(57)【要約】ａ）哺乳動物の組織外植片の一部を、外植片の一部由来の哺乳動物の細胞から細胞コロニー形成ユニットを得るための生育培地で生育し、そしてb）オートロガスな細胞内植/移植の方法で使用するため、1つ以上の細胞コロニー形成ユニットから細胞を採取する工程からなるインビトロでの哺乳動物の組織外植片から細胞コロニー形成ユニットを生産するための生産方法。哺乳動物の組織外植片を、軟骨、骨、例えば骨髄、関節組織、筋組織、例えば平滑筋組織、心臓組織、肝臓組織および骨格筋組織、皮膚組織、例えば骨膜、粘膜組織、脳組織、膵臓組織、ならびに血管からなる群から選択される。特に、哺乳動物の組織外植片は、軟骨、例えば弾性、繊維、ヒアリンまたは合成ヒアリン軟骨である。得られた細胞は、オートロガスな内植/移植方法で使用するのに適している。特定の実施例で、得られた細胞は、特にオートロガスな軟骨細胞の内植（ACI）法で使用するための軟骨細胞である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（a）外植片の一部由来の未熟な細胞から細胞コロニー形成ユニットを得るために、生育培地で哺乳動物の組織外植片の一部を生育し、
（b）オートロガスな細胞内植/移植の方法で使用するための１つ以上の細胞コロニー形成ユニットを採取する
工程からなるインビトロで哺乳動物の組織外植片から細胞コロニー形成ユニットを生産する生産プラント方法。
【請求項２】
さらに、哺乳動物の組織外植片から生育培地への未熟な細胞の移動および選択する工程からなる請求項１による方法。
【請求項３】
哺乳動物の組織外植片が、間葉細胞、外胚葉細胞および内胚葉細胞からなる群由来の細胞から発生する組織から選択される請求項１または２による方法。
【請求項４】
哺乳動物の組織外植片が、軟骨、例えば骨髄のような骨、結合組織、平滑筋組織、心臓組織、肝臓組織および骨格筋組織のような筋組織、例えば骨膜のような皮膚組織、粘膜組織、脳組織、膵臓組織、血管からなる群から選択される先の請求項のいずれかによる方法。
【請求項５】
哺乳動物の組織外植片が、軟骨、例えば弾性、繊維状、ヒアリンまたは関節ヒアリン軟骨である請求項４による方法。
【請求項６】
さらに、請求項１の工程（a）に供する前に、哺乳動物の組織外植片の一部を洗浄する工程からなる先の請求項のいずれかによる方法。
【請求項７】
洗浄を、洗浄培地、例えば、pH約5〜約9を有する水性培地を使って行う請求項６による方法。
【請求項８】
請求項１の工程（a）に供する前に、哺乳動物の組織外植片の全てまたは少なくとも１部を、約-180℃〜約37℃、例えば約-180℃〜約-70℃、または約-70℃〜約10℃の温度で保存する先の請求項のいずれかによる方法。
【請求項９】
哺乳動物の組織外植片を、組織に器具を挿入するための鋭利な末端部分と、組織の外植片を運ぶための十分に画定された内腔を有する器具を使って得る先の請求項のいずれかによる方法。
【請求項１０】
哺乳動物の組織外植片の一部を、哺乳動物の組織外植片から切断するか、または打ち抜く請求項９による方法。
【請求項１１】
哺乳動物の組織外植片を、請求項１の工程（a）に供する前に、1つ以上のタンパク質分解酵素を使って、部分的に処理する先の請求項のいずれかによる方法。
【請求項１２】
部分的な処理を、哺乳動物の組織外植片の構造を切開し、その結果、成長因子および代謝産物、ならびに未熟な細胞の哺乳動物の組織外植片の内部、または外部での分散を容易にする請求項１１の方法。
【請求項１３】
１つ以上のタンパク質分解酵素を使った部分的な処理を、約1〜約90U/１mgの哺乳動物の組織外植片の濃度で行う請求項１１または１２による方法。
【請求項１４】
１つ以上のタンパク質分解酵素を使った部分的な処理を、約1〜10U/mg/１mgの哺乳動物の組織外植片の濃度で行う請求項１３による方法。
【請求項１５】
１つ以上のタンパク質分解酵素を使った部分的な処理を、約1〜5U/１mgの哺乳動物の組織外植片の濃度で行う請求項１４による方法。
【請求項１６】
タンパク質分解酵素が、プロテイナーゼである請求項１１〜１５のいずれかによる方法。
【請求項１７】
プロテイナーゼを、カテプシンDのようなアスパルテートプロテイナーゼ、カテプシンB、L、S、KならびにカルパインＩおよびIIのようなシステインプロテイナーゼ、好中
球エラスターゼ、カテプシンGおよびプロテイナーゼ3のようなセリンプロテイナーゼ、およびMMP-1、MMP-2、MMP-3、MMP-4、MMP-5、MMP-6、MMP-7、MMP-8、MMP-9、MMP-10、MMP-11、MMP-12、MMP-13、MMP-14、MMP-15、MMP-16、MMP-17、MMP-18、MMP-19、MMP-20および/またはトリプシンのようなメタロプロテイナーゼからなる群から選択する請求項１６による方法。
【請求項１８】
哺乳動物の組織外植片を、ｐH7.4（生理学的なｐH）から少なくとも±0.5であるｐH、例えば約4〜約6.9の範囲内のｐH、または、約7.9〜約10の範囲内のｐH、例えばｐH約8.0を有する水性培地を使って前処理を行う先の請求項のいずれかによる方法。
【請求項１９】
生育培地が、例えば炭水化物、脂質およびアミノ酸のような代謝産物、ビタミン、成長因子、サイトカイン、ミネラルおよび抗菌物質からなる群から選択される1つ以上の成分を含む先の請求項のいずれかによる方法。
【請求項２０】
生育培地が、例えばヒト、馬やらくだを含む家畜または競走用動物の哺乳動物の血清、を含む請求項１６による方法。
【請求項２１】
哺乳動物の血清が、請求項１〜１９のいずれかによる方法で使用される哺乳動物の組織外植片に対してオートロガスである請求項２０による方法。
【請求項２２】
生育培地が、DMEM/F12と約1pg/ml〜約10μg/mlの1つ以上の成長因子を含む請求項１９〜２１のいずれかによる方法。
【請求項２３】
哺乳動物の組織外植片の一部を、培養過程を通して、例えば１つ以上の細胞コロニー形成ユニットを採取するまで保持する先の請求項のいずれかによる方法。
【請求項２４】
細胞コロニー形成ユニットを、間葉、外胚葉、および内胚葉由来細胞からなる群から選択される未熟な細胞から得る先の請求項のいずれかによる方法。
【請求項２５】
細胞コロニー形成ユニットが、未熟な細胞、基幹細胞、前軟骨芽細胞、軟骨芽細胞、軟骨細胞、前骨芽細胞、骨芽細胞、骨細胞、前筋原細胞、筋原細胞、筋細胞、セメント芽細胞、セメント細胞、象牙芽細胞、象牙細胞、エナメル芽細胞、エナメル細胞、繊維芽細胞からなる群から選択される細胞からなる細胞コロニー形成ユニットである請求項２４による方法。
【請求項２６】
さらに、コロニー形成ユニットの細胞を、分析および同定する工程からなる先の請求項のいずれかによる方法。
【請求項２７】
細胞コロニー形成ユニットを、組織培養フラスコから細胞コロニー形成ユニットの細胞を遊離させる遊離培地に接触させる工程からなる先の請求項のいずれかによる方法。
【請求項２８】
遊離培地が、トリプシンのようなプロテイナーゼからなる群から選択される１つ以上の酵素を任意に含む請求項２７による方法。
【請求項２９】
遊離培地が、二価の金属イオンを含まないPBS緩衝液のような緩衝液である請求項２７または２８による方法。
【請求項３０】
さらに、哺乳動物の組織外植片の一部を、電磁誘導に供する工程からなる先の請求項のいずれかによる方法。
【請求項３１】
さらに、成長因子および/またはサイトカインを含む組織培養フラスコ内で、哺乳動物の組織外植片および/または生育培地を富化する工程からなる先の請求項のいずれかによる方法。
【請求項３２】
生育培地、生育培地の成分またはその他の薬剤を組織培養フラスコ内に、連続的および/またはパルス状放出を設定さすことからなる先の請求項のいずれかによる方法。
【請求項３３】
組織培養フラスコが、連続的および/またはパルス状放出用の入口と出口末端部を有し、連続的および/またはパルス状放出が、圧力差を入口と出口末端で得られるように設定される請求項３２による方法。
【請求項３４】
さらに、採取した細胞コロニー形成ユニットを、少なくとも哺乳動物から得た液体のある量を含む培地で洗浄および/または培養する工程からなる先の請求項のいずれかによる方法。
【請求項３５】
哺乳動物の液体が、先の請求項のいずれかによる培養された哺乳動物の組織外植片の一部に対してオートロガスである請求項３４による方法。
【請求項３６】
ｉ）哺乳動物組織外植片の一部の組織培養フラスコへの適用
ii）生育培地の組織培養フラスコへの適用
iii）哺乳動物の組織外植片の一部から生育培地に移動する細胞を生育、および
iv）遊離培地の組織培養フラスコへの適用
のための手段からなる哺乳動物組織外植片由来のインビトロでの細胞コロニー形成ユニットの生産用の先の請求項のいずれかによる方法。
【請求項３７】
さらに、生育培地、遊離培地、および/または例えば炭水化物、脂質およびアミノ酸のような代謝産物、ビタミン、成長因子、サイトカイン、ミネラルおよび抗菌物質からなる群から選択される1つ以上の因子の連続的またはパルス状放出のための手段からなる請求項３６による方法。
【請求項３８】
先の請求項のいずれかで請求された方法によって得ることができる細胞。
【請求項３９】
請求項３８による細胞およびキャリアーを含む組成物。
【請求項４０】
細胞およびキャリアーが、動物に対してオートロガスである請求項３９による組成物。
【請求項４１】
細胞およびキャリアーが、動物に対してオートロガスであり、キャリアーが血清である請求項３９または４０による組成物。
【請求項４２】
キャリアーが、さらにマトリクス成分を含む請求項３９〜４１による組成物。
【請求項４３】
医薬で使用するための、請求項３８による細胞または請求項３９〜４２による組成物の使用。
【請求項４４】
組織障害の治療のための医薬組成物の製造のための請求項３８による細胞の使用。
【請求項４５】
哺乳動物の軟骨および/または骨の異常の治療のための請求項４４による使用。
【請求項４６】
ヒト、あるいは馬およびらくだを含む家畜または競走用の動物の軟骨および/または骨の障害を治療するための請求項４４または４５による使用。
【請求項４７】
哺乳動物の組織から哺乳動物の組織外植片を採取するための、請求項９で画定したような器具、および哺乳動物の組織外植片を保護するための運搬容器、ならびに任意に、先に画定した器具の使用のための説明書からなる哺乳動物の組織外植片を採取するための運搬キット。
【請求項４８】
採取した哺乳動物の組織外植片を、請求項１〜３７のいずれかによる方法で使用する請求項４７による運搬キット。
【請求項４９】
キットが、さらに哺乳動物からオートロガスな血液サンプルを採取する血液サンプルチューブを含む請求項４７または４８による運搬キット。
【請求項５０】
DNA、RNAおよび/またはタンパク質を分析するための生化学的な分析で使用するために、哺乳動物の外植片を採取するための請求項４７〜５０のいずれかによる運搬キット。
【請求項５１】
少なくとも請求項３８による細胞とキャリアーを含む第１容器、および軟骨および/または中間膜を含む第２容器からなる放出キット。
【請求項５２】
