(57)【要約】【課題】本発明は、ビブリオ・メチニコビ（Ｖｉｂｒｉｏ ｍｅｔｓｃｈｎｉｋｏｖｉｉ）ＫＳ１から由来したアルカリ性蛋白質分解酵素活性を有するポリペプチドＶａｐＫをコードする遺伝子断片ｖａｐｋが対で連結された二合体遺伝子ｖａｐｋを組換させたベクタを製造し、その組換えベクタを導入した大腸菌、ビブリオ・メチニコビ（Ｖｉｂｒｉｏ ｍｅｔｓｃｈｎｉｋｏｖｉｉ）形質転換体及びこれら形質転換体を利用してアルカリ性蛋白質分解酵素を生産する方法を提供する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
アルカリ性蛋白質分解酵素をコードした遺伝子ｖａｐｋが連鎖した二合体遺伝子ｖａｐｋを含有したプラスミドｐＤＳＢＣｍ。
【請求項２】
請求項１に記載の組換えプラスミドｐＤＳＢＣｍの製造方法であって、アルカリ性蛋白質分解酵素をコードした遺伝子ｖａｐｋを含む組換えプラスミドｐＳＢＣｍにｐａｒ遺伝子を挿入してプラスミド安定性を向上させたｐＳＰ１プラスミドを製造する段階；
前記ｐＳＰ１に含有されたアルカリ性蛋白質分解酵素遺伝子ｖａｐｋが逆方向に組換えされたｐＳＰＲ１プラスミドを製造する段階、
前記ｐＳＰＲ１内のｖａｐｋ遺伝子とｐａｒ遺伝子間をＥｃｏＲＩで切断した後、エキソヌクレアーゼＢａｌ３１で処理した後、遺伝子接合酵素を処理して遺伝子サイズを減らしたｐＳＰＲ−４７プラスミドを製造する段階、および
前記ｐＳＰＲ−４７をＨｉｎｄＩＩＩで切断した後、新たなｖａｐｋ遺伝子を組換えて組換えプラスミドｐＤＳＢＣｍを製造する段階を含むアルカリ性蛋白質分解酵素をコードしたｖａｐｋ遺伝子を対で含有する組換えプラスミドｐＤＳＢＣｍ製造方法。
【請求項３】
請求項１に記載の組換えプラスミドベクタを含む形質転換された宿主細胞。
【請求項４】
前記形質転換された宿主細胞が大腸菌またはビブリオ・メチニコビ（Ｖｉｂｒｉｏ ｍｅｔｓｃｈｎｉｋｏｖｉｉ）であることを特徴とする請求項３に記載の形質転換された宿主細胞。
【請求項５】
請求項３または請求項４に記載の形質転換された菌株を利用してアルカリ性蛋白質分解酵素ＶａｐＫを生産する方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、すでに報告されたビブリオアルカリ性蛋白質分解酵素生産菌株において、二重のアルカリ性蛋白質分解酵素遺伝子を有する組換えプラスミドに形質転換して菌株を改良する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ビブリオアルカリ性蛋白質分解酵素は、蛋白質をアミノ酸により分解する酵素を言い、アルカリ性蛋白質分解酵素の活性を有する微生物は多様である。これにはバシラス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、セラチア属（Ｓｅｒｒａｔｉａ）などが代表的に用られている。
【０００３】
前記菌株を利用したアルカリ性蛋白質分解酵素の生産において主要な点はアルカリ性蛋白質分解酵素の活性が高く、これは生産工程の経済性に非常に重要な要素である。
【０００４】
最近の発明では、アルカリ性蛋白質分解酵素の活性を高めるために遺伝工学技術を利用してアルカリ性蛋白質分解酵素をコードする遺伝子を含有した組換えベクタを製造し、組換えベクタ形質転換体を製造してアルカリ性蛋白質分解酵素の活性を増加させる研究が進行された。
【０００５】
