(57)【要約】本発明は、単一ヌクレオチド変異または多型性、１つ以上のヌクレオチド挿入、および１つ以上のヌクレオチド欠失を含むＤＮＡ配列の相違を検出するための方法である。塩基ミスマッチを含有する標識ヘテロ二重鎖ＰＣＲフラグメントを作製する。エンドヌクレアーゼは、変化（１つ以上のミスマッチ塩基）を含有する位置およびこれより少ない程度で非異型（完全に適合した）位置の両方でヘテロ二重鎖ＰＣＲフラグメントを開裂する。開裂生成物とＤＮＡリガーゼとの連結は非異型開裂を補正するので、従って実質的にバックグラウンドを減少させる。この後に、反応生成物を検出する検出段階が続き、さらに配列変化の位置が決定される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
正常標的塩基配列とは１つ以上の単一塩基の変化、挿入、または欠失によって相違する変異核酸配列を同定するための方法であって、
潜在的に正常標的塩基配列並びに変異核酸配列を含有する検体を提供する段階；
標的塩基配列および変異核酸配列の相補的鎖上でのハイブリダイゼーションに適した２種の標識オリゴヌクレオチドプライマーを提供する段階；
ポリメラーゼを提供する段階；
ポリメラーゼ連鎖反応混合物を形成するために検体、標識オリゴヌクレオチドプライマー、およびポリメラーゼを混合する段階；
ポリメラーゼ連鎖反応混合物を、オリゴヌクレオチドプライマーが標的塩基配列および／または変異核酸配列にハイブリダイズすることができるハイブリダイゼーション処理、ハイブリダイズされたオリゴヌクレオチドプライマーが伸長されてそれにオリゴヌクレオチドプライマーがハイブリダイズされる標的塩基配列および／または変異核酸配列に相補的な伸長生成物が形成される伸長処理、ならびにハイブリダイズされた核酸配列が分離される変性処理を含む１回以上のポリメラーゼ連鎖反応サイクルに供する段階；
ポリメラーゼを不活化する段階；
ポリメラーゼ連鎖反応伸長生成物を変性させる段階；
潜在的に正常標的塩基配列および変異核酸配列を含有するヘテロ二重鎖生成物を形成するためにポリメラーゼ連鎖反応伸長生成物をアニーリングする段階；
ミスマッチ塩基対から１塩基離れた位置でヘテロ二重鎖ＤＮＡに優先的にニックを入れる、または開裂するエンドヌクレアーゼを提供する段階；
エンドヌクレアーゼ開裂反応混合物を形成するためにヘテロ二重鎖生成物とエンドヌクレアーゼとを混合する段階；
エンドヌクレアーゼがミスマッチ塩基対から１塩基離れた位置でヘテロ二重鎖生成物に優先的にニックを入れる、または開裂するようにエンドヌクレアーゼ開裂反応混合物をインキュベートする段階；
リガーゼを提供する段階；
リガーゼ再シーリング反応混合物を形成するために潜在的にニックが入れられた、または開裂されたヘテロ二重鎖生成物およびリガーゼを混合する段階；
ミスマッチ塩基対に隣接する位置でニックが入れられたヘテロ二重鎖生成物の再シーリングを実質的に生じさせずに完全に適合した塩基対でニックが入れられたヘテロ二重鎖生成物をシールするためにリガーゼ再シーリング反応混合物をインキュベートする段階；
リガーゼ再シーリング反応混合物をインキュベートする該段階から生じる生成物を、サイズまたは電気泳動移動度によって分離する段階；ならびに
リガーゼ再シーリング反応混合物をインキュベートする該段階の結果として生じる分離された生成物を区別することによって検体中で正常標的塩基配列および変異核酸配列の存在を検出する段階を含む方法。
【請求項２】
標的塩基配列がゲノムＤＮＡである請求項１に記載の方法。
【請求項３】
標的塩基配列が腫瘍検体から単離される請求項１に記載の方法。
【請求項４】
標的塩基配列がｍＲＮＡの二本鎖ｃＤＮＡコピーである請求項１に記載の方法。
【請求項５】
標的塩基配列がＰＣＲ増幅フラグメントである請求項１に記載の方法。
【請求項６】
２種の標識オリゴヌクレオチドプライマーが蛍光色素、ＩＲ色素、または放射性基である請求項１に記載の方法。
【請求項７】
２種の標識オリゴヌクレオチドプライマーがそれらの５’末端で標識されている請求項６に記載の方法。
【請求項８】
ポリメラーゼが、テルムス・アクアティクス、テルムス・サーモフィルス、ピロコッカス・フリオサス、またはテルモトガ・マリチマに由来する天然もしくは組換えのいずれかの熱安定性ポリメラーゼである、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
ポリメラーゼ連鎖反応が、６５℃を超える温度でポリメラーゼ連鎖反応混合物へポリメラーゼまたは金属コファクターのいずれかを添加することによって開始される、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
ポリメラーゼ連鎖反応伸長生成物を変性させる前記の段階が８０〜１０５℃の温度に加熱することによって実施される、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
ポリメラーゼ連鎖反応伸長生成物をアニーリングする前記の段階が最初に２０〜８５℃の温度および次に室温へ冷却することによって実施される、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
エンドヌクレアーゼがテルモトガ・マリチマ由来のエンドヌクレアーゼＶである請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
エンドヌクレアーゼがミスマッチ塩基対から３’側の位置でヘテロ二重鎖生成物にニックを入れる、または開裂する、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
リガーゼ再シーリング反応混合物をインキュベートする前記の段階が、２５℃で測定したときに７.２〜７.８のｐＨ値で実施される、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
エンドヌクレアーゼ開裂反応混合物が２〜７ｍＭの濃度でＭｇＣｌ２をさらに含む請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
エンドヌクレアーゼ開裂反応混合物中のエンドヌクレアーゼ対ヘテロ二重鎖生成物の比が１０：１〜１００：１の範囲内にある請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
エンドヌクレアーゼ開裂反応混合物が実質的にＮａＣｌもＫＣｌも含有していない請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
エンドヌクレアーゼ開裂反応混合物が０.４〜１.２ｍＭの濃度でＭｎＣｌ２をさらに含む請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
エンドヌクレアーゼ開裂反応混合物中のエンドヌクレアーゼ対ヘテロ二重鎖生成物の比が１：１〜１：１０の範囲内にある請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
エンドヌクレアーゼ開裂反応混合物が５０〜１００ｍＭ  ＮａＣｌまたはＫＣｌを含む請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
エンドヌクレアーゼ開裂反応混合物が２.５〜１０容量％の範囲内でＤＭＳＯを含有する請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
エンドヌクレアーゼ開裂反応混合物が０.５Ｍ〜１.５Ｍの濃度でベタインを含有する請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
エンドヌクレアーゼ開裂反応混合物をインキュベートする前記の段階が５０〜６５℃で実施される請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
リガーゼが熱安定性リガーゼである請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
リガーゼがテルムス種ＡＫ１６Ｄ由来である請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
リガーゼが、テルムス・アクアティクス、テルムス・サーモフィルス、ピロコッカス・フリオサス、またはテルモトガ・マリチマ由来である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
リガーゼ再シーリング反応混合物が、さらなるエンドヌクレオチド結合分解性開裂を阻害するために５０〜１５０ｍＭのＫＣｌを含有する、請求項２４に記載の方法。
【請求項２８】
前記分離する段階が変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動を使用することにより実施される請求項１に記載の方法。
【請求項２９】
前記分離する段階がキャピラリーゲル電気泳動を使用することにより実施される請求項１に記載の方法。
【請求項３０】
変異核酸配列対正常標的塩基配列の比率が１：２０〜２０：１の範囲内にある請求項１に記載の方法。
【請求項３１】
ポリメラーゼ連鎖反応伸長生成物が５０ｂｐ〜１，７００ｂｐの範囲内の長さを有する請求項１に記載の方法。
【請求項３２】
エンドヌクレアーゼが、Ａ／Ａ、Ｇ／Ｇ、Ｔ／Ｔ、Ａ／Ｇ、Ａ／Ｃ、Ｇ／Ａ、Ｇ／Ｔ、Ｔ／Ｇ、Ｔ／Ｃ、Ｃ／Ａ、およびＣ／Ｔからなる群より選択されるヘテロ二重鎖生成物内のミスマッチを優先的に開裂する、請求項１に記載の方法。
【請求項３３】
エンドヌクレアーゼが、ミスマッチの位置に下線が引かれ大文字で示されているｇＲｃｇ、ｒｃＲｃ、ｃｇＹｃ、またはｇＹｇｙからなる群より選択される配列を有するものを除いて、いずれかの単一塩基変異または多型性のために形成された少なくとも１本のヘテロ二重鎖生成物に優先的にニックを入れる、または開裂する、請求項１に記載の方法。
【請求項３４】
エンドヌクレアーゼが、ヘテロ二重鎖生成物内の１、２、および３塩基の挿入または欠失に優先的にニックを入れる、または開裂する、請求項１に記載の方法。
【請求項３５】
正常標的配列における多型性から遺伝性または散発性の変異または多型性を区別する請求項１に記載の方法。
【請求項３６】
遺伝性または散発性の変異または多型性が腫瘍抑制遺伝子、癌遺伝子、またはＤＮＡ複製もしくは修復遺伝子中で区別される、請求項１に記載の方法。
【請求項３７】
遺伝子が、Ｂｃｌ２、Ｍｄｍ２、Ｃｄｃ２５Ａ、サイクリンＤ１、サイクリンＥ１、Ｃｄｋ４、サバイビン、ＨＳＰ２７、ＨＳＰ７０、ｐ５３、ｐ２１Ｃｉｐ、ｐ１６Ｉｎｋ４ａ、ｐ１９ＡＲＦ、ｐ１５ＩＮＫ４ｂ、ｐ２７Ｋｉｐ、Ｂａｘ、成長因子類、ＥＧＦＲ、Ｈｅｒ２−ｎｅｕ、ＥｒｂＢ−３、ＥｒｂＢ−４、ｃ−Ｍｅｔ、ｃ−Ｓｅａ、Ｒｏｎ、ｃ−Ｒｅｔ、ＮＧＦＲ、ＴｒｋＢ、ＴｒｋＣ、ＩＧＦ１Ｒ、ＣＳＦ１Ｒ、ＣＳＦ２、ｃ−Ｋｉｔ、ＡＸＬ、Ｆｌｔ−１（ＶＥＧＦＲ−１）、Ｆｌｋ−１（ＶＥＧＦＲ−２）、ＰＤＧＦＲα、ＰＤＧＦＲβ、ＦＧＦＲ−１、ＦＧＦＲ−２、ＦＧＦＲ−３、ＦＧＦＲ−４、その他のタンパク質チロシンキナーゼレセプター類、β−カテニン、Ｗｎｔ（ｓ）、Ａｋｔ、Ｔｃｆ４、ｃ−Ｍｙｃ、ｎ−Ｍｙｃ、Ｗｉｓｐ−１、Ｗｉｓｐ−３、Ｋ−ｒａｓ、Ｈ−ｒａｓ、Ｎ−ｒａｓ、ｃ−Ｊｕｎ、ｃ−Ｆｏｓ、ＰＩ３Ｋ、ｃ−Ｓｒｃ、Ｓｈｃ、Ｒａｆ１、ＴＧＦβ、およびＭＥＫ、Ｅ−カドヘリン、ＡＰＣ、ＴβＲＩＩ、Ｓｍａｄ２、Ｓｍａｄ４、Ｓｍａｄ７、ＰＴＥＮ、ＶＨＬ、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＡＴＭ、ｈＭＳＨ２、ｈＭＬＨ１、ｈＰＭＳ１、ｈＰＭＳ２、およびｈＭＳＨ３からなる群より選択される、請求項３８に記載の方法。
【請求項３８】
エンドヌクレアーゼが、塩基対がミスマッチであるかまたはミスマッチを１塩基越える位置でヘテロ二重鎖ＤＮＡに優先的にニックを入れるかまたは開裂し、完全に適合したＤＮＡにニックを入れたときに連結に適した末端を生成する熱安定性エンドヌクレアーゼである、請求項１に記載の方法。
【請求項３９】
エンドヌクレアーゼが、塩基対がミスマッチであるかまたはミスマッチを１塩基越える位置でのＡ／Ａ、Ｇ／Ｇ、Ｔ／Ｔ、Ａ／Ｇ、Ａ／Ｃ、Ｇ／Ａ、Ｇ／Ｔ、Ｔ／Ｇ、Ｔ／Ｃ、Ｃ／Ａ、またはＣ／Ｔミスマッチ塩基対でヘテロ二重鎖ＤＮＡに優先的にニックを入れるかまたは開裂し、完全に適合したＤＮＡにニックを入れたときに連結に適した末端を生成する熱安定性エンドヌクレアーゼである、請求項１に記載の方法。
【請求項４０】
エンドヌクレアーゼが、ミスマッチの位置に下線が引かれ大文字で示されているｇＲｃｇ、ｒｃＲｃ、ｃｇＹｃ、またはｇＹｇｙ配列を有するものを除いて、いずれかの単一塩基変異または多型性のために形成された少なくとも１本のヘテロ二重鎖に優先的にニックを入れるかまたは開裂し、完全に適合したＤＮＡにニックを入れたときに連結に適した末端を生成する熱安定性エンドヌクレアーゼである、請求項１に記載の方法。
【請求項４１】
エンドヌクレアーゼが、塩基対がミスマッチであるかまたは不対塩基を１塩基越える位置で１、２、および３塩基の挿入または欠失を含有するヘテロ二重鎖ＤＮＡに優先的にニックを入れるかまたは開裂し、完全に適合したＤＮＡにニックを入れたときに連結に適した末端を生成する熱安定性エンドヌクレアーゼである、請求項１に記載の方法。
【請求項４２】
エンドヌクレアーゼが、野生型エンドヌクレアーゼよりむしろミスマッチ塩基を含有する少なくとも１つのヘテロ二重鎖ＤＮＡに優先的にニックを入れるかまたは開裂する変異エンドヌクレアーゼである、請求項１に記載の方法。
【請求項４３】
少なくとも１つのヘテロ二重鎖ＤＮＡ中のミスマッチ塩基の１つが「Ａ」である請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
少なくとも１つのヘテロ二重鎖ＤＮＡ中のミスマッチ塩基の１つが「Ｇ」である請求項４２に記載の方法。
【請求項４５】
エンドヌクレアーゼが、（１）Ｙ８０Ａ残基の変化；（２）Ｙ８０Ｆ残基の変化；（３）Ｙ８０Ｌ、Ｙ８０Ｉ、Ｙ８０Ｖ、もしくはＹ８０Ｍのいずれかの残基の変化；（４）Ｒ８８Ａ残基の変化；（５）Ｒ８８Ｌ、Ｒ８８Ｉ、Ｒ８８Ｖ、もしくはＲ８８Ｍ残基の変化；（６）Ｒ８８Ｋ残基の変化；（７）Ｒ８８ＮもしくはＲ８８Ｑ残基の変化；（８）Ｒ８８ＤもしくはＲ８８Ｅ残基の変化；（９）Ｒ８８ＴもしくはＲ８８Ｓ残基の変化；（１０）Ｅ８９Ａ残基の変化；（１１）Ｅ８９Ｌ、Ｅ８９Ｉ、Ｅ８９Ｖ、もしくはＥ８９Ｍ残基の変化；（１２）Ｅ８９Ｄ残基の変化；（１３）Ｅ８９ＮもしくはＥ８９Ｑ残基の変化；（１４）Ｅ８９ＲもしくはＥ８９Ｋ残基の変化；（１５）Ｅ８９ＴもしくはＥ８９Ｓ残基の変化；（１６）Ｈ１１６Ａ残基の変化；（１７）Ｈ１１６Ｌ、Ｈ１１６Ｉ、Ｈ１１６Ｖ、もしくはＨ１１６Ｍ残基の変化；（１８）Ｈ１１６ＫもしくはＨ１１６Ｒ残基の変化；（１９）Ｈ１１６ＮもしくはＨ１１６Ｑ残基の変化；（２０）Ｈ１１６ＴもしくはＨ１１６Ｓ残基の変化；（２１）Ｋ１３９Ａ残基の変化；（２２）Ｋ１３９Ｌ、Ｋ１３９Ｉ、Ｋ１３９Ｖ、もしくはＫ１３９Ｍ残基の変化；（２３）Ｋ１３９Ｒ残基の変化；（２４）Ｋ１３９ＮもしくはＫ１３９Ｑ残基の変化；（２５）Ｋ１３９ＤもしくはＫ１３９Ｅ残基の変化；（２６）Ｋ１３９ＴもしくはＫ１３９Ｓ残基の変化；（２７）Ｄ４３Ａ残基の変化；（２８）Ｄ４３Ｅ残基の変化；（２９）Ｄ１０５Ａ残基の変化；（３０）Ｄ１０５Ｅ残基の変化；（３１）Ｆ４６Ａ残基の変化；（３２）Ｆ４６Ｙ残基の変化；（３３）Ｆ４６Ｌ、Ｆ４６Ｉ、Ｆ４６Ｖ、もしくはＦ４６Ｍ残基の変化；（３４）Ｒ１１８Ａ残基の変化；（３５）Ｒ１１８Ｌ、Ｒ１１８Ｉ、Ｒ１１８Ｖ、もしくはＲ１１８Ｍ残基の変化；（３６）Ｒ１１８Ｋ残基の変化；（３７）Ｒ１１８ＮもしくはＲ１１８Ｑ残基の変化；（３８）Ｒ１１８ＤもしくはＲ１１８Ｅ残基の変化；（３９）Ｒ１１８ＴもしくはＲ１１８Ｓ残基の変化；（４０）Ｆ１８０Ａ残基の変化；（４１）Ｆ１８０Ｙ残基の変化；（４２）Ｆ１８０Ｌ、Ｆ１８０Ｉ、Ｆ１８０Ｖ、もしくはＦ１８０Ｍ残基の変化；（４３）Ｇ８３Ａ残基の変化；（４４）Ｇ８３Ｌ、Ｇ８３Ｉ、Ｇ８３Ｖ、もしくはＧ８３Ｍ残基の変化；（４５）Ｇ８３ＫもしくはＧ８３Ｒ残基の変化；（４６）Ｇ８３ＮもしくはＧ８３Ｑ残基の変化；（４７）Ｇ８３ＤもしくはＧ８３Ｅ残基の変化；（４８）Ｇ８３ＴまたはＧ８３Ｓ残基の変化；（４９）Ｉ１７９Ａ残基の変化；（５０）Ｉ１７９ＫもしくはＩ１７９Ｒ残基の変化；（５１）Ｉ１７９ＮもしくはＩ１７９Ｑ残基の変化；（５２）Ｉ１７９ＤもしくはＩ１７９Ｅ残基の変化；（５３）Ｉ１７９ＴもしくはＩ１７９Ｓ残基の変化；（５４）Ｄ１１０Ａ残基の変化；または（５５）Ｈ１２５Ａ残基の変化のいずれかを含有するテルモトガ・マリチマ由来の変異エンドヌクレアーゼＶである、請求項１に記載の方法。
【請求項４６】
正常標的核酸配列とは１つ以上の単一塩基の変化、挿入、または欠失によって相違する変異核酸配列を同定するための方法であって、
潜在的に変異核酸配列を含有するが、必ずしも正常標的核酸配列を含有していない検体を提供する段階；
正常標的核酸配列を含有する標準を提供する段階；
変異核酸配列の相補的鎖上でのハイブリダイゼーションに適した２種の標識オリゴヌクレオチドプライマーを提供する段階；
ポリメラーゼを提供する段階；
第１ポリメラーゼ連鎖反応混合物を形成するために検体、標準、標識オリゴヌクレオチドプライマー、およびポリメラーゼを混合する段階；
該第１ポリメラーゼ連鎖反応混合物を、標識オリゴヌクレオチドプライマーが変異核酸配列にハイブリダイズすることができるハイブリダイゼーション処理、ハイブリダイズされたオリゴヌクレオチドプライマーが伸長されてそれにオリゴヌクレオチドプライマーがハイブリダイズされる変異核酸配列に相補的な伸長生成物が形成される伸長処理、およびハイブリダイズされた核酸配列が分離される変性処理を含む１回以上のポリメラーゼ連鎖反応サイクルに供する段階；
ポリメラーゼを不活化する段階；
正常標的核酸配列を提供する段階；
第２ポリメラーゼ連鎖反応混合物を形成するために正常標的核酸配列、標識オリゴヌクレオチドプライマー、およびポリメラーゼを混合する段階；
該第２ポリメラーゼ連鎖反応混合物を、標識オリゴヌクレオチドプライマーが正常標的核酸配列にハイブリダイズすることができるハイブリダイゼーション処理、ハイブリダイズされたオリゴヌクレオチドプライマーが伸長されてそれにオリゴヌクレオチドプライマーがハイブリダイズされる正常標的核酸配列に相補的な伸長生成物が形成される伸長処理、およびハイブリダイズされた核酸配列が分離される変性処理を含む１回以上のポリメラーゼ連鎖反応サイクルに供する段階；
ポリメラーゼを不活化する段階；
第１および第２のポリメラーゼ連鎖反応伸長生成物を混合する段階；
第１および第２のポリメラーゼ連鎖反応伸長生成物を変性させる段階；
正常標的核酸配列および変異核酸配列を潜在的に含有するヘテロ二重鎖生成物を形成するために第１および第２のポリメラーゼ連鎖反応伸長生成物をアニーリングする段階；
ミスマッチ塩基対から１塩基離れた位置でヘテロ二重鎖ＤＮＡに優先的にニックを入れるかまたは開裂するエンドヌクレアーゼを提供する段階；
エンドヌクレアーゼ開裂反応混合物を形成するためにヘテロ二重鎖生成物とエンドヌクレアーゼとを混合する段階；
エンドヌクレアーゼがミスマッチ塩基対から１塩基離れた位置でヘテロ二重鎖生成物に優先的にニックを入れるかまたは開裂するようにエンドヌクレアーゼ開裂反応混合物をインキュベートする段階；
リガーゼを提供する段階；
リガーゼ再シーリング反応混合物を形成するために潜在的にニックが入れられたまたは開裂されたヘテロ二重鎖生成物およびリガーゼを混合する段階；
ミスマッチ塩基対に隣接する位置でニックが入れられたヘテロ二重鎖生成物の再シーリングを実質的に生じさせずに完全に適合した塩基対でニックが入れられたヘテロ二重鎖生成物をシールするためにリガーゼ再シーリング反応混合物をインキュベートする段階；
リガーゼ再シーリング反応混合物をインキュベートする前記の段階から生じる生成物をサイズまたは電気泳動移動度によって分離する段階；ならびに
リガーゼ再シーリング反応混合物をインキュベートする前記の段階の結果として生じる分離された生成物を区別することによって検体中で正常標的核酸配列および変異核酸配列標的ヌクレオチドの存在を検出する段階を含む方法。
【請求項４７】
標的塩基配列がゲノムＤＮＡである請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
標的塩基配列が腫瘍検体から単離される請求項４６に記載の方法。
【請求項４９】
標的塩基配列がｍＲＮＡの二本鎖ｃＤＮＡコピーである請求項４６に記載の方法。
【請求項５０】
標的塩基配列がＰＣＲ増幅フラグメントである請求項４６に記載の方法。
【請求項５１】
２種の標識オリゴヌクレオチドプライマーが蛍光色素、ＩＲ色素、または放射性基である請求項４６に記載の方法。
【請求項５２】
２種の標識オリゴヌクレオチドプライマーがそれらの５’末端で標識されている請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
ポリメラーゼが、テルムス・アクアティクス、テルムス・サーモフィルス、ピロコッカス・フリオサス、またはテルモトガ・マリチマに由来する天然もしくは組換えのいずれかの熱安定性ポリメラーゼである、請求項４６に記載の方法。
【請求項５４】
ポリメラーゼ連鎖反応が、６５〜９４℃の温度でポリメラーゼ連鎖反応混合物へポリメラーゼまたは金属コファクターのいずれかを添加することによって開始される、請求項４６に記載の方法。
【請求項５５】
ポリメラーゼ連鎖反応伸長生成物を変性させる前記の段階が９４℃を超える温度へ加熱することによって実施される、請求項４６に記載の方法。
【請求項５６】
ポリメラーゼ連鎖反応伸長生成物をアニーリングする前記の段階が最初に５０〜８５℃の温度および続いて室温へ冷却することによって実施される、請求項４６に記載の方法。
【請求項５７】
エンドヌクレアーゼがテルモトガ・マリチマ由来のエンドヌクレアーゼＶである請求項４６に記載の方法。
【請求項５８】
エンドヌクレアーゼがミスマッチ塩基対から１塩基離れた３’側の位置でヘテロ二重鎖生成物にニックを入れるかまたは開裂する、請求項４６に記載の方法。
【請求項５９】
リガーゼ再シーリング反応混合物をインキュベートする前記の段階が２５℃で測定したときに７.２〜７.８のｐＨ値で実施される、請求項４６に記載の方法。
【請求項６０】
エンドヌクレアーゼ開裂反応混合物が２〜７ｍＭの濃度でＭｇＣｌ２をさらに含む請求項４６に記載の方法。
【請求項６１】
エンドヌクレアーゼ開裂反応混合物中のエンドヌクレアーゼ対ヘテロ二重鎖生成物の比が１０：１〜１００：１の範囲内にある、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
エンドヌクレアーゼ開裂反応混合物が実質的にＮａＣｌもＫＣｌも含有していない請求項６０に記載の方法。
【請求項６３】
エンドヌクレアーゼ開裂反応混合物が０.４〜１.２ｍＭの濃度でＭｎＣｌ２をさらに含む請求項４６に記載の方法。
【請求項６４】
エンドヌクレアーゼ開裂反応混合物中のエンドヌクレアーゼ対ヘテロ二重鎖生成物の比が１：１〜１：１０の範囲内にある請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
エンドヌクレアーゼ開裂反応混合物が２５〜７５ｍＭのＮａＣｌまたはＫＣｌを含む請求項６３に記載の方法。
【請求項６６】
エンドヌクレアーゼ開裂反応混合物が２.５％〜１０容量％の範囲内でＤＭＳＯを含有する請求項４６に記載の方法。
【請求項６７】
エンドヌクレアーゼ開裂反応混合物が０.５Ｍ〜１.５Ｍの濃度でベタインを含有する請求項４６に記載の方法。
【請求項６８】
エンドヌクレアーゼ開裂反応混合物をインキュベートする前記の段階が６５℃で１時間実施される請求項４６に記載の方法。
【請求項６９】
リガーゼが熱安定性リガーゼである請求項４６に記載の方法。
【請求項７０】
リガーゼがテルムス種ＡＫ１６Ｄ由来である請求項６９に記載の方法。
【請求項７１】
リガーゼが、テルムス・アクアティクス、テルムス・サーモフィルス、ピロコッカス・フリオサス、またはテルモトガ・マリチマに由来する、請求項６９に記載の方法。
【請求項７２】
リガーゼ再シーリング反応混合物がさらなるエンドヌクレオチド結合分解性開裂を阻害するために２５〜７５ｍＭのＫＣｌを含有する、請求項６９に記載の方法。
【請求項７３】
前記分離する段階が変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動を使用することにより実施される請求項４６に記載の方法。
【請求項７４】
前記分離する段階がキャピラリーゲル電気泳動を使用することにより実施される請求項４６に記載の方法。
【請求項７５】
変異核酸配列対正常標的塩基配列の比率が１：２０〜２０：１の範囲内にある請求項４６に記載の方法。
【請求項７６】
ポリメラーゼ連鎖反応伸長生成物が５０ｂｐ〜１，７００ｂｐの範囲内の長さを有する請求項４６に記載の方法。
【請求項７７】
エンドヌクレアーゼが、Ａ／Ａ、Ｇ／Ｇ、Ｔ／Ｔ、Ａ／Ｇ、Ａ／Ｃ、Ｇ／Ａ、Ｇ／Ｔ、Ｔ／Ｇ、Ｔ／Ｃ、Ｃ／Ａ、およびＣ／Ｔからなる群より選択されるヘテロ二重鎖生成物内のミスマッチを優先的に開裂する、請求項４６に記載の方法。
【請求項７８】
エンドヌクレアーゼが、ミスマッチの位置に下線が引かれ大文字で示されているｇＲｃｇ、ｒｃＲｃ、ｃｇＹｃ、およびｇＹｇｙからなる群より選択される配列を有するものを除いて、いずれかの単一塩基変異または多型性のために形成された少なくとも１本のヘテロ二重鎖生成物に優先的にニックを入れるかまたは開裂する、請求項４６に記載の方法。
【請求項７９】
エンドヌクレアーゼが、ヘテロ二重鎖生成物内の１、２、および３塩基の挿入または欠失に優先的にニックを入れるかまたは開裂する、請求項４６に記載の方法。
【請求項８０】
正常標的配列における多型性から遺伝性または散発性の変異または多型性を区別する請求項４６に記載の方法。
【請求項８１】
遺伝性または散発性の変異または多型性が腫瘍抑制遺伝子、癌遺伝子、またはＤＮＡ複製もしくは修復遺伝子中で区別される請求項４６に記載の方法。
【請求項８２】
遺伝子が、Ｂｃｌ２、Ｍｄｍ２、Ｃｄｃ２５Ａ、サイクリンＤ１、サイクリンＥ１、Ｃｄｋ４、サバイビン、ＨＳＰ２７、ＨＳＰ７０、ｐ５３、ｐ２１Ｃｉｐ、ｐ１６Ｉｎｋ４ａ、ｐ１９ＡＲＦ、ｐ１５ＩＮＫ４ｂ、ｐ２７Ｋｉｐ、Ｂａｘ、成長因子類、ＥＧＦＲ、Ｈｅｒ２−ｎｅｕ、ＥｒｂＢ−３、ＥｒｂＢ−４、ｃ−Ｍｅｔ、ｃ−Ｓｅａ、Ｒｏｎ、ｃ−Ｒｅｔ、ＮＧＦＲ、ＴｒｋＢ、ＴｒｋＣ、ＩＧＦ１Ｒ、ＣＳＦ１Ｒ、ＣＳＦ２、ｃ−Ｋｉｔ、ＡＸＬ、Ｆｌｔ−１（ＶＥＧＦＲ−１）、Ｆｌｋ−１（ＶＥＧＦＲ−２）、ＰＤＧＦＲα、ＰＤＧＦＲβ、ＦＧＦＲ−１、ＦＧＦＲ−２、ＦＧＦＲ−３、ＦＧＦＲ−４、その他のタンパク質チロシンキナーゼレセプター類、β−カテニン、Ｗｎｔ（ｓ）、Ａｋｔ、Ｔｃｆ４、ｃ−Ｍｙｃ、ｎ−Ｍｙｃ、Ｗｉｓｐ−１、Ｗｉｓｐ−３、Ｋ−ｒａｓ、Ｈ−ｒａｓ、Ｎ−ｒａｓ、ｃ−Ｊｕｎ、ｃ−Ｆｏｓ、ＰＩ３Ｋ、ｃ−Ｓｒｃ、Ｓｈｃ、Ｒａｆ１、ＴＧＦβ、およびＭＥＫ、Ｅ−カドヘリン、ＡＰＣ、ＴβＲＩＩ、Ｓｍａｄ２、Ｓｍａｄ４、Ｓｍａｄ７、ＰＴＥＮ、ＶＨＬ、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＡＴＭ、ｈＭＳＨ２、ｈＭＬＨ１、ｈＰＭＳ１、ｈＰＭＳ２、およびｈＭＳＨ３からなる群より選択される、請求項８１に記載の方法。
【請求項８３】
エンドヌクレアーゼが、塩基対がミスマッチであるかまたはミスマッチを１塩基越える位置でヘテロ二重鎖ＤＮＡに優先的にニックを入れるかまたは開裂し、完全に適合したＤＮＡにニックを入れたときに連結に適した末端を生成する熱安定性エンドヌクレアーゼである、請求項４６に記載の方法。
【請求項８４】
エンドヌクレアーゼが、塩基対がミスマッチであるかまたはミスマッチを１塩基越える位置でのＡ／Ａ、Ｇ／Ｇ、Ｔ／Ｔ、Ａ／Ｇ、Ａ／Ｃ、Ｇ／Ａ、Ｇ／Ｔ、Ｔ／Ｇ、Ｔ／Ｃ、Ｃ／Ａ、またはＣ／Ｔミスマッチ塩基対でヘテロ二重鎖ＤＮＡに優先的にニックを入れるかまたは開裂し、完全に適合したＤＮＡにニックを入れたときに連結に適した末端を生成する熱安定性エンドヌクレアーゼである、請求項４６に記載の方法。
【請求項８５】
エンドヌクレアーゼが、ミスマッチの位置に下線が引かれ大文字で示されているｇＲｃｇ、ｒｃＲｃ、ｃｇＹｃ、またはｇＹｇｙ配列を有するものを除いて、いずれかの単一塩基変異または多型性のために形成された少なくとも１本のヘテロ二重鎖に優先的にニックを入れるかまたは開裂し、完全に適合したＤＮＡにニックを入れたときに連結に適した末端を生成する熱安定性エンドヌクレアーゼである、請求項４６に記載の方法。
【請求項８６】
エンドヌクレアーゼが、塩基対がミスマッチであるかまたは不対塩基を１塩基越える位置で１、２、および３塩基の挿入または欠失を含有するヘテロ二重鎖ＤＮＡに優先的にニックを入れるかまたは開裂し、完全に適合したＤＮＡにニックを入れたときに連結に適した末端を生成する熱安定性エンドヌクレアーゼである、請求項４６に記載の方法。
【請求項８７】
エンドヌクレアーゼが、野生型エンドヌクレアーゼよりむしろミスマッチ塩基を含有する少なくとも１つのヘテロ二重鎖ＤＮＡに優先的にニックを入れるかまたは開裂する変異エンドヌクレアーゼである、請求項４６に記載の方法。
【請求項８８】
少なくとも１つのヘテロ二重鎖ＤＮＡ中のミスマッチ塩基の１つが「Ａ」である請求項８７に記載の方法。
【請求項８９】
少なくとも１つのヘテロ二重鎖ＤＮＡ中のミスマッチ塩基の１つが「Ｇ」である請求項８７に記載の方法。
【請求項９０】
エンドヌクレアーゼが、（１）Ｙ８０Ａ残基の変化；（２）Ｙ８０Ｆ残基の変化；（３）Ｙ８０Ｌ、Ｙ８０Ｉ、Ｙ８０Ｖ、もしくはＹ８０Ｍのいずれかの残基の変化；（４）Ｒ８８Ａ残基の変化；（５）Ｒ８８Ｌ、Ｒ８８Ｉ、Ｒ８８Ｖ、もしくはＲ８８Ｍ残基の変化；（６）Ｒ８８Ｋ残基の変化；（７）Ｒ８８ＮもしくはＲ８８Ｑ残基の変化；（８）Ｒ８８ＤもしくはＲ８８Ｅ残基の変化；（９）Ｒ８８ＴもしくはＲ８８Ｓ残基の変化；（１０）Ｅ８９Ａ残基の変化；（１１）Ｅ８９Ｌ、Ｅ８９Ｉ、Ｅ８９Ｖ、もしくはＥ８９Ｍ残基の変化；（１２）Ｅ８９Ｄ残基の変化；（１３）Ｅ８９ＮもしくはＥ８９Ｑ残基の変化；（１４）Ｅ８９ＲもしくはＥ８９Ｋ残基の変化；（１５）Ｅ８９ＴもしくはＥ８９Ｓ残基の変化；（１６）Ｈ１１６Ａ残基の変化；（１７）Ｈ１１６Ｌ、Ｈ１１６Ｉ、Ｈ１１６Ｖ、もしくはＨ１１６Ｍ残基の変化；（１８）Ｈ１１６ＫもしくはＨ１１６Ｒ残基の変化；（１９）Ｈ１１６ＮもしくはＨ１１６Ｑ残基の変化；（２０）Ｈ１１６ＴもしくはＨ１１６Ｓ残基の変化；（２１）Ｋ１３９Ａ残基の変化；（２２）Ｋ１３９Ｌ、Ｋ１３９Ｉ、Ｋ１３９Ｖ、もしくはＫ１３９Ｍ残基の変化；（２３）Ｋ１３９Ｒ残基の変化；（２４）Ｋ１３９ＮもしくはＫ１３９Ｑ残基の変化；（２５）Ｋ１３９ＤもしくはＫ１３９Ｅ残基の変化；（２６）Ｋ１３９ＴもしくはＫ１３９Ｓ残基の変化；（２７）Ｄ４３Ａ残基の変化；（２８）Ｄ４３Ｅ残基の変化；（２９）Ｄ１０５Ａ残基の変化；（３０）Ｄ１０５Ｅ残基の変化；（３１）Ｆ４６Ａ残基の変化；（３２）Ｆ４６Ｙ残基の変化；（３３）Ｆ４６Ｌ、Ｆ４６Ｉ、Ｆ４６Ｖ、もしくはＦ４６Ｍ残基の変化；（３４）Ｒ１１８Ａ残基の変化；（３５）Ｒ１１８Ｌ、Ｒ１１８Ｉ、Ｒ１１８Ｖ、もしくはＲ１１８Ｍ残基の変化；（３６）Ｒ１１８Ｋ残基の変化；（３７）Ｒ１１８ＮもしくはＲ１１８Ｑ残基の変化；（３８）Ｒ１１８ＤもしくはＲ１１８Ｅ残基の変化；（３９）Ｒ１１８ＴもしくはＲ１１８Ｓ残基の変化；（４０）Ｆ１８０Ａ残基の変化；（４１）Ｆ１８０Ｙ残基の変化；（４２）Ｆ１８０Ｌ、Ｆ１８０Ｉ、Ｆ１８０Ｖ、もしくはＦ１８０Ｍ残基の変化；（４３）Ｇ８３Ａ残基の変化；（４４）Ｇ８３Ｌ、Ｇ８３Ｉ、Ｇ８３Ｖ、もしくはＧ８３Ｍ残基の変化；（４５）Ｇ８３ＫもしくはＧ８３Ｒ残基の変化；（４６）Ｇ８３ＮもしくはＧ８３Ｑ残基の変化；（４７）Ｇ８３ＤもしくはＧ８３Ｅ残基の変化；（４８）Ｇ８３ＴもしくはＧ８３Ｓ残基の変化；（４９）Ｉ１７９Ａ残基の変化；（５０）Ｉ１７９ＫもしくはＩ１７９Ｒ残基の変化；（５１）Ｉ１７９ＮもしくはＩ１７９Ｑ残基の変化；（５２）Ｉ１７９ＤもしくはＩ１７９Ｅ残基の変化；（５３）Ｉ１７９ＴもしくはＩ１７９Ｓ残基の変化；（５４）Ｄ１１０Ａ残基の変化；または（５５）Ｈ１２５Ａ残基の変化のいずれかを含有するテルモトガ・マリチマ由来の変異エンドヌクレアーゼＶである、請求項４６に記載の方法。
【請求項９１】
塩基対がミスマッチであるかまたはミスマッチを１塩基越える位置でヘテロ二重鎖ＤＮＡに優先的にニックを入れるかまたは開裂し、完全に適合したＤＮＡにニックを入れたときに連結に適した末端を生成する熱安定性エンドヌクレアーゼ。
【請求項９２】
塩基対がミスマッチであるかまたはミスマッチを１塩基越える位置でのＡ／Ａ、Ｇ／Ｇ、Ｔ／Ｔ、Ａ／Ｇ、Ａ／Ｃ、Ｇ／Ａ、Ｇ／Ｔ、Ｔ／Ｇ、Ｔ／Ｃ、Ｃ／Ａ、またはＣ／Ｔミスマッチ塩基対でヘテロ二重鎖ＤＮＡに優先的にニックを入れるかまたは開裂し、完全に適合したＤＮＡにニックを入れたときに連結に適した末端を生成する熱安定性エンドヌクレアーゼ。
【請求項９３】
ミスマッチの位置に下線が引かれ大文字で示されているｇＲｃｇ、ｒｃＲｃ、ｃｇＹｃ、またはｇＹｇｙ配列を有するものを除いて、いずれかの単一塩基変異または多型性のために形成された少なくとも１本のヘテロ二重鎖に優先的にニックを入れるかまたは開裂し、完全に適合したＤＮＡにニックを入れたときに連結に適した末端を生成する熱安定性エンドヌクレアーゼ。
【請求項９４】
塩基対がミスマッチであるかまたは不対塩基を１塩基越える位置で１、２、および３塩基の挿入または欠失を含有するヘテロ二重鎖ＤＮＡに優先的にニックを入れるかまたは開裂し、完全に適合したＤＮＡでＤＮＡにニックを入れたときに連結に適した末端を生成する熱安定性エンドヌクレアーゼ。
【請求項９５】
野生型エンドヌクレアーゼよりむしろ、ミスマッチ塩基を含有する少なくとも１つのヘテロ二重鎖ＤＮＡで優先的にニックを入れるかまたは開裂する変異エンドヌクレアーゼ。
【請求項９６】
少なくとも１つのヘテロ二重鎖ＤＮＡ中のミスマッチ塩基の１つが「Ａ」である請求項９５に記載の変異エンドヌクレアーゼ。
【請求項９７】
少なくとも１つのヘテロ二重鎖ＤＮＡ中のミスマッチ塩基の１つが「Ｇ」である請求項９５に記載の変異エンドヌクレアーゼ。
【請求項９８】
（１）Ｙ８０Ａ残基の変化；（２）Ｙ８０Ｆ残基の変化；（３）Ｙ８０Ｌ、Ｙ８０Ｉ、Ｙ８０Ｖ、もしくはＹ８０Ｍのいずれかの残基の変化；（４）Ｒ８８Ａ残基の変化；（５）Ｒ８８Ｌ、Ｒ８８Ｉ、Ｒ８８Ｖ、もしくはＲ８８Ｍ残基の変化；（６）Ｒ８８Ｋ残基の変化；（７）Ｒ８８ＮもしくはＲ８８Ｑ残基の変化；（８）Ｒ８８ＤもしくはＲ８８Ｅ残基の変化；（９）Ｒ８８ＴもしくはＲ８８Ｓ残基の変化；（１０）Ｅ８９Ａ残基の変化；（１１）Ｅ８９Ｌ、Ｅ８９Ｉ、Ｅ８９Ｖ、もしくはＥ８９Ｍ残基の変化；（１２）Ｅ８９Ｄ残基の変化；（１３）Ｅ８９ＮもしくはＥ８９Ｑ残基の変化；（１４）Ｅ８９ＲもしくはＥ８９Ｋ残基の変化；（１５）Ｅ８９ＴもしくはＥ８９Ｓ残基の変化；（１６）Ｈ１１６Ａ残基の変化；（１７）Ｈ１１６Ｌ、Ｈ１１６Ｉ、Ｈ１１６Ｖ、もしくはＨ１１６Ｍ残基の変化；（１８）Ｈ１１６ＫもしくはＨ１１６Ｒ残基の変化；（１９）Ｈ１１６ＮもしくはＨ１１６Ｑ残基の変化；（２０）Ｈ１１６ＴもしくはＨ１１６Ｓ残基の変化；（２１）Ｋ１３９Ａ残基の変化；（２２）Ｋ１３９Ｌ、Ｋ１３９Ｉ、Ｋ１３９Ｖ、もしくはＫ１３９Ｍ残基の変化；（２３）Ｋ１３９Ｒ残基の変化；（２４）Ｋ１３９ＮもしくはＫ１３９Ｑ残基の変化；（２５）Ｋ１３９ＤもしくはＫ１３９Ｅ残基の変化；（２６）Ｋ１３９ＴもしくはＫ１３９Ｓ残基の変化；（２７）Ｄ４３Ａ残基の変化；（２８）Ｄ４３Ｅ残基の変化；（２９）Ｄ１０５Ａ残基の変化；（３０）Ｄ１０５Ｅ残基の変化；（３１）Ｆ４６Ａ残基の変化；（３２）Ｆ４６Ｙ残基の変化；（３３）Ｆ４６Ｌ、Ｆ４６Ｉ、Ｆ４６Ｖ、もしくはＦ４６Ｍ残基の変化；（３４）Ｒ１１８Ａ残基の変化；（３５）Ｒ１１８Ｌ、Ｒ１１８Ｉ、Ｒ１１８Ｖ、もしくはＲ１１８Ｍ残基の変化；（３６）Ｒ１１８Ｋ残基の変化；（３７）Ｒ１１８ＮもしくはＲ１１８Ｑ残基の変化；（３８）Ｒ１１８ＤもしくはＲ１１８Ｅ残基の変化；（３９）Ｒ１１８ＴもしくはＲ１１８Ｓ残基の変化；（４０）Ｆ１８０Ａ残基の変化；（４１）Ｆ１８０Ｙ残基の変化；（４２）Ｆ１８０Ｌ、Ｆ１８０Ｉ、Ｆ１８０Ｖ、もしくはＦ１８０Ｍ残基の変化；（４３）Ｇ８３Ａ残基の変化；（４４）Ｇ８３Ｌ、Ｇ８３Ｉ、Ｇ８３Ｖ、もしくはＧ８３Ｍ残基の変化；（４５）Ｇ８３ＫもしくはＧ８３Ｒ残基の変化；（４６）Ｇ８３ＮもしくはＧ８３Ｑ残基の変化；（４７）Ｇ８３ＤもしくはＧ８３Ｅ残基の変化；（４８）Ｇ８３ＴまたはＧ８３Ｓ残基の変化；（４９）Ｉ１７９Ａ残基の変化；（５０）Ｉ１７９ＫもしくはＩ１７９Ｒ残基の変化；（５１）Ｉ１７９ＮもしくはＩ１７９Ｑ残基の変化；（５２）Ｉ１７９ＤもしくはＩ１７９Ｅ残基の変化；（５３）Ｉ１７９ＴもしくはＩ１７９Ｓ残基の変化；（５４）Ｄ１１０Ａ残基の変化；または（５５）Ｈ１２５Ａ残基の変化のいずれかを含有するテルモトガ・マリチマ由来の変異エンドヌクレアーゼＶ。
