(57)【要約】本発明は、個体の血漿中の神経毒性物質を体外で定性的および／または定量的に記録する方法に関する。該方法によれば、微小電極アレーまたはニューロチップの表面に適用されたまたはそこで培養されたニューロンまたはニューロンネットワークを、該ニューロンの少なくとも１つ以上の電気的活性を測定するための装置に加えて含有する系が提供され、該ニューロンを調製された血漿試料と接触させ、該ニューロンの電気的活性を測定する。本発明の目的は、該方法を発展させ、改良して、とくに、たとえば肝不全や種々の原因の昏睡状態などの脳症状態の場合に、個体の血漿中の神経毒性物質を記録するについて、それが信頼でき、再現性のある結果を与えるようにすることである。これを達成するため、測定に先立ち、個体の血漿を濾過法、好ましくは限外濾過法に付し、その際、他の溶解物質から血漿蛋白質をできる限り完璧に分離できる分子量を排除限界として選び、および／または、測定に先立ち、個体の血漿を脂溶性物質に対する溶媒を用いた脂溶性物質の抽出に付して、当該限外濾過液または脂溶性物質含有抽出液あるいは両者を、順次にあるいは混合して、測定に用いる。
2004532993.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
個体の血漿中の神経毒性物質を体外で定性的および／または定量的に検出するために、微小電極アレーまたはニューロチップの表面に適用されたまたはそこで培養されたニューロンまたはニューロンネットワーク、およびそれらのニューロンの少なくとも１つ以上の電気的活性を測定するための装置を備えた系を提供し、それらのニューロンを処理された血漿試料と接触させて、それらニューロンの電気的活性を測定する方法であって、
前記個体の血漿を濾過過程、好ましくは限外濾過操作に付して、測定操作に先立つ準備をなし、その場合に、他の溶解物質から血漿蛋白質をきわめて実質的に分離できる分子量を排除限界として選び、および／または、前記個体の血漿を脂溶性物質に対する溶媒を用いる脂溶性物質抽出操作に付して、測定操作に先立つ準備をなし、当該限外濾過液または脂溶性物質含有抽出液あるいは両者を、順次にあるいは混合物として、測定操作に使用することを特徴とする個体の血漿中の神経毒性物質を体外で定性的および／または定量的に検出する方法。
【請求項２】
高くとも４５０００ドルトン、好ましくは高くとも３００００ドルトンの分子量を排除限界として前記濾過過程を実施することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記抽出操作に先立ち、好ましくは無機酸、とくに好ましくは塩酸を用いて、血漿を酸性化することを特徴とする請求項１又は２のいずれかに記載の方法。
【請求項４】
前記脂溶性物質の抽出のために有機溶媒、好ましくはジクロロメタンまたはクロロホルムを用いることを特徴とする請求項１乃至３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
前記抽出操作後、当該有機相を別個の容器に移し、有機溶媒を蒸発により除去し、あとに残った抽出された脂溶性物質を適当な液体、好ましくは細胞培養培地とジメチルスルホキシドなどの低濃度の溶解媒体との混合物に再溶解させることを特徴とする請求項１乃至４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
個体の血漿中の、代謝性脳症、とくに肝性脳症を惹起する神経毒性物質を体外で定性的および／または定量的に検出するために、微小電極アレーまたはニューロチップの表面に適用されたまたはそこで培養されたニューロンまたはニューロンネットワーク、およびそれらのニューロンの少なくとも１つ以上の電気的活性を測定するための装置を備えた系を使用すること。
【請求項７】
不確かな昏睡状態における意識障害の可能性ある原因を鑑別するための請求項６に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、個体の血漿中の神経毒性物質を体外で定性的および／または定量的に検出する方法に関し、そこでは、微小電極アレーまたはニューロチップ（神経チップ）の表面に適用されたまたはそこで培養されたニューロンまたはニューロンネットワーク、およびそれらのニューロンの少なくとも１つ以上の電気的活性を測定するための装置を備えた系が提供され、それらのニューロンは処理された血漿試料と接触させて、それらニューロンの電気的活性を測定するものである。
【背景技術】
【０００２】
医学において多くの疾患状態が、患者の意識の低下、最後には昏睡に至るまでの低下に関係する可能性をもっている。その低下は血漿の組成変化に帰されている（たとえば肝不全や腎不全、糖尿病性昏睡、中毒状態または投薬の影響に関連しての、代謝性脳症）。
【０００３】
