(57)【要約】ポリヌクレオチドの配列を決定する方法であって、下記の工程：（ｉ）一定の位置に固定されたポリヌクレオチド進行型酵素を標的ポリヌクレオチドに、酵素活性を誘導するのに十分な条件で接触せしめること、（ii）酵素とポリヌクレオチドとの相互作用に対する結果的作用を検出すること、なお、この作用を非リニア光シグナルまたは非リニア光シグナルに結合しているリニアシグナルの測定により検出する、を含む方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリヌクレオチドの配列を決定する方法であって、下記の工程：
（ｉ）一定の位置に固定されたポリヌクレオチド進行型酵素を標的ポリヌクレオチドに、酵素活性を誘導するのに十分な条件で接触せしめること、
（ii）酵素とポリヌクレオチドとの相互作用に対する結果的作用を検出すること、なお、この作用を非リニア光シグナルまたは非リニア光シグナルに結合しているリニアシグナルの測定により検出する、
を含む方法。
【請求項２】
作用を非リニアシグナルの測定により検出する、請求項１の方法。
【請求項３】
非リニア光検出が二次または三次高調波発生影像である、請求項１または２の方法。
【請求項４】
非リニア光検出がラマン分光法または表面増強ラマン分光法である、請求項１または２の方法。
【請求項５】
２極分子が酵素上にまたは酵素に近接して位置する、請求項１−４のいずれかの方法。
【請求項６】
分子がスチリル染料分子である、請求項５の方法。
【請求項７】
分子が緑色蛍光タンパク質である、請求項５の方法。
【請求項８】
２極分子がポリヌクレオチドの個々の塩基に付着している、請求項５または６の方法。
【請求項９】
酵素がポリメラーゼである、請求項１−８のいずれかの方法。
【請求項１０】
酵素がヘリカーゼまたはプリマーゼ酵素である、請求項１−８のいずれかの方法。
【請求項１１】
工程（ｉ）がヌクレオシド三リン酸ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰの付加を含む、請求項１０の方法。
【請求項１２】
ヌクレオシド三リン酸がパルス単色光により選択的に除去され得る１以上のブロッキング基を含む、請求項１１の方法。
【請求項１３】
金属ナノ粒子が酵素上にまたは酵素に近接して位置する、請求項１−１２のいずれかの方法。
【請求項１４】
ナノ粒子が金または銀のナノ粒子である、請求項１３の方法。
【請求項１５】
ナノ粒子をポリヌクレオチドの１以上の個々の基に組み込む、請求項１３または１４の方法。
【請求項１６】
酵素を固体支持体に固定する、請求項１−１５のいずれかの方法。
【請求項１７】
固体支持体に固定されている複数の酵素が存在する、請求項１６の方法。
【請求項１８】
固体支持体が金属粗面である、請求項１６または１７の方法。
【請求項１９】
支持体が銀または金である、請求項１６−１８のいずれかの方法。
【請求項２０】
検出を原子力顕微鏡法または近傍走査顕微鏡法とともに実施する、請求項１−１９のいずれかの方法。
【請求項２１】
局所的表面プラズモン共鳴の利用をさらに含む、請求項１−２０のいずれかの方法。
【請求項２２】
酵素を細胞中の一定の位置に固定する、請求項１−１４のいずれかの方法。
【請求項２３】
少なくとも１の固定されたポリマーおよびポリマー上またはそれに近接して位置する少なくとも１の２極分子を含む固体支持体材料。
【請求項２４】
固定された細胞を含む固体支持体材料であって、細胞が細胞中の一定の位置に保持されるポリメラーゼ酵素を含む、固体支持体材料。
【請求項２５】
非リニアシグナルを検出するための影像システムであって、ポリヌクレオチドと相互反応する酵素および酵素上または酵素に近接して位置する２極分子を固定している固体支持体を含むシステム。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明は、ポリヌクレオチドの配列を決定するための方法に関する。
【０００２】
発明の背景
ポリヌクレオチドの配列を決定することは、ヒトゲノム中にコードされるＤＮＡの３０億もの塩基のマッピングについてのヒトゲノム計画に示されるように、科学的に非常に重要性がある。