【請求項９９】
Ｙ８０Ａ残基の変化を含有する請求項９８に記載の変異エンドヌクレアーゼＶ。
【請求項１００】
Ｙ８０Ｆ残基の変化を含有する請求項９８に記載の変異エンドヌクレアーゼＶ。
【請求項１０１】
Ｙ８０Ｌ、Ｙ８０Ｉ、Ｙ８０Ｖ、もしくはＹ８０Ｍ残基の変化を含有する請求項９８に記載の変異エンドヌクレアーゼＶ。
【請求項１０２】
Ｒ８８Ａ残基の変化を含有する請求項９８に記載の変異エンドヌクレアーゼＶ。
【請求項１０３】
Ｒ８８Ｌ、Ｒ８８Ｉ、Ｒ８８Ｖ、もしくはＲ８８Ｍ残基の変化を含有する請求項９８に記載の変異エンドヌクレアーゼＶ。
【請求項１０４】
Ｒ８８Ｋ残基の変化を含有する請求項９８に記載の変異エンドヌクレアーゼＶ。
【請求項１０５】
Ｒ８８ＮもしくはＲ８８Ｑ残基の変化を含有する請求項９８に記載の変異エンドヌクレアーゼＶ。
【請求項１０６】
Ｒ８８ＤもしくはＲ８８Ｅ残基の変化を含有する請求項９８に記載の変異エンドヌクレアーゼＶ。
【請求項１０７】
Ｒ８８ＴもしくはＲ８８Ｓ残基の変化を含有する請求項９８に記載の変異エンドヌクレアーゼＶ。
【請求項１０８】
Ｅ８９Ａ残基の変化を含有する請求項９８に記載の変異エンドヌクレアーゼＶ。
【請求項１０９】
Ｅ８９Ｌ、Ｅ８９Ｉ、Ｅ８９Ｖ、もしくはＥ８９Ｍ残基の変化を含有する請求項９８に記載の変異エンドヌクレアーゼＶ。
【請求項１１０】
Ｅ８９Ｄ残基の変化を含有する請求項９８に記載の変異エンドヌクレアーゼＶ。
【請求項１１１】
Ｅ８９ＮもしくはＥ８９Ｑ残基の変化を含有する請求項９８に記載の変異エンドヌクレアーゼＶ。
【請求項１１２】
Ｅ８９ＲもしくはＥ８９Ｋ残基の変化を含有する請求項９８に記載の変異エンドヌクレアーゼＶ。
【請求項１１３】
Ｅ８９ＴもしくはＥ８９Ｓ残基の変化を含有する請求項９８に記載の変異エンドヌクレアーゼＶ。
【請求項１１４】
Ｈ１１６Ａ残基の変化を含有する請求項９８に記載の変異エンドヌクレアーゼＶ。
【請求項１１５】
Ｈ１１６Ｌ、Ｈ１１６Ｉ、Ｈ１１６Ｖ、もしくはＨ１１６Ｍ残基の変化を含有する請求項９８に記載の変異エンドヌクレアーゼＶ。
【請求項１１６】
Ｈ１１６ＫもしくはＨ１１６Ｒ残基の変化を含有する請求項９８に記載の変異エンドヌクレアーゼＶ。
【請求項１１７】
Ｈ１１６ＮもしくはＨ１１６Ｑ残基の変化を含有する請求項９８に記載の変異エンドヌクレアーゼＶ。
【請求項１１８】
Ｈ１１６ＤもしくはＨ１１６Ｅ残基の変化を含有する請求項９８に記載の変異エンドヌクレアーゼＶ。
【請求項１１９】
Ｈ１１６ＴもしくはＨ１１６Ｓ残基の変化を含有する請求項９８に記載の変異エンドヌクレアーゼＶ。
【請求項１２０】
Ｋ１３９Ａ残基の変化を含有する請求項９８に記載の変異エンドヌクレアーゼＶ。
【請求項１２１】
Ｋ１３９Ｌ、Ｋ１３９Ｉ、Ｋ１３９Ｖ、もしくはＫ１３９Ｍ残基の変化を含有する請求項９８に記載の変異エンドヌクレアーゼＶ。
【請求項１２２】
Ｋ１３９Ｒ残基の変化を含有する請求項９８に記載の変異エンドヌクレアーゼＶ。
【請求項１２３】
Ｋ１３９ＮもしくはＫ１３９Ｑ残基の変化を含有する請求項９８に記載の変異エンドヌクレアーゼＶ。
【請求項１２４】
Ｋ１３９ＤもしくはＫ１３９Ｅ残基の変化を含有する請求項９８に記載の変異エンドヌクレアーゼＶ。
【請求項１２５】
Ｋ１３９ＴもしくはＫ１３９Ｓ残基の変化を含有する請求項９８に記載の変異エンドヌクレアーゼＶ。
【請求項１２６】
Ｄ４３Ａ残基の変化を含有する請求項９８に記載の変異エンドヌクレアーゼＶ。
【請求項１２７】
Ｄ４３Ｅ残基の変化を含有する請求項９８に記載の変異エンドヌクレアーゼＶ。
【請求項１２８】
Ｄ１０５Ａ残基の変化を含有する請求項９８に記載の変異エンドヌクレアーゼＶ。
【請求項１２９】
Ｄ１０５Ｅ残基の変化を含有する請求項９８に記載の変異エンドヌクレアーゼＶ。
【請求項１３０】
Ｆ４６Ａ残基の変化を含有する請求項９８に記載の変異エンドヌクレアーゼＶ。
【請求項１３１】
Ｆ４６Ｙ残基の変化を含有する請求項９８に記載の変異エンドヌクレアーゼＶ。
【請求項１３２】
Ｆ４６Ｌ、Ｆ４６Ｉ、Ｆ４６Ｖ、もしくはＦ４６Ｍ残基の変化を含有する請求項９８に記載の変異エンドヌクレアーゼＶ。
【請求項１３３】
Ｒ１１８Ａ残基の変化を含有する請求項９８に記載の変異エンドヌクレアーゼＶ。
【請求項１３４】
Ｒ１１８Ｌ、Ｒ１１８Ｉ、Ｒ１１８Ｖ、もしくはＲ１１８Ｍ残基の変化を含有する請求項９８に記載の変異エンドヌクレアーゼＶ。
【請求項１３５】
Ｒ１１８Ｋ残基の変化を含有する請求項９８に記載の変異エンドヌクレアーゼＶ。
【請求項１３６】
Ｒ１１８ＮもしくはＲ１１８Ｑ残基の変化を含有する請求項９８に記載の変異エンドヌクレアーゼＶ。
【請求項１３７】
Ｒ１１８ＤもしくはＲ１１８Ｅ残基の変化を含有する請求項９８に記載の変異エンドヌクレアーゼＶ。
【請求項１３８】
Ｒ１１８ＴもしくはＲ１１８Ｓ残基の変化を含有する請求項９８に記載の変異エンドヌクレアーゼＶ。
【請求項１３９】
Ｆ１８０Ａ残基の変化を含有する請求項９８に記載の変異エンドヌクレアーゼＶ。
【請求項１４０】
Ｆ１８０Ｙ残基の変化を含有する請求項９８に記載の変異エンドヌクレアーゼＶ。
【請求項１４１】
Ｆ１８０Ｌ、Ｆ１８０Ｉ、Ｆ１８０Ｖ、もしくはＦ１８０Ｍ残基の変化を含有する請求項９８に記載の変異エンドヌクレアーゼＶ。
【請求項１４２】
Ｇ８３Ａ残基の変化を含有する請求項９８に記載の変異エンドヌクレアーゼＶ。
【請求項１４３】
Ｇ８３Ｌ、Ｇ８３Ｉ、Ｇ８３Ｖ、もしくはＧ８３Ｍ残基の変化を含有する請求項９８に記載の変異エンドヌクレアーゼＶ。
【請求項１４４】
Ｇ８３ＫもしくはＧ８３Ｒ残基の変化を含有する請求項９８に記載の変異エンドヌクレアーゼＶ。
【請求項１４５】
Ｇ８３ＮもしくはＧ８３Ｑ残基の変化を含有する請求項９８に記載の変異エンドヌクレアーゼＶ。
【請求項１４６】
Ｇ８３ＤもしくはＧ８３Ｅ残基の変化を含有する請求項９８に記載の変異エンドヌクレアーゼＶ。
【請求項１４７】
Ｇ８３ＴもしくはＧ８３Ｓ残基の変化を含有する請求項９８に記載の変異エンドヌクレアーゼＶ。
【請求項１４８】
Ｉ１７９Ａ残基の変化を含有する請求項９８に記載の変異エンドヌクレアーゼＶ。
【請求項１４９】
Ｉ１７９ＫもしくはＩ１７９Ｒ残基の変化を含有する請求項９８に記載の変異エンドヌクレアーゼＶ。
【請求項１５０】
Ｉ１７９ＮもしくはＩ１７９Ｑ残基の変化を含有する請求項９８に記載の変異エンドヌクレアーゼＶ。
【請求項１５１】
Ｉ１７９ＤもしくはＩ１７９Ｅ残基の変化を含有する請求項９８に記載の変異エンドヌクレアーゼＶ。
【請求項１５２】
Ｉ１７９ＴもしくはＩ１７９Ｓ残基の変化を含有する請求項９８に記載の変異エンドヌクレアーゼＶ。
【請求項１５３】
Ｄ１１０Ａ残基の変化を含有する請求項９８に記載の変異エンドヌクレアーゼＶ。
【請求項１５４】
Ｈ１２５Ａ残基の変化を含有する請求項９８に記載の変異エンドヌクレアーゼＶ。
【請求項１５５】
正常標的核酸配列とは１つ以上の単一塩基の変化、挿入、または欠失によって相違する変異核酸配列を同定するための方法であって、
潜在的に正常標的核酸配列並びに変異核酸配列を含有する検体を提供する段階；
標的核酸配列および変異核酸配列の相補的鎖上でのハイブリダイゼーションに適した２種の標識オリゴヌクレオチドプライマーを提供する段階；
ポリメラーゼを提供する段階；
ポリメラーゼ連鎖反応混合物を形成するために検体、標識オリゴヌクレオチドプライマー、およびポリメラーゼを混合する段階；
ポリメラーゼ連鎖反応混合物を、オリゴヌクレオチドプライマーが標的核酸配列および／または変異核酸配列にハイブリダイズすることができるハイブリダイゼーション処理、ハイブリダイズされたオリゴヌクレオチドプライマーが伸長されてそれにオリゴヌクレオチドプライマーがハイブリダイズされる標的核酸配列および／または変異核酸配列に相補的な伸長生成物が形成される伸長処理、およびハイブリダイズされた核酸配列が分離される変性処理を含む１回以上のポリメラーゼ連鎖反応サイクルに供する段階；
ポリメラーゼを不活化する段階；
ポリメラーゼ連鎖反応伸長生成物を変性させる段階；
正常標的核酸配列および変異核酸配列を潜在的に含有するヘテロ二重鎖生成物を形成するためにポリメラーゼ連鎖反応伸長生成物をアニーリングする段階；
ミスマッチ塩基対から１塩基離れた位置でヘテロ二重鎖ＤＮＡに優先的にニックを入れるかまたは開裂するエンドヌクレアーゼを提供する段階；
エンドヌクレアーゼ開裂反応混合物を形成するためにヘテロ二重鎖生成物とエンドヌクレアーゼとを混合する段階；
エンドヌクレアーゼがミスマッチ塩基対から１塩基離れた位置でヘテロ二重鎖生成物に優先的にニックを入れるかまたは開裂するようにエンドヌクレアーゼ開裂反応混合物をインキュベートする段階；
リガーゼを提供する段階；
リガーゼ再シーリング反応混合物を形成するために潜在的にニックが入れられたまたは開裂されたヘテロ二重鎖生成物およびリガーゼを混合する段階；
ミスマッチ塩基対に隣接する位置でニックが入れられたヘテロ二重鎖生成物の再シーリングを実質的に生じさせずに完全に適合した塩基対でニックが入れられたヘテロ二重鎖生成物をシールするためにリガーゼ再シーリング反応混合物をインキュベートする段階；
３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼを提供する段階；
ポリメラーゼヌクレオチド鎖分解性分解反応混合物を形成するために潜在的にニックが入れられたまたは開裂されたヘテロ二重鎖生成物および３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼを混合する段階；
ニックへ３’側の数塩基を除去するために３’−５’ヌクレオチド鎖分解活性に有効な条件下でポリメラーゼヌクレオチド鎖分解性分解反応混合物をインキュベートする段階；
３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼを不活化する段階；
３’−５’活性を備えていないポリメラーゼを提供する段階；
ポリメラーゼ・ミニシーケンシング反応混合物を形成するためにインキュベートされたポリメラーゼ分解反応混合物、３’−５’活性を備えていないポリメラーゼ、標識ジデオキシターミネーター三リン酸ヌクレオチド、およびデオキシリボヌクレオチド三リン酸類を混合する段階；
ミニシーケンシング反応生成物を形成するためにニックが入れられたまたは開裂されたヘテロ二重鎖生成物の３’末端を伸長させるために３’−５’活性を備えていないポリメラーゼに有効な条件下でポリメラーゼ・ミニシーケンシング反応混合物をインキュベートする段階；
ミニシーケンシング生成物をサイズまたは電気泳動移動度によって分離する段階；ならびに
ポリメラーゼ・ミニシーケンシング反応混合物をインキュベートする前記の段階の結果として生じる分離されたミニシーケンシング生成物を区別することによって正常標的核酸配列および変異核酸配列の存在を検出する段階を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０００年１２月１日に出願された米国仮特許出願第６０／２５０，４３５号明細書の恩典を主張する。
【０００２】
本発明は、補助金番号第ＲＯＩ−ＣＡ６５９３０号および第ＲＯＩ−ＣＡ８１４６７号の下で国立保健研究所によって後援された研究から生まれた。米合衆国政府は一定の権利を保有できる。
【０００３】
発明の分野
本発明は、結合エンドヌクレアーゼ（「エンド」）開裂および連結（ライゲーション）反応を使用した核酸の相違の検出に関する。
【背景技術】
【０００４】
発明の背景
ＤＮＡ配列変化の検出
基礎研究および臨床研究のいずれにおいても、ＤＮＡ配列変化を高効率かつ高精度で同定することが大いに必要である。かかる変化を検出するための現行技術は、２つのグループに分けることができる。１）既知の変異または多型性の検出、および２）未知の変異または多型性の検出（変異スキャニングとも呼ばれる）。既知の変異および多形性を検出するために種々の有効な方法が開発されており、それらの方法には例えば直接ＤＮＡシーケンシング、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション、対立遺伝子特異的ＰＣＲ、ＤＮＡアレイ、およびＰＣＲ／ＬＤＲが含まれる。未知の変異を検出するためにも様々な方法があるが、これらの感度および精度は大きく相違する。
【０００５】
臨床検体中の未知の変異を同定するための高処理技術の比較
臨床検体中の未知の変異を同定することは、既知の変異並びに一部の新規合併症についてのスクリーニングと類似の困難を提示する。腫瘍検体中に存在する変異は、基質汚染のためにその遺伝子に対するＤＮＡ配列の１５％しか表していない場合がある。このため未知の変異についてのスクリーンは、低存在率配列を同定するために高感度を必要とする。大多数の癌遺伝子は変化させられる可能性がある複数のエキソンを含有しているので、広く変異した遺伝子（例、ＰＴＥＮ）についてさえ、単一エキソンのほとんどのアッセイ結果は陰性であると考えられる。しかし、検体をまとめてプールすることによって、所定のアッセイにおいて有意な変異を発見する確率が増加する。検体をプールすることによりスクリーンの能力を増加させるためには、この方法はプーリングの結果として生じるそれ以上の変異希釈を許容するために十分に高い感度を有していなければならない。さらに、異常な生殖細胞系の変異に対しては、検体をプールする能力は複数エキソンにおいて極めて多数の検体を評価するスループットを向上させる。
【０００６】
未知の癌変異をスクリーニングすることに関連するその他の重大な厄介な問題は、下記の段階を行う必要である。（ｉ）フレームシフト、ノンセンス、もしくはミスセンス変異のいずれであるかを同定する段階、および（ｉｉ）生殖細胞系（即ち、サイレント）多型性からミスセンス変異を区別する段階。後者は、多型性がヒトゲノム内では１ｋｂ毎にほぼ１回存在すると推定されるので、極めて重要である。Ｗａｎｇ  Ｄ.Ｇ.ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８０（５３６６）：１０７７−８２（１９９８）、Ｌｉ  Ｗ.Ｈ.ら、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１２９（２）：５１３−２３（１９９１）、Ｌａｉ  Ｅ.ら、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，５４（１）：３１−３８（１９９８）、Ｎｉｃｋｅｒｓｏｎ  Ｄ.Ａ.ら、Ｎａｔ.Ｇｅｎｅｔ，１９（３）：２３３−４０（１９９８）、Ｈａｒｄｉｎｇ  Ｒ.Ｍ.ら、Ａｍ.Ｊ.Ｈｕｍ.Ｇｅｎｅｔ.，６０（４）：７７２−８９（１９９７）、Ｔａｉｌｌｏｎ−Ｍｉｌｌｅｒ  Ｐ.ら、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ.，８（７）：７４８−５４（１９９８）、Ｈａｌｕｓｈｋａ  Ｍ.Ｋ.ら、Ｎａｔ.Ｇｅｎｅｔ.，２２（３）：２３９−４７（１９９９）、およびＣａｒｇｉｌｌ  Ｍ.ら、Ｎａｔ.Ｇｅｎｅｔ.，２２（３）：２３１−３８（１９９９）を参照。明らかに重要性の低い多型性を分離すれば、情報を提供する変異を同定する際の効率が有意に増加するはずである。あいにくなことに、臨床的有意性を備えた追加の希頻度変異を同定する現在の方法は、それらの適用が限定されている。現在までの大多数の方法は、識別するための精度または有効な方法であるための感度のいずれかが欠如している。その結果として、緻密な変異を同定する可能性およびプールされた検体中で腫瘍または生殖細胞系ＤＮＡを分析する感度を備えたスキャニング法に対する差し迫った必要がある。
【０００７】
直接シーケンシングおよび変化検出アレイ
様々な方法が、未知の変異についてスキャンするために開発されてきた。直接シーケンシングは、あらゆる変異およびその位置を検出できる理想を表しているが、高処理は費用がかかる。Ｇｙｌｌｅｎｓｔｅｎ  Ｕ.Ｂ.ら、Ｐｒｏｃ.Ｎａｔｌ.Ａｃａｄ.Ｓｃｉ.ＵＳＡ，８５（２０）：７６５２−５６（１９８８）、Ｈｕｌｔｍａｎ  Ｔ.ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ.，１７（１３）：４９３７−４６（１９８９）、Ｐｈｅａｒ  Ｇ.Ａ.ら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ.Ｂｉｏｌ.，３１：２４７−５６（１９９４）、Ｒａｏ  Ｖ.Ｂ.，Ａｎａｌ.Ｂｉｏｃｈｅｍ.，２１６（１）：１−１４（１９９４）、Ｋｏｖａｃｈ  Ｊ.Ｓ.ら、Ｊ.Ｎａｔｌ.Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ.，８３（１４）：１００４−９（１９９１）。この方法は感度が低いためにプールされた検体の正確な解析を妨げ、さらに充実性腫瘍検体に関しては、この方法は基質の汚染に対して脆弱である。盲験試験では、直接シーケンシングは顕微解剖された腫瘍検体中でＫ−ｒａｓ変異の２０％を同定することができなかった。この数は、肺腫瘍検体中のｐ５３変異の２４％が同定されなかった他の試験と一致している。Ａｈｒｅｎｄｔ  Ｓ.ら、Ｐｒｏｃ.Ｎａｔｌ.Ａｃａｄ.Ｓｃｉ.ＵＳＡ，９６：７３８２−８７（１９９９）。自動シーケンス解析をこれらの同一肺腫瘍検体に対して実施すると、この偽陰性値は３２％へ上昇した。Ａｈｒｅｎｄｔ  Ｓ.ら、Ｐｒｏｃ.Ｎａｔｌ.Ａｃａｄ.Ｓｃｉ.ＵＳＡ，９６：７３８２−８７（１９９９）。これらの結果は直接シーケンシングに結び付いた感度の限界を反映しており、さらにこのアプローチを自動化するのが困難であることを証明している。検体が特定領域において変異を有することが分かっている場合は、直接シーケンシングを反復して試みれば変異およびその位置を同定することができるはずである。このため直接シーケンシングには、事前に変異を含有することが同定された遺伝子領域において変化した正確な塩基を同定するための第２段階としての有用性があるかも知れない。
【０００８】
変化検出アレイ（ＶＤＡ）は、所定の遺伝子中の大きな配列ブロックをスキャンするために標準ハイブリダイゼーション・マイクロアレイを使用する。スキャニング能力のレベルは高いにもかかわらず、このアプローチは有用性を制限する幾つかの特徴を有している。ＶＤＡは、すべての変異を検出することはできず、例えばＢＲＣＡ２およびｐ５３遺伝子中のフレームシフト変異を検出するのは特に困難である。Ａｈｒｅｎｄｔ  Ｓ.ら、Ｐｒｏｃ.Ｎａｔｌ.Ａｃａｄ.Ｓｃｉ.ＵＳＡ，９６：７３８２−８７（１９９６）、Ｈａｃｉａ  Ｊ.Ｇ.ら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１４（４）：４４１−４７（１９９９）。プライマー伸長アレイもまた、モノヌクレオチド反復配列のスリップを検出することができない。Ｓｙｖａｎｅｎ  Ａ.Ｃ.ら、Ｈｕｍ.Ｍｕｔａｔ.，３（３）：１７２−７９（１９９４）。ＶＤＡを使用した場合には１１〜２１％の高い偽陽性率が観察されている。Ｈａｌｕｓｈｋａ  Ｍ.Ｋ.ら、Ｎａｔ.Ｇｅｎｅｔ.，２２（３）：２３９−４７（１９９９）。これらの不正確な結果の原因となった可能性がある直接ハイブリダイゼーションの１つの結果には、二次構造の破壊が含まれる。完全適合ＰＣＲフラグメントは、異型フラグメント中に存在しない二次構造を想定している。二次構造は、通例はフラグメント／アレイハイブリダイゼーションに関してエネルギー的に好ましくなく、異型フラグメントは真の完全適合フラグメントより高度の結合親和性でアレイ上の完全適合補体に結合することができる。Ｈａｃｉａ  Ｊ.，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ），２１：４２−４７（１９９９）。このような非正統的ハイブリダイゼーションは、偽陽性シグナルを生じさせうる。変異含有ＰＣＲフラグメントからアレイ上の配列への直接ハイブリダイゼーションは、Ｇ＋ＣおよびＡ＋Ｔ両方の高含量の局在化領域とともに同時に配列路をアッセイすることの追加の困難を有している。Ｈａｃｉａ  Ｊ.，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ），２１：４２−４７（１９９９）。これらの配列路内の一定の変異は、Ｔｍを有意に減少させ、従って偽陰性シグナルを引き起こす可能性がある。
【０００９】
ゲルに基づくアッセイ、ミスマッチ開裂酵素、および短縮タンパク質アッセイ
未知の変異を検出するために広く使用されるその他の方法は、相違する電気泳動移動挙動に基づいてホモ二重鎖およびヘテロ二重鎖ＤＮＡを分離する。これらの方法には、一本鎖構造的多型性（ＳＳＣＰ）（Ｓｕｚｕｋｉ  Ｙ.ら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，５（７）：１０３７−４３（１９９０）、Ｍａｋｉｎｏ  Ｒ.ら、ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ａｐｐｌ.，２（１）：１０−１３（１９９２）、Ｈａｙａｓｈｉ  Ｋ.，ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ａｐｐｌ.，１（１）：３４−３８（１９９１）、Ｋｏｒｎ  Ｓ.ら、Ｊ.Ｃｌｉｎ.Ｐａｔｈｏｌ.，４６（７）：６２１−２３（１９９３））、変性勾配ゲル電気泳動法（ＤＧＧＥ）（Ｆａｈｙ  Ｅ.ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２５（１５）：３１０２−９（１９９７）、Ｆｏｄｄｅ  Ｒ.ら、Ｈｕｍ.Ｍｕｔａｔ.，３（２）：８３−９４（１９９４）、Ｇｕｌｄｂｅｒｇ  Ｐ.ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ.，２２（５）：８８０−８１（１９９４）、Ｒｉｄａｎｐａａ  Ｍ.ら、Ｈｕｍ.Ｍｏｌ.Ｇｅｎｅｔ.，２（６）６３９−４４（１９９３）、Ｒｉｄａｎｐａａ  Ｍ.ら、Ｍｕｔａｔ.Ｒｅｓ.，３３４（３）：３５７−６４（１９９５））、定常変性キャピラリー電気泳動法（ＣＤＣＥ）（Ｃｈｅｎ  Ｊ.ら、Ｅｎｖｉｒｏｎ.Ｈｅａｌｔｈ  Ｐｅｒｓｐｅｃｔ，３：２２７−２９（１９９４）、Ｋｈｒａｐｋｏ  Ｋ.ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ.，２２（３）：３６４−６９（１９９４））、ジデオキシフィンガープリンティング（ｄｄｆ）（Ｓａｒｋａｒ  Ｇ.ら、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，１３：４４１−４３（１９９２））、および制限エンドヌクレアーゼフィンガープリンティング法（ＲＥＦ）（Ｌｉｕ  Ｑ.ら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１８（３）：４７０−７７（１９９４））が含まれる。類似のアプローチである変性高速液体クロマトグラフィー（ＤＨＰＬＣ）もまた、ヘテロ二重鎖ＤＮＡからホモ二重鎖を分離するが、これはアルキル化非多孔性（スチレンジビニルベンゼン）粒子上でのイオン対逆相液体クロマトグラフィーによる分離に基づいている。Ｕｎｄｅｒｈｉｌｌ  Ｐ.Ａ.ら、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ.，７（１０）：９９６−１００５（１９９７）。これらの方法は幾つかのは極めて望ましい特徴を含むが、上記で考察したスループットおよび感度の両方に関して完全な方法は１つもない。多型性の位置を同定できる方法（ｄｄＦおよびＲＥＦ）は、プールされた検体中の低レベル変異を評価するためには適切ではない。残りの方法はどちらかと言えば高速で低レベル変異を検出できるが、サイレント多型性からミスセンスを識別することはできない。さらに、これらの方法は変異の位置を定位しないので、例えば直接シーケンシングのようなフォローアップ方法とは余り適合しない。
【００１０】
ＡＰＣ遺伝子中のフレームシフトまたは終止コドンを検出するための洗練されたアプローチは、タンパク質短縮法（ｐｒｏｔｅｉｎ  ｔｒｕｎｃａｔｉｏｎ  ｔｅｓｔ）と呼ばれる結合転写翻訳アッセイを使用する。Ｐｏｗｅｌｌ  Ｓ.Ｍ.ら、Ｎａｔｕｒｅ，３５９（６３９２）：２３５−３７（１９９２）、Ｐｏｗｅｌｌ  Ｓ.Ｍ.ら、Ｎ.Ｅｎｇｌ.Ｊ.Ｍｅｄ.，３２９：１９８２−８７（１９９３）、Ｒｅｄｓｔｏｎ  Ｍ.Ｓ.ら、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ，１０８（２）：３８３−９２（１９９５）、Ｐｅｔｅｒｓｅｎ  Ｇ.Ｍ.ら、Ｈｕｍ.Ｇｅｎｅｔ.，９１（４）：３０７−１１（１９９３）、Ｓｕ  Ｌ.Ｋ.ら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ.，５３（１２）：２７２８−３１（１９９３）。この方法は現在、大きな遺伝子において短縮タンパク質を生成する変異を発見するために最も強力なアプローチである；しかし、この方法ではミスセンス変異または多型性を検出することはできない。多型性は、ＲＮａｓｅ  Ａミスマッチ開裂を通しての例えばＤＮＡ−ＲＮＡヘテロ二重鎖のようなＤＮＡハイブリッド（Ｗｉｎｔｅｒ  Ｅ.，Ｐｒｏｃ.Ｎａｔｌ.Ａｃａｄ.Ｓｃｉ.ＵＳＡ，８２（２２）：７５７５−７９（１９８５）、Ｐｅｒｕｃｈｏ  Ｍ.ら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌｓ，７：１３７−４１（１９８９）、Ｍｙｅｒｓ  Ｒ.Ｍ.ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３０（４７３１）：１２４２−４６（１９８５））、並びに化学的ミスマッチ開裂（ＣＣＭ）を通してのＤＮＡ−ＤＮＡホモ二重鎖（Ｃｏｔｔｏｎ  Ｒ.Ｇ.Ｈ.ら、Ｐｒｏｃ.Ｎａｔｌ.Ａｃａｄ.Ｓｃｉ.ＵＳＡ，８５（４３９７−４０１（１９８８）、Ｈａｎｓｅｎ  Ｌ.Ｌ.ら、ＰＣＲ  Ｐｒｉｍｅｒ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（ＰＲＣプライマー：実験マニュアル）Ｃ.Ｗ.Ｄｉｅｆｅｎｂａｃｈ  ａｎｄ  Ｇ.Ｓ.Ｄｖｅｋｓｌｅｒ編集、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ：Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、第２７５−８６頁（１９９５）中の「Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ａｎｄ  Ｆａｓｔ  Ｍｕｔａｔｉｏｎ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｂｙ  Ｓｏｌｉｄ−Ｐｈａｓｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｌｅａｖａｇｅ（固相化学開裂による高感度および高速変異検出）」、Ｈａｒｉｓ  Ｉ.Ｉ.ら、ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ａｐｐｌ.，３（５）：２６８−７１（１９９４））におけるミスマッチの開裂、Ｔ４エンドヌクレアーゼＶＩＩもしくはＭｕｔＹ開裂（Ｙｏｕｉｌ  Ｒ.ら、Ｐｒｏｃ.Ｎａｔｌ.Ａｃａｄ.Ｓｃｉ.ＵＳＡ，９２（１）：８７−９１（１９９５）、Ｘｕ  Ｊ.Ｆ.ら、Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ，１７（２）：３２１−２６（１９９６）、Ｇｉｕｎｔａ  Ｃ.ら、Ｄｉａｇｎ.Ｍｏｌ.Ｐａｔｈｏｌ.，５（４）：２６５−７０（１９９６））、またはクリーバーゼ（Ｃｌｅａｖａｓｅ）によって同定できる。近年では、Ｔ４エンドヌクレアーゼＶＩＩと類似の活性を備えた植物エンドヌクレアーゼＣＥＬ  Ｉが報告されている。Ｏｌｅｙｋｏｗｓｋｉ  Ｃ.Ａ.ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ.，２６（２０）：４５９７−６０２（１９９８）。ＣＥＬ  Ｉは、ヌクレアーゼＳ１と類似の活性を有し、中性ｐＨで作用する。その開裂効率およびバックグラウンドは試験されるミスマッチおよび特異的テンプレートに従って変化するので、さらにまだ他のテンプレ���ト（例、ＧＣ富裕領域における）の詳細な評価が必要とされる。最も一般的に認められたミスマッチ開裂アプローチは、ミスマッチでの正常および多型性基質のヘテロ二重鎖を開裂させるためにＴ４エンドヌクレアーゼＶＩＩもしくはＭｕｔＹを使用することにより多型性の近似位置を同定する。Ｙｏｕｉｌ  Ｒ.ら、Ｐｒｏｃ.Ｎａｔｌ.Ａｃａｄ.Ｓｃｉ.ＵＳＡ，９２（１）：８７−９１（１９９５）、Ｘｕ  Ｊ.Ｆ.ら、Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ，１７（２）：３２１−２６（１９９６）、Ｇｉｕｎｔａ  Ｃ.ら、Ｄｉａｇｎ.Ｍｏｌ.Ｐａｔｈｏｌ.，５（４）：２６５−７０（１９９６）。これらの酵素開裂アプローチは、大多数の多型性の近似位置を同定する；しかしこれらの酵素はしばしばマッチＤＮＡをニックし、高いバックグラウンドノイズを引き起こす。この高いバックグラウンドは充実性腫瘍試験に関して有用性を制限する傾向がある。
【００１１】
そこで本発明は、先行技術における上記の欠点を克服することに向けられる。
【発明の開示】
【００１２】
発明の概要
本発明の１つの局面は、正常標的塩基配列とは１つ以上の単一塩基の変化、挿入、または欠失によって相違する変異核酸配列を同定するための方法に向けられる。この方法には次の混合が含まれる。（１）潜在的に正常標的塩基配列並びに変異核酸配列を含有する検体；（２）標的塩基配列および変異核酸配列の相補的鎖上でのハイブリダイゼーションに適した２種の標識オリゴヌクレオチドプライマーを提供する段階；および（３）ポリメラーゼ連鎖反応混合物を形成するためにポリメラーゼを提供する段階。ポリメラーゼ連鎖反応混合物は、オリゴヌクレオチドプライマーが標的塩基配列および／または変異核酸配列をハイブリダイズすることができるハイブリダイゼーション処理、ハイブリダイズされたオリゴヌクレオチドプライマーが伸長されてそれにオリゴヌクレオチドプライマーがハイブリダイズされる標的塩基配列および／または変異核酸配列に相補的な伸長生成物が形成される伸長処理、およびハイブリダイズされた核酸配列が分離される変性処理を含む１回以上のポリメラーゼ連鎖反応サイクルを受ける。ポリメラーゼが不活化された後、ポリメラーゼ連鎖反応伸長生成物は変性させられ、ポリメラーゼ連鎖反応伸長生成物はアニーリングされて潜在的に正常標的塩基配列および変異核酸配列を含有するヘテロ二重鎖生成物が形成される。ミスマッチ塩基対から１塩基離れた位置でヘテロ二重鎖ＤＮＡに優先的にニックを入れるかまたは開裂するエンドヌクレアーゼは、その後ヘテロ二重鎖生成物と混合されてエンドヌクレアーゼ開裂反応混合物が形成される。エンドヌクレアーゼ開裂反応混合物は、エンドヌクレアーゼがミスマッチ塩基対から１塩基離れた位置でヘテロ二重鎖生成物に優先的にニックを入れるかまたは開裂するように混合される。リガーゼおよび潜在的にニックが入れられたまたは開裂されたヘテロ二重鎖生成物が混合されてリガーゼ再シーリング反応混合物が形成される。リガーゼ再シーリング反応混合物がインキュベートされると、完全適合塩基対でニックが入れられたヘテロ二重鎖生成物がシーリングされるが、ミスマッチ塩基対に隣接する位置でのニックが入れられたヘテロ二重鎖生成物は実質的に再シーリングはされない。リガーゼ再シーリング反応混合物をインキュベートすることから生じる生成物はサイズまたは電気泳動移動度によって分離され、正常標的塩基配列および変異核酸配列の存在はリガーゼ再シーリング反応混合物をインキュベートした結果として生じる分離された生成物を区別することによって検体中で検出される。
【００１３】
本発明のまた別の局面は、正常標的核酸配列とは１つ以上の単一塩基の変化、挿入、または欠失によって相違する変異核酸配列を同定するための方法に関する。この方法では、潜在的に変異核酸配列を含有しているが必ずしも正常標的核酸配列を含有していない検体、正常標的核酸配列を含有する標準物質、変異核酸配列の相補的鎖上でハイブリダイゼーションに適した２種の標識オリゴヌクレオチドプライマー、およびポリメラーゼが混合されて、第１ポリメラーゼ連鎖反応混合物が形成される。第１ポリメラーゼ連鎖反応混合物は、標識オリゴヌクレオチドプライマーが変異核酸配列にハイブリダイズできるハイブリダイゼーション処理、ハイブリダイズされたオリゴヌクレオチドプライマーが伸長されてそれにオリゴヌクレオチドプライマーがハイブリダイズされる変異核酸配列に相補的な伸長生成物が形成される伸長処理、およびハイブリダイズされた核酸配列が分離される変性処理を含む１回以上のポリメラーゼ連鎖反応サイクルを受ける。その後ポリメラーゼは不活化される。正常標的核酸配列、標識オリゴヌクレオチドプライマー、およびポリメラーゼが混合されて、第２ポリメラーゼ連鎖反応混合物が形成される。第２ポリメラーゼ連鎖反応混合物は、標識オリゴヌクレオチドプライマーが正常標的核酸配列にハイブリダイズできるハイブリダイゼーション処理、ハイブリダイズされたオリゴヌクレオチドプライマーが伸長されてそれにオリゴヌクレオチドプライマーがハイブリダイズする正常標的核酸配列に相補的な伸長生成物を形成する伸長処理、およびハイブリダイズされた核酸配列が分離される変性処理を含む１回以上のポリメラーゼ連鎖反応サイクルを受ける。その後ポリメラーゼは不活化される。第１および第２ポリメラーゼ連鎖反応伸長生成物は変性させられ、その後アニーリングされて潜在的に正常標的塩基配列および変異核酸配列を含有するヘテロ二重鎖生成物が形成される。ミスマッチ塩基対から１塩基離れた位置でヘテロ二重鎖ＤＮＡに優先的にニックを入れる、または開裂するエンドヌクレアーゼがヘテロ二重鎖生成物と混合されてエンドヌクレアーゼ開裂反応混合物が形成される。エンドヌクレアーゼ開裂反応混合物をインキュベートすると、エンドヌクレアーゼはミスマッチ塩基対から１塩基離れた位置でヘテロ二重鎖生成物に優先的にニックを入れる、または開裂する。リガーゼおよび潜在的にニックが入れられた、または開裂されたヘテロ二重鎖生成物が混合されると、リガーゼ再シーリング反応混合物が形成され、これがインキュベートされると、完全適合塩基対でニックが入れられたヘテロ二重鎖生成物がシーリングされるが、ミスマッチ塩基対に隣接する位置でのニックが入れられたヘテロ二重鎖生成物は実質的に再シーリングはされない。リガーゼ再シーリング反応混合物をインキューべーとした結果として生じる生成物はサイズまたは電気泳動移動度によって分離され、検体中の正常標的核酸配列および変異核酸配列の存在はリガーゼ再シーリング反応混合物をインキュベートした結果として生じる分離された生成物を区別することによって検出される。
