(57)【要約】式（Ｉ）：【化１】2004524290.tif 000024[式中、Ｒは水素、及びＣ１−４アルキル、例えばメチル、エチル、プロピル、及びブチルからなる群から選択され、一方Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、及びＲ４は水素、ハロゲン、シアノ、ニトロ、カルボキシ、アミノ、１または２のＣ１−４アルキル基で置換されたアミノ、アミノメチル、ヒドロキシ、Ｃ１−４アルコキシ、カルボキシアルキル、及びスルホニルからなる群から独立に選択される]の発色性３−インドキシルコリンホスファート化合物。【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）：
【化１】
2004524290.tif 000017
[式中、Ｒは水素、及びＣ１−４アルキル、例えばメチル、エチル、プロピル、及びブチルからなる群から選択され、一方Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、及びＲ４は水素、ハロゲン、シアノ、ニトロ、カルボキシ、アミノ、１または２のＣ１−４アルキル基で置換されたアミノ、アミノメチル、ヒドロキシ、Ｃ１−４アルコキシ、カルボキシアルキル、及びスルホニルからなる群から独立に選択される]
の発色性３−インドキシルコリンホスファート化合物。
【請求項２】
Ｒが水素及びメチルからなる群から選択され；Ｒ１が水素及びハロゲンからなる群から選択され；Ｒ２が水素、ハロゲン、シアノ、ニトロからなる群から選択され；並びにＲ３及びＲ４が水素及びハロゲンからなる群から独立に選択される請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
Ｒが水素であり、Ｒ１が水素及び塩素から選択され、Ｒ２が水素及び臭素から選択され、Ｒ３が水素、塩素、及びフッ素から選択され、及びＲ４が水素であり；好ましくはＲ、Ｒ１及びＲ４が水素であり、Ｒ２が水素または臭素であり、Ｒ３が塩素である請求項１または２に記載の化合物。
【請求項４】
式（ＩＶ）：
【化２】
2004524290.tif 000018
によって表される５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシルコリンホスファート。
【請求項５】
式（Ｖ）：
【化３】
2004524290.tif 000019
によって表される３−インドキシルコリンホスファート。
【請求項６】
請求項１から５のいずれか一項に記載の少なくとも一つの発色性３−インドキシルコリンホスファート化合物を含む、微生物活性の指標としてのホスファチジルコリン特異的ホスホリパーゼＣ酵素の検出のための基質。
【請求項７】
血清アルブミン、界面活性剤、及び金属イオンからなる群から選択される少なくとも一つの添加剤をさらに含む請求項６に記載の基質。
【請求項８】
少なくとも一つの金属イオンと、界面活性剤及び血清アルブミンからなる群から選択される少なくとも一つのメンバーとをさらに含む請求項６に記載の基質。
【請求項９】
前記金属イオンが、コバルト、マンガン、ニッケル、亜鉛、カルシウム、またはマグネシウムの二価イオンである請求項７または８に記載の基質。
【請求項１０】
式（Ｉ）：
【化４】
2004524290.tif 000020
[式中、Ｒは水素、及びＣ１−４アルキル、例えばメチル、エチル、プロピル、及びブチルからなる群から選択され、一方Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、及びＲ４は水素、ハロゲン、シアノ、ニトロ、カルボキシ、アミノ、１または２のＣ１−４アルキル基で置換されたアミノ、アミノメチル、ヒドロキシ、Ｃ１−４アルコキシ、カルボキシアルキル、及びスルホニルからなる群から独立に選択される；及び前記化合物は、前記酵素による切断に感受性であり、色素を生産する]
の少なくとも一つの３−インドキシルコリンホスファート化合物を含む基質と、ホスファチジルコリン特異的ホスホリパーゼＣ酵素を含む疑いのあるサンプルを接触させる工程、並びに前記ホスファチジルコリン特異的ホスホリパーゼＣ酵素の疑いのある前記サンプルの結果として、色素の形成をモニターする工程を含む、ホスファチジルコリン特異的ホスホリパーゼＣ酵素の検出方法。
【請求項１１】
Ｒが水素及びメチルからなる群から選択され；Ｒ１が水素及びハロゲンからなる群から選択され；Ｒ２が水素、ハロゲン、シアノ、ニトロからなる群から選択され；並びにＲ３及びＲ４が水素及びハロゲンからなる群から独立に選択される請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
Ｒが水素であり、Ｒ１が水素及び塩素から選択され、Ｒ２が水素及び臭素から選択され、Ｒ３が水素、塩素、及びフッ素から選択され、及びＲ４が水素であり；好ましくはＲ、Ｒ１及びＲ４が水素であり、Ｒ２が水素または臭素であり、Ｒ３が塩素である請求項１０または１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記少なくとも一つの化合物が、式（ＩＶ）：
【化５】
2004524290.tif 000021
によって表される５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシルコリンホスファートである請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
前記基質が、血清アルブミン、界面活性剤、及び金属イオンからなる群から選択される少なくとも一つの添加剤をさらに含む請求項１０から１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記基質が、少なくとも一つの金属イオンと、界面活性剤及び血清アルブミンからなる群から選択される少なくとも一つのメンバーとをさらに含む請求項１０から１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記金属イオンが、コバルト、マンガン、ニッケル、亜鉛、カルシウム、またはマグネシウムの二価イオンである請求項１４または１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記ホスファチジルコリン特異的ホスホリパーゼＣ酵素が、Clostridium perfringens、Clostridium novyi、Bacillus cereus、Bacillus thuringensis、Bacillus anthracis、Pseudomonas aeruginosa、Helicobacter pylori、Legionella pneumophila、Listeria monocytogenes、Aspergillus fumigatus、及びCandida albicansからなる群から選択される病原体から由来する請求項１０から１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
（ｉ）請求項１から５のいずれか一項に記載の少なくとも一つの式（Ｉ）の化合物を含む基質とサンプルを接触させる工程；及び（ｉｉ）比色測定手段によって前記基質と接触させた前記サンプルを調べる工程を含む、サンプル中の微生物活性の検出方法。
【請求項１９】
前記基質が、血清アルブミン、界面活性剤、及び金属イオンからなる群から選択される少なくとも一つの添加剤をさらに含み、好ましくは前記金属イオンが、コバルト、マンガン、ニッケル、亜鉛、カルシウム、またはマグネシウムの二価イオンである請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
Clostridium perfringens、Clostridium novyi、Bacillus cereus、Bacillus thuringensis、Bacillus anthracis、Pseudomonas aeruginosa、Helicobacter pylori、Legionella pneumophila、及びListeria monocytogenesを含む群の細菌の検出における、並びに酵母Candida albicansの検出におけるスクリーニング試験としての使用のための請求項１８または１９に記載の方法。
【請求項２１】
請求項１から５のいずれか一項記載の少なくとも一つの式（Ｉ）の化合物を含む、細菌活性の指標としてのホスファチジルコリン特異的ホスホリパーゼＣ酵素の検出のためのキット。
