(57)【要約】本発明は、精子を低温保存する方法に関する。本方法は：精子試料を提供する工程；前記精子試料を第１温度まで冷却する工程；前記精子試料を前記第１温度で維持する工程；前記精子試料を第２温度まで冷却する工程；前記精子試料を前記第２温度で維持する工程；および前記精子試料を第３温度で保管する工程を含む。それら方法を用いて、例えばトランスジェニック哺乳動物のような哺乳動物からの精子を低温保存し、さらに、後で行う人工授精または体外受精のために精子を保存することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
精子を提供する方法において：
ａ）精子の代謝速度を下げる十分遅い速度で、グリセロール毒性から精子を保護するのに十分な第１温度まで精子を含む試料を冷却して、冷却精子試料を提供する工程；
ｂ）前記冷却精子試料にグリセロールを含有する溶液を添加する工程；および
ｃ）精子が保存されるように、グルセロールと精液とを平衡化させるのに十分な時間をかけて第２温度まで前記冷却精子試料を凍結し、それによって凍結精子試料を提供する工程；
を含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
グリセロールを欠く低温保存バッファー中に、冷却されるべき精子試料を提供する工程をさらに含むことを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記低温保存バッファーが、約１０％から約３０％までの卵黄を含むことを特徴とする請求項２記載の方法。
【請求項４】
グリセロール溶液を添加した後の試料中のグリセロール濃度が、約５％から約１０％までのグリセロール濃度であることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項５】
前記精子試料が哺乳動物から得られることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項６】
前記第１温度が、約０℃から約１０℃までの温度であることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項７】
前記精子試料が、約４時間から約２１時間、前記第１温度で維持されることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項８】
前記精子が、約０．２℃／分から約０．５℃／分までの速度で、前記第１温度まで冷却されることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項９】
前記精子が、約１．５時間から約４時間かけて前記第１温度まで冷却されることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項１０】
前記第２温度が、約−４０℃から約−１００℃までの温度であることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項１１】
前記精子試料が、約７分から約２０分間、前記第２温度で維持されることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項１２】
約−１９０℃から約−２００℃の第３温度で前記凍結精子試料を保管する工程をさらに含むことを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項１３】
精子を保存する方法において：
ａ）精子を第１低温保存バッファーと混合する工程；
ｂ）精子の代謝速度を下げる十分遅い速度で、約２℃から約１０℃の第１温度まで前記精子を冷却して、冷却精子を作成する工程；
ｃ）約−６０℃から約−９０℃の第２温度で前記冷却精子を凍結する工程；および
ｄ）液体窒素中で凍結精子を保管する工程；
を含むことを特徴とする方法。
【請求項１４】
前記第１低温保存バッファーが、約５％から約１０％までのグリセロールを含むことを特徴とする請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
前記第１低温保存バッファーが、グリセロールを欠くことを特徴とする請求項１３記載の方法。
【請求項１６】
前記精子が哺乳動物から得られることを特徴とする請求項１３記載の方法。
【請求項１７】
前記精子が、約４時間から約２１時間、前記第１温度で維持されることを特徴とする請求項１３記載の方法。
【請求項１８】
前記精子が、約０．２℃／分から約０．５℃／分までの速度で、前記第１温度まで冷却されることを特徴とする請求項１３記載の方法。
【請求項１９】
前記精子が、約１．５時間から約４時間かけて前記第１温度まで冷却されることを特徴とする請求項１３記載の方法。
【請求項２０】
精子が第１温度まで冷却された後でかつ精子が第２温度までさらに冷却される前に、第２低温保存バッファーを試料に添加することを特徴とする請求項１５記載の方法。
【請求項２１】
前記第２低温保存バッファーが、約５％から約１０％までのグリセロールを含むことを特徴とする請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
前記第２温度が約−８０℃であることを特徴とする請求項１３記載の方法。
【請求項２３】
前記精子が、約７分から約２０分間、前記第２温度で維持されることを特徴とする請求項１３記載の方法。
【請求項２４】
精子を提供する方法において：
ａ）精子を含む試料を提供する工程；
ｂ）前記試料から精子を単離する工程；
ｃ）前記単離精子を、グリセロールを欠く第１低温保存バッファーと混合する工程；
ｄ）約０．２℃／分から約０．５℃／分までの速度で、約２℃から約８℃の第１温度まで前記精子を冷却して、冷却精子を作成する工程；
ｅ）グリセロールを含有する第２低温保存バッファーを添加する工程；
ｆ）約４時間から約２１時間、前記冷却精子を第１温度で維持する工程；
ｇ）約−６０℃から約−９０℃の第２温度で、約１０分から約１５分間かけて、前記冷却精子を凍結する工程；
ｈ）所望の期間、約−１８０℃から約−２２０℃までの温度で、前記凍結精子を保管する工程；および
ｉ）前記精子を解凍して精子を提供する工程；
を含むことを特徴とする方法。
【請求項２５】
前記精子が、約３７℃の水浴中において約９０秒間解凍されることを特徴とする請求項２４記載の方法。
【請求項２６】
請求項１、３、または２４記載の方法によって保存された精子で卵母細胞を受精させる工程を含んで成る、動物を作成する方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の背景
トランスジェニック技術によって動物ゲノムを改変し得ることは、医療適用のための新たな道を開いた。医用タンパク質の発現を家畜の乳腺に標的化させることによって、高品質の有用な治療タンパク質を低コストで生産することが現在可能である（Ｈｏｕｄｅｂｉｎｅ （１９９５） Ｒｅｐｒｏｄ． Ｎｕｔｒ． Ｄｅｖ． ３５： ６０９−６１７； Ｍａｇａ ｅｔ ａｌ． （１９９５） Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， １３： １４５２−１４５７； Ｅｃｈｅｌａｒｄ （１９９６） Ｃｕｒｒ． Ｏｐ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ７： ５３６−５４０； Ｙｏｕｎｇ ｅｔ ａｌ． （１９９７） Ｂｉｏｐｈａｒｍ． １０：３４−３８）。１９９６年における上位１５の生物薬剤の総売上高は７５億ドルであったが、その値は将来上昇し続けることが予想される（Ｍｅｄ． Ａｄ Ｎｅｗｓ １６： ３０）。高い単位投薬量の必要性、高い投与頻度、または大きな患者人口のせいで大容量が必要とされるタンパク質、および従来の細胞培養法では採算に合う量で生産するのが困難であるような複合タンパク質に関して、トランスジェニック技術は適用可能でありかつ魅力的である。さらには、トランスジェニック家畜の乳中でのヒト薬剤の製造は、例えば翻訳後修飾の欠損、不適切な折畳み、高い精製コストのような細菌バイオリアクターに関連する問題、あるいは例えば高い資本コスト、高価な培地、低い収率のような動物細胞バイオリアクターに関連する問題の多くを解決する。
