(57)【要約】本発明者らは、表皮細胞間の異常な細胞−細胞接着に関連する疾患またはそのような疾患に対する感受性を診断する方法で、個体の接着タンパク質またはプロテアーゼまたはプロテアーゼ阻害剤をコードする核酸における変異を検出することを含む方法を開示する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
上皮細胞間の異常な細胞−細胞接着に関連する疾患またはそのような疾患に対する感受性を診断する方法であって、前記方法が個体の接着タンパク質またはプロテアーゼまたはプロテアーゼ阻害剤をコードする核酸における変異を検出することを含む方法。
【請求項２】
個体における第Ｉ群疾患または第Ｉ群疾患に対する感受性を診断する方法であって、前記方法が接着タンパク質またはプロテアーゼまたはプロテアーゼ阻害剤のポリペプチドにおける多型、あるいは接着タンパク質またはプロテアーゼまたはプロテアーゼ阻害剤のポリペプチドをコードする核酸における多型で、第Ｉ群疾患に関連する多型の存在の有無を検出することを含む方法。
【請求項３】
接着タンパク質が、表Ｄ２．１および表Ｄ５．１に示される接着タンパク質からなる群から選択され、好ましくは、コルネオデスモシン、デスモグレインＩ、デスモグレイン３、プラコグロビン、デスモプラキン、デスモコリンＩ、エンボプラキン、プロリンリッチタンパク質、好ましくは小さいプロリンリッチタンパク質（ＳＰＲＲ）、ＳＰＲＲ２Ａ、ＳＰＲＲ１Ｂ、ＳＰＲＫ、ＳＰＲＲ２Ｅ、ＳＰＲＲ２Ｆ、ＳＰＲＲ２Ｂ、ＳＰＲＲ２Ｄ、ＳＰＲＲ２Ｃ、ＳＰＲＲ２Ｇ、ＳＰＲＲ１Ａ、ＳＰＲＲ３、ＳＰＲＲ４、インボルクリンまたはロリクリンである、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項４】
プロテアーゼが、表Ｄ３．１および表Ｄ６．１に示されるプロテアーゼからなる群から選択され、好ましくは角質層キモトリプシン様酵素（ＳＣＣＥ）または角質層トリプシン様酵素（ＳＣＴＥ）である、先行する請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
プロテアーゼ阻害剤が、表Ｄ４．１および表Ｄ７．１に示されるプロテアーゼ阻害剤からなる群から選択され、好ましくは、分泌型ロイコプロテアーゼ阻害剤（ＳＬＰＩ）、エラフィンプロテアーゼ阻害剤３（ＰＩ３もしくはＳＫＡＬＰ）またはシスタチンＡ（ＣＳＴＡ）である、先行する請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
第Ｉ群疾患が、アトピー性湿疹、脂漏性湿疹、刺激性接触皮膚炎、アレルギー性接触皮膚炎、肺アトピー性喘息、ウイルス感染後喘息、気管支反応亢進、慢性閉塞性肺疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎、セリアック病、消化性潰瘍化、膿痂疹、ウイルス性いぼ、伝染性軟属腫、細菌性髄膜炎、ウイルス性髄膜炎、ヘリコバクター・ピロリの侵入に関連する消化性潰瘍化、皮膚黒色腫、扁平上皮ガン、基底細胞ガン、皮膚型リンパ腫、皮膚ガン、胃腸管悪性腫瘍、および肺悪性腫瘍からなる群から選択される、先行する請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
疾患が第Ｉ群疾患を含み、方法が、個体の（ａ）コルネオデスモシン核酸の＋１２４３位におけるＴの存在、（ｂ）コルネオデスモシン核酸の＋１２４３位におけるＨｐｈ１制限酵素部位の非存在、（ｃ）コルネオデスモシンポリペプチド（Ｌ２０８１５）の３９４位におけるロイシン（Ｌ）残基の存在、および（ｄ）（ｃ）をもたらすコルネオデスモシン核酸における変異のいずれか１つまたは２つ以上を検出することを含む、先行する請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
疾患が第Ｉ群疾患を含み、方法が、個体の（ａ）コルネオデスモシン核酸の＋１２４３位におけるＴの存在、（ｂ）コルネオデスモシンポリペプチド（Ｌ２０８１５）の３９４位におけるロイシン（Ｌ）残基の存在、および（ｃ）（ｂ）をもたらすコルネオデスモシン核酸における変異のいずれか１つまたは２つ以上を検出することを含む、先行する請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
疾患が第Ｉ群疾患を含み、方法が、コルネオデスモシン核酸またはコルネオデスモシンポリペプチドの関連位置における下記ヌクレオチドのいずれか１つもしくは２つ以上または下記アミノ酸のいずれか１つもしくは２つ以上：
【表１】
2004524010.tif 000049
（表中、「残基位置（１）は、アクセション番号Ｌ２０８１５を有する配列の番号づけを参照し、「残基位置（２）は、アクセション番号ＡＦ０３０１３０を有する配列の番号づけを参照する）
を検出することを含む、先行する請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
疾患が第Ｉ群疾患を含み、方法が、Ｊｅｎｉｓｃｈら（１９９９）、Ｔｉｓｓｕｅ  Ａｎｔｉｇｅｎｓ、５４：４３９〜４４９に記載されるようなＣＤ５コルネオデスモシン対立遺伝子またはＣＤ６コルネオデスモシン対立遺伝子を個体において検出することを含む、先行する請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
疾患が第Ｉ群疾患を含み、方法が、個体の（ａ）コルネオデスモシン核酸の１８０位におけるＴの存在、（ｂ）アクセション番号Ｌ２０８１５を有するコルネオデスモシンポリペプチドの４０位におけるＦの存在、（ｃ）アクセション番号ＡＦ０３０１３０を有するコルネオデスモシンポリペプチドの５６位におけるＦの存在、および（ｄ）（ｂ）または（ｃ）をもたらすコルネオデスモシン核酸における変異のいずれか１つまたは２つ以上を検出することを含む、先行する請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
疾患が第Ｉ群疾患を含み、方法が、個体の（ａ）コルネオデスモシン核酸の６１９位におけるＴの存在、（ｂ）コルネオデスモシンポリペプチドの１８６位におけるＦの存在、および（ｃ）（ｂ）をもたらすコルネオデスモシン核酸における変異のいずれか１つまたは２つ以上を検出することを含む、先行する請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
疾患が第Ｉ群疾患を含み、方法が、好ましくはＳＣＣＥゲノム配列（ＧＢ：ＡＦ１６６３３０）における７６３４位〜７６３７位に対応する位置において、個体のＳＣＣＥ核酸におけるＡＡＣＣＡＡＣＣ配列の存在を検出することを含む、先行する請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
疾患が第Ｉ群疾患（好ましくはアトピー性湿疹）を含み、方法が、（ａ）ＳＬＰＩ核酸の２８０位におけるＴ残基の存在、（ｂ）ＳＬＰＩ核酸の２９２／２９３位におけるＧ残基の存在、（ｃ）ＳＬＰＩ核酸の１２３５／１２３６位におけるＣ残基の存在、（ｄ）ＳＬＰＩ核酸の１３８４／１３８５位におけるＣ残基またはＡ残基の非存在、および（ｄ）上記のいずれかに対応するＳＬＰＩポリペプチドにおける多型からなる群から選択される１つまたは２つ以上の多型の存在を検出することを含む、先行する請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
疾患が第Ｉ群疾患（好ましくは湿疹、より好ましくはアトピー性湿疹）を含み、位置の番号付けがシスタチンＡ配列ＣｙｓｔＡ．１を参照して行われる場合、方法が、シスタチンＡ核酸の１２２位および１２１位におけるＡＣの非存在、シスタチンＡ核酸の１１０位におけるＧ残基の非存在、シスタチンＡ核酸の８５位におけるｔ残基の存在、シスタチンＡ核酸の７３位におけるＧ残基の存在、シスタチンＡ核酸の７２位におけるＡ残基の非存在、シスタチンＡ核酸の６０位におけるＴの非存在、シスタチンＡ核酸の１５位におけるＣの非存在、シスタチンＡ核酸の１４位におけるＡ残基の非存在、シスタチンＡ核酸の１３位におけるＣ残基の非存在、シスタチンＡ核酸の６位におけるＣ残基の非存在、シスタチンＡ核酸の５位におけるＴ残基の非存在、シスタチンＡ核酸の４位におけるＧ残基の非存在、およびシスタチンＡ核酸の７位におけるＧ残基の非存在からなる群から選択される１つまたは２つ以上の多型の存在を検出することを含む、先行する請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
疾患、好ましくは皮膚疾患、好ましくは皮膚の炎症性疾患、好ましくは湿疹を診断する方法であって、シスタチンＡ核酸のＴＲＥ−２領域におけるＧ残基の存在を検出することを含む方法。
【請求項１７】
個体における第Ｉ群疾患または第Ｉ群疾患に対する感受性を診断する方法であって、接着タンパク質またはプロテアーゼまたはプロテアーゼ阻害剤あるいは接着タンパク質またはプロテアーゼまたはプロテアーゼ阻害剤のフラグメントの存在または非存在または調節されたレベルを個体において検出することを含む方法。
【請求項１８】
（ａ）３６ｋＤａおよび４６〜４３ｋＤａおよび５２〜５６ｋＤａのコルネオデスモシンポリペプチドの相対的存在量、（ｂ）３６ｋＤａおよび４６〜４３ｋＤａのコルネオデスモシンポリペプチドの１つ以上の存在または上昇したレベル、（ｃ）５２〜５６ｋＤａのコルネオデスモシンポリペプチドの非存在または調節されたレベル（好ましくはより低いレベル）のいずれか１つまたは２つ以上を個体において検出することを含む、先行する請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項１９】
（ａ）８０ｋＤａおよび９５ｋＤａおよび１６０ｋＤａのデスモグレインＩポリペプチドの相対的存在量、（ｂ）９５ｋＤａおよび８０ｋＤａのポリペプチドの１つ以上の存在または上昇したレベル、（ｃ）１６０ｋＤａのデスモグレインＩポリペプチドの低下したレベル、（ｄ）１６０ｋＤａのデスモグレインＩポリペプチドのタンパク質分解のいずれか１つまたは２つ以上を個体において検出することを含む、先行する請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項２０】
５５ｋＤａのデスモグレイン３ポリペプチド、８０ｋＤａのデスモグレイン３ポリペプチド、および１００ｋＤａのデスモグレイン３ポリペプチドのいずれか１つまたは２つ以上の存在または上昇したレベルを個体において検出することを含む、先行する請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項２１】
（ａ）８５ｋＤａおよび７５ｋＤａおよび７０ｋＤａのプラコグロビンポリペプチドの相対的存在量、（ｂ）７０ｋＤａのプラコグロビンポリペプチドの非存在または低下したレベル、（ｃ）８５ｋＤａのプラコグロビンポリペプチドおよび／または７５ｋＤａのプラコグロビンポリペプチドの存在または上昇したレベルのいずれか１つまたは２つ以上を個体において検出することを含む、先行する請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項２２】
（ａ）７０〜８０ｋＤａおよび６０〜７０ｋＤａおよび５０〜６０ｋＤａのデスモコリン１ポリペプチドの相対的存在量、ならびに（ｂ）５０〜６０ｋＤａデスモコリン１ポリペプチドの存在または上昇したレベルのいずれか１つまたは２つ以上を個体において検出することを含む、先行する請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項２３】
ポリペプチドまたはフラグメントが、好ましくは皮膚生検物の形態でエクスビボで、個体の表皮において検出されるか、または好ましくはテープストリップの形態で、個体の角質層において検出されることを含む、先行する請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項２４】
ケラチン６Ａ（Ｌ４２６１１）、ケラチン１７（Ｚ１９５７４）、アネキシンＡ１／リポコルチン（Ｘ０５９０８）およびＶＩ型コラーゲンα３（ＣＯＬ６Ａ３）（ＮＭ＿００４３６９）からなる群から選択される接着タンパク質のポリペプチドまたは核酸の発現のアップレギュレーションを検出することを含む、先行する請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項２５】
Ｓ／コルネオデスモシン（ＡＦ０３０１３０）、デソプラキン（ＸＭ＿００４４６３）、プラコグロビン（ＮＭ＿００２２３０；ＮＭ＿０２１９９１）、デスモグレイン１（ＸＭ＿００８８１０）、デスモコリン１（ＭＸ＿００８６８７）、エンボプラキン（ＸＭ＿００８１３５；Ｕ７２５４３）、プレクチン１（ＮＭ０００４４５）、Ｓ１００Ａ２（ＡＩ５３９４３９；Ｍ８７０６８）、Ｓ１００Ａ８（ＡＩ１２６１３４）、Ｓ１００Ａ７（ＡＡ５８６８９４）、Ｓ１００Ａ９（ＧＢ：Ｗ７２４２４）、ＳＰＲＲ２Ａ（ＧＢ：Ｍ２１３０２）、ＳＰＲＲ１Ｂ（Ｍ１９８８８）、ＳＰＲＫ（ＡＩ９２３９８４）、ＨＣＲ（ＢＡＡ８１８９０）、ＳＥＥＫ１（ＢＡＡ８８１３０）、ＳＰＲ１（ＢＡＢ６３３１５）、ＳＴＧ（ＢＡＡ８８１３２）、インボルクリン（ＮＭ＿００５５４７）、トリコヒアリン（ＮＭ＿００５５４７）およびロリクリン（ＸＭ＿０４８９０２）からなる群から選択される接着タンパク質のポリペプチドまたは核酸の発現のダウンレギュレーションを検出することを含む、先行する請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項２６】
