(57)【要約】規定のＣｐＧジヌクレオチドでの混成のＤＮＡメチル化状態をもつＤＮＡ分子プールにおける特定のＤＮＡ配列中の上記ＣｐＧジヌクレオチドでヘミメチル化されているＤＮＡ分子の割合の決定方法を開示する。前記ＣｐＧジヌクレオチドで生じる、細胞分裂あたりの新規−、そして維持−メチル化率の計算方法をも開示する。その上、ヘミメチル化を計測、定量に使用するための、そして新規−と維持−メチル化率を計算するためのメチル化キットを開示する。
2004535757.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
パリンドロームＣｐＧ部位での混成のＤＮＡメチル化状態をもつＤＮＡ分子プール中、パリンドロームＣｐＧメチル化部位内の特定のＣｐＧジヌクレオチド配列でヘミメチル化されたＤＮＡ分子の割合の決定方法であって、以下の：
単離されたゲノムＤＮＡサンプルを得；
パリンドロームＣｐＧメチル化部位を含むモチーフを認識配列に従って切断する、過剰量のメチル化感受性制限エンドヌクレアーゼにより上記ＤＮＡサンプルを消化し、ここで、上記それぞれのパリンドロームＣｐＧメチル化部位のメチル化状態がヘミメチル化又は完全なメチル化ではなく、非メチル化であるとき、上記エンドヌクレアーゼは、特定の認識モチーフの位置で上記ＤＮＡを切断する；
上記のエンドヌクレアーゼにより消化されたＤＮＡを亜硫酸水素塩により処理し、ここで、ＤＮＡの両鎖上の非メチル化シトシン残基がウラシルに変換される；
パリンドロームＣｐＧメチル化部位の亜硫酸水素塩処理された特定のＣｐＧジヌクレオチドを含む特定の認識モチーフ位置の側面に位置するプライマーを用いて、亜硫酸水素塩処理された消化ＤＮＡの１本の鎖を増幅し、ここで、全てのウラシル残基がチミジン残基に変換される；そして
特定のＣｐＧジヌクレオチドの最初のヌクレオチド位置に相当する位置でシトシン又はチミジンのいずれかの存在を、増幅産物又はその個々のクローンの配列分析により測定する、ここで、特定のＣｐＧジヌクレオチドでヘミメチル化されているＤＮＡ分子の割合を、配列分析により得られた結果を平均することにより決定する、
を含む上記決定方法。
【請求項２】
前記制限エンドヌクレアーゼがＨｐａＩＩである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記亜硫酸水素塩処理されたＤＮＡの増幅がＰＣＲにより起こる、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記配列分析を、Ｍｓ−ＳＮｕＰＥ、ＣＯＢＲＡ、ＤＧＥ、メチライト、ＭＳＰ、ＭＣＡ、ダイレクト・シークエンシング、ハイブリッド形成アレイ、及びそれらの組み合わせから成る群から選ばれる配列決定法により実施する、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記ゲノムＤＮＡサンプルを、第２の制限エンドヌクレアーゼにより消化することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記第２の制限エンドヌクレアーゼがＲｓａＩである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
パリンドロームＣｐＧメチル化部位内の特定のＣｐＧジヌクレオチド配列での新規メチル化率（ｎ）又は維持メチル化率（ｍ）の少なくとも１方の計算方法であって、以下の：
Ｓ値を測定し、ここで、Ｓは２つの単独のＤＮＡ鎖の内の１つの亜硫酸水素塩分析によって、メチル化されていないことが請求項１に記載の方法により確認された特定のＣｐＧジヌクレオチドでのシトシンの割合である；
Ｐ値を測定し、ここで、Ｐは２つの単独のＤＮＡ鎖の内の１つの亜硫酸水素塩分析によって、メチル化されていることが請求項１に記載の方法により確認された特定のＣｐＧジヌクレオチドでのシトシンの割合である；
Ｄが１００−２Ｓであるとして、Ｄを決定し；
Ｈが２ＳＰ／（Ｓ＋Ｄ）であるとして、Ｈを決定し；
ＦがＤＰ／（Ｓ＋Ｄ）であるとして、Ｆを決定し；そして
Ｕが１００−Ｈ−Ｆであるとして、Ｕを決定する、ここで、特定のＣｐＧジヌクレオチド配列での新規メチル化率（ｎ）が、ｎ＝１−（Ｕ／（Ｕ＋Ｈ／２））と規定され、ｎは、細胞分裂あたりの、完全にメチル化されたＣｐＧへの変換を受ける、ＤＮＡ合成後にメチル化されていない特定のＣｐＧジヌクレオチド配列の割合である、並びにここで、特定のＣｐＧジヌクレオチド配列での維持メチル化率（ｍ）が、ｍ＝１−（Ｈ／（Ｆ＋Ｈ／２））と規定され、ｍは、細胞分裂あたりの、完全にメチル化されたＣｐＧへの変換を受ける、ＤＮＡ合成後にヘミメチル化された特定のＣｐＧジヌクレオチド配列の割合である、
を含む上記計算方法。
【請求項８】
前記Ｓ及びＰの測定が、同じＤＮＡ鎖の分析に基づく、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
パリンドロームＣｐＧメチル化部位内の特定のＣｐＧジヌクレオチド配列での維持メチル化率（ｍ）の計算方法であって、以下の：
Ｓ値を測定し、ここで、Ｓは２つの単独のＤＮＡ鎖の内の１つの亜硫酸水素塩分析によって、メチル化されていないことが、請求項１に記載の方法により確認された特定のＣｐＧジヌクレオチドでのシトシンの割合である；
Ｐ値を測定し、ここで、Ｐは２つの単独のＤＮＡ鎖の内の１つの亜硫酸水素塩分析によって、メチル化されていることが、請求項１に記載の方法により確認された特定のＣｐＧジヌクレオチドでのシトシンの割合である；
Ｄが１００−２Ｓであるとして、Ｄを決定し；
Ｈが２ＳＰ／（Ｓ＋Ｄ）であるとして、Ｈを決定し；そして
ＦがＤＰ／（Ｓ＋Ｄ）であるとして、Ｆを決定する、ここで、特定のＣｐＧジヌクレオチド配列での維持メチル化率（ｍ）が、ｍ＝１−（Ｈ／（Ｆ＋Ｈ／２））と規定され、ｍは、細胞分裂あたりの、完全にメチル化されたＣｐＧへの変換を受ける、合成後にヘミメチル化された特定のＣｐＧジヌクレオチド配列の割合である、
を含む上記計算方法。
【請求項１０】
前記Ｓ及びＰの測定が、同じＤＮＡ鎖の分析に基づく、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
ＣｐＧでの混成のＤＮＡメチル化状態をもつＤＮＡプール中、特定のＣｐＧジヌクレオチドでヘミメチル化されたＤＮＡ分子の割合の計測に有用な、１以上の容器に入ったメチル化検出キットであって、以下の：
パリンドロームＣｐＧメチル化部位を含むモチーフを認識配列に従って切断する、メチル化感受性制限エンドヌクレアーゼ、ここで、上記それぞれのパリンドロームＣｐＧメチル化部位のメチル化状態が、ヘミメチル化又は完全なメチル化ではなく、非メチル化であるとき、上記エンドヌクレアーゼは、特定の認識モチーフ位置でＤＮＡを切断する；及び
特定の認識モチーフ位置の側面に位置する増幅プライマー、
を含む上記メチル化検出キット。
【請求項１２】
亜硫酸水素塩処理試薬をさらに含む、請求項１１に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
関連特許
本特許出願は、２０００年１１月８日に提出された、ヘミメチル化の検出及び定量のための新規アッセイ法と題された米国仮特許出願番号第６０／２４７，１９１号に対する優先権の利益を主張する。
【０００２】
本発明の技術分野
本発明は、ＤＮＡのメチル化、特にヘミメチル化に関する。本発明は、上記ＣｐＧジヌクレオチドでの混成のＤＮＡのメチル化状態をもつＤＮＡ分子のプール中、ＤＮＡ分子の断片、すなわち特定のＤＮＡ配列中の特定のＣｐＧジヌクレオチドでのヘミメチル化を計測する方法を提供する。本発明は、上記ＣｐＧジヌクレオチドで起こる、細胞分裂あたりの新規−、及び維持−メチル化の割合を計算するための方法をも提供する。
【０００３】
本発明の背景
腫瘍形成の初期遺伝子変化の同定は、分子的癌研究の第一の焦点である。癌に関連した遺伝子の変更の性質及びパターンの特徴づけは、癌の早期検出、診断、及び治療を可能にする。脊椎動物におけるそのような遺伝子の変更は、一般に：遺伝物質の取得か損失；遺伝物質の突然変異；又は「ＣｐＧ島」内のＣｐＧジヌクレオチドのシトシン残基のメチル化の３種類のいずれかに分類される。これら中でＤＮＡのメチル化が唯一可逆的であり、そしてメチル化状態の変化が、遺伝子発現（例えば、ＣｐＧ島か、又はプロモーター領域の付近に位置する遺伝子の転写促進）かゲノムの安定性に影響することが知られている。
【０００４】
高等な真核生物体において、ＤＮＡは、ＣｐＧジヌクレオチド内で、グアノシンに対して５’側に位置するシトシンだけでメチル化される。遺伝子配列のプロモーター領域内に位置するＣｐＧの多い部位（ＣｐＧ島）がそれに関与するとき、この修飾はほとんどの遺伝子発現に対し重要な調節的影響を与える。ＣｐＧ島の幅広いメチル化は、選ばれたインプリンティング遺伝子の転写不活化、及び女性の不活性なＸ染色体上の遺伝子に関係する。通常メチル化されないＣｐＧ島の異常なメチル化は、不死化及び形質転換細胞において頻繁な事件として説明されており、そしてヒトの癌において腫瘍抑制遺伝子の転写不活化にしばしば関係している。
【０００５】
ＤＮＡメチル化酵素は、普遍的なメチル供給体からのメチル基、例えばＳ−アデノシル・メチオニンを、ＤＮＡ上の特定の部位に移す。哺乳動物細胞は、ＣｐＧジヌクレオチド（ＣｐＧ）のグアニンの５’側に隣接する、ＤＮＡ上のシトシン残基をメチル化するメチル化酵素を有する。このメチル化は遺伝子不活化、細胞分化、腫瘍形成、Ｘ染色体不活化、及びゲノム・インプリンティングの役割を担う。Ｘ染色体不活化、及び５’制御的な部位のメチル化が転写抑制をもたらすことができる、また親の特定のインプリンティングの間を除いて、正常な細胞でＣｐＧ島はメチル化されていないままである。ＤＮＡのメチル化は、そのコード機能を変えることなくＤＮＡの塩基配列を修飾するための機構でもある。ＤＮＡのメチル化は、遺伝性で、可逆的で、後成的な変化である。しかしながら、ＤＮＡのメチル化は、重大な発生上の及び遺伝子的な影響を生じる、遺伝子発現を変える能力を持っている。
【０００６】
ＤＮＡのメチル化は、哺乳動物の発生のために必要とされるが（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．， １９９２；Ｏｋａｎｏ ｅｔ ａｌ．， １９９９）、しかしながらメチル化パターンの確立及び複製を担う機構は、全くと言ってよいほど知られていないままである。５−メチルシトシンは、ゲノムに不均整に分配され、インプリンティング遺伝子のプロモーター及び不活性なＸ染色体上の遺伝子を除いて、体細胞内のほとんどのＣｐＧ島がメチル化されないままなのでＣｐＧが乏しい領域で最も一般に見られる（ｂｉｒｄ ｅｔ ａｌ．， １９８５）。
【０００７】
メチル化は、特徴的にパリンドロームＣｐＧジヌクレオチドの状況だけでなく、メチル基をＳ−アデノシルメチオニンからピリミジン環の５’位置に移す、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ（「Ｄｎｍｔｓ」）により触媒された過程により、シトシンがＤＮＡに組み込まれた後に生じる（Ｒａｍｓａｈｏｙｅ ｅｔ ａｌ．， ２０００）。３種類のＤｎｍｔ酵素がマウス及びヒトで知られていて、これらは重複するが、しかし「ヘミメチル化する」及び完全な非メチル化ＣｐＧジヌクレオチド対をメチル化する明瞭な能力を持っている。ヘミメチル化は、一方がＣ−５位置でメチル化されており、そして他方がされていないという点で異なる、単独のパリンドロームＣｐＧジヌクレオチドのいずれか一方のＤＮＡ鎖上の２つの対立するシトシンの状態として定義される。
【０００８】
細胞内の主要なＤｎｍｔである、Ｄｎｍｔ１は、クローン化されて、Ｂｅｓｔｏｒとその同僚（１９８８年）により特徴づけられ、Ｓ期の核の複製機構に局所的に存在する（Ｌｅｏｎｈａｒｄｔ ｅｔ ａｌ．， １９９２；Ｒｏｕｎｔｒｅｅ ｅｔ ａｌ．， ２０００）。Ｄｎｍｔ１はヘミメチル化ＣｐＧ対に関して優先傾向を示すので（Ｇｒｕｅｎｂａｕｍ ｅｔ ａｌ．， １９８１； Ｂｅｓｔｏｒ ａｎｄ Ｉｎｇｒａｍ， １９８３）、ＤＮＡが複製された後に親の鎖に存在するメチル化パターンのコピーに関する優れた候補であるとみなされる。しかし、Ｄｎｍｔ１は、試験管内で非メチル化ＤＮＡを修飾することができ、よって新規メチル化の誘発に関する候補でもある。最近発見されたＤｎｍｔｓである、Ｄｎｍｔ３ａ及び３ｂ（Ｏｋａｎｏ ｅｔ ａｌ．， １９９８）は、試験管内で非メチル化及びヘミメチル化基質に関し同じ活性を示し（Ｏｋａｎｏ ｅｔ ａｌ．， １９９８）、そして培養（Ｈｓｉｅｈ， １９９９）及びショウジョウバエ（Ｌｙｋｏ ｅｔ ａｌ．， １９９９）中のトランスフェクトＤＮＡの新規メチル化が可能であることを示した。興味深いことに、付随ＤＮＡは、ヒトＤＮＭＴ３Ｂ酵素に対する好ましいターゲットであると思われる、なぜなら、これらの付随ＤＮＡ配列が、特に、ＤＮＭＴ３Ｂ遺伝子の生殖細胞系突然変異により特徴づけられるＩＣＦ症候群の患者においてメチル化下にあるためである（Ｈａｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．， １９９９； Ｏｋａｎｏ ｅｔ ａｌ．， １９９９； Ｘｕ ｅｔ ａｌ．， １９９９）。
【０００９】
残念ながら、前記Ｄｎｍｔｓの同定にもかかわらず、一方でＤＮＡのメチル化は、遺伝子調節、及び癌、特にＣｐＧ島の状況に関係していると見なされ、これらの過程における、特定のＣｐＧ部位のヘミメチル化の、あるいはＣｐＧの乏しいＤＮＡ部位のヘミメチル化の全般的な程度の重要性についてわずかにしか知られていない。この知識は、特定のＣｐＧジヌクレオチドのヘミメチル化の特徴（例えば、範囲、比率）を計測する方法を必要とする。
【００１０】
従って、ＤＮＡのＣｐＧが乏しい部位のメチル化パターンの複製における特定のＤｎｍｔｓの役割を決定するために本技術分野における必要性がある。その上、上記ＣｐＧジヌクレオチドに混成のＤＮＡメチル化状態をもつＤＮＡ分子のプール中の、特別なＤＮＡ塩基配列における、特定のＣｐＧジヌクレオチドでヘミメチル化されたＤＮＡ分子の比を計測するための方法の必要性が本技術分野にある。さらに、上記ＣｐＧジヌクレオチドで生じる、細胞分裂あたりの新規、及び維持−メチル化の比率を計算するための方法が本技術分野に必要とされている。
【００１１】
本発明の概要
