(57)【要約】本発明により、免疫抑制を誘導するのに、および移植片拒絶、自己免疫疾患、充実性腫瘍、真菌感染症、および血管疾患の治療に有用なＰＥＧ化されたラパマイシンヒドロキシエステルが提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
構造式（Ａ）：
【化１】
2004509898.tif 000009
（式中、
Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立に、水素または−ＣＯ（ＣＲ３Ｒ４）ｂ（ＣＲ５Ｒ６）ｄＣＲ７Ｒ８Ｒ９；
Ｒ３およびＲ４は、それぞれ独立に、水素、１−６個の炭素原子のアルキル、２−７個の炭素原子のアルケニル、２−７個の炭素原子のアルキニル、トリフルオロメチル、または−Ｆ；
Ｒ５およびＲ６は、それぞれ独立に、水素、１−６個の炭素原子のアルキル、２−７個の炭素原子のアルケニル、２−７個の炭素原子のアルキニル、−（ＣＲ３Ｒ４）ｆＯＲ１０、−ＣＦ３、−Ｆ、または−ＣＯ２Ｒ１１；
Ｒ７は、水素、１−６個の炭素原子のアルキル、２−７個の炭素原子のアルケニル、２−７個の炭素原子のアルキニル、−（ＣＲ３Ｒ４）ｆＯＲ１０、−ＣＦ３、−Ｆ、または−ＣＯ２Ｒ１１；
Ｒ８およびＲ９は、それぞれ独立に、水素、１−６個の炭素原子のアルキル、２−７個の炭素原子のアルケニル、２−７個の炭素原子のアルキニル、−（ＣＲ３Ｒ４）ｆＯＲ１０、−ＣＦ３、−Ｆ、または−ＣＯ２Ｒ１１；
Ｒ１０は、水素、または−ＣＯＣＨ２−Ｓ−ＣＨ２ＣＨ２−（Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２）ｎ−ＯＣＨ３；
Ｒ１１は、水素、１−６個の炭素原子のアルキル、２−７個の炭素原子のアルケニル、２−７個の炭素原子のアルキニル、７−１０個の炭素原子のフェニルアルキル；
ｂ＝０−６；
ｄ＝０−６；
ｆ＝０−６；
ｎ＝５−４５０を意味する；
ただし、Ｒ１およびＲ２は両方ともが水素ではなく、およびさらに、Ｒ１またはＲ２のいずれかは少なくとも一つの−（ＣＲ３Ｒ４）ｆＯＲ１０基、ここでＲ１０は−ＣＯＣＨ２−Ｓ−ＣＨ２ＣＨ２−（Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２）ｎ−ＯＣＨ３である、を含む）
を有する化合物または医薬上許容されるその塩。
【請求項２】
Ｒ２が水素である、請求項１記載の化合物。
【請求項３】
ｂ＝０およびｄ＝０である、請求項１または請求項２記載の化合物。
【請求項４】
ｆ＝１である、請求項１〜３のいずれか一項記載の化合物。
【請求項５】
Ｒ３およびＲ４が水素である、請求項１〜４のいずれか一項記載の化合物。
【請求項６】
Ｒ７が水素、１−６個の炭素原子のアルキル、２−７個の炭素原子のアルケニル、２−７個の炭素原子のアルキニルまたは−ＣＦ３である、請求項１〜５のいずれか一項記載の化合物。
【請求項７】
Ｒ８およびＲ９が−（ＣＲ３Ｒ４）ｆＯＲ１０である、請求項１〜６のいずれか一項記載の化合物。
【請求項８】
ｎ＝５−２００である、請求項１〜７のいずれか一項記載の化合物。
【請求項９】
ｎ＝８−１３５である、請求項８記載の化合物。
【請求項１０】
ｎ＝８−２０である、請求項８記載の化合物。
【請求項１１】
ｎ＝９０−１２０である、請求項８記載の化合物。
【請求項１２】
３−ヒドロキシ−２−（ヒドロキシメチル）−２−メチルプロピオン酸メトキシポリ（エチレングリコール）チオール５０００コンジュゲートとのラパマイシン４２−エステルである、請求項１記載の化合物。
【請求項１３】
３−ヒドロキシ−２−（ヒドロキシメチル）−２−メチルプロピオン酸ビス（メトキシポリ（エチレングリコール）チオール５０００）コンジュゲートとのラパマイシン４２−エステルである、請求項１記載の化合物。
【請求項１４】
それを必要とする哺乳動物において、移植片拒絶反応または対宿主移植片疾患を治療または阻害する方法であって、該哺乳動物に、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の式（Ａ）の化合物の有効量を提供することを含む方法。
【請求項１５】
それを必要とする哺乳動物において、充実性腫瘍を治療または阻害する方法であって、該哺乳動物に請求項１〜１３のいずれか一項記載の式（Ａ）の化合物を提供することを含む方法。
【請求項１６】
それを必要とする哺乳動物において、真菌感染症を治療または阻害する方法であって、該哺乳動物に請求項１〜１３のいずれか一項記載の式（Ａ）の化合物の有効量を提供することを含む方法。
【請求項１７】
それを必要とする哺乳動物において、慢性関節リウマチを治療または阻害する方法であって、該哺乳動物に請求項１〜１３のいずれか一項記載の式（Ａ）の化合物の有効量を提供することを含む方法。
【請求項１８】
それを必要とする哺乳動物において、多発性硬化症を治療または阻害する方法であって、該哺乳動物に請求項１〜１３のいずれか一項記載の式（Ａ）の化合物の有効量を提供することを含む方法。
【請求項１９】
それを必要とする哺乳動物において、再狭窄を治療または阻害する方法であって、該哺乳動物に請求項１〜１３のいずれか一項記載の式（Ａ）の化合物の有効量を提供することを含む方法。
【請求項２０】
それを必要とする哺乳動物において、肺炎を治療または阻害する方法であって、該哺乳動物に請求項１〜１３のいずれか一項記載の式（Ａ）の化合物の有効量を提供することを含む方法。
【請求項２１】
哺乳動物において移植片拒絶反応または対宿主移植片疾患を治療または阻害するための薬剤の調製における、請求項１〜１３のいずれか一項記載の式（Ａ）の化合物または医薬上許容されるその塩の使用。
【請求項２２】