アポトーシス関連システインプロテアーゼ（ＣＡＳＰ１４）ｍＲＮＡ（ＮＭ＿０１２１１４）、ＴＧＭ５（ＸＭ＿００７５２９）、ホスホリパーゼＡ（２）（ＢＣ０１３３８４）、ＣＤ４７抗原（Ｘ６９３９８）、カリクレイン８（ＡＢ００８３９０）、ＡＤ０２４タンパク質（ＸＭ＿００２６４２）、ＳＣＣＥ（ＸＭ＿００９００２）、ディフェンシンβ２（ＡＦ０７１１２１６）、インターフェロンａ誘導性タンパク質２７（Ｘ６７３２５）、脂肪酸結合タンパク質ＦＡＢＰ５（Ｍ９４８５６）、ＳＣＴＥ（ＸＭ＿００９０００）、カリクレイン１（腎臓／膵臓／唾液性）（ＫＬＫ１）（ＸＭ＿０４７３００）、ヒトカリクレイン２（前立腺性）（ＫＬＫ２）（ＸＭ＿０３１７５７）、カリクレイン３（前立腺特異的抗原）（ＫＬＫ３）（ＸＭ＿０３１７６８）、カリクレイン６（ニューロシン、ザイム）（ＫＬＫ６）（ＸＭ＿０５５６５８）、カリクレイン４（プロスターゼ、エナメルマトリックス、前立腺）（ＫＬＫ４）（ＸＭ＿００８９９７）、膜型セリンプロテアーゼ１（ＡＦ１３３０８６）、ヒト皮膚コラゲナーゼ（Ｍ１３５０９）、コラゲナーゼＭＭＰ−１（ＬＯＣ１１６３８９）、コラゲナーゼＭＭＰ−１２（Ｕ７８０４５）、コラゲナーゼＭＭＰ−９（ＮＭ＿００４９９４）、コラゲナーゼＭＭＰ−３（Ｕ７８０４５）、コラゲナーゼＭＭＰ−２８（ＡＦ２１９６２４）、カスパーゼ７（ＢＣ０１５７９９）、カスパーゼ５（ＮＭ＿００４３４７）、カスパーゼ−１４（ＮＭ＿０１２１１４）、ユビキチン特異的プロテアーゼＵＳＰ−５（ＮＭ＿００３４８１）、ユビキチン特異的プロテアーゼＵＳＰ−１１（ＮＭ＿００４６５１）、ユビキチン特異的プロテアーゼＵＳＰ−６（ＮＭ＿００４５０５）、ＴＰＳ１（ＮＭ＿００３２９３）、ＴＰＳＢ１（ＸＭ＿０１６２０４）、ＴＰＳＧ１（ＸＭ＿００８１２３）、プロテアーゼネキシン−ＩＩ（ＸＭ＿０４７７９３）、グリア由来ネキシン前駆体（Ｐ０７０９３）、２６Ｓプロテアーゼ調節サブユニットＳ１０Ｂ（Ｑ９２５２４）およびＰＣＯＬＮ３（ＸＭ＿０４７５２４）からなる群から選択されるプロテアーゼのポリペプチドまたは核酸の発現のアップレギュレーションを検出することを含む、先行する請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項２７】
トランスグルタミナーゼ１（ＴＧＭ１）（Ｍ９８４４７）、ＴＧＭ２（ＸＭ＿００９４８２）、ＴＧＭ４（ＸＭ＿０５６２０３）、ＴＧＭ７（ＮＭ＿０５２９５５）、ＴＧＭ３（Ｌ１０３８６）、ユビキチン特異的プロテアーゼＵＳＰ２６（ＮＭ＿０３１９０７）、ユビキチン特異的プロテアーゼ（ＵＳＰ２８）（ＮＭ＿０２０８８６）、２６Ｓプロテアーゼサブユニット４（Ｌ０２４２６）、ＬＩＬＲＢ１（ＡＦ００４２３０）、転写のシグナル変換因子／活性化因子１（９１ｋＤａ）（ＳＴＡＴ１）（９７７９３５）、およびプロテアソーム（プロソーム、マクロパイン）サブユニット６（ＰＳＭＡ６）（Ｘ５９４１７）からなる群から選択されるプロテアーゼのポリペプチドまたは核酸の発現のダウンレギュレーションを検出することを含む、先行する請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項２８】
ｈｂｃ７５０ヒト膵臓小島（Ｔ１１１４１；Ｔ１０９２０）、ＴＩＭＰ−４（ＮＭ＿００３２５６）、ＴＩＭ９ａ（ＡＦ１５０１００）、２型プラスミノーゲン活性化因子阻害剤（Ｌ１９０６６）、多価プロテアーゼ阻害剤ＷＦＩＫＫＮ（ＡＦ４２２１９４）、エピン−１（ＥＰＰＩＮ）（ＡＦ２８６３６８）、エピン−２（ＥＰＰＩＮ）（ＡＦ２８６３６９）、エピン−３（ＥＰＰＩＮ）（ＡＦ２８６３７０）、ｓｐａｒｃ／オステオネクチン（ｃｗｃｖ様ドメインおよびｋａｚａｌ様ドメインのプロテオグリカン［テスティカン］）（ＳＰＯＣＫ）（ＮＭ＿００４５９８）、ＰＩ１２（ＡＨ００９７５６）、ＨＩＶ−１プロテアーゼのＩ型ヒト免疫不全症ウイルス遺伝子（ＡＢ０２０９２３）、分泌型リンタンパク質２（２４ｋＤ）（ＳＰＰ２）（ＮＭ＿００６９４４）、およびサイクリン依存性キナーゼ阻害剤２Ｂ（ｐ１５、ＣＤＫ４を阻害する）（ＣＤＫＮ２Ｂ）（ＮＭ＿００４９３６）からなる群から選択されるプロテアーゼ阻害剤のポリペプチドまたは核酸の発現のダウンレギュレーションを検出することを含む、先行する請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項２９】
ＳＬＰ１（Ｘ０４５０２）、ＳＫＡＬＰ（ＸＭ＿００９５２４；Ｌ１０３４３）、ＣＳＴＡ（ＮＭ＿００５１２３；ＡＡ５７０１９３）、ＳＣＣＡ（Ｓ６６２９６）、ＳＣＣＡ２（Ｕ１９５５７）、１型プラスミノーゲン活性化因子阻害剤（Ｘ０４７２９；Ｘ０４７３１）、ＰＡＩ２（ＡＦ０７１４００）、ＳＥＲＰＩＮＡ５（ＮＭ＿０００６２４）、ＴＩＭＰ（Ｄ１１１３９）、ＴＩＭＰ−１（ＮＭ＿００３２５４）、ＴＩＭＰ−２（ＮＭ＿００３２５５）、ＴＩＭＰ−３（Ｅ１３８８０）、ＴＩＭ９ｂ（ＡＦ１５０１０５）、シスタチンＡ（ＡＡ５７０１９３）、シスタチンＭ／Ｅ（ＮＭ＿００１３２３）、Ｃ１阻害剤（ＳＥＲＰＩＮＧ１）（ＸＭ＿０４６２１８）、プロテアーゼ阻害剤（Ｋｕｎｉｔｚ型２）（ＳＰＩＮＴ２）（ＸＭ＿０３２２８０）、セリンプロテアーゼ阻害剤（Ｋａｚａｌ型４）（ＳＰＩＮＫ４）（ＸＭ＿００５５３９）、プロテイナーゼ阻害剤（ｃｌａｄｅＢ［オバルブミン］）（メンバー９）（ＸＭ＿０５３６４２）、セリン（またはシステイン）プロテイナーゼ阻害剤（ｃｌａｄｅＢ［オバルブミン］）（メンバー６）（ＸＭ＿０４７９８４）、ＫｕｎｉｔｚドメインおよびＷＡＰドメインを有するセリンプロテアーゼ阻害剤様１（エピン）（ＳＰＩＮＬＷ１）（ＮＭ＿０２０３９８）、プロテアーゼ阻害剤（Ｋｕｎｉｔｚ型１）（ＳＰＩＮＴ１）（ＸＭ＿０５６８３６）、ＨＩＶ−１プロテアーゼのＩ型ヒト免疫不全症ウイルス遺伝子（ＡＢ０２０９２４）、組織因子経路阻害剤２（ＴＦＰＩ２）（ＮＭ＿００６５２８）、カテプシンＦ（ＣＴＳＦ）（ＮＭ＿００３７９３）、セリン（またはシステイン）プロテイナーゼ阻害剤（ｃｌａｄｅＡ［α−１抗プロテイナーゼ、アンチトリプシン］）（メンバー６）（ＳＥＲＰＩＮＡ６）（ＮＭ＿００１７５６）、セリン（またはシステイン）プロテイナーゼ阻害剤（ｃｌａｄｅＢ［オバルブミン］）（メンバー３）（ＳＥＲＰＩＮＢ３）（ＮＭ＿００６９１９）、セリン（またはシステイン）プロテイナーゼ阻害剤（ｃｌａｄｅＡ［α−１抗プロテイナーゼ、アンチトリプシン］）（メンバー３）（ＳＥＲＰＩＮＡ３）（ＮＭ＿００１０８５）、ヒトセリン（またはシステイン）プロテイナーゼ阻害剤（ｃｌａｄｅＢ［オバルブミン］）（メンバー１３）（ＸＭ＿００８７４３）、セリン（またはシステイン）プロテイナーゼ阻害剤（ｃｌａｄｅＢ［オバルブミン］）（メンバー５）（ＳＥＲＰＩＮＢ５）（ＸＭ＿００８７４２）、ＲｅｌＡ結合型阻害剤（ＸＭ＿０５７６９３）、ＤＮＡ結合阻害剤１（優性ネガティブなヘリックス−ループ−ヘリックスタンパク質［ＩＤ１］）（ＸＭ＿０４６１７９）、セリン（またはシステイン）プロテイナーゼ阻害剤（ｃｌａｄｅＥ［ネキシン、１型プラスミノーゲン活性化因子阻害剤］）（メンバー）（ＳＥＲＰＩＮＥ１）（ＸＭ＿０５４８５０）、サイクリン依存性キナーゼ阻害剤２Ｂ（ｐ１５、ＣＤＫ４を阻害する）に類似するもの（ＢＣ０１４４６９）、セリン（またはシステイン）プロテイナーゼ阻害剤（ｃｌａｄｅＢ［オバルブミン］）（メンバー７）（ＳＥＲＰＩＮＢ７）（ＸＭ＿００８７４５）、活性化ＳＴＡＴタンパク質ＰＩＡＳｙのタンパク質阻害剤（ＰＩＡＳＹ）（ＮＭ＿０１６１４９）��活性化ＳＴＡＴタンパク質ＰＩＡＳｙのタンパク質阻害剤に類似するもの（ＬＯＣ９５８３０）（ＸＭ＿０１６８６４）、ＰＫＣにより強化されるＰＰ１阻害タンパク質（ＰＰＰ１Ｒ１４Ａ）（ＡＹ０５０６６８）、ＤＮＡ結合阻害剤３（優性ネガティブなヘリックス−ループ−ヘリックスタンパク質［ＩＤ３］）（ＮＭ＿００２１６７）、ＣｌａｄｅＡ（α−１抗プロテイナーゼ、アンチトリプシン）セリン（またはシステイン）プロテイナーゼ阻害剤（ｃｌａｄｅＨ［熱ショックタンパク質４７］）（メンバー１）（ＳＥＲＰＩＮＨ１）（ＮＭ＿００４３５３）、フルピン（セリンプロテアーゼ阻害剤）に対するＰＩ１３遺伝子（ＡＪ２７８７１７）、プロテアーゼ阻害剤５（マスピン）（ＰＩ５）（ＸＭ＿００８７４２）、およびＰＡＩ−２（Ａ３２４１５）からなる群から選択されるプロテアーゼ阻害剤のポリペプチドまたは核酸の発現のアップレギュレーションを検出することを含む、先行する請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項３０】
第Ｉ群疾患を処置または予防する方法であって、前記方法が細胞間の接着を担う接着タンパク質の発現および／または活性をアップレギュレーションさせること、あるいはそのような接着タンパク質のタンパク質分解をダウンレギュレーションさせることを含む方法。
【請求項３１】
接着タンパク質の発現および／または活性が転写レベルまたは翻訳レベルまたはその両方でアップレギュレーションされる、前記請求項に記載の方法。
【請求項３２】
接着タンパク質のタンパク質分解に関与するプロテアーゼの発現および／または活性および／または分解がダウンレギュレーションされる、先行する請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項３３】
接着タンパク質のタンパク質分解に関与するプロテアーゼの活性を阻害することを担うプロテアーゼ阻害剤の発現および／または活性がアップレギュレーションされ、かつ／またはそのようなプロテアーゼ阻害剤の分解がダウンレギュレーションされる、先行する請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項３４】
接着タンパク質のタンパク質分解が、プロテアーゼ阻害剤またはそのフラグメントを投与すること、プロテアーゼのアンタゴニストまたはそのフラグメントを投与すること、プロテアーゼ阻害剤のアゴニストを投与すること、プロテアーゼの発現を低下させること、プロテアーゼの活性を低下させること、プロテアーゼ阻害剤の発現を増大させること、プロテアーゼ阻害剤の活性を増大させることの１つまたは２つ以上によって低下させられる、前記請求項に記載の方法。
【請求項３５】
第Ｉ群疾患を処置または予防する方法であって、そのような疾患に罹患している患者またはそのような疾患に罹患する可能性を有する患者に、接着タンパク質またはプロテアーゼまたはプロテアーゼ阻害剤あるいは接着タンパク質またはプロテアーゼまたはプロテアーゼ阻害剤のフラグメントの疾患非関連形態の治療効果的な量を投与することを含む方法。
【請求項３６】
プロテアーゼ活性を阻害することができるプロテアーゼ阻害剤またはそのフラグメントを投与することを含む、先行する請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項３７】
ＳＬＰ１のフラグメントを投与すること、好ましくは、ＣＧＫＳ（ＳＢ７ａ）およびＣＧＫＳＣＶＳＰＶＫＡ（ＳＢ７ｂ）、ＫＩＩＤＧＡ、ＧＤＫＩＩＤＧＡ、ＧＤＫＩＩＤ、ＫＩＩ、ＫＩＩＤ、ＫＩＩＤＧ、ＫＩＩＤＧＡ、ＬＤＰＶＤ（６５１）、ＫＲＤＬＫ（６５２）、ＬＤＰＶＤＴＰＮＰ（６５３）、ＬＤＰＶＤＴＰＮＰＴＲＲＫＰＧ（６５４）、ＣＧＫＳＣＶＳＰＶＫＡ（６４４）、ＣＶＳＰＶＫＡ（６４３）からなる群から選択されるペプチドを投与すること、最も好ましくは、ペプチド６４３またはペプチド６５１またはペプチド６５３を投与することを含む、前記請求項に記載の方法。
【請求項３８】
ＴＮＦ−αおよび／またはＩＬ−βを投与することを含む、先行する請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項３９】
第Ｉ群疾患が湿疹（好ましくはアトピー性湿疹）または皮膚炎（好ましくは疱疹状皮膚炎）である、先行する請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項４０】
個体における第ＩＩ群疾患または第ＩＩ群疾患に対する感受性を診断する方法であって、接着タンパク質またはプロテアーゼまたはプロテアーゼ阻害剤のポリペプチドにおける多型、あるいは接着タンパク質またはプロテアーゼまたはプロテアーゼ阻害剤のポリペプチドをコードする核酸における多型で、第ＩＩ群疾患に関連する多型の存在の有無を検出することを含む方法。
【請求項４１】
疾患が第ＩＩ群疾患を含み、方法が、コルネオデスモシン核酸またはコルネオデスモシンポリペプチドの関連位置における下記ヌクレオチドのいずれか１つもしくは２つ以上または下記アミノ酸のいずれか１つもしくは２つ以上：
【表２】
2004524010.tif 000050
（表中、「残基位置（１）は、アクセション番号Ｌ２０８１５を有する配列の番号づけを参照し、「残基位置（２）は、アクセション番号ＡＦ０３０１３０を有する配列の番号づけを参照する）
を検出することを含む、先行する請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項４２】
