(57)【要約】本発明は、個体中の、たとえば癌細胞のような一群の標的細胞状態を変えるのに、治療が有効であるかどうかを測定する方法を提供する。この方法は、治療を開始後に患者から検体を採取することそして該検体が少なくとも１つのマーカー遺伝子の発現産物を含んでいるかどうかを測定することを含む。好ましくは、該検体は血液検体である。１つの局面で当該発現産物は末梢血単細胞によって発現される。該マーカー遺伝子は、血管の生成、維持および／または損傷（新脈管形成）に関与する遺伝子でありえる。本発明の方法は、カポジ肉腫に対する特定の治療が成功かどうか数日内に測定するのに非常に適している。さらにこの方法は、新脈管形成および／または癌細胞の患者内での存在を測定するのに適している。【特許請求の範囲】
【請求項１】
個体中の特定の一群の標的細胞状態を変えるのに治療が有効であるかどうかを測定する方法であって、
・治療開始後に該個体から検体を採取すること、および
・該検体が少なくとも１つのマーカー遺伝子の発現産物を含んでいるかどうかを測定すること
を含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
標的細胞が癌細胞を含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
検体が少なくとも１つの標的細胞を含むことを特徴とする請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項４】
検体が該治療開始の１週間以内に採取されることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１つの請求項に記載の方法。
【請求項５】
検体が該治療開始の２日以内に採取されることを特徴とする請求項１〜４のいずれか１つの請求項に記載の方法。
【請求項６】
マーカー遺伝子が血管の生成、維持および／または損傷に関与する遺伝子を含むことを特徴とする請求項１〜５のいずれか１つの請求項に記載の方法。
【請求項７】
マーカー遺伝子が表１または２に示される配列を含むことを特徴とする請求項１〜６のいずれか１つの請求項に記載の方法。
【請求項８】
マーカー遺伝子が図１〜１８に示される配列、もしくはそれらの一部分またはそれら配列の類似体を含むことを特徴とする請求項１〜７のいずれか１つの請求項に記載の方法。
【請求項９】
マーカー遺伝子の発現が定量されることを特徴とする請求項１〜８のいずれか１つの請求項に記載の方法。
【請求項１０】
マーカー遺伝子の発現を対照と比較することをさらに含むことを特徴とする請求項１〜９のいずれか１つの請求項に記載の方法。
【請求項１１】
癌がカポジ肉腫を含むことを特徴とする請求項２〜１０のいずれか１つの請求項に記載の方法。
【請求項１２】
発現生成物の検出方法において、図１〜１８および／または表１または２に示される配列もしくはそれらの一部分または類似体を含むことを特徴とする核酸の使用。
【請求項１３】
検出方法において、図１〜１８および／または表１または２に示される配列もしくはそれらの一部分または類似体を含む核酸によってエンコードされた蛋白質に特異的に結合する能力を有する蛋白様分子の使用。
【請求項１４】
個体中の癌細胞の存在を測定するための請求項１２または請求項１３に記載の使用。
【請求項１５】
個体中の新脈管形成部位の存在を測定するための請求項１２または請求項１３に記載の使用。
【請求項１６】
個体中の特定の一群の標的細胞状態を変えるのに治療が有効であるかどうかを決定するための請求項１２または請求項１３に記載の使用。
【請求項１７】
個体中の癌を打ち消すのに治療が有効であるかどうかを決定するための請求項１２〜１６のいずれか１つの請求項に記載の使用。
【請求項１８】
癌がカポジ肉腫を含むことを特徴とする請求項１４または請求項１７に記載の使用。
【請求項１９】
個体が癌細胞および／または新脈管形成部位を含んでいるかどうかを測定する方法であって、
・該個体から検体を採取すること、および
・該検体が少なくとも１つのマーカー遺伝子の発現産物を含んでいるかどうかを測定すること
を含むことを特徴とする方法。
【請求項２０】
マーカー遺伝子が、表１または２、および／または図１〜１８に示される配列、もしくはそれらの一部分または類似体を含むことを特徴とする請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
個体が非造血性癌細胞および／または新脈管形成部位を含むかどうかを測定する方法であって、
患者からの造血細胞が、対照値と比較して変化したマーカー遺伝子発現産物量を含んでいるかどうかを測定することを含むことを特徴とする方法。
【請求項２２】
マーカー遺伝子が新脈管形成に関与する遺伝子を含むことを特徴とする請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
マーカー遺伝子が、表１または２、および／または図１〜１８に示される配列、もしくはそれらの一部分または類似体を含むことを特徴とする請求項２１または請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
造血細胞が末梢血単核細胞を含むことを特徴とする請求項２１〜２３のいずれか１つの請求項に記載の方法。
【請求項２５】
個体中の脈管形成過程を変化させるのに治療が有効かどうか測定する方法であって、
・該治療を開始後に該個体から検体を採取すること、および
・該検体が少なくとも１つのマーカー遺伝子の発現産物を含んでいるかどうかを測定すること
を含むことを特徴とする方法。
【請求項２６】
治療が該患者中の新脈管形成を妨害することを含むことを特徴とする請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
マーカー遺伝子が、表１、表２または図１〜１８に示される配列、もしくはそれらの一部分または類似体を含むことを特徴とする請求項２５または請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
治療が少なくとも以下の薬剤：
２ＭＥ２、アンジオスタチン（Angiostatin）、アンジオザイム（Angiozyme）、抗−ＶＥＧＦ（Anti−VEGF）ＲｈｕＭＡｂ、 アプラ（Apra （ＣＴ−２５８４））、アビシン（Avicine）、ベネフィン（Benefin）、ＢＭＳ２７５２９１、カルボキシアミドトリアゾール、ＣＣ４０４７，ＣＣ５０１３、ＣＣ７０８５、ＣＤＣ８０１、ＣＧＰ−４１２５１（ＰＫＣ４１２）、ＣＭ１０１、コンブレタスタチン（Combretastatin）Ａ−４プロドラッグ、ＥＭＤ１２１９７４、エンドスタチン（Endostatin）、フラボピリドール（Flavopiridol）、ゲニステイン（Genistein（ＧＣＰ））、緑茶抽出物、ＩＭ−８６２、イムザー（Imm Ther）、インターフェロンアルファ、インターロイキン−１２、イレッサ（ＺＤ１８３９）、マリマスタート（Marimastat）、メタスタート（Metastat（Ｃｏｌ−３））、ネオバスタート（Neovastat）、オクトレオチド（Octreotide）、パクリタクセル（Paclitaxel）、ペニシラミン、フォトフリン（Photofrin）、フォトポイント（Photopoint）、ＰＩ−８８、プリノマスタート（Prinomastat（AG−3340））、ＰＴＫ７８７（ＺＫ２２５８４）、ＲＯ３１７４５３、ソリマスタート（Solimastat）、スクアラミン（Squalamin）、ＳＵ１０１、ＳＵ５４１６、ＳＵ−６６６８、スラジスタ（Suradista（FCE26644））、スラミン（Suramin（メタレット（Metaret）、テトラチオモリブデイト（Tetrathiomolybdate）、サリドマイド、ＴＮＰ−４７０、ビタキシン（Vitaxin）
の少なくとも一種を使用することを特徴とする請求項２５〜２７のいずれか１つの請求項に記載の方法。
【請求項２９】
検体が血液検体である請求項１〜１１、１９〜２０または２３〜２６のいずれか１つの請求項に記載の方法。
【請求項３０】
検体が末梢血単核細胞を含むことを特徴とする請求項１〜１１、１９〜２０または２４〜２７のいずれか１つの請求項に記載の方法。
【請求項３１】
発現産物が、ＴＩＥ１配列、サリオアドヘシン（Salioadhesin）またはシグレック1（Siglec 1）配列、図８または１７に示される配列、もしくはこれらの一部分または類似体を含むことを特徴とする請求項１〜１１または１９〜３０のいずれか１つの請求項に記載の方法。
【請求項３２】
ケラチン１４配列、ＴＩＥ１配列、サリオアドヘシン（Salioadhesin）またはシグレック1（Siglec 1）配列、図２、８または１７に示される配列もしくはこれらの一部分または類似体が発現されたＰＢＭＣの、新脈管形成の指標としての使用。
【請求項３３】
ケラチン１４配列、ＴＩＥ１配列、サリオアドヘシン（Salioadhesin）またはシグレック1（Siglec 1）配列、図２、８または１７に示される配列もしくはこれらの一部分または類似体が発現されたＰＢＭＣの、個体中の癌細胞の存在を測定するための使用。
【請求項３４】
診断方法で使用するための、単離されたケラチン１４配列、ＴＩＥ１配列、サリオアドヘシン（Salioadhesin）またはシグレック1（Siglec 1）配列、図２、８または１７に示される配列もしくはこれらの一部分または類似体。
【請求項３５】
図１〜１８および／または表１または２もしくはこれらの一部分または類似体を含む核酸、および／または該核酸または該一部分または類似体によってエンコードされた蛋白質に特異的に結合する能力のある蛋白様分子を含むことを特徴とする診断キット。
【請求項３６】
ケラチン１４配列および／またはＴＩＥ１配列、および／またはサリオアドヘシン（Salioadhesin）またはシグレック1（Siglec 1）配列、および／または図２、８または１７に示される配列もしくはこれらの一部分または類似体を含むことを特徴とする請求項３５に記載の診断キット。
【請求項３７】
個体中の特定の一群の標的細胞状態を変えるのにおよび／または個体中の脈管形成過程を変えるのに治療が有効であるかどうかを測定するための、請求項３５または請求項３６に記載の診断キットの使用。
【請求項３８】
個体が癌細胞または新脈管形成部位を含むかどうかを測定するための請求項３５または請求項３６に記載の診断キットの使用。
【請求項３９】
図１〜１８、表１または表２に示される配列を含む遺伝子発現産物の薬剤標的としての使用。
【請求項４０】
サリオアドヘシン（Salioadhesin）またはシグレック1（Siglec 1）、ＴＩＥ１、ケラチン１４の活性を変える能力がある、および／または細胞中のサリオアドヘシン（Salioadhesin）またはシグレック1（Siglec 1）、ＴＩＥ１および／またはケラチン１４の発現を変える能力がある物質。
【請求項４１】
薬剤調製のための、請求項４０に記載の物質の使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、医薬の分野に関する。特に、本発明は分子生物学と検出方法の分野に関する。
【０００２】
細胞内分子の変化の知識とこれら分子変化の研究技術の最近の進歩は、改善された、病態の決定方法とその治療方法をもたらした。癌の内在する分子多様性を理解することによって、たとえば、形態学的に類似した癌の治療への対応の多様性が一層良好に理解ができるようになった。
