(57)【要約】本発明は一般に、核酸分子間の差異を同定する方法に関し、核酸分子におけるヌクレオチド配列の違いを、核酸二本鎖における不適正対合塩基または非対合塩基に対する、正しく対合した塩基と比した、酸化剤の選択性に基づいて同定しうる方法を提供する。本発明の方法は、野生型および変異型のホモ二本鎖に由来する標的核酸ヘテロ二本鎖分子における、塩基変化（変異および多型）などに起因する、ヌクレオチドの違いの検出を可能にする。【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験核酸二本鎖における第1の核酸分子と第2の核酸分子との間の塩基対合の不一致を検出するための方法であって、
（i）被験核酸二本鎖を、被験核酸二本鎖における不適正対合塩基または非対合（塩基を酸化するのに十分な時間および条件の下で、有効量の酸化剤によって処理する段階；
（ii）1つもしくは複数の反応生成物の形成もしくはその速度；および／または1つもしくは複数の出発物質の消費もしくはその速度をモニターする段階；ならびに
（iii）被験核酸二本鎖の1つもしくは複数の反応生成物の形成もしくはその速度、および／または1つもしくは複数の出発物質の消費もしくはその速度と、同じ条件の段階（i）および（ii）を別個に行った対照核酸二本鎖のものとの間に差があるか否かを判定する段階；
を含み、
被験および対照核酸二本鎖との間で、1つもしくは複数の反応生成物の形成もしくはその速度、および／または1つもしくは複数の出発物質の消費もしくはその速度に差があることによって、被験核酸二本鎖における第1および第2の核酸分子の間の塩基対合の不一致が示されるような方法。
【請求項２】
第1および第2の核酸分子がヌクレオチド配列である、請求項1記載の方法。
【請求項３】
塩基対合の不一致が核酸分子における点変異、挿入または欠失の結果である、請求項1記載の方法。
【請求項４】
被験核酸二本鎖における不適正対合塩基または非対合塩基がチミン、シトシンまたはウラシルである、請求項1記載の方法。
【請求項５】
被験核酸二本鎖における不適正対合塩基または非対合塩基がチミンまたはシトシンである、請求項4記載の方法。
【請求項６】
1つもしくは複数の反応生成物の形成もしくはその速度、および／または1つもしくは複数の出発物質の消費もしくはその速度のモニタリングが、UV可視分光法、NMR分光法、質量分析法、クロマトグラフィー、滴定、比色法、電気化学的検出、視覚的検出、融解温度検出および酸化還元染色からなる群より選択される技術による、請求項1記載の方法。
【請求項７】
1つもしくは複数の反応生成物の形成もしくはその速度、および／または1つもしくは複数の出発物質の消費もしくはその速度のモニタリングが、酸化剤および／または還元型の酸化剤の存在についてのモニタリングを含む、請求項6記載の方法。
【請求項８】
技術がUV可視分光法である、請求項6または7記載の方法。
【請求項９】
酸化剤がKMnO4であって、反応生成物の形成またはその速度のモニタリングが約420nmでの吸光度を測定することを含む、請求項8記載の方法。
【請求項１０】
酸化剤がKMnO4であって、出発物質の消費またはその速度のモニタリングが約525nmでの吸光度を測定することを含む、請求項8記載の方法。
【請求項１１】
被験および対照核酸二本鎖のそれぞれの酸化に関する等吸収点の決定をさらに含む、請求項8記載の方法。
【請求項１２】
技術が視覚的検出である、請求項6記載の方法。
【請求項１３】
技術が、酸化剤による処理を受ける二本鎖の融解温度についてのモニタリングを含む、請求項6記載の方法。
【請求項１４】
酸化剤がKMnO4である、請求項1記載の方法。
【請求項１５】
KMnO4による処理がTEACまたはTMACの存在下で行われる、請求項14記載の方法。
【請求項１６】
区画化された形態にあり、酸化剤、塩基（またはその塩）、被験核酸または二本鎖分子、対照核酸二本鎖または分子、緩衝液および分光セルからなる群より選択される少なくとも2つの成分を含むキットである、請求項1記載の方法を実施するために適合化されたキット。
【請求項１７】
第2の核酸二本鎖を被験核酸二本鎖と同時に処理し、該被験核酸二本鎖および第2の核酸二本鎖が対照核酸二本鎖および被験変異型核酸二本鎖の混合、融解および再アニーリングによって形成されたものである、請求項1記載の方法。
【請求項１８】
第1の核酸二本鎖と第2の核酸二本鎖との間の差異を同定するための方法であって、
（i）各二本鎖を、少なくとも1つの二本鎖を少なくとも部分的に酸化するのに十分な時間および条件の下で、有効量の酸化剤によって別個に処理する段階；
（ii）各二本鎖に関して、1つもしくは複数の反応生成物の形成もしくはその速度、および／または1つもしくは複数の出発物質の消費もしくはその速度をモニターする段階；
（iii）第1および第2の核酸二本鎖の間で、1つもしくは複数の反応生成物の形成もしくはその速度、および／または1つもしくは複数の出発物質の消費もしくはその速度に差があるか否かを判定する段階；
を含み、
1つもしくは複数の反応生成物の形成もしくはその速度、および／または1つもしくは複数の出発物質の消費もしくはその速度に差があることによって、第1および第2の核酸二本鎖の間の差異が示されるような方法。
【請求項１９】
各二本鎖の酸化のモニタリングを、UV可視分光法、NMR分光法、質量分析法、クロマトグラフィー、滴定、比色法、電気化学的検出、視覚的検出、融解温度検出および酸化還元染色からなる群より選択される技術によって評価する、請求項18記載の方法。
【請求項２０】
モニタリングをUV可視分光法によって評価する、請求項19記載の方法。
【請求項２１】
酸化剤がKMnO4であって、反応生成物の形成またはその速度のモニタリングが約420nmでの吸光度を測定することを含む、請求項20記載の方法。
【請求項２２】
酸化剤がKMnO4であって、出発物質の消費またはその速度のモニタリングが約525nmでの吸光度を測定することを含む、請求項20記載の方法。
【請求項２３】
各二本鎖の酸化に関する等吸収点の決定をさらに含む、請求項20記載の方法。
【請求項２４】
技術が、酸化剤による処理を受ける二本鎖の融解温度についてのモニタリングを含む、請求項19記載の方法。
【請求項２５】
酸化剤がKMnO4である、請求項18記載の方法。
【請求項２６】
KMnO4による処理がTEACまたはTMACの存在下で行われる、請求項25記載の方法。
【請求項２７】
区画化された形態にあり、酸化剤、塩基（またはその塩）、第1および／または第2の核酸二本鎖またはその形成のための分子、緩衝液ならびに分光セルからなる群より選択される少なくとも2つの成分を含むキットである、請求項18記載の方法を実施するために適合化されたキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は一般に、核酸分子間の差異を同定する方法に関する。より詳細には、本発明は、核酸分子におけるヌクレオチド配列の違いを、核酸二本鎖中の不適正対合（mismatched）塩基または非対合（unmatched）塩基に対する、正しく対合した（matched）塩基と比した、酸化剤の選択性に基づいて同定しうる方法を提供する。本発明の方法は、野生型および変異型のホモ二本鎖に由来する標的核酸ヘテロ二本鎖分子における、塩基変化（変異および多型）などに起因する、ヌクレオチドの違いの検出を可能にする。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
組換え技術の急速な高度化により、遺伝子活性の制御および調節の双方に関するあらゆる生体系の研究および開発（ゲノミクス）、ならびに、遺伝子機能がいかにして細胞内および細胞外の細胞成分、特にタンパク質および糖タンパク質（プロテオミクス）、さらには細胞表面受容体、他のオルガネラおよび細胞膜内または膜貫通性の構造の合成を制御する遺伝子の動作を決定しているかの解明が、大きく促進されている。
【０００３】
組換えDNA／RNA技術は、個々の細胞、器官および生物全体がいかにして作り出され、成長して成熟し、その本来の寿命を生き続けるかを解明するための研究において、中心的なツールとなっている。このような範囲に含まれるものとしては、それらが、通常であれば物理的完全性の喪失、またはさらには細胞死にさえつながるような物理的、栄養的、化学的、生物的な現象および他の現象に直面した際に、いかにして自らの完全性を修復して維持するように応答しうるかに関する知見がある。
【０００４】
この知見により、臨床研究および基礎研究、商業的、科学的、薬学的、産業的または軍事的な用途のために望ましい特性を有する、トランスジェニック細胞系、動物、植物または他の種を含む、自然界に本来存在しない独特な生物的実体および他の実体の構築も可能になった。
【０００５】
今日の知識の結果として、生きた状態にないDNA／RNA構築物が、工業プロセス、科学研究または軍事目的における使用といった、商業的活動または他の活動のために作製される可能性も存在している。
【０００６】
このため、ヌクレオチド配列の変化を検出できることは、今や、以下のプロセス／現象を非制限的に含む、さまざまな科学的活動を可能にする重要な技術的能力となっている：
1）ヒト、動物、植物、細菌、ウイルス、真菌、原生動物、およびDNA／RNAに基盤をおく他の生命形態を含む種の遺伝暗号の正常性、ならびに／またはこのような生命形態に遺伝子操作が行われていないことを確認すること；
