(57)【要約】性的に伝達される病気の予防および処置に局所的に適用される薬剤としてナフチルジスルフォネート末端基を有するポリリシン、ポリアミドアミン、ポリプロピレンデンドリマーの使用を開示する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
式Ｉ，ＩＩ，またはＩＩＩの化合物または医薬的に許容できるその塩。
【化１】
2004532211.tif 000016
【化２】
2004532211.tif 000017
【化３】
2004532211.tif 000018
式中Ｒは式ＩＶの基を表わす。
【化４】
2004532211.tif 000019
【請求項２】
医薬的に許容できる塩が、アルミニウム、カルシウム、リチウム、マグネシウム、カリウム、ナトリウムおよび亜鉛等の金属塩、そしてまたＮ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン、クロロプロカイン、ジエタノールアミン、エチレンジアミン、ジシクロヘキシルアミン、メグルミン（Ｎ−メチルグルカミン）およびプロカイン、コリン等の４級化アミン、スルホニウム塩、並びにホスホニウム塩等の有機アミンから選択される請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
化合物ＳＰＬ-７０１３または医薬的に許容できるその塩。
【請求項４】
化合物ＳＰＬ-７３０４または医薬的に許容できるその塩。
【請求項５】
化合物ＳＰＬ-７３２０または医薬的に許容できるその塩。
【請求項６】
ヒト患者における性的に伝達される病気の予防的および治療的処置のための局所的医薬組成物であって、請求項１−５のいずれかに記載の化合部を、少なくとも１つの医薬的に許容し得る局所的担体または希釈剤とともに含む組成物。
【請求項７】
ヒト患者における性的に伝達される病気の予防的および治療的処置のための方法であって、請求項１−５のいずれかに記載の化合部の有効量を、患者に局所的に投与することを含む方法。
【請求項８】
病気がＨＳＶ−１，ＨＳＶ−２，ＨＩＶ−１，ＨＩＶ−２、およびＨＰＶ感染、並びにChlamydia trachomatisより選択される、膣または直腸に性的に伝達される請求項７に記載の方法。
【請求項９】
ヒト患者における性的に伝達される病気の予防的および治療的処置における局所的投与のための薬剤の製造における、請求項１−５のいずれかに記載の化合物の使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
技術分野
本発明は性的に伝達される病気の予防および治療に関し、特にこれらの病気の予防および治療的処置に局所的に適用される薬剤としての、ナフチルジスルホネート末端基を有するデンドライマーの使用に関する。
背景技術
【０００２】
ＨＩＶ、ＨＳＶ、および他のウイルス性および微生物病原により引き起こされる性的に伝達される病気（ＳＴＤ）の世界的な発生、罹患率、大量死は、世界的に数億と見積もられる。ＳＴＤの伝達を制御する１つの方法は関連する病原を非活性化させる、局所的に適用される、女性／男性を制御する膣、または直腸殺菌剤の使用である。その結果として、ＳＴＤの予防および治療のための膣内、または直腸内使用のための新しい、安全な、局所的殺菌剤の開発が新規薬剤開発の重要な標的である。
【０００３】
国際特許出願ＰＣＴ／ＡＵ９５／００３５０（ＷＯ９５／３４５９５）およびＰＣＴ／ＡＵ９９／００７６３（ＷＯ００／１５２４０）（その内容は本発明の一部を構成する）は新しい種類の多価の薬剤−デンドリマー、ポリアニオン性またはポリカチオン性表面基の一定のエンベロープを有する高度に枝分かれした高分子を開示する。それは最小の毒性を有する、ある範囲の抗ウイルスおよび抗微生物活性を示すことが知られている。大部分の抗ウイルス剤の小さい分子構造とは異なり、これらのデンドリマーは１種の多価の高度に枝分かれた高分子化合物であって、３次元の高度に規則正しいポリマー化合物を作り上げるために、連続した「ジェネレーション」の付加される連続的な層または段階を有する最初のコア分子から出発する反復反応連続により形成される。デンドリマーは次の特徴によって特徴づけられる。
ｉ．１以上の反応部位を有し、デンドリマーの最終のトポロジーに影響するように点のようなまたは有意な大きさであるイニシエーターコア、
ｉｉ．イニシエーターコアに結合した枝分かれした繰り返し単位の層、
ｉｉｉ．場合により結合基を介してデンドリマー表面に結合した機能的な末端基（アニオンまたはカチオンを含む部分）。
【０００４】
これらの高分子化合物は多数の枝または木の様な構造を有するモノマー性ビルディングブロックから合成され、分子の外側表面は生物学的受容体による認識に導かれる多数の機能性基を有する。
【０００５】
デンドリマーの製造はよく知られており、例えば米国特許第４２８９８７２号および第４４１０６８８号（リシン単位の層をベースにしたデンドリマー）そしてまた米国特許第４５０７４６０号、第４５５８１２０号、第４５６８７３７号および第４５８７３２９号（ポリアミドアミン即ちＰＡＭＡＭデンドリマーを含む他の単位をベースにしたデンドリマー）に記載されている。
【０００６】
発明の概要
本発明によれば式Ｉ，ＩＩ，またはＩＩＩの化合物または医薬的に許容できるその塩を提供する。
【化１】
2004532211.tif 000002
【化２】
2004532211.tif 000003
【化３】
2004532211.tif 000004
式中Ｒは式ＩＶの基を表わす。
【化４】
2004532211.tif 000005
【０００７】
適当な医薬的に許容し得る塩基付加塩は、限定するものではないが、アルミニウム、カルシウム、リチウム、マグネシウム、カリウム、ナトリウムおよび亜鉛等の金属塩、そしてまたＮ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン、クロロプロカイン、ジエタノールアミン、エチレンジアミン、ジシクロヘキシルアミン、メグルミン（Ｎ−メチルグルカミン）およびプロカイン、コリン等の４級化アミン、スルホニウム塩、並びにホスホニウム塩を含む。
【０００８】
本発明の特に好ましい化合物は本明細書でＳＰＬ−７０１３、ＳＰＬ−７３０４、およびＳＰＬ−７３２０と呼ぶ化合物であり、その構造は、ナトリウム塩として３２のナフチルジスルホン酸基よりなる活性な表面基を有する、それぞれポリリシンデンドリマー、ポリアミドアミン（ＰＡＭＡＭ）デンドリマー、およびポリプロピレンイミンデンドリマースキャホールドよりなる。ナフチルジスルホン酸塩の機能性表面基のそれぞれは３２末端基にアミド−メチレンオキシ結合で枝分かれデンドリマースキャホールドに結合している。
【０００９】
本発明は、ヒト患者における性的に伝達される病気の予防的または治療的処置のための局所的医薬組成物も提供し、その医薬組成物は、上の式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩの化合物またはその医薬的に許容し得る塩を、少なくとも１つの医薬的に許容し得る局所的担体または希釈剤とともに含む。
【００１０】