それが必要な哺乳動物に、請求項３８による細胞または請求項３９〜４２のいずれかによる組成物を投与することからなる組織または組織関連異常を患った哺乳動物のオートロガスの治療用の方法。
【請求項５３】
投与された組成物が、同一の哺乳動物からのオートロガスな血清を含むオートロガスな材料からなる請求項５２による方法。
【請求項５４】
関節のヒアリン関節軟骨障害の修復、椎間板のヒアリン/繊維軟骨障害の修復、ヒアリン/繊維軟骨に関連した喉頭障害の修復、形成外科様式で使用される弾性軟骨を含む結合組織の整形、骨関節炎、骨関節症、骨粗鬆症、複雑骨折に関連した欠損骨構造、および萎縮性擬似関節に関連した欠損骨構造の修復、例えば歯の修復用のチタン製のねじの内植に関連した不完全なあごの骨構造の修復、皮膚の火傷、または外傷に関連するその他の皮膚の異常および例えば血管腫や黒色腫のような悪性腫瘍のような皮膚関連腫瘍の処置および修復、閉塞後の心臓の心室壁の修復、パーキンソン病、アルツハイマー病、痴呆症、多発性硬化症およびその他の全身性脳疾患のようなCNS関連疾患の修復、異なる病的源の網膜炎の修復、糖尿病Ｉ型および/またはII型に関連した膵臓組織の修復、肝硬変、脂肪肝の
修復、ならびに初期の肝臓癌ならびに肝臓転移の切除後の肝臓組織の再構築、および脳異常がある子供の肝臓組織の再形成のため、からなる群から選択される組織または組織関連障害を患っている哺乳動物のオートロガスな治療のための請求項５２または５３による方法。
【請求項５５】
軟骨および/または骨の障害または関連傷害を患っている哺乳動物のオートロガスな治療のための請求項５２〜５４のいずれかによる方法。
【請求項５６】
ヒト、または馬およびらくだを含む家畜または競走用の動物からなる群から選択される哺乳動物のオートロガスな治療用の請求項５２〜５４のいずれかによる方法。
【請求項５７】
（a）組織培養フラスコ中の生育培地におけるマトリクスと未熟な細胞からなる哺乳動物の組織外植片の一部を生育し、そして
（b）組織培養フラスコ中の少なくとも一部の内容物を、哺乳動物の組織外植片および/または未熟な細胞の性質の情報を受ける検査に付す
工程からなるインビトロ培養物中で哺乳動物の組織外植片の一部の生物学的活性を測定するための診断方法。
【請求項５８】
検査が、形態学的、組織学的および/または細胞病理学的な検査である請求項５７による診断方法。
【請求項５９】
工程（b）における内容物を、DNA、RNA、および/またはタンパク質を分析するために、生化学的な分析によって分析する請求項５７による診断方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、哺乳動物の組織外植片（explant）由来の１つ以上の細胞コロニー形成ユニット(CFU)の生産で使用するための方法、キットおよび生産プラント、さらには治療、特に組織障害を患っている哺乳動物のオートロガスな細胞治療のための、その様な細胞コロニー形成ユニット由来の細胞の使用に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
ヒト、家畜および/または競走用の動物などの多くの哺乳動物は、様々な組織障害または組織関連障害を患っているか、患うであろう。組織は、軟骨、例えば骨髄などのような骨、関節組織、例えば平滑筋組織、心臓組織、肝臓組織および骨格筋組織などのような筋組織、例えば骨膜などのような皮膚組織、粘膜組織、脳組織および膵臓組織でありうる。
例えば軟骨組織に関して、アメリカおよびヨーロッパで、合わせて100万以上のヒトの関節鏡手術および人工関節置換術を毎年行っている。アメリカで、これらの数で含まれているのは、年間、約90,000の膝の関節全置換、および50,000前後の膝だけの欠損を修復するための手術である（Praemer,A.、Furner,S.、Rice,D.P.、Musculoskeletal Conditions in the United States、Park Ridge、III.:American Academy of Orthopaedic Surgeons、1992、125）。
【０００３】
自己修復を受けるヒトの関節軟骨は、多くの軟骨細胞が人生の最初の年中に、それらの有糸分裂の能力を損失するため、緩やかな過程である。関節軟骨、特に荷重関節の欠失は、予測通り骨関節炎に向かって悪化する。従来の方法では、この悪化を防ぐことはできないであろう。
肋軟骨下骨の穿孔は、弾力性のない繊維軟骨の形成を引き起こすことができ、そして緩やかに劣化する一時的な修復であるとしかみなすことができない。動物実験は、関節の軟骨細胞のような分裂増殖した軟骨細胞の導入が、関節の欠失を確実に再構築するようであることを示している（Robinson D.ら、Isr.Med.Assoc.J.、2000、2:290）。
アメリカおよびヨーロッパで様々な馬の繁殖の間で、登録されている競馬で使用され、「高価な」サラブレッド競走馬が500万頭存在し、そしてその評価した６０％を、直接または間接的にアメリカ馬主協会が所有している。総ての繁殖のサラブレッドは、変性関節疾患、主に離断性骨軟骨炎（OCD）の形態での最も頻繁な患者である。最も頻繁に冒される関節は、いわゆる膝関節（大腿膝蓋関節、後脚）である。馬および特に競走馬にとって、OCDを発生する最も一般的な年齢は、１〜６歳である。サラブレッドの訓練を始めるのが早ければ早いほど（１歳以下）、より頻繁に障害がみられるようである。
【０００４】
一般に、関節鏡観察の介在を含む外科手術は、臨床症状のほとんどの場合で使用されている。治療した馬の６４％前後は、以前のように使えるように戻る（競走など）。馬の約３５％は、競走において、以前のように使えるように戻ることができないか、以前の競走レベルを得ることがほとんど不可能であるようである。
観察することができ、OCDと記載される第２の容態は、球節の後で、第１趾骨または長繋骨（long pastern bone）の隣接する面または足底面が砕けることである。第３に、競走馬の状態に関連したよくある外傷は、砲骨関節丘に対する軟骨の損傷であり、それは、実際には真のOCDではない。肩関節のOCDは、しばしば関節表面の広い領域を冒し、二次的な骨関節炎が一般的である。
【０００５】
患者にとって軟骨の構造を清浄または表の付け替えをすることは、肋軟骨穿孔、剥離などを使って試みられており、それゆえ病気を患った軟骨および軟骨下骨ですら切除される（insall,J.、Clin.Orthop.1974、101:61;Ficat,R.P.ら、Clin Orthop.1979、144:74;Johnson,L.L.、In(McGinty,J.B.編)Operative Arthroscopy、New York、Raven Press、1991、341）。しかし、関節障害の初期段階で行うことができ、将来人工関節置換術を必要とするヒトの数を減らす軟骨障害の再生治療または修復の方法が未だに必要とされている。さらに、方法が、オートロガスな材料、すなわち全過程を通して、または少なくとも過程の重要な工程を通して、単一または同一の哺乳動物由来の材料の使用に適している場合に有利であろう。
【０００６】
関節の軟骨の欠損の修復は、従来の外科手術や医学的な治療以外の別の方法でも行われている。比較的新しい方法は、関節の軟骨を修復するためのオートロガスな軟骨細胞内植（ACI）と称される。
軟骨内植は、ヒアリン様軟骨を、ヒトの膝の遊離した病的な総厚軟骨損傷への修復において、医学的に有効であることを証明した。幾人かの著者らは、卓越した成果を用いて、ヒトで軟骨の内植を行った（Brittbergら、1994 New Engl.J.Med.;Minas,T.、Am.J.Orthop.1998、11:739）、（Roberts S.ら、Arthritis & Rheumatism、Vol.44、no.11、Nov 2001、pp 2586-2598）。
【０００７】
骨膜弁（例えば頸骨から除去された）を、欠損を覆って縫合する方法は、現在、それ自体治療方法として、または培養したオートロガスな軟骨細胞の内植とを組み合わせて使用されている。組み合わせを使った方法は、主として、Brittbergらによって改良された。Brittbergらによって記載された方法を使った細胞培養物は、患者の膝の関節で、オートロガスな内植用に使用されている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題及び課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の簡潔な開示
本発明の対象は、哺乳動物の組織外植片の一部を回収し、哺乳動物の組織外植片の一部から１つ以上の細胞コロニー形成ユニット（CFU）を生産する方法、そして、１）オートロガスな細胞治療、特に組織異常を患った哺乳動物の処置用、および２）医薬組成物に関連した方法または診断ツールとして、細胞コロニー形成ユニットを使用する方法および手段を提供することである。
ある面で、本発明は、十分な量の１つ以上の細胞コロニー形成ユニット、または１つ以上の細胞形成ユニットからなる組成物を、それが必要な哺乳動物に投与することからなる組織または組織関連異常を患った哺乳動物のオートロガスな細胞治療用の方法である。
【０００９】
本発明は、さらに哺乳動物組織由来の１つ以上の細胞コロニー形成ユニット（CFU）の生産で使用するための方法、キットおよび生産プラントに関する。
加えて、第一の側面として、本発明は、外植片の一部から未熟な細胞由来の細胞コロニー形成ユニットを得るための生育培地で、哺乳動物の組織移植片の一部を刺激し、生育する工程、およびオートロガスな細胞移植用の１つ以上の細胞コロニー形成ユニットを収穫する工程からなる、インビトロで哺乳動物の組織外植片から細胞コロニー形成ユニットを生産する方法に関する。
他の側面として、本発明は、本方法にて生産される１つ以上の細胞コロニー形成ユニットに関するものであり、さらにその細胞形成ユニットは、医薬に関連するか、または診断ツールとして使用してもよい。
【００１０】
更なる側面として、本発明は、哺乳動物の組織由来の哺乳動物の組織外植片を採取するための道具、および哺乳動物の組織外植片を保護し運搬するための運搬容器、任意に、道具を使用するための説明書からなる、哺乳動物の哺乳動物の組織外植片を採取するための運搬キットに関する。
さらに、更なる側面として、本発明は、キャリアー内に、１つの細胞コロニー形成ユニット、または細胞コロニー形成ユニットの群由来の懸濁細胞を含む容器からなる放出キットに関する。加えて、放出キットは、軟骨および／または中間膜を含んでもよい（その様な膜の詳細は、例えばWO 01/06949を参照）。
【００１１】
その他の側面として、本発明は、組織培養フラスコ内の生育培地で、マトリクスおよび細胞からなる哺乳動物の組織外植片の一部を生育する工程、およびマトリクス組成物に関連する哺乳動物組織外植片の特性の情報、および／または外植片およびコロニー形成ユニット由来の細胞に関連する情報を得るために、組織培養フラスコの中身の少なくとも一部を、検査および分析に供する工程からなるインビトロでの培養系での哺乳動物の組織外植片の一部の生物学的活性を測定するための診断方法に関する。
最後の側面として、本発明は、
