(57)【要約】哺乳動物細胞におけるＴＳＰＡＮ−７の発現または生物学的活性を減少する、ＴＳＰＡＮ−７のインヒビターが提供される。ＴＳＰＡＮ−７インヒビターとしては、アンチセンス分子、リボザイム、抗体および抗体フラグメント、タンパク質およびポリペプチド、ならびに低分子が挙げられる。ＴＳＰＡＮ−７インヒビターは、ＴＳＰＡＮ−７遺伝子の発現を減少するための組成物および方法、ならびに哺乳動物細胞（腫瘍細胞を含む）における増殖を阻害するための方法、癌治療の副作用を低減するための方法、および新生物形成疾患を処置するための方法における用途を見出す。テトラスパンファミリーの新しいメンバー、ＴＳＰＡＮ−７をコードする核酸、およびそれによってコードされるポリペプチドもまた、提供される。
2004504021.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離されたＴＳＰＡＮ−７インヒビターであって、ここで、該ＴＳＰＡＮ−７インヒビターは、アンチセンス分子、抗体、リボザイム、ペプチド、ペプチド模倣物、および環状ペプチドからなる群より選択される、ＴＳＰＡＮ−７インヒビター。
【請求項２】
前記アンチセンス分子またはその相補体が、配列番号１の配列の少なくとも１０個、少なくとも１６個、少なくとも２０個、および少なくとも２５個連続したヌクレオチドからなる群より選択されるオリゴヌクレオチドを含む、請求項１に記載の単離されたＴＳＰＡＮ−７インヒビター。
【請求項３】
前記アンチセンス分子またはその相補体が、高ストリンジェンシー条件下で配列番号１の配列にハイブリダイズする、請求項１に記載の単離されたＴＳＰＡＮ−７インヒビター。
【請求項４】
前記アンチセンス分子が、配列番号３〜７からなる群より選択される核酸配列を含む、請求項１に記載の単離されたＴＳＰＡＮ−７インヒビター。
【請求項５】
前記ＴＳＰＡＮ−７インヒビターがリボザイムである、単離されたＴＳＰＡＮ−７インヒビター。
【請求項６】
前記インヒビターが、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、抗体フラグメント、二重特異的抗体、および三重特異的抗体からなる群より選択される抗体である、請求項１に記載の単離されたＴＳＰＡＮ−７インヒビター。
【請求項７】
前記抗体フラグメントが、Ｆ（ａｂ’）２および単鎖Ｆｖフラグメントからなる群より選択される、請求項６に記載の単離されたＴＳＰＡＮ−７インヒビター。
【請求項８】
哺乳動物細胞におけるＴＳＰＡＮ−７の発現を減少する方法であって、該方法は、該細胞に請求項１に記載のＴＳＰＡＮ−７インヒビターを投与する工程を包含する、方法。
【請求項９】
前記ＴＳＰＡＮ−７インヒビターが、配列番号１の配列の少なくとも１０個、少なくとも１６個、少なくとも２０個、および少なくとも２５個連続した核酸からなる群より選択されるオリゴヌクレオチドを含むアンチセンス分子である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
過剰増殖性障害を処置する方法であって、該方法は、哺乳動物細胞に、該過剰増殖性障害の重症度が減少するようにＴＳＰＡＮ−７インヒビターを投与する工程を包含する、方法。
【請求項１１】
前記過剰増殖性障害が癌である、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
組換えベクターを作製する方法であって、該方法は、配列番号１の少なくとも１０個、少なくとも１６個、少なくとも２０個、および少なくとも２５個連続したヌクレオチド、またはその相補体からなる群より選択されるオリゴヌクレオチドを、プロモーターへの作動可能な連結においてベクターに挿入する工程を包含する、方法。
【請求項１３】
請求項１２に記載の方法によって産生される、組換えベクター。
【請求項１４】
組換え宿主細胞を作製する方法であって、該方法は、請求項１３に記載の組換えベクターを、宿主細胞に導入する工程を包含する、方法。
【請求項１５】
請求項１４に記載の方法によって産生される、組換え宿主細胞。
【請求項１６】
ポリペプチドを産生する組換え方法であって、該方法は、該ポリペプチドが発現するような条件下で請求項１５に記載の組換え宿主細胞を培養する工程、および該ポリペプチドを回収する工程を包含する、方法。
【請求項１７】
配列番号２のポリペプチドのエピトープ保有部分。
【請求項１８】
配列番号２、配列番号１３および配列番号１４のいずれか１つのうち、約８〜約２５個連続したアミノ酸を含む、請求項１７に記載のエピトープ保有部分。
【請求項１９】
配列番号２、配列番号１３および配列番号１４のうち約１０〜約１５個連続したアミノ酸を含む、請求項１７に記載のエピトープ保有部分。
【請求項２０】
配列番号２の約１〜約２７０のアミノ酸を含むポリペプチドに少なくとも９５％同一なアミノ酸を含むポリペプチドに特異的に結合する、単離された抗体。
【請求項２１】
単離されたポリペプチドに特異的に結合する単離された抗体であって、ここで、少なくとも１つの保存的アミノ酸置換を除いて、該ポリペプチドは、（ａ）配列番号２の約１〜約２７０のアミノ酸；および（ｂ）配列番号２の約２〜約２７０のアミノ酸からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する、抗体。
【請求項２２】
請求項１７に記載のエピトープ保有部分を含むポリペプチドに特異的に結合する、単離された抗体。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の背景）
（技術分野）
本発明は、新規テトラスパン（ｔｅｔｒａｓｐａｎ）タンパク質、このタンパク質をコードするポリヌクレオチド、ならびにテトラスパンタンパク質の発現および／または生物学的活性を阻害するための組成物および方法を提供する。このような組成物および方法は、新生物疾患の処置において有用性を見出す。
【０００２】
（関連分野の説明）
テトラスパンファミリーは、Ｍａｅｃｋｅｒ，Ｈ．Ｔ．ら、ＦＡＳＥＢ　Ｊ．１１：４２８−４４２，１９９７において議論されている。リンパ腫細胞株におけるテトラスパン遺伝子の発現は、Ｆｅｒｒｅｒ，Ｍ．ら、Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１３：３４６−３５２，１９９８において議論されている。
【０００３】
（発明の要旨）
本発明は、１つの実施形態において、配列番号１によりコードされる新規テトラスパンタンパク質（ＴＳＰＡＮ−７と称される）（配列番号２）を提供する。
【０００４】
本発明はさらに、以下からなる群より選択されるポリヌクレオチドを含む単離された核酸分子を提供する：
（ａ）配列番号２のアミノ酸約１〜約２７０をコードするポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号２のアミノ酸約２〜約２７０をコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）（ａ）または（ｂ）のポリヌクレオチドのポリヌクレオチド相補体；および
（ｄ）（ａ）、（ｂ）、または（ｃ）のポリヌクレオチドに少なくとも９０％同一であるポリヌクレオチド。
【０００５】
本発明はなおさらに、配列番号１のコード領域から少なくとも８１０連続するヌクレオチドを含む単離された核酸分子を提供する。
【０００６】
本発明はまた、少なくとも１つの保存的アミノ酸置換を除いて、以下からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む単離された核酸分子を提供する：
（ａ）配列番号２のアミノ酸約１〜約２７０をコードするポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号２のアミノ酸約２〜約２７０をコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）（ａ）または（ｂ）のポリヌクレオチドのポリヌクレオチド相補体；および
（ｄ）（ａ）、（ｂ）、または（ｃ）のポリヌクレオチドに少なくとも９０％同一であるポリヌクレオチド。
【０００７】
本発明はさらに、配列番号１の配列を有する単離された核酸分子を提供する。ここで、この核酸分子は、ＤＮＡである。
【０００８】
さらなる実施形態において、本発明は、組換えベクターを作製する方法であって、配列番号１および配列番号３〜７のいずれか１つの核酸分子を、プロモーターに作動可能に連結されるようにベクターに挿入する工程を包含する方法、この方法により生成される組換えベクター、ならびに組換え宿主細胞を作製する方法であって、上記組換えベクターを宿主細胞に導入する工程を包含する方法、を提供する。
【０００９】
本発明はさらに、配列番号２のアミノ酸約１〜約２７０を含むポリペプチドに少なくとも９５％同一なアミノ酸を含む単離されたポリペプチド、および少なくとも１つの保存的アミノ酸置換を除いて、以下からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する単離されたポリペプチドを提供する：
（ａ）配列番号２のアミノ酸約１〜約２７０をコードするポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号２のアミノ酸約２〜約２７０をコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）（ａ）または（ｂ）のポリヌクレオチドのポリヌクレオチド相補体；および
（ｄ）（ａ）、（ｂ）、または（ｃ）のポリヌクレオチドに少なくとも９０％同一であるポリヌクレオチド。
【００１０】
本発明はまた、配列番号１３または配列番号１４を含むＴＳＰＡＮ−７タンパク質の一部分、ならびに配列番号１３および配列番号１４の少なくとも１つを含む融合タンパク質またはそのフラグメントを提供する。
【００１１】
本発明はなおさらに、配列番号２のポリペプチドのエピトープ保有部分を提供し；１つの実施形態において、配列番号２の約８〜約２５の連続するアミノ酸、より好ましくは配列番号２の約１０〜約１５の連続するアミノ酸を含むエピトープ保有部分を提供する。
【００１２】
本発明はまた、配列番号２のポリペプチドに特異的に結合する単離された抗体またはその一部分を提供する。ここで、この抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、または抗体フラグメントであり得る。
【００１３】
本発明はさらに、単離されたＴＳＰＡＮ−７インヒビターを提供する。ここで、このＴＳＰＡＮ−７インヒビターは、アンチセンス分子であり；１つの実施形態において、このアンチセンス分子またはその相補体は、配列番号１の配列の少なくとも１０連続する核酸を含み；そして別の実施形態において、このアンチセンス分子またはその相補体は、高ストリンジェンシー条件下で配列番号１の配列にハイブリダイズする。
【００１４】
本発明はなおさらに、配列番号３〜７からなる群より選択される核酸配列を含むアンチセンス分子を提供する。
【００１５】
本発明はまた、単離されたＴＳＰＡＮ−７インヒビターを提供する。ここで、このＴＳＰＡＮ−７インヒビターは、リボザイムである。他の実施形態において、ＴＳＰＡＮ−７インヒビターは、抗体および抗体フラグメントからなる群より選択され；そして抗体または抗体フラグメントは、モノクローナルであり得、そして抗体または抗体フラグメントはヒト化され得る。
【００１６】
本発明はなおさらに、薬学的に受容可能なキャリア中に治療有効量のＴＳＰＡＮ−７インヒビターを含む組成物を提供し；特定の実施形態において、この組成物は、２つ以上のＴＳＰＡＮ−７インヒビターを含み得、そして１つの実施形態において、このＴＳＰＡＮ−７インヒビターは、アンチセンス分子である。
【００１７】
本発明はまた、哺乳動物細胞においてＴＳＰＡＮ−７の発現を減少させる方法を提供し、この方法は、ＴＳＰＡＮ−７インヒビターを細胞に投与する工程を包含する。ここで、ＴＳＰＡＮ−７インヒビターは、アンチセンス分子、リボザイム、抗体、抗体フラグメント、タンパク質、ポリペプチド、または低分子である。
【００１８】
本発明はさらに、過増殖性障害を処置する方法を提供する。この方法は、哺乳動物細胞にＴＳＰＡＮ−７インヒビターを投与する工程を包含し、その結果、過増殖性障害が、重篤度において減少される。特定の実施形態において、過増殖性障害は、癌である。
【００１９】
（発明の詳細な説明）
テトラスパンスーパーファミリーのタンパク質は、４つの膜貫通ドメインおよび２つの細胞外領域により特徴付けられる（４回膜貫通タンパク質の概略図を図１に示す）。ＮＥＴタンパク質と称される特定のファミリーは、「新規のＥＳＴテトラスパン」としてこのスーパーファミリーに含まれる（Ｓｅｒｒｕ，Ｖ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ　１４７８：１５９−１６３、２０００）。Ｓｅｒｒｕらは、７つのＮＥＴタンパク質の存在を報告し（ＮＥＴ−１〜ＮＥＴ−７と命名された）、そして細胞株のパネルにおける発現を研究した。
【００２０】
本発明は、本明細書でＴＳＰＡＮ−７と称される、テトラスパンファミリーの新規メンバーを提供する。本発明のＴＳＰＡＮ−７は、Ｔリンパ細胞株において発現されたが、研究されたほとんどのＢリンパ細胞株によっては発現されなかった。このｃＤＮＡは、ＮＥＴ−４（ＴＳＰＡＮ−５としても公知である）に対してほとんど相同である。全長ｃＤＮＡ配列（配列番号１）を図２に提供し、そしてコードされるアミノ酸配列（配列番号２）を図３に提供する。本発明は、ＴＳＰＡＮ−７　ｍＲＮＡが前立腺癌細胞株において示差的に発現されることを開示することによって、テトラスパンファミリーについての知見にさらに追加する。詳細には、ＴＳＰＡＮ−７の発現は、正常な前立腺細胞株ＧＲＲｐｚよりも前立腺癌細胞株ＷＯｃａにおいて９倍より高い。ＧＲＲｐｚ細胞株は、低継代（３継代以下）ヒト前立腺細胞をいう。ＷＯｃａ細胞株は、低継代（３継代以下）ヒト前立腺癌細胞をいう。従って、ＴＳＰＡＮ−７は、前立腺癌、過増殖性障害、および他の癌の成長、増殖、移動、および転移を調節するための候補物質である。診断用途において、前立腺癌細胞の存在は、ＴＳＰＡＮ−７またはその細胞外領域に結合する因子（例えば、抗体）を用いて検出され得る。
【００２１】
ＴＳＰＡＮ−７の発現を調節するために、ＳＷ６２０結腸癌細胞を、ＴＳＰＡＮ−７ポリヌクレオチドと特異的にハイブリダイズするよう設計されたアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いてトランスフェクトした。本発明で使用したオリゴヌクレオチドを、配列番号３〜７に示し、そしてそれぞれ、２２−１、２２−２、２２−３、２２−４、および２２−５と命名する。コントロールとして、細胞を、対応する逆向きの相補体オリゴヌクレオチド（２２−１ＲＣ、２２−２ＲＣ、２２−３ＲＣ、２２−４ＲＣ、および２２−５ＲＣ（それぞれ、配列番号８〜１２）と命名した）を用いてトランスフェクトした。処理した細胞におけるｍＲＮＡレベルを分析し、そしてアクチンに対して正規化した。図４に示されるように、５つのアンチセンスオリゴヌクレオチドのうちの４つ（２２−１、２２−２、２２−４、および２２−５）で処理した細胞集団は、対応するＲＣ処理細胞におけるｍＲＮＡレベルに対して減少したｍＲＮＡレベルを示した。
【００２２】
最も大きなｍＲＮＡの減少を、２２−４アンチセンスで処理した細胞において見出し、そしてこのオリゴヌクレオチドを、ＳＷ６２０細胞の増殖に対する効果を測定するために選択した。図５に示されるように、未処理のＳＷ６２０細胞（ＷＴ）は、０日目と４日目との間で１２００から４２５０への蛍光の増加を有した。これは、総ＤＮＡレベルおよび増殖を示す。２２−４ＲＣで処理した細胞もまた、０日目の１３００から４日目の３０００への安定な速度の増殖を示した。対照的に、２２−４アンチセンス処理した細胞は、０日目から２日目の約１０００、３日目の約１３００、そして４日目の約２３００にとどまった。従って、ＳＷ６２０細胞の増殖のアンチセンス阻害は、この細胞における減少したＴＳＰＡＮ−７　ｍＲＮＡと相関した。
【００２３】
ＮＥＴタンパク質スーパーファミリーは１９９０年に発見され、そして１９９７年の時点で２０のメンバーが同定された。この分子の機能の１つは、特定の細胞表面タンパク質をグループ化することであり、それによって機能的なシグナル伝達複合体の形成および安定性を増加させることが示唆された。Ｍａｅｃｋｅｒ，Ｈ．Ｔ．ら、ＦＡＳＥＢ　Ｊ．１１：４２８−４４２、１９９７。図１は、テトラスパンタンパク質の図解的構造を示す。今日までに公開された情報は、いくつかのテトラスパンタンパク質が、癌の発症または成長において阻害的な役割を果たし得る一方、他のテトラスパンタンパク質は、癌細胞においてより高レベルで発現されることを示す。例えば、ＣＤ９の発現は、癌細胞における運動および転移を抑制し（Ｉｋｅｙａｍａ，Ｓら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７７：１２３１−１２３７、１９９３）、そしてＣＤ９の発現は逆に、黒色腫細胞における転移と相関する（Ｓｉ，Ｚら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ　５４：３７−４３、１９９３）。ＣＤ９発現の減少は、乳癌における貧弱な予後と相関する（Ｍｉｙａｋｅ，Ｍら、Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．５６：１２４４−１２４９、１９９６）。ＣＤ８２の発現は、前立腺癌細胞株における転移を抑制し得る（Ｄｏｎｇ，Ｊら、Ｓｃｉｅｎｃｅ　２６８：８８４−８８６、１９９５）。
【００２４】
従って、ＴＳＰＡＮ−７のポリヌクレオチド配列に基づくアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＴＳＰＡＮ−７発現の特異的なインヒビターであり、そしてこのことは、結腸癌細胞の減少した増殖と相関する。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、前立腺癌ならびに減少したＴＳＰＡＮ−７発現が細胞の成長、移動、転移、および生存において役割を果たす他の癌のインビボでの処置に適している。しかし、本発明は、アンチセンスインヒビターの使用に限定されない。本明細書中の結果に基づき、ＴＳＰＡＮ−７発現を阻害するか、またはＴＳＰＡＮ−７機能を調節もしくは阻害するための他の組成物および方法もまた、細胞成長を調節するのに適している。ＴＳＰＡＮ−７は、膜貫通タンパク質なので、その効果を阻害するために、抗体が特に適している。
【００２５】
ＴＳＰＡＮ−７は、少なくとも２つの細胞外ドメインを有する。第１のドメインは以下のアミノ酸配列を有する：
【００２６】
【表１】
2004504021.tif 000003
第２のドメインは、以下のアミノ酸配列を有する：
【００２７】
【表２】
2004504021.tif 000004
これらのドメインは、結合パートナー（例えば、配列番号１３もしくは１４、またはそれらのフラグメントに特異的に結合し得る抗体）の使用を通して、治療因子を癌細胞（例えば、前立腺癌細胞）に標的化するのに適している。
【００２８】
本発明は、一般的に、過増殖性障害における（例えば、癌細胞、特に前立腺癌細胞における）ＴＳＰＡＮ−７の発現および機能を調節することに関する。より詳細には、本明細書で開示される本発明は、ＴＳＰＡＮ−７のインヒビター（アンチセンスポリヌクレオチドおよびリボザイム、タンパク質またはポリペプチド、抗体またはそのフラグメントならびに低分子、が挙げられる）；ＴＳＰＡＮ−７インヒビターを含む組成物；哺乳動物細胞に対する化学療法効果および／または放射線効果を補足する方法、ならびに過増殖性障害および新生物疾患を処置する方法を提供する。これらの方法は、通常、１つ以上のＴＳＰＡＮ−７インヒビターの哺乳動物細胞への投与を包含する。
【００２９】
（ＴＳＰＡＮ−７ポリペプチド、ポリヌクレオチド、およびその改変体）
（ポリペプチドフラグメント）
本発明は、ＴＳＰＡＮ−７のポリペプチドフラグメントを提供する。本発明のポリペプチドフラグメントは、配列番号２から選択される少なくとも８、１０、１２、１５、１８、１９、２０、２５、５０、７５、１００、１２５、１３０、１５０、１７０、１８０、２００、２２５、２５０、２６０、２６５、２６７、および２６９連続するアミノ酸を含み得る。好ましいフラグメントは、配列番号１３、配列番号１４、およびそれらのフラグメントを含む。
【００３０】
（生物学的に活性な改変体）
本明細書で開示されるタンパク質およびポリペプチドの改変体もまた、生じ得る。改変体は、天然にも非天然にも生じ得る。天然に存在する改変体は、ヒトまたは他の種において見出され、そして配列番号２に示されるアミノ酸配列に実質的に同一なアミノ酸配列を含む。好ましいフラグメントは、配列番号１３、配列番号１４、およびそれらのフラグメントを含む。このタンパク質の種ホモログは、本発明のサブゲノムポリヌクレオチドを用いて他の種（例えば、マウス、サル、酵母、または細菌）由来のｃＤＮＡ発現ライブラリーをスクリーニングするために適切なプローブまたはプライマーを作製し、このタンパク質のホモログをコードするｃＤＮＡを同定し、そして当該分野で公知のようにｃＤＮＡを発現させることにより獲得され得る。
【００３１】