【０００３】
改良された病態決定法は、治療を受けている癌患者の治療方法に影響を与える。現在の治療法の短所は、しかしながら、患者への治療方法が現実に有効か否かを決定するまでに比較的長い時間を要することである。このことが投与量および／または治療計画の最適化を遅らせている。さらに、このことが一緒になって、療養法の適正化の可能性を遅らせている。たとえば、治療の適正化は、現在、施された治療法が体内の癌細胞の肉眼による分析で有効でないと認められたときにのみ可能である。肉眼での変化は、通常はそれがはっきりと現れるのに数週間を要し、そのような変化を測定する機器はしばしば使用の準備ができていないことがある。
【０００４】
本発明は、個体中の特定の一群の標的細胞状態を変えるのに治療が有効であるかどうかを測定する方法を提供するものであり、該治療開始後に患者から検体を採取することおよび該検体が少なくとも１つのマーカー遺伝子の発現産物を含んでいるかどうかを測定することを含んでいる。本発明の１つの実施形態では、該一群の標的細胞が癌細胞を含んでいる。一群の標的細胞の状態変化とは、ここでは該一群の標的細胞の少なくとも１つの特性が変化することを意味する。たとえば、該標的細胞の数量が変化するかも知れない。かかる数量は増加または減少するかもしれない。あるいはまた、当該標的細胞の活性が変化するかもしれない。該活性は複写活性であってもよい。他の例として、該活性は新脈管形成に伴う活性でありえる。あるいはアポプトティック（apoptotic）活性でもよい。
【０００５】
分子レベルで癌細胞および／または周囲組織は有効な治療に分子レベルですばやく反応することが発見された。この反応は、マーカー遺伝子の発現産物を測定することによって検出することができる。マーカー遺伝子の発現産物は治療への応答を示している。マーカー遺伝子は、通常、該一群の標的細胞、たとえば、癌細胞および／または周辺組織によって発現される遺伝子である。しかしながらマーカー遺伝子はまた体内の他部分の非癌細胞、たとえば赤血球および／または心臓血管細胞においても発現される。
【０００６】
あるいは、マーカー遺伝子の発現は個体に治療を行ったときに開始されうる。マーカー遺伝子発現産物は患者に施された治療に応答する。応答は発現産物の比較量の変化でありえる。しかしながら、それはまたＲＮＡおよび／または蛋白質のような発現産物が絶対的に存在するか非存在であるかという変化でもありえる。
【０００７】
本発明に従えば、患者から取得した検体は少なくとも１つの前述の標的細胞を含む。これは癌から遊離して患者の血中で循環している循環癌細胞を検出するのに特に好ましい。あるいは、該標的細胞を非癌細胞とすることもできる。本発明の他の実施形態では、該検体はいかなる標的細胞も含まない。しかしながら、該検体はもう一つの非標的細胞を含むことができる。この非標的細胞による少なくとも１つのマーカー遺伝子の発現または発現の変化は、特定の一群の標的細胞の状態を示している。該非標的細胞は、好ましくは以下に記載するような末梢血単核細胞を含んでいる。さらに他の態様では、上記の検体はいかなる細胞をも含まない。たとえば、それぞれの個体の他の場所で標的細胞または非標的細胞によって生産されたマーカー遺伝子の発現産物も上記検体で検出できるレベルで存在しえる。
【０００８】
本発明の方法によって該個体に治療が有効かどうかを測定することが可能である。これは、治療中あるいは該治療の短時間の後ですることができる。このようにして、たとえば治療計画、投与量と病態（type）を個々の患者ごとに適正化することができる。該検体は治療開始の１週間内に採取することが好ましい。さらに好ましくは、該検体は治療開始の２日以内に採取される。本発明の方法によって、当該治療の開始後ほとんど直ぐに治療効果を評価することができる。従って、本発明の方法は治療の適正化が必要か否かの決定に良好な機会を提供する。
【０００９】
マーカー遺伝子は、好ましくは血管の新生、維持および／または損傷（新脈管形成）に関与する遺伝子を含む。新脈管形成の過程にかかわる遺伝子類には他の受容体、リガンドおよびシグナル分子が包含される。癌細胞は、癌塊の増大維持のために新血管の成長に依存している。一方、血管には癌部位へ栄養を輸送することが必要とされており、これに対して老廃物は癌から輸送されることが必要である。本発明で、血管の新生、維持および／または損傷に関与する遺伝子の発現産物が、なかんずく、抗癌治療に応答することが示された。従ってそのような遺伝子は本発明の非常に好ましいマーカー遺伝子である。１つの実施形態として、該マーカー遺伝子は、表１または２に記載された配列を含む。他の実施形態では、該マーカー遺伝子は、図１〜１８に示される配列もしくはこれら配列の一部分または類似体を含む。好ましい実施形態では、該マーカーはＴＩＥ１配列、サリオアドヘシン（Salioadhesin）またはシグレック1（Siglec 1）配列、図８または１７に示される配列、もしくはこれらの一部分または類似体を含む。
【００１０】
マーカー遺伝子の発現産物のレベルの変化は、治療が有効かそうでないかを示すものである。たとえば、マーカー遺伝子の発現産物のレベルは、治療が有効であるときは高くなり、そうでない場合はマーカー遺伝子の発現産物のレベルは低くなる。従って、好ましくは、マーカー遺伝子の発現産物は定量される。検体中の発現産物のレベルは、マーカー遺伝子の発現変化によって変化する。しかしながら、該検体中の該発現産物を含む細胞型の変化、たとえば、治療に関連する検体が採取された体の部位での細胞の死滅によって発現産物レベルは変化する可能性がある。マーカー遺伝子の発現産物のレベル患者ごとに異なることを考えて、本発明の方法はさらに、当該マーカー遺伝子の発現産物のレベルを対照と比較することを含む。好ましくは、該対照は、治療の前のまたは治療が施されていない同型の癌細胞を含む。好ましくは、該癌細胞は同じ患者から得られる。有効な治療と有効でない治療において、マーカー遺伝子の発現産物レベルの差は非常に大きい。極端な場合には、発現産物のレベルは、検出可能から検出不可能までの範囲で変動する。本発明では、発現産物でそのような０対１関係を表すマーカー遺伝子が好ましい。０対１関係は比較的単純な検査システムに使用することができる。もちろん、０対１関係はマーカー遺伝子の発現産物を検出するために使用される検出システムに依存する。非常に感度のよい発現産物検出システムは、低感度の検出システムが発現産物を検出しない場合でも発現産物を通常に検出するであろう。発現産物は、該マーカー遺伝子から転写されたＲＮＡまたはその一部分、もしくは翻訳された蛋白質またはその一部であることができる。この分野における通常の技術者は、この好適な本発明実施形態を実施するために最も適切な発現検出システムを充分に設計することができるであろう。
【００１１】
ＲＮＡまたはＤＮＡ分子の一部分とは、ここでは少なくとも５０のヌクレオチドを含むＲＮＡまたはＤＮＡ配列と定義される。ここでは、発現産物の一部分および／または類似体とは、検出感度は異なるかもしれないが、該発現産物と実質的に同一種類の検出方法を使用して検出可能な発現産物の一部分および／または類似体と定義される。ＲＮＡまたはＤＮＡ分子の類似体とは、ここでは、その配列が実質的に特定のＲＮＡまたはＤＮＡ配列と同一のＲＮＡまたはＤＮＡ配列と定義される。しかしながら、実質的に該特定のＲＮＡまたはＤＮＡ配列の検出と比較して該類似体の検出を変えることなく、ヌクレオチド変異、置換、変質、付加および／または欠失が天然および／または人工的に起こってもよい。この分野における通常の技術者は、この技術分野で知られた技術を使用して、提起されたＲＮＡまたはＤＮＡが特定のＲＮＡまたはＤＮＡ類似体であるかどうかを充分に決定することができる。
【００１２】
好ましい実施形態では、前述の癌はカポジ肉腫（Kaposi's Sarcoma）を含む。カポジ肉腫は増殖性血管の疾病で、従って、新脈管形成に関与するマーカー遺伝子を同定するのに適している。本発明に従えば、新脈管形成因子の変化は、なかんずく、治療の結果としてマーカーに起こる事象である。カポジ肉腫（ＫＳ）は臨床的には赤みを帯びた皮膚病変として出現する。
【００１３】
カポジ肉腫は、青みがかった赤色の皮膚団塊が通常、下肢に、もっと頻繁には足指と脚に発現し、そしてゆっくりと大きさと数が増えてもっと基部に近い領域に広がることに特徴づけられる、多中心性の悪性腫瘍性の血管増殖である。癌は内皮連結経路と紡錘型細胞の種々の大きさの集合体が混ざり合った血管空間を有しており、しばしば皮膚と皮下組織に限定して留まっているが、広範囲な内蔵の関与が起こり得る。カポジ肉腫はヨーロッパとアメリカ合衆国のユダヤ人男性とイタリヤ男性に自然発生する。幼児における悪性変種がアフリカのいくつかの地域に特有である。第３の型が腎臓移植患者の約０．０４％に発生する。またエイズ（ＡＩＤＳ）患者に高い頻度の発生がある。（From Dorland,27th ed & Hollandet. al., Cancer Medicine, 3d ed. pp 2105−7））
【００１４】
カポジ肉腫はＨＩＶ感染者で悪性である。損傷を引き起こしている新脈管形成機構は、ウイルスと細胞遺伝子発現との相互作用から生じ、どの遺伝子が関与し何がそれらの発現を制御しているのかということについてはよく理解されていない。ＫＳにおける新脈管形成の増殖には、新脈管形成に共通らしい機構が関与している。カポジ肉腫の主要役割はこの癌のフランス名：angiosarcomatose kaposi）、によって明瞭に説明されている。カポジ肉腫においては新脈管形成が主要役割であるので、新脈管形成に関与するマーカー遺伝子の測定は、カポジ肉腫の治療が有効かどうかを測定するために非常に好適である。
【００１５】
本発明で、カポジ肉腫の遺伝子発現パターンは、遺伝子発現の連続分析（serial analysis of gene expression（ＳＡＧＥ））（Velculescu et. al., （1995） Science 270;484−487））と呼ばれる方法で試験された。この方法は、多数の転写体の定量的で連続的な分析を可能にする。ＳＡＧＥは２つの原理に基づいている。第１に、短いヌクレオチド配列タグ（TAG）（１４塩基対）は、もしそれが転写体内の限定された位置から単離されれば、転写体を固有に同定するための十分な情報を含んでいる。第２に、短配列タグ（TAG's）の鎖状体化により、単一クローン内での多種多様のタグ（TAG's）の配列決定法によって連続的に転写体の効率的な分析が可能になる。
【００１６】
要するに、この方法ではビオチン化されたオリゴ（ｄＴ）プライマーがｍＲＮＡからのｃＤＮＡ合成に使用され、そして制限酵素での消化の後に、最端の３’末端（ポリ−Ａ末端に近い）が単離される。このｃＤＮＡの３’断片はリンカーに結合され、そしてタイプＩＩ制限酵素で切断されて原型のｃＤＮＡの短鎖配列（１４塩基対）を遊離する。そのタグ（TAG's）は、ジタグ（di−TAG's）に結合されＰＣＲ法で増幅される。このジタグ（di−TAG's）はリガーゼで結合され鎖状体（concatamers）を形成し、この鎖状体（concatamers）はクローン化されその配列が決定される。このようにして、１つの配列決定反応が、多数の異なるＲＮＡの分布に関する情報を与える。最後に、必要なコンピュータソフトウエアを使用して多数の異なるタグについての計算と遺伝子バンク（Genbank）タグ（TAG's）との照合が実施される。
