(57)【要約】本発明は、インビボまたはインビトロにおける卵巣卵胞成長を変更するための卵母細胞因子のヌクレオチドおよびアミノ酸配列に関する。本発明はまた、新規なホモ２量体およびヘテロ２量体ポリペプチドならびにインビボまたはインビトロで哺乳動物卵巣卵胞成長を変更するためのそれらの使用に関する。特に、本発明は、卵胞成長をインビボまたはインビトロで変更するようにホモ−またはヘテロ２量体ポリペプチドまたはそれらの機能的フラグメントまたは変異体に対して能動的または受動的に免疫感作することに関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）配列番号１、
ｂ）ストリンジェントな条件下で（ａ）の分子にハイブリダイズし得る配列、
ｃ）（ａ）の分子の機能的な変異体またはフラグメントである配列、
ｄ）（ａ）、（ｂ）または（ｃ）中に規定した分子に相補的な配列、および
ｅ）（ａ）〜（ｄ）中の分子のいずれかに対応するアンチセンス配列、
からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む、単離された野生型ＧＤＦ−９Ｂ核酸分子。
【請求項２】
ａ）配列番号３または５、
ｂ）ストリンジェントな条件下で（ａ）中の分子にハイブリダイズし得る配列、
ｃ）（ａ）中の分子の機能的な変異体またはフラグメントである配列、
ｄ）（ａ）、（ｂ）または（ｃ）中に規定した分子に相補的な配列、および
ｅ）（ａ）〜（ｄ）中の分子のいずれかに対応するアンチセンス配列、
からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む、単離された全長変異型ＧＤＦ−９Ｂ核酸分子。
【請求項３】
ａ）配列番号２、配列番号４または配列番号６、および
ｂ）（ａ）中の配列の機能的な変異体またはフラグメント、
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、単離された全長ＧＤＦ−９Ｂポリペプチド。
【請求項４】
配列番号２またはその配列の機能的なフラグメントもしくは変異体からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むサブユニットを有する、ホモ２量体成熟ＧＤＦ−９Ｂポリペプチド。
【請求項５】
ａ）配列番号２由来のアミノ酸配列またはその配列の機能的なフラグメントまたは変異体を含む成熟ＧＤＦ−９Ｂポリペプチド、および
ｂ）成熟ＧＤＦ−９ポリペプチドまたはその機能的な変異体またはフラグメントからなる群から選択されるサブユニットを有するヘテロ２量体ポリペプチド。
【請求項６】
請求項１または請求項２のいずれかに記載の核酸分子を含むベクター。
【請求項７】
請求項１または請求項２のいずれかに記載の核酸分子を含む構築物。
【請求項８】
請求項６または請求項７のいずれかに記載のベクターまたは構築物により形質転換されている宿主細胞。
【請求項９】
請求項３に記載の全長プレプロポリペプチド由来のポリペプチドに結合するリガンド。
【請求項１０】
請求項４に記載のホモ２量体ポリペプチドに結合するリガンド。
【請求項１１】
請求項５に記載のヘテロ２量体ポリペプチドに結合するリガンド。
【請求項１２】
抗原結合ドメインを含む抗体または抗体フラグメントである、請求項１０または１１のいずれかに記載のリガンド。
【請求項１３】
モノクローナル抗体である、請求項１２に記載のリガンド。
【請求項１４】
ファージディスプレイ分子である、請求項１０または１１に記載のリガンド。
【請求項１５】
細胞表面レセプターの形態である、請求項１０または１１に記載のリガンド。
【請求項１６】
ａ）配列番号１からなる群から選択される核酸配列またはその群の配列の機能的なフラグメントもしくは変異体を含む核酸分子を含有する発現構築物を作製すること、
ｂ）適切な細胞をその構築物でトランスフェクトすること、
ｃ）安定なクローンを選択すること、ならびに
ｄ）発現されたポリペプチドを単離および精製すること、
を含む生物学的に活性なプロセシングされたホモ２量体ＧＤＦ−９Ｂポリペプチドを発現させる方法。
【請求項１７】
ａ）（ｉ）配列番号１からなる群から選択される核酸配列またはその配列の機能的なフラグメントもしくは変異体、および
（ｉｉ）ＧＤＦ−９をコードする核酸分子またはその機能的なフラグメントもしくは変異体
を含む核酸分子を含有する発現構築物を作製すること、
ｂ）適切な細胞を構築物でトランスフェクトすること、
ｃ）安定なクローンを選択すること、ならびに
ｄ）発現されたポリペプチドを単離および精製すること、
を含む生物学的に活性なプロセシングされたヘテロ２量体ＧＤＦ−９ＢおよびＧＤＦ−９ポリペプチドの発現方法。
【請求項１８】
ＧＤＦ−９Ｂ発現カセットまたはＧＤＦ−９発現カセットの、宿主細胞または生物へのアデノウィルス、レトロウィルスおよびαウィルス移入により、ＧＤＦ−９Ｂホモ２量体またはＧＤＦ−９Ｂ／ＧＤＦ−９ヘテロ２量体のインビボ発現をもたらす方法であって、配列１からなる群から選択されるヌクレオチド配列またはその配列の機能的なフラグメントもしくは変異体を有する核酸分子（ここで、この核酸分子が発現制御配列と機能的に関連している）を含有する発現カセットを含む組換えアデノウィルスを、レシピエント細胞、器官培養物またはレシピエント動物に移入する工程を含む方法。
【請求項１９】
請求項６または７のいずれかに記載のベクターまたは構築物により形質転換されているトランスジェニック動物。
【請求項２０】
哺乳動物および他の脊椎動物の卵巣宿主細胞を、ＧＤＦ−９ＢおよびＧＤＦ−９発現カセットで形質転換し、ＧＤＦ−９Ｂホモ２量体およびＧＤＦ−９Ｂ／ＧＤＦ−９へテロ２量体の過剰発現を可能にすることを含む、雌性哺乳動物または他の雌性脊椎動物におけるインビボでの卵巣卵胞成長を改変する方法。
【請求項２１】
哺乳動物および他の脊椎動物の卵巣宿主細胞を、ＧＤＦ−９ＢおよびＧＤＦ−９発現カセットで形質転換し、ＧＤＦ−９Ｂホモ２量体およびＧＤＦ−９Ｂ／ＧＤＦ−９へテロ２量体の過剰発現を可能にすることを含む、雌性哺乳動物または他の雌性脊椎動物におけるインビトロ卵巣卵胞成長を改変する方法。
【請求項２２】
哺乳動物が、ヒツジ、ウシ、ヤギ、シカ、ヒト、ブタ、ウマ、ラクダおよびフクロネズミ、ネコおよびイヌならびに任意の他の商業的に重要な種からなる群から選択される、請求項１９または２０のいずれかに記載の方法。
【請求項２３】
脊椎動物が、ニワトリ、アヒル、ガチョウ、サケおよび任意の他の商標的に重要な種からなる群から選択される、請求項１９または２０のいずれかに記載の方法。
【請求項２４】
ａ）ＧＤＦ−９ポリペプチドまたはその機能的なフラグメントもしくは変異体を含むサブユニットを有するホモ２量体ポリペプチドの存在下または非存在下の、ＧＤＦ−９Ｂポリペプチドまたはその機能的なフラグメントまたは変異体を含むサブユニットを有するホモ２量体ポリペプチド、
ｂ）ＧＤＦ−９ＢポリペプチドおよびＧＥＦ−９ポリペプチドを含むサブユニットまたはＧＥＦ−９ＢまたはＧＤＦ−９ポリペプチドの機能的なフラグメントもしくは変異体を有するヘテロ２量体ポリペプチド、
からなる群から選択される有効量の薬剤を、製薬上または獣医学的に許容されるキャリア（アジュバントを含む）または希釈剤とともに含み、そして必要に応じて補助的な性腺刺激ホルモンを含む、組成物。
【請求項２５】
ｉ）インビボまたはインビトロのいずれかで、哺乳動物または他の脊椎動物の卵巣中の卵胞成長を改変するため、または
ｉｉ）インビトロで、単離された卵巣細胞成長／成熟を改変するための、
ａ）ＧＤＦ−９ポリペプチドまたはその機能的なフラグメントもしくは変異体を含むサブユニットを有するホモ２量体ポリペプチドを有するか、もしくは有さない、ＧＤＦ−９Ｂまたはその機能的なフラグメントまたは変異体を含むサブユニットを有するホモ２量体ポリペプチド
ｂ）ＧＤＦ−９ＢおよびＧＤＦ−９ポリペプチド、またはＧＥＦ−９ＢまたはＧＤＦ−９ポリペプチドの機能的なフラグメントもしくは変異体を含むサブユニットを有するヘテロ２量体ポリペプチド
からなる群から選択される因子の、補助的な性腺刺激ホルモンおよび／または、他の卵巣成長因子（ＩＧＦ−１、ｋｉｔリガンド（幹細胞因子）、表皮細胞増殖因子またはＴＧＦβアゴニスト／アンタゴニストを含む）の存在下、または非存在下での使用。
【請求項２６】
ａ）ＧＤＦ−９Ｂホモ２量体ポリペプチドおよび／またはＧＤＦ−９Ｂ／ＧＤＦ−９ヘテロ２量体ポリペプチドを有効量で、卵巣細胞または器官培養物に、他の卵巣成長因子（ＴＧＦβアゴニスト／アンタゴニストを含む）の存在下または非存在下で加えること、
ｂ）この細胞または器官培養物にバイオアッセイを行って、ホモ２量体またはヘテロ２量体のポリペプチドの生物学的活性を評価すること、
を含む、ＧＤＦ−９Ｂホモ２量体および／またはＧＤＦ−９Ｂ／ＧＤＦ−９ヘテロ２量体の活性を評価する方法。
【請求項２７】
請求項９〜１５のいずれかに記載のリガンドを導入して、ｉｉ）哺乳動物またの他の脊椎動物の卵巣における卵胞成長を、インビボまたはインビトロのいずれかで改変すること、または
ｉｉｉ）単離された卵巣細胞成長／成熟をインビトロで改変すること、
を含む卵胞成長を改変する方法。
【請求項２８】
配列番号１７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、単離された機能的な変異体ポリペプチド。
【請求項２９】
配列番号１８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、単離された機能的な変異体ポリペプチド。
【請求項３０】
配列番号１１、配列番号１３および配列番号１５からなる群から選択される核酸配列、またはそれらの配列の機能的なフラグメントもしくは変異体を含む単離された核酸分子。
【請求項３１】
配列番号１２、配列番号１４および配列番号１６からなる群から選択されるアミノ酸配列、またはそれらの配列の機能的なフラグメントもしくは変異体を含む単離されたポリペプチド。
