(57)【要約】宿主細胞の少なくとも部分的には細胞内の経路から誘導される所望の化合物の、該宿主細胞の生合成的産生を促進する方法が記述されている。そのような方法は、細胞外基質を利用する、少なくとも部分的には細胞内合成経路を持つ宿主細胞を選択し；宿主細胞の完全性を維持すると同時に該宿主細胞内への該細胞外基質の輸送を増加させ；該細胞外基質を産生するために宿主細胞を培養し；および所望の化合物を産生することを含んでいる。基質の輸送は、宿主細胞内へ基質を輸送する、一つまたはそれ以上の酵素をコードしているＤＮＡで宿主細胞を形質転換することにより増加する。
2004519213.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
宿主細胞の少なくとも部分的には細胞内の経路から誘導される所望の化合物の、該宿主細胞の生合成的産生を促進する方法であって：
ａ）細胞外基質を利用する、少なくとも部分的には細胞内合成経路を持つ宿主細胞を選択し；
ｂ）宿主細胞の完全性を維持すると同時に該宿主細胞内への該細胞外基質の輸送を増加させ；
ｃ）該細胞外基質を産生するために宿主細胞を培養し；および
ｄ）所望の化合物を産生することから成る方法。
【請求項２】
該宿主細胞内へ該細胞外基質の輸送を増加させることが、該宿主細胞への該基質の輸送を増加させる一つまたはそれ以上のポリペプチドをコードしているＤＮＡで該宿主細胞を形質転換する工程を含んでいる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
該一つまたはそれ以上のポリペプチドが輸送体プロモーターである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
該一つまたはそれ以上のポリペプチドが主促進体スーパーファミリー輸送体である、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
該一つまたはそれ以上のポリペプチドがアニオン／カチオンＨ＋共輸送体である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
宿主細胞の少なくとも部分的には細胞内の経路から誘導される所望の化合物の、該宿主細胞の生合成的産生を促進する方法であって：
ａ）細胞外基質を利用する、少なくとも部分的には細胞内合成経路を持つ宿主細胞を選択し；
ｂ）宿主細胞の完全性を維持すると同時に該宿主細胞内への該細胞外基質の輸送を増加させ、ここで該宿主細胞内への該基質の輸送が、該宿主細胞生合成的産生における律速段階である；
ｃ）該細胞外基質を産生するために宿主細胞を培養し；および
ｄ）所望の化合物を産生することから成る方法。
【請求項７】
【請求項８】
【請求項９】
【請求項１０】
内部細胞膜を横切った細胞質ゾル内への基質輸送を促進させるための方法であって：
宿主細胞を選択し；および
該宿主細胞内へ基質を輸送する一つまたはそれ以上の酵素をコードしているＤＮＡで該宿主細胞を形質転換することからなる方法。
【請求項１１】
該宿主細胞が細菌および酵母から成る群より選択される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
該宿主細胞がパントエアである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
アニオン／カチオン共輸送体を過剰発現する方法であって：
宿主細胞を選択し；および
一つまたはそれ以上のアニオン／カチオン共輸送体をコードしているＤＮＡで該宿主細胞を形質転換する工程から成る方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
技術分野
本発明は一般的に所望の化合物の生物変換を促進すること、特に、膜を横切った一つの細胞位置から別の位置への基質の輸送を容易にする輸送体を過剰発現することに関している。本発明は微生物中での、所望の最終生成物の促進された産生のための発現ベクター、方法およびシステムを提供する。
背景技術
２−ケト−Ｌ−グロン酸（２−ＫＬＧ）は、Ｒｅｉｃｈｓｔｅｉｎ法（Ｒｅｉｃｈｓｔｅｉｎ，Ｔ．，ｅｔ  ａｌ，Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ  Ａｃｔａ，１９３４，１７  ３１１−３２８；Ｒｅｉｃｈｓｔｅｉｎ，Ｔ．，ｅｔ  ａｌ，１９３３，Ｈｅｌｖ  Ｃｈｉｍ  Ａｃｔａ，１６，５６１，１０１９）における一工程の化学的手順によりＬ−アスコルビン酸（ビタミンＣ）へ容易に変換されることが、一般的によく知られている。出発基質を２−ＫＬＧへ変換するための異種酵素を発現する組換え微生物が存在する。単一発酵工程により、Ｅｒｗｉｎｉａ  ｈｅｒｂｉｃｏｌａ中でＤ−グルコースを２−ＫＬＧへ生物変換するために、組換えＤＮＡ技術が使用されてきた（Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｓ．，ｅｔ  ａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３０，１４４−１４９（１９８５））。しかしながら、この研究は最終生成物の工業的生産における基質輸送の重要性を認識することなく、２，５−ＤＫＧレダクターゼの発現を増加させること、または他の合成的生産に向けられている。実際に、発明者の研究は、レダクターゼの過剰発現の結果として、２−ＫＬＧ生産における極微の増加を明らかにした。それ故、細胞内で蛋白質を変換する発現レベルを増加させる以外の手段により、組換え微生物を利用する生合成経路を経る、２−ＫＬＧの工業的生産を増加させるための手段が必要とされている。
【０００２】
生体膜の脂質二重層は一般的にイオンおよび極性分子に対して不透過性である。これらの生体膜は細胞を区画化し、細胞の異なった部分をお互いに分離している。それ故、種々の生成物を合成するために細胞により利用される基質、ならびにエネルギー発生または増殖のために細胞により利用される代謝物は、それらを利用する合成および／または分解反応から分離されているであろう。生成物合成に関しては、異なった合成経路またはその一部を、細胞の異なった部分に見ることができる。いくつかの酸化的反応は細胞質ゾルの外側で起こることができる。例えば、炭素源を別の中間体に酸化するため、膜結合蛋白質を利用できる。細胞質ゾル反応または経路（例えば、いくつかの還元または脱水素反応）はまた、基質または中間体を別の生成物へ変換するために利用できる。基質および合成装置が膜の反対側にある場合、所望の最終生成物の産生には、所望の最終生成物への変換を可能にするため、合成反応の原位置への基質移動を必要とする。もしくは、細胞膜の内側で発生した最終生成物は、細胞内からの移動を必要とする。細胞の区画化部分は異なった環境パラメーター（例えば、溶質、イオン、最終生成物、濃度その他）を持っている、または正常では不透過性の障壁を横切った移動を必要とするので、何らかの形の能動輸送が必要とされるであろう。
【０００３】
これらの問題に答えて、膜を横切った物質の輸送を増加させることに関する研究が現れた。溶媒または溶解剤が、膜を破断するために使用され、膜を横切った物質の横断を可能にしてきた。しかしながら、そのような方法は宿主細胞の生存力に有害な効果を示す。もし、合成または代謝経路が、宿主細胞自身の代謝または分解経路によりエネルギーを与えられているまたは依存するとしたら（ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨのような補因子を必要とするような）、細胞の生存力を破壊することは、宿主細胞によるさらなるまたは連続した合成的産生を停止させる。加えて、細胞増殖を増加させることによるグルコースまたは他のサッカリド輸送の増加が探求されているが（Ｐａｒｋｅｒ，Ｃ．，ｅｔ  ａｌ，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  １５（５）：７９５−８０２（１９９５））、組換え微生物を利用する生合成経路による化学最終生成物または中間体の工業的生産を増加させるために細胞輸送システムを改変することは認識されていない。
【０００４】
Ｃｏｒｎｉｓｈ（Ｊ．ｏｆ  Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１３４：３１１１−３１２２（１９８８））はＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｙｕｍ  ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒによるグルコース輸送とスクシノグルカン  エキソポリサッカリド産生の関係を議論している。Ｃｏｒｎｉｓｈは、グルコース取込がスクシノグルカン産生の主たる反応速度制御点であったこと、およびもっと速い速度のスクシノグルカン産生を得るために組換えＤＮＡ法を使用することにより、もっと速い速度でスクシノグルカン産生が得られるはずであることを提案している。しかしながら、Ｃｏｒｎｉｓｈの産生速度は工業的に要求される規模ではなかった。さらに、高いレベルのエネルギーが消費され、およびグルコースの輸送に複雑な調節機構が含まれており、その使用を助長するというよりもむしろ思いとどまらせるものであったであろう。
【０００５】
Ｖｏｌｓｃｈｅｎｋ，Ｈ．，ｅｔ  ａｌ（Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１  ５：２５３（１９９７年３月）は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ内へのリンゴ酸分解経路の導入を記載しており、ワイン中に存在するリンゴ酸レベルを枯渇させる目的で、それをコードしている異種ＤＮＡのクローニングおよび発現を行っている。Ｖｏｌｓｃｈｅｎｋは主として、取り巻いている培地からのリンゴ酸の除去に関心を示し、工業的規模での所望の最終生成物生産には関心を持ってはいない。
【０００６】
さらに、輸送システムが関与するという単なる知見は、所望の最終生成物または中間体の促進された産生をほとんど保証しない。合成装置はすでに飽和されているであろうから、存在する基質が増加しても、所望の最終生成物の産生が必然的に増加するわけではないであろう。加えて、産生基質としてのその使用に加えて代謝産物として直接的にまたは間接的に利用される基質の輸送が増加しても、望まれた産生の増加は生じないであろう。