【００１７】
もう１つの実施形態において、本発明は、図１〜1８および／または表１または２に示された配列、もしくはそれらの一部分または類似体を含む核酸の発現産物の検出法での使用を提供する。好ましくは、該核酸は、ＴＩＥ１配列、サリオアドヘシン（Salioadhesin）またはシグレック１（Siglec 1）配列、図８または１７に表示された配列、もしくはそれらの一部分または類似体を含む。個体中のマーカー遺伝子の発現は、該核酸もしくはその一部分または類似体が、該個体の検体中の核酸、好ましくはＲＮＡとハイブリッド形成するかどうかを測定することによって検出することができる。もし、ハイブリッド形成が起これば、当該個体でマーカー遺伝子が発現していることを示す。もちろん、この分野の通常の技術を有する者に知られているように、ＤＮＡ／ＲＮＡのコーディングストランド（coding strand）は、対応する２重鎖核酸配列の相補的な鎖とハイブリド形成をすることができる。従って、特定のコーディングストランド（coding strand）の相補的ストランドが該コーディングストランド（coding strand）の発現の検出に特に好ましい。たとえば、図１〜１８および／または表１または２に示されるコーディングストランド（coding strand）の相補的ストランドが、該コーディングストランド（coding strand）を含む遺伝子発現の検出に適している。
【００１８】
さらにもう１つの実施形態では、本発明は、図１〜１８および／または表１または２に示される配列、もしくはそれらの一部分または類似体を含む核酸によってエンコードされた（encoded）蛋白質に特異的に結合する蛋白性分子の検出法における使用を提供する。好ましくは、該蛋白性分子は、ＴＩＥ１配列、サリオアドヘシン（Salioadhesin）またはシグレック１（Siglec 1）配列、図８または１７に示される配列、もしくはそれらの一部分または類似体を含む核酸によってエンコードされた蛋白質に特異的に結合する能力を有する。本発明のもう１つの実施形態において、該使用は、個体の新脈管形成の部位の存在を測定することに向けられる。本発明のもう１つの実施形態では、該使用は、個体中の癌細胞の存在を測定することに向けられる。個体中の癌細胞の存在は、該癌細胞が発現産物検出法によって検出することのできるマーカー遺伝子を典型的に発現するので、測定することができる。たとえば、該マーカー遺伝子の発現産物に対して特異的に指向された抗体またはその類似体を生成させることができる。該抗体またはその類似体は、検体中で該マーカー遺伝子の発現産物の測定に好適である。個体中の癌細胞の存在を測定するために個体から得られた検体は該抗体とインキュベートされる。もし該検体が該マーカー遺伝子の発現産物を含んでいるならば、該抗体は結合するであろう。結合は、当該分野で既知の技術、たとえばエンザイムイムノアッセイ（ＥＬＩＳＡ）によって証明することができる。もし該抗体の結合が証明されると、該検体は該マーカー分子の発現産物を含有していると結論づけることができる。該マーカー分子は癌細胞によって発現されるので、該マーカー分子の発現産物の存在によって、個体中の癌細胞の存在を示すことができる。もちろん、蛋白性結合分子の使用によって発現産物を検出するためにもっと多くの代替技術があるが、それらはこの技術分野でよく知られており、ここでさらに論ずる必要はない。すなわち、癌細胞によって発現された蛋白質は、図１〜１８および／または表１または２、たとえばＴＩＥ１配列、サリオアドヘシン（Salioadhesin） および／またはシグレック1（Siglec 1）配列、もしくはそれらの一部分または類似体を含む核酸によってエンコードされた蛋白質に特異的な結合能力を有する蛋白性分子で検出することができる。同様に、個体中の新脈管形成部位の存在はマーカー遺伝子の発現産物を検出することによって測定することができる。
【００１９】
本発明のもう１つの実施形態では、図１〜１８および／または表１または２に示される配列を含む核酸の使用、または、図１〜１８および／または表１または２に示される配列を含む核酸もしくはそれらの一部分または類似体によってエンコードされた蛋白に特異的に結合能を有する蛋白性分子の使用は、治療が個体中標的細胞の一定セットの状況変化に有効かどうかを決定するのに好適である。好ましい実施形態には、該核酸はＴＩＥ１配列、サリオアドヘシン（Salioadhesin）またはシグレック1（Siglec 1）配列、図８または１７に示される配列、もしくはそれらの一部分または類似体を含む。もう１つの好ましい実施形態では、該蛋白性分子は、ＴＩＥ１配列、サリオアドヘシン（Salioadhesin）またはシグレック1（Siglec 1）配列、図８または１７に示される配列、もしくはもしくはそれらの一部分または類似体を含む核酸によってエンコードされた蛋白質に特異的に結合する能力を有する。さらに好ましくは、該使用は、治療が個体中で癌細胞を打ち消すのに有効かどうかを決めるのに好適である。本発明の１つの実施形態において、該癌細胞はカポジ肉腫を含む。
【００２０】
本発明の一態様において、表１または２および／または図１〜１８に示される配列を含む核酸の、新脈管形成のための指標としての使用を提供する。好ましい実施形態で本発明は、ＴＩＥ１配列、サリオアドヘシン（Salioadhesin）またはシグレック1（Siglec 1）配列、図８または１７に示される配列、もしくはそれらの一部分または類似体を含む核酸の、新脈管形成に関する指標としての使用を提供する。たとえば、図１〜１８および／または表１または２に示される配列を含む核酸は、再生治療のコースでの新脈管形成過程に関する検出マーカーとして使用することができる。検出マーカーの発現レベルの変化は、再生治療コースで誘導された活性な血管の成長（すなわち、新脈管形成）を示す。好ましい実施形態で、そのような応用は心臓と冠状動脈疾病の分野で、新生血管によって影響を受けた臓器への新しい血液供給の生成を目的としている。同様に、抗新脈管形成薬による治療は、ＴＩＥ１配列、サリオアドヘシン（Salioadhesin）および／またはシグレック1（Siglec 1）配列のような、図１〜１８および／または表１または２に示される検出マーカーの発現レベルの変化によってモニターすることができる。
【００２１】
もう１つの態様において、本発明は、図１〜１８および／または表１または２に示されるな配列を含む核酸の癌細胞の検出マーカーとしての使用を提供する。さらにもう１つの態様において、本発明は、図１〜１８および／または表１または２に示される配列を含む核酸によりエンコードされた蛋白様分子、もしくは図１〜１８および／または表１または２に示されるような配列を含む核酸によりエンコードされた蛋白質に結合能力を有する蛋白様分子の、癌細胞の検出マーカーとしての使用を提供する。
【００２２】
本発明の方法で、個体の特別な状態をモニタ−することが可能である。疾病の存在、または進行中の病変は、個体の検体がマーカー遺伝子の発現産物を含んでいるかどうか測定することによって決定することができる。このことは、また、検体にマーカー遺伝子が存在しないと、疾病の存在または疾病の進行の危険性があることも意味している。このことは、疾病に少なくとも１つのマーカー遺伝子の変化した発現パターンが関与する限り、どんな疾病にも可能性がある。好ましくは、検体中のマーカー遺伝子の存在が測定される。
【００２３】
さらに治癒過程も追跡することができる。たとえば、損傷を受けた組織の回復にはその期間を通してマーカー遺伝子発現産物の量の増加が伴うことがありえる。しかしながら、損傷した組織の回復にはその期間を通してマーカー遺伝子発現産物の量の減少が伴う可能性がある。異なる時間間隔で採取された検体は、異なった時間間隔で生成される発現産物の量について情報を提供する。その間に検体中に見出された特定の発現産物の変化量は、生成した組織の量を示す。同様に、検体中に特定期間中に見出された発現産物の減少量は、ある種の、有益か有害かいずれかの過程を示す。たとえば、該過程は疾病の進行または治癒に関与しているかもしれない。重要な応用は、心臓と冠状動脈疾病の治療である。本発明の方法は、新心筋組織の生成のモニターリングに極めて適している。
【００２４】
すなわち、本発明の１つの態様は、診断方法、特に個体が癌細胞および／または新脈管形成部位を含んでいるかどうかを測定する方法を提供し、個体から検体を採取すること、そして該検体が少なくとも一つのマーカー遺伝子の発現産物を含有しているかどうかを測定することを含む。好ましくは、該マーカー遺伝子は、表１または２および／または図１〜１８、もしくはこれらの一部分または類似体を含む。さらに好ましくは、該マーカー遺伝子は、ＴＩＥ１配列、サリオアドヘシン（Salioadhesin）またはシグレック1（Siglec 1）配列、図８または１７に示される配列、もしくはこれらの一部分または類似体を含む。本発明の方法で、癌から遊離して体内の他の場所に存在する癌細胞を検出することが可能である。好ましい実施形態でかかる検出方法は、循環している癌細胞を人の血中で検出することにより実施される。これら循環癌細胞は、他の人体部分での予備検出のために使用することができ、また当初の人体部位に隣接する人体の他部位への癌転移リスクの検出のためにも使用することが可能である。同様に、本発明の方法は、個体中の新脈形成部位を測定するためにも好適である。たとえば、新脈管形成の増加したレベルは、癌細胞の存在を示すか、または、たとえば、心臓と冠動脈疾病の回復のように損傷組織の治癒をしめす。
【００２５】
新脈管形成過程はいまや本発明の方法によって容易にモニターできるので、ある特定の治療が新脈管形成過程を変えるのに有効かどうかを測定するのと同様に容易である。たとえば、もしある特定の治療が新脈管形成過程を妨害するのに有効ならば、新脈管形成に関与しているマーカー遺伝子の発現産物量もその期間を通じて減少する。当該技術分野で、新脈管形成治療のための多くの薬剤が知られている。したがって、本発明の１つの実施形態は、治療が個体中の新脈管形成過程を変化させるのに有効かどうかを測定するための方法を提供し、該治療を開始後に該個体から検体を採取すること、そして、該検体が少なくとも１つのマーカー遺伝子を含有しているかどうかを測定することを含む。好ましくは、該マーカー遺伝子は、表１、２、および／または図１〜１８に示される配列、もしくはこれらの一部分または類似体を包含する。さらに好ましくは、該マーカー遺伝子は、ＴＩＥ１配列、サリオアドヘシン（Salioadhesin）またはシグレック1（Siglec 1）配列、図８または１７に示される配列、もしくはこれらの一部分または類似体を含む。１つの実施形態で上記の治療は、該個体中の新脈管形成を妨害することを含む。さらにもう１つの実施形態では、該治療は、次の薬剤の少なくとも１種の使用を含む：２ＭＥ２、アンジオスタチン（Angiostatin）、アンジオザイム（Angiozyme）、抗−ＶＥＧＦ（Anti−VEGF）ＲｈｕＭＡｂ、アプラ（Apra （ＣＴ−２５８４））、アビシン（Avicine）、ベネフィン（Benefin）、ＢＭＳ２７５２９１、カルボキシアミドトリアゾール、ＣＣ４０４７，ＣＣ５０１３、ＣＣ７０８５、ＣＤＣ８０１、ＣＧＰ−４１２５１（ＰＫＣ４１２）、ＣＭ１０１、コンブレタスタチン（Combretastatin）Ａ−４プロドラッグ、ＥＭＤ１２１９７４、エンドスタチン（Endostatin）、フラボピリドール（Flavopiridol）、ゲニステイン（Genistein（ＧＣＰ））、緑茶抽出物、ＩＭ−８６２、イムザー（Imm Ther）、インターフェロンアルファ、インターロイキン−１２、イレッサ（ＺＤ１８３９）、マリマスタート（Marimastat）、メタスタート（Metastat（Ｃｏｌ−３））、ネオバスタート（Neovastat）、オクトレオチド（Octreotide）、パクリタクセル（Paclitaxel）、ペニシラミン、フォトフリン（Photofrin）、フォトポイント（Photopoint）、ＰＩ−８８、プリノマスタート（Prinomastat（AG−3340））、ＰＴＫ７８７（ＺＫ２２５８４）、ＲＯ３１７４５３、ソリマスタート（Solimastat）、スクアラミン（Squalamin）、ＳＵ１０１、ＳＵ５４１６、ＳＵ−６６６８、スラジスタ（Suradista（FCE26644））、スラミン（Suramin（メタレット（Metaret）、テトラチオモリブデイト（Tetrathiomolybdate）、サリドマイド、ＴＮＰ−４７０および／またはビタキシン（Vitaxin）。しかしながら熟練者は該治療中に使用し得るさらに多種の薬剤を思いつくことができる。