他の態様において、本発明は、ヒト患者における性的に伝達される病気の予防的または治療的処置のための方法も提供し、その方法は、上の式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩの化合物またはその医薬的に許容し得る塩の有効量を、患者に局所的に投与することを含む。
【００１１】
他の態様において、本発明はヒト患者における性的に伝達される病気の予防的または治療的処置における局所的投与のための薬剤の製造における、上の式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩの化合物またはその医薬的に許容し得る塩の使用を提供する。
発明の詳細な記述
【００１２】
式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩの化合物またはその医薬的に許容し得る塩は、新規な化合物であり、性的に伝達される病気に関連する病原体の広いスペクトルに対して例外的な活性を予期しないことに示す。
【００１３】
上に記載したように、化合物ＳＰＬ−７０１３、ＳＰＬ−７３０４、およびＳＰＬ−７３２０は本発明の好ましい化合物であり、特に最も一般的な性的伝達病のウイルスベクターおよび微生物ベクターに対して、顕著な抗ウイルス活性を示すことが見出された。
【００１４】
ＳＰＬ−７０１３は、最も重要な膣および直腸に性的に伝達される病気のいくつかのベクターに対して高効力で、最小の細胞または動物毒性を有する広いスペクトルの抗ウイルス活性を有する。高活性はインビトロ細胞試験およびインビボ動物（マウス）モデル試験における性器のヘルペスウイルス−２（ＨＳＶ−２）、ヘルペスウイルス−１（ＨＳＰ−１）およびヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ−１，ＨＩＶ−２）に対するインビトロ細胞試験の療法において測定された。それは、性器のいぼ、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）を引き起こす病原体に対して、および非特異的尿道炎Chlamydia trachomatisのバクテリアベクターに対して活性であることも示された。細胞試験において、ＳＰＬ−７０１３は、現在用いられている改変ヌクレオシドをベースにした抗ウイルス剤に耐性のヘルペスウイルス−２に対して活性を示した。更に、ＳＰＬ−７３０４およびＳＰＬ−７３２０は、ＨＳＶ−１、ＨＳＶ−２、ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２に対して高活性を示す。更に、ＳＰＬ−７０１３、ＳＰＬ−７３０４、およびＳＰＬ−７３２０はＣＤ４依存性およびＣＤ４非依存性ＨＩＶ伝達試験において活性であり、ＨＩＶ−１付着および融解の防止に有効である。すべての化合物は様々な種の有益なラクトバチルスの増殖を阻害しないことが示された。更に、ＳＰＬ−７０１３、ＳＰＬ−７３０４、およびＳＰＬ−７３２０はＨＩＶ−１ＲｏＪｏまたはＳＩＶ８９．６ｐｄによるヒトの末梢血液単核細胞の感染（ＰＢＭＣ）の防止に有効であることが示された。
【００１５】
従って、これらの化合物は、性的に伝達される感染に対して保護するために膣または直腸粘膜への適用を意図した局部的抗微生物剤として性的に伝達される病気の予防および治療に有用である。
【００１６】
本発明は、ヒト患者における性的に伝達される病気の予防的および治療的処置のための局所的医薬組成物も提供し、その医薬組成物は、上の式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩの化合物またはその医薬的に許容し得る塩を、少なくとも１つの医薬的に許容し得る局所的担体または希釈剤とともに含む。
【００１７】
そのような化合物の製剤化は、この分野の当業者によく知られている。適当な医薬的に許容し得る担体および／または希釈剤は、いずれかの、すべての従来の溶媒、分散媒体、充填剤、固体担体、水溶液、被覆剤、抗細菌性および抗真菌剤、等張性、および吸収促進または遅延剤、活性促進または遅延剤等を含む。医薬的に活性な物質に対するそのような媒体および薬剤の使用は当業界で周知であり、例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences, 18 Edition, Mack publishing Company, Pennsylvania, USA に記載されている。いずれかの従来来の担体および／または希釈剤が活性成分と相溶性でない場合を除き、本発明の医薬組成物におけるその使用を意図する。抗ウイルスまたは抗微生物活性を有する薬剤を含む補助的な活性成分も本発明の組成物に導入できる。
【００１８】
投与の容易さと用量の均一性のために用量単位形で組成物を製剤化するのが特に有利である。本明細書で用いる「用量単位形」という用語は、処置されるヒト患者に対して単一の用量として適した物理的に分離した単位をいい；各単位は、必要な医薬的担体および／または希釈剤と共に、所望の治療効果を得るよう計算された前もって決められた量の有効成分を含む。本発明の新規な用量単位形についての詳細は（ａ）活性成分のユニークな特徴および達成されるべき特定の治療効果、および（ｂ）特定の処置のためにそのような活性成分を混合する技術に固有の限界により、指図され、そして直接依存する。
【００１９】
上述のように、本発明は、ヒト患者における性的に伝達される病気の予防的および治療的処置のための方法も提供し、その方法は、上の式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩの化合物またはその医薬的に許容し得る塩の有効量を、患者に局所的に投与することを含む。更に、本発明は、性的に伝達される病気の予防的および治療的処置における局所的投与のための薬剤の製造における、上の式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩの化合物またはその医薬的に許容し得る塩の使用を提供する。
【００２０】
様々な局所投与経路が利用可能である。選択される特定の様式は勿論処置される特定の状態および予防的または治療的効力に必要な用量に依存するであろう。一般的に言って、本発明の方法は医学的に許容できるいずれかの投与モード、臨床的に許容されない副作用を起すことなしに本発明の活性成分の予防的または治療的レベルを得るいずれの様式をも意味する。そのような投与様式は膣、直腸、経皮経路を含む。局所的な、特に、膣、直腸投与のための適当な製剤は、溶液、懸濁液、ゲル、ローションおよびクリーム、そしてまた座剤およびミクロカプセル化した座剤を含む。他の運搬システムは徐放生のゲル、クリーム、座剤、カプセルを含み、本発明の活性化合物の遅い放出を提供できる徐放生運搬システムを含み得る。多くのタイプの運搬システムが利用可能である。これらは、限定するものではないが、（ａ）活性成分がマトリックス中に含まれる侵食性システムおよび（ｂ）活性成分がポリーマを通って調節された速度で浸透する拡散システムを含む。
【００２１】
