(57)【要約】ウキクサにおける高速大量処理スクリーニングの方法が提供される。ある態様では、かかる方法を用いて関心あるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を識別する。別の態様では、かかる方法を用いて標的ヌクレオチド配列の発現を調節するヌクレオチド配列を識別する。これらの方法は全植物において予測されるスクリーニングの利点を、高速大量処理系の速度および効率と組み合わせる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
関心ある核酸分子を識別するための高速大量処理方法であって、
（ａ）ウキクサ植物培養物、ウキクサ根粒培養物、ウキクサ懸濁培養物、またはウキクサプロトプラスト細胞培養物を被験ヌクレオチド配列で形質転換するステップと、
（ｂ）該被験ヌクレオチド配列の生物学的機能を決定し、それにより該被験ヌクレオチド配列が関心ある核酸分子であるかどうかを決定するステップと
を含む方法。
【請求項２】
前記関心ある前記核酸分子の生物学的機能が、関心ある生物学的応答を調節する能力である請求項１の方法。
【請求項３】
前記関心ある前記生物学的応答が、温度変化に対する応答、日長変化に対する応答、水分ポテンシャル変化に対する応答、光レベル変化に対する応答、病原体への暴露に対する応答、毒素への暴露に対する応答、植物ホルモンに対する応答、または植物成長レギュレーターに対する応答からなる群から選択される請求項２の方法。
【請求項４】
前記関心ある核酸分子が、関心ある生物学的機能を有するポリペプチドに関するコード配列を含む請求項３の方法。
【請求項５】
前記関心ある前記生物学的機能が、
（ａ）関心ある構造特性、
（ｂ）関心ある基質に結合する能力、
（ｃ）関心あるリガンドに結合する能力、
（ｄ）関心あるレセプターに結合する能力、
（ｅ）関心ある反応を触媒する能力、
（ｆ）植物ホルモンに対する応答を調節する能力、
（ｇ）植物成長レギュレーターに対する応答を調節する能力、
（ｈ）環境撹乱に対する応答を調節する能力、
（ｉ）生理学的撹乱に対する応答を調節する能力、
（ｊ）一つまたはそれ以上の病原体に対する応答を調節する能力、および
（ｋ）一つまたはそれ以上の毒素に対する応答を調節する能力
からなる群から選択される請求項４の方法。
【請求項６】
前記関心ある生物学的機能を有する前記ポリペプチドが天然発生ポリペプチドの変種であり、前記関心ある生物学的機能が、該天然発生ポリペプチドと比較して、該関心ある生物学的機能を有するポリペプチドの少なくとも一つの特性における変化であり、該変化が、
（ａ）構造特性の変化、
（ｂ）基質に結合する能力の増大、
（ｃ）基質に結合する能力の低減、
（ｄ）リガンドに結合する能力の増大、
（ｅ）リガンドに結合する能力の低減、
（ｆ）レセプターに結合する能力の増大、
（ｇ）レセプターに結合する能力の低減、
（ｈ）関心ある反応を触媒する能力の増大、
（ｉ）関心ある反応を触媒する能力の低減、
（ｊ）環境撹乱に対する応答を調節する能力の増大、
（ｋ）環境撹乱に対する応答を調節する能力の低減、
（ｌ）生理学的撹乱に対する応答を調節する能力の増大、
（ｍ）一つまたはそれ以上の生理学的撹乱に対する応答を調節する能力の低減、
（ｎ）一つまたはそれ以上の病原体に対する応答を調節する能力の増大、
（ｏ）一つまたはそれ以上の病原体に対する応答を調節する能力の低減、
（ｐ）一つまたはそれ以上の毒素に対する応答を調節する能力の増大、および
（ｑ）一つまたはそれ以上の毒素に対する応答を調節する能力の低減、
からなる群から選択される請求項４の方法。
【請求項７】
前記被験ヌクレオチド配列がポリペプチドをコードし、該被験ヌクレオチド配列で形質転換されているウキクサ植物培養物、ウキクサ根粒培養物、ウキクサ懸濁培養物、またはウキクサプロトプラスト細胞培養物を、該被験ヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチドが発現される条件下で培養する請求項４の方法。
【請求項８】
前記被験ヌクレオチド配列の生物学的機能が、前記関心ある生物学的機能を有するポリペプチドの発現の指標である生化学的アッセイにより決定される請求項７の方法。
【請求項９】
前記被験ヌクレオチド配列の生物学的機能が、前記関心ある生物学的機能を有するポリペプチドの発現の指標である生理学的アッセイにより決定される請求項７の方法。
【請求項１０】
前記関心ある生物学的機能を有するポリペプチドの存在が、該関心ある生物学的機能を有するポリペプチドの発現の指標である表現型の変化により決定される請求項７の方法。
【請求項１１】
前記関心ある生物学的機能を有するポリペプチドが作用物質の結合部位を有し、該関心ある生物学的機能を有するポリペプチドの存在が、該関心ある生物学的機能を有するポリペプチドと作用物質との間の複合体形成を検出することにより決定される請求項７の方法。
【請求項１２】
前記関心ある核酸分子で形質転換されたウキクサ植物培養物、ウキクサ根粒培養物、ウキクサ懸濁培養物、またはウキクサプロトプラスト細胞培養物の成長速度が、該関心ある核酸分子で形質転換されていないウキクサ植物培養物、ウキクサ根粒培養物、ウキクサ懸濁培養物、またはウキクサプロトプラスト細胞培養物の成長速度と比較して変化しており、前記被験ヌクレオチド配列の生物学的機能が該被験ヌクレオチド配列で形質転換されたウキクサ植物培養物、ウキクサ根粒培養物、ウキクサ懸濁培養物、またはウキクサプロトプラスト細胞培養物の成長速度決定により決定される請求項１の方法。
【請求項１３】
選択的成長条件下での前記関心ある核酸分子で形質転換されたウキクサ植物培養物、ウキクサ根粒培養物、ウキクサ懸濁培養物、またはウキクサプロトプラスト細胞培養物の成長速度が、同一の選択的成長条件下での該関心ある核酸分子で形質転換されていないウキクサ植物培養物、ウキクサ根粒培養物、ウキクサ懸濁培養物、またはウキクサプロトプラスト細胞培養物の成長速度と比較して増大しており、前記被験ヌクレオチド配列で形質転換されたウキクサ植物培養物、ウキクサ根粒培養物、ウキクサ懸濁培養物、またはウキクサプロトプラスト細胞培養物の成長速度が選択的成長条件下で決定される請求項１２の方法。
【請求項１４】
選択的成長条件下での前記関心ある核酸分子で形質転換されたウキクサ植物培養物、ウキクサ根粒培養物、ウキクサ懸濁培養物、またはウキクサプロトプラスト細胞培養物の成長速度が、同一の選択的成長条件下での該関心ある核酸分子で形質転換されていないウキクサ植物培養物、ウキクサ根粒培養物、ウキクサ懸濁培養物、またはウキクサプロトプラスト細胞培養物の成長速度と比較して低減しており、前記被験ヌクレオチド配列で形質転換されたウキクサ植物培養物、ウキクサ根粒培養物、ウキクサ懸濁培養物、またはウキクサプロトプラスト細胞培養物の成長速度が選択的成長条件下で決定される請求項１２の方法。
【請求項１５】
前記選択的成長条件が、高濃度の塩、制限された光レベル、制限されたｐＨ、病原体の存在および毒素の存在のうちの少なくとも一つを含む請求項１３の方法。
【請求項１６】
前記ウキクサ植物培養物、ウキクサ根粒培養物、ウキクサ懸濁培養物、またはウキクサプロトプラスト細胞培養物が、前記被験ヌクレオチド配列を含むアグロバクテリウムで接種することにより形質転換される請求項１の方法。
【請求項１７】
前記ウキクサ植物培養物、ウキクサ根粒培養物、ウキクサ懸濁培養物、またはウキクサプロトプラスト細胞培養物がバリスティック・ボンバードメントにより形質転換される請求項１の方法。
【請求項１８】
前記ウキクサ植物培養物、ウキクサ根粒培養物、ウキクサ懸濁培養物、またはウキクサプロトプラスト細胞培養物がエレクトロポレーションにより形質転換される請求項１の方法。
【請求項１９】
前記ウキクサプロトプラスト細胞培養物が形質転換され、該形質転換方法がＰＥＧ媒介形質転換である請求項１の方法。
【請求項２０】
前記ウキクサ植物培養物、ウキクサ根粒培養物、ウキクサ懸濁培養物、またはウキクサプロトプラスト細胞培養物が、Ｓｐｒｉｏｄｅｌａ属、Ｗｏｌｆｆｉａ属、Ｗｏｌｆｉｅｌｌａ属およびＬｅｍｎａ属からなる群から選択される請求項１の方法。
【請求項２１】
前記ウキクサ植物またはウキクサ根粒がコウキクサ（Ｌｅｍｎａ  ｍｉｎｏｒ）、ヒメウキクサ（Ｌｅｍｎａ  ｍｉｎｉｓｃｕｌａ）、ナンゴクアオウキクサ（Ｌｅｍｎａ  ａｅｑｕｉｎｏｃｉｔａｌｉｓ）、およびイボウキクサ（Ｌｅｍｎａ  ｇｉｂｂａ）からなる群から選択される請求項２０の方法。
【請求項２２】
関心ある核酸分子を識別するための高速大量処理方法であって、
（ａ）レポーターヌクレオチド配列がウキクサ植物培養物、ウキクサ根粒培養物、ウキクサ懸濁培養物、またはウキクサプロトプラスト細胞培養物のＤＮＡに組み込まれるような条件下で、該ウキクサ植物培養物、ウキクサ根粒培養物、ウキクサ懸濁培養物、またはウキクサプロトプラスト細胞培養物をレポーターヌクレオチド配列で形質転換するステップと、
（ｂ）該レポーターヌクレオチド配列が関心ある核酸分子に機能的に連結されているかどうかを決定するステップと
を含む方法。
【請求項２３】
前記関心ある核酸分子が前記レポーターヌクレオチド配列の発現を調節する請求項２２の方法。
【請求項２４】
前記関心ある核酸分子が前記標的ヌクレオチド配列の転写を調節する請求項２３の方法。
【請求項２５】
前記関心ある核酸分子が、
（ａ）前記レポーターヌクレオチド配列の転写レベルを増大させる能力、
（ｂ）前記レポーターヌクレオチド配列の転写レベルを低減させる能力、および
（ｃ）前記レポーターヌクレオチド配列の転写の組織特異性を調節する能力
から選択される活性を有する請求項２４の方法。
【請求項２６】
前記関心ある核酸分子が、
（ａ）前記関心ある刺激に応答して前記レポーターヌクレオチド配列の転写のレベルを増大させる能力、
（ｂ）前記関心ある刺激に応答して前記レポーターヌクレオチド配列の転写のレベルを低減させる能力、
（ｃ）前記関心ある刺激に応答して前記レポーターヌクレオチド配列の転写の組織特異性を調節する能力、
から選択される活性を有する請求項２４の方法。
【請求項２７】
前記関心ある刺激が、光レベル変化、温度変化、水分ポテンシャル変化、日長変化、ｐＨ変化、植物ホルモンレベルの変化、植物成長レギュレーターレベルの変化、病原体への暴露、および毒素への暴露からなる群から選択される請求項２６の方法。
【請求項２８】
前記核酸分子が前記レポーターヌクレオチド配列の翻訳を調節する請求項２３の方法。
【請求項２９】
前記核酸分子が、
（ａ）前記レポーターヌクレオチド配列の安定性を増大させる能力、
（ｂ）前記レポーターヌクレオチド配列の安定性を低減させる能力、