【００２６】
好ましい実施形態では、本発明の方法の検体は血液検体である。たとえば新脈管形成過程の部位は、癌または皮膚の一部である可能性があるが、血液検体は採取に容易であるのでとりわけ好ましい。血液検体はまた多くの場合検査するのが容易であり、高価なそして／または特別な装置を必要としない。極めて驚くべきことに、我々は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）のような造血細胞（hemopoietic cell）によるある種のマーカー遺伝子の発現が、個体のどこか他の部位で起こっている一連の変化を表示し得ることを見出した。たとえば、ＰＢＭＣ中のマーカー分子発現産物の存在または量変化は、身体のどこかに癌細胞が存在することを示し得る。実施例１０では、たとえばＴＩＥ１配列（タグ１５、表３）またはサリオアドヘシン（Salioadhesin）またはシグレック1（Siglec 1）配列（タグ３２、表４）はともに皮膚癌とカポジ肉腫患者のＰＢＭＣ細胞で高く制御されていることが示されている。さらに、癌細胞ではケラチン１４配列は過剰発現されているのに対して、該患者の血液検体中のケラチン１４（タグ７、表３）配列の発現産物が存在しないということは、該検体は癌細胞で汚染されていないことを示すということを実施例８は表している。同様に、ＰＢＭＣによるある種のマーカー遺伝子の発現はもう１つの診断の指標を提供し得る。ＰＢＭＣ中のマーカー遺伝子発現産物の存在または非存在は、異なった側面および／または個々の身体の一連変化について適切な情報を提供する。好ましくは、非造血細胞での発現産物の量は、対照値と比較される。このように該造血細胞中の発現の増加または減少について指標が得られる。
【００２７】
それゆえ１つの態様において本発明は、個体が非造血癌細胞および／または新脈管形成部位を含むかどうかを測定する方法を提供し、該方法は該患者からの造血細胞が対照値と比べてマーカー遺伝子の発現産物の変化量を含んでいるかどうかを含む。好ましくは、該マーカー遺伝子は、新脈管形成に関与する遺伝子を含む。さらに好ましくは、該遺伝子は表１または２、および／または図１〜１８に示される配列、もしくはこれらの一部分または類似体を含む。最も好ましくは、該遺伝子は、ＴＩＥ１配列、サリオアドヘシン（Salioadhesin）またはシグレック1（Siglec 1）配列、図８または１７に示される配列、もしくはこれらの一部分または類似体を含む。本発明の１つの実施形態では、該造血細胞は末梢血単核細胞を含む。
【００２８】
１つの態様において、本発明は本発明の測定方法を提供し、ここで該発現産物ははＰＢＭＣによって発現される。好ましくは、該発現産物は、ＴＩＥ１配列、サリオアドヘシン（Salioadhesin）またはシグレック1（Siglec 1）配列、図８または１７に示される配列、もしくはこれらの一部分または類似体を含む。これら配列は新脈管形成に関与するので、本発明は、ケラチン１４配列、ＴＩＥ１配列、サリオアドヘシン（Salioadhesin）またはシグレック1（Siglec 1）配列、図２、８または１７に示される配列、もしくはこれらの一部分または類似体の新脈管形成の指標としての使用を提供する。同様に、これら配列は癌細胞の存在に関与する。したがって、ケラチン１４配列、ＴＩＥ１配列、サリオアドヘシン（Salioadhesin）またはシグレック1（Siglec 1）配列、図２、８または１７に示される配列、もしくはこれらの一部分または類似体を発現したＰＢＭＣの、個体中の癌細胞の存在を測定するための使用も提供される。さらに、本発明は、また、診断方法での使用のための、単離されたケラチン１４配列、ＴＩＥ１配列、サリオアドヘシン（Salioadhesin）またはシグレック1（Siglec 1）配列、図２、８または１７に示される配列、もしくはこれらの一部分または類似体を提供する。診断方法は診断キットを使用して実施される。したがって、図１〜１８および／または表１または２もしくはこれらの一部分または類似体を含む核酸、および／または該核酸または該一部分または類似体によってエンコードされた蛋白質に特異的に結合する能力のある蛋白様分子を含む診断キットもまた、ここで提供される。好ましくは、該キットは、適切な検出手段を含む。１つの実施形態で、本発明の、ケラチン１４配列および／またはＴＩＥ１配列、および／またはサリオアドヘシン（Salioadhesin）またはシグレック1（Siglec 1）配列、および／または図２、８または１７に示される配列もしくはこれらの一部分または類似体を含む診断キットも提供される。本発明の診断キットは、本発明の方法を実施するのに特に有用である。もう１つのさらなる実施形態で、したがって、個体中の特定の一群の標的細胞状態を変えるのに、および／または個体中の脈管形成過程を変えるのに治療が有効であるかどうかを測定するための、本発明診断キットの使用を提供する。さらに、本発明は個体が癌細胞および／または新脈管形成部位を含んでいるのかのかどうかを測定するための本発明診断キットの使用を提供する。
【００２９】
本発明のマーカー遺伝子によって該マーカー遺伝子が示唆する疾病に対する薬剤のスクリーニングが可能である。特異的な薬物活性をスクリーニングする技術で多種の利用可能な方法がある。たとえば、細胞を種々の異なる薬剤候補化合物とインキュベートし、該細胞中のマーカー遺伝子の発現パターンを、薬剤候補化合物へ該細胞を曝す前と後で比較することができる。薬剤候補化合物へ該細胞を曝したのちの特異的な発現パターンの差異は、該化合物が医薬開発の適切な候補物であることを示す。従って、本発明は、図１〜１８、表１または表２に示される配列を含む遺伝子の発現産物の薬剤標的としての使用を提供する。
【００３０】
好ましくは、該配列は、サリオアドヘシン（Salioadhesin）またはシグレック1（Siglec 1）、ＴＩＥ１、および／またはケラチン１４配列である。
【００３１】
サリオアドヘシン（Salioadhesin）またはシグレック1（Siglec 1）、ＴＩＥ１、ケラチン１４の活性を変える能力がある、および／または細胞中のサリオアドヘシン（Salioadhesin）またはシグレック1（Siglec 1）、ＴＩＥ１および／またはケラチン１４の発現を変える能力がある物質もここで提供される。該物質は特に薬剤の調製に好適である。
【００３２】
本発明はさらに以下の実施例によってさらに詳細に説明されるが、これは本発明を決して限定するものではない。
【００３３】
実施例
実施例１
この実施例において発現プロファイルの分析のための検体の選定が実施される。３１歳の男性が１９９７年２月にＨＩＶ−１血清陽性と判定された。初期のＣＤ４細胞数は、２５×１０6／ｌであった。この患者は２ヶ月以内に粘膜皮膚単純疱疹と肺外クリプトコックス症に感染を呈し、このため特別の薬物治療が行われた。ＨＩＶ−１  ＲＮＡ負荷は当初１５，０００コピー／ｍｌで３ヶ月で３３，０００コピー／ｍｌに増加した。そこで、抗ウイルス療法がジドブジン（zidovudine）、ラミブジン（lamivudine）およびインヂナビィル（Indinavir）を使用して始められた。治療開始後直ぐに、ＨＩＶ−１  ＲＮＡ負荷は、検出限界以下に低下した。１９９７年１１月、患者は増加する紫色の皮膚病変を徐々に示し、それは臨床的にカポジ肉腫に類似していた。診断は、病変の組織学的検査で確認された。化学療法（ブレオマイシン、ビンクリスチン、およびアドリアマイシンの静脈内投与）の初期に、ＫＳは約１５０皮膚病変まで進行した。化学療法のコース中の休止期間は３週間であり、第５コースの後に中止された。３週間の治療でいくつかの病変は消失し、１年の後に、徐々に完全回復に近づいた。
【００３４】
化学療法の間に、いくつかの生検が行われた。最初の生検試料は化学療法開始後２４時間に採取され（ＫＳ１と名づけられた）そして２番目の生検試料は４８時間後に採取された（ＫＳ２と名づけられた）。全ての生検試料は、外科的除去の後即座に液体窒素中で瞬間凍結され−８０℃で保存された。カポジ肉腫の診断が組織学的に確定された。
【００３５】
対照ＳＡＧＥライブラリＫＳ３とＫＳ４は、いかなる形の化学療法もあるいは抗ウイルス治療も受けずに１９８６年に死亡したカポジ肉腫を伴う２名のエイズ患者から検死時に採取された、凍結材料で作製された。
【００３６】
実施例２
生検検体の発現プロファイルは、ＳＡＧＥ技術を使用して決定された。全ての生検試料はミクロトームで１５〜２０μｍの切片に切断され、トリゾール（TRIzol）を含有する試験管へ移された。製造者の説明書に従ってトリゾール（TRIzol）によってＲＮＡの単離が行われた。ポリ（Ａ）ＲＮＡはミクローファーストトラックTM（Micro−FastTrackTM）２．０ｍＲＮＡ分離キットを使用して得られた。ｃＤＮＡの調製とそれに続くステップはベルクレスク（Velculescu）によって記載されたように実施された。配列決定結果の予備試験は、ＳＡＧＥのために特別にアカデミックメディカルセンター、アムステルダムのビオインフォマチックス研究所（Bioinformatics Laboratory）によって設計されたソフトウエアを使用して実施された（van Kampen et al., ＵＳＡＧＥ: ＳＡＧＥデータ分析へのウェブに基づくアプローチ、Bioinfomaticcs、 印刷中）。ライブラリもまたヒト染色体にＴＡＧを位置付けるＡＭＣで開発されたプログラム、ヒューマン トランスクリプト―ムマップ（Human Transcriptome Map （HTM））で分析された（Caron et al., ヒューマン  トランストーム  マップは染色体ドメインで高度に発現された遺伝子のクラスタリングを明らかにする。投稿中）。
【００３７】
