(57)【要約】核酸増幅反応を実施するための方法であって、前記方法はプライマー伸長が生じないようにするために十分なピロリン酸塩の存在下に増幅反応混合物を形成する段階と、前記ピロリン酸塩をピロホスファターゼ酵素（ＰＰａｓｅ）で消化する段階と、増幅反応が進行するような条件下に前記反応混合物をおく段階を含む。本方法はいわゆる「ホットスタート」増幅法として使用することができる。本方法で使用する新規な特定ピロホスファターゼ酵素も記載され、請求される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸増幅反応を実施するための方法であって、プライマー伸長が生じないようにするために十分なピロリン酸塩の存在下に増幅反応混合物を形成する段階と、前記ピロリン酸塩をピロホスファターゼ酵素（ＰＰａｓｅ）で消化する段階と、増幅反応が進行するような条件下に前記反応混合物をおく段階を含む前記方法。
【請求項２】
増幅反応がポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）であり、反応混合物が前記反応を実施するのに適した試薬を含む請求項１に記載の方法。
【請求項３】
反応混合物がＴｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓポリメラーゼ（Ｔａｑ）、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓポリメラーゼ（Ｔｔｈ）、Ｔｈｅｒｍｕｓ種ＮＨポリメラーゼ（ＴｓｐＮＨ）、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｂｒｏｃｋｉａｎｕｓポリメラーゼ（Ｔｂｒ）、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓポリメラーゼ（Ｐｆｕ）、９°Ｎ７  エキソＤＮＡポリメラーゼ、及びＴｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｉｔｏｒａｌｉｓ  ＤＮＡポリメラーゼから選択されるＤＮＡポリメラーゼを含む請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
無機ピロリン酸塩がアルカリ土類金属ピロリン酸塩である請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
無機ピロリン酸塩が式Ｎａ４Ｐ２Ｏ７のピロリン酸四ナトリウムである請求項４に記載の方法。
【請求項６】
ピロリン酸塩が少なくとも０．５ｍＭの濃度で反応混合物中に存在する請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
ピロリン酸塩が１〜１０ｍＭの濃度で存在する請求項６に記載の方法。
【請求項８】
熱安定性ＰＰａｓｅを使用して前記消化を行う請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
熱安定性ＰＰａｓｅがＳｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ無機ピロホスファターゼ（Ｓａｃ  ＰＰａｓｅ）、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｉｔｏｒａｌｉｓ無機ピロホスファターゼ又はＡｅｒｏｐｙｒｕｍ  ｐｅｒｎｉｘ無機ピロホスファターゼである請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
熱安定性ＰＰａｓｅを反応混合物の形成直後に添加する請求項８又は９に記載の方法。
【請求項１１】
存在する無機ピロリン酸塩をＰＰａｓｅで消化できるように増幅反応前の高温インキュベーション段階を含む請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
ＰＰａｓｅをＰＣＲ反応混合物５０μＬ当たり少なくとも０．０４ｕの濃度で反応混合物に加える請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
ＰＰａｓｅをＰＣＲ反応混合物５０μＬ当たり０．０８ｕの濃度で反応混合物に加える請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
ＰＰａｓｅをＰＣＲ反応混合物５０μＬ当たり０．２〜１０ｕの濃度で反応混合物に加える請求項１２又は１３に記載の方法。
【請求項１５】
増幅反応を実施するためのキットであって、ピロリン酸塩と、ピロホスファターゼ酵素と、場合により増幅反応で使用するのに必要な１種以上の試薬を含む前記キット。
【請求項１６】
特定ターゲット核酸の増幅を実施するために必要な１種以上のプライマーを更に含む請求項１５に記載のキット。
【請求項１７】
１種以上の蛍光標識試薬を更に含む請求項１５又は１６に記載のキット。
【請求項１８】
蛍光標識試薬がインターカレーター色素、蛍光標識プローブ、蛍光標識プライマー又は蛍光標識ヌクレオチドの１種以上から選択される請求項１７に記載のキット。
【請求項１９】
請求項１から１４のいずれか一項に記載の増幅反応を実施するための方法におけるピロリン酸塩の使用。
【請求項２０】
請求項１から１４のいずれか一項に記載の増幅反応を実施するための方法におけるピロホスファターゼ酵素の使用。
【請求項２１】
Ａｅｒｏｐｙｒｕｍ  ｐｅｒｎｉｘから単離したピロホスファターゼ酵素。
【請求項２２】
配列番号２６に示すポリヌクレオチド配列又はその変異体もしくはフラグメントによりコードされるピロホスファターゼ酵素。
【請求項２３】
配列番号２５に示すアミノ酸配列又はその変異体もしくはフラグメントを含むピロホスファターゼ酵素。
【請求項２４】
請求項２２又は２３に記載の酵素をコードする単離ポリヌクレオチド。
【請求項２５】
請求項１から１４のいずれか一項に記載の増幅反応を実施するための方法における請求項２１から２３のいずれか一項に記載のピロホスファターゼ酵素の使用。
【請求項２６】
実施例に関して明細書に実質的に記載する増幅反応を実施するための方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は核酸を増幅する反応を実施するための方法、これらの反応を制御する手段及びその実施に使用するキットと試薬、特に酵素に関する。
【背景技術】
【０００２】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）等の増幅反応は非常によく知られており、バイオテクノロジー研究分野や診断及び検出に広く使用されている。
【０００３】
ＰＣＲは大量の特定核酸配列、特にＤＮＡ配列を作製する方法であり、塩基の対合及び相補ＤＮＡ鎖の正確なコピーというＤＮＡの特徴に基づいている。典型的なＰＣＲは以下の３つの基本ステップの繰返し方法からなっている。
【０００４】
変性：（コピーしようとする核酸（ＤＮＡでもＲＮＡでもよい）（鋳型）と各ヌクレオチド塩基（Ａ，Ｔ，Ｇ，Ｃ）と適当なプライマーとポリメラーゼ酵素を含む）ＰＣＲ試薬を含む混合物を所定温度まで加熱し、ターゲットＤＮＡの２本鎖を解離する。
【０００５】
アニーリング：次に混合物を別の所定温度まで冷却すると、プライマーはＤＮＡ鎖上の相補的配列を見つけてこれと結合する。
【０００６】
伸長：混合物を別の所定温度まで再加熱する。（触媒として作用する）ポリメラーゼ酵素は各ヌクレオチド塩基をプライマーの末端に結合し、ターゲットＤＮＡの配列に相補的な新しいＤＮＡ鎖を形成する。２本のＤＮＡ鎖は互いに結合される。
【０００７】
これらの反応においては、一連のステップを非常に厳密な順序で繰返さなければならず、かつ各ステップの操作には厳密な温度を設定する必要がある。例えば反応開始前のように短時間であっても、試薬を異なる温度で混合する場合には問題が生じる。プライマーが核酸鋳型と相互作用し、鋳型のプライマー伸長が生じる可能性がある。この結果、所期産物の総収率が低下すると共に非特異的産物が生産される恐れがある。
