(57)【要約】複数の異なる標的ポリヌクレオチドを検出するためのオリゴヌクレオチドプローブの集合及び方法が開示される。この集合は異なる入り混じったプローブの集合を含み、該入り混じったプローブのそれぞれが該標的ポリヌクレオチドの少なくとも二つの間で共有される標的配列にハイブリダイズできるものである。少なくとも一つの標的ポリヌクレオチドは一つ以上の他の標的ポリヌクレオチドと共有される少なくとも一つの標的配列を含んでいる。入り混じったプローブの予め定められた組み合わせは該少なくとも一つの標的ポリヌクレオチドの標的配列にハイブリダイズでき、該予め定められたプローブの組み合わせは該標的ポリヌクレオチドの検出に特異性を与える。また、本明細書のオリゴヌクレオチドプローブの集合を設計するための標的配列の集合を同定するプロセスも開示される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数の異なる標的ポリヌクレオチドを検出するためのオリゴヌクレオチドプローブの集合であって、個々の標的ポリヌクレオチドが単一のポリヌクレオチド又は類似するポリヌクレオチド群に対応するものであり、該集合が異なる入り混じったプローブの集まりを含むものであり、個々の入り混じったプローブが少なくとも二つの該標的ポリヌクレオチドの間で共有される標的配列にハイブリダイズできるものであり、少なくとも一つの標的ポリヌクレオチドが他の標的ポリヌクレオチドの間で共有される少なくとも二つの標的配列を含むものであり、そして入り混じったプローブの予め定められた組み合わせが該少なくとも二つの標的配列にハイブリダイズできるものであり、該予め定められた組み合わせが該少なくとも一つの標的ポリヌクレオチドの検出の特異性を提供するものであるオリゴヌクレオチドプローブの集合。
【請求項２】
複数の異なる、予め定められたプローブの組み合わせを含む請求項１記載のプローブの集合であって、予め定められたプローブの組み合わせのそれぞれが異なる標的ポリヌクレオチドの検出の特異性を提供するものであるプローブの集合。
【請求項３】
単一の標的ポリヌクレオチドの固有の標的配列にハイブリダイズできる入り混じっていないプローブの少なくとも一つをさらに含む、請求項１記載のプローブの集合。
【請求項４】
ピボット配列にハイブリダイズできる少なくとも一つのプローブを含む請求項１記載のプローブの集合であって、該ピボット配列が二つ以上のポリヌクレオチドを異なる群に分割するものであるプローブの集合。
【請求項５】
重複標的配列にハイブリダイズできる縮重オリゴヌクレオチドプローブを少なくとも一つ含む、請求項１記載のプローブの集合。
【請求項６】
該プローブが固体支持体上に固定されているものである、請求項１記載のプローブの集合。
【請求項７】
該プローブが核酸アレイの形状である、請求項６記載のプローブの集合。
【請求項８】
該プローブが高密度核酸アレイの形状である、請求項７記載のプローブの集合。
【請求項９】
該プローブがスペーサーを介して該支持体に連結されているものである、請求項６記載のプローブの集合。
【請求項１０】
請求項１記載のプローブの集合を用いて複数の異なる標的ポリヌクレオチドを検出する方法であって、
厳格ハイブリダイゼーション条件下で該標的ポリヌクレオチドの一つ以上を含むと推定される試験試料に該プローブを曝す工程、
どのプローブが該試験試料中のポリヌクレオチドにハイブリダイズしたかを検出する工程、及び
該予め定められたプローブの組み合わせのどれが該ポリヌクレオチドにハイブリダイズしたかを決定するためにハイブリダイゼーションデータを処理し、それにより該試験試料が該標的ポリヌクレオチドのいずれを含むかを決定する工程、
を含む方法。
【請求項１１】
該厳格条件が高識別ハイブリダイゼーションを有利にするものである、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
該試験試料中の該標的ポリヌクレオチドのいずれが表現型を決定する標的ポリヌクレオチドに対応するかを分析する工程をさらに含む、請求項１０記載の方法。
【請求項１３】
該試験試料中に存在する表現型を決定する標的ポリヌクレオチド（単数又は複数）に基づいて該試験試料が由来した患者の表現型を診断する工程をさらに含む、請求項１０記載の方法。
【請求項１４】
該処理工程がプログラム可能なデジタルコンピュータにより行なわれるものである、請求項１０記載の方法。
【請求項１５】
請求項１記載のプローブの集合を用いるポリヌクレオチドファミリーの未知の若しくは特性決定されていない構成員を検出する方法であって、
厳格ハイブリダイゼーション条件下で試験試料に該プローブを曝す工程、
どのプローブが該試験試料中のポリヌクレオチドにハイブリダイズしたかを検出する工程、及び
どのプローブ組み合わせが該試験試料中のポリヌクレオチドにハイブリダイズしたかを決定し、該組み合わせのいずれが既知の標的配列にハイブリダイズする少なくとも一つの予め定められたプローブ組み合わせと異なるかを決定するためハイブリダイゼーションデータを処理する工程であって、オリゴヌクレオチドプローブの異なる組み合わせの存在が該未知の若しくは特性決定されていない構成員の存在を示すものである処理工程、
を含む方法。
【請求項１６】
オリゴヌクレオチドプローブの異なる組み合わせが予め定められた集合に属する仮定的な予め定められたプローブ組み合わせに対応するものである、請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
該仮定的な予め定められたプローブ組み合わせが、重複標的配列にハイブリダイズできる少なくとも一つの縮重オリゴヌクレオチドプローブを含むものである、請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
該標的ポリヌクレオチドを検出するためのオリゴヌクレオチドプローブの集合を設計すべく複数の既知の標的ポリヌクレオチドから得られた標的配列の集合を同定するプロセスであって、個々の標的ポリヌクレオチドが単一のポリヌクレオチド又は類似するポリヌクレオチドの群に対応するものであり、該集合が異なる入り混じったプローブの集まりを含むものである、個々の入り混じったプローブが該標的ポリヌクレオチドの少なくとも二つの間で共有される標的配列にハイブリダイズできるものであり、少なくとも一つの標的ポリヌクレオチドが他の標的ポリヌクレオチドの間で共有される少なくとも二つの標的配列を含むものであり、且つ、入り混じったプローブの予め定められた組み合わせが該少なくとも二つの標的配列にハイブリダイズできるものであり、該予め定められた組み合わせが該少なくとも一つの標的ポリヌクレオチドの検出の特異性を提供するものであり、該プロセスが
該標的ポリヌクレオチドの二つ以上の間で共有される同一標的配列について、該標的ポリヌクレオチドの配列を含む核酸配列データベースを検索し、それにより共有された標的配列の部分集合を得る工程、及び
相補的若しくは実質的に相補的なオリゴヌクレオチドプローブによりハイブリダイズされると該標的ポリヌクレオチドの特異的検出を促進する該部分集合から標的配列の組み合わせを個々の標的ポリヌクレオチドについて決定する工程、を含むプロセス。
【請求項１９】
異なる組み合わせにおいて異なる標的ポリヌクレオチドの間を識別する入り混じったオリゴヌクレオチドプローブの最小数若しくは最小に近い数を決定する工程をさらに含む、請求項１８記載のプロセス。
【請求項２０】
上記部分集合から標的配列を分類して二つ以上のポリヌクレオチドを異なる群に分割するピボット配列の部分集合を得る工程、
をさらに含む、請求項１８記載のプロセス。
【請求項２１】
個々の標的ポリヌクレオチドに固有である配列についてデータベースを検索し、それにより固有の標的配列の部分集合を得る工程、
個々の標的ポリヌクレオチドについて、該固有の部分集合から標的配列を、又は相補的若しくは実質的に相補的なオリゴヌクレオチドプローブ（単数又は複数）によりハイブリダイズされた場合該標的ポリヌクレオチドの特異的検出を促進する該固有の部分集合及び該共有部分集合から標的配列の組み合わせを決定する工程、
をさらに含む、請求項１８記載のプロセス。
【請求項２２】
異なる組み合わせにおいて一つ以上の入り混じっていないプローブと共に異なる標的ポリヌクレオチドの間を識別する最小数の若しくは最小に近い数の入り混じったプローブを決定する工程、
をさらに含む請求項２１記載のプロセス。
【請求項２３】
類似の標的ポリヌクレオチドの間で実質的に同一な又は保存されている標的配列についてデータベースを検索する工程、及び
該標的配列の潜在的な配列変異型に対応する重複配列を演繹し、それにより未知の又は特性決定されていない潜在的標的ポリヌクレオチドに対応する重複標的配列の部分集合を得る工程、及び
個々の標的ポリヌクレオチドについて、該重複部分集合から標的配列を、又は相補的若しくは実質的に相補的なオリゴヌクレオチドプローブ（単数又は複数）によりハイブリダイズされた場合該標的ポリヌクレオチドの特異的検出を促進する該共有部分集合及び／又は該重複部分集合から標的配列の組み合わせを決定する工程、
をさらに含む、請求項１８記載のプロセス。
【請求項２４】
該部分集合（単数又は複数）から標的配列を分類してその相補的若しくは実質的に相補的なオリゴヌクレオチドプローブに対する実質的に類似の親和性を有する標的配列を得る工程、
をさらに含む、請求項１８、請求項２０、請求項２１及び請求項２３いずれか１項に記載のプロセス。
【請求項２５】
該標的ポリヌクレオチドを検出するためのオリゴヌクレオチドプローブの集合を設計するために複数の既知の標的ポリヌクレオチドから標的配列の集合を同定するプロセスであって、個々の標的ポリヌクレオチドが単一のポリヌクレオチド若しくは類似するポリヌクレオチド群に対応するものであり、該集合が異なる入り混じったプローブの集まりを含むものであり、個々の入り混じったプローブが少なくとも二つの該標的ポリヌクレオチドの間で共有される標的配列にハイブリダイズできるものであり、少なくとも一つの標的ポリヌクレオチドが他の標的ポリヌクレオチドの間で共有される少なくとも二つの標的配列を含むものであり、そして入り混じったプローブの予め定められた組み合わせが該少なくとも二つの標的配列にハイブリダイズできるものであり、該予め定められた組み合わせが該少なくとも一つの標的ポリヌクレオチドの検出の特異性を与えるものであり、該プロセスが
二つ以上の該標的ポリヌクレオチドの間で共有される同一の標的配列について、該標的ポリヌクレオチドの配列を含む核酸配列データベースを検索し、それにより共有される標的配列の部分集合を得る工程、
任意選択的に、個々の標的ポリヌクレオチドに固有の配列についてデータベースを検索し、それにより固有の標的配列の部分集合を得る工程、
類似する標的ポリヌクレオチドの間で実質的に同一な若しくは保存されている標的配列についてデータベースを検索し、そして該標的配列の潜在的配列変異型に対応する重複配列を演繹し、それにより潜在的に未知の又は特性決定されていない標的ポリヌクレオチドに対応する重複標的配列の部分集合を得る工程、
個々の標的ポリヌクレオチドについて、該固有の部分集合から又は該重複部分集合から標的配列を、又は相補的若しくは実質的に相補的なオリゴヌクレオチドプローブ（単数又は複数）によりハイブリダイズされる場合該標的ポリヌクレオチドの特異的検出を促進する該共有部分集合及び／又は該重複部分集合から標的配列の組み合わせを決定する工程、
を含むプロセス。
【請求項２６】
該重複部分集合から、該共有部分集合から、及び該固有の部分集合があるとすればそれから、標的配列を分類してそれらに相補的若しくは実質的に相補的なオリゴヌクレオチドプローブに対する実質的に類似の親和性を有する標的配列を得る工程、
をさらに含む、請求項２５記載のプロセス。
【請求項２７】
異なる組み合わせにおいて、一つ以上の入り混じっていないプローブと共に異なる標的ポリヌクレオチドの間を識別する入り混じったプローブの最小数若しくは最小に近い数を決定する工程
をさらに含む請求項２５記載のプロセス。
【請求項２８】
該プロセスがデジタルコンピュータにより行なわれるものである、請求項１８又は請求項２５記載のプロセス。
【請求項２９】
請求項１記載のオリゴヌクレオチドプローブの集合を設計するために標的配列の集合を同定するためのコンピュータ・プログラム産物であって、該標的ポリヌクレオチドに対応する配列を同定する一つ以上の核酸配列データベース及び／又は核酸配列情報における標的ポリヌクレオチドの配列を入力として受け取るコード、標的ポリヌクレオチド内の潜在的標的配列を同定するコード、個々の標的ポリヌクレオチド内に見出される可能性のある標的配列の存在又は不存在を登録するデータベースを作成するコード、異なる標的ポリヌクレオチドの間で共有される標的配列を同定するコード、特定の標的ポリヌクレオチドに固有の標的配列を同定する任意選択的なコード、相補的なオリゴヌクレオチドプローブにハイブリダイズされる場合異なる標的ポリヌクレオチドの間の識別を促進する標的配列の組み合わせを同定するために標的配列の全ての可能な組み合わせ又は組み合わせの数を評価するコード、及びこれらのコードを記憶するコンピュータ読み取り可能媒体、を含むコンピュータ・プログラム産物。
【請求項３０】
標的配列の間の実質的に同一の又は保存された配列を同定するコード及び該実質的に同一の標的配列の重複配列変異型を同定するコードであって該重複配列変異型が標的配列として登録されるものであるコードをさらに含む、請求項２９記載のコンピュータ・プログラム産物。
【請求項３１】
請求項１記載のオリゴヌクレオチドプローブの集合を用いるハイブリダイゼーションデータを処理するためのコンピュータ・プログラム産物であって、個々の標的ポリヌクレオチドについて、そのプローブが該ポリヌクレオチドの特異的検出を促進するオリゴヌクレオチド・アレイにおける地点の組み合わせを同定するコード、該アレイ中の試料ポリヌクレオチドとオリゴヌクレオチドプローブの間のハイブリダイゼーション反応から得られるハイブリダイゼーションデータを入力として受け取るコード、標的配列の予め定められた組み合わせ又は予め定められた集合のいずれかと合致するハイブリダイゼーション・パターンを検索することにより該試料ポリヌクレオチドが標的ポリヌクレオチドを含むかどうかを決定するためにハイブリダイゼーションデータを処理するコード、及びこれらのコードを記憶するコンピュータ読み取り可能媒体を含むコンピュータ・プログラム産物。
【請求項３２】
オリゴヌクレオチド・アレイのの各地点のオリゴヌクレオチド・プローブの配列を入力として受け取るコード及び標的ポリヌクレオチドにおける標的配列の存在又は不存在に関する情報を含むデータベースを入力として受け取るコードをさらに含む、請求項３１記載のコンピュータ・プログラム産物。
【請求項３３】
標的ポリヌクレオチドの存在を示すハイブリダイゼーションのパターンを検出した確率を演繹するコードをさらに含む、請求項３１記載のコンピュータ・プログラム産物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明は一般的に核酸の分析及び検出のための新規な手段及び方法に関する。より具体的には、本発明はオリゴヌクレオチド・プローブの集合であって、組合わせた二つ以上のプローブが標的のポリヌクレオチドを特異的に検出でき、プローブの異なる組合わせが異なる標的ポリヌクレオチドを検出し識別するための特異性を付与するものであるプローブの集合に関する。本発明は、デジタル・コンピュータを用いて実施されるのが好ましい遺伝子配列分析のためにこのようなオリゴヌクレオチド・プローブの組合わせを設計する方法、並びにこのようなプローブの組合わせを用いた試験結果を解釈する方法にも関する。
【０００２】
発明の背景