本発明者らは、すでに「洗濯洗剤用アルカリ性蛋白質分解酵素ＶａｐＫ、これをコードする遺伝子組換え発現ベクタおよび形質転換された菌株」において菌株としてビブリオ・メチニコビＫＳ１および組換え発現ベクタとしてｐＳＢＣｍを特許出願したことがあり（大韓民国特許出願番号１９９９−１２５８８）、本発明では前記ベクタおよび菌株を全面的に参照した。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明者らは、アルカリ性蛋白質分解酵素の活性が高い形質転換体を製造するためにビブリオ・メチニコビ（Ｖｉｂｒｉｏ ｍｅｔｓｃｈｎｉｋｏｖｉｉ）ＫＳ１から分離したアルカリ性蛋白質分解酵素遺伝子を二重で含有した組換えベクタを製造し、これをビブリオに形質転換し、アルカリ性蛋白質分解酵素活性が増加した形質転換体を開発した。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明は、アルカリ性蛋白質分解酵素をコードした遺伝子ｖａｐｋが連鎖した二合体遺伝子ｖａｐｋを含有したプラスミドｐＤＳＢＣｍを提供する。
【０００８】
また、本発明はアルカリ性蛋白質分解酵素をコードした遺伝子ｖａｐｋを含む組換えプラスミドｐＳＢＣｍにｐａｒ遺伝子を挿入してプラスミド安定性を向上させたｐＳＰ１プラスミドを製造する段階；
前記ｐＳＰ１に含有されたアルカリ性蛋白質分解酵素遺伝子ｖａｐｋが逆方向に組換されたｐＳＰＲ１プラスミドを製造する段階；
前記ｐＳＰＲ１内のｖａｐｋ遺伝子とｐａｒ遺伝子間をＥｃｏＲＩで切断した後、エキソヌクレアーゼＢａｌ３１で処理した後、遺伝子接合酵素を処理して遺伝子サイズを減らしたｐＳＰＲ−４７プラスミドを製造する段階；および
前記ｐＳＰＲ−４７をＨｉｎｄＩＩＩで切断した後、新たなｖａｐｋ遺伝子を組換えて組換えプラスミドｐＤＳＢＣｍを製造する段階を含むアルカリ性蛋白質分解酵素をコードしたｖａｐｋ遺伝子を対で含有する組換えプラスミドｐＤＳＢＣｍの製造方法を提供する。
【０００９】
また、本発明は前記組換えプラスミドベクタを含む形質転換された宿主細胞を提供する。
【００１０】
また、本発明は前記形質転換された宿主細胞が大腸菌またはビブリオ・メチニコビ（Ｖｉｂｒｉｏ ｍｅｔｓｃｈｎｉｋｏｖｉｉ）である形質転換された宿主細胞を提供する。
【００１１】
本発明はまた、本発明は前記形質転換された菌株を利用してアルカリ性蛋白質分解酵素ＶＡＰＫを生産する方法を提供する。
【００１２】
【発明の実施の形態】
本発明は、遺伝子組換え技術を利用してアルカリ性蛋白質分解酵素ＶａｐＫをコードする遺伝子の二合体、すなわち、２個のアルカリ性蛋白質分解酵素遺伝子が連鎖したプラスミドが導入された形質転換体を開発し、これを通じてアルカリ性蛋白質分解酵素を高収率で生産する方法を提供する。
【００１３】
本発明では、アルカリ性蛋白質分解酵素をコードする遺伝子を分離するためにビブリオ・メチニコビＫＳ１を培養した後、細胞を収穫して破砕した後、固形物を遠心分離により除去した無細胞助酵素液からビブリオの染色体ＤＮＡを得た。前記から得られた染色体ＤＮＡを制限酵素で切取って遺伝子運搬体であるベクタに組換えてｐＳＢＣｍ、ｐＳＰ１、ｐＳＰＲ１、ｐＳＰＲ−４７、ｐＤＳＢＣｍなどの組換えプラスミドを製造し、これを大腸菌にクローニングした。
【００１４】
製造されたｐＳＢＣｍ組換えプラスミドを、まず大腸菌にクローニングしてアルカリ性条件で蛋白質分解酵素測定を行い、アルカリ性蛋白質分解酵素の発現を確認した。しかし、大腸菌からアルカリ性蛋白質分解酵素の発現は一般的に知られている通り非常に低かった。