【０００８】
この問題を解決する種々の手段が既に提案されている。例えば、この問題に対する初期の試みでは各種ＰＣＲ試薬を試験管内で分離するためにワックスバリアーを使用している（例えば米国特許第５，５６５，３３９号参照）。ワックスは反応混合物を初期変性温度に加熱した時に融解し、試薬の混合をできるだけ遅くできるので、副反応の可能性を最小限にすることができた。このような反応は「ホットスタート」反応として知られる。
【０００９】
副反応を抑制するために他の化学的方法も試みられている。例えば、米国特許第５，６７７，１５２号は高温でしか活性化しないようにＤＮＡポリメラーゼを化学的に修飾する方法を記載している。しかし、この方法を実施するためには、活性酵素を生成するために反応混合物を所定時間高温に保温する必要がある。このような遅延は場合によっては重大ではないものの、ＰＣＲの結果が迅速に必要な場合には問題となることがある。ＰＣＲ技術の多くの用途では、サイクルシーケンスをできるだけ短時間で完了することが望ましい。特に、例えば呼気やヒト及び動物が消費する飲食物に汚染の疑いがある場合には、迅速な診断法は健康を改善することはできないとしても費用を著しく節約することができ、生命さえ救うことができる。
【００１０】
他の方法では、Ｓｉｇｍａから市販されている抗Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ抗体等のＴｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ（Ｔａｑ）ＤＮＡポリメラーゼのモノクローナル抗体が反応混合物に添加されている。抗体は酵素に結合し、これを室温で不活化させる。しかし、抗体は増幅サイクル中に使用する高温で変性し、酵素から解離するので、酵素は活性化する。他方、この方法は場合により非特異的な副生物を避けられないと思われる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
ＰＣＲ反応中の鋳型のプライマー伸長は下式：
【００１２】
【化１】
2004524853.tif 000002
（式中、ｄＮＴＰはデオキシリボ核酸三リン酸であり、ｄＮＭＰは対応するデオキシリボ核酸一リン酸であり、ＰＰｉは無機ピロリン酸塩である）により表すことができる。この反応は次のように表すこともできる。
（ＤＮＡ）ｎ残基＋ｄＮＴＰ⇔（ＤＮＡ）ｎ＋１残基＋ＰＰｉ
例えばＤＮＡシーケンシング反応で高濃度のＰＰｉが存在すると上記反応は逆方向になることが知られている。これはピロリン酸分解として知られており、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを使用して７０℃でＤＮＡシーケンシングする場合に問題となることが認められている。ＤＮＡシーケンシングで使用するＤＮＡポリメラーゼ製剤に熱安定性ＰＰａｓｅを加えることによりこの問題は解決された。
【００１３】
本発明者らはこの反応が非特異的産物の生産を最小限にできる有利な増幅反応の基礎となることを見出した。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明によると、核酸増幅反応を実施するための方法が提供され、前記方法はプライマー伸長が生じないようにするために十分なピロリン酸塩の存在下に増幅反応混合物を形成する段階と、前記ピロリン酸塩を酵素消化する段階と、増幅反応が進行するような条件下に前記反応混合物をおく段階を含む。
【００１５】
本発明の方法を使用すると、正確な増幅反応を迅速且つ良好な特異性で実施することができる。従って、本発明の方法は既存の「ホットスタート」増幅法に代わる優れた方法である。
【００１６】
本発明の方法で使用する出発増幅反応混合物は広義にはＰＣＲで使用されているような慣用混合物にピロリン酸塩を加えたものである。従って、出発増幅反応混合物は一般に（ｉ）ターゲット核酸配列を含むか又は含む疑いのある試料と、（ｉｉ）前記ターゲット配列の末端領域にハイブリダイズする少なくとも１種のプライマーと、（ｉｉｉ）マグネシウムイオン源と、（ｉｖ）ターゲット配列を構成するヌクレオチド又はヌクレオシド塩基（即ちＤＮＡ増幅の場合にはＡ、Ｔ、Ｃ、Ｇ及び／又はＵであり、ＲＮＡ増幅の場合にはＡ、Ｕ、Ｃ及びＧ）と、（ｖ）増幅反応を実施する温度で熱安定性のＤＮＡポリメラーゼを含む。更に、当分野で公知のように反応を実施するために必要に応じて緩衝液を含む。
【００１７】
特に、（ｉｖ）はＤＮＡ増幅の場合にはヌクレオチドＡ、Ｔ、Ｇ及びＣを含み、ＲＮＡ増幅の場合にはヌクレオシドＡ、Ｕ、Ｃ及びＧを含む。
【００１８】
但し、逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）等の他のプライマー開始増幅反応を実施する場合には他の組合せも使用できる。
【００１９】
更に、試薬は産物を後でゲル上で試験する必要なく増幅をモニターできるような標識プローブ又はプライマー、及び／又は他の標識手段（例えばインターカレーター色素（例えばＳｙｂｒグリーン、Ｓｙｂｒゴールド）、臭化エチジウム等）又はその組合せを含むことができる。これらの種類は実施するアッセイの種類によって異なる。一般的なインターカレーター法は増幅プロセス中に生じる２本鎖ＤＮＡの増加をモニターするためにインターカレーター色素を使用する。これらは準鎖特異的でしかないので、鎖特異的検出が必要な場合には他のラベルが必要である。
【００２０】
鎖特異的方法は増幅反応の進行をモニターするために付加的核酸反応成分を使用する。これらの方法は蛍光エネルギー移動（ＦＥＴ）を検出の指標として使用することが多い。一方がエネルギー供与体として作用し、他方がエネルギー受容分子として作用するように１種以上の核酸プローブを蛍光分子で標識する。これらは夫々レポーター分子及びクエンチャー分子としても知られる。供与分子はその励起スペクトルに含まれる特定波長で励起された後、その蛍光発光波長内で発光する。受容分子も各種距離依存性エネルギー移動メカニズムにより供与分子からエネルギーを受容することによりこの波長で励起される。考えられる蛍光エネルギー移動の特定例は蛍光共振エネルギー移動即ち「ＦＲＥＴ」である。一般に、受容分子は供与分子とごく近接している（例えば同一又は隣接分子上にある）ときに供与分子の発光エネルギーを受容する。蛍光エネルギー移動検出の基礎は供与分子と受容分子の発光波長での変化をモニターすることにある。
【００２１】
ＦＥＴ又はＦＲＥＴプローブとしては、核酸プローブの加水分解を使用して供与分子を受容分子から分離するものと、ハイブリダイゼーションを使用して供与分子と受容分子の空間位置関係を変えるものの２種類が一般に使用されている。
【００２２】
加水分解プローブはＴａｑＭａｎ（商標）プローブとして市販されている。これらは供与分子と受容分子で標識したＤＮＡオリゴヌクレオチドから構成される。このプローブはＰＣＲ産物の一方の鎖の特定領域に結合するように設計されている。
【００２３】
ＰＣＲプライマーをこの鎖にアニールした後に、Ｔａｑ酵素は５’→３’ポリメラーゼ活性でＤＮＡを伸長する。Ｔａｑ酵素は５’→３’エキソヌクレアーゼ活性も示す。ＴａｑＭａｎ（商標）プローブはＴａｑ伸長が開始しないように３’末端をリン酸化により保護している。ＴａｑＭａｎ（商標）プローブを産物鎖にハイブリダイズするならば、伸長Ｔａｑ分子はプローブも加水分解し、検出の指標として受容分子から供与分子を遊離する。この場合のシグナルは累積的であり、遊離供与分子と受容分子の濃度は増幅反応のサイクル毎に増加する。
【００２４】