ｉ）哺乳動物の組織外植片の一部を組織培養フラスコへの適用、
ii）生育培地の組織培養フラスコへの適用、
iii）哺乳動物の組織外植片の一部から生育培地に移動（migrate）する細胞を、刺激し、生育、および
iv）遊離培地の組織培養フラスコへの適用
のための手段からなるインビトロで、哺乳動物組織外植片から細胞コロニー形成ユニットを生産するための生産プラントに関する。
【００１２】
本発明は、生検材料を使った最初の細胞単離過程で、分解酵素の使用を必要とせず、細胞の単離、および組織外植片の一部から１つ以上の細胞コロニー形成ユニットを生産するための新規な方法および手段を提供する。本発明は、哺乳動物動物で、オートロガスな様式で作り出される組織異常の処置のための新規な治療方法を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
図面の説明
本発明を、次の図面を参照してさらに説明する。
図１は、十分に画定された大きさの哺乳動物の組織外植片を得るために、本発明に従って使用される道具の概略図である
図２は、異なる表現型のコロニー形成ユニットから得た軟骨と骨の外植片由来の移動性の未熟細胞を一緒に培養した場合のそれらを示す。左上のコロニーは、骨源性CFUである。右下のコロニーは、軟骨原性CFUである。
図３は、異なる７つの起源からのヒトの軟骨の外植片の細胞コロニー形成ユニットを示す。
図４は、図１での道具によって得られた軟骨の組織外植片を示す。移動した細胞は、軟骨の組織外植片の外表面を正確に確認することができる。
図５ａおよびｂは、生産プラント設備の使用後、培養４週間後の軟骨の外植片および細胞コロニー形成ユニットを示す。
図６は、コラゲナーゼを使って処理した軟骨から得た軟骨原性細胞を示す。単層の培養物は、培養１週間後の表現型の変化と繊維芽細胞の形態を示している。
図７は、未熟な軟骨源性細胞の細胞コロニー形成ユニットの表面を示す。細胞コロニー由来の未熟な細胞を単離し、そして軟骨の外植片系を使って選択した。細胞は、軟骨源性表現型を示す−幾つかは大規模なマトリクス生産を有する。
図８は、培養フラスコ内に存在するコロニー形成ユニットで発生した新生軟骨（meocartilage）の電子顕微鏡（ＥＭ）を示す。新たに形成された組織は、コラーゲンII型、IX型、およびXI型由来の原繊維で構成され、そして大きなアグリカン凝集物はヒアルロナン、結合タンパク質およびプロテオグリカンで構成される。プロテオグリカン鎖は、凝固の間に崩壊し、II型、IX型およびXI型のコラーゲン分子に付着する黒色の丸い球状構造として見える。このＥＭ像は、コロニー形成ユニット由来の軟骨細胞が、培養した軟骨芽細胞の適切な分化を示す多量のヒアリン軟骨分子を分泌することを示している。
図９は、実施例９に関するものである。図９aは、関節の半月板の外植片由来のコロニー形成ユニットを示しており、図９bは、関節の半月板の移植片由来のコロニー形成ユニットに存在する拡大した未熟な細胞を示している。
図１０は、実施例７に関するものである。図１０aは、♯21〜30の患者由来のコロニー形成ユニットを示している。図１０bは、ある軟骨の生検材料由来のコロニー形成ユニットを示している。ゲンチアナバイオレットを使って染色した。
【００１４】
本発明の詳細な説明
上記から明らかなように、本発明は、哺乳動物の組織から得ることができるあらゆる細胞に適用することができる。以下のように、本発明は、主に軟骨組織に関して説明するが、その目的を説明するだけでない。それゆえ、本発明は、それによって限定されるものではない。
【００１５】
細胞の内植の成功で、主要な役割は、内植された細胞の状態と相同性に深く依存している。軟骨細胞の内植の場合、主に重要なことは、軟骨細胞の培養物が、生育可能で、かつ分裂増殖を誘導でき、そして内植された際に、十分なマトリクス生産を提供することができることである。内植された軟骨細胞を、細胞膜の不要な酵素の障害を避け、最も緩やで最も精密な培養方法の下で培養すると同時に、健全なヒアリン関節軟骨を生産するのに最も適した軟骨の細胞培養物を得ることが重要である。軟骨細胞に対して大変緩やかな細胞の培養方法を使用することは、インビボで周辺軟骨と相互作用しうる十分に健全な移植細胞を得るために、最も重要なことである。同様なことは他の細胞に適用され、哺乳動物の組織から得て、哺乳動物の外で培養し、そして細胞を培養した後に、同一の哺乳動物（オートロガス）に戻される。
【００１６】
Brittbergら（1994、New Engl．J．Med．;Minas，T．、Am．J．Orthop．1998、11:739）による軟骨の欠損を有する患者で、幾つかのオートロガスな軟骨細胞の内植の最初の成果を記載した報告の中で、培養した軟骨細胞の内植２ヵ月後に、修復した組織の大多数の部分が、ヒアリン軟骨と同一の生化学的な特性を有さない繊維軟骨に分化することを記載している。この問題は、プラスチック表面上で培養して、単離した軟骨細胞が、細胞に似た繊維芽細胞に脱分化するが、軟骨細胞の表現型には脱分化しないという結果と関連しているようである。この問題は、細胞から単層を生産するまで、組織培養フラスコ中で培養されるその他の細胞にもいえる。単層培養の場合、時として、単層を、トリプシンのような酵素を使って、プラスチック表面から遊離し、そして単層の培養物から遊離した細胞を、さらに培養するために、その他の組織培養フラスコに移しかえる。傷害を受けた組織部位で、細胞依存型の分化過程は、細胞内植した後に起こる。培養した細胞は、細胞の内植の部位で、最終的に本来の表現型に分化する一連の細胞の変遷を受ける。つまり、組織の修復は、内植した細胞の分化の程度および型に依存する。分化が乏しく未熟な細胞、例えば本発明による軟骨外植片法によって単離されたものは、これらの細胞型が、内植の部位でさらに分化および成熟するためのそれらの潜在能力を損失していないため、局所的な修復過程で寄与しうる細胞である。内植された細胞の最終的な成熟は、正確な表現型マトリクスの合成および細胞の発生を確保にするため、内植の部位で、局所的な環境に左右されるはずである。この様に、細胞は、修復組織、例えば損傷を受けた組織の適切な形態特性を有するヒアリン軟骨を生産するであろう。それに対して、コンドロンに存在する成熟した軟骨細胞のような最終分化した細胞は、細胞の内植後、修復過程にほとんど寄与できない。この様な細胞型は、しばしば、この本文内で記載した従来のコラゲナーゼ単離法によって、共に単離される。
【００１７】
外植系は、細胞外マトリクスに存在する種々の細胞の成長および分化因子の「結合および放出」系として、軟骨マトリクスを使った概念の上に成り立っている。仔牛胎児血清で存在するか、または組換えペプチドとして各々の培地に加えられる成長因子と分化因子は、例えばデコリン、ビグリカン、およびフィブロモジュリンなどのマトリクスに存在する結合タンパク質由来の軟骨に結合しうる。その様な結合および放出系は、最初にその天然の中間マトリクス分子−様々な細胞受容体に対する「放出媒体（delivery vehicle）」に結合する場合、これらやその他の因子が、タンパク質分解からより保護することを意図する培地に存在する様々な成長因子および分化因子の半減期を増加させるであろう。
【００１８】
加えて、培地で存在するこれら因子の濃度と比べて、細胞周囲のへりの周り、領域ならびに異なる領域にまたがって、因子がより高く局所的に蓄積するため、成長因子および分化因子による細胞のより高い刺激を推測することができた。マトリクス内の天然のリガンドに結合し、後に結合受容体（例えば、IGFI-R、TGFβ-R、bFGF-R）に対して「放出された」これら因子の局所的に濃度が高いのは、原形質膜上でクラスター形成に対する受容体さらにシグナル伝達および生育刺激を誘導する。
【００１９】
マトリクス内の様々な細胞の刺激および生育にとって、それはその天然のマトリクス成分、細胞のヒストリーから細胞を取り除く代わりに、従来のコラゲナーゼ消化法によって、細胞が、それら天然の細胞外マトリクス内で、それらの生育および分化を開始するためのより自然で効果的な過程である。
【００２０】
仔牛胎児血清、またはその他の添加された成長因子の欠如下で、軟骨芽細胞／軟骨細胞が、軟骨の外植片内で生育可能なままでいる能力は、細胞が細胞外マトリクスによって保護されていることをさらに示唆している。加えて、近年、我々の研究室で、マトリクスの従来のコラゲナーゼ消化が、単離した多くの細胞に甚大な損傷を与え、その他に、細胞アポプトーシスを介して細胞死を誘発することを示した。これらの結果は、最後の内植のために培養フラスコ内で培養した細胞が遊離される前に、細胞の環境およびマトリクスの保全をなるべく維持することが重要であることをさらに強調する。
【００２１】
哺乳動物の細胞の培養で、第二の問題点は、同一起源の細胞を含むと同時に良い状態である同種な細胞培養物を得ることである。タンパク質分解酵素は、通常、哺乳動物の組織由来の細胞を遊離させるのに使用し、そして酵素処理後、組織の一体部分が存在しないその様な様式で、組織の正常な構造を破壊する。しかし、本発明者らは、使用したタンパク質分解酵素に対する細胞またはマトリクスの感受性、ならびに哺乳動物の組織内の細胞の位置および型に依存する遊離された細胞の質および量で、大きなばらつきが存在することを観察した。
【００２２】
今日、哺乳動物の軟骨細胞を、1mgの組織材料に対して約100〜150mgの間のタンパク質分解コラゲナーゼを使って、特定の時間で遊離させる。この時間を通して、組織の細胞および他のマトリクス成分を遊離させる。消化されずに分解された組織材料を、例えば遠心分離または濾過によって、遊離された細胞から除去し、そして細胞を生育培地で培養する。しかし、本発明者らは、そのような酵素法を使用することが、結果として様々な表現型および起源の細胞を単離することとなることを発見した。さらに培養を通して、最も生育可能な細胞は分裂増殖し、そして最終的な培養物は、細胞の混合物となるであろう。そのうえ、哺乳動物に内植した際に、細胞のそのような最初の酵素処理が、培養した細胞の望ましくない特性をもたらすであろうことを観察した。
【００２３】
要約すると、インビトロで、外植片から細胞を分裂増殖させる1つの例として、軟骨の外植片を使って記載された文章の中で、上記組織培養系は、公知の軟骨の細胞単離および培養方法よりもその他の幾つかの利点を有している。先に言及したように、外植片内の軟骨由来細胞は、「本来の」細胞刺激および細胞分裂増殖が進行する間、マトリクスで、それらの分化状態を維持する。第2に、細胞は、例えばマトリクスのコラゲナーゼ消化によって、使用されるタンパク質分解活性に傷害を与える高濃度にさらされない。第3に、培養系は、生産ユニットで取り扱うことが容易であり、第4に、従来の酵素消化法と比べた場合、外植片系は、細胞単離過程を通してならびに一般の細胞培養過程を通して、労力と手間をそれほど必要としないため、生産費用がより少ない。
【００２４】
本発明の対象は、哺乳動物の組織の一部を哺乳動物から採取し、培養前に哺乳動物の組織の一部内の細胞を遊離させる必要がない一般的な方法を提供することである。哺乳動物の組織の一部の培養は、それが、結果として1つ以上のコロニー形成ユニットを生じる組織培養フラスコの表面からコロニー形成ユニットを最後に遊離させるために、酵素を使った処理を受けるだけであり、さらにその方法はオートロガスである。
