の場合には光）に前記組換えウイルスを接触させる段階とである。
【０１０６】
この方法における切断手段が酵素である場合には、切断酵素は組換えウイルスのゲノム内でコード化されることができ、誘発性とし得る。好ましい実施形態においては、切断部位は因子Ｘａ酵素により切断される。当該技術分野において知られている他のプロテアーゼ、例えばヒトライノウイルス３Ｃプロテアーゼ、の使用も想定でき、これはＧＳＴとの融合タンパク質として利用可能である（Ｗａｌｋｅｒら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １２： ６０１（１９９４））。このプロテアーゼは、４℃で活性があり、配列ＬＥＶＬＦＱ／／ＧＰを認識してこれを分裂する。
【０１０７】
本発明の非天然ポリペプチドは、ライブラリーから、当該技術分野において公知のファージ表示技術と同様なやり方で正確な核およびサイトゾルのペプチド折り返しならびに所望の結合機能についてそのようなライブラリーをスクリーニングした後に選択され得る。そのようなライブラリーは、本発明による野生型または修飾（例えば、組換え）ウイルス成分、例えばアデノウイルスファイバータンパク質に融合された候補的ペプチドから構成され得る。ファイバー融合ライブラリーは、アデノビリオン上で発現させることができ、複製を容易にする候補的融合を観察することにより正しいサイトゾルおよび核のコンホメーションについて選択するために使用できる。
【０１０８】
本発明による修飾ウイルスは、野生型およびゲノム中に存在する、またはコード化された修飾ウイルス成分でも構成され、必要なら、種々の遺伝制御要素、例えばプロモーターの制御下で各成分遺伝子で構成できる。従って、本発明による修飾ウイルスは、修飾ウイルス成分（すなわち、非天然ポリペプチドを含有または包含するように修飾されている）と、未修飾である同等ないし対応するウイルス成分、例えば野生型ファイバーと、修飾されたファイバーとを含み得る。
【０１０９】
例えば、組換えアデノウイルスは、野生型ファイバーと、修飾または組換えファイバー（すなわち、非天然ポリペプチドを包含または組込んた修飾ファイバー）、例えば別のプロモーターの制御下でＥ１欠失アデノウイルス中で発現される「ファイバー−候補的結合ペプチド」融合ライブラリーから誘導される修飾ファイバーで構成できる。例えば、本発明者らは、ＣＭＶプロモーターの下での組換えアデノウイルスファイバー遺伝子が、シャトルベクターｐＡｄＴｒａｃｋの多重クローニング部位中へクローニングされ得ること、さらにＡｄベクターｐＡｄＥａｓｙを用いた相同的組換えによりＷＴファイバーと組換えファイバーの双方を発現するウイルスが産生され得ることを示した（Ｈｅ Ｔ−Ｃ， Ｚｈｏｕ Ｓ， ＤａＣｏｓｔａ ＬＴ， Ｙｕ Ｊ， Ｋｉｎｚｌｅｒ ＫＷ ａｎｄ Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎ Ｂ： Ａ ｓｉｍｐｌｉｆｉｅｄ ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ｇｅｎｒａｔｉｎｇ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓｅｓ． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ， ＵＳＡ， ９５： ２５０９−２５１４， １９９８）。
【０１１０】
１つ以上の誘発プロモーターの制御下でアデノウイルスベクターゲノム中に１つ以上のファイバー遺伝子（例えば、野生型遺伝子および修飾遺伝子）を存在させ、従って、各遺伝子のスイッチを独立してオン・オフできるようにすることも可能である。例えば、所望のＡｄ構成においては、主要後期プロモーター（ＭＬＰ）によってその正常な位置およびその制御からずらされた野生型ファイバー遺伝子は、デキサメタゾンにより誘導可能なホルモン誘発性ＭＭＴＶプロモーターの制御下でクローニングされ得る。このプロモーターは、ベクター増殖細胞中での野生型ファイバーの発現を可能にする。好ましくは、修飾ファイバーは、同じＡｄベクターゲノム中で、例えば下流で、所望の細胞系中でスイッチオンにされるＴＲＥ（テトラサイクリン感受性要素）配列要素からクローニングされる。ｔＴＡタンパク質（ＴＲＥに結合する転写活性化因子）を発現している細胞中において、ＴＲＥはＴｃ（テトラサイクリン）またはＤｏｘ（ドキサシクリン）が存在しない場合に活性化される。代わりに、そしてより有利には、Ａｄベクター構成は、逆転ｔＴＡ（ｒｔＴＡ）を発現する細胞中で増殖させることができ、そこではＴＲＥ、および修飾ファイバーの発現、がＴｃ（またはＤｏｘ）の存在下で活性化される。
【０１１１】
ライブラリー中の組換えファイバータンパク質は、外部三量体形成モチーフで置換された野生型ファイバーノブと、ペプチドライブラリーの１つ以上のメンバー（または、他の非天然ポリペプチド）を持つことができる。いったん組換えアデノウイルスが増殖細胞培養中での野生型ファイバーの発現によって増殖されたら、所望の結合活性についての組換えファイバータンパク質のスクリーニングは、ファージ表示に類似のやり方で実行できる。
【０１１２】
従って、屈性が改変された修飾ウイルスは、増殖を可能にするために感染できる細胞を必要とする。従って、ウイルスを増殖させるために培養可能な、本発明によるウイルスのための許容細胞も本発明により提供される。複製不能ウイルス（一般に、それを不能にしている欠失をそのゲノム中に含む）は、複製するためには、ウイルスから欠失または欠けている遺伝情報を供給できる特殊な産生または増殖細胞を必要とする。そのような細胞または細胞系は、当該技術分野において公知である。屈性が改変された修飾ウイルスは、当該技術分野において知られているように、そのような細胞に感染できないことがある。従って、本発明には、修飾ウイルスの結合部分のための結合パートナー（リガンド）を含むように（例えば、細胞がそのようなリガンドをその表面で発現するように）、そのような増殖細胞の修飾が含まれる。
【０１１３】
従って、本発明により、本発明の修飾ウイルスまたはウイルス成分を含んでいる細胞、好ましくはｉｎｖｉｔｒｏまたはｅｘ−ｖｉｖｏ真核細胞が提供される。
【０１１４】
屈性が改変されたウイルスが、野生型ウイルスと同じ細胞中で、野生型結合部分（すなわちノブ）を、そのような部分間の（例えば、因子Ｘａまたはヒトライノウイルス３Ｃプロテアーゼのような酵素のための）切断可能部位と共に含むウイルス成分内に新しい屈性改変結合部分を配置することによって増殖し得ることも想定される。野生型結合部分の作用による通常細胞中での増殖後、ウイルス成分を切断して、野生型結合部分（例えば、野生型ノブ）を取り去り、新しい結合部分を明らかにして、新しい屈性を付与することができる。明らかにされた結合部分が、細胞結合能力をそれ自身が有しているリガンドに特異的になり得ることも想定される。例えば、結合部分は、抗体のＦｃ領域について特異的とすることができ、それによって所望の細胞タイプについて細胞特異的である抗体の使用が可能になる。野生型結合部分を、切断およびウイルスを細胞特異性抗体へ露出させて除去することにより、抗体をウイルスに吸着させることが可能になり、従って、抗体によって特定された細胞をウイルスで狙う。
【０１１５】
本発明による非天然ポリペプチドは、好ましくは、非天然ポリペプチドが導入されたウイルスの屈性に比べて、改変された屈性を組換えウイルスに付与する。そのような改変屈性により、本発明の組換えウイルスを、被験者または被験動物の疾病治療において、治療を必要とする被験者の細胞のｉｎ ｖｉｖｏ治療またはｅｘ ｖｉｖｏ治療により用いることが可能になる。
【０１１６】
本発明の修飾ウイルスの屈性は、１つ以上の結合部分を介してウイルスが特定細胞を標的とするように改変できる。従って、本発明により、細胞特異性リガンドに結合可能な結合部分を非天然ポリペプチドが含む修飾ウイルスも提供され、前記リガンドは随意に、前立腺特異性膜抗原、ＥＧＦレセプター、Ｈｅｒ−２／Ｎｅｕ、ＶＥＧＦレセプター、ＣＤ２２、ｇｐ１２０、ＭＨＣ／ペプチドコンプレックス、または増殖性細胞、腫瘍細胞、またはウイルス感染細胞上で発現または存在する膜構造または表面分子であることができる。
【０１１７】
遺伝子治療用途において、本発明による改変屈性を示す修飾ウイルスを用い得ることができる多くの方法がある。腫瘍疾患の場合には、以下の選択が存在する。
【０１１８】
Ｉ．腫瘍内に以下のような導入遺伝子を導入するためのベクターの使用
−　アンチセンス発ガン遺伝子
−　自殺遺伝子
−　免疫変調物質または腫瘍抗原のための遺伝子
−　抗脈管形成因子のための遺伝子
本発明の修飾ウイルスへの封入に適した導入遺伝子の例は、アンチセンス発ガン遺伝子、自殺遺伝子、免疫変調物質のための遺伝子、腫瘍抗原のための遺伝子、抗脈管形成因子のための遺伝子、サイトカイン、導管内皮成長阻害因子のための遺伝子、融合誘導膜糖タンパク質、細胞毒性遺伝子、プロドラッグを細胞毒性物質に変換する酵素をコード化する遺伝子、シトシンデアミナーゼのための遺伝子、ウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼのための遺伝子である。本発明の好ましい実施形態においては、修飾ウイルスは、シトシンデアミナーゼおよびウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼをコード化している導入遺伝子を、別個の遺伝子として、あるいはより好ましくは、二元機能融合遺伝子として共に含む。
【０１１９】
シトシンデアミナーゼおよびウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼ導入遺伝子を持つ本発明のウイルスを用いる治療法においては、好ましくは、ウイルスは存在しているか、ジヒドロピリミジンデヒドロゲナーゼの１つ以上の阻害剤と共に同時投与される。これには、プロドラッグである５−フルオロシトシンからこれらの導入遺伝子により形成された生成物の毒性を増大させる効果がある。
【０１２０】
本発明により、１つ以上の誘導性プロモーターまたは遺伝要素の制御下で１つ以上のウイルス成分または導入遺伝子を含む修飾ウイルスが提供され、これは、例えば、外因性発現変調物質の存在に特異的または応答する組織である。
【０１２１】
ＩＩ．感染性ウイルスの使用。これには、ウイルスが腫瘍内部で細胞から細胞へ広がることができ、それによって腫瘍への初期ヒット、すなわち効果を増加させるという点で、非複製ベクターの使用に対する付加価値がある。腫瘍細胞破壊は、ベクター中に設計した細胞破壊機構によってだけではなく、ウイルス感染それ自体に伴う細胞破壊およびウイルス感染細胞への体の免疫応答の攻撃によって生じ得る。この原理はすでに、ｐ５３突然変異腫瘍細胞においてのみ複製するように遺伝子操作したアデノウイルスの直接的腫瘍内注入によりヒトにおいて試験されている。大きい「頭頸部」腫瘍についてのこれらの限定された試みからの経験は、他のやり方では既知のどのような形態の治療に対しても抵抗力がある２／１１の治療した腫瘍に全体的な退行が見られたことにより部分的に有望である（Ｓｈｅｎ Ｙ： 個人的通信）。
【０１２２】
本発明により、アデノウイルス死滅タンパク質（ＡＤＰ）をコード化している遺伝子が、修飾ウイルスの溶菌能力が増大するように、タンパク質の過剰発現を可能にするプロモーターの制御下に置かれる、修飾ウイルスも提供される。
【０１２３】
従って、遺伝子治療用に、修飾ウイルスは、所望の治療的遺伝子または治療的核酸分子を組込むか含有させるように、文献中に広く記載されている標準的技術、原理および提言に従って、さらに修飾できる。「治療的」とは、本明細書中では、（既存または診断済み状態の治療的または一時的軽減療法の意味の）治療法および予防法の双方を含むように広く用いられる。遺伝子は、所望の治療的生成物をコード化できる（例えば、治療的ポリペプチドまたはアンチセンス分子）。
【０１２４】
本発明のさらなる局面においては、修飾ウイルスは、所望の治療的遺伝子／核酸分子挿入のための部位（例えば、制限部位）を含み得る。
【０１２５】
本発明による修飾の後であっても、遺伝子治療において野生型ウイルスを使うことの１つの不都合は、ウイルスで処理される被験者または被験動物が、まだ存在しているかまたは修飾ウイルス中で部分的にのみ修飾された野生型ウイルスの成分に対する事前形成された抗体を有している場合があることである。例えば、ヒトアデノウイルス血清型５ヘキソンタンパク質は、事前形成された抗体によりしばしば標的にされる。単独のウイルス成分、例えば本発明による非天然ポリペプチドを含む成分の修飾が、事前形成された抗体による初期免疫応答を低減するのに十分である一方で、宿主の免疫応答をさらに低減すべくさらなる成分を修飾することが望ましいことがある。