米国特許第５，４９１，０６３号は蛍光標識プローブの溶液内消光法として、標識１本鎖オリゴヌクレオチドからのシグナルをＤＮＡ結合剤により修飾する方法を記載している。ポリメラーゼ連鎖反応中のプローブ開裂（加水分解）後にプローブの鎖長が短縮する結果として生じるこのシグナルの差はターゲット核酸の存在を検出するための手段となると予想される。
【００２５】
多数の形態のハイブリダイゼーションプローブが入手可能である。分子ビーコンはヘアピンループを形成するように相補的な５’及び３’配列をもつオリゴヌクレオチドである。ヘアピン構造が形成されると末端蛍光ラベルは相互にごく近接しているのでＦＲＥＴが生じる。分子ビーコンが相補的配列にハイブリダイズすると、蛍光ラベルは分離するのでＦＲＥＴは生じず、これが検出の指標となる。
【００２６】
標識オリゴヌクレオチド対も使用することができる。これらはＰＣＲ産物鎖上でごく近接してハイブリダイズし、供与分子と受容分子を一緒にするのでＦＲＥＴが生じる。ＦＲＥＴの増加が検出の指標である。この型の変形では標識増幅プライマーと単一の隣接プローブを使用している。
【００２７】
米国特許第４，８６８，１０３号は分析物の存在を検出するためのＦＲＥＴシステムとして、インターカレーター色素を供与分子として使用するシステムを概説している。この方法は増幅段階を含まない。
【００２８】
ＦＥＴ又はＦＲＥＴ検出を利用するアッセイの他の例はインターカレーター色素と単一標識プローブの組合せをシグナルシステムとして利用するＷＯ９９／２８５００、標識プライマーと酵素の組合せを使用して検出可能な蛍光シグナルを発生するＷＯ９９／２８５０１、及びインターカレーター色素と蛍光標識ヌクレオチドの組合せをシグナルの基礎として使用するＷＯ９９／４２６１１に記載されている。更に、相互に相補的なラベルと化学的ブロッキング剤を含む複合プライマーを利用するアッセイも例えばＷＯ９９／６６０７１に記載されている。
【００２９】
本発明の方法で使用する反応混合物は上述のようにアッセイを実施するために必要ないかなる標識試薬をも含むことができる。特に、このような反応混合物はゲノタイピングや、特にＳＮＰ評価で有利に使用することができる。これらの場合には、基本配列と突然変異体に夫々特異的な２つのＴａｑｍａｎ（商標）プローブと本発明の方法を組合せる。各プローブを異なる蛍光体で標識し、遺伝子の各種形態の存在量に応じて異なるシグナルを発生するようにすることが好ましい。ホモ接合体からは単一シグナルが発生し、ヘテロ接合体からは混合シグナルが発生する。
【００３０】
本発明との関連で使用可能な適当なＤＮＡポリメラーゼの例はＴｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓポリメラーゼ（Ｔａｑ）、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓポリメラーゼ（Ｔｔｈ）、Ｔｈｅｒｍｕｓ種ＮＨポリメラーゼ（ＴｓｐＮＨ）、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｂｒｏｃｋｉａｎｕｓポリメラーゼ（Ｔｂｒ）（いずれも例えばＧｅｎｅＳｙｓ  Ｌｉｍｉｔｅｄ，Ｆａｒｎｂｏｒｏｕｇｈ，英国から入手可能）、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓポリメラーゼ（Ｐｆｕ）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅから入手可能）、９°Ｎ７  エキソＤＮＡポリメラーゼ、及びＴｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｉｔｏｒａｌｉｓ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏｌａｂｓからＶＥＮＴ（商標）ＤＮＡポリメラーゼとして入手可能）等の熱安定性ポリメラーゼである。
【００３１】
本発明の方法で使用するピロリン酸塩は可溶性金属及び非金属（例えばアンモニウム塩）を含む任意の可溶性ピロリン酸塩とすることができる。このような化合物は「無機ピロリン酸塩」又はＰＰｉと総称されることが多く、本明細書でもこの呼称を使用する。特に、ピロリン酸塩はピロリン酸ナトリウム又はカリウム等のアルカリ金属ピロリン酸塩であり、例えばピロリン酸二ナトリウム（Ｎａ２Ｈ２Ｐ２Ｏ７）、無水ピロリン酸四ナトリウム（Ｎａ４Ｐ２Ｏ７）、ピロリン酸四ナトリウム１０水和物（Ｎａ４Ｐ２Ｏ７・１０Ｈ２Ｏ）及び（無水）ピロリン酸四カリウムが挙げられる。使用可能な他の可溶性ピロリン酸塩としては、ピロリン酸第二鉄（Ｆｅ４（Ｐ２Ｏ７）３）等のピロリン酸鉄や、無水ピロリン酸トリブチルアンモニウム等の可溶性アンモニウム塩が挙げられる。他の可溶性ピロリン酸塩も市販されている。
【００３２】
好適な無機ピロリン酸塩は式Ｎａ４Ｐ２Ｏ７のピロリン酸四ナトリウムである。
【００３３】
反応混合物中に使用するピロリン酸塩の濃度はプライマー伸長が生じないようにするために十分な濃度とすべきである。これは増幅する配列の特定種類と濃度、使用するプライマー及びポリメラーゼ酵素とそれらの濃度に大きく依存し、任意の特定例において定型的な方法により決定することができる。
【００３４】
形成される反応混合物はまず少なくとも０．５ｍＭの濃度のピロリン酸塩を含むと適当であり、少なくとも１ｍＭ、例えば１〜１０ｍＭの濃度が適当であり、１〜５ｍＭが好ましい。
【００３５】
無機ピロリン酸塩の酵素消化は増幅反応の第１段階の直前又はその間に実施すると適当である。これは増幅反応の開始直前にピロホスファターゼ酵素（ＰＰａｓｅ）（無機ピロホスファターゼ酵素−ＰＰｉａｓｅとも言う）を加えることにより実施できる。
【００３６】
但し、酵素消化は高温（例えば５０℃を超える温度）で活性な熱安定性ＰＰａｓｅを使用して実施することが好ましい。酵素は前記高温度のみで有意に活性であることが好ましい。これは、ＰＰａｓｅは反応混合物の形成時に添加できるが、室温では阻害剤であるピロリン酸塩を全く又は有意には消化しないということである。例えばＰＣＲ反応の初期変性段階中に必要に応じて反応混合物を加熱するときのみに適度に活性になるのである。しかし、例えば５０〜１００℃、好ましくは８０〜９５℃の高温で短時間のプレインキュベーションを実施することはできる。
【００３７】
熱安定性ＰＰａｓｅの例としてはＧｅｎｅＳｙｓ  Ｌｉｍｉｔｅｄ，Ｆａｒｎｂｏｒｏｕｇｈ，英国から入手可能なＳｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓピロホスファターゼ（Ｓａｃ  ＰＰａｓｅ−Ｍｅｙｅｒら，Ａｃｈｉｖｅｓ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓ．（１９９５）３１９，１，１４９−１５６）や、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ（カタログ番号Ｍ０２９６Ｓ及びＭ０２９６Ｌ）から入手可能なＴｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｉｔｏｒａｌｉｓピロホスファターゼが挙げられる。熱安定性ＰＰａｓｅはＧｅｎｅｓｙｓ  Ｌｉｍｉｔｅｄ，Ｆａｒｎｂｏｒｏｕｇｈ，英国から入手可能なＡｅｒｏｐｙｒｕｍ  ｐｅｒｎｉｘ無機ピロホスファターゼが好ましい。
【００３８】
最初の厳密な好気性超好熱始原菌であるＡｅｒｏｐｙｒｕｍ  ｐｅｒｎｉｘ  Ｋ１は１９９３年に日本の小宝島沿岸の熱性硫気孔から単離された（Ｓａｋｏら，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｓｙｓｔ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．４６（１９９６）：１０７０−１０７７）。この菌は微生物系統保存施設（理化学研究所）にＪＣＭ９８２０で寄託されている。
【００３９】