【０００３】
大規模なＤＮＡ配列決定に通常使用されている主要な方法は、鎖終結法である。この方法は、最初 Sanger および Coulson (Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1977; 74: 5463-5467) により開発され、ポリメラーゼ反応において未完ポリヌクレオチド鎖中に取り込まれる４ヌクレオシド三リン酸のジデオキシ誘導体の使用を基としている。組み込み時に、ジデオキシ誘導体がポリメラーゼ反応を終結し、ついで産物をゲル電気泳動により分離し、解析すると、特定のジデオキシ誘導体が鎖中に取り込まれた位置が明らかになる。
この方法は、広く使用され、信頼できる結果をもたらすが、遅く、労力を要し、費用がかかるとされている。
【０００４】
蛍光標識を用いて、ポリメラーゼ反応により、大きくなりつつある未完ＤＮＡ分子へのヌクレオチド組み込みが同定されている（参照、WO 91/06678)。しかし、この技法は、蛍光団からのバックグラウンド干渉が増すという欠点がある。ＤＮＡ分子が大きくなるにつれ、バックグラウンド「ノイズ」が増加し、各ヌクレオチドの組み込みを検出するのに要する時間を増さねばならない。このことは、大きいポリヌクレオチドの配列決定について、この方法の使用を非常に制限する。しかし、蛍光染料でつくられたポリヌクレオチド配列決定システムについての最も深刻な制限は、光漂白の問題である。
【０００５】
光漂白は、蛍光染料システムにおいてよく報告されている現象であって、染料の励起波長への曝露により生じる。すべての染料システムが、光漂白の起きる前に限られた数の光子を吸収する能力を有する。光漂白が起きると、蛍光染料はもはや観測者に見えず、それ故に、分子にコンジュゲートしていると、検出不能である。
【０００６】
従って、ポリヌクレオチドの配列を決定するための改善方法を必要としている。この方法は、その速度および配列決定されるヌクレオチドの断片サイズを有意に増加すべきものであって、好ましくは検出が蛍光標識ヌクレオチドに依存しないことである。さらに、方法が自動的工程で実施可能であり、現有方法に関連する複雑さおよび費用を減じるものでなければならない。
【０００７】
発明の要旨
本発明は、酵素が標的ポリヌクレオチドに結合して、それに沿って移動するときに、生じるポリヌクレオチド進行型酵素における配座および/またはマスおよび/またはエネルギー分布の変化を、二次または三次高調波発生影像を含む非リニア光影像用いて、検出できることに基づく。
【０００８】
本発明において、ポリヌクレオチドの配列を決定する方法が下記の工程：
（ｉ）一定の位置に固定されたポリヌクレオチド進行型酵素を標的ポリヌクレオチドに、酵素活性を誘導するのに十分な条件で接触せしめること、
（ii）酵素とポリヌクレオチドとの相互作用に対する結果的作用を検出すること、なお、この作用を非リニア光シグナルまたは非リニア光シグナルに結合しているリニアシグナルの測定により検出する、
を含む。
【０００９】
いくつもの利点を本発明で達成できる。配列決定を少量のポリヌクレオチドで実施でき、単一のポリヌクレオチド分子の配列決定ができ、それによって配列決定開始前の増幅の必要がなくなる。長い配列読取長を得ることができ、二次的な構造考慮が小さくなる。長い読取長を得ることは、伸長断片の再集合使用コンピューター化の必要性をなくする。さらに、本発明は、蛍光的標識ヌクレオチドまたは蛍光の測定に依存する必要がないので、光漂白の機能などの検出できない蛍光作用としての単一分子レベルでの読取長の制限を回避できる。本発明はまた、長いポリヌクレオチド断片を同じ酵素システムで順次読み取ることを可能にする。このことは、再製でき再使用できる単一の酵素システムを使用可能にし、多くの異なるポリヌクレオチド・テンプレートを配列決定できる。最後に、二次および三次高調波発生が、光障害および光漂白を欠くことによる利点を提供する。これは、光化学が焦平面においても起きないことによる。非共鳴照射により刺激されたシグナルが有限のライフタイムをもつ励起状態を含まないからである。