【０１２６】
従って、本発明により、同等の成分と交換されるか、事前形成された抗体による野生型ウイルスへの前記修飾ウイルスの結合が減少するように修飾されたウイルス成分をさらに含む本発明による修飾ウイルスが提供される。例えば、血清型Ａｄ５のアデノウイルスは、血清型Ａｄ５に比べて事前形成された抗体が低いレベルで存在する別の血清型のヘキソンタンパク質で交換されたヘキソンタンパク質を含むことができ、例えば別の血清型はＡｄ３７とし得る。代わりに、修飾アデノウイルスは、事前形成された抗体が結合し、免疫原性エピトープを欠く組換えヘキソンを産生するために修飾されるヘキソンタンパク質のエピトープ配列を含み得る。
【０１２７】
さらに、修飾アデノウイルスは、タンパク質、例えば事前形成された抗体により結合されたヘキソンの免疫原性エピトープをカバーするのに十分な、ヒト血清アルブミンのような非免疫系タンパク質を結合できるペプチドをさらに含むヘキソンタンパク質をさらに含み得る。
【０１２８】
腫瘍細胞または増殖細胞の療法においてまたは治療用薬物の調製において使用するための本発明による修飾ウイルスも本発明により提供される。
【０１２９】
さらに、本発明の修飾ウイルスおよび薬学的に許容できる担体または賦形剤を含む医薬組成物も本発明により提供される。
【０１３０】
本発明を、以下の非限定的な実施例を参照してより詳細に説明する。
【０１３１】
（発明を実施するための最良の形態）
実施例
一般手順および出発物質
組換えアデノウイルスファイバーは、ライゲーション（ｌｉｇａｔｉｏｎ）およびＰＣＲに基づく方法論（Ｃｌａｃｋｓｏｎら、Ｇｅｎｅｒａｌ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＰＣＲ ｔｏ ｇｅｎｅ ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ， ｉｎ ＰＣＲ， Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ， Ｅｄｓ ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ ＭＪ， Ｑｕｉｒｋｅ Ｐ ａｎｄ Ｔａｙｌｏｒ ＧＲ， ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ， Ｏｘｆｏｒｄ， ｐａｇｅ １８７，（１９９２））、すなわちＰＣＲ−ライゲーション−ＰＣＲ（Ａｌｖａｒｏら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １８： ７４６−７５０（１９９５））およびオーバーラップ伸長によるスプライシング（ＳＯＥ）（Ｈｏｒｔｏｎら、Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ａｎｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｏｆ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｕｓｉｎｇ ＰＣＲ， ｉｎ ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ ＭＪ（ｅｄ）， Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ， ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ １９９１，ｐ ２１７）を用いて構成した。ＰＣＲにより生成された遺伝子製品は、いわゆるＴＡクローニング（ＣｌａｒｋＪ．Ｍ．， Ｎｕｃ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １６： ９６７７−８６， （１９９８））を用いてベクターｐＣＲＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｏ．）中に一般的にクローニングされる。サブクローニングは、標準的方法（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ． Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ． Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ． Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， （１９８９））により、ベクターｐＧＥＸ−４Ｔ−３（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）中で実行した。組換えファイバーをコード化している遺伝子を、パーキン・エルマー社製ＡＢＩプリズムシーケンスを用いて配列決定し、以下で説明するベクターを用いて哺乳動物細胞（ＳＶ４０形質変換されたアフリカミドリザル腎臓細胞、ＣＯＳ７、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ， ＶＡ， ＵＳＡより入手）中で、バキュロウイルス発現（Ｋｉｔｔｓら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １４（５）： ８１０−７（１９９３））を用いて昆虫細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ， ＶＡ， ＵＳＡより入手のＳ． ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａからの Ｓｆ９細胞）中で発現させ（ウイルスおよびベクターは、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ， Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ， ＣＡ， ＵＳＡより入手）、ファイバー尾部、三量体ファイバーおよび新しい細胞結合リガンドに特異的なモノクローナル抗体で染色した。以下のパラメーターを、免疫染色により評価した。
【０１３２】
ｉ）核輸送
ｉｉ）新しい細胞結合リガンドの機能的発現
ｉｉｉ）三量体形成能力
組換えファイバーは、最近開発された手順（本明細書中の実施例７で説明）によりＡｄゲノム中に取り出した。全Ａｄ５ゲノムをＰａｃ１−Ｐａｃ１フラグメントとして含むプラスミドｐＴＧ３６０２（Ｃｈａｒｔｉｅｒら、Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．， ７０： ４８０５−１０， （１９９６））を出発物質として用いた。Ｓｐｅ１とＰａｃ１との間にあり野生型ファイバー遺伝子を含んでいるゲノムの約９ｋｂフラグメントを、ｐブルースクリプト中で別個にクローニングした。このフラグメントから、Ｓａｃ１とＫｐｎ１との間の約３ｋｂフラグメントをさらにサブクローニングした。ファイバーのＮｄｅ１部位の上流Ｎ末端ヌクレオチド以外の天然ファイバー遺伝子の欠失を３ｋｂフラグメント中で行い、その代わりにＸｈｏ１部位を、組換えファイバーのライゲーションを考慮して、Ｎｄｅ１とＸｈｏ１との間のファイバー欠失３ｋｂフラグメント（３ｋｂファイバーシャトル）中に導入した。
【０１３３】
組換えファイバーを持つ３ｋｂファイバーシャトルを、Ｅ．ｃｏｌｉ中での相同組換えを用いてＮｈｅ１で切断した９ｋｂフラグメント中に再導入した（Ｃｈａｒｔｉｅｒら、前出）。結果として得られた組換え９ｋｂフラグメントを、最終的に、Ｓｐｅ１とＰａｃ１によってベクターから切り取り、単離した２７ｋｂフラグメントにコスミドクローニングにより結合した。
【０１３４】
予期される特性の挿入の存在は、すべてのコスミドクローンにおいてＰＣＲにより立証された。コスミドクローンも、ＨｉｎｄＩＩＩで制限され、予期されるサイズの制限フラグメントの存在がゲル上で立証された。
【０１３５】
組換え体Ａｄゲノムを、Ｐａｃ１での制限後に単離し、適切な細胞を形質移入するために用いた。プラークの発生は、形質移入された細胞培養の顕微鏡検査により決定した。
【０１３６】
使用したプライマーについてのオリゴヌクレオチドプライマー名のリスト（すべて、５’−３’配列として与えられる）
2004504062.tif 000004
2004504062.tif 000005
実施例１：
三量体形成モチーフ（ヒト肺サーファクタントＤからのネック領域ペプチド）のアデノウイルスファイバーへの遺伝子挿入
Ａｄ５ＷＴファイバーをコード化している遺伝子は、ファイバーの最初の６つのコード化トリプレットと同一の上流プライマー（プライマー１７５）プラスＥｃｏＲ１部位およびファイバーの６つの末端コード化トリプレットまでアニーリングする下流プライマー（プライマー１４９）プラスＸｈｏ１部位を用いたＰＣＲによりＡｄ５ウイルスの調製品から得た。従って、得られたファイバー［ＳＥＱ．ＩＤ ＮＯ．： １］は、これらの制限部位を用いてベクターｐブルースクリプト中へクローニングし、同じ制限酵素を用いて他のベクター中へさらにサブクローニングできる。
【０１３７】
ファイバーペプチドは、ノブが外部三量体形成モチーフと交換された場合に作られた（下記を参照）。外部三量体形成モチーフ導入の背後にある目的は二重である。すなわち、ａ）天然の三量体形成シグナルを含んでいるノブだけでなくファイバーの細胞結合部分を除去すること、およびｂ）同時に、必要な三量体形成シグナルを供給することである。このケースでは、１つの特定のアミノ酸モチーフが使用された。すなわち、３６のａａ「ネック領域ペプチド」＝ヒト「肺サーファクタントタンパク質Ｄ」からのＮＲＰ［ＳＥＱ． ＩＤ Ｎｏ．： ２］（Ｈｏｐｐｅら、前出）である。留意すべきことは、ヒト肺サーファクタントタンパク質Ｄの三量体形成シグナルに続く８つのアミノ酸（ＫＫＶＥＬＦＰＮ）は、ＮＲＰ配列を含むすべての構成中で保持されるという点で、用いた配列はＮＲＰの実際の三量体形成部分より若干長いということである。配列ＫＫＶＥＬＦＰＮは、三量体形成シグナルとヒト肺サーファクタントＤのＣ末端炭水化物ドメインとの間の効率的なリンカーとして機能し、本明細書中で説明される組換えファイバーにおける同じ重要な機能を有していると見なされる。三量体形成モチーフについてのＤＮＡシーケンスコーディングが合成され、クローニングされ、配列決定により検証された。
【０１３８】
ＮＲＰモチーフをアデノウイルスファイバーに導入するため、ＮＲＰ配列は、ＮＲＰコーディング配列のＮ末端側にＳｐｈ１を含む上流プライマー２３８と、コーディング配列のＣ末端側にＸｈｏ１を含むリバースプライマー１９６と共にＰＣＲ（Ｃｌａｃｋｓｏｎら、前出）にかけた。Ｓｐｈ１およびＸｈｏ１による切断後、ＮＲＰ配列を、同じ酵素で切断したＷＴファイバー遺伝子中にライゲートさせた。結果として得られた組換えファイバーＡ１［ＳＥＱ． ＩＤ ＮＯ．： ３］は、ファイバー尾部と、ＮＲＰ三量体形成モチーフが続く最初のシャフト反復を含んでいる。構成および構成経路の概要については、図１および図２を参照。
【０１３９】
ノブの細胞結合機能を置き換えるため、続いて、外部三量体形成アミノ酸モチーフの他に、新しい細胞結合リガンドをファイバー中に導入した（下記を参照）。
【０１４０】
実施例２：
表皮成長因子（ＥＧＦ）とヒト肺サーファクタントＤから外部三量体形成モチーフとを有する遺伝子構成コード化組換えアデノウイルスファイバーの集合。
【０１４１】
構成および構成経路の概要については図１および図２を参照。
【０１４２】
ヒトＥＧＦ［ＳＥＱ． ＩＤ． ＮＯ．： ４］についてのＤＮＡ配列は、このプロジェクトにおいて合成し、クローニングし、配列決定した。次に、この配列を、オーバーラップ伸長によるスプライシングによって上述のＡ１ファイバーに結合した。このケースにおいては、ＥＧＦ遺伝子を、ブドウ球菌タンパク質Ａ由来アミノ酸リンカー［ＳＥＱ． ＩＤ． ＮＯ．： ５］についての配列を有するオーバーハングとＣｌａ１制限部位とを含む上流プライマー（２７０）（最初の７つのコーディングトリプレットと同一）と、下流プライマー（２２８）（＋鎖の７つの末端トリプレットに相補的かつＸｈｏ１部位を含む）とでＰＣＲにかけた。Ａ１ファイバー遺伝子は、遺伝子の最初の６つのコーティングトリプレットと同一でＥｃｏＲ１部位（１７５）を含む上流プライマーと、＋鎖の７つの末端コーディングトリプレットに相補的でＥＧＦ配列についてのバックプライマーにおけるオーバーハングに補足的なオーバーハングを含む下流プライマー（２６９）でＰＣＲにかけた。次に２つのＰＣＲ産物は、標準的ＳＯＥ条件（Ｈｏｒｔｏｎら、前出）の下でＰＣＲにより結合して、ファイバーＡ１ＥＧＦ［ＳＥＱ． ＩＤ． ＮＯ．： ６］を製作した。