【００１４】
本発明のまた別の局面は、次のように完全に適合したＤＮＡにニックを入れたときの連結に適した末端を生成し、ヘテロ二重鎖ＤＮＡに優先的にニックを入れる、または開裂する熱安定性エンドヌクレアーゼに関する。（１）塩基対がミスマッチである、またはミスマッチを１塩基越える場所で、および（２）塩基対がミスマッチである、またはミスマッチを１塩基越える場所でのＡ／Ａ、Ｇ／Ｇ、Ｔ／Ｔ、Ａ／Ｇ、Ａ／Ｃ、Ｇ／Ａ、Ｇ／Ｔ、Ｔ／Ｇ、Ｔ／Ｃ、Ｃ／Ａ、またはＣ／Ｔミスマッチ塩基対で。代替場所（１）および（２）の各々で、完全に適合したＤＮＡにニックを入れるときに連結に適した末端が生成される。本発明に従った熱安定性エンドヌクレアーゼは、ミスマッチの位置に下線が引かれ大文字で示されているｇＲｃｇ、ｒｃＲｃ、ｃｇＹｃ、またはｇＹｇｙ配列を有するものを除いて、いずれかの単一塩基変異または多型性のために形成された少なくとも１本のヘテロ二重鎖に優先的にニックを入れる、または開裂し、完全に適合したＤＮＡでニックを入れるときに連結に適した末端を生成する。あるいはまた、ヘテロ二重鎖ＤＮＡに優先的にニックを入れる、または開裂する熱安定性エンドヌクレアーゼは、塩基対がミスマッチである、または不対塩基を１塩基越える場所で１、２、および３塩基の挿入もしくは欠失を含有しており、完全に適合したＤＮＡでＤＮＡにニックを入れるときに連結に適した末端を生成する。
【００１５】
本発明のまた別の局面は、次のいずれかを含有するテルモトガ・マリチマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ）からの変異エンドヌクレアーゼＶ（「エンドＶ」）である。（１）Ｙ８０Ａ残基の変化；（２）Ｙ８０Ｆ残基の変化；（３）Ｙ８０Ｌ、Ｙ８０Ｉ、Ｙ８０Ｖ、もしくはＹ８０Ｍのいずれかの残基の変化；（４）Ｒ８８Ａ残基の変化；（５）Ｒ８８Ｌ、Ｒ８８Ｉ、Ｒ８８Ｖ、もしくはＲ８８Ｍ残基の変化；（６）Ｒ８８Ｋ残基の変化；（７）Ｒ８８ＮもしくはＲ８８Ｑ残基の変化；（８）Ｒ８８ＤもしくはＲ８８Ｅ残基の変化；（９）Ｒ８８ＴもしくはＲ８８Ｓ残基の変化；（１０）Ｅ８９Ａ残基の変化；（１１）Ｅ８９Ｌ、Ｅ８９Ｉ、Ｅ８９Ｖ、もしくはＥ８９Ｍ残基の変化；（１２）Ｅ８９Ｄ残基の変化；（１３）Ｅ８９ＮもしくはＥ８９Ｑ残基の変化；（１４）Ｅ８９ＲもしくはＥ８９Ｋ残基の変化；（１５）Ｅ８９ＴもしくはＥ８９Ｓ残基の変化；（１６）Ｈ１１６Ａ残基の変化；（１７）Ｈ１１６Ｌ、Ｈ１１６Ｉ、Ｈ１１６ＶもしくはＨ１１６Ｍ残基の変化；（１８）Ｈ１１６ＫもしくはＨ１１６Ｒ残基の変化；（１９）Ｈ１１６ＮもしくはＨ１１６Ｑ残基の変化；（２０）Ｈ１１６ＴもしくはＨ１１６Ｓ残基の変化；（２１）Ｋ１３９Ａ残基の変化；（２２）Ｋ１３９Ｌ、Ｋ１３９Ｉ、Ｋ１３９Ｖ、もしくはＫ１３９Ｍ残基の変化；（２３）Ｋ１３９Ｒ残基の変化；（２４）Ｋ１３９ＮもしくはＫ１３９Ｑ残基の変化；（２５）Ｋ１３９ＤもしくはＫ１３９Ｅ残基の変化；（２６）Ｋ１３９ＴもしくはＫ１３９Ｓ残基の変化；（２７）Ｄ４３Ａ残基の変化；（２８）Ｄ４３Ｅ残基の変化；（２９）Ｄ１０５Ａ残基の変化；（３０）Ｄ１０５Ｅ残基の変化；（３１）Ｆ４６Ａ残基の変化；（３２）Ｆ４６Ｙ残基の変化；（３３）Ｆ４６Ｌ、Ｆ４６Ｉ、Ｆ４６Ｖ、もしくはＦ４６Ｍ残基の変化；（３４）Ｒ１１８Ａ残基の変化；（３５）Ｒ１１８Ｌ、Ｒ１１８Ｉ、Ｒ１１８Ｖ、もしくはＲ１１８Ｍ残基の変化；（３６）Ｒ１１８Ｋ残基の変化；（３７）Ｒ１１８ＮもしくはＲ１１８Ｑ残基の変化；（３８）Ｒ１１８ＤもしくはＲ１１８Ｅ残基の変化；（３９）Ｒ１１８ＴもしくはＲ１１８Ｓ残基の変化；（４０）Ｆ１８０Ａ残基の変化；（４１）Ｆ１８０Ｙ残基の変化；（４２）Ｆ１８０Ｌ、Ｆ１８０Ｉ、Ｆ１８０Ｖ、もしくはＦ１８０Ｍ残基の変化；（４３）Ｇ８３Ａ残基の変化；（４４）Ｇ８３Ｌ、Ｇ８３Ｉ、Ｇ８３Ｖ、もしくはＧ８３Ｍ残基の変化；（４５）Ｇ８３ＫもしくはＧ８３Ｒ残基の変化；（４６）Ｇ８３ＮもしくはＧ８３Ｑ残基の変化；（４７）Ｇ８３ＤもしくはＧ８３Ｅ残基の変化；（４８）Ｇ８３ＴまたはＧ８３Ｓ残基の変化；（４９）Ｉ１７９Ａ残基の変化；（５０）Ｉ１７９ＫもしくはＩ１７９Ｒ残基の変化；（５１）Ｉ１７９ＮもしくはＩ１７９Ｑ残基の変化；（５２）Ｉ１７９ＤもしくはＩ１７９Ｅ残基の変化；（５３）Ｉ１７９ＴもしくはＩ１７９Ｓ残基の変化；（５４）Ｄ１１０Ａ残基の変化；または（５５）Ｈ１２５Ａ残基の変化。
【００１６】
本発明のまた別の局面は、野生型エンドヌクレアーゼＶではなくむしろミスマッチ塩基を含有する、少なくとも１つのヘテロ二重鎖ＤＮＡに優先的にニックを入れる、または開裂する変異エンドヌクレアーゼＶに向けられる。
【００１７】
本発明のまた別の局面は、正常標的核酸配列とは１つ以上の単一塩基の変化、挿入、または欠失によって相違する変異核酸配列を同定するための方法に向けられる。この方法では、潜在的に正常標的核酸配列並びに変異核酸配列を含有する検体、標的核酸配列および変異核酸配列の相補的鎖上でのハイブリダイゼーションに適した２種の標識オリゴヌクレオチドプライマー、およびポリメラーゼが混合されてポリメラーゼ連鎖反応混合物が形成される。ポリメラーゼ連鎖反応混合物は、オリゴヌクレオチドプライマーが標的核酸配列および／または変異核酸配列にハイブリダイズできるハイブリダイゼーション処理、ハイブリダイズされたオリゴヌクレオチドプライマーが伸長されてそれにオリゴヌクレオチドプライマーがハイブリダイズする標的核酸配列および／または変異核酸配列に相補的な伸長生成物を形成する伸長処理、およびハイブリダイズされた核酸配列が分離される変性処理を含む１回以上のポリメラーゼ連鎖反応サイクルを受ける。ポリメラーゼが不活化された後、ポリメラーゼ連鎖反応伸長生成物が変性かつアニーリングさせられて潜在的に正常標的核酸配列および変異核酸配列を含有するヘテロ二重鎖生成物が形成される。ミスマッチ塩基対から１塩基離れた位置でヘテロ二重鎖ＤＮＡに優先的にニックを入れる、または開裂するエンドヌクレアーゼおよびヘテロ二重鎖生成物が混合されてエンドヌクレアーゼ開裂反応混合物が形成され、この反応混合物はエンドヌクレアーゼがミスマッチ塩基対から１塩基離れた位置でヘテロ二重鎖生成物に優先的にニックを入れる、または開裂するようにインキュベートされる。リガーゼおよび潜在的にニックが入れられた、または開裂されたヘテロ二重鎖生成物が混合されると、リガーゼ再シーリング反応混合物が形成され、これがインキュベートされると、完全適合塩基対でニックが入れられたヘテロ二重鎖生成物がシーリングされるが、ミスマッチ塩基対に隣接する位置でのニックが入れられたヘテロ二重鎖生成物は実質的に再シーリングはされない。３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼおよび潜在的にニックが入れられた、または開裂されたヘテロ二重鎖生成物が混合されるとポリメラーゼヌクレオチド鎖分解性分解反応混合物が形成され、これはニックへ３’側の数個の塩基を取り除くために３’−５’ヌクレオチド鎖分解活性に有効な条件下でインキュベートされる。３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を含むポリメラーゼが不活化された後、３’−５’活性を備えていないポリメラーゼおよびインキュベートされたポリメラーゼ分解反応混合物、標識ジデオキシターミネーター三リン酸ヌクレオチド類、およびデオキシリボヌクレオチド三リン酸類が混合されてポリメラーゼミニシーケンシング反応混合物が形成され、これは３’−５’活性を備えていないポリメラーゼのために有効な条件下でインキュベートされ、ニックが入れられた、または開裂されたヘテロ二重鎖生成物の３’末端が伸長されて、ミニシーケンシング反応生成物が形成される。このミニシーケンシング生成物はサイズもしくは電気泳動移動度によって分離され、さらに正常標的核酸配列および変異核酸配列の存在がポリメラーゼミニシーケンシング反応混合物をインキュベートした結果として生じる分離されたミニシーケンシング生成物を区別することによって検出される。
【００１８】
本発明は、遺伝性または散発性癌の発生に関連する６種の遺伝子中の様々な変異についてスクリーニングする試験で証明されたように、未知のフレームシフト、ナンセンス、およびミスセンス変異を同定する際に効果的であることが証明されている。さらにその上、対の生殖細胞系ＤＮＡを腫瘍ＤＮＡと並行して評価できるので、本発明はミスセンス変異を近くの、または隣接する遺伝性多型性から区別することさえ許容する。このアッセイはさらに検出できる配列変化のタイプに関して極めて広い適用性を有しており、さらにヒトゲノムで見出される典型的変異または多型性の９８％を同定することができる。さらに、このアッセイは１.７ｋｂ以上の長い領域における変異をスキャニングすることができる。本発明は、正常配列の高度のバックグラウンドにおいて変異を検出できる。本発明は、野生型ＤＮＡとの１：２０の希釈率で変異または多型性を検出でき、さらに野生型ＤＮＡとの希釈率が１：５０と低い場合にさえ変異／多型性を検出できる。この高い感度は、本発明をプールされた検体に対して敏感に反応させるので、従ってその処理能力を統計的に有意に増加させる。
【００１９】
発明の詳細な説明
ＤＮＡ配列の相違を検出する
本発明の１つの局面は、正常標的塩基配列とは１つ以上の単一塩基の変化、挿入、または欠失によって相違する変異核酸配列を同定するための方法に向けられる。この方法には次の混合が含まれる。（１）潜在的に正常標的塩基配列並びに変異核酸配列を含有する検体；（２）標的塩基配列および変異核酸配列の相補的鎖上でのハイブリダイゼーションに適した２種の標識オリゴヌクレオチドプライマーを提供する段階；および（３）ポリメラーゼ連鎖反応混合物を形成するためにポリメラーゼを提供する段階。ポリメラーゼ連鎖反応混合物は、オリゴヌクレオチドプライマーが標的塩基配列および／または変異核酸配列をハイブリダイズすることができるハイブリダイゼーション処理、ハイブリダイズされたオリゴヌクレオチドプライマーが伸長されてそれにオリゴヌクレオチドプライマーがハイブリダイズされる標的塩基配列および／または変異核酸配列に相補的な伸長生成物が形成される伸長処理、およびハイブリダイズされた核酸配列が分離される変性処理を含む１回以上のポリメラーゼ連鎖反応サイクルを受ける。ポリメラーゼが不活化された後、ポリメラーゼ連鎖反応伸長生成物は変性させられ、ポリメラーゼ連鎖反応伸長生成物はアニーリングされて潜在的に正常標的塩基配列および変異核酸配列を含有するヘテロ二重鎖生成物が形成される。ミスマッチ塩基対から１塩基離れた位置でヘテロ二重鎖ＤＮＡに優先的にニックを入れる、または開裂するエンドヌクレアーゼは、その後ヘテロ二重鎖生成物と混合されてエンドヌクレアーゼ開裂反応混合物が形成される。エンドヌクレアーゼ開裂反応混合物は、エンドヌクレアーゼがミスマッチ塩基対から１塩基離れた位置でヘテロ二重鎖生成物に優先的にニックを入れる、または開裂するように混合される。リガーゼおよび潜在的にニックが入れられた、または開裂されたヘテロ二重鎖生成物が混合されてリガーゼ再シーリング反応混合物が形成される。リガーゼ再シーリング反応混合物がインキュベートされると、完全適合塩基対でニックが入れられたヘテロ二重鎖生成物がシーリングされるが、ミスマッチ塩基対に隣接する位置でのニックが入れられたヘテロ二重鎖生成物は実質的に再シーリングはされない。リガーゼ再シーリング反応混合物をインキュベートすることから生じる生成物はサイズまたは電気泳動移動度によって分離され、正常標的塩基配列および変異核酸配列の存在はリガーゼ再シーリング反応混合物をインキュベートした結果として生じる分離された生成物を区別することによって検体中で検出される。
【００２０】
本発明の第１段階は、ヘテロ二重鎖核酸フラグメントの作製である。好ましい態様では、野生型および配列変化（例、単一ヌクレオチドの変異または多型性、１つ以上のヌクレオチド挿入、および１つ以上のヌクレオチド欠失）の両方を含むゲノムＤＮＡが標識オリゴヌクレオチドプライマーと一緒にＰＣＲ増幅させられる。プライマー中で蛍光、赤外線、放射性、またはその他の標識を使用できる。好ましい態様では、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼもしくはその他のＰＣＲ酵素が、例えばプロテイナーゼＫを用いる消化により不活化される。変異または多型性を含有するフラグメントおよび野生型ＰＣＲフラグメントの混合物が変性させられ、その後再アニーリングされてヌクレオチドミスマッチを含むヘテロ二重鎖ＰＣＲフラグメントが形成される。好ましい態様では、フラグメントをそれらのＴｍ（熱融点）値より高温（一般には９４℃以上）へ加熱することによって変性が達成され、再アニーリングは最初は５０〜８５℃、より好ましくは６５℃へ５〜３０分間、より好ましくは１５分間冷却され、さらにその後室温へ５〜３０分間、より好ましくは１５分間冷却されることで達成され、その結果としてヘテロ二重鎖ＰＣＲフラグメントが形成される。また別の変性／再生手段を使用することもできる。最初の反応物中に、それから同時に別個の反応物中にも野生型ゲノムＤＮＡが存在するかどうかが不明である場合は、野生型ゲノムＤＮＡは上記と正確に同一のプライマーを使用してＰＣＲ増幅させられる。ＰＣＲフラグメントおよび野生型ＰＣＲフラグメントを含有する当モル量の変異体が混合され、加熱され、その後冷却されるとヌクレオチドミスマッチを含むヘテロ二重鎖ＰＣＲフラグメントが形成される。
【００２１】
第２段階は、塩基ミスマッチを含有するヘテロ二重鎖ＤＮＡを開裂させるためにＴｍａエンドヌクレアーゼＶを利用する。この反応は、好ましくは３０分間から１時間に渡り高温（５０〜６０℃）で、最適化反応バッファー中で実施する。最適反応条件は、中性ｐＨ、低いもしくはゼロの塩含量、およびＭｇ２＋の存在を含む。ＴｍａエンドＶによる開裂を促進するために、例えばＤＭＳＯおよびベタインのような有機溶剤または他の化合物の添加を使用してもよい。代替条件または金属コファクター（例えばＭｎ２＋）の使用もまた開裂を促進できると考えられる。ＴｍａエンドヌクレアーゼＶ活性は、最適以下の条件下でさえ十分である可能性がある。開裂部位は、ヌクレオチドミスマッチの３’位置を１ヌクレオチド越える部位であると決定された。
【００２２】
次の段階では、バッファーの含量および濃度を熱安定性ＤＮＡリガーゼにとって最適なレベルにするために補助バッファーが添加される。好ましい態様では、テルムス（Ｔｈｅｒｍｕｓ）種（「Ｔｓｐ.」）ＡＫ１６Ｄ  ＤＮＡリガーゼが使用される。この連結反応は、４５〜８５℃、好ましくは６５℃で２〜６０分間、好ましくは２０分間に渡り実施され、開裂されたミスマッチを変化させずに残しながらＴｓｐ.ＡＫ１６Ｄ  ＤＮＡリガーゼの高度の特異性を利用して相補的ニックを再シーリングする。これは、バックグラウンドを大きく減少させるので、このためアッセイの感度が劇的に増加する。
【００２３】
第４段階では、開裂されたフラグメントが、例えば変性ポリアクリルアミドゲル上での電気泳動によって、またはキャピラリー電気泳動によって分離される。段階１のＰＣＲプライマーが標識されるので、フラグメントは適した検出装置を用いて検出できる。好ましい態様では、プライマーは蛍光標識され、自動ＤＮＡシーケンシング装置または蛍光フラグメント解析装置を使用して検出される。生成物の長さは、開裂生成物の移動度を蛍光標識分子サイズスタンダードと比較することによって決定される。これにより、変異の位置の近似測定が可能になる。
【００２４】
本発明の第２の態様では、どのヌクレオチドが変異したのかを決定するためにマイクロシーケンシング法を組み込むことができる。ＰＣＲフラグメントを作製する際に、標識プライマーの代わりに非標識プライマーが使用されるので、ヘテロ二重鎖ＰＣＲフラグメントは蛍光性ではない。ＴｍａエンドＶによる開裂およびＴｓｐ.ＡＫ１６Ｄリガーゼによる連結後に、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩクレノウフラグメントを使用してＴｍａエンドＶによって生成したニックの３’末端から数個のヌクレオチドが切り出される。次に、テルムス・アクアティクス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ）（「Ｔａｑ」）ＤＮＡポリメラーゼＦＳが、基質としての蛍光標識ジデオキシヌクレオチドおよび非標識デオキシヌクレオチドの混合物を使用して短縮フラグメントを伸長させる。これは短いシーケンシングラダーを生じさせ、そこから変異する位置での正常および変異ヌクレオチドの混合シグナルを原因として異型ヌクレオチドの位置および塩基を決定できる。
【００２５】
図１は、本発明のプロセスを図解している略図である。この図面では、検体は潜在的に正常標的核酸配列並びに標的塩基配列とは１つ以上の単一塩基の変化、挿入、または欠失によって相違する変異核酸配列を含む。
【００２６】
この方法の第１段階では、潜在的に野生型および変異核酸配列を含有する検体中の標的ＤＮＡ分子がポリメラーゼ連鎖反応プロセスによって増幅させられる。これには、相補的鎖を相互から分離させるための二本鎖標的ＤＮＡ分子の変性が含まれる。その後、蛍光標識を含むプライマーＦ１およびＦ２が標的ＤＮＡ分子の一部へハイブリダイズすることが惹起される。ＤＮＡポリメラーゼおよびｄＮＴＰｓの存在下で、プライマーが伸長されて標的ＤＮＡ分子の１本の鎖に相補的である伸長生成物が形成される。伸長が完了した後、ハイブリダイズされた核酸鎖は変性段階によって相互から分離される。このハイブリダイゼーション、プライマー伸長、および変性のサイクルを十分な増幅が発生するまで繰り返される。これが発生したら、ポリメラーゼが不活化され、ハイブリダイズされた核酸鎖を変性させることによってＰＣＲが終了される。
【００２７】
図１の第２段階では、ＰＣＲによって形成された伸長生成物が相互にアニーリングされてヘテロ二重鎖生成物が形成される。これらの伸長生成物が検体内の変異核酸配列にハイブリダイズされたプライマーの伸長によって図１の第１段階で形成される程度まで、伸長生成物はミスマッチ塩基を含む。図１の第２段階に示したように、伸長生成物中のミスマッチはＡ、Ｃ、ＴまたはＧヌクレオチドである可能性がある。図１の第２段階において、標的核酸配列によって生成した伸長生成物が変異核酸配列によって生成した伸長生成物とヘテロ二重鎖を形成した場合は、ヘテロ二重鎖中にミスマッチが存在しうる。このような伸長生成物間のこの相補性の欠如は、伸長生成物が相互に入れ替わっている「バブル（ｂｕｂｂｌｅ）」によって証明される。図１には示されていないが、変異核酸だけから生成された（通常はまれであると思われる）、または標的核酸配列だけから生成された伸長生成物を含有しているホモ二重鎖は完全に相補的であると考えられるため、バブルは形成されないであろう。本発明は、ヘテロ二重鎖中のミスマッチについて解析することにより検体中のこのような変異核酸配列の存在を検出することに向けられる。
【００２８】
図１の第３段階は、ヘテロ二重鎖生成物に、ミスマッチ塩基から１塩基離れた位置でヘテロ二重鎖生成物の成分鎖に優先的にニックを入れる、または開裂するエンドヌクレアーゼ処理を受けさせることを含む。図１の第３段階に示されているように変異核酸配列によって生成した伸長生成物へアニーリングされた標的核酸配列によって生成した伸長生成物から形成されるヘテロ二重鎖生成物の場合には、成分核酸鎖はバブルから１塩基離れてニックが入れられる、または開裂される。同様に図１の第３段階に示されているように、エンドヌクレアーゼはこれらの鎖をミスマッチが存在しない非特異的開裂部位で開裂する。ミスマッチが存在する特異的開裂部位で発生するニッキングに関しては、エンドヌクレアーゼは一般にミスマッチ塩基がＡまたはＧである鎖においてニックを形成する際に極めて有効であり、ミスマッチ塩基がＴである鎖においてニックを形成する際には余り有効ではなく、さらにミスマッチ塩基がＣであるニッキングでは一般に無効である。これは、ニッキングがミスマッチＡ、ＧおよびＴ塩基では発生しているが、ミスマッチＣ塩基では発生していない図１の第３段階に示されている。
【００２９】
エンドヌクレアーゼ処理が完了した後、結果として生じた潜在的にニックが入れられた、または開裂されたヘテロ二重鎖生成物はリガーゼを用いて処理される。図１の第４段階に示されているように、リガーゼはニックが入れられたヘテロ二重鎖生成物を完全にミスマッチの塩基で再シールする。しかし、ミスマッチ塩基が存在する場所に隣接する位置でニックが入れられたヘテロ二重鎖生成物の再シーリングは行われない。
【００３０】
リガーゼ再シーリング段階の生成物は、その後サイズまたは電気泳動移動度によって、通常はゲル電気泳動によって相互から分離される。エンドヌクレアーゼまたはリガーゼのどちらかを用いての処理前、エンドヌクレアーゼおよびリガーゼを用いた処理後およびエンドヌクレアーゼおよびリガーゼの両方を用いた処理後のゲル電気泳動の結果は、図１に示されている。その結果として、検体内の変異核酸配列の存在を原因として生成した開裂生成物が検出される。
【００３１】
本発明のプロセスを実施する際には、検体はゲノムＤＮＡ、腫瘍検体から単離されたＤＮＡ、ｍＲＮＡの二本鎖ｃＤＮＡコピー、またはＰＣＲ増幅ＤＮＡフラグメントのいずれかである標的核酸配列を含む可能性がある。本発明のプロセスに従って解析される検体中では、正常標的核酸配列に対する変異核酸配列のモル比は１：２０〜２０：１の範囲内にある。
【００３２】
本発明のプロセスは、正常標的配列において遺伝性もしくは散発性変異または多型性を区別することができる。この区別は、腫瘍抑制遺伝子、癌遺伝子、またはＤＮＡ複製もしくは修復遺伝子中で実施できる。このような遺伝子には、Ｂｃｌ２、Ｍｄｍ２、Ｃｄｃ２５Ａ、サイクリン（Ｃｙｃｌｉｎ）Ｄ１、サイクリンＥ１、Ｃｄｋ４、サバイビン（ｓｕｒｖｉｖｉｎ）、ＨＳＰ２７、ＨＳＰ７０、ｐ５３、ｐ２１Ｃｉｐ、ｐ１６Ｉｎｋ４ａ、ｐ１９ＡＲＦ、ｐ１５ＩＮＫ４ｂ、ｐ２７Ｋｉｐ、Ｂａｘ、成長因子類、ＥＧＦＲ、Ｈｅｒ２−ｎｅｕ、ＥｒｂＢ−３、ＥｒｂＢ−４、ｃ−Ｍｅｔ、ｃ−Ｓｅａ、Ｒｏｎ、ｃ−Ｒｅｔ、ＮＧＦＲ、ＴｒｋＢ、ＴｒｋＣ、ＩＧＦ１Ｒ、ＣＳＦ１Ｒ、ＣＳＦ２、ｃ−Ｋｉｔ、ＡＸＬ、Ｆｌｔ−１（ＶＥＧＦＲ−１）、Ｆｌｋ−１（ＶＥＧＦＲ−２）、ＰＤＧＦＲα、ＰＤＧＦＲβ、ＦＧＦＲ−１、ＦＧＦＲ−２、ＦＧＦＲ−３、ＦＧＦＲ−４、その他のタンパク質チロシンキナーゼレセプター類、β−カテニン、Ｗｎｔ（ｓ）、Ａｋｔ、Ｔｃｆ４、ｃ−Ｍｙｃ、ｎ−Ｍｙｃ、Ｗｉｓｐ−１、Ｗｉｓｐ−３、Ｋ−ｒａｓ、Ｈ−ｒａｓ、Ｎ−ｒａｓ、ｃ−Ｊｕｎ、ｃ−Ｆｏｓ、ＰＩ３Ｋ、ｃ−Ｓｒｃ、Ｓｈｃ、Ｒａｆ１、ＴＧＦβ、およびＭＥＫ、Ｅ−カドヘリン、ＡＰＣ、ＴβＲＩＩ、Ｓｍａｄ２、Ｓｍａｄ４、Ｓｍａｄ７、ＰＴＥＮ、ＶＨＬ、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＡＴＭ、ｈＭＳＨ２、ｈＭＬＨ１、ｈＰＭＳ１、ｈＰＭＳ２、またはｈＭＳＨ３が含まれる。
【００３３】
残留活性Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼはエンドＶ開裂ＤＮＡを伸長させることができるので、ＰＣＲ反応はプロテイナーゼＫと一緒に４５〜７５℃で５〜６０分間、好ましくは７０℃で１０分間インキュベートできる。引き続いて、プロテイナーゼＫを９０〜９５℃で１０〜６０分間、好ましくは７０℃で１０分間インキュベートすることによって活性化される。増幅およびプロテイナーゼＫ消化の後、ＰＣＲフラグメントはアガロースゲル電気泳動によって分離させられ、臭化エチジウム染色によって可視化できる。
【００３４】
標的ＤＮＡの大多数の生物学的起源は異型（変異または多型性）および野生型ＤＮＡを含むと考えられる。これらの場合には、ヘテロ二重鎖ハイブリダイゼーション段階に外因性的に野生型ＰＣＲフラグメントを添加する必要はない。例えば、基質がヘテロ接合性生殖細胞系変異を含有するゲノムＤＮＡである場合は、ＰＣＲフラグメントの５０％しか変異を含んでおらず、残り半分は野生型配列の変異を含むと考えられる。このため、野生型ＰＣＲフラグメントを添加する必要はない。同様に、充実性腫瘍検体のためには、典型的にはこれらの検体内に有意な量の基質性（即ち野生型）ＤＮＡが存在する。有意な量の内因性野生型ＤＮＡが存在しない基質の起源のためには、ほぼ等量の野生型ＰＣＲフラグメントを添加する必要がある。この方法は他の比率の変異対野生型ＰＣＲフラグメントと適合するが、変異対野生型ＰＣＲフラグメントの最適最終比は１：１でなければならない。
【００３５】
標識オリゴヌクレオチドプライマーは、好ましくはそれらの５’末端で標識する。有用な標識には、発色団、蛍光成分、酵素、抗原、重金属、磁気プローブ、赤外線色素、燐光基、放射性物質、化学発光成分、および電気化学的検出成分が含まれる。
【００３６】
ポリメラーゼは、テルムス・アクアティクス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ）、テルムス・サーモフィルス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、ピロコッカス・フリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ）、またはテルモトガ・マリチマ由来の天然もしくは組換えのいずれかの熱安定性ポリメラーゼである。
【００３７】
ポリメラーゼ連鎖反応プロセスは、参照として本明細書に組み入れられるＨ.Ｅｒｌｉｃｈら、「ポリメラーゼ連鎖反応における近年の進歩（Ｒｅｃｅｎｔ  Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）」，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５２：１６４３−５０（１９９１）；Ｍ.Ｉｎｎｉｓら、ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（ＰＣＲプロトコール：方法および適用指針），Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ：Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９０）；およびＲ.Ｓａｉｋｉら、「熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを用いたプライマー使用酵素増幅（Ｐｒｉｍｅｒ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｗｉｔｈ  ａ  Ｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｌｅ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）」，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９：４８７−９１（１９８８）に十分に記載されている。ポリメラーゼ連鎖反応は、ポリメラーゼもしくは金属コファクターのいずれかを６５〜９４℃の温度でポリメラーゼ連鎖反応混合物へ添加することによって開始される。ポリメラーゼ連鎖反応伸長生成物を変性させる段階は、プロテイナーゼＫの存在下で、好ましくは８０〜１０５℃で、より好ましくは９４℃で加熱することによって実施される。ポリメラーゼ連鎖反応伸長生成物をアニーリングする段階は、まず最初に５０〜８５℃へ、好ましくは６５℃へ５〜３０分間、好ましくは１０分間冷却し、その後は室温へ５〜３０分間、好ましくは１５分間冷却することによって実施される。
【００３８】
ヘテロ二重鎖ＤＮＡ形成のためには、蛍光標識変異および野生型ＰＣＲフラグメントを含有する混合物は、９３〜１００℃で１５秒間〜５分間、好ましくは９４℃で１分間加熱することによって、従ってＤＮＡを一本鎖にすることによって変性させられる。この後に、４５〜８５℃で２〜６０分間、好ましくは６５℃で１０分間の再アニーリング段階、および引き続いて室温で５〜３０分間、好ましくは１５分間のインキュベーションが続く。このプロセス後には、再アニーリング生成物の５０％は理論的には塩基ミスマッチを含有するヘテロ二重鎖ＤＮＡである。また別の再アニーリング段階は、温度を１分につき１℃未満、好ましくは９４℃から６５℃へ３０〜６０分間低下させることによる９５〜２５℃への緩徐な冷却である。ＤＮＡの代替変性／再生手段（例、塩基を用いての処理、その後の中性化）もまた使用できる。典型的には、ポリメラーゼ連鎖反応伸長生成物は、５０ｂｐ〜１，７００ｂｐの範囲内の長さを有している。
【００３９】
エンドヌクレアーゼは、好ましくはテルモトガ・マリチマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ）、アクイフェックス・アエロリカス（Ａｑｕｉｆｅｘ  ａｅｏｌｉｃｕｓ）、ピロコッカス・フリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ）、ピロコッカス・ホリコシ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ）、ピロコッカス・アビッシ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ａｂｙｓｓｉ）、ピロバクルム・アエロフィウム（Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ  ａｅｒｏｐｈｉｌｕｍ）、アルカエグロブス・フルギドゥス（Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ  ｆｕｌｇｉｄｕｓ）、アエロピルム・ペルニクス（Ａｅｒｏｐｙｒｕｍ  ｐｅｒｎｉｘ）、クロストリジウム・アセトブチリクム、または枯草菌からのエンドヌクレアーゼＶである。エンドヌクレアーゼは、望ましくはミスマッチ塩基対から１塩基離れた３’側の場所でヘテロ二重鎖生成物にニックを入れる、または開裂する。エンドヌクレアーゼは、優先的にＡ／Ａ、Ｇ／Ｇ、Ｔ／Ｔ、Ａ／Ｇ、Ａ／Ｃ、Ｇ／Ａ、Ｇ／Ｔ、Ｔ／Ｇ、Ｔ／Ｃ、Ｃ／Ａ、およびＣ／Ｔからなる群より選択されるヘテロ二重鎖生成物内のミスマッチを開裂する。あるいはまた、エンドヌクレアーゼは、ミスマッチの位置に下線が引かれて大文字で示されているｇＲｃｇ、ｒｃＲｃ、ｃｇＹｃ、およびｇＹｇｙからなる群より選択される配列を有するものを除いて、優先的にいずれかの単一塩基の変異または多型性のために形成された少なくとも１つのヘテロ二重鎖生成物にニックを入れる、または開裂する。エンドヌクレアーゼは、ヘテロ二重鎖生成物内の１、２および３塩基の挿入または欠失に優先的にニックを入れる、または開裂する。
【００４０】
エンドヌクレアーゼ開裂反応は、好ましくは濃度が２〜７ｍＭのＭｇＣｌ２の存在下で、または濃度が０.４〜１.２ｍＭのＭｎＣｌ２の存在下で実施される。ＭｇＣｌ２は、エンドヌクレアーゼ開裂反応混合物中のエンドヌクレアーゼ対ヘテロ二重鎖生成物の重量比が１０：１〜１００：１の範囲内にあり、実質的にＮａＣｌもしくはＫＣｌが存在していない場合に添加すべきである。エンドヌクレアーゼ開裂反応混合物中のエンドヌクレアーゼ対ヘテロ二重鎖生成物の重量比が１：１〜１：１０の範囲内にある場合は、ＭｎＣｌ２を添加すべきである；この場合には、２５〜７５ｍＭ、好ましくは５０ｍＭの濃度のＮａＣｌもしくはＫＣｌが存在する。エンドヌクレアーゼ開裂は、さらにまた２.５〜１０％の容積百分率範囲内のＤＭＳＯおよび濃度が０.５〜１.５Ｍの範囲内のベタインの存在下で実施することもできる。好ましくは、エンドヌクレアーゼ処理は６５℃で１時間実施される。
【００４１】
本発明の第２段階では、ヘテロ二重鎖ＰＣＲフラグメントがＴｍａエンドヌクレアーゼＶによって開裂される。ＴｍａエンドヌクレアーゼＶは、このプロセスのために理想的である独特の特性を有している。最も重要なのは、優先的にミスマッチの３’側を越えた１塩基を開裂する能力、および相補的領域における偽ニックがＤＮＡリガーゼと連結するために適した基質であるという事実にある。塩基ミスマッチを認識する際により効率的である他のミスマッチ修復酵素があるが、それらは一般にミスマッチで開裂することも、再連結に適した末端を開裂することもしない。適したリガーゼと結び付けると、ＴｍａエンドＶのこれらの特性は、ミスマッチ配列と関連した開裂部位を維持しながら、偽ニッキングを原因とするバックグラウンドノイズの減少を可能にする。
【００４２】
本発明の第３の段階は、例えばテルムス種ＡＫ１６Ｄ、テルムス・アクアティクス、テルムス・サーモフィルス、ピロコッカス・フリオサス、またはテルモトガ・マリチマのような熱安定性リガーゼを用いてヘテロ二重鎖ＰＣＲフラグメント内の非特異的ニックをシールする。熱安定性リガーゼは、テルムス・アクアティクスから引き出すことができる。参照として本明細書に組み入れられるＭ.Ｔａｋａｈａｓｈｉら、「好熱性ＤＮＡリガーゼ（Ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｃ  ＤＮＡ  Ｌｉｇａｓｅ）」，Ｊ.Ｂｉｏｌ.Ｃｈｅｍ.，２５９：１００４１−４７（１９８４）を参照。あるいはまた、これは組換え技術によって作製できる。このような単離並びにテルムス・アクアティクス由来リガーゼおよびテルムス・サーモフィルス由来リガーゼの組換え生成のための方法は、参照として本明細書に組み入れられるＢａｒａｎｙらへの国際特許第９０／１７２３９号明細書およびＦ.Ｂａｒａｎｙら、「熱安定性ＤＮＡリガーゼコーディング遺伝子のクローニング、過剰発現および塩基配列（Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ａ  Ｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｌｅ  ＤＮＡ−Ｌｉｇａｓｅ  Ｅｎｃｏｄｉｎｇ  Ｇｅｎｅ）」，Ｇｅｎｅ，１０９：１−１１（１９９１）に開示されている。これらの参考文献は、このリガーゼ並びにＤＮＡのコード化についての完全な配列情報を含む。リガーゼ再シーリングは、それ以上のエンドヌクレオチド開裂を阻害するために好ましくは５０ｍＭ  ＫＣｌの存在下で実施される。好ましくは、Ｔｓｐ  ＡＫ１６Ｄリガーゼが使用される。リガーゼ再シーリングは、２５℃で測定したときに７.２〜７.８のｐＨ値で実施される。理想的には、この段階ではＴｍａエンドヌクレアーゼＶの開裂が阻害されなければならない。Ｔｓｐ  ＡＫ１６Ｄリガーゼのための最適な反応バッファーは、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８.５）、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２５〜７５ｍＭ（好ましくは、５０ｍＭ）ＫＣｌ、１０ｍＭジチオトレイトール、１ｍＭ  ＮＡＤ＋、および２０ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡである。Ｔｏｎｇ  Ｊ.ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２７：７８８−９４（１９９９）を参照。後に実施例で証明されるように、ＴｍａエンドＶは５０ｍＭ  ＮａＣｌもしくは５０ｍＭ  ＫＣｌの存在下でほぼ完全に阻害される。
【００４３】