【００１０】
本発明の第２の態様において、固体支持体材料が少なくとも１の固定されたポリマーおよびポリマー上またはそれに近接して位置する少なくとも１の２極分子を含む。
【００１１】
本発明の第３態様において、非リニアシグナルを検出するための影像システムが、ポリヌクレオチドと相互反応する酵素および酵素上または酵素に近接して位置する２極分子を固定している固体支持体を含むシステムを含む。
【００１２】
図面の説明
本発明を添付図面の参照で説明する。
図１は、二次高調波発生を用いる影像システムの模式的表示である。
図２は、具体的なポリヌクレオチドの組み込みに対するポリメラーゼにより発生された二次高調波シグナルを示す。
【００１３】
本発明の詳細な説明
本発明は、通常の非リニア光測定を用いて、ポリヌクレオチド進行型酵素が標的ポリヌクレオチド上の個々の塩基と相互反応するか、またはヌクレオチドを未完ポリヌクレオチド分子上に取り込むにしたがって起きる配座および/またはマスおよび/またはエネルギー分布の変化を同定する。
【００１４】
分子の影像に非リニア光法を使用することは既知である。知られていなかったことは、固定または固着された酵素を使用して、この方法をポリヌクレオチドの配列決定に利用できることである。
【００１５】
別の実施態様において、非リニアシグナルに加えてリニアシグナルをつくり、リニアシグナルを検出する。この２シグナルは合わさって、検出能を高めると言える。
【００１６】
本明細書での用語「ポリヌクレオチド」は、広く解釈されるべきであって、ＤＮＡおよびＲＮＡを含み、修飾ＤＮＡおよびＲＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリド、および他のハイブリダイズ核酸様分子、例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）を含む。
【００１７】
本明細書での用語「ポリヌクレオチド進行型酵素」は、広く解釈されるべきであって、ポリヌクレオチドと相互反応し、ポリヌクレオチドに沿って継続的に移動するすべての酵素に関する。この酵素は、好ましくはポリメラーゼ酵素であって、すべての既知の型であり得る。例えば、このポリメラーゼはＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼであり得る。標的ポリヌクレオチドがＲＮＡ分子であると、ポリメラーゼは、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼすなわちリバーストランスクリプターゼまたはＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼすなわちＲＮＡレプリカーゼであり得る。本発明の好ましい実施態様において、ポリメラーゼはＴ４ポリメラーゼである。さらなる好ましい実施態様において、ポリメラーゼは、E. coli ポリメラーゼIIIホロ酵素（McHenry, Ann. Rev. Biochem., 1988; 57: 519)、Ｔ７ポリメラーゼ（Schwager et al., Methods in Molecular and Cellular Biology, 1989/90; 1(4): 155-159)、E. coli チオレドキシンと複合しているバクテリアファージＴ７遺伝子５ポリメラーゼ（Tabor et al., J. Biol. Chem., 1987; 262: 1612-1623) のいずれかである。これらの各酵素は、高い進行性（信頼性）をもって標的ポリヌクレオチドに結合するので、重合化が活性的に起きないときでも、ポリメラーゼ-ポリヌクレオチド複合体を保持する。
【００１８】
ポリヌクレオチドと相互反応する別の酵素に、ヘリカーゼ、プリマーゼ、ホロ酵素、トポイソメラーゼ、ギナーゼ酵素がある。これらの酵素はさらなる利点を提供する。例えば、ヘリカーゼの使用は、ポリヌクレオチド分子中に存在する二次的構造の問題を減じる。ヘリカーゼは天然環境中でこの構造に対抗し克服する。第２に、ヘリカーゼは室温で２本鎖ＤＮＡに実施すべき必要な反応を可能にする。