【０００２】
しかしながら、初代トランスジェニック動物の作成は費用がかかる。有用な遺伝情報（ｇｅｎｅｔｉｃｓ）を有する雄動物はしばしば突然死ぬことがある。そのような突然死は、所有者に膨大な財務上の損失をもたらし、さらに重要なこととして、もし子孫が産生されずまたは精液が低温保存されなければ、その動物の遺伝情報は失われる。トランスジェニック産生の状況において、初代雄動物の死は、重大な経済的影響を有し、かつプロジェクトの期限を乱す。
【０００３】
多くの種からの遺伝物質は、人工授精および体外受精技術を用いることによって保存および伝えられてきた。精子を凍結する工程は、細胞への温度衝撃、浸透圧衝撃および／または機械的衝撃、ならびに細胞構造、特に原形質膜を傷つける結晶形成の結果として過酷であろう。さらには、凍結解凍の工程は、細胞傷害を招く可能性がある細胞の脱水を生じさせる。そのような障害を克服する方法は、例えば医療目的、商業目的、および農業目的のような、多くの任意の目的のために精子を保存するのに有用である。
【０００４】
発明の概要
本発明は、部分的に、精子の代謝速度を下げる十分遅い速度で、第１温度まで精子試料を冷却し、次に、（例えば液体窒素中で）試料を保管する前に、第２温度で精子試料を凍結することによって、生存精子を保存できることの発見に基づく。そのような生殖体の低温保存は、それらを後に利用することを可能にする。また、グルセロールの添加前に第１温度まで精子を冷却することによって、精子がグリセロールの毒性から保護されることも分かった。そのような発明は、農業、薬学、天然資源保全、ならびに家畜およびヒトの医学の分野で広い適用を有する。特に、そのような方法は、個体の遺伝組成物の保存を容易にする。
【０００５】
従って、１つの態様において、本発明は精子を提供する方法に関する。本方法は、グリセロール添加から精子を保護するのに十分な第１温度まで、ならびに精子の代謝速度を下げる十分遅い速度で、精子を含む試料を冷却し、それによって冷却精子試料を提供する工程を含む。本方法は、グリセロールを含有する溶液を添加する工程、および、精子が保存されるように、グルセロールと精液とを平衡化させるのに十分な時間をかけて、第２温度まで冷却精子試料を凍結し、それによって凍結精子試料を提供する工程をさらに含む。
【０００６】
１つの実施形態において、本方法は、例えば生きた動物から得られた精液のような、精液試料を提供する工程を含む。別の実施形態では、精子試料は、例えば剖検で、精子上体からの抽出によって得られる。本方法は、例えば遠心によって、提供された試料から精子を単離する工程を含む。１つの実施形態において、冷却前、精子試料は、約２７℃から約３８℃までの温度、好ましくは、約３７℃である。例えば、ヤギ、ウシ、ヒツジ、ウサギ、ブタ、またはマウスのような哺乳動物、好ましくはヤギまたはウサギから精子試料を得ることができる。好ましい実施形態において、哺乳動物は、例えばポリペプチドをコードする導入遺伝子（ｔｒａｎｓｇｅｎｅ）を包含する哺乳動物のようなトランスジェニック哺乳動物である。そのポリペプチドは、トランスジェニック哺乳動物での発現が望ましい任意のタンパク質であり、例えば、α−プロテイナーゼ阻害剤、アルカリホスファターゼ、アンギオゲニン、抗体、細胞外スーパーオキシドジスムターゼ、フィブロゲン、グルコセレブロシダーゼ、グルタミン酸デカルボキシラーゼ、ヒト血清アルブミン、ミエリン塩基性タンパク質、プロインスリン、可溶性ＣＤ４、ラクトフェリン、ラクトグロブリン、リゾチーム、ラクトアルブミン、エリスロポエチン、組織プラスミノーゲンアクチベーター、ヒト成長因子、アンチトロンビンＩＩＩ、インシュリン、プロラクチン、またはα−抗トリプシンの何れかである。導入遺伝子は、例えば乳特異的プロモーターのようなプロモーターをさらに含んでいて差し支えない。乳特異的プロモーターは、カゼインプロモーター、乳漿酸タンパク質（ｗｈｅｙ ａｃｉｄ ｐｒｏｔｅｉｎ）プロモーター、α−ラクトアルブミンプロモーター、β−ラクトグロブリンプロモーター、またはラクトフェリンプロモーターの何れかであって差し支えない。
【０００７】
１つの実施形態において、本方法は、低温保存バッファー中に、冷却されるべき試料を提供する。好ましい実施形態において、低温保存バッファーはグリセロールを欠く。低温保存バッファーは、例えば約１０％から約３０％までの卵黄、例えば約１５％から２５％までの卵黄、好ましくは２０％の卵黄のような、卵黄を含んでいて差し支えない。低温保存バッファーは、例えば約１％（ｗ／ｖ）の濃度のフルクトースのようなフルクトース；例えば約１．５％（ｗ／ｖ）の濃度のクエン酸のようなクエン酸；Ｔｒｉｓバッファー；例えばチロシン、ゲンタマイシン、リンコスペクチンおよび／またはスペクチノマイシンのような抗生物質；の１つ以上をさらに含んでいて差し支えない。
【０００８】
１つの実施形態において、第１温度は約０℃から約１０℃までの温度、好ましくは約１℃から約８℃までの温度であり、さらに好ましくは約５℃である。好ましい実施形態において、精子試料は、約０．２℃／分から約０．５℃／分までの速度、好ましくは約０．５℃／分の速度で、第１温度まで冷却される。別の実施形態において、精子試料は、約１．５時間から約４時間、好ましくは約１．５時間かけて冷却される。別の実施形態では、精子試料は、約４時間から約２１時間、好ましくは約４時間、第１温度に維持される。
【０００９】
１つの実施形態において、グリセロールを含有する溶液は、約５％から１０％までのグリセロール濃度、好ましくは約７％グリセロール濃度を有する。その溶液が、さらにグリセロールを含有する冷却工程前に用いられる低温保存バッファーであって差し支えない。低温保存バッファーは、例えば約１０％から約３０％までの卵黄、例えば約１５％から２５％までの卵黄、好ましくは２０％の卵黄のような、卵黄を含んでいて差し支えない。低温保存バッファーは、例えば約１％（ｗ／ｖ）の濃度のフルクトースのようなフルクトース；例えば約１．５％（ｗ／ｖ）の濃度のクエン酸のようなクエン酸；Ｔｒｉｓバッファー；例えばチロシン、ゲンタマイシン、リンコスペクチンおよび／またはスペクチノマイシンのような抗生物質；の１つ以上をさらに含んでいて差し支えない。
【００１０】
好ましい実施形態において、第２温度は、約−４０℃から約−１００℃までの温度、例えば約−６０℃から約−９０℃までの温度、好ましくは約−８０℃であって差し支えない。別の実施形態において、凍結精子試料は、約７分から２０分間、好ましくは約１０分から約１８分間、さらに好ましくは約１５分間、第２温度に維持される。
【００１１】
１つの実施形態において、本発明は、例えば液体窒素中、約−１８０℃から約−２００℃、例えば約−１９６℃の第３温度に凍結精子を置く工程をさらに含む。使用するまで精子試料を第３の温度に維持することができる。好ましくは、約２７℃から約３８℃までの温度で、約１分から約５分間、好ましくは約１．５分間、試料を解凍する。１つの実施形態において、解凍後の生存精子の割合（％）は、約２０％、３０％、４０％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、または１００％である。
【００１２】
本発明の別の態様は、精子を保存する方法に関する。本方法は、グリセロール添加から精子を保護するのに十分な第１温度まで、ならびに精子の代謝速度を下げる十分遅い速度で、精子を含む試料を冷却し、それによって冷却精子試料を提供する工程を含む。本方法は、グリセロールを含有する溶液を添加する工程、および、精子が保存されるように、グルセロールと精液とを平衡化させるのに十分な時間をかけて、第２温度まで冷却精子試料を凍結し、それによって凍結精子試料を提供する工程をさらに含む。
