(57)【要約】本発明は、アテローム性動脈硬化症のマーカーとしての、破壊されたおよび安定なアテローム性動脈硬化性プラークにおいて差別的に発現されるポリヌクレオチド（を使用する方法）に関する。上記ポリヌクレオチドは、アテローム性動脈硬化性疾患の診断、予防および治療において有用であり得る。【特許請求の範囲】
【請求項１】
破壊されたアテローム性動脈硬化性プラークおよび安定なアテローム性動脈硬化性プラークにおいて差別的に発現されるポリヌクレオチドをアテローム性動脈硬化症のマーカーとして使用する方法において、該ポリヌクレオチドは、配列ＩＤ  ＮＯ：１、配列ＩＤ  ＮＯ：３または配列ＩＤ  ＮＯ：５から選択されるアミノ酸配列をコードするところの方法。
【請求項２】
個体からポリヌクレオチドを得ること、および配列ＩＤ  ＮＯ：１、配列ＩＤ  ＮＯ：３または配列ＩＤ  ＮＯ：５から選択されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドが存在するかどうかを決定することを含む、サンプル中のポリヌクレオチドの存在を決定する方法。
【請求項３】
ポリヌクレオチドがＲＮＡポリヌクレオチドである、請求項２記載の方法。
【請求項４】
配列ＩＤ  ＮＯ：１、配列ＩＤ  ＮＯ：３または配列ＩＤ  ＮＯ：５から選択されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドに特異的なプローブを、該プローブが該ポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズするのに有効な条件でサンプルにハイブリダイズさせる工程、および該サンプルにおける該プローブのポリヌクレオチドへのハイブリダイゼーションを決定する工程を含む、請求項２または３記載の方法。
【請求項５】
配列ＩＤ  ＮＯ：１、配列ＩＤ  ＮＯ：３または配列ＩＤ  ＮＯ：５から選択されるアミノ酸配列を有するタンパク質をサンプル中において検出する方法であって、
該タンパク質に特異的に結合する試薬を、特異的結合に有効な条件下でサンプルと共にインキュベートすること、および
該サンプルにおける該試薬の該タンパク質への結合を決定すること、
を含む方法。
【請求項６】
宿主由来のサンプルにおける配列ＩＤ  ＮＯ：１、配列ＩＤ  ＮＯ：３または配列ＩＤ  ＮＯ：５から選択されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドの発現レベルを公知基準と比較したときの相違を決定することを含む診断方法。
【請求項７】
宿主由来のサンプルにおける配列ＩＤ  ＮＯ：１、配列ＩＤ  ＮＯ：３または配列ＩＤ  ＮＯ：５から選択されるアミノ酸配列を有するタンパク質の存在を分析することを含む診断方法。
【請求項８】
アミノ酸配列ＩＤ  ＮＯ：１をコードする核酸配列を含む単離されたポリヌクレオチド。
【請求項９】
核酸配列ＩＤ  ＮＯ：２を含む、請求項８記載のポリヌクレオチド。
【請求項１０】
配列ＩＤ  ＮＯ：２のヌクレオチド１１６９〜２５８７を含む、請求項８または９記載のポリヌクレオチド。
【請求項１１】
アミノ酸配列ＩＤ  ＮＯ：１をコードする核酸配列から成る請求項８〜１０のいずれか１項記載のポリヌクレオチド。
【請求項１２】
核酸配列ＩＤ  ＮＯ：２から成る請求項８〜１１のいずれか１項記載のポリヌクレオチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、破壊されたおよび安定なアテローム性動脈硬化性プラークにおいて差別的に発現されるポリヌクレオチドのアテローム性動脈硬化症用マーカーとしての使用、サンプル中の該ポリヌクレオチドの存在を決定する方法、サンプル中の、該ポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸の存在を決定する方法、該ポリヌクレオチドの発現量が決定されるところの診断法、サンプルが該アミノ酸配列の存在に関して分析されるところの診断法、ならびに新しく同定されたポリヌクレオチドおよびそのポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列に関する。
【背景技術】
【０００２】
アテローム性動脈硬化症は、西側世界における大きな問題であり、心臓血管の疾患および死亡の主な原因である。それは、全ての主要な動脈に影響を及ぼす全身性の慢性進行性疾患である。アテローム性動脈硬化性の心臓血管疾患は、多くの病理学的症状、例えば、虚血性心疾患（ＩＨＤ）のような急性冠動脈症候群、発作、および末梢血管疾患、を含む。
【０００３】
臨床的に明白になるのに少なくとも３０〜４０年かかり得るが、アテローム性動脈硬化症は、いつも重症とは限らないものの、西側世界の全ての大人に影響を及ぼすと結論付けられ得る。
【０００４】
内皮機能不全は、慢性アテローム性動脈硬化症の初期症状の一つであり、ゆっくり増殖するアテローム性動脈硬化性プラークが管腔を侵略しそして管腔を減少させる。内皮機能不全は、血管拡張性一酸化窒素（ＮＯ）の合成における明らかな減少と関連する。アテローム性動脈硬化性病変の続く発達は、５段階、すなわち初期病変から狭窄性またはトロンボゲン形成のかつ閉塞性のプラークまで、を通って進行する。種々のプラークの型は、組織学的基準（Staryら、Circulation 1999; 92; 1355-1374）によって定義される。ほとんどの臨床上のアテローム性動脈硬化症の症状（冠動脈閉塞の約３分の２）は、安定なアテローム性動脈硬化性プラークの破壊されたアテローム性動脈硬化性プラークへの変化に関係する。不安定なアテローム性動脈硬化性プラークの破壊は、管腔の突然の閉塞（血栓症）をもたらす、凝固系の突然の活性化を特徴とする（Libby, Circulation 1995; 91: 2844-2850; Dolleryら、Circ. Res. 1995; 77: 863-868; Davies, Circulation 1996; 94: 2013-2020）。従って、プラークの安定性を増加させまたは維持する治療は、例えば、ＩＨＤ患者の冠動脈症候群の危険を減少させ、または心臓血管疾患と関連する他の臨床的症状の危険を減少させ得る。
【０００５】
アテローム性動脈硬化症が疾患の主な原因である患者群は、心筋梗塞、狭心症、不安定狭心症、脳性の虚血および梗塞、痴呆、ならびに末梢および腸の虚血の患者を包含する。アテローム性動脈硬化症の（早期）症状が現れる危険性の高い患者は、高い血清コレステロール値（低密度リポ蛋白（ＬＤＬ）または極低密度リポ蛋白（ＶＬＤＬ）粒子における）、または高レベルのトリグリセリド、リポ蛋白（ａ）もしくはフィブリノゲンを有する人であり、あるいは、喫煙する人や、高血圧、糖尿病、またはリポ蛋白代謝における家族性（遺伝性）疾患、例えば家族性複合高脂質血症、を有する人である。これらの患者は全て、不安定なプラーク特異的診断／治療の効用を得ることができる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