【００１９】
酵素がポリヌクレオチド上で連続する塩基と相互作用するので、酵素が標的上のどの塩基（またはヌクレオチド）と接触させられるかに依存して、その配座が変化する。従って、反応における塩基対の付加についての時間的順序を核酸の単一分子について測定する。すなわち、配列決定すべきテンプレートのポリヌクレオチドに対する酵素系の活性をリアルタイムで追跡できる。配列は、どの塩基（またはヌクレオチド）が標的ポリヌクレオチドの大きくなりつつある相補鎖中に酵素の触媒的活性により取り込まれたかを同定することでもって、演繹する。
【００２０】
本発明の重要な態様は、影像システムに関する一定の位置に酵素を固定することである。これは、好ましくは酵素を固体支持体に、生物活性を保持する酵素で固定して、実施する。適当な酵素の固体支持体への固定化の方法は既知である。例えば、WO-A-99/05315 にポリメラーゼ酵素の固体支持体への固定化が記載されている。タンパク質を支持体に固定する一般的な方法が適している。
【００２１】
本発明で使用される光検出法は、単一分子レベルで影像し、すなわち１つの酵素についての明瞭な像／シグナルをつくることを意図する。複数の酵素をひとつの固体支持体に単一酵素分割ができる密度で固定し得る。従って、ひとつの実施態様では、固体支持体上に固定された複数酵素が存在し、本発明の方法をそれらに同時に実施できる。このことは異なるポリヌクレオチドを一緒に配列決定できる。
【００２２】
当業者に明らかなように、酵素活性を促進するのに適した条件で影像法を実施できる。例えば、ポリメラーゼ酵素については、ポリメラーゼ反応を進行さすのに必要な他の要素を要することは明らかである。この実施態様において、ポリヌクレオチド・プライマー分子およびヌクレオシド三リン酸ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰの各々を要する。ヌクレオシド三リン酸を順次加え、次のヌクレオシド三リン酸の導入の前に非結合ヌクレオチドを除去できる。あるいは、すべての三リン酸塩を同時に存在せしめ得る。好ましくは、１以上のブロッキング基を有する三リン酸塩を用いる。ブロッキング基はパルス単色光により選択的に除去でき、それにより非制御の組み込みを防げる。適当なブロックされた三リン酸塩は、WO-A-99/05315 に開示されている。
【００２３】
高分割非リニア光影像システムは当技術分野で既知である。一般的に、１つの物質についての非リニア分極化は、下記のように表示される。
Ｐ = Ｘ(１)Ｅ１ + Ｘ(２)Ｅ２ + Ｘ(３)Ｅ３ +.....
式中、Ｐは減少した分極化、Ｘ（ｎ）はｎ位数の非リニア感受性、Ｅは電場ベクターを表す。第１項は光の正常な吸収と反射を示し、第２項は二次高調波発生（ＳＨＧ）、和および差周波発生を示し、第３項は光散乱誘導ラマンプロセス、三次高調波発生（ＴＧＨ)、２および３光子吸収を示す。
【００２４】
本発明の好ましい影像システムは、二次および三次高調波発生から起きるシグナルの検出に依存する。
二次および三次高調波発生（以下、ＳＨＧという）を用いる単一分子分割は当技術分野で既知である（Peleg et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1999; 95: 6700-6704 および Peleg et al., Bioimaging, 1996, 4: 215-224)。
【００２５】
影像システムの一般的な仕組みについては、Peleg et al. (前出）に記載され、また図１に示すとおりである。図１において、レーザー（１）を照射源として用いて、レーザー光束を発生せしめ、これがポラライザー（２）を通過する。レーザー光束の一部が非リニア結晶（３）を通り、緑色光束をつくって、レーザー光束のアラインメントを助ける。フォトダイオード（４）を、発生された近赤外（ＮＩＲ）強度をモニターする手段を準備するために、光通路に近接して置く。フィルター（５）を顕微鏡の入口の前に入れて、顕微鏡の設置からくるいかなる二次高調波を防ぐ。固定された酵素を含む固体支持体上にレーザー光束を集め、非リニアシグナルをレンズ（７）で取り、モノクロメーター（８）で検出する。基本強度をＩＲフィルターでブロックする。光増倍器からのシグナルを、ボックスカー平均器およびチャネル積算器（９）で、増幅し、平均し、積算する。ついで、発生されたシグナルをコンピューター（１０）に移し、影像をつくる。