現代社会は、病気の診断、理解及び制御、隔離制御並びに工業プロセスなどを含む全範囲の重要な理由のため生物又はそれらの一部の正確な同定を必要としている。核酸ハイブリダイゼーションに基づく技術は、特定の生物又は遺伝的に近縁の生物群の遺伝物質（ＤＮＡ又はＲＮＡ）を同定又は定量する能力において並ぶものがない。ＤＮＡ微細加工配置（ｍｉｃｒｏｆａｂｒｉｃａｔｅｄ ａｒｒａｙ）（マイクロアレイ）などの多重（平行）検定の提供により、今やこの種の遺伝子に基づく分析の速度及び特異性において「１０倍もの」増大が認められる。例えば、サザン（ＷＯ８９／１０９７７；米国特許第６，０４５，２７０号）、チーら（米国特許第５，８３７，８３２号）、カントルら（米国特許第６，００７，９８７号）及びフォドールら（米国特許第５，８７１，９２８号）が参照されうる。類似の多重アレイはマイクロビーズを用いて得られ、それらの検定はフローサイトメトリー（カイ・エイチら、２０００、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ６６： １３５−４３（前記個所の誤植６９：３９５））により得られる。
【０００３】
最近まで核酸ハイブリダイゼーションに用いられる核酸プローブは標的の生物（単数又は複数）又は遺伝子（単数又は複数）に由来したＤＮＡ又はＲＮＡの断片を単離することにより主に経験的に得られていた。しかしながら、現在、国際的な配列データベース（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ及びＥＭＢＬのデータベース）から得られるデータを用いて核酸プローブを設計及び合成することが可能である。既知遺伝子配列のこれらのデータベースは、長い間５年毎にサイズが１０倍に増加し、今ではほとんどの遺伝子及びほとんどの主要な生物群の代表的な試料を含んでいる。
【０００４】
一般的に、ＤＮＡマイクロアレイは、固体支持体（通常ガラスウエハー）上のアレイに配置された検出用のオリゴヌクレオチド即ちプローブの点を用いる。該プローブは、標的核酸を含み且つ蛍光標識された試料核酸とハイブリダイズさせられる。該プローブ及び該試料の標的核酸は、該プローブと該標的核酸との間の正確な又はほとんど正確な相補性のみを検出する条件下でハイブリダイズさせられる。標的核酸が該アレイ中の特定のプローブに相補しハイブリダイズする場合、該点は蛍光を発する。該点の蛍光を記録することにより、どの標的配列が該核酸混合物中に存在するかを判断できる。
【０００５】
天然のＲＮＡ又はＤＮＡの分子から得られた配列情報は合成オリゴヌクレオチド・プローブの配列を決定するために用いられ、この情報は通常コンピュータのデータベースに保存されソフトウェアを用いて操作される。個々のプローブは、既知の天然ヌクレオチド配列の一部又は該配列の一部の相補配列に対合する順序（配列）でヌクレオチドを含むように合成される。従来のアレイで用いられるオリゴヌクレオチド・プローブは通常１０〜２５ヌクレオチド長である。本発明の目的上、並びに以下でより十分に論じられるように、検定又は試験で同定されるべき核酸分子は「標的ポリヌクレオチド」と呼ばれる。オリゴヌクレオチド・プローブの配列に対合し且つハイブリダイズするこれらのポリヌクレオチドの一部又はセグメントは「標的配列」と呼ばれる。この用語はコンピュータのデータファイル又は何らかの他の読み取り可能形式で表されるような配列もその範囲内で含む。
【０００６】
現在、オリゴヌクレオチド・プローブは、遺伝子からのｍＲＮＡ転写物を同定及び定量するためにマイクロアレイで最も一般的に使用されている。これらのマイクロアレイは通常各遺伝子配列に由来する幾つかの異なる標的配列に相当するプローブを含み、これらのプローブは通常標的に特異的であるように選択される（即ち、該プローブは唯一つの標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズする）。従って、これらのマイクロアレイは、検出するよう設計された標的ポリヌクレオチドの数より多くのプローブを含む。
【０００７】
制限酵素断片長多型（ＲＦＬＰ）分析及びポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を含む従来の核酸分析技術と比較して、ＤＮＡマイクロアレイは異なる遺伝子の発現を検出し測定する容易で迅速な手段を提供する。該アレイはよく特性決定された核酸分子の変異型を検出する（即ち、遺伝的多型及び遺伝子型を検出する）ためにも用いられてきた。しかしながら、感染病及び遺伝障害を診断するための道具としての有望性にもかかわらず、日常的な診断のためのマイクロアレイの開発は沈滞しているように思われる。これはおそらく多数の標的ポリヌクレオチドを検出しうるマイクロアレイを設計し、開発しそして生産する費用が比較的高いことによるのであろう。従って、この有望性を実現するためには新規な方法及び試薬が必要であり、本発明はこの必要性を満たすのに役立つ。本発明は以下により十分に記載するように改良された核酸分析技術を提供する。
【０００８】
発明の概要
従って、本発明の一側面において、複数の異なる標的ポリヌクレオチドを検出するためのオリゴヌクレオチド・プローブの集合であって、それぞれの標的ポリヌクレオチドが単一のポリヌクレオチド又は同類のポリヌクレオチド群に対応するものであり、該集合が異なる入り混じったプローブの収集物を含むものであり、個々の入り混じったプローブが少なくとも二つの該標的ポリヌクレオチド間で共有される標的配列にハイブリダイズできるものであり、少なくとも一つの標的ポリヌクレオチドが他の標的ポリヌクレオチド間で共有される少なくとも二つの標的配列を含むものであり、且つ、入り混じったプローブの予め定めた組合わせが該少なくとも二つの標的配列にハイブリダイズできるものであり、該予め定められた組合わせが該少なくとも一つの標的ポリヌクレオチドの検出の特異性を与えるものであるプローブの集合が提供される。
【０００９】
該オリゴヌクレオチド・プローブの集合は複数の異なる予め定められた組合わせのプローブを含み、それぞれが異なる標的ポリヌクレオチドの検出の特異性を提供することが好ましい。
【００１０】
一実施態様においては、該オリゴヌクレオチド・プローブの集合は単一の標的ポリヌクレオチドの独自の標的配列にハイブリダイズできる少なくとも一つの入り混じっていない（ｎｏｎ−ｐｒｏｍｉｓｃｕｏｕｓ）プローブをさらに含む。
【００１１】
別の一実施態様において、該オリゴヌクレオチド・プローブの集合は、二つ以上のポリヌクレオチドを異なる群に分類するピボット配列にハイブリダイズできる少なくとも一つのプローブを含む。
【００１２】
更なる別の一実施態様においては、該オリゴヌクレオチド・プローブの集合は重複（ｒｅｄｕｎｄａｎｔ）標的配列にハイブリダイズできる少なくとも一つの縮重オリゴヌクレオチド・プローブを含む。
【００１３】
別の一側面において、本発明は、上で大まかに記載したオリゴヌクレオチド・プローブの集合を用いて複数の異なる標的ポリヌクレオチドを検出する方法であって、
厳格なハイブリダイゼーション条件下で一つ以上の該標的ポリヌクレオチドを含む疑いのある試験試料に該プローブを曝す工程、
どのプローブが該試験試料中のポリヌクレオチドにハイブリダイズしたかを検出する工程、及び
該ハイブリダイゼーションのデータを処理して、該予め定められた組合わせのプローブのいずれが該ポリヌクレオチドにハイブリダイズしたかを決定することにより該試験試料が該標的ポリヌクレオチドのいずれかを含むか否かを決定する工程、
を含む方法を提供する。
【００１４】
該方法は、該試験試料中の該標的ポリヌクレオチドのいずれかが表現型を決定する標的ポリヌクレオチドに対応するか否かを分析する工程をさらに含むことが好ましい。
【００１５】
該方法は、該試験試料中に存在する表現型を決定する標的ポリヌクレオチド（単数又は複数）に基づいて、該試験試料を採取した患者の表現型を診断する工程をさらに含むことが好ましい。
【００１６】
好ましい一実施態様においては、処理の工程はプログラム可能なデジタル・コンピュータにより実施される。
【００１７】
更なる別の一側面において、本発明は、上で大まかに記載したプローブの集合を用いてポリヌクレオチド・ファミリーの未知の構成員又は特性決定されていない構成員を検出する方法であって、
厳格なハイブリダイゼーション条件下で試験試料に該プローブを曝す工程、
該試験試料においてどのプローブがポリヌクレオチドにハイブリダイズしたかを検出する工程、及び
該ハイブリダイゼーションのデータを処理して、どの組合わせのプローブが該試験試料のポリヌクレオチドにハイブリダイズしたか、そして該組合わせのいずれが既知の標的配列にハイブリダイズするプローブの少なくとも一つの予め定められた組合わせと異なるか否かを決定する工程であって、異なる組合わせのオリゴヌクレオチド・プローブの存在が該未知の構成員又は特性決定されていない構成員の存在を示すものである工程、
を含む方法を提供する。
【００１８】
オリゴヌクレオチド・プローブの該異なる組み合わせは、予め定められた集団に属する仮定上の予め定められたプローブ組合わせに対応することが好ましい。
【００１９】
該仮定上の予め定められたプローブ組合わせは重複標的配列にハイブリダイズできる少なくとも一つの縮重オリゴヌクレオチド・プローブを含むことが好ましい。
【００２０】
本発明の更なる一側面では、上で大まかに記載したオリゴヌクレオチド・プローブの集合を設計するために複数の既知の標的ポリヌクレオチドから標的配列の集合を同定するプロセスであって、
二つ以上の該標的ポリヌクレオチド間で共有される同一の標的配列を探すために複数の標的ポリヌクレオチドの配列を含む核酸配列データベースを検索し、それにより共有される標的配列の部分集合を得る工程、及び
相補的な又は実質的に相補的なオリゴヌクレオチド・プローブによりハイブリダイズされる場合に該標的ポリヌクレオチドの特異的検出を容易にする該部分集合から、個々の標的ポリヌクレオチドについての標的配列の組合わせを決定する工程
を含むプロセスが提供される。
【００２１】
好ましい実施態様においては、該プロセス下記の工程、
該部分集合から該標的配列を選別し二つ以上のポリヌクレオチドを異なる群に分類するピボット配列を得る工程
をさらに含む。
【００２２】
該プロセスは、
異なる組み合わせで異なる該標的ポリヌクレオチドの間を識別する最小数又は最小に近い数の入り混じったオリゴヌクレオチド・プローブを決定する工程をさらに含むことが好ましい。
【００２３】
代替的一実施態様においては、該プロセスは、
個々の標的ポリヌクレオチドに特有の配列についてデータベースを検索することにより独自の標的配列の部分集合を得る工程、及び
個々の標的ポリヌクレオチドについて、該独自の部分集合から標的配列を決定する工程、又は相補的な若しくは実質的に相補的なオリゴヌクレオチド・プローブ（単数又は複数）によりハイブリダイズされる場合、該標的ポリヌクレオチドの特異的検出を容易にする該共有される部分集合及び／又はは該独自の部分集合から標的配列の組合わせを決定する工程
を含むことが好ましい。
【００２４】
該プロセスは、
異なる組み合わせで、一つ以上の入り混じっていないプローブとともに、異なる該標的ポリヌクレオチドの間を識別する最小数又は最小に近い数の入り混じったプローブを決定する工程をさらに含むことが好ましい。
【００２５】
別の一実施態様において、該プロセスは、
同類の標的ポリヌクレオチド間で実質的に同一な又は保存されている標的配列についてデータベースを検索する工程、及び
該標的配列の潜在的な配列変異型に対応する重複配列を推定することにより、潜在的に未知の又は特性決定されていない標的ポリヌクレオチドに対応する重複標的配列の部分集合を得る工程、及び
個々の標的ポリヌクレオチドについて、該重複する部分集合から標的配列を決定する工程、又は相補的な若しくは実質的に相補的なオリゴヌクレオチド・プローブ（単数又は複数）によりハイブリダイズされる場合、該標的ポリヌクレオチドの特異的検出を容易にする該共有された部分集合及び／又は該重複する部分集合から標的配列の組合わせを決定する工程
を含むことが好ましい。
【００２６】
該プロセスは、
一つ以上の該部分集合から標的配列を選別しそれらの相補的な又は実質的に相補的なオリゴヌクレオチド・プローブに対して実質的に類似の親和性をもつ標的配列を得る工程
を含むことが好ましい。
【００２７】
該プロセスは、
該重複部分集合から、該共有部分集合から、及び任意選択的に該独自の部分集合から該標的配列を選別しそれらの相補的な又は実質的に相補的な入り混じった又は入り混じっていないオリゴヌクレオチド・プローブに対して実質的に類似の親和性をもつ標的配列を得る工程
を含むことが好ましい。
【００２８】
該プロセスはデジタル・コンピュータにより実施されることが好ましい。
【００２９】
更なる別の一側面においては、本発明は、上で大まかに記載したオリゴヌクレオチド・プローブの集合を設計すべく標的配列の集合を同定するためのコンピュータ・プログラム産物を提供する。該産物は、該標的ポリヌクレオチドに対応する配列を同定する一つ以上の核酸配列のデータベース及び／又は情報から標的ポリヌクレオチドの配列を入力として受信するコード、該標的ポリヌクレオチド内の潜在的な標的配列を同定するコード、異なる標的ポリヌクレオチド間で共有される標的配列を同定するコード、特異的な標的ポリヌクレオチドに特有の標的配列を同定する任意選択的なコード、相補的なオリゴヌクレオチド・プローブによりハイブリダイズされる場合、異なる標的ポリヌクレオチド間の識別を容易にする標的配列の組合わせを同定するために標的配列のあらゆる可能な組合わせ又は幾つかの組合わせを評価するコード、並びにこれらのコードを保存するコンピュータ読み取り可能媒体を含む。
【００３０】
該コンピュータ・プログラム産物は、個々の標的ポリヌクレオチド内に見出される可能な標的配列の存在又は非存在を登録するデータベースを作成するコードをさらに含むことが好ましい。
【００３１】
該コンピュータ・プログラム産物は、該標的配列間で実質的に同一な又は保存されている配列を同定するコード並びに該実質的に同一な標的配列の重複配列変異型（この重複配列変異型は標的配列として登録されている）を同定するコードをさらに含むことが好ましい。
【００３２】
更なる別の一側面において、本発明はハイブリダイゼーション・データを処理するためのコンピュータ・プログラム産物であって、個々の標的ポリヌクレオチドについてオリゴヌクレオチド・アレイの地点（ｆｅａｔｕｒｅｓ） の組合わせを同定するコード（該アレイのプローブは該ポリヌクレオチドの特異的検出を容易にする）、該アレイにおける試料ポリヌクレオチドと該オリゴヌクレオチド・プローブの間のハイブリダイゼーション反応からのハイブリダイゼーション・データを入力として受信するコード、標的配列の予め定めた組合わせ又は予め定めた集団のいずれかに合致するハイブリダイゼーション様式について検索することにより該試料ポリヌクレオチドが該標的ポリヌクレオチドのいずれを含むかを決定するために該ハイブリダイゼーション・データを処理するコード、並びにこれらのコードを保存するコンピュータ読み取り可能媒体、を含むコンピュータ・プログラム産物を提供する。
【００３３】
該コンピュータ・プログラム産物は、オリゴヌクレオチド・アレイの各地点におけるオリゴヌクレオチド・プローブの配列を入力として受信するコード並びに標的ポリヌクレオチドにおける標的配列の存在又は非存在についての情報を含むデータベースを入力として受信するコードを含むことが好ましい。
【００３４】
該コンピュータ・プログラム産物は、検出されたハイブリダイゼーションの様式が標的ポリヌクレオチドの存在を示す確率を演繹するコードをさらに含むことが好ましい。
【００３５】
【表Ａ】
2004504068.tif 000002
【００３６】
【表Ａ−１】
2004504068.tif 000003
【００３７】
発明の詳細な説明
１．定義
他に定義されない限り、本明細書で用いられる全ての技術用語及び科学用語は本発明が属する分野で通常の技術を有する者に通常理解されているのと同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと類似の又は等価なあらゆる方法及び材料が本発明の実施又は試験に用いられ得るが、好ましい方法及び材料が記載される。本発明の目的上、下記の用語が以下に定義される。
【００３８】
冠詞の「ａ」及び「ａｎ」は、該冠詞の文法上の目的語の一つ又は二つ以上（即ち、少なくとも一つ）を指すために本明細書で用いられる。一例として、「元素（ａｎ ｅｌｅｍｅｎｔ）」は一つの元素又は二つ以上の元素を意味する。
【００３９】
