(57)【要約】本発明は、遺伝子産物が神経疾患または神経障害に対して防御効果をもたらす遺伝子を同定する。さらに本発明は、脳卒中などの神経障害に対する個体の感受性の診断法または評価法を提供する。また患者を治療する方法、およびさまざまな神経疾患または神経障害に感受性のある個体を予防的に治療する方法も提供する。また本発明は、このような疾患または障害に罹患した個体、またはリスクのある個体を治療するために投与可能な薬剤を同定するスクリーニング法について開示する。2004523216.tif 000004
【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者試料中に高レベルのＵＣＰ−２発現を検出する段階を含む、脳卒中の発生を診断する方法、または患者の脳卒中に対する感受性を評価する方法。
【請求項２】
検出が、高レベルのＵＣＰ−２転写産物を検出する段階を含む、請求項１記載の方法。
【請求項３】
検出が、ＵＣＰ−２配列の連続した少なくとも１５のヌクレオチドに相同な核酸プローブを用いて試料を調査する段階、およびプローブに結合され核酸の量を決定する段階を含む、請求項２記載の方法。
【請求項４】
検出が、高レベルのＵＣＰ−２ポリペプチドを検出する段階を含む、請求項１記載の方法。
【請求項５】
検出が、ＵＣＰ−２ポリペプチドに特異的に結合する抗体を試料に接触させて複合体を形成させることによりＵＣＰ−２ポリペプチドの存在をアッセイする段階、およびこの複合体を検出する段階を含む、請求項４記載の方法。
【請求項６】
検出がＥＬＩＳＡを行う段階を含む、請求項５記載の方法。
【請求項７】
脳卒中が虚血性脳卒中である、請求項１記載の方法。
【請求項８】
患者に由来する試験試料中のＵＣＰ−２発現レベルをベースライン値と比較する段階を含む、患者が脳卒中を有するリスクを評価する方法であって、ベースラインに対する患者試料中のＵＣＰ−２発現レベルの上昇が、患者に脳卒中のリスクがあることを示す方法。
【請求項９】
ベースライン値が、試験試料に先だって得られた患者試料中のＵＣＰ−２発現のレベルである、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
ベースライン値が、対照個体の集団におけるＵＣＰ−２発現の平均値（ａｖｅｒａｇｅまたはｍｅａｎ ｖａｌｕｅ）である、請求項８記載の方法。
【請求項１１】
ＵＣＰ−２活性を高める有効量の薬剤を被験者に投与する段階を含む、神経疾患または神経障害に罹患した被験者、またはその感受性を有する被験者を治療する方法。
【請求項１２】
神経障害が脳卒中である、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
神経障害が虚血性脳卒中である、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
神経疾患が、パーキンソン病、ハンチントン病、遺伝性運動失調、運動ニューロン疾患、アルツハイマー病、てんかん、および外傷性脳損傷からなる群より選択される、請求項１１記載の方法。
【請求項１５】
被験者が神経疾患または神経障害に感受性を有し、神経疾患または神経障害の発生前に被験者に予防量の薬剤が投与される、請求項１１記載の方法。
【請求項１６】
被験者が神経疾患または神経障害に罹患しており、被験者に治療量の薬剤が投与される、請求項１１記載の方法。
【請求項１７】
薬剤が、血液脳関門の透過性を高める第二の薬剤と組み合わせて投与される、請求項１１記載の方法。
【請求項１８】
第二の薬剤が、ブラジキニン、セロトニン、ヒスタミン、およびアラキドン酸からなる群より選択される、請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
薬剤が、抗凝固剤と組み合わせて投与される、請求項１１記載の方法。
【請求項２０】
薬剤が、薬学的に許容される担体と組み合わせられた精製ＵＣＰ−２ポリペプチドである、請求項１１記載の方法。
【請求項２１】
薬剤がＵＣＰ−２以外の薬剤である、請求項１１記載の方法。
【請求項２２】
薬剤が、ＵＣＰ−２または他の任意のＵＣＰ−２誘導性因子の合成または発現を促進する、請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
薬剤が、ＵＣＰ−２または他の任意のＵＣＰ−２誘導性因子をコードする核酸を含む、請求項２１記載の方法。
【請求項２４】
薬剤が、ＵＣＰ−２をコードする核酸を含むベクターを含む、請求項２３記載の方法。
【請求項２５】
ベクターがウイルスベクターである、請求項２４記載の方法。
【請求項２６】
ウイルスベクターがアデノウイルスベクターである、請求項２５記載の方法。
【請求項２７】
ベクターが、ＵＣＰ−２をコードする核酸に使用可能に連結されたプロモーターをさらに含み、該プロモーターが、神経細胞内でＵＣＰ−２またはＵＣＰ−２誘導性因子の発現を選択的に誘導する、請求項２６記載の方法。
【請求項２８】
神経細胞が、脳卒中の影響を受ける皮質ニューロン細胞、海馬のニューロン細胞、または他の任意の脳領域のニューロン細胞である、請求項２７記載の方法。
【請求項２９】
ウイルスベクターが髄液に導入される、請求項２５記載の方法。
【請求項３０】
ウイルスベクターが脳室内空間に導入される、請求項２５記載の方法。
【請求項３１】
ＵＣＰ−２をコードする核酸を含むベクターを有する、エクスビボで遺伝的に修飾された神経幹細胞または非神経幹細胞を作製する段階をさらに含み、投与する段階が、修飾型幹細胞を脳室内空間にまたは髄液に導入する段階を含む、請求項２４記載の方法。
【請求項３２】
ＵＣＰ−２の発現および／または活性を高める薬剤を同定する段階を含む、神経疾患または神経障害の治療に有用な薬剤のスクリーニング法。
【請求項３３】
神経障害が脳卒中である、請求項３２記載の方法。
【請求項３４】
神経疾患が、パーキンソン病、ハンチントン病、遺伝性運動失調、運動ニューロン疾患、アルツハイマー病、てんかん、および外傷性脳損傷からなる群より選択される、請求項３２記載の方法。
【請求項３５】
以下の段階を含む、請求項３２記載の方法：
（ａ）ヒト以外の哺乳類である被験対象に被験化合物を投与する段階；
（ｂ）被験対象を前処置する段階；および
（ｃ）被験対象に由来する試料中におけるＵＣＰ−２発現レベルを決定することで、被験対象におけるＵＣＰ−２発現を高める試験薬剤を同定する段階。
【請求項３６】
試験対象および対照がラットである、請求項３５記載の方法。
【請求項３７】
細胞のアポトーシスを抑制する薬剤を同定する段階を含む、神経疾患または神経障害の治療に有用な薬剤のスクリーニング法。
【請求項３８】
神経障害が脳卒中である、請求項３７記載の方法。
【請求項３９】
神経障害が虚血性脳卒中である、請求項３７記載の方法。
【請求項４０】
神経疾患が、パーキンソン病、ハンチントン病、遺伝性運動失調、運動ニューロン疾患、アルツハイマー病、てんかん、および外傷性脳損傷からなる群より選択される、請求項３７記載の方法。
【請求項４１】
薬剤が、ミトコンドリア膜電位の喪失を抑制する、請求項３７記載の方法。
【請求項４２】
薬剤が、ミトコンドリアからのシトクロムｃの放出を抑制する、請求項３７記載の方法。
【請求項４３】
薬剤が、カスパーゼ３の活性化を抑制する、請求項３７記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、完全な開示が、あらゆる目的のために全体が参照として本明細書に組み入れられる、２０００年１１月１日に出願された米国特許出願第６０／２４４，９４６号によって得られる優先権の利益を主張するものである。
【０００２】
技術分野
本発明は、神経疾患または神経障害に対する個体の感受性の診断法または評価法に関する。本発明はまた、神経疾患または神経障害に罹患した個体を治療する方法、ならびにこのような個体を治療するために投与可能な薬剤を同定する方法にも関する。
【０００３】
発明の背景
脱共役タンパク質（ＵＣＰ；サーモゲニン）は、代謝過程（特に非ふるえ熱産生）に役割を果たす、ミトコンドリア内膜内に局在するプロトン輸送タンパク質である。第一のＵＣＰ（ＵＣＰ−１）は、熱産生およびエネルギーバランスに機能する特殊な脂肪細胞である褐色脂肪組織中に局在することがわかっている。冬眠性動物、および寒冷に適応した動物は、このような組織をかなり多く貯蔵している。ＵＣＰが、動物の安静時代謝率を上昇させることで冬眠性動物および他の寒冷適応動物の体内温度を維持するように機能していることを示す証拠がある（例えばＮｉｃｏｌｌｓ、Ｄ．Ｇ．およびＬｏｃｋｅ、Ｒ．Ｍ． （１９８４） Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｒｅｖ． ６４：２〜４０；ならびにＲｏｔｈｗｅｌｌ、Ｎ．Ｊ．、およびＳｔｏｃｋ、Ｍ．Ｊ． （１９７９） Ｎａｔｕｒｅ ２８１：３１〜３５を参照）。
【０００４】
ＵＣＰは、その名前が示すように、具体的にはミトコンドリア膜を通過するプロトン流とＡＴＰ合成を脱共役することで脱共役機能を果たしている。代謝物（例えばピルビン酸および脂肪酸）のミトコンドリアにおける酸化は、ミトコンドリアマトリックスからのプロトン輸送を伴うことで、膜を介したプロトン勾配を生じる。プロトンは、タンパク質ＡＴＰ合成酵素のはたらきでミトコンドリアに再び入り、ＡＴＰ合成を誘導する。しかしＵＣＰは、ＡＴＰ合成と脱共役しているプロトン再侵入の経路となる。したがって、プロトン勾配がＡＴＰを生成を導く代わりに、ＵＣＰはプロトン勾配を熱エネルギーに変換するように作用して呼吸速度を速める。寒冷状態に曝されると、褐色脂肪組織の神経およびホルモンの刺激が誘導され、ＵＣＰを介したプロトン輸送および熱産生が上昇する（例えばＳｕｓｕｌｉｃ、Ｖ．Ｓ．、およびＬｏｗｅｌｌ、Ｂ．Ｂ． （１９９６） Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ． ａｎｄ Ｍｅｔａ． ３：４４〜５０を参照）。さまざまなトランスジェニック動物を対象とした研究により、ＵＣＰ活性の低下が肥満および糖尿病の発症と相関することが報告されている（例えばＬｏｗｅｌｌ、Ｂ．Ｂ．ら （１９９３） Ｎａｔｕｒｅ ３６６：７４０；およびＫｏｐｅｃｋｙ、Ｊ．ら、（１９９５） Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ． ９６：２９１４〜２３を参照）。
【０００５】
ヒトには褐色脂肪内で活性を示すＵＣＰ−１遺伝子があるが、このような脂肪蓄積は出生後すぐに消失する（例えばＢｏｕｉｌｌａｕｄら （１９８５） Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ８２：４４５〜４４８を参照）。それでも、ヒトおよび他の動物が食物の代謝に使用する酸素の２５％〜３０％がミトコンドリアからのプロトン漏出を補償するために用いられていることを示す測定値から、ヒトにおける他のＵＣＰの存在が示唆される。そして実際に複数のヒトＵＣＰがこれまでに同定されている。
【０００６】
このようなＵＣＰの一つは、文献ではＵＣＰ−２またはＵＣＰＨと呼ばれている。このタンパク質をコードする遺伝子は、ヒトの第１１染色体にマップされており、高インスリン血症および肥満と関連づけられている。ＵＣＰ−２は、脳、筋肉、および脂肪細胞などのさまざまな成体組織で発現されることが報告されている（例えばＦｌｅｕｒｙら、（１９９７） Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ． １５：２６９〜２７２；Ｔａｒｔａｇｌｉａら、国際公開公報第９６／０５８６１号；Ｇｉｍｅｎｏら、（１９９７） Ｄｉａｂｅｔｅｓ ４６：９００〜９０６；およびＢｏｓｓら、（１９９７） ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ ４０８：３９〜４２を参照）。ＵＣＰ−２の対立遺伝子変異体は同定されていると考えられている。一部のＵＣＰ−２タンパク質は５５位にアラニンを有する（Ｆｌｅｕｒｙ、前掲、および国際公開公報第００／０６０８７号を参照）が、他のＵＣＰ−２タンパク質はバリンを有する（国際公開公報第９６／０５８６１号を参照）。２１９位において一部のＵＣＰ−２タンパク質はスレオニンを有する（国際公開公報第９６／０５８６１号、および国際公開公報第００／０６０８７号を参照）が、他のＵＣＰ−２タンパク質はイソロイシンを有する（Ｆｌｅｕｒｙ、前掲を参照）。対立遺伝子変異体のスクリーニング法については国際公開公報第９９／４８９０５号に記載されている。
【０００７】
第三のヒトＵＣＰ （ＵＣＰ−３）も最近報告された。このＵＣＰは、ヒト骨格筋でもっぱら発現されている。この特殊なＵＣＰをコードする遺伝子は、ヒトの第１１染色体上に、ＵＣＰ−２遺伝子に隣接してマップされている。研究では、ＵＣＰ−３の発現が、レプチン、β−アドレナリン作動性物質、および甲状腺ホルモンなどの既知の熱産生性刺激によって制御される場合があることがわかっている（例えば国際公開公報第９８／４５３１３号；Ｂｏｓｓら、（１９９７） Ｌｅｔｔｅｒｓ ４０８：３９〜４２；Ｖｉｄａｌ−Ｐｕｉｇら、（１９９７） Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２７２：２４１２９〜２４１３２；Ｓｏｌａｎｅｓら、（１９９７） Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２７２：２５４３３〜２５４３６；およびＧｏｎｇら、（１９９７） Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２７２：２４１２９〜２４３１２を参照）。
【０００８】
第四のヒトＵＣＰ （ＵＣＰ−４）が同定されている。このＵＣＰは、脳、心臓、膵臓、および筋肉組織などの、いくつかの異なる組織で発現される（例えば国際公開公報第００／０４０３７号を参照）。別のヒトＵＣＰ （ＵＣＰ５／ＢＭＣＰ１）は脳内で最も豊富に発現され、ほとんどの末梢器官で低レベルで発現されている（Ｓａｎｃｈｉｓら、（１９９８） Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２７３：３６４１１、および国際公開公報第００／０３２６２４号）。
【０００９】
ＵＣＰは、代謝物の酸化と、ＡＴＰの状態で結果として生じたエネルギーの貯蔵との脱共役に役割を果たすので、ＵＣＰは主に、いくつかの重量関連疾患（例えば肥満や低体重疾患）、ならびに関連疾患（例えば糖尿病）の制御の標的とみなされてきた。しかし、ＵＣＰの他の生理学的機能、および重量関連応用以外の他のタイプの応用においてＵＣＰが使用可能な機構に関する情報は少ない。
【００１０】
発明の概要
本明細書では、さまざまな神経疾患および神経障害、特に脳卒中および虚血性脳卒中のさまざまな診断法および治療法を提供する。また薬剤をスクリーニングして、神経疾患および神経障害の治療に有用な薬剤を同定する方法も提供する。
【００１１】
具体的には、ある方法には、患者試料中にＵＣＰ−２発現レベルの上昇を検出することで、脳卒中の発生を診断する段階、または脳卒中に対する患者の感受性を評価する段階が含まれる。いくつかの方法では、検出はＵＣＰ−２転写産物レベルの上昇を検出することで達成される。他の方法には、ＵＣＰ−２ポリペプチドレベルの上昇を検出する段階が含まれる。ＵＣＰ−２ポリペプチドレベルの上昇は、ＥＬＩＳＡアッセイ法などのさまざまな免疫学的手法で検出することができる。
【００１２】
本明細書に記載されている診断法の一部には、患者の脳卒中リスクを評価する段階が含まれる。このような方法には、患者に由来する試験試料中のＵＣＰ−２発現レベルをベースライン値と比較する段階が含まれる（患者試料中のＵＣＰ−２発現レベルがベースラインに対して高い場合は、患者に脳卒中リスクがあることを意味する）。方法にはさまざまなベースライン値を使用することができる。場合によっては、ベースラインは、過去に得られた患者試料のＵＣＰ−２発現のレベルである。他の方法では、ベースライン値は、対象者集団に対する重み付けされた平均値、平均値、または他の統計値である。
【００１３】
本明細書に記載されたある治療法には、ＵＣＰ−２活性を高める有効量の薬剤を被験者に投与することで、神経疾患または神経障害に罹患した被験者、またはこれらのリスクのある被験者を治療する段階が含まれる。このような方法に適した神経疾患または神経障害には、脳卒中、パーキンソン病、ハンチントン病、遺伝性運動失調、運動ニューロン疾患、アルツハイマー病、てんかん、および外傷性脳損傷などがある。被験者が、神経疾患または神経障害に感受性がある場合は、疾患または障害が発生する前に予防量の薬剤が被験者に投与される。しかし被験者が既に神経疾患または神経障害に罹患している場合は、治療量の薬剤が被験者に投与される。ＵＣＰ−２の活性を高める薬剤は、例えば血液脳関門の透過性を高める薬剤、および／または血液凝固剤を含む他のさまざまな薬剤と同時投与することができる。ある治療法では、このような薬剤は、薬学的に許容される担体とともに投与される精製ＵＣＰ−２ポリペプチドである。
【００１４】
ある治療法には、ＵＣＰ−２の合成もしくは発現を促進する薬剤、またはＵＣＰ−２誘導性薬剤を投与する段階が含まれる。いくつかの方法では、投与される薬剤は、ＵＣＰ−２またはＵＣＰ−２誘導性薬剤をコードする核酸である。このような場合は、核酸は、ウイルスベクターまたは他の発現ベクター中に挿入される場合がある。ウイルスベクターは、神経細胞内における発現を選択的に誘導する核酸に使用可能に連結されたプロモーターを含む場合もある。このようなプロモーターは、ＵＣＰ−２のプロモーター、または異種プロモーターの場合がある。ある方法では、ウイルスベクターは髄液中に導入され；また他の方法では、ベクターは脳室内空間内に注入される。さらに他の治療法には、ＵＣＰ−２をコードする核酸を含むベクターを有する、エクスビボで遺伝的に修飾された神経幹細胞または非ニューロン幹細胞を作製する段階も含まれる。修飾型幹細胞は次に脳室内空間内、または髄液中に導入される。
【００１５】
さまざまなスクリーニング法を提供する。このような方法のあるものには、ＵＣＰ−２の発現および／または活性を高める薬剤を同定することで、神経障害（例えば脳卒中や外傷性脳損傷）、または神経疾患（例えばパーキンソン病、アルツハイマー病、もしくはてんかん）の治療に有用な薬剤をスクリーニングする段階が含まれる。いくつかのスクリーニング法には以下の段階が含まれる：（ａ）試験対象に被験化合物を投与する段階（試験対象はヒト以外の哺乳類）；（ｂ）試験対象を前処置する段階；および（ｃ）ＵＣＰ−２の発現レベルを試験対象に由来する試料中で決定して、試験対象でＵＣＰ−２発現を高める試験薬剤を同定する段階。
【００１６】
他のスクリーニング法では、細胞のアポトーシスを抑制する薬剤を同定することで、神経疾患または神経障害の治療に有用な薬剤が同定される。このような方法は、脳卒中または虚血性脳卒中を治療する際に有用な薬剤を同定するために行われることが多い。あるスクリーニングでは、ミトコンドリア膜電位の喪失を抑制する化合物が同定される。本明細書に記載された他のスクリーニングでは、ミトコンドリアの透過性小孔の開口、およびミトコンドリアからのシトクロムｃの放出を抑制する薬剤、および／またはカスパーゼの活性化を抑制する薬剤が同定される（このような事象が細胞のアポトーシスに関連するため）。
【００１７】
詳細な説明
Ｉ．定義
本明細書および添付の特許請求の範囲に記載されているように、単数形の「一つの（ａ、ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」は、文中で特に断らない限り複数の対象を含む。
【００１８】
文中で特に断らない限り、本明細書で使用されるすべての科学技術用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解される意味をもつ。以下の参考文献には、本発明で使用される多くの用語の一般的な定義が当業者に提供されている：シングルトン（Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ）ら、ＤＩＣＴＩＯＮＡＲＹ ＯＦ ＭＩＣＲＯＢＩＯＬＯＧＹ ＡＮＤ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ （第２版、１９９４年）；ＴＨＥ ＣＡＭＢＲＩＤＧＥ ＤＩＣＴＩＯＮＡＲＹ ＯＦ ＳＣＩＥＮＣＥ ＡＮＤ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ （Ｗａｌｋｅｒ編、１９８８）；ＴＨＥ ＧＬＯＳＳＡＲＹ ＯＦ ＧＥＮＥＴＩＣＳ、第５版、リーガー（Ｒ．Ｒｉｅｇｅｒ）ら（編）、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ （１９９１）；およびヘイル（Ｈａｌｅ）およびマーハム（Ｍａｒｈａｍ）、ＴＨＥ ＨＡＲＰＥＲ ＣＯＬＬＩＮＳ ＤＩＣＴＩＯＮＡＲＹ ＯＦ ＢＩＯＬＯＧＹ （１９９１）。本明細書で用いられるように、以下に示す用語は、文中で特に断らない限り、これらに帰する意味をもつ。
【００１９】
さまざまな生化学的方法、および分子生物学的方法が当技術分野で周知である。例えば核酸を単離および精製する方法は、国際公開公報第９７／１０３６５号、国際公開公報第９７／２７３１７号、Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｗｉｔｈ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｐｒｏｂｅｓ、パートＩ、Ｔｈｅｏｒｙ ａｎｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎの第３章（Ｐ．Ｔｉｊｓｓｅｎ編） Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、Ｎ．Ｙ．（１９９３）；Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｗｉｔｈ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｐｒｏｂｅｓ、パート１、Ｔｈｅｏｒｙ ａｎｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎの第３章（Ｐ．Ｔｉｊｓｓｅｎ編） Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、Ｎ．Ｙ．（１９９３）；およびサンブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ、Ｎ．Ｙ．、（１９８９）；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、（Ａｕｓｕｂｅｌ、Ｐ．Ｍ．ら編） Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （１９８７〜１９９３）に詳述されている。多数の組織試料を、当技術分野で周知の技術を用いて容易に処理することが可能であり、これには例えば、一段階ＲＮＡ単離処理（Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ、Ｐ．、米国特許第４，８４３，１５５号に記載）が含まれる。
【００２０】