【００２６】
二次および三次高調波を発生さすために、適当な標識を固定された酵素上に、または酵素の近縁に置くことが必要である。高２極分子がこの目的に適している（Lewis et al., Chem. Phys., 1999; 245: 133-144)。適当な分子の例は、染料、特にスチリル染料（膜染料 JPW 1259 など、Molecular Probes 供給)。緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）が、ＳＨＧによる影像に使用し得る「染料」または「標識」の例である。本明細書において、ＧＦＳは、野生型タンパク質およびそのスペクトルシフトされた変異体の両方を意味する（Tsien, Ann. Rev. Biochem., 1998; 67: 509、US 5,777,079、US 5,625,048)。他の適当な染料には、ｄｉ-４-ＡＮＥＰＰＳ、ｄｉ-８-ＡＮＥＰＰＳ、ＪＰＷ２０８０（Molecular Probes）がある。
【００２７】
２極分子をポリヌクレオチドの個々の塩基に局在せしめ得る（または、２極分子がヌクレオチド三リン酸に接着し、ポリメラーゼ反応に使用されると、その相補体)。
【００２８】
本発明の好ましい実施態様において、酵素、例えばポリメラーゼをＧＦＰとの組換え融合として調製する。ＧＦＰは酵素のＮまたはＣ末端に位置し得る（ポリメラーゼを「スライディングクランプ」と関連して使用すると、Ｃ末端が望ましい)。あるいは、ＧＦＰ分子は、酵素活性が保持される限り、酵素中のいずれの位置でもよい。
【００２９】
本発明の別の実施態様において、非リニア光影像システムはラマン分光法または表面増強ラマン分光法（ＳＥＲＳ）である。ラマン分光法についての概要が McGlip, Progress in Surface Science, 1995; 49(1): 1-106 に記載されている。
【００３０】
ラマンシステムの励起に使用する光照射は、好ましくは近赤外照射（ＮＩＲ）である。ＮＩＲ照射は、周りの媒体または溶媒の蛍光およびラマンシグナルを低下せしめる利点がある。
【００３１】
本発明の別の実施態様において、非リニアシグナルを金属ナノ粒子および/または金属粗面の使用により高め得る（Boyed et al., Phys Rev., 1984; B. 30: 519-526, chen et al., Phys. Rev. Lett., 1981: 46; 1010-1012, Peleg et al. 前出)。シグナル増強金属ナノ粒子を、酵素にコンジュゲートし（例えば、ナノ粒子コンジュゲート抗体、Lewis et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1999; 96: 6700-6704)、固定された／局在された酵素の近くで固定されるか、またはＳＨＧ／酵素に密接するようにし得る。
【００３２】
金属ナノ粒子は、特にナノメータ領域からのＳＨＧに関連する分光影像を高め、もって単一分子レベルでの影像を改善する。ラマン散乱を基にする分光影像も金属ナノ粒子で改善できる。適当な金属ナノ粒子は既知であり、金および銀のナノ粒子がある。ナノ粒子は、一般的に直径が５ｎｍから１００ｎｍであり、好ましくは１０ｎｍから６０ｎｍである。ナノ粒子をポリヌクレオチドに接着できる（または、ナノ粒子がヌクレオチド三リン酸に接着し、ポリメラーゼ反応に使用されると、その相補体)。
【００３３】
