(57)【要約】本発明は、簡単な１成分系において修復組換えを使用して核酸分子の配列を改変するための新規な方法に関する。組換え反応の頻度は高く、一定範囲の可能な選択ストラテジーにより首尾よい組換え事象が同定されることを可能にする。この方法は、以下の工程を包含する：第１の核酸分子を、該第１の核酸分子と第２の核酸分子との間に修復組換えが生じるに適切な条件下で、ファージアニーリングタンパク質、またはその機能的等価物もしくはフラグメントの存在下で第２の核酸分子と接触させる工程であって、該第１の核酸分子は、該第２の核酸分子と共有された配列相同性の少なくとも２つの領域を含む、工程；ならびに配列が第２の核酸分子由来の配列を含むように改変された核酸分子を選択する工程。【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸分子の配列を改変するための方法であって、該方法は、以下の工程：
ａ）第１の核酸分子を、ファージアニーリングタンパク質、またはその機能的等価物もしくはフラグメントの存在下で第２の核酸分子と接触させる工程であって、該第１の核酸分子は、該第１の核酸分子と該第２の核酸分子との間で修復組換えが生じるに適切な条件下で、該第２の核酸分子と共有された配列相同性の少なくとも２つの領域を含む、工程；ならびに
ｂ）配列が第２の核酸分子由来の配列を含むように改変された核酸分子を選択する工程、
を包含する、方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、ＲｅｃＥ／Ｒｅｄαタンパク質が、原核生物細胞において行われるいずれの配列改変反応の間にも存在しないことを条件とする、方法。
【請求項３】
請求項１または請求項２に記載の方法であって、前記ファージアニーリングタンパク質が、宿主種内に含まれるか、または宿主種によりコードされる、方法。
【請求項４】
請求項３に記載の方法であって、前記宿主種が、ウイルス細胞、寄生生物細胞、原核生物細胞または真核生物細胞である、方法。
【請求項５】
請求項４に記載の方法であって、前記宿主種が、グラム陰性細菌細胞である、方法。
【請求項６】
請求項５に記載の方法であって、前記細菌細胞が、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ細胞である、方法。
【請求項７】
請求項６に記載の方法であって、前記Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ細胞が、ＪＣ５５１９株、ＪＣ８６７９株、またはＪＣ９６０４株のようなＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｋ１２株の細胞である、方法。
【請求項８】
請求項４に記載の方法であって、前記宿主種がＥＳ細胞である、方法。
【請求項９】
請求項８に記載の方法であって、前記宿主がマウスＥＳ細胞である、方法。
【請求項１０】
請求項３〜９のいずれか１項に記載の方法であって、前記宿主が、ファージアニーリングタンパク質、その機能的等価物またはフラグメントをコードする遺伝子を発現し得る少なくとも１つのベクターで形質転換される、方法。
【請求項１１】
請求項１０に記載の方法であって、前記ファージアニーリングタンパク質、機能的等価物またはフラグメントをコードする遺伝子の発現が、調節可能なプロモーターの制御下にある、方法。
【請求項１２】
請求項３〜９のいずれか１項に記載の方法であって、前記ファージアニーリングタンパク質、機能的等価物またはフラグメントが、前記宿主種に導入されたメッセンジャーＲＮＡ分子から発現される、方法。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法であって、前記ファージアニーリングタンパク質が、ＲｅｃＴ（ｒａｃプロファージ）、Ｒｅｄβ（ファージλ）、およびＥｒｆ（ｐ２２）、またはその機能的等価物もしくは活性なフラグメントからなる群より選択される、方法。
【請求項１４】
請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法であって、前記第１の核酸分子が直鎖状である、方法。
【請求項１５】
請求項１４に記載の方法であって、前記第１の核酸分子は、一本鎖ＤＮＡ分子、一本鎖ＲＮＡ分子、二本鎖ＤＮＡ分子、５’オーバーハングを有する二本鎖ＤＮＡ分子、および３’オーバーハングを有する二本鎖ＤＮＡ分子からなる群より選択される、方法。
【請求項１６】
請求項１５に記載の方法であって、前記第１の核酸分子が、一本鎖核酸分子である、方法。
【請求項１７】
請求項１４〜１６のいずれか１項に記載の方法であって、前記第１のＤＮＡ分子が、増幅反応により得られる、方法。
【請求項１８】
請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法であって、前記第２の核酸分子が、環状である、方法。
【請求項１９】
請求項１８に記載の方法であって、前記第２の核酸分子が、宿主細胞において作動する複製起点を含む染色体外核酸分子である、方法。
【請求項２０】
請求項１８または請求項１９に記載の方法であって、前記第２の核酸分子が、プラスミド、コスミド、Ｐ１ベクター、ＢＡＣベクターおよびＰＡＣベクターからなる群より選択される、方法。
【請求項２１】
請求項１８〜２０のいずれか１項に記載の方法であって、前記第２の核酸分子が宿主細胞染色体である、方法。
【請求項２２】
請求項１〜２１のいずれか１項に記載の方法であって、前記第１の核酸分子と前記第２の核酸分子との間で共有される配列相同性の領域が、各々少なくとも９ヌクレオチドである、方法。
【請求項２３】
請求項３〜２２のいずれか１項に記載の方法であって、前記第１および／または前記第２の核酸分子が、形質転換により宿主種に導入される、方法。
【請求項２４】
請求項２３に記載の方法であって、前記形質転換法がエレクトロポレーションである、方法。
【請求項２５】
請求項３〜２４のいずれか１項に記載の方法であって、前記第１および前記第２の核酸分子が、同時形質転換により前記宿主種に導入される、方法。
【請求項２６】
請求項３〜２５のいずれか１項に記載の方法であって、前記第１の核酸分子が、前記第２の核酸分子が既に存在する宿主細胞に導入される、方法。
【請求項２７】
請求項１〜２６のいずれか１項に記載の方法であって、前記組換え事象がインビトロで生じる、方法。
【請求項２８】
請求項１〜２７のいずれか１項に記載の方法であって、前記組換え事象がインビボで生じる、方法。
【請求項２９】
ファージアニーリングタンパク質、またはその機能的等価物もしくはフラグメントをコードする遺伝子を発現し得る細胞の、修復組換えを含むクローニング法のための宿主としての使用。
【請求項３０】
請求項２９に記載の使用であって、前記細胞が原核生物であり、該細胞がＲｅｃＥ／Ｒｅｄαを含まないことを条件とする、使用。
【請求項３１】
ファージアニーリングタンパク質、またはその機能的等価物もしくはフラグメントをコードする遺伝子を発現し得るベクター系の、修復組換えを含むクローニング法のための宿主種における使用。
【請求項３２】
請求項３１に記載の使用であって、前記宿主種が原核生物であり、該宿主種がＲｅｃＥ／Ｒｅｄαを含まないことを条件とする、使用。
【請求項３３】
核酸分子の配列を改変するための方法であって、該方法は、以下の工程：
ａ）第１の核酸分子を、第２の核酸分子の存在下で、ファージアニーリングタンパク質、またはその機能的等価物もしくはフラグメントに曝して、結合分子を生成する工程であって、該第１および該第２の核酸分子は、配列相同性の少なくとも２つの領域を共有する、工程；
ｂ）該結合分子を、該第１の核酸分子と該第２の核酸分子との間に組換え修復が生じるに適切な条件下でインキュベートする工程；ならびに
ｃ）配列が該第２の核酸分子由来の配列を含むように改変された核酸分子を選択する工程、
を包含する、方法。
【請求項３４】
請求項３３に記載の方法であって、前記ＲｅｃＥ／Ｒｅｄαタンパク質が、原核生物細胞において行われる配列改変反応の過程の間に存在しないことを条件とする、方法。
【請求項３５】
核酸分子の配列を改変するための方法であって、該方法は、以下の工程：
ａ）第１の核酸分子を、ファージアニーリングタンパク質またはその機能的等価物もしくはフラグメントに曝して、コートされた核酸分子を生成する工程；
ｂ）該コートされた分子を、該第１の核酸分子と該第２の核酸分子との間に修復組換えが生じるに適切な条件下で、該第２の核酸分子に接触させる工程であって、該第１および該第２の核酸分子は、配列相同性の少なくとも２つの領域を共有する、工程；ならびに
ｃ）配列が、該第２の核酸分子由来の配列を含むように改変された核酸分子を選択する工程、
を包含する、方法。
【請求項３６】
核酸をクローニングするための方法であって、請求項１〜２８または請求項３３〜３５のいずれか１項に記載の核酸分子の配列を改変する方法を利用する、方法。
【請求項３７】
核酸分子の配列を操作するための、請求項１〜２８または請求項３３〜３５のいずれか１項に記載の方法の工程を包含する、方法。
【請求項３８】
核酸分子の混合物から所望の核酸分子を選択する方法であって、該方法は、以下の工程：
ａ）所望の核酸分子の配列に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチド分子を、コートされた分子または結合分子複合体の形成に適切な条件下で、ファージアニーリングタンパク質、またはその機能的等価物もしくはフラグメントに曝す工程；
ｂ）該コートされた分子または結合分子の複合体を、前記核酸分子の混合物とともにインキュベートする工程；ならびに
ｃ）ファージアニーリングタンパク質に結合された核酸分子を選択する工程、
を包含する、方法。
【請求項３９】
請求項３８に記載の方法であって、前記オリゴヌクレオチドがタグを含む、方法。
【請求項４０】
請求項３８または請求項３９に記載の方法であって、前記工程ｃ）において選択された核酸分子は、タグ化されたオリゴヌクレオチドを単離するためにアフィニティー分離方法を使用して選択される、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、簡単な１成分系において修復組換えを使用して核酸分子の配列を改変するための新規な方法に関する。組換え反応の頻度は高く、一定範囲の可能な選択ストラテジーにより首尾よい組換え事象が同定されることを可能にする。
【背景技術】
【０００２】
本明細書中に引用される全ての刊行物、特許および特許出願は、全体が参考として援用される。
【０００３】
核酸分子、特にＤＮＡ分子の操作は、生命科学の研究にとって根本的に重要である。例えば、核酸分子の構築および正確な操作が多くの研究、ならびに例えば、機能的ゲノミクス（総説については、ＶｕｋｍｉｒｏｖｉｃおよびＴｉｌｇｈｍａｎ、Ｎａｔｕｒｅ  ４０５（２０００），８２０−８２２を参照のこと）、構造ゲノミクス（総説については、Ｓｋｏｌｎｉｃｋら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  １８（２０００），２８３−２８７を参照のこと）およびプロテオミクス（総説については、Ｂａｎｋｓら、Ｌａｎｃｅｔ  ３５６（２０００），１７４９−１７５６；ＰａｎｄｅｙおよびＭａｎｎ，Ｎａｔｕｒｅ  ４０５（２０００），８３７−８４６を参照のこと）の研究分野における応用において必要である。
【０００４】
核酸分子、特にＤＮＡ分子の操作に現在利用可能な多くの方法がある。なお最も広く使用されている従来の方法は、制限消化、続いてライゲーション（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ＪおよびＲｕｓｓｅｌｌ  Ｄ．Ｗ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ，第３版（２０００）Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋを参照のこと）に依存している。核酸組換えの種々の機構の本発明者らの理解が進んだことにより、従来のクローニング技術を補足し、相同組換え（原核生物においては、以下を参照のこと；真核生物においては、例えば、Ｂｏｄｅら、Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ３８１（２０００）８０１−８１３；Ｊｏｙｎｅｒ，Ｇｅｎｅ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ，ａ  ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ（２０００）第２版，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋを参照のこと）、ＰＣＲ特異的変異誘発（ＬｉｎｇおよびＲｏｂｉｎｓｏｎ，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２５４（１９９７），１５７−１７８を参照のこと）、部位特異的組換え（例えば、Ｈａｕｓｅｒら、Ｃｅｌｌｓ  Ｔｉｓｓｕｅｓ  Ｏｒｇａｎｓ  １６７（２０００），７５−８０）およびトランスポゾン変異誘発（例えば、Ｍａｒｔｉｅｎｓｓｅｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９５（１９９８），２０２１−２０２６；ＰａｒｉｎｏｖおよびＳｕｎｄａｒｅｓａｎ，Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １１（２０００），１５７−１６１を参照のこと）を利用する、より進んだストラテジーにより部分的に置換することを可能にした。
【０００５】
しかし、これらの技術は、しばしば、固有の複雑さを含む。例えば、ＰＣＲベースのインビトロストラテジーは、正確な部位特異的変異誘発をもたらすことを可能にするが、このような方法は、変異した核酸生成物の増幅の間に、標的化された分子において所望でない人工的な第２の変異が導入されるという欠点をもつ。さらに、この方法は、現在では、最大サイズが約１０〜１５キロ塩基対の分子に制限されている。他の技術は、任意の選択された位置での融通のきくＤＮＡ操作が可能ではないが、代わりに、特定の配列エレメントを要する（部位特異的組換えベースの方法）か、またはランダム標的化（トランスポゾンベースの方法）のために使用される。また、現在では、相同組換えによる真核生物におけるＤＮＡ操作については、長い相同性の長さが必要である。
【０００６】
ＤＮＡ操作における相同組換えの適用は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおいて開拓されてきた（総説については、Ｓｈａｓｈｉｋａｎｔら、Ｇｅｎｅ  ２２３（１９９８），９−２０を参照のこと）。しかし、いくつかの固有の複雑さが、ＤＮＡ操作の宿主としての酵母の有用性を制限しているので、相同組換えベースのＤＮＡ操作は、現在では、最初のクローニング宿主であるＥ．ｃｏｌｉにおいて確立されている（総説については、Ｍｕｙｒｅｒｓら、Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈ  Ｓｃｉ，（２００１）２６（５）：３２５−３３１を参照のこと）。今日まで、３つの主要な組換え経路がＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉにおいて記載されている。これら経路の全ては、何らかの方法で、組換え生成（recombinogenic）ＤＮＡ操作のために使用されてきた（総説については、Ｍｕｙｒｅｒｓら、Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｓｃｉ，（２００１）２６（５）：３２５−３３１を参照のこと）。
【０００７】
最も広く保存されている経路は、ＲｅｃＡ依存性組換え経路であり、この経路は、細菌細胞において組換え生成プロセスの大部分を担う。多くのこのような組換え生成プロセスにおいて、ＲｅｃＡ（進化において最も顕著な鎖侵入タンパク質（strand invasion protein））は、ＲｅｃＢＳＤ（ＲｅｃＢサブユニット、ＲｅｃＣサブユニットおよびＲｅｃＤサブユニットから構成される最も大きなホロ酵素）と機能的に働き合い、これらのサブユニットは、他の機能の中でも、活発なエキソヌクレアーゼ活性を示す（総説については、Ｋｏｗａｌｃｚｙｋｏｗｓｋｉら、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｒｅｖ  ５８（１９９４），４０１−４６５；Ｋｕｚｍｉｎｏｖ，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  Ｒｅｖ  ６３（１９９９），７５１−８１３を参照のこと）。
【０００８】