【０００７】
基質を望まれる最終生成物に変換する酵素の発現レベルを単に増加させても、組換え微生物を使用する化学的化合物の産生を増加させないであろう。細胞中の基質発現レベルを増加させる以外の手段により、組換え微生物を使用する化学的化合物の産生を増加させるための手段が必要とされている。
【０００８】
また、細胞中の細胞質ゾルレダクターゼの発現レベルを増加させる以外の手段により、組換え微生物を利用する、生合成経路を通した２−ＫＬＧの工業的生産を増加させるための手段も必要とされている。
発明の要約
微生物の基質輸送装置の能力は所望の最終生成物産生、特に、最終生成物、中間体または前駆体産生が細胞の異なった領域に区画化されている場合に障害になるであろう。本発明はその障害を軽減する手段を提供する。
【０００９】
本発明は、一部、細胞膜を横切った基質輸送を増加させると、所望の基質の総産生を増加させるという発見に基づいている。
本発明はまた、微生物中の少なくとも部分的には細胞内の経路から誘導される所望の化合物の生合成的産生を促進するための改良法も提供する。従って、該宿主細胞の少なくとも部分的には細胞内の経路から誘導される所望の化合物の宿主細胞生合成的産生を促進するための方法が提供され、該方法は、細胞外基質を利用する、少なくとも部分的には細胞内合成経路を持つ宿主細胞を選択し；宿主細胞の完全性を維持すると同時に該宿主細胞内への該細胞外基質の輸送を増加させ；該細胞外基質を産生するために宿主細胞を培養し；および所望の化合物を産生することを含んでいる。
【００１０】
本発明の一つの好適な態様において、再宿主細胞内への該基質の輸送は、宿主細胞生合成産生の律速段階である。
好適な態様において、宿主細胞はクレブシエラおよびパントエアから選択される。
【００１１】
本発明の一つの態様において、宿主細胞内への細胞外基質を増加させることは、宿主細胞内への基質の輸送を増加させる一つまたはそれ以上の蛋白質をコードしているＤＮＡで、宿主細胞を形質転換する工程を含んでいる。一つの態様において、蛋白質は輸送体プロモーターである。別の態様において、蛋白質は主スーパーファミリー促進剤である。さらに別の態様において、蛋白質はアニオン／カチオンＨ＋共輸送体である。
【００１２】
本発明はさらに、基質／Ｈ＋共輸送体を過剰発現させる方法を提供し、それは宿主細胞を選択し、および一つまたはそれ以上の基質／Ｈ＋共輸送体をコードしているＤＮＡで該宿主細胞を形質転換する工程を含んでいる。
発明の詳細な説明
定義
輸送体の定義
細菌チャンネル輸送体とは、一般的にＴＣ分類の＃１．Ａにある輸送体を指している（Ｓａｉｅｒ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ（Ｐｏｏｌｅ，Ｒ．Ｋ．，ｅｄ．）ｐｐ．８１−１３６，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ．）。（“ＴＣ”とは“輸送に関する会議”、輸送体の系統発生的様相を考慮に入れた分類システム、を表している。）これらは一般的に、膜貫通孔を用いるエネルギー非依存性促進拡散機構を経て、基質、イオンまたは他の物質を輸送する。
【００１３】
一次輸送体とは一般的にＴＣ分類の（ＴＣ＃３．Ａ）にある輸送体を指しており（Ｓａｉｅｒ  Ｍ．，ｅｔ  ａｌ，１９９８）、基質の能動取込および輸送押し出しのために、典型的にはエネルギーカップリングの様式としてＡＴＰ加水分解の形で、化学エネルギーを利用する輸送体である。
【００１４】
グループ輸送システムとはＴＣ分類のＴＣ＃４．Ａにある輸送体を指しており（Ｓａｉｅｒ  Ｍ．，ｅｔ  ａｌ，１９９８）、輸送の間に輸送およびそれらの基質のリン酸化を同時に行う輸送体である。この範疇のメンバーは細菌特異性ホスホトランスフェラーゼシステム（ＰＴＳ）の一部であり、ホスホエノールピルビン酸（ＰＥＰ）利用酸化へのカップリングにより特徴付けられる。
【００１５】
二次輸送体とはＴＣ分類のＴＣ＃２．Ａにある輸送体を指しており（Ｓａｉｅｒ  Ｍ．，ｅｔ  ａｌ，１９９８）、膜を横切って基質、イオンまたは最終生成物を輸送するためのエネルギーを提供するため、化学浸透圧エネルギー（例えば、プロトン勾配の形で）を一般的に使用する輸送体である。
【００１６】
主促進体スーパーファミリー（ＭＦＳ）とはＴＣ分類の＃２にある二次輸送体を指している（Ｓａｉｅｒ  Ｍ．，ｅｔ  ａｌ，１９９８）。
輸送体とは、細胞膜を横切りおよび細胞または細胞区画内へまたはそれらから、化学化合物または基質を移動することを可能にする任意の巨大分子を指している。輸送体はまた、透過酵素としても知られ、および称されている。特定の理論に限定されているわけではないが、輸送体は膜、膜外表面および膜を通して膜内表面から伸びている蛋白質の一部分と相互作用する蛋白質である。
【００１７】
能動輸送とは、エネルギー消費、例えば、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）またはホスホエノールピルビン酸（ＰＥＰ）の加水分解、とカップルしている輸送を指している。
【００１８】
アニオン／カチオン共輸送体とは膜を横切って基質を輸送するために化学浸透圧勾配を利用する輸送体である（ＴＣクラス１４）。それらはまた、基質／Ｈ＋共輸送体とも称されている。
【００１９】
ＴＭＳとは膜貫通ドメインを指している。
経路の定義
細胞質の、とは内部細胞膜内に存在することを指している。
【００２０】
外因性基質とは、合成反応を分離する膜の反対側に観察される物質を指している（例えば、基質が所望の最終生成物または中間体へ、細胞内合成経路または合成経路の細胞内部分により変換されるべき場合には内部細胞膜の外側）。外因性基質の例には、ヘキソース（グルコースを含んで）、ペントース（キシロース、アラビノース、リボース、リキソースを含んで）、ヌクレオシド、神経伝達物質、薬剤、アミノ酸、種々の経路の中間体または前駆体（アスコルビン酸を含んで）が含まれる。
【００２１】
細胞外または内部細胞膜の外側とは、細胞質から膜の反対側の細胞位置を指しており、ペリプラスムが含まれるが、それに限定されるわけではない。
内部細胞膜とはペリプラスムから細胞質を分離している障壁を指している。
【００２２】
膜とは基質に対して本質的に不透過性である脂質二重層を指している。
細胞内とは細胞質ゾルに最も近い膜側または細胞質ゾル側の細胞部分を指している。
【００２３】
細胞内反応とは、細胞質ゾル細胞物質、即ち、内部細胞膜内部に封じ込められている物質内に位置している合成反応または生物変換を指している。
律速段階とは、合成経路内の段階を指しており、ここで、その段階を通る変換の増加は合成経路による産生の増加を生じる。
【００２４】
産生の促進とは、所望の合成反応の中間体、最終生成物または前駆体の力価（全量）が増加したことを指しており、一般的にプロセスを通して得られたｇｍ／ｌ／時間での増加により測定される。それはまた、所望の生成物が作られる速度の増加も指しており、一般的に組換え体産生の単位時間当たりのｇ／ｌで測定され、ここで、産生された中間体、最終生成物または前駆体の量は、過剰発現された輸送体の存在下、膜を横切る基質の輸送を増加させる少なくとも一つの蛋白質をコードしているＤＮＡでの形質転換の結果として増加する。
【００２５】
増加した収率とは、産生された所望の最終生成物または中間体の量を消費された量で割ることにより計算された、重量パーセントの増加を指している。
基質とは合成反応により生物変換された化合物を指しており、細胞質ゾル反応原位置は一般に膜により基質から分離されており、基質を反応原位置に持っていく輸送機構を必要としている。
【００２６】
合成反応とは、中間体または最終生成物への基質の生物変換を指している。反応は生物体にとり内在性でもよく、または遺伝子工学により細胞装置内へ取り込むこともできる。
【００２７】
２，５−ＤＫＧレダクターゼとは、２，５−ＤＫＧの２−ＫＬＧへの立体選択的変換を触媒できる蛋白質を指している。
２，５−ＤＫＧ輸送体とは、２，５−ＤＫＧレダクターゼによる２−ＫＬＧへの変換のため、内部細胞膜を横切って２，５−ＤＫＧを輸送できる蛋白質を指している。
発現における定義
プロモーターとは、細胞の翻訳装置により一度翻訳されたら、ポリペプチドを形成できるメッセンジャーＲＮＡを発生するために適した部位で遺伝子の転写を開始するようにＲＮＡポリメラーゼを導くＤＮＡ要素を指している。
【００２８】
“上流活性化配列”は正に作用するＤＮＡ結合レギュレータのための結合位置である。その名前から示されるように、上流活性化配列は転写開始部位の上流であり、核酸である。
【００２９】
調節領域とは、遺伝子の発現を調節するＤＮＡ上の領域を指している。この変更のための一機構は、いくつかの調節領域が蛋白質のための結合部位として働くことである（リプレッサーとしても知られている）。一度結合したら、リプレッサーは遺伝子を転写するためのＲＮＡポリメラーゼの能力を妨害する。
【００３０】
発現系は一つまたはそれ以上の蛋白質および／または核酸を含んでおり、一緒になって作用する場合、宿主細胞中の蛋白質発現を増加できる。発現系は一つまたはそれ以上のプラスミド上にコードでき、問題とする蛋白質をコードしている遺伝子と同じプラスミドでも異なったプラスミドでもよい。
【００３１】
句“機能的に連結された”または“機能的にカップルされた”とは、調節要素（ＤＮＡまたは蛋白質）がそれらの機能を果たすために物理的に相互作用することを意味している。これは蛋白質／蛋白質、ＤＮＡ／蛋白質またはＤＮＡ／ＤＮＡ相互作用であり得る。例えば、ＤＮＡ結合レギュレータはプロモーターと相互作用するが、それらをコードしている遺伝子は染色体の異なった部位に存在してもよい。そのようであるので、要素をコードしている遺伝子はお互いにおよび問題とする蛋白質をコードしている遺伝子と異なったプラスミド上にあることができ、それでも蛋白質の発現を調節するために一緒に働くことができる。
【００３２】
通例、蛋白質およびそれらをコードする遺伝子を説明する場合、遺伝子のための用語は大文字化されず、およびイタリック体であり、即ち、ｐｅｒｍＡである。蛋白質のための用語は一般に普通の文字であり、最初の文字は大文字であり、即ち、ＰｅｒｍＡである。
生物の定義
