(57)【要約】環化型または多量体形態の、酸化低密度リポタンパク質に対する親和性を有するペプチドは、冠状動脈性心臓疾患のマーカーであるｏｘＬＤＬを検出するための免疫吸着（ｉｍｍｕｎｏｓｏｌｖｅｎｔ）アッセイに有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
酸化低密度リポ蛋白に対する親和性を有する、環化型または多量体形のペプチド。
【請求項２】
その単量体形が８〜４０アミノ酸残基を含有する、請求項１に記載のペプチド。
【請求項３】
同じ長さのａｐｏＢ−１００タンパク質の配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含有する、請求項１または２に記載のペプチド。
【請求項４】
ａｐｏＢ−１００タンパク質の少なくとも一部に対応するアミノ酸配列を有する、請求項３に記載のペプチド。
【請求項５】
単量体形のペプチドが１０５ ｌ／ｍｏｌより大きい親和定数を有する抗体と相互作用する、請求項１〜４のいずれかに記載のペプチド。
【請求項６】
単量体形のペプチドが配列番号１〜３のいずれかの配列を含む、請求項１〜５のいずれかに記載のペプチド。
【請求項７】
単量体形のペプチドが配列番号５の配列を含む、請求項１〜５のいずれかに記載のペプチド。
【請求項８】
各単量体が１つ以上のＬｙｓ残基を含有し、多量体形はジアルデヒドを用いて誘導体化させることにより得ることができる、請求項１〜７のいずれかに記載のペプチド。
【請求項９】
ジアルデヒドがマロンジアルデヒドである、請求項８に記載のペプチド。
【請求項１０】
単量体がＣｙｓ残基を含有し、それにより多量体形が連結されている、請求項１〜７のいずれかに記載のペプチド。
【請求項１１】
環化型である、請求項１〜７のいずれかに記載のペプチド。
【請求項１２】
イムノアッセイにおいて、酸化低密度リポ蛋白に対する親和性を有するサンプル中の抗体の存在、場合により量を検出するための、請求項１〜１１のいずれかに記載のペプチドの使用。
【請求項１３】
サンプル中の低密度リポ蛋白に対する自己抗体の量を測定する方法であって、
（ｉ）サンプルを、固定化した請求項１〜１１のいずれかに記載のペプチドと、自己抗体が該ペプチドと結合し得る条件下で接触させること、および
（ｉｉ）結合の量を決定すること、
を含む方法。
【請求項１４】
サンプルが患者からの血清または血漿サンプルである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
（ｉ）請求項１〜１１のいずれかに記載のペプチド、および
（ｉｉ）免疫吸着アッセイを行うために必須の試薬
をそれぞれ含む容器を備えたユニットを有する、酸化ＬＤＬの自己抗体を測定するのに適したキット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明は、冠状動脈性心臓病および他の心血管疾患の危険性を評価するためのアッセイでの使用のためのペプチドの製造に関する。
【０００２】
発明の背景
冠状動脈性心臓病（ＣＨＤ）は欧州の国において主要な死亡原因である。ほとんどの場合、ＣＨＤの基本的な原因はアテローム性動脈硬化症である。現在、アテローム性動脈硬化症の危険性は、総コレステロール、低密度リポ蛋白（ＬＤＬ）および高密度リポ蛋白（ＨＤＬ）の量を測定することにより評価される。しかし、これらの試験では、およそ１／３の患者の疾患は推測できない。Ｙｌａ−Ｈｅｒｔｔｕａｌａ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ Ｌｉｐｉｄｏｌ．（１９９８）９：３３７〜３４４を参照。それゆえ、ＣＨＤの危険性を推定するためのよりよいアッセイを開発する必要性がある。