哺乳動物において充実性腫瘍を治療または阻害するための薬剤の調製における、請求項１〜１３のいずれか一項記載の式（Ａ）の化合物または医薬上許容されるその塩の使用。
【請求項２３】
哺乳動物において真菌感染症を治療または阻害するための薬剤の調製における、請求項１〜１３のいずれか一項記載の式（Ａ）の化合物または医薬上許容されるその塩の使用。
【請求項２４】
哺乳動物において慢性関節リウマチを治療または阻害するための薬剤の調製における、請求項１〜１３のいずれか一項記載の式（Ａ）の化合物または医薬上許容されるその塩の使用。
【請求項２５】
哺乳動物において多発性硬化症を治療または阻害するための薬剤の調製における、請求項１〜１３のいずれか一項記載の式（Ａ）の化合物または医薬上許容されるその塩の使用。
【請求項２６】
哺乳動物において再狭窄を治療または阻害するための薬剤の調製における、請求項１〜１３のいずれか一項記載の式（Ａ）の化合物または医薬上許容されるその塩の使用。
【請求項２７】
哺乳動物において肺炎を治療または阻害するための薬剤の調製における、請求項１〜１３のいずれか一項記載の式（Ａ）の化合物または医薬上許容されるその塩の使用。
【請求項２８】
請求項１〜１３のいずれか一項記載の式（Ａ）の化合物および医薬上許容されるキャリアを含む医薬組成物。
【請求項２９】
請求項１に定義する式（Ａ）の化合物の調製法であって、構造式（Ｂ）：
【化２】
2004509898.tif 000010
（式中、ＲＡは請求項１に定義するＲ１である、ＲＢは請求項１に定義するＲ２である、Ｒ１０は請求項１において式（Ａ）に関して定義するものである、ただし、少なくとも一つのＲ１０は−ＣＯＣＨ２−Ｘ、ここでＸは適当な遊離基である、を示す）の化合物を、式（Ｃ）：
【化３】
2004509898.tif 000011
（式中、ｎは請求項１に定義するものである）の化合物と、必要であればいずれかの反応性置換基を保護して反応させ、次いで所望によりいずれかの保護基を除去して、対応する式（Ａ）の化合物を得ることを含む方法。
【請求項３０】
請求項２９に定義する式（Ｂ）の化合物。
【請求項３１】
３−ヒドロキシ−２−（２−ヨード−アセトキシメチル）−２−メチル−プロピオン酸とのラパマイシン４２−エステルである、請求項３０記載の式（Ｂ）の化合物。
【請求項３２】
３−（２−ヨード−アセトキシ）−２−（２−ヨード−アセトキシメチル）−２−メチル−プロピオン酸とのラパマイシン４２−エステルである、請求項３０記載の式（Ｂ）の化合物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、免疫抑制を誘発するのに、また、移植片拒絶反応、自己免疫疾患、充実性腫瘍、真菌感染症、および血管疾患の治療に有用な水溶性ラパマイシンエステルに関する。さらに詳しくは、本発明は、ラパマイシンのヒドロキシ−エステルのメトキシポリ（エチレングリコール）エステル、その調製および調製中における中間体、および免疫抑制を誘導するために、および移植片拒絶反応、対宿主移植片疾患、自己免疫疾患、炎症性疾患、成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫、充実性腫瘍、真菌感染症、心血管疾患、脳血管疾患、末梢血管疾患または高増殖（ｈｙｐｅｒｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ）血管障害の治療にそれらを用いるための方法に関する。
【０００２】
ラパマイシンは、ストレプトマイセス・ハイグロスコピカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ）により産生される大環状トリエン系の抗生物質であり、インビトロおよびインビボ両方における抗真菌活性、特にカンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）に対する抗真菌活性を有することが見い出されている［シー・ヴェチーナ（Ｃ． Ｖｅｚｉｎａ）ら、ジャーナル・オブ・アンチバイオティクス（Ｊ． Ａｎｔｉｂｉｏｔ．）２８，７２１（１９７５）；エス・エヌ・セガール（Ｓ．Ｎ． Ｓｅｇｈａｌ）ら、ジャーナル・オブ・アンチバイオティクス（Ｊ． Ａｎｔｉｂｉｏｔ．）２８，７２７（１９７５）；エイチ・エイ・ベイカー（Ｈ．Ａ． Ｂａｋｅｒ）ら、ジャーナル・オブ・アンチバイオティクス（Ｊ． Ａｎｔｉｂｉｏｔ．）３１，５３９（１９７８）；米国特許第３，９２９，９９２号；および米国特許第３，９９３，７４９号］。さらに、ラパマイシン単独（英国特許第４，８８５，１７１号）またはピシバニルとの組み合わせ（米国特許第４，４０１，６５３号）が抗腫瘍活性を有することが示されている。
【０００３】
ラパマイシンの免疫抑制効果は、ファセブ（ＦＡＳＥＢ）３，３４１１（１９８９）に開示されている。他の大環状分子であるシクロスポリンＡおよびＦＫ−５０６についても、これらが免疫抑制薬として有効であり、それゆえ、移植片拒絶反応を防止するのに有用であることが示されている［ファセブ（ＦＡＳＥＢ）３，３４１１（１９８９）；ファセブ（ＦＡＳＥＢ）３，５２５６（１９８９）；アール・ワイ・カルネ（Ｒ．Ｙ． Ｃａｌｎｅ）ら、ランセット（Ｌａｎｃｅｔ）１１８３（１９７８）；および米国特許第５，１００，８９９号］。アール・マルテル（Ｒ． Ｍａｒｔｅｌ）ら［Ｃａｎ． Ｊ． Ｐｈｙｓｉｏｌ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． ５５， ４８ （１９７７）］は、ラパマイシンが多発性硬化症のモデルである試験的アレルギー性脳脊髄炎モデルに、慢性関節リウマチのモデルであるアジュバント関節炎モデルに有効であること、およびＩｇＥ様抗体の形成を効果的に阻害することを開示している。
【０００４】