（ｃ）前記レポーターヌクレオチド配列の翻訳効率を増大させる能力、および
（ｄ）前記レポーターヌクレオチド配列の翻訳効率を低減させる能力
からなる群から選択される活性を有する請求項２８の方法。
【請求項３０】
前記核酸分子が、
（ａ）関心ある刺激に応答して前記レポーターヌクレオチド配列の安定性を増大させる能力、
（ｂ）関心ある刺激に応答して前記レポーターヌクレオチド配列の安定性を低減させる能力、
（ｃ）関心ある刺激に応答して前記レポーターヌクレオチド配列の翻訳効率を増大させる能力、および
（ｄ）関心ある刺激に応答して前記レポーターヌクレオチド配列の翻訳効率を低減させる能力
からなる群から選択される活性を有する請求項２８の方法。
【請求項３１】
前記関心ある刺激が、光レベル変化、温度変化、水分ポテンシャル変化、日長変化、ｐＨ変化、植物ホルモンレベル変化、植物成長レギュレーターレベルの変化、病原体への暴露、および毒素への暴露からなる群から選択される請求項３０の方法。
【請求項３２】
前記レポーターヌクレオチド配列がメッセンジャーＲＮＡである請求項２８の方法。
【請求項３３】
前記関心ある前記核酸分子が、プロモーターヌクレオチド配列、エンハンサーヌクレオチド配列、リーダーヌクレオチド配列、ターミネーターヌクレオチド配列、およびイントロンヌクレオチド配列からなる群から選択される請求項２２の方法。
【請求項３４】
前記レポーターヌクレオチド配列が、ウキクサ植物培養物、ウキクサ根粒培養物、ウキクサ懸濁培養物、またはウキクサプロトプラスト細胞培養物のＤＮＡへの組み込みを促進する一つまたはそれ以上のヌクレオチド配列を含む請求項２２の方法。
【請求項３５】
ウキクサ植物培養物、ウキクサ根粒培養物、ウキクサ懸濁培養物、またはウキクサプロトプラスト細胞培養物のＤＮＡへの、レポーターヌクレオチド配列の組み込みを促進する前記ヌクレオチド配列が、少なくとも一つのＴ−ＤＮＡ由来のヌクレオチド配列を含む請求項３４の方法。
【請求項３６】
前記レポーターヌクレオチド配列がレポーターポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、該レポーターポリペプチドの発現を検出して、該レポーターヌクレオチド配列が関心ある核酸分子に機能的に連結されているかどうかを決定する請求項３５の方法。
【請求項３７】
前記レポーターポリペプチドがＧＵＳ、ＣＡＴ、ルシフェラーゼ、およびＧＦＰからなる群から選択される請求項３６の方法。
【請求項３８】
前記ウキクサ植物培養物、ウキクサ根粒培養物、ウキクサ懸濁培養物、またはウキクサプロトプラスト細胞培養物が、前記レポーターヌクレオチド配列を含むアグロバクテリウムで接種することにより形質転換される請求項２２の方法。
【請求項３９】
前記ウキクサ植物培養物、ウキクサ根粒培養物、ウキクサ懸濁培養物、またはウキクサプロトプラスト細胞培養物がバリスティック・ボンバードメントにより形質転換される請求項２２の方法。
【請求項４０】
前記ウキクサ植物培養物、ウキクサ根粒培養物、ウキクサ懸濁培養物、またはウキクサプロトプラスト細胞培養物がエレクトロポレーションにより形質転換される請求項２２の方法。
【請求項４１】
前記ウキクサプロトプラスト細胞培養物が形質転換され、該形質転換方法がＰＥＧ媒介形質転換である請求項２２の方法。
【請求項４２】
前記ウキクサ植物培養物、ウキクサ根粒培養物、ウキクサ懸濁培養物、またはウキクサプロトプラスト細胞培養物が、Ｓｐｉｒｏｄｅｌａ属、Ｗｏｌｆｆｉａ属、Ｗｏｌｆｉｅｌｌａ属およびＬｅｍｎａ属からなる群から選択される請求項２２の方法。
【請求項４３】
前記前記ウキクサ植物またはウキクサ根粒が、コウキクサ（Ｌｅｍｎａ  ｍｉｎｏｒ）、ヒメウキクサ（Ｌｅｍｎａ  ｍｉｎｉｓｃｕｌａ）、ナンゴクアオウキクサ（Ｌｅｍｎａ  ａｅｑｕｉｎｏｃｉｔａｌｉｓ）、およびイボウキクサ（Ｌｅｍｎａ  ｇｉｂｂａ）からなる群から選択される請求項４２の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はウキクサを用いる高速大量処理スクリーニングのための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ウキクサは単子葉植物ファミリーＬｅｍｎａｃｅａｅの唯一のメンバーである。４つの属および３４の種は全て、その地理的範囲が地球全体にわたる小型の浮遊性の淡水性植物である（Ｌａｎｄｏｌｔ，Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ  ｏｎ  ｔｈｅ  Ｆａｍｉｌｙ  ｏｆ  Ｄｕｃｋｗｅｅｄｓ：Ｔｈｅ  Ｆａｍｉｌｙ  ｏｆ  Ｌｅｍｎａｃｅａｅ−Ａ  Ｍｏｎｏｇｒａｐｈ  Ｓｔｕｄｙ  Ｇｅｏｂａｔａｎｉｓｃｈｅｎ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔ  ＥＴＨ，Ｓｔｉｆｕｎｇ  Ｒｕｂｅｌ，Ｚｕｒｉｃｈ（１９８６））。ウキクサは、既知の最も形態学的に退化した植物であるが、大部分のウキクサの種は根、茎、花、種子および葉状体を含むもっと大型の植物の組織および器官を全て有している。ウキクサ種は十分に研究されており、そしてその生態学、分類学、ライフサイクル、代謝、病気および害虫に対する感受性、その繁殖生物学、遺伝子構造および細胞生物学について詳記される相当量の文献が存在する。（Ｈｉｌｌｍａｎ、Ｂｏｔ．Ｒｅｖｉｅｗ  ２７：２２１（１９６１）；Ｌａｎｄｏｌｔ、Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ  ｏｎ  ｔｈｅ  Ｆａｍｉｌｙ  ｏｆ  Ｄｕｃｋｗｅｅｄｓ：Ｔｈｅ  Ｆａｍｉｌｙ  ｏｆ  Ｌｅｍｎａｃｅａｅ−Ａ  Ｍｏｎｏｇｒａｐｈ  Ｓｔｕｄｙ  Ｇｅｏｂａｔａｎｉｓｃｈｅｎ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔ  ＥＴＨ，Ｓｔｉｆｕｎｇ  Ｒｕｂｅｌ，Ｚｕｒｉｃｈ（１９８６））。
【０００３】
ウキクサの生育習性は微生物培養方法に理想的である。植物は酵母の無性生殖性増殖に類似の巨視的様式で新規葉状体の植物性出芽を介して増殖する。この増殖は分裂細胞からの植物性出芽により生じる。分裂領域は小型であり、そして葉状体の腹面に見出される。分裂細胞は中央脈の各々の側面にある２つのポケットにある。小型の中央脈領域は根が発生し、そして各葉状体をその母葉状体に繋ぐ幹ができる部位でもある。分裂ポケットは組織フラップにより保護されている。葉状体はこれらのポケットから交互に出芽する。倍化時間は種によって異なり、２０から２４時間ほどの短時間である（Ｌａｎｄｏｌｔ、Ｂｅｒ．Ｓｃｈｗｅｉｚ．Ｂｏｔ．Ｇｅｓ．６７：２７１（１９５７）；Ｃｈａｎｇら、Ｂｕｌｌ．Ｉｎｓｔ．Ｃｈｅｍ．Ａｃａｄ．Ｓｉｎ．２４：１９（１９７７）；ＤａｔｋｏおよびＭｕｄｄ、Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．６５：１６（１９７０）；Ｖｅｎｋａｔａｒａｍａｎら、Ｚ．Ｐｆｌａｎｚｅｎｐｈｙｓｉｏｌ．６２：３１６（１９７０））。
【０００４】
アグロバクテリウム媒介遺伝子導入、バリスティック・ボンバードメント、またはエレクトロポレーションなどの多くの方法のいずれかによりウキクサ植物およびウキクサ根粒培養物を効率的に形質転換することができる。関心あるヌクレオチド配列および選択物質に対する抵抗性を付与する遺伝子の双方でウキクサ細胞を形質転換し、続いて選択物質を含有する培地中で形質転換された細胞を培養することにより、安定したウキクサ形質転換体を単離することができる。米国特許第６，０４０，４９８号および米国特許出願第６０／２２１，７０５号参照（引用することにより本明細書の一部をなすものとする）。
【０００５】
植物ゲノムシークエンシングの最近の進歩により、新規ポリペプチドをコードする遺伝子配列、およびこれらのコード配列の発現を制御するために提供され得る関連ヌクレオチド配列に関する多量の情報が提供されている。しかしながら、これらの配列データは、これらのヌクレオチド配列の生理学的に重要な過程における正確な役割に関する情報を提供していない。
【０００６】
新規遺伝子の機能を決定または確認するために、一般にこれらの遺伝子をインビボで発現させる必要がある。植物におけるその活性を決定するためにヌクレオチド配列をスクリーニングする場合、最も高い成功率が予測されるのは全植物での配列活性に関する試験からである。しかしながら、土壌で成長した無傷の植物の温室試験は時間および場所をとる。これらのスクリーニングを準備し、手入れをし、そしてスコア化するのに多大な労力も必要とされ、これらのステップは概して自動化できない。
【０００７】
成功が予測される全植物スクリーニングを規模および経費が縮小された高速大量処理スクリーニングと組み合わせた系でのヌクレオチド配列に関するスクリーニング方法が望ましい。従って、本発明はウキクサ系での高速大量処理スクリーニングを実施するための方法を提供する。
【発明の開示】
【０００８】
ウキクサ系において核酸分子の生物学的機能を決定するための、および関心ある核酸分子を識別するための高速大量処理方法が提供される。
【０００９】
本発明の方法は、核酸分子の迅速および効率的な識別ならびにキャラクタリゼーションを可能にする自動化を施すことができる。複数のサンプルを同時に処理できるように高密度フォーマット（high-density format）で該方法を実施することができる。加えて、本発明の方法の複数のステップを同一の高密度フォーマットで実施することができる。例えば、一つの実施形態では、ウキクサ培養の形質転換、選択および再生を同一の高密度フォーマットプレートで全て実施することができる。ウキクサ培養の形質転換の後、関心ある核酸分子を短縮された時間枠内で識別できるようなヌクレオチド配列の高速度スクリーニングが本発明の方法により提供される。最終的には、形質転換されたウキクサ系の非常に効率のよい回収が本発明の方法により提供される。
【００１０】
本発明の方法はウキクサ植物培養物、ウキクサ根粒培養物、ウキクサ懸濁培養物またはウキクサプロトプラスト細胞培養物のヌクレオチド配列での形質転換に関与する。次いでウキクサ系を操作して関心ある核酸分子を同定する。
【００１１】
一つの実施形態では、ウキクサ植物培養物、ウキクサ根粒培養物、ウキクサ懸濁培養物またはウキクサプロトプラスト細胞培養物を被験ヌクレオチド配列で形質転換し、そして被験ヌクレオチド配列の生物学的機能を決定し、それにより被験ヌクレオチド配列が関心ある核酸分子であるかどうかを決定する。
【００１２】
