(57)【要約】本発明は、ヒトゲノム中の遺伝子によりコード化されているペプチド、本発明のホスホリパーゼペプチドのアミノ酸配列を提供するものである。本発明は、特に、単離ペプチド及び核酸分子、ホスホリパーゼペプチドのオルトログ及びパラログを同定する方法、及びホスホリパーゼペプチドのモジュレータを同定する方法を提供するものである。【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記グループから選択されるアミノ酸配列から成る単離ペプチド。
（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２に示されるアミノ酸配列；
（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２に示されるアミノ酸配列の対立変異体のアミノ酸配列であって、該対立変異体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１あるいは３に示される核酸分子の対向鎖に、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズされる核酸分子によってコード化されていることを特徴とするアミノ酸配列；
（ｃ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２に示されるアミノ酸配列のオルトログのアミノ酸配列であって、該オルトログは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１あるいは３に示される核酸分子の対向鎖に、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズされる核酸分子によってコード化されていることを特徴とするアミノ酸配列；及び
（ｄ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２に示されるアミノ酸配列のフラグメントであって、該フラグメントは、少なくとも１０の隣接するアミノ酸を含むことを特徴とするアミノ酸配列。
【請求項２】
下記グループから選択されるアミノ酸配列を含む単離ペプチド。
（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２に示されるアミノ酸配列；
（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２に示されるアミノ酸配列の対立変異体のアミノ酸配列であって、該対立変異体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１あるいは３に示される核酸分子の対向鎖に、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズされる核酸分子によってコード化されていることを特徴とするアミノ酸配列；
（ｃ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２に示されるアミノ酸配列のオルトログのアミノ酸配列であって、該オルトログは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１あるいは３に示される核酸分子の対向鎖に、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズされる核酸分子によってコード化されていることを特徴とするアミノ酸配列；及び
（ｄ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２に示されるアミノ酸配列のフラグメントであって、該フラグメントは、少なくとも１０の隣接するアミノ酸を含むことを特徴とするアミノ酸配列。
【請求項３】
請求項２記載のペプチドに選択的に結合する単離抗体。
【請求項４】
下記グループから選択されるヌクレオチド配列から成る単離核酸分子。
（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２に示されるアミノ酸配列をコード化するヌクレオチド配列；
（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２に示されるアミノ酸配列の対立変異体のアミノ酸配列をコード化するヌクレオチド配列であって、該ヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１あるいは３に示される核酸分子の対向鎖に、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズされることを特徴とするヌクレオチド配列；
（ｃ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２に示されるアミノ酸配列のオルトログのアミノ酸配列をコード化するヌクレオチド配列であって、該ヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１あるいは３に示される核酸分子の対向鎖に、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズされることを特徴とするヌクレオチド配列；及び
（ｄ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２に示されるアミノ酸配列のフラグメントをコード化するヌクレオチド配列であって、該フラグメントは、少なくとも１０の隣接するアミノ酸を含むことを特徴とするヌクレオチド配列。
（ｅ）（ａ）〜（ｄ）のヌクレオチド配列に相補的であるヌクレオチド配列。
【請求項５】
下記グループから選択されるヌクレオチド配列を含む単離核酸分子。
（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２に示されるアミノ酸配列をコード化するヌクレオチド配列；
（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２に示されるアミノ酸配列の対立変異体のアミノ酸配列をコード化するヌクレオチド配列であって、該ヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１あるいは３に示される核酸分子の対向鎖に、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズされることを特徴とするヌクレオチド配列；
（ｃ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２に示されるアミノ酸配列のオルトログのアミノ酸配列をコード化するヌクレオチド配列であって、該ヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１あるいは３に示される核酸分子の対向鎖に、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズされることを特徴とするヌクレオチド配列；及び
（ｄ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２に示されるアミノ酸配列のフラグメントをコード化するヌクレオチド配列であって、該フラグメントは、少なくとも１０の隣接するアミノ酸を含むことを特徴とするヌクレオチド配列。
（ｅ）（ａ）〜（ｄ）のヌクレオチド配列に相補的であるヌクレオチド配列。
【請求項６】
請求項５記載の核酸分子を含む遺伝子チップ。
【請求項７】
請求項５記載の核酸分子を含むヒト以外の遺伝子組み換え動物。
【請求項８】
請求項５記載の核酸分子を含む核酸ベクター。
【請求項９】
請求項８記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項１０】
請求項１記載の何れかのペプチドを製造する方法であって、（ａ）〜（ｄ）の何れかのアミノ酸配列をコード化するヌクレオチド配列を宿主細胞内に導入し、ペプチドがヌクレオチド配列から発現される条件下で宿主細胞を培養する方法。
【請求項１１】
請求項２記載の何れかのペプチドを製造する方法であって、（ａ）〜（ｄ）の何れかのアミノ酸配列をコード化するヌクレオチド配列を宿主細胞に導入し、ペプチドがヌクレオチド配列から発現される条件下で宿主細胞を培養する方法。
【請求項１２】
サンプル中における請求項２記載の何れかのペプチドの存在を検出する方法であって、サンプル中の該ペプチドの存在を特異的に検出する試薬とサンプルを接触させ、該ペプチドの存在を検出する方法。
【請求項１３】
サンプル中における請求項５記載の核酸分子の存在を検出する方法であって、ストリンジェントな条件下で該核酸分子にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドとサンプルを接触させ、サンプル中の該核酸分子とオリゴヌクレオチドが結合するかどうかを判定する方法。
【請求項１４】
請求項２記載のペプチドのモジュレータを同定する方法であって、該ペプチドを試薬と接触させ、該試薬が該ペプチドの機能又は活性を変調したかどうかを判定する方法。
【請求項１５】
請求項１４記載の方法において、前記試薬は前記ペプチドを発現する発現ベクターを含む宿主細胞に対して与えられる方法。
【請求項１６】
請求項２記載の何れかのペプチドに結合する試薬の同定方法であって、ペプチドと試薬を接触させ、接触混合物中にペプチドと試薬とが結合した複合体が形成されるかどうかをアッセイする方法。
【請求項１７】
請求項１６記載の方法により同定された試薬と、薬学的に許容可能なそれらの担体とを含む薬剤組成物。
【請求項１８】
ヒトホスホリパーゼタンパク質により媒介される疾患又は症状を治療する方法であって、請求項１６記載の方法で同定された試薬を薬学的に有効な量、患者に投与する方法。
【請求項１９】
請求項２記載のペプチドの発現のモジュレータを同定する方法であって、該ペプチドを発現する細胞と試薬とを接触させ、該試薬が該ペプチドの発現を変調したかどうかを測定する方法。
【請求項２０】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２に示されるアミノ酸配列と少なくとも７０％の相同性を持つアミノ酸配列を有する単離ヒトホスホリパーゼペプチド。
【請求項２１】
請求項２０記載のペプチドにおいて、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の相同性を持つアミノ酸配列を有するペプチド。
【請求項２２】
ヒトホスホリパーゼペプチドをコード化している単離核酸分子であって、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１あるいは３に示される核酸分子と少なくとも８０％の相同性を有している核酸分子。
【請求項２３】
請求項２２記載の核酸分子において、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１あるいは３に示される核酸分子と少なくとも９０％の相同性を有している核酸分子。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【技術分野】
本発明は、ホスホリパーゼＣサブファミリーに関連したホスホリパーゼタンパク質、組み換えＤＮＡ分子、及びタンパク質の製造に関する。本発明は、特に、タンパク質のリン酸化に影響を与える新規なペプチド、タンパク質、及びこれらのペプチド、タンパク質分子をコード化する核酸分子を提供するものである。そして、これらはヒトの治療及び診断用の組成物、方法の開発に有用である。
【０００２】
【背景技術】
ホスホリパーゼ
ヒトのホスホリパーゼ酵素には、ホスホリパーゼＡ２、ホスホリパーゼＣ、ホスホリパーゼＤの３つの主要なファミリーが知られている。
【０００３】
ホスホリパーゼＡ２ファミリー（ＰｌＡ２）に属する酵素は、ホスホグリセリドのｓｎ−２脂肪酸アシルエステル結合を加水分解し、遊離脂肪酸とリゾホスホリピッドを放出する。ＰｌＡ２は塩基配列、機能、局在、及び２価陽イオンの要求性に基づいて分類される多様な酵素ファミリーから構成される。ＰｌＡ２はリン脂質の消化、及び代謝や、炎症反応の前駆体の産生を含む様々な細胞プロセスにおいて重要な役割を果たしている。ＰｌＡ２は、そのサイズ、構造、及び２価陽イオンの要求性に基づいて、少なくとも５つのグループ（別の分類方法も存在し、ある権威によれば１０のグループまで同定されてはいるが）に分類される。グループＩ、ＩＩ、およびＩＩＩは、すべて分泌型のＰｌＡを含み、それは分子量が小さく、触媒作用にカルシウムが必要な細胞外酵素である。グループＩＶとＶは細胞質型のＰｌＡ２を含み、分子量が大きく、カルシウムイオンを必要としない。
【０００４】
ＰｌＡ２ホスホリパーゼの中で最もよく解析されているものは、膵臓が酵素原として分泌する消化酵素である。これらの酵素は、食物中のリン脂質の加水分解に関与しており、蛇毒ホスホリパーゼと強い相同性を有している。その他のＰｌＡ２はシグナル伝達系の制御に重要な役割を果たしており、その中には膜リン脂質からのアラキドン酸の遊離を触媒する細胞質ＰｌＡ２のグループＩＶＡ酵素（ＰＬＡ２Ｇ４Ａ）が含まれる。アラキドン酸は、集団としてエイコサノイド（プロスタグランジングループの分子を含む）として知られている広範な生物学的作用因子の前駆体としての働きを有しており、エイコサノイドは血流力学的制御や、炎症反応、及びその他の細胞制御に関与している。
【０００５】
別の生理活性リン脂質である血小板活性化因子（ＰＡＦ）は、ＰＡＦアセチルヒドロラーゼとして知られるグループＶＩＩのＰｌＡ２により代謝性不活化分解産物へと加水分解される。ＰＡＦアセチルヒドロラーゼの欠損は全身性エリテマトーデスの患者で報告されており、急性喘息発作の子供においてはＰＡＦレベルの上昇が報告されている。また、炎症性関節炎患者の血漿と関節液において、ＰＬＡ２Ｇ２Ａとして知られるグループＩＩのＰｌＡ２の上昇が報告されている。マウスの大腸癌モデルを用いた研究では、この遺伝子のマウスのオルトログの対立遺伝子が多発性腸新生物発症マウス（家族性アデノーマ様ポリポーシスとして知られるヒトの疾患のマウスモデル）において腫瘍数を調節し得ることが示されている。引き続くヒトにおける研究においては、ＰＬＡ２Ｇ２Ａの変異が、直腸結腸癌の発症リスクと関連していることが示されている。ＰＬＡ２Ｇ２Ａは結腸粘膜の腸陰窩内の細胞微細環境を変化させることにより働いていると推測されているが、その作用が発揮される詳細なメカニズムは明らかではない。
【０００６】
ホスホリパーゼＣ（ＰＬＣ）ファミリーに属する酵素は、細胞膜リン脂質、ホスファチジルイノシトールリン酸（ＰＩＰ）、又はホスファチジルイノシトール４，５−二リン酸（ＰＩＰ２）の加水分解を触媒し、セカンドメッセンジャー産物として１，４，５−イノシトール三リン酸（ＩＰ３）と１，２−ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）を産生する。ＰＬＣ遺伝子ファミリーに属する分子は、ＰＬＣ−β、ＰＬＣ−γ、及びＰＬＣ−δのサブファミリーに分類される。ＰＬＣ−δは、ＳＨ２とＳＨ３ドメインを欠いているという点でＰＬＣ−γと区別され、この領域はチロシンキナーゼによるＰＬＣ−γの活性化に必須である。ＰＬＣ−δは、ＰＬＣ−βのＣ末領域を欠いているという点でＰＬＣ−βと区別され、この領域はＧタンパクの結合と活性化に重要である。様々なＰＬＣ酵素が全身のシグナル伝達系において重要な役割を果たしている。活性化シグナルは、ホルモン、成長因子、及び神経伝達物質を含む。ＩＰ２の機能の一つは細胞内カルシウムレベルの調節であり、一方、ＤＡＧはある種のプロテインキナーゼの活性化に関与し、小胞輸送過程における膜融合を促進する。
【０００７】
本発明で提供される新規ヒトタンパクはホスホリパーゼＣファミリーに関連しており、特にホスホリパーゼＣ−δサブクラスの酵素と高い相同性を示している。ＰＬＣ−δタンパクはカルシウムホメオスタシスの異常や、細胞内カルシウムイオン濃度の上昇といった、一般的に高血圧と関係する状況に関与している可能性が考えられている（Ｙａｇｉｓａｗａ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓ １９９１ Ｎｏｖ；９（１１）：９９７−１００４）。さらに、ＰＬＣ−δ１をコードしている遺伝子は、肺癌細胞株で欠損していることが知られている３番染色体上領域のちょうど遠位に位置しており（Ｉｓｈｉｋａｗａ ｅｔ ａｌ．， Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔ Ｃｅｌｌ Ｇｅｎｅｔ １９９７；７８（１）：５８−６０）、肺癌などの癌への関与が示唆されている。それに加えて、ＰＬＣ−δ１のプレックストリンホモロジー領域における変異が若年性自然発症アルツハイマー病の患者で見いだされており（Ｓｈｉｍｏｈａｍａ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ． ２４５： ７２２−７２８， １９９８）、プレックストリンホモロジー領域の変異はブルトン無ガンマグロブリン血症を引き起こすことが知られている（Ｓｈｉｍｏｈａｍａ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ． ２４５： ７２２−７２８， １９９８）。ＰＬＣタンパク、特に、ＰＬＣ−δサブファミリーのタンパクに関するさらに詳細な解説は、Ｌｅｏｎｉｓ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ １９９６ Ｊｕｌ １６；２２４（２）：３８２−９０； Ｃｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ １９９５ Ｍａｒ １０；２７０（１０）：５４９５−５０５； Ｓｕｈ ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ １９８８ Ｊｕｌ １５；５４（２）：１６１−９； Ｍｉｌｔｉｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｍｕｓｃｌｅ Ｒｅｓ Ｃｅｌｌ Ｍｏｔｉｌ １９９６ Ｆｅｂ；１７（１）：７９−８４； ａｎｄ Ｌｙｕ ｅｔ ａｌ．， Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｇｅｎｏｍｅ ７： ５０１−５０４， １９９６を参照。
【０００８】
ホスホリパーゼＤ（ＰＬＤ）ファミリーに属する酵素は、ホスファチジルコリン（ＰＣ）やその他のリン脂質の加水分解を触媒し、ホスファチジン酸を産生する。Ｇタンパク結合型レセプターやレセプター型チロシンキナーゼを介して作用する一連のアゴニストはこの加水分解を刺激する。ホスファチジン酸は、広範なシグナル伝達系を活性化できるセカンドメッセンジャーとして重要であることが明らかにされている。ＰＣ特異的ＰＬＤ活性は、シグナル伝達系、膜輸送、細胞分裂の制御、分泌制御、細胞骨格の再構築、転写制御、および細胞周期の制御といった多様な細胞側経路に関与している。多くのタンパクが、グリシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）アンカーを介して細胞膜と結合している。ホスファチジルイノシトール−グリカン（ＰＩＧ）特異的ＰＬＤは、イノシトールリン酸結合を選択的に加水分解し、タンパクの放出を促す。