【請求項２２】
請求項６から９のいずれか一項に記載の基質による、ＰＣ−ＰＬＣの検出のためのアッセイ方法。
【請求項２３】
請求項６から９のいずれか一項に記載の基質による、Clostridium perfringensを含む疑いのあるサンプル中のClostridium perfringensの病原性株の存在を検出するためのアッセイ方法。
【請求項２４】
式（ＩＶ）によって表される５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシルコリンホスファート、または式（Ｖ）によって表される３−インドキシルコリンホスファート、ウシ血清アルブミン、及び少なくとも一つのＣｏ２＋イオンの供給源を含む基質による、Clostridium perfringensを含む疑いのあるサンプル中のClostridium perfringensの病原性株の存在を検出するためのアッセイ方法。
【請求項２５】
式（ＩＶ）によって表される５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシルコリンホスファート、または式（Ｖ）によって表される３−インドキシルコリンホスファート、ウシ血清アルブミン、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレアート、及び少なくとも一つのＭｎ２＋イオンの供給源を含む基質による、Bacillus cereus、Bacillus thuringensis、またはBacillus anthracisを含む疑いのあるサンプル中のBacillus cereus、Bacillus thuringensis、またはBacillus anthracisの病原性株の存在を検出するためのアッセイ方法。
【請求項２６】
式（ＩＶ）によって表される５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシルコリンホスファート、または式（Ｖ）によって表される３−インドキシルコリンホスファート、ウシ血清アルブミン、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレアート、及び少なくとも一つのＺｎ２＋イオンの供給源を含む基質による、Pseudomonas aeruginosaを含む疑いのあるサンプル中のPseudomonas aeruginosaの病原性株の存在を検出するためのアッセイ方法。
【請求項２７】
以下の工程：
（Ａ）興味ある微生物を含む疑いのある試験サンプルを準備する工程；
（Ｂ）好ましくは富栄養ブロスステップに試験サンプルをかける工程；
（Ｃ）少なくとも前記試験サンプルの一部、または工程（Ｂ）で得られた産物を、微生物に曝した際に発色を生ずることが可能な少なくとも一つの式（Ｉ）の化合物を含む培地である、微生物の培養に適した培地に移す工程；
（Ｄ）前記発色を示す少なくとも一つのコロニーを形成するように、前記移された一部を含む培地を培養する工程；及び
（Ｅ）最終同定のために前記発色化コロニーの少なくとも一部を回収する工程；
を含む、ホスファチジルコリン特異的ホスホリパーゼＣ（ＰＣ−ＰＬＣ）酵素を生産可能な興味ある細菌性微生物の同定方法。
【請求項２８】
式（Ｉ）：
【化６】
2004524290.tif 000022
[式中、Ｒは水素、及びＣ１−４アルキル、例えばメチル、エチル、プロピル、及びブチルからなる群から選択され、一方Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、及びＲ４は水素、ハロゲン、シアノ、ニトロ、カルボキシ、アミノ、１または２のＣ１−４アルキル基で置換されたアミノ、アミノメチル、ヒドロキシ、Ｃ１−４アルコキシ、カルボキシアルキル、及びスルホニルからなる群から独立に選択される]
の発色性３−インドキシルコリンホスファート化合物の調製方法であって、
以下の反応：
【化７】
2004524290.tif 000023
[式中、Ａは水素、またはＣ１−４アルキル、例えばメチル、エチル、プロピル、及びブチルを含むＮ保護基を表し；及びＸは前記コリンの塩の対応するカウンターアニオンである]
によって、コリンの塩と、式（ＩＩ）を有する対応するインドキシル−３−ジクロロホスファートを反応させて、中間体化合物（ＩＩＩ）を得る工程；
及び任意に、式（ＩＩＩ）の前記中間体からＮ保護基を除去する工程、及び／または式（ＩＩＩ）の前記中間体に前記Ｒ基を導入する工程；
を含む方法。
【請求項２９】
請求項１から５のいずれか一項に記載の３−インドキシルコリンホスファート化合物を取り込ませることによって基質を生産する工程を含む、細菌性ホスファチジルコリン特異的ホスホリパーゼＣ酵素を検出可能な基質の調製方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細菌代謝産物、即ちそのような微生物により分泌され、さもなければ生産される物質の、そのような代謝産物と接触して発色を形成することによる検出のための有用性を有する新規な化合物及び基質、並びにそのような化合物及び基質の製造方法、及び細菌を含む各種の微生物の検出及び同定のためのそれらの使用方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ホスホリパーゼＣ酵素は、各種の細菌で見出されている。これらの酵素は、宿主に対する細菌の病原性と関連している。
【０００３】
とりわけ、ホスファチジルコリン特異的ホスホリパーゼＣ（ホスファチジルコリンコリンホスホヒドロラーゼ、またはレシチナーゼＣとしても知られ、ここで簡略化のためＰＣ−ＰＬＣと称される；酵素分類ＥＣ３．１．４．３）は、Clostridium perfringens、Clostridium novyi、Bacillus cereus、Bacillus thuringensis、Pseudomonas aeruginosa、及びStaphylococcus aureus（J.G. Sonder; Trends in Microbiology 5 (1997), 156参照）、並びにBacillus anthracis（D.M. Guttmann, D.J. Ellar, FEMS Microbiology Letters 188 (2000) 7参照）、Helicobacter pylori（J.-H. Weitkamp等; Zentrablatt fur Bakteriologie 280 (1993), 11参照）、Legionella pneumophila（W.B. Baine; Jounal of General Microbiology 134 (1988), 489参照）、及びListeria monocytogenes（A. Coffey等; Applied and Environmental Microbiology 62 (1996), 1252参照）を含む各種の細菌で見出すことができることが知られている。さらにＰＣ−ＰＬＣは、酵母、例えばCandida albicans、及び糸状菌、例えばAspergillus fumigatus（M. Birth等; Infect. Immun. 64 (1996), 751参照）でも見出されている。
【０００４】
ＰＣ−ＰＬＣのアッセイのためのいくつかの方法が開発されている。より最近のアッセイのあるものは、E.L. Krug及びC. Kent（Methods in Enzymology 71 (1981), 347（非特許文献１）参照）によってレビューされている。最も一般的に使用される方法は、天然基質ホスファチジルコリンに対するホスホリパーゼＣの反応によって生産されるコリンホスファートを検出する。他の方法のためには特別な装置が必要とされる。全てのこれらの方法は、特定のモーメントでのサンプル中に存在する酵素の全量の測定のみを許容し、それ故不連続的アッセイ方法である。さらに、全てのこれらの方法は、ＰＣ−ＰＬＣを分泌する微生物の直接的検出には明らかに適さない。
【０００５】
１９７６年、Kurioka等（S. Kurioka, M. Matsuda; Analytical Biochemistry 75 (1976), 281（非特許文献２）参照）は、４−ニトロフェニルコリンホスファート（ｐ−ニトロフェニルホスホリルコリン）を含む基質を使用するＰＣ−ＰＬＣのための連続的分光光学的アッセイを報告した。Kuriokaは、１９６８年にこの化合物を初めて合成した（S. Kurioka; Jounal of Biochemistry 63 (1968), 678（非特許文献３）参照）。