破壊されたプラークは、アテローム性動脈硬化性心臓血管疾患の臨床上の症状の大部分を引き起こすことが知られているが（Ross R., N Engl J Med 1999; 340:115-26; Libby P., J Intern Med 2000; 247:349-58; Zaman A.G.ら、Atherosclerosis 2000; 149:251-66）、どの因子および分子機構が安定なプラークの破壊されたプラークへの移行の原因であるかはまだ解明されていない。
【０００７】
破壊されたプラークの形態学は充分記載されているが（Stary H.C.ら、Arterioscler Thromb Vasc Biol 1995; 15:1512-31; Virmani R.ら、Arterioscler Thromb Vasc Biol 2000; 20:1262-75）、破壊されたプラークまたはインビボで（in vivo）破壊しやすいプラークを同定するための特異的マーカーは入手可能でない（Kullo I.J.ら、Ann Intern Med 1998; 129:1050-60）。
【０００８】
アテローム性動脈硬化性の始まりおよび進行に関与するありうる分子機構をより解明するための試みにおいて、いくつかの研究は、活性化されたヒト臍帯静脈内皮細胞および血管平滑筋細胞の遺伝子発現を非活性化細胞と比較した（Lu K.P.ら、Biochem Biophys Res Commun 1998; 253:828-33; Sato N.ら、J Biochem (Tokyo) 1998; 123:1119-26; De Waard V ら、Gene 1999; 226:1-8; Horrevoets A.J.ら、Blood 1999; 93:3418-3431; De Vries C.J.ら；J Biol Chem 2000: 275; 31:23939-47）。細胞系におけるこれらの研究は、白血球の通行、細胞周期制御およびアポプトシスに関与する遺伝子の差別的レギュレーションを示した。しかし、細胞系は、ＲＮＡの再現可能な源を提供するが、インビトロ（in vitro）での遺伝子発現がインビボ（in vivo）での遺伝子発現を模倣するかどうかを決定することが残っている。他（Hiltunen M.O., Curr Opin Lipidol 1999; 10:515-9）は、ホールマウントヒトアテローム性動脈硬化性プラークを使用して、脂肪層（fatty streaks）と進行した病変との間の遺伝子発現における相違を研究した。しかし、彼らは、彼らの発見を個々の患者の大きいパネル上において確認しなかったし、差別的に発現された遺伝子の局在性の研究も行わなかった。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、破壊された（不安定な）および安定なアテローム性動脈硬化性プラークにおいて差別的に発現されるポリヌクレオチドをアテローム性動脈硬化性のためのマーカーとして使用することに関し、ここで、該ポリヌクレオチドは、配列ＩＤ  Ｎｏ：１、配列ＩＤ  Ｎｏ：３または配列ＩＤ  Ｎｏ：５から選択されるアミノ酸配列をコードしている。上記ポリヌクレオチドは、不安定なアテローム性動脈硬化性プラークにおいてアップレギュレーションされまたはダウンレギュレーションされることが今分かった。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
配列ＩＤ  Ｎｏ：３および配列ＩＤ  Ｎｏ：５を含むポリヌクレオチドは、夫々、膜スパニングタンパク質およびヒト分類ネキシンとして、その技術分野においてすでに公知である（例えば、夫々、国際特許出願公開第９９４６３８０号および受理番号ＡＫ０００３６２から公知である）。これらの遺伝子が不安定なプラーク組織においてアップレギュレーションされまたはダウンレギュレーションされ得ることは、従来技術において示されていない。
【００１１】
本発明の特に好ましい実施態様は、不安定な破壊されたアテローム性動脈硬化性病変において非常に発現される新規ポリヌクレオチドに関する。特に、本発明は、アミノ酸配列ＩＤ  Ｎｏ：１をコードする単離されたポリヌクレオチドを提供する。単離されたとは、ポリヌクレオチドがその自然環境から取り出されており、従って、遺伝子操作された蛋白質産生系内での使用に適する形状にあることを意味する。
【００１２】
本発明はまた、配列ＩＤ  Ｎｏ：２で示されるＤＮＡ配列を含むポリヌクレオチドを包含する。特に好ましくは、配列ＩＤ  Ｎｏ：２のヌクレオチド１１６９−２５８７の完全なコードＤＮＡ配列を含むポリヌクレオチドである。さらに、コドン可変性を適応させるために、本明細書に開示された配列（ＩＤ  Ｎｏ：１）と同じアミノ酸配列をコードする配列をも包含する。発現されたタンパク質の個々の領域をコードするコード配列の一部も、対立遺伝子およびその種変形物と同様に本発明の一部である。遺伝子は、ある特定の組織においてスプライシング変異体として発現され、その結果、追加のエキソン配列の包含またはエキソンの排除を生じることがある。また、部分的エキソン配列が包含されまたは排除され得る。遺伝子はまた、遺伝子内の種々の位置にある別のプロモーターから転写され、その結果、種々の５’端を有する転写産物が得られ得る。転写はまた、種々の部位で終結し、その結果、転写産物の種々の３’端を生じ得る。これらの配列およびこれらの配列によってコードされるタンパク質は全て、同じまたは同様の機能を行うことが予想され、これらも本発明の一部を形成する。
【００１３】
本明細書で提供される配列情報は、誤って同定された塩基を包含することを要求するように狭く解釈されるべきではない。本明細書に開示された特定の配列は、完全な遺伝子を単離するために容易に使用され得、次いで、その完全な遺伝子は、配列決定誤差が同定される更なる配列分析に容易に付され得る。
【００１４】
破壊されたおよび安定なアテローム性動脈硬化性プラークにおいて差別的に発現される本発明のポリヌクレオチドまたはコードされるタンパク質は、診断および治療のための重要な道具である。
【００１５】
差別的に発現される遺伝子は、診断用道具として、個体における不安定なプラークのためのマーカーとして使用され得、そこで、組織サンプルにおける該遺伝子の発現レベルが決定される。さらに、末梢虚血を引き起こす、動脈、例えば腸骨動脈、の不安定プラークの臨床的症状を示す患者における他の部位のプラーク不安定性を同定するために使用することもできる。そのような患者の長期の予後は、末梢介入の成功率によって決定されるのではなく、心筋梗塞または脳梗塞の発生によって決定されるので、全ての部位のプラーク不安定性を正確に診断することは非常に重要である。画像法などの診断技術、例えばシンチグラフィー、が適用され得る。この方法では、放射標識された不安定プラーク特異的遺伝子が標的として使用される。あるいは、不安定プラーク特異的遺伝子を表す本発明のポリヌクレオチド、またはコードされるタンパク質が、血清／血漿マーカーとして使用され得、これは、プラーク不安定性の危険のある患者のスクリーニング、または他の治療の効果の評価にも使用され得る。さらに、本発明の（新規な）不安定プラーク特異的ポリヌクレオチド、またはコードされるタンパク質、またはそのタンパク質に対する抗体は、不安定プラークに対する他の療法を目標にするために使用され得る。