肝臓や腎臓などの身体の重要な解毒系の広範な障害によって惹起される代謝性脳症のうちでも、肝性脳症は、重篤な肝疾患が発生する頻度およびこれまでの治療上の選択肢の不十分さのために、医療および社会経済の上で大きい今日的意味をもっている。それに対し、その発生にかかわる正確な機構は、いまだ実質的に説明されていない。現在の知識水準によれば、その原因は、肝臓や腎臓などの、最終代謝産物の排出または解毒の点で重要な臓器の機能喪失によって惹起される肝不全時の代謝産物の蓄積による中枢神経機能関連の影響であると、考えられる。時間が経過するにつれ、状況は進行性脳症を伴うが、これは、臨床的には、敏捷性、注意深さおよび集中力の波状性変化ならびに筋緊張の増大や震せんなどの錐体外路系運動障害が影響するものである。このほかに、錯乱、誤認、幻覚がある。重篤な場合には、これが譫妄、昏睡、最後には患者の死に至る。中枢神経系の機能低下をもたらす機構に関しては、いろいろな仮説がある。それらには、偽神経伝達物質理論（非特許文献１参照）、アンモニア仮説（非特許文献２および３参照）、ＧＡＢＡ−ベンゾジアゼピン受容体リガンド仮説（非特許文献４参照）および複数の原因代謝産物の相互増強作用に関する相乗効果理論（非特許文献５参照）が含まれる。これまでに同定された可能性ある毒物としては、アンモニア、ビリルビン、胆汁酸類、トリプトファン、アミノ酸類のフェノール性およびインドール性分解生成物、メルカプタン類、中鎖脂肪酸類および内因性ベンゾジアゼピン類がある（非特許文献６参照）。これらの理論に共通しているのは、臓器不全の結果として身体中に蓄積された物質が惹起される脳症の病因の中心部分に関係しているということである（非特許文献７および８参照）。脳中で起こる病態生理学的諸過程に関して依然として残っている不明快さの原因は、とりわけ、生体内モデルにおいて明確な証拠を得る上での困難さである。他の多くの昏睡状態の発生にかかわる正確な機構さえも、いまだ実質的に解明されていない。現在の知識水準に従えば病因論的に重要であると考えられる個々の実験室パラメータの測定が、臨床的に見られる意識消失度と相関しないことがしばしばである。患者の血漿試料の結果と種々の純物質の結果との比較が、昏睡のひょっとしての誘因の同定に、かくしてそれらの疾患形態の病因の解明に寄与
できる。
【０００４】
とくに、中毒状態や自殺未遂をも含めて、本性が不明の昏睡状態に関しては、患者に生命の危険がある救急医療に関連して、最適に構成された形の処置を開始するために、引き金となっている毒物または毒性物質をできるだけ早く検出し、定量する必要のあることがしばしばである。
【０００５】
肝不全時に患者の血漿から毒性化合物を排出するためにとくに開発された体外解毒のための新しい種類の透析法（非特許文献９参照）が、ＭＡＲＳ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ａｄｓｏｒｂｅｎｔｓ  Ｒｅ−ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ）（テラクリン（Teraklin）（株）、ロストク市）の名で使用されている。水溶性代謝産物以外に、比較的脂溶性の物質もこれに包含される。後者は、主として、血漿蛋白質、とくにアルブミンに結合されて、血液中を輸送される。透析液中にアクセプタである蛋白質（アルブミン）が存在するために、他の方法では血漿から透析により除去することがほとんどできない化合物をＭＡＲＳによって排出することができる（非特許文献１０および１１参照）。それは、さらに、さもなければ前記症候群では典型的な、血漿中での分枝鎖アミノ酸と芳香族アミノ酸との間のアミノ酸不平衡に対して好ましい影響をも達成する（非特許文献１２参照）。研究においての肝性昏睡患者へのこの方法の臨床的利用に関連して、患者の脳症の程度が有意に低下することが見出された（非特許文献１３参照）。
【０００６】
しかし、肝不全が原因の肝性脳症の程度を臨床的に評価することは、いくつかの状況のもとでは、他の昏睡誘発因子や薬物の影響があるために、困難となるか、まったく不可能となる。これまで、処置の成功を、すなわち処置中および処置後の解毒度を、迅速かつ確実にモニターする方法はなかった。
【０００７】
それらのハイリスク患者に関して、しばしば存在する多疾患状態を考慮すると、中枢神経系機能の障害が、付加的に存在する他の疾患によるものである可能性もある。これに関連して、正確な診断に到達できるのが、しばしば遅れる。これに関連した脳機能障害の他の誘因の具体例は、感染（たとえば髄膜炎、膿瘍、脳炎）、薬物の副作用ならびに脳循環障害あるいは併発性腎不全に関連した腎臓関連代謝産物の蓄積でありうる。意識に影響するに至る他の原因を適時に検出できる改良された診断法があれば、適切な治療を早期に開始することによって患者の予後が改善され、費用のきわめてかさむ集中治療室での滞在期間が短縮されるであろう。
【０００８】
微小電極アレー表面のニューロンネットワークの開発は、種々の実験条件下でのニューロン集合体の電気的活性を連続的に記録し、解析することを可能にしている（非特許文献１４および１５参照）。先行する研究は、該ネットワークの活性が、ニューロンに活性を示す多くの物質の添加によって、各々の場合に濃度特異的かつ物質特異的に、そして通常は可逆的に、影響されることを示している。細胞毒性濃度の場合のみ、ネットワーク活性を不可逆的に終止させる（非特許文献１５参照）。それは、脳内での病態生理学的諸過程を定性的および定量的に検知するに際して、まったく新しい可能な選択肢を提供する。