【００２５】
本発明は、本発明の生産方法によって得られたその細胞を、それが必要な哺乳動物に、投与することからなる組織または組織関連障害を患った哺乳動物のオートロガスな治療用の方法にも関する。
【００２６】
該当する組織または組織関連障害の例は、関節のヒアリン関節軟骨障害の修復、椎間板のヒアリン/繊維軟骨障害の修復、ヒアリン/繊維軟骨に関連した喉頭障害の修復、形成外科様式で使用される弾性軟骨を含む結合組織の整形、骨関節炎、骨関節症、骨粗鬆症、複雑骨折に関連した欠損骨構造、および萎縮性擬似関節に関連した欠損骨構造の修復、例えば歯の修復用のチタン製のねじの内植に関連した不完全なあごの骨構造の修復、皮膚の火傷、または外傷に関連するその他の皮膚の異常および例えば血管腫や黒色腫のような悪性腫瘍のような皮膚関連腫瘍の処置および修復、閉塞後の心臓の心室壁の修復、パーキンソン病、アルツハイマー病、痴呆症、多発性硬化症およびその他の全身性脳疾患のようなCNS関連疾患の修復、様々な病的源の網膜炎の修復、糖尿病Ｉ型および/またはII型に関連した膵臓組織の修復、肝硬変、脂肪肝の修復、ならびに初期の肝臓癌ならびに肝臓転移の切除後の肝臓組織の再構築、および脳異常がある子供の肝臓組織の再形成のため、からなる群から選択されるものである。
【００２７】
定義
本出願および本発明の文脈において、以下の定義があてはまる。：
用語「オートロガスな細胞の内殖/移植」は、生検材料（または細胞）を哺乳動物から切除し、それらの細胞を培養し、そして生育し、後に同一の哺乳動物に戻す工程を意図するつもりである。
【００２８】
用語「細胞コロニー形成ユニット」は、同一な起源を有する細胞のコロニー、すなわち一つの細胞由来であり、例えば哺乳動物の組織外植片の一部から外に移動され、哺乳動物の組織外植片の一部の外で、細胞コロニーを生産するために分裂し始めた未熟な細胞を意図するつもりである（図2）。細胞コロニー形成ユニットは、幾つかの層内に細胞を含み、第一に、細胞コロニー形成ユニットが、広がり、生育する組織培養フラスコの表面に付着している。細部コロニー形成ユニットは、細胞コロニー形成ユニットの直径の増加によって、垂直、および水平の両方に大きさが増加する。このように、細胞コロニー形成ユニットは、一般に、細胞のクローンを形成する多層の細胞であるため、通常、単層の細胞とは異なる。
【００２９】
用語「哺乳動物の組織外植片」は、適切な器具を使って、哺乳動物から外植された哺乳動物の組織の一部を意図するつもりである。外植片は、１つ以上の膝の組織を含んでいてもよく、例えば膝由来の組織の外植の場合、外植は、軟骨組織ならびに骨組織を含んでいてもよい。本文において、組織の外植は、再生手段、つまり十分に画定された器具と十分に画定された方法によって適切に行われる。
【００３０】
用語「哺乳動物の組織外植片の一部」は、先に定義した哺乳動物の組織外植片の部分を意図するつもりである。有利には、部分は、十分に画定された大きさを有し、哺乳動物の組織外植片から外植片をより小さな部分に切断またはスライスすることによって得られる。ある目的のために、外植片の特定の部分を使用することが好ましいであろう。通常、部分は、先に定義したように、哺乳動物から採取し、１つ以上の細胞コロニー形成ユニットを生産するために使用される。特定の因子の助けによって、未熟な細胞は、哺乳動物の組織外植片の一部から出て生育培地に移動することができる。生育培地ならびに外植片において、未熟な細胞は、幾つかの細胞に分裂増殖し始め、それによって細胞コロニー形成ユニットを生産する。一つの未熟な細胞は、一つの細胞コロニー形成ユニットを発生させる。しかし、１つおよび同一の組織培養フラスコ内で、幾つかの未熟な細胞は、哺乳動物の組織外植片の一部から出て移動され、幾つかの細胞コロニー形成ユニットを発生させるかもしれない。哺乳動物の組織外植片の一部で、数種類の膝の細胞が存在していてもよいが、本文において、未熟な細胞が、哺乳動物の組織外植片の一部から出て生育培地に移動することができ、分裂増殖を開始することは興味深いことである。それに対して、成熟な細胞は、特定の細胞を回収し、そしてその他の細胞型を選択するためのフィルターとして、この様に哺乳動物の組織外植片の一部および哺乳動物の組織外植片の一部の機能を保持する。その結果、細胞の選択は、哺乳動物の組織外植片の一部の助けによって得られる。
【００３１】
外植片細胞の培養系は、第一に、細胞外マトリクスに存在する未熟な細胞に対する生育因子およびサイトカインの結合および放出系として、軟骨マトリクスを使用する概念の上に立脚している。生育培地に存在する成長因子およびサイトカインは、外植片に拡散し始め、一定の時間後、マトリクスに生育因子およびサイトカインの様々な濃度勾配を築く。  結果として、未熟な細胞は、築かれた勾配に抗して移動し始めることが推測される。培養約1〜2週間後、外植片の表面にあり、そして最後に細胞コロニー形成ユニットを組織の外部に築く。
【００３２】
用語「未熟な細胞」は、基幹細胞または前駆体レベルに近い細胞に相当する細胞、例えば前軟骨芽細胞（prochondroblast）、または同等の軟骨芽細胞を意図するつもりである。未熟な細胞は、哺乳動物の組織外植片の一部で、取り巻く生育培地に移動することができ、そして細胞は、生育培地自体内で移動することもできる。軟骨の外植片系の例で、軟骨マトリクスの内部で刺激された細胞が、緻密に構成されたコラーゲンネットワークによってトラップされるため、マトリクスでの細胞の移動は、軟骨生検材料の周囲に限定されるであろう。移動は、幾つかの因子によって影響されるようである。細胞が、哺乳動物の組織外植片の一部の外側に移動した後、未熟な細胞は、先に記載したように、１つ以上の細胞コロニー形成ユニットを形成するように分裂増殖することができる。
【００３３】
用語「移動」は、未熟な細胞が可動性であることを意図するつもりである。細胞は、哺乳動物の組織外植片の一部で、哺乳動物の組織外植片から生育培地へ、そして生育培地内での移動が制限されえる。
【００３４】
用語「生産」は、未熟な細胞の小さなまたは大きな細胞コロニー形成ユニットへの大規模な分裂増殖を意図するつもりである。生産された細胞は、同一の親細胞から発生し、そして、また同じ型の細胞に分化するであろう。
【００３５】
用語「マトリクス」は、組織の細胞外タンパク質を意図するつもりである。
【００３６】
用語「洗浄」は、血液、哺乳動物の組織の望まざる材料、および/またはその他の望まざる成分を除去するような様式の液体に、哺乳動物の組織外植片の一部を供することを意図するつもりである。そのような成分を、哺乳動物の組織外植片の一部に付けてもよく、そして、それらは、例えば水性培地を使って除去してもよい。
【００３７】
用語「水性培地」は、水または水溶性の液体を含む培地を意図するつもりである。培地は、水を含むことが好ましい。水の容量は、1〜100％W/W、通常、約60〜100％W/Wの範囲であってもよい。水性培地は、重要には、pH約5〜約9を有する生理学的な培地である。しかし、水性培地を、哺乳動物の組織外植片に対する毒性を最少限にし、一方で、望まざる物質の量を除去するか、減少できるように設計すべきである。培地は、さらに、洗浄効果を向上させるため、血清またはその他の成分を含んでいてもよい。適した培地の例は、PBSまたはDMEM/F12である。
【００３８】
用語「器具」は、組織に器具を挿入するための鋭利な末端部分と、組織の外植片を運ぶための十分に画定された内腔を有する器具を意図するつもりである。器具は、例えば図１に示すように、針の形態であってもよい。器具の大きさは、重要ではなく、細胞培養物を得るために必要な哺乳動物の組織外植片の一部の量に大いに依存するであろう。
【００３９】
用語「部分的な処理」は、外植片の切開した構造を有する外植片を得るために、哺乳動物の組織外植片の一部の処理することを意図するつもりである。処理は、大変穏やかであるので、組織が統合されたりすることはなく、実質的に、つまり細胞または組織移植片のその他の部分の遊離が起きない組織外植片が崩壊されることはない。部分的な処理は、成長因子および代謝産物、ならびに未熟な細胞の組織外植片から内部、または外部への分散、および／または移動を容易にする。
【００４０】
用語「生育培地」は、組織外植片の一部および生育培地を含む組織培養フラスコの表面に付着する未熟な細胞の組織材料から、周囲の培地への移動、ならびにさらなる分裂増殖および未熟な細胞のコロニー形成ユニットへの分化を誘導または提供することができる培地を意図するつもりである。
【００４１】
用語「組織培養フラスコ」は、当業者で十分公知な、従来のあらゆる組織培養フラスコを意図するつもりである。組織培養フラスコは、様々な形態および大きさを有していてもよい。しかし、組織培養フラスコは、細胞を付着させることができ、かつ開閉可能な少なくとも一端を構成する。
【００４２】
用語「軟骨」は、細胞外マトリクスに埋め込まれた基幹細胞、前軟骨芽細胞、軟骨芽細胞、軟骨細胞を含む結合組織を意図するつもりである。軟骨は、ヒアリン、ヒアリン関節、弾性軟骨および繊維軟骨を含む。
【００４３】
用語「遊離」は、生育を通して、細胞が、細胞が付着した組織培養フラスコの表面から遊離し、さらに遊離する細胞が互いに付着することを意図するつもりである。細胞の遊離は、細胞培養物から細胞を採取できるようにする。細胞の遊離に使用される薬剤の例は、トリプシン、またはＥＤＴＡを使ったキレート緩衝系である。細胞コロニー形成ユニットの遊離は、細胞のかきとり（cell scraping）を使って行ってもよい。
【００４４】
用語「電磁誘導」は、例えば細胞が哺乳動物の組織材料の一部に存在し、その結果、細胞が哺乳動物の組織外植片の一部で活性化されるシグナル変換を引き起こす電磁的な誘導を意図するつもりである。電磁誘導は、好ましくは、約0.1〜0.8mTの不連続または連続したパルスフィードを使って、行ってもよい。電磁誘導フィールドの大きさの唯一の制限は、細胞が生育可能を維持し、電磁誘導を使った処理後に分裂増殖できることである。
【００４５】
用語「キャリアー」は、液体、流体、半固体または固体のキャリアーを意図するつもりである。薬事目的のため、キャリアーは、当業者で十分に公知な基準で、薬事的に受容されなければならない。その結果、薬事的に受容されたキャリアーは、あらゆる実質的な、薬事上および/または本質的な予防効果を有さない、ある意味で不活性なあらゆる材料を意図するつもりである。
【００４６】
用語「生体材料」は、成分を大規模に生産できる量に対する、細胞コロニー形成ユニットの細胞によって生産されるであろう細胞のあらゆる成分を意図するつもりである。成分は、例えば、例えば酵素、コラーゲン、プロテオグリカン、グリコセミグリカンおよびヒアルロン酸のようなあらゆる興味深いタンパク質であってもよい。
【００４７】