「相補的」という用語は、オリゴヌクレオチド・プローブ及びその標的オリゴヌクレオチド（より大きなポリヌクレオチドの一部でありうる）の相互作用面の位相能力即ち共に適合することを指す。従って、該標的とそのプローブは相補的であると記載できる。さらに、該接触面の特徴は互いに相補的である。相補的とは、遺伝コードにおいてＡがＴ又はＵに相補的であり、そしてＣがＧに相補的であるなどの塩基相補性を含む。しかしながら、本発明は、ある種の転移ＲＮＡ分子で同定され三重らせんに存在すると仮定されているフーグスティーン型塩基対合などの非伝統的な塩基対合が存在する状況も包含する。「相補的」という用語の定義の文脈において、本明細書で用いられる「適合」及び「不適合」という用語は相補的な核酸鎖における対にされたヌクレオチドのハイブリダイゼーション能力を指す。上記の伝統的なＡ−Ｔ及びＧ−Ｃの塩基対などの適合したヌクレオチドは効率的にハイブリダイズする。不適合は非効率的にハイブリダイズするヌクレオチドの他の組合わせである。
【００４０】
本明細書を通して、文脈が他の意味を要しない限り、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」及び「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という単語は、明記した工程若しくは要素又は工程若しくは要素の群の包含を意味するが、任意の他の工程若しくは要素又は工程若しくは要素の群の排除を意味するわけではないと理解される。
【００４１】
「縮重オリゴヌクレオチド・プローブ」という用語は実質的に類似の配列を有するプローブの集合を指し、そのいくつかは既知の、好ましくは保存された標的配列と適合し、そのいくつかは同じ既知の標的配列と類似であるが同一ではない。これらの後者の標的配列は本明細書で定義される重複標的配列に相当する。重複標的配列を認識するオリゴヌクレオチド・プローブは、少なくとも二つの既知の標的配列に存在するが一つの配列に一緒に存在しない配列変異型を含む。即ち、該プローブは一つのヌクレオチドの位置でこれらの配列の一つに適合するが別の一つのヌクレオチドの位置で少なくとも一つの他の既知の標的配列に適合しない。従って、これらのプローブの集合は、まだ報告されていないが天然に存在しそうな既知の配列変異型の潜在的な順列を含む。
【００４２】
「地点（ｆｅａｔｕｒｅ）」という用語は、実質的に同じ配列の表面固定されたオリゴヌクレオチド・プローブの集合を有する基板の一区域を指す。一般的に、異なる地点のプローブが実質的に異なるヌクレオチド配列を有する場合、一つの地点は他の地点と異なる。光誘導される（ｌｉｇｈｔ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ）オリゴヌクレオチド合成の文脈において、例えば、地点は、例えば米国特許第５，３８４，２６１号；第５，１４３，８５４号；第５，１５０，２７０号；第５，５９３，１３９号；第５，６３４，７３４号及びＷＯ９５／１１９９５に開示されているような、空間的にアドレス可能な合成部位である。
【００４３】
「遺伝子」とは、特定の遺伝子座にあるゲノム核酸配列を意味する。
【００４４】
「遺伝子ファミリー」又は「ポリヌクレオチドのファミリー」という用語は、例えば適切なモンテ・カルロ・シャッフリング試験（ハンター及びカーニー、１９８３、Ｂｉｏｌ Ｃｙｂｅｒｎ ４７（２）： １４１−１４６）により決定されるような統計学的に有意な配列相同性を有するポリヌクレオチド若しくは遺伝子又はそれらがコードするポリペプチドの集合を指す。このような集合は、近縁だが別個の系統による又は遺伝子重複による又は遺伝子の水平移動若しくは同等の組換え工程及びその後の進化による遺伝子継承の結果として共通の先祖を通して関連している。このような集合は、異なる遺伝子型若しくは株の細菌若しくはウイルスの種又は一つの属に属する異なる細菌若しくはウイルスの種などの近縁の病原体から得られる核酸種を含む。このような集合は関連するドメインをコードする領域を共有する遺伝子も含む。例えばＡＴＰアーゼ・ドメイン、カドヘリン様ドメイン、ＥＧＦドメイン、免疫グロブリン・ドメイン、及びＩＩ型フィブロネクチン・ドメインを含むドメインをコードする多数の共有配列が当分野で知られている。この点について、アール・エフ・ドゥーリトル（１９９５、Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ６４： ２８７−３１４）が参照されうる。遺伝子ファミリーは、しばしば保存領域を共有するポリペプチドをコードするが、ホメオボックス及びチモボックス（ｔｙｍｏｂｏｘ）の領域など、他のポリヌクレオチドと相互作用するＲＮＡをコードする保存領域、及びタンパク質と相互作用する領域も含みうる。保存領域は、現時点ではその機能が知られていないイントロン配列及びゲノム領域における保存領域に及びうる。一例として、ポリペプチドが１０個のアミノ酸の比較窓の上で少なくとも６０％の配列同一性を有する場合、又は該ポリペプチドが少なくとも５個のアミノ酸の比較窓の上で少なくとも８０％の配列同一性を共有する場合、該ポリペプチドは高度に保存された領域を共有する。
【００４５】
「高密度ポリヌクレオチド・アレイ」等とは、１ｃｍ２ 当たり少なくとも４００個の異なる地点を含むアレイを意味する。
【００４６】
「高識別ハイブリダイゼーション条件」という語句は一塩基の不適合が認識されうるハイブリダイゼーション条件を指す。
【００４７】
「〜に特異的にハイブリダイズする」等の語句は、該配列が複雑な混合物（例えば全細胞）のＤＮＡ又はＲＮＡ中に存在する場合、ある分子が厳格条件下で特定のヌクレオチド配列にのみ結合し、二本鎖を形成し、又はハイブリダイズすることを指す。
【００４８】
「最少数のプローブ」とは、Ｘ＝ｌｏｇ２ Ｙ（Ｘがプローブの数であり且つＹが該プローブにより識別される標的ポリヌクレオチドの数である）の式により表されるプローブの理論的最少数を意味する。
【００４９】
「最小に近い数のプローブ」とは、標的ポリヌクレオチドの数より少ないがプローブの最小数より多いプローブの数を意味する。プローブの最小に近い数は標的ポリヌクレオチドの数の５０％未満であることが好ましいが、４０％未満、３０％未満、２０％未満、１０％未満、又は５％未満であることがより好ましい。
【００５０】
「〜から得られた」とは、例えばポリヌクレオチド抽出物などの試料が該宿主の特定源から単離され又は由来することを意味する。例えば、該抽出物は該宿主から直接単離される組織又は体液から得られ得る。
【００５１】
本明細書で用いられる「オリゴヌクレオチド」という用語はホスホジエステル結合を介して連結される非常に多数のヌクレオチド残基（デオキシリボヌクレオチド若しくはリボヌクレオチド、又はそれらの関連する構造変異型若しくは合成類似体）から成る重合体、又は「施錠（ｌｏｃｋｅｄ）核酸」など（例えば該リボース環に付加した余分な２’−Ｏ，４’−Ｃ−メチレン架橋をもつコンフォメーション上制限されたヌクレオチド類似体、クリステンセン，Ｕら、２００１、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ ３５４：４８１−４）のそれらの関連する構造変異型若しくは合成類似体を指す。従って、「オリゴヌクレオチド」という用語は通常それらの間の該ヌクレオチドの残基及び連結が天然に存在するヌクレオチド重合体を指す一方で、該用語がその範囲内でペプチド核酸（ＰＮＡ）、ホスホルアミデート、ホスホロチオエート、メチルホスホン酸塩、２−Ｏ−メチルリボ核酸等を含む（しかし、これらに限定されない）種々の類似体も含むことが理解されよう。該分子の正確な大きさは具体的な適用に応じて変化し得る。オリゴヌクレオチドは通常長さがかなり短く、一般に約８から３０のヌクレオチドであり、より好ましくは約１０から２０のヌクレオチドであり、さらにより好ましくは約１１から１７のヌクレオチドであるが、この用語は任意の長さの分子を指すこともできるが、「ポリヌクレオチド」又は「核酸」という用語が通常巨大なオリゴヌクレオチドについて用いられる。オリゴヌクレオチドは、例えばナラングら（１９７９、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． ６８ ９０）及び米国特許第４，３５６，２７０号による論文に記載されたホスホトリエステル方法などの任意の適切な方法を用いて調製されうる。または、ブラウンら（１９７９， Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． ６８ １０９）に記載されたホスホジエステル方法がこのような調製に用いられうる。上記方法の自動化された実施態様も用いられうる。例えば、このような自動化された実施態様の一つにおいては、ジエチルホスホルアミダイトが開始物質として用いられボーケイジら（１９８１、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ ２２ １８５９−１８６２）により記載されたように合成されうる。改良された固体支持体上でオリゴヌクレオチドを合成する方法について言及する米国特許の第４，４５８，０６６号及び第４，５００，７０７号も参照されうる。生物起源から単離されたプライマー（プラスミド又はファージＤＮＡの制限エンドヌクレアーゼ消化の変性鎖など）を使用することも可能である。好ましい実施態様では、該オリゴヌクレオチドは米国特許第５，４２４，１８６号（フォドルら）に開示された方法に従って合成される。この方法は石版技術を用いて基板表面上の正確に知られている位置で複数の異なるオリゴヌクレオチドを合成する。
【００５２】
「オリゴヌクレオチド・アレイ」という用語は、その表面と結びついた不連続な既知の位置に置かれた異なる既知配列をもつオリゴヌクレオチド・プローブを有する基板を指す。例えば、該基板は米国特許第５，４２４，１８６号に記載されるように二次元基板の形態であり得る。このような基板は二次元で且つ空間的にアドレス指定されたオリゴヌクレオチド（行列）アレイを合成するために用いられうる。または、該基板は、二次元の平らなシートが巻かれて三次元の管状のコンフィギュレーションになる管状アレイを形成する点で特徴づけられうる。該基板は、例えばＷＯ００／３９５８７でチーらにより開示されたように、光ファイバーの表面に接続された微小球又はビーズの形態であってもよい。オリゴヌクレオチド・アレイは少なくとも二つの異なる地点を有し、そして１ｃｍ２ 当たり少なくとも４００地点の密度を有する。ある実施態様において、該アレイは、１ ｃｍ２当たり約５００、少なくとも１０００、少なくとも１０，０００、少なくとも１００，０００、少なくとも１，０００，０００又は少なくとも１０，０００，０００の地点の密度を有し得る。例えば、該基板はシリコン又はガラスであってもよく、顕微鏡のスライドガラス又はガラスカバー片の厚さを有することができ、又は他の合成重合体から構成してもよい。光に透明な基板は、該基板上で検定を実施する方法が光学的検出を伴う場合に有用である。該用語はプローブ・アレイを指し、そして該アレイが付着し且つウエハーの一部を形成する基板も指す。
【００５３】
「患者」という用語は、ヒトを含む任意の動物起源の患者を指し、本発明の方法を用いて試験又は治療することが望まれる任意の個体を含む。しかしながら、「患者」は症状が存在することを示すものではないことが理解されよう。
【００５４】
「表現型を決定する標的ポリヌクレオチド」とは、病気又は状態（しかし、これらに限定されない）を含む生物の特定の表現型に関連する標的ポリヌクレオチドを意味する。
【００５５】
「ピボット配列」という用語は、二つ以上の標的ポリヌクレオチドに存在するが全ての標的ポリヌクレオチドに存在しない標的配列を指すために本明細書で用いられる。ピボット配列は約２０％から約８０％の標的ポリヌクレオチドに存在することが好ましく、選択された標的ポリヌクレオチドの約３０％から約７０％に存在することがより好ましく、約４０％から約６０％に存在することがより好ましく、約４５％から約５５％に存在することがさらに好ましい。
【００５６】
「予め定められた集団」という用語は、オリゴヌクレオチド・プローブの二つ以上の予め定められた集合に属する構成員から構成されるオリゴヌクレオチド・プローブの集合を指す。上文中、これらの予め定められた集合から得られるオリゴヌクレオチド・プローブは、関連する標的ポリヌクレオチドのファミリー又は群に少なくとも実質的に相補的であり、従ってそれらとハイブリダイズすることが予想されるであろう。例えば、標的ポリヌクレオチドの存在は幾つかの予め定められた集合から得られるオリゴヌクレオチド・プローブとのハイブリダイゼーションにより明らかにされうるが、個々の集合のどのオリゴヌクレオチド・プローブに対して該標的ポリヌクレオチドがハイブリダイズするかは事前に分からないかもしれない。予め定められた集団は本明細書で定義されるように縮重オリゴヌクレオチド・プローブを含むことが好ましい。
【００５７】
「予め定められた組合わせ」という用語は、単一の標的ポリヌクレオチドの標的配列に少なくとも実質的に相補的であり又は該配列とハイブリダイズすることが予想されるであろうオリゴヌクレオチド・プローブの組合わせを指す。予め定められた組合わせのプローブにより認識される標的配列は既知の標的配列又は少なくとも一つの既知の標的配列の潜在的な若しくは仮定上の組合わせ及び本明細書で定義される少なくとも一つの重複標的配列を包含する。標的配列のこのような潜在的な組合わせは以下の明細書で説明されるように予め定められた集団に属するオリゴヌクレオチド・プローブにより認識され得る。
【００５８】
「プローブ」とは、他の核酸分子の特定の標的配列又は他の部分に結合するオリゴヌクレオチド分子を指す。特に断らない限り、本発明の文脈における「プローブ」という用語は通常相補的な塩基対合を介して、しばしば「標的ポリヌクレオチド」と呼ばれる他のオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドに結合するオリゴヌクレオチドのプローブを指す。プローブは、ハイブリダイゼーション条件の厳格性に応じて、該プローブとの完全な配列相補性を欠く標的ポリヌクレオチドに結合し得る。オリゴヌクレオチド・プローブは本明細書で定義される標的配列と「実質的に相補的」であるように選択されうる。該オリゴヌクレオチド・プローブの正確な長さは温度及びプローブの起源及び該方法の使用を含む多数の因子に依存する。例えば、該標的配列の複雑性に応じて、該オリゴヌクレオチド・プローブは標的配列とハイブリダイズできる通常８から３０のヌクレオチド、より好ましくは約１０から２０のヌクレオチド、さらにより好ましくは約１１から１７のヌクレオチドを含みうるが、より多くの又はより少ない該ヌクレオチドを含みうる。
【００５９】
「重複標的配列」という用語は、実質的に同一の又は保存された標的ポリヌクレオチドから推定された仮定上の又は潜在的な標的配列を指す。従って、該推定配列は、まだ報告されていないが天然に存在しそうな既知配列の変異型の潜在的な順列に対応しうる。例えば、重複標的配列は遺伝子ファミリーの参照配列から推定されうる。この用語は、コンピュータのデータファイルで又は重複オリゴヌクレオチド・プローブの合成を誘導するために用いられうる幾つかの他の読み取り可能な形式で表されるような配列もその範囲内で含む。
【００６０】
「参照配列」とは、標的配列の選択を誘導するために用いられうる標的ポリヌクレオチドの一部又はセグメントを意味する。
【００６１】