天然に存在するタンパク質改変体と実質的に同一の生物学的活性（特に、テトラスパン構造（図１）および他の細胞表面タンパク質との相互作用）を保持する天然に存在しない改変体もまた、本発明に含まれる。好ましくは、天然に存在する改変体も天然に存在しない改変体も、配列番号２に示されるアミノ酸配列に少なくとも８５％、９０％、または９５％同一であるアミノ酸配列を有する。より詳細には、この分子は、少なくとも９６％、９７％、９８％、または９９％同一である。パーセント同一性は、当該分野で任意の方法を用いて決定される。非限定的な例は、ギャップオープンペナルティーが１２、そしてギャップエクステンションペナルティーが１でのアフィンギャップ検索を用いた、Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ相同性検索アルゴリズムである。Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ相同性検索アルゴリズムは、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ、Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．（１９８１）２：４８２−４８９に教示されている。
【００３２】
どのアミノ酸残基が、生物学的活性または免疫学的活性を失うことなく置換、挿入、または欠失され得るかを決定する上での手引きは、当該分野で周知のコンピュータープログラム（例えば、ＤＮＡＳＴＡＲソフトウェア）を用いて見出され得る。好ましくは、ＴＳＰＡＮ−７タンパク質改変体におけるアミノ酸変化は、保存的アミノ酸変化、すなわち、類似の荷電アミノ酸または非荷電アミノ酸の置換である。保存的アミノ酸変化は、それらの側鎖において関連するアミノ酸のファミリーのうちの１つの置換を含む。天然に存在するアミノ酸は、一般的に、以下の４つのファミリーに分類される：酸性アミノ酸（アスパラギン酸、グルタミン酸）、塩基性アミノ酸（リジン、アルギニン、ヒスチジン）、非極性アミノ酸（アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、および非荷電極性アミノ酸（グリシン、アスパラギン、グルタミン、シスチン、セリン、スレオニン、チロシン）。フェニルアラニン、トリプトファン、およびチロシンは、しばしば、芳香族アミノ酸としてひとつに分類される。
【００３３】
イソロイシンもしくはバリンによる散発性のロイシンの置換、グルタミン酸による散発性のアスパラギン酸の置換、セリンによる散発性のスレオニンの置換、または構造的に関連するアミノ酸による散発性のアミノ酸の同様の置換は、得られる改変体の生物学的特性に対して大きな効果を有さないと考えることが、合理的である。
【００３４】
本明細書で開示されるＴＳＰＡＮ−７タンパク質の改変体として、グリコシル化形態、他の分子との凝集性結合体、および関連しない化学的部分との共有結合性結合体が挙げられる。共有結合性改変体は、当該分野で公知のように、アミノ酸鎖またはＮ末端残基もしくはＣ末端残基において見出される基への官能基の連結により調製され得る。また改変体として、対立遺伝子改変体、種改変体、およびムテインが挙げられる。このタンパク質の機能的活性に影響を及ぼさない領域の短縮物または欠失物もまた、改変体である。
【００３５】
ムテインと呼ばれる変異体のサブセットは、中性アミノ酸（例えば、セリン）が、ジスルフィド結合に関わっていないシステイン残基と置換されているポリペプチドの群である。これらの変異体は、ネイティブの分泌タンパク質よりも広い温度範囲にわたって安定であり得る。Ｍａｒｋら、米国特許第４，９５９，３１４号を参照のこと。
【００３６】
好ましくは、ＴＳＰＡＮ−７タンパク質改変体またはポリペプチド改変体におけるアミノ酸変化は、保存的アミノ酸変化、すなわち、類似の荷電アミノ酸または非荷電アミノ酸の置換である。保存的アミノ酸変化は、それらの側鎖において関連するアミノ酸のファミリーのうちの１つの置換を含む。天然に存在するアミノ酸は、一般的に、以下の４つのファミリーに分類される：酸性アミノ酸（アスパラギン酸、グルタミン酸）、塩基性アミノ酸（リジン、アルギニン、ヒスチジン）、非極性アミノ酸（アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、および非荷電極性アミノ酸（グリシン、アスパラギン、グルタミン、シスチン、セリン、スレオニン、チロシン）。フェニルアラニン、トリプトファン、およびチロシンは、しばしば、芳香族アミノ酸としてひとつに分類される。改変体を調製するための手引きは、図１において見出され得る。図１は、テトラスパンファミリーの保存されたアミノ酸の位置を示す。
【００３７】
イソロイシンもしくはバリンによる散発性のロイシンの置換、グルタミン酸による散発性のアスパラギン酸の置換、セリンによる散発性のスレオニンの置換、または構造的に関連するアミノ酸による散発性のアミノ酸の同様の置換は、得られるタンパク質またはポリペプチド改変体の生物学的特性に対して大きな効果を有さないと考えることが、合理的である。ＴＳＰＡＮ−７タンパク質改変体またはポリペプチド改変体の特性および機能は、配列番号１に示されるヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列を含むタンパク質と同一型の特性および機能であるが、改変体の特性および機能はある程度異なり得る。
【００３８】
ＴＳＰＡＮ−７タンパク質の改変体として、グリコシル化形態、他の分子との凝集性結合体、および関連しない化学的部分との共有結合性結合体が挙げられる。またＴＳＰＡＮ−７タンパク質改変体として、対立遺伝子改変体、種改変体、およびムテインが挙げられる。ＴＳＰＡＮ−７タンパク質の示差的な発現または膜貫通構造に影響を及ぼさない領域の短縮物または欠失物もまた、改変体である。共有結合性改変体は、当該分野で公知のように、アミノ酸鎖またはＮ末端残基もしくはＣ末端残基において見出される基への官能基の連結により調製され得る。
【００３９】
本発明のＴＳＰＡＮ−７タンパク質のいくつかのアミノ酸配列は、タンパク質の構造または機能に関して重大な影響を有さずに改変され得ることが、当該分野において認識される。配列におけるこのような差が熟慮される場合、活性を決定するタンパク質の決定的な領域が存在することが思い起こされるべきである（図１）。一般的に、類似の機能を実行する残基が使用されるとすると、三次元構造を形成する残基を置換することが可能である。他の例において、タンパク質の決定的でない領域で変更が生じる場合、残基の型は全く重要ではない。アミノ酸の置換はまた、細胞表面レセプターへの結合の選択性を変化させ得る。Ｏｓｔａｄｅら、Ｎａｔｕｒｅ　３６１：２６６−２６８（１９９３）は、ＴＮＦレセプターの２つの公知の型のうちの１つだけへのＴＮＦ−αの選択的結合において生じる特定の変異を記載する。従って、本発明のポリペプチドは、天然の変異またはヒトの操作のいずれかに由来する１つ以上のアミノ酸置換、欠失または付加を含む。
【００４０】
本発明は、比較可能な発現パターンを示すか、または抗原性領域を含むＴＳＰＡＮ−７ポリペプチドの改変体をさらに含む。このような変異体としては、欠失、挿入、反転、反復、および置換の型が挙げられる。アミノ酸変化が表現型的に現れない（ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃａｌｌｙ　ｓｉｌｅｎｔ）ことに関するガイダンスは、Ｂｏｗｉｅ，Ｊ．Ｕ．ら，「Ｄｅｃｉｐｈｅｒｉｎｇ　ｔｈｅ　Ｍｅｓｓａｇｅ　ｉｎ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ：Ｔｏｌｅｒａｎｃｅ　ｔｏ　Ａｍｉｎｏ　Ａｃｉｄ　Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎｓ」，Ｓｃｉｅｎｃｅ　２４７：１３０６−１３１０（１９９０）に見出され得る。
【００４１】
特別な目的は、荷電アミノ酸と別の荷電アミノ酸および中性または負に荷電したアミノ酸との置換である。後者は、開示のタンパク質の特性を改善するために、正電荷が減少したタンパク質において生じる。凝集の予防が非常に望まれる。薬学的処方物を調製する場合、タンパク質の凝集は、活性の欠損を生じるだけでなく、それらが免疫原性であるために問題になり得る。（Ｐｉｎｃｋａｒｄら，Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ　２：３３１−３４０（１９６７）；Ｒｏｂｂｉｎｓら，Ｄｉａｂｅｔｅｓ　３６：８３８−８４５（１９８７）；Ｃｌｅｌａｎｄら，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ　Ｄｒｕｇ　Ｃａｒｒｉｅｒ　Ｓｙｓｔｅｍｓ　１０：３０７−３７７（１９９３））。
【００４２】
機能にとって必須の本発明のＴＳＰＡＮ−７のアミノ酸は、部位特異的変異誘発またはアラニンスキャンニング変異誘発（ＣｕｎｎｉｎｇｈａｍおよびＷｅｌｌｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ　２４４：１０８１−１０８５（１９８９））などの当該分野に公知の方法によって同定され得る。後者の手順は、分子内のあらゆる残基で単一のアラニン変異を導く。次いで、生じる変異体分子は、天然または合成の結合パートナーへの結合のような生物学的活性について試験される。リガンドレセプター結合について重要な部位はまた、結晶化、核磁気共鳴またはフォトアフィニティーラベリング（Ｓｍｉｔｈら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２４：８９９−９０４（１９９２）およびｄｅ　Ｖｏｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ　２５５：３０６−３１２（１９９２））などの構造分析によって決定され得る。
【００４３】
示されるように、変化は、タンパク質の折りたたみまたは活性に重大な影響を及ぼさない保存的アミノ酸置換のような小さな性質のものが好ましい。もちろん、当業者が行うアミノ酸置換の数は、上に記載のものを含む多くの因子に依存する。一般的に言えば、任意の所定のポリペプチドの置換数は、５０、４０、３０、２５、２０、１５、１０、５または３以下である。
【００４４】
（融合タンパク質）
ＴＳＰＡＮ−７のタンパク質またはポリペプチドフラグメントを含む融合タンパク質もまた、構築され得る。融合タンパク質は、アミノ酸配列に対する抗体の産生のため、および種々のアッセイ系における使用のために、有用である。例えば、融合タンパク質は、ＴＳＰＡＮ−７と相互作用するか、またはその生物学的な機能を妨害するタンパク質を同定するために使用され得る。物理的な方法（例えば、タンパク質アフィニティークロマトグラフィー）またはタンパク質−タンパク質相互作用についてのライブラリーベースのアッセイ（例えば、酵母２−ハイブリッド系またはファージディスプレイ系）がまた、この目的のために使用され得る。このような方法は、当該分野で周知であり、そしてまた、薬物スクリーニングとして使用され得る。ＴＳＰＡＮ−７もしくはそのフラグメントのシグナル配列および／または膜貫通ドメインを含む融合タンパク質は、そのドメインが通常見出されない細胞位置（例えば、細胞膜に対して結合するか、または細胞外に分泌される）に対して他のタンパク質ドメインを標的化するために使用され得る。
【００４５】
融合タンパク質は、ペプチド結合によってお互いに融合された２つのタンパク質セグメントを含む。本発明の融合タンパク質において使用されるアミノ酸配列は、配列番号２において示されるアミノ酸配列を利用し得るか、または上記に記載されるような配列番号２の生物学的に活性な改変体から調製され得る。第１タンパク質セグメントは、全長ＴＳＰＡＮ−７からなり得る。
【００４６】
他の第１タンパク質セグメントは、配列番号２から選択される、少なくとも８、１０、１２、１５、１８、１９、２０、２５、５０、７５、１００、１２５、１３０、１４０、１６０、１８０、２００、２２０、２４０、２６０、２６５または２６９連続したアミノ酸からなり得る。
【００４７】
特定の実施形態において、第１のタンパク質セグメントは、配列番号１３および配列番号１４の一方かもしくは両方、またはこれらの一部であり得る。好ましい実施形態としては、以下が挙げられる：配列番号１３の１〜２４、２〜２５、２〜２４、３〜２５もしくは３〜２４のアミノ酸；または配列番号１３の８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０または２１連続するアミノ酸のフラグメント。他の好ましい実施形態としては、以下が挙げられる：配列番号１４の１〜１１９、２〜２２０、２〜１１９、３〜２２０、３〜１１９もしくは４〜２２０のアミノ酸；または１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０もしくは１１５連続するアミノ酸を有する配列番号１４のフラグメント。
【００４８】
第２のタンパク質セグメントは、全長タンパク質またはポリペプチドフラグメントであり得る。融合タンパク質構築物において通常使用されるタンパク質としては、β−ガラクトシダーゼ、β−グルクロニダーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、自己蛍光タンパク質（青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）を含む）、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、ルシフェラーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、およびクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）が挙げられる。さらに、エピトープタグ（ヒスチジン（Ｈｉｓ）タグ、ＦＬＡＧタグ、インフルエンザ赤血球凝集素（ＨＡ）タグ、Ｍｙｃタグ、ＶＳＶ−Ｇタグ、およびチオレドキシン（Ｔｒｘ）タグが挙げられる）が、融合タンパク質構築物において使用され得る。他の融合構築物としては、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、Ｓ−タグ、Ｌｅｘ　ａ　ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）融合物、ＧＡＬ４　ＤＮＡ結合ドメイン融合物、および単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ＢＰ１６タンパク質融合物が挙げられ得る。
【００４９】
これらの融合は、例えば、２つのタンパク質セグメントの共有結合によって、または分子生物学の分野の標準的な手順によって、作製され得る。組換えＤＮＡ方法は、例えば、ＤＮＡ構築物を作製することによって融合タンパク質を調製するために使用され得、ここでこのＤＮＡ構築物は、配列番号１のコード配列を、当該分野で公知のような、第２タンパク質セグメントをコードし、かつ宿主細胞においてＤＮＡ構築物を発現するヌクレオチドをとともに、適切なリーディングフレーム中に含む。融合タンパク質を構築するための多くのキットが、実験のためのツールと一緒に、供給研究所である会社（例えば、Ｐｒｏｍｅｇａ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（Ｌａ　Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（Ｍｏｕｎｔａｉｎ　Ｖｉｅｗ，ＣＡ）、Ｓａｎｔａ　Ｃｒｕｚ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｓａｎｔａ　Ｃｒｕｚ，ＣＡ）、ＭＢＬ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（ＭＩＣ；Ｗａｔｅｒｔｏｗｎ，ＭＡ）、およびＱｕａｎｔｕｍ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｍｏｎｔｒｅａｌ，Ｃａｎａｄａ；１−８８８−ＤＮＡ−ＫＩＴＳ）が挙げられる）から市販されている。
【００５０】
（ＴＳＰＡＮ−７の単離および産生）
ＴＳＰＡＮ−７は、前立腺癌ＷＯｃａにおいて発現され、そしてこの細胞または他のヒト細胞（例えば、配列番号１を含む組換え細胞）から、標準的な生化学的方法を使用して抽出され得る。これらの方法としては、サイズ排除クロマトグラフィー、硫酸アンモニウム分画、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、結晶化、等電点電気泳動、および調製用ゲル電気泳動が挙げられるが、これらに限定されない。単離および精製されたタンパク質またはポリペプチドは、細胞において、このタンパク質またはポリペプチドに通常会合している他の化合物（例えば、他のタンパク質、糖質、脂質、または細胞下小器官）から分離される。単離および精製されたタンパク質またはポリペプチドの調製物は、少なくとも８０％純粋である；好ましくは、この調製物は、９０％、９５％、または９９％純粋である。この調製物の純度は、当該分野で公知の任意の手段によって評価され得る。例えば、調製物の純度は、当該分野で公知であるように、いくつかのｐＨ値でかついくつかのポリアクリルアミド濃度で、タンパク質またはポリペプチド調製物の電気泳動を試験することによって、評価され得る。
【００５１】
本発明のタンパク質、融合タンパク質、またはポリペプチドは、組換えＤＮＡ方法によって産生され得る。組換えタンパク質を産生するために、融合タンパク質、またはポリペプチド、配列番号１において示されるヌクレオチド配列のコード配列は、当該分野で公知の発現系を使用して、原核生物宿主細胞または真核生物宿主細胞において発現され得る。これらの発現系としては、細菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞、および哺乳動物細胞が挙げられる。次いで、生じた発現されたＴＳＰＡＮ−７タンパク質は、培養培地または培養細胞の抽出物から、当該分野で公知の精製手順を使用して精製され得る。
【００５２】
機能的タンパク質を得るために、例えば、適切な部位のリン酸化またはグリコシル化によって、酵母または細菌において産生されるタンパク質を修飾することが必要とされ得る。このような共有結合は、公知の化学的方法または酵素的方法を使用して生成され得る。
【００５３】
本発明のＴＳＰＡＮ−７タンパク質またはＴＳＰＡＮ−７ポリペプチドはまた、精製を容易にする形式で、培養された宿主細胞において発現され得る。例えば、タンパク質またはポリペプチドは、例えば、マルトース結合タンパク質、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ、またはチオレドキシンを含む融合タンパク質として発現され得、そして市販のキットを使用して精製され得る。このような融合タンパク質の発現および精製のためのキットは、Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　ＢｉｏＬａｂｓ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ、およびＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのような会社から市販されている。タンパク質、融合タンパク質、またはポリペプチドはまた、エピトープ（例えば、「Ｆｌａｇ」エピトープ（Ｋｏｄａｋ））でタグ化され得、そして、そのエピトープに特異的に結合する抗体を使用して精製され得る。
【００５４】
本明細書中に開示されるコード配列はまた、トランスジェニック動物（例えば、ウシ、ヤギ、ブタ、またはヒツジ）を構築するために使用され得る。次いで、雌性のトランスジェニック動物は、その乳中に本発明のタンパク質、ポリペプチド、または融合タンパク質を産生し得る。このような動物を構築するための方法は、当該分野で公知であり、広範に使用されている。
【００５５】
あるいは、合成化学的な方法（例えば、固相ペプチド合成）が、ＴＳＰＡＮ−７を合成するために使用され得る。ペプチド、アナログまたは誘導体の産生のための一般的な手段は、Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ａｎｄ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ｏｆ　Ａｍｉｎｏ　Ａｃｉｄｓ，Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，ａｎｄ　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ−−Ａ　Ｓｕｒｖｅｙ　ｏｆ　Ｒｅｃｅｎｔ　Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ，Ｂ．Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ編（１９８３）に要約される。Ｄ−アミノ酸を通常のＬ−立体異性体に置換することは、分子の半減期を増加させるために実行され得る。改変体は、同様に産生され得る。
【００５６】
（ポリヌクレオチド配列）