Ｔｓｐ  ＡＫ１６Ｄリガーゼ反応のためにほぼ最適な緩衝条件を入手するためには、ＴｍａエンドＶ反応液に補助バッファーが添加される。ある好ましい態様では、１０×補助バッファーは２００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８.５）、１２.５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５００ｍＭ  ＫＣｌ、１００ｍＭ  ＤＴＴ、および２００ｇ／ｍＬ  ＢＳＡから構成される。典型的には、ＴｍａエンドヌクレアーゼＶ開裂反応液からの反応混合物１５μＬ、２μＬの１０×補助バッファー、１μＬの２０ｍＭ  ＮＡＤ＋、および２μＬの１０〜１００ｎＭ  Ｔｓｐ  ＡＫ１６Ｄリガーゼ（ストック酵素溶液）が結合される。この混合液はその後６５℃で２０分間インキュベートされ、等量のＧｅｎｅＳｃａｎ停止液（５０ｍＭ  ＥＤＴＡ、１％ブルーデキストランおよび８０％ホルムアミド）を添加することによって終了される。
【００４４】
次の段階は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動法またはキャピラリーゲル電気泳動を使用して実施できる反応生成物の検出を含む。
【００４５】
好ましい態様では、反応混合物は９４℃で１分間だけ（バックグラウンドシグナルを増加させる可能性があるＤＮＡフラグメント化を回避するため）変性させられ、その後氷上で冷却される。その後、２〜３μＬの混合液を６％変性ポリアクリルアミドゲル上に装填して１時間、電気泳動にかけることができる。１，０００ボルト、電圧６０ｍＭ、出力２００Ｗ、および４５℃のゲル温度でＡＢＩ３７７塩基配列決定装置（パーキン・エルマー（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）製）を使用すると、ＤＮＡ生成物を分離して検出することができるが、キャピラリー電気泳動またはゲル電気泳動を使用することもできる。蛍光基の６−ＦＡＭ（下方フラグメント）およびＴＥＴ（上方フラグメント）は、ＡＢＩＤＮＡ３７７塩基配列決定装置において各々青色および緑色を分解する。開裂バンドの色は、開裂生成物が上方または下方鎖を起始とするかどうかを示す。ＴＡＭＲＡ標識ＧｅｎｅＳｃａｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒサイズスタンダード５００が同一ゲル上に装填される。これは、開裂生成物の相対移動度をサイズスタンダードと比較することによって開裂生成物の分子量を推定することを許容する。好ましくは、ＧｅｎｅＳｃａｎ解析ソフトウエアのバージョン２.１または３.０ａ（ＰＥ−バイオシステムズ（Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）製）が使用されるが、あらゆる最新技術のゲル解析ソフトウエアを代わりに使用することができる。この解析は、変異の近似部位を決定することを許容する。
【００４６】
本発明のまた別の局面は、正常標的核酸配列とは１つ以上の単一塩基の変化、挿入、または欠失によって相違する変異核酸配列を同定するための方法に関する。この方法では、潜在的に変異核酸配列を含有しているが必ずしも正常標的核酸配列を含有していない検体、正常標的核酸配列を含有する標準物質、変異核酸配列の相補的鎖上でのハイブリダイゼーションに適した２種の標識オリゴヌクレオチドプライマー、およびポリメラーゼが混合されて、第１ポリメラーゼ連鎖反応混合物が形成される。第１ポリメラーゼ連鎖反応混合物は、標識オリゴヌクレオチドプライマーが変異核酸配列にハイブリダイズできるハイブリダイゼーション処理、ハイブリダイズされたオリゴヌクレオチドプライマーが伸長されてそれにオリゴヌクレオチドプライマーがハイブリダイズされる変異核酸配列に相補的な伸長生成物が形成される伸長処理、およびハイブリダイズされた核酸配列が分離される変性処理を含む１回以上のポリメラーゼ連鎖反応サイクルを受ける。その後ポリメラーゼは不活化される。正常標的核酸配列、標識オリゴヌクレオチドプライマー、およびポリメラーゼが混合されて、第２ポリメラーゼ連鎖反応混合物が形成される。第２ポリメラーゼ連鎖反応混合物は、標識オリゴヌクレオチドプライマーが正常標的核酸配列にハイブリダイズできるハイブリダイゼーション処理、ハイブリダイズされたオリゴヌクレオチドプライマーが伸長されてそれにオリゴヌクレオチドプライマーがハイブリダイズする正常標的核酸配列に相補的な伸長生成物を形成する伸長処理、およびハイブリダイズされた核酸配列が分離される変性処理を含む１回以上のポリメラーゼ連鎖反応サイクルを受ける。その後ポリメラーゼは不活化される。第１および第２ポリメラーゼ連鎖反応伸長生成物は変性させられ、その後アニーリングされて潜在的に正常標的核酸配列および変異核酸配列を含有するヘテロ二重鎖生成物が形成される。ミスマッチ塩基対から１塩基離れた位置でヘテロ二重鎖ＤＮＡに優先的にニックを入れる、または開裂するエンドヌクレアーゼは、その後ヘテロ二重鎖生成物と混合されてエンドヌクレアーゼ開裂反応混合物が形成される。エンドヌクレアーゼ開裂反応混合物をインキュベートすると、エンドヌクレアーゼは優先的にミスマッチ塩基対から１塩基離れた位置でヘテロ二重鎖生成物にニックを入れる、または開裂する。リガーゼおよび潜在的にニックが入れられた、または開裂されたヘテロ二重鎖生成物が混合されると、リガーゼ再シーリング反応混合物が形成され、これがインキュベートされると、完全適合塩基対でニックが入れられたヘテロ二重鎖生成物がシーリングされるが、ミスマッチ塩基対に隣接する位置でのニックが入れられたヘテロ二重鎖生成物は実質的に再シーリングはされない。リガーゼ再シーリング反応混合物をインキュベートした結果として生じる生成物はサイズまたは電気泳動移動度によって分離され、検体中の正常標的核酸配列および変異核酸配列標的ヌクレオチドの存在はリガーゼ再シーリング反応混合物をインキュベートした結果として生じる分離された生成物を区別することによって検出される。
【００４７】
変異または挿入／欠失の位置および組成を同定するためのＤＮＡマイクロシーケンシング
本発明のまた別の局面は、正常標的核酸配列とは１つ以上の単一塩基の変化、挿入、または欠失によって相違する変異核酸配列を同定するための方法に向けられる。この方法では、潜在的に正常標的核酸配列並びに変異核酸配列を含有する検体、標的核酸配列および変異核酸配列の相補的鎖上でのハイブリダイゼーションに適した２種の標識オリゴヌクレオチドプライマー、およびポリメラーゼが混合されてポリメラーゼ連鎖反応混合物が形成される。ポリメラーゼ連鎖反応混合物は、オリゴヌクレオチドプライマーが標的核酸配列および／または変異核酸配列にハイブリダイズできるハイブリダイゼーション処理、ハイブリダイズされたオリゴヌクレオチドプライマーが伸長されてそれにオリゴヌクレオチドプライマーがハイブリダイズする標的核酸配列および／または変異核酸配列に相補的な伸長生成物を形成する伸長処理、およびハイブリダイズされた核酸配列が分離される変性処理を含む１回以上のポリメラーゼ連鎖反応サイクルを受ける。ポリメラーゼが不活化された後、ポリメラーゼ連鎖反応伸長生成物が変性かつアニーリングさせられて潜在的に正常標的核酸配列および変異核酸配列を含有するヘテロ二重鎖生成物が形成される。優先的にミスマッチ塩基対から１塩基離れた位置でヘテロ二重鎖ＤＮＡにニックを入れる、または開裂するエンドヌクレアーゼおよびヘテロ二重鎖生成物が混合されてエンドヌクレアーゼ開裂反応混合物が形成され、この反応混合物はエンドヌクレアーゼが優先的にミスマッチ塩基対から１塩基離れた位置でヘテロ二重鎖生成物にニックを入れる、または開裂するようにインキュベートされる。リガーゼおよび潜在的にニックが入れられた、または開裂されたヘテロ二重鎖生成物が混合されると、リガーゼ再シーリング反応混合物が形成され、これがインキュベートされると、完全適合塩基対でニックが入れられたヘテロ二重鎖生成物がシーリングされるが、ミスマッチ塩基対に隣接する位置でのニックが入れられたヘテロ二重鎖生成物は実質的に再シーリングはされない。３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼおよび潜在的にニックが入れられた、または開裂されたヘテロ二重鎖生成物が混合されるとポリメラーゼヌクレオチド鎖分解性分解反応混合物が形成されるが、これはそのニックへ３’側の数個の塩基を取り除くために３’−５’ヌクレオチド鎖分解活性のために有効な条件下でインキュベートされる。３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼが不活化された後、３’−５’活性を備えていないポリメラーゼおよびインキュベートされたポリメラーゼ分解反応混合物、標識ジデオキシターミネーター三リン酸ヌクレオチド類、およびデオキシリボヌクレオチド三リン酸類が混合されてポリメラーゼミニシーケンシング反応混合物が形成され、これは３’−５’活性を備えていないポリメラーゼのために有効な条件下でインキュベートされ、ニックが入れられた、または開裂されたヘテロ二重鎖生成物の３’末端が伸長されて、ミニシーケンシング反応生成物が形成される。このミニシーケンシング反応生成物はサイズもしくは電気泳動移動度によって分離され、さらに正常標的核酸配列および変異核酸配列の存在がポリメラーゼミニシーケンシング反応混合物をインキュベートした結果として生じる分離されたミニシーケンシング生成物を区別することによって検出される。
【００４８】
３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を備えたポリメラーゼを用いた処理は２０〜４０℃の温度で１０〜６０分間、好ましくは３７℃で３０分間実施される。３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を備えた適したポリメラーゼは、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩクレノウフラグメント、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼ、およびＴ７  ＤＮＡポリメラーゼである。
【００４９】
３’−５’活性を備えていないポリメラーゼは、２０〜８５℃の温度で１０〜６０秒間、好ましくは６０℃および３０秒間、ポリメラーゼミニシーケンシング反応混合物中で利用される。３’−５’活性を備えていない適したポリメラーゼは、ＡｍｐｌｉＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼＦＳ（パーキン・エルマー製、フォスターシティ、ＣＡ）、サーモ・シーケナーゼ（Ｔｈｅｒｍｏ−ｓｅｑｕｅｎａｓｅ）（アマシャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）製、ピスカタウェイ、ＮＪ０８８５５）、およびＤｙＮＡＳｅｑ（Ｍ.Ｊ.リサーチ（Ｒｅｓｅａｒｃｈ）製、５９０リンカーン街、ウォルサム、ＭＡ０２４５１）である。３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を備えていない中温性ポリメラーゼの例は、シーケナーゼ（Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ）（ＵＳＢ製、クリーブランド、ＯＨ４４１２８）、およびその他の３’−５’  エキソヌクレアーゼ活性を無効にする部位特異的変異を有するポリメラーゼ類である。
【００５０】
本発明のこの態様では、変化したヌクレオチドの組成および位置を正確に決定するために最適なＤＮＡシーケンシング段階（即ち、マイクロＤＮＡシーケンシング）を含めることができる。本発明のこの変形では、この方法は、ＰＣＲ反応において非標識ＰＣＲプライマーが使用されることを除いて、上記の方法に類似である。これは非標識のＰＣＲフラグメントを生じさせるので、従って蛍光ジデオキシシーケンシングと適合する。蛍光標識の存在または不在は、放射性標識ジデオキシシーケンシングを用いる場合には問題とはならないので、このためこの技術の変形は全くシーケンシングアッセイの検出方法との適合性の１つであり、一般には必ずしもＤＮＡシーケンシングのためには必要とされない。
【００５１】
マイクロシーケンシング方法は、２つの追加の段階を含む。第１追加段階では、ＴｍａエンドＶ開裂およびＴｓｐ  ＡＫ１６Ｄリガーゼとの連結後に、ＤＮＡポリメラーゼＩクレノウフラグメントの３’エキソヌクレアーゼ活性を利用してＴｍａエンドＶによって生成したミスマッチニックから数個の塩基３’→５’が切断される。大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩクレノウフラグメントは、Ｔ４もしくはＴ７  ＤＮＡポリメラーゼよりほぼ１００倍低い３’エキソヌクレアーゼ活性を有している（参照として本明細書に組み入れられるＳａｍｂｒｏｏｋ  Ｊ.ら、分子クローニング−実験マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ），第２版，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，コールドスプリングハーバー、ニューヨーク（１９８９）を参照）。これは、たった数塩基のより制御された除去を可能にする。その後ＡｍｐｌｉＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼＦＳ（パーキン・エルマー製）が使用されて、結果として生じたギャップにＢｉｇＤｙｅ（登録商標）ｄｄＮＴＰ／ｄＮＴＰの基質混合物が充填される。これは、変化の正確な位置および性質を決定するために解析できる極めて短い蛍光配列ラダーを生じさせる。
【００５２】
テルモトガ・マリチマ・エンドＶの変異体
本発明のまた別の局面は、完全に適合したＤＮＡにニックを入れるときに連結に適した末端を生成し、さらに下記のようにヘテロ二重鎖ＤＮＡにニックを入れる、または開裂する熱安定性エンドヌクレアーゼに関する。（１）塩基対がミスマッチである、またはミスマッチを１塩基越える場所で、および（２）塩基対がミスマッチである、または１塩基がミスマッチを越える場所でのＡ／Ａ、Ｇ／Ｇ、Ｔ／Ｔ、Ａ／Ｇ、Ａ／Ｃ、Ｇ／Ａ、Ｇ／Ｔ、Ｔ／Ｇ、Ｔ／Ｃ、Ｃ／Ａ、またはＣ／Ｔミスマッチ塩基対で。代替位置（１）および（２）の各々において、完全に適合したＤＮＡにニックを入れるときに連結に適した末端が生成される。本発明に従った熱安定性エンドヌクレアーゼは、ミスマッチの位置に下線が引かれて大文字で示されているｇＲｃｇ、ｒｃＲｃ、ｃｇＹｃ、またはｇＹｇｙ配列を有するものを除いて、優先的にいずれかの単一塩基変異または多型性のために形成された少なくとも１つのヘテロ二重鎖にニックを入れる、または開裂し、完全に適合したＤＮＡにニックを入れるときに連結に適した末端を生成する。あるいはまた、ヘテロ二重鎖ＤＮＡに優先的にニックを入れる、または開裂する熱安定性エンドヌクレアーゼは、塩基対がミスマッチである、または不対塩基を１塩基越える場所で１、２、および３塩基の挿入もしくは欠失を含有しており、完全に適合したＤＮＡでＤＮＡにニックを入れるときに連結に適した末端を生成する。
【００５３】
本発明のまた別の局面は、次のいずれかを含有するテルモトガ・マリチマからの変異エンドヌクレアーゼＶである。（１）Ｙ８０Ａ残基の変化；（２）Ｙ８０Ｆ残基の変化；（３）Ｙ８０Ｌ、Ｙ８０Ｉ、Ｙ８０ＶもしくはＹ８０Ｍのいずれかの残基の変化；（４）Ｒ８８Ａの残基の変化；（５）Ｒ８８Ｌ、Ｒ８８Ｉ、Ｒ８８ＶもしくはＲ８８Ｍ残基の変化；（６）Ｒ８８Ｋ残基の変化；（７）Ｒ８８ＮもしくはＲ８８Ｑ残基の変化；（８）Ｒ８８ＤもしくはＲ８８Ｅ残基の変化；（９）Ｒ８８ＴもしくはＲ８８Ｓ残基の変化；（１０）Ｅ８９Ａ残基の変化；（１１）Ｅ８９Ｌ、Ｅ８９Ｉ、Ｅ８９Ｖ、もしくはＥ８９Ｍ残基の変化；（１２）Ｅ８９Ｄ残基の変化；（１３）Ｅ８９ＮもしくはＥ８９Ｑ残基の変化；（１４）Ｅ８９ＲもしくはＥ８９Ｋ残基の変化；（１５）Ｅ８９ＴもしくはＥ８９Ｓ残基の変化；（１６）Ｈ１１６Ａ残基の変化；（１７）Ｈ１１６Ｌ、Ｈ１１６Ｉ、Ｈ１１６ＶもしくはＨ１１６Ｍ残基の変化；（１８）Ｈ１１６ＫもしくはＨ１１６Ｒ残基の変化；（１９）Ｈ１１６ＮもしくはＨ１１６Ｑ残基の変化；（２０）Ｈ１１６ＴもしくはＨ１１６Ｓ残基の変化；（２１）Ｋ１３９Ａ残基の変化；（２２）Ｋ１３９Ｌ、Ｋ１３９Ｉ、Ｋ１３９Ｖ、もしくはＫ１３９Ｍ残基の変化；（２３）Ｋ１３９Ｒ残基の変化；（２４）Ｋ１３９ＮもしくはＫ１３９Ｑ残基の変化；（２５）Ｋ１３９ＤもしくはＫ１３９Ｅ残基の変化；（２６）Ｋ１３９ＴもしくはＫ１３９Ｓ残基の変化；（２７）Ｄ４３Ａ残基の変化；（２８）Ｄ４３Ｅ残基の変化；（２９）Ｄ１０５Ａ残基の変化；（３０）Ｄ１０５Ｅ残基の変化；（３１）Ｆ４６Ａ残基の変化；（３２）Ｆ４６Ｙ残基の変化；（３３）Ｆ４６Ｌ、Ｆ４６Ｉ、Ｆ４６Ｖ、もしくはＦ４６Ｍ残基の変化；（３４）Ｒ１１８Ａ残基の変化；（３５）Ｒ１１８Ｌ、Ｒ１１８Ｉ、Ｒ１１８Ｖ、もしくはＲ１１８Ｍ残基の変化；（３６）Ｒ１１８Ｋ残基の変化；（３７）Ｒ１１８ＮもしくはＲ１１８Ｑ残基の変化；（３８）Ｒ１１８ＤもしくはＲ１１８Ｅ残基の変化；（３９）Ｒ１１８ＴもしくはＲ１１８Ｓ残基の変化；（４０）Ｆ１８０Ａ残基の変化；（４１）Ｆ１８０Ｙ残基の変化；（４２）Ｆ１８０Ｌ、Ｆ１８０Ｉ、Ｆ１８０Ｖ、もしくはＦ１８０Ｍ残基の変化；（４３）Ｇ８３Ａ残基の変化；（４４）Ｇ８３Ｌ、Ｇ８３Ｉ、Ｇ８３Ｖ、もしくはＧ８３Ｍ残基の変化；（４５）Ｇ８３ＫもしくはＧ８３Ｒ残基の変化；（４６）Ｇ８３ＮもしくはＧ８３Ｑ残基の変化；（４７）Ｇ８３ＤもしくはＧ８３Ｅ残基の変化；（４８）Ｇ８３ＴまたはＧ８３Ｓ残基の変化；（４９）Ｉ１７９Ａ残基の変化；（５０）Ｉ１７９ＫもしくはＩ１７９Ｒ残基の変化；（５１）Ｉ１７９ＮもしくはＩ１７９Ｑ残基の変化；（５２）Ｉ１７９ＤもしくはＩ１７９Ｅ残基の変化；（５３）Ｉ１７９ＴもしくはＩ１７９Ｓ残基の変化；（５４）Ｄ１１０Ａ残基の変化；または（５５）Ｈ１２５Ａ残基の変化。
【００５４】
本発明のまた別の局面は、野生型エンドヌクレアーゼＶではなくむしろミスマッチ塩基を含有する、少なくとも１つのヘテロ二重鎖ＤＮＡに優先的にニックを入れる、または開裂する変異エンドヌクレアーゼＶ（および上記のその使用）に向けられる。好ましくは、ヘテロ二重鎖ＤＮＡの少なくとも１つにおけるミスマッチ塩基の１つは「Ａ」または「Ｇ」である。
【００５５】
実施例
実施例１  試薬類、培地、および菌株類
すべての常用化学試薬類は、シグマ・ケミカル（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、セントルイス、ＭＯ）社またはフィッシャー・サイエンティフィック社（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、フェアローン、ＮＪ）から購入した。デオキシヌクレオチド、ＢＳＡおよびＡＴＰはベーリンガー・マンハイム社（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ、インディアナポリス、ＩＮ）から購入した。デオキシオリゴヌクレオチドは、インテグレーテッドＤＮＡテクノロジーズ社（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ.、コーラルビル、ＩＡ）から購入した。ＨｉＴｒａｐ  ＳＰカラムはアマシャム・ファルマシア・バイオテック社（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、ピスカタウェイ、ＮＪ）から購入した。
【００５６】
制限酵素のＴ４  ＤＮＡリガーゼおよびＤＮＡポリメラーゼＩ（クレノウフラグメント）は、ニューイングランド・バイオラブ社（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂ、ベバリー、ＭＡ）から購入した。ＤＮＡシーケンシングキット、ＰＣＲキット、およびＧＥＮＥＳＣＡＮ−５００（タムラ（ＴＡＭＲＡ）サイズスタンダードは、パーキン・エルマー社応用バイオシステム部門（フォスターシティ、ＣＡ）から購入した。Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ、ＰＣＲバッファーおよびＴａｑＰｌｕｓ精密ＰＣＲキットは、ストラタジーン社（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、ラヨラ、ＣＡ）から購入した。タンパク質アッセイキットは、バイオラッド社（ハーキュリーズ、ＣＡ）から購入した。
【００５７】
ＦＢ培地（１Ｌ）は、２５ｇのＢａｃｔｏトリプトン、７５ｇの酵母抽出液、６ｇのＮａＣｌ、１ｇのグルコース、および５０ｍＬの１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７.６）から構成した。ＭＯＰＳ培地（参照として本明細書に組み入れられるＮｅｉｄｈａｒｄｔ  Ｆ.Ｃ.ら、Ｊ.Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ.，１１９（３）：７３６−７４７（１９７４）に記載されている通りに）並びに腸内細菌用培地を作製した。ＴｍａエンドＶ音波処理バッファーは、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７.４）；１ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８.０）；０.１ｍＭ  ＤＴＴ；０.１５ｍＭ  ＰＭＳＦ；５０ｍＭ  ＮａＣｌから構成した。ＧｅｎｅＳｃａｎ停止液は、８０％ホルムアミド（アムレスコ（Ａｍｒｅｓｃｏ）製、ソロン、オハイオ州）、５０ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８.０）、１％ブルーデキストラン（シグマ・ケミカル製）から構成した。ＴＢバッファー（１×）は８９ｍＭ  Ｔｒｉｓおよび８９ｍＭホウ酸から構成した。ＴＥバッファーは、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８.０および１ｍＭ  ＥＤＴＡから構成した。
【００５８】
プロテイナーゼＫは、キアゲン社（ＱＩＡＧＥＮ、バレンシア、ＣＡ）から購入した。マイクロコン（Ｍｉｃｒｏｃｏｎ）３０フィルターは、ミリポア社（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ベッドフォード、ＭＡ）から購入した。Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼＦＳおよび４種のジデオキシヌクレオチド類は、寛大にもパーキン・エルマー社から提供された。Ｓｅｐ−ＰａｋカートリッジＣ−１８は、ウォーターズ社（Ｗａｔｅｒｓ、ミルフォード、ＭＡ）から購入した。Ｃｅｎｔｒｉ−Ｓｅｐ（登録商標）スピンカラムＰ／Ｎ  ＣＳ−９０は、プリンストン・セパレーション社（Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ、アデルフィア、ＮＪ）から購入した。
【００５９】
テルムス種ＡＫ１６Ｄ  ＤＮＡリガーゼは、参照として本明細書に組み入れられるＴｏｎｇ  Ｊ.ら、「テルムス種ＡＫ１６Ｄ由来の高適合度ＤＮＡリガーゼの生化学的特性（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ａ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＤＮＡ  Ｌｉｇａｓｅ  ｆｒｏｍ  Ｔｈｅｒｍｕｓ  Ｓｐｅｃｉｅｓ  ＡＫ１６Ｄ）」，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ.，２７：７８８−９４（１９９９９）に記載されている通りに大腸菌中でクローニングして過剰発現させ、同質性となるまで精製した。
【００６０】
実施例２  テルモトガ・マリチマ・エンドヌクレアーゼＶのプラスミド構築、クローニング、発現、および精製
ＢＬＡＳＴサーチ（参照として本明細書に組み入れられるＡｌｔｓｃｈｕｌ  Ｓ.Ｆ.ら、Ｊ.Ｍｏｌ.Ｂｉｏｌ.，２１５（３）：４０３−１０（１９９０）を参照）を通して、２２５アミノ酸の推定オープン・リーディングフレームが大腸菌エンドヌクレアーゼＶ遺伝子との３４％配列同一性を示すテルモトガ・マリチマゲノム内で同定された。この、Ｔｍａ  ＯＲＦが実際にエンドヌクレアーゼＶをコードすることを証明するために、大腸菌中でクローニングして過剰発現させた。
【００６１】
テルモトガ・マリチマ由来の推定エンドヌクレアーゼＶ遺伝子（ｎｆｉ）は、フォワードプライマーＥＶ.Ｔｍａ.０１Ａ（
2004526423.tif 000002
ＮｄｅＩ部位には下線が引かれている）およびリバースプライマーＥＶ.Ｔｍａ.０２Ｒ（
2004526423.tif 000003
ＳｐｅＩおよびＢａｍＨＩ部位には下線が引かれている）を使用するＰＣＲによって増幅させた。ＰＣＲ反応混合物（１００μＬ）は、５０ｎｇのテルモトガ・マリチマゲノムＤＮＡ、１０μＭのフォワードプライマーＥＶ.Ｔｍａ.０１Ａ、１０μＭのリバースプライマーＥＶ.Ｔｍａ.０２Ｒ、１×Ｐｆｕ  ＰＣＲバッファー、１００μＭの各ｄＮＴＰ、および２.５Ｕ  Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ（ストラタジーン製、ラヨラ、カリフォルニア州）から構成した。ＰＣＲ法は、９５℃で２分間の予備変性段階、各サイクルが９４℃で３０秒間の変性および６０℃で６分間のアニーリング伸長から構成される２５サイクルの２段階増幅、および７２℃で５分間の最終伸長段階を含んでいた。ＰＣＲ生成物は、熱安定性Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼを除去するためにルーチンのフェノール抽出およびエタノール沈降によって精製した。参照として本明細書に組み入れられるＳａｍｂｒｏｏｋ  Ｊ.ら、分子クローニング−実験マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ），第２版，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，コールドスプリングハーバー、ニューヨーク（１９８９）を参照。精製されたＰＣＲ生成物は、ＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩを用いて消化され、同一対の制限酵素を用いて消化されたｐＥＶ１ベクターへ連結された。ｐＥＶ１は、ｐｈｏＡプロモーター領域内のシャイン・ダルガーノ（Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ）配列後のＮａｄｅＩ部位および下流複数クローニング部位（ＢａｍＨＩ−ＫａｓＩ−ＢｓｔＸＩ−ＥｃｏＲＶ−ＥｃｏＲＩ−ＭｌｕＩ）を含有するｐＦＢＴ６９の誘導体（参照として本明細書に組み入れられるＢａｒａｎｙ  Ｆ.，Ｇｅｎｅ，６３：１６７−１７７（１９８８）を参照）である。推定ＴｍａエンドヌクレアーゼＶ遺伝子を含有するプラスミドをｐＥＶ５と指定し、参照として本明細書に組み入れられるＣｈｕｎｇ  Ｃ.Ｔ.ら、Ｐｒｏｃ.Ｎａｔｌ.Ａｃａｄ.Ｓｃｉ.ＵＳＡ，８６（７）２１７２−７５（１９８９）に記載されている通りに１段階プロトコールによって大腸菌菌株ＡＫ５３内へ形質転換した。エンドヌクレアーゼＶ遺伝子は、ｐｈｏＡプロモーターによって調節する。プラスミド構築体の信頼性を保証するためにＴｍａエンドヌクレアーゼＶ遺伝子を含有するインサートをシーケンシングした。
【００６２】
ｐＥＶ５を含有する大腸菌の終夜培養物は、５０μｇ／ｍＬアンピシリンを補充したＦＢ培地内へ１００倍に希釈した。大腸菌細胞は５５０ｎｍでの０.８の吸光度へ２００ｒｐｍで撹拌しながら３７℃で増殖させた。培地は、５０μｇ／ｍＬのアンピシリンを補充した１ＬのＭＯＰＳ培地内へ５０倍に希釈し、同一条件下で一晩増殖させた。１０分間の３，０００×ｇでの遠心後、細胞ペレットを１０ｍＬのＴｍａエンドＶ音波処理バッファー（２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７.４）；１ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８.０）；０.１ｍＭ  ＤＴＴ；０.１５ｍＭ  ＰＭＳＦ；５０ｍＭ  ＮａＣｌ）中に懸濁させ、氷上で各１０秒間ずつ２〜３回音波処理した。
【００６３】
エンドヌクレアーゼＶタンパク質を精製するために、３，０００×ｇでの１５分間の遠心によって細胞破片を取り除いた。上清を７０℃で１５分間インキュベートして熱不安定性大腸菌宿主タンパク質を変性させた。１０，０００×ｇで２０分間の遠心によって不活化大腸菌タンパク質を不活化させた後、上清を開始バッファー（５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７.４）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ，５０ｍＭ  ＮａＣｌ，０.１ｍＭ  ＤＴＴ）に対して一晩透析した。
【００６４】
図２は、プロセス中の様々な段階でのテルモトガ・マリチマ・エンドヌクレアーゼＶタンパク質の精製を示している１２.５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示している。レーン２は、大腸菌細胞から遊離した全タンパク質を示している。ＴｍａエンドＶは熱安定性であるが大多数の大腸菌宿主タンパク質は熱不安定性であるので、ＴｍａエンドＶ活性を維持しながら大多数の大腸菌宿主タンパク質（大腸菌エンドＶを含む、実施例４を参照）を不活化するために溶解液を７０℃で１５分間加熱した。熱処理後は、不活化大腸菌宿主タンパク質は凝集し、宿主タンパク質の大半はペレット化して遠心により除去できる。これにより、熱処理および遠心後の上清中のタンパク質を示している図２のレーン３に示されているように上清中に主要タンパク質としてＴｍａエンドＶが残る。ＴｍａエンドヌクレアーゼＶは約２４ｋＤａ位置で溶出したので、溶液中にモノマーとして存在することを示している（図２Ｂ）。
【００６５】
ＴｍａエンドヌクレアーゼＶは、スルホプロピル官能基を含有するＨｉＴｒａｐ  ＳＰカラム（ファルマシア製）を使用してほぼ同質性となるまで精製した。ｐＨ７.４のバッファー中で、ＴｍａエンドヌクレアーゼＶは、ＨｉＴｒａｐ  ＳＰのための適合する基質にさせる正味正電荷を有している。その後カラムは、ＮａＣｌの含量を増加させながら溶出用バッファーを使用して段階的に洗浄するか、またはＦＰＬＣもしくはＨＰＬＣシステムと接続してＮａＣｌ濃度勾配を含有するバッファーを使用して洗浄した。カラムからのタンパク質の溶出は、そのタンパク質に対する特定ＮａＣｌ濃度に左右される。段階的溶出では、タンパク質は５０ｍＭ間隔で１５０ｍＭ  ＮａＣｌ〜５００ｍＭ  ＮａＣｌを用いて溶出させた。純粋ＴｍａエンドＶは、２５０〜３００ｍＭ  ＮａＣｌで溶出した。図２のレーン４は、２５０〜３００ｍＭ  ＮａＣｌを用いた溶出からの酵素がほぼ同質性であることを証明している。酵素の濃度は、紫外線吸光法により測定した。タンパク質濃度＝Ａ（２８０）×ＯＤ２８０。参照として本明細書に組み入れられるＷｅｔｌａｕｆｅｒ  Ｄ.Ｂ.，Ａｄｖ.Ｐｒｏｔ.Ｃｈｅｍ.，１７：３０３−３９０（１９６２）を参照。ＴｍａエンドＶについては、プロティアン（Ｐｒｏｔｅａｎ）ソフトウエアプログラム（パワー・マッキントッシュ（Ｐｏｗｅｒ  Ｍａｃｉｎｔｏｓｈ）バージョン３.０５、ＤＮＡ  Ｓｔａｒ製）を使用し、ＴｍａエンドＶのタンパク質配列に基づいて計算した１Ａ＝０.８９ｍｇ／ｍＬであった。ＴｍａエンドＶタンパク質配列（ｎｆｉ遺伝子）は、ウエブサイト：ｈｔｔｐ／／ｗｗｗ.ｔｉｇｒ.ｏｒｇ／ｔｄｂ／のＴＩＧＲ微生物学データベース遺伝子座ＴＭ１８６５、テルモトガ・マリチマのセクション下で入手できる。
【００６６】
図２に示した精製ＴｍａエンドヌクレアーゼＶに類似の分子量を有する内因性大腸菌エンドヌクレアーゼＶが欠けていることを確認するために、このタンパク質をＰＶＤＦ膜へトランスファーさせ、参照として本明細書に組み入れられるＣａｏ  Ｗ.ら、Ｊ.Ｂｉｏｌ.Ｃｈｅｍ.，２７３（４９）：３３００２−１０（１９９８）で使用された方法に従ってＮ−末端シーケンシングを受けさせた。ペプチドシーケンシングの結果は、Ｔｍａ  ｎｆｉ遺伝子の予想Ｎ−末端配列と適合した。さらに、７０℃、１５分間の熱処理を市販入手元（トレビゲン（Ｔｒｅｖｉｇｅｎ）社、ゲーサーズバーグ、ＭＤ）から購入した大腸菌エンドヌクレアーゼＶについて実施した。未処理酵素は報告された通り活性であったが、熱処理酵素はその酵素活性を消失していた。従って、精製において使用した熱処理段階が大腸菌エンドヌクレアーゼＶを不活化させたと思われる。
【００６７】
実施例３  オリゴヌクレオチド基質の作製
大腸菌エンドヌクレアーゼＶは、デオキシイノシン−デオキシイノシンまたはデオキシイノシン−塩基ミスマッチを含有する二本鎖ＤＮＡ鎖との高度の活性を示す。参照として本明細書に組み入れられるＹａｏ  Ｍ.ａｎｄ  Ｋｏｗ  Ｙ.Ｗ.，Ｊ.Ｂｉｏｌ.Ｃｈｅｍ.，２６９（５０）：３１３９０−９６（１９９４）を参照。エンドＶのこの一般的特徴を使用して精製ＴｍａエンドＶ酵素を機能的に同定した。精製酵素による開裂活性について監視するための基質として、塩基ミスマッチを含有する二本鎖オリゴヌクレオチドを設計した。図３Ａは、２種の相違して標識された蛍光オリゴヌクレオチドを使用する単純なアッセイシステムを示している。上方鎖は６−ＦＡＭを使用して標識され、下方鎖はＴＥＴ標識されている。デオキシイノシンヌクレオチドのミスマッチ位置は中心を外れているので、ニックが入れられた生成物は変性ポリアクリルアミドゲル上で共移動しない。相違する二重標識により、ゲル上で両方の鎖上のニッキング事象を容易に観察して区別することができる。
【００６８】
オリゴヌクレオチドＤＮＡ基質は、「完全ガイド：合成オリゴヌクレオチドの評価および単離（Ｔｈｅ  Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ｇｕｉｄｅ：Ｅｖａｌｕａｔｉｎｇ  ａｎｄ  Ｉｓｏｌａｔｉｎｇ  Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ）」（アプライド・バイオシステムズ社、フォスターシティ、ＣＡ）に記載されている通りに変性シーケンシングゲル（７Ｍ尿素／１０％ポリアクリルアミドゲル）上で精製した。精製オリゴヌクレオチドは、ＴＥバッファー中に溶解させた。等モル濃度の２本の相補的一本鎖を混合し、８５℃で３分間インキュベートし、室温で３０分間かけて二本鎖ＤＮＡ基質を形成させた。
【００６９】
実施例４  デオキシイノシン含有オリゴヌクレオチドの開裂
精製酵素を機能的に同定するために最初はデオキシイノシン含有基質を使用したが、これは大腸菌エンドヌクレアーゼＶがデオキシイノシン含有鎖に向かう高度の活性を示すためであった。参照として本明細書に組み入れられるＹａｏ  Ｍ.ら、Ｊ.Ｂｉｏｌ.Ｃｈｅｍ.，２６９（５０）：３１３９０−９６（１９９４）を参照。
【００７０】
開裂反応は、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７.４）、１ｍＭ  ＤＴＴ、２％グリセロール、他に規定されていない限り５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０ｎＭ  ＤＮＡ基質、および指示された量の精製ＴｍａエンドヌクレアーゼＶタンパク質を含有する２０μＬ反応混合物中で６５℃で３０分間実施した。この反応は等量のＧｅｎｅＳｃａｎ停止液を添加することにより終了させた。この反応混合物をその後９４℃で２分間加熱し、氷上で冷却した。３μＬの検体を１０％ＧｅｎｅＳｃａｎ変性ポリアクリルアミドゲル（パーキン・エルマー製）上に装填した。電気泳動は、ＡＢＩ３７７シーケンサー（パーキン・エルマー製）を使用して１，５００ボルトで１時間実施した。開裂生成物および残留基質は、ＧｅｎｅＳｃａｎ解析ソフトウエア、バージョン２.１または３.０を使用して定量した。
