(57)【要約】複数の分離レーンを有する電気泳動システムが、各レーンが別々に較正される自動較正の特徴とともに提供される。各分離レーンについて、較正係数は、受け取ったチャンネル強度のスペクトルを、存在している複数の色素のそれぞれの相対的確率を反映する値へとマッピングする。単一の色素の影響を反映する個々のピークは、検出された光強度スペクトルの種々のセットから分離される。これらのピークは、存在する色素成分の数を検出し、較正係数用の模範的なベクトルを確立し、クラスター化し、更に当該システム用のマトリックスへと処理するために使用することができる。本発明のシステムは、分離レーン中を移動するサンプル中のＤＮＡヌクレオチドを異なる色素セットを使用してタグ付けすることを許容し、更に、新規な色素セット及び従来未使用の色素セットについての現位置較正を許容する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
平行電気泳動システムであって、
複数の分離レーン、検出器及び該検出器に接続したプロセッサを有し、
少なくとも２つの異なる分離レーンからの光強度を該検出器で受け取り、
該受け取った光強度を、少なくとも２つの異なる較正マトリックスを使用して処理すること
を特徴とするシステム。
【請求項２】
少なくとも１つの分離レーンを含む電気泳動装置において検出システムを較正する方法であって、
該検出システムが、該少なくとも１つの分離レーンからｍ個の波長チャンネルにわたり光強度のスペクトルを感知するように構成されており、
複数のサンプルのそれぞれについて少なくとも１つの光強度スペクトルを検出する工程、
該検出した光強度スペクトルを、予め決定したクラスター化基準を使用して、ｎ個のカテゴリーへクラスター化する工程、及び
該クラスターから較正マトリックスを作成する工程
を含むことを特徴とする方法。
【請求項３】
少なくとも数個のサンプルについて検出したスペクトルを、クラスター化工程の前に破棄する、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
対応する複数の分離レーンのそれぞれについて較正マトリックスを決定する、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
総数が少なくとも９６個の較正マトリックスを生成し、各マトリックスが対応する分離レーンのそれぞれに対応している、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
電気泳動分離装置であって、
少なくとも１つの分離レーン、検出器及びプロセッサを有し、
該検出器が、
複数のサンプルのそれぞれについて少なくとも１つの光強度スペクトルを検出し、
検出した光強度のセットを、予め決定したクラスター化基準を使用してｎ個のカテゴリーへクラスター化し、
該クラスターから較正マトリックスを作成するように構成されている
ことを特徴とする装置。
【請求項７】
該装置が、クラスター化工程の前に、少なくとも数個のサンプルのスペクトルを廃棄するように構成されている、請求項６に記載の装置。
【請求項８】
電気泳動により分離した、色素でタグ付けされたＤＮＡサンプルにおいて、ヌクレオチドを同定する方法であって、
光強度を２次元時間−波長プロット上に表示する工程、及び
該プロット上に表示された形成物の形状及び位置に基づいてヌクレオチドを同定する工程
を含むことを特徴とする方法。
【請求項９】
複数の色素成分を含むサンプルを分離するための電気泳動検出システムであって、
該検出システムが、該サンプルのスペクトルから異なる色素成分の数を自動的に決定するように構成されていることを特徴とするシステム。
【請求項１０】
複数の分離レーンを有する電気泳動分離装置を自動的に較正する方法であって、
各分離レーンについて、移動サンプルから光強度について複数のセットを検出する工程であって、各セットにおいて光強度が総数Ｒ個（Ｒ≧２）のチャンネルに集められる工程、
各分離レーンについて、該光強度についての複数のセットのうちの少なくとも幾つかのセットにおいてピークを分離する工程、
該分離したピークに基づいて、移動サンプル中に存在する色素の数Ｍ（Ｍ≧２）を推定する工程、及び
各分離レーンについて、該分離したピークのチャンネルにおける光強度の分布に基づいて係数を計算する工程であって、該係数が、Ｒ個のチャンネルから検出した光強度を、存在している各色素の相対的確率を反映する値へとマッピングする工程
を含むことを特徴とする方法。
【請求項１１】
係数が、Ｒ×Ｍのマトリックスの形状で配列している、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
平行電気泳動システムであって、
複数の分離レーンであって、それぞれの分離レーンにおいてサンプルを同時に分離するためのレーン、
検出器、及び
該検出器に接続したプロセッサを有し、
該プロセッサが、１種以上の色素セットに属する色素でタグ付けされた種から検出した光を同時に処理するように構成されている
ことを特徴とするシステム。
【請求項１３】
分離装置を自動的に較正する方法であって、
色素を有する種から発光した光をサンプリングする工程であって、該サンプリングを波長チャンネルの第一数ｍ及び時間間隔の第二数ｎにわたり行い、時間−波長分布を形成する工程であって、該時間−波長分布において総数ｋ個の分離した種が形態学的形成物により表される工程、
該形成物から総数ｌ個のピークを分離する工程であって、各ピークが分離した種に対応している工程、
該ｌ個のピークを、少なくとも１つの類似性基準に基づいてｊ個のクラスへとクラスター化する工程、
総数ｊ個の較正ベクトルを形成する工程であって、各較正ベクトルが該クラスの１つを表している工程、及び
該ｊ個の較正ベクトルからなる較正マトリックスＡを形成する工程
を含むことを特徴とする方法。
【請求項１４】
形成物からｌ個のピークを分離する工程が、
タイムドメインにおけるサンプルデータを予備処理する工程、
該タイムドメインにおける総数ｐ個のピークを分離する工程、及び
該ｐ個のピークから、該タイムドメインにおける該ピークの幅及び間隔にしたがい総数ｌ個のピークを分離する工程
を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
ピークを分離する工程が、
形態学的フィルターを使用して、時間−波長分布中のピークを同定する工程を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
ピークを分離する工程が、
時間−波長分布を可視的に調べる工程及び他のピークへ結びついていないピークを選択する工程を含む、請求項１３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
関連出願
本出願は、米国仮出願第６０／２３１，５７４号（出願日２０００年９月１１日）及び米国出願第０９／６７６，５３６号（出願日２０００年１０月２日）に基づく優先権を主張する。
技術分野
本発明は、検出された蛍光レベルの分析に基づいて移動種（ｍｉｇｒａｔｉｎｇ ｓｐｅｃｉｅｓ）を同定する電気泳動装置に関する。より詳細には、本発明は、原位置（ｉｎ−ｓｉｔｕ）較正能力を有し、種々の色素セットの使用を許容し、かつ、単純化された塩基の呼び出し（ｂａｓｅ ｃａｌｌｉｎｇ）について結果の三次元グラフ表示を許容する装置に関する。