第２の組換え経路は、ＲｅｃＦ経路である。この経路は、タンパク質の大きな群（ＲｅｃＦ、および最もあり得るのは、ＲｅｃＡを含む）の間の相互作用に依存し、ｓｂｃＢＣＤ変異により活性化される（Ｒｙｄｅｒら、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １４３（１９９６），１１０１−１１１４；Ｐｈｉｌｌｉｐｓら、Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ  １７０（１９９８），２０８９−２０９４；Ｃｒｏｍｉｅら、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １５４（２０００），５１３−５２２）。
【０００９】
第３の経路において、組換えは、ＲｅｃＥ／ＲｅｃＴタンパク質対またはλファージ由来のその機能的ホモログ（Ｒｅｄα／Ｒｅｄβ）の両方の成分の発現を必要とする。これらタンパク質対の機能的相同性は、ＲｅｃＥおよびＲｅｄαの両方が５’→３’エキソヌクレアーゼであり、ＲｅｃＴおよびＲｅｄβの両方がインビトロおよびインビボで種々の類似の活性を示すアニーリングタンパク質であるという知見から明らかである。ＲｅｃＥ／ＲｅｃＴおよびＲｅｄα／Ｒｅｄβが機能的に等価であることが、種々の研究により結論付けられた（ＨａｌｌおよびＫｏｌｏｄｎｅｒ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１（１９９４），３２０５−３２０９；Ｋｏｌｏｄｎｅｒら、Ｍｏｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  １１（１９９４）２３−３０；Ｍｕｙｒｅｒｓら、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ  １４（２０００），１９７１−１９８２）。
【００１０】
最近の数年、正確なＤＮＡ操作のためにＲｅｃＥ／ＲｅｃＴタンパク質対（またはその機能的ホモログ対であるＲｅｄα／Ｒｅｄβ）を使用するＥＴ組換えといわれる技術が、開発された（Ｚｈａｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ  ２０（１９９８），１２３−１２８；Ｍｕｙｒｅｒｓら、Ｎｕｃｌ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ２７（１９９９），１５５５−１５５７；共有に係る同時係属中の国際特許出願ＷＯ９９／２９８３７；総説については、Ｍｕｙｒｅｒｓら、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈ  Ｓｃｉ（２００１）２６（５）：３２５−３３１を参照のこと）。ＥＴ組換えは、一定範囲のＤＮＡ改変に広く適用可能である。さらに、この方法は、１工程にて複雑な混合物（例えば、ゲノムＤＮＡおよび細菌人工染色体（ＢＡＣ））からＤＮＡ配列をクローニングし、それによりＰＣＲ増幅の代わりに、高い忠実度を提供するために使用され得る（Ｚｈａｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  １８（２０００），１３１４−１３１７；また、共有に係る同時係属中の国際特許出願ＷＯ０１／０４２８８）。
【００１１】
ＥＴ組換えは、ＲｅｃＡ依存性組換え機構を介して機能する。この機構は、オルソログタンパク質対の両方の成分の間の（最もあり得るのは、物理的相互作用を介して）特定の機能的協同作用を使用する（従って、機能的相互作用は、ＲｅｃＥとＲｅｃＴとの間、またはＲｅｄαとＲｅｄβとの間に必要とされる；Ｍｕｙｒｅｒｓら、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ  １４（２０００），１９７１−１９８２）。さらに、オルソログタンパク質対の各々は、２つの異なる組換え経路を通じて必要な組換え反応を媒介し得る。これらの組換え経路は、おそらく、それぞれ鎖侵入および鎖アニーリングに基づくようである（Ｍｕｙｒｅｒｓら、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ  １４（２０００），１９７１−１９８２）。
【００１２】
この系は、非常に強力であり、所望であれば、核酸分子に置換、欠失および挿入を導入するために使用され得る。しかし、この方法は、２つのタンパク質の発現が必要であることにより複雑であり、いくつかの場合においては、調節と組み合わされる。従って、特定の適用において、成分の制御された発現を達成することは、骨が折れることである。また、ＥＴ組換えは、ＲｅｃＢＣＤホロ酵素の非存在または不活性化を必要とする。また、ＥＴ組換えに要する組換え生成能力は、特に標的核酸分子がかなりの反復を含む場合は、標的核酸分子における所望されない内部欠失または再配置の出現を生じ得る。
【００１３】
従って、上記の問題を欠点としてもたない、核酸分子を操作するための簡単な、効率的な方法を開発する必要が未だにある。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明に従って、核酸分子の配列を改変するための方法が提供される。この方法は、以下の工程を包含する：
ａ）第１の核酸分子を、この第１の核酸分子とこの第２の核酸分子との間に修復組換えが生じるに適切な条件下で、ファージアニーリングタンパク質、またはその機能的等価物もしくはフラグメントの存在下で第２の核酸分子と接触させる工程であって、この第１の核酸分子は、この第２の核酸分子と共有された配列相同性の少なくとも２つの領域を含む、工程；ならびに
ｂ）配列が第２の核酸分子由来の配列を含むように改変された核酸分子を選択する工程。
【００１５】
本発明に従って、ＲｅｃＴ（ｒａｃプロファージ由来）、Ｒｅｄβ（ファージλ由来）、およびＥｒｆ（ファージｐ２２由来）のようなファージアニーリングタンパク質が、修復組換え事象の促進において活性を示すことが発見された。この活性は、任意の他のファージ由来パートナーとは無関係である。インビトロでは、上記第１の核酸分子と上記第２の核酸分子との間の結合分子の形成は、アニーリングタンパク質の存在にのみ依存する。インビボでは、他の外来性成分は、反応にまったく必要なく、特定の細胞操作も、この方法を進めるためには必要でない。例えば、ｒｅｃＢＣＤは、不活化される必要がなく；この方法はなお、ｒｅｃＢＣＤ＋バックグラウンドにおいて有効に働く。従って、この方法は、これまで記載された方法より有利である。特に、この方法は、ＲｅｃＥタンパク質およびＲｅｃＴタンパク質の両方が存在する必要がないという点で、ＥＴ組換えより有利である（Ｚｈａｎｇら（１９９８）；Ｍｕｙｒｅｒｓら（１９９９）；ＷＯ９９／２９８３７）。この方法と、ＥＴ組換えをさらに区別するために、この方法は、ＲｅｃＥ／Ｒｅｄαタンパク質が、原核生物細胞において行われるいずれの配列改変反応の間にも存在しないという条件を含み得る。この方法は、１つの種のファージアニーリングタンパク質、機能的等価物もしくはフラグメントの存在下で行われ得るが、当業者に明らかなように、他の関与しないファージアニーリングタンパク質の存在は、本明細書中に記載の方法に対して悪影響を及ぼさない。この方法は、置換核酸（第１の核酸分子）の一部の、標的核酸（第２の核酸分子）の等価な部分への置換を含む組換え事象に依存する。この標的核酸の等価な部分に対して、２つの分子型の間の配列相同性の共有された領域の存在を介してこの方法が方向付けられる。従来の相同組換え事象を用いると、置換核酸が、標的核酸に共有結合される。
【００１６】
このようにして、第１の核酸分子（置換核酸分子）における配列情報は、正確かつ特異的様式にて、高い忠実度を伴って、第２の核酸分子（標的核酸分子）へと組み込まれる。
【００１７】
この方法の効率は高く、選択可能な遺伝子を使用して任意の圧を与える必要なくして、１工程で配列の操作を可能にする。さらに、置換核酸と標的核酸との間に必要な相同性の領域が短く、このことは、例えば、必要な配列を有するオリゴヌクレオチドを調製または購入することにより、導入される核酸配列を含む分子を生成することが簡単であることを意味する。
【００１８】
この方法は、例えば、正確な部位特異的変異誘発（配列の欠失、挿入および置換を含む）のような多くの異なる適用に使用され得る。欠失、挿入または置換される配列の量は、１ヌクレオチド（点変異の導入の場合）と長さ数キロ塩基対の核酸分子との間で変化し得る。適切に操作され得る核酸分子型の例としては、プラスミド（例えば、ＥＳ細胞標的化のために使用される標的構築物）、細菌人工染色体（ＢＡＣ）（例えば、遺伝子導入（transgenesis）において使用される）、内因性の原核生物染色体および真核生物細胞染色体が挙げられる。
【００１９】
ＥＴ組換えと修復組換えとの間のいくつかの差異が存在することが見出される。これらの差異により、以前に記載された経路から、本発明において利用される組換え経路が明らかに区別される（以下で議論される）。
【００２０】
「核酸分子の配列を改変する」とは、核酸分子の構成ヌクレオチド成分がある方法において変化されることを意味する。改変の例としては、標的核酸分子の１以上の構成ヌクレオチドの挿入、欠失または置換（例えば、点変異の導入または改変されたタンパク質リーディングフレームの作製）が挙げられる。挿入、欠失および置換の興味ある組み合わせもまた可能である。
【００２１】
本出願に適用される変更事象の型に制限はないが、最も明らかな適用は、現在利用可能なアプローチを使用するかなり困難でありかつ時間を浪費する適用である。例としては、任意の種における内因性核酸分子（例えば、酵母染色体、マウス胚性幹細胞染色体、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ染色体、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ染色体およびＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ染色体、ヒト細胞株、ウイルスおよび寄生虫）または外因性分子（例えば、プラスミド、酵母人工染色体（ＹＡＣ）およびヒト人口染色体（ＨＡＣ））の正確な改変が挙げられる。
【００２２】
第１の核酸分子、または置換核酸分子は、環状であっても線状であってもよいが、好ましくは、線状ＤＮＡ分子または線状ＲＮＡ分子である。例としては、５’または３’のいずれかの方向での一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡである。平滑末端を有するかまたは５’オーバーハングもしくは３’オーバーハングのいずれかを有する、アニーリングしたオリゴヌクレオチドがまた、使用され得る。好ましくは、一本鎖オリゴヌクレオチドが使用され、最も好ましくは、一本鎖デオキシリボヌクレオチドである。合成改変を保有する第１の核酸分子がまた、使用され得る。
【００２３】
置換核酸分子が必ずしも単一種の核酸分子ではないことは、注意すべきである。例えば、ＤＮＡライブラリー（例えば、ゲノムライブラリーまたはｃＤＮＡライブラリー）を生成するための核酸分子の異種性集団を使用することが可能である。
【００２４】
第２の核酸分子はまた、本明細書中で標的核酸分子といわれる。多くの異なる型の核酸分子は、本発明の方法を使用して標的化され得る。従って、プラスミドのようなインタクトな環状二本鎖核酸分子（ＤＮＡまたはＲＮＡ）、およびコスミドベクター技術、Ｐ１ベクター技術、ＢＡＣベクター技術またはＰＡＣベクター技術に基づく他の染色体外ＤＮＡ分子は、上記の本発明の従う第２の核酸分子として使用され得る。このようなベクターの例は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ（Ｍｏｅｌｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｔｈｉｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（２０００），Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）およびＩｏａｎｎｏｕ，ｅｔ  ａｌ．（Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．６（１９９４），８４−８９）ならびにこれらに引用される参考文献によって記載される。
【００２５】
第２の核酸分子はまた、宿主細胞染色体（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ染色体）であり得る。あるいは、真核生物宿主細胞染色体（例えば、酵母、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ、マウスまたはヒト由来）または真核生物染色体外ＤＮＡ分子（例えば、プラスミドＹＡＣおよびＨＡＣ）が使用され得る。あるいは、標的核酸分子は、環状である必要はないが、直線であり得る。好ましくは、第２の核酸分子は、二本鎖核酸分子であり、より好ましくは、二本鎖ＤＮＡ分子である。
【００２６】
第１の核酸分子または第２の核酸分子のいずれかが、選択マーカーおよび複製起点を含むべきであることは、注意すべきである。この方法において、選択マーカーおよび／または複製起点は、修復組換えによって標的核酸分子中に組み込まれ得、これによりこの核酸分子は、宿主細胞中で選択され得そして増殖され得る。
【００２７】
第１の核酸分子（第２の核酸分子ではない）が起点および選択マーカー遺伝子を保有する場合において、本発明の方法は、Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  １８（２０００），１３１４−１３１７によって記載されるような核酸サブクローニングの方法を利用し得る（国際特許出願ＷＯ０１／０４２８８もまた参照のこと）。ＲｅｃＥ／Ｒｅｄαの存在下または非存在下で、アニーリングタンパク質はまた、一本鎖の第１および／または第２の核酸分子、二本鎖の核酸分子、あるいは一本鎖および二本鎖の核酸分子の任意の組み合わせのいずれかを使用して、このような核酸サブクローニングをもたらし得る。
【００２８】
第１の核酸分子は、少なくとも２つの、第２の核酸分子上の配列の領域との配列相同性領域で有するべきである。「相同性」によって、第１および第２の核酸分子の配列が整列される場合、これらの配列間で等価な位置で同一である多くのヌクレオチド残基が存在することが意味される。相同性の程度は、容易に計算され得る（Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．ｅｄ．，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８８；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ．Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔｓ，Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．，ｅｄ．Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９３；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａ，Ｐａｒｔ  １，Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．，ａｎｄ  Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．ｅｄｓ．，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ，１９９４；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｎ  Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９８７；ａｎｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ，Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．ａｎｄ  Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．，ｅｄｓ．，Ｍ  Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９１）。このような相同性領域は、好ましくは、各々少なくとも９ヌクレオチド、より好ましくは、各々少なくとも１５ヌクレオチド、より好ましくは、各々少なくとも２０ヌクレオチド、さらにより好ましくは、各々少なくとも３０ヌクレオチドである。特に有効な組換え事象は、より長い相同性領域（例えば、５０ヌクレオチド以上）を使用してもたらされ得る。好ましくは、これらの領域にわたる相同性の程度は、ＮＣＢＩ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）によって特定されるデフォルトパラメータ［Ｂｌｏｓｕｍ  ６２マトリクス；ギャップオープンペナルティー＝１１およびギャップ伸長ペナルティー＝１］を用いるＢＬＡＳＴバージョン２．１．３を使用して決定される場合、少なくとも４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％または９９％以上同一である。