我々は４つの生検資料から約４７，０００タグ（ＴＡＧ’ｓ）、ＫＳ１ライブラリから４７，２９８タグ（ＴＡＧ’ｓ）、ＫＳ２ライブラリから４６，６７１、ＫＳ３ライブラリから４９，３３５タグ（ＴＡＧ’ｓ）をそしてＫＳ４ライブラリから４８，８１４タグ（ＴＡＧ’ｓ）の配列を決定した。タグ（ＴＡＧ）リスト（すなわち、個々のＴＡＧ’ｓプラス出現回数）は、互いにＵＳＡＧＥで比較され、最も高いカウントを持つタグ（ＴＡＧ）配列は、ＵＳＡＧＥで利用可能なａｍｃｔ２ｇデータベースで同定された（これはＣＧＡＰ（GenBankで利用可能）のＳＡＧＥｍａｐデータベースと比べて進歩したＴＡＧ同定法である））。次に、タグ（ＴＡＧ）リストはＨＴＭプログラムで染色体位にマッピングされ、同時に特定のＴＡＧリスト（たとえば血管内皮、公に利用可能）と比較され、ＳＡＧＥｍａｐデータベース（ＨＴＭで「全て」を指定）の全てのＴＡＧと組合みわせて、ＫＳ３とＫＳ４で特に昂進した遺伝子に属しているタグ（ＴＡＧ’ｓ）が同定された（表１）。ヌクレオチド１５はＵＳＡＧＥの原本ジタグ（diTAG）リストから決定された。１５ヌクレチド（１５nt.）のＴＡＧ配列は、その同定を確認するためにＧｅｎＢａｎｋ（ＢＬＡＳＴ）で照合された。１５番目のヌクレオチドでの不明確さのゆえにあるいは間違った同定のゆえに、少数のタグ（ＴＡＧ’ｓ）が排除された。
【００３８】
実施例３
ＫＳ１とＫＳ２ライブラリに比較してカポジ肉腫ＳＡＧＥライブラリＫＳ３とＫＳ４で発現が増加している既知遺伝子由来の同定可能なタグ（ＴＡＧ’ｓ）を示している分析結果。タグ（ＴＡＧ）数は、そのライブラリと公開された他のライブラリ間で比較できるようにまず、ライブラリ当たりの配列決定された１００．０００総タグ（ＴＡＧ）レベルに標準化された。
配列ｃatgは、表１の縦列２に示された各タグ（ＴＡＧ）配列に優先して起こる。
【００３９】
【表１】
2004523232.tif 000002
【００４０】
実施例４
ＫＳ１とＫＳ２ライブラリに比較してカポジ肉腫ＳＡＧＥライブラリＫＳ３とＫＳ４で発現が増加している未知因子を有する遺伝子のＥＳＴ’ｓ由来の同定不可能なタグ（ＴＡＧ’ｓ）を示す分析結果。
【００４１】
タグ（ＴＡＧ）数は、そのライブラリと公開された他のライブラリ間で比較できるようにまず、ライブラリ当たりの、配列決定された１００．０００総ＴＡＧレベルに標準化された。
配列ｃａｔｇは表２の縦列２に示された各タグ（ＴＡＧ）配列に優先して起こる。
【００４２】
【表２】
2004523232.tif 000003
【００４３】
実施例５
カポジ肉腫の皮膚組織が実施例１に記載されたのと同じ２人のエイズ患者から採取され、その患者からＫＳ３とＫＳ４ライブラリが作成された。両患者とも同性愛の患者でヨーロッパでＨＩＶ−１が流行した初期に感染した。インドネシアで出生した患者１は、ＨＩＶ−１陽性であると１９８２年に証明された。１９８５年２月に組織学的な検査によってカポジ肉腫の診断が確認された。彼は１３ヵ月後に死亡し、検死によって内蔵ＫＳの形態学的変種であることが判明した。患者２は、１９８４年２月アカデミックメディカルセンター（Academic Medical Centre）で進行性ＫＳ皮膚病変を示した。追跡治療中に、ＫＳは腸管、咽頭部、肺、舌、梨状陥凹およびリンパ節へ進行した。１９８６年３月、この患者は死亡し、検死が行われた。上記２名の患者から採取した組織試料は、ＫＳ３とＫＳ４と命名された。
【００４４】
正常成人の胸部皮膚組織が、乳房形成での廃棄組織として採取された（我々の病院の形成手術部から得られた）。３つの胸部整復手術からの単離ＲＮＡは、正常皮膚発現プロファイルのライブラリに使用された。
【００４５】
生検試料の発現プロファイルは、実施例２に記載したようなＳＡＧＥ技術で決定された。我々は４つの生検試料から約４７，０００タグ（ＴＡＧ’ｓ）、ＫＳ３ライブラリから４９，３３５タグ（ＴＡＧ’ｓ）そしてＫＳ４ライブラリから４８，８１４タグ（ＴＡＧ’ｓ）の配列を決定した。タグ（ＴＡＧ）リスト（すなわち、個々のタグ（ＴＡＧ’ｓ）プラス出現回数）はＵＳＡＧＥで利用可能なａｍｃｔ２ｇデータベースで同定された（これはＣＧＡＰ（ＧｅｎＢａｎｋで利用可能）からのＳＡＧＥｍａｐデータベースと比較して進歩したタグ（ＴＡＧ）同定法である）。次に、タグ（ＴＡＧ）リストはＨＴＭプログラムで染色体部位にマッピングされ、同時に特定のタグ（ＴＡＧ）リスト（たとえば血管内皮、公に利用可能）と比較され、ＳＡＧＥｍａｐデータベース（ＨＴＭで「全て」を指定）の全てのタグ（ＴＡＧ）リストと組み合わせて、ＫＳ３とＫＳ４で特に昂進した遺伝子に属しているタグ（ＴＡＧ’ｓ）が同定された（表１）。ヌクレオチド１５はＵＳＡＧＥの原本ジタグ（diTAG）リストから決定された。１５ヌクレオチド（１５nt.）のＴＡＧ配列は、その同定を確認するためにＧｅｎＢａｎｋ（ＢＬＡＳＴ）によって照合された。１５番目のヌクレオチドでの不明確さのゆえにあるいは間違った同定のゆえに、少数のタグ（ＴＡＧ）は排除された。
【００４６】
実施例６
ＫＳ１とＫＳ２ライブラリに比較してカポジ肉腫ＳＡＧＥライブラリＫＳ３とＫＳ４で発現が増加している既知遺伝子由来の同定可能なタグ（ＴＡＧ’ｓ）を示している分析結果。タグ（ＴＡＧ）数は、そのライブラリと公開された他のライブラリ間で比較できるようにまず、ライブラリ当たりの配列決定された１００．０００総タグ（ＴＡＧ）レベルに標準化された。
配列ｃａｔｇは、表３の縦列２に示された各ＴＡＧ配列に優先して起こる。
【００４７】
【表３】
2004523232.tif 000004
【００４８】
実施例７
ＫＳ１とＫＳ２ライブラリに比較してカポジ肉腫ＳＡＧＥライブラリＫＳ３とＫＳ４で発現が増加している未知因子を有する遺伝子のＥＳＴ’ｓ由来の同定不可能なタグ（ＴＡＧ’ｓ）を示す分析結果。タグ（ＴＡＧ）数は、そのライブラリと公開された他のライブラリ間で比較できるようにまず、ライブラリ当たりの、配列決定された１００．０００総ＴＡＧレベルに標準化された。
配列ｃａｔｇは、表４の縦列２に示された各ＴＡＧ配列に優先して起こる。
【００４９】
【表４】
2004523232.tif 000005
【００５０】
表３と表４に記載された過剰発現タグ（ＴＡＧ’ｓ）は表１および表２記載のものとそれぞれ同一である。このことは，治療後の発現パターンは正常な発現パターンを有する健常個体の発現パターンに匹敵することを示している。
【００５１】
実施例８
ＲＴ−ＰＣＲに基づく方法を使用して我々は、ＴＡＧ１１（表２）／ＴＡＧ００４（表４）が確かに相違して発現された遺伝子を示していることを決定することができた。ＲＮＡがＫＳ病巣から単離され、最初のストランドｃＤＮＡ合成が、５’Ｍ１３テイル（５’ＣＴＡ  ＧＴＴ  ＧＴＡ  ＡＡＡ  ＣＧＡ  ＣＧＧ  ＣＣＡＧ−（Ｔ）24３’）のオリゴ（ｄＴ）プライマーで試みられた。１０マイクロリットルの全ＲＮＡが使用され、プラスプライマーと５μｌＲＴ−ｍｉｘ  （５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．３、７５ｍＭ  ＫＣｌ、３ｍＭ  ＭｇＣｌ2、１０ｍＭ  ＤＴＴ）、８０ｍＭ  ｄＮＴＰｓと２０ユニットＲＮＡｓｉｎが加えられ、６５℃で３分間インキュベーションされて、氷上で冷却された。ＲＴ反応は５ユニットのＡＭＶ  ＲＴを加えて開始され、続いて４２℃で４５分間インキュベートされた。ＰＣＲのために、我々は１９−塩基ＴＡＧ−特異的プライマー（アニ−リング温度を増加させるために、5'NLAIII制限反応サイトとイノシン  ヌクレオチドでＳＡＧＥで厳密に同定された１１  ヌクレオチド（nt）からなる）と−２１Ｍ１３プライマーを使用した。ＲＴ混合物（RT−mix）は、１００ngの各プライマー（−２１ｍ１３プライマー：５’ＧＴＡ  ＡＡＡ  ＣＧＡ  ＣＧＧ  ＣＣＡ  ＧＴ３’と５’ＩＩＩ  ＩＩＣ  ＡＴＧ  ＡＣＣ  ＴＣＣ  ＡＣＴ  ＧＧ３’）、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．３）、２０ｍＭ  ＫＣｌ、１ミリリットル当たり０．１ｍｇＢＳＡ、dNTPs（各０．１ｍＭ）、２．４ｍＭ ＭｇＣｌ2および２ユニットＴａｑポリメラーゼを含有する８０μｌＰＣＲ混合物に加えられた。５分間９４℃でインキュベーションの後、反応はサーモサイクラー（９７００パーキン−エルマー（Perkin−Elmer））中で３５サイクルの増幅にかけられた。１サイクルは、９５℃で１分間の変性、５５℃で１分間のアニーリングそして７２℃で２分間の伸長を含む。最後のサイクルの次に７２℃で１０分間のインキュベーションが実施された。
【００５２】
増幅されたフラグメントは、ＡＴプラスミド（インビトロジェン（InvitroGen））にクローン化され続いて挿入物は、アプライドビオシステムズ（Applied Biosystems Inc.）製の染色ターミネーター配列決定キット（dye terminator sequencing kit）を用いて配列が決定された。フラグメントは、１０２塩基対の長さを有しており、フラグメントの配列分析は図１に示す配列を示した。この配列はヒト胎児の心臓から同定されたＥＳＴ配列（ジェンバンク  登録番号（GenBank acc.）ＡＩ２１７５６５およびその他）と同一であり、その結果これは染色体１９上の予想されたエクソンと合致した。新脈管形成との関係は文献未記載であり新規である。
【００５３】
実施例９
タグ配列の同定の確認。
１５ヌクレオチドからなる配列は特定のｍＲＮＡまたは遺伝子を同定するのに十分であろう。タグの独自性を確認するために、我々はＲＴ反応のためのオリゴ２４ｄＴプライマーを用いてＲＴ−ＰＣＲを作製した。タグ配列自身を含有する５’プライマーが２番目のストランド合成に使用された。オリゴ２４ｄＴは、−２１Ｍ１３配列で延長された５’位置に延長された。ＰＣＲ反応とそれに続くＲＴ反応において、−２１Ｍ１３プライマーが、タグ配列を含む５’プライマーとともに増幅に使用される。タグ配列を含む５’プライマーは、このプライマーの結合能力を増大するためにその５’位置に５イノシンで延長された。増幅されたフラグメントの配列は、これがタグ配列で同定された遺伝子であることを確認するために決定することができる。タグを確認するためのＲＴ−ＰＣＲ反応は、タグ配列の発現プロファイルを調製するために使用されたと同一の組織検体で実施された。
【００５４】
手順
実験に使用された共通の緩衝液
１０×ＲＴ緩衝液：
−  ５００ｍＭ  ＴＲＩＳ、ｐＨ８．３
−  ７５０ｍＭ  ＫＣＬ
−  ３０ｍＭ  ＭｇＣｌ2
−  １００ｍＭ  ＤＴＴ
１０ｘＰＣＲ緩衝液:
−  ２００ｍＭ  ＴＲＩＳ  ｐＨ８．３
−  ５００ｍＭ  ＫＣＬ
−  １ｍｇ/ｍｌ  ＢＳＡ
１ｍｌ  トリゾール（ＴＲＩｚｏｌ）試薬（インビトロジェンライフテクノロジ（Invitrogen Life Technologies）カタログ番号１５５９６）が、１０〜１００ｍｇの組織または約１０7細胞に即時に加えられる（組織は、ミクロトームで１４μｍの厚さに薄く切り取られる）。
【００５５】
検体の全ＲＮＡ単離は製造者プロトコルに従って、以下の通り実施される：
・クロロフォルム（メルク）０．２ｍｌ添加、そして手で１５秒間試験管を激しく振盪。
・室温で５分間インキュベート。
・４℃で１５分間、１２,０００×ｇ以下で遠心分離。
・無色の上部水層６００μｌを新しい試験管に移す。下部の有機層は赤色であるべき。
・０．５ｍｌイソプロピルアルコール（メルク）を添加し、撹拌。
・室温で５分間インキュベート。
・４℃で１５分間、１２,０００×ｇ以下で遠心分離。
・上澄みを捨て、１ｍｌの８０％エタノールでＲＮＡペッレットをボルテキシング（vortexing）により洗浄し、４℃で５分間、７,５００×ｇ以下で遠心分離し、上澄み液を捨てる。
・ペレットを乾燥するために、５６℃に３分間試験管おき、以下の欄に記載の通りポリＡ+ＲＮＡ単離を続ける。