疾患が第ＩＩ群疾患を含み、方法が、Ｊｅｎｉｓｃｈら（１９９９）、Ｔｉｓｓｕｅ  Ａｎｔｉｇｅｎｓ、５４：４３９〜４４９に記載されるようなＣＤ２コルネオデスモシン対立遺伝子を個体において検出することを含む、先行する請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項４３】
疾患が第ＩＩ群疾患を含み、方法が、個体の（ａ）コルネオデスモシン核酸の１８０位におけるＣの存在、（ｂ）アクセション番号Ｌ２０８１５を有するコルネオデスモシンポリペプチドの４０位におけるＬの存在、（ｃ）アクセション番号ＡＦ０３０１３０を有するコルネオデスモシンポリペプチドの５６位におけるＬの存在、および（ｄ）（ｂ）または（ｃ）をもたらすコルネオデスモシン核酸における変異のいずれか１つまたは２つ以上を検出することを含む、先行する請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項４４】
疾患が第ＩＩ群疾患を含み、方法が、（ａ）個体のコルネオデスモシン核酸の６１９位におけるＣの存在、（ｂ）個体のコルネオデスモシンポリペプチドの１８６位におけるＳの存在、および（ｃ）（ｂ）をもたらす、個体のコルネオデスモシン核酸における変異のいずれか１つまたは２つ以上を検出することを含む、先行する請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項４５】
疾患が第ＩＩ群疾患を含み、方法が、好ましくはＳＣＣＥゲノム配列（ＧＢ：ＡＦ１６６３３０）における７６３４位〜７６３７位に対応する位置において、個体のＳＣＣＥ核酸におけるＡＡＣＣＡＡＣＣ配列の非存在を検出することを含む、先行する請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項４６】
疾患が個体における第ＩＩ群疾患（好ましくはざ瘡）を含み、方法が、ＳＬＰＩの１３００位におけるＧ残基の存在、またはＳＬＰＩの１４１８位におけるＣ残基の存在、またはそれらの両方を検出することを含む、先行する請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項４７】
疾患が個体における第ＩＩ群疾患（好ましくは乾癬）を含み、方法が、（ａ）ＳＬＰＩ核酸の２９１位におけるＧ残基の存在、（ｂ）ＳＬＰＩ核酸の２９２／２９３位におけるＧ残基の非存在、（ｃ）ＳＬＰＩ核酸の１３２５位におけるＧ残基の存在、（ｄ）ＳＬＰＩ核酸の１４１８位におけるＣ残基の存在、および（ｄ）上記のいずれかに対応するＳＬＰＩポリペプチドにおける多型からなる群から選択される１つまたは２つ以上の多型の存在を検出することを含む、先行する請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項４８】
疾患が個体における第ＩＩ群疾患（好ましくはざ瘡）を含み、位置の番号付けがシスタチンＡ配列ＣｙｓｔＡ．１を参照して行われる場合、方法が、１１０１位におけるＧ残基の存在、シスタチンＡ核酸の９６位におけるＣ残基の存在、シスタチンＡの７１位におけるＡ残基の存在、シスタチンＡ核酸の２０位におけるＧ残基の存在、シスタチンＡ核酸の１７位におけるＴ残基の存在、シスタチンＡ核酸の１３位におけるＣ残基の存在、スタチンＡ核酸の１０位におけるＴ残基の存在、シスタチンＡ核酸の８位におけるＴ残基の存在、シスタチンＡ核酸の７３位におけるＧ残基の非存在、シスタチンＡ核酸の７６位および７７位におけるＴＧの非存在、ならびにシスタチンＡ核酸の６位におけるＣ残基の非存在からなる群から選択される１つまたは２つ以上の多型の存在を検出することを含む、先行する請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項４９】
疾患が個体における第ＩＩ群疾患（好ましくは乾癬）を含み、位置の番号付けがシスタチンＡ配列ＣｙｓｔＡ．１を参照して行われる場合、方法が、ＣｙｓｔＡ．１の２７０位におけるＧ残基の非存在、ＣｙｓｔＡ．１の７３位におけるＧ残基の存在、ＣｙｓｔＡ．１の１５位におけるＣ残基の非存在、ＣｙｓｔＡ．１の６位におけるＣ残基の非存在、ＣｙｓｔＡ．１の４位におけるＧ残基の非存在、およびＣｙｓｔＡ．１の７位におけるＧ残基の非存在からなる群から選択される１つまたは２つ以上の多型の存在を検出することを含む、先行する請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項５０】
第ＩＩ群疾患がざ瘡（好ましくは尋常性ざ瘡）または乾癬（好ましくは尋常性乾癬）である、先行する請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項５１】
個体における第ＩＩ群疾患または第ＩＩ群疾患感受性を診断する方法であって、前記方法が接着タンパク質またはプロテアーゼまたはプロテアーゼ阻害剤あるいは接着タンパク質またはプロテアーゼまたはプロテアーゼ阻害剤のフラグメントの存在または非存在または調節されたレベルを個体において検出することを含む方法。
【請求項５２】
（ａ）３６ｋＤａおよび４６〜４３ｋＤａおよび５２〜５６ｋＤａのコルネオデスモシンポリペプチドの相対的存在量、（ｂ）５２〜５６ｋＤａのコルネオデスモシンポリペプチドの上昇したレベル、ならびに（ｃ）３６ｋＤａおよび４６〜４３ｋＤａのコルネオデスモシンポリペプチドの一方または両方の低下したレベルのいずれか１つまたは２つ以上を個体において検出することを含む、先行する請求項のいずれかに記載される第ＩＩ群疾患または第ＩＩ群疾患感受性の診断方法。
【請求項５３】
（ａ）８０ｋＤａおよび９５ｋＤａおよび１６０ｋＤａのデスモグレインＩポリペプチドの相対的存在量、（ｂ）１６０ｋＤａのデスモグレインＩポリペプチドの上昇したレベル、ならびに（ｃ）９５ｋＤａおよび８０ｋＤａのデスモグレインＩポリペプチドの一方または両方の低下したレベルまたは非存在、ならびに（ｄ）１６０ｋＤａのデスモグレインＩポリペプチドのタンパク質分解の非存在のいずれか１つまたは２つ以上を個体において検出することを含む、先行する請求項のいずれかに記載される第ＩＩ群疾患または第ＩＩ群疾患感受性の診断方法。
【請求項５４】
５５ｋＤａのデスモグレイン３ポリペプチド、８０ｋＤａのデスモグレイン３ポリペプチド、および１００ｋＤａのデスモグレイン３ポリペプチドのいずれか１つまたは２つ以上の低下したレベルまたは非存在を個体において検出することを含む、先行する請求項のいずれかに記載される第ＩＩ群疾患または第ＩＩ群疾患感受性の診断方法。
【請求項５５】
（ａ）８５ｋＤａおよび７５ｋＤａおよび７０ｋＤａのプラコグロビンポリペプチドの相対的存在量、（ｂ）７０ｋＤａのプラコグロビンポリペプチドの存在または上昇したレベル、ならびに（ｃ）７５ｋＤａのプラコグロビンポリペプチドの非存在またはは低下したレベルのいずれか１つまたは２つ以上を個体において検出することを含む、先行する請求項のいずれかに記載される第ＩＩ群疾患または第ＩＩ群疾患感受性の診断方法。
【請求項５６】
（ａ）７５〜８０ｋＤａおよび／または１９０〜２５０ｋＤａおよび／または１２０〜１８０ｋＤａのデスモプラキンポリペプチドの相対的存在量、（ｂ）１９０〜２５０ｋＤａおよび１２０〜１８０ｋＤａのデスモプラキンポリペプチドのいずれかまたは両方の非存在または低下したレベル、ならびに（ｃ）８５ｋＤａデスモプラキンポリペプチドのタンパク質分解の非存在のいずれか１つまたは２つ以上を個体において検出することを含む、先行する請求項のいずれかに記載される第ＩＩ群疾患または第ＩＩ群疾患感受性の診断方法。
【請求項５７】
（ａ）７０〜８０ｋＤａおよび６０〜７０ｋＤａおよび５０〜６０ｋＤａのデスモコリン１ポリペプチドの相対的存在量、（ｂ）５０〜６０ｋＤａのデスモコリンＩポリペプチドの非存在または低下したレベルのいずれか１つまたは２つ以上を個体において検出することを含む、先行する請求項のいずれかに記載される第ＩＩ群疾患または第ＩＩ群疾患感受性の診断方法。
【請求項５８】
（ａ）１２４〜２０９ｋＤａ、１００〜１２０ｋＤａ、６０〜８０ｋＤａおよび５０〜５５ｋＤａのエンボプラキンポリペプチドの相対的存在量、（ｂ）６０〜８０ｋＤａおよび／または５０〜５５ｋＤａのエンボプラキンポリペプチドの存在または上昇したレベル、ならびに（ｃ）１２４〜２０９ｋＤａおよび／または１００〜１２０ｋＤａのエンボプラキンポリペプチドの非存在または低下したレベルのいずれか１つまたは２つ以上を個体において検出することを含む、先行する請求項のいずれかに記載される第ＩＩ群疾患または第ＩＩ群疾患感受性の診断方法。
【請求項５９】
（ａ）８０〜９０ｋＤａおよび７０〜７５ｋＤａのポリペプチドの相対的存在量、（ｂ）１２４〜２０９ｋＤａのＳＣＣＥポリペプチドの存在または上昇したレベル、（ｃ）８０〜９０ｋＤａのＳＣＣＥポリペプチドの非存在または低下したレベルのいずれか１つまたは２つ以上を個体において検出することを含む、先行する請求項のいずれかに記載される第ＩＩ群疾患または第ＩＩ群疾患感受性の診断方法。
【請求項６０】
（ａ）９０〜１００ｋＤａおよび２０ｋＤａのポリペプチドの相対的存在量、（ｂ）９０〜１００ｋＤａのＳＬＰＩポリペプチドの存在または上昇したレベル、（ｃ）２０ｋＤａのＳＬＰＩポリペプチドの非存在または低下したレベルのいずれか１つまたは２つ以上を個体において検出することを含む、先行する請求項のいずれかに記載される第ＩＩ群疾患または第ＩＩ群疾患感受性の診断方法。
【請求項６１】
Ｓ／コルネオデスモシン（ＡＦ０３０１３０）、デソプラキン（ＸＭ＿００４４６３）、プラコグロビン（ＮＭ＿００２２３０；ＧＢ：ＮＭ＿０２１９９１）、デスモグレイン１（ＸＭ＿００８８１０）、デスモコリン１（ＭＸ＿００８６８７）、エンボプラキン（ＸＭ＿００８１３５；Ｕ７２５４３）、プレクチン１（ＮＭ０００４４５）、Ｓ１００Ａ２（ＡＩ５３９４３９；Ｍ８７０６８）、ケラチン６Ａ（Ｌ４２６１１）、ケラチン１７（Ｚ１９５７４）、Ｓ１００Ａ８（ＡＩ１２６１３４）、Ｓ１００Ａ７（ＡＡ５８６８９４）、Ｓ１００Ａ９（ＧＢ：Ｗ７２４２４）、ＳＰＲＲ２Ａ（ＧＢ：Ｍ２１３０２）、ＳＰＲＲ１Ｂ（Ｍ１９８８８）、ＳＰＲＫ（ＡＩ９２３９８４）、ＨＣＲ（ＢＡＡ８１８９０）、ＳＥＥＫ１（ＢＡＡ８８１３０）、ＳＰＲ１（ＢＡＢ６３３１５）、ＳＴＧ（ＢＡＡ８８１３２）、インボルクリン（ＮＭ＿００５５４７）、アネキシンＡ１／リポコルチン（Ｘ０５９０８）、ＶＩ型コラーゲンα３（ＣＯＬ６Ａ３）（ＮＭ＿００４３６９）、トリコヒアリン（ＮＭ＿００５５４７）およびロリクリン（ＸＭ＿０４８９０２）からなる群から選択される接着タンパク質のポリペプチドまたは核酸の発現のダウンレギュレーションを検出することを含む、先行する請求項のいずれかに記載される第ＩＩ群疾患または第ＩＩ群疾患感受性の診断方法。
【請求項６２】
トランスグルタミナーゼ１（ＴＧＭ１）（Ｍ９８４４７）、ＴＧＭ２（ＸＭ＿００９４８２）、ＴＧＭ４（ＸＭ＿０５６２０３）、ＴＧＭ５（ＸＭ＿００７５２９）、ＴＧＭ７（ＮＭ＿０５２９５５）、ＴＧＭ３（Ｌ１０３８６）、ホスホリパーゼＡ（２）（ＢＣ０１３３８４）、ＣＤ４７抗原（Ｘ６９３９８）、カリクレイン８（ＡＢ００８３９０）、ＡＤ０２４タンパク質（ＸＭ＿００２６４２）、ディフェンシンβ２（ＡＦ０７１１２１６）、インターフェロンａ誘導性タンパク質２７（Ｘ６７３２５）、脂肪酸結合タンパク質ＦＡＢＰ５（Ｍ９４８５６）、ＳＣＴＥ（ＸＭ＿００９０００）、カリクレイン１（腎臓／膵臓／唾液性）（ＫＬＫ１）（ＸＭ＿０４７３００）、ヒトカリクレイン２（前立腺性）（ＫＬＫ２）（ＸＭ＿０３１７５７）、カリクレイン３（前立腺特異的抗原）（ＫＬＫ３）（ＸＭ＿０３１７６８）、カリクレイン６（ニューロシン、ザイム）（ＫＬＫ６）（ＸＭ＿０５５６５８）、カリクレイン４（プロスターゼ、エナメルマトリックス、前立腺）（ＫＬＫ４）（ＸＭ＿００８９９７）、膜型セリンプロテアーゼ１（ＡＦ１３３０８６）、コラゲナーゼＭＭＰ−１（ＬＯＣ１１６３８９）、コラゲナーゼＭＭＰ−１２（Ｕ７８０４５）、コラゲナーゼＭＭＰ−９（ＮＭ＿００４９９４）、コラゲナーゼＭＭＰ−３（Ｕ７８０４５）、コラゲナーゼＭＭＰ−２８（ＡＦ２１９６２４）、カスパーゼ７（ＢＣ０１５７９９）、カスパーゼ５（ＮＭ＿００４３４７）、カスパーゼ−１４（ＮＭ＿０１２１１４）、ユビキチン特異的プロテアーゼＵＳＰ−５（ＮＭ＿００３４８１）、ユビキチン特異的プロテアーゼＵＳＰ−１１（ＮＭ＿００４６５１）、ユビキチン特異的プロテアーゼＵＳＰ−６（ＮＭ＿００４５０５）、ユビキチン特異的プロテアーゼＵＳＰ−２６（ＮＭ＿０３１９０７）、ユビキチン特異的プロテアーゼ（ＵＳＰ２８）（ＮＭ＿０２０８８６）、２６Ｓプロテアーゼサブユニット４（Ｌ０２４２６）、ＬＩＬＲＢ１（ＡＦ００４２３０）、転写のシグナル変換因子／活性化因子１（９１ｋＤａ）（ＳＴＡＴ１）（９７７９３５）、プロテアソーム（プロソーム、マクロパイン）サブユニット６（ＰＳＭＡ６）（Ｘ５９４１７）、ＴＰＳＢ１（ＸＭ＿０１６２０４）、プロテアーゼネキシン−ＩＩ（ＸＭ＿０４７７９３）、グリア由来ネキシン前駆体（Ｐ０７０９３）、および２６Ｓプロテアーゼ調節サブユニットＳ１０Ｂ、ＰＣＯＬＮ３（ＸＭ＿０４７５２４）からなる群から選択されるプロテアーゼのポリペプチドまたは核酸の発現のアップレギュレーションを検出することを含む、先行する請求項のいずれかに記載される第ＩＩ群疾患または第ＩＩ群疾患感受性の診断方法。
【請求項６３】