本発明者らはＡｅｒｏｐｙｒｕｍ  ｐｅｒｎｉｘから熱安定性ＰＰａｓｅを最初に単離したが、これは本発明の別の側面を構成する。このピロホスファターゼを含むゲノム配列を配列番号１に示し、対応するアミノ酸配列を配列番号２に示す（下記図１１）。特に、本発明の酵素は図１１に太字で示す配列番号１の領域（配列番号２６参照）によりコードされるアミノ酸配列（配列番号２５参照）をもつ。
【００４０】
従って、本発明は配列番号２６を含むポリヌクレオチドとその変異体又はフラグメントを含む。例えば、本発明は配列番号１のポリヌクレオチドを提供する。
【００４１】
本発明は更に配列番号２５のアミノ酸配列とその変異体又はフラグメントも含む。例えば、アミノ酸配列は配列番号２を含むことができる。
【００４２】
本明細書でポリヌクレオチド配列に関して使用する「そのフラグメント」なる用語は完全ポリヌクレオチド配列と同一活性をもつ所与ポリヌクレオチド配列の任意部分を意味する。フラグメントは基本配列からの連続塩基を少なくとも３００個含むものが適当であり、少なくとも４５０個含むものが好ましい。
【００４３】
ポリヌクレオチド配列に関して「その変異体」なる用語はポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質配列が基本配列によりコードされるタンパク質と同一性質を示すという条件で１個以上の核酸を任意に置換、変異、修飾、欠失置換又は付加したポリヌクレオチド配列を意味する。従って、この用語は対立遺伝子変異体を含むだけでなく、本発明のポリヌクレオチド配列に実質的にハイブリダイズするポリヌクレオチドも含む。このようなハイブリダイゼーションは低〜高ストリンジェンシー条件で行うことが好ましい。一般に、低ストリンジェンシー条件は約室温〜約５５℃の温度で３×ＳＳＣとして定義することができ、高ストリンジェンシー条件は約６５℃で０．１×ＳＳＣとして定義することができる。ＳＳＣは０．１５Ｍ  ＮａＣｌ，０．０１５Ｍクエン酸三ナトリウムの緩衝液名である。３×ＳＳＣは３倍濃度のＳＳＣであり、以下同様である。
【００４４】
典型的には、変異体はヌクレオチドの６２％以上が本発明のポリヌクレオチド配列と共通であり、一致度はより典型的には６５％であり、７０％が好ましく、８０％又は８５％がより好ましく、９０％、９５％、９８％又は９９％以上が特に好ましい。
【００４５】
一致度を決定する目的で核酸配列を比較する場合には、ＢＥＳＴＦＩＴやＧＡＰ（いずれもＷｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ）ソフトウェアパッケージ）等のプログラムを使用する。例えばＢＥＳＴＦＩＴは２つの配列を比較し、最類似セグメントの最適アラインメントを得る。ＧＡＰは配列を全長で整列させ、適宜どちらかの配列にスペースを挿入することにより最適アラインメントを探す。本発明との関連で核酸配列の一致度について記載する場合には、配列を全長で整列させて比較すると妥当である。
【００４６】
本明細書でアミノ酸配列に関して使用する「そのフラグメント」なる用語は完全アミノ酸配列と同一活性をもつ所与アミノ酸配列の任意部分を意味する。フラグメントは基本配列からの連続アミノ酸を少なくとも１００個含むものが適当であり、少なくとも１５０個含むものが好ましい。
【００４７】
本明細書でアミノ酸配列に関して使用する「その変異体」なる用語はその基本配列に対して配列内の１個以上のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されているアミノ酸配列を意味する。アミノ酸置換はアミノ酸が広義に類似の性質をもつ別のアミノ酸で置換されている場合には「保存的」とみなすことができる。アミノ酸が異なる型のアミノ酸で置換されている場合には非保存的置換である。概してポリペプチドの生物活性を変えることなしには少数の非保存的置換のみが可能である。変異体は基本配列と少なくとも６０％一致していると適当であり、少なくとも７５％一致していることが好ましく、少なくとも９０％一致しているとより好ましい。
【００４８】
この場合の相同度は例えばＬｉｐｍａｎ−Ｐｅａｒｓｏｎのアルゴリズムを使用し、Ｋｔｕｐｌｅ：２、ギャップペナルティ：４、ギャップ長ペナルティ：１２、標準ＰＡＭスコアリングマトリクスで判定することができる（Ｌｉｐｍａｎ，Ｄ．Ｊ．とＰｅａｒｓｏｎ，Ｗ．Ｒ．，Ｒａｐｉｄ  ａｎｄ  Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ  Ｓｅａｒｃｈｅｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９８５，ｖｏｌ．２２７，１４３５−１４４１）。
【００４９】
本発明のポリヌクレオチドは配列番号２６とこの配列に対して６２％を上回る一致度をもつ配列を含むことが好ましい。
【００５０】
これらの酵素は天然源からも得られるし、慣用方法を使用して大腸菌細胞等の組換え宿主細胞で発現させてもよい。
【００５１】
次いで例えば熱安定性ピロホスファターゼ酵素（ＰＰａｓｅ）を作用させることにより＞５０℃でピロリン酸塩を除去するとプライマー伸長（及び従って増幅）が正常に進行する。このプロセス中にピロリン酸塩１モルが無機リン酸塩（Ｐｉ）２モルに変換されるが、これは増幅反応を妨げない。
【００５２】
ピロホスファターゼの添加量は反応混合物中に存在する過剰のピロリン酸塩を消化するに十分でなければならない。一般に、この量はピロリン酸分解を阻止するために等価なサイクル反応で慣用的に使用されているこれらの酵素の量よりも多く、例えば５倍量以上である。厳密な量は使用する特定酵素、ピロリン酸塩の濃度等の各種因子により異なる。典型的には、ＰＰａｓｅ、特に熱安定性ＰＰａｓｅ酵素をＰＣＲ反応混合物５０μＬ当たり少なくとも０．０４単位の濃度で増幅反応混合物に加え、ＰＣＲ反応混合物５０μＬ当たり少なくとも０．０８単位が好ましく、ＰＣＲ反応混合物５０μＬ当たり０．２〜１０単位がより好ましい。この場合、１単位は１ｍＭ  Ｋ４Ｐ２Ｏ７，２ｍＭ  ＭｇＣｌ２，５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ９．０（２５℃）の反応条件下に７５℃で１分間にピロリン酸塩１μｍｏｌがオルトリン酸塩２μｍｏｌに変換されるのを触媒する酵素の量として定義される。
【００５３】
本発明の方法で使用する酵素は使用する温度に応じて無機ピロリン酸塩を迅速に除去することができる。一般に、５分未満、より多くの場合には２分未満、必要に応じて１５秒といった短時間に完全に除去することができる。
【００５４】
無機ピロリン酸塩が反応混合物から酵素により除去されたら、例えば慣用熱サイクル法を使用して増幅反応を進めることができる。
【００５５】
本発明の方法が所期結果を達成するメカニズムは明らかではない。恐らく過剰のピロリン酸塩の存在がプライマー伸長反応を抑制するのだと思われる。しかし、ＰＣＲ感度や産物収率に目立った低下はないと思われる。
【００５６】
本発明の方法は増幅反応を実施するための任意の慣用装置で実施することができる。このような装置としては例えばＥＰ−Ａ−０８１００３０に記載され、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ社から販売されているような慣用ブロック加熱装置や、Ｉｄａｈｏ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社のＲａｐｉｄＣｙｃｌｅｒ（商標）及びＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（商標）等の高速熱風サーマルサイクラーや、ＷＯ９８／２４５４８に記載されているような他の型のサーマルサイクラーが挙げられる。
【００５７】
