(57)【要約】例えばそのアポトーシス阻止能および／または内分泌反応阻害能を特徴とする、受容体拮抗ドメインおよび正の免疫調節物質ドメインを含む、新規融合タンパク質は、癌の治療において有用である。例えば、ヒトプロラクチン拮抗剤−インターロイキン２（ｈＰＲＬＡ−ＩＬ−２）融合タンパク質は、アポトーシスの誘導と免疫治療を組み合わせて、乳房または前立腺における癌を抑制する。
2004504272.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
受容体拮抗ドメインおよび正の免疫調節物質ドメインを有する、タンパク質の有効量を患者に投与する段階を含む、癌を治療する方法。
【請求項２】
受容体拮抗ドメインがプロラクチン拮抗剤ドメインである、請求項１記載の方法。
【請求項３】
正の免疫調節物質ドメインがインターロイキンである、請求項１記載の方法。
【請求項４】
インターロイキンがインターロイキン２（ＩＬ−２）である、請求項３記載の方法。
【請求項５】
正の免疫調節物質ドメインがインターロイキン１２（ＩＬ−１２）である、請求項３記載の方法。
【請求項６】
正の免疫調節物質ドメインがγインターフェロン（ＩＦＮγ）である、請求項３記載の方法。
【請求項７】
タンパク質がプロラクチン拮抗剤−インターロイキン２（ｈＰＲＬＡ−ＩＬ−２）融合タンパク質である、請求項１記載の方法。
【請求項８】
プロラクチン拮抗剤ドメインが、プロラクチンタンパク質の１２９位に対応する位置での、グリシンからアルギニンへの一アミノ酸置換を特徴とする、請求項２記載の方法。
【請求項９】
プロラクチン拮抗剤ドメインが、配列番号：１（ｈＰＲＬＡ）のアミノ酸配列を有するタンパク質またはその保存的変異体を含む、請求項２記載の方法。
【請求項１０】
プロラクチン拮抗剤ドメインが、本来のプロラクチン配列の切断型またはその保存的変異体を含む、請求項２記載の方法。
【請求項１１】
受容体拮抗ドメインおよび正の免疫調節物質ドメインを含む、タンパク質。
【請求項１２】
受容体拮抗ドメインがアポトーシス促進ドメインである、請求項１１記載のタンパク質。
【請求項１３】
アポトーシス促進ドメインがプロラクチン拮抗剤ドメインである、請求項１２記載のタンパク質。
【請求項１４】
正の免疫調節物質ドメインがインターロイキンである、請求項１２記載のタンパク質。
【請求項１５】
インターロイキンがインターロイキン２（ＩＬ−２）である、請求項１４記載のタンパク質。
【請求項１６】
正の免疫調節物質ドメインがＩＬ−１２である、請求項１４記載のタンパク質。
【請求項１７】
正の免疫調節物質ドメインがＩＦＮγである、請求項１４記載のタンパク質。
【請求項１８】
タンパク質が、プロラクチン拮抗剤−インターロイキン２（ｈＰＲＬＡ−ＩＬ−２）融合タンパク質である、請求項１２記載のタンパク質。
【請求項１９】
プロラクチン拮抗剤ドメインが、プロラクチンドメインの１２９位に対応する位置での、グリシンからアルギニンへの一アミノ酸置換を特徴とする、請求項１３記載のタンパク質。
【請求項２０】
プロラクチン拮抗剤ドメインが、配列番号：１（ｈＰＲＬＡ）のアミノ酸配列を有するタンパク質またはその保存的変異体を含む、請求項１３記載のタンパク質。
【請求項２１】
プロラクチン拮抗剤ドメインが、本来のプロラクチン配列の切断型またはその保存的変異体を含む、請求項１３記載のタンパク質。
【請求項２２】
癌がプロラクチン受容体を発現するものとして特徴づけられる、請求項３記載の方法。
【請求項２３】
配列番号：１のアミノ酸配列を有する第一ドメインまたはその保存的変異体、および正の免疫調節物質ドメインを含む、タンパク質。
【請求項２４】
受容体拮抗ドメインがアポトーシス促進ドメインである、請求項１記載の方法。
【請求項２５】
アポトーシス促進ドメインが、標的細胞においてＳＴＡＴ３リン酸化を阻害することによって機能する、請求項２４記載の方法。
【請求項２６】
アポトーシス促進ドメインが、標的細胞においてＳＴＡＴ３リン酸化を阻害することによって機能する、請求項１２記載のタンパク質。
【請求項２７】
治療的有効量の請求項１１記載のタンパク質、および適量の担体賦形剤を含む、薬学的組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明は全般的に、癌を治療するために融合タンパク質を調製し、かつ用いる方法に関する。
【０００２】
発明の背景
ヒト乳癌は、ミラー（Ｍｉｌｌｅｒ）ら編、「女性の癌の生物学（Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｆｅｍａｌｅ Ｃａｎｃｅｒｓ）」、３１〜４２頁（ＣＲＣ出版、１９９７）に報告されたように、悪性度が高く、西欧社会の女性における癌による死因の第一位である。全米癌学会による最近の推定によれば、１９９８年にはアメリカ人女性８人に１人が乳癌を有し、この疾患のために女性４３，５００人が死亡すると考えられる。
【０００３】
いくつかの系列の証拠から、プロラクチン（ＰＲＬ）は乳癌の発達に強く関連づけられている。プロラクチン受容体（ＰＲＬＲ）の発現レベルは、正常な乳腺上皮細胞と比較して、ヒト乳癌細胞のみならず（レイノルズ（Ｒｅｙｎｏｌｄｓ）ら、１９９７）、手術によって摘出した乳癌組織（ツーレイン・マルティニ（Ｔｏｕｒａｉｎｅ， Ｍａｒｔｉｎｉ Ｐ．）ら、「ヒト乳腺癌対隣接する正常乳腺組織における、プロラクチン受容体遺伝子の発現の増加（Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｏｆ Ｐｒｏｌａｃｔｉｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｇｅｎｅ Ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｂｒｅａｓｔ Ｔｕｍｏｒｓ Ｖｅｒｓｕｓ Ｃｏｎｔｉｇｕｏｕｓ Ｎｏｒｍａｌ Ｂｒｅａｓｔ Ｔｉｓｓｕｅｓ）」、抄録、第７９回全米内分泌学会総会、ｐ１１３、（１９９７））において高いと報告されている。悪性乳腺組織におけるＰＲＬＲレベルは、その周辺の正常組織よりも５倍高くなることがあり（ツーレイン（Ｔｏｕｒａｉｎｅ）ら（１９９７）、上記を参照）、このため、これらの細胞はｈＰＲＬに対して非常に感受性が高くなる。さらに、ＰＲＬＲ、エストロゲン受容体（ＥＲ）、またはプロゲステロン受容体レベルのあいだに正の相関が存在することから、乳房におけるエストロゲンの分裂誘起作用の一つの機構は、ヒトプロラクチン（ｈＰＲＬ）の産生および分泌に影響を及ぼす可能性があることが示唆されている（サーバスク（Ｓｉｒｂａｓｋｕ）、１９７８；ディクソンおよびリップマン（ＤｉｘｏｎおよびＬｉｐｐｍａｎ）、１９８６；リップマンおよびディクソン（ＬｉｐｐｍａｎおよびＤｉｃｋｓｏｎ）、１９８９）。併せて考慮すると、これらの知見から、ｈＰＲＬが、乳癌形成において重要な役割を有する自己分泌／傍分泌増殖因子として働くという仮説が得られる（クレベンガー（Ｃｌｅｖｅｎｇｅｒ）ら、Ａｍ． Ｊ． Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ， １４６：６９５〜７０５（１９９５）；ギンスバーグ（Ｇｉｎｓｂｕｒｇ， Ｅ．）ら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５５：２５９１〜２５９５（１９９５））。
【０００４】
ＰＲＬ発現と前立腺疾患との関連も同様に、ウェンボ（Ｗｅｎｎｂｏ）ら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ． １３８：４４１０〜４４１５（１９９７）によって提唱されている。ＰＲＬ受容体は、アラゴナ（Ａｒａｇｏｎａ）ら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ． ９７：６７７〜６８４（１９７５）およびリーキ（Ｌｅａｋｅ）ら、Ｊ． Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ． ９９：３２１〜３２８（１９８３）に報告されているように、前立腺組織に認められる。さらに、ＰＲＬレベルは、年齢と共に増加しうることが認められ、これは前立腺過形成の発達と一致する（ハモンド（Ｈａｍｍｏｎｄ）ら、Ｃｌｉｎ． Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ． ７：１２９〜１３５（１９７７）、ベケマンスら（Ｖｅｋｅｍａｎｓ）ら、Ｂｒ． Ｍｅｄ． Ｊ． ４：７３８〜７３９（１９７５））。ＰＲＬ遺伝子を過剰発現するトランスジェニックマウスは、前立腺の劇的な肥大を起こした（ウェンボら（Ｗｅｎｎｂｏ）（１９７７）、上記を参照のこと）。
【０００５】
乳癌と前立腺癌の双方に対するこの連鎖を考慮すると、ＰＲＬシグナル伝達は治療的介入にとって魅力的な標的となる。しかし、これまでこの目的に適した薬剤は利用されていない。
【０００６】
免疫学的アプローチは癌の治療において非常に有望である。癌が腫瘍特異的抗原を発現し、かつ患者がこれらの抗原に反応しうるＴ細胞を有する証拠は十分に存在する（ブーン、トワード（Ｂｏｏｎ， Ｔｏｗａｒｄ Ｔ．）、「ヒト腫瘍拒絶抗原の遺伝子分析（Ａ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｔｕｍｏｒ Ｒｅｊｅｃｔｉｏｎ Ａｎｔｉｇｅｎｓ）」、Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５８：１７７〜２１０（１９９２）；アーバン（Ｕｒｂａｎ， ＪＬ）ら、「腫瘍抗原（Ｔｕｍｏｒ Ａｎｔｉｇｅｎｓ）」、Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｉｍｍｕｎｏ． １０：６１７〜６４４（１９９２））。しかし、これらのＴ細胞は、多くの場合アネルギーであるか、またはそうでなければ癌と闘う場合に無効である。これまでは、腫瘍の治療に対する免疫学的アプローチの主な努力は、患者への外部からのサイトカインの投与のような、腫瘍抗原に対する宿主の弱い免疫応答を増強することである。
【０００７】
用いた多くのサイトカインの中で、インターロイキン２（ＩＬ−２）は、有望な結果を有することが証明された。ＩＬ−２は、Ｔリンパ球の細胞周期のＧ１からＳ期への進行に関与する、主なサイトカインである（モーガン（Ｍｏｒｇａｎ）ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ １９３：１００７〜１００８（１９７９）を参照のこと）。リンパ球に及ぼすＩＬ−２の主な作用は、以下の通りである：（１）Ｔリンパ球の主要な自己分泌増殖因子としてのＩＬ−２は、Ｔ細胞依存的免疫応答の程度を決定する。（２）ＩＬ−２は、ヘンドルザック（Ｈｅｎｄｒｚａｋ）ら、「実験物質と臨床物質（ＥｘｐｅｒｉｍａｎｔａｌおよびＣｌｉｎｉｃａｌ Ａｇｅｎｔｓ）」、２６３〜２８２、ヒュマナ出版、（１９９７）に報告されているように、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の増殖を刺激して、その細胞溶解作用を増強する。