本発明の活性成分は予防的に又は治療的に有効な量を投与する。予防的に又は治療的に有効な量とは少なくとも部分的に所望の効果を達成する、開始を遅らせ、処置すべき特定の状態の開始または進行を防止し、休止するに必要な量をいう。そのような量は勿論、処置すべき特定の状態、状態の重篤さ、および年齢、身体的状態、大きさ、重量、同時の処置を含む個々の患者のパラメーターによるであろう。これらの要因は当業者によく知られており、ルーチンな実験以上のものなしに決定できる。最高用量、即ち、正常な医学的判断に従う最大の安全用量を用いるのが好ましい。しかしながら、より低い用量または許容できる用量を医学的、心理学的理由、または事実上いずれかの他の理由により投与し得ることは当業者に理解されるであろう。
【００２２】
一般に、発病させる状態の予防または処置により決定すべき間隔で、活性成分の膣内または直腸内の用量は１日あたり約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜１０００ｍｇ／ｋｇであろう。少ない用量（０．０１−１ｍｇ）を最初に投与した後、１日あたり約１０００ｍｇ／ｋｇまで用量を増加させ得る。そのような用量で患者の応答が不十分である場合、より大きい用量（または異なったより局部化した運搬経路により効果的なより高い用量）を患者の許容度が許す程度まで用い得る。１日あたり多数回投与は化合物の適当な全身的なレベルを達成するため企図する。
【００２３】
特別な好ましい態様では、本発明は、ＳＰＬ−７０１３，ＳＰＬ７３０４、またはＳＰＬ７３２０の、ウイルスおよび微生物の性的に伝達される病気の予防および治療に有用な広いスペクトルの膣または直腸殺菌剤としての使用を提供する。ＳＰＬ−７０１３，ＳＰＬ７３０４、またはＳＰＬ７３２０は水溶性であり、溶液中で用いることができ、または活性の向上剤または遅延剤、局所適用における吸収の向上または遅延剤、膣／直腸上皮または粘膜層に対する付着向上剤と共に、ゲル、ローション、クリーム、座剤、水性または非水生溶媒中のミクロカプセル懸濁液の形で適当なビークル中で製剤化できる。
【００２４】
本明細書および特許請求の範囲を通じて、断らない限り、「含む」の語は述べられた工程、整数、整数の群の包含を意味するが、他の工程、整数、整数の群の排除を意味しないことが理解されるであろう。
【００２５】
本発明の更なる特徴は次の実施例により明かになるであろうが、本発明の説明のためであり、限定を含まない。
実施例１
【００２６】
Ａ．ＢＨＡｌｙｓｌｙｓ２ｌｙｓ４ｌｙｓ８ｌｙｓ１６  ＴＦＡ３２
１．Ｎ，Ｎ’−ジ−ｔ−Ｂｏｃ−Ｌ−リシン（ＤＢＬ）
Ｌ−ＬｙｓｉｎｅＨＣｌ（１．８３ｋｇ；１０ｍｏｌ）を水（２０ｌ）中の水酸化ナトリウム（８８０ｇ；２２ｍｏｌ）の溶液に溶解し、生じた溶液をｔ−ブタノール（１５い）で希釈した。ジ−ｔ−ブチルジカーボネート（４．４８ｋｇ；２０．５ｍｏｌ）を１時間かけて滴加し、その間に、反応混合物はミルク状になり暖かくなった（３０−３５℃）。その混合物を１晩攪拌し、透明な溶液を得た。その溶液を石油で抽出し（４０−６０℃）（２ｘ１０ｌ）、有機層をＮａＨＣＯ３飽和溶液で抽出した（３ｘ４ｌ）。一緒にした水層を氷浴で冷却し、１Ｍ  ＫＨＳＯ４溶液で注意深くｐＨ２に酸性化した。濁った混合物を次にエーテルで抽出し（４ｘ１６ｌ）、一緒にした有機層を水で洗い（２ｘ８ｌ）、乾燥し（ＭｇＳＯ４），＜３０℃の浴温度で濃縮し、定量的収率でＮ，Ｎ’−ジ−ｔ−Ｂｏｃ−Ｌ−リシンを非常に粘ちょうな油として得た。
【００２７】
２．Ｎ，Ｎ’−ジ−ｔ−Ｂｏｃ−Ｌ−リシン−４−ニトロフェニルエステル（ＤＢＬＯＮｐ）
酢酸エチル（５ｌ）中のジシクロヘキシルカルボジアミド（ＤＣＣ）（２．０６ｋｇ；１０ｍｏｌ）の溶液を酢酸エチル（１５ｌ）中のジ−ｔ−Ｂｏｃ−Ｌ−リシン（３．４６ｋｇ；１０ｍｏｌ）および４−ニトロフェノール（ＮｐＯＨ）（１．３９ｋｇ；１０ｍｏｌ）の氷冷した溶液に窒素下に滴加した。添加が完了した後、混合物を室温まで暖め、１晩攪拌した。生じた白色懸濁液を次に濾過し、濾液を濃縮して黄色の固体残渣を得た。残渣をエーテルから再結晶し、Ｎ，Ｎ’−ジ−ｔ−Ｂｏｃ−Ｌ−リシン−４−ニトロフェニルエステルを白色固体として得た（収率約６０％）。生成物の多くは母液から後に回収できた。
【００２８】
３．ＢＨＡｌｙｓ．２ＨＣｌ
乾燥ジクロロメタン（２００ｍｌ）中のＤＣＣ（４１．２ｇ；０．２ｍｏｌ）の溶液をジクロロメタン（６００ｍｌ）中のＤＢＬ（６９．２ｇ；０．２ｍｏｌ）およびベンズヒドリルアミン（ＢＨＡ）（３６．６５ｇ；０．２ｍｏｌ）の氷冷溶液に加えた。混合物を０℃で３０分攪拌し、次に室温で３０分攪拌した。生じた懸濁液を濾過し、濾液のｔｌｃ（石油エーテル／ＥｔＯＡｃ，９：１）によれば出発物質を含まなかった。濾液を５％ＨＣｌ、水、飽和ＮａＨＣＯ３で洗浄し、次に乾燥し（ＭｇＳＯ４），濃縮して、泡状物質を得た。トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）（４００ｍｌ）を、乾燥ジクロロメタン（２００ｍｌ）中の泡状物質の攪拌した溶液に添加した。最初に激しい気体発生があり、それは約１５分後に止まった；ｔｌｃ（ＥｔＯＡｃ）によれば出発物質を含まなかった。その溶液をさらに２時間攪拌し、次に濃縮して褐色油を得た。この油を乾燥アセトニトリル（６００ｍｌ）中に溶解し、無水エタノール（約３６０ｍｌ）に溶解したＨＣｌ気体の飽和溶液を渦巻きさせながら滴加した。白色の固体が直ちに結晶化し始め、混合物を１時間室温で放置して、結晶化を完了させた。混合物を濾過し、固体を乾燥アセトニトリルで洗い、次に乾燥して、ＢＨＡｌｙｓ．２ＨＣｌを白色粉末として得た（収率約８０％）。
【００２９】
４．ＢＨＡｌｙｓｌｙｓ２Ｂｏｃ４
トリエチルアミン（３９．５ｍｌ；０．２８３ｍｏｌ）を乾燥ＤＭＦ（３００ｍｌ）中のＢＨＡｌｙｓ．２ＨＣｌ（５４．４ｇ；０．１４ｍｏｌ）の攪拌した溶液に添加した。白色懸濁液が生成し、１５分攪拌して、ＤＢＬＯＮｐ（２６２ｇ、０．５６ｍｏｌ）を滴加した。混合物は直ちに黄色になり、３時間攪拌し、トリエチルアミンの滴加により混合物のｐＨを８−９に維持した。反応混合物を次に大量の激しく攪拌した水にゆっくり加え、混合物を一晩攪拌した。沈殿を濾過により集め水（３ｘ）で洗浄し、乾燥して黄色の固体を得た。この固体を粉末化し、次にＮａＯＨ水溶液で処理してエーテルが黄色を示さなくなるまで、エーテルで連続的に洗浄した。残った固体を乾燥して、ＢＨＡｌｙｓｌｙｓ２Ｂｏｃ４を白色粉末（収率約７０％）として得た。
【００３０】
５．ＢＨＡｌｙｓｌｙｓ２ｌｙｓ４Ｂｏｃ８
トリフルオロ酢酸（６００ｍｌ）を乾燥ジクロロメタン（６００ｍｌ）中のＢＨＡｌｙｓｌｙｓ２Ｂｏｃ４（１１６ｇ；０．１２ｍｏｌ）の溶液に加え、直ちに気体の激しい発生があった。その溶液を２時間攪拌し、濃縮して粘ちょうな油を得た。この油を乾燥ＤＭＦ（５００ｍｌ）に溶解し、溶液のｐＨをトリエチルアミンで８−９に調節した。ＤＢＬＯＮｐ（４６０ｇ；０．９９ｍｏｌ）を次に加え、黄色の溶液を２日間室温で攪拌し、周期的なｐＨ調節をトリエチルアミンで行い、ｐＨを８以上に維持した。反応物を水中に沈殿させ上記のように処理して、ＢＨＡｌｙｓｌｙｓ２ｌｙｓ４Ｂｏｃ８を白色固体（収率約１００％）として得た。
【００３１】
６．ＢＨＡｌｙｓｌｙｓ２ｌｙｓ４ｌｙｓ８Ｂｏｃ１６