【０００９】
特許文献１は、薬理活性物質、毒物などの物質のニューロン細胞集合体に対する作用を測定する方法を記載している。その方法は、ニューロンを溶液状態で微小電極アレー（ニューロチップ）に適用し、前記細胞集合体の生体電気活性を測定し、細胞外溶液中の少なくとも１つのイオン濃度を変化させることによって所定の活性状態を設定することを規定している。つぎに、検討対象物質を前記細胞外溶液に加え、前記細胞集合体の活性またはその変化を再び測定する。この方法は、諸物質を、ニューロンの興奮性、シナプス伝達および／またはネットワークの挙動に対する影響についてスクリーニングできるようにすることを意図している。前記の活性状態は、細胞機構とシナプス機構との相互作用に基づいているので、前記細胞集合体は、細胞外で添加された物質の作用にきわめて敏感に反応する。このようにして、試験すべき物質または材料の作用をきわめて良好に、とくに再現性よく、試験することが可能である。さらに、前記ネットワークの状態が細胞外で操作可能なパラメータ（ニューロン興奮性およびシナプス伝達の有効性）に依存していることが知られれば、良好な校正が可能になり、かくして所定の試験状態を設定することが可能になる。特許文献１は、本質的に、当該系の作成と校正に関するものである。使用された唯一の試験物質は、４−アミノピリジンの１００μＭ溶液であった。
【００１０】
しかしながら、特許文献１に従った患者の血漿または血清中の神経毒性物質を検出する方法は、再現性があるように使用することは容易にはできないことが見出された。特許文献１において試験物質として使用されたような純物質に比して、血漿は、多数の蛋白質および他の脂溶性および水溶性の物質からなる混合物を含んでいる。それら蛋白質は、低いレベルの水溶性しかもたない種々の物質の担体として作用し、かくして血流中でのそれらの輸送を可能にする。しかし、他の蛋白質は、生体内で異物および微生物であると認識される物質に対する非特異的または特異的（免疫）防御における機能にかかわっている（補体因子類、免疫グロブリン類）。ニューロンネットワークは哺乳動物（たとえばマウス）の胎仔から得るので、センサー系に血漿または血清を添加したときに、当該操作は、血漿蛋白質と異種細胞との接触を含むことになる。そのことが、補体系の活性化および特異的免疫相互作用を惹起させうることとなり、その結果、異物であると認識された細胞が防御系によって攻撃され、損傷される。さらに、前記の他の脂溶性および水溶性の物質は、一部が、たとえば肝不全状態の脳症患者または昏睡患者の血漿中に、健康者の血漿中とは異なる濃度レベルで、すなわち相対的に高いまたは低い濃度で、または異なる形状、結合状態または荷電状態で、存在している。それゆえ、それらは、与えられた疾患状態についての利用可能性のある指標になる。しかし、他方では、血漿中には、前記特定の症候群に関して特異的指標ではない、および／または、既知の試験方法においてニューロンの電気的活性に、したがって電流測定で得られる結果に、著しく影響したり、それらを撹乱したりして、測定結果についての信頼できる再現性のある情報を得ることを極めて困難にする複数の物質も存在している。
【００１１】
【非特許文献１】
フィッシャー、ジェイ・イー（Fischer, J. E.）、バルデサリーニ、アール・ジェイ（Baldessarini, R. J.）：偽神経伝達物質と肝不全。ランセット（Lancet）第２巻（１９７５年）７５−８０頁。
【００１２】
【非特許文献２】
ブレイ・エイ・ティー（Blei, A. T.）、オラフソン・エス（Olafsson, S.）、テリアン・ジー（Therrien, G.）、バタワース・アール・エフ（Butterworth, R. F.）：門脈大静脈吻合後のラットにおけるアンモニア誘発脳浮腫および頭蓋内高血圧。ヘパトロジー（Hapatology）第１９巻（１９９４年）１４３７−１４４４頁。
【００１３】
【非特許文献３】
バタワース・アール・エフ：肝性脳症の病態生理学：アンモニア仮説再訪。肝性脳症および代謝性窒素交換の進歩（Progress in hepatic encephalopathy and metabolic nitrogen exchange）中の論文。発行者：ベンソン・エフ（Bengtsson, F.）、ボカ・レイトン（Boca Raton）、ＣＲＣプレス、１９９１年、９−２４頁）。
【００１４】
【非特許文献４】
バジル・エイ・エス（Basile, A. S.）、ハリソン・ピー・エム（Harrison, P. M.）、ヒューズ・アール・ディー（Hughes, R. D.）、グー・ゼット・キュー（Gu, Z. Q.）、パネリ・エル（Panneli, L.）、マッキニー・エイ（McKinney, A.）、ジョウンズ・イー・エイ（Jones, E. A.）、ウィリアムズ・アール（Williams, R.）：血漿ベンゾジアゼピン受容体リガンド濃度と肝性脳症の重篤度との関係。ヘパトロジー第１９巻（１９９４年）１１２−１２１頁。
【００１５】
【非特許文献５】