2）疾患状態における診断、予後評価、最適な治療法の選択、治療薬による有害もしくは有毒な作用の軽減、ならびに、疾病の経過に際しての疾患の再発および／または疾患プロセスの発生の予測もしくは発見を可能にする手段として、遺伝子異常を検出すること；
3）動物の的確な育種を可能にすること、これには、特定の固有の産物または研究、商業的もしくは薬学的な目的のための能力を得るために挿入された新たな遺伝子を含有および／または発現する「新たな」種の作出が含まれる；
4）研究または商業的な目的のために特定の遺伝子をそれらのゲノムから除去すること；
5）植物の的確な育種を可能にすること、これには、特定の固有の産物または研究、商業的もしくは薬学的な目的のための能力を得るために挿入された新たな遺伝子を含有および／または発現する「新たな」種の作出が含まれる；
6）研究または商業的な目的のために特定の遺伝子をそれらのゲノムから除去すること；
7）生物における感染の有無を検出すること、および／または、生物的実体（生命形態）に外来性生物が存在することによって想定される転帰を判定すること；
8）宿主／寄生生物の状態および感染状態を検出および探索すること、これは自然界では生存のための適応として、良性もしくは必要なプロセスとして、または潜在性もしくは潜伏性感染の状態としてみられることがある。場合によっては、このような感染状態が、宿主が自己免疫または悪性腫瘍などの疾患を後に発症しやすくなる素因となる感作現象として作用することもある；
9）遺伝的変異を非常に起こしやすいことが知られている、例えばインフルエンザウイルスおよびヒト免疫不全ウイルスなどの感染性因子を含む生物の遺伝子フィンガープリント法を可能にすること；
10）個別的および相互依存的な遺伝子の機能、調節および意義、ならびに健康状態および疾患における特定のプロセスおよび身体機能の調節に関する研究を行うこと；
11）理由の如何を問わず、新たなヌクレオチド配列をDNA／RNAに挿入することを試みたプロセスの成功または失敗を確認すること、およびその反対に、ヒトが用いるため、または食物もしくは薬剤もしくは栄養製品として消費するために特別に育成された動物体もしくは植物体またはこの種の動物もしくは植物から生じた産物にこの種の操作が行われていないことを判定しうること；
12）DNAにランダムまたは特定の障害（突然変異誘発）をもたらすことが知られた、地球外の条件を含む、化学的環境、物理的環境または他の環境に対する曝露後に、細胞のDNA／RNAの状態をモニターしうること。現時点ではこれには電離放射線、変異原性化学物質、食物汚染物質またはある種の感染因子が含まれるが、これは将来の発見によって拡張される可能性がある；
13）生命形態のクローニング後に細胞のDNA／RNAの状態をモニターしうること。このようなプロセスには、クローニングされた生物が無傷または損傷のないDNA配列またはホモ二本鎖を有することの確認が必要なことがある；
14）本来のDNA／RNAが生物体において損傷、切断、ループ置換および欠失を被っていず、細胞核内にその天然の状態と異ならない形態として、または細胞サイトゾル内に存在する場合は他の形態として存在することを確認しうること。
【０００７】
核酸分子はヌクレオチドの重合体であり、1つのヌクレオチド糖の3'位置が次のものの5'位置とホスホジエステル結合によって連結している。ヌクレオチド分子は、DNAの場合には塩基チミン（T）、シトシン（C）、グアニン（G）およびアデニン（A）を含み、RNAの場合にはC、G、Aおよびウラシル（U）を含む。二本鎖核酸分子は相補的塩基の対合による二本鎖の形成によって生じ、この際、CおよびGが互いに結合し、AおよびT（DNA）またはUおよびA（RNA）が互いに結合する。DNAをウラシルなどの異常な誘導塩基を用いて作製することもできる。
【０００８】
塩基の配列により、核酸分子によってコードされるタンパク質のアミノ酸の配列が決定される。ヌクレオチドの変化はアミノ酸配列の違いをもたらし、後者は3次元構造およびタンパク質機能に影響を及ぼす。DNAヌクレオチド配列の異常はそれに依存するタンパク質の産生および機能に影響を及ぼすことがあり、これはタンパク質の産生の喪失から、アミノ酸配列の切断、または単一もしくは複数のアミノ酸置換、欠失もしくは挿入に至るまでの範囲にわたる。
【０００９】
核酸分子における変異および小規模な挿入または欠失を検出できる能力は、疾病状態または疾病状態を発症する性向に関する遺伝子検査の分野でますます重要になっている。一本鎖高次構造多型（SSCP）および不適正対合化学切断（CCM）法などの既存の方法は費用および時間を要するが、これは特にこれらが、必ずしも容易には分解されない一本鎖または断片を分離するための分離段階を含むためである。CCM法にも切断剤が用いられており、通常これは有毒なピペリジンであるため、プロトコールに安全性および取り扱いの問題をさらに付与する余分な段階が組み込まれている。
【００１０】
このように、核酸配列における変異を検出するため、または核酸二本鎖間の差異を検出するためのさらなるプロトコールであって、切断剤の使用および一本鎖もしくは断片を分離するための時間のかかる段階が回避される、または分離段階に依拠する方法における分解能もしくは識別性の向上（すなわち、分離の向上）が得られるプロトコールに対する需要は未だに存在する。
【発明の開示】
【００１１】
発明の概要
本明細書および添付する特許請求の範囲の全体を通じて、文脈で別のものを要求しない限り、「含む（comprise）」という用語、または「含む（comprises）」もしくは「含む（comprising）」などの変形物は、言及した要素または整数、または要素もしくは整数の群を含むものの、他の要素または整数または要素もしくは整数の群を除外しないことを意味するものと解釈される。
【００１２】
本明細書における先行技術の文献に関するいかなる言及も、それらの文献がオーストラリアにおける関連技術に関する共通の一般的な知識の一部をなすことを認めたものではない。
【００１３】
本明細書は、プログラムパテントインバージョン3.0（PatentIn Version 3.0）を使って作成したヌクレオチド配列情報を、本明細書中の参照文献目録の後に含んでいる。各ヌクレオチド配列は、配列表において、数字表示<210>とその後ろに続く配列識別子（例えば、<210>1、<210>2など）によって識別される。各ヌクレオチド配列に関する配列の長さ、配列の種類（DNA）および起源はそれぞれ数字表示欄<211>、<212>および<213>に記載の情報によって示される。本明細書中に言及するヌクレオチド配列は、数字表示欄<400>とその後ろに続く配列識別子（例えば、<400>1、<400>2など）によって定義される。列挙した配列情報中の各配列は左から右に読むと5'から3'の向きである。
【００１４】
核酸分子間の塩基対合の差異、例えば、対照核酸二本鎖（例えば、ホモ二本鎖）と比較した核酸ヘテロ二本鎖における不適正対合または非対合のヌクレオチド塩基を、一本鎖または断片の分離段階を行わずに、核酸二本鎖を酸化剤で処理する結果として、出発物質（starting agent）および／または反応生成物の存在（消費または形成）を決定することに基づいて検出しうることが今回明らかになった。本発明により、被験核酸分子（第1の核酸分子）における相違もしくは変異または置換塩基を、それを対照核酸分子（第2の核酸分子）とハイブリダイズさせて被験核酸二本鎖（ヘテロ二本鎖）を得ることによって、検出することが可能となる。続いて、被験核酸分子における相違もしくは変異または置換塩基が、被験核酸二本鎖における塩基対合の不一致（不適正対合塩基または非対合塩基）として明らかになると考えられる。すなわち、本発明は、第1の核酸分子と第2の核酸分子との間の塩基対合の不一致を検出するための方法であって、前記第1および第2の核酸分子から形成された二本鎖を、核酸二本鎖における不適正対合塩基または非対合塩基を酸化するのに十分な量の酸化剤で処理する段階、ならびにその後に、1つもしくは複数の反応生成物の形成もしくは形成速度、および／または1つもしくは複数の出発物質の消費もしくは消費速度をモニターする段階を含む方法に関する。対照二本鎖を同じ条件下で別個に処理し、その酸化反応を被験二本鎖のものと比較することにより、第1および第2の核酸分子の間の塩基対合の不一致を同定することができる。
【００１５】
本発明はまた、2つの異なる核酸二本鎖の間の差異を、二本鎖に不適正対合または非対合のヌクレオチド塩基が存在しない場合であっても、酸化剤で処理した際の各二本鎖の酸化の程度を評価し、続いて2つの二本鎖の酸化の程度の間に差があるか否かを判定することによって、検出するための方法も提供する。
【００１６】
本発明によれば、被験核酸二本鎖における第1の核酸分子と第2の核酸分子との間の塩基対合の不一致を検出するための方法であって、
（i）被験核酸二本鎖を、被験核酸二本鎖における不適正対合塩基または非対合塩基を酸化するのに十分な時間および条件の下で、有効量の酸化剤によって処理する段階；
（ii）1つもしくは複数の反応生成物の形成もしくはその速度；および／または1つもしくは複数の出発物質の消費もしくはその速度をモニターする段階；ならびに
（iii）被験核酸二本鎖の1つもしくは複数の反応生成物の形成もしくはその速度、および／または1つもしくは複数の出発物質消費もしくはその速度と、同じ条件の段階（i）および（ii）を別個に行った対照核酸二本鎖のものとの間に差があるか否かを判定する段階；
を含み、
被験および対照核酸二本鎖との間で、1つもしくは複数の反応生成物の形成もしくはその速度、および／または1つもしくは複数の出発物質の消費もしくはその速度に差があることによって、前記第1および第2の核酸分子の間の塩基対合の不一致が示されるような方法が提供される。