【０００３】
酸化低密度リポ蛋白（ｏｘＬＤＬ）はアテローム性動脈硬化症における危険因子であることが示されているが、循環中での半減期が短いので血漿中のｏｘＬＤＬを直接測定することは可能ではなかった。それゆえ、最近の研究はＬＤＬ酸化の程度を規定するために別の間接測定に焦点をあてている。
【０００４】
ｏｘＬＤＬはアテローム性動脈硬化症に重要な役割を果たす。それはアテローム性動脈硬化症の病変に見出されており、種々の細胞型に対し細胞傷害性であり、かつ血中単球に対して走化性である。さらに、ｏｘＬＤＬは免疫原性であり、アテローム性動脈硬化症の病変はｏｘＬＤＬを認識するイムノグロブリンを含有している（ｏｘＬＤＬに対する自己抗体はヒトおよびウサギ血清中に存在する）。Ｙｌａ−Ｈｅｒｔｔｕａｌａ（前述）により示唆されるように、ｏｘＬＤＬを分析するための最も良い方法はｏｘＬＤＬに対する自己抗体の測定であろう。
【０００５】
アポリポ蛋白Ｂ−１００（ａｐｏＢ−１００）はＬＤＬにおける主要なタンパク質構成要素である。ヒトｃＤＮＡおよびアミノ酸配列は、Ｃｈｅｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９８６）２６１：１２９１２〜１２９２１により報告されている。
【０００６】
ＬＤＬの酸化の間、粒子のタンパク質および脂質部分の両方が修飾され得る。Ｅｓｔｅｒｂａｕｅｒら、Ｆｒｅｅ Ｒａｄｉｃａｌ Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．（１９９２）１３：３４１〜３９０により報告されているように、マロンジアルデヒド（ＭＤＡ）および４−ヒドロキシノネナル（ｈｙｄｒｏｘｙｎｏｎｅｎａｌ）（４−ＨＮＥ）はＬＤＬ酸化の間に形成される主要な反応性アルデヒドであり、これらは各々、ａｐｏ−Ｂ１００のリジン残基とさらに反応し得る。これらのほとんど特徴付けられていない酸化特異的エピトープは自己抗体により認識される。さらに最近、Ｐａｌｉｎｓｋｉら（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．（１９９６）９８：８００−８１４）により、酸化されたリン脂質が自己抗体に関するエピトープであると示唆されている。さらに、健常な個体が、ｏｘＬＤＬの主要な構成成分であるリソフォスファチジルコリンに対する抗体を生じることが報告されている。
【０００７】
抗ｏｘＬＤＬ自己抗体からは頸動脈アテローム性動脈硬化症、冠動脈アテローム性動脈硬化症および心筋梗塞の進行を推定することができる。また、増加したレベルの自己抗体は、全身性ループスエリトマトーデス（ＳＬＥ）、子癇前症、慢性大動脈周囲炎、インシュリン非依存性糖尿病および内皮機能不全において見出されている。
【０００８】
ｏｘＬＤＬに対する自己抗体は、非常に異なるイムノアッセイ（ＥＩＡまたはＲＩＡ）を使用して測定されてきたが、アッセイの標準化に利用可能な標準方法または参照物質は存在しない。これまでの試験に用いられていたＬＤＬはヒト血漿から精製されており、通常、銅イオンとのインキュベーションまたはＭＤＡとの結合により酸化される。銅酸化型ＬＤＬは、酸化特異的エピトープの混合物を含有しているので、均一な抗原を作製するために酸化プロセスを注意深く標準化しなければならない。ヒト血漿ＬＤＬベースの抗原もまた、本質的に不安定であり、市販の試験キットの作製には適していない。それゆえ、標準化することができ、安定で、再現性のある結果を与える試薬を利用する、ＣＨＤに関するアッセイを作製する必要性がある。
【０００９】
発明の要旨
本発明は、適切なペプチド（例えば、反応性アルデヒドで修飾したもの）が安定であり、かつＣＨＤに関するイムノアッセイにおいて抗原として使用され得る、という認識に基づく。より具体的には、新規なペプチドは、環化形または多量体形の、酸化低密度リポ蛋白に対して親和性を有する。