トリフルオロ酢酸（１ｌ）を乾燥ジクロロメタン（１ｌ）中のＢＨＡｌｙｓｌｙｓ２ｌｙｓ４Ｂｏｃ８（２００ｇ；０．１０６ｍｏｌ）の溶液に加え、直ちに気体の激しい発生があった。その溶液を２時間攪拌し、濃縮して粘ちょうな油を得た。この油を乾燥ＤＭＦに溶解し、溶液のｐＨをトリエチルアミンで８−９に調節した。ＤＢＬＯＮｐ（７８０ｇ；１．６７ｍｏｌ）を次に加え、黄色の溶液を２日間室温で攪拌し、周期的なｐＨ調節をトリエチルアミンで行い、ｐＨを８以上に維持した。反応物を水中に沈殿させ上記のように処理してＢＨＡｌｙｓｌｙｓ２ｌｙｓ４ｌｙｓ８Ｂｏｃ１６を白色固体（収率約１００％）として得た。
【００３２】
７．ＢＨＡｌｙｓｌｙｓ２ｌｙｓ４ｌｙｓ８ｌｙｓ１６Ｂｏｃ３２
トリフルオロ酢酸（１．６ｌ）を乾燥ジクロロメタン（８００ｍｌ）中のＢＨＡｌｙｓｌｙｓ２ｌｙｓ４ｌｙｓ８Ｂｏｃ１６（３００ｇ；０．０８１ｍｏｌ）の混合物に加え、直ちに気体の激しい発生があった。その溶液を２時間攪拌し、濃縮して粘ちょうな油を得た。この油を乾燥ＤＭＦ（１．２ｌ）に溶解し、溶液のｐＨをトリエチルアミンで８−９に調節した。ＤＢＬＯＮｐ（１０３０ｇ；２．２１ｍｏｌ）を次に加え、黄色の溶液を２日間室温で攪拌し、周期的なｐＨ調節をトリエチルアミンで行い、ｐＨを８以上に維持した。反応物を水中に沈殿させ上記のように処理してＢＨＡｌｙｓｌｙｓ２ｌｙｓ４ｌｙｓ８ｌｙｓ１６Ｂｏｃ３２を白色固体（収率約１００％）として得た。
【００３３】
８．ＢＨＡｌｙｓｌｙｓ２ｌｙｓ４ｌｙｓ８ｌｙｓ１６ＴＦＡ３２
トリフルオロ酢酸（１６８ｍｌ）をジクロロメタン（３５０ｍｌ）中のｔ−ブチルカーボネート（Ｂｏｃ）保護ポリリシンコアＢＨＡｌｙｓｌｙｓ２ｌｙｓ４ｌｙｓ８ｌｙｓ１６Ｂｏｃ３２（２０ｇ）の懸濁液に加え、反応物を１４時間室温で攪拌した。反応混合物を真空下に濃縮し、水（２００ｍｌ）に溶解し、凍結乾燥し、ＢＨＡｌｙｓｌｙｓ２ｌｙｓ４ｌｙｓ８ｌｙｓ１６ＴＦＡ３２（１７．５ｇ、８３％）を白色がかった固体として得た。
【００３４】
Ｂ．ＳＰＬ７０１３の製造
（ｉ）[１−(オキシメチレン−カルボキシエチル)−３，６−ナフタレンジスルホン酸]ニナトリウム
１−ヒドロキシ−３，６−ナフタレンジスルホン酸]ニナトリウム（１００ｇ）をジメチルスルホオキサイド（２５０ｍｌ）に溶解し、ジイソプロピルエチルアミン（６０ｍｌ）を一度に加えた。ブロモ酢酸エチル（３８ｍｌ）を３０分かけて添加し、反応物を水蒸気を排除しながら室温で１４時間攪拌した。反応物を酢酸エチル（２Ｌ）中にゆっくり注ぎ、油状残渣／ガムを得た。上澄み液をデカントし更に酢酸エチル（１．５Ｌ）を加えた。数度のトリチュレーションにつづく残渣のアセトンによる洗浄により、[１−(オキシメチレン−カルボキシエチル)−３，６−ナフタレンジスルホン酸]ニナトリウム（９７ｇ、７８％）を褐色固体として得た。
【００３５】
（ｉｉ）１−(オキシメチレン−カルボキシ)−３，６−ナフタレンジスルホン酸
ＮａＯＨ水溶液（１３４ｍｌ）を水５００ｍｌ中の[１−(オキシメチレン−カルボキシエチル)−３，６−ナフタレンジスルホン酸]ニナトリウム（９７ｇ）の溶液に一度に加えた。反応物を１４時間室温で攪拌し、次にＩＲ１２０（酸型）カラムを通した。集めた画分を凍結乾燥することによって１−(オキシメチレン−カルボキシ)−３，６−ナフタレンジスルホン酸（６７ｇ、８３％）を褐色固体として得た。
【００３６】
（ｉｉｉ）ＢＨＡｌｙｓｌｙｓ２ｌｙｓ４ｌｙｓ８ｌｙｓ１６[ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ２Ｏ−３，６−ナフチル−（ＳＯ３Ｎａ）２]３２−ＳＰＬ７０１３
１−(オキシメチレン−カルボキシ)−３，６−ナフタレンジスルホン酸（４７．８５ｇ）をＤＭＦ（５００ｍｌ）に溶解し、ジイソプロピルエチルアミン（１１５ｍｌ）を一度に加えた。この溶液を次に、ベンゾトリアゾ−ル−１−イル−オキシ−トリスピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＰｙＢＯＰ；７２ｇ）を一度にＤＭＦ（６５０ｍｌ）中のＢＨＡｌｙｓｌｙｓ２ｌｙｓ４ｌｙｓ８ｌｙｓ１６ＴＦＡ３２（１５．９５ｇ）の溶液に添加することにより製造した溶液に加えた。ＤＭＦ（１００ｍｌ）を用いて滴下ロートを濯いだ。反応混合物を室温で１４時間攪拌し、次に水（１０Ｌ）で希釈した。溶液を１ミクロンの深さのフィルターを通って１０ｋＤ膜を含むＰａｌｌＦｉｔｒｏｎ装置（Ｐａｌｌ  Ｇｅｌｍａｎ）を横切ってポンプで揚げた。生じた溶液をＩＲ１２０（ナトリウム形）カラムを通し、０．２２ミクロン深さのフィルターをポンプで通して、凍結乾燥して、ＳＰＬ−７０１３を白色がかった固体として７５％収率で得た。３０℃でＯＤＳ−ＥＣ１５ｃｍｘ４．６ｍｍＨＰＬＣカラムで保持時間１５分であり、２４０ｎｍにおける検出波長セット。その試料は下に記載するグラジエント溶出をもちいて１分あたり１ｍｌの流速で溶出させた。
【表１】
2004532211.tif 000006
【００３７】
ＳＰＬ７０１３のマススペクトル分析は、１６５８０±２ダルトンの分子量を示した。ＳＰＬ７０１３についての予期される平均分子量は、Ｃ５８３Ｈ５７７Ｎ６４Ｏ２８７Ｓ６４について１６５８１．１５３である。
【００３８】
Ｃ．ＳＰＬ７３０４の製造
同様の方法で、ＳＰＬ７３０４は、１−(オキシメチレン−カルボキシ)−３，６−ナフタレンジスルホン酸のポリアミドアミン（ＰＡＭＡＭ）デンドリマー、生成３（Starburst, Sigma-Aldrich Pty. Ltd., Australia)とのＰｙＢＯＰカップリングにより製造した。
【００３９】
Ｄ．ＳＰＬ７３２０の製造
同様の方法で、ＳＰＬ７３２０は、１−(オキシメチレン−カルボキシ)−３，６−ナフタレンジスルホン酸のポリプロピレンイミンドトリアコンタアミン  デンドリマー、生成４．０（DAB-Am-32, Sigma-Aldrich Pty. Ltd., Australia)とのＰｙＢＯＰカップリングにより製造した。
【００４０】
実施例２
ＳＰＬ７０１３，ＳＰＬ７３０４、およびＳＰＬ７３２０の生物学的活性
Ａ．ヒト免疫不全ウイルスに対する活性
用いたヒト免疫不全ウイルス株はＨＩＶ−１（ＩＩＩＢ）１およびＨＩＶ−（ＲＯＤ）２であった。抗レトロウイルス活性および細胞毒性を平行におこなった。それらはＨＩＶに感染し、次に様々な濃度の試験化合物にさらされたＭＴ−４細胞の生存能力をベースにする。ＭＴ−４細胞を５日間増殖させた後、生存能力のある細胞の数を９６ウエルマイクロトレイ中のテトラゾリウムをベースにする比色的３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロマイド（ＭＴＴ）方法により定量した。
【００４１】
これらの試験の全てにおいて、ウイルス投入量（感染のウイルスの多重度、ＭＯＩ）は５０％細胞培養感染用量（ＣＣＩＤ５０）の０．０１または１００倍であった。５０％抗ウイルス的阻害濃度（ＥＣ５０）はウイルスサイトパシシティに対してウイルスが感染した細胞の５０％を保護するに必要な化合物濃度として定義した。５０％細胞毒性濃度（ＣＣ５０）は、モック感染細胞の生存能力を５０％減少させるのに必要な化合物濃度として定義した。＞という記号は化合物が試験され、なお非毒性であることがわかった最高濃度を示すために用いた。いくつかの別の実験についての平均ＥＣ５０およびＣＣ５０値は上に定義したように示した。原則として個別の値はＥＣ５０およびＣＣ５０値から２倍以上または以下離れなかった。ＳＩは抗ウイルス選択性指数ＣＣ５０／ＥＣ５０である。