発明の背景
米国特許第６，０２７，６２７号明細書に記載の検出システムにおいて、並列に並んだ複数のキャピラリー内の移動種からの蛍光は、ＣＣＤ検出器へ入射（ｉｍｐｉｎｇｅ）する前に、フィルター、トランスミッション・グレーティング・ビーム・スプリッタ（ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ ｇｒａｔｉｎｇ ｂｅａｍ ｓｐｌｉｔｔｅｒ）及びレンズを通過する。好ましい態様において、ＣＣＤ検出器は１０２４×２５６画素から構成される。第一の次元（１０２４画素）は９６の平行キャピラリーをカバーし、各キャピラリーは１０２４の列（ｒｏｗ）のうちの少なくとも１つへ集中（ｆｏｃｕｓ）している（但し、１キャピラリーあたりの列の数は、異なる焦点距離を有するレンズの選択又はその他の光学パラメータの変更により増加させることができる）。第二の次元（２５６画素）はトランスミッション・グレーティングにより拡散（ｓｐｒｅａｄ）した蛍光スペクトルをカバーする。
この先行技術のシステムにおいては、一次コンポーネント及び二次コンポーネントの双方を検出器アレイへ集中させることができる。但し、これは絶対的な要件ではない。しかしながら、各キャピラリーに対して（例えば１セットオーダーのコンポーネントにより表される）スペクトルが作成し、かつ、検出することが要求される。興味の対象となるスペクトルは、色素が蛍光を発することが知られている光の波長を含んでいなければならない。各キャピラリーについての興味の対象となるスペクトルはＰ個の近接する画素にわたって広がる。Ｐ個の近接する画素は、Ｑ個の近接する画素からなるＲ個のチャンネルへと分割される。すなわち、Ｒ＝Ｐ／Ｑ。Ｒは使用する色素の数Ｍと少なくとも同じ大きさであり、好ましくは当該色素の数よりも大きい。
【０００２】
先行技術の検出器は、各キャピラリー及びデータを担当プロセッサへ提供する各時間につき、Ｒ個の光強度を含むスペクトルを出力する。次いでプロセッサは、各キャピラリーに対するＲ個の強度のスペクトルを、当該キャピラリーにおいてどの色素が検出されたかの決定を補助する値へとマッピング（ｍａｐ）する。これは、各キャピラリーについて、較正係数（ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎ ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ）に強度のベクトルを乗じることにより行われる。
較正係数の背後にある原理は、各チャンネルにおける受光強度のスペクトルは、検出システムの作用（較正係数）により秤量される単一の色素（対応する塩基をタグ付けしている）のスペクトルにより生じるというものである。
Ｉ０（ｎ）、Ｉ１（ｎ）、…、Ｉ９（ｎ）が、（検出、ビンニング（ｂｉｎｎｉｎｇ）及びベースライン・サブトラクション（ｂａｓｅｌｉｎｅ ｓｕｂｔｒａｃｔｉｏｎ）を含む前処理後の）ＣＣＤからの出力のｎ次セットにおけるＲ＝１０個のチャンネルの測定強度を表し、Ｂ０（ｎ）、Ｂ１（ｎ）、…、Ｂ３（ｎ）が、Ｍ＝４の塩基の寄与（存在１、非存在０）を示すベクトルであり、Ｃｉｊが、検出されたチャンネルへ塩基をマッピングした既知の１０×４マトリックスの係数である場合、以下の関係が成立する。
〔式１〕
2004509326.tif 000002
式１は下記のとおり書き換えることができる。
〔式２〕
2004509326.tif 000003
各分離レーンにつきＣＣＤにより強度出力のベクトルが与えられる場合、Ｒ＝１０個の波長チャンネルからＭ＝４塩基のそれぞれについての存在又は不存在を決定する理論がかなり十分に確立される。これは、少数の未知数（ｕｎｋｎｏｗｎ）が多数の式から決定される多元システム（ｏｖｅｒ−ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ ｓｙｓｔｅｍ）の単なる特別なケースである。数学的変換の後、式２は下記の通り書き換えることができる。
〔式３〕
2004509326.tif 000004
【０００３】
式中、Ｂ０（ｎ）、…、Ｂ３（ｎ）は、タイムインデックス（ｔｉｍｅ ｉｎｄｅｘ）ｎの関数としての個々の塩基の未知の値を示し、各値は存在する塩基にタグ付けしている対応の色素の相対的確率であり、Ｉ０（ｎ）、Ｉ１（ｎ）、…、Ｉ９（ｎ）は１０個のチャンネルの蛍光強度であり、Ｃｉｊは、既知の塩基ｊにおける波長ｉの係数であり、ＣＴはマトリックスＣの転置である場合、Ａ＝（ＣＴＣ）−１ＣＴは、マトリックスＣの疑似変換（ｐｓｅｕｄｏ−ｉｎｖｅｒｓｅ）である。前記の分析では総数１０個のチャンネル及び４種の塩基を使用しているため、Ｃは１０×４のマトリックスであるが、一般的な場合、ＣはＲ×Ｍマトリックス（式中、Ｒ≧Ｍであり、Ｒ及びＭは共に２より大きい整数である。）である。
典型的には、先行技術のシステムにおいて、較正マトリックス（ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎ ｍａｔｒｉｘ）Ｃは、当該システムを作成するときに決定される。より詳細には、較正マトリックスＣは、使用する色素のセットに特異的であり、かつ、システム中の全ての分離レーンに対して一定である。そのような先行技術のシステムを光学フィルターを新しいセットへアップグレードすることなどにより変更する場合、較正マトリックスＣを再較正する必要がある。
図１は、キャピラリーアレイ中の全キャピラリーに対して一定の較正マトリックスを使用する際の２つの欠点を示している。図１から理解されるように、各キャピラリーに由来する０次スペクトル強度１０２は、対応する画素カラム中の同一画素へマッピングされない。特に、それぞれが対応の画素カラム１０４及び１０６において検出される、キャピラリー７及び１０由来の０次スペクトル強度は、残りのキャピラリー由来の０次スペクトルイメージと同じ位置の画素へ位置付けられない。同様に、これらの同一カラム中のキャピラリー７及び１０に由来する１次スペクトル強度１１２も、残りのキャピラリー由来の１次スペクトルイメージと同じ位置の画素へ位置付けられない。むしろ、単一画素の歪み（ｓｋｅｗ）により補正（ｏｆｆｓｅｔ）される。キャピラリーアレイ内のキャピラリー７及び１０の不適切な配置により生ずる、この歪みがもたらす結果は、キャピラリー７及び１０由来の１次強度に対するビンニング工程が、当該ビンニング工程が１画素から始まる場合とはわずかに異なるスペクトルを生じさせることである。
【０００４】
結果として、式３を呼び出してキャピラリー７及び１０から検出される蛍光の正当な原因を特定しようと試みるとき、全てのキャピラリーに対して単一の較正マトリックスＣを使用することは、不正確な結果をもたらすことになる。更に図１に示されるように、キャピラリー１についての１次スペクトルイメージ１１４は、残りのキャピラリーのスペクトルイメージと比べて１つ多い画素へ位置付けられる。グレーティングイメージシステムのコマ収差、球面収差、非点収差及び外側色収差等の因子により引き起こされるこの特性は、式３の場合における較正マトリックスに使用へと続くビンニングのときの不正確性を導くだろう。