【００１５】
これに、本発明者は上記の組換えプラスミドをビブリオに導入した。このようにして製造された組換えビブリオ・メチニコビｐＤＳＢＣｍは、既存のビブリオ・メチニコビに比べて約２．５倍の蛋白質分解酵素活性が増加した。
【００１６】
本発明に使用された菌株であるビブリオ・メチニコビＫＳ１はビブリオ・メチニコビＲＨ５３０Ｎ−４−８菌株（韓国種菌協会に１９９８年２月２３日付でＫＦＣＣ−１１０３０に寄託）を突然変異原にしてＮ，Ｎ−ニトロソグアニチン（ＮＴＧ）を処理し、生産収率を２倍以上向上させた改良菌株としてＫｏｒｅａｎ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｅｎｔｅｒ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓに１９９８年１２月１５日付で寄託番号ＫＣＣＭ−１０１４１として寄託された菌株である。
【００１７】
本発明に使用されたｐＳＢＣｍ組換えプラスミドは、大腸菌Ｔｏｐ１０Ｆ’を宿主にして国際寄託機関であるＫｏｒｅａｎ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｅｎｔｅｒ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓに１９９８年１２月１５日付で寄託番号ＫＣＣＭ−１０１４２として寄託された。
【００１８】
発明の詳細な内容を、下記実施例により記述する。
【００１９】
＜実施例１＞
アルカリ性蛋白質分解酵素遺伝子ｖａｐｋのクローニング
ビブリオ・メチニコビＫＳ１を下記表１の組成からなる培地を利用して３０℃で培養した後、細胞を回収して破砕した。この破砕液を遠心分離した（６，０００ｒｐｍ）後、上澄液を回収して染色体ＤＮＡを精製し、制限酵素であるＨｉｎｄＩＩＩで切取って運搬体であるベクタ（ｐＫＦ３）に組換え、２．９Ｋｂのアルカリ性蛋白質分解酵素遺伝子をクローニングした。クローニングしたプラスミド（これをｐＳＢＣｍと言う）に制限酵素であるＨｉｎｄＩＩＩで処理した後、１％アガロースゲルで電気泳動を行った。電気泳動したゲルを染色薬（エチジウムブロマイド）で染色した。アガロースゲル電気泳動を通じて分析した結果、アルカリ性蛋白質分解酵素遺伝子がクローニングされていることを確認した（図１）。
【００２０】
【表１】
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【００２１】
＜実施例２＞
アルカリ性蛋白質分解酵素の分離および精製
前記培地で培養したビブリオ・メチニコビＫＳ１を遠心分離し、上澄液を準備して酵素試料として利用した。一方、大腸菌（ｐＳＢＣｍ）形質転換体の細胞を回収して破砕した後、この破砕液を遠心分離（６０００ｒｐｍ）して上澄液を酵素試料として準備した。試料を緩衝液（６Ｍ要素、２．５％ソジウムドデシルスルフェート、５％（ｗ／ｖ）β−メルカプトエタノール、０．０１Ｍトリス−塩酸（ｐＨ６．８）、１０％（ｗ／ｖ）グリセロール、０．００２％ブロモフェノールブルー）と同量で混ぜて１５分間沸水で湯せんした後、電気泳動した。電気泳動したゲルを染色薬（０．０５％クマシーブリリアントブルーＲ−２５０）で染色し、脱色薬（５０％メタノール、１０％酢酸）により脱色した。ＳＤＳ−電気泳動は図２に示されており、その結果、２９ｋＤａのアルカリ性蛋白質分解酵素のバンドが確認された。
【００２２】