【０１４３】
最初の７つのシャフト反復、ＮＲＰ三量体形成シグナル、ブドウ球菌リンカーおよびＥＧＦを有するファイバーを構成するため、ファイバーＡ１ＥＧＦを、ＮＲＰ配列の最初の７つの５’トリプレットと同一の上流プライマー（３２６）プラス上流Ｎｈｅ１部位およびＡ＋鎖の７つの末端トリプレットに補足的な下流プライマー（２２８）でＰＣＲにかけた。クローニング後、ＰＣＲ産物を、Ｎｈｅ１およびＸｈｏ１で制限し、同じ酵素で制限されたＷＴファイバー中にライゲートさせて、ファイバーＡ７ＥＧＦ［ＳＥＱ． ＩＤ． ＮＯ．： ７］を得、これはＡ１ＥＧＦに似ているが、Ａｄ５ファイバーの最初の７つのシャフト反復を含んでいるという点で異なる。
【０１４４】
実施例３：
単鎖抗体およびヒト肺サーファクタントＤからの外部三量体形成モチーフを有する組換えアデノウイルスファイバーをコード化している遺伝子構成の集合。
【０１４５】
２つのモノクローナル抗体単鎖フラグメントを用いて組換えアデノウイルスファイバーを構成した。最初のものは、モノクローナル抗体Ｇ２５０の単鎖フラグメント（ｓｃＦｖ）であり、これは、高い選択性を有し、ヒト腎癌細胞上でタンパク質抗原と反応することが示されている（Ｏｏｓｔｅｒｗｉｊｋら、Ｉｎｔ． Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ ３８： ４８９−９４，（１９８６））。第２のものは、モノクローナル抗体Ｃ２４２の単鎖フラグメントで、結腸直腸癌および膵癌と反応する（Ｊｏｈａｎｓｓｏｎ Ｃ．， Ｔｈｅｓｉｓ， Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｇ’ｔｅｂｕｒｇ，（１９９１））。
【０１４６】
Ｇ２５０構成
抗体Ｇ２５０の単鎖フラグメント（可変カッパー鎖すなわちＶＫ、リンカー、可変重鎖すなわちＶＨ、結合配列および定常重ドメイン２すなわちＣＨ２）を、以前に記載されているように（Ｗｅｉｊｔｅｎｓら、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， １５２（２）： ８３６−４３（１９９６））構成した。このＧ２５０構成は、［ＳＥＱ． ＩＤ． ＮＯ．：８］である。前述のＡ１およびＡ７ファイバー構成中へのクローニングを可能にするため、単鎖フラグメントを、プライマー４１６および４０３を用いたＰＣＲにより上流Ｃｌａ１部位および下流Ｘｈｏ１部位で供給した。
【０１４７】
Ｃ２４２構成
抗体Ｃ２４２の単鎖フラグメント（可変カッパー、リンカー、可変重および定常カッパーすなわちＣＫ）［ＳＥＱ． ＩＤ． ＮＯ．： ９］を、以下のようにして、オリジナルテンプレートとして抗体産生ハイブリドーマからのｃＤＮＡを用いるＳＯＥにより構成した。ＶＫＣＫはプライマー２７４および２７５を用いて増幅し、ＶＨＣＨ１はプライマー２５３および２７３を用いて増幅した。ｓｃＦｖ（単鎖可変フラグメント）（ＶＫＬｉｎｋｌｉｂＶＨ）は、ＳＯＥにより以下のように構成した。ＶＫおよびＶＨは、それぞれプライマー４１６／４１８および２６５／４１４を上述のテンプレートとしてのＶＫＣＫおよびＶＨＣＨ１と共に用いて別個に増幅し、プライマー４１４および４１６を用いたＳＯＥにより共に結合した。構成ＶＫＬｉｎｋＬｉｂＶＨ中では、ＶＫとＶＨとの間のリンカーは、以前に記載されているように、ランダム化された１８個のアミノ酸配列である（Ｔｎａｇら、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２７１： １５６８２−８６，（１９９６））。このリンカーについてのヌクレオチド配列は、プライマー４１８中に存在する。構成ＶＫＬｉｎｋＬｉｂＶＨは、ベクターｐＡＫ１００（Ｋｒｅｂｂｅｒら、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２０１： ３５−５５， （１９９７））中へクローニングした。パニングによる抗原結合材のファージ表示および選択は、以前に記載された方法（Ｋｒｅｂｂｅｒら、前出）を用いて実行した。本実験において、抗体Ｃ２４２と反応するＣａｎＡｇ抗原は、ストレプトアビジンコート管（ＣａｎＡｇ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｌｔｄ， Ｇ’ｔｅｂｕｒｇ， Ｓｗｅｄｅｎ）に結合させたビオチン化抗体Ｃ２４１（これは抗原上でＣ２４２以外の別のエピトープと結合する）に吸着させた。いくつかの結合剤が単離され、種々のリンカーを含んでいることが明らかにされた。配列によりリンカーＰＰＤＦＶＰＰＡＡＳＦＰＤＨＳＰＲＧ（１文字アミノ酸コード）を含むことが明らかにされている特定のＶＫリンカーＶＨ構成を、抗原結合能力に基づくさらなる研究用に選択した。ＣＫをＳＯＥによりこの構成に結合して、型式Ｃ２４２ＶＫＬｉｎｋＶＨＣＫを得た。このＳＯＥにおいて、ＶＫＬｉｎｋＬｉｂＶＨを、プライマー４１６および４７８を用いて増幅し、ＣＫをプライマー４７６および４７４を用いて増幅した。次に増幅産物を、プライマー４１６および４７４を用いてＳＯＥにより結合した。
【０１４８】
上述のＰＣＲ反応において、単鎖フラグメントについての遺伝子配列は、前述のＡ１およびＡ７ファイバー構成（構成および構成経路の概略については図１および図２参照）中へのライゲーションを可能にしてファイバーＡ１Ｇ２５０、Ａ７Ｇ２５０、Ａ１Ｃ２４２およびＡ７Ｃ２４２（図１および［ＳＥＱ Ｉ．Ｄ． ＮＯ． １０−１３］）を構成するため、上流Ｃｌａ１部位（プライマー４１６および４７３中に存在）および下流Ｘｈｏ１（プライマー４０３および４７４中に存在）で供給された。
【０１４９】
実施例４：
抗体およびヒト肺サーファクタントＤからの外部三量体形成モチーフを有する組換えアデノウイルスファイバーをコード化している遺伝子構成の集合。
【０１５０】
単独のブドウ球菌タンパク質Ａドメインの構造に基づく１価および２価のの抗原結合構造が、組換えアデノウイルスファイバー中に組込まれた場合に機能的に発現されるかどうかを調査するため、哺乳動物および昆虫細胞発現についての遺伝子構成を作った。ブドウ球菌タンパク質Ａ由来のＩｇＧ結合Ｚドメイン（ＺＩｇＧ）（Ｎｉｌｓｓｏｎ Ｂ．， Ｐｒｏｔ． Ｅｎｇ． １：， １０７−１３（１９８７））［ＳＥＱ． ＩＤ． ＮＯ．： １４］またはファージ表示を用いて選択されたＺドメイン由来ＩｇＡ特異的抗体（ＺＩｇＡ）（Ｇｕｎｎｅｒｉｕｓｓｏｎ Ｅ．ら、Ａｐｐ． Ｅｎｖ． Ｍｉｃｒｏ．， ６５： ４１３４−４０，（１９９９））［ＳＥＱ． ＩＤ． ＮＯ．： １５］を含む組換えアデノウイルスファイバーをコード化する構成の集合を以下の通り実行した。
【０１５１】
それぞれの親和性部分をコード化している遺伝子は、以下のプラスミドテンプレート上でプライマー５０３および５０４を用いたＰＣＲにより増幅した：Ｚドメイン構成についてはｐＥＡＡｍｐ１８（Ｔａｎｇら、前出）、ＺＩｇＡ構成についてはｐｋＮ１−ｄＺＩｇＡ（Ｃｌａｃｋｓｏｎら、前出）。
【０１５２】
ＰＣＲ増幅において、２つの異なる親和性リガンドのための遺伝子は、結果としてそれぞれ組換えファイバーＡ７ＺＩｇＧ［ＳＥＱ． ＩＤ． ＮＯ．：１６］およびＡ７ＺＩｇＡ［ＳＥＱ． ＩＤ． ＮＯ．： １７］となる上記のファイバー遺伝子Ａ７ＥＧＦ中へのライゲーションに適した読み取り枠中における上流ＣｌａＩ部位および下流ＸｈｏＩ部位と共に供給され、前記組換えファイバーは、新しい結合特異性を有する組換えウイルスの産生のために後にＡｄゲノム（以下を参照）中に回復されるように適合させた。さらに、ファイバーＡ１ＺＩｇＧは、前述のファイバーＡ１ＥＧＦ中への修飾ＺＩｇＧのライゲーションにより構成した（図１参照）。
【０１５３】
加えて、第３の遺伝子構成を、上記の親和性ドメインを両方を含んでいるファイバーをコード化して集合させた。この構成は、ファイバー尾部、最初の７つのシャフト反復、ＮＲＰ配列、ブドウ球菌タンパク質Ａリンカー、ＩｇＧ結合Ｚ領域、ＩｇＡ結合アフィボディが続くＮＲＰ（ＫＫＶＥＬＦＰＮ）からの８つのアミノ酸リンカーを含むファイバーをコード化する。このファイバーを構成するため、２つの異なる親和性ドメインを最初に、リンカー配列ＫＫＶＥＬＦＰＮをコード化しているヌクレオチド配列に補足的なオーバーハングを有するプライマー５５０および５５１を用いるＳＯＥにより遺伝学的に結合した。ＰＣＲプロセスにおいて、上流ＣｌａＩ部位および下流ＸｈｏＩ部位は、ライゲーションを可能にするプライマーによりファイバーＡ７ＥＧＦ遺伝子構成を含んでいるベクターｐＧＥＸ−４Ｔ−３中へ導入し、ファイバーＡ７ＺＩｇＧ／ＺＩｇＡ［ＳＥＱ． ＩＤ． ＮＯ．： １８］を得た。
【０１５４】
２つの連結されたＺＩｇＧドメインを含むファイバーをコード化するため、さらなる遺伝子構成も集合させた。この遺伝子はファイバーＡ７ＺＩｇＧ／ＺＩｇＧ［ＳＥＱ． ＩＤ． ＮＯ．： １９］についてコード化し、さらにＰＣＲ反応においてＺＩｇＡの代わりにＺＩｇＧのための遺伝子が用いられたこと以外はＡ７ＺＩｇＧ／ＺＩｇＡについて説明したとおりに集合させた。
【０１５５】
構成と構成経路の概略については図１および図２を参照。
【０１５６】
実施例５：
結合能評価
組換えファイバーをコード化している遺伝子は、オランダベクターｐｃＤＮＡ（サイトゾル中での発現のためにタンパク質を標的にする）およびｐＳｅｃＴａｇ（分泌産物としての発現のためにタンパク質を標的にする）（どちらもオランダ国グローニンゲン市Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＢＶ社製）中にクローニングし、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ， Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ， ＭＤ， ＵＳＡ）を用いて、製造元の説明通りに、ＣＯＳ７細胞中に形質移入した。
【０１５７】
組換えファイバーの発現および細胞局在化は、以下の１次試薬を用いた免疫染色により評価した。
【０１５８】
マウスモノクローナル抗体４Ｄ２．５（抗Ａｄ５ファイバー）（米国アラバマ州バーミンガム大ジェフリー・エングラー博士のご好意により提供）（Ｓｈｉｎ Ｈｏｎｇら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １８５： ７５８−７６７，（１９９１））。
【０１５９】
マウスモノクローナル抗体２Ａ６．３６（抗三量体化Ａｄ５ファイバー）（米国アラバマ州バーミンガム大ジェフリー・エングラー博士のご好意により提供）（Ｓｈｉｎ Ｈｏｎｇら、前出）。
【０１６０】
表皮成長因子に対するマウスモノクローナル抗体（ＥＧＦ）＝ａ−ＥＧＦ（Ｃａｍｂｉｏ， Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ， ＵＫ， Ｃａｔ ｎｏ ＣＡ ９５４）。
【０１６１】
モノクローナル抗体Ｃ２４２に対するビオチン化マウスモノクローナル抗イディオタイプ抗体＝ａ−ＩｄＣ２４２（Ｌｉｎｄｈｏｌｍら、未発表の結果）。
【０１６２】
モノクローナル抗体Ｇ２５２に対するビオチン化マウスモノクローナル抗イディオタイプ抗体＝ａ−ＩｄＣ２５２（オランダ国ロッテルダム市、Ｄａｎｉｅｌ Ｄｅｎ Ｈｏｅｄ癌センター、Ｒｅｉｎｄｅｒ Ｂｏｌｈｕｉｓ氏のご好意により提供）。
【０１６３】
アフィボディ活性評価用ヒトポリクローナルＩｇＧおよびＩｇＡ＝ＨＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｆｉｎｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ， Ｃａｔ ｎｏ Ｉ４５０６）およびＨＩｇＡ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｆｉｎｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ， Ｃａｔ ｎｏ Ｉ１０１０）。
【０１６４】
２次試薬は以下の通りであった。
【０１６５】
マウス抗体同定用：ＦＩＴＣ標識Ｆ（ａｂ）２ウサギ抗マウス免疫グロブリン（ＤＡＫＯ Ａ／Ｓ， Ｇｌｏｓｔｒｕｐ， Ｄｅｎｍａｒｋ， Ｃａｔ ｎｏ Ｆ０３１３）＝ａＭＩｇ。
【０１６６】
ヒトＩｇＧ同定用：ＦＩＴＣ標識Ｆ（ａｂ）２ウサギ抗ヒトＩｇＧ（ＤＡＫＯ Ａ／Ｓ， Ｇｌｏｓｔｒｕｐ， Ｄｅｎｍａｒｋ，Ｃａｔ ｎｏ Ｆ０３１５）＝ａＨＩｇＧ。
【０１６７】