【０００８】
しかし、ＩＬ−２の全身投与を受けた癌患者は投与できる総量を制限する、生命を脅かす可能性のある副作用を経験することが多く、これは治療の有効性に直接影響を及ぼす（ローゼンバーグ（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ）ら、Ｎ． Ｅｎｌ． Ｊ． Ｍｅｄ． ３１９：１６７６〜１６８０（１９８８）；マース（Ｍａａｓ）、Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ １８８：２８１〜２９２（１９９３））。したがって、腫瘍の治療においてＩＬ−２を用いることに関する主な努力は、副作用と有効量の平衡を保つこと、すなわち投与したＩＬ−２の特異性を増加させて（腫瘍部位に正確にＩＬ−２をターゲティングする）、それによって高い全身用量によって誘発される副作用を劇的に減少させる方法および手段に、集中されてきた。
【０００９】
フォルニ（Ｆｏｒｎｉ）Ｇ．ら 、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １３８：４０３３〜４０４１（１９８７）は、ＩＬ−２の生理的用量を腫瘍に直接注入すると、その増殖の抑制を引き起こすことを証明した。このインサイチュー適用の主な長所は、それによってサイトカインの全身的使用に関連した毒性が減少することであるが、全ての腫瘍の正確な位置を知る必要があるという短所を有し、これは広汎な転移を有する患者では特に問題となる。
【００１０】
毒性を減少させるさらなる努力は、ガンスバッカー（Ｇａｎｓｂａｃｈｅｒ）ら、Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １７２：１２１７〜１２２４（１９９０）；フェアロン（Ｆｅａｒｏｎら）、Ｃｅｌｌ ６０：３９７〜４０３（１９９０）；およびパードル（Ｐａｒｄｏｌｌ）， Ｄ．Ｍ．、Ｉｍｍｕｎ． Ｔｏｄａｙ １４：３１０〜３１６（１９９３）において報告されているように、ＩＬ−２を分泌するトランスフェクト腫瘍細胞を注入すると、非改変腫瘍細胞によるその後の攻撃の際に、特異的Ｔ細胞依存的免疫を誘導できることを示した。しかし、ライスフェルド（Ｒｅｉｓｆｅｌｄ）ら、Ｃｕｒｒ． Ｔｏｐ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２１３：２７〜５３（１９９６）は、そのようなアプローチが、個々の患者の腫瘍細胞の単離、トランスフェクション、および再投与を含むことから、そのようなアプローチの臨床適用が時間を浪費して費用が高いことを認めた。
【００１１】
最近、サイトカインを腫瘍部位に向けるために、抗腫瘍モノクローナル抗体（ｍＡｂ）の結合特異性を用いるもう一つのアプローチが導入されている。ライスフェルドら（Ｒｅｉｓｆｅｌｄ、１９９６）を参照のこと。このアプローチは、ｍＡｂの独自のターゲティング能をサイトカインの多機能活性と組み合わせ、したがって、腫瘍環境においてＩＬ−２の有効な濃度を得る。標的化ＩＬ−２治療は、ギリース（Ｇｉｌｌｉｅｓ）ら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８９：１４２８〜１４３２（１９９２）；およびサブゼバリ（Ｓａｂｚｅｖａｒｉ）ら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９１：９６２６〜９６３０（１９９４）において示されるように、免疫コンピテントの同系マウスにおける播種性の肺および肝マウス黒色腫転移を、完全に根治することができる。
【００１２】
この標的化ＩＬ−２治療には長所がある。例えば、この治療は、これが直接の細胞障害性反応ではないために、他のｍＡｂ標的化治療の場合のように、最大の効果を得るためにｍＡｂ−ＩＬ−２融合タンパク質が全ての標的細胞に達する必要がない。ライスフェルドら（Ｒｅｉｓｆｅｌｄ、１９９６）、上記。最も重要な点は、標的化ＩＬ−２治療の治療効果が、長期間持続する移入可能な保護腫瘍免疫の誘導に関連している点である。このｍＡｂ標的化ＩＬ−２治療はまた、これが普遍的な腫瘍環境においてＩＬ−２を濃縮することから、サイトカイン遺伝子のエキソビボ移入とは異なって都合がよく、それによってこのアプローチは臨床的により実現可能となる。
【００１３】
標的化免疫療法アプローチは癌の治療において有望であるが、ＰＲＬに拮抗する作用と標的化ＩＬ−２の作用を組み合わせる治療利益は、癌の治療において不明である。したがって、癌の維持または増殖におけるＰＲＬの役割に拮抗し、同時に癌に対する患者の免疫応答を増強する物質および治療を開発する必要がある。
【００１４】
発明の概要
したがって、本発明の目的は、癌細胞におけるプロラクチンシグナル伝達機構を妨害することができる薬剤を提供することである。
【００１５】
本発明のさらにもう一つの目的は、癌細胞にアポトーシスを誘導する薬剤を提供することである。
【００１６】
本発明のさらなる目的は、受容体拮抗ドメインおよび正の免疫調節物質ドメインを含む薬剤を提供することである。
【００１７】
本発明のなおもう一つの目的は、標的癌細胞に存在する受容体に拮抗して、同時に癌に対する患者の免疫応答を増強することによって、癌を有する患者を治療する方法を提供することである。
【００１８】
本発明のもう一つの目的は、本明細書に記載の薬剤を用いることによって癌を治療する方法を提供することである。
【００１９】
以下の開示を読むことによって、より容易に明らかとなると考えられるこれらの目的および他の目的は、本発明によって達成される。
【００２０】
物質の組成に関する局面において、本発明は、受容体拮抗ドメインおよび正の免疫調節物質ドメインを含むタンパク質に実質的に関する。本発明はさらに、受容体拮抗ドメインはアポトーシス促進ドメインであってよく、正の免疫調節物質ドメインはインターロイキンであってよいことをさらに提供する。受容体拮抗ドメインはまた、配列番号：１のアミノ酸配列またはその保存的変異体でありうる。
2004504272.tif 000003
【００２１】
方法論の局面において、本発明は、受容体拮抗ドメインおよび正の免疫調節物質ドメインを有するタンパク質の有効量を、患者に投与する段階を含む、癌を治療する方法に関する。本発明はさらに、本明細書に記載の任意のタンパク質を患者に投与する方法論を提供する。
【００２２】
好ましい態様の詳細な説明
内分泌に基づく治療および標的化サイトカイン治療の併用効果は、癌の治療を大いに増強することが発見されている。例えば、本明細書に開示する治療の産物および方法は、ＰＲＬＲを阻害することによって内因性ＰＲＬの自己分泌／傍分泌作用を阻害して、一般的にアポトーシスに至るように作用する。さらに、このアプローチは免疫応答を正に調節し、それによって特に悪性組織において腫瘍特異的Ｔリンパ球細胞障害性を誘導する。
【００２３】
本明細書において用いられるように、「アポトーシス」とは、それによって発生的または環境的刺激が、一連の特異的な事象を実行するための遺伝子プログラムを活性化させ、最終的に細胞の死および効率的な処理に至る過程を意味する。細胞における形態学的変化には、小胞体の拡張および細胞質膜の回旋を伴う細胞容積の劇的な縮小が含まれる。今度はこれにより、構造的に正常であるが圧縮されたオルガネラを含む、一連の膜結合体へと細胞が破壊される。核は不連続な染色質の濃縮を受けて、ヌクレアーゼが媒介するＤＮＡ断片化が起こり、染色体ＤＮＡを小さなオリゴヌクレオソーム断片に分解する。核および細胞質は濃縮して、死につつある細胞は、最終的に膜結合アポトーシス体に断片化して、これはマクロファージまたは隣接する細胞によって迅速に貪食され、消化される。
【００２４】
本発明は、各ドメインがこれらの機能の一つを実行する能力を有する、多ドメイン分子を利用することによって、ＰＲＬＲを阻止する段階および免疫応答を正に調節する段階に関連した利益を組み合わせる。典型的な分子は、「正の免疫調節物質ドメイン」と組み合わせた「受容体拮抗ドメイン」または「アポトーシス促進ドメイン」を有する。
【００２５】
本明細書において用いられるように、「受容体拮抗ドメイン」は、受容体に結合すると、受容体拮抗ドメインが一つまたは複数の細胞過程を阻害するように作用し、それによって疾患の病因または維持を妨害する、癌のような障害に関連する受容体に特異的に結合するリガンドである。アポトーシスを誘導するそのようなドメインは、本明細書において「アポトーシス促進ドメイン」と呼ばれ、「正の免疫調節物質ドメイン」は、免疫応答を増強する、好ましくは、癌細胞のような異常細胞に対する免疫応答を増強するドメインである。そのような免疫応答は一般的に、Ｔ細胞を動員する段階、および例えばその細胞障害機能を増強する段階を伴う。
【００２６】
これらの特徴を有する融合タンパク質の利益は限りない。例えば、腫瘍形成組織はしばしば、一つまたは複数のタンパク質受容体レベルの増加を特徴とする。これらの受容体の一つに対して特異的なドメインを含む融合タンパク質はまた、癌組織を特異的にターゲティングすることができると考えられる。受容体拮抗ドメインは、アポトーシス促進ドメインの場合のように、癌の病因を破壊するか、または癌の維持を妨害するが、分子の受容体拮抗部分は直接の治療効果を有する。さらに、正の免疫調節物質ドメインの存在により、分子は、疾患組織に対して特異的に反応する患者自身の免疫系を誘導することによって、二次的な治療効果を有する。
【００２７】
したがって、本発明に従う治療を受ける候補者には、その腫瘍が腫瘍の維持または増殖に関連する少なくとも一つの受容体の存在を特徴とする、悪性腫瘍を有する人が含まれる。好ましい態様において、融合タンパク質の受容体拮抗ドメインは、標的とする膜結合受容体に結合するアポトーシス促進ドメインである。そのような結合はアポトーシスを誘導する；同時に、正の免疫調節物質ドメインが、腫瘍特異的な動員およびＴリンパ球細胞障害性の増強を誘導する。
【００２８】
本発明の双機能タンパク質：
本発明に従って、悪性組織に対して独自の二重の治療効果、すなわち（ａ）受容体拮抗および／またはアポトーシス促進（１つで同一であってもよい）および（ｂ）正の免疫調節、を有する双機能タンパク質が意図される。本発明はまた、本発明の双機能タンパク質をコードする核酸（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）を意図する。
【００２９】
受容体拮抗ドメイン
本発明は、一つの局面において、正の免疫調節物質ドメインの作用を、疾患を有する組織に限局する第一のドメインを意図する。例えば、発癌組織はしばしば一つまたは複数のタンパク質受容体レベルの増加を特徴とする。これらの受容体の一つに対して特異的なドメインを含む融合タンパク質は、癌組織を特異的に標的とすることができ、その結果、局所的な腫瘍細胞障害性反応が標的組織に向けられる。