【００１６】
従って、本発明の別の局面は、サンプル中のポリヌクレオチドの存在を決定するための方法であり、該方法は、一個体からポリヌクレオチドを得ること(例えば、そのような目的のための従来周知の（臨床）法を使用して、組織サンプル、血液サンプルなどを採取することによる)、および配列ＩＤ  Ｎｏ：１、配列ＩＤ  Ｎｏ：３または配列ＩＤ  Ｎｏ：５から選択されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドが存在するかどうかを決定することを含む。これと共に、そのような目的のために従来公知の（ポリ）ヌクレオチドのいずれかの検出法が包含される。例えば、ヌクレオチド伸長法／増幅法が考えられ得るが、そのような方法は、配列ＩＤ  Ｎｏ：１、配列ＩＤ  Ｎｏ：３または配列ＩＤ  Ｎｏ：５から選択されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドに特異的なプローブをサンプルに、該プローブが該ポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズするのに有効な条件でハイブリダイズさせる工程、および該サンプルにおけるポリヌクレオチドへの該プローブのハイブリダイゼーションを決定する工程を含み得る。これに関して「特異的」とは、ハイブリダイゼーションの大部分が本発明のポリヌクレオチドによって生じることを意味する。好ましくは、該プローブは、配列ＩＤ  Ｎｏ：２、配列ＩＤ  Ｎｏ：４または配列ＩＤ  Ｎｏ：６のヌクレオチドの少なくとも２５を含む。より好ましくは、プローブが、配列ＩＤ  Ｎｏ：２、配列ＩＤ  Ｎｏ.４または配列ＩＤ  Ｎｏ.６の５０、特に好ましくは１００より多くのヌクレオチドを含む。最も好ましくは、プローブが、配列ＩＤ  Ｎｏ：２のヌクレオチド１１６９〜２５８７から選択されるポリヌクレオチドから成る。ＤＮＡハイブリダイゼーションを促進する適切なストリンジェント条件、例えば約４５℃で６．０ｘ塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）および続く５０℃での２．０ｘＳＳＣの洗浄、は、当業者に公知であり、あるいはCurrent Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6に見ることができる。例えば、洗浄工程における塩濃度は、５０℃で約２．０ｘＳＳＣの低いストリンジェンシーから５０℃で約０．２ｘＳＳＣの高いストリンジェンシーまで選択され得る。さらに、洗浄工程における温度は、室温（約２２℃）での低いストリンジェント条件から約６５℃での高いストリンジェント条件まで高められ得る。
【００１７】
本発明の更なる局面は、サンプルにおいて配列ＩＤ  Ｎｏ：１、配列ＩＤ  Ｎｏ：３または配列ＩＤ  Ｎｏ：５から選択されるアミノ酸配列を有するタンパク質を検出するための方法である。該方法は、該タンパク質に特異的に結合する試薬（例えば抗体）を、特異的結合に有効な条件下でサンプルとインキュベートすること、およびサンプル中の該タンパク質への該試薬の結合を決定することを含む。
【００１８】
さらに、診断法も本発明の一実施態様である。この方法は、ホスト由来のサンプルにおける、配列ＩＤ  Ｎｏ.１、配列ＩＤ  Ｎｏ.３または配列ＩＤ  Ｎｏ.５から選択されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドの発現レベルの、公知基準と比較したときの相違を決定すること（例えば、上記方法を使用する）を含む。上記公知基準は、健康な個体の健康な組織および安定プラーク物質に関する。本発明の上記ポリヌクレオチドの発現レベルが、その基準と比較して、アップレギュレーションまたはダウンレギュレーションされるとき、サンプル源であるホスト（通常はヒト）は、アテローム性動脈硬化症の危険性を有する。さらに、本発明の別の局面は、ホスト由来のサンプルにおける、配列ＩＤ  Ｎｏ：１、配列ＩＤ  Ｎｏ：３または配列ＩＤ  Ｎｏ：５から選択されるアミノ酸配列を有するタンパク質の存在を分析すること（分析法はその技術分野において周知であり、例えば上記方法を使用する）を含む診断法である。タンパク質の量が健康な組織および／または安定プラーク物質に存在する量よりも多いまたは少ないとき、サンプル源であるホスト（通常はヒト）は、アテローム性動脈硬化症の危険性を有する。
【００１９】
治療具として、配列ＩＤ  Ｎｏ.１、配列ＩＤ  Ｎｏ.３または配列ＩＤ  Ｎｏ.５から選択されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドの発現の調節（直接的または関節的）が、プラーク安定性を高め、従ってアテローム性動脈硬化性心臓血管疾患の進行を抑制し得る。例えば、不安定プラーク特異的遺伝子に対する抗体および／またはアンタゴニストをブロックすることによって、安定プラークから不安定プラークへの移行を妨げ、または不安定プラークを安定プラークに戻すことができる。さらに、遺伝子のプロモ−ターの調節によって、または遺伝子治療のために特に合成されたアンチセンスＲＮＡの使用によって、対応するタンパク質の発現の調節および体組織および体液に存在する上記タンパク質の量に影響を及ぼすことができる。
【００２０】
本発明に従うＤＮＡは、配列ＩＤ  Ｎｏ：２、配列ＩＤ  Ｎｏ：４または配列ＩＤ  Ｎｏ：６由来の適するプローブを使用してｃＤＮＡから得られ得る。あるいは、コードする配列が、ゲノムＤＮＡであり得、またはＤＮＡ合成法を使用して作製され得る。ポリヌクレオチドは、ＲＮＡの形状でもあり得る。ポリヌクレオチドがＤＮＡの場合、それは一本鎖または二本鎖形状であり得る。一本鎖はコードする鎖であってもコードしない（アンチセンス）鎖であってもよい。
【００２１】
本発明はさらに、配列ＩＤ  Ｎｏ：２のヌクレオチド１１６９−２５８７の全ＤＮＡ配列との相同性が少なくとも７０％、好ましくは８０％、より好ましくは９０％、さらにより好ましくは９５％、非常に好ましくは９８％、最も好ましくは少なくとも９９％であるポリヌクレオチドに関する。そのようなポリヌクレオチドは、天然の成熟タンパク質と同じ生物学的機能または活性を保持するポリペプチドをコードする。あるいは、基質になおも結合し得るタンパク質のドメインをコードするところの上記ポリヌクレオチドの断片も本発明に包含される。
【００２２】
２つの配列間の相同性の割合は、ＤＮＡＭＡＮ（Lynnon Biosoft、バージョン３．２）などのプログラムによって決定され得る。このプログラムを使用すると、２つの配列が、Smith and Waterman (1981, J. Mol. Biol, 147:195-197)の最適な配列アルゴリズムを使用して整列され得る。２つの配列の整列の後、２つの配列間の同一ヌクレオチドの数を、整列された配列の長さから全ギャップの長さを引いたもので割ることによって、相同性の割合が計算され得る。