【０００９】
ホスホリパーゼタンパク、特にホスホリパーゼＣサブファミリーのメンバーは、薬剤作用と薬剤開発の主要なターゲットである。したがって、このサブファミリーのホスホリパーゼに属するこれまでに知られていないメンバーを同定し、性状解析することは製薬開発の分野において価値のあることである。本発明は、ホスホリパーゼＣサブファミリーのメンバーとホモロジーを有するこれまでに未知のヒトホスホリパーゼタンパクを提供するという点で最先端のものである。
【００１０】
【発明の要約】
本発明は、ホスホリパーゼＣサブファミリー、これらの対立遺伝子変異体、および他の哺乳類におけるこれらのオルトログに関係する、ヒトホスホリパーゼペプチド及びタンパク質のアミノ酸配列同定の一部に基づいたものである。これらの特異なペプチド配列、及びこれらのペプチドをコード化する核酸配列は、ヒトの治療ターゲット開発のためのモデルとして用いることができ、治療に用いるタンパク質の識別に役立ち、また、ホスホリパーゼを発現する細胞及び組織内でのホスホリパーゼ活性を調節するようなヒトの治療薬の開発におけるターゲットとなり得る。図１の実験データによると、ヒトにおいては、膵臓の腺癌、肺、脳の退形成型乏突起膠腫、胎盤の絨毛癌、膵臓の腺癌、子宮内膜、結腸の腺癌、眼の網膜芽細胞腫、及び胎児の脳において発現が示されている。
【００１１】
【発明を実施するための最良の形態】
概論
本発明は、ヒトゲノムの配列解析に基づいている。ヒトゲノムの配列解析及び構築に際して、配列情報を解析することによって、当該分野においてホスホリパーゼタンパク質、またはその一部であると同定され、またホスホリパーゼＣサブファミリーに関連付けられるタンパク質／ペプチド／ドメインに対して構造及び／又は配列の相同性を有するペプチドをコード化するヒトゲノムの未確認フラグメントが明らかになった。これらの配列を用いて、付加的なゲノム配列を構築、転写し、及び／又はｃＤＮＡ配列を単離し、特徴付けた。この解析に基づき、本発明は、ホスホリパーゼＣサブファミリーに関連するヒトホスホリパーゼペプチドとタンパクのアミノ酸配列、これらのタンパクをコード化する転写配列、ｃＤＮＡ配列及びゲノム配列型の核酸配列、核酸変異（対立遺伝子情報）、発現の組織分布、及び本発明のホスホリパーゼに対して構造又は配列の相同性を有する、最も関連性の高い既知のタンパク質／ペプチド／ドメインに関する情報を提供するものである。
【００１２】
本発明において提供されるペプチドは、従来未知であることに加えて、商業的に重要な製品及びサービスの開発にとって有用であるという点に基づいて、選択され得るものである。特に、本発明のペプチドは、ホスホリパーゼＣサブファミリーにおける既知のホスホリパーゼタンパク質に対して相同性及び／又は構造上の相関性を有し、発現パターンが観察されることに基づいて選択される。図１の実験データによると、ヒトにおいては、膵臓の腺癌、肺、脳の退形成型乏突起膠腫、胎盤の絨毛癌、膵臓の腺癌、子宮内膜、結腸の腺癌、眼の網膜芽細胞腫、及び胎児の脳において発現が示されている。この技術は、このファミリーのタンパク質、及び本発明の遺伝子に類似した発現パターンを有するタンパク質の商業的な重要性を確立するものである。本発明のペプチドについてのより特異的な性質、及びその使用については、本明細書、特に背景技術、図面の注釈に記載され、及び／又は既知のホスホリパーゼＣファミリー、またはホスホリパーゼタンパク質サブファミリーのそれぞれにおいて周知である。
【００１３】
【実施例の詳細】
ペプチド分子
本発明は、ホスホリパーゼファミリーのタンパク質の１つであると同定されたタンパク質分子をコード化する核酸配列を提供するものであり、これらはホスホリパーゼＣサブファミリー（図２にタンパク質配列、図１に転写／ｃＤＮＡ配列、図３にゲノム配列を示す）に関連付けられる。図２にはペプチド配列が記載され、ここには明らかな変異体、特に本明細書及び図３の情報を用いて同定される対立変異体も記載されており、これらは、本発明のホスホリパーゼペプチド、ホスホリパーゼペプチド、又は本発明のペプチド／タンパク質と呼ばれる。
【００１４】
本発明は、図２に示すホスホリパーゼペプチド（図１の転写／ｃＤＮＡ、又は図３のゲノム配列に示される核酸分子によりコード化される）のアミノ酸から成る、あるいは実質的に成る、あるいはこれを含む単離ペプチド及びタンパク質分子を提供するとともに、本技術により作製、使用されるこれらのペプチドの明らかな変異体を提供するものである。これらの変異体については、以下で詳述する。
【００１５】
本明細書で使用されているように、ペプチドが細胞物質を実質的に含まない、又は化学前駆物質あるいは他の化学物質を含まない場合に、ペプチドは「単離」または「精製」されたという。本ペプチドは、均一、又は他の純度になるまで精製することができる。精製のレベルは使用目的に基づく。重要な性質は、調製物中に他の成分が多量に存在していたとしても、要求されるペプチドの機能を発揮できるということである（単離核酸分子の性質については、後述する）。
【００１６】
いくつかの例によると、「実質的に細胞物質を含まない」とは、他のタンパク質（すなわち汚染タンパク質）を約３０％（乾燥重量）未満、他のタンパク質を約２０％未満、他のタンパク質を約１０％未満、又は、他のタンパク質を約５％未満有するペプチド調製物を含む。ペプチドが組み換えにより製造される場合、培地がタンパク質調製物の容量に対して２０％未満の時には、実質的に培地は存在しないとすることができる。
【００１７】
「実質的に化学前駆物質又は他の化学物質を含まない」という用語は、合成に関与した化学前駆物質又は他の化学物質から分離されたペプチド調製物をいう。ある例においては、「実質的に化学前駆物質又は他の化学物質を含まない」とは、化学前駆物質又は他の化学物質を約３０％（乾燥重量）未満、化学前駆物質又は他の化学物質を約２０％未満、化学前駆物質又は他の化学物質を約１０％未満、又は化学前駆物質又は他の化学物質を約５％未満有するホスホリパーゼペプチド調製物を含む。
【００１８】
単離ホスホリパーゼペプチドは、自然に発現する細胞、発現のために変形された（組み換えられた）細胞から精製するか、又は、既知のタンパク質合成方法を用いて合成することができる。図１の実験データによると、ヒトにおいては、膵臓の腺癌、肺、脳の退形成型乏突起膠腫、胎盤の絨毛癌、膵臓の腺癌、子宮内膜、結腸の腺癌、眼の網膜芽細胞腫、及び胎児の脳において発現が示されている。例えば、ホスホリパーゼペプチドをコード化している核酸分子は、発現ベクター中にクローニングされ、さらにこの発現ベクターは宿主細胞に導入されて、タンパク質が宿主細胞内で発現する。そして、タンパク質は標準のタンパク質精製技術を用いた適当なスキームによって、細胞から単離することができる。これらの多くの技術については、以下で詳述する。
【００１９】
したがって、本発明は、図２に示されるアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２）から成るタンパク質、例えば、図１に示される転写／ｃＤＮＡ核酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１）や、図３に示されるゲノム配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３）によりコード化されるタンパク質を提供するものである。このようなタンパク質の最終的なアミノ酸配列がこのアミノ酸配列であるとき、タンパク質はアミノ酸配列から成る。
【００２０】
本発明はさらに、図２に示されるアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２）から実質的に成るタンパク質、例えば、図１に示される転写／ｃＤＮＡ核酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１）や、図３に示されるゲノム配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３）によりコード化されるタンパク質を提供するものである。このようなアミノ酸配列が微量の付加アミノ酸残基、例えば、最終的にタンパク質中に約１〜１００程度の付加残基、一般的には１〜２０の付加残基が存在する場合、タンパク質はアミノ酸配列から実質的に成る。
【００２１】
本発明はさらに、図２に示されるアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２）を含むタンパク質、例えば、図１に示される転写／ｃＤＮＡ核酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１）及び図３に示されるゲノム配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３）によりコード化されるタンパク質を提供するものである。このアミノ酸配列が、タンパク質の最終的なアミノ酸配列の少なくとも一部である場合、タンパク質はアミノ酸配列を含む。このような場合、タンパク質はペプチドのみであるか、またはタンパク質と自然に結びついているアミノ酸残基（コード化された配列と隣接する）や、非相同アミノ酸残基／ペプチド配列のように、付加的なアミノ酸を有することができる。このようなタンパク質は、少量の付加的アミノ酸残基を有するか、又は数百あるいはそれ以上の付加的アミノ酸を含むことができる。本発明のホスホリパーゼペプチドが含まれるタンパク質の好適な種として、天然の成熟タンパク質がある。これらの各種タンパク質を調製／単離する方法について、以下に簡単に述べる。
【００２２】
本発明のホスホリパーゼペプチドは、キメラ又は融合タンパク質を形成するために、非相同性の配列に結合することができる。このようなキメラ及び融合タンパク質は、ホスホリパーゼペプチドに対して実質的に相同性のないアミノ酸配列を有する非相同タンパク質に、有効に結合され得るホスホリパーゼペプチドを含む。「有効に結合され得る」とは、ホスホリパーゼペプチドと非相同タンパク質がフレーム中で融合していることを意味する。非相同タンパク質は、ホスホリパーゼペプチドのＮ末端又はＣ末端に融合されることができる。
【００２３】
いくつかの例では、融合タンパク質は、ホスホリパーゼペプチド自体の活性に影響を及ぼさない。例えば、融合タンパク質には、βガラクトシダーゼ融合、イースト２−ハイブリッドＧＡＬ融合、ポリＨｉｓ融合、ＭＹＣ標識、ＨＩ標識及びＩｇ融合といった酵素融合タンパク質が含まれるが、融合タンパク質はこれに限られるものではない。このような融合タンパク質、特にポリＨｉｓ融合は、組み換えホスホリパーゼペプチドの精製に有用である。ある種の宿主細胞（例えば哺乳類の宿主細胞）においては、タンパク質の発現及び／又は分泌は、非相同信号配列を用いることにより増加させることができる。
【００２４】
キメラ又は融合タンパク質は、標準の組み換えＤＮＡ技術により製造することができる。例えば、異なるタンパク質配列をコードしているＤＮＡフラグメントは、従来技術に従ってフレーム中に共に配置される。あるいは、融合遺伝子は、自動ＤＮＡ合成機を含む従来技術により合成することが可能である。あるいは、遺伝子フラグメントのＰＣＲ増幅にアンカープライマーを用い、２つの連続的な遺伝子フラグメント間に相補的な突出部を形成し、その後アニールすることにより、キメラ遺伝子配列を再増幅することができる （Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， １９９２参照） 。さらに、発現ベクターとしては、既に融合部分（例えばＧＳＴタンパク質）をコード化した多くのものを、商業的に入手することができる。ホスホリパーゼペプチドをコード化した核酸は、融合部がフレーム中でホスホリパーゼペプチドに結合するようにして、このような発現ベクター中にクローニングされることができる。
【００２５】
以上説明したように、本研究はまた、天然のペプチド成熟形態、ペプチドの対立遺伝子／配列変異体、非天然の組み換え誘導変異体、ペプチドのオルトログ及びパラログなど、本発明のタンパク質のアミノ酸配列における明らかな変異体を提供、及び実施可能にするものである。このような変異体は、核酸組み換え技術やタンパク質生化学の分野で公知の技術を用いることにより、容易に生成することができる。しかし、当然のことながら、この変異体には、本発明以前に公開されている何れのアミノ酸配列も含まれないものである。
【００２６】
このような変異体は、本発明に示される分子技術や配列情報を用いることにより、容易に同定／製造することが可能である。さらに、このような変異体は、本発明のホスホリパーゼペプチドに対する配列及び／又は構造上の相同性に基づいて、他のペプチドと容易に区別することができる。相同性／同一性の程度は、主に、ペプチドが機能的な変異体であるか非機能的な変異体であるか、パラログファミリー中に存在する分化量、オルトログ間の進化的相違に基づいて判断される。
【００２７】
２つのアミノ酸配列、又は２つの核酸配列の同一性パーセントを決定するために、最適な比較を行う目的で配列は整列される（例えば、最適な配列比較のために、ギャップが第一及び第二アミノ酸又は核酸配列の一方又は両方に導入され、非相同性配列は比較を行うために無視することができる）。好適な例としては、対象配列の長さの少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又はそれ以上が、比較目的に応じて整列される。そして、対応するアミノ酸配置又はヌクレオチド配置上のアミノ酸残基又はヌクレオチドが比較される。第一配列での配置が、第二配列において対応する配置と同じアミノ酸残基又はヌクレオチドによって占められている時、分子はその配置と同じで同一である（ここで用いられているアミノ酸又は核酸の「同一性」は、アミノ酸又は核酸の「相同性」と同意義である）。２つの配列間の同一性パーセントは、配列において共有される同一配置数の関数であり、ギャップ数及び各ギャップ長さを考慮し、ギャップは２つの配列が最適な比較を行えるように導入される必要がある。
【００２８】
２つの配列間における、配列の比較及び同一性、類似性パーセントの決定は、数学的アルゴリズムを用いて行うことができる（Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｌｅｓｋ， Ａ．Ｍ．， ｅｄ．， Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９８８； Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔｓ， Ｓｍｉｔｈ， Ｄ．Ｗ．， ｅｄ．， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９９３； Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａ， Ｐａｒｔ １， Ｇｒｉｆｆｉｎ， Ａ．Ｍ．， ａｎｄ Ｇｒｉｆｆｉｎ， Ｈ．Ｇ．， ｅｄｓ．， Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ， １９９４； Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， ｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅ， Ｇ．， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， １９８７； ａｎｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐｒｉｍｅｒ， Ｇｒｉｂｓｋｏｖ， Ｍ． ａｎｄ Ｄｅｖｅｒｅｕｘ， Ｊ．， ｅｄｓ．， Ｍ Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９９１）。好適な例として、２つのアミノ酸配列間の同一性パーセントはＧＣＧソフトウェアパッケージ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｃｇ．ｃｏｍで入手可能）のＧＡＰプログラムに組み込まれたＮｅｅｄｌｅｍａｎ・Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム（Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． （４８）：４４４−４５３ （１９７０））を用い、Ｂｌｏｓｓｏｍ６２マトリックス、又はＰＡＭ２５０マトリックス、及びギャップ重量１６、１４、１２、１０、８、６、４、長さ重量１、２、３、４、５、６を用いて決定される。他の好適な例としては、２つのヌクレオチド配列間の同一性パーセントは、ＧＡＰプログラム （Ｄｅｖｅｒｅｕｘ， Ｊ．， ｅｔ ａｌ．， （Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １２（１） ： ３８７ （１９８４））を用い、ＮＷＳｇａｐｄｎａ．ＣＭＰマトリックス、ギャップ重量４０、５０、６０、７０、８０と長さ重量１、２、３、４、５、６を用いて決定される。さらに他の一例としては、２つのアミノ酸又ヌクレオチド配列間の同一性パーセントは、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれたＥ． Ｍｙｅｒｓ・Ｗ． Ｍｉｌｌｅｒのアルゴリズム （ＣＡＢＩＯＳ， ４：１１−１７ （１９８９））を用い、ＰＡＭ１２０重量残基表、ギャップ長ペナルティ２、ギャップペナルティ４を用いて決定される。
【００２９】
本発明の核酸及びタンパク質配列は、例えば他のファミリー又は関連した配列を発見するために、配列データベースに対して検索を行う「クエリー配列」として用いられることができる。このような検索は、ＡｌｔｓｃｈｕｌらのＮＢＬＡＳＴ、及びＸＢＬＡＳＴプログラム（バージョン２．０）（Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２１５：４０３−１０ （１９９０）） を用いて行うことができる。ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索は、本発明の核酸分子に相同性のあるヌクレオチド配列を得るために、ＮＢＬＡＳＴプログラムを用い、 で行うことができる。ＢＬＡＳＴタンパク検索は、本発明のタンパク質に相同性のあるアミノ酸配列を得るために、ＸＢＬＡＳＴプログラムを用い、ｓｃｏｒｅ＝５０、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝３で行うことができる。比較目的のギャップ配列を得るために、ＡｌｔｓｃｈｕｌらのＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴ （Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２５（１７）：３３８９−３４０２ （１９９７））を用いることができる。ＢＬＡＳＴ及びギャップＢＬＡＳＴプログラムを用いる際には、各プログラム（例えばＸＢＬＡＳＴやＮＢＬＡＳＴ）の既定のパラメータを用いることができる。
【００３０】
本発明のペプチドのうちの一つを含むタンパク質における、成熟プロセシングを受ける前の形態、およびプロセシングを受けた形態の全長は、本発明のホスホリパーゼのうちの一つに対して完全な配列同一性を有し、本発明のホスホリパーゼペプチドと同じ遺伝子位置によりコード化されているものとして、容易に同定することができる。本発明の新規ホスホリパーゼタンパクをコードする遺伝子は、ヒト１７番染色体にマップされるゲノム構成要素上に位置しており（図３に示す）、この結果はＳＴＳ、及びＢＡＣのマップデータなどの多系統にわたる証拠により支持されている。