本発明は、そのＣｐＧジヌクレオチドでの混成のＤＮＡメチル化状態を有するＤＮＡプールにおける、特定のＣｐＧジヌクレオチドでヘミメチル化されているＤＮＡ分子の比を計測するための方法を提供し、それは、以下のステップ：様々な細胞型からＤＮＡを取り出し；パリンドロームＣｐＧメチル化部位を含む認識配列モチーフに従って切断し、過剰なメチル化感受性制限エンドヌクレアーゼによりＤＮＡサンプルを消化し、ここでそれぞれのパリンドロームＣｐＧメチル化部位のメチル化状態がヘミメチル化又は完全なメチル化を除く、メチル化されていない場合、エンドヌクレアーゼが特定の認識モチーフの位置でＤＮＡを切断する（例えば、ＨｐａＩＩ）；亜硫酸水素塩によりＤＮＡを処理し；特定の認識モチーフ位置（例えばＨｐａＩＩ部位）の側面に位置するプライマーを用いたＰＣＲにより処理したＤＮＡを増幅し；そして特定のＣｐＧジヌクレオチドの最初の位置のＣかＴの存在について個々のクローン化ＰＣＲ産物の配列分析で得られた結果の平均化によりヘミメチル化の程度を決定する、を含む。好ましくは、特定のＣｐＧジヌクレオチドの最初の位置のＣかＴの存在に関する個々のクローン化ＰＣＲ産物の分析は、メチル化感受性単ヌクレオチド・プライマー伸長（Ｍｓ−ＳＮｕＰＥ）アッセイ（Ｇｏｎｚａｌｇｏ ａｎｄ Ｊｏｎｅｓ， １９９７）を使って達成された。
【００１２】
本発明によると、新規メチル化及び維持メチル化の細胞分裂あたりの平均比率は、たった２つの測定可能な変数：Ｓ＝先立つＨｐａＩＩ消化を伴う、亜硫酸水素塩分析により２本の単独ＤＮＡ鎖の一方がメチル化されていないことが見つかったＣｐＧｓ内のシトシンの割合；そしてＰ＝先立つＨｐａＩＩ消化を伴わない、亜硫酸水素塩分析により２本のＤＮＡ鎖の一方がメチル化されていることが分かったＣｐＧｓ内のシトシンの割合、により示される。
【００１３】
本発明は、ＨｐａＩＩ部位内の単一のＣｐＧジヌクレオチドの新規メチル化率（ｎ）と維持メチル化率（ｍ）を計算するための方程式の新規セットをさらに提供する。本発明は、ＨｐａＩＩ部位内の単一のＣｐＧジヌクレオチドでの新規メチル化率（ｎ）と維持メチル化率（ｍ）を計算するための方法をさらに提供し、それは以下の：変数Ｓ及び変数Ｐの値を測定し、ここで、Ｓ＝先立つＨｐａＩＩ消化を伴う、亜硫酸水素塩分析により２本の単独ＤＮＡ鎖の一方がメチル化されていないことが見つかったＣｐＧｓ内のシトシンの割合、およびＰ＝先立つＨｐａＩＩ消化を伴わない、亜硫酸水素塩分析により２本のＤＮＡ鎖の一方がメチル化されていることが分かったＣｐＧｓ内のシトシンの割合；そしてＤ＝１００−２Ｓとして：２本鎖の（完全な）メチル化（Ｄ）をもつＨｐａＩＩ抵抗分子の割合を計算し；それらに基づきＨ＝２ＳＰ／（Ｓ＋Ｄ）、及びＦ＝ＤＰ／（Ｓ＋Ｄ）、及びＵ＝１００−Ｈ−Ｆの値を決定することで、このＣｐＧジヌクレオチドでの新規メチル化率（ｎ）が、細胞分裂あたりの完全にメチル化されたＣｐＧへの転換を受けるメチル化されていない合成後ＣｐＧｓの比と規定され：ｎ＝１−（Ｕ／（Ｕ＋Ｈ／２））、ここで、このＣｐＧジヌクレオチドでの維持メチル化率（ｍ）が、細胞分裂あたりの完全にメチル化されたＣｐＧへの転換を受ける合成後ヘミメチル化ＣｐＧｓの比と規定される：ｍ＝１−（Ｈ／（Ｆ＋Ｈ／２））を含む。
本発明は、そのＣｐＧでの混成のＤＮＡメチル化状態を有するＤＮＡプール中の特定のＣｐＧジヌクレオチドでヘミメチル化されているＤＮＡ分子の比を計測するために有用なヘミメチル化検出キットをさらに提供する。
本発明は、パリンドロームＣｐＧメチル化部位内の単一のＣｐＧジヌクレオチドの新規メチル化率（ｎ）と維持メチル化（ｍ）の率を計測するために役立つヘミメチル化検出キットをさらに提供する。
【００１４】
本発明の詳細な説明
定義
「亜硫酸水素ナトリウム処理」は、亜硫酸水素ナトリウムによる本技術分野により認められたゲノムＤＮＡの処理を指し、ここでＤＮＡ中の非メチル化シトシンが脱アミノ化によりウラシルに変換され、そしてメチル化シトシン残基は保存される（Ｆｒｏｍｍｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．ＵＳＡ ８９：１８２７−３１，１９９２）。続くＰＣＲ増幅が、前記ウラシル残基をチミンで置き換え、そして５−メチルシトシン残基をシトシンで置き換える。
【００１５】
「ＧＣ含量」は、特定のＤＮＡ塩基配列内の［（Ｃ塩基の数＋Ｇ塩基の数）／各々の断片のバンド長］を指す。
「ＣｐＧ島」は、以下の基準（１）「観察された／期待される比率」＞０．６に相当するＣｐＧジヌクレオチドの頻度をもつこと、及び（２）「ＧＣ含量」＞０．５をもつこと、を満たすゲノムＤＮＡの隣接部位を指す。常にではないが、一般にＣｐＧ島は約０．２〜約１ ｋｂの長さがある。
「ＨｐａＩＩ」は、パリンドローム「ＣＣＧＧ」（トップ鎖）：「ＧＧＣＣ」（ボトム鎖）認識モチーフをもつ本技術分野で認められた制限エンドヌクレアーゼを指し、上記認識モチーフは、有効なメチル化部位として機能する２つのＣｐＧジヌクレオチド配列（各々のＤＮＡ鎖に１つずつ）を含む。
【００１６】
「ＲｓａＩ」は、「ＧＴＡＣ」（トップ鎖）：「ＣＡＴＧ」（ボトム鎖）認識モチーフをもつ本技術分野で認められた制限エンドヌクレアーゼを指す。
ＤＮＡ消化に使用されるメチル化感受性制限エンドヌクレアーゼの「過剰」は、正確度を裏付けるための亜硫酸水素塩処理の前に、反応条件の下、ＤＮＡのほぼ本質的に完全な消化を引き起こすのに十分な量を指す。
【００１７】
「メチル化状態」は、ＤＮＡ塩基配列内のＣｐＧジヌクレオチドの１つ又は大多数での、５−メチルシトシン（「５−ｍＣｙｔ」）の存在又は不存在を指す。（各々が２つのＣｐＧ ＣｐＧジヌクレオチド配列をもつような）そのようなＤＮＡ塩基配列内の１以上の特定のパリンドロームＣｐＧメチル化部位のメチル化状態は、「非メチル化」「完全なメチル化」、及び「ヘミメチル化」を含んでいる。
「ヘミメチル化」は、パリンドロームＣｐＧメチル化部位の２つのＣｐＧジヌクレオチド配列の一方の１つのシトシンだけがメチル化されている、パリンドロームＣｐＧメチル化部位のメチル化状態を指す（例えば、５’−ＣＣＭＧＧ−３’（トップ鎖）：３’−ＧＧＣＣ−５’（ボトム鎖））。
【００１８】
「高メチル化」は、正常な対照ＤＮＡサンプル中のＣｐＧジヌクレオチドに見られる５−ｍＣｙｔの量に対して、試験ＤＮＡサンプルのＤＮＡ塩基配列内のＣｐＧジヌクレオチドの１以上で増加した５−ｍＣｙｔに相当するメチル化状態を指す。
「低メチル化」は、正常な対照ＤＮＡサンプル中のＣｐＧジヌクレオチドに見られる５−ｍＣｙｔの量に対して、試験ＤＮＡサンプルのＤＮＡ塩基配列内のＣｐＧジヌクレオチドの１以上で減少した５−ｍＣｙｔに相当するメチル化状態を指す。
「新規メチル化」は、（パリンドロームＣｐＧメチル化部位内の）メチル化されていない合成後ＣｐＧジヌクレオチド配列の、完全にメチル化されたＣｐＧ配列への変換を指す。
【００１９】
「維持メチル化」は、（パリンドロームＣｐＧメチル化部位内の）合成後の、ヘミメチル化されたＣｐＧジヌクレオチド配列の、完全にメチル化されたＣｐＧ配列への変換を指す。
「メチル化アッセイ」は、ＤＮＡの配列内のＣｐＧジヌクレオチドのメチル化状態を測定するためのあらゆるアッセイを指す。
「Ｍｓ．ＡＰ−ＰＣＲ」（メチル化感受性アルビトラリリー−プライムド・ポリメラーゼ連鎖反応（Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ−Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ Ａｒｂｉｔｒａｒｉｌｙ−Ｐｒｉｍｅｄ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ））は、ＣｐＧジヌクレオチドを含むことが最も見込まれる部位に重点を置くための、ＣＧの多いプライマーを使ったゲノムの全体的なスキャンを可能にする本技術分野で認められた技術を指し、Ｇｏｎｚａｌｇｏ ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５７：５９４−５９９，１９９７に記載されている。
【００２０】
「メチライト（ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔ）」は、Ｅａｄｓ ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５９：２３０２−２３０６，１９９９に記載の、本技術分野で認められた蛍光に基づくリアルタイムＰＣＲ技術を指す。
「Ｍｓ−ＳＮｕＰＥ」（メチル化感受性単ヌクレオチド・プライマー伸長法（Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ−ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ Ｓｉｎｇｌｅ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｐｒｉｍｅｒ Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ））は、Ｇｏｎｚａｌｇｏ ＆ Ｊｏｎｅｓ， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２５：２５２９−２５３１， １９９７に記載の本技術分野で認められたアッセイを指す。
【００２１】
「ＭＳＰ」（メチル化特異的ＰＣＲ法）は、Ｈｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ． Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９３：９８２１−９８２６， １９９６及び米国特許第５，７８６，１４６号に記載の本技術分野で認められたメチル化アッセイを指す。
「ＣＯＢＲＡ」（複合亜硫酸水素塩制限分析法（Ｃｏｍｂｉｎｅｄ Ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ Ａｎａｌｙｓｉｓ））は、Ｘｉｏｎｇ ＆ Ｌａｉｒｄ， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２５：２５３２−２５３４，１９９７に記載の本技術分野で認められたメチル化アッセイを指す。
【００２２】
「ＭＣＡ」（メチル化ＣｐＧ島増幅法）は、Ｔｏｙｏｔａ ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５９：２３０７−１２，１９９９及びＷＯ ００／２６４０１ Ａ１に記載のメチル化アッセイを指す。
「ＤＧＥ」は、本技術分野で認められた２次元ゲル電気泳動（２−ＤＧＥ）の方法を指す。
【００２３】
概要
本発明は、ヘミメチル化レベルの定量のための新規、かつ、明快な技術を提供する。この方法の開発以前は、ゲノム中の特定のＣｐＧジヌクレオチドでのヘミメチル化レベルを測定するための正確な方法がなかった。その上、本発明により、ＣｐＧジヌクレオチドのヘミメチル化及び完全なメチル化の定常状態のレベルが、新規メチル化率及び維持メチル化率の計算を可能にするのに十分な情報を提供する。本発明は、この概念を反映する方程式の独特なセットを提供する。これが、Ｄｎｍｔ３ａ及び３ｂ酵素だけを含んでいる細胞がこの部位で新規メチルトランスフェラーゼ活性より多くの維持メチルトランスフェラーゼ活力を示すという発見に通じた。これは、主要な新規メチルトランスフェラーゼとしてのこれらの酵素に対する先の見解とは対照的であるが、しかしポスト−Ｄｎｍｔ１維持メチルトランスフェラーゼから成る我々の提案した概念を支持する。
【００２４】
このように、本発明は、そのＣｐＧジヌクレオチドでの混成のＤＮＡのメチル化状態をもつＤＮＡ分子のプール中、特別なＤＮＡ塩基配列の特定のＣｐＧジヌクレオチドでヘミメチル化されているＤＮＡ分子の比を計測するための方法を提供する。本発明は、前記ＣｐＧジヌクレオチドで生じる、細胞分裂あたりの新規及び維持メチル化率を計算する溜めの方法をも提供する。
【００２５】
研究のために選ばれた部位は、マウス乳腺及び胸腺組織で発現された遺伝子の転写部位だった。それは、しばしばプロモーター中にあるＣｐＧ島がメチル化を含むことがなく、そしてほとんどの５−メチルシトシンがコード領域と反復要素中で見つかるという、哺乳動物ゲノムの大多数の状況を代表している（Ｂｉｒｄ ｅｔ ａｌ．， １９８５年；Ｙｏｄｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９９７；Ｊｏｎｅｓ， １９９９）。重複する少なくとも３つの酵素と関係する複雑さのために、野生型細胞のメチル化のパターン及び動力学を、Ｄｎｍｔ１遺伝子の同型突然変異のいずれかを含む細胞又は二重のＤｎｍｔ３ａ／３ｂノックアウトと比較した。パルスチェイス実験は、現在の仮定に反して、ＤＮＡが合成の直後にその最終レベルまでメチル化されず、むしろそのメチル化は二相で生じたことを示した。前記データは、モデルとほぼ一致しており、ここでＤｎｍｔ１は、複製直後に働くが、しかしヘミメチル化ＤＮＡのギャップを残す。前記ギャップは、その後Ｄｎｍｔ３ａ及び／又は３ｂにより埋められ、故に新規メチルトランスフェラーゼとしてのそれらの潜在的な役割に加え「メチル化修復」酵素としての役割をもっている。
【００２６】
実験手順
ＥＳ細胞系．前記（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．， １９９２）のとおり、ＥＳ細胞培養、形質移入、及び選択を実行した。Ｊ１（Ｍ１／３Ａ／３Ｂ）は、近交系の１２９／Ｓｖ育ちの野生型ＥＳ細胞系である（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．， １９９２）。Ｄｎｍｔ１−／−（Ｍ３Ａ／３Ｂ）、Ｄｎｍｔ３ａ−／−（Ｍ１／３Ｂ）、Ｄｎｍｔ３ｂ−／−（Ｍ１／３Ａ）、及び［Ｄｎｍｔ３ａ−／−、Ｄｎｍｔ３ｂ−／−］（Ｍ１）ＥＳ細胞は、Ｏｋａｎｏ ｅｔ ａｌ．， （１９９９）により先に記載された。
【００２７】