一般的に、異なる色素のセットは異なるスペクトルを有する。結果として、各色素セットは異なる較正マトリックスを有する。結果として、複数レーン分離システムに対して単一の較正マトリックスを使用することの不利益は、複数の色素セットを異なる分離レーンに用いることができないということである。
【０００５】
発明の概要
本発明は、一つの側面において、タグ付けした移動種に用いた異なる種類の色素を較正する複数の較正マトリックスを同時に利用する複数レーン電気泳動分離装置により実現される。
別の側面において、本発明は、較正マトリックスが原位置で計算される複数レーン電気泳動分離装置により実現される。
更に別の側面において、本発明は、較正マトリックスが各レーンにつき計算される複数レーン電気泳動分離装置により実現される。
更に別の側面において、本発明は、サンプルから得られたデータから較正マトリックスを計算する方法により実現される。本発明の方法は、タグ付き移動種の複数から放射された蛍光スペクトルを検出する工程、検出したピークを多数のグループに分ける（クラスター化（ｃｌｕｓｔｅｒ）する）工程、及び、少なくともいくつかのグループを代表する較正係数を計算する工程を含んでいる。ピーク検出後、グループ分けの前に、ピークを選抜して、特定のグループと関連する可能性が高いピークのみが較正係数の計算に使用されることを保証してもよい。
【０００６】
好ましい態様の詳細な説明
本発明を使用することができる好ましいシステムは、例えば米国特許第６，０２７，６２７号明細書に記載される自動化キャピラリー電気泳動システムである。前記のシステムについて好ましい検出器配列は、米国特許第５，９９８，７９６号明細書に示される。前記の双方の刊行物の内容は、参照することにより、本発明を理解するのに必要な程度まで本明細書に組み込まれる。
本発明を、総数３０画素（Ｐ＝３０）が各チャンネルにつき３画素（Ｑ＝３）からなる１０の波長チャンネル（Ｒ＝１０）へビンニングしている検出器システムを参照して説明する。ビンニングは、ソフトウェアの制御下、オンボードＣＣＤアレイチップにおいて行われる。ＤＮＡ配列決定について、色素数は４（Ｍ＝４）（各ヌクレオチドにつき１つ）であり、興味の対象となるスペクトルは５２０ｎｍ〜６７０ｎｍである。したがって、１０個の波長チャンネルのスペクトル解像度はそれぞれ約１５ｎｍである。データ収集の間、９６個のキャピラリーのそれぞれについて、ＣＣＤアレイが読み取る各時間につき１０のデータポイントをオフロード（ｏｆｆｌｏａｄ）し、これらの値を続く分析のために蓄積（ｓｔｏｒｅ）する。更に、電気泳動を行う間、ＣＣＤアレイからのデータを、サンプル速度＝ｆ個のサンプル／秒で定期的にオフロードする。したがって、時間Ｔが続く間、総数Ｎ＝ｆｔ個サンプルが得られる。
図２は、本発明の好ましい態様にしたがう、各キャピラリーについての較正マトリックスを計算する一般的工程を示すフローチャート２００である。工程２０２では、単一のキャピラリーに由来するＲ個のチャンネルの蛍光データをあらかじめ決められた時間期間集める。図３は、総数１０個（Ｒ＝１０）のチャンネルについての光強度の時系列データを図示したものである。工程２０４では、オリジナルのデータについてスムージング（ｓｍｏｏｔｈｉｎｇ）及びベースライン・サブトラクション（ｂａｓｅｌｉｎｅ ｓｕｂｔｒａｃｔｉｏｎ）を行いトレンド（ｔｒｅｎｄ）を除去する。工程２０６では、時間ドメイン（ｔｉｍｅ ｄｏｍａｉｎ）におけるピークを同定する。工程２０８では、ピーク幅及びピーク間隔（ｓｐａｃｉｎｇ）の測定基準（ｍｅｔｒｉｃ）を計算する。工程２１０では、前記の測定基準を同定されたピークと共に使用して、係数マトリックス作成についての考慮からピークを除去する。工程２１２では、残りのピークをランク付け（ｒａｎｋ）し、最強のピークを使用するようにする。工程２１４では、較正マトリックスの係数を計算する。最後に、工程２１６では、較正マトリックスを使用してスペクトルをデコンボルーション（ｄｅｃｏｎｖｏｌｕｔｉｏｎ）し、移動サンプルを同定する。前記の工程を以下で詳述する。
【０００７】
工程２０４…データのスムージング及びベースライン・サブトラクション
生データを、本発明の使用者により決定される幾つかの接近するポイント（ｃｌｏｓｅ ｐｏｉｎｔ）、例えば、１、３、５、７、９ポイントについて、サビツキー−ゴレイ（Ｓａｖｉｔｚｋｙ−Ｇｏｌａｙ）法によりスムージングする。一般的に、１つのポイントを選択する場合は、データのスムージングは行わないだろう。１０個のチャンネルにおけるスムージングされたデータのベースラインを、検出器システムと結びついたプロセッサ上で動作するソフトウェアを用いてサブトラクションする。ソフトウェアは、ローカルセクション（ｌｏｃａｌ ｓｅｃｔｉｏｎ）ごとにローカル最小値（ｌｏｃａｌ ｍｉｎｉｍｕｍ）、例えば１セクションとして１個のチャンネル中の３００個のデータポイントごとに最小値を検索する。連続するセクションの２つの最小値を直線であるベースラインで結びつける。２つのローカル最小値間の生データ値をベースライン値についてサブトラクトする。ベースライン・サブトラクション及びスムージングの後の値を更なる処理のために蓄積する。データのスムージング及びベースライン・サブトラクションの順番を逆転させることができる。
【０００８】
工程２０６…タイムドメインにおけるピークの選択（ｐｉｃｋｉｎｇ）
ベースライン・サブトラクション後の各波長チャンネルの性質をピーク選択の前に計算する。前記の性質には、予め決められた数、好ましくは４０のセクションにおける全平均（ｇｌｏｂａｌ ａｖｅｒａｇｅ）シグナル強度、２つの連続的ポイント間の全平均強度偏差、ローカル最大値（ｌｏｃａｌ ｍａｘｉｍｕｎ）及びローカル平均偏差が含まれる。
全平均強度：
〔式４〕
2004509326.tif 000005
全平均偏差：
〔式５〕
2004509326.tif 000006
極小：
〔式６〕
2004509326.tif 000007
ローカル平均偏差：
〔式７〕
2004509326.tif 000008
【０００９】
式中、Ｉｊはポイントｊにおける強度を表し、ｍはデータポイントの総数であり、ｓはローカルセクションにおけるデータ数であり、ｋはセクションにおける開始点（ｓｔａｒｔｉｎｇ ｐｏｉｎｔ）である。
サンプリングした強度に沿った適切なポイントにおける、１０個のチャンネルのそれぞれについての前記４つのパラメータを、ピーク決定のための発見的（ｈｅｕｒｉｓｔｉｃ）アルゴリズムにおいて使用する。与えられたチャンネルにおけるポイントＩｊが以下の基準に適合する場合、ピークであるとみなす。
（１）Ｉｊが５つの連続ポイント間のローカル最大値である。
すなわち、Ｉｊ＞Ｉｊ−１＞Ｉｊ−２かつＩｊ＞Ｉｊ＋１＞Ｉｊ＋２である。
（２）Ｉｊがセクション最大値（ｓｅｃｔｉｏｎ ｍａｘｉｍｕｍ）の２０％よりも大きく、かつ、全平均強度の４０％よりも大きい。
すなわち、Ｉｊ＞０．２Ｉｓ，ｍａｘ、Ｉｊ＞０．４Ｉｇ，ａｖｅである。
（３）Ｉｊのいずれかの側における２つのエッジ偏差（ｅｄｇｅ ｄｅｖｉａｔｉｏｎ）のうち少なくとも１つがセクション平均偏差の７０％よりも大きくなければならず、かつ、全平均偏差の２０％よりも大きくなければならない。