【００３１】
ホスホリパーゼペプチドの対立遺伝子変異体は、ホスホリパーゼペプチドの少なくとも一部に対して高度の（著しい）配列相同性／同一性を有するヒトタンパク質であり、同様に本発明のホスホリパーゼペプチドと同じ遺伝子位置においてコード化されるものとして、容易に同定することができる。遺伝子位置は、対象となるヒトに対してマッピングされたゲノム配列のような、図３に示されるゲノム情報に基づいて容易に決定することができる。本発明の新規ホスホリパーゼタンパクをコードする遺伝子は、ヒト１７番染色体にマップされるゲノム構成要素上に位置しており（図３に示す）、この結果はＳＴＳ、及びＢＡＣのマップデータなどの多系統にわたる証拠により支持されている。本発明に用いられているように、アミノ酸配列において、典型的には少なくとも約７０〜８０％、８０〜９０％、さらに典型的には少なくとも約９０〜９５％、又はそれ以上の相同性を有する場合、２つのタンパク質（又はタンパク質の一領域）は著しい相同性を有している。本発明によれば、著しい相同性を有するアミノ酸配列は、より詳細には以下に述べられるようなストリンジェントな条件の下で、核酸分子にコード化されるホスホリパーゼペプチドとハイブリダイズする核酸配列によりコード化される。
【００３２】
図３は、本発明のホスホリパーゼタンパクをコードする遺伝子において見出されたＳＮＰの情報を提供している。ＳＮＰは１６カ所の異なる塩基ポジションにおいて同定された。ＯＲＦの外側とイントロン中に位置しているＳＮＰは、制御／調整領域に影響を与える可能性がある。
【００３３】
ホスホリパーゼペプチドのパラログは、ホスホリパーゼペプチドの少なくとも一部に対して、ある程度の著しい配列相同性／同一性を有し、ヒトの遺伝子によってコード化され、また同様の活性又は機能を有しているものとして、容易に同定することができる。アミノ酸配列が、与えられた領域又はドメインを通じて、典型的に少なくとも約６０％以上、さらに典型的には７０％以上の相同性を有する場合、２つのタンパク質は典型的なパラログであると考えられる。このようなパラログは、より詳細には以下に述べられるような適度にストリンジェントな条件の下で、核酸分子にコード化されるホスホリパーゼペプチドとハイブリダイズする核酸配列によりコード化される。
【００３４】
ホスホリパーゼペプチドのオルトログは、ホスホリパーゼペプチドの少なくとも一部に対してある程度の著しい配列相同性／同一性を有し、他の生体の遺伝子によってコード化されているものとして、容易に同定することができる。オルトログは、好適には、哺乳類、さらに好適には霊長類から単離され、ヒトの治療のターゲット及び治療薬剤の開発のために用いられる。このようなオルトログは、より詳細には以下に述べられるような、モディレートからストリンジェントな条件の下で核酸をコード化するホスホリパーゼペプチドとハイブリダイズするような核酸配列によりコード化され、これはタンパク質を生成する２つの生体の関連性に依存する。
【００３５】
本発明のホスホリパーゼペプチドの非天然の変異体は、組み換え技術を用いて容易に生成することができる。このような変異体には、ホスホリパーゼペプチドのアミノ酸配列中における欠失、付加、置換によるものが含まれるが、これらに限定されるものではない。例えば、置換の１種として、保存的アミノ酸置換が挙げられる。この置換は、ホスホリパーゼペプチドにおける特定のアミノ酸が同様の特徴を持つ他のアミノ酸によって置換されるものである。保存的置換においては、脂肪族のアミノ酸Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅの中の一つが他の一つに置換、ヒドロキシル残基ＳｅｒとＧｌｎ間の置換、酸性残基ＡｓｐとＧｌｕとの置換、アミド残基ＡｓｎとＧｌｎ間の置換、塩基性残基ＬｙｓとＡｒｇとの置換、芳香族残基ＰｈｅとＴｙｌとの置換がある。表現型に現れないアミノ酸置換に関する指針については、Ｂｏｗｉｅ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４７：１３０６−１３１０ （１９９０）に述べられている。
【００３６】
変異ホスホリパーゼペプチドは、完全に機能しているか、又は、例えば基質結合能、基質リン酸化能、信号伝達を介在する能力の一つ以上の活性において機能が欠落していることがある。完全機能的な変異体は、一般的に、保存的な変異、又は致命的でない残基あるいは領域内での変異体のみが含まれる。図２は、タンパク質分析の結果を示しており、致命的ドメイン／領域を特定するのに使用することができる。機能的変異体には、機能が変化しない、又は著しい機能変化の無い類似アミノ酸の置換も含まれる。他方、このような置換は、ある程度機能に対してプラス又はマイナスの影響を及ぼすことがある。
【００３７】
非機能的変異は、典型的には、一つ以上の非保存的なアミノ酸の置換、欠失、導入、反転、切断、又は致命的な残基あるいは領域での置換、欠失、導入、反転が含まれる。
【００３８】
機能において必須のアミノ酸は、例えば、特定部位の突然変異誘発、又はアラニンスキャニング突然変異誘発（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：１０８１−１０８５ （１９８９））等の当該分野における既知の方法により、特に図２に示す結果を用いて確認することができる。アラニンスキャニング突然変異誘発では、分子内のすべての残基において、単独のアラニン突然変異を行う。この結果生じた変異分子は、その後、ホスホリパーゼ活性のような生物活性、又はｉｎ ｖｉｔｒｏ増殖活性分析のようなアッセイのために試験される。結合相手／基質結合にとって重要な部位は、結晶化、核磁気共鳴、光学親和性ラベル等の構造解析によって決定される（Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２２４：８９９−９０４ （１９９２）； ｄｅ Ｖｏｓ ｅｔ ａｌ． Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５５：３０６−３１２ （１９９２））。
【００３９】
本発明はさらに、ホスホリパーゼペプチドのフラグメントを提供し、これに加えて、該フラグメントを含む、及びから成るタンパク質及びペプチド、特に図２に同定された残基を含むタンパク質及びペプチドを提供するものである。しかしながら、本発明に関連するフラグメントは、本発明より以前に公開されているフラグメントを含むものとは見なされない。
【００４０】
ここで用いられているように、フラグメントは、ホスホリパーゼペプチドに隣接するアミノ酸残基を、少なくとも８、１０、１２、１４、１６又はそれ以上含んでいる。このようなフラグメントは、１以上のホスホリパーゼペプチドの活性を保持する能力によって選択されるか、あるいは、基質との結合又は抗原としての挙動等の機能を果たす能力によって選択され得る。特に重要なフラグメントは生物活性フラグメントであり、これは例えば、８又はそれ以上のアミノ酸のペプチドである。このようなフラグメントは、典型的には、例えば活性部位、膜内外ドメイン又は基質結合ドメインのような、ホスホリパーゼペプチドのドメイン又はモチーフを含んでいる。さらに、可能なフラグメントとしては、ドメイン又はモチーフ含有フラグメント、溶解性ペプチドフラグメント、抗原性構造含有フラグメントを含むが、フラグメントはこれに限定されるものではない。予想されるドメイン及び機能性部位は、当業者にとって容易に入手可能な公知のコンピュータプログラム（例えばＰＲＯＳＩＴＥ分析）により、容易に確認することができる。このような分析結果の１つを図２に示す。
【００４１】
ポリペプチドは、一般に２０天然アミノ酸と呼ばれている２０種のアミノ酸以外のアミノ酸を、しばしば含むことがある。さらに、末端アミノ酸を含む多くのアミノ酸は、プロセシング及び翻訳後修飾等の自然の過程、又は当該分野において公知の化学修飾技術によって修飾され得る。ホスホリパーゼペプチドにおいて自然に生じる一般的な修飾については、基本的なテキスト、詳細な研究論文及び文献に記述されており、これは当業者においては周知である。（これらの特性のいくつかは図２において確認される）。
【００４２】
既知の修飾としては、アセチル化、アシル化、ＡＤＰリボシル化、アミド化、フラビンの共有結合付加、ヘム部分の共有結合付加、ヌクレオチド又はヌクレオチド誘導体の共有結合付加、脂質又は脂質誘導体の共有結合付加、ホスファチジルイノシトールの共有結合付加、架橋結合、環化、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、共有結合架橋の形成、シスチンの形成、ピログルタミン酸塩の形成、ホルミン化、γ−カルボキシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨウ素化、メチル化、ミリストイル化、酸化、タンパク質分解プロセシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、アルギニン化などのタンパク質へのアミノ酸の転写ＲＮＡ媒介付加、ユビキチン化を含むが、修飾はこれに限定されるものではない。
【００４３】
このような修飾は、当業者には周知であり、科学文献に非常に詳細に記載されてきた。グリコシル化、脂質付加、硫酸化、グルタミン酸残基のγ−カルボキシル化、ヒドロキシル化、ＡＤＰリボシル化など、特に一般的な修飾は、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ − Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ， ２ｎｄ Ｅｄ．， Ｔ．Ｅ． Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ， Ｗ． Ｈ． Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （１９９３） のような、ほとんどの基本テキストにおいて記載されている。この点に関する詳細な文献としては、Ｗｏｌｄ， Ｆ．， Ｐｏｓｔｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｖａｌｅｎｔ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ， Ｂ．Ｃ． Ｊｏｈｎｓｏｎ， Ｅｄ．， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ １−１２ （１９８３）； Ｓｅｉｆｔｅｒ ｅｔ ａｌ． （Ｍｅｔｈ． Ｅｎｚｙｍｏｌ． １８２： ６２６−６４６ （１９９０）） ａｎｄ Ｒａｔｔａｎ ｅｔ ａｌ． （Ａｎｎ． Ｎ．Ｙ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ６６３：４８−６２ （１９９２）） のような多くの文献を利用することができる。
【００４４】
したがって、本発明のホスホリパーゼペプチドは、誘導体又は類似体をも包括するものであり、ここで、置換されたアミノ酸残基は遺伝子コードによってコード化されるものではなく、置換基が含まれ、成熟ホスホリパーゼペプチドが、例えばホスホリパーゼペプチドの半減期を長くする化合物（例えば、ポリエチレングリコール）のような他の化合物と融合するか、又は付加アミノ酸が、例えば主、副配列、成熟ホスホリパーゼペプチドの精製配列、あるいは前タンパク質配列のような成熟ホスホリパーゼペプチドと融合する。
【００４５】
タンパク質／ペプチドの使用
本発明のタンパク質は、図面に示される機能情報に関連した、実質的かつ特異的なアッセイにおいて、例えば、抗体を高める、又は他の免疫反応を誘導させるための、生物液中でのタンパク質（又はその結合対象、又はリガンド）レベルの定量のためのアッセイに用いる試薬（ラベル化試薬を含む）として、また、対象となるタンパク質を選択的に発現する組織のマーカー（組織の分化又は発達のある特定段階、あるいは疾患の状態）として使用することができる。タンパク質が、別のタンパク質又はリガンドと結合する、又は結合し得る場合（例えば、ホスホリパーゼ関与タンパク質間の相互作用、又はホスホリパーゼリガンド間の相互作用）、このタンパク質を用いて結合相手／リガンドを特定し、結合相互作用のインヒビターを同定するシステムを開発することができる。これらの一部又はすべての使用により、試薬グレード、又は商業製品としてのキットファーマットへと開発することが可能となる。
【００４６】
上に列記した使用を実際に行う方法は、当業者にとって周知のことである。このような方法を開示している参考文献としては、”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”， ２ｄ ｅｄ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｊ．， Ｅ． Ｆ． Ｆｒｉｔｓｃｈ ａｎｄ Ｔ． Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｄｓ．， １９８９ と ”Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ： Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ”， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｂｅｒｇｅｒ， Ｓ． Ｌ． ａｎｄ Ａ． Ｒ． Ｋｉｍｍｅｌ ｅｄｓ．， １９８７がある。
【００４７】
本発明のペプチドの潜在的な用途は、第一に、タンパク源、及びタンパク質の種類／作用に基づいている。例えば、ヒトから単離したホスホリパーゼ、及びそれらのヒト／哺乳類オルトログは、哺乳類の治療用医薬、例えば、ヒト用の医薬品、特に、ホスホリパーゼを発現する細胞又は組織での生物反応又は病理学的反応の調整に用いられる医薬を発見するためのターゲットとして有用である。図１の実験データによると、ヒトにおいては、膵臓の腺癌、肺、脳の退形成型乏突起膠腫、胎盤の絨毛癌、膵臓の腺癌、子宮内膜、結腸の腺癌、眼の網膜芽細胞腫、及び胎児の脳において発現が示されている。特に、実質的なノーザンブロット解析により、膵臓の腺癌、肺、脳の退形成型乏突起膠腫、胎盤の絨毛癌、膵臓の腺癌、子宮内膜、結腸の腺癌、及び眼の網膜芽細胞腫において発現が示されている。これに加えて、ＰＣＲを用いた組織スクリーニングパネルにより、胎児の脳に発現していることも示されている。ホスホリパーゼタンパク質、特に、ホスホリパーゼＣサブファミリーの活性を調整する医薬品の多くは、現在開発中である（背景技術を参照）。背景技術及び図面に記載されている構造情報及び機能情報は、特に、図１の発現情報と組み合わせることによって、本発明の分子の特異的及び本質的な使用が提供される。図１の実験データによると、ヒトにおいては、膵臓の腺癌、肺、脳の退形成型乏突起膠腫、胎盤の絨毛癌、膵臓の腺癌、子宮内膜、結腸の腺癌、眼の網膜芽細胞腫、及び胎児の脳において発現が示されている。このような使用は、本発明で与えられる情報と、当業者において既知の情報、及びルーチン実験を用いて、容易に決定することができる。
【００４８】
本発明のタンパク質（本発明以前に開示されている変異体及びフラグメントを含む）は、ホスホリパーゼＣサブファミリーに関連付けられるホスホリパーゼに関する生物学的アッセイに有用である。このようなアッセイは、ホスホリパーゼの機能あるいは活性、又は、特にホスホリパーゼを発現する細胞及び組織における本発明の一つが属するホスホリパーゼサブファミリーに特有のホスホリパーゼに関連する症状の診断及び治療に有用な性質、の何れかに関連している。図１の実験データに示されるように、本発明のホスホリパーゼタンパクは膵臓の腺癌、肺、脳の退形成型乏突起膠腫、胎盤の絨毛癌、膵臓の腺癌、子宮内膜、結腸の腺癌、眼の網膜芽細胞腫、及び胎児の脳において発現が示されている。特に、実質的なノーザンブロット解析により、膵臓の腺癌、肺、脳の退形成型乏突起膠腫、胎盤の絨毛癌、膵臓の腺癌、子宮内膜、結腸の腺癌、及び眼の網膜芽細胞腫において発現が示されている。これに加えて、ＰＣＲを用いた組織スクリーニングパネルにより、胎児の脳に発現していることも示されている。
【００４９】
本発明のタンパク質は、細胞ベース、又は無細胞系における薬剤スクリーニングアッセイにおいても有用である。細胞ベース系は、天然型、すなわちホスホリパーゼを正常に発現する細胞であり、生体組織検査、又は細胞培地中で増殖する。図１の実験データによると、ヒトにおいては、膵臓の腺癌、肺、脳の退形成型乏突起膠腫、胎盤の絨毛癌、膵臓の腺癌、子宮内膜、結腸の腺癌、眼の網膜芽細胞腫、及び胎児の脳において発現が示されている。あるいは、細胞ベースアッセイは、ホスホリパーゼタンパク質を発現する組み換え宿主細胞に関係している。
【００５０】
ポリペプチドは、自然状態、又はホスホリパーゼに関連する特定の疾患又は症状を引き起こす変異型のタンパク質のホスホリパーゼ活性を調整する化合物を同定するために用いることができる。本発明のホスホリパーゼ、及び適当な変異体やフラグメントは、このホスホリパーゼに対して結合能力を持つ候補化合物をアッセイするための高効率スクリーンにおいて使用することができる。これらの化合物は、さらに、これらのホスホリパーゼ活性に対する影響を判定するために、機能性のホスホリパーゼに対してスクリーニングを行うことができる。さらにこれらの化合物は、動物又は無脊椎動物系において、活性／効果を判定するために試験することができる。化合物は、ホスホリパーゼを望ましい程度まで活性化（アゴニスト）又は不活化（アンタゴニスト）するかどうか判定される。
【００５１】
さらに、本発明のタンパク質は、ホスホリパーゼタンパク質と、該ホスホリパーゼタンパク質と通常相互作用する分子、例えば、ホスホリパーゼタンパク質が通常相互作用する信号経路の基質又は含有成分（例えば別のホスホリパーゼ）との間での相互作用を促進又は阻害する能力を持つ化合物をスクリーニングするのに用いることができる。このようなアッセイでは、一般的には、ホスホリパーゼタンパク質又はフラグメントがターゲット分子と相互作用するか、タンパク質とターゲットとの複合物を検出するか、又はタンパク質リン酸化、ｃＡＭＰ回転、アデニル酸シクラーゼ活性などの信号変換に関連する影響のような、ホスホリパーゼタンパク質とターゲットとの間の相互作用の生化学的結果を検出することができる条件で、ホスホリパーゼタンパク質と候補化合物が結合される工程が含まれる。
【００５２】
候補化合物としては、例えば、１）最終部がＩｇの融合ペプチド、及びランダムペプチドライブラリを含む可溶性ペプチド（例えば、Ｌａｍ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３５４：８２−８４ （１９９１）； Ｈｏｕｇｈｔｅｎ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３５４：８４−８６ （１９９１）参照）、及びＤ−及び／又はＬ−型アミノ酸の組み合わせからできている化学誘導分子ライブラリを含むペプチド、２）ホスホペプチド（例えば、ランダム、又は部分的に変質したホスホペプチドライブラリ。例えば、Ｓｏｎｇｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ ７２：７６７−７７８ （１９９３）参照）、３）抗体（例えば、ポリクローナル抗体、モノクローン抗体、ヒト化抗体、抗イディオタイプ抗体、キメラ抗体、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ発現ライブラリフラグメントを含む単鎖抗体、及び抗体のエピトープ結合フラグメントを含む単鎖抗体、及び抗体のエピトープ結合フラグメント）、４）小さな有機及び無機分子（例えば、組み合わせ及び天然生成物ライブラリから得られる分子）が含まれる。