【０００６】
しかしながら、この基質はいくつかの欠点を有する。この基質に対する酵素の特異的活性は極端に低い。合理的なＰＣ−ＰＬＣのアッセイのため高濃度（６０％まで）のソルビトールまたはグリセロールを添加した後でさえ、依然として低い切断速度のみが発生する。かくして、Krug及びKentによって既に述べられているように、この方法は、純粋な酵素調製物での調査のためのみに適している。これは、この基質がＰＣ−ＰＬＣを含む細菌または細菌分泌物の直接的検出にはあまり適していないことを意味する。
【０００７】
さらに、酵素での切断に際して遊離される４−ニトロフェノラートは水溶性であり、かくして培地に移動するために、この基質は植菌培地には使用できない。さらに、４−ニトロフェノラートの黄色は、体液のような生物学的サンプルまたは培養培地においてバックグランドで妨げられるであろう。
【０００８】
要約すると、従来技術のアッセイ方法は非特異的であり、柔軟ではなく、サンプル中の実際のＰＣ−ＰＬＣ濃度の連続的測定を許容しない。
【０００９】
ＰＣ−ＰＬＣを生産する細菌の検出及び同定のための従来技術の方法は、新たに調製された卵黄のアガーを使用する。卵黄は各種のホスファチドを含む；主な構成成分は、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、及びイノシトールホスファチドである。ホスファチジルコリンはＰＣ−ＰＬＣによって切断され、コリンホスファートと水不溶性ジグリセリドを形成し、後者は卵黄のアガー上でＰＣ−ＰＬＣを生産する細菌コロニーの周りに不透明な領域を生ずる。
【００１０】
これらの方法は、粗ダイズレシチンを含むレシチンアガー（G.L. Chrisope等; Applied and Environmental Microbiology 31 (1976), 784（非特許文献４）参照）の使用によって改良された。ＰＣ−ＰＬＣを分泌する細菌は、酵素の存在を示すコロニーの周りの濁ったハロを示した。穏やかな度合いの反応を生産する平均時間は、約２から３日であった。他のホスホリパーゼ、例えばホスホリパーゼＡまたはホスファチジルイノシトール特異的ホスホリパーゼＣ（ＰＩ−ＰＬＣ）もまた、コロニーの周りの不透明な領域を生産するレシチンの他の構成成分として機能するため、この検出法は特異性を欠く。さらに、そのような領域についてプレートを正確にスクリーニングするためにはトレーニングが必要である。一般的に、これらの従来技術の方法は非特異的であり、煩雑であり、時間を浪費し、それ故高価である。
【００１１】
さらに、従来技術の検出システムは一般的に、各種の細菌の間を識別できない。例えば、特にBacillus cereus及びBacillus thuringiensisは、プラスミドゲノムの平行的な移動が生じる一つの種として考慮されるべきであるため（C.R. Carlson, Applied and Environmental Microbiology 60 (1994), 1719（非特許文献５）参照）、Bacillus cereusとBacillus thuringiensisの間を識別する単純なプレーティング培地は存在しない。
【非特許文献１】
E.L. Krug及びC. Kent, Methods in Enzymology 71 (1981), 347
【非特許文献２】
Kurioka等, S. Kurioka, M. Matsuda; Analytical Biochemistry 75 (1976), 281
【非特許文献３】
S. Kurioka; Jounal of Biochemistry 63 (1968), 678
【非特許文献４】
G.L. Chrisope等; Applied and Environmental Microbiology 31 (1976), 784
【非特許文献５】
C.R. Carlson, Applied and Environmental Microbiology 60 (1994), 1719
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
従って、従来技術の欠点を避ける、ＰＣ−ＰＬＣの容易で簡便な検出のための新規な発色性化合物を提供することが、本発明の主な目的である。
【００１３】
従来技術の基質または方法の欠点を実質的に有さない、ブロス、特にプレーティング培地での使用を含む簡便な分光光学的及び／または組織化学的アッセイ方法によってＰＣ−ＰＬＣを生産する微生物の検出及び／または同定のための新規な発色性基質及ぶ方法を提供することが、本発明の別の主な目的である。
【００１４】
各種の病理学的細菌、例えばClostridium perfringens、Pseudomonas aeruginosa、Helicobacter pylori、Legionella pneumophila、Bacillus cereus、Bacillus anthracis、Listeria monocytogenes、及び他のものを検出及び／または同定するための手段を提供することが、本発明のさらなる目的である。
【００１５】
本発明のまた別の目的は、Bacillus thuringiensisからBacillus cereusを識別するための方法である。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
ここでの開示から明らかとなる前述及びさらなる目的及び利点は、式（Ｉ）の特定の新規な発色性化合物によって達成されるであろう：
【化８】
2004524290.tif 000002
[式中、Ｒは水素、及びＣ１−４アルキル、例えばメチル、エチル、及びプロピルとブチルの全ての考え得るアイソマーからなる群から選択され、一方Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、及びＲ４は水素、ハロゲン（例えばフッ素、塩素、臭素、及びヨウ素）、シアノ、ニトロ、カルボキシ、アミノ、１または２のＣ１−４アルキル基で置換されたアミノ、アミノメチル、ヒドロキシ、Ｃ１−４アルコキシ、カルボキシアルキル、及びスルホニルからなる群から独立に選択された基である]。
【００１７】
本発明に係る化合物に関連してここで使用される用語「発色性」は、細菌との相互作用に際して、特にＰＣ−ＰＬＣとの相互作用に際して、色を発する、即ち視覚的または比色定量的に検出可能となるそのような化合物の能力を示すように企図される。
【００１８】
用語「検出」または「同定」は、検出法及びアッセイ技術、並びにそのような方法または技術での使用のための物質または基質を含むようにここで企図される。
【００１９】
当業者に明らかであるように、前述の式（Ｉ）の範囲内で最も好ましい化合物は、ＰＣ−ＰＬＣを検出するための基質として使用された際に深色のインジゴを生じ、好ましくは容易に入手可能で、一般的に組織化学的使用のために適したものである。好ましい式（Ｉ）の化合物の典型例は、ここで以下に示されるであろう。
【００２０】
そのような説明によって制限されることを企図しないが、ＰＣ−ＰＬＣ酵素の検出のための基質としての式（Ｉ）の化合物の有効性は、細菌性ＰＣ−ＰＬＣによる本発明に係る化合物の切断が、コリンホスファートと（任意に置換された）インドキシル（３−ヒドロキシインドール）の形成を導くであろう事実に存在すると介される。（任意に置換された）インドキシルは、その後迅速に二量体形成し、環境の酸素または別の酸化剤によって酸化されて、深色のインジゴ色素を形成し、それは簡便な方法及び装置手段によって高感度で比色定量的検出に適した周知の発色分子である。
【００２１】
プレーティング培地上で、インジゴ色素は、水性媒体に実質的に不溶性である特徴的で強力な発色性沈降物を形成するであろう。その結果、形成された発色はコロニーと共に存在し、プレート中に拡散することはない。また形成された発色は、培地の黄色のバックグランドからでさえ明らかに識別されるであろう。かくして、ＰＣ−ＰＬＣに対する新規な化合物及び基質は、組織化学的使用に非常に良く適している。以下に示されるように、式（Ｉ）の基質及び化合物を使用する培地は、一般的に検出を改良して容易にし、細菌及び他の微生物のＰＣ−ＰＬＣ生産コロニーを同定するのに役立つであろう。
【００２２】