パルスチェイスが実験．ＥＳ細胞を、６０ ｍｍ皿につき９×１０５細胞で、フィーダー細胞と一緒に撒き、７２時間後に１×１０−４ ＭのＢｒｄＵ（Ｓｉｇｍａ）を含んでいる２．５ ｍｌの培地により１時間パルスした。次に、ＢｒｄＵを含んでいる培地を除去し、細胞を３７℃の通常の培地で一度洗って、その後１×１０−４ Ｍのチミジン（Ｓｉｇｍａ）を補った培地４ ｍｌでチェイスした。抑制研究のために、ＢｒｄＵも１０−６ Ｍの５−Ａｚａ−ＣｄＲ（Ｓｉｇｍａ）、０．１ ｎｇ／ｍｌのトリコスタチン（ＴＳＡ）（Ｓｉｇｍａ）、５×１０−６ Ｍのアフィジコリン（Ｓｉｇｍａ）、又は５０ ｎｇ／ｍｌのコルセミド（Ｓｉｇｍａ）によりチェイスした。ゲノムＤＮＡを、１００ ｍＭ ＮａＣｌ、１０ ｍＭ ＥＤＴＡ、１％ ＳＤＳ、及び１ μｇ／ｍｌ プロテイナーゼＫを用いた溶解により得、そしてフェノール−クロロホルム抽出及びエタノール沈殿により精製した。ＤＮＡの収量及び純度を、光学濃度測定法により測定し、３００ μｇのＤＮＡを３０００ユニットのＲｓａＩ（Ｒｏｃｈｅ）により３７℃で１６時間消化した。消化されたＤＮＡを、再びフェノール−クロロホルム抽出、エタノール沈澱により精製し、５０ μｌの１０×免疫沈降緩衝液（リン酸ナトリウム（ｐＨ７．０））、０．１４ ＭのＮａＣｌ、０．０５％のトリトンＸ−１００）を含む５００ μｌのＴＥ緩衝液 ｐＨ７．５に再懸濁した。サンプルを９５℃で５分間変性し、２分間氷上で冷やし、そして１ μｇ ＤＮＡあたり２．４ μｌ抗ＢｒｄＵ抗体（２５ μｇ／ｍｌ）（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）と直ちに混合した（Ｒｉｄｅｏｕｔ ｅｔ ａｌ．， １９９４）。緩やかに振盪しながら室温で３０分間インキュベートした後に、１ μｇ ＤＮＡ（Ｓｉｇｍａ）につき０．４６ μｌの抗マウスＩｇＧウサギ（２．６ ｍｇ／ｍｌ）を加え、室温でもう３０分間インキュベーションを続けた。冷却微量遠心機による１３，０００ｒｐｍで５分間の遠心分離後に沈殿物を回収し、２００ μｌのＴＥ ｐＨ７．５中に溶かし、５０℃で１２時間超プロテイナーゼＫにより処理した。ＤＮＡを、フェノール−クロロホルム抽出、エタノール沈澱により蛋白質を取り除いた。
【００２８】
Ｍｓ−ＳＮｕＰＥ．Ｍｓ−ＳＮｕＰＥ技術は、ＤＮＡの亜硫酸水素塩処理、続くシングル・ヌクレオチド・プライマー伸長に基づく特定のＣｐＧ部位でのメチル化の相違を評価するための定量的手法である（Ｇｏｎｚａｌｇｏ ＆ Ｊｏｎｅｓ， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２５：２５２９−２５３１， １９９７）。要するに、ゲノムＤＮＡを、亜硫酸水素ナトリウムと反応させ５−メチルシトシンを変えないまま、非メチル化シトシンをウラシルに変える。次に、亜硫酸水素塩により変換されたＤＮＡに特異的なＰＣＲプライマーを使って所望の標的配列の増幅が実施し、そして得られた産物を単離し、着目のＣｐＧ部位でのメチル化分析のための鋳型として使用した。少量のＤＮＡ（例えば、顕微解剖した病理切片）をアッセイすることができ、ＣｐＧ部位でのメチル化状態を決定するための制限酵素の利用を回避する。（例えば、典型的なＭｓ−ＳＮｕＰＥベースのキットに見られる）Ｍｓ−ＳＮｕＰＥ分析のための典型的な試薬は、これだけに制限されることなく、以下の：特定の遺伝子（又はメチル化により変えられたＤＮＡ塩基配列又はＣｐＧ島）のためのＰＣＲプライマー；最適化されたＰＣＲ緩衝液とデオキシヌクレオチド；ゲル抽出キット；正の対照プライマー；特定の遺伝子のためのＭｓ−ＳＮｕＰＥプライマー；（Ｍｓ−ＳＮｕＰＥ反応のための）反応緩衝液；そして放射性ヌクレオチドを含んでいる。その上、亜硫酸水素塩変換試薬が、以下の：ＤＮＡ変性緩衝液；スルホン化緩衝液；ＤＮＡ回収試薬又はキット（例えば、沈殿、限外濾過、アフィニティカラム）；脱スルホン化緩衝液；そしてＤＮＡ回収成分を含んでいるかもしれない。
【００２９】
メチル化感受性単ヌクレオチド・プライマー伸長（Ｍｓ−ＳＮｕＰＥ）アッセイ．断片内のＣｐＧ部位２、３の平均シトシン・メチル化レベルを、Ｆｒｏｍｍｅｒ ｅｔ ａｌ．， （１９９２）に従い亜硫酸水素ナトリウムによるＤＮＡ（２ μｇ）の処理により測定した。メチル化分析を、メチル化感受性単ヌクレオチド・プライマー伸長（Ｍｓ−ＳＮｕＰＥ）アッセイ（Ｇｏｎｚａｌｇｏ ａｎｄ Ｊｏｎｅｓ， １９９７）を使って実施した。
【００３０】
以下、実施例１〜５に関して：
亜硫酸水素塩処理したＤＮＡの増幅のために使用したプライマーの配列は以下の通りだった：トップ鎖：５’プライマー（５’−ＡＡＴＧＴＧＴＡＡＴＡＴＴＴＴＴＡＴＧＧＴＴＴＴＴＴＴＡＧＡＡＴＧＧ−３’）（配列番号：１）、３’プライマー（５’−ＴＴＡＣＡＡＡＡＡＡＡＡＴＡＣＣＴＣＴＴＣＣＴＴＡＣＴＡＡＡＣ−３’）（配列番号：２）。ボトム鎖：５’プライマー（５’−ＴＧＧＴＡＴＴＴＧＧＡＡＡＧＡＴＴＧＴＡＧＧＡＡＡＧ−３’）（配列番号：３）、３’プライマー（５’−ＣＡＡＴＡＣＣＴＣＴＡＴＡＡＣＣＣＴＴＣＣＡＡＡ−３’）（配列番号：４）。ＰＣＲ反応を、２５ μｌの全容積中で以下の条件下で実施した：１００〜２００ ｎｇの亜硫酸水素塩処理したＤＮＡ、２０ ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、２．５ ｍＭのＭｇＣｌ２、１００ ｍＭのＫＣｌ、０．５ μＭの終濃度の各々のプライマー、各２００ μＭの４のデオキシヌクレオチド三リン酸塩、及びＴａｑポリメラーゼ抗体（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）と複合体を形成した０．５ ＵのＴａｑポリメラーゼ（Ｓｉｇｍａ）。ＤＮＡを、まず９４℃で５分間変性させ、９４℃で１分間、５６℃で５０秒間、及び７２℃で１分間を３５サイクルし、７２℃で４分間の最終伸長した。ＰＣＲ産物を、Ｑｉａｑｕｉｃｋゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ）によりゲル精製し、そしてこの鋳型を３０ μｌのＨ２Ｏ中に再懸濁した。
【００３１】
Ｍｓ−ＳＮｕＰＥプライマー：トップ鎖部位２に関して（５’−ＡＡＴＡＡＴＴＴＴＧＴＴＴＴＴＴＴＧＧＡＴＡＴＴ−３’）（配列番号：５）、部位３（５’−ＡＡＡＴＴＴＴＧＴＴＴＴＴＧＧＴＴＧＴＡＡＡ−３’）（配列番号：６）、ボトム鎖部位２に関して（５’−ＡＧＧＡＡＴＡＧＡＡＴＴＴＧＡＧＡＴＡＴＴ−３’）（配列番号：７）、部位３（５’−ＴＡＡＡＴＴＧＴＴＴＴＡＡＴＴＡＧＡＴＴＡＡＴＡＡ−３’）（配列番号：８）。
Ｍｓ−ＳＮｕＰＥ反応．Ｍｓ−ＳＮｕＰＥ反応を、１０ μｌの全容量で以下の条件下で実施した：４ μｌのＱｉａｑｕｉｃｋ産物、２０ ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、２．５ ｍＭのＭｇＣｌ２、１００ ｍＭのＫＣｌ、０．５ μｌの終濃度の各々のプライマー、そして１ μＣｉの ［３２Ｐ］ｄＣＴＰ又は［３２Ｐ］ｄＴＴＰのいずれか。プライマー伸長条件は：９５℃で２分間、５０℃で２分間、７２℃で１分間であった。前記反応物を、９５℃で５分間変性する前に、４ μｌの停止液と合わせ、そして１５％の変性ポリアクリルアミドゲル（７ Ｍの尿素）に添加した。メチル化レベルの定量を、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ ＰｈｏｓｐｈｏｒＩｍａｇｅｒで実施した。
【００３２】
以下、実施例６〜８に関して：
ＰＣＲプライマーを、亜硫酸水素塩変換ＤＮＡだけを増幅するように特別に設計し、対照実験は、これらのプライマーにより変換されていないＤＮＡの増幅がないことを示した。同様に、亜硫酸水素塩処理後のＰＣＲ産物の配列決定は、非ＣｐＧ部位での１％未満の残留Ｃｓを示し、このアッセイがＣｐＧ部位でのメチル化状態に関して有効だったことを示した。亜硫酸水素塩処理したＤＮＡの増幅のために使用したプライマーの配列は以下のとおりだった：
【００３３】
ＣＩ−ｆ．（トップ鎖）５’プライマー、５’−ＡＡＴＧＴＧＴＡＡＴＡＴＴＴＴＴＡＴＧＧＴＴＴＴＴＴＴＡＧＡＡＴＧＧ−３’（配列番号：１）、３’プライマー、５’−ＴＴＡＣＡＡＡＡＡＡＡＡＴＡＣＣＴＣＴＴＣＣＴＴＡＣＴＡＡＡＣ−３’（配列番号：２）。
ＣＩ−ｆ．（ボトム鎖）５’プライマー、５’−ＧＡＧＴＡＡＡＧＡＴＡＧＡＡＴＡＡＡＴＴＧＴＴＴＴＡＡＴＴＡＧ−３’（配列番号：１６）、及び３’プライマー、５’−ＣＡＡＴＡＣＣＴＣＴＡＴＡＡＣＣＣＴＴＣＣＡＡＡ−３’（配列番号：４）。
【００３４】
ＣＩＩ−ｄ．５’プライマー、５’−ＧＴＴＴＡＴＡＧＧＴＴＴＡＧＡＧＧＴＴＴＴ−３’（配列番号：１７）、３’プライマー、５’−ＡＡＣＡＣＡＴＡＡＡＣＣＴＡＴＴＴＴＡＡＡＣＴＴＡ−３’（配列番号：１８）。
Ａ−反復．５’プライマー、５’−ＴＧＡＴＴＴＡＴＴＴＡＴＴＡＧＡＧＧＴＴＴＴＡＧＧ−３’（配列番号：１９）、３’プライマー、３’−ＡＣＡＴＡＡＡＡＡＡＡＣＡＡＡＣＴＡＣＣＣ−３’（配列番号：２０）。
【００３５】
ＰＣＲ条件．ＣＩ−ｆ． ９５℃で２分間、９５℃で１分間、５６℃で５０秒間を３５サイクルし、そして７２℃で１０分間の最終伸長。．ＣＩＩ−ｄ：９５℃で２分間、９４℃で１分間、５０℃で５０秒間、及び７２℃で１．５分間を４０サイクル、そして７２℃で１０分間の最終伸長。Ａ−反復：９５℃で２分間、９４℃で１分間、５０℃で５０秒間、及び７２℃で１分間を４０サイクル、そして７２℃で１０分間の最終伸長。ＰＣＲ産物を、Ｑｉａｑｕｉｃｋゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ）によりゲル精製し、この鋳型を３０ μｌのＨ２Ｏで再懸濁した。
【００３６】
Ｍｓ−ＳＮｕＰＥプライマー．ＣＩ−ｆ：５’−ＡＡＴＡＡＴＴＴＴＧＴＴＴＴＴＴＴＧＧＡＴＡＴＴ−３’（配列番号：５）（ＨｐａＩＩ部位）；ＣＩＩ−ｄ：５’−ＴＴＴＴＡＴＴＴＡＴＴＧＴＴＡＴＴＡＴＧＧ−３’（配列番号：２１）（部位１）、５’−ＧＧＴＡＴＡＧＴＴＴＧＡＧＴＡＴ−３’（部位２）（配列番号：２２）、５’−ＴＡＴＴＴＴＴＴＡＡＴＡＧＴＡＴＴＡＴＴＴＴＴＴＡＴ−３’（配列番号：２３）（部位３、ＨｐａＩＩ部位）。
Ｍｓ−ＳＮｕＰＥ反応を、１０ μｌの全容量で以下の条件下で実施した：４ μｌのＱｉａｑｕｉｃｋ製品、２０ ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、２．５ ｍＭのＭｇＣｌ２、１００ ｍＭのＫＣｌ、０．５ μｌの終濃度の各々のプライマー、そして１ μＣｉの ［３２Ｐ］ｄＣＴＰ又は［３２Ｐ］ｄＴＴＰのいずれか。ＣＩ−ｆとＣＩＩ−ｄのプライマー伸長条件は：９５℃で１分間、４６℃で３０秒間、７２℃で２０秒間であった。前記反応物を、９５℃で５分間変性する前に、４ μｌの停止液と合わせ、そして１５％の変性ポリアクリルアミドゲル（７ Ｍの尿素）に添加した。メチル化レベルの定量を、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ ＰｈｏｓｐｈｏｒＩｍａｇｅｒで実施した。
【００３７】
Ｍｓ−ＳＮｕＰＥによる亜硫酸水素塩ゲノム配列決定。Ｍｓ−ＳＮｕＰＥ又は自動ＤＮＡシーケンサーによる亜硫酸水素塩ゲノム配列決定。慣習的に、パターンは、個々の亜硫酸水素塩処理された分子のクローン化、続くＤＮＡ塩基配列決定法により決定される。４つの部位がどのようにメチル化されたか（ＣＩ−ｆ及びＣＩＩ−ｄ）をより速く評価するＭｓ−ＳＮｕＰＥ分析のために、別個にクローン化された分子を対象にするのが適当であった。亜硫酸水素塩変換されたＤＮＡからのＰＣＲ産物を、ｐＣＲＩＩクローニング・ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ）中に連結した。個々のプラスミド・クローンを、Ｍ１３プライマー（前方及び後方）により増幅した。このＰＣＲ産物をＭｓ−ＳＮｕＰＥによる配列決定に使用した。条件は、前記と同じものである。プライマーの配列は、ＣＩ−ｆに関して、部位１（５’−ＴＡＴＧＧＴＴＴＴＴＴＴＡＧＡＡＴＧＧ−３’）（配列番号：９）、部位２（５’−ＡＡＴＡＡＴＴＴＴＧＴＴＴＴＴＴＴＧＧＡＴＡＴＴ−３’）（配列番号：１０）、部位３（５’−ＡＡＡＴＴＴＴＧＴＴＴＴＴＧＧＴＴＧＴＡＡＡ−３’）（配列番号：１１）、部位４（５’−ＴＴＧＴＴＧＴＴＡＴＧＴＧＴＡＡＴＴＡＴＴＴＴＴＴ−３’）（配列番号：１２）；そしてＣＩＩ−ｄに関して（部位４）：５’−ＴＴＴＴＡＴＴＴＡＴＴＧＴＴＡＴＴＡＴＧＧ−３’（配列番号：２４）、５’−ＧＧＴＡＴＡＧＴＴＴＧＡＧＴＡＴ−３’（配列番号：２５）、５’−ＴＴＴＴＴＴＡＡＴＡＡＧＧＴＴＡＴＡＴＴＴＴＴＴ−３’（配列番号：２６）、５’−ＴＡＴＴＴＴＴＴＡＡＴＡＧＴＡＴＴＡＴＴＴＴＴＴＡＴ−３’（配列番号：２７）。
Ａ−反復のクローンを、ＵＳＣ／Ｎｏｒｒｉｓ Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｎｔｅｒ 微量化学施設の自動ＤＮＡシーケンサーにより配列決定した。
【００３８】
５−Ａｚａ−ＣｄＲ処理．細胞を蒔き（２×ｌ０６細胞／６０ ｍｍ皿）、２４時間後に、３×１０−７ Ｍの５−Ａｚａ−ＣｄＲ（Ｓｉｇｍａ）で処理した。培地を、薬物処理の２４時間後、そして連日交換した。記載されたように、処理後の指示された時点でＤＮＡを単離した（Ｐｆｅｉｆｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．ＵＳＡ ８７：８２５２−８２５６， １９９０）。
ヘミメチル化アッセイ．完全に又はヘミメチル化配置のいずれかにあり、亜硫酸水素塩処理が続いた配列ＣＣＧＧを、酵素ＨｐａＩＩが切断しないという事実を、ＨｐａＩＩに感受性がない部位のＣｐＧ配列との関係で非メチル化シトシンが生じたかどうかを測定することに使用した。２〜４ μｇのＤＮＡを、３７℃で１６時間ＲｓａＩとＨｐａＩＩ（１ μｇにつき１０ユニット）により消化し、次にＨｐａＩＩ（１ μｇにつき１０ユニット）を追加しさらに２時間消化した。次に、消化物を、前記のとおり個々のＰＣＲ増幅し亜硫酸水素塩処理した分子のクローン化により部位２でのメチル化について分析した。
【００３９】
メチル化方程式．ＨｐａＩＩ部位内のＣｐＧジヌクレオチドの完全なメチル化、ヘミメチル化、及びメチル化の欠如の相対的な量を、以下の２つの計測可能な変数：Ｓ＝ＨｐａＩＩ消化の後の２つの１本鎖ＤＮＡ鎖の一方の、亜硫酸水素塩分析で見つかった非メチル化シトシンの割合；及びＰ＝先のＨｐａＩＩ消化のない、２本のＤＮＡ鎖の一方の亜硫酸水素塩分析で見つかったメチル化されたシトシンの割合、から導き出しうる。
第一に、２本鎖の（完全な）メチル化をもつＨｐａＩＩに抵抗性がある分子の割合（Ｄ）を、Ｄ＝１−２ｓとして計算する。この方程式で、トップ及びボトム鎖はそれらのメチル化レベル及び比率が等しいと仮定する（このさらなる裏付けについて図１０を参照のこと）。平均により、新規合成鎖とＤＮＡ複製後の娘鎖との間の相違を、細胞の多集団中のトップ及びボトム鎖の間で等しく分配する。
ヘミメチル化の量（Ｈ）は、以下のとおり：Ｈ＝２ＳＰ／（Ｓ＋Ｄ）、そして完全なメチル化（Ｆ）は以下のとおり：Ｆ＝ＤＰ／（Ｓ＋Ｄ）計算されうる。これらの２つの方程式の根拠は、ヘミメチル化と完全なメチル化の間の比率が特定のＤＮＡサンプルに関して一定であるという仮定にある。
従って、（非メチル化ＤＮＡについての情報を欠く）Ｓの計測から決定することができるこの比率は、１本鎖内の全てのメチル化（Ｐ）の測定法に適用されることができる。非メチル化ＣｐＧｓの割合の計算（Ｕ）は、Ｕ＝１００−Ｈ−ＦとしてＨとＦから計算されることができる。
【００４０】