＜実施例３＞
分離されたアルカリ性蛋白質分解酵素ＶａｐＫの活性染色
前記培地で培養したビブリオ・メチニコビＫＳ１を遠心分離（６０００ｒｐｍ、１０分）した上澄液を助酵素として使用し、大腸菌（ｐＳＢＣｍ）形質転換体の細胞を回収して破砕した後、この破砕液を遠心分離（６０００ｒｐｍ）して上澄液を試料として準備した。試料を緩衝液（５０ｍＭ ｐｈｏｓｔａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．０）、１０％（ｗ／ｖ）グリセロール、０．００２％ブロモフェノールブルー）と同量で混ぜて電気泳動した。電気泳動したゲルを脱脂粉乳（Ｓｋｉｍ ｍｉｌｋ）とバッファ（５０ｍＭ Ｓｏｄｉｕｍ ｃａｒｂｏｎａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ、ｐＨ １０．０）が含有された寒天上に置いてアルカリ性蛋白質分解酵素の活性を観察した。その結果、寒天内の脱脂粉乳（Ｓｋｉｍ ｍｉｌｋ）が分解され、アルカリ性蛋白質分解酵素の活性が確認できた（図３）。
【００２３】
＜実施例４＞
二合体アルカリ性蛋白質分解酵素遺伝子のクローニング
前記アルカリ性蛋白質分解酵素遺伝子ｖａｐｋを含む組換えプラスミドｐＳＢＣｍ（図４）を二つのアルカリ性蛋白質分解酵素遺伝子を対で有する組換えプラスミド（ｄｉｍｅｒｅｄ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐ ｌａｓｍｉｄ）にするために中間段階でｐＳＰ１、ｐＳＰＲ１、ｐＳＰＲ−４７プラスミドに組換えた。
【００２４】
ｐＳＢＣｍのプラスミド安全性を高めるためにプラスミドの安全性を高める機能を有するｐａｒ遺伝子をｐＳＢＣｍのＰｖｕＩＩ、ＨｉｎｃＩＩサイトに組換えてアルカリ性蛋白質分解酵素遺伝子ｖａｐｋとｐａｒ遺伝子を含有した組換えプラスミドであるｐＳＰ１を製造した（図５）。
【００２５】
前記製造された組換えプラスミドｐＳＰ１に含有されたアルカリ性蛋白質分解酵素遺伝子のサイズを減らすためにアルカリ性蛋白質分解酵素遺伝子ｖａｐｋの方向が反対に組換えられたプラスミドであるｐＳＰＲ１を製造した（図６）。
【００２６】
前記製造された組換えプラスミドであるｐＳＰＲ１内にアルカリ性蛋白質分解酵素遺伝子ｖａｐｋとｐａｒ遺伝子間に存在するＥｃｏＲＩサイトを切断した後、エキソヌクレアーゼであるＢａｌ３１で処理した後、遺伝子接合酵素を処理した。このように組換えてプラスミドｐＳＰＲ−４７を製造した（図７）。
【００２７】
前記製造された組換えプラスミドであるｐＳＰＲ−４７内に存在するＨｉｎｄＩＩＩサイトに実施例１でクローニングされた２．９Ｋｂのアルカリ性蛋白質分解酵素遺伝子を再度導入して組換えプラスミドｐＤＳＢＣｍを製造した（図８）。
【００２８】
＜実施例５＞
単一アルカリ性蛋白質分解酵素遺伝子を含有した組換えベクタの大腸菌に形質転換
実施例１および実施例２の２．９Ｋｂのアルカリ性蛋白質分解酵素遺伝子を含む組換えプラスミドｐＳＢＣｍ、ｐＳＰ１、ｐＳＰＲ１、ｐＳＰＲ−４７、ｐＤＳＢＣｍを大腸菌に導入するために大腸菌ＨＢ１０１をＬＢ培地で培養した後、１００ｍＭ塩化カルシウムを添加し、０℃で１５分間放置した後、更に遠心分離して菌体を回収した。菌体を再度１００ｍＭ塩化カルシウム溶液で懸濁した後、０℃で５分間放置し、ｐＳＢＣｍプラスミドを入れて０℃で１時間放置した後、４２℃で９０秒間熱衝撃を加え、更に０℃で５分間放置し、ＬＢ培地１ｍｌを入れた後、クロラムフェニコール（３４μｇ／ｍｌ）が含まれたＬＢ培地に塗抹し、３７℃で培養して３０℃で２４時間培養して育つコロニーを選別した。