ヒトＩｇＡ同定用：ＦＩＴＣ標識Ｆ（ａｂ）２ウサギ抗ヒトＩｇＡ（ＤＡＫＯ Ａ／Ｓ， Ｇｌｏｓｔｒｕｐ， Ｄｅｎｍａｒｋ，Ｃａｔ ｎｏ Ｆ０３１６）＝ａＨＩｇＡ。
【０１６８】
ビオチン化抗体同定用：ＦＩＴＣ標識ストレプトアビジン（ＤＡＫＯ Ａ／Ｓ， Ｇｌｏｓｔｒｕｐ， Ｄｅｎｍａｒｋ， Ｃａｔ ｎｏ Ｆ０４２２）。
【０１６９】
簡単には、細胞はＳｈａｎｄｏｎ Ｃｙｔｏｓｐｉｎ２細胞遠心分離機中で顕微鏡スライド上に遠心分離し、室温一晩空気乾燥した。調製品は、ｐＨ７．４のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中の３％パラホルムアルデヒドで固定し、ＰＢＳ中の０．１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００で透過化処理した。ＰＢＳで洗った後、調製品を、１次試薬と共に湿潤チャンバー内で３０分間３７℃でインキュベートし、ＰＢＳ中で再度洗い、２次試薬と共に湿潤チャンバー内で３０分間３７℃でインキュベートした。ＰＢＳ中で洗った後、調製品を、５０％グリセリンと共にＰＢＳ中にマウントし、適切な光源とＦＩＦＴ用フィルタを備えたＺｅｉｓｓ Ａｘｏｐｈｏｔ顕微鏡で観察した。
【０１７０】
結果を表２および表３に示す。対応するファイバーが分泌産物として発現される場合に、種々のリガンドのすべてが適切な結合を示すことは明らかである。しかしながら、ファイバーがサイトゾル中で発現され、続いて核へ輸送された場合に、アフィボディだけが予期される正しい結合を示す。従って、すべてのリガンドがサイトゾルおよび核中で正しく折り返せるわけではない。興味深いことは、サイトゾル内および核内（アフィボディ）環境に耐えられるリガンドは、そのコンホメーションについてＳ−Ｓブリッジに依存しない小さいα螺旋構造であるのに対して、サイトゾル／核内で適切に発現されないことが明らかになったすべてのリガンドは、サイトゾル中で非常に不十分にしか形成されないかあるいは全く形成されないＳ−Ｓブリッジに依存するコンホメーションを有する。
【０１７１】
【表２】
2004504062.tif 000006
【０１７２】
【表３】
2004504062.tif 000007
【０１７３】
新しい細胞結合リガンドを含んでいるウイルス構造成分が哺乳動物細胞サイトゾル、すなわちアデノウイルス中で合成されたヒトの遺伝子治療用のそれらの再標的化ウイルスが構成されたことを、結果は明らかに意味している。以下は、そのような再標的化アデノウイルスがどのように構成できるかを示す２つの例である。
【０１７４】
実施例６：
ＣＤＲループのグラフティング
モノクローナル抗体の特定の単鎖構成は、哺乳動物細胞サイトゾル中でさえもそれらの結合特異性を保持する（Ｃａｔｔａｎｅｏら、ＴＩＢＴＥＣＨ １７： １１５−１２１， （１９９９））。これは、抗体可変領域のいわゆるフレームワーク領域の機能である。組換えＤＮＡ技術により抗原結合ＣＤＲループが１つの抗体から他のものへ転移でき、それによって一方の抗体からのフレームワーク特性と、他方の抗体からの結合特性とを有する抗体を作り出せることが知られている（方法論については、Ｅｍｅｒｙら、Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ ＨｕｍａｎｉｚｉｎｇＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ， ｉｎ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， Ｃａｒｌ Ａ．Ｋ． Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ， （ｅｄ．）， Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ １９９５， ｐａｇｅ １５９を参照）。
【０１７５】
そのようなループグラフト単鎖抗体は、サイトゾル中での折り返しおよびこのようにして作られた細胞核へのその後の輸送が可能な可変ドメインフレームワークに基づいて、その後に遺伝子レベルにおける適切なクローニング部位で供給、ファイバーＡ７ＲＧＤコード化遺伝子中へのライゲーション、および以下（実施例７）で説明されるようにアデノウイルスゲノム中に回復し得る。
【０１７６】
実施例７：
アデノウイルスゲノムへの組換えファイバーの回復
Ａｄゲノムにおいてコード化される野生型ファイバーは、本プロジェクトで開発された以下の方法により組換えファイバーで置換した。この方法において、プラスミドｐＴＧ３６０２（Ｅｍｅｒｙら、前出）中の野生型Ａｄ５ゲノムは、組換えファイバーをコード化する遺伝子のためのレセプターとして用いた。このプラスミドは、Ｐａｃ１リンカーによりプラスミドバックボーンに結合された野生型Ａｄ５ゲノム全体を含んでいる。Ｐａｃ１部位がＡｄゲノムに欠けているので、全体ゲノムはＰａｃ１による切断後に線状ＤＮＡフラグメントとして回収できる。結果として得られる線状ＡｄＤＮＡは次に、ウイルスを産出するために、感受性細胞に形質移入できる（Ｃｈａｒｔｉｅｒら、前出）。このプラスミドから、Ａｄゲノムは、酵素Ｐａｃ１およびＳｐｅ１を用いて、一方が２７ｋｂで他方が９ｋｂの２つのフラグメントとして切断できる。９ｋｂフラグメントはｐブルースクリプトにクローニングされている。ファイバーを含んでいる９ｋｂフラグメントから、ファイバー遺伝子を含んでいる３ｋｂＳａｃ１−Ｋｐｎ１フラグメントをさらにサブクローニングした。ファイバー遺伝子は、ファイバーの尾部中のＮｄｅ１部位と、ファイバー遺伝子のすぐ下流側に位置するＭｕｎ１部位との間で欠失され、Ｘｈｏ１部位と下流配列とを含んでいるアダプターを、Ｎｄｅ１とＭｕｎ１部位の間に導入してファイバーシャトルベクターを得た。いくつかの組換えファイバーをこのシャトルベクターのＮｄｅ１およびＸｈｏ１との間でライゲートさせ、その後Ｅ．ｃｏｌｉ中での相同的組換えにより上述の９ｋｂフラグメント中で回復し（Ｃｈａｒｔｉｅｒら、前出）。これは、ファイバー発現を調節しているすべての正常な要素が無傷で残されたことを意味している。
【０１７７】
最後に、組換え９ｋｂフラグメントを、コスミドクローニングにより２７ｋｂフラグメントに別個に結合させて完全なＡｄゲノムを再形成した。
【０１７８】
２７ｋｂフラグメントは、Ｈｅらが記載しているＡｄ−ＹＦＧのようなアデノウイルスゲノムから誘導することもできる（Ｈｅ Ｔ−Ｃ， Ｚｈｏｕ Ｓ， ＤａＣｏｓｔａ ＬＴ， Ｙｕ Ｊ， Ｋｉｎｚｌｅｒ ＫＷ ａｎｄ Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎ Ｂ： Ａ ｓｉｍｐｌｉｆｉｅｄ ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｄｅｎｏｖｉｓｕｒｅｓ． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ， ＵＳＡ， ９５： ２５０９−２５１４， １９９８）。２７ｋｂフラグメントがｐＴＧ３６０２から誘導されれば、結果として得られるゲノムはＷＴＥ１＋となり、その一方でＡｄ−ＹＦＧからの２７ｋｂフラグメントは、Ｅ１欠失ウイルスを複製用に例えば低継代２９３を必要とするようにするであろう。
【０１７９】
上記の操作により得られる組換え体Ａｄゲノムは、最終的に、Ｐａｃ１で切断することによって線状フラグメントとして得られ、許容細胞系に形質移入するために用いることができ、この細胞系は次に、ゲノムが機能的であれば、ウイルスプラークを産出する。これらの形質移入には、ＦｕＧＥＮＥ６形質移入剤（Ｒｏｃｈｅ）を用いた。
【０１８０】
種々の組換えファイバーはＡｄゲノム中に回復し、その後許容細胞中にトランスフェクトした。結果を下記の表４に示す。説明されたファイバーのうちで、ＷＴノブとアフィボディＡ７ＺＩｇＧ／ＩｇＧを含むものだけが機能的ビリオンにすることが可能であった。結果は、表２および表３で示した結果と完全に一致する。
【０１８１】
【表４】
2004504062.tif 000008
【０１８２】
（＊）２９３／Ｆｃ細胞は、膜タンパク質として発現されたヒトＩｇＧからのＦｃ３（１）で安定的に形質移入された２９３細胞である。２９３／Ｆｃを作るため、Ｚ−ドメインと反応するヒトＩｇＧからのクローニングされたＦｃ３（１）（Ｊｅｎｄｅｂｅｒｇ， Ｌ．， Ｎｉｌｓｓｏｎ， Ｐ．， Ｌａｒｓｓｏｎ， Ａ．， Ｎｉｌｓｓｏｎ， Ｂ．， Ｕｈｌｅｎ， Ｍ．， ａｎｄ Ｎｙｇｒｅｎ， Ｐ．−Ａ（１９９７）”Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ Ｆｃ１ ａｎｄ Ｆｃ３ ｆｒｏｍ ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｇ ｔｏ ａｎａｌｙｓｅ ｓｕｂｃｌａｓｓ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｆｏｒ ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ” Ｊ． Ｉｍｍ． Ｍｅｔｈｏｄｓ ２０１， ２５−３４．）を、このベクター中に存在するＰＤＧＦＲ膜貫通ドメイン配列存在でフレーム内のベクターｐＤｉｓｐｌａｙ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中に連結させた。ＰＤＧＦＲ膜貫通ドメイン配列に融合されたＦｃ配列を含んでいるコード化配列を次に、制限酵素Ｓｆｉ１およびＮｏｔ１を用いてベクターから切断し、同じ酵素で切断された（ゼオシン耐性遺伝子を持つ）ベクターｐＳｅｃＴａｇ中に連結させた。再構成されたベクターを、ＦｕＧＥＮＥを用いて低継代２９３細胞中に形質移入し、細胞は、安定的に変換された細胞を選択するため、選択圧下に置いた。クローンを単離し、ＦＩＴＣ標識したブドウ球菌タンパク質Ａ（Ｓｉｇｍａ）を用いて膜結合Ｆｃ３（１）の膜発現について試験した。膜結合Ｆｃを均質に発現する１つの２９３クローンを、ゲノムを含むＡ７ＺＩｇＧ／ＺＩｇＧの形質移入に用いてビリオンを産生した。
【０１８３】
実施例８：
アフィボディおよび切断可能野生型ノブを有する組換えアデノウイルスファイバーをコード化する遺伝子構成の集合
外部リガンドを含む非天然ポリペプチド、ここではアフィボディと、Ｃ末端配置野生型ノブとを両方含有している切断可能ファイバーを、ノブを切断してアフィボディを露出できるように、細胞結合構造の間に位置する活性化された因子Ｘ部位により構成した。これにより、ノブのタンパク分解除去後のアフィボディによる定義される新しい標的細胞の次の感染による２９３細胞中のウイルス産生が可能になる。
【０１８４】
種々のリガンドのライゲーション用の切断可能ファイバーを構成するため、Ｃｌａ１、Ｍｕｎ１および因子Ｘａ認識部位を、反復２２の最初の７つのトリプレットの前に導入する上流プライマー（４３７）と、ファイバーノブ終端でプライミングする下流プライマー１４９とでＷＴファイバーをＰＣＲにかけた。クローニングおよびＣｌａ１とＸｈｏ１とでの制限後、ＤＮＡフラグメントを、以前に言及したＡ７ファイバー構成中にクローニングした。結果として得られるファイバー遺伝子は、Ｎ末端から、尾部についての配列、最初の７つのシャフト反復、ＮＲＰ三量体形成シグナル、ブドウ球菌タンパク質Ａからのリンカー、Ｃｌａ１部位、Ｍｕｎｉ部位、Ｘａ切断部位、反復２２および野生型ノブを含んでいる。このファイバー遺伝子中へのライゲーションのため、アフィボディＺＩｇＧのための遺伝子を、前述の「Ｘａファイバー」遺伝子中に連結されたプライマー５０３および５０５を用いて、上流Ｃｌａ１部位および下流Ｍｕｎ１部位でＰＣＲにより供給した。結果として得られるファイバー遺伝子は、Ｎ末端から、尾部についての配列、最初の７つのシャフト反復、ＮＲＰ三量体形成シグナル、ブドウ球菌タンパク質Ａからのリンカー、Ｃｌａ１部位、新たなリンカー、Ｍｕｎｌ部位、Ｘａ切断部位、反復２２および野生型ノブを含んでいる。
【０１８５】
ファイバー遺伝子はアデノウイルスゲノム中に回復した（実施例７を参照）。
【０１８６】
組換えゲノムは、２９３細胞中に形質移入し、ビリオンを産生してＣｓＣｌ勾配上で精製した。精製ビリオンを、５０ｍＭトリス−ＣｌｐＨ８．０；１００ｍＭＮａＣｌ；５ｍＭＣａＣｌ２中の活性化された因子Ｘ（Ｘａ）（Ｓｉｇｍａ）により室温で４８時間で切断した。１ＵのＸａをウイルス懸濁液５μＬに対して用いた。
【０１８７】