用語「生化学分析」は、哺乳動物の組織外植片の一部上で行われるであろうあらゆる生化学的な分析を意図するつもりである。分析を、DNA、RNAおよび/または、特定のタンパク質の容量、あるいは哺乳動物の組織外植片の一部由来の細胞で進行中の特定の遺伝子の活性を高めるために行ってもよい。その結果、哺乳動物の組織外植片の状態を、入手できるであろう。例えば、哺乳動物から得た軟骨の一部の状態は、骨関節炎のような、その後の軟骨異常を示しているであろうし、そして、そのような異常の発生を避けるための前処理の必要性の兆しを与える。
【００４８】
用語「組織障害」は、哺乳動物の軟骨、骨、結合組織、筋組織、皮膚組織、粘膜組織、脳組織、心臓組織、腎臓組織、膵臓組織および肝臓組織の異常ような組織の組織障害を意図するつもりである。
軟骨：−関節のヒアリン関節軟骨の異常について、および椎間盤のヒアリン軟骨/繊維軟骨の修復について。さらに、ヒアリン/繊維軟骨結合組織の障害に関連する喉頭障害について。骨：−骨関節炎、骨関節症、骨粗鬆症、複雑骨折および萎縮性擬似関節による欠陥骨骨折に関連した欠失骨構造。さらに、不完全なあごの骨の構造。結合組織の障害：−皮膚の火傷、または外傷と関連した他の皮膚の異常ならびに例えば、血管腫および黒色腫のような悪性腫瘍のような皮膚関連腫瘍。筋肉：−亀裂骨折後心臓の心室の壁の障害。皮膚：−皮膚の火傷または外傷に関連したその他の皮膚の異常、例えば血管腫および黒色腫のような悪性腫瘍のような皮膚関連腫瘍。脳：−パーキンソン病、アルツハイマー病、痴呆症、多発性硬化症および他の全身性脳疾患。目：−様々な病的な生物の網膜炎。心臓：心臓の心室の壁の梗塞。膵臓：−糖尿病１型および２型に関連した膵臓組織。肝臓：−肝硬変の修復のための初期肝臓癌の切除後の肝臓組織の異常ならびに肝臓転移。さらに出生異常な子供の肝臓組織の障害。
【００４９】
生産プラントで、インビトロでの細胞コロニー形成ユニットを生産する方法
ある面、本発明は、
（a）哺乳動物の組織外植片の一部由来の未熟な細胞から細胞コロニー形成ユニットを得るために、生育培地で哺乳動物の組織外植片の一部を生育し、
（b）オートロガスな細胞内植/移植の方法で使用するための１つ以上の細胞コロニー形成ユニットを採取する
工程を使った、インビトロで細胞コロニー形成ユニットを生産する方法に関する。
【００５０】
哺乳動物の組織外植片の無傷な部分（すなわち、細胞の遊離を引き起こすための酵素処理を受けない部分）を使って、未熟な細胞は、培養過程の最初の部分中、マトリクス構造内で保持される。これが、細胞とその巨大分子との中間環境を保存し、これには、細胞結合タンパク質、ならびに表現型的に安定なように制御した細胞成長をする個々の細胞の周囲の領域マトリクス内での繊維状ネットワーク状軟骨組織が含まれる。
【００５１】
その方法は、哺乳動物の組織外植片由来の未熟な細胞を生育培地に移動させる工程からなる。移動した細胞を、プラスチック表面上の小さなおよび大きな細胞のコロニーとして、三次元系で培養する。移動した細胞から生産されたコロニー形成ユニットは、生育のある特定の期間の後に、非常に融合性となる。しかし、生産期間中、コロニー形成ユニットは、遊離培地の助けによって、プラスチック表面から遊離されない。それゆえ、細胞の損傷が避けられ、さらに細胞分化は、全培養過程を通して維持される。軟骨細胞のような細胞を、低密度単層培養に入れ、そして組織培養フラスコの表面に拡がると、培養された単層細胞は、繊維芽細胞と似て、軟骨細胞であるとは思われない（図６）が前に見出されている。コロニー形成ユニットを、オートロガスな細胞の内植の時期より前に、最後に組織培養フラスコから遊離する。
【００５２】
哺乳動物の組織外植片およびその扱い
本発明による方法で使用した哺乳動物の組織外植片は、間葉細胞、外胚葉細胞および内胚葉細胞からなる群、好ましくは軟骨；例えば骨髄のような骨、結合組織、平滑筋組織、心臓組織、肝臓組織および骨格筋組織のような筋組織、例えば骨膜のような皮膚組織、粘膜組織、脳組織、腎臓組織、膵臓組織およびランゲルハンス島からなる群、好ましくは弾力、線維、ヒアリンまたは関節の軟骨のような軟骨から選択される細胞起源の組織から選択される。
【００５３】
哺乳動物の組織外植片を、先に規定したような器具を使って得てもよい。器具を、周辺の組織にかなりの害を引き起こすことなく、哺乳動物の組織の一部を適切に得るために設計する。十分に規定された器具の内腔は、採取される組織に依存して、様々な大きさおよび形態であってもよい。その結果、断面は、円形または多角形の形態であってもよく、円形または多角形の直径は、約0.3〜約100mm、例えば約2〜10mmの範囲であってもよい。適切には、全体の形状は円筒形である。特殊な哺乳動物の組織外植片の回収、および器具の扱いに適するような長さを備えれば、器具の長さは重要ではない。特定の組織の貫通を容易にするために、円筒状の器具の一端を、鋭利にし、そしてそれは、円錐の形状を有する。重要なことは、その器具が、組織に入り、そして貫通するために、適した長さを備えたあらゆる適した材料で作ってもよい。軟骨に関して、器具を、比較的強化した材料、例えば金属またはスチールなどで作るべきである。外植片を、多くの方法、好ましくは切断または打ち抜き、より好ましくは打ち抜きで、器具から回収してもよい。哺乳動物の組織外植片の回収で使用するのに適した器具の例を、図1に示す（器具は、哺乳動物の組織外植片の一部、例えば軟骨の一部などを得るのに使用される図4も参照）。軟骨の一部を、関節、例えばヒト、馬やらくだを含む家畜および/または競走用動物のような哺乳動物の膝から得てもよい。特殊な場合、器具を、軟骨を貫通し、外植片を得る能力を有する強化した材料の針として設計する。針は、様々な大きさの外植片を得ることが出来るように、様々な直径の鋭利な端を有していてもよい。器具は、使い捨てでも、数回使用してもよい。
【００５４】
哺乳動物の組織外植片は、工程（a）の前で貯蔵できる。哺乳動物の組織外植片を、元々の哺乳動物の組織外植片の全て、または少なくとも一部のいずれかで保存してもよい。保存は、、約-180℃〜約37℃、例えば好ましくは約-180℃〜約-70℃、または約-70℃〜約10℃の温度で、好ましくは約-180℃、約-70℃、約4℃、または8℃、さらに好ましくは約-70℃の温度で、さらにより好ましくは約-180℃であってもよい。保存は、冷蔵庫、通常の冷凍庫、液体窒素中で約-70℃〜約-80℃の温度で、実験冷凍庫で、または適切な固形キャリアーと任意に合わせて凍結乾燥された組織として、あってもよい。工程（a）の前に、哺乳動物の組織外植片の保存した一部を、保存場所から移動させ、そして、ある場合に、方法の工程（a）の前に、温度を、保存温度からより高い温度に徐々に上昇させる。
【００５５】
切除する前の哺乳動物の組織外植片の処理
通常、細胞コロニー形成ユニットを生産する方法は、さらに、付加的な工程、例えば工程（a）の前に哺乳動物の組織外植片の一部を洗浄する工程などを含む。洗浄を、未熟な細胞の移植および分裂増殖を阻害および/または影響を与え、細胞形成ユニットの形成を阻害するであろう哺乳動物の組織外植片に付着した望まざる成分を除去するために行う。  洗浄を、pH約5〜約9、好ましくはpH7.4近くを有する水性培地にて行ってもよい。水性培地の例は、実施例1に記載のように、生理食塩水またはPBSのあらゆる形態である。
【００５６】
その他の付加的な工程は、工程（a）の前に行われる処理、例えば1つ以上のタンパク質分解酵素のみを使用した部分的な処理、または水性培地を使った前処理との組み合わせを伴っていてもよい。1つ以上のタンパク質分解酵素を使った哺乳動物の組織外植片の一部の部分的な処理を、哺乳動物の組織外植片の構造の開口をさせ、それによって、工程（a）の前に、組織外植片内へおよび/またはから外への成長因子の拡散および未熟な細胞の哺乳動物の移動を促進するような条件下で行う。その結果、哺乳動物の組織外植片の一部は、細胞またはその他の部分を、切除前に、哺乳動物の組織外植片の一部から遊離しないような方法で、無傷のままにしておく。哺乳動物の組織の一部の部分的な処理を、約1〜約90U/１mgの哺乳動物の組織外植片の、例えば約1〜10U/mg、約1〜5U/mgまたは2.5U/mgの範囲の濃度で、1つ以上のタンパク質分解酵素を利用して行う。哺乳動物の組織外植片の一部の部分的な処理を、タンパク質分解酵素、例えばプロテイナーゼおよび/またはチロシン、好ましくはカテプシンDのようなアスパルテートプロテイナーゼ、カテプシンB、L、S、KならびにカルパインＩおよびIIのようなシステインプロテイナーゼ、好中球エラスターゼ、カテプシンGおよびプロテイナーゼ3のようなセリンプロテイナーゼ、およびMMP-1、MMP-2、MMP-3、MMP-4、MMP-5、MMP-6、MMP-7、MMP-8、MMP-9、MMP-10、MMP-11、MMP-12、MMP-13、MMP-14、MMP-15、MMP-16、MMP-17、MMP-18、MMP-19、MMP-20および/またはトリプシンのようなメタロプロテイナーゼからなる群から選択されるプロテイナーゼを利用して行ってもよい。水性培地を使った哺乳動物の組織外植片の一部の処理を、ｐH7.4（生理学的なｐH）から少なくとも±0.5であるｐH、例えば約4〜約6.9、例えば約5〜約6.9、約6〜約6.9の範囲内のｐH、例えば約6.5、または約7.9〜約10、例えば約7.9〜約9、約7.9〜約8.5の範囲内のｐH、例えばｐH約8.0を有する水性培地を使って行ってもよい。
【００５７】
哺乳動物の組織外植片の一部の培養
哺乳動物の組織外植片の一部を、培養過程、例えば1つ以上の細胞形成ユニットを採取するまでの間、任意に維持する。全培養過程を通して、組織を離れるまで、方法を通して、細胞形成ユニットを生産する未熟な細胞は、ほとんど刺激されず、そのため改善された結果が想定される。
【００５８】
さらに、哺乳動物の組織外植片の一部を除去する工程を除くことで、組織培養物は、組織培養フラスコを開け、成分を入れたり除いたりすることが必要な工程を通して、組織培養フラスコに入るであろう取り巻く微生物物質にほとんどさらされない。
【００５９】
生育培地
哺乳動物の組織外植片の一部を、適切な生育培地またはそれに代わる2つ以上の適切な生育培地を使って、組織培養フラスコで培養する。1つの生育培地を、本発明の方法を通して使用してもよいし、または、代わりに、培養方法を通して2つ以上の生育培地を使用してもよい。生育培地は、培養方法を通して、2つ以上の様々な生育培地を使用する場合、様々な成分を含んでいてもよい。生育培地は、例えば炭水化物、脂質およびアミノ酸のような代謝産物、ビタミン、成長因子、サイトカイン、ミネラルおよび抗菌物質からなる群から選択される1つ以上の成分を含み、好ましくは、生育培地は、哺乳動物、例えばヒト、家畜および/または競走用動物（例えば馬やらくだ）の血清を含み、好ましくは哺乳動物の血清は、上記方法を通して使用される哺乳動物の組織外植片に対してオートロガスである。適切な生育培地の例は、10〜20％W/Wの仔牛胎児血清を含むDMEM/F12である。
【００６０】
本発明の1つの実施例に関して、第一の生育培地は、方法で、初期で使用される少なくとも非-オートロガスな血清を含む。細胞の採取および遊離の前に、第一の生育培地を、第一の生育培地で使用される非-オートロガスな血清から望ましくない免疫成分の削減および/または除去することを可能にする少なくともオートロガスな血清を含む第二の生育培地に移し代える。