金属粗面もＳＨＧプロセスの感受性を改善することが知られており（Chen et al., 1981、前出、および Peleg et al., 1996、前出)、そしてＳＥＲＳの要件でもある。金属表面は、通常は銀などの貴金属である。サブ波長空間分割での金属表面の最初の選択的改変を、原子力顕微鏡法（ＡＦＭ）を含む種々の技法で実施できる。白金被覆ＡＦＭチップを用いて、末端アジドのアミノ基への水素添加を触媒でき、このアミノ基をさらに誘導できる（Muller et al., Science, 1995; 268: 272-273)。ついで、この酵素を、光モードの局在する領域に高い局所場が存在する「ホットスポット」に置くことができる（Shalaev et al., Phys. Res., 1996; 272:61)。
【００３４】
本発明の別の実施態様において、ナノ粒子を、ＡＦＭカンチレバー・チップ／プローブを用いて酵素に密接の位置に持ってきて、もって非リニアシグナルを高め得る。
【００３５】
ＡＦＭは、タンパク質配座変化のダイナミックな影像に適用できる時間分割および感受性を有し得ることが最近明らかにされている（Rousso et al., J. Struc, Biol., 1997; 119: 158-164)。これを本発明の好ましい実施態様で使用する。そこでは、ＡＦＭプローブ／チップが酵素上に位置し、これを非リニア光情報（例えば、ＳＨＧ）と相俟って使用すると、酵素とヌクレオチド配列との相互作用によるタンパク質の配座の変化を、酵素が標的ポリヌクレオチドに沿って移動するにつれて、検出できる。この情報を、遠場使用共焦点光学または反射モードに、全内部反射と共に使用すると、収集できる。
【００３６】
さらなる実施態様において、非リニアシグナル（例えば、ＳＨＧ）を近場使用の近場走査光学顕微鏡（ＮＳＯＭ）でモニターできる。ＮＳＯＭは走査プローブ顕微鏡のひとつの形態であって、ナノ空間チップ（ＡＦＭで使用）とサンプルとの光学的相互作用を利用して、空間分割光学的情報を得る。ＳＨＧと併用される近場顕微鏡はよく研究されており、原子スケールで表面感受性であることが知られている（McGilp, 1995、前出)。影像システムの部分としてＮＳＯＭを用いる主な利点は、サブ波長次元への分割を非常に増加せしめ得ることである。本発明がポリメラーゼ酵素などの単一酵素の配座的モニターに関し、それがポリヌクレオチドと相互作用するので、サブ波長空間分割は非常に望ましい。本発明のこの態様において、ＡＦＭカンチレバー・チップを開口なしの近場走査顕微鏡（Sangohdar et al., J. Opt. A.: Pure Appl. Opt. 1999; 523-530）として使用するのが望ましい。これは、局所場向上源として金属ナノ粒子の使用に類似する。好ましくは、チップを、局所電磁場を増加するように働く貴金属などの金属からつくるか、それらの金属で被覆する。あるいは、金属ナノ粒子をカンチレバーチップに直接結合せしめる。これを単一分子レベルで配座変化のモニターに適用できることが知られている（Rousso et al.、前出)。
【００３７】
本発明のさらなる別の実施態様において、独立的に発生された表面プラズモン（または分極化）／一過性場を用いて、非リニアシグナルのシグナル対ノイズの比率を高めることができる。この一過性波が高める影像法は、ＳＨＧ影像などの単独よりも大きいシグナル対ノイズの比率を有する。この実施態様において、標識酵素からの一過性に高められたＳＨＧ場シグナルは、ＮＳＯＭファイバーにより近場に、ＡＦＭ配座データを同時的に得るとともに、収集でき、同時に、吸収された一時的照射の量をモニターして、一時的場と標識ポリメラーゼ／ＳＨＧ場とのカップリング量に関する情報を得ることができる。
【００３８】
この配置（ＮＳＯＭ収集態様）において、システムが光子走査トンネル顕微鏡（ＰＳＴＭ）として働き、一時的または表面のプラズモン場がＮＳＯＭファイバープローブ・チップ中に結合される。ポリメラーゼによるチップ到達シグナルの場強度の低下をチップ末端に位置する検出器でモニターする。
【００３９】