ビリオン上でのＺＩｇＧアフィボディの結合についてのアッセイは、本質的には以下の通り実行した。ウイルス懸濁液をＰＶＤＦ膜（Ｂｉｏｒａｄ）上にブロットした。トリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）、ｐＨ７．４、中の３％ゼラチンでのブロック後、膜をＦＣ１０μｇ／ｍＬと共にＴＢＳ中の１％ゼラチン中で室温で９０分間インキュベートし、洗浄し、抗ヒトＩｇＧ−ＨＲＰ（Ｄａｋｏｐａｔｔｓ）と共にＴＢＳ／１％ゼラチン中で室温で９０分間インキュベートし、洗浄し、４−クロロナフトール試薬（Ｂｉｏｒａｄ）中で展開した。ＷＴおよび組換えウイルスの染色の結果を、種々の対照と共に図３に示す。組換えウイルスが、ＷＴＺに結合するＦｃ３（１）と結合し、それに対してＷＴＺに結合しないＦｃ３が組換えウイルスと結合できないことは明白である（Ｊｅｎｄｅｂｅｒｇ， Ｌ．， Ｎｉｌｓｓｏｎ， Ｐ．， Ｌａｒｓｓｏｎ， Ａ．， Ｎｉｌｓｓｏｎ， Ｂ．， Ｕｈｌｅｎ， Ｍ． ａｎｄ Ｎｙｇｒｅｎ， Ｐ．−Ａ． （１９９７） ”Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ Ｆｃ１ ａｎｄ Ｆｃ３ ｆｒｏｍ ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｇ ｔｏ ａｎａｌｙｓｅ ｓｕｂｃｌａｓｓ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｆｏｒ ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ” Ｊ． Ｉｍｍ． Ｍｅｔｈｏｄｓ２０１， ２５−３４）。ＷＴウイルスはどちらのＦｃ調製品とも結合しない。
【０１８８】
実施例９：
機能性コンホメーションおよび結合特異性についての非天然ポリペプチドのアッセイ
候補的ポリペプチドは、適切な構成中への対応するコード化配列の挿入によりウイルス成分タンパク質の一部として発現される。１つ以上の成分が対応する組換え成分遺伝子により交換されているウイルスゲノム全体を含む構成は、組換えウイルスゲノムによってコード化された組換えウイルスの増殖に適した細胞系中で発現される。ＷＴ細胞結合機能が組換えゲノム中に保持されるかどうかによって、２つの主要な可能性がある。
【０１８９】
もしＷＴ細胞結合機能が保持されれば、ウイルスは、アデノウイルスの場合の２９３のような正常な産生株系において産生できる。細胞外リガンドに結合し、機能性ビリオンの一部となることを可能にするコンホメーション中で発現される非天然ポリペプチドの能力は、ビリオン上での結合研究により評価する。このやり方は、上記の実施例８で用いた方法により例示されており、そこではウイルスファイバーはＷＴノブおよび非天然の結合リガンドの両方を含んでおり、ノブはタンパク分解切断によって除去できる。非天然ポリペプチドの結合機能は標準固相免疫技術により実証された。同じ目的を達成するための別の方法は、組換えファイバーでだけでなく天然ノブの置換として非天然ポリペプチドを含むＷＴファイバーでビリオンを産生することであろう。
【０１９０】
もしＷＴ細胞結合機能がウイルスゲノムから欠失されていれば、ビリオンは細胞結合について非天然ポリペプチドに依存するであろう。従って、細胞系が組換えウイルスのエントリーを可能にできなければならないのであれば、必要なら、組換えウイルスに欠けている可能性がある遺伝情報、例えばＥ１についての配列を供給できなければならない。もし組換えゲノムがＥ１欠失であれば、１つの解決策は、２９３のようなＥ１形質移入された細胞系を使用し、組換えウイルスゲノムによりコード化された非天然ポリペプチドに結合可能なレセプターをこれらに安定的に形質移入することである。対応するレセプター構造に結合可能とし、機能性ビリオンの一部とするコンホメーション中で発現される非天然ポリペプチドの能力は、ウイルスゲノムの形質移入に続く細胞中のプラーク形成についてのスクリーニングにより評価される。この方法は、上記の実施例７で使用され、そこではヒトＩｇＧからの膜結合Ｆｃを安定的に発現する２９３細胞がビリオンの産生に用いられ、ＷＴ結合機能がアフィボディＺＩｇＧと置換されている。非天然ポリペプチドの正確な結合特性は、細胞結合に関与する非天然ポリペプチドに構造的に関連したペプチドとウイルスが結合について競合できる研究においてさらに決定できる。
【０１９１】
実施例１０：
抗βガラクトシダーゼ単鎖Ｆｖフラグメント
実施例３中で説明した実験の続きにおいて、βガラクトシダーゼとの反応性を有しかつ細胞質中で発現され得る（Ｍａｒｔｉｎｅａｕ ＰおよびＢｅｔｔｏｎ Ｊ−Ｍ： Ｊ． Ｍｏｌ． ２９２， ９２１−９２９（１９９９））単鎖可変鎖フラグメント（ＶＫ、リンカー、ＶＨ）を、前述のＡ７ファイバー構成中にクローニングした。この単鎖フラグメントは［ＳＥＱ． ＩＤ． ＮＯ．： ４７］である。前述のＡ７ファイバー構成中へのクローニングを可能にするため、単鎖フラグメントを、Ｎｃｏ１／ＥｃｏＲ１によってプラスミドｐＰＭ１６３Ｒ４から切断し（Ｍａｒｔｉｎｅａｕ ＰおよびＢｅｔｔｏｎ Ｊ−Ｍ、前出）、単鎖フラグメントのインフレームライゲーション（ｉｎ−ｆｒａｍｅ　ｌｉｇａｔｉｏｎ）を可能とするＣｌａ１−Ｎｃｏ１−ＥｃｏＲ１−Ｘｈｏ１アダプターで供給された前述のファイバーＲ７ＥＧＦを含んでいるプラスミド中へ連結した。
【０１９２】
実施例５で説明した実験の続きにおいて、βガラクトシダーゼとの反応性を有する単鎖可変鎖フラグメント（ＶＫ、リンカー、ＶＨ）を含んでいる組換えファイバーの発現および細胞局在化は、以下の付加的な１次試薬、すなわちβガラクトシダーゼ−ビオチン（ＳＩＧＭＡ， Ｇ ５０２５）を用いた免疫染色により評価した。
【０１９３】
表２に示す結果に加え、抗βガラクトシダーゼ単一鎖Ｆｖフラグメントファイバー構成についての同等の実験で得られた結果を表５に示す。
【０１９４】
【表５】
2004504062.tif 000009
【０１９５】
表３に示した結果に加え、抗βガラクトシダーゼ単一鎖Ｆｖフラグメントファイバー構成についての同等の実験で得られた結果を表６に示す。
【０１９６】
【表６】
2004504062.tif 000010
【０１９７】
実施例１１：
ファイバータンパク質の表現型分析
以下は、複合ポリペプチドリガンドが修飾アデノウイルスファイバータンパク質中に組入れられた、本発明の修飾ウイルスのさらなる例である。この例は、再標的化された生育可能かつ機能性Ａｄベクターの生成についての２つの特徴の重要性を実証するものである。すなわち、（ｉ）ファイバー構造修飾はそれでもなお、ウイルスの効率的な付着および細胞エントリーを考慮すべきであること、および（ｉｉ）ファイバー中に挿入されたリガンドは、哺乳動物細胞細胞質中で正確な折り返しが可能であるべきこと、である。溶解性は、ジスルフィド結合の欠如に一般に結び付けられる正確な折り返しの評価に便利に用いられる。好ましくは、本明細書中で記載された非天然ポリペプチドは、ジスルフィド結合を２つだけ有し、典型的には１つだけ、そして最も好ましくはジスルフィドを結合１つも有さない。
【０１９８】
材料および方法
細胞。ＨＥＫ−２９３細胞はＭｉｃｒｏｂｉｘＩｎｃ．（Ｔｒｏｎｔｏ， Ｏｎｔａｒｉｏ， Ｃａｎａｄａ）から入手した。Ｃｏｓ７、Ａ４３１およびＣｏｌｏ２０５細胞はＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ： Ｍａｎａｓｓａｓ， Ｖｉｒｇｉｎｉａ）から購入し、Ａ７５およびＧ４３細胞は、Ｒｅｉｎｄｅｒ Ｂｏｌｈｕｉｓ（Ｄａｎｉｅｌ Ｄｅｎ Ｈｏｅｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｎｔｅｒ， Ｒｏｔｔｅｒｄａｍ， Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄ）から入手した。すべての細胞は、１０％ウシ胎仔血清（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）と５０ｍｇ／ｍｌゲンタマイシン（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）を補ったＩｓｃｏｖｅ培地（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）中で、３７℃および５％ＣＯ２で維持した。Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ（Ｓｆ９）細胞（ＡＴＣＣ）は、上記と同じサプリメントを補ったＴＣ１００培地（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）中で２８℃で培養した。
【０１９９】
抗体。表皮成長因子（ＥＧＦ）に対するモノクローナル抗体（ｍＡｂ）はＣａｍｂｉｏ Ｌｔｄ．（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ， ＵＫ）から購入した。単鎖Ｔ細胞レセプター（ｓｃＴＣＲ）のＶαおよびＶβドメインに向けられた抗体、およびｍＡｂＧ２５０（ＮＵＨ３１およびＮＵＨ８４）に向けられた抗イディオタイプ抗体は、Ｒｅｉｎｄｅｒ Ｂｏｌｈｕｉｓのご好意により供給された。ファイバー尾部（４Ｄ２．５）に対するＭＡｂおよびファイバー三量体（２Ａ６．３６）に対するｍＡｂは、Ｊｅｆｆ Ｅｎｇｌｅｒ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ａｌａｂａｍａ ａｔ Ｂｉｒｍｉｎｈａｍ， ＡＬ）から入手した。ＣＡＲ−ブロッキング、ファイバーノブ指向ｍＡｂ１Ｄ６．１４は、Ｂｕｃｋ Ｒｏｇｅｒｓ（ＵＡＢａｔ Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ， ＡＬ）から供給された。Ｏ結合ＧｌｃＮＡｃ残基について特異性のモノクローナル抗体ＲＬ２は、Ｊｅｆｆ Ｅｎｇｌｅｒを介してＬａｒｒｙ Ｇｅｒａｃｅから入手した。ｍＡｂＣ２４２に向けられたビオチン化抗イディオタイプ抗体（Ｉｄ１、Ｉｄ１３およびＩｄ２０）は、オリジナルのハイブリドーマから産出した。西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識したストレプトアビジン、フルオロセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）標識したウサギ抗マウス免疫グロブリンＧおよびストレプトアビジン−ＦＩＴＣは、ＤＡＫＯ（Ｇｌｏｓｔｒｕｐ， ＤＫ）から購入した。
【０２００】
組換えブレスファイバーの発生および命名。組換えファイバー遺伝子は、ライゲーション、ＰＣＲおよびオーバーラップ伸長によるスプライシング（ＳＯＥ）に基づく方法を用いて構成した。ＰＣＲにより発生した遺伝子配列は、サブクローニングの前に配列決定した。Ａｄ５ＷＴファイバーをコード化している遺伝子は、ｐＡＢ２６（Ｍｉｃｒｏｂｉｘ， Ｔｒｏｎｔｏ， Ｃａｎａｄａ）から、上流ＢａｍＨＩおよび下流Ｘｈｏをそれぞれ導入するフォワードプライマー（ＳＥＱ． ＩＤ ＮＯ： ４８）５’−ＣＴＣ ＧＧＡ ＴＣＣ ＧＡＴ ＧＡＡ ＧＣＧ ＣＧＣ ＡＡＧ ＡＣＣ ＧＴＣ ＴＧＡ Ａ−３’およびリバースプライマー（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４９）５’−ＴＴＣ ＣＴＣ ＴＴＡ ＴＴＣ ＴＴＧ ＧＧＣ ＡＡＴ ＧＴＡ ＴＧＡ−３’を用いたＰＣＲにより得た。組換えファイバーにおいて、ノブドメインは欠失され、ヒト肺サーファクタントタンパク質Ｄのネック領域ペプチド（ＮＲＰ）から誘導した３６アミノ酸（ａａ）外因性三量体形成モチーフにより置き換えられた。ブドウ球菌タンパク質Ａ（Ｓｔａｐｈ−Ａリンカー：ＡＫＫＬＮＤＡＱＡＰＫＳＤ）からのリンカー配列が続くＮＲＰ配列（ＰＤＶＡＳＬＲＱＱＶＡＥＬＱＧＱＶＱＨＬＱＡＡＦＳＱＹＫＫＶＥＬＦＰＮＧ）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２）を、種々の長さ、１、７または２２回反復のファイバーシャフトのＣ末端に連結した。
【０２０１】
結果として得られる構成は、Ｒ１、Ｒ７およびＲ２２とそれぞれ名付けた。再標的リガンドを、Ｓｔａｐｈ−ＡリンカーのＣ末端部に付加した。種々のリガンドの便利なクローニングのため、ＣｌａＩおよびＸｈｏＩ部位をリンカー配列の後に導入した。以下で言及する全リガンドは、これらの制限部位により提供され、リガンドの名称は、ファイバー名のシャフト反復数の後に示した。例えば、Ｒ１−ＲＧＤ、Ｒ７−ＥＧＦ等である（図４）。Ｒ７−ノブは、端を切り取った（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）ファイバーシャフト（１〜７の反復）を指し、ＮＲＰ、Ｓｔａｐｈ−Ａリンカーおよび天然ノブドメインを有し、最後のシャフト反復とシャフトノブ接合を含む（図４）。２つのＲ７−ノブファイバー構成について１つの付加的リンカーが、ＮＲＰのＮ末端側に位置するＮｈｅＩ部位中に挿入された。これらのリンカーは、Ａｄ５ＷＴファイバーシャフト反復１７（Ｌ１７： ＴＴＴＡＣＡＧＣＴＴＣＡＡＡＣＡＡＴＴＣＣＡＡＡＡＡＧＣＴＴＧＡＧ）およびファイバーシャフト反復２２（Ｌ２２ ＧＧＡＡＡＣＡＡＡＡＡＴＡＡＴＧＡＴＡＡＧＣＴＡＡＣＴＴＴＧＴＧＴＧＡＣＣ）から誘導され、それぞれＲ７−Ｌ１７−ノブおよびＲ７−Ｌ２２−ノブと名付けた。ファイバーの概略を図４に示す。