本発明のＴＳＰＡＮ−７タンパク質をコードする遺伝子は、配列番号１において示されるコード配列を有する。本発明のポリヌクレオチド分子は、全体に満たない染色体を含み、そして、一本鎖または二本鎖であり得る。好ましくは、このポリヌクレオチド分子は、イントロンを有さない。本発明のポリヌクレオチド分子は、配列番号１からの少なくとも１１、１５、１６、１８、２１、２５、２６、３０、３３、４２、５４、６０、６６、７２、８４、９０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２４０、３００、３３０、４００、４２０、５００、５４０、６００、６６０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、１０５０、１１００、１１５０、１２００、１２５０、１３００、１３２５、１３５０または１３７４以上連続したヌクレオチドまたはそれらの相補体を含み得る。配列番号１において示されるヌクレオチド配列の相補体は、配列番号１において示される連続したヌクレオチド配列とワトソン−クリック塩基対を形成する、連続するヌクレオチド配列である。
【００５７】
ＴＳＰＡＮ−７タンパク質および改変体のアミノ酸配列をコードする縮重したポリヌクレオチド配列、および配列番号１に示されるヌクレオチド配列に対して、少なくとも６５％、７５％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一性である相同ヌクレオチド配列はまた、本発明のポリヌクレオチド分子である。パーセント配列同一性は、当該分野に公知の任意の方法、例えば、ＭＰＳＲＣＨプログラム（Ｏｘｆｏｒｄ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ）のようなＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムを実行するコンピュータープログラムの使用、以下のパラメーター：ギャップオープンペナルティー１２およびギャップ伸長ペナルティー１、を用いるアフィンギャップ検索の使用によって決定される。
【００５８】
代表的に、相同ポリヌクレオチド配列は、当該分野に公知のように、ストリージェントな条件下でのハイブリダイゼーションによって確認され得る。例えば、以下の洗浄条件：２×ＳＳＣ（０．３Ｍ　ＮａＣｌ，０．０３Ｍクエン酸ナトリウム，ｐＨ７．０），０．１％　ＳＤＳ，室温２回，各３０分間；次いで２×ＳＳＣ，０．１％　ＳＤＳ，５０℃一回，３０分間；次いで２×ＳＳＣ，室温２回，各１０分間、を使用して、せいぜい約２５〜３０％の塩基対ミスマッチを含む相同配列が同定され得る。より好ましくは、相同核酸鎖は、１５〜２５％塩基対ミスマッチを含み、さらにより好ましくは、５〜１５％の塩基ミスマッチである。
【００５９】
本発明はまた、例えば、ノザンブロッティングまたはサザンブロッティング、あるいはインサイチュハイブリダイゼーションなどのハイブリダイゼーションプロトコールにおいて、相補的ヌクレオチド配列を検出するために使用され得るポリヌクレオチドプローブを提供する。本発明のポリヌクレオチドプローブは、配列番号１からの少なくとも１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、３０、または４０以上の連続したヌクレオチドを含む。本発明のポリヌクレオチドプローブは、ラジオアイソトープ標識、蛍光標識、酵素標識、または化学発光標識などの検出標識を含み得る。
【００６０】
配列番号１に対応する単離遺伝子がまた提供される。標準的な分子生物学的方法は、本明細書中に提供されるｃＤＮＡ配列を使用して、対応する遺伝子を単離するために使用され得る。これらの方法としては、ヒトゲのノムライブラリーまたはヒトゲノムＤＮＡの他の供給源からの遺伝子の同定または増幅における使用のための、配列番号１に示されるヌクレオチド配列由来のプローブまたはプライマーの調製が挙げられる。
【００６１】
本発明のポリヌクレオチド分子は、ポリヌクレオチド増幅方法を使用して、ポリヌクレオチドのさらなる複製を得るためにプライマーとして使用され得る。ポリヌクレオチド分子は、当該分野に周知の技術を使用して、ベクターおよび細胞株において増殖され得る。ポリヌクレオチド分子は、線状分子または環状分子で使用され得る。これらは、自立的複製分子または複製配列を有さない分子であり得る。これらは、当該分野で公知のように、それ自身の調節配列または他の調節配列によって調節され得る。
【００６２】
（ポリヌクレオチド構築物）
ＴＳＰＡＮ−７タンパク質またはＴＳＰＡＮ−７ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド分子は、ＤＮＡ構築物またはＲＮＡ構築物などのポリヌクレオチド構築物において使用され得る。本発明のポリヌクレオチド分子は、例えば、宿主細胞において、ＴＳＰＡＮ−７タンパク質、改変体、融合タンパク質または単鎖抗体の全てあるいは一部分を発現するための発現構築物において使用され得る。発現構築物は、選択された宿主細胞において機能的なプロモーターを含む。当業者は、当該分野に公知でありそして使用される細胞型特異的プロモーターの多数に由来する適切なプロモーターを容易に選択し得る。この発現構築物はまた、宿主細胞において機構的な転写ターミネーターを含み得る。この発現構築物は所望のタンパク質の全てまたは一部分をコードするポリヌクレオチドセグメントを含む。このポリヌクレオチドセグメントは、プロモーターから下流に位置する。ポリヌクレオチドセグメントの転写は、プロモーターで開始する。発現構築物は、線状または環状であり得、そして所望であれば、自律的複製のための配列を含み得る。
【００６３】
（宿主細胞）
発現構築物は、宿主細胞中に導入され得る。発現構築物を含む宿主細胞は、任意の適切な原核生物細胞または真核生物細胞であり得る。細菌における発現系は、Ｃｈａｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ（１９７８）２７５：６１５；Ｇｏｅｄｄｅｌら、Ｎａｔｕｒｅ　２８１：５４４（１９７９）；Ｇｏｅｄｄｅｌら、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．８：４０５７（１９８０）；ＥＰ　３６，７７６；米国特許第４，５５１，４３３号；ｄｅＢｏｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８０：２１−２５（１９８３）；およびＳｉｅｂｅｎｌｉｓｔら、Ｃｅｌｌ　２０：２６９（１９８０）に記載される発現系を含む。
【００６４】
酵母における発現系には、以下に記載の発現系が含まれる：Ｈｉｎｎｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　７５：１９２９（１９７８）；Ｉｔｏら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５３：１６３（１９８３）；Ｋｕｒｔｚら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．６：１４２（１９８６）；Ｋｕｎｚｅら、Ｊ．Ｂａｓｉｃ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２５：１４１（１９８５）；Ｇｌｅｅｓｏｎら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１３２：３４５９（１９８６）；Ｒｏｇｇｅｎｋａｍｐら、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２０２：３０２（１９８６）；Ｄａｓら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５８：１１６５（１９８４）；Ｄｅ　Ｌｏｕｖｅｎｃｏｕｒｔら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５４：７３７（１９８３）；Ｖａｎ　ｄｅｎ　Ｂｅｒｇら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　８：１３５（１９９０）；Ｋｕｎｚｅら、Ｊ．Ｂａｓｉｃ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２５：１４１（１９８５）；Ｃｒｅｇｇら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：３３７６（１９８５）；米国特許第４，８３７，１４８号および同第４，９２９，５５５号；ＢｅａｃｈおよびＮｕｒｓｅ、Ｎａｔｕｒｅ　３００：７０６（１９８１）；Ｄａｖｉｄｏｗら、Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．１ｐ：３８０（１９８５）；Ｇａｉｌｌａｒｄｉｎら、Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．１０：４９（１９８５）；Ｂａｌｌａｎｃｅら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１１２：２８４−２８９（１９８３）；Ｔｉｌｂｕｒｎら、Ｇｅｎｅ　２６：２０５−２２（１９８３）；Ｙｅｌｔｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８１：１４７０−１４７４（１９８４）；ＫｅｌｌｙおよびＨｙｎｅｓ、ＥＭＢＯ　Ｊ．４：４７５−４７９（１９８５）：ＥＰ　０　２４４，２３４；およびＷＯ９１／００３５７。
【００６５】
昆虫における異種遺伝子の発現は、以下に記載のように達成され得る：米国特許第４，７４５，０５１号；Ｆｒｉｅｓｅｎら、「Ｔｈｅ　Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ　Ｇｅｎｅ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ」　Ｔｈｅ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　Ｏｆ　Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓｅｓ（Ｄｏｅｒｆｌｅｒ，Ｗ編　１９８６）；ＥＰ　１２７，８３９；ＥＰ　１５５，４７６；Ｖｌａｋら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．６９：７６５−７７６（１９８８）；Ｍｉｌｌｅｒら、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４２：１７７（１９８８）；Ｃａｒｂｏｎｅｌｌら、Ｇｅｎｅ　７３：４０９（１９８８）；Ｍａｅｄａら、Ｎａｔｕｒｅ　３１５：５９２−５９４（１９８５）；Ｌｅｂａｃｑ−Ｖｅｒｈｅｙｄｅｎら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ．８：３１２９（１９８８）：Ｓｍｉｔｈら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８２：８４０４（１９８５）；Ｍｉｙａｊｉｍａら、Ｇｅｎｅ　５８：２７３（１９８７）；およびＭａｒｔｉｎら、ＤＮＡ　７：９９（１９８８）。多数のバキュロウイルス株および改変株ならびに宿主からの対応する許容性昆虫宿主細胞が、Ｌｕｃｋｏｗら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ６：４７−５５（１９８８）、Ｍｉｌｌｅｒら、Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（Ｓｅｔｌｏｗ，Ｊ．Ｋ．ら編）第８巻：（Ｐｌｅｎｕｍ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，１９８６）２７７−２７９頁、およびＭａｅｄａら、Ｎａｔｕｒｅ　３１５：５９２−５９４（１９８５）に記載される。
【００６６】
哺乳動物発現は、Ｄｉｊｋｅｍａら、ＥＭＢＯ　Ｊ．４：７６１（１９８５）、Ｇｏｒｍａｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　７９：６７７７（１９８２ｂ）、Ｂｏｓｈａｒｔら、Ｃｅｌｌ　４１：５２１（１９８５）および米国特許第４，３９９，２１６号に記載のように達成され得る。哺乳動物発現の他の特徴は、以下に記載のように容易にされ得る：ＨａｍおよびＷａｌｌａｃｅ、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．５８：４４（１９７９）、ＢａｒｎｅｓおよびＳａｔｏ，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０２：２５５（１９８０）、米国特許第４，７６７，７０４号，同第４，６５７，８６６号、同第４，９２７，７６２号、同第４，５６０，６５５号、ＷＯ９０／１０３４３０、ＷＯ８７／００１９５、およびＵ．Ｓ．ＲＥ　３０，９８５。
【００６７】
発現構築物は、当該分野で公知の任意の技術を使用して宿主細胞に導入され得る。これらの技術としては、トランスフェリン−ポリカチオン媒介ＤＮＡ移入、裸の、またはカプセル化された核酸を用いるトランスフェクション、リポソーム媒介細胞融合、ＤＮＡコートラテックスビーズの細胞内輸送、プロトプラスト融合、ウイルス感染、エレクトロポレーション、「遺伝子銃」、リン酸カルシウム媒介トランスフェクションが挙げられる。
【００６８】
ＴＳＰＡＮ−７をコードする内在性遺伝子の発現はまた、転写単位を含む相同組換え細胞を形成するために、内在性遺伝子とインフレームで転写単位を含むＤＮＡ構築物を相同組換えによって導入することによって操作し得る。転写単位は、標的化配列、調節配列、エクソン、および不対スプライスドナー部位を含む。新しい転写単位は、所望のように内在性遺伝子のオンまたはオフのために使用され得る。内在性遺伝子発現に影響を与えるこの方法は、米国特許５，６４１，６７０号に教示される。
【００６９】
標的化配列は配列番号１に示されるヌクレオチド配列に由来する、少なくとも１０、１２、１５、２０，または５０連続したヌクレオチドのセグメントである。転写単位は内在性遺伝子のコード配列に対して上流に配置される。外因性調節配列は、内在性遺伝子のコード配列の転写に指向する。
【００７０】
（ＴＳＰＡＮ−７のインヒビターは、ＴＳＰＡＮ−７遺伝子発現を減少させるのに効果的である）
本発明は、ＴＳＰＡＮ−７のインヒビターを提供する。本発明のインヒビターとしては、アンチセンス分子およびリボザイム、タンパク質またはポリペプチド、抗体あるいはそれらのフラグメントならびに低分子が挙げられる。これらのＴＳＰＡＮ−７インヒビターの各々は、これらが、ＴＳＰＡＮ−７の発現および／または生物学的活性を減少させ、その結果、癌細胞の増殖を阻害するという共通の特徴を共有する。本明細書中に開示される代表的なＴＳＰＡＮ−７インヒビターに加えて、代替のインヒビターは、本明細書中に具体的に開示される方法または当業者に容易に利用可能でかつ当業者の専門知識内にある別の方法を利用して慣用的な実験を介して得られ得る。
【００７１】
（アンチセンス分子およびリボザイム）
上記で議論されるように、本発明のＴＳＰＡＮ−７インヒビターは、哺乳動物細胞に投与される場合に、例えば、ＴＳＰＡＮ−７　ｍＲＮＡレベルの減少に有効なアンチセンス分子を含む。アンチセンス分子は、配列特異的な様式で、核酸（例えば、ｍＲＮＡまたはＤＮＡ）に結合する。相補的な配列を有するｍＲＮＡに結合する場合、アンチセンス分子は、ｍＲＮＡの翻訳を防止する（Ａｌｔｍａｎらに対する米国特許第５，１６８，０５３号；Ｉｎｏｕｙｅに対する米国特許第５，１９０，９３１号、Ｂｕｒｃｈに対する米国特許第５，１３５，９１７号；Ｓｍｉｔｈに対する米国特許第５，０８７，６１７号、およびＣｌｕｓｅｌら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．２１：３４０５−３４１１（１９９３）これらは、ダンベルアンチセンスオリゴヌクレオチドを記載する）。
【００７２】
アンチセンス技術を使用して、ポリメラーゼ、転写因子または転写調節分子の結合のために十分に開く二重らせんの能力を促進する三重らせん形成を介して、遺伝子発現を制御し得る。Ｇｅｅら、Ｉｎ　Ｈｕｂｅｒ　ａｎｄ　Ｃａｒｒ、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ａｎｄ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃ　Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ」、Ｆｕｔｕｒａ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ｃｏ．（Ｍｔ．Ｋｉｓｃｏ、ＮＹ；１９９４）。あるいは、アンチセンス分子は、ＴＳＰＡＮ−７遺伝子の制御領域（例えば、プロモーター、エンハンサーまたは転写開始部位）とハイブリダイズし、そして遺伝子の転写をブロックする；または転写物のリボソームへの結合を阻害することによって翻訳をブロックするように設計され得る。一般には、Ｈｉｒａｓｈｉｍａら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　ｏｆ　ＲＮＡ：Ｎｅｗ　Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ（Ｍ．ＩｎｏｕｙｅおよびＢ．Ｓ．Ｄｕｄｏｃｋ、編、１９８７　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ、４０１頁）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｅｏｔｉｄｅｓ：Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ　Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ　ｏｆ　Ｇｅｎｅ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ（Ｊ．Ｓ．Ｃｏｈｅｎ、編、１９８９　ＭａｃＭｉｌｌａｎ　Ｐｒｅｓｓ、Ｌｏｎｄｏｎ）；ＳｔｅｉｎおよびＣｈｅｎｇ、Ｓｃｉｅｎｃｅ　２６１：１００４−１０１２（１９９３）；ＷＯ　９５／１０６０７；米国特許第５，３５９，０５１号；ＷＯ　９２／０６６９３；ならびにＥＰ−Ａ２−６１２８４４を参照のこと。これらの各々は、本明細書中で参考として援用される。
【００７３】
簡潔には、このような分子は、転写されたＴＳＰＡＮ−７　ｍＲＮＡ配列の領域に相補的であり、かつこの領域とＷａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ塩基対を形成し得るように構築される。得られた二本鎖核酸は、その後のｍＲＮＡのプロセシングを妨害し、それによってタンパク質合成を防止する。本発明に従うアンチセンス分子は、配列番号１またはその相補体にハイブリダイズし得る連続するヌクレオチドの領域で構成される。好ましいアンチセンス分子は、配列番号１の１０、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５もしくは２６連続するヌクレオチド、またはこれらの相補体からなる。
【００７４】
一般に、ＴＳＰＡＮ−７コード領域に相補的な配列の一部は、遺伝子発現を調節するために使用され得る。ヒトＴＳＰＡＮ−７　ｃＤＮＡの核酸配列は、本明細書中で配列番号１に示される。あるいは、アンチセンスＲＮＡに転写され得るｃＤＮＡ構築物は、細胞または組織に導入されてアンチセンスＲＮＡの生成を容易にし得る。従って、本明細書中で使用される場合、句「アンチセンス分子」は、ＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子として合成されるか否かに関わらずアンチセンスオリゴヌクレオチドを、ならびに哺乳動物細胞に導入された場合にアンチセンスＲＮＡ分子の生成を容易にする全てのプラスミド構築物を広く包含する。アンチセンス分子を使用して、本明細書中に記載のように、ＴＳＰＡＮ−７遺伝子の発現およびその発現のためにＴＳＰＡＮ−７を必要とする任意の他の遺伝子の発現を阻害し得る。
【００７５】
当該分野でアンチセンス技術に広く適用可能であることが公知の、アンチセンス分子の任意の改変または改変体は、本発明の範囲内に含まれる。このような改変は、米国特許第５，５３６，８２１号；同第５，５４１，３０６号；同第５，５５０，１１１号；同第５，５６３，２５３号；同第５，５７１，７９９号；同第５，５８７，３６１号；同第５，６２５，０５０号および同第５，９５８，７７３号に開示されるようなリン含有結合の調製を含む。
【００７６】