真菌とは、クロロフィルを欠くかなり多数の植物生物体に関連していることを意味しており、酵母、カビおよびキノコが含まれている。
【００３３】
哺乳動物とは種々の温血脊椎動物に関連していることを指しており、その皮膚が毛で覆われていることで区分される。
植物の、とは植物に関連していることを指しており、単子葉、双子葉などが含まれる。
【００３４】
“細菌”には分裂菌類の微生物が含まれる。細菌はグラム陰性でもグラム陽性でもよい。グラム陰性菌には、エシェリキア、ヘモフィラス、クレブシエラ、プロテウス、シュードモナス、サルモネラ、グルコノバクター、アセトバクター、エルセニア、シゲラ、ビブリオ、アシネトバクター、パントエアおよびセラチア属の細菌が含まれる。グラム陽性菌には、バチルス、クロストジウム、スタフィロコッカス、ストレプトミセス、ラクトバチルスおよびラクトコッカス属の細菌が含まれる。
【００３５】
グラム陰性菌は、パントエア属の構成細菌株であるパントエアンでありうる。好適な細菌はＰａｎｔｏｅａ  ｃｉｔｒｅａである。Ｐａｎｔｏｅａ  ｃｉｔｒｅａはまた、時にはＥｒｗｉｎｉａ  ｈｅｒｂｉｃｏｌａとも呼ばれている。
【００３６】
ここで使用される場合、用語“単離された”または“精製された”とは、天然に付随している少なくとも一つの成分が除去された核酸またはアミノ酸を指している。
好適な態様の詳細な説明
本発明は、経路合成および所望の中間体または最終生成物の促進された産生への障害を軽減するために、外因性または細胞外基質の輸送を増加させることにより、特に輸送体が組換え的に挿入されおよび宿主細胞により過剰発現されている場合、該宿主細胞の少なくとも部分的には細胞内の経路から誘導される、所望の化合物の宿主細胞生合成的産生を促進するための新規方法を提供する。
【００３７】
本発明の一つの態様は発現系をコードしている核酸を含むプラスミドで宿主細胞を形質転換する方法に関している。本発明の別の態様は、膜を横切った基質の輸送を増加させる一つまたはそれ以上の蛋白質をコードしているＤＮＡを含むプラスミドで宿主細胞を形質転換する方法に関している。宿主細胞は本発明のプラスミドが、例えば、形質転換により挿入できる細胞である。好適には、宿主細胞は細菌であり、より好適にはＰａｎｔｏｅａ  ｃｉｔｒｅａ、大腸菌；クレブシエラまたはバチルスの群内のものである。
【００３８】
別の態様において、もし調節要素が取り込まれているとしたら、発現系のそのような要素は大腸菌および枯草菌からのものである。一つの態様において、宿主細胞は、好適には、グラム陰性菌である。別の好適な態様において、宿主細胞はパントエアである。同じ宿主細胞が、一つまたはそれ以上の輸送体をコードする核酸を誘導するさらなるプラスミドで形質転換できる。好適には、輸送体はＭＦＳ輸送体、さらに好適にはアニオン／カチオン共輸送体がコードされている。輸送体の例には、Ｐａｎｔｏｅａ  ｃｉｔｒｅａまたはＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｏｘｙｔｏｃａおよび異種源からのｙｉａＸ２、ｐｅｒｍＡ、ｐｅｒｍＢ、ｐｅ６、ｐｅ１がコードまたは発現されるものが含まれる。
合成反応
本発明は、合成反応の産出を促進させるため、膜を横切った基質の輸送増加を提供する。増加した輸送は、合成反応の細胞内位置から基質を分離している膜を横切った基質の転位置を提供する。合成反応は単一の酵素的変換でも、合成経路の一部またはすべてでもよい。本発明は、細胞質ゾルおよび細胞外合成反応の両方を含む合成経路で特に有用であり、ここで一つの反応により発生された最終生成物は、膜の他の側での別の反応による利用のために輸送される。発明者は、細胞質ゾルの内側で起こり、および細胞質ゾル内への基質の輸送を必要とする合成反応；または細胞質ゾルの外側で起こり、および細胞外位置への膜を横切った基質の輸送を必要とする反応を企図している。それ故、本発明は、反応中の存在する補因子を必要とする反応（例えば、ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨ反応）、基質または中間体の還元を一般的に必要とする反応、または酸化されて還元等価物を提供する反応の組合せに特に有用である。反応の例には、２，５−ＤＫＧから２−ＫＬＧへの還元；Ｌ−ソルボソンから２−ＫＬＧへの還元；５−ケト−Ｄ−グルコン酸（５−ＫＤＧ）からＬ−イドン酸（ＩＡ）への還元；および５−ＫＤＧからＬ−グロン酸（ＧＡ）への還元が含まれるが、それらに限定されるわけではない。追加の反応には下記のものが含まれる：
ホスファターゼ
（１）グリセロール−３−リン酸＋ＮＡＤＨ―――――――→グリセロール
いくつかの酵素的段階
（２）グルコナート――――――――――→Ｄ−リボース５−リン酸
上記反応（１）において、グリセロールへのグリセロール−３−リン酸の生物変換は、グリセロール−３−リン酸の輸送が律速段階であろうことが想像できる。
【００３９】
上記反応（２）において、一連の酵素的段階を通り、グルコナートはＤ−リボース  ５−リン酸へ変換される。Ｄ−リボース  ５−リン酸はリボース、ヌクレオチド、リボフラビンまたは芳香促進剤様イノシン一リン酸へ変換できる価値のある化合物である（Ｗｕｌｆ＆Ｖａｎｄａｍｅ，１９９７，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．４８：１４１−１４８）。グルコナートの他生成物への生物変換は、細胞間輸送が律速段階であろうという問題に到達することがあり得る。
【００４０】
本発明の実施が特に有用な別の反応は、ペントース糖からエタノールへの生物変換である。最近、キシロースが大腸菌におけるホモエタノール経路の工学処理のために使用された。Ｔａｏ，Ｈ．，ｅｔ  ａｌ  Ｊ．ｂａｃｔ．２００１，１８３，２９７９−２９８８。細胞質ゾルへの増加したキシロースの輸送は、エタノールの促進された産生を生じた。植物由来バイオマスによるこれらの糖の産生とカップルさせ、これらのペントース糖由来化学化合物の促進された産生のための安価な供給源を想像することが可能である。細菌プロトン連結輸送系、Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ，Ｐ．Ｊ．，Ｂｉｏｅｎｇ．Ｂｉｏｍｅｍ  １９９０，４，５２５−５６９、またはこれらのペントースに連結された類似の生成物、経路による、これらの糖の増加した輸送。
【００４１】
発明者は上に提供された反応は単に本発明の例示であり、本発明を理解するための有用な例として提供されていることを理解している。当業者は、容易に他の合成反応を同定できるし、それにより、本発明の使用は基質からの所望の中間体または最終生成物の増加した産生に有効になる。同様に、適した化学生産または生合成的経路の選択が、ここに提供された技術を使用して当業者により容易に決定される。例えば、最終生成物が生物体の内在性代謝の一部である経路または反応に関係する時、ここに提供された技術を使用して、決定的な経路要素、および基質輸送を最適化するどの点が、最終生成物の産生のためになるであろうかを決定することが可能である。
【００４２】
一つの態様において、合成反応は、細胞内へ、または細胞外へ輸送されるべき基質かまたは生成物を含んでいる少なくとも一つの合成反応を含んでいる。例えばこの態様において、促進されるべき反応は、細胞間または細胞質ゾル内に存在する経路の少なくとも一部を含んでおり；および経路の少なくとも一部は細胞外に存在している。外因性基質は細胞質ゾルにある合成反応または合成経路の一部により利用される。例として、ケト糖誘導体（そのいくつかはアスコルビン酸前駆体または中間体として使用できる）の産生は本発明を使用することにより最適化できる。５−ケト−Ｄ−グルコン酸のような他のものは、酒石酸の製造に使用できる（米国特許第５，７６３，６５６号）。本発明はアスコルビン酸中間体合成、例えば、２−ＫＬＧへの２，５−ＤＫＧの変換；ソルボソンを経る２−ＫＬＧへのソルボースまたはソルビトールの変換；Ｌ−イドン酸への５−ケト−Ｄ−グルコン酸（５−ＫＤＧ）の還元；およびＬ−グロン酸への５−ケト−Ｄ−グルコン酸の還元、に関連して特に有用である。これらの経路の各々は、細胞質内に存する合成経路、合成反応の部分により特徴付けられる、例えば、２，５−ＤＫＧレダクターゼによる２，５−ＤＫＧの還元；ソルボソン  デヒドロゲナーゼによる２−ＫＬＧへのＬ−ソルボソンの還元；５−ＫＤＧデヒドロゲナーゼによるＬ−イドン酸への５−ケト−Ｄ−グルコン酸（５−ＫＤＧ）の還元；および５−ＫＤＧレダクターゼによるＬ−グロン酸への５−ケト−Ｄ−グルコン酸の還元。これらの経路はまた、細胞質中に存している合成反応による生物変換のため、膜を横切って基質（例えば、２，５−ＤＫＧ；Ｌ−ソルボソンなど）を輸送することの必要性によっても特徴付けられる。
【００４３】
基質は一般に、ある種の能動輸送機構なしでは効率よく膜を通って通過できないものである。好適には、これらはアスコルビン酸中間体（２，５−ＤＫＧ、ソルボソン）を含むことができるが、これらに限定されるわけではない。発明者により企図された他の基質には、表２および表３に記載されているものが含まれる。加えて、基質は工業的規模での合成的使用のために輸送される物質であり、一般的に宿主細胞による代謝的使用のためではない。工業的使用とは、好適には２ｇ／ｌ／ｈより多く、より好適には３ｇ／ｌ／ｈより多く、およびさらにより好適には５ｇ／ｌ／ｈより多い、力価および容量生産力を指している。別の態様において、生産力力価は、２から１４ｇｍ／ｌ／時間の間、好適には３から１２ｇｍ／ｌ／時間の間、およびさらにより好適には５から１０ｇｍ／ｌ／時間の間であり、経済的に存立できる工業的生産プロセスになる。加えて、合成経路の収率はまた、本発明の結果として増加することができる。一つの態様において、収率は５０重量％を超えており、別の態様においては６０重量％を超えており、別の態様においては７０重量％を超えている。特に好適な基質には２，５−ＤＫＧおよびソルボソンが含まれる。本発明の発明的様相はこれらの実施態様において特に有用である。
【００４４】