【００２９】
配列相同性の領域は、第１の核酸分子上に位置され得、その結果、１つの相同性領域は、その分子の一端であり、そして他方は、そのもう一端である。しかし、相同性領域の１つまたは両方はまた、内部に位置され得る。よって、この２つの配列相同性領域は、各特定の実験の要求性にあわされるべきである。環状二本鎖ＤＮＡ分子に対する位置を除いて、第２のＤＮＡ分子上に位置する２つの配列相同性領域に対する位置に関して特に制限はなく、修復組換え事象は、複製能力を破壊すべきではない。当業者に明らかなように、配列相同性領域は、非同一配列領域によって妨害され得るが、但し、修復組換え反応を生じさせ得る十分な配列相同性が、残存する。第２の核酸分子と比較して非同一である配列の領域にわたる配列相同性アームが第１の核酸分子に含まれることによって、置換（例えば、点変異）、挿入および／または欠失のような変異は、第２の核酸分子中に導入され得る。
【００３０】
本発明における使用のための、（出願時に公知であるような）適切なファージアニーリングタンパク質としては、ＲｅｃＴ（ｒａｃプロファージ由来）、Ｒｅｄβ（ファージλ由来）およびＥｒｆ（ファージＰ２２由来）が挙げられる。ｒｅｃＴ遺伝子の同定は、元々Ｈａｌｌ  ｅｔ  ａｌ．によって報告された（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７５（１９９３）２７７−２８７）。ＲｅｃＴタンパク質は、λバクテリオファージβタンパク質またはＲｅｄβに類似することが公知である（Ｈａｌｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）前出；Ｍｕｎｉｙａｐｐａ  ａｎｄ  Ｒａｄｄｉｎｇ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６１（１９８６）７４７２−７４７８；Ｋｍｉｅｃ  ａｎｄ  Ｈｏｌｌｏｍａｎ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５６（１９８１）１２６３６−１２６３９）。Ｅｒｆタンパク質は、Ｐｏｔｅｅｔｅ  ａｎｄ  Ｆｅｎｔｏｎ（Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  １６３（１９８３）２５７−２７５）およびその中の参考文献によって記載される。Ｅｒｆは、ＲｅｄβおよびＲｅｃＴと機能的に類似し（Ｍｕｒｐｈｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  １９４（１９８７）１０５−１１７）、そしていくつかの場合において、λファージ組換え系に置換され得る（Ｐｏｔｅｅｔｅ  ａｎｄ  Ｆｅｎｔｏｎ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １３４（１９９３）１０１３−１０２１）。ＥｒｆについてのＧｅｎｂａｎｋ  ＩＤは、Ｘ０５２６８（Ｖ０１１５２）である。ＲｅｃＴおよびＲｅｄβの配列は、配列番号１（ＲｅｃＴ）および配列番号２（Ｒｅｄβ）として本明細書中に含まれる。
【００３１】
本発明はまた、ＲｅｃＴ、ＲｅｄβおよびＥｒｆとして上記で明確に同定される分子の機能的等価物の使用を含む。但し、その機能的等価物は、本明細書中に記載されるような組換えを介する能力が残存する。このような機能的等価物としては、バクテリオファージ中に存在する組換え系のエレメントのホモログ（ラージＤＮＡファージ、Ｔ４ファージ、Ｔ７ファージ、スモールＤＮＡファージ、異性体ファージ、フィラメントＤＮＡファージ、ＲＮＡファージ、Ｍｕファージ、Ｐ１ファージ、誘導体ファージおよびファージ様物が挙げられるが、これらに限定されない）、ならびにウイルス中に存在する組換え系のエレメントの機能的ホモログ（以下の群のいずれかに属する任意のウイルスが挙げられるが、これらに限定されない：植物ウイルス、昆虫ウイルス、酵母ウイルス、真菌ウイルス、寄生虫性微生物ウイルス、ピコルナウイルス、エンテロウイルス、ポリオウイルス、コクサッキーウイルス、エコーウイルス、ライノウイルス、全ての肝炎ウイルス、カルシウイルス科、ノーウォーク群のウイルス、アストロウイルス科、アストロウイルス、トガウイルス、アルファウイルス、風疹ウイルス、フラビウイルス科、フラビウイルス、ペスチウイルス、コロナウイルス科、コロナウイルス、乳酸デヒドロゲナーゼ増大（ｅｌｅｖａｔｉｎｇ）ウイルスおよび関連ウイルス、ラブドウイルス科、ラブドウイルス、フィロウイルス科、マールブルグウイルス、エボラウイルス、パラミクソウイルス科、パラインフルエンザウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、麻疹ウイルス、ＲＳウイルス、オルソミクソウイルス科、オルソミクソウイルス、ブンヤウイルス科、アレナウイルス科、アレナウイルス、レオウイルス科、レオウイルス、ロタウイルス、オルビウイルス、コルチウイルス（ｃｏｌｔｉｖｉｒｕｓ）、レトロウイルス、ヒトＴ細胞白血球ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、レンチウイルス、パポバウイルス科（ｐａｐｏｖｉｒｉｄａｅ）、ポリオーマウイルス科、ポリオーマウイルス、パピローマウイルス科、パピローマウイルス、アデノウイルス科、アデノウイルス、パルボウイルス科、パルボウイルス、ヘルペスウイルス科、単純ヘルペスウイルス、エプスタイン−バーウイルス、サイトメガロウイルス、水痘‐帯状疱疹ウイルス、ヒトヘルペスウイルス、オナガザルヘルペスウイルス、Ｂウイルス、ポックスウイルス科、ポックスウイルス、ヘパドナウイルス科、ならびに未分類の因子（例えば、δ型肝炎ウイルスおよびＥ型肝炎ウイルス（Ｆｉｅｌｄｓ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，Ｔｈｉｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ  Ｂ．Ｎ．Ｆｉｅｌｄｓ，Ｄ．Ｍ．Ｋｎｉｐｅ，Ｐ．Ｍ．Ｈｏｗｌｅｙ，ｅｔ  ａｌ．  Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ  ＰＡ  ＵＳＡ（１９９６））が挙げられる。
【００３２】
もちろん、さらなる、機能的に等価なアニーリングタンパク質が発見される場合（例えば、他の大腸菌ファージおよびλファージのゲノム配列決定プロジェクトの結果として）、これらのアニーリングタンパク質は、明らかに上記されたものに等しく適切であることが認識される。
【００３３】
本発明に従って有用であるファージアニーリングタンパク質の機能的等価物の特定の例示としては、種々の生物において見出される形態であるＲＡＤ５２（Ｐａｓｓｙ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９６（１９９９）４２７９−４２８４）、およびＳｅｐ１（Ｋｏｌｏｄｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  １１（１９９４）２３−３０）が挙げられる。機能的等価分子のさらなる例示としては、野生型配列からのアミノ酸の置換、挿入および／または欠失を含む、ＲｅｃＴタンパク質、Ｒｅｄβタンパク質またはＥｒｆタンパク質が挙げられる。但し、これらの変化は、上記のような修復組換えを介する際にアニーリングタンパク質の機能に不利に作用しない。このような機能的等価物は、［ＮＣＢＩによって特定されるデフォルトパラメータを用いるＢＬＡＳＴバージョン２．１．３を使用して決定される場合］、好ましくは、上記で参照したＧｅｎｂａｎｋの位置に示される野生型配列と少なくとも２０％、好ましくは、少なくとも４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％または９９％以上のアミノ酸配列同一性を有する。
【００３４】
また、ＲｅｃＴタンパク質、Ｒｅｄβタンパク質およびＥｒｆタンパク質のフラグメント（例えば、短縮型改変体）、ならびに、ＲｅｃＴタンパク質、Ｒｅｄβタンパク質またはＥｒｆタンパク質の配列がその一部を形成する融合タンパク質（これは、相同組換えまたは修復組換えを介する能力を残存する）（例えば、Ｍｕｙｒｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ  １４（２０００）１９７１−１９８２を参照のこと）は、機能的等価物として含まれる。このような機能的等価物の同定は当業者の能力の範囲内であるとみなされる。例えば、機能的Ｅｒｆ短縮型変異体が同定されている（Ｐｏｔｅｅｔｅ  ａｎｄ  Ｆｅｎｔｏｎ，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  １６３（１９８３）２５７−２７５；Ｐｏｔｅｅｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  １７１（１９８３）４０１−４１８；Ｆｅｎｔｏｎ  ａｎｄ  Ｐｏｔｅｅｔｅ，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １３４（１９８４）１４８−１６０）。
【００３５】
また、例えば、ＤＮＡシャッフリング（Ｓｔｅｍｍｅｒ，Ｗ．Ｐ．Ｎａｔｕｒｅ  ３７０，３８９−９１（１９９４）または基質連結指向性進化（Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ−ｌｉｎｋｅｄ  ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ）（ＳｌｉＤＥ、共有であり同時係属の英国特許出願ＧＢ００２９３７５．３を参照のこと）を介して、最適化および／または進化されているアニーリングタンパク質改変体は、機能的改変体として含まれる。
【００３６】
核酸分子間の組換えが本発明に従ってもたらされ得るために、第１の置換核酸分子は、ファージアニーリングタンパク質またはその機能的等価物もしくはフラグメントの存在下で第２の標的核酸分子と接触させられねばならない。
【００３７】
本発明の方法は、宿主中で全体または一部もたらされ得る。適切な宿主としては、ウイルスおよび寄生虫、原核生物および真核生物を含む、多くの種の細胞が挙げられるが、細菌（例えば、グラム陰性細菌）が好ましい宿主である。より好ましくは、宿主細胞は、腸内細菌細胞（例えば、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ細胞、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ細胞、Ｂａｃｉｌｌｕｓ細胞、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ細胞またはＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ細胞（本発明の方法は、試験されているＥ．ｃｏｌｉの株全てにおいて効果的に働く））である。しかし、本発明の方法はまた、真核細胞または生物（例えば、真菌細胞、植物細胞または動物細胞）、ならびにウイルス性および寄生虫性の細胞および生物における使用のために適切であることは、注意すべきである。この系は、マウスＥＳ細胞において十分機能することが実証されており、他の真核生物細胞においても機能的ではないことを支持する理由はない。
【００３８】
よって、本発明の１つの局面は、核酸分子の配列を変更するための方法を提供し、この方法は、以下の工程：
ａ）ファージアニーリングタンパク質またはその機能的等価物もしくはフラグメントを含有する宿主を提供する工程；
ｂ）この宿主中で、第１の核酸分子を、少なくとも２つの、この第１の核酸分子上の領域との配列相同性領域を含む第２の核酸分子と、この第１の核酸分子と第２の核酸分子との間で修復組換えが生じるに適切な条件下で、接触させる工程；
ｃ）この第１の核酸分子と第２の核酸分子との間で修復組換えが生じた宿主を選択する工程、
を包含する。
【００３９】
原核生物宿主において、本方法は、配列変更反応の経過中にＲｅｃＥ／Ｒｅｄαタンパク質が存在しないという条件を含み得る。好ましくは、修復組換えに使用される宿主細胞は、ＲｅｃＴタンパク質、Ｒｅｄβタンパク質もしくはＥｒｆタンパク質またはその機能的等価物もしくはフラグメントが発現される任意の細胞であり得る。例えば、宿主細胞は、宿主細胞染色体上または非染色体核酸分子（例えば、ベクター）上に位置される（必要に応じて、プロモーター（例えば、調節可能なアラビノース誘導性ＢＡＤまたはｌａｃプロモーターまたは強力な構成的プロモーターＥＭ−７）から発現される）ｒｅｃＴ遺伝子、ｒｅｄβ遺伝子またはｅｒｆ遺伝子を含み得る。あるいは、ＲｅｃＴ、ＲｅｄβまたはＥｒｆは、第１の核酸分子、潜在的には第２の核酸分子で誘導されるｍＲＮＡから発現され得る。修復組換え反応は、置換核酸配列を忠実に組み込む。例えば、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて、組み換えられた分子全ては、内因性複製系および修復系によって校正される。結果として、配列再生成の忠実度は、かなり高い。
【００４０】
本明細書中に記載される系において、ファージアニーリングタンパク質またはその機能的等価物もしくはフラグメントの発現は、調節可能なプロモーターによって制御され得る。この様式において、この系の遺伝子組換え（ｒｅｃｏｍｂｉｎｏｇｅｎｉｃ）の潜在性は、必要とされる場合にのみ誘発され、そして他の時には、起こり得る所望されない組換え反応が制限される。多くの所望されない組換え反応が二本鎖崩壊（ｂｒｅａｋ）修復による相同組換えを介して生じ（Ｍｕｙｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ  １４（２０００）１９７１−１９８２；Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  １８（２０００）１３１４−１３１７）、よって、ファージタンパク質対の両方の成分の発現を必要とするので（Ｍｕｙｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ  １４（２０００）１９７１−１９８２）、このような所望されない組換えの危険性は、アニーリングタンパク質の存在下でのみ大いに低減される。さらに、ＲｅｃＡの存在下での本明細書中に記載される系に依存しない場合、この危険性は、ＲｅｃＡが発現されない宿主細胞においてこの方法を実施することによってさらに低減される。
【００４１】
上記のように、第２の核酸分子（標的核酸分子）（例えば、染色体由来または染色体外エレメント由来）は、環状化されたかまたは線状の分子であり得、よって本発明のこの局面において宿主細胞中で一過性または持続的に発現され得る。第１の核酸分子（置換核酸分子）はまた、任意の供給源由来であり得るが、本発明のこの実施形態において、組換え反応が効果的に生じるために、宿主細胞中に導入される必要がある。例えば、置換核酸分子は、ＰＣＲ反応のような核酸増幅反応によって合成され得、ここで、例えば、増幅をプライムするために使用されるＤＮＡオリゴヌクレオチドの両方が、増幅についてのプライマーとして働く３’末端での配列に加えて、２つの相同性領域の一方または他方を含む。この設計のオリゴヌクレオチドを使用して、核酸増幅産物は、増幅に適切な任意の核酸配列であり得、さらに各末端で配列相同性領域を有する。
【００４２】
本発明の方法は、インビボで第１の核酸分子と第２の核酸分子とを接触させる工程を包含し得る。１つの実施形態において、第１の核酸分子は、第２の核酸分子を既に含有する宿主細胞中に形質転換され得る。異なる実施形態において、第１および第２の核酸分子は、宿主細胞への同時形質転換の前にインビトロで一緒に混合され得る。もちろん、これらの核酸分子種の一方または両方は、任意の手段（例えば、トランスフェクション、形質導入、形質転換、エレクトロポレーションなど）によって宿主細胞中に導入され得る。細菌細胞について、形質転換または同時形質転換の好ましい方法は、エレクトロポレーションである。
【００４３】
本発明は、宿主細胞または細胞性組換え機構の関与なしに、全体的にインビトロで開始され得る。ファージアニーリングタンパク質（例えば、ＲｅｃＴ）は、タンパク質自体とオリゴヌクレオチド分子と二本鎖核酸分子との間でインビトロで複合体を形成し得る（Ｎｏｉｒｏｔ  ａｎｄ  Ｋｏｌｏｄｎｅｒ，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７３（１９９８）１２２７４−１２２８０）。このような複合体の１つの例は、ＲｅｃＴとｓｓＤＮＡオリゴヌクレオチドとインタクトな環状プラスミドとの間で形成されるものである。このような複合体は、本明細書中で「連結（ｊｏｉｎｔ）分子」と呼ばれる複合体（この例において、プラスミドおよびｓｓＤＮＡオリゴヌクレオチドからなる）の形成を導く。このような連結分子は、ファージアニーリングタンパク質の除去後に安定であることが見出されている。安定な連結分子の形成は、ｓｓＤＮＡオリゴヌクレオチドとプラスミドとの間で共有される相同性領域の存在に依存することが見出されている。
【００４４】