ラパマイシンは、全身性エリテマトーデス［米国特許第５，０７８，８９９号］、肺炎［米国特許第５，０８０，８９９号］、インスリン依存性糖尿病［米国特許第５，３２１，００９号］、乾癬等の皮膚疾患［米国特許第５，２８６，７３０号］、内臓疾患［米国特許第５，２８６，７３１号］、血管損傷後の平滑筋細胞増殖および内膜肥厚化［米国特許第５，２８８，７１１号および５，５１６，７８１号］、成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫［欧州特許出願第５２５，９６０ Ａ１号］および眼の炎症［米国特許第５，３８７，５８９号］、悪性腫瘍［米国特許第５，２０６，０１８号］、心臓の炎症疾患［米国特許第５，４９６，８３２号］、および貧血［米国特許第５，５６１，１３８号］を予防または治療するのにも有用である。
【０００５】
ＣＣｌ−７７９としても知られる、３−ヒドロキシ−２−（ヒドロキシメチル）−２−メチルプロピオン酸とのラパマイシンエステル、ラパマイシン４２−エステル［米国特許第５，３６２，７１８号に開示されている］が、種々の腫瘍細胞系統に対して抗腫瘍活性を有することが、インビボでの動物腫瘍モデルにおいて、およびフェーズＩ臨床試験において示されている［Ｇｉｂｂｏｎｓ， Ｊ．， Ｐｒｏｃ． Ａｍ． Ａｓｓｏｃ． Ｃａｎ． Ｒｅｓ． ４０： ３０１ （１９９９）； Ｇｅｏｅｒｇｅｒ， Ｂ．， Ｐｒｏｃ． Ａｍ． Ａｓｓｏｃ． Ｃａｎ． Ｒｅｓ． ４０： ６０３ （１９９９）； Ａｌｅｘａｎｄｒｅ， Ｊ．， Ｐｒｏｃ． Ａｍ． Ａｓｓｏｃ． Ｃａｎ． Ｒｅｓ． ４０： ６１３ （１９９９）； ａｎｄ Ａｌｅｘａｎｄｒｅ， Ｊ．， Ｃｌｉｎ． Ｃａｎｃｅｒ． Ｒｅｓ． ５ （Ｎｏｖｅｍｂｅｒ Ｓｕｐｐ．）： Ａｂｓｔｒ． ７ （１９９９）］。
【０００６】
ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）は、種々の分子量で入手可能な、直鎖または分枝鎖の中性ポリマーであり、水およびほとんどの有機溶媒に可溶である。１０００未満の分子量にて、粘着性の、無色の液体であり、より大きな分子量のＰＥＧは蝋質の白色固体である。該固体の融点は分子量に比例し、６７℃にてプラトーに近づく。数百から約２０，０００の範囲の分子量が生物学および生物工学における適用に一般に用いられる。生物医学領域において最も重要なのは、ＰＥＧが無毒であり、体内での消費につき、ＦＤＡにより認証されたという事実である。ぺグ化（ｐｅｇｙｌａｔｅｄ）ラパマイシンが、米国特許第５，７８０，４６２に開示されている。
【０００７】
（発明の開示）
本発明は、免疫抑制を誘導するために、および移植片拒絶反応、対宿主移植片疾患、自己免疫疾患、炎症性疾患、成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫、充実性腫瘍、真菌感染症、心血管疾患、脳血管疾患、末梢血管疾患または高増殖（ｈｙｐｅｒｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ）血管障害の治療に有用な、構造式：
【化４】
2004509898.tif 000002
【０００８】
（式中、
Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立に、水素または−ＣＯ（ＣＲ３Ｒ４）ｂ（ＣＲ５Ｒ６）ｄＣＲ７Ｒ８Ｒ９；
Ｒ３およびＲ４は、それぞれ独立に、水素、１−６個の炭素原子のアルキル、２−７個の炭素原子のアルケニル、２−７個の炭素原子のアルキニル、トリフルオロメチル、または−Ｆ；
Ｒ５およびＲ６は、それぞれ独立に、水素、１−６個の炭素原子のアルキル、２−７個の炭素原子のアルケニル、２−７個の炭素原子のアルキニル、−（ＣＲ３Ｒ４）ｆＯＲ１０、−ＣＦ３、−Ｆ、または−ＣＯ２Ｒ１１；
【０００９】
Ｒ７は、水素、１−６個の炭素原子のアルキル、２−７個の炭素原子のアルケニル、２−７個の炭素原子のアルキニル、−（ＣＲ３Ｒ４）ｆＯＲ１０、−ＣＦ３、−Ｆ、または−ＣＯ２Ｒ１１；
Ｒ８およびＲ９は、それぞれ独立に、水素、１−６個の炭素原子のアルキル、２−７個の炭素原子のアルケニル、２−７個の炭素原子のアルキニル、−（ＣＲ３Ｒ４）ｆＯＲ１０、−ＣＦ３、−Ｆ、または−ＣＯ２Ｒ１１；
Ｒ１０は、水素、または−ＣＯＣＨ２−Ｓ−ＣＨ２ＣＨ２−（Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２）ｎ−ＯＣＨ３；
【００１０】
Ｒ１１は、水素、１−６個の炭素原子のアルキル、２−７個の炭素原子のアルケニル、２−７個の炭素原子のアルキニル、または７−１０個の炭素原子のフェニルアルキル；
ｂ＝０−６；
ｄ＝０−６；
ｆ＝０−６；
ｎ＝５−４５０を意味する；
【００１１】
ただし、Ｒ１およびＲ２は両方ともが水素ではなく、およびさらに、Ｒ１またはＲ２のいずれかは少なくとも一つの−（ＣＲ３Ｒ４）ｆＯＲ１０基、ここでＲ１０は−ＣＯＣＨ２−Ｓ−ＣＨ２ＣＨ２−（Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２）ｎ−ＯＣＨ３である、を含む）
を有するラパマイシンのヒドロキシエステルのメトキシポリ（エチレングリコール）エステル、または医薬上許容されるその塩を提供する。本発明の化合物は、ラパマイシンのぺグ化ヒドロキシエステルとも呼ぶことができる。
【００１２】
本発明の化合物（Ａ）および（Ｂ）において、以下は、単独で、またはいずれかの組み合わせまたはあらゆる組み合わせとして採用される変化の例である：
Ｒ２は、例えば水素であってよい。
ｂおよびｄは、例えば独立に０または１であってよく、例えばｂは０およびｄは１；好ましくは両方ともが０である。
【００１３】
ｆの例は、１−４、例えば１−２であり、好ましくは、ｆは１である。