本発明の実施において特に有用な反応は、細胞質ゾル  デヒドロゲナーゼ２，５−ＤＫＧレダクターゼによる、２−ＫＬＧへの２，５−ＤＫＧ細胞質ゾル還元のための、内部細胞膜を横切る２，５−ＤＫＧの輸送である。２，５−ＤＫＧは膜結合２−ケトグルコナート  デヒドロゲナーゼにより２−ケト−Ｄ−グルコナート（２−ＫＤＧ）から変換される。内部細胞膜を横切り、２−ＫＬＧへの細胞質ゾル還元部位への２，５−ＤＫＧの輸送は、２，５−ＤＫＧの輸送の増加をコードしているＤＮＡにより達成できる。Ｂｏｕｄｒａｎｔ，Ｊ．（１９９０）Ｅｎｚｙｍｅ  Ｍｉｃｒｏｂ，Ｔｅｃｈｎｏｌ．，１９９０：３２２−３２９。
【００４５】
本発明の実施において別の特に有用な反応は、ソルボース、ソルビトールを経る２−ＫＬＧ生成の中間体、ソルボソンの輸送である（Ｓａｉｔｏ，Ｙ，ｅｔ  ａｌ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．５８（２／３）：３０９−３１５（１９９７）。ソルボソンへのソルビトールおよび／またはソルボースの変換は、ソルビトールまたはソルボースを２−ＫＬＧへ変換する経路の一工程である（Ｂｏｕｄｒａｎｔ  Ｊ．，１９９０；Ｓａｉｔｏ（１９９７））。以下は本発明に従ったソルボソン輸送体の工学技術の議論である。
【００４６】
図４ａに示されているように、Ｄ−ソルボースから２−ＫＬＧへの経路は、Ｌ−ソルボース  デヒドロゲナーゼ（ＳＤＨ）によるＬ−ソルボソンへのＬ−ソルボースの酸化、続いてのＬ−ソルボソン  デヒドロゲナーゼによる２−ＫＬＧへのＬ−ソルボソンの酸化を含んでいる。膜結合デヒドロゲナーゼによりＤ−ソルビトールをＬ−ソルボソンへ変換する一つの組換え宿主細胞が記述されている（Ｓａｉｔｏ，Ｙ．，ｅｔ  ａｌ（１９９７））。Ｌ−ソルボソンは次に、細胞質中のＬ−ソルボソン−デヒドロゲナーゼによる還元のため、ペリプラスムから輸送される。２−ＫＬＧへの変換のため、経路へのソルボソン中間体の輸送を容易にするソルボソン輸送体の過剰発現は、有益な効果を持っていると理解されている。
【００４７】
図４に示されているように、Ｄ−グルコースから２−ＫＬＧへの別の経路は、５−ケト−Ｄ−グルコン酸（５−ＫＤＧ）へのＤ−グルコン酸の酸化を含んでおり、それは順に２−ＫＬＧへの酸化のために、Ｌ−イドン酸（ＩＡ）またはＬ−グロン酸へ還元される（Ｂｏｕｄｒａｎｔ，Ｊ．（１９９０））。ケト−レダクターゼによる還元のため、細胞質ゾル内への５−ケト−Ｄ−グルコン酸の輸送もまた５−ＫＤＧ輸送体の過剰発現により容易にすることができる。
【００４８】
別の態様において、合成反応は細胞質ゾル外または基質に関して膜の外側に位置していてもよい。第一の反応の最終生成物は、膜の反対側で行われる第二の反応の中間基質であろう。例えば、日本の柿からのＧｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ  ｏｘｙｄａｎｓ  Ｔ−１００（ＦＥＲＭ  ＢＰ−４１８８）中の、Ｄ−ソルビトールからの２−ＫＬＧの合成において、細胞質ゾルＬ−ソルビトール  デヒドロゲナーゼによるＬ−ソルボースへのＤ−ソルビトールの変換では、膜結合Ｌ−ソルボース  デヒドロゲナーゼによるＬ−ソルボソンへの変換のために細胞膜を横切り、細胞質の外へ輸送される中間体を生じる。それ故、続いての変換のため、膜を横切った内部膜の細胞質ゾル側から膜の外側への細胞質ゾル性中間体（基質）の輸送を増加させることを本発明は企図している。Ｓａｉｔｏ，Ｙ．，（１９９７）。
【００４９】
好適な態様は合成反応またはそれを含んでいる経路が単一の生物体内に存在することを含んでいるが、別の生物体が別の反応を行うことも本発明者により企図されている。例えば、グルコースから２−ＫＬＧ生成のための混合培養系において、中間体２，５−ＤＫＧへのグルコースの変換は一つの生物体内（アセトモナス、アセトバクター、グルコノバクターまたはエルウィニア）で起こるが、一方、その中間体の所望のアスコルビン酸中間体２−ＫＬＧへの変換は第二の生物体内（ブレビバクテリウムまたはコリネバクテリウム）で起こる、Ｓｏｎｏｙａｍａ（１９７６）による米国特許第３，９６３，５７４号を参照されたい。また、Ｈｏｓｈｉｎｏ、米国特許第５，３１２，７４１号も参照されたい。
【００５０】
別の実施例において、アミノ酸Ｌ−トリプトファンが、インドールまたはアントラニル酸からＬ−トリプトファンへ変換することにより産生された。この場合、生成物は、蛋白質生合成のため、細胞により部分的に利用された（米国特許第３，８０１，４５７号）。
【００５１】
従って、合成反応は中間体を発生させてもよく、それ自身は細胞膜により分離された別の細胞位置で変換されてもよい。この態様においての最終生成物は、続いての反応の中間体基質であることができる。
律速段階を決定するための方法
第一の細胞内位置から第二の細胞内位置への、基質の輸送増加の効果を最大にするためには、好適な態様において、膜を横切る基質の輸送が経路の律速段階となっている。そのような段階が律速段階かどうかの決定は、経路を分析し、各々の段階の産生を評価し、および、基質存在の増加が経路の全産生の増加を生じるかどうかを確かめるため、経路による変換に利用可能な基質量を変化させることにより行われた。基質の存在を増加させることが所望の最終生成物の産生を促進することが決定されると、もし基質が一つの細胞位置から細胞膜を横切った別の位置への転位置を必要とするものであれば、基質の輸送を増加させると経路による産生が促進されるであろう。
【００５２】
所望の分子の産生を制限するであろう障害を同定するいくつかの方法が存在する。一般に、それらのほとんどは生合成経路の一つまたはそれ以上の成分レベルの変異に依存しており、これらの変異が過程において持っている影響を測定する。これらの変異は、基質が生成物へ変換される時の合成速度、蓄積された総量、または収率に対するものであろう。（Ｗａｌｓｈ＆Ｋｏｓｈｌａｎｄ．，１９８５，ＰＮＡＳ  ８２：３５７７−３５８１）（Ｊｅｎｓｅｎ  ｅｔ．ａｌ．，１９９３，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２１１：１８１−１９１）。
【００５３】
経路部分の律速状態を決定するための一つの方法は、特定の生物変換器の存在を増加させる前後に、経路の色々な時点での中間体生産性を比較することである。もし、中間体存在の増加または変換経路の過剰発現にもかかわらず、最終生成物産生の増加がなかったら、その工程は律速ではないであろうし、およびそれ故、合成反応に影響する特定酵素の過剰発現は促進された産生を生じないであろう。個々の中間体の量は種々の間接または直接手段により決定できる。間接手段は、ガス分圧のようなインライン測定による呼吸パラメーターの消費または生成（例えば、二酸化炭素生成、酸素消費）を測定することを含んでいる。中間体の直接測定は、Ｌａｚａｒｕｓ，Ａｎａｌｙｔ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  １５７，３６０−３６６（１９８６）およびそれに引用されている文献（それらは参照文献として本明細書に組み入れられる）に記載されているような、本分野では既知の種々の分析技術により達成でき、ペーパー、ガス、液体および薄層クロマトグラフィーならびに化学的および酵素的アッセイが含まれるが、それらに限定されるわけではない。Ｌａｚａｒｕｓ，１９８６、に特に示されているような高速液体クロマトグラフィー方法論は特に役に立つ。発明者により使用された一つの方法は、存在する化学化合物の分離および定量のため、Ｗａｔｅｒｓ  ２６９０  ＨＰＬＣおよびＷａｔｅｒｓ  ４１０示差屈折計を使用している（設定、溶離媒質として５０ｍＭ酢酸緩衝液（１ｍｌ／分の流速で）、およびＤｙｏｎｅｘ  Ｉｏｎｐａｃ  ＡＳ−１０イオン交換カラム（４ｘ２５０ｍｍ）を使用）。
【００５４】
ブロス中に産生された２−ＫＬＧの純度を決定するために発明者により使用された別の方法は全炭素分析によるものである。
従って一つの態様において、細胞外基質存在下で生成物の産生を測定することにより、基質を生成物へ変換できる任意の細胞中で輸送活性が測定できる。例えば、２，５−ＤＫＧレダクターゼを天然に発現している、または組換え的に発現している細胞において、細胞内２，５−ＤＫＧは２−ＫＬＧへ変換される。細胞外２，５−ＤＫＧが提供された場合に２−ＫＬＧを産生する細菌細胞の能力は、２，５−ＤＫＧ透過酵素の発現により細胞内へ２，５−ＤＫＧを輸送する、発現された透過酵素能力の指標であり、および、それ故２，５−ＤＫＧ透過酵素活性の指標である。細胞内２，５−ＤＫＧは、例えば、ＨＰＬＣまたは本分野で既知の他の高感度検出法を使用して検出できる。２，５−ＤＫＧの他の代謝産物もまた同様の方法により検出できる。
望ましい基質の輸送体
本発明で使用されるような輸送体は、細胞膜を横切った物質の転位置を容易にする化合物を含んでいる。一つの態様において、輸送体の型はチャンネル蛋白質、一次活性輸送体、二次活性輸送体およびグループトランスロケーターから成る群より選択される。別の態様において、輸送体の型は二次輸送体、好適には主促進体スーパーファミリー、より好適にはアニオン：カチオン共輸送体（ＡＣＳ）メンバー、最も好適にはｙｉａＸ２、ｐｅｍＡ、ｐｅｒｍＢ、ｐｅ１およびｐｅ６からコードされている群から選択される輸送体である。
【００５５】
輸送様式およびエネルギーカップリング機構に基づいて、４つの別個の型の機能的に特徴付けられた輸送システムが存在する。第一は細菌チャンネル蛋白質（ＴＣ＃１．Ａ，Ｓａｉｅｒ，１９９８）であり、それは膜貫通孔を利用するエネルギー非依存性促進拡散機構を経て輸送する。第二の輸送システム、促進体および／または二次輸送体（第二のクラス、ＴＣ＃２．Ａ）は輸送体の最も大きな部門を表している。第三の群、ＡＴＰ駆動一次活性輸送体は、能動取込および／または溶質押し出しのために、エネルギーカップリングの様式としてＡＴＰ加水分解を使用する。最後の群は、輸送の間にそれらの基質をリン酸化する輸送体の群から成っている（ＴＣ＃４．Ａ）。
【００５６】