【請求項３２】
本明細書中において任意の実施例および／またはその図に関連して実質的に記載されている、単離された核酸分子。
【請求項３３】
本明細書中において任意の実施例および／またはその図に関連して実質的に記載されている、単離されたポリペプチド。
【請求項３４】
本明細書中において任意の実施例および／またはその図に関連して実質的に記載されている本発明の単離された核酸分子を組込んだベクターまたは遺伝子構築物。
【請求項３５】
本明細書中において任意の実施例および／またはその図に関連して実質的に記載されている本発明のポリペプチドに結合するリガンド。
【請求項３６】
本明細書中において任意の実施例および／またはその図に関連して実質的に記載されている、ホモ２量体ポリペプチド。
【請求項３７】
本明細書中において任意の実施例および／またはその図に関連して実質的に記載されている、ヘテロ２量体ポリペプチド。
【請求項３８】
本明細書中において任意の実施例および／またはその図に関連して実質的に記載されている、生物学的に活性にプロセシングされているホモ２量体ポリペプチドを発現する方法。
【請求項３９】
本明細書中において任意の実施例および／またはその図に関連して実質的に記載されている、生物学的に活性にプロセシングされているヘテロ２量体ポリペプチドを発現する方法。
【請求項４０】
ポリペプチドのアデノウィルス移入により、本明細書中において任意の実施例に関連して実質的に記載されている、本発明のホモ２量体またはヘテロ２量体ポリペプチドのインビボ発現をもたらすための方法。
【請求項４１】
本明細書中において任意の実施例に関連して実質的に記載されている、雌性哺乳動物または他の脊椎動物における卵巣卵胞成長を改変する方法。
【請求項４２】
本明細書中において任意の実施例および／または図面に関連して実質的に記載されている、組成物。
【請求項４３】
本明細書中において任意の実施例に関連して実質的に記載されている卵胞成長を改変するための、ホモ２量体またはヘテロ２量体ポリペプチドの使用。
【請求項４４】
本明細書中において任意の実施例に関連して実質的に記載されている、ホモ２量体およびヘテロ２量体ポリペプチドの生物学的な活性を評価する方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、インビボまたはインビトロで卵巣卵胞成長を改変する卵母細胞因子のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列に関する。本発明はまた、新規なホモ２量体及びヘテロ２量体のポリペプチド、ならびにインビボおよびインビトロで哺乳動物卵巣卵胞成長を改変するためのそれらの使用に関する。特に、本発明は、広義には、インビボまたはインビトロで卵胞成長を改変するための、これらのホモ−あるいはへテロ２量体ポリペプチドまたはその機能的フラグメントもしくは変異体に対する能動的あるいは受動的な免疫感作に関する。
【０００２】
発明の背景
卵巣卵胞形成（ｆｏｌｌｉｃｕｌｏｇｅｎｅｓｉｓ）の初期段階（すなわち、一次、二次および前胞状卵胞（ｐｒｅ−ａｎｔｒａｌ ｆｏｌｌｉｃｌｅｓ）への原始卵胞の成長及び分化）の刺激を担う調節分子の分子的性質はほとんどわかっていない。他方、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）および黄体形成ホルモンは下垂体に由来する糖タンパク質ホルモンであり、一般的に卵巣卵胞形成の後期段階を調節する重要な因子と認められている。さらに、ＦＳＨは、正常な数よりも多くの卵胞が排卵されるように刺激する唯一の最も重要な因子として受け入れられており、この事実は医学及び獣医学の両方での卵巣過剰刺激レジメにおける市販のＦＳＨ製剤の広範な使用により良く例示されている。最近の研究は、初期の卵胞形成は卵巣内因子（なかでも顆粒膜細胞由来幹細胞因子（またはｃ−ｋｉｔリガンド）および卵母細胞由来成長分化因子−９（ＧＤＦ−９）が最も注目を集めている。なぜならば、両方とも初期の哺乳動物卵胞形成におそらく必須であるからである）により制御されていることを示している。
【０００３】
ＧＤＦ−９は、最初は、１９９３年に形質転換増殖因子β（ＴＧＦ−β）スーパーファミリーの新規なメンバーとして記載された（これは、卵巣中で特異的に発現される）（ＭｃＰｈｅｒｒｏｎおよびＬｅｅ，１９９３）。ＴＧＦ−βファミリーの他のメンバーと同様に、ＧＤＦ−９はシグナルペプチド、プロ領域、およびいわゆるＣ−末端成熟領域から構成されるプレプロペプチドとしてコードされている（これはフリン（ｆｕｒｉｎ）様プロテアーゼのグループに属する細胞内プロテアーゼにより前駆体ペプチドから切断される）。ＴＧＦ−βファミリーの成長因子は、成熟領域中に見出される共通のパターンのシステイン残基により特徴付けられ、これはおそらくファミリーの全てのメンバーにおいて形成されている（これはＴＧＦ−βファミリーメンバーの１量体中における３個の特徴的なジスルフィド結合を形成する６個のシステイン残基から構成される「システインノット（ｋｎｏｔ）」として公知の堅い分子内構造である）（Ｄａｏｐｉｎら、１９９２；ＳｃｈｌｕｎｅｇｇｅｒおよびＧｒｕｔｔｅｒ，１９９２および１９９３；Ｇｒｉｆｆｉｔｈら、１９９６；Ｓｃｈｅｕｆｌｅｒら、１９９９）。ＴＧＦ−βファミリーのほとんどのメンバーは、２つの同一の１量体の共有結合ホモ２量体化（ホモ２量体）、または所定のＴＧＦ−βファミリーメンバーのファミリーの別の異なるメンバーとのヘテロ２量体化（ヘテロ２量体）の原因である保存された第７のＣｙｓ残基を有している。
【０００４】
マウスにおいては、ＧＤＦ−９は卵胞発達の初期段階から排卵まで卵母細胞において発現される（ＭｃＧｒａｔｈら、１９９５；Ｌａｉｔｉｎｅｎら、１９９８）。マウスＧＤＦ−９配列をデータベース検索の試験配列として使用して、本発明者らは、マウス２細胞期胚ライブラリー由来のＧＤＦ−９様発現配列タグ（ＥＳＴ）ｃＤＮＡを同定した（Ｌａｉｔｉｎｅｎら、１９９８）。本発明者らは、この新規な因子（ＧＤＦ−９Ｂ（これはＧＤＦ−９と５５％相同である））の転写物がＧＤＦ−９と同時にマウス卵巣の卵母細胞中で発現されることを見出した（Ｌａｉｔｉｎｅｎら、１９９８）。ＰＣＲおよびマウスＥＳＴ配列由来のプライマーを使用して、本発明者らは対応する遺伝子のフラグメントをヒトゲノムＤＮＡから増幅し、遺伝子座を染色体Ｘｐ１１．２に対して位置決めし、ヒトＧＤＦ−９Ｂ遺伝子の構造を単離したコスミドクローンから推定した（Ａａｌｔｏｎｅｎら、１９９９）。興味深いことに、ヒト卵巣においては、ＧＤＦ−９　ｍＲＮＡの発現は、ＧＤＦ−９Ｂよりもわずかに早く一次卵胞中で始まる（Ａａｌｔｏｎｅｎら、１９９９）。マウスおよびヒトのＧＤＦ−９Ｂ遺伝子がクローニングされ、また、この遺伝子によりコードされるタンパク質は骨形成性タンパク質１５（ＢＭＰ−１５）と命名された（Ｄｕｂｅら、１９９８）。
【０００５】
ＧＤＦ−９は、おそらく卵巣卵胞形態形成に必須である。文献によると、ＧＤＦ−９欠損マウス（ＧＤＦ−９−／−）は、初期の卵胞形態形成停止状態に起因して生殖不能であることが知られている（Ｄｏｎｇら、１９９６）。ＧＤＦ−９−／−の卵巣では、卵母細胞を単層立方顆粒膜細胞の単層が覆った時点の初期卵胞段階で、卵胞形態形成が停止する。たとえ卵母細胞が成長しつづけたとしても、顆粒膜細胞は増殖することはできず、卵胞膜細胞分化は卵胞の増大化と関連していない。
【０００６】
Ｉｎｖｅｒｄａｌｅ生殖遺伝子（ＦｅｃＸＩ）は、ロメニ（Ｒｏｍｎｅｙ）ヒツジ群（ｆｌｏｃｋ）の出産に影響を与える主要な遺伝子として同定された（Ｄａｖｉｓら、１９９１）。セグメンテーション分析により、遺伝子がＸ染色体上に保有されていること、１コピーの遺伝子（Ｉ／＋）を保有する雌ヒツジは、保有しない雌ヒツジ（＋／＋）よりも同腹仔ヒツジがおよそ０．６匹多いことが決定された。生まれた仔ヒツジの数の増加は、卵胞発達の改変パターン、および野生型の約１．０の場合を超える排卵速度の増加と直接関係している（Ｓｈａｃｋｅｌｌら、１９９３；Ｄａｖｉｓら、１９９１）。対照的に、２コピーの遺伝子を有するホモ接合体キャリア雌ヒツジ（Ｉ／Ｉ）は卵巣不全状態に起因して不妊である（Ｄａｖｉｓら、１９９２）。（Ｉ／Ｉ）雌ヒツジの卵巣では、卵胞形態形成が一次卵胞段階で停止しており、表現型はＧＤＦ−９（−／−）マウスにおいて見出されるものとは異ならない（Ｂｒａｗ−Ｔａｌら、１９９３；ＭｃＮａｔｔｙら、１９９５；Ｓｍｉｔｈら、１９９７）。
【０００７】
Ｉｎｖｅｒｄａｌｅ群との関係が未知である第２の多産ロメニ群（Ｈａｎｎａ、１９９５）もまた、Ｉｎｖｅｒｄａｌｅに類似の表現型を有するＸ連関変異を保有することが示された。Ｈａｎｎａ動物がＩｎｖｅｒｄａｌｅと同じ遺伝子中に変異（ＦｅｃＸＨ）を保有するという証拠は、Ｉｎｖｅｒｄａｌｅキャリアの雄ヒツジをＨａｎｎａ雌ヒツジキャリアと交配することにより不妊のメスが生じることから得られた（Ｄａｖｉｓら、１９９５）。Ｈａｎｎａ系統はＩｎｖｅｒｍａｙ　ＡｇＲｅｓｅａｒｃｈ　Ｃｅｎｔｒｅに、Ｉｎｖｅｒｄａｌｅ系統の傍の異なるグループとして維持されている。
【０００８】
ニュージーランド特許出願第５００８４４号で、本発明者らはＩｎｖｅｒｄａｌｅヒツジにおいて、ＧＤＦ−９Ｂ遺伝子の成熟ペプチドプロセシング部位を超えたところに、コドンＧＴＣ（アミノ酸バリン（Ｖ））をＧＡＣ（アミノ酸アスパラギン酸（Ｄ））に変換するヌクレオチド置換を同定した。また、本発明者らは、Ｈａｎｎａヒツジにおいて、成熟ペプチドプロセシング部位を超えたところのＣヌクレオチドがＴに変換されていることを示した。これにより、コドンＣＡＧ（グルタミン（Ｑ）をコードする）がコドンＴＡＧ（終止をコードする）に変換し、短縮型成熟タンパク質が生じる。ＩｎｖｅｒｄａｌｅおよびＨａｎｎａにおけるこれらの個々の変異が、ホモ接合体のＩｎｖｅｒｄａｌｅまたはＨａｎｎａ雌ヒツジ、およびＩｎｖｅｒｄａｌｅ×（ｃｒｏｓｓ）Ｈａｎｎａ雌ヒツジにおける「痕跡的線条（ｓｔｒｅａｋ）」卵巣および無排卵状態の根源的な原因であると示唆されている。