Ｒ３およびＲ４は、水素、または１−６個の炭素原子のアルキル、好ましくは水素であってよい。
Ｒ７は、例えば水素、１−６個の炭素原子のアルキル、２−７個の炭素原子のアルケニル、２−７個の炭素原子のアルキニル、または−ＣＦ３；例えば、水素、または１−４個の炭素原子のアルキルであってよい。
【００１４】
Ｒ８およびＲ９は、例えば水素、または−（ＣＲ３Ｒ４）ｆＯＲ１０であってよい。
１より多いＲ１０＝−ＣＯＣＨ２−Ｓ−ＣＨ２ＣＨ２−（Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２）ｎ−ＯＣＨ３基が存在する場合、それらは同一または異なっていてよい。好ましくは、１または２つのそのような基が存在する。
ｎの例は、５−４００の範囲であり、例えば、５−３５０または５−３００、例えば約６５−１５５の範囲にある。
【００１５】
あてはまる場合、医薬上許容される塩は、ラパマイシンが適当な酸性部分を含む場合、例えばアルカリ金属塩（例えば、ナトリウム、リチウム、またはカリウム）、アルカリ土類金属塩、アンモニウム塩、１−６個の炭素原子を含むアルキルアンモニウム塩、または各アルキル基に１−６個の炭素原子を含むジアルキルアンモニウム塩、および各アルキル基に１−６個の炭素原子を含むトリアルキルアンモニウム塩のように、有機塩基および無機塩基（例えば、化合物が遊離ヒドロキシル基を含む場合）から作成することができる。
【００１６】
本発明に従って用いられる、本発明により包含される化合物または物質を提供することに関して、「提供する」なる用語は、そのような化合物または物質を直接投与すること、または有効量の化合物または物質を体内で形成するプロドラッグ、誘導体または類縁体を投与することのいずれかを意味する。
【００１７】
本発明により包含されるラパマイシンのＰＥＧ化ヒドロキシエステルに関して、ラパマイシンのヒドロキシエステルは、３−ヒドロキシ−２−（ヒドロキシメチル）−２−メチルプロピオン酸部分の１または両方のヒドロキシル基がＰＥＧ化されるＣＣｌ−７７９であることが好ましい。本発明の化合物に関して、ｎ＝５−２００；より好ましくはｎ＝８−１３５であることが好ましい。最も好ましいメンバーは、ｎ＝８−２０であるもの、およびｎ＝９０−１２０であるものである。ｎの値は、ＰＥＧ側鎖における反復しているエトキシユニットの範囲をいう。例えば、化合物がｎ＝５−２００を有すると記載されている場合、そのような化合物は、ｎ＝５およびｎ＝２００の間の正規分布を有する、およそｎ＝１００にて最大頻度を有する化合物の混合物から成ることを意味する。化合物ＩＩＩおよびＩＶに関して、平均ｎは１０８であり、９９％のｎは６５〜１５５である。本発明の化合物は、エステル鎖を製造するのに用いられるポリエチレングリコール鎖の平均分子量に基いて記載および理解されてもよい。例えば、ＣＣｌ−７７９−ＰＥＧ５０００エステルは、一側鎖ＰＥＧエステルが、５，０００の、または５，０００付近の平均分子量を有するポリエチレングリコール誘導体を用いて形成されている、前記一般構造式の化合物を意味し、およびＣＣｌ−７７９−（ＰＥＧ５０００）２エステルは、２側鎖ＰＥＧエステルが、５，０００のまたは５，０００付近の平均分子量を有するポリエチレングリコール誘導体を用いて形成されている前記一般構造式の化合物を意味する。
【００１８】
「アルキル」、「アルケニル」および「アルキニル」なる用語には、直鎖ならびに分枝鎖の炭素鎖の両方が含まれる、アルキル基は１−６個、例えば１−４個の炭素原子、例えばメチル、エチル、プロピルおよびｔｅｒｔ−ブチルを含んで良い。アルケニルまたはアルキニルは、２−７個の炭素原子、例えば２−５個の炭素原子、例えばビニル、プロペニル、またはアセチレニルを含んでよい。
【００１９】
本発明はさらに、構造式（Ａ）の化合物を調製するための方法であって、構造式（Ｂ）の化合物：
【化５】
2004509898.tif 000003
【００２０】
（式中、ＲＡは前に定義したＲ１であり、ＲＢは前に定義したＲ２であり、Ｒ１０は構造式（Ａ）に関して前に定義したものである、但し、少なくとも一つのＲ１０基は、−ＣＯＣＨ２−Ｘを意味し、ここでＸは適当な遊離基である）を、式（Ｃ）：
【化６】
2004509898.tif 000004
【００２１】
（ここで、ｎは前に定義したものである）の化合物と、必要であればいずれかの反応性置換基を保護して反応させ、次いで所望によりいずれかの保護基を除去して、構造式（Ａ）の化合物または医薬上許容されるその塩を提供する方法をさらに提供する。
【００２２】
構造式（Ｂ）の化合物も、本発明の更なる態様を構成する。
本発明の化合物の調製に用いられる試薬は、市場入手可能であるか、または文献に開示される標準的方法により調製することができる。
【００２３】
それからＰＥＧ化ヒドロキシエステルが作成される、ラパマイシンのヒドロキシエステルの調製法が、米国特許第５，３６２，７１８号および国際公開第９５／２８４０６号に開示されており、これを引用により本明細書中に組み込む。都合よくは、１またはそれ以上のヒドロキシエステルを、一般式Ｘ−ＣＨ２ＣＯ２Ｈ、ここでＸは臭素またはヨウ素などの適当な遊離基である、を有するアシル化剤で、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）などのカップリング試薬の存在下、ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）などの塩基性触媒の存在下でアシル化してよい。従って、３−ヒドロキシ−２−（２−ヨード−アセトキシメチル）−２−メチル−プロピオン酸とのラパマイシン４２−エステル（化合物Ｉ）および３−（２−ヨード−アセトキシ）−２−（２−ヨード−アセトキシメチル）−２−メチル−プロピオン酸とのラパマイシン４２−エステル（化合物ＩＩ）は、この方法を用いて調製される中間体であり、それらはラパマイシンの対応するＰＥＧ化ヒドロキシエステル（それぞれ、化合物ＩＩＩおよびＩＶ）の製造に有用である。