ジーヴ・エル（Zieve L.）：肝性脳症における毒物の役割と相乗作用。へパティック・エンセファロパシー（Hepatic encephalopathy）中の論文。発行者バタワース・アール・エフ、ヒュマーナ・プレス（Humana Press）、クリフトン、ニュージャージー、１９８９年、１４１−１５６頁。
【００１６】
【非特許文献６】
ワイセンボーン・ケイ（Weissenborn, K.）：肝性脳症の病態生理学および治療における最近の進展。バリエールズ・クリニカル・ガストロエンテロロジー（Balliere’s Clin. Gastroenterol.）第６巻（１９９２年）６０９−６３０頁。
【００１７】
【非特許文献７】
ジョウンズ・イー・エイ、ガマル・エス・エイチ（Gammal, S. H.）：肝性脳症。ザ・リヴァー。バイオロジー・アンド・パソバイオロジー（The liver. Biology and Pathobiology）第２版中の論文。発行者：アリアス・アイ・エム（Arias, I. M.）、レイヴン・プレス・リミテッド（Raven Press, Ltd.）、ニューヨーク、１９８８年、９８５−１００４頁。
【００１８】
【非特許文献８】
レコード・シー・オウ（Record, C. O.）：肝性脳症の神経化学。ガット（Gut）第３２巻（１９９１年）１２６１−１２６３頁。
【００１９】
【非特許文献９】
シュタンゲ・ヨット（Stange, J.）、ミッツナー・エス（Mitzner, S.）、ラムロフ・ウェー（Ramlow, W）、グリーシェ・ハー（Gliesche, H.）、ヒックスタイン・ハー（Hickstein, H.）、シュミット・エル（Schmidt, R.）：蛋白質に結合した薬物および毒物を除去する新しい方法。ＡＳＡＩＯジャーナル（ASAIO J.）第３９巻（１９９３年）Ｍ６２１−Ｍ６２５頁。
【００２０】
【非特許文献１０】
シュタンゲ・ヨット、ラムロフ・ウェー、ミッツナー・エス、シュミット・エル、クリンクマン・ハー（Klinkmann, H.）：再循環アルブミン溶液に対する透析はアルブミン結合毒物の除去を可能にする。アーティフィシャル・オーガンズ（Artif. Org.）第１７巻（１９９３年）８０９−８１３頁。
【００２１】
【非特許文献１１】
シュタンゲ・ヨット、ミッツナー・エス・エル、リスラー・テー（Risler, T.）、アーリー・シー・エム（Erley, C. M.）、ラウヒャルト・ウェー（Lauchart, W.）、ゲール・ハー（Gohl, H.）、クラムト・エス（Klammt, S.）、ペシンスキ・ペー（Peszynski, P.）、フライターク・ヨット（Freytag, J.）、ヒックスタイン・ハー、レール・エム（Lohr, M.）、リーベ・エス（Liebe, S.）、シャレック・ウェー（Schareck, W.）、ホプト・ウー・テー（Hopt, U. T.）、シュミット・エル：分子吸着剤再循環系（ＭＡＲＳ）：生物人工的肝臓支持のための膜をベースとした新規血液精製系の臨床成績。アーティフィシャル・オーガンズ第２３巻（１９９９年）３１９−３３０頁。
【００２２】
【非特許文献１２】
ローク・ヨット（Loock, J.）、ペテルス・エー（Peters, E.）、シュタンゲ・ヨット、ミッツナー・エス、ペルシンスキ・ペー、クラムト・エス、リービッヒ・ハー（Liebich, H.）、シュミット・エル：肝不全の新規透析治療（ＭＡＲＳ）の間のヒト血清アルブミンアミノ酸パターン（フィッシャー指数）の変化。インターナショナル・ジャーナル・オヴ・アーティフィシャル・オーガンズ（Internat. J. Artif. Org.）第２０巻（１９９７年）５００頁。
【００２３】
【非特許文献１３】
シュタンゲ・ヨット、ミッツナー・エス、クラムト・エス、フライターク・ヨット、ペシンスキ・ペー、ローク・ヨット、ヒックスタイン・ハー、コルテン・ゲー（Korten, G.）、シュミット・エル、ヘンチェル・ヨット（Hentschel, J.）、シュルツ・エム（Schulz, M.）、レール・エム、リーベ・エス、シャレック・ウェー、ホプト・ウー・テー：体外血液精製による肝臓支持−一臨床観察。リヴァー・トランスプランテーション（Liver Transpl.）２０００年９月；６（５）；６０３−１３頁。
【００２４】
【非特許文献１４】
グロス・ゲー・ウェー（Gross, G. W.）、リースケ・エー（Rieske, E.）、クロイツベルク・ゲー・ウェー（Kreutzberg, G. W.）、マイヤー・アー（Meyer, A.）：試験管内での体外単一ユニットニューロンネットワーク活性の長期モニターのために設計された新規固定アレー多微小電極系。ニューロサイエンス・レターズ（Neurosci. Lett.）第６巻（１９７７年）１０１−１０５頁。
【００２５】
【非特許文献１５】
グロス・ゲー・ウェー：ランダム化された培養哺乳動物ニューロンネットワークの内部動力学。培養神経ネットワークのための効果的技術（Enabling technologies for cultured neural networks）の中の論文。発行者：ステンガー（Stenger）、マッケンナ・ティー・エム（McKenna, T. M.）、アカデミック・プレス、ニューヨーク、１９９４年、２７７−３１７頁。