二次ファミリーの内、クラスＩＩファミリーの最も大きなものは主促進体スーパーファミリー（ＭＦＳ）およびアミノ酸ポリアミンコリン（ＡＰＣ）ファミリー（Ｒｅｉｚｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ  ２（１）：２０−３０（１９９３）））である。これらの二次輸送体ファミリーは３つの群にさらに分割できる（１）起プロトン形（ｐｍｆ駆動）、（２）起ナトリウム力（ｓｍｆ）−駆動、および（３）他のイオンまたは溶質駆動交換器。これらの輸送システムは溶質の単一、抗および／または共輸送を触媒する。二次活性輸送体は大腸菌、インフルエンザ菌、ピロリ菌、枯草菌、Ｍ．ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍ、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ、Ｍ．Ｊａｎｎａｓｃｈｉｉで同定されている（Ｐａｕｌｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ  ｌ９９８  Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７７：５７３−５９２）。二次輸送体は典型的には多所性膜蛋白質であり、しばしば、ほとんど一次担体を含む１２のＴＭＳを持ち、エネルギーの化学形が基転位置を駆動し、ほとんどのＡＴＰ−結合カセット（ＡＢＣ）スーパーファミリーメンバーがそうであるようにＡＴＰ−依存性システムであるか、または、糖取り込みおよびリン酸化のためのホスホリル供与体としてＰＥＰを使用するＰＴＳである。一次輸送体がＡＴＰを使用する（細胞からエネルギーを得ている）点で、二次輸送体は一次輸送体（ＡＢＣ輸送体）とは異なっている。加えて、ＡＢＣ輸送体の使用は一般的にはより複雑な輸送体システムを必要とし、その一つは二つの疎水性の膜内在性ドメイン、および二つのＡＴＰ−結合ドメインから成っている（Ｈｏｓｉｅ，ｅｔ  ａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ（２００１）４０（６），１４４９−１４５９）。溶質の取り込みに関連しているＡＢＣ輸送体もまた溶質−結合蛋白質（ＳＢＰ）の存在を必要とする。それ故、改良されたＡＢＣ輸送システムの遺伝子工学は、二次輸送体の一つよりも複雑な性質の発現および形質転換を必要とするであろう。
【００５７】
本発明の範囲内の輸送体には、表ＩおよびＩＩに記載されているものが含まれる：
【００５８】
【表１】
2004519213.tif 000003
【００５９】
【表２】
2004519213.tif 000004
【００６０】
【表３】
2004519213.tif 000005
【００６１】
【表４】
2004519213.tif 000006
【００６２】
【表５】
2004519213.tif 000007
【００６３】
【表６】
2004519213.tif 000008
【００６４】
本発明の範囲内の二次輸送体は表３および４に記載されている：
【００６５】
【表７】
2004519213.tif 000009
【００６６】
【表８】
2004519213.tif 000010
【００６７】
一つの態様において、内部細胞膜を横切った基質の輸送を増加させるための少なくとも一つの蛋白質をコードしているＤＮＡは、哺乳動物、植物、真菌または細菌細胞から選択される。植物細胞の例としては下記のものが有用である：草本植物、高木植物、海中植物。真菌細胞の例としては下記のものが有用である：酵母、糸状菌、白腐れ菌および粘菌。細菌細胞の例としては下記のものが有用である：アセトバクター、シュードモナス、バクテリウム、シアノコッカス、ミクロコッカス、ブレビバクテリウム、アルスロバクター、スタフィロコッカス、バチルス、コリネバクテリウム、アセトモナス、グルコノバクターおよびエルウィニアから選択される。好適な生物体は大腸菌、パントエアおよびクレブシエラから成る群より選択される。
ＩＩ発現系
本発明は、細菌および酵母を含む微生物中での所望の異種または同種蛋白質の促進された産生および輸送のための発現系を提供する。
ａ．コード配列
本発明において、ベクターは輸送体をコードしている少なくとも一つのコピーを含み、好適には多コピーを含んでいる。輸送体のためのコード配列は、本分野の当業者には利用可能である日常のおよび標準の技術に準じて得られるであろう。適切な開始および停止コドン、およびイントロン、エキソンおよび他の遺伝子構築最適化に関する発行物が、標準分子生物学の方法で容易に応用されるであろう。
ｂ．ベクター配列
微生物中で本発明の輸送体の発現に使用される発現ベクターは、輸送体因子の発現または過剰発現に必須な、または望ましい、少なくとも一つのプロモーター、終止配列および他の制御配列を含んでおり、そのプロモーターは宿主細胞中で機能的である。本発明の一つの態様において、プロモーターは選択された輸送体の野生型プロモーターであり、本発明の別の態様において、プロモーターは輸送体に関しては異種であるが、宿主細胞中でなお機能的である。
【００６８】
所望の蛋白質またはポリペプチドをコードしている異種核酸に関係する追加のプロモーターは、組換えＤＮＡ技術により導入することができる。本発明の一つの態様において、宿主細胞は異種蛋白質またはポリペプチドを過剰発現でき、および、一つまたはそれ以上の輸送体をコードしている核酸は組換え的に導入される。本発明の一つの好適な態様において、基質の輸送を増加する少なくとも一つの蛋白質またはそれ以上の蛋白質をコードしている核酸は微生物ゲノム内へ安定に組み込まれるであろう。別の態様において、本発明の該宿主細胞内への該基質の輸送を増加させる一つまたはそれ以上の蛋白質をコードしているＤＮＡを過剰発現するように宿主細胞が工学処理され、異種蛋白質またはポリペプチドをコードしている核酸は組換えＤＮＡ技術により導入される。本発明は、当業者には既知である他の輸送体を過剰発現できる宿主細胞を包含しており、表１、２または３に同定されているもの、または当業者には既知の、または将来同定されるであろう他の輸送体が含まれるが、それらに限定されるわけではない。
【００６９】
好適な態様において、核酸操作を容易にするため、好適にはベクターに独特な少なくとも一つの制限エンドヌクレアーゼ部位を含んだ多クローニング部位カセットを発現ベクターは含んでいる。好適な態様において、ベクターはまた、一つまたはそれ以上の選択可能マーカーも含んでいる。ここで使用される場合、用語、選択可能マーカーとは、ベクターを含んでいる宿主の選択を容易にすることが可能で、グラム陽性宿主中で発現できる遺伝子を意味している。そのような選択可能マーカーには、エリスロマイシン、アスペクチノマイシン、クロラムフェニコールおよびテトラサイクリンのような抗生物質が含まれるが、それらに限定されるわけではない。輸送体がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯＳ：＿に示されたＤＮＡ配列と少なくとも９０％の相同性を持っている核酸によりコードされている態様もまた提供される。好適には、相同性は少なくとも９５％であり、より好適には少なくとも９８％である。相同性は、特許請求されたアミノ酸またはＤＮＡ配列と別の配列を並べ、全体のパーセンテージとしてどのくらい多くのアミノ酸または核酸が一致するかで決定される。相同性はまた、市販品として入手可能な配列分析ソフトウェアープログラムの一つ、例えば、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ６．０（Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｅｎｔｅｒ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．５３７０５）で利用可能なＴＦａｓｔＡ  Ｄａｔａ  Ｓｅａｒｃｈｉｎｇ  Ｐｒｏｇｒａｍを使用して決定できる。
【００７０】
ここに説明したようなハイブリダイゼーションを使用して、または縮重プライマーを用いるＰＣＲを使用して、相同性配列をスクリーニングできる。Ｃｈｅｎ  ａｎｄ  Ｓｕｔｔｌｅ（１９９５）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １８（４）：６０９−６１０，６１２。
【００７１】
また、本発明のいくつかの態様において、ストリンジェント条件下、各々図およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯＳ：に示したＤＮＡまたはその断片とハイブリダイズできる核酸が提供される。ストリンジェントハイブリダイゼーション条件には、当業者には知られているようなストリンジェントハイブリダイゼーションおよび洗浄条件が含まれる。ハイブリダイゼーションおよび適切なストリンジェント条件は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．１９８９  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ２ｄ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、に記載されている。
輸送体蛋白質をコードしている形質転換ＤＮＡを持っている宿主細胞からの組換えペプチド産生を増加させる方法
一つの細胞位置から別の位置への基質輸送を増加させる特に強力な方法には、形質転換宿主細胞からの代謝転換ゲノムの欠失、および所望の基質の輸送を増加させるＤＮＡコード化の同時供給が含まれる。このことは、欠失される部分の代謝転換が最小化され、および輸送体能力部分が過剰発現される、欠失−輸送体キメラまたは融合蛋白質を細胞に提供することにより都合よく達成される。化学的−融合ポリペプチドまたはゲノムの組み替えた部位が一つの可能性であるが、組換え蛋白質がこの様式での使用に本来最も好適である。そのようなキメラで使用するための適切な透過酵素断片の同定は、上に説明されている。
【００７２】
これらの融合蛋白質の輸送部分に関しては、キメラに輸送能力を与える十分な一次配列情報を含む任意の透過酵素由来配列が、この状況で有用であろう。しかしながら、方法論に関してより直接的であるので、全輸送体酵素を使用するのがしばしば好適であろう。再び、適した輸送体またはその断片の同定を助けるため、種々の公表された文献中の利用可能な情報を広く探すことができる。
形質転換
本発明はまた、生物学的に活性なポリペプチドを産生する細胞の能力を増大または増加させることを企図しており、そのようなポリペプチドは基質を細胞の第一の位置から、膜を横切った細胞の第二の位置への輸送を増加させる。このことは、いくつかの例において、アニオン／カチオン共輸送体の二次輸送体（Ｓａｉｅｒ，１９８８）、一つの態様においてはアニオン／カチオンＨ＋共輸送体のような、追加の生物変換のため、別の細胞位置への基質輸送に関係する蛋白質を過剰発現することにより達成できる。