【００２４】
ＰＥＧ化エステルは、ｔｈｅ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ， Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ， １９９４の第３５５頁〜３６１頁に記載されているもののような、当該分野で公知のポリエチレングリコールを用いることにより都合よく製造してよい。本発明の好ましい化合物は、約２００〜約２００，０００の平均分子量を有するポリエチレングリコールを用いてエステル化された構造のものとして開示することができる。本発明のＰＥＧエステルの好ましい範囲には、エステル鎖のポリエチレングリコール部分の分子量が約３００から約２０，０００の範囲、より好ましくは約３５０〜約６，０００の範囲に分子量を有するものが含まれる。前記のようにアシル化されたラパマイシンのヒドロキシエステルの、適当なポリエチレングリコールチオールとの、塩基、例えばナトリウムバイカーボネートなどの存在下での反応により、所望のＰＥＧ化ラパマイシンヒドロキシエステルが提供される。
【００２５】
本発明の化合物の抗腫瘍活性を、本発明の典型的な化合物としてＣＣｌ−７７９−ＰＥＧ５０００エステル（化合物ＩＩＩ）およびＣＣｌ−７７９−（ＰＥＧ５０００）２エステル（化合物ＩＶ）を用い、Ｕ８７ＭＧヒト神経膠芽細胞腫の細胞成長の阻害を（３Ｈ−チミジンの取りこみに相関するものとして）測定する標準的な薬理学的試験法にて確認した。以下に、用いた方法と得られた結果を簡単に示す。Ｕ８７ＭＧヒト神経膠芽細胞腫（ＡＴＣＣ＃ＨＴＢ−１４；Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ； １０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ； Ｍａｎａｓｓａｓ， ＶＡ ２０１１０より入手可能）は、以下の培地中で生育させた。
【００２６】
生育培地：
Ｅａｒｌｅ塩を含むＢＲＬ最小必須培地（５００ｍＬ）
＋５ｍＬのＢＲＬ　ＭＥＭ　非必須アミノ酸（１０ｍＭ）
＋５ｍＬのＢＲＬペニシリン−ストレプトマイシン（１００００ｕ／ｍＬ、１００００μｇ／ｍＬ）
＋５ｍＬのＢＲＬ　Ｎａピルベート溶液（１００ｍＭ）
＋５ｍＬのＢＲＬ　Ｌ−グルタミン２００ｍＭ
＋５０ｍＬのＢＲＬ　ウシ胎児血清（適性化したもの）
【００２７】
試験方法：
１．細胞をトリプシン処理し、次いで最終容積２００μＬの生育培地中１０４細胞／ウェルの濃度で９６ウェルの平底プレートに蒔き、２４時間３７℃にて接着させた。
【００２８】
２．培地を細胞の単層を乱さないよう注意して、吸引により除去した。２００μｌの新鮮な生育培地をウェル当たりに添加し、サンプルに関して十分な数のウェルを３倍にて実施した。試験化合物は１０μＬのリン酸バッファー溶液（ＰＢＳ）に添加し、そして別に４８時間３７度にてインキュベートした。
【００２９】
３．インキュベーションの最後の５時間中に、プレートをウェル当たり１μＣｉ３Ｈチミジンにて標識した。（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｎｕｃｌｅａｒ ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ、カタログ＃ＮＥＴ−０２７、６．７Ｃｉ／ｍｍｏｌ）。１μＣｉは１０μＬのＰＢＳに（採取日に）添加した。プレートは最後の５時間、インキュベーターに戻した。
【００３０】
４．放射能活性のある培地を、細胞の単層を乱さないように注意して吸引により除去した。次いで、５０μＬのＢＲＬ１０×トリプシンを各ウェルに添加した後、３７℃にて１０分間、または単層がウェルの底から剥がれるまでインキュベートした。Ｓｋａｔｒｏｎ９６ウェルハーベスターを用いて、ガラスファイバーフィルターマット上にサンプルを採取した。マットをＷａｌｌａｃ　Ｂｅｔａｐｌａｔｅカウンターにてカウントした。
【００３１】
2004509898.tif 000005
【００３２】
この標準的な薬理学試験方法にて得られた結果は、本発明の化合物が腫瘍細胞の生育を阻害すること、およびそれゆえ抗腫瘍剤として有用であることを示す。特に、本発明の化合物は、肉腫および癌腫、例えば星状細胞腫、前立腺癌、乳癌、小細胞性肺癌、および卵巣癌などを含む充実性腫瘍の生育を治療または阻害するのに有用である。
【００３３】
本発明の化合物は、腎臓、心臓、肝臓、肺、骨髄、膵臓（島細胞）、角膜、小腸、および皮膚同種移植片、および心臓弁異種移植片などの移植片拒絶の治療または阻害に；対宿主移植片疾患の治療または阻害に；狼瘡、慢性関節リウマチ、糖尿病、重症筋無力症、および多発性硬化症などの自己免疫疾患の治療または阻害に；および乾癬、皮膚炎、湿疹、脂漏症、炎症性内臓疾患、肺炎（喘息、慢性閉塞性肺疾患、気腫、急性呼吸困難症候群、気管支炎などを含む）および眼のブドウ膜炎；成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫；真菌感染症；再狭窄などの高増殖血管疾患；移植組織血管アテローム性動脈硬化症；および心血管疾患、脳血管疾患、および末梢血管疾患、例えば冠状動脈疾患、脳血管疾患、動脈硬化症、アテローム性動脈硬化症、非アテローム性動脈硬化症、または免疫介在性の血管障害に至る細胞現象からの血管壁障害の治療または阻害に、および卒中または多重梗塞性痴呆症を阻害するのにも有用である。
【００３４】