【０２０２】
標的リガンド。ポリペプチドリガンド。ＲＧＤまたはＡＣＤＣＲＧＤＣＦＣＧ（ＲＧＤ４Ｃと省略される）モチーフを含む二本鎖ＤＮＡフラグメントを、一本鎖末端アダプターと共に補足的オリゴヌクレオチドとして合成し、共にアニーリングした。シャフト反復２２、シャフトノブ接合および全体ノブを含んでいるフラグメントは、ＰＣＲによりＷＴＡｄ５ファイバー遺伝子から得た。ヒトＥＧＦについてのＤＮＡ配列を合成し、クローニングし、配列決定によって立証した。Ｍａｇｅｌ／ＨＬＡＡ１への特異性を持つクローニングされた単鎖Ｔ細胞レセプター（ジスルフィド結合を含む）を、Ｒｅｉｎｄｅｒ Ｂｏｌｈｕｉｓから入手した。用いたｓｃＴＣＲは、型式Ｖα−リンカー−ＶβＣβを有していた。
【０２０３】
モノクローナル抗体。２ｍＡｂ単鎖フラグメント（ｓｃＦｖ）を用いた。最初のｓｃＦｖは、可変カッパー鎖（すなわちＶＫ）、スページングリンカー、可変重鎖（すなわちＶＨ）、連結配列（ＪＳ）およびｍＡｂＧ２５０の定常重鎖ドメイン２（すなわちＣＨ２）から構成された。ＭＡｂＧ２５０は、ヒト腎癌細胞の表面抗原に対する高い特異性を有することが明らかになっている。
【０２０４】
アフィボディ。第２のｓｃＦｖは、同じ基本構造ＶＫ−リンカー−ＪＳ−ＶＨを含み、結腸直腸癌および膵癌と反応するｍＡｂＣ２４２から誘導された。しかしながら、設計された標的細胞に対するより優れた選択性を得るため、Ｃ２４２ｓｃＦｖ由来アフィボディのライブラリーを、オリジナルのテンプレートとしてｍＡｂ産生ハイブリドーマ細胞からのｃＤＮＡを用いてＳＯＥにより生成した。ランダム化した１８アミノ酸ペプチドリガンド（ＳＮＮ）１８をＶＫおよびＶＨドメイン領域間に挿入し、ここでＳはｄＡ、ｄＧまたはｄＣであり、ＮはｄＡ、ｄＧ、ｄＣまたはｄＴであった。アフィボディは、結腸直腸癌細胞Ｃｏｌｏ２０５上でのファージ表示により選択され、配列ＰＰＤＦＶＰＰＡＡＳＦＰＤＨＳＰＲＧはペプチドリガンドについて同定された。次に、Ｃ２４２ｓｃＦｖＶＫ−（ＰＰＤＦＶＰＰＡＡＳＦＰＤＨＳＰＲＧ）−ＶＨは、その抗原結合能力に基づき、さらなる研究用に選択された。
【０２０５】
ファイバーの細胞の発現および局在化ならびにリガンド反応性。組換えファイバーをコード化している遺伝子を、細胞内発現および細胞外放出のために、それぞれベクターｐｃＤＮＡ３．１およびｐＳｅｃＴａｇ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＢＶ， Ｇｒｏｎｉｎｇｅｎ， Ｇｅｒｍａｎｙ）中にクローニングした。製造元の指示に従い、ベクターをＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．， Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ， ＭＤ， ＵＳＡ）を用いてＣｏｓ７細胞中に形質移入した。新しい細胞結合リガンドを持つファイバーの発現、核輸送および機能性発現、以下の通りに免疫染色により評価した。細胞はＳｈａｎｄｏｎ Ｃｙｔｏｓｏｐｉｎ２細胞遠心分離機中で顕微鏡スライド上に遠心分離し、室温一晩空気乾燥した。調製品は、ｐＨ７．４のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中の３％パラホルムアルデヒドで固定し、ＰＢＳ中の０．１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００で透過化処理した。ＰＢＳで洗った後、調製品を、１次試薬（抗ファイバーｍＡｂ、または抗リガンドｍＡｂ）と共に湿潤チャンバー内で３０分間３７℃でインキュベートし、ＰＢＳ中で再度洗い、２次試薬と共に湿潤チャンバー内で３０分間３７℃でインキュベートした。ＰＢＳ中で洗った後、調製品を、５０％グリセリンと共にＰＢＳ中にマウントし、適切な光源とＦＩＦＴ用フィルタを備えたＺｅｉｓｓ Ａｘｏｐｈｏｔ顕微鏡で観察した。
【０２０６】
ファイバータンパク質の表現型分析。組換えファイバータンパク質は、組換えバキュロウイルスで感染させた昆虫細胞中で発現させ、以下の４つの基準に従って分析した。すなわち、（ｉ）溶解性、（ｉｉ）三量体形成、（ｉｉｉ）グリコシル化および（ｉｖ）ｉｎ ｖｉｖｏでの組換えペントンベースとの集合によるペントンカプソマー形成である。
【０２０７】
（ｉ）可溶性および不溶性組換えファイバーフラクションの免疫学的定量化のため、Ｓｆ９細胞を、０℃で低張バッファ（１０ｍＭトリス−ＨＣｌバッファ、ｐＨ７．５）中に溶解し、細胞溶解産物を等張条件（１０ｍＭトリス−ＨＣｌ中の１５０ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ７．５）に調整し、１５，０００ｘｇで１０分間遠心分離にかけた。次に、上澄みおよびペレットを、１次抗体としての抗末端４Ｄ２．５ｍＡｂ、および［３５Ｓ］ＳＲＬ−標識した抗マウスＩｇＧ２次抗体（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ；１００μＣｉ／ｍｌ；ブロットあたり５μＣｉ）を用いて従来のＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび免疫ブロット法を用いて分析した。（ｉｉ）ファイバーのオリゴマー形成状態を、非変性ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ＮＤＳ−ＰＡＧＥと呼ばれる）および従来の変性ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いてアッセイした。ＮＤＳ−ＰＡＧＥは、電気泳動に先がけてのＳＤＳ試料バッファ中での煮沸により変性されないという点でＳＤＳ−ＰＡＧＥと異なる。（ｉｉｉ）組換えファイバーのグリコシル化を、モノクローナル抗体ＲＬ２を用いたブロット上の免疫反応と、ＤＩＤグリカン検出キット（Ｒｏｃｈｅ）を用いた化学的検出の両方を用いて評価した。（ｉｖ）ペントンベースを持つファイバーの集合は、一方がペントンベースを発現し、他方がファイバータンパク質を発現する２つの組換えＡｃＮＰＶで同じＳｆ９細胞を同時感染させてアッセイした。
【０２０８】
ペントンカプソマーの存在は、感染後４０時間の細胞溶解産物中で検出し、ＰＡＧＥにより、天然条件中で夜通し低電圧で冷却しつつ分析した。天然のペントン、ペントンベースおよびファイバータンパク質の免疫学的定量化は、上記のように、対応する１次抗体（抗ペントンベースまたは抗ファイバー）を、続いて、［３５Ｓ］ＳＲＬ標識した抗マウスまたは抗ウサギ全ＩｇＧ２次抗体を用いて実施した。ブロットを放射線用フィルム（Ｈｙｐｅｒｆｉｌｍ ｂｅｔａ−ｍａｘ， Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）に露出し、オートラジオグラムを６１０ｎｍで、自動デンシトメーター（ＲＥＰ−ＥＤＣ， Ｈｅｌｅｎａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｂｅａｕｍｏｎｔ， ＴＸ）を用いて走査した。代わりに、タンパク質バンドをブロットから切り取り、放射性をシンチレーション計数管（Ｂｅｃｋｍａｎ ＬＳ−６５００）で測定した。
【０２０９】
ビリオンへの組換え修飾ファイバーの回復。
【０２１０】
組換えファイバーを、上記のようにＡｄ５ゲノム中に回復した。簡単には、マップユニット（ｍｕ）が７５．４〜１００で、ＷＴファイバー遺伝子を含む、Ａｄ５ゲノムからの９ｋｂフラグメントを、ｐＴＧ３６０２のＳｐｅＩおよびＰａｃＩ消化により生成した。プラスミドｐＴＧ３６０２は、２つのＰａｃＩ部位に結合された全ＷＴＡｄ５ゲノムを含んでいた。次に、７５．４〜１００ｍｕフラグメントを、ＰａｃＩ部位をそのＭＳＣ中に付加後、ｐブルースクリプトＩＩＳＫ（−）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）中にクローニングして、プラスミドｐＧＡＧ９を生成した。ｐＧＡＧ９から、次に、ＳａｃＩ−ＫｐｎＩ３ｋｂフラグメントを、ｐブルースクリプトＩＩＳＫ（−）中にサブクローニングした。ＮｄｅＩ部位（Ａｄ５ファイバーの尾部ドメイン内に位置する）下流の大きい欠失を３ｋｂフラグメント中に生成し、欠失した配列をＸｈｏＩ部位含有リンカーで置き換えた。これによりプラスミドｐＧＡＧ３が生成され、これはＮｄｅＩ部位とＸｈｏＩ部位との間に挿入された本発明者らの全ファイバー遺伝子構成にとっての受容プラスミドであった。ｐＧＡＧ挿入された組換えファイバーを、ＮｈｅＩで消化したｐＧＡＧ９中に、Ｅ．ｃｏｌｉＢＪ５１８３中での相同的組換えを用いて再導入した。次に、結果として得られる組換えｐＧＡＧ９を、ＳｐｅＩおよびＰａｃＩでベクターから切断し、コスミドクローニング（ＳｕｐｅｒＣｏｓ１ Ｃｏｓｍｉｄ Ｖｅｃｔｏｒ ＫｉｔおよびＧｉｇａｐａｃｋ ＩＩＩ Ｇｏｌｄ Ｐａｃｋａｇｉｎｇ Ｅｘｔｒａｃｔ， Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）によって、Ａｄ５ゲノムの左手セグメントを表す単離２７ｋｂフラグメント（０〜７５．５ｍｕ）に接合した。コスミドクローン中の正しい組換えファイバーの存在を、ＰＣＲおよびＳｐｅＩとＨｉｎｄＩＩＩを用いた制限分析により立証した。
【０２１１】
ウイルス産生のため、組換えコスミドゲノムを、ＰａｃＩでの制限後に単離し、ファイバー挿入されたリガンドに対応するレセプターを発現している細胞中にトランスフェクトした。標準形質移入反応において、製造元のプロトコルに従って、２μｇＤＮＡおよび３μｌＦｕＧＥＮＥ（Ｒｏｃｈｅ）を３５ｍｍウェルあたりに用いた。リガンドとしてＲＧＤモチーフまたはＷＴファイバーノブを含むファイバー遺伝子を有するＡｄ５ゲノムを、２９３細胞に形質移入した。他のリガンド結合されたファイバーについては、ＥＧＦリガンドを持つＡｄ５ゲノムをＡ５４９細胞へ、ｓｃＦｖ−Ｃ２４２をＣｏｌｏ２０５細胞へ、ｓｃＦｖ−Ｇ２５０をＡ７５細胞へ、そしてＭａｇｅｌ／ＨＬＡＡ１に特異的なｓｃＴＣＲをＧ４３細胞へ形質移入した。少なくとも３つの異なる形質移入を、それぞれ６−ウェルプレートを使用して、同時に実行した。プラークの発生は、形質移入した細胞培養の顕微鏡観察により決定した。組換えファイバー配列の立証は各ファイバー構成について特異的なプライマーでＰＣＲにより行った。
【０２１２】
組換えファイバーおよびＡｄ５ビリオンのキャラクタリゼーション
細胞の発現。ファイバー発現のレベルを評価するため、２９３細胞を１０ｐｆｕ／細胞のＷＴ、Ｒ７−ノブおよびＲ７−ＲＧＤウイルスで感染させた。細胞を収集し、４回凍結融解し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロッティングで分析した。ブロットを４Ｄ２．５と反応させ、ＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ（ＤＡＫＯ）で明らかにした。
【０２１３】
Ａｄ５ビリオンのファイバー含量。ビリオンのファイバー複写数は、Ａｄ５ビリオンのＣｓＣｌ精製後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロット分析により上記のように決定した。アクリルアミドゲル中のウイルスロード（ｖｉｒｕｓ　ｌｏａｄ）は、２９３細胞上でのウイルス力価（プラーク形成単位／ｍｌ；ＰＦＵ／ｆｍｌとして表される）により決定された等量の感染性粒子について、およびタンパク質アッセイ（Ｂｉｏｒａｄ）により決定された等量の物理的粒子（ＰＰ）について基準化した。ＰＰの数は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析および標準ウシ胎仔血清アルブミン（ＢＳＡ）（２ｘ結晶化、ＢｉｏＲａｄ）試料の範囲で同時電気泳動したＡｄ５組換え体のクマシーブルー染色により決定した。ヘキソンバンドのタンパク質含量は、自動デンシトメーター（ＲＥＰ−ＥＤＣ， Ｈｅｌｅｎａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｂｅａｕｍｏｎｔ， ＴＸ）中での走査により、ＢＳＡ標準バンドと比較して評価した。試料中のＡｄ５ＰＰの数は、単独のビリオンあたり２．９１×１０ｅ−１６ｇの質量、すなわち１０ｅ＋１３ビリオンあたり２．９１ｍｇから計算した。感染力指数は物理的粒子に対する感染の比率を表した。