【０００９】
以前より、ＧＤＦ−９−／−マウスが不妊であり、これはある哺乳動物にとってはＧＤＦ−９が正常な生殖能力に重要であることを示すと提示されていた。しかしながら、関連する卵母細胞特異的因子ＧＤＦ−９Ｂの発見に伴い、本発明者らにより、いくつかの新規な知見が見出され、これは以下の概念を支持した：（１）ＧＤＦ−９Ｂは、ある哺乳動物においては正常な卵胞形成に必須である；（２）ＧＤＦ−９Ｂは、ある哺乳動物においては排卵速度を決定するために非常に重要である；（３）ＧＤＦ−９およびＧＤＦ−９Ｂは卵母細胞により同時に発現され、卵胞発達および排卵速度の両方を向上させるために共同的に機能する。総括すると、これらの新規な仮説は、まさに、本発明者らによるヒツジにおけるＩｎｖｅｒｄａｌｅおよびＨａｎｎａ　ＧＤＦ−９Ｂ変異の発見によってのみ可能となった。
【００１０】
本発明者らは、野生型タンパク質をコードするヒツジＧＤＦ−９Ｂ遺伝子の全遺伝子構造を初めて決定し、ヒツジにおける正常な卵巣卵胞形成を維持するために必須であることを示した。また、本発明者らは、ＩｎｖｅｒｄａｌｅおよびＨａｎｎａヒツジにおけるＧＤＦ−９Ｂ変異体の全遺伝子構造を同定した。これらは、ヘテロ接合体の動物においては排卵速度が正常な排卵速度よりも早いことの原因であり、そしてホモ接合体動物中においては不妊体の原因である。概して、本発明は、全長野生型および変異型ＧＤＦ−９Ｂ配列ならびにその変異体に関し、そして哺乳動物不妊におけるそれらの使用に関する。
【００１１】
この明細書中で引用する特許または特許出願を含む全ての参考文献は、本明細書中に参照してくみこむ。いずれの参考文献も従来技術を構成するわけではない。参考文献の考察は、著者が主張することを記載しており、本出願人は参考文献の正確さおよび適切さを調べる権利を保有する。多数の先行技術刊行物を本明細書中に参照するが、これらの参考文献はいずれも、ニュージーランドにおいても他のいずれの国においても、当該技術分野における共通の一般的な知識の一部を形成するという認識を構成するわけではないことは明らかに理解される。
【００１２】
発明の要旨
従って、第１の局面において、本発明は、
ａ）配列番号１；
ｂ）ストリンジェントな条件下で（ａ）の分子にハイブリダイズし得る配列；
ｃ）（ａ）の分子の機能的な変異体またはフラグメントである配列；
ｄ）（ａ）、（ｂ）または（ｃ）において定義した分子に対して相補的な配列；ならびに
ｅ）（ａ）〜（ｄ）中の分子のいずれかに対応するアンチセンス配列
からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む、単離された野生型ＧＤＦ−９Ｂ核酸分子を提供する。
【００１３】
第２の局面において、本発明は
ａ）配列番号３または配列番号５；
ｂ）ストリンジェントな条件下で（ａ）中の分子にハイブリダイズし得る配列；
ｃ）（ａ）中の分子の機能的な変異体またはフラグメントである配列；
ｄ）（ａ）、（ｂ）または（ｃ）において定義した分子に対して相補的な配列；ならびに
ｅ）（ａ）〜（ｄ）中の分子のいずれかに対応するアンチセンス配列
からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む、単離された全長変異型ＧＤＦ−９Ｂ核酸分子を提供する。
【００１４】
核酸分子は、ＲＮＡ、ｃＲＮＡ、ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡ分子であり得、１本鎖または２本鎖であり得る。また、場合により、核酸分子は１つ以上の合成された、非天然の、または改変されたヌクレオチド塩基、あるいはそれらの組合わせを含有し得る。
【００１５】
第３の局面において、本発明は、
ａ）配列番号２、配列番号４または配列番号６、および
ｂ）（ａ）の配列の機能的な変異体またはフラグメント
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、単離された全長ＧＤＦ−９Ｂポリペプチドを提供する。
【００１６】
第４の局面において、本発明は、配列番号２またはその配列の機能的なフラグメントもしくは変異体からなる群から選択されるアミノ酸配列を含有するサブユニットを有するホモ２量体成熟ＧＤＦ−９Ｂポリペプチドを提供する。
【００１７】
第５の局面において、本発明は、
ａ）配列番号２由来のアミノ酸配列またはこの配列の機能的なフラグメントもしくは変異体を含む成熟ＧＤＦ−９Ｂポリペプチド；ならびに
ｂ）成熟ＧＤＦ−９ポリペプチドまたはその機能的な変異体もしくはフラグメント
からなる群から選択されるサブユニットを有するヘテロ２量体ポリペプチドを提供する。
【００１８】
さらに、本発明は第６の局面において生物学的に活性にプロセシングされたホモ２量体ＧＤＦ−９Ｂポリペプチドを発現する方法を提供し、この方法は以下の工程を含む：
ａ）配列番号１からなる群から選択される核酸配列またはその群の配列の機能的なフラグメントまたは変異体を含む核酸分子を含有する発現構築物を作製すること；
ｂ）適切な細胞にこの構築物をトランスフェクトすること；
ｃ）安定なクローンを選択すること；ならびに
ｄ）発現されたポリペプチドを単離および精製すること。
【００１９】
第７の局面において、本発明は生物学的に活性にプロセシングされたヘテロ２量体ＧＤＦ−９ＢおよびＧＤＦ−９ポリペプチドを発現させる方法を提供し、この方法は以下の工程を含む：
ａ）（ｉ）配列番号１からなる群から選択される核酸配列またはこの配列の機能的なフラグメントもしくは変異体；ならびに
（ｉｉ）ＧＤＦ−９をコードする核酸分子またはその機能的なフラグメントもしくは変異体
を含む核酸分子を含有する発現構築物を作製すること；
ｂ）適切な細胞をこの構築物でトランスフェクトすること；
ｃ）適切なクローンを選択すること、ならびに発現されたポリペプチドを単離および精製すること。
【００２０】
好ましくは、トランスフェクトされる細胞は脊椎動物であるが、しかしながら他のタイプの細胞の使用も認識されている。
【００２１】
ＧＤＦ−９核酸およびタンパク質配列は、ＧＥＮｂａｎｋおよびＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴのような公共のデータベースにおいて入手可能である。ヒツジＧＤＦ−９の核酸の寄託番号はＡＦＯ７８５４５であり、タンパク質に関してはＡＡＣ２８０８９である。
【００２２】
また、本発明により、本発明のＤＮＡ分子またはその機能的な変異体を含有する組換え発現ベクター、ならびに本発明のポリペプチドを発現し得る本発明のベクターで形質転換した宿主が提供される。
【００２３】
本発明はさらなる局面において、本発明のポリペプチドに結合するリガンドを提供する。最も一般的には、このリガンドは抗体である。用語「抗体」は、本発明のポリペプチドに結合する能力を保持している抗体のフラグメントまたはアナログ（これは、Ｆｖ、Ｆ（ａｂ）２フラグメント、ＳｃＦｖ分子などを含むが、これらに限定されない）を含むと理解されるべきである。抗体はポリクローナルまたはモノクローナルであり得るが、好ましくはモノクローナルである。いくつかの実施態様において、リガンドは本発明のポリペプチドに対して作製されたファージディスプレイ分子、単一細胞表面レセプターまたは複合型細胞表面レセプターであり得る。ポリペプチドまたはペプチドは、１量体、２量体、ヘテロ２量体、マルチマーまたはそれらの変異体として存在し得る。
【００２４】
第８の局面において、本発明はＧＤＦ−９Ｂホモ２量体および／またはＧＤＦ−９Ｂ／ＧＤＦ−９ヘテロ２量体の活性を評価する方法を提供し、この方法は以下の工程を含む：
ａ）有効量のＧＤＦ−９Ｂホモ２量体ポリペプチド、および／またはＧＤＦ−９Ｂ／ＧＤＦ−９ヘテロ２量体ポリペプチドを、ＩＧＦ−１および／または形質転換増殖因子スーパーファミリーの他のメンバーのような他の卵巣成長因子（例えば、アクチビン、ＢＭＰ２、ＴＧＦβ１）の存在下または非存在下で、卵巣細胞または器官培養物に加えること；ならびに
ｂ）この細胞または器官培養物に対してバイオアッセイを行ってこのホモ２量体およびヘテロ２量体ポリペプチドの生物学的活性を評価すること。
【００２５】
第９の局面において、本発明は、ＧＤＦ−９Ｂホモ２量体およびＧＤＦ−９Ｂ／ＧＤＦ−９ヘテロ２量体の全身的産生の、卵胞成長に対する効果を示すために有用なトランスジェニック動物モデルを提供する。
【００２６】
第１０の局面において、本発明は、宿主細胞または生物にＧＤＦ−９Ｂ発現カセットまたはＧＤＦ−９発現カセットをアデノウィルス、レトロウィルスおよびアルファウィルスにより移入し、これによりＧＤＦ−９Ｂホモ２量体またはＧＤＦ−９Ｂ／ＧＤＦ−９ヘテロ２量体のインビボ発現をもたらす方法を提供し、この方法はレシピエント細胞、器官培養物またはレシピエント動物に、配列番号１からなる群から選択されるヌクレオチド配列またはその配列の機能的なフラグメントもしくは変異体を有する核酸分子を含む発現カセットを有する組換えアデノウィルスを移入する工程を含み、ここで、この核酸分子は発現制御配列と機能的に関連している。
【００２７】
第１１の局面において、本発明は、
ａ）ＧＤＦ−９ポリペプチドまたはその機能的なフラグメントもしくは変異体を含むサブユニットを有するホモ２量体ポリペプチドの存在下もしくは非存在下の、ＧＤＦ−９Ｂまたはその機能的なフラグメントもしくは変異体を含むサブユニットを有するホモ２量体ポリペプチド；
ｂ）ＧＤＦ−９ＢおよびＧＤＦ−９ポリペプチド、またはＧＤＦ−９ＢもしくはＧＤＦ−９ポリペプチドの機能的なフラグメントもしくは変異体を含むサブユニットを有するヘテロ２量体ポリペプチド；