インビトロで連結分子を作製するＲｅｃＡの潜在性は、例えば、ＲｅｃＡ関連クローニング（Ｆｅｒｒｉｎ  ａｎｄ  Ｃａｍｅｒｉｎｉ−Ｏｔｅｒｏ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９５（１９９８）２１５２−２１５７、総説については、Ｆｅｒｒｉｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  １５２（２０００）１３５−１４７を参照のこと）、およびＲｅｃＡ媒介アフィニティ捕捉（Ｚｈｕｍａｂａｙｅｖａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ２７（１９９９）８３４−８４０）において、プール由来の所望のＤＮＡストラテジーの単離を可能にするようにすでに開発されている。このＲｅｃＡの捕捉はまた、他の課題（例えば、ＲｅｃＡ関連制限エンドヌクレアーゼ（ＲＡＲＥ）切断（Ｆｅｒｒｉｎ  ａｎｄ  Ｃａｍｅｒｉｎｉ−Ｏｔｅｒｏ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５４（１９９１）１４９４−１４９７）について使用されている。しかし、組換えがファージアニーリングタンパク質によってインビトロで開始されることは現在まで何ら記載も適用もなく、そして、任意の外因性に添加されるタンパク質の非存在下で、インビボで特定の改変された核酸分子を生じることが意図される。
【００４５】
上記されるようないわゆる「連結分子」が宿主細胞における組換えを媒介するために直接使用され得ることが、本明細書において提唱される。ここで、宿主細胞は、任意のファージアニーリングタンパク質を発現する必要が少しもない。本発明のこの局面は、核酸分子の配列を変更する方法を提供し、この方法は、以下の工程：
ａ）第２の核酸分子の存在下で、第１の核酸分子を、ファージアニーリングタンパク質またはその機能的等価物もしくはフラグメントに曝露して、連結分子を生成する工程であって、ここで、この第１および第２の核酸分子は、少なくとも２つの配列相同性領域を共有する、工程；
ｂ）この第１の核酸分子と第２の核酸分子との間で修復組換えが生じるに適切な条件下で、この連結分子をインキュベートする工程；および
ｃ）その配列が、この第２の核酸分子由来の配列を含むように変更されている核酸分子を選択する工程、
を包含する。
【００４６】
本方法は、原核生物細胞においてインビボで実施される配列変更反応の経過中にＲｅｃＥ／Ｒｅｄαタンパク質が存在しないという条件を含み得る。
【００４７】
本発明のこの局面に従って、連結分子を使用して、組換え事象の効率を増大し得る。
【００４８】
「コート分子」と本明細書中でいわれる、ファージアニーリングタンパク質またはその機能的等価物もしくはフラグメントによってコートされる核酸分子（例えば、ｓｓＤＮＡオリゴヌクレオチドまたはｄｓＤＮＡ分子）が、「裸の」コートされていない核酸分子と比較して高効率で組換え得ることが、本明細書において提唱される。これは、多くの種（原核生物および真核生物（酵母、マウス、植物、原始的ヒト細胞、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ、Ｘ．ｌａｅｖｉｓなどを含む）の両方を含む）ならびにウイルスおよび寄生虫における外因性核酸分子および内因性核酸分子の操作のような技術において重要な適用である。この方法で組み換えられ得る外因性核酸分子（本明細書中で使用される場合、第１の置換核酸分子）の例としては、トランスポゾン、ＨＡＣ、ＹＡＣ、プラスミドが挙げられるが、内因性核酸分子（本明細書中で使用される場合、第２の標的核酸分子）の１つの好ましい例は、染色体である。
【００４９】
従って、本発明のこの局面はまた、相同組換え事象または修復組換え事象（例えば、ＤＮＡ操作またはサブクローニング（Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  １８（２０００）１３１４−１３１７）を参照のこと）の効率を増大させるための、ファージアニーリングタンパク質または機能的等価物もしくはフラグメントの使用を提供する。例えば、第１の置換核酸分子（これは、一本鎖または二本鎖であり得る）の宿主細胞への導入前に、置換核酸分子は、ファージアニーリングタンパク質または機能的等価物もしくはフラグメントの存在下でインビトロでインキュベートされ得る。次いで、核酸調製物は、アニーリングタンパク質から部分的にかまたは全体的に精製され得、組換え事象がもたらされ得る場合、宿主細胞中に形質転換され得る。裸の分子よりもこのようなコート分子を使用することによって、記載された活性の適用の効率のいずれもが、顕著に増強され得る。
【００５０】
本発明のこの局面の１つの実施形態は、ファージアニーリングタンパク質またはその機能的等価物もしくはフラグメントと第１の核酸分子との単離された複合体の、修復組換えプロセスについてのテンプレートとしての使用を提供し、任意のファージアニーリングタンパク質の発現を少しも必要としない宿主細胞における組換え分子の形成を導く。
【００５１】
本発明のこの局面のさらなる実施形態は、ファージアニーリングタンパク質またはその機能的等価物もしくはフラグメントと第１の核酸分子と第２の二本鎖ＤＮＡ分子（連結分子；Ｎｏｉｒｏｔ  ａｎｄ  Ｋｏｌｄｎｅｒ，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７３（１９９８）１２２７４−１２２８０）との単離された複合体の、修復組換えプロセスについてのテンプレートとしての使用を提供し、任意のファージアニーリングタンパク質の発現を少しも必要としない宿主細胞における組換え分子の形成を導く。
【００５２】
宿主細胞（多くの場合、標的分子を含む）へのコート分子または連結分子の送達は、いくつかの型であり得る：形質転換、トランスフェクション、エレクトロポレーションなど（また真核生物送達技術）、または細胞壁を超え得るタグ（例えば、ＴＡＴ（Ｎａｇａｈａｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ  ４（１９９８）１４４９−１４５２；Ｓｃｈｗａｒｚｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８５（１９９９）１５６９−１５７２）またはｋＦＧＦタグ（Ｄｅｌｌｉ  Ｂｏｖｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ５０（１９８７）７２９−７３７；Ｙｏｓｈｉｄａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８４（１９８７）７３０５−７３０９；Ｐｅｔｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６（１９８９）５６７８−５６８２））を保有するファージアニーリングタンパク質を使用することによる送達。
【００５３】
インビトロでの組換えの開始について上記される本発明の局面の全てにおいて、ファージアニーリングタンパク質および１つまたは２つの核酸分子の型のみが、現在必要とされる。さらなる工程について、宿主は、相同組換え反応または修復組換え反応を進めるために必要なタンパク質を提供するために必要とされる（これは、もはや相同組換えおよび／または修復組換えの機能が解明されている場合であり得る）。原核生物において、相同組換えを生じるに必要なタンパク質は、ＲｅｃＡ経路における相同組換えの下流プロセスで機能的であるタンパク質に類似するようである。このようなタンパク質としては、例えば、ブランチの移動および分離ならびにＤＮＡ複製を実施し得るタンパク質が挙げられる。他の適切なタンパク質は、ＤＮＡ修復に関与するタンパク質を含む（Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈ  Ｓｃｉ  ２０（１９９５）を参照のこと）。いくつかの候補タンパク質は、既に知られている（総説について、Ｋｏｗａｌｃｚｙｋｏｗｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｒｅｖ  ５８（１９９４）４０１−４６５；Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈ  Ｓｃｉ  ２０（１９９５）を参照のこと）。
【００５４】
本明細書中に記載されている活性が生じることが実証されている、原核生物宿主細胞の特定の例としては、以下の株が挙げられる；ＪＣ５５１９（ＷｉｌｌｅｔｓおよびＣｌａｒｋ、Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ  １００（１９６９）、２３１−２３９）；ＪＣ８６７９およびＪＣ９６０４（Ｃｌａｒｋ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ７８（１９７４），２５９−２７１）；ＤＫ１（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）；ならびにＤＨ１０Ｂ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）。
【００５５】
真核生物において、この特定の機能は以前に記載されていないが、原核生物タンパク質の機能的相同性が存在することは公知である。さらなる真核生物に特徴的な因子はまた、重要であるかもしれない。本発明の方法のために適切な真核生物細胞には、相同組換えによるＤＮＡ操作が実行可能なことが公知である細胞が含まれ、例えば、大部分のＳ．ｃｅｒｅｖｉｓａｅ系、マウスＥＳ細胞（例えば、Ｅ１４およびＲ１；Ｊｏｙｎｅｒ，Ｇｅｎｅ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ，ａ  ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ（２０００）第２版、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）およびＢＴ−４０のような特定の体細胞株が挙げられる。さらに、ＤＮＡ修復についての機能的経路を含む任意の細胞または種（これらには、大部分の細胞が含まれる；例えば、Ｓｔｕｃｋｉら、Ｐｒｏｇ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ６５（２０００），２６１−２９８；ＨａｎｓｅｎおよびＫｅｌｌｅｙ、Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  ｅｘｐ  Ｔｈｅｒ  ２９５（２０００），１−９）を参照のこと）がおそらく適切である。
【００５６】
組換え分子を選択するために複雑な選択工程を必要としないことは、本発明の方法の長所である。
【００５７】
本明細書中に記載される組換え方法の効率は、いくつかの選択方法が、単一の工程において遺伝子操作を可能にし、そしてさらに核酸配列の操作を可能にすることである。
【００５８】
しかし、２つの分子種間の修復組換えが望ましい条件下において、第１核酸分子と第２の核酸分子とを接触させた後、１つ以上の核酸分子が、置換核酸分子と標的核酸分子との間の修復組換えが生じる種を再現するように選択されなければならない。この手順は、いくつかの異なる方法によって実行され得、同様に当業者に明らかである。好ましくは、ＰＣＲを用いる選択（ハイブリダイゼーション反応ではあるが）、ブロッティングの技術を用いるか、またはアッセイを用いる選択もまた、使用され得る（ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌを参照のこと；ｌｏｃ．ｓｉｔ．）。本発明の方法の高い効率にもかかわらず、本方法の効率を増大するために、選択可能な遺伝子工程がこの方法論（抗生物質選択方法および部位特異的組換え酵素を用いる選択を含む）に含まれ得る場合が生じ得る。適切な選択方法の例は、例えば、国際特許出願ＷＯ９９／２９８３７に記載されている。
【００５９】
単離された複合体（これらは、ファージアニーリングタンパク質、オリゴヌクレオチドおよび連結分子については２本鎖核酸分子を含む（ＮｏｉｒｏｔおよびＫｏｌｏｄｎｅｒ、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７３（１９９８），１２２７４−１２２８０））の構成（連結分子およびコートされた分子）の発見は、このような特性が非常に有用である他の技術のために重要な影響を有する。１つの例、すなわち、ファージアニーリングタンパク質と接触している核酸分子間の修復組換えおよび／または相同組換えの効率の増大は、上で議論される。
【００６０】
本発明のなおさらなる局面は、核酸分子混合物からの所望される核酸分子の選択を提供する。目的の核酸分子の配列に相補的な配列を含むオリゴヌクレオチド分子を設計する工程、および上記のように連結分子の形成のために適切な条件下で、このオリゴヌクレオチドをファージアニーリングタンパク質フラグメントまたは機能的な等価物と共にインキュベートする工程により、形成される連結分子複合体は、混合物から所望の核酸分子を分離するために使用され得る。この複合体は、例えば、親和性分離およびファージアニーリングタンパク質または機能的な等価物またはフラグメントについての選択を用いて分離され得る。
【００６１】
本発明のこの局面は、核酸分子の混合物から目的の核酸分子を選択する方法を提供する。この方法は以下の工程を包含する：
ａ）目的の核酸分子の配列に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチド分子を、コートされた分子または連結分子複合体の形成に適切な条件下で、ファージアニーリングタンパク質、またはそれらの機能的な等価物もしくはフラグメントに曝露する工程
ｂ）このコートした分子または連結分子複合体を、核酸分子の混合物と共にインキュベートする工程；および
ｃ）ファージアニーリングタンパク質またはそれらの機能的な等価物またはフラグメントに結合する核酸分子を選択する工程。
【００６２】
連結分子またはコートされた分子を分離するための１つの方法は、合成タグを含むオリゴヌクレオチドの使用に関連し得る。目的の核酸配列を含む組換え分子を生成するために、単離された連結分子またはコートされた分子は、宿主細胞中に導入され得る。ファージアニーリングタンパク質またはそれらの機能的な等価物もしくはフラグメントを使用して生成される連結分子およびコートされた分子の特性に起因して、宿主細胞は、修復組換えが生じるためにファージアニーリングタンパク質を発現する必要はない。
【００６３】
核酸分子の操作およびサブクローニングにおける上記の適用に加えて、ファージアニーリングタンパク質またはそれらの機能的な等価物もしくはフラグメントでコートされた核酸分子は、アンチセンス戦略（例えば、ＲＮＡ結合および阻害、ｍＲＮＡの遮断、ｒＲＮＡを遮断することよる翻訳の阻害ならびにＲＮＡ輸送の遮断に基づく）において使用され得る。第１（置換）の核酸分子のライブラリーはまた、無作為化または標的化されたアンチセンスのために利用され得る。このような方法は、潜在的な任意の生物において実行可能である。
【００６４】
本発明のなおさらなる局面に従って、核酸をクローニングする方法が提供され、この方法は、上記の本発明の任意の局面において記載されるように、核酸分子の配列を変更する方法を利用する。
【００６５】
本発明のなおさらなる局面に従って、核酸分子の配列を操作する方法が提供され、この方法は、上記の本発明の任意の局面において記載されるように、核酸分子の配列を変更する方法を包含する。
【００６６】
本発明は、ここで、ＲｅｃＴおよびＲｅｄβにより調節される修復組換えに関して、特に強調して詳述されている。詳細な改変は、本発明の範囲から逸脱することなしになされ得ることは理解される。
【実施例】
【００６７】
注：全てのオリゴヌクレオチドを、ＥＭＢＬオリゴヌクレオチドサービスから入手した。
【００６８】
（実施例１：ファージアニーリングタンパク質を用いる修復組換え）
２つのＤＮＡ分子の間の修復組換えを媒介するファージアニーリングタンパク質の組換え活性を、図１の実験を用いて、初めに見出した。
【００６９】
図１に示す例において、置換オリゴヌクレオチド中の相同性領域を、インタクトな環状プラスミド（ｐＧＫｎｅｏ＊またはｐＧＫｎｅｏΔ）に存在するｎｅｏ遺伝子中の欠損領域に隣接するように選択した。これらの相同性領域をまた、ｎｅｏ遺伝子に本来存在していた配列に隣接するようにオリゴヌクレオチドに入れた。この例において、ｐＧＫｎｅｏ＊（ｐＧＫｎｅｏから作製した（Ｚｈａｎｇ  Ｙ．Ｍｕｙｒｅｒｓ  Ｊ．Ｐ．Ｐ．，Ｓｔｅｗａｒｔ  Ａ．Ｆ．，非公開データ；ｐＧＫｎｅｏの配列を配列番号３に与える））を用いて、欠損ｎｅｏ遺伝子を入れた。従って、ｐＧＫｎｅｏ＊を含む宿主細胞は、カナマイシン選択の存在下で増殖することができない。ｐＧＫｎｅｏ＊はまた、アンピシリンによる選択のためのｂｌａ遺伝子を保有する。インタクトな環状プラスミドとオリゴヌクレオチドとの間の修復組換え（ファージアニーリングタンパク質により媒介される）を通じて、欠損ｎｅｏ遺伝子を修復して、ｐＧＫｎｅｏにおいて機能的ｎｅｏ遺伝子を作製し得る。この組換え事象を、カナマイシンを含むＬＢ−プレートでの増殖により選択し得る。