【００５３】
ある候補化合物は、基質結合と競合する受容体の可溶性フラグメントである。他の候補化合物には、変異ホスホリパーゼ、又はホスホリパーゼ機能に影響を及ぼす変異体を含む適切なフラグメントがあり、このため、基質との競合が起こる。したがって、例えば高い親和性を有するか、又はフラグメントが基質と結合し解離しないような、基質と競合するフラグメントが本発明に包含される。
【００５４】
本発明はさらに、ホスホリパーゼ活性を変調（刺激又は阻害）する化合物を同定するための、他のエンドポイントアッセイを含む。このアッセイは、一般的に、ホスホリパーゼ活性を示す信号変換経路における挙動のアッセイに関連している。このため、ホスホリパーゼタンパク質依存信号カスケードに対する応答が促進又は抑制するよう調整される、基質のリン酸化、タンパク質の活性化、遺伝子発現の変化についてのアッセイが行われる。
【００５５】
ホスホリパーゼにより媒介される、生物学的又は生化学的な機能は、何れもエンドポイントアッセイとして用いることができる。これらは、ここに記載されている全ての生化学的又は生化学的／生物学的挙動を含み、ここに引用される文献にはこれらのエンドポイントアッセイのターゲットが織り込まれており、また、他の機能については、当業者において公知であるか、又は図面、特に図２の情報を用いて、容易に確認することができる。特に、ホスホリパーゼを発現する又は組織の生化学的機能についてのアッセイを行うことができる。図１の実験データによると、ヒトにおいては、膵臓の腺癌、肺、脳の退形成型乏突起膠腫、胎盤の絨毛癌、膵臓の腺癌、子宮内膜、結腸の腺癌、眼の網膜芽細胞腫、及び胎児の脳において発現が示されている。特に、実質的なノーザンブロット解析により、膵臓の腺癌、肺、脳の退形成型乏突起膠腫、胎盤の絨毛癌、膵臓の腺癌、子宮内膜、結腸の腺癌、及び眼の網膜芽細胞腫において発現が示されている。これに加えて、ＰＣＲを用いた組織スクリーニングパネルにより、胎児の脳に発現していることも示されている。
【００５６】
結合及び／又は活性化化合物はまた、アミノ末端細胞外ドメイン又はその一部、あるいは、異種ドメイン又はサブリジョンに置換され得る７つの膜内外セグメントの何れかの又は細胞内又は細胞外ループの何れか、及びカルボキシ末端細胞内ドメインのような膜内外ドメイン全体あるいはサブリジョン、又はその一部においてキメラホスホリパーゼタンパク質を用いることによりスクリーニングを行うことができる。例えば、基質結合領域は、異なる基質と相互作用するものとして用いられることができ、さらに天然のホスホリパーゼによって認識されるものとして同定されうる。同様に、異なるセットの信号変換成分を活性化のエンドポイントアッセイとして利用することができる。このような方法により、ホスホリパーゼが由来する特定の宿主細胞以外でアッセイを行うことが可能となる。
【００５７】
本発明のタンパク質はまた、ホスホリパーゼと相互作用する化合物（例えば、結合相手及び／又はリガンド）を発見するため利用される方法である、競争結合アッセイにも有用である。このために、化合物がポリペプチドと結合又は相互作用できる条件下で、化合物をホスホリパーゼポリペプチドと接触させる。可溶性ホスホリパーゼポリペプチドもまた混合物中に加えられる。テスト化合物が可溶性ホスホリパーゼポリペプチドと相互作用する場合、ホスホリパーゼターゲットから形成される複合体の量、又は活性は減少する。このタイプのアッセイは特にホスホリパーゼの特定領域と相互作用する化合物を検索する場合に有用である。したがって、標的のホスホリパーゼ領域と競合する可溶性ポリペプチドは、対象となる領域に対応したペプチド配列を含むように設計されている。
【００５８】
無細胞系薬剤のスクリーニングアッセイを行うためには、タンパク質の一方又は両方の非複合化形態からの複合化形態の分離を効率化し、アッセイを自動化するために．ホスホリパーゼタンパク質又はフラグメント、そのターゲット分子の何れかを固定化するのが望ましい場合がある。
【００５９】
薬剤スクリーニングアッセイにおいては、マトリックスにタンパク質を固定化する技術を使用することができる。ある例では、融合タンパク質はタンパク質をマトリックスに結合することのできるドメインを付加することができる。例えばグルタチオンＳトランスフェラーゼ融合タンパク質は、グルタチオンセファロースビーズ（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａ１，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍ０）又はグルタチオン誘導マイクロタイタープレート上に吸着され、細胞溶解物（例えば、３５Ｓ標識）と候補化合物とが結合され、複合体形成条件（例えば、塩及びｐＨの生理学的条件）の下で混合物が培養される。培養の後、非結合ラベルの除去のためにビーズは洗浄され、マトリックスを固相化して、放射性ラベルを直接、又は複合体を分離した後の上澄みを測定することにより定量される。あるいは．複合体はＳＤＳ−ＰＡＧＥによりマトリックスから分離することができ、標準の電気泳動技術を用いることによって、ゲルからビーズフラクション中のホスホリパーゼ結合タンパク質のレベルを定量することができる。例えば、ポリペプチド又はそのターゲット分子は、当業者に周知の技術を利用して、ビオチン及びストレプトアビジンの結合を用いて固定化される。あるいは、タンパク質と反応し、タンパク質とターゲット分子との結合を妨げない抗体は、プレートのウェルに誘導化されこのタンパク質は抗体との結合によりそのウェルの中に捕らえられる。ホスホリパーゼ結合タンパク質の組成物と候補化合物は、ホスホリパーゼタンパク質存在ウェル中で培養され、ウェルに捕らえられた複合体の量を測定する。このような複合体を検出する方法としては、ＧＳＴ固定複合体による前述の方法に加えて、ホスホリパーゼタンパク質ターゲット分子に反応性のある抗体、又は、ホスホリパーゼタンパク質に反応性がありターゲット分子と競合する抗体を用いた複合体の免疫検出怯、及びターゲット分子と関連する酵素活性の検出に基づく酵素結合アッセイが含まれる。
【００６０】
本発明のホスホリパーゼのうちの１つを変調する薬剤は、上述の分析方怯を単独あるいは組み合わせて用いることにより同定することができる。一般的には、最初に細胞ベース又は無細胞系のシステムを用いて、動物又は他のモデルシステムにおける活性を確認することが好ましい。このようなモデルシステムは、当業者に周知であり、本記載において容易に用いることができる。
【００６１】
これらの薬剤スクリーニングアッセイによって同定されるホスホリパーゼタンパク質活性のモジュレータは、ホスホリパーゼを発現する細胞又は組織を処置することにより、ホスホリパーゼ経路により媒介される疾患を患う患者の治療に用いることができる。図１の実験データによると、ヒトにおいては、膵臓の腺癌、肺、脳の退形成型乏突起膠腫、胎盤の絨毛癌、膵臓の腺癌、子宮内膜、結腸の腺癌、眼の網膜芽細胞腫、及び胎児の脳において発現が示されている。これらの治療方法には、薬剤組成物中のホスホリパーゼ活性のモジュレータを患者の治療に必要な量投与する工程が含まれており、このモジュレータはここに記載されるようにして同定される。
【００６２】
本発明は、他の観点では、ホスホリパーゼと結合又は相互作用する、又はホスホリパーゼ活性に関連している他のタンパク質を同定するために、２−ハイブリッドアッセイ又は３−ハイブリッドアッセイ （Ｕ．Ｓ． Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ． ５，２８３，３１７； Ｚｅｒｖｏｓ ｅｔ ａｌ． （１９９３） Ｃｅｌｌ ７２：２２３−２３２； Ｍａｄｕｒａ ｅｔ ａｌ． （１９９３） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６８：１２０４６−１２０５４； Ｂａｒｔｅｌ ｅｔ ａｌ． （１９９３）  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １４：９２０−９２４； Ｉｗａｂｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ． （１９９３） Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ８：１６９３−１６９６； ａｎｄ Ｂｒｅｎｔ ＷＯ９４／１０３００参照）においてホスホリパーゼタンパク質を「ｂａｉｔタンパク質」として使用することができる。このようなホスホリパーゼ結合タンパク質は、例えば、ホスホリパーゼ媒介信号伝達経路の下流因子としてのホスホリパーゼタンパク質、又はホスホリパーゼターゲットによる信号伝達に関与している。あるいは、このようなホスホリパーゼ結合タンパク質は、ホスホリパーゼ阻害剤である可能性も考えられる。
【００６３】
２−ハイブリッドシステムは、分離可能なＤＮＡ結合ドメイン及び活性化ドメインから成る、大部分の転写因子のモジュラー性に基づいている。簡単に言うと、このアッセイでは２つの異なるＤＮＡ構造を利用する。一方の構造においては、ホスホリパーゼタンパク質をコードしている遺伝子は、既知の転写調節因子（例えばＧＡＬ４）のＤＮＡ結合ドメインをコード化している遺伝子に融合される。他方の構造においては、ＤＮＡ配列ライブラリから得られ、未知のタンパク質（「ｐｒｅｙ」又は「ｓａｍｐｌｅ」）をコード化しているＤＮＡ配列が既知の転写調節因子の活性化ドメインをコード化している遺伝子に融合される。「ｂａｉｔタンパク質」及び「ｐｒｅｙタンパク質」が生体内で相互作用することができ、ホスホリパーゼ依存複合体を形成する場合、転写調節因子のＤＮＡ結合ドメイン及び活性化ドメインは近接する。この近接により、転写調節因子に反応する転写調節部位に結合可能なリポーター遺伝子（例えばＬａｃ Ｚ）の転写を行うことができる。リポーター遺伝子の発現は検出することが可能であり、機能的転写調節因子を含んでいる細胞コロニーを単離及び使用して、ホスホリパーゼタンパク質と相互作用するタンパク質をコード化するクローン遺伝子を得ることができる。
【００６４】
本発明はさらに、前述のスクリーニングアッセイによって同定される新規な薬剤にも関係する。したがって、ここに記載されるようにして同定された薬剤を適当な動物のモデルに使用することも本発明の範囲内である。例えば、本発明で同定された薬剤（例えばホスホリパーゼ媒介薬剤、アンチセンスホスホリパーゼ核酸分子、ホスホリパーゼ特異抗体、又はホスホリパーゼ結合パートナー）は、これらの薬剤の処方における有効性、毒性、副作用を判定するために、動物、又は他のモデルで用いることができる。あるいは、本発明で同定された薬剤が、このような薬剤の作用のメカニズムを決定するために、動物又は他のモデルで使われることができる。さらに、本発明は、治療のための前記スクリーニングアッセイにより同定された新規な薬剤の使用に関する。
【００６５】
本発明のホスホリパーゼタンパク質は、ペプチドにより媒介される疾患又は疾患体質の診断のためのターゲットを提供するのに有用である。したがって、本発明は、タンパク質（又はコード化したｍＲＮＡ）が、細胞、組織、又は生体中の存在、あるいはそのレベルを検出する方法を提供するものである。図１の実験データによると、ヒトにおいては、膵臓の腺癌、肺、脳の退形成型乏突起膠腫、胎盤の絨毛癌、膵臓の腺癌、子宮内膜、結腸の腺癌、眼の網膜芽細胞腫、及び胎児の脳において発現が示されている。方法としては、ホスホリパーゼタンパク質との相互作用能力を有する化合物と生物サンプルとを接触させるものが含まれ、この方法により相互作用が検出される。このようなアッセイは、単検出形態、又は抗体チップアレイのような多検出形態で提供される。
【００６６】
サンプル中のタンパク質を検出する１つの薬剤は、タンパク質に選択的に結合することのできる抗体である。生物サンプルには、被験者から単離されるか、又は被験者の内部に存在する組織、細胞、体液が含まれる。
【００６７】
本発明のペプチドは、ペプチド変異体を持つ患者、特に現存するタンパク質ファミリー以外のものとして知られる活性、及び症状において、タンパク質の活性、疾患又は疾患素質の診断に用いるためのターゲットを提供するものである。したがって、ペプチドは生物学的サンプルから単離されることができ、また、異常ペプチドを生じる遺伝子突然変異の存在についてアッセイを行うことができる。これは、アミノ酸置換、欠失、挿入、再配置（異常なスプライシング拳動の結果生じる）、及び不適当な翻訳後の修飾を含む。分析方法としては、変容電気泳動移動度、変容トリプシンペプチド消化、細胞ベース又は無細胞系アッセイによる変容ホスホリパーゼ活性、基質又は抗体の変容結合パターン、変容等電点、直接アミノ酸配列、及びタンパク質の変異の検出に有用な他の公知のアッセイ技術を含む。このようなアッセイは、単検出形態、又は抗体チップアレイのような、多検出形態で提供される。
【００６８】
ペプチドのｉｎ ｖｉｔｒｏ検出技術としては、酵素結合免疫吸着剤アッセイ（ＥＬＩＳＡｓ）ウェスタンブロット、抗体、又はタンパク質結合剤のような検出試薬を用いた免疫沈降、免疫蛍光検査法を含む。あるいは、ラベルされた抗ペプチド抗体、又は他のタイブの検出試薬を被験者に導入することにより、被験著のｉｎ ｖｉｖｏ検出を行うことができる。例えば、抗体は放射性マーカーをラベルすることができ、被験者中のこのマーカーの存在及び位置は、標準イメージング技術によって検出することができる。被験者において発現されたペプチドの対立変異体を検出する方法、及びサンブル中のペプチドのブラグメントを検出する方法は、特に有用である。
【００６９】
ペプチドはまた、ゲノム薬理学分析においても有用である。ゲノム薬理学では、薬剤の変化の傾向と、影響を受けたヒトの異常拳動に従って、薬剤に対しての応答における著しい遺伝的変異について臨床的に取り扱う。例えば、Ｅｉｃｈｅｌｂａｕｍ， Ｍ． （Ｃｌｉｎ． Ｅｘｐ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． Ｐｈｙｓｉｏｌ． ２３（１０−１１）：９８３−９８５ （１９９６））， ａｎｄ Ｌｉｎｄｅｒ， Ｍ．Ｗ． （Ｃｌｉｎ． Ｃｈｅｍ． ４３（２）：２５４−２６６ （１９９７））参照。これらの変異の臨床的な結果、個人の代謝変異の結果として、ある個人に対しては治療薬剤が重い毒性となり、又はある個人に対しては治療の失敗に終わる。このように、個人の遺伝子型は、体内で治療化合物を作用させる方法、又は体が化合物を代謝する方法を決定することができる。さらに、酵素を代謝させる薬剤の活性は、薬剤の作用の強度と期間に影響する。このように、個人のゲノム薬理学は、個人の遺伝子型に基づいた予防、又は治療的な処置において、効果的な化合物、又はこのような化合物の効果的な投与量の選択を可能とする。遺伝子多形性の発見により、酵素代謝性の薬剤において、患者が期待される薬効を得られない、不自然な薬効を示す、又は標準の投薬量から重大な毒性を被るといったことの理由を説明することができる。多形性は、強い代謝系の表現型と弱い代謝形の表現型で表されることができる。したがって、遺伝子の多形性は、ある集団のホスホリパーゼ機能の１つ以上が他の集団のそれと異なるような、ホスホリパーゼタンパク質の対立タンパク質変異に至るかもしれない。このように、ペプチドは治療法に影響する遺伝子の素因を確認するためのターゲットとなり得る。このため、リガンドベースの治療において、多形性は末端アミノ基の細胞外ドメイン及び／又は他の基質結合領域における基質結合活性及びホスホリパーゼ活性が、より高い、又はより低いことを引き起こし得る。したがって、多形性を含む集団においては、治療効果を最大にするように、基質投薬量は必然的に修正される。遺伝子型に代わるものとしては、特定の多形性のペプチドを同定することができる。
【００７０】
ペプチドはまた、タンパクの発現がない、発現が不適当、又は発現が不必要であることによって特徴づけられる障害を治療することに有用である。図１の実験データによると、ヒトにおいては、膵臓の腺癌、肺、脳の退形成型乏突起膠腫、胎盤の絨毛癌、膵臓の腺癌、子宮内膜、結腸の腺癌、眼の網膜芽細胞腫、及び胎児の脳において発現が示されている。したがって、処置方法としては、ホスホリパーゼタンパク質又はフラグメントの使用を含むものである。
【００７１】
抗体
本発明は、本発明のペプチド、このようなペプチドを含むタンパク質、それらの変異体及びフラグメントの１つに選択的に結合する抗体を提供するものである。ここで用いられているように、抗体がターゲットペプチドと結合し、無関係なタンパク質と強く結合しないような場合、抗体は選択的にターゲットペプチドと結合している。ターゲットペプチドと実質的に相同性の無い他のタンパク質と結合していても、そのペプチドが抗体のターゲットとなるペプチドに対してフラグメント又はドメインにおける相同性を有している限り、抗体は選択的にペプチドを結びつけると考えられる。この場合、ペプチドに結合している抗体は、ある程度の交差反応性を持つにも関わらず、選択的であると理解される。
【００７２】
ここで用いられるように、抗体は当該分野で認められているものと同じ用語で定義され、これらは、哺乳類生体により生成され、抗原の攻撃に対して応答するマルチサブユニットタンパク質である。本発明の抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、及びこれらの抗体のフラグメントを含み、また、Ｆａｂ又はＦ（ａｂ’）２、及びＦｖを含むが、これに限定されるものではない。
【００７３】
ターゲットペプチドを得るための、抗体の生成及び／又は同定について、多くの方法が知られている。このような方法のいくつかは、Ｈａｒｌｏｗ， Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ， （１９８９） に記載されている。
【００７４】
一般に、抗体を生成するためには、単離ペプチドを免疫原として用い、例えばラット、ウサギ又はマウスのような哺乳類生体に投与される。全長タンパク質、抗原性ペプチドブラグメント又は融合タンパク質が用いられる。特に重要なフラグメントは、図２に示されるような、機能性ドメインをカバーするものであり、また、タンパク質配置方法を使用して容易に確認することができ、図に示されているようなファミリーと配列相同性又は相違性を持つドメインである。
【００７５】
抗体は、ホスホリパーゼタンパク質の領域、又は単離されたフラグメントから好適に調製される。抗体は、ここで述べられているように、ペプチドのどんな領域からでも調製することができる。しかしながら、好適な領域には、機能／活性及び／又はホスホリパーゼ結合対象相互作用に関係している領域が含まれる。図２は特に重要な領域を特定するのに用いることができ、この時、配列配置は保持されたユニークな配列フラグメントを特定するのに用いることができる。
【００７６】
抗原性フラグメントは、一般的に、少なくとも８つの憐接するアミノ酸残基から成っている。抗原性ペプチドは、少なくとも１０、１２、１４、１６以上のアミノ酸残基から成ることができる。このようなフラグメントは、例えば、タンパク質の表面上に位置する領域、例えば、親水性の領域に対応するフラグメントのような物理的な性質、あるいは配列の特異性（図２参照）に基づいて選択することができる。