【００１７】
本発明の方法はそれにより、核酸分子における、置換塩基を含む、相違または修飾の存在を検出することを間接的に可能にする。
【００１８】
本発明の1つの態様において、第1の核酸分子および第2の核酸分子はヌクレオチド配列である。
【００１９】
本発明のもう1つの態様において、塩基対合の不一致は、核酸分子における点変異、点挿入または点欠失の結果である（すなわち、一塩基の不適正対合または非対合塩基）。
【００２０】
本発明のもう1つの態様において、被験核酸二本鎖における不適正対合塩基または非対合塩基は、チミン（DNA）、シトシン（DNAまたはRNA）またはウラシル（RNA）である。
【００２１】
もう1つの局面において、本発明は、第1の核酸二本鎖と第2の核酸二本鎖との間の差異を検出するための方法であって、
（i）各二本鎖を、少なくとも1つの二本鎖を少なくとも部分的に酸化するのに十分な時間および条件の下で、有効量の酸化剤によって別個に処理する段階；
（ii）各二本鎖に関して、1つもしくは複数の反応生成物の形成もしくはその速度、および／または1つもしくは複数の出発物質の消費もしくはその速度をモニターする段階；
（iii）第1および第2の核酸二本鎖の間で、1つもしくは複数の反応生成物の形成もしくはその速度、および／または1つもしくは複数の出発物質の消費もしくはその速度に差があるか否かを判定する段階；
を含み、
1つもしくは複数の反応生成物の形成もしくはその速度、および／または1つもしくは複数の出発物質の消費もしくはその速度に差があることによって第1および第2の核酸二本鎖の間の差異が示されるような方法を提供する。
【００２２】
本発明のさらに好ましい態様において、酸化剤は過マンガン酸カリウム（KMnO4）である。
【００２３】
本発明の他の好ましい態様において、酸化反応は、UV可視分光法、または適した装置での裸眼によるものを含む視覚的検出によってモニターされる。
【００２４】
発明の詳細な説明
本明細書で用いる「酸化」「反応」および「修飾」（ならびにそれらの変形物）という用語は互換的に用いうる。
【００２５】
上記の通り、一本鎖核酸分子がその相補鎖と互いにハイブリダイズしたものからなる二本鎖核酸では、G塩基およびC塩基が互いに結合し、A塩基およびT塩基が互いに結合した（またはUおよびAが互いに結合した）場合に相補的塩基対合が起こる。相補的塩基と結合せず、代わりに別の塩基と対合している塩基は不適正対合塩基と呼ばれ、その対、例えば、CC、CT、CA、TG、TT、AA、AG、GG、UG、UUまたはUCは不適正対合塩基対と呼ばれる。塩基が第2鎖上の別の塩基と結合していない場合には、これは非対合塩基と呼ばれる。第1の核酸分子と第2の核酸分子との間の塩基対合の不一致とは、非相補的塩基対合または非対合、すなわち不適正対合塩基または非対合塩基のことを指すものと解釈される必要がある。
【００２６】
対照核酸二本鎖とは、それに関する塩基対合情報が知られている二本鎖、例えば、完全に相補的に対合した二本鎖（ホモ二本鎖と呼ばれる）のことである。しかし、状況によっては適宜、塩基対合情報が知られているという前提の下で、対照核酸二本鎖が1つまたは複数の不適正対合塩基または非対合塩基を含んでもよい。ホモ二本鎖とは、第1および第2の核酸分子のすべての塩基が相補的な様式で対合している二本鎖のことを指し、これを対照核酸二本鎖として用いることが好ましい。
【００２７】
ヘテロ二本鎖とは、1つまたは複数の不適正対合塩基または非対合塩基が存在する二本鎖のことを指し、これは被験核酸二本鎖とも呼ばれる。第1および第2のヌクレオチド分子の間の塩基対合の不一致は、核酸分子（すなわち、被験核酸分子）における単一のヌクレオチドまたは複数のヌクレオチドの修飾、塩基除去（すなわち、塩基非存在部位（abasic site））、置換、付加または欠失のいずれの結果であってもよい。ヌクレオチド配列におけるこのような変化は、第1（被験）および第2の（対照）ヌクレオチド配列がハイブリダイズして二本鎖を形成した場合に、塩基対不適正対合、または1つもしくは複数の非結合（非対合）塩基を生じさせると考えられる。本発明の方法は、ハイブリダイゼーション時に一塩基対の不適正対合または非結合（非対合）塩基を生じさせる、核酸分子における一塩基の変化（変異または相違と呼ばれる）によって生じた不一致の検出が得られる点で、特に有用である。すなわち、本発明は、核酸分子における1つまたは複数の塩基変異または相違を、それを対照核酸分子（相違または変異を伴わない、被験核酸分子に対して相補的な核酸分子）とハイブリダイズさせ、被験核酸二本鎖の内部での塩基対合の不一致（不適正対合塩基または非対合塩基）を検出することによって、検出することを可能にする。
【００２８】
本発明を、異なる種に由来するDNAホモ二本鎖などの2つの核酸間の差異を検出するために用いることもできる。2つの核酸二本鎖間の差異とは、ヌクレオチド配列および／または塩基対合に関して同一でない2つの核酸二本鎖のことを指す。核酸二本鎖間の差異は本明細書に記載の不適正対合塩基または非対合塩基によって生じるだけではなく、1つまたは複数の正しく対合したヌクレオチド対の差異によっても生じる（実施例8のホモ野生型およびホモ変異型二本鎖、または全く異なる源から得られた核酸二本鎖に起因する単なる差異（例えば、実施例5参照）など）。したがって、本発明は、第1の核酸二本鎖と第2の核酸二本鎖との間の差異を検出するための方法であって、前記第1および第2の核酸二本鎖を、少なくとも1つの二本鎖を少なくとも部分的に酸化するのに十分な時間および条件の下で、有効量の酸化剤によって別個に処理する段階、ならびに所定時間後の各二本鎖の酸化の相対的な程度を決定する段階を含み、各二本鎖の酸化の程度（例えば、等吸収点によって決定）が異なることによって第1および第2の核酸二本鎖の間の差異が示されるような方法も提供する。
【００２９】
本明細書で用いる「ヌクレオチド」という用語は、リン酸基、糖部分および窒素含有塩基を含む単量体単位のことを指すものと解釈される。好ましい糖部分はリボースおよびデオキシリボースなどの五炭糖であるが、六炭糖も「糖部分」という用語の範囲に含まれると見なされる。窒素含有塩基は、核酸二本鎖における対合および誤対合に働きうる上に、プロトン受容体として作用しうる部分を含む、任意の窒素を指すものと解釈される。好ましい窒素含有塩基は、好ましくは1つまたは複数の環を含み（例えば、単環式または二環式）、少なくとも1つの窒素原子を含む、環状のものである。好ましい窒素含有塩基には、ウラシル、チミンおよびシトシンなどのピリミジン塩基、ならびにアデニンおよびグアニンなどのプリン塩基、またはそれらの単純な誘導体（すなわち、置換塩基）、例えばデアザプリンおよびイノシンなどが含まれる。
【００３０】
本明細書で用いる「核酸分子」という用語は、少なくとも2つのヌクレオチドを含む「一本鎖」分子のことを指すものと解釈され、すなわち、核酸二本鎖は少なくとも2対のヌクレオチドを有する。したがって、本発明の方法は、2ヌクレオチド（または2対のヌクレオチド）から全ゲノムまでにわたる核酸分子（二本鎖）に対して適用しうる。
【００３１】
本明細書で用いる「ヌクレオチド配列」は、以下のものから選択されるヌクレオチドの線状配列を指すものと解釈される：
2'-デオキシシチジン5'-リン酸；  シチジン5'-リン酸；
2'-デオキシアデノシン5'-リン酸；  アデノシン5'-リン酸；
2'-デオキシグアノシン5'-リン酸；  グアノシン5'-リン酸；
2'デオキシチミジン5'-リン酸；  ウリジン5'-リン酸
またはそれらの簡単な誘導体、例えばデアザプリンおよびイノシン。
【００３２】
したがって、本発明の1つの好ましい態様において、第1および第2の核酸分子はヌクレオチド配列である。
【００３３】
核酸二本鎖は市販のものを入手しても合成的に入手してもよく、または核酸二本鎖から融解および再アニーリングによって入手してもよく、ゲノムDNAもしくはRNAもしくはPCR産物、または光学顕微鏡検査、電子顕微鏡検査、共焦点顕微鏡検査もしくは類似の技術を含む、透過放射線もしくは反射放射線による検査に適した何らかの形態の固体マトリックスに対して固定された細胞もしくは組織中の原位置に存在するDNA／RNAに由来するものでもよい。本発明の方法は、1つまたは複数の変異を含む可能性のある第1の「被験」核酸分子を、変異を全く含まない第2の「対照」核酸分子とハイブリダイズさせて、被験核酸二本鎖（ヘテロ二本鎖）を形成させることによって、2つの核酸分子の間の不一致を検出するために用いることができる。2つの被験核酸二本鎖は、対照核酸二本鎖と、完全に相補的に対合している上に対照核酸二本鎖と比較して1つまたは複数の配列の相違を含む被験変異型核酸二本鎖との、混合、融解および再アニーリングによって調製しうる（例えば、実施例8を参照のこと）。これにより、相補的な不適正対合塩基対または非対合塩基の調製が可能となる。このハイブリダイゼーションは当技術分野で知られた方法を用いて行うことができ、これは天然のDNAまたはRNAを増幅するPCR工程の際にも起こりうる。続いて、不適正対合塩基対および／または非対合塩基を検出することができる。このようにして、被験核酸分子（すなわち、被験鎖）における遺伝的相違または変異の存在を検出することが可能である。二本鎖の適した種類の1つに、より高温での反応が可能であって、このため融解に起因する酸化を減らすことが可能な、拘束DNA（locked DNA）がある。
【００３４】