【００７１】
酵素濃度が低い場合は（Ｅ：Ｓ＝１：１０、Ｓ＝１０ｎＭ、Ｅ：Ｓは酵素対基質の比率を表し、Ｓは基質を表す）、ＴｍａエンドヌクレアーゼＶはデオキシイノシンが上方鎖もしくは下方鎖または両方の鎖のいずれに置かれたのかとは無関係に、もっぱらデオキシイノシン含有鎖でニックを入れた（図３Ｂ）。開裂は全４種のデオキシイノシン−塩基対（Ｉ／Ａ，Ｉ／Ｇ，Ｉ／Ｃ，Ｉ／Ｔ）について有効であったが、これは大腸菌酵素についての以前の観察を確証している。参照として本明細書に組み入れられるＹａｏ  Ｍ.ら、Ｊ.Ｂｉｏｌ.Ｃｈｅｍ.，２６９（５０）：３１３９０−９６（１９９４）を参照。優勢生成物は、両方の鎖上のイノシン塩基から１ヌクレオチド後の３’側でのニッキングにより形成された（図３Ｄ）。酵素濃度が高い場合は（Ｅ：Ｓ＝１０：１、Ｓ＝１０ｎＭ）、ＴｍａエンドヌクレアーゼＶはデオキシイノシン含有鎖に効果的にニックを入れ、実質的に完全なニック生成物への変換を生じさせた（図３Ｃ）。低酵素濃度を用いた場合の結果（図３Ｂ）とは対照的に、高酵素濃度は反対側の鎖のニッキング（例、ｄＩ／ｄＡ二本鎖オリゴヌクレオチド基質におけるＡ含有鎖のニッキング）を促進した。Ｉ／ＡおよびＩ／Ｇ基質については、ニッキングは主としてミスマッチＡまたはＧ塩基を１ヌクレオチド越えた３’側で発生した。しかし、Ｉ／ＣおよびＩ／Ｔ基質に対する反対側の鎖のニッキングは低分子量位置で追加の生成物を生じさせた（図３Ｃ）。長さマーカーを用いた比較は、３８ｍｅｒおよび２７ｍｅｒは３’側でのＴまたはＣ塩基のすぐ後の開裂生成物を表しているので、３’側開裂部位がＴまたはＣ塩基の５’側でほぼ２〜３ｎｔであることを示唆した（図３Ｄ）。反対側の鎖のニッキングはＩ／ＣおよびＩ／Ｔでは不完全であったが、デオキシイノシン開裂は完全であり、これはＣまたはＴの５’側ニッキングがデオキシイノシン含有鎖のニッキング後に発生したことを示している。Ｉ／Ｃにおける５’側での高収率の反対側の鎖のニッキングにＩ／Ｃがワトソン・クリック（Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ）塩基対を形成するという事実（参照として本明細書に組み入れられるＸｕａｎ  Ｊ.Ｃ.ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ.，２０：５４５７−６４（１９９２）を参照）、およびＩ／ＡおよびＩ／Ｇにおけるに５’側での低収率の反対側の鎖のニッキングにそれらが非ワトソン・クリック塩基対を形成するという事実（参照として本明細書に組み入れられるＣｏｒｆｉｅｌｄ  Ｐ.Ｗ.ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ.，１５（１９）：７９３５−４９（１９８７）を参照）に関連しているかどうかは不明である。Ｉ／ＣおよびＩ／Ｔ塩基対の５’側での反対側の鎖のニッキングは、Ｃ／ＩまたはＴ／Ｉ基質を用いては観察されなかったので、これはニッキング生成物が６５℃のインキュベーションでは余り安定性ではなく一本鎖ＤＮＡとして変性している、またはこれらの基質でのニッキングは配列の前後関係を原因として余り効率的ではなかったのいずれかであることを示している。これらの結果は、ニッキング事象が一般には３’側で発生するが、この酵素はデオキシイノシン含有鎖に相補的な反対側の鎖の５’側で開裂させることができるを示唆している。以前に実施された試験は、大腸菌エンドヌクレアーゼＶがメチルベンズ［ア］アントラセン付加物の５’側を開裂することを示唆していた。参照として本明細書に組み入れられるＤｅｍｐｌｅ  Ｂ.ら、Ｊ.Ｂｉｏｌ.Ｃｈｅｍ.，２５７（６）：２８４８−５５（１９８２）を参照。従って、この酵素は一部の病変部位で５’切開を作製できる。上記の結果は、精製酵素がエンドヌクレアーゼＶであることを確証した。
【００７２】
実施例５  反応バッファーがＴｍａエンドヌクレアーゼＶ活性および特異性に及ぼす作用
酵素活性および特異性は酵素によって使用された金属コファクターによって影響を受ける可能性があるので、Ｍｇ２＋、Ｍｎ２＋、Ｆｅ２＋、Ｃａ２＋、Ｃｏ２＋、Ｎｉ２＋、Ｃｕ２＋、Ｚｎ２＋、Ｃｄ２＋、Ｂａ２＋またはＳｒ２＋のいずれかの存在下でＴｍａエンドＶミスマッチ開裂活性を分析した。各金属の濃度は５ｍＭであった。反応混合物は１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７.４）、１ｍＭ  ＤＴＴ、２％グリセロール、５ｍＭ  金属塩化物、１００ｎＭ  ＴｍａエンドＶおよび（Ａ／Ａ）、または（Ｃ／Ｔ）、または（Ｃ／Ｃ）のいずれかの塩基ミスマッチを含有する１０ｎＭオリゴヌクレオチド類を含んでおり、対照として塩基ミスマッチを含有しない正規オリゴヌクレオチドを使用した。この混合物を６５℃で３０分間インキュベートし、電気泳動のためにゲル上に装填した。開裂生成物および残留基質は、ＧｅｎｅＳｃａｎ解析ソフトウエア、バージョン２.１または３.０を使用して定量した。開裂生成物は、Ｍｇ２＋またはＭｎ２＋の存在下でのみ観察され、これは試験したセット中でのＴｍａエンドＶの金属コファクターがこれら２種のカチオンだけであることを示している。図４は、基質としてのＡ／Ａミスマッチとともに二本鎖オリゴヌクレオチドＤＮＡを使用した種々の濃度のＭｇ２＋またはＭｎ２＋の存在下でのＴｍａエンドＶ活性を示している。ミスマッチ開裂活性は、Ｍｇ２＋の濃度が２〜７ｍＭおよびＭｎ２＋の濃度が０.４〜１.２ｍＭのときに最も活性であった。
【００７３】
実施例６  塩基ミスマッチ含有オリゴヌクレオチド類の開裂
種々の塩基ミスマッチを含有する１２種の基質を使用して塩基ミスマッチニッキングを調査した（図５）。開裂反応は、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７.４）、１ｍＭ  ＤＴＴ、２％グリセロール、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２もしくは１ｍＭ  ＭｎＣｌ２、１０ｎＭ  ＤＮＡ基質および指示した量の精製ＴｍａエンドヌクレアーゼＶタンパク質を含有する２０μＬ反応混合物中において、６５℃、３０分間で実施した。この反応は等量のＧｅｎｅＳｃａｎ停止液を添加することによって終了させた。この反応混合物をその後９４℃で２分間加熱し、氷上で冷却した。３μＬの検体を１０％ＧｅｎｅＳｃａｎ変性ポリアクリルアミドゲル（パーキン・エルマー製）上に装填した。電気泳動は、ＡＢＩ３７７シーケンサー（パーキン・エルマー製）を使用して１，５００ボルトで１時間実施した。開裂生成物および残留基質は、ＧｅｎｅＳｃａｎ解析ソフトウエア、バージョン２.１または３.０を使用して定量した。金属コファクターとしてＭｇ２＋を用いると、この酵素はミスマッチでの切開を作製するためにより高度の酵素対基質（Ｅ：Ｓ）比を必要とした（図５Ａ〜Ｂ）。金属コファクターとしてＭｎ２＋を用いると、ミスマッチ基質でのニックはより低いＥ：Ｓ比で発生した（図５Ｃ〜Ｄ）。より高いＥ：Ｓ比でさえ非特異的ニッキングは有意になったが依然として基質を含有する有意に高いミスマッチが残っていたので、ミスマッチの開裂反応は完了までは進行しなかった（図５Ｂ）。開裂部位はデオキシイノシン含有基質を用いて同定された部位に同一であった、即ちミスマッチから１ヌクレオチド後の３’側であった。ミスマッチニッキングは、ＡもしくはＧ塩基を用いた場合に最も効率的であり、Ｔ塩基を用いた場合はそれほど効率的ではなかった。Ｃ塩基は、ＡもしくはＴ塩基と塩基対合したときにははるかに低い効率でニックが入れられ、開裂はＣと塩基対合したときには観察されなかった。このミスマッチ開裂プロファイルは大腸菌酵素と一致している。参照として本明細書に組み入れられるＹａｏ  Ｍ.ら、Ｊ.Ｂｉｏｌ.Ｃｈｅｍ，２６９（５０）：３１３９０−９６（１９９４）を参照。しかし、大腸菌酵素を使用して以前に報告されたように、鎖優先もしくは末端依存性ミスマッチ開裂は観察されなかった（参照として本明細書に組み入れられるＹａｏ  Ｍ.ら、Ｊ.Ｂｉｏｌ.Ｃｈｅｍ，２６９（５０）：３１３９０−９６（１９９４）を参照）。塩基ミスマッチ開裂は、ミスマッチ塩基と５’末端の間の距離とは関係なく上方鎖および下方鎖の両方で発生した（図２Ａ、図５Ａ）。ＴｍａエンドＶがミスマッチ塩基と５’末端の間の距離とは関係なく上方鎖および下方鎖の両方で開裂させることができるという所見は予想外で、この酵素が大腸菌酵素と区別する独特の特性を有していることを証明している。中温性大腸菌エンドＶ酵素を特徴付けた同一著者らは、極めて細菌熱安定性Ａ.フルギドゥス（Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ  ｆｕｌｇｉｄｕｓ）エンドＶ酵素を特徴付けた（Ｌｉｕら、Ｍｕｔａｔｉｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，４６１：１６９−１７７（２０００）。Ａ.フルギドゥス  エンドＶ酵素だけはＤＮＡを含有するイノシンに対して活性を有していたが、ミスマッチまたはその他の傷害に対しての活性は有してい���かった。従って、熱安定性エンドＶが塩基ミスマッチを含有する基質に活性を有するであろうとは推定できない。
【００７４】
表１は、単一塩基ミスマッチを含有するヘテロ二重鎖合成基質のＴｍａエンドヌクレアーゼＶ開裂の結果の要約を提供している。あらゆる可能性のある塩基変化に対して、次を形成する２種の可能性のあるヘテロ二重鎖生成物がある。Ａ⇔Ｇ（Ａ−Ｃ，Ｇ−Ｔ）；Ｃ⇔Ｔ（Ｃ−Ａ，Ｔ−Ｇ）；Ａ⇔Ｃ（Ａ−Ｇ，Ｃ−Ｔ）；Ｇ⇔Ｔ（Ｇ−Ａ，Ｔ−Ｃ）；Ａ⇔Ｔ（Ａ−Ａ，Ｔ−Ｔ）、およびＧ⇔Ｃ（Ｇ−Ｇ，Ｃ−Ｃ）。
（表１）単一塩基ミスマッチを含有するヘテロ二重鎖合成基質のＴｍａエンドヌクレアーゼＶ開裂の要約
2004526423.tif 000004
備考：
上方鎖：
2004526423.tif 000005
下方鎖：
2004526423.tif 000006
開裂記号：
（＋＋＋）：高強度の開裂。（＋＋）：中強度の開裂。（＋）：低強度の開裂。（−）開裂なし。
これらのヘテロ二重鎖生成物の開裂は必ずしも同一ではないが（即ち、Ａ−ＣをＣ−Ａと比較する）、これは隣接配列変化の結果としてのＤＮＡの構造における繊細さを反映している。それでも、可能性のある各塩基変化に対して、少なくとも１本の上方鎖および少なくとも１本の下方鎖に対してシグナルが生成される。従って、ＴｍａエンドＶ酵素は、いずれかの可能性のある単一塩基変異または多型性を認識できるはずである。
【００７５】
実施例７  ＴｍａエンドヌクレアーゼＶが一本鎖および二本鎖ＤＮＡへ及ぼす非特異的開裂活性
ＴｍａエンドＶの非特異的開裂活性を決定するために、一本鎖オリゴヌクレオチドおよび正規プラスミドに及ぼす開裂活性を測定した。一本鎖ＤＮＡ開裂反応は、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７.４）、１ｍＭ  ＤＴＴ、２％グリセロール、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２もしくは０.６ｍＭ  ＭｎＣｌ２、１０ｎＭ一本鎖ＤＮＡ基質および指示した量の精製ＴｍａエンドヌクレアーゼＶタンパク質を含有する２０μＬ反応混合物中において６５℃で３０分間実施した。
【００７６】
プラスミド開裂反応は、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７.４）、１ｍＭ  ＤＴＴ、２％グリセロール、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２もしくは１ｍＭ  ＭｎＣｌ２、１０ｎＭプラスミドｐＦＢ７.６および指示した量の精製ＴｍａエンドヌクレアーゼＶタンパク質を含有する２０μＬ反応混合物中において６５℃で３０分間実施した。
【００７７】
この反応は、等量のＧｅｎｅＳｃａｎ停止液を添加することによって終了させた。この反応混合物をその後９４℃で２分間加熱し、氷上で冷却した。３μＬの検体を１０％ＧｅｎｅＳｃａｎ変性ポリアクリルアミドゲル（パーキン・エルマー製）上に装填した。電気泳動は、ＡＢＩ３７７シーケンサー（パーキン・エルマー製）を使用して１，５００ボルトで１時間実施した。開裂生成物および残留基質は、ＧｅｎｅＳｃａｎ解析ソフトウエア、バージョン２.１または３.０を使用して定量した。
【００７８】
この酵素は、ＡＰ部位もしくはウラシル含有鎖に特異的に低酵素濃度でニックを入れた（図６Ａ、レーン３〜４および６〜７）。酵素濃度を１００ｎＭへ増加させると（Ｅ：Ｓ＝１０：１）、反対側の鎖のニッキングが発生し始め（図６Ａ、レーン５および８）、これは反対側の鎖のニッキングがイノシン含有基質にとって独特ではないことを示唆している。この酵素は、ＡＰ部位基質とは弱いが明確な複合体を形成したが、ウラシル基質とは形成せず（図６Ｂ）、これはこの酵素が基底状態結合を達成するために塩基認識だけに依存するのではないことを示唆している。ウラシル部位との安定性結合の欠如は、エンドＶがウラシル修復において重要な役割を果たさないことを指摘している遺伝学的試験と一致している（参照として本明細書に組み入れられるＧｕｏ  Ｇ.ら、Ｊ.Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ.，１８０：４６−５１（１９９８）を参照）。
【００７９】
Ｉ／Ｉ基質から入手した結合データは、この酵素が一本鎖法でイノシン基質と相互作用できる可能性があることを証明した。以前の試験は、大腸菌エンドＶが一本鎖イノシン基質を開裂することを証明している（参照として本明細書に組み入れられるＹａｏら、Ｊ.Ｂｉｏｌ.Ｃｈｅｍ.，２７１：３０６７２−７６（１９９６）を参照）。この酵素が一本鎖ＤＮＡをどのようにして開裂するのかをより明確に理解するために、イノシン、ＡＰ部位およびウラシル基質の開裂および結合について試験した。ＴｍａエンドＶは、金属コファクターとしてＭｇ２＋またはＭｎ２＋のどちらかを用いた場合に一本鎖イノシン基質を開裂した（図６Ｃ）。一本鎖ＡＰ部位またはウラシルの開裂は金属コファクターとしてＭｎ２＋を使用することを好むように思われた（図６Ｃ）。さらに、Ｍｎ２＋は非特異的一本鎖ＤＮＡの開裂を促進した（図６Ｃ）。非特異的エンドヌクレアーゼ活性は、さらにスーパーコイルプラスミド基質を使用して確証された（図６Ｄ）。金属コファクターとしてＭｇ２＋を使用すると、非特異的エンドヌクレアーゼ活性はプラスミドに１回ニックを入れた。金属コファクターとしてＭｎ２＋を使用すると、この酵素は少なくとも２回プラスミド分子にニックを入れることができ、直鎖状プラスミドを生成させた（図６Ｄ）。２回のニッキング事象は、ニックが入れられたプラスミド中間物の外観によって証明されたように連続的である。ニックが入れられた、または直鎖状プラスミドへのスーパーコイルプラスミドの変換は、この酵素がＤＮＡ分子にアクセスするために遊離５’または３’末端を必要としないことを示唆している。
【００８０】
二本鎖イノシン基質を用いた場合のように、一本鎖イノシン基質への結合にはさらに金属コファクターも必要とする（図６Ｅ）。一本鎖イノシン基質への結合親和性は、二本鎖より弱いように見えた（図６Ｅ）。安定性複合体は、Ｍｇ２＋の存在下で形成され、これはＴｍａエンドＶがニックが入れられた一本鎖生成物への相当に高い親和性を維持することを示唆した（図６Ｆ）。一本鎖イノシン開裂活性は、複製および転写中に一過性一本鎖領域での損傷の修復に役立つ可能性がある。
【００８１】
これは、非特異的開裂が金属コファクターとしてＭｎ２＋を用いた場合の方が優勢であることを示唆している。さらに、ニックが入れられた、または直鎖状プラスミドへのスーパーコイルプラスミドの変換は、この酵素がＤＮＡ分子にアクセスするために遊離５’または３’末端を必要としないことを示唆している。上記の結果は、ＴｍａエンドＶ開裂がＭｎ２＋よりＭｇ２＋の存在下における方が特異的であり、Ｍｇ２＋が反応バッファー中で優先金属コファクターであると決定された。
【００８２】
実施例８  ｐＨがＴｍａエンドヌクレアーゼＶの塩基ミスマッチ開裂活性に及ぼす作用
ｐＨは、ミスマッチ開裂に重大な作用を発揮することがある。このアッセイ中の基質は４種のオリゴヌクレオチド群であるが、それらのうちの３種は各々ミスマッチ（Ａ／Ａ）、（Ｃ／Ｔ）、および（Ｃ／Ｃ）を含んでおり、残り１種はミスマッチを含まない正規オリゴヌクレオチドである。開裂反応は、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７.４）、１ｍＭ  ＤＴＴ、２％グリセロール、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２（または１ｍＭ  ＭｎＣｌ２）、１０ｎ ＭＤＮＡ基質、様々なＥ：Ｓ比を備えた指示した量の精製ＴｍａエンドヌクレアーゼＶタンパク質を含有するバッファー中において６５℃で１時間実施した。
【００８３】
相違するｐＨを作製する際には下記のバッファーを使用した。２０ｍＭ  ＭＥＳ（ｐＨ６.０）、２０ｍＭ  ＭＯＰＳ（ｐＨ６.５）、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７.０〜７.５）、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８.０〜８.５）。Ａ.反応は、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２の存在下で１００ｎＭエンドヌクレアーゼＶ（Ｅ：Ｓ＝１０：１）を用いて実施した。Ｂ.反応は、１ｍＭ  ＭｎＣｌ２の存在下で１０ｎＭエンドヌクレアーゼＶ（Ｅ：Ｓ＝１：１）を用いて実施した。
【００８４】
その後反応混合物を９４℃で２分間加熱し、氷上で冷却した。３μＬ検体を１０％ＧｅｎｅＳｃａｎ変性ポリアクリルアミドゲル（パーキン・エルマー製）上に装填した。電気泳動は、ＡＢＩ３７７シーケンサー（パーキン・エルマー製）を使用して１，５００ボルトで１時間実施した。開裂生成物および残留基質は、ＧｅｎｅＳｃａｎ解析ソフトウエア、バージョン２.１または３.０を使用して定量した。
【００８５】
図７は、反応バッファーのｐＨはミスマッチ開裂に重大な作用を発揮することができる。ミスマッチ位置でのニックは、ｐＨ６.５で観察できるようになり、５ｍＭ  Ｍｇ２＋（Ｅ：Ｓ＝１０：１）（図７Ａ）または１ｍＭ  Ｍｎ２＋（Ｅ：Ｓ＝１：１）（図７Ｂ）の両方の存在下で非特異的開裂において同時増加を伴ってｐＨ７.５で最高に達した。大腸菌エンドヌクレアーゼＶ（参照として本明細書に組み入れられるＧａｔｅｓ  Ｆ.Ｔ.，３ｒｄ  ａｎｄ  Ｌｉｎｎ  Ｓ.，Ｊ.Ｂｉｏｌ.Ｃｈｅｍ.，２５２（５）：１６４７−５３（１９７７）を参照）および大腸菌ＤＮＡポリメラーゼ（参照として本明細書に組み入れられるＥｃｋｅｒｔ  Ｋ.Ａ.ら、「反応ｐＨがエキソヌクレアーゼ欠損クレノウポリメラーゼの適合度および加工性に及ぼす作用（Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｐＨ  ｏｎ  ｔｈｅ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ａｎｄ  Ｐｒｏｃｅｓｓｉｖｉｔｙ  ｏｆ  Ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ−Ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ  Ｋｌｅｎｏｗ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）」，Ｊ.Ｂｉｏｌ.Ｃｈｅｍ.，２６８（１８）：１３６４２−７１（１９９３）を参照）についての以前の試験に一致して、ＴｍａエンドヌクレアーゼＶは高ｐＨ条件ではより非特異的になった。
【００８６】
実施例９  塩が塩基ミスマッチを含有するオリゴヌクレオチド類の開裂に及ぼす作用
反応条件が塩基ミスマッチ開裂にどのように影響を及ぼすのかを試験するために、代表的ミスマッチ開裂を種々のＮａＣｌ濃度で試験した。このアッセイでの基質は４種のオリゴヌクレオチド群であるが、それらのうちの３種は各々ミスマッチ（Ａ／Ａ）、（Ｃ／Ｔ）、および（Ｃ／Ｃ）を含んでおり、残り１種はミスマッチを含まない正規オリゴヌクレオチドである。開裂反応は、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７.４）、１ｍＭ  ＤＴＴ、２％グリセロール、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２または１ｍＭ  ＭｎＣｌ２、１０ｎＭＤＮＡ基質および指示した量の精製ＴｍａエンドヌクレアーゼＶタンパク質を含有する２０μＬ反応混合物中において６５℃で３０分間実施した。ＮａＣｌの濃度は、５０ｍＭ間隔で０〜２５０ｍＭの範囲内であった。この反応は、等量のＧｅｎｅＳｃａｎ停止液を添加することによって終了させた。この反応混合物をその後９４℃で２分間加熱し、氷上で冷却した。３μＬの検体を１０％ＧｅｎｅＳｃａｎ変性ポリアクリルアミドゲル（パーキン・エルマー製）上に装填した。電気泳動は、ＡＢＩ３７７シーケンサー（パーキン・エルマー製）を使用して１，５００ボルトで１時間実施した。開裂生成物および残留基質は、ＧｅｎｅＳｃａｎ解析ソフトウエア、バージョン２.１または３.０を使用して定量した。
【００８７】
この酵素がＭｇ２＋またはＭｎ２＋のどちらかを用いてのミスマッチ開裂のために低塩環境を好むことが明白であった。金属コファクターとしてＭｇ２＋を用いると、ミスマッチ開裂収率は塩を含まない場合に最高であった。金属コファクターとしてＭｎ２＋を用いると、ミスマッチ開裂収率は５０ｍＭ  ＮａＣｌを用いた場合に最高であった。図８を参照。これは、塩濃度が上昇するとＤＮＡ結合親和性が低下するという見解と一致している。これらの条件下では、Ｃ−ＣミスマッチまたはＡ−Ｔマッチのどちらを用いても開裂は観察されなかった。
【００８８】
上記の実験から、ＴｍａエンドＶミスマッチ開裂が最大化され、非特異的ミスマッチ開裂が最小限に抑えられる最適反応バッファー条件が決定された。最適条件は、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７.４）、１ｍＭ  ＤＴＴ、２％グリセロール、および５ｍＭ  ＭｇＣｌ２である。これらの条件は、基質として主としてオリゴヌクレオチド類を使用したデータから決定した。このため、最適条件は例えばゲノムＤＮＡのような相違する基質を利用したときには変動する可能性がある。さらに、この最適条件は、本発明の状況において最も望ましい開裂特徴に関して最善と思われる条件であるが、最適以下条件も本発明の状況において適合することを述べておかなければならない。
【００８９】
実施例１０  合成オリゴヌクレオチドＤＮＡを基質として使用した場合のＴｍａエンドヌクレアーゼＶ開裂反応条件におけるＭｇ２＋およびＭｎ２＋濃度の最適化
基質として（Ａ／Ａ）ミスマッチを含有する蛍光標識二本鎖オリゴヌクレオチドを使用して、ＴｍａエンドＶの開裂活性を様々な濃度のＭｇ２＋またはＭｎ２＋を使用して測定した。開裂反応は、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７.４）、１ｍＭ  ＤＴＴ、２％グリセロール、他に規定されていない限り１０ｎＭ  ＤＮＡ基質、様々な濃度のＭｇ２＋またはＭｎ２＋、および１００ｎＭ  ＴｍａエンドＶ（Ｍｇ２＋の存在下）または１０ｎＭ  ＴｍａエンドＶ（Ｍｎ２＋の存在下）を含有する２０μＬ反応混合物中において６５℃で３０分間実施した。
【００９０】
この反応は、等量のＧｅｎｅＳｃａｎ停止液（５０ｍＭ  ＥＤＴＡ、８０％ホルムアルデヒド、１％ブルーデキストラン）を添加することによって終了させた。この反応混合物をその後９４℃で２分間加熱し、氷上で冷却した。３μＬの検体を１０％ＧｅｎｅＳｃａｎ変性ポリアクリルアミドゲル（パーキン・エルマー製）上に装填した。電気泳動は、ＡＢＩ３７７シーケンサー（パーキン・エルマー製）を使用して１，５００ボルトで１時間実施した。開裂生成物および残留基質は、ＧｅｎｅＳｃａｎ解析ソフトウエア、バージョン２.１または３.０（パーキン・エルマー製）を使用して定量した。定量結果は、図４に示されている。塩基ミスマッチを含有するＤＮＡ基質の開裂におけるＭｇ２＋の最適濃度は２〜７ｍＭであり、Ｍｎ２＋の最適濃度は０.４〜１.２ｍＭである。
【００９１】
実施例１１  ＰＣＲ増幅
ｋ−ｒａｓ遺伝子コドン１２および１３における変異を含むゲノムＤＮＡは変異を含有する細胞系から抽出した。細胞系ｈｔ２９またはｓｗ１４１７は正常ゲノムＤＮＡを含有している。細胞系ｓｗ６２０またはｓｗ４８０は、純粋ｇ１２ｖ（ｇ→ｔ）変異を含有するＤＮＡを有している。細胞系Ｉｓ１８０から抽出したゲノムＤＮＡ内の野生型対変異ｇ１２ｄ（ｇ→ａ）の比率は１：１.８である。細胞系ｓｗ１１１６から抽出したＤＮＡ内の野生型対変異ｇ１２ａ（ｇ→ｃ）の比率は１：０.７である。細胞系ｈｃｔ１５またはｄｌｄ１から抽出したゲノムＤＮＡ内の野生型対変異ｇ１３ｄ（ｇ→ａ）の比率は１：１.１である。
【００９２】
ＰＣＲ増幅プロセスを実施する際には、フォワードプライマーおよびリバースＰＣＲプライマーはＴＥＴおよび６−ＦＡＭ（ＰＥ−バイオシステムズ、フォスターシティ、ＣＡ）の５’末端標識を用いて合成できる。これら２種の蛍光基は、ＡＢＩ３７７シーケンサーによって解析したときに、各々緑色および青色に見える。上方鎖および下方鎖の鑑別標識は、各鎖から開裂生成物を独立して区別することを許容する。ＴｍａエンドＶによるＴＥＴおよび６−ＦＡＭ標識の非特異的開裂を最小限に抑えるために、３種の追加のシトシンデオキシヌクレオチドを各プライマーの５’末端上で合成した。適したプライマーの例は表１Ａに示されている。
（表２Ａ）癌遺伝子フラグメントを増幅させるためのＰＣＲプライマー配列
2004526423.tif 000007
【００９３】
ＰＣＲプライマーの生成のプロセスでは、２００ｎｇの標識プライマーを２０μＬのｄｄＨ２Ｏ中に溶解させ、等量のホルムアルデヒドと混合した。約６４℃で２分間インキュベートした後、７Ｍ尿素を含有する１００％ポリアクリルアミドゲル上にプライマーを装填した。電気泳動後に、純粋のプライマーを含有するゲルスライスを切り取り、３７℃のＴＮＥ溶液（０.１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８.０）、０.５Ｍ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＥＤＴＡ）中に一晩浸漬した。ゲルスライスを含有する溶液を除去し、メタノールおよび水で予備洗浄したＳｅｐ−ＰａｋカートリッジＣ−１８（ウォーターズ（Ｗａｔｅｒｓ）製、ミルフォード、マサチューセッツ州）上に装填した。２０ｍＬのｄｄＨ２Ｏを用いて洗浄した後、２ｍＬの溶出バッファー（５ｍＭ  ＴＥＡＡ（酢酸トリエチルアミン）、５０％メタノール）を用いてプライマーを溶出させ、高速真空装置を用いて乾燥させた。ＴＥバッファーを用いてペレットを懸濁させた。ＰＣＲ反応は、ＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲシステム２４００またはＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲシステム９７００において実施した。５０μＬのＰＣＲ反応溶液は１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８.３）、５０ｍＭ  ＫＣｌ、２００μＭの各ｄＮＴＰ、０.２μＭのプライマー、２.５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、および約１００ｎｇのゲノムＤＮＡまたはアンプリコンを含有している。高ＧＣ含量を用いたＶＨＬエキソン１の増幅では、ＰＣＲ反応混合物中に２％ＤＭＳＯを含めた。
【００９４】
ＰＣＲ増幅は、ゲノムＤＮＡ、あるいはまた対照のフラグメントを含有するアンプリコンから直接的であってよい。ＰＣＲ反応のための熱サイクル条件は、非特異的フラグメントの増幅を減少させるように調整しなければならない。表２Ｂは、様々な遺伝子のための典型的な熱サイクル条件を示している。
【００９５】
（表２Ｂ）種々の遺伝子中のフラグメントを増幅させるためのＰＣＲサイクル条件
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備考：ＡｍｐｌｉＴａｑおよびＴａｑＰｌｕｓＤＮＡポリメラーゼについては、初期変性段階後に、ホットスタート（ｈｏｔ  ｓｔａｒｔ）ＰＣＲを実施するためにＤＮＡポリメラーゼを添加した。ｇｏｌｄＴａｑＤＮＡポリメラーゼについては、ＰＣＲ反応を開始させる前に反応混合物中にＤＮＡポリメラーゼを含めた。ＰＣＲ装置は、ＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲシステム２４００または９７００（パーキン・エルマー製）である。
【００９６】
実施例１２  ヘテロ二重鎖ＤＮＡ基質の作製
ＴａｑＤＮＡポリメラーゼを除去するために、ＰＣＲフラグメントを１μＬのプロテイナーゼＫ対１２μＬのＰＣＲ生成物の比率でプロテイナーゼＫ（２０ｍｇ／ｍＬ、キアゲン製）と一緒にインキュベートした。この反応は、プロテイナーゼＫを不活化するために７０℃で１０分間および８０℃で１０分間実施した。この混合物を９４℃で１分間、６５℃で１５分間加熱し、その後は室温へ冷却してヘテロ二重鎖ＤＮＡを形成させた。例えば細胞系ＬＳ１８０のような正常ＤＮＡより多数の変異体を含有する細胞系からのゲノムＤＮＡに対しては、正常ゲノムＤＮＡからのＰＣＲフラグメントを添加して１：１の最終比（変異対野生型）を作り出した。細胞系ＳＷ１１１６における変異対野生型の比率は０.７：１.０であり、純粋変異ＤＮＡは入手できないので、ゲノムＤＮＡ単独を下記の本文に記載した通りに処理した。ゲノムＤＮＡを例えば標的ＤＮＡがＡＰＣ、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２およびＶＨＬ遺伝子中の変異である血液から精製した場合は、ＰＣＲフラグメントは野生型ＰＣＲフラグメントを添加せずに以前に記載した通りに処理した。
【００９７】
実施例１３  基質としてのヘテロ二重鎖ＰＣＲフラグメントを使用した場合のＴｍａエンドＶ／リガーゼによる変異検出条件の最適化
エンドＶ開裂のためのＤＮＡ基質として合成二本鎖オリゴヌクレオチド類（６０〜６６ｍｅｒ）を使用したときは、最適バッファー条件はＴｍａエンドＶが高い特異的開裂活性および低い非特異的開裂活性を有する１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７.４）、１ｍＭ  ＤＴＴ、２％グリセロール、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２である。しかし、Ｋ−ｒａｓ遺伝子中にＧ１２Ｖ変異を含有する約３００ｂｐのＰＣＲフラグメントを基質として使用したときには、開裂は観察されなかった。このＴｍａエンドＶ開裂活性については、Ｋ−ｒａｓコドン１２変異を含有する様々なヘテロ二重鎖ＰＣＲフラグメントを基質として使用した。これらの実験では、野生型およびＧ１２Ｖ変異ＤＮＡ  ＰＣＲ増幅フラグメントの混合物を使用した。結果として生じた２種のヘテロ二重鎖フラグメントは、各々Ｇ−ＡおよびＴ−Ｃミスマッチを含有している。上方および下方鎖両方の開裂が観察され、生成物をＡＢＩ３７７ＤＮＡシーケンシング装置上で分離し、開裂生成物の量はＧｅｎｅＳｃａｎ  ３.０解析ソフトウエア（ＰＥ−バイオシステムズ製、フォスターシティ、ＣＡ）を使用して定量した。図９は、反応への５％ＤＭＳＯの添加がミスマッチ開裂活性を約２〜３倍増強させることを示している。ミスマッチ開裂を増強できるその他の有機溶媒には、ジメチルホルムアミド、エチレングリコール、グリセロール、ホルムアルデヒド等が含まれる。
【００９８】
開裂を改良するための第２アプローチは、ベタイン、Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルグリシンの添加を含んでいた。ベタインは、相違するＧＣ含量を有するＤＮＡフラグメントの融解温度を等しくするために最初に使用した。ベタインの一定の「等安定化（ｉｓｏｓｔａｂｉｌｉｚｉｎｇ）」濃度において、ＡＴおよびＧＣ対が同等に安定性であることが見出された（参照として本明細書に組み入れられるＲｅｅｓ  Ｗ.Ａ.ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３２：１３７−４４（１９９３）を参照）。ベタインは、さらにまた高ＧＣ含量を含む領域のＰＣＲ増幅を促進するための添加物としても使用した（参照として本明細書に組み入れられるＨｅｎｋｅ  Ｗ.ら、「ベタインはＧＣ富裕ＤＮＡ配列のＰＣＲ増幅を向上させる（Ｂｅｔａｉｎ  Ｉｍｐｒｏｖｅｓ  ｔｈｅ  ＰＣＲ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＧＣ−Ｒｉｃｈ  ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ），」Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ.，２５：３９５７−５８（１９９７）を参照）。
【００９９】
図１０は、反応バッファーへのベタインの添加がＴｍａエンドＶの塩基ミスマッチ開裂活性を促進できるが、これをフラグメント依存性方法で実施することを示している。例えばＡＰＣ遺伝子から生成されるもののような低ＧＣ含量のＰＣＲフラグメントについては、開裂活性は１.０Ｍベタインで最大２倍の刺激に達した。例えばＫ−ｒａｓフラグメントのような高ＧＣ含量のＰＣＲフラグメントについては、最高開裂活性は１.５Ｍベタインで観察され、２.７倍のより大きな刺激を生じさせた。高および低ＧＣ含量フラグメントの両方に対する相対刺激は、１Ｍベタインでほぼ同一の２倍であった。
【０１００】
ＮａＣｌの作用をヘテロ二重鎖フラグメントについて再試験し、図１１Ａは、ＮａＣｌの添加が開裂反応を阻害することを証明している。５０ｍＭ  ＮａＣｌで、開裂反応はほぼ完全に阻害された。図１１Ｂは、ＫＣｌがＴｍａエンドＶのミスマッチ開裂活性に及ぼす作用を示している。このアッセイのための基質としてＫ−ｒａｓＧ１２Ｖ（Ｇ→Ｔ）変異を含有する１００ｎｇのヘテロ二重鎖ＰＣＲフラグメントを使用し、反応は１００ｎＭ  ＴｍａエンドヌクレアーゼＶおよび種々の濃度のＫＣｌを含む修正最適反応バッファー（２.０Ｍベタイン、１０％ＤＭＳＯ）中において６５℃で１時間実施した。結果は、ＫＣｌの作用がＮａＣｌの作用と実際に類似していること、および５０ｍＭ  ＫＣｌの存在下ではＴｍａエンドＶ開裂活性がほぼ完全に阻害されることを示している。このため、本発明の連結段階では、ＴｍａエンドＶ開裂活性は実質的に排除される。これらの結果は、反応バッファーに追加の塩を含めるべきではないことを確証している。
【０１０１】
上記の解析は、基質としてＰＣＲフラグメントを使用した場合は、塩の添加は回避すべきであるが、反応への５％ＤＭＳＯおよび１〜１.５Ｍベタインの添加はＴｍａエンドＶの特異的開裂活性を増強できることを示唆している。
【０１０２】