【００６１】
一方、生育培地は、合成または半合成の培地、すなわち哺乳動物の生物材料を含まないか、実質的に含まない培地に基づいていてもよい。そのような培地に対して、上記のようなその他の因子を添加してもよい。アメリカ特許6,150,163で、適した生育培地の例を挙げている。
【００６２】
また、必要であれば、本発明の方法は、哺乳動物の組織外植片内に、および/または組織培養フラスコ内の生育培地に、生育因子を使って生育培地を強化する工程を含む。
【００６３】
加えて、先の本発明による方法は、生育培地の、組織培養フラスコに対する生育培地または他の物質の成分の連続的および/またはパルス状放出を行ってもよく、その結果上記の成分または物質の制御された放出を得る。そのような場合、組織培養フラスコを、連続的および/またはパルス状放出のための入口および出口末端部分（開放）を備える。幾つかの場合、連続的および/またはパルス状放出が、圧力差を入口と出口末端で得られるように設定されることが有利であろう。
【００６４】
先に規定したような本発明による方法を、従来の組織培養フラスコ内で行う。しかし、組織培養フラスコのサイズまたは形態は、目的に適し、そして上記の方法を使って、生産される細胞コロニー形成ユニットの量に適合するように備えることは、重要ではない。
【００６５】
細胞コロニー形成ユニットの遊離
細胞コロニー形成ユニットを、遊離培地を使うことで遊離させてもよい。本工程は、組織培養フラスコおよび互いから、細胞コロニー形成ユニットの細胞を遊離させえる遊離培地を使って、細胞コロニー形成ユニットを接触させることからなり、好ましくは、遊離培地は、トリプシンおよびその他の酵素から選択された1つ以の酵素を任意に含む水性培地である。一方、遊離培地は、二価の金属イオンを含まないPBS緩衝液のような緩衝液である。細胞コロニー形成ユニットの遊離を、組織培養フラスコから細胞コロニー形成ユニットを除去するため、および/または細胞コロニー形成ユニットを、細胞コロニー形成ユニットをさらに生育させえる新たな組織培養フラスコに移し代えることを可能にするために行う。
【００６６】
それに対して、哺乳動物の組織外植片の一部を電磁誘導に供する工程を、生産方法と組み合わせて利用してもよい。電磁誘導の工程を、哺乳動物の組織外植片の一部から未熟な細胞の分裂増殖および移動を促進させるために行ってもよい。
【００６７】
特定の環境でさらに培養するために、細胞コロニー形成ユニットを、別の組織培養フラスコに移し代えてもよい。
【００６８】
細胞コロニー形成ユニット（CFU）
本方法によって生産される細胞コロニー形成ユニットは、3つの組織層、例えば間葉、外胚葉、および内胚葉層由来の未熟な細胞、好ましくは基幹細胞、前軟骨芽細胞、軟骨芽細胞、軟骨細胞、前骨芽細胞、骨芽細胞、骨細胞、前筋原細胞、筋原細胞、筋細胞、セメント芽細胞、セメント細胞、象牙芽細胞、象牙細胞、エナメル芽細胞、エナメル細胞、繊維芽細胞または繊維細胞由来である。
【００６９】
哺乳動物の組織外植片の一部の培養を通して、細胞コロニー形成ユニット内で細胞の同定を実証する能力について、未熟な細胞が細胞コロニー形成ユニットに分裂増殖し始めると直に分析を行ってもよい。好ましくは、哺乳動物の組織外植片の一部は、軟骨、例えば弾性、繊維、ヒアリンまたは関節ヒアリンであり、外植片内の未熟な細胞は、前軟骨芽細胞または軟骨芽細胞あるいは軟骨細胞に分裂増殖する。哺乳動物の組織外植片の一部が骨である場合、未熟な細胞は、前骨芽細胞または骨芽細胞、あるいは骨細胞に繁殖する。軟骨細胞または軟骨芽細胞を、光学顕微鏡での形態分析、あるいはコラーゲンII型またはヒアリン合成の検出、およびPCRまたはウエスタンブロット解析のようなRNAま
たはタンパク質の解析を含む方法による分泌によって解析してもよい。
【００７０】
本発明による方法は、通常、約37℃±10℃の温度で行われる。しかし、実施例で示したように、低温を、よりゆっくりとした成長が必要とされるこれらの場合で用いてもよい。
【００７１】
軟骨細胞を培養するための方法は、同じ発明者によって提出された特許出願PCT/EP00/0711の主題である。もし関連し、同一事項があれば、権利放棄される。
【００７２】
1つ以上の細胞コロニー形成ユニットの組成物
本発明は、さらに、細胞コロニー形成ユニットまたは細胞コロニー形成ユニットの群、あるいは「インビトロでの細胞コロニー形成ユニットを生産する方法」のもとで開示した本発明の方法に従って生産されたその懸濁液に関する。
【００７３】
加えて、本発明は、本発明に従って生産される1つ以上の細胞コロニー形成ユニット、およびキャリアーを含む組成物に関する。好ましくは、1つ以上の細胞コロニー形成ユニットおよびキャリアーの少なくとも一部が、オートロガスな血清のようなオートロガスである。キャリアーは、先の「定義」のもとで定義される。
【００７４】
細胞または1つ以上の細胞コロニー形成ユニットは、通常、懸濁または分散した形態でキャリアー中に存在する。
【００７５】
キャリアーは、また、ｐH調整剤、可溶化剤、湿潤剤および緩衝剤を含んでいてもよい。キャリアーは、添加剤、例えばナトリウム、カリウムおよびマグネシウムのようなアルカリ金属またはアルカリ土類金属を有する塩類、ならびに例えば亜鉛塩類のような適切な塩類を含んでいてもよい。他の実施例は、安定化剤、防腐剤、浸透圧または等張調整剤、非イオン洗剤、抗酸化剤ならびに血清、例えばオートロガスな血清である。キャリアーは、また、例えばアミノ酸、脂質および/または炭水化物のような代謝産物、養分および/またはミネラルを含んでいてもよく、また、治療上および/または予防上、活性な基質、例えば薬剤物質または免疫抑制剤をも含んでもよい。
【００７６】
半固体キャリアーの例は、例えばポリエチレングリコール、グリコフロル（glycofurol）などである。
【００７７】
上記組成物を、治療上および診断上の組成物として、または生物材料の単離、精製または生産に使用してもよい。治療上の組成物は、それのみ、または上記のようなキャリアーと共に使用することができる。単体の少なくとも一部は、好ましくはオートロガス、例えば本発明の方法で使用した哺乳動物の組織と同一の哺乳動物から得た血清である。治療上の組成物は、さらにコラーゲンタンパク質、例えばコラーゲンII型、IV型、IX型およびXI型、プロテオグリカン、例えばアグリガン（aggregan）、デコリン、フィブロモジュリンおよびビグリカン、ならびに非コラーゲンタンパク質、例えば寒冷沈降物、フィブロネクチン、ビトロネクチン、フィブロノゲン、フィブリン、キストリン、エチスタチン、フォンウィルブランド因子、テナスシンおよびアンコリンCIIを含み、特許出願PCT/EP00/07111で記載されているその他の刺激因子を含むマトリクス由来の特定の成分を含んでいてもよい。
【００７８】
本発明の治療上の組成物を、組織障害、例えば軟骨、および/または骨の障害を患っている哺乳動物の治療で使用してもよい。哺乳動物は、ヒト、あるいは家畜または馬およびらくだを含む競走用動物を含む。
【００７９】
本発明の診断上の組成物を、組織障害に関連する問題を検査するための診断方法、例えば下文で言及した診断方法で使用してもよい。
【００８０】
生物材料の単離物、精製物または生産物を、1つ以上の細胞形成ユニット、例えば本発明の方法によって生産されたこれら細胞コロニー形成ユニットから得ることができるあらゆる材料、例えばDNA、RNAまたはタンパク質であってもよい。
【００８１】
加えて、上記細胞コロニー形成ユニット、細胞コロニー形成ユニットのグループ、または組成物を、医療、例えば組織障害、例えば軟骨および/または骨の障害の治療に使用してもよい。
【００８２】
さらに、上記細胞コロニー形成ユニット、細胞コロニー形成ユニットのグループを組織障害の治療、好ましくは哺乳動物の軟骨および/または骨の障害の治療、さらに好ましくはヒト、あるいは馬およびらくだを含む家畜または競走用動物の軟骨および/または骨の障害の治療のための治療上の組成物の製造に使用してもよい。
【００８３】
哺乳動物の、哺乳動物の組織外植片を採取するための哺乳動物の運搬キット
さらに、本発明は、運搬キットに関する。哺乳動物の組織から哺乳動物の組織外植片を採取するためのこの中で記載されている器具、および哺乳動物の組織外植片を保護するための運搬容器、ならびに任意に、先に規定した器具の使用のための説明書からなる運搬キット、哺乳動物の組織外植片を採取するために使用される哺乳動物の運搬キット。
【００８４】
器具を、周辺組織を多大に害することなく、哺乳動物の組織の一部を任意に得るためにデザインする。十分に画定された器具の内腔は、採取される組織に依存した様々な大きさおよび形態であってもよい。外植片を、あらゆる方法、好ましくは切断または打ち抜き、さらに好ましくは打ち抜きで、哺乳動物の組織から遊離させてもよい。軟骨の一部を回収する適切な器具の例を、図1で挙げている。軟骨の一部を、ヒト、馬ならびにらくだを含む家畜および/または競走用動物のような哺乳動物の膝から得てもよい。そのような特別な場合、器具を、軟骨を貫通して外植片を得る機能のために、硬い材料の針として設計してもよい。針は、様々なサイズの外植片を得ることができるようにするために、組織を貫通する目的で様々な直径の端を有していてもよい。器具は、使い捨てでも、数回使用してもよい。
【００８５】
器具を使用するための説明書は、任意に、例えば哺乳動物の組織上の同一な場所から同一量の哺乳動物の組織外植片を得るための再現性を含む。
【００８６】
運搬キットは、哺乳動物からオートロガスな血液サンプルを採取し、その結果、先に、「インビトロでの細胞コロニー形成ユニットの生産方法」の下で記載したような方法、または方法の最終部分のいずれかを通して、オートロガスな血清を含む生育培地を使用することを可能にするための血液サンプルチューブを含む。
【００８７】
また、運搬キットを、DNA、RNAおよび/またはタンパク質の分析のための生化学的な検査で使用するための哺乳動物の外植片を採取するために使用してもよい。
【００８８】
オートロガスな細胞内植用の1つ以上の細胞コロニー形成ユニットを含む運搬キット
本発明は、さらに、少なくとも本発明の方法によって得られる細胞および担体を含む第一容器、ならびに軟骨および/または中間膜を含む第二容器からなる運搬キットに関する。有用な軟骨および/または中間膜の例は、特許出願PCT/EP00/07111で記載されている。
【００８９】
運搬キットは、先に規定したような、軟骨および/または骨の障害のような組織障害を患っている哺乳動物の処置で使用するのに適している。哺乳動物は、ヒト、または馬およびらくだを含む家畜および競走用動物である。
【００９０】
オートロガスな細胞内植法用の1つ以上の細胞コロニー形成ユニットを生産するための生産プラント
先に規定し、記載したように、
哺乳動物の組織外植片の一部を組織培養フラスコへの適用、
生育培地を組織培養フラスコへの適用、
哺乳動物の組織外植片の一部から生育培地に移動する細胞を生育、および
遊離培地を組織培養フラスコへの適用