核酸を増幅するさまざまな方法が知られている。適切な増幅法の例には以下のような方法があるがこれらに限定されない：（１）ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）［例えばＰＣＲ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ＤＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ （Ｈ．Ａ．Ｅｒｌｉｃｈ編） Ｆｒｅｅｍａｎ Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ、ＮＹ （１９９２）；ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ （Ｉｎｎｉｓら編） Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ （１９９０）；および米国特許第４，６８３，２０２号および４，６８３，１９５号を参照］；（２）リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）［例えばＷｕおよびＷａｌｌａｃｅ、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ４：５６０ （１９８９）、ならびにＬａｎｄｅｇｒｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４１：１０７７ （１９８８）を参照］；（３）転写増幅［例えばＫｗｏｈら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：１１７３ （１９８９）を参照］；（４）自律的配列複製［例えばＧｕａｔｅｌｌｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８７：１８７４ （１９９０）を参照］；および（５）核酸ベースの配列増幅（ＮＡＢＳＡ）［例えばＳｏｏｋｎａｎａｎ、Ｒ．およびＭａｌｅｋ、Ｌ．、ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １３：５６３〜６５ （１９９５）を参照］。
【００２１】
「核酸」、「ポリヌクレオチド」、および「オリゴヌクレオチド」という用語は、リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドを含むがこれらに限定されない、任意の長さの重合体ヌクレオチドを含むように本明細書で使用される。これらの用語には、長さを区別する意図はない。さらにこれらの用語は分子の一次構造のみを意味する。したがってある態様では、これらの用語は、三本鎖、二本鎖、および一本鎖のＤＮＡ、ならびに三本鎖、二本鎖、および一本鎖のＲＮＡを含む場合がある。これらはまた、ポリヌクレオチドのメチル化、および／またはキャップ形成などによる修飾、および未修飾状態のポリヌクレオチドも含む。具体的には、「核酸」、「ポリヌクレオチド」、および「オリゴヌクレオチド」という用語は、ポリデオキシリボヌクレオチド（２−デオキシ−Ｄ−リボースを含む）、ポリリボヌクレオチド（Ｄ−リボースを含む）、他の任意の種類のポリヌクレオチド（プリン塩基またはピリミジン塩基のＮもしくはＣグリコシド、および非ヌクレオチド主鎖、例えばポリアミドを含む他の重合体（例えばペプチド核酸（ＰＮＡ）、およびポリモルホリノ（Ａｎｔｉ−Ｖｉｒａｌｓ社、Ｃｏｒｖａｌｌｉｓ、ＯｒｅｇｏｎからＮｅｕｇｅｎｅとして市販されている）重合体、ならびに重合体が核酸塩基を塩基対合および塩基スタッキング（ＤＮＡおよびＲＮＡでみられる）を可能とする配置で含む重合体である、他の配列特異的な合成核酸重合体を含む。したがって、ある態様では、これらの用語は例えば３’−デオキシ−２’，５’−ＤＮＡ、オリゴデオキシリボヌクレオチドＮ３’Ｐ５’ホスホラミダイト、２’−Ｏ−アルキル−置換ＲＮＡ、二本鎖および一本鎖のＤＮＡ、ならびに二本鎖および一本鎖のＲＮＡ、ＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッド、およびＰＮＡとＤＮＡもしくはＲＮＡのハイブリッドを含み、また既知の種類の修飾、例えば当技術分野で知られている標識、メチル化、「キャップ」、１個もしくは複数の天然のヌクレオチドと類似体との置換、例えば無電荷結合（例えばメチルホスホン酸、リン酸トリエステル、ホスホラミダイト、カルバメートなど）によるヌクレオチド間修飾、負に帯電した結合（例えばホスホロチオエート、ホスホロジチオエート）によるヌクレオチド間修飾、および正に帯電した結合（例えばアミノアルキルホスホラミダイト、アミノアルキルホスホトリエステル）によるヌクレオチド間修飾などの修飾（例えばタンパク質（ヌクレアーゼ、毒素、抗体、シグナルペプチド、ポリ−Ｌ−リシンを含む）などの付属的な部分を含むもの）、インターカレーター（例えばアクリジン、ソラレン）による修飾（キレート剤（例えば金属、放射性金属、ホウ素、酸化金属）を含むもの、アルキル化剤を含むもの）、修飾型連結による修飾（例えばアルファアノマー核酸）、ならびにポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの非修飾型も含む。特にＤＮＡはデオキシリボ核酸である。
【００２２】
「プローブ」は、１個もしくは複数の種類の化学結合、通常は相補的な塩基対合により、通常は水素結合の形成により相補配列の標的核酸と結合して二本鎖構造を形成する能力を有する核酸である。プローブは、「プローブ結合部位」と結合、すなわちハイブリッドを形成する。検出可能な標識でプローブを標識することで、プローブの検出が、プローブが相補的な標的とハイブリッドを形成している場合に容易になる。プローブに結合させる標識は、例えば化学的または物理的な手段で検出可能な、当技術分野で周知の任意の多種多様な標識がある。プローブに結合可能な適切な標識には、放射性同位元素、フルオロフォア、発色団、マスラベル、高電子密度粒子、磁気粒子、スピンラベル、化学発光放出分子、電気化学的活性分子、酵素、補因子、および酵素基質などがあるがこれらに限定されない。プローブはさまざまな長さをとりうる。一部のプローブは比較的短い。一般にプローブは、長さが少なくとも７〜１５ヌクレオチドである。他のプローブは長さが少なくとも２０、３０、または４０ ヌクレオチドである。さらに他のプローブはいくぶん長く、長さが少なくとも５０、６０、７０、８０、９０ヌクレオチドである。さらに他のプローブはこれより長く、長さが少なくとも１００、１５０、２００、またはこれ以上のヌクレオチドである。プローブは、前述の範囲内におさまる任意の特定の長さの場合もある。
【００２３】
「プライマー」は、適切な緩衝液中で、また適切な温度の下で、適切な条件下（すなわち４種の異なるヌクレオチド三リン酸、およびＤＮＡポリメラーゼもしくはＲＮＡポリメラーゼ、または逆転写酵素などの重合化用の薬剤の存在下）におけるテンプレート依存性のＤＮＡ合成の開始点として作用可能な一本鎖のポリヌクレオチドである。プライマーの適切な長さは、プライマーの意図した用途によって変わるが、典型的には長さが少なくとも７ヌクレオチドであり、より典型的には長さが１０〜３０ヌクレオチドの範囲である。他のプライマーは、長さが３０〜５０ヌクレオチドなどと、いくぶん長くなる場合がある。短いプライマー分子は一般に、テンプレートと十分安定なハイブリッド複合体を形成する際に低い温度を必要とする。プライマーは、テンプレートの正確な配列を反映する必要はないが、テンプレートとハイブリッドを形成するだけの十分な相補性をもたなければならない。「プライマー部位」または「プライマー結合部位」という用語は、プライマーがハイブリッドを形成する標的ＤＮＡのセグメントを意味する。「プライマー対」という用語は、増幅されるＤＮＡ配列の５’端の相補物とハイブリッドを形成する５’側の「上流プライマー」、および増幅される配列の３’端とハイブリッドを形成する３’側の「下流プライマー」を含む一組のプライマーを意味する。
【００２４】
「完全に相補的な」プライマーは、プライマー長の全体に対して完全に相補的な配列を有し、ミスマッチがない。このようなプライマーは典型的には、標的配列の一部（サブ配列）に完全に相補的である。「ミスマッチ」は、プライマー中のヌクレオチドを、標的核酸中のヌクレオチドとアライメントさせたときに相補的にならない部位を意味する。プライマーを指して使用される「実質的に相補的である」という用語は、プライマーが標的配列に対して完全に相補的ではなく、むしろプライマーが、所望のプライマー結合部位における対応鎖に対して選択的にハイブリッドを形成するのに十分相補的であるだけであることを意味する。
【００２５】
「相補的である」という用語は、一つの核酸が、別の核酸分子と同一である、または選択的にハイブリッドを形成することを意味する。ハイブリダイゼーションの選択性は、特異性が全くない場合より選択性の大きなハイブリダイゼーションが起こる場合に存在する。典型的には、選択的なハイブリダイゼーションは、少なくとも１４〜２５ヌクレオチドの連続に対して少なくとも約５５％の同一性、好ましくは少なくとも６５％の同一性、より好ましくは少なくとも７５％の同一性、また最も好ましくは少なくとも９０％の同一性がある場合に起こる。好ましくは、一つの核酸は他の核酸と特異的にハイブリッドを形成する。これについてはカネシタ（Ｍ．Ｋａｎｅｈｉｓａ）、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ． １２：２０３ （１９８４）を参照されたい。
【００２６】
「使用可能に連結される」という用語は、核酸の発現制御配列（プロモーター、シグナル配列、または一連の転写因子結合部位など）と第二のポリヌクレオチドとの機能的な連結を意味する（発現制御配列は、第二のヌクレオチドの転写および／または翻訳に影響する）。
【００２７】
本明細書で用いられる「異種配列」または「異種核酸」という用語は、特定の宿主細胞にとって外来の供給源に起源を有する配列を、または同じ供給源に由来する場合であれば、元の状態から修飾された配列を意味する。したがって、原核生物の宿主細胞における異種遺伝子は、特定の宿主細胞にとっては内因性であるが修飾された遺伝子を含む。異種配列の修飾は例えば、制限酵素でＤＮＡを処理して、プロモーターに使用可能に連結させることが可能なＤＮＡ断片を生じさせることで起こる場合がある。部位特異的変異誘発などの手法も異種核酸の修飾に有用である。
【００２８】
細胞に関して使用される「組換え体」という用語は、細胞が異種核酸を複製すること、または異種核酸にコードされたペプチドもしくはタンパク質を発現することを意味する。組換え細胞は、天然（非組換え体）の状態の細胞内には見出されない遺伝子を含む場合がある。組換え細胞は、天然の状態の細胞内に見出される遺伝子を含む場合もある（遺伝子は人工的な手段で修飾されて細胞内に再導入される）。この用語は、細胞から核酸が除かれることなく修飾を受けた細胞にとって内因性の核酸を含む細胞も含む：つまり、このような修飾は、遺伝子置換、部位特異的変異、および関連手段によって得られた修飾を含む。
【００２９】
「組換え発現カセット」、または単に「発現カセット」は、このような配列に適合する宿主内において制御配列に使用可能に連結された構造遺伝子の発現に影響を及ぼすことが可能な制御配列をもつ、組換え的または合成的に作製された核酸コンストラクトである。発現カセットは少なくともプロモーター、また任意選択で転写終結シグナルを含む。典型的には、組換え発現カセットは少なくとも、転写される核酸（例えばＵＣＰ−２をコードする核酸）およびプロモーターを含む。発現に影響するのに必要な、または有用な他の因子も本明細書に記載されるように使用される場合がある。例えば、遺伝子発現に影響を及ぼす転写終結シグナル、エンハンサー、および他の核酸配列も発現カセットに含まれる場合がある。
【００３０】
「ストリンジェントな条件」という用語は、プローブまたはプライマーが標的サブ配列とハイブリッドを形成するが、他の配列とはハイブリッドを形成しない条件を意味する。ストリンジェントな条件は配列依存性であり、別の環境では異なる。より長い配列は高温で特異的にハイブリッドを形成する。一般にストリンジェントな条件は、特定のイオン強度およびｐＨにおいて、特定配列の融点（Ｔｍ）より約５℃低くなるように選択される。他の場合では、ストリンジェントな条件は、標的に対して完全な相補性、またはほぼ完全な相補性を有する配列およびプローブの融点より約２０℃または２５℃低くなるように選択される。本明細書で用いられるように、融点とは、二本鎖の核酸分子集団が半分解離して一本鎖になる温度のことである。核酸のＴｍを計算する方法は当技術分野で周知である（例えばいずれも参照として本明細書に組み入れられるＢｅｒｇｅｒおよびＫｉｍｍｅｌ （１９８７） Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、第１５２巻：Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ：Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ社、ならびにＳａｍｂｒｏｏｋら、（１９８９） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版、１〜３巻、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙを参照）。標準的な参考文献に示されているように、Ｔｍ値の単純な推定値は次の方程式で計算できる：Ｔｍ＝８１．５＋０．４１ （％Ｇ＋Ｃ）（左式で核酸は１ Ｍ ＮａＣｌ水溶液中に存在する）（例えばＡｎｄｅｒｓｏｎおよびＹｏｕｎｇ、「Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ Ｆｉｌｔｅｒ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ」、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（１９８５）を参照）。他の参考文献には、配列特性に加えて構造をＴｍの計算に加味した、より詳細な計算法が含まれる。ハイブリッドの溶解温度（したがってストリンジェントなハイブリダイゼーションの条件）は、プローブの長さおよび性質（ＤＮＡ、ＲＮＡ、塩基の組成）、および標的の性質（ＤＮＡ、ＲＮＡ、塩基の組成、溶液中に存在するか固定されているか、など）、ならびに塩および他の成分の濃度（例えば、ホルムアミド、硫酸デキストラン、ポリエチレングリコールの有無）などのさまざまな因子の影響を受ける。これらの因子の影響は周知であり、当技術分野の標準的な参考文献（例えばＳａｍｂｒｏｏｋ、前掲、およびＡｕｓｕｂｅｌ、前掲を参照）で考察されている。典型的にはストリンジェントな条件は、塩濃度が約１．０ Ｍ Ｎａイオン未満、典型的にはｐＨ ７．０〜８．３で濃度が約０．０１〜１．０ Ｍ Ｎａイオン（または他の塩）、また短いプローブまたはプライマー（例えば１０〜５０ヌクレオチド）については温度が少なくとも約３０℃、また長いプローブもしくはプライマー（例えば５０ヌクレオチドを上回る長さ）については少なくとも約６０℃である。ストリンジェントな条件は、ホルムアミドなどの不安定化する薬剤を添加することで達成することもできる。
【００３１】
遺伝子もしくは核酸の発現に関して使用される「発現」という用語は、遺伝子に含まれる情報が遺伝子産物へ変換されることを意味する。遺伝子産物は、遺伝子の直接の転写産物（例えば、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、構造ＲＮＡ、もしくは他の任意の種類のＲＮＡ）、またはｍＲＮＡの翻訳で作られるタンパク質の場合がある。遺伝子産物はまた、キャップ形成、ポリアデニル化、メチル化、および編集などの段階によって修飾されるＲＮＡ、および例えばメチル化、アセチル化、リン酸化、ユビキチン化、ＡＤＰ−リボシル化、ミリストイル化、およびグリコシル化によって修飾されるタンパク質も含む。
【００３２】
遺伝子（特にＵＣＰ−２）などの核酸の発現に関して使用される「発現が上昇する」、および「活性化」という用語は、遺伝子産物の産生を高める任意の段階を意味する。遺伝子産物は、ＲＮＡ （ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、および構造ＲＮＡを含むがこれらに限定されない）、またはタンパク質のいずれかの場合がある。したがって遺伝子の発現上昇または活性化は、遺伝子の転写、および／またはｍＲＮＡの翻訳を上昇させる過程を含む。転写を上昇させる遺伝子の発現上昇または活性化の過程の例には、転写開始複合体の形成を促進すること、転写開始速度を上昇させること、転写伸長速度を上昇させること、転写の伸長性を上昇させること、および転写抑制を（例えば転写抑制因子の結合を妨げることで）緩和することなどが含まれるがこれらに限定されない。遺伝子の発現上昇または活性化は例えば、抑制の阻害、ならびに既存のレベルを上回る発現の促進を含む場合がある。翻訳を高める遺伝子の発現上昇または活性化の過程の例には、翻訳の開始を亢進させること、翻訳における伸長を亢進させること、およびｍＲＮＡの安定性を高めることが含まれる。
【００３３】
遺伝子の活性化または発現上昇のレベルを含む遺伝子発現のレベルは、ノーザンブロット、ＲＮａｓｅプロテクションアッセイ法（ＲＰＡ）、核酸プローブアレイ、定量ＰＣＲ（例えば、いわゆるＴａｑＭａｎアッセイ法）、ドットブロットアッセイ法、およびインサイチューハイブリダイゼーションを含むがこれらに限定されない、いくつかの確立された手法で定量することができる。これらについてはさらに後述する。
【００３４】
一般に、遺伝子の発現上昇または活性化は、遺伝子産物産生の任意の検出可能な上昇、好ましくは遺伝子産物の産生の少なくとも５０〜１００％の上昇、他の状況では約２〜約５倍（またはこの間の任意の整数倍）、さらに他の状況では約５〜約１０倍（またはこの間の任意の整数倍）、ときには約１０〜約２０倍（またはこの間の任意の整数倍）、他の状況では約２０〜約５０倍（またはこの間の任意の整数倍）、さらに他の状況では約５０〜約１００倍（またはこの間の任意の整数倍）、またさらに他の状況では１００倍もしくはそれ以上の上昇を含む。発現上昇および遺伝子の活性化という用語は、ベースライン値に対して観察された活性が統計的有意差をもつこと（すなわち上昇）を意味する場合もある。
【００３５】
本明細書で用いられる「ベースライン値」は一般に、実験値もしくは決定値（例えば診断検査もしくは予後判定検査の一貫として患者試料について決定された値）に対する値（または値の範囲）が比較されることを意味する。したがってＵＣＰ−２の発現上昇の場合、ベースライン値は、同じ個体から異なる時点で得られた試料に対するＵＣＰ−２活性または発現の値の場合がある。他の場合では、ベースライン値は、対照となる細胞または個体に関して決定された値、または対照となる細胞もしくは個体の集団について決定された統計値（例えば、重み付けされた平均値または平均値）である。ＵＣＰ−２の発現上昇の特定の場合では、対照は、ＵＣＰ−２レベルが上昇されないと予測される細胞、個体、またはそれらの集団の場合がある。したがって例えば、対照となる個体、または対照となる集団は、健康な個体、特に、脳卒中に罹患していない個体、または脳卒中に感受性のない個体を含む場合がある。対照となる集団の大きさは変動する場合があり、少数であれば１個体であるが、１０、１００、１０００、１００００、またはこれ以上の個体を含む場合がある。対照が大集団の場合、ベースライン値は、各構成員に関する個々の値から決定される統計値の場合があるほか、集合体としての対照集団から決定される値（例えばウェル中の細胞集団についての測定値）の場合がある。
【００３６】
差は典型的には、観察された差が偶然生じる確率（ｐ値）が所定のレベル未満の場合に「統計的に有意である」とみなされる。本明細書で用いられる「統計的有意差」は、０．０５未満のｐ値、好ましくは０．０１未満のｐ値、また最も好ましくは０．００１未満のｐ値を意味する。典型的には、ＵＣＰ−２の発現上昇は少なくとも２０％であり、さらに他の状況では少なくとも４０％もしくは５０％であり、さらに他の状況では少なくとも７０％もしくは８０％であり、また他の状況では少なくとも９０％もしくは１００％であるが、変化はかなり大きくなる場合がある。
【００３７】
「ポリペプチド」および「タンパク質」は、本明細書では互換的に使用され、ペプチド結合で連結されたアミノ酸の分子鎖を含む。この用語は特定の長さの産物を意味しない。したがって「ペプチド」、「オリゴペプチド」、および「タンパク質」はポリペプチドの定義に含まれる。この用語は、ポリペプチドの翻訳後修飾、例えばグリコシル化、アセチル化、リン酸化などを含む。またタンパク質断片、類似体、変異型タンパク質もしくは異型タンパク質、融合タンパク質などはポリペプチドの意味に含まれる。
【００３８】
単純化するために、本明細書で用いられる「ＵＣＰ−２ポリペプチド」、「ＵＣＰ−２タンパク質」、または単に「ＵＣＰ−２」という用語は、天然のＵＣＰ−２のアミノ酸配列、ならびに起源または調製方法にかかわらず異型および修飾型を有するタンパク質を意味する。ＵＣＰ−２タンパク質は、任意の動物供給源、典型的には哺乳類供給源、最も典型的にはヒトに由来する場合がある。天然のアミノ酸配列を有するＵＣＰ−２タンパク質は、自然界から得られるＵＣＰ−２（天然ＵＣＰ−２）と同じアミノ酸配列を有するタンパク質である。天然の配列を有するＵＣＰ−２タンパク質は、自然界から単離することができるほか、標準的な組換え法、および／または合成法で調製することができる。天然の配列を有するＵＣＰ−２タンパク質は、ＵＣＰ−２の天然の切断型、もしくは可溶化型、天然の異型（例えば選択的スプライシングを受けた状態）、天然の対立遺伝子異型、および翻訳後修飾を含む形状を特異的に含む。ＵＣＰ−２の天然配列の特定の例は、配列番号：２（ゲンバンクアクセッション番号Ｕ７６３６７）に記載されたアミノ酸残基を含む完全長の天然配列のＵＣＰ−２である。これについては、参照として全体が本明細書に組み入れられるフルーリ（Ｆｌｅｕｒｙ）ら、（１９９７） Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １５：２６９〜２７２に報告されている。このタンパク質は、配列番号：１に記載された配列を有する核酸にコードされている。天然配列を有する他のＵＣＰ−２配列タンパク質は、５５位のアミノ酸残基がアラニンではなくバリンであることを除いて配列番号：２に記載された配列と同じ配列を有し（参照として本明細書に組み入れられるＴａｒｔａｇｌｉａら、国際公開公報第９６／０５８６１号を参照）、および／または２１９位のアミノ酸残基がイソロイシンではなくスレオニンであることを除いて配列番号：２に記載された同じ配列を有する（参照として本明細書に記載されるＴａｒｔａｇｌｉａ、前掲、およびＣｈｅｎら、国際公開公報第００／０６０８７号を参照）。天然配列を有するＵＣＰ−２タンパク質は、あるアミノ酸残基のグリコシル化などの翻訳後修飾を受けたタンパク質を含む。
【００３９】
ＵＣＰ−２の異型は、類似のアミノ酸配列を有し、またある程度はＵＣＰ−２活性の一つを保持する、天然配列を有するＵＣＰ−２タンパク質と機能的に同等なタンパク質を意味する。異型はまた、ＵＣＰ−２活性を保持する断片も含む。ＵＣＰ−２活性は、脱共役活性、および天然配列を有するＵＣＰ−２と特異的に結合する抗体との免疫学的交差反応性を含むがこれらに限定されない。好ましい機能的同等物はＵＣＰ−２の全活性を保持するが、このような同等なタンパク質の活性は、定量的に比較した場合に強かったり弱かったりする場合がある。典型的には、機能的同等物は、天然配列を有するＵＣＰ−２の活性の１％〜１０，０００％の間の活性を有するが、他の機能的同等物は、天然配列を有するＵＣＰ−２の１０％〜１０００％、または５０％〜５００％の活性を有する。
【００４０】