【００３０】
一つの態様において、特定の受容体部位を標的とするドメインは、その名称が示唆するように、その対応する受容体に結合して拮抗する受容体拮抗ドメインである。好ましい態様において、受容体拮抗ドメインは、アポトーシス促進ドメインである。受容体拮抗ドメインを利用する、この目的の治療アプローチは、正の免疫調節物質ドメイン（例えば、ＩＬ−２）の全身濃度の劇的な減少を提供し、それによってインビボでのその毒性を減少させるように設計される。
【００３１】
この双機能分子のさらなる治療的恩典は、受容体拮抗ドメインが一般的に内分泌阻害能を有する点である。したがって、受容体拮抗ドメインが、例えばプロラクチン拮抗剤である場合、プロラクチンの正常な内分泌機能は妨害されると考えられる。この内分泌阻止の結果として、プロラクチンおよび類似の分子の場合、例えば、標的細胞のアポトーシスがその結果として起こりうる。その場合、受容体拮抗ドメインはまた、アポトーシス促進ドメインでもある。
【００３２】
アポトーシス促進ドメインの場合、そのようなドメインは一般的にアポトーシスの予防に関係する、細胞成分の正常な機能の拮抗剤を作製することによって設計される。乳癌および前立腺癌組織の双方において、例えば、発癌および悪性細胞増殖は、少なくとも部分的にＰＲＬＲレベルの増加によって刺激される。ＰＲＬＲによるシグナル伝達は、プロラクチン受容体の二量体形成によって媒介され、受容体の二量体形成そのものは、受容体結合プロラクチン分子の二量体形成によって媒介されることが公知である。２つのＰＲＬＲに内因性ＰＲＬが結合すると、ＰＲＬＲの二量体形成を誘導し、それによって癌細胞へのシグナル伝達を誘発する。したがって本発明の一つの態様は、プロラクチン拮抗剤（ＰＲＬＡ）（すなわち、プロラクチン拮抗剤ドメイン）を用いて、プロラクチンの正常なアポトーシス阻害機能に拮抗する段階を含む。
【００３３】
ＰＲＬＲシグナル伝達経路におけるシグナル伝達は、転写シグナル伝達物質および活性化物質（ＳＴＡＴ）のリン酸化を必然的に伴い、これはＰＲＬＲアゴニズムの正常な結果であるアポトーシスの予防または阻止に関係する。このように、Ｇ１２９Ｒ拮抗剤は、ヒト乳癌細胞におけるＳＴＡＴ ５リン酸化を阻害することによって、アポトーシスを促進する。したがって、ＰＲＬＲを遮断すると、ＳＴＡＴ ５を含む内因性ＰＲＬの自己分泌／傍分泌作用が阻害され、その結果アポトーシスが起こる。このように、本発明によって意図される一つのクラスのアポトーシス促進化合物は、ＳＴＡＴ ５リン酸化を阻害することができる化合物である。
【００３４】
本発明によって意図される適切なＰＲＬＡは、一般に、ＰＲＬＲに対する特異的結合の特徴を保持するが、正常なＰＲＬアポトーシス阻止機構を妨害する、いくつかの構造上の欠陥をさらに有すると考えられる。そのような構造上の欠陥には、ＰＲＬ（およびしたがってＰＲＬＲ）を妨害する欠陥が含まれる。
【００３５】
一つの好ましい態様において、配列番号：１に示すように、この構造的欠陥は、ｈＰＲＬにおける１２９位に対応する位置の、グリシンのアルギニンへの置換である（ｈＰＲＬ−Ｇ１２９Ｒと呼ぶ）。実施例４、５、および６に示す細胞に基づくアッセイ法と共に、図３および４は、この変異したｈＰＲＬが真のｈＰＲＬＲ拮抗剤として作用することを証明する。したがって、ｈＰＲＬ−Ｇ１２９Ｒのような受容体拮抗ドメインは、特定の型の癌を治療するための治療的薬剤として役立ちうる。
【００３６】
この態様は、表１に示す、ＰＲＬの第三のαヘリックス領域内のアミノ酸配列の種間比較を開示する、チェン（Ｃｈｅｎ）ら、Ｃｌｉｎ． Ｃａｎ． Ｒｅｓ． ５：３５８３〜９３（１９９９）によって支持される。
【００３７】
【表１】
2004504272.tif 000004
【００３８】
表１に従って、ｈＰＲＬのグリシン１２９位はＰＲＬにおいて不変であることは明白であり、このことはその機能における重要な役割を示唆している。したがって、Ｇ１２９の代わりに任意のアミノ酸も用いると、これらの種のそれぞれにおいてＰＲＬＡを産生するはずである（チェン（Ｃｈｅｎ）ら、Ｍｏｌｅｃ． Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．（１９９５））。一つの態様において、拮抗剤はグリシン１２９位の代わりにアルギニンのような、比較的かさ高い側鎖アミノ酸を用いることによって作製される。したがって、本発明の一つの局面は、かさ高い側鎖アミノ酸の代わりに小さな側鎖アミノ酸を用いると、タンパク質の拮抗剤型が得られるように、特定の位置での比較的小さな側鎖アミノ酸（すなわち、グリシン）の存在を特徴とする、ＰＲＬの保存的変異体を意図する。
【００３９】
本発明の受容体拮抗ドメインにはまた、本明細書において考察した受容体拮抗ドメインの保存的変異体が含まれる。本発明のドメインの全体的な構造および組成は、その点においてそれらが適当な機能的特徴、すなわち受容体の拮抗作用、アポトーシスの誘導、正の免疫調節を付与する限り、重要である。
【００４０】
本発明に従う保存的変異体は、一般的に、タンパク質ドメインの全体的な分子構造を保存する。開示のタンパク質産物を含む個々のアミノ酸の特性を意図すると、いくつかの合理的な置換が明白であると考えられる。アミノ酸置換、すなわち、「保存的置換」は、例えば、関与する残基の極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性、および／または両親媒性特性における類似性に基づいて行ってもよい。
【００４１】
例えば：（ａ）非極性（疎水性）アミノ酸には、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、およびメチオニンが含まれる；（ｂ）極性中性アミノ酸には、グリシン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、およびグルタミンが含まれる；（ｃ）正荷電（塩基性）アミノ酸には、アルギニン、リジン、およびヒスチジンが含まれる；ならびに（ｄ）負荷電（酸性）アミノ酸には、アスパラギン酸およびグルタミン酸が含まれる。置換は一般的に（ａ）〜（ｄ）のグループ内で行ってもよい。さらに、グリシンおよびプロリンは、そのαヘリックス破壊能に基づいて互いに置換してもよい。同様に、アラニン、システイン、ロイシン、メチオニン、グルタミン酸、グルタミン、ヒスチジン、およびリジンのような特定のアミノ酸は、αヘリックスにおいてより一般的に認められ、バリン、イソロイシン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、およびトレオニンは、βプリーツシートにおいてより一般的に認められる。グリシン、セリン、アスパラギン酸、アスパラギンおよびプロリンは、ターン構造において一般的に認められる。以下の群におけるいくつかの好ましい置換を行ってもよい：（ｉ）ＳおよびＴ；（ｉｉ）ＰおよびＧ；ならびに（ｉｉｉ）Ａ、Ｖ、Ｌ、およびＩ。既知の遺伝子コード、ならびに組換えおよび合成ＤＮＡ技術があれば、当業者は保存的アミノ酸変異体をコードするＤＮＡを容易に構築することができると考えられる。
【００４２】
保存的変異体は特に、本明細書に記載の受容体拮抗ドメインの切断型を意図する。切断は、Ｎ末端またはＣ末端から作製してもよいが、一般に本来の分子の約３０％を超える欠失は伴わない。より好ましくは、本来の分子の約２０％未満、および最も好ましくは約１０％未満を欠失させる。
【００４３】
一般に、本発明のＤＮＡおよびタンパク質分子はいずれも、「配列同一性」を参照して定義することができる。いくつかの分子は、少なくとも約５０％、５５％、または６０％の同一性を有する。好ましい分子は少なくとも約６５％の配列同一性、より好ましくは少なくとも７０％の配列同一性を有する分子である。他の好ましい分子は少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも８５％の配列同一性を有する。最も好ましい分子は、少なくとも約９５％、より好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有する。本明細書において用いられるように、二つの核酸分子またはタンパク質は、二つが８５％を超える配列（アミノ酸または核酸）同一性を有する領域を含む場合、「有意な配列同一性を共有する」と言われる。
【００４４】
「配列同一性」は、本明細書において、ＮＣＢＩ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ）で入手できるＢｌａｓｔ ２アルゴリズムを参照して、デフォルトパラメータを用いて定義される。このアルゴリズムに関する参考文献には以下が含まれる：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／ｂｌａｓｔ＿ｒｅｆｅｒｅｎｃｅｓ．ｈｔｍｌにおいて認められる文献；アルトシュル、ギッシュ、ミラー、マイヤースおよびリップマン（Ａｌｔｓｃｈｕｌ， Ｓ．Ｆ．， Ｇｉｓｈ， Ｗ．， Ｍｉｌｌｅｒ， Ｗ．， Ｍｙｅｒｓ， Ｅ．Ｗ．およびＬｉｐｍａｎ， Ｄ．Ｊ．、（１９９０）「基本局所アラインメント検索手段（Ｂａｓｉｃ ｌｏｃａｌ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｓｅａｒｃｈ ｔｏｏｌ）」、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２１５：４０３〜４１０）；ギッシュおよびステイツ（Ｇｉｓｈ， Ｗ．およびＳｔａｔｅｓ， Ｄ．Ｊ．、（１９９３）、「データベース類似性検索によるタンパク質コード領域の同定（Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｄｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎｓ ｂｙ ｄａｔａｂａｓｅ ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ ｓｅａｒｃｈ）」、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ． ３：２６６〜２７２）；マッデン、タツソフおよびザング（Ｍａｄｄｅｎ， Ｔ．Ｌ．， Ｔａｔｕｓｏｖ， Ｒ．Ｌ．，およびＺｈａｎｇ， Ｊ．、（１９９６）、「ネットワークＢＬＡＳＴサーバーの応用（Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｎｅｔｗｏｒｋ ＢＬＡＳＴ ｓｅｒｖｅｒ）」、Ｍｅｔｈ． Ｅｎｚｙｍｏｌ． ２６６：１３１〜１４１）；アルトシュル、マッデン、シェーファー、ザング、ザング、ミラーおよびリップマン（Ａｌｔｓｃｈｕｌ， Ｓ．Ｆ．， Ｍａｄｄｅｎ， Ｔ．Ｌ．， Ｓｃｈａｆｆｅｒ， Ａ．