別の実施形態では、レポーターヌクレオチド配列がウキクサ植物培養物、ウキクサ根粒培養物、ウキクサ懸濁培養物またはウキクサプロトプラスト細胞培養物のＤＮＡに組み込まれるような条件下で、ウキクサ植物培養物、ウキクサ根粒培養物、ウキクサ懸濁培養物またはウキクサプロトプラスト細胞培養物をレポーターヌクレオチド配列で形質転換し、そしてレポーターヌクレオチド配列が関心ある核酸分子に機能的に連結されるようにウキクサＤＮＡに組み込まれているかどうかを決定することにより関心ある核酸分子を同定する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明は関心ある核酸分子を同定およびキャラクタリゼーションするための、ウキクサ系における核酸分子の高速大量処理スクリーニングの方法に関する。これらの方法は成功が予測される全植物のスクリーニングを、典型的には単一の細胞技術に関連する高速大量処理スクリーニングの規模、労力、時間および経費効率と組み合わせる。
【００１４】
［定義］
本発明の方法は高速大量処理スクリーニング法である。本明細書で用いる「高速大量処理方法」とは少なくとも以下の一つが当てはまる方法を意図する。
【００１５】
（１）該方法を高密度フォーマット、すなわち、一つ以上のサンプルを同時に処理するような様式で実施する。例えばある実施形態では、少なくとも１２以上、少なくとも２４以上、少なくとも４８以上、少なくとも９６以上、または少なくとも３８４以上のサンプルを単一のプレートまたはその他の容器内で処置できる。各ウェルに多孔性支持システムを加えることにより、プレートまたはその他の容器を特にウキクサ培養物の成長、維持、および自動化処理に適応させることができる。例えば２００１年５月３０日出願の米国仮特許出願第６０／２９４，４３０号、および２００２年５月２８日出願の「高速大量処理スクリーニングのためのプレートおよび方法」と題した米国特許出願を参照されたい。
【００１６】
（２）複数のステップ、例えばウキクサ培養物の形質転換、選択および再生を同一の高密度フォーマットプレートまたは容器で実施できるように方法を実施する。一つの実施形態では、ウキクサ培養物の移動をステップ間で必要としないように形質転換ステップ、選択ステップおよび再生ステップから選択される２つまたはそれ以上のステップを同一プレート内で実施する。
【００１７】
（３）自動化を施すことができる、すなわち実験室ロボットステーションを用いて方法の一つまたはそれ以上のステップを実施することができる。
【００１８】
（４）本発明の方法によりヌクレオチド配列の高速スクリーニングが可能になる。例えば、本発明のある実施形態では、形質転換後わずか４から１６週間で、例えば４週間またはそれ以内、５週間またはそれ以内、６週間またはそれ以内、７週間またはそれ以内、８週間またはそれ以内、９週間またはそれ以内、１０週間またはそれ以内、１１週間またはそれ以内、１２週間またはそれ以内、１３週間またはそれ以内、１４週間またはそれ以内、１５週間またはそれ以内、１６週間またはそれ以内に形質転換されたウキクサをアッセイして関心ある核酸分子を同定することができる。
【００１９】
（５）本発明の方法により、形質転換された少なくとも３０％以上、少なくとも３５％以上、少なくとも４０％以上、少なくとも４５％以上、少なくとも５０％以上、少なくとも５５％以上、少なくとも６０％以上、少なくとも６５％以上、少なくとも７０％以上、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％以上、少なくとも約８５％以上、少なくとも約９０％以上、少なくとも約９５％以上のウキクサ培養物が被験ヌクレオチド配列またはレポーターヌクレオチド配列を含むトランスジェニックウキクサ系を生じるような非常に効率のよい、形質転換されたウキクサ系の回収が提供される。
【００２０】
本明細書で用いる「ウキクサ系」または「ウキクサ培養物」なる用語はウキクサ植物培養物、ウキクサ根粒培養物、ウキクサ懸濁培養物およびウキクサプロトプラスト培養物を包含する。
【００２１】
本明細書で用いる「ウキクサ植物培養物（duckweed plant culture）」なる用語は大部分が十分に分化したウキクサ植物を含む培養物を意味する。
【００２２】
本明細書で用いる「ウキクサ根粒培養物」なる用語は、少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％の細胞が分化した細胞であるウキクサ細胞を含む培養物を意味する。本明細書で用いる「分化した細胞」は、それを未分化細胞から、または別の組織型で見出される細胞から区別する少なくとも一つの表現型特性（例えば特徴的な細胞形態学またはマーカー核酸もしくはタンパク質の発現）を有する。ある実施形態では、ウキクサ根粒培養物は本明細書の別の部分で記載するウキクサ微小根粒を含む。
【００２３】
本明細書で用いる「ウキクサ懸濁培養物」なる用語は、分散したウキクサ細胞、例えば分散したウキクサカルス細胞を含む培養物を意味する。概して、ウキクサ懸濁培養物は単一の細胞および種々の大きさの組織化されていない細胞凝集物の双方を含む。
【００２４】
「ウキクサプロトプラスト培養物」なる用語は、少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％または９０％のウキクサ細胞が細胞壁を欠くウキクサ細胞を含む培養物を意味する。植物細胞からプロトプラスト細胞を作製するための方法は、例えばＥｒｉｋｓｓｏｎ，Ｐｌａｎｔ  Ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓ（１９９５），Ｆｏｗｋｅら編、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ（引用することにより本明細書の一部をなすものとする）に記載されている。
【００２５】
本明細書で用いる「生物学的機能」なる用語は核酸分子またはポリペプチドの生物学的活性または特性を意味する。例えば核酸分子の生物学的機能には、生物学的応答を調節（modulate）すること、ポリペプチドをコードすること、および標的ヌクレオチド配列の発現を調節することなどがある。ポリペプチドの生物学的機能の実例には、生物学的応答を調節すること、関心ある構造特性を付与すること、関心ある生化学的活性を付与すること、および関心ある制御活性を付与することなどがある。特に調節および制御活性の限定的ではない例としては、関心ある基質に結合する能力、関心あるリガンドに結合する能力、関心ある反応を触媒する能力、植物ホルモンに対する応答を調節する能力、植物成長レギュレーターに対する応答を調節する能力、環境的撹乱に対する応答を調節する能力、生理学的撹乱に対する応答を調節する能力、一つまたはそれ以上の病原体に対する応答を調節する能力、および一つまたはそれ以上の毒素に対する応答を調節する能力などがある。
【００２６】
本明細書で用いる「発現」なる用語はヌクレオチド配列の転写または翻訳を意味する。
【００２７】
「ウキクサ」なる用語はＬｅｍｎａｃｅａｅファミリーのメンバーを意味する。このファミリーは現在以下のウキクサの４つの属および３４の種に分けられている。Ｌｅｍｎａ属（Ｌ．ａｅｑｕｉｎｏｃｉｔａｌｉｓ，Ｌ．ｄｉｓｐｅｒｍａ，Ｌ．ｅｃｕａｄｏｒｉｅｎｓｉｓ，Ｌ．ｇｉｂｂａ，Ｌ．ｊａｐｏｎｉｃａ，Ｌ．ｍｉｎｏｒ，Ｌ．ｍｉｎｉｓｃｕｌａ，Ｌ．ｏｂｓｃｕｒａ，Ｌ．ｐｅｒｐｕｓｉｌｌａ，Ｌ．ｔｅｎｅｒａ，Ｌ．ｔｒｉｓｕｌｃａ，Ｌ．ｔｕｒｉｏｎｉｆｅｒａ，Ｌ．ｖａｌｄｉｖｉａｎａ）；Ｓｐｉｒｏｄｅｌａ属（Ｓ．ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ，Ｓ．ｐｏｌｙｒｒｈｉｚａ，Ｓ．ｐｕｎｃｔａｔａ）；Ｗｏｌｆｆｉａ属（Ｗａ．ａｎｇｕｓｔａ，Ｗａ．ａｒｒｈｉｚａ，Ｗａ．ａｕｓｔｒａｌｉｎａ，Ｗａ．ｂｏｒｅａｌｉｓ，Ｗａ．ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ，Ｗａ．ｃｏｌｕｍｂｉａｎａ，Ｗａ．ｅｌｏｎｇａｔａ，Ｗａ．ｇｌｏｂｏｓａ，Ｗａ．ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｉｃａ，Ｗａ．ｎｅｇｌｅｃｔａ）；およびＷｏｌｆｉｅｌｌａ属（Ｗｌ．ｃａｕｄａｔａ，Ｗｌ．ｄｅｎｔｉｃｕｌａｔａ，Ｗｌ．ｇｌａｄｉａｔａ，Ｗｌ．ｈｙａｌｉｎａ，Ｗｌ．ｌｉｎｇｕｌａｔａ，Ｗｌ．ｒｅｐｕｎｄａ，Ｗｌ．ｒｏｔｕｎｄａおよびＷｌ．ｎｅｏｔｒｏｐｉｃａ）。Ｌｅｍｎａｃｅａｅのその他のいずれかの属または種が存在すれば、それもまた本発明の態様である。Ｌａｎｄｏｌｔ，Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ  ｏｎ  ｔｈｅ  Ｆａｍｉｌｙ  ｏｆ  Ｄｕｃｋｗｅｅｄｓ：Ｔｈｅ  Ｆａｍｉｌｙ  ｏｆ  Ｌｅｍｎａｃｅａｅ−Ａ  Ｍｏｎｏｇｒａｐｈ  Ｓｔｕｄｙ  Ｇｅｏｂａｔａｎｉｓｃｈｅｎ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔ  ＥＴＨ，Ｓｔｉｆｕｎｇ  Ｒｕｂｅｌ，Ｚｕｒｉｃｈ（１９８６）に記載されるように、分類学体系を用いてＬｅｍｎａ種を分類することができる。
【００２８】
ヌクレオチド配列を参照して本明細書で用いる、「機能的に連結された」とは互いに機能的な関係に配置された複数のヌクレオチド配列を意味する。例えばプロモーターヌクレオチド配列が、第２のヌクレオチド配列の転写を誘導できるように配置されている場合、プロモーターヌクレオチド配列は第２のヌクレオチド配列に機能的に連結されている。
【００２９】