二本鎖における不適正対合または非対合のヌクレオチド塩基は、正対合または対合したヌクレオチド塩基よりも酸化剤に対する反応性が選択的により高い場合があることが明らかになった。本発明に用いるのに適した酸化剤には、KMnO4、OsO4、クロム酸、オゾンガス、過酸化物（例えば、H2O2）および過安息香酸（例えば、m-クロロ過安息香酸およびその誘導体）が含まれる。特に適した酸化剤はKMnO4である。
【００３５】
酸化剤の酸化的有効量とは、核酸二本鎖における非対合塩基または不適正対合塩基を、1つもしくは複数の出発物質の消費または1つもしくは複数の生成物の形成を検出しうる程度に修飾（酸化）するのに十分な量のことである。
【００３６】
出発物質とは、酸化反応に用いられる酸化剤などの薬剤、または検討対象の核酸二本鎖のことである。反応生成物とは、二本鎖中の不適正対合塩基または非対合塩基の酸化の結果として形成された生成物、例えば、酸化された核酸二本鎖または還元型の酸化剤などのことである。
【００３７】
核酸分子は末端標識してもよく、標識しなくともよい。標識した（末端標識または内部標識を行った）DNAまたはRNAを適宜用いることにより、変異の位置に関する情報を入手することが可能と思われる。放射性標識、蛍光性標識および酵素性標識などを含む任意の好都合な標識を当業者に周知の様式で用いることができる。適した標識には以下のものが含まれる：32P、33P、14C、FAM、TET、TAMRA、フルオレセインおよびJOE。
【００３８】
核酸二本鎖の酸化は、すべての出発物質を溶液中で用いて、または二本鎖を固体支持体マトリックスに固定化することによって行える。本発明のある種の態様においては、反応溶液から二本鎖を容易に分離することが可能となり、このために出発物質および／または反応生成物の検出が簡略化されることから、二本鎖の固体支持体への固定化が有利と思われる。適した固体支持体は、シリコン由来（例えば、シリカ／ガラス）または紙といった適切な重合体材料から製造しうる。支持体はピン、ウェル、プレートまたはビーズの形状であってよく、磁性成分を有してもよく、または、ビオチン化した二本鎖の付着が可能になるように完全もしくは部分的にストレプトアビジンでコーティングしてもよい。二本鎖を固体支持体に固定化する際には、二本鎖を支持体に付着させることにより、または第1の核酸分子を支持体に付着させ、続いて第2の核酸分子をそれとハイブリダイズさせて付着二本鎖を形成させることにより、これを行うことができる。
【００３９】
出発物質および／または反応生成物の存在の判定、すなわち、1つもしくは複数の反応生成物の形成の程度もしくは速度、および／または1つもしくは複数の出発物質の消費の程度もしくは速度のモニタリングは、任意の適した手段によって行うことができ、これには酸化剤またはその還元型（例えば、MnO2）の検出のための分光法（例えば、UV可視分光法、NMR分光法、質量分析法）、顕微鏡検査、クロマトグラフィー（例えば、HPLC、GC）、滴定、比色法、無機的アッセイ法、および電流の変化によって酸化還元反応が示される電気化学的検出が含まれうる。酸化された核酸二本鎖を、酸化された不適正対合塩基または非対合塩基を別の有機分子（例えば、アルデヒド）または別の酸化還元試薬系、例えば酸化還元色素と結合させること、およびその結果生じた結合生成物の形成を適した手段、例えば上記のものによって検出することによって検出してもよい。本発明のある種の態様においては、酸化剤および／または還元型の酸化剤の存在を判定することが有用と思われる。
【００４０】
第1の核酸分子と第2の核酸分子との間の不一致を検出するための酸化反応は、約0℃から二本鎖の融解点、例えば約10〜50℃までの範囲で行ってよい。酸化を約20〜40℃の温度範囲、より好ましくは約25℃または37℃で行うことが好ましい。異なる核酸二本鎖の間の差異を同定するための酸化反応は上記の温度で行うことができるが、各二本鎖における反応性塩基（例えば、TまたはC塩基）の数の違いに起因する酸化速度を比較することにより、二本鎖の融解点を上回る温度で行うこともできる。
【００４１】
不適正対合塩基または非対合塩基の修飾の速度は、塩基自体の性質に依存する。ある種の酸化試薬（例えば、KMnO4、OsO4）は非対合または不適正対合のチミンおよびウラシルに対する選択性が強く、その半面、シトシンとの反応速度は緩徐である。不適正対合塩基または非対合塩基がグアニンまたはアデニンである場合は、反応速度は一般にさらに低い。したがって、修飾される不適正対合塩基または非対合塩基はチミン、ウラシルまたはシトシンであることが好ましい。好ましくは、不適正対合塩基または非対合塩基の2つの相補的な対が存在する場合には、これらはチミン（またはウラシル）およびシトシンを含むことが好ましい。これによってすべての変異の検出が可能となり、各変異に2回の検出機会が与えられる。近隣の正対合塩基に反応性がある場合もあり、これは特に二本鎖が融解を開始した時にみられる。
【００４２】
酸化のために要する時間は、反応温度、および修飾しようとする不適正対合塩基または非対合塩基の性質に依存すると考えられる。この時間は約1分間から約10時間までの範囲、例えば、約5分間から約3〜4時間までの範囲にあることが好ましい。修飾は約10分間から約1時間の範囲、例えば約30分間かけて行うことが好ましい。
【００４３】
修飾は水溶液中または水性溶媒と非水溶媒との混合物中で行うことが好適であり、適宜、酸性、中性または塩基性の条件下で行ってよく、選択的には、緩衝液、クエン酸緩衝液またはリン酸緩衝液といった緩衝液などの他の物質の存在下で行ってもよい。1つの態様において、修飾はアミノ塩基またはその塩の存在下で行いうる。適したアミノ塩基にはアルキルアミン（モノアルキル性およびジアルキル性）が含まれ、その適した塩には硫酸塩、硝酸塩およびハロゲン化塩、例えば塩化物が含まれる。塩基の例には、テトラエチルアミン、テトラメチルアミンジイソプロピルアミン、テトエチレンジアミンヒドラジンおよびピリジンが含まれる。好ましいアンモニウム塩の例には、テトラエチル塩化アンモニウム（TEAC）およびテトラメチル塩化アンモニウム（TMAC）が含まれる。塩基（または塩）溶液の濃度は、約0〜約6M、好ましくは約2〜4Mの範囲、特に約3Mであってよい。
【００４４】
本発明の1つの好ましい態様において、酸化剤はKMnO4である。遊離ヌクレオチド塩基（チミンなど）の過マンガン酸酸化（修飾）により、不安定な中間生成物である環状過マンガン酸ジエステルの形成がもたらされ、これが塩基性条件下で分解されて、ジオールおよび可溶性のMnO2が放出される（スキーム1）。
【化１】
2004528831.tif 000002
【００４５】
MnO2は420nmに強い吸光性があるが、MnO4−はこの波長をほとんど透過させる。しかし、MnO4−は525nmに強い吸光性を示す。したがって、好都合なことに、酸化反応をUV分光法により、約400〜440nmの範囲、より好ましくは410〜430nmの範囲にある波長、例えば約420nmでMnO2の形成に関して、および／または、約505〜545nmの範囲、より好ましくは515〜535nmの範囲、例えば約525nmでKMnO4の消費に関して、モニターすることができる。
【００４６】
MnO2の形成を検出するのであれば、KMnO4を、不適正対合塩基または非対合塩基に対するモル過剰量、例えば、少なくとも約3モル過剰量、より好ましくは約5モル過剰量として用いることが好ましい。KMnO4（MnO4−）の消費をモニターするのであれば、KMnO4を不適正対合塩基または非対合塩基に対するほぼ等モル量として用いることが好ましい。KMnO4を用いる酸化は、TEACもしくはTMACの存在下または非存在下で行うことができる。本発明の1つの態様において、酸化はTEACまたはTMACの溶液中で行うことができる。
【００４７】
1つの好ましい態様において、不適正対合または非対合のT塩基、U塩基またはC塩基はKMnO4によって修飾される。
【００４８】
この2つのマンガン種はいずれも可視領域に強い吸光性があるため、MnO4−またはMnO2の存在に関する判定を、例えば、MnO4−はTEAC中で薄紅色を呈し、MnO2はTEAC中で黄色を呈するといった単純な視覚的分析によって行うこともできる。
【００４９】
不適正対合塩基または非対合塩基の存在を、ヘテロ二本鎖、すなわち不適正対合塩基または非対合塩基を含む被験核酸二本鎖、およびその対応するホモ二本鎖、すなわち不適正対合塩基または非対合塩基を含まない対照核酸二本鎖のそれぞれの等吸収点の比較によって判定することもできる。互いに平衡状態にある2つの物質（例えば、MnO2およびMnO4−）の吸収スペクトルにおける等吸収点は、2つの物質が同じモル吸光係数を有する波長である。UV可視領域内を適した期間にわたって連続的に走査することにより、核酸試料の修飾に関して等吸収点を評価することができる。ホモ二本鎖における正しく対合したヌクレオチド塩基は、ヘテロ二本鎖中の不適正対合塩基または非対合塩基よりも酸化剤との反応が緩徐である。このため、所定の期間の後には、ヘテロ二本鎖の等吸収点はホモ二本鎖のものとは異なることが予想される。等吸収点を吸光度の変化速度と併用することにより、より正確な測定値を得ることができる。
【００５０】
2つの核酸二本鎖の等吸収点の相対的比較を用いて、2つの核酸二本鎖、例えば、異なる種由来のDNAなどの異なる源に由来する核酸二本鎖の間の差異を、二本鎖の一方または両方に不適正対合塩基または非対合塩基がない場合であっても検出することができるが、これは所定の期間にわたる酸化速度が異なると予想されるためである。2つの核酸二本鎖の間の差異を検出するための酸化法は、第1および第2の核酸分子の間の不一致の検出に関して本明細書に記載した通りに行うことができる。