表面プラズモン共鳴は当技術分野で既知であり、インシデント光束をプリズムに適用することによる一時的波の形成に基づく。この実施態様における使用の典型的セットアップは、酵素が固定された金属被覆ガラスのカバースリップに光学的に結合されたプリズムからなる。カバースリップは、固定された酵素上にリガンド（ヌクレオチド）を導入するための入口を有する微流体流細胞システムの部分である。酵素を標識して、非リニア作用の形成を可能ともする。インシデント光束をプラズマに適用して、表面プラズモン場を形成せしめる。同時に、パルス近赤外レーザーをポラライザーおよび半波プレートを通して、光二次高調波ノイズ除くためのフィルターによる光束制御用の光スキャナーに、ついでサンプルに向けることによって、形成せしめる。非リニア光シグナルをレンズおよびフィルターで収集し、モノクロメーターに向け、検出のための光増倍管に通して増幅し、コンピューターシステムで記録する。
【００４０】
非リニア光シグナルが一時的場を形成する光に結合されると、検出される光がリニア（一時的）シグナルでもあり得る。この実施態様において、ＮＳＯＭを収集に用いてリニアシグナルを検出できる。
【００４１】
本発明の別の態様において、ポリヌクレオチド配列決定を細胞中で実施できる。
元の細胞環境において、ＤＮＡポリメラーゼおよびその関連レプリソーム複合体が細胞中の適所（または空間に位置されて）に保持されていることが示されている（Newport et al., Curr. Opin. Cell Biol., 1996; 8: 365、Lemon et al., Science, 1998; 1516-1519)。この元の保持複製複合体は酵素の固体支持体への固定に類似する。
【００４２】
これは、単一分子レベルでのレプリソーム関連分子の配座的およびテンプレート関連変化のインビボ・モニターをＤＮＡ複製および/または細胞分裂時にリアルタイムで実施可能にする。
【００４３】
この態様を実施するために、非リニア光検出法を用いて酵素を造影できるように、酵素を修飾することが必要である。これは、酵素の緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）との遺伝学的融合により達成できる。細胞はまた、検出ができるように固定化しなければならない。
【００４４】
発現された融合タンパク質を、その保持細胞位置で、非リニア光検出を用いて（二次高調波発生）、モニター／検出できる。
下記の実施例が本発明を説明する。
【実施例】
【００４５】
この試験において、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）とポリメラーゼとの融合タンパク質を、当技術分野で既知の組換え法でつくった。
石英チップ（直径１４ｍｍ、厚さ０.３ｍｍ）を厚さ５０ｎｍ層の金でスピン被覆し、ついで１層の平面デキストランで被覆した。これらの金被覆石英チップを注文製造の近場走査光顕微鏡（ＮＳＯＭ）の流体細胞中に入れた。金被覆石英チップを石英プリズムにインデクス・マッチング油で光学的に結合せしめた。流体細胞を密封し、ポリメラーゼ緩衝液がチップ上を流れるようにした。
【００４６】
ポリメラーゼのチップ表面への固定を、Jonsson et al., Biotechniques, 1991, 11: 620-627 に従って行った。チップ環境をランニング緩衝液（１０ｍＭ hepes、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０.０５％界面活性剤Ｐ２０、ｐＨ７.４）で平衡とした。等量のＮ-ヒドロキシスクシンイミド（水中０.１Ｍ）およびＮ-エチル-Ｎ'-(ジメチルアミノプロピル)-カルボジミド（ＥＤＣ)（水中０.１Ｍ）を混合し、チップ表面に沿って注入して、カルボキシメチル化デキストランを活性化した。ポリメラーゼ−ＧＦＰ融合タンパク質（１５０μｌ）を１０ｍＭ酢酸ナトリウム（１００μｌ、ｐＨ５）と混合し、活性化表面に注入した。最後に、チップ表面の残渣のＮ-ヒドロキシスクシンイミドエステルをエタノールアミン（３５μ１、水中１Ｍ、ｐＨ８.５）と反応せしめ、非結合ポリメラーゼを表面から洗い出した。固定を、連続流のランニング緩衝液（５μｌ／分）で、温度２５℃で実施した。
【００４７】