本発明のアンチセンス化合物は、米国特許第５，９５８，７７３号およびそこで開示された特許に開示されるような、改変塩基を含み得る。本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドはまた、アンチセンスオリゴヌクレオチドの活性、細胞分布または細胞取り込みを増強するために、１以上の部分または結合体とこのオリゴヌクレオチドとを化学的に結合させることによって、改変され得る。このような部分または結合体としては、脂質（例えば、コレステロール）、コール酸、チオエーテル、脂肪族鎖、リン脂質、ポリアミン、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、パルミチル部分、ならびに例えば、米国特許第５，５１４，７５８号、同第５，５６５，５５２号、同第５，５６７，８１０号、同第５，５７４，１４２号、同第５，５８５，４８１号、同第５，５８７，３７１号、同第５，５９７，６９６号および同第５，９５８，７７３号に開示されるような他のものが挙げられる。
【００７７】
キメラアンチセンスオリゴヌクレオチドもまた、本発明の範囲内であり、そして例えば、米国特許第５，０１３，８３０号、同第５，１４９，７９７号、同第５，４０３，７１１号、同第５，４９１，１３３号、同第５，５６５，３５０号、同第５，６５２，３５５号、同第５，７００，９２２号および同第５，９５８，７７３号に記載される方法を使用して、本発明のオリゴヌクレオチドから調製され得る。
【００７８】
アンチセンス分野において、ある程度の慣用的実験が、特定の標的のために最適なアンチセンス分子を選択するために必要とされる。有効にするために、このアンチセンス分子は、好ましくは、接近可能な、または露出された標的ＲＮＡ分子の部分に標的化される。いくつかの場合において、標的ｍＲＮＡ分子の構造に関する情報が利用可能であるが、アンチセンスを使用する阻害のための現行のアプローチは、実験を介してである。本発明に従って、この実験は、実施例１に記載の方法を使用して、アンチセンスオリゴヌクレオチドで細胞をトランスフェクトすることによって慣用的に実施され得る。細胞中のｍＲＮＡレベルは、ｍＲＮＡの逆転写およびｃＤＮＡレベルをアッセイすることによって、処理された細胞およびコントロール細胞において、慣用的に測定され得る。生物学的効果は、当該分野で公知のように細胞の増殖または生存率を測定することによって、慣用的に決定され得る。
【００７９】
ｃＤＮＡレベルをアッセイおよび分析することによってアンチセンス活性の特異性を測定することは、アンチセンス結果を確認する、当該分野で認識された方法である。処理された細胞およびコントロール細胞由来のＲＮＡが逆転写され、そして得られたｃＤＮＡ集団が分析されるべきであることが、示唆される。（Ｂｒａｎｃｈ，Ａ．Ｄ．、Ｔ．Ｉ．Ｂ．Ｓ．２３：４５−５０、１９９８）。本発明に従って、ＳＷ６２０細胞の培養物を、ＴＳＰＡＮ−７を標的とするように設計された５つの異なるアンチセンスオリゴヌクレオチドでトランスフェクトした。これらのオリゴヌクレオチドは、配列番号３〜７に示される。ＴＳＰＡＮ−７に対応するｍＲＮＡのレベルを、処理された細胞およびコントロール細胞において測定した。配列番号３、４、５および７は、アクチンｍＲＮＡのレベルに対して正規化された場合、ＴＳＰＡＮ−７　ｍＲＮＡにおける劇的な減少を引き起こした。
【００８０】
本明細書中に記載されるような使用のためのアンチセンス分子は、当業者に公知の任意の方法（例えば、固相ホスホラミデート化学合成による化学合成を含む）によって合成され得る。例えば、その各々が、本明細書中で参考として援用される、ＷＯ　９３／０１２８６；米国特許第６，０４３，０９０号；米国特許第５，２１８，０８８号；米国特許第５，１７５，２６９号；および米国特許第５，１０９，１２４号を参照のこと。あるいは、ＲＮＡ分子は、ＴＳＰＡＮ−７　ｃＤＮＡまたはその一部をコードするＤＮＡ配列のインビトロまたはインビボの転写によって生成され得る。ただし、このＤＮＡは、適切なＲＮＡポリメラーゼプロモーター（例えば、Ｔ３、Ｔ７またはＳＰ６）の下流のベクターに組み込まれる。大量のアンチセンスＲＮＡは、適切なＲＮＡポリメラーゼの存在下で、このようなプロモーターの下流の線状ＴＳＰＡＮ−７　ｃＤＮＡフラグメントと共に、標識されたヌクレオチドをインキュベートすることによって、生成され得る。特定の実施形態において、本発明のアンチセンス分子は、配列番号１のＴＳＰＡＮ−７　ｃＤＮＡ配列に独自である配列、あるいは高いストリンジェンシーの条件下で配列番号１のｃＤＮＡにハイブリダイズし得る配列を含む。本発明に関して、高いストリンジェンシーは、標準的なハイブリダイゼーション条件（例えば、６５℃で５×ＳＳＰＥ、０．５％　ＳＤＳ）またはその等価物を意味する。Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出およびＭｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ　ａｎｄ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ　ｏｆ　Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ＤＮＡ、前出（本明細書中で参考として援用される）を参照のこと。
【００８１】
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、代表的に、以下のような結合を使用することによって、内因性核酸分解（ｎｕｃｌｅｏｌｙｔｉｃ）酵素による分解に抵抗であるように設計される：ホスホロチオエート、メチルホスホネート、スルホン、硫酸エステル、ケチル、ホスホロジチオエート、ホスホラミデート、リン酸エステル、および他のこのような結合（例えば、Ａｇｒｗａｌら、Ｔｅｔｒｅｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔ．２８：３５３９−３５４２（１９８７）；Ｍｉｌｌｅｒら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．９３：６６５７−６６６５（１９７１）；Ｓｔｅｃら、Ｔｅｔｒｅｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔ．２６：２１９１−２１９４（１９８５）；Ｍｏｏｄｙら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．１２：４７６９−４７８２（１９８９）；Ｕｚｎａｎｓｋｉら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．１７（１２）：４８６３−４８７１（１９８９）；Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　４０：１３７−１４３（１９８４）；Ｅｃｋｓｔｅｉｎ、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５４：３６７−４０２（１９８５）；Ｅｃｋｓｔｅｉｎ、Ｔｒｅｎｄｓ　Ｂｉｏｌ．Ｓｃｉ．１４：９７−１００（１９８９）；Ｓｔｅｉｎ、Ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ．Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ　Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ　ｏｆ　Ｇｅｎｅ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ、Ｃｏｈｅｎ編、Ｍａｃｍｉｌｌａｎ　Ｐｒｅｓｓ、Ｌｏｎｄｏｎ、９７−１１７頁（１９８９）；Ｊａｇｅｒら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　２７：７２３７−７２４６（１９８８）を参照のこと）。可能なさらなる改変または代替の改変としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：５’末端および／もしくは３’末端での隣接配列の付加、ならびに／または伝統的でない塩基（例えば、イノシン、キューオシンおよびワイブトシン（ｗｙｂｕｔｏｓｉｎｅ）、ならびにアデニン、シチジン、グアニン、チミジンおよびウリジンのアセチル、メチル、チオおよび他の改変形態）を含めること。
【００８２】
本発明の例示的なアンチセンス分子としては、以下が挙げられる：配列番号１のヌクレオチド
【００８３】
【表３】
2004504021.tif 000005
2004504021.tif 000006
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あるいはその相補体を有する２０マーのポリヌクレオチド、および配列番号１のヌクレオチド：
【００８４】
【表４】
2004504021.tif 000012
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2004504021.tif 000014
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あるいはその相補体を有する２５マーのポリヌクレオチド。
【００８５】
本発明の代替の実施形態において、ＴＳＰＡＮ−７インヒビターは、リボザイムであり得る。リボザイムは、ＲＮＡ基質（例えば、ｍＲＮＡ）を特異的に切断し、細胞の遺伝子発現の特異的な阻害または妨害を生じるＲＮＡ分子である。本明細書中で使用される場合、用語「リボザイム」は、特異的認識のためのアンチセンス配列およびＲＮＡ切断酵素活性を含むＲＮＡ分子を含む。触媒鎖は、化学量論的な濃度よりもより高い濃度で標的ＲＮＡの特定の部位を切断する。
【００８６】
広範な種々のリボザイムが、本発明において使用され得、例えば、以下が挙げられる：ハンマーヘッドリボザイム（例えば、ＦｏｒｓｔｅｒおよびＳｙｍｏｎｓ、Ｃｅｌｌ　４８：２１１−２２０（１９８７）；ＨａｓｅｌｏｆｆおよびＧｅｒｌａｃｈ、Ｎａｔｕｒｅ　３２８：５９６−６００（１９８８）；ＷａｌｂｏｔおよびＢｒｕｅｎｉｎｇ、Ｎａｔｕｒｅ　３３４：１９６（１９８８）；ＨａｓｅｌｏｆｆおよびＧｅｒｌａｃｈ、Ｎａｔｕｒｅ　３３４：５８５（１９８８）によって記載される）；ヘアピンリボザイム（例えば、１９９３年１０月１９日に発行されたＨａｓｅｌｏｆｆら、米国特許第５，２５４，６７８号、および１９９０年３月２６日に公開されたＨｅｍｐｅｌら、欧州特許公開番号０　３６０　２５７に記載される）；ならびにＴｅｔｒａｈｙｍｅｎａリボソームＲＮＡベースのリボザイム（Ｃｅｃｈら、米国特許第４，９８７，０７１号を参照のこと）。本発明のリボザイムは、代表的に、ＲＮＡからなるが、ＤＮＡ、核酸アナログ（例えば、ホスホロチオエート）、またはこれらのキメラ（例えば、ＤＮＡ／ＲＮＡ／ＲＮＡ）からも構成され得る。
【００８７】
リボザイムは、任意のＲＮＡ転写物に標的化され得、そしてこのような転写物を触媒的に切断し得る（例えば、米国特許第５，２７２，２６２号；米国特許第５，１４４，０１９号；ならびにＣｅｃｈらに対する米国特許第５，１６８，０５３号、同第５，１８０，８１８号、同第５，１１６，７４２号および同第５，０９３，２４６号を参照のこと）。本発明の特定の実施形態に従って、任意のこのようなＴＳＰＡＮ−７　ｍＲＮＡ特異的リボザイムまたはこのようなリボザイムをコードする核酸は、ＴＳＰＡＮ−７遺伝子発現の阻害をもたらすために、宿主細胞に送達され得る。従って、リボザイムなどは、真核生物プロモーター（例えば、真核生物ウイルスプロモーター）に連結されたリボザイムをコードするＤＮＡによって宿主細胞に送達され得、その結果、核への導入に際して、このリボザイムは直接転写される。
【００８８】
（タンパク質およびポリペプチド）
本明細書中に開示されるアンチセンス分子およびリボザイムに加えて、本発明のＴＳＰＡＮ−７インヒビターはまた、ＴＳＰＡＮ−７遺伝子発現を減少させるかまたは１以上のＴＳＰＡＮ−７の生物学的活性を減少させるかのいずれかにおいて有効な、タンパク質またはポリペプチドを含む。当業者が慣用的な実験を介してこのようなＴＳＰＡＮ−７インヒビターを迅速に同定し得る種々の方法が、当該分野で容易に利用可能である。本発明は、以下の例示的な方法論によって限定されない。
【００８９】
ＴＳＰＡＮ−７は、他の細胞表面タンパク質と相互作用することによって、生物学的効果を発揮すると考えられる。ＴＳＰＡＮ−７の生物学的活性のインヒビターは、ＴＳＰＡＮ−７の活性を妨害するタンパク質および／またはポリペプチドを含む。このような妨害は、ＴＳＰＡＮ−７との直接の相互作用を介してか、あるいは非競合的阻害または不競合的阻害（例えば、アロステリックな部位に対する結合を介した）によって、間接的に生じ得る。従って、ＴＳＰＡＮ−７に結合するタンパク質および／またはポリペプチドを同定するために利用可能な方法が使用されて、本明細書中に開示される方法論を介してそのＴＳＰＡＮ−７阻害活性について特徴付けられ得る、リード（ｌｅａｄ）化合物を同定し得る。
【００９０】
タンパク質−タンパク質相互作用を検出および分析するための方法を記載した多くの文献が、当業者に利用可能である。本明細書で参考として援用される、Ｐｈｉｚｉｃｋｙ，Ｅ．Ｍ．ら、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｒｅｖｉｅｗｓ　５９：９４−１２３（１９９５）に総説される。このような方法として、物理的方法（例えば、タンパク質アフィニティークロマトグラフィー、アフィニティーブロッティング、免疫沈降、および架橋）、およびライブラリーに基づく方法（例えば、タンパク質プロービング、ファージディスプレイ、およびツーハイブリッドスクリーニング）が挙げられるがこれらに限定されない。タンパク質−タンパク質相互作用を同定するために用いられ得る他の方法として、遺伝学的方法（例えば、遺伝子外サプレッサー、合成致死効果、および非連結非相補性（ｕｎｌｉｎｋｅｄ　ｎｏｎｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ）の使用）が挙げられる。例示的な方法が、以下にさらに詳細に記載されている。
【００９１】
本発明のＴＳＰＡＮ−７インヒビターは、ＴＳＰＡＮ−７タンパク質と潜在的なインヒビタータンパク質のパネルまたはライブラリーとの間の直接的な相互作用に基づく生物学的スクリーニングアッセイを通して同定され得る。生物学的スクリーニング方法論（種々の「ｎ−ハイブリッド技術」を含む）は、例えば、Ｖｉｄａｌ，Ｍ．ら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．２７（４）：９１９−９２９（１９９９）；Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋｓｏｎ，Ｒ．Ｍ．、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．９（１）：９０−６（１９９８）；Ｂｒａｃｈｍａｎｎ，Ｒ．Ｋ．ら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．８（５）：５６１−５６８（１９９７）；およびＷｈｉｔｅ，Ｍ．Ａ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９３：１０００１−１０００３（１９９６）に記載されている（これらの各々は、本明細書で参考として援用されている）。
【００９２】
ツーハイブリッドスクリーニング方法論は、阻害特性を有するＴＳＰＡＮ−７結合タンパク質についての新規のまたは既存の標的ｃＤＮＡライブラリーを検索するために使用され得る。ツーハイブリッド系は、タンパク質−タンパク質相互作用をレポーター遺伝子の転写における増加により検出する遺伝学的な方法である。この系は、部位特異的な転写アクチベーターがＤＮＡ結合ドメインおよび転写活性化ドメインを有するという事実に基づく。ＤＮＡ結合ドメインは、発現される特定の遺伝子に活性化ドメインを標的化する。転写アクチベーターの調節的性質により、ＤＮＡ結合ドメインは、いずれのドメインの活性の損失も伴わずに転写活性化ドメインから共有結合的に切断され得る。さらに、これらの２つのドメインは、転写機構に関連しない２つのタンパク質間のタンパク質−タンパク質接触により近位に運ばれ得る。従って、２つのハイブリッドが構築され、機能的な系が作製される。第１のハイブリッド（すなわち、ベイト）は、目的のタンパク質に融合された転写アクチベーターＤＮＡ結合ドメインからなる。第２のハイブリッド（標的）は、転写活性化ドメインとタンパク質またはポリペプチドのライブラリーとの融合により作製される。ベイトタンパク質と標的ライブラリーのメンバーとの間の相互作用により、ＤＮＡ結合ドメインと転写活性化ドメインとが近接し、そしてその後、レポーター遺伝子の発現がアップレギュレートされる。
【００９３】
種々のツーハイブリッドに基づく系が、当業者に利用可能であり、最も一般的に、酵母Ｇａｌ４またはＥ．ｃｏｌｉ　ＬｅｘＡのいずれかのＤＮＡ結合ドメイン（ＢＤ）および酵母Ｇａｌ４または単純疱疹ウイルスＶＰ１６のいずれかの転写活性化ドメインが使用される。Ｃｈｉｅｎ，Ｃ．−Ｔ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８８：９５７８−９５８２（１９９１）；Ｄａｌｔｏｎ，Ｓ．ら、Ｃｅｌｌ　６８：５９７−６１２（１９９２）；Ｄｕｒｆｅｅ，Ｔ．Ｋ．ら、Ｇｅｎｅｓ　Ｄｅｖ．７：５５５−５６９（１９９３）；Ｖｏｊｔｅｋ，Ａ．Ｂ．ら、Ｃｅｌｌ　７４：２０５−２１４（１９９３）；およびＺｅｒｖｏｓ，Ａ．Ｓ．ら、Ｃｅｌｌ　７２：２２３−２３２（１９９３）。一般的に用いられるレポーター遺伝子としては、Ｅ．ｃｏｌｉ　ｌａｃＺ遺伝子および選択可能な酵母遺伝子（例えば、ＨＩＳ３およびＬＥＵ２）が挙げられる。Ｆｉｅｌｄｓ，Ｓ．ら、Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ）３４０：２４５−２４６（１９８９）；Ｄｕｒｆｅｅ，Ｔ．Ｋ．ら、前出、およびＺｅｒｖｏｓ，Ａ．Ｓ．、前出。広範な種々の活性化ドメインのライブラリーは、当該分野で容易に入手可能であり、それによって慣用的な実験を通して、相互作用するタンパク質についてのスクリーニングが実施され得る。
【００９４】
ＴＳＰＡＮ−７相互作用タンパク質の同定のために適切なベイトタンパク質は、ＴＳＰＡＮ−７　ｃＤＮＡ配列（配列番号１）に基づき設計され得る。このようなベイトタンパク質は、全長ＴＳＰＡＮ−７タンパク質またはそのフラグメントのいずれかを含む。特定の領域は、配列番号１３および配列番号１４をコードするものを含む。
【００９５】
ＴＳＰＡＮ−７ベイト構築物および標的ライブラリーを調製するためのプラスミドベクター（例えば、ｐＢＴＭ１１６およびｐＡＳ２−１）は、当業者に容易に利用可能であり、そして例えば、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（Ｐａｌｏ　Ａｌｔｏ、ＣＡ）、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）、およびＳｔｒａｔａｇｅｎｅ（Ｌａ　Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）のような販売元から入手され得る。これらのプラスミドベクターは、それぞれ、ｃＤＮＡとＤＮＡ結合ドメイン（ＬｅｘＡまたはＧａｌ４ＤＢ）とのインフレーム融合を可能にする。
【００９６】
本発明のＴＳＰＡＮ−７インヒビターは、代替的に、タンパク質−タンパク質相互作用を検出するための当該分野で利用可能な物理的方法または生物学的方法の１つによって同定され得る。
【００９７】
タンパク質アフィニティークロマトグラフィー方法論によって、潜在的なＴＳＰＡＮ−７インヒビターとして試験されるリード化合物は、固体マトリックス（例えば、セファロースビーズ）に共有結合または非共有結合的にかのいずれかで結合されている場合、ＴＳＰＡＮ−７に対するそれらの特異的保持により同定され得る。タンパク質アフィニティーカラムの調製は、例えば、Ｂｅｅｃｋｍａｎｓ，Ｓら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１７：５２７−５３５（１９８１）およびＦｏｒｍｏｓａ，Ｔ．ら、Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ．２０８：２４−４５（１９９１）に記載されている。細胞タンパク質の総員を含む細胞溶解物またはＴＳＰＡＮ−７と相互作用し得る細胞膜タンパク質が豊富な画分が、ＴＳＰＡＮ−７アフィニティーカラムを通され得る。ＴＳＰＡＮ−７に対する高い親和性を有するタンパク質は、低塩条件下で特異的に保持されるが、細胞タンパク質の大部分は、このカラムを通過する。このような高い親和性のタンパク質は、高塩条件下で固定されたＴＳＰＡＮ−７から、カオトロピック溶媒またはドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）により溶出され得る。いくつかの実施形態において、ＴＳＰＡＮ−７特異的結合タンパク質を同定する上での補助として、溶解物の調製前に細胞を放射標識することが好ましくあり得る。哺乳動物細胞を放射標識する方法は当該分野で周知であり、例えば、Ｓｏｐｔａ，Ｍ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：１０３５３−１０３６０（１９８５）において提供される。
【００９８】