からなる群から選択される因子を、補助的な性腺刺激ホルモン（例えば、ＦＳＨおよび／またはＬＨ）ならびに／あるいは他の卵巣成長因子（例えば、ＩＧＦ−１、ｋｉｔリガンド（幹細胞因子）、表皮増殖因子またはＴＧＦβスーパーファミリー（すなわち、アゴニストもしくはアンタゴニスト）のメンバー）の存在下、または非存在下での、
１）インビボまたはインビトロのいずれかでの、哺乳動物または他の脊椎動物の卵巣中の卵胞成長を改変する、
あるいは
２）単離した卵巣細胞の成長／成熟（例えば、卵母細胞−卵丘細胞および／もしくは顆粒膜細胞）をインビトロで改変する
ための使用を提供する。
【００２８】
さらに第１２の局面において、本発明は、
ａ）ＧＤＦ−９ポリペプチドまたはその機能的なフラグメントもしくは変異体を含むサブユニットを有するホモ２量体ポリペプチドの存在下もしくは非存在下の、ＧＤＦ−９Ｂまたはその機能的なフラグメントもしくは変異体を含むサブユニットを有するホモ２量体ポリペプチド；
ｂ）ＧＤＦ−９ＢおよびＧＤＦ−９ポリペプチド、またはＧＤＦ−９ＢもしくはＧＤＦ−９ポリペプチドの機能的なフラグメントもしくは変異体を含むサブユニットを有するヘテロ２量体ポリペプチド；
からなる群から選択される因子を有効量で、製薬学的にまたは獣医学的に許容されるキャリア（アジュバントを含む）または希釈剤と共に含む組成物を提供し、これは、場合により補助的な性腺刺激ホルモンおよび／または他の関連する卵巣成長因子アゴニスト／アンタゴニストを含む。
【００２９】
第１３の局面において、本発明は、雌性哺乳動物または他の雌性脊椎動物における卵巣卵胞成長をインビボで変更する方法を提供し、この方法は哺乳動物および他の脊椎動物卵巣宿主細胞をＧＤＦ−９ＢおよびＧＤＦ−９発現カセットで形質転換して、ＧＤＦ−９Ｂホモ２量体およびＧＤＦ−９Ｂ／ＧＤＦ−９ヘテロ２量体の過剰発現を可能とする工程を包含する。
【００３０】
第１４の局面において、本発明は、インビトロで雌性哺乳動物または他の雌性脊椎動物における卵巣卵胞成長を変更する方法を提供し、この方法は哺乳動物および他の脊椎動物卵巣宿主細胞をＧＤＦ−９ＢおよびＧＤＦ−９発現カセットで形質転換して、ＧＤＦ−９Ｂホモ２量体およびＧＤＦ−９Ｂ／ＧＤＦ−９ヘテロ２量体の過剰発現を可能とする工程を包含する。
【００３１】
さらなる局面に従い、本発明は、配列番号１１、配列番号１３および配列番号１５あるいはこれらの配列の変異体の機能的なフラグメントからなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸分子を提供する。
【００３２】
さらなる局面に従い、本発明は、配列番号１２および配列番号１６あるいはこれらの配列の機能的なフラグメントまたは変異体からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドを提供する。
【００３３】
別の局面に従って、本発明は、卵胞成長を変更する方法を提供し、この方法は、請求項９−１５のいずれかひとつに記載のリガンドを導入して、
ｉ）インビボまたはインビトロのいずれかで哺乳動物または他の脊椎動物の卵巣中の卵胞の成長を変更する、あるいは
ｉｉ）単離された卵巣細胞の成長／成熟をインビトロで変更する
工程を含む。
【００３４】
好ましくは、哺乳動物は、ヒツジ、ウシ、ヤギ、シカ、ブタ、ヒト、ウマ、ラクダよびフクロネズミ、ネコおよびイヌ、ならびに本発明のＧＤＦ−９Ｂ配列と実質的な同一性を有するＧＤＦ−９Ｂ遺伝子を有する他の商業的に重要な種からなる群から選択される。好ましくは、脊椎動物は、ニワトリ、アヒル、ガチョウ、サケならびに本発明のＧＤＦ−９Ｂ配列と実質的な同一性を有する他の商業的に重要な種からなる群から選択される。
【００３５】
発明の詳細な説明
上記のように、本発明の主な目的は、ＧＤＦ−９Ｂホモ２量体およびＧＤＦ−９Ｂ／ＧＤＦ−９ヘテロ２量体活性を介してのインビボおよびインビトロでの卵巣卵胞成長の調節である。
【００３６】
用語「単離された」とは、天然において核酸が存在する細胞または器官中の莢雑配列から実質的に分離または精製されていることを意味し、これには標準的な精製技術により精製された核酸および組換え技術（ＰＣＲ技術を含む）により調製された核酸ならびに化学的に合成されたものが含まれる。
【００３７】
好ましくは、配列番号１の核酸分子はヒツジゲノムＤＮＡから単離されており、配列番号３および配列番号５の核酸分子はＩｎｖｅｒｄａｌｅまたはＨａｎｎａ表現型を発現するヒツジのＤＮＡから単離されている。
【００３８】
多形性がヒツジにおけるＧＤＦ−９Ｂのシグナルペプチド（配列番号７、配列番号８）中で生じうることが認められた。推定シグナル配列は、おそらく、Ｓｉｇｎａｌ　Ｐプログラム（ｈｔｔｐ：／／ｇｅｎｏｍｅ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＳｉｇｎａｌＰのＳｉｇｎａｌ　Ｐ　Ｖ１．１サーバー）（Ｎｅｉｌｓｅｎら、１９９７）を用いて推定されるように、配列番号７および配列番号８中ＡＴＧ（Ｍｅｔ）〜ＡＣＡ（Ｔｈｒ）の、約２５アミノ酸長であると思われる。２つのＣＴＴ配列のうちの１つが存在しない３塩基対欠失が観察されたヒツジもいる。それゆえ、ほとんどは全長を有するが、より短いシグナル配列を有するヒツジもいる。ＩｎｖｅｒｄａｌｅもしくはＨａｎｎａに関連しているか、または関連していないかのいずれかである、Ｈａｎｎａ、Ｈａｎｎａ×Ｉｎｖｅｒｄａｌｅ、Ｉｎｖｅｒｄａｌｅおよび野生型ヒツジの研究から、２つのＣＴＴに関してはほとんどはホモ接合体であったが、１つのＣＴＴに関してはヘテロ接合体であるものもいた。より短いバージョンのシグナルペプチドへの偏りは、ヒツジのメリノ種中では高いが、ロメニ種中では低いことが見出された。このことは、多形性が品種と関連するかもしれないことを示す。ほとんどのロメニヒツジは、ＩｎｖｅｒｄａｌｅまたはＨａｎｎａに関するキャリア状態にかかわらず、より長いシグナルペプチドを有していた。この多形性が認められることは必要であるが、このことは、本発明においてなされる特許請求の範囲に影響を与えず、またこれを変更することもない。
【００３９】
また、さらなる「インフレーム」ＡＴＧ開始コドンがＧＤＦ−９Ｂ　ＡＴＧ開始コドンから２７ヌクレオチド上流のヒツジゲノムＤＮＡ配列（配列番号９、配列番号１０）中に存在することも認められた。この配列は、野生型、ＩｎｖｅｒｄａｌｅまたはＨａｎｎａキャリアのいずれかであるにかかわらず、全ての配列決定されたヒツジ中に存在し、明らかにＩｎｖｅｒｄａｌｅおよびＨａｎｎａ変異とは関係ない。この上流の開始コドンがヒツジにおいてタンパク質翻訳の間に使用されるかどうかは知られていない（配列番号９、配列番号１０）。もし、使用されているならば、さらに９アミノ酸のシグナル配列が生じるだろう。ヒツジおよび他の哺乳動物のＧＤＦ−９Ｂタンパク質におけるこのような差異は、分子のこの部分は活性成熟型ＧＤＦ−９Ｂでは取り除かれているので成熟型タンパク質の機能にはおそらく影響を与えないが、本発明者らはヒツジ中に存在し得る別のタンパク質翻訳開始部位の可能性について言及しておく。シグナルペプチド推定プログラム（Ｎｅｉｌｓｅｎら、１９９７）は、このさらなる９アミノ酸配列がシグナルペプチドとして機能し得、シグナルペプチドの適当な末端部位が、配列番号７および配列番号８に記載のＴｈｒ（Ｔ）アミノ酸でもありうることを示している。
【００４０】
さらなる局面において、本発明は、配列番号２、配列番号４および配列番号６に記載のアミノ酸配列ならびにそれらの機能的変異体から選択される単離されたポリペプチドを提供し、これらは雌性哺乳動物における卵巣卵胞成長を操作するように機能する。
【００４１】
ポリペプチドは、本発明の核酸分子またはその機能的変異体を含む適切なベクターの適切な宿主細胞中での発現により作製され得ることが当業者に理解されるであろう。
【００４２】
本明細書中で使用する用語「変異体」は、ヌクレオチドおよびポリペプチド配列を意味し、ここでヌクレオチドまたはアミノ酸配列は、それぞれ、配列番号１〜６のヌクレオチドまたはアミノ酸配列と実質的に５０％以上のホモロジー、好ましくは、本発明の配列と７５％のホモロジーおよび最も好ましくは９０〜９５％のホモロジーを示す。ただし、この変異体は、本明細書中に規定の生物学的活性を有する。変異体は、１つ以上のヌクレオチドまたはアミノ酸の挿入、置換または欠失のような修飾による天然のヌクレオチドまたはアミノ酸配列の修飾により生じるか、または天然に存在する変異体であり得る。また、用語「変異体」は、当業者に良く知られている標準的または好ましいストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で本発明の配列にハイブリダイズする相同配列を含む。代表的に使用されるインサイチュハイブリダイゼーション手順の例は、（Ｔｉｓｄａｌｌら、１９９９）；（Ｊｕｅｎｇｅｌら、２０００）に記載されている。このような変異体が望ましい場合、ネイティブなＤＮＡのヌクレオチド配列は適切に改変される。この改変は、ＤＮＡの選択的合成を介して、または、例えば、部位特異的もしくはカセット変異誘発による天然のＤＮＡの修飾により行われ得る。好ましくは、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡの一部が配列の修飾を必要とする場合、当該分野において標準的な技術を使用して、部位特異的プライマー指向性突然変異誘発が使用される。
【００４３】
核酸の「フラグメント」とは全長よりは短い核酸の一部であり、少なくとも、以下に記載するストリンジェントな条件下で本発明の核酸分子と特異的にハイブリダイズし得る最小配列、またはそれに相補的な配列である。ポリペプチドの「フラグメント」とは、全長よりは短いが、本明細書中に記載の生物学的な活性ををなお保持しているポリペプチドの一部である。
【００４４】