関心ある核酸分子を同定するための方法はウキクサ植物培養物、ウキクサ根粒培養物、ウキクサ懸濁培養物またはウキクサプロトプラスト細胞培養物をヌクレオチド配列で形質転換するステップを含む。ある実施形態では、ヌクレオチド配列は被験ヌクレオチド配列またはレポーターヌクレオチド配列である。当分野で公知のいずれかの方法を用いてウキクサ培養物を形質転換することができる。一つの実施形態では、Ｓｔｏｍｐらに対する米国特許第６０４０４９８号、または米国特許出願第６０／２２１７０５号（引用することにより本明細書の一部をなすものとする）に開示される遺伝子導入方法の一つにより、安定して形質転換されたウキクサが得られる。これらの参照文献に記載された方法には関心あるヌクレオチド配列を含む核酸でコーティングした微粒子銃を用いるバリスティック・ボンバードメントによる遺伝子導入（遺伝子銃ボンバードメント、微粒子銃ボンバードメント、または微粒子ボンバードメントとしても公知である）、エレクトロポレーションによる遺伝子導入、および関心あるヌクレオチド配列を含むベクターを含むアグロバクテリウム媒介遺伝子導入などがある。トランスジェニックウキクサ系の選択および再生についてはこれらの参照文献ならびに本明細書の他の部分に記載されている。一つの実施形態では、Ｓｔｏｍｐらに対する米国特許第６，０４０，４９８号にて開示されるアグロバクテリウム媒介法のいずれか一つにより安定して形質転換されたウキクサが得られる。使用されたアグロバクテリウムはアグロバクテリウム−ツメファシエンスまたはＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓである。もう一つの実施形態では、ＰＥＧ媒介形質転換を用いてウキクサ培養物を形質転換する。例えば、Ｌａｚｅｒｒｉ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４９：９５−１０６（１９９５）；Ｍａｔｈｕｒら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．８２：２６７−２７６（１９９８）；Ｄｅｔｔａら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１１１：３３５−３４７（１９９９）（引用することにより本明細書の一部をなすものとする）を参照。
【００３０】
一つの実施形態では、ウキクサ植物培養物、ウキクサ根粒培養物、ウキクサ懸濁培養物またはウキクサプロトプラスト細胞培養物を高密度フォーマットプレートまたはその他の容器、例えば２４ウェルプレート、４８ウェルプレート、または９６ウェルプレートで形質転換する。各ウェルに多孔性支持体を加えることにより、ウキクサ培養物の処理を自動化するようにプレートを適応させることができる。例えば２００１年５月３０日出願の米国仮特許出願第６０／２９４，４３０号、および２００２年５月２８日出願の「高速大量処理スクリーニングのためのプレートおよび方法」と題した米国特許出願（引用することにより本明細書の一部をなすものとする）を参照されたい。別の実施形態では、単一の容器内でウキクサ培養物を形質転換し、そして次にウキクサを高密度フォーマットに移す。ウキクサを手動で高密度フォーマットに移すか、またはウキクサ植物、根粒、懸濁細胞の移動を当分野で公知の方法を用いて自動化することができる。
【００３１】
本発明は自動化された手順を用いて容易に操作することができるウキクサ根粒培養物の調製方法を提供する。本発明の方法は、大きなウキクサ根粒を粉砕してウキクサ「微細根粒」培養物を生成することを含む。「微細根粒」は自動化液体ハンドラーのノズルを使用して吸引または分散され得る、十分に小型のサイズであるウキクサ根粒である。ある実施形態では、微細根粒がピペットチップの内外に自由に移動できるように、自動化液体ハンドラーまたは自動化液体ハンドラーピペットチップは、バレルのサイズおよびチップ開口部を大きくするように改造されている。ウキクサ根粒を粉砕してウキクサ「微細根粒」を生成するために、機械的方法、酵素的方法、または微細根粒の形成を促進する条件下でウキクサを成長させる方法などのいずれかの方法を用いることができる。一つの実施形態では、一つまたはそれ以上の層の網目ふるいを通してウキクサ根粒を押し出すことにより、微細根粒培養物を生成する。特定の実施形態では、３０メッシュふるいを使用する。次いで微細根粒を高密度フォーマットプレートまたはその他の容器に移すことができる。高密度フォーマットプレートまたは容器の大部分のウェルが一つの形質転換事象のみを有するように、微細根粒の濃度を調整することができる。本発明の微細根粒は、細片に粉砕されていないウキクサ根粒に関して観察されるのと類似の葉状体再生効率が示される。
【００３２】
本発明のある実施形態では、被験ヌクレオチド配列を含む核酸分子でウキクサを形質転換する。特定の実施形態では、被験ヌクレオチド配列は、被験ヌクレオチド配列に機能的に連結された転写開始領域を有する発現カセットを含む。転写開始領域（例えばプロモーター）は、宿主に対して生来のもの、相同性、外来性もしくは非相同性でよく、または自然発生配列もしくは合成により作製された配列でよい。外来性とは、転写開始領域が導入される野生型宿主において、転写開始領域が見出されないことを意図している。
【００３３】
当分野で公知のいずれかの適当なプロモーターを本発明に従って用いることができる（細菌、酵母、菌類、昆虫、哺乳動物および植物プロモーターを含む）。例えば、ウキクサプロモーターを含む植物プロモーターを用いることができる。プロモーターの実例としては、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーター、オパインシンターゼプロモーター（例えばｎｏｓ、ｍａｓ、ｏｃｓ等）、ユビキチンプロモーター、アクチンプロモーター、リブロースビスホスフェート（ＲｕｂＰ）カルボキシラーゼ小型サブユニットプロモーター、およびアルコールデヒドロゲナーゼプロモーターなどが挙げられるが、これらには限定されない。ウキクサＲｕｂＰカルボキシラーゼ小型サブユニットプロモーターは当分野で公知である（Ｓｉｌｖｅｒｔｈｒｏｎｅら、Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５：４９（１９９０））。植物、好ましくはウキクサに感染するウイルスに由来するその他のプロモーターとしては、Ｄａｓｈｅｅｎモザイクウイルスから単離されたプロモーター、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａウイルス（例えばＣｈｌｏｒｅｌｌａウイルス・アデニンメチルトランスフェラーゼ・プロモーター；Ｍｉｔｒａら、Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６：８５（１９９４））、トマト黄化壊疽ウイルス、タバコ茎壊疽ウイルス、タバコ壊疽ウイルス、タバコ・リングスポットウイルス、トマト・リングスポットウイルス、キュウリ・モザイクウイルス、ピーナッツ・スタンプ・ウイルス、アルファルファ・モザイクウイルス、サトウキビ・バシリフォーム・バドナウイルス等が挙げられるが、これらには限定されない。
【００３４】
最終的に、プロモーターを選択して望ましいレベルの制御を得ることができる。例えば、いくつかの例では構成的発現を付与するプロモーターを用いるのが有利である（例えばアグロバクテリウム−ツメファシエンスに由来するマノパインシンターゼプロモーター）。あるいは、別の状況では、特定の環境刺激に応答して活性化されるプロモーター（例えば熱ショック遺伝子プロモーター、乾燥誘導遺伝子プロモーター、病原体誘導遺伝子プロモーター、創傷誘導遺伝子プロモーター、および明暗誘導遺伝子プロモーター）または植物成長レギュレーター（例えばアブサイシン酸、オーキシン、サイトカイニンおよびジベレリン酸により誘導された遺伝子に由来するプロモーター）を用いるのが有利である。さらなる代替としては、組織特異的発現を提供するプロモーターを選択することができる（例えば根、葉および花特異的プロモーター）。
【００３５】
所与のプロモーターの全体的な強度は、シス作動性ヌクレオチド配列、例えば上流活性化配列の組み合わせおよび空間的構成により影響され得る。例えば、アグロバクテリウム−ツメファシエンスオクトパイン・シンターゼ遺伝子に由来する活性化ヌクレオチド配列は、アグロバクテリウム−ツメファシエンスマノパインシンターゼプロモーターからの転写を増強することができる（Ｇｅｌｖｉｎらに対する米国特許第５，９５５，６４６号参照）。本発明では、発現カセットがプロモーター配列の上流に挿入された活性化ヌクレオチド配列を含有して、被験ヌクレオチド配列の発現を増強することができる。一つの実施形態では、発現カセットはアグロバクテリウム−ツメファシエンスマノパイン・シンターゼ遺伝子に由来するプロモーターに機能的に連結された、アグロバクテリウム−ツメファシエンスオクトパイン・シンターゼ遺伝子に由来する３つの上流活性化配列を含む（米国特許第５，９５５，６４６号、引用することにより本明細書の一部をなすものとする）。
【００３６】
発現カセットはさらに、植物において機能的である転写および翻訳終止領域を含むことができる。当分野で公知のいずれかの適当な終止配列を、本発明に従って用いることができる。終止領域は転写開始領域と同一起源、関心あるヌクレオチド配列と同一起源、または別の供給源に由来するものであってよい。都合よい終止領域はアグロバクテリウム−ツメファシエンスのＴｉプラスミド、例えばオクトパイン・シンターゼおよびノパリン・シンターゼ終止領域から入手可能である。Ｇｕｅｒｉｎｅａｕら、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２６２：１４１（１９９１）；Ｐｒｏｕｄｆｏｏｔ、Ｃｅｌｌ  ６４：６７１（１９９１）；Ｓａｎｆａｃｏｎら、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．５：１４１（１９９１）；Ｍｏｇｅｎら、Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ２：１２６１（１９９０）；Ｍｕｎｒｏｅら、Ｇｅｎｅ  ９１：１５１（１９９０）；Ｂａｌｌａｓら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１７：７８９１（１９８９）；およびＪｏｓｈｉら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１５：９６２７（１９８７）もまた参照されたい。さらなる終止配列の実例は、エンドウＲｕｂＰカルボキシラーゼ小型サブユニット終止配列およびカリフラワーモザイクウイルス３５Ｓ終止配列である。その他の適当な終止配列は当分野の当業者に明らかであろう。
【００３７】
一つ以上の遺伝子または核酸配列を含有する発現カセットを移行させ、そして形質転換された植物内で発現させることができる。従って、各々の核酸配列は５’および３’制御配列に機能的に連結されている。あるいは、複数の発現カセットを提供することができる。
【００３８】