すなわち、右端エッジ偏差：（Ｉｊ＋１＋Ｉｊ＋３）／２＞０．７Ｉ１，ｄｅｖかつ（Ｉｊ＋１＋Ｉｊ＋３）／２＞０．２Ｉｇ，ｄｅｖであるか、又は
左端エッジ偏差：（Ｉｊ−１−Ｉｊ−３）／２＞０．７Ｉ１，ｄｅｖかつ（Ｉｊ−１＋Ｉｊ−３）／２＞０．２Ｉｇ，ｄｅｖであるか、又は前記の双方を満たさなければならない。
（４）ピークの構築（ａｓｓｅｍｂｌｙ）。これは１つのチャンネルにのみ発生する（物理的に測定されない）ピークを除去し、かつ、数学的操作によりピーク最大値が１フレーム分シフトする場合に同一ピークとして同定し、タイムドメインにおけるバンド位置を決定する工程である。ほとんどのピーク最大値が１個より多いチャンネルにおいて特定の時間に発生した。少なくとも２個のチャンネルが特定の時間で複数のピークを示した。個々のチャンネルについて別々にベースライン・サブトラクションを行ったからである。あるピークの最大値はタイムドメインにおいてフレームシフトするかもしれない。ピーク位置が異なる色のチャンネルにおいてフレームシフトする場合、同一ピークである。全てのチャンネルにおけるピーク強度をタイムドメインにおいて合計したものが図ｂに示される。
図３は、ＤＮＡ配列決定実行中の単一キャピラリーに由来する１０個のチャンネルのそれぞれについての、強度Ｘｊの時系列生データの一部を示す。ｊはサンプルのタイムインデックスを示す。与えられたどの時点においても、わずか数個のチャンネルのみがピークを示した。なぜなら、各４種の色素が有限のバンド幅のみを有するからである。各キャピラリーについて１０個チャンネルのそれぞれに由来する強度シグナルＸｊの生データを、多成分マトリックスを作成しかつ検出される蛍光強度を生じさせた蛍光種を同定するための将来の処理のために蓄積する。ピック−ピッキング（ｐｉｃｋ−ｐｉｃｋｉｎｇ）工程を１０個のトレース全てについて行い、タイムドメインおけるピーク位置を与える。サンプル中の特定種類の分子に起因するピークは、特定の時間において１個より多いトレースに現れる。なぜなら、スペクトルがオーバーラップするからである。例えば図３において、５２分におけるピークはトレース３〜トレース９においてピックアップされる。５０００におけるピークの直前の５１．９におけるピークは、トレース０〜トレース６に現れている。ピークが１個より多くのチャンネルに現れる特定の時間においては、全１０個のチャンネルのピーク強度をデータ処理工程のために記録する。当該特定の時間においては、全１０個のチャンネルの中で最大強度を示すチャンネル番号も記録する。
【００１０】
工程２０８…ピーク間隔の決定
（ａ）ローカルセクションにおけるピーク間隔。ローカルセクションでは、ピーク間隔は一定であると考えることができる。全てのピークを、図４ｂに示す前工程により決定する。ローカルセクションにおける平均ピーク間隔Δｔｓｐ，ａｖｅを、図４ａ及び４ｂに示される全ての同定ピークに基づいて計算する。平均ピーク間隔は１２．５フレームである。連続するピーク間隔における間隔が平均ピーク間隔の７５％よりも大きい場合、又はΔｔｓｐ＞０．７５Δｔｓｐ，ａｖｅの場合、当該ピーク対を係数計算のために保持する。したがって、図４ｂでＸを付したピークは係数計算から排除する。
（ｂ）ピーク・フィッティング（ｐｅａｋ−ｆｉｔｔｉｎｇ）・ソフトウェアによる重複ピークの同定。ピークを同定した後、ピーク・フィッティング・ソフトウェアを用いてピーク幅を同定することができる。ほとんどの電気泳動分離において、エレクトロフェログラム（ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｅｒｏｇｒａｍ）の第一のセクションに現れるピークは、通常、非常に鋭く、分離の後半のセクションにおけるピークは、通常、幅広い。しかしながら、小さいローカルセクション、例えば３００フレームにおけるピーク幅は実際的には同一である。この概念は、ローカルセクションにおいて一時的に重複するピークの分離にとって非常に重要である。ＤＮＡ分析では、タイムドメインおいて大きさが異なるＤＮＡについてのバンドが完全に重複することは希である。重複のほとんどは、一方が検出窓に入り、他方が当該検出窓を出る場合のピークの立ち上がり又は立ち下がりに限定される。ＤＮＡ分離において、重複ピークは、単一ピークよりも３０％幅が広い。チャンネルにおけるピーク強度がローカル最大強度の２０％と小さい場合、その低強度を理由に当該ピークのピーク幅を計算しなかった。特定の瞬間におけるピーク幅及び間隔は、データのトレースから計算することができる。
【００１１】
工程２１０…ピークのフィルタリング（ｆｉｌｔｅｒｉｎｇ）及びスパイク（ｓｐｉｋｅ）の排除。正常なピークの幅は通常４〜２０フレームである。対照的に、スパイクは通常１つのフレーム中に現れ、かつ非常に鋭いピークとして現れる。スパイクは、カメラによる宇宙線のピックアップ、カメラのオーバーヒートによる熱雑音及びサンプル中の不純物により生ずる。ピーク間隔の基準。ピーク間隔が平均ピーク間隔よりも７５％より大きい場合、２つのピークを係数の計算のために保持する。別の方法はピーク幅及び間隔の両方を使用することである。隣接する２つのピークについて、それらの半分の強度における幅の平均がピーク間隔よりも大きい場合、２つのピークをマトリックス係数計算から排除する。重複ピークについては２つのケースが存在する。１つのケースにおいて、２つのピークはＤＮＡ分子にタグ付けされた同一色素に由来する。この場合、分離解像度が低いため分離されない。このケースは、２つのピークが同一色素に由来しているのでマトリックス計算において問題を全く生じないことを本発明者等は見いだした。しかしながら、ピーク幅についての一般規則として、マトリックス計算においてこの種のピークを排除することが好ましいだろう。他のケースは、２つのピークが、大きさが１塩基対分異なるＤＮＡ分子をタグ付けする異なる色素に由来するケースである。本発明者等は、これらの色素は、通常、タイムドメインにおいて多少離れているが、完全には分離していないことを見いだした。それゆえ、全チャンネルにおけるピーク位置は、数フレーム（２〜３フレーム）分異なる。ピーク・フィッティングは、重複ピークとしての前記ピークに起因（ａｔｔｒｉｂｕｔｅ）する。これらのバンドを排除することはマトリックス計算にとって重要である。強度の基準。ローカルセクションにおける最大強度が平均ピーク強度のわずか２０％に過ぎないピークの場合、当該ピークをマトリックス係数の計算から排除する。小さいピークはマトリックス係数について有意な誤差を生じさせるだろう。図５は、４種のヌクレオチドの各ヌクレオチドについての相対蛍光候補のピーク強度のプロットである。＊で標識したピークは、間隔についての基準によって排除する。排除されるピークのほとんどは、Ａの後がＧの場合に起こる。移動度のシフトは２つのピークの重複を引き起こす。
【００１２】
工程２１２…バンドのカテゴリー化（クラスター化）
バンドが前記フィルタリング工程を通過した場合、当該バンドはバンドカテゴリー化（クラスター化）工程へ進む。バンド強度は、全波長チャンネルについての強度の和であるデータチャンネルから決定する。このチャンネルシグナルは、ほとんどの場合において、いずれの色分散出力（ｃｏｌｏｒ−ｄｉｓｐｅｒｓｅｄ ｐｏｗｅｒ）を有しないグレーティングの０次に由来する。別のより好ましい方法は、全チャンネルについての強度の和であるデータのチャンネルを作成することである。