別の側面によると、本発明は増幅反応を実施するためのキットを提供し、前記キットは無機ピロリン酸塩と、無機ピロホスファターゼ酵素と、場合により増幅反応で使用するのに必要な１種以上の試薬を含む。無機ピロリン酸塩は上述のように増幅反応を抑制するために十分な量で存在していると適当である。キットに加える無機ピロホスファターゼ酵素の量は前記無機ピロリン酸塩を完全に消化するために十分であることが好ましい。
【００５８】
１種以上の試薬としては上記試薬（ｉｉ）〜（ｖ）の任意の１種が挙げられ、緩衝液も含むことができる。無機ピロホスファターゼ酵素の特定例は上記のような熱安定性無機ピロホスファターゼ酵素である。
【００５９】
特に、キットは特定ターゲットＤＮＡ配列、例えば特定疾病状態又は試料中の特定病原体の存在を診断する配列の増幅を行うために必要な１種以上のプライマーを場合により付加試薬として含むことができる。本方法は遺伝分析における多形や対立遺伝子変異の検出にも使用することができる。
【００６０】
更に、キットは増幅反応のその場での（ｉｎ  ｓｉｔｕ）検出又はモニターに有用であり得る１種以上の標識試薬（例えばインターカレーター色素、蛍光標識プローブ、蛍光標識プライマー又は蛍光標識ヌクレオチド）を含むことができる。
【００６１】
別の側面において、本発明は上記のような増幅反応を実施するための方法における上記のような無機ピロリン酸塩の使用を提供する。無機ピロホスファターゼ酵素はＡｅｒｏｐｙｒｕｍ  ｐｅｒｎｉｘに由来するものが好ましい。
【００６２】
最後に、更に別の側面では、本発明は上記のような増幅反応を実施するための方法における上記のような無機ピロホスファターゼ酵素の使用を提供する。
【００６３】
以下、添付図面を参考に本発明を実施例により具体的に説明する。
【実施例１】
【００６４】
ＰＣＲに及ぼすＰＰｉの影響
Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼを使用し、無機ピロリン酸塩として各種量のピロリン酸四ナトリウム・１０水和物（ＰＰｉ）の存在下に下記試薬を使用して標準の５００ｂｐのラムダ鋳型を用いるＰＣＲを実施した。
【００６５】
【表１】
2004524853.tif 000003
【００６６】
ラムダ５００ｂｐプライマー配列は以下の通りである。
【００６７】
【化２】
2004524853.tif 000004
【００６８】
１倍反応緩衝液：１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ，ｐＨ８．０，５０ｍＭ  ＫＣｌ。
【００６９】
アッセイのＰＣＲ反応条件は以下の通りとした。
ｉ）９４℃で３．００分間、
ｉｉ）９４℃で１０秒間、５０℃で１０秒間、７２℃で３０秒間を２０サイクル、
ｉｉｉ）７２℃で７分間、
ｉｖ）２５℃に保温。
【００７０】
ＰＰｉは反応混合物中の終濃度が０、１、２、３、４及び５ｍＭとなるように加えた。結果を図１に示す。同図中、各レーンは以下のＰＰｉ濃度に対応する。
【００７１】
レーン
１＋２    ０      ＰＰｉ
３＋４    １ｍＭ  ＰＰｉ
５＋６    ２ｍＭ  ＰＰｉ
７＋８    ３ｍＭ  ＰＰｉ
９＋１０  ４ｍＭ  ＰＰｉ
１１      ５ｍＭ  ＰＰｉ。
【００７２】
試験した全ＰＰｉ濃度でＰＣＲ産物は生産されなかった。
【実施例２】
【００７３】
マグネシウムイオン濃度増加の影響
ＭｇはＰＰｉに結合するので、実施例１の結果はＭｇが過剰のＰＰｉによりキレート化されたためであるとも考えられる。その結果、プライマー伸長を進行させるにはＭｇが不足したとも考えられる。この可能性を排除するために、各種濃度のマグネシウムイオンの存在下に３ｍＭ  ＰＰｉを使用して実施例１の手順を繰返した。
【００７４】
結果を図２に示す。同図中、各レーンは以下の反応を表す。
【００７５】
レーン
１＋２      １．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２
３＋４      ５ｍＭ  ＭｇＣｌ２
５＋６      ７．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２
７＋８      １０ｍＭ  ＭｇＣｌ２
９＋１０    １．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２＋３ｍＭ  ＰＰｉ
１１＋１２  ５ｍＭ  ＭｇＣｌ２＋３ｍＭ  ＰＰｉ
１３＋１４  ７．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２＋３ｍＭ  ＰＰｉ
１５        １０ｍＭ  ＭｇＣｌ２＋３ｍＭ  ＰＰｉ。
【００７６】
この結果、終濃度１０ｍＭ（ＰＣＲの標準は１．５ｍＭ）までＭｇ＋＋を加えてもＰＣＲは起こらず、プライマー伸長を阻止しているのはＰＰｉであることが示唆された。
【実施例３】
【００７７】
ＰＰｉとＰＰａｓｅの存在下のＰＣＲ反応
ピロリン酸塩（ＰＰｉ）を加えた反応混合物にＳｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ  ＰＰａｓｅ（Ｓａｃ  ＰＰａｓｅ）０．２ｕを加えた以外は実施例１の５００ｂｐラムダＰＣＲを繰返した。反応混合物をＳａｃ  ＰＰａｓｅ  ０．２ｕの存在下で９５℃に５分間保温すると、ピロリン酸塩を分解してＰＣＲ反応を進行させるに十分であった。
【００７８】
結果を図３に示す。同図中、各レーンは以下の反応を表す。
【００７９】
レーン
上段
１＋２      １ｍＭ  ＰＰｉ＋０．２ｕ  ＰＰａｓｅ
３＋４      ２ｍＭ  ＰＰｉ＋０．２ｕ  ＰＰａｓｅ
５＋６      ３ｍＭ  ＰＰｉ＋０．２ｕ  ＰＰａｓｅ
７＋８      ４ｍＭ  ＰＰｉ＋０．２ｕ  ＰＰａｓｅ
９＋１０    ５ｍＭ  ＰＰｉ＋０．２ｕ  ＰＰａｓｅ
下段
１＋２      １ｍＭ  ＰＰｉ
３＋４      ２ｍＭ  ＰＰｉ
５＋６      ３ｍＭ  ＰＰｉ
７＋８      ４ｍＭ  ＰＰｉ
９＋１０    ５ｍＭ  ＰＰｉ
１１＋１２  ０ｍＭ  ＰＰｉ。
【００８０】
ＰＰｉとＰＰａｓｅのどちらも加えない反応に比較して同等レベルのＰＣＲ産物が生産された。
【００８１】
１ｍＭ未満のＰＰｉ濃度を使用してこの実施例を繰返した。その結果（図示せず）、０．４ｍＭ  ＰＰｉではＰＣＲは完全には抑制されなかったが、０．６ｍＭの濃度ではＰＣＲは起こらなかった。
【実施例４】
【００８２】
ＰＣＲアッセイ
次に、正しい寸法のＰＣＲ産物を生産するために「ホットスタート」反応を必要とするアッセイシステムに本発明の方法を適用した。
【００８３】
このアッセイの基本はヒトアンギオテンシン遺伝子の３２１ｂｐフラグメントの増幅である。このアッセイはベタインの存在下で正しい増幅産物のみを生産することが認められている（ＥＰ−Ａ−０９６２５２６、特に実施例８参照）。
【００８４】
ベタインの不在下ではホットスタートＤＮＡポリメラーゼはわずかの非特異的増幅産物を生産するか又は産物を全く生産しないが、非ホットスタートＤＮＡポリメラーゼＰＣＲは多量の非特異的増幅産物を生産する。
【００８５】
アンギオテンシンアッセイで使用したＰＣＲ条件は以下のように要約できる。
【００８６】
【表２】
2004524853.tif 000005
【００８７】
アンギオテンシンプライマー配列は以下の通りである。
【００８８】
【化３】
2004524853.tif 000006
【００８９】
１倍反応緩衝液：１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ，ｐＨ８．０，５０ｍＭ  ＫＣｌ。
【００９０】
アッセイのＰＣＲ反応条件は以下の通りとした。
ｉ）９５℃で２．００分以下、
ｉｉ）９５℃で１５秒間、５０℃で３０秒間、７２℃で３０秒間を３５サイクル、
ｉｉｉ）７２℃で７分間、
ｉｖ）２５℃に保温。
【００９１】
反応はＰＥ９７００装置を使用して実施例３に記載したように３ｍＭ  ＰＰｉと０．２ｕ  ＰＰａｓｅの存在下に実施した。