【００７０】
用いたオリゴヌクレオチド（置換核酸分子）は、左の相同性領域、ｐＧＫｎｅｏのｎｅｏ遺伝子に本来存在していたヌクレオチド、および右の相同性領域からなる。ｐＧＫｎｅｏ＊およびオリゴヌクレオチドを、宿主株（通常、ＪＣ５５１９（ＷｉｌｌｅｔｔｓおよびＣｌａｒｋ，Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ  １００（１９６９），２３１−２３９）これは、ファージアニーリングタンパク質を発現する）に同時エレクトロポレーションした。本明細書中で用いられるオリゴヌクレオチドの配列を、配列番号４および５に与える。
【００７１】
図１Ｂは、インタクトな環状プラスミドへの配列の追加を生じる修復組換えを示す。図１Ａ）の場合、ｐＧＫｎｅｏΔ（これを、欠損ｎｅｏ遺伝子を含むようにｐＧＫｎｅｏから作製した）と、オリゴヌクレオチドとの間の組換えは、ｐＧＫｎｅｏを作製するための機能的ｎｅｏ遺伝子の修復を生じる。再度、このファージアニーリングにより促進された組換え事象を、カナマイシンを含むＬＢ−プレートでの増殖により選択し得る。
【００７２】
修復組換えを可能にするために、２つのＤＮＡ分子は、２つの相同性領域（共有されたＤＮＡ配列のストレッチ）を共有する必要がある。この共有されたＤＮＡ配列のストレッチは、組換えプロセスを正しい領域に導き、そしてこれらを通じて修復組換えを生じる。これらの相同性領域の配列は、自由に選択され得、任意の位置でのＤＮＡ操作を可能にする。
【００７３】
（実験プロトコル）
ｐＧＫｎｅｏ＊およびｐＧＫｎｅｏΔを、以下の手順によりｐＧＫｎｅｏから作製した：ｐＧＫｎｅｏを、ＮｃｏＩ制限酵素（これは、ｎｅｏ遺伝子中に固有の認識部位を有する）を用いて線状化した。ｐＧＫｎｅｏ＊を作製するために、ＮｃｏＩで消化したｐＧＫｎｅｏの５’オーバーハングを、製造業者（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）の指示書に従ってＫｌｅｎｏｗおよびヌクレオチドを用いて補充し、次いで、連結により、インタクトな環状プラスミドを作製した。ｐＧＫｎｅｏΔを作製するために、ＮｃｏＩで消化したｐＧＫｎｅｏの５’オーバーハングを、製造業者（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）の指示書に従ってＭｕｎｇ  Ｂｅａｎヌクレアーゼを用いて取り除き、次いで、連結により、インタクトな環状プラスミドを作製した。
【００７４】
インタクトな環状プラスミドおよびオリゴヌクレオチドを、エレクトロコンピテント（ｅｌｅｃｔｒｏｃｏｍｐｅｔｅｎｔ）宿主細胞へと同時エレクトロポレーションした。ファージアニーリングタンパク質が発現される、これらのエレクトロコンピテント宿主細胞のみが、機能的ｎｅｏ遺伝子を作製するための修復組換えを可能にした。エレクトロコンピテントＥ．ｃｏｌｉ細胞を、以前に記載されるように調製した（Ｚｈａｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ  ２０（１９９８），１２３−１２８；Ｍｕｙｒｅｒｓら、Ｎｕｃｌ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ２７（１９９９），１５５５−１５５７；Ｍｕｙｒｅｒｓら、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ  １４（２０００），１９７１−１９８２；Ｍｕｙｒｅｒｓら、ＥＭＢＯ  Ｒ  １（２０００），２３９−２４３；Ｍｕｙｒｅｒｓら、Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，Ｊ．Ｋ．Ｓｅｔｌｏｗ編、２２（２０００），７７−９８，Ｋｌｕｗｅｒ  Ａｃａｄｅｍｉｃ／Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，ＮＹ；Ｚｈａｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  １８（２０００），１３１４−１３１７；さらなる情報は、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｍｂｌ−ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ．ｄｅ／ＥｘｔｅｒｎａｌＩｎｆｏ／ｓｔｅｗａｒｔ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌから利用可能である）。簡単に言えば、ファージアニーリングタンパク質を発現し得る細胞の２５０ｍｌ培養物を、新鮮なＬＢ培地への１００倍希釈の飽和一晩培養（ｓａｔｕｒａｔｅｄ  ｏｖｅｒｎｉｇｈｔ  ｃｕｌｔｕｒｅ）により開始した。これらの細胞を、３７℃にて０．４のＯＤ６００まで増殖させ、０．４のＯＤ６００で、これらを収集した。ファージアニーリングタンパク質の発現が必要である場合（すなわち、ファージアニーリングタンパク質遺伝子が、宿主細胞内のｐＢＡＤ２４ベースのプラスミドに存在していた場合）、細胞を誘導した１時間後に、０．１％の最終濃度までＬ−アラビノース（Ｓｉｇｍａ）を添加することによって収集した。細胞をＳｏｒｖａｌｌ  ＳＬＡ１５００ローター中７０００ｒｐｍで、−３℃にて８分間遠心分離することにより収集した。ペレットを２５０ｍｌの氷冷１０％グリセロールに再懸濁し、そして再度遠心分離（７０００ｒｐｍ、８分間、−３℃）した。これを２回より多く繰返し、その後、細胞ペレットを、等量の氷冷１０％グリセロールに再懸濁した。アリコート（５０μｌ）を、２つのＤＮＡ分子（図１の場合、インタクトなプラスミドおよびオリゴヌクレオチド）と共に、同時エレクトロポレーションした。ＢｉｏＲａｄ  Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ（２ｍｍキュベット、２．５ｋＶ、２５μＦ、２００  Ｏｈｍ）でのエレクトロポレーション後、細胞を、振盪しながら３７℃にて１．５時間インキュベートし、そして抗生物質プレートに薄く塗った。カナマイシン選択のために用いた濃度は、５０μｇ／ｍｌであり；アンピシリン選択については、５０μｇ／ｍｌであった。
【００７５】
修復組換え反応を支持した宿主細胞は、内因性染色体由来のファージアニーリングタンパク質か、または（少なくとも）ファージアニーリングタンパク質の構成的発現もしくは誘導性発現を可能にするプラスミド由来のファージアニーリングタンパク質のいずれかを発現した。ファージアニーリングタンパク質遺伝子を、ｐＢＡＤ２４に存在するプロモーターから誘導性発現させた。ｐＢＡＤ２４は、Ｌ−アラビノースの添加により、誘導性発現を可能にする（Ｇｕｚｍａｎら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ  １７７（１９９５），４１２１−４１３０）。
【００７６】
図１Ａに記載した実験を用いて、いくつかの組換え経路およびタンパク質を、この型の修復組換えを支持する能力について試験した。これらの実験の結果を表１に要約する。表１は、図１に記載したような、一本鎖オリゴヌクレオチドとインタクトな環状プラスミドとの間の修復組換えを媒介する能力についての、いくつかの組換え経路およびタンパク質の評価の結果を示す。試験株の名称、この株の遺伝子型、この株に存在する組換え媒介経路またはタンパク質、およびカナマイシン耐性、ｐＧＫｎｅｏ含有組換え体の基準化した量を示す。この表のデータを作成するために行った全ての実験において、２２ｎｔ（ヌクレオチド）の左の相同性領域および右の相同性領域を含む、ｓｓＤＮＡオリゴヌクレオチドを用いた。この表の全ての実験において、データは、少なくとも２つの独立した実験の平均を表す。
【００７７】
実験の詳細を表１に記載する。株を、ｐＧＫｎｅｏ＊（０．１μｇ）、ならびに２２ｎｔの左の相同性領域、ｐＧＫｎｅｏのｎｅｏ遺伝子に本来存在していたヌクレオチド、および２２ｎｔの右の相同性領域からなるオリゴヌクレオチド（２．２μｇ）と共に、同時エレクトロポレーションした。全てのｐＢＡＤベースの構築物は、Ｌ−アラビノース誘導性プロモーターからの示した遺伝子の誘導性発現を可能にする。このような構築物を含む宿主細胞を、上記のように、Ｌ−ａｒａ誘導した後に収集した。カナマイシンを含むＬＢプレートで得られた組換え体の量を基準化することを可能にするために、標準的な量（０．５ｎｇ）のｐＢＲ３２２プラスミドを形質転換することにより得たコロニーの量を、試験した株ごとのコンピテント細胞調製物ごとに決定した。従って、株対株変化の得られたコロニーの量を、基準化因子として用いた。ＬＢ−カナマイシン選択について、５０μｇ／ｍｌの濃度を用いた。
【００７８】
ファージアニーリングタンパク質（ＲｅｃＴ、ＲｅｄβおよびＥｒｆ）を発現する宿主株のみが、必要な組換え反応を媒介することを見出したことが明らかである。さらに、ファージアニーリングタンパク質は、記載された活性を媒介するのに必要十分である。ＥＴ組換え（国際特許出願公開ＷＯ９９／２９８３７を参照のこと）とは対照的に、アニーリングタンパク質の発現のみでも、所望の活性を示すのに十分である。他の組換え経路（ＲｅｃＡ、ＲｅｃＡ／ＲｅｃＢＣＤ、ＲｅｃＦ）は、必要な組換え反応を媒介し得ないことを見出した。また、ＥＴ組換えと対照的に、ＲｅｃＢＣＤの発現は、記載した活性を妨害しない。
【００７９】
（実施例２：相同性領域の必要な長さ）
ファージアニーリングタンパク質の活性を調査するために、さらに、相同性領域の長さと組換えの効率との間の関連性を試験した。
【００８０】
図１の実験設定に従って、相同性領域を、５ヌクレオチドから５０ヌクレオチドまで変化するように選択したオリゴヌクレオチドのセットを、ｐＧＫｎｅｏ＊の欠損ｎｅｏ遺伝子を修復する能力について試験した。ファージタンパク質を、対応する遺伝子を含むｐＢＡＤ２４ベースのプラスミドから誘導性発現させた。示したタンパク質を誘導性発現するエレクトロコンピテント細胞を、上記のように調製した。エレクトロポレーション、選択および得られた組換え効率の基準化を、図１および表１のプロトコルおよび条件を用いて行った。
【００８１】
この実験の結果を、図２に要約する。図２は、相同性領域の長さと組換え効率との間の関係に関連する結果を示す。
【００８２】
組換えは、約９ヌクレオチドの非常に短い相同性領域で検出可能であることを見出した。しかし、ＲｅｃＴおよびＲｅｄβの両方について、相同性領域の長さの増加は、組換え能力の増大と関連する。
【００８３】
２つの相同性領域が、組換えを生じるために厳密に要求されるか否かを決定するために、オリゴヌクレオチドを、ｐＧＫｎｅｏ＊の欠損ｎｅｏ遺伝子を修復し得るヌクレオチド、および１つのみの相同性領域（左または右のいずれか）からなる組換え体のために提供した。このようなオリゴヌクレオチド（１つのみの可変長の相同性領域を含む）を、図１に記載したアッセイを用いて試験した。結果を表２に要約する。
【００８４】
これらの結果は、ＲｅｃＴおよびＲｅｄβの両方について、２つの相同性領域が一本鎖オリゴヌクレオチドに存在した場合にのみ、組換えが検出され得ることを示す。従って、２つの相同性領域は、ファージアニーリングタンパク質により媒介される修復組換えのために、厳密に要求される。
【００８５】
記載した組換え機構のいくつかの局面を、図１Ａに記載した組換えアッセイを用いて、より詳細に研究した。
【００８６】
表３は、図１のアッセイを用いる、組換え反応を媒介するための、ｓｓＤＮＡオリゴヌクレオチドに存在する相同性領域の長さ、このオリゴヌクレオチド（ｐＧＫｎｅｏ＊の欠損ｎｅｏ遺伝子の下の鎖または上の鎖のいずれかに相補的である）の配向、およびＲｅｃＴまたはＲｅｃβのいずれかを使用して達成される標準化した組換え効率を示す。この実験について、示したファージタンパク質を、ＪＣ５５１９において、対応する遺伝子を含むｐＢＡＤ２４ベースのプラスミドから誘導性発現させた。示したタンパク質を誘導性発現するエレクトロコンピテント細胞を、上記のように（エレクトロポレーション、選択、および得られた組換え効率の標準化で既に述べたように）調製した。
【００８７】
これらの実験から、組換えのために用いられるオリゴヌクレオチドを、ｐＧＫｎｅｏ＊の欠損ｎｅｏ遺伝子のいずれかの鎖に相補的であるように設計し得ることを実証した（表３を参照のこと）。しかし、一貫した差異を、組換え効率において見出した。この効率は、上の鎖に相補的であったオリゴヌクレオチドと比べて、下の鎖に相補的であるオリゴヌクレオチドについてより高かった。
【００８８】
（実施例３：組換えに必要であるヌクレオチドの数に関する組換え効率）
この実験の詳細は、以下のとおりであった。４つの型のｐＧＫｎｅｏ由来プラスミドを、各々可変長のｎｅｏ遺伝子中に配列欠損を含み、これらの各々のプラスミドの中にｎｅｏ遺伝子欠損を与えるように構築した。ｐＧＫｎｅｏΔにおいて、４個のヌクレオチドを、ｎｅｏ遺伝子内から欠失させ（図１Ｂを参照のこと）、ｐＧＫｎｅｏΔ１５において、１５個のヌクレオチドを欠失させ、ｐＧＫｎｅｏΔ３３において、３３個のヌクレオチドを欠失させ；そしてｐＧＫｎｅｏΔ６０において、６０個のヌクレオチドを欠失させた。これらのプラスミドの各々を、２５個のヌクレオチドの相同性領域に隣接する損失配列を含むオリゴヌクレオチドと組換えた。従って、全てのｐＧＫｎｅｏΔプラスミド改変体を、それ自体に特異的なオリゴヌクレオチドと共に、同時エレクトロポレーションした。この特異的なオリゴヌクレオチドは、２５ｎｔの相同性領域（用いられる全てのプラスミドについて同じ）に隣接する、これらのプラスミド型の欠損配列（用いられるプラスミドに依存して４、１５、３３または６０個のヌクレオチド）を含んでいた。全ての組換え反応について、相同性領域の長さは、同じ（すなわち、２５ｎｔ）であった。ｐＧＫｎｅｏΔ１５、ｐＧＫｎｅｏΔ３３およびｐＧＫｎｅｏΔ６０を作製するために、ｐＧＫｎｅｏを、ｎｅｏ遺伝子を独自に切断するＮｃｏＩを用いて消化した。引き続いて、製造業者（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）の指示書に従ってＢａｌ３１と共にインキュベーションすることにより、配列欠損を作製した。Ｂａｌ３１消化の後、得られた分子を連結して、インタクトな環状プラスミドを作製した。作製した配列の長さを、ＤＮＡ配列決定により決定した。作製した配列の長さを、ＤＮＡ配列決定により決定した。示したファージタンパク質を、ＪＣ５５１９細胞において、それぞれの遺伝子を含むｐＢＡＤ２４ベースのプラスミドから誘導性発現させた。示したタンパク質を誘導性発現したエレクトロコンピテント細胞を、上記のように（エレクトロポレーション、選択、および得られた組換え効率の標準化で既に述べたように）調製した。
【００８９】
組換え効率と、環状プラスミドへと組換えられる必要があり、そして一本鎖オリゴヌクレオチドの相同性領域の間に存在するヌクレオチドの量との間に負の相関が存在することを見出した（図３および凡例を参照のこと）。
【００９０】
（実施例４：相同性領域に存在する点変異）
図４Ａは、組換えアッセイにおいて用いられるオリゴヌクレオチドおよびプラスミドの図を示す。オリゴヌクレオチドの両方の配向を試験した（上の鎖または下の鎖に相補的、表３を参照のこと）。用いられるオリゴヌクレオチドに依存して、点変異は、（下の鎖に相補的であるオリゴヌクレオチドの場合）欠損ｎｅｏ遺伝子を修復し得る配列に対して５’側にあるか、または（上の鎖に相補的であるオリゴヌクレオチドの場合）欠損ｎｅｏ遺伝子を修復し得る配列に対して３’側にある。導入した点変異は、ｎｅｏ遺伝子に組換えられる場合、ｎｅｏ遺伝子中にサイレントな変異を導入し、それにより、タンパク質配列および遺伝子の機能を変化しない。これらのオリゴヌクレオチドを、ｐＧＫｎｅｏ＊プラスミドを用いて、ファージアニーリングタンパク質を発現するＪＣ５５１９遺伝子へと同時エレクトロポレーションした。
【００９１】
図４Ｂは、達成された組換え効率を表す。各配向についてのｓｓＤＮＡオリゴヌクレオチドを用る組換えの後に試験した約５０個の組換えクローンの中で、相同性領域に存在する点変異を組換え産物へと組み込んだクローンはなかった（データ示さず）。
【００９２】
この実験は、いずれかの相同性領域に存在する単一の点変異が、環状プラスミドへと組換えられず、そして組換え反応を無効にしないことを実証した。この実験についての実験手順は、以下のとおりである。示したファージタンパク質を、ＪＣ５５１９において、対応する遺伝子を含むｐＢＡＤ２４ベースのプラスミドから誘導性発現させた。示したタンパク質を誘導性発現するエレクトロコンピテント細胞を、上記のように（エレクトロポレーション、選択、および得られた組換え効率の標準化で既に述べたように）調製した。
【００９３】
（実施例５：末端ジデオキシ残基を含む一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドは、組換えに熟達している）
図５Ａは、組換えアッセイに用いられるオリゴヌクレオチドおよびプラスミドをの図を示す。オリゴヌクレオチドの両方の配向を試験した（上の鎖または下の鎖に相補的、表３を参照のこと）。両方の配向において、ｓｓＤＮＡオリゴヌクレオチドの３’末端は、ジデオキシ残基を含む。これらのオリゴヌクレオチドを、ｐＧＫｎｅｏ＊プラスミドを用いて、ファージアニーリングタンパク質を発現するＪＣ５５１９遺伝子へと同時エレクトロポレーションした。