アフィニティークロマトグラフィーに適切なＴＳＰＡＮ−７タンパク質は、タンパク質またはポリペプチドと融合されて、適切なアフィニティー樹脂上での迅速な精製を可能にし得る。例えば、ＴＳＰＡＮ−７　ｃＤＮＡは、グルタチオン−アガロースカラムへの融合タンパク質の吸着を促進するグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）のコード領域と融合され得る。Ｓｍｉｔｈら、Ｇｅｎｅ　６７：３１−４０（１９８８）。あるいは、融合タンパク質としては、プロテインＡ（免疫グロブリンＧを保有するカラム上で精製され得る）；オリゴヒスチジン含有ペプチド（Ｎｉ２＋を保有するカラム上で精製され得る）；マルトース結合タンパク質（アミロースを含む樹脂上で精製され得る）；およびジヒドロ葉酸レダクターゼ（メトトレキセートカラム上で精製され得る）が挙げられ得る。ＴＳＰＡＮ−７融合タンパク質の調製に適した１つの例示的なタグは、インフルエンザウイルスヘマグルチニン（ＨＡ）のエピトープであり、このエピトープに対するモノクローナル抗体は容易に利用可能であり、このエピトープの抗体からアフィニティーカラムが調製され得る。
【００９９】
ＴＳＰＡＮ−７アフィニティーカラム上に特異的に保持されるタンパク質は、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）に供された後に同定され得る。従って、細胞が細胞溶解物の調製およびＴＳＰＡＮ−７アフィニティーカラムの通過の前に放射標識される場合、ＴＳＰＡＮ−７に対する高い親和性を有するタンパク質は、オートラジオグラフィーにより検出され得る。ＴＳＰＡＮ−７特異的結合タンパク質の同一性は、当業者に容易に利用可能なタンパク質配列決定技術（例えば、Ｍａｔｔｈｅｗｓ，Ｃ．Ｋ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、Ｔｈｅ　Ｂｅｎｊａｍｉｎ／Ｃｕｍｍｉｎｇｓ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｉｎｃ．１６６−１７０頁（１９９０））により決定され得る。
【０１００】
（アンタゴニストの生成）
本発明の方法および組成物は、ＴＳＰＡＮ−７アンタゴニストを使用または取り込む。従って、このようなアンタゴニストを生成するための方法が、本明細書中に記載される。アンタゴニストの生成またはスクリーニングのために使用されるＴＳＰＡＮ−７は、例えば、所望のエピトープ（例えば、配列番号１３または配列番号１４）を含む、タンパク質またはその一部の可溶形態であり得る。あるいは、またはさらに、細胞表面上にＴＳＰＡＮ−７を発現する細胞は、アンタゴニストを生成またはスクリーニングするために使用され得る。
【０１０１】
好ましいアンタゴニストはまた、以下に議論するように、抗体およびアンチセンス分子を含むが、抗体およびアンチセンス分子以外のアンタゴニストが、本明細書中で意図される。例えば、このアンタゴニストは、必要に応じて細胞傷害性薬剤と融合または結合体化した低分子アンタゴニストを含み得る。低分子のライブラリーは、その抗原に結合する低分子を同定するために、ＴＳＰＡＮ−７またはＴＳＰＡＮ−７発現細胞に対してスクリーニングされ得る。この低分子は、さらに、拮抗的特性についてスクリーニングされ得、そして／または細胞傷害性薬剤と結合体化され得る。
【０１０２】
アンタゴニストはまた、合理的な設計またはファージディスプレイによって生成されるペプチドであり得る（例えば、１９９８年８月１３日に公開されたＷＯ９８／３５０３６を参照のこと）。１つの実施形態において、選択される分子は、抗体のＣＤＲに基づいて設計された「ＣＤＲ模倣物」または抗体アナログであり得る。このようなペプチドは、それ自体拮抗的であり得るが、このペプチドは、必要に応じて、ペプチドの拮抗的特性を付加または増強するように、細胞傷害性薬剤に融合され得る。細胞表面タンパク質に対してアンタゴニストとして作用し得るペプチドを同定する方法は、例えば、米国特許第６，１１０，７４７号；同第６，２０３，７８８号；および同第６，２４８，８６４号に開示された方法に基づく。ＴＳＰＡＮ−７の好ましいペプチドアンタゴニストとしては、ペプチド、ペプチド模倣物および環状ペプチドが挙げられる。さらに、このアンタゴニストは、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはリボザイムであり得る。本発明に従って使用される抗体アンタゴニストの生成のための例示的な技術に関する説明が以下に続く。
【０１０３】
本発明のＴＳＰＡＮ−７インヒビターとしては、例えば、他の細胞膜タンパク質とのＴＳＰＡＮ−７の相互作用を妨害することによって、ＴＳＰＡＮ−７の遺伝子発現および／または生物学的活性を減少させるに有効な抗体および／または抗体フラグメントが挙げられる。適切な抗体は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、またはヒト化モノクローナル抗体であり得る。抗体は、従来のハイブリドーマに基づく方法論によるか、ＴＳＰＡＮ−７接種した動物から単離された抗血清から獲得され得るか、または組換えＤＮＡ技術によって誘導され得る。あるいは、本発明の抗体または抗体フラグメントは、１つ以上の容易に利用可能なファージディスプレイライブラリーの使用により、インビトロで同定され得る。例示的な方法は、本明細書に開示されている。
【０１０４】
本明細書中でいうＴＳＰＡＮ−７のフラグメントは、例えば、配列番号２の少なくとも８、９、１０、１２、１５または２０連続アミノ酸を有するポリペプチドである。例示的なポリペプチドとしては、２７０アミノ酸のＴＳＰＡＮ−７の、以下の９マーのポリペプチドが挙げられる：配列番号２のアミノ酸
【０１０５】
【表５】
2004504021.tif 000018
2004504021.tif 000019
。
【０１０６】
２７０アミノ酸のＴＳＰＡＮ−７の１２マーポリペプチドとしては、配列番号２のアミノ酸
【０１０７】
【表６】
2004504021.tif 000020
2004504021.tif 000021
が挙げられる。
【０１０８】
２７０アミノ酸のＴＳＰＡＮ−７の１５マーポリペプチドとしては、配列番号２のアミノ酸
【０１０９】
【表７】
2004504021.tif 000022
2004504021.tif 000023
が挙げられる。
【０１１０】
２７０アミノ酸のＴＳＰＡＮ−７の２０マーポリペプチドとしては、配列番号２のアミノ酸
【０１１１】
【表８】
2004504021.tif 000024
2004504021.tif 000025
が挙げられる。
【０１１２】
（ポリクローナル抗体）
ポリクローナル抗体は、好ましくは、関連する抗原およびアジュバントの複数回の皮下注射（ｓｃ）、腹腔内注射（ｉｐ）、または筋内注射（ｉｍ）によって動物内で惹起される。関連抗原を、二官能性薬剤または誘導剤（例えば、マレイミドベンゾイルスルホスクシンイミドエステル（ｍａｌｃｉｍｉｄｏｂｅｎｚｏｙｌ　ｓｕｌｆｏｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ　ｅｓｔｅｒ）（システイン残基を通して結合体化している），Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（リジン残基を通して結合体化している）、グルタルアルデヒド、無水コハク酸、ＳＯＣ１２、またはＲ１Ｎ−−Ｃ−−ＮＲ（ここで、ＲおよびＲ１は異なるアルキル基である））を用いて、免疫される種において免疫原性であるタンパク質（例えば、キーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシチログロブリン、またはダイズトリプシンインヒビター）に結合体化させることが有用であり得る。例えば、１００ｐｇまたは５ｗｇのタンパク質または結合体（それぞれ、ウサギまたはマウスに対して）と３容量のフロイントの完全アジュバントを合わせ、そしてこの溶液を複数の部位に皮内注射することによって、動物は、抗原、免疫原性結合体、または誘導体に対して免疫される。１ヶ月後、動物を、複数部位での皮内注射によって、フロイントの完全アジュバント中の、元の量の１／５〜１／１０のペプチドまたは結合体を用いて追加免疫する。７〜１４日後、動物を採血し、そして血清を抗体力価についてアッセイする。動物を、力価がプラトーになるまで追加免疫する。好ましくは、動物は、同じ抗原の結合体で追加免疫されるが、異なるタンパク質に対して結合体化されるか、および／または異なる架橋試薬を介して結合体化される。結合体はまた、タンパク質融合物として組換え細胞培養物中で作製され得る。また、ミョウバンのような凝集剤が、免疫応答を増強するために適切に使用される。
【０１１３】
（モノクローナル抗体）
モノクローナル抗体は、実質的に均質な抗体の集団から得られ、すなわち、個々の抗体は、可能性のある天然に存在する変異（これは、少量で存在し得る）以外は同一である集団を含む。従って、修飾成句「モノクローナル」は、別々の抗体の混合物ではないという抗体の特徴を示す。例えば、モノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ、２５６：４９５（１９７５）によって最初に記載されたハイブリドーマ方法を用いて作製され得るか、または組換えＤＮＡ法（米国特許第４，８１６，５６７号）によって作製され得る。
【０１１４】
ハイブリドーマ方法において、マウスまたは他の適切な宿主動物（例えば、ウサギまたはハムスター）は、記載されるように免疫されて、免疫に使用されるタンパク質に特異的に結合する抗体を産生するかまたは産生し得るリンパ球を誘発する。あるいは、リンパ球のトレイが、インビトロで免疫される。次いで、リンパ球は、適切な融合剤（例えば、ポリエチレングリコール）を用いて骨髄腫細胞と融合されて、ハイブリドーマ細胞を形成する［Ｇｏｄｉｎｇ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ　ａｎｄ　Ｐｒａｃｔｉｃｅ，５９−１０３頁（Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ，１９８６）］。
【０１１５】
このようにして調製されたハイブリドーマ細胞は、融合していない親の骨髄腫細胞の増殖または生存を阻害する１つ以上の物質を好ましくは含む適切な培養培地に播種され、そして増殖される。例えば、親の骨髄腫細胞が酵素のヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴまたはＨＰＲＴ）を欠く場合、ハイブリドーマの培養培地は、代表的に、ヒポキサンチン、アミノプテリン、およびチミジンを含み（ＨＡＴ培地）、これらの物質は、ＨＧＰＲＴ欠損細胞の増殖を妨害する。
【０１１６】
好ましい骨髄腫細胞は、効果的に融合し、選択された抗体産生細胞による抗体の安定な高レベルの産生を支持し、そしてＨＡＴ培地のような培地に感受性のな骨髄腫細胞である。とりわけ好ましい骨髄腫細胞株は、マウス骨髄腫株、例えば、Ｓａｌｋ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　Ｃｅｌｌ　Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ　Ｃｅｎｔｅｒ，Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ　ＵＳＡから入手可能なＭＯＰＣ−２１およびＭＰＣ−１１マウス腫瘍（１１）、およびＡｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ，ＵＳＡから入手可能なＳＰ−２またはＸ６３−Ａｇ８−６５３細胞から誘導される骨髄腫細胞株である。ヒト骨髄腫細胞株およびマウスヒト異種骨髄腫（ｈｅｔｅｒｏｍｙｅｌｏｍａ）細胞株もまた、ヒトモノクローナル抗体の産生について記載されている［Ｋｏｚｂｏｒ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３３：３００１（１９８４）；Ｂｒｏｄｅｕｒら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｙ　Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　ａｎｄ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，５１−６３頁（Ｍａｒｃｅｌ　Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ，１９８７）］。
【０１１７】
ハイブリドーマ細胞が増殖した培養培地は、例えば、酵素結合イムノソルベント検定法（ＥＬＩＳＡ）またはラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）のようなインビトロ結合アッセイによって、必須の特異性を有するモノクローナル抗体の産生についてアッセイされる。抗体を発現する細胞の位置は、ＦＡＣＳによって検出され得る。その後、ハイブリドーマクローンは、限界希釈手順によってサブクローニングされ得、そして標準的な方法によって増殖され得る（Ｇｏｄｉｎｇ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ　ａｎｄ　Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ（１９８６）５９−１０３頁）。この目的のための適切な培養培地として、例えば、ＤＭＢＭ培地またはＲＰＭＩ−１６４０培地が挙げられる。さらに、ハイブリドーマ細胞は、動物中の腹水腫瘍としてインビボで増殖され得る。
【０１１８】
サブクローンによって分泌されるモノクローナル抗体は、従来の免疫グロブリン精製手順（例えば、プロテインＡ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、またはアフィニティークロマトグラフィーなど）によって、培養培地、腹水、または血清から適切に分離される。
【０１１９】
モノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、従来の手順（例えば、マウス（抗体）の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合し得るオリゴヌクレオチドプローブを用いることによって）を用いて容易に単離され、そして配列決定される。ハイブリドーマ細胞は、このようなＤＮＡの好ましい供給源としてはたらく。一旦単離されると、このＤＮＡは、発現ベクター中に配置され得、次いでこのベクターは、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、または骨髄腫細胞のような宿主細胞（これらは、トランスフェクトされなければ免疫グロブリンタンパク質を産生しない）にトランスフェクトされ、組換え宿主細胞中でのモノクローナル抗体の合成を得る。抗体をコードするＤＮＡの細菌中での組換え発現に関する総説の文献としては、Ｓｋｅｒｒａら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ、Ｉｍｍｕｎｏｌ．、５：２５６−２６２（１９９３）およびＰｈｉｃｋｔｈｕｎ、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖｓ．、１３０：１５１−１８８（１９９２）が挙げられる。
【０１２０】
さらなる実施形態において、抗体または抗体フラグメントは、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら，Ｎａｔｕｒｅ，３４８：５５２−５５４（１９９０）に記載される技術を用いて作製された抗体ファージライブラリーから単離され得る。Ｃｌａｃｋｓｏｎら，Ｎａｔｕｒｅ，３５２：６２４−６２８（１９９１）、およびＭａｒｋｓら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２２２：５８１−５９７（１９９１）は、それぞれ、ファージライブラリーを用いたマウス抗体およびヒト抗体の単離を記載する。その後の刊行物は、鎖シャッフリング（Ｍａｒｋｓら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１０：７７９−７８３（１９９２））、ならびに非常に大きなファージライブラリーを構築するための戦略としての、コンビナトリアル感染およびインビボ組換え（Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅら、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．、２１：２２６５−２２６６（１９９３））によって、高い親和性（ｎＭの範囲）のヒト抗体の産生を記載する。従って、これらの技術は、モノクローナル抗体の単離のための従来のモノクローナル抗体ハイブリドーマ技術に対して実現可能な代替技術である。
【０１２１】
ＤＮＡはまた、例えば、相同マウス（ｍａｒｉｎｅ）配列の代わりにヒト重鎖定常ドメインおよびヒト軽鎖定常ドメインのコード配列を置換することによってか（米国特許第４，８１６，５６７；Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８１：６８５１（１９８４））、または非免疫グロブリンポリペプチドのコード配列の全体または一部を免疫グロブリンコード配列に共有結合的に連結することによって、改変され得る。代表的に、このような非免疫グロブリンポリペプチドは、抗体の定常ドメインの代わりに置換されるか、これらは、抗体の１つの抗原結合部位の可変ドメインの代わりに置換されて、１つの抗原に対して特異性を有する１つの抗原結合部位および異なる抗原に対して特異性を有する別の抗原結合部位を含む、キメラの二価抗体を作製する。
【０１２２】
さらに、ＴＳＰＡＮ−７に対する組換え抗体は、例えば、種々の特許（これらの多くは、ＡｂｇｅｎｉｘおよびＭｅｄａｒｅｘに属している）において記載されるように、トランスジェニック動物において産生され得る。例えば、組換え抗体が、米国特許第５，８７７，３９７号、同第５，８７４，２９９号、同第５，８１４，３１８号、同第５，７８９，６５０号、同第５，７７０，４２９号、同第５，６６１，０１６号、同第５，６３３，４２５号、同第５，６２５，１２６号、同第５，５６９，８２５号、同第５，５４５，８０６号、同第６，１６２，９６３号、同第６，１５０，５８４号、同第６，１３０，３６４号、同第６，１１４，５９８号、同第６，０９１，００１号、同第５，９３９，５９８号のうちのいずれかに開示されるように、トランスジェニック動物（例えば、げっ歯類）において発現され得る。あるいは、組換え抗体は、米国特許第５，８４９，９９２号または同第５，８２７，６９０号（これらは、Ｐｆａｒｍｉｎに属し、本明細書中に参考として援用される）に議論されるように、トランスジェニック動物の乳汁中に発現され得る。
【０１２３】
（ヒト化抗体）
非ヒト抗体をヒト化するための方法は、当該分野で記載されている。好ましくは、ヒト化抗体は、非ヒトである供給源由来の１つ以上のアミノ酸残基が導入されている。これらの非ヒトアミノ酸残基は、しばしば、「移入（ｉｍｐｏｒｔ）」残基と呼ばれ、これらは、代表的に、「移入」可変ドメインから獲得される。ヒト化は、本質的に、Ｗｉｎｔｅｒおよび共同研究者（Ｊｏｎｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ、３２１：５２２−５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ、３３２：３２３−３２７（１９８８）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３９：１５３４−１５３６（１９８８））の方法に従って、超可変領域の配列をヒト抗体の対応する配列の代わりに置換することによって実行され得る。従って、このような「ヒト化」抗体は、キメラ抗体であり（米国特許第４，８１６，５６７号）、ここで、実質的に、完全ではないヒト可変ドメインが、非ヒト種由来の対応する配列によって置換されている。実際には、ヒト化抗体は、代表的に、いくつかの超可変領域の残基および可能ないくつかのＦＲ残基が、げっ歯類抗体中の相同部位由来の残基によって置換されているヒト抗体である。
【０１２４】
ヒト化抗体を作製するために使用されるヒト可変ドメイン（軽鎖および重鎖の両方）の選択は、抗原性を減少するのに非常に重要である。いわゆる「ベスト−フィット」方法に従って、げっ歯類抗体の可変ドメインの配列は、既知のヒト可変ドメイン配列のライブラリー全体に対してスクリーニングされる。次いで、げっ歯類の配列に最も近いヒトの配列が、ヒト化抗体のためにヒトフレームワーク領域（ＦＲ）として適用される（Ｓｉｍｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ、１５１：２２９６（１９９３）；Ｃｈｏｔｈｉａら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１９６：９０１（１９８７））。別の方法は、全ヒト抗体の特定の軽鎖サブグループまたは重鎖サブグループのコンセンサス配列由来の、特定のフレームワーク領域を使用する。同じフレームワークが、いくつかの異なるヒト化抗体に使用され得る（Ｃａｒｔｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：４２８５（１９９２）；Ｐｒｅｓｔａら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，１５１：２６２３（１９９３））。