【００１０】
本発明の局面の１つに従って、本発明のペプチドはサンプル中の、酸化低密度リポ蛋白に対する親和性を有する抗体の存在および、場合により、量を測定するためのイムノアッセイに使用される。
【００１１】
第２の局面に従い、サンプル中の酸化低密度に対する自己抗体の量を測定する方法は、
（ｉ）サンプルを、固定された、上記のように誘導体化されたペプチドと自己抗体がペプチドに結合することを可能とする条件下で、接触させること、および
（ｉｉ）結合の量を検出すること、を含む。
【００１２】
結合の量は、直接的に測定され得、サンプル中の酸化ＬＤＬの量に相関する。抗体の量は酸化ＬＤＬとネイティブなＬＤＬとの間の抗体結合の比として表現される。
【００１３】
誘導体型ペプチドを使用することにより、イムノアッセイに再現性のある結果を提供する安定な抗原の使用を確実にすることができる。
【００１４】
第３の局面に従って、酸化ＬＤＬの自己抗体を測定するためのキットは、
（ｉ）上記の誘導体ペプチドを含む組成物、
（ｉｉ）免疫吸着アッセイを行うために必須の試薬、
を含むマルチコンテナユニット（複数容器からなるユニット）を有する。
【００１５】
本発明は、タンパク質を患者の血液から単離する必要性が無い、簡単に合成し得る試薬を提供する。このペプチドは、従来的なＣＨＤアッセイに用いるタンパク質に伴う短い半減期を有しておらず、それゆえ、診断キット中での使用のために商業的に製造することができる。
【００１６】
発明の説明
本発明は、好ましくはａｐｏＢ−１００タンパク質に由来するペプチド、または好ましくはａｐｏＢ−１００タンパク質上のエピトープの構造に類似の構造を形成するアミノ酸配列を有するペプチドの生産に基く。従って、これらのペプチドは酸化ＬＤＬに対して親和性を有する自己抗体との特異的な相互作用を受け得る。用語「特異的な相互作用」とは、ペプチド（抗原）に対する自己抗体の認識を意味する。このペプチドは、１０５ ｌ／ｍｏｌ、好ましくは１０７ ｌ／ｍｏｌ、より好ましくは１０８ ｌ／ｍｏｌよりも高い親和定数を有する抗体結合を誘発し得る。
【００１７】
原則として、およそ１０アミノ酸よりも大きい（ただし、自己抗体に対するリガンドとして働く）ペプチド配列が本発明に使用され得る。ペプチドはａｐｏＢ−１００の天然の供給源に由来するか、またはａｐｏＢ−１００に関する既知のタンパク質配列に基づく合成ペプチドであり得る。ａｐｏＢ−１００由来のペプチドを単離する方法、ペプチドを合成する方法は当業者に明らかである。
【００１８】
ペプチドは任意の適切なアミノ酸上で、反応性アルデヒドを用いて誘導体化される。好ましくは、ペプチドはアルギニン、ヒスチジンまたはリジン残基上で誘導体化される。また、ペプチドを誘導体化する方法は、本明細書中に開示される方法に加えて、当業者に明らかである。
【００１９】
ペプチドを誘導体化するために用いる反応性アルデヒドは、マロンジアルデヒドまたはヒドロキシノネナルである。また、他の反応性アルデヒドも当業者に明らかである。
【００２０】
ペプチドのサイズは自己抗体による認識に充分なものである。好ましくは、ペプチドは１０〜４０アミノ酸のサイズであり、より好ましくは１５〜３０アミノ酸である。好ましくは、ペプチドのアミノ酸配列は、ネイティブなａｐｏＢ−１００タンパク質上の領域と、８０％より高い、好ましくは９０％より高い、最も好ましくは９５％よりも高い同一性を有する。
【００２１】
本発明のペプチドは、抗体反応を誘発し得る他の試薬と共に診断アッセイで使用することができる。例えば、ホスファチジルエタノールアミンはＭＤＡを用いて誘導体化することができ、本発明のペプチドと共に使用する場合、自己抗体に対するエピトープとして機能し得る。