用語「生物学的に活性な」とは、哺乳動物または他の脊椎動物の卵巣または卵巣細胞にはっきりと生理学的効果を誘発し得る本発明のポリペプチドを意味する。生理学的効果は、トリチル化チミジンの顆粒膜細胞への組込みのようなアッセイにより測定され得る。このようなアッセイの１例では、卵胞膜および卵母細胞卵丘複合体（卵子卵丘複合体）から単離された卵巣間質および顆粒膜細胞から卵胞（１〜２．５ｍｍ直径）を切り出す。細胞を洗浄し、バイオアッセイ用に１ウェルあたり最終濃度１００，０００生存細胞で新鮮な培地中に再懸濁し、ポリペプチド存在下または非存在下で４８時間インキュベートする。この時点でトリチル化チミジンの組込みを測定する。
【００４５】
用語「タンパク質（またはポリペプチド）」とは、本発明の核酸分子によりコードされるタンパク質を意味し、これには同一の生物学的活性、すなわち、卵巣操作活性を有するフラグメント、変異体およびホモログが含まれる。本発明のポリペプチドは、天然の供給源から単離され、組換え核酸分子の発現により作製され、または化学的に合成され得る。
【００４６】
用語「リガンド」とは、ポリペプチドまたはペプチドのような別の分子に結合し得る任意の分子を意味し、抗体、細胞表面レセプターまたはファージディスプレイ分子を含むがこれらに限定されるわけではないと扱われるべきである。
【００４７】
さらに、本発明のヌクレオチドおよびアミノ酸配列と実質的な同一性を有するヌクレオチドおよびペプチドもまた、好ましい実施態様で利用され得る。ここで、「実質的な同一性」とは、２つの配列を、デフォルトギャップウェイト（ｄｅｆａｕｌｔ ｇａｐ ｗｅｉｇｈｔ）を用いるＧＡＰまたはＢＥＳＴＦＩＴ（ペプチド）のようなプログラムにより適当に整列させた場合、またはＢＬＡＳＴＸまたはＢＬＡＳＴＰのようなコンピューターアルゴリズムにより測定した場合に、少なくとも５０％、好ましくは７５％、最も好ましくは９０〜９５％の配列同一性を共有することを意味する。同一ではない残基の位置は保存的アミノ酸置換により異なっていることが好ましい。例えば、類似する化学特性（例えば、電荷または極性）を有するアミノ酸の置換は、おそらくタンパク質の特性に影響を与えない。非限定的な例としては、アスパラギンの代わりのグルタミンまたはアスパラギン酸の代わりのグルタミン酸が挙げられる。
【００４８】
さらなる局面において、本発明は、本発明のポリペプチドまたはペプチドを製造する際の使用に適した複製可能な移入ベクターとして提供される。これらのベクターは、当該分野において周知の技術に従って構築するか、または当該分野において利用可能なクローニングベクターから選択することができる。
【００４９】
クローニングベクターは、使用される宿主または宿主細胞に応じて選択することができる。有用なベクターは、一般的に以下の特性を有する。
（ａ）自己複製能力；
（ｂ）任意の特定の制限エンドヌクレアーゼに対して１つの標的を有すること；および
（ｃ）望ましくは、抗生物質耐性のような簡単な選択マーカーに関する保有遺伝子。
【００５０】
これらの特性を有する２つの主なタイプのベクターは、プラスミドおよび細菌ウィルス（バクテリオファージまたはファージ）である。現在好ましいベクターとしては、細菌、昆虫、または哺乳動物ベクターがあり、これらには以下のものが挙げられ得る。ｐＵＣ、ｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔ、ｐＧＥＭ、ＰＧＥＸ、ｐＢＫ−ＣＭＶ、λＺＡＰ、λＧＥＭ、ｐＥＦＩＲＥＳ−Ｐ、ｐＵＢ６／Ｖ５／Ｈｉｓ、ｐＢＣｌ、ｐＡＤＴｒａｃｋ−ＣＭＶ、ｐＡｄｅｎｏｖａｔｏｒ、ｐＡｄＥａｓｙ−１、ｐＳＦＶ−ＰＤ、ｐＣＡ３、ｐＢＡＢＥ、ｐＰＩＣ９、ｐＡ０８１５、ｐＥＴおよびｐＳＰシリーズ。しかしながら、このリストは本発明の範囲を制限するものと理解されるべきではない。
【００５１】
好ましい発現システムの例は、以下の通りである。
１．インビトロ細胞発現系に関しては、ピューロマイシン耐性を付与するｐＥＦＩＲＥＳ−Ｐベクター（Ｈｏｂｂｓ Ｓ．ら、１９９８）を有する２９３Ｔ細胞系が使用され得る。２つの遺伝子の同時発現に関しては、上述のベクターを、抗生物質耐性遺伝子をブレオマイシン耐性に変更することができる。あるいは、２つの遺伝子および選択遺伝子の同時発現は、トリシス性（ｔｒｉｃｉｓｔｒｏｎｉｃ）発現ベクターを構築することにより達成され得る。対応する安定にトランスフェクトされた昆虫細胞系（例えば、「ＤＥＳ」ベクター発現系を使用するＳ２細胞系；ｗｗｗ．ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ．ｃｏｍ）もまた、使用し得る。
【００５２】
２．トランスジェニック動物の全組織でのＧＤＦの発現に関して、ｐＵＢ６／Ｖ５−Ｈｉｓ　Ａベクター（ｗｗｗ．ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ．ｃｏｍ）を使用して構築物を作製するアプローチがある。組織特異的な発現に関しては、肝臓および腎臓での発現のためのラットＰＥＰＣＫ０．６ｋｂプロモーターは、ｐＵＢ６／Ｖ５−Ｈｉｓ　Ａベクター中のＵｂｉ−ＣプロモーターをＰＥＰＣＫプロモーターでおきかえることにより、構築物中に包含させることができる。乳房組織中でのＧＤＦ発現に関しては、別のプロモーター系が好ましい。この組織に関しては、ウシβ−ラクトグロブリン遺伝子プロモーターおよび／またはウシαＳ１カゼインプロモーター（例えば、ｐＢＣ１ベクター、ｗｗｗ．ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ．ｃｏｍ）を使用してＧＤＦの乳の中への発現を駆動するアプローチがある。トランスジェニック動物中での全体的な過剰発現に関しては、ＣＭＶ強化β−アクチンプロモーター（Ｏｋａｂｅ　Ｍ．ら；ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔｅｒｓ　４０７：３１３〜３１９、１９９７）または改変型ＥＦ１α−プロモーターもまた、使用し得る（Ｔａｂｏｉｔ−Ｄａｍｅｒｏｎ　Ｆ．ら、Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　８：２２３〜２３５、１９９８）。
【００５３】
アデノウィルス、レトロウィルスおよびアルファウィルスは他の適切な哺乳動物発現系である。当業者にとって代表的なアプローチは、（ＴＣ　Ｈｅら、１９９８）に記載されている。ＧＤＦ発現に関しては、ｐＡｄ　Ｔｒａｃｋ−ＣＭＶベクターまたはｐＡｄｅｎｏｖａｔｏｒベクター（ｗｗｗ．ｑｂｉｏｇｅｎｅ．ｃｏｍ）を使用して構築物を作製し、次いでｐＡｄ　Ｅａｓｙ−１アデノウィルスプラスミドを大腸菌に同時形質転換して、ＣＭＶ−プロモーター駆動性ＧＤＦ発現カセットを有する組換えアデノウィルスゲノムを作製する。次いで、この組換えアデノウィルスゲノムを２９３Ｔ細胞にトランスフェクトしてウィルスストックを作製する。アデノウィルスを作製するための別の方法もまた、同一の目的のために使用され得る（例えば、ＰＣＡ３プラスミドに基づく遺伝子移入（ｗｗｗ．ｍｉｃｒｏｂｉｘ．ｃｏｍ）またはＣＯＳ−ＴＰＣ方法（Ｍｉｙａｋｅ　Ｓ．ら、１９９６）。
【００５４】
３．ＧＤＦを発現する、非細胞病原性のセムリキ森林ウィルスを、例えば、ｐＳＦＶ−ＰＤベクターを用いて、Ｌｕｎｄｓｔｒｏｍら、Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ　１１５：８３〜９１，２００１に記載されるように作製することができる。さらに、例えば、ｐＢＡＢＥベクターに基づくレトロウィルス発現系は、哺乳動物細胞中においてＧＤＦを発現させるために使用することができる（Ｍｏｒｇｅｎｓｔｅｒｎ，ＪＰおよびＬａｎｄ，Ｈ，１９９０；Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ　１８：３５８７〜３５９６）。
【００５５】
４．酵母細胞（例えば、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ　ｐａｓｔｏｒｉｓ）、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ））は、当業者にとって非常に良く確立されている別の発現系である（Ｃ　Ｈａｄｆｉｅｌｄら、１９９３）；（ＭＡ　Ｒｏｍａｎｏｓら、１９９２）。例えば、ｐＰＩＣ９ベクター（ｗｗｗ．ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ．ｃｏｍ）を、ピキア・パストリス中でＧＤＦの発現のために使用することができる。２つの遺伝子の同時発現に関しては、ベクターｐＡ０８１５（ｗｗｗ．ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ．ｃｏｍ）が好ましい候補である。
【００５６】
５．大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）は、広範な用途における標準的な実験用発現系である。例えば、ｐＥＴ発現系（ｗｗｗ．ｎｏｖａｇｅｎ．ｃｏｍ）を使用して組換え哺乳動物ＧＤＦ−９およびＧＤＦ−９Ｂ（ｓｔｅｖｅ．ｌａｗｒｅｎｃｅ＠ａｇｒｅｓｅａｒｃｈ．ｃｏ．ｎｚ）を発現させることができる。
【００５７】
本発明のＤＮＡ分子は、複製可能な発現ベクター中に適切な制御配列と共に作動可能な連結で配置することにより、発現することができる。制御配列とは、特に、複製起点、プロモーター、エンハンサーおよび転写終結配列を含み得る。発現ベクター中に含まれる制御配列の選択は、ＤＮＡを発現するために使用される宿主または宿主細胞のタイプに依存することを、当業者は理解する。
【００５８】