アポトーシス関連システインプロテアーゼ（ＣＡＳＰ１４）ｍＲＮＡ（ＮＭ＿０１２１１４）、ＳＣＣＥ（ＸＭ＿００９００２）、ヒト皮膚コラゲナーゼ（Ｍ１３５０９）、ＴＰＳ１（ＮＭ＿００３２９３）、およびＴＰＳＧ１（ＸＭ＿００８１２３）からなる群から選択されるプロテアーゼのポリペプチドまたは核酸の発現のダウンレギュレーションを検出することを含む、先行する請求項のいずれかに記載される第ＩＩ群疾患または第ＩＩ群疾患感受性の診断方法。
【請求項６４】
ＳＬＰ１（Ｘ０４５０２）、ＳＫＡＬＰ（ＸＭ＿００９５２４；Ｌ１０３４３）、ＣＳＴＡ（ＮＭ＿００５１２３；ＡＡ５７０１９３）、ＳＣＣＡ（Ｓ６６２９６）、ＳＣＣＡ２（Ｕ１９５５７）、１型プラスミノーゲン活性化因子阻害剤（Ｘ０４７２９；Ｘ０４７３１）、ＰＡＩ２（ＡＦ０７１４００）、ＳＥＲＰＩＮＡ５（ＮＭ＿０００６２４）、２型プラスミノーゲン活性化因子阻害剤（Ｌ１９０６６）、ＴＩＭＰ（Ｄ１１１３９）、ＴＩＭＰ−１（ＮＭ＿００３２５４）、ＴＩＭＰ−２（ＮＭ＿００３２５５）、ＴＩＭＰ−３（Ｅ１３８８０）、ＴＩＭＰ−４（ＮＭ＿００３２５６）、ＴＩＭ９ａ（ＡＦ１５０１００）、ＴＩＭ９ｂ（ＡＦ１５０１０５）、シスタチンＡ（ＡＡ５７０１９３）、シスタチンＭ／Ｅ（ＮＭ＿００１３２３）、多価プロテアーゼ阻害剤ＷＦＩＫＫＮ（ＡＦ４２２１９４）、Ｃ１阻害剤（ＳＥＲＰＩＮＧ１）（ＸＭ＿０４６２１８）、プロテアーゼ阻害剤（Ｋｕｎｉｔｚ型２）（ＳＰＩＮＴ２）（ＸＭ＿０３２２８０）、セリンプロテアーゼ阻害剤（Ｋａｚａｌ型４）（ＳＰＩＮＫ４）（ＸＭ＿００５５３９）、プロテイナーゼ阻害剤（ｃｌａｄｅＢ［オバルブミン］）（メンバー９）（ＸＭ＿０５３６４２）、セリン（またはシステイン）プロテイナーゼ阻害剤（ｃｌａｄｅＢ［オバルブミン］）（メンバー６）（ＸＭ＿０４７９８４）、エピン−１（ＥＰＰＩＮ）（ＡＦ２８６３６８）、エピン−２（ＥＰＰＩＮ）（ＡＦ２８６３６９）、エピン−３（ＥＰＰＩＮ）（ＡＦ２８６３７０）、ＫｕｎｉｔｚドメインおよびＷＡＰドメインを有するセリンプロテアーゼ阻害剤様１（エピン）（ＳＰＩＮＬＷ１）（ＮＭ＿０２０３９８）、ｓｐａｒｃ／オステオネクチン（ｃｗｃｖ様ドメインおよびｋａｚａｌ様ドメインのプロテオグリカン［テスティカン］）（ＳＰＯＣＫ）（ＮＭ＿００４５９８）、プロテアーゼ阻害剤（Ｋｕｎｉｔｚ型１）（ＳＰＩＮＴ１）（ＸＭ＿０５６８３６）、ＰＩ１２（ＡＨ００９７５６）、ＨＩＶ−１プロテアーゼのＩ型ヒト免疫不全症ウイルス遺伝子（ＡＢ０２０９２３）、ＨＩＶ−１プロテアーゼのＩ型ヒト免疫不全症ウイルス遺伝子（ＡＢ０２０９２４）、組織因子経路阻害剤２（ＴＦＰＩ２）（ＮＭ＿００６５２８）、分泌型リンタンパク質２（２４ｋＤ）（ＳＰＰ２）（ＮＭ＿００６９４４）、カテプシンＦ（ＣＴＳＦ）（ＮＭ＿００３７９３）、セリン（またはシステイン）プロテイナーゼ阻害剤（ｃｌａｄｅＡ［α−１抗プロテイナーゼ、アンチトリプシン］）（メンバー６）（ＳＥＲＰＩＮＡ６）（ＮＭ＿００１７５６）、セリン（またはシステイン）プロテイナーゼ阻害剤（ｃｌａｄｅＢ［オバルブミン］）（メンバー３）（ＳＥＲＰＩＮＢ３）（ＮＭ＿００６９１９）、セリン（またはシステイン）プロテイナーゼ阻害剤（ｃｌａｄｅＡ［α−１抗プロテイナーゼ、アンチトリプシン］）（メンバー３）（ＳＥＲＰＩＮＡ３）（ＮＭ＿００１０８５）、ヒトセリン（またはシステイン）プロテイナーゼ阻害剤（ｃｌａｄｅＢ［オバルブミン］）（メンバー１３）（ＸＭ＿００８７４３）、セリン（またはシステイン）プロテイナーゼ阻害剤（ｃｌａｄｅＢ［オバルブミン］）（メンバー５）（ＳＥＲＰＩＮＢ５）（ＸＭ＿００８７４２）、Ｒｅｌ��結合型阻害剤（ＸＭ＿０５７６９３）、ＤＮＡ結合阻害剤１（優性ネガティブなヘリックス−ループ−ヘリックスタンパク質［ＩＤ１］）（ＸＭ＿０４６１７９）、セリン（またはシステイン）プロテイナーゼ阻害剤（ｃｌａｄｅＥ［ネキシン、１型プラスミノーゲン活性化因子阻害剤］）（メンバー）（ＳＥＲＰＩＮＥ１）（ＸＭ＿０５４８５０）、サイクリン依存性キナーゼ阻害剤２Ｂ（ｐ１５、ＣＤＫ４を阻害する）（ＣＤＫＮ２Ｂ）（ＮＭ＿００４９３６）、サイクリン依存性キナーゼ阻害剤２Ｂ（ｐ１５、ＣＤＫ４を阻害する）に類似するもの（ＢＣ０１４４６９）、セリン（またはシステイン）プロテイナーゼ阻害剤（ｃｌａｄｅＢ［オバルブミン］）（メンバー７）（ＳＥＲＰＩＮＢ７）（ＸＭ＿００８７４５）、活性化ＳＴＡＴタンパク質ＰＩＡＳｙのタンパク質阻害剤（ＰＩＡＳＹ）（ＮＭ＿０１６１４９）、活性化ＳＴＡＴタンパク質ＰＩＡＳｙのタンパク質阻害剤に類似するもの（ＬＯＣ９５８３０）（ＸＭ＿０１６８６４）、ＰＫＣにより強化されるＰＰ１阻害タンパク質（ＰＰＰ１Ｒ１４Ａ）（ＡＹ０５０６６８）、ＤＮＡ結合阻害剤３（優性ネガティブなヘリックス−ループ−ヘリックスタンパク質［ＩＤ３］）（ＮＭ＿００２１６７）、ＣｌａｄｅＡ（α−１抗プロテイナーゼ、アンチトリプシン）（ＸＭ＿０２８３５８）、セリン（またはシステイン）プロテイナーゼ阻害剤（ｃｌａｄｅＨ［熱ショックタンパク質４７］）（メンバー１）（ＳＥＲＰＩＮＨ１）（ＮＭ＿００４３５３）、フルピン（セリンプロテアーゼ阻害剤）に対するＰＩ１３遺伝子（ＡＪ２７８７１７）、プロテアーゼ阻害剤５（マスピン）（ＰＩ５）（ＸＭ＿００８７４２）、ＰＡＩ−２（Ａ３２４１５）からなる群から選択されるプロテアーゼ阻害剤のポリペプチドまたは核酸の発現のアップレギュレーションを検出することを含む、先行する請求項のいずれかに記載される第ＩＩ群疾患または第ＩＩ群疾患感受性の診断方法。
【請求項６５】
ｈｂｃ７５０ヒト膵臓小島（Ｔ１１１４１；Ｔ１０９２０）のポリペプチドまたは核酸の発現のダウンレギュレーションを検出することを含む、先行する請求項のいずれかに記載される第ＩＩ群疾患または第ＩＩ群疾患感受性の診断方法。
【請求項６６】
第ＩＩ群疾患が、乾癬、魚鱗癬、尋常性ざ瘡および毛孔性角化症からなる群から選択される、先行する請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項６７】
第ＩＩ群疾患を処置または予防する方法であって、細胞間の接着に関する接着タンパク質の発現および／または活性をダウンレギュレーションさせること、またはそのような接着タンパク質のタンパク質分解をアップレギュレーションさせることを含む方法。
【請求項６８】
接着タンパク質の発現および／または活性が転写レベルまたは翻訳レベルまたはその両方でダウンレギュレーションされる、先行する請求項のいずれかに記載される、第ＩＩ群疾患を処置または予防する方法。
【請求項６９】
接着タンパク質のタンパク質分解に関与するプロテアーゼの発現および／または活性および／または分解がアップレギュレーションされる、先行する請求項のいずれかに記載される、第ＩＩ群疾患を処置または予防する方法。
【請求項７０】
接着タンパク質のタンパク質分解に関与するプロテアーゼの活性を阻害することを担うプロテアーゼ阻害剤の発現および／または活性がダウンレギュレーションされ、かつ／またはそのようなプロテアーゼ阻害剤の分解がアップレギュレーションされる、先行する請求項のいずれかに記載される、第ＩＩ群疾患を処置または予防する方法。
【請求項７１】
接着タンパク質のタンパク質分解が、プロテアーゼまたはそのフラグメントを投与すること、プロテアーゼのアゴニストを投与すること、プロテアーゼ阻害剤のアンタゴニストを投与すること、プロテアーゼの発現を増大させること、プロテアーゼの活性を増大させること、プロテアーゼ阻害剤の発現を低下させること、プロテアーゼ阻害剤の活性を低下させることの１つまたは２つ以上によって増大させられる、先行する請求項のいずれかに記載される、第ＩＩ群疾患を処置または予防する方法。
【請求項７２】
第ＩＩ群疾患を処置または予防する方法であって、前記方法がそのような疾患に罹患している患者またはそのような疾患に罹患する可能性を有する患者に、接着タンパク質またはプロテアーゼまたはプロテアーゼ阻害剤あるいは接着タンパク質またはプロテアーゼまたはプロテアーゼ阻害剤のフラグメントの疾患非関連形態の治療効果的な量を投与することを含む方法。
【請求項７３】
接着タンパク質またはそのフラグメントを投与することを含む、先行する請求項のいずれかに記載される、第ＩＩ群疾患を処置または予防する方法。
【請求項７４】
デスモコリンＩのフラグメント（好ましくは、ペプチド６４１の配列を含むペプチド）、またはデスモプラキンのフラグメント（好ましくは、ペプチド６４２の配列を含むペプチド）を投与することを含む、先行する請求項のいずれかに記載される、第ＩＩ群疾患を処置または予防する方法。
【請求項７５】
接着タンパク質またはプロテアーゼまたはプロテアーゼ阻害剤（好ましくは、疾患関連形態の接着タンパク質またはプロテアーゼまたはプロテアーゼ阻害剤）と特異的に反応し得るポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体。
【請求項７６】
接着タンパク質またはプロテアーゼまたはプロテアーゼ阻害剤に結合することができる分子を同定するための方法であって、接着タンパク質またはプロテアーゼまたはプロテアーゼ阻害剤を候補化合物と接触させること、および候補化合物が接着タンパク質またはプロテアーゼまたはプロテアーゼ阻害剤に結合するかどうかを測定することを含む方法。
【請求項７７】
請求項７６に記載される方法によって同定される化合物。
【請求項７８】
プロテアーゼの活性を調節することができる分子を同定するための方法であって、（ａ）接着タンパク質を提供すること、（ｂ）プロテアーゼを提供すること、（ｃ）接着タンパク質を候補分子の存在下でプロテアーゼにさらすこと、および（ｄ）プロテアーゼによる接着タンパク質の切断または非切断を検出することを含む方法。
【請求項７９】
請求項７８に記載の方法によって同定された化合物で、プロテアーゼによる接着分子の切断を増強することができる化合物の、第ＩＩ群疾患を処置するための使用。
【請求項８０】
請求項７８に記載の方法によって同定された化合物で、プロテアーゼによる接着分子の切断を阻害することができる化合物の、第Ｉ群疾患を処置するための使用。
【請求項８１】
異種の接着タンパク質またはプロテアーゼまたはプロテアーゼ阻害剤を発現するトランスジェニック非ヒト動物。
【請求項８２】
調節されたレベル（好ましくは、アップレギュレーションされたレベルまたはダウンレギュレーションされたレベル）の接着タンパク質またはプロテアーゼまたはプロテアーゼ阻害剤を発現するトランスジェニック非ヒト動物。
【請求項８３】
接着タンパク質またはプロテアーゼまたはプロテアーゼ阻害剤を実質的に発現しないトランスジェニック非ヒト動物。
【請求項８４】
皮膚疾患（好ましくは、第Ｉ群疾患または第ＩＩ群疾患）のモデルとしての、前記請求項いずれかに記載されるトランスジェニック動物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は疾患の診断および処置に関する。より詳細には、本発明は、表皮または皮膚の疾患の処置および診断、ならびにそのような処置および／または診断に必要な薬剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
皮膚は、水を体内に保持し、かつ環境的因子の体内への侵入を防止するバリアである。従って、皮膚のバリア機能は、体内の恒常性を維持するためには不可欠である（Ｃｏｒｋ、１９９７）。表皮は、基底層（または胚芽層）における分裂によって形成される非常に詰まった角化細胞の層から構成される。角化細胞が有棘層および顆粒層を通って上に移動するに従い、角化細胞は分化して、ケラチンおよび微小繊維および微小管からなる堅い内部構造体が形成される。角質層は、核を失っている平坦化した死細胞の層から構成され、その間には、脂質およびタンパク質の複雑な混合物が存在する。
【０００３】
表皮バリアが角質層に存在するが、表皮バリアは角質細胞間の強い接着に依存している（Ｅｇｅｌｒｕｄ、２０００）。この接着はコレネオデスモソームにより媒介される（ＭｅｎｔｏｎおよびＥｌｉｓｅｎ、１９７１；ＣｈａｐｍａｎおよびＷａｌｓｈ、１９９０；Ｎｏｒｔｈら、１９９９）。コルネオデスモシンはコレネオデスモソームの糖タンパク質である。
【０００４】
表皮バリアのそれ以外の成分はラメラ脂質である。脂質は表皮顆粒層内のラメラ体内に分泌される（Ｅｌｉａｓ、１９９３）。表皮顆粒層と角質層との境界において、脂質が顆粒細胞から角質細胞間の空間内に抜き取られる。その後、脂質は、高度に組織化された多層の二重層構造体に組織化される（Ｌａｎｄｍａｎｎ、１９８８）。角質層は、れんがおよびラメラ脂質（モルタル）を形成する角質細胞を伴うれんが壁にかなり似て可視化され得る（Ｅｌｉａｓ、１９８３）。角質細胞は、水をその中に保持する保水性物質である天然保湿性因子（ＮＭＦ）を含有する。大きい水分含有量により、角質細胞は膨潤させられ、角質細胞間における裂け目および亀裂の形成が防止される。皮膚の柔軟性および弾力性は、直接、その水分含有量に関係づけられる。正常な健康な角質層は比較的大きい水分含有量を有する。
【０００５】
従って、角質層は、成長可能な表皮における角化細胞の増殖および分化によって絶えず置き換えられているバリアである。一定した角質層厚を特定の身体部位において維持するために、角質層の表面部分は、その産生を平衡させる速度での落屑プロセスで絶えず生え替わらなければならない。角質細胞の損なわれた落屑は、なかでも、乾癬、尋常性ざ瘡、魚鱗癬および毛孔性角化症などの多数の疾患の特徴である。乾癬では、角質細胞の損なわれた落屑は角質層の厚さを増大させ、バリアが通常高まっている。尋常性ざ瘡の初期の病理学的事象は、角質細胞の損なわれた落屑の結果として生じる毛嚢脂腺ユニットの狭小化である。この欠陥は、増大した皮脂産生速度と一緒になっており、そして二次的な事象には、皮脂の停滞が含まれる。