【００９４】
これらの実験は、一本鎖オリゴヌクレオチドのまさに３’末端でのジデオキシ残基の存在が、一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドの配向にかかわらず、組換えをブロックしないことを示した（図５を参照のこと）。この実験についての実験手順は上記のとおりであった。示したファージタンパク質を、ＪＣ５５１９において、対応する遺伝子を含むｐＢＡＤ２４ベースのプラスミドから誘導性発現させた。
【００９５】
（実施例６：Ｅ．ｃｏｌｉ染色体の標的化）
Ｅ．ｃｏｌｉ染色体が、一本鎖オリゴヌクレオチドを用いるファージアニーリングタンパク質を媒介した修復組換えを介して、標的化され得るか否かを決定すために、このアッセイを、図６に記載したように行った。
【００９６】
このアッセイは、図１のアッセイに原則的に類似する。ファージタンパク質を、ＪＣ５５１９において、対応する遺伝子を含むｐＢＡＤ２４ベースのプラスミドから誘導性発現させた（図６を参照のこと）。ＪＣ５５１９ｎｅｏ＊およびＪＣ５５１９ｎｅｏΔを、以下の手順を用いてＥＴ組換えにより生成した。初めに、クロラムフェニコール耐性遺伝子（ｃｍｒ）およびそのプロモーターを、ＥＴ組換えにより、ｐＧＫｎｅｏ＊およびｐＧＫｎｅｏΔの欠損ｎｅｏ遺伝子の３’側にクローン化した。次いで、ＰＣＲフラグメントを、ｎｅｏ＊遺伝子およびｃｍｒ遺伝子およびこれらのプロモーター（ｃｍｒを含むｐＧＫｎｅｏ＊から増幅される）を含むか、またはｎｅｏΔ遺伝子およびｃｍｒ遺伝子およびこれらのプロモーター（ｃｍｒを含むｐＧＫｎｅｏΔから増幅される）を含むように作製した。これらのＰＣＲフラグメントはまた、ＪＣ５５１９のｌａｃＺ遺伝子座に対するフラグメントの標的化を可能にする相同性領域を含んでいた。ｎｅｏ＊−ｃｍｒカセットまたはｎｅｏΔ−ｃｍｒカセットを有するＪＣ５５１９の標的化、およびクロラムフェニコールを含むＬＢプレートでの選択の後、それぞれ、ＪＣ５５１９ｎｅｏ＊、ＪＣ５５１９ｎｅｏΔを得た。正確な組込みをサザン分析により確認した。
【００９７】
示したタンパク質を誘導性発現するエレクトロコンピテント細胞を、図１に対する凡例に記載したように、厳密に調製した。エレクトロポレーション、選択、およびの得られた組換え効率の標準化を、図１および表１のプロトコルおよび条件を用いて行った。ＪＣ５５１９の染色体に対する欠損ｎｅｏ遺伝子のＥＴクローニングの間のクロラムフェニコール選択について、２０μｇ／ｍｌの濃度を用いた。機能的ｎｅｏ遺伝子を有する正確な組換え体の選択のために、２０μｇ／ｍｌの濃度を用いた。
【００９８】
従って、図６において、標的化配列は、欠損ｎｅｏ遺伝子（ｐＧＫｎｅｏ＊およびｐＧＫｎｅｏΔから得た）であり、この遺伝子を、ＥＴ組換えにより、ＪＣ５５１９  Ｅ．ｃｏｌｉ宿主株の染色体上に置いた。ファージアニーリングタンパク質を発現し、そして欠損ｎｅｏ遺伝子を含むコンピテント細胞を調製し、そしてｓｓＤＮＡオリゴヌクレオチドと共にエレクトロポレーションした。このｓｓＤＮＡオリゴヌクレオチドは、修復組換えにより、ｎｅｏ遺伝子を修復した。一本鎖オリゴヌクレオチドの両方の配向（ｎｅｏ遺伝子の上の鎖または下の鎖に相補的）は、このアッセイにおいて機能的であることを見出した。このことは、一本鎖オリゴヌクレオチドが、複製を開始するためにＯｋａｚａｋｉフラグメントとして直接機能するという組換え理論に対して反対の議論をする。
【００９９】
（実施例７：絶対的操作効率）
上に示されるデータを得るために、ｎｅｏ遺伝子の修復を、組換え事象についてのスコア付けするための便利な系として利用した。しかし、殆どの実験的適用において、修復組換えにより改変される配列は、抗生物質を用いて選択することができない。従って、記載した活性の絶対的な効率を決定することが望ましい。
【０１００】
これを行うために、同じモデル系を、図１Ａに示すように用い、そして得られたクローンの数を２つの異なる選択プレートにおいて比較した。（図１Ａに示すような）ｐＧＫｎｅｏ＊およびオリゴヌクレオチドのファージアニーリングタンパク質発現宿主細胞への同時エレクトロポレーションの後、（連続希釈として）等量の細胞を、アンピシリンのみを含むＬＢプレート上にプレートし、そして、並行して、アンピシリンおよびカナマイシンを含むＬＢプレート上にプレーとした。アンピシリンのみを含むＬＢプレートにおいて、ｐＧＫｎｅｏ＊プラスミドと共にエレクトロポレーションされた任意の細胞は、コロニーを形成し得る。しかし、カナマイシンおよびアンピシリンを含むＬＢプレートにおいて、組換えが機能的ｎｅｏ遺伝子の修復を生じた細胞のみが生存し得る。
【０１０１】
この実験の結果を表４に要約する。表４は、一本鎖オリゴヌクレオチドとインタクトな環状プラスミドとの間の組換えが、非常に効果的であることを示す。各々５０ｎｔの２つの相同性領域を含むｓｓＤＮＡ分子を、図１のアッセイに記載したように、ファージアニーリングタンパク質を発現するＪＣ５５１９においてｐＧＫｎｅｏ＊と共に同時エレクトロポレーションした。エレクトロポレーションおよび３７℃でのインキュベーションの後、等量の細胞をアンピシリンを含むＬＢプレート、ならびにアンピシリンおよびカナマイシンを含むＬＢプレート上にプレートした。示したファージアニーリングタンパク質を用いて、示したＬＢプレートにおいて得られたコロニーの数を示す。全ての場合において、示したファージタンパク質を、ＪＣ５５１９において、対応する遺伝子を含むｐＢＡＤ２４ベースのプラスミドから、誘導性発現させた。示したタンパク質を誘導性発現するエレクトロコンピテント細胞を、上記のように（エレクトロポレーション、選択、および得られた組換え効率の標準化で既に述べたように）厳密に調製した。カナマイシン選択およびアンピシリン選択の両方について、５０μｇ／ｍｌの濃度を用いた。示したデータは、３つの独立した実験の平均値を表す。
【０１０２】
アンピシリンのみを含むプレート上で得られたコロニーの量とアンピシリンおよびカナマイシンを含むプレートにおいて得られたコロニーの量の間の比から、どのファージアニーリングタンパク質が用いられるかに依存して、エレクトロポレーションした細胞の２００個に約１個が、修復組換えを受けたことが結論付けられ得る。これは、エレクトロポレーションした細胞の総プールから、抗生物質選択に基づかないで、所望の組換え体を同定する選択方法を可能にするのに、実行可能な数である。このような代替的選択方法としては、選択的ＰＣＲベースのストラテジー、制限酵素分析、およびコロニーハイブリダイゼーションが挙げられる。
【０１０３】
（実施例８：線状化プラスミドの再環化）
ファージアニーリングタンパク質の所望の組換え活性をまた、線状化プラスミドの再環化するために（図７に示すように、この実施例では、ｓｓＤＮＡオリゴヌクレオチドの相同性領域間に既に存在する配列を含むために）適用し得る。ここで、線状化プラスミドを、ｓｓＤＮＡオリゴヌクレオチドと共に、ファージアニーリングタンパク質を発現した宿主株へと同時エレクトロポレーションした。淘汰圧を、線状化プラスミドに存在する選択可能なマーカー遺伝子ｂｌａの発現についてのみ用いた。従って、組換え領域については淘汰圧を適用しなかった。組換えの後、ｓｓＤＮＡオリゴヌクレオチドの相同性領域の間に本来存在する配列を含んでいた、インタクトな環状プラスミドを得た。
【０１０４】
この実験についての詳細な実験手順は以下のとおりである。ＮｃｏＩ線状化ｐＧＫｎｅｏ（ＮｃｏＩは、ｐＧＫｎｅｏのｎｅｏ遺伝子中に固有の認識部位を有する、図１の実験プロトコルを参照のこと）を、製造業者（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）の指示書に従って、緑豆（ｍｕｎｇ  ｂｅａｎ）ヌクレアーゼ処理した。緑豆ヌクレアーゼ処理は、ＮｃｏＩにより作製した５’オーバーハングを取り除き、そしてｐＧＫｎｅｏのｎｅｏ遺伝子から４個のヌクレオチドを欠失させる。これらの４つのヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドに存在し、従って、修復組換えを通じて、機能的ｎｅｏ遺伝子を修復し得る。示したファージタンパク質を、ＪＣ５５１９において、それぞれの遺伝子を含むｐＢＡＤ２４ベースのプラスミドから誘導性発現させた。示したタンパク質を誘導性発現するエレクトロコンピテントな細胞を、上記のように（エレクトロポレーション、選択、および得られた組換え効率の標準化で既に述べたように）厳密に調製した。アンピシリン選択について、５０μｇ／ｍｌの濃度を用いた。
【０１０５】
記載した活性が機能する正確な機構は、正確に知られていないが、ファージアニーリングタンパク質は、ｓｓＤＮＡ分子および／またはｄｓＤＮＡ分子に有効に結合し得ることが知られている（ＲｅｃＴ、ＮｏｉｒｏｔおよびＫｏｌｏｄｎｅｒ，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７３（１９９８），１２２７４−１２２８０およびその中の参考文献を参照のこと；Ｒｅｄβ、ＭｕｎｉｙａｐｐａおよびＲａｄｄｉｎｇ、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２６１（１９８６），７４７２−７４７８；Ｋａｒａｋｏｕｓｉｓら、Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２７６（１９９８），７２１−７３１；Ｌｉら、Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２７６（１９９８），７３３−７４４およびその中の参考文献を参照のこと）。さらに、ファージアニーリングタンパク質である、ＲｅｃＴは、それ自身と、ｓｓＤＮＡオリゴヌクレオチドと、インタクトな環状プラスミドとの間でインビトロで複合体を形成し得る。このような複合体は、接合分子（プラスミドおよびｓｓＤＮＡオリゴヌクレオチドからなる接合分子）の形成を導く。この分子はＲｅｃＴの除去後に安定であることを見出した。しかし、安定な接合分子の形成は、ｓｓＤＮＡオリゴヌクレオチドとプラスミドとの間の共有した相同性領域に依存することを見出した（図８）。
【０１０６】
この実験について、以下の手順を用いた。示したｓｓＤＮＡオリゴヌクレオチドを、製造業者（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）の指示書に従って末端標識した。ＲｅｃＴを、以前に記載されるように（Ｈａｌｌら、Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ  １７５（１９９３），２７７−２８７）、ＲｅｃＴを過剰発現する細菌株から均質になるまで精製した。ＲｅｃＴを、２５ｍＭ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ  ＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１００μｇ／ｍｌ  ＢＳＡ、０．５ｍＭ  ＤＴＴからなる緩衝液（２７μｌの総量）中の３μｇの標識ｓｓＤＮＡオリゴヌクレオチドと共に、示した濃度範囲で、２５℃にて２０分間インキュベートした。次いで、３μｌ（２μｇに対応）のプラスミドを添加し、そしてインキュベーションを３７℃にてさらに４５分間続けた。サンプルを、０．５ｍｇ／ｍｌの最終濃度までの濃度のプロテイナーゼＫ、０．１％の最終濃度までの濃度のＳＤＳ、および５０ｍＭの最終濃度までの濃度のＥＤＴＡ（ｐＨ＝８）の添加、ならびに３７℃にて１０分間のインキュベーションによって、除タンパクした。２０μｌのサンプルを、０．８％のアガロースゲルにロードし、次いで、７５Ｖにて２時間電気泳動した。ニトロセルロースへのブロッティングおよび写真用フィルムへの露出の後に、シグナルを検出した。
【０１０７】
このようなインビトロで作製した接合分子は、宿主細胞における直接組換えを媒介するのに有用であり得る。これは、ファージアニーリングタンパク質を発現する必要がない。また、インビトロで形成した接合分子の使用は任意の適用において記載した活性の有効性を増大する。また、ファージアニーリングタンパク質によりコートされるＤＮＡ分子（例えば、ｓｓＤＮＡオリゴヌクレオチド）は、「裸の」ＤＮＡ分子と比較してより高い効率で組換わるべきである。
【０１０８】
ファージアニーリングタンパク質の記載した活性を、種々の型および高次構造のいくつかの分子の操作に適用し得る。概要を表５に与える。
【０１０９】
表５．列挙したファージアニーリングタンパク質による操作のために用い得る第１および第２のＤＮＡ分子の型の概要。組換え反応は、ファージアニーリングタンパク質により媒介される、第１の分子と第２の分子との間の組換えを構成する。いくつかの例が、先の図および表に与えたデータにおいて見出され得る。アニールしたＤＮＡオリゴヌクレオチドおよびＲＮＡ分子の使用を含む他の例を、ここでのみ列挙する。
【０１１０】
（実施例９：ＥＳ細胞における、相同組換えによる修復）
（プラスミド）
ＰＫＧプロモーターおよびｎｅｏ＊からなるＤＮＡフラグメントを、ｐｃＤＮＡ３／ｈｙｇ（−）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のＢｓｔ１１０７Ｉ部位に挿入して、ｐｃＤＮＡ／ＰＧＫ−ｎｅｏ＊を作製した。ｒｅｄβ遺伝子およびｒｅｃＥ／ＩＲＥＳ／ｒｅｃＴフラグメントを、ｐｃＤＮＡ／ＰＧＫ−ｎｅｏ＊中にＣＭＶプロモーターの制御下で挿入して、ｐｃＤＮＡ−ｒｅｄβ／ＰＧＫ−ｎｅｏ＊およびｐｃＤＮＡ−ｒｅｃＥＴ／ＰＧＫ−ｎｅｏ＊を作製した（図９を参照のこと）。
【０１１１】
（修復オリゴヌクレオチド）
５０ヌクレオチド（ｎｔ）のオリゴヌクレオチドを、ＮｃｏＩ部位の領域中のｎｅｏ遺伝子の配列に従って合成した。このオリゴヌクレオチドは、２つの２２ｎｔの相同領域からなり、各々が、正確なＮｃｏＩ配列に隣接する（図９の下を参照のこと）。このオリゴヌクレオチドの配列は、以下の通りである：
【０１１２】
【化１】
2004535773.tif 000002
。
【０１１３】
（マウスＥＳ細胞）
マウスＥＳ細胞を、４％のグルコース（Ｇｉｂｃｏ＆ＢＲＬ）、１５％のＦＣＳ（ＰＡＡ）、１００μｍ／ｍｌのペニシリン／ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ＆ＢＲＬ）、１００μＭの非必須アミノ酸（Ｓｅｒｏｍｅｄ）、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ＆ＢＲＬ）、１μＭのβ−メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ）、２ｍＭのＬ−グルタミン（Ｇｉｂｃｏ＆ＢＲＬ）および５００Ｕ／ｍｌのＬＩＦ「ＥＳＧＲＯＴＭ」（Ｇｉｂｃｏ＆ＢＲＬ）を含むＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ＆ＢＲＬ）中で培養した。
【０１１４】
（プラスミドＤＮＡ）
発現プラスミド（図１）を、Ｑｉａｇｅｎ  Ｍａｘｉ−ｐｒｅｐキットを使用して単離し、そしてＡｈｄ  Ｉ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）で消化して、線状ＤＮＡを作製した。沈殿後、ＤＮＡを０．５ｍｇ／ｍｌでＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ＆ＢＲＬ）中に再懸濁した。
【０１１５】
（エレクトロポレーション）
１０ｃｍディッシュ上のＥＳ細胞を、コンフルエントになった後に、１０ｍｌのＰＢＳで１回リンスした。１ｍｌのトリプシン／ＥＤＴＡ（Ｇｉｂｃｏ＆ＢＲＬ）溶液を、このディッシュに添加した。このディッシュをインキュベータ中で３〜５分間インキュベートした。１０ｍｌのＥＳ培養培地を、このディッシュに添加し、そしてＥＳ細胞を、上下にピペッティングすることによって単一の細胞に分離した。ＥＳ細胞を、１，０００ｒｐｍで５分間スピンダウンした。上清を除去し、そして細胞ペレットを０．８ｍｌのＰＢＳに再懸濁した。２０μｇのプラスミドＤＮＡまたは５μｇのオリゴヌクレオチドを、ＥＳ細胞と混合し、そして４ｍｍのエレクトロポレーションキュベット中に配置した。ＤＮＡとＥＳ細胞との混合物を、２４０Ｖでエレクトロポレーションした。エレクトロポレーションした細胞を、ゼラチンコーティングしたディッシュに移し、そして１０ｍｌの培養培地を添加した（図１０を参照のこと）。
【０１１６】
（選択）
トランスフェクトした細胞の培地を、毎日交換し、そして選択抗生物質をトランスフェクションの４８時間後に添加した。コロニーを、選択のほぼ１０日後に観察した。使用した抗生物質の濃度は、以下であった：
Ｇ４１８−２００μｇ／ｍｌ（Ｇｉｂｃｏ＆ＢＲＬ）
ハイグロマイシンＢ−４００μｇ／ｍｌ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）。
【０１１７】
（実験手順）