【００９２】
結果を図４に示す。同図中、各レーンは以下の反応を表す。
【００９３】
レーン
2004524853.tif 000007
【００９４】
本発明の方法を使用すると、有効な「ホットスタート」反応が達成されることが明らかである。ベタインの存在下にＰＰｉとＳａｃ  ＰＰａｓｅを使用すると明白な単一の産物バンドが得られた。更に、ベタインの不在下でもミスプライミングは認められなかった。
【実施例５】
【００９５】
室温保存の影響
０．２ｕ  Ｓａｃ  ＰＰａｓｅと３ｍＭ  ＰＰｉを加えたＰＣＲ混合物をアンギオテンシンアッセイ実施前に各種時間２０℃の室温に放置した場合の影響を調べた。Ｓａｃ  ＰＰａｓｅは熱安定性酵素であるが、室温で低レベルの酵素活性がある可能性があった。その結果、ＤＮＡポリメラーゼを抑制／停止させるには反応にＰＰｉが不足し、プライマー伸長が起こり、「ホットスタート」機能が失われる恐れがあった。
【００９６】
アッセイを実施する前に反応混合物を室温で２時間までの各種時間保存した以外は実施例４の方法を繰返した。
【００９７】
結果を図５に示す。同図中、上段は試薬を室温で指定時間保温後の（ベタインの存在下と不在下の）アンギオテンシンの慣用ＴａｑポリメラーゼＰＣＲの結果を示し、下段はいずれの場合もＰＣＲ５０μｌ当たり３ｍＭ  ＰＰｉと０．２ｕ  ＰＰａｓｅをアッセイ混合物に加えた本発明の方法による同様のアッセイの結果を示す。
【００９８】
【表３】
2004524853.tif 000008
【００９９】
２時間後でも本発明に従って実施したアッセイは予想通り機能し、室温ではＰＰｉをＳａｃ  ＰＰａｓｅにより消化するには不十分であることが示唆された。
【０１００】
図５に示す結果から明らかなように、ＰＰｉとＳａｃ  ＰＰａｓｅを使用すると、ＰＣＲ前にＰＣＲ混合物を室温で２時間保温しても特異性に影響ないことが判明した。
【実施例６】
【０１０１】
本発明の方法における他の熱安定性ＰＰａｓｅ酵素の使用
Ｓａｃ  ＰＰａｓｅの代わりに別の市販熱安定性ＰＰａｓｅ（活性単位の定義は異なる）を使用して同様の反応を行い、実施例４に記載したアッセイを繰返した。結果を図６に示す。同図中、各レーンは以下の反応を表す。
【０１０２】
レーン
2004524853.tif 000009
【０１０３】
＊この場合に使用した単位は製造業者の指定により、標準反応条件下（５０ｍＭトリシン［ｐＨ８．５］，１ｍＭ  ＭｇＣｌ２，０．３２ｍＭ  ＰＰｉ，反応容量０．５ｍｌ中７５℃で１０分間反応）で４０ｎｍｏｌ／分のリン酸塩を生産する酵素の量として定義される。
【０１０４】
Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｉｔｏｒａｌｉｓ  ＰＰａｓｅ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ市販品）はこのアッセイでＳａｃ  ＰＰａｓｅと同一効果をもつと思われる。
【実施例７】
【０１０５】
本発明の方法における各種熱安定性ＤＮＡポリメラーゼの使用
本発明の方法と数種の比較アッセイで各種熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを使用した。使用したポリメラーゼは数種の非プルーフリーディングＴｈｅｒｍｕｓ種ＤＮＡポリメラーゼ、プルーフリーディング超好熱始原菌ＤＮＡポリメラーゼ、及び非プルーフリーディングＤＮＡポリメラーゼとプルーフリーディングＤＮＡポリメラーゼの混合物である。
【０１０６】
実施例１に記載したような５００ｂｐラムダＰＣＲを使用して全ポリメラーゼを試験し（図７ａ及び７ｂ）、また実施例４に記載したようなアンギオテンシンアッセイを使用して数種を試験した（図８ａ及び８ｂ）。
【０１０７】
アッセイ条件の詳細を以下に要約する。
【０１０８】
図７ａ−Ｔｈｅｒｍｕｓ  ＤＮＡポリメラーゼ
レーン
2004524853.tif 000010
【０１０９】
図７ｂ−始原菌プルーフリーディングＤＮＡポリメラーゼ
レーン
2004524853.tif 000011
【０１１０】
図８ａ  ＰＰｉとＳａｃ  ＰＰａｓｅの不在下のアンギオテンシンアッセイ（ベタインの有りと無し）
レーン
１＋２      Ｔａｑポリメラーゼ，ベタイン無；
３＋４      Ｔａｑポリメラーゼ，ベタイン有；
５＋６      Ａｃｃｕｒａｓｅポリメラーゼ，ベタイン無；
７＋８      Ａｃｃｕｒａｓｅポリメラーゼ，ベタイン有；
９＋１０    Ｔｂｒポリメラーゼ，ベタイン無；
１１＋１２  Ｔｂｒポリメラーゼ，ベタイン有；
１３＋１４  Ｔｔｈポリメラーゼ，ベタイン無；
１５＋１６  Ｔｔｈポリメラーゼ，ベタイン有。
【０１１１】
図８ｂ  ＰＰｉとＳａｃ  ＰＰａｓｅの存在下のアンギオテンシンアッセイ（ベタインの有りと無し）
対照レーン１〜４（上段）及び１２〜１６（下段）
レーン
2004524853.tif 000012
下段
以下、全て３ｍＭ  ＰＰｉと０．２ｕ  Ｓａｃ  ＰＰａｓｅ添加
１＋２      ＴｔｈポリメラーゼＰＣＲ，ベタイン無；
３＋４      ＴｔｈポリメラーゼＰＣＲ，ベタイン有；
５＋６      ＴｓｐＮＨポリメラーゼ，ベタイン無；
７＋８      ＴｓｐＮＨポリメラーゼ，ベタイン有；
９＋１０    Ｐｆｕポリメラーゼ，ベタイン無；
１１＋１２  Ｐｆｕポリメラーゼ，ベタイン有；
１３＋１４  Ｔａｑポリメラーゼ対照，ベタイン無，ＰＰｉ又はＰＰａｓｅ無；
１５＋１６  Ｔａｑポリメラーゼ対照，ベタイン有，ＰＰｉ又はＰＰａｓｅ無。
【０１１２】
試験した全ＤＮＡポリメラーゼはＰＰｉにより抑制され、その抑制はＳａｃ  ＰＰａｓｅで解除することができた。
【実施例８】
【０１１３】
本発明の方法と慣用「ホットスタート」法の比較
当初の結果（図９及び１０）によると、化学修飾Ｔａｑポリメラーゼ（米国特許第５，６７７，１５２号に記載されているように修飾）はベタインの不在下では多少の偽ＰＣＲ産物を生産するが、ベタインの存在下では正しい産物が得られる。
【０１１４】
図９  アンギオテンシンアッセイ
レーン
2004524853.tif 000013
【０１１５】
これらの状況では、化学修飾酵素は９５℃で１０分間活性化するまで不活性であると思われる。このプレインキュベーションを実施しないと、僅かではあるがＰＣＲ産物が生産された。しかし、化学修飾Ｔａｑは室温で不活性であるので、ベタインの不在下の外見上のミスプライミングと偽ＰＣＲ産物の生産は説明し難い。
【０１１６】
図１０  Ｔａｑと抗Ｔａｑ抗体の存在下のアンギオテンシンアッセイ
レーン
１＋２  抗Ｔａｑ抗体＋Ｔａｑポリメラーゼ，ベタイン無；
３＋４  抗Ｔａｑ抗体＋Ｔａｑポリメラーゼ，ベタイン有。
【０１１７】
抗Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ抗体を介するホットスタートの場合、ベタインの不在下では（ベタインの不在下の標準ＴａｑポリメラーゼＰＣＲと同様に）実質的数の偽産物が生産され、ベタインの存在下では正しい産物と共に少量の偽産物も生産される。
【０１１８】
本発明の方法はこれらの市販ホットスタート法のどちらよりも特異的な迅速なＰＣＲ反応を提供すると思われる。
【実施例９】
【０１１９】
Ａｅｒｏｐｙｒｕｍ  ｐｅｒｎｉｘからの無機ピロホスファターゼの単離
微生物系統保存施設のカルチャーコレクションからＡｅｒｏｐｙｒｕｍ  ｐｅｒｎｉｘを入手した。無機ピロホスファターゼ酵素をクローニングし、発現させ、精製した。
【０１２０】
Ａ．ｐｅｒｎｉｘからの無機ピロホスファターゼのクローニングと発現
Ａｅｒｏｐｙｒｕｍ  ｐｅｒｎｉｘのピロホスファターゼ遺伝子を含むゲノム配列を図１１に示す。使用したプライマーはＡｅｒｏｐｙｒｕｍ  ｐｅｒｎｉｘのゲノム配列から設計した。これらを５’→３’ として以下に示し、制限部位を太字で示す。
【０１２１】
【表４】