【０００６】
（概要）
本発明者らは、コルネオデスモソームタンパク質のタンパク質分解が、落屑に関与する重要なプロセスであることを明らかにしている。
【０００７】
その結果、本発明者らは、コルネオデスモソームタンパク質の増大したタンパク質分解、またはその損なわれたタンパク質分解、またはそうでない場合にはその異常なタンパク質分解がいくつかの皮膚障害に関与していることを発見した。具体的には、本発明者らは、接着タンパク質の増大したタンパク質分解が、損なわれたバリア機能を特徴とする疾患に関与していること、そして接着タンパク質の低下したタンパク質分解が、角質細胞の損なわれた落屑を特徴とする疾患に関与していることを見出した。本発明者らはさらに、接着タンパク質をコードする遺伝子における変異が表皮細胞間の低下した接着をもたらすことを明らかにしている。
【０００８】
本発明の第１の態様によれば、本発明者らは、上皮細胞間の異常な細胞−細胞接着に関連する疾患またはそのような疾患に対する感受性を診断する方法を提供する。この方法は、個体の接着タンパク質またはプロテアーゼまたはプロテアーゼ阻害剤をコードする核酸における変異を検出することを含む。
【０００９】
本発明の第２の態様によれば、個体における第Ｉ群疾患または第Ｉ群疾患に対する感受性を診断する方法が提供される。この方法は、接着タンパク質またはプロテアーゼまたはプロテアーゼ阻害剤のポリペプチドにおける多型、あるいは接着タンパク質またはプロテアーゼまたはプロテアーゼ阻害剤のポリペプチドをコードする核酸における多型で、第Ｉ群疾患に関連する多型の存在の有無を検出することを含む。
【００１０】
好ましくは、接着タンパク質は、表Ｄ２．１および表Ｄ５．１に示される接着タンパク質からなる群から選択され、好ましくは、コルネオデスモシン、デスモグレインＩ、デスモグレイン３、プラコグロビン、デスモプラキン、デスモコリンＩ、およびエンボプラキン、セリンリッチタンパク質、好ましくは小さいプロリンリッチタンパク質（ＳＰＲＲ）、ＳＰＲＲ２Ａ、ＳＰＲＲ１Ｂ、ＳＰＲＫ、ＳＰＲＲ２Ｅ、ＳＰＲＲ２Ｆ、ＳＰＲＲ２Ｂ、ＳＰＲＲ２Ｄ、ＳＰＲＲ２Ｃ、ＳＰＲＲ２Ｇ、ＳＰＲＲ１Ａ、ＳＰＲＲ３、ＳＰＲＲ４、インボルクリンまたはロリクリンである。
【００１１】
好ましくは、プロテアーゼは、表Ｄ３．１および表Ｄ６．１に示されるプロテアーゼからなる群から選択され、好ましくは角質層キモトリプシン様酵素（ＳＣＣＥ）または角質層トリプシン様酵素（ＳＣＴＥ）である。
【００１２】
好ましくは、プロテアーゼ阻害剤は、表Ｄ４．１および表Ｄ７．１に示されるプロテアーゼ阻害剤からなる群から選択され、好ましくは、分泌型ロイコプロテアーゼ阻害剤（ＳＬＰＩ）、エラフィンプロテアーゼ阻害剤３（ＰＩ３もしくはＳＫＡＬＰ）またはシスタチンＡ（ＣＳＴＡ）である。
【００１３】
好ましくは、第Ｉ群疾患は、アトピー性湿疹、脂漏性湿疹、刺激性接触皮膚炎、アレルギー性接触皮膚炎、肺アトピー性喘息、ウイルス感染後喘息、気管支反応亢進、慢性閉塞性肺疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎、セリアック病、消化性潰瘍化、膿痂疹、ウイルス性いぼ、伝染性軟属腫、細菌性髄膜炎、ウイルス性髄膜炎、ヘリコバクター・ピロリの侵入に関連する消化性潰瘍化、皮膚黒色腫、扁平上皮ガン、基底細胞ガン、皮膚型リンパ腫、皮膚ガン、胃腸管悪性腫瘍、および肺悪性腫瘍からなる群から選択される。
【００１４】
本発明者らは、本発明の第３の態様によれば、個体における第Ｉ群疾患または第Ｉ群疾患に対する感受性を診断する方法を提供するが、この方法は、接着タンパク質またはプロテアーゼまたはプロテアーゼ阻害剤あるいは接着タンパク質またはプロテアーゼまたはプロテアーゼ阻害剤のフラグメントの存在または非存在または調節されたレベルを個体において検出することを含む。
【００１５】
本発明の第４の態様として、第Ｉ群疾患を処置または予防する方法が提供される。この方法は、細胞間の接着を担う接着タンパク質の発現および／または活性をアップレギュレーションさせること、またはそのような接着タンパク質のタンパク質分解をダウンレギュレーションさせることを含む。
【００１６】
好ましくは、本発明の処置方法は、接着タンパク質の発現および／または活性が転写レベルまたは翻訳レベルまたはその両方でアップレギュレーションされる方法である。
【００１７】
あるいは、またはさらに、接着タンパク質のタンパク質分解に関与するプロテアーゼの発現および／または活性および／または分解がダウンレギュレーションされる。
【００１８】
その上、あるいは、またはさらに、接着タンパク質のタンパク質分解に関与するプロテアーゼの活性を阻害することを担うプロテアーゼ阻害剤の発現および／または活性がアップレギュレーションされ、かつ／またはそのようなプロテアーゼ阻害剤の分解がダウンレギュレーションされる。
【００１９】
接着タンパク質のタンパク質分解は、プロテアーゼ阻害剤またはそのフラグメントを投与すること、プロテアーゼのアンタゴニストまたはそのフラグメントを投与すること、プロテアーゼ阻害剤のアゴニストを投与すること、プロテアーゼの発現を低下させること、プロテアーゼの活性を低下させること、プロテアーゼ阻害剤の発現を増大させること、プロテアーゼ阻害剤の活性を増大させることの１つまたは２つ以上によって低下させることができる。
【００２０】
本発明は、第６の態様において、第Ｉ群疾患を処置または予防する方法を提供する。この方法は、そのような疾患に罹患している患者またはそのような疾患に罹患する可能性を有する患者に、接着タンパク質またはプロテアーゼまたはプロテアーゼ阻害剤あるいは接着タンパク質またはプロテアーゼまたはプロテアーゼ阻害剤のフラグメントの疾患非関連形態の治療効果的な量を投与することを含む。
【００２１】
好ましくは、この方法は、プロテアーゼ活性を阻害することができるプロテアーゼ阻害剤またはそのフラグメントを投与することを含む。
【００２２】
好ましくは、この方法は、ＳＬＰＩのフラグメントを投与すること、好ましくは、ＣＧＫＳ（ＳＢ７ａ）およびＣＧＫＳＣＶＳＰＶＫＡ（ＳＢ７ｂ）、ＫＩＩＤＧＡ、ＧＤＫＩＩＤＧＡ、ＧＤＫＩＩＤ、ＫＩＩ、ＫＩＩＤ、ＫＩＩＤＧ、ＫＩＩＤＧＡ、ＬＤＰＶＤ（６５１）、ＫＲＤＬＫ（６５２）、ＬＤＰＶＤＴＰＮＰ（６５３）、ＬＤＰＶＤＴＰＮＰＴＲＲＫＰＧ（６５４）、ＣＧＫＳＣＶＳＰＶＫＡ（６４４）、ＣＶＳＰＶＫＡ（６４３）からなる群から選択されるペプチドを投与すること、最も好ましくは、ペプチド６４３またはペプチド６５１またはペプチド６５３を投与することを含む。
【００２３】
あるいは、またはさらに、この方法は、ＴＮＦ−αおよび／またはＩＬ−βを投与することを含む。
【００２４】
好ましくは、第１群疾患は湿疹（好ましくはアトピー性湿疹）または皮膚炎（好ましくは疱疹状皮膚炎）である。
【００２５】
本発明の第７の態様において、個体における第ＩＩ群疾患または第ＩＩ群疾患に対する感受性を診断する方法が提供される。この方法は、接着タンパク質またはプロテアーゼまたはプロテアーゼ阻害剤のポリペプチドにおける多型、あるいは接着タンパク質またはプロテアーゼまたはプロテアーゼ阻害剤のポリペプチドをコードする核酸における多型で、第ＩＩ群疾患に関連する多型の存在の有無を検出することを含む。
【００２６】
本発明の第８の態様によれば、本発明者らは、第ＩＩ群疾患を処置または予防する方法で、細胞間の接着に関する接着タンパク質の発現および／または活性をダウンレギュレーションさせること、またはそのような接着タンパク質のタンパク質分解をアップレギュレーションさせることを含む方法を提供する。
【００２７】
好ましくは、接着タンパク質の発現および／または活性が転写レベルまたは翻訳レベルまたはその両方でダウンレギュレーションされる。
【００２８】
あるいは、またはさらに、接着タンパク質のタンパク質分解に関与するプロテアーゼの発現および／または活性および／または分解がアップレギュレーションされる。
【００２９】
その上、あるいは、またはさらに、接着タンパク質のタンパク質分解に関与するプロテアーゼの活性を阻害することを担うプロテアーゼ阻害剤の発現および／または活性がダウンレギュレーションされ、かつ／またはそのようなプロテアーゼ阻害剤の分解がアップレギュレーションされる。
【００３０】
好ましくは、接着タンパク質のタンパク質分解は、プロテアーゼまたはそのフラグメントを投与すること、プロテアーゼのアゴニストを投与すること、プロテアーゼ阻害剤のアンタゴニストを投与すること、プロテアーゼの発現を増大させること、プロテアーゼの活性を増大させること、プロテアーゼ阻害剤の発現を低下させること、プロテアーゼ阻害剤の活性を低下させることの１つまたは２つ以上によって増大させられる。
【００３１】
本発明者らは、本発明の第９の態様によれば、第ＩＩ群疾患を処置または予防する方法で、そのような疾患に罹患している患者またはそのような疾患に罹患する可能性を有する患者に、接着タンパク質またはプロテアーゼまたはプロテアーゼ阻害剤あるいは接着タンパク質またはプロテアーゼまたはプロテアーゼ阻害剤のフラグメントの疾患非関連形態の治療効果的な量を投与することを含む方法を提供する。
【００３２】
好ましくは、この方法は、接着タンパク質またはそのフラグメントを投与することを含む。
【００３３】
好ましくは、この方法は、デスモコリンＩのフラグメント（好ましくは、ペプチド６４１の配列を含むペプチド）、またはデスモプラキンのフラグメント（好ましくは、ペプチド６４２の配列を含むペプチド）を投与することを含む。
【００３４】
本発明の第１０の態様によれば、接着タンパク質またはプロテアーゼまたはプロテアーゼ阻害剤（好ましくは、疾患関連形態の接着タンパク質またはプロテアーゼまたはプロテアーゼ阻害剤）と特異的に結合することができるポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体が提供される。
【００３５】
本発明の第１１の態様として、本発明者らは、接着タンパク質またはプロテアーゼまたはプロテアーゼ阻害剤に結合することができる分子を同定するための方法を提供する。この方法は、接着タンパク質またはプロテアーゼまたはプロテアーゼ阻害剤ポリペプチドを候補化合物と接触させること、および候補化合物が接着タンパク質またはプロテアーゼまたはプロテアーゼ阻害剤に結合するかどうかを測定することを含む。
【００３６】
本発明者らは、本発明の第１２の態様によれば、上記態様による方法によって同定される化合物を提供する。
【００３７】
本発明の第１３の態様によれば、本発明者らは、プロテアーゼの活性を調節することができる分子を同定するための方法を提供する。この方法は、（ａ）接着タンパク質を提供すること、（ｂ）プロテアーゼを提供すること、（ｃ）接着タンパク質を候補分子の存在下でプロテアーゼにさらすこと、および（ｄ）プロテアーゼによる接着タンパク質の切断または非切断を検出することを含む。
【００３８】
本発明の第１４の態様によれば、本発明の前記第１３の態様による方法によって同定された化合物で、プロテアーゼによる接着分子の切断を増強することができる化合物の、第ＩＩ群疾患を処置するための使用が提供される。
【００３９】
本発明者らは、本発明の第１５の態様によれば、本発明の前記第１３の態様の方法によって同定された化合物で、プロテアーゼによる接着分子の切断を阻害することができる化合物の、第Ｉ群疾患を処置するための使用を提供する。
【００４０】
本発明の第１６の態様として、異種の接着タンパク質またはプロテアーゼまたはプロテアーゼ阻害剤（好ましくは、疾患関連形態の接着タンパク質またはプロテアーゼまたはプロテアーゼ阻害剤）を発現するトランスジェニック非ヒト動物が提供される。本発明の第１７の態様では、調節されたレベル（好ましくは、アップレギュレーションされたレベルまたはダウンレギュレーションされたレベル）の接着タンパク質またはプロテアーゼまたはプロテアーゼ阻害剤を発現するトランスジェニック非ヒト動物が提供される。本発明の第１８の態様によれば、本発明者らは、接着タンパク質またはプロテアーゼまたはプロテアーゼ阻害剤を実質的に発現しないトランスジェニック非ヒト動物を提供する。そのような動物は、皮膚疾患のモデルとして、好ましくは第Ｉ群疾患または第ＩＩ群疾患のモデルとして使用することができる。
【００４１】
（詳細な説明）
本発明者らは、接着タンパク質の調節されたタンパク質分解が健全な皮膚にとって重要であることを明らかにしている。本発明者らは、様々な皮膚疾患の根本的原因が、角質細胞間の増大した接着、または角質細胞間の低下した接着、またはそうでない場合には角質細胞間の異常な接着をもたらす、接着タンパク質のタンパク質分解の調節における崩壊であることを示している。そのような異常なタンパク質分解には様々な原因が考えられ、これには、接着タンパク質遺伝子における変異、接着タンパク質に作用するプロテアーゼにおける変異、および／またはそのようなプロテアーゼに作用して、その活性を調製するプロテアーゼ阻害剤における変異が含まれる。
【００４２】