【００２３】
本発明はさらに、わずかな変異を有するまたは多型部位を有するポリヌクレオチド（の使用法）に関する。わずかな変異を有するポリヌクレオチドは、天然の成熟タンパク質と同じ生物学的機能または活性を保持するポリペプチドをコードする。
【００２４】
本発明の新規に同定されたポリヌクレオチドの配列、配列ＩＤ  Ｎｏ：２、および配列ＩＤ  Ｎｏ：４または配列ＩＤ  Ｎｏ：６の配列は、適するホスト細胞におけるコードされたタンパク質の発現のためのベクター分子の作製においても使用され得る。配列ＩＤ  Ｎｏ：１、配列ＩＤ  Ｎｏ：３、配列ＩＤ  Ｎｏ：５またはそれらの一部のタンパク質をコードする核酸配列のクローニングにおいて、広範囲のホスト細胞およびクローニングベヒクルの組み合わせが有効に使用され得る。例えば、有用なクローニングベヒクルは、染色体の、非染色体のおよび合成のＤＮＡ配列、例えば種々の公知の細菌プラスミドおよび、より広いホスト範囲のプラスミドおよび、プラスミドおよびファージまたはウイルスＤＮＡの組み合わせから誘導されるベクター、を包含し得る。本発明のポリヌクレオチドまたは機能的ドメインを含むその一部の発現に使用するためのベヒクルは、上記タンパク質をコードする核酸配列に操作可能に連結した制御配列をさらに含む。そのような制御配列は一般に、プロモーター配列および、発現レベルを調節しおよび／または高める配列を含む。もちろん、制御配列および他の配列は、選択されるホスト細胞に依存して変わり得る。
【００２５】
適する発現ベクターは、例えば、細菌または酵母プラスミド、広いホスト範囲のプラスミド、ならびにプラスミドおよびファージまたはウイルスＤＮＡの組み合わせから誘導されるベクターである。染色体ＤＮＡから誘導されるベクターも包含される。さらに、本発明に従うベクターには、複製起点および／または優性選択マーカーが存在し得る。本発明に従うベクターは、ホスト細胞の形質転換に適する。
【００２６】
本発明のＤＮＡを含む組換え発現ベクターおよび該ＤＮＡまたは該発現ベクターによって形質転換された細胞も本発明の一部を形成する。
【００２７】
本発明に従う適するホスト細胞は、細菌ホスト細胞、酵母および他の真菌、昆虫、植物または動物ホスト細胞、例えばチャイニーズハムスター卵巣細胞またはサルの細胞またはヒト細胞系、である。従って、本発明に従うＤＮＡまたは発現ベクターを含むホスト細胞も本発明の範囲内である。遺伝子操作されたホスト細胞は、例えば適切な選択、増幅または転写の誘導のために改変され得る慣用の栄養培地において培養され得る。培養条件、例えば温度、ｐＨ、栄養などは、当業者に周知である。
【００２８】
本発明に従うＤＮＡまたはベクターの作製法、ならびに該ＤＮＡまたはベクターによるホスト細胞の形質転換またはトランスフェクションは一般的であり、その技術分野において周知である。例えば、Sambrookら、Molecular Cloning: A laboratory Manual、第２版、Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1989を参照。
【００２９】
本発明の別の局面では、上記ＤＮＡ分子によってコードされるアミノ酸配列を含むタンパク質が提供される。好ましくは、本発明に従うタンパク質が、配列ＩＤ  Ｎｏ.１に示されるアミノ酸配列を含む。また、本発明の一部は、翻訳後処理によって得られるタンパク質であり、このタンパク質は、本発明のポリヌクレオチドによってコードされる。
【００３０】
機能的に等価なもの、すなわち、機能的特性をなおも保持しながら配列の変異を有する、アミノ酸配列ＩＤ  Ｎｏ：１、配列ＩＤ  Ｎｏ：３、配列ＩＤ  Ｎｏ：５またはそれらの一部と相同のタンパク質も本発明に包含される。配列において生じ得る変異は、全配列における１以上のアミノ酸の相違によって、または該配列における１以上のアミノ酸の欠失、置換、挿入、逆位または付加によって示され得る。生物学的および免疫学的活性を本質的に変えないことが予想されるアミノ酸置換は記載されている。関連するアミノ酸の間のアミノ酸の置き換えまたは進化においてしばしば生じた置き換えは、とりわけ、Ｓｅｒ／Ａｌａ、Ｓｅｒ／Ｇｌｙ、Ａｓｐ／Ｇｌｙ、Ａｓｐ／Ａｓｎ、Ｉｌｅ／Ｖａｌである（Dayhof, M.D., タンパク質の配列および構造の図表集（Atlas of protein sequence and structure）, Nat. Biomed. Res. Found., ワシントンＤ．Ｃ．、1978、vol.5, suppl.3を参照）。この情報に基づいて、LipmanおよびPearsonが、迅速かつ敏感にタンパク質を比較し（Science, 1985, 227, 1435-1441）、そして相同ポリペプチド間の機能的類似性を決定するための方法を開発した。明らかなように、そのような変異体をコードするポリヌクレオチドも本発明の一部である。
【００３１】
本発明に従うポリペプチドは、配列ＩＤ  Ｎｏ：１を含むポリペプチドをも包含するが、さらに、少なくとも７０％、好ましくは８０％、より好ましくは９０％、さらにより好ましくは９５％の相同性を有するポリペプチドも包含する。生物学的効果をなおも付与できる、そのようなポリペプチドの一部も包含される。特に、標的になおも結合する部分は本発明の一部を形成する。そのような部分は、例えば可溶化形態で、自体機能性であり得、または公知のバイオテクノロジー的方法もしくは化学合成によって他のポリペプチドに結合されてキメラタンパク質を得ることができる。そのようなタンパク質は、治療剤として有用であり得る。
【００３２】
本発明に従うタンパク質は、通常の生化学精製法（Havelaarら、J. Biol. Chem. 273, 34568-34574 (1998)に記載）、例えば硫安沈殿、抽出、クロマトグラフィー、例えば疎水性相互作用クロマトグラフィー、陰イオンもしくは陽イオン交換クロマトグラフィーまたはアフィニティークロマトグラフィーおよび高性能液体クロマトグラフィー、によって組換え細胞培養物から回収および精製され得る。必要ならば、タンパク質リフォールディング工程も包含され得る。あるいは、タンパク質が、アフィニティー精製のために使用され得る「タグ」を含む融合タンパク質として発現および精製され得る。
【００３３】
本発明に従うタンパク質は、新規標的または類似物のインビトロ（in vitro）またはインビボ（in vivo）同定のために使用され得る。この目的のために、例えば結合の研究が、本発明に従うＤＮＡによって形質転換された細胞または本発明に従うＤＮＡを含む発現ベクターを用いて行われ得る。ここで、上記細胞は、本発明に従う不安定プラーク特異的ポリヌクレオチドを発現する。
【００３４】
あるいは、本発明に従う（新しく同定された）ポリヌクレオチドおよびその標的結合ドメインが、上記遺伝子のための機能的標的または類似物の同定のためのアッセイにおいて使用され得る。そのようなアッセイを使用して、安定プラークが不安定プラークへ移行するのを防止し、または不安定プラークを安定プラークへ逆戻りさせ、したがってアテローム性動脈硬化性疾患の進行を抑制するところの化合物が同定され得る。