Ａ．， Ｚｈａｎｇ， Ｊ．， Ｚｈａｎｇ， Ｚ．， Ｍｉｌｌｅｒ， Ｗ．およびＬｉｐｍａｎ， Ｄ．Ｊ．、（１９９７）、「ギャップトＢＬＡＳＴおよびＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ：タンパク質データベース検索プログラムの新世代（Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴおよびＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ：ａ ｎｅｗ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄａｔａｂａｓｅ ｓｅａｒｃｈ ｐｒｏｇｒａｍｓ）」、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２５：３３８９〜３４０２）；ならびにザングおよびマッデン（Ｚｈａｎｇ， Ｊ．およびＭａｄｄｅｎ， Ｔ．Ｌ．、（１９９７）、「パワーＢＬＡＳＴ：相互または自動配列分析および注釈のための新しいネットワークＢＬＡＳＴの応用（ＰｏｗｅｒＢＬＡＳＴ：Ａ ｎｅｗ ｎｅｔｗｏｒｋ ＢＬＡＳＴ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｖｅ ｏｒ ａｕｔｏｍａｔｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ａｎｄ ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ）」、Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ． ７：６４９〜６５６）。したがって、表１に記載の配列を含む、異なる種由来のプロラクチンペプチド配列は、その本質的機能を保存するプロラクチン由来受容体拮抗ドメインにおける、さらなる変動に関する情報を与えるために、ＢＬＡＳＴのような標準的なコンピュータープログラムを用いて整列させることができる。
【００４５】
本明細書に開示の保存的変異体であるタンパク質に加えて、本発明はまた、腫瘍の増殖誘導において役割を果たすタンパク質を用いることを意図し、ここでアミノ酸の置換によってタンパク質がこの増殖を誘導する能力が阻害される。例えば、ウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）およびｈＧＨのグリシン１１９位およびグリシン１２０位はそれぞれ、成長増強を刺激するＧＨの作用において重要な役割を有する。成長ホルモン受容体（ＧＨＲ）の二量体形成は、ＨＧシグナル伝達にとっての重要な段階であると考えられる。したがって、これらの各位置での何らかのアミノ酸置換（アラニン以外）、特にアルギニンのようなかさ高い側鎖へのアミノ酸置換は、受容体の二量体形成を妨害し、その結果成長ホルモン拮抗剤（ＧＨＡ）となる。このように、ＧＨＡのような拮抗剤が本発明によって意図される。
【００４６】
アポトーシスの予防に関係する細胞成分の正常な機能に拮抗することに加えて、本発明はさらに、アポトーシス促進ドメインの意味において、積極的な手段によってアポトーシスを誘導する物質を含む。すなわち、そのような物質は、抗アポトーシス経路に拮抗することによって作用しない；むしろ、それらはアポトーシス経路を誘導する。そのような物質の例は、ケレリトリンを含むプロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）阻害剤である。
【００４７】
ベンゾフェナントリジンアルカロイドであり、トッダリンとしても知られるケレリトリン（１，２−ジメトキシ−１２−メチル［１，３］ベンゾジオキソロ［５，６−ｃ］フェナントリジニウム；Ｃ２１Ｈ１８ＮＯ４）は、クサノオウ（Ｃｈｅｌｉｄｏｎｉｕｍ ｍａｊｕｓ）、ザントキシラム・シミュランス（Ｚａｎｔｈｏｘｙｌｕｍ ｓｉｍｕｌａｎｓ）、サンギナリア・カンデンシス（Ｓａｎｇｕｉｎａｒｉａ ｃａｎｄｅｎｓｉｓ）（またはブラッドルート）、タケニグサ（Ｍａｃｌｅａｙａ ｃｏｒｄａｔａ）、カリダリ・セブクトコジイ（Ｃａｒｙｄａｌｉ ｓｅｖｃｔｏｃｏｚｉｉ）、カリダリ・レデバウニ（Ｃａｒｙｄａｌｉ ｌｅｄｅｂｏｕｎｉ）、クサノオウ（Ｃｈｅｌｉｄｏｎｉｕｍ ｍａｊｕｓ）、および他のケシ科植物から純粋な形で、または他のベンゾフェナントリジンアルカロイドとの混合物のいずれかとして抽出することができる。
【００４８】
ＰＫＣの阻害剤は、活性化が起こると、基質結合部位（ＡＴＰもしくはタンパク質）または調節ドメイン（ジアシルグリセロールもしくはホルボルエステル結合部位）と相互作用することができる。ケレリトリンは、ＰＫＣの触媒ドメインと直接相互作用する。これは同定されたＰＫＣの最も強力な阻害剤の一つであり、他のどのタンパク質キナーゼも阻害しないと考えられる。例えば、ケレリトリンは、ハーバート（Ｈｅｒｂｅｒｔ）ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ． １７２：９９３（１９９０）によって議論されるように、細胞増殖および分化を阻害することによって、Ｌ−１２１０腫瘍細胞に対して強力な細胞障害作用を示し、ＩＣ５０値は０．０５３ μＭである。ケレリトリンはＰＫＣを濃度依存的に特異的に阻害することによってアポトーシスを誘導し、アラキドン酸およびコラーゲンのような、強い凝集誘導剤によって誘導される血小板の凝集を強力に阻害する。
【００４９】
このように腫瘍細胞に導入されると、塩化ケレリトリンはアポトーシス閾値を低下させ、アポトーシスを誘発することができる。これは、ケレリトリン治療を他の治療方法と組み合わせて用いる場合に特に当てはまる。したがって、例えば癌と闘うために用いられるもう一つの分子、例えば正の免疫調節物質ドメインと融合したケレリトリンを含む融合分子が、本発明によって意図される。ケレリトリンを含む分子は、例えば多機能架橋剤を用いて、従来の化学的手段によってもう一つの分子（すなわち、本明細書に記載のドメイン）に融合させることができる。タンパク質に基づくＰＫＣ阻害剤は、融合タンパク質として作製してもよい。
【００５０】
正の免疫調節物質ドメイン
本発明はまた、正の免疫調節物質として作用する、さらなる、しかし別のドメインを意図する。好ましい免疫調節物質ドメインは、腫瘍に向けられる正の免疫応答を支持する。適した正の免疫調節物質の例には、Ｔリンパ球を腫瘍に動員し、それによって悪性組織での腫瘍特異的Ｔリンパ球細胞障害性を誘導することができるサイトカインが含まれる。好ましい態様において、正の免疫調節物質はＴ細胞依存的免疫応答の程度を制御できることを特徴とする、ＩＬ−２である。ＩＬ−２はまた、マクロファージおよび単球に対して活性を有する。さらに、ＩＬ−２はナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の増殖を刺激し、その細胞溶解作用を増強する。
【００５１】
ＩＬ−２の他に、本発明は、これらのまたは類似の特性を有するさらなるサイトカインを含む、他の分子を意図する。例えば、ＩＬ−１２は、正の免疫調節物質ドメインを提示することができる。ＩＬ−１２は、Ｔ細胞反応をＴｈ１型に向けるための重要なサイトカインである。ＩＬ−１２は、Ｂ細胞および単球／マクロファージによって産生され、ＩＬ−２と相乗的に作用して、Ｔ細胞およびＮＫ細胞によるＩＦＮγ産生を誘導する。これは同様に、Ｔ細胞とＮＫ細胞の双方の細胞障害活性を増強する。本発明にはまた、前述の正の免疫調節物質ドメインの保存的変異体（上記のように）が含まれる。
【００５２】
正の免疫調節物質ドメインのその他の適した候補物質には、インターフェロン（ＩＦＮ）が含まれる。例えば、ＩＦＮ−βはそれ自身、腫瘍の細胞増殖を阻害することが知られている。ＩＦＮ−βは抗腫瘍活性に関する普遍的なマクロファージ活性化剤である。したがって、アポトーシス促進ドメインと結合したＩＦＮ−βを含む融合分子は、標的組織に限局された正の免疫調節による治療を提供すると考えられる。
【００５３】
典型的な双機能分子の調製：
本発明によって意図される双機能タンパク質は、先に述べたドメインのそれぞれ、すなわち受容体拮抗ドメイン（同様に、アポトーシス促進ドメインであってもよい）および正の免疫調節物質ドメインを含むタンパク質であり、そのような融合の際に、双方のドメインは互いに独立して、実質的にその関連する特徴を保持している。図２は、これらの特徴に従う本発明の一つの態様を開示する。ドメインは融合タンパク質として一般的に産生されるが、ドメインはまた、例えば多機能架橋剤を用いて従来の化学的手段によって融合してもよい。融合タンパク質を作製する場合、いずれかのドメインをもう一方のＣ末端またはＮ末端に配置してもよい。
【００５４】
一つの態様において、融合タンパク質は、図１に示すようにｈＰＲＬＡ−ＩＬ−２タンパク質である。この融合タンパク質は、実施例１および図５に示すように発現ベクターに組み入れることができる。次に、産生された発現ベクターを安定な細胞株にトランスフェクトして、その後精製タンパク質を産生することができる。実施例２および３は、ベクターの形質転換および精製過程を実行するための、非制限的な手法である。この融合タンパク質は、ＩＬ−２のＮ末端側に融合したＰＲＬＡのＣ末端を有し、これを図５に示す。しかし、本発明はまた、本明細書に記載のドメインを有する任意の融合タンパク質を意図する。
【００５５】
融合タンパク質を作製するための適した方法は、これらのドメインのいずれかの生物活性を実質的に変化させない方法でなければならない。例えば、ＩＬ−２のＮ末端を抗体のＣ末端に融合させても、ＩＬ−２の生物活性は変化しないことが証明されている。ライスフェルド（Ｒｅｉｓｆｅｌｄ）ら（１９９６）、上記。したがって、類似の戦略を用いて、本発明の融合タンパク質を作製することができる。この過程には、正の免疫調節物質ドメインのＮ末端を受容体拮抗ドメインのＣ末端に結合する、融合タンパク質をコードするｃＤＮＡを設計する段階が含まれる。
【００５６】
さらに、ｈＧＨ（本発明者らは、最大１０個のアミノ酸を欠失させる）のＣ末端は、トランスジェニックマウスにおいて成長促進活性にとって重要でないという証拠があり（チェン（Ｃｈｅｎ）ら、１９９３）、かつ構造的類似性に基づき、正の調節物質とｈＰＲＬＡのような他の受容体拮抗ドメインのＣ末端との融合体は、これらのドメインの結合親和性を変化させないはずである。
【００５７】
本発明は、本明細書において意図した所望の融合タンパク質を作製するどの特定の方法にも限定されない。しかし、意図される組換え体作製方法に従って、本発明は本発明に記載のドメインのヌクレオチド配列の一つまたは複数を含む、組換えＤＮＡ構築物を提供する。本発明の組換え構築物は、その中に一般的にオープンリーディングフレームを含むＤＮＡまたはＤＮＡ断片が、いずれかの方向に挿入される、プラスミドまたはウイルスベクターのようなベクターを含む。本発明はさらに、これらのベクターを含む細胞を意図する。