本発明者らは、そのような疾患の処置および防止が、接着タンパク質のタンパク質分解を調節することによって達成され得ることを示している。本発明者らはまた、接着タンパク質および／またはプロテアーゼおよび／またはプロテアーゼ阻害剤におけるそのような変異の検出が、様々な皮膚疾患および／またはそのような疾患に対する感受性を診断するために使用できることを明らかにしている。
【００４３】
従って、例えば、本発明者らは、接着タンパク質をコードする遺伝子（例えば、コルネオデスモシンをコードする遺伝子（Ｓ遺伝子）など）における変異は角質細胞などの上皮細胞間の低下した接着または増大した接着をもたらし、これにより疾患が生じることを示している。その上、そのような接着タンパク質に関連する遺伝子（例えば、染色体６ｐ２１におけるＭＨＣ表皮遺伝子クラスター内の遺伝子）における変異もまた上皮細胞間の低下した接着をもたらす。本発明者らは、＋１２４３位、＋１８０位および＋６１９位を含む様々な位置において特定の変異を特定し、それらを第Ｉ群疾患および第ＩＩ群疾患に関連させている。
【００４４】
さらに、本発明者らは、タンパク質分解酵素をコードする遺伝子（第１９染色体のｑ１３バンドにおける角質層キモトリプシン様酵素（ＳＣＣＥ）遺伝子および／または角質層トリプシン様酵素（ＳＣＴＥ）遺伝子など）および第１７染色体内の関連するセリンプロテアーゼ遺伝子における変異はこれらの酵素の増大した活性をもたらし、結果として、角質細胞の早すぎる落屑をもたらすことを示している。具体的には、本発明者らは、ＡＡＣＣＡＡＣＣ配列とアトピー性湿疹および他の第Ｉ群疾患との関連を確認している。
【００４５】
さらに、ＳＫＡＬＰおよびＳＬＰＩなどのセリンプロテアーゼ阻害剤遺伝子における変異は落屑プロセスの調節不全をもたらす。従って、例えば、Ｓ遺伝子、ＳＣＣＥ遺伝子、ＳＣＴＥ遺伝子、ＳＫＡＬＰ遺伝子、ＳＬＰＩ遺伝子またはこれらの遺伝子の任意の組合せにおける変異は表皮バリア機能の障害をもたらす。これらの遺伝子における変異が一緒に存在すると、表皮バリア機能欠陥の重篤度が大きくなる。
【００４６】
従って、本発明者らは、そのような変異を検出することによって、上皮細胞間の異常な細胞−細胞接着に関連する疾患を診断する方法を提供する。さらに、本発明者らはまた、そのようなプロテアーゼ遺伝子およびプロテアーゼ阻害剤遺伝子の発現を調節することによって、上皮細胞間の異常な細胞−細胞接着に関連する疾患を処置する方法を提供する。
【００４７】
疾患の「処置」に対する言及がなされる場合、これは、そのような疾患の症状の軽減に対する言及を含むことを理解しなければならない。好ましくは、そのような疾患を有する個体の症状の実質的にすべてが軽減または除去される。「疾患」は、個体の健康状態または安寧を冒している任意の症状ならびに任意の状態を含むことを理解しなければならない。好ましくは、個体は、本明細書に記載される方法および組成物を使用して、少なくとも１つの疾患症状または状態から解放される。好ましくは、個体は、正常な非罹患者の状態に実質的に復帰する。これは、関連する臨床パラメーターを使用して医師によって評価され得る。
【００４８】
同様に、疾患の「診断」に対する言及がなされる場合、これは、そのような疾患そのものの診断、ならびに疾患に対する感受性の診断の両方を含むことを理解しなければならない。本明細書に開示される診断方法はまた、疾患の診断において有用な徴候を提供する方法として用いることができる。
【００４９】
別途定義されない限り、本明細書中で使用されるすべての技術的用語および科学的用語は、（例えば、細胞培養、分子遺伝学、核酸化学、ハイブリダイゼーション技術および生化学における）当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。標準的な様々な技術が、分子的方法、遺伝学的方法および生化学的方法（一般的には、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版（１９８９）、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．および；Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９９）、第４版、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃを参照のこと。これらは参考として本明細書中に組み込まれる）、化学的方法、薬学的な配合物および送達、ならびに患者の処置のために使用される。
【００５０】
表皮バリア機能
本明細書に記載される方法および組成物は主に、異常な表皮バリア機能に関連するか、または異常な表皮バリア機能を特徴とする疾患の診断および／または処置に関する。
【００５１】
皮膚は、水を体内に保持し、かつ環境的因子の体内への侵入を防止するバリアである。侵入を阻止するこの能力は、体内の恒常性を維持するためには不可欠である（Ｃｏｒｋ、１９９７）。表皮は、基底層（または胚芽層）における分裂によって形成される非常に詰まった角化細胞の層から構成される。角化細胞が有棘層および顆粒層を通って上に移動するに従い、角化細胞は分化して、ケラチンおよび微小繊維および微小管からなる堅い内部構造体が形成される。表皮内において、バリア機能は典型的には角質層によって行われ、そしてコルネオデスモソームによる媒介（ＭｅｎｔｏｎおよびＥｌｉｓｅｎ、１９７１；ＣｈａｐｍａｎおよびＷａｌｓｈ、１９９０；Ｎｏｒｔｈら、１９９９）によりもたらされる角質細胞間の強い接着に依存している（Ｅｇｅｌｒｕｄ、２０００）。
【００５２】
角質層は、核を失っている平坦化した死細胞の層から構成され、その間には、脂質およびタンパク質の複雑な混合物が存在する。角質層は、成長可能な表皮における角化細胞の増殖および分化によって絶えず置き換えられているバリアである。一定した角質層厚を特定の身体部位において維持するために、角質層の表面部分は、その産生を平衡させる速度での落屑プロセスで絶えず生え替わらなければならない。
【００５３】
従って、表皮の「バリア機能」または「表皮バリア機能」は、これらの用語が本明細書中で使用されるとき、外部因子の侵入を阻止する表皮層の能力を示すことが意図される。従って、本発明の方法および組成物は、個体の表皮バリア機能を調節することによって作用する。詳細には、本明細に記載される方法および組成物は、疾患を処置および／または診断するために使用することができ、この場合、そのような疾患に罹患している個体における表皮バリアが調節され、すなわち、正常な個体における表皮バリアと比較したとき、増強されるか、または弱められる。
【００５４】
バリア機能の測定は様々な方法で行うことができる。例えば、Ｆｒａｎｚチャンバー／カダベルシステム（これはまたＦｒａｎｚチャンバー浸透システムとして知られている）を使用することができる。このシステムは、バリアを通過する物質を測定することによってバリア機能を測定し、従って、測定条件の影響を受けにくい（ｒｏｂｕｓｔ）迅速かつ容易なシステムであるという点で利点を有している。
【００５５】
損なわれたバリア機能
損なわれたバリア機能は、下記に詳しく記載される第Ｉ群疾患の特徴である。
【００５６】
表皮は、外部因子に対する透過性が、同じ人または別人に由来する正常な健全な表皮よりも大きいとき、バリア機能が損なわれている。従って、バリア機能が損なわれた表皮は、そうでない場合よりも大きい外部因子の浸透を許す。好ましくは、バリア機能が損なわれた表皮は、外部因子に対する透過性が、正常な表皮よりも２０％以上大きく、または４０％以上大きく、または６０％以上大きく、または８０％以上大きく、または１００％以上大きい。好ましくは、正常な表皮バリアを実質的に横断することができない分子が、バリア機能が損なわれた表皮のバリアを横断することができる。
【００５７】
浸透または透過性の増大は、好ましくは、因子または薬物の量の増大、表皮層を通過することができる因子または薬物の活性（関連する化学的活性、生物学的活性または酵素活性など）の増大によって反映される。例えば、従って、バリア機能が損なわれた表皮は、好ましくは、正常な表皮の５％以上または１０％以上または２０％以上または３０％以上または４０％以上または５０％以上または６０％以上または７０％以上または８０％以上または９０％以上または１００％以上の、因子または薬物の浸透を可能にする。
【００５８】
透過性または浸透の増大はまた、遅れる分子と比較して通過する分子の増大した比率、あるいは添加された分子と比較したときの通過する分子の増大した比率によって反映される場合がある。この比率Ｎは、本明細書に記載されるような方法および組成物によって５％または１０％または２０％または３０％または４０％または５０％または６０％または７０％または８０％または９０％または１００％またはそれよりも大きく増大させることができる。
【００５９】
表皮バリア機能の測定は様々な方法で行うことができる。同様に、因子または組成物が浸透するレベルまたは程度は、当業者に知られている様々な技術によって測定することができる。例えば、活性な化合物またはトレーサー化合物を放射能標識し、その後、皮膚によって吸収された放射能標識化合物の量を測定することにより、当業者は、試験化合物の皮膚浸透を測定するいくつかの方法のいずれかを使用して、吸収された組成物のレベルを決定することができる。皮膚の層を横断する放射能標識化合物の量の測定もまた行うことができる。
【００６０】
好ましい実施形態において、Ｆｒａｎｚチャンバー／カダベルシステム（これはまたＦｒａｎｚチャンバー浸透システムとして知られている）が、因子の浸透を測定するために使用される。このシステムでは、バリア機能が、皮膚片を通って受容液に至る放射能標識化合物の量の測定を可能にすることによって測定される。Ｆｒａｎｚチャンバーは、実験条件の影響を受けにくい迅速かつ容易なシステムであるという点で利点を有しており、下記においてより詳しく記載される。
【００６１】
増強されたバリア機能
バリア機能が増大している表皮は、外部因子に対する透過性が、同じ人または他人に由来する正常な健全な表皮よりも低い。
【００６２】
表皮は、外部因子に対する透過性が、同じ人または他人に由来する正常な健全な表皮よりも低いとき、増大または増強されたバリア機能を有する。従って、バリア機能が損なわれている表皮は、そうでない場合よりも小さい外部因子の浸透を許す。好ましくは、そのような表皮は、外部因子に対する透過性が正常な表皮の９０％または８０％または７０％または６０％または４０％または２０％または１０％または５％またはそれ以下である透過性を有する。好ましくは、正常なバリア機能を有する表皮を横断することができる分子は、バリア機能が増大または増強されている表皮を実質的に横断することができない。
【００６３】
浸透または透過性の低下は、好ましくは、因子または薬物の量の低下、表皮層を通過することができる因子または薬物の活性（関連する化学的活性、生物学的活性または酵素活性など）の低下によって反映される。例えば、従って、バリア機能が増強された表皮は、好ましくは、正常な表皮の９０％以下、より好ましくは８０％以下、より好ましくは７０％以下、より好ましくは６０％以下、より好ましくは５０％以下、より好ましくは４０％以下、より好ましくは３０％以下、より好ましくは２０％以下、より好ましくは１０％以下、最も好ましくは５％以下の、因子または薬物の浸透を可能にする。
【００６４】
透過性または浸透の低下はまた、遅れる分子と比較して通過する分子の低下した比率、あるいは添加された分子と比較したときの通過する分子の低下した比率によって反映される場合がある。この比率Ｎは、本明細書に記載されるような方法および組成物によって５％または１０％または２０％または３０％または４０％または５０％または６０％または７０％または８０％または９０％または１００％またはそれよりも大きく低下させることができる。
【００６５】
第Ｉ群疾患：低下した細胞−細胞接着との関連
１つの実施形態において、本明細書に開示される方法は、特に上皮細胞（特に角質細胞）の低下した細胞−細胞接着に関連する疾患の処置および診断に好適である。そのような疾患は、本明細書中では、「第Ｉ群疾患」として示され、従って、損なわれたバリア機能または低下したバリア機能の疾患である。
【００６６】
第Ｉ群疾患には、３つのサブグループを認めることができる。それぞれのグループにおいて、損なわれたバリア機能により、上皮バリアを通る異物の侵入が可能になっている。異物が上皮バリアを通って侵入すると、異物は宿主細胞と相互作用して、疾患表現型をもたらす。
【００６７】
第Ｉ群疾患の第１のサブグループ（サブグループ１．１）は、刺激物またはアレルゲンまたは他の異物の侵入を許す損なわれたバリアを特徴とする。これらの異物は身体の免疫系と相互作用して、異常な炎症性応答を生じさせ、これが次に組織の破壊をもたらす。異物に対する免疫応答は、関連する遺伝的素因の結果として増強されることがある。皮膚を冒すそのような疾患の例には、アトピー性湿疹、脂漏性湿疹、刺激性接触皮膚炎、およびアレルギー性接触皮膚炎が含まれる。肺を冒すそのような疾患の例には、アトピー性喘息、ウイルス感染後喘息／気管支反応亢進、および慢性閉塞性肺疾患が含まれる。腸を冒すそのような疾患の例には、クローン病、潰瘍性大腸炎、セリアック病、および消化性潰瘍化が含まれる。
【００６８】