【０１２５】
抗体が、抗原に対して高い親和性を維持し、そして他の望ましい生物学的特性を維持したままで、ヒト化されることが、さらに重要である。この目的を達成するために、好ましい方法に従って、ヒト化抗体は、親配列ならびに親配列およびヒト化配列の三次元モデルを用いる種々の概念的なヒト産物の分析プロセスによって調製される。
【０１２６】
三次元免疫グロブリンモデルは、一般的に利用可能であり、そして当業者はこれに精通している。選択された候補免疫グロブリン配列の可能な三次元コンフォメーション構造を例示かつ表示するコンピュータープログラムが、利用可能である。これらの表示の観察によって、候補免疫グロブリン配列の機能における残基の可能性のある役割の分析が可能になり、すなわち、候補免疫グロブリンがその抗原に結合する能力に影響を与える残基の分析が可能になる。この方法において、ＦＲ残基は、レシピエントから選択され、そして合わされて、所望の抗体特徴（例えば、標的抗原に対する増加した親和性）が達成されるような配列を移入させ得る。一般的に、超可変領域の残基は、抗原結合の作用に直接的かつほぼ実質的に関与する。
【０１２７】
（ヒト抗体）
ヒト化抗体の代替として、ヒト抗体が、作製され得る。上記のように、トランスジェニック動物における抗体（特に、ヒト抗体）の産生が公知である。例えば、免疫の際に、内因性免疫グロブリン産生の非存在下でヒト抗体の完全なレパートリーを産生し得るトランスジェニック動物（例えば、マウス）が、作製され得る。例えば、キメラ変異体マウスおよび生殖系列変異体マウスにおける抗体の重鎖連結領域（ＪＨ）遺伝子のホモ接合体欠失が、内因性抗体の産生を完全に阻害することが、記載されている。このような生殖系列変異体マウスにおけるヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子配列の移入は、抗原チャレンジの際に、ヒト抗体の産生をもたらす。例えば、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら、Ｐｒｏｃ．Ｍａｄ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：２５５１（１９９３）；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら、Ｎａｔｕｒｅ、３６２：２５５−２５８（１９９３）；Ｂｒｕｇｇｅｒｍａｎｎら、Ｙｅａｒ　ｉｎ　Ｉｍｍｕｎｏ．、７：３３（１９９３）；および米国特許第５，５９１，６６９号、同第５，５８９，３６９号、および同第５，５４５，８０７を参照のこと。あるいは、ファージディスプレイ技術（ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら，Ｎａｔｕｒｅ，３４８：５５２−５５３（１９９０））が使用されて、免疫化されていないドナー由来の免疫グロブリン可変（Ｖ）ドメインの遺伝子レパートリーから、インビトロでヒト抗体およびヒト抗体フラグメントを産生し得る。この技術に従って、抗体のＶドメイン遺伝子は、糸状バクテリオファージ（（例えば、Ｍ１３またはｆｄ）のメジャーコートタンパク質遺伝子またはマイナーコートタンパク質遺伝子のいずれかにインフレームでクローニングされ、そしてファージ粒子の表面上に機能的抗体フラグメントとして提示される。糸状粒子は、ファージゲノムの一本鎖ＤＮＡコピーを含むので、抗体の機能的特性に基づく選択がまた、これらの特徴を示す抗体をコードする遺伝子の選択をもたらす。従って、ファージは、Ｂ細胞のいくつかの特徴を模倣する。ファージディスプレイは、種々の形式で実施され得る；これらの概説については、例えば、Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｋｅｖｉｎ　Ｓ．およびＣｈｉｓｗｅｌｌ，Ｄａｖｉｄ　Ｊ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｏｐｉｎｉｏｎ　ｉｎ　Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，３：５６４−５７１（１９９３）を参照のこと。Ｖ遺伝子セグメントのいくつかの供給源が、ファージディスプレイに使用され得る。Ｃｌａｃｋｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ、３５２：６２４−６２８（１９９１）は、免疫したマウスの脾臓由来のＶ遺伝子の、小さなランダムコンビナトリアルライブラリーから、抗オキサゾロン抗体の多様な配列を単離した。免疫されていないヒトドナー由来のＶ遺伝子のレパートリーが構築され得、そして抗原（自己抗原を含む）の多様な配列に対する抗体が、Ｍａｒｋｓら、Ｊ．Ｍａｌ．Ｂｉｏｌ．、２２２：５８１−５９７（１９９１）、またはＧｒｉｆｆｉｔｈら、ＥＭＢＯ　Ｊ．、１２：７２５−７３４（１９９３）によって記載される技術に本質的に従って単離され得る。米国特許第５，５６５，３３２号および同第５，５７３，９０５号を参照のこと。ヒト抗体はまた、インビトロで活性化されたＢ細胞によって作製され得る（米国特許第５，５６７，６１０号および同第５，２２９，２７５号を参照のこと）。
【０１２８】
（抗体フラグメント）
抗体フラグメントの産生についての種々の技術が、開発されている。従来、これらのフラグメントは、インタクトな抗体のタンパク質分解性の消化を介して誘導されていた（例えば、Ｍｏｒｉｍｏｔｏら、Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　ａｎｄ　Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ　Ｍｅｔｈｏｄｓ，２４：１０７−１１７（１９９２）およびＢｒｅｎｎａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２２９：８１（１９８５）を参照のこと）。しかし、これらのフラグメントは、現在、組換え宿主細胞によって直接的に産生され得る。例えば、抗体フラグメントは、上記の抗体ファージライブラリーから単離され得る。あるいは、Ｆａｂ−ＳＨフラグメントが、Ｅ．ｃｏｌｉから直接的に収集されるか、または化学的に結合されてＦ（ａｂ’）２フラグメントを形成し得る［Ｃａｒｔｅｒら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１０：１６３−１６７（１９９２）］。別の手段に従って、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントは、組換え宿主細胞の培養物から直接的に単離され得る。抗体フラグメントを産生するための他の技術は、当業者に明らかである。別の実施形態において、選択される抗体は、単鎖Ｆｖフラグメント（ｓｃＦｖ）である。ＷＯ９３／１６１８５；米国特許第５，５７１，８９４号；および米国特許第５，５８７，４５８号を参照のこと。抗体フラグメントはまた、例えば、米国特許第５，６４１，８７０に記載されるように「線状抗体」であり得る。このような線状抗体フラグメントは、一重特異的であっても二重特異的であってもよい。
【０１２９】
（二重特異的抗体）
二重特異的抗体を作製する方法は、当該分野で公知である。全長二重特異的抗体の従来の産生は、２つの免疫グロブリン重鎖−軽鎖対（ここで、２つの鎖は、異なる特異性を有する）の同時発現に基づく（Ｍｉｌｌｓｔｅｉｎら、Ｎａｔｕｒｅ，３０５：５３７−５３９（１９８３））。免疫グロブリン重鎖および軽鎖のランダムな分類に起因して、これらのハイブリドーマ（クアドローマ）は、１０個の異なる抗体分子（これらのうちの１つのみが、正確な二重特異的構造を有する）を有する可能性のある混合物を産生する。通常アフィニティークロマトグラフィー工程によってなされる正確な分子の精製は、かなり厄介であり、そして産物の収量は低い。類似の手順が、ＷＯ　９３／０８８２９およびＴｒａｕｎｅｃｋｅｒら、ＥＭＢＯ　Ｊ，１０：３６５５−３６５９（１９９１）に開示される。
【０１３０】
異なる手段に従って、所望の結合特異的を有する抗体可変ドメイン（抗原‐抗体結合部位）は、免疫グロブリン定常ドメインの配列に融合される。この融合は、好ましくは、ヒンジ領域、ＣＨ２領域およびＣＨ３領域のうちの少なくとも一部を含む免疫グロブリン重鎖可変ドメインとの融合である。軽鎖結合に必要な部位を含む第１の重鎖定常領域（ＣＨＩ）がこの融合のうちの少なくとも１つに存在することが、好ましい。免疫グロブリン重鎖融合、および所望される場合、免疫グロブリン軽鎖をコードするＤＮＡが、別々の発現ベクターに挿入され、そして適切な宿主生物にトランスフェクトされる。これは、構築に使用される等しくない比率の３つのポリペプチド鎖が最適な収率を提供する実施形態において３つのポリペプチドフラグメントの相互の比率を調節する際に、大きな順応性を提供する。しかし、等しい比率の少なくとも２つのポリペプチド鎖の発現が高い収率をもたらす場合か、または比率に特定の優位性がない場合、２または３つ全てのポリペプチド鎖のコード配列を１つの発現ベクターに挿入することが、可能である。
【０１３１】
近年の進歩によって、Ｅ．ｃｏｌｉからのＦａｂ’−ＳＨフラグメント（これは、化学的に結合されて、二重特異的抗体を形成する）の直接的な収集が容易になった。Ｓｈａｌａｂｙら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１７５：２１７−２２５（１９９２）は、完全にヒト化された二重特異的抗体Ｆ（ａｂ’）２分子の産生を記載する。各Ｆａｂ’フラグメントは、Ｅ．ｃｏｌｉから別々に分泌され、そしてインビトロで直接的な化学結合に供されて、二重特異的抗体を形成する。従って、形成された二重特異的抗体は、ＥｒｂＨ２レセプターを過剰発現する細胞および正常ヒトＴ細胞に結合し得、そしてヒト胸部腫瘍標的に対するヒト細胞傷害性リンパ球の溶解性の活性を誘発する。
【０１３２】
二重特異的抗体フラグメントを作製し、そして組換え細胞培養物から直接的に二重特異的抗体フラグメントを単離するための種々の方法もまた、記載されている。例えば、二重特異的抗体は、ロイシンジッパーを用いて産生される。Ｋｏｓｔｅｌｎｙら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４８（５）：１５４７−１５５３（１９９２）。Ｆｏｓタンパク質およびＪｕｎタンパク質由来のロイシンジッパーペプチドは、遺伝子融合によって２つの異なる抗体のＦａｂ’部分に連結された。抗体二量体は、ヒンジ領域において還元されて、単量体を形成し、次いで、再び酸化されて抗体へテロ二量体を形成した。この方法はまた、抗体ホモ二量体の産生にも使用され得る。Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：６４４４−６４４８（１９９３）によって記載される「ジアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）」技術は、二重特異的抗体フラグメントを作製するための代替機構を提供している。これらのフラグメントは、同じ鎖状の２つのドメイン間の対形成には短すぎるリンカーによって、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に連結された重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。
【０１３３】
従って、一方のフラグメントのＶＨドメインおよびＶＬドメインは、別のフラグメントの相補的なＶＬドメインおよびＶＨドメインと対を形成し、それによって、２つの抗原結合部位を形成する。単鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）二量体の使用によって二重特異的抗体フラグメントを作製する別の戦略もまた、報告されている。Ｇｒｕｂｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５２：５３６８（１９９４）を参照のこと。２より多くの結合価を有する抗体が意図される。例えば、三重特異的抗体が調製され得る。Ｔｕｔｔら、Ｊ．Ｉｍｎｉｕｎｏｌ．，１４７：６０（１９９１）。
【０１３４】
高親和性抗体の産生のためのファージディスプレイライブラリーは、例えば、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ，Ｈ．Ｒ．ら、Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　４（１）：１〜２０（１９８８）；Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ，Ｈ．Ｒ．、Ｔｒｅｎｄｓ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１５：６２〜７０（１９９７）およびＭｃＧｕｉｎｎｅｓｓ，Ｂ．ら、Ｎａｔｕｒｅ　Ｂｉｏ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．１４：１１４９〜１１５４（１９９６）（これらのそれぞれは、本明細書中において参考として援用される）に記載される。ファージディスプレイ技術の利点には、その他の従来のハイブリドーマ技術によっては容易に単離され得ない、ヒト起源の抗体を単離する能力がある。さらに、ファージディスプレイ抗体は、動物の免疫系に頼ることなく、インビトロで単離され得る。
【０１３５】
抗体ファージディスプレイライブラリーは、例えば、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら、Ｎａｔｕｒｅ　３４８：５５２〜５５４（１９９０）（本明細書中で参考として援用される）の方法によって達成され得る。簡単に言うと、抗体可変領域のコード配列が、ファージマイナーコートタンパク質（ｐＩＩＩ）のアミノ末端に融合される。抗体可変領域−ｐＩＩＩ融合構築物の発現は、ファージ粒子中に含まれる対応する遺伝物質を有するファージ表面に抗体の「提示」を生じる。
【０１３６】
ファージライブラリーをスクリーニングするのに適したＴＳＰＡＮ−７タンパク質は、例えば、上記のバキュロウイルスＳｆ９細胞における発現によって獲得され得る。あるいは、ＴＳＰＡＮ−７コード領域は、ＴＳＰＡＮ−７タンパク質の所望の領域に特異的なプライマーを使用してＰＣＲ増幅され得る。例えば、インヒビターがＴＳＰＡＮ−７キナーゼドメインに対して指向される場合、活性部位中のリジン４０に隣接するアミノ酸配列をコードするフラグメントが、増幅され得る。上で議論されるように、ＴＳＰＡＮ−７タンパク質は、市販のアフィニティータグのうちの１つとの融合物としてＥ．ｃｏｌｉまたは酵母において発現され得る。
【０１３７】
次いで、得られた融合タンパク質は、固体マトリクス（例えば、組織培養プレートまたはビーズ）に吸着され得る。所望の抗ＴＳＰＡＮ−７結合特性を有するファージ発現抗体は、続いて、固体マトリクスの場合、連続的なパニングによって、またはＴＳＰＡＮ−７抗原カラムへのアフィニティー吸着によって単離され得る。所望のＴＳＰＡＮ−７阻害活性を有するファージは、感染によって細菌に再導入され得、そして当業者に公知の標準的な方法によって増殖され得る。陽性抗体−ｐＩＩＩファージをスクリーニングするための方法の総説として、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ，Ｈ．Ｒ．、Ｔｒｅｎｄｓ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，（前出）を参照のこと。
【０１３８】
（低分子）
本発明はまた、ハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）方法の慣用的な適用を通じて容易に同定され得る、低分子ＴＳＰＡＮ−７インヒビターを提供する。これは、Ｐｅｒｓｉｄｉｓ，Ａ．、Ｎａｔｕｒｅ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　１６：４８８〜４８９（１９９８）によって概説されている。ＨＴＳ方法とは、一般に、治療能力について、リード化合物（例えば、低分子）の迅速なアッセイを可能にする技術をいう。ＨＴＳ方法は、試験材料のロボット的な取り扱い、ポジティブシグナルの検出、およびデータの解釈を使用する。このような方法としては、例えば、可溶性分子、および上記に詳細に記載されたツーハイブリッドシステムのような細胞ベースの系（システム）を用いるロボット的なスクリーニング技術が挙げられる。
【０１３９】
溶液中とは対照的に細胞の状況下で生じる相互作用の操作が容易であることおよびその臨床的関連性によって有益である、細胞株ベースの種々のＨＴＳ方法が、利用可能である。リード化合物は、放射線活性の組み込みを介して、または読み出しとしての吸収、蛍光または発光（ルミネセンス）に依存する光学的アッセイを通じて同定され得る。例えば、本明細書において参考として援用されている、Ｇｏｎｚａｌｅｚ，Ｊ．Ｅ．ら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．９（６）６２４〜６３１（１９９８）を参照のこと。
【０１４０】
（ＴＳＰＡＮ−７インヒビターの有効性の評価のための方法）
リード分子またはリード化合物は、アンチセンス分子またはリボザイム、タンパク質および／またはペプチド、抗体および／または抗体フラグメントまたは低分子（本明細書において記載される方法の１つによって、またはさもなれれば当該分野で利用可能な技術を介してのいずれかで同定される）であろうとなかろうと、ＴＳＰＡＮ−７の遺伝子発現または生物学的活性を阻害する能力について、種々のインビトロ、エキソビボ、およびインビボの動物モデルアッセイ系（システム）でさらに特徴付けられ得る。以下に提供される実施例にさらに詳細に考察されるように、本発明のＴＳＰＡＮ−７インヒビターは、ＴＳＰＡＮ−７の発現レベルを低下するだけでなく、ＳＷ６２０細胞の増殖を低下するのにおいても有効である。従って、本発明はさらに、当業者が、これらのパラメーターの各々に対する候補インヒビターの効果を評価することを可能にする方法を開示する。
【０１４１】
上記のように、そして実施例に示されるように、候補ＴＳＰＡＮ−７インヒビターは、内因性ＴＳＰＡＮ−７を発現する細胞か、または組み換えＴＳＰＡＮ−７プラスミド構築物での哺乳動物細胞のトランスフェクションによってＴＳＰＡＮ−７を発現するように作製されている細胞への投与によって試験され得る。
【０１４２】
有効なＴＳＰＡＮ−７阻害性分子は、例えば、ノーザンブロット分析またはＲＴ−ＰＣＲ分析によって決定されたようにＴＳＰＡＮ−７　ｍＲＮＡのレベルを低下するのに有効である。これらの手順の一般的な記載については、例えば、参考として本明細書に援用されている、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｐｒｅｓｓ（１９８９）およびＭｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ　ａｎｄ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ　ｏｆ　Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ＤＮＡ、ＡＳＭ　Ｐｒｅｓｓ（編、Ｇｌｉｃｋ、Ｂ．Ｒ．およびＰａｓｔｅｒｎａｋ，Ｊ．Ｊ．１９９８）を参照のこと。所定の候補アンチセンス分子の有効性は、哺乳動物細胞に投与された場合、ＴＳＰＡＮ−７発現に対して実質的な効果を有さないことが既知のコントロールの「アンチセンス」分子との比較によって評価され得る。代表的なコントロール分子としては、実施例に開示したＲＣオリゴヌクレオチドが挙げられる。
【０１４３】
上記で議論した１つ以上の方法によってＴＳＰＡＮ−７遺伝子発現または細胞増殖を低下するのに有効なＴＳＰＡＮ−７インヒビターは、容易に利用可能な動物モデル系の１つにおいて有効性に関して、インビボでさらに特徴付けられ得る。癌および遺伝子に関連する遺伝的不安定性の研究のための種々の動物モデル系（システム）は、例えば、本明細書において参考として援用されている、Ｄｏｎｅｈｏｗｅｒ、Ｌ．Ａ．Ｃａｎｃｅｒ　Ｓｕｒｖｅｙｓ　２９：３２９〜３５２（１９９７）に考察されている。
【０１４４】
（癌治療の副作用の重篤度を減じるためのＴＳＰＡＮ−７インヒビターの使用）
本発明の一部として、ＴＳＰＡＮ−７インヒビターが腫瘍細胞増殖を低下するのに有効であることが発見された。従って、ＴＳＰＡＮ−７インヒビターは、癌治療（例えば、放射線療法または化学療法）を補助するための薬物として有効であり得る。
【０１４５】
リード化合物は、本明細書に提供される方法によって、または当該分野で公知の他の適切な方法によって同定され得る。
【０１４６】
（ＴＳＰＡＮ−７インヒビターおよびその組成物の投与）
本発明は、ＴＳＰＡＮ−７インヒビターおよび１つ以上のＴＳＰＡＮ−７インヒビターを含む組成物、ならびにインビボ、エキソビボ、およびインビトロの適用においてこれらの本発明のインヒビターを使用する方法を提供する。ここでＴＳＰＡＮ−７または機能的に下流の分子の発現または活性を減少または排除することが有利である。上記のように、ＴＳＰＡＮ−７インヒビターに基づく組成物は、処置レジメンが腫瘍細胞の放射線高感受性によって改善される、新生物疾患および関連状態の処置において有用性を見出す。あるいは、ＴＳＰＡＮ−７インヒビターは、例えば、癌治療薬および他の薬剤の副作用を軽減するための薬物としての用途を見出し得る。