【００３５】
従って、本発明は、安定プラークが不安定プラークへ移行するのを防止し、または不安定プラークを安定プラークへ逆戻りさせる化合物を同定する方法を提供する。上記方法は、
ａ）配列ＩＤ  Ｎｏ：１、配列ＩＤ  Ｎｏ：３、および配列ＩＤ  Ｎｏ：５の配列から選択されるアミノ酸をコードするヌクレオチドを適切なホスト細胞に導入する工程；
ｂ）上記ホスト細胞を、導入されたＤＮＡ配列の発現を可能にする条件下で培養する工程；
ｃ）工程ｂのホスト細胞またはその産物を、配列ＩＤ  Ｎｏ：１、配列ＩＤ  Ｎｏ：３、または配列ＩＤ  Ｎｏ：５を有する発現されたタンパク質の機能を潜在的にもたらす化合物と接触させる工程；
ｄ）発現されたタンパク質の機能に関するそのような化合物の効果を決定する工程；
を含む。
【００３６】
従って、本発明は、安定プラークの不安定プラークへの移行に関する心臓血管疾患の防止および／または治療のための治療剤をスクリーニングするための迅速かつ経済的な方法を提供する。
【００３７】
本発明はまた、上記方法に従って同定された調節剤化合物を薬剤的に許容され得る担体と混合することを含む、薬剤組成物の調製法を提供する。薬剤的に許容され得る担体は当業者に周知であり、例えば、滅菌水、ラクトース、スクロース、リン酸カルシウム、ゼラチン、デキストリン、寒天、ペクチン、ピーナツ油、オリーブ油、ゴマ油および水を包含する。さらに、本発明に従う薬剤組成物は、１以上の安定剤、例えば炭水化物、例えばソルビトール、マンニトール、スターチ、スクロースデキストリンおよびグルコース、タンパク質、例えばアルブミンまたはカゼイン、ならびに緩衝剤、例えばアルカリホスフェート、を含み得る。調製物および静脈注射用混合物の製造法は、Remingtons’s Pharmaceutical Sciences, pp. 1463-1497 (第１６版、1980, Mack Publ. Co of Easton, Pa, 米国)に開示されている。
【００３８】
従って、本発明に従うポリヌクレオチドを使用することによって同定される調節剤化合物は、薬剤の調製において有用である。薬剤は、アテローム性動脈硬化性疾患において使用されるべきである。
【００３９】
また、本発明に従うタンパク質に対する抗体、特にモノクローナル抗体も本発明の範囲内である。そのような抗体は、治療および診断の両方において使用され得る。抗体は、従来公知の方法、例えば欧州特許第４８８４７０号に記載された方法、に従って作製され得る。
【００４０】
本発明を、以下の例示的実施例を参照してさらに説明する。
【００４１】
図１は、ＳＳＨによって生成したｃＤＮＡクローンの逆ノーザンドットブロット分析を示す。２つの同一のドットブロットが、ＰＣＲ産物のナイロン膜への移動によって作られた。ドットブロットを、実施例に記載したように、Ａ）３種類の安定プラークの32Ｐ標識されたｃＤＮＡプールおよびＢ）３種類の破壊されたプラークの32Ｐ標識されたｃＤＮＡプールにハイブリダイズさせた。配列ＩＤ  Ｎｏ：２、破壊されたプラークにおいてアップレギュレーションされたクローン、の位置はＤ６である。
【００４２】
図２は、破壊されたまたは安定なヒトアテローム性動脈硬化性プラークにおいて差別的に発現された配列ＩＤ  Ｎｏ：２の新しく同定されたポリヌクレオチドのＲＴ−ＰＣＲ分析を示す。数字は、１０種類の安定プラーク（左のパネル）および１０種類の破壊されたプラーク（右のパネル）における発現を示す。
【００４３】
図３は、ＳＳＨによって生成したｃＤＮＡクローンの逆ノーザンドットブロット分析を示す。２つの同一のドットブロットが、ＰＣＲ産物のナイロン膜への移動によって作られた。ドットブロットを、実施例に記載したように、Ａ）３種類の安定プラークの32Ｐ標識されたｃＤＮＡプールおよびＢ）３種類の破壊されたプラークの32Ｐ標識されたｃＤＮＡプールにハイブリダイズさせた。配列ＩＤ  Ｎｏ：６、破壊されたプラークにおいてダウンレギュレーションされたクローン、の位置はＣ３である。
【００４４】
図４は、管壁におけるＳＳＨ６の発現。静脈および、種々の段階のアテローム性動脈硬化性病変を有する動脈から単離したｍＲＮＡに関するＲＴ−ＰＣＲ。
【００４５】
図５は、偏在的に発現されたＳＳＨ６ｍＲＮＡの組織分布を示す。ヒト多重組織配列と配列ＩＤ  Ｎｏ：２のヌクレオチド９０５−１３４１の33Ｐ−ｄＣＴＰ標識されたｃＤＮＡ配列とのハイブリダイゼーション。種々の組織および細胞系の模式的表示を下のパネルに示す。
【００４６】
図６は、ＳＳＨ６νｍＲＮＡの組織分布を示す。ヒト多重組織配列と33Ｐ−ｄＣＴＰ標識されたエキソン３とのハイブリダイゼーション（ブロット組成に関しては、図５の下のパネルにおける模式的表示を参照）。下のパネルは、ＶＳＭＣ由来のＲＮＡおよび正の対照としてのエキソン３含有プラスミドＤＮＡによるハイブリダイゼーションを示す。
【００４７】
図７は、ＧＳＴ−ＳＳＨ６融合タンパク質の模式的表示を示す。ＳＳＨ６の推定のオープンリーディングから推測される３０２Ｃ末端ＡＡをグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）の末端に融合させる。
【００４８】
図８は、ＳＳＨ６タンパク質発現を示す。ＳＳＨ６特異的ＳＳＨ６−ｓｃＦｖを使用する、ヒトアテローム性動脈硬化性プラーク、ヒト血漿、ならびにいくつかのヒト組織溶解物および細胞系のウエスターンブロット分析。レーン１：平滑筋細胞溶解物、レーン２：ヒト大動脈、レーン３：ＬＳ１７４Ｔ細胞、レーン４：ＬＬＣ細胞、レーン５：ＣａＣｏ細胞、レーン６：ＣＯＳ細胞、レーン７：マーカー、レーン８：破壊されたアテローム性動脈硬化性プラーク、レーン９：ＨＵＶＥＣ細胞、レーン１０：ＯＶＣＡＲ細胞、レーン１１：ヒト血漿。
【００４９】
総論
ホールマウントヒト安定プラークおよび破壊されたプラークにおいて差別的に発現される本発明のポリヌクレオチドの同定のために、ホールマウント試料を使用して、抑制減法ハイブリダイゼーション（suppression subtractive hybridization）（ＳＳＨ）の方法（Diatchenko Lら、Proc Natl Acad Sci USA, 1996; 93:6025-30）が適用された。プラーク型特異的遺伝子を得るために、２つのプールに含まれるプラーク（破壊されたプラークおよび安定プラーク）は、脂質コアの存在、カルシウム沈着および炎症細胞の量に関して形態学的に様々であった。さらに、患者に基づく相違を回避するために、３種の進行した安定病変（タイプＩＶおよびＶ）および３種の破壊された病変（タイプＶＩ）のプールに関して、ＳＳＨ手順が行われた。発現においてより大きい相違を有する遺伝子を選択するために、ＳＳＨを４倍過剰のドライバーを用いて行った。そのＳＳＨ手順によって、破壊されたプラークにおいてダウンレギュレーションされたクローンに富むｃＤＮＡライブラリーが得られた。多数のランダムに選択されたクローンの差別的発現が、逆ノーザンドットブロット（ＩＮＤＢ）分析によって確認された。発現において少なくとも２倍の相違を示す配列が決定された。これらの配列の発現の再現性を確認するために、より大きい一連の個体の破壊されたプラーク（ｎ＝１０）および個体の安定なプラーク（ｎ＝１０）に関してＲＴ−ＰＣＲ分析を行った。それは、本発明のポリヌクレオチドに関する発現の著しい一致が、８の破壊されたプラークおよび２の安定なプラークに存在することを示した。本発明のポリヌクレオチドの差別的発現パターンは、プラーク破壊におけるこの遺伝子の潜在的役割を示唆する。