第二の実施態様によれば、本発明は、微生物または細菌活性の指標としての、ホスファチジルコリン特異的ホスホリパーゼＣ酵素を検出するための基質を提供する。前記基質は、好ましくは適切な培地、例えば典型的に水性アガー−アガーまたは同様なゲル形成物質において、少なくとも一つの式（Ｉ）の発色性３−インドキシルコリンホスファート化合物を含む。
【００２３】
ここで特に式（Ｉ）の化合物と結びつけて使用される用語「基質」は、少なくとも一つの式（Ｉ）の化合物が、適切な培地、例えば水性アガー−アガーまたは従来のバッファー溶液において、ＰＣ−ＰＬＣを検出するために使用されることを意味するように企図される。
【００２４】
第三の実施態様によれば、本発明は、ホスファチジルコリン特異的ホスホリパーゼＣ酵素の検出方法を提供し、その方法は、ホスファチジルコリン特異的ホスホリパーゼＣ酵素を含む疑いのあるサンプルを、少なくとも一つの式（Ｉ）の化合物を含む本発明に係る基質と接触させ、ここで−前述のように−そのような化合物は、ＰＣ−ＰＬＣ酵素による切断に感受性であり色素を生ずる工程；及び微生物の活性の結果として、サンプル中に疑われるＰＣ−ＰＬＣ酵素の結果として発色の形成をモニターする工程を含む。
【００２５】
第四の実施態様によれば、本発明は、前記サンプルを本発明に係る式（Ｉ）の化合物の基質と組み合わせ、分光光学的手段、特に比色定量手段によって生成した混合物を調べることによる、サンプル中の微生物活性の検出方法を提供する。
【００２６】
第五の実施態様によれば、本発明は、微生物活性の指標としての、ＰＣ−ＰＬＣの検出における使用のための、少なくとも一つの式（Ｉ）の化合物を含むキットを提供する。
【００２７】
別の実施態様によれば、本発明は、スペクトル光測定手段によるＰＣ−ＰＬＣの検出のための連続的アッセイ方法を提供する。
【００２８】
さらなる実施態様によれば、本発明は、以下の種：Clostridium perfringens、Bacillus cereus、Bacillus anthracis、Bacillus thuringiensis、Pseudomonas aeruginosa、Listeria monocytogenes、Helicobacter pylori、及びLegionella pneumophilaの一つ以上の病理学的株−そのような株を含む疑いのあるサンプル中の−の存在を検出する方法を提供する。
【００２９】
さらなる実施態様によれば、本発明は、以下の工程：
（Ａ）興味ある微生物を含む疑いのある試験サンプルを準備する工程；
（Ｂ）好ましくは富栄養ブロスステップに試験サンプルをかける工程；
（Ｃ）少なくとも試験サンプルの一部、または工程（Ｂ）で得られた産物を、微生物に曝した際に発色を生ずることが可能な少なくとも一つの式（Ｉ）の化合物を含む培地である、微生物の培養に適した培地に移す工程；
（Ｄ）前記発色を示す少なくとも一つのコロニーを形成するように移された一部を含む培地を培養する工程；及び
（Ｅ）最終同定のために発色化コロニーの少なくとも一部を回収する工程；
を含む、ホスファチジルコリン特異的ホスホリパーゼＣ（ＰＣ−ＰＬＣ）を生産可能な細菌性微生物の同定方法を提供する。
【００３０】
また別の実施態様によれば、本発明は、コリン塩、例えばハロゲン化コリン、典型的に塩化物またはヨウ化物と、対応する（任意にＮ保護化）インドキシル−３−ジクロロホスファート（以下の式（ＩＩ））を反応させて、例えば約１時間以上、例えば１−８時間の期間の間、環境温度、典型的に１５−３０℃で、反応媒体として有機塩基、例えばキノリン、トリエチルアミン、Ｎ−メチルホルホリン、またはピリジン中で反応物を攪拌することにより、中間体化合物（以下の式（ＩＩＩ））を形成する工程：
【化９】
2004524290.tif 000003
[式中、Ａは水素、または窒素原子の従来の保護基、例えばＣ１−４アルキル（好ましくはメチル）、アシル（好ましくはアセチルまたはベンゾイル）、またはＢｏｃ、ＣＢＺ、Ｆｍｏｃ等のようなペプチド化学から既知のタイプのＮ保護基を表し；及びＸは無機酸または有機酸、例えば塩酸またはクエン酸から由来するアニオンであり；Ｒ１−Ｒ４は前述の式（Ｉ）と関連して定義された意味を有する]
による、式（Ｉ）の化合物の生産方法を提供する。
【００３１】
式（Ｉ）の化合物の合成を完成するために、式（ＩＩＩ）の中間体上の任意のＮ保護基は、後の第二の反応工程において−例えば前記基の性質に依存して、酸性または穏やかに塩基性の切断、あるいは水素化分解によって、またはペプチド化学から既知の他の従来法によって−除去される；必要または所望であれば、Ｒ基は従来の反応によって導入される。
【００３２】
前述のことから、以下に定義されるその好ましい種を含む式（Ｉ）の化合物は、標準的なスクリーニング方法またはプレーティング培地における応用のための基質としての使用に必要とされるように、経済的に且つ商業的な量で生産できる。
【００３３】
またさらなる特徴点によれば、本発明は、式（Ｉ）の３−インドキシルコリンホスファート化合物を中に取り込むことによって、基質を生産する工程を含む、細菌性ホスファチジルコリン特異的ホスホリパーゼＣ酵素を検出可能な基質の調製方法を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３４】
式（Ｉ）の化合物の群では−好ましくは高い発色性性のため−Ｒは水素またはメチルから選択され、Ｒ１は水素及びハロゲン（塩素及びフッ素がしばしば好ましい）からなる群から選択され、Ｒ２は水素、シアノ、ニトロ、及びハロゲン（臭素及びヨウ素がしばしば好ましい）からなる群から選択され、Ｒ３及びＲ４は水素及びハロゲン（塩素及びフッ素がしばしば好ましい）からなる群から独立に選択される。
【００３５】
特に好ましい特異的な新規化合物は、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシルコリンホスファート、即ち以下の式（ＩＶ）の化合物である：
【化１０】
2004524290.tif 000004
【００３６】
式（ＩＶ）の化合物は、ここで以下に「Ｘ−ホス−コリン」または「Ｘ−ＣＰ」と称されるであろう。
【００３７】
本発明に係る別の特異的化合物は、３−インドキシルコリンホスファート、即ち以下の式（Ｖ）の化合物である：
【化１１】
2004524290.tif 000005
【００３８】
式（Ｖ）の化合物は、ここで以下に「Ｙ−ホス−コリン」または「Ｙ−ＣＰ」と称されるであろう。
【００３９】
両者の化合物は、水中に遊離して可溶性の白色の結晶状パウダーである。Ｘ−ホス−コリン（Ｘ−ＣＰ）及びＹ−ホス−コリン（Ｙ−ＣＰ）でなされた試験は、化合物（Ｉ）及びそれらを含む基質が、光から保護されると、約５℃未満の温度で長期的に安定であることを示した。かくして同様な特性は、他の式（Ｉ）の化合物についても合理的に予測できる。
【００４０】
Ｘ−ホス−コリン及びＹ−ホス−コリンでなされた試験に基づいて、式（Ｉ）の化合物は、環境温度で約４から約１０の範囲のｐＨで少なくとも１０日間従来のバッファー溶液（例えばクエン酸塩／塩酸；Ｈｅｐｅｓ／ＮａＯＨ；Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ；ホウ酸／塩化カリウム−水酸化ナトリウム）、並びに従来のプレーティング培地、例えばTryptic Soy Agarで安定であることが分かった。かくして、バッファー培地におけるゆっくりとした非酵素的加水分解によって引き起こされるバックグランドシグナルの問題（従来技術の基質４−ニトロフェニルコリンホスファートで観察されるような）は避けられる。再言すると、同様な特性は、他の式（Ｉ）の化合物についても合理的に予測できる。
【００４１】
ＰＣ−ＰＬＣによるＸ−ＣＰの切断、二量体形成、及び後の酸化から生成する５，５’−ジブロモ−４，４’−ジクロロインジゴは、それ自体既知の色素であり、６５２ｎｍで最大を有する〜５００ｎｍから〜７００ｎｍの範囲の広い吸収を有する。この色素は、約６０００Ｌｍｏｌ−１ｃｍ−１での吸収係数を有する強烈なブリリアントブルーの発色を有する。
【００４２】
本発明の目的のために特に適した式（Ｉ）の化合物のさらなる好ましい群は、以下のものである：
４−クロロ−３−インドキシルコリンホスファート；
５−ブロモ−３−インドキシルコリンホスファート；
５−ブロモ−６−クロロ−３−インドキシルコリンホスファート（ここで「Ｍａｇｅｎｔａ−ＣＰ」と称される）；
６−クロロ−３−インドキシルコリンホスファート（ここで「Ｓａｌｍｏｎ−ＣＰ」と称される）；及び
６−フルオロ−３−インドキシルコリンホスファート。
【００４３】