二つ以上のポリヌクレオチド又はポリペプチドの間の配列関係を記載するために用いられる用語には「比較窓」、「配列同一性」、「配列同一性パーセント」及び「実質的な同一性」が含まれる。二つのポリヌクレオチドは（１）二つのポリヌクレオチド間で類似する配列（即ち、完全なポリヌクレオチド配列の一部のみ）、及び（２）二つの該ポリヌクレオチド間で相違する配列をそれぞれ含みうるからである。二つ（以上）のポリヌクレオチド間の配列比較は、通常、配列類似性の局部領域を同定し比較するために、「比較窓」の上で二つのポリヌクレオチドの配列を比較することにより実施される。「比較窓」とは、ある配列と参照配列を最適に整列した後、この窓でこの配列を同数の連続的な位置の参照配列と比較する、少なくとも２０個の連続的な位置、通常約２０個から約１００個、より一般的には約１００個から約１５０個の観念上のセグメントを指す。この比較窓は該二配列の最適な整列につき参照配列（付加又は欠失を含まない）と比較して約２０％未満の付加又は欠失（即ちギャップ）を含みうる。比較窓を整列するための配列の最適整列は、アルゴリズム（ウィスコンシン・ジェネティックス・ソフトウェア・パッケージ・リリース７．０、ジェネティックス・コンピュータ・グループ、５７５サイエンス・ドライブ・マディソン、ウィスコンシン州、米国のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、及びＴＦＡＳＴＡ、及びジーンモウギン，エフら、１９９８、Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｓｃｉ． ２３：４０３−５に記載のＣＬＵＳＴＡＬ）のコンピュータによる実行により、又は検査により、又は点図表及び選択された種々の方法の何れかにより作製された最良整列（即ち、該比較窓の上で最高の相同性パーセントという結果になる）を用いて、実施されうる。例えば、アルチュルら、１９９７、Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２５： ３３８９に開示されたようなプログラムのＢＬＡＳＴファミリーも参照されうる。配列分析の詳細な議論はオーズベルら、「分子生物学の最新プロトコル」、ジョン・ウィリー＆ソンズ社、１９９４−１９９８、１５章の１９．３単元に見いだすことができる。
【００６２】
本明細書で用いられる「配列同一性」という用語は、配列が比較窓の上でヌクレオチドごとの対比に基づいて又はアミノ酸ごとの対比に基づいて同一である程度を指す。従って、「配列同一性パーセント」は、比較窓の上で最適に整列された二つの配列を比較する工程、同一な核酸塩基（例えば、Ａ， Ｔ， Ｃ， Ｇ， Ｉ）又は同一なアミノ酸残基（例えば、Ａｌａ， Ｐｒｏ， Ｓｅｒ， Ｔｈｒ， Ｇｌｙ， Ｖａｌ， Ｌｅｕ， Ｉｌｅ， Ｐｈｅ， Ｔｙｒ， Ｔｒｐ， Ｌｙｓ， Ａｒｇ， Ｈｉｓ， Ａｓｐ， Ｇｌｕ， Ａｓｎ， Ｇｌｎ， Ｃｙｓ及びＭｅｔ）が両配列に生じる位置の数を決定し適合位置の数を求める工程、適合位置の数を比較窓の位置の総数（即ち窓の大きさ）で割る工程、及び該結果に１００を乗じて配列同一性パーセントを得る工程により算出される。本発明の目的上、「配列同一性」は適切な方法により算出された「適合パーセンテージ」を意味すると理解されよう。例えば、配列同一性分析は、該ソフトウェアに添付されたレファレンス・マニュアルで用いられるような標準設定を用いる該ＤＮＡＳＩＳコンピュータ・プログラム（ウィンドウズ（登録商標）用２．５版、ヒタチ・ソフトウェア・エンジニアリング社、南サンフランシスコ、カリフォルニア州、米国から入手できる）を用いて実施されうる。
【００６３】
本明細書で用いられる「厳格性（ｓｔｒｉｎｇｅｎｃｙ） 」は、ハイブリダイゼーション中の温度及びイオン強度の条件、並びにある種の有機溶媒の存在又は不存在を指す。該厳格性が高くなるほど、固定されたポリヌクレオチドと標識された標的ポリヌクレオチドとの間で観察される相補性の程度が高くなる。
【００６４】
本明細書で用いられる「厳格条件 （ｓｔｒｉｎｇｅｎｔ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ） 」は、高い割合の相補的塩基を有する、好ましくは厳密な相補性を有するポリヌクレオチドのみがハイブリダイズする温度及びイオン条件を指す。要求される厳格性は、ヌクレオチド配列依存性であり、ハイブリダイゼーションの際に存在する種々の成分に依存し、ヌクレオチド類似体が用いられる場合は大きく変化する。一般的に、厳格条件は確定されたイオン強度及びｐＨで特定配列の熱融解点（Ｔｍ）より約１０℃から２０℃低いものであるよう選択される。該Ｔｍは、標的配列の５０％が相補的プローブにハイブリダイズする（確定されたイオン強度及びｐＨの下での）温度である。オリゴヌクレオチド・プローブは、少なくとも低度の厳格性条件下で、好ましくは少なくとも中度の厳格性条件下で、並びにより好ましくは高度の厳格性条件下で、標的配列にハイブリダイズすることが理解される。本明細書中、低度の厳格性条件についての言及は、４２℃でのハイブリダイゼーションにおける少なくとも約１％ｖ／ｖから少なくとも約１５％ｖ／ｖまでのホルムアミド及び少なくとも約１Ｍから少なくとも約２Ｍまでの塩、且つ４２℃での洗浄工程における少なくとも約１Ｍから少なくとも約２Ｍまでの塩を含み且つ包含する。低度の厳格性条件は、６５℃でのハイブリダイゼーションにおける１％の仔牛血清アルブミン（ＢＳＡ）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５Ｍ ＮａＨＰＯ４（ｐＨ７．２）、７％ ＳＤＳ、且つ、室温での洗浄における（ｉ）２ｘＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳ、又は（ｉｉ）０．５％ ＢＳＡ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、４０ｍＭ ＮａＨＰＯ４（ｐＨ７．２）、５％ ＳＤＳをも含みうる。中度の厳格性条件は、４２℃でのハイブリダイゼーションにおける少なくとも約１６％ｖ／ｖから少なくとも約３０％ｖ／ｖまでのホルムアミド及び少なくとも約０．５Ｍから少なくとも約０．９Ｍまでの塩、且つ、４２℃での洗浄における少なくとも約０．５Ｍから少なくとも約０．９Ｍまでの塩を含み且つ包含する。中度の厳格性条件は、６５℃でのハイブリダイゼーションにおける１％の仔牛血清アルブミン（ＢＳＡ）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５Ｍ ＮａＨＰＯ４（ｐＨ７．２）、７％ ＳＤＳ、且つ、４２℃での洗浄における（ｉ）２ｘＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳ、又は（ｉｉ）０．５％ ＢＳＡ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、４０ｍＭ ＮａＨＰＯ４（ｐＨ７．２）、５％ ＳＤＳをも含みうる。高度の厳格性条件は、４２℃でのハイブリダイゼーションにおける少なくとも約３１％ｖ／ｖから少なくとも約５０％ｖ／ｖまでのホルムアミド及び少なくとも約０．０１Ｍから少なくとも約０．１５Ｍまでの塩、且つ、４２℃での洗浄における少なくとも約０．０１Ｍから少なくとも約０．１５Ｍまでの塩を含み且つ包含する。高度の厳格性条件は、６５℃でのハイブリダイゼーションにおける１％ ＢＳＡ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５Ｍ ＮａＨＰＯ４（ｐＨ７．２）、７％ ＳＤＳ、且つ、６５℃を上回る温度での洗浄における（ｉ）０．２ｘＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳ、又は（ｉｉ）０．５％ ＢＳＡ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、４０ｍＭ ＮａＨＰＯ４（ｐＨ７．２）、１％ ＳＤＳをも含みうる。他の厳格性条件は当分野で周知である。当業者はハイブリダイゼーシ��ンの特異性を最適化するために種々の因子を操作できることを認識してる。最終洗浄工程の厳格性の最適化は高度のハイブリダイゼーションを確実にするために役立ち得る。詳細な例については、オーズベルら、前出、２．１０．１から２．１０．１６頁及びサムブルックら（１９８９、前出）、１．１０１から１．１０４節を参照。
【００６５】
「実質的に相補的」とは、オリゴヌクレオチド・プローブが標的配列とハイブリダイズするために十分に相補的であることを意味する。従って、該オリゴヌクレオチド・プローブのヌクレオチド配列は該標的配列の厳密な相補的配列を反映する必要はない。好ましい実施態様においては、該オリゴヌクレオチド・プローブは該標的配列との不適合を含まない。
【００６６】
本明細書中、「実質的に類似の親和性」という語句は、選択された一式の厳格性条件下で標的配列の相補的な又は実質的に相補的なオリゴヌクレオチド・プローブに対する検出可能なハイブリダイゼーションの強度が類似である標的配列を指す。
【００６７】
「標的ポリヌクレオチド」という用語は、目的のポリヌクレオチド（例えば、単独の遺伝子若しくはポリヌクレオチド）又はポリヌクレオチド群（例えば、上述したようなポリヌクレオチドのファミリー）を指す。該標的ポリヌクレオチドはｍＲＮＡ、ＲＮＡ、ｃＲＮＡ、ｃＤＮＡ又はＤＮＡであることができる。該プローブは該標的ポリヌクレオチドが所与のプローブに対して親和性を有するか否かの該標的ポリヌクレオチドについての情報を得るために用いられる。標的ポリヌクレオチドは天然に存在する又は人工の核酸分子でありうる。また、それらは未改変の状態で又は他種との集合体として使用できる。標的ポリヌクレオチドは直接的に又は特定の結合物質を介してのいずれかで結合構成員と共有結合又は非共有結合により結合しうる。標的ポリヌクレオチドは、プローブの配列が該標的ポリヌクレオチドの部分配列と少なくとも部分的に相補的であるプローブにハイブリダイズできる。
【００６８】
「標的配列」という用語は、長さが多くとも３００、２５０、２００、１５０、１００、７５、５０、３０、２５又は多くとも１５ヌクレオチドの選択されたヌクレオチド配列を指すために本明細書で用いられる。標的配列は長さが少なくとも８、１０、１５、２５、３０、３５、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１３５、１５０、１７５、２００、２５０及び３００ヌクレオチドの配列を含む。標的配列の非限定的な例には、Ａｌｕ反復配列などの反復配列、遺伝子ファミリーの保存領域又は非保存領域、イントロン、ホグネス・ボックス及びＴＡＴＡボックスを含むプロモーター配列、シグナル配列、エンハンサー、ホメオボックス、チモボックスなどのタンパク質結合ドメイン、多型並びに保存されたタンパク質ドメイン又はそれらの一部が含まれるが、これらに限定されない。
【００６９】
２．コンビナトリアル・プローブ
生物のゲノム（即ち完全な遺伝子配列）は長さがウイロイド及びウイルスの数百ヌクレオチドから多細胞生物の数十億ヌクレオチドの範囲にわたる。しかしながら、従来のオリゴヌクレオチド・プローブは、検出目的上、通常僅か８〜３０ヌクレオチド長の配列を標的とする。従って、標的ポリヌクレオチドの検出で用いられる適切なオリゴヌクレオチド・プローブを同定するためには、標的ポリヌクレオチド配列の短いストレッチ（部分鎖又は部分配列）が検討される。これは該標的ポリヌクレオチド又は該標的ポリヌクレオチドに対応する参照配列の配列をあらゆる可能な部分配列又はこれらの長さの部分配列に変換することにより実施されうる、又は該標的ポリヌクレオチド又は参照配列の上に置かれる「窓」を用いて検討されるべき部分配列を確定することにより実施されうる。この第二の技法はより長い整列から整列された短い部分配列の集合を検討するために用いられうる。検討される部分配列の長さの範囲に応じて、幾つかの可能な部分配列は他の部分配列と重複し又は他の部分配列を含む（図１）。保存され且つ実質的に類似の又は実質的に同一の配列は周知のアルゴリズムで実行されるようなこれらの技法を用いて見出され得る。実質的に同一の又は類似の部分配列が重複して又は隣接して又は近接して見出される場合、より長い保存領域も同定されうる。
【００７０】
幾つかの部分配列は標的ポリヌクレオチドに特有である（即ち、他の標的ポリヌクレオチドに見出されない）が、一つの標的ポリヌクレオチドから得られる多数のより短い部分配列は他の標的ポリヌクレオチドにも見出される（共有部分配列）。さらに、異なる集合のこれらのより短い部分配列は異なる組み合わせの標的ポリヌクレオチド間で共有される（図２Ａ）（即ち、一つの標的ポリヌクレオチドは他の標的ポリヌクレオチドと幾つかの部分配列を共有しうるが別の集合の部分配列は第三の標的ポリヌクレオチドと共有される等々）。従って、該共有部分配列から設計されたプローブは二つ以上の標的ポリヌクレオチドとハイブリダイズし、プローブが幾つかの異なる共有部分配列から設計される場合ハイブリダイゼーションの様式は複雑となる。このような共有及び特有の部分配列は以下の明細書で説明されるように標的配列の基礎を形成する。
【００７１】
本発明は複数の標的ポリヌクレオチドを検出しこれらの間を識別するのに必要なオリゴヌクレオチド・プローブの数及び／又は大きさを減少させるための新規な戦略に一部基づいている。この戦略は、少なくとも二つの標的ポリヌクレオチド間で共有される予め定められた部分配列又は標的配列にハイブリダイズできる入り混じったプローブの集合を含む一群のオリゴヌクレオチド・プローブを用いて異なる標的ポリヌクレオチドを検出する工程を含む。
【００７２】
検出されるべき標的ポリヌクレオチドは二つ以上の標的配列を含み、これらの標的配列の少なくとも一つは一つ以上の他の標的ポリヌクレオチドと共有される。二つ以上の標的ポリヌクレオチドとハイブリダイズする個々の入り混じったプローブの乱雑性にも関わらず、特定の標的ポリヌクレオチドは少なくとも二つの入り混じったプローブのそれらへのハイブリダイゼーションを検出することにより特異的に検出され得る。その場合、異なる標的ポリヌクレオチドは該プローブの異なる組み合わせにより同定される。
【００７３】
例えば、本発明のコンビナトリアル検出は、例えば標的Ａ、Ｂ及びＣの三つの遺伝子標的を用いて最小限で実施できる。これらの遺伝子は三つの特異的なプローブを用いて同定できるであろうが、これらのプローブが二つの共有標的配列（ｘ及びｙ）の配列を用いて設計されたのであれば、これらは二つのプローブのみによっても同定できるであろう。標的配列ｘから設計されたプローブはＡと反応し、標的配列ｙから設計されたプローブはＢと反応し、両プローブはＣと反応する（図２Ｂ）。さらに、オリゴヌクレオチドが短くなるほどハイブリダイズしそうな遺伝子配列の数が大きくなる。従って、コンビナトリアル方法で用いられるプローブは特異的なプローブより短くできる。故に、効率的に設計されたコンビナトリアル・アレイは標的に特異的なプローブを用いたアレイよりもより少なく且つ通常はより短いプローブから構成される。こうして、このようなアレイの具体的な利点はそれらを生産する費用がより少ないことである。可能な節約は標的配列の集合の大きさに一部依存しており、コンビナトリアルの検出又は同定に利用できる標的配列の数がより多くなるにつれ、該標的配列の集合は大きくなり、可能な節約も大きくなるであろう。
【００７４】
プローブの集合は、任意選択的に、そのそれぞれが複数の標的ポリヌクレオチドの中の単一の又は特有の標的配列にハイブリダイズできる入り混じっていないプローブを含みうる。この実施態様では、入り混じっていないプローブ及び入り混じったプローブの組み合わせが複数の異なる標的ポリヌクレオチドの間を識別するために用いられる。従って、個々の標的ポリヌクレオチドは、少なくとも二つの入り混じったプローブ又は一個の入り混じっていないプローブのそれらへのハイブリダイゼーションを検出することにより特異的に検出できる。
【００７５】
上記のコンビナトリアル方法は、例えば類似するが変異している遺伝子の群の全ての可能な構成員を検出するために効果的なプローブの集合を設計するのに特に有用である。全ての可能な配列が特異的に同定されるべきである場合、大きなプローブの集合が必要である。しかしながら、コンビナトリアル方法が本明細書で記載するように用いられる場合、必要な特異性は、特異性のより低い（即ち交差してハイブリダズする）小集合の組み合わせ、又は入り混じったプローブを用いることにより得ることができる。
【００７６】
前記から、プローブの集合は標的ポリヌクレオチドが該集合からの少なくとも二つのプローブにハイブリダイズするよう設計できる。一実施態様において、交差反応性の即ち「入り混じった」プローブのみの異なる組み合わせが複数の標的ポリヌクレオチドの間を識別し、そして特異的に同定するために用いられる。別の一実施態様では、独自に標的配列とハイブリダイズするプローブが、入り混じったプローブと協力してこのような識別及び同定を行なうために用いられる。プローブ数の節約は該標的配列の変異性に応じて変化する。特異的なプローブの大きな集合が重複配列変異を検出するために用いられると、必要となるであろう縮重プローブの数は部分配列におけるあらゆる変異可能な部位の変異数の「積」である。対照的に、より短く特異性のより低いプローブが用いられる場合、これらは変異可能部位がより少なく、それらの数は僅かに個々の変異可能な部位について用いられるプローブ数の「和」に等しい。この分類の例は以下に説明する。