第Ｉ群疾患の第２のサブグループ（サブグループ１．２）は、細菌、ウイルス、他の微生物、または微生物生成物（例えば、スーパー抗原性の外毒素）の侵入を許す損なわれたバリアを特徴とする。その場合、微生物および／または微生物生成物により疾患プロセスがもたらされる。そのような疾患の例には、アトピー性湿疹、接触性皮膚炎、膿痂疹、ウイルス性いぼ、伝染性軟属腫、髄膜炎（細菌性およびウイルス性）、ヘリコバクター・ピロリの侵入によって引き起こされるか、またはヘリコバクター・ピロリの侵入に関連する消化性潰瘍化が含まれる。
【００６９】
第Ｉ群疾患の第３のサブグループ（サブグループ１．３）は、発ガン物質の侵入を許す損なわれたバリアを特徴とする。発ガン物質は、それにより、上皮幹細胞集団に到達することができ、形質転換を誘導することができる。発ガン物質は、他の環境因子（例えば、紫外線）と一緒に発ガン補助物質として作用する場合がある。皮膚を冒すそのような疾患の例には、黒色腫、扁平上皮ガン、基底細胞ガン、皮膚型リンパ腫、および他の皮膚ガンが含まれる。腸を冒すそのような疾患の例には、胃腸管全体の悪性腫瘍が含まれる。肺悪性腫瘍は、肺を冒す疾患の例である。
【００７０】
第Ｉ群疾患の処置
本明細書に記載される方法および組成物によれば、第Ｉ群疾患は、皮膚における上皮細胞間（例えば、角質細胞間）の低下した接着から生じる。これは、上皮細胞間の接着を調節するか、または上皮細胞間の接着を担う接着タンパク質（例えば、コルネオデスモシン）の発現および／または活性および／または分解における変化の結果として、ならびに／あるいは接着タンパク質を分解するプロテアーゼの発現および／または活性および／または分解における変化の結果として、ならびに／あるいは接着タンパク質を分解するプロテアーゼの阻害剤の発現および／または活性および／または分解における変化の結果として生じ得る。本発明者らは、上記のいずれか、または一部、またはすべてにおける変化が角質細胞などの上皮細胞間の低下した接着をもたらし得ることを発見した。
【００７１】
一例として、遺伝的変異の結果としてその構造が変化している接着タンパク質は、接着活性が低下している場合があり、かつ／またはタンパク質分解酵素（プロテアーゼ）による分解をより受けやすくなっている場合がある。そのため、従って、第Ｉ群疾患の処置は、接着タンパク質（例えば、コルネオデスモシン）の発現を増大させることによって達成することができる。あるいは、または組合せにおいて、処置は、接着タンパク質の接着活性および／またはプロテアーゼ抵抗性を増強することによって達成することができる。従って、低下した細胞−細胞接着の原因となる接着タンパク質は、別の接着タンパク質で代用することができ、または接着活性および／もしくはプロテアーゼ抵抗性が増強された最初の接着タンパク質の変化体で代用することができ、あるいは別の接着タンパク質を補充することができ、または接着活性および／もしくはプロテアーゼ抵抗性が増強された最初の接着タンパク質の変化体を補充することができる。
【００７２】
さらに、プロテアーゼの量および／または活性および／または生物利用性の増大は、接着タンパク質の増大した分解を生じさせることがある。そのため、従って、第Ｉ群疾患は、接着タンパク質を分解することに関わるプロテアーゼの発現および／または活性を低下させることによって処置することができる。例えば、そのようなプロテアーゼの転写および／または翻訳を、第Ｉ群疾患を処置するための手段としてダウンレギュレーションすることができる。従って、ＳＣＣＥおよびＳＣＴＥなどのプロテアーゼの発現を、第Ｉ群疾患を処置するために、転写レベルおよび／または翻訳レベルで低下させることができる。
【００７３】
低下した細胞−細胞接着の結果としての損なわれたバリア機能はまた、接着タンパク質を分解するプロテアーゼの阻害剤の量および／または活性および／または生物利用性が低下した場合にも生じ得る。従って、上記の変化のいずれか、またはいくつか、またはすべての組合せは、細胞−細胞接着のより大きい低下および損なわれたバリア機能をもたらし得る。
【００７４】
従って、接着タンパク質を分解し得るプロテアーゼ活性を阻害することができるプロテアーゼ阻害剤の発現および／または活性を、第Ｉ群疾患を処置するための手段としてアップレギュレーションすることができる。その発現および／または活性がアップレギュレーションされるプロテアーゼ阻害剤は、問題としているプロテアーゼ（すなわち、接着タンパク質のタンパク質分解を関わるプロテアーゼ）を生理学的に阻害する天然のプロテアーゼ阻害剤であり得る。そのようなプロテアーゼ阻害剤は、本明細書では「一次」プロテアーゼ阻害剤として示される。従って、本発明者らは、ＳＣＣＥおよびＳＣＴＥなどのプロテアーゼの活性を低下させるためにプロテアーゼ阻害剤（例えば、ＳＫＡＬＰおよびＳＬＰＩ）の転写および／または翻訳を活性化することによって第Ｉ群疾患を処置する方法を提供する。さらに、二次プロテアーゼ阻害剤（すなわち、プロテアーゼ活性の生理学的調節に通常の場合には関与していないプロテアーゼ阻害剤）もまた、一次プロテアーゼ阻害剤の活性を補充および／または代替するために使用することができる。
【００７５】
さらに、本明細書に記載される方法および組成物は、第Ｉ群疾患に罹患している個体または第Ｉ群疾患に罹患する可能性を有する個体にプロテアーゼ阻害剤またはプロテアーゼ阻害剤のフラグメントを投与することを含む。プロテアーゼ阻害剤および／またはフラグメントは天然ペプチドまたは合成ペプチドの形態で投与することができる。好ましくは、ペプチドはプロテアーゼ阻害剤の活性な部分を含む。好ましくは、ペプチドは、１つまたは複数のプロテアーゼ活性を阻害することができる。好適なペプチドは、分泌型ロイコプロテアーゼ阻害剤（ＳＬＰＩ）、エラフィンプロテアーゼ阻害剤３（ＰＩ３もしくはＳＫＡＬＰ）またはシスタチンＡ（ＣＳＴＡ）を含む任意のプロテアーゼ阻害剤に対して設計することができる。
【００７６】
好ましくは、ペプチドは、ＣＧＫＳ（ＳＢ７ａ）およびＣＧＫＳＣＶＳＰＶＫＡ（ＳＢ７ｂ）、ＫＩＩＤＧＡ、ＧＤＫＩＩＤＧＡ、ＧＤＫＩＩＤ、ＫＩＩ、ＫＩＩＤ、ＫＩＩＤＧ、ＫＩＩＤＧＡ、ＬＤＰＶＤ（６５１）、ＫＲＤＬＫ（６５２）、ＬＤＰＶＤＴＰＮＰ（６５３）、ＬＤＰＶＤＴＰＮＰＴＲＲＫＰＧ（６５４）、ＣＧＫＳＣＶＳＰＶＫＡ（６４４）、ＣＶＳＰＶＫＡ（６４３）からなる群から選択される。好ましい実施形態において、ペプチドはペプチド６４３またはペプチド６５１またはペプチド６５３を含む。
【００７７】
さらに、角質層キモトリプシン様酵素／トリプシン様酵素などのプロテアーゼの天然阻害剤が活性において不完全であるか、または低下していることが見出される場合、これらは、この分野で知られているようなキモトリプシン、ダイズトリプシン阻害剤、カテプシンＧまたは他のプロテアーゼ阻害剤などの二次プロテアーゼ阻害剤により代替または補充することができる。一次プロテアーゼ阻害剤には、抗ロイコプロテアーゼおよびエラフィンが含まれる。そのような一次プロテアーゼ阻害剤および／または二次プロテアーゼ阻害剤は、より詳しくは下記に記載されるような薬学的組成物の形態で、全身的に、または好ましくは上皮表面に適用することができる。
【００７８】
皮膚を例として使用すると、プロテアーゼ阻害剤を上皮表面に適用することができ、この場合、プロテアーゼ阻害剤は、例えば、角質層キモトリプシン酵素に対して拮抗する。そのようなプロテアーゼ阻害剤は皮膚軟化剤基剤に配合することができる。プロテアーゼ阻害剤は、コルネオデスモシンなどの接着タンパク質の分解を阻害し、その結果として、角質細胞間の密着を増大させ、表皮バリアの構造および／または抵抗性を改善する。
【００７９】
プロテアーゼ阻害剤をコードする１つ以上の遺伝子の発現は、プロテアーゼ阻害剤が一次プロテアーゼ阻害剤または二次プロテアーゼ阻害剤であるとしても、プロテアーゼ阻害剤の活性を増大させるために使用することができる。例えば、本発明者らは、プロテアーゼ阻害剤の活性を増大させて接着タンパク質のタンパク質分解を低下させるために、例えば、キモトリプシン、ダイズトリプシン阻害剤、カテプシンＧまたは他のプロテアーゼ阻害剤を発現する発現ベクターの皮下注射（またはそれ以外の注射）を提供する。さらに、上記に示されるように、一次プロテアーゼ阻害剤の内因性産生を、この分野で知られている手段によって、関連するプロテアーゼ阻害剤遺伝子の転写および／または翻訳をアップレギュレーションすることによって増強することができる。
【００８０】
さらに、本発明者らは、第Ｉ群疾患を処置するために、上皮タンパク質もしくはデスモソームタンパク質の病原性形態の不活性化、および／または上皮タンパク質もしくはデスモソームタンパク質の非病原性形態の活性化を提供する。従って、ヘテロ接合性患者において、デスモソームタンパク質（例えば、コルネオデスモシン）の非病原性形態の発現を、この分野で知られている手段によってアップレギュレーションすることができる。あるいは、または組み合わせて、デスモソームタンパク質（例えば、コルネオデスモシン）の病原性形態の発現を、この分野で知られている手段によってダウンレギュレーションすることができる。そのようなタンパク質の病原性形態および非病原性形態は、遺伝子分析およびタンパク質分解プロフィルなどの、そして下記に詳しく記載されるようなこの分野で知られている手段によって同定することができる。
【００８１】
第Ｉ群疾患の診断
接着タンパク質および／またはプロテアーゼおよび／またはプロテアーゼ阻害剤における変異は第Ｉ群疾患に関連する。そのような変異は実施例Ａ１〜Ａ６および実施例Ｂ１〜Ｂ６に開示される。これらの変異のいずれかを、第Ｉ群疾患を診断するために、関連する遺伝子または核酸またはポリペプチドにおいて検出することができる。
【００８２】
第ＩＩ群疾患：増大した細胞−細胞接着との関連
別の実施形態において、本明細書に開示される方法および組成物は、上皮細胞（特に角質細胞）の増大した細胞−細胞接着を特徴とする疾患の処置および診断に好適である。そのような疾患は、本明細書中では第２群疾患として示される。従って、第２群疾患は、増大または増強されたバリア機能の疾患である。
【００８３】
第ＩＩ群疾患
第２群疾患の例には、乾癬、魚鱗癬、尋常性ざ瘡および毛孔性角化症が含まれる。
【００８４】
第２群疾患は、皮膚における上皮細胞間（例えば、角質細胞間）の増大した接着から生じ得る。増大した接触は角質層の増大した厚さをもたらす。例えば、乾癬および魚鱗癬では、角質層の全身性の肥厚が存在する。ざ瘡では、入口から毛嚢脂腺管における角質層の局所化された限局的肥厚が存在する。
【００８５】
増大した接着は、上皮細胞間の接着を調節するか、または上皮細胞間の接着を担う接着タンパク質（例えば、コルネオデスモシン）の発現および／または活性および／または分解における変化の結果として、ならびに／あるいは接着タンパク質を分解するプロテアーゼの発現および／または活性および／または分解における変化の結果として、ならびに／あるいは接着タンパク質を分解するプロテアーゼの阻害剤の発現および／または活性および／または分解における変化の結果として生じ得る。本発明者らは、上記のいずれか、または一部、またはすべてにおける変化が角質細胞などの上皮細胞間の増大した接着をもたらし得ることを発見した。
【００８６】
一例として、遺伝的変異の結果としてその構造が変化している接着タンパク質は、より接着的になっている場合があり、かつ／またはタンパク質分解酵素（プロテアーゼ）による分解をより受けなくなっている場合がある。そのため、従って、本明細書に記載される方法および組成物は、増強された接着活性を有する変異接着タンパク質の活性および／または発現をダウンレギュレーションすることによって第２群疾患を処置するために使用することができる。従って、低下したタンパク質分解的分解に関連するコルネオデスモシンの病原性形態をこの分野で知られている方法によって同定することができる。これらは、病変層エンベロープの表面層におけるコルネオデスモシンタンパク質の全長形態（５２〜５６ｋＤａ）に対応し得る。コルネオデスモシンの病原性形態は、正常皮膚および病変皮膚から得られるタンパク質分解プロフィルを比較することによって同定することができる。例えば、皮膚ストリップからのタンパク質抽出物を使用し、そしてコルネオデスモシンを認識する抗体を用いてプローブされるウエスタンブロットを使用することができる。コルネオデスモシンタンパク質の病原性形態はまた、ケースコントロール研究および伝達非平衡研究（ＴＤＴ、実施例を参照のこと）を使用する遺伝子分析によって同定することができる。例えば、乾癬では、最も可能性のある病原性形態は、ＣＤ２ハプロタイプによりコードされる形態である（Ｊｅｎｉｓｃｈら、１９９９）。そのような病原性形態の転写を転写レベルおよび／または翻訳レベルで阻止することができる。コルネオデスモシンの病原性形態についてヘテロ接合性の患者は、このタンパク質の非病原性形態をコードする代わりの対立遺伝子を活性化することによって処置することができる。
【００８７】
さらに、プロテアーゼの量および／または活性および／または生物利用性の低下は、接着タンパク質の低下した分解を生じさせることがある。そのため、従って、第２群疾患は、接着タンパク質を分解することに関わるプロテアーゼの発現および／または活性を増大させることによって処置することができる。例えば、そのようなプロテアーゼの転写および／または翻訳を、第２群疾患を処置する手段としてアップレギュレーションすることができる。
【００８８】
増大した細胞−細胞接着は、接着タンパク質を分解するプロテアーゼの阻害剤の量および／または活性および／または生物利用性が増大した場合に生じることがある。従って、上記の変化のいずれか、またはいくつか、またはすべての組合せは、細胞−細胞接着の増大をもたらし得る。