【００５１】
ヘテロ二本鎖の融解温度は、酸化された塩基の存在量が、酸化されていない不適正対合塩基、特にホモ二本鎖の存在量を上回ることによって低下する可能性が高い。したがって、本発明のもう1つの局面において、本明細書に記載の酸化法は、既存の技術、すなわち、修飾された核酸二本鎖の存在を検出するための分離法を改良するために用いることができる。したがって、本発明の他の態様において、酸化されたヘテロ二本鎖の形成および／または出発材料のヘテロ二本鎖の消費を、融解温度に依拠する方法により、例えば、酸化されたヘテロ二本鎖と出発材料のヘテロ二本鎖または対応するホモ二本鎖との間の融解温度の差を比較することにより、判定または検出することができる。本発明のこのような態様において、酸化法（上記のKMnO4などを用いる）による不適正対合塩基または非対合塩基の検出を、勾配式の温度上昇（約2℃／分など）と組み合わせて用いることができる。このようにして、ホモ二本鎖と不適正対合塩基または非対合塩基を含むヘテロ二本鎖との間の融解温度の違いによって酸化法が改良され、この際、ヘテロ二本鎖は初期融解温度が低いために酸化剤による酸化をより受けやすくなる。反応した不適正対合塩基および近傍の新たな非対合塩基は、ヘテロ二本鎖の融解温度をさらに低下させる効果を及ぼし、ヘテロ二本鎖およびホモ二本鎖の融解温度の差を拡大する。
【００５２】
DNA二本鎖の融解温度は、そのまま吸光度により、または二本鎖特異的色素（例えば、サイバーグリーンI）を酸化されたヘテロ二本鎖およびホモ二本鎖に添加して、温度を徐々に高めることにより、現在の技術を用いて容易に測定できる。一本鎖DNAが多く生じるにつれて蛍光が低下するが、これは容易に検出可能であり、その差を示すことができる。一本鎖特異的色素を用いることにより、融解曲線も得られると考えられる。
【００５３】
適した方法には、高次構造選択的ゲル電気泳動（CSGE）、変性勾配ゲル電気泳動（DGGE）または変性高圧液体クロマトグラフィー（dHPLC）が含まれ、これらの識別能力は酸化プロセスによって向上する可能性が高いと考えられる。
【００５４】
CSGE、dHPLCまたはDGGEなどの方法は、ホモ二本鎖と対応するヘテロ二本鎖との間の融解温度の違いに依拠している。しかし、場合によっては、この融解温度の違いは、不適正対合塩基または非対合塩基を適切に分離してその存在を示すには十分でないことがある。しかし、不適正対合塩基または非対合塩基が酸化剤によって酸化された酸化ヘテロ二本鎖は、酸化されていないヘテロ二本鎖よりも低い温度で融解すると考えられ、このため、ホモ二本鎖と比較した融解温度の差はさらに大きくなる。この差の拡大は分解能に寄与すると思われ、そのために「融解温度」法は不適正対合塩基または非対合塩基を含む二本鎖の同定により有用なものになると考えられる。
【００５５】
DGGEの場合には、酸化されたヘテロ二本鎖、酸化されていないヘテロ二本鎖およびホモ二本鎖を分離しなくとも、この方法が依拠する物理的現象を検出しうると考えられる。すなわち、この方法では、電気泳動分離中に温度または変性濃度を徐々に高めることにより、二本鎖の急激な変性（開放）が起こる。この開放はヘテロ二本鎖の方が早く起こると考えられ、ヘテロ二本鎖の酸化後にはさらに早く起こることが予想される。ホモ二本鎖の開放は遅くなり、より遠方へと移動する。このようにして、ヘテロ二本鎖、すなわち変異を検出することができる。変性因子（例えば、温度または変性化学物質）を酸化剤の存在下で徐々に増加させると、二本鎖が開放された時に酸化剤の消費（または生成物の形成）が急激に増えると予想され、これが検出されると考えられる。これはヘテロ二本鎖の方が対応するホモ二本鎖よりも早く起こると考えられる。
【００５６】
不適正対合塩基または非対合塩基を検出するもう1つの方法は、対立遺伝子特異的なオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションを用いるものであり、これはチップ、ビーズ、ピン、ウェルなどの表面上で、または液相中で行わせることができる。すなわち、酸化されたヘテロ二本鎖が融解して別のDNA片（例えば、プローブ）とハイブリダイズすると考えられる温度は、対応する酸化されていないヘテロ二本鎖のものよりも低いと考えられ、そのために、より大きな差異を伴うハイブリダイゼーションシグナルが得られ、不適正対合塩基または非対合塩基の検出がさらに容易になる可能性がある。
【００５７】
本明細書に記載の酸化プロセスによって改良されると思われるその他の分離法には、当技術分野で知られたSSCPおよびシークエンシング法が含まれる。アガロースゲルを反応生成物の検出に用いてもよい。本発明の方法をさらに、不適正対合塩基または非対合塩基と反応するヒドロキシルアミンまたはカルボジイミドなどの他の試薬と併用してもよい。すなわち、不適正対合塩基が酸化剤（例えば、KMnO4）と反応した後には、この種の試薬は不適正対合塩基または非対合塩基との反応性の向上を示すと思われる。または、不適正対合塩基または非対合塩基を最初に試薬と反応させることにより、不適正対合塩基または非対合塩基の酸化を向上させることも考えられる。ヒドロキシルアミンまたはカルボジイミドと不適正対合塩基または非対合塩基との反応のための条件は、例えば、それぞれ欧州特許第329 311号およびNovackら、PNAS、83、586-60に記載されている。他の試薬には、修復酵素などの酵素が含まれうる（例えば、mut Y、mut A、除去ヌクレアーゼ、s1ヌクレアーゼおよびリゾルベース）。
【００５８】
本発明のさらにもう1つの態様においては、2つの核酸二本鎖の間の差異を、ヘテロ二本鎖の融解温度よりもわずかに下の温度で修飾を行うことによって検出することができる。すなわち、ヘテロ二本鎖およびホモ二本鎖の両方をヘテロ二本鎖の融解温度よりもわずかに下の温度で酸化剤と反応させると、その結果形成された酸化ヘテロ二本鎖は融解し、そのためにT塩基およびC塩基（すなわち、この時点では非対合塩基）を露出すると考えられる。これはヘテロ二本鎖の酸化活性の「急上昇（burst）」をもたらすと考えられ、これは本明細書に記載の技術、例えばMnO2形成またはKMnO4消費などによってモニターすることができる。
【００５９】
本発明のさらにもう1つの局面において、本発明を実施するための成分および／または試薬をキットとして提供してもよい。キットは、本発明における使用に適合した区画化された形態として提供することができ、これは、酸化剤、塩基（またはその塩）、被験核酸分子または二本鎖、緩衝液、分光セルおよび固体支持体相のうち1つまたは複数を含んでよく、さらに本発明を実施するための指示をあわせて提供してもよい。
【００６０】
本発明の方法は、哺乳動物細胞（例えば、ヒト；サル；ウシ、ヤギ、ヒツジ、ウマ、ブタなどの家畜；ラット、マウス、モルモット、ウサギなどの実験動物；イヌ、ネコなどの家庭内伴侶動物；または捕獲された野生動物）、魚類細胞、爬虫類細胞、鳥類細胞、昆虫細胞、真菌細胞、細菌細胞またはウイルス性因子、寄生生物（例えば、プラスモディウム（Plasmodium）、クラミジア（Chlamidia）、リケッチア（Rickettsia）および原虫）、ならびにタバコ、観賞用樹木、低木および顕花植物（例えば、バラ）、樹木、果実を生じる植物、ヒトもしくは動物の消費用の野菜（例えば、リンゴ；ナシ；バナナ；柑橘類果実；モモ、サクランボ、プラムを含む石果；ジャガイモ；根菜；キャベツ科など）ならびにカラスムギ、トウモロコシ、オオムギ、ライムギ、ワタ、ヒマワリ、コムギ、イネ、ならびにエンドウおよびダイズなどのマメ科植物のような農作物、ならびにシロイヌナズナ（Arabidopsis Thaliana）などの実験用植物を含む植物細胞に由来する遺伝物質のスクリーニングに特に有用である。
【００６１】
本発明を特に、多数の試料を高スループット方式でスクリーニングする目的に適用することもできる。
【００６２】
本発明の検出法のいくつかの有用な用途を以下に述べる。
【００６３】
現時点で認識および想定されているすべての生命形態において、遺伝子の変異および相違、または細胞のDNAおよびRNAの完全性に対する損傷の存在の検出または予測を行えることには、以下のものを非制限的に含む、さまざまな状況に用途がある。
【００６４】
遺伝性疾患
染色体または遺伝子におけるDNAの配列の変化が、以下を生じる可能性のある遺伝性状態の同定：
a）免疫性、神経筋、心血管、知的または身体的な能力の向上などの望ましい便益を付与すること；
b）生物の健康および環境変化に対する応答、ならびに／または以下のものを含む疾患の発生の両者を制御する遺伝的機構の能力の低下または消失に起因する能力障害を付与すること；
I．種々の疾患に対する易罹病性の増大（これには場合によっては特異的な遺伝性疾患が含まれる）；
II．十分な機能のある細胞内オルガネラが全く／または十分な量として産生されないこと、細胞内または細胞外タンパク質、他の細胞成分、特に細胞膜上のタンパク質または細胞膜受容体構築物の摂取または分泌などの細胞プロセスに起因する疾患または状態；
III．正常な細胞受精、発生、器官形成、細胞機能の適応および修復、ならびに適正にプログラムされた細胞死に関与するプロセスの不全；
IV．外的もしくは内的な環境要因または食事性要因に対する異常または不適切な応答（これには感染、悪性腫瘍、炎症性または変性疾患、栄養性疾患、自己免疫疾患、依存性障害、行動障害、精神疾患、双極性障害および摂食障害を含む精神障害が含まれる）；