【００７７】
本発明の抗体の検出は、検出可能物質と抗体とのカップリング（すなわち、物理的な結合）によって容易にすることができる。検出可能物質の例としては、例えば、種々の酵素、補欠分子族、蛍光性物質、発光性物質、生物発光性物質、及び放射性物質が含まれる。好適な酵素の例としては、セイヨウワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、βガラクトシダーゼ、又はアセチルコリンエステラーゼを含み、好適な補欠分子族の例としては、ストレプトアピジン／ビオチン、アビジン／ビオチンを含み、好適な蛍光性物質の例としては、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセイン・イソチオシアン酸塩、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロライド、又はフィコエリトリンを含み、発光性物質の例としては、ルミノールを含み、生物発光性物質の例としては、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、及びエクオリンを含み、そして、適切な放射性物質の例として、は１２５Ｉ、１３１Ｉ、３５Ｓ、又は３Ｈを含む。
【００７８】
抗体の使用
抗体は、本発明のタンパク質の１つを、アフィニティクロマトグラフィ、又は免疫沈降のような標準の技術によって単離するために用いることができる。抗体は、細胞からの自然タンパク質、及び宿主細胞に表現される組換えによって生産されたタンパク質の精製を容易にすることができる。さらに、このような抗体は組織や生体内のタンパク質の発現パターンを決定するため、細胞や組織内における本発明のタンパク質の存在の検出に、通常の開発段階を経ずに用いることができる。図１の実験データに示されるように、本発明のホスホリパーゼは、ヒトにおいては、膵臓の腺癌、肺、脳の退形成型乏突起膠腫、胎盤の絨毛癌、膵臓の腺癌、子宮内膜、結腸の腺癌、眼の網膜芽細胞腫、及び胎児の脳において発現が示されている。特に、実質的なノーザンブロット解析により、膵臓の腺癌、肺、脳の退形成型乏突起膠腫、胎盤の絨毛癌、膵臓の腺癌、子宮内膜、結腸の腺癌、及び眼の網膜芽細胞腫において発現が示されている。これに加えて、ＰＣＲを用いた組織スクリーニングパネルにより、胎児の脳に発現していることも示されている。さらに、このような抗体は、発現の量及びパターンを評価することによって、ｉｎ ｓｉｔｕ、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、細胞溶解物中、及び上澄み中でのタンパク質の検出に用いることができる。また、このような抗体は、生物学的状態の発展又は進行問における、異常な組織分布、又は異常な発現を評価するのに用いることができる。全長タンパク質の循環フラグメントにおける抗体探知は、回転率を同定するのに用いることができる。
【００７９】
さらに、抗体は、タンパク質に関連した疾患の活発な段階、又は該疾患素因を持つ個人といった、疾患の症状発現を評価するのに用いることができる。障害が不適当な組織分布、発展性の発現、タンパク質の発現レベル、又は発現／進行状態に起因する場合、抗体は通常のタンパク質に対して調製される。図１の実験データによると、ヒトにおいては、膵臓の腺癌、肺、脳の退形成型乏突起膠腫、胎盤の絨毛癌、膵臓の腺癌、子宮内膜、結腸の腺癌、眼の網膜芽細胞腫、及び胎児の脳において発現が示されている。障害がタンパク質の特定の変異により特徴づけられる場合、この変異タンパク質に特異的な抗体を、特定の変異タンパク質の存在のアッセイを行うために用いることができる。
【００８０】
抗体はまた、生体内の各種組織における、細胞の正常又は異常な細胞小器官の位置を評価するのに用いることができる。図１の実験データによると、ヒトにおいては、膵臓の腺癌、肺、脳の退形成型乏突起膠腫、胎盤の絨毛癌、膵臓の腺癌、子宮内膜、結腸の腺癌、眼の網膜芽細胞腫、及び胎児の脳において発現が示されている。診断としての使用は、遺伝子のテストだけでなく、治療法をモニターすることにも適用することができる。したがって、治療が最終的に、発現レベル、又は異常配列及び異常組織配布の存在、又は発展性の発現を修正することを目指すものである場合、タンパク質又は関連するフラグメントに直接的に対する抗体を、治療の有効性をモニターするのに用いることができる。
【００８１】
さらに、抗体はゲノム薬理学的な分析に有用である。このように、多形態のタンパク質に対して調製される抗体は、治療法の修正を必要とする個人を特定するために用いることができる。抗体は、また、電気泳動、等電点、トリプシンペプチド消化、当該分野において周知な他の物理的なアッセイによって分析される異常タンパク質の免疫学的なマーカーのような診断上のツールとしても有用である。
【００８２】
抗体はまた、組織型の分類にも有用である。図１の実験データによると、ヒトにおいては、膵臓の腺癌、肺、脳の退形成型乏突起膠腫、胎盤の絨毛癌、膵臓の腺癌、子宮内膜、結腸の腺癌、眼の網膜芽細胞腫、及び胎児の脳において発現が示されている。このように、特定のタンパク質が特定の組織中の発現と相関していた場合、このタンパク質に特異である抗体を、組織型を同定するために用いることができる。
【００８３】
抗体はまた、タンパク質機能を阻害するのに有用であり、例えば、基質のような結合相手へのホスホリパーゼペプチドの結合をブロックする。これらの使用はタンパク質の機能阻害に関連する治療法における、治療環境において適用されることができる。抗体は、例えば、結合をブロックすることにより、ペプチド活性の変調（アゴナイズ又はアンタゴナイズ）を阻害することに用いることができる。抗体は、機能のために必要な部位を含む特定のフラグメントに対して、又は細胞又は細胞膜と関係している完全タンパク質に対して調製される。図２に、本発明のタンパク質に関する構造情報を示す。
【００８４】
本発明は、生物学的サンプル中のタンパク質の存在を検出するために抗体を用いたキットを包含する。キットには、ラベル化された、又はラベル化可能な抗体と、生物学的サンブル中でタンパク質を検出するための化合物又は試薬を含み、サンプル中のタンパク質量を決定する手段；標準サンプルのタンパク質量と比較する手段；及び使用の説明、とを含む。このようなキットは、単一のタンパク質、又はエピトープを検出するために提供されるか、又は抗体検出アレイのように、多数のエピトープのうちの１つを検出するように設定されることができる。アレイとしては、核酸アレイが後述され、また抗体アレイのための同様の方法も開発されている。
【００８５】
核酸分子
本発明は、さらに本発明のホスホリパーゼペプチド又はタンパク質をコード化する核酸分子（ｃＤＮＡ、転写及びゲノム配列）を提供するものである。このような核酸分子は、本発明のホスホリパーゼペプチドの１つをコード化する核酸分子、又はこれらの対立変異体、又はこれらのオルトログ又はパラログから成る、実質的に成る、又は含んでいる。
【００８６】
ここで用いられているように、「単離された」核酸分子は、核酸の天然起源における他の核酸の存在から分離されたものである。好ましくは、「単離」核酸はその核酸の由来となる生物のゲノムＤＮＡにおいて、核酸の側面に位置する配列（すなわち、５’、及び３’末端に位置する配列）は含まない。しかしながら例えば、約５ＫＢ、４ＫＢ、３ＫＢ、２ＫＢ又は特に１ＫＢ以上、またはこれ以下、特に配列によりコード化された隣接ペプチドのように、いくつかの側面のヌクレオチド配列があるが、同一の遺伝子の配列によりコード化されたペプチドはゲノム配列中のイントロンにより分離されている。重要な点は、核酸が、ここに記載されているような特定の操作、例えば、組み換え発現、プローブやプライマーの調製、核酸配列のための他の使用等に取り扱うことができるように、遠くの重要でない側面の配列から分離されているということである。
【００８７】
さらに、例えば、転写／ｃＤＮＡ分子のような「単離」核酸分子は、他の細胞物質、組み換え技術により製造される場合には培地、また化学的に合成される場合には前駆体又は他の化学物質を、実質的に含まない。しかしながら、この核酸分子は、コード化又は調節する他の配列に融合されることができるが、これは単離されたものとして考えられる。
【００８８】
例えば、ベクターに含まれる組み換えＤＮＡ分子は、単離されたものとして考えられる。さらに、単離したＤＮＡ分子の例は、非相同的な宿主細胞、又は溶液中で精製（部分的又は実質的に）されたＤＮＡ分子中に保持される。単離されたＲＮＡ分子は、本発明の単離したＤＮＡ分子の、ｉｎ ｖｉｖｏ又はｉｎ ｖｉｔｒｏで転写されたＲＮＡを含む。本発明により単離された核酸分子としては、更に合成的に製造された分子を含む。
【００８９】
したがって、本発明は、図１又は３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１ 転写配列、及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３ ゲノム配列）において示されるヌクレオチド配列から成る核酸分子、又は図２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２）に示されるタンパク質をコード化する核酸分子を提供するものである。ヌクレオチド配列がこの核酸分子の完全なヌクレオチド配列であるとき、核酸分子はヌクレオチド配列から成る。
【００９０】
本発明はさらに、図１又は３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１ 転写配列、及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３、 ゲノム配列）において示されるヌクレオチド配列から実質的に成る核酸分子、又は図２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２）に示されるタンパク質をコード化する核酸分子を提供するものである。最終的な核酸分子において、このようなヌクレオチド配列がごくわずかの付加アミノ残基とともに存在するとき、核酸分子はヌクレオチド配列から実質的に成る。
【００９１】
本発明はさらに、図１又は３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１、転写配列、及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３、ゲノム配列）において示されるヌクレオチド配列を含む核酸分子、又は図２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２）に示されるタンパク質をコード化する核酸分子を提供するものである。核酸分子の最終的な核酸配列においての少なくとも一部がこの核酸配列である場合、核酸分子はヌクレオチド配列を含む。これによると、核酸分子は、そのヌクレオチド配列だけであるか又は付加的な核酸残基、例えば、自然に関する核酸配列、又は非相同的な核酸配列を有することもできる。このような核酸分子は、ごくわずかの付加的なヌクレオチドを有するか、又は数百又はそれ以上の付加的なヌクレオチドを含むこともできる。これらの種々のタイプの核酸分子を容易に生成／単離する方法について、以下に簡単に述べる。
【００９２】
図１及び３に、コード、及び非コードの配列の両者が示される。本発明のソースである、ヒトゲノム配列（図３）、及びｃＤＮＡ／転写配列（図１）のため、図中の核酸分子は、ゲノムイントロン配列、５’と３’の非コード配列、遺伝子調節領域、及び非コード遺伝子間配列を含む。一般に、図１と３の両方において記載されているこのような配列の特徴は、当該分野において公知の計算ツールを用いて容易に確認することができる。以下で議論されるように、いくつかの非コーディング部位、特にプロモーターのような遺伝子の調節因子は、例えば、非相同的な遺伝子発現の制御、遺伝子活性を変調する化合物同定のターゲット等の種々の目的にとって有用であり、また特に、本発明で提供されるゲノム配列のフラグメントとしてクレームされている。
【００９３】
単離した核酸分子は、成熟したタンパク質と付加的アミノ末端あるいはカルボキシ未端アミノ基、又は成熟ペプチド内のアミノ基（例えば、成熟形態が１以上のペプチド鎖を有する場合）をコード化することができる。このような配列は、前駆体から成熟した形態へのタンパク質のプロセシングにおいて、タンパク質搬送の促進、タンパク質半減期の延長あるいは短縮、又はタンパク質のアッセイ又は製造の際の操作の効率化、又は他の事象における役割を果たし得る。一般に、ｉｎ ｓｉｔｕの場合、付加アミノ酸は細胞酵素によって成熟したタンパク質へとプロセシングされる。
【００９４】
上述したように、単離した核酸分子は、単独でホスホリパーゼペプチドをコード化している配列、成熟したペプチドをコード化している配列、そして、主、又は副配列（例えば、ｐｒｅ−ｐｒｏ、ｐｒｏ−ｐｒｏｔｅｉｎ配列）のような付加的なコード配列を含むが、これに限定されるものではなく、付加的なコード配列に加えて、付加的な非コード配列、例えば、イントロンと非コード５’及び３’配列のような、転写されるものの翻訳はされずに、転写、ｍＲＮＡブロセシング（スプライシング及びポリアデニル化を含む）、リボソームの結合、及びｍＲＮＡの安定性の役割を果たすものを、含んでも含まなくても良い。加えて、核酸分子は、例えば、精製を容易にするようなコード化した配列のマーカーと融合されることもできる。
【００９５】
単離した核酸分子は、ｍＲＮＡのようなＲＮＡの形態、又はクローニング、化学合成技術又はその組み合わせによって生成するｃＤＮＡ及びゲノムＤＮＡを含む、ＤＮＡの形態をとり得る。核酸、特にＤＮＡは、二重鎖、又は単鎖であり得る。単鎖の核酸は、コード鎖（センス鎖）、又は非コード鎖（アンチセンス鎖）であり得る。
【００９６】
本発明はさらに、本発明のペプチドのフラグメントをコード化する核酸分子と同様に、上記したような本発明のホスホリパーゼタンパク質の明らかな変異体をコード化する核酸分子を提供するものである。このような核酸分子は、対立変異体（同一位置）、パラログ（異なる位置）とオルトログ（異なる生体）のように自然に発生するか、又は組み換えＤＮＡ法あるいは化学合成によって生成され得る。このような非自然に発生する変異体は、核酸分子、細胞又は生体に適用される突然変異生成技術によって生成され得る。したがって、上述したように、変異体にはヌクレオチドの置換、欠失、倒置、挿入が含まれる。変異は、コード、非コード領域のどちらか、又は両方で起こることができる。変異は、保持及び非保持アミノ酸置換の両方で生じることができる。
【００９７】
本発明はさらに、図１及び３に示される核酸分子の非コードのフラグメントを提供するものである。好適な非コードのフラグメントとしては、プロモーター配列、エンハンサ配列、遺伝子変調配列、遺伝子終結配列が含まれるが、これに限定されるものではない。このようなフラグメントは、非相同的な遺伝子発現の制御、及び遺伝子変調薬の同定を行うためのスクリーニングの開発において有用であるプロモーターは、図３のゲノム配列における５’からＡＴＧ開始部位において容易に確認される。
【００９８】
フラグメントは、１２又はそれ以上の隣接するヌクレオチド配列を含む。さらに、フラグメントは少なくとも３０、４０、５０、１００、２５０、又は５００のヌクレオチド長であり得る。フラグメントの長さは使用自的に基づく。例えばフラグメントは、ペプチドのエピトープ結果領域をコード化することができるか、又はＤＮＡプローブ及びＤＮＡプライマーとして有用である。このようなフラグメントは、オリゴヌクレオチドプローブを合成するための既知のヌクレオチド配列を用いて単離することができる。ラベル化されたプローブは、コード化領域と対応する核酸を単離するため、ｃＤＮＡライブラリ、ゲノムＤＮＡライブラリ、又はｍＲＮＡのスクリーニングに用いることができる。さらに、プライマーは、遺伝子の特定領域をクローンするためのＰＣＲ反応に用いることができる。
【００９９】
一般的なプローブプライマーは、実質的に精製されたオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドペアを含む。オリゴヌクレオチドは、一般に、少なくとも１２、２０、２５、４０、５０又はそれ以上の連続的ヌクレオチドに、ストリンジェントな柔件下でハイブリダイズされたヌクレオチド配列領域を含む。
【０１００】
オルトログ、ホモログ、及び対立変異体は、当該技術分野において周知の方法を用いて同定することができる。ペプチドの項で述べたように、これらの変異体は、ペプチドをコード化するヌクレオチド配列を含み、図面に示されるヌクレオチド配列、又はこの配列のフラグメントに対して、典型的には、６０〜７０％、７０〜８０％、８０〜９０％、より典型的には、少なくとも９０〜９５％以上の相同性を有するものである。このような核酸分子は．モディレートな条件からストリンジェントな条件の下で、図面に示されるヌクレオチド配列、又はこの配列のフラグメントに対してハイブリダイズが可能なものとして、容易に同定することができる。対立変異体は、コード化している遺伝子の遺伝子位置で、容易に決定されることができる。本発明の新規ホスホリパーゼタンパクをコードする遺伝子は、ヒト１７番染色体にマップされるゲノム構成要素上に位置しており（図３に示す）、この結果はＳＴＳ、及びＢＡＣのマップデータなどの多系統にわたる証拠により支持されている。
【０１０１】
図３は、本発明のホスホリパーゼタンパクをコードする遺伝子において見出されたＳＮＰの情報を提供している。ＳＮＰは１６カ所の異なる塩基ポジションにおいて同定された。ＯＲＦの外側とイントロン中に位置しているＳＮＰは、制御／調整領域に影響を与える可能性がある。
【０１０２】
ここで用いられるように、「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」という用語は、互いにハイブリダイズして残存する、ペプチドをコード化しているヌクレオチド配列が、互いに少なくとも６０〜７０％の相同性を有する程度にハイブリダイズ、及び洗浄が行われる条件を意味している。この条件では、ハイブリダイズして残る配列が、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、又はそれ以上となる。このようなストリンジェントな条件は、当業者においては周知であり、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｎ．Ｙ． （１９８９）， ６．３．１−６．３．６． に記載されている。ストリンジェントなハイブリダイズ条件の１つの例では、６Ｘ塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）中、約４５℃でハイブリダイズし、その後、０．２ Ｘ ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳ中、５０〜６５℃で洗浄する。モディレートな、低ストリンジェントのハイブリダイズ条件の例は、当業者において周知である。
【０１０３】
核酸分子の使用