【００１３】
１つの実施形態において、本方法は、精子の代謝速度を下げる十分遅い速度で、約２℃から約１０℃の第１温度に精子試料を冷却して、冷却精子を作成する工程；約−６０℃から約−９０℃の第２温度で前記冷却精子を凍結する工程；および約−１８０℃から約−２２０℃の温度、好ましくは−１９６℃の温度で、前記凍結精子を保管する工程を含む。
【００１４】
１つの実施形態において、本方法は、例えば生きた動物から得られた精液のような、精液試料を提供する工程を含む。別の実施形態では、精子試料は、例えば剖検で、精子上体からの抽出によって得られる。本方法は、例えば遠心によって、提供された試料から精子を単離する工程を含む。１つの実施形態において、冷却前、精子試料は約２７℃から約３８℃までの温度、好ましくは、約３７℃である。例えば、ヤギ、ウシ、ヒツジ、ウサギ、ブタ、またはマウスのような哺乳動物、好ましくはヤギまたはウサギから精子試料を得ることができる。好ましい実施形態において、哺乳動物は、例えばポリペプチドをコードする導入遺伝子を包含する哺乳動物のようなトランスジェニック哺乳動物である。そのポリペプチドは、トランスジェニック哺乳動物での発現が望ましい任意のタンパク質であり、例えば、α−プロテイナーゼ阻害剤、アルカリホスファターゼ、アンギオゲニン、抗体、細胞外スーパーオキシドジスムターゼ、フィブロゲン、グルコセレブロシダーゼ、グルタミン酸デカルボキシラーゼ、ヒト血清アルブミン、ミエリン塩基性タンパク質、プロインスリン、可溶性ＣＤ４、ラクトフェリン、ラクトグロブリン、リゾチーム、ラクトアルブミン、エリスロポエチン、組織プラスミノーゲンアクチベーター、ヒト成長因子、アンチトロンビンＩＩＩ、インシュリン、プロラクチン、またはα−抗トリプシンの何れかである。導入遺伝子は、例えば乳特異的プロモーターのようなプロモーターをさらに含んでいて差し支えない。乳特異的プロモーターは、カゼインプロモーター、乳漿酸タンパク質プロモーター、α−ラクトアルブミンプロモーター、β−ラクトグロブリンプロモーター、またはラクトフェリンプロモーターの何れかであって差し支えない。
【００１５】
本方法は、低温保存バッファー中に、冷却されるべき試料を提供する。１つの実施形態において、低温保存バッファーは、例えば約５％から１０％までのグリセロール、好ましくは約７％グリセロールを含む。別の好ましい実施形態では、低温保存バッファーはグリセロールを欠く。低温保存バッファーは、例えば約１０％から約３０％までの卵黄、例えば約１５％から２５％までの卵黄、好ましくは２０％の卵黄のような、卵黄を含んでいて差し支えない。第１低温保存バッファーは、例えば約１％（ｗ／ｖ）の濃度のフルクトースのようなフルクトース；例えば約１．５％（ｗ／ｖ）の濃度のクエン酸のようなクエン酸；Ｔｒｉｓバッファー；例えばチロシン、ゲンタマイシン、リンコスペクチンおよび／またはスペクチノマイシンのような抗生物質；の１つ以上をさらに含んでいて差し支えない。
【００１６】
１つの実施形態において、約１℃から約８℃、好ましくは約５℃の第１温度に精子試料を冷却する。好ましい実施形態において、精子試料は、約０．２℃／分から約０．５℃／分までの速度、好ましくは約０．５℃／分の速度で、第１温度まで冷却される。別の実施形態では、精子試料は、約１．５時間から約４時間、好ましくは約１．５時間かけて冷却される。精子試料を、約４時間から約２１時間、好ましくは約４時間、第１温度に維持して差し支えない。
【００１７】
好ましい実施形態において、グリセロールを欠く低温保存バッファーが冷却前に添加される場合、精子試料が第１温度に維持されている間に、第２低温保存バッファーを冷却精子試料に添加して差し支えない。第２低温保存バッファーは、そのバッファーを添加後の試料が約５％から１０％までのグリセロール濃度、好ましくは約７％グリセロール濃度を有するような濃度でグリセロールを含む。第２低温保存バッファーは、例えば約１０％から約３０％までの卵黄、例えば約１５％から２５％までの卵黄、好ましくは２０％の卵黄のような、卵黄を含んでいて差し支えない。第２低温保存バッファーは、例えば約１％（ｗ／ｖ）の濃度のフルクトースのようなフルクトース；例えば約１．５％（ｗ／ｖ）の濃度のクエン酸のようなクエン酸；Ｔｒｉｓバッファー；例えばチロシン、ゲンタマイシン、リンコスペクチンおよび／またはスペクチノマイシンのような抗生物質；の１つ以上をさらに含んでいて差し支えない。
【００１８】
１つの実施形態において、冷却精子試料は、約−８０℃の第２温度で凍結される。別の好ましい実施形態において、凍結精子試料は、約７分から２０分間、好ましくは約１０分から約１８分間、さらに好ましくは約１５分間、第２温度に維持される。
【００１９】
１つの実施形態において、例えば液体窒素中、約−１８０℃から約−２００℃、例えば約−１９６℃の第３温度で凍結精子を保管する。使用するまで精子試料を第３の温度に維持することができる。別の実施形態では、凍結精子試料を第３温度から解凍する。好ましくは、約２７℃から約３８℃までの温度で、約１分から約５分間、好ましくは約１．５分間、試料を解凍する。１つの実施形態において、解凍後の生存精子の割合（％）は、約２０％、３０％、４０％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、または１００％である。
【００２０】
本発明の別の態様は、精子を提供する方法に関する。本方法は：精子を含む試料を提供する工程；前記試料から精子を単離する工程；前記単離精子を第１低温保存バッファーと混合する工程；約０．２℃／分から約０．５℃／分までの速度、好ましくは約０．５℃／分の速度で、約２℃から約８℃、例えば約５℃の第１温度まで精子試料を冷却して、冷却精子を作成する工程；第２低温保存バッファーを添加する工程；約４時間から約２１時間、好ましくは約４時間、前記冷却精子を第１温度で維持する工程；約−６０℃から約−９０℃の第２温度で、約１０分から約１５分間、例えば約１５分間かけて、前記冷却精子を凍結する工程；および例えば液体窒素中において、約−１８０℃から約−２２０℃、好ましくは−１９６℃の温度で前記凍結精子を保管する工程を含む。使用するまで、第３温度で試料を維持することができる。
【００２１】
１つの実施形態において、本方法は、例えば生きた動物から得られた精液のような、精液試料を提供する工程を含む。別の実施形態では、精子試料は、例えば検死において、精子上体からの抽出によって得られる。本方法は、例えば遠心によって、提供された試料から精子を単離する工程をさらに含む。１つの実施形態において、冷却前、精子試料は、約２７℃から約３８℃までの温度、好ましくは、約３７℃である。例えば、ヤギ、ウシ、ヒツジ、ウサギ、ブタ、またはマウスのような哺乳動物、好ましくはヤギまたはウサギから精子試料を得ることができる。好ましい実施形態において、哺乳動物は、例えばポリペプチドをコードする導入遺伝子を包含する哺乳動物のようなトランスジェニック哺乳動物である。そのポリペプチドは、トランスジェニック哺乳動物での発現が望ましい任意のタンパク質であり、例えば、α−プロテイナーゼ阻害剤、アルカリホスファターゼ、アンギオゲニン、抗体、細胞外スーパーオキシドジスムターゼ、フィブロゲン、グルコセレブロシダーゼ、グルタミン酸デカルボキシラーゼ、ヒト血清アルブミン、ミエリン塩基性タンパク質、プロインスリン、可溶性ＣＤ４、ラクトフェリン、ラクトグロブリン、リゾチーム、ラクトアルブミン、エリスロポエチン、組織プラスミノーゲンアクチベーター、ヒト成長因子、アンチトロンビンＩＩＩ、インシュリン、プロラクチン、またはα−抗トリプシンの何れかである。導入遺伝子は、例えば乳特異的プロモーターのようなプロモーターをさらに含んでいて差し支えない。乳特異的プロモーターは、カゼインプロモーター、乳漿酸タンパク質プロモーター、α−ラクトアルブミンプロモーター、β−ラクトグロブリンプロモーター、またはラクトフェリンプロモーターの何れかであって差し支えない。