V．免疫系の不適切な活動（これにはアレルギー、自己免疫および免疫不全が含まれる）。
【００６５】
遺伝性の遺伝子変異または差異を正確に同定または予測しうることにより、医学および診断の分野において一定範囲にわたる用途がもたらされる。疾患の原因になることが知られた、またはそう考えられている遺伝子における既知または未知の変異に関して、DNAを高スループット様式で検査することは特に有用である。本方法によってmRNAにおける変異を検出することも可能であり、これが診断的に有用な状況もある。
【００６６】
DNAおよびRNA分子の同定
さまざまな源に由来するDNA分子およびRNA分子を検出しうることは、感染症の診断および遺伝子組換え生物の検出といった場合に重要である。原則的に、過マンガン酸イオンに対するDNAおよびRNA分子の感受性は、それらのヌクレオチド塩基の組成および高次構造に強く依存する。記載した酸化法は、種々の源（植物、動物、ヒト、ウイルスなど）および種々の菌株またはこれらの変種に由来するDNAおよびRNA分子の同定に適用することができる。実施例5には、仔ウシ胸腺DNAおよびマウスプロモーターDNAの等吸収点に関する比較試験について、典型的な例を記載している。
【００６７】
関連のあるウイルス分離株の比較
ウイルスには典型的な例としてインフルエンザウイルスおよびヒト免疫不全ウイルスが含まれ、これらは自らのヌクレオチド配列を短時間のうちに急速に変化させることによって変異することができる。これらの変異株を標準株と比較する通常の方法は、シークエンシングを行った後に配列を比較することである。シークエンシングには長い時間がかかる上に誤りを免れず、現在の方法はあるウイルスと別のものとの間の差異を不適正対合／非対合性のT塩基およびC塩基の数として示すことができ、これはKMnO4反応性と比例している。
【００６８】
癌遺伝子または腫瘍抑制遺伝子
進行性悪性腫瘍を含む腫瘍の発生は、細胞増殖および器官形成の調節に関与する遺伝子の変異と関連がある。これらは天然の局所性または全身性の増殖因子、さらには細胞の正常な寿命を制御する遺伝子およびプログラム細胞死を制御する遺伝子によって制御されるプロセスである。これらの遺伝子はそれぞれ癌遺伝子および腫瘍抑制遺伝子と呼ばれ、生物が正常性を維持し、腫瘍を免れるために重要である。多くの癌遺伝子または腫瘍抑制遺伝子は正常なものと一塩基の違いがあることが明らかにされている。比較はウイルスの場合と同様にシークエンシングによって行われた。本発明の方法は、1つの癌遺伝子に変異があるか否か、または別のものと比較して差異があるか否かを判定するための迅速な評価法への機会を提供するものである。これを行えることは、腫瘍を有する患者の診断、予後評価、治療および監視に有意義と考えられる。
【００６９】
インビトロ変異誘発の検査
遺伝子中の特定の塩基を変更し、それが機能に及ぼす影響を評価することを目的とする取り組みは数多く行われている。このために不可欠なのは、（a）求めた塩基変化が実際に起こっていること、および（b）他の望んでいない塩基変化が生じていないこと、を明らかにすることである。これは現在、シークエンシングおよび配列比較によって判定されている。本発明は、これを行うためのより簡便な方法を提供する。
【００７０】
一塩基多型（SNP's）または多型
生物の遺伝子は、遺伝性疾患または癌の原因になるものとは異なり、無害な変化を配列中に含んでいる。以前は、これらの変化は臨床遺伝学者および診断医にとって邪魔なものとみなされていた。ところが近年、それらは遺伝子を基盤とする医学において非常に重要なものとなっており、世界中の製薬企業の関心の的となっている。
【００７１】
これには主に3つの理由がある：
1．疾患の連鎖マッピング。疾患の原因となる新たな遺伝子（または農業種の場合には良い特徴が得られるもの）は、連鎖というプロセスによって位置が特定され、最終的には同定される。このプロセスでは、何百もの「標識」またはマーカーを遺伝情報に従って同定し、ファミリー内のそれぞれを追跡することにより、どれが本当に当該疾患（または形質）と一緒に遺伝するかを明らかにすることができる。これにより、遺伝子の位置決定が可能になる。現在用いられているマーカーは、そのアッセイ法のために複雑なゲル電気泳動を必要とする。SNP'sは、例えばチップ上でのより簡便なアッセイ法を実現する。
【００７２】
2．SNPsの結果として天然に存在する、より機能的な型およびより機能的でない型の遺伝子の両者を同定することは、薬物代謝を変化させるSNPsを同定することによって特定の治療薬に対する患者の反応を解明および／または予測するのに役立つと思われる。疾患を引き起こさない遺伝子の機能を例えば25％に低下させる変化は、投与した薬剤に重大な副作用を生じさせる恐れがある。このようなSNP'sの同定により、重大な反応を起こすと考えられる患者を同定するための前投与遺伝子検査が可能になり、これによって代替的な治療が可能になると考えられる。
【００７３】
3．喘息、糖尿病、肥満、自己免疫疾患、心血管疾患などの疾患において多数の遺伝子におけるSNPsを同定することができれば、これらの疾患を診断および管理する能力は大きく改善されると考えられる。このような、多くの一般疾患遺伝子（例えば、喘息、糖尿病）における多数のSNPsの同定により、これらの疾患に関して重要な理解が得られると考えられる。2に述べたような変化を伴う遺伝子が多数のこのような遺伝子と組み合わされると一般疾患が引き起こされると考えられている。このため、この種の遺伝子を相関研究によって同定するための取り組みは盛んに行われている。
【００７４】
本方法の諸態様は、費用のかかる分離段階または切断薬が必要でないことから、特に費用に関して、これらの研究を改良するために必要な高スループット様式を提供すると考えられる。
【００７５】
心血管疾患および脳血管疾患
心血管疾患および脳血管疾患は、西洋社会における主な死因および病因である。オーストラリアだけでは、1996年の全死亡のうち41.95％が心疾患または脳卒中に起因し、これに対して癌によるものは26.93％である。地域社会への負担は、財政面のみならず、人的な面でも莫大である。
【００７６】
治療的用途
相補的DNAを用いた後に酸化変異法を用いた検査を行うことによるDNA／RNA構築物の完全性の検査を、遺伝子治療、アンチセンスオリゴヌクレオチド療法、DNAワクチンの作製またはヌクレオチド構築物を用いて開発しうる他の治療手段といった治療目的用のヌクレオチド構築物の品質管理を可能とする使用のために適合化することができる。
【００７７】
RNA変異
RNAにおける変異を検出することもできる。しかし、関心対象のSS RNAからcDNAを作製して、このDNAを対照DNAとともに検査することにより、またはウイルスRNAを参照DNAと直接ハイブリダイズさせることにより、より完全な情報を得ることができる。
【００７８】
疫学
個体群における遺伝子または全ゲノムに対する変化または損傷をモニターすることができれば、環境の質および／または危険でないことを保証する手段として有意義と考えられる。
【００７９】
産業的／商業的用途
DNAおよびRNA構築物を合成することができれば、純粋に産業的な目的でヌクレオチド鎖を構築することが可能となる。相補的DNAを用いた後に望ましくない相違の酸化検出を行うことによって科学用および産業用の構築物の検査および同定を行えれば、将来的に産業用途に必要と思われるこのような「人工的に設計された（designer）」ヌクレオチド配列が正しく規格通りであることを使用前に確認することができる。想定しうる用途には以下が含まれる；
I．単一または複数のオリゴヌクレオチド配列を同定および／または暗号化のために用いること、
II．DNAを基盤とするコンピュータ・システム、
III．取り替えを防ぐために、輸送中の工業製品または商品の完全性を維持すること。
【００８０】
当業者は、本明細書に記載した本発明に対して、具体的に記載したもの以外に変更および修正を行えることを理解していると考えられる。本発明にはこのようなあらゆる変更および修正が含まれ、それらもその精神および範囲に含まれることが理解される必要がある。本発明はまた、本明細書において個別的または一括的に言及または指摘されたすべての段階、特徴、組成物および化合物、ならびに任意の2つまたはそれ以上の前記の段階または特徴の任意およびすべての組み合わせも含む。
【００８１】
ここで、以下の実施例を参照しながら本発明を説明するが、これらは例示のみを目的としており、本明細書中の前記の内容の一般性を限定するものとみなされるべきではない。
【００８２】
実施例
化学物質および分光光度計
化学物質、溶媒および仔ウシ胸腺DNAは、Aldrich Chemical社（Castle Hill、Australia）から購入した。オリゴヌクレオチド（HPLC級）はGeneworks社、South Australiaから購入した。二本鎖4〜15は、以前に記載された手順による一本鎖ヌクレオチドの1対1混合物の調製によって調製した1。547塩基対のDNAの被験試料（マウスβ-グロビンプロモーター）を入手し、以前に記載された条件に従って増幅した2。仔ウシ胸腺DNA（CAS#[91080-16-19]）はSigma-Aldrich社から購入した（製品番号D4522）。溶液は水溶液として調製した。シリカビーズ（Ultraclean（商標）15精製キット）はMO BIO Laboratories社、CA、USAから購入した。過マンガン酸カリウムによる酸化反応は1.2ml石英キュベット内で行い、スペクトルデータはシントラ(Cintra)-10分光光度計（GBC Scientific Equipment Pty Ltd、Victoria、Australia）から、あらかじめ選択した波長で吸光度-時間曲線を記録することによって、および／または紫外-可視領域（200〜800nm）の反復走査によって入手した。