一般的に、発現カセットは形質転換された細胞または組織を選択するための選択マーカー遺伝子を含む。選択マーカー遺伝子には抗生物質抵抗性をコードする遺伝子、例えばネオマイシン・ホスホトランスフェラーゼＩＩ（ＮＥＯ）およびヒグロマイシン・ホスホトランスフェラーゼ（ＨＰＴ）をコードする遺伝子、ならびに除草性化合物に対する抵抗性を付与する遺伝子などがある。除草剤抵抗性遺伝子は一般に除草剤に非感受性である修飾された標的タンパク質か、または除草剤が作用できる前に、植物において除草剤を分解もしくは解毒する酵素をコードする。ＤｅＢｌｏｃｋら、ＥＭＢＯ  Ｊ．６：２５１３（１９８７）；ＤｅＢｌｏｃｋら、Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．９１：６９１（１９８９）；Ｆｒｏｍｍら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ８：８３３（１９９０）；Ｇｏｒｄｏｎ−Ｋａｍｍら、Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ２：６０３（１９９０）参照。例えば、グリホスフェートまたはスルフォニル尿素除草剤に対する抵抗性は、変異標的酵素、５−エノールピルビルシキメート−３−ホスフェート・シンターゼ（ＥＰＳＰＳ）およびアセトラクテート・シンターゼ（ＡＬＳ）をコードする遺伝子を使用して得られる。グルホシネート・アンモニウム、ブロモキシニル、および２，４−ジクロロフェノキシアセテート（２，４−Ｄ）に対する抵抗性は、各除草剤を解毒するホスフィノスリシン・アセチルトランスフェラーゼ、ニトリラーゼ、または２，４−ジクロロフェノキシアセテート・モノオキシゲナーゼをコードする細菌遺伝子を用いることにより獲得される。
【００３９】
本発明の関心あるための選択マーカー遺伝子としては、ネオマイシン・ホスホトランスフェラーゼＩＩ（Ｆｒａｌｅｙら、ＣＲＣ  Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ４：１（１９８６））；シアナミドヒドラターゼ（Ｍａｉｅｒ−Ｇｒｅｉｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：４２５０（１９９１））；アスパルテートキナーゼ；ジヒドロジピコリネートシンターゼ（Ｐｅｒｌら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １１：７１５（１９９３））；ｂａｒ遺伝子（Ｔｏｋｉら、Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１００：１５０３（１９９２）；Ｍｅａｇｈｅｒら、Ｃｒｏｐ  Ｓｃｉ．３６：１３６７（１９９６））；トリプトファンデカルボキシラーゼ（Ｇｏｄｄｉｊｎら、Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２：９０７（１９９３））；ネオマイシン・ホスホトランスフェラーゼ（ＮＥＯ；Ｓｏｕｔｈｅｒｎら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎ．１：３２７（１９８２））；ヒグロマイシン・ホスホトランスフェラーゼ（ＨＰＴまたはＨＹＧ；Ｓｈｉｍｉｚｕら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．６：１０７４）；ジヒドロ葉酸リダクターゼ（ＤＨＦＲ；Ｋｗｏｋら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８３：４５５２（１９８６））；ホスフィノスリシン・アセチルトランスフェラーゼ（ＤｅＢｌｏｃｋら、ＥＭＢＯ  Ｊ．６：２５１３（１９８７））；２，２−ジクロロプロピオン酸デハロゲナーゼ（Ｂｕｃｈａｎａｎ−Ｗｏｌｌａｔｒｏｎら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１３Ｄ：３３０）；アセトヒドロキシ酸シンターゼ（Ａｎｄｅｒｓｏｎらに対する米国特許第４，７６１，３７３号）；Ｈａｕｇｈｎら、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２２１：２６６（１９８８）；５−エノールピルビルシキメート・ホスフェート・シンターゼ（ａｒｏＡ；Ｃｏｍａｉら、Ｎａｔｕｒｅ  ３１７：７４１（１９８５））；ハロアリールニトリラーゼ（Ｓｔａｌｋｅｒらに対する国際公開公報第８７／０４１８１号）；アセチル・コエンザイムＡカルボキシラーゼ（Ｐａｒｋｅｒら、Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．９２：１２２０（１９９０））；ジヒドロプテロエートシンターゼ（ＳｕｌＩ；Ｇｕｅｒｉｎｅａｕら、Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５：１２７（１９９０））；および３２ｋＤａ  フォトシステムＩＩポリペプチド（ｐｓｂＡ；Ｈｉｒｓｃｈｂｅｒｇｒら（１９８３）、Ｓｃｉｅｎｃｅ２２２：１３４６（１９８３））などがある。
【００４０】
ゲンタマイシン（Ｃａｒｒｅｒら、Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１７：３０１−３０３（１９９１））；クロラムフェニコール（Ｈｅｒｒｅｒａ−Ｅｓｔｒｅｌｌａら、ＥＭＢＯ  Ｊ．２：９８７（１９８３））；メソトレキセート（（Ｈｅｒｒｅｒａ−Ｅｓｔｒｅｌｌａら、Ｎａｔｕｒｅ  ３０３：２０９（１９８３）；Ｍｅｉｊｅｒら、Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１６：８０７（１９９１））；ヒグロマイシン（Ｗａｌｄｒｏｎら、Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．５：１０３（１９８５）；Ｚｈｉｊｉａｎら、Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  １０８：２１９（１９９５）；Ｍｅｉｊｅｒら、Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１６：８０７（１９９１））；ストレプトマイシン（Ｊｏｎｅｓら、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２１０：８６（１９８７））；スペクチノマイシン（Ｂｒｅｔａｇｎｅ−Ｓａｇｎａｒｄら、Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ｒｅｓ．５：１３１（１９９６））；ブレオマイシン（Ｈｉｌｌｅら、Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．７：１７１（１９８６））；スルフォンアミド（Ｇｕｅｒｉｎｅａｕら、Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５：１２７（１９９０））；ブロモシキニル（Ｓｔａｌｋｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４１９（１９８８））；２，４−Ｄ（Ｓｔｒｅｂｅｒら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ７：８１１（１９８９））；およびホスフィノスリシン（ＤｅＢｌｏｃｋら、ＥＭＢＯ  Ｊ．６：２５１３（１９８７））に対する抵抗性をコードする遺伝子もまた含まれる。
【００４１】
ｂａｒ遺伝子はグルフォシネート型除草剤、例えばホスフィノトリシン（ＰＰＴ）またはビアラフォス等に対する除草剤抵抗性を付与する。前記したように、ベクター構築物において使用できるその他の選択マーカーとしてはビアラフォスおよびホスフィノスリシン抵抗性のためでもあるｐａｔ遺伝子、イミダゾリノン抵抗性のためのＡＬＳ遺伝子、ヒグロマイシン抵抗性のためのＨＰＨまたはＨＹＧ遺伝子、グリフォセート抵抗性のためのＥＳＰＳシンターゼ遺伝子、Ｈｃ毒素に対する抵抗性のためのＨｍ１遺伝子、および日常的に使用され、そして当分野の当業者に公知のその他の選択物質などが挙げられるが、これらには限定されない。Ｙａｒｒａｎｔｏｎ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．３：５０６（１９９２）；Ｃｈｉｓｔｏｐｈｅｒｓｏｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８９：６３１４（１９９２）；Ｙａｏら，Ｃｅｌｌ  ７１：６３（１９９２）；Ｒｅｚｎｉｋｏｆｆ，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６：２４１９（１９９２）；Ｂａｒｋｌｅｙら，Ｔｈｅ  Ｏｐｅｒｏｎ  １７７−２２０（１９８０）；Ｈｕら，Ｃｅｌｌ  ４８：５５５（１９８７）；Ｂｒｏｗｎら，Ｃｅｌｌ  ４９：６０３（１９８７）；Ｆｉｇｇｅら，Ｃｅｌｌ  ５２：７１３（１９８８）；Ｄｅｕｓｃｈｌｅら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：５４００（１９８９）；Ｆｕｅｒｓｔら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：２５４９（１９８９）；Ｄｅｕｓｃｈｌｅら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４８：４８０（１９９０）；Ｌａｂｏｗら，Ｍｏｌｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０：３３４３（１９９０）；Ｚａｍｂｒｅｔｔｉら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：３９５２（１９９２）；Ｂａｉｍら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：５０７２（１９９１）；Ｗｙｂｏｒｓｋｉら，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９：４６４７（１９９１）；Ｈｉｌｌｅｎａｎｄ−Ｗｉｓｓｍａｎ，Ｔｏｐｉｃｓ  ｉｎ  Ｍｏｌ．Ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃ．Ｂｉｏｌ．１０：１４３（１９８９）；Ｄｅｇｅｎｋｏｌｂら，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．３５：１５９１（１９９１）；Ｋｌｅｉｎｓｃｈｎｉｄｔら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２７：１０９４（１９８８）；Ｇａｔｚら，Ｐｌａｎｔ  Ｊ．２：３９７（１９９２）；Ｇｏｓｓｅｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：５５４７（１９９２）；Ｏｌｉｖａら，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．３６：９１３（１９９２）；Ｈｌａｖｋａら，Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ７８（１９８５）およびＧｉｌｌら，Ｎａｔｕｒｅ  ３３４：７２１（１９８８）参照。このような開示は引用することにより本明細書の一部をなすものとする。