本発明の核酸分子は、プローブ、プライマー、化学合成中間体、及び生物学アッセイにおいて有用である。核酸分子は、図２に示されているペプチドをコード化する全長ｃＤＮＡ及びゲノムクローンを単離するため、及び図２に示すペプチドと同一又は関連したペプチドを生成する変異体（対立遺伝子、オルトログ等）に対応するゲノムクローンを単離するために、メッセンジャーＲＮＡ、転写／ｃＤＮＡ、及びゲノムＤＮＡのハイブリダイゼーションプローブとして有用である。図３に示されるように、ＳＮＰは１６カ所の異なる塩基ポジションにおいて同定された。
【０１０４】
プローブは、図に示されている核酸分子の全長における、どんな配列とも対応することができる。したがって、それは５’非コード領域、コード領域、及び３’非コード領域から誘導することができる。しかしながら、すでに述べたように、フラグメントは、本発明以前に公開されたフラグメントを含まないものと見なされる。
【０１０５】
核酸分子はまた、核酸分子の何れかの領域を増幅するＰＣＲのプライマーとしても有用であり、必要な長さ及び配列のアンチセンス分子の合成においても有用である。
【０１０６】
核酸分子はまた、組み換えベクターの製造にも有用である。このようなベクターとしては、ペプチド配列の一部、又は全部を表現する発現ベクターを含む。ベクターはまた、挿入ベクターも含み、これは他の核酸分子中に統合され、例えば細胞ゲノム中で、遺伝子及び／又は遺伝子生成物のｉｎ ｓｉｔｕ発現を変化させるために用いられる。例えば、内生コード配列では、１つ以上の特異的に導入された変異を含むコード領域の一部、又は全部との相同的な組み換えを経て置換され得る。
【０１０７】
核酸分子はまた、タンパク質の抗原部分を発現することにも有用である。
【０１０８】
核酸分子はまた、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法により、核酸分子の染色体の位置を決定するためのプローブとしても有用である。本発明の新規ホスホリパーゼタンパクをコードする遺伝子は、ヒト１７番染色体にマップされるゲノム構成要素上に位置しており（図３に示す）、この結果はＳＴＳ、及びＢＡＣのマップデータなどの多系統にわたる証拠により支持されている。
【０１０９】
核酸分子はまた、本発明の核酸分子の遺伝子調整領域を含むベクターの製造にも有用である。
【０１１０】
核酸分子はまた、ここに記載される核酸分子から生成されるｍＲＮＡの、一部又は全部と対応しているリボザイムの設計にも有用である。
【０１１１】
核酸分子はまた、ペプチドの一部又は全部を表現しているベクターの製造にも有用である。
【０１１２】
核酸分子はまた、核酸分子及びペプチドの一部又は全部を表現している宿主細胞の製造にも有用である。
【０１１３】
核酸分子はまた、核酸分子及びペプチドの一部又は全部を表現している遺伝子導入動物の製造にも有用である。
【０１１４】
核酸分子はまた、核酸発現の存在、レベル、形態、分布を決定するためのハイブリダイゼーションプローブとしても有用である。図１の実験データによると、本発明のホスホリパーゼタンパクはヒトにおいては、膵臓の腺癌、肺、脳の退形成型乏突起膠腫、胎盤の絨毛癌、膵臓の腺癌、子宮内膜、結腸の腺癌、眼の網膜芽細胞腫、及び胎児の脳において発現が示されている。特に、実質的なノーザンブロット解析により、膵臓の腺癌、肺、脳の退形成型乏突起膠腫、胎盤の絨毛癌、膵臓の腺癌、子宮内膜、結腸の腺癌、及び眼の網膜芽細胞腫において発現が示されている。これに加えて、ＰＣＲを用いた組織スクリーニングパネルにより、胎児の脳に発現していることも示されている。したがって、このプローブは細胞、組織、及び臓器中での特定の核酸分子の存在、あるいは量を測定することに使用することができる。定量可能な核酸には、ＤＮＡとＲＮＡがある。したがって、ここで述べられるペプチドに対応するプローブは、与えられた細胞、組織、及び臓器における発現、及び／或いは遺伝子コピー数の評価に用いることができる。これらの使用は、正常値と比較して上昇又は低下しているホスホリパーゼタンパクの異常の診断に適当である。
【０１１５】
ｍＲＮＡを検出するｉｎ ｖｉｔｒｏの技術にはノーザンブロットハイブリダイゼーションとｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションがある。ＤＮＡを検出するｉｎ ｖｉｔｒｏの技術にはサザンブロットハイブリダイゼーションとｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションがある。
【０１１６】
プローブは、例えばｍＲＮＡやゲノムＤＮＡといったサンプル細胞中でホスホリパーゼをコードしている核酸の量を測定したり、ホスホリパーゼ遺伝子が変異しているかを確認することにより、ホスホリパーゼタンパクを発現している細胞、あるいは組織を同定する診断キットの一部として使用することができる。図１の実験データによると、本発明のホスホリパーゼタンパクはヒトにおいては、膵臓の腺癌、肺、脳の退形成型乏突起膠腫、胎盤の絨毛癌、膵臓の腺癌、子宮内膜、結腸の腺癌、眼の網膜芽細胞腫、及び胎児の脳において発現が示されている。特に、実質的なノーザンブロット解析により、膵臓の腺癌、肺、脳の退形成型乏突起膠腫、胎盤の絨毛癌、膵臓の腺癌、子宮内膜、結腸の腺癌、及び眼の網膜芽細胞腫において発現が示されている。これに加えて、ＰＣＲを用いた組織スクリーニングパネルにより、胎児の脳に発現していることも示されている。
【０１１７】
核酸発現アッセイは、ホスホリパーゼの核酸発現を変調させる化合物を同定する薬剤スクリーニングに有用である。
【０１１８】
本発明は、ホスホリパーゼ遺伝子の核酸発現、特に、細胞及び組織においてホスホリパーゼを媒介する生物学的、病理学的プロセスに関連した障害の治療に用いる化合物を同定する方法を提供するものである。図１の実験データによると、ヒトにおいては、膵臓の腺癌、肺、脳の退形成型乏突起膠腫、胎盤の絨毛癌、膵臓の腺癌、子宮内膜、結腸の腺癌、眼の網膜芽細胞腫、及び胎児の脳において発現が示されている。この方法は、典型的には、ホスホリパーゼ核酸の発現を変調する化合物の能力についてアッセイを行い、その後、不必要なホスホリパーゼ核酸発現により特徴づけられる障害を治療するのに用いることができる化合物を同定する。このアッセイは、細胞ベース及び無細胞の系において行われることができる。細胞ベースのアッセイには、自然にホスホリパーゼ核酸を表現している細胞、又は特定の核酸配列を表現するために設計された組み換え細胞を含む。
【０１１９】
ホスホリパーゼ核酸発現のアッセイは、例えばｍＲＮＡレベルのような核酸レベル、又は信号経路に関連する副次化合物の直接的なアッセイと関連している。さらに、ホスホリパーゼタンパク質信号経路における応答性を向上、又は低下させる遺伝子の発現についてもアッセイされる。この例として、これらの遺伝子の調整領域は、ルシフェラーゼのようなリポーター遺伝子に結合されることができる。
【０１２０】
したがって、ホスホリパーゼ遺伝子発現のモジュレータは、細胞と候補化合物と接触させ、ｍＲＮＡの発現を判定する方法により同定されることができる。候補化合物の存在下でのホスホリパーゼｍＲＮＡの発現レベルは、候補化合物非存在下でのホスホリパーゼｍＲＮＡの発現レベルと比較される。この比較に基づいて、候補化合物は核酸発現のモジュレータとして同定され、例えば、異常核酸発現により特徴付けられる障害の治療に用いることができる。候補化合物存在下でのｍＲＮＡの発現が、非存在下のものと比較して統計的に著しく大きい場合、候補化合物は核酸発現の促進剤として同定される。候補化合物存在下でのｍＲＮＡの発現が、非存在下のものと比較して統計的に著しく小さい場合、候補化合物は核酸発現の阻害剤として同定される。
【０１２１】
本発明はさらに、ホスホリパーゼを発現する細胞及び組織においてホスホリパーゼ核酸発現を変調する遺伝子モジュレータとしての薬剤スクリーニングを経て同定された化合物を用い、これをターゲットとして用いる治療方法を提供するものである。図１の実験データによると、本発明のホスホリパーゼタンパクはヒトにおいては、膵臓の腺癌、肺、脳の退形成型乏突起膠腫、胎盤の絨毛癌、膵臓の腺癌、子宮内膜、結腸の腺癌、眼の網膜芽細胞腫、及び胎児の脳において発現が示されている。特に、実質的なノーザンブロット解析により、膵臓の腺癌、肺、脳の退形成型乏突起膠腫、胎盤の絨毛癌、膵臓の腺癌、子宮内膜、結腸の腺癌、及び眼の網膜芽細胞腫において発現が示されている。これに加えて、ＰＣＲを用いた組織スクリーニングパネルにより、胎児の脳に発現していることも示されている。変調は、上方調整（例えば、活性化又はアゴニゼーション）、下方調整（抑制又はアンタゴニゼーション）の両者、又は核酸発現を含む。
【０１２２】
あるいは、薬剤又は小分子がタンパク質を発現している細胞又は組織中でホスホリパーゼ発現を阻害するものである限りは、ホスホリパーゼ核酸発現のモジュレータは、ここに記載されるスクリーニングアッセイを用いて同定される薬剤又は小分子であり得る。図１の実験データによると、ヒトにおいては、膵臓の腺癌、肺、脳の退形成型乏突起膠腫、胎盤の絨毛癌、膵臓の腺癌、子宮内膜、結腸の腺癌、眼の網膜芽細胞腫、及び胎児の脳において発現が示されている。
【０１２３】
核酸分子はまた、臨床試験又は治療方法において、ホスホリパーゼ遺伝子の発現及び活性に対する変調化合物の効果をモニターするのに有用である。したがって、遺伝子発現パターンは、化合物、特に患者の耐性を向上させる化合物を用いた治療における、継続的効果のバロメータとなり得る。遺伝子発現パターンは、また、化合物に対する細胞の生理的反応を示すマーカーとなり得る。したがってこのようなモニタリングにより、化合物の投与量の増加、又は患者が耐性を示さない代替化合物の投与を行うことができる。同様に、核酸発現のレベルが望ましいレベルまで低下したならば、化合物の投与をこれに比例して減少することができる。
【０１２４】
核酸分子はまた、ホスホリパーゼ核酸発現の質的変化、特に疾患に至る質的変化の診断アッセイにも有用である、核酸分子は、ｍＲＮＡのようなホスホリパーゼ遺伝子、及び遺伝子発現生成物における突然変異の検出に用いることができる。核酸分子は、ホスホリパーゼ遺伝子において自然発生した遺伝子突然変異を検出し、その変異を持つ被験者が変異により生じる障害の危険性を有しているかどうかを判定するためのハイブリダイゼーションプローブとして用いることができる。突然変異は、欠失、付加、又は遺伝子中の１以上のヌクレオチドの置換、倒置又は転移のような染色体の組み換え、異常メチル化パターンのようなゲノムＤＮＡの修飾、又は増幅のような遺伝子コピー数の変化を含む。障害に関連するホスホリパーゼ遺伝子の変異体の検出は、疾患がホスホリパーゼタンパク質の過剰発現、過小発現、変異発現の結果生じる場合に、活性又は感受性の診断ツールを提供するものである。
【０１２５】
ホスホリパーゼ遺伝子における突然変異をもたらしている個体は、種々の技術によって核酸レベルにおいて検出されることができる。図３は、本発明のホスホリパーゼタンパクをコードする遺伝子において見出されたＳＮＰの情報を提供している。ＳＮＰは１６カ所の異なる塩基ポジションにおいて同定された。ＯＲＦの外側とイントロン中に位置しているＳＮＰは、制御／調整領域に影響を与える可能性がある。本発明の新規ホスホリパーゼタンパクをコードする遺伝子は、ヒト１７番染色体にマップされるゲノム構成要素上に位置しており（図３に示す）、この結果はＳＴＳ、及びＢＡＣのマップデータなどの多系統にわたる証拠により支持されている。ゲノムＤＮＡは直接又は予めＰＣＲを用いて増幅した後で分析されることができる。ＲＮＡ又はｃＤＮＡも、同様にして用いることができる。ある使用においては、突然変異の検出は、例えば、アンカーＰＣＲ、ＲＡＣＥＰＣＲのような、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（例えばＵ．Ｓ． Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏｓ． ４，６８３，１９５ ａｎｄ ４，６８３，２０２参照）又は他のものとして、リゲーション連鎖反応（ＬＣＲ）（例えば、Ｌａｎｄｅｇｒａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４１：１０７７−１０８０ （１９８８）； ａｎｄ Ｎａｋａｚａｗａ ｅｔ ａｌ．， ＰＮＡＳ ９１：３６０−３６４ （１９９４） 参照）において、プローブ／プライマーの使用に関連し、特に後者は遺伝子中の変異位置の同定に有用である（Ａｂｒａｖａｙａ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２３：６７５−６８２ （１９９５）参照）。この方法には、患者から細胞サンプルを収集する工程と、サンプルの細胞から核酸（例えば、ゲノム、ｍＲＮＡ又はその両方）を単離する工程と、遺伝子（もし存在すれば）のハイブリダイズ及び増幅が起こりうる条件下で遺伝子に特異的にハイブリダイズさせた１以上のプライマーと、核酸とを接触させる工程と、増幅生成物の存在を検出するか、又は増幅生成物のサイズを検出し、コントロールサンプルの長さと比較する工程を含む。欠失及び挿入は、増幅生成物のサイズの変化を、正常な遺伝子型と比較することにより検出することができる。点突然変異は、増幅ＤＮＡと正常なＲＮＡ、又はアンチセンスのＤＮＡ配列とハイブリダイズすることによって確認することができる。
【０１２６】
あるいは、ホスホリパーゼ遺伝子の突然変異は、例えば、ゲル電気泳動により決定される制限酵素消化パターンの変更により、直接的に確認することができる。
【０１２７】
さらに、配列特定リボザイム（Ｕ．Ｓ． Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ． ５，４９８，５３１）は、リボザイム開裂部位の成長又は滅少により、特定の変異の存在を評点することに用いることがてきる。完全に一致する配列は、ヌクレアーゼ開裂消化分析評価、又は融点の違いによって、不一致の配列から分離することができる。
【０１２８】
特定位置での配列変化は、ＲＮａｓｅ及びＳ１保護、又は化学開裂法のようなヌクレアーゼ保護アッセイによって評価することができる。さらに、変異体ホスホリパーゼ遺伝子と野生型遺伝子との配列の相違は、直接ＤＮＡ配列解析によって決定することができる。種々の自動化された配列解析手段は、診断アッセイ（Ｎａｅｖｅ， Ｃ．Ｗ．， （１９９５） Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １９：４４８）の実行において有用であり、これらには、マススペクトルによる配列解析（例えば、ＰＣＴ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ． ＷＯ ９４／１６１０１； Ｃｏｈｅｎ ｅｔ ａｌ．， Ａｄｖ． Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ． ３６：１２７−１６２ （１９９６）； ａｎｄ Ｇｒｉｆｆｉｎ ｅｔ ａｌ．， Ａｐｐｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ３８：１４７−１５９ （１９９３） 参照）も含まれる。
【０１２９】
遺伝子中の突然変異を検出する他の技術の例としては、ＲＮＡ／ＲＮＡ、又はＲＮＡ／ＤＮＡ二重鎖から、不一致の塩基を検出するために、開裂試薬から保護する方法（Ｍｙｅｒｓ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３０：１２４２ （１９８５））； Ｃｏｔｔｏｎ ｅｔ ａｌ．， ＰＮＡＳ ８５：４３９７ （１９８８）； Ｓａｌｅｅｂａ ｅｔ ａｌ．， Ｍｅｔｈ． Ｅｎｚｙｍｏｌ． ２１７：２８６−２９５ （１９９２））、変異体と野生型の核酸の電気泳動移動度を比較する方法（Ｏｒｉｔａ ｅｔ ａｌ．， ＰＮＡＳ ８６：２７６６ （１９８９）； Ｃｏｔｔｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｍｕｔａｔ． Ｒｅｓ． ２８５：１２５−１４４ （１９９３）； ａｎｄ Ｈａｙａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅｔ． Ａｎａｌ． Ｔｅｃｈ． Ａｐｐｌ． ９：７３−７９ （１９９２））、及び変性剤の勾配を含んだポリアクリルアミドゲル中での変異体又は野生型のフラグメントの動きを、勾配ゲル電気泳動を用いてアッセイする方法（Ｍｙｅｒｓ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３１３：４９５ （１９８５））を含む。点突然変異を検出する他の技術の例としては、選択的オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション、選択的増幅、及び選択的プライマー伸長を含む。
【０１３０】
核酸分子は、治療方法としての効果を持つにも関わらず、必ずしも疾患を引き起こすわけではない遺伝子型のための、個人テストにおいても有用である。このため、核酸分子は、個人の遺伝子型と、治療に用いられる化合物に対する個人の応答との相関（薬理ゲノム相関）についての研究に用いることができる。したがって、ここに記載されている核酸分子は、治療のための適切な化合物及び投与量を選択することによって、個人のホスホリパーゼ遺伝子の変異についての評価に用いることができる。図３は、本発明のホスホリパーゼタンパクをコードする遺伝子において見出されたＳＮＰの情報を提供している。ＳＮＰは１６カ所の異なる塩基ポジションにおいて同定された。ＯＲＦの外側とイントロン中に位置しているＳＮＰは、制御／調整領域に影響を与える可能性がある。
【０１３１】
このように、治療に影響する遺伝子変異を示す核酸分子は、個人におけるテイラー治療に用いることのできる診断ターゲットを提供するものである。したがって、これらの多形性を含んだ組み換え細胞及び組み換え動物の製造は、治療化合物及び薬剤投与についての効果的な臨床設計を可能とする。
【０１３２】
核酸分子は、細胞、組織、及び生体におけるホスホリパーゼ遺伝子発現を制御するためのアンチセンス構成物として有用である。ＤＮＡアンチセンスの核酸分子は、転写に聞連する遺伝子の部位に対して相補的になるよう設計され、それ故に、ホスホリパーゼタンパク質の生産と転写が妨げられる。アンチセンスのＲＮＡ又はＤＮＡ核酸分子はｍＲＮＡへとハイブリダイズされ、これによりホスホリパーゼタンパク質中でのｍＲＮＡの翻訳がブロックされる。
【０１３３】
あるいは、アンチセンス分子は、ホスホリパーゼ核酸の発現を減少させるためのｍＲＮＡの不活性化に用いることができる。したがって、これらの分子は、異常、又は不必要なホスホリパーゼ核酸の発現により特徴づけられる障害の治療に用いることができる。この技術は、ｍＲＮＡの翻訳能力を減少させるような、ｍＲＮＡの１以上の領域に相補的なヌクレオチド配列を含んだリボザイムによる開裂に関連している。可能な領域としては、コード領域、特に、基質結合のようなホスホリパーゼタンパク質の触媒活性及び他の機能活性に対応したコード領域を含む。
【０１３４】
核酸分子はまた、ホスホリパーゼ遺伝子発現において異常な細胞を持つ患者の遺伝子治療のためのベクターを提供するものである。ｅｘ ｖｉｖｏで調製され患者に戻される細胞を含む組み換え細胞は、個人の体内に導入されて、そこで個人の治療のために必要とされるホスホリパーゼタンパク質を生産する。
【０１３５】