【００８３】
実施例1
この試験では、以前の研究のものに基づく1、2つの11残基オリゴヌクレオチド配列を、以前の記載の通りにアニーリングさせて、ホモおよびヘテロ二本鎖DNAを得た。この結果得られた二本鎖を、室温の3M TEAC溶液中にあるKMnO4溶液に曝露させた。反応の後に420nmの吸光度を測定した。
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【００８４】
モデルとしたホモ二本鎖DNA 4は、
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の1対1混合物の調製によって調製し、ヘテロ二本鎖DNA 5（中央の位置にT-C不適正対合が1つある1）は、
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の1対1混合物の調製によって調製した。
【００８５】
酸化反応に関しては、40μlの試料（20nmolの4または5、蒸留水中）を、0.95mlの3M TEAC溶液中にある10μlのKMnO4溶液（100nmol）と混合した。この反応の後に420nmおよび525nmの吸光度を30分間にわたって測定した。25℃および50℃での30分間にわたる連続走査により、等吸収点を評価した。
【００８６】
この結果を、図1（シリーズ1（二本鎖4、25℃）；シリーズ2（二本鎖5、25℃）；シリーズ3（二本鎖4、50℃）およびシリーズ4（二本鎖5、50℃）および図2a（二本鎖5、25℃）〜2b（二本鎖4、25℃））に示した。
【００８７】
さらにもう1つの試験を25℃でさまざまな反応時間にわたって行ったところ（表1）、2つの二本鎖から明確に異なるMnO2レベルが得られる、これらの二本鎖に関して好ましい条件は25℃、30分間であることがわかった。これらの条件下で、ヘテロ二本鎖5に含まれるT-C不適正対合の酸化速度は、ホモ二本鎖4よりもほぼ2倍の速さであった。
【００８８】
（表１）2つのモデル二本鎖4および二本鎖5を25℃で用いた過マンガン酸酸化反応の完了率
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【００８９】
酸化反応の200〜800nmでの連続走査によって得られた紫外-可視吸収スペクトルにより、二本鎖4および二本鎖5の25℃での等吸収点に有意差があることが判明した（表2、図2bおよび2a）。
【００９０】
（表２）DNA二本鎖の等吸収点
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a二本鎖4（20nmol）および二本鎖5（20nmol）をKMnO4（100nmol）とともにインキュベートした。反応はすべて1mlの3M TEAC溶液中にて25℃で行った。
【００９１】
実施例2
この試験では、ホモ二本鎖（野生型、図6参照）およびヘテロ二本鎖（C-T不適正対合、図11参照）の試料（547塩基対のマウスプロモーター）2を磁性ビーズ上に固定化し（二重反復として）、その結果得られた材料を同量のKMnO4により、25℃で15分間処理した。上清を直ちに分離し、420nmおよび525nmで測定した。2つの試料の間には過マンガン酸イオンに対する反応性の差が認められた（図3）。固体支持体（これらの場合はビーズ）上へのDNAの固定化により、DNAによるスペクトル干渉が回避される。
【００９２】
モデルとした547bpの野生型および変異型DNA断片を蛍光標識プライマー（5'プライマーの場合は6-FAM、3'プライマーの場合はHEX）を用いて増幅したものを用いて、KMnO4の反応性を検討した。プライマーの配列およびPCR条件は以前に報告された通りとした1。DNAホモ二本鎖およびヘテロ二本鎖の形成は以前に報告された条件下で行い、これらに対してKMnO4／TEAC酸化反応を行った2。蛍光標識されたDNAは概ねシリカビーズ上に固定化された。この結果得られたDNA結合ビーズ（75〜100ng）を20μlの1mM KMnO4／3M TEAC溶液とともに25℃で15分間インキュベートした。インキュベーション期間（15分間）の後に、上清を直ちにクオーツキュベット内で3M TEAC溶液により1mlに希釈した。2つの被験二本鎖の比較試験では、MnO2の生成およびKMnO4の消失をそれぞれ420nmおよび525nmで定量的にモニターすることによって行った。その結果を図3に示した（ヘテロ二本鎖：曲線1；ホモ二本鎖：曲線2；対照（DNAなし）：曲線3）。
【００９３】
実施例3
4種類の異なる不適正対合（T-C、C-C、G-TおよびC-A）を有するヘテロ二本鎖DNAの6種のモデル（表3）およびそれらに対応するホモ二本鎖DNAに対して、過マンガン酸酸化試験を上記の条件下で行った。MnO2レベルおよび等吸収点はいずれも、対応するホモ二本鎖と比較してヘテロ二本鎖で変化していることが明らかになった。
【００９４】
（表３）モデルDNA試料の過マンガン酸酸化に関するUV-可視スペクトルデータ
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aMnO2レベル（任意単位）は420nmでの吸光度に基づく。ホモ二本鎖およびヘテロ二本鎖（20nmol）を、1mlの3M TEAC溶液中のKMnO4（100nmol）とともに25℃でインキュベートした。
【００９５】
実施例4
表4には、モデルDNA試料4および5に関する不適正対合酸化呈色（MOC）試験のプロトコールを記載している。簡潔に述べると、DNA試料（チューブ1および2では20nmol、またはチューブ4および5では40nmolのホモ二本鎖およびヘテロ二本鎖）を、容積1mlの3M TEAC溶液中でそれぞれ10μlまたは20μlのKMnO4とともにインキュベートした。反応混合物ならびに対照（DNAなし、チューブ3および6）を25℃で1時間インキュベートした。ヘテロ二本鎖試料はいずれの濃度条件でも濃い黄色を呈したが、ホモ二本鎖試料は対照（濃い紅色）と比べて薄紅色がかっていた（黄色／薄紅色）。この黄色の呈色により、ヘテロ二本鎖の反応の方がMnO2レベルが高いことが示された。ホモ二本鎖試料とヘテロ二本鎖試料との色調の違いはすべての場合（4〜13）に認められた。
【００９６】
（表４）MOC試験のプロトコール
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【００９７】
実施例5
仔ウシ胸腺DNAおよび547bpのマウスプロモーター（上と同じ）の等吸収点を、25μgの仔ウシ胸腺DNAまたは12.4μgのマウスプロモーターを1mlのTEAC中にある0.2μmolのKMnO4とともに25℃でインキュベートすることによって決定して比較した。その結果を表5に示した。
【００９８】
（表５）仔ウシ胸腺DNAおよびマウスβ-グロビンの等吸収点の比較
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【００９９】
実施例6
二本鎖4および二本鎖5に対して25℃で行った過マンガン酸酸化反応（表1参照、実施例1）を、50℃で再度行った（表6および図1）。
【０１００】
（表６）2つのモデル二本鎖4および二本鎖5を用いた50℃での過マンガン酸酸化の完了率
2004528831.tif 000011
【０１０１】
より高いこの温度では、MnO2形成によって計測される酸化速度は25℃の場合よりも有意に高く、早くも5分間後にはホモ二本鎖4の酸化の程度が二本鎖4の25℃での30分間後のものよりも大きかった。理論に限定されることはないが、50℃ではどちらの二本鎖も変性していて、反応速度は各一本鎖核酸分子でのTおよびC塩基の個別の数によって制御されると推定される（4および5の融解温度はそれぞれ50℃および45℃と報告されている1）。したがって、二本鎖の融解温度またはそれを上回る温度において、酸化反応は2つの核酸二本鎖の間の差異を同定するのに有用と考えられる。
【０１０２】
実施例7
T-C不適正対合を含む、モデルとした2つのヘテロ二本鎖DNA（22bpおよび38bp、各20nmol）およびそれらに対応するホモ二本鎖DNAを、1mlの3M TEAC溶液中にあるKMnO4（20μl、0.2μmol）と反応させた。反応混合物を1.2mlクオーツキュベット内で2℃／分の速度で20℃〜80℃に加熱した。420nmの吸光度を測定することによって反応を追跡し、熱分析スペクトルおよび結果をそれぞれ図4および5ならびに表7に示した。
【０１０３】
初期酸化温度は一次導関数分光法（Varian、Cary-300分光光度計）によって容易に得ることができる。その結果から、ヘテロ二本鎖DNAの初期酸化温度がホモ二本鎖DNAのものよりも低いことが示されている。
【０１０４】
（表７）モデルDNAの過マンガン酸酸化に関する熱分析データ
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cTm（初期酸化温度）は一次導関数融解計算ソフトウエア（Cary-300分光光度計）によって得た。
dMnO2レベル（任意単位）は420nmでの吸光度に基づく。
【０１０５】
実施例8