新規最適反応条件を使用して、ＴｍａエンドＶ開裂反応の時間経過はＫ−ｒａｓＧ１２Ｄ（Ｇ→Ａ）変異を含有するＰＣＲフラグメントを使用して６５℃で実施した（図１２）。これらの実験では、野生型およびＧ１２Ｄ変異ＤＮＡ  ＰＣＲ増幅フラグメントの混合物を使用した。結果として生じた２種のヘテロ二重鎖ＰＣＲフラグメントは各々Ｇ−ＴおよびＡ−Ｃミスマッチを含有している。上方および下方鎖両方の開裂が観察され、生成物をＡＢＩ３７７ＤＮＡシーケンシング装置上で分離し、開裂生成物の量はＧｅｎｅＳｃａｎ  ３.０解析ソフトウエアを使用して定量した。生成物は時間経過に渡って線形に増加した。インキュベーション時間が長くなると、非特異的生成物の望ましくない増加を生じさせる可能性がある。このため、基質としてヘテロ二重鎖ＰＣＲフラグメントを使用したＴｍａエンドＶのための最適反応条件は、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７.４）、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＤＴＴ、２％グリセロール、およそ１〜１.５Ｍベタイン、および５％ＤＭＳＯを含有する反応バッファー中で６５℃で１時間のインキュベーションである。
【０１０３】
図１３（−ＤＮＡリガーゼレーン）は、新規最適反応条件が基質としてＰＣＲフラグメントを使用したときにＴｍａエンドＶ酵素の高い活性および相対的に良好な特異性を生じさせることを証明している。それでも、非特異的ニッキングが依然として観察されるので、その結果として有意なバックグラウンドシグナルが存在する。
【０１０４】
実施例１４  ＮＡＤ＋ＤＮＡリガーゼを用いた連結反応条件
Ｔｓｐ.ＡＫ１６Ｄリガーゼのための最適反応バッファーは、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８.５）、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５０ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  ＤＴＴ、１ｍＭ  ＮＡＤ＋、２０μｇ／ｍＬ  ＢＳＡである（参照として本明細書に組み入れられるＴｏｎｇ  Ｊ.ら、「テルムス種由来高適合度ＤＮＡリガーゼＡＫ１６Ｄの生化学的特性（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ａ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＤＮＡ  Ｌｉｇａｓｅ  ｆｒｏｍ  Ｔｈｅｒｍｕｓ  Ｓｐｅｃｉｅｓ  ＡＫ１６Ｄ）」，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ.，２７：７８８−９４（１９９９）を参照）。エンドＶ開裂反応からの１５μＬの反応混合物を２μＬの１０×補助バッファー（２００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８.５）、１２.５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５００ｍＭ  ＫＣｌ、１００ｍＭ  ＤＴＴおよび２００μｇ／ｍＬ  ＢＳＡ）、１μＬの２０ｍＭ  ＮＡＤ＋、および２μＬの１０〜６０ｎＭ  Ｔｓｐ.ＡＫ１６Ｄリガーゼに添加した。混合物の最終濃度を２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８.５、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５０ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  ＤＴＴ、１ｍＭ  ＮＡＤ＋、２０μｇ／ｍＬ  ＢＳＡ、および１〜６ｎＭ  ＡＫ１６Ｄ  ＤＮＡリガーゼとした。この混合物を６５℃で２０分間インキュベートし、等量のＧｅｎｅＳｃａｎ停止液（５０ｍＭ  ＥＤＴＡ、１％ブルーデキストランおよび８０％ホルムアミド）を添加することによって終了させた。その後この反応混合物を９４℃で２分間加熱し、氷上で冷却した。２〜３μＬの混合物を６％変性ポリアクリルアミドゲル上に装填し、次の条件下でＡＢＩ３７７シーケンサー（パーキン・エルマー製）中で１時間、電気泳動にかけた。１，０００ボルトの電圧、６０ｍＡの電流、２００Ｗの出力、および４５℃のゲル温度。６−ＦＡＭおよびＴＥＴは、各々上方および下方鎖プライマーで標識された蛍光基であった。それらはＡＢＩ  ＤＮＡシーケンサー３７７を用いると、各々青色および緑色に見える。このため、ＴＥＴ標識（緑色）開裂バンドが上方鎖から生成され、ＦＡＭ標識（青色）開裂バンドが下方鎖から生成されると結論することができる。ＴＡＭＲＡ標識ＧｅｎｅＳｃａｎ分子サイズスタンダード５００（赤色バンド）は同一ゲル上に装填されたので、開裂生成物の分子量はＧｅｎｅＳｃａｎ解析ソフトウエア、バージョン２.１または３.０ａを使用してサイズスタンダードの移動度を開裂生成物の移動度と比較することによって推定できた。
【０１０５】
実施例１５  Ｋ−ｒａｓ遺伝子中のコドン１２および１３の変異の検出
Ｋ−ｒａｓ遺伝子中のコドン１２および１３の変異の検出では、ＴｍａエンドＶ／ＡＫ１６Ｄ  ＤＮＡリガーゼを用いた変異スキャニングの戦略を最初に試験した。ＰＣＲ増幅のためのテンプレートとしてコドン１２および１３において変異を含有する細胞系からのゲノムＤＮＡを使用した。Ｋ−ｒａｓ変異を含有する細胞系は、下記の通りに表３に列挙した。
【０１０６】
（表３）
2004526423.tif 000009
上方鎖のＰＣＲプライマーの配列は下記であり、
2004526423.tif 000010
および下方鎖のプライマーの配列は下記であった。
2004526423.tif 000011
【０１０７】
ＰＣＲ反応は、９４℃で２分間で実施し、その後ＡｍｐｌｉＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼを添加し、さらに９４℃で１５秒間、６０℃で２分間の加熱を３０サイクル実施した。最終伸長は７２℃で７分間実施した。その後ゲノムＤＮＡからの野生型ＰＣＲフラグメントを１：１の比率で変異ＰＣＲフラグメントと混合した。ＴａｑＤＮＡポリメラーゼを除去するために、各１２μＬのＰＣＲ産物に対して１μＬのプロテイナーゼＫ（２０ｍｇ／ｍＬ、キアゲン製）を添加した。この反応物を７０℃で１０分間および８０℃で１０分間インキュベートしてプロテイナーゼＫを不活化した。その後この混合物を９４℃で１分間、６５℃で１５分間加熱することによってヘテロ二重鎖フラグメントを形成させ、さらに室温へ冷却した。細胞系ＳＷ１１１６のゲノムＤＮＡから精製したＰＣＲフラグメントは野生型ＰＣＲフラグメントの添加を必要としなかった。
【０１０８】
開裂反応のために、標準反応混合物は１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７.４）、１ｍＭ  ＤＴＴ、２％グリセロール、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５％ＤＭＳＯ、１.５Ｍベタイン、１００ｎｇ  ＰＣＲ産物、および５００ｎＭ精製ＴｍａエンドヌクレアーゼＶタンパク質から構成した。この反応混合物を６５℃で１時間インキュベートし、１５μＬの反応混合物を２μＬの１０×リガーゼ補助バッファー（２００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８.５）、１２.５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５００ｍＭ  ＫＣｌ、１００ｍＭ  ＤＴＴおよび２００μｇ／ｍＬ  ＢＳＡ）に添加することによって反応を終了させた。１０×リガーゼ補助バッファーのＫＣｌがＴｍａエンドＶ開裂活性の阻害の原因である。次に、１μＬの２０ｍＭ  ＮＡＤ＋、および２μＬの６０ｎＭ  ＡＫ１６Ｄ  ＤＮＡリガーゼを添加して、リガーゼ反応混合物の最終濃度を２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７.６）、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５０ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  ＤＴＴ、１ｍＭ  ＮＡＤ＋、２０μｇ／ｍＬ  ＢＳＡ、および６ｎＭ  ＡＫ１６Ｄ  ＤＮＡリガーゼとした。この混合物を６５℃で２０分間インキュベートし、等量のＧｅｎｅＳｃａｎ停止液（５０ｍＭ  ＥＤＴＡ、１％ブルーデキストランおよび８０％ホルムアミド）を添加することによって終了させた。その後この反応混合物を９４℃で２分間加熱し、氷上で冷却した。３μＬの混合物を６％変性ポリアクリルアミドゲル上に装填し、次の条件下でＡＢＩ３７７シーケンサー（パーキン・エルマー製）中で１時間、電気泳動にかけた。１，０００ボルト、６０ｍＡ、２００Ｗ、および４５℃のゲル温度。
【０１０９】
エンドＶ開裂後、純粋野生型および純粋変異Ｇ１２Ｖにおいて主要開裂バンドは全く所見されなかった。Ｇ１２＋Ｇ１２ＶおよびＧ１２＋Ｇ１２Ｄ（ＬＳ１８０）の検体中では２つの主要開裂バンドが所見された。ＦＡＭ標識（青色バンド；上方鎖の開裂生成物）の長さは、ミスマッチ開裂についての１５９ｂｐの予想長さの範囲内にある約１５７〜１６０ｂｐであった。ＴＥＴ標識（緑色バンド；下方鎖の開裂生成物）の長さは、同様にミスマッチ開裂についての１１６ｂｐの予想長さに近い約１１８ｂｐであった。Ｇ１２Ｖ変異に加えて、変異Ｇ１２ＤおよびＧ１２Ａもまた類似アッセイにおいて検出された。Ｇ１２Ｄアッセイでは、上およびしたの両方の鎖の開裂生成物が観察され、それらの強度はＧ１２Ｖよりほんのわずかだけ低かった。Ｇ１２Ａの検出でも、両方の鎖の開裂が観察された。上方鎖の生成物の強度はＧ１２Ｄの強度とほぼ同一であったが、下方鎖の生成物の強度は他の２種の変異体の強度よりはるかに低かった。変異Ｇ１３Ｄは検出されなかった。
【０１１０】
図１３は、連結段階の添加が非特異的ニッキングのためにいかにバックグラウンドを劇的に減少させるのかを証明している。このアッセイのために、ＰＣＲフラグメントはｋｒａｓにおける位置Ｇ１２でｗｔもしくは変異のいずれかに対してホモ接合性であった、またはこの位置でヘテロ接合性であったＤＮＡ検体から生成した。連結段階を使用しないと、非特異的開裂は全検体において観察される。Ｔｓｐ.ＡＫ１６Ｄリガーゼ段階の添加を行わないと、このバックグラウンドシグナルは劇的に減少する。ヘテロ接合性検体（即ち、各セットの最後の２レーン）中でのみ、ヘテロ二重鎖ミスマッチに関連する開裂が観察され、これらの結果は追加の連結段階が特異的ミスマッチ開裂を傷つけないことを証明している。このため、追加の連結段階は非ミスマッチ位置での開裂を原因とするバックグラウンドを減少させることはできるが、ミスマッチ開裂部位での開裂は連結しない。
【０１１１】
主要開裂バンドミスマッチ開裂生成物に加えて、一部の非特異的開裂バンドもまた観察された。青色（即ち、上方鎖）開裂生成物を越えて移動する全検体において１つの非特異的バンドが存在する。さらにまた１つは青色およびもう１つは緑色の２種の非特異的開裂生成物が存在するが、これらは低分子量生成物とともに移動し、全４種の検体中に存在する。１〜６ｎＭ  ＤＮＡリガーゼと一緒のインキュベーション後に、青色開裂バンドの上方の非特異的バンドは強度が減少するので、これは非特異的ニックがＤＮＡリガーゼによってシールされたことを意味している。低分子量非特異的バンドは、ＡＫ１６Ｄリガーゼの濃度を６ｎＭまで上昇させた場合でさえ存在する（図１３参照）。これは、これらが連結不能な変性生成物である、あるいはまた有機溶媒中での６５℃で１時間のエンドＶインキュベーション中に基質から変性した短いフラグメントである可能性を示唆している。
【０１１２】
本発明の感度を特徴付けるために、Ｋ−ｒａｓエキソン１変異を含有するＰＣＲフラグメント中の塩基ミスマッチを様々な比率の変異対野生型ＤＮＡ比下でアッセイした。本発明を用いると、Ｋ−ｒａｓ変異を含有するＤＮＡに対する１：１の変異対野生型ＤＮＡ比に対する開裂効率は、Ｇ１２Ｖ、Ｇ１２ＤおよびＧ１２Ａは典型的には各々高い、中、および低い。このセットの変異を利用すると、広範囲の開裂効率に渡って感度についてスクリーニングすることができ、本発明の有用な範囲をより正確に反映するはずである。Ｋ−ｒａｓエキソン１変異を含有するＰＣＲフラグメントであるＧ１２Ｖ、Ｇ１２ＤおよびＧ１２Ａを個別に野生型ＰＣＲフラグメントと１：１、１：２、１：５、１：１０、１：２０、１：５０、および１：１００の変異対野生型比で混合した。これらのフラグメント混合物をその後、上記のＴｍａエンドＶおよびＤＮＡリガーゼ条件を使用してアッセイした。図１４は、様々な比率の変異対野生型ＤＮＡ比についての開裂生成物の量を示している。この結果は、全３種の変異について１：２０までの変異対野生型比については開裂シグナルをバックグラウンドから区別できることを示している。１：２０を超える比については、正確な位置でのシグナルがまだ観察された；しかし、開裂生成物とバックグラウンドとを決定的に区別するのは困難である。このアッセイから、本発明の感度の限界は約１：２０（変異対野生型比）であると思われる。
【０１１３】
実施例１６  ｐ５３およびＶＨＬ遺伝子中の様々な点変異の検出
様々な点変異をスキャンするエンドＶの汎用性を試験するために、本発明の方法をｐ５３およびＶＨＬ遺伝子中の様々な点変異を含むゲノムＤＮＡに適用した。ｐ５３およびＶＨＬ内に点変異を含有する１３の検体中のエキソン５、６、７および８に点変異を含有する１１の検体を入手した。ｐ５３およびＶＨＬ遺伝子中のエキソンを増幅させるためのＰＣＲプライマーの配列は、表２Ａに列挙した。ＰＣＲ熱サイクル条件は表２Ｂに列挙した。５００ｂｐ  ＶＨＬエキソン１フラグメントのゲル画像から、約１８０〜５００ｂｐへ伸びるスメア（ｓｍｅａｒ）が観察された。これは、ＶＨＬのエキソン１の中央部における極めて高いＧＣ含量のために、この領域で開裂生成物を観察することを極めて困難にする。その結果として、ＰＣＲフラグメントとゲノムＤＮＡの他の領域との相互作用が発生する可能性がある。そうであれば、このスメアを減少させるために第２ラウンドのＰＣＲ増幅においてテンプレートを希釈すべきである。このため、第２ラウンドのＰＣＲ増幅において、ＰＣＲ産物の１００倍希釈物を１μＬだけ使用し、以前に考察したのと同一サイクル条件下で、しかし今回は１５ラウンドだけ増幅させた。するとスメアは劇的に減少し、その後は生成物を可視化できた。
【０１１４】
ｐ５３変異を含有するゲノムＤＮＡは、腫瘍検体から抽出し、ＰＣＲ増幅させた。引き続き、等量の変異および野生型ＰＣＲフラグメントが存在するように野生型ＰＣＲフラグメントを添加した。ＶＨＬ遺伝子変異を含有するゲノムＤＮＡはヘテロ接合性検体からであったので、野生型ＰＣＲフラグメントは添加しなかった。ＴａｑＤＮＡポリメラーゼを除去するために、各１２μＬのＰＣＲ産物に対して１μＬのプロテイナーゼＫ（２０ｍｇ／ｍＬ、キアゲン製）を添加した。この反応物を７０℃で１０分間および８０℃で１０分間インキュベートしてプロテイナーゼＫを不活化した。その後この混合物を９４℃で１分間、６５℃で１５分間加熱することによってヘテロ二重鎖フラグメントを形成させ、さらに室温へ冷却した。
【０１１５】
開裂反応のために、標準反応混合物は１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７.４）、１ｍＭ  ＤＴＴ、２％グリセロール、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５％ＤＭＳＯ、１.５Ｍベタイン、１００ｎｇ  ＰＣＲ産物、および５００ｎＭ精製ＴｍａエンドヌクレアーゼＶタンパク質から構成した。この反応混合物を６５℃で１時間インキュベートし、１５μＬの反応混合物を２μＬの１０×リガーゼ補助バッファー（２００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８.５）、１２.５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５００ｍＭ  ＫＣｌ、１００ｍＭ  ＤＴＴおよび２００μｇ／ｍＬ  ＢＳＡ）に添加することによって反応を終了させた。次に、１μＬの２０ｍＭ  ＮＡＤ＋、および２μＬの６０ｎＭ  ＡＫ１６Ｄ  ＤＮＡリガーゼを添加して、リガーゼ反応混合物の最終濃度を２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７.６）、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５０ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  ＤＴＴ、１ｍＭ  ＮＡＤ＋、２０μｇ／ｍＬ  ＢＳＡ、および６ｎＭ  ＡＫ１６Ｄ  ＤＮＡリガーゼとした。この混合物を６５℃で２０分間インキュベートし、等量のＧｅｎｅＳｃａｎ停止液（５０ｍＭ  ＥＤＴＡ、１％ブルーデキストランおよび８０％ホルムアミド）を添加することによって反応を終了させた。その後この反応混合物を９４℃で２分間加熱し、氷上で冷却した。３μＬの混合物を６％変性ポリアクリルアミドゲル上に装填し、次の条件下でＡＢＩ３７７シーケンサー（パーキン・エルマー製）中で１時間、電気泳動にかけた。１，０００ボルト、６０ｍＡ、２００Ｗ、および４５℃のゲル温度。
【０１１６】
この方法による変異スキャニング結果の要約は表４に示した。
【０１１７】
（表４）癌遺伝子についてのＴｍａエンドＶ／リガーゼ変異スキャニングの要約
2004526423.tif 000012
＊：（＋＋＋）：高強度の開裂；（＋＋）：中強度の開裂；（＋）：低強度の開裂；（−）：開裂が観察されなかった。
【０１１８】
ｐ５３遺伝子については、１１変異中９の変異が検出された。ＶＨＬ遺伝子については、１３点変異中１２の点変異が検出された。全点変異は検出されなかったため、変異の存在および変異対野生型ＤＮＡ比を検証するためにこれらの検体のＰＣＲフラグメントについてＤＮＡシーケンシングを実施した。結果は、これらの検体中に変異が存在し、検変異対野生型ＤＮＡ比が検体Ｒ１７５Ｈを除く検体全部においておよそ１：１であることを示した。Ｒ１７５Ｈを含有する変異ＰＣＲフラグメントへ野生型ＰＣＲフラグメントを添加した後、開裂アッセイを繰り返したが、それでもＲ１７５Ｈについての結果はまだ陰性であった。
【０１１９】
表４中の４変異を除く全変異は、ＴｍａエンドヌクレアーゼＶによって認識できた。４種の検出不能な変異は、Ｋ−ｒａｓＧ１３Ｄ（Ｇ→Ａ）、ｐ５３  Ｒ１７５Ｈ（Ｇ→Ａ）、Ｒ２７３Ｃ（Ｃ→Ｔ）、およびＶＨＬ  Ｇ１６４Ｄ（Ｇ→Ａ）であり（表４）、上方および下方鎖両方についての各変異の周囲配列は表５に列挙した。
【０１２０】
（表５）開裂強度を含む、上方および下方鎖についての変異および周囲配列変異のリスト
2004526423.tif 000013
2004526423.tif 000014
2004526423.tif 000015
【０１２１】
二本鎖オリゴヌクレオチド基質を用いた以前のアッセイは、各点変異をこの方法で検出できることを証明し、シトシンを含有するミスマッチが最小効率で開裂された（図３および５、表４）。これらの変異全４つがシトシンミスマッチを含むヘテロ二重鎖ＰＣＲフラグメントを生成するにもかかわらず、調査された極めて大多数の変異も生成する。このため、シトシンミスマッチの存在は、これら４つの変異がなぜ検出されなかったのかを十分には説明していない。その代わりに、データはフランキング配列を考慮に入れる必要があることを示唆している。ＴｍａエンドＶによって開裂できなかった４つの変異の周囲配列の解析は次のコンセンサス配列を生じさせる。ｇＲｃｇ、ｒｃＲｃ、ｃｇＹｃ、およびｇＹｇｙ。変異または多型性の位置には下線が引かれており、上方の場合に示されており、列挙されている最後の２つの配列は最初の２つの配列の補体である（式中、ＲおよびＹは各々プリンおよびピリミジン塩基を表す）。極めて初期の予備解析では、ヒト染色体２２からの最初の１００ランダム単一ヌクレオチド多型性（ＳＮＰ）を４つの不応配列についてサーチしたところ、唯一ｒｃＲｃだけが発見された（表６）。
【０１２２】
（表６）ヒト染色体２２、最初の１００ランダムＳＮＰにおけるＴｍａエンドＶ不応配列の頻度
2004526423.tif 000016
引き続いてのＳＮＰデータベースにおける約４，０００ＳＮＰのコンピュータサーチにより、ｇＲｃｇ（および相補的ｃｇＹｃ）の頻度は約０.１％であり、ｒｃＲｃ（および相補的ｇＹｇｙ）が約２％であることが判明した。この予備試験結果は、４つの不応配列の頻度が極めて低いことを示唆しているので（２％）、ＴｍａエンドＶがヒトゲノム内で所見された多型性および変異の約９８％を開裂できると考えられる。
【０１２３】
単一塩基変異を検出することに加えて、この解析は本発明が小さな挿入および欠失を検出できることを証明している（表４）。ＶＨＬ遺伝子中の３塩基挿入およびＢＲＣＡ１における２塩基欠失は、どちらも両方の鎖について強力な開裂シグナルを生じさせた。ＶＨＬ遺伝子中の単一塩基欠失はさらに両方の鎖について強力なシグナルを生じさせた。ＢＲＣＡ１遺伝子中の単一挿入および単一塩基欠失を用いると最悪の結果が入手された。挿入および欠失の両方について、１本の鎖だけが開裂されることが観察され、シグナルはどちらの場合にも相当に弱かった。この低い効率にもかかわらず、このタイプのシグナルは未知のサンプルにおける変化を確証することができる。これらの結果は、本発明が小さな挿入および欠失を検出できること、および変異検出と同様に、効率が配列依存性であることを証明している。
【０１２４】
実施例１７  ＡＰＣ遺伝子中のエキソン１５のコドン１３０７におけるＴ→Ａ変異の検出
本発明の方法を、ＡＰＣ遺伝子中のエキソン１５のコドン１３０７におけるＴ→Ａ変異をスキャンすることによって臨床検体へ適用した。結腸癌組織からの９つのゲノム検体および４つの野生型検体をアッセイした。
上方鎖ＰＣＲプライマーの配列は下記であり、
2004526423.tif 000017
および下方鎖のプライマーの配列は下記であった。
2004526423.tif 000018
【０１２５】
ＰＣＲ反応条件は表２Ｂに列挙した。ＡＰＣ変異を含有するゲノムＤＮＡはヘテロ接合性であったので、野生型ＰＣＲフラグメントを添加する必要はない。ＴａｑＤＮＡポリメラーゼを除去するために、各１２μＬのＰＣＲ産物に対して１μＬのプロテイナーゼＫ（２０ｍｇ／ｍＬ、キアゲン製）を添加した。この反応物を７０℃で１０分間および８０℃で１０分間インキュベートしてプロテイナーゼＫを不活化した。その後この混合物を９４℃で１分間、６５℃で１５分間加熱することによってヘテロ二重鎖フラグメントを形成させ、さらに室温へ冷却した。細胞系ＳＷ１１１６のゲノムＤＮＡ由来のＰＣＲフラグメントは、野生型ＰＣＲフラグメントを添加せずに直接加熱し、冷却してヘテロ二重鎖を生成させた。
【０１２６】
開裂反応のために、標準反応混合物は１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７.４）、１ｍＭ  ＤＴＴ、２％グリセロール、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５％ＤＭＳＯ、１.５Ｍベタイン、１００ｎｇ  ＰＣＲ産物、および５００ｎＭ精製ＴｍａエンドヌクレアーゼＶタンパク質から構成した。この反応混合物を６５℃で１時間インキュベートし、１５μＬの反応混合物を２μＬの１０×リガーゼ補助バッファー（２００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８.５）、１２.５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５００ｍＭ  ＫＣｌ、１００ｍＭ  ＤＴＴおよび２００μｇ／ｍＬ  ＢＳＡ）に添加することによって反応を終了させた。次に、１μＬの２０ｍＭ  ＮＡＤ＋、および２μＬの６０ｎＭ  ＡＫ１６Ｄ  ＤＮＡリガーゼを添加して、リガーゼ反応混合物の最終濃度を２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７.６）、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５０ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  ＤＴＴ、１ｍＭ  ＮＡＤ＋、２０μｇ／ｍＬ  ＢＳＡ、および６ｎＭ  ＡＫ１６Ｄ  ＤＮＡリガーゼとした。この混合物を６５℃で２０分間インキュベートし、等量のＧｅｎｅＳｃａｎ停止液（５０ｍＭ  ＥＤＴＡ、１％ブルーデキストランおよび８０％ホルムアミド）を添加することによって反応を終了させた。その後この反応混合物を９４℃で２分間加熱し、氷上で冷却した。３μＬの混合物を６％変性ポリアクリルアミドゲル上に装填し、１，０００ボルト、６０ｍＡ、２００Ｗ、および４５℃のゲル温度でＡＢＩ３７７シーケンサー（パーキン・エルマー製）中で１時間、電気泳動にかけた。全検体中で正確な変異が検出され、野生型もしくは腫瘍検体中で偽陽性は検出されなかった。開裂活性は、おそらくＡＰＣ遺伝子のエキソン１５のＡＴ富裕な性質のために、１.５Ｍベタイン中におけるより１.０Ｍベタインの存在下における方が高かった（図１０Ｂ）。このためベタインの量を調整する必要があり、増幅させた領域のＧＣ含量がガイドとして機能する可能性がある。
【０１２７】
実施例１８  希釈検体中でのＫ−ｒａｓ変異の検出
本発明の感度を決定するために、Ｋ−ｒａｓエキソン１変異であるＧ１２Ｖ、Ｇ１２ＤおよびＧ１２Ａを含有するＰＣＲフラグメントをテンプレートとして使用し、本発明の変異検出能力を１：１〜１：１００の範囲内の様々な変異対野生型ＤＮＡ比でアッセイした。Ｇ１２Ａアッセイにおける初期比は、Ｇ１２Ａ変異を含有するゲノムＤＮＡにおける変異対野生型ＤＮＡ比が０.７：１であり、純粋変異Ｇ１２Ａは入手できなかったので、０.７：１であった。ＰＣＲプライマーの配列は表２Ａに列挙し、ＰＣＲ熱サイクル条件は表２Ｂに列挙した。ＴａｑＤＮＡポリメラーゼを除去するために、各１２μＬのＰＣＲ産物に対して１μＬのプロテイナーゼＫ（２０ｍｇ／ｍＬ、キアゲン製）を添加した。この反応物を７０℃で１０分間および８０℃で１０分間インキュベートしてプロテイナーゼＫを不活化した。その後この混合物を９４℃で１分間、６５℃で１５分間加熱することによってヘテロ二重鎖フラグメントを形成させ、さらに室温へ冷却した。
【０１２８】
Ｋ−ｒａｓエキソン１変異を含有するＰＣＲフラグメントであるＧ１２Ｖ、Ｇ１２ＤおよびＧ１２Ａを個別に野生型ＰＣＲフラグメントと１：１、１：２、１：５、１：１０、１：２０、１：５０、および１：１００の変異対野生型比で混合した。このアッセイのために、ＰＣＲフラグメントの総量は一定に維持した。このため種々の変異対野生型ＤＮＡ比を有するヘテロ二重鎖ＰＣＲフラグメント１００ｎｇはＴｍａエンドＶを用いて開裂し、Ｔｓｐ.ＡＫ１６Ｄ  ＤＮＡリガーゼを用いて連結した。
【０１２９】
開裂反応のために、標準反応混合物は１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７.４）、１ｍＭ  ＤＴＴ、２％グリセロール、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５％ＤＭＳＯ、１.５Ｍベタイン、１００ｎｇ  ＰＣＲ産物、および５００ｎＭ精製ＴｍａエンドヌクレアーゼＶタンパク質から構成した。この反応混合物を６５℃で１時間インキュベートし、１５μＬの反応混合物を２μＬの１０×リガーゼ補助バッファー（２００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８.５）、１２.５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５００ｍＭ  ＫＣｌ、１００ｍＭ  ＤＴＴおよび２００μｇ／ｍＬ  ＢＳＡ）に添加することによって反応を終了させた。次に、２０ｍＭ  ＮＡＤ＋、および２μＬの６０ｎＭ  ＡＫ１６Ｄ  ＤＮＡリガーゼを添加して、リガーゼ反応混合物の最終濃度を２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７.６）、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５０ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  ＤＴＴ、１ｍＭ  ＮＡＤ＋、２０μｇ／ｍＬ  ＢＳＡ、および６ｎＭ  ＡＫ１６Ｄ  ＤＮＡリガーゼとした。この混合物を６５℃で２０分間インキュベートし、等量のＧｅｎｅＳｃａｎ停止液（５０ｍＭ  ＥＤＴＡ、１％ブルーデキストランおよび８０％ホルムアミド）を添加することによって終了させた。その後この反応混合物を９４℃で２分間加熱し、氷上で冷却した。３μＬの混合物を６％変性ポリアクリルアミドゲル上に装填し、１，０００ボルト、６０ｍＡ、２００Ｗ、および４５℃のゲル温度でＡＢＩ３７７シーケンサー（パーキン・エルマー製）中で１時間、電気泳動にかけた。ＴＡＭＲＡ標識ＧｅｎｅＳｃａｎ分子サイズスタンダード５００を同一ゲル上に装填し、開裂生成物の分子量は、ＧｅｎｅＳｃａｎ解析ソフトウエア、バージョン２.１または３.ａを使用してサイズスタンダードの移動度と比較することによって推定できる。
【０１３０】
図１４は、様々な変異対野生型ＤＮＡ比についての開裂生成物の量を示している。ピーク面積は、ＧｅｎｅＳｃａｎソフトウエア（バージョン３.０）によって測定し、これを使用して相対蛍光強度を測定した。野生型ホモ二重鎖を生成した開裂シグナルを野生型対照として使用した。バックグラウンド強度は、上方および下方鎖各々の生成物についての開裂バンドのすぐ上方および下方でシグナル強度を測定することによって決定した。バックグラウンドシグナルは、その後相違する比率を含む７検体および野生型１検体から平均化した。開裂生成物に関連するピーク面積は、ＧｅｎｅＳｃａｎ解析ソフトウエア３.０を用いた解析によって決定した。図１４における棒グラフは、各変異対野生型比を用いた相対蛍光強度を示している（斜線棒：上方鎖の開裂生成物；黒色棒：下方鎖の開裂生成物）。平均バックグラウンドシグナルは、水平波線で示されている（Ｂｋｄｇ−上は平均上方鎖の開裂生成物に対する平均バックグラウンドシグナルを表しており、ｂｋｄｇ−下は下方鎖の開裂生成物に対する平均バックグラウンドシグナルを表している）。変異、ヌクレオチド変化、およびミスマッチ塩基対はグラフ内に示されている。
【０１３１】
これらの結果は、本発明が全３変異について少なくとも１：２０の変異対野生型ＤＮＡ比でバックグラウンドシグナルから開裂シグナルを一貫して区別できることを示している。本発明は、１：５０という高い変異対野生型ＤＮＡ比において開裂シグナルを検出することができたが、これは試験したすべての場合で観察はされなかった。このため、本発明は１：２０（変異対野生型ＤＮＡ比）の感度へ限定されている。
【０１３２】
実施例１９  ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、およびＶＨＬ遺伝子中の小さな欠失、挿入の検出
本発明が小さな欠失または挿入を検出する能力を決定するために、ＢＲＣＡ１のエキソン２におけるＡＧ欠失もしくはエキソン２０におけるＣ挿入、ＢＲＣＡ２遺伝子のエキソン１１におけるＴ欠失、またはフォン・ヒッペル・リンダウ（ｖｏｎ  Ｈｉｐｐｅｌ  Ｌｉｎｄａｕ（ＶＨＬ）遺伝子のエキソン２におけるＡＧＡ挿入もしくはＡ欠失のいずれかを含有する検体に適用した。
【０１３３】
ＢＲＣＡ１中のエキソン２および２０、ＢＲＣＡ２中のエキソン１１およびＶＨＬ中のエキソン２を増幅させるためのＰＣＲプライマーの配列は表２Ａに列挙し、ＰＣＲ熱サイクル条件は表２Ｂに列挙した。変異は検体中のヘテロ接合性であるので、野生型ＰＣＲフラグメントを添加する必要はなかった。ＴａｑＤＮＡポリメラーゼを除去するために、各１２μＬのＰＣＲ産物に対して１μＬのプロテイナーゼＫ（２０ｍｇ／ｍＬ、キアゲン製）を添加した。この反応物を７０℃で１０分間および８０℃で１０分間インキュベートしてプロテイナーゼＫを不活化した。その後この混合物を９４℃で１分間、６５℃で１５分間加熱することによってヘテロ二重鎖フラグメントを形成させ、さらに室温へ冷却した。
【０１３４】
開裂反応のために、標準反応混合物は１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７.４）、１ｍＭ  ＤＴＴ、２％グリセロール、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５％ＤＭＳＯ、１.５Ｍベタイン、１００ｎｇ  ＰＣＲ産物、および５００ｎＭ精製ＴｍａエンドヌクレアーゼＶタンパク質から構成した。この反応混合物を６５℃で１時間インキュベートし、１５μＬの反応混合物を２μＬの１０×リガーゼ補助バッファー（２００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８.５）、１２.５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５００ｍＭ  ＫＣｌ、１００ｍＭ  ＤＴＴおよび２００μｇ／ｍＬ  ＢＳＡ）に添加することによって反応を終了させた。次に、１μＬの２０ｍＭ  ＮＡＤ＋、および２μＬの６０ｎＭ  ＡＫ１６Ｄ  ＤＮＡリガーゼを添加して、リガーゼ反応混合物の最終濃度を２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７.６）、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５０ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  ＤＴＴ、１ｍＭ  ＮＡＤ＋、２０μｇ／ｍＬ  ＢＳＡ、および６ｎＭ  ＡＫ１６Ｄ  ＤＮＡリガーゼとした。この混合物を６５℃で２０分間インキュベートし、等量のＧｅｎｅＳｃａｎ停止液（５０ｍＭ  ＥＤＴＡ、１％ブルーデキストランおよび８０％ホルムアミド）を添加することによって反応を終了させた。その後この反応混合物を９４℃で２分間加熱し、氷上で冷却した。３μＬの混合物を６％変性ポリアクリルアミドゲル上に装填し、１，０００ボルト、６０ｍＡ、２００Ｗ、および４５℃のゲル温度でＡＢＩ３７７シーケンサー（パーキン・エルマー製）中で１時間、電気泳動にかけた。ＴＡＭＲＡ標識ＧｅｎｅＳｃａｎ分子サイズスタンダード５００を同一ゲル上に装填したので、開裂生成物の分子量はＧｅｎｅＳｃａｎ解析ソフトウエア、バージョン２.１または３.０ａを使用してサイズスタンダードの移動度を開裂生成物の移動度と比較することによって推定できた。
【０１３５】
ゲル画像は、ＢＲＣＡ１のＡＧ欠失ミスマッチの開裂が極めて強力であるが、ＢＲＣＡ１のＣ挿入およびＢＲＣＡ２のＴ欠失に関連している開裂バンドがかすかであることを証明した（図１５）。Ｔ欠失の開裂バンドの下方の非特異的バンドは連結後には除去されたが、これはリガーゼによって非特異的ニックをシールできることを示している。ＶＨＬ遺伝子については、ＡＧＡ挿入の開裂は極めて強力であり、Ａ挿入の開裂は極めて良好である（表４）。これらの結果は、エンドＶが２〜３つのヌクレオチド挿入または欠失を認識して開裂できることを証明している。さらにまた１つのヌクレオチド挿入または欠失も検出できるが、効率は２もしくは３つのヌクレオチド変化を検出する効率より低いことが観察された。
【０１３６】