再狭窄に用いる場合、本発明の化合物は、血管形成術後に起こる再狭窄を治療するのに用いることが好ましい。血管形成後の再狭窄を治療するのに用いる場合、本発明の化合物は手術前に、手術中に、手術後に、またはこれらのいずれかの組み合わせにて投与することができる。
【００３５】
本発明はまた、当業者に公知の他のラパマイシンの類似ＰＥＧ化ヒドロキシエステル、例えば制限されるものではないが、２９−デメトキシラパマイシン、［米国特許第４，３７５，４６４号、Ｃ．Ａ．命名法下では３２−デメトキシラパマイシン］；１−、３−、および／または５−位の二重結合が還元されたラパマイシン誘導体［米国特許第５，０２３，２６２号］；２９−デスメチルラパマイシン［米国特許第５，０９３，３３９号、Ｃ．Ａ．命名法下では３２−デスメチルラパマイシン］；７，２９−ビスデスメチルラパマイシン［米国特許第５，０９３，３３８号、Ｃ．Ａ．命名法下では７，３２−デスメチルラパマイシン］、２７−ヒドロキシ−ラパマイシン［Ｕ．Ｓ．特許第５，２５６，７９０号］および１５−ヒドロキシラパマイシン［米国特許第５，１０２，８７６号］なども包含する。本発明は、４２−オキソラパマイシンの３１−位におけるエステルも包含する［米国特許第５，０２３，２６３号］。前記の米国特許における開示は、引用により本明細書中に組み込む。
【００３６】
特定の疾患状態または病気の治療または阻害のために投与する場合、ＰＥＧ化ラパマイシンヒドロキシエステルの有効投与量は、用いられる特定化合物、投与様式、治療される疾患の症状、および重篤度、ならびに治療される個人に関連する種々の身体的要因により変更してよいことが理解される。本発明に従って用いる場合、満足できる結果は、活性化合物のおよその見積り毎日投与量が０．１μｇ／ｋｇ−１００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは０．００１−２５ｍｇ／ｋｇ、およびより好ましくは０．０１−５ｍｇ／ｋｇであるところの毎日経口投与にて、ＰＥＧ化ラパマイシンヒドロキシエステルが投与される場合に得ることができる。見積り毎日投与量は、投与経路により変化することが期待される。
【００３７】
そのような投与製剤は、本明細書中の活性化合物を方向付けるのに有用な、経口、インプラント、非経口（静脈内、腹膜内および皮下注射を含む）、直腸、鼻腔内、経膣、および経皮を含むあらゆる方法でレシピエントの血流に投与されてよい。本発明のＰＥＧ化エステルは、対応する非−ＰＥＧ化エステルよりも水溶性が明らかに大きいという点で、ラパマイシンの非−ＰＥＧ化エステルよりも、処方および投与し易いという利点を提供する。例えば、化合物３および４は共に＞１００ｍｇ／ｍＬの水溶性を有し、一方、ＣＣｌ−７７９は＜１．１μｇ／ｍＬの水溶性を有した。この利点は、経口および非経口投与に特に重要である。
【００３８】
本発明の活性化合物を含有する経口製剤は、従来から用いられているあらゆる経口製剤、例えば、錠剤、カプセル剤、バッカル形態、トローチ剤、ロゼンジ剤および経口液、懸濁剤または液剤を包含しうる。カプセル剤は、活性化合物と、医薬上許容されるデンプン（例えば、コーンスターチ、馬鈴薯デンプンまたはタピオカデンプン）、砂糖、人工甘味料、粉末状セルロース（例えば、結晶性および微結晶セルロース）、小麦粉、ゼラチン、ガム質などの不活性充填剤および／または希釈剤との混合物を含有しうる。有用な錠剤製剤は、従来の圧縮成形法、湿式造粒法または乾式造粒法により製造すればよく、医薬上許容される希釈剤、結合剤、滑沢剤、崩壊剤、表面変性剤（界面活性剤を含む）、懸濁化剤または安定剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、タルク、ラウリル硫酸ナトリウム、微結晶セルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウム、ポリビニルピロリドン、ゼラチン、アルギン酸、アラビアゴム、キサンタンガム、クエン酸ナトリウム、複合ケイ酸塩、炭酸カルシウム、グリシン、デキストリン、ショ糖、ソルビトール、リン酸二カルシウム、硫酸カルシウム、乳糖、カオリン、マンニトール、塩化ナトリウム、タルク、乾燥デンプンおよび粉砂糖などが挙げられるが、これらに限定されない）を利用する。好ましい表面変性剤としては、非イオン性およびアニオン性の表面変性剤が挙げられる。表面変性剤の代表例としては、ポロキサマー１８８、塩化ベンザルコニウム、ステアリン酸カルシウム、セトステアリルアルコール、セトマクロゴール乳化ワックス、ソルビタンエステル、コロイド状二酸化ケイ素、リン酸塩、ドデシル硫酸ナトリウム、ケイ酸アルミニウムマグネシウムおよびトリエタノールアミンが挙げられるが、これらに限定されない。本明細書中の経口製剤は、活性化合物の吸収を変更するために、常套の遅延または時間放出製剤を利用してもよい。経口製剤は、必要とされる適当な溶解剤または乳化剤を含む水または果汁中の活性成分を投与することからなってもよい。
【００３９】
場合によっては、化合物はエアロゾルの形態で気道に直接投与することが望ましいことがある。
また、本発明の化合物は、非経口的または腹腔内に投与してもよい。遊離塩基または医薬上許容される塩としてのこれら活性化合物の液剤または懸濁剤は、ヒドロキシ−プロピルセルロースなどの界面活性剤と適当に混合した水中にて製造することができる。また、懸濁剤は、油中のグリセロール、液状ポリエチレングリコールおよびその混合物中にて製造することもできる。保存および使用に関する通常の条件下では、これらの製剤は、微生物の増殖を防止するために保存剤を含有する。
【００４０】