【００２２】
新規のペプチドベースのＥＩＡアッセイは、心血管疾患およびいくつかの他の障害（例えば、大動脈周囲炎、子癇前症、インシュリン非依存性糖尿病および内皮機能不全）を有する患者の評価および追跡のための試験キットとして使用され得る。
【００２３】
イムノアッセイで使用する場合、続いての洗浄工程を簡単に行うことができるように、ペプチドは固体支持体上に固定されていることが好ましい。イムノアッセイを行う方法は当業者に明らかである。
【００２４】
以下の実施例は本発明を例示する。
【００２５】
実施例１
ａｐｏＢ−１００のアミノ酸配列（Ｃｈｅｎら、前述）由来の、種々のネイティブなペプチドおよび修飾型ペプチドを、ＥＩＡでの使用に適した抗原として試験した。ペプチドをＭＤＡを用いて修飾してｏｘＬＤＬにおける場合に類似する酸化特異的エピトープを作製した。ペプチドＥＩＡの結果をｏｘＬＤＬ ＥＩＡ（これは銅酸化型ＬＤＬを用いて抗原として最適化されている。Ｎａｒｖａｎｅｎら、Ｆｒｅｅ Ｒａｄｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ＆Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、印刷中を参照のこと）の結果と比較する。
【００２６】
ペプチドを固相ペプチド合成技術およびＦｍｏｃ化学を用いることにより合成し、Ｃ１８カラムを用いるＨＰＬＣで精製した。合成したペプチドの分子量を、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析機を用いることにより同定した。ａｐｏＢ−１００のアミノ酸配列に由来する、または無関係のいずれかのペプチド配列を、表１に示す。
【００２７】
【表１】
2004504327.tif 000002
【００２８】
ＭＤＡを用いるペプチドの修飾
ＭＤＡは、Ｐａｌｉｎｓｋｉら（Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ（１９９０）１０：３２５−３３５）の修飾方法を用いることによりリジンの第１アミンを介してペプチドに連結した。ＭＤＡは、マロンジアルデヒド−ビス（ジメチルアセタール）から、酸加水分解により新規に作製した。次いで、混合物を３７℃で３時間攪拌することにより、ＭＤＡ（１０ｍｏｌ）をペプチド（１ｍｏｌ）へと連結した。連結効率は第１アミンの存在を示すニンヒドリン反応により検査した。
【００２９】
ペプチドＥＩＡ試験のための血清および血漿サンプルを、実施中の研究から集めた。これは冠状動脈性心臓病が疑われる患者、および健常者対照からのサンプルを含む。これらのサンプルは−２０℃で、アリコートで保存した。
【００３０】
ペプチドおよびペプチド−ＭＤＡ複合体に対する自己抗体（ペプチドＥＩＡ）
ネイティブなペプチドおよびＭＤＡ−修飾型ペプチドは、常にサンプルプレート上で試験した。プレートの１／２をネイティブなペプチド（２０μｇ／ｍｌ）でコーティングし、他方の１／２をＭＤＡ修飾型ペプチド（２０μｇ／ｍｌ）でコーティングした［重炭酸塩緩衝液（１００ｍｍｏｌ／ｌ、ｐＨ９．５）中１００μｌ／ウェル］。コーティングしたプレートを室温（ＲＴ）で一晩インキュベートし、次いで、０．０５％　Ｔｗｅｅｎ２０を含むリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）を用いて自動洗浄機（Ｗｅｌｌｗａｓｈ４ＭＫＩＩ、Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ Ｏｙ）で３回洗浄した。