以下のプロトコール（表8）は、比較的長い不適正対合DNA配列の検出用に開発されたものである。この条件を547bp DNA（β-グロビンマウスプロモーター）に適用したところ、あらゆる可能な種類の不適正対合塩基対のセットをうまく検出することができた（C-A、T-G；C-T、A-G；G-G、C-CおよびA-A、T-Tそれぞれ図8、9、11、12、14、15、17および18）。ホモ二本鎖（野生型および変異型）は以前の記載の通りに入手した2。ヘテロ二本鎖試料16〜19は野生型および変異型のホモ二本鎖を増幅して混合することによって入手した。
【０１０６】
（表８）長い不適正対合DNA配列（547bp）の検出のために用いたプロトコール
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・ ホモ二本鎖とヘテロ二本鎖との間の差が最大になるように、3M TEAC溶液は不適正対合のセット：T.G、A.C；T.C、A.G；C.C、G.Gに用い、2M TEAC溶液は不適正対合のセット：T.T、A.Aに用いた。
【０１０７】
このようにして、DNA試料（547bp断片、表9）を2Mまたは3M TEAC溶液中でKMnO4とともにインキュベートした。反応混合物は20℃で開始し、その後は2℃／分の速度で徐々に50℃または60℃まで加熱した。酸化レベルは420nmの吸光度の測定によって追跡し、データを420nmでの吸光度によって分析した。
【０１０８】
酸化反応は、DNA配列（すなわち、ホモ二本鎖およびヘテロ二本鎖DNA）ならびに不適正対合の種類に応じた異なる温度で開始した。いずれの場合にも、ヘテロ二本鎖の酸化レベルは対応するホモ二本鎖のものよりも高かった（表9）。全4セットの不適正対合の熱分析スペクトルを図19〜22に示した。
【０１０９】
以上の実験によって得た酸化パターンの分解能を高めるために、UV-可視微分分光法を分析ツールとして用いた。この微分法による結果を表10に示した。不適正対合のすべての場合において、ヘテロ二本鎖はホモ二本鎖DNAとの比較で、三次導関数分光法に関して最も強いシグナルを呈した。
【０１１０】
（表９）至適温度での420nm吸光度に基づく変異検出
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注：最後の不適正対合セット（T.T、A.A）には2M TEAC溶液を用いた。反復実験のすべてにおいて、酸化レベルには同様の傾向および差が認められた。実験はすべて二重反復式に行った。
a至適温度：ホモ二本鎖DNAとヘテロ二本鎖DNAとの間の420nm吸光度の差が最大となった温度
【０１１１】
（表１０）不適正対合 DNA試料のUV-可視三次導関数分析
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【０１１２】
参照文献
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【図面の簡単な説明】
【０１１３】
【図１】過マンガン酸塩と11塩基対のホモ二本鎖DNA 4およびヘテロ二本鎖DNA 5との、25℃および50℃での酸化反応に関する比較試験を示している。シリーズ1：二本鎖4（25℃）；シリーズ2：二本鎖5（25℃）；シリーズ3：二本鎖4（50℃）およびシリーズ4：二本鎖5（50℃）。二本鎖（各20nmol）を、3M TEAC溶液中のKMnO4（100nmol）と反応させた。
【図２】図2Aおよび図2Bは、それぞれ、二本鎖5との25℃での、および二本鎖4との25℃での酸化反応の連続的走査および等吸収点の測定について示している。二本鎖4および二本鎖5（各20nmol）を、3M TEAC溶液中のKMnO4（100nmol）と反応させた。
【図３】547塩基対の被験ヘテロ二本鎖DNA（曲線1）、ホモ二本鎖DNA（曲線2）および対照（DNAなし、曲線3）を用いた過マンガン酸酸化反応のUV可視スペクトルを示している。被験二本鎖（マウスβ-グロビンプロモーター、12.4μg）を、3M TEAC溶液中のKMnO4（0.2nmol）と25℃で反応させた。
【図４】初期酸化温度53℃および59℃での二本鎖12（上の曲線）および13（下の曲線）の酸化スペクトルを示している。
【図５】初期酸化温度51℃および55℃での二本鎖14（上の曲線）および15（下の曲線）の酸化スペクトルを示している。
【図６】547塩基対のマウスβ-グロビンプロモーターホモ二本鎖（野生型）2の配列を示している。
【図７】野生型ホモ二本鎖の107位（二本鎖配列を左から右に読む）の5'T-3'Aヌクレオチド対が5'C-3'G正対合対（囲み枠により特定されたもの）によって置換された二本鎖試料16に関する、547塩基対のマウスβ-グロビンプロモーターホモ二本鎖（変異型）の配列を示している。
【図８】野生型ホモ二本鎖の107位の5'T-3'Aヌクレオチド対（二本鎖配列を左から右に読む）が5'C-3'A不適正対合対（囲み枠により特定されたもの）によって置換された二本鎖試料16に関する、547塩基対のマウスβ-グロビンプロモーターヘテロ二本鎖（C-A不適正対合）の配列を示している。
【図９】野生型ホモ二本鎖の107位（二本鎖配列を左から右に読む）の5'T-3'Aヌクレオチド対が5'T-3'G不適正対合対（囲み枠により特定されたもの）によって置換された二本鎖試料16に関する、547塩基対のマウスβ-グロビンプロモーターヘテロ二本鎖（T-G不適正対合）の配列を示している。
【図１０】野生型ホモ二本鎖の82位（二本鎖配列を左から右に読む）の5'C-3'Gヌクレオチド対が5'A-3'T正対合対（囲み枠により特定されたもの）によって置換された二本鎖試料17に関する、547塩基対のマウスβ-グロビンプロモーターホモ二本鎖（変異型）の配列を示している。
【図１１】野生型ホモ二本鎖の82位（二本鎖配列を左から右に読む）の5'C-3'Gヌクレオチド対が5'C-3'T不適正対合対（囲み枠により特定されたもの）によって置換された二本鎖試料17に関する、547塩基対のマウスβ-グロビンプロモーターヘテロ二本鎖（C-T不適正対合）の配列を示している。
【図１２】野生型ホモ二本鎖の82位（二本鎖配列を左から右に読む）の5'C-3'Gヌクレオチド対が5'A-3'G不適正対合対（囲み枠により特定されたもの）によって置換された二本鎖試料17に関する、547塩基対のマウスβ-グロビンプロモーターヘテロ二本鎖（A-G不適正対合）を示している。
【図１３】野生型ホモ二本鎖の83位（二本鎖配列を左から右に読む）の5'C-3'Gヌクレオチド対が5'G-3'C正対合対（囲み枠により特定されたもの）によって置換された二本鎖試料18に関する、547塩基対のマウスβ-グロビンプロモーターホモ二本鎖（変異型）の配列を示している。
【図１４】野生型ホモ二本鎖の83位（二本鎖配列を左から右に読む）の5'C-3'Gヌクレオチド対が5'G-3'G不適正対合対（囲み枠により特定されたもの）によって置換された二本鎖試料18に関する、547塩基対のマウスβ-グロビンプロモーターヘテロ二本鎖（G-G不適正対合）の配列を示している。
【図１５】野生型ホモ二本鎖の83位（二本鎖配列を左から右に読む）の5'C-3'Gヌクレオチド対が5'C-3'C不適正対合（囲み枠により特定されたもの）によって置換された二本鎖試料18に関する、547塩基対のマウスβ-グロビンプロモーターヘテロ二本鎖（CC不適正対合）の配列を示している。
【図１６】野生型ホモ二本鎖の123位（二本鎖配列を左から右に読む）の5'T-3'Aヌクレオチド対が5'A-3'T正対合対（囲み枠により特定されたもの）によって置換された二本鎖試料19に関する、547塩基対のマウスβ-グロビンプロモーターホモ二本鎖（変異型）の配列を示している。
【図１７】ホモ二本鎖の123位（二本鎖配列を左から右に読む）の5'T-3'Aヌクレオチド対が5'A-3'A不適正対合対（囲み枠により特定されたもの）によって置換された二本鎖試料19に関する、547塩基対のマウスβ-グロビンプロモーターヘテロ二本鎖（A-A不適正対合）の配列を示している。
【図１８】野生型ホモ二本鎖の123位（二本鎖配列を左から右に読む）の5'T-3'Aヌクレオチド対が5'T-3'T不適正対合対（囲み枠により特定されたもの）によって置換された二本鎖試料19に関する、547塩基対のマウスβ-グロビンプロモーターヘテロ二本鎖（T-T不適正対合）の配列を示している。
【図１９】T-G／A-C不適正対合を含む547塩基対のDNA（試料16）の酸化分析スペクトルを示している：ヘテロ二本鎖（左）、ホモ二本鎖野生型（中央）およびホモ二本鎖変異型（右）。吸光度は420nmで測定した。
【図２０】T-C／A-G不適正対合を含む547塩基対のDNA（試料17）の酸化分析スペクトルを示している：ヘテロ二本鎖（左）、ホモ二本鎖野生型（中央）およびホモ二本鎖変異型（右）。吸光度は420nmで測定した。
【図２１】C-C／G-G不適正対合を含む547bpのDNA（試料18）の酸化分析スペクトルを示している：ヘテロ二本鎖（左）、ホモ二本鎖野生型（中央）およびホモ二本鎖変異型（右）。吸光度は420nmで測定した。
【図２２】T-T／A-A不適正対合を含む547bpのDNA（試料19）の酸化分析スペクトルを示している：ヘテロ二本鎖（左）、ホモ二本鎖野生型（中央）およびホモ二本鎖変異型（右）。吸光度は420nmで測定した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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