【００４２】
選択マーカー遺伝子の上述の列記は、限定することを意図するものではない。いずれかの選択マーカー遺伝子を本発明で使用することができる。
【００４３】
被験ヌクレオチド配列を含む発現カセットは、ウキクサ植物培養物、ウキクサ根粒培養物、ウキクサ懸濁培養物またはウキクサプロトプラスト細胞培養物に形質転換される。次いで形質転換されたウキクサを再生し、そしてアッセイして被験ヌクレオチド配列が関心ある生物学的機能を有するかどうかを決定する。ウキクサ系を操作して、被験ヌクレオチドの生物学的機能を決定できることは認識されている。
【００４４】
一つの実施形態では、関心ある生物学的機能は関心ある生物学的または生理学的応答を調節する能力である。この生物学的応答は温度変化に対する応答、日長の変化に対する応答、水分ポテンシャルの変化に対する応答、光レベルの変化に対する応答、病原体暴露（菌類病原体、ウイルス、ビリオン、線虫、害虫、および細菌性病原体を含む）に対する応答、毒素暴露（例えば、高濃度の塩、重金属を含む金属、除草剤または重要な生理学的機能に干渉するその他の物質）に対する応答、植物ホルモンに対する応答、植物成長レギュレーターに対する応答、またはいずれかその他の環境撹乱に対する応答などのいずれかの応答でよい。
【００４５】
関心ある核酸分子（例えば関心ある応答を調節するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列）を同定するために、被験ヌクレオチド配列を含有するウキクサの応答をアッセイする。ある実施形態では、被験ヌクレオチド配列を含有するウキクサの応答を、被験ヌクレオチド配列を含有しないウキクサの応答と比較する。例えば成長速度などのいずれかの表現型における変化により応答をアッセイする。応答における検出可能な差異は、被験ヌクレオチド配列が関心ある核酸分子であることを示している。次いで被験ヌクレオチドの供給源として提供された大腸菌またはアグロバクテリウム系に対する生物学的応答において検出可能な差異を有するトランスジェニックウキクサ系を相関させることにより、関心ある核酸分子（例えば関心ある応答を調節するポリペプチドをコードする）を容易に同定することができる。
【００４６】
当分野で公知のいずれかの方法により、例えば湿潤もしくは乾燥重量、または窒素含量により成長速度を決定できる。選択的または制限的条件下でウキクサ培養物を成長させることができる。本明細書で用いる「選択的」または「制限的」成長条件なる用語は、形質転換されていないウキクサの成長速度が最適条件下での成長速度と比較して低下している条件を意味する。選択的成長条件の実例としては、制限的光レベル、制限的ｐＨ条件、または成長を制限する病原体もしくは毒素の存在などがある。
【００４７】
ある実施形態では、関心ある核酸分子は、関心ある生物学的機能を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列である。関心ある生物学的機能はいずれかの生物学的機能、例えば構造的もしくは機械的特性を付与する能力、特定の基質を結合させる能力、特定のリガンドを結合させる能力、特定のレセプターを結合させる能力、または特定の反応を触媒する能力などであってよい。被験ヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチドが分泌されるこれらの例では、ウキクサ培養物の培地を別の容器に除去して、そして関心ある生物学的機能、例えば特定の構造的特性、特定の生化学的作用、または特定のリガンド、基質もしくはその他の作用物質と複合体を形成する能力に関してアッセイすることができる。被験ヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチドがウキクサ組織内で保有されると、組織を分裂させ、タンパク質を抽出し、関心ある生物学的機能を有するポリペプチドの発現をアッセイする。ある実施形態では、破壊、抽出、および／またはアッセイステップを自動化する。
【００４８】
ある実施形態では、関心ある生物学的機能を有するポリペプチドは天然発生ポリペプチドの変種であり、そして関心ある生物学的機能は天然発生ポリペプチドと比較した、関心ある生物学的機能を有するポリペプチドの少なくとも一つの特性の変化である。このような変種を作製する方法は当分野で公知であり、そして本明細書の別の部分に記載されている。実験セクションの実施例２を参照。関心ある生物学的機能を有するポリペプチド（すなわち変種）と天然発生ポリペプチド間で異なる特性は、構造特性、基質を結合させる能力、リガンドを結合させる能力、関心ある反応を触媒する能力、生物学的範囲を超えた条件下で機能する能力、または生物学的応答を調節する能力などのいずれかの関心ある特性が挙げられるが、これらには限定されない。関心ある特性を有するポリペプチドを前記したように同定することができる。
【００４９】
唯一の元来のヌクレオチド配列の配列変種を含有する核酸調製物で、各々のウキクサ培養物サンプルを形質転換することができる。また別に、いくつかの被験ヌクレオチド配列のプールを含有する異種性核酸調製物で各サンプルを形質転換することができる。ウキクサ培養物あたり約３、約５、約１０、約１５、約２０、約２５、約３０、約４０、約５０、約６０、約７０、約８０、約９０、または約１００の被験ヌクレオチド配列を使用することができる。この方法では、関心ある生物学的機能を有するヌクレオチド配列を含有する被験ヌクレオチド配列のプールを、一つまたはそれ以上のラウンドの細目およびスクリーニングに供して関心ある単一の核酸分子を同定する。いずれかの方法でスクリーニングされた被験ヌクレオチド配列の全数は少なくとも一つまたはそれ以上、少なくとも１０以上、少なくとも１００以上、少なくとも１，０００以上、少なくとも１０，０００以上、少なくとも１００，０００以上、少なくとも５００，０００以上、少なくとも１，０００，０００以上であってよい。
【００５０】
本発明のある実施形態では、レポーターヌクレオチド配列がウキクサＤＮＡに組み込まれるような条件下で、ウキクサ植物培養物、ウキクサ根粒培養物、ウキクサ懸濁培養物またはウキクサプロトプラスト細胞培養物をレポーターヌクレオチド配列で形質転換することにより関心ある核酸分子を同定する。レポーターヌクレオチド配列はレポーターポリペプチドのコード配列を含む。レポーターポリペプチドは当分野で公知であり、非限定例としてはβ−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）、ルシフェラーゼ、クロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、または緑色蛍光タンパク質（ＧＥＰ）などがある。これらのレポーターポリペプチドの各々の検出方法は当分野で公知である。
【００５１】
ある実施形態では、レポーターヌクレオチド配列は転写開始ヌクレオチド配列を欠如している。別の実施形態では、レポーターヌクレオチド配列は転写開始ヌクレオチド配列を含む。転写開始ヌクレオチド配列は当分野で公知であり、本明細書に記載されているものなどがある。ある実施形態では、転写開始配列は最小プロモーター配列である。これにより、レポーターヌクレオチド配列がエンハンサー配列と機能的に連結されるようにウキクサＤＮＡに組み込まれる場合、転写エンハンサーとして提供されるヌクレオチド配列の識別が可能になる。
【００５２】
レポーターヌクレオチド配列は、前記した選択マーカーを含有して、トランスジェニック植物の選択を助けることができる。当分野で公知のいずれかの選択マーカーを使用することができる。
【００５３】
レポーターヌクレオチド配列は、レポーターヌクレオチド配列をウキクサＤＮＡに組み込むことを可能にするヌクレオチド配列を含むこともできる。一つの実施形態では、これらのヌクレオチド配列はトランスファーＤＮＡ（Ｔ−ＤＮＡ）配列である。これらの配列は全ての毒性アグロバクテリウム株に宿される大型Ｔｉ（腫瘍誘発）プラスミドのセグメントである。一つの実施形態では、Ｔ−ＤＮＡ配列ボーダーで見出される不完全な正方向反復配列をレポーターヌクレオチド配列の５’および３’末端に挿入する。本発明のＴ−ＤＮＡヌクレオチド配列は、好ましくは少なくとも一つのＴ−ＤＮＡ反復配列を含む。例えば国際公開広報第９３／１７１１６号（引用することにより本明細書の一部をなすものとする）参照。
【００５４】
Ｔ領域の植物細胞への移行は、Ｔｉプラスミドの別の領域であるｖｉｒ（毒性）領域（Ｚａｍｂｒｙｓｋｉ，Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．２２：１−３０（１９８８）；Ｚａｍｂｒｙｓｋｉら、Ｃｅｌｌ  ５６：１９３−２０１（１９８９）；ならびにＢａｒｏｎおよびＺａｍｂｒｙｓｋｉ、Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．６：１５６７−１５６９（１９９６））により媒介される。必要なｖｉｒ領域はトランスで、例えばバイナリープラスミド系の第２のプラスミド上で提供される。例えばＨｏｅｋｅｍａら、Ｎａｔｕｒｅ  ３１０：１１５−１２０（１９８３）およびＢｅｖａｎ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２２：８７１１−８７２１（１９８４）。別の実施形態では、移入されるＤＮＡを含有するベクターを三親性交配（triparental mating）またはエレクトロポレーションによりアグロバクテリウムに導入し、そしてこのベクターおよび受容体Ｔｉプラスミド間で相同組換えを生じる。
【００５５】