【００２６】
【特許文献１】
独国特許出願公開第１９９３２７２０号明細書
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２７】
それゆえ、本発明の目的は、微小電極アレー上の培養ニューロンネットワークによって神経毒性物質を検出するためのそれ自体は既知の方法を、とくに肝不全状態におけるごとき脳症に相当するときあるいは異なる原因の昏睡状態があるときの、個体の血漿中の神経毒性物質の検出について信頼でき、再現可能な結果を生じるように、発展させ、改善することである。
【課題を解決するための手段】
【００２８】
本発明に従えば、上記の目的は、本明細書の冒頭部で述べた種類の方法であって、前記個体の血漿を濾過過程、好ましくは限外濾過操作に付して、測定操作に先立つ準備をなし、その場合に、他の溶解物質から血漿蛋白質をきわめて実質的に分離できる分子量を排除限界として選び、および／または、前記個体の血漿を脂溶性物質に対する溶媒を用いる脂溶性物質抽出操作に付して、測定操作に先立つ準備をなし、当該限外濾過液または脂溶性物質含有抽出液あるいは両者を、順次にあるいは混合物として、測定操作に使用することを特徴とする方法によって、達成される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２９】
健康な個体および、たとえば肝不全状態の昏睡患者から所定の方法で調製した血漿試料が、微小電極アレー（ニューロチップ）表面のニューロンネットワークにおいて再現性のある異なった電気的刺激状態を生じること、より具体的には、健康な個体に由来する試料はそれぞれ前記ニューロンネットワークの初期活性と比較して変化を示さないかまたはごくわずかに認められる変化を示すだけである一方、肝不全状態の昏睡患者からの試料はそれぞれに前記活性に大きい変化を生じさせることを、示すことができた（下記参照）。本発明方法に従って前処理していない血漿を用いるときには、健康な個体の試料を添加したときに既に細胞集合体の活性が大きく影響され、昏睡患者に対する差異があまり明瞭でなくなり、あるいはまったく認められなくなった。これは、健康者の血液と不健康な患者の血液の両方に存在する所定の物質が同じようにニューロンの電気的活性に大きく影響するため、結果として、疾患特異的物質に対するニューロン側の反応が重ね合わされたためであった。異物および病原体に対する防御のために血漿および血清中に含まれている前記蛋白質と細胞集合体表面との相互作用が、たぶん、それらの効果を誘発する上で大きい意味をもっているのであろう。それゆえ、健康個体の血漿と昏睡患者の血漿との間の有意な区別は、することができなかったか、または当該方法の再現性ある使用をするのに十分な明快さをもってすることはできなかった。
【００３０】
患者からの調製ずみ血漿または血清試料を添加したあとのニューロン活性の特異的変化は、昏睡の基礎にある原因に関して重要な指摘を与えることができ、特異的に標的を定めたさらなる診断および治療を可能にすることができる。試料添加後のニューロン活性の変化を定量的に検出すれば、現在の中毒の度合いに関する情報が提供されるだけでなく、疾患の過程におけるある患者の複数の試料を検討するとき、適用されている治療形態の有効性を評価することもできる。
【００３１】
驚くべきことに、測定操作に先立って分子量排除限界が６００００ドルトンの限外濾過に付した血漿を用いると、健康な個体からの血漿と不健康な患者からの血漿との間でより一層顕著に区別できるニューロン興奮の得られることが、見出された。分子量排除限界が４５０００ドルトンで、結果はさらに明瞭により顕著であり、３００００ドルトンでは、より一層良好であった。
【００３２】
たとえば肝不全患者からの血漿を用いて測定した興奮電流は、同様に限外濾過に付した健康個体からの血漿で測定したものよりも有意に高かった。ニューロン興奮作用の強さは症状の重篤度と相関していることを示すこともできた。それらの血液がたとえばＭＡＲＳ法を用いた肝臓透析に付された患者からの血漿試料の場合、透析の進行中に興奮のレベルが連続的に低下するのが観察された。このように、血漿中の疾患特異的物質の濃度と興奮電流レベルとの間に再現性のある相関関係を確認することができた。また、同じ症状をもつ種々の患者からの血漿試料を扱ったときの測定操作の間の興奮電流の変化が、測定操作時間にわたってきわめて類似していること、すなわち比較可能な興奮パターンを示すことも見出された。かくして、患者からの、本発明方法に従った限外濾過を受けた血漿試料から測定された興奮パターンに基づいて、健康者からの標準を症状が既知であり、疾患の重篤度も既知の患者からの標準と比較することにより、定性的および定量的関係を示すことができた。
【００３３】
限外濾過によって血漿から分離できる高分子物質は、たとえば抗体、アルブミンなどの高分子蛋白質を包含する。それらの蛋白質を限外濾過により分離するとき、限外濾過液中には主として水溶性の比較的良好な化合物が得られ、脂溶性物質はごく僅かしか含まれていなかった。このことは、脂溶性物質のいくらかが前記高分子蛋白質に結合し、その結果、限外濾過操作で血漿から分離されもしたことに帰される。しかし、血漿中の脂溶性物質が、本発明の方法においてニューロンネットワークの活性にそれら自身の影響を及ぼし、それらの影響は昏睡患者からの試料によってのみ惹起されることを示すこともできた。