図６は残ったピーク（したがって、残った検出バンドに対応する）の特徴付けを示すフローチャート６００を示す。工程６０２では、残ったピークの強度を標準化する。工程６０４では、バンドのカテゴリー化を最強のバンドを用いて開始する。工程６０６では、スペクトルセット内の標準化強度を比較し、ノイズレベルをこえる有意な値を有するもののみを保持する。工程６０８では、対応する標準化係数における差異が最大強度の５％（最大値が１．０に標準化される場合に０．０５）よりも低い場合に、バンドをクラスター化する。工程６１０では、クラスター化したバンドセットから、係数の平均及び標準偏差を計算する。最後に、工程６１２では、較正マトリックス用の係数を計算する。前記の工程は、実施例により最良に説明される。
【００１３】
工程６０２…強度の標準化。下記の例は、図５の時間５３．８９分における塩基Ｃに対応するデータから抽出したデータセットである。表１はこのデータセットについての１．０に標準化した強度値を示している。
表１．生データ、係数の計算及び非比較可能なデータ（ｕｎ−ｃｏｍｐａｒａｂｌｅ ｄａｔａ）
2004509326.tif 000009
工程６０４…最強のバンドを用いたバンドのクラスター化。バンドのパターンを認識する工程を最強のバンドから開始し、次いで二番目に強いバンド、次に強いバンド…、へと進める。特定の時間において、数個のチャンネル中にバンドがピークとして現れる場合、他のチャンネルにおける全強度について強度をマトリックス係数として標準化する。最初に最強のバンドを選択し、次いで二番目に強いバンド、その次に強いバンド…、を選択することにはいくらかの利点がある。機器のノイズがあるため、最強のバンドの係数計算は、低強度のバンドを用いたときよりもより正確である。したがって、偽ピークのリーディング部分（ｌｅａｄｉｎｇ ｐｏｒｔｉｏｎ）及びトレイリング部分（ｔｒａｉｌｉｎｇ ｐｏｒｔｉｏｎ）が及ぼす全体的影響は、弱いバンドに対してよりも強いバンドに対して低い。
【００１４】
工程６０６…強度の選択（ｃｕｌｌｉｎｇ）、ノイズの影響、低強度及び係数。好ましい実施態様では、全ノイズ源、例えば散弾ノイズ（ｓｈｏｔ ｎｏｉｓｅ）、ＣＣＤ読取ノイズ、ＣＣＤ暗ノイズ等に由来する全体のノイズレベルは、約５０カウント程度である。生データの数学的操作、例えばベースライン・サブトラクション及びスムージング等もノイズをデータへ取り入れることができる。好ましい態様において、データ強度はノイズレベルの約３倍（１５０カウント）になるように選択する。この値を閾値として選択する。この基準は従来の統計学的原理と一致する。したがって、データ強度が１５０カウントよりも低い場合、当該データ強度はバンドのカテゴリー化に使用しないことが好ましい。例えば、表１において、チャンネル０、１、２及び３のデータ強度は１５０未満であり、その係数０．０１１４、０．０２１、０．０１９８及び０．０１５８はカテゴリー化に使用しない。これらの係数は、計算誤差を引き起こしやすい非比較可能な係数と呼ばれ、廃棄する。
【００１５】
工程６０８…バンドのカテゴリー化。２つのバンドの比較可能な係数間の差異が最大強度の５％（又は０．０５単位）未満である場合、当該２つのバンドを同一のカテゴリーに存在するようにクラスター化する。表２は７セットの係数の例を示している。各セットは個々に標準化されている。表２に示されるバンドにおいて、バンド１、３及び４は同一のカテゴリーに存在する。なぜなら、係数の差異が０．０５をこえるものが存在しないからである。しかしながら、バンド１と２とは０．０５単位をこえる係数の差異を有するので、異なるカテゴリーに存在するものとみなす。この５％ルールを使用すると、バンド５及び６は同一カテゴリーであり、バンド７はそれ自体のカテゴリーを形成することが明らかになる。
表２．ピークのクラスター化
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表２のデータを考慮して、最大の標準化ピークに基づいて常にバンドをカテゴリー化することが適切であると考えてもよい。しかしながら、これが常に最良のアプローチとは限らない。ある場合では、最大強度を有するチャンネルが、同一種類のバンドに対する２つの隣接するチャンネルのいずれかに存在することができる。例えば、２つのバンドが、チャンネル２及び３において、それぞれ０．９９４８，１及び１，０．９８２の係数を有している場合、最大強度に基づくルールのみを使用する場合に限り、当該２つのバンドを異なるカテゴリーに属すると考えてもよい。しかしながら、最大強度の５％ルールを使用するシステムは、これらの２つのピークを常に同一のバンドとは解釈しないだろう。
バンドを、コンピュータにより自動的に、電気泳動に使用する色素の数よりも多くの色素スペクトルへとクラスター化してもよい。この結果、図７ｂに示される偽クラスター７２０が生じる。偽クラスターは、重複ピークにより生じる偽色素スペクトルを引き起こす。種々の処理及び選択にしたがい、重複ピークの数は、真のＤＮＡスペクトルの数と比較して少ないことが好ましい。偽スペクトル（及び対応する余分なクラスター）が現れる場合、５％ルールを７％へと増やして、重複バンドが１以上の別のバンドへ併合するかどうかを調べてもよい。偽バンドの係数は、高発生バンドのスペクトルの組合せとして表すことができる。低発生バンドを、２つのポジティブ・ディストリビューション（ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ）を有する高発生バンドの組合せとして記載することができる場合、この種の低発生バンドは偽バンドである。前記２つの性質を用いて偽バンドを認識した後、偽スペクトルを係数計算から排除する。
【００１６】
工程６１０…標準偏差排除。各セットの係数の平均偏差及び標準偏差を、バンドのカテゴリー化工程の後に計算する。与えられたセットの標準化係数の偏差が、標準偏差の１３０％よりも大きい場合、対応するバンドは係数計算から排除すべきである。
【００１７】
工程６１２…係数の計算。クラスター化の後、４つのクラスター（各ヌクレオチドにつき１クラスター）内の各セットの係数を図７ａに示すようにプロットして、クラスター化が適切に行われかつ所望の数のクラスターが生じたことを確認することができる。各セットの係数の平均をとり、Ｒ個の長さベクトル（Ｒ−ｌｅｎｇｔｈ ｖｅｃｔｏｒ）（好ましい態様では、Ｒ＝１０）を形成する。Ｒ個の長さベクトルのそれぞれは、較正マトリックスＣにおける４つの縦列のうちの１つに対応する。
【００１８】
工程２１６…色（スペクトル）のデコンボルーション。使用中、各分離レーンについて計算した係数マトリックスＣの偽逆転（ｐｓｅｕｄｏ−ｉｎｖｅｒｓｅ）を使用して、当該分離レーンから検出した強度のセットを、式３に与えられる決定ベクトル（ｄｅｃｉｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ）Ｂへマッピングする。決定ベクトルＢにおける最大値の位置が色素の同一性に対応する。
前述の技術の使用を、実施例を使用して説明する。
【００１９】
実施例Ａ　ＤＮＡ配列決定分析