【００５６】
ポリＡ+ＲＮＡ単離は、製造者インビトロジェン  コーポレーション、カールスバッド、ＵＳＡ  カタログ番号Ｋ１５２０）から提供されたミクロ  ファ−ストトラック（Micro Fasttrack）２．０ポリＡ+ｍＲＮＡ  単離キットのマニュアルに従って実施された。
【００５７】
続いて、単離されたポリＡ+ＲＮＡは、ＲＴ−ＰＣＲ反応の分析にインプットとして使用された。ＲＴ−ＰＣＲ反応は、以下の材料の混合物を使用して開始した：
２１Ｍ１３ポリＴプライマー（１００ｎｇ／μｌ）    １．２５μｌ
１０  ｘ  ＲＴ緩衝液                              ２．０μｌ
１００ｍＭ  ｄＮＴＰ（ファルマシア）              ０．８μｌ
２０Ｕ  ＲＮＡｓｉｎ（ロッシュ）                  ０．３μｌ
ｄＨ2Ｏ（ベイカー）                               ０．６５μｌ
・ポリＡ+ｍＲＮＡの１０μｌ希釈液をＲＴ−mixの５μｌに加える。
・プライマーをテンプレートにアニーリングするために反応溶液を６５℃で４５分間インキュベートし、その後室温まで冷却する。
・５μｌ  １Ｕ／μｌ  ＡＭＶ−ＲＴを反応溶液に加え４２℃で４５分間インキュベーションすることによって逆転写を実施する。
・逆転写の後、すぐに混合物を９５℃で５分間インキュベートし反応を停止する。そして，反応混合物を室温まで冷却する。
・ＰＣＲ−mixの８０μｌを各反応混合物（全容量は１００μｌ）に添加。
反応あたりのＰＣＲ−mixは次の通り調製する：
−５’プライマー（１００ｎｇ／μｌ）、表５参照      １．０μｌ
−２１Ｍ１３（１００ｎｇ／μｌ）                    １．０μｌ
−１０×ＰＣＲ緩衝液                                ８．０μｌ
−１００ｍＭ  ＭｇＣｌ2                              ２．１μｌ
−Ａｍｐｌｉｔａｑ  ５Ｕ／μｌ（パーキンエルマー）  ０．４μｌ
−ｄＨ2Ｏ（ベイカー）                              ６７．５μｌ
・ＰＣＲ増幅は、９７００  ＤＮＡ  サーマルサイクラー（パーキンエルマー）中で以下のプログラムに従い実施した。
−９５℃で５分間
−９５℃で１分間；５５℃で１分間；７２℃で２分間、３５サイクル
−７２℃で１０分間
【００５８】
ＲＴ−ＰＣＲ産物のＴＡ−クローニングは、製造者（インビトロジェン  コーポレーション、カールスバッド、（Invitrogen Corporation, Carlsbad） 米国  カタログ番号Ｋ４６００）から提供されたＴＯＰＯ  ＴＡクローニング（登録商標）（キットのマニュアルに従って、ｐＣＲ（登録商標）ＩＩ−ＴＯＰＯ（登録商標）  ＤｕａｌプロモターベクターとＴＯＰ１０  Ｏｎｅ  Ｓｈｏｔ（登録商標）細胞を使用して実施された。
【００５９】
クローンのスクリーニングは、ＳＰ６とＴ７プライマーでＰＣＲを使用して以下のとおり実施された。
【００６０】
・コロニーを５０μｌｄＨ2Ｏ（ベイカー）に最懸濁する。この細菌懸濁液をＰＣＲ混合物の１０μｌに懸濁する。
・反応あたりのＰＣＲ−混合物は次の通り調製する：
ＳＰ６（１００ｎｇ／μｌ）、                        ０．１０μｌ
Ｔ７（１００ｎｇ／μｌ）                            ０．１０μｌ
１０×ＰＣＲ緩衝液                                  １．００μｌ
１００ｍＭ  ＭｇＣｌ2                                ０．２０μｌ
１００ｍＭ  ｄＮＴＰ’ｓ（ファルマシア）            ０．０８μｌ
Ａｍｐｌｉｔａｑ  ５Ｕ／μｌ（パーキンエルマー）    ０．０４μｌ
ｄＨ2Ｏ（ベイカー）                                  ７．４８μｌ
・ＰＣＲ増幅は、９７００  ＤＮＡ  サーマルサイクラー（パーキンエルマー）中で以下のプログラムに従い実施した。
−９５℃で５分間
−９５℃で３０秒間；５５℃で３０秒間；７２℃で１分間、３５サイクル
−７２℃で１０分間
・コロニー−ＰＣＲ産物の５μｌを１．５％アガロース  １×ＴＢＥ  ゲルにかけ  エチジュウム  ブロマイド（Ethidium Bromide）で染める。
・挿入物含有（insert−containing）クローンを同定するために、増幅産物をＵＶ−照射装置（ＵＶ−illuminator）上で目に見えるようにする。
【００６１】
挿入物含有クローン（Clones containing insert）は、ＳＰ６とＴ７プラーマ−、およびエイビアイ  プリズム  ビグ−ダイ  ターミネイターサイクル配列決定キット（ABI Prism Big−Dye terminator cycle sequencing kit、パーキンエルマー  アプライド  ビオシステズ、フォスター市、カルフォルニア、米国（ Perkin Elmer Applied Biosystems, Foster City, Caif USA））を使用して両方向から配列決定された。
【００６２】
【表５】
2004523232.tif 000006
【００６３】
タグ配列の確認結果：
オリゴ２４ｄＴプライマーと上記のタグを基本としたプライマー（tag−based primer primer）（表５中で指定されたタグ  ００４、００７、０１１、０１２、０１４、０１５、０１６、０１７、０２２、０２５，０２９、０３０、０３２、０３６）とのＲＴ−ＰＣＲを使用した配列分析によってこの実施例１４に記載されたプロトコルで分析された１８のタグ配列が確認された。４種のタグ配列（指定されたタグ０１０、０１３、０１８、０１９）はこの方法で確認できなかった。これはおそらく、タグを基本としたプライマーは充分に特異的でないかあるいはｍＲＮＡのポリＡ末尾が充分に長くはなかった事実によるものであった。１つのタグに対してもう一つのもっと特異的な５’プライマーが、−２１Ｍ１３ポリＴ（指定タグ００４）とともにＲＴ−ＰＣＲを実施するためにデザインされた。タグ０１０について、逆転写と増幅を実施するために完全に特異的なプライマーセットがデザインされた。他のタグは特異的なＲＴ−ＰＣＲプライマーセットを使用し、次いで特異的なネスト化プライマーセット（指定タグ０１３、０１８、０１９）でのネスト化ＰＣＲ（Nested PCR）を使用して確認された。全て確認された配列の結果は、以下と、図に一覧として記載されている。ｍＲＮＡ配列中のタグ配列は、もし存在すれば太文字で示されている。
【００６４】
ＴＡＧ００４（ＥＳＴ  ＡＩ２１７５６５、ｇｅｎｂａｎｋ番号ＢＥ４６６７２８）：
この実施例のプロトコルで確認された。
2004523232.tif 000007
（図１）
【００６５】
ＴＡＧ００７（ケラチン１４、ｇｅｎｂａｎｋ番号ＸＭ＿００８５７８）：この実施例のプロトコルで確認された。
2004523232.tif 000008
（図２）
【００６６】
ＴＡＧ０１０（エフリンＡ２（ephrin A2）、ｇｅｎｂａｎｋ番号ＸＭ＿００２０８８）：
catg−位置上にデザインされた５’プライマー（元のプライマーは表５に示す）でのＲＴ−ＰＣＲでは確認できなかった。おそらく確実にタグを基礎とするプライマー（tag−based primer）が充分特異的でない。エフリンＡ２（Ephrin A2）特異的プライマーが確認のために使用された。タグ配列は、エフリン（Ephrin）特異的ＲＴ−ＰＣＲに含まれていない。
2004523232.tif 000009
（図３）
【００６７】
ＴＡＧ０１１（デュアルスペシフィシティホスファターゼ（dual specificity phosphatase）、ｇｅｎｂａｎｋ番号ＸＭ＿００３７２０）：この実施例のプロトコルで確認された。
2004523232.tif 000010
（図４）
【００６８】
ＴＡＧ０１２（ＩＬ１レセプター、タイプ１、ｇｅｎｂａｎｋ番号ＸＭ＿００２６８６）：この実施例のプロトコルで確認された。
2004523232.tif 000011
（図５）
【００６９】
ＴＡＧ０１３（エフリン  Ｂ１（ephrin B1）、ｇｅｎｂａｎｋ番号ＸＭ＿００２５３５、ＢＣ００２５２４）：
catg−位置上にデザインされた５’プライマー（元のプライマーは表５に示す）でのＲＴ−ＰＣＲでは確認できなかった。おそらく確実に、タグを基礎とするプライマーは充分特異的でない。エフリンＢ１（Ephrin B1）特異的プライマーが確認のために使用された。タグ配列は、エフリンＢ１（Ephrin B1）特異的ＲＴ−ＰＣＲフラグメントの３’プライマーに含まれている。ネスト化されたＰＣＲフラグメント（Nested PCR fragment）がここに示されており、タグ配列のちょうど上流部に位置している。
2004523232.tif 000012
（図６）
【００７０】
ＴＡＧ０１４（ＡＴグループＤ蛋白、ｇｅｎｂａｎｋ番号ＸＭ＿００６１８４、ＡＦ２３０３８８）：
この実施例のプロトコルで確認された。
2004523232.tif 000013
（図７）
【００７１】
ＴＡＧ０１５（ＴＩＥ１、ｇｅｎｂａｎｋ番号ＸＭ＿００２０３７）：
この実施例のプロトコルで確認された。
2004523232.tif 000014
（図８）
【００７２】
ＴＡＧ０１６（小さいind.サイトカインＡ１８、ｇｅｎｂａｎｋ番号ＸＭ＿００８４５１、Ｙ１３７１０，ＡＦ１１１１９８）：
この実施例のプロトコルで確認された。
2004523232.tif 000015
（図９）
【００７３】
ＴＡＧ０１７（補体、１Ｑベータ、ｇｅｎｂａｎｋ番号ＸＭ＿０１０６６６）：この実施例のプロトコルで確認された。
2004523232.tif 000016
（図１０）
【００７４】
ＴＡＧ０１８ （ガレクチン７（galectin 7）、ｇｅｎｂａｎｋ番号ＮＭ＿００２３０７、Ｕ０６６４３）：
catg−位置上にデザインされた５’プライマー（元のプライマーは表５に示す）でのＲＴ−ＰＣＲでは確認できなかった。おそらく確実に、タグを基礎とするプライマー（tag−based primer）は充分特異的でない。ガレクチン７（galectin 7）特異的プライマーが確認のために使用された。ガレクチン７（galectin 7）特異的プライマーで使用された５’プライマーは、タグ配列を含む。タグ配列は、ガレクチン７（galectin 7）特異的ＲＴ−ＰＣＲフラグメントに含まれている。ネスト化されたＰＣＲフラグメント（Nested PCR fragment）がここに示されており、タグ配列のちょうど下流部に位置している。
2004523232.tif 000017
（図１１）
【００７５】
ＴＡＧ０１９ （ＦＧＦＲ３、ｇｅｎｂａｎｋ番号ＮＭ＿０２２９６５、ＮＭ＿０００１４２）：
catg−位置上にデザインされた５’プライマー（元のプライマーは表５に示す）でのＲＴ−ＰＣＲでは確認できなかった。おそらく確実に、タグを基礎とするプライマー（tag−based primer）は充分特異的でない。ＦＧＦＲ３特異的プライマーが確認のために使用された。タグ配列は、エフリン（Ephrin）特異的ＲＴ−ＰＣＲに含まれていない。ネスト化されたＰＣＲフラグメント（Nested−PCR fragment）がここに示されており、タグ配列の上流部に位置している。