【００３４】
それゆえ、本発明に従えば、結晶からの脂溶性物質の抽出物も、単独で、または本発明に従って使用される限外濾過血漿試料と組合せて、使用することもできる。この目的には、血漿を好ましくは有機溶媒と混合して、抽出する。本発明の好ましい一実施態様にあっては、ジクロロメタンまたはクロロホルムをその目的で使用する。血漿を該有機溶媒とよく混合したのち、混合物を放置して、沈降させ、相分離する。
【００３５】
脂溶性物質が溶解している有機相を分離し、溶媒は蒸発させることができ、脂溶性物質を含む残留物を、好ましくは同じまたは類似の媒質に、再び溶解または懸濁させる。その媒質中で、培養したニューロンネットワークを微小電極アレー上に配置する。再懸濁操作には、細胞培養液と低レベルのジメチルスルホキシドなどの溶解媒体との混合物を用いるのが好ましい。
【００３６】
本発明のとくに好ましい一実施態様にあっては、有機溶媒による抽出操作に先立って血漿を酸性化する。この目的には、塩酸などの無機酸を用いるのが好ましい。酸性化操作のために、血漿のｐＨ値条件下で存在し、プロトン化された状態と脱プロトン化された状態との間の平衡状態にある有機酸などの酸性有機物質がより一層プロトン化され、かくして平衡がプロトン化された、より脂溶性の状態に向けて移動させられる。これにより、かかる酸性物質の多くが血漿から抽出液中へ移動させられうることになる。
【００３７】
本発明に従えば、限外濾過された血漿試料と抽出された血漿試料とを組合せての測定が、順次であっても、混合物としてであっても、とくに好ましい。同一血漿試料の２つの異なる調製物に基づいた測定操作は、通常は定性的および／または定量的に異なる興奮パターンを生じるが、それは、健康者からの血液および症状ならびに疾患の重篤度を異にする患者からの血液についての多数の標準を試験対象血液試料と比較して、それにより結果の信頼性と再現性を相当程度改善する可能性を与える。
【００３８】
本発明に関する研究に関連して、代謝性脳症患者からの血漿試料がニューロンネットワークの電気的活性に及ぼす影響を、試験管内で本質的に検討した。結果は、かかる試料の限外濾過液および抽出液が、健康者からの試料と比較して、ネットワーク活性の顕著な変化を生じさせることを示した。それは、患者の現在の脳症の程度と相関関係を示した。多数のニューロンに対して活性な物質に基づいた検討により、ネットワークの反応の用量特異性および物質特異性ならびに同じネットワークと異なるネットワークで得られる結果のきわめて良好な再現性が証明された。このように、微小電極アレー上で培養されたニューロンまたはニューロンネットワーク系は、代謝性脳症の診断および鑑別診断ならびに現行並びに新規な治療構想の検討に有利に使用できる。
【００３９】
本発明方法を適用すれば、結果として、患者の改善された特異的標的療法が可能となり、それは、ひいては、罹患率および死亡率の低下につながる。さらに、適切な治療を早期に開始することが、集中治療室および病院内で患者が過ごす時間の短縮のために費用節減を達成することを可能ならしめる。脳症の根底にある病理機構を本発明の方法によって同定・識別することは、新しい予防および治療戦略を開発するためのアプローチともなりうるであろう。
【００４０】
限外濾過
血漿試料の限外濾過を、シュライヘル・ウント・シュル（Schleicher & Schull）社の限外濾過器を用い、各場合に試料体積０．５ｍｌで、メーカーの仕様書によれば膜についての排除寸法３００００ドルトンにおいて、実施した。
【００４１】
抽出
試験すべき血漿試料５００μｌを、２ｍｌのセーフロック反応器（エッペンドルフ社、ハンブルク市）中で、塩酸（３７％、分析用、メルク社、ダルムシュタット市）１５０μｌで酸性化した。ジクロロメタン（分析用、メルク社、ダルムシュタット市）１０００μｌを加えたのち、ミキサー（ジャイレーター・ユニプレプ（yrator Uniprep）、ユニエクイプ（UniEquip）社、マルチンスリート市）を用いて試料を３分間強力に混合したのち、２０８００xｇで５分間遠心分離した（遠心機５４１７Ｃ、エッペンドルフ社、ハンブルク市）。下方の有機相（ジクロロメタン相）を分離し、新しい２ｍｌのセーフロック反応器に移し、外界温度で注意して蒸発させた。溶媒が完全に蒸発したのち、容器中に残存している沈積物を、ＤＭＥＭ（ダルベッコの最少必須培地）中の１％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）溶液５００μｌに再度溶解させた。上記のように、再振盪によって試料の混合を行った。このようにして調製した血漿試料を、測定操作のために、ニューロンと接触させた。
微小電極アレー上でのニューロンネットワークの製出−マウス胎仔脳培養／ラット胎仔脳培養
【００４２】