本発明に有用な発現ベクターは、発現されるＤＮＡ配列またはフラグメントに操作可能に連結された少なくとも１つの発現制御配列を含み得る。クローニングしたＤＮＡ配列の発現を制御および調節するために、制御配列をベクター中に挿入する。有用な発現制御配列の例は、ｌａｃ系、ｔｒｐ系、ｔａｃ系、ｔｒｃ系、ファージλの主なオペレーターおよびプロモーター領域、酵母酸フォスファターゼの糖分解性プロモーター（例えば、Ｐｈｏ５）、酵母α−接合因子のプロモーター、ならびにポリオーマ、アデノウィルス、レトロウィルスおよびサルウィルスに由来するプロモーター、ならびにサイトメガロウィルス（例えば、ＳＶ４０の初期および後期プロモーター）ならびに原核生物および真核生物細胞の遺伝子の発現を制御するために公知である他の配列、ならびにそれらのウィルスまたは組合わせ、である。
【００５９】
ベクターの構築に関しては、外来性ＤＮＡを組込んでいるベクターを保有する細菌クローンを同定できることもまた、利点である。このようなアッセイとしては、はっきりとした色の変化、抗生物質耐性などが挙げられる。ある好ましいベクターでは、β−ガラクトシダーゼ遺伝子が使用され、この遺伝子はＸ−ｇａｌプレート上で青色の表現型を示すクローンにより検出可能である。これにより選択が容易になる。一旦選択したら、標準的な手段を用いて培養物からベクターを単離することができる。
【００６０】
用いた宿主に応じて、そのような細胞に適した標準的な技術に従って、形質転換およびトランスフェクションを行う。実質的な細胞壁を有する原核生物または他の細胞に関しては、カルシウム処理方法（Ｃｏｈｅｎ，Ｓ．Ｎ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ，Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｆ　Ｓｃｉｅｎｃｅ，ＵＳＡ　６９　２１１０（１９７２））が利用され得る。このような細胞壁を有さない哺乳動物細胞に関しては、ＧｒａｅｍｅおよびＶａｎ　Ｄｅｒ　Ｅｂ，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　５２：５４６（１９７８）のリン酸カルシウム沈殿法、またはリポソーム試薬が好ましい。
【００６１】
選択した宿主を適切なベクターで形質転換すると、宿主細胞を培養することによりコードされているポリペプチドが、しばしば、融合タンパク質の形態で産生され得る。本発明のポリペプチドは、上記のような迅速なアッセイにより検出することができる。次いで、ポリペプチドを回収し、必要な場合には精製する。回収および精製は、当該分野において公知の任意の手順を使用して（例えば、アニオン交換樹脂への吸着および溶離により）達成され得る。本発明のポリペプチドを作製する方法は、本発明のさらなる局面を構成する。
【００６２】
本発明のベクターで形質転換した、トランスフェクトした、または感染させた宿主細胞（動物宿主全体を含む）もまた、本発明のさらなる局面を形成する。
【００６３】
さらに、本発明のさらなる局面は、本発明のポリペプチドまたはペプチドに結合する抗体、抗体フラグメント、単独の細胞表面レセプターまたは複合型細胞表面レセプターまたはファージディスプレイ分子を提供する。ポリペプチドまたはペプチドは、１量体、２量体、ヘテロ２量体、マルチマーまたはそれらの変異体として存在し得る。
【００６４】
より具体的には、本発明は、１量体またはホモ２量体、またはＧＤＦ−９との組み合わせでのヘテロ２量体として、野生型（配列番号２）または変異型（配列番号４および配列番号６）のＧＤＦ−９Ｂポリペプチド配列に対する抗体を産生する方法を提供する。抗体は、野生型内在性タンパク質、ペプチドフラグメントおよび発現組換えタンパク質、またはペプチドフラグメントの特徴付けのため、およびインビボでの卵巣卵胞成長の調節のためにレシピエント哺乳動物の受動免疫化のために使用され得る。
【００６５】
本発明のさらなる局面が、他のＧＤＦ−９Ｂ様ペプチドの検出のための抗血清の製造の際での本発明のポリペプチドの使用を意図していることは、本明細書から明らかである。
【００６６】
ポリクローナル抗体は、（Ｋｏｅｌｌｅら、１９９１）（これは、本明細書中に参照してくみこむ）により使用される方法に従って製造され得る。有用な抗体産生プロトコルは、米国特許第５，５１４，５７８号に概説されている。当該分野において公知の方法によりモノクローナル抗体を製造することができる。これらの方法としては、（ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ，１９７５）により記載される免疫学的方法、ならびに（Ｈｕｓｅら、１９８９）により記載される組換えＤＮＡ法が挙げられる。
【００６７】
さらなる実施態様において、本発明は、培養中の細胞および／またはトランスジェニック動物における卵巣卵胞成長を操作する方法を提供する。ＧＤＦ−９Ｂホモ２量体およびＧＤＦ−９Ｂ／ＧＤＦ−９へテロ２量体の過剰発現により、培養細胞またはトランスジェニック動物において、特異的な卵巣卵胞タンパク質遺伝子の発現のタイミングおよびレベルが変更され得る。例えば、ＧＤＦ−９Ｂホモ２量体またはＧＤＦ−９Ｂ／ＧＤＦ−９へテロ２量体をコードする配列を遺伝子カセット内に、特異的なプロモーターまたは全ての細胞タイプにおいて発現するプロモーター（以下の実施例を参照のこと）（構成性発現）の制御下に挿入し得る。また、このカセットはｍＲＮＡを安定化し得る３’隣接ＤＮＡを含み、場合により下流の調節配列を含んでもよい。このＤＮＡカセットはＤＮＡの卵前核中へのマイクロインジェクションにより、哺乳動物のゲノム中へと導入され得（Ｌ　Ｈｕｉｌｌｉｅｒら、１９９６に記載）、続いて、これはレシピエント動物へと戻されて出産まで成長させられる。このトランスジェニック動物を作製する技術は、（Ｈｏｇａｎら、１９９６）に記載されている。トランスジェニック動物は胚、胎児、または成体組織由来の培養細胞のトランスフェクション、続いて核移入およびレシピエント動物への胚移入により作製され得る。あるいは、遺伝子カセットは哺乳動物精子へと連結され、インビトロまたはインビボでの受精を介して卵へと送達されて非ヒトトランスジェニック動物を生じ得る。発達調節またはＧＤＦ−９Ｂホモ２量体またはＧＤＦ−９Ｂ／ＧＤＦ−９ヘテロ２量体の発現のレベルの操作を使用して、卵巣卵胞タンパク質合成または産生のレベルを変更し得る。
【００６８】
また、本発明は、卵巣卵胞タンパク質合成または産生を操作するために細胞培養物、器官培養物および実験動物全体においてＧＤＦ−９ＢおよびＧＤＦ−９／ＧＤＦ−９Ｂを発現させるためのアデノウィルスベースの遺伝子治療技術を含む。
【００６９】
ここで、本発明を例示する非限定的な実施例を提供する。上記の説明は単なる例示のために提供されたものであり、用いられる物質および技術の両方において、当該分野において公知である変更が行われ得ることが意図されている。
【００７０】
実施例
実施例１
野生型ヒツジＧＤＦ−９Ｂ　ＤＮＡの単離および変異型ヒツジＧＤＦ−９Ｂ　ＤＮＡ配列の同定
配列決定用ヒツジＧＤＦ−９Ｂ遺伝子のフラグメントを得るため、本発明者らが予めクローニングしたヒト／マウス／ラットＧＤＦ−９Ｂ配列由来のオリゴヌクレオチドプライマーの異なる組み合わせを、ゲノムヒツジＤＮＡでのＰＣＲに使用した。整列した（アレイド）ライブラリーから野生型ヒツジゲノムクローンを得るため、および野生型ヒツジ卵巣ｃＤＮＡからｃＤＮＡ配列を得るために機能的なプライマー対を使用した。ＩｎｖｅｒｄａｌｅおよびＨａｎｎａの全コード領域からの配列を、個々のゲノムＤＮＡから得た関連するＰＣＲフラグメントを配列決定することにより得た。野生型ＧＤＦ−９Ｂ配列は、本出願に配列番号１として開示されており、Ｉｎｖｅｒｄａｌｅは配列番号３そしてＨａｎｎａは配列番号５として開示されている。
【００７１】
実施例２
特異抗体の産生ならびに哺乳動物卵巣中での天然のホモ２量体ＧＤＦ−９Ｂおよびヘテロ２量体ＧＤＦ−９Ｂ／ＧＤＦ−９タンパク質の証明
哺乳動物または鳥を免疫感作するための抗原は、本発明において配列番号１、配列番号３および配列番号５に開示されるヌクレオチド配列またそれらの変異体を、大腸菌中でのタンパク質の発現を可能にする発現制御配列とともに機能的に関連付けて使用することにより作製する。なお、別のアプローチとしては、配列番号２、配列番号４、配列番号６またはそれらの変異体由来の特異的なペプチド配列に対する抗ペプチド抗体を作製する。免疫反応性を標準的な方法（例えば、ＥＬＩＳＡ）により評価し、および／または天然の供給源および個々の組換えタンパク質を過剰発現する細胞／組織からＧＤＦ−９Ｂホモ２量体およびＧＤＦ−９Ｂ／ＧＤＦ−９タンパク質へテロ２量体を認識する特異的なＩｇＧを得ることができる。
【００７２】
本発明者らのグループによるこれまでの証拠（例えば、Ａａｌｔｏｎｅｎら（１９９９）およびＪａａｔｉｎｅｎら、１９９９）は、げっ歯類および霊長類中の前胞状卵胞（ｐｒｅａｎｔｒａｌ　ｆｏｌｌｉｃｌｅｓ）の卵母細胞においてＧＤＦ−９のｍＲＮＡおよびタンパク質の存在を示している。ここで、本発明者らは、ヒツジ卵巣におけるＧＤＦ−９Ｂタンパク質の存在に関して、マウス抗体を用いる免疫細胞化学により証拠を示す（図９）。免疫組織化学方法は、Ｔｉｓｄａｌｌら（１９９９）（Ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌ　ｆａｃｔｏｒ　ａｎｄ　ｃ−ｋｉｔ　ｇｅｎｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ａｎｄ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｌｏｃａｌｉｓａｔｉｏｎ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｓｈｅｅｐ　ｏｖａｒｙ　ｄｕｒｉｎｇ　ｆｅｔａｌ　ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，Ｊ　Ｒｅｐｒｏｄ　Ｆｅｒｔ　１１６：２７７−２９１）に記載される方法と類似していた。異なる点は、本発明の実験はチラミド（ｔｙｒａｍｉｄｅ）シグナル増幅工程も含むという点のみである（ＴＳＡビオチンシステム，ＮＥＮ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）。大腸菌由来の成熟ヒツジＧＤＦ−９Ｂペプチド（０．２ｍｇ）をフロイント完全アジュバント（ＦＣＡ）中で腹膜内（ｉ．ｐ．）に注射し、２週間の間隔で抗原を０．１ｍｇ、ｉ．ｐ．で、続いて抗原０．０５ｍｇをＳｐａｎ／Ｔｗｅｅｎ／油混合物中で追加免疫し、最終的な追加免疫の１週間後に屠殺して血清を回収して、マウス抗体Ｍ１０を作製した。