【表２】
2004532211.tif 000007
【００４２】
（ｉ）ＣＤ−４依存性およびＣＤ−４非依存性ＨＩＶ伝達阻害試験方法，ＨＩＶ付着および融解、およびLactobacillus種増殖の阻害
細胞およびウイルス：
ＨＩＶ−１ＩＩＩＢおよびＨｅＬａ  ＣＤ４ＬＴＲβ−ｇａｌ、ＧＨＯＳＴＸ４／Ｒ５、およびＨＬ２／３細胞ラインは、NIH AIDS Research and Reference Reagent Program (Bethesda, MD)から入手し、推奨されるように保持した。ＭＥ１８０細胞は、American Type Culture Collection (Manassas, VA) から入手した。
【００４３】
試験試料の取り扱いおよび貯蔵：
化合物は、別の溶媒および貯蔵条件がスポンサーにより指定されない限り、典型的には１００％ＤＭＳＯに溶解し、試験するまで−８０℃で貯蔵した。凍結した貯蔵物を室温で解凍し、15分３７℃で予熱し、組織培養媒地中の作業溶液の製造前に渦巻かせた。化合物希釈および取り扱いのすべての段階の間、化合物は不透明なカバリングにより、および不透明なまたは琥珀色の組織培養プラスチック中の貯蔵および希釈により偶発的な光から保護する。更に、偶発的な室光曝露および層流組織培養フード光曝露することは実験室に置ける全蛍光ライトニングを５０％だけ減ずることにより調節した。最終ＤＭＳＯ濃度は最高試験濃度で０．２５％である。
【００４４】
ＣＤ４非依存性ＨＩＶ伝達阻害試験：
ＭＥ１８０細胞、ＣＤ４陰性、Ｘ４陽性頚部の上皮細胞ラインを、１０％胎児ウシ血清、グルタミンおよび抗生物質をおぎなったＲＰＭＩ１６４０中に維持する。試験の２４時間前に、ＭＥ１８０細胞をトリプソナイズし、洗浄し、９６ウエル平底マイクタイタープレートに２ｘ１０３細胞／ウエルで接種する，試験の日に、ＨＩＶ−１（Ｈ９−ＳＫＩ）のＳＫＩ臨床的単離で慢性的に感染したＨ９細胞を、新しく作ったマイトマイシンＣ（２００μｇ／ｍｌ）で６０分間３７℃で処理した。このマイトマイシンＣ濃度は細胞死をもたらすに十分であるが、ウイルス伝達を生ずるのを可能にする。マイトマイシンＣ処置後、Ｈ９−ＳＫ１細胞を３度組織培養培地で洗浄する。試験化合物をＭＥ１８０単層に添加し、次に２ｘ１０４のＨ９−ＳＫ１細胞を添加する。ＭＥ１８０細胞をＨ９−ＳＫ−１細胞および試験物質と４時間共培養し、Ｈ９−ＳＫ１細胞を、ＭＥ１８０単層をＰＢＳで３度洗浄することにより除去する。試験開始２４時間および４８時間にウエルをＰＢＳで３度洗浄し、Ｈ９−ＳＫ−１細胞の除去を確認し、培養を試験物質を含まない培地で継続した。共培養後６日目に上澄み液を集め、ELISAによるｐ２４抗原発現について評価した。細胞生存能力はXTT染料還元により評価した。第１の試験において活性と判断された化合物はムチンの添加と共に、或いはなしに再試験した。ムチン存在下における試験は伝達反応に２００μｇ／ｍｌのブタムチン（Sigma Chemical Co., St Louis, MO）を添加して行う。伝達間隔およびムチンまたは化合物の置換なしの洗浄は上記のように行う。すべての測定は３回行い試験化合物の連続的１／２Ｌｏｇ１０希釈をした。
【００４５】
ＣＤ４依存性ＨＩＶ伝達阻害試験：
ＣＤ４依存性ＨＩＶ伝達阻害試験は、ＣＤ４陽性ＧＨＯＳＴ（３）Ｘ４／Ｒ５細胞ラインの使用を除いて、本質的にＣＤ４非依存性伝達試験について記載のように行った。この細胞ラインはＨＩＶ共受容体およびＣＤ４発現について陰性のＨＯＳ（ヒト骨肉腫）細胞ラインに由来する。その細胞ラインを操作して選択不可能なレトロウイルスベクターを介してＴ４（ＣＤ４），Ｒ５およびＸ４，ハイグロマイシン選択可能なマーカーを有するＨＩＶ−２  ＬＴＲ  ｈＧＦＰ構築物を介して発現させる。その細胞ラインは、２．５ｘ１０４ＧＨＯＳＴ（３）Ｘ４／Ｒ５および５ｘ１０２マイトマイシンＣ処理Ｈ９／ＳＫ−１を試験にもちいることを除いて、ＣＤ４非依存性ＨＩＶ伝達阻害試験について上記のように扱い、培養した。化合物の添加、マイトマイシンＣ処理、およびＨ９／ＳＫ−１を除去するための伝達後洗浄は上に記載したように行い、２つの抗ウイルス試験を可能にした。ウイルス複製は感染後２４時間に３回の洗浄後、ＥＬＩＳＡによる細胞にともなうｐ２４の測定により評価し、ＣＤ４の存在下の単一ラウンドの感染を保証した。化合物毒性および細胞生存可能性はＸＴＴ染料還元により評価した。最初の試験で活性と判断された化合物はムチンの添加と共に、またはなしに再試験した。ムチン存在下における試験は伝達反応に組織培養培地中の２００μｇ／ｍｌのブタムチン（Sigma Chemical Co., St Louis, MO）を添加して行う。伝達間隔およびムチンまたは化合物の置換なしの洗浄は上記のように行った。すべての測定は３回行い試験化合物の連続的１／２Ｌｏｇ１０希釈をした。
【００４６】
ラクトバチラス試験：
Lactobacillus crispatusおよび Lactobacillus jensenti は、American Type Tissue Culture Collectionから得、Lactobacilli MRS ブロス(Difco, Fisher Scientific, Pittsburgh, PA)中で増殖させた。この培地は嫌気性条件下でのLactobacilliの充分な増殖を可能にする。バチラスストックを作り、感受性試験での使用のために−８０℃で１５％グリセロール中で凍結した。L． crispatusおよび L．jensenti増殖に及ぼす化合物の影響を評価するために、１０ｍｌのＭＲＳ培地をグリセロール細菌ストックからスタブで接種する。培養はＧａｓ  Ｐａｋ  ＣＯ２バッグ中に置き、３７℃で２４時間インキュベートした。次の日、ラクトバチラス培養物を、６７０ｎｍの波長で０．０６のＯＤまで希釈する。化合物を希釈し、９６ウエル平底プレート中に置き、ラクトバチラス種を添加した。それぞれ、１．２５Ｕ／ｍｌおよび１．２５μｇ／ｍｌの高試験濃度での、商業的に入手し得るペニシリン／ストレプトマイシン溶液を正の対照として用いた。プレートを再びＧａｓ  Ｐａｋ  ＣＯ２バッグ中で３７℃で２４時間インキュベートし、モレキュラーデバイスリーダーで４９０ｎｍでの光学密度測定により細菌増殖を測定する。すべての測定は３回行い高試験濃度から６  １／２Ｌｏｇ１０希釈をした。
【００４７】
ウイルス付着試験：