異型はまた、天然配列を有するＵＣＰ−２配列と実質的に同一なタンパク質も含む。このような異型は、欠失、挿入、および／または置換などのアミノ酸の変化を有するタンパク質を含む。「欠失」は、関連タンパク質中に１個もしくは複数のアミノ酸残基が存在しないことを意味する。「挿入」という用語は、関連タンパク質中に１個もしくは複数のアミノ酸が付加されることを意味する。「置換」は、ポリペプチド中の１個もしくは複数のアミノ酸残基が、別のアミノ酸残基と交換されることを意味する。典型的には、このような変化は、異型タンパク質の活性が天然配列を有するＵＣＰ−２と実質的に同等であるように、性質が保存的である（例えばＣｒｅｉｇｈｔｏｎ （１９８４） Ｐｒｏｔｅｉｎｓ、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙを参照）。置換の場合は、別のアミノ酸と置き換わるアミノ酸は通常、類似の構造特性および／または化学特性を有する。挿入および欠失は、典型的には１〜５アミノ酸の範囲にあるが、挿入位置によって変わり、より多くのアミノ酸が挿入されたり除去されたりする場合がある。変形形態は、部位特異的変異誘発（Ｃａｒｔｅｒら （１９８６） Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １３：４３３１；Ｚｏｌｌｅｒら、（１９８７） Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １０：６４８７）、カセット変異誘発（Ｗｅｌｌｓら、（１９８５） Ｇｅｎｅ ３４：３１５）、制限酵素選択変異誘発（Ｗｅｌｌｓら、（１９８６） Ｐｈｉｌｏｓ．Ｔｒａｎｓ．Ｒ．Ｓｏｃ．Ｌｏｎｄｏｎ ＳｅｒＡ ３１７：４１５）、およびＰＣＲ変異誘発（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、（１９８９） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）などの当技術分野で周知の方法で作製される場合がある。
【００４１】
ＵＣＰ−２遺伝子の修飾型は一般に、天然配列を有するＵＣＰ−２の１個もしくは複数のアミノ酸が非天然アミノ酸残基に変換されたタンパク質を意味する。このような修飾は、翻訳中または翻訳後に起こる場合があり、リン酸化、グリコシル化、架橋、アシル化、およびタンパク質分解による切断を含むがこれらに限定されない。
【００４２】
前述した点を考慮して、「ＵＣＰ−２の核酸」という用語は、上述のさまざまなＵＣＰ−２タンパク質についてコードする核酸を含む。ＵＣＰ−２の核酸は、コード配列に相補的な核酸（例えばＤＮＡおよびＲＮＡ）を含む。遺伝暗号が縮重していることを考えれば、ＵＣＰ−２のヌクレオチドは、上述したＵＣＰ−２タンパク質をコードするあらゆる縮重配列も含む。
【００４３】
二つまたはそれ以上の核酸もしくはポリペプチドを指して「同一である」、または「同一性」パーセントという用語は、例えば後述するアルゴリズムなどの配列比較アルゴリズム、または目視評価によって測定されるように、比較して最大の一致となるようにアライメントさせたときに同じか、または同じヌクレオチド残基もしくはアミノ酸残基の特定のパーセンテージを有する二つもしくはそれ以上の配列、もしくはサブ配列を意味する。
【００４４】
二つの核酸もしくはポリペプチドを指して「実質的に同一である」という用語は、例えば後述するアルゴリズムなどの配列比較アルゴリズム、または目視評価によって測定されるように、比較して最大の一致となるようにアライメントさせたときに、少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、９５％またはこれ以上のヌクレオチド残基もしくはアミノ酸残基の同一性を有する二つまたはそれ以上の配列もしくはサブ配列を意味する。実質的な同一性は、少なくとも長さが約４０〜６０残基の領域、好ましくは６０〜８０アミノ酸より長い領域、より好ましくは少なくとも９０〜１００残基に対し、また最も好ましくは、配列が完全長の比較対象配列（例えばヌクレオチドのコード配列など）に対して配列が実質的に同一であることが好ましい。
【００４５】
配列の比較に関しては、典型的には一つの配列が参照配列となり、これと試験配列を比較する。配列比較アルゴリズムを使用する場合は、試験配列および参照配列をコンピュータに入力し、サブ配列の座標を指定し、必要であれば配列アルゴリズムプログラムのパラメータを指定する。次に配列比較アルゴリズムが、指定されたプログラムパラメータに基づき、参照配列に対する試験配列に関して配列同一性パーセントを算出する。
【００４６】
比較目的の配列の最適アライメントは例えば、局所相同性アルゴリズム（ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ、Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ． ２：４８２ （１９８１））、相同性アライメントアルゴリズム（ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ． ４８：４４３ （１９７０））、類似性検索法（ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：２４４４ （１９８８））、これらのアルゴリズムのコンピュータ上での実行（ＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ；Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ、５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ））、または目視評価によって実施することができる［一般にＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、（Ａｕｓｕｂｅｌ、Ｐ．Ｍ．ら編） Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ社、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （１９８７〜１９９９；補遺４６（１９９９年４月）など補遺を含む）を参照］により実施される。これらのプログラムの配列比較に対する使用は、典型的には、各プログラムに特異的なデフォルトのパラメータを用いて行われる。
【００４７】
配列同一性パーセントおよび配列類似性の決定に適したアルゴリズムの別の例が、アルチュール（Ａｌｔｓｃｈｕｌ）ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ． ２１５：４０３〜４１０ （１９９０）に記載されているＢＬＡＳＴアルゴリズムである。ＢＬＡＳＴ解析を実施するためのソフトウェアは、生物工学情報センター（ＮＣＢＩ）を通して入手することができる。このアルゴリズムでは、データベース配列中の同じ長さのワードとアライメントさせたときにマッチするか、またはある程度の正の値をとる閾値スコアＴを満たす、問合わせ配列中の短いワードの長さＷの同定による高スコアリング配列ペア（ＨＳＰ）の同定段階が最初に行われる。Ｔは近傍のワードスコアの閾値を意味する（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、前掲）。初期の近傍ワードのヒットは、それを含む、より長いＨＳＰを見つけるための検索を開始するためのシードとなる。ワードのヒットを次に、累積アライメントスコアが増加する限り、各配列に沿って両方向に拡張してゆく。累積スコアは、ヌクレオチド配列、パラメータＭ （マッチング残基のペアのリワードスコア；常に＞０）およびＮ （ミスマッチ残基のペナルティスコア；常に＜０）を用いて計算する。アミノ酸配列の場合は、スコア行列を用いて累積スコアを計算する。各方向におけるワードヒットの拡張は以下の時点で終了する：累積アライメントスコアが最大達成値から量Ｘに低下した場合；一つまたは複数の負のスコアリング残基アライメントが蓄積したために累積スコアがゼロまたはそれ以下となったとき；またはいずれかの配列の末端に達したとき。核酸またはポリペプチドが本発明の範囲にあるか否かを判定する場合は、ＢＬＡＳＴプログラムのデフォルトパラメータが適している。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列用）では、デフォルトのワード長（Ｗ）として１１、期待値（Ｅ）として１０、Ｍ＝５、Ｎ＝−４を用い、双方の鎖の比較を行う。アミノ酸配列の場合は、ＢＬＡＳＴＰプログラムは、デフォルトのワード長（Ｗ）として３、期待値（Ｅ）として１０、およびＢＬＯＳＵＭ６２スコア行列を用いる。ＴＢＬＡＴＮプログラム（ヌクレオチド配列に対するタンパク質配列を用いる）では、デフォルトのワード長（Ｗ）として３、期待値（Ｅ）として１０、およびＢＬＯＳＵＭ６２スコア行列を用いる（ＨｅｎｉｋｏｆｆおよびＨｅｎｉｋｏｆｆ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：１０９１５ （１９８９）を参照）。
【００４８】
配列同一性パーセントの計算に加えて、ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、二つの配列間の類似性の統計解析も行う（例えばＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：５８７３〜５７８７ （１９９３）を参照）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムで提供される類似性の尺度の一つは、二つのヌクレオチド配列またはアミノ酸配列間でマッチングが偶然生じる確率の指標となる最小和確率（Ｐ（Ｎ））である。例えば核酸は、被験核酸と標準核酸との比較時の最小和確率が約０．１未満、より好ましくは約０．０１未満、また最も好ましくは約０．００１未満の場合に、参照配列と類似しているとみなされる。
【００４９】
二つの核酸配列が実質的に同一であることを示す別の指標が、二つの分子がストリンジェントな条件下で相互にハイブリッドを形成することである。「実質的に結合する」という用語は、プローブ核酸と標的核酸間における相補的なハイブリダイゼーションを意味し、標的ポリペプチド配列の所望の検出を達成するためにハイブリダイゼーション溶媒のストリンジェンシーを低下させた際に生じる場合がある少数のミスマッチを含む。「と特異的にハイブリッドを形成する」という用語は、特定のヌクレオチド配列がＤＮＡもしくはＲＮＡの複合混合物（例えば全細胞）中に存在する場合にストリンジェントな条件下における、特定のヌクレオチド配列との分子の結合、二本鎖形成、またはハイブリッド形成を意味する。
【００５０】
二つの核酸配列またはポリペプチドが実質的に同一であることを示す他の指標が、後述するように、第一の核酸にコードされたポリペプチドが、第二の核酸にコードされたポリペプチドと免疫学的に交差反応することである。
【００５１】
特定のポリヌクレオチド配列の「保存的に修飾された異型」は、同一のアミノ酸配列、または本質的に同一のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド、またはポリヌクレオチドがアミノ酸配列をコードしない場合は実質的に同一の配列を意味する。遺伝暗号の縮重のため、多数の機能的に同一の核酸が任意のポリペプチドをコードする。例えば、コドンＣＧＵ、ＣＧＣ、ＣＧＡ、ＣＧＧ、ＡＧＡ、およびＡＧＧはいずれもアミノ酸アルギニンをコードする。したがってアルギニンがコドンで特定されるどの位置においても、このコドンはコードされたポリペプチドを変化させることなく、記載された任意の対応コドンに変化することができる。このような核酸の異型は、「保存的に修飾された異型」の一種である「サイレント変異」である。ポリペプチドをコードする、本明細書に記載されたどのポリヌクレオチド配列も、特記する場合を除いて、可能なあらゆるサイレント変異を意味する。核酸の各コドン（通常メチオニンのみを示すコドンＡＵＧを除く）が修飾されても、標準的な手法で機能的に同一な分子を生じることがあることを当業者であれば認識すると思われる。したがって、あるポリペプチドをコードする核酸の個々の「サイレント変異」は、個々に記載された配列上明らかにならない。
【００５２】
ポリペプチドは典型的には第二のポリペプチドと、例えば二つのペプチドが保存的置換のみが異なる場合に実質的に同一である。タンパク質について言われる「保存的置換」は、タンパク質の活性を実質的に変化させないタンパク質のアミノ酸組成の変化を意味する。したがって特定のアミノ酸配列の「保存的に修飾された変異」は、タンパク質の活性に重要でないアミノ酸のアミノ酸置換、または重要なアミノ酸の置換であっても実質的に活性を変化させない、類似の特性（例えば、酸性、塩基性、正電荷性もしくは負電荷性、極性もしくは非極性など）を有する他のアミノ酸とのアミノ酸置換を意味する。機能的に似たアミノ酸についてまとめられた保存的置換の表は当技術分野で周知である。これについては例えばクレイトン（Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ）、（１９８４） Ｐｒｏｔｅｉｎｓ、Ｗ．Ｈ． Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙを参照されたい。また、コード配列内において一つのアミノ酸または少ないパーセンテージのアミノ酸を変化させたり、付加したり、欠失させたりする個々の置換、欠失、または付加も「保存的に修飾された変異」である。
【００５３】
本明細書で用いられる「抗体」という用語は、ポリクローナル調製物およびモノクローナル調製物の両方、ならびに以下から得られる抗体を含む：（ｉ）ハイブリッド（キメラ）抗体分子（例えばＷｉｎｔｅｒら、（１９９１） Ｎａｔｕｒｅ ３４９：２９３〜２９９；および米国特許第４，８１６，５６７号を参照）；（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２断片およびＦ（ａｂ）断片；（ｉｉｉ）Ｆｖ分子（非共有結合性のヘテロ二量体、例えばＩｎｂａｒら、（１９７２） Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ６９：２６５９〜２６６２；およびＥｈｒｌｉｃｈら、（１９８０） Ｂｉｏｃｈｅｍ １９：４０９１〜４０９６を参照）；（ｉｖ）一本鎖Ｆｖ分子（ｓＦｖ）（例えばＨｕｓｔｏｎら （１９８８） Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：５８７９〜５８８３を参照）；（ｖ）二量体および三量体の抗体断片コンストラクト；（ｖｉ）ヒト化抗体分子（例えばＲｉｅｃｈｍａｎｎら、（１９８８） Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３〜３２７；Ｖｅｒｈｏｅｙａｎら、（１９８８） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：１５３４〜１５３６；および１９９４年９月２１日に公表された英国特許出願第２，２７６，１６９号を参照）；（ｖｉｉ）ミニ抗体すなわちミニボディ（ｍｉｎｉｂｏｄｙ）（Ｃ末端にオリゴマー形成ドメインを含むｓＦｖポリペプチド鎖で、ヒンジ領域によりｓＦｖから分離される；例えばＰａｃｋら、（１９９２） Ｂｉｏｃｈｅｍ ３１：１５７９〜１５８４；Ｃｕｍｂｅｒら、（１９９２） Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １４９Ｂ：１２０〜１２６を参照）；および（ｖｉｉ）これらの分子から得られる任意の機能性断片（このような断片は親抗体分子の特異的結合特性を保持する）。
【００５４】
タンパク質を指して言われる「特異的に結合する」という用語、抗体を指して言われる「特異的に免疫学的に公差反応する」、または単に「特異的に免疫反応する」という用語は、異種タンパク質集団および他の生物製剤の存在下におけるタンパク質の存在の決定因子の結合反応を意味する。したがって指定条件下で、特殊なリガンドは、特定のタンパク質と優先的に結合し、試料中に存在する他のタンパク質とは有意な量では結合しない。タンパク質に特異的に結合する分子またはリガンド（例えば抗体）の結合定数は、少なくとも１０３ Ｍ−１もしくは１０４ Ｍ−１、ときには１０５ Ｍ−１もしくは１０６ Ｍ−１、他の状況では１０６ Ｍ−１もしくは１０７ Ｍ−１、好ましくは １０８ Ｍ−１〜１０９ Ｍ−１、またより好ましくは約１０１０ Ｍ−１ 〜１０１１ Ｍ−１、またはこれ以上の結合定数を有する。さまざまな免疫アッセイ法のフォーマットを用いて、特定のタンパク質と特異的に免疫反応する抗体を選択することができる。例えば固相ＥＬＩＳＡ免疫アッセイ法は、タンパク質と特異的に免疫応答するモノクローナル抗体の選択に常用されている。特異的な免疫反応性の決定に使用可能な免疫アッセイ法のフォーマットおよび条件の記述に関しては、例えばハーロウ（Ｈａｒｌｏｗ）およびレーン（Ｌａｎｅ）（１９８８）「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを参照されたい。
【００５５】
「単離された」、「精製された」、または「実質的に純粋な」という用語は、対象分子種（例えばＵＣＰ−２のタンパク質もしくは核酸）が、存在する優勢な高分子種であること（すなわち組成物に含まれる他の任意の各分子種よりモルベースで量が多いこと）、また好ましくは対象分子種が、存在する全高分子種の少なくとも約５０％（モルベース）を含むことを意味する。一般には、単離された、精製された、または実質的に純粋なＵＣＰ−２のタンパク質もしくは核酸は、組成物中に存在する全高分子種の８０〜９０％を上回る量を含む。最も好ましくは、対象分子種は、本質的に均一となるまで（すなわち、従来の検出法で混入分子種が組成物中に検出されなくなるまで）精製される（組成物は本質的に１種の高分子種を含む）。
【００５６】
対象に対して適用される「天然」という用語は、対象が自然界に見出されうることを意味する。
【００５７】
「神経疾患」、「神経学的障害」、または「神経障害」という用語は一般に、ニューロン細胞に対するいくつかの種類の障害、またはニューロンの細胞死に関連した疾患を意味する。このような疾患の特定の例には、脳卒中、虚血性脳卒中、パーキンソン病、ハンチントン病、遺伝性運動失調、運動ニューロン疾患、アルツハイマー病、てんかん、および外傷性脳損傷などが含まれるがこれらに限定されない。
【００５８】
「アポトーシス」という用語は当技術分野で一般的な意味をもち、細胞がプログラム細胞死の過程を受ける過程を意味する。カスパーゼ３の活性化はアポトーシスのマーカーとなる。カスパーゼ３の活性の上昇を含むアポトーシスは、さまざまな神経疾患もしくは神経障害、例えば脳卒中（Ｒｏｓｅｎｂｌｕｍ、Ｓｔｒｏｋｅ、３０：１１５４〜６；１９９９；ＭａｃＭａｎｕｓら、Ｊ Ｎｅｕｒｏｔｒａｕｍａ、１７：８９９〜９１４、２０００；およびＧｕｇｌｉｅｉｍｏら、Ｎｅｕｒｏｌ Ｒｅｓ、２０：２８３〜９６、１９９８）、外傷性脳損傷（Ｒａｇｈｕｐａｔｈｉら、Ｊ Ｎｅｕｒｏｔｒａｕｍａ、１７：９２７〜３８、２０００）、てんかん（Ｔｉｍｓｉｔら、Ｅｕｒ Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、１１：２６３〜７８、１９９９；およびＰｉｔｋＡｎｅｎら、Ａｃｔａ Ｎｅｕｒｏｌ Ｓｃａｎｄ Ｓｕｐｐｌ、１６２：２２〜３、１９９５）、パーキンソン病（Ｚｉｖら、Ｍｏｖ Ｄｉｓｏｒｄ、１３：８６５〜７０、１９９８；およびＴａｔｔｏｎ、Ｅｘｐ Ｎｅｕｒｏｌ、１６６：２９〜４３、２０００）、ならびにアルツハイマー病（Ｈｕｇｏｎら、Ｊ Ｎｅｕｒａｌ Ｔｒａｎｓｍ Ｓｕｐｐｌ、５９：１２５〜３１、２０００；およびＭａｓｕｍｕｒａら、Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ Ｍｏｌ Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ、８０：２１９〜２７、２０００）に関連づけられている。
【００５９】
本明細書で用いられる「脳卒中」という用語は、当技術分野で通常受け入れられている意味をもつ。この用語は、原因にかかわらず血流異常が関連する神経学的異常の発生を広く意味する場合がある。考えられる原因には、血栓症、出血、および塞栓症などが含まれるがこれらに限定されない。「虚血性脳卒中」という用語は、具体的には、程度が限定され、また血流閉塞によって生じる脳卒中の一種を意味する。
【００６０】
「組織」は、特定の機能を果たすために集まった類似の細胞の集合体を意味する。組織は、生物体の一部、生物体から切除された切片の場合があるほか、人工物の場合がある。人工組織は、細胞の集合体が成長して、生物体の組織に似た機能を果たす組織である。しかし、集合状態の細胞は宿主（生物体）からは得られない。人工組織は、インビボまたはインビトロで成長させることができる。
【００６１】
「検出可能に標識された」という用語は、薬剤（例えばプローブ）に、物理的、化学的、電磁気的、および他の関連する分析手法で検出可能な標識が結合された状態を意味する。使用可能な検出可能な標識の例には、放射性同位元素、フルオロフォア、発色団、マスラベル、高電子密度粒子、磁気粒子、スピンラベル、化学ルミネセンス放出分子、電気化学的活性分子、酵素、補因子、および酵素基質などがあるがこれらに限定されない。
【００６２】
ＩＩ．概要
神経学的障害に罹患した者、神経学的障害のリスクがある者、または神経疾患に罹患した者のさまざまな診断法および治療法について説明する。このような者の治療に有効な化合物を同定するための高スループットのスクリーニング法についても、組成物が、このようなスクリーニング法で同定された化合物を含むことから提供する。このような方法および組成物は、脳卒中、具体的には虚血性脳卒中を含む、さまざまな神経疾患に有用である。このような方法は部分的には、ＵＣＰ−２が、ラットの虚血前処置モデルで異なって発現される（発現が上昇する）ことで、ＵＣＰ−２がさまざまな神経疾患、具体的には脳卒中に対する防御効果を発揮することを示す、という知見に基づく。
【００６３】
ある方法は、ＵＣＰ−２が、アポトーシスカスケードのある成分を抑制することを示す証拠にも基づく（例えば実施例４を参照）。具体的には、この証拠は、ＵＣＰ−２が、ミトコンドリアのＣａ２＋蓄積作用、およびこれに続くミトコンドリア透過性の変化に干渉する可能性があることを示す（例えば実施例４を参照）。ミトコンドリアのＣａ２＋緩衝能力は大きく、またさまざまな毒性刺激を受けている間にミトコンドリアは大量のＣａ２＋を蓄積する。しかし、ミトコンドリア内の過剰なＣａ２＋の蓄積は、ミトコンドリアのＡＴＰ産生に干渉し、透過性小孔（ＰＴＰ）を開口させる。ＰＴＰは電位感受性のタンパク質性小孔であり、１，５００ダルトン未満の溶質を通過させて膜内外を平衡化することができる（Ｄ．Ｇ．ＮｉｃｈｏｌｌｓおよびＳ．Ｌ．Ｂｕｄｄ （２０００） Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ８０：３１５〜３６１を参照）。この小孔が開くとミトコンドリア膜電位が消失してミトコンドリアが膨化する。ミトコンドリアの膨化は、シトクロムｃの細胞質中への放出を誘導し、シトクロムｃはそこでアポトーシスのメディエーターと相互作用する。小孔形成は、特にマトリックスのｐＨを低下させることで抑制することができる。ＵＣＰ−２は、プロトンをミトコンドリアマトリックス中へ漏出するミトコンドリアにおけるプロトン輸送体である。したがって、特定の理論に拘束されるわけではないが、ＵＣＰ−２の活性化は、マトリックスのｐＨの低下、およびこれに続くＰＴＰ開口の防止に至る可能性がある。
【００６４】
ＵＣＰ−２発現の上昇が、神経学的障害に応じてみられることを考えると、診断法および予後判定法には一般に、脳卒中の発生を検出する段階、または患者から得られた試料中にＵＣＰ−２の発現もしくは活性の上昇を検出することがで脳卒中に対する個体の感受性を評価する段階が含まれる。ＵＣＰ−２により防御効果がもたらされるので、脳卒中などの神経疾患に罹患した者、またはリスクのある者に対する治療法および予防的治療法にはいずれも、ＵＣＰ−２活性を高める治療量もしくは予防量の薬剤のいずれかを投与する段階が含まれる。ＵＣＰ−２活性を高めるように作用する薬剤は、精製されたＵＣＰ−２の状態、ＵＣＰ−２の発現もしくは合成を促進する薬剤、もしくはＵＣＰ−２をコードするセグメントを含む核酸、またはＵＣＰ−２活性および機能の活性化因子（薬理学的作動物質もしくは部分的作動物質を含むがこれらに限定されない）として作用する任意の薬剤の場合がありうる。ＵＣＰ−２が、ミトコンドリア透過性の変化、およびシトクロムｃ放出の潜在的な調節因子として、ならびにカスパーゼ３活性化の阻害因子として果たす役割を考えれば、このような薬剤は、ＰＴＰ、シトクロムｃ放出、およびカスパーゼ−３活性化に及ぼす作用に似たものをもつ可能性もある。