比率の計算．平衡状態で、ＨｐａＩＩ部位内に含まれているＣｐＧジヌクレオチドで、いずれかの鎖が非メチル化（Ｕ）、ヘミメチル化されているか（Ｈ）、又は両方の鎖で完全にメチル化されている（Ｆ））ＤＮＡ分子の割合は、一定のままである。従って、このＣｐＧでの新規メチル化と維持メチル化の複合効果の結果としての各々の細胞分裂から得られたこれら３つのメチル化状態の相対的な比は、一定のままであろう。メチル化されていない合成後ＣｐＧｓの新規メチル化が完全な２本鎖ＤＮＡのメチル化をもたらすと仮定すると、その後細胞分裂あたりの新規メチル化と維持メチル化の分布は、たった２つの計測可能な変数：Ｓ＝先立つＨｐａＩＩ消化を伴い、２つの１本鎖ＤＮＡ鎖の一方の、亜硫酸水素塩分析によりメチル化されていないことが分かったＣｐＧｓ内のシトシンの割合；及びＰ＝先立つＨｐａＩＩ消化を伴わない、２つのＤＮＡ鎖の一方の、亜硫酸水素塩分析によりメチル化されていることがわかったＣｐＧｓ内のシトシンの割合、により決定される。
【００４１】
これら２つの計測可能な入力変数だけを使った、方程式の新しいセットを、ＨｐａＩＩ部位内の１本鎖ＣｐＧジヌクレオチドでの新規メチル化率（ｎ）と維持メチル化率（ｍ）を計算するために開発した。第一に、２本鎖の（完全な）メチル化（Ｄ）をもつＨｐａＩＩ抵抗性分子の割合を：Ｄ＝１００−２Ｓとして計算する。
これから、Ｈ＝２ＳＰ／（Ｓ＋Ｄ）、Ｆ＝ＤＰ／（Ｓ＋Ｄ）、及びＵ＝１００−Ｈ−Ｆが次に計算できる。このＣｐＧジヌクレオチドでの新規メチル化率（ｎ）を、細胞分裂あたりの、完全にメチル化されたＣｐＧへの変換を受けるメチル化されていない合成後ＣｐＧｓの割合と規定する：ｎ＝１−（Ｕ／（Ｕ＋Ｈ／２））。このＣｐＧジヌクレオチドでの維持メチル化率（ｍ）を、細胞分裂あたりの、完全にメチル化されたＣｐＧへの変換を受けるヘミメチル化されている合成後ＣｐＧｓの割合と規定する：ｍ＝１−（Ｈ／（Ｆ＋Ｈ／２））。
【００４２】
メチル化感受性ＡＰ−ＰＣＲ．メチル化感受性ＡＰ−ＰＣＲと着目の断片の単離を前記のとおり実施した（Ｇｏｎｚａｌｇｏ， ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５７：５９４−５９９，１９９７； Ｌｉａｎｇ， ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ５３：２６０−２６８，１９９８）。以下のＣｐＧが乏しいプライマーをＡＰ−ＰＣＲ分析に使用した：ＧＣＰ１、５’−ＣＡＣＡＴＧＧＴＴＣＴＧＣ−３’（配列番号：１３）；ＧＣＰ２、５’−ＧＴＣＴＣＴＡＴＧＡＣＣＣ−３’（配列番号：１４）；ＧＣＰ４、５’−ＣＴＴＡＣＴＧＴＧＣＣＡＣ−３’（配列番号：１５）。以下の組をＡＰ−ＰＣＲ反応でしようした：ＧＣＰ１／ＧＣＰ２、ＧＣＰ２／ＧＣＰ４、ＧＣＰ１／ＧＣＰ４。
【００４３】
細胞系からのＤＮＡのサザンブロット分析．細胞系からの１０ μｇのＤＮＡを、３７℃で１６時間、５０ユニットのＲｓａＩ、各５０のユニットのＲｓａＩとＨｐａＩＩ、又は各５０ユニットのＲｓａＩとＭｓｐＩ（Ｒｏｃｈｅ）のいずれかにより別個に消化した。消化したゲノムＤＮＡを、０．７％アガロースゲルで電気泳動し、そしてＺｅｔａ−Ｐｒｏｂｅ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）膜に一晩サザンブロットした。先にＡＰ−ＰＣＲポリアクリルアミド・ゲルから単離したクローン化ＤＮＡ断片を、その後ハイブリッド形成のためのプローブとしてこれらのフィルターに使用した。約１００ ｎｇのプラスミド挿入断片ＤＮＡを、ランダム・プライミングにより３２Ｐ標識し、そして前記フィルターのプローブに使用した。全てのハイブリッド形成を、５００ ｍＭのＮａＰＯ４（ｐＨ６．８）、７％のＳＤＳ、１ ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）中、６５℃で１６時間実施した。膜を２×ＳＳＣ／１％のＳＤＳにより６５℃で２回洗浄し、続いて０．５×ＳＳＣ／１％のＳＤＳにより室温で３回洗浄した。次に、それらを−８０℃でオートラジオグラフィー・フィルムに晒した。メチル化レベルの定量を、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ ＰｈｏｓｐｈｏｒＩｍａｇｅｒで実施した。
【００４４】
メチル化アッセイ手順．様々なメチル化アッセイ手順が本技術分野で知られていて、配列測定のために本発明に関連して使われうる。これらのアッセイは、ＤＮＡ塩基配列内の１以上のＣｐＧジヌクレオチド（例えば、ＣｐＧ島）のメチル化状態の測定を可能にする。そのようなアッセイは、他の技術の中でも、亜硫酸水素塩処理したＤＮＡのＤＮＡ塩基配列測定法、（配列に特有な増幅のための）ＰＣＲ法、サザンブロット分析法、メチル化感受性制限酵素の使用などに関係する。
例えば、亜硫酸水素塩処理を使うことにより、ゲノム配列は、ＤＮＡのメチル化パターン及び５−メチルシトシン分布の分析のために簡素化される（Ｆｒｏｍｍｅｒ  ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８９：１８２７−１８３１， １９９２）。さらに、亜硫酸水素塩により変換されたＤＮＡから増幅したＰＣＲ産物の制限酵素消化が、例えばＳａｄｒｉ ＆ Ｈｏｒｎｓｂｙ（Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２４：５０５８−５０５９，１９９６）に記載の方法、又はＣＯＢＲＡ（複合亜硫酸水素塩制限分析）（Ｘｉｏｎｇ ＆ Ｌａｉｒｄ， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２５：２５３２−２５３４， １９９７）で使用される。
【００４５】
ＣＯＢＲＡ．ＣＯＢＲＡ分析は、少量のゲノムＤＮＡ中の特定の遺伝子座のでのＤＮＡのメチル化レベルを測定するために役立つ定量的なメチル化アッセイである（Ｘｉｏｎｇ ＆ Ｌａｉｒｄ， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２５：２５３２−２５３４， １９９７）。要するに、制限酵素消化が、亜硫酸水素ナトリウム処理されたＤＮＡのＰＣＲ産物におけるメチル化依存配列の相違を明らかにするために使用する。メチル化依存配列の相違は、まずＦｒｏｍｍｅｒ ｅｔ ａｌ． （Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８９：１８２７−１８３１， １９９２）により記載された手順に従って標準的な亜硫酸水素塩処理によりゲノムＤＮＡに導入される。次に着目のＣｐＧ島に特異的なプライマーを使って亜硫酸水素塩により変換されたＤＮＡのＰＣＲ増幅を実施し、続いて制限エンドヌクレアーゼ消化し、ゲル電気泳動し、そして特異的な、標識ハイブリッド形成プローブを使って検出した。元のＤＮＡサンプルのメチル化レベルを、ＤＮＡのメチル化レベルの幅広い範囲にまたがる線形に定量的な様式の、消化されたか、又は消化されないＰＣＲ産物の相対的な量によって表す。さらに、この技術は、顕微鏡解剖したパラフィン包埋組織サンプルから得られたＤＮＡに確実に適用されることができる。（例えば、典型的なＣＯＢＲＡに基づくキットで見られるような）ＣＯＢＲＡ分析のための典型的な試薬は、これだけに制限されることなく：特定の遺伝子（又はメチル化により変化したＤＮＡ塩基配列又はＣｐＧ島）のためのＰＣＲプライマー；制限酵素及び適当な緩衝液；遺伝子ハイブリッド形成オリゴ；対照ハイブリッド形成オリゴ；オリゴ・プローブのためのキナーゼ標識キット；そして放射性ヌクレオチドを含んでいるかもしれない。その上、亜硫酸水素塩変換試薬は：ＤＮＡ変性緩衝液；スルホン化緩衝液；ＤＮＡ回収試薬又はキット（例えば、沈殿、限外濾過、アフィニティカラム）；脱スルホン化緩衝液；そしてＤＮＡ回収成分を含んでいるかもしれない。
【００４６】
好ましくは、「メチライト」（蛍光に基づくリアルタイムＰＣＲ技術）（ Ｅａｄｓ ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５９：２３０２−２３０６， １９９９）、Ｍｓ−ＳＮｕＰＥ（メチル化感受性単ヌクレオチド・プライマー伸長）反応（Ｇｏｎｚａｌｇｏ ＆ Ｊｏｎｅｓ， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２５：２５２９−２５３１，１９９７）、メチル化特異的ＰＣＲ（「ＭＳＰ」；Ｈｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９３：９８２１−９８２６，１９９６；米国特許番号第５，７８６，１４６号）、及びＣｐＧ島増幅（「ＭＣＡ」；Ｔｏｙｏｔａ ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５９：２３０７−１２，１９９９）は、単独で又はこれらの他の方法との組み合わせで使用される。
【００４７】
メチライト．メチライト・アッセイは、ＰＣＲステップ（Ｅａｄｓ ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５９：２３０２−２３０６， １９９９）後の多くの操作を必要としない蛍光に基づくリアルタイムＰＣＲ（ＴａｑＭａｎ（登録商標））技術を利用した高速大量処理の定量的なメチル化アッセイである。要するに、メチライト法は、亜硫酸水素ナトリウム反応で標準手順（亜硫酸水素塩処理は、非メチル化シトシン残基をウラシルに変換する）に従ってメチル化依存配列相違の混成のプールに変換されたゲノムＤＮＡの混合サンプルで始まる。次に、蛍光に基づくＰＣＲを、「不偏」（既知のＣｐＧメチル化部位に重ならないプライマーでの）ＰＣＲ反応で、又は「偏った」（既知のＣｐＧジヌクレオチドに重なるＰＣＲプライマーでの」反応のいずれかにより実施する。配列識別は、増幅過程のレベルか、又は蛍光検出過程のレベルか、あるいはその両方で生じうる。
【００４８】
メチライトは、ゲノムＤＮＡサンプルのメチル化パターンの定量的な試験として使用されるアッセイであり、ここで配列識別は、ハイブリッド形成プローブのレベルで生じる。この定量化版で、ＰＣＲ反応は、特定の推定上のメチル化部位に重なる蛍光プローブの存在下での不偏増幅を提供する。入力したＤＮＡ量に対する不偏対照は、プライマーもプローブも全てのＣｐＧジヌクレオチド上に重ならない反応により提供される。あるいは、ゲノムのメチル化に関する定性試験は、既知のメチル化部位を「対象としない」オリゴヌクレオチド（「ＭＳＰ」技術の蛍光に基づくバージョン）、又は潜在的なメチル化部位対象としたオリゴヌクレオチドのいずれかによる偏ったＰＣＲプールの調査により成し遂げられる。
【００４９】
メチライト法は、増幅プロセスで「ＴａｑＭａｎ（登録商標）」プローブを使用しうる。例えば、２本鎖ゲノムＤＮＡを亜硫酸水素ナトリウムで処理し、そしてＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブを使った、２セットのＰＣＲ反応；例えば、偏ったプライマーとＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブか、又は不偏プライマーとＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブのいずれか、の一方を与える。ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブは、蛍光性の「リポーター」と「消光剤」分子で二重標識されていて、比較的に高いＧＣ含量部位に対して特異的に設計されており、そのためそれはＰＣＲサイクルにおいて前方又は後方プライマーより約１０℃高い温度で融解する。これは、ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブがＰＣＲアニーリング／伸長ステップの間に完全にハイブリッド形成することを可能にする。ＰＣＲの間にＴａｑポリメラーゼが酵素的に新しい鎖を合成するので、それはアニールしたＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブに結局到達する。次に、Ｔａｑポリメラーゼ５’→３’エンドヌクレアーゼ活性が、それを消化することによりＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブを置換し、リアルタイム蛍光検出システムを使って、その消光されていないシグナルの定量的な検出のための蛍光リポーター分子を放出する。
【００５０】
メチライト分析のための典型的な試薬（例えば、典型的なメチライトに基づくキットに見られるもの）は、これだけに制限されることなく：特定の遺伝子（又はメチル化で変更されたＤＮＡ塩基配列又はＣｐＧ島）のためのＰＣＲプライマー；ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブ；最適なＰＣＲ緩衝液とデオキシヌクレオチド；そしてＴａｑポリメラーゼ、を含んでいるかもしれない。
【００５１】
Ｍｓ−ＳＮｕＰＥ．Ｍｓ−ＳＮｕＰＥ技術は、ＤＮＡの亜硫酸水素塩処理、続く単ヌクレオチド・プライマー伸長（Ｇｏｎｚａｌｇｏ ＆ Ｊｏｎｅｓ， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２５：２５２９−２５３１， １９９７）に基づいた特定のＣｐＧ部位のメチル化の相違を評価するための定量的手法である。要するに、ゲノムＤＮＡを亜硫酸水素ナトリウムと反応させて５−メチルシトシンを変えないまま、非メチル化シトシンをウラシルに変える。次に、亜硫酸水素塩により変換されたＤＮＡに特異的なＰＣＲプライマーを使って所望の標的配列の増幅を実施し、そして得られた産物を分離し、そして着目のＣｐＧサイト）でのメチル化分析のための鋳型として使用した。少量のＤＮＡを（例えば、顕微解剖した病理切片で）アッセイすることができて、そしてＣｐＧ部位でのメチル化状態を測定するための制限酵素の利用を避ける。Ｍｓ−ＳＮｕＰＥ分析のための典型的な試薬（例えば、典型的なＭｓ−ＳＮｕＰＥに基づくキットに見られるもの）は、これだけに制限されることなく：特定の遺伝子（又はメチル化で変更されたＤＮＡ塩基配列又はＣｐＧ島）のためのＰＣＲプライマー；最適なＰＣＲ緩衝液とデオキシヌクレオチド；ゲル抽出キット；正の対照プライマー；特定の遺伝子のためのＭｓ−ＳＮｕＰＥプライマー；（Ｍｓ−ＳＮｕＰＥ反応のための）反応緩衝液；そして放射性ヌクレオチド、を含んでいる。その上、亜硫酸水素塩変換試薬は：ＤＮＡ変性緩衝液；スルホン化緩衝液；ＤＮＡ回収試薬又はキット（例えば沈殿、限外濾過、アフィニティカラム）；脱スルホン化緩衝液；そしてＤＮＡ回収成分、を含むかもしれない。
【００５２】