2004524853.tif 000014
【０１２２】
ゲノムからの推定配列を他のピロホスファターゼ遺伝子と整列させると、（図１１の配列番号１中に斜体で示す）データバンクで示されているものではなく後のＡＴＧが開始メチオニンであり、酵素のアミノ酸配列が実際には配列番号２５に示す配列であることが示唆された。従って、（図１１の配列番号１中に太字で示す）後のメチオニンに対応するプライマーを設計した。
【０１２３】
上記プライマー５０ｐＭを加えた１００μｌ容量中でＡｅｒｏｐｙｒｕｍ  ｐｅｒｎｉｘ  ＤＮＡ１００ｎｇを使用してＰＣＲを実施した。２０サイクルを実施し、５５℃でアニーリングし、伸長時間４５秒とした。
９４℃で３分間初期保温、
９４℃で１０秒間、５５℃で１０秒間、６８℃で４５秒間を２０サイクル、
７２℃で７分間最終保温。
【０１２４】
ＰＣＲ条件
５０ｐＭ上流プライマー（５’．．ＴＧＣＡＴＧＣＡＴＡＴＧＡＣＡＧＧＣＴＧＴＣＴＧＡＡＡＡＴＴＧ．．３’−配列番号１８）
５０ｐＭ下流プライマー（５’．．ＴＡＡＧＴＧＴＡＡＧＣＴＴＧＡＣＴＧＴＧＧＧＧＧＣＧＧＴＧＡＡＡＧ．．３’−配列番号１９）
１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２
１．２５ｕ  Ａｃｃｕｒａｓｅ  ＤＮＡポリメラーゼ（カタログ番号ＡＣ００１，ＧｅｎｅＳｙｓ  Ｌｔｄ．）
７５ｍＭ  Ｔｒｉｓ，ｐＨ８．８
２０ｍＭ硫酸アンモニウム
０．１％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ  ２０
１００ｎｇ  Ａｅｒｏｐｙｒｕｍ  ｐｅｒｎｉｘゲノムＤＮＡ。
【０１２５】
ＰＣＲ産物は図１３に示すように６８６塩基対の長さであった。ＰＣＲ産物は製造業者に推奨されている条件に従ってＰｒｅｐａｎｏｌ（商標）（カタログ番号Ｐ００１，ＧｅｎｅＳｙｓ  Ｌｔｄ．）沈殿させ、最後に１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ，０．１ｍＭ  ＥＤＴＡに再懸濁した。
【０１２６】
ＰＣＲ産物を制限酵素ＮｄｅＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化し、フェノール抽出し、エタノール沈殿させ、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ，０．１ｍＭ  ＥＤＴＡに再懸濁した。
【０１２７】
（図１５に示す）ｐＴＴＱ１８ＮＨＫベクターもＮｄｅＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化し、フェノール抽出し、エタノール沈殿させ、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ，０．１ｍＭ  ＥＤＴＡに再懸濁しておいた。
【０１２８】
Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ  Ｔ４ＤＮＡリガーゼ２００ｕを使用して１×ＮＥＢライゲーションバッファー中で最終容量１０μｌとなるように消化ＰＣＲ配列１００ｎｇを消化ｐＴＴＱ１８ＮＨＫベクター（図１６参照）１μｇと１６℃で一晩ライゲートした。プラスミドベクターはベクターｐＴＴＱ１８（Ｓｔａｒｋ  ＭＪ，Ｇｅｎｅ，１９８７；５１（２−３）：２５５−６７）のユニークＥｃｏ０１０９Ｉ制限酵素部位にカナマイシン抗生物質遺伝子を挿入し、ＩｃｏＲＩ部位とＨｉｎｄＩＩＩ部位の間に置換ポリリンカー（図１４参照）を挿入した改変形であるｐＴＴＱ１８ＮＨＫとした。
【０１２９】
水２０μｌを加え、反応混合物を７０℃まで２０分間加熱した。３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．２）１／１０容量とエタノール２容量を加えた。反応混合物を混合し、−２０℃に１時間保存した。１０，０００ｇで１０分間マイクロ遠心後に上澄みをペレット化ＤＮＡから除去し、ＤＮＡを水５μｌに再懸濁した。
【０１３０】
０．５μｌを大腸菌ＴＯＰ１０Ｆ’細胞にエレクトロポレーションし、３７℃で１時間再生後に細胞アリコートをカナマイシンルリアブロス寒天プレートに播種した。プレートを３７℃で一晩培養した。
【０１３１】
新鮮なカナマイシンルリアブロス寒天プレートと、寒天ゲル１ｍｌ当たり２０ｍｇ／ｍｌ  ＸＧＡＬ１μｌと０．５Ｍ  ＩＰＴＧ  １μｌを加えることにより調製した寒天ルリアブロス寒天プレート（ＫＩＸプレート）の両者にコロニーを２回ずつ画線した。
【０１３２】
３７℃で一晩培養後にＭ１３フォワード及びリバースプライマーを使用するＰＣＲによりＫＩＸプレート上の白色コロニーをスクリーニングし、Ａｅｒｏｐｙｒｕｍ  ｐｅｒｎｉｘ  ＰＣＲ産物に対応するインサートの有無を調べた。
【０１３３】
１００μｇ／ｍｌカナマイシンを加えたＬＢ２０ｍｌ中で７０１ｂｐ産物を含むコロニー９個をＯＤ６００＝１まで増殖させた後、ＩＰＴＧを終濃度０．５ｍＭまで加えることにより発現を誘導した。細胞を更に４時間増殖させた後に細胞を回収し、−２０℃で凍結保存した。
【０１３４】
５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．９，５０ｍＭデキストロース，１ｍＭ  ＥＤＴＡ  ０．５ｍｌと、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．９，５０ｍＭ  ＫＣｌ，１ｍＭ  ＥＤＴＡ，０．５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ  ２０，０．５％（ｖ／ｖ）Ｎｏｎｉｄｅｔ−Ｐ４０  ０．５ｍｌを加えて細胞を溶解させ、８０℃で１５分間培養した。
【０１３５】
１０，０００ｇで１０分間室温で遠心分離後、１２％ゲルを使用するＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動により各溶解細胞からのアリコートを分析した。ゲルを泳動後にクーマシーブルーＲ２５０で染色した。全試料は推定ＰＰａｓｅの寸法に対応する約２３ｋＤａのバンドを示した。
【０１３６】
次にＪｕｋｋａ  Ｋ．Ｈｅｉｎｏｎｅｎ，Ｒｅｉｊｏ  Ｊ．Ｌａｈｔｉ．（１９８１）Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ．１１３，ｐｐ３１３−３１７の比色アッセイを使用して７５℃のＰＰａｓｅ活性について同一試料をアッセイした。
【０１３７】
全試料は陽性であり、発現されたタンパク質が好熱性無機ピロホスファターゼ活性をもつことが確認された。
【０１３８】
その後、初代クローンをより大規模のタンパク質生産に使用した。
【０１３９】
ピロホスファターゼの精製
このクローンをＬＢ２４リットルに移した。ＯＤ６００が約１．５に達したら、０．５ｍＭ  ＩＰＴＧを加えて培養を誘導し、更に４時間増殖させた。次に細胞を回収し、細胞ペレットを溶解させた。発現酵素をフェニルセファロースＣＬ４Ｂ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）、ヒドロキシアパタイト（Ｂｉｏ−ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）及び高性能Ｑセファロース（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）で標準カラムクロマトグラフィ¬により精製し、最後に２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．０，１００ｍＭ  ＮａＣｌ，０．５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ  ２０，０．５％（ｖ／ｖ）Ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ４０，０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ，１ｍＭジチオスレイトール及び５０％グリセロール中で−２０℃で保存した。