2004523232.tif 000018
（図１２）
【００７６】
ＴＡＧ０２２（プソリアシン（Psoriasin）（Ｓ１００  Ａ７））、ｇｅｎｂａｎｋ番号ＸＭ＿０４８１２０）：この実施例のプロトコルで確認された。
2004523232.tif 000019
（図１３）
【００７７】
ＴＡＧ０２５（ＥＳＴユニジーン（EST Unigene）番号Ｈｓ１７３７８９、ｇｅｎｂａｎｋ番号ＸＭ＿０１８４０４、ＡＬ１３７２６２）：
この実施例のプロトコルで確認された。
2004523232.tif 000020
（図１４）
【００７８】
ＴＡＧ０２９（ＰＩＧ、ｇｅｎｂａｎｋ番号ＸＭ＿０１１４５３、ＡＪ２５１８３０）：
この実施例のプロトコルで確認された。
2004523232.tif 000021
（図１５）
【００７９】
ＴＡＧ０３０（ＥＳＴ  ユニジーン（EST Unigene）番号Ｈｓ４６９８７、ｇｅｎｂａｎｋ番号ＤＧ１５１１９０、ＢＧ０５７２８９、ＢＥ８５８２７６、ＡＶ６８１７５９、ＢＥ５０３１６９）：
この実施例のプロトコルで確認された。
2004523232.tif 000022
（図１６）
【００８０】
ＴＡＧ０３２（シアロアドヘシン（SialoAdhesin）、シグレック１（Siglec 1）とも呼ばれる、ｇｅｎｂａｎｋ番号ＸＭ＿０１６２４５）：
この実施例のプロトコルで確認された。
2004523232.tif 000023
（図１７）
【００８１】
ＴＡＧ０３６（デスモプラキン（Dsmoplakin）、ｇｅｎｂａｎｋ番号ＸＭ＿００４４６３、ＮＭ＿００４４１５、ＡＦ１３９０６５）：
この実施例のプロトコルで確認された。
2004523232.tif 000024
（図１８）
【００８２】
実施例１０
皮膚検体中のタグ配列の遺伝子発現レベルの測定
新脈管形成のマーカーとしてタグ配列の使用に関する感触を得るために、カポジ肉腫病変のある皮膚検体（５種の異なる検体）とカポジ肉腫病変のない皮膚検体（２種の対照検体）が、タグ配列で同定された遺伝子の発現レベルについて分析された。
【００８３】
手順：
１ｍｌ  トリゾール（TRIzol）試薬（インビトロジェン  ライフ  テクノロジーズ（Invitrogen Life Technologies）カタログ番号１５５９６）が、１０〜１００ｍｇの組織または約１０7細胞に即時に加えられる（組織は、ミクロトームで１４μｍの厚さに薄く切り取られる）。
【００８４】
検体の全ＲＮＡの単離は製造者プロトコルに従って、以下の通り実施される：
・クロロフォルム（メルク）０．２ｍｌ添加、そして手で１５秒間試験管を激しくし振盪。
・室温で５分間インキュベートする。
・４℃で１５分間、１２,０００×ｇ以下で遠心分離。
・無色の上部水層６００μｌを新しい試験管に移す。下部の有機層は赤色であるべき。
・０．５ｍｌイソプロピルアルコール（メルク）を添加し、混合。
・室温で１０分間インキュベートする。
・４℃で１５分間、１２,０００×ｇ以下で遠心分離。
・上澄みを捨て、１ｍｌの８０％エタノールでＲＮＡペッレットをボーテクシング（vortexing）により洗浄し、４℃で５分間、７,５００×ｇ以下で遠心分離し、上澄み液を捨てる。
・ペレットを乾燥するために、５６℃に３分間試験管をおき、以下の欄に記載の通りＤＮＡ分解酵素（DNase）処理をする。
【００８５】
全ての単離されたＲＮＡにゲノミック（genomic）ＤＮＡが存在ないことを確認するために、われわれはＤＮＡ分解酵素処理を実施し、ＤＮＡ分解酵素反応にＲＮＡ分解酵素阻害剤（ＲＮａｓｉｎ）を添加することによって、ＤＮアーゼ  ＩのＲＮアーゼ活性に対してＲＮＡが保護された。ＤＮＡ分解酵素処理は以下の通り実施された：/
・トリゾール（Trizol）全ＲＮＡ単離の後、ペッレットを８８μｌのｄＨ2Ｏ中に再懸濁する。
・以下を、順次、ＲＮＡ溶液に加える：
−１０μｌ  １０×ＤＮＡ分解酵素緩衝液  （アムビオン（Ambion））
−１μｌ  ４０Ｕ／μｌ  ＲＮＡ分解酵素阻害剤 （RNasin,ロッシュ）
−１μｌ  １０Ｕ／μｌ  ＤＮＡ分解酵素 I（DNase I, ロッシュ）/
・３７℃で１時間インキュベートする。
・１００μｌのｄＨ2Ｏを加えて検体容量を２００μｌに増量する。
・２００μｌの冷フェノール／クロロフォルム  ｐＨ８（ＰＣ８）を加える。
・マイクロ遠心分離機中、全速で室温下５分間遠心分離する。
・水性上層を新しいマイクロ遠心分離試験管に移し、順次、以下を加える：
−３μｌグリコーゲン（ロッシュ）
−１００μｌ  １０Ｍ  酢酸アンモニウム
−７００μｌ  １００％エタノール
・完全に混合し２５，０００×ｇで１５分間４℃で遠心分離し、傾斜し上澄を注ぎだす。
・７００μｌの８０％エタノールを加えて２回洗浄する。完全に混合し２５，０００×ｇで５分間、４℃で遠心分離し、傾斜し上澄を注ぎ出す。
・ペレットを５６℃で５分間乾燥し、１１μｌのｄＨ2Ｏに再懸濁する。
・１μｌのＲＮＡ単離物を１４０μｌのｄＨ2Ｏに希釈し、ＯＤ260測定によって単離物のＲＮＡ濃度と収率を計算する。ＤＮＡ分解酵素処理された全ＲＮＡの収率は、完全なタグ発現プロファイルの測定には少なくとも１３．５μｇであるべきである。
・濃度５０ｎｇ／μｌのＲＮＡ単離物の溶液を調製する。これは、ＴＡＧ特異的なＲＴ−ＰＣＲのための希釈用のもととなるＲＮＡ溶液である。
【００８６】
ＤＮＡ分解酵素処理された全ＲＮＡのサンプルごとに、１８のＴＡＧ特異的ＲＴ−ＰＣＲ／ネスティド  ＰＣＲ（Nested PCR）反応が、ＲＮＡの希釈シリーズで実施された。各検体に対して５つの対照ＲＴ−ＰＣＲが希釈シリーズ、すなわち、ＨＩＶ−１  ＧＡＧ（ＳＫ３９／１４５）、ＧＡＰＤＨ＋ＲＴ（２回）およびＲＴ反応なし（２回）、で実施されるだろう。次の希釈体系は、ＲＴ−ＰＣＲで分析される検体のシリーズの希釈を得るために使用された：
１．  ２７０μｌ  ５０ｎｇ／μｌＤＮＡ分解酵素処理された全ＲＮＡ。
各プライマーセットのＰＴ−ＰＣＲにおける投入量としての、１０μｌ  ５０ｎｇ／μｌ溶液＝５００ｎｇ。
２．  ２７μｌ  ５０ｎｇ／μｌ全ＲＮＡ  １０×希釈＝２７０μｌ  ５ｎｇ／μｌ。
各プライマーセットのＰＴ−ＰＣＲにおける投入量としての、１０μｌ  ５ｎｇ／μｌ溶液＝５０ｎｇ。
３．  ２７μｌ  ５ｎｇ／μｌ全ＲＮＡ  １０×希釈＝２７０μｌ  ０．５ｎｇ／μｌ。
各プライマーセットのＰＴ−ＰＣＲにおける投入量としての、１０μｌ  ０．５ｎｇ／μｌ溶液＝５ｎｇ。
４．  ２７μｌ  ０．５ｎｇ／μｌ全ＲＮＡ  １０×希釈＝２７０μｌ  ０．０５ｎｇ／μｌ。
各プライマーセットのＰＴ−ＰＣＲにおける投入量としての、１０μｌ  ０．０５ｎｇ／μｌ溶液＝０．５ｎｇ。
５．  ２７μｌ  ０．０５ｎｇ／μｌ全ＲＮＡ  １０×希釈＝２７０μｌ  ０．００５ｎｇ／μｌ。
各プライマーセットのＰＴ−ＰＣＲにおける投入量としての、１０μｌ  ０．００５ｎｇ／μｌ溶液＝０．０５ｎｇ。
６．  ２７μｌ  ０．００５ｎｇ／μｌ全ＲＮＡ  １０×希釈＝２７０μｌ  ０．０００５ｎｇ／μｌ。
各プライマーセットのＰＴ−ＰＣＲにおける投入量としての、１０μｌ  ０．０００５ｎｇ／μｌ溶液＝０．００５ｎｇ。
７．  ２７μｌ  ０．０００５ｎｇ／μｌ全ＲＮＡ  １０×希釈＝２７０μｌ  ０．００００５ｎｇ／μｌ。
各プライマーセットのＰＴ−ＰＣＲにおける投入量としての、１０μｌ  ０．００００５ｎｇ／μｌ溶液＝０．０００５ｎｇ。
８．  ２７μｌ  ０．００００５ｎｇ／μｌ全ＲＮＡ  １０×希釈＝２７０μｌ  ０．０００００５ｎｇ／μｌ。
各プライマーセットのＰＴ−ＰＣＲにおける投入量としての、１０μｌ  ０．０００００５ｎｇ／μｌ溶液＝０．００００５ｎｇ。
【００８７】
ＡＭＶ−ＲＴを用いる希釈の全ＲＮＡシリーズにおけるＴＡＧ特異的ＲＴ−ＰＣＲは以下の通り実施された。希釈シリーズ中のＤＮＡ分解酵素処理全ＲＮＡ上の全てのＴＡＧの逆転写反応は、９６ウエルＰＣＲ板で実施された。それぞれの全ＲＮＡ希釈液の１０μｌがＲＴ  ＰＣＲの投入量として使用された。逆転写反応の反応容量は、２０μｌでありｄＮＴＰ、ＭｇＣｌ2およびＲＮＡ分解酵素阻害剤（RNasin）を含有している。
【００８８】
・反応毎のＲＴ混合物（RT−mix）を次の通り調製する：
３’プライマー（１００ｎｇ／μｌ）表６参照    １．２５μｌ
１０×ＲＴ緩衝液                              ２．０μｌ
１００ｍＭ  ｄＮＴＰ（ファルマシア）          ０．８μｌ
２０ＵＲＮＡｓｉｎ（ロッシュ）                ０．３μｌ
ｄＨ2Ｏ（ベイカー（Ｂａｋｅｒ））            ０．６５μｌ
・全ＲＮＡ希釈液１０μｌをＲＴ混合物（RT−mix）の５μｌに加える。
・プライマーをテンプレートにアニーリングするために反応溶液を６５℃で５分間インキュベートし、その後室温まで冷却する。
・５μｌ  １Ｕ／μｌ  ＡＭＶ−ＲＴを反応溶液に加え、４２℃で４５分間インキュベーションすることによって逆転写を実施する。
・逆転写の後、すぐに混合物を９５℃で５分間インキュベートし反応を停止する。そして、反応物を室温まで冷却する。
・ＰＣＲ反混合物（PCR−mix）の８０μｌを各反応混合物に添加（全容量は１００μｌ）。
反応あたりのＰＣＲ混合物（PCR−mix）は次の通り調製する：
−５’プライマー（１００ｎｇ／μｌ）、表６参照    １．０μｌ
−１０×ＰＣＲ緩衝液                              ８．０μｌ
−１００ｍＭ ＭｇＣｌ2                            １．９μｌ
−Ａｍｐｌｉｔａｑ  ５Ｕ／μ                      ０．４μｌ
−ｄＨ2Ｏ（ベイカー）                            ６８．７μｌ
・ＰＣＲ増幅は、９７００  ＤＮＡ  サーマルサイクラー（パーキンエルマー）中で以下のプログラムに従い実施される。
−９５℃で５分間
−９５℃で１分間；５５℃で１分間；７２℃で２分間、３５サイクル
−７２℃で１０分間
【００８９】
この最初の増幅に続いて、第２回のネスト化された （nested）増幅が実施された。ＲＴ−ＰＣＲ産物上のＴＡＧ特異的な第２回のネスト化された（nested）ＰＣＲは、以下のとおり実施された：
ネスト化ＰＣＲ混合物（Nested−PCR mix）４５μｌにＴＡＧ  ＲＴ−ＰＣＲ産物５μｌを加える。
・反応ごとのネスト化されたＰＣＲ混合物（Nested−PCR mix）を次のように調製する：
５’ネスト化（nested）プライマー（１００ｎｇ／μｌ）、表７参照０．５μｌ
３’ネスト化（nested）プライマー（１００ｎｇ／μｌ）、表７参照０．５μｌ
１０×ＰＣＲ緩衝液                                ５．０μｌ
１００ｍＭ  ＭｇＣｌ2                             １．２５μｌ
１００ｍＭ  ｄＮＴＰ（ファルマシア）              ０．４μｌ
Ａｍｐｌｉｔａｑ  ５Ｕ／μｌ                      ０．２μｌ
ｄＨ2Ｏ（ベイカー）                             ３７．１５μｌ
タグによって同定された遺伝子の増幅のために使用されたプライマーの組み合わせと増幅されたフラグメントの長さは、表８に示されている。