【００８９】
従って、接着タンパク質を分解し得るプロテアーゼ活性を阻害することができるプロテアーゼ阻害剤の発現および／または活性を、第１群疾患を処置するための手段としてダウンレギュレーションすることができる。その発現および／または活性がダウンレギュレーションされるプロテアーゼ阻害剤は、典型的には、問題としているプロテアーゼ（すなわち、接着タンパク質のタンパク質分解を関わるプロテアーゼ）を阻害する天然のプロテアーゼ阻害剤である。そのようなプロテアーゼ阻害剤は、本明細書では「一次」プロテアーゼ阻害剤として示される。プロテアーゼ阻害剤の発現は転写レベルおよび／または翻訳レベルで達成することができる。
【００９０】
乾癬
本明細書に記載される組成物および方法は、乾癬の症状を処置または緩和するために好適であり、本発明者らはさらに乾癬の診断方法を提供する。
【００９１】
乾癬は、銀のような白色鱗片で覆われた炎症化した膨潤皮膚病変として発現する。乾癬の特徴には、膿様水疱（膿疱性乾癬）、皮膚の重症な剥脱（紅皮性乾癬）、滴様の斑点（滴状乾癬）、および平坦な炎症化病変（逆（ｉｎｖｅｒｓｅ）乾癬）が含まれる。
【００９２】
乾癬の原因は現在不明であるが、遺伝的成分を伴う自己免疫皮膚障害として明らかにされている。３人に１人の割合で乾癬の家族歴が報告されるが、遺伝パターンは存在しない。しかし、この疾患の明かな家族歴を有しない小児が乾癬を発症する症例が多く存在する。人が実際に乾癬を発症するかどうかは、敗血性咽頭炎などの全身的感染症、皮膚に対する傷害（ケブネル現象）、予防接種、ある種の医薬品、および筋肉内注射または経口ステロイド医薬品を含む「トリガー因子」に依存し得る。乾癬を発症させる人の遺伝的傾向の引き金が何かによって引かれると、次に免疫系が過度の皮膚細胞再生産を開始させると考えられている。
【００９３】
皮膚細胞は、通常の増殖または外傷治癒の２つの考えられるプログラムに従うようにプログラムされている。通常の増殖パターンでは、皮膚細胞は基底細胞層で作られ、その後、表皮を通って角質層（皮膚の最外層）に上がっていく。この通常のプロセスは細胞の誕生から死まで約２８日かかる。皮膚が傷ついたとき、外傷治癒プロセス（再生的成熟化）が開始され、この場合には、細胞がはるかにより早い速度で産生され、血液供給が増大し、そして局所的な炎症が生じる。病変的乾癬は、代わりの増殖プログラムでの細胞増殖を特徴とする。皮膚細胞（角化細胞）は通常の増殖プログラムから再生的成熟化に切り替わり、細胞が作られ、そして２日〜４日もの短期間で表面に押し出され、従って、皮膚は十分にしっかり細胞を生え替えることができない。過度の皮膚細胞は積み重なり、隆起した鱗片状病変を形成する。病変部を通常覆う白色の鱗片（「斑」）は、死んだ皮膚細胞から構成されるが、病変部の赤みが、迅速に分裂している皮膚細胞の領域に対する増大した血液供給によって生じる。
【００９４】
乾癬は、２つの生物学的特徴を特徴とする、皮膚の遺伝的に決定される疾患である。第１に、促進され、かつ不完全な分化に関連する顕著な表皮の過増殖が存在する。第２に、Ｔリンパ球の増大した補充を伴う表皮および真皮の両方の著しい炎症が存在し、そして場合により、好中球の微小膿瘍が形成される。乾癬の多くの病理学的特徴は、表皮角化細胞の増殖および成熟化における変化が、表皮細胞の増大した増殖を伴って、０．２ｍｍの皮膚表面内に生じるためであると考えることができる。乾癬の病因に対する従来の調査は表皮の増大した増殖および過形成に集中している。正常な皮膚では、細胞が基底層から顆粒層を通って移動する時間は４週間〜５週間である。乾癬病変では、この時間は、短くなった細胞サイクル時間のために、そして増殖し得る細胞の絶対数が増大しているために、そして実際に分裂している細胞の割合が増大しているために１／７〜１／１０（sevenfold to tenfold）に低下する。このような過増殖現象はまた、実質的にはより小さい程度であるが、乾癬患者の臨床的に関与しない皮膚においても現れる。
【００９５】
乾癬、尋常性乾癬の共通する形態は、厚い銀色の鱗片によって覆われる、境界が十分に明確である紅斑性の斑を特徴とする。特徴的な知見は、新しい乾癬病変が皮膚外傷部位において生じる同形応答（ケブネル現象）である。
【００９６】
病変は四肢の伸筋表面に局在化することが多いが、爪および頭皮もまた一般には関わる。あまり一般的でない形態には、滴状乾癬（敗血性咽頭炎の後に始まることが多い、この疾患の一形態）、および膿疱性乾癬（これは、掌および足裏におけるか、または身体中に広がる、直径が２〜５ｍｍであることが多い無数の無菌の膿疱を特徴とする）が含まれる。
【００９７】
乾癬患者の処置の効果を明らかにするために用いられる客観的方法には、目視モニタリングおよび写真撮影による斑の消散が含まれる。目視スコア化は、ＰＡＳＩ（乾癬面積および重篤度指数）スコアを使用して行われる（Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋｓｓｏｎ，Ａ．Ｊ．、Ｐｅｔｅｒｓｓｏｎｎ，ＢＣ、Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｉｅｓ、１５７：２３８〜２４４（１９７８）を参照のこと）。
【００９８】
乾癬には、英国人口の約２％が罹患しており、そして関節炎（７％〜２５％で）およびクローン病が関連する。個人の自己秘密および社会的活動に対する影響は悲惨になり得る。現在、乾癬に対する治療は抑制的でしかなく、全身処置は著しい有害作用を有している。乾癬は多因子性疾患であり、ゲノムワイドスキャンにより、６ｐ２１、１ｑ２１、４ｑ、１９ｐおよび１７ｑを含むいくつかの染色体に対する著しい連鎖が明らかにされている。６ｐ２１において、最も強い連関が主要組織適合性領域（ＭＨＣ）に関して存在する。ＭＨＣのＳ遺伝子（コルネオデスモシン）がＨＬＡ−Ｃの１６０ｋｂテロメア側に存在し、コルネオデスモソームの一成分として角化細胞分化の際に発現している。
【００９９】
ざ瘡
本明細書に記載される方法および組成物はまた、ざ瘡を処置および／または診断するために好適である。
【０１００】
ざ瘡には多くの患者が罹患しており、ざ瘡は、通常の場合には顔に局在化する一般的な炎症性の皮膚障害である。幸運なことに、この疾患は通常的に消散し、そして発症と消散との間の数ヶ月または数年の間隔で、治療は、治癒的ではないが、患者の大部分においてこの疾患を抑制することに成功することができる。
【０１０１】
重症な疾患を有する少数のざ瘡患者は、高用量で経口投与されるテトラサイクリン、ダプソーン、プレドニゾン、そして女性の場合にはエストロゲンの使用を含む集中的な治療活動に対する応答をほとんど示さない。多くの場合、これらの薬物は適度な抑制をもたらすだけであり、その一方で、これらの薬剤の副作用により、それらの有用性がひどく制限されている。小結節嚢胞性ざ瘡の患者は、顔に現れ、そして背中および胸に頻繁に現れる大きい炎症性の化膿性小結節に苦しんでいる。その出現に加えて、病変部はさわると痛く、そして多くの場合には化膿性の滲出性で出血性である。外観を損なう瘢痕が避けられないことが多い。
【０１０２】
ざ瘡に対する治療には、レチノイドの局所的投与および全身投与が伴う。ａｌｌ−ｔｒａｎｓ−レチノイン酸（トレチノイン）の局所適用が、特にコメドおよびにきびに対して試みられており、ある程度の成功を得ているが、この状態は、処置を中断したとき、元に戻ることが多い。
【０１０３】
ざ瘡は、思春期の１５％が臨床的が罹患し、８５％が生理学的に罹患する非常に一般的な皮膚障害の１つである（主ざ瘡（ａｃｎｅ  ｍａｊｏｒ））。主ざ瘡患者の１５％では、治療を必要とする病変が２５歳まで持続する。ざ瘡は、４つの主要な病因的因子が存在する毛嚢性脂腺小胞を冒す疾患である。増大した皮脂産生、毛嚢性脂腺管の過角質化、異常な細菌機能、および炎症の生成（Ｃｕｎｌｉｆｆｅ、１９８９）。軽度のざ瘡は大きい心理的影響を有し得るが、重症なざ瘡では、うつ病、そしてさらには自殺さえ生じさせることがある。失業が、一致したコントロールにおける９．２５％と比較して、ざ瘡患者では１６．５％にまで増大している。ざ瘡に対する現在の治療に関しては様々な問題がある。抗生物質に対する抵抗性の増大、および催奇性を含む経口イソトレチノインに由来する大きい有害作用、骨増殖の阻害および高脂血症。ざ瘡の処置は、皮膚科診療所において認められる新しい患者の６％〜１０％である。
【０１０４】
接着タンパク質
用語「接着タンパク質」が本明細書中で使用される場合、これは、細胞間の接着を媒介する任意のタンパク質またはポリペプチドまたはペプチドに対する参照として理解しなければならない。従って、「接着タンパク質」には、細胞−細胞接着に関与する任意のタンパク質が含まれる。
【０１０５】
好ましくは、接着タンパク質は上皮細胞間の細胞−細胞接着を媒介する。すなわち、接着タンパク質は上皮細胞接着タンパク質である。好ましくは、接着タンパク質は表皮細胞間の細胞−細胞接着を媒介する。より好ましくは、接着タンパク質は角質細胞間の細胞−細胞相互作用を媒介する。好ましくは、接着タンパク質はコルネオデスモソームに存在する。最も好ましくは、接着タンパク質はデスモソームタンパク質またはコルネオデスモソームタンパク質である。
【０１０６】
接着タンパク質は、好適には、表Ｄ２．１および表Ｄ５．１に示される接着タンパク質からなる群から選択され得る。好ましくは、接着タンパク質は、コルネオデスモシン（ＡＦ０３０１３０）、デソプラキン（ＸＭ＿００４４６３）、プラコグロビン（ＮＭ＿００２２３０；ＮＭ＿０２１９９１）、デスモグレイン１（ＸＭ＿００８８１０）、デスモコリン１（ＭＸ＿００８６８７）、エンボプラキン（ＸＭ＿００８１３５；Ｕ７２５４３）、プレクチン１（ＮＭ０００４４５）、Ｓ１００Ａ２（ＡＩ５３９４３９；Ｍ８７０６８）、ケラチン６Ａ（Ｌ４２６１１）、ケラチン１７（Ｚ１９５７４）、Ｓ１００Ａ８（ＡＩ１２６１３４）、Ｓ１００Ａ７（ＡＡ５８６８９４）、Ｓ１００Ａ９（ＧＢ：Ｗ７２４２４）、ＳＰＲＲ２Ａ（ＧＢ：Ｍ２１３０２）、ＳＰＲＲ１Ｂ（Ｍ１９８８８）、ＳＰＲＫ（ＡＩ９２３９８４）、ＨＣＲ（ＢＡＡ８１８９０）、ＳＥＥＫ１（ＢＡＡ８８１３０）、ＳＰＲ１（ＢＡＢ６３３１５）、ＳＴＧ（ＢＡＡ８８１３２）、インボルクリン（ＮＭ＿００５５４７）、アネキシンＡ１／リポコルチン（Ｘ０５９０８）、ＶＩ型コラーゲンα３（ＣＯＬ６Ａ３）（ＮＭ＿００４３６９）、トリコヒアリン（ＮＭ＿００５５４７）およびロリクリン（ＸＭ＿０４８９０２）からなる群から選択される。ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号が括弧内に示される。
【０１０７】
特に好ましい接着タンパク質は、デスモソームタンパク質、すなわち、コルネオデスモシン（これはまたＳとして知られている；ＡＦ０３０１３０）、デスモグレイン１（ＸＭ＿００８８１０）、デスモコリン１（ＭＸ＿００８６８７）、デスモプラキンＩおよびＩＩ（ＸＭ＿００４４６３）、プラコグロビン（これはまたＰＧとして知られている；ＮＭ＿００２２３０）、およびプラコフィリン（これはまたＰＰとして知られている）のいずれかを含む。
【０１０８】
非常に好ましい接着タンパク質には、コルネオデスモシン、デスモグレインＩ、デスモグレイン３、プラコグロビン、デスモプラキン、デスモコリンＩ、エンボプラキン、プロリンリッチタンパク質、好ましくは小さいプロリンリッチタンパク質（ＳＰＲＲ）、ＳＰＲＲ２Ａ、ＳＰＲＲ１Ｂ、ＳＰＲＫ、ＳＰＲＲ２Ｅ、ＳＰＲＲ２Ｆ、ＳＰＲＲ２Ｂ、ＳＰＲＲ２Ｄ、ＳＰＲＲ２Ｃ、ＳＰＲＲ２Ｇ、ＳＰＲＲ１Ａ、ＳＰＲＲ３、ＳＰＲＲ４、インボルクリンまたはロリクリンが含まれる。
【０１０９】
表皮細胞間の増大した接着もしくは低下した接着をもたらすか、またはそのような接着に関連する上記接着タンパク質のいずれかにおける変異および多型を、実施例において詳しく記載される方法によって検出することができる。そのような変化は、皮膚疾患またはそのような疾患に対する感受性を同定または診断するための手段として検出することができる。
【０１１０】
コルネオデスモシン
接着タンパク質における変異は、皮膚疾患またはそのような疾患に対する感受性を診断するための手段として検出することができる。非常に好ましい実施形態において、接着タンパク質はコルネオデスモシンである。
【０１１１】
コルネオデスモシン遺伝子は非常に多型である。今日まで、１９個の変化体が文献に記載されている（Ｋａｓａｈａｒａら、１９９６；Ｊｅｎｉｓｃｈら、１９９９）。これらの多型は、突発的ではなく非常に保存されており、従って、本発明者らは、これらの多型が脊椎動物の進化時に選択されてきたと考えている。皮膚のバリア機能のために、強い抵抗性および／または動的機能を皮膚に与えるコルネオデスモシンのいくつかの形態が選択されている。強い連関が、＋１２４３位におけるコルネオデスモシン変化体と慢性的な斑乾癬との間に示されている（Ｔａｚｉ−Ａｈｎｉｎｉら、１９９９ｂ）。この連関は、滴状乾癬ではさらに強くなっている（Ｔａｚｉ−Ａｈｎｉｎｉら、１９９９ｂ）。＋１２４３位における置換はアミノ酸変化Ｌ３９４Ｓをもたらす。本発明者らは、この置換がコルネオデスモシンのプロセシングを妨げ、従って、落屑の崩壊の一因であると考えている。本発明者らは、アミノ酸変化をもたらす９個のコルネオデスモシン多型（Ｓｅｒ１４３／Ａｓｐ、