ＭＳＰ．ＭＳＰ（メチル化特異的ＰＣＲ）は、メチル化感受性制限酵素の使用から離れ、ＣｐＧ島内のＣｐＧ部位の事実上全ての群のメチル化状態を評価することを可能にする（Ｈｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ． Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９３：９８２１−９８２６， １９９６；米国特許番号第５，７８６，１４６号）。要するに、全ての非メチル化シトシンをウラシルに変換し、メチル化シトシンを変換しない亜硫酸水素ナトリウムによりＤＮＡを修飾し、続いてメチル化対非メチル化ＤＮＡに関して特異的なプライマーで増幅した。ＭＳＰはわずかな量のＤＮＡしか必要とせず、与えられたＣｐＧ島遺伝子座の０．１％のメチル化対立遺伝子に感受性であり、パラフィン包埋されたサンプルから抽出したＤＮＡで実施されうる。ＭＳＰ分析のための典型的な試薬（例えば、典型的なＭＳＰに基づくキットで見られるもの）は、これだけに制限されることなく：特定の遺伝子（又はメチル化で変更されたＤＮＡ塩基配列又はＣｐＧ島）に対するメチル化、又は非メチル化ＰＣＲプライマー、最適なＰＣＲ緩衝液とデオキシヌクレオチド、そして特定のプローブ、を含むかもしれない。
【００５３】
ＭＣＡ．ＭＣＡ技術は、ゲノムＤＮＡの変更されたメチル化パターンに関するスクリーニング、及びこれらの変化に関係している特定の配列の分離に使用することができる方法である（Ｔｏｙｏｔａ ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５９：２３０７−１２，１９９９）。要するに、任意に開始されるＰＣＲ増幅（ａｒｂｉｔｒａｒｉｌｙ ｐｒｉｍｅｄ ＰＣＲ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）に先立ち、それらの認識部位内のシトシンのメチル化に対する異なる感受性をもつ制限酵素を、原発腫瘍、細胞系、及び正常組織からのゲノムＤＮＡの消化に使用する。示差的なメチル化を示す断片を、クローン化し、高解像度ポリアクリルアミドゲルによりＰＣＲ産物を分けた後に配列を決定する。クローン化した断片を、これらの部位の差異的なメチル化を確認するためのサザンブロット分析にプローブとして使用する。ＭＣＡ分析のための典型的な試薬（例えば、典型的なＭＣＡに基づくキットに見られるもの）は、これだけに制限されることなく：ゲノムＤＮＡの任意のプライミングのためのＰＣＲプライマー；ＰＣＲ緩衝液とヌクレオチド、制限酵素と適当な緩衝液；遺伝子−ハイブリッド形成オリゴ又はプローブ；対照ハイブリッド形成オリゴ又はプローブ、を含んでいる。
【００５４】
直接シークエンス法のような他の本技術分野で認められた配列決定法を、本発明の目的のために使用することができるが、しかし前記メチル化アッセイが、使用されうるそのような方法の例であることは当業者に明らかである。
【００５５】
ヘミメチル化したＣｐＧを含んでいる核酸の検出キット．本発明は、ＣｐＧで混成のＤＮＡメチル化状態を有するＤＮＡのプール中の特定のＣｐＧジヌクレオチドでのヘミメチル化しいるＤＮＡ分子の割合を計測するためのヘミメチル化検出キットを提供する。本発明は、ＨｐａＩＩ部位内の１つのＣｐＧジヌクレオチドでの新規メチル化率（ｎ）と維持メチル化率（ｍ）の計測に役立つヘミメチル化検出キットをさらに提供する。
【００５６】
本発明によるＣｐＧを含んでいる核酸のヘミメチル化状態、あるいは、ＨｐａＩＩ内の１つのＣｐＧジヌクレオチドの新規メチル化率（ｎ）と維持メチル化率（ｍ）を測定するための、１以上の本技術分野で認められたメチル化アッセイを実施するために必要な試薬（先に確認したＭｓ−ＳＮｕＰＥアッセイを含む）は、特異的なプライマーかプローブと組み合わせられる。
例えば、Ｍｓ−ＳＮｕＰＥメチル化アッセイは、単独で、又は本技術分野で知られている他のメチル化アッセイ方法、中でも特定のゲノム配列内のＣｐＧジヌクレオチドのヘミメチル化状態を測定するための特異的なプライマーかプローブとの組み合わせで使用されうる。
【００５７】
実施例１
ＥＳ細胞のメチル化パターン
詳細な実験を、マウスＥＳＴにあたる４４０−ｂｐのＤＮＡ断片（ＢＥ６４６９７５．１） （ＣＩ−ｆ断片；ジーンバンク登録番号ＡＫ０１４０１９）で行った。乳腺及び胸腺で発現され、それ故、ＣｐＧが乏しく、かつ、メチル化された典型的な哺乳動物の遺伝子のコード領域を代表している。ノックアウトＥＳ細胞において残りとしてメチル化される１つのＨｐａＩＩ部位と３つのさらなるＣｐＧ部位（図１Ａ）が断片に存在する。３つのＤｎｍｔｓ（Ｍ１／３Ａ／３Ｂ細胞）の全てを含むか、Ｄｎｍｔ１（Ｍ１細胞）を含むか、又はＤｎｍｔ３ａと３ｂだけ（Ｍ３Ａ／３Ｂ細胞）を含む細胞の個々のＤＮＡ鎖における４つのＣｐＧ部位のメチル化状態を、メチル化パターンの潜在的な相違を調査するために詳細に評価した。細胞型を記載するために使われた命名法を、不存在なものよりむしろ細胞中に存在する酵素に焦点を当てて選んだ。メチル化レベルとパターンの最小の相違は、Ｄｎｍｔ３ａか３ｂのいずれかのみを欠いている細胞で見られた。
【００５８】
最初に、部位２〜４のメチル化パターンを、個々の、亜硫酸水素塩処理した分子のクローン化、続くＤＮＡ塩基配列決定法により測定した（Ｆｉｇ．１Ｂの最上部の断片）。しかし一般的に、個々のクローン化分子を、４つの部位がどのようにメチル化されているか素速く評価するためにＭｓ−ＳＮｕＰＥ分析に供した（図１Ａ）。
図１Ａは、ＥＳ細胞のメチル化のパターンを示す。４４０ｂｐの配列を含んでいるＤＮＡ（断片ＣＩ−ｆ）の個々の分子内の４つのＣｐＧ部位のメチル化状態を、個々の分子のクローン化し、続いて示された４つの部位のＭＳ−ＳＮｕＰＥ分析により評価した。ｄＣＴＰ「Ｃ」又はｄＴＴＰ「ｔ」のいずれかでマークしたサンプルの実施例のゲルを示す。所定の部位でのメチル化の存在は、Ｍｓ−ＳＮｕＰＥゲルの「Ｃ」レーンのバンドにより示され、一方「Ｔ」レーンのバンドがメチル化のないことを示す。パターンを推定できるように、個々の分子のＣｐＧ部位を、メチル化（黒塗り四角）又は（白抜き四角）で示される非メチル化で記録する。
【００５９】
Ｍ１／３Ａ／３Ｂ細胞とＭ１細胞の異質なメチル化パターンを、図１Ｂで示されるように異なった効率によりメチル化される４つの個々の部位により明らかになった。
図１Ｂは、本発明に従って実験された３つの細胞型の中の個々のＤＮＡ分子のメチル化パターンを示す、Ｎ＝評価したＤＮＡ分子の数。各々のパネル内の上部セクションからのデータを、部位２〜４を含む断片の直接配列決定により得た。下部セクションは、全４つの部位に関する。個々の分子内の部位でのメチル化の状態を、左から右に読む。図１Ｂは、試験した３つの細胞型の４つの部位でのメチル化の割合の平均をも示す。
部位２及び４は、平均して最もメチル化されていたが、一方で部位１及び３は、効率的でないメチル受容部だった。しかし、２つのクラスの分子が存在し、Ｍ３Ａ／３Ｂ細胞のメチル化パターンは、完全に異なった。４つの部位全てを同時に評価した大多数の分子は、メチル化を含まず（７２％）、１４％は１つの部位のみメチル化されており、しかし１４％は１つの分子において複数の部位でメチル化されている。
【００６０】
このデータは、１００％の効率を伴わなくても連続して部位をメチル化する傾向にある、進化性の又は共同性の酵素Ｄｎｍｔ３ａ／３ｂと最も一致して、そのため部位２及び４は、部位１及び３よりメチル化された。前記４つの部位でのメチル化のレベルの相違が、酵素の作用の向上か、又はむしろ１つの部位のそのメチル化が隣接している部位のメチル化の可能性を高める可能性かの区別を困難にした。単独のメチルトランスフェラーゼとしてＤｎｍｔ３ａ又は３ｂを含んでいるＥＳ細胞を試験しなかったため、酵素どうしのいずれかの差異的な特異性を効果的に見分けるのは困難だった。対を成したボトム鎖シトシンのメチル化状態の分析は、アッセイしたいかなる細胞型であれ、鎖の偏りでないことを明らかにした。
【００６１】
実施例２
ヘミメチル化の定量と検出のための新しいアッセイ
亜硫酸水素塩配列決定法がメチル化パターンの詳細な分析のための扉を開いたが（Ｆｒｏｍｍｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９９２）、しかし、親の対を成したＤＮＡ鎖が分析前に分けられるので、ヘミメチル化の程度（すなわち、ＣｐＧパリンドローム中の１つのシトシンだけがメチル化される場合）を評価することはこれまで不可能であった。ヘミメチル化の程度の知識は、どのようなパターンが複製されるのか理解することが不可欠である。
【００６２】
酵素ＨｐａＩＩが、完全なメチル化又はヘミメチル化構造のいずれかの認識モチーフ配列ＣＣＧＧを切断しないという事実（Ｇｒｕｅｒｉｂａｕｍ ｅｔ ａｌ．， １９８１）と続く亜硫酸水素塩処理を、ＨｐａＩＩ抵抗性部位中のＣｐＧ配列との関係で非メチル化シトシンが生じたかどうかを測定するために使用した（図２を参照のこと）。
図２は、本発明による個々のクローン化されたＤＮＡ分子のヘミメチル化の検出及び定量を示す。ＥＳ細胞におけるヘミメチル化を検出するために使われた実験的なアプローチは、ＨｐａＩＩによりゲノムＤＮＡを前もって切断し、続いて亜硫酸水素塩処理し、その後個々のＰＣＲ産物をクローン化し、そしてＭＳ−ＳＮｕＰＥ分析により、例えば、部位２のメチル化状態を評価するステップを含む。典型的な結果を、これらのＭＳ−ＳＮｕＰＥ結果に対して示す、ここで実施例のクローンのＴレーンのシグナルは、メチル化されていないトップ鎖をもつヘミメチル化を示す。「Ｃ」レーンのシグナルの存在は、その部位が完全にメチル化されているか、又はヘミメチル化されている（すなわち、ボトム鎖がメチル化されていない）かのいずれかであることを示す。これらの２つのシナリオの分布は、トップ又はボトム鎖のいずれのヘミメチル化も等しい可能性をもつことを前提として、計算により決定される。
【００６３】
特に、様々な細胞型から抽出したＤＮＡを、過剰のＨｐａＩＩで消化し、亜硫酸水素塩処理し、そしてＨｐａＩＩ部位（部位２）の側面に位置するプライマーを用いてＰＣＲにより増幅する。ＨｐａＩＩ部位はプライマーの間に存在するため、部位２の完全なメチル化又はヘミメチル化のない分子は、増幅されないので、こうして分析から取り除かれる。特定の部位でのヘミメチル化の程度を、（例えば）部位２のＣ又はＴの存在に関して個々のクローン化ＰＣＲ産物の分析により得られた結果を平均することによって正確に測定することができる。このアプローチでトップ鎖だけがアッセイされ、かつ、トップ又はボトム鎖どちらもメチル化が可能であるため、先の「実験手順」に示したとおり、ヘミメチル化の程度を計算した。これらの計算は、追加の実験（以下の実施例６〜８を参照のこと）により支持された仮定である、トップ又はボトム鎖のいずれもヘミメチル化の等しい可能性を有することを前提とする。
【００６４】
このアプローチは、３つの異なる細胞型における、完全な非メチル化、ヘミメチル化、及び完全なメチル化に関する部位２のメチル化分布の決定を可能にする（図３）。
図３は、計測された定常状態のメチル化レベル、メチル化率、並びに２つの実験的な変数（「Ｐ」と「Ｓ」）の測定で始まる、ＨｐａＩＩ部位内の単一のＣｐＧジヌクレオチドでの（細胞分裂あたりの基質分子の変換の比として表される）新規（ｎ）及び維持（ｍ）メチル化率の計算に使用される手順の概要を示す。各々の変数の説明と一緒に計算された変数を得るために使用した方程式を最初の列に示した（前記「実験手順」を参照のこと）。２列目は、変数（白抜き四角）、並びに特定のステップで評価される全ての他のメチル化状態（灰色の四角）を表すメチル化状態のサブセットを説明する。ＨｐａＩＩ消化がこのステップの検討材料からこれらの分子を取り除くので、非メチル化ＣｐＧｓは、Ｓ及びＤ変数の場合に不在である。３つの細胞系についての計測された変数「Ｐ」と「Ｓ」に対するデータ、続いて評価した分子の絶対数を、百分率で右側に列に示す。トップ及びボトム鎖がそれらのメチル化レベル及び比率において等しいと仮定する。平均することによって、新規合成鎖とＤＮＡ複製後の娘鎖の間の相違を、細胞の多数集団の中のトップ鎖とボトム鎖の間で等しく分配させた。
【００６５】
期待されるように、野生型細胞の大多数の部位が、完全にメチル化され、ごくわずかな割合（６％）のヘミメチル化された部位を含んだ。Ｍ１細胞（すなわち、Ｄｎｍｔ１だけを含んでいる）におけるヘミメチル化した部位の高い割合（１９％）は、この酵素がヘミメチル化酵素として高度に効率的で、そして急速に変換された半メチル化部位がＤＮＡの複製に続いて完全なメチル化に変換されると考えたので予想されなかった。３つ全ての酵素（Ｍ１／３Ａ／３Ｂ）を含んでいる野生型細胞の中にはわずかなヘミメチル化部位しか存在しなかったので、データは、さらにＤｎｍｔ３ａ／３ｂが、それらの新規メチル化酵素としての役割に加え、効率的なヘミメチル化酵素として作用していることを示す。
【００６６】
図３は、このデータから計算しうる新規メチル化率、及び維持メチル化率をも示す（前記「実験的な手順」を参照のこと）。興味深いことには、図３が、Ｍ３Ａ／３Ｂ細胞が新規メチルトランスフェラーゼ活性（０．０７）より高い比率のヘミメチル化酵素活性（０．３７）をもつことを示したことである。これらの結果は、野生型細胞においてＤｎｍｔ１及びＤｎｍｔ３ａ／３ｂが対等に作用して、ヘミメチル化部位の低い比率を確保することを示す。
【００６７】
実施例３
新規合成ＤＮＡのメチル化の動力学
ＤＮＡ合成に関するメチル化のタイミングを調査した。Ｄｎｍｔ１は、Ｓ期核内の複製機構に局在することが証明され（Ｌｅｏｎｈａｒｄｔ ｅｔ ａｌ．， １９９２）、そしてＰＣＮＡ（Ｃｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ．， １９９７）との相互作用は、メチル化パターンが合成直後に複製されるという期待をもたらしたが（Ａｒａｕｊｏ ｅｔ ａｌ．， １９９８）、初期の研究は、シトシン修飾が二相性の様式で生じたため一部のメチル化が遅れるのかもしれないことを示唆した（Ａｄａｍｓ， １９７１； Ｗｏｏｄｃｏｃｋ ｅｔ ａｌ．， １９８２， Ｗｏｏｄｃｏｃｋ ｅｔ ａｌ．， １９８６）。
【００６８】
１時間のＢｒｄＵパルス、続く様々な時間のチェイスを、合成に関するメチル化のタイミングを調査するために使用した。ＢｒｄＵを含むＤＮＡを免疫沈降により単離し（Ｒｉｄｅｏｕｔ ｅｔ ａｌ．， １９９４）、そしてＤＮＡ断片内の部位２及び３（マップに関しては図１Ａを参照のこと）のメチル化状態を定量的なＭｓ−ＳＮｕＰＥ分析で計測した。