【００２２】
好ましい実施形態において、第１低温保存バッファーはグリセロールを欠く。好ましい実施形態では、例えば約１０％から約３０％までの卵黄、例えば約１５％から２５％までの卵黄、好ましくは２０％の卵黄のような、卵黄を含む低温保存バッファー中に冷却すべき精子を混合する。低温保存バッファーは、例えば約１％（ｗ／ｖ）の濃度のフルクトースのようなフルクトース；例えば約１．５％（ｗ／ｖ）の濃度のクエン酸のようなクエン酸；Ｔｒｉｓバッファー；例えばチロシン、ゲンタマイシン、リンコスペクチンおよび／またはスペクチノマイシンのような抗生物質；の１つ以上をさらに含んでいて差し支えない。
【００２３】
好ましい実施形態において、第２低温保存バッファーは、約５％から１０％までのグリセロール、好ましくは約７％グリセロールのようなグリセロールを含む。好ましくは、低温保存バッファーは、例えば約１０％から約３０％までの卵黄、例えば約１５％から２５％までの卵黄、好ましくは２０％の卵黄のような、卵黄をさらに含む。低温保存バッファーは、例えば約１％（ｗ／ｖ）の濃度のフルクトースのようなフルクトース；例えば約１．５％（ｗ／ｖ）の濃度のクエン酸のようなクエン酸；Ｔｒｉｓバッファー；例えばチロシン、ゲンタマイシン、リンコスペクチンおよび／またはスペクチノマイシンのような抗生物質；の１つ以上をさらに含んでいて差し支えない。
【００２４】
１つの実施形態では、精子試料は、約１．５時間から約４時間、好ましくは約１．５時間かけて第１温度まで冷却される
好ましい実施形態において、好ましくは、約２７℃から約３８℃までの温度で、約１分から約５分間、好ましくは約１．５分間、試料を解凍する。１つの実施形態において、解凍後の生存精子の割合（％）は、約２０％、３０％、４０％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、または１００％である。
【００２５】
本発明の別の態様は、例えば哺乳動物のような動物を作成する方法に関する。本方法は、この中に記載の任意の方法によって提供される精子で卵母細胞を受精させる工程を含む。１つの実施形態では、体内で卵母細胞を受精させる。例えば、解凍精子を子宮頸管内または子宮内に注入する。別の実施形態では、体外で卵母細胞を受精させる。好ましい実施形態では、体外受精に利用される卵母細胞を、体外または体内で成熟させることができる。
【００２６】
１つの実施形態において、本方法は、哺乳動物から得られた精子で卵母細胞を受精させる工程を含む。哺乳動物は、ヤギ、ウシ、ヒツジ、ウサギ、ブタ、またはマウスであって差し支えない、好ましくは、哺乳動物はヤギまたはウサギである。好ましい実施形態において、哺乳動物は、例えばポリペプチドをコードする導入遺伝子を包含する哺乳動物のようなトランスジェニック哺乳動物である。そのポリペプチドは、トランスジェニック哺乳動物での発現が望ましい任意のタンパク質であり、例えば、α−プロテイナーゼ阻害剤、アルカリホスファターゼ、アンギオゲニン、抗体、細胞外スーパーオキシドジスムターゼ、フィブロゲン、グルコセレブロシダーゼ、グルタミン酸デカルボキシラーゼ、ヒト血清アルブミン、ミエリン塩基性タンパク質、プロインスリン、可溶性ＣＤ４、ラクトフェリン、ラクトグロブリン、リゾチーム、ラクトアルブミン、エリスロポエチン、組織プラスミノーゲンアクチベーター、ヒト成長因子、アンチトロンビンＩＩＩ、インシュリン、プロラクチン、またはα−抗トリプシンの何れかである。導入遺伝子は、例えば乳特異的プロモーターのようなプロモーターをさらに含んでいて差し支えない。乳特異的プロモーターは、カゼインプロモーター、乳漿酸タンパク質プロモーター、α−ラクトアルブミンプロモーター、β−ラクトグロブリンプロモーター、またはラクトフェリンプロモーターの何れかであって差し支えない。
【００２７】
本発明の別の態様は、例えば、この中に記載の任意の方法によって調製される精子によって受精した卵母細胞から派生した動物のような、動物に関する。
【００２８】
本発明の別の態様は、本発明の任意の方法によって処理された保存精子試料に関する。
【００２９】
本発明の別の態様は、低温保存バッファーを含んで成る低温保存精子用のキットに関する。本キットは、精子を保存するための使用説明書をさらに含む。
【００３０】
好ましい実施形態において、低温保存バッファーは約５％から１０％までのグリセロール、好ましくは７％グリセロールを含有していて差し支えない。別の好ましい実施形態では、低温保存バッファーはグリセロールを欠く。低温保存バッファーは、例えば約１０％から約３０％までの卵黄、例えば約１５％から２５％までの卵黄、好ましくは２０％の卵黄のような、卵黄を含んでいて差し支えない。低温保存バッファーは、例えば約１％（ｗ／ｖ）の濃度のフルクトースのようなフルクトース；例えば約１．５％（ｗ／ｖ）の濃度のクエン酸のようなクエン酸；Ｔｒｉｓバッファー；例えばチロシン、ゲンタマイシン、リンコスペクチンおよび／またはスペクチノマイシンのような抗生物質；の１つ以上をさらに含んでいて差し支えない。
【００３１】
好ましい実施形態において、使用説明書は、この中に記載の任意の方法を詳述するプロトコルを含む。別の実施形態では、本キットは、滅菌プラスチックストロー、およびそのストロー用のラックをさらに含んでいて差し支えない。別の実施形態では、本キットは、精子の生存性を調べるための染色液を、好ましくはその使用説明書と共にさらに含む。
【００３２】
本発明の別の態様は、例えば哺乳動物のような動物を作成するためのキットに関する。本キットは、低温保存バッファー、この中に記載の任意の方法によって精子を保存するための使用説明書、および保存精子で卵母細胞を受精させるための使用説明書を含む。
【００３３】
好ましい実施形態において、低温保存バッファーは約５％から１０％までのグリセロール、好ましくは７％グリセロールを含有していて差し支えない。別の好ましい実施形態では、低温バッファーはグリセロールを欠く。低温保存バッファーは、例えば約１０％から約３０％までの卵黄、例えば約１５％から２５％までの卵黄、好ましくは２０％の卵黄のような、卵黄を含んでいて差し支えない。低温保存バッファーは、例えば約１％（ｗ／ｖ）の濃度のフルクトースのようなフルクトース；例えば約１．５％（ｗ／ｖ）の濃度のクエン酸のようなクエン酸；Ｔｒｉｓバッファー；例えばチロシン、ゲンタマイシン、リンコスペクチンおよび／またはスペクチノマイシンのような抗生物質；の１つ以上をさらに含んでいて差し支えない。
【００３４】
本発明の別の態様は、動物を作成するためのキットに関する。本キットは、この中に記載の方法によって保存された精子、およびその保存精子で卵母細胞を受精させるための使用説明書を含む。
【００３５】
１つの実施形態において、本方法は、哺乳動物から得られた精子で卵母細胞を受精させる工程を含む。哺乳動物は、ヤギ、ウシ、ヒツジ、ウサギ、ブタ、またはマウスであって差し支えない、好ましくは、哺乳動物はヤギまたはウサギである。好ましい実施形態において、哺乳動物は、例えばポリペプチドをコードする導入遺伝子を包含する哺乳動物のようなトランスジェニック哺乳動物である。そのポリペプチドは、トランスジェニック哺乳動物での発現が望ましい任意のタンパク質であり、例えば、α−プロテイナーゼ阻害剤、アルカリホスファターゼ、アンギオゲニン、抗体、細胞外スーパーオキシドジスムターゼ、フィブロゲン、グルコセレブロシダーゼ、グルタミン酸デカルボキシラーゼ、ヒト血清アルブミン、ミエリン塩基性タンパク質、プロインスリン、可溶性ＣＤ４、ラクトフェリン、ラクトグロブリン、リゾチーム、ラクトアルブミン、エリスロポエチン、組織プラスミノーゲンアクチベーター、ヒト成長因子、アンチトロンビンＩＩＩ、インシュリン、プロラクチン、またはα−抗トリプシンの何れかである。導入遺伝子は、例えば乳特異的プロモーターのようなプロモーターをさらに含んでいて差し支えない。乳特異的プロモーターは、カゼインプロモーター、乳漿酸タンパク質プロモーター、α−ラクトアルブミンプロモーター、β−ラクトグロブリンプロモーター、またはラクトフェリンプロモーターの何れかであって差し支えない。