【００５８】
組換えタンパク質の産生は当技術分野で周知であり、下記に簡単に概要する。
【００５９】
細菌の発現
細菌において用いるために有用な細菌の発現ベクターは、所望のタンパク質をコードする構造ＤＮＡ配列を、適した翻訳開始シグナルおよび終了シグナルと共に、機能的プロモーターを伴う実施可能な読みとり相で挿入することによって、構築される。ベクターは、ベクターの維持を確実にし、望ましければ宿主内で増幅するために、一つまたは複数の表現型選択マーカーおよび複製開始点を含むと考えられる。形質転換のための適した原核生物宿主には、大腸菌（Ｅ． Ｃｏｌｉ）、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、ならびにシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、放線菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、およびブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）属内の様々な種が含まれるが、他の種も選択材料として用いてもよい。好ましい態様において、原核生物宿主は大腸菌である。
【００６０】
細菌ベクターは、例えば、バクテリオファージ、プラスミド、またはコスミドに基づいてもよい。これらのベクターは、選択マーカー、および周知のクローニングベクターｐＢＲ３２（ＡＴＣＣ ３７０１７）の要素を一般的に含む市販のプラスミドに由来する、細菌の複製開始点を含みうる。そのような市販のベクターには、例えば、ＧＥＭ １（プロメガバイオテック、マディソン、ウィスコンシン州、アメリカ）、ｐＢｓ、フェージスクリプト、ＰｓｉＸ１７４、ｐＢｌｅｕｓｃｒｉｐｔ ＳＫ、ｐＢｓ ＫＳ、ｐＮＨ８ａ、ｐＮＨ１６ａ、ｐＮＨ１８ａ、ｐＮＨ４６ａ（ストラタジーン）；ｐＴｒｃ９９Ａ、ｐＫＫ２２３−３、ｐＫＫ２３３−３、ｐＫＫ２３２−８、ｐＤＲ５４０およびｐＲＩＴ５（ファルマシア）が含まれる。本発明に従う好ましいベクターは、Ｐｔ７１発現ベクター（パリ（Ｐａｒｉｓ）ら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ａｐｐｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． １２：４３６〜４４９（１９９０））である。
【００６１】
これらの「骨格」部分を、適当なプロモーターおよび発現すべき構造配列と組み合わせる。細菌プロモーターには、ｌａｃ、Ｔ３、Ｔ７、ラムダＰＲまたはＰＬ、ｔｒｐおよびａｒａが含まれる。Ｔ７が好ましい細菌プロモーターである。
【００６２】
適した宿主株を形質転換して、宿主株を適当な細胞密度に増殖させた後、選択したプロモーターを適当な手段（例えば、温度シフトまたは化学的誘導）によって抑制／誘導して、細胞をさらなる期間培養する。細胞は一般的に、遠心分離によって回収して、物理的または化学的手段によって破壊し、得られた粗抽出物をさらなる精製のために残しておく。
【００６３】
真核細胞発現
様々な哺乳類細胞培養系もまた、組換え型タンパク質を発現させるために用いることができる。哺乳類の発現系の例には、チミジンキナーゼ陰性（ＴＫ）細胞およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ陰性（ＡＰＲＴ）細胞のような、選択されたマウスＬ細胞が含まれる。他の例には、グルツマン（Ｇｌｕｚｍａｎ）、Ｃｅｌｌ ２３：１７５（１９８１）によって記述されたサル腎線維芽細胞のＣＯＳ−７株、および適合性のベクターを発現することができる他の細胞株、例えば、Ｃ１２７、３Ｔ３、ＣＨＯ、ＨｅＬａおよびＢＨＫ細胞株が含まれる。哺乳類の発現ベクターは、複製開始点、適したプロモーター、およびエンハンサーを含み、同様に任意の必要なリボソーム結合部位、ポリアデニル部位、スプライス供与部位および受容部位、転写終了配列、ならびに５’隣接非転写配列を含むと考えられる。ＳＶ４０ウイルスゲノムに由来するＤＮＡ配列、例えば、ＳＶ４０開始点、初期プロモーター、エンハンサー、スプライス部位、およびポリアデニル部位を用いて、必要な非転写遺伝子要素を提供してもよい。
【００６４】
哺乳類プロモーターには、ＣＭＶ前初期、ＨＳＶチミジンキナーゼ、初期および後期ＳＶ４０、レトロウイルス由来のＬＴＲ、ならびにマウスメタロチオネイン−Ｉが含まれる。典型的な哺乳類ベクターには、ｐＷＬｎｅｏ、ｐＳＶ２ｃａｔ、ｐＯＧ４４、ｐＸＴ１、ｐＳＧ（ストラタジーン）、ｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧ、およびｐＳＶＬ（ファルマシア）が含まれる。好ましい態様において、哺乳類の発現ベクターはｐＵＣＩＧ−ＭＥＴである。選択マーカーには、ＣＡＴ（クロラムフェニコールトランスフェラーゼ）が含まれる。
【００６５】
哺乳類の宿主細胞において、多数のウイルスに基づく発現系を利用してもよい。アデノウイルスを発現ベクターとして用いる場合、関係するコード配列を、アデノウイルス転写／翻訳制御複合体、例えば後期プロモーターおよび三連リーダー配列にライゲーションしてもよい。次に、このキメラ遺伝子をインビトロまたはインビボでの組換えによって、アデノウイルスゲノムに挿入してもよい。ウイルスゲノムの非必須領域への挿入（例えば、領域Ｅ１またはＥ３）の結果、生存可能であって、かつ感染宿主において標的タンパク質を発現することができる組換え型ウイルスが得られると考えられる（例えば、ローガン（Ｌｏｇａｎ）ら、１９８４、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８１：３６５５〜３６５９を参照のこと）。
【００６６】
治療的組成物：
本発明のタンパク質は、薬学的に有用な組成物を調製するために、既知の方法に従って処方することができ、それによって本発明の分子またはその機能的誘導体を薬学的に許容される担体賦形剤との混合物において組み合わせる。他のヒトタンパク質、例えばヒト血清アルブミンを含む、適した賦形剤およびその処方は、例えば「レミントンの製薬科学（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）」、（第１６版、オソル（Ｏｓｏｌ， Ａ．）編、マック、イーストン、ペンシルバニア州（１９８０））に記載されている。有効な投与に適した、薬学的に許容される組成物を形成するために、そのような組成物は、本発明の一つまたは複数のタンパク質の有効量を担体賦形剤の適量と共に含むと考えられる。
【００６７】
本発明に従って用いられる薬学的組成物は、一つまたは複数の生理的に許容される担体または賦形剤を用いて、従来の方法において処方してもよい。このように、双機能分子およびその生理的に許容される塩および溶媒化合物は、吸入、もしくは通気（ｉｎｓｕｆｆｌａｔｉｏｎ）（口または鼻のいずれかを通して）、または経口、口腔内、非経口、もしくは直腸投与によって投与するために処方してもよい。
【００６８】
経口投与の場合、薬学的組成物は、例えば、結合剤（例えば、予めゼラチン処理したトウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドン、もしくはヒドロキシプロピルメチルセルロース）；充填剤（例えば、乳糖、微結晶セルロース、もしくはリン酸水素カルシウム）；潤滑剤（ステアリン酸マグネシウム、タルクもしくはシリカ）；崩壊剤（例えば、ジャガイモデンプンもしくはグリコール酸デンプンナトリウム）；または湿潤剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウム）のような薬学的に許容される賦形剤を用いて従来の手段によって調製された錠剤、またはカプセル剤の形であってもよい。錠剤は、当技術分野で周知の方法によってコーティングしてもよい。経口投与のための液体調製物は、例えば、溶液、シロップ剤、もしくは懸濁剤の形であってもよく、またはそれらは使用前に水もしくは他の適した溶媒によって溶解するための乾燥製品の形であってもよい。そのような液体調製物は、懸濁剤（例えば、ソルビトールシロップ、セルロース誘導体、または硬化食用油）；乳化剤（例えば、レシチンまたはアカシア）；非水性溶媒（例えば、アーモンド油、油状エステル、エチルアルコール、または精留食用油）；および保存剤（例えば、メチルまたはプロピル−ｐ−ヒドロキシベンゾエートまたはソルビン酸）のような、薬学的に許容される添加剤を用いて従来の手段によって調製してもよい。調製物はまた、適当であれば緩衝塩、着香料、着色剤および甘味料を含んでもよい。
【００６９】
経口投与のための調製物は、活性化合物の放出を制御するように適切に処方してもよい。口腔内適用の場合、組成物は、従来の方法で処方された錠剤またはロゼンジの形であってもよい。
【００７０】
吸入投与の場合、本発明に従って用いられる双機能分子は、適した噴射剤、例えばジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素、または他の適したガスを用いて加圧パックまたはネブライザーからのエアロゾルスプレーの形で都合よく送達される。加圧式エアロゾルの場合、用量単位は、計測した量を送達するための弁を提供することによって決定してもよい。化合物の粉末混合物および乳糖またはデンプンのような適した粉末基剤を含む、吸入器ーまたは注入器において用いるためのゼラチンのようなカプセルおよびカートリッジを処方してもよい。
【００７１】
双機能タンパク質は、注射、例えば、大量注射または持続的注入による非経口投与のために処方してもよい。注射用製剤は、単位投与剤形、例えば保存剤を添加したアンプルまたは多用量容器であってもよい。組成物は、油性または水性賦形剤中の懸濁剤、溶液、または乳剤の形であってもよく、懸濁剤、安定化剤、および／または分散剤のような処方物質を含んでもよい。または、活性成分は、使用前に適した賦形剤、例えば滅菌した発熱物質不含水で溶解するための粉末形状であってもよい。
【００７２】
化合物はまた、例えばカカオバターまたは他のグリセリドのような従来の坐剤基剤を含む坐剤、または浣腸のような直腸組成物において、処方してもよい。
【００７３】
先に記述した処方の他に、双機能分子は、デポー調製物として処方してもよい。そのような長時間持続型製剤は、埋め込み（例えば、皮下または筋肉内）、または筋肉内注射によって投与してもよい。このように、例えば、化合物は適したポリマーもしくは疎水性材料（例えば、許容される油中の乳剤として）、またはイオン交換樹脂と共に、またはほとんど溶解しない誘導体、例えば難溶性の塩として処方してもよい。
【００７４】
組成物は、望ましければ活性成分を含む、一つまたは複数の単位用量剤形を含んでもよい、パックまたはディスペンサー装置において提供してもよい。パックは例えば、ブリスタパックのような金属またはプラスチックホイルを含んでもよい。パックまたはディスペンサー装置は、投与説明書を添付してもよい。