本発明は、生物学的サンブル中のホスホリパーゼ核酸の存在を検出するために抗体を用いたキットも包含する。図１に示される実験データによると、本発明のホスホリパーゼタンパクはヒトにおいては、膵臓の腺癌、肺、脳の退形成型乏突起膠腫、胎盤の絨毛癌、膵臓の腺癌、子宮内膜、結腸の腺癌、眼の網膜芽細胞腫、及び胎児の脳において発現が示されている。特に、実質的なノーザンブロット解析により、膵臓の腺癌、肺、脳の退形成型乏突起膠腫、胎盤の絨毛癌、膵臓の腺癌、子宮内膜、結腸の腺癌、及び眼の網膜芽細胞腫において発現が示されている。これに加えて、ＰＣＲを用いた組織スクリーニングパネルにより、胎児の脳に発現していることも示されている。例えば、キットは、ラベル化された、又はラベル化可能な核酸、又は生物学的サンプル中でホスホリパーゼ核酸を検出することのできる試薬を含み、；サンプル中のホスホリパーゼ核酸量を決定する手段；標準サンプルのホスホリパーゼ核酸量と比較する手段とを含むことができる。この化合物又は試薬は適当な容器に封入することができる。このキットは、さらにホスホリパーゼプロテインｍＲＮＡ又はＤＮＡの検出キットとして使用するための説明を含むことができる。
【０１３６】
核酸アレイ
本発明はさらに、核酸検出キットを提供するものであり、これらは、例えば、図１及び３（ＳＥＱＩＤＮＯ．１，３）に示される配列情報に基づいた核酸分子のアレイ又はマイクロアレイである。
【０１３７】
ここで用いられている、「アレイ」又は「マイクロアレイ」は、紙、ナイロン又は他の膜、フィルタ、チップ、ガラススライド、又は他の適当な固形支持体のような、基板の上で合成された別個のポリヌクレオチド、又はオリゴヌクレオチドのアレイのことである。１つの例として、マイクロアレイは、ＵＳ Ｐａｔｅｎｔ ５，８３７，８３２， Ｃｈｅｅ ｅｔ ａｌ．， ＰＣＴ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ Ｗ０９５／１１９９５ （Ｃｈｅｅ ｅｔ ａｌ．）， Ｌｏｃｋｈａｒｔ， Ｄ． Ｊ． ｅｔ ａｌ． （１９９６； Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈ． １４： １６７５−１６８０） ａｎｄ Ｓｃｈｅｎａ， Ｍ． ｅｔ ａｌ． （１９９６； Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ９３： １０６１４−１０６１９）に記載される方法にしたがって調製、使用され、これらの全ては参考としてここに折り込まれる。あるいは、このようなアレイは、Ｂｒｏｗｎ ｅｔ ａｌ．， ＵＳ Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ． ５，８０７，５２２．に記載される方法により製造される。
【０１３８】
マイクロアレイ又は検出キットは、好適には、多数の特異的な単鎖の核酸配列を構成し、通常は合成アンチセンスのオリゴヌクレオチドか、又はｃＤＮＡのフラグメントのどちらかが固体支持体上に固定される。オリゴヌクレオチドは、好適には約６〜６０のヌクレオチド長さより好適には１５〜３０のヌクレオチド長、最も好適には２０〜２５のヌクレオチド長である。あるタイプのマイクロアレイ又は検出キットのためには、７〜２０のヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドのみを使うことが好適であり得る。マイクロアレイ又は検出キットは、既知の５’又は３’配列を含んだオリゴヌクレオチド、全長配列を含んだオリゴヌクレオチド、又は配列長さの特定領域から選択された特異なオリゴヌクレオチドを含むものであり得る。マイクロアレイ又は検出キットにおいて用いられるポリヌクレオチドは、遺伝子又は対象となる遺伝子において特異的なオリゴヌクレオチドであり得る。
【０１３９】
マイクロアレイ又は検出キットにおいて、既知の配列のオリゴヌクレオチドを製造するために、対象となる遺伝子（又は、本発明により確認されたＯＲＦ）は典型的にはコンピュータアルゴリズムを用いて、核酸配列の５’から開始、又は３’で終了する。典型的なアルゴリズムでは、遺伝子に特異的な長さに規定されたオリゴマーが同定され、ハイブリダイゼーションに好適な範囲にＧＣ成分を持ち、ハイブリダイゼーションの妨害となると予測される二次構造を持たない。ある条件では、マイクロアレイ又は検出キットにおいて、オリゴヌクレオチドのペアを用いることが好適であり得る。オリゴヌクレオチドの「ペア」は、好適には、配列の中央に位置する１つのヌクレオチドを除いて、同一である。２つ目のペアのオリゴヌクレオチド（一方とは不一致）はコントロールとして用いられる。オリゴヌクレオチドペアの数は、２から１００万の間である。オリゴマーは、光誘導化学プロセスを用いて、基盤上の指定領域で合成される。基盤は、紙、ナイロン又は他の膜、フィルタ、チップ、ガラススライド、又は他の適当な固形支持体である。
【０１４０】
他方、オリゴヌクレオチドは、ＰＣＴ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ Ｗ０９５／２５１１１６ （Ｂａｌｄｅｓｃｈｗｅｉｌｅｒ ｅｔ ａｌ．）に記載されているように、化学カップリング手段、及びインクジェットアプリケーション装置を用いて基盤の表面上で合成され、これらの全ては参考としてここに折り込まれる。あるいは、「グリッドした」アレイではドット（又はスロット）ブロットとなるように、真空システム、加熱、ＵＶ、機械的又は化学的結合工程を用いて、ｃＤＮＡ、又はオリゴヌクレオチドを基板の表面上に結合させることができる。上記のようなアレイは、手工、又は利用可能な装置（スロットブロット、又はドットブロット装置）、材料（適当な固形支持体）、及び機械（ロボット装置を含む）を用いて製造され、また、８、２４、９６、３８４、１５３６、６１４４又はこれ以上、又は商業的に用いられる装置に効果的に使用される２から１００万の間の他の数のオリゴヌクレオチドを含んでもいても良い。
【０１４１】
マイクロアレイ又は検出キットを用いてサンプルの分析を行うために、生物サンプルから得られたＲＮＡ又はＤＮＡは、ハイブリダイゼーションプローブ中に調製される。ｍＲＮＡが単離され、そしてｃＤＮＡが調製され、アンチセンスのＲＮＡ（ａＲＮＡ）を調製するためのテンプレートとして用いられる。ａＲＮＡは蛍光性ヌクレオチドの存在化で増輻し、ラベル化されたプローブがマイクロアレイ又は検出キットと共に培養され、そして、プローブの配列がマイクロアレイ又は検出キット中の相補的なオリゴヌクレオチドとハイブリダイズされる。培養条件は、正碓に相補的に一致しているか、又は各種程度の相補性でハイブリダイゼーションが起こりうるように調節される。ハイブリダイズしていないプローブを除去した後、蛍光のレベルとパターンを判定するためにスキャナが用いられる。スキャンされたイメージは、マイクロアレイ又は検出キット上の、相補性の程度及び各々のオリゴヌクレオチド配列の相対的な量を決定するために試験される。生物学的サンプルは、体液（例えば血、尿、唾液、痰、胃液、その他）、培養細胞、生体組織検査、又は他の組織調製品から得られる。検出システムでは、全ての異なる配列において、ハイブリダイゼーションの存在、非存在、及び量を、同時に計測するのに用いられる。このデータは、サンプル中での、配列、発現パターン、変異、変異体、又は多形性といった、大規模な相関性の研究に用いられる。
【０１４２】
本発明は、このようなアレイを用いて、本発明のホスホリパーゼタンパク質／ペプチドの発現を同定するための方法を提供するものである。詳細には、このような方法は、テストサンプルと一つ以上の核酸分子との培養とテストサンプル中の成分と核酸分子との結合についてのアッセイとを含む。このようなアッセイは、少なくとも遺伝子の一つが本発明の遺伝子及び／又は本発明のホスホリパーゼ遺伝子の対立変異体である、多くの遺伝子を含むアレイに関連している。図３は、本発明のホスホリパーゼタンパクをコードする遺伝子において見出されたＳＮＰの情報を提供している。ＳＮＰは１６カ所の異なる塩基ポジションにおいて同定された。ＯＲＦの外側とイントロン中に位置しているＳＮＰは、制御／調整領域に影響を与える可能性がある。
【０１４３】
テストサンプルと核酸分子のインキュベーションの条件は変化する。インキュベーション条件は、使用されるアッセイの形式、使用される検出方法、及びアッセイに用いられる核酸分子のタイプ及び性質に依存する。一般的に利用可能なハイブリダイゼーション、増幅、又はアレイアッセイの形式を認識している当業者は、ここに記載されるヒトゲノムの新規フラグメントを用いるにあたって、容易に適用を行うことができる。このようなアッセイの例は、Ｃｈａｒｄ， Ｔ， Ａｎ Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ ａｎｄ Ｒｅｌａｔｅｄ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ， Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ， Ａｍｓｔｅｒｄａｍ， Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ （１９８６）； Ｂｕｌｌｏｃｋ， Ｇ．  Ｒ．  ｅｔ ａｌ．， Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｏｒｌａｎｄｏ， ＦＬ Ｖｏｌ．  １ （１ ９８２）， Ｖｏｌ．  ２ （１９８３）， Ｖｏｌ．  ３ （１９８５）； Ｔｉｊｓｓｅｎ， Ｐ．， Ｐｒａｃｔｉｃｅ ａｎｄ Ｔｈｅｏｒｙ ｏｆ Ｅｎｚｙｍｅ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ： Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ， Ａｍｓｔｅｒｄａｍ， Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ （１９８５） に記載されている。
【０１４４】
本発明のテストサンプルは、細胞、タンパク質、細胞からの膜抽出物を含む。上記の方法に用いられるテストサンプルは、アッセイの形式、検出方法の性質、及びアッセイのサンプルとして用いられる組織、細胞、又はその抽出物に基づいて変化する。核酸抽出物又は細胞抽出物の調製は、当業者において周知であり、用いられるシステムと調和するサンプルを得ることにより、容易に適用することができる。
【０１４５】
本発明の他の例としては、本発明のアッセイを行うために必要な試薬を含むキットが提供される。
【０１４６】
特に、本発明は、（ａ）ここに記載されるヒトゲノムのフラグメントと結合することのできる１以上の核酸分子を含む第一の容器、（ｂ）１以上の洗浄試薬、結合核酸を検出することのできる試薬を含む他の１以上の容器、とを含む１以上の容器に区分され、封入されたキットを提供するものである。
【０１４７】
詳細には、区分されたキットには、試薬が別々の容器に含まれているキットを含む。このような容器としては、小さいガラスの容器、プラスチック容器、帯状のブラスチック、ガラス又は紙、又は二酸化ケイ素のようなアレイ材料を含む。このような容器は、サンプルと試薬が混合して汚染しないように、１つの区分から他の区分へと試薬を効率的に移動することができ、またそれぞれの容器の試薬又は溶液は他の容器へと定量的に添加することができる。このような容器には、テストサンプルを入れる容器、核酸プローブが含まれる容器、洗浄試薬（例えば、リン酸塩緩衝液、Ｔｒｉｓ−緩衝液等）を含む容器、及び結合プローブの検出に用いられる試薬を含む容器を含む。当業者は、本発明にかかる従来未知のホスホリパーゼ遺伝子を認識し、ここに開示されている配列情報を用いて定型的に確認することができ、さらにこれを当業者において周知の確立されたキット形態、特に発現アレイに組み込んで用いることができる。
【０１４８】
ベクター／宿主細胞
本発明は、またここに記載される核酸分子を含んだベクターを提供するものである。「ベクター」という用語は、ビヒクルのことを言い、好適には核酸分子であり、核酸分子の輸送をすることができるものである。ベクターが核酸分子である場合、核酸分子はベクターの核酸と共有結合している。本発明のこの観点ではベクターはプラスミド、単鎖又は二重鎖のファージ、単鎖又は二重鎖のウイルス性ベクター、又はＢＡＣ、ＰＡＣ、ＹＡＣ、ＯＲＭＣのような人工染色体を含む。
【０１４９】
ベクターは宿主細胞中に染色体外の成分として保持され、そこで核酸分子の付加的なコピーを複製及び生成する。あるいは、ベクターは宿主細胞のゲノム中に組み込まれ、宿主細胞の複製の際に核酸分子の付加的なコピーを生成する。
【０１５０】
本発明は、核酸分子の補修のためのベクター（クローニングベクター）、又は核酸分子の発現のためのベクター（発現ベクター）を提供するものである。このベクターは、原核生物細胞又は真核生物細胞、又はその両方で機能することができる（シヤトルベクター）。
【０１５１】
発現ベクターは、ベクター中で核酸分子と結合可能なｃｉｓ作用性調節領域を含み、これにより宿主細胞中での核酸分子の転写が可能となる。この核酸分子は転写に影響を及ぼす核酸分子と分けられて、宿主細胞に導入されることができる。したがって、第二の核酸分子は、ベクターからの核酸分子の転写を行うｃｉｓ調節制御領域と相互作用するトランス作用性因子を提供するものである。あるいは、トランス作用性因子は宿主細胞により提供される。最終的に、トランス作用性因子は、ベクター自身から作り出すことができる。しかし、いくつかの例では、核酸分子の転写及び／又は翻訳は無細胞系でも起こり得る。
【０１５２】
ここに記載される核酸分子の調節配列は、目的のｍＲＮＡ転写のためのプロモーターを含んで結合されることができる。これらには、パクテリオファージλからの左部プロモーター、Ｅ．ｃｏｌｉから得られたｌａｃ、ＴＲＰ及びＴＡＣプロモーター、ＳＶ４０から得られた初期及び後期のプロモーター、ＣＭＶの極初期のプロモーター、アデノウイルスの初期及び後期のプロモーター、及びレトロウイルスのＬＴＲが含まれるが、これに限定されるものではない。
【０１５３】
転写を促進する制御領域に加えて、発現ベクターはまた、リプレッサー結合部位やエンハンサのような転写を調整する領域を含むものであり得る。この例としては、ＳＶ４０エンハンサ、サイトメガロウイルスの極初期のエンハンサ、ポリオーマエンハンサ、アデノウイルスエンハンサー、レトロウイルスＬＴＲエンハンサが含まれる。
【０１５４】
転写の開始及び制御領域を含む場合に加えて、発現ベクターはまた、転写のためのリボソーム結合部位である転写領域における、転写終了のために必要な配列を含むことができる。他の発現調整制御成分としては、ポリアデニル化信号と同様に、開始及び終止コドンが含まれる。当業者は、発現ベクターに有用な多数の調整配列を知り得る。このような調整配列は、例えば、ｉｎ Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ． ２ｎｄ． ｅｄ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， ＮＹ， （１９８９） に記載されている。
【０１５５】
各種発現ベクターは、核酸分子の発現に用いることができる。このようなベクターには、染色体、エピソーム、ウイルス由来のベクターが含まれ、これらは例えば、バクテリアプラスミド、バクテリオファージ、酵母エピソーム、人工酵母染色体のような酵母染色体成分、バキュロウイルス、ＳＶ４０のようなパボパウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、ポックスウイルス、シュードラビスウイルス、及びレトロウイルスのようなウイルス由来のベクターである。ベクターはまた、これらの起源の組み合わせから誘導することができ、例えば、コスミドとファージミドのようなプラスミドとバクテリオファージの遺伝子成分から誘導することができる。原核及び真核生物の宿主細胞のための適切なクローニングベクター及び発現ベクターは、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ． ２ｎｄ． ｅｄ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， ＮＹ， （１９８９） に記載されている。
【０１５６】
調整配列では、１以上の宿主細胞の構成としての発現（すなわち組織特異性）又は、温度、養分添加、又はホルモンや他のリガンドのような外生の要因による１以上の細胞タイプでの指示的な発現を提供するものである。原核及び真核生物の宿主細胞において構成的、及び指示的に発現する種々のベクターは、当業者において周知である。
【０１５７】
核酸分子は、周知の方法によってベクター核酸内に導入されることができる。通常、最終的に発現するＤＮＡ配列は、発現ベクターと１以上の制限酵素によりＤＮＡ配列とが開裂し、フラグメントが共に結さつすることによって、発現べクターと結合される。制限酵素の消化及び結さつの手順は、当業者において周知である。
【０１５８】
適切な核酸分子を含んでいるベクターは、公知の技術を用いて、増殖又は発現のために適切な宿主細胞内へ導入することができる。バクテリア細胞には、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ、及びＳａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍが含まれるがこれに限定されるものではない。真核生物細胞には、酵母、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａのような昆虫細胞、ＣＯＳ及びＣＨＯ細胞のような動物細胞、及び植物細胞が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【０１５９】
ここに記載されているように、融合タンパク質としてのペプチドの発現が好適である。したがって、本発明はペプチドの生産が可能な融合ベクターを提供するものである。融合ベクターは組み換えタンパク質の発現及び溶解性を向上することができ、また、例えば、アフィニティー精製のためのリガンドの作用によってタンパク質精製を促進することができる。タンパク質分解性開裂部位は、融合部分との結合位置に導入され、このために、目的となるペプチドは最終的に融合部分から分離される。タンパク質分解酵素としては、ファクターＸａ、スロンビン、エンテロホスホリパーゼを含むが、これに限定されるものではない。典型的な融合発現ベクターとしては、グルタチオンＳ転移酵素（ＧＳＴ）、マルトースＥ結合タンパク質、又はタンパク質Ａのそれぞれをターゲット組み換えタンパク質に融合した、ｐＧＥＸ （Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅ ６７：３１−４０ （１９８８））、ｐＭＡＬ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ， Ｂｅｖｅｒｌｙ， ＭＡ）、及びｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ， Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ， ＮＪ）を含むが、これに限定されるものではない。好適な指示的非融合Ｅ． ｃｏｌｉ発現ベクターの例としては、ｐＴｒｃ（Ａｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅ ６９：３０１−３１５ （１９８８））やｐＥＴ１１ｄ（Ｓｔｕｄｉｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ： Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １８５：６０−８９ （１９９０）） を含む。