図４Ａは、野生型Ｍ１／３Ａ／３Ｂ細胞においてＢｒｄＵの１時間のパルスの間に合成されたＤＮＡが合成後２４〜４８時間の間その最終レベルまでメチル化されなかったことを示すようなパルスチェイス実験からの結果を要約する。所定のＤＮＡメチルトランスフェラーゼの遺伝子を含むＥＳ細胞をＢｒｄＵにより１時間パルスした。次に、前記パルスを取り除き、そしてチェイス期間中、細胞に新しい培地を添加した。前記ＤＮＡを、パルス開始後の様々な時点で細胞から抽出し、ＤＮＡを含むＢｒｄＵを免疫沈降して分離した。部位２及び３のメチル化状態を定量的なＭＳ−ＳＮｕＰＥ分析で測定した後、所定の時点で平均した。データは、２〜３の実験のトップ及びボトム鎖における測定の平均値を表し、誤差範囲は標準偏差を示す。
【００６９】
従って、一部のメチル化は、合成に対して遅れて、そしてＤｎｍｔ３ａ又は３ｂと一緒にＤｎｍｔ１を含む細胞で見られもしたが、Ｍ１細胞においてあまり目立たなかった（図４Ａ）。Ｍ３Ａ／３Ｂ細胞で合成したＤＮＡのメチル化レベルは、他の細胞型のそれよりはるかに低く、合成後４８時間目までわずかな上昇を示した。データは、野生型のＭ１／３Ａ／３Ｂ細胞における合成後のメチル化が、Ｄｎｍｔ３ａと３ｂの活性によるかもしれないことを示した、なぜならこれらの２つの酵素を欠くＭ１細胞において合成後のメチル化の程度が顕著でなかったためである。
【００７０】
図４Ｂは、ＤＮＡの遅延型メチル化が活性なＤＮＡメチルトランスフェラーゼ酵素を必要とすることを示す。３つのＤＮＡメチルトランスフェラーゼ酵素（Ｍ１／３Ａ／３Ｂ）全てを含む細胞を、ＢｒｄＵにより１時間パルスし、そして１時間後に一部の培養からＤＮＡを回収した。残りの培養の培地を、チェイス期間中、所定の化合物を含む培地に変え、実験開始後２４時間目にＤＮＡを得た。ＢｒｄＵを含むＤＮＡを、免疫沈降し、そしてこのＤＮＡのメチル化レベルを定量的なＭＳ−ＳＮｕＰＥ分析で測定した。
【００７１】
野生型Ｍ１／３Ａ／３Ｂ細胞において、新規合成ＤＮＡ鎖の遅延型メチル化は、活性なＤｎｍｔｓの存在を必要としている、なぜならＢｒｄＵパルスが取り除かれた時点の５−ａｚａ−２’−デオキシシチジン処理がパルスされた鎖のさらなるメチル化をもたらさなかったからである（図４Ｂ）。前記薬剤は、Ｄｎｍｔｓと共有結合を形成するので、活性酵素の迅速な「一時的なノックアウト」を誘発する（Ｔａｙｌｏｒ ａｎｄ Ｊｏｎｅｓ， １９８２）。
図４Ｂは、成熟プロセスが、ヒストン脱アセチル化酵素（トリコスタチンＡ、「ＴＳＡ」）、ＤＮＡ合成（アフィジコリン）又は有糸分裂（コルセミド））を阻害する薬剤により遮断されなかったことをも示す。
このように、遅延型メチル化が生じるためには、ヒストンのアセチル化、ＤＮＡ合成、又は有糸分裂ではなく、活性メチルトランスフェラーゼを必要とした。
【００７２】
実施例４
新規合成ＤＮＡのメチル化パターン
前述の実験は、合成後の時間に関して４つの部位の２つの平均メチル化レベルの情報をもたらした。ＢｒｄＵ後１時間と２４時間、それぞれパルスとチェイスの時点で得た個々のＤＮＡ鎖を、クローン化し、１時間と２４時間での鎖あたりの同時メチル化部位の数をプロットすることにより、分子ベースでどのような状態でパターンが分子上に展開したかを見た（図５）。
図５は、メチル化パターン細胞の成熟を示す。個々のＤＮＡ分子のメチル化状態を、ＢｒｄＵを含んでいない媒質中で、ＢｒｄＵでの１時間のパルスの直後、又はチェイス期間（２４時間）の後に測定した。これらの２つの時点から得たＤＮＡを、免疫沈降してＢｒｄＵを含むＤＮＡを単離し、そして個々の分子のメチル化状態を測定し、これらの分子のメチル化の程度を、図１にあるように合成後の時間関数として評価した。データを、個々の分子において同時にメチル化された０〜４の部位を含む個々の分子の割合として表した。
【００７３】
意外にも、Ｍ１／３Ａ／３Ｂ細胞から１時間のパルス直後に得たＤＮＡは、相当な割合（３８％）の分子が、４つのうちでメチル化部位を１つも含まないか、又はたった１つ含むこと、並びにメチル化の程度の比較的に均一な分布を示した。前記パターンは、分子のほとんどが３又は４つの部位で同時メチル化をここで得ることにより、実質的に２４時間のチェイス期間中に変化する。Ｍ１細胞の新規合成ＤＮＡは、分子の４０％が０又は１つのメチル化部位をもち、９％が２つのメチル化部位をもち、及び５０％が３又は４のメチル化部位をもつ。同様に、このパターンは、チェイス期間中に変化するが、しかし、程度分布の様式は、Ｍ１／３Ａ／３Ｂ細胞の３つに対し、１分子につき２つのメチル化部位だった。
【００７４】
このように、全４つの同時非メチル化部位をもつ分子の発生により明らかなように、両細胞型における非メチル化「パッチ」を含んだ新規合成ＤＮＡは、合成後相において非常に減少した。顕著でない変化がこれらの酵素を欠いていたＭ１細胞で生じたため、この減少は、野生型細胞において、たぶんＤｎｍｔ３ａ及び／又は３ｂにより成されている。
同じパターン分析をＭ３Ａ／３Ｂ細胞で実施しなかった。なぜなら、大多数の分子（７２％）が平衡状態でメチル化されておらず（図１を参照のこと）、意味のある解釈に十分な多数のそれらをクローン化及び評価することが技術的に負担であったためである。
【００７５】
実施例５
ＤＮＡメチルトランスフェラーゼの細胞下局在
ＤＮＡのメチル化レベルの合成後の修復の動力学で観察された不連続性が、ＤＮＡ合成直後の修復活性を主に担うＤｎｍｔ１、並びに細胞周期において後で活性化するＤｎｍｔ３ａ及び／又は３ｂによる、別個のメチルトランスフェラーゼ活性に起因している場合、その後、Ｄｎｍｔ３ａ及び／又は３ｂが、Ｄｎｍｔ１について観察されているような、トロイダル複製中心に大きく関係するとは思えない。
３つのメチルトランスフェラーゼの細胞下の局在を、マウスＣ３Ｈ １０Ｔ１／２ Ｃ１８細胞内に緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）に融合した３つの遺伝子を含むプラスミドの形質移入により測定した。細胞を、テキサス・レッドにより標識したＰＣＮＡに対する抗体により二重染色し、そして形質移入後４８〜７２時間目に共焦点顕微鏡により検査した。
【００７６】
ＤＮＭＴ−１で形質移入した細胞は、このタンパク質がしばしばＰＣＮＡ、特に恐らく後期Ｓ期の複製機構を表しているトロイダル構造と共に局在したとの、初期の研究を立証した（Ｌｅｏｎｈａｒｄｔ ｅｔ ａｌ．， １９９２； Ｃｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ．， １９９７； Ｒｏｕｎｔｒｅｅ ｅｔ ａｌ．， ２０００）。
Ｄｎｍｔ３ａ及び３ｂは、ほぼ完全に核に局在化し、かつ、これらのトロイドを含む核内により広く存在した。興味深いことに、Ｄｎｍｔ３ｂは、Ｄｎｍｔ３ａと異なりＰＣＮＡを含むトロイドと一緒にかなりの共局在性を示した。
よって、Ｄｎｍｔ３ａではなく、Ｄｎｍｔ３ｂは、複製機構に関係するかもしれない。
【００７７】
実施例６
メチル化パターンを調査するための配列同定へのゲノム走査法の使用
（前記）実施例１〜５の所見を拡張した。特に、ゲノム走査アプローチを、マウス胚性幹（ＥＳ）細胞内の大部分のメチル化を実行するための酵素の役割を測定するために、ＣｐＧの乏しい及びＣｐＧの豊かな部位での、様々なノックアウトＥＳ細胞のメチル化パターンを調査するために使用した。
ＣｐＧが乏しい配列のメチル化レベルは、概して一様にＤｎｍｔ１欠損細胞で減少した。しかし、異なる部位の間で、効率に非常な変動が存在し、Ｄｎｍｔ１酵素を優先する配列を示すＤｎｍｔ３ａ／３ｂ欠損細胞においてＤＮＡのメチル化を維持した。
ＭＳ ＡＰ−ＰＣＲを、異なる組み合わせＤＮＡメチルトランスフェラーゼ（Ｄｎｍｔ１（−／−）又はＤｎｍｔ３ａ（−／−）／３ｂ（−／−））を含むＥＳ細胞のパネルにおけるメチル化パターンのフィンガープリントのために使用した。前記ＭＳ ＡＰ−ＰＣＲ法は、容易に得られるメチル化パターンを可能にし、そしてそれは、ＣｐＧ島のメチル化状態の有効なフィンガープリントを生じる、酵素ＨｐａＩＩによる切断のための、非メチル化及びメチル化ＣＣＧＧ部位の差異的な感受性に依存する。ＭＳ ＡＰ−ＰＣＲの目的及び利点は、より詳細な分析のための代表的な配列の同定をその後可能にするゲノムの迅速で、全体的な走査を実施することであった。大多数の５−メチルシトシンが見つかっているＤＮＡ部位が存在するため、我々はまず現在作業中のＤＮＡのＣｐＧの乏しい部位に注目した。
【００７８】
図７Ａは、ＣｐＧ島内に位置していないＤＮＡの標的部位に対するＣｐＧの乏しいプライマーを使用した、様々な細胞型から抽出したＤＮＡ分析の実施例を示す。細胞に関して使用した命名法は、不在なものよりむしろ細胞内で活性である遺伝子産物を強調して選ばれた。フィンガープリント分析は、検査した他の細胞型と比べてＤｎｍｔ３ａと３ｂだけを含む細胞（Ｍ３Ａ／３Ｂ）のほとんどの評価可能なバンドでメチル化の均一な損失を示した（レーン２、及び黒塗り矢印により示したバンドを参照のこと）。野生型又は突然変異細胞型と関連して、完全にメチル化されたか又はメチル化されていないバンドが明らかでなかったので、これらの細胞からのＤＮＡのＲｓａ／ＨｐａＩＩ消化物における強度の減少は、機能的なＤｎｍｔ１酵素をもたない細胞におけるメチル化の全般的な減少、並びに維持されたＤｎｍｔ３ａ及び３ｂの著しい配列特異性の欠如を示唆した。
【００７９】
重要な特徴を、Ｄｎｍｔ１のみを含む細胞で観察した（Ｍ１細胞、レーン３）。それらのメチル化パターンは、多くのバンドに関して野生型細胞のそれと類似していた。しかし、メチル化の明らかな減少が明白である６／１２の評価可能なバンドが存在した（白抜き矢印により示す）。これは、実験した全ての配列において全般的な減少があったＭ３Ａ／３Ｂ細胞の状況と対照的であった。ＡＰ−ＰＣＲ法は半定量的でしかないため、ＡＰ−ＰＣＲゲル上の、低下した強度をもつバンドのいくつかのメチル化レベルを、サザンブロット分析又はＭｓ−ＳＮｕＰＥ分析のいずれかを用いて評価した（図７Ｂ及び７Ｃ）。結果は、ＡＰ−ＰＣＲゲルから明らかな減少を確認し、このように前記アプローチの正当性を立証した。
【００８０】
従って、フィンガープリントにおいて明らかな、断片の２つのクラスが存在した。我々は、Ｍ３Ａ／３Ｂ細胞（すなわち、Ｄｎｍｔ１を欠く）においてメチル化を減少させたが、Ｍ１細胞において正常なメチル化レベル近かったものをクラスＩ配列と定義した。一方、クラスＩＩ配列は、Ｍ１及びＭ３Ａ／３Ｂ細胞の両方でメチル化の損失を示した。
図８は、ＣｐＧジヌクレオチドの存在、及びに反復要素の存在に関する断片のこれらの２つのクラスの選択のための配列特性を示す。クラスＩ配列は、より多くの反復要素をもち、そしてクラスＩＩ配列よりわずかに低いＣｐＧ密度をもつ傾向にある。明らかに、この識別は、絶対的なものではなかった、なぜならこれらの性質、例えば断片ＣＩ−ｂとＣＩＩ−ａ、又はＣＩ−ａとＣＩＩ−ｂに関係する明確な相違がなかったからである。
【００８１】
個々のＤＮＡ分子におけるメチル化パターン．先に述べた分析は、個々のＣｐＧジヌクレオチドのメチル化レベルへの見識を提供した、しかし、それはこれらの領域でのメチル化パターンについての情報をもたらさなかった。亜硫酸水素塩により処理したゲノムＤＮＡのクローン化ＰＣＲ産物の配列は、個々のＤＮＡ分子のメチル化パターンを明らかにすることができる。従って、そのような分析を、クラスＩの１つの配列と、クラスＩＩの２つの配列において実施した。これらの実験は、異なるノックアウト細胞のメチル化レベルの相違をはっきりと説明した（図９）。
【００８２】
４４０ｂｐ断片のＣＩ−ｆ配列（ジーンバンク登録番号ＡＫ０１４０１９）は、野生型細胞で配列決定された４つの部位全てで幅広いメチル化を示し、そしてＭ１細胞でも幅広いメチル化を示した、しかしＭ３Ａ／３Ｂではトップの上及びボトム鎖における著しい減少を示した（全ての細胞型のＣｐＧ部位で大体等しいメチル化レベルであった）。Ｍ３Ａ／３Ｂ細胞における個々の分子のトップ鎖の分析は、分子の７２％が完全に非メチル化され、１４％がたった１ヶ所でメチル化されているが、１４％が１分子に複数のメチル化部位をもっているというパターンの強い不均整を示した。４つの部位でのメチル化レベルの相違が、酵素が前進的に作用するのか、又はむしろ１つの部位でのメチル化が、隣接する部位のメチル化の可能性を高めるかの可能性を見分けるのを困難にさせた。
【００８３】
図９は、Ｍ１及びＭ３Ａ／３Ｂ細胞の両者における、ＬＴＲ／ＭＡＬＲ要素を含むＣＩＩ−ｄ断片のメチル化レベルの劇的な減少をも示す。野生型細胞にはかなりのメチル化が存在するが、Ｍ１細胞には実質的にメチル化はなく、そしてＭ３Ａ／３Ｂ細胞には低レベルのメチル化があった。しかし、データは、Ｍ１細胞のメチル化の実質的なレベルを示しつづけるＣＩ−ｆ断片とは対照的に、Ｍ１細胞のこの断片中の４つの部位のわずかなメチル化しか存在しないことをはっきりと示した。類似した状況を、Ｍ３Ａ／３Ｂ細胞でメチル化されることを先に示したＬＩＮＥ−１反復要素のＡ反復（すなわち、プロモーター）でも観察した。同様に、Ｍ１細胞では事実上メチル化は生じず、そしてＭ３Ａ／３Ｂ細胞でメチル化のよりわずかに高いレベルが示された。
【００８４】
Ｄｎｍｔ１は、哺乳動物の主なシトシン−５ＤＮＡメチルトランスフェラーゼであると思われるので、細胞内の維持活性に限らず、大部分に関して責任を負う、Ｄｎｍｔ１単独による不完全に維持されるように思われた配列のクラスの同定は、興味深い。これらの配列が、Ｍ３Ａ／３Ｂ細胞において実質的に脱メチル化されてもいるので（図７及び９）、Ｄｎｍｔ３ａ又は３ｂが、これらの部位のメチル化に独自に責任があるように思われなかった。さらに、Ｄｎｍｔ１及びＤｎｍｔ３ａ／３ｂの両者がこれらの配列の維持及び新規メチル化が独立した参加者であるケースの場合、Ｄｎｍｔ１及びＤｎｍｔ３ａ／３ｂの効果は、単なる添加剤であるように思われなかった（図９）。むしろ、これらの配列のメチル化が、Ｄｎｍｔ１及びＤｎｍｔ３ａ／３ｂ両者の活性の協力を必要とするように思われる。これらのデータの最も明快な解釈は、Ｄｎｍｔ３ａ及び／又は３ｂが、Ｄｎｍｔ１による乏しい維持メチル化を償うために、これらの配列の新規メチル化に必要である。これらの活性のどちらも不在ならば、これらの配列のメチル化は正確に維持されることができない。
【００８５】
実施例７
（ヘミメチル化検出のための新規アッセイ；乏しい維持メチル化を、Ｄｎｍｔ３ａ及び／又はＤｎｍｔ３ｂを介した連続的な高い割合の新規メチル化により均衡を保たせる）
Ｄｎｍｔ１のみにより不十分に維持された配列の１つが、さらに調査され、野生型細胞でさえ、それが非常に高いレベルのヘミメチル化をもつことを示し、Ｄｎｍｔ３ａ及び／又はＤｎｍｔ３ｂにより仲介された新規メチル化の連続した高い比率により均衡を保っている不十分な維持メチル化を示唆した。この研究は、本明細書中で先に記載の発明のヘミメチル化アッセイを使った。この新しくて、明快な方法の開発以前に、ゲノム中の特定のＣｐＧジヌクレオチドでのヘミメチル化レベルの測定をするための正確な方法はなかった。
【００８６】