【００７７】
共有される参照配列の配列は標的ポリヌクレオチドの進化の間保存されてきたかもしれない（即ち、該標的ポリヌクレオチドは幾つかの共通の祖先を有する）又は偶然一致する配列類似性が収斂の過程を通して生じたためそれらが共有されているのかもしれない。両方のタイプの共有配列が本発明の入り混じったプローブを設計するために有用である。使用されうるであろう標的配列の別の集合は程度の差はあっても類似するものである。異なる標的ポリヌクレオチドは多数のこのような類似の標的配列を含むべきであり、ある種の条件下でプローブはほとんど同一であるが完全に同一でない配列にハイブリダイズするため、幾つかの類似の標的配列が用いられうるであろう。標的配列の選別を誘導するために有用な参照配列は、反復配列を規定するもの、遺伝子ファミリーの保存領域若しくは非保存領域、イントロン若しくはエキソン、プロモーター、シグナル配列、エンハンサー、ボックス、タンパク質結合ドメイン、多型及び保存されたタンパク質ドメイン又は目的とする他の多ヌクレオチド集団（例えばホメオボックス、チモボックスなど）を含むが、これらに限定されない。一実施態様においては、該プローブの集合はオリゴヌクレオチドの縮重集合を規定するプローブを含む。縮重プローブ集合に加えて又はその代替として、有用なプローブは、とりわけコドン部位の第三部分にイノシン、他の一般的塩基、又はＡ、Ｃ、Ｔ、Ｇの混合物を含み得る。代替的実施態様においては、参照配列は多型を規定する。この場合、プローブは個々の多型変異型の存在を探索する。
【００７８】
プローブの減少した集合を設計するコンビナトリアル方法は二つ以上のプローブを用いる任意の試験又は装置に適用されうるであろう。そして、より多くの数のプローブを用い且つ幅広い範囲の標的ポリヌクレオチドを有する試験又は装置において顕著な経済効果又は費用節約が可能になる。該方法は、一実施態様において、遺伝子発現の研究、病原体株の型決定、遺伝子型の型決定、診断、法医学、又は種若しくは遺伝子が検出、識別若しくは同定されることを要する任意の他の用途のために用いられるＤＮＡマイクロアレイの設計を改良するために用いられうるであろう。該方法は、ヌクレオチドのハイブリダイゼーションに基づくがアレイ中のプローブ若しくは固体基盤に結合したプローブを使用せずにＲＮＡオリゴヌクレオチドを使用し又は同じ目的で核酸類似体を使用する試験又は装置の設計を改良するためにも用いられうる。
【００７９】
該プローブの集合は一つ以上の固体支持体上に固定されることが好ましい。オリゴヌクレオチド・プローブは任意の適切な技術を用いて該固体支持体に固定されうる。例えば、ホルストロムら（１９９３、Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２０９： ２７８−２８３ ）はアビジン及びストレプトアビジンへのビオチンの親和性を活用してビオチン化核酸分子をアビジン／ストレプトアビジンで被覆された支持体に固定する。利用されうる他の方法は、ポリスチレン又はガラスの固相をポリＬ−Ｌｙｓ又はポリＬ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅで予め被覆した後、二官能性架橋結合試薬を用いてアミノ又はスルフヒドリルで修飾されたオリゴヌクレオチドに共有結合する工程を含む（ランニングら，１９９０，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ８： ２７６−２７７、ニュートンら，１９９３，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２１： １１５５−１１６２）。カワイら（１９９３、Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２０９： ６３−６９）は、ファージミド・ベクター中にクローニングする前に短いオリゴヌクレオチド・プローブを連結して多量体を形成させる代替的方法を記載している。次に、該オリゴヌクレオチドをポリスチレン・プレート上に固定し、２５４ｎｍでのＵＶ照射により固定する。化学的に修飾されたポリスチレン・プレート（Ｃｏｖａｌｉｎｋ （商標） プレート、ヌンク社）への短い５−リン酸化オリゴヌクレオチド・プライマーの直接的な共有結合の方法も参照されうる（ラスムッセンら、１９９１、Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． １９８： １３８−１４２）。ストレプトアビジンで被覆したシリコン・ウエハー及びヨードアセタミドで被覆されたシリコン・ウエハーにビオチン化オリゴヌクレオチド及びスルフヒドリル化オリゴヌクレオチドをそれぞれ固定する方法を開示するオコンネル−マロネイら（１９９６、ＴＩＢＴＥＣＨ １４： ４０１−４０７）による記事も関心が払われうる。また、アミノ修飾されたオリゴヌクレオチドはイソチオシアネートで被覆されたガラス（グオら、１９９４、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２２： ５４５６−５４６５）及びシラン−エポキシドで被覆されたウエハー（エッガースら、１９９４、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １７： ５１６−５２４０）の上に固定された。前述した方法はオリゴヌクレオチド・プライマーの基板への合成後付着について言及している。または、該オリゴヌクレオチド・プライマーは、例えばマスコスとサザン（１９９２、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２０ １６７９−１６８４）又はフォドルら（前出）の方法を利用してインサイツで合成されうる。該プローブの集合は核酸アレイの形式であることが好ましく、異なるが個々にアドレス可能なマイクロビーズの混合物を任意選択的に含みうる高密度核酸アレイの形であることが好ましい。
【００８０】
本発明で用いられるオリゴヌクレオチド・プローブが直接的に又は間接的に固定されうることは無論理解されよう。例えば、プローブは表面に吸着され或いはスペーサー分子に共有結合されうる。該スペーサー分子はラテックス微粒子、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）などのタンパク質又はデキストラン若しくはポリ（エチレングリコール）などの重合体を含みうる。このようなスペーサー分子はオリゴヌクレオチド・プライマーを標的ヌクレオチド配列のハイブリダイゼーションに近づきやすくすると考えられる。代わりに、該スペーサー分子は例えばオリゴｄＴなどのホモポリヌクレオチド尾部を含みうる。好ましい実施態様では、該スペーサー分子は長さが１０から２５の分子である。
【００８１】
プローブはそれらの参照配列に対する特異的なハイブリダイゼーションを最適化するように設計されうる。例えば、ドルマナックら（米国特許第５，９７２，６１９号）は、８量体のコア、及び各末端に二つの変異型をもつ外側の位置に三つの可能な変異型の一つを含むプローブを記載している。このようなプローブは５’−（Ａ，Ｔ，Ｇ，Ｃ）（Ａ，Ｔ，Ｇ，Ｃ）Ｎ８（Ａ，Ｔ，Ｇ，Ｃ）−３’として表される。この型のプローブを用いると、内部の８量体のみがプローブ配列として解読されるので、無情報の末端塩基（５’末端の二つ、及び３’末端の一つ）を識別する必要がない。
【００８２】
３．標的配列を同定する
本発明は上で大まかに定義したオリゴヌクレオチド・プローブの集合の調製用に標的配列を同定するプロセスも意図する。一実施態様においては、該プロセスは、二つ以上の標的ポリヌクレオチドの間で共有される同一の標的配列について複数の標的ポリヌクレオチドの配列を含む核酸配列データベースを検索することにより共有される標的配列（共有部分）の部分集合を得る工程を含む。該プロセスは、該配列内での全ての重なり合っている部分配列、例えば長さが８から３０のヌクレオチド、の個々のポリヌクレオチド配列における位置を記録する工程をさらに含むことが好ましい。代替的実施態様においては、該プロセスは該配列内での全ての固有の部分配列（固有部分集合）の、個々のポリヌクレオチド配列における位置を記録する工程をさらに含む。更なる別の一実施態様においては、該プロセスは該部分集合から該標的配列を分類しそれらの相補的なオリゴヌクレオチド・プローブに対して実質的に類似の親和性をもつ標的配列を得る工程をさらに含む。
【００８３】
好ましくは該部分配列データベースで同定される潜在的な標的配列は下記のものを含むが、これらに限定されない。
１．好ましくは二つ以上の標的ポリヌクレオチドを二つの集合に分けるピボット
配列であって、一つの集合は該ピボット配列が存在する標的グループの４０〜
６０％を含み、他方の集合は該ピボット配列が存在しない該ポリヌクレオチド
の残りの６０〜４０％を含む。この分類は線形計画法のダンチヒの単純アルゴリ
ズムの様式での計算実施態様を用いて為される。
２．該標的ポリヌクレオチド配列に存在し他のものには稀有であるか又は存在し
ないことにより標的グループの以外の全てからポリヌクレオチドの標的グル
ープを識別する「保存された」又は重複した配列。
【００８４】
従って、他の実施態様においては、該プロセスは、二つ以上の標的ポリヌクレオチドを複数の集合に分ける任意の標的配列の、個々のポリヌクレオチド配列における位置を記録し、こうして、ピボット配列の部分集合を規定する工程をさらに含む。更なる別の一実施態様においては、プロセスは、関連する標的ポリヌクレオチドの間で実質的に同一な又は保存されている任意の標的配列の、個々のポリヌクレオチド配列における位置を記録する工程をさらに含む。次に、このような標的配列の潜在的な配列変異型に対応する重複配列が演繹され、潜在的に未知の又は特性決定されていない標的ポリヌクレオチドに対応する重複標的配列の部分集合（重複した部分集合）を得ることができる。
【００８５】
次いで、標的配列の組み合わせが一つ以上の該共有部分集合、該重複部分集合及び該ピボット部分集合から選択され、又は単独の標的配列が個々の標的ポリヌクレオチド又は標的ポリヌクレオチドのグループを検出するために該固有部分集合から選択される。ポリヌクレオチド・ファミリーの未知の又は特性決定されていないと推定される構成員を検出する場合、標的配列の予め定められた集合が同定される。該組み合わせの少なくとも一つの構成員が重複標的配列である。未知の又は特性決定されていない構成員は、従って、少なくとも一つのプローブが重複標的配列と実質的に相補的であるオリゴヌクレオチド・プローブの予め定められた集合とハイブリダイズすることが予測されるであろう。
【００８６】
好ましい実施態様において、最小数の又は最小に近い数のオリゴヌクレオチド・プローブが決定される。該プローブは、異なる組み合わせでは、異なる標的ポリヌクレオチドの間を識別する。
【００８７】
少なくとも２、より好ましくは少なくとも１０、より好ましくは少なくとも５０、より好ましくは少なくとも１００そして更により好ましくは少なくとも１０００の異なる標的配列の組み合わせが対応する数の標的ポリヌクレオチドを特異的に検出するために決定されることが好ましい。
【００８８】
前記のことから、実質的にあらゆる可能な組み合わせに該標的ポリヌクレオチドを分類し且つ最小若しくは最小に近い長さであるピボット配列に基づくプローブの集合は、マイクロアレイを用いて標的ポリヌクレオチドを同定するための効果的なプローブを提供するために用いられ得ることが理解される。保存配列に基づくプローブの集合は、共有する祖先から受け継いだ遺伝子ファミリーの領域を表すので、分類学的情報を提供するために用いられ得る。以下の明細書でポティウイルスについて説明されるものと同様に、プローブ配列は次いでこのような分類学的分析から演繹され、選択された標的群又はポリヌクレオチドのファミリーのこれまで未知の近縁物を同定し得るプローブ・アレイの構築のための基礎を提供し得る。幾つかの標的配列がピボット群と保存群の両方に存在すること並びにこれらの共有配列のほとんどが共有配列の連続領域として認識されることも予想される。
【００８９】
実際に、最も効率的なマイクロアレイは、ピボット及び保存の両方の検索技術により同定され、配列重複性についての試験後余分なものを取除かれそして遺伝子ファミリーの有望な配列変異型を捕えるべく連続し且つ保存された領域の順列を含むように拡大されたプローブの混合物を含むことが予想される。
【００９０】
効率的なマイクロアレイは既知の標的配列のみだけでなく類似の配列も同定することも予想される。さらに、これまで未知のポリヌクレオチドがこのようなマイクロアレイにより認識され最初に特性決定されること、並びに未知のポリヌクレオチドがハイブリダイズすることが見出されるプローブ配列がポリメラーゼ連鎖反応でプライマーとして使用され、このような未知のポリヌクレオチドをさらに特性決定し同定できることが予想される。
【００９１】
４．コンピュータに関する実施態様
本発明のコンビナトリアル・プローブの集合の設計又は構築は、二つ以上の標的ポリヌクレオチドの間で共有される同一の標的配列について複数の標的ポリヌクレオチドの配列を含む核酸配列データベースを特に検索し、それにより共有標的配列の部分集合（共有部分集合）を得るソフトウェアでプログラムされたコンピュータの援助で容易にすることが好ましい。該ソフトウェアは続いて各標的ポリヌクレオチドについて該部分集合から標的配列の組み合わせを決定する。該部分集合の配列情報は該標的ポリヌクレオチドの特異的な検出を容易にし得るプローブを構築するために用いることができる。従って、別の一側面においては、本発明は、本発明のコンビナトリアル・プローブの集合の配列を設計するコンピュータであって、（ａ）複数の標的ポリヌクレオチド（例えば遺伝子データベース）を含む機械読み取り可能データでコードされたデータ記憶物質を含む機械読み取り可能データ記憶媒体、（ｂ）該機械読み取り可能データを処理するための命令を保存するためのワーキングメモリ、（ｃ）該機械読み取り可能データを処理し二つ以上の標的ポリヌクレオチド間で共有される同一の標的配列を提供するための、該ワーキングメモリ及び該機械読み取り可能データ記憶媒体と連結された中央演算処理装置、並びに（ｄ）該同一の標的配列を受信するための中央演算処理装置と連結された出力ハードウェア、を含むコンピュータを包含する。
【００９２】
好ましい実施態様において、該コンピュータは該機械読み取り可能データを処理して各標的ポリヌクレオチドについて標的配列の組み合わせを提供する。相補的な又は実質的に相補的なオリゴヌクレオチド・プローブによりハイブリダイズされる場合、該標的配列の組み合わせは該標的ポリヌクレオチドの特異的な検出を容易にする。該コンピュータは該機械読み取り可能データを処理して、該配列内における例えば長さが８から３０ヌクレオチドの全ての重なり合っている部分配列の、個々のポリヌクレオチド配列における位置も記録しうる。代わりに又はそれに加えて、該コンピュータは該機械読み取り可能データを処理して該配列内の全ての固有の部分配列（固有部分集合）の、個々のポリヌクレオチド配列における位置を記録しうる。
【００９３】
好ましい実施態様においては、該コンピュータは該機械読み取り可能データを処理して該部分集合（単数又は複数）中の該標的配列を分類しそれらの相補的なオリゴヌクレオチド・プローブに対して実質的に類似の親和性をもつ標的配列を得る。代わりに又はそれに加えて、該コンピュータは該機械読み取り可能データを処理し、二つ以上の標的ポリヌクレオチドを複数の集合に分ける任意の標的配列の、個々のポリヌクレオチド配列における位置を記録し、それにより、ピボット配列部分集合を規定する。代替実施態様においては、該コンピュータは該機械読み取り可能データを処理して類似の標的ポリヌクレオチド間で実質的に同一の又は保存されている任意の標的配列の、個々のポリヌクレオチド配列における位置を記録しうる。該コンピュータは該機械読み取り可能データを処理してこのような標的配列の潜在的な配列変異型に対応する重複配列を演繹し、潜在的に未知の又は特性決定されていない標的ポリヌクレオチドに対応する重複標的配列の部分集合（重複部分集合）を得ることもできる。
【００９４】