１．ＥＳ細胞を培養し、そして発現プラスミド（ｐｃＤＮＡ／ＰＧＫ−ｎｅｏ＊、ｐｃＤＮＡ−ｒｅｄβ／ＰＧＫ−ｎｅｏ＊およびｐｃＤＮＡ−ｒｅｃＥＴ／ＰＧＫ−ｎｅｏ＊）でトランスフェクトした（従って、３つの別個のトランスフェクションを実行した）。
【０１１８】
２．ハイグロマイシンＢでの選択の１０日後、１２個のコロニーを各ディッシュから取り、そして２４ウェルのプレート中に移した。
【０１１９】
３．細胞を、２４ウェルプレート中でコンフルエントになった後、６ウェルのプレートに移した。
【０１２０】
４．細胞を、６ウェルプレート中でコンフルエントになった後、１０ｃｍディッシュに移した。
【０１２１】
５．オリゴヌクレオチドでのトランスフェクションを、細胞が７０〜８０％のコンフルエントになった後に、実行した。
【０１２２】
６．トランスフェクトした細胞を、Ｇ４１８およびハイグロマイシンによって選択した。
【０１２３】
７．コロニーを計数した（図１１）。
【０１２４】
図１１に示される結果から、このオリゴヌクレオチドが、ｐｃＤＮＡ／ＰＧＫ−ｎｅｏ＊でトランスフェクトされたコントロール細胞と比較して、培養され、そして発現プラスミドｐｃＤＮＡ−ｒｅｄβ／ＰＧＫ−ｎｅｏ＊およびｐｃＤＮＡ−ｒｅｃＥＴ／ＰＧＫ−ｎｅｏ＊でトランスフェクトしたＥＳ細胞において、変異したｎｅｏ遺伝子を首尾よく修復したことが見出され得る。
【０１２５】
（実施例１０：ＢＡＣ中の選択した部位への、短いフラグメントの導入）
本発明の組換え方法はまた、細菌人工染色体（ＢＡＣ）（これは、挿入物の長さに対する大きな収容能力に起因して、第一のクローニングベクターとなっている）に対しても実行され得る。
【０１２６】
この実施例に使用されるＢＡＣは、マウスＭ２２遺伝子を含み、そして１５０ｋｂを超えるサイズである。ｓｓオリゴヌクレオチド組換え工程の評価を容易にした基質を作製するために、Ｍ１１  ＢＡＣを、Ｔｎ５カナマイシン耐性遺伝子（ｎｅｏ）およびストレプトマイシン対抗選択遺伝子（ｒｐｓＬ）を所定の部位に含むカセットを配置するために、１回のＥＴ組換え（ＷＯ９９／２９８３７）に最初に供した。これを、ｐＳＣ１０１／ＢＡＤ／γβα発現ベクターを用いて、Ｍ１１  ＢＡＣ含有Ｅ．ｃｏｌｉを形質転換することによって達成した。アラビノースを、細胞培養の間に添加して、ファージ組換えタンパク質γβαの発現を誘導し、その後、エレクトロコンピテント細胞の調製を行った。これらのエレクトロコンピテント細胞を２つの６０ヌクレオチドのオリゴヌクレオチド（これは、その５’末端に、ＢＡＣ中の選択された領域と同一な４０ヌクレオチドの配列を含み、そして３’末端に、ＰＣＲ反応のためのｒｐｓＬ／ｎｅｏテンプレートに対するプライマーとして働く２０ヌクレオチドの配列を含む）を使用して作製された線状ＰＣＲフラグメントでエレクトロポレーションした。ＥＴクローニングによるＢＡＣへのＰＣＲフラグメントの組込みを、カナマイシン耐性についての選択によって同定した。
【０１２７】
カナマイシン（１５μｇ／ｍｌ）耐性であった５，０００より多くのコロニーのうち、２２個のコロニーを制限消化で分析し、全てが正確であった。ｒｐｓＬ遺伝子が機能的であることをチェックするために、これら２２個をまた、ストレプトマイシンプレート（５０μｇ／ｍｌ）上にストリークした。これらのクローンのうち２０個は、ストレプトマイシンに感受性であり、そして４個を、次の工程のために取り上げた。
【０１２８】
ｓｓオリゴヌクレオチド組換えを使用して、短い配列（ここでは、ＸｈｏＩ制限部位または３４ｂｐのＦＲＴ（ＦＬＰ組換え標的）のいずれか）をＢＡＣに挿入した。２つの一本鎖オリゴを使用して、ｒｐｓＬ−ｎｅｏカセットを欠失した。両方のオリゴは、ｒｐｓＬ／ｎｅｏカセットの挿入部位に直ぐ隣接するＭ１１  ＢＡＣ配列に対して２５ヌクレオチド（ｎｔ）の相同性を有した。オリゴの中ほどにおいて、ＸｈｏＩ部位（オリゴヌクレオチド１）またはＦＲＴ（オリゴヌクレオチド２）を含めた。ＥＴエレクトロコンピテント細胞の（前記のような）調製後、オリゴをエレクトロポレーションし、そしてｓｓオリゴヌクレオチド組換えを、ストレプトマイシン（５０μｇ／ｍｌ）上にプレートすることによって選択して、ｒｐｓＬ遺伝子の喪失について選択した。
【０１２９】
このプレート上で増殖したコロニーを計数した（図１２の下に示される）。２２個のコロニーを取り上げ、そしてＢＡＣ  ＤＮＡを制限消化によって分析した。両方の場合において、２２個のうち２０個が正確であった。
【０１３０】
これらの実験は、ｓｓオリゴヌクレオチド組換えが以下であることを示す：
ａ．ＢＡＣ由来の領域（ここでは、ｒｐｓＬ／ｎｅｏカセット）を欠失し得る；
ｂ．特定の部位に新規の配列を導入するために使用され得る。ここで、この配列は、短かった。なぜなら、１００ｎｔ長までの短い配列領域は、オリゴヌクレオチド合成の間に容易に含まれ得るからである。しかし、ｓｓＤＮＡがより長いＤＮＡ供給源から他の方法によって調製される場合、より長い配列が含まれ得る。
ｃ．単純で強力かつ効率的である。
【０１３１】
（ｐＳＣ１０１／ＢＡＤ／γβα発現系を使用するｓｓオリゴヌクレオチド組換えによる、ＢＡＣの改変のための実験手順）
従来の形質転換方法に記載されるように、ｐＳＣ１０１／γβαＡ発現プラスミドを、マウスＭＬＬ  ＢＡＣ宿主細胞（ＨＳ９９６）中に形質転換する。温度を２℃に設定した冷却Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ遠心分離を使用して、細胞を冷却する。実験前に、ｄＨ２Ｏを少なくとも３時間氷上で冷却するか、または冷蔵庫から冷却ｄＨ２Ｏを取り出して、それを氷上に置く。エレクトロポレーションキュベットもまた、氷上に置くべきである。
１．ｒｐｓＬ−ｎｅｏカセットおよびｐＳＣ１０１／ＢＡＤ／γβαと共にＭｌｌ  ＢＡＣを含むシングルコロニーを、蓋に穴を有するＥｐｐｅｎｄｏｒｆチューブ中に、テトラサイクリン（５μｇ／ｍｌ）、カナマイシン（１５μｇ／ｍｌ）およびクロラムフェニコール（１５μｇ／ｍｌ）を含むＬＢ培地１．４ｍｌ中に接種する。加熱ブロックにおいて３０℃で攪拌しながら、ＯＤ６００が約０．１５〜０．２になるまで、４〜５時間このチューブをインキュベートする。
または
蓋に穴を有するＥｐｐｅｎｄｏｒｆチューブ中に、テトラサイクリン（５μｇ／ｍｌ）、カナマイシン（１５μｇ／ｍｌ）およびクロラムフェニコール（１５μｇ／ｍｌ）を含むＬＢ培地１．４ｍｌ中に３０μｌの一晩培養物を添加する。加熱ブロックにおいて３０℃で攪拌しながら、ＯＤ６００が約０．２になるまで、約２時間このチューブをインキュベートする。
次いで
２．Ｌ−アラビノースを０．１％〜０．２％（最終）まで添加して、リコンビナーゼの発現を誘導する。
３．３７℃の加熱ブロック中に移し、そしてＯＤ６００が約０．３５〜０．４になるまで、４５〜６０分間３７℃でインキュベートする。
４．室温にて、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ遠心分離において、最高速度を３０秒間使用して、細胞をスピンダウンする。
５．上清を廃棄し、そしてチューブを氷上に置く。
６．細胞を、１．０ｍｌの氷冷ｄＨ２Ｏまたは１０％の氷冷グリセロール中に、氷上で再懸濁する。
７．最高速度を３０秒間使用して、細胞をスピンダウンし、上清を廃棄する。
８．細胞を、１．０ｍｌの氷冷ｄＨ２Ｏまたは１０％の氷冷グリセロール中に、氷上で再び再懸濁する。
９．最高速度を３０秒間使用して、細胞をスピンダウンする。
１０．１ｍｌのピペットを使用して上清を廃棄し、約２０〜３０μｌの溶液を残す。
１１．ｄＨ２Ｏ中のオリゴヌクレオチド（５０μＭ）１μｌを添加し、そして氷冷エレクトロポレータキュベット（１ｍｍ）中に取り出す。
１２．細胞を、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆエレクトロポレータを使用して１，３５０Ｖでエレクトロポレーションする。
１３．１ｍｌのＬＢ培地を添加し、３７℃で７５分間インキュベートする。
１４．細胞を、クロラムフェニコール（１５μｇ／ｍｌ）およびストレプトマイシン（１５μｇ／ｍｌ）または他の抗生物質を含むプレート上に移す。
１５．このプレートを、３７℃で一晩インキュベートする。ＥＴプラスミド（ｐＳＣ１０１／ＢＡＤ／γβα）は、３７℃で失われる。
【０１３２】
（実施例１０の結論）
ＢＡＣは、しばしば、改変のためには、最も厳しいテンプレートであることが示されてきた。本発明の組換え技術が、ＢＡＣに対して機能し得ることを実証することによって、Ｅ．ｃｏｌｉ中のすべての他のテンプレート（Ｅ．ｃｏｌｉ染色体、ＰＡＣ、および他の低コピーテンプレートを含む）ならびに培地および高コピープラスミドがまた、ｓｓオリゴヌクレオチド組換えによって改変され得る。
【０１３３】
（実施例１１：ＥＴ組換えを介した一本鎖オリゴヌクレオチドによる、マウスＭｌｌ  ＢＡＣ中の短いフラグメントの高スループットの配列欠失および導入）
この実施例は、さらに、本発明の組換え技術がＢＡＣと共に機能する能力を実証する。
【０１３４】
ＢＡＣを、実施例１０のように、第１回のＥＴ組換えによって改変した。しかし、この場合、ＢＡＣはすでにＴｎ５カナマイシン耐性遺伝子（ｎｅｏ）（これは、以前の回のＥＴ組換え（示さず）において導入された）を含んだ。ｎｅｏ遺伝子自体は、ＥＴ組換え後のゼオシン（ｚｅｏｃｉｎ）耐性獲得についての選択によるｌａｃＺ／Ｚｅｏカセットの導入によって破壊した。この実験においては、実施例１０で使用したｐＳＣ１０１プラスミドではなく、ＣｏｌＥ１起源のプラスミドｐＢＡＤ  αβγを使用した。
【０１３５】
ｌａｃＺ／ｚｅｏカセットは、約３．４５ｋｂ長であり、そして３’末端でゼオシン耐性遺伝子（ｚｅｏ）に融合したｌａｃＺ遺伝子からなる。ＥＴ組換えによる改変Ｍ１１  ＢＡＣへのｎｅｏ遺伝子の組込み後、ゼオシン耐性（１０μｇ／ｍｌ）についてアッセイするための１アリコートのプレーティングは、１０５より多いコロニーが、正確な組換え体であることを示した。次いで、５０個のコロニーを、カナマイシンプレート上にストリークして、カナマイシン耐性の喪失を評価したところ、これらのうち全てがカナマイシンに感受性であり、これは、正確な組換えを示す。２２個のコロニーを、制限消化によってさらに分析したところ、全てが正確であった。４個の正確なクローンを、次の工程に使用した。
【０１３６】
ｎｅｏ遺伝子の破壊点の各側に同一な配列の長さが異なる、５個のｓｓオリゴヌクレオチドのセットを合成した。これらのオリゴヌクレオチドは、６ヌクレオチドのＮｃｏＩ制限部位のいずれかの側の相同性アーム（ｈａ）において同一な、２０、３５、５０、６５または８０ヌクレオチドのいずれかの配列を有した。各オリゴヌクレオチドは、ｓｓオリゴヌクレオチド組換えによってＢＡＣ中に正確に組み換えられる場合、ＮｃｏＩ部位でｎｅｏ遺伝子を再構成し、ｌａｃＺ／ｚｅｏカセットを欠失する。従って、正確な組換えは、カナマイシン耐性の獲得によってスコアリングされ得る。ＥＴエレクトロコンピテント細胞の調製（以下の実験手順を参照のこと）およびオリゴヌクレオチドのエレクトロポレーション後、細胞を希釈し、そしてカナマイシン（１５μｇ／ｍｌ）およびクロラムフェニコール（１５μｇ／ｍｌ）のプレート上、またはクロラムフェニコール（１５μｇ／ｍｌ）のみのプレート上にプレートし、そしてコロニーの数をスコアリングした。結果を、図１３の下に示す。２２個のカナマイシン耐性コロニーを、ＮｃｏＩ制限消化によって分析したところ、全てが正確であった。
【０１３７】
（ｐＢＡＤ／γβα発現系を使用してオリゴヌクレオチドを用いるＢＡＣの改変のための実験手順）
従来の形質転換方法に記載されるように、ｐＢＡＤ／βγα発現プラスミドを、マウスＭ１１  ＢＡＣ宿主細胞（ＨＳ９９６）中に形質転換する。−５℃の温度に設定した冷却遠心分離を使用して、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞を冷却する。実験前に、ｄＨ２Ｏを少なくとも３時間氷上で冷却するか、または冷蔵庫から冷却ｄＨ２Ｏを取り出して、それを氷上に置く。エレクトロポレーションキュベットもまた、氷上に置くべきである。
【０１３８】
１．ｎｅｏ−ｌａｃＺ−ｎｅｏカセットおよびｐＢＡＤ−γβαと共にＭｌｌ  ＢＡＣを含むシングルコロニーを、蓋に穴を有するＥｐｐｅｎｄｏｒｆチューブ中の、アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）、ゼオシン（１０μｇ／ｍｌ）およびクロラムフェニコール（１５μｇ／ｍｌ）を含むＬＢ培地１．４ｍｌ中に接種する。
【０１３９】
２．このチューブを、加熱ブロックにおいて、３７℃で攪拌しながら一晩インキュベートする。
【０１４０】
３．２００ｍｌのフラスコ中の、アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）、ゼオシン（１０μｇ／ｍｌ）およびクロラムフェニコール（１５μｇ／ｍｌ）を含むＬＢ培地３０ｍｌ中に０．３ｍｌ一晩培養物を添加する。
【０１４１】
４．このフラスコを、３７℃で攪拌しながら、ＯＤ６００が約０．２になるまで、約２時間インキュベートする。
【０１４２】
５．Ｌ−アラビノースを０．１％〜０．２％（最終）まで添加して、リコンビナーゼの発現を誘導する。
【０１４３】
６．ＯＤ６００が約０．３５〜０．４になるまで、４５〜６０分間３７℃でインキュベートする。
【０１４４】
７．培養物を遠心分離チューブに移し、細胞を−５℃にて７，０００ｒｐｍで６分間スピンダウンする。
【０１４５】
８．上清を廃棄し、そしてチューブを氷上に置く。
【０１４６】
９．細胞を、３０ｍｌの氷冷ｄＨ２Ｏまたは１０％の氷冷グリセロール中に、氷上で再懸濁する。
【０１４７】
１０．細胞を、−５℃にて７，０００ｒｐｍで６分間スピンダウンし、上清を廃棄する。
【０１４８】
１１．細胞を、３０ｍｌの氷冷ｄＨ２Ｏまたは１０％の氷冷グリセロール中に、氷上で再び再懸濁する。
【０１４９】
１２．細胞を、−５℃にて７，０００ｒｐｍで６分間スピンダウンする。
【０１５０】
１３．上清を廃棄し、そしてティッシュを使用してチューブをすぐにきれいにし、約２０〜３０μｌの溶液を残す。
【０１５１】
１４．コンピテント細胞をＥｐｐｅｎｄｏｒｆチューブに移し、そしてｄＨ２Ｏ中のオリゴヌクレオチド（５０μＭ）１μｌを添加する。
【０１５２】
１５．この混合物を氷冷エレクトロポレータキュベット（１ｍｍ）に取り出し、そしてＥｐｐｅｎｄｏｒｆエレクトロポレータを使用して、１，３５０Ｖで細胞をエレクトロポレーションする。
【０１５３】
１６．１ｍｌのＬＢ培地を添加し、そして３７℃で７５分間インキュベートする。
【０１５４】
１７．クロラムフェニコール（１５μｇ／ｍｌ）およびカナマイシン（１５μｇ／ｍｌ）を含むプレート上に、細胞を移す。
【０１５５】
１８．このプレートを３７℃で一晩インキュベートする。
【０１５６】
（実施例１１に対する結論）
実施例１０と同じ結論を確立することに加えて、異なるストラテジーおよび異なる発現プラスミドを使用することによって、この実験は、ｓｓオリゴヌクレオチド組換えの絶対的な効率を測定する。相同性アーム中の５０ヌクレオチド長の見かけ上最適の長さで、総コロニー数の３％が、正確に組換えられた。この顕著な有効性を考慮すると、抗生物質耐性についての選択が必要なく、そして単純な物理的方法論（例えば、制限分析、ＰＣＲ、コロニーＰＣＲまたはコロニーハイブリダイゼーション）を使用して、正確な組換え体を同定し得ることが明らかである。
【０１５７】
（考察）
本発明者らは、共有された相同配列を介した修復組換えによって、単一のファージアニーリングタンパク質が２つの分子の組換えを媒介する、新規の組換え活性を本明細書中に記載する。この活性を使用して、いくつかの操作ストラテジー（例えば、欠失（図１Ａ）、挿入（ヌクレオチドおよび短い操作配列（例えば、タンパク質タグ（図１Ｂ））から、数キロ塩基対までの）、または配列の置換）は、一定範囲の分子に適切である。この活性のいくつかの重要な特徴を、以下に要約する。これらの特徴の多くは、本明細書に記載される活性を、ＥＴ組換え（上記を参照のこと）（これはまた、ファージアニーリングタンパク質の発現を必要とする）から識別する。適切な場合、これらの差異は、強調される。
・記載された活性は、一定範囲の分子中の１個または多数のヌクレオチドの、欠失、挿入および置換を可能にする。
・相同性領域の配列の設計により、記載された活性は、所望の任意の改変可能な部分での分子のＤＮＡ操作に適用され得る。
・記載された活性は、外因性（例えば、プラスミド）ＤＮＡおよび内因性（染色体）ＤＮＡの改変に適切である。
・記載された活性は、ファージアニーリングタンパク質の発現を必要とする。しかし、オルソロガスなエキソヌクレアーゼパートナーの発現は、必要ではない。このことは、アニーリングタンパク質の発現およびそのオルソロガスなエキソヌクレアーゼパートナーの発現が厳密に必要なＥＴ組換えとは対照的である（Ｍｕｙｒｅｒｓら、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ  １４（２０００）、１９７１−１９８２）。さらに、Ｅ．ｃｏｌｉにおける他の組換え経路が、記載される活性を媒介できないことが見出された。