プレートを、１％ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を含有するＰＢＳ（１５０μｌ／ウェル）を用いて室温で１時間ブロックし、上記のように洗浄した。０．２％ＨＳＡおよび０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳ中で血清サンプルを希釈（１：２０）し、１００μｌ／ウェルにピペッティングした。プレートを室温で２時間インキュベートし、上記のように洗浄した。ＨＲＰ結合型抗ヒトＩｇＧ（サンプル緩衝液中で１：２００００に希釈）を各ウェルに加え（１００μｌ）、室温で１時間インキュベートした。洗浄後、ペルオキシダーゼ基質（発色源としてテトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）、１００μ／ウェル）を添加し、プレートを暗所にて室温で３０分間インキュベートすることにより発色した。０．５ｍｏｌ／ｌ Ｈ２ＳＯ４（１００μｌ／ウェル）を用いて反応を停止させ、４５０ｎｍで吸光度を測定した（Ｍｕｌｔｉｓｋａｎマイクロプレートリーダー、Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ Ｏｙ）。結果を表２に示す。この結果は、ブランク対照を差し引いた後の、ネイティブなペプチドおよび修飾型ペプチドについて得られた吸光度測定値、またはネイティブなペプチドおよび修飾型ペプチドに対する抗体結合の比として表されている。
【００３１】
【表２】
2004504327.tif 000003
【００３２】
比の値に基づくと、ペプチドＥＩＡおよびヒトＬＤＬベースのｏｘＬＳＬ ＥＩＡを用いて試験した場合は、抗体の量は対照の場合よりも患者サンプルの場合の方が高かった。ネイティブおよび修飾型（ペプチド）抗原を用いる自己抗体の反応は、ｏｘＬＤＬ−ＥＩＡおよびペプチド−ＥＩＡの場合は類似している。なぜならば、修飾型抗原（ｏｘＬＤＬおよびＭＤＡｐ６３）はネイティブな抗原（ｎａｔＬＤＬおよびｎａｔｐ６３）よりもより良く認識されるからである（すなち、修飾型抗原に対する特異性のほうが高い）。ペプチド−ＥＩＡに関する結果は、ｏｘＬＤＬ−ＥＩＡに関する結果よりも有意に良好である。
【００３３】
ペプチド−ＭＤＡ複合体を抗原として使用する場合、自己抗体が、ペプチド、ＭＤＡ、または両方と反応するかどうかを調べるために、マイクロタイタープレートをｎａｔｐ６３、ＭＤＡおよびＭＤＡｐ６３抗原を用いてコーティングし、イムノアッセイを行った。ＭＤＡ抗原は、ペプチドを用いずにＭＤＡｐ６３抗原と同様にして製造し、ＭＤＡをＭＤＡｐ６３と同様にしてコーティングのために希釈した。自己抗体のＭＤＡｐ６３との反応は、対照中のｎａｔｐ６３およびＭＤＡとの反応よりも高かった（それぞれ、０．５３３±０．０７７、０．２８２±０．１００および０．３００±０．０１９、平均値±ＳＤ、ｎ＝２３、患者サンプルの場合、それぞれ、０．４３１±０．０４０、０．２２２±０．０４１および０．３３８±０．０００、ｎ＝１６）。この結果は、最適な認識にペプチドおよびＭＤＡの両方が必要であることを示している。
【００３４】
ｎａｔｐ６３、ＭＤＡおよびＭＤＡｐ６３に対する抗体間のスピアマンの相関係数を計算した。対照および患者サンプルの場合、抗ＭＤＡおよび抗ＭＤＡｐ６３抗体は相関した（それぞれ、ｒ＝０．５８１、ｐ＝０．００４およびｒ＝０．５８２、ｐ＝０．０１８）が、抗ｎａｔｐ６３および抗ＭＤＡ抗体は相関しなかった（それぞれ、ｒ＝０．２９７、ｐ＝０．１６９およびｒ＝０．１１２、ｐ＝０．６８）。これは、異なる抗体がＭＤＡおよびｎａｔｐ６３と反応することを示し、ペプチド−ＭＤＡ複合体が最適抗原であることの証拠である。
【００３５】
実施例２
何がＥＩＡに対するペプチドの最も良い修飾であるかを見出すために、６個の異なる形態のペプチドｐ６３を試験した。