【０２１４】
組換え体Ａｄ５の成長速度。成長速度は２９３細胞中のプラーク産生により測定した。標準のアッセイにおいて、ＰＢＳ中のウイルスを、３７℃で１時間、細胞単層（試料あたり４×１０４細胞）に吸着させた。細胞を１度ゆすぎ、１０％ＦＣＳと５０ｍｇ／ｍｌゲンタマイシンを補ったＩｓｃｏｖｅ培地中で３７℃でさらに培養した。細胞は、感染から２４、４８、および７２時間後（ｐｉ）に収集し、遠心分離し、０．２ｍｌＰＢＳに溶解し、４回凍結融解させた。上澄みを２９３細胞上で力価測定し、力価はｍｌあたりのプラーク形成単位で表した。全Ａｄタンパク質含量をＩＤＥＡ（登録商標）アデノウイルス・キット（ＤＡＫＯ）により測定した。
【０２１５】
遺伝形質導入効率。２４ウエルプレート中の２９３細胞の単層を、上記で説明したように、１０ｐｆｕ／細胞の組換えウイルスで感染させた。細胞を、２４ｈｐｉで収集し、氷冷したＰＢＳで洗い、続いて０．５％グルタルアルデヒド中で１５分間固定した。ＰＢＳ中で３回洗った後、細胞を、ＦＡＣＳｃａｎ血球計算器（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ， Ｓａｎ Ｊｏｓｅ， ＣＡ）中のＦＬ１放出チャンネルを使って遺伝導入ＧＦＰ発現について分析した。
【０２１６】
ウイルスカプシド中のファイバーノブのアッセイ。ビリオン中のアクセス可能なノブの存在または不在は、ＥＬＩＳＡにより評価した。精製ビリオンを、ｐＨ９．６の５０ｍＭの炭酸塩−炭酸水素塩バッファで希釈して、５×１０５ＰＦＵ／ｍｌの最終濃度とした。１００ｍｌのアリコートを、４℃で一晩、ＥＬＩＳＡプレート上に吸着させた。ウエル（ｗｅｌｌ）中に吸着した物質を、０．５％グルタルアルデヒドで固定し、その後ウエルを０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳ（洗浄バッファ）で洗い、１％ＢＳＡを含むＰＢＳ２００ｍｌで２ｈブロックした。次に、ウエルを洗浄バッファ中で３回洗い、１ｍｇ／ｍｌの濃度の１００ｍｌビオチン化抗ノブｍＡｂ１Ｄ６．１４中で室温で１時間培養した。結合した抗体を、ＨＲＰ−ストレプトアビジン（ＤＡＫＯ）を用いて、１：２０００の希釈で、室温で１時間検出した。発色は、ＴＭＢ基質（ＣａｎＡｇ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ， Ｇｏｔｅｂｏｒｇ， Ｓｗｅｄｅｎ）で得られ、０．１２ＭＨＣｌで１０分間で停止した。プレートを、４５０ｎｍにセットした微量定量プレート中で読んだ。
【０２１７】
組換えファイバーの構成の原理
ヒト肺サーファクタントタンパク質Ｄからの外来三量体形成モチーフ（ＮＲＰ）を持つノブレスファイバーを、種々の数のシャフト反復および種々のリガンド構造により構成した。これらのファイバー構成の３つの構成要素は、構造的および機能的観点から考慮した。すなわち、（ｉ）ファイバー骨格、（ｉｉ）柔軟リンカーおよび（ｉｉｉ）細胞リガンドである。
【０２１８】
ファイバー骨格。ファイバーは、シャフト反復の数および存在するリガンドに従って名付けた。例として、Ｒ７−ＥＧＦは、ファイバー尾部、Ｎ末端シャフトの７つの反復、ＮＲＰモチーフおよび細胞リガンドとしてＣ末端ＥＧＦペプチドを含んでいた。Ｒ１−ＲＧＤファイバーは、ただ１つのシャフト反復（最初のもの）およびリガンドとしてＲＧＤ、等を有していた。考えられる３つシャフト長さ、すなわち短い（１反復）、中間の（７反復）および長（２２反復）い反復のうち、７つの反復（Ｒ７）を持つ中間サイズファイバーを、さらなる構成および種々のリガンドを用いた研究のためのビルディング骨格（ｂｕｉｌｄｉｎｇ　ｓｃａｆｆｏｌｄ）として選択した。以下で論じる理由のため、Ｒ７選択の理由は、組換えタンパク質としてのその高い溶解性、ほとんどのファイバー生物学的機能の維持、さらにＡｄ５／ＦｉｂＲ７ウイルス子孫の収率に基づいた。種々の長さのファイバーシャフトの比較優位についての研究は、同じ細胞リガンドＲＧＤを有する３つの構成、Ｒ１−ＲＧＤ、Ｒ７−ＲＧＤおよびＲ２２−ＲＧＤファイバーで実行した。
【０２１９】
リンカー。ファイバーシャフトドメイン内の付加的リンカーの考えられる利点を評価するため、２つのＲ７−ＮＲＰ−ノブファイバーを、シャフトドメインとＮＲＰモチーフとの間に挿入された付加的ペプチドリンカーによって構成した。従って、２つのウイルス由来リンカー、Ａｄ５シャフト反復１７（Ｌ１７）およびＡｄ５シャフト反復２２（Ｌ２２）を試験した。結果として得られる組換えファイバーを、Ｒ７−Ｌ１７−ノブおよびＲ７−Ｌ２２−ノブとそれぞれ名付けた。
【０２２０】
細胞リガンド。いくつかのリガンドを、機能性について試験および比較した。これらのリガンドは、インテグリンまたはＨＬＡ分子のような広域分布の細胞表面分子、あるいは悪性細胞特異性決定因子のような偏在性の低い分子をＡｄ５ベクターが再標的化するように設計した。それらは、ＲＧＤのような単純なトリペプチドモチーフから、適切な折り返しを要する複数のポリペプチドドメインで構成されるｓｃＴＲまたはｓｃＦｖのようなより複雑な構造まで、サイズおよび複雑さが変わる。
【０２２１】
哺乳動物細胞中におけるファイバーおよびリガンドの発現。組換えファイバーは、最初に、プラスミド−形質移入したＣｏｓ７細胞を用いて、哺乳動物細胞中で過渡的に発現させた。組換えファイバーは、２つの異なるベクター、すなわち一方は組換えタンパク質の細胞内の発現用に設計され、他方は分泌経路を介してたそれらの細胞外放出用に設計されたベクターから発現させた。細胞は、ファイバー発現のレベル、細胞局在化およびそれらのリガンドの機能性についてアッセイした。試験されたすべての種々のファイバーは、分泌タンパク質として回収される場合に、明白な適切なリガンド結合を示した。細胞内発現ベクターから合成されたファイバーについては、核内局在化は、Ｒ７−Ｌ２２−ノブを除き、すべてのケースで観察された。これは、細胞質通過および核孔が、修飾ファイバーについてＷＴＡｄ５ファイバーについてと同様に効率的に起こることを意味した。
【０２２２】
しかしながら、ファイバーに融合された外来リガンドのいずれも予期された結合活性を示さなかった。細胞内発現させたＲ７−ｓｃＴＣＲファイバーが核内で検出でき、Ｖａドメインコンホメーションから独立したエピトープ認識する抗ＶａｍＡｂドメインで染色したとしても、どの染色も、Ｖｂドメインに対して向けられた別のコンホメーション依存ｍＡｂで全く検出できないであろう。細胞内のリガンドの反応性へのファイバードメインの考えられる有害作用を試験するため、本発明者らのリガンドも、別個の構成としてベクターｐｃＤＮＡから発現させた。非融合の細胞内リガンドのそれらの特異性ｍＡｂへの検出可能な結合は全くなく、リガンドは、フリーであってもファイバーに融合していても同様に振舞うことを示している。
【０２２３】
従って、分泌用に設計および細胞質発現用に設計したファイバー−リガンド融合の間には結合能力に大きい差異があった。このことは、分泌経路をたどるように設計されたファイバー−リガンド融合タンパク質が適切な折り返しを受け、正しいコンホメーションであったことを示唆した。このことは、すべての細胞内ファイバー−リガンド融合タンパク質が不正確に折り返されることを意味するものではなかった。なぜならば、細胞環境もこのプロセスにおいて主要な役割を果たすと見られたからである。Ｃｏｓ７のサイトゾルとＳｆ９細胞との間で、ファイバーーリガンド融合タンパク質の折り返しパターンと反応性について重要な違いが検出できた。これは、Ｒ７−Ｌ２２−ノブのファイバーノブドメイン、Ｒ７−ＥＧＦのＥＧＦリガンドおよびＲ７−Ｇ２５０のｓｃＦＶリガンドの場合であり、Ｓｆ９細胞においては若干の反応性があるが、Ｃｏｓ７細胞においては反応性がないことを示した。
【０２２４】
昆虫細胞中で発現された組換えファイバーの発現型。リガンド結合されたファイバーの特性をさらに分析するため、本発明者らの種々の構成を、バキュロウイルス−昆虫細胞系で組換えタンパク質として発現させ、タンパク質溶解性、三量体形成、グリコシル化およびＳｆ９細胞中でのｉｎ ｖｉｖｏのペントンベースとの集合によるペントンの形成をアッセイした。
【０２２５】
タンパク質溶解性およびコンホメーション。組換えタンパク質の溶解性は、通常それらの適切な折り返しのよい指標と考えられる。本発明者らは、従って、本発明者らの組換えファイバータンパク質すべてを昆虫細胞中でそれらの全体の発現について試験し、細胞溶解産物の可溶性フラクション中で回収された割合を求めた。すべてのファイバー組換え体は、溶解度は互いに大きく変わったけれども、ＷＴＡｄ５ファイバーと同様なレベルで、Ｓｆ９細胞中で高度に発現された。本発明者らは、ファイバーがＷＴ様の溶解性を有し、従って、可溶性フラクションが発現された全ファイバーの５０％以上を含む場合に、適切な折り返しを有しているものと見積もった。ファイバーは、その可溶性フラクションが全体の２０％未満である場合に不正折り返しされていると見なすことができた。これらの基準によると、ＷＴ、Ｒ７−ノブ、Ｒ７−Ｌ１７−ノブ、Ｒ７−Ｌ２２−ノブ、Ｒ１−ＲＧＤ、Ｒ７−ＲＧＤおよびＲ７−ＲＧＤ４Ｃファイバーは、主に可溶性フラクション（６０〜９５％溶解度）中で回収された。対照的に、Ｒ２２−ＲＧＤのわずか２２％、ならびにＲ７−ＥＧＦ、Ｒ７−Ｃ２４２およびＲ７−ｓｃＴＣＲファイバーの１５％未満が可溶性であることが見出され、それらの個々のｍＡｂとの反応性の不在によって示唆されるそれらの不正折り返しが確認された。最も可溶性が低いファイバー構成はＲ７−Ｇ２５０であり、これは不溶性フラクション中で９５％回収された（以下の図５および表７を参照）。
【０２２６】
【表７】
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【０２２７】
（ａ）バキュロウイルス感染Ｓｆ９細胞は、感染の４８時間後に収集し、組換えファイバーを、種々の生物学的機能、溶解性、Ｏ−ＧｌｃＮＡｃグリコシル化、三量体形成、およびペントンカプソマー形成についてアッセイした。
【０２２８】
（ｂ）ファイバーの三量体形成ステータスは、ｉｎ ｖｉｔｏｒｏでＳＤＳゲル中でのＳｆ９細胞溶解産物の電気泳動により熱変性なしで（ＮＤＳ−ＰＡＧＥ）、さらにｉｎ ｓｉｔｕで、抗トリマーｍＡｂ（２Ａ６．３６）を用いて固定細胞の免疫蛍光染色により決定した。
【０２２９】
（ｃ）ペントンベースと集合してペントンカプソマーを形成するファイバーの能力は、同じＳｆ９細胞を２つの異なる組換えバキュロウイルス、すなわち一方は発現Ａｄファイバー、他方はＡｄペントンベースにより共同感染してアッセイした。Ｓｆ９細胞溶解産物は、同時感染の４８時間後に、非変性６％アクリルアミドゲル（Ｋａｒａｙａｎら、１９９４）中の天然タンパク質の電気泳動によりペントン（ベース＋ファイバー）の発生について分析した。
【０２３０】
（ｄ）溶解性は単独のバキュロウイルス感染Ｓｆ９細胞中でアッセイした。感染の４８時間後に収集した細胞を等張バッファに溶解し、細胞溶解産物を２つのアリコートに分割した。一方のアリコートを、１０，０００ｘｇで１０分間遠心分離して上澄みを保存し、それに対して、他方を全細胞溶解産物として分析した。両方のアリコートを、ＳＤＳ試料バッファ中で１００℃で変性し、変性ＳＤＳゲル中で電気泳動し、ブロットした。図５に示すように、ブロットを抗ファイバー尾部ｍＡｂ４Ｄ２．５および放射標識した第２の抗体と反応させた。免疫ブロットを、オートラジオグラム走査により定量化し、結果を可溶性対全ファイバー含量の百分率として表した。３つの測定の平均、ＳＤは、平均についての報告値の１５％以内であった。
【０２３１】
（ｅ）ＮＤ。検出できず。
【０２３２】
三量体形成。三量体への種々のファイバーの自己集合能力を、ｉｎ ｖｉｔｒｏで細胞溶解産物のＮＤＳ−ＰＡＧＥ分析により電気泳動的に、さらにｉｎ ｓｉｔｕで固定細胞の免疫蛍光染色により免疫学的に決定した。それらの電気泳動パターンによると、Ｒ７−ＥＧＦ、Ｒ７−Ｃ２４２、Ｒ７−Ｇ２５０およびＲ７−ｓｃＴＣＲはホモ三量体を形成できず、それに対してＲ７−ノブ、Ｒ７−Ｌ１７−ノブ、Ｒ７−Ｌ２２−ノブ、Ｒ７−ＲＧＤ、Ｒ２２−ＲＧＤおよびＲ７−ＲＧＤ４Ｃは、ＷＴレベルにおいて三量体化した（表７）。しかしながら、抗三量体ｍＡｂ２Ａ６．３６を用いた細胞の免疫蛍光染色により、Ｒ７−Ｃ２４２およびＲ７−Ｇ２５０を除くすべてが三量体を形成することが明らかになった（表７）。明白な不一致は、検出方法またはＲ７−ＥＧＦ、Ｒ７−Ｃ２４２、Ｒ７−Ｇ２５０およびＲ７−ｓｃＴＣＲファイバー三量体がｉｎ ｖｉｔｒｏで不安定になったこと、あるいはその両方の可能性があった。理由がどうであれ、ファイバー三量体が細胞内で非常に低い効率で形成したとしても、免疫蛍光染色は、この場合、より敏感かつ三量体検出により適切であった。