【００７３】
総括すると、これらおよび他のデータは、ＧＤＦ−９およびＧＤＦ−９Ｂに関するｍＲＮＡおよびタンパク質の両方が哺乳動物の卵母細胞中に存在することを示す（Ａａｌｔｏｎｅｎら、１９９９；Ｇａｌｌｏｗａｙら、２０００）。
【００７４】
特定のペプチド配列に対する抗ペプチド抗体が哺乳動物卵巣活性に影響を与えるという証拠を表１に示す。
【００７５】
表１：ＧＤＦ−９Ｂペプチドに結合したカサガイヘモシアニン（ＫＬＨ）に対する抗体を含む血漿投与後のヒツジの排卵速度
【表１】
2004503236.tif 000002
【００７６】
本研究では、雌性ヒツジ１０匹は、プロスタグランジンＦ２α（Ｅｓｔｒｕｍａｔｅ、１２５μｇ、ｉ．ｍ．）を用いて発情（すなわち、卵巣の）周期を同期化させた。全ての動物が、精管切除した雄ヒツジとマーキング（ｍａｒｋｉｎｇ）した後に同期化した発情期を示すことを観察した。続いての黄体期の５日目に、５匹の雌ヒツジに、カサガイヘモシアニン（ＫＬＨ）に結合させた１５マーのＧＤＦ−９Ｂペプチドを用いて７ヶ月間、毎月連続して免疫化した別の雌ヒツジ群由来のプールした血漿を投与した。プールした血清は、全長大腸菌発現型ＧＤＦ−９Ｂを抗原として用いるＥＬＩＳＡアッセイにより評価した場合に、ＧＤＦ−９Ｂに対する高力価の抗体を含んだ。他の５匹の雌ヒツジには、７ヶ月間、毎月連続して免疫化した集団群の雌ヒツジから回収した、ＫＬＨに対するプールした血漿を投与した。これらの動物からプールした血漿には検出可能なＧＤＦ−９Ｂ抗体は含有されていなかった。
【００７７】
ヒツジ血漿を１：５００００に希釈した後に、抗体レベルをＥＬＩＳＡ方法により測定した。ＥＬＩＳＡ方法は、９６ウェルプレートを１００ｎｇ／ウェルの大腸菌発現型全長ＧＤＦ−９Ｂでコーティングすること、ならびに処理の適切なブロックおよび連続的な洗浄の後に希釈ヒツジ血清１００μｌおよびアッセイ緩衝液１００μｌとインキュベーションする工程を含んでいた。ヒツジ血清でのインキュベーションおよび数回の洗浄の後、ウサギ抗ヒツジＨＲＰを３７℃で１時間、加えた。次いで、ウェルを洗浄し、ｏ−フェニレンジアミン＋過酸化水素を用いて発色させ、硫酸を用いて発色を停止した。
【００７８】
各雌ヒツジに、滅菌血漿１００ｍｌを静脈内に投与し、４日後に２回目のプロスタグランジンＦ２α注射を投与して発情期を同期化した。排卵ラットを、血漿投与後１４日目に腹腔鏡により試験した。
【００７９】
本発明者らの先の特許である第５００８４４号では、マウスを大腸菌由来成熟ヒツジＧＤＦ−９Ｂで免疫化した際に、動物における卵巣卵胞発達が顕著にかく乱されることを示した。この研究では、フロイント完全アジュバント（ＦＣＡ）（０．２ｍｌ）中大腸菌由来成熟ヒツジＧＤＦ−９Ｂタンパク質（０．２ｍｌ）を用いて１０匹の雌マウスを腹膜内（ｉ．ｐ．）で免疫し、別の１０匹の雌マウスをＦＣＡ（０．２２ｍｌ）中ウシαラクトアルブミン（０．２ｍｇ）を用いてｉ．ｐ．で免疫してコントロールとして使用した。続いて、適切な抗原の３回の追加免疫注射（最初の追加免疫は０．１ｍｇ、２回目及び３回目の追加免疫は０．０５ｍｇ）を２週間の間隔で、Ｓｐａｎ／Ｔｗｅｅｎ／油の混合物中で行い、最後の追加免疫の１週間後に動物を屠殺した。
【００８０】
これらのＧＤＦ−９Ｂ免疫化マウスに関し、これらの動物はＧＤＦ−９およびＧＤＦ−９Ｂ両方の成長因子に対し交差反応性抗体を有するので、これら両因子の外因性生物学的活性がおそらく影響を受けるであろうことの証拠をここに示す（図２）。
【００８１】
表２：ウシαラクトアルブミンまたはヒツジＧＤＦ−９Ｂでの免疫感作後のマウス血漿中の平均（±ｓ．ｅ．ｍ．）抗体レベル。提示した値は、４９０ｎｍでの吸光度を示し、これはＧＤＦ−９ＢまたはＧＤＦ−９に対する抗体のレベルを表す。
【表２】
2004503236.tif 000003
【００８２】
従って、本発明者らは外来性ＧＤＦ−９およびＧＤＦ−９Ｂの調節を導く方法は卵巣機能を変更すると断言する。
【００８３】
ホモ２量体ＤＧＦ−９Ｂ、またはホモ２量体の混合物もしくはへテロ２量体のいずれかとしてのＧＤＦ−９およびＧＤＦ−９Ｂの調節という本発明者らの特許請求を支持するさらなる証拠は、ヒツジ（処置群毎に３〜５匹）をＫＬＨ（コントロール）、ＫＬＨ結合ＧＤＦ−９Ｂペプチド、またはＫＬＨ結合ＧＤＦ−９ペプチドに対して免疫化した後の新規な知見により提供される。動物を７ヶ月間、毎月免疫化し、屠殺後に卵巣を回収し、その後に卵巣の体積および１型、１ａ型および２型の卵胞の数を標準的な形態学的手順により評価した（Ｓｍｉｔｈら、１９９７）。さらに、胞状卵胞の有無について記載した。これらの結果を表３にまとめる。
【００８４】
表３：ＫＬＨ、ＧＤＦ−９ＢペプチドまたはＧＤＦ−９ペプチドに結合したＫＬＨでのヒツジの免疫感作の後の、平均卵巣体積ならびに１〜２型、３〜４型および胞状卵胞の数。
【表３】
2004503236.tif 000004
【００８５】
これらの実験に関して、ＧＤＦ−９Ｂペプチド配列はＳＥＶＰＧＰＳＲＥＨＤＧＰＥＳＣ（配列番号１７）であり、ＧＤＦ−９ペプチド配列はＫＫＰＬＶＰＡＳＶＮＬＳＥＹＦＣ（配列番号１８）である。ロメニ種雌ヒツジに、フロイント完全アジュバント中でＫＬＨまたはＫＬＨ−ＧＤＦ−９ＢペプチドもしくはＫＬＨ−ＧＤＦ−９ペプチドを０．４ｍｇ／雌ヒツジで注射した。続いて、１ヶ月の間隔で６回、動物をさらなる抗原（Ｓｐａｎ／Ｔｗｅｅｎ／油の混合物中（ｓ．ｃ．））で追加免疫（毎回、０．２ｍｇ／雌ヒツジ）した。
【００８６】
結果を、コントロール（ＫＬＨ免疫化）と比較して示す。（１）ＧＤＦ−９−ＫＬＨおよびＧＤＦ−９Ｂ−ＫＬＨ免疫化は、それぞれ、ある哺乳動物においては胞状卵胞発達を阻害し、これはＧＤＦ−９およびＧＤＦ−９Ｂの両方が正常な卵胞発達に必須であることを示している。
【００８７】
実施例３
哺乳動物細胞中におけるインビトロおよびインビボでの組換えホモ２量体ＧＤＦ−９Ｂおよびヘテロ２量体ＧＤＦ−９Ｂ／ＧＤＦ−９タンパク質の発現
【００８８】
本発明において配列番号１、配列番号３および配列番号５として開示されるヌクレオチド配列、またはそれらの変異体を、発現制御配列（ＣＭＶ、ＥＦ１および哺乳動物特異的プロモーター配列）と機能的に関連して含むプラスミドベクター中に作製された発現構築物を哺乳動物細胞にトランスフェクト／または移入し、安定なクローンを抗生物質選択マーカーを用いて選択する。発現される組換えポリペプチド配列のプロセシングを最適化するために、フリンプロセシング部位を変異させ、生産細胞中のフリンプロテアーゼの過剰発現を駆動する補助発現カセットを導入する。
【００８９】
ｏＧＤＦ−９Ｂホモ２量体タンパク質を作製するための有効な哺乳動物発現系の例として、本発明者らはヒツジＧＤＦ−９Ｂ成熟領域配列（配列番号１および配列番号２）に縮合したラットＧＤＦ−９Ｂプロ領域（Ｊａａｔｉｎｅｎら、Ｍｏｌ　Ｃｅｌｌ　Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１５６：１８９−９３、１９９９）を含むｐＥＦＩＲＥＳ−Ｐベクターでトランスフェクトしたヒト２９３Ｔ細胞株を作製した。フリンプロセシング部位は、有効に切断されたＲＲＲＲ配列を含むように操作されている。ピューロマイシン１２０〜１５０μｇ／ｍｌに対して抵抗性であるように選択した細胞を、無血清条件下で４日間、ＨａｍＦ１２／ＤＭＥＭ中で培養し、ヒツジＧＤＦ−９Ｂを上清中に産生させ、ついで実施例４に記載のバイオアッセイに使用した。
【００９０】
ヒツジＧＤＦ−９ＢとＧＤＦ−９との天然のヘテロ２量体化の生化学的な証拠を得るために、以下のアプローチを使用した。上記の、類似するラット／ヒツジキメラＧＤＦ−９Ｂオープンリーディングフレーム（しかし、Ｃ−末端に８アミノ酸ＦＬＡＧエピトープを含む）を、ｐＳＦＶ−ＰＤセムリキ森林ウィルスベクターにクローニングし、ＳＦＶ−ＰＤ−ｏＧＤＦ−９Ｂ−ＦＬＡＧの高力価ウィルスストックを、Ｌｕｎｄｓｔｒｏｍら、Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ　１１５：８３〜９１，２００１に記載のようにＢＨＫ細胞中に作製した。高力価のＳＦＶ−ＰＤ−ｏＧＤＦ−９Ｂ−ＦＬＡＧウィルスは非常に効率良くヒト２９３Ｔ細胞に感染し、これらの細胞中でｏＧＤＦ−９Ｂ−ＦＬＡＧの高い発現を引き起こすことを見出した。感染後、４日間の培養の間に、プロセシングされたｏＧＤＦ−９Ｂ−ＦＬＡＧが培地中に分泌され、そしてこのタンパク質は抗−ＦＬＡＧ　Ｍ２抗体を用いるウェスタンブロット分析で１８ｋｄのバンドとして簡単に可視化された。ヒツジＧＤＦ−９Ｂ−ＦＬＡＧのヒツジＧＤＦ−９との同時発現に関しては、プレプロＧＤＦ−９ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを含有するｐＥＦＩＲＥＳ−Ｐベクターを用いて、別の２９３Ｔ細胞株を作製した。親２９３Ｔ細胞およびｏＧＤＦ−９を安定に発現する２９３Ｔ細胞を等量のＳＦＶ−ＰＤ−ｏＧＤＦ−９Ｂ−ＦＬＡＧウィルスで感染させ、４日間の培養後に上清を回収した。非感染細胞、およびＳＦＶ−ＰＤ−ｏＧＤＦ−９Ｂ−ＦＬＡＧ感染細胞からの上清１ｍｌを、１μｇ／ｍｌ抗ＦＬＡＧ−Ｍ２抗体での免疫沈降に供し、複合体をプロテインＧアガロースを用いて回収した。溶出液を、抗ＦＬＡＧ−Ｍ２抗体および抗ＧＤＦ−９抗体を用いてウェスタンブロットで評価した。抗ＦＬＡＧ　Ｍ２抗体はヒツジＧＤＦ−９と反応しないが、ＳＦＶ−ＰＤ−ｏＧＤＦ−９Ｂ−ＦＬＡＧウィルスで感染させたＧＤＦの発現細胞の上清中に免疫反応性ＧＤＦ−９成熟ペプチド（２０ｋｄ）が見出され、抗ＦＬＡＧ　Ｍ２抗体で免疫沈降した。これらの同時免疫沈降実験は、組換え発現させたヒツジＧＤＦ−９ＢおよびＧＤＦ−９の直接物理的相互作用を示し、これはヒツジＧＤＦ−９／ＧＤＦ−９ヘテロ２量体の存在を確認するものである。