【０１６０】
組み換えタンパク質の発現は、宿主細胞において、組み換えタンパク質のタンパク質分解性の開裂欠損能カを持つ遺伝子の背景を提供することによって宿主バクテリアにおいて最大化することができる （Ｇｏｔｔｅｓｍａｎ， Ｓ．， Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ： Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １８５， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ （１９９０） １１９−１２８）。あるいは、対象となる核酸分子の配列は、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉのような特定の宿主細胞のために優先的に使用されるコドンとなるように変更されることができる （Ｗａｄａ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２０：２１１１−２１１８ （１９９２））。
【０１６１】
核酸分子はまた、酵母において作用する発現ベクターにより発現されることもできる。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのような酵母中で発現するベクターの例としては、ｐＹｅｐＳｅｃ１ （Ｂａｌｄａｒｉ， ｅｔ ａｌ．， ＥＭＢＯ  Ｊ． ６：２２９−２３４ （１９８７））、ｐＭＦａ（Ｋｕｒｊａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ ３０：９３３−９４３（１９８２））、ｐＪＲＹ８８（Ｓｃｈｕｌｔｚ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅ ５４：１１３−１２３ （１９８７））、及びｐＹＥＳ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ）を含む。
【０１６２】
核酸分子はまた、例えば、バキュロウイルス発現ベクターを用いて、昆虫細胞内で表現されることもできる。培養昆虫細胞（例えば、Ｓｆ９細胞）中のタンパク質の発現に利用されるベクターは、ｐＡｃシリーズ （Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． ３：２１５６−２１６５ （１９８３））及びｐＶＬシリーズ （Ｌｕｃｋｌｏｗ ｅｔ ａｌ．， Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １７０：３１−３９ （１９８９））を含む。
【０１６３】
本発明のある実施例においては、ここに記載されている核酸分子は、哺乳類発現ベクターを用いて哺乳類の細胞内で表現される。哺乳類発現ベクターの例としては、ｐＣＤＭ８（Ｓｅｅｄ， Ｂ． Ｎａｔｕｒｅ ３２９：８４０（１９８７））やｐＭＴ２ＰＣ（Ｋａｕｆｍａｎ ｅｔ ａｌ．， ＥＭＢＯ  Ｊ． ６：１８７−１９５ （１９８７））を含む。
【０１６４】
ここに列記されている発現ベクターとしては、核酸分子を表現するために有用であり、当業者が利用可能なベクターとして周知のもののみが示されている。ここに記載されている核酸分子の維持増殖、又は発現において、好適な他のベクターは、当業者において周知である。これらは、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｊ．， Ｆｒｉｔｓｈ， Ｅ． Ｆ．， ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ， Ｔ． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ． ２ｎｄ， ｅｄ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， ＮＹ， １９８９に記載されている。
【０１６５】
ここに記載されている核酸配列がベクター中に逆方向にクローンされたベクターは、アンチセンスＲＮＡの転写を許す調節配列に結合可能であるが、本発明はまた、このようなベクターも包含するものである。このように、アンチセンス転写は、コード、非コード領域の両方が含まれている、ここに記載されている核酸分子配列の、全部又は一部を生産することができる。そして、このアンチセンスのＲＮＡの発現は、センスＲＮＡの発現（調整配列、構成的、又は指示的発現、組織特異発現）に関して、前記した各パラメータに対応する。
【０１６６】
本発明はまた、ここに記載されるベクターを含む組み換え宿主細胞に関連するものである。宿主細胞は、したがって、原核生物細胞、酵母のような低真核生物細胞、昆虫細胞のような他の真核生物細胞、及び哺乳類の細胞のような高真核生物細胞を含む。
【０１６７】
組み換え宿主細胞は、当業者が容易に利用することのできる技術により、ここに記載されるように構成されるベクターを細胞中に導入することにより、調製することができる。これらには、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥデキストラン媒介トランスフェクション、カチオン性脂質媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、トランスダクション、インフェクション、リポフェクション、及びＳａｍｂｒｏｏｋ， ｅｔ ａｌ． （Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ． ２ｎｄ， ｅｄ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， ＮＹ， １９８９） に記載されているような他の技術が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【０１６８】
宿主細胞は、１以上のベクターを含むことができる。このため、異なるヌクレオチド配列が、同じ細胞の異なるベクター中に導入されることができる。同様に、核酸分子は、単独で、又は発現ベクターのトランス作用因子を提供しているような、関連のない他の核酸分子と共に導入されることができる。１以上のベクターが細胞内に導入される場合、ベクターは単独で導入されるか、共に導入されるか、又は核酸分子ベクターに結合されることができる。
【０１６９】
バクテリオファージ及びウイルスベクターの場合、これらはインフェクション及びトランスダクションの標準的な操作により、封入又はカプセル化されたウイルスとして細胞内に導入されることができる。ウイルスベクターは、複製可能、又は複製欠陥であり得る。ウイルスの複製に欠陥がある場合、複製は欠陥を補完する機能が提供される宿主細胞内で起こり得る。
【０１７０】
ベクターは一般に、組み換えベクターの構成物を含む細胞の部分母集団の選択を可能とする選択性マーカーを含む。このマーカーは、ここに記載される核酸分子を含む同一のベクター内か、又は別のベクター中に含まれることができる。マーカーは、原核生物宿主細胞のためのテトラサイクリン又はアンピシリン−抵抗遺伝子、及び真核生物宿主細胞のためのジヒドロフォレート還元酵素又はネオマイシン耐性を含む。しかしながら、表現型特性の選択性を提供するマーカーは何れの場合にも有効である。
【０１７１】
成熟タンパク質は、適切な調整配列の制御下で、バクテリア、酵母、哺乳類の細胞、及び他の細胞で生産されることができるが、無細胞系転写及び翻訳システムもまた、ここに記載されるＤＮＡ構成物から誘導されるＲＮＡを用い、これらのタンパク質を生産するために用いることができる。
【０１７２】
ペプチドの分泌が必要とされる場合、ホスホリパーゼのようなタンパク質を含むマルチトランスメンブランドメイン内で達成されることは難しく、適切な分泌信号がベクター中に組み込まれる。信号配列は、これらのペプチドに内生であるか、又はペプチドに非相同であり得る。
【０１７３】
ペプチドが媒体内で分泌されない場合、典型的にはホスホリパーゼの場合、タンパク質は、凍結融解、超音波処理、機械的破壊、分解試薬等の標準的な破壊操作によって、宿主細胞から単離されることができる。ペプチドは、硫酸アンモニウム沈降、酸抽出、又はアニオン又はカチオン交換クロマトグラフィ、ホスホセルロースクロマトグラフィ、疎水性相互作用クロマトグラフィ、アフィニテイクロマトグラフィ、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィ、レクチンクロマトグラフィ、又は高速液体クロマトグラフィを含む、公知の精製方法によって、回収、精製されることができる。
【０１７４】
また、ここに記載されているペプチドの組み換え製造の宿主細胞に依存して、ペプチドは種々のグリコシル化パターンを持ち、細胞に依存する場合、グリコシル化されずにバクテリア内で製造され得ることが理解される。さらに、ペプチドは、ホストを媒介する過程の結果として、いくつかの場合で最初に修飾されたメチオニンを含むものであり得る。
【０１７５】
ベクター及び宿主細胞の使用
ここに記載されているペプチドを表現している組み換え宿主細胞には、種々の使用用途がある。まず、この細胞は、ホスホリパーゼタンパク質又はフラグメントを必要量生産するため、さらに精製を行うことのできるホスホリパーゼタンパク、又はペプチドの生産に有用である。このため、発現ベクターを含む宿主細胞は、ペプチドの生産に有用である。
【０１７６】
宿主細胞は、ホスホリパーゼタンパク質又はホスホリパーゼタンパク質フラグメントに関連している細胞ベースのアッセイ、例えば上記したもの、同様に当業者において周知の他の形態のものの実行において有用である。このため、天然のホスホリパーゼタンパク質を表現している組み換え宿主細胞は、ホスホリパーゼタンパク質機能を刺激又は阻害する化合物のアッセイに有用である。
【０１７７】
宿主細胞はまた、機能的な影響を受けるホスホリパーゼタンパク質変異体を同定することに有用である。変異が自然に生じ病理を引き起こすような場合、突然変異を含む宿主細胞は、天然のホスホリパーゼタンパク質の効果を示さずに、ホスホリパーゼタンパク質変異体に要求される効果（例えば、機能を刺激、又は阻害）を持つ化合物のアッセイに有用である。
【０１７８】
遺伝子的に工作された宿主細胞は、さらにヒト以外の遺伝子組み換え動物を生産するために用いることができる。遺伝子組み換え動物は、好適には哺乳類であり、例えば、１以上の細胞が組み換え遺伝子を含んだ、ラット又はマウスのような齧歯類動物である。組み換え遺伝子は、成長中の遺伝子組み換え動物の細胞のゲノムに組み込まれ、１以上の細胞型又は組織において、成熟した動物のゲノム中に残存する外生のＤＮＡである。これらの動物は、ホスホリパーゼタンパク質の機能の研究、及びホスホリパーゼタンパク質活性のモジュレータの同定及び評価に有用である。遺伝子組み換え動物の他の例としては、ヒト以外の霊長類、羊、犬、牛、ヤギ、鶏、及び両生類を含む。
【０１７９】
遺伝子組み換え動物は、例えば、マイクロインジェクション、レトロウイルス感染によって、受精卵母細胞の雄性前核細胞内に核酸分子を導入し、卵母細胞は偽妊娠性の雌性育成動物中で育成されることにより作製される。何れのホスホリパーゼタンパク質ヌクレオチド配列も、マウスのようなヒト以外の動物のゲノム中に組み換え遺伝子として導入されることができる。
【０１８０】
発現ベクターに有用な調整配列、又は他の配列は、何れも組み換え遺伝子配列の一部分を形成することができる。これには、イントロン配列及びポリアデニル化信号が、すでに含まれていない場合には含まれる。組織特異性調整配列は、特定の細胞に対しホスホリパーゼタンパク質が直接発現するために、組み換え遺伝子に結合されることができる。
【０１８１】
受胎操作及びマイクロインジェクションを通して、遺伝子組み換え動物を生産する方法、特にマウスのような動物を用いる方法は、当業界において一般化されており、例えば、Ｕ．Ｓ． Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏｓ． ４，７３６，８６６ ａｎｄ ４，８７０，００９， ｂｏｔｈ ｂｙ Ｌｅｄｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｕ．Ｓ． Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ． ４，８７３，１９１ ｂｙ Ｗａｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ． ａｎｄ ｉｎ Ｈｏｇａｎ， Ｂ．， Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏ， （Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎ．Ｙ．， １９８６） に記載されている。また、同様の方法が、他の遺伝子組み換え動物の生産のために用いられている。最初の遺伝子組み換え動物は、ゲノム中の組み換え遺伝子の存在及び／又は動物の組織や細胞内での遺伝子組み換えｍＲＮＡの発現に基づいて確認されることができる。最初の遺伝子組み換え動物は、その後、さらに組み換え遺伝子を有する動物を繋殖するために用いられることができる。その上、組み換え遺伝子を有している遺伝子組み換え動物は、さらに他の組み換え遺伝子を有する他の遺伝子組み換え動物へと生育されることができる。遺伝子組み換え動物はまた、ここに記載されている相同的な組み換え宿主細胞を用いて製造された、全ての動物又は動物の組織を含む。
【０１８２】
他の例では、ヒト以外の遺伝子組み換え動物は、組み換え遺伝子の調節された発現を行う選択システムを含むものとして生産されることができる。このようなシステムの１つの例は、バクテリオファージＰ１ｌのｃｒｅ／ｌｏｘＰリコンビナーゼシステムである。ｃｒｅ／ｌｏｘＰリコンビナーゼシステムについての記載は、例えば、Ｌａｋｓｏ ｅｔ ａｌ． ＰＮＡＳ ８９：６２３２−６２３６ （１９９２） 参照。リコンビナーゼシステムのもう一つの例は、Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＦＬＰリコンビナーゼシステムである （Ｏ’Ｇｏｒｍａｎ ｅｔ ａｌ． Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５１：１３５１−１３５５ （１９９１）。ｃｒｅ／ｌｏｘＰリコンビナーゼシステムが組み換え遺伝子の発現の調節に用いられる場合は、動物において、ｃｒｅリコンビナーゼ及び選択されたタンパク質をコード化している組み換え遺伝子が含まれていることが必要である。このような動物は、例えば、一方は選択されたタンパク質をコード化した組み換え遺伝子を持ち、他方はリコンビナーゼをコード化した組み換え遺伝子を持った２つの組み換え遺伝子動物を交配させることにより、「二重」遺伝子組み換え動物を構成することによって提供される。
【０１８３】
ここに記載されるヒト以外の遺伝子組み換え動物のクローンは、また、Ｗｉｌｍｕｔ， Ｉ． ｅｔ ａｌ． Ｎａｔｕｒｅ ３８５：８１０−８１３ （１９９７） 及び ＰＣＴ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏｓ． ＷＯ ９７／０７６６８ ａｎｄ ＷＯ ９７／０７６６９ に記載されている方法に従って生産されることができる。簡単に述べると、遺伝子組み換え動物からの細胞、例えば体細胞は単離されて、成長サイクルから出てＧ０相に入れられるように誘導することができる。静止細胞は、例えば、電気パルスの使用によって、静止細胞単離されたものと同種の動物の細胞核を取り除かれた卵母細胞に融合されることができる。再構成された卵母細胞は、桑実胚又は芽細胞に発達するよう培養され、その後、偽妊娠性の雌性育成動物中に移される。この雌性育成動物から誕生する子孫は、細胞、例えば体細胞を単離した動物のクローンとなる。
【０１８４】
ここに記載されているペプチドを表現する組み換え細胞を含んだ遺伝子組み換え動物は、ｉｎ ｖｉｖｏの環境で、ここに記載したようなアッセイを行うために有用である。したがって、生体内に存在し、基質結合、ホスホリパーゼタンパク質活性化、信号伝達に影響を与えている各種の生理学的ファクターは、ｉｎ ｖｉｔｒｏの無細胞系又は細胞ベースのアッセイでは明らかにならないかもしれない。したがって、これらは、基質相互作用、ホスホリパーゼタンパク質機能及び基質相互作用に対する特定の変異体ホスホリパーゼタンパク質の影響、及びキメラなホスホリパーゼタンパク質の影響を含むホスホリパーゼタンパク質機能を、ｉｎ ｖｉｖｏでアッセイするための、ヒト以外の遺伝子組み換え動物を提供するために有用である。また、実質的に又は完全に一つ以上のホスホリパーゼタンパク質機能を除去する突然変異である、ヌル変異の影響を評価することも可能である。
【０１８５】
本明細書において、上に記載された全ての刊行物及び特許は、ここに参考として折り込まれている。本発明に記載された方法及びシステムの各種修正及び変形は、本発明の範囲及び精神から外れない限り、当業者において明らかなものである。本発明は、特定の好適な具体例に関連して記述されているが、特許請求の範囲に記載された発明は、このような特定の実施例に不当に限定されないと理解されるべきである。実際に、本発明を実行するための上記方法の各種変形は、分子生物学又は関連した分野の当業者において明らかであり、このようなものも特許請求の範囲に含まれるものである。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】
図１には、本発明のホスホリパーゼタンパクをコードするｃＤＮＡ分子のヌクレオチド配列を示す（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１）。さらに、ＡＴＧ開始、終結、及び組織分布のような構造及び機能情報が提供され、ここではこの分子配列に基づく発明の特定用途を容易に決定することのできる構造及び機能情報を利用することができる。図１の実験データによると、ヒトにおいては、膵臓の腺癌、肺、脳の退形成型乏突起膠腫、胎盤の絨毛癌、膵臓の腺癌、子宮内膜、結腸の腺癌、眼の網膜芽細胞腫、及び胎児の脳において発現が示されている。
【図２】
図２には、本発明の３つのホスホリパーゼの予測アミノ酸配列を示す（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２）。さらに、タンパク質ファミリー、機能、変更部位のような構造及び機能情報が提供され、ここではこの分子配列に基づく発明の特定用途を容易に決定することのできる構造及び機能情報を利用することができる。
【図３】
図３には、本発明のホスホリパーゼをコード化している遺伝子のゲノム配列を示す。（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３）。さらに、イントロン／エクソン構造、プロモーター位置のような構造及び機能情報が提供され、ここではこの分子配列に基づく発明の特定用途を容易に決定することのできる構造及び機能情報を利用することができる。図３に示されるように、ＳＮＰは１６カ所の異なる塩基ポジションにおいて同定された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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