の手段からなるインビトロで、哺乳動物の組織外植片から細胞コロニー形成ユニットを生産するための生産プラント。生産プラントは、さらに生育培地、遊離培地および/または例えば炭水化物、脂質およびアミノ酸のような代謝産物、ビタミン、生育因子、サイトカイン、ミネラルならびに抗菌物質からなる群から選択される1つ以上の因子の連続的またはパルス状放出の手段を含んでもよい。生産プラントの例は、実施例1および図5での生産計画で記載したオートロガスな細胞内植/移植の方法を意図している。
【００９１】
医薬的な使用および製剤
一面で、本発明による細胞または組成物を、疾患、特に哺乳動物の軟骨、骨、関節組織、筋組織、皮膚組織、粘膜組織、脳組織、心臓組織、腎臓組織、膵臓組織および肝臓組織の異常に関連する組織障害のような疾患、ならびに、定義の下で規定した疾患、好ましくは、軟骨および/または骨の異常の処置のための医薬組成物を製造するために使用される。
【００９２】
他の面で、本発明による細胞または組成物を、細胞コロニー形成ユニットまたは細胞コロニー形成ユニットの群、あるいは組成物の十分な量を、それが必要な哺乳動物に投与することからなる、組織または組織関連疾患を患っている哺乳動物を治療するための方法で使用する。
【００９３】
さらに他の面で、本発明による細胞または組成物を、細胞コロニー形成ユニットまたは細胞コロニー形成ユニットの群、あるいは組成物の十分な量を、それが必要な哺乳動物に投与することからなる、組織または組織関連疾患を患っている哺乳動物を治療するためのオートロガスな方法で使用する。いかなる関連があれども、本方法は、細胞コロニー形成ユニットまたは細胞コロニー形成ユニットの群、あるいは同一の哺乳動物由来のオートロガスな材料、例えばオートロガスな血清の手段の組成物の生産工程を使用する。
【００９４】
生物学的活性の測定の診断方法
加えて、本発明は、組織培養フラスコ中の生育培地におけるマトリクスと未熟な細胞からなる哺乳動物の組織外植片の一部を生育し、そして、組織培養フラスコ中の少なくとも一部の内容物を、哺乳動物の組織外植片および/または未熟な細胞の性質の情報、例えば軟骨の外植片の細胞コロニー形成ユニットを生産する可能性を受ける検査に付す（図3）工程からなるインビトロ培養物から哺乳動物の組織外植片の一部の生物学的活性を測定するための診断方法に関する。診断方法は、検査、例えば組織化学的および/または細胞病理学的な検査であってもよい。さらに、診断方法は、DNA、RNAおよび/またはタンパク質の検査のための生化学的分析のような検査であってもよい。
【００９５】
材料と方法
生育培地または滅菌した生育培地：20％の仔牛胎児血清を含むDMEM/F12。DMEM/F12（カタログNo 31331-028）を、Life Technologies Inc.、Rockville、MD、アメリカ合衆国から得、そして仔牛胎児血清を、Life Technologies Inc.、Rockville、MD、アメリカ合衆国から得た。
【００９６】
以下の材料を、Life Technologies Inc.、Rockville、MD、アメリカ合衆国から得た。
トリプシン 0.25％：カタログNo 258200-056
仔牛胎児血清：カタログNo 10084-168、バッチNo 302528 1A
ファンギゾン：カタログNo 15290-026
ゲンタマイシン：カタログNo 15710-031
組織培養フラスコ：簡易フラスコ：25cm2、カタログNo 156367A
組織培養フラスコ：簡易フラスコ：75cm2、カタログNo 156499A
Mg、Caを含まないPBS：カタログNo 14190-094
1mgのMgと1mgのCaを含むPBS
L-アスコルビン酸2-リン酸塩を、Sigma、カタログNo A8960から得た。
【００９７】
実施例
実施例１
インビトロでオートロガスな軟骨細胞の内植（ACI）の使用のための軟骨外植片の培養、および細胞コロニー形成ユニットの生産のためのプロトコル
軟骨外植片系は、近年、臨床試験に関連するカンパニー（company）細胞生成ユニットで使用されている：IBO-AC-02は、培養したオートロガスな軟骨細胞を、膝の関節軟骨の欠失に内植した修復効果を検査する。2001年12月までに、軟骨の生検材料を、膝の問題に苦しむ７人の患者から得た。コペンハーゲン地方の2箇所の主要なデンマークの病院で、７つの生検材料の外植片を、各々約1100万個の細胞に培養し、そして患者に無事に内植した。臨床検査の最初の成果は、2003/4の間に出るであろう。
要するに、軟骨生検材料を、患者の膝から採取し、そして組織培養フラスコに、Ｌ−アスコルビン酸２−リン酸塩［50μg/ml(300μmol/l)］、ゲンタマイシン硫酸塩[50μg/ml(10mmol/l)]、そしてファンギゾン[2μg/ml(2.2μmol/l)]を補充し、滅菌した成育培地に直接移し代えた。そして、軟骨生検材料を、マグネシウムとカルシウムを含むＰＢＳを使って注意深く洗浄した。軟骨外植片を、最初に培養に入れた際に、安定した代謝期に達するのに提供材料に応じて数日間費やす。
その様な安定した状態（安定した状態とは、合成と代謝との間でのバランスである）に達すると、未熟な細胞、前軟骨芽細胞／軟骨芽細胞は、生育培地に存在する成長因子によって刺激され、それは、軟骨マトリクスの隅々に散乱し、マトリクスに存在する種々の結合タンパクに結合し、そして直接、選択的な細胞受容体に結合した。
【００９８】
刺激された（および分裂増殖する）細胞は、通常１〜２週間（提供材料に依存する）の間外植片中に残存し、そして、細胞の移動および化学走化を介して、組織培養フラスコにさらに付着し、細胞コロニー形成ユニットを生成するために、外植片を培地に「放つ」。
培養３〜５週間後、より小さいのと、より大きな細胞コロニー形成ユニットは、生育し（図５Ａおよび５Ｂ参照）、そして細胞を、トリプシンを使って採取する。
細胞を採取し、キャリアー内で細胞懸濁液として診療所または病院に放出する前にさらに２〜３日間培養するために、２０％仔牛胎児血清の代わりに１０％哺乳動物血清を含むオートロガスな生育培地を、組織培養フラスコに加えた。
【００９９】
実施例２
軟骨の外植片系で、軟骨原細胞系列のディファレンシャル単離
軟骨の生検材料を、針またはメスを使って患者の膝から採取し、上記の滅菌した生育培地に移し代えた。軟骨片を、鋭利な滅菌したメスを使って様々な領域に水平に切った。切断工程を、正確な分離と選択を確保するために、層状の気流フード内の顕微鏡下で行った。軟骨片を、様々な領域に水平に数回切るか、または軟骨の生検材料を２層にまさに１回切る。数回切ることで、様々な軟骨層を滅菌したチューブに分けた後、軟骨片を組織培養フラスコに加える前に、最後に軟骨片をマグネシウムイオンとカルシウムイオンを含むPBS緩衝液を使って数回洗浄した。さらなる細胞培養過程を実施例１でのプロトコルで記載したのと同様な形式で行った。
【０１００】
実施例３
本発明に従ってCFUを得るための生のコラゲナーゼを使った軟骨の外植片の部分酵素処理
実施例１で記載したように、重量100mgの軟骨の生検材料を、患者の膝から採取し、抗菌物質とファンギゾンとを含む滅菌した成育培地に移し代えた。軟骨生検材料をマグネシウムとカルシウムを含むPBS緩衝液で洗浄し、鋭利な滅菌したメスを使って、垂直と水平に2〜4mmの軟骨片（外植片）に切り裂いた。２５ｍｌの生育培地中の軟骨の外植片を、クロストリディウム  ヒストリチカム（Clostridium  Histolyticum）（1A型（C9891）またはＩ型（C0130）、あるいはVIII型（C2139）、II型（C6885）またはIV型（C5138）またはV型（C9283）（総てシグマ化学から得た））由来の10U/ml（10U/ml×25ml=250ユニット）の生のコラゲナーゼを一緒に含む75cm2の組織培養フラスコに加えた。そして組織培養フラスコを、緩やかに振とうしながら37℃、5％CO2で18時間培養した。
【０１０１】
生のコラゲナーゼを使った培養18時間後、軟骨外植片を40umの細胞ろ過器内で、マグネシウムとカルシウムを含まない100mlのPBSを使って洗浄し、そして同一の細胞ろ過器内で50mlの成育培地を使って洗浄した。外植片の様々な洗浄過程は、軟骨の外植片に存在するコラゲナーゼを除去するために、重要である。
最終洗浄過程後、処理した（前−消化した）軟骨の外植片（あるいは遊離細胞）を、新たな生育培地を含む75cm2の新たな組織培養フラスコに直に加えた。軟骨外植片の細胞培養工程の最後の部分は、実施例１でのプロトコルに記載のようにして直に行った。
【０１０２】
実施例４
pH6.5に調節した生育培地を使った軟骨外植片の処理
実施例１で記載したように、重量約100mgの軟骨生検材料を患者の大腿顆から採取し、抗菌物質とファンギゾンを含む滅菌した生育培地に移し代えた。軟骨の生検材料を、マグネシウムとカルシウムを含み、pH6.5に調節したPBS緩衝液で洗浄し、鋭利な滅菌したメスを使って、垂直および水平に2〜4mmの軟骨片（外植片）に切り裂いた。軟骨外植片を、（滅菌したHClを使って）pH6.5に調節した25mlの生育培地を含む組織培養フラスコに加え、緩やかに振とうしながら37℃で18時間培養した。「pH6.5生育培地」を使って培養した後、軟骨外植片を、マグネシウムとカルシウムを含む50mlの通常の生理PBS緩衝液（pH7.4）および実施例１で使用した50mlの生育培地を使って細胞ろ過器内で洗浄した。そして、実施例１で記載したように、洗浄した軟骨外植片を、新たな生育培地（25ml）を含む新たな75ｃｍ2の組織培養フラスコに加え、さらに培養した。
得られたCFUは、本発明に従ったものである。
【０１０３】
実施例５
培養温度および生育培地中の血清の濃度の変化による、軟骨の外植片内の軟骨原細胞の細胞の移動と分裂増殖の延長
実施例１で記載したように、軟骨生検材料を患者の大腿顆から採取し、滅菌した生育培地に移し代えた。実施例１で記載したように、軟骨生検材料を、新しい生育培地を使って注意深く洗浄した。生育培地は、この時点で、低濃度の例えば培地中の成長因子を与える5％FCSからなる。軟骨の生検材料（100mg）を鋭利なメスを使って水平および垂直に切り、培地フラスコ（5度の角度で）を一時的に振とうしながら37℃/5％CO2で外植片を含む培養フラスコ（75cm2）で72時間培養する前に、、外植片を5％生育培地（25ml）に加える。CO2−培養器内で、静止状態で外植片を７２時間保存した後、実施例１で記載したように、軟骨の外植片を、20％FCSを含む新しい生育培地を含む新たな組織培養フラスコに移し代え、37℃、5％CO2で培養した。外植片のさらなる細胞培養過程を、直に、実施例１で記載したのと同様なプロトコルを続けた。
得られたＣＦＵは、本発明に従ったものである。
【０１０４】
実施例６
近位中膜頸骨（proximal media tibia）から採取した骨膜の外植片の培養
骨膜の弁を、「骨膜起子（elevator）」を使って近位中膜頸骨から採取し、滅菌したチューブにマグネシウムとカルシウムを含むPBS緩衝液に加えた。弁を、鋭利なメスを使って、弁に沿って垂直に幾つかの組織片に切る。骨膜組織の小片を、骨膜外植片を生育培地に加える前に、実施例１のプロトコルで記載のように、PBS緩衝液でもう一回洗浄した。