【００５０】
組織のサンプリングおよびＲＮＡ単離
血管手術を受けた患者からプラークを得た（マーストリヒト大学病院一般手術科）。患者の特徴を表１にまとめる。切除の直後に、ＲＮＡ単離および組織学的分析のために、アテローム性動脈硬化性試料を５ｍｍの平行部分に分けた。ＲＮＡ単離のために予定された組織は、液体窒素中で直ちに凍結させ、−８０℃で貯蔵した。全ＲＮＡを、グアニジンイソチオシアネート／ＣｓＣｌ法（Chomczynski P.ら、Anal Biochem 1987; 162:156-9）を使用して単離した。組織学的分析のための試料は、１０％リン酸緩衝液で処理されたホルマリン（ｐＨ７．４）中に固定され、型通りの処理を行い、パラフィンに包埋させた。断片を切り取り、ヘアマトキシリンおよびエオシンで染色し、米国心臓学会の形態学的基準（Stary H.C.ら、Arterioscler Thromb Vasc Biol 1995; 15:1512-31）に従って分類した。進行したアテローム性動脈硬化性プラークのみを研究に含めた。ＩＶ型およびＶ型病変を安定プラークと定義し、ＶＩ型病変を破壊されたプラークと定義した。
【実施例１】
【００５１】
抑制減法ハイブリダイゼーション
ＰＣＲ−Select  ｃＤＮＡ減法キット（Clontech）を使用し、少しの調整を伴うが本質的には製造者のプロトコルに従って、ＳＳＨ手順を行った。簡単に言うと、末梢血管手術を受けた６人の同年齢の男性患者のホールマウントプラークから全ＲＮＡを単離した（表１）。遺伝子発現における患者に基づく相違を較正するために、２プールの全ＲＮＡを生じさせた。プール１は、３人の患者の３の破壊されたプラークに由来する全ＲＮＡの１μｇを含んでいた。プール２は、３人の患者の３の安定なプラークに由来する全ＲＮＡの１μｇを含んでいた。二本鎖ｃＤＮＡの作製および増幅のために、ＳＭＡＲＴ(商標)ＰＣＲｃＤＮＡ合成キット（Clontech）を使用した。前進反応では、破壊されたプラークにおいてアップレギュレーションされた遺伝子が単離された。ＲｓａＩ消化されたテスターｃＤＮＡを２つの異なるアダプターに連結し、４倍過剰のドライバーｃＤＮＡにハイブリダイズさせて、差別的に発現される遺伝子を富ませた。差別的に発現される遺伝子を２回のＰＣＲによって増幅させた。得られた断片はゲル精製され、ｐＧＥＭＴ−ｅａｓｙベクター（Promega）に入れてクローン化され、次いで非常にコンピテントな大腸菌JM109細胞（Promega）に形質転換された。こうして構築された（前方減法された）ライブラリーは、破壊されたアテローム性動脈硬化性プラークにおいてアップレギュレーションされた多数のクローンを含んでいた。
【実施例２】
【００５２】
減法されたｃＤＮＡライブラリーの分析
逆ノーザンドットブロット法（ＩＮＤＢ）
ＳＳＨライブラリーの配列の差別的発現を、第２の独立した方法、ＩＮＤＢ分析によって確認した。ライブラリーの配列をランダムに選択し、破壊されたプラークおよび安定なプラークにおける発現に関してスクリーニングした。この結果、破壊されたプラークにおいてユニークに発現されたクローンの同定が得られた（図１）。
手順：標準条件下で、Ｔ７（５’−ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧ−３’、配列ＩＤ  Ｎｏ：７）およびＳＰ６（５’−ＡＴＴＴＡＧＧＴＧＡＣＡＣＴＡＴＡ−３’、配列ＩＤ  Ｎｏ：８）プライマーを使用してＰＣＲによってインサートを増幅した。簡単に言うと、１０μｌのＰＣＲ産物が２００μｌの６ｘＳＳＣ中に希釈され、９５℃に加熱され、氷上で冷却された。９６ウェルのＢｉｏＲａｄドットブロット装置を使用してナイロン膜に１００μｌのサンプルを移すことによって２つの同一のドットブロットが作製され、次いで、ＵＶ照射によってそのＤＮＡが架橋された。上記フィルターを、標準的手順を使用して安定なまたは破壊されたプラークのいずれかの32Ｐ−標識された（High Prime, Boehringer Mannheim）ＳＭＡＲＴ（商標）ＤＮＡと高緊縮条件でハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーション信号を、ＲＮＡ−ポリメラーゼIIおよびゲノムＤＮＡ信号を使用して正規化した。燐光体像分析によって定量分析を行った。
【実施例３】
【００５３】
シークエンス法
Thermo Sequenase蛍光標識されたプライマー（Ｍ１３復帰５’−ＴＴＴＣＡＣＡＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡ−３’、配列ＩＤ  Ｎｏ：９；Ｍ１３前進５’−ＣＧＣＣＡＧＧＧＴＴＴＴＣＣＣＡＧＴＣＡＣＧＡＣ−３’、配列ＩＤ  Ｎｏ：１０）サイクルシークエンス法キット（Amersham Pharmacia Biotech）を使用して実施例２の差別的に発現されたポリヌクレオチドの配列分析を行い、ＡＬＦ−高速自動シークエンサー上で分析した。ｃＤＮＡクローンは５４０塩基対のインサートを含んでおり、そのうち３４４ヌクレオチドを配列分析した。
【００５４】
ＩＮＣＹＴＥの遺伝子データベースにおけるこれら３４４ヌクレオチドと相同または同一の配列の研究は、その配列の３’部分にオープンリーディングフレームを含み、終止コドンのない２０９８ヌクレオチドの鋳型を示した。この鋳型を使用してオーバーラップ配列を調べた。このようにして見出された鋳型を集め、手で編集して、５３．３ｋＤａの計算された分子量を有するタンパク質をコードする４７３アミノ酸（配列ＩＤ  Ｎｏ：１）のオープンリーディングフレームを有する３８３５ヌクレオチドの配列（配列ＩＤ  Ｎｏ：２）を示した。
【実施例４】
【００５５】
ＲＴ−ＰＣＲ
ＩＮＤＢで見出された発現プロファイルをさらに確認するために、１０の破壊されたプラークおよび１０の安定プラークに対してＲＴ−ＰＣＲ分析を行った。患者および動脈に偏った発現を除外するために、プラークは、種々の患者のいくつかの動脈に由来した（表１）。発現をＧＡＰＤＨの発現レベルに正規化した。この発現レベルは、種々のサンプル間で比較できた（図２）。
手順：全ＲＮＡの単離を上記のように行った。０．５μｇの鋳型ＲＮＡから二本鎖ｃＤＮＡを作成するために、ＳＭＡＲＴ（商標）ＰＣＲｃＤＮＡ合成キット（Clontech）を使用した。ｃＤＮＡを希釈して全体積を５０μｌにした。ポリヌクレオチド（センス：５’−ＧＧＣＴＡＡＴＴＣＧＧＧＡＧＡＴＡＧＣＣ−３’、配列ＩＤ  Ｎｏ：１１；アンチセンス：５’−ＣＡＡＣＡＣＣＴＣＡＴＧＧＣＡＡＧＴＣＣ−３’、配列ＩＤ  Ｎｏ：１２）のＰＣＲ増幅を、標準条件（９４℃で１分間の変性３０サイクル、５５℃で１分間のアニーリングおよび７２℃で１分間の伸長）を使用して一本鎖ｃＤＮＡの１μｇに対して行った。得られた約３００ｂｐのＰＣＲ産物を１％アガロースゲル上で分析した。