【００３６】
この中で用いられている「トランスジェニック配列」の用語は、技術によって細胞に導入された核酸配列（例えば１つ以上のヒトタンパク質をコードする）を称する。また、トランスジェニック配列は、この中で導入遺伝子としても称されているが、それが導入された細胞から全部または一部が発生する動物のゲノムの一部となる。本発明の実施形態において、トランスジェニック配列は染色体ゲノム中に一体化される。トランスジェニック配列がゲノム中に一体化される場合、単にその挿入の効果によって、その配列が挿入されたゲノムの核酸配列に変化をもたらす。トランスジェニック配列は、部分的にまたは完全に、種が異なっていて差し支えなく、すなわち、トランスジェニック配列またはその一部は、それが導入される細胞と異なる種に由来していて差し支えない。トランスジェニック配列は、部分的にまたは完全に、種が同じであって差し支えなく、すなわち、トランスジェニック配列またはその一部は、それが導入される細胞と同じ種に由来していて差し支えない。トランスジェニック配列が、それが導入される細胞の内因性遺伝子と同種（配列の意味においてまたは種が同じであるという意味において）である場合、好ましくは、トランスジェニック配列は１つ以上の以下の特徴を有する：それが挿入される細胞ゲノムの配列を変化させるように（例えば内因性遺伝子の位置と異なる位置に挿入され、またはその挿入が結果として内因性遺伝子の配列に変化をもたらすように）、細胞ゲノム中に挿入されるように設計され、または細胞ゲノム中に挿入され；例えばトランスジェニック配列の異常発現（ｍｉｓｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）をもたらす変異のような変異を含み；その挿入の効果として、それが挿入されている遺伝子の異常発現をもたらすことができ、例えば、その挿入が結果として、それを挿入された遺伝子のノックアウトをもたらす。トランスジェニック配列は、選択された核酸の所望のレベルまたはパターンの発現のために必要でありかつその選択された核酸に作動可能に連結された、１つ以上の転写調節配列および例えばイントロンのような任意の他の核酸配列を含む。トランスジェニック配列は、エンハンサー配列および／または分泌を可能とする配列を含んでいて差し支えない。
【００３７】
この中で用いられる「トランスジェニック細胞」の用語は、導入遺伝子を包含する細胞を称する。
【００３８】
この中で用いられている「トランスジェニック動物」は、その動物の１つ以上の、好ましくは実質的に全ての細胞が、人間の介入によって（例えば当業界で公知のトランスジェニック技術によって）導入された異種核酸を包含する非ヒト動物である。例えばマイクロインジェクションまたは組換えウィルスの感染等の計画的遺伝子操作によって、直接的に、または細胞の前駆体に導入することによって間接的に、導入遺伝子を細胞に導入することができる。
【００３９】
この中で、哺乳動物は、乳腺を有しかつ乳を産生する、ヒト以外の全ての動物として定義される。
【００４０】
この中で用いられている「精液」は、精子を含む雄動物の精液を称する。
【００４１】
この中で用いられている「精巣上体精子」は、精巣の精巣上体の外科的解剖によって得られた精子を称する。
【００４２】
この中に記載の「凍結防止剤」は、凍結、解凍、および／または凍結温度より低い温度での保存の影響を減らすことができる物質を称する。凍結防止剤の例として、例えばグリセロールおよびエチレングリコールが挙げられる。
【００４３】
この中で用いられている「増量剤バッファー（ｅｘｔｅｎｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ）」は、増量剤バッファー無しでの精子の生存性、運動性、および／または受精能と比べて、インキュベーション、凍結、保管、および／または解凍の間に精子の生存性、運動性、および／または受精能を増強する物質を含む溶液を称する。
【００４４】
「人工授精」は、精子の注射または適用によって雌動物を受胎させる方法として定義される。そのような方法において、精子は雄動物から前もって得られるため、受精の時には雄動物は必要ない。
【００４５】
生存精子の割合（％）は、観察される生存精子数を、同じ試料中において観察される全精子数で割ることによって特定される。その割合は、本明細書中において、生／死精子比率としても称される。
【００４６】
本発明は、絶滅に瀕した種、トランスジェニック動物、および個体のような、稀少で有用な遺伝材料から得られる生殖能力のある雄生殖体の維持および保存を含むいくつかの利益を提供する。例えば、本発明は、突然死したまたは安楽死させる必要があるような雄動物からの精子の保存を提供する。本方法は、生物学的多様性に対する寄与についてまだ調べることができない絶滅に瀕した種を保存する際に有益となり得るであろう。精子の保存は、問題の種が限定された繁殖周期すなわち季節繁殖周期を有する場合にも有用である。本発明は、通常、長年に亘り、同じ遺伝組成物で動物を拡大および維持することを促進する。
【００４７】
本発明は、トランスジェニック動物に関してもいくつかの利益を提供する。トランスジェニック動物は、作成するのが困難でありかつ費用がかかる、高価な商業的投資である。例えば、導入遺伝子のゲノムへの挿入の固有の無作為性および低頻度のせいで、個々の初代トランスジェニック動物は、例えばモザイクである等、細胞の一部においてのみ導入遺伝子を担持することができる。さらには、それら初代動物は、変動する濃度でその乳中にトランスジェニックタンパク質を発現する。従って、高発現個体からの精子の選択および保存は、トランスジェニック動物作成への初期投資の長期間の保証、ならびに、子孫をスクリーニングおよび選別する必要性を除去することによる費用節約を提供する。
【００４８】
本発明の他の特徴および利点は、以下の説明および請求項から明らかになるであろう。
【００４９】
発明の詳細な説明
精子を低温保存する詳細な方法をこの箇所および以下の「実施例」の箇所で説明する。
【００５０】
本発明は、例えばトランスジェニック哺乳動物のような動物を後で作成するのに用いることができるトランスジェニック哺乳動物からの精子のような精子を保存する方法を提供する。以下の工程を含むいくつかの工程が、開示された方法において用いられる：精子を含む試料を得る工程；精子の生存性を調べる工程；精子を単離する工程；精子試料を低温保存する工程；レシピエント動物を受精させる工程；または体内または体外で成熟させた卵母細胞の体外受精を含む、体外法によって胚を提供する工程。
【００５１】
本発明は、以下の実施例を用いてさらに説明されるが、それら実施例は何ら本発明を制限するものとして解釈されるべきでない。本出願を通して挙げられた全ての引例（文献、発行済み特許、公開特許出願、および同時継続特許出願を含む）が参照によって特別に組み込まれる
精子試料を得る
いくつかの方法によって、保存すべき精子を含む試料を得ることができる。この中で用いられている「精子」の用語は、成熟雄生殖体を称する。「精子」と「精虫」の用語はこの中で互換的に用いられている。精子試料を得る方法は、雄動物から、または精巣上体からの精子の抽出によって、精子を得ることを含んでいて差し支えない。
【００５２】
人口膣を用いて刺激することによって動物から精液を得ることができる。例えば、人口膣を以下のように用いることができる：