【００２９】
＜実施例６＞
ビブリオ・メチニコビにおける形質転換
アルカリ性蛋白質分解酵素遺伝子を含有した組換えプラスミドをビブリオ・メチニコビＫＳ１に形質転換するため、エレクトロポレーション（Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）方法を使用した。
【００３０】
ＫＳ１菌株を前記培地で３０℃で培養した後、細胞を遠心分離により回収（６，０００ｒｐｍ、１０分、４℃）し、１／２０体積のＨ−緩衝溶液（２００ｍＭ Ｓｕｃｒｏｓｅ、１ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１０％ ｇｌｙｃｅｒｏｌ）で懸濁した。これを２回繰り返した後、８０μｌのＨ−緩衝溶液に再懸濁する。この懸濁液に組換えプラスミドを添加した後、０．２ｃｍキュベットに入れ、ＧＥＮＥ ＰＵＬＳＥＲ ＩＩ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｃｏ．）を使用して１，５００Ｖ、１０μＦ、２００Ωで電気衝撃を与えた後、前記培地６００μｌを添加して３０℃で培養し、２５μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールが添加された寒天培地でビブリオ形質転換体を選別した。
【００３１】
＜実施例７＞
組換えビブリオ形質転換体からアルカリ性蛋白質分解酵素の発現測定
アルカリ性蛋白質分解酵素活性の測定のためにＹａｎａｇｉｄａ ｅｔ ａｌ．（１９８６）の方法を変形して使用した。１００ｍＭ炭酸ナトリウム緩衝溶液（Ｓｏｄｉｕｍ ｃａｒｂｏｎａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ、ｐＨ １０．５）に溶かし、熱を加えた２％カゼイン溶液（ｃａｓｅｉｎ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）２．５ｍｌと前記培地で培養した細胞を遠心分離（６，０００ｒｐｍ、１０分、４℃）して得られた上澄液を同一な緩衝溶液に希釈して０．５ｍｌを混合した。この混合物を３７℃で１０分間反応させた後、反応停止溶液（０．２２Ｍ ｔｒｉｃｈｌｏｒｏａｃｅｔａｔｅ、０．２２Ｍ ａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ、０．２２Ｍ ｓｏｄｉｕｍ ａｃｅｔａｔｅ）を添加して反応を中止させ、氷で１５分間冷却させた後、蛋白質沈殿物を遠心分離（１２，０００ｒｐｍ、１５分、４℃）して除去した。上層液１ｍｌと蒸溜水９ｍｌを混合後、２８０ｎｍで吸光度を測定した。蛋白質分解酵素１ユニット（ｕｎｉｔ）は１０分間反応させた反応液の吸光度が０．１増加する量にして使用した。
【００３２】
上記の方法によりビブリオ・メチニコビＫＳ１と組換えビブリオ・メチニコビｐＤＳＢＣｍのアルカリ性蛋白質分解酵素活性を測定した結果、既存のビブリオ・メチニコビＫＳ１に比べて形質転換体であるビブリオ・メチニコビｐＤＳＢＣｍでアルカリ性蛋白質分解酵素の活性が２．５倍以上増加していることを確認した（図９）。
本発明の組換えプラスミドの寄託