微小電極アレー（ニューロチップ）上でのニューロンの培養は、既知の方法（グロス、ゲー・ウェー、ランダム化された培養哺乳動物ニューロンネットワークの内部動力学。培養ニューロンネットワークのための効果的技術の中の論文。発行者：ステンガー・エイ・ディー（Stenger, A. D.）、マッケンナ・ティー・エム、アカデミック・プレス、ニューヨーク、１９９４年、２７７−３１７頁（非特許文献１５）；ジーブラー（Siebler）らの独国特許出願公開第１９９３２７２０号明細書）に従って実施した。
【００４３】
神経細胞培養を生育させるためのセンサー細胞培養表面の調製は、滅菌（たとえばアルコール、紫外線、ガンマ線による）、表面の親水化（たとえば火焔にあてる工程、酸またはアルカリ処理とそれに続く洗浄）およびカチオン性電荷担体および／または接着因子（個々に、組合わせて、または混合物として）、たとえばポリリシン、ポリエチレンイミン、ラミニン、フィブロネクチンの適用を含む。
【００４４】
脳またはその部分は胎仔（妊娠１５−１８日）から調製する。細胞集合体は、緩衝溶液中で、外科用メスの刃により機械的に寸法を小さくする。つぎに、細胞外マトリックスおよび細胞膜蛋白質を、消化酵素の添加によって初期消化に付す。蛋白質含有栄養液の添加によって消化液の作用を停止させ、ブロックされた消化液を吸引除去したのち、当該組織を栄養培地中へ入れる。ピペットで注意深く上下させて細胞を分離する。
【００４５】
つぎに、動物の種類および原組織に応じて、細胞懸濁液を、前処理したニューロチップのセンサー細胞培養面上に、５万−１００万細胞／ｃｍ２の密度で蒔く。ニューロチップを蓋つきプラスチックボウルに入れ、インキュベーションキャビネット（３７℃、５−１０％の二酸化炭素を添加した空気、空気湿度９０−９５％）に入れる。週に２または３回、消費された栄養培地の一部を新鮮培地と交換する。
【００４６】
細胞（神経細胞と支持および代謝機能をもつグリア細胞との混合物）がセンサー細胞培養面に付着し、神経細胞から伸展部が成育し、互いにリンク（連鎖）を形成する。その状態では、グリア細胞と密接に接触しているので、結果は、もとの組織と組成の類似した神経ネットワークとなる。それは、数日ないし数週間のうちに、組織に典型的であって、細胞をセンサーに連結することによって測定が可能な自発的電気活性パターンを生じる。
【実施例】
【００４７】
１８日齢マウス胎仔からの解離前脳皮質組織を、１ｍｍ２の面積に６４個の薄膜電極をもつ微小電極アレープレート上で培養した。グロスが記載している前記方法に従って細胞の培養を続けた。健康被験者２名（男性）およびＭＡＲＳシステムにより肝臓透析を受けている肝不全患者４名（表１参照）から、血漿試料を採取した。上記の方法に従い、排除サイズ３００００ドルトンでの限外濾過により、高分子量蛋白質を除去した。
【表１】
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【００４８】
実験は、取外し可能な加熱されたプラスチックカバーで覆われ、３７℃の温度が得られている開放性高品質鋼製チェンバ中、空気と１０％ＣＯ２とからなる雰囲気中で実施した。光学顕微鏡により、細胞を定期的にチェックした。実験中の細胞の形態変化をよりよく記録文書化するために、時間依存性記録を並行して実施した。電極の電気活性を増幅し、デジタル方式で検出した（アメリカ合衆国テキサス州ダラス市のスペクトラム・サイエンティフィック社からのソフトウェア）。実験開始後、３０分間から１時間までの間、培養を放置して、それらのバックグラウンド活性を安定化させるようにした。その後、ニューロンネットワークの自発性活性を少なくとも３０分間記録した。つぎに、各場合のヒト血漿の限外濾過液１００マイクロリットルずつを、ニューロンネットワーク上の培地６００マイクロリットルに加え、２時間まで放置した。つぎに、培養物を少なくとも２回細胞培養培地で洗い、ニューロンネットワークの活性を再び少なくとも３０分間記録したのち、つぎの試験すべき試料を加えた。
【００４９】
図１は、微小電極アレー上のグリア細胞と中枢神経系に本来存在する他の細胞性要素（繊維芽細胞、内皮細胞）の間のニューロン細胞集合体の配置を示しており、ニューロン細胞はシナプス接続によって互いに連結されており、キャリヤープレートに存在する微小電極のすぐ近傍にそれらが配置されているため、個々のニューロンの電気信号を導出することができる。
【００５０】
図２ａおよび２ｂは、健康被験者（健康者＃１）および肝不全時に蓄積する毒性物質の生体からの除去のためのＭＡＲＳ法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ａｄｓｏｒｂｅｎｔｓ  Ｒｅ−ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ）を用いる特定の治療法の前、間および後の重篤な肝不全の患者（患者＃４）の限外濾過液の影響を示している。それらは、水溶性代謝産物のほかに、比較的脂溶性の物質を含んでいる。後者は、主として血漿蛋白質、とくにアルブミンに結合されて血中を運ばれる。透析液中にアクセプタ蛋白質（アルブミン）が存在するために、ＭＡＲＳは、その他の方法ではほとんど透析できない化合物を血漿から排除することができる。さらに、それはまた、さもなければ前記症候群に典型的なものである血漿中の分枝鎖アミノ酸と芳香族アミノ酸との間のアミノ酸不平衡に対して好ましい影響を与える。