試料採取の前に、水浴を３７℃に平衡化させ、７％グリセロール、２．４２％ Ｔｒｉｓバッファー、１．３８％クエン酸、１％フルクトース、抗生物質（１００ｍｌ当り、５．５ｍｇチロシン、２７．５ｍｇ ゲンタマイシン、１６．５ｍｇリンコスペクチン、および３３．０ｍｇスペクチノマイシン）、ならびに２０％（ｖ／ｖ）卵黄（特定病原菌フリー、ＳＰＡＦＡＳ， Ｎｏｒｗｉｃｈ ＣＴ）を含有する増量剤溶液（ｅｘｔｅｎｄｅｒ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）（Ｃｏｎｔｉｎｅｎｔａｌ Ｐｌａｓｔｉｃｓ Ｃｏｒｐ．， Ｄｅｌｅｖａｎ， ＷＩ）を３７℃に平衡化させる。新鮮に採取した試料を維持および輸送するために、サーモメーターを有するサーモスを３５−３９℃の水で準備した。人口膣も準備した。好ましくは、使用前に、人口膣をその構成部品に分解し、熱水および１０％ノルバサン（Ｎｏｌｖａｓａｎ）溶液で完全に汚れを除いた。その後、全ての部品をＲＯ／ＤＩ水で洗浄し、その後乾燥した。用いることができる人口膣の型は、約６−１０インチの長さの固いゴムの外輪構造、および膨らませることができるゴムの内張りから構成される。内張りは温水で満たされその後空気で膨張して適当な圧力をもたらす。テーパー円錐開口部が一体化した別の内張りが、人口膣器具内に置かれている。
適当な量の滅菌婦人科潤滑剤を一方の端部に塗布し、１５ｍｌの滅菌円錐チューブを他方の端部に挿入する。
【００５３】
雄を調べて、良好な健康状態であることを確認する。適当なあて雌（ｔｅａｓｅｒ）を選択する。あて雌は、約２４時間前に外因性エストロゲンで準備された卵巣切除雌、採取の日に発情しているあて雌、または（別の雄）に十分刺激を与える任意の動物であって差し支えない。雄を刺激するために人口膣およびあて雌を用いて精液を採取する。試料を直ぐに、７％グリセロール、２．４７％Ｔｒｉｓバッファー、１．３８％クエン酸、１％フルクトース、抗生物質（５．５ｍｇチロシン、２７．５ｍｇゲンタマイシン、１６．５ｍｇリンコスペクチン、および３３．０ｍｇスペクチノマイシン／１００ｍｌ）、および２０％（ｖ／ｖ）卵黄（特定病原菌フリー、ＳＰＡＦＡＳ， Ｎｏｒｗｉｃｈ ＣＴ）を含有する平衡化増量剤と混合する。分析および保存のために試料を直ぐに実験室に戻した。
【００５４】
例えば精巣上体精子のような精子を直接動物の精巣上体から得ることもできる。その方法は、生きたおよび死んだ動物の両方から精子を得るのに用いることができる。精巣上体から精子を抽出する方法は当業界で公知であり、例えば、Ｓｈａｒｍａ ｅｔ ａｌ． （１９９７） Ｆｅｒｔｉｌ Ｓｔｅｒｉｌ． ６８： ６２６−６３１に記載されており、さらに、以下の実施例でもより詳細に記載されている。
【００５５】
精子の生存性を調べる
例えば波動分析、運動性測定、および生存性カウント等によって、得られた精子試料を分析して、精子の状態を特定することができる。
【００５６】
例えば、低い倍率（１０ｘ）で波動を分析し、動きに対して０−５のスコアを割り当てる（全く波動が無い場合は０で、渦巻きを有する迅速な波動の場合は５）ことによって精液の巨視的顕微分析を実施することができる。第２に、高倍率（ｘ４０）で運動精子の数をカウントし、全精子数に対する割合（％）として採点する。その割合（％）に濃度／カウントを掛けて、視覚的生存精子数を特定する。好ましくは、試料は保存するのに十分良質のものである。例えば、約４０％以上の運動性を有する精子を用いることができる。様々な方法：０．９％生理食塩水で１：１０に希釈した精液を含むマイクロキュベットをスペルマキューホトメーター（Ｓｐｅｒｍａｃｕｅ Ｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ）において測定し；または精子の一連の希釈液（１：１０００）を血球計算盤でカウントする：によって特定することができる。
【００５７】
拡大した１５μｌの１滴の精子試料を、１５μｌの１滴の生／死染色液（Ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ Ｓｔａｉｎ， Ｌａｎｅ Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ， Ｉｎｃ．， Ｄｅｎｖｅｒ ＣＯ）と共に顕微鏡スライド上にのせることによって、生存精子の割合（％）を特定することができる。２つの液滴を混合した後、薄い塗沫標本を調製する。その試料を風乾し、バイタル色素（ｖｉｔａｌ ｄｙｅ）で染色することによって、１００ｘ油浸レンズを用いる顕微鏡で２００個の精子をカウントする。
【００５８】
最後に、スペルマック（Ｓｐｅｒｍａｃ）染色液を用いて精子の先体帽および尾部の形態を観察することによって、精子の完全な状態を調べる。１５μｌの一滴の精子を用いて別のスライドを調製し、風乾し、その後、製品の仕様書に従ってスペルマック（Ｓｐｅｒｍａｃ）で染色する。無傷または傷があるとして先体帽を記録することによって、ならびに２００個の精子当りの正常な尾部の数をカウントすることによって、試料の全体の質および形態を特定する。
【００５９】
精子を単離する
必要に応じて、提供された試料から精子を単離する。例えば、１０ｍｌ容量まで増量剤バッファーを添加した後、約１５００ｒｐｍ（５００−６００ｘｇ）で１５分間、または精子が適切に分離するまで、試料を遠心することができる。上清を除き、次に、ストロー当り必要とされる適切な量の精子になるまで十分な質の試料を増量剤溶液で希釈する。通常０．５ｍｌストローが用いられるが、必要な場合には０．２５ｍｌストローを用いて差し支えない。加えられる増量剤の量は試料間で変動するであろう。ストロー当り１ｘ１０８−１．５ｘ１０８個、好ましくは１．５ｘ１０８生存精子の精子カウントになるように増量剤の量を調整することができる。
【００６０】
２つのタイプの増量剤溶液を用いることができる。一段階（ｏｎｅ−ｓｔｅｐ）増量剤溶液が用いられる場合、全容量の増量剤をその段階に添加することができる。一段階増量剤溶液はグリセロールを含有する。二段階増量剤溶液が用いられる場合、増量剤溶液の最終容量の一部（例えば最終容量の約半分）をその段階に添加することができる。２つのパートの増量剤の第１パート（パートＡ）はグリセロールを欠く。第２パート（パートＢ）はグリセロールを含有し、好ましくは精子が第１温度まで冷却された後に添加される。パートＡ増量剤は：卵黄、パートＡバッファー濃縮物、および／または抗生物質濃縮物を含んでいて差し支えない。パートＢ増量剤は：卵黄、パートＢ増量剤濃縮物、および／または抗生物質濃縮物を含んでいて差し支えない。
【００６１】
パートＡ増量剤およびパートＢ増量剤は、例えば以下のように調製される。使用前に抗生物質および卵黄の両方をパートＡ増量剤およびパートＢ増量剤中に捕捉する。大量の卵黄は、クロルヘキシジン溶液中において卵を洗浄し、ペーパータオルで乾燥させることによって調製される。各卵を割り、卵黄嚢を破らないように注意する。卵殻を用いて卵黄とアルブミンを分離することによって、卵黄からアルブミンを除去する。卵黄嚢をビーカー上に置いたガーゼに注ぐ。卵黄に穴を開け、それによって卵黄がガーゼを通過して流れるようにする。十分な卵黄を処理して、各増量剤（パートＡおよびパートＢ）中において２０％（ｖ／ｖ）卵黄溶液を作成する。各パートを別々に作成して差し支えない。パートＡおよびパートＢに関して、増量剤濃縮物を目盛付きシリンダー中に注ぎ、卵黄および抗生物質をその増量剤に添加し、さらに滅菌水で全体を５００ｍｌにする。好ましくは、増量剤濃縮物、卵黄、および構成物質を以下の容量で添加する。１リットルのパートＡ増量剤に関して、２００ｍｌの卵黄、３４０ｍｌのパートＡ濃縮物、２０ｍｌの再構成抗生物質溶液を添加し、さらに滅菌水を最終容量１リットルまで添加する。１リットルのパートＢ増量剤に関して、２００ｍｌの卵黄、３４０ｍｌのパートＢ濃縮物、２ｍｌの再構成抗生物質溶液を添加し、さらに滅菌水を最終容量１リットルまで添加する。４５ｍｌの増量剤を滅菌５０ｍｌ遠心チューブに注ぎ入れ、そのチューブに標識を付け、日付を入れ、−２０℃で保管することができる。
【００６２】
精子を低温保存する