Ｍａｇｅｎｔａ−ＣＰ及びＳａｌｍｏｎ−ＣＰは、ＰＣ−ＰＬＣにより切断、二量体形成、後の酸化が、特徴的な赤色の発色の色素を生産するため、この群の中で特別である。
【００４４】
本発明の重要な特徴点によれば、式（Ｉ）の化合物及びそれらを含む基質は、例えばClostridium perfringensまたは他の微生物種由来のＰＣ−ＰＬＣの連続的分光光学的アッセイのために使用される。前述のように、従来使用されている４−ニトロフェニルコリンホスファートに対する高濃度（約６０％まで）でのソルビトールまたはグリセロールの添加は、Clostridium perfringens ＰＣ−ＰＬＣによる４−ニトロフェニルコリンホスファートの酵素的切断を加速し、合理的であるが非常に低い切断速度を有するＰＣ−ＰＬＣの検出のためのアッセイを生成する。
【００４５】
他方で、式（Ｉ）の化合物及びそれらを含む基質に対するデオキシコール酸、グリコール、または特にソルビトールの添加は、式（Ｉ）の化合物に対する酵素的反応の強さを改良せず、むしろ反応を阻害した。
【００４６】
さらに、Clostridium perfrigensのＰＣ−ＰＬＣによる従来技術の基質４−ニトロフェニルコリンホスファートの切断のための至適温度が、６５℃であると報告されている（J.-H. Weitkamp; Zentralblatt fur Bakteriologie 280 (1993), 15参照）が、約６０℃への温度の上昇は、酵素的加水分解を顕著には加速しなかった。
【００４７】
予期せぬことであるが、血清アルブミン、界面活性剤、好ましくはコバルト、マンガン、ニッケル、亜鉛、カルシウム、またはマグネシウムの二価イオンから選択される金属イオンからなる群から選択される少なくとも一つの添加剤を使用した場合、切断速度の顕著な加速が見出されている。
【００４８】
さらなる好ましい実施態様によれば、本発明に係る基質は、好ましくはコバルト、マンガン、ニッケル、亜鉛、カルシウム、またはマグネシウムの二価イオンから選択される少なくとも一つの金属イオン、並びに界面活性剤及び血清アルブミンからなる群から選択される少なくとも一つのメンバーをさらに含む。
【００４９】
好ましく選択される添加剤、または添加剤の組み合わせは、検出される微生物に依存する。好ましい添加剤または添加剤の組み合わせは、２まらは３の促進係数を提供する従来技術と比較して、少なくとも１００の係数によって酵素的切断を促進したことに注意すべきである（J.-H. Weitkamp; Zentralblatt fur Bakteriologie 280 (1993), 11、及びW.B. Baine; Journal of General Microbiology 134 (1988), 489参照）。
【００５０】
これは驚くべきことであり、一定量のリン脂質鎖の疎水性結合が、ＰＣ−ＰＬＣの「天然の基質」、例えばホスファチジルコリンに対するこの水溶性表面活性酵素について重要であると思われるため、予測されていなかった。また、脂肪酸カルボニル（好ましくは妨害されていない）は、保護結合及び後の加水分解においてより重要であると記載されている（El-Sayed等; Biochimica et Biophysica Acta 837 (1985), p. 326参照）。さらに、El-Sayed等は、脂肪酸鎖が脂質分子上の疎水性結合部位を生産するために十分に長くて良いことを示している（El-Sayed等; Biochimica et Biophysica Acta 837 (1985), p. 333参照）。しかしながら、本発明に係る化合物は非常に極性であり、いずれの疎水性部位、例えば比較的長いアルキル鎖、並びに脂肪酸カルボニルを欠いている。
【００５１】
かくして、好ましく正しい添加剤、及び添加剤の組み合わせを使用して、本発明に係る基質は、特定の微生物由来のＰＣ−ＰＬＣのずっと高感度のアッセイのために利用できる。典型的に、好ましく適切な添加剤または添加剤の組み合わせは、検出される各微生物、またはアッセイされる各ＰＣ−ＰＬＣについて個々的に評価されるであろう。これは、例えば以下に例示されるような、数個の単純な実験によって当業者によってなされ得る。
【００５２】
典型的に、本発明に係る化合物は、アッセイされる微生物のＰＣ−ＰＬＣに依存して、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、特定の二価金属イオン、例えばコバルト、マンガン、ニッケル、亜鉛、マグネシウム、またはカルシウム、及び界面活性剤、好ましくは非イオン性界面活性剤、例えばポリソルバート、より好ましくはTween(登録商標)80（ポリオキシエチレンソルビタンモノオレアート）から選択される少なくとも一つのエンハンサーと組み合わせて使用される。
【００５３】
理論的に制限されることを企図しないが、ＢＳＡの特別な効果は、疎水性の基質に対して通常機能する酵素、例えばホスファチジルコリンを切断するＰＣ−ＰＬＣの反応を促進することが既知の特性である、タンパク質の疎水性特性から由来すると解される。
【００５４】
特に好ましい実施態様では、本発明に係る基質は、少なくとも一つの式（Ｉ）の化合物、好ましくはＸ−ＣＰと、ＢＳＡ及びコバルトの二価塩、好ましくは硫酸コバルト（ＩＩ）の組み合わせを含む。この組み合わせは、Clostridium perfringens ＰＣ−ＰＬＣによるＸ−ＣＰの極端な切断促進を提供することが見出されている。かくして、Ｘ−ＣＰと共にこの組み合わせを使用して、Clostridium perfringens由来のＰＣ−ＰＬＣの最も高感度の測定が利用可能である。
【００５５】
従来技術の基質である４−ニトロフェニルコリンホスファートと比較すると、ＰＣ−ＰＬＣのアッセイが、好ましくは極少量の添加剤を加えることによって、一般的なバッファー溶液で実施できるため、本発明に係る化合物及び基質は、さらなる利点を提供する：４−ニトロコリンホスファートを使用した場合、酵素的加水分解の合理的速度は、ソルビトール中のそのような従来技術の基質の粘性溶液の使用を必要とする。
【００５６】
本発明のさらに重要な特徴点は、好ましくは分光光学的手段、特に比色測定的手段による、微生物におけるＰＣ−ＰＬＣの検出のための、式（Ｉ）の化合物、例えば特に好ましい５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシルコリンホスファート（Ｘ−ホス−コリン；Ｘ−ＣＰ）または３−インドキシルコリンホスファート（Ｙ−ホス−コリン；Ｙ−ＣＰ）の使用に関する。
【００５７】
以下の実施例から得られるデータによって明らかに示されるように、発色性基質Ｘ−ＣＰ及びＹ−ＣＰは、青緑色−青色のコロニーの発色の形成により、ＰＣ−ＰＬＣを検出するための従来のプレーティング培地で使用できる。不溶性により培地に対する色素の移動が妨げられるため、発色はコロニー内に維持される。
本発明は、実施例を使用して、及び添付の図面を参考にして、より詳細に制限することなくここで説明されるであろう。
【実施例】
【００５８】
式（Ｉ）の化合物の調製
１−アセチル−５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシル−ジクロロホスファート（１−アセチル−５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシル−ホスホロジクロロリダート）を、本質的に既知の態様で調製した。J.P. Horwitz, J.V. Freisler; Jounal of Medicinal Chemistry 13 (1970), 1024参照。１−アセチル−３−インドキシル−ジクロロホスファートを、類似の態様で調製した。ヨウ化コリンを、B. Chesebro及びH. Metzger（Biochemistry 11 (1972), 766）の方法によって合成した。
【００５９】
実施例１：Ｘ−ホス−コリン（ＩＶ）の調製
工程１：１−アセチル−５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシルコリンホスファートの調製
１−アセチル−５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシル−ジクロロホスファート（４．０６ｇ、１０ｍＭｏｌ）を、純粋アセトニトリル（１２ｍｌ）中で窒素下でけん濁し、ヨウ化コリン（２．３１ｇ；１０ｍＭｏｌ）を加えた。混合物を環境温度で攪拌し、キノリン（１．４６ｍｌ；１０ｍＭｏｌ）を５分の間隔以内で滴下した。ヨウ化コリンがゆっくりと溶解した。わずかに濁った溶液が１時間後に得られ、同じ温度でさらに２時間の期間攪拌した。