【０１４７】
組成物は、治療処置のために非経口的に、局所的に、経口的にまたは局部的に投与され得る。好ましくは、組成物は、経口的にまたは非経口的に（すなわち、静脈内に、腹腔内に、皮内に、または筋肉内に）投与される。
【０１４８】
本発明の組成物は、１つ以上のＴＳＰＡＮ−７インヒビターを含み、そしてさらに薬学的に受容可能なキャリアまたは賦形剤を含み得る。種々の水性キャリア（例えば、水、緩衝化水、０．４％生理食塩水、０．３％グリシンなど）を用い得、そしてこれらは、安定性の増強のために、温和な化学的修飾などに供された、他のタンパク質（例えば、アルブミン、リポタンパク質、グロブリンなど）を含み得る。
【０１４９】
哺乳動物における疾患の処置に有用なＴＳＰＡＮ−７インヒビターはしばしば、他の天然に存在する免疫グロブリンまたは他の生物学的分子を実質的に含まずに調製される。好ましいＴＳＰＡＮ−７インヒビターはまた、哺乳動物に投与された場合に哺乳動物毒性を示す。
【０１５０】
本発明の組成物は、従来の、周知の滅菌技術によって滅菌され得る。得られた溶液は、使用のために包装（パッケージング）され得るか、または無菌的条件下で濾過されて凍結乾燥され得る。この凍結乾燥された調製物は、投与前に滅菌溶液と組み合わせられる。この組成物は、生理学的な条件に近似させるのに必要な場合、薬学的に受容可能な補助物質（例えば、ｐＨ調整剤、および緩衝化剤、張度調節剤など）（例えば、酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、および安定化剤（例えば、１〜２０％マルトースなど））を含み得る。
【０１５１】
本発明のＴＳＰＡＮ−７インヒビターを投与するための適切な方法の選択は、想定される適用の性質、およびＴＳＰＡＮ−７インヒビターの性質に依存する。従って、例えば、ＴＳＰＡＮ−７インヒビターを投与するための正確な方法は、それがアンチセンス分子、タンパク質、および／またはペプチド、抗体もしくは抗体フラグメント、または低分子であるか否かに依存する。他の検討事項としては、例えば、ＴＳＰＡＮ−７インヒビターが、癌細胞増殖を処置するために用いられるか、または他の癌治療を補助するために用いられるかが挙げられる。
【０１５２】
アンチセンス分子の投与のためには、当該分野で種々の方法が利用可能である。代表的な方法としては、遺伝子送達技術が挙げられる。これには、ウイルスベースの方法およびウイルスベースでない方法の両方、ならびにリポソーム媒介送達方法が挙げられる。
【０１５３】
これらの方法によって、１００％よりもかなり少ないトランスフェクション効率、トランスフェクトされたインヒビターの一時的な保持、および／または治療に不応性の標的細胞の小集団の存在にもかかわらず、実質的な治療上の有益性が達成され得る。
【０１５４】
遺伝子送達方法を用いて、腫瘍細胞内で内因性ＴＳＰＡＮ−７を直接ノックアウトして、これによって細胞増殖を阻害し得る。例えば、ＴＳＰＡＮ−７遺伝子を、ＴＳＰＡＮ−７インヒビターを担持する遺伝子送達ベクターのトランスフェクションによって標的し得る。腫瘍細胞への優先的トランスフェクションまたは腫瘍細胞内での発現は、組織特異的プロモーターまたは細胞周期特異的プロモーター（例えば、前立腺特異的抗原または免疫グロブリン遺伝子のためのプロモーターなど）（Ｖｉｌｅ、Ｒ．Ｇ．ら、Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．５３：９６２〜９６７（１９９３）およびＶｉｌｅ，Ｒ．Ｇ．Ｓｅｍｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ　Ｂｉｏｌ．５：４３７〜４４３（１９９４））の使用を通じて、または特定の器官もしくは構造に限定される栄養性ウイルス（例えば、中枢神経系において増殖する細胞にのみ感染し得る複製選択性ウイルスおよび神経栄養性ウイルス）の使用を通じて達成され得る。
【０１５５】
従って、治療の利益を達成するため、腫瘍細胞内のＴＳＰＡＮ−７は、優先的に阻害されるべきである。これは、ＴＳＰＡＮ−７インヒビター、ＴＳＰＡＮ−７アンチセンス分子、ＴＳＰＡＮ−７遺伝子特異的リプレッサー、またはＴＳＰＡＮ−７遺伝子のタンパク質産物のインヒビターを発現する遺伝子をトランスフェクトすることによって達成され得る。
【０１５６】
本明細書において用いる場合、句「遺伝子送達ベクター」とは一般に、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ　ａｎｄ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ　ｏｆ　Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ＤＮＡ，第２１章、第５５５〜５９０頁（編、Ｂ．Ｐ．ＧｌｉｃｋおよびＪ．Ｊ．Ｐａｓｔｅｒｎａｋ、第２版、１９９８）；Ｊｏｌｌｙ，Ｃａｎｃｅｒ　Ｇｅｎｅ　Ｔｈｅｒ．１：５１〜６４（１９９４）；Ｋｉｍｕｒａ，Ｈｕｍａｎ　Ｇｅｎｅ　Ｔｈｅｒ．５：８４５〜８５２（１９９４）；Ｃｏｎｎｅｌｌｙ，Ｈｕｍａｎ　Ｇｅｎｅ　Ｔｈｅｒ．６：１８５〜１９３（１９９５）；およびＫａｐｌｉｔｔ、Ｎａｔ．Ｇｅｎ．６：１４８〜１５３（１９９４）に記載のように、目的のアンチセンス分子を担持し、そして特定の実施形態においては、目的のアンチセンス分子の発現を指向し得る核酸構築物をいう。
【０１５７】
ウイルスベースの、およびウイルスベースでない、多数の遺伝子送達ベクター系が、ＴＳＰＡＮ−７インヒビターの投与に適切であることが記載されている。ウイルスベースの遺伝子送達系としては、レトロウイルス（例えば、モロニーマウス白血病ウイルス、スプマウイルスおよびレンチウイルス）ベクター系；アデノウイルスベクター系；アデノ随伴ウイルスベクター系；および単純疱疹（ヘルペス）ウイルスベクター系が挙げられるがこれらに限定されない。各タイプのウイルスは、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ；１０８０１　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ，Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖｉｒｇｉｎｉａ　２０１１０−２２０９）のような寄託機関または収集機関から容易に入手可能であるか、または通常利用可能な物質および技術を用いて公知の供給源から単離され得る。
【０１５８】
本発明の遺伝子送達ベクター系は、インビボ治療レジメンおよびエキソビボ治療レジメンの両方において適用を見出す。これらの適用の各々は、以下にさらに詳細に記載されている。
【０１５９】
（１．レトロウイルス遺伝子送達ベクター系）
本発明の１つの局面において、ＴＳＰＡＮ−７阻害性アンチセンス分子を担持または発現するように構築されているレトロウイルス遺伝子送達ベクターが提供される。本明細書において用いる場合、用語「ＴＳＰＡＮ−７阻害性アンチセンス分子」とは一般に、ＴＳＰＡＮ−７阻害性活性を有する核酸配列をいう。さらに詳細には、このようなアンチセンス分子は、ＴＳＰＡＮ−７遺伝子発現を減じ、そして標的細胞増殖を阻害する。本発明のレトロウイルス遺伝子送達ベクターは、広範な種々のレトロウイルス（例えば、Ｂ型、Ｃ型およびＤ型のレトロウイルスを含む）ならびにスプマウイルスおよびレンチウイルスから容易に構築され得る。ＲＮＡ　Ｔｕｍｏｒ　Ｖｉｒｕｓｅｓ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（第２版、１９８５）を参照のこと。
【０１６０】
上記のレトロウイルスのいずれかは、本明細書中において提供される開示、および標準的な組み換えＤＮＡ技術を考慮して、レトロウイルス遺伝子送達ベクターを組み立てるか、または構築するために容易に利用され得る。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ（第２版、１９８９）およびＫｕｎｋｌｅ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８２：４８８（１９８５）を参照のこと。さらに、本発明の特定の実施形態において、レトロウイルス遺伝子送達ベクターの一部は、異なるレトロウイルスに由来し得る。
【０１６１】
ＴＳＰＡＮ−７阻害性アンチセンス分子の発現に適切なレトロウイルスベクターは、好ましくは、少なくとも１つの転写プロモーター／エンハンサーもしくは遺伝子座規定エレメント（単数または複数）、または他のエレメント（選択的スプライシング、核ＲＮＡ輸送、メッセンジャーの翻訳後修飾、またはタンパク質の転写後修飾のような他の手段によって遺伝子発現をコントロールする）を含む。このようなベクター構築物は、好ましくはまた、パッケージングシグナル、末端反復配列（ＬＴＲ）またはその部分、ならびに用いられるレトロウイルスに適切なポジティブ鎖およびネガティブ鎖のプライマー結合部位（これらが、レトロウイルスベクターにすでに存在しない場合）を含む。必要に応じて、レトロウイルスベクターはまた、ポリアデニル化を指向するシグナル、選択マーカー（例えば、ネオマイシン耐性マーカー、ＴＫマーカー、ハイグロマイシン耐性マーカー、フレオマイシン耐性マーカー、ヒスチジノール耐性マーカー、またはＤＨＦＲマーカー）、ならびに１つ以上の制限部位および翻訳終止配列を含む。本発明の１つの局面において、レトロウイルス遺伝子送達ベクター構築物が提供され、このベクター構築物は、５’ＬＴＲ、ｔＲＮＡ結合部位、パッケージングシグナル、１つ以上の異種配列、第二鎖ＤＮＡ合成の起点、および３’ＬＴＲを含み、ここでこのベクター構築物は、ｇａｇ／ｐｏｌコード配列またはｅｎｖコード配列を欠く。
【０１６２】
他のレトロウイルス遺伝子送達ベクターは、本発明の状況内で同様に利用可能であり得る。このベクターとしては、例えば、各々が参考として本明細書において援用される、以下に開示されているベクターが挙げられる：欧州特許０，４１５，７３１号；ＷＯ　９０／０７９３６；ＷＯ　９４／０３６２２；ＷＯ　９３／２５６９８；ＷＯ　９３／２５２３４；米国特許第５，２１９，７４０号；ＷＯ　９３／１１２３０；ＷＯ　９３／１０２１８；Ｖｉｌｅら，Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．５３：３８６０−３８６４（１９９３）；Ｖｉｌｅら，Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．５３：９６２−９６７（１９９３）；Ｒａｍら，Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．５３：８３−８８（１９９３）；Ｔａｋａｍｉｙａら，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｒｅｓ．３３：４９３−５０３（１９９２）；Ｂａｂａら，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．７９：７２９−７３５（１９９３）；米国特許第４，７７７，１２７号；ＧＢ　２，２００，６５１；欧州特許０，３４５，２４２；およびＷＯ　９１／０２８０５。
【０１６３】
上記のレトロウイルス遺伝子送達ベクター構築物と共に使用するために適切なパッケージング細胞株は、容易に調製され得る。例えば、米国特許第５，７１６，８３２号および同第５，５９１，６２４号を参照のこと。これらのパッケージング細胞株は、組換えベクター粒子の産生のためのプロデューサー細胞株（ベクター細胞株または「ＶＣＬ」とも呼ばれる）を作製するために使用され得る。ヒトから作製されたパッケージング細胞株（例えば、ＨＴ１０８０細胞）またはミンク親細胞株を使用することが好ましくあり得、これによりヒト血清における不活性化を回避する組換えレトロウイルスの産生が可能となる。
【０１６４】
（２．アデノ随伴ウイルス遺伝子送達ベクター系）
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、多数の特性を有する。これらの特性により、このアデノ随伴ウイルスは、一般的に遺伝子送達ベクターの開発のために、そして特に、ＴＳＰＡＮ−７阻害性アンチセンス分子をコードするポリヌクレオチドの送達のために特に適切となる。ＡＡＶ発現系の一般的な総説については、Ｒａｂｉｎｏｗｉｔｚら，Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．９（５）：４７０−４７５（１９９８）を参照のこと。ＡＡＶは、アデノウイルスまたはヘルペスへルーパーウイルスなしでは非感染性である非病原性の欠損ヒトパルボウイルスである。従って、ヘルパーウイルスの非存在下で、ＡＡＶは、宿主ゲノムに潜在的に組み込まれる。さらに、ＡＡＶは、広範な分裂している細胞型および休止細胞型の両方を形質転換し得るという点において、上記のレトロウイルスを超える利点を有する。
【０１６５】
様々なＡＡＶ遺伝子送達ベクターを利用して、１つ以上のＴＳＰＡＮ−７インヒビターアンチセンス分子の発現を指向し得る。このようなベクターの代表的な例としては、Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ、ＷＯ　９３／０９２３９；Ｓａｍｕｌｓｋｉら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３：３８２２−３８２８（１９８９）；Ｍｅｎｄｅｌｓｏｎら、Ｖｉｒｏｌ．１６６：１５４−１６５（１９８８）；およびＦｌｏｔｔｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９０（２２）：１０６１３−１０６１７（１９９３）（本明細書中で参考として援用される）に開示されるＡＡＶベクターが挙げられる。
【０１６６】
簡潔には、本発明のＡＡＶ遺伝子送達ベクターは、５’アデノ随伴ウイルス逆末端反復；ＴＳＰＡＮ−７阻害性アンチセンス分子をコードするポリヌクレオチド；標的組織、器官または細胞における発現を調節するＴＳＰＡＮ−７阻害性アンチセンス分子に作動可能に連結された配列；および３’アデノ随伴ウイルス逆末端反復を、この順で含み得る。ＴＳＰＡＮ−７阻害性アンチセンス分子の発現のために適切な調節配列は、例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）のエンハンサー／プロモーター配列である。さらに、ＡＡＶベクターは、好ましくは、ポリアデニル化配列（例えば、ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリアデニル化配列）を有し得る。
【０１６７】
一般に、ＡＡＶベクターは、複製、パッケージング、宿主細胞ゲノムへの効率的な組込み、および染色体からのレスキューを可能にするために、ＴＳＰＡＮ−７阻害アンチセンス分子の各末端にＡＡＶ　ＩＴＲの１つのコピーを有さなければならない。５’ＩＴＲ配列は、ＡＡＶ　ＤＮＡゲノムの５’末端においてヌクレオチド１〜１４５からなり、そして３’ＩＴＲは、ＡＡＶゲノムのヌクレオチド４６８１〜４５３６を含む。好ましくは、ＡＡＶベクターはまた、ＩＴＲの末端に続く、少なくとも１０ヌクレオチド（すなわち、いわゆる「Ｄ領域」の部分）を含み得る。
【０１６８】
アデノ随伴ウイルス遺伝子送達ベクターの至適のパッケージングには、この５’および３’ＩＴＲが約２〜５ｋｂだけ離れていることが必要である。しかし、ＩＴＲ配列の間の理想的な間隔は、使用される特定のパッケージング系に依存して変わり得ることが明らかである。この間隔は、「スタッファー（ｓｔｕｆｆｅｒ）」または「フィラー（ｆｉｌｌｅｒ）」ポリヌクレオチドフラグメントを組込み、２つのＩＴＲの間のその核酸配列の全サイズを２ｋｂと５ｋｂとの間にすることによって、達成され得る。従って、ＴＳＰＡＮ−７阻害性アンチセンス分子が２〜５ｋｂより小さい場合、非コードスタッファーポリヌクレオチドは、例えば、５’ＩＴＲ配列の３’側かつＴＳＰＡＮ−７阻害アンチセンス分子の５’側に組み込まれ得る。このスタッファーフラグメントの正確なヌクレオチド配列は、最終的な構築物の必須のエレメントではない。
【０１６９】
スタッファーフラグメントの組込みではなく、意図される正確な用途に依存して、ＴＳＰＡＮ−７阻害性アンチセンス分子の複数のコピーを、特に、最適なＩＴＲ配列間隔を達成するために挿入し得る。このポリヌクレオチドを２つ以上の別個の転写単位（その各々がその独自のプロモーターおよびポリアデニル化シグナルを有する）として構築することが好ましくあり得る。
【０１７０】
本発明の組換えＡＡＶベクターは、様々なアデノ随伴ウイルス（例えば、血清型１〜６が挙げられる）から作製され得る。例えば、任意のＡＡＶ血清型由来のＩＴＲは、複製、組込み、切り出しおよび転写機構に関して類似の構造および機能を有すると予測される。
【０１７１】
本発明の特定の実施形態において、ＴＳＰＡＮ−７阻害性アンチセンス分子の発現は、別個のプロモーター（例えば、ウイルスプロモーター）によって達成され得る。この点について適切なプロモーターの代表的な例としては、ＣＭＶプロモーター、ＲＳＶプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、またはＭｏＭＬＶプロモーターが挙げられる。本発明の状況において同様に使用され得る他のプロモーターとしては、細胞または組織特異的プロモーター、または誘導性プロモーターが挙げられる。代表的な誘導性プロモーターとしては、テトラサイクリン応答プロモーター（例えば、「Ｔｅｔ」プロモーター）（Ｇｏｓｓｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８９：５５４７−５５５１（１９９２）；Ｇｏｓｓｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ　２６８：１７６６−１７６９（１９９５）；Ｂａｒｏｎら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．２５：２７２３−２７２９（１９９７）；Ｂｌａｕら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９６：７９７−７９９（１９９９）；Ｂｏｈｌら、Ｂｌｏｏｄ　９２：１５１２−１５１７（１９９８）；およびＨａｂｅｒｍａｎら、Ｇｅｎｅ　Ｔｈｅｒａｐｙ　５：１６０４−１６１１（１９９８）に記載されるような）；エクジソンプロモーター系（Ｎｏら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９３：３３４６−３３５１（１９９６）に記載されるような）；ならびにＲｉｖｅｒａら、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．２：１０２８−１０３２（１９９６）に記載されるような他の調節性プロモーターまたはプロモーター系が挙げられる。
【０１７２】
ＡＡＶ遺伝子送達ベクターはまた、ベクターの所望の機能の実施を助けるさらなる配列（例えば、アデノウイルス由来の配列）を含み得る。このような配列としては、例えば、アデノウイルス粒子中にＡＡＶ遺伝子送達ベクターをパッケージングするのを助ける配列が挙げられる。
【０１７３】
アデノ随伴ウイルスベクターを生成するために適切なパッケージング細胞株は、所定の容易に利用可能な技術によって慣用的に調製され得る。例えば、米国特許第５，８７２，００５号（本明細書中で参考として援用される）を参照のこと。最低限、本発明のＡＡＶ遺伝子送達系に適切なパッケージング系は、ＡＡＶ複製遺伝子およびカプシド遺伝子を含む。
【０１７４】
好ましいパッケージング細胞株は、ＡＡＶヘルパーウイルス、ならびにＴＳＰＡＮ−７阻害アンチセンス分子を含むＡＡＶ遺伝子送達ベクターの両方を含み得る。代表的なパッケージング細胞株系の詳細な説明については、例えば、Ｈｏｌｓｃｈｅｒ，Ｃ．ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６８：７１６９−７１７７（１９９４）；Ｃｌａｒｋ，Ｋ．Ｒ．ら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ　Ｔｈｅｒ．６：１３２９−１３４１（１９９５）；およびＴａｍａｙｏｓａ，Ｋ．ら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎ．Ｔｈｅｒ．７：５０７−５１３（１９９６）（これらは本明細書中で参考として援用される）を参照のこと。
【０１７５】
あるいは、ＡＡＶのパッケージングは、トランスフェクションプロトコル、またはパッケージング細胞株を排除する無細胞系においてインビトロで達成され得る。このようなインビトロ系は、ＴＳＰＡＮ−７阻害性アンチセンス分子を有するＡＡＶ遺伝子送達ベクター、ならびにＲｅｐタンパク質、カプシドタンパク質、およびヘルパーウイルス機能を供給するアデノウイルスタンパク質の供給源を組み込む。後者のタンパク質は、代表的に、細胞抽出物の形態で供給される。代表的なインビトロ系は、Ｄｉｎｇ，Ｌ．ら、Ｇｅｎ．Ｔｈｅｒ．４：１１６７−１１７２（１９９７）およびＺｈｏｕ，Ｚ．ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：３２４１−３２４７（１９９８）（これらは本明細書中で参考として援用される）にさらに記載される。