【００６５】
スクリーニング法には一般に、さまざまな種類のアッセイ法を実施して、ＵＣＰ−２の発現または活性を高める薬剤を同定する段階が含まれる。このようなスクリーニング法では、最初にスクリーニングを行って、ＵＣＰ−２に結合可能な化合物を同定することができる。あるアッセイ法は、異なる薬剤がＵＣＰ−２の活性または発現のレベルに及ぼす作用を、より明瞭に測定するように設計されている。他のスクリーニング法は、ミトコンドリア透過性の変化に影響し、またＵＣＰ−２のようにカスパーゼ３の活性化を抑制する化合物を同定するように設計されている。このスクリーニング中に同定されたリード化合物は、より活性の高い類似体の合成基剤となりうる。リード化合物、および／またはリード化合物から作られる活性類似体は、脳卒中などの神経疾患の治療に有効な薬学的組成物中に製剤化することができる。
【００６６】
ＩＩＩ．ＵＣＰ−２の差次的発現
哺乳類の脳が、低酸素および虚血状態（酸素および血液供給の欠乏）で長期間生存する能力には限界がある。低酸素虚血状態に曝されると、ニューロンは、細胞死の迅速な機構または緩慢な機構（ネクローシスもしくはアポトーシス）で死滅する。脳卒中、新生児仮死、心不全（脳への血液供給の長期欠乏）、または溺水などの低酸素虚血による脳障害は、重度の永久的な脳損傷を引き起す場合がある。
【００６７】
一方、致死時間に満たない短期間の低酸素虚血は、続く障害および細胞死からニューロンが防御されるという、脳内における過渡的な相に至る場合がある。このような処置は一般に、虚血耐性、または虚血前処置と呼ばれ、内因性の防御機構、およびこのような作用をもたらす内因性のタンパク質および因子による経路の理解の基礎となり、また理解に至る場合がある。したがって本明細書で用いられる虚血前処置は、内因性の神経防御機構を惹起する、短時間の一過性の非破壊性の脳卒中を意味する。
【００６８】
脳卒中は、脳の特定領域への血流を妨げた後に、閉鎖を解放して血流を脳領域に戻す（再潅流）、一部の大脳動脈の閉鎖により、ラットなどの動物でモデル化することができる。このような局所虚血モデルは全汎的虚血モデルとは異なる。後者では、脳全体に至る血流が、ある程度の時間ブロックされてから再潅流される。脳のある領域は、この種の全汎的虚血障害に特に感受性が高い。海馬、具体的には海馬のＣＡ１領域は、全汎的虚血に大きな影響を受ける。１０分間の全汎的虚血により、海馬のＣＡ１領域に重篤な選択的なニューロンの喪失が誘導され、これには海馬のＣＡ３領域および歯状回における検出不能な神経損傷が伴う。全汎的虚血の期間を長くすることで、遅延型細胞死を線条体および大脳皮質の第２層および第５層でも検出することができる（Ｌｉｐｔｏｎ、（１９９９） Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｒｅｖ． ７９：１４３１〜１５６８）。これとは対照的に局所虚血では、直接損傷を被る正確な領域は、閉塞の位置、および再潅流までの虚血期間により決定される。局所虚血の動物モデルでは、ヒトにみられる状況と同じように、病変の梗塞中心部から最外側境界に至る虚血の段階的変化がみられるので、患部内の代謝条件に差が存在する。このような期間および不均一性の存在により、障害は複雑となる。
【００６９】
ラットでは、１０分間の全汎的虚血（血圧低下を伴う二血管閉鎖モデル、Ｌｉｐｔｏｎ、（１９９９） Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｒｅｖ． ７９：１４３１〜１５６８）は、海馬のＣＡ１ニューロンの完全破壊を十分誘導する。しかし３分間の虚血イベント、および数時間の回復期間は、１０分間の虚血障害による損傷を効率的に低下させる。このような神経防御作用は、新規タンパク質合成に依存する。したがって、虚血前処置モデルで特異的に発現が上昇される遺伝子は、直接もしくは間接的に神経防御作用をもたらす可能性があり、一方で長時間の虚血は、神経障害特性を有する他の遺伝子を誘導する可能性がある。虚血前処置および全汎的虚血のラットモデルはいずれも極めて妥当である。というのは、これが溺水、心臓バイパス手術、および心停止時にヒトの脳で生じる虚血／再潅流を再現できるからである。
【００７０】
実施例１に詳述するように、このような防御的な低酸素虚血処置により海馬で誘導されるいくつかの遺伝子はラットモデル系で同定されている。これらの遺伝子群は、前処置ラット脳と正常ラット脳間で差次的クローニングを行い、差次的に発現された遺伝子の配列を決定することで同定された。このような配列情報を用いて次に、公的データベースから利用可能な配列との、標準配列アルゴリズム（例えばＢＬＡＳＴ）を用いた配列比較が実施された。同定された差次的発現遺伝子群のうち、ラットＵＣＰ−２の配列（ゲンバンクアクセッション番号ＡＢ０１０７４３）に一致する４つの独立したクローンが同定された。前処置が後の神経学的障害に対して防御効果をもたらす虚血前処置モデルにおけるＵＣＰ−２の発現上昇は、ＵＣＰ−２活性の上昇が、さまざまな神経細胞（例えば、ニューロン、グリア細胞、ミクログリア細胞）に神経防御作用をもたらすことで、脳卒中および虚血性脳卒中を含むがこれらに限定されないさまざまな神経疾患を防御することを意味する。したがってＵＣＰ−２の発現レベルまたは活性を高めることができる薬剤は、潜在的に神経防御作用を有する可能性がある。
【００７１】
ミトコンドリア膜電位の調節にＵＣＰ−２が果たす役割も、ミトコンドリア透過性を変化させる薬剤も、神経防御作用をもたらす候補となることを意味する。実施例でさらに詳しく説明するように、このような証拠は、ＵＣＰ−２の作用機構に細胞アポトーシスが関与し、これがミトコンドリア透過性の変化がかかわる一連の事象のカスケードを導くことになることを意味する。
【００７２】
アポトーシス、すなわちプログラム細胞死は、通常の生物学的過程、ならびに複数の疾患状態に基本的な役割を果たす（例えばＮｉｃｈｏｌｓｏｎおよびＴｈｏｍｂｅｒｒｙ、（１９９６） Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ． ２２：２９９〜３０６；およびＴｈｏｍｐｓｏｎ、（１９９５） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８１：１３１２〜１３１６を参照）。アポトーシスは、いずれも同じ最終結果（規則的および計画された細胞死）を生じるさまざまな刺激によって誘導される場合がある。一つのアポトーシスカスケードは、ミトコンドリア膜内外の溶質の平衡化を可能とする、電位感受性小孔の開口を含むミトコンドリア透過性変化により引き起される。ミトコンドリアは、シトクロムｃの細胞質への放出を介するカスパーゼの活性化に介在することでアポトーシス情報伝達に関与する。したがってシトクロムｃの局在は、アポトーシスに対するミトコンドリアの関与を調べる際の便利なマーカーとなる。カスパーゼは、アスパラギン酸残基の後で基質を切断するという変わった能力をもつシステインプロテアーゼである。この活性は、アポトーシスにおける役割の中心である。活性化したカスパーゼは、細胞の恒常性および修復過程を無効にし、細胞内の重要な構造成分を切断する。カスパーゼ−３は、アポトーシスの進行を担う細胞タンパク質のタンパク質分解による消化に直接的な役割を果たす（例えばＦｅｍａｎｄｅｓ−Ａｉｎｅｍｒｉら、（１９９４） Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２６９：３０７６１〜３０７６４を参照）。
【００７３】
ＵＣＰ−２の神経防御的役割の基礎となる機構は、実施例で証拠を示すように、ミトコンドリア膜電位およびミトコンドリア透過性変化に及ぼす作用、ミトコンドリアからのシトクロムｃの放出の遮断、およびカスパーゼの活性化を含むがこれらに限定されない、アポトーシスカスケードの任意の成分の阻害および／または調節を含む場合がある。ＵＣＰ−２が、ニューロンのアポトーシスに関与する、ミトコンドリアマトリックスのｐＨを低下させる能力、フリーラジカルおよびＡＴＰ産生を減少させる能力を有するミトコンドリアタンパク質であることは上述した機構と矛盾しない。
【００７４】
ＵＣＰ−２の発現上昇が防御的な神経学的作用をもたらす機構であるという知見、およびアポトーシス阻害における役割を示す証拠は、いくつかの診断法および治療法、ならびにスクリーニング法の基礎となる。ＵＣＰ−２の活性もしくは発現に影響する薬剤は、アポトーシスカスケードの下流の成分と相互作用する薬剤（例えばカスパーゼ３）と比べて、効率的な神経防御作用を提供する可能性がある。ＵＣＰ−２は、アポトーシスカスケードの初期に現れるので、カスケードのさらに下流に位置する成分と比較して、多くの細胞経路に影響する可能性がある。このようなさまざまな診断法、治療法、およびスクリーニング法についてさらに後述する。
【００７５】
ＩＶ．診断法および予後判定法
虚血イベントに反応したＵＣＰ−２の差次的発現は、ＵＣＰ−２が、軽度の脳卒中に罹患した者を診断する際の、また脳卒中リスクのある者を検出する予後判定における評価のマーカーとなりうることを意味する。予後判定法は、脳卒中の重症度、および回復の見込みの評価に用いられる場合もある。
【００７６】
一般に、このような診断法および予後判定法には、個体またはその試料の細胞または組織内におけるＵＣＰ−２レベルの上昇を検出する段階が含まれる。ＵＣＰ−２転写産物およびＵＣＰ−２タンパクの質レベルを検出する両方法を含む多種多様なアッセイ法でＵＣＰ−２発現の上昇を検出することができる。具体的には、本明細書に開示された診断法および予後判定法には、個体から試料を得る段階、および少なくとも定性的に、また好ましくは定量的に、試料内のＵＣＰ−２発現レベルを決定する段階が含まれる。通常、このようにして決定された値、または試験値は、数種の参照値またはベースライン値と比較される。試料、発現レベルの定量法、および対照に関する詳細は、以下のセクションに記載されている。
【００７７】
Ａ．転写産物の検出
ＵＣＰ−２転写産物を検出する、また任意選択で定量する多種多様な方法があり、当業者に知られている。ＵＣＰ−２発現の変化を検出する、および定量する適切な方法の例には、ドットプロット、インサイチューハイブリダイゼーション、核酸プローブアレイ、定量逆転写ＰＣＲ （ＲＴ−ＰＣＲ）、ノーザンブロット、およびＲＮＡａｓｅプロテクション法などがあるがこれらに限定されない。
【００７８】
１．ドットブロットおよびインサイチューハイブリダイゼーション
ドットブロットは、被験者から得られた核酸試料中に存在するＵＣＰ−２転写産物の量の決定に使用されるアッセイ法の一例である。このアッセイ法では、脳卒中を検討する被験者に由来する試料は、支持体（例えばフィルター）上にスポットされた後に、ＵＣＰ−２核酸と特異的にハイブリッドを形成する標識核酸プローブで選び出される。フィルター上に固定された核酸とプローブとの間でハイブリッドを形成させた後に、未結合状態の核酸を洗い流し、ハイブリダイゼーション複合体の存在を検出し、フィルターに結合した標識プローブの量を元に定量する。
【００７９】
インサイチューハイブリダイゼーション法は、細胞を溶解せずにハイブリッドを形成させるハイブリダイゼーション法である。この方法はインサイチューで行われるので、細胞からＲＮＡを調製する必要がないという利点がある。この方法には通常、最初に試験細胞を支持体（例えばマイクロタイターウェルの壁）に固定する段階と、これに続く、細胞に適切な透過性溶液を透過させる段階が含まれる。ＵＣＰ−２に対する標識プローブを含む溶液を次に細胞に接触させ、プローブとＵＣＰ−２核酸とのハイブリッドを形成させる。過剰なプローブを消化して洗い流し、ハイブリッドを形成したプローブの量を測定する。この方法は、ハリス（Ｈａｒｒｉｓ）、Ｄ．Ｗ． （１９９６） Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２４３：２４９〜２５６；シンガー（Ｓｉｎｇｅｒ）ら、（１９８６） Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ４：２３０〜２５０；ハーゼ（Ｈａａｓｅ）ら、（１９８４） Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、第ＶＩＩ巻、１８９〜２２６；およびＮｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ （Ｈａｍｅｓら編、１９８７）に詳しく記載されている。
【００８０】
前述の方法に使用されるハイブリダイゼーション用プローブは、ＵＣＰ−２核酸と特異的にハイブリッドを形成するのに十分な長さを有するポリヌクレオチドである。ハイブリダイゼーション用プローブは、典型的には少なくとも長さが１５ヌクレオチド、場合によっては長さが２０〜３０ヌクレオチド、他の場合では長さが３０〜５０ヌクレオチド、またさらに他の場合では最長で完全長のＵＣＰ−２核酸である。このようなプローブは、検出を容易にするための放射性標識、フルオロフォア、発色団、または酵素などの検出可能な標識で標識される。必要なプローブを合成する方法には、ホスホトリエステル法（Ｎａｒａｎｇら、（１９７９） Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ６８：９０）、およびホスホジエステル法（Ｂｒｏｗｎら、（１９７９） Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ６８：１０９）などがある。
【００８１】
２．核酸プローブアレイ
関連するハイブリダイゼーション法では、核酸プローブアレイでＵＣＰ−２転写産物が検出および定量される。ＵＣＰ−２の検出に使用されるアレイには、さまざまな種類がある。アレイに使用されるプローブは、さまざまな種類があり、例えば比較的長さが短い（例えば２０−ｍｅｒまたは２５−ｍｅｒ）合成プローブ、ｃＤＮＡ（完全長または断片状の遺伝子）、増幅ＤＮＡ、ＤＮＡ断片（例えば制限酵素により作製）、および逆転写ＤＮＡ（例えばサザンら、（１９９９） Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ ２１：５〜９ （１９９９）を参照）を含む場合がある。ＵＣＰ−２発現レベルの検出には、カスタムアレイおよびジェネリックアレイを使用することができる。カスタムアレイは、特定の事前選択されたＵＣＰ−２のｍＲＮＡ遺伝子配列のサブ配列、またはこれから調製された増幅産物とハイブリッドを形成するプローブを用いて調製することができる。ジェネリックアレイは、ＵＣＰ−２配列に結合するように特別に調製されたものではなく、配列にかかわらずにｍＲＮＡを分析するように設計されている。これにもかかわらず、このようなアレイは現在でも使用されている。というのは、ＵＣＰ−２核酸が、相補的プローブを含む位置とのみとハイブリッドを形成するからである。したがってＵＣＰ−２のレベルは現在でも、相補配列のプローブを有する位置における結合の程度を元に決定される場合がある。
【００８２】
プローブアレイ法では、試験試料から核酸が得られたら、典型的には、核酸を標識ｃＤＮＡに逆転写するが、標識されたｍＲＮＡが直接使用される場合がある。標識核酸を含む試験試料を次にアレイのプローブと接触させる。試料中の任意の標識ＵＣＰ−２核酸がプローブとハイブリッドを形成するための十分な時間をおいた後に、アレイを対象に典型的には１回もしくは複数回の高ストリンジェンシーの洗浄を行って、未結合状態の核酸を除去し、アレイの核酸プローブとの非特異的な結合を最小化する。標識ＵＣＰ−２の結合は、任意のさまざまな市販のスキャナーと付属のソフトウェアプログラムを用いて検出される。
【００８３】
例えば、試料の核酸が蛍光標識で標識されている場合、ハイブリダイゼーションの強度は例えば、フォトン計数モードに設定した走査型共焦点顕微鏡で決定される場合がある。適切なスキャン装置については、例えばツルーソン（Ｔｒｕｌｓｏｎ）らによる米国特許第５，５７８，８３２号、およびスターン（Ｓｔｅｒｎ）らによる米国特許第５，６３１，７３４号に記載されており、またアフィメトリックス（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）社からＧｅｎｅＣｈｉｐ（商標）標識の名称で入手することができる。数種の標識は、酵素学的方法によって増幅可能なシグナルを発する（Ｂｒｏｕｄｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ． ９１、３０７２〜３０７６ （１９９４）を参照）。例えば放射性同位元素、発色団、磁気粒子、および高電子密度粒子を含む他のさまざまな標識も適している。
【００８４】
標識核酸とハイブリッドを形成するプローブアレイ上の位置は、米国特許第５，１４３，８５４号、国際公開公報第９０／１５０７０号、および米国特許第５，５７８，８３２号に記載されている装置などの読み取り装置を用いて検出される。カスタム化されたアレイの場合、例えば国際公開公報第９７／１０３６５号に記載されている手順で次にハイブリダイゼーションパターンを解析して、解析対象試料中の既知ｍＲＮＡ種の存在、および／または相対量もしくは絶対量を決定することができる。
【００８５】
当業者に有用なプローブアレイの用途に関するさらなる手引きは、国際公開公報第９７／１０３６５号、国際公開公報第９６／１４３８３９、および国際公開公報第９７／２７３１７号に記載されている。発現解析におけるマイクロアレイの用途に関する、さらに別の考察は例えばダガン（Ｄｕｇｇａｎ）ら、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ ２１：１０〜１４ （１９９９）；ボートウェル（Ｂｏｗｔｅｌｌ）、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ ２１：２５〜３２ （１９９９）；ブラウン（Ｂｒｏｗｎ）およびボシュテイン（Ｂｏｔｓｔｅｉｎ）、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ ２１：３３〜３７ （１９９９）；コール（Ｃｏｌｅ）ら、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ ２１：３８〜４１ （１９９９）；デブック（Ｄｅｂｏｕｃｋ）およびグッドフェロー（Ｇｏｏｄｆｅｌｌｏｗ）、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ ２１：４８〜５０ （１９９９）；場セット（Ｂａｓｓｅｔｔ、Ｊｒ）ら、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ ２１：５１〜５５ （１９９９）；ならびにチャクラバルティ（Ｃｈａｋｒａｖａｒｔｉ）、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ ２１：５６〜６０ （１９９９）に記載されている。
【００８６】
３．定量ＲＴ−ＰＣＲ
さまざまないわゆる「リアルタイム増幅」法、または「リアルタイム定量ＰＣＲ」法も、試料中のＵＣＰ−２ ｍＲＮＡ量の決定に使用することができる。このような方法には、増幅過程で形成された増幅産物の量を測定する段階が含まれる。蛍光発生ヌクレアーゼアッセイ法は、ＵＣＰ−２転写産物の検出および定量に使用可能なリアルタイム定量法の特定の例の一つである。一般に、このようなアッセイ法では、二重標識蛍光発生オリゴヌクレオチドプローブを用いてＰＣＲ産物の蓄積が連続的に測定される（文献では単に「ＴａｑＭａｎ」法と呼ばれることの多い方法）。
【００８７】
このようなアッセイ法に使用されるプローブは、典型的には、二種の異なる蛍光色素で標識される短い（約２０〜２５塩基）ポリヌクレオチドである。プローブの５’端には通常、レポーター色素が結合され、３’端にはクエンチング色素が結合されるが、これらの色素は、プローブ上の他の位置に結合することもできる。ＵＣＰ−２転写産物を測定するためには、ＵＣＰ−２転写産物上のプローブ結合部位と少なくとも実質的な配列相補性をもつようにプローブを設計する。ＵＣＰ−２に隣接する領域に結合する上流および下流のＰＣＲプライマーを、ＵＣＰ−２の増幅用に反応混合物に付加することもできる。
【００８８】
プローブが完全な場合、二種のフルオロフォア間にエネルギー移動が生じ、クエンチャーが、レポーターからの発光を消失させる。ＰＣＲの伸長段階中では、Ｔａｑポリメラーゼなどの核酸ポリメラーゼの５’ヌクレアーゼ活性によってプローブが切断されることで、レポーター色素がポリヌクレオチド−クエンチャー複合体から放出され、結果として、適切な検出系で測定可能なレポーターの発光強度が上昇する。
【００８９】
蛍光発生アッセイ法中に生じるものなどの蛍光放出の測定に特に適合する一つの検出装置が、アプライドバイオシステムズ社（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｉｎｃ．、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ）によって製造されているＡＢＩ ７７００である。この装置に付属するコンピュータソフトウェアでは、増幅過程におけるレポーターおよびクエンチャーの蛍光強度を記録することができる。次に記録値を用いて、規格化されたレポーター発光強度の上昇を連続的に算出し、増幅対象ｍＲＮＡの量を最終的に定量することができる。
【００９０】
増幅産物の濃度のリアルタイム決定を行う、蛍光発生法の理論および操作に関する詳細は、例えば全体が参照として本明細書に組み入れられるゲルファンド（Ｇｅｌｆａｎｄ）による米国特許第５，２１０，０１５号、Ｌｉｖａｋらによる第５，５３８，８４８号、およびハーランド（Ｈａａｌａｎｄ）による第５，８６３，７３６号、ならびにヘルド（Ｈｅｌｄ、Ｃ．Ａ．）ら、Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、６：９８６〜９９４ （１９９６）；ギブソン（Ｇｉｂｓｏｎ、Ｕ．Ｅ．Ｍ）ら、Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ６：９９５〜１００１ （１９９６）；ホランド（Ｈｏｌｌａｎｄ、Ｐ．Ｍ．）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：７２７６〜７２８０、（１９９１）；およびリバック（Ｌｉｖａｋ、Ｋ．Ｊ．）ら、ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ３５７〜３６２ （１９９５）に記載されている。
【００９１】
４．ノーザンブロット
ノーザンブロットでＵＣＰ−２転写産物を検出および定量することができる。この方法には典型的には、最初に全細胞すなわちポリ（Ａ）のＲＮＡを単離する段階、およびＲＮＡをアガロースゲル上で電気泳動により分離する段階が含まれる。次にゲルに、ニトロセルロース（活性化セルロース）のシート、またはガラスもしくはナイロンのメンブレンをかぶせ、ゲル、ならびにシートおよびメンブレンに緩衝液を通過させることで、シートまたはメンブレン上に分離ＲＮＡを移す。次に、シートもしくはメンブレン上に存在するＵＣＰ−２転写産物の存在および量を、ＵＣＰ−２に相補的な標識プローブで選び出し、検出および任意選択で定量可能な標識ハイブリダイゼーション複合体を形成させることで決定することができる（例えばＳａｍｂｒｏｏｋら、（１９８９） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ − Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ （第２版）、第１〜３巻、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ、ＮＹを参照）。