【００７５】
組成物は、癌の治療において有用であるため、従来の化学療法剤と共に処方してもよい。従来の化学療法剤には、アルキル化剤、抗代謝剤、様々な天然物（例えば、ビンカアルカロイド、エピポドフィロトキシン、抗生物質、およびアミノ酸枯渇酵素）、ホルモンならびにホルモン拮抗剤が含まれる。特定のクラスの物質には、ナイトロジェンマスタード、アルキルスルホネート、ニトロソウレア、トリアゼン、葉酸類似体、ピリミジン類似体、プリン類似体、プラチナ複合体、副腎皮質抑制剤、副腎皮質ステロイド、プロゲスチン、エストロゲン、抗エストロゲンおよびアンドロゲンが含まれる。いくつかの典型的な化合物には、シクロホスファミド、クロラムブシル、メソトレキセート、フルオロウラシル、シタラビン、チオグアニン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、マイトマイシン、シスプラチン、ヒドロキシウレア、プレドニゾン、カプロン酸ヒドロキシプロゲステロン、メドロキシプロゲステロン、酢酸メゲストロール、ジエチルスチルベストロール、エチニルエストラジオール、タモキシフェン、プロピオン酸テストステロン、およびフルオキシメステロンが含まれる。乳癌を治療する場合、例えば、タモキシフェンが特に好ましい。
【００７６】
発明の方法：
治療方法
本発明に従う本発明の治療方法は一般に、先に同定した双機能タンパク質を利用する。融合タンパク質のドメインは、標的組織の特異的ターゲティング能および／または標的組織に対する免疫応答の増強能を共有する。したがって、典型的な方法は、融合タンパク質の受容体拮抗ドメインへの標的細胞の受容体の結合、および／または正の免疫調節物質ドメインによるＴ細胞依存的免疫応答の刺激を含む。
【００７７】
治療方法は、治療を必要とする被験者に、融合タンパク質の治療的有効量を投与する段階を含む。「治療的に有効な」とは、本明細書において、癌の増殖を阻害するかまたは後退させる（例えば、アポトーシスを誘導する）ために十分な量である、融合タンパク質の量を意味するために用いられる。いくつかの方法は、既知の癌用薬剤または治療、例えば化学療法（好ましくは上記の種類の化合物を用いる）もしくは放射線療法との併用療法を意図する。患者はヒトまたはヒト以外の動物であってもよい。患者は一般的に、癌の維持または増殖を促進する、受容体レベルの増加を特徴とする癌を有する場合に、治療を必要とすると考えられる。
【００７８】
インビボ治療の際の投与は、非経口および経口を含む任意の数の経路でなされてもよいが、好ましくは非経口投与である。嚢内、静脈内、髄腔内、および腹腔内投与経路を用いてもよいが、一般に静脈内投与が好ましい。当業者は、投与経路は治療すべき障害に応じて変化することを認識すると考えられる。
【００７９】
本発明に従う双機能タンパク質の治療的有効量の決定は、特定の患者の特徴、投与経路、および治療される障害の特性に大きく依存すると考えられる。一般的な手引きは、例えば国際調和会議の刊行物およびレミントンの製薬科学（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）、第２７章および２８章、４８４〜５２８頁（マックパブリッシングカンパニー、１９９０）に見出される。
【００８０】
治療的有効量の明確な決定は、薬剤の毒性および有効性のような要因に依存すると考えられる。毒性は、当技術分野で周知の方法を用いて決定してもよく、前述の参考文献に認められる。有効性は、実施例において下記に記述する方法と共に同じ手引きを利用して決定してもよい。したがって、薬学的有効量は、医師によって毒性学的に許容でき、なおも有効であると考えられる量である。例えば、有効性は、標的組織でのＴリンパ球細胞障害性の誘導もしくは実質的な誘導によって、または標的組織塊の減少によって、測定することができる。適した用量は、約１ｍｇ／ｋｇ〜１０ ｍｇ／ｋｇでありうる。
【００８１】
融合タンパク質の生物活性を決定するためのスクリーニングアッセイ法
本発明はまた、アポトーシス促進ドメイン、正の免疫調節物質ドメイン、および／またはこれらのドメインのそれぞれを含む、融合タンパク質の生物活性を比較するために用いることができる、細胞に基づくアッセイ系を提供する。この目的のため、融合タンパク質の融合ドメインが融合していない場合（すなわち、融合タンパク質の一部ではない）、各ドメインに類似の機能を確実に保持するように細胞増殖アッセイを用いる。
【００８２】
一つの態様において、融合タンパク質の生物活性は、インビトロで２つの異なる型の細胞株、すなわち特異的ドメインの活性を決定する各細胞株に、タンパク質を導入することによって決定されると考えられる。例えば、アポトーシス促進ドメインの生物活性の信頼できる指標である細胞株を、そのドメインの作用を調べるために用いなければならず、他のドメインの活性をモニターするためには、正の免疫調節物質ドメインを示すことができる細胞株を用いなければならない。
【００８３】
細胞株に様々な濃度の特定のドメインを、その拮抗、非拮抗、および融合型で導入することによって、当業者はその非融合型の同じドメインと比較して、融合タンパク質のアポトーシス促進ドメインの生物活性を決定することができる。アポトーシスを測定する方法は無数にある。これらの方法には、以下の技術が含まれるがこれらに限定されない：（１）細胞生存率の喪失−生体色素の排除、またはＭＴＴ（３−（４，５−ジメチルチアゾル−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロマイド）もしくはＭＴＳ−ＰＭＳの取り込みのいずれかの障害によって測定する；（２）ＤＮＡ断片化−アガロースゲル電気泳動、ＰＦＧ電気泳動、インサイチューターミナルトランスフェラーゼ標識（ＴＵＮＥＬ）によりアッセイする；細胞および核の形態学−顕微鏡を用いて染色質濃縮、ＤＮＡ構築、および細胞質の完全性を可視化する；ならびにシステインプロテアーゼ活性化アッセイ−比色もしくは蛍光読み出しと組み合わせた、カスパーゼ活性化アッセイ、ポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）、またはウェスタンブロットもしくは免疫組織化学によるラミニン切断を利用する。ヒト乳癌細胞株（Ｔ−４７Ｄ）を用いる実施例４および９は、許容されるアッセイ系のこの程度までの非制限的な実施例を提供する。
【００８４】
同様に、正の免疫調節物質ドメインの活性を測定することができる細胞株も同様に用いて、融合タンパク質のこのドメインの活性をモニターしなければならない。マウスＴ細胞株（ＨＴ−２）を用いる実施例９は、融合タンパク質における正の免疫調節物質ドメインの生物活性を決定するための一つの可能な、しかし非制限的な方法である。
【００８５】
本発明の融合タンパク質の活性を決定するためのもう一つの好ましい方法は、インビボでの実施試験である。この試験の適した宿主は、融合タンパク質のアポトーシス促進ドメインに結合することができる癌組織を含む、哺乳類宿主であると考えられる。適した対照は、選択したアポトーシス促進ドメインのための受容体部位をほとんどまたは全く含まないことを特徴とする、任意の細胞株でありうる。実施例１０は、マウス細胞を用いたインビボ試験の非制限的な実施例を提供する。
【００８６】
以下の実施例は説明するためであって、制限的であるようには意図されていない。
【００８７】
実施例
実施例１：発現プラスミドｐＵＣＩＧ−ＭＴ−Ｈｐｌａ−ＩＬ２融合タンパク質ｃＤＮＡのクローニングおよび構築
ｈＰＲＬＡ ｃＤＮＡ（ＸｂａＩ制限部位から翻訳停止コドンの直前の配列まで）およびアミノ酸配列＋１部位から翻訳停止コドンまでの、ＩＬ−２ ｃＤＮＡ（ＡＴＣＣから購入）由来のＰＣＲ断片をそれぞれ、個々に増幅した。次に、これらの断片を哺乳類の発現ベクターであるｐＵＣＩＧ−ＭＥＴにライゲーションして、これらの断片を組み入れた発現ベクターを作製した（すなわちｐＵＣＩＧ−ＭＥＴ−ｈＰＲＬＡ−ＩＬ２）。ｈＰＲＬＡとＩＬ−２ ｃＤＮＡのあいだにクローニング目的のためにＢａｍＨＩ制限酵素部位を付加すると、融合タンパク質の接合部で余分なアミノ酸残基２個（グリシンおよびセリン）が得られた。
【００８８】
実施例２：安定な細胞株への発現プラスミドのトランスフェクト
本発明者らは既に、インビトロ試験において予備試験のためにｈＰＲＬ−ＩＬ−２、およびｈＰＲＬＡ−ＩＬ−２をプールした安定なマウス細胞を作製した。本発明に従う融合タンパク質を作製するために、マウスＬ細胞を用いる。これらの細胞はまず、リポフェクチン法（ギブコＢＲＬ、ガイサースバーグ、メリーランド州）を用いて、マウスメタロチオネイン調節配列によって駆動されるｈＰＲＬＡ−ＩＬ−２ ｃＤＮＡをコードするＤＮＡ分子を、ヘルペスウイルスＴＫ遺伝子およびハムスターＡＰＲＴ遺伝子（ロイング（Ｌｅｕｎｇ）ら、１９８５）に加えて共トランスフェクトする。ＴＫ＋、ＡＰＲＴ＋表現型に関する二重選択の後、安定なｈＰＲＬまたはｈＰＲＬ類似体分泌マウスＬ細胞株を、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ、ギブコＢＲＬ、ガイサースバーク、メリーランド州）＋１０％Ｎｕ−血清（コラボレイティブリサーチ、ベドフォード、マサチューセッツ州）、１５ μｇ／ｍｌヒポキサンチン、１μｇ／ｍｌアミノプテリン、１５ μｇ／ｍｌチミジンおよび５０ μｇ／ｍｌゲンタマイシンにおいて確立し、維持する。細胞を、９０％の集密度に達するまでＴ１５０フラスコにおいて継代する。その際に、血清不含条件培地を２４時間毎に回収してプールする。プールした培地をさらなる精製を行うまで−２０℃で凍結する。
【００８９】
実施例３：融合タンパク質の精製
融合タンパク質の収量を増加させるため、当技術分野で周知の手法に従って、それらをまず精製することが望ましい。これらの段階には以下が含まれる：遠心分離による培養物からの細胞の除去、その後の沈殿、クロスフロー限外濾過、ならびに低圧ＳＥＣおよび調整的ＲＰ−ＨＰＬＣクロマトグラフィーのようなクローニング方法が含まれる。これらの段階の後に、緩衝液交換、発熱物質除去、および凍結乾燥を行う。
【００９０】
段階１：細胞の除去−条件培地８０〜１００％を６０００×ｇ、４℃で３０分間遠心分離する。開始細胞培養培地の容量は８０ Ｌ〜１００ Ｌである。ｈＰＲＬ−Ｇ１２９Ｒは全てこの段階で回収される。
【００９１】
段階２：沈殿−沈殿手法は、細胞培養培地１０ Ｌに硫酸アンモニウム３．５ ｋｇを絶えず攪拌しながら徐々に加えることによって行う。溶液を４℃で１２時間放置する。上清を遠心分離して捨てる。次に、沈殿物を蒸留水２Ｌに溶解する。溶解しない不純物を遠心分離によって除去する。遠心分離段階は全て６０００×ｇ、４℃で３０分間行う。溶液の最終容量は約５Ｌである。
【００９２】