特許請求される方法により関心ある種々核酸分子の識別が提供される。一つの実施形態では、関心ある核酸分子は標的ヌクレオチド配列の転写を調節するプロモーターまたはエンハンサーとして提供される。従って、本発明の方法を用いて関心ある刺激に対する生物学的応答に関与するプロモーターおよびエンハンサーを識別することができる。関心ある刺激としては、光の変化、温度の変化、水分ポテンシャルの変化、日長変化、植物ホルモンレベルの変化、植物成長レギュレーターレベルの変化、病原体への暴露、および毒素への暴露などが挙げられるが、これらには限定されない。刺激に対する生物学的応答に関与する核酸分子を同定するために、組み込まれたレポーターヌクレオチド配列を含むウキクサ培養物を刺激に暴露し、そしてレポーターポリペプチドの発現を決定する。レポーターヌクレオチド配列が、刺激により活性化されるプロモーターまたはエンハンサーに機能的に連結されるようにウキクサＤＮＡに組み込まれている場合では、レポーターポリペプチドの発現を検出する。マーカーとしてレポーターヌクレオチド配列の部分を用いて、レポーターヌクレオチド配列の組み込み部位を同定し、それにより刺激に応答して調節した活性を呈するヌクレオチド配列を同定することができる。
【００５６】
本発明の方法を用いて組織特異的様式で標的ヌクレオチド配列の転写を調節するヌクレオチド配列を同定することができる。トランスジェニックウキクサ系をスクリーニングして、特定のウキクサ組織、例えば根、茎、花、種子、または葉状体においてのみレポーターポリペプチドを発現するこれらの系を識別することができる。次いで関心ある核酸分子を前記したように同定することができる。
【００５７】
標的ヌクレオチド配列（例えばレポーターヌクレオチド配列）の翻訳を調節する核酸分子には、転写効率を増強する配列、例えば標的ヌクレオチド配列の５’非翻訳領域に位置するリーダー配列（例えば、リボソーム結合を促進する配列）およびｍＲＮＡ安定性を増強する配列などがある。これらのヌクレオチド配列は、転写物の５’非翻訳領域、遺伝子のイントロン領域、および転写物の３’非翻訳領域などの遺伝子の転写された部分内のいずれの場所に位置してもよい。レポーターヌクレオチド配列が遺伝子の転写された部位内に組み込まれる場合、これらの配列が同定される。レポーターポリペプチドの発現に関してアッセイすることにより翻訳調節効果をモニター観察する。前記した転写制御配列に関して記載するように、翻訳を調節するヌクレオチド配列を特定の刺激により制御することができる。従って、関心ある刺激に応答したレポーターポリペプチド発現をモニター観察して、刺激に応答して活性化される制御ヌクレオチド配列を同定することができる。
【００５８】
ある実施形態では、レポーターヌクレオチド配列が、その発現（すなわち添書および／または翻訳）が関心ある刺激により制御される遺伝子のコード配列に機能的に連結されるようにウキクサＤＮＡに組み込まれている。レポーターポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を制御された遺伝子と一緒に転写し、そして翻訳して、レポーターポリペプチドを同定するのに用いられるのと同一の技術を用いて検出することができるキメラポリペプチドを形成することができる。関心ある刺激に応答したキメラポリペプチドの発現を用いて、レポーターヌクレオチド配列が関心ある核酸分子である制御された遺伝子に機能的に連結されているトランスジェニックウキクサ系を同定することができる。Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  １２：１００７−１０２０（２０００）（引用することにより本明細書の一部をなすものとする）参照。
【００５９】
［実験］
以下の実施例は説明を目的とするものであり、本発明を限定するためのものではない。
【実施例１】
【００６０】
［高密度フォーマットでのウキクサの系および再生］
＜液体培地の使用＞
以前に記載された実験では、ウキクサの培養を固体培地上で実施していた。この実験の目的は液体培地で飽和した多孔性支持体上でウキクサを培養できるかどうかを試験することであった。これによりウキクサの形質転換、選択および再生ステップが自動化され、ウキクサ系がヌクレオチド配列の高速大量処理スクリーニングに有用であることが実証される。
【００６１】
以下のようにアグロバクテリウム媒介形質転換を用いてウキクサ根粒培養物（Ｌｅｍｎａ  ｍｉｎｏｒ  Ｃ０１６株に由来する）をＧＵＳ発現構築物で形質転換した。
【００６２】
ＧＵＳ発現構築物に使用した発現ベクターはｐＢＭＳＰ−３であった。この発現ベクターは米国特許第５，９５５，６４６号（引用することにより本明細書の一部をなすものとする）に記載されているｐＢＭＳＰ−１から誘導される。ｐＢＭＳＰ−３転写カセットはアグロバクテリウム−ツメファシエンスオクトパイン・シンターゼから誘導される転写活性化ヌクレオチド配列の３つのコピー、およびアグロバクテリウム−ツメファシエンスマノパイン・シンターゼ遺伝子から誘導される別の転写活性化ヌクレオチド配列、アグロバクテリウム−ツメファシエンスマノパイン・シンターゼ遺伝子から誘導されるプロモーター領域、関心あるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の挿入のためのポリリンカー部位、ならびにアグロバクテリウム−ツメファシエンスノパリン・シンターゼ遺伝子から誘導される終止配列を含有する。この発現ベクターはまた選択マーカーとしてネオマイシン・ホスホトランスフェラーゼＩＩをコードするヌクレオチド配列をも含有する。選択マーカー配列の転写はアグロバクテリウム−ツメファシエンスノパリン・シンターゼ遺伝子から誘導されるプロモーターにより駆動される。ｐＢＭＳＰ−３はさらにプロモーターおよびポリリンカーの間に挿入されたトウモロコシデヒドロゲナーゼ遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｘ０４０４９）のヌクレオチド１２２２〜１７７５に相当するヌクレオチド配列を含有する。この実施例で用いられるＧＵＳ発現構築物を作製するために、ＧＵＳコード配列およびカナマイシン抵抗性遺伝子をｐＢＭＳＰ−３発現ベクターに挿入した。
【００６３】
ＧＵＳ発現構築物で形質転換したアグロバクテリウム−ツメファシエンス  Ｅｇｓ０５株を５００ｍｇ／ｌのストレプトマイシン、５０ｍｇ／ｌのスペクチノマイシンおよび５０ｍｇ／ｌの硫酸カナマイシン含有ＹＥＢ培地（１ｇ／ｌの酵母抽出物、５ｇ／ｌの牛肉抽出物、５ｇ／ｌのペプトン、５ｇ／ｌのスクロース、０．５ｇ／ｌのＭｇＳＯ4）上で成長させた。
【００６４】
形質転換のためのウキクサ根粒培養物を以下のように調製した。ウキクサ葉状体を分離し、滅菌メスで根を切断し、そして葉状体を、腹側を下にして、５μＭの２，４−ジクロロフェノキシ酢酸、０．５μＭの１−フェニル−３（１，２，３−チアジアゾル−５−イル）尿素チジアズロン（Ｓｉｇｍａ製  Ｐ６１８６）、３％のスクロース、０．４Ｄｉｆｃｏ  Ｂａｃｔｏ寒天（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製）および０．１５％Ｇｅｌｒｉｔｅ（Ｓｉｇｍａ）を補充したＭｕｒａｓｈｉｇｅおよびＳｋｏｏｇ培地（カタログ番号  Ｍ−５５１９；Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ミズーリ州）ｐＨ５．６上に置いた。葉状体を５から６週間成長させた。この時点で、概して腹側の中央部分から根粒（小型の帯黄色細胞塊）が出現した。この根粒組織片（平均サイズ３から６ｍｇ）を母葉状体から剥離し、そして３％のスクロース、０．４％のＤｉｆｃｏ  Ｂａｃｔｏ寒天、１μＭの２，４−ジクロロフェノキシ酢酸、および２μＭのベンジルアデニンを補充したＭｕｒａｓｈｉｇｅおよびＳｋｏｏｇ培地中で培養した。
【００６５】
ウキクサ根粒培養物を以下のように形質転換した。適当なアグロバクテリウム−ツメファシエンス株を５０μｇ／ｌのカナマイシンおよび１００μＭのアセトシリンゴンを含有ＹＥＢ寒天プレート上で成長させ、十分に成長したプレートを、０．６Ｍのマンニトールおよび１００μＭのアセトシリンゴンを補充したＭｕｒａｓｈｉｇｅおよびＳｋｏｏｇ培地１００ｍｌに再懸濁した。再懸濁した細菌の溶液に１から２分間浸漬することにより根粒培養組織に接種し、過剰の液体を吸い取らせて除去し、そして根粒成長を促進するように最適化されたオーキシンおよびサイトカイニンならびに１００μＭのアセトシリンゴンを補充したＭｕｒａｓｈｉｇｅおよびＳｋｏｏｇ培地からなる共培養培地にプレートした。次いで根粒培養物を暗闇で２日間インキュベートした。
【００６６】
選択用に、根粒培養物を寒天プレートに移し（処置１、以下を参照）または２００１年５月３０日出願の米国特許第号仮特許出願第６０／２９４４３０号および２００２年５月２８日出願の「高速大量処理スクリーニングのためのプレートおよび方法」と題した米国特許出願に記載されるポリエチレン支持体に適応させた２４ウェルプレートに移した（処置２、以下を参照）。ポリエチレン支持体（フリット）の２４ウェルプレートを調製するために、親水性ポリエチレン（厚さ１／１６インチ）を２４ウェルプレートに適応する大きさに切断し、そして培地交換のために中央にドリルで孔を開けた。これらのフリットを加圧滅菌し、乾燥させて、そして滑らかな表面を上にして２４ウェルプレートに置いた。該フリットを３％のスクロース、１μＭの２，４−ジクロロフェノキシ酢酸、２μＭのベンジルアデニンおよび以下の処置の一つを含有するＭｕｒａｓｈｉｇｅおよびＳｋｏｏｇ（ｐＨ５．６）５６０μｌで湿潤させた。
処置１：（寒天プレート）２００ｍｇ／ｌの硫酸カナマイシンおよび５００ｍｇ／ｌのセフォタキシム
処置２：（２４ウェルプレート）２００ｍｇ／ｌの硫酸カナマイシンおよび５００ｍｇ／ｌのセフォタキシム
そして、連続光（２０から４０μ／ｍ2・秒）の下で４日間培養した。４日目に処置１の形質転換した根粒培養物を３％のスクロース、２００ｍｇ／ｌの硫酸カナマイシンおよび５００ｍｇ／ｌのセフォタキシムを伴うＳｃｈｅｎｋおよびＨｉｌｄｅｂｒａｎｄｔ培地を含有する寒天培地に移した。処置２の根粒培養に関しては、１２ウェルでは培地を３％のスクロース、２００ｍｇ／ｌのカナマイシンおよび５００ｍｇ／ｌのセフォタキシムを含有する０．５Ｘ  ＳｃｈｅｎｋおよびＨｉｌｄｅｂｒａｎｄｔ培地に変更し、残りの１２ウェルに関しては２００ｍｇ／ｌのカナマイシンおよび３００ｍｇ／ｌの塩化セチルピリジニウムを含有する０．５Ｘ  ＳｃｈｅｎｋおよびＨｉｌｄｅｂｒａｎｄｔ培地に変更した。これらの根粒培養物を全光下でインキュベートした、６日後にいくつかのサンプルに由来する組織を染色してＧＵＳ発現をモニター観察した。結果は以下のとおりであった。
【００６７】
【表１】
2004529653.tif 000002
【００６８】
根粒培養物をさらに７週間インキュベートし、ウキクサ葉状体の再生に関してモニター観察した。セフォタキシムと共に成長した処置２ウェルからの結果を以下に示す。
【００６９】
【表２】
2004529653.tif 000003
【００７０】