【００５１】
図２ａは、バースト率（単位時間当たりのバースト数）の、図２ｂは、スパイク率（単位時間当たりのスパイク数）の、異なる限外濾過液添加への依存性を示している。これに関して、１つのスパイクは、あるニューロン活動電位の記録された活性を表わす。バーストなる語は、接近して限られた時間にわたってのあるニューロン単位における「スパイクパケット」の形での多くの活動電位のきわめて速やかな連続を表わすために使用している。線図に示されている異なる活性形状は、各々、同じ実験の間に微小電極アレーの７つの異なる細胞外電極によって記録されたものである。健康者からの試料を添加したときには細胞集合体の活性にほとんど変化が見られなかったが、重篤な肝不全と高度の肝性昏睡との患者から同様にして調製した試料の添加後には、状況は複数のニューロン単位の活性の顕著な上昇を含むが、他のものは比較的影響されず、一部ではニューロン活性の阻害さえ示した。最初のＭＡＲＳ治療終了後で、処置シリーズ（個々の処置５回、１日当たりそれぞれ１回の処置）終了後の同じ患者からの同様にして調製した試料は、実験開始前の状態に比して、ネットワーク活性に小さい変化をもたらした。この点で、実施されたＭＡＲＳ治療の期間と臨床的に検知された患者の昏睡度との相互関係により、処置期間が増し、患者の脳症の程度が低下するとともに、誘発された変化も減少するというようなものであることが明らかにされた。中間での洗浄操作（培地の部分的交換）により、観察される作用の可逆性が示された。
【００５２】
図３は、図２に示したものと類似の試験操作を示しているが、試験系列を反復している。ただし、異なるが類似の細胞集合体を基礎としており、やはり肝性昏睡でやはりＭＡＲＳ法を用いて同様に処置を受けていた別の患者（患者＃１）からの試料を用いている。その点では、種々の試料の添加後に起きるニューロン活性の変化の高度の再現性が現れることが見出された。
【００５３】
異なったグラフによって示されている１３のニューロン単位の活性の変化を、バースト率と単位時間当たりのバーストの平均持続時間との積として示す（図では「活動（ｏｎ−ｄｕｔｙ）時間」と呼んでいる）。使用した試料のネットワーク活性に及ぼす作用は、図２について述べたところに実質的に相当している。健康な個体（健康者＃１）からの試料の添加後に、ネットワークの初期活性と比較してわずかな活性の変化が認められるが、これに対し、ＭＡＲＳ治療開始前の患者（患者＃１）からの試料の添加後には検知されたニューロン単位の大部分について高度の活性が認められる。ＭＡＲＳ治療期間が増すとともに、誘発される変化の低減が漸次増し、かくして健康者からの試料の作用に近づいている。この場合には、ニューロン活性に対して誘起された試料の作用の程度と臨床的に目につく患者の脳症の程度との相関関係も現れた。試料系列を反復することによって、種々の試料の添加後に生じるニューロン活性の変化に高度の再現性のあることを証明できた。
【００５４】
図４は、肝不全と高度の肝性脳症の４名の異なる患者（患者＃１−＃４）および健康な個体（健康者＃１）からの血漿の限外濾過液を実験の開始時および終了時に試験したときの、それらがニューロンネットワークの６つの異なる単位のバースト率に及ぼす影響の比較を示している。患者試料添加後のネットワーク活性の変化は、個人的な差を示したが、これらの差は限外濾過液の物質組成が異なることを示している。この点では、健康な個体からの試料に対する差は、多少とも顕著であった。そのことは、疾患の種々の重篤度ならびに昏睡を生じる点で重要な随伴疾患の有無について識別するための基礎となりうる。バースト率に関しては、種々の重篤度の患者からの試料の添加後に起こるところの、図においてグラフの互いの間隔によって表わした個々のニューロン単位の活性状態の分裂は、健康な個体からの試料と比較するとき、もっとも顕著な特徴である（図２ａも参照）。
【図面の簡単な説明】
【００５５】
【図１】
電気信号を取出すための集積微小電極および微小導体をもつ二次元キャリヤー上での細胞集合体の配列の概略図である。
【図２ａ−ｂ】
健康被験者（健康者♯１）および昏睡度の顕著な低下を伴う進行中の治療法の前およびその間の重篤な肝不全と高度の肝性脳症との患者（患者♯４）の限外濾過液を添加したときのニューロンネットワークの電気的活性の変化を示す図である。
【図３】
健康被験者（健康者♯１）および昏睡度の顕著な低下を伴う進行中の治療法の前およびその間の重篤な肝不全と高度の肝性脳症との別の患者（患者♯１）からの限外濾過液の添加に基づく、図２ａおよび２ｂに示したのと同様のニューロンネットワークの電気的活性の変化の再現性を示す図である。
【図４】
健康被験者（健康者♯１）および以前に透析処置を受けていない肝不全と高度の肝性脳症との４名の患者（患者♯１〜♯４））の限外濾過液を添加したときのニューロンネットワークの電気的活性における変化の比較を示す図である。
【図１】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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