【００９２】
５．ＲＮＡａｓｅプロテクションアッセイ法
リボヌクレアーゼプロテクションアッセイ法（ＲＰＡ）には、ＵＣＰ−２に対する標識アンチセンスＲＮＡプローブを調製する段階が含まれる。このプローブは、生物学的試料に含まれるＵＣＰ−２転写産物と溶液中で実質的にハイブリッドを形成させてＲＮＡ：ＲＮＡハイブリッドを形成させることができる。ハイブリッドを形成しなかったＲＮＡは次にＲＮＡａｓｅで消化して除去する（ＲＮＡ：ＲＮＡハイブリッドは分解から保護される）。標識されたＲＮＡ：ＲＮＡハイブリッドをゲル電気泳動で分離し、ＵＣＰ−２に対応するバンドが検出をして定量を行う。通常、標識ＲＮＡプローブは放射標識されており、またＵＣＰ−２のバンドはオートラジオグラフィーで検出および定量される。ＲＰＡについては文献で詳しく説明されている（Ｌｙｎｎら、（１９８３） Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ８０：２６５６；Ｚｉｎｎら、（１９８３） Ｃｅｌｌ ３４：８６５；およびＳａｍｂｒｏｏｋら （１９８９） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ （第２版）、第１〜３巻、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ）。
【００９３】
Ｂ．ＵＣＰ−２の翻訳産物の検出
転写産物の増加を検出する代わりに、ＵＣＰ−２発現を検出する別の選択肢では、ＵＣＰ−２のタンパク質レベルおよび／または活性が決定される。この目標を達成するためには、ＵＣＰ−２に特異的に結合する抗体の使用を含むいくつかの異なるアプローチ、およびＵＣＰ−２活性（例えばミトコンドリアの呼吸）を測定するアッセイ法を使用することができる。
【００９４】
１．免疫学的方法
ＵＣＰ−２の発現レベルを決定する一つの方法では、ＵＣＰ−２に特異的に結合することで試料中のＵＣＰ−２を捕捉する抗体が使用される。このようなアプローチの一つが、いわゆる「サンドイッチ免疫アッセイ法」である。この方法には一般に、個体に由来する試料に、試料からＵＣＰ−２を捕捉して複合体を形成させる、固定化された抗ＵＣＰ−２抗体を接触させる段階が含まれる。この複合体を次に、好ましくはＵＣＰ−２のさまざまな部分を特異的に認識する標識抗ＵＣＰ−２検出用抗体に接触させ、後に固定化された抗体に接触させる。このような検出用抗体は、ＵＣＰ−２を含む複合体、および固定化された抗体に結合することで、標識検出用抗体から発せられるシグナルの規模を元に定量可能な三元複合体を形成する。サンドイッチアッセイ法には、検出用抗体が酵素を含む酵素結合免疫吸着アッセイ法（ＥＬＩＳＡ）がある。検出用抗体は、酵素基質を提供して検出可能なシグナルを発生させることで検出される。
【００９５】
さまざまな抗体アッセイ法の方法および段階に関するさらなる手引きは、例えばグリーン（Ｇｒｅｅｎｅ）による米国特許第４，３７６，１１０号；「Ｉｍｍｕｎｏｍｅｔｒｉｃ Ａｓｓａｙｓ Ｕｓｉｎｇ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ」、Ａｎｔｉｂｏｄｙ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、第１４章、（１９８８）；ボルトン（Ｂｏｌｔｏｎ）およびハンター（Ｈｕｎｔｅｒ）、「Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ ａｎｄ Ｒｅｌａｔｅｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ」、Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ （Ｄ．Ｍ．Ｗｅｉｒ編）、第１巻、第２６章、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ、１９８６；ナカムラ（Ｎａｋａｍｕｒａ）ら、「Ｅｎｚｙｍｅ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ：Ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｏｕｓ ａｎｄ Ｈｏｍｏｇｅｎｏｕｓ Ｓｙｓｔｅｍｓ」、Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ （Ｄ．Ｍ．Ｗｅｉｒ編）、第１巻、第２７章、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ、１９８６；およびＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、（Ｊｏｈｎ Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎら編）、第２章、第Ｉ節、（１９９１）に記載されている。
【００９６】
前述のアッセイ法を実施する際に使用される抗体は、上記のポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、およびこれらの断片を含む場合がある。モノクローナル抗体は、確立した方法で調製することができる（例えばＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ、（１９７５） Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５；ならびにＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、（１９８８） Ａｎｔｉｂｏｄｙ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ （Ｃ．Ｈ．Ｓ．Ｐ．、Ｎ．Ｙ．）を参照）。
【００９７】
２．活性アッセイ法
多種多様なＵＣＰ−２活性を決定することで、ＵＣＰ−２発現の上昇を検出することもできる。例えば、ミトコンドリア内において脱共役に果たす役割を考えて、あるアッセイ法には、脳卒中に罹患していると考えられる患者、または脳卒中リスクのある者に由来する試料中のＵＣＰ−２が介在するミトコンドリア呼吸のベースライン値に対する上昇を検出する段階が含まれる。アッセイ法は、単離された細胞試料もしくは組織試料を用いて、またはミトコンドリア調製物を用いて実施することができる。ミトコンドリア呼吸を測定する代わりに、ミトコンドリアの膨化の程度を測定することができる。ミトコンドリアを対象としたこのようなアッセイ法を実施する方法は当技術分野で周知であり、例えばサルビオリ（Ｓａｌｖｉｏｌｉ）ら、（１９９７） ＦＥＥＳ Ｌｅｔｔ ４１１：７７〜８２；およびスマイリー（Ｓｍｉｌｅｙ）ら、（１９９１） Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：３６７１〜３６７５）に記載されている。このような方法を、ある種の脱共役タンパク質を用いて実施する方法は、例えば国際公開公報第００／１７３５３号および国際公開公報第９８／４５３１３号で説明されている。
【００９８】
ＵＣＰ−１活性と同様に、一部の状況でＵＣＰ−２活性の尺度となりうる別の活性が、ＵＣＰ−２による脂肪酸輸送である。ＵＣＰ−１によるプロトン輸送活性は脂肪酸によって調節されている。インビトロ試験でも、ＵＣＰ−１が脂肪酸陰イオン輸送体として機能可能なことが示されている。脂肪酸は、ミトコンドリア膜内外のプロトン輸送を、ＵＣＰ−１プロトノフォアとしてプロトン輸送に関与することで促進すると考えられている（例えばＧａｒｌｉｄ、Ｋ．Ｄ．ら、（１９９６） Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２７１：２６１５〜２６２０を参照）。ＵＣＰ−１とＵＣＰ−２の配列が相同であることは、ＵＣＰ−２活性が脂肪酸輸送も含むことを示している。このようなアッセイ法は、標識された（例えば放射標識された）脂肪酸を用いて実施することができる。
【００９９】
Ｃ．経時変化解析
患者の脳卒中リスクを評価するある種の予後判定法には、脳卒中に感受性のある患者のＵＣＰ−２発現レベルをモニタリングして、ＵＣＰ−２発現の上昇傾向を経時的に追跡する段階が含まれる。経時的なＵＣＰ−２発現の上昇は、個体の脳卒中リスクが高いことの指標となりうる。ＵＣＰ−２の他の尺度と同様に、脳卒中リスクのある患者のＵＣＰ−２発現レベルをベースライン値と比較する（後述）。このような分析におけるベースラインは、同じ個体に対して決定される事前の値、または対照群（例えば見かけ上の神経学的リスク因子のない者の集団）について決定される統計値（例えば平均値、または重み付けされた平均値）の場合がある。ＵＣＰ−２発現レベルに経時的に統計的に有意な上昇を示す者は、かかりつけの医師による予防的な処置を促して、脳卒中発生のリスクを小さくすることができる。例えば医師は、ある種の生活習慣の変更（例えば食事の改善や運動プログラム）を勧めることで、脳卒中リスクを低下させることができる。あるいは、またはこれに加えて医師は、医薬品を処方して脳卒中リスクを低下させることができる。
【０１００】
Ｄ．対照
脳卒中に罹患していると考えられる者、または脳卒中に感受性があると考えられる者に由来する試料について決定されるさまざまな試験値を典型的にはベースライン値と比較して、ＵＣＰ−２発現の上昇（もしあれば）の程度を評価する。このようなベースライン値は、いくつかの異なる値の任意の値をとりうる。いくつかの状況では、ベースライン値は、試験試料に平行に実施される、健康な細胞試料もしくは組織試料を用いた試行で決定された値である。あるいは、ベースライン値は、対照となる細胞または個体の集団から決定された統計値（例えば平均値、もしくは重み付けされた平均値）の場合がある。例えばベースライン値は、対照者または対照集団に特徴的な値または範囲の場合がある。例えばベースライン値は、一般集団、具体的には脳卒中に感受性のない健常者のＵＣＰ−２レベルを反映した統計値または範囲の場合がある。脳卒中に感受性のない者とは、脳卒中に相関した見かけ上のリスク因子（例えば、高血圧、高コレステロール値、糖尿病、喫煙、および高塩分の食事など）を有しない者を一般に意味する。
【０１０１】
Ｅ．試料
試料はさまざまな供給源から得られる場合がある。例えば、方法は主に、神経疾患（脳卒中など）に対するヒトのリスク因子を診断および評価するために設計されるので、試料は典型的にはヒト被験者から得られる。しかし、このような方法は、ヒト以外の霊長類（例えばサルおよびチンパンジー）、マウス、ならびにラットなどの、他のあらゆる哺乳類から得られる試料について実施される場合もある。このような試料は、患者試料、または生物学的試料と呼ばれる場合がある。
【０１０２】
試料は、個体の組織または体液から、ならびに細胞培養物または組織ホモジネートから得られる場合がある。例えば試料は、全血、血清、精液、唾液、涙液、尿、糞便、汗、頬面、皮膚、髄液、および羊水から得られる場合がある。試料は、成長培地、組換え細胞、および細胞成分を含むインビトロ細胞培養物に由来する場合もある。
【０１０３】
ある診断法では、神経細胞における発現レベルを評価する段階が含まれるので、試料は、ニューロン細胞、グリア細胞、ミクログリア細胞、および皮質ニューロン細胞を含むがこれらに限定されないさまざまな種類の神経細胞から得られる場合がある。現在得られている証拠では、脳卒中の一つの結果が、血液脳関門の透過性が増すことであることが明らかにされている。脳卒中はまた、ある種の細胞の細胞死も生じ、細胞死に伴い、細胞が溶解されてＵＣＰ−２などの細胞成分が放出されることになる。このような成分は後に血液脳関門を通過して、循環系によ捕捉される場合がある。したがって、ある診断法および予後判定法は血液試料を対象に行われる。
【０１０４】
ＵＣＰ−２は、神経防御反応の一部として発現されるので、診断用試料は、個体が脳卒中であること、または脳卒中の予測因子となる症状を示すことが疑われた後の任意の時点で採取される。予防試験では、試料は、脳卒中に対する感受性を示すリスク因子（例えば、高血圧、肥満、糖尿病）を、個体の健康状態の日常的な評価の一部として呈する個体から得られる場合がある。
【０１０５】
ＵＣＰ−２転写産物の検出を含む診断法および予後判定法の一部は、細胞の溶解で開始され、これに他の細胞材料由来の核酸の精製が続く。ＵＣＰ−２の転写レベル（すなわち発現レベル）を測定するためには、ＵＣＰ−２のｍＲＮＡ転写産物を含む核酸試料、またはｍＲＮＡ転写産物に由来する核酸を得る。ｍＲＮＡ転写産物に由来する核酸は、ｍＲＮＡ転写産物またはそのサブ配列の合成が最終的にテンプレートとなる核酸を意味する。したがってｍＲＮＡから逆転写されたｃＤＮＡ、ｃＤＮＡから転写されたＲＮＡ、ｃＤＮＡから増幅されたＤＮＡ、増幅後のＤＮＡから転写されたＲＮＡはいずれもｍＲＮＡ転写産物に由来し、また由来する産物の検出は、試料中に含まれる元の転写産物の存在および量の指標となる。したがって適切な試料は、ＵＣＰ−２のｍＲＮＡ転写産物、ｍＲＮＡから逆転写されたｃＤＮＡ、ｃＤＮＡから転写されたｃＲＮＡ、ＵＣＰ−２核酸から増幅されたＤＮＡ、および増幅後のＤＮＡから転写されたＲＮＡを含むがこれらに限定されない。
【０１０６】
いくつかの方法では、核酸試料は生物学的試料から単離された全ｍＲＮＡであり；他の場合では、核酸試料は、個体から採取された試料に由来する全ＲＮＡである。ｍＲＮＡの単離に対して選択を行わない、上述した任意のＲＮＡ単離法が、ＲＮＡ試料の精製に使用される場合がある。このような方法の検出限界を改善する必要がある場合は、上述のような確立された増幅法を用いた解析をさらに行う前にＵＣＰ−２を増幅することができる。
【０１０７】
ＩＶ．治療法／予防的治療法
Ａ．一般的事項
神経防御モデル系で検出されるＵＣＰ−２の発現上昇は、ＵＣＰ−２の発現または活性を高める方法が、神経障害患者の治療に、ならびに神経障害リスクのある者の予防的治療に使用可能であることを意味する。一般に、このような方法には、神経障害患者、または神経障害リスクのある者に、ＵＣＰ−２の発現または活性を高める有効量の薬剤を投与する段階が含まれる。治療対象となる神経障害は、脳卒中（特に虚血性脳卒中）、およびアルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、遺伝性運動失調、統合失調症、痴呆症、ミトコンドリア脳症、筋萎縮性側索硬化症、運動ニューロン疾患など（例えばＢｅａｌ、（２０００） ＴＩＮＳ ２３：２９８を参照）を含むがこれらに限定されない、ミトコンドリア機能の変化が関連する他のすべての神経疾患を含む場合がある。広い意味では、ミトコンドリアの機能不全は、ネクローシスおよびアポトーシスによる細胞死の重要な因子である。したがって、アポトーシスおよび／またはネクローシスによる細胞死が関与する多くの疾患（神経学的疾患および末梢性疾患）は、ＵＣＰ−２活性の上昇による標的となりうる（例えば心筋虚血、糖尿病、肝硬変、筋ジストロフィー症、脊髄損傷）。
【０１０８】
ＵＣＰ−２の発現および／または活性を高める治療的／予防的介入には、脳卒中の既往のある者、脳卒中リスクの高い者、および遺伝的素因のある者への、虚血エピソード直後におけるＵＣＰ−２誘導性因子の投与および長期投与が含まれるがこれらに限定されない。
【０１０９】
個体の状態に依存して、薬剤を治療量または予防量で投与することができる。個体が神経障害に罹患している場合、障害後の少なくともある程度の期間は、および薬剤は、典型的には治療量で投与される。本明細書で定義される「治療量」は、神経疾患の状態または症状を緩和する、またそれ以外では神経疾患もしくは他の任意の望ましくない症状、特に脳卒中、具体的には虚血性脳卒中の進行を予防する、妨害する、遅延させる、または逆転させるのに十分な量を意味する。しかし個体が、神経障害に対する感受性があることを示すリスク因子しか呈しない場合は、薬剤は予防的有効量で投与される。予防量はまた、既に脳卒中の既往があり、別の脳卒中のリスクが高い者に対する長期療法の一部として投与される場合もある。「予防量」は、神経疾患、または特に、脳卒中（具体的には虚血性脳卒中）などの神経疾患に関して任意の望ましくない症状を予防する、妨害する、または遅延させるのに十分な量である。
【０１１０】
予防的治療は、個体が、脳卒中などの神経疾患に罹患するリスクが高くなったらいつでも開始することができる。例えば、脳卒中と相関することが知られているリスク因子を有する個体には、ＵＣＰ−２活性を高める予防量の薬剤を投与することができる。このような個体は例えば以下の状態を示す：過体重もしくは肥満、高血圧、高コレステロール値、糖尿病、および／またはリスクを増す医学的処置を受ける予定がある（例えば心臓バイパス手術を受ける予定の患者）。
【０１１１】
ミトコンドリアの透過性変化を調節するミトコンドリアタンパク質としてのＵＣＰ−２の活性に関しては、治療法に使用される薬剤は、ミトコンドリアの透過性小孔に、類似の様式で影響を及ぼす薬剤を含む場合がある。同様に、ＵＣＰ−２がカスパーゼ３の活性化を抑制することでアポトーシスを少なくとも部分的に抑制することを示す証拠を考えれば、治療薬は、類似の阻害特性をもつ薬剤を含む場合もある。
【０１１２】
Ｂ．ＵＣＰ−２および他の薬剤
多種多様な薬剤を投与して、ＵＣＰ−２活性の所望の上昇を達成することができる。ある場合では、薬剤は、既に定義した精製ＵＣＰ−２ポリペプチドである（活性断片も含む）。精製ＵＣＰ−２を調製する方法は後述する。投与される他の治療薬は、ＵＣＰ−２の発現または活性を促進するように作用する。このような薬剤には、ＵＣＰ−２のプロモーターを誘導することで、細胞内におけるＵＣＰ−２発現を高める薬剤が含まれる。このような活性を有する化合物は、スクリーニングのセクションで後述するスクリーニング法で同定することができる。このような化合物は、薬学的に許容される担体と組み合わせて投与されることが多い。このような担体および投与様式は、後述する薬学的組成物のセクションでさらに説明する。ＵＣＰ−２のさまざまな誘導性因子をある方法で使用することができる。このような誘導性因子の特定の例には、イソプロテレノールのようなβ３−作動性物質のようなＰＰＡＲγ作動性物質などがある。誘導性因子には、ＵＣＰ−２の転写を活性化する薬剤が含まれる場合もある。
【０１１３】
ＵＣＰ−２活性を高める化合物は、他のさまざまな化合物と組み合わせて投与することができる。例えば、このような化合物は、血液脳関門の透過性を高める薬剤とともに投与することで、ＵＣＰ−２活性を活性化する薬剤の脳への輸送を促進することができる。このような薬剤には、ブラジキニン、セロトニン、ヒスタミン、およびアラキドン酸などが含まれるがこれらに限定されない。ＵＣＰ−２活性を高める化合物とともに投与可能な他の化合物には、ヘパリンおよびフコイダンを含むがこれらに限定されない、血液凝固を防止して血栓形成を予防する成分が含まれる。
【０１１４】
ＵＣＰ−２は、プロトンチャネルとして機能する、ミトコンドリア内膜の膜貫通タンパク質なので（ＲｉｃｑｕｉｅｒおよびＢｏｕｉｌｌａｕｄ、（２０００） Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ ３４５：１６１〜１７９）、ＵＣＰ−２活性を高める作動性物質を同定することは別の治療選択肢となる（一般にイオンチャネルに対する薬剤標的に関する考察に関しては、Ｄｒｅｗｓ、（２０００） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８７：１９６０を参照）。このような作動性物質は、生理的調節およびゲート開閉機構の非存在下でＵＣＰ−２チャネルを開閉させること、そしてＵＣＰ−２介在型のプロトン流の増加を誘導することができる。
【０１１５】
同定された化合物と組み合わせて投与可能な他の薬剤、および輸送様式の選択肢は、薬学的組成物のセクションで詳しく説明する。
【０１１６】
Ｃ．遺伝子治療
ＵＣＰ−２の発現を高める別の選択肢が遺伝子治療である。この方法には一般に、ＵＣＰ−２をコードする核酸分子、またはこの活性断片を個体に投与する段階が含まれる。投与された核酸は、一つもしくは複数の組織、特に神経細胞、具体的にはニューロン細胞におけるＵＣＰ−２発現レベルを高める。このような核酸が投与されることで、有効量のＵＣＰ−２の合成が達成され、治療を受ける個体で治療効果および予防効果が得られる。本明細書で用いられる「遺伝子治療」という用語は、１回の治療で長期効果が得られる治療を意味し、遺伝子治療用の薬剤が複数回投与されてＵＣＰ−２発現の所望の上昇が達成されたり維持されたりする方法である。
【０１１７】
ＵＣＰ−２をコードする核酸分子は、エクスビボまたはインビボで投与される場合がある。エクスビボ遺伝子治療法には、核酸を細胞にインビトロで投与する段階、およびこれに続く、導入核酸を含む細胞を治療対象者に移植して戻す段階が含まれる。ＵＣＰ−２核酸の哺乳類細胞へのインビトロ輸送に適した手法には、リポソーム、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、細胞融合、ＤＥＡＥ−デキストラン、およびカルシウムリン酸沈殿法の使用が含まれるがこれらに限定されない。トランスフェクションを行った細胞を次に患者に導入する。
【０１１８】
あるエクスビボ法は、脳内へのＵＣＰ−２の連続的な輸送を目的とした、任意の状態の遺伝的に修飾された神経幹細胞の使用に基づく。例えばＵＣＰ−２産生細胞は、脳室内空間内、または髄液中に直接移植するか、または半透膜（例えばカプセル）で包んだものを移植する。
【０１１９】
インビボ遺伝子治療法では、核酸または核酸／タンパク質複合体が治療対象者に直接投与される。インビボ投与は、裸の核酸の注入、ウイルス感染、リポソームを介した輸送、およびエンドサイトーシスによる輸送を含むがこれらに限定されない、いくつかの確立された手法で達成される場合がある。これらのうち、ウイルスベクターによるトランスフェクション、およびウイルスのコートタンパク質−リポソームを介したトランスフェクションが広く用いられている方法である（例えばＤｚａｕら、（１９９３） Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １１：２０５〜２１０を参照）。適切なウイルスベクターには例えば、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、およびレトロウイルスのベクターなどがある。
【０１２０】
方法は、核酸をある細胞に選択的に輸送するように設計される場合がある。このような細胞の例には、ニューロン、アストロサイト、オリゴデンドロサイト、ミクログリア、および内皮細胞などがある。ＵＣＰ−２は神経防御作用を示すので、ある治療法は、ＵＣＰ−２をニューロン細胞内で選択的に発現するように、および／または核酸を神経細胞に標的輸送するように設計される。しかし他の場合では、非神経細胞（例えば、ミクログリア、アストロサイト、内皮細胞、オリゴデンドロサイト）が標的となる。神経細胞内における選択的な発現を達成する一つの方法では、ＵＣＰ−２をコードする核酸を、神経細胞内で主に活性を示すプロモーターに使用可能に連結する。このようなプロモーターの例には、プリオンタンパク質のプロモーター、カルシウム−カルモジュリン依存性タンパク質キナーゼのプロモーター、エノラーゼのプロモーター、およびＰＤＧＦβのプロモーターなどがあるがこれらに限定されない。あるいは、またはこれに加えて、核酸を、核酸を神経細胞に向かわせる薬剤とともに投与することができる。例えば核酸は、神経細胞上の細胞表面抗原、または神経細胞上の受容体に対するリガンドに特異的に結合する抗体とともに投与することができる。リポソームを使用する場合は、エンドサイトーシスが関与する細胞表面の膜タンパク質に結合する基質をリポソームに結合させることで、リポソームを神経細胞に向かわせて取り込みを促すことができる。結合可能なタンパク質の例には、神経細胞に結合するカプシドタンパク質、またはその断片、サイクリング中に内部移行を受ける神経細胞上の細胞表面タンパク質に特異的に結合する抗体、および神経細胞内における細胞内局在を標的とするタンパク質などがある（例えばＷｕら、（１９８７） Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２６２：４４２９〜４４３２；およびＷａｇｎｅｒら、（１９９０） Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：３４１０〜３４１４を参照）。遺伝子の標識、および遺伝子治療のプロトコルは、アンダーソン（Ａｎｄｅｒｓｏｎ）ら、（１９９２） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５６：８０８〜８１３で概説されている。