本発明は本発明のコンビナトリアル・プローブを設計するためのコンピュータ・プログラム産物も意図する。該産物は、一つ以上の核酸配列のデータベース及び／又は該標的ポリヌクレオチドに対応する配列を同定する情報から標的ポリヌクレオチドの配列を入力として受信するコード、該標的ポリヌクレオチド内で潜在的な標的配列を同定するコード、異なる標的ポリヌクレオチド間で共有される標的配列を同定するコード、特異的な標的ポリヌクレオチドに固有の標的配列を同定する任意選択的なコード、相補的なオリゴヌクレオチド・プローブによりハイブリダイズされる場合、異なる標的ポリヌクレオチドの間の識別を容易にする標的配列の組合わせを同定するために標的配列のあらゆる可能な組合わせ又は幾つかの組合わせを評価するコード、並びにこれらのコードを保存するコンピュータ読み取り可能媒体を含む。
【００９５】
好ましい実施態様において、該コンピュータ・プログラム産物は、個々の標的ポリヌクレオチド内に見出される可能な標的配列の存在又は不存在を登録するデータベースを作成するコードをさらに含む。更に又はこれに代わり、該コンピュータ・プログラム産物は該標的配列間で実質的に同一の又は保存されている配列を同定するコード及び該実質的に同一の標的配列の重複配列変異型を同定しそしてそれを標的配列として登録するコードをさらに含む。
【００９６】
これらの実施態様版は図９に提示される。この図は、中央演算処理装置（「ＣＰＵ」）２０、例えばＲＡＭ（ランダム・アクセス・メモリ）又は「コア」メモリであってもよいワーキングメモリ２２、大容量記憶メモリ２４（一つ以上のディスク・ドライブ若しくはＣＤ−ＲＯＭドライブなど）、一つ以上の陰極線管（「ＣＲＴ」）表示端末装置２６、一つ以上のキーボード２８、一つ以上の入力ライン３０、並びに一つ以上の出力ライン４０、これら全ては従来の双方向性システム・バス５０により相互接続されている、を含むコンピュータ１１を含むシステム１０を示す。。
【００９７】
入力ライン３０によりコンピュータ１１に連結される入力ハードウェア３６は種々の方法で実行されうる。例えば、機械読み取り可能データは電話線又は専用データ線３４により接続された単数又は複数のモデム３２の使用を介して入力されうる。代わりに又はそれに加えて、該入力ハードウェア３６はＣＤを含みうる。代わりに、表示端末装置２６と連結したＲＯＭドライブ又はディスク・ドライブ２４、キーボード２８も入力装置として用いられうる。
【００９８】
出力ライン４０によりコンピュータ１１に連結された出力ハードウェア４６は同様に従来の装置により実行されうる。例を挙げれば、出力ハードウェア４６は本明細書に記載される合成ポリヌクレオチド配列又は合成ポリペプチド配列を表示するためのＣＲＴ表示端末装置２６を含みうる。出力ハードウェアは、ハードコピーを出力できるように印刷機４２又は後の使用のためにシステム出力を記憶するディスク・ドライブ２４も含みうる。
【００９９】
作動中、ＣＰＵ２０は、種々の入力装置３６及び出力装置４６の使用と連係し、大容量記憶２４からのデータ・アクセス及びワーキングメモリ２２への及び該メモリ２２からのアクセスと連係し、並びにデータ処理工程の順序を決定する。幾つかのプログラムを本発明の機械読み取り可能データを処理するために用いうる。典型的なプログラムは例えば図１０で説明される流れ図で概説される工程を用いうる。大まかには、これらの工程は（１）同定されるべき実体群（例えば生物群、類似するポリヌクレオチドのファミリーなど）を選択する工程、（２）該実体について配列データをコンパイルする工程、（３）該実体間で共有される標的配列を同定し共有配列の部分集合を提供する工程、（４）該群の構成員を検出し識別するためのプローブとして使用できる潜在的なオリゴヌクレオチド配列（オリゴ）を導き出す工程、（５）一次の「分類群Ｘオリゴ」行列を作成する工程、（６）高次の「分類群対−オリゴ」行列を演繹する工程、（７）「貪欲な戦略」を用いてオリゴの「最小集合・カバー」を同定する工程、（８）工程（７）のオリゴから同一プローブの重複集合を同定する工程、及び（９）該プローブの識別力を評価する工程を含む。
【０１００】
図１１は、本発明のプローブの集合を設計するための機械読み取り可能データ又は命令の集合でコードされ得る磁気データ記憶媒体１００の断面を示す。それは図９のシステム１０などのシステムにより実行され得る。媒体１００は、従来型であってもよい適切な基盤１０１及び片面若しくは両面に従来型であってもよい適切な被膜１０２を有し且つその極性若しくは方向性が磁気で変化し得る磁気ドメイン（可視でない）を含む従来型のフロッピーディスク（登録商標）又はハードディスクであり得る。媒体１００はディスク・ドライブ又は他のデータ記憶装置２４の軸を受けるための開口部（示していない）持っていてもよい。媒体１００の被膜１０２の磁気ドメインは、図９のシステム１０などのシステムによる実行のため従来型であってもよい様式で本明細書に記載されるものなどの機械読み取り可能データをコードするよう分極され又は方向付けされる。
【０１０１】
図１２は、本発明の合成分子を設計するために、このような機械読み取り可能データ又は命令の集合でもコードされ得る光学的読み取り可能データ記憶媒体１１０の断面を示す。それは図９のシステム１０などのシステムにより実行され得る。媒体１１０は、従来式のコンパクトディスク読取り専用メモリ（ＣＤ−ＲＯＭ）又は光学的に読取り可能であり且つ光磁気的に書き込み可能である光磁気ディスクなどの書換可能媒体でありうる。媒体１００は、従来型であってもよい適切な基盤１１１及び通常基盤１１１の片面に従来型であってもよい適切な被膜１１２を有することが好ましい。
【０１０２】
ＣＤ−ＲＯＭの場合、周知のように、被膜１１２は反射性であり、該機械読み取り可能データをコードするために複数のピット１１３で印加されている。ピットの配置は被膜１１２の表面にレーザー光線を反射させることにより読み取られる。実質的に透明であることが好ましい保護用被膜１１４を被膜１１２の表面に被せる。
【０１０３】
光磁気ディスクの場合、周知のように、被膜１１２は、ピット１１３を有さないが、レーザー（示していない）によりある温度を上回って加熱されるとその極性又は方向性が磁気的に変化し得る複数の磁気ドメインを有する。該ドメインの方向性は被膜１１２から反射されるレーザー光線の偏光を測定することにより読み取ることができる。該ドメインの配置が上述したように該データをコードする。
【０１０４】
５．スクリーニング方法
本発明は上で大まかに記載したようにプローブの集合を用いて複数の異なる標的ポリヌクレオチドを検出する方法をも提供する。該方法は特異的なハイブリダイゼーションに有利に働く条件下で一つ以上の該標的ポリヌクレオチドを含む疑いのある試験試料に該プローブを接触させる工程を含む。該方法で用いられうる適切な試験試料は、古細菌、真核細菌又は真核生物の起源から得られる二本鎖又は一本鎖の核酸の抽出物を含みうる。例えば、このような抽出物は植物、菌類、細菌又は動物に由来する細胞、組織又は材料並びにウイルス、サテライト・ウイルス、ウイロイド及び類似の非細胞生物に由来する材料から得られうる。
【０１０５】
一本鎖又は二本鎖のいずれかのＤＮＡ又はＲＮＡの試料抽出物は、生体物質の流体懸濁液から、又は生体物質を砕くことにより、又はＳＤＳ（若しくは他の界面活性剤）、浸透圧衝撃、グアニジニウム・イソチオシアネート及びリゾチーム、これらに限定されないが、を用いる処置によりもたらされる溶解を含む細胞溶解工程に従って、調製されうる。本発明の方法で用いられうる適切なＤＮＡにはゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡが含まれる。このようなＤＮＡは、例えば分子生物学の最新プロトコル（オーズベルら編）（ジョン・ウィリー＆ソンズ社、１９９５）及び分子クローニング、実験マニュアル（サムブルックら編）（コールド・スプリング・ハーバー・プレス、１９８９）に記載されたような幾つかの通常用いられるプロトコルの任意の一つにより調製されうる。ＲＮＡの試料抽出物は、例えば分子生物学の最新プロトコル（前出）、分子クローニング、実験マニュアル（前出）及びコムクジンスキーとサッチ（１９８７、Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． １６２ １５６、参照により本明細書にインコーポレートされる）に記載されるような任意の適切なプロトコルにより調製されうる。
【０１０６】
本発明の方法で用いられうる適切なＲＮＡには、メッセンジャーＲＮＡ、ＤＮＡから転写された相補的ＲＮＡ（ｃＲＮＡ）又はゲノム若しくは部分ゲノム（ｓｕｂｇｅｎｏｍｉｃ）のＲＮＡが含まれる。このようなＲＮＡは例えばオーズベルら（前出）及びサムブロックら（前出）の該当する節に記載される標準的なプロトコルを用いて調製されうる。
【０１０７】
該ゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡは、例えば音波破砕により又は制限エンドヌクレアーゼでの処理により断片化されうる。該ゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡは、得られるＤＮＡ断片が固定化されたオリゴヌクレオチド・プローブの長さより長いが適切なハイブリダイゼーション条件下でそれらに迅速に接近できる程に十分短くなるように断片化されることが好ましい。または、ゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡの断片は、選別され、適切なランダム又は特異的なプライマーを用いる適切なヌクレオチド増幅技術を用いて増幅されうる。このような増幅技術は、当業者に周知であり、例えばＰＣＲ（サイキら、１９８８、前出）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）（米国５，４２２，２５２、リトルら）、ローリング・サークル複製（ＲＣＲ）（リウら、１９９６、Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． １１８： １５８７−１５９４、国際出願公開第ＷＯ９２／０１８１３）、核酸配列に基づく増幅（ＮＡＳＢＡ）（ソックナナンら、１９９４、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １７ １０７７−１０８０）及びＱ−βレプリカーゼ増幅（チャギら、１９９６、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９３： ５３９５−５４００）が含まれる。
【０１０８】
通常、該標的ポリヌクレオチド又はその断片は個々のプローブに対するそれらのハイブリダイゼーションが測定できるよう検出可能に標識される。この点で、該標的ポリヌクレオチド又は断片はそれらと結合した一つ以上のレポーター分子を有しうる。該レポーター分子は色素原、触媒、酵素、蛍光色素、化学発光分子、生物発光分子、ユーロピウム（Ｅｕ３４）などのランタンイオン、放射性同位元素及び直接観察できる標識を含む群から選択されうる。
【０１０９】
直接観察できる標識の場合、コロイド状の金属若しくは非金属の粒子、色素粒子、酵素若しくは基質、有機重合体、ラテックス粒子、リポソーム、又はシグナルを発生する物質等を含む他の小胞が使用されうる。この型のとりわけ好ましい標識には大きなコロイド、例えば金、セレン、銀、錫及び酸化チタンなどの金属コロイドが含まれる。酵素が直接観察できる標識として用いられる一実施態様においては、ビオチン化塩基が標的ポリヌクレオチドに組み込まれる。ハイブリダイゼーションはストレプトアビジン−レポーター分子とのインキュベーションにより検出される。
【０１１０】
適切な蛍光色素には、フルオレセイン・イソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、テトラメチルローダミン・イソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）、Ｒ−フィコエリスリン（ＲＰＥ）、及びテキサス・レッドが含まれるが、これらに限定されない。他の典型的な蛍光色素には、ドーヴァーら（国際公開ＷＯ９３／０６１２１）により論議されているものが含まれる。米国特許第５，５７３，９０９号（シンガーら）、第５，３２６，６９２号（ブリンクレイら）に記載された蛍光色素も参照されうる。または、米国特許第５，２２７，４８７号、第５，２７４，１１３号、第５，４０５，９７５号、第５，４３３，８９６号、第５，４４２，０４５号、第５，４５１，６６３号、第５，４５３，５１７号、第５，４５９，２７６号、第５，５１６，８６４号、第５，６４８，２７０号及び第５，７２３，２１８号に記載された蛍光色素が参照されうる。市販の蛍光標識には、例えば、フルオレプライム（ファルマシア社）、フルオレダイト（ミリポア社）及びＦＡＭ（アプライド・バイオシステムズ・インターナショナル社）などのフルオレセイン・ホスホルアミダイトが含まれる。
【０１１１】
放射活性レポーター分子には、例えばＸ線又はホスホイメージャー技術により検出され得る３２Ｐが含まれる。
【０１１２】
該ハイブリッドを形成する工程は、ＤＮＡ又はＲＮＡを含む試験用核酸にオリゴヌクレオチド・プローブをハイブリダイズさせるのに適した条件下で実施され得る。この点で、例えば「核酸ハイブリダイゼーション，実践アプローチ」（ホームズとヒギンズ編）（ＩＲＬプレス、ワシントン市、１９８５）が参照されうる。一般的に、ハイブリダイゼーションが起こるか否かは、試験用の該オリゴヌクレオチド・プローブ及び該ポリヌクレオチド配列の長さ、ｐＨ、温度、一価及び二価の陽イオン濃度、該ハイブリッド形成領域におけるＧ及びＣヌクレオチドの割合、媒体の粘度並びにありうる変性剤の存在により影響される。このような変数はハイブリダイゼーションに要する時間にも影響を及ぼす。従って、好ましい条件は個々の適用に応じて変化する。しかしながら、このような実証的条件は過度の実験を行うことなく機械的に決定できる。
【０１１３】
高識別ハイブリダイゼーション条件を用いることが好ましい。例えば、一つの内部塩基対の不適合を含む類似のオリゴヌクレオチド・プローブと比較して、完全に適合し且つ標的配列と完全に相同な１１から１７塩基長のオリゴヌクレオチド・プローブのハイブリダイゼーションを識別する条件を記載するヴァラスら（１９７９、Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ６： ３５４３ ）が参照されうる。３Ｍのテトラメチルアンモニウムクロライドを用いた１１から２０塩基長のオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションについての条件を記載するウッドら（１９８５、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２： １５８５）も参照されうる。ウッドらの条件では、該ハイブリッドの融点はそのＧＣ含量に関わらず該オリゴヌクレオチド・プローブの長さにのみ依存する。さらに、ドルマナックら（前出）は６〜１０ヌクレオチド長のオリゴマーの厳格なハイブリダイゼーションを可能にするハイブリダイゼーション条件を記載し、同様な条件は「施錠核酸」などのヌクレオチド類似体を使用することにより極めて容易に得られうる（クリステンセンら、２００１、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ ３５４： ４８１−４）。
【０１１４】
一般的に、ハイブリダイゼーション反応は、等安定化剤（ｉｓｏｓｔａｂｉｌｉｓｉｎｇ ａｇｅｎｔ）、変性剤及び／又は再生促進剤などのハイブリダイゼーションを最適にする薬剤を任意選択的に含むハイブリダイゼーション緩衝液の存在下で実施できる。等安定化剤の例としては、ベタイン及び低級テトラアルキルアンモニウム塩が挙げられるが、これらに限定されない。変性剤は二本鎖核酸の塩基間の水素結合又は核酸分子の水和を妨げることにより二本鎖核酸分子の融解温度を下げる組成物である。変性剤にはホルムアミド、ホルムアルデヒド、ジメチルスルホキシド、酢酸テトラエチル、尿素、グアニジウム・イソチオシアネート、グリセロール及びカオトロピック塩が含まれるが、これらに限定されない。ハイブリダイゼーション促進剤は、ヘテロ核リボ核タンパク質（ｈｎＲＰ）Ａ１、セチルトリメチルアンモニウムブロマイド（ＣＴＡＢ）及びドデシルトリメチルアンモニウムブロマイド（ＤＴＡＢ）などの陽イオン界面活性剤、ポリリシン、スペルミン、スペルミジン、一本鎖結合タンパク質（ＳＳＢ）、ファージＴ４遺伝子３２タンパク質並びに酢酸アンモニウムとエタノールの混合物を含む。ハイブリダイゼーション緩衝液は、約０．００５ｎＭから約５０ｎＭ、好ましくは約０．５ｎＭから５ｎＭ、より好ましくは約１ｎＭから２ｎＭの間の濃度で標的ポリヌクレオチドを含みうる。