レーン１３〜１８とレーン１９〜２４との比較は、臨床検体を使用したときにｐ５３遺伝子中の点変異を区別するためにＤＮＡリガーゼ段階を使用することの長所を証明している。レーン１３〜１８における重大なバックグラウンドシグナルは、レーン１９〜２４を除いて全部排除されるので変異シグナルの明白な検出が可能になる。
【０１３７】
実施例２０  長鎖ＰＣＲフラグメントにおける変異の検出
本発明が、長鎖ＰＣＲフラグメント上で変異スキャンを行う能力を、ｐ５３遺伝子からの１.７ｋｂ  ＰＣＲフラグメントを使用して決定した。この１.７ｋｂセグメントを増幅させるために使用したＰＣＲプライマーの配列は表２Ａに列挙し、ＰＣＲ熱サイクル条件は表２Ｂに列挙した。ＴａｑＤＮＡポリメラーゼを除去するために、各１２μＬのＰＣＲ産物に対して１μＬのプロテイナーゼＫ（２０ｍｇ／ｍＬ、キアゲン製）を添加した。この反応物を７０℃で１０分間および８０℃で１０分間インキュベートしてプロテイナーゼＫを不活化した。その後この混合物を９４℃で１分間、６５℃で１５分間加熱することによってヘテロ二重鎖フラグメントを形成させ、さらに室温へ冷却した。ＰＣＲフラグメントは１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７.５）および過剰ｄＮＴＰを用いて２回洗浄し、エンドＶ開裂反応の前にマイクロコン３０フィルター（ミリポア製）遠心段階によってプライマーを除去した。これはバッファー条件の変更を生じさせ、容量を洗浄前のオリジナル容量の半分へ減少させた。このため、ＤＮＡ濃度は２倍の約１０〜２０ｎｇ／μＬへ増加した。ＴｍａエンドＶ開裂反応は、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７.４）、１ｍＭ  ＤＴＴ、２％グリセロール、２００ｎｇ  ＰＣＲへテロ二重鎖フラグメント、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１.５Ｍベタイン、２％ＤＭＳＯ、および５００ｎＭ精製ＴｍａエンドＶを含有するバッファー中で６５℃で１時間実施した。エンドＶ反応後、フラグメントを再度洗浄してベタインおよびＤＭＳＯを除去した。連結は、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７.６）、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５０ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  ＤＴＴ、１ｍＭ  ＮＡＤ＋、および２０μｇ／ｍＬ  ＢＳＡを含有するバッファー中での１〜６ｎＭ  Ｔｓｐ.ＡＫ１６Ｄリガーゼの存在下で、６５℃で２０分間実施した。
【０１３８】
この方法は、テンプレートとしてｐ５３Ｒ２４８Ｗ（Ｃ→Ｔ）を含有するゲノムＤＮＡを使用して実施し、Ｒ２４８Ｗ変異を含有する４００ｂｐ、８００ｂｐ、１.２ｋｂおよび１.７ｋｂフラグメントを増幅させた。このアッセイは、本発明がサイズが１.７ｋｂまで、もしかするとそれより大きいＰＣＲフラグメントにおける変異を検出できることを証明している（図１６）。これらのアッセイでは、上方鎖の開裂（ＴＥＴ標識）もまた観察された。
【０１３９】
実施例２１  ｐ５３Ｒ２４８Ｗ（Ｃ→Ｔ）を検出するためのマイクロＤＮＡシーケンシング
マイクロＤＮＡシーケンシングの方法は、図１６Ａおよび１８Ａに示されている。ｐ５３Ｒ２４８Ｗ（Ｃ→Ｔ）を含有するＤＮＡフラグメントは非標識プライマーを用いてＰＣＲを増幅させた。ＰＣＲプライマーの配列は表２Ａに列挙し、ＰＣＲ熱サイクル条件は表２Ｂに列挙した。ｐ５３Ｒ２４８Ｗ（Ｃ→Ｔ）を含有するＰＣＲフラグメントを等量の野生型ＰＣＲフラグメントと混合した。ＴａｑＤＮＡポリメラーゼを除去するために、各１２μＬのＰＣＲ産物に対して１μＬのプロテイナーゼＫ（２０ｍｇ／ｍＬ、キアゲン製）を添加した。この反応物を７０℃で１０分間および８０℃で１０分間インキュベートしてプロテイナーゼＫを不活化した。その後この混合物を９４℃で１分間、６５℃で１５分間加熱することによってヘテロ二重鎖フラグメントを形成させ、さらに室温へ冷却した。ＰＣＲフラグメントは１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７.５）および過剰ｄＮＴＰを用いて２回洗浄し、エンドＶ開裂反応の前にマイクロコン３０フィルター（ミリポア製）遠心段階によってプライマーを除去した。
【０１４０】
ＴｍａエンドＶ開裂反応は、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７.４）、１ｍＭ  ＤＴＴ、２％グリセロール、、２００ｎｇ  ＰＣＲへテロ二重鎖フラグメント、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１.５Ｍベタイン、２％ＤＭＳＯ、および５００ｎＭＴｍａエンドＶを含有するバッファー中で６５℃で１時間実施した。エンドＶ反応後、フラグメントを再度洗浄してベタインおよびＤＭＳＯを除去した。連結は、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７.６）、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５０ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  ＤＴＴ、１ｍＭ  ＮＡＤ＋、および２０μｇ／ｍＬ  ＢＳＡを含有するバッファー中での１〜６ｎＭ  Ｔｓｐ.ＡＫ１６Ｄリガーゼの存在下で、６５℃で２０分間実施した。連結後、この混合物を６５℃で２０分間インキュベートし、その後洗浄して塩を除去した。
【０１４１】
ニックが入れられたヘテロ二重鎖生成物は、ＤＮＡポリメラーゼＩクレノウフラグメントを用いてニック３’から５’へ数ヌクレオチドを切断し戻した。この反応混合物（４０μＬ）は、１×大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩバッファーおよび２０単位のＤＮＡポリメラーゼＩクレノウフラグメントを含む連結反応物からの１２０ｎｇ  ＤＮＡを含んでいた。この混合物を３７℃で３０分間インキュベートした。この反応生成物を引き続きシーケンシング反応のための基質として使用した。
【０１４２】
ＤＮＡシーケンシング反応物は、クレノウフラグメント反応物からの３０ｎｇ  ＤＮＡ、２０μＭ  ｄＮＴＰ、２０μＭ  ｄｄＧＴＰ、２２４μＭ  ｄｄＴＴＰ、２２μＭ  ｄｄＡＴＰ、３２μＭ  ｄｄＣＴＰ、１×シーケンシングバッファー、および１μＬのＴａｑＤＮＡポリメラーゼＦＳ（パーキン・エルマー製：ロット番号３６１４５１００５）を含有していた。４種のジデオキシヌクレオチドの比率（Ａ：Ｃ：Ｇ：Ｔ＝０.１１：０.１６：０.１０：１.１２）は、参照として本明細書に組み入れられるＲｏｓｅｎｂｌｕｍ  Ｂ.Ｂ.ら、「改良ＤＮＡシーケンシングパターンのための新規色素標識ターミネーター（Ｎｅｗ  Ｄｙｅ−Ｌａｂｅｌｅｄ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｐａｔｔｅｒｎ）」，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ.，２５：４５００−４（１９９７）から採用した。この反応混合物はＰＥ  ＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲシステム２４００サーモサイクラーを使用して６０℃で３０分間インキュベートした。過剰のＢｉｇＤｙｅジデオキシヌクレオチドは反応混合物をセントリ・セップ（Ｃｅｎｔｒｉ−Ｓｅｐ）（登録商標）スピンカラムＰ／Ｎ  ＣＳ−９０（プリンストン・セパレーション（Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ）製、アデルフィア、ＮＪ）上に装填し、３，０００ｒｐｍで２分間超遠心することによって除去した。５μＬの溶離液を等量のＧｅｎｅＳｃａｎ停止液（５０ｍＭ  ＥＤＴＡ、８０％ホルムアミド、および１％ブルーデキストラン）へ添加した。９４℃で２分間加熱し、１μＬの混合物を１０％変性ポリアクリルアミドゲル上に装填し、１，０００ボルト、６０ｍＡ、１５０Ｗおよび４５℃のゲル温度で電気泳動にかけた。ラン時間は約４時間であった。ランモジュールはＥを濾過するように設定し、マトリックスはｄＲｈｏｄａｍｉｎｅマトリックスへ設定した。データは、ＧｅｎｅＳｃａｎ解析（バージョン３.０ａ）を用いて解析した。図１６Ｂを参照。
【０１４３】
配列結果を比較するために、標準ｄＲｈｏｄａｍｉｎｅＤＮＡサイクリングシーケンシングもまた実施した。このシーケンシング反応のためのＤＮＡテンプレートは非標識ＰＣＲプライマーを用いて増幅させたＰＣＲ産物であった。その後、検体は１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７.５）を用いて２回洗浄し、過剰なプライマーはマイクロコン３０フィルター（ミリポア製）遠心段階によって除去した。非標識ＰＣＲプライマーの一つはその後シーケンシングプライマーとして使用されるべく添加された。標準ＤＮＡシーケンシングはＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ｄＲｈｏｄａｍｉｎｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（パーキンソン・エルマー製）を使用して実施した。８.０μＬのターミネーター用準備ができた反応混合物、６.０μＬのＰＣＲ産物（１０ｎｇ／Ｌ）、１.０μＬの各ＰＣＲプライマー（３.２μＭ）、および７μＬのｄｄＨ２Ｏを含有する２０μＬの反応混合物は、ＰＥ  ＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲシステム２４００サーモサイクラー中で９６℃で１０秒間、５０℃で５秒間、および６０℃で４分間から構成される２５サイクルでインキュベートした。反応後、混合物に２μＬの３Ｍ  ＮａＡｃ（ｐＨ.４.６）および５０μＬの９５％エタノールを添加することにより沈降させ、これを氷上に１０分間置いた。最高速度で１５〜２０分間に渡りマイクロ遠心し、７０％エタノールを用いてペレットをすすぎ洗い、乾燥させた。その後ペレットを４μＬのＤＮＡシーケンシング・ローディングバッファー（５ｍＭ  ＥＤＴＡ、１％ブルーデキストラン、および８０％ホルムアミド）中に懸濁させた。９５℃で２分間の加熱後、１〜２μＬの混合物を１０％変性ポリアクリルアミドゲル（小プレート）上に装填し、１，０００ボルト、６０ｍＡ、１５０Ｗおよび４５℃のゲル温度で電気泳動にかけた。ラン時間は、ＡＢＩ  ＤＮＡシーケンサー３７７上で約４時間であった。ランモジュールはＥを濾過するように設定し、色素セット／プライマーファイルはＤＴ｛ｄＲ  Ｓｅｔ  Ａｎｙ−ｐｒｉｍｅｒ｝へ設定した。シーケンシングパターンは、ＤＮＡシーケンシング解析ソフトウエア（バージョン３.０）を用いて解析した（図１８を参照）。
【０１４４】
下方鎖のシーケンシング結果は、図１８Ｂ（マイクロＤＮＡシーケンシング）および図１８Ｃ（標準ＤＮＡシーケンシング）に示した。Ｇ（青色）およびＡ（緑色）ピークが重複する位置はミスマッチの位置を示しており、変異がＧ→Ａ（上方鎖についてはＣ→Ｔ）であることを示している。
【０１４５】
実施例２２  ７−デアザ−ｄＧＴＰを含有するＰＣＲフラグメント中のＫ−ｒａｓ  Ｇ１２Ｖ変異の検出
ＴｍａエンドヌクレアーゼＶを用いてヌクレオチド類似体を使用する可能性を探索するために、ＰＣＲ反応混合物中の正規ｄｇｔｐの代わりに同一濃度の７−デアザ−ｄｇｔｐを使用した。ＰＣＲ反応は、野生型ＤＮＡ（ｈｔ２９）および変異ＤＮＡ  ｇ１２ｖ（ｇ→ｔ）（ｓｗ６２０）を含有する細胞系からのゲノムＤＮＡを使用してＫ−ｒａｓエキソン１を増幅させるためにセットアップした。ＰＣＲプライマーおよびＰＣＲプログラム、Ｔｍａ開裂およびＴｓｐ.ＤＮＡ連結条件は標準条件と同一であった。７−デアザ−ｄｇｔｐを含有するＰＣＲフラグメントからの開裂生成物を比較するために、正規ｄｇｔｐを含有するＰＣＲフラグメントからの開裂生成物も同一ゲル上に装填した。
【０１４６】
７−デアザ−ｄＧＴＰにおける７位は、窒素の代わりに炭素である（図１７Ａ）。ＰＣＲ反応は、野生型ＤＮＡ（ＨＴ２９）および変異ＤＮＡ  Ｇ１２Ｖ（Ｇ→Ｔ）（ＳＷ６２０）を含有する細胞系からのゲノムＤＮＡを使用してＫ−ｒａｓエキソン１を増幅させるための準備をした。７−デアザ−ｄＧＴＰを含有するＰＣＲフラグメントからの開裂生成物と比較する際に、正規ｄＧＴＰを含有するＰＣＲフラグメントからの開裂生成物もまた同一ゲル上に想定した。７−デアザ−ｄＧＴＰを含有するヘテロ二重鎖ＰＣＲフラグメントについては、（Ｇ→Ｔ）変異を含有する上方鎖の開裂が阻害されたが、（Ｃ→Ａ）を含有する下方鎖の開裂は依然として存在している（図１７Ｂ）。この結果は、ＴｍａエンドヌクレアーゼＶとグアニン中のＮ−７との接触の可能性を示した。７−デアザＧの使用は不応Ｇ１３Ｄ変異の開裂を許容しなかったが、開裂できない類似体を使用することによってＧ−Ｃ塩基対の安定性を低下させるという概念が強固であることが証明された。幾つかの追加の（非特異的）開裂生成物は、デアザＧを含有する第２レーンで観察される。特にグアノシンを含むがハイブリダイゼーションを不安定化させるシトシンの代わりに、例えば２−ピリミジノンのようなまた代わりの類似体を考慮に入れることができる。
【０１４７】
実施例２３  変異エンドヌクレアーゼ類
野生型テルモトガ・マリチマ  エンドＶは、ヒトゲノム内で発見されるＳＮＰのほぼ９８％を同定できる。残りのＳＮＰを同定するために、または存在するＳＮＰまたは変異上のより強固なシグナルを達成するためには、修飾または新規エンドＶ酵素類が必要になることがある。これは、ミスマッチ塩基特異性を変化させるためにテルモトガ・マリチマ  エンドＶ内へ変異を導入すること、または相違するミスマッチ塩基特異性を有する相違する有機体からのエンドＶを利用することのいずれかによって達成できる。変異テルモトガ・マリチマ  エンドＶまたは代替エンドＶはこのアッセイで認識できる配列の繰返しを伸長させるために、野生型テルモトガ・マリチマ  エンドＶを用いた同一反応に使用できた。
【０１４８】
様々な真核生物、原核生物、および始原菌エンドＶオルトログの一次配列アライメントは、進化的に保存されたと思われる数残基を解明した。９種の部位特異的変異体（Ｄ４３Ａ、Ｙ８０Ａ、Ｒ８８Ａ、Ｅ８９Ａ、Ｄ１０５Ａ、Ｄ１１０Ａ、Ｈ１１６Ａ、Ｈ１２５Ａ、およびＫ１３９Ａ）を構築したが、これらのうち５種（Ｙ８０Ａ、Ｒ８８Ａ、Ｅ８９Ａ、Ｈ１１６Ａ、およびＫ１３９Ａ）は有用な変化した特異性を有すると思われる（表７参照）。
【０１４９】
（表７）ＴｍａエンドＶ変異体の酵素活性および結合活性の要約
2004526423.tif 000019
さらに、この解析はこの酵素にとっての触媒残基として２種のアスパラギン酸塩Ｄ４３およびＤ１０５を同定した。
【０１５０】
有用なテルモトガ・マリチマ・エンドＶ変異体を開発するために使用したアプローチは、タンパク質−基質相互作用に含まれる位置での部位特異的変異体を作製することに基づいている。テルモトガ・マリチマ・エンドＶは、天然発生デオキシリボヌクレオチド塩基（ｄＡ、ｄＣ、ｄＧ、およびｄＴ）を含有するミスマッチと比較して、適合した基質またはミスマッチ基質のいずれかの内でのイノシンまたはウラシルを用いた有意に大きな開裂活性を証明している。このため、イノシンまたはウラシルに対する酵素の特異性を減少させることによって、および／または天然塩基に対する特異性を増加させることによって天然塩基に対する酵素の相対特異性を増加させることができる。
【０１５１】
基質に対するタンパク質特異性は、典型的には酵素のアミノ酸側鎖と基質の官能基との相互作用を含む。アミノ酸側鎖と種々の化学成分の基質成分（例、疎水性／極性相互作用）に関わる相互作用は、大きく基質結合を不安定化させ、特異的基質を利用する酵素の能力を劇的に低下させることができる。基質および天然発生デオキシリボヌクレオチド塩基を含有するイノシンおよびウラシルとの劇的に高い活性を伴うインビトロでの酵素機能は余り好都合には開裂されないので、これは１種以上の不安定化相互作用が強力に天然塩基と関連することを示唆している。このため、この酵素を酵素−ミスマッチ塩基相互作用の位置で突然変異を起こさせることによって、天然発生デオキシリボヌクレオチド塩基に好都合となるように酵素の特異性を変化させることができる。ＤＮＡ基質内のウラシルを認識するヒトＵＤＧを用いて、類似のアプローチが成功している。参照として本明細書に組み入れられるＫａｖｌｉら、Ｔｈｅ  ＥＭＢＯ  Ｊｏｕｒｎａｌ，１５：３４４２−４７（１９９６）を参照。
【０１５２】
タンパク質−基質相互作用に直接関係する残基は、同一ファミリーの酵素間で保存される強度の傾向を有している。このため、一次アミノ酸配列アライメントにおいて、高度に保存された残基は突然変異誘発のための優れた候補を表している。突然変異誘発に適したテルモトガ・マリチマ・エンドＶにおける位置を同定するために、ＰＡＭ２５０残基重量表を用いたＣｌｕｓｔａｌＷアライメントアルゴリズム（ペアワイズアライメント・パラメーター：Ｋｔｕｐｌｅ＝１、ギャップペナルティ＝３、ウィンドウ＝５、およびＤｉａｇｏｎａｌｓ  Ｓａｖｅｄ＝５；複数アライメント／パラメーター：ギャップペナルティ＝１０およびギャップ長ペナルティ＝１０）を使用して高温性および中温性始原菌および真核生物（即ち、テルモトガ・マリチマ（配列番号：３７）、ピロバクルム・アエロフィウム（配列番号：３８）、ピロコッカス・ホリコシ（配列番号：３９）、ピロコッカス・アビッシ（配列番号：４０）、ピロコッカス・フリオサス（配列番号：４１）、アルカエグロブス・フルギドゥス（配列番号：４２）、アエロピルム・ペルニクス（配列番号：４３）、クロストリジウム・アセトブチリクム（配列番号：４４）、ペスト菌（配列番号：４５）、大腸菌（配列番号：４６）、枯草菌（配列番号：４７）、ネズミチフス菌（配列番号：４８）、およびストレプトミセス・コエリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｎｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）（配列番号：４９））からの１３種の同定されたおよび推定されたエンドＶ酵素間で一次アミノ酸配列アライメントを実施した（図１９）。アライメントに利用した酵素の大多数は推定エンドＶ酵素であるので、これらの酵素の大多数のミスマッチ特異性は不明である。その結果として、テルモトガ・マリチマ・エンドＶ中の候補残基を同定するためにアライメントを利用すると、同種酵素が類似または相違する特異性のどちらを有するのかを推定できる。類似特異性を有すると推定した場合は、エンドＶの大多数に対して高度に保存されている残基が候補を提供する。相違する特異性を推定した場合は、２セットの高度に保存された残基が存在する位置は候補を表している。
【０１５３】
エンドＶのファミリー間での類似のミスマッチ特異性を推定する解析では、１）大多数のエンドＶ酵素に対して高度に保存された、および２）突然変異誘発に対して最善に適しているテルモトガ・マリチマ・エンドＶ中の１２残基（Ｄ４３、Ｆ４６、Ｙ８０、Ｒ８８、Ｅ８９、Ｄ１０５、Ｄ１１０、Ｈ１１６、Ｒ１１８、Ｈ１２５、Ｋ１３９、およびＦ１８０）が同定された。脂肪族炭化水素鎖（即ち、Ｌ、Ｉ、ＶおよびＭ残基）はタンパク質−基質相互作用において重要な役割を果たすことができるが、これらの残基との高度の保存の位置は列挙されていない。それはそれらが酵素の疎水性コアを安定化する際にも重要な役割を果たすことができるからである。さらに、高度に保存されたプロリン類およびグリシン類は、これらのアミノ酸残基と関連する独特の化学的および構造的影響のために突然変異誘発にためには避けなければならない。１２種の初期セットから９種の部位特異的変異体（Ｄ４３Ａ、Ｙ８０Ａ、Ｒ８８Ａ、Ｅ８９Ａ、Ｄ１０５Ａ、Ｄ１１０Ａ、Ｈ１１６Ａ、Ｈ１２５Ａ、およびＫ１３９Ａ）およびこれらの変異エンドＶｓ中５種（Ｙ８０Ａ、Ｒ８８Ａ、Ｅ８９Ａ、Ｈ１１６Ａ、およびＫ１３９Ａ）は有用に変化した特異性を有すると思われる。これらの結果は、本発明が変化した特異性を付与するために変異するテルモトガ・マリチマ・エンドＶ位置を同定するために有用であることを証明している。極性基の化学的性質（例、水素結合供与体対水素結合受容体）はさらにまた基質特異性に強度の影響を及ぼす可能性があるので、これらの位置でのいっそうの変異は本発明の能力を拡大する変異エンドＶ酵素の生成を促進することができる（表８）。
【０１５４】
（表８）エンドＶ変異体、第１群
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上記に示した実施例では、アラニンを置換するとミスマッチでの天然発生塩基のための不安定化残基を除去すると予想される。あるいはまた、電荷極性基を純粋疎水性残基を用いて変化させるとミスマッチでの天然発生塩基の安定性または結合親和性が増加することがある。さらに、正電荷または負電荷から残基を変化させると、ミスマッチでの天然塩基が優先されるように酵素の特異性が変化することがある。基質と酵素との間の相互作用は複雑な水素結合ネットワークを含む可能性があるので、天然塩基を含有するミスマッチへの酵素のより優れた活性を入手するためには表７に列挙した２個以上の残基を変化させることが必要になる。さらに、例えばＤ４３ＥもしくはＤ１０５Ｅのような触媒性残基におけるかすかな変化は、ミスマッチでの天然発生塩基の触媒を支援することがある。
【０１５５】
エンドＶファミリーの一部のメンバー間で異なるミスマッチ特異性を推定する解析において、２つの別個の保存配列セットを含有する２残基（Ｇ８３およびＩ１７９）を同定した。例えば、テルモトガ・マリチマ・エンドＶのＩ１７９と同種である残基は、極性荷電残基（Ｋ）または脂肪族残基（Ｌ，ＩまたはＶ）のいずれかである。この位置がそのミスマッチでＤＮＡ塩基との相互作用することに関係している場合は、残基の組成（極性および荷電対疎水性）はどの基質が優先されるのかに影響を及ぼすと考えられる。最初の突然変異誘発（例えば、Ｉ１７９Ｋ）のための基礎として所定の位置でテルモトガ・マリチマ・エンドＶとは相違する保存されたセットを使用した（表９）。
【０１５６】
（表９）エンドＶ変異体、第２群
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【０１５７】
変異テルモトガ・マリチマ・エンドＶ酵素を開発することに加えて、他の熱安定性エンドＶ酵素のクローニングは本発明において使用するためのまた別の、しかし機能的には類似の酵素源を提供する。本発明は、生成物が本発明の熱安定性リガーゼ段階と適合する限り、他の熱安定性エンドＶ酵素類、または他のエンドヌクレオチド結合分解性酵素類を利用することができる。テルモトガ・マリチマ・エンドＶとは相違する基質特異性を含む熱安定性エンドＶを利用することによって、本発明の能力をさらに拡大することができる。
【０１５８】
実施例２４  結合エンドＶ／ＤＮＡリガーゼアッセイを使用した変異スキャニング
ＰＣＲ／ＬＤＲ／アレイおよびエンドＶ／ＤＮＡリガーゼ変異スキャニング両方の組み合わせを使用した結腸腫瘍ＤＮＡ中のｐ５３変異の解析は、自動シーケンシングより優れていることを証明した（表１０を参照）。ＰＣＲ／ＬＤＲとエンドＶ／ＤＮＡリガーゼを組み合わせることによって２６のｐ５３変異を有することが証明された検体２３中８検体は自動シーケンシングでは見つけられなかった（６５％真陽性、３５％偽陰性）。エンドＶ／ＤＮＡリガーゼ変異スキャニングを用いて陽性であるとされた５検体における変異検出は、ＰＣＲフラグメントのゲル精製、および手動読み取りを用いた両方の鎖に再シーケンシングを必要とした。重要なことに、エンドＶ／ＤＮＡリガーゼ変異スキャニングは全４つのフレームシフト変異をスコア付けしたが、これはｐ５３変異を有する検体のほぼ２０％を説明している。このようなフレームシフト変異は、市販で入手できるｐ５３ハイブリダイゼーションチップの検出能力を超えている。
【０１５９】
（表１０）腫瘍検体中のｐ５３変異の検出：ジデオキシシーケンシングとのＰＣＲ／ＬＤＲおよびエンドＶ／ＤＮＡリガーゼ変異スキャニングを用いる組み合わせ解析を使用した比較
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＊  シーケンシング結果を入手するためにＰＣＲ産物のゲル精製を必要とした。
＃  ＰＣＲ／ＬＤＲおよびエンドＶ／ＤＮＡリガーゼによって陰性とされた２７中の任意の５個の検体のシーケンシングでは新規変異が明らかでない。
【０１６０】
３種のＫ−ｒａｓ変異を使用した混合実験は、エンドＶ／ＤＮＡリガーゼ反応もまた高感度アッセイであることを証明した。１変異シーケンスを２０野生型シーケンスを用いて希釈した場合は、変異をバックグラウンドの上方で検出できる。
【０１６１】
結腸腫瘍ＤＮＡは、約１０〜５０％の基質細胞浸潤を含む非顕微解剖検体から単離した。１つのｐ５３対立遺伝子の変異には、染色体消失または有糸分裂不分離のどちらかを通して発生する他の対立遺伝子のヘテロ接合性の消失（「ＬＯＨ」）が常に付随していた（即ち、両方の変異染色体が娘細胞へ）。従って、上記の検体からのＤＮＡは９０％：１０％（１０％基質を含む不分離に対して）から３３％：６７％（５０％基質を含む染色体消失に対して）の変異ｐ５３：野生型対立遺伝子の範囲を有している。上記の検体を３検体のプール中のｐ５３変異について再解析すると、エンドＶ変異スキャニングアッセイはまだ全変異体の存在を同定することができた。プールされた検体バンド中数個は個別検体からのバンドより強力で（オリジナルの検体がほとんど変異ＤＮＡであることを示唆している）、２、３のバンドは弱かったが、それでもまだ検出できた（オリジナルの検体が実質的な基質汚染を有していることを示唆している）。５または１０検体さえのプール中で変異を検出する能力は、癌変異スコアリングを大きく改良する。
【０１６２】
実施例２５  ＴｍａエンドＶの部位特異性突然変異誘発
エンドヌクレアーゼ活性のために重要なアミノ酸残基を同定するために、アラニンスキャニング突然変異誘発をテルモトガ・マリチマ・エンドＶの９つの保存された位置で実施した（表１１）。ＤＤＥモチーフ残基Ｄ４３、Ｅ８９、Ｄ１１０でのアラニン置換は、イノシン開裂活性を無効にする、または実質的に低下させる。これらの変異体はさらに金属イオンの不在下では二本鎖もしくは一本鎖イノシン基質への結合親和性も入手するが、これはこれらの残基が触媒性Ｍｇ２＋の調整に関係していることを示唆している。Ｙ８０Ａ、Ｈ１１６Ａ、およびそれらより少ない程度でＲ８８Ａは、二本鎖もしくは一本鎖イノシン基質またはニック生成物への低い親和性を示す。ニックが入れられたイノシン生成物への緊密な結合の欠如は、生成物遊離が余り律速性ではないので、イノシン基質の代謝回転において観察された増加の原因である。Ｙ８０Ａ、Ｒ８８Ａ、Ｋ１３９Ａ、およびそれらより少ない程度でＨ１１６ＡはＡＰおよびウラシル基質に向かう低い活性を示す。塩基認識ポケット内またはその近くにあるそれらの位置と一致して、これらの残基は基質認識において重要な役割を果たす可能性がある。
【０１６３】
（表１１）９個のＴｍａエンドＶ変異体のＤＮＡ開裂活性ａ
2004526423.tif 000023
ａ開裂反応は、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７.４）、１ｍＭ  ＤＴＴ、２％グリセロール、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０ｎＭ  ＤＮＡ基質、１００ｎＭ精製ＴｍａエンドＶ変異体を含有する２０μＬ反応混合物中で６５℃で３０分間実施した。この反応は等量のＧｅｎｅＳｃａｎ停止液を添加することによって終了させた。この反応混合物をその後９４℃で２分間加熱し、氷上で冷却した。３μＬの検体を１０％ＧｅｎｅＳｃａｎ変性ポリアクリルアミドゲル（パーキン・エルマー製）上に装填した。電気泳動は、ＡＢＩ３７７シーケンサー（パーキン・エルマー製）を使用して１，５００ボルトで１時間実施した。ｓｓＩ：一本鎖イノシン含有基質。プラス記号の数はイノシン−、ウラシル−、またはＡＰ部位−含有鎖の開裂の程度を表している。（＋＋＋）＝約１０％；（＋＋）＝約５％；（＋）＝約２％；（−）開裂が観察されなかった。
【０１６４】
部位特異的突然変異誘発を使用して、Ｒ８８（−→Ｋ，Ｑ，Ｅ）、Ｈ１１６（−→Ｑ，Ｔ，Ｅ）、およびＫ１３９（−→Ｑ，Ｅ）での追加の変異を発生させた。これらの変異体は、コファクターとしてＭｇ２＋を使用する活性を実質的に消失していた。変異体中４つ（Ｒ８８Ｑ，Ｒ８８Ｅ，Ｈ１１６Ｑ，およびＨ１１６Ｔ）は野生型酵素より良好にＭｎ２＋における一定の基質を開裂した（図２０のレーン１２と比較してレーン４および６、および表１２を参照）。変異体はおそらく野生型酵素よりはるかに少なく基質と結合し、その結果として非特異的結合および開裂が少ないので、この結果は驚くことではない。Ｒ８８ＱおよびＲ８８Ｅ酵素は、Ｇ：ＡおよびＡ：Ｇ両方のミスマッチ基質におけるＧ塩基を開裂することに野生型酵素より強力な優先を示した。重大なことに、「Ｇ」鎖の優先開裂部位は現在はミスマッチ塩基の３’側で優勢である（図２０、レーン１および７、表１２を参照）。野生型酵素はＡ：Ｃ基質におけるＣ鎖を開裂しないが、Ｒ８８変異体は中レベルの活性をしており、「Ｃ」鎖の優先開裂部位は現在はこのミスマッチの３’末端から２塩基である（表１２）。
【０１６５】
（表１２）野生型および変異ＴｍａエンドＶを用いて処理した種々の基質の開裂強度
2004526423.tif 000024
2004526423.tif 000025
上付き文字（１〜６）は、開裂パターンおよび相対強度を示している。上付き文字がないものは、開裂パターンが野生型（ＷＴ）酵素と同様であることを示している。総開裂強度は切断されていない開始基質に基づいて推定した。（＋＋＋＋）＝約３０％；（＋＋＋）＝約２０％；（＋＋）＝約１０％；（＋）＝約５％；（ｗ）＝約２％。
【０１６６】
ＴｍａエンドＶ  Ｈ１１６ＱおよびＨ１１６Ｔの両方は、正確に最後から２番目の位置での開裂を含む基質を含有するアデノシンに向かうほぼ排他的な活性を示した（図２０、表１２、レーン４および６）。「Ｇ」含有鎖に向かう活性はほとんど見られず、これはこれらの変異酵素が特異的ミスマッチ配列に対するより強力な酵素の開発に向かう第１段階であることを示唆している。Ｒ８８およびＨ１１６変異体に対する開裂部位における変化は、異型酵素による結合特異的ミスマッチＤＮＡにおける重大な柔軟性を示唆しており、さらに特異的ミスマッチについての非伝統的開裂を理解するための複数の結晶構造に対する必要を強調している。
【０１６７】
実施例２６  アラニンスキャニング突然変異誘発
部位特異的突然変異誘発に対して重複伸長ＰＣＲ法を使用した（参照してここにその全体が組み込まれるＨｏ  Ｓ.ら、Ｇｅｎｅ  ７７：５１−５９（１９８９）を参照）。ＮｄｅＩおよびＳｐｅＩの対を用いて消化したＰＣＲ産物は同一対の制限エンドヌクレアーゼを用いて処理したクローニングベクターｐＥＶ５へ連結した。連結されたベクター類は、大腸菌菌株ＡＫ５３（ｍｒｒＢ−、ＭＭ２９４）内へ形質転換させた。インサートを含有するプラスミドを再単離し、変異配列を同定してそれらの構築体にＰＣＲエラーが含まれていないことを確証するために色素ジデオキシターミネーター化学を使用してＡＢＩシーケンサー上でシーケンシングした。変異ＴｍａエンドヌクレアーゼＶ（ｎｆｉ）遺伝子を含有する菌株は、５０μｇ／ｍＬアンピシリン（参照してここにその全体が組み込まれるＮｅｉｄｈａｒｔ  Ｆ.Ｃ.ら、Ｊ.Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ.１１９（３）：７３６−４７（１９７４）を参照）を添加した５ｍＬのＭＯＰＳ培地中で３７℃で一晩かけて発現させた。細胞ペーストは、３００μＬの音波処理バッファー中に懸濁させ、Ｓｏｎｉｆｉｅｒ  Ｃｅｌｌ  Ｄｉｓｒｕｐｔｏｒ  ３５０（ブランソン（Ｂｒａｎｓｏｎ）製）を使用して４×１０秒間をかけて４℃で音波処理した。細胞破片を遠心によって除去した後、ＴｍａエンドヌクレアーゼＶタンパク質を含有する上清を７０℃で１５分間インキュベートして宿主タンパク質を不活化した。変性したタンパク質は、遠心分離によって可溶性ＴｍａエンドヌクレアーゼＶタンパク質から分離した。ＴｍａエンドヌクレアーゼＶ変異体のタンパク質濃度は、既知量の野生型ＴｍａエンドヌクレアーゼＶを装填した１２.５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルをスキャニングすることによって定量した。部分的に精製したタンパク質は１×ＴａｑＩ保存バッファーを用いて１μＭに希釈し、使用するまで−２０℃で保存した。
【０１６８】
実施例２７  異型エンドヌクレアーゼ類をアッセイするためのＤＮＡ開裂反応
蛍光標識デオキシオリゴヌクレオチド基質は、（参照してここにその全体が組み込まれるＨｕａｎｇ  Ｊ.ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４０（３０）：８７３８−８７４８（２００１））に記載されている通りに作製した。典型的なイノシン基質の配列（各々、配列番号：５０〜５１）は次の通りである。
2004526423.tif 000026
上方鎖でのニック事象は、２７ｎｔ標識生成物を生成するが下方鎖では３８ｎｔ標識生成物を生成する。開裂反応は、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７.４）、１ｍＭ  ＤＴＴ、２％グリセロール、他に規定されていない限り５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０ｎＭ  ＤＮＡ基質、および指示された量の精製ＴｍａエンドヌクレアーゼＶタンパク質を含有する２０μＬ反応混合物中で６５℃で３０分間実施した。この反応は等量のＧｅｎｅＳｃａｎ停止液を添加することで終了させた。この反応混合物をその後９４℃で２分間加熱し、氷上で冷却した。３μＬの検体を１０％ＧｅｎｅＳｃａｎ変性ポリアクリルアミドゲル（パーキン・エルマー製）上に装填した。電気泳動は、ＡＢＩ３７７シーケンサー（パーキン・エルマー製）を使用して１，５００ボルトで１時間実施した。開裂生成物および残留基質は、ＧｅｎｅＳｃａｎ解析ソフトウエア、バージョン２.１または３.０を使用して定量した。
【０１６９】
実施例２８  ゲル移動度シフトアッセイ
結合反応混合物は、１００ｎＭ二本鎖蛍光標識オリゴヌクレオチドＤＮＡ基質、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２もしくはＣａＣｌ２または２ｍＭ  ＥＤＴＡ、２％グリセロール、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７.４）、１ｍＭ  ＤＴＴ、および７５ｍＭのＴｍａエンドヌクレアーゼＶタンパク質を含有している。結合反応は、６５℃で３０分間実施した。検体は、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２もしくはＣａＣｌ２または２ｍＭ  ＥＤＴＡを添加した１×ＴＢバッファー中の６％天然ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動にかけた。結合および遊離ＤＮＡ種は次の設定でＦｌｕｏｒＩｍａｇｅｒ  ５９５（モレキュラー・ダイナミクス製）を使用して解析した。１，０００ボルトでＰＭＴ、４８８ｎｍでの励起、５３０ｎｍでの発光（フィルター５３０ＤＦ３０）。データ解析は、ＩｍａｇｅＱｕａＮＴバージョン４.１（モレキュラー・ダイナミクス製）を使用して実施した。