生育培地に最初に入れ、そして生育培地中の成長因子にて刺激される際に、未熟な間葉細胞１〜２週由来の骨膜は外植片の外に移動し、細胞コロニー形成ユニットを確立するプラスチック表面上に定着する。
多くの潜在的な特性を有する間葉前駆体は、繊維芽細胞が見られる細胞形成ユニットを、プラスチック表面に確立する。コロニーは、大きさ（直径）や細胞数が異なり、骨髄間質前駆細胞と記載されるのと同一の表現型の形態を示す。
【０１０５】
個々のコロニーを、さらに多数の細胞に分裂増殖させ、オートロガスな細胞の移植法そして修復過程で使用することができる。
外植片の間葉、外胚葉および内胚葉由来細胞の選択された比率を引き出し、生育培地で培養される化学走化因子に向かった細胞の移動の知見を、再度適用し、成熟な間葉細胞の単離および選択する過程で利用される−この実施例で、未熟な間葉細胞は、頸骨から採取した骨膜弁（形成層）に存在する。
得られたＣＦＵは、本発明に従ったものである。
【０１０６】
実施例７
軟骨の分析を目的とした軟骨外植片系の使用
計画の表題：オートロガスな軟骨細胞移植（ACI）を最適化するための膝関節鏡検査を受けた患者から得たヒト軟骨細胞の培養に関する生存可能研究
この実施例で述べられている次の研究は、Videnskabsetisk Komite for Kobenhavns Amtにて承認され、♯KA99148ｍ（190201）として設計された。
工程：
要約すると、重量１〜３ｍｇの２つの小さな軟骨の生検材料を、大腿顆の隣接した領域からφ2mmのスチール製の針を使って採取した。標準的な軟骨の生検材料サンプルを、例えば関節鏡検査試験を通して患者から得、室温で２４時間以内に移動培地（DMEM/F12、ゲンタマイシン硫酸塩［50μg/ml（10mmol/l）］、ファンギゾン［2μg/ml（2.2μmol/l）］中で、実験室に放出した。
【０１０７】
細胞実験室で、２つの軟骨サンプルを、サンプルが、血球または骨原細胞系列などで汚染されないことを確実にするために、はじめにカルシウムとマグネシウムのイオンを含むＰＢＳ緩衝液で洗浄する。生検材料を、マイクロ重量天秤上で秤量し、各々の生検材料の長さを付加的に記録した。生育培地で１または２の軟骨外植片サンプルを刺激し、培養する前に、２つの軟骨の生検材料を、はじめに鋭利なメスを使って、解析で骨細胞または骨様マトリクス材料を排除するためのタイドマーク（tide mark）以下に切る。２つの軟骨の生検材料のうち一方を、同じ部分から得た２つのサンプルの、細胞−および組織病理学的な条件を測定するための対照として使用する。対照サンプルを、最後の洗浄の後、抱埋、切断、ならびにサフラニンＯ、トルイジン  ブルー、ヘマトキソリン＆エオシン、およびゲンチアン  バイオレット（当業者で公知）などの色素を使った染色を含む組織学的な調整の前に、10％ホルマリン/PBS内で48時間固定した。
【０１０８】
その他の軟骨サンプルを、実施例１で記載のように、20％仔牛胎児血清、ゲンタマイシン、アスコルビン酸およびファンギゾンを含むDMEM/F12培地で（３および４日毎に培地交換しながら）30日培養する。
総ての上清を、後の生化学的な解析用に各々の培地交換を通して採取する（-80℃冷凍庫で保存した）。
培養30日後、25cm2培養フラスコ内に存在する細胞コロニー形成ユニットと軟骨外植片サンプルを、1mMマグネシウムと1mMカルシウムを含むPBSで一旦洗浄し、サフラニンＯ、ゲンチアン  バイオレットまたはその他の色素を使った染色（当業者で公知）を行う前に、10％ホルマリン／PBS内で48時間固定する。
【０１０９】
25cm2培養フラスコ内で存在する各々の細胞コロニー形成ユニットを測定し、細胞コロニー形成ユニットを計数して記録する。軟骨原細胞コロニーの正確な数を表し、それらの直径の大きさ（細胞（群）および細胞発生の大まかな数に相当するコロニーの正確な直径）を、対照サンプルおよび培養した軟骨外植片の組織−および細胞の病理学的な評価と対比する。
上清の生検材料、細胞アッセイおよび組織学的な調整の生化学的な検査から得た結果の総てを、患者の膝の問題点および膝の関節軟骨の総体的な質の場合のさらなるデータを得るために、一般的に解析し、調査し、そして性別、年齢、身体活動度、一般医学、栄養、外傷、病気などの患者の臨床データと対比する。
総計、５１人の患者が、医学的な検査計画のために軟骨生検材料を提供した。
医学的な調査の最終的な結論は、2002/3の間に示されるであろう。
【０１１０】
実施例８
仔牛胎児血清およびヒトのオートロガスな血清中の成長因子およびサイトカインの相対的な測定
組換え成長因子およびサイトカインで富化されたオートロガスな生育培地；5％ヒトのオートロガスな血清（患者の血液から調製）を含むDMEM/F12基本培地を、ビタミンD3（0.1〜10μg/ml）、アスコルビン酸（50μg/ml、シグマ）、ファンギゾン（2μg/ml）およびゲンタマイシン硫酸塩（100U/ml、Gibco）と一緒に、ヒト組換え成長因子およびTGF-ベータ1（0.1〜20μg/ml）、IGF-1（0.1〜2０μg/ml）、IGF-2（0.1〜２０μg/ml）、インスリン（1〜100μg/ml）、EGF（0.1〜20μg/ml）、FGF-B（0.1〜10μg/ml）、PDGF（0.1〜20μg/ml）、GM-CSF（0.1〜20μg/ml）、IL-6（0.1〜20μg/ml）、IL-8（0.1〜20μg/ml）のようなサイトカインで富化する。組換え成長因子およびサイトカインを含むオートロガスな生育培地の滴定および富化を、以下に挙げるように20％仔牛胎児血清を含む生育培地に存在するこれらの因子の相対濃度に調節する。
【０１１１】
酵素結合免疫吸着検定法（ELISA）を、抗ヒト血清仔牛胎児血清中で成長因子およびサイトカインの相対濃度を検出するのに用いた。ヒト血清サンプルを、オートロガスな軟骨細胞内植を受けた様々な患者から得た。
仔牛胎児血清およびヒト血清中のTGF−ベータ１、IGF−ベータ１、IGF−Ｉ、IGF−II、インスリン、EGF、FGF−B、PDGF、IL-6、IL-8、GM-CSFの相対的な定量比を、受容成長因子およびサイトカインの検出に特異的なモノクローナル抗体を使って、サンドウィッチELISAにて算出した。総てのモノクローナル抗体を、BIφDESIGN  インターナショナル（Saco、Maine、USA）から購入した。
成長因子およびサイトカインに対して挙げられたモノクローナル抗体を、９６ウエルELISAプレート（NUNC免疫プレート）内でDMEM/F12培地で薄め、４℃で24時間培養した。培養24時間後、ELISAプレートを洗浄し、0.1％トウィ−ン20を含むDMEM/F12培地でブロックした。
【０１１２】
ヒト血清サンプル、成育培地（実施例１で記載のように調整した）、およびLife  Technologyから得た希釈していない仔牛胎児血清を、付加的に連続希釈し、ELISA系でモノクローナル抗体に加えた。サンプルをウエル内で２時間培養し、0.1％トウィーン20を含むDMEM/F12培地を使って、さらなる洗浄工程を続けた。ウエル内の「第１」抗体に結合した様々な成長因子およびサイトカインを、上記のようなサンドウィッチＥＬＩＳＡ系の最後の部分で「第２」モノクローナル抗体をさらに加え、第２抗体に対して挙げられた「第３」酵素結合モノクローナル抗体（アルカリリン酸塩、ＢＩφＤＥＳＩＧＮ）で最後に発生させた。
ELISAプレートを、ELIASAリーダーでスキャンし、結果を、成長因子と、ヒト血清サンプル、仔牛胎児血清、および２０％ＦＣＳを含む生育培地のサイトカインとの相対濃度を各々比較するために、様々な滴定曲線にあてた。
【０１１３】
20％FCSを含む生育培地（30人のヒト軟骨外植片サンプルに対して早期試験された）を、オートロガスな富化された5％生育培地中の成長因子およびサイトカインの適切な濃度を得るため、滴定終点として使用した。
言い換えれば、上記ELISA系で測定したTGF−ベータ１の濃度は、仔牛胎児血清と比べて、ヒト血清サンプル中でより低く、そして組換えヒトTGF−ベータ１を、5％ヒト血清を含むオートロガスな成育培地に加えなければならない。一方で、もし、例えばIGF-1の濃度が、20％FCSと比べてヒト血清サンプル中で相対的に高い場合、オートロガスな生育培地は、その因子でさらに富化されることはない。
この様に、言及した成長因子およびサイトカインの相対濃度を、哺乳動物の細胞をインビトロでの適切で安全に培養するために、細胞を培養するのに使用した総てのヒト血清サンプルについて測定し、最終的に、個々のオートロガスな生育培地中のこれらの因子の適切なレベルを達成するために、例えば組換えタンパク質を使って調整する。
【０１１４】
実施例９
半月板の一部を、膝の手術を受けた患者から得、生検材料を、滅菌したチューブ内で、マグネシウムとカルシウムを含むPBS緩衝液に加えた。層状のフード内で、組織を、滅菌した鋭利なナイフを使って、垂直および水平に幾つかの組織片に切った。小さな組織片を、実施例１でのプロトコルで記載したように、生育培地に外植片加える前に、ＰＢＳ緩衝液でもう一度洗浄した。
最初に培地に入れ、成長因子にて刺激された際に、約２週間の半月板由来の未熟な間葉細胞を外植片の外に移動させ、コロニー形成ユニットを確立させるためにプラスチック表面に定着させる。
【０１１５】
この実施例で確立した間葉前駆体は、プラスチック表面上で見られる繊維芽細胞様を有するコロニー形成ユニットを規定にした。コロニーは、大きさ（直径）および細胞数が異なり、表現型の形態が類似した繊維芽細胞を示す。個々のコロニーが、個々のコロニー形成ユニットとして、より大きな組織培養フラスコ内にクローンされた場合、さらに多数の細胞に分裂増殖させることができる。
オートロガスな細胞内植法で、膝で障害を受けた半月板の修復に、軟骨の半月板の外植片由来のコロニー形成ユニットを使用することが、この研究でのさらなる目的である。
【図面の簡単な説明】
【０１１６】
【図１】図１は、十分に画定された大きさの哺乳動物の組織外植片を得るために、本発明に従って使用される道具の概略図である
【図２】図２は、異なる表現型のコロニー形成ユニットから得た軟骨と骨の外植片由来の移動性の未熟細胞を一緒に培養した場合のそれらを示す。
【図３】図３は、異なる７つの起源からのヒトの軟骨の外植片の細胞コロニー形成ユニットを示す。
【図４】図４は、図１での道具によって得られた軟骨の組織外植片を示す。
【図５】図５ａおよびｂは、生産プラント設備の使用後、培養４週間後の軟骨の外植片および細胞コロニー形成ユニットを示す。
【図６】図６は、コラゲナーゼを使って処理した軟骨から得た軟骨原性細胞を示す。
【図７】図７は、未熟な軟骨源性細胞の細胞コロニー形成ユニットの表面を示す。
【図８】図８は、培養フラスコ内に存在するコロニー形成ユニットで発生した新生軟骨（meocartilage）の電子顕微鏡（ＥＭ）を示す。
【図９】図９は、実施例９に関するものである。
【図１０】図１０aは、♯21〜30の患者由来のコロニー形成ユニットを示している。
【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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