この試験は細胞と相互作用し、ウイルス付着をブロックする化合物、および/または形成する付着/溶融複合体と相互作用する化合物を検出するため設計した。付着試験は、ＨｅＬａ  ＣＤ４  ＬＴＲ  βｇａｌ細胞を用いておこなう。ＨｅＬａ  ＣＤ４  ＬＴＲ  βｇａｌ細胞は必要な選択抗生物質と共にルーチンに培養する。試験の開始２４時間前に、細胞をトリプシナイズし、計数し、１ｘ１０４細胞を選択抗生物質のない培地で0.2ｃｍウエルにおく。２４時間に培地を除去し、培地中の化合物を細胞上に置き、３７℃で１５分培養する。知られた力価のＨＩＶのＩＩＩＢ株を次にウエルに加え培養を１時間続ける。培養の最後に、ウエルを３回培地で洗い、培養を40-48時間続ける。試験の終わりに、培地を除去し、β-ガラクトシダーゼ酵素発現を、細胞を溶解し、β-ガラクトシダーゼ酵素活性を検出するために単一溶液を用いる単一工程ケミルミネッセント方法により、製造者の指示（Tropix,Gal-screen,Bedford Mass.）に従いケミルミネッセンスにより測定する。化合物毒性はXTT染料還元によりシスタープレートでモニターする。すべての測定は３回、試験材料の連続的な1/2Ｌｏｇ希釈でおこなう。１時間のウイルス吸着間隔は、その活性なトリホスフェート形（ＡＺＺ−ＴＰＰ）にホスホリレーションすることを必要とするＡＺＴがこの試験で活性でないのに十分短い。
【００４８】
溶融試験：
溶融試験は別の細胞で発現されるＨＩＶ−１ＥｎｖおよびＣＤ４により媒介される細胞-細胞溶融をブロックする化合物の能力を評価する。この試験はｇｐ１２０/ＣＤ４相互作用およびＸ４コレセプターの阻害剤の両方に鋭敏である。最初に、５ｘ１０３ＨｅＬａ  ＣＤ４  ＬＴＲ  βｇａｌ細胞をマクロタイターウェルに置き、一晩培養する。次の日、培地を除去し、ＨｅＬａ  ＣＤ４  ＬＴＲ  βｇａｌ細胞を、試験化合物を有する新鮮な培地37℃で１時間インキュベートする。インキュベーション後、５ｘ１０３ＨＬ２/３細胞を加えインキュベーションを40−４８時間続ける。40-48時間に、βガラクトシダーゼ酵素発現をケミルミネッセンス（Tropix,Gal-screen,Bedford Mass.）により検出する。化合物毒性はＸＴＴ染料還元を用いるシスタープレート上でモニターする。すべての測定は３回試験材料の連続的な1/2Ｌｏｇ希釈でおこなう。
【００４９】
ｐ２４抗原ＥＬＩＳＡ：
ＥＬＩＳＡキットはＣｏｕｌｔｅｒ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓから入手し、スーパーネートまたは細胞関連ｐ２４抗原の検出を製造者の支持に従っておこなう。細胞関連ｐ２４について、細胞ライゼートをＣｏｕｌｔｅｒ供給ウイルス溶解緩衝液25-50μl中のウエル内容物の溶解により製造し、１ラウンドの凍結/融解後に試験する。すべてのｐ２４測定は試料の連続的希釈後行い、標準的なｐ２４抗原曲線の直線部分の吸収を確認する。標準曲線は製造者が供給する標準品および指示を用いて製造する。データは、Molecular Devices Soft Maxソフトウエアパッケイジを用いて光学密度から最終濃度を計算しｐｇ/ｍｌｐ２４抗原で表す。
【００５０】
細胞生存力および化合物毒性についてのＸＴＴ染色：
試験物質についてのＴＣ５０は、ウイルスなしの細胞および化合物を含むレプリケートマイクロタイタープレート中でテトラゾリウム染料ＸＴＴ（２,3−ビス（2−メトキシ-4−ニトロ−５−スルホフェニル）-5[（フェニルアミノ）カルボニル]-2Ｈ−テトラゾリウムヒドロオキサイド）の還元を測定することにより誘導する。ＸＴＴは代謝的に活性な細胞中でミトコンドリア酵素ＮＡＤＰＨオキシダーゼにる可溶性のホルマザン生成物に代謝され、細胞生存能力および化合物毒性の早い定量的な分析を可能にする。ＸＴＴ溶液はＰＢＳ中の１ｍｇ/ｍｌのストックとして毎日調製する。フェナジンメトサルフェート（ＰＭＳ）溶液はＰＢＳ中で15ｍｇ/ｍｌで調製し、暗所で-２０℃で貯蔵する。ＸＴＴ/ＰＭＳストックはＰＭＳをＰＢＳ中に1：100に希釈し４０μｌ/ｍＬＸＴＴ溶液を添加することにより使用直前に調製する。５０μｌのＸＴＴ/ＰＭＳをプレートの各ウエルに加え、プレートを３7℃で４時間インキュベートする。４時間インキュベーションは、各試験についての細胞の指示された数で、ＭＴＳ染料還元についての直線の応答範囲内であることが実験的に決定された。接着性プレートシーラーをリッドの代わりに用い、シールしたプレー−トを数回転倒させて可溶性ホルマザン生成物を混合し、プレートをＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｖｉｃｅｓ  Ｖｍａｘ９６ウエルプレートフォーマット分光光度計を用いて４５０ｎｍで読む。
【００５１】
データ分析
デキストラン硫酸（正）およびデキストラン（負）をＣＤ４依存性およびＣＤ４非依存性ＫＩＶ伝達阻害試験の対照として用いる。スルホン酸染料Ｃｈｉｃａｇｏ  Ｓｋｙ  Ｂｌｕｅを付着および融解試験の正の対照として用いる４。商業的に利用できるペニシリン(10,000Ｕ/ｍｌ)ストレプトマイシン(10.0ｍｇ/ｍｌ)溶液をラクトバチルス感受性試験の正の対照として用いる。適当な場合、各化合物についてＩＣ５０（ウイルス複製または伝達を５０％阻害する濃度）、ＩＤ５０（ラクトバシリの５０％増殖を阻害する濃度）ＴＣ５０（細胞生存可能性の５０％減少をもたらす濃度）および治療指数（ＴＩ：ＴＣ５０/ＩＣ５０  またはＩＤ５０）を線形回帰により計算する
【表３】
2004532211.tif 000008
【表４】
2004532211.tif 000009
１ペニシリンおよびストレプトマイシンの出発濃度はそれぞれ１．２５U/mlおよび１．２５μｇ／ｍｌである
【表５】
2004532211.tif 000010
【００５２】
（ｉｉ）ＨＩＶ−１ＲｏＪｏおよびＳＩＶ８９．６ｐｄに対するＳＰＬ7013、ＳＰＬ7304、およびＳＰＬ7320の活性
方法
ウイルス
ヒト免疫不全ウイルス１型（ＨＩＶ-１）株ＲｏＪｏはＳｏｕｔｈｅｒｎ  Ｒｅｓａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＳＲＩ）の研究室に由来する低パッセージ小児分離物である。ＳＨＩＶ89.6ｐｄはＳＲＩのマークルイスから得、ストックは抗ウイルス試験のためのヒトＰＢＭＣｓ中で増殖させた。
【００５３】
ＰＢＭＣ単離およびブラスティング
末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣｓ）は正常な肝炎およびＨＩＶ−１陰性ドナーからフィコールハイパクーグラジエント分離により得た。簡単に言えば。抗凝固血液をＣａ＋＋およびＭｇ＋＋を除いたDulbeccoのリン酸塩緩衝液で（ＰＢＳ）１：１希釈し、５０ｍｌの遠心管中に１４ｍｌのリンパ球分離培地の上に重ねた。次に管を３０分間６００ｘｇで遠心分離した。帯状のＰＢＬｓを生じた界面から穏やかに吸引し、続いて低速度遠心分離によりＰＢＳで２度洗浄した。単核細胞を計数し、生存能力をＴｒｙｐａｎ  Ｂｌｕｅ染料排除により測定し、１５％ＦＢＳ（熱不活性化）、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン，１００Ｕ／ｍＬペニシリン、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンおよび１０μｇ／ｍＬジェンタマイシンを２μｇ／ｍＬフィトヘマグルチン（ＰＨＡ）とともに補ったＲＰＭＩ１６４０中に１ｘ１０６細胞／ｍＬで再懸濁した。細胞を４８−７２時間、３７℃、５％ＣＯ２で培養した。培養後、細胞を遠心分離で集め、洗浄し、１５％ＦＢＳ（熱不活性化）、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン，１００Ｕ／ｍＬペニシリン、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンおよび１０μｇ／ｍＬジェンタマイシンを補ったＲＰＭＩ１６４０中に、２０Ｕ／ｍＬの組換えＩＬ−２（R&D Systems, Minneapolis, MN）と共に再懸濁した。ＩＬ−２を培養培地に含め、ＰＨＡマイトジェン刺激により開始される細胞分裂を維持した。細胞はＩＬ−２中で７２時間培養され、次にウイルステャレンジのために用いた。