５０μｌの抗体形成緩衝液（１０ｍＭ ＭＥＳ ｐＨ６.０、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＥＤＴＡ）をチップ表面上の固定されたポリメラーゼ／ＧＦＰに流速５μｌ／分、２５℃で流した。主要抗体（ＧＦＰ（Ｂ−２）Ｂビオチン・コンジュゲート２００μｌ ｍｌ-１、Santa Crus Biotechnology）を抗体形成緩衝液中に１：３０００で稀釈し、チップ表面上に流速５μｌ／分で３０分間流れるようにした。ついで過剰の抗体を表面から、抗体形成緩衝液をチップ表面上に流速５μｌ／分で３０分間流して除去した。
【００４８】
二次抗体（免疫金コンジュゲートＥＭ山羊アンチマウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）４０ｎｍ、british Biocell International）を抗体形成緩衝液中に１：１０００で稀釈し、チップ表面上に流速５μｌ／分で３０分間流れるようにした。ついで過剰の抗体を表面から、抗体形成緩衝液をチップ表面上に流速５μｌ／分で３０分間流して除去した。緩衝液をランニング緩衝液に戻し、次の工程の開始前に、チップ表面上に流速５μｌ／分で３０分間流れるようにした。
【００４９】
２つのオリゴヌクレオチドを標準的ホスホアミジト化学で合成した。配列番号１と称するオリゴヌクレオチドを標的ポリヌクレオチドとして使用し、配列番号２と称するオリゴヌクレオチドをプライマーとして使用した。
配列番号１
【表１】
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配列番号２
【表２】
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【００５０】
ポリメラーゼの配座変化を検出するために、修飾ＮＳＯＭを、タッピングモードで、引き石英多モード１００μｍ長ファイバー・カンチレバーとともに使用した。カンチレバーをその共鳴波近くで駆動し、最初の面積走査を、固定された酵素を含有するチップの表面で実施した。二次高調波シグナルを流細胞中の固定ポリメラーゼから、律動近赤外レザー源からの最初の照射により発生せしめた。ついでＮＳＯＭチップを、ポリメラーゼに連結する流細胞中の４０ｎｍ金粒子の影像を得るために、流細胞中のチップ表面上を走査した。ついでチップをポリメラーゼ上に停止モードで保持した。
【００５１】
前開始で前駆動の複合体を流細胞中に流速５μｌ／分で注入すると、プライマー−テンプレート分子の周りの「クランプ」が、固定されたポリメラーゼとの複合体を形成した。流細胞を２５℃に、流細胞中につくられた冷デバイスにより保持した。
【００５２】
ランニング緩衝液を流細胞に５００μ／分で持続的に流した。１０分後に配列決定反応を、０.４ｍＭ ｄＡＴＰ（８μｌ）を緩衝液へ流速５００μｌ／分で注入して、開始した。４分後に０.４ｍＭ ｄＴＴＰ（８μｌ）を流細胞に注入した。さらに４分後に０.４ｍＭ ｄＧＴＰ（８μｌ）を、そしてさらに４分後に０.４ｍＭ ｄＣＴＰ（８μｌ）を注入した。この周期を１０回繰り返した。全期間を通じて、多モード・ファイバーにより移行された二次高調波シグナルをモノクロメーターに通し、ついで光増倍器に通した。光増倍器からのシグナルを増幅し、処理および保存のためのコンピューターに入れた。
【００５３】
各注入開始から１０秒間におけるポリメラーゼ複合体から生じる二次高調波シグナルの強度変化を計算し、流細胞中に注入されたヌクレオチドに対してプロットした。配列決定反応の結果を図２に示す。グラフから読み取れるように、大きい強度変化（各々に近接する同一のヌクレオチドを説明する大きい強度変化）が配列番号１の変化の補足に相当する（右から左に読む。プライマー配列にハイブリダイズする部分を引く)。
【図面の簡単な説明】
【００５４】
【図１】二次高調波発生を用いる影像システムの模式的表示である。
【図２】具体的なポリヌクレオチドの組み込みでポリメラーゼにより発生された二次高調波シグナルを示す。
【図２】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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