【００９１】
組換えホモ２量体ＧＤＦ−９Ｂおよびヘテロ２量体ＧＤＦ−９Ｂ／ＧＤＦ−９タンパク質の全身的な投与を模倣するために、本発明において配列番号１、配列番号３および配列番号５として開示されるヌクレオチド配列またはそれらの変異体をトランスジェニック動物の卵巣外のいくつかの部位で過剰発現させる方法を記載する。関連するＧＤＦコード配列は、発現制御配列と機能的に関連して個別に発現されるかまたは同時に発現されるかのいずれかである。これらのトランスジェニック動物における卵巣卵胞成長に対するＧＤＦ−９Ｂホモ２量体およびＧＤＦ−９Ｂ／ＧＤＦ−９ヘテロ２量体の効果は、形態形成測定またはホルモンアッセイにより測定する。このアプローチは、トランスジェニック動物における排卵速度を変更するための一般的な方法を提供する。乳腺特異的過剰発現によるＧＤＦのミルク中への産生は、医薬または製薬用途のための大量の試薬の別の製造方法を提供する。この方法には、禁忌は観察されていないので、トランスジェニック動物の健康に対して有害なものではない。
【００９２】
組換えアデノウィルス中に、発現制御配列（ＣＭＶプロモーター）と機能的に関連した、配列番号１、配列番号３および配列番号５として本発明中に開示されるヌクレオチド配列またはその変異体から構成される発現カセットを、レシピエント細胞または器官培養物またはレシピエント動物に有効に移入してインビトロまたはインビボにおいて卵胞成長を改変する方法を記載する。例えば、この方法により、レシピエント動物の肝臓に特異的である（ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｎｇ）ＧＤＦ−９ＢおよびＧＤＦ−９発現カセット保有アデノウィルスでレシピエント哺乳動物を全身感染させ、これにより高レベルの肝臓特異的組換えタンパク質を循環中へと放出させることが可能となる。卵巣卵胞成長に対する効果は、腹腔鏡、形態形成測定またはホルモンアッセイのような、１つ以上の基準により評価され得る。ＧＤＦ−９ＢおよびＧＤＦ−９配列、ならびに転写単位の類似のインビボウィルス移入は、アルファウィルスまたはレトロウィルスを用いて達成され得る。これらのウィルスアプローチは、異なるＧＤＦ−９ＢおよびＧＤＦ−９遺伝子構築物の対生物活性をインビボで試験する方法を提供し、また、動物をＧＤＦ−９ＢおよびＧＤＦ−９に対して免疫感作する別の方法を提供する。
【００９３】
実施例４
卵巣細胞培養物中でのホモ２量体ＧＤＦ−９Ｂおよびヘテロ２量体ＧＤＦ−９Ｂ／ＧＤＦ−９タンパク質の生物学的活性の測定
本発明において配列番号１、配列番号３および配列番号５として開示されるヌクレオチド配列またはそれらの変異体から発現されたタンパク質の生物学的活性を評価するために、卵巣細胞および器官培養モデルを使用することができる。ホモ２量体ＧＤＦ−９Ｂの生物学的活性を評価する例を、以下の表４に示す（これは、部分的に精製した組換え（ｒ）ヒツジ（ｏ）ＧＤＦ−９Ｂ抽出物を、３７℃での４８時間のインキュベーションの間の、単離したヒツジ顆粒膜細胞による［３Ｈ］チミジンの取りこみの測定により評価する）。結果は、ｒｏＧＤＦ−９Ｂが、顆粒膜細胞によるトリチル化チミジンの取りこみに１．９倍の増加を引き起こしたことを示し、これは、ｒｏＧＤＦ−９Ｂが生物学的に活性であることを示す。顆粒膜細胞を得るために、卵巣を雌ヒツジから回収し、卵胞（１〜２．５ｍｍ直径）を切開して遊離させ、細胞を単離して卵胞膜および卵母細胞−卵丘複合体から分離させた。細胞を洗浄し、新しい培地中で、１ウェルあたり１×１０５生存細胞のバイオアッセイ最終濃度で再懸濁した。
【００９４】
表４：ｒｏＧＤＦ−９Ｂまたはコントロール培地に曝した後の、ヒツジ（ｏ）顆粒膜細胞への［３Ｈ］チミジン取りこみにおける平均±ｓ．ｅ．ｍ．の上昇（ｎ＝３回の個別の実験）。
【表４】
2004503236.tif 000005
【００９５】
トランスフェクトした２９３Ｔ細胞によりｒｏＧＤＦ−９Ｂを作製し、ヘパリン−セファロースクロマトグラフィーを用いて部分的に精製し、タンパク質を０．５Ｍ　ＮａＣｌで溶出させ、組織培養培地に対して一晩透析した。この実験に対するコントロールは、トランスフェクトしていない２９３Ｔ細胞に曝し、そしてヘパリン−セファロースクロマトグラフィー、ＮａＣｌ溶離および透析に供した培地であった。
＊＊＊Ｐ＜０．００１、ＡＮＯＶＡ。
【００９６】
考察
公知のヒトＧＤＦ−９Ｂ配列およびそれに由来するオリゴヌクレオチドプライマーにより、本発明者らは、ヒツジＧＤＦ−９ＢゲノムおよびｃＤＮＡ配列を決定することができ、ヒツジ卵巣中でのＧＤＦ−９Ｂ転写物の発現を評価することができた（Ｇａｌｌｏｗａｙら、２０００）。
【００９７】
文献から、ＧＤＦ−９は、顆粒膜細胞の有糸分裂誘発および卵胞膜細胞分化に必要とされることが明らかである。事実、組換えラットＧＤＦ−９は、インビトロでのラット卵胞成長（Ｈａｙａｓｈｉら、１９９９）および培養中のラット顆粒膜細胞増殖を刺激することができる（Ｖｉｔｔら、２０００）。また、組換えＧＤＦ−９は、マウスまたはラット顆粒膜細胞におけるステロイド合成および性腺刺激ホルモンレセプター発現を調節する（Ｅｌｖｉｎら、１９９９；Ｖｉｔｔら、２０００）。さらに、ＧＤＦ−９は、培養中のヒト顆粒膜細胞におけるインヒビンＢの産生を刺激する（Ｖｕｏｊｏｌａｉｎｅｎら、準備中）。これらの最近の研究は、ＧＤＦ−９ホモ２量体がいくつかの哺乳動物における卵胞成長および分化に対して強力な効果を有することを明らかに示し、本明細書中に記載の発明以前には卵巣におけるＧＤＦ−９Ｂの強力な生物学的効果に対しては何も記載されていなかった。
【００９８】
本発明者らの先のニュージーランド特許明細書第５００８４４号において、本発明者らは、ヒトにおいてＸｐ１１．２〜１１．４にシンテニーな（ｓｙｎｔｅｎｉｃ）遺伝子を含むヒツジＸ染色体領域にＩｎｖｅｒｄａｌｅ遺伝子を位置決めし（Ｇａｌｌｏｗａｙら、２０００）、そしてＧＤＦ−９Ｂ遺伝子がこれらの動物において影響を与えるかどうかを測定することにより、Ｉｎｖｅｒｄａｌｅ遺伝子が実際に不活化型のヒツジＧＤＦ−９Ｂ遺伝子であることを示した。Ｉｎｖｅｒｄａｌｅ動物においては、成熟ペプチドプロセシング部位を超えた９２ヌクレオチド位のＴヌクレオチドがＡ残基になっており、これによりコドンＧＴＣがＧＡＣへと変換して、アミノ酸バリン（Ｖ）のアスパラギン酸（Ｄ）への置換を引き起こしている。全てのＴＧＦ−βファミリーメンバーにおいて、このアミノ酸はまさしくバリン、イソロイシンまたはロイシンのいずれかであり、これらは全て負に荷電したアスパラギン酸とは対照的に疎水性の残基を表す。このアミノ酸置換は、ＴＧＦ−β　２、ＢＭＰ−２およびＢＭＰ−７の結晶構造から示唆される、分子の２量体化プロセスに関連する部位の表面電荷に変化を引き起こす（ＳｃｈｌｕｎｅｇｇｅｒおよびＧｒｕｔｔｅｒ、１９９３；Ｇｒｉｆｆｉｔｈら、１９９６；Ｓｃｈｅｕｆｌｅｒら、１９９９）。また、ニュージーランド第５００８４４号の発明は、Ｉｎｖｅｒｄａｌｅ雌ヒツジとまさに同一のヘテロ接合性およびホモ接合性遺伝子キャリア表現型を有する、別のヒツジ群（Ｈａｎｎａ）において同定された第２のＧＤＦ−９Ｂ遺伝子変異に関する証拠を提供する。Ｈａｎｎａ動物は成熟ペプチドプロセシング部位を過ぎた６７ヌクレオチド位にＣからＴへのヌクレオチド点変異を提示し、これによりグルタミン（Ｑ）残基の位置にプレマチュア（ｐｒｅｍａｔｕｒｅ）停止コドンを導入する。この変化は成熟ペプチド領域の主な短縮（ｍａｊｏｒ　ｔｒｕｎｃａｔｉｏｎ）を引き起こし、タンパク質生成物の不活化を生じさせる。ＩｎｖｅｒｄａｌｅおよびＨａｎｎａファミリーの間の交差は、雌における５０％の不妊を導き、これにより両方の変異がＧＤＦ−９Ｂ遺伝子産物を不活化することがはっきりと証明された。
【００９９】
参考文献
【表５−１】
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【表５−２】
2004503236.tif 000007
【表５−３】
2004503236.tif 000008
【表５−４】
2004503236.tif 000009
【図面の簡単な説明】
特に、本発明の好ましい局面を添付の図面に関して記載する。
【図１−１】ヒツジにおける野生型ＧＤＦ−９Ｂのヌクレオチド配列を示す。
【図１−２】ヒツジにおける野生型ＧＤＦ−９Ｂのヌクレオチド配列を示す。
【図１−３】ヒツジにおける野生型ＧＤＦ−９Ｂのヌクレオチド配列を示す。
【図２】図１のヌクレオチド配列の一部を示し、Ｉｎｖｅｒｄａｌｅ変異を図示する。
【図３】図１のヌクレオチド配列の一部を示し、Ｈａｎｎａ変異を図示する。
【図４】ヒツジにおける野生型ＧＤＦ−９Ｂ縮重型アミノ酸配列を示す。
【図５】図１のアミノ酸配列の一部を示し、Ｉｎｖｅｒｄａｌｅ変異を図示する。
【図６】図１のヌクレオチド配列の一部を示し、Ｈａｎｎａ変異を図示する。
【図７】ヒツジでのＧＤＦ−９Ｂに関する単一配列多形を示す。
【図８】ヒツジ中に存在するさらなる上流のＡＴＧコドンを示す。
【図９】卵母細胞におけるＧＤＦ−９Ｂの集中を例示する顕微鏡写真を示す。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図１−３】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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