【００６０】
濾過によりある程度の固体を除去した後、透明な黄褐色の濾過物を、水中（２０ｍｌ）のピリジン（５．６ｍｌ；７０ｍＭｏｌ）の冷却（０−５℃）溶液に滴下した。
【００６１】
溶液を減圧下で蒸発し、黄褐色の油を生じ、それを水中（６０ｍｌ）に溶解した。混合ベッド交換樹脂MB-150 (Sigma # A-5710; 60g)を加え、攪拌を２０分間継続した。水中（１．５ｍｌ）に２５％の水酸化アンモニウム溶液を加えることによってｐＨを〜５に調節し、ガラスフィルター漏斗を通じた濾過によって樹脂を除去し、水で洗浄した。
【００６２】
エタノール（１０ｍｌ）を濾過物に加えて起泡を防止し、減圧下で回転蒸発によって４０ｍｌの容量に溶液を注意深く濃縮した。環境温度への冷却の際に、無色の産物の結晶が得られた。懸濁液を一晩５℃で貯蔵した。産物を濾過によって回収し、氷冷水（２×２ｍｌ）で二度、アセトンで一度洗浄し、最後に真空で乾燥し、１．２８ｇの白色結晶パウダーを得た。０．２０ｇと０．２４ｇの別の物質を母液から得て、アセトンでそれぞれ洗浄した。全体の収率は、１．７２ｇ（３７％）、ｍ．ｐ．２４１−２４３℃（ｄｅｃ．）であった。
【００６３】
【数１】
2004524290.tif 000006
【００６４】
工程２：５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシルコリンホスファート（ＩＶ）の調製
１−アセチル−５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシルコリンホスファート（０．５１ｇ；１．１ｍＭｏｌ）を、窒素下でメタノール（１０ｍｌ）中のアンモニアの２Ｎ溶液に溶解した。抽出物を迅速に溶解し、緑黄色の溶液が生じた。２時間後溶媒を真空下で除去した。
【００６５】
かくして得られた緑ベージュ色の泡を、温めた（〜５０℃）エタノール（２ｍｌ）に溶解し、アセトン（４ｍｌ）を加えた。溶液を種晶し、数分後に白色の結晶状沈降物が形成した。懸濁物を環境温度で３０分攪拌し、その際さらなるアセトン（１ｍｌ）を加えた。懸濁液をガラスフィルター漏斗を通じて６０分後に濾過し、結晶をアセトン（２×２ｍｌ）で洗浄した。産物を真空下で乾燥し、０．３６ｇ（８０％）のほぼ無色の結晶状パウダーを得た。ｍ．ｐ．２４７−２４８℃（ｄｅｃ．）。
【００６６】
【数２】
2004524290.tif 000007
【００６７】
実施例２：３−インドキシルコリンホスファート（Ｖ）の調製
工程１：１−アセチル−３−インドキシルコリンホスファートの調製
１−アセチル−３−インドキシル−ジクロロホスファート（８．７６ｇ、３０ｍＭｏｌ）を、純粋アセトニトリル（３６ｍｌ）で窒素下で懸濁し、ヨウ化コリン（６．９３ｇ；３０ｍＭｏｌ）を加えた。混合物を環境温度で攪拌し、キノリン（４．３８ｍｌ；３０ｍＭｏｌ）を１５分間滴下した。ヨウ化コリンをゆっくりと溶解し、わずかに濁った溶液が３０分後に得られた。溶液を同じ温度で数字管攪拌した。黄褐色の液体を、水中（６０ｍｌ）にピリジン（１６．８ｍｌ；２１０ｍＭｏｌ）の冷却（０−５℃）溶液に滴下した。
【００６８】
溶液を減圧下で５５−６０℃で蒸発し、黄褐色の油が得られ、それを水中（６０ｍｌ）に溶解した。少量の固体を濾過により除去した。水（１０５ｍｌ）を濾過物に加え、混合ベッド交換樹脂MB-150 （Sigma＃A-5710;９０ｇ）を加えた。攪拌を１０分間継続した。樹脂を濾過により除去し、水で洗浄した。
【００６９】
得られた黄橙色の濾過物を、減圧下で５５−６０℃で回転蒸発により、５−１０ｍｌの容量に注意深く濃縮した。産物の無色の結晶が、環境温度への冷却の際に自然に生じた。懸濁液を同じ温度で３０分間攪拌し、その後５℃で一晩貯蔵した。産物を濾過によって回収し、氷冷水（４ｍｌ）で一度、アセトン（６ｍｌ）で一度洗浄し、最後に真空下で乾燥し、４．３８ｇ（４３％）の白色結晶パウダーを得た。ｍ．ｐ．２５９−２６０℃（ｄｅｃｆ．）。
【００７０】
【数３】
2004524290.tif 000008
【００７１】
工程２：３−インドキシルコリンホスファート（Ｖ）の調製
メタノール（２８ｍｌ）中のアンモニアの２Ｎ溶液を、１−アセチル−３−インドキシル−コリンホスファート（２．７２ｇ；８ｍＭｏｌ）に１０−２０℃の温度で窒素下で加えた。抽出物を迅速に溶解し、わずかに青色の溶液を得た。３時間後にアセトン（８０ｍｌ）を加えた。溶液を種晶し、その際に白色の結晶状沈降物が迅速に形成された。懸濁液を環境温度で３０分間攪拌し、次いでアイスバスに２時間置いた。産物をガラスフィルター漏斗での濾過により回収し、結晶をアセトン（２×２０ｍｌ）で洗浄した。産物を真空下で乾燥し、１．５８ｇ（６６％）の白色の結晶パウダーを得た。ｍ．ｐ．２６１−２６２℃（ｄｅｃ．）。
【００７２】
【数４】
2004524290.tif 000009
【００７３】
実施例３：正しく好ましい添加剤、またはClostridium perfringens ＰＣ−ＰＬＣに対する切断速度エンハンサーの組み合わせの評価
Clostridium perfrigensのＰＣ−ＰＬＣでの酵素的加水分解によるＸ−ホス−コリン（Ｘ−ＣＰ）からの迅速な発色形成に対する、好ましい添加剤または添加剤の組み合わせを選択するため、単純な試験チューブ実験を実施した。
【００７４】
〜４０℃での予備試験により、Ｘ−ＣＰに対して、０．１％でのオクチル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド(Biosynth O-2700)；０．１％でのオクチル−β−Ｄチオグルコピラノシド(Biosynth O-2710)；０．１％から１％の範囲でのＮ−ノナノイル−Ｎ−メチル−グルカミン(Fluka 74315)；及び０．１％でのグリコール酸のナトリウム塩(Sigma G-7132)を使用した場合、酵素の切断速度のわずかな促進が得られることが示された（％単位で示される値は、容量当たりの重量での添加剤濃度を示す）。全てのこれらのデタージェント及び界面活性剤それぞれについて、ＢＳＡと組み合わせた場合にさらなる促進は観察されなかった。
【００７５】
酵素の至適温度に近い６０℃でさらなる実験を実施した。実施例４参照。基本的なパラメーターは以下の通りであった：
〜１．７ｍｇのＸ−ＣＰを、１ｍｌのｐＨ７．０の０．１Ｎ ＨＥＰＥＳ／ＮａＯＨバッファーに溶解し、〜４ｍＭｏｌの基質の溶液を生じた。
【００７６】
酵素的切断の促進を試験するために、単独または組み合わせて、以下の化学物質をバッファーに添加した：
2004524290.tif 000010
【００７７】
Clostridium perfringensから得た１ユニット（Ｕ）のホスホリパーゼＣ(Sigma P-4030、以下の実施例４−６参照)を、各溶液に加えた。所定の期間の後、チューブを視覚的にチェックした。氷１は、６０℃で１時間後の前述の試薬の各種の組み合わせを使用する溶液の発色を示す。
【００７８】
【表１】
2004524290.tif 000011
【００７９】
表１は明らかに、切断の速度に対する添加剤の劇的な効果を示す。かくして、Ｘ−ＣＰを含む基質に対するＢＳＡ及びＣｏ２＋の添加は、Clostridium perfringens ＰＣ−ＰＬＣについての切断速度を強力に加速する。ＢＳＡ及びコバルトイオンの組み合わせでの促進は、Clostridium perfringensのＰＣ−ＰＬＣを検出するために、Ｘ−ホス−コリン（Ｘ−ＣＰ）を非常に有用な化合物及び基質とする顕著な役割を有する。
【００８０】
しかしながら、最適な速度の促進を得るために、添加剤または添加剤の組み合わせの正確な選択を必要とするので、速度の促進における顕著なバリエーションが観察される。ＢＳＡ／Ｃｏ２＋システムと比較して、マンガンまたはニッケルの添加は、切断速度を穏やかにのみ加速する一方、カルシウム及び亜鉛イオンは、阻害効果を有する。ＢＳＡと組み合わせると、マンガンイオンは弱い促進を引き起こし、一方でニッケルイオンは阻害を引き起こす。明らかなように、大きな切断速度の促進のための添加剤の最適な選択は、特異的な微生物に依存し、かくして前記例示されるような単純な試験によって最適化が図れるであろう。
【００８１】
実施例４−６：Ｘ−ホス−コリンを使用するClostridium perfringensから得たＰＣ−ＰＬＣの比色測定アッセイ