注射用に適した医薬製剤としては、無菌の水溶液または懸濁液、および無菌の水溶液または懸濁液の即時調製用の無菌散剤が挙げられる。すべての場合において、製剤は無菌でなければならず、容易な注射可能性が存在する程度まで流体でなければならない。それは製造および保存の条件下で安定でなければならず、細菌やカビなどの微生物の汚染作用に対して保存されなければならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコールおよび液状ポリエチレングリコール）、その適当な混合物、および植物油などを含有する溶媒または分散媒とすることができる。
【００４１】
本開示の目的に関して、経皮投与は、体の表面、および上皮および粘膜組織を含む体管内層を通過する全投与を含むことが理解される。そのような投与は、ローション、クリーム、フォーム、パッチ、懸濁液、溶液および坐薬（直腸および膣）中に、本化合物または医薬上許容されるその塩を用いて行なってよい。
【００４２】
経皮投与は、活性化合物、および活性化合物に対して不活性で、皮膚に無毒で、かつ皮膚経由の血流への全身吸収用の薬剤の送達を可能とするキャリアを含む経皮パッチの使用により達成されてよい。キャリアは、クリームおよび軟膏、ペースト、ゲル、および閉塞装置などの、非常に多数の形態をとってよい。クリームおよび軟膏は、オイル−イン−ウォーターまたはウォーター−イン−オイルいずれかのタイプの粘液または半固体エマルジョンであってよい。ペーストは、ペトロレウム中に分散された吸収性粉末から成り、または活性成分を含む親水性ペトロレウムも適当であり得る。必要に応じてキャリアと共に活性成分を含む容器を覆う半透膜または活性成分を含むマトリックスなどの種々の閉塞装置を、活性成分を血流に放出するのに用いてもよい。他の閉塞装置は文献にて公知である。
【００４３】
坐剤の製剤は、伝統的な材料、例えば、カカオバター（坐剤の融点を変化させるために必要に応じてワックスを添加して）およびグリセリンから製造してよい。水溶性の坐剤用基剤、例えば、様々な分子量のポリエチレングリコールを用いてもよい。
本発明の典型的な例の調製を、以下に示す。
【００４４】
実施例１
３−ヒドロキシ−２−（２−ヨード−アセトキシメチル）−２−メチル−プロピオン酸とのラパマイシン４２−エステル（化合物Ｉ）および３−（２−ヨード−アセトキシ）−（２−ヨード−アセトキシメチル）−２−メチル−プロピオン酸とのラパマイシン４２−エステル（化合物ＩＩ）の調製
【００４５】
【化７】
2004509898.tif 000006
【００４６】
ＣＣｌ−７７９（１．０３ｇ　１．０×１０−３モル）、４−ジメチルアミノピリジン（３．０ｍｇ）および１，３−ジシクロへキシルカルボジイミド（０．１３６ｇ、６．６×１０−４モル）を、２５０ｍＬの丸底フラスコ中、５０ｍＬの無水メチレンクロライドに溶解した。ヨード酢酸（０．１８５ｇ、１．０×１０−３モル）を１０ｍＬの無水メチレンクロライドに溶解した。ヨード酢酸溶液を１０分間、磁石棒により攪拌しながら反応混合液に添加した。次いで反応混合液を室温にてさらに２．５時間攪拌した。溶液を次いで濾紙を通して濾過した。濾液を分液漏斗に移し、５０ｍＬのナトリウムバイカーボネート溶液（５．５ｇ／１００ｍＬ）で洗浄し、次いで２×５０ｍＬの水で洗浄した。メチレンクロライド層を１０ｇの無水硫酸ナトリウムで２時間乾燥した。次いで硫酸ナトリウムを濾過除去し、メチレンクロライドをロータリーエバポレーションにより除去した。全部で０．９３ｇの黄色固体を得た。純粋な化合物Ｉおよび化合物ＩＩの単離を、Ｐｒｅｐ　Ｎｏｖａ−ｐａｋ　ＨＲ　Ｃ１８（３００×１９ｍｍ）カラム上、水からの分取ＨＰＬＣにより行った。勾配（３０％Ａ、７０％Ｂを５分間、次いで１００％Ｂを３０分以内）を用いて、化合物Ｉは１８．４分で溶離し、化合物ＩＩは２４．４分で溶離した。Ａは９０％水、１０％アセトニトリル；Ｂは１０％水、９０％アセトニトリルである。フラクションを集め、ついで２×１００ｍｌのメチレンクロライドにより抽出した。有機層を合わせ、次いで無水硫酸ナトリウムで４時間乾燥した。有機溶媒をロータリーエバポレーションにより除去して乾燥させた。化合物Ｉの黄色固体を得た（０．１４ｇ）。１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣＬ３， ４００ＭＨｚ） δ３．６８ （ｓ， ２Ｈ， １−ＣＨ２−ＣＯ２−）， ４．２８ （ｄｄ， ２Ｈ， −ＣＯ２−ＣＨ２−）． ＭＳ ｍ／ｚ １２１５．８ （Ｍ＋ＮＨ４）＋．　化合物ＩＩの黄色固体を得た（０．０８ｇ）。１ＨＮＭＲ （ＣＤＣＬ３， ４００ＭＨｚ）δ ３．７２ （ｓ， ４Ｈ， ２×１−ＣＨ２−ＣＯ２−）， ４．２８ （ｄｄ， ４Ｈ， ２×−ＣＯ２−ＣＨ２）． ＭＳ ｍ／ｚ １３８３．６ （Ｍ＋ＮＨ４）＋．
【００４７】
実施例２
ＣＣｌ−７７９−ＰＥＧ５０００−３−ヒドロキシ−２−（ヒドロキシメチル）−２−メチルプロピオン酸メトキシポリ（エチレングリコール）チオール５０００コンジュゲートとのラパマイシン４２−エステル（化合物ＩＩＩ）の調製
【００４８】
【化８】
2004509898.tif 000007
【００４９】