この実験における形質転換効率は少なくとも５０％であった。ポリエチレン支持体上で成長したウキクサ培養物は、寒天プレート上で成長したものよりもより迅速に再生葉状体を生成し、そして形質転換効率はより高かった。従って、ウキクサが液体培地で成長できることの実証に加えて、この実験によりウキクサを培養するためのポリエチレン支持体の使用が形質転換効率を高め、そしてトランスジェニックウキクサ系の生成に必要な時間を低下させたことが示される。これらの知見により、ウキクサ系がヌクレオチド配列の全植物基盤のスクリーニングのための貴重な方法を提供することが実証される。
【実施例２】
【００７１】
［高密度フォーマットでのウキクサの形質転換および再生］
＜選択マーカーとしてのカナマイシン使用＞
この実験における、発現ベクター、アグロバクテリウム株、およびウキクサ根粒培養物は実施例１に記載したとおりである。この実験において使用した根粒培養物は２週齢であった。実施例１に記載したように共培養を実施した。汚染除去および選択のために、３％のスクロース、１μＭの２，４−ジクロロフェノキシアセテート、２μＭのベンジルアデニン、５００ｍｇ／ｌのセフォタキシムおよび２００ｍｇ／ｌの硫酸カナマイシンを含むＭｕｒａｓｈｉｇｅおよびＳｋｏｏｇ培地（ｐＨ５．６）を含有するポリエチレン支持体を適応させた２４ウェルプレートに根粒培養物を移した。
【００７２】
翌日、２４ウェルプレートの培地を以下のように交換した。古い培地を除去し、そして新鮮な培地２００μｌを加えた。過剰の培地を除去した。さらに培地２００μｌを加え、そして記載したように除去した。さらに培地２００μｌを加えた。培地がポリエチレン支持体のレベルを超えて上昇すると、過剰の培地を除去した。
【００７３】
翌日、２４ウェルプレートの培地を前記したように交換した。次いで２日毎にさらにおよそ２週間培地を交換した。この時点で根粒培養物の成長をモニター観察した。２４ウェルのうち２０個のウェルが生存カルス細胞を含有した。
【００７４】
続いて根粒培養物を３％のスクロース、２００ｍｇ／ｌのカナマイシンおよび５００ｍｇ／ｌのセフォタキシムを含有する０．５Ｘ  ＳｃｈｅｎｋおよびＨｉｌｄｅｂｒａｎｄｔ培地中で保持し、そして培地交換を２日毎におよそ４週間、そして次に週１回でさらに４週間実施した。ＳｃｈｅｎｋおよびＨｉｌｄｅｂｒａｎｄｔ培地への変更のおよそ１週間後、５個のウェルからの細胞を染色してＧＵＳ発現を検出した。結果は以下のとおりである。
【００７５】
【表３】
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【００７６】
選択下で８週後に、ウキクサ培養物が３つの成長パターンを呈した。１６％の培養物が速やかな成長を呈した。この場合ウェルはウキクサ葉状体でほとんど完全に充満していた。６２％の培養物が穏やかな成長を呈し、この場合ウェルはウキクサ葉状体でおよそ半分充満しており、そして１２％のサンプルがゆっくりした成長を呈し、この場合ウェルの半分未満がウキクサ葉状体で充満していた。
【００７７】
選択下で１１週後に、２４個のウキクサ培養物のうちの１８個が再生した葉状体を含有し、全体の形質転換効率は７５％以上であった。
【実施例３】
【００７８】
［高密度フォーマットでのウキクサの形質転換および再生］
＜選択マーカーとしてＧ４１８使用＞
この実験の目的はさらにウキクサ形質転換効率を高め、そしてトランスジェニックウキクサ系を再生するのに必要な時間を低減させるための方法を試験することであった。
【００７９】
この実施例における発現ベクターおよびアグロバクテリウム株は実施例１で記載したとおりのものである。ウキクサ根粒をＬ．ｍｉｎｏｒ株８６２７から誘導した。実質的に実施例１で記載したように根粒培養物を調製し、例外はいくつかの根粒組織サンプルを３％のスクロース、０．４％のＤｉｆｃｏ  Ｂａｃｔｏ寒天、１μＭの２，４−ジクロロフェノキシ酢酸、および２μＭのベンジルアデニンを補充したＭｕｒａｓｈｉｇｅおよびＳｋｏｏｇ培地中で培養し（「対照」サンプルと称する）、そしていくつかの根粒組織サンプルを、同一添加物を含有する０．５ＸＳｃｈｅｎｋおよびＨｉｌｄｅｂｒａｎｄｔ培地上で成長させた（「前処置」サンプルと称する）。
【００８０】
実施例１に記載したように共培養を実施した。汚染除去および選択のために、３％のスクロース、１μＭの２，４−ジクロロフェノキシアセテート、２μＭのベンジルアデニン、５００ｍｇ／ｌのセフォタキシムおよび２５ｍｇ／ｌ、５０ｍｇ／ｌ、１００ｍｇ／ｌ、または２００ｍｇ／ｌの濃度のＧ４１８を含むＭｕｒａｓｈｉｇｅおよびＳｋｏｏｇ培地（ｐＨ５．６）をウェルあたり５６０μｌ含有する多孔性ポリエチレン支持体を適応させた２４ウェルプレートに根粒培養物を移した。
【００８１】
実施例２に記載したようにウキクサ培地を交換した。Ｇ４１８は強力な選択圧を提供するので、選択の３週後に形質転換された細胞は死滅した。選択の６週後のみで多数の再生されたウキクサ葉状体が観察された。８週後に、以下に示すように形質転換効率が決定された。
【００８２】
【表４】
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【００８３】
この実施例により、本発明の方法を用いてわずか６週でトランスジェニックウキクサ系を生成することができ、形質転換効率は８０％以上であることが実証される。
【実施例４】
【００８４】
［関心ある生物学的機能を有するタンパク質変種の同定］
以下の実施例は、変種が少なくとも一つの特性において天然発生ポリペプチドと異なっている、天然発生ポリペプチドの変種の識別に関する。
【００８５】
変種を生成するために、ポリペプチドのコード配列を飽和変異誘発に供してヌクレオチド配列の集団を作製し、その各々は元来コードされるポリペプチドのアミノ酸変種をコードする。このような方法は当分野で公知であり、例えば米国特許第６，０９６，５４８号、第６，１１７，６７９号、第６，１３２，９７０号、第６，１６５，７９３号、および第６，１８０，４０６号に記載されている（引用することにより本明細書の一部をなすものとする）。
【００８６】
関心ある特性を有する変種をコードするヌクレオチド配列を同定するために、変種ヌクレオチド配列の集団を前記したように生成し、アグロバクテリウムバイナリー・ベクターにクローン化し、そして大腸菌に形質転換する。およそ５，０００から１０，０００個のコロニーをこのライブラリーから採取し、そしてエレクトロポレーションにより対応するプラスミドをアグロバクテリウムに形質転換する。当分野で公知の自動化コロニー採取技術（例えばＵｂｅｒら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １１（５）：６４２−６４７（１９９１）およびＷａｔｓｏｎら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２０：４５９９−４６０６（１９９２）（引用することにより本明細書の一部をなすものとする））を用いてウキクサの形質転換に使用するために単一のアグロバクテリウムコロニーを採取する。
【００８７】
各ウェルへのフィルター支持体の添加によりウキクサ培養物の処置に特に適応させた２４ウェルプレートのウェル（アグロバクテリウムコロニーあたり１、２、または３ウェル）に単一のコロニーアグロバクテリウム調製物を加え（２００１年５月３０日出願の米国仮特許出願第６０／２９４４３０号、および２００２年５月２８日出願の「高速大量処理スクリーニングのためのプレートおよび方法」と題した米国特許出願参照）、そしてウキクサ植物培養物、ウキクサ根粒培養物、またはウキクサ懸濁培養物を各ウェルに加える。共培養、選択および再生ステップを、前記の実施例で記載した、特別に適応させた２４ウェルプレートで行う。全ての液体移動を自動化プレート処理および液体処理手順を用いて実施する。
【００８８】
再生に続いて、関心ある特性を有する変種ポリペプチドの発現に関してトランスジェニックウキクサ植物をアッセイする。いくつかの例では、元来のコードされたポリペプチドはその分泌を指示する配列を含有している。これらの場合、培地をトランスジェニック動物ウキクサから除去し、そしてアッセイして関心ある特性を有する変種ポリペプチドの存在を決定する。このようなアッセイを当分野で公知の高速大量処理スクリーニング方法を用いて行う。
【００８９】
ポリペプチドがウキクサ組織内で発現されるこれらの例では、自動化技術を用いてウキクサ組織を破壊し、そして発現されたポリペプチドを抽出する。次いで関心ある特性を有する変種ポリペプチドの存在に関して抽出物をアッセイする。
【００９０】
関心ある変種を発現するウキクサを含有するウェルが複数のトランスジェニック系を含有する場合、このウェルからの葉状体を１個ずつに分離し、そして次にアッセイして、どの個々の系が関心ある特性を有する変種ポリペプチドを発現するかを決定する。
【実施例５】
【００９１】
［ウキクサにおけるｃＤＮＡ発現ライブラリーのスクリーニング］
この実施例は関心ある生物学的応答を調節するヌクレオチド配列に関してｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることに関する。
【００９２】
エレクトロポレーションによりｃＤＮＡ発現ライブラリーをアグロバクテリウムに形質転換し、そしてアグロバクテリウム培養物を単一のコロニーから誘導し、そして１５３４ウェルプレート中に保持する。前記の実施例に記載したように形質転換されたアグロバクテリウムをウキクサ培養物と共培養する。前記したようにトランスジェニックウキクサ植物を再生し、そして次に環境撹乱における変化、例えば温度変化、日長、水分ポテンシャル変化、光レベル変化、病原体暴露、および毒素暴露に対するその応答に関してアッセイする。トランスジェニックウキクサ細胞系の単一の集合を用いて、多くの異なる応答に関与するコード化タンパク質に関してスクリーニングすることができる。
【００９３】
本明細書にて記載した全ての刊行物および特許出願は本発明が関係する当分野の当業者のレベルの水準である。全ての刊行物および特許出願は、各々別個の刊行物および特許出願が具体的におよび個別に本明細書に組み入れられるのと同程度に、引用することにより本明細書の一部をなすものとする。
【００９４】
理解を明確にする目的で、本発明を説明および実施例によりいくらか詳細に記載してきたが、添付の請求の範囲内で特定の変更および修飾を実施できることは明らかであろう。
【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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