【０１２１】
他のさまざまな輸送の選択肢を使用することもできる。例えば、ＵＣＰ−２を含む核酸（例えばＵＣＰ−２を含むベクター）を髄液中に直接注入することができる。あるいは、このような核酸を脳室内注射で投与することができる。
【０１２２】
Ｖ．スクリーニング法
いくつかの異なるスクリーニングプロトコルを用いて、細胞、具体的には哺乳類細胞（特にヒト細胞）内でＵＣＰ−２発現を高める薬剤を同定することができる。一般的な意味では、スクリーニング法には、複数の薬剤のスクリーニングを行うことで、例えばＵＣＰ−２に結合させたり、阻害性因子とＵＣＰ−２との結合を妨げたり、またはＵＣＰ−２の発現を活性化させたりすることでＵＣＰ−２活性を高める薬剤を同定する段階が含まれる。
【０１２３】
Ａ．ＵＣＰ−２結合アッセイ法
予備的なスクリーニングを、ＵＣＰ−２に結合可能な化合物のスクリーニングによって実施することができる。というのは、このようにして同定される少なくとも一部の化合物はＵＣＰ−２の活性化因子である可能性が高いからである。結合アッセイ法には通常、ＵＣＰ−２タンパク質に１個もしくは複数の被験化合物を接触させ、タンパク質と被験化合物が結合複合体を形成する十分な時間を確保する段階が含まれる。形成される任意の結合複合体は、任意のいくつかの確立された分析的手法で検出することができる。タンパク質結合アッセイ法には、共沈殿、非変性ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上における共移動、およびウエスタンブロットにおける共移動を測定する方法が含まれるがこれらに限定されない（例えばＢｅｎｎｅｔ、Ｊ．Ｐ．およびＹａｍａｍｕｒａ、Ｈ．Ｉ． （１９８５）、「Ｎｅｕｒｏｔｒａｎｓｍｉｔｔｅｒ、Ｈｏｒｍｏｎｅ ｏｒ Ｄｒｕｇ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｍｅｔｈｏｄｓ」、Ｎｅｕｒｏｔｒａｎｓｍｉｔｔｅｒ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｂｉｎｄｉｎｇ （Ｙａｍａｍｕｒａ、Ｈ．Ｉ．ら編）、６１〜８９を参照）。このようなアッセイ法で使用されるＵＣＰ−２タンパク質は天然の状態で発現させたり、クローン化したり、ＵＣＰ−２を合成させたりすることができる。
【０１２４】
Ｂ．発現アッセイ法
あるスクリーニング法には、ＵＣＰ−２の発現を高める化合物をスクリーニングする段階が含まれる。このような方法には一般に、ＵＣＰ−２を発現する１個もしくは複数の細胞に被験化合物を接触させた後に、ＵＣＰ−２発現（転写産物または翻訳産物のいずれか）の上昇を検出する、細胞ベースのアッセイ法を行う段階が含まれる。いくつかのアッセイ法は、内因性ＵＣＰ−２を発現するニューロン細胞（例えば、皮質ニューロン細胞、グリア細胞、またはミクログリア細胞）を対象に行われる。他の発現アッセイ法は、外因性ＵＣＰ−２を発現する非ニューロン細胞を対象に行われる。
【０１２５】
ＵＣＰ−２の発現は、いくつかの異なる方法で検出することができる。後述するように、細胞内におけるＵＣＰ−２の発現レベルは、細胞内で発現されるｍＲＮＡを、ＵＣＰ−２の転写産物（またはこれに由来する相補的な核酸）と特異的にハイブリッドを形成するプローブで選び出すことで決定可能である。プローブ処理は、細胞を溶解し、ノーザンブロットを行うことで、またはインサイチュー−ハイブリダイゼーション法（上述）で細胞を溶解することなく実施可能である。あるいはＵＣＰ−２タンパク質は、細胞溶解物を、ＵＣＰ−２に特異的に結合する抗体をプローブとして処理する免疫学的方法で検出することができる。
【０１２６】
他の細胞ベースのアッセイ法が、ＵＣＰ−２を発現しない細胞を対象に行われるレポーターアッセイ法である。このアッセイ法は、検出可能な産物をコードするレポーター遺伝子に使用可能に連結されるＵＣＰ−２プロモーターを含む異種核酸コンストラクトを用いて行われる。適切なＵＣＰ−２プロモーターは、例えば国際公開公報第０００３９３１５号に記載されている。いくつかの異なるレポーター遺伝子を使用することができる。一部のレポーターは遺伝的に検出可能である。レポーターの一例が、蛍光検出装置で検出可能な蛍光を発する緑色蛍光タンパク質である。検出可能な産物を生じるレポーターもある。このようなレポーターは酵素である場合が多い。例示的な酵素型レポーターには、β−グルクロニダーゼ、ＣＡＴ（クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ；ＡｌｔｏｎおよびＶａｐｎｅｋ、（１９７９） Ｎａｔｕｒｅ ２８２：８６４〜８６９）、ルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、およびアルカリホスファターゼ（Ｔｏｈら、（１９８０） Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ． １８２：２３１〜２３８；およびＨａｌｌら、（１９８３）、Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎ． ２：１０１）などがあるがこれらに限定されない。
【０１２７】
これらのアッセイ法では、レポーターコンストラクトを有する細胞に被験化合物を接触させる。結合によりプロモーターを活性化するか、またはプロモーターを活性化させる分子を産生するカスケードを惹起させる被験化合物は、検出可能なレポーターの発現を引き起す。他のレポーターアッセイ法は、ＵＣＰ−２の発現を活性化させる転写制御被験者、およびこれに使用可能に連結されるレポーターを含む異種コンストラクトを有する細胞を用いて行われる。この場合も、転写制御配列に結合してレポーターの発現を活性化する薬剤、または転写制御配列に結合してレポーターの発現を活性化する薬剤の形成を惹起する薬剤は、レポーター発現と関連したシグナルを発生させることで同定される場合がある。
【０１２８】
発現または活性のレベルは、ベースライン値と比較することができる。上述したように、ベースライン値は、対照試料についての値、または対照集団（例えば脳卒中などの神経障害リスクのない健常者）のＵＣＰ−２発現レベルを代表する統計値の場合がある。発現レベルは、負の対照としてのＵＣＰ−２非発現細胞について決定することもできる。このような細胞は一般に、それ以外の点では、試験細胞と実質的に遺伝的に同じである。
【０１２９】
レポーターアッセイ法には多種多様な種類の細胞を使用することができる。上述したように、ある種の細胞は、内因性ＵＣＰ−２を発現する神経細胞である。ＵＣＰ−２を発現しない細胞は原核細胞の場合があるが、好ましくは真核細胞である。このような真核細胞は、組換え核酸コンストラクトを有する細胞の作製に典型的に使用される任意の細胞の場合がある。例示的な真核細胞には、酵母、およびさまざまな高等真核細胞（ＣＯＳ、ＣＨＯ、およびＨｅＬａ細胞系列など）があるがこれらに限定されない。
【０１３０】
さまざまな対照を対象に、レポーターコンストラクトを欠く細胞とともに平行反応を行う段階、またはレポーターコンストラクトを有する細胞に被験化合物を接触させないことで、観察された活性が真性のものであることを確認することができる。化合物は後述するように、さらに検証することもできる。
【０１３１】
Ｃ．ＵＣＰ−２活性のアッセイ法
さまざまなスクリーニング法を実施して、ＵＣＰ−２活性を高める化合物を同定することができる。測定可能なＵＣＰ−２活性の一部は、診断法のセクションで上述したように、ミトコンドリア呼吸および脂肪酸輸送速度の決定を含む。ＵＣＰ−２とＵＣＰ−１の間に配列相同性が存在する場合、いくつかの条件では、ＵＣＰ−２のプロトン輸送が、あるプリンヌクレオチド（プリンヌクレオチドの二リン酸塩、および三リン酸塩など）によって阻害されうることを意味する。例えばＧＤＰは、ＵＣＰ−１上の阻害性部位に結合する阻害因子となることがわかっている（例えばＭｕｒｄｚａ−Ｉｎｇｌｉｓ、Ｄ．Ｌ．ら、（１９９４） Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２６９：７４３５〜３８；およびＢｏｕｉｌｌａｕｄ、Ｆら、（１９９４） ＥＭＢＯ Ｊ． １３：１９９０〜９７を参照）。したがって、このようなプリンヌクレオチドの結合を、同じ阻害性部位への結合により、またはＵＣＰ−２の別の部位への結合により阻害する化合物を同定するスクリーニングは、ＵＣＰ−２の潜在的な活性化因子となりうる。このような種類の化合物は、標識プリンヌクレオチドを用いて、例えば被験化合物のもつ、標識ヌクレオチドとＵＣＰ−２との結合を阻害する能力を検出することで同定される場合がある（例えばＵＣＰ−２を含むミトコンドリア膜調製物）。ミトコンドリア膜電位、および関連するプロトン駆動力（ＰＭＦ）の測定に基づくアッセイ法は、ＵＣＰ−２を異所性発現させることで、酵母および哺乳類細胞の両方で行うことができる。ＰＭＦに影響を及ぼす化合物は次に、蛍光色素を用いた方法、または電気化学的方法で同定することができる。
【０１３２】
他のアッセイ法をスクリーニング段階に用いることもできる。例には、診断法および予後判定法のセクションで既に述べたミトコンドリア呼吸速度、ミトコンドリアの膨化、および／または脂肪酸輸送を調べる段階などがある。特定のアッセイ法とは無関係に、さまざまな対照をおくことで、観察された活性が真性のものか否かを確認することができる。例えばアッセイ法は、ＵＣＰ−２を発現していない細胞を対象に行うことができるほか、ＵＣＰ−２を発現していない細胞に被験化合物を接触させないアッセイ法を行うことができる。
【０１３３】
Ｄ．検証
前述の任意のスクリーニング法で最初に同定された化合物をさらに検討して、見かけ上の活性を検証することができる。好ましくは、このような試験は、実施例１で後述するラットモデル系などの適切な動物モデルを対象に行われる。この方法の基本フォーマットには、初期スクリーニングで同定されたリード化合物を、ヒトに代わるモデルとなる動物に投与する段階、およびこれに続くＵＣＰ−２の発現が実際に上昇しているか否かを判定する段階が含まれる。検証試験に使用される動物モデルは一般に、任意の種の哺乳類である。適切な動物の特定の例には、霊長類、マウス、およびラットなどがあるがこれらに限定されない。
【０１３４】
ある方法は、動物モデルでリード化合物のもつＵＣＰ−２活性上昇能力を検討するだけでなく、動物が防御効果を発揮することを示す時間よりも長期間の一過性の虚血を受けた後に防御を提供することも検討するように設計されている。このような方法では、リード化合物がモデル動物（すなわち典型的にはヒト以外の哺乳類）に投与される。次に動物を対象に、一過性の虚血を、防御効果をもたらすより長い期間かけて生じさせる。虚血を生じる条件を停止し、ＵＣＰ−２活性をモニタリングして、対象化合物がＵＣＰ−２活性をベースライン値以上に高める能力を維持していることを確認する。前処置モデルにおいてＵＣＰ−２の発現を高めるより長時間にわたってＵＣＰ−２発現を促進することができる化合物は、後続の試験における有望な候補となる。
【０１３５】
Ｅ．ミトコンドリアおよび細胞のアポトーシスに影響を及ぼす化合物
ＵＣＰ−２が、ミトコンドリア透過性および膜電位を変化させることにより、ならびにカスパーゼ３の活性化を抑制することにより、細胞のアポトーシスに影響を及ぼすことを示す証拠があるので、スクリーニングを行って、類似の作用をミトコンドリア透過性、膜電位、およびカスパーゼ−３活性化に及ぼす化合物を同定することもできる。
【０１３６】
さまざまな方法で、ミトコンドリア膜電位を決定することができる。一つの方法では蛍光指示薬を使用する（例えばＨａｕｇｌａｎｄ、１９９６、Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｂｅｓ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、第６版、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、ＯＲ、２６６〜２７４および５８９〜５９４を参照）。さまざまな非蛍光プローブも使用することができる（例えばＫａｍｏら、（１９７９） Ｊ．Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｂｉｏｌ． ４９：１０５を参照）。ミトコンドリア膜電位は、ミトコンドリア膜の透過性から間接的に決定される場合もある（例えばＱｕｉｎｎ、（１９７６） Ｔｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｍｅｍｂｒａｎｅｓ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐａｒｋ Ｐｒｅｓｓ、Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ、Ｍａｒｙｌａｎｄ、２００〜２１７を参照）。さまざまなイオン感受性電極を使用することもできる。
【０１３７】
カスパーゼ３活性は、当技術分野で周知のさまざまな既知の基質を用いてモニタリングすることができる。適切なカスパーゼ−３アッセイ法については諸文献に記載されている（Ｅｌｌｅｒｂｙら、（１９９７） Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． １７：６１６５；Ｒｏｓｅｎら、（１９９７） Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ． ６４：５０；およびＫｌｕｃｋら、（１９９７） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７５：１１３２）。別のカスパーゼアッセイ法については実施例４に記載する。
【０１３８】
ミトコンドリアからのシトクロムｃの放出は、任意のいくつかの免疫学的方法または分光法で検出することができる。
【０１３９】
Ｆ．被験化合物
ＵＣＰ−２発現を活性化する可能性のある本質的に任意の種類の化合物を用いたスクリーニング法を実施することができる。したがって被験化合物は、ポリペプチド；糖質（オリゴ糖や多糖など）；ポリヌクレオチド；脂質、もしくはリン脂質；脂肪酸；ステロイド；またはアミノ酸類似体を含むがこれらに限定されない、さまざまな一般的な種類の場合がある。被験化合物は、複素環式化合物、炭素環式化合物、β−ラクタム、ポリカルバメート、オリゴマー−Ｎ−置換グリシン、ベンゾジアゼピン、チアゾリジノン、およびイミジゾリジノン（ｉｍｉｄｉｚｏｌｉｄｉｎｏｎｅ）を含むがこれらに限定されない、さまざまな化学種の場合がある。ある試験薬剤は、合成有機化合物を含む小分子である。
【０１４０】
試験薬剤は、例えば天然物ライブラリー、またはコンビナトリアルライブラリーから得られる。いくつかの異なるコンビナトリアルライブラリー、およびライブラリーを作製する方法は例えば、それぞれが参照として本明細書に組み入れられる国際公開公報第９３／０６１２１号、国際公開公報第９５／１２６０８号、国際公開公報第９５／３５５０３号、国際公開公報第９４／０８０５１号、および国際公開公報第９５／３０６４２号に記載されている。
【０１４１】
ＶＩ．ＵＣＰ−２の産生
Ａ．ＵＣＰ−２核酸
ＵＣＰ−２核酸は、例えば以下の方法を含む、当技術分野で周知の任意の適切な方法で得られる場合がある：（１）ゲノムライブラリーもしくはｃＤＮＡライブラリーとプローブとのハイブリダイゼーションによる相同ヌクレオチド配列の検出、（２）発現ライブラリーの抗体スクリーニングによる、構造的特性を共有するクローン化ＤＮＡ断片の検出、（３）ＵＣＰ−２核酸と特異的にハイブリッドを形成するプライマーを用いたさまざまな増幅法［例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）］；および（４）直接化学合成。
【０１４２】
具体的には、ＵＣＰ−２核酸は、確立されたクローニング法で得られる場合がある。ＵＣＰ−２をコードする遺伝子もしくはｃＤＮＡのヌクレオチド配列（例えば配列番号：１を参照）を用いることで、ｃＤＮＡライブラリー中のＵＣＰ−２ ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ試料中のＵＣＰ−２遺伝子、または全ＲＮＡ試料中のＵＣＰ−２ ｍＲＮＡと特異的にハイブリッドを形成するプローブが提供される（例えばサザンブロットまたはノーザンブロット）。ライブラリーは好ましくは神経細胞から調製される。標的核酸が同定されたら、単離して、既知の増幅法でクローン化することができる。このような方法には、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、Ｑβ−レプリカーゼによる増幅、自律的配列複製系（ＳＳＲ）、および転写ベースの増幅系（ＴＡＳ）などがある。ＵＣＰ−２のクローン化に使用可能なクローニング法は、バーガー（Ｂｅｒｇｅｒ）およびキンメル（Ｋｉｍｍｅｌ）、Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１５２、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｉｎｃ． Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ；サンブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、（１９８９） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（第２版）、第１〜３巻、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ；およびＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ （１９９４）、ａ ｊｏｉｎｔ ｖｅｎｔｕｒｅ ｂｅｔｗｅｅｎ Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ、Ｉｎｃ． ａｎｄ Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ、Ｉｎｃ．に記載されている。
【０１４３】
ＵＣＰ−２核酸は、さまざまな増幅法で得られる場合もある。このような方法には、例えばムリス（Ｍｕｌｌｉｓ）らによる米国特許第４，６８３，２０２号；ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ （Ｉｎｎｉｓら編） Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ． Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ （１９９０）；コー（Ｋｗｏｈ）ら、（１９８９） Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：１１７３；Ｇｕａｔｅｌｌｉら、（１９９０） Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：１８７４；ロメル（Ｌｏｍｅｌｌ）ら、（１９８９） Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ． ３５：１８２６；ランダーゲン（Ｌａｎｄｅｇｒｅｎ）ら、（１９８８） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４１：１０７７〜１０８０；ヴァンブラント（Ｖａｎ Ｂｒｕｎｔ）（１９９０） Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ８：２９１〜２９４；ウー（Ｗｕ）およびウォレス（Ｗａｌｌａｃｅ）（１９８９） Ｇｅｎｅ ４：５６０；ならびにバーリンジャー（Ｂａｒｒｉｎｇｅｒ）ら、（１９９０） Ｇｅｎｅ ８９：１１７に記載された方法などがある。
【０１４４】
核酸をクローニングする別の方法として、適切な核酸を化学合成する場合がある。直接化学合成法には、例えばホスホトリエステル法（Ｎａｒａｎｇら、（１９７９） Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ． ６８：９０〜９９；ホスホジエステル法（Ｂｒｏｗｎら、（１９７９） Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ． ６８：１０９〜１５１；ジエチルホスホラミダイト法（Ｂｅａｕｃａｇｅら、（１９８１） Ｔｅｔｒａ．Ｌｅｔｔ．、２２：１８５９〜１８６２）；および固相支持体法（米国特許第４，４５８，０６６号）などがある。化学合成により一本鎖オリゴヌクレオチドが作られる。これは、相補配列とのハイブリダイゼーションにより、または一本鎖をテンプレートとして用いるＤＮＡポリメラーゼによる重合化によって二本鎖ＤＮＡに変換される。ＤＮＡの化学合成は、約１００塩基の配列に制限されることが多いが、短い配列を連結することで、長い配列を得ることができる。あるいは、サブ配列をクローン化し、また適切なサブ配列を適切な制限酵素で切断することができる。次に断片を連結することでＵＣＰ−２配列が得られる。
【０１４５】
ＵＣＰ−２核酸の調製に関する別の特定の手引きは、それぞれ全体が参照として本明細書に組み入れられるフルーリ（Ｆｌｅｕｒｙ）ら、（１９９７） Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １５：２６９〜２７２；タルタリア（Ｔａｒｔａｇｌｉａ）ら、国際公開公報第９６／０５８６１号；およびチェン（Ｃｈｅｎ）ら、国際公開公報第００／０６０８７号に記載されている。
【０１４６】
Ｂ．ＵＣＰ−２タンパク質
ＵＣＰ−２タンパク質は、天然供給源からの単離、組換え法、および化学合成で得られる。例えばＵＣＰ−２タンパク質は、クローン化されたＵＣＰ−２を宿主細胞中で発現させて調製することができる。クローン化されたＵＣＰ−２配列は、配列を発現ベクター中の発現制御配列に使用可能に連結後に宿主中で発現させる。発現ベクターは通常、宿主生物中でエピソームとして、または宿主の染色体ＤＮＡに組み込まれた状態として複製可能である。
【０１４７】
典型的には、ＵＣＰ−２をコードするポリヌクレオチドを、所望の宿主細胞内で機能するプロモーターの制御下に配置することで、比較的多量のＵＣＰ−２を産生させる。例示的な広範囲のプロモーターは既知であり、特定の応用に応じて、本発明の発現ベクター中で使用することができる。通常は、選択されるプロモーターは、プロモーターが活性な状態となる細胞に依存する。リボソーム結合部位、転写終結部位などの他の発現制御配列も任意選択で含めることができる。これらの制御配列を一つもしくは複数含むコンストラクトは「発現カセット」と呼ばれる。発現は、プロモーター、および特定の宿主細胞に適した他の制御配列を用いることで原核細胞および真核細胞内で達成することができる。例示的な宿主細胞には、大腸菌、他の細菌宿主、酵母、およびさまざまな高等真核細胞（ＣＯＳ、ＣＨＯ、およびＨｅＬａ細胞系列など）、ならびにミエローマ細胞系列などがあるがこれらに限定されない。