【０２３３】
グリコシル化。同様に、ファイバーのグリコシル化を、ペプチド結合Ｏ−ＧｌｃＮＡｃ残基に特異的なｍＡｂであるＲＬ２を用いたウエスタンブロッティングにより分析した。ＲＬ２と反応したファイバー構成は、ＷＴに加え、Ｒ７−Ｌ１７−ノブ、Ｒ７−Ｌ２２−ノブ、Ｒ７−ノブおよびＲ７−ＲＧＤ４Ｃであった（表７）。
【０２３４】
ペントンベースとの集合。一方がＡｄファイバーを、他方がペントンベースを発現する、２つの異なるバキュロウイルスでＳｆ９細胞を感染させた場合、２つのタンパク質は、細胞内で相互作用してペントンカプソマーを形成し得る。この特性についてアッセイする場合、ファイバータンパク質Ｒ７−ＥＧＦ、Ｒ７−Ｃ２４２、Ｒ７−Ｇ２５０およびＲ７−ｓｃＴＣＲはペントンベースと集合する能力を失ったのに対して、他の８つの組換えファイバーは集合機能を維持した（表７）。
【０２３５】
ウイルスゲノム中への組換えファイバー遺伝子の回復およびウイルスの生存度。本発明者らの組換えファイバー遺伝子を、ＷＴファイバー遺伝子と引き換えにＡｄ５ウイルスゲノム中に再挿入した。次に、各組換えウイルスゲノムを、形質移入により、組換えファイバーのための適切なレセプターを発現する対応する細胞系中に導入した。生育可能な組換えウイルスの回復は、プラーク発達により評価した。プラークは、ＷＴファイバーのすみかとなるＡｄ５ゲノム、ならびに組換えファイバーＲ７−ノブ、Ｒ７−Ｌ１７−ノブ、Ｒ１−ＲＧＤ、Ｒ７−ＲＧＤおよびＲ７−ＲＧＤ４Ｃについて観察した。
【０２３６】
組換えウイルスのファイバー含量、感染力および成長速度。７つのシャフト反復を有する組換えＲ７−ＲＧＤＡｄを、ファイバー三量体形成、安定性、ペントンベースとの集合およびリガンド結合について最良の選択として選んだ。しかしながら、このノブレスＡｄは、ＷＴウイルスと比較して、ウイルス集合および産生において効率が低かった。この例において、ノブドメインを有するＡｄ−Ｒ７−ノブの特徴を、ＷＴＡｄおよびノブレスＡｄ−Ｒ７−ＲＧＤの特性と比較した。最初に、３つのＡｄのそれぞれで感染させた２９３細胞のファイバー産生について、異なる感染後（ｐｉ）時間にアッセイした。Ｒ７−ノブＡｄからのファイバータンパク質の産生はＷＴＡｄのそれと同程度であったのに対して、Ｒ７−ＲＧＤＡｄからのファイバータンパク質のレベルはかなり低かった。
【０２３７】
本発明者らは、次にＲ７−ノブＡｄのビリオンあたりファイバー含量をＷＴＡｄのそれと比較した。２つのウイルスは、物理的粒子（ＰＰ）の数に基準化した場合には同程度のファイバー含量を示したが、２つのウイルス試料を感染性粒子（ＰＦＵ）の数に基準化した場合には、Ｒ７−ノブＡｄ中により多くのファイバータンパク質があった。これはＲ７−ノブＡｄがＷＴほど感染性がないことを示した。このことは感染力指数（ＰＦＵ：ＰＰ比）によって立証され、この指数は感染力価（２９３細胞での滴定により求められるような、ＰＦＵ／ｍｌとして表される）とＰＰの濃度（生化学的方法により求められる）から計算された。Ａｄ−Ｒ７−ノブの感染力指数（１：１００〜１：２００）は、ＷＴＡｄ５の指数（１：２５〜１：５０）よりも２〜８倍低かった。Ａｄ−Ｒ７−ＲＧＤの感染力指数（１：２００〜１：５００）は、Ａｄ−Ｒ７−ノブの指数と同様な範囲であった。
【０２３８】
Ａｄ−Ｒ−ノブの成長速度を、ＷＴウイルスの速度と比較した。細胞試料のアリコートを同じＭＯＩで感染させ、感染性ウイルス子孫を２９３細胞のプラークアッセイによって決定した。３つのウイルスについての成長曲線は同様であったが、感染性Ａｄの産生は、Ａｄ−Ｒ７―ノブおよびＡｄ−Ｒ７−ＲＧＤの双方についてＷＴよりも劣っていた。ウイルス摂取もＡｄ−Ｒ７−ノブについて検討し、ＷＴファイバーを有するＡｄ５−ＧＦＰ（Ａｄ−ＷＴＦｉｂ）と比較して、ＧＦＰレポーター遺伝子を２９３細胞中に形質導入するその能力から評価した。ＰＰあたりの形質導入能力は、Ｒ７−ノブＡｄの場合には、Ａｄ−ＷＴＦｏｂよりも６倍低いことが見出された。
【０２３９】
組換えビリオンのレセプター結合能力
Ａｄ−ＦｉｂＲ７−ノブを、ＷＴウイルスと比較して、そのレセプター結合能力についてアッセイした。ＷＴＡｄ５およびＡｄＦｉｂＲ７−ノブビリオンはどちらも、ＥＬＩＳＡ中の抗ノブｍＡｂと反応することが見出され、ノブエピトープが両タイプのビリオン上のｍＡｂにアクセス可能であることを示唆している。しかしながら、ノブの免疫反応性は、ＡｄＦｉｂＲ７−ノブについてよりもＷＴＡｄの場合のほうが高かった。このことは、ＷＴＡｄ５におけるように、ノブが２２−シャフト−反復ファイバーにより保持される場合には、より短い７−反復ファイバーにより保持されるよりも、ビリオンの細胞結合決定因子がより効率的および／または高い親和性を持っていることを示唆した。
【０２４０】
これらの結果は、サイトゾルおよび核内で不適切に折り返されることが見出されたリガンドはすべてジスルフィドブリッジの形成に非常に依存するコンホメーションを有することを示している。従って、ジスルフィドブリッジを欠く一方で天然または修飾されたエピトープ結合を保持する抗体またはそのフラグメントが用いられるべきである。
【０２４１】
シャフト部分の反復数は、好ましくは、少なくとも約７、例えば６〜１２とすべきである。野生型ノブ（例えば、２タイプのファイバータンパク質の１つとしてであって、第２のものは再標的化用に修飾される）の存在は、組換え生育可能Ａｄビリオンの発生にとり有利であり得る。
【０２４２】
配列表
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【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】
種々の組換えファイバーの構成配列の概略を示す。
Ａ．　ＮＲＰ配列は、ＰＣＲを用いてフランキングＳｐｈ１およびＸｈｏ１部位と共に供給され、フランキングＥｃｏＲ１およびとＸｈｏ１部位と共に供給されているＷＴファイバーに連結される。結果として得られるファイバーはＡ１と呼ばれ、ファイバー尾部、最初のシャフト反復およびＮＲＰモチーフを含んでいる。
Ｂ．　ＥＧＦは、ＳＯＥによってファイバーＡ１に結合される。このプロセスににおいて、アミノ酸リンカーとＣｌａ１制限部位が、ＮＲＰとＥＧＦ配列との間に付加される。結果として得られるファイバーは、Ａ１ＥＧＦと名付けられる。このファイバーにおいて、ＥＧＦは、Ｃｌａ１およびＸｈｏ１部位を使ったライゲーション（ｌｉｇａｔｉｏｎ）により新しいリガンドで置換できる。
Ｃ．　ファイバーＡ１ＥＧＦのＮＲＰ−リンカー−ＥＧＦ部分をＰＣＲにかける。このプロセスにおいて、上流Ｎｈｅ１部位がＷＴファイバー配列と共にフレーム中の配列に導入される。ＡＴクローニング後、配列は、ＥＧＦを創造するために、Ｎｈｅ１とＸｈｏ１とを用いてＷＴファイバー中に連結させてファイバーＡ７を作り出す。Ａｄ５ファイバーの最初の７つのシャフト反復をＡ７が含んでいる点で、Ａ７はＡ１と異なる。Ａ７ＥＧＦ構成において、ＥＧＦは、Ｃｌａ１およびＸｈｏ１部位を使ったライゲーションにより新しいリガンドで置換できる。
【図２】
本出願中で用いられる種々の組換えファイバーの概略を示す。
Ａ．　Ａｄ５野生型ファイバー。
Ｂ．　上で説明したファイバーＡ７ ＥＧＦ記載。
Ｃ．　上で言及したように、ライゲーションにより、ファイバーＡ７ＥＧＦ中のＥＧＦをｓｃＦｖフラグメントで置換して得られたファイバーＡ７ｓｃＦｖＣ２４２。
Ｄ．　上で言及したように、ライゲーションにより、ファイバーＡ７ＥＧＦ中のＥＧＦをｓｃＦｖフラグメントで置換して得られたファイバーＡ７ｓｃＦｖＣ２４２
Ｅ．　上で言及したように、ファイバーＡ７ＥＧＦ中のＥＧＦがＩｇＧ結合アフィボディで置換されている、ファイバーＡ７ＡｆｆｉＩｇＧ。
Ｆ．　上で言及したように、ファイバーＡ７ＥＧＦ中のＥＧＦがＩｇＡ結合アフィボディで置換されている、ファイバーＡ７ＡｆｆｉＩｇＡ。
Ｇ．　上で言及したように、ファイバーＡ７ＥＧＦ中のＥＧＦが、ＩｇＡ結合アフィボディに連結されたＩｇＧ結合アフィボディで置換されている、ファイバーＡ７ＡｆｆｉＩｇＧ／ＡｆｆｉＩｇＡ。
Ｈ．　上で言及したように、ファイバーＡ７ＥＧＦ中のＥＧＦが、別のＩｇＧ結合アフィボディに連結されたＩｇＧ結合アフィボディで置換されている、ファイバーＡ７ＺＩｇＧ／ＺＩｇＧ。
Ｉ．　ファイバーＡ７ＥＧＦ中のＥＧＦが、切断可能な野生型ファイバーノブに連結されたＩｇＧ結合アフィボディで置換されている、ファイバーＡ７ＺＩｇＧＸａノブ。
【図３】
ビリオン上で発現されたファイバー中に組込まれた場合のＺＩｇＧアフィボディの結合を示す。
パネルＡ．　ウイルスまたはタンパク質を膜へ結合させた後、Ｆｃ３（１）と共に、続いてＨＲＰ複合抗ヒトＩｇＧでインキュベーションし、展開した。１＝ウイルスＡ７ＺＩｇＧＸａノブ、２＝Ｘａによる切断後の同じウイルス、３＝ＷＴウイルス、４＝２つのファイバー、例えばＷＴおよびＡ７ＺＩｇＧを備えるウイルス、５＝Ｆｃ３（１）、６＝タンパク質Ａ、７＝タンパク質ＡＧ。
パネルＢ．　ウイルスまたはタンパク質を膜へ結合させた後、Ｆｃ３と共に、続いてＨＲＰ複合抗ヒトＩｇＧでインキュベーションし、展開した。１＝ウイルスＡ７ＺＩｇＧＸａノブ、２＝Ｘａによる切断後の同じウイルス、３＝ＷＴウイルス、４＝２つのファイバー、例えばＷＴおよびＡ７ＺＩｇＧを備えるウイルス、５＝Ｆｃ３、６＝タンパク質Ａ、７＝タンパク質ＡＧ。
パネルＣ．　膜上のウイルスの存在に示すように制御する。１＝ウイルスＡ７ＺＩｇＧＸａノブ、２＝Ｘａによる切断後の同じウイルス、３＝ＷＴウイルス。ウイルスの結合後、膜をＨＲＰ複合抗Ａｄ５ヘキソンと共にインキュベーションし、展開した
パネルＤ．　パネルＡおよびＢの膜と同様に処理したが、Ｆｃとのインキュベーションは省いた。１＝ウイルスＡ７ＺＩｇＧＸａノブ、２＝ＷＴウイルス、３＝タンパク質Ａ、４＝タンパク質ＡＧ。
注記：Ｆｃ３（１）は、ＺＩｇＧおよびタンパク質Ａと結合することが知られている。Ｆｃ３は、タンパク質Ｇ（ＡＧ）とのみ結合することが知られている。
【図４】
実施例１１で説明されるファイバーの概略を示す。ＮＲＰ−リンカーは、ＮＲＰの上流Ｎｈｅ１部位に挿入した。
【図５】
Ｓｆ９細胞中の組換えファイバーの発現および溶解性を示すゲル写真。（Ａ）全体の細胞溶解産物、（Ｂ）可溶性フラクション。
バキュロウイルスで感染させた細胞を、感染４８ｈ後に収集し、等張バッファ中に溶解し、細胞溶解産物を２つのアリコートに分割した。一方のアリコートを１０，０００ｘｇで１０ｍｉｎ間遠心分離し、上澄みを保存し（パネルＡ）、他方を全体細胞溶解産物として分析した（パネルＢ）。両方のアリコートを、ＳＤＳ−試料バッファ中で熱変性し、従来のＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析して、ブロッティングした。ブロットは、４Ｄ２．５ｍＡｂ（ファイバー尾部について特異的）および放射標識した２次抗体と反応させた。免疫ブロットを、オートラジオグラム走査によって定量した。溶解性対全ファイバー含有量の百分率として表される定量データを、表７に示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【手続補正書】
【提出日】平成14年9月9日(2002.9.9)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】請求項１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項１】
１つ以上の非天然ポリペプチドを含む修飾ウイルスであって、前記ポリペプチドが３次元構造を有する１つ以上のフレームワーク部分を含み、各々のフレームワーク部分が１つ以上の結合部分を含んでおり、前記ポリペプチドが哺乳動物の宿主細胞の原形質および核内において前記結合部分のためのリガンドがない場合に維持されるコンホメーションで発現することができ、当該コンホメーションが前記結合部分が引き続き前記リガンドと結合することを可能とし、さらに前記ポリペプチドが核膜を通って輸送可能であり、前記修飾ウイルスが前記結合部分により付与される改変された屈性を有する、当該修飾ウイルス。
【国際調査報告】
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