精液を適当な希釈率まで増量させると、低温保存の準備ができる。好ましくは、この時点まで約３７℃の温度で試料を維持する。拡大した精液を含有するチューブを約３７℃の水を含むビーカー中に置くことによって、低温保存工程を開始させることができる。その構成を冷蔵庫に入れる。その最初の冷却は、好ましくは、１．５時間以上かけて、試料温度を５℃（＋／−２℃）まで下げる。冷却工程の間に、試料を混合し、温度をモニターし、さらに冷却速度を特定して差し支えない。
【００６３】
二段階増量剤溶液が利用される場合、試料が約５℃に達した時に増量剤のパートＢを添加して差し支えない。
【００６４】
凍結前に最低約４時間でかつ最大約２１時間、試料を約０−５℃（＋／−２℃）で維持する。好ましくは、約４時間、約５℃（＋／−２℃）に維持された冷蔵庫中において試料を保管する。
【００６５】
この平衡期間の後、約５℃（＋／−２℃）に事前に冷却したプラスチックストローに試料を移す。ストローにプラスチックプラグを詰めて密封しまたはヒートシールし、全てが修了するまで氷床中のストローラックに置く。次に、ストローラックを−８０℃フリーザー中に置いて差し支えない。好ましくは、約１５−２０分間、−８０℃フリーザー中にストローを維持する。液体窒素中に入れる直前に、予め−８０℃に冷却したステッキ（ｃａｎｅ）およびゴブレット内にストローを入れる。
【００６６】
液体窒素中に入れると、ストローを液体窒素タンク中において保管することができる。低温保存後３日以内に、各精子試料からの１つのストローを分析する。凍結ストローを３７℃の水中で９０秒間解凍する。その後、生存精子の割合（％）、ならびに先体帽および尾部形態の完全性を上記のように特定することができる。
【００６７】
レシピエント動物を体外受精させる
本発明の１つの実施形態において、低温保存精子を利用して、雌レシピエントを体外受精させた。６ｍｇノルゲストメット耳移植片（Ｓｙｎｃｒｏｍａｔｅ−Ｂ， Ｒｈｏｎｅ−Ｍｅｒｉｕｅｘ， Ａｔｈｅｎｓ ＧＡ）によって、レシピエントにおいて発情期の同期化を誘導することができる。移植片の挿入後１３日目に、妊馬血清ゴナドトロピン（ＰＭＳＧ， Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ−Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ Ｃｏｒｐ．， Ｌａ Ｊｏｌｌａ ＣＡ）の単回の非過剰排卵注射（ｓｉｎｇｌｅ ｎｏｎ−ｓｕｐｅｒｏｖｕｌａｔｏｒｙ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）（４００ Ｉ．Ｕ．）を動物に行う。精管切除術を行った雄と雌レシピエントとを交尾させて、発情期の同期化を確実にする（Ｓｅｌｇｒａｔｈ， ｅｔ ａｌ．， Ｔｈｅｒｉｏｇｅｎｏｌｏｇｙ， １９９０， ｐｐ． １１９５−１２０５）。次に、上記のように精子を解凍し、当業者によって通常実施される方法に従って、雌レシピエントを受精させるのに用いることができる。
【００６８】
胚を提供する
別の実施形態では、低温保存精子で体外受精した雌動物から卵母細胞を採取することができる。上記のように、ノルゲストメット耳移植片を用いて発情期を同期化させる。７日目に、プロスタグランジン（ＰＧＦ２α）（Ｕｐｊｏｈｎ ＵＳ）を単回注射する。１２日目から、ＦＳＨ（Ｆｏｌｌｔｒｏｐｉｎ−Ｖ， Ｖｅｔｒｅｐｈａｒｍ， Ｃａｎａｄａ）を４日連続で、１日２回投与した。１４日目にノルゲストメット耳移植片を除去した。移植片除去の２４時間後、４８時間に亘り、精管切除した雄とその雌動物とを数回交尾させた。最後のＦＳＨ注射後、雌動物にＧｎＲＨ（Ｒｈｏｎｅ−Ｍｅｒｉｅｕｘ Ａｔｈｅｎｓ ＧＡ）を単回注射する。最後の交尾の約１８および２４時間後、中腹部の開腹によって雌ドナーから卵母細胞を外科的に回収した。卵母細胞は、予め３７℃に暖めたＣａ２＋／Ｍｇ２＋を含まないＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）で卵管からフラッシングされる。回収した卵母細胞を２ｍｌ Ｌ−グルタミン、１００Ｕ／ｍｌペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを補充した１０％ＦＢＳ含有平衡Ｍ１９９培地中において培養する。
【００６９】
次に、当業界で通常実施される方法に従って、回収した卵母細胞を解凍精子で受精させる。精子を解凍し、９０％−４５％パーコール勾配を用いて精製し、さらに、油下において、２０％ＦＢＳ、７．７ｍＭ乳酸カルシウム、１００Ｕ／ｍｌペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを補充したＢ−Ｏ培地の５０μｌ液滴中、５％ＣＯ２下、３８℃で１８時間インキュベートして受精を実施した。初代ヤギ卵管上皮細胞と共培養（ｃｏ−ｃｕｌｔｕｒｅ）して、１０％ＦＢＳ含有Ｍ１９９培地中においてインビトロ培養した。最初の卵割（２細胞期）から胚盤胞期までの段階に胚を培養において維持することができる。好ましくは、胚は２または４細胞期で移植される。胚をレシピエントに移植する方法と同様に、胚の発生のための様々な培地が当業界で公知である（例えば、Ｅｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ． （１９９４） Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １２： ６９９を参照）。
【００７０】
本発明を以下の実施例によってさらに説明するが、それら実施例は何ら限定を構成するものではない。
【００７１】
実施例１
生後１３日から７才までの範囲の年齢の３２匹の３系統（アルパイン、ザーネン、およびトッゲンブルグ種）の雄ヤギを利用した。それら動物の処置は、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（ＩＡＣＵＣ）が承認するプロトコルおよび動物保護法（ＡＷＡ）に規定された規則に従って実施した。静脈内バルビツール酸系麻酔薬の過量投与によって動物を安楽死させた。約５から約１０分以内に陰嚢から精巣を取り出し、３８℃のインキュベーター中に置いた。精巣は個別に処理された。滅菌メスを用いて、壁側白膜（ｐａｒｉｅｔａｌ ｔｕｎｉｃ）を除去して、精巣上体の尾部（ｔａｉｌ）を曝した。精巣上体の尾部に沿って小さな側部切り込みを入れて曲精細管を開いた。尾部に僅かな圧力を与えて、精子の小滴を形成させた。２０％（ｖ／ｖ）卵黄（標準−病原菌フリー，ＳＰＡＦＡＳ， Ｎｏｒｗｉｃｈ， ＣＴ）、７％グリセロール、２．４２％Ｔｒｉｓバッファー、１％フルクトース、１．３８％クエン酸、ならびに１００ｍｌ当り、５．５ｍｇチロシン、２７．５ｍｇゲンタマイシン、１６．５ｍｇリンコスペクチン、および３３ｍｇスペクチノマイシンを含有する平衡化増量剤（Ｃｏｎｔｉｎｅｎｔａｌ Ｐｌａｓｔｉｃ Ｃｏｒｐ．， Ｄｅｌａｖａｎ ＷＩ）中に精子の小滴をピペットで取って入れた。精巣上体尾部中の精子が完全に抽出されるまでこの工程を繰り返した。両方の精巣からの精子を合わせた。精巣上体が存在する２５匹の雄ヤギから精巣上体精子をうまく採取し、低温保存した。精子を産生する雄ヤギの平均年齢は、４ヶ月から７才の範囲であり、平均２．１才であった。精子を有しなかった７匹の雄ヤギは全て４ヶ月未満の年齢であった。
【００７２】
１５μｌの材料を用いて、精子の運動性および波動を分析した。個々の精子に関して、０−５（０＝動きなし、５＝迅速な直線の動き）の運動スコアを各試料に割り当てた。１５μｌの試料および１５μｌのＭｏｒｐｈｏｌｏｇｙ Ｓｔａｉｎ（登録商標）（Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｔｈｅｒｉｏｇｅｎｏｌｏｇｙ， Ｈａｓｔｉｎｇｓ， ＮＥ）をスライド上に置き、それら２つの液滴を混ぜ合わせ、薄い塗抹標本を調製することによって、生／死精子の割合（％）を特定した。１００ｘ油浸レンズの下、各試料中の２００精子のランダムカウントを実施した。スペルマック（Ｓｐｅｒｍａｃ（登録商標））染色液（Ｍｉｎｉｔｕｂｅ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ， Ｖｅｒｏｎａ， ＷＩ）を用いて、先体帽の完全性を同様に特定した。抽出された精子の平均数は、３．８ｘ１０９±２．０ｘ１０９（１．１ｘ１０９から１２．３ｘ１０９までの範囲）であった。精巣上体精子の平均の生／死比率は、９２％（６３％から９７％の範囲）であった。解凍後の平均生／死比率は８３％（３２％から９３％の範囲）であった。さらには、８４％の試料が解凍後に無傷の先体帽を有していた。それらデータを表１に示す：