【００７３】
宿主細胞の生存性および生産の質、特にそれらの輸送能力の維持に関連する輸送体の発現は重要である。経路がＮＡＤＰＨまたはＮＡＤＨ要求性反応である場合は、所望の経路による連続的生成を成功させるため、宿主細胞の連続した生存性が必要である。生物体の生存性を維持しながら過剰発現できる、多コピーまたはプロモーターの数を決定する時に、ある種の考慮および因子を心に留めるほうがよい。一般に、膜中に輸送体を取り込むために利用可能な空間が限られているので、輸送体の過大な発現は細胞には有害であろう。従って、一つの輸送体の非常に過大な発現は、培地からの他の栄養素の輸送に関係するであろう他の輸送体の膜中取込を減少させるであろう。細胞型特異的転写因子の過剰発現を工学処理することで、工学処理された宿主細胞の輸送体能力を増加または安定化できた。
【００７４】
細菌宿主細胞中でのＨ＋共輸送体の安定な過剰発現は、いくつかの目的の役に立つことになる。それは微生物の生存性を維持しながら、導入遺伝子発現を増加させる。共輸送体はＡＢＣ輸送体の多成分を大量にコードする必要がないので、共輸送体の過剰発現はＡＢＣ輸送体の過剰発現よりも簡単である。第三に、ＡＴＰまたはＰＴＳカップル輸送の代わりに二次輸送体を過剰発現させることにより、宿主細胞からのエネルギー転換要求性が最小化される。
【００７５】
本発明の一つの態様において、本発明の一つまたはそれ以上の輸送体をコードしている核酸は、宿主細胞内で複製することができる発現ベクターを経て宿主細胞内へ導入される。パントエアのために適した複製プラスミドはＳａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ  ａｌ，１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ２ｄ，ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）（ここに参照文献として特別に組み入れられる）、に記載されており、パントエアが大腸菌と同じプラスミドの複製を維持しているという事実に基づいている。
【００７６】
別の態様において、一つまたはそれ以上の輸送体をコードしている核酸は微生物ゲノム内へ安定して組み入れられる。好適な宿主細胞はパントエア属からのものである。別の好適な宿主細胞はＫ．ｏｘｙｔｏｃａである。染色体内へのＤＮＡ組込のためのいくつかの戦略が文献に記載されている（例えば、Ｂａｌｂａｓ，ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｇｅｎｅ  １７２：６５−６９；ＬｅＢｏｒｇｅ，ｅｔ  ａｌ，１９９８，Ｇｅｎｅ  ２２３：２１３−２１９、を参照されたい）。
【００７７】
Ｐ．ｃｉｔｒｅａの形質転換は、大腸菌のために開発されたプロトコールを使用したエレクトロポレーション法により達成できる（Ｐｏｔｔｅｒ，Ｈ．，１  ９８８，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１７４：３６１−３７３）。
ＩＩＩ形質転換体の同定
宿主内へＤＮＡを導入した後、形質転換体はベクター中にコードされた抗生物質耐性により、または、プラスミド内にコードされた機能で一般的に選択することにより選択される。形質転換体が非形質転換細胞から区別されたら、無傷の構造を持つプラスミドの存在が、標準プロトコールを使用して確認できる（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ  ａｌ，１９８９）。
【００７８】
ポリヌクレオチド配列コード輸送体の存在は、配列または相同性に基づいて適切に設計されたプローブ、一部、または断片を使用するＤＮＡ−ＤＮＡまたはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリダイゼーションまたは増幅により検出できる。
ＩＶ．輸送アッセイ
特定の経路に対する、宿主細胞中に輸送された基質レベルを決定するための、および輸送された基質を検出するための手段は当業者により容易に決定され、蛋白質に特異的なポリクローナルかまたはモノクローナル抗体の使用を含んでいる。例として、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）および蛍光表示式細胞分取器（ＦＡＣＳ）が含まれる。これらおよび他のアッセイは、中でも、Ｈａｍｐｔｏｎ  Ｒ  ｅｔ  ａｌ  （１９９０，Ｓｅｒｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，ＡＰＳ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓｔ  Ｐａｕｌ  Ｍｉｎｎ．）およびＭａｄｄｏｘ  ＤＥ  ｅｔ  ａｌ（１９８３，Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １５８：１２１１）に説明されている。
【００７９】
本発明の例示の目的で、２−ＫＬＧ経路に従ったアスコルビン酸中間体レベルを決定する方法が以下に提供される。しかしながら、開示された一般概念および技術は、本分野の当業者には知られているものと一緒に、生合成経路における基質、中間体および最終生成物レベル決定のための戦略設計において一般に有用であろう。
【００８０】
ＫＬＧ産生経路におけるアスコルビン酸中間体のレベルを決定するための方法の例を通して、ＨＰＬＣ方法論が化学化合物のレベルを決定するための、およびお互いに関連したそれらの産生および消費を評価するための一つの方法であることを当業者は認識するであろう。
【００８１】
加えて、当業者には幅広い種類の標識および結合法が知られており、種々の核酸およびアミノ酸アッセイで使用できる。特異的ポリヌクレオチド配列を検出するための、標識ハイブリダイゼーションまたはＰＣＲプローブには、オリゴ標識、ニックトランスレーション、末端標識または標識ヌクレオチドを使用するＰＣＲ増幅が含まれる。もしくは、ヌクレオチド配列またはその任意の一部は、ｍＲＮＡプローブ生成のためのベクター内へクローン化することができる。そのようなベクターは本分野では既知であり、市販品として利用可能であり、および、Ｔ７、Ｔ３またはＳＰ６のような適切なＲＮＡポリメラーゼおよび標識ヌクレオチドの添加により、インビトロでＲＮＡプローブを合成するために使用することができる。
【００８２】
Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ  Ｎ．Ｊ．）、Ｐｒｏｍｅｇａ（Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．）およびＵＳ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｒｐ（Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ  Ｏｈｉｏ）のような多くの会社がこれらの方法のための市販キットおよびプロトコールを供給している。適したレポーター分子または標識には、放射性同位元素、酵素、蛍光、化学発光または色素産生剤、ならびに基質、補因子、阻害剤、磁気粒子などが含まれる。そのような標識の使用を教えている特許には、米国特許第３，８１７，８３７；３，８５０，７５２；３，９３９，３５０；３，９９６，３４５：４，２７７，４３７；４，２７５，１４９および４，３６６，２４１号が含まれる。また、組換え免疫グロブリンは米国特許第４，８１６，５６７号（本明細書に参照文献として組み入れられる）に示されているように生成することができる。
実施例
実施例１
材料および方法
ａ．プラスミド、細菌株および培地：プラスミドｐＢＣＬ１９２０、Ｋ．ｏｘｙｔｏｃａ、Ｐ．ｃｉｔｒｅａ  １３９２Ａ。マーフィＩＩＩ培地は、フルクトース０．５％、リン酸１．６％、ＭｇＳＯ４．７Ｈ２Ｏ  ０．２％、Ｓｏｙｔｏｎｅ  ０．２％、クエン酸０．０１％、（ＮＨ４）２ＳＯ４  １％、ｐｐｍ範囲のＦｅ、Ｃｏ、Ｍｎ、Ｚｎのような微量金属塩、およびニコチン酸、葉酸およびＢ１２のようなビタミンを含んでいる；Ｍ９培地、０．９％リン酸、０．１％ＮａＣｌ、０．１％  ＮＨ４Ｃｌ、ＭｇＳＯ４  ０．０００５％、ＣａＣｌ２  ０．０２５％；発酵培地、リン酸カリウム１％、ＭｇＳＯ４  ０．１５％、グルタミン酸１．５％、フルクトース２．５％、硫酸アンモニウム０．１％、およびビオチン、チアミン、ピリドキシン、リボフラビン、ニコチン酸、葉酸およびＢ１２を含むビタミン混合物、鉄、ＺｎおよびＭｎイオンを１０−１００ｐｐｍの範囲で含んでいる微量金属カクテル；輸送アッセイ培地、１００ｍＭリン酸カリウム  ｐＨ６．９；抗生物質、スペクチオマイシン５０μｇ／ｍｌおよびテトラサイクリン２０μｇ／ｍｌ、ＩＰＴＧ  １００μＭ。
ｂ．ＤＮＡ技術
ｃ．細胞の増殖：組換え法および野生型Ｐ．ｃｉｔｒｅａおよびＫ．ｏｘｙｔｏｃａを使用して構築された株は、単一の炭素源としてＤＫＧを含んでいるＭ９培地かまたは単一の炭素源としてフルクトースを含むＭ  ＩＩＩ培地、または０．１％から１％の範囲のフルクトース、グルコナートおよびＤＫＧのような混合炭素源を含んでいるＭ  ＩＩＩで増殖させた。細胞は２０−３７℃の間で、しかし好適には３０℃以下で増殖させた。細胞は好適には中性ｐＨで、しかしｐＨ５−８を含む範囲で増殖させた。種フラスコから発酵槽で増殖させたＰ．ｃｉｔｒｅａ細胞は、フルクトースかまたはグルコース給餌を使用する発酵培地を使用した。
ｄ．ＤＫＧ取込生化学アッセイ：細胞を含んでいる発酵ブロス試料はそれぞれの増殖装置から引き出し、氷−水浴上で反応停止させた。発酵ブロスを遠心分離し、上清を廃棄した。細胞ペレットは０．９％氷冷食塩水を使用して洗浄し、続いてＤＫＧ取込アッセイ緩衝液、１００ｍＭ氷冷リン酸カリウム  ｐＨ６．９、により２回洗浄した。細胞を同じアッセイ緩衝液に、５５０ｎｍでＯＤが１２になるように再懸濁し、室温で、または好適には２８℃でインキュベートした。ＤＫＧ取込アッセイは、細胞にＣ−１４濃縮放射線同位元素化２，５−ＤＫＧを混合することにより開始させた。ＤＫＧ取込の時間変化が、氷冷アッセイ緩衝液を使用する、真空／フィルターに基づいた反応停止を用いて追跡された。ＤＫＧ取込測定は細胞への放射性同位元素取込により行われ、得られたデータを時間に対してプロットすると、ＤＫＧ取込速度が得られる。