Ｄｎｍｔ３ａ及び／又はＤｎｍｔ３ｂが新規メチル化の補填を担うというさらなる証拠は、Ｄｎｍｔ１がそうすることができなかったが、これらの酵素が、５−Ａｚａ−ＣｄＲへの細胞の一時的な暴露に続いて、処置前のレベルにメチル化を戻すことができたという事実により提供された。
Ｄｎｍｔ１は単独で、５−Ａｚａ−ＣｄＲ処理前に維持することができた配列のメチル化の修復ができないとも判明し、新規メチル化するためのその能力が、ＣｐＧ部位での欠くことのできないレベルの前もって存在しているメチル化の存在に依存していることを示唆した。
【００８７】
ヘミメチル化の検出のための新しいアッセイ．クラスＩＩ配列の不十分な維持メチル化についての１つの予想は、連続する新規メチル化による埋め合わせには、これらの部位でのヘミメチル化レベル（すなわち、パリンドローム中のたった１つのシトシンがメチル化されるとき）が、低レベルの新規メチル化を有する配列中より実質的に高く、そして非常に効率的な維持メチル化がＤＮＡの複製の各々の段階に続くべきである。
この予想の試験は、個々のＣｐＧジヌクレオチドのヘミメチル化レベルの算定方法の開発を必要とした。本発明は、本明細書中の実施例１〜５（図２及び３を参照のこと）の下に記載されるような発明を提供する。前記アッセイは、追加のクラスＩとクラスＩＩゲノム配列に及ぶまで拡張した。
【００８８】
図１０は、クラスＩ配列（ＣＩ−ｆ）及びクラスＩＩ配列（ＣＩＩ−ｄ）のヘミメチル化分析の結果を示す。野生型（Ｍ１／３Ａ／３Ｂ）細胞中のＣＩＩ−ｄ配列に非常に高レベルのヘミメチル化が存在し、これらの部位のメチル化がＤｎｍｔ１により不十分に維持され、そしてＤｎｍｔ３ａ及び／又はＤｎｍｔ３ｂにより仲介された新規メチル化の継続を必要とするという解釈と一致した。Ｄｎｍｔ１による効率的な維持メチル化を受けることが部位に関して期待される場合、ＣＩ−ｆのヘミメチル化レベルは実質的に低かった。Ｍ３Ａ／３Ｂ細胞のこの配列の対照実験は、同じ量のヘミメチル化がトップとボトム鎖に存在することを説明した（図５）。
【００８９】
５−Ａｚａ−２’−デオキシシチジン処理後の酵素間の共同性．ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ阻害薬５−ａｚａ−ＣｄＲによる分裂細胞の処理は、ゲノムの一時的な脱メチル基、続く次の細胞分裂時のメチル化レベルのリバウンド現象をもたらす。そのようなリバウンドは、新規メチル化を必要とするため、メチル化活性のこの種類の分析は、特定の部位の様々なＤＮＡメチルトランスフェラーゼ酵素の新規メチル化能力の独立した評価を提供しうる。これは、Ｄｎｍｔ３ａ及び／又はＤｎｍｔ３ｂがクラスＩＩ配列の新規メチル化の継続を担っているという提案へのさらなる支持を添える。
従って、ノックアウト細胞を、５−ａｚａ−ＣｄＲに暴露し、そしてＣＩ−ｆ及びＣＩＩ−ｄ断片の再メチル化の動力学を、ＥＳ細胞型における平衡の撹乱後のメチル化レベルを回復させるためにＤｎｍｔがどのように相互作用したかを測定するために続けた（図１１）。結果は、野生型において、薬物処理３日後にそれらの最小限のメチル化レベルに達し、そして両断片のメチル化が処理後１４日までに処置前のレベル付近まで回復したことを示した。図１１は、Ｄｎｍｔ３ａと３ｂ（Ｍ３Ａ／３Ｂ）の組み合わせがＣＩＩ−ｄの迅速な再メチル化をもたらすのに十分であり、しかしＣＩ−ｆ断片ではそうでなかったことをも示す。
【００９０】
意外なことに、Ｄｎｍｔ１酵素は単独で、一時的な薬物処理後の両方の断片のメチル化の回復を失敗した（図１１）。Ｍ１細胞は、処理後に持続的なメチル化喪失を示し、５−ａｚａ−ＣｄＲによりいったん平衡が特定のレベル未満に乱されれば、Ｄｎｍｔ１単独か今のところ正体不明のメチルトランスフェラーゼは、処置前のレベルにメチル化レベルを修復するには不十分な新規メチル化活性を有する。対照的に、Ｄｎｍｔ３ａとＤｎｍｔ３ｂを組み合わせた活性は、ＣＩＩ−ｄ配列でのメチル化の処置前レベルの完全な修復をもたらした。これらの結果は、ＣＩＩ−ｄ配列がＤｎｍｔ３ａ及び／又はＤｎｍｔ３ｂによる新規メチル化の効率的なターゲットであるが、しかしＤｎｍｔ１によるそれではないことを示唆する。これは、Ｄｎｍｔ３ａ及び／又は３ｂの継続した新規メチル化活性が、Ｄｎｍｔ１によるこの配列の不十分な維持を埋め合わせするモデルに適合する。
【００９１】
実施例８
（Ｄｎｍｔ３ａ及び／又はＤｎｍｔ３ｂのメチル化は、ＤＮＡ複製の時間付近で起こるが、一方Ｄｎｍｔ１は、多量の遅延型メチル化を示す）
Ｄｎｍｔ３ａ及び／又はＤｎｍｔ３ｂのメチル化は、ＤＮＡ複製の時間付近で起こるが、一方Ｄｎｍｔ１は、ＤＮＡ合成後１時間以上あとに、多量の遅延型メチル化を示す。しかし、両方のタイプの配列がこの維持メチル化の遅れを示したので、Ｄｎｍｔ１による維持メチル化のこの遅れは、Ｄｎｍｔ３ａ／３ｂが足りない細胞のメチル化レベルで配列に依存した変動性には原因はない。我々は、Ｄｎｍｔ１により十分に維持されている部位、対そうではない部位の間の主な区別が、新規メチル化での、又は遅延型維持メチル化での相違よりむしろ、Ｄｎｍｔ１による複製後維持メチル化効率の効率に存在すると結論する。
【００９２】
新規合成ＤＮＡのメチル化の動力学．Ｄｎｍｔ３ａ及び／又はＤｎｍｔ３ｂの埋め合わせの新規メチル化によるクラスＩＩ配列の不十分な維持メチル化のバランスは、これらのメチル化活性の両方が同時に複製直後に生じるのかどうか、又は新規メチル化が細胞周期のいずれか他の時点で生じるかどうかという問題を生じる。１時間のＢｒｄＵパルス、続く様々な時間でのチェイスが、２つのＤＮＡ配列クラスの合成に関してのメチル化のタイミングを調査するために使用される。
ＢｒｄＵを含むＤＮＡを、標準法を用いた免疫沈降により単離し、そして断片内のＣｐＧ部位のメチル化状態を、個々のＤＮＡ分子のクローン化により計測し、メチル化レベルの定量を、Ｍｓ−ＳＮｕＰＥ分析により計測した。
【００９３】
図１２は、野生型（Ｍ１／３Ａ／ＳＢ）細胞において、ＢｒｄＵによる１時間のパルスの間に合成されたＤＮＡは、合成直後にその最終レベルまでメチル化されなかったが、しかし３．５及び２４時間で計測された合成後の相でいくらかのさらなるメチル化が生じたことを示す、前記パルスチェイス実験からの結果を要約する。しかし、これは、Ｄｎｍｔ３ａ及び／又はＤｎｍｔ３ｂに起因するメチル化は発生しなかった、なぜならＭ３Ａ／３Ｂ細胞が１時間後にさらなる新規メチル化を示さなかったからである。実際には、メチル化の遅延型増加がＭ１細胞中のＣＩ−ｆ配列に関して明白でもあった。Ｄｎｍｔ１がＳ期の核の複製機構に局在化し、ＰＣＮＡと相互作用するという先の証明が、メチル化パターンが合成直後に複製されるという本技術分野の予想をもたらした。しかし、いくつかの初期の先行技術研究は、シトシンのメチル化が二相様式で生じていることを含め、いくらかのメチル化が遅れるかもしれないことを示唆していた。現在の結果は、これらの初期の研究と一致している。
最後に、Ｄｎｍｔ３ａ及び／又はＤｎｍｔ３ｂによる大部分のメチル化がＤＮＡ合成前に、又はその直後に発生するが、一方でＤｎｍｔ１は、複製後１時間超で維持活性を表し続けた。
【００９４】
概要
（実施例１〜８）
メチル化パターンの確立及び維持における３つの既知のＤＮＡメチルトランスフェラーゼ、Ｄｎｍｔ１、Ｄｎｍｔ３ａ、及び３ｂの機能は完全には理解されていない。本発明により、Ｄｎｍｔ１、Ｄｎｍｔ３ａ、及び３ｂについての系統立った遺伝子ノックアウトをもつマウス胚性幹細胞（ＥＳ）を、ＤＮＡ合成に関しての２つの相で生じるＣｐＧが乏しい転写配列におけるＤＮＡメチル化を示すために使用した。ＢｒｄＵパルスチェイス実験は、Ｄｎｍｔ１が複製で又はその直後で機能し、平衡レベルの約７２％まで新規合成鎖をメチル化したが、しかしヘミメチル化ＤＮＡのパッチをそのままにしたことを示した。パターンの修復は、新規メチル化酵素としてのそれらの役割に加えて、その活性がパッチを埋める、前進的な酵素であるように思われるＤｎｍｔ３ａ及び３ｂにより大幅に促進された。本発明は、ヘミメチル化を計測し、そしてメチル化率を計算するための新規方法を提供する。これらの新規方法は、Ｄｎｍｔ３ａと３ｂがＥＳ細胞のゲノムの完全なメチル化を確実にするために主に維持メチルトランスフェラーゼとして作用すると結論するために本明細書中で使用された。
【００９５】
インプリンティングのような発生上の過程、及び癌、ＩＣＦ、及びＲｅｔｔ症候群のような病理的な状況におけるＤＮＡのメチル化の中心的で、原因となる役割は、ますます評価されている。これは、メチル化パターンがどのように獲得され、そして維持されるかを理解するための調査研究を刺激した。最近のクローン化及びＤｎｍｔ３ａ及び３ｂの酵素の予備的な特徴づけは、十分に特徴づけられたＤｎｍｔ１により複製されたパターンの確立によりそれらが新規メチル化に対して主に責任があるかもしれないという示唆をもたらした。
本発明により、Ｄｎｍｔ３ａ、及び３ｂが新規酵素として作用し、さらに、未分化細胞においてメチル化パターンの完全な維持の確保でＤｎｍｔ１を支援する、より重要な役割を多分もっている。
【００９６】
本発明によると、ＣｐＧの不足に関して哺乳動物の遺伝子の典型的なＤＮＡ部位のメチル化が、２つの相で生じ、従って不連続的になった（図６Ａ、Ｂ、及びＣに示されるモデルに要約した）。
６Ａ、ＢとＣは、ＥＳ細胞のＤＮＡメチルトランスフェラーゼ酵素の間の双方向性について提案されたモデルを説明する。この図面は、本発明のデータの高度な図式的な解釈を表す。データは隣接している４つのＣｐＧｓ、及び特に詳細に１つのＣｐＧジヌクレオチドの分析に基づくが、均等に間隔を空けて配置されたＣｐＧジヌクレオチドが円で表される仮説の複製フォークを使って、結論を要約した。黒い円は、親ＤＮＡ上のメチル化したＣｐＧｓを表し、一方、灰色の円は、娘鎖上の新しくメチル化されたＣｐＧｓを表す。非メチル化ＣｐＧｓは白い円により示される。ＰＣＮＡはリングにより示される。ＤＮＡメチルトランスフェラーゼは、長方形（Ｄｎｍｔ１）か卵形（Ｄｎｍｔ３ａ及び／又は３ｂ）により示される。
【００９７】
図６Ａは、３つ全てのＤＮＡメチルトランスフェラーゼ酵素を含んでいる野生型細胞においてメチル化パターンがどのように維持されるかを表す。野生型細胞において合成されたほとんどのＤＮＡが、ＰＣＮＡとの相互作用を通して、複製機構に綿密に関係するであろうＤｎｍｔ１により多分合成直後にメチル化される。その中にヘミメチル化のパッチが生じて、これらがＤｎｍｔ３ａ及び３ｂの酵素のための基質として与えられるようなＤＮＡの部位がある。パターンの完全な複写は、３つの酵素全ての調和した作動力を要求する。
図６Ｂは、メチル化がＤｎｍｔ３ａ及びＤｎｍｔ３ｂ酵素を欠いている細胞において生じるためにどのように提案されるか示す。Ｄｎｍｔ３ａとＤｎｍｔ３ｂが欠けているので、個々のＣｐＧｓ、又はＣｐＧｓのパッチがＤｎｍｔ１により外されて、メチル化されないままでいる。これは、複製の次の段階に非メチル化ＣｐＧｓの残存のより高い発生率をもたらす。これらのＣｐＧｓのいくつかかが複製の次の段階でＤｎｍｔ１によりメチル化され、そのため２４時間までに、Ｍ１細胞における非メチル化ＣｐＧｓの比較的にやや大きなパッチしか存在しなかった（図５を参照のこと）。
【００９８】
図６Ｃは、Ｄｎｍｔ１を欠くＭ３Ａ／３Ｂ細胞の状況を示す。モザイク・メチル化パターンは、メチル化と非メチル化のパッチ、並びにヘミメチル化部位のかなりの部分と一緒に存在する。Ｄｎｍｔ１、Ｄｎｍｔ３ａ及び／又は３ｂの欠如は、存在しているメチル化パターンのいくらかの複写は可能であるが、しかし特に効率的なわけでない可能性が高い。さらに、これらの細胞型におけるメチル化のモザイク・パターンをもたらすので、前記酵素が、ＤＮＡの両鎖の新規修飾もできるように思われる。
【００９９】
ＣｐＧ部位がそれらの最終レベルの約７２％までメチル化される、メチル化の最初の相は、多分、Ｌｅｏｎｈａｒｄｔ ｅｔ ａｌ．， （１９９２）及びＲｏｕｎｔｒｅｅ ｅｔ ａｌ．， （２０００）、そして本明細書中で立証された的確な仕事によりＤＮＡ複製機構と関連することが示されているＤｎｍｔ１により達成される。
面白いことに、ＢｒｄＵパルス標識されたＤＮＡのダイレクト・シークエンシングにより示されるとおり、前記酵素は非メチル化部位のギャップを互いに結び付けられたままにした。これらのギャップ又はパッチのサイズは、確立されなかったが、しかしそれらは、本明細書中で調査した断片中の部位１と４の間の距離で、少なくとも３００ｂｐあった。このＤＮＡは、相当な数のヘミメチル化部位を含んでおり、それらは合成後の相中に完全にメチル化した部位に変えられた。遅延型メチル化は、おそらくＤｎｍｔ３ａ／３ｂにより成され、従ってそれは、前進的であるが、１００％効率的ではないヘミメチラーゼ酵素として作用しているに違いない。
【０１００】
この前進性に関する証拠は、アッセイした分子の７２％がメチル化をもたず、一方で１４％が１つの部位超でメチル化をもつ、Ｄｎｍｔ１を欠いたＭ３Ａ／３Ｂ細胞の分析から得た。これらの２つの性質をまとめることは、おそらくパターンの安定性を保証する。しかし、酵素が前進的でないことよりも、むしろメチル化の存在がさらなるメチル化部位に引き付ける可能性がある。
【０１０１】
新規ヘミメチル化アッセイ．本発明は、ヘミメチル化の定量の新規な方法を提供し、それは、正確度を確保するために、亜硫酸水素塩処理前のＨｐａＩＩによるＤＮＡの完璧な消化を必要とする。これを、過剰な酵素の使用、及び１６時間のインキュベーション後の酵素の補充により達成した。前記方法は、強固で、他の実験、及び適用される応用に全体的な有用性をもっている。
Ｍ３Ａ／３Ｂ細胞のヘミメチル化部位の高い割合の発生は、当初、Ｄｍｎｔ３ａ及び３ｂ酵素が野生型細胞のギャップを埋めるためにヘミメチル化酵素として作用しているという示唆に適合しないと思われた。Ｍ３Ａ／３Ｂ細胞のシトシン・メチルトランスフェラーゼ活性の総体的なレベルが有効なメチル化維持に不十分ならば、この見かけ上のパラドックスを説明することができた。これは、実際は、Ｍ３Ａ／３Ｂ細胞に存在する新規と維持メチル化の混合比率（０．０７＋０．３７＝０．４４）が、Ｍ１細胞（０．３９＋０．７５＝１．１４）又は野生型細胞（０．５０＋０．９４＝１．４４）のそれより実質的に低かったケースであるかもしれない。Ｏｋａｎｏら（１９９８）は、試験管内において、Ｄｎｍｔ３ａ及びＤｎｍｔ３ｂがＤｎｍｔ１より実質的に低い活性レベルをもっていたことを発見した。故に、Ｍ３Ａ／３Ｂ細胞のパターンは、Ｄｎｍｔ３ａ及び３ｂが完全にメチル化した立体配位に戻すことができないヘミメチル化パッチの有意な割合をもつ高度なモザイクである。
【０１０２】