【００５４】
ＰＢＭＣ試験
ＰＨＡおよびＩＬ−２でブラストした最小２のドナーからのヒト末梢血液単核細胞を計数し、生存可能性をＴｒｙｐａｎ  Ｂｌｕｅ染料排除により測定し、等しい割合で混合した。プールしたドナーを用いて、ＨＩＶ感染および１次リンパ球のＰＨＡおよびＩＬ−２への全体の応答における定量的および定性的差異から生ずる個々のドナー間に認められる変動を最小化した。細胞を１５％ＦＢＳ（熱不活性化）、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン，１００Ｕ／ｍＬペニシリン、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン、１０μｇ／ｍＬジェンタマイシンおよびＩＬ−２（２０Ｕ／ｍＬ，R&D Systems, Minneapolis, MN）を補い、フェノールレッドを除いたＲＰＭＩ１６４０中で１ｘ１０６細胞／ｍＬで再懸濁した。５０μＬの細胞を次にInfectious Disease Research department of Southern Research Instituteにより開発された標準フォーマットで９６ウエル丸底マイクロタイター培養プレートの内部６０ウエルに分配した。各プレートは細胞対照ウエル（細胞のみ）、ウイルス対照ウエル（細胞プラスウイルス）、および実験ウエル（薬剤プラス細胞プラスウイルス）を含む。連続的に希釈した化合物をマイクロタイタープレートに加え、ＨＩＶ−１およびＳＨＩＶ−１の適当なプレタイター株を加えた。すべての試料は化合物毒性の決定のためにウイルスなしのレプリケートプレートで３回試験した。ウエル当たりの最終容積は２００μＬであった。試験は３７℃、５％ＣＯ２で加湿した雰囲気中で６日間インキュベートし、その後ＲＴ活性の分析のため上澄みを集め、シスタープレートをＭＴＳ染料還元により細胞の生存能力を分析した。ウエルは顕微鏡的調べ、いずれかの異常性も注意した。
【００５５】
細胞生存能力のためのＭＴＳ染色
試験の終わりに、試験プレートを可溶性のテトラズリウムをベースにした染料ＭＴＳ(CellTiter Reagent Promega, Madison, WI)で染色して、細胞生存可能性を調べ、化合物毒性を定量化した。ＭＴＳは代謝的に活性な細胞のミトコンドリア酵素により可溶性のホルマザン生成物に代謝され、細胞生存可能性と化合物の細胞毒性の迅速な定量的分析を可能にする。この試薬は使用前に調製を必要としない単一の安定な溶液である。ＰＢＭＣ試験の終わりに、２０μＬのＭＴＳ試薬をウエルに加え、ウエルを３７℃で４時間インキュベートした。接着性プレートシーラーをふたの変わりに用い、シールしたプレートを数回逆さにし、可溶性のホルマザン生成物を混合し、プレートをMolecular  Devices  Vmaxプレートリーダーで分光光度計で読んだ。
【００５６】
逆転写酵素試験
逆転写酵素活性を細胞を含まない上澄み中で測定した。トリチウム化チミジントリホスフェート（ＮＥＮ）（ＴＴＰ）を５Ｃｉ/ｍｌで蒸留水に再けん濁した。ポリｒＡおよびオリゴｄＴをストック溶液として調製し、−20℃に保った。ＲＴ反応緩衝液は毎日新鮮なものをつくり、125μＬの１．０Ｍ  ＥＧＴＡ，１２５μＬのｄＨ２Ｏ，１１０μＬの１０％ＳＤＡ，５０μＬの１．０ＭＴｒｉｓ（ｐＨ７．４）、５０μＬの１．０Ｍ  ＤＴＴ  および４０μＬの１．０Ｍ  ＭｇＣｌ２よりなる。これら３つの溶液を、２部のＴＴＰ，１部のポリｒＡ：オリゴｄＴ、および１部の反応緩衝液の割合で混合した。１０μＬのこの反応混合物を丸底マイクロタイタープレート中に置き、１５μＬのウイルスを含む上澄みを加え、混合した。プレートを37℃でプレートの浸水を防ぐため頑丈な支持体を有する水浴でインキュベートし、６０分インキュベートした。反応後、反応容積をＤＥ８１紙の片上にスポットし、５度５分間、５％リン酸ナトリウム緩衝液、２度１分間蒸留水、２度１分間７０％エタノールで洗浄し、次に乾燥した。Ｏｐｔｉ−Ｆｌｕｏｒ  Ｏを各試料に加え、導入し放射活性をＷａｌｌａｃ  １４５０  Ｍｉｃｒｏｂｅｔａｐｌｕｓ液体シンチレーションカウンターを用いて定量した。
【００５７】
データ分析
ＩＣ５０（５０％ウイルス複製の阻害）、ＴＣ５０（５０％細胞生存能力の減少）および治療指標（ＴＩ，ＩＣ５０/ＴＣ５０）を与える。ＡＺＴは個々の試験についての関連する正の対照化合物として用いた。行った抗ウイルス評価の結果を次表に要約する。
【表６】
2004532211.tif 000011
【００５８】
Ｂ.ヘルペスウイルス-ＨＳＶ-１およびＨＳＶ−２に対する活性
（ｉ）ウイルスプラーク減少試験
一般的な方法
ＨＳＶ標準株Ｇ（ＨＳＶ−２）およびＦ（ＨＳＶ−１）を試験に用いた。６ウエルプレートに対するウイルスインプットは１００ｐｆｕ/ウエルであった。ＨＳＶ感受性の細胞ライン、Ｖｅｒｏ細胞、をウイルス産出減少試験に用いた。細胞毒性試験について上皮細胞ライン、Ｈｅｌａ−２２９細胞を用いた。
【００５９】
化合物の抗ウイルス効果を修飾プラーク減少試験により測定した。集密細胞をＰＢＳで洗浄し、続いてＨＳＶ（１００ｐｆｕ/ウエル）で１時間37℃で感染させ。１０分ごとに傾けた。ウイルス接種を除いた後、感染した細胞をＰＢＳで洗浄し、培養培地中で０．５％メチルセルロースでおおった（１％のメチルセルロースの等容量を２ｘ培養培地と混合）。細胞を37℃で、ＨＳＶ−２感染については２日間、ＨＳＶ−１感染については３日間インキュベートした。プラークの大きさが適当になった時、細胞を１０％ホルマリンで10分間固定した。つぎにプラークを０．５％クリスタルバイオレットで10分間染色した。染料を水道水で洗うことにより除去し、ヒュームフードで乾燥するまで放置した。次にプラークを計数した。
【００６０】
すべてのデータは２回の実験から得た。試験ウエル中の平均プラーク計数を対照ウエル中の平均プラーク計数と比較した。
【００６１】
ＥＣ５０（イノキュラムのプラークカウントの５０％減少を与える濃度）を計算した。抗ウイルス活性および細胞毒性測定は細胞の同じ株において平行しておこなった。５０％細胞毒性（ＣＣ５０）はモック感染した細胞の生存可能性を５０％減少させるに必要な化合物濃度として定義した。
【００６２】
感染前処置方法