段階３：クロスフロー限外濾過を用いる容量の減少−攪拌細胞２０００ ｍｌ中で１０Ｋ分子量カットオフ膜を用いて、ＳＥＣサイズ排除カラムの吸着層容積の１０％に達するように、溶液の容量を減少させる。この膜濾過段階は５５ ｐｓｉで操作する。
【００９３】
段階４：低圧ＳＥＣ−この低圧ＳＥＣ段階の目的は、大きいサイズの不純物および調整的ＲＰ−ＨＰＬＣカラムを汚染させる可能性がある、小さなサイズの不純物を除去することである。低圧ＳＥＣは、バイオラドＰ６０ゲルを充填した４４×１０００ ｍｍアミコンガラスカラムにおいて行う。ゲルの吸着層の容積は１２３１ ｍｌである。０．０５ Ｍ硫酸アンモニウムを流速０．５ ｍｌ／分でカラムを通過させる。装置全体を冷蔵庫に入れて４℃で維持する。
【００９４】
段階５：調整的ＲＰ−ＨＰＬＣ−この作業において、ＵＶ−可視検出器を備えたウォーターズ（ミリポアコーポレーション、ベッドフォード、マサチューセッツ州）調整的ＨＰＬＣを用いる。レイニン・インストルメント・インク（ウォバーン、マサチューセッツ州）からの調整的スケールダイナマックスＣ、ＲＰ−ＢＰＬＣカラム（２１．４×２５０ ｍｍ、５ｇｍ、３００Ａ孔サイズ）を用いて高純度のｈＰＲＬ−Ｇ１２９Ｒ産物を得る。４０％アセトニトリル（ＡＣＮ）（ｖ／ｖ）＋０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）から８０％ＡＣＮ＋０．１％ＴＦＡへの直線勾配を用いて分離を行った。直線勾配は６０分間確立して、移動相の流速は５ｍｌ／分である。ＵＶ検出器は２２０ ｎｍに設定する。
【００９５】
段階６：緩衝液の交換−残っている有機溶媒を、膜透析を用いて緩衝液交換によって除去する。緩衝液交換はアミコンＹＭＩＯ膜によって攪拌細胞５０ ｍｌ中で行う。限外濾過系は、タンパク質溶液を添加する前に発熱物質除去プロトコールに従って調製する。有機溶媒は、何度か流した後に非発熱物質蒸留水によってディアフィルトレーションする（ｄｉａｆｉｌｔｅｒ）。ｈＰＲＬ−Ｇ１２９Ｒは、５０ ｍｌ保持溶液において保持する。
【００９６】
段階７：発熱物質除去−これらの産物はインビボで用いられるために、非発熱性産物が好ましい。したがって、１００Ｋ膜濾過段階を用いて発熱物質を除去する。発熱物質除去は、１００Ｋ膜を用いて攪拌細胞５０ ｍｌ中で行う。攪拌した細胞を、発熱物質除去プロトコールに従って０．１ Ｎ ＮａＯＨ溶液によって処理する。保持溶液を非発熱性水で３回洗浄し、浸透液中でｈＰＲＬ−Ｇ１２９Ｒを回収する。浸透液の容量は〜１００ ｍｌである。ｈＰＲＬまたはｈＰＲＬ−Ｇ１２９Ｒの濃度は、放射免疫基質アッセイ法（ＲＩＭＡ）によって決定する。
【００９７】
段階８：凍結乾燥−凍結乾燥は、最終産物を保存するために必要である。ｈＰＲＬ−Ｇ１２９Ｒは、凍結乾燥型でより安定である。液体溶媒は全て、遠心真空エバポレーターを備えた凍結乾燥装置において除去する。次に、凍結乾燥ｈＰＲＬ−Ｇ１２９Ｒ試料を−２０℃の冷凍庫内でＮ２中で保存する。
【００９８】
実施例４：放射受容体結合アッセイ法による、精製ｈＰＲＬおよびｈＰＲＬ−Ｇ１２９Ｒの生物活性試験
放射受容体結合アッセイ法は、ＰＲＬをＧＨの代わりに用いた点を除き、チェン（Ｃｈｅｎ）ら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８７：５０６１（１９９１）において既に記載されているとおりに実施する。簡単に説明すると、Ｔ−４７Ｄ細胞を６ウェル組織培養プレートにおいて、９０％の集密度（〜１０５個／ウェル）になるまで増殖させる。細胞単層を血清不含ＲＰＭＩ １６４０培地中で２時間飢餓状態にする。次に、細胞を、８×１０４ ｃｐｍの１２５Ｉ−ｈＰＲＬ（比活性＝３０ μＣｉ／μｇ；ＮＥＮデュポン、ボストン、マサチューセッツ州）を含む血清不含ＲＰＭＩ １６４０中で、様々な濃度のｈＰＲＬ（標準物質としてＮＩＨから）およびｈＰＲＬ−Ｇ１２９Ｒの存在下または非存在下で、室温でインキュベートする。次に、細胞を血清不含ＲＰＭＩ １６４０培地中で３回洗浄して、０．１ Ｎ ＮａＯＨ／１％ＳＤＳ ０．５ ｍｌ中で可溶化して、結合した放射活性をガンマカウンター（ＩＣＮバイオメディカル、モデル４／６００プラス；コスタメサ、カリフォルニア州）によって決定する。次に、ｈＰＲＬおよびｈＰＲＬ−Ｇ１２９ＲのＥＣ５０値を決定して、平均値±ＳＤとして表記する。比較は、スチューデントのｔ検定によって行う。
【００９９】
実施例５：ＳＴＡＴ ５リン酸化／免疫沈降アッセイ法による、精製ｈＰＲＬおよびｈＰＲＬ−Ｇ１２９Ｒの生物活性試験
Ｔ−４７Ｄ細胞を１０％活性炭除去ウシ胎児血清（ＣＳＦＢＳ；増殖培地）を含むＲＰＭＩ １６４０培地において増殖させる。各実験に関して、細胞を９０％の集密度に達するまで、増殖培地中で６ウェル培養プレートに継代する。実験当日、細胞を血清不含培地において１時間枯渇させて、ｈＰＲＬ、ｈＰＲＬ−Ｇ１２９Ｒまたは両者の組み合わせと共に３０分間インキュベートする。処置後、Ｔ４７−Ｄ細胞を氷冷ＰＢＳによって１回洗浄して、氷冷溶解緩衝液［２０ ｍＭトリスＣｌ（ｐＨ ７．４）、１００ ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＥＤＴＡ、１％ＮＰ−４０、１ｍＭフッ化フェニルメチルスルホニル、１０ μｇ／ｍｌアプロチニン、１０ μｇ／ｍｌロイペプチン］１ｍｌ中で軽く剥がして回収する。この溶解混合物を、気泡ができないように２２ゲージ針の中を数回上下させて、最高速度で２０分間回転させる。上清を新しい微量遠心管に移す。ＳＴＡＴ ５モノクローナル抗体５μｇを、ｄｄＨ２Ｏ ４００μｌおよび２×ＩＰ緩衝液［１％トリトンＸ−１００、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ ｍＭトリス、ｐＨ ７．４、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＥＧＴＡ、０．２ ｍＭバナジン酸ナトリウム、０．２ ｍＭ ＰＭＳＦ、０．５％ＮＰ−４０］５００ μｌと共に、細胞溶解物１００ μｌ（総タンパク質２００〜５００ μｇ）に加える。４℃でゆっくり回転させながら一晩インキュベートした後、予め洗浄した（１×ＩＰ緩衝液）プロテインＡアガロースビーズ５０ μｌを各ＩＰ反応に加えて、インキュベーションを４℃でさらに２時間継続する。インキュベーション終了時、アガロースビーズを１×ＩＰ緩衝液によって３回洗浄して、１×ＳＤＳ ＰＡＧＥ添加緩衝液５０ μｌ中にプロテインＡアガロースビーズを再懸濁させることによって、タンパク質を溶出する。次に、試料を４％〜１２．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合抗ホスホチロシン抗体ＰＹ２０およびＥＣＬ試薬キット（アマシャム、イリノイ州）を用いて、免疫ブロットを行う。次に、ブロットをＸ線フィルムに感光させて、標準的な手法を用いて現像する（コダック、ロチェスター、ニューヨーク州）。Ｔ−４７Ｄヒト乳癌細胞に対してｈＰＲＬおよびｈＰＲＬ−Ｇ１２９Ｒを用いた結果は、ｈＰＲＬ−Ｇ１２９Ｒが同様に、ｈＰＲＬによって誘導されるシグナル伝達を阻止することができることを証明し、このことはその拮抗剤作用を示唆する。
【０１００】
実施例６：ＴＵＮＥＬアッセイ法による、精製ｈＰＲＬおよびｈＰＲＬ−Ｇ１２９Ｒの生物活性試験
このアッセイ（フルオレセインアポトーシス検出システム、プロメガ）は、３−ＯＨ末端で断片化ＤＮＡの切れ目を標識することによって作用する。フルオレセイン標識ｄＵＴＰは、ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼによって３−ＯＨ末端で組み入れられる。Ｔ４７−Ｄヒト乳癌細胞を用いる。アッセイの前に、乳癌細胞を１０％活性炭除去ウシ胎児血清（ＣＣＳ）に１週間切り替える。その後、細胞を８チャンバー式スライドシステム（ラブテックＩＩ）に１室あたり６０％〜７０％の集密度で播種する。翌日、乳癌細胞をｈＰＲＬ−Ｇ１２９Ｒ条件培地（０．５％ＣＳＳ）中で様々な濃度のｈＲＰＬ−Ｇ１２９Ｒによって処理する。約２４時間〜４８時間後、チャンバーを解体して製造元の説明書の通りにアッセイを行う。オリンパスＩＸ ７０顕微鏡システムを用いてＦＩＴＣフィルター下でスライドガラスを調べる。
【０１０１】
実施例７：ｈＰＲＬＡ−ＩＬ−２融合タンパク質濃度の決定
ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび免疫ブロット分析を行って、発現されたｈＰＲＬＡ−ＩＬ−２融合タンパク質が適当な分子量を有することを確認する。一過性にトランスフェクトしたマウスＬ細胞からの培養液を回収し、バイオラドプロテインＩＩまたはミニプロティーンＩＩシステム（バイオラド、ハーキュラス、カリフォルニア州）を用いて、本発明者らの研究室で日常的に行われている１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供する。タンパク質の転写後、ニトロセルロース紙を２％ゼラチンのＴＢＳ溶液で軽く攪拌しながら室温で１時間ブロックした後、０．０５％ツイーン２０のＴＢＳ溶液（５分／洗浄）によって３回洗浄する。ポリクローナルウサギ抗ｈＰＲＬ（バイオデザインインターナショナル、ケネバンク、メイン州、２００倍希釈）の１％ゼラチン／ＴＢＳ溶液をニトロセルロース膜に加えて、室温で軽く攪拌しながら一晩インキュベートする。一次抗体を除去した後、ニトロセルロース紙を０．０５％ツイーン２０のＴＢＳ溶液によって３回洗浄した後、ヤギ抗ウサギＩｇＧ西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合体（ベーリンガー・マンハイム・バイオケミカルズ）の１％ゼラチン／ＴＢＳ溶液の存在下で、室温で２時間インキュベートする。二次抗体と共にインキュベートした後、ニトロセルロースを０．０５％ツイーン２０のＴＢＳ溶液によって３回洗浄する。
【０１０２】
タンパク質のバンドを可視化するために、ニトロセルロース紙を０．０１８％Ｈ２Ｏ２（ｖ／ｖ）のＴＢＳ溶液５０ ｍｌ、およびＨＲＰ発色試薬（バイオラド）３０ ｍｇを含むメタノール１０ ｍｌとの混合物中で、１０分間インキュベートする。ニトロセルロース紙を水ですすぎ、風乾させて、写真を撮影する。精製ｈＰＲＬ、およびＩＬ−２（アキュレートケミカルおよびサイエンティフィック、ウェストバリー、ニューヨーク州）を用いて、写真撮影および密度測定法（フェルナンデスおよびコプチック（ＦｅｒｎａｎｄｅｚおよびＫｏｐｃｈｉｃｋ）、１９９０）によって、発現されたｈＰＲＬＡ−ＩＬ−２レベルを定量する。
【０１０３】
実施例８：放射受容体結合アッセイ法およびヒト乳癌細胞を用いる、ｈＰＲＬＡ−ＩＬ−２融合タンパク質の結合特徴の決定
この実験の主な目的は、ｈＰＲＬＡとＩＬ−２との融合が乳癌細胞におけるｈＰＲＬＡに対する結合能に影響を及ぼさないことを確認するために、ヒト乳癌細胞を用いてｈＰＲＬ、ｈＰＲＬＡおよびｈＰＲＬＡ−ＩＬ−２融合タンパク質の結合親和性を比較することである。
【０１０４】