【０１１５】
該標的ポリヌクレオチドを含むハイブリダイゼーション混合物を、該プローブのアレイと接触させて配置し、該標的ポリヌクレオチドの標的配列と任意の相補的なプローブとの間でハイブリダイゼーションさせるのに適した温度及び時間でインキュベートする。接触は任意の適切な容器、例えば、その上に該プローブを結合させた固体支持体を保持するよう設計された皿又は容器内でさせることができる。一般的に、インキュベーションは核酸のハイブリダイゼーションで通常使用される温度であり、例えば約２０℃から約７５℃の間、例えば約２５℃、約３０℃、約３５℃、約４０℃、約４５℃、約５０℃、約５５℃、約６０℃、又は約６５℃である。１４ヌクレオチドより長いプローブについては、２０℃から５０℃が好ましい。より短いプローブについては、より低い温度が好ましい。標的ポリヌクレオチドの試料は、該標的ポリヌクレオチドの標的配列と任意の相補的プローブとの間で所望するレベルのハイブリダイゼーションをさせるのに十分な時間の間該プローブとインキュベートする。例えば、該ハイブリダイゼーションはホルムアミド中で１〜２日間約４５℃＋／−１０℃で実施されうる。
【０１１６】
該ハイブリッドを形成する工程の後、該プローブをハイブリダイゼーション緩衝液で洗浄しあらゆる未結合の核酸を取除く。該緩衝液は通常該ハイブリダイゼーション工程用と同様な範囲の濃度でハイブリダイゼーション最適化剤を含み得る。この洗浄工程は結合した標的ポリヌクレオチドだけを残す。次に、該プローブを、どのプローブが標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズしたかを確認するため試験する。
【０１１７】
次に、該プローブのいずれが対応する標的配列にハイブリダイズしたかを決定するため、該ハイブリダイゼーション反応液を検出する。標的ポリヌクレオチドと結合したレポーター分子の性質に応じて、シグナルは、蛍光標識に光を照射し蛍光光度計で蛍光を検出することにより、分光光度計を用いて検出されうる色素を生じる酵素系を提供することにより、又は反射率計を用いて色素粒子若しくは着色したコロイド状の金属粒子若しくは非金属粒子を検出することにより、放射活性標識若しくは化学発光分子を用いる場合には放射線測定器若しくはオートラジオグラフィーを利用することにより、機器によって検出されうる。従って、検出手段は、該標識と関連する光を検出若しくは走査するように適応される。この光は蛍光、発光、収束ビーム又はレーザー光を含みうる。このような場合、該マイクロアレイ中の各位置のプローブ：標的ポリヌクレオチドのハイブリッドに由来する光の放出について走査しデジタル・コンピュータに直接該データを記録するために電荷結合素子（ＣＣＤ）又は光電池が用いられ得る。幾つかの場合において、該シグナルの電子検出は必要でないかもしれない。例えば、本明細書で記載されるように、核酸アレイ形式と結びついた酵素で生成する着色点を用いて、該アレイの目視試験により該アレイ上のパターンを解釈できる。核酸アレイの場合、該検出手段は該アレイからのシグナルのパターンを普通語の遺伝プロフィールに変換するためパターン認識ソフトウェアと接続されることが好ましい。好ましい実施態様では、該プローブの集合は核酸アレイの形式であり、該アレイ上のレポーター分子から生じるシグナルの検出は「チップ・リーダー」を用いて実施される。「チップ・リーダー」により用いられ得る検出システムは例えばピルングら（米国特許第５，１４３，８５４号）により記載される。該チップ・リーダーは通常特定のアレイの位置若しくは地点にあるシグナルが真の陽性であるか又は偽のシグナルであるかもしれないかを決定するために若干のシグナル処理も組込む。典型的なチップ・リーダーは例えばフォドルら（米国特許第５，９２５，５２５号）により記載される。または、該アレイが個々にアドレス可能な種類の標識されたマイクロビーズの混合物を用いて作製される場合、該反応はフローサイトメトリーを用いて検出されうる。
【０１１８】
６．データ分析
次に、該ハイブリダイゼーションのデータは、どのプローブがハイブリッドを形成したか決定するために処理される。好ましい実施態様では、それに対して該プローブが相互作用の特異性を有する標的配列のいずれかの存在と、該アレイ上の特異的な位置標識化とを関連付けるためにデジタル・コンピュータが用いられる。該位置情報はどの配列相互作用が起きたかを示すデータベースに直接変換される。ハイブリダイゼーション検定で形成されたデータはプログラム可能なデジタル・コンピュータの使用で最も容易に分析される。該コンピュータ・プログラム産物は一般的に該コードを記憶する読み取り可能媒体を含む。ある種のファイルは各地点の位置及び該地点で該オリゴヌクレオチド・プローブの配列を含むことが知られているあらゆる標的配列を含むメモリに充てられる。核酸アレイから得られたハイブリダイゼーション・データを分析するコンピュータ方法はＰＣＴ公開第ＷＯ９７／２９２１２号及びＥＰ公開９５３０７４７６．２で教示される。好ましい実施態様では、該プログラム可能なコンピュータは専門ソフトウェア・コード及び全配列データベースに由来する登録データを含み、又は特定のプローブ・アレイに関連する部分配列データベース全体の該部分を含み、ハイブリダイゼーションの様式から、特定の標的配列が試験されたＤＮＡ試料に存在した確率を評価する。
【０１１９】
該コンピュータ・プログラム産物は標的配列とオリゴヌクレオチド・プローブとの間のハイブリダイゼーション反応からのハイブリダイゼーションのデータを入力として受信するコードも含み得る。該コンピュータ・プログラム産物は該ハイブリダイゼーションのデータを処理するコードも含み得る。データ分析は、例えば、収集された該データからの基盤位置の関数として蛍光強度を決定する工程、「外れ値」（予め定められた統計的分布から逸脱するデータ）を除去する工程、及び残りのデータから該標的配列の相対的な結合親和性を計算する工程を含み得る。得られたデータは光放出又は標的配列とその中のプローブとの間の結合親和性に応じて変化する各領域の色を帯びた画像として表示され得る。
【０１２０】
一実施態様において、各アドレスでの結合量は該ハイブリダイゼーションのオン−オフ速度を試験することにより決定される。例えば、各アドレスでの結合量は該核酸試料が該アレイと接触した後に幾つかの時点で測定される。総ハイブリダイゼーション量は各時点での結合量に基づいた結合動力学の関数として決定され得る。当業者は、ハイブリダイゼーション速度及び信号対雑音比に対する条件を最大にするため、温度、試料攪拌、洗浄の条件（例えば、ｐＨ、溶媒の特徴、温度）への該ハイブリダイゼーション速度の依存性を容易に決定し得る。
【０１２１】
該コンピュータ・プログラム産物はプログラマーからの命令を入力として受信するコードも含み得る。該コンピュータ・プログラム産物はまた該データを提示用の形式に変換しうる。
【０１２２】
一実施態様においては、ハイブリダイゼーションのデータを処理するためのコンピュータ・プログラム産物は、個々の標的ポリヌクレオチドについてオリゴヌクレオチド・アレイの地点の組合わせを同定するコードであって、該アレイのプローブが該ポリヌクレオチドの特異的検出を容易にするものであるコード、該アレイにおける試料ポリヌクレオチドと該オリゴヌクレオチド・プローブとのハイブリダイゼーション反応からのハイブリダイゼーション・データを入力として受信するコード、標的配列の予め定められた組合わせのいずれかに適合するハイブリダイゼーションパターンを検索することにより該試料ポリヌクレオチドが該標的ポリヌクレオチドのいずれかを含むか否かを決定するために該ハイブリダイゼーション・データを処理するコード、並びにこれらのコードを記憶するコンピュータ読み取り可能媒体を含む。該アレイの各地点における個々のオリゴヌクレオチド・プローブの配列を同定することは必要ない。この点で、該ハイブリダイゼーション分析ソフトウェアは、該アレイの地点のどの組合わせが個々の標的ポリヌクレオチドに対応するかを入力として必要とするのみである。しかしながら、好ましい実施態様では、該コンピュータ・プログラム産物は、オリゴヌクレオチド・アレイの各地点におけるオリゴヌクレオチド・プローブの配列を入力として受信するコード及び標的ポリヌクレオチドにおける標的配列の存在又は不存在についての情報を含むデータベースを入力として受信するコードを含む。
【０１２３】
該コンピュータ・プログラム産物は検出されたハイブリダイゼーションのパターンが標的ポリヌクレオチドの存在を示す確率を演繹するコードをさらに含むことが好ましい。
【０１２４】
標的配列のデータベースは定期的に更新され、それぞれのマイクロアレイを形成するプローブの個々の具体的な集合に該当するその部分も本発明の特定の市販のアプリケーションを用いて更新しうるであろう。
【０１２５】
本発明が容易に理解され実際の効果を得るため、具体的な好ましい実施態様が下記の実施例を参照しながらここに説明される。
【０１２６】
実施例
実施例１
異なる株のジャガイモＹウイルスを検出するためのコンビナトリアル・プローブ
本実施例で説明するのは、例えば、ポティビリダエ科の最大属であるポティウイルスの遺伝子配列を用いて変異可能な遺伝子ファミリーの全構成員を検出するためのプローブの組み合わせの使用である。該ポティビリダエ科は最も大きく最も良く研究される植物ウイルス科の一つであり、この種は世界中で多数の作物に顕著な損害を惹き起こしている。少なくとも４００のポティウイルスが知られており、それらは知られている全植物ウイルスの約４分の１を含む。
【０１２７】
異なるポティウイルスを検出しそれらの間を識別しうるＤＮＡマイクロアレイ用のプローブを設計するために幾つかの異なる戦術が用いられうる。最も直接的だが最も非効率な戦術は、全ての既知ポティウイルスのゲノムＲＮＡをクローニングされたＤＮＡに変換しこれらのＤＮＡの個々の試料をＤＮＡマイクロアレイのプローブとして使用することである。個々のポティウイルスについて該プローブの特異性やその他のことを確認するために多くの試験を実施しなければならず、そしてその後に発見されるいかなる新規のポティウイルスもそれらの構成要素から構築されるＤＮＡマイクロアレイにより検出される保証はない。
【０１２８】
遥かに良い戦術は共有される配列に基づいた特異的なプローブを設計するために国際的な遺伝子配列データベースにおけるポティウイルスのゲノム配列を使用することである。現在約７５のポティウイルスのゲノムが完全に配列決定され（それぞれ約１０，０００ヌクレオチド）多くの他のものの部分配列とともにデータベースに記録されてきた。配列分析は、これらのゲノムの配列がより多かれ少なかれ類似していることを示した。従って、共有領域用に設計されたプローブの集合は、全ての既知ポティウイルスの存在を検出するはずであり、未記載のポティウイルス全てを検出する可能性もあるであろう。上述のクローニングされたポティウイルスｃＤＮＡのアレイはこの最後の性質をおそらく持たないであろう。
【０１２９】
全てのポティウイルスのゲノム配列の最も保存された部分はそれらのポリメラーゼ遺伝子のいわゆる「Ｂモチーフ」であり、それは直鎖の２０ヌクレオチド長である（図３）。この共有領域は変化しない１４ヌクレオチドの「領域」及び変化する６ヌクレオチドを含む（図３）。４つの領域で、二つのヌクレオチドの一方又は他方が異なる種で見出され、二つの領域で、全部で四つのヌクレオチドの一方又は他方が見出される。これまで、該配列の変異可能な領域で記録されたヌクレオチドの異なる組み合わせの多くが異なるポティウイルスで見出されてきたが、全てではない。しかしながら、既知及び未知の両方のポティウイルスを検出するためのマイクロアレイを設計する際、変異可能なヌクレオチドのあらゆる組み合わせを含めることが賢明であり、これは下記の実施例で説明される。
【０１３０】
図３に記載される類似配列の集合を現在の国際的な配列データベース（１．７ｘ１０９ヌクレオチド、２０００年５月）と照合する場合、配列決定されたいずれのポティウイルス・ゲノムも変異可能な配列の一つと適合し、この集合の唯一つの配列がヒトの未知機能の遺伝子配列である非ポティウイルス配列と適合する。各ポティウイルスが単独のプローブにより特異的に検出されうるようにこの変異を全て包含するプローブのマイクロアレイを構築するためには、図４で説明されるように、２５６のプローブ配列（４ｘ２ｘ２ｘ２ｘ４ｘ２＝２５６の組み合わせ）が必要となるであろう。
【０１３１】
この設計のマイクロアレイを用いて、６株のジャガイモＹウイルス（ＰＶＹ）の「ポティウイルスＢモチーフ」をコードするゲノム領域の変異型は、図５の３つの図で説明されるプローブとハイブリダイズするであろう。興味深いことに、ＰＶＹ−ＣＯ（図５ｃ）とハイブリダイズするプローブは、インゲンマメ黄斑モザイク・ポティウイルスＳ株ともハイブリダイズするが、ＭＢ株とはハイブリダイズしない。
【０１３２】
同じポティウイルスのゲノムは、しかしながら、上記のコンビナトリアル・アプローチにより設計されたマイクロアレイを用いてより効率的に検出されるであろう、そしてこのようなアレイは、識別力が増すにつれ、より多くの情報を与えるであろう。上述したポティウイルスの保存されたＢモチーフ領域の存在は、該２０ヌクレオチド長の配列に由来する配列の重なり合っている二つ部分群が用いられるならば、より少なく且つより短いプローブにより検出されうるであろう（図６Ａ）。一方の部分群は１４ヌクレオチド長のみであり全モチーフのうち終わりの６ヌクレオチドを除くことになろう、従って、該部分群は３２配列（４ｘ２ｘ２ｘ２＝３２の組み合わせ）となるであろう。他方の部分群は全モチーフのうち最初の３ヌクレオチドを除くので、１７ヌクレオチドの長さであり、従って、６４配列（２ｘ２ｘ２ｘ４ｘ２＝６４の組み合わせ）となるであろう。これらの二つの部分群のマイクロアレイは、従って、９６のプローブ、即ち全２０ヌクレオチドのモチーフに要するプローブ数の約３分の１、から成ることになるであろう。このアレイが試験で用いられる際、ポティウイルスのポリメラーゼ・Ｂモチーフ領域の存在は各部分群から得られる少なくとも一つのプローブへのハイブリダイゼーションにより示される。幾つかのポティウイルスにから得られるｃＤＮＡは一つの部分群で同じプローブに結合するが他の部分群では異なるプローブに結合するであろう、従って、これらの配列から設計されるアレイは組み合わせの方法で機能することになろう。
【０１３３】
該Ｂモチーフがそれぞれ１１ヌクレオチド長の三つの重なり合っている短鎖により表されるならば、さらに節減が生じる（図６Ｂ）。そのときは、保存されたＢモチーフ配列のあらゆる可能な組み合わせはちょうど４０のプローブにより表され得るであろう、従って、必要なプローブの数は１６％（４０／２５６）まで減少し、そして該プローブに必要なヌクレオチドの数は２５６のプローブ・アレイの９％（４４０／５１２０）まで減少するであろう。より短い配列の三つの集合を含むアレイが試験で用いられる場合、ポティウイルスのＢモチーフ領域の存在は該三つの部分群のそれぞれから得られる少なくとも一つのプローブへのハイブリダイゼーションにより示される。
【０１３４】
Ｂモチーフ配列の二つ又は三つの部分群を用いて設計されたアレイは完全な２０ヌクレオチド長の配列をもつプローブから成るアレイより特異性は低い。しかしながら、それらの特異性は、ポティウイルス・ゲノムの他領域に基づく追加のプローブを含めることにより、より大きなアレイよりおそらくさらに大きなレベルまで増大しうるであろう。
【０１３５】