Pye Unicam SP 6-450 UV/VISとして既知の分光光度計を、これらの実施例で使用した。分光光度計を６５２ｎｍにセットした。
【００８２】
実施例５及び６における試験のための一般的方法は以下の通りである：
【００８３】
全ての成分を、ｐＨ７．０の０．１Ｍ ＨＥＰＥＳ／ＮａＯＨバッファーに溶解した。求キュベット（３ｍｌの容量）に、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ；Fluka 05470）と、各種の量のコバルト塩を、２ｍｌのバッファー溶液に溶解した。Clostridium perfringensから得たＰＣ−ＰＬＣ(Sigma P-4039；タイプXIV、クロマトグラフィーで精製した緩衝塩の凍結乾燥パウダー；活性：卵黄のホスファチジルコリンを使用してｍｇのタンパク質当たり３００ユニット（Ｕ）(Lowry法))のストック溶液からの等量物を加えた。酵素のストック溶液は、１ユニット／１０μＬの溶液の最終濃度を生ずるように、前述のバッファーにパウダーを溶解することによって調製された。各キュベット中の混合物を、６０℃で３０分インキュベートした。
【００８４】
途中で、Ｘ−ホス−コリン（Ｘ−ＣＰ）を１ｍｌのバッファーに溶解した。この溶液をキュベットに移し、Ｘ−ＣＰと基質のそれぞれの酵素的加水分解を開始した。光度計の読み取りを、各種の温度について、並びに化合物、基質、及び酵素のそれぞれの各種の濃度について、所定の期間の後に記録した。
【００８５】
実施例４：
温度の効果
第一セットの実験では、Clostridium perfringensから得たＰＣ−ＰＬＣによるＸ−ＣＰの酵素的切断に対する温度の影響を試験した。この場合、キュベットはＸ−ＣＰと基質のそれぞれの添加の前にインキュベートされないが、反応は酵素の添加によって開始された。
【００８６】
ＢＳＡ及び塩化コバルト（ＩＩ）七水和物(Fluka 60820)を、前述のバッファー中のＸ−ＣＰの溶液に添加し、以下の最終濃度を得た。再言すると、％単位で示される値は、３ｍｌの容量での容量当たりの重量での濃度を示す：
２０ｍＭ（２４．７ｍｇ／３ｍｌ）でのＸ−ＣＰ、０．３％でのＢＳＡ、０．０２５％（１．０５ｍＭｏｌ）での塩化コバルト（ＩＩ）七水和物。
【００８７】
キュベットを、環境温度（２２℃）、並びに４１℃、４６℃、５１℃、５５℃、及び６０℃でそれぞれインキュベートした。各測定を、キュベットにＰＣ−ＰＬＣ(Sigma P-4039、前述の通り)の２ユニット（Ｕ）を添加することによって開始した。
【００８８】
図１は、各種の温度についての時間の関数としての吸光度Ａの変化を示す。
【００８９】
酵素的切断の反応速度Δｃ／Δｔ（ｃ＝濃度）を、Lambert-Berr等式を使用して各曲線の直線部分のΔＡ／Δｔの傾斜から計算した：
ΔＡ＝ε・Δｃ・ｄ（ｄ＝１ｃｍ；５，５’−ジブロモ−４，４’−ジクロロインジゴ色素について吸光係数ε＝６０００Ｌｍｏｌ−１ｃｍ−１）。
【００９０】
使用された酵素の量（２ユニット（Ｕ）＝６．６６７μｇ）を考慮して、特異的な活性を速度から計算した。
【００９１】
表２は、考慮される温度についての、Clostridium perfringens ＰＣ−ＰＬＣの反応速度（３ｍｌの容量に関して）及び特異的活性[１ｎＭｏｌ分−１（μｇタンパク質）−１＝１μＭｏｌ分−１（ｍｇタンパク質）−１]を示す。
【００９２】
【表２】
2004524290.tif 000012
【００９３】
表２は、酵素活性に対する温度の顕著な影響を示す。１０℃ごとの温度の上昇について、酵素活性は３−４の係数まで増大する。例として、６０℃での切断は、環境温度でのものより約１６０倍早い。
【００９４】
実施例５：
Ｘ−ＣＰの濃度依存性
Ｘ−ＣＰ濃度の影響を、５８−５９℃で実施されたこの第二セットの実験で試験した。固定したパラメーターは以下の通りであった：０．１％でのＢＳＡ、０．０１％（０．３５６ｍＭ）での硫酸コバルト（ＩＩ）七水和物(Fluka 00622)、１ユニットの酵素、実施例４参照。
【００９５】
図２は、所定の濃度のＸ−ＣＰに対する時間に依存した６５２ｎｍでの吸光度の増大を示す。
【００９６】
表３は、表４に記載されたように計算された切断の速度（再び３ｍｌのキュベット容量について）及び特異的活性を示す。
【００９７】
【表３】
2004524290.tif 000013
【００９８】
ＰＣ−ＰＬＣ活性は、Ｘ−ＣＰ濃度に完全には比例しなかった。１５ｍＭｏｌ及び２０ｍＭｏｌのより高濃度では、活性は減少し、かくしてＰＣ−ＰＬＣ活性のMichaelis挙動を示した。同様な挙動は、ホスホリパーゼＣ−アルカリホスファターゼ結合アッセイにおいて、天然の基質ホスファチジルコリンでも観察されている(E.L. Krug, C. Kent; Archives of Biochemistry and Biophysics 231 (1984), p. 406参照)。
【００９９】
かくして、速度と濃度の逆数、即ち１／速度ｖｓ１／基質濃度、のLineweaver-Burkプロットから、速度パラメーターを測定できた。図３参照。データの直線回帰分析から、飽和条件Ｖｍａｘの下での切断の速度と、Michaelis-Menten定数Ｋｍから値を見積もることができた：
Ｖｍａｘ＝１／０．００３２＝３１２ｎＭｏｌ分−１（使用された酵素の１ユニット＝３．３３３μｇについて）；
Ｖｍａｘ＝３１２ｎＭｏｌ分−１（３．３３３μｇ酵素）−１＝９３．６ｎＭｏｌ分−１（μｇ酵素）−１〜９４μＭｏｌ分−１（ｍｇ酵素）−１；
Ｋｍ＝０．１３４９／０．００３２〜４２ｍＭｏｌ
【０１００】
Ｋｍのそのような見積もりは、Ｘ−ＣＰに対する酵素のむしろ低いアフィニティーを示す。しかしながら、Ｖｍａｘの値から、酵素結合Ｘ−ＣＰのターンオーバーは、酵素アッセイの実施において有用な程度に十分高いことは明らかである。実施例６参照。
【０１０１】
実施例６
酵素濃度依存性
これらの試験は、切断速度と適用された酵素の量の間の相関関係を確立するために実施された。パラメーターは以下の通りであった：
１０ｍＭでのＸ−ＣＰ（１２．３５ｍｇ／３ｍｌ）、０．１％でのＢＳＡ、０．０１％での硫酸コバルト（ＩＩ）七水和物。実施例５参照。
【０１０２】
図４及び５は、Clostridium perfringens由来のＰＣ−ＰＬＣの０．０１から０．２及び０．５から８ユニット（Ｕ）をそれぞれ使用する、Ｘ−ＣＰ加水分解の時間依存性を示す。
【０１０３】
再言すると、反応速度は、実施例４に記載された曲線の直線部分の傾斜から計算された。表４は、各種の量の使用された酵素についての切断の速度と特異的活性を示す（１ユニット（Ｕ）＝３．３３μｇ酵素、前記の一般的方法参照）。
【０１０４】
【表４】
2004524290.tif 000014
【０１０５】
表４は、０．０２から０．５ユニット（Ｕ）の範囲に存在する酵素の量と反応速度の間のほぼ直線状の関係を示す一方、特異的活性は０．０１ユニット（Ｕ）について減少し、より高い酵素濃度（≧１Ｕ）では実質的に減退することを示す。
【０１０６】
図６は、０．０１から０．５Ｕ（３３ｎｇから１６６７ｎｇ）の範囲の酵素量と速度のプロットである。速度と適用された酵素の量の間の比例関係が明らかである。
【０１０７】
０．５から８ユニットの酵素の範囲では、直線関係は観察されたなかった。しかしながら反応速度は、用語１，６√酵素の量に比例する；表４中の因子ＣＦはほぼ一定である。図７は、存在する酵素の０．５から８Ｕ（１．６６から２７μｇ）の範囲の１，６√酵素の量と速度の間の直線関係を示す。かくして、Ｘ−ＣＰを含む基質を使用すると、Clostridium perfrigensのＰＣ−ＰＬＣ酵素は、少なくとも３３ｎｇから２７μｇの範囲では、非常に正確にアッセイできる。この実施例は、そのようなアッセイが、単純な、即ち最適ではない条件でさえ、実践的な値を有することを示す。
【０１０８】
実施例７：
（ａ）Ｘ−ＣＰ及びＹ−ＣＰの効力を試験するためのプレーティング培地の調製とイノキュレーション
微生物株
Bacillus cereus (ATCC 13061)、Bacillus thuringiensis (ATCC 33680)、及びPseudomonas aeruginosa(ATCC 15442)を、Difco Brain Heart Infusion Agar (BHIA)スラント上に４℃で貯蔵した。培養物を毎月新鮮なBHIAスラントに移した。B. cereus、B. thuringiensis、及びP. aeruginosa細胞のループフルを、Difco Brain Heart Infusion Broth (BHIB)に無菌的に移し、２４時間３５℃でインキュベートした。インキュベーションの後、これらの細胞を使用して、ＰＣ−ＰＬＣの比色測定検出のための試験プレーティング培地にストリークした。