【０１４８】
上述の一つもしくは複数の成分を含む適切なベクターの構築には標準的な連結法が用いられる。ＵＣＰ−２をコードする配列を含む組換え核酸の調製法に関する記述は、例えばバーガー（Ｂｅｒｇｅｒ）およびキンメル（Ｋｉｍｍｅｌ）、Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、第１５２巻、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｉｎｃ．、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ （Ｂｅｒｇｅｒ）；ならびにＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、アウシュベル（Ｐ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ）ら編、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、ａ ｊｏｉｎｔ ｖｅｎｔｕｒｅ ｂｅｔｗｅｅｎ Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ、Ｉｎｃ． ａｎｄ Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、Ｉｎｃ．、（１９９８ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）（Ａｕｓｕｂｅｌ）にある。
【０１４９】
発現後、組換えポリペプチドを、硫酸アンモニウム沈殿、アフィニティカラム、イオン交換および／またはサイズ排除クロマトグラフィー、ゲル電気泳動など（一般には、Ｒ．Ｓｃｏｐｅｓ、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、 Ｎ．Ｙ． （１９８２）、Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ 第１８２巻：Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｉｎｃ． Ｎ．Ｙ． （１９９０）を参照）を含む、当技術分野で標準的な手順で精製することができる。
【０１５０】
組換え法に代わる選択肢としてＵＣＰ−２を化学合成することができる。このような方法は典型的には、固相法を含むが、溶液ベースの化学的方法、および固相法および溶液法の組み合わせを用いることもできる。タンパク質を合成する固相法の例は、メリフィールド（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ）（１９６４） Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ． ８５：２１４９；およびホートン（Ｈｏｕｇｈｔｏｎ）（１９８５） Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、８２：５１３２に記載されている。ＵＣＰ−２の断片は合成後に連結することができる。このような反応を実施する方法は、グラント（Ｇｒａｎｔ）（１９９２） Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｐｅｐｔｉｄｅ：Ａ Ｕｓｅｒ Ｇｕｉｄｅ、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．、Ｎ．Ｙ．；および「Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」、（ＢｏｄａｎｓｋｙおよびＴｒｏｓｔ編）、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｉｎｃ． Ｎ．Ｙ． （１９９３）に記載されている。
【０１５１】
ＵＣＰ−２タンパク質の調製に特有の他の手引きは、フルーリ（Ｆｌｅｕｒｙ）ら、（１９９７） Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １５：２６９〜２７２；タルタリア（Ｔａｒｔａｇｌｉａ）ら、国際公開公報第９６／０５８６１号；およびチェン（Ｃｈｅｎ）ら、国際公開公報第００／０６０８７号に記載されている。
【０１５２】
ＶＩＩ．変形形態
Ａ．類似体の合成
ＵＣＰ−２活性を高める、本明細書に記載されたスクリーニング法で同定された活性試験薬剤は、類似体化合物を合成するためのリード化合物となる場合がある。典型的には、このような類似体化合物は、リード化合物に似た電子配置および分子構造を有するように合成される。類似体化合物の同定は、自己無撞着場（ＳＣＦ）解析、配置間相互作用（ＣＩ）解析、および通常モードの動力学解析などの手法で行うことができる。以上の手法を実施するためのコンピュータプログラムがある。これについては、例えばレイン（Ｒｅｉｎ）ら、（１９８９） Ｃｏｍｐｕｔｅｒ−Ａｓｓｉｓｔｅｄ Ｍｏｄｅｌｉｎｇ ｏｆ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ−Ｌｉｇａｎｄ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ （Ａｌａｎ Ｌｉｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）を参照されたい。
【０１５３】
類似体が調製されたら、本明細書に開示された方法でスクリーニングを行い、ＵＣＰ−２活性を高める能力を示す類似体を同定できる。次に、このような化合物を対象に、さらに解析を行うことで、薬剤として大きな可能性を有すると考えられる化合物を同定することができる。あるいは、スクリーニング法で活性をもつことが明らかとなった類似体は、本明細書に記載された方法でスクリーニングを行うことが可能な、さらなる類似体の調製におけるリード化合物となる場合がある。スクリーニング段階、類似体の合成段階、および再スクリーニング段階のサイクルは複数回繰りかえすことができる。
【０１５４】
Ｂ．薬学的組成物
１．組成物
上述のスクリーニング法で同定された化合物、その類似体、およびＵＣＰ−２そのものは、脳卒中を含むさまざまな神経疾患の治療用に製剤化される薬学的組成物中の活性成分となりうる。組成物は、輸送および有効性を促進する他のさまざまな薬剤を含む場合もある。例えば組成物は、血液脳関門の透過性を高める能力を有する薬剤を含む場合がある。同時投与が可能な他の薬剤には、抗凝血剤や血液低粘稠化剤などがある。組成物は、活性成分の輸送および安定性を促進するさまざまな薬剤を含む場合もある。
【０１５５】
したがって例えば組成物は、所望の製剤化に応じて、動物またはヒトへの投与用の薬学的組成物の製剤化に一般に使用される輸送体として定義される、希釈物の、薬学的に許容される非毒性の担体を含む場合もある。希釈剤は、組み合わせの生物学的活性に影響を及ぼさないように選択される。このような希釈物の例には、蒸留水、緩衝水、生理食塩水、ＰＢＳ、リンガー液、デキストロース溶液、およびハンクス液などがある。また薬学的組成物または製剤は、他の担体、アジュバント、または非毒性で非治療用の非免疫原性の安定剤や賦形剤などを含む場合がある。組成物はまた、生理的条件に近づけるための他の物質（ｐＨ調整剤、および緩衝剤、毒性調整剤、湿潤剤、ならびに界面活性剤など）を含む場合もある。
【０１５６】
組成物は、任意のさまざまな安定剤（例えば抗酸化剤など）を含む場合もある。薬学的組成物がポリペプチド（例えばＵＣＰ−２）を含む場合、このポリペプチドは、ポリペプチドのインビボにおける安定性を促進する、またはこれ以外では、薬学的特性（例えば、ポリペプチドの半減期の延長、毒性の低下、可溶性もしくは取り込みの促進）を促進する、さまざまな既知の化合物との複合体を形成する場合がある。このような修飾剤、もしくは錯化剤の例には、硫酸塩、グルコン酸塩、クエン酸塩、およびリン酸塩などがある。組成物のポリペプチドは、インビボにおける性質を促進する分子と複合体を形成する場合もある。このような分子には例えば、糖質、ポリアミン、アミノ酸、他のペプチド、イオン類（例えばナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、マンガン）、および脂質が含まれる。
【０１５７】
さまざまな種類の投与に適した製剤に関する、さらなる手引きは、レミントン薬理学（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）、Ｍａｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、ＰＡ、第１７版 （１９８５）に記載されている。薬剤輸送法に関する簡潔な総説についてはランガー（Ｌａｎｇｅｒ）、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：１５２７〜１５３３ （１９９０）を参照されたい。
【０１５８】
２．投与量
薬学的組成物は、予防的および／または治療的な処置のために投与される場合がある。活性成分の毒性、および治療効率は、例えばＬＤ５０（集団の５０％が致死となる用量）、およびＥＤ５０（集団の５０％に治療的に有効な用量）の決定を含む、細胞培養物および／または実験動物を対象とする標準的な薬学的手順で決定することができる。毒性作用と治療的作用間の用量の比が治療指数であり、ＬＤ５０／ＥＤ５０の比として表すことができる。大きな治療指数を示す化合物が好ましい。
【０１５９】
細胞培養物、および／または動物を対象とした試験から得られるデータを、ヒトに対する投与量範囲の定式化に用いることができる。活性成分の投与量は典型的には、毒性がほとんどないか全くないＥＤ５０を含む循環濃度の範囲内にある。投与量は、使用される投与剤形、および採用される投与経路に依存して、同範囲内で変動する場合がある。
【０１６０】
３．投与
本明細書に記載された薬学的組成物は、多種多少な方法で投与される場合がある。例には、薬学的に許容される担体を含む組成物を、経口、経鼻、直腸内、局所、腹腔内、静脈内、筋肉内、皮下（ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓ、ｓｕｂｄｅｒｍａｌ）、経皮、髄腔内、および頭蓋内への方法で投与する段階が含まれる。
【０１６１】
経口投与の場合、活性成分は、カプセル、錠剤、および粉末などの固体状の剤形で、またはエリキシル、シロップ、および懸濁物などの液体状の剤形で投与される場合がある。活性化合物は、ゼラチンカプセル中に、活性成分および粉末状担体（グルコース、乳糖、ショ糖、マンニトール、デンプン、セルロース、またはセルロース誘導体、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、サッカリンナトリウム、滑石粉、炭酸マグネシウムなど）とともに封入することができる。所望の色、味、安定性、緩衝能、分散性、または他の既知の所望の特性を加えるために添加することができる他の不活性成分の例には、ベンガラ、シリカゲル、ラウリル硫酸ナトリウム、二酸化チタン、および食用白色インクなどがある。同様の希釈物は圧縮錠を作製する際に用いられる場合がある。錠剤とカプセル剤はいずれも、数時間におよぶ薬剤の連続的な放出をもたらす徐放剤として作製することができる。圧縮錠は、不快な味を隠し、また錠剤を大気から保護するために糖衣状またはフィルムコート状の場合があるほか、消化管内で選択的に崩壊させるために腸溶性とすることができる。経口投与用の液体状の剤形は、患者に受け入れられやすいように着色剤および香料を含む場合がある。
【０１６２】
活性成分は単独で、または他の適切な成分と組み合わせることで、吸入投与されるエアゾル状の剤形（「噴霧」可能となる）とすることができる。エアゾル剤形は、加圧型噴霧剤であるジクロロジフルオロメタン、プロパン、窒素などの中に含めることができる。
【０１６３】
経腸投与に適した剤形には例えば、坐剤基剤とともにパッケージされた活性成分を含む坐剤がある。適切な坐剤基剤には、天然もしくは合成のトリグリセリド、またはパラフィン炭化水素などがある。また、例えば液体状のトリグリセリド、ポリエチレングリコール、およびパラフィン炭化水素を含む基剤ベースとともにパッケージされた活性成分の組み合わせを含むゼラチン製経腸用カプセルを使用することも可能である。
【０１６４】
非経口投与、例えば関節内、静脈内、筋肉内、皮内、腹腔内、および皮下の経路に適した剤形には、抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤、および製剤を、意図されたレシピエントの血液と等張化させる溶質を含む場合がある水性および非水性の等張性の無菌性注射液、ならびに懸濁性薬剤、溶解剤、増粘剤、安定剤、および保存剤を含む場合がある水性および非水性の無菌性懸濁物などがある。
【０１６５】
薬学的組成物の製剤化に使用される化合物は、好ましくは純度が高く、有害な恐れのある混入物を実質的に含まない（例えば少なくともＮａｔｉｏｎａｌ Ｆｏｏｄ （ＮＦ）グレード、一般には少なくとも分析グレード、またさらに典型的には少なくとも製薬グレード）。また、インビボで使用が意図される組成物は通常、無菌性である。任意の化合物が使用前に合成されなければならない限り、結果として得られる産物は、典型的には、任意の潜在的に毒性を有する薬剤、具体的には合成段階または精製段階中に存在する可能性のあるエンドトキシンを実質的に含まない。非経口投与用の組成物も無菌性であり、実質的に等張性であり、ＧＭＰ条件下で製造される。
【０１６６】
以下の実施例は、本発明のある局面を詳細を説明する目的のみで提供され、本発明の範囲を制限する意図はない。
【０１６７】
実施例１
前処置ラットモデルにおけるＵＣＰ−２の差次的発現
１．背景
中等度の期間の全汎的脳虚血は、げっ歯類ならびにヒトと脳の海馬で選択的な神経変性を引き起す。特に感受性が高い領域は、ＣＡ１と呼ばれる海馬の小領域の錘体神経である。虚血に対する特異的な感受性は、全汎的脳虚血後にみられる選択的な神経変性の一例である。細胞死の過程は緩やかに進む過程であり、光学顕微鏡では１０分間の虚血障害から回復後の３６〜４８時間まで認められない。この期間中、ニューロンは機能状態を回復の少なくとも２４時間後まで保つ。
【０１６８】
それ自身は虚血性損傷を引き起さない、一定期間における３分間の虚血障害後の１０分の虚血障害の場合は、神経変性はＣＡ１領域でみられない。この現象は虚血前処置と呼ばれ、心臓および腎臓、またおそらく他の臓器でもみられる。
【０１６９】
ＩＩ．実験／結果
Ａ．ＵＣＰ−２の差次的発現
同じ系列、週齢、および性別のラットを以下の二つの実験群に分けた：（ａ）第一群のラット（「実験群」）には、低血圧下で全汎的虚血を誘導するために、頸動脈の１回の３分間におよぶ両側性閉鎖を含む外科的処置を行い、また（ｂ）第二群のラット（「対照群」）には擬似的な処置を行った。擬似処置を行ったラットはシクロヘキシミドで処理して麻酔を行ったが、動脈閉鎖は行わなかった。ラットは、外科的処置の４時間後に殺すか、または擬似処置を行い、海馬のＣＡ１領域を摘出した。採取組織から調製したポリＡ＋ ＲＮＡを、二本鎖のｃＤＮＡ （ｄｓｃＤＮＡ）に変換した。サブトラクティブハイブリダイゼーションを、擬似処置ラットから調製した過剰なｄｓｃＤＮＡで前処置したラットに由来するｄｓｃＤＮＡを用いて実施した。異なって発現された遺伝子断片をプラスミドベクターにクローン化し、結果として得られたライブラリーで大腸菌細胞を形質転換した。組換えクローンの挿入物はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）で増幅した。ＰＣＲ産物（長さが２００〜２，０００ ｂｐの断片）の配列を、一般的なベクター配列に相補的なオリゴヌクレオチドを用いて決定した。
【０１７０】
差次的に発現されたクローン化断片は、以下の４種の独立したクローンを含んでいた：（ａ）ＳＬ３ｂＥ＿Ｆ１９（配列番号：３）；ＳＬ３ｂＦ＿Ｄ２０（配列番号：４）；ＳＬ３ｂＣ＿Ｍ２４（配列番号：５）；およびＳＬ３ｂ＿ＣＰ２＿Ｊ１１（配列番号：６）（発現レベルは上昇していることがわかった）。これらのクローンについて決定した配列を、ＢＬＡＳＴ（ｂｌａｓｔｎおよびｔｂｌａｓｔｘ）アルゴリズムを用いて公的データベースと比較した。４種のクローンのＤＮＡ配列は、ラットのＵＣＰ−２の配列（ゲンバンクアクセッション番号ＡＢ１０７４３、ＵＣＰ−２のＲａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ ｍＲＮＡ）と一定することがわかった。
【０１７１】
Ｂ．インサイチューハイブリダイゼーション
一連のインサイチューハイブリダイゼーション実験を行い、虚血前処置後におけるＵＣＰ−２ ｍＲＮＡのＣＡ１特異的な発現上昇を確認した。インサイチューハイブリダイゼーション実験は、実験群および対照群のラットに由来する脳切片を対象に、二種の異なるプローブを用いて標準的なプロトコルで行った［例えばＨａｒｒｉｓ、Ｄ．Ｗ． （１９９６） Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２４３：２４９〜２５６；Ｓｉｎｇｅｒら、（１９８６） Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ４：２３０〜２５０；Ｈａａｓｅら、（１９８４） Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、第ＶＩＩ巻、１８９〜２２６；およびＮｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ （Ｈａｍｅｓら編、１９８７）を参照］。第一のプローブ「オリゴ２８」の配列は以下の通りであった
2004523216.tif 000002
第二のプローブ「オリゴ３３」の配列は以下の通りであった：
2004523216.tif 000003
【０１７２】
インサイチューハイブリダイゼーションの結果は図１Ａ〜１Ｄ（オリゴ２８で得られた結果）、および図２Ａ〜２Ｄ（オリゴ３３で得られた結果）に示す。オリゴ２８または３３のいずれかをプローブとして用いた際には、通常の条件下のラットでは、ＣＡ１領域におけるＵＣＰ−２ ｍＲＮＡの発現は低い（擬似処置；図１Ａおよび２Ａ）。この発現は、３分間の虚血の２日後の時点で上昇している（３分間のＩＰＣ；図１Ｂおよび２Ｂ）。１０分間の虚血後の回復の１日後（細胞死に至る約１２時間前）には、対照と比較してＵＣＰ−２ ｍＲＮＡの上昇はみられない（ｓｈ ＋ １０分間の虚血；図１Ｃおよび２Ｃ）。しかし１０分間の虚血期間に３分間の前処置エピソードを先行させると、ＣＡ１領域におけるＵＣＰ−２発現は上昇する（３分間のＩＰＣ ＋ １０分間の虚血；図１Ｄおよび２Ｄ）。ＵＣＰ−２の発現は、ラットの海馬の虚血耐性のＣＡ３領域（図１Ａ〜１Ｄ）、ならびに３分間および１０分間の虚血期間後の防御されたＣＡ１領域では高い（図１Ｄ）。したがって、ＵＣＰ−２ ｍＲＮＡの発現プロフィールは、神経防御状態の確立と良好に相関する。
【０１７３】
虚血前処置のインビボおよびインビトロモデル系を用いることで、ＵＣＰ−２ ｍＲＮＡレベルが、インサイチューハイブリダイゼーションおよびｃＤＮＡを用いて測定すると、場合によっては約１．５倍上昇することがわかった。定量時には、インサイチューハイブリダイゼーションの画像をスキャンし、ＣＡ１領域におけるピクセル密度を、５枚の独立したインサイチュー画像を元に解析した。擬似処置を行ったラットのＣＡ１のピクセル密度（図１Ａ、２Ａ）は２３±１０であり、３分間の虚血＋４８時間の回復時間の際のピクセル密度（図１Ｂ、２Ｂ）は３３±１３であった。この結果は、対のあるｔ検定で統計的に有意である（ｐ＜０．０１１）。独立した証拠として、ＵＣＰ−２ ｍＲＮＡの発現レベルの上昇がｃＤＮＡアレイ解析でも判定されている：４種のＵＣＰ−２を含むクローン（ＳＬ３ｂＥ＿Ｆ１９．Ｓｅｑ；ＳＬ３ｂＦ＿Ｄ２０．Ｓｅｑ；ＳＬ３ｂＣ＿Ｍ２４．Ｓｅｑ；およびＳＬ３ｂ＿ＣＰ２＿Ｊ１１．Ｓｅｑ）の組換え挿入体を固相支持体上に配置し、インビボにおける虚血前処置、および全汎的虚血を行ったラットのＣＡ１領域に由来する標識ｃＤＮＡ、またはインビトロにおける酵素−グルコース欠乏状態（下記参照）においたラットの皮質ニューロン培養物に由来する標識ｃＤＮＡとハイブリッドを形成させた。いずれの場合も、対照ＣＡ１領域または対照培養物と比較して、ＵＣＰ−２ ｍＲＮＡ量に１．５倍の上昇が認められた。
【０１７４】
Ｃ．ＵＣＰ−２発現のウエスタンブロット解析
ラットの前処置した一次皮質ニューロン培養物におけるＵＣＰ−２タンパク質のレベルをウエスタンブロットで解析した。一次皮質細胞培養物は、妊娠１７日目における胎児ラットから調製した。簡単に説明すると、皮質を顕微鏡下で切除し、細胞を改変イーグル培地（ＭＥＭ）、１０％ウマ血清、１０％ウシ胎児血清、２ ｍＭ グルタミン中で摩砕後に、０．０２７％トリプシン／生理食塩水（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、Ｍａｒｙｌａｎｄ）中で３０分間消化して解離させた。細胞は、ポリオルニチンでコーティングした１５ ｍｍのマルチウェル（Ｎｕｎｃ）プレート中に、１ウェルあたり３〜４×１０５ 個の密度となるようにプレーティングした。プレーティングから４日後に、細胞を１０ μｇ／ｍｌの５−フルオロ−２’−デオキシウリジンで３日間かけて処理し、非ニューロン細胞の増殖を抑制した。培養物はＭＥＭ、５％ウマ血清、２ ｍＭ グルタミン中で、８％ ＣＯ２で加湿した３７℃の大気中で維持した。培地は週に２回交換した。成熟ニューロン（培養１４日目）をすべての実験に使用した。混合型酸素−グルコース欠乏は、培地を、脱酸素化した、グルコースを含まない、１１６ ｍＭ ＮａＣｌ、５．４ ｍＭ ＫＣｌ、０．８ ｍＭ ＭｇＳＯ４、１ ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、および０．９ ｍＭ ＣａＣｌ２を含むアール平衡塩類溶液（ＥＢＳＳ）に全交換し、５％ Ｈ２／８５％ Ｎ２／５％ ＣＯ２の気泡を加えながら行った。培養物は、混合気体を含む嫌気チャンバー内で５分間または６０分間維持した。ＯＧＤは、培養物をチャンバーから取り出し、ＥＢＳＳ溶液を酸素付加した成長培地と交換することで終了した。
【０１７５】
高レベルのＵＣＰ−２タンパク質が、ＯＧＤ（１０分間）、または４０ μＭのＮＭＤＡ（５分間）のいずれかの曝露により前処置した皮質ニューロン培養物中に認められた。この結果を図３に示す。
【０１７６】
前述の結果は、ＵＣＰ−２の発現上昇が神経損傷と逆相関することを示している。言い替えると、この結果は、ＵＣＰ−２の発現パターンが、虚血中および虚血後に脳の神経防御状態と相関することを示している。これらの結果は、ＵＣＰ−２の活性を高めることが可能な薬剤が神経防御性を有し、脳卒中および他の神経変性疾患に対する治療薬となりうることを示している。
【０１７７】
実施例２
組換えＵＣＰ−２ アデノウイルスによるニューロン内におけるＵＣＰ−２過剰産生による神経防御
Ｉ．方法
Ａ．組換えＵＣＰ−２アデノウイルスの作製