用いられうる全てのポティウイルス・ゲノムにおける二つの他の保存された領域は図６Ｃ及び図６Ｄで示される。これらの一番手は、ビリオン・タンパク質の「ＷＣＩＥＮモチーフ」をコードし、該Ｂモチーフ遺伝子のように二つの重複領域に細分されうるであろう。その一方は最後の三つのヌクレオチドを除き、他方は最初の五つを除く。得られる二つの部分群は、１３及び１１のヌクレオチド長であり、変異可能な配列位置のあらゆる組み合わせを表すために４８のプローブを必要とする。二番手は、円柱状封入タンパク質の「ＮＥＶＤモチーフ」をコードし、あらゆる既知の変異型を表すために、これも４８プローブの一集合を必要とする。マイクロアレイが図６Ｂで示される二つのＢモチーフ部分群配列とともにこれらの三つの付加的な保存配列を用いて設計されるなら、五つの部分は２５６プローブではなく１３６プローブ（５３％）、そして５１２０ヌクレオチドではなく１４９２ヌクレオチド（２９％）をともに含むことになるであろう。
【０１３６】
これら五つの部分群の配列を含むマイクロアレイは図７に記載される。比較のため、このようなアレイと、完全な２０ヌクレオチド長のＢモチーフのプローブ配列（図５）をもつアレイの実施例で用いたウイルス遺伝子のｃＤＮＡの間のハイブリダイゼーションパターンを図８に示す。該コンビナトリアル・アレイは同様に任意のポティウイルスのｃＤＮＡを検出できるであろうが、該ＰＶＹ−ハング株とＮＳＷ株との間、並びにＰＶＹ−ＣｏとＢＹＭＶとの間を識別するためにも用いられうるであろう。より大きなアレイはこれらの性能を有さないであろう。
【０１３７】
遺伝子配列の複雑性及び偏りのため、並びにそれらの特異性が実際には該ｃＤＮＡの起源、従って似たような夾雑物に依存するため、コンビナトリアル・プローブ集合の特異性を見積もることは難しい。しかしながら、国際的な遺伝子配列データベース又はそれらの一部を用いてコンピュータで見積もることができるであろう。適切な特異性は五つではなくまさに三つ又は四つの部分群により提供されうるであろうことが見出されるかも知れない。上で示したポティウイルスの例は診断用マイクロアレイに必要なプローブの数を最小限に半分とし、その費用をさらにより削減し、そして無論、該節減は、該マイクロアレイが他の組み合わせで該プローブを共有する他の遺伝子標的を有する場合、さらに大きくなりうるであろう。
【０１３８】
該ポティウイルスの既知のゲノム配列を用いて上に説明した実施例は、コンビナトリアル戦術を適用できるとしても、不連続な（重なり合っていない）配列には等価である該ゲノムの三領域の重なり合っている部分の使用を伴う。これらは、適切なコンピュータ・アルゴリズムを用いて簡便に見出されうるであろう。
【０１３９】
実施例２
コンビナトリアル・プローブを同定する工程
この実施例では、複数の生物を検出するためのコンビナトリアル・プローブを作成するのに有用な配列を同定する本発明プロセスの一実施態様が説明される。
【０１４０】
コンビナトリアル・プローブとして用いるべき配列は、目的とする複数の生物の標的ポリヌクレオチド（例えば、一遺伝子又は遺伝子の群又はそれらに関連する転写産物）に類似する既知の配列（例えば核酸配列データベースで公開されたもの）を用いて同定され得る。該標的ポリヌクレオチドにおけるありそうな変異型を網羅するため且つプローブの集合として用いられるために部分配列の「最小集合」を見出すことは、「非決定論的な多項時間（ＮＰ）−全数調査」の問題であり、適切な標的配列の同定用のアルゴリズムは、例えば、ガレイ，エム・アールとジョンソン，ディ・エス（１９７９）：コンピュータと処置困難：ＮＰ完全性の理論への指針、ダブリュ・エイチ・フリーマン＆社、サンフランシスコ，クレッセンジ，ピイとカン，ブイ（編），ＮＰ最適化問題の概要、及びハルドルソン，エム（編集補佐）：グラフ理論：網羅及び区分：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎａｄａ．ｋｔｈ．ｓｅ／〜ｖｉｇｇｏ／ｐｒｏｂｌｅｍｌｉｓｔ／ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ．ｈｔｍｌ、で論じられた原則に基づくことができる。
【０１４１】
目的とする生物の集合を識別するために適切な標的配列を同定する好ましいプロセスは、図１０にまとめられ、下記のコンピュータ工程により処理できる。
１）　核酸配列データベースは生物の標的集合（例えば複数の「分類群」を規定するかも知れない）に存在する選択されたゲノム領域の配列について検索される。一例として、選択された該領域は、範囲を定め且つ一対の重複ＰＣＲプライマー（即ち該集合のあらゆる既知の種とハイブリダイズするプライマーの混合物）を用いてＰＣＲで増幅され得るＺＺ配列、例えばインフルエンザ（オルトミクソ）ウイルスの記録されたポリメラーゼ遺伝子全てを含みうる。これらの配列は工程（２）のためにコンパイルされる。
２）　コンパイルされた配列を、理想的には８〜１２ヌクレオチド長であるが６ヌクレオチド長以上でも良いより短い重なり合っているヌクレオチド配列又はオリゴヌクレオチド配列（オリゴ）の集合に断片化される。
３）　特定の大きさのオリゴ全てを一次の「分類群Ｘオリゴ」行列に分類される。最初に異なる行列が個々のオリゴの大きさの部類に対して構築される。個々の行列において、該分類群のそれぞれにおけるオリゴの各種類の存在又は不存在が記録される。
４）　次に、「後続−分類群対Ｘオリゴ」行列（即ち、後続−行列）は、一次行列で全ての分類群対を比較しそしてそれらが各オリゴにより識別されるか否かを各対について記録することにより、個々の一次行列から構築される。
５）　次いで、該標的配列を識別するためのオリゴの「最小集合」を、標準的な「貪欲な戦術」を用いて、該後続−行列から誘導する。
ａ）該後続−行列で最大分類群を識別するオリゴを該後続−行列の各オリゴについてヒット件数を合計することにより同定する
ｂ）次に該オリゴを、その「ヒットする集合」、即ちそれが識別する分類群の全ての対、とともに該後続−行列から削除する。
ｃ）この工程を、全ての又はほとんどの分類群を含むヒットする集合が見出されるまで反復する、通常全部で１２回以上である。
ｄ）一般的に、二つ以上の「最良」オリゴが各合計段階で同定されるので、該アルゴリズムを反復して徐々にあらゆる可能な集合を試し各反復でオリゴを交換することにより最良最小の集合を同定する。最良のプローブ、例えば同様の組成から成るもの且つ相互の部分配列を含まないものを作成しそうな（物理化学的理由で）オリゴを選択するために他の基準も使用できる。
【０１４２】
個々の機能するプローブの集合はこの方法で発見される幾つかのオリゴの最小集合を用い得る。とりわけ単一の個々の最小集合が該集合中の全ての分類群を固有に同定しないこともありうるので、少なくとも５つの集合が通常同定の正確性を保証するために必要とされる。機能する集合は二つ以上の長さの部類のオリゴも含みうる。
【０１４３】
本明細書で引用した全ての特許、特許出願、及び刊行物の開示はその全体において引用文献により本明細書にインコーポレートされる。
【０１４４】
本明細書におけるいずれの引用文献の引用も、このような引用文献が本出願に対する「先行技術」として利用できることの承認として解釈されるべきでない。
【０１４５】
本明細書を通して、その目的は本発明をいずれか一つの実施態様又は特定の特性の集合に限定することなく本発明の好ましい実施態様を記載することであった。従って、当業者は、当該開示に鑑みて、本発明の範囲から逸脱することなく例証された具体的な実施態様に種々の修飾及び変更が為され得ることを理解するであろう。このような全ての改変及び変更は添付の請求の範囲内に含まれることが意図される。
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は仮定上の標的配列及び該標的配列に由来する８以上の塩基を含むあらゆる可能な部分配列（ｓｕｂ−ｓｅｑｕｅｎｃｅ）の集合を示す。
【図２】
図２Ａは三つの仮定上の標的配列（Ａ、Ｂ及びＣ）の部分配列の間の関係を表すベン図を示す。個々の標的配列に由来する部分配列のいくつかは独自の配列であり、いくつかは共有されている。標的ＡはＢといくつかの部分配列を共有し、いくつかをＣと共有し、いくつかをＢ及びＣの両方と共有し、Ｃ及びＢはＡと共有されないいくつかを共有する。
図２Ｂは、図２Ａと合致するベン図を示し、標的のＡ、Ｂ及びＣを検出しそれらの間を識別するために必要な集合の大きさを推定するためにどの部分配列（Ｘ及びＹ）が用いられうるであろうかを示す。
【図３】
図３はポティウイルスのポリメラーゼ遺伝子で共有される「Ｂモチーフ」の配列を示す。変異型が見出される配列内の位置（部位）は箱で囲み、個々の箱はその部位で生じることが知られている異なるヌクレオチドを列挙する。
【図４】
図４はオリゴヌクレオチドのアレイの図式表示である。該格子の個々の正方形（地点）は２５６個の異なるオリゴヌクレオチドから成るアレイ上の異なるオリゴヌクレオチドの点を表している。図３で示される該配列変異型のあらゆる可能な組み合わせは該アレイ上の２５６点のうちの１点で表される。矢印で特定される横列及び縦列のオリゴヌクレオチドが３、６及び９の位置について示されるような該配列変異型を含むように該アレイ上の点は順序付けられうる。１２、１５及び１８の位置に変異型をもつオリゴヌクレオチドが同様に同定されうるであろう。
【図５】
図５は、ポティウイルス属のジャガイモＹウイルス（ＰＶＹ）及びインゲンマメ黄斑モザイク（ＢＹＭＶ）のポリメラーゼＢモチーフをコードするＤＮＡが用いられる場合、図４に示されるように設計されたアレイ上の予測される反応を示す図式的表示である。３及び６の変異型位置のヌクレオチド（図３参照）は該アレイの左部に示され、９、１２及び１５の変異型位置のヌクレオチドは該アレイの上部に示される。ポティウイルス属の三群のＲＮＡから形成されたｃＤＮＡとの反応が示される。Ａ株−Ｎ（ＧｅｎＢａｎｋコードＤ００４４１）、−ＮＦＲ（Ｘ１２４５６）及び−ＰＡ（Ａ０８７７６）、Ｂ株−Ｈｕｎｇ（Ｍ９５４９１）及び−ＮＳＷ（Ｘ９７８９５）、並びにＣ株−ＣＯ（Ｕ０９５０９）及びＢＹＭＶのＳ株（Ｕ４７０３３）もである、がＭＢ（Ｄ８３７４９）を除く。
【図６】
図６はポティウイルス・ゲノムの共有された遺伝子配列を示す図式的表示であり、これらの配列に存在する配列変異型、並びにポティウイルスを検出し同定するためにマイクロアレイのプローブとして組合わせて用いられうるであろうこれらの配列のうちの二つの重複部分を示す。Ａ）「Ｂモチーフ」をコードする該ポリメラーゼの領域、及びそれに由来する二つの部分配列、Ｂ）「Ｂモチーフ」をコードする該ポリメラーゼの領域及びそれに由来する三つの部分配列、Ｃ）「ＷＣＩＥＮモチーフ」をコードするビリオンタンパク質遺伝子の領域、及びその二つの部分配列、Ｄ）「ＮＶＥＤモチーフ」をコードする円柱状封入タンパク質の領域。
【図７】
図７はポティウイルス・ゲノムの三つの保存領域（図６）から設計されたプローブにおける変異部位の順列様式を示す図式的表示である。各格子の個々の正方形は異なるオリゴヌクレオチドを含む該アレイ上の点に等しい。該配列における変異位置のヌクレオチドは該格子／アレイの上部及び左部に示される。
【図８】
図８はジャガイモＹウイルスの６個の異なる株及びインゲンマメ黄斑モザイクウイルス（ＢＹＭＶ−Ｓ）の一株のゲノムをコードするｃＤＮＡを検出するために仮定上のマイクロアレイのコピーを用いて得られるハイブリダイゼーション様式を示す図式的表示である。該プローブは１１〜１３ヌクレオチド長であり、図７に示す配列を有していた。このウイルス由来のｃＤＮＡは図５に示す実施例中のものと合致する。
【図９】
図９は図１１及び図１２の記憶媒体によりコードされる命令を実行するために用いられるシステムの図式的表示である。
【図１０】
図１０は本発明のコンビナトリアル・プローブを設計する方法の実施態様を示す流れ図を示す。
【図１１】
図１１は磁気記憶媒体の断面を示す図式的表示である。
【図１２】
図１２は任意選択的に読取り可能なデータ記憶媒体の断面を示す図式的表示である。
【図１】
2004504068.tif 000004
【図２】
2004504068.tif 000005
【図３】
2004504068.tif 000006
【図４】
2004504068.tif 000007
【図５】
2004504068.tif 000008
【図６】
2004504068.tif 000009
【図６−１】
2004504068.tif 000010
【図７】
2004504068.tif 000011
【図８】
2004504068.tif 000012
【図９】
2004504068.tif 000013
【図１０】
2004504068.tif 000014
【図１０−１】
2004504068.tif 000015
【図１１】
2004504068.tif 000016
【図１２】
2004504068.tif 000017
【国際公開パンフレット】
2004504068.tif 000018
2004504068.tif 000019
2004504068.tif 000020
2004504068.tif 000021
2004504068.tif 000022
2004504068.tif 000023
2004504068.tif 000024
2004504068.tif 000025
2004504068.tif 000026
2004504068.tif 000027
2004504068.tif 000028
2004504068.tif 000029
2004504068.tif 000030
2004504068.tif 000031
2004504068.tif 000032
2004504068.tif 000033
2004504068.tif 000034
2004504068.tif 000035
2004504068.tif 000036
2004504068.tif 000037
2004504068.tif 000038
2004504068.tif 000039
2004504068.tif 000040
2004504068.tif 000041
2004504068.tif 000042
2004504068.tif 000043
2004504068.tif 000044
2004504068.tif 000045
2004504068.tif 000046
2004504068.tif 000047
2004504068.tif 000048
2004504068.tif 000049
2004504068.tif 000050
2004504068.tif 000051
2004504068.tif 000052
2004504068.tif 000053
2004504068.tif 000054
2004504068.tif 000055
2004504068.tif 000056
2004504068.tif 000057
2004504068.tif 000058
2004504068.tif 000059
2004504068.tif 000060
2004504068.tif 000061
2004504068.tif 000062
2004504068.tif 000063
2004504068.tif 000064
2004504068.tif 000065
2004504068.tif 000066
2004504068.tif 000067
2004504068.tif 000068
2004504068.tif 000069
2004504068.tif 000070
2004504068.tif 000071
2004504068.tif 000072
2004504068.tif 000073
2004504068.tif 000074
2004504068.tif 000075
2004504068.tif 000076
2004504068.tif 000077
2004504068.tif 000078
2004504068.tif 000079
2004504068.tif 000080
2004504068.tif 000081
2004504068.tif 000082
2004504068.tif 000083
2004504068.tif 000084
2004504068.tif 000085
2004504068.tif 000086
2004504068.tif 000087
2004504068.tif 000088
2004504068.tif 000089
【国際調査報告】
2004504068.tif 000090
2004504068.tif 000091
2004504068.tif 000092