実験条件：キャピラリーＩＤ　７５μｍ、ＯＤ　２００μｍ、全長８０ｃｍ、有効長（注入端部から検出ウインドウまで）　５５ｃｍ。分離電圧　１５０ｖ／ｃｍ（１２ｋＶ）。９６のキャピラリーを平面に平行に配置し、キャピラリーアレイを作成する。
注入：６ｋＶで１分間。
ＤＮＡ配列決定サンプル：標識ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ ＢｉｇＤｙｅ。
励起：４５０〜５２０ｎｍ（５１４．５ｎｍ及び４８８ｎｍに２つの最強輝線がある）を放射するオールライン（ａｌｌ−ｌｉｎｅ）Ａｒイオン・レーザー。円柱レンズにより、レーザー光を９６のキャピラリーにわたって拡散させる。
検出：Ｎｉｋｏｎカメラレンズ（焦点距離８５ｍｍ、Ｆ１．４）を使用して、キャピラリーアレイからの蛍光を集める。次いで蛍光をロング・パス（ｌｏｎｇｐａｓｓ）光学フィルター（カットオフ　５２５ｎｍ）（Ｏｐｔｉｃａｌ Ｏｍａｇａ Ｉｎｃ．， ＣＴ）及び透過グレーティング（ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ ｇｒａｔｉｎｇ）（Ｅｄｍｕｎｄ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ， ＮＹ）を通過させ、ＣＣＤカメラ（ＰｉｘｅｌＶｉｓｉｏｎ， ＷＡ）へ入射（ｉｍｐｉｎｇｅ）させる。システムの解像度は約５ｎｍ／画素である。３つの連続画素毎にビンニングする。各チャンネルは１５ｎｍにわたる蛍光強度を表す。
ゲル及び分離条件：ゲルは７Ｍの５％直鎖状ポリマーゲルである。図１のＤＮＡを室温下で分離した。
図３は、時間窓（ｔｉｍｅ ｗｉｎｄｏｗ）４２〜５４分におけるＤＮＡ分析配列決定についての１０個の波長チャンネルのエレクトロフェログラムを示す。上端のトレースは５２５ｎｍの青色チャンネルである。以降のトレースは、５４０ｎｍ、…のデータである。下端のチャンネルは６５０ｎｍの赤色チャンネルを示す。トレースは良好な視野に対して常時シフトする。
図７ａは、得られた幾つかのＤＮＡバンドについてのスペクトルのプロファイルを示す。バンドを４つのカテゴリーに分類する。各カテゴリーは４種の塩基のうちの１つに対応する。図７ｂは各カテゴリーにおけるバンドの数を示す。重複バンドのグループ７２０は係数の計算から排除する。重複バンドのほとんどは、Ａの直後がＧである場合に生じる。Ｇを有するＤＮＡフラグメント末端は、Ａを有するＤＮＡフラグメント末端よりもわずかに速く移動するので、Ａの直後にＧがある場合に２つのピークが重複する。
図５は、自動的にデコンボルーションした４つのトレースを示す。４つのトレースは、上端から下端に向けてＧ、Ａ、Ｔ、Ｃのフラグメントについてのものである。＊で標識したバンドは排除されたバンドである。
【００２０】
実施例Ｂ　ＤＮＡフラグメント分析
図８、９及び１０は、ＤＮＡフラグメントのデータを示す。本実施例のゲルは尿素を全く含まない５％ポリマーゲルである。分離温度を８０℃に調節した。３種類の色素を使用してＤＮＡフラグメントを標識する。８つのトレースが図８に示される。図８はＤＮＡ配列分析と類似している。バンドを自動的に３種類のスペクトルへ分類する。次いで３種類のバンドの係数を自動的に計算して図１０に示される３つの異なるトレースへとデコンボルーションする。トレース３は標準サンプルであるＧｅｎｅＳｃａｎ ５００（ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ （ＣＡ））である。このセクションは大きさが６０〜３５０塩基対、特に７５、１００、１３９、１５０、１６０、２００、２５０、３００、３４０及び３５０塩基対のＤＮＡフラグメントを示している。このトレースの強度は他のトレースの強度よりも低いので、図９ａの対応のスペクトルプロファイル９１０は高い変動を示す。
【００２１】
実施例Ｃ　タンパク質分離のためのＣＺＥ（キャピラリーゾーン電気泳動）
キャピラリーゾーン電気泳動について同様のセットアップを使用した。タンパク質サンプルを、９６キャピラリーからなるアレイの個々のキャピラリーへ注入する。ＩＤ　５０μｍ、ＯＤ　１５０μｍ、全長　３５ｃｍ及び有効長　２５ｃｍのキャピラリーを実験に使用する。分離は１５０Ｖ／ｃｍで起こる。ホウ酸塩緩衝液（ｐＨ１０．５）が分離媒体であった。サンプルは、真空注入（水力学的（ｈｙｄｒｏｄｙｎａｍｉｃａｌ）注入）したタンパク質の混合物である。タンパク質とは異なる発光スペクトルを有する標準を、定量的分析のためにサンプルへ添加する。６つの波長データを集めたところ、図１１ａに示される２つの未知のものが分離される。コンピュータプログラムによりバンドをピックアップし、図１１ｃに示されるスペクトルパターンを認識した後に、マトリックスデコンボルーション後のデータの２つのトレースが、図１１ｂに示される。
【００２２】
実施例Ｄ　同一キャピラリーアレイにおける異なる色素セットの使用
本実施例で検討する技術を使用して、ＤＮＡ配列決定で一般的に使用される異なる色素セットについての較正係数を自動的に得た。この方法論は、ピーク分類、初期のピーク排除、係数決定、洗練されたピーク排除及び色のデコンボルーションを含んでいる。
（１）ピーク分類
単一の色素セットを自動的に較正するために、タグ付けしたＤＮＡサンプルを単一のキャピラリーへ導入し、電気泳動に付した。単一のエレクトロフェログラムにおいて約５００の塩基が検出された。各塩基は１０個のチャンネルからなるセット内にピークを生じさせた。次いで、ピーク強度が最大であるチャンネルにしたがいピークを分類した。最初に、ピーク位置及び強度を記録し、タイムドメインにおける平均ピーク間隔及び平均ピーク強度等の基準を計算した。一般的に、あるピークが１つのチャンネルに現れるとき、多くの場合、同一時間におけるタイムドメインにおいて、あるピークが他のチャンネルに現れる。これは、１つの色素ファミリー内の各メンバーが１０個の連続チャンネルでいくつかの重複を起こすからである。ピークが現れる特定の時間において、１０個の波長チャンネルにわたるピーク強度を比較して、１０のチャンネルの内どのチャンネルが最大強度を示すかを決定した。ピークの強度が最大であることが見いだされたチャンネルを各ピークについて記録し、これをヒストグラムにした。図１２は、波長チャンネル間における最大強度のヒストグラムを示している。図１２は、最大ピークがチャンネル２、４、６及び８において最も頻繁に現れたことを示している。これは、１０個の連続チャンネル中の４塩基の光学ピークに対応する。したがって、幾つかの最大ピークが１０のチャンネル全てにおいて見いだされたけれども、これらの４つのチャンネルが有力であった。
（２）初期のピーク排除
較正係数の計算前に、３種類のピークを排除した。第一に、最大強度がチャンネル２、４、６及び８のいずれにも該当しないピークを排除し、考察から無視した。第二に、タイムドメインにおいて重複したピークを排除した。タイムドメインにおける２つの隣接ピークの間隔が、ピーク間における平均間隔距離の８０％よりも小さい場合、当該ピークは重複しているものとした。第三に、平均ピーク強度の２０％よりも低い最大ピーク強度を有するピークも更なる考察から排除した。初期ピーク排除の後、オリジナルの５００個のピークのうちわずか約３００個のピークが、較正係数計算に使用する候補として残った。