線状ｐ６３（ｐ６３）
ＭＤＡで修飾したｐ６３（ｐ６３−ＭＤＡ）
ＭＤＡおよびホスファチジルエタノールアミンを用いて修飾したｐ６３（ｐ６３−ＰＥＡ−ＭＤＡ）
ペプチドの両端に２個の余分なアミノ酸（グリシンおよびシステイン）を含有する線状形態のｐ６３（ｐ２４４）；配列番号５を参照のこと。
環状ｐ２４４（ｐ２４４ｃｙｃ）
ＭＤＡで修飾した環状ｐ６３（ｐ２４４ｃｙｃ−ＭＤＡ）
【００３６】
線状ペプチドｐ２４４を抗原として用いた場合に、患者サンプルにおける自己抗体の量が最も高かった（表３）。また、環状ペプチド（ｐ２４４ｃｙｃ）に対する抗体力価はｐ６３−ＭＤＡに対する抗体力価よりもわずかに高かった。この実験において、自己抗体は、ペプチド有り、脂質無しの場合に最も良く反応した。
【００３７】
特異性研究
異なる抗原の特異性をペプチドの力価測定により試験した。図１は、１つの患者サンプルを用いて試験した４個のペプチド抗原に対する力価曲線を示す。さらに、環状ペプチドおよび線状ペプチド（ｐ２４４ｃｙｃおよびｐ２４４）に対する抗体の特異性を、０．５Ｍ塩化ナトリウムをサンプル希釈物に加えることにより試験した。塩をサンプル希釈物に加えた場合、ｐ２４４、ｐ２４４ｃｙｃおよびｐ６３−ＭＤＡに対する患者サンプルの力価は、それぞれ、１９％、３８％および４７％低かった（２０個の患者サンプルの平均値）。おそらく、ｐ２４４に対する抗体が最も良い特異性を有する。
【００３８】
阻害研究
漸増濃度のペプチドをサンプル希釈物に加えることにより、環状ペプチド（ｐ２４４ｃｙｃ）および対応する線状ペプチド（ｐ２４４）の特異性を阻害試験で試験した。ｐ２４４ｃｙｃペプチドは最も高いインヒビター濃度（１００μｇ／ｍｌ）で阻害し、８個の患者サンプルの結合の平均は６１％であった（図２Ａ）。３個のサンプルは５０％未満で阻害された。ｐ２４４は最も高いインヒビター濃度（１００μｇ／ｍｌ）で阻害し、２４個の患者サンプルの結合の平均は７０％であった（図２Ｂ）。３個のサンプルは５０％未満で阻害された。ｐ２４４はおそらくｐ２４４ｃｙｃペプチドよりも特異的であるようである。最終的に、プレートをｐ２４４でコーティングし、患者サンプルのｐ６３との結合を阻害することにより、ｐ２４４のエピトープはｐ６３に類似することが確認された。ｐ６３は最も高い阻害濃度（１００μｇ／ｍｌ）で阻害し、２２個の患者サンプルの結合の平均は５３％であった（図３）。９個のサンプルは５０％未満で阻害した。
【００３９】
ｐ２４４の修飾
これまでの結果をまとめると、患者サンプルはペプチド２４４により最も良く認識されるようである。それゆえ、修飾型ｐ２４４をＭＤＡを用いて修飾し、ｐ２４４およびｐ２４４−ＭＤＡの両方をＥＩＡにおける抗原として使用した。ｐ２４４およびｐ２４４−ＭＤＡに対する患者サンプルの力価（平均値±ＳＤ）は対照サンプルの力価よりもわずかに高かった（表５）。
【００４０】
ペプチドＥＩＡの評価
ＣＨＤの症状を有する患者の２０５個のサンプルを分析した。患者を血管造影法により試験し、０−、１−、２−または３−脈管疾患として分類した。ペプチドｐ２４４およびｐ２４４−ＭＤＡをペプチドＥＩＡにおける抗原として使用し、結果をヒト−ＬＤＬ−ベースのｏｘＬＤＬ ＥＩＡと比較した。
【００４１】