ラット脳全体のｃＤＮＡを用いて、ラットのＵＣＰ−２に対応する９３０ヌクレオチドのＯＲＦ（読み枠）を含むＰＣＲ断片を得た。ＰＣＲ産物をＴ／ＡクローニングベクターｐＣＲ２．１ （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ）に連結して配列を決定した。ラットＵＣＰ−２のｃＤＮＡを次にｐＳｈｕｔｔｌｅ−ＣＭＶ輸送ベクター（Ｑｕａｎｔｕｍ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｍｏｎｔｒｅａｌ）にサブクローン化した。結果として得られたプラスミドをＰｍｅＩで直線化し、大腸菌株ＢＪ１８３をウイルスＤＮＡプラスミドｐＡｄＥａｓｙ−１（Ｑｕａｎｔｕｍ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｍｏｎｔｒｅａｌ）とともに同時形質転換した。ｐＡｄＥａｓｙ−１は、Ｅ１およびＥ３が欠失しており、またＥ１機能は２９３細胞内で相補可能である。組換え体をカナマイシンで選択し、制限酵素解析でスクリーニングを行った。次に組換えアデノウイルスコンストラクトをＰａｃＩで切断してＩＴＲ（末端繰返し配列）を露出させ、２９３細胞にトランスフェクトしてウイルス粒子を得た。１０１２ ＶＰ／ｍｌ（ウイルス粒子／ｍｌ）のストックの組換えＵＣＰ−２アデノウイルスが得られた。強力なＣＭＶ（サイトメガロウイルス）プロモーターによって誘導される組換えラットＵＣＰ−２の発現は、感染２９３細胞を対象にウエスタンブロット解析で確認した。
【０１７８】
Ｂ．インビトロにおけるＵＣＰ−２の機能検証
細胞培養：一次皮質ニューロン培養物を１７日齢の胎児ラットから調製した。皮質は顕微鏡下で切除し、細胞を、改変イーグル培地（ＭＥＭ）、１０％ウマ血清、１０％ウシ胎児血清、２ ｍＭ グルタミン中で摩砕後に、０．０２７％トリプシン／生理食塩水中で３０分間かけて消化して解離させた。細胞を、ポリオルニチンでコーティングされた６ ｍｍのマルチウェル（Ｎｕｎｃ）プレートに、ウェルあたりの密度が１〜２×１０５個となるようにプレーティングした。プレーティングから４日後に、培養物を１０ μｇ／ｍｌの５−フルオロ−２’−デオキシウリジンで３日間処理して、非ニューロン細胞の増殖を抑制した。培養物は、ＭＥＭ、５％ウマ血清、２ ｍＭ グルタミン中で、８％ ＣＯ２で加湿しながら３７℃の大気下で維持した。培地は週に２回交換した。成熟ニューロン（インビトロで１２日、ＤＩＶ１２）をすべての実験に使用した。成熟培養物中では、ニューロンは総細胞数の７０〜９０％を占める。
【０１７９】
ニューロンの感染：ニューロンを、ラットのＵＣＰ−２を含む組換えアデノウイルスに２×１０１０ ＶＰ／ｍｌ（おおよその感染多重度は細胞１個あたり２０個のウイルス粒子）になるように曝露させた。同じプロモーター（ＣＭＶ）によって誘導されるｌａｃＺ遺伝子を発現するアデノウイルスを対照として用いた。ＤＩＶ１２ニューロン培養物は、無血清培地中で３７℃で２時間かけて組換えアデノウイルスに曝露させた。このインキュベーション中、細胞は１５分ごとに緩やかに振盪した。無血清培地中で２時間経過した後に、５％ウマ血清を含む通常の成長培地を培養物に添加した。実験は、感染細胞を対象に、ウイルス粒子へ曝露してから２４時間後に行った。
【０１８０】
虚血：混合型酸素−グルコース欠乏（ＯＧＤ）は、培地を、脱酸素化した、グルコースを含まない、１１６ ｍＭ ＮａＣｌ、５．４ ｍＭ ＫＣｌ、０．８ ｍＭ ＭｇＳＯ４、１ ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、および０．９ ｍＭ ＣａＣｌ２を含むアール平衡塩類溶液（ＥＢＳＳ）に全交換し、５％ Ｈ２／８５％ Ｎ２／５％ ＣＯ２の気泡を加えながら、ニューロンに対するアデノウイルス感染から２４時間後に行った。培養物は、混合気体（５％ Ｈ２／８５％ Ｎ２／５％ ＣＯ２）を含む無菌性チャンバー内で９０分間３７℃で維持した。ＯＧＤは、培養物をチャンバーから取り出し、ＥＢＳＳ溶液を酸素付加した成長培地と交換することで終了した。
【０１８１】
生存／細胞死アッセイ法：ニューロンの生存率をＯＧＤから２４時間後に評価し、生存細胞に対する死滅細胞の比として判定された細胞死の百分率で表した。細胞が生存していることは、死んだニューロンの核を８ μＭのエチジウムホモダイマーで、また生きている細胞の細胞質をカルセイン（Ｃａｌｃｅｉｎ）で染色後に蛍光プレートリーダーで蛍光読み値を決定して判定した。一部の処理条件については、細胞生存の結果は、１ μｇ／ｍｌ Ｈｏｅｓｃｈｔ ３３３４２ですべての核を、また死んだ細胞の核を７ μＭのヨウ化プロピジウムで染色後に、コンピュータ支援細胞計数を用いた独立した方法で確認した。１回の実験につき３個の異なるウェルを対象に少なくとも３回の独立した実験を行った。
【０１８２】
ウエスタンブロット解析：ラットの一次ニューロン培養物におけるＵＣＰ−２発現をウエスタンブロットで解析した。各フラクションに由来する計６０ μｇのタンパク質を、１０〜２０％アクリルアミド勾配ゲルで分離し、ニトロセルロースメンブレン上にブロットし、抗ＵＣＰ２ 抗体または抗ＭＡＰ−２抗体で展開した。
【０１８３】
免疫蛍光解析：一次ニューロンを、ＰＤＬでコートしたカバースリップ上で培養し、Ａｄ．ＵＣＰ−２を感染させた。ミトコンドリア選択的プローブであるＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒグリーン（２５０ ｎＭ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅ、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ）を用いて、培地中で３７℃で３０分間かけて細胞を染色した。ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒグリーンとのインキュベーション後、細胞をＰＢＳで洗浄し、調製直後の４％パラホルムアルデヒド（溶媒はリン酸緩衝液溶液；ＰＢＳ）で３０分間かけて３７℃で固定した後に、０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を４℃で３分間かけて透過させた。固定した細胞は、５％ ＢＳＡ、０．１％ Ｔｗｅｅｎ ２０（溶媒：ＰＢＳ）で１時間かけて室温でブロックし、ＵＣＰ−２を認識するモノクローナル抗体（１：１００、ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ、ＣＡ）と一晩４℃でインキュベートした。ＰＢＳで２回洗浄後、一次抗体をＣｙ（商標）３−結合抗ウサギＩｇＧ （１：１００ Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｉｎｃ． ＰＡ）で検出した。ニューロンをマウントし、油浸下で倍率１００倍で蛍光顕微鏡により観察した。画像はデジタルビデオカメラシステム（Ｏｐｔｒｏｎｉｃｓ、Ｇｏｌｅｔａ、ＣＡ）で撮影した。
【０１８４】
ＩＩ．結果
図４は、ラットの一次皮質ニューロン培養物中のＵＣＰ−２タンパク質レベルのウエスタンブロット解析の結果を示す。組換えアデノウイルスの感染から２４時間後に、ＵＣＰ−２タンパク質レベルは、Ａｄ．ｌａｃＺ感染培養物と比較してＡｄ．ＵＣＰ−２曝露培養物の方が約２０倍高かった。抗ＭＡＰ２抗体でプローブ処理することで、同等のタンパク質がローディングされていることを確認している。
【０１８５】
ラットの一次ニューロン培養物中におけるＵＣＰ−２組換え体発現の免疫蛍光解析の結果を図５に示す。培養物に組換えＵＣＰ−２アデノウイルスを感染させ、ＵＣＰ−２に特異的な抗体（ＵＣＰ−２）、またはミトコンドリア選択的色素（ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ）で染色した。画像は１０倍および１００倍の倍率で撮影した。染色パターンから、ＵＣＰ−２タンパク質がミトコンドリアに局在していることがわかる。
【０１８６】
ＵＣＰ−２の過剰発現が、ＯＧＤに起因するニューロンの細胞死に及ぼす作用を図６Ａと６Ｂに示す。組換えアデノウイルス系で誘導される作用に対する対照には、レポーターとしてｌａｃＺ遺伝子を使用した。ＯＧＤは、ｌａｃＺアデノウイルスを感染させた培養物、および非感染対照細胞におけるニューロン細胞死の９０％以上を誘導した（図６Ａ）。これとは対照的に、組換えＵＣＰ−２を発現するニューロンは、ＯＧＤが細胞死を４８％しか引き起さなかったことから、ＯＧＤ誘導性損傷から顕著に守られていた。これらの結果は、ＵＣＰ−２の過剰発現がＯＧＤ誘導性の細胞死に対するニューロン防御の５５〜６０％をもたらすことを示しており、ＵＣＰ−２が、虚血に対する神経防御タンパク質として大きな役割を果たすことがわかる。
【０１８７】
皮質ニューロン培養物におけるＵＣＰ−２の過剰発現は、ＯＧＤ誘導性の細胞死に対してある程度の耐性（５２％の防御）を示し、これは、インビトロにおいて虚血前処置で誘導される防御（５９％の防御）と極めて近い（図６Ｂ）。
【０１８８】
以上の結果は、ＵＣＰ−２および虚血前処置が共通の神経防御経路を誘導する可能性があることを意味しており、さらに脳卒中、全汎的虚血、およびおそらく他の神経学的障害で誘導されるニューロンの喪失に対してＵＣＰ−２が顕著な神経防御作用をもつことを支持する。
【０１８９】
実施例３
ＵＣＰ−２の過剰発現によるインビボにおける虚血性脳損傷の低下
ＵＣＰ−２の過剰発現が虚血脳損傷にインビボにおいて及ぼす作用を調べるために、マウスの局所虚血を、シリコーンでコーティングされた６−ナイロン縫合糸を、Ｎ２Ｏ／Ｏ２（７０／３０）の混合気体中に含まれる２％ハロタンの存在下で中大脳動脈に、ハラ（Ｈａｒａ）ら、Ｊ．Ｃｅｒｅｂ．Ｂｌｏｏｄ Ｆｌｏｗ Ｍｅｔａｂ． １６、６０５ （１９９６）に記載された手順で（ただしマウスはオープンマスクを通して自然呼吸させながら）挿入することで誘導した。体温は３６〜３８℃に維持し、皮質の血流をレーザードップラー血流計で測定した。５０分間の閉塞後にナイロン縫合糸を除去した。創傷を縫合し、２４時間かけてマウスを回復させてから殺した。脳切片を作製し、生組織は三塩化テトラゾリウムがミトコンドリアにより酸化されて赤く染色された。梗塞は、クロダ（Ｋｕｒｏｄａ）ら、Ｊ Ｃｅｒｅｂ Ｂｌｏｏｄ Ｆｌｏｗ Ｍｅｔａｂ １９、７７８ （１９９９）に記載された手順で計算した。
【０１９０】
図７は、野生型マウス（ｗｔ）、およびＵＣＰ−２／３トランスジェニックマウス（ＵＣＰ−２／３ Ｔｇ）の中大脳動脈の閉鎖によって誘導された虚血脳損傷を示す。上の写真の白い領域は組織の損傷を示す。下のグラフのデータは、平均梗塞サイズをｍｍ３±ＳＥＭで示す（Ｍａｎｎ Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ検定、ｎ＝９）。この結果は、ＵＣＰ−２を過剰発現させると梗塞サイズが小さくなることを示しており、インビボにおける虚血脳損傷の減少を意味する。
【０１９１】
実施例４
ＵＣＰ−２による、ミトコンドリア透過性変化、シトクロムＣ放出、およびカスパーゼ３活性化の調節
Ｉ．方法
脳のミトコンドリアの単離および解析：ラット脳のミトコンドリアを、シュン（Ｘｉｏｎｇ）ら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｔｒａｕｍａ． １４、２３ （１９９７）に記載の方法を一部変更して単離した。マウスの皮質を、２ ｍｌ容のコンテステフロン（Ｋｏｎｔｅｓ Ｔｅｆｌｏｎ）ホモジナイザーを用いて、３２０ ｍＭ ショ糖、１ ｍＭ ＥＧＴＡ、１０ ｍＭ Ｔｒｉｓ （ｐＨ ７．４）中でホモジナイズした。細胞破片は沈殿化させた（２，０００ ｇ、３分、４℃）。上精を遠心した（１０，０００ ｇ、１０分、４℃）。粗ミトコンドリアペレットを、ホモジナイズ緩衝液中で１回洗浄した。ミトコンドリア調製物の呼吸活性は、シムス（Ｓｉｍｓ）、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ． ５５、６９８ （１９９０）に記載の手順で決定した。ミトコンドリアによるフリーラジカルの発生は、４８８ ｎｍのアルゴンレーザーを装着したＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒでフローサイトメトリー解析により測定した。使用した蛍光プローブの濃度は、対照と比較してＲＣＲに影響を及ぼさなかった。
【０１９２】
解析については、ミトコンドリアを、５ ｍＭのコハク酸も含む５００ μｌの緩衝液（２５０ ｍＭ ショ糖、２０ ｍＭ ＭＯＰＳ、１０ ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｂａｓｅ、１００ μＭ Ｐｉ（Ｋ）、０、５ ｍＭ Ｍｇ２＋、ｐＨ ７．０）中に懸濁した。解析ゲートの純度を評価するために、ミトコンドリアを１００ ｎＭ １０−ノニル−アクリジンオレンジ（Ｍｏｌ．Ｐｒｏｂｅｓ、Ｏｒｅｇｏｎ、ＵＳＡ）で染色した。このゲートは、Ｈ２ＤＣＦ−ＤＡ解析（Ｔｅｒａｎｉｓｈｉら、Ｅｘｐ．Ｍｏｌ．Ｐａｔｈｏｌ． ６８、１０４ （２０００）によるフリーラジカル発生の解析に用いた。計４０ μｇのミトコンドリアタンパク質を、１０ μＭのＨ２ＤＣＦＤＡの存在下もしくは非存在下で、５ ｍＭ コハク酸、１ μＭ ＣｓＡを含む５００ μｌの解析緩衝液中に再懸濁した。Ｈ２ＤＣＦＤＡはＲＯＳと反応すると蛍光化合物ＤＣＦに変換される。各試料について蛍光の幾何平均値を計算し、各試料のバックグラウンド蛍光を差引いた。結果として得られた値を、二つの遺伝子型間で異なる時点で比較した。試料は３回解析を行った。各時点において、各試料の平均蛍光を計算し、対照値（バックグラウンド）を差引いた。
【０１９３】
ミトコンドリア膜電位の解析：ラットの一次ニューロン培養物を、２ μｇ／ｍｌのＪＣ−１ （Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）と２０分間、３７℃でインキュベートした。インキュベーション後に細胞を１×ＰＢＳで２回洗浄し、４７５ ｍｍの励起フィルターを用いて蛍光顕微鏡で観察した。
【０１９４】
ミトコンドリアタンパク質のウエスタンブロット解析：ラットの一次皮質ニューロン培養物に由来する細胞質およびミトコンドリアの抽出物を、ＡｐｏＡｌｅｒｔ Ｃｅｌｌ Ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ Ｋｉｔ （Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いて製造業者の指示書通りに調製した。各フラクションに由来する計６０ μｇのタンパク質を、１０〜２０％アクリルアミド勾配ゲルで分離し、ニトロセルロースメンブレン上にブロットし、抗シトクロムｃ抗体（１：５００、ＢＤ Ｐｈａｎｎｉｎｇｅｎ）で展開した。
【０１９５】
カスパーゼ−３活性アッセイ法：カスパーゼ−３活性アッセイ法を実施して、ＵＣＰ−２の過剰発現がアポトーシスカスケードに及ぼす作用を調べた。カスパーゼ−３活性は、ラットの一次皮質ニューロン培養物の全細胞溶解液を対象に、Ｃａｓｐａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いて製造業者の指示書通りに測定した。カスパーゼ−３活性化アッセイ法は、哺乳類細胞中のカスパーゼ−３活性を調べる単純な手法となる。このアッセイ法では、７−アミノ−４−トリフルオロメチルクマリン（ＡＦＣ）の蛍光放出シフトが、カスパーゼ３によるＡＦＣ−基質コンジュゲートの切断後に検出される。ＤＥＶＤ−ＡＦＣは通常、青色光（λｍａｘ＝４００ ｎｍ）を放出する。しかし、カスパーゼ３により基質がタンパク質分解性の切断を受けると、遊離のＡＦＣが５０５ ｎｍにおいて黄色−緑色の蛍光を発する。組換えＵＣＰ−２アデノウイルスの作製、細胞培養条件、ニューロン細胞への感染、ＯＧＤの誘導、および生存／細胞死アッセイ法は、実施例２に記載した手順で実施した。
【０１９６】
ＩＩ．結果
単離した脳ミトコンドリアを、図８に示すようにフローサイトメトリーで解析した。左上のパネルは、側方散乱（ＳＳＣ）および前方散乱（ＦＳＣ）をプロットした結果を示す。個々の点は１個の粒子を表し、Ｒ１領域内の粒子を解析用に選択した。試料は、ミトコンドリア（カルジオリピン）色素である１００ ｎＭの１０−ノニル−アクリジンオレンジ（ＮＡＯ）で染色した。右上のパネルに示すように、ゲートＲ１内の９８％以上がＮＡＯ（右のピーク）で染色され、主にミトコンドリアが解析されたことを示唆する（右上）。図８の右上のパネルの左側のピークはバックグラウンドの試料の蛍光を示す。図８の左下のパネルは、ＵＣＰ−２／３ Ｔｇラット（中央のピーク）、および野生型ラット（右側のピーク）の皮質から単離したミトコンドリア中に活性酸素種（ＲＯＳ）が発生していることを示す（Ｈ２ＤＣＦ−ジアセテートに由来するジクロロフルオレセイン（ＤＣＦ）の生成を測定）。パネルの左側のピークはバックグラウンドの蛍光を示す。右下のパネルは、ＵＣＰ−２／３ Ｔｇラット（四角、点線）、および野生型ラット（三角、実線）のＨ２ＤＣＦ（右下）とのインキュベーションの５つの時点における脳皮質ミトコンドリア内におけるＲＯＳの生成を示す。これらの値は、対応のないスチューデントのｔ−検定で比較した（＊＝ｐ＜０．０５）。
【０１９７】
この結果は、ＵＣＰ−２の過剰発現が、ラットの一次皮質ニューロン培養物におけるＯＧＤ誘導性のミトコンドリア膜脱分極をブロックすることを示している。培養物にＡｄ．ＵＣＰ−２またはＡｄ．ｌａｃＺを感染させ、２４時間後に９０分のＯＧＤを行った。ミトコンドリア膜電位の変化は、陽イオン性蛍光色素ＪＣ−１を用いて、ＯＧＤから８時間後に定性的に評価した。Ａｄ．ｌａｃＺを感染培養物と比較して、Ａｄ．ＵＣＰ−２を発現する培養物は、高い赤色／緑色蛍光比（データは提示していない）を示し、ミトコンドリア膜電位が保たれていることがわかった。
【０１９８】
細胞質、およびミトコンドリアの細胞フラクションにおけるシトクロムｃタンパク質のレベルを調べたウエスタンブロット解析の結果を図９に示す。ラットの一次皮質培養物にＡｄ．ＵＣＰ−２またはＡｄ．ＧＦＰを感染させ、３６時間後に９０分間のＯＧＤを行った。細胞質（Ｃ）およびミトコンドリア（Ｍ）の各フラクションは、ＯＧＤ曝露から２４時間後に調製し、タンパク質濃度を補正し、シトクロムｃに特異的な抗体を用いて免疫ブロット解析を行った。Ａｄ．ＧＦＰ感染細胞についてＯＧＤの９０分後に細胞質フラクションにシトクロムｃが存在することは、細胞死がミトコンドリアからのシトクロムｃの細胞質中への放出を伴うことを意味する。下のパネルは、ウエスタンブロットの結果の定量を示し、各条件における、ミトコンドリア内のシトクロムｃのバンド強度と細胞質フラクションとの比がわかる。比が低いことは、ミトコンドリアから細胞質へのシトクロムｃの放出を意味する。この結果は、ＵＣＰ−２の過剰発現が、ミトコンドリアからのＯＧＤ誘導性のシトクロムｃ放出を低下させることを意味する。計３回の独立した実験で同様の結果が得られた。ウエスタンブロットの結果は、Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ Ｍ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙキット（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いた定量ＥＬＩＳＡ解析で確認した。
【０１９９】
カスパーゼ３の活性化はアポトーシスのマーカーである。ＵＰＣ−２が神経防御作用を発揮する機構を詳しく調べるために、アポトーシスカスケードのどの成分がＵＣＰ−２過剰発現の影響を受けるのかを決定する試験を行った。特にＵＣＰ−２過剰発現がカスパーゼ３活性に及ぼす作用が認められた。これは、ＵＣＰ−２過剰発現が、ＯＧＤ誘導性ニューロン死に及ぼす作用を、ＵＣＰ−２過剰発現を達成する組換えアデノウイルスを用いて検討することで行った。ＵＣＰ−２の代わりにｌａｃＺ遺伝子を有する組換えアデノウイルスを対照として用いた。
【０２００】
図１０は、皮質培養物中で過剰に発現されたＵＣＰ−２が、ＯＧＤ誘導型のカスパーゼ３の活性化をブロックすることを示す。この結果は、ＵＣＰ−２が、ＵＣＰ−２によるカスパーゼ３活性化の遮断を含むアポトーシスの阻害によって神経防御作用を発揮することを強く示している。プログラム細胞死すなわちアポトーシスは、標的タンパク質をアスパラギン酸残基の後で特異的に切断する一連のシステインプロテアーゼの活性化を必要とする。
【０２０１】
本明細書に記載された実施例および態様は、すべて説明目的であって、これに関してさまざまな変形形態または変更が当業者に示唆され、本出願および添付の特許請求の範囲の精神および範囲に含まれることは言うまでもない。本明細書に引用されたすべての出版物、特許、および特許出願は、個々の出版物、特許、もしくは特許出願が参照として組み入れられることが特異的および個別に指示されるのと同程度に、あらゆる目的のために全体が参照として本明細書に組み入れられる。
【図面の簡単な説明】
【図１Ａ〜１Ｄ】ＵＣＰ−２のｍＲＮＡが局在する脳領域を示す、さまざまな治療プロトコルを行ったラットの脳切片を対象に実施したインサイチューハイブリダイゼーション実験の結果を示す顕微鏡写真である。特にこれらの写真は、ＵＣＰ−２と特異的にハイブリッドを形成する標識プローブ（オリゴ２８）が、ラット脳の海馬のＣＡ１領域、ＣＡ３領域、およびＤＧ領域に局在することを示す。図１Ａは、ＵＣＰ−２の発現が通常条件下ではＣＡ１で低いことを示す。図１Ｂは、３分間の虚血イベントから２日後の時点でＵＣＰ−２のｍＲＮＡレベルが上昇していることを示す。図１Ｃは、１０分間の虚血性障害から回復後の１日目にＵＣＰ−２のｍＲＮＡレベルの上昇がみられないことを示す。図１Ｄは、ＵＣＰ−２のｍＲＮＡレベルが、３分間の虚血前処置後で、１０分間の虚血性障害の前の２４時後の時点で上昇していることを示す（３分→２４時間→１０分→２４時間のインサイチュー）。
【図２Ａ〜２Ｄ】図１Ａ〜１Ｄに示したものと同じイベントを示すが、ＵＣＰ−２のｍＲＮＡと特異的にハイブリッドを形成する異なる標識プローブ（オリゴ３３）を使用したときの顕微鏡写真である。
【図３】１０分間のＯＧＤ、または５分間の４０ μＭ ＮＭＤＡに対する曝露で前処置したラット皮質ニューロンの一次培養物中におけるＵＣＰ−２タンパク質レベルのウエスタンブロット解析を示す。
【図４】ＵＣＰ−２をコードする核酸を含むアデノウイルスのニューロンへの感染による、ラットニューロンの一次培養物における組換えＵＣＰ−２の過剰発現のウエスタンブロット解析を示す。
【図５】ラットニューロンの一次培養物における組換えＵＣＰ−２の過剰発現の免疫蛍光解析を示す。
【図６Ａおよび６Ｂ】ＵＣＰ−２をコードする核酸を含むアデノウイルスをニューロンに感染させることで得られた神経防御作用を示すプロットである。具体的には同プロットは、ニューロン培養物が混合型酸素グルコース欠乏（ＯＧＤ）から誘導される細胞死から防御されることを示す。図６Ａは、未感染細胞（Ｎｏ Ａｄ）、ＵＣＰ−２遺伝子の代わりにｌａｃＺ遺伝子を有するアデノウイルス（Ａｄ．ＬａｃＺ）を感染させた対照細胞、またはＵＣＰ−２遺伝子を有するアデノウイルス（Ａｄ．ＵＣＰ２）を感染させた試験細胞における細胞死についてプロットである。試験は、ＯＧＤなし（□）、または９０分間のＯＧＤ（■）のいずれかの条件で実施した。図６Ｂは、ＯＧＤを行わなかった細胞培養物（対照）、および１０分間のＯＧＤ、９０分間のＯＧＤ、または１０分間のＯＧＤ前処置とそれに続く９０分間のＯＧＤに曝露させた細胞培養物における細胞死の程度を示す。
【図７】ＵＣＰ−２の過剰発現が、インビボで虚血性脳損傷に及ぼす作用を示す。
【図８】ラット脳培養物から単離したミトコンドリアのフローサイトメトリー解析を示す。
【図９】細胞質フラクション、およびミトコンドリアの細胞フラクションにおけるシトクロムｃタンパク質レベルのウエスタンブロット解析の結果を示す。
【図１０】ＵＣＰ−２の発現がカスパーゼ３の活性化に及ぼす作用を示すチャートであり、カスパーゼ３は、細胞培養物に９０分間のＯＧＤを行うことで誘導した。試験は、ＵＣＰ−２の代わりにｌａｃＺ遺伝子を有するアデノウイルス（Ａｄ．ＬａｃＺ；対照）を感染させた細胞、およびＵＣＰ−２遺伝子を含むアデノウイルス（Ａｄ．ＵＣＰ２）を感染させた細胞を対象に行った。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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