培養培地を６ウエルプレートの集密Ｖｅｒｏ細胞から除去し、ＰＢＳ１ｍｌで洗浄した。０、０．０１、０．０３、０．１、０．３、１．３、１０、３０μｇ/ｍｌの濃度で化合物を含む１ｍｌの培養培地を各ウエルに加え、３７℃で１時間インキュベートした。細胞のデンドリマーとのプレインキュベーションの後、次に細胞をＨＳＶ−１またはＨＳＶ−２の１００ｐｆｕ／ウエルで感染させた。感染物は３７℃で１時間インキュベートし、１０分ごとに傾けた。摂取物を除去した後、感染した細胞をプラーク試験のため２ｘ培養培地で希釈した０．５％メチルセルロース１．５ｍｌで被覆した。
【００６３】
感染した細胞の処置
集密Ｖｅｒｏ細胞をＰＢＳで洗浄した。次に細胞をＨＳＶ−１または-２の１００ｐｆｕ／ウエルで３７℃で１時間感染させた。ウイルス接種物の除去の後、感染した細胞を一度ＰＢＳで洗浄し、０、０．０３、０．１、０．３、１．３、１０、３０、および１００μｇ/ｍｌの濃度でデンドリマーを含む０．５％メチルセルロースで被覆した。細胞を37℃で2日(ＨＳＶ−２)または３日（ＨＳＶ−１）プラークアッセイのためインキュベートした。
【００６４】
デンドリマーの細胞毒性
培養培地をポンプにより２４ウエルプレート中の集密ＨｅＬａ−２２９細胞から除去した。次に細胞を一度１ｍｌのＰＢＳで洗浄した。０、１００，５００、および１０００μｇ/ｍｌの濃度でデンドリマーを含む１ｍｌの培養培地を各ウエルに添加した。細胞を37℃のインキュベーターで２日間インキュベートした。インキュベートの終わりに、培地を除去し、細胞をＰＢＳで洗浄した。５００μｌの０．０１％ニュートラルレッド(ＰＢＳ中)をつぎに各ウエルに加え、37℃で３０分間インキュベートした。次に染料を除去し、細胞をウエルあたり１ｍｌのＰＢＳで二度洗浄した。染料を５００μｌのＰＢＳ中の５０％エタノールおよび１％の氷酢酸を各ウエルに添加することにより抽出し、室温で１５分間、１２０−１５０ｒｐｍでおだやかに振とうしながらインキュベートした。各ウエルから抽出した１００μｌ染料を９６ウエルプレート中に置き、５５０ｎｍにおける吸光度をＥＬＩＳＡリーダーで読んだ
【表７】
2004532211.tif 000012
【００６５】
（ｉｉ）ヘルペスウイルスー２  動物モデルにおける効力
SPL-7013の効力をマウス(株MS)モデルにおける生殖器のHSV防止試験で試験した。化合物の１００ｍｇ/ｍｌ、または１０ｍｇ/ｍｌの１５μｌの用量をＨＳＶ−２感染の２０秒前に１６の動物の膣内に一滴ずつたらした。ＳＰＬ−７０１３は感染を防止し、試験したすべての動物の病気を対照と比較した、対照感染マウスの同じ数の３日での全死亡率を試験の終点として用いた。
【表８】
2004532211.tif 000013
【００６６】
Ｃ.ヒトパピロマウイルス（ＨＰＶ）  ヒト上皮細胞取りこみの阻害
化合物をヒトパピローマウイルス様粒子のヒト上皮細胞ラインへの結合と取りこみを阻害するその能力ついて評価した。
【００６７】
化合物を、ヒトパピローマウイルスタイプ６ｂのパピローマウイルスフルオロクロム標識ウイルス様粒子（ＶＬＰｓ）の結合阻害剤としておよび取りこみ阻害剤として６の希釈の範囲で試験した。ＶＬＰｓをＳＰＬ-７０１３の存在下で上皮細胞へ結合させ、取りこみさせた。結合と取りこみ試験はフローサイトメトリーを用いて測定し、結合の阻害は阻害剤不存在で観測された結合にたいするパーセントとして報告した。試験は２つの独立した試験で行った。
【００６８】
方法
細胞。ヒト類表皮カルシノーマ細胞ラインＡ４３１はアメリカンタイプカルチャーコレクションからパッセージ３０（ＣＲＬ−１５５５、バッチＦ−１３５３０）で購入し、１０％ＦＣＳ中のＤＭＥＭ中に保存した。
【００６９】
ヒトパピローマウイルスタイプ６ｂ  ＶＬＰｓを増殖させ、標準的な操作方法に従い精製した。粒子はフルオロクロムで標識した。
【００７０】
化合物は５ｍＭの濃度まで滅菌水に再溶解し、最初の試験のために新鮮で用いた後、−２０℃で凍結した。それは第二の試験のために次に解凍した。
【００７１】
取りこみ試験
Ａ４３１細胞のＴ７５フラスコを３７℃で５分間１０ｍｌのＰＢＳ／ＥＤＴＡ（０．０５％）で洗浄後、３７℃でさらに５分間２ｍｌのトリプシンで処理した。ＤＭＥＭ／１０％ＦＣＳ（１０ｍｌ）を細胞に加え、室温で５分間１０００ｘ  ｇで遠心分離し、１５ｍｌ試験管中で３ｘ１０５細胞／ｍｌで完全培地に再けん濁した。細胞を３７℃で２時間、細胞表面のタンパク質の再発現が可能なように２０分ごとに転倒しながらインキュベートした。細胞を室温で５分間１０００ｘｇで遠心分離し、血清を含まないＤＭＥＭ中で３ｘ１０５細胞／１００μｌで再けん濁し、１００μｌのけん濁液を１．５ｍｌの試験管にいれた。化合物を１０μＬのＰＢＳ中での次の６の希釈で細胞に加えた。１００μＭ，１０μＭ，１．０μＭ，１００ｎＭ，１０ｎＭ，１．０ｎＭ．
【００７２】
細胞を３７℃で３０分間化合物とインキュベートした後、標識したＶＬＰｓ（２００ｎｇ）を加えた。正の対照としてＶＬＰｓのみを細胞に加え、負の対照はＶＬＰを加えるが、氷上でインキュベートした細胞であった。細胞を混合し、３７℃で２時間インキュベートした。細胞を一度１ｍｌのＰＢＳで洗浄し、ＦＡＣＳ緩衝液（Ｐ１３Ｓ／４％パラホルムアルデヒド）中で固定した。分析はＣｏｕｌｔｅｒＦＡＣＳ機でおこなった。
【００７３】
分析
結果はＷｉｎＬｉｓＴを用いて分析した。最初に前面/側面スキャターを用いて細胞の大きさを分析し、生きている細胞をゲイトした。このゲイトの平均蛍光強度（ＭＦＩ）を作り更なる分析に用いた。取りこみは氷でインキュベートしたＶＬＰを有する細胞（０％）に対するＶＬＰ（１００％）のみについて認められた結合に関するパーセントとして報告した。
【００７４】
効果
ＳＰＬ−７０１３。取りこみ（２６％取りこみ）の最大阻害は１μＭで観察され、より高い濃度でのさらなる阻害はなかった。この化合物は１μＭおよび１０ｎＭで取りこみ阻害をなお示した。ウイルス取りこみはＳＰＬ−７０１３濃度の減少と共に、この点の後増加した。
【００７５】
Ｄ.Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ感染  動物モデルにおけるＳＰＬ-7013の効力
雌マウス（株ＭＳ）をＣ．Ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓで感染させる２０秒前に、ＳＰＬ−７０１３Ｎの１００ｍｇ／ｍＬ溶液の１５μＬ滴加で上部または下部性器管中で処理した。下部性器管感染はチャレンジ３日または６日後に集めた膣のスワブサンプルからの培養による生物体の単離により定義する。上部性器管感染については、定義はチャレンジ１０日後に収集した上部性器管組織からの培養による生物体の単離である。リン酸塩緩衝液ＰＢＳで処理したマウスを対照として用いた。
【表９】
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【００７６】
当業者は具体的に記載されたもの以外の変更および修飾が本発明の精神と範囲を離れることなく本明細書に広く記載された本発明になされることを理解すであろう。本発明はすべてのそのような変更および修飾を含むよ拡張されることが理解されるであろう。
【表１０】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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