本明細書中、先に記載の総体的な比率は、メチル化酵素の異なる補足物をもつ細胞において計測された定常状態のＤＮＡメチル化レベルから計算した。それにしても、得られた率は、相互一貫して機能の比較的に少ない重複しか示唆していないように思われる。例えば、Ｍ１細胞について計算した新規と維持メチル化率の合計（１．１４）を、Ｍ３Ａ／３Ｂ細胞について計算した新規と維持メチル化率の合計（０．４４）に加えると１．５８であった。これは、Ｍ１／３Ａ／３Ｂ細胞に関して計算された総体的な活性の１．４４から遠くなく、活性が重複するよりむしろ主に相補的であることを示唆している。
【０１０３】
本発明の方程式は、全ての新規メチル化が完全にメチル化された産物に通じるとみなす。その上、計算方法は、新規メチルトランスフェラーゼ活性がヘミメチル化をもたらすという考察を導き出した。しかし、本発明の目的のためのそのような活性の包含は、実験データとのより最適な合致の喪失をもたらす。その上、真核生物のメチルトランスフェラーゼからの実験的な証拠は、新規メチルトランスフェラーゼが連続的に第１鎖のシトシンのメチル化が比率を制約する、２つ対向するＤＮＡ鎖に作用することを示した。
本発明の方程式は、トップ及びボトム鎖が等しくメチル化されるとみなし、仮定は、実施した数個の予備的な実験で支持された。
【０１０４】
本発明による、ヘミメチル化率の計算は、ＤＮＡ鎖のメチル化状態が細胞分裂内の計測された平衡レベルに達すると推定する。実際には、ＢｒｄＵデータは、ＤＮＡ鎖が最初の細胞分裂の内にそのメチル化のほとんどを獲得したが、それらが各々の細胞分裂により老化する場合に追加のメチル化を獲得し続けることを示唆した。
従って、細胞集団からのＤＮＡ分子のプールは、ＤＮＡメチル化レベルでの、又はわずかに集団全体に対してわずかに平均レベル未満の最近合成された鎖、並びに高レベルのメチル化をもつ古いＤＮＡ鎖を含む。集団のＤＮＡ鎖の相対的な有病数は、その最初の合成以来、ＤＮＡ複製の段階の数に相関して減少する。再結合と修復に関係したＤＮＡ合成がそれらの隣接を中断させうるので、これらの「鎖」は分子全体（染色体）よりむしろ長いパッチを表すかもしれない。
【０１０５】
本発明によるモデルは、ＤＮＡ鎖がそれらの老化とともにますますメチル化されるようになり続ける機構を支持する。結果として、本発明の比率計算は、異なる年齢のＤＮＡ鎖の集団全体のための加重平均と考えられるべきである。老化したＤＮＡ鎖で生じるあらゆる新規メチル化は、ＤＮＡの複製により取り除かれることができなかった、故に、この累積性のメチル化を防ぐ唯一の方法は、活性な酵素的脱メチル化を発動させることである。これらの老化した鎖がさらにわずかな集団を表すが、表現型の効果をもたらすＤＮＡメチル化のしきい値に達したとき、それらは、例えばクローンの発生を導き、腫瘍サプレッサー遺伝子を封じる、生物学的な結果を生むことができた。このこれまで確認されていない現象は、老化（Ａｈｕｊａ ａｎｄ Ｉｓｓａ， ２０００）及び癌（Ｊｏｎｅｓ ａｎｄ Ｌａｉｒｄ， １９９９）で観察されたＣｐＧ島の高メチル化の増加を、部分的に、説明するかもしれない。
【０１０６】
Ｄｎｍｔ３ａと３ｂを欠いているＭ１細胞で、同時にメチル化された２つ未満の部位がある、１時間のＢｒｄＵパルスの間に新規合成された分子の５０％の分子、並びにとメチル化された３又は４の部位を含む残りから成る２つのクラスに関する明らかな証拠が存在した（図５）。分布の二相特性は、リーディング及びラギング鎖が差別的にメチル化酵素により処理されたという考えと一致していたが、しかしながら、これが複製起点を伴うケースであると判明していない（Ａｒａｕｊｏ ｅｔ ａｌ．， １９９８）。しかし、Ｄｎｍｔ３ａ及び３ｂ酵素が差異的な核での局在を示すことは興味深く、そしてリーディング及びラギング鎖のメチル化動力学が異なるかどうかを測定するのにさらなる作業が必要である。
【０１０７】
本発明に従って得られたデータの解釈は、引き続く分析のための新規合成ＤＮＡにタグを付けるためのＢｒｄＵの使用による重要な範囲に期待する。従って、ＤＮＡの中へのこの分子の取り込みがその合成後のメチル化パターンを変えるかどうかを疑うことが重要である。先の実験が、ＢｒｄＵがチミンの９５％が相似体により置換されているレベルでさえメチル化レベル全体の変化を引き起こさないことを直接的に示したので、これはありそうもない（Ｓｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９７７）。
【０１０８】
注目すべきは、ＤＮＡの非ＣｐＧ島部位のメチル化性質が計測された。ほとんどのゲノムのメチル化がそのような配列で生じるが、酵素間の同じ協力が、修飾がプロモーター・サイレンシングとより密に結びつくＣｐＧ島で明白であるかどうかを見ることが重要である。この件に関して、反復が多い配列のメチル化がＤｎｍｔ３ａと３ｂを欠いているＥＳ細胞において十分でないことが測定され、少なくとも２つのメチルトランスフェラーゼがこれらの配列のメチル化を確実にするために必要とされていることを示し、Ｍ１細胞において実質的にメチル化された本明細書中で研究した断片と異なる。また、哺乳動物の細胞の複製起点が合成後５分以内にメチル化されるようになることが示されており（Ａｒａｕｊｏ ｅｔ ａｌ．， １９９８；Ｒｅｉｎ ｅｔ ａｌ．， １９９９）、それらが我々が研究している断片の外見上の遅延を示さないかもしれないことを示唆する。
【０１０９】
本発明の結果は、ＤＮＡ代謝に関係している他の酵素システムの相補的な活性を強く連想させる。例えば、ＤＮＡポリメラーゼでαとδは、ＤＮＡ合成の異なる段階で加わる（Ｗａｇａ ａｎｄ Ｓｔｉｌｌｍａｎ， １９９８）。多分、メチル化パターンは、重複するが、しかし専門的な活性をもつ酵素により維持される。
本発明のデータは、発生初期の細胞におけるＤｎｍｔ３ａ及び３ｂの重要な機能が、複製フォークでのＤｎｍｔ１により見逃された非メチル化ＤＮＡのパッチを補填することであることを示す。従って、これらの酵素には、新規メチルトランスフェラーゼとしてのそれらの潜在的な役割に加えて、修復機能がある。
【０１１０】
最後に、実施例６〜８は、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ（Ｄｎｍｔｓ）に関して系統立った遺伝子ノックアウトをもつマウスＥＳ細胞が、マウス・ゲノムのメチル化パターンの維持におけるＤｎｍｔ１及びＤｎｍｔ３ａと３ｂの役割の輪郭を描くために使用することができること示す。単独のＤｎｍｔ１は、アッセイしたほとんどのＣｐＧが乏しい部位の維持メチル化が可能であった。対照的に、Ｄｎｍｔ１、並びにＤｎｍｔ３ａ及び／又はＤｎｍｔ３ｂは、たくさんのマウスＬＩＮＥ−１プロモーターを含む配列の選ばれたクラスにメチル化を必要とした。
【０１１１】
新規ヘミメチル化アッセイは、野生型細胞であっても、これらの配列が不十分な維持メチル化を示唆したヘミメチル化されたＤＮＡを高レベルで含むことを示すために使用された。Ｄｎｍｔ３ａ及び／又は３ｂは、５−Ａｚａ−ＣｄＲへの細胞の一時的な暴露に続くこれらの配列のメチル化を処置前のレベルに戻すことができたが、一方でＤｎｍｔ１単独では、そうすることができなかった。
【０１１２】
最後に、Ｄｎｍｔ３ａ及び／又はＤｎｍｔ３ｂによる継続的な新規メチル化は、これらの内生的な反復が多い配列のＤｎｍｔ１による非効率的な維持メチル化を償う。当該結果は、ＥＳ細胞における哺乳動物のＤＮＡメチルトランスフェラーゼ間のこれまで認識されていない程度の共同性を明らかにした。
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１Ａは、ＥＳ細胞のメチル化のパターンを示す。４４０ｂｐの配列を含んでいるＤＮＡ（断片ＣＩ−ｆ）の個々の分子内の４つのＣｐＧ部位のメチル化状態を、個々の分子をクローン化し、続いて所定の４つの部位のＭＳ−ＳＮｕＰＥ分析により評価した。
図１Ｂは、本発明に従って実験された３つの細胞型の中の個々のＤＮＡ分子のメチル化パターンを示す、Ｎ＝評価したＤＮＡ分子の数。
【図２】
本発明による、個々のクローン化されたＤＮＡ分子のヘミメチル化の検出及び定量を示す。ＥＳ細胞におけるヘミメチル化を検出するために使われた実験的なアプローチは、ＨｐａＩＩによりゲノムＤＮＡを前もって切断し、続いて亜硫酸水素塩処理し、その後個々のＰＣＲ産物をクローン化し、そしてＭＳ−ＳＮｕＰＥ分析により、例えば、部位２のメチル化状態を評価するステップを含む。
【図３】
計測された定常状態のメチル化レベル、メチル化率、並びに２つの実験的な変数（「Ｐ」と「Ｓ」）の測定で始まる、ＨｐａＩＩ部位内の単一のＣｐＧジヌクレオチドでの（細胞分裂あたりの基質分子の変換の比として表される）新規（ｎ）及び維持（ｍ）メチル化率の計算に使用される手順の概要を示す。
【図４】
図４Ａは、野生型Ｍ１／３Ａ／３Ｂ細胞においてＢｒｄＵによる１時間のパルスの間に合成されたＤＮＡが合成後２４〜４８時間の間その最終レベルまでメチル化されなかったことを示すようなパルスチェイス実験からの結果を要約する。
図４Ｂは、ＤＮＡの遅延型メチル化が活性なＤＮＡメチルトランスフェラーゼ酵素を必要とすることを示す。
【図５】
メチル化パターン細胞の成熟を示す。個々のＤＮＡ分子のメチル化状態を、ＢｒｄＵを含んでいない媒質中で、ＢｒｄＵでの１時間のパルスの直後、又はチェイス期間（２４時間）の後に測定した。
【図６】
図６Ａ、Ｂ、及びＣは、ＥＳ細胞におけるＤＮＡメチルトランスフェラーゼ酵素の間の相互作用力に関する提案されたモデルを説明する。
図６Ａは、３つのＤＮＡメチルトランスフェラーゼ酵素の全てを含んでいる野生型細胞において、メチル化パターンがどのように維持されるかを表す。
図６Ｂは、Ｄｎｍｔ３ａ及びＤｎｍｔ３ｂ酵素を欠いている細胞において、どのようにメチル化の発生が提案されるかを示す。
図６Ｃは、Ｄｎｍｔ１を欠いているＭ３Ａ／３Ｂ細胞の状況を示す。モザイク・メチル化パターンをメチル化と非メチル化のパッチ、並びにヘミメチル化された部位の実質的な比により示した。
【図７】
図７Ａは、ＲｓａＩ、ＲｓａＩとＨｐａＩＩ、又はＲｓａＩとＭｓｐＩの各々の１６時間の酵素消化後のＭ１／３Ａ／３Ｂ、Ｍ３Ａ／３Ｂ、及びＭ１ＥＳ細胞ＤＮＡのメチル化感受性フィンガープリント法を示す。レーン２のみの低メチル化されているように思われるバンドを、黒塗り矢印（クラスＩ）で示した。レーン２及び３の両方で低メチル化されているように思われるバンドを、白抜き矢印（クラスＩＩ）で示した。機能的ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ遺伝子を、黒塗り四角で示し、不活性遺伝子を白抜きの四角で示した。ＧＣＰ１、２、４は、ＧＣの乏しいプライマーである。
図７Ｂは、単離したＡＰ−ＰＣＲ断片ＣＩ−ｆを用いた、Ｍ１／３Ａ／３Ｂ、Ｍ３Ａ／３Ｂ、及びＭ１ＥＳ細胞ＤＮＡからのゲノムＤＮＡのサザンブロット分析を示す。
図７Ｃは、Ｍ１／３Ａ／３Ｂ、Ｍ３Ａ／３Ｂ、及びＭ１ＥＳ細胞ＤＮＡからのＣＩＩ−ｄ断片に関するＭｓ−ＳＮｕＰＥ分析を示す。ＣＩＩ−ｄの３つのＣｐＧ部位の定量的なメチル化分析。メチル化の割合は、ＰｈｏｓｐｈｏＩｍａｇｅｒ定量に対して以下の方程式：（メチル化）Ｃ／［（メチル化）Ｃ＋（非メチル化）Ｔ］Ｘ１００、を使った３つの部位の平均を表す。ＣｐＧ部位を、チェック・マークで表す；縞模様の四角は反復配列を表す；矢印はＰＣＲプライマーを表す。
【図８】
ＥＳ細胞におけるメチル化感受性フィンガープリントから分離した低メチル化断片の配列特性を示す（図７ＡのＣｐＧ部位をチェック・マークで表す；縞模様の四角は反復配列を表す；上向きの矢印はＨｐａＩＩ部位を表す）。※図７Ａに含まれていないバンドを示す。
【図９】
異なる部位でのＥＳ細胞におけるメチル化パターンを示す。ＣＩ−ｆ（クラスＩ）、ＣＩＩ−ｄ及びＡ−反復部位（クラスＩＩ）からのＤＮＡの個々の分子のメチル化状態を、個々の亜硫酸水素塩変換分子のクローン化し、続いてＭｓ−ＳＮｕＰＥ又は自動化配列決定法により評価した。ＣｐＧ部位をチェック・マークで表す。ＣｐＧジヌクレオチドのメチル化状態：（黒塗りのくさび／円）メチル化されている；（白いくさび／円）メチル化されていない。くさび／円の水平の列は、亜硫酸水素塩により処理したＤＮＡのＰＣＲ増幅、そしてクローン化の後に配列決定した、個々の分子を示す。縞模様の部位は反復配列を示す。
【図１０】
図１０Ａは、ＣＩ−ｆとＣＩＩ−ｄ部位のメチル化状態の分布、並びに２つの実験的な変数（「Ｐ」及び「ｓ」）の測定から始まる、ＨｐａＩＩ部位内の単一のＣｐＧジヌクレオチドでのメチル化状態（完全にメチル化されている、ヘミメチル化されている、全くメチル化されていない）の分布の計算に使用される手順の概要を示す。各々の変数の説明を、計算された変数を得るために使用される方程式と一緒に最初の欄でする（実験手順を参照のこと）。２番目の欄は、変数を表すメチル化状態（白いボックス）、並びにその特別なステップで評価されている全ての他のメチル化状態（灰色のボックス）のサブセットを説明する。ＨｐａＩＩ消化がこのステップでの検討からこれらの分子を取り除くので、非メチル化ＣｐＧｓはＳ及びＤ変数の場合には存在しない。計測された変数「Ｐ」と「Ｓ」に関する３種類の細胞系についてのデータを、割合として欄の右側に、続いて評価した分子の絶対数を示す。対照実験は、トップ及びボトム鎖が、それらのメチル化レベル及び比率において等しいことを証明した。平均化により、新規合成鎖とＤＮＡ複製後の娘鎖の間の相違は、細胞の多数の集団においてトップとボトム鎖の間で等しく分配される。
図１０Ｂは、ＣＩ−ｆとＣＩＩ−ｄのメチル化状態の分布を示す。Ｆは、完全にメチル化していることを；Ｈは、ヘミメチル化を；Ｕは全くメチル化していないことを示す。
【図１１】
５−Ａｚａ−ＣｄＲ処理後のメチル化の修復を示す。所定の細胞型を、３ｘ１０−７Ｍの５−ａｚａ−ＣｄＲで２４時間処理し、培地を交換し、そして細胞をさらに培養した。薬剤を培養に添加した後の指示された時点でＤＮＡを抽出し、指示されたとおりＭｓ−ＳＮｕＰＥ分析によりＣＩ−ｆ（黒）及びＣＩＩ−ｄ断片（白）のメチル化状態を計測した。得られた結果は２つの別々の実験の平均値である。
【図１２】
ＣＩ−ｆとＣＩＩ−ｄでの新規合成ＤＮＡのメチル化動力学を示す。示されたＤＮＡメチルトランスフェラーゼに関する遺伝子を含んでいるＥＳ細胞を、ＢｒｄＵにより１時間パルスした。次に、パルスを取り除き、チェイス期間中新鮮な培地を細胞に添加した。パルス開始後の様々な時点で、ＤＮＡを細胞から抽出し、そして免疫沈降してＤＮＡを含んでいるＢｒｄＵを分離した。指示された時点でのＣＩ−ｆ及びＣＩＩ−ｄ中のＨｐａＩＩ部位のメチル化状態を定量的なＭＳ−ＳＮｕＰＥ分析により決定した。データは２〜６の実験の平均値を表し、誤差範囲は標準偏差を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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