放射受容体結合アッセイ法は、チェン（Ｃｈｅｎ）ら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８７：５０６１（１９９１）に記載の通りに実施する。簡単に説明すると、Ｔ−４７Ｄ細胞を６ウェル組織培養プレートにおいて９０％の集密度（〜１０５個／ウェル）になるまで増殖させる。細胞単層を血清不含ＲＰＭＩ １６４０培地中で２時間飢えさせる。次に、細胞を、８×１０４ ｃｐｍの１２５Ｉ−ｈＰＲＬ（比活性＝３０ μＣｉ／μｇ；ＮＥＮデュポン、ボストン、マサチューセッツ州）を含む血清不含ＲＰＭＩ １６４０中で、様々な濃度のｈＰＲＬ（標準物質としてＮＩＨから）およびｈＰＲＬ−Ｇ１２９Ｒの存在下または非存在下で、室温でインキュベートする。次に、細胞を血清不含ＲＰＭＩ １６４０培地中で３回洗浄して、０．１ Ｎ ＮａＯＨ／１％ＳＤＳ ０．５ ｍｌ中で可溶化して、結合した放射活性をガンマカウンター（ＩＣＮバイオメディカル、モデル４／６００プラス；コスタメサ、カリフォルニア州）によって決定する。次に、ｈＰＲＬおよびｈＰＲＬ−Ｇ１２９ＲのＥＣ５０値を決定して、平均値±ＳＤとして表記する。比較は、スチューデントのｔ検定によって行う。非特異的結合は、非標識ｈＰＲＬ１μｇ／ｍｌ＋ＩＬ−２ １μｇを加えることによって決定する。
【０１０５】
実施例９：細胞増殖アッセイ法を用いたＩＬ−２、ｈＰＲＬＡ、およびｈＰＲＬＡ−ＩＬ−２融合タンパク質の生物活性の比較
本試験において２つの型の細胞増殖アッセイ法を用いて、ｈＰＲＬＡ−ＩＬ−２融合タンパク質がｈＰＲＬＡ様活性と共にＩＬ−２様活性を保持していることを確認する。マウスＴ細胞株（ＨＴ−２細胞）は、一般的に組換え型マウスおよびヒトＩＬ−２の生物活性を調べるために用いられているＩＬ−２反応性細胞株であり、これを用いて融合タンパク質のＩＬ−２様活性を調べる（タニグチ（Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ）ら、１９８３；ローゼンバーグ（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ）ら、１９８４）。さらに、ヒト乳癌細胞を用いて潜在的な拮抗活性に関して、融合タンパク質を調べる。
【０１０６】
ヒト乳癌細胞株（Ｔ４７−Ｄ）を用いる（ＡＴＣＣから）。細胞をＡＴＣＣの推奨に従う対応する増殖培地中で増殖させる。アッセイ条件は、ギンスブルグおよびフォンデルハール（ＧｉｎｓｂｕｒｇおよびＶｏｎｄｅｒｈａｒｒ、１９９５）によって記述され、それぞれの細胞株について改変してもよい。一般に、細胞は空気中に５％ＣＯ２の湿潤大気中で３７℃で維持する。個々の増殖実験に関して、細胞を１２ウェル培養プレートに約２×１０４個／ｍｌ／ウェルの密度で播種する。細胞を１日接着させて、培地を除去し、ＩＴＳ＋（インスリン−トランスフェリン−セレニウム−ＢＳＡ−リノレン酸培養添加物；コラボレイティブリサーチ、ベッドフォード、マサチューセッツ州）を含む培地によって血清不含条件に変更する。様々な濃度のｈＰＲＬ、ｈＰＲＬＡ、ｈＰＲＬＡ−ＩＬ−２または両者の組み合わせ（ｈＰＲＬＡ：ｈＰＲＬまたはｈＰＲＬＡ−ＩＬ−２：ｈＰＲＬを１：１、５：１、１０：１等）を加える。さらに３日間培養した後、細胞を短いトリプシン処理後に回収して、細胞計数器で計数する。
【０１０７】
実施例１０：ｈＰＲＬＡ−ＩＬ−２融合タンパク質の抗腫瘍活性を調べるための、同系マウスモデルを用いたインビボ試験
ｈＰＲＬＡ−ＩＬ−２の抗腫瘍効果の最終的な試験は、インビボ試験である。この目的のために、融合タンパク質の潜在的な抗腫瘍活性を調べるために、同系免疫コンピテントＣ３Ｈマウス、および同じ系統のマウスに由来する乳腺癌細胞を用いる。
【０１０８】
特にＣＲＬ−６３２６および／またはＣＲＬ−６３７８マウス乳腺癌細胞を用いる。それらの細胞に対するＰＲＬＲの状態を確認するために、放射受容体結合アッセイ法をこれらの細胞について行い、それらがＰＲＬＲを含むことを確認する。２つの細胞株は陽性および陰性対照として用いる。一つの細胞株は、ＡＴＣＣから購入したＣ３Ｈ由来マウスＬ細胞である。これらの形質転換線維芽細胞は、皮下注射すると腫瘍を誘導する。ＧＨＲまたはＰＲＬＲはＬ細胞表面上では検出不可能であるため（データは示していない）、Ｌ細胞は非乳癌対照として用いる。ｈＰＲＬＲ ｃＤＮＡを安定にトランスフェクトしたマウスＬ細胞株は、Ｃ３Ｈマウスにおいて腫瘍を誘導するために用いる。これらの細胞によって誘導された腫瘍は、細胞表面上に高レベルのｈＰＲＬＲが存在するために陽性対照であると見なされる。
【０１０９】
癌のモデルとするために癌細胞５×１０６個を接種することによって、皮下腫瘍を誘発する。これは、１０日以内に体積２５ μｌに増殖するように腫瘍を誘導する。ライスフェルド（Ｒｅｉｓｆｅｌｄ）ら、上記。その時点で、動物をＩＬ−２、ＰＲＬＡ、およびＰＲＬＡ−ＩＬ−２融合タンパク質の静脈内投与によって７日間処置した。各群について２用量（５μｇおよび２５ μｇ／注射）を用いる。処置終了時、動物を屠殺して、処置を受けなかった、またはＩＬ−２、ｈＰＲＬＡ、もしくはｈＰＲＬＡ−ＩＬ−２融合タンパク質による処置を受けた、いずれかの動物において腫瘍重量を測定して、統計分析を行う。
【０１１０】
腫瘍の免疫組織学的評価も同様に行って、インサイチューでの細胞浸潤の証拠を調べる。簡単に説明すると、凍結切片を冷アセトン中で１０分間固定した後、０．０３％Ｈ２Ｏ２によって内因性ペルオキシダーゼを除去して、１０％血清の１％ＢＳＡ／ＰＢＳ溶液によってコラーゲン性要素を阻止する。次に、ＣＤ４５特異的抗体を既定の濃度（〜２０ μｇ／ｍｌ）で連続切片上に重層して、スライドガラスを湿潤チャンバーにおいて３０分間インキュベートする。各段階のあいだにＰＢＳ洗浄を行い、ビオチン結合二次抗体を１０分間適用した後、ストレプトアビジン結合アルカリホスファターゼを１０分間適用する。さらに洗浄した後、基質を加えて、スライドガラスを暗所で２０分間インキュベートする。ＰＢＳ中で洗浄した後、スライドガラスを対比染色して、オリンパス（ニューハイドパーク、ニューヨーク州）ＢＨ２顕微鏡に載せて、これを用いて観察する。
【０１１１】
以下の表は、ｈＰＲＬＡ−ＩＬ２融合タンパク質の生物活性を調べるために、同系マウスおよび腫瘍細胞を用いる実験計画を示す。
2004504272.tif 000005
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の双機能分子の略図である。（Ａ）ライスフェルドら（Ｒｅｉｓｆｅｌｄ、１９９６）による先の研究において提唱されている、ｍＡｂ−ＩＬ−２融合タンパク質、および（Ｂ）本発明に従うｈＰＲＬＡ−ＩＬ−２融合タンパク質。
【図２】本発明の双機能融合タンパク質に関して提唱される作用機序の略図である。乳癌細胞によって産生されるＰＲＬは、融合タンパク質（ＰＲＬＡ）が占有していることからＰＲＬＲに達することができない。同時に、融合タンパク質のＩＬ−２部分が抗腫瘍Ｔ細胞反応を刺激する。
【図３】共培養法を用いた、Ｔ−４７Ｄヒト乳癌細胞におけるｈＰＲ１−Ｇ１２９Ｒの用量依存的な阻害作用、およびｈＰＲＬの刺激作用を示す。ｘ軸は共培養したＬ細胞（対照）、Ｌ−ＰＲＬまたはＬ−ｈＰＲＬ−Ｇ１２９Ｒ細胞数を表す。各データポイントは、少なくとも３回の、３通のウェルでの独立した実験の平均値を表す。
【図４】Ｔ−４７Ｄヒト乳癌細胞増殖アッセイにおけるｈＰＲＬ−Ｇ１２９Ｒの用量依存的な阻害作用、および４−ＯＨ−タモキシフェンとの相加作用を示す。ｘ軸は、４−ＯＨ−タモキシフェンの非存在下（白いバー）または存在下の、いずれかでのｈＰＲＬ−Ｇ１２９Ｒ濃度を表す。各データポイントは、少なくとも３回の、３通のウェルでの独立した実験の平均値を表す。
【図５】ｐＵＣＩＧ−ＭＴ−ｈＰＲＬ−ＩＬ−２融合タンパク質ｃＤＮＡの、発現プラスミドのクローニングおよび構築の略図である。
【図１】
2004504272.tif 000006
【図２】
2004504272.tif 000007
【図３】
2004504272.tif 000008
【図４】
2004504272.tif 000009
【図５】
2004504272.tif 000010
【国際公開パンフレット】
2004504272.tif 000011
2004504272.tif 000012
2004504272.tif 000013
2004504272.tif 000014
2004504272.tif 000015
2004504272.tif 000016
2004504272.tif 000017
2004504272.tif 000018
2004504272.tif 000019
2004504272.tif 000020
2004504272.tif 000021
2004504272.tif 000022
2004504272.tif 000023
2004504272.tif 000024
2004504272.tif 000025
2004504272.tif 000026
2004504272.tif 000027
2004504272.tif 000028
2004504272.tif 000029
2004504272.tif 000030
2004504272.tif 000031
2004504272.tif 000032
2004504272.tif 000033
2004504272.tif 000034
2004504272.tif 000035
2004504272.tif 000036
2004504272.tif 000037
2004504272.tif 000038
2004504272.tif 000039
2004504272.tif 000040
2004504272.tif 000041
2004504272.tif 000042
2004504272.tif 000043
2004504272.tif 000044
2004504272.tif 000045
2004504272.tif 000046
2004504272.tif 000047
2004504272.tif 000048
2004504272.tif 000049
2004504272.tif 000050
2004504272.tif 000051
2004504272.tif 000052
2004504272.tif 000053
2004504272.tif 000054
2004504272.tif 000055
2004504272.tif 000056
2004504272.tif 000057
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004504272.tif 000058
【国際調査報告】
2004504272.tif 000059
2004504272.tif 000060
2004504272.tif 000061
2004504272.tif 000062