【０１０９】
（ｂ）発色性化合物（Ｉ）を含むプレーティング培地の調製
Difco Tryptic Soy Agar (TSA)を、基底プレーティング培地として使用した。TSAを製造者の説明書に従って調製した。培地の煮沸によりアガーを溶解し、培地を分割した。特定の濃度の以下の化学物質を、熱い培地に加えた：
０．１％（ｗｔ／ｖｏｌ）での塩化マンガン四水和物(Sigma M-3634)；
０．０５％（ｗｔ／ｖｏｌ）でのTween(登録商標)80（ポリオキシエチレンソルビタンモノオレアート；Difco）；
２０％（ｗｔ／ｖｏｌ）でのソルビトール(Difco 0179)；
０．０７８ｇ／１００ｍｌでの硫酸銅五水和物(Sigma C-7631)；
０．０１５ｇ／１００ｍｌでの硫酸亜鉛七水和物(Sigma Z-4750)；
０．０７４ｇ／１００ｍｌでの塩化カルシウム二水和物(Fisher)；
０．０１２ｇ／１００ｍｌでの硫酸マグネシウム無水物(Sigma M-7506)。
【０１１０】
各種の組み合わせで前述の化学物質を含むTSA培地を、１２１℃で１５分オートクレーブ処理した。オートクレーブ処理の後、培地を５０℃の温度にセットした水浴中に配置した。
【０１１１】
ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ；Serologicals 82-067）及びＸ−ホス−コリン（Ｘ−ＣＰ）またはＹ−ホス−コリン（Ｙ−ＣＰ）を脱イオン水に溶解した。溶液を０．４５μｍのフィルターでの濾過によって滅菌した。適当な容量の濾過物を、事前に５０℃に冷却したTSA培地に無菌条件下で加えた。
【０１１２】
ＢＳＡの最終濃度は、３２０ｍｇ／１００ｍｌであった。Ｘ−ホス−コリン（Ｘ−ＣＰ）またはＹ−ホス−コリン（Ｙ−ＣＰ）の最終濃度は、それぞれ３２ｍｇ／１００ｍｌであった。完全TSA培地をペトリ皿に注ぎ固化させた。プレートを暗所で一晩室温で維持し、培地を表面乾燥させた。
【０１１３】
実施例８：TSA培地のイノキュレート−Ｘ−ＣＰ及びＹ−ＣＰの効力の試験
前述の２４時間のBHIB培養物から得た細胞を、特定の化学物質を含むTSA培地にストリークした。Bacillus cereus、Bachillus thringiensis、及びPseudomonas aeruginosaでイノキュレートしたプレートを、２４時間３５℃で嫌気的にインキュベートした。インキュベーションの後、コロニーの形態を特別な発色のフェーズで測定した。
結果：各種のTSA培地でのBacillus cereus、Bachillus thringiensis、及びPseudomonas aeruginosaについての発色を含むコロニーの形態は、表５に示されている。
【０１１４】
【表５】
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【０１１５】
Ｙ−ＣＰを含む基質を有する各種のTSA培地でのBacillus cereus、Bachillus thringiensis、及びPseudomonas aeruginosaについての発色を含むコロニーの形態は、表６に示されている。
【０１１６】
【表６】
2004524290.tif 000016
【０１１７】
表５及び６から観察できるように、非イオン性デタージェント及び界面活性剤、それぞれTween(登録商標)80は、Bachillus cereusについてのコロニーの発色について青緑色によって示されるＰＣ−ＰＬＣ酵素についての発現の促進を引き起こした。塩化マンガンのさらなる添加は、Bacillus thuringiensisコロニーについて青緑色の発色を導き、一方硫酸亜鉛は、暗青緑色のコロニーの発色に培地によって示されるPseudomonas aeruginosaについてのＰＣ−ＰＬＣの発現の増大を引き起こした。
【０１１８】
表５及び６に示されるデータは、発色性化合物Ｘ−ホス−コリン（Ｘ−ＣＰ）及びＹ−ホス−コリン（Ｙ−ＣＰ）の使用が、青緑色−青色のコロニーの発色の形成によってＰＣ−ＰＬＣの検出を可能にすることを明らかに示す。二つの化合物及び基質はそれぞれ、非常に類似して挙動する。しかしながら、Ｙ−ＣＰでの発色強度はわずかに減少している。これらのデータはまた、試験された細菌によるＰＣ−ＰＬＣの発現が、プレーティング培地に加えられた特定の添加剤または組み合わせ、並びにそれらの濃度によって影響されることも示す。
【０１１９】
前述の実施例は、３−インドキシルコリンホスファート及びＸ−ホス−コリン−式（Ｉ）の好ましい化合物に関するものである一方で、式（Ｉ）の化合物のベンゼン核の置換基Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４が、インジゴタイプの色素の化学構造から本質的に既知の態様で、且つ組織化学で当業者によって選択されるのであれば、前述の開示から、式（Ｉ）の他の基質でも同様の結果が得られるであろうことは明らかである。
【０１２０】
前述のように、ＰＣ−ＰＬＣは各種のヒトの病原体によって生産され、本発明は、例えば臨床上のサンプルまたは食物から単離された培養物のプレーティング培地に対して直接細菌酵素生産についてスクリーニングすることによって、各種の態様で適用できる。
【０１２１】
一般的に本発明は、Clostridium perfringens、Bacillus cereus、Bacillus anthracis、Pseudomonas aeruginosa、Listeria monocytogenes、Helicobacter pylori、Legionella pneumophila、及びそのような活性を含むであろう物質の他のもののような微生物の潜在的病原性細菌活性の安全で高感度の検出を提供する。そのような物質の典型例は、生理学的サンプル、例えば血液、尿、便、及びリンパ液、並びに消費のためのグッズ、例えば食料または野菜、及び衣服、カーペット、家庭繊維、家具、私用または公用の乗り物、私用及び公用の台所用品または台所設備、並びに空気循環装置、及び公に接触する他のもの、例えば郵便の仕分け及び輸送装置を含むいずれかの他の潜在的感染物を含む。
【０１２２】
本発明のいくつかの好ましい実施態様は、ここに特別に記載されているが、ここに示され記載された各種の実施態様の変形例及び改変例が、本発明の精神及び範囲から逸脱することなくなされ得ることは、当業者に明らかであろう。従って、添付の特許請求の範囲及び適用される法律の規則によって必要とされる範囲にのみ、本発明が制限されることが企図される。
【図面の簡単な説明】
【０１２３】
【図１】図１は、Clostridium perfringens由来のＰＣ−ＰＬＣでの切断の際の、Ｘ−ホス−コリンを含む本発明の基質で得られた各種の温度での時間（横軸）に対する吸光度（縦軸）の依存性を示すグラフである（実施例４参照）。
【図２】図２は、曲線が５８−５９℃の温度でのＸ−ＣＰの各種の濃度で示されることを除いて、図１のものと同じグラフである（実施例５参照）。
【図３】図３は、１／切断速度のLineweaver-Burkプロット（縦軸；単位分／ｎＭｏｌ）と、１／Ｘ−ＣＰ濃度（横軸；単位１／ｍＭｏｌ）の関係である（実施例５参照）。
【図４】図４は、５８−５９℃でＸ−ＣＰを含む基質で得られたClostridium perfringens ＰＣ−ＰＬＣの０．０１、０．０２、０．０５、０．１及び０．２ユニット（Ｕ）での時間（横軸）に対する吸光度（縦軸）の依存性を示すグラフである（実施例６参照）。
【図５】酵素の０．５、１、２、４及び８ユニットについての図４と同様なグラフである。
【図６】図６は、Clostridium perfringens ＰＣ−ＰＬＣの０．０１から０．５ユニット（Ｕ）、即ち３３ｎｇから１６６７ｎｇの範囲での、Ｘ−ＣＰの切断速度（縦軸；単位ｎＭｏｌ／分）と酵素の量（横軸；単位μｇ）の関係を示すグラフである。
【図７】図７は、酵素の０．５から８ユニット（Ｕ）、即ち１．６６から２７μｇの範囲での、Ｘ−ＣＰの切断速度（縦軸）と用語１，６√酵素の量（横軸）の間の直線関係を示す（実施例６）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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