【表１】
2004505624.tif 000002
【００７３】
合わせた精子試料を遠心し、３００ｘ１０６精子／ｍｌとなるように新鮮な平衡化増量剤中に再懸濁させた。試料を３７℃水浴中に入れ、０．５℃／分の冷却速度で、１．５時間かけて、５℃まで冷却した。最低４時間で最大２１時間までの間、その温度で試料を維持した。次に、精子試料を０．５ｍｌストロー中に装填し、−８０℃フリーザー中に約１０分から約１５分間置き、その後、液体窒素中に入れた。少なくとも３日間低温保存した後、１つのストローを３７℃で２分間解凍し、解凍後の生／死割合（％）および先体帽の完全性を上記のように特定した。北半球の繁殖期を逸した雌ヤギから剖検で得た卵巣から卵母細胞を吸引し、１０％ウシ胎児血清、５．０Ｕ／ｍｌのＦＳＨ、５．０Ｕ／ｍｌのＬＨ、１μｇ／ｍｌのβ−エストラジオール、およびペニシリン−ストレプトマイシンを補足したＭ１９９（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）中において１８−２４時間、生体外で成熟させた。精子を解凍し、９０％−４５％パーコール勾配を用いて精製し、さらに、油下において、２０％ＦＢＳ、７．７ｍＭ乳酸カルシウム、１００Ｕ／ｍｌペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを捕捉したＢ−Ｏ培地の５０μｌ液滴中、５％ＣＯ２下、３８℃で１８時間インキュベートして受精を実施した。初代ヤギ卵管上皮細胞と共培養して、１０％ＦＢＳ含有Ｍ１９９培地中においてインビトロ培養した。
【００７４】
低温保存してその後解凍した精巣上体精子を用いた体外受精によって、４０％の卵母細胞が卵割を示し、さらに６％が胚盤胞期まで発生した（表２）。一方、射精精子を用いた体外受精では、３７％の卵母細胞が卵割を示し、さらに４％が胚盤胞期まで発生した。
【００７５】
体外受精に用いる動物を、０日目にプロゲステロン移植片（Ｓｕｎｃｈｒｏｍａｔｅ−Ｂ， Ｒｈｏｎｅ Ｍｅｒｉｕｘ， Ａｔｈｅｎｓ ＧＡ）を用いて同期化した。７日目に、７．５ｍｇのＰＧＦ２α（Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＆ Ｕｐｊｏｈｎ）を投与し、続いて、１４日目に３００−４００ＩＵ ＩＭのＰＭＳＧ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ−Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ）を投与した。１４日目にプロゲステロン移植片を除去し、１５−１６日目に、精管切除した雄ヤギと交尾させた。精管切除した雄ヤギで発情の兆候について雌ヤギをチェックした。継続する発情の約１２時間後、１つのストローの解凍精子で雌ヤギに１回精子を注入する。用いられる技術は、子宮頸管内または子宮内注入の何れかであった。２１匹の雌ヤギにおいて人工授精を実施した。雌ヤギが最早発情しなくなるまで、１２時間後ごとにその工程を繰り返した。３２日目から３６日目の間、および５５日目から６０日目の間に再度、雌ヤギを超音波診断した。１４５日目からは毎日雌ヤギをモニターした。出生時に子ヤギを離し、雌ヤギは通常の乳生産に入った。２１匹の雌ヤギの人工授精によって、１匹の妊娠（４％）が得られ、１匹の健康な子ヤギが生まれた。
【００７６】
【表２】
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【００７７】
有用な動物の精巣からの精巣上体精子の低温保存の成功は、その動物が突然死した場合または安楽死させる必要がある場合に、その遺伝的寄与を伝えることを可能にする。潜在的に、そのような方法は死の数時間後でさえ実施できる。本研究において、精巣上体精子が抽出された２５匹の動物の内２５匹が、低温保存精子をもたらした。これは、他の種における精巣上体抽出に関する公開された研究と一致する（Ｆｏｏｔｅ ａｎｄ Ｉｇｂｏｅｌｉ （１９６８） Ｊ Ｄｉａｒｙ Ｓｃｉ １０： １７０３−５； Ｐａｕｆｆｌｅｒ ｅｔ ａｌ． （１９６８） Ｊ Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｆｅｒｔｉｌ １７： １２５−１３７）。
【００７８】
卵割および胚盤胞の発生をもたらす制御されたヤギインビトロ胚作成システム（ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｃａｐｒｉｎｅ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｅｍｂｒｙｏ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ）中に精巣上体精子を置いた。非発生胚をレシピエントに移植した。他の種でも報告されたように、体外受精に用いられた精子は妊娠をもたらした（Ｆｏｏｔｅ ａｎｄ Ｉｇｂｏｅｌｉ， ｓｕｐｒａ； Ｓｈａｒｍａ ｅｔ ａｌ． ｓｕｐｒａ）。
【００７９】
精巣上体から抽出された精子の量および質に潜在的に影響を及ぼすいくつかの因子として、動物の年齢および年数が挙げられる。ヤギは季節繁殖であり；従って、非繁殖期の間に精巣上体から抽出される精子の量は繁殖期の間に抽出される精子の量よりも少ないであろう。精子を採取できる最低年齢は、繁殖期の間で４ヶ月である。精子を抽出できる年齢を下げる１つの可能性のある方法は、繁殖期の間に、雄ヤギを発情期の雌ヤギと接触させることである。この方法は、環境要因を介して、生殖器官を刺激し、より早期に精子産生を開始させるのを助けるであろう。
【００８０】
結論として、剖検でヤギから採取した精巣上体精子を量的および質的に良好な状態で低温保存できる。その精子を体外発生または人工授精に用いて、有用な遺伝情報を伝えることができる。最適繁殖期および低い精子産生年齢のような因子が、有益な効果を有するであろう。精巣から抽出される精液の量を増やすことによって、精子のより高い収率が得られるであろう。人工授精のための精巣上体精子の使用を最適化するのと並行して、それら理論を調べるためにさらなる研究を実施する必要がある。
【００８１】
実施例２
人口膣を用いて、トランスジェニック雄ヤギから精子を採取した。グリセロールを欠くパートＡ増量剤を用いて試料を希釈し、約３７℃の温度のサーモス中の実験室に戻した。以下に記載の点を除いて実施例１と同様に試料を処理した。ストロー当り２ｘ１０７の精子をストローに装填した。試料を４℃に冷却した後、グリセロールを含有するパートＢ増量剤を添加した。次に、実施例１に詳述したように試料を−８０℃まで凍結し、その試料を１ヶ月液体窒素中で保管した。４匹のダッチウサギを卵胞刺激ホルモンおよびヒト絨毛ゴナドトロピン等のホルモンで同期化した。３７℃の水浴中に９０秒間置くことによって精子試料を解凍した。その後、精子試料を用いて同期化雌ヤギを人工授精した。精子試料で受精した２匹の母ウサギから１１匹の子孫が生まれた。
【００８２】
この中で挙げられた全ての特許および文献は、参照によってその全てが組み込まれる。
【００８３】
他の実施形態も請求項に含まれる。
【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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