化合物Ｉ（９０ｍｇ、７．５×１０−５モル）を５０％のアセトニトリルおよび５０％のＮａＨＣＯ３（０．１Ｍ）水溶液を含む４０ｍＬの溶液に溶解した。溶液にＮ２を１０分間通気した。オリジナルサンプル１０μＬをＨＰＬＣ分析のために採取した。次いでｍＰＥＧ−ＳＨ５０００（４５０ｍｇ、９．１×１０−５モル）を反応溶液に添加し、次いで反応混合液を室温にてさらに４５分間攪拌した。ＨＰＬＣ分析のために１０μＬのサンプルを採取することにより反応を再び検査した。クロマトグラムは、化合物Ｉが化合物ＩＩＩへと１００％変換したことを示した。反応混合物を２×１００ｍＬのメチレンクロライドで抽出した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、次いで濾過した。濾液を２０ｍＬの体積へと、ロータリーエバポレーションにより濃縮した。粗生成物が、１５０ｍＬのエーテルを添加した後に沈殿した。焼結ガラス漏斗による濾過除去後に全部で４０４ｍｇの白色粉末を得、次いで真空下に乾燥した。純粋な、ＣＣｌ−７７９０ＰＥＧ５０００とも呼ばれる化合物ＩＩＩの単離を、Ｐｒｅｐ　Ｎｏｖａ−ｐａｋ　ＨＲ　Ｃ１８（３００×１９ｍｍ）カラム上水からの分取ＨＰＬＣにより行なった。勾配（６０％Ａ、４０％Ｂを５分間、次いで２０％Ａ、８０％Ｂにて３０分以内）を用いて１８分にて化合物ＩＩＩが溶離した。フラクションを回収し、次いで２×１００ｍＬのメチレンクロライドにより抽出した。有機層を合わせ、次いで無水硫酸ナトリウムで４時間乾燥した。有機溶媒をロータリーエバポレーションにより除去して乾燥した。残存物を５ｍＬのメチレンクロライドに溶解し、そして１５０ｍＬエーテルを添加後に沈殿させた。焼結ガラス漏斗による濾過および真空下での乾燥後に、白色粉末を得た。
【００５０】
１Ｈ ＮＭＲ （ＣＤＣｌ３， ４００ＭＨｚ） δ ２．８３ （ｔ， ２Ｈ， −Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ２−）， ３．３０ （ｓ， ２Ｈ， −ＣＯ−ＣＨ２−Ｓ）， ３．３８ （ｓ， ３Ｈ， −ＯＣＨ３）， ４．２５ （ｄｄ， ２Ｈ， −ＣＯ２−ＣＨ２−）．　ＭＳ （ＭＡＬＤ／ＴＯＦ） ｍ／ｚ ５８９４．５（ａｖｅ． Ｍ． Ｗｔ．）、これは化合物ＩＩＩに関しては平均ｎ＝１０８であり、ｎの９９％が６５〜１５５であることを示す。
【００５１】
実施例３
ＣＣｌ−７７９−（ＰＥＧ５０００）２−３−ヒドロキシ−２−（ヒドロキシメチル）−２−メチルプロピオン酸ビス（メトキシポリ（エチレングリコール）チオール５０００）コンジュゲートとのパラマイシン４２−エステル（化合物ＩＶ）の調製
【００５２】
【化９】
2004509898.tif 000008
【００５３】
化合物ＩＩ（５０ｍｇ、３．６×１０−５モル）を５０％のアセトニトリルおよび５０％のＮａＨＣＯ３（０．１Ｍ）水溶液を含む３０ｍＬの溶液に溶解した。溶液にＮ２を１０分間通気した。オリジナルサンプル１０μＬをＨＰＬＣ分析のために採取した。次いでｍＰＥＧ−ＳＨ５０００（５００ｍｇ、１．０×１０−４モル）を反応溶液に添加し、次いで反応混合液を室温にて約７０分間攪拌した。ＨＰＬＣ分析のために１０μＬサンプルを採取することにより反応を再び検査した。クロマトグラムは、化合物ＩＩが化合物ＩＶへと１００％変換したことを示した。反応混合物を２×５０ｍＬのメチレンクロライドで抽出した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、次いで濾過した。濾液を１０ｍＬの体積へと、ロータリーエバポレーションにより濃縮した。粗生成物が、１５０ｍＬのエーテルを添加した後に沈殿した。全部で５００ｍｇの白色粉末を、焼結ガラス漏斗により濾過除去および真空下での乾燥後に得た。純粋な、ＣＣｌ−７７９−（ＰＥＧ５０００）２とも呼ばれる化合物ＩＶの単離を、Ｐｒｅｐ　Ｎｏｖａ−ｐａｋ　ＨＲ　Ｃ１８（３００×１９ｍｍ）カラム上水からの分取ＨＰＬＣにより行なった。勾配（６０％Ａ、４０％Ｂを５分間、次いで２０％Ａ、８０％Ｂにて３０分以内）を用いて２２分にて化合物ＩＶが溶離した。フラクションを回収し、次いで２×１００ｍＬのメチレンクロライドにより抽出した。有機層を合わせ、次いで無水硫酸ナトリウムで４時間乾燥した。有機溶媒をロータリーエバポレーションにより除去して乾燥させた。残存物を５ｍＬのメチレンクロライドに溶解し、ついで１５０ｍＬエーテルを添加後に沈殿させた。焼結ガラス漏斗による濾過および真空下での乾燥後に、白色粉末を得た。
【００５４】
１Ｈ ＮＭＲ （ＣＤＣｌ３， ４００ＭＨｚ） δ ２．８１ （ｔ， ４Ｈ， −Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ２−）， ３．２９ （ｓ， ４Ｈ， −ＣＯ−ＣＨ２−Ｓ）， ３．３８ （ｓ， ６Ｈ， ２×−ＯＣＨ３）， ４．２６ （ｄｄ， ２Ｈ， ２×−ＣＯ２−ＣＨ２−）．　ＭＳ （ＭＡＬＤ／ＴＯＦ） ｍ／ｚ １０７６０．７（ａｖｅ． Ｍ． Ｗｔ．）、これは化合物ＩＶに関しては平均ｎ＝１０８であり、ｎの９９％が６５〜１５５であることを示す。
【国際公開パンフレット】
2004509898.tif 000012
2004509898.tif 000013
2004509898.tif 000014
2004509898.tif 000015
2004509898.tif 000016
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2004509898.tif 000020
2004509898.tif 000021
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2004509898.tif 000024
2004509898.tif 000025
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2004509898.tif 000029
2004509898.tif 000030
2004509898.tif 000031
2004509898.tif 000032
2004509898.tif 000033
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004509898.tif 000034
【国際調査報告】
2004509898.tif 000035
2004509898.tif 000036
2004509898.tif 000037