【０１７０】
実施例２９  異型エンドヌクレアーゼ類によるＤＮＡ開裂
ＴｍａエンドＶ変異体は、重複ＰＣＲ法を通して生成し、７５℃で１５分間の熱処理を通して部分的に精製した。結果として生じた変異タンパク質には常在大腸菌エンドヌクレアーゼＶが欠けている（参照してここにその全体が組み込まれるＨｕａｎｇ  Ｊ.ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４０（３０）：８７３８−８７４８（２００１）を参照）。開裂アッセイは、両方の鎖で蛍光標識したオリゴヌクレオチド基質を用いて実施した。以前の試験は、野生型ＴｍａエンドＶがイノシン部位でニックすることを証明した。酵素が過剰である場合は、これはイノシン含有鎖の反対側の相補的鎖を開裂する（参照してここにその全体が組み込まれるＨｕａｎｇ  Ｊ.ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４０（３０）：８７３８−８７４８（２００１）を参照）。野生型対照について予想されるように、上方のイノシン開裂生成物を表す青色バンドおよび下方の相補的鎖開裂生成物を表す緑色バンドが観察された（図２１Ａ）。幾つかの低分子量非特異的開裂生成物もまた観察された。Ｄ４３ＡおよびＤ１１０Ａは、いずれかの鎖を開裂するＤＮＡエンドヌクレアーゼ活性を消失した。Ｅ８９Ａは限定されたイノシン鎖の開裂を示し、相補的鎖の開裂は検出できなかった。Ｙ８０Ａ、Ｒ８８Ａ、Ｈ１１６Ａ、およびＫ１３９Ａはイノシン鎖に向かうｗｔレベルの開裂活性を維持したが、相補的鎖開裂活性は消失した。Ｄ１０５ＡおよびＨ１２５Ａは、二本鎖基質中の本質的にイノシン含有鎖および相補的鎖の両方に向かうｗｔ開裂活性を維持した（図２１Ａ〜Ｃ）。Ｍｎ２＋は、非特異的開裂活性を増強したが、変異体の全開裂プロフィールはＭｇ２＋と類似のままであった（図２１Ｂ〜Ｃ）。
【０１７１】
実施例３０  異型エンドヌクレアーゼ類によるイノシン基質への結合
蛍光に基づくゲル移動度シフトアッセイを使用して９つのアラニン置換変異対間で基質結合を比較した（参照してここにその全体が組み込まれるＨｕａｎｇ  Ｊ.ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４０（３０）：８７３８−８７４８（２００１）を参照）。以前に報告されたように、ｗｔ  ＴｍａエンドＶは金属コファクターの不在かでイノシン基質と安定性複合体を形成しなかった（参照してここにその全体が組み込まれるＨｕａｎｇ  Ｊ.ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４０（３０）：８７３８−８７４８（２００１）、および図２２Ａを参照）。興味深いことに、２つの触媒的に不活性な変異体Ｄ４３ＡおよびＤ１１０Ａは、今度はイノシン基質との別個の複合体を形成した。エンドヌクレアーゼ類上で実施された大多数の変異試験では観察されなかったが、制限エンドヌクレアーゼＭｕｎＩはこのような特有の特性を示さない、即ち一部の金属結合残基での負電荷の排除は同族配列へ結合特異性を授与しない（参照してここにその全体が組み込まれるＬａｇｕｎａｖｉｃｉｕｓ  Ａ.ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３６（３７）：１１０８６−１１０９２（１９９７）を参照）。負電荷が中和金属イオンの不在下でカルボン酸塩類とリン酸塩との間の静電反発を惹起する可能性があることが示唆されている。負荷電ＡｓｐもしくはＧｌｕをＡｌａと置換することによって、変異体は金属イオンが含まれていない場合でさえ同族配列へ結合できるようになる。Ｄ４３ＡおよびＤ１１０Ａ変異体の結合挙動を説明するために同様の概念を適用できるが、これはＤ４３ＡおよびＤ１１０Ａが触媒のために必要な二価金属イオンの協調に関わっていることを意味している。
【０１７２】
例えばＭｇ２＋またはＣａ２＋のような金属コファクターの存在下で、変異体の大多数はｗｔ酵素に匹敵する二本鎖イノシン基質への結合親和性を示した（図２２Ｂ）。Ｃａ２＋は結合だけを支援して触媒は支援しないので（参照してここにその全体が組み込まれるＨｕａｎｇ  Ｊ.ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４０（３０）：８７３８−８７４８（２００１）を参照）、シフトしたバンドはＥＳ（酵素−基質）複合体を表す。他方Ｍｇ２＋を用いて観察されたシフトしたバンドは、鎖開裂を原因とする酵素−ニックが入れられた生成物複合体を表す可能性がある。明白にも、Ｙ８０ＡおよびＨ１１６Ａは、Ｃａ２＋を用いたゲルシフトデータによって判定されるようにもはやｗｔ酵素ほど緊密には無傷イノシン基質へ結合しない（図２２Ｂ）。さらにＭｇ２＋を用いたゲルシフトデータは、Ｙ８０ＡおよびＨ１１６Ａが同様にニックが入れられた生成物への結合親和性を低下させた可能性があることを示唆した（図２２Ｃ）。アラニン置換変異体がニックが入れられた生成物へのエンドヌクレアーゼ結合に及ぼす影響をより決定的に評価するために、ゲル移動度シフト解析は先行ニックを含む合成イノシンオリゴヌクレオチド基質を使用して実施した（図２３）。Ｃａ２＋を用いたゲルシフト実験から、Ｙ８０Ａ、Ｒ８８Ａ、およびＨ１１６Ａが野生型（即ち、ｗｔ）酵素と同等に緊密にニックが入れられたイノシン生成物に結合できなかったことは明白である（図２３Ａ）。金属コファクターとして触媒的に有能な金属イオンＭｇ２＋を使用すると、Ｈ１１６Ａはｗｔ酵素のほぼ半分の緊密さでニックが入れられた生成物に結合した（図２３Ｂ）。Ｙ８０Ａは、別個のバンドシフトの検出を許容するために十分に長い半減期を有するニックが入れられた生成物への結合を維持しなかった（図２３Ｂ〜Ｃ）。これらの結果は、例えばＹ８０ＡおよびＨ１１６Ａのような一部のエンドＶ異型がＥＳおよびＥＰ結合の両方に影響を及ぼし、他方ではＲ８８Ａは主として生成物遊離に影響を及ぼした可能性があることを示唆した。
【０１７３】
変化した結合挙動が二本鎖配列中のイノシン含有鎖の開裂動態をどのように変化させたのかを評価するために時間経過解析を実施した。この酵素が不足しているときは（Ｅ：Ｓ＝１：１０）、ｗｔ酵素はニックが入れられた生成物へ結合したままであったので限定された量の基質しか開裂しなかった（図２４）。同様に、ｗｔレベルの開裂活性および結合親和性を示した変異Ｈ１２５Ａもまた、このイノシン含有二本鎖基質を代謝回転させることができなかった。ゲル移動度シフト解析によってニックが入れられたイノシン基質への親和性の低下を示した（図２３）３つの変異体Ｙ８０Ａ、Ｒ８８Ａ、およびＨ１１６Ａは、今度はこの生成物を遊離することができ、複数代謝回転法でイノシン鎖をニックした（図２４Ａ）。最も顕著には、Ｙ８０Ａによる開裂反応は０.０４ｍｉｎ−１の見かけの一次速度定数を用いてほぼ完了間近へ進行した。結合データと組み合わせた運動解析は、一部の変異体（Ｙ８０Ａによって表される）が複数代謝回転を促進するために生成物遊離速度定数ｋ３を増加させることによって反応動力学を変化させたことを示唆している（図２４Ｂ）。
【０１７４】
実施例３１  異型エンドヌクレアーゼ類による一本鎖イノシン基質の開裂および結合
一本鎖エンドヌクレアーゼ活性を評価するために、蛍光標識（Ｔｅｔ）イノシン含有一本鎖オリゴヌクレオチドを使用して開裂を試験した。大多数のエンドＶ異型は一本鎖イノシン含有基質に向かうｗｔ開裂活性を維持した（図２５Ａ）。二本鎖イノシン含有基質を使用して入手した開裂結果と一致して（図２１）、Ｅ８９Ａは重大に低下した開裂活性を有していたが、Ｄ４３ＡおよびＤ１１０Ａは一本鎖イノシン含有基質に向かっては不活性であった（図２５Ａ）。一本鎖イノシン含有基質の結合もまた大多数の変異体に対して金属コファクターを必要とした。しかしＤ４３Ａ、Ｄ１１０Ａ、およびＥ８９Ａは金属イオンを使用せずに一本鎖イノシン含有基質へ結合することができ（図２５Ｂ）、これは酵素、イノシン基質、および金属イオン間の一本鎖または二本鎖基質の両方についての類似の相互作用を示唆していた。一本鎖イノシン基質を使用した金属イオンの不在下でのＥ８９Ａによる別個のシフトバンドの形成は、Ｅ８９がＤ４３ＡおよびＤ１１０Ａに類似する金属結合において類似の役割を果たせることを示唆している（図２２Ａおよび２５Ｂ）。
【０１７５】
Ｃａ２＋の存在下での一本鎖イノシン含有基質の結合パターンは、本質的に二本鎖基質の結合パターンと同一である、即ち大多数の変異体は少なくともｗｔ酵素と同一強度で結合親和性を示した。Ｙ８０ＡおよびＨ１１６Ａもまたイノシン基質への低い親和性を示した（図２５Ｃ）。Ｍｇ２＋の存在下では、Ｙ８０ＡおよびＨ１１６Ａは遊離ＤＮＡバンドの同時消失を伴う強度の低分子量バンドを示し、これは一本鎖基質の大多数が開裂されたことを示唆していた（図２５Ｄ）。Ｃａ２＋を用いて結合の低下が所見されることを前提に、これら２つの変異体がもはや一本鎖ニック生成物に緊密には結合せず、これにより生成物から分離すると思われる。Ｄ４３Ａ、Ｄ１１０Ａ、およびＥ８９Ａは、イノシン基質を開裂することも、はるかに低い速度で開裂することもできなかった（図２５Ａ）。予想された通りに、それらは移動度シフトゲルによって所見されたものとは別個の安定性複合体を形成した（図２５Ｄ）。しかし、それらはｗｔおよびその他の触媒的に活性なエンドＶ変異体より高速で移動した。相違する移動パターンを説明する１つのシナリオは、ｗｔ酵素および一部の他の活性変異体の結合がニックが入れられたイノシン生成物の結合を惹起して（図２５Ｄ）、これがより緩徐内動を生じさせることにある（参照してここにその全体が組み込まれるＬａｎｅ  Ｄ.ら、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｒｅｖ.，５６（４）：５０９−２８（１９９２）を参照）。Ｄ４３、Ｄ１１０Ａ、およびＥ８９Ａ変異体は陰電荷の消失のためにＤＮＡを結合する能力を消失した可能性がある。
【０１７６】
実施例３２  異型エンドヌクレアーゼ類によるウラシルおよびＡＰ部位基質の開裂
ＴｍａエンドＶ変異体のウラシルエンドヌクレアーゼ活性は、Ａ／Ｕ、Ｇ／Ｕ、およびＴ／Ｕ基質を使用して評価した。Ｄ４３、Ｄ１１０Ａ、およびＥ８９Ａは、ウラシル基質のいずれに向かっても不活性であるが、これは提案された金属結合の役割と一致している（図２６Ａ〜Ｃ）。様々なイノシン基質に向かう野生型活性を示したＤ１０５Ａは、ウラシル含有基質との野生型活性を本質的に維持した。Ｈ１２５Ａは、Ｇ／ＵおよびＴ／Ｕ基質並びに野生型酵素を開裂した（図２６Ｂ  〜Ｃ）；しかし、これは完全な塩基対基質Ａ／Ｕに対する活性を減少させた（図２６Ａ）。Ｙ８０Ａは最小のウラシル開裂活性を有していた。Ｒ８８Ａ、Ｈ１１６Ａ、およびＫ１３９Ａは低いウラシル開裂を示した。これらの３種の変異体によるウラシル開裂の程度は、塩基対の性質によって影響を受けると思われた。基質が例えばＡ／Ｕのようなワトソン・クリック（Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ）塩基対を含有している場合は（図２６Ａ）、ウラシル開裂活性は最低であった。基質が例えばＧ／ＵまたはＴ／Ｕのようなミスマッチを含有している場合は、ウラシル開裂活性が増強された（図２６Ｂ〜Ｃ）。これらの結果はＡ／ＵおよびＴ／Ｕ基質を使用したｗｔ酵素の以前の時間経過解析と一致しており（参照してここにその全体が組み込まれるＨｕａｎｇ  Ｊ.ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４０（３０）；８７３８−４８（２００１）を参照）、これはウラシルは局所的に変形されたミスマッチ環境において塩基認識のためのより良好なシグナルを提供することを示唆している。
【０１７７】
ＴｍａエンドＶ変異体のＡＰエンドヌクレアーゼ活性は、Ａ／ＡＰ基質を使用して評価した。大腸菌エンドヌクレアーゼＩＶは、熱安定性５’ＡＰエンドヌクレアーゼである（参照してここにその全体が組み込まれるＬｊｕｎｇｑｕｉｓｔ  Ｓ.，Ｊ.Ｂｉｏｌ.Ｃｈｅｍ.２５２（９）：ｐ２８０８−０４（１９９７を参照）。宿主ＡＰエンドヌクレアーゼの影響を防止するために、ｗｔおよび変異エンドＶはさらにＨｉＴｒａｐ  ＳＰカラムクロマトグラフィー（アマシャム・ファルマシア・バイオテック製）によって精製した。カラム精製変異タンパク質を使用して、ＡＰエンドヌクレアーゼ活性は、どちらも一貫して他の基質に向かうｗｔ  ＤＮＡ開裂活性を示していたＤ１０５ＡおよびＨ１２５Ａを用いた場合にのみ観察された（図２６Ｄ）。６５℃のアッセイ条件下で、ＡＰ基質が特発性開裂を受け、対照レーンで所見されたように弱いバックグラウンドを発生した（図２６Ｄ）。一部の境界ＡＰエンドヌクレアーゼ活性はＨ１１６Ａと関連している可能性があるが、他の全変異体はＡＰ開裂を排除した。
【０１７８】
金属結合および活性部位（Ｄ４３、Ｄ１１０、Ｅ８９）  本試験からの重大な所見の１つは、金属結合および触媒反応に含まれるアミノ算残基の同定である。生化学的試験から、エンドヌクレアーゼＶが金属依存性ＤＮＡエンドヌクレアーゼであることが知られている（参照してここにその全体が組み込まれるＨｕａｎｇ  Ｊ.ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４０（３０）；８７３８−４８（２００１）およびＹａｏ  Ｍ.ら、Ｊ.Ｂｉｏｌ.Ｃｈｅｍ.，２６９（２３）：１６２６０−０８（１９９４）を参照）。この酵素は、金属コファクターとしてＭｇ２＋またはＭｎ２＋を用いた場合に最も活性である。以前の結合試験は、二価金属イオンが触媒反応のためだけではなく、安定性酵素−基質複合体の形成のためにも必要とされることを証明した（参照してここにその全体が組み込まれるＨｕａｎｇ  Ｊ.ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４０（３０）；８７３８−４８（２００１）を参照）。多数のエンドヌクレアーゼ類に対して、例えばＡｓｐおよびＧｌｕのような数種の陰荷電アミノ酸残基が金属結合に含まれている（参照してここにその全体が組み込まれるＣａｏ  Ｗ.ら、Ｊ.Ｂｉｏｌ.Ｃｈｅｍ.，２７３（４９）：３３００２−１０（１９９８）；Ｋｉｍ  Ｄ.Ｒ.ら、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ.，１３（２３）：３０７０−８０（１９９９）およびＫｏｖａｌ  Ｒ.Ａ.ら、Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ.Ｃｈｅｍ.Ｂｉｏｌ.，３（５）：５７８−８３（１９９９）を参照）。金属イオンを調整するために、変異したこのような残基４個中３個（Ｄ４３，Ｄ１１０，Ｅ８９）が重要であると思われる。Ｄ４３ＡおよびＤ１１０Ａは、二本鎖および一本鎖イノシン基質（図２１）および二本鎖ウラシルおよびＡＰ部位基質（図２６）を含む試験した全基質に向かうエンドヌクレアーゼ活性を無効にする。Ｅ８９Ａは、実質的に触媒活性を低下させた。しかし、全３種の変異体はイノシン基質に向かう野生型結合親和性を維持しているが、これはそれらが触媒作用において果たす重要な役割を示している。極めて興味深いことに、Ｄ４３ＡおよびＤ１１０Ａ、および一部の場合にはＥ８９Ａは、金属イオンの不在下でイノシン基質へ結合する。制限エンドヌクレアーゼＭｕｎＩにおけるＤ８３ＡおよびＥ８９Ａは、類似の結合挙動を示してきた（参照してここにその全体が組み込まれるＬａｕｇｎａｖｉｃｉｕｓ  Ａ.ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３６（３７）：１１０８６−９２（１９９７）を参照）。より近年には、ＭｕｎＩ結晶構造は活性部位で同族ＤＮＡ位置Ｄ８３ＡおよびＥ８９Ａと複合した（参照してここにその全体が組み込まれるＤｅｉｂｅｒｔ  Ｍ.ら、Ｅｍｂｏ.Ｊ.，１８（２１）：５８０５−１６（１９９９）を参照）。ＴｍａエンドＶ中のＤ４３およびＤ１１０、およびもしかするとＥ８９は、切断可能なリン酸塩結合の加水分解のための触媒金属に結合することに含まれていると思われる。Ｃａ２＋競合は、ＥｃｏＲＶによるＤＮＡ開裂に含まれている多数の金属イオンを評価するためのプローブとして使用されてきた（参照してここにその全体が組み込まれるＣａｏ  Ｗ.ら、Ｂｉｏｃｈｉｍ.Ｂｉｏｐｈｙｓ.Ａｃｔａ，１５４６（１）：２５３−６０（２００１）およびＶｉｐｏｎｄ  Ｉ.Ｂ.ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３４���２）：６９７−７０４（１９９５）を参照）。同族部位開裂へのＣａ２＋による刺激作用は、２金属触媒機序の指標であると見なされてきた。Ｃａ２＋−Ｍｇ２＋競合ではイノシン開裂の増強は観察されなかった。従って、エンドヌクレアーゼＶにおける鎖開裂に含まれている金属イオンの数はまだ決定されていない。
【０１７９】
Ｙ８０  Ｙ８０でのアラニン置換は、二本鎖および一本鎖イノシン基質（図２２および２５）並びにニックが入れられたイノシン生成物（図２３）へのエンドＶの親和性を実質的に低下させた。明らかに、弱い結合は生成物からのエンドＶ分離を助け、それによってイノシン基質の高速代謝回転を可能にする（図２４）。ＡＰエンドヌクレアーゼおよびウラシルエンドヌクレアーゼ活性の消失は、さらに弱い結合親和性に帰することができる（図２６）。これらの結果は、Ｙ８０がこの酵素と修復中間物との間で安定性複合体を維持することに重要な役割を果たすことを示唆している。Ｙ８０は、塩基接触またはリン酸塩バックボーン相互作用を通して基質および生成物と直接接触することによって、または他のアミノ酸残基によって媒介される接触のネットワークを組織化することによって、このような役割を果たすことができる。促進された生成物遊離の運動学的特性は、ヒトＡＰエンドヌクレアーゼＡＰＥ１においてＲ１７７Ａに類似である（参照してここにその全体が組み込まれるＭｏｌ  Ｃ.Ｄ.ら、Ｎａｔｕｒｅ，４０３（６７６８）：４５１−５６（２０００）を参照）。ＤＮＡ結合構造では、Ｒ１７７はＡＰ部位上にＡＰＥ１へ固定するためにＡＰ部位で３’リン酸塩へ直接接触する（参照してここにその全体が組み込まれるＭｏｌ  Ｃ.Ｄ.ら、Ｎａｔｕｒｅ，４０３（６７６８）：４５１−５６（２０００）を参照）。従って、リン酸塩バックボーン接触は、緊密な生成物結合に寄与することができる。
【０１８０】
Ｒ８８ＡおよびＨ１１６  Ｒ８８ＡおよびＨ１１６Ａは類似の特性を示す。これらの異型はどちらも二本鎖イノシン基質およびニックが入れられた生成物への親和性を低下させ（図２２〜２３）、これはより高度の代謝回転を生じさせる（図２４）。それらはｗｔレベルの一本鎖イノシン開裂活性を維持する（図２５）。Ｒ８８ＡとＨ１１６Ａの間の主要な相違は、ウラシル基質にある。Ｈ１１６ＡはＲ８８Ａより、Ｇ／Ｕ基質については約９倍、Ｔ／Ｕ基質については５倍活性である（図２６）。明らかに、Ｒ８８はウラシル認識においてより重要な役割を果たす。
【０１８１】
Ｋ１３９  Ｋ１３９でのアラニン置換は、結合にほとんど作用を及ぼさない（図２２〜２３，２５）。Ｋ１３９Ａは、二本鎖イノシン基質Ｉ／Ａに向かうｗｔレベルの開裂活性を維持する（図２１）。ｗｔ酵素に類似して、Ｋ１３９Ａは緊密な生成物結合のためにイノシン基質を開裂した後にさえ結合を維持する（図２４）。エンドＶへのＫ１３９Ａ置換の主要作用は、非イノシン基質の開裂にある。ＡＰエンドヌクレアーゼ活性の欠如に加えて、Ｋ１３９Ａはウラシルエンドヌクレアーゼ活性を実質的に低下させた（図２６）。Ｋ１３９が種々の基質を用いて果たす可能性がある正確な触媒的役割を理解するためにはより詳細な運動学的解析が必要とされる。
【０１８２】
エンドヌクレアーゼＶの触媒および認識機序の構造的根拠を解明するための第１段階として、ＴｍａエンドヌクレアーゼＶの９つの保存された位置でアラニンスキャニング突然変異誘発を実施した。Ｄ４３およびＤ１１０は、Ｅ８９と一緒に切断可能なリン酸塩結合加水分解のために金属イオンを調整する可能性があり、活性部位の一部である。Ｙ８０は基質およびニックが入れられた生成物結合に実質的に寄与する。基質への強力な結合の欠如はＡＰ部位およびウラシル開裂活性の消失の原因である可能性があるが、この同一の特性がさらにまた、生成物遊離段階がもはや律速性ではなくなるようにイノシン含有基質を開裂する運動学を変化させる。Ｒ８８ＡおよびＨ１１６Ａは同様に結合段階へ影響を及ぼし、これは非イノシン基質に向かうエンドヌクレアーゼ活性の現象を生じさせた。Ｋ１３９Ａによる緊密な結合は、イノシン基質の代謝回転を制限する。ＡＰ部位およびウラシル開裂の欠如は、Ｋ１３９Ａは基質もしくは生成物結合以外の段階に影響を及ぼす可能性を示唆している。ここに記載した変異の作用を完全に理解するには、エンドＶ−ＤＮＡ複合体構造の決定が待たれる。
【０１８３】
上記の位置で追加のＴｍａエンドヌクレアーゼＶ変異体の生成は、選択されたバッファー条件において野生型酵素より優れたミスマッチ塩基を含有する少なくとも１つのヘテロ二重鎖ＤＮＡを優先的にニックを入れる、または開裂するこれら異型中４種（Ｒ８８Ｑ，Ｒ８８Ｅ，Ｈ１１６Ｑ，およびＨ１１６Ｔ）を解明した。Ｒ８８ＱおよびＲ８８Ｅ酵素は、野生型エンドヌクレアーゼよりもＧ：ＡおよびＡ：Ｇミスマッチ基質の両方においてＧ塩基を開裂することに対する強力な優先を証明した。Ｈ１１６ＱおよびＨ１１６Ｔ酵素は、「Ａ」塩基含有基質に向かうほとんど排他的活性を示した。「Ｇ」含有鎖に向かう活性はほとんどなく、これはこれらの異型酵素が特異的ミスマッチ配列に対するより強力な酵素を開発できるという原理の証拠であることを示唆している。このような酵素は、未知の変異および多型性のスコアリング、プーリング実験、および困難な配列環境における変異のための両方においてシグナル／ノイズ比を向上させる。
【０１８４】
本明細書に好ましい態様を詳細に描出かつ記載してきたが、当業者には本発明から逸脱せずに様々な変形、追加、置換等を行えることは明白であると思われることから、それらは特許請求の範囲に定義されたように本発明の範囲内に含まれる。
【図面の簡単な説明】
【０１８５】
【図１】図１はテルモトガ・マリチマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ）（「Ｔｍａ」）エンドＶとＴｓｐ.ＡＫ１６Ｄ  ＤＮＡリガーゼの組み合わせを用いた変異スキャニング法を示している略図である。
【図２Ａ−Ｂ】図２Ａ〜ＢはＴｍａエンドヌクレアーゼＶの精製を示している図である。図２Ａは、精製されたエンドＶの１２.５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥを示し、図２Ｂは精製されたエンドＶのゲル濾過を示している。分子量マーカーはシグマ・ケミカル社（セントルイス、ＭＯ）から入手した。Ｖｅは溶出量、Ｖ０はボイド容量である。
【図３Ａ−Ｄ】図３Ａ〜Ｄは二本鎖イノシン含有基質上でのＴｍａエンドヌクレアーゼＶの開裂アッセイを示している図である。図３Ａは、ＧｅｎｅＳｃａｎゲル（パーキン・エルマー製）上での蛍光検出を許容するために、上方鎖（配列番号：１）がＦａｍ標識されており、下方鎖（配列番号：２）がＴｅｔ標識されているアッセイデザインである。両方の鎖におけるヌクレオチドの変化の位置には下線が引かれている。基質および優勢生成物の長さはマークされている。開裂部位は矢印によってマークされている。開裂反応は、様々なＥ：Ｓ（酵素：基質）比での５ｍＭ  ＭｇＣｌ２の存在下で材料および方法の項に記載した通りに実施した。図３Ｂでは、Ｅ：Ｓ＝１：１０であり、基質と生成物との関係は矢印によって示した。図３Ｃでは、Ｅ：Ｓ＝１：１０であり、図３ＢおよびＣの第１レーンは基質陰性対照である。図３Ｄは、開裂部位の場所を示している。長さマーカーは、図３Ａに示したように上方鎖または下方鎖と同一の合成オリゴヌクレオチドであった。
【図４Ａ−Ｂ】図４Ａ〜ＢはＭｇ２＋またはＭｎ２＋が様々な濃度の場合のＴｍａエンドヌクレアーゼＶの塩基ミスマッチ開裂活性を示している、開裂生成物の相対蛍光強度対ＭｇＣｌ２濃度のプロット図である。
【図５Ａ−Ｄ】図５Ａ〜ＤはＴｍａエンドヌクレアーゼＶがＭｇ２＋またはＭｎ２＋の存在下で様々な相違する単一塩基ミスマッチを開裂させる能力を示している図である。
【図６Ａ−Ｂ】図６Ａ〜ＢはＡＰおよびウラシル部位の開裂および結合を示している図である。図６Ａは、塩基性部位（ＡＰ部位）またはデオキシウリジンを含有する二本鎖オリゴヌクレオチド類の開裂を示している。１：未処理基質対照；２：ＡＰ部位対照として５０ｍＭ  ＮａＯＨ中で９５℃で１分間インキュベートされたＡＰ基質；３および１０：オリゴヌクレオチド長さマーカー；４および７：１ｎＭ  ＴｍａエンドＶ（Ｅ：Ｓ＝：１０）；５および８：１０ｎＭ  ＴｍａエンドＶ（Ｅ：Ｓ＝１：１）；６および９：１００ｎＭ  ＴｍａエンドＶ（Ｅ：Ｓ＝１０：１）。図６Ｂは、ＡＰおよびウラシル部位のゲル移動度シフトアッセイの図である。反応は、２０ｎＭ二本鎖オリゴヌクレオチドＤＮＡ基質、５ｍＭ  ＣａＣｌ２および下記に規定する指示量のＴｍａエンドＶを用いて実施した。その他のバッファー構成要素は不変である。１：基質対照；２：１０ｎＭ  ＴｍａエンドＶ；４および６：１００ｎＭ  ＴｍａエンドＶ；７：イノシン基質対照；８：陽性対照としての２０ｎＭイノシン基質を含む１００ｎＭ  ＴｍａエンドＶ。図６Ｃ〜Ｇは、ＴｍａエンドヌクレアーゼＶによる一本鎖および非特異的開裂および結合を示している図である。図６Ｃは、一本鎖オリゴヌクレオチドの開裂を示す。開裂反応は、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２または１ｍＭ  ＭｎＣｌ２の存在下で１０ｎＭ  ＴｍａエンドＶ用いて実施した（Ｅ：Ｓ＝１：１）。ＮＳ：非特異的配列。図６Ｄは、プラスミド基質の開裂を示している。開裂反応は、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２または１ｍＭ  ＭｎＣｌ２の存在下で１０ｎＭ  ｐＦＢ７６プラスミドを用いて実施した。Ｍ：１ｋｂ  ＤＮＡラダー；レーン１：無傷プラスミドｐＦＢ７６；レーン２：１００ｎＭ  ＴｍａエンドＶは用いるが金属コファクターは添加せずに実施した開裂反応；レーン３および６：Ｅ：Ｓ＝１：１０；レーン４および７：Ｅ：Ｓ＝１：１；レーン５および８：Ｅ：Ｓ＝１０：１。図６Ｅ〜Ｇは、一本鎖イノシン基質の結合を示している。結合反応混合物は、１００ｎＭ一本鎖イノシン基質、２ｍＭ  ＥＤＴＡ（図６Ｅ）または５ｍＭ  ＭｇＣｌ２（図６Ｆ）または５ｍＭ  ＭｎＣｌ２（図６Ｇ）、２０％グリセロール、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７.４）、１ｍＭ  ｄＴＴ、および１０ｎＭ−１μｍ  ＴｍａエンドＶを含有していた。反応混合物を６５℃で３０分間インキュベートし、その後６％天然ポリアミドゲルへ装填した。レーン１：Ｅ：Ｓ＝０；レーン２：Ｅ：Ｓ＝１：１０；レーン３：Ｅ：Ｓ＝１.２；レーン４：Ｅ：Ｓ＝１：１；レーン５：Ｅ：Ｓ＝５：１；レーン６：Ｅ：Ｓ＝１０：１。
【図７Ａ−Ｂ】図７Ａ〜ＢはＴｍａエンドヌクレアーゼＶの塩基ミスマッチ開裂活性にｐＨが及ぼす作用を示している図である。
【図８】図８はＴｍａエンドヌクレアーゼＶの塩基ミスマッチ開裂活性のためのＮａＣｌ至適濃度を示している図である。
【図９】図９はＴｍａエンドヌクレアーゼＶの塩基ミスマッチ開裂活性にＤＭＳＯ濃度が及ぼす作用を示している、開裂生成物の相対強度対ＤＭＳＯ濃度のプロット図である。
【図１０Ａ−Ｂ】図１０Ａ〜ＢはＴｍａエンドヌクレアーゼＶの塩基ミスマッチ開裂活性にベタイン濃度が及ぼす作用を示している開裂生成物の相対強度対ベタイン濃度のプロット図である。
【図１１Ａ−Ｂ】図１１Ａ〜Ｂは開裂生成物の相対強度対ＫＣＲ濃度のプロット図である。図１１Ａは、ＴｍａエンドＶを用いたＰＣＲフラグメントの開裂にはＮａＣｌの濃度が低い、またはゼロであることが好ましいことを示している。図１１Ｂは、ＴｍａエンドＶを用いての開裂反応に及ぼすＫＣｌの阻害作用を示している。
【図１２】図１２はＴｍａエンドＶの活性を時間に関して開裂反応と関連付ける相対強度対時間のプロット図である。
【図１３Ａ−Ｂ】図１３Ａは、プライマー標識および開裂生成物の予想サイズを示しているＫ−ｒａｓエキソン１アンプリコンの略図である。図１３Ｂは、本発明がＫ−ｒａｓ遺伝子中の点変異を検出する能力を示しており、引き続いて様々な量のＤＮＡリガーゼと一緒にインキュベートすると、依然として正確な特異的開裂生成物を維持しながら非特異的開裂生成物をシーリングすることが可能になる。
【図１４Ａ−Ｃ】図１４Ａ〜Ｃは本発明の感度を示している、蛍光の相対強度対変異／野生型の比率のプロット図である。
【図１５】図１５は本発明が、ＢＲＣＡ１およびＢＲＣＡ２における小さな挿入／欠失、およびｐ５３遺伝子中の点変異を検出する能力を示している図である。
【図１６Ａ−Ｂ】図１６Ａ〜Ｂは本発明が１.７ｋｂのようにＤＮＡの大きな領域内の変異を検出できることを要約して示している図である。図１６Ａは、プライマー標識および開裂生成物の予想サイズを示しているｐ５３  １.７ｋｂアンプリコンの略図である。図１６Ｂは、本発明がｐ５３遺伝子中の点変異を検出する能力を示しており、引き続いてＤＮＡリガーゼと一緒にインキュベーションすると、依然として正確な特異的開裂生成物を維持しながら非特異的開裂生成物をシーリングすることが可能になる。
【図１７Ａ−Ｃ】図１７Ａ〜Ｂは、各々グアニンおよび７−デアザ−グアニンに対する化学式を示している。図１７Ｃは、ＰＣＲフラグメントが７−デアザ−ｄＧを含有しているときのＴｍａエンドＶの塩基ミスマッチ開裂活性を証明している。
【図１８Ａ−Ｃ】図１８Ａは、ＤＮＡマイクロシーケンシングプロセスの略図である。図１８Ｂ〜Ｃはマイクロシーケンシング反応の配列解析トレースの図である。
【図１９】図１９は高温性および中温性の古細菌および真核生物由来の同定された１３種の推定エンドＶ酵素類のアライメントの結果を表している。
【図２０】図２０は、Ａ：ＧおよびＧ：Ａミスマッチを含有する合成基質上での変異エンドＶ  Ｒ８８Ｑ、Ｒ８８Ｅ、Ｈ１１６Ｑ、およびＨ１１６Ｔの活性を示している図である。開裂反応は、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７.４）、１ｍＭ  ＤＴＴ、２％グリセロール、１ｍＭ  ＭｎＣｌ２、２０ｎＭ  ＤＮＡ基質、および２０ｎＭ精製ＴｍａエンドＶ変異体を含有する２０μＬ反応混合物中で６５℃、３０分間で実施した。この反応は等量のＧｅｎｅＳｃａｎ停止液を添加することによって終了させた。その後反応混合物を９４℃で２分間加熱し、氷上で冷却した。３μＬの検体を１０％ＧｅｎｅＳｃａｎ変性ポリアクリルアミドゲル（パーキン・エルマー製、フォスターシティ、カリフォルニア州）上に装填した。ＡＢＩ３７７シーケンサー（パーキン・エルマー製）を使用して、電気泳動を１，５００ボルトで１時間実施した。レーン１〜１２は、１０％変性ポリアクリルアミドゲル上で解析した開裂生成物を示している。対照として、野生型エンドＶについても各々１０ｎＮ（ＷＴ、レーン９，１０）および３ｎＭ（ＷＴ１、レーン１１および１２）でアッセイした。
【図２１Ａ−Ｃ】図２１Ａ〜Ｃは二本鎖イノシン含有基質（Ｉ／Ａ）上でのＴｍａエンドヌクレアーゼＶ変異体の開裂活性を示している図である。イノシン含有基質（上方鎖）はＦａｍ標識されており、反対側の鎖（下方鎖）はＴｅｔ標識されている。Ｃｎｔｌ：基質対照（図２１Ａ）。図２１Ｂでは、開裂反応は５ｍＭ  ＭｇＣｌ２の存在下で１０：１（Ｓ＝１０ｎＭ）のＥ：Ｓ（酵素：基質）比で実施した。図２１Ｃでは、開裂反応は５ｍＭ  ＭｎＣｌ２の存在下で１：１（Ｓ＝１０ｎＭ）のＥ：Ｓ（酵素：基質）比で実施した。
【図２２Ａ−Ｃ】図２２Ａ〜ＣはＴｍａエンドヌクレアーゼＶ変異体のゲル移動度シフトを示している図である。Ｃｎｔｌ：基質対照。図２２Ａでは、ＭｇＣｌ２の代わりに２ｍＭ  ＥＤＴＡを使用してイノシン含有二本鎖基質（Ｉ／Ａ）を用いてゲル移動度シフトアッセイを実施した。図２２Ｂでは、ＣａＣｌ２の存在下でイノシン含有二本鎖基質（Ｉ／Ａ）を用いてゲル移動度シフトアッセイを実施した。図２２Ｃでは、ＭｇＣｌ２の存在下でイノシン含有二本鎖基質（Ｉ／Ａ）を用いてゲル移動度シフトアッセイを実施した。
【図２３Ａ−Ｂ】図２３Ａ〜Ｂはニックが入れられたイノシン生成物を用いたＴｍａエンドヌクレアーゼＶ変異体のゲル移動度シフトを示している図である。Ｃｎｔｌ：基質対照。図２３ＢＡでは、ＣａＣｌ２の存在下でニックが入れられたイノシン含有二本鎖基質（Ｉ／Ａ）を用いてゲル移動度シフトアッセイを実施した。図２３Ｂでは、ＭｇＣｌ２の存在下でニックが入れられたイノシン含有二本鎖基質（Ｉ／Ａ）を用いてゲル移動度シフトアッセイを実施した。
【図２４Ａ−Ｂ】図２４Ａ〜ＢはＴｍａエンドＶ変異体によるイノシン開裂の時間経過解析を示している。開裂反応は、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２の存在下で１：１０（Ｓ＝１０ｎＭ）のＥ：Ｓ（酵素：基質）の比率を用いて実施した。反応はＧｅｎｅＳｃａｎ解析のための特定時点で終了させた。楕円：ＴｍａエンドＶ。
【図２５Ａ−Ｄ】図２５Ａ〜Ｄは一本鎖イノシン基質の結合および開裂を示している図である。Ｃｎｔｌ：基質対照。図２５Ａは、ＴｍａエンドＶ変異体による開裂を示している。開裂反応は、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２の存在下で１：１（Ｓ＝１０ｎＭ）のＥ：Ｓ（酵素：基質）の比率を用いて記載されたように実施した。図２５Ｂは、金属コファクターを使用しないＴｍａエンドＶ変異体のゲル移動度シフトを示している。図２５Ｃは、５ｍＭ  ＣａＣｌ２と一緒にＴｍａエンドＶ変異体のゲル移動度シフトを示している。図２５Ｄは、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２と一緒にＴｍａエンドＶ変異体のゲル移動度シフトを示している。
【図２６Ａ−Ｄ】図２６Ａ〜ＤはウラシルおよびＡＰ部位基質上でのＴｍａエンドＶ変異体の開裂活性を示している図である。開裂反応は、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２の存在下で１０：１（Ｓ＝１０ｎＭ）のＥ：Ｓ（酵素：基質）の比率を用いて実施した。Ｃｎｔｌ：基質対照。図２６Ａは、Ａ／Ｕ基質の開裂を示している。図１６Ｂは、Ｇ／Ｕ基質の開裂を示している。図２６Ｃは、Ｔ／Ｕ基質の開裂を示している。図２６Ｄは、ＡＰ部位基質（Ａ／ＡＰ）の開裂を示している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図６Ｅ】
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【図６Ｆ】
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【図６Ｇ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９−１】
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【図１９−２】
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【図１９−３】
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【図１９−４】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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