【実施例１０】
【０１４０】
Ａ．ｐｅｒｎｉｘ無機ピロホスファターゼ酵素を使用したＰＣＲアッセイ
Ａ．ｐｅｒｎｉｘ無機ピロホスファターゼ酵素を使用して本発明の方法を実施した。このアッセイの基本はヒトＢアクチン遺伝子の増幅である。
【０１４１】
このアッセイでは、Ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃ  Ｓ．Ａ．，Ｐａｒｃ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｑｕｅ  ｄｕ  Ｓａｒｔ−Ｔｉｌｍａｎ，  ｒｕｅ  Ｂｏｉｓ  Ｓａｉｎｔ−Ｊｅａｎ  １４，４１０２  ＳＥＲＡＩＮＧ，ベルギー（カタログ番号ＲＴ−ＱＰ７３−０５）から入手したキットを使用した。キットに付属のホットスタートＴａｑポリメラーゼの代わりに標準Ｔａｑポリメラーゼを使用した。
【０１４２】
ＰＣＲ反応混合物
１倍反応緩衝液
ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ各２００μＭ及びｄＵＴＰ４００μＭ
０．０２５ｕ／μｌ未修飾Ｔａｑポリメラーゼ
０．００２ｕ／μｌ  Ａｅｒｏｐｙｒｕｍ  ｐｅｒｎｉｘ無機ピロホスファターゼ
０．３μＭ  ５’プライマー（５’ＧＡＣ  ＴＣＧ  ＴＣＡ  ＴＡＣ  ＴＣＣ  ＴＧＣ  ＴＴＧ  ＣＴ  ３’−配列番号２２）
０．３μＭ  ３’プライマー（５’ＣＡＴ  ＴＧＣ  ＣＧＡ  ＣＡＧ  ＧＡＴ  ＧＣＡ  ＧＡＡ  ３’−配列番号２３）
０．１５μＭ  Ｔａｑｍａｎプローブ（ＦＡＭ−ＡＴＣＣＡＣＡＴＣＴＧＣＴＧＧＡＡＧＧＴＧＧＡＣＡＧＴ−ＴＡＭＲＡ−配列番号２４）
５ｍＭ  ＭｇＣｌ２
２ｍＭ  ＮａＰＰｉ
受動的参照
７．５ｎｇから出発したヒトゲノムＤＮＡの４倍希釈液（２５００コピー）。
【０１４３】
サイクル条件
９４℃で３分間初期変性、
９４℃で１５秒間と６０℃で６０秒間を４０サイクル。
【０１４４】
結果を図１９に示す。
【０１４５】
結論として、本発明の方法を使用すると、ピロリン酸塩を使用してＰＣＲを抑制した後に熱安定性ＰＰａｓｅを使用して例えば８０℃〜９５℃でこの抑制を解除することによりホットスタートＰＣＲと同様に機能しながら、迅速で特異性の増加という付加的利点もあると確信される。
【０１４６】
上記全文献は参考資料として本明細書に組込む。本発明の範囲と精神から逸脱することなく本発明の他の変形も当業者に自明である。特定の好適態様について本発明を説明したが、当然のことながら請求する発明はこのような特定態様に不当に限定されない。実際に、本発明を実施するために記載態様の種々の変形が当業者に自明であり、このような変形も請求の範囲に含まれる。
【図面の簡単な説明】
【０１４７】
【図１】各種量のＰＰｉ（ＰＰｉはピロリン酸四ナトリウムである）の存在下で実施したＰＣＲの結果を示す。
【図２】３ｍＭ  ＰＰｉの不在下と存在下におけるＭｇＣｌ２増加の影響を示す。
【図３】本発明の方法と慣用ＰＣＲ反応を使用して得られた結果を示す。
【図４】従来のＰＣＲアッセイと同等のアッセイで本発明の方法を使用して得られた結果を示す。
【図５】本発明の方法で使用するＰＣＲ反応混合物の貯蔵安定性を従来の混合物に比較して試験した実験結果を示す。
【図６】本発明の方法で別のＰＰａｓｅを使用した結果を示す。
【図７ａ】本発明の方法と各種ＤＮＡポリメラーゼを使用したＰＣＲ実験の結果を示す。
【図７ｂ】本発明の方法と各種ＤＮＡポリメラーゼを使用したＰＣＲ実験の結果を示す。
【図８ａ】本発明の方法と各種ＤＮＡポリメラーゼを使用したＰＣＲ実験の結果を示す。
【図８ｂ】本発明の方法と各種ＤＮＡポリメラーゼを使用したＰＣＲ実験の結果を示す。
【図９】従来の「ホットスタート」ＰＣＲを本発明の方法と比較した実験の結果を示す。
【図１０】別の慣用ＰＣＲを使用した以外は同様のアッセイを実施することにより得られた結果を示す。
【図１１】配列番号１として示すＡｅｒｏｐｙｒｕｍ  ｐｅｒｎｉｘのゲノム配列（ＧｅｎＢａｎｋ  ＢＡ０００００２登録番号ＮＣ０００８５４）、対応するアミノ酸配列（配列番号２）及び酵素の配列（配列番号２５）を示す。
【図１２】配列番号２に示すＡｅｒｏｐｙｒｕｍ  ｐｅｒｎｉｘのタンパク質配列を含む各種ＰＰａｓｅ配列（配列番号２〜９）のアラインメントを示す。
【図１３】Ａｅｒｏｐｙｒｕｍ  ｐｅｒｎｉｘからピロホスファターゼ酵素を単離する間に生産された６８６塩基対ＰＣＲ産物（配列番号１０）を示す。
【図１４】Ａｅｒｏｐｙｒｕｍ  ｐｅｒｎｉｘからピロホスファターゼ酵素を単離するのに使用したポリリンカー配列（配列番号１１）を示す。
【図１５−１】Ａｅｒｏｐｙｒｕｍ  ｐｅｒｎｉｘからピロホスファターゼ酵素を単離するのに使用したｐＴＴＱ１８ＮＨＫベクターの配列（配列番号１２）を示す。
【図１５−２】Ａｅｒｏｐｙｒｕｍ  ｐｅｒｎｉｘからピロホスファターゼ酵素を単離するのに使用したｐＴＴＱ１８ＮＨＫベクターの配列（配列番号１２）を示す。
【図１６−１】Ａｅｒｏｐｙｒｕｍ  ｐｅｒｎｉｘからピロホスファターゼ酵素を単離するのに使用したＰＰａｓｅ配列を含むｐＴＴＱ１８ＮＨＫベクターの配列（配列番号１３）の配列（Ｚ＝終止）を示す。
【図１６−２】Ａｅｒｏｐｙｒｕｍ  ｐｅｒｎｉｘからピロホスファターゼ酵素を単離するのに使用したＰＰａｓｅ配列を含むｐＴＴＱ１８ＮＨＫベクターの配列（配列番号１３）の配列（Ｚ＝終止）を示す。
【図１６−３】Ａｅｒｏｐｙｒｕｍ  ｐｅｒｎｉｘからピロホスファターゼ酵素を単離するのに使用したＰＰａｓｅ配列を含むｐＴＴＱ１８ＮＨＫベクターの配列（配列番号１３）の配列（Ｚ＝終止）を示す。
【図１７】Ａｅｒｏｐｙｒｕｍ  ｐｅｒｎｉｘからの無機ピロホスファターゼを使用した本発明の方法の結果を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７ａ】
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【図７ｂ】
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【図８ａ】
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【図８ｂ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５−１】
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【図１５−２】
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【図１６−１】
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【図１６−２】
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【図１６−３】
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【図１７】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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2004524853.tif 000111
2004524853.tif 000112
2004524853.tif 000113
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