結果：配列ＩＤ  Ｎｏ：２のポリヌクレオチドの発現が、１０の破壊されたプラークのうち８において認められた。一方、試験された１０の安定プラークは、そのうちの２のみが陽性であった。
【００５６】
【表１】
2004529620.tif 000002
【実施例５】
【００５７】
ＳＳＨ６：血管平滑筋細胞特異的ｍＲＮＡおよびタンパク質
アテローム性動脈硬化性プラークのプラーク破壊は、急性冠動脈症候群および末梢血管疾患の病因論において支配的な基礎的プロセスである。プラークを不安定化する経路への洞察は貧弱である。ヒトアテローム性動脈硬化性プラーク由来のＲＮＡに関する抑制減法ハイブリダイゼーション（ＳＳＨ）分析によって、安定なおよび破壊されたアテローム性動脈硬化性プラークにおいて差別的に発現されたｃＤＮＡの大きいライブラリーの同定が得られた（実施例１参照）。ＳＳＨライブラリーの配列の差別的発現が、逆ノーザンドットブロット（ＩＮＤＢ）またはマクロ配列分析によって立証された（実施例２を参照）。これらｃＤＮＡクローンのうちの１つ、ＳＳＨ６、は、破壊されたプラークにおいて２倍以上アップレギュレーションされた。このクローンは、５７アミノ酸の推定ＯＲＦ（配列ＩＤ  Ｎｏ：１のアミノ酸１〜５７）を含む４３６ｂｐのｃＤＮＡインサート（配列ＩＤ  Ｎｏ：２のヌクレオチド９０５〜１３４１）を含んでいた。
【００５８】
ＩＮＤＢにおいて見出された発現プロファイルをさらに確認するために、１０の破壊されたプラークおよび１０の安定プラークに対するＲＴ−ＰＣＲ分析が行われた。患者および動脈に偏った発現を除外するために、プラークは、個々の患者のいくつかの動脈に由来した（表１、実施例４）。発現をＧＡＰＤＨの発現レベルに正規化した。これは、種々のサンプル間で比較できた。この配列の発現は、１０の破壊されたプラークのうち８において認められた。一方、試験された１０の安定プラークは、そのうちの２のみが陽性であった（実施例４を参照）。
【００５９】
静脈（ｎ＝５）、病的でない動脈（ｎ＝４）、および初期アテローム性動脈硬化性プラーク（ｎ＝５）の個々のサンプルに対するＲＴ−ＰＣＲは、夫々、静脈の全て、病的でない動脈の５０％、および初期病変の４０％においてＳＳＨ６発現を示した（図４）。
【００６０】
ＳＳＨ６配列と相同または同一の配列に関する研究は、部分的オーバーラップを示すいくつかの鋳型（ＩＮＣＹＴＥ遺伝子データベースにおける２０９８ヌクレオチドの鋳型を含む）を示した。しかし、クローンＳＳＨ６は、上記データベースにおける配列の大部分と比較すると、１２０ｎｔ（配列ＩＤ  Ｎｏ：２のヌクレオチド１１１２〜１２３１）のインサートを含んでいた。この１２０ｎｔインサートは、大きいＯＲＦと共に推定開始コドン（配列ＩＤ  Ｎｏ：２のヌクレオチド１１６９〜１１７１）をフレームにおいて含む。全長ＳＳＨ６クローンを得るために、血管平滑筋細胞（ＶＳＭＣ）由来のｃＤＮＡライブラリーをオリジナルｃＤＮＡ断片（de Vries博士（AMC、アムステルダム）によって快く提供された）を用いてスクリーニングした。このスクリーニングの結果、多くの（＞１０）ｃＤＮＡクローンが単離され、それらは全て、２０００ｂｐを超えるＳＳＨ６配列を含んでいた。最も大きいクローンの配列分析は、４７３アミノ酸のＯＲＦ（配列ＩＤ  Ｎｏ：１）を含む２８５８ｎｔのｃＤＮＡ断片（配列ＩＤ  Ｎｏ：２のヌクレオチド６４〜２９２０と同一であるが、ただし、この断片には、その配列の非コード部分中である配列ＩＤ  Ｎｏ：２のヌクレオチド２９０４と２９０５との間に追加の「ｇ」ヌクレオチドが存在する）の存在を示した。
【００６１】
周知ドメインおよびＩＮＣＹＴＥデータベースを使用した詳細なバイオ情報科学は、推定の「血管壁特異的」ｍＲＮＡおよび血管壁特異的タンパク質の存在を示し、これを以降、ＳＳＨ６νとして示した。ＳＳＨ６νｃＤＮＡの配列およびゲノムデータベースは、ＳＳＨ６遺伝子が、染色体５ｐ１３上の９０Ｋｂ以上のゲノム領域にわたり、少なくとも１２エキソンから成ることを示した（表２参照）。
【００６２】
【表２】
2004529620.tif 000003
【００６３】
血管壁特異的ｍＲＮＡ／タンパク質ＳＳＨ６νおよび偏在的に発現したＳＳＨ６ｍＲＮＡは、エキソン３（配列ＩＤ  Ｎｏ：２のヌクレオチド１１１２〜１２３１）の別のスプライシングから生じる。ＳＳＨ６νおよびＳＳＨ６の差別的組織分布は、６２の成人組織、８のヒト細胞系、７の胎児組織および６の対照に関する多組織ノーザンブロット分析（Multiple Tissue Expression Array MTE: Clontech（米国カリフォルニア州, Palo Alto））によってさらに実証された。図５は、ＳＳＨ６の組織分布を示し（プローブとして、配列ＩＤ  Ｎｏ：２の４３６ｂｐのｃＤＮＡインサート（ヌクレオチド９０５〜１３４１）を使用）、図６は、ＳＳＨ６νメッセンジャーの血管壁特異的発現を示す（１２０ｎｔエキソン３特異的プローブを使用）。図６の下のパネルは、このプローブのＶＳＭＣ由来ＲＮＡおよび正の対照（全長ＳＳＨ６νｃＤＮＡ）へのハイブリダイゼーションを示す。
【００６４】
ＳＳＨ６タンパク質をより詳細に解析するための免疫学的手段を開発するために、ＯＲＦの一部（９０９ｂｐ）をグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（６７ｋＤａ）に融合させ、得られた組換えタンパク質を使用して、ＳＳＨ６特異的一本鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）を選択した（模式的表示に関して図７を参照）。ＳＳＨ６特異的ｓｃＦｖを使用したヒトアテローム性動脈硬化性プラーク、ヒト血漿、ヒト組織溶解産物およびいくつかの細胞系のウェスターンブロット分析が、予想された大きさ（〜５３ｋＤａ）のタンパク質が血管壁由来の溶解産物および血漿においてのみ存在し、溶解産物の大部分には３５ｋＤａの産物が存在することを示した（図８参照）。この３５ｋＤａのタンパク質はおそらく、内部メチオニン（ＡＡ１７２）での翻訳開始の結果である。さらに、ヒトの破壊されたアテローム性動脈硬化性プラークの免疫組織化学分析が、血管平滑筋細胞（ＶＳＭＣ）におけるＳＳＨ６タンパク質発現を示した（図９参照）。興味深いことに、ＳＳＨ６タンパク質の局在化は、破壊されたプラークに由来するヒトＶＳＭＣの初代培養物においてＳＳＨ６ｍＲＮＡの存在が認められたこととうまく相関する。
【００６５】
結果：
ヒトＶＳＭＣにおいて発現されかつ破壊されたアテローム性動脈硬化性プラークにおいてアップレギュレーションされるところの以前知られていなかった血管壁特異的ｍＲＮＡ／タンパク質ＳＳＨ６νが同定された。
【００６６】
材料および方法
ＲＴ−ＰＣＲ分析