・必要な共有された必要とされる相同性の長さは、非常に短い（ＥＴ組換え（Ｚｈａｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ  ２０（１９９８）、１２３−１２８；Ｍｕｙｒｅｒｓら、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ  １４（２０００）、１９７１−１９８２）よりも短い）。
・これまでに試験した長さまでは、組換え効率は、共有された相同性領域の長さの増加と伴に増加し続ける。
・インビトロで、ファージアニーリングタンパク質は、分子をコーティングし得、そして相同性領域共有分子間で分子の連結を形成し得る。
・記載される活性において、相同性領域における点変異は、組換え体に導入されない（図４）。
・記載される活性が機能する機構において、第二の分子（表５）単独では、複製のためのプライマーとしても岡崎フラグメントとしてもおそらく機能しない。なぜなら、ジデオキシ残基を含む第二の分子は、記載される活性について使用され得（図５）、そしてプラスミドおよび染色体の操作は、リーディング鎖およびラギング鎖の両方由来の一本鎖分子を使用して行われ得るからである（表３、図６）。
・ＲｅｃＢＣＤの発現は、記載される活性を阻害しないが、一方で、ＥＴ組換えを阻害する（Ｚｈａｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ  ２０（１９９８）、１２３−１２８）。
・Ｅｒｆのみ、またはＡｒｆ、Ｅｒｆ、Ａｂｃ１およびＡｂｃ２の任意の組み合わせを構成するＰ２２組換え系は、記載される活性について熟練しているが、ＥＴ組換えについては熟練していない（おそらく、Ｅｒｆに対するオルソロガスなエキソヌクレアーゼパートナーの非存在に起因する）。
・記載される活性において、オリゴヌクレオチドから環状プラスミド中に組換える必要のあるヌクレオチドの量の増加は、組換え効率における減少と相関する。このような影響は、ＥＴ組換えについては、観察されない。
・ＲＮＡ分子が、記載される活性において使用され得る。
【０１５８】
記載される活性は、ＤＮＡ操作のための広く適用可能なストラテジーを可能にする。記載される活性の高い効率を考慮して、抗生物質選択のいくつかの形態に基づかない、エレクトロポレーションした細胞の全プールから正確な組換え体を同定するための選択方法が、適切である。このような選択方法としては、例えば、選択的ＰＣＲ法、制限酵素分析およびコロニーハイブリダイゼーションが挙げられる。さらに、標的分子の安定性は、ファージアニーリングタンパク質に加えて、オルソロガスなエキソヌクレアーゼパートナータンパク質の存在を必要とする機能的相同組換え経路の存在によっては、危険にさらされない。記載される活性を使用するＤＮＡ操作の効率は、組換えストラテジーにおいて、コーティングされた分子または連結された分子を使用することによって、さらに増大され得る（図８を参照のこと）。
【０１５９】
記載される活性はまた、内因性または外因性の供給源由来のファージアニーリングタンパク質を発現し得る他の種または細胞における遺伝子操作についても、有用であり得る。あるいは、インビトロで予め作製された連結またはコーティングされた分子（この方法は、図８に記載され、そして任意の第一および／または第二のＤＮＡ分子ならびに表５に列挙される任意のアニーリングタンパク質を使用して、任意の型の連結またはコーティングされた分子に適用され得る）は、いずれのファージアニーリングタンパク質を発現することも必要としないが、なお記載される活性を可能にする、任意の種または細胞における、修復および相同組換えのために使用され得る。
【０１６０】
実施例９に詳述される、ＲｅｃＴおよびＲｅｄβが、この染色体遺伝子座に対する非常に短い相同性領域のみを共有するＤＮＡ分子（ここでは、オリゴヌクレオチド）を使用して、ＥＳ細胞の染色体上に存在する遺伝子座の標的化された改変を可能にする、という知見は、非常に重要なものである。
【０１６１】
第一に、ＲｅｄβおよびＲｅｃＴ（ならびに、おそらくＲｅｃＴおよびＲｅｃＥ）が、真核生物細胞（例えば、ＥＳ細胞）において機能的であることが実証される。従って、おそらく、これらのタンパク質およびそれらの機能的ホモログは、他の真核生物の細胞および生物体においても同様に機能する。
【０１６２】
第二に、このことは、真核生物の細胞および生物体のＤＮＡ操作における新たな可能性への扉を開ける。これまで、例えば、植物細胞株、ハエ細胞株など、および哺乳動物の体細胞株のほとんどは、（存在するとしても）非常に低い相同組換え効率を有する。従って、今日、このような細胞における特定の遺伝子座を標的化することは、非常に困難である；ほとんどの真核生物の生物体の標的化された改変についても同じことがいえる。このことは、ファージアニーリングタンパク質（またはこれらの機能的ホモログ）を使用することによって単純化されて、非常に短い相同性領域を有する標的化分子（例えば、オリゴヌクレオチド、しかし、他の核酸分子が使用され得る）を使用して、選択された遺伝子座を大きく改変し得る。改変された遺伝子座は、内因的（染色体上）または外因的に存在し得る。
【０１６３】
第三に、これまで、ほとんどの相同組換えに熟練した真核生物細胞（しかし、酵母においてではない）において、専用の標的化構築物中に構築される必要のある長い相同性領域長を有する標的化分子を必要とした。この方法を使用して、本発明者らは、ここに、標的化構築物が構築される必要がないが；その代わり、合成オリゴヌクレオチドが購入され、そして直接使用されることを記載する。また、全体的な標的化改変効率は、この知見の適用により、有意に増大され得る。
【０１６４】
第四に、この知見は、選択マーカーを適用しない、高等真核生物におけるＤＮＡ改変へのアクセスを開く。実施例９に示される実験から、分析したコロニーの一部において、標的化改変が生じていたことが明らかである（この改変は、選択マーカーの修復により検出されたが、これは、改変がすでに生じた後にのみ行われることに注意すること）。
【０１６５】
第五に、ＲｅｃＴおよびＲｅｄβが、ＥＳ細胞において機能的であるという知見は、連結およびコーティングされた分子が、同様に機能的であることを確認する。従って、ＲｅｃＴまたはＲｅｄβのインビトロでの予備インキュベーションによって、真核生物細胞および動物における標的化改変の効率は、おそらく増大される。連結およびコーティングされた分子を使用することによって、おそらく標的化改変もまた、相同組換えについての低い（かまたはない）固有の能力を有する生物または生物体において適切である。
【０１６６】
第六に、ＥＴ組換え（共有に係る特許出願のＷＯ９９２９８３７およびＷＯ０１０４２８８に記載される）は、潜在的に、高等真核生物においても同様に直接適用され得る。ＥＴ組換えは、両方の成分（ＲｅｃＥおよびＲｅｃＴ、またはＲｅｄαおよびＲｅｄβ；Ｍｕｙｒｅｒｓら、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ  １４、１９７１−１９８２（２０００）を参照のこと）に厳密に依存するが、少なくともＲｅｃＴおよびＲｅｄβが機能的であるという知見は、有望であり、そしてＥＴ組換えが、高等真核生物において直接開発され得ることを暗示する。
【０１６７】
従って、この知見および暗示（例えば、コーティングされた分子、連結された分子、または真核生物のＥＴ組換えの使用）は、相同組換えにおいてすでに適切である真核生物の細胞および生物体の標的化改変効率を単純化および増大させるために使用され得、そして相同組換えにおいて適切でない真核生物の細胞および生物体における標的化改変が可能であり得る。従って、ＲｅｃＴまたはＲｅｄβ（あるいは任意のそれらの機能的ホモログ；必要な場合、他の成分（例えば、ＲｅｃＥ、またはＲｅｄα、ＲｅｃＡ、それらの機能的ホモログなど）がまた含まれ得る）は、インビボおよび／またはインビトロで提供され得る（連結およびコーティングされた分子）。
【０１６８】
全てにおいて、この知見の重要性は、高等真核生物細胞におけるＣｒｅ（細菌タンパク質）の使用に対する影響において、潜在的に類似し、そして真核生物におけるＤＮＡ操作についての新規の理論へのアクセスを開く。
【０１６９】
（表）
【０１７０】
【表１】
2004535773.tif 000003
【０１７１】
【表２】
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【０１７２】
【表３】
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【０１７３】
【表４】
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【０１７４】
【表５】
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【図面の簡単な説明】
【０１７５】
【図１Ａ】図１Ａは、インタクトな環状プラスミドと単鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドとの間の組換えを調節するファージアニーリングタンパク質を示す。（Ａ）オリゴヌクレオチドとプラスミドｐＧＫｎｅｏ＊との間の修復組換えは、ｐＧＫｎｅｏを作製するための機能的ｎｅｏ遺伝子の回復を生じ、これは、カナマイシンを含むＬＢプレート上で増殖させることによって選択され得る。ｂｌａは、アンピシリン耐性遺伝子を示す。
【図１Ｂ】図１Ｂは、インタクトな環状プラスミドと単鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドとの間の組換えを調節するファージアニーリングタンパク質を示す。（Ｂ）修復組換えは、インタクトな環状プラスミドへの配列の付加を生じる。（Ａ）と同じように、ｐＧＫｎｅｏΔ（これは、欠損ｎｅｏ遺伝子を含むｐＧＫｎｅｏから生じた）とオリゴヌクレオチドとの間の組換えは、機能的なｎｅｏ遺伝子の修復を生じて、ｐＧＫｎｅｏを作製する。また一方、このファージアニーリング促進組換え事象は、カナマイシンを含有するＬＢプレート上で増殖させることによって選択され得る。
【図２Ａ】図２Ａは、組換えプロセスの図解である。異なる長さの相同領域を有するｓｓＤＮＡオリゴヌクレオチドは、宿主系中にｐＧｋｎｅｏ＊と共に同時エレクロトポレートされ、ファージアニーリングタンパク質を発現する。
【図２Ｂ】図２Ｂは、ＪＣ５５１９において試験した、ＲｅｃＴ（Ｔ）、Ｒｅｄβ（β）または外因性タンパク質なし（Ｃ）によって調節される組換えを示す。Ｘ軸上において、ｓｓＤＮＡオリゴヌクレオチド上に存在する相同領域のｎｔ長さが提供される（右および左の相同領域は同じ長さである）。Ｙ軸は、正規化した組換え効率を示す。
【図３Ａ】図３Ａは、オリゴヌクレオチドから環状プラスミド中に組換える必要のあるヌクレオチドの増加量は、組換え効率の減少に関係することを示す。（Ａ）組換えアッセイにおいて使用されるオリゴヌクレオチドおよびプラスミドの図解である。
【図３Ｂ】図３Ｂは、オリゴヌクレオチドから環状プラスミド中に組換える必要のあるヌクレオチドの増加量は、組換え効率の減少に関係することを示す。（Ｂ）（Ａ）に記載されるオリゴヌクレオチドおよびプラスミドならびに組換え反応を調節するために、ＲｅｃＴまたはＲｅｄβのいずれかを用いて達成した、正規化した組換え効率。
【図４】図４は、ｓｓＤＮＡオリゴヌクレオチド上の相同領域のいずれかに存在する点変異は、環状プラスミド中に組換えられず、そして組換え効率を遮断しないことを示す。（Ａ）組換えアッセイにおいて使用されるオリゴヌクレオチドおよびプラスミドの図解である。（Ｂ）（Ａ）に記載されるオリゴヌクレオチド、ｐＧＫｎｅｏ＊およびＲｅｃＴまたはＲｅｄβのいずれかを用いて達成した、正規化した組換え効率。ＲｅｃＴまたはＲｅｄβは、示されるように組換え反応を調節する。
【図５】図５は、末端ジデオキシ残基を含むｓｓＤＮＡオリゴヌクレオチドは、首尾よい組換えであることを示す。（Ａ）組換えアッセイにおいて使用されるオリゴヌクレオチドおよびプラスミドの図解である。（Ｂ）（Ａ）に記載されるオリゴヌクレオチド、ｐＧＫｎｅｏ＊およびＲｅｃＴまたはＲｅｄβのいずれかを用いて達成した、正規化した組換え効率。ＲｅｃＴまたはＲｅｄβは、示されるように組換え反応を調節する。
【図６Ａ】図６Ａは、ファージアニーリングタンパク質調節組換えは、染色体操作のために使用され得ることを示す。（Ａ）使用したオリゴヌクレオチドおよび細菌系の概要。ｓｓＤＮＡオリゴヌクレオチドの両方の配向性は、ＪＣ５５１９ｎｅｏ＊（その染色体上に欠損ｎｅｏ＊遺伝子を含むＪＣ５５１９）またはＪＣ５５１９ｎｅｏΔ（その染色体上に欠損ｎｅｏΔ遺伝子を含むＪＣ５５１９）の染色体上に存在する欠陥のあるｎｅｏ遺伝子を修復するために使用される。オリゴヌクレオチドは、ＪＣ５５１９ｎｅｏ＊またはＪＣ５５１９ｎｅｏΔのいずれかにエレクトロポレートされることが示された。これらの系はまた、ファージアニーリングタンパク質を発現した。
【図６Ｂ】図６Ｂは、ファージアニーリングタンパク質調節組換えは、染色体の操作のために使用され得ることを示す。（Ｂ）（Ａ）に示されるオリゴヌクレオチドおよびＪＣ５５１９ｎｅｏ＊またはＪＣ５５１９ｎｅｏΔ（ＲｅｃＴまたはＲｅｄβのいずれかを発現する）を用いて達成される正規化した組換え効率。ＲｅｃＴまたはＲｅｄβは、示されるように組換え反応を調節する。ｃｍｒは、クロラムフェニコール耐性遺伝子を示す。
【図７Ａ】図７Ａは、線状ｄｓＤＮＡプラスミドとｓｓＤＮＡオリゴヌクレオチドとの間の組換えを調節するファージタンパク質を示す。（Ａ）組換えアッセイにおいて使用されるオリゴヌクレオチドおよびプラスミドの図解である。示されるオリゴヌクレオチドは、ＮｃｏＩで線状化した緑豆ヌクレアーゼ処理したｐＧＫｎｅｏプラスミド（ｎｅｏ遺伝子から４つのヌクレオチドを除去するために；実験プロトコルを参照のこと）と共に、ファージアニーリングタンパク質を発現するＪＣ５５１９遺伝子中に同時エレクトロポレートした。選択プレッシャは、線状化したプラスミド上に存在するｂｌａ遺伝子の発現にのみ影響を与えた。組換え後、ｓｓＤＮＡオリゴヌクレオチドの相同領域間にもともと存在する配列を含むインタクトな環状プラスミドが得られた。従って、これらの組換えられたプラスミドは、機能的なｎｅｏ遺伝子を含んだ（このプラスミドを保有する細胞は、カナマイシンを含有するＬＢプレート上で増殖可能であった；データは示さず）。
【図７Ｂ】図７Ｂは、線状ｄｓＤＮＡプラスミドとｓｓＤＮＡオリゴヌクレオチドとの間の組換えを調節するファージタンパク質を示す。（Ｂ）ＮｃｏＩでの線状化した緑豆ヌクレアーゼ処理したｐＧＫｎｅｏ（組換えなしでの再環状化のためのコントロール）単独、またはＮｃｏＩで線状化した緑豆ヌクレアーゼ処理したｐＧｋｎｅｏおよび（Ａ）に示されるオリゴヌクレオチドを用いて、ＪＣ５５１９（ＲｅｃＴまたはＲｅｄβのいずれかを発現する）において達成された、正規化した組換え効率。ＲｅｃＴまたはＲｅｄβは、示されるように組換え反応を調節する。
【図８】図８は、ＲｅｃＴが、ｓｓＤＮＡオリゴヌクレオチドとプラスミドとの間の安定な、相同領域に依存する連結分子（配列相同性を共有する）を形成し得ることを示す。精製されたＲｅｃＴは、第１に、示されたｓｓＤＮＡオリゴヌクレオチド（これは、検出目的のために３２Ｐ末端標識された）と共にインビトロでインキュベートされた。この工程において、このｓｓＤＮＡオリゴヌクレオチドは、ＲｅｃＴによってコートされる。次いで、ｐＧＫｎｅｏ＊（これは、オリゴヌクレオチドで２つの相同領域を共有する）またはｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（これは、オリゴヌクレオチドで相同領域を共有しない）のいずれかが添加され、さらなるインキュベーションに供された。この混合物は、続いて徐タンパク質（ｄｅｐｒｏｔｅｉｎｉｓｅ）され、アガロースゲル電気泳動および放射活性シグナルの検出に供された。２つのＤＮＡ分子が相同領域を（ｐＧＫｎｅｏ＊およびそのパートナーのｓｓＤＮＡオリゴヌクレオチド）を共有する場合のみ、安定な連結ＤＮＡ分子（ｐＧＫｎｅｏ＊およびそのパートナーのｓｓＤＮＡオリゴヌクレオチドからなる）が、形成された（矢印により示される）。連結分子は、必要に応じて、約０．２μｇ／μｌの濃度のＲｅｃＴで形成された。徐タンパク質化（ｄｅｐｒｏｔｅｉｎｉｓａｔｉｏｎ）が実行されない場合、ＲｅｃＴおよび２つの関連する分子は、共に分子量の大きな複合体となることが見い出された（データは示さず）。
【図９】図９は、ｐｃＤＮＡ／ＰＧＫ−ｎｅｏ＊、ｐｃＤＮＡ−ｒｅｄβ／ＰＧＫ−ｎｅｏ＊およびｐｃＤＮＡ−ｒｅｃＥＴ／ＰＧＫ−ｎｅｏ＊の図解である。
【図１０】図１０は、マウスＥＳ細胞において実行した実験（実施例９）の図解であるを示す。
【図１１】図１１は、実施例９に詳述される実験の結果である。
【図１２】図１２は、実施例１０に詳述される実験の図解および結果である。
【図１３】図１３は、実施例１１に詳述される実験の図解および結果である。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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2004535773.tif 000102
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