ｐ２４４−ＭＤＡに対する自己抗体の力価は、３−脈環疾患を有する患者において、０−、１−または２−脈管疾患を有する患者と比較して最も高かった（ＡＮＯＶＡ ｐ＝０．０２６８）。ヒト−ＬＤＬ−ベースのｏｘＬＤＬ（ｎ＝１８５）に対する自己抗体の力価は、ｐ２４４に対する力価と相関し（ｒ＝０．２２７ ｐ＝０．００１９）、ならびにｐ２４４−ＭＤＡに対する力価と相関していた（ｐ＝０．２１７ ｐ＝０．００３）。ペプチドｐ２４４およびｐ２４４−ＭＤＡに対する自己抗体の力価を、抗ｏｘＬＤＬ力価に基づいて４つのグループに分類したヒト−ＬＤＬ−ベースのｏｘＬＤＬに対する自己抗体の力価と比較した場合に相関が確認された（第１四分位値．０．０７２−０．２２（ｎ＝３７）、第２四分位値．０．２２−０．３６（ｎ＝４４），第３四分位値．０．３６−０．６３（ｎ＝５７）および第４四分位値．０．６３−２．７５７（ｎ＝６８））（図４）。さらに、本発明者らはｐ２４４およびｐ２４４−ＭＤＡに対する抗体の量を、ｔｈｅ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ｈｅａｒｔ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ（ＮＹＨＡ）心疾患分類（ｈｅａｒｔ ｄｉｓｅａｓｅ ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ）に従って分類した狭心症症状と比較した（ＮＹＨＡ−１ ｎ＝５、ＮＹＨＡ−２ ｎ＝１２、ＮＹＨＡ−３ ｎ＝２７およびＮＹＨＡ−４ ｎ＝１４）。本発明者らは、狭心症の症状が強まると抗体力価が上昇することを見出した（図５）。ＮＹＨＡクラス分けと比較した冠状血管狭窄の総和（ＮＹＨＡ−１ ｎ＝１４、ＮＹＨＡ−２ ｎ＝２６、ＮＹＨＡ−３ ｎ＝５７およびＮＹＨＡ−４ ｎ＝２９）は、冠状動脈性心臓病の進行に伴う、さらに深刻な症状を示した（図６）。この結果は、冠状血管造影法を用いて試験した冠状血管狭窄の総和、ならびに抗体が狭心症症状の重篤さと相関することを示した。
【００４２】
【表３】
2004504327.tif 000004
値は、ブランクを差し引いた後の平均吸光度±ＳＤである。
【００４３】
【表４】
2004504327.tif 000005
値は、ブランクを差し引いた後の平均吸光度±ＳＤである。
【図２Ａ】
2004504327.tif 000006
【図２Ｂ】
2004504327.tif 000007
【図３】
2004504327.tif 000008
【図４】
2004504327.tif 000009
【図５】
2004504327.tif 000010
【図６】
2004504327.tif 000011
【国際公開パンフレット】
2004504327.tif 000012
2004504327.tif 000013
2004504327.tif 000014
2004504327.tif 000015
2004504327.tif 000016
2004504327.tif 000017
2004504327.tif 000018
2004504327.tif 000019
2004504327.tif 000020
2004504327.tif 000021
2004504327.tif 000022
2004504327.tif 000023
2004504327.tif 000024
2004504327.tif 000025
2004504327.tif 000026
2004504327.tif 000027
2004504327.tif 000028
2004504327.tif 000029
2004504327.tif 000030
2004504327.tif 000031
2004504327.tif 000032
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004504327.tif 000033
【国際調査報告】
2004504327.tif 000034
2004504327.tif 000035
2004504327.tif 000036
2004504327.tif 000037
2004504327.tif 000038