【０１７６】
（３．他のウイルス遺伝子送達ベクター系）
レトロウイルスベクターおよびアデノ随伴ウイルスベースのベクターに加えて、多数の他のウイルス遺伝子送達ベクター系もまた、ＴＳＰＡＮ−７阻害アンチセンス分子の発現のために使用され得る。例えば、本発明の一実施形態において、アデノウイルスベクターが用いられ得る。このようなベクターの代表的な例としては、例えば、以下に記載されるベクターが挙げられる：Ｂｅｒｋｎｅｒ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　６：６１６−６２７（１９８８）；Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら、Ｓｃｉｅｎｃｅ　２５２：４３１−４３４（１９９１）；ＷＯ　９３／９１９１；Ｋｏｌｌｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９１（１）：２１５−２１９（１９９４）；Ｋａｓｓ−Ｅｉｓｌｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９０（２４）：１１４９８−５０２（１９９３）；Ｇｕｚｍａｎら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ　８８（６）：２８３８−４８（１９９３）；Ｇｕｚｍａｎら、Ｃｉｒ．Ｒｅｓ．７３（６）：１２０２−１２０７（１９９３）；Ｚａｂｎｅｒら、Ｃｅｌｌ　７５（２）：２０７−２１６（１９９３）；Ｌｉら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ　Ｔｈｅｒ．４（４）：４０３−４０９（１９９３）；Ｃａｉｌｌａｕｄら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．５（１０）：１２８７−１２９１（１９９３）；Ｖｉｎｃｅｎｔら、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．５（２）：１３０−１３４（１９９３）；Ｊａｆｆｅら、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．１（５）：３７２−３７８（１９９２）；およびＬｅｖｒｅｒｏら、Ｇｅｎｅ　１０１（２）：１９５−２０２（１９９１）；ならびにＷＯ　９３／０７２８３；ＷＯ　９３／０６２２３；およびＷＯ　９３／０７２８２。
【０１７７】
本発明の遺伝子送達ベクターはまた、ヘルパーベクターを含む。このようなベクターの代表的な例としては、Ａｄｖ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．２１５：２１９−２３６（１９８９）においてＫｉｔによって開示されるベクター；ならびに米国特許第５，２８８，６４１号およびＥＰ　０１７６１７０（Ｒｏｉｚｍａｎ）に開示されるベクターが挙げられる。さらなる代表的な単純疱疹ウイルスベクターとしては、ＷＯ　９５／０４１３９（Ｗｉｓｔａｒ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）に開示される、ＨＦＥＭ／ＩＣＰ６−ＬａｃＺ；Ｇｅｌｌｅｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ　２４１：１６６７−１６６９（１９８８）、ならびにＷＯ　９０／０９４４１およびＷＯ　９２／０７９４５に記載される、ｐＨＳＶｌａｃ；Ｆｉｎｋ，Ｈｕｍａｎ　Ｇｅｎｅ　Ｔｈｅｒａｐｙ　３：１１−１９（１９９２）に記載されるＨＳＶ　Ｕｓ３：：ｐｇＣ−ｌａｃＺ；およびＥＰ　０４５３２４２（Ｂｒｅａｋｅｆｉｅｌｄ）に記載されるＨＳＶ　７１３４、２　ＲＨ　１０５およびＧＡＬ４；ならびに受託番号ＡＴＣＣ　ＶＲ−９７７およびＡＴＣＣ　ＶＲ−２６０としてＡＴＣＣに寄託されるベクターが挙げられる。
【０１７８】
遺伝子送達ベクターはまた、例えば、以下を含む広範な種々の他のウイルスから作製され得る：ポリオウイルス（Ｅｖａｎｓら、Ｎａｔｕｒｅ　３３９：３８５−３８８（１９８９）；およびＳａｂｉｎ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｓｔａｎｄａｒｄｉｚａｔｉｏｎ　１：１１５−１１８（１９７３））；ライノウイルス；カナリアポックスウイルスまたはワクシニアウイルスのようなポックスウイルス（Ｆｉｓｈｅｒ−Ｈｏｃｈら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８６：３１７−３２１（１９８９）；Ｆｌｅｘｎｅｒら、Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．５６９：８６−１０３（１９８９）；Ｆｌｅｘｎｅｒら、Ｖａｃｃｉｎｅ　８：１７−２１（１９９０）；米国特許第４，６０３，１１２号、同第４，７６９，３３０号、および同第５，０１７，４８７号；ＷＯ８９／０１９７３）；ＳＶ４０（Ｍｕｌｌｉｇａｎら、Ｎａｔｕｒｅ　２７７：１０８−１１４（１９７９）；インフルエンザウイルス（Ｌｕｙｔｊｅｓら、Ｃｅｌｌ　５９：１１０７−１１１３（１９８９）；ＭｃＭｉｃｈｅａｌら、Ｎ．Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ．３０９：１３−１７（１９８３）；およびＹａｐら、Ｎａｔｕｒｅ　２７３：２３８−２３９（１９７８））；ＨＩＶ（Ｐｏｚｎａｎｓｋｙ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６５：５３２−５３６（１９９１））；麻疹（ＥＰ　０　４４０，２１９）；アストロウイルス（Ｍｕｎｒｏｅら、Ｊ．Ｖｉｒ．６７：３６１１−３６１４（１９９３））；およびコロナウイルス、ならびに他のウイルス系（例えば、ＥＰ　０，４４０，２１９；ＷＯ９２／０６６９３；米国特許第５，１６６，０５７号）。
【０１７９】
（４．非ウイルス遺伝子送達ベクター）
例えば、以下のようなＴＳＰＡＮ−７阻害アンチセンス分子の発現のために、他の遺伝子送達ベクターおよび方法が、使用され得る：核酸発現ベクター；殺傷されたアデノウイルス単独に連結されたかまたは連結されていないポリカチオン濃縮ＤＮＡ（例えば、Ｃｕｒｉｅｌ，Ｈｕｍ　Ｇｅｎｅ　Ｔｈｅｒ　３：１４７−１５４（１９９２）を参照のこと）；リガンド結合ＤＮＡ（例えば、Ｗｕ，Ｊ　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｍ　２６４：１６９８５−１６９８７（１９８９）を参照のこと）；真核生物細胞送達ベクター；光重合ヒドロゲル物質の沈着；携帯型遺伝子送達粒子銃（米国特許第５，１４９，６５５号において記載されるような）；電離放射線（米国特許第５，２０６，１５２号およびＷＯ９２／１１０３３において記載されるような）；核電荷の中和または細胞膜との融合。さらなるアプローチが、Ｐｈｉｌｉｐ，Ｍｏｌ　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ　１４：２４１１−２４１８（１９９４）およびＷｏｆｆｅｎｄｉｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９１：１５８１−１５８５（１９９４）において記載される。
【０１８０】
粒子媒介性遺伝子送達が使用され得る。手短にいうと、目的のＴＳＰＡＮ−７阻害性アンチセンス分子は、高レベルの発現のための従来の制御配列を含む従来のベクターに挿入され得、次いで、アシアロオロソムコイド（Ｗｕら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：４４２９−４４３２（１９８７）において記載されるような）、インスリン（Ｈｕｃｋｅｄ，Ｂｉｏｃｈｅｍ　Ｐｈａｒｍａｃｏｌ　４０：２５３−２６３（１９９０）において記載されるような）、ガラクトース（Ｐｌａｎｋ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ　Ｃｈｅｍ　３：５３３−５３９（１９９２）において記載されるような）、ラクトースまたはトランスフェリンのような細胞標的化リガンドに連結された、ポリマーＤＮＡ結合カチオン様ポリリジン、プロタミン、およびアルブミンのような合成遺伝子送達分子と共にインキュベートされ得る。
【０１８１】
裸のＤＮＡもまた、使用され得る。例示的な裸のＤＮＡ導入方法は、ＷＯ９０／１１０９２および米国特許第５，５８０，８５９号において記載されている。取り込み効率は、生分解性ラテックスビーズを使用して改善され得る。ＤＮＡコートラテックスビーズは、ビーズによるエンドサイトーシス開始後、細胞に効率的に輸送される。この方法は、疎水性を増加するためのビーズの処理によってさらに改善され得、それにより、エンドソームの破壊およびＤＮＡの細胞質への放出を容易にする。
【０１８２】
遺伝子送達ビヒクルとして作用し得るリポソームは、米国特許第５，４２２，１２０号、ＰＣＴ特許公開番号ＷＯ９５／１３７９６、ＷＯ９４／２３６９７、およびＷＯ９１／１４４４４５、および欧州特許公開番号５２４，９６８において記載される。核酸配列は、高レベルの発現のための従来の制御配列を含む従来のベクターに挿入され得、次いで、アシアロオロソムコイド、インスリン、ガラクトース、ラクトースまたはトランスフェリンのような細胞標的化リガンドに連結された、ポリマーＤＮＡ結合カチオン様ポリリジン、プロタミン、およびアルブミンのような合成遺伝子送達分子と共にインキュベートされ得る。他の送達系としては、種々の組織特異的または遍在性の活性プロモーターの制御下の遺伝子を含むＤＮＡをカプセル化するためのリポソームの使用が挙げられる。使用のために適切なさらなる非ウイルス送達は、Ｗｏｆｆｅｎｄｉｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９１（２４）：１１５８１−１１５８５（１９９４）において記載されるアプローチのような機械的送達系が挙げられる。さらに、コード配列およびこのような配列の発現産物は、光重合したヒドロゲル物質の沈着を介して送達され得る。
【０１８３】
例示的なリポソームおよびポリカチオン遺伝子送達ビヒクルは、米国特許第５，４２２，１２０号および同第４，７６２，９１５号、ＰＣＴ特許公開番号ＷＯ９５／１３７９６、ＷＯ９４／２３６９７、およびＷＯ９１／１４４４５、欧州特許公開番号５２４，９６８、ならびにＳｔａｒｒｉｅｒ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２３６−２４０頁（１９７５）Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ，Ｓａｎ　Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ；Ｓｈｏｋａｉ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．６００：１（１９８０）；Ｂａｙｅｒ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．５５０：４６４（１９７９）；Ｒｉｖｅｔ，Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ．１４９：１１９（１９８７）；Ｗａｎｇ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８４：７８５１（１９８７）；Ｐｌａｎｔ，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１７６：４２０（１９８９）において記載されるものである。例示的なリピトイドキャリアは、ＷＯ９８／０６４３７、およびＷＯ０１／１６３０６（アンチセンス分子に関連する）において開示され、そして例示的なコレステロイドキャリアは、ＷＯ９９／０８７１１において開示される（これらの全ては、本明細書中に参考として援用される）。
【０１８４】
（実施例）
以下の実施例は、例示の目的で提供され、限定ではない。
【０１８５】
（実施例１）
（ＴＳＰＡＮ−７　ＭＲＮＡのアンチセンス阻害）
（Ａ．トランスフェクション混合物の調製）
各トランスフェクション混合物について、キャリア分子（好ましくはリピトイドまたはコレステロイド）を、水中で作用濃度０．５ｍＭで調製し、均一な溶液を得るために超音波処理し、そして０．４５μｍのＰＶＤＦ膜を通して濾過した。アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはコントロールオリゴヌクレオチド（図４、配列番号３〜１２）を、滅菌Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ水中で作用濃度１００μＭで調製した。
【０１８６】
オリゴヌクレオチドを、ミクロチューブ中、ＯｐｔｉＭＥＭＴＭ（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）中で２μＭまで希釈するか、または約２０μｇ　オリゴ／ＯｐｔｉＭＥＭＴＭのｍｌで希釈した。別個のミクロチューブ中で、リピトイドまたはコレステロイド（代表的には、アンチセンスオリゴヌクレオチド１μｇ当たり、約１．５〜２ｎｍｏｌの量）を、オリゴヌクレオチドを希釈するために使用したＯｐｔｉＭＥＭＴＭの等容量中に希釈した。この希釈したアンチセンスオリゴヌクレオチドを、希釈したリピトイドに直ちに添加し、そして上下にピペッティングすることによって混合した。
【０１８７】
（Ｂ．トランスフェクション）
ＳＷ６２０細胞を、トランスフェクションの前に１日、組織培養皿上、血清を有する増殖培地中にプレートして、トランスフェクションの際に６０〜９０％の密度を得た。このオリゴヌクレオチド／リピトイド混合物を、混合の直後に、細胞に添加して、１００〜３００ｎＭアンチセンスオリゴヌクレオチドの最終濃度にした。細胞を、トランスフェクション混合物と共に、３７℃、５％ＣＯ２で４〜２４時間インキュベートした。インキュベーション後、このトランスフェクション混合物を除去し、そして血清を含む通常の増殖培地で置き換えた。
【０１８８】
総ＲＮＡを、ＲＮｅａｓｙＴＭキット（Ｑｕｉａｇｅｎ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ，ＣＡ）を使用して、製造業者のプロトコルに従って抽出した。
【０１８９】
（Ｃ．逆転写）
標的ｍＲＮＡのレベルを、Ｒｏｃｈｅ　ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒＴＭリアルタイムＰＣＲ機器を使用して定量した。標的ｍＲＮＡについての値を、内部コントロール（例えば、β−アクチン）に対して正規化した。
【０１９０】
各２０μｌの反応について、抽出したＲＮＡ（一般に、合計０．２〜１μｇ）を、滅菌した０．５または１．５ｍｌの微小遠心管に入れ、そして１２．５μｌの総容量まで水を添加した。各管に、７．５μｌの緩衝液／酵素混合物（２．５μｌ　Ｈ２Ｏ、２．０μｌ　１０×反応緩衝液、１０μｌ　オリゴｄＴ（２０ｐｍｏｌ）、１．０μｌ　ｄＮＴＰミックス（各１０ｍＭ）、０．５μｌ　ＲＮＡｓｉｎ（登録商標）（２０ｕ）（Ａｍｂｉｏｎ，Ｉｎｃ．，Ｈｉａｌｅａｈ，ＦＬ）、および０．５μｌ　ＭＭＬＶ逆トランスクリプターゼ（５０ｕ）（Ａｍｂｉｏｎ，Ｉｎｃ．）を列挙される順序で混合することによって調製した）を添加した。この内容物を、上下にピペッティングすることによって混合し、そしてこの反応混合物を４２℃で１時間インキュベートした。各管の内容物を、増幅の前に遠心分離した。
【０１９１】
（Ｄ．ＲＴ反応物のＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒＴＭ増幅）
増幅混合物を、以下の順序で混合することによって調製した：１×ＰＣＲ緩衝液ＩＩ、３ｍＭ　ＭｇＣｌ２、各１４０μＭのｄＮＴＰ、各０．１７５ｐｍｏｌのオリゴ、１：５０，０００希釈のＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ、０．２５ｍｇ／ｍｌ　ＢＳＡ、１単位のＴａｑポリメラーゼ、および２０μｌまでのＨ２Ｏ。（ＰＣＲ緩衝液ＩＩは、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ，Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴから、１０×濃度で入手可能）。１×濃度において、これは、１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．３）および５０ｍＭ　ＫＣｌを含む。ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）は、二本鎖ＤＮＡに結合するときに蛍光を発する色素である。二本鎖ＰＣＲ産物が増幅の間に産生されるにつれて、ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎからの蛍光が増大する。
【０１９２】
増幅混合物の各２０μｌのアリコートに、２μｌのテンプレートＲＴを添加し、そして標準的なプロトコルに従って増幅を行った。
【０１９３】
図５および以下の表１に示されるように、ＴＳＰＡＮ−７メッセージレベルは、ＳＷ６２０細胞中のアクチンと比較して減少した。
【０１９４】
（表１）
ＳＷ６２０増殖に対するＴＳＰＡＮ−７オリゴヌクレオチドの効果
【０１９５】
【表９】
2004504021.tif 000026
（実施例２）
（細胞増殖アッセイ）
細胞を、１ウェル当たり５０００細胞の密度で、９６ウェルプレートに播種した。４日間の増殖アッセイのために、５つの独立した９６ウェルプレートを調製した（各日に１つ）。一晩のインキュベーション後、細胞を、上記の手順を使用してトランスフェクトした。増殖アッセイの各日に、１つのプレートから全ての培地を除去し、そして−７０℃で凍結した。４日目に、全てのプレートを、ＱｕａｎｔｓＴＭアッセイキット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ　Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）（これは、各ウェルにおけるＤＮＡの量（従って細胞数）を決定する）を用いて展開した。結果を、図６および以下の表２に示す。
【０１９６】
（表２）
ＳＷ６２０細胞の増殖に対するＴＳＰＡＮ−７オリゴヌクレオチドの効果
【０１９７】
【表１０】
2004504021.tif 000027
本発明の特定の実施形態が例示の目的で本明細書中に記載されているが、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、種々の改変がなされ得ることが上記から理解される。従って、本発明は、添付の特許請求の範囲以外では限定されない。
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は、テトラスパンタンパク質の構造を示す図である。アミノ酸（Ｎ）末端およびカルボシキル（Ｃ）末端ならびに細胞外ドメインおよび膜貫通ドメインを示す。１８個のテトラスパン遺伝子のうちの少なくとも１２個において見出される高度に保存されたアミノ酸を、円で示す。１４以上のテトラスパンにおいて見出される高度に保存されたアミノ酸を、太線の円で示す。この保存されたＰＸＳＣモチーフは、種々のテトラスパンにおいてＥＣ２内の異なる位置に配置されているので、浮いている矢印で示す。星印は、膜貫通ドメイン内の保存された荷電アミノ酸を示す（Ｍａｅｃｋｅｒら、ＦＡＳＥＢ　Ｊ．１１：４２８−４４２、１９９７）。
【図２】
図２（Ａ、Ｂ、およびＣ）は、ＴＳＰＡＮ−７をコードする１３８７塩基対（配列番号１）のポリヌクレオチド配列である。
【図３】
図３は、配列番号１によりコードされる２７０アミノ酸のＴＳＰＡＮ−７アミノ酸配列（配列番号２）を示す。
【図４】
図４は、配列番号１に基づくアンチセンスオリゴヌクレオチドおよびコントロール（ＲＣ）オリゴヌクレオチド（配列番号３〜１２）を提供する。
【図５】
図５は、ＳＷ６２０細胞におけるアクチンｍＲＮＡに対して正規化された、ＴＳＰＡＮ−７　ｍＲＮＡレベルに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドおよびコントロールオリゴヌクレオチドの効果を示す棒グラフである。
【図６】
図６は、４日間の増殖にわたる、ＳＷ６２０細胞におけるｍＲＮＡレベルに対する配列番号６のアンチセンスオリゴヌクレオチド（２２−４ＡＳ）および配列番号１１のコントロールオリゴヌクレオチド（２２−４ＲＣ）の効果を示す棒グラフである。
【図５】
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【図６】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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