【００８３】
細胞ＤＫＧ取込および代謝研究に、シリコン油を使用する別のアッセイも実施された（Ｊｏｈｎｓｏｎ．Ｊ．Ｄ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．，１９８０，９５：４２９−４３９）。１００μｌのシリコン油をアッセイするばかりになったエピチューブに加えた。細胞および１４（Ｕ）濃縮２，５−ＤＫＧを混合し、規則的な時間間隔で細胞／基質混合物を引き出し、シリコン油を含んでいるエピチューブに加え、１５秒間遠心分離し、続いて直ちにドライアイス／エタノール浴で凍結した。５分後、細胞ペレットを含んでいるエピチューブのチップを直接切断してシンチレーションバイアル内へ落とした。チューブの残りは、凍結部分のすぐ上で再切断し、シンチレーション液を含んでいる別のバイアル内へ落下させた。エピチップから細胞ペレットが放たれるのを容易にするため、一夜たった後にカウントを測定した。上層からのカウント損失およびペレット中のカウント出現間の差は細胞代謝および放出されたＣＯ２によるものである。取込アッセイの終わりに、細胞を透過可能にした場合、低分子量細胞内容物が漏出し、蓄積された移入基質について、および代謝されて細胞成分になった基質についての情報が提供される。
【００８４】
ｅ．ＤＫＧレダクターゼアッセイ：各々の発酵槽から細胞ペレットを集め、−７０℃で約２４時間凍結した。１５および２５時間の時点でのペレットを氷上で融解し、５０ｍＭ  ＰＩＰＥＳ緩衝液、ｐＨ６．５中でフレンチプレスした。抽出物はベンチトップ遠心分離器中、２分ｘ１４Ｋｒｐｍで回転し、続いて全蛋白質濃度およびレダクターゼ活性を測定した。すべての試料は、蛋白質のためのブラッドフォードおよびＢＣＡアッセイで測定し、正確な速度アッセイに必要とされるまで希釈した。アッセイは２，５−ＤＫＧ以外のすべてを含んでいるバックグラウンド速度（総計の速度の１０％未満であった）に対して測定された。緩衝液は：５０ｍＭ  ＰＩＰＥＳ  ｐＨ６．５、１５０μＭ  ＮＡＤＰＨおよび５ｍＭ  ２，５−ＤＫＧを含んでいた。
【００８５】
細胞ＤＫＧ取込および代謝研究に、シリコン油を使用する別のアッセイも実施された（Ｊｏｈｎｓｏｎ．Ｊ．Ｄ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．，１９８０，９５：４２９−４３９）。１００μｌのシリコン油をアッセイするばかりになったエピチューブに加えた。細胞および１４（Ｕ）濃縮２，５−ＤＫＧを混合し、規則的な時間間隔（例えば、約１０秒毎）で細胞／基質混合物を引き出し、シリコン油を含んでいるエピチューブに加え、１５分間遠心分離し、続いて直ちにドライアイス／エタノール浴で凍結した。５分後、細胞ペレットを含んでいるエピチューブのチップを直接切断してシンチレーションバイアル内へ落とした。チューブの残りは、凍結部分のすぐ上で再切断し、シンチレーション液を含んでいる別のバイアル内へ落下させた。エピチップから細胞ペレットが放たれるのを容易にするため、一夜たった後にカウントを測定した。上層からのカウント損失およびペレット中のカウント出現間の差は細胞代謝および放出されたＣＯ２によるものである。取込アッセイの終わりに、細胞を透過可能にした場合、低分子量細胞内容物が漏出し、蓄積された移入基質について、および代謝されて細胞成分になった基質についての情報が提供される。
実施例ＩＩ
実施例ＩＩは基質の輸送が全細胞生物変換における律速といってもさしつかえない根拠を提供する。
【００８６】
この実施例は、四つの部分に区分化できる、グルコースからの２−ＫＬＧ形成の鍵となる工程を述べている（図５）。Ｐ．ｃｉｔｒｅａ中の三つのペリプラスム酵素を使用する、鍵となる中間体２，５−ＤＫＧの生成は１４−１５ｇ／ｌ／ｈｒである（Ｓｏｎｏｙａｍａ，ｅｔ  ａｌ，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１９８２，４３：１０６４−１０６９）。第二の部分はＤＫＧが細胞の細胞質空間へ輸送されるのに必要な速度である。第三は、ＤＫＧレダクターゼを使用する２−ＫＬＧへのＤＫＧの変換速度である（米国特許第５，０３２，５１４号）。２−ＫＬＧへのＤＫＧの変換は、ＤＫＧレダクターゼが過剰発現されている場合は律速ではない。我々の現２−ＫＬＧ産生発酵の場合、ＤＫＧレダクターゼが構成的ｔｒｐプロモーター下にあるｐＤ９２を現在使用している、典型的な発酵と比較し、レダクターゼ特異的活性を増加および減少させることの両方に誘導可能なプラスミドが使用された。誘導可能プラスミド、ｐＤ２３は、ｔａｑプロモーターの下にあり、ＩＰＴＧで誘導できる。三つの発酵槽を、一つはｐＤ９２で、および二つはｐＤ２３（その一つはＩＰＴＧで誘導された）で稼働させた。対照ｐＤ９２および誘導ｐＤ２３はほぼ同一レベルの２−ＫＬＧを産生したが、一方、非誘導ｐＤ２３は著しく少なかった。レダクターゼ特異的活性のアッセイは、対照ｐＤ９２と比較して、非誘導プラスミドは半分以下のレダクターゼしか作っていなかったが、一方、誘導ｐＤ２３は２倍以上を作り出していたことを示した。これらの結果は、我々の２−ＫＬＧ産生Ｐ．ｃｉｔｒｅａ発酵におけるレダクターゼ活性レベルは２−ＫＬＧ産生の障害ではないことを示している。
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第四の部分は、細胞内で行われ、移出される必要がある２−ＫＬＧの輸送である。発酵における２−ＫＬＧの産生速度（２．２ｇ／ｌ／ｈｒ−２．７ｇ／ｌ／ｈｒ）は、細胞からの２−ＫＬＧの移出速度と等しいべきと考えられる。もし、２−ＫＬＧの移出速度が制限されていたら、細胞側に２−ＫＬＧが蓄積されるであろうし、細胞はそれらの代謝ポテンシャルで機能することができなくなり、最後には死んでしまうであろう。しかしながら、Ｐ．ｃｉｔｒｅａの２−ＫＬＧ産生細胞はこれらの状態を示さず、２−ＫＬＧの細胞内測定では、産生された２−ＫＬＧ最大濃度の１０−２０分の１が残っていた。２−ＫＬＧ移出も２−ＫＬＧ生成における律速段階ではないことが考えられた。
実施例ＩＩＩ
実施例ＩＩＩは、生物変換のための細胞内への基質輸送速度が本当に律速段階にちがいないという証拠を提出している。
【００８７】
三つの異なった時点の発酵過程からの細胞ペレット、種フラスコ段階、フルクトース給餌段階およびグルコース給餌段階、を集め、実験の部で説明したように処理した。これらの細胞型を使用するＤＫＧ取込アッセイは、ＤＫＧをＫＬＧへ変換することをもたらす、０．５ｇ／ｌ／ｈｒ、２．７ｇ／ｌ／ｈｒおよび２．７５ｇ／ｌ／ｈｒＤＫＧ取込速度を与えた（図２）。ＤＫＧ移入の速度はＫＬＧ移出と同じである。それ故この結果は、ＫＬＧへのＤＫＧの生物変換速度は、細胞内への２，５−ＤＫＧ移入速度に依存していることを示している。それ故、本発明は、過剰発現によりＤＫＧ取込輸送体を増加させることが、２，５−ＤＫＧの移入速度を促進し、従って、２−ＫＬＧ産生速度を促進するであろうことを示すであろう。当業者は、全細胞変換法を使用し、種々の生物形質転換において鍵となる制限因子が、実際に生物形質転換のための、細胞内への基質の移入および移入速度であることを思い浮かべることができる。
実施例ＩＶ
実施例ＩＶはＤＫＧ取込アッセイを使用した、Ｋ．ｏｘｙｔｏｃａ中の２，５−ＤＫＧ輸送体の発見を提供する。ＷＯ００２１７０は、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｏｘｙｔｏｃａからのオペロンの同定および配列決定を記載しており（ｙｉａオペロンと称される）、それは８つの推定読み取り枠を含んでいる。ｙｉａオペロン中の個々の読み取り枠によりコードされているこれらのポリペプチドの機能は、ＷＯ００２１７０には記載されていない。このオペロンの破壊は、単一炭素源としてアスコルビン酸を使用するＫ．ｏｘｙｔｏｃａの能力を取り除いた。アスコルビン酸は酸化に不安定な物質であり、空気酸化により２，３−ＤＫＧへ分解することが知られている（Ｋｉｍａｙａ，Ｓ．，Ｊ．Ｖｉｔａｍｉｎｏｌ，，１９６１，７：１９−２６）。２，３−ＤＫＧが増殖のための実際の基質であることを示唆するのは妥当であった。ｙｉａオペロン中の読み取り枠の一つ（ｙｉａＸ２と称される）は、輸送体型膜貫通蛋白質をコードしており、それ故、２，３−ＤＫＧ透過酵素の候補であると考えられた。２，５−ＤＫＧ透過酵素を発見する平行的研究を照らし合わせると、２，３−ＤＫＧおよび２，５−ＤＫＧは類似の分子であることが理解され、ｙｉａＸ２が２，５−ＤＫＧおよび２−ＫＬＧのような他の糖ケト酸を輸送することは可能であろう。
【００８８】
ｙｉａＸ２が，５−ＤＫＧおよび２−ＫＬＧを輸送できるかどうかを決定するため、この遺伝子をＫ．ｏｘｙｔｏｃａ株Ｍ５ａ１の染色体から欠失させた（例えば、Ｓｔｒｅｉｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ，Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．６８：１１７４−１１７７（１９７１）を参照されたい）。ｙｉａＸ２欠失変異体（ＭＧＫ００２と称される）は、本分野では既知の標準分子生物学プロトコールを使用して作り出された（例えば、Ｈａｍｉｌｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．ｂａｃｔｅｒｉａｌ．１７１：４６１７−４６２２（１９８９）を参照されたい）。Ｔｅｓｔｅｒ株と称される別のＫ．ｏｘｙｔｏｃａ株はＫ．ｏｘｙｔｏｃａ株ＭＧＫ００２に、プラスミド的にコードされている、およびｌａｃオペロン制御ｙｉａＸ２遺伝子を付加し戻すことにより作り出された。ＭＧＫ００２およびＴｅｓｔｅｒ株を使用する、＋／−ＩＰＴＧ下でのＤＫＧ取込アッセイから、ｙｉａＸ２が２，５−ＤＫＧ輸送活性を持っているポリペプチドをコードしていることが確認された（図９）。
実施例Ｖ
実施例Ｖは、微生物からの２，５−ＤＫＧ透過酵素をスクリーニングするための選択方法論を提供する。
【００８９】