血管壁におけるＳＳＨ６νの発現プロファイルを示すために、静脈および種々の段階のアテローム性動脈硬化性病変を有する動脈から単離されたｍＲＮＡ、および破壊されたアテローム性動脈硬化性病変由来のＶＳＭＣの初代培養物から単離されたｍＲＮＡに対してＲＴ−ＰＣＲが行われた。ＲＮＡ単離、ｃＤＮＡ合成およびＲＴ−ＰＣＲは上記したように行われた。簡単に述べると、２１７ｂｐのＳＳＨ６ν特異的ＤＮＡ断片を、標準条件（３０ｘ（９４℃、１分；５５℃、１分；７２℃、１分））下、センスプライマー（５’−ＧＧＣＴＡＡＴＴＣＧＧＧＡＧＡＴＡＧＣＣ−３’、配列ＩＤ  Ｎｏ：１１）およびアンチセンスプライマー（５’−ＣＡＡＣＡＣＣＴＣＡＴＧＧＣＡＡＧＴＣＣ−３’、配列ＩＤ  Ｎｏ：１２）を使用して、一本鎖ｃＤＮＡに対してＰＣＲを行うことにより増幅した。得られたＰＣＲ産物を、１％アガロースゲル上で分析した。
【００６７】
多組織ノーザンブロット分析
本質的に製造者のプロトコルに従って、Multiple Tissue Expression Array MTE（Clontech （米国カリフォルニア州、Palo Alto））を使用して、多組織ノーザンブロット分析を行った。簡単に述べると、ＭＴＥアレイを、変性された、33Ｐ標識されたｃＤＮＡプローブと、６５℃で１２時間ハイブリダイズさせ、−７０℃で１２時間、Ｘ線フィルムに暴露させた。
【００６８】
グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ−ＳＳＨ６融合タンパク質（ＧＳＴ−ＳＳＨ６）発現プラスミドの構築
発現プラスミドの構築のためにＳａｌＩ制限部位を導入するために、ＳＳＨ６ｃＤＮＡのＣ末端部分を、センスプライマー（５’−ＣＣＴＡＡＡＴＣＴＡＧＡＧＣＧＴＣＧＡＣＧＡＴＧＣＴＧＧ−３’、配列ＩＤ  Ｎｏ：１３）およびアンチセンスプライマー（５’−ＡＡＧＣＴＧＴＴＡＧＴＣＧＡＣＣＣＴＴＣＡＣＡ−３’、配列ＩＤ  Ｎｏ：１４）を使用して増幅した。所望の制限部位の導入と同時に、ＳＳＨ６のオープンリーディングフレーム内のプロリン（ＣＣＡ）およびアルギニン（ＡＧＧ）コドンを突然変異させて、夫々、セリン（ＴＣＧ）およびスレオニン（ＡＣＧ）コドンにした。次いで、ＰＣＲ産物をＳａｌＩで消化し、得られた９３８ｂｐ断片をｐＧＥＸ−４Ｔ−２中に連結し、ＢＬ２１大腸菌細胞への形質転換を行った。ＧＳＴタンパク質を産生するために、ＢＬ２１大腸菌細胞を、追加のインサートを有しないｐＧＥＸ−４Ｔ−２を用いて形質転換させた。
【００６９】
ＳＳＨ６のウェスターンブロット分析
種々のヒト組織および細胞系の溶解産物を次のように調製した。２〜５ｘ１０7の細胞を集め、５００μｌの氷冷溶菌緩衝液（２５ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、２ｍＭのＰＭＳＦ、１ｍＭのＤＴＴ、０．１ｍＭのベンズアミジンおよび１％Nonidet P40を含む）に再懸濁させ、氷上で２０分インキュベートした。細胞溶解産物を遠心分離によって透明にした。１０〜２０μｇの全タンパク質と等価の溶解産物またはヒト血漿の連続希釈物をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（９％）によって分離し、ニトロセルロース上に移した。２％（ｗ／ｖ）スキムミルク粉末（ＭＰＢＳ）を含むＰＢＳでブロックした後、５μｇ／ｍｌの精製された抗ＳＳＨ６−ｓｃＦｖによってブロットを１時間染色した。ＨＲＰ標識された抗ｍｙｃ抗体とインキュベートした後、ＨＲＰ活性をＥＣＬ染色によって可視化した。
【００７０】
免疫組織化学分析
４μｍの凍結したアテローム性動脈硬化性プラーク切片を、ＴＢＳ−ＴＳ（ＴＢＳ、０．１％（ｖ／ｖ）Tween 20、３％ヒト血清および３％ヒツジ血清）で前処理した。次いで、切片を、ｓｃＦｖ−２Ａ４と共に３０分間インキュベートした。結合したｓｃＦｖ抗体を抗ｍｙｃ抗体（９Ｅ１０）で検出した後、ビオチニル化したヒツジ抗マウス抗体およびアルカリホスファターゼ結合ＡＢＣ試薬と共にインキュベートした。アルカリホスファターゼ活性を、１ｍＭのレバミソール（levamisole、Sigma製）を含むアルカリホスファターゼキットＩ（Vector）を使用して可視化した結果、赤い沈殿を生じた。それらの切片を、ヘマトキシリンによって対比染色した。
【実施例６】
【００７１】
実施例１〜４に記載された手順に従って、不安定プラークにおいてアップレギュレーション（３倍）された別のクローンである配列ＩＤ  Ｎｏ：４も同定された。
特異的シークエンス法：
上記ｃＤＮＡクローンは１０５０塩基対のインサートを含み、そのうち３９１ヌクレオチドが配列分析された。ＩＮＣＹＴＥ遺伝子データベースにおけるこれら３９１ヌクレオチドと相同または同一の配列の検索が、９４６アミノ酸のオープンリーディングフレーム（配列ＩＤ  Ｎｏ：３）を含む３１４５ヌクレオチドの配列（配列ＩＤ  Ｎｏ：４）を示した。このオープンリーディングフレームは、ヒトソーティングネキシン（GenBank受理番号ＡＫ０００３６２）に似たタンパク質に相当する。
【実施例７】
【００７２】
実施例１〜４に記載された手順に従って、不安定プラークにおいてダウンレギュレーションされた（安定プラークに関して特異的）クローンである配列ＩＤ  Ｎｏ：６も同定された（。図３に、配列ＩＤ  Ｎｏ：６のポリヌクレオチドのＩＮＤＢ分析を示す。
特異的シークエンス法：
上記ｃＤＮＡクローンは４００塩基対のインサートを含み、そのうち３４８ヌクレオチドが配列分析された。Geneseq特許データベースにおけるこれら３４８ヌクレオチドと相同または同一の配列の検索が、９５０アミノ酸のオープンリーディングフレーム（配列ＩＤ  Ｎｏ：５）を含む４１１７ヌクレオチドの配列（配列ＩＤ  Ｎｏ：６）を示した。このオープンリーディングフレームは、膜スパニングタンパク質、ＭＳＰ−５（国際特許出願第９９４６３８０号）をコードすると推定された。
【図面の簡単な説明】
【００７３】
【図１】ＳＳＨによって生成したｃＤＮＡクローンの逆ノーザンドットブロット分析を示す。
【図２】破壊されたまたは安定なヒトアテローム性動脈硬化性プラークにおいて差別的に発現された配列ＩＤ  Ｎｏ：２の新しく同定されたポリヌクレオチドのＲＴ−ＰＣＲ分析を示す。
【図３】ＳＳＨによって生成したｃＤＮＡクローンの逆ノーザンドットブロット分析を示す。
【図４】管壁におけるＳＳＨ６の発現を示す。
【図５】偏在的に発現されたＳＳＨ６ｍＲＮＡの組織分布を示す。
【図６】ＳＳＨ６νｍＲＮＡの組織分布を示す。
【図７】ＧＳＴ−ＳＳＨ６融合タンパク質の模式的表示を示す。
【図８】ＳＳＨ６特異的ＳＳＨ６−ｓｃＦｖを使用する、ヒトアテローム性動脈硬化性プラーク、ヒト血漿、ならびにいくつかのヒト組織溶解物および細胞系のウエスターンブロット分析を示す。
【図９】ヒトの破壊されたアテローム性動脈硬化性プラークの免疫組織化学分析を示す。
【図１】
2004529620.tif 000004
【図２】
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【図３】
2004529620.tif 000006
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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