【００２３】
（３）平均係数及びその標準偏差の計算
最初に、約３００の残存ピークの最大強度を１．００００に対して標準化した。標準化は波長ドメインにおいて行った。換言すれば、ピークの最大値がチャンネル２に存在する場合（特定の色素セットにつき塩基「Ｇ」を示す）、この特定のピークに対する塩基「Ｇ」についての１０の係数を、チャンネル２で見いだされた当該ピークの強度に対する、１０個のチャンネルの内の各チャンネルにおけるピーク強度の比として計算した。したがって、塩基「Ｇ」についての較正係数のセットは、チャンネル２で最大強度を有することが見いだされた３００のピークから、波長ドメインにおいて当該ピークを標準化し及び１０セットのそれぞれについての係数の平均値をとることにより導かれる。同様に、塩基Ａ、Ｔ及びＣについての較正係数のセットを、それぞれチャンネル４、６及び８において最大強度が見出された残り３００個のピークから計算した。４つのグループ（Ｇ、Ａ、Ｔ及びＣ）のそれぞれについて、１０個のグループ係数平均値及び１０個のグループ標準偏差を、更なる処理のために計算する。
（４）追加のピーク排除
特定のグループ（Ｇ、Ａ、Ｔ又はＣ）内のピークに対する１０個の標準化係数のいずれか１つと当該係数についてのグループの平均値との間の差異が、当該係数についてのグループ標準偏差と比較して予め決めた倍数（例えば１．５倍）よりも大きい場合、当該ピークは排除し、係数の計算には使用しない。
（５）マトリックスの形成
追加のピーク排除を行った後、各グループについての平均係数を計算して較正マトリックスを確立する。
（６）色のデコンボルーション
検出器から出力が得られると、適切な較正マトリックスと共に式３を使用して、４塩基の強度を計算する。これにより、シグナルの色デコンボルーションが起こる。
【００２４】
較正係数マトリックスを、以下の色素セット：ＡＢＩ ＢｉｇＤｙｅ ターミネーター色素セット、ＡＢＩ ローダミン　ターミネーター色素セット、Ａｍｅｒｓｈａｍ ＥＴ プライマー色素セット及びＢａｙｌｏｒ Ｂｏｄｉｐｙ 色素セットのそれぞれにつき、Ｓｐｅｃｔｒｕｍｅｄｉｘ Ｍｏｄｅｌ ＳＣＥ ９６１０ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍに対して計算した。得られたマトリックスを図１３ａ〜１３ｄに示す。各マトリックスの第一列のデータは、最短波長を発光する塩基についての１０チャンネルにわたる平均化された強度の分布を示す。第二列、第三列及び第四列は、蛍光発光中により長い波長の光を発光する塩基の係数を示す。第四列は、最長波長の蛍光を発光する塩基の係数を示す。
当業者に知られているように、Ｂｏｄｉｐｙ色素は狭い発光スペクトルを有し、かつ、隣接する色素間の波長間隔が小さい（２０ｎｍ）。Ｂｏｄｉｐｙ色素に適応させるために、３つの隣接する画素よりもわずか２つの隣接する画素をビンニングして、高解像度を与えるようにした。各チャンネルにつき２画素をビンニングした新しいマトリックスは、ＤＮＡ配列決定に対してＢｏｄｉｐｙ色素を使用したときの結果を劇的に増強する。
複数レーンの電気泳動分離システムにおける各レーンが、それぞれの較正マトリックスを有することができるので、各レーンにおいてサンプルをタグ付けするために単一の色素セットを使用して、同時に複数の色素セットを使用することができる。これにより、１つのサンプルを２つ以上の部分へ分け、各部分を異なる色素セットでタグ付けし、異なる色素セットでタグ付けされた当該サンプルの分離結果を比較することができるようになる。したがって、装置のセットアップを変更することなしに、例えば異なるフィルターセットを使用することなしに、異なる色素セットの性能を直接比較することができる。キャピラリーアレイを使用して分離されたサンプルでは、色素セットの異なる組合せを使用してサンプルをタグ付けしているが、各キャピラリーにおいて各サンプルは単一の色素セットによりタグ付けされている。
【００２５】
３Ｄパターン認識を使用したピークの選択及びベースコーリング（Ｂｓｅｃａｌｌｉｎｇ）
前記の検討では、種々の発見的及び統計学的技術を使用して、特にＤＮＡ配列決定用途における較正マトリックスを形成するために使用する基礎データを有するピークを選択している。係数計算に使用するためのピークを選択する代替のアプローチは、時間−頻度プロット（ｔｉｍｅ−ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ ｐｌｏｔ）のトポグラフィック・プロット（ｔｏｐｏｇｒａｐｈｉｃ ｐｌｏｔ）において単独ピークを同定することである。
図１４〜１６は、Ｓｐｅｃｔｒｕｍｅｄｉｘ ＳＣＥ ９６１０装置を使用してキャピラリー中で行ったＤＮＡサンプルの配列決定に由来する時間−頻度プロットを示す。Ｘ軸は、検出器の出力のフレーム数で表した時間的要素を示す。これらの図に見られるように、時間の次元において単一ピークが数個のフレームを占めている。正確な数は、サンプルの移動速度及び蛍光を検出器によりサンプリングする速度に依存する。Ｙ軸は画素の位置を示す。画素の位置は、５２０ｎｍから５ｎｍ／区画の刻みで出発する波長に関連し、総数３５個のポイントがあり、Ｙの次元において３５個のチャンネルとして効率的に役立つ。図１４〜１６に見られるように、各色素のスペクトルの重複により、単一のピークが、波長の次元において１より多くのフレームを占めている。各ピークに関する輪郭、すなわち平板化された「Ｚ」軸は、当該ピークの強度に対応する。
図１４〜１６は、異なる形態のピークを示している。単一の単独ピーク７００は、他のピークと重複しておらず、その形状は円形又はわずかに卵形である。当該分離ピークに対応するデータを使用して、較正係数を作成することができる。併合して結合ツインピーク７１０又は複数の結合ピークからなるセット７２０を形成するピークは、好ましくは、較正係数を計算するときに排除する。したがって、データを時間−頻度プロットの形式で最初にプロットすることにより、単独ピークを最初に同定し、次いで同一塩基（又はその他のタグ付き種）に対応する単独ピークをグループ化することができる。分離されたピークが与えられると、その基礎データを使用して各ピークを標準化し、較正マトリックスの計算に必要なその他の操作を行うことができる。
【００２６】
図１４はサンプル分離の初期部分（塩基対１００〜１３０間）を示している。図１５はサンプル分離の中間部分（塩基対３２０〜４４０間）を示している。図１６は時間−頻度プロットの最終部分を示している。サンプル分離の初期及び中間部分では、形態学的特徴が互いに十分に分離していることが注目される。これは、対応するフラグメントが小さく、移動するときに、タイムドメインにおいてより識別可能であるからである。したがって、形態学を使用して候補ピークを同定するときは、短いフラグメント、すなわちより速く移動するフラグメントに由来する時間−頻度プロットを使用することが好ましいだろう。
更に図１４〜１６のプロットは、受け取ったチャンネルデータについての色デコンボルーションを実行するための、較正マトリックスと共同した式３の使用に対する代替物を示唆している。この代替物は、時間−頻度プロットにおける形態学的形状を直接同定することである。したがって、図１４〜１６の場合、最初に較正マトリックスを計算することなしに、直接ベースコーリングを行うことができる。直接のベースコーリングは、重複ピークを取り扱うときにはより正確であろう。なぜなら、隣接ピークのペアはほとんど一致する外観を示すからである。