ｙｉａＸ２遺伝子が２，５−ＤＫＧ輸送活性を持っている輸送蛋白質をコードしているという情報により、Ｐ．ｃｉｔｒｅａおよび他の生物源の２，５−ＤＫＧ輸送蛋白質を発見するための選択宿主を設計することが可能になった。ｙｉａＸ２遺伝子欠失および酵素を発現する遺伝子の付加を持つＫ．ｏｘｙｔｏｃａは２，５−ＤＫＧからグルコン酸への異化に関係しており、それは生物体の中枢代謝を評価可能である。２，５−ＤＫＧをグロン酸に異化できる酵素は、いくつかのグラム陰性生物体に存在する、ｔｋｒ  ｉｄｎＤ  ｉｄｎＯオペロンのｔｋｒおよびｉｄｎｏ遺伝子によりコードされている（Ｂａｕｓｃｈ，Ｃ．，ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１９９８，１８０：３７０４−３７１０）。
【００９０】
得られたＫ．ｏｘｙｔｏｃａのｔｅｓｔｅｒ株はｙｉａＸ２［ｔｋｒ  ｉｄｎｏ］であり、単一炭素源として２，５−ＤＫＧ上での増殖に必要とされるすべての成分を持っているが、但し、細胞質内へＤＫＧを移入する能力は持っていない。従って、２，５−ＤＫＧ透過酵素をコードする核酸分子は、ｔｅｓｔｅｒ株中での発現により、２，５−ＤＫＧ上で増殖するｔｅｓｔｅｒ株の能力を与えるべきである。この選択方法論は図９に示されている。
【００９１】
Ｐ．ｃｉｔｒｅａゲノムライブラリーを構築するために使用されたクローニングベクターはプラスミドｐＣｌ１９２０（Ｌｅｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．，１９９４，１８：４６２１）であり、スペクチノマイシン／ストレプトマイシン耐性決定基を運んでいる低コピー数発現ベクターである。宿主に提供された場合、ｌａｃｌｑ遺伝子産物により抑制される，ｌａｃＰＯプロモーター／オペレーター領域により駆動される。Ｐ．ｃｉｔｒｅａ（ＡＴＣＣ３９１４０）からのゲノムＤＮＡは標準プロトコールを使用して単離し、ゲノムライブラリーを作製した（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ  ａｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９２））。増幅されたライブラリーは、Ｐ．ｃｉｔｒｅａの２，５−ＤＫＧ透過酵素発見にさらに使用するため、プラスミドＤＮＡの形で保存した。
実施例ＶＩ
実施例ＶＩは宿主細胞中でＤＫＧ輸送体を過剰発現することにより、細胞中のＤＫＧ移入を促進できるという証拠を提供する。
【００９２】
ゲノムライブラリーをｔｅｓｔｅｒ株Ｋ．ｏｘｙｔｏｃａ  ｙｉａＸ２［ｔｋｒ  ｉｄｎｏ］株内へ導入した。２．５％２，５−ＤＫＧおよび０．１ｍＭ  ＩＰＴＧを含むＭ９寒天プレートを使用し、２，５−ＤＫＧ上で成長させたクローンは、放射標識１４Ｃ（Ｕ）ＤＫＧを使用してＤＫＧ取込を試験した。種々のクローンが対照ｔｅｓｔｅｒ株より改良されたＤＫＧ取込を持つことが観察された（図１０）。これらの陽性クローンからのゲノムライブラリーＤＮＡでＰ．ｃｉｔｒｅａ（１３９−２Ａ）を形質転換し、Ｐ．ｃｉｔｒｅａ  １３９−２Ａ株よりもＤＫＧ取込が改良されていることを測定するため、ＤＫＧ取込アッセイが実施された。ゲノムライブラリースクリーニングおよび選択方法論を通して発見された、ＤＫＧ透過酵素をコードしているプラスミドの追加のコピーを持っている形質転換体中で、ＤＫＧ取込速度に３から５倍の改良がみられた（図１１）。
実施例ＶＩＩ
実施例ＶＩＩは宿主細胞中でＤＫＧ輸送体を過剰発現させることにより、２−ＫＬＧの産生を改良できることの証拠を提供している。Ｐａｎｔｏｅａ  ｃｉｔｒｅａ  ＤＫＧ透過酵素ＰｅｒｍＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）をコードしている核酸分子が、グルコースから２−ＫＬＧの生合成に適したＰａｎｔｏｅａ  ｃｉｔｒｅａ株１３９−２Ａ内へ低コピーベクターｐＢＣＬ１９２０を使用してサブクローン化された場合（米国特許第５，０３２．５１４号）、２−ＫＬＧ産生の産生速度が２．５ｇ／ｌ／ｈｒから３．２ｇ／ｌ／ｈｒへ改良され、糖に対する収率が４５％から５３％へ改良された（図１２）。
実施例ＶＩＩＩ
実施例ＶＩＩＩはＰ．ｃｉｔｒｅａからのＤＫＧ透過酵素ＰｅｒｍＡの特性を記述している。
【００９３】
この実施例は、Ｐ．ｃｉｔｒｅａのＰｅｒｍＡの膜トポロジーを説明している。ＰＦＡＭ分析（Ｈｉｒｏｋａｗａ，Ｔ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，１９９８，４（４）：３７８）は、ＰｅｒｍＡは八つの一次ドメインおよび三つの二次貫通ドメインを持つ１１の膜貫通ドメインを持っている（図１３）。アミノ末端はペリプラスムにあり、カルボキシ末端は細胞質中に位置している。二つの主および２つの副ループが存在し、ペリプラスムおよび細胞質の両方が一つの主および一つの副ループを持っている。ＰｅｒｍＡは０．６２の疎水性を持つ膜蛋白質であり、４８ダルトンの分子量を持っている。集積比分析（Ｌｏｌｋｅｍａ，Ｊ．Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．１９９６，Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｐｈｙｓｉｃｓ，Ｃｈａｐｔｅｒ  １１，２２９−２６０）に基づくと、それは２，５−ＤＫＧのＨ＋関連共輸送体の一つである。共通配列分析（Ｐａｏ，Ｓ．Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．，１９９８，６２：１−３４）に基づくと、それはＭＦＳのＡＣＳファミリーに属している（図１４）。
【００９４】
本開示を読んだ後に、本発明の精神および範囲から離れることなく、前記の説明および例の種々の別例および変形が、当業者には明らかになるであろうが、そのような例または変形は付随する特許請求の範囲内に含まれているつもりである。本明細書で参照されたすべての報文および特許はその全体がここに組み入れられる。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１はＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｏｘｙｔｏｃａのＹｉａＸ２のＤＮＡおよびアミノ酸配列を示している。ＰＥ１（環境透過酵素）；ＰＥ６（環境透過酵素）；Ｐａｎｔｏｅａ  ｃｉｔｒｅａのＰｅｒｍＡ；Ｐａｎｔｏｅａ  ｃｉｔｒｅａのＰｅｒｍＢ；Ｐａｎｔｏｅａ  ｃｉｔｒｅａのＹｉａＸ２。
【図２】図２はグルコースからのアスコルビン酸前駆体２−ＫＬＧ生産のための合成経路を示している流れ図である。
【図３】図３はアスコルビン酸前駆体２−ケト−Ｌ−グロン酸（２−ＫＬＧ）の合成経路を示している図である。
【図４】図４は、グルコースが２−ＫＬＧを得るようにたどることができる種々の合成経路を示している流れ図である。Ｂｏｕｄｒａｎｔ，Ｊ．，Ｅｎｚｙｍ  Ｍｉｃｒｏｂ．Ｔｅｃｈ．，１９９０，１２，３２２−３２９。
図４ＡはＤ−ソルビトールから２−ＫＬＧへの合成経路を示している図であり、経路内の他の反応および細胞膜を横切った基質の輸送に関係する反応の細胞位置を示している。Ｓａｉｔｏ，Ｙ，ｅｔ  ａｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｔ．Ｂｉｏｅｎｇ．５８（２／３）：３０５−３１５（１９９８）。
【図５】図５はＤ−グルコースから２，５−ＤＫＧ、２−ＫＬＧの合成経路を示しており、経路内の他の反応および細胞膜を横切った各々の基質の輸送に関係する反応の位置を示している。
【図６】図６はＤＫＧ輸送速度とＫＬＧ産生速度を比較している線グラフであり、時間に対する２，５−ＤＫＧ取込量（ナノモル／ＯＤ６００）を示している（−◆−＝フルクトース給餌１３９−２ａ、０．０４８６ｘ＋０．６７；−▲−＝グルコース給餌１３９−２ａ、ｙ＝０．０４９７＋０．５８７７；−●−＝種フラスコ１３９−２ａ、ｙ＝０．００７５ｘ＋０．０５６７）。
【図７】図７はＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｏｘｙｔｏｃａ中のアスコルビン酸異化作用のｙｉａオペロン概略図である。
【図８】図８はシリコン油輸送アッセイにより測定された、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｏｘｙｔｏｃａによる２，５−ＤＫＧ取込量（ナノモル）を示しているグラフである（−◆−＝Ｔｅｓｔｅｒ＋イソプロピルβ−Ｄ＝チオガラクトピラノシド〔ＩＰＴＧ〕；−▲−＝ΔｙｉａＸ２＋ＩＰＴＧ；−黒四角−＝Ｔｅｓｔｅｒ−ＩＰＴＧ）。
【図９】図９はＰ．ｃｉｔｒｅａ、Ｋ．ｏｘｙｔｏｃａおよび環境源から透過酵素を選ぶための選択計画を示している概略図である。
【図１０】図１０はＫ．ｏｘｙｔｏｃａ株における２，５−ＤＫＧ取込活性を示している棒グラフである（ＹｉａＸ２、ｐｃｐ１、ｐｃｐ１０、ｐｃｐ３２、ｐＫ１、環境＃１および環境＃６）。
【図１１】図１１は２８度ＣでのＤＫＧ取込速度（ｇ／ｌ／ｈｒ）を測定することによる、同一のプラスミド構築物（ｐＢＣＬ１９２０）中に種々のＤＫＧ透過酵素（１３９−２Ａ、１３９−２Ａ＋ＰＣＰ３２；１３９−２Ａ＋ＰＣＰ１０；１３９−２Ａ＋ＰＫ１；１３９−２Ａ＋ＰＣＰ１および１３９−２Ａ＋ＰＥ６）を含んでいる振盪フラスコの２，５−ＤＫＧ取込アッセイを示している棒グラフである。９Ａ−９Ｂ
【図１２】図１２は、特異的生産性が過剰発現されたＤＫＧ透過酵素で増加することを示している線グラフである。特異的産生速度（ｇ／ｌ／ｈｒ）（−◆−＝野生型；−ｘ−＝ＷＴ、ｐｒｍＡ）。
【図１３】図１３は膜表面におけるＰｅｒｍＡ輸送体の概略図である。推定膜貫通ドメインはＩ−ＸＩと番号付けられている。保存残基の位置はボールド体で示されている。Ｎはアミノ末端であり、Ｃはカルボキシル末端である。Ｐａｎｔｏｅａ  ｃｉｔｒｅａ  透過酵素Ａ（ＳＥＱ  ＩＤ：＿）の推定膜貫通ドメインはｈｔｔｐ：／／ｓｏｓｕｉ．ｐｒｏｔｅｏｍｅ．ｂｉｏ．ｔｕａｔ．ａｃ．ｊｐ／ｓｏｓｕｉｆｒａｍｅ０．ｈｔｍｌ  で利用可能な道具を使用して導き出された。
【図１４】図１４は残基Ｇ１１９から１４２に対応する保存アミノ酸配列である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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