本発明の組換えベクタｐＤＳＢＣｍは、ビブリオ・メチニコビ（Ｖｉｂｒｉｏ ｍｅｔｓｃｈｎｉｋｏｖｉｉ）ＫＳ１を宿主にして国際寄託機関である韓国種菌協会に２０００年７月４日付で寄託番号ＫＦＣＣ−１１１８０として寄託され、２００１年７月９日付でブダペスト条約の下に同機関に国際寄託番号ＫＣＣＭ−１０２９２に変更されて寄託された。
【００３３】
【発明の効果】
本発明の方法により提供されるアルカリ性蛋白質分解酵素コーディング遺伝子を二重で組換えベクタに入れて作った組換えプラスミド形質転換体のアルカリ性蛋白質分解酵素生産能が既存の形質転換しない菌株に比べて優れるため、本発明のプラスミドを含有するビブリオ・メチニコビ形質転換体はアルカリ性蛋白質分解酵素生産菌株として有用に利用され得る。
【図面の簡単な説明】
【図１】アルカリ性蛋白質分解酵素遺伝子ｖａｐｋを含む組換えプラスミドｐＳＢＣｍの電気泳動写真
【図２】ビブリオ・メチニコビ（Ｖｉｂｒｉｏ ｍｅｔｓｃｈｎｉｋｏｖｉｉ）ＫＳ１とｐＳＢＣｍ大腸菌形質転換体から分離したアルカリ性蛋白質分解酵素ｖａｐｋのＳＤＳ−電気泳動写真
【図３】ビブリオ・メチニコビＫＳ１とｐＳＢＣｍ大腸菌形質転換体から分離したアルカリ性蛋白質分解酵素ＶａｐＫの活性染色写真
【図４】アルカリ性蛋白質分解酵素遺伝子を含有した組換えプラスミドｐＳＢＣｍの制限酵素地図
【図５】アルカリ性蛋白質分解酵素遺伝子ｖａｐｋとｐａｒ遺伝子を含有した組換えプラスミドｐＳＰ１の制限酵素地図
【図６】逆方向のアルカリ性蛋白質分解酵素遺伝子ｖａｐｋとｐａｒ遺伝子を含有した組換えプラスミドｐＳＰＲ１の制限酵素
【図７】逆方向のアルカリ性蛋白質分解酵素遺伝子ｖａｐｋとｐａｒ遺伝子を含有してサイズを減らした組換えプラスミドｐＳＰＲ−４７の制限酵素地図
【図８】アルカリ性蛋白質分解酵素遺伝子ｖａｐｋを二合体として含む組換えプラスミドｐＤＳＢＣｍの制限酵素地図
【図９】ビブリオ・メチニコビＫＳ１菌株と組換えビブリオ・メチニコビｐＳＢＣｍ菌株、組換えビブリオ・メチニコビｐＤＳＢＣｍ菌株のアルカリ性蛋白質分解酵素の活性を比較した結果を示した図面
【符号の説明】
Ｍ　サイズマーカー（図１）
１　１線組換えプラスミドｐＳＢＣｍ（図１）
２　２線組換えプラスミドｐＳＢＣｍ／ＨｉｎｄＩＩＩ（図１）
−　２．２Ｋｂの運搬体ベクタｐＫＦ３（図１）
−　２．９Ｋｂのビブリオアルカリ性蛋白質分解酵素遺伝子（図１）
Ｍ　サイズマーカー（図２）
１　大腸菌形質転換体から発現されたアルカリ性蛋白質分解酵素（図２）
２　ビブリオから発現されたアルカリ性蛋白質分解酵素（図２）
−　２９ｋＤａのアルカリ性蛋白質分解酵素（図２）
１　大腸菌形質転換体から発現されたアルカリ性蛋白質分解酵素活性（図３）
２　ビブリオから発現されたアルカリ性蛋白質分解酵素活性
【図９】
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【国際公開パンフレット】
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2004504034.tif 000006
2004504034.tif 000007
2004504034.tif 000008
2004504034.tif 000009
2004504034.tif 000010
2004504034.tif 000011
2004504034.tif 000012
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【国際調査報告】
2004504034.tif 000028
2004504034.tif 000029