図１７は、分離された、異なる形態の例を示す。図１７ａは単一ピークを示している。図１７ｂは、タイムドメインにおいて２つのピークが伸長した卵形として現れている、同一塩基についての２重の重複ピークを示している。図１７ｃ及び１７ｄは、異なる塩基についての２重の重複ピークを示している。図１７ｅ、１７ｆ及び１７ｇは、重複した３つの隣接ピークを示している。
単独ピークの同定、直接のベースコーリングは、ヒトにより視覚的に、又は、コンピュータ・ビジョン分野の当業者に周知の機械をベースとする画像処理又はパターン認識技術を使用することにより自動的に行うことができる。したがって、機械をベースとする処理の場合、形態フィルターをテンプレートとして使用して、図１７に示される特徴を同定することができる。
本発明を、特定の好ましい態様を参照して説明したが、本発明の範囲はこれらに限定されないことに留意すべきである。当業者は、その範囲が請求の範囲で定義される本発明の精神の範囲内で前記の好ましい態様の変形を見いだすだろう。
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は、０次コンポーネント及び１次コンポーネントの検出器アレイへの画像化を示している。
【図２】
図２は、本発明にしたがう係数マトリックス計算における工程の概要を示すフローチャートを示す。
【図３】
図３は、検出器アレイから１０個のチャンネルにわたり検出された強度の例示を示す。
【図４ａ】
図４ａは、ピーク間隔決定による中間結果を示す。
【図４ｂ】
図４ｂは、ピーク間隔決定による中間結果を示す。
【図５】
図５は、各ヌクレオチドの候補ピークについての相対的蛍光強度を示す。
【図６】
図６は、初期の選択後に残ったピークを特徴付ける方法を示している。
【図７ａ】
図７ａは、各ヌクレオチドのクラスターについてのプロットを示している。
【図７ｂ】
図７ｂは、分離したピークのヒストグラムを示している。
【図８】
図８は、例示としての、較正する３種の色素に対する７個のチャンネルのデータについてのまばらなピークを示している。
【図９ａ】
図９ａは、図８に関連して使用する３種の色素についての係数プロットを示している。
【図９ｂ】
図９ｂは、図９ａの３種の色素に対応するクラスター化ピークについてのヒストグラムを示している。
【図１０】
図１０は、図８〜９ｂの各候補色素についてのデコンボルーションしたデータを示している。
【図１１ａ】
図１１ａは、タンパク質同定についての実験結果を示している。
【図１１ｂ】
図１１ｂは、タンパク質同定についての実験結果を示している。
【図１１ｃ】
図１１ｃは、タンパク質同定についての実験結果を示している。
【図１２】
図１２は、例示としてのＤＮＡ配列決定に由来するピーク実験的ヒストグラムを示している。
【図１３ａ】
図１３ａは、ＤＮＡ配列決定で一般的に使用される４種の色素セットのそれぞれについての較正係数マトリックスを示している。
【図１３ｂ】
図１３ｂは、ＤＮＡ配列決定で一般的に使用される４種の色素セットのそれぞれについての較正係数マトリックスを示している。
【図１４】
図１４は、ＤＮＡサンプルの単一キャピラリーにおける電気泳動についての輪郭を示す時間−頻度プロットの初期部分を示している。
【図１５】
図１５は、ＤＮＡサンプルの単一キャピラリーにおける電気泳動実行についての輪郭を示す時間−頻度プロットの中間部分を示している。
【図１６】
図１６は、ＤＮＡサンプルの単一キャピラリーにおける電気泳動実行についての輪郭を示す時間−頻度プロットの最終部分を示している。
【図１７】
図１７は、図１４〜１６等の輪郭を示す時間−頻度プロットにおいて見られる典型的な形態を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４ａ】
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【図４ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【図７ａ】
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【図７ｂ】
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【図８】
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【図９ａ】
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【図９ｂ】
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【図１０】
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【図１１ａ】
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【図１１ｂ】
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【図１１ｃ】
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【図１２】
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【図１３ａ】
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【図１３ｂ】
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【図１３ｃ】
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【図１３ｄ】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７ａ】
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【図１７ｂ】
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【図１７ｃ】
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【図１７ｄ】
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【図１７ｅ】
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【図１７ｆ】
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【図１７ｇ】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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