・ＰＣＲ増幅は、９７００  ＤＮＡ  サーマルサイクラー（パーキンエルマー中で以下のプログラムに従い実施される。
−９５℃で５分間
−９５℃で１分間；５５℃で１分間；７２℃で２分間、２５サイクル
−７２℃で１０分間
・ネスト化（nested）ＰＣＲ産物の１０μｌを１．５％アガロース  １×ＴＢＥ  ゲルにかけ、エチジュウム  ブロマイド（Ethidium Bromide）で染める。
・希釈シリーズのＴＡＧ増幅フラグメントをＵＶ−照射装置（ＵＶ−illuminator）上で可視化することで、希釈しても明白なシグナルを示す最高希釈度を決定することにより発現レベルが明らかになる。
【００９０】
【表６】
2004523232.tif 000025
【００９１】
【表７】
2004523232.tif 000026
【００９２】
【表８】
2004523232.tif 000027
【００９３】
結果
タグ配列によって同定された遺伝子の発現レベルの測定結果は、図１９に示されている。データ−は明らかにタグ配列によって同定された遺伝子の数は、正常皮膚に比べてカポジ肉腫病変の皮膚検体において高発現である事を示している：タグ００７、タグ０１０、タグ０１２、タグ０１３、タグ０１４、タグ０１５、タグ０１６、タグ０１７、タグ０２２、タグ０２９、タグ０３０、タグ０３２およびタグ０３６。
【００９４】
実施例１１
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）検体中でのタグ配列の遺伝子発現レベルの測定
新脈管形成部位、すなわち皮膚中のカポジ肉腫または体内の他の癌からの検体中ではなく、血液（ＰＢＭＣ）から入手可能な検体で、新脈管形成過程のマーカーとしてのタグ配列の使用感触を得るために、５種のタグ同定された遺伝子の発現が、ＰＢＭＣ検体で測定された。ＰＢＭＣ検体は、カポジ肉腫病変のある患者の血液から（４種の異なる検体）とそうでない患者（２種の対照検体）血液由来であり、タグ配列で同定された５種の遺伝子のＰＢＭＣ中での発現について分析された。
【００９５】
この実施例の手法は、皮膚生検のかわりにＰＢＭＣ検体（１検体当たり、約１千万細胞、２５０万から５０００万の範囲）が使用される以外は実施例１０で記載されたものと同一であった。分析される遺伝子は、タグ００７、タグ０１７、タグ０１０、タグ０１３、タグ０１５、タグ０２９およびタグ０３２によって同定された。分析結果は、図２０に示されている。これらのデータ−から、タグ０１５（ＴＩＥ１）とタグ０３２（サリオアドヘシン（Salioadhesin）またはシグレック１（Siglec１））で同定された遺伝子の癌位置での昂進された発現は、血液細胞画分すなわちＰＢＭＣ、と対応していることが明らかである。
【００９６】
結果
タグ００７（ケラチン１４）で皮膚検体（実施例５参照）中で同定された遺伝子の過剰発現は、血液と対応していないことを、このデータ−は明らかに示している。対照的に、この実施例で試験された検体中では、タグ００７によって同定された遺伝子は血液画分で全く発現されていない。このことは、タグ００７を発現している癌細胞は血液中に存在しないことを示している。その結果、血液中のタグ００７の測定は、血液中のこれら癌細胞存在のためのよい標識になるであろう、そして従って、転移を起こし得る循環癌細胞のマーカーになる。
【００９７】
皮膚検体中のタグ０１５（ＴＩＥ１）とタグ０３２（サリオアドヘシン（Salioadhesin）またはシグレック１（Siglec１））によって同定された遺伝子のアップレギュレイションは明らかに血液と相関している。これら２つのタグは、健常人と比較して癌保持患者の血液中で高く発現している。このアップレギュレイションは、典型的な血液細胞中の発現のアップレギュレイションに起因している。
【００９８】
このアップレギュレイションは、血液中でタグ０１５とタグ０３２を発現する癌細胞の存在に帰する事はできない、なぜなら、タグ００７によって同定された遺伝子発現のないことが、上記で説明したよう、血中に癌細胞が存在しないことを示すからである。このことは、血液中のタグ０１５および／またはタグ０３２の発現の測定が体内のどこか他の場所での癌細胞の存在を示唆することを意味する。さらに、抗癌治療および／または抗新脈管形成治療中でのタグ０１５および／またはタグ０３２によって同定された遺伝子の発現の測定は、この治療の有効性をモニターするために使用できる。
【００９９】
結論
タグ０１５（ＴＩＥ１）とタグ０３２（サリオアドヘシン（Ｓalioadhesin）またはシグレック１（Siglec 1））によって癌と血液中で同定された遺伝子の相関したアップレグレーションは、癌の成長の減少を目的とする治療、特に抗新脈管形成性癌治療の有効性をモニターすることを可能にする。このことは、もしこの２つの遺伝子が体内の他の場所での癌中の血管形成のためのＰＢＭＣ中でのマーカーであるとすると、血中のこの２つのマーカーも癌側でのこの血管形成の減少と共に減少するであろうとの推論による。
【０１００】
タグ００７（ケラチン１４）、タグ０１５（ＴＩＥ１）およびタグ０３２（サリオアドヘシン（Ｓalioadhesin）またはシグレック１（Siglec 1））によって同定された遺伝子は、正常個体と比較して癌保有患者の血中で異なった発現をしている。従って、これらの遺伝子は、特にその発現は、その住民の各メンバーで癌の存在の危険に曝されている住民を集団検診するのに使用できる。
【０１０１】
正常組織と癌組織を比べて変化した発現レベルを示す、この研究でタグによって同定された全ての遺伝子、すなわち、タグ００７、タグ０１０、タグ０１２、タグ０１３、タグ０１４、タグ０１５、タグ０１６、タグ０１７、タグ０２２、タグ０２９、タグ０３０、タグ０３２およびタグ０３６は、抗新脈管形成効果を有し癌治療に適用可能な治療薬剤とっての潜在的な標的分子をエンコードしている、そして／またはこれらの遺伝子は、たとえば心臓および冠動脈疾患の治療で血管成長を刺激する治療薬剤の潜在的標的分子になりえる潜在的標的分子をエンコードしている。
【図面の簡単な説明】
【０１０２】
【図１】新脈管形成に含まれる配列。特定の治療後のこの配列の発現変化は、その治療が有効であることを示す。この配列は、ヒト胎児の心臓から同定されたＥＳＴ配列と同一である（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＩ２１７５６５およびその他）、その結果これは染色体１９上の予測されたエクソンと合致する。新脈管形成との関係について今まで記載されたことがない。
【図２】名称とＧｅｎｂａｎｋ番号で同定された配列（ＮＣＢＩデータベース）。他の同定は表１〜４（ユニジーン（Unigene）番号）で見ることができ、これはＮＣＢＩのＳＡＧＥデータベースで見つけることができる。
【図３】名称とＧｅｎｂａｎｋ番号で同定された配列（ＮＣＢＩデータベース）。他の同定は表１〜４（ユニジーン（Unigene）番号）で見ることができ、これはＮＣＢＩのＳＡＧＥデータベースで見つけることができる。
【図４】名称とＧｅｎｂａｎｋ番号で同定された配列（ＮＣＢＩデータベース）。他の同定は表１〜４（ユニジーン（Unigene）番号）で見ることができ、これはＮＣＢＩのＳＡＧＥデータベースで見つけることができる。
【図５】名称とＧｅｎｂａｎｋ番号で同定された配列（ＮＣＢＩデータベース）。他の同定は表１〜４（ユニジーン（Unigene）番号）で見ることができる、これはＮＣＢＩのＳＡＧＥデータベースで見つけることができる。
【図６】名称とＧｅｎｂａｎｋ番号で同定された配列（ＮＣＢＩデータベース）。他の同定は表１〜４（ユニジーン（Unigene）番号）で見ることができ、これはＮＣＢＩのＳＡＧＥデータベースで見つけることができる。
【図７】名称とＧｅｎｂａｎｋ番号で同定された配列（ＮＣＢＩデータベース）。他の同定は表１〜４（ユニジーン（Unigene）番号）で見ることができ、これはＮＣＢＩのＳＡＧＥデータベースで見つけることができる。
【図８】名称とＧｅｎｂａｎｋ番号で同定された配列（ＮＣＢＩデータベース）。他の同定は表１〜４（ユニジーン（Unigene）番号）で見ることができ、これはＮＣＢＩのＳＡＧＥデータベースで見つけることができる。
【図９】名称とＧｅｎｂａｎｋ番号で同定された配列（ＮＣＢＩデータベース）。他の同定は表１〜４（ユニジーン（Unigene）番号）で見ることができ、これはＮＣＢＩのＳＡＧＥデータベースで見つけることができる。
【図１０】名称とＧｅｎｂａｎｋ番号で同定された配列（ＮＣＢＩデータベース）。他の同定は表１〜４（ユニジーン（Unigene）番号）で見ることができ、これはＮＣＢＩのＳＡＧＥデータベースで見つけることができる。
【図１１】名称とＧｅｎｂａｎｋ番号で同定された配列（ＮＣＢＩデータベース）。他の同定は表１〜４（ユニジーン（Unigene）番号）で見ることができ、これはＮＣＢＩのＳＡＧＥデータベースで見つけることができる。
【図１２】名称とＧｅｎｂａｎｋ番号で同定された配列（ＮＣＢＩデータベース）。他の同定は表１〜４（ユニジーン（Unigene）番号）で見ることができ、これはＮＣＢＩのＳＡＧＥデータベースで見つけることができる。
【図１３】名称とＧｅｎｂａｎｋ番号で同定された配列（ＮＣＢＩデータベース）。他の同定は表１〜４（ユニジーン（Unigene）番号）で見ることができ、これはＮＣＢＩのＳＡＧＥデータベースで見つけることができる。
【図１４】名称とＧｅｎｂａｎｋ番号で同定された配列（ＮＣＢＩデータベース）。他の同定は表１〜４（ユニジーン（Unigene）番号）で見ることができ、これはＮＣＢＩのＳＡＧＥデータベースで見つけることができる。
【図１５】名称とＧｅｎｂａｎｋ番号で同定された配列（ＮＣＢＩデータベース）。他の同定は表１〜４（ユニジーン（Unigene）番号）で見ることができ、これはＮＣＢＩのＳＡＧＥデータベースで見つけることができる。
【図１６】名称とＧｅｎｂａｎｋ番号で同定された配列（ＮＣＢＩデータベース）。他の同定は表１〜４（ユニジーン（Unigene）番号）で見ることができ、これはＮＣＢＩのＳＡＧＥデータベースで見つけることができる。
【図１７】名称とＧｅｎｂａｎｋ番号で同定された配列（ＮＣＢＩデータベース）。他の同定は表１〜４（ユニジーン（Unigene）番号）で見ることができ、これはＮＣＢＩのＳＡＧＥデータベースで見つけることができる。
【図１８】名称とＧｅｎｂａｎｋ番号で同定された配列（ＮＣＢＩデータベース）。他の同定は表１〜４（ユニジーン（Unigene）番号）で見ることができ、これはＮＣＢＩのＳＡＧＥデータベースで見つけることができる。
【図１９】カポジ肉腫の皮膚５検体（明るい色の棒線）と２つの対照正常皮膚検体（黒棒線）から単離された全ＲＮＡの５００ｎｇから希釈し始めてもなお陽性を示すログ希釈ファクターとして表示された平均発現レベルと標準偏差。
【図２０】カポジ肉腫患者の４ＰＢＭＣ検体（明るい色の棒線）と２つの対照正常ＰＢＭＣ検体（黒棒線）から単離された全ＲＮＡの５００ｎｇから希釈し始めてもなお陽性をしめすログ希釈ファクターとして表示された平均発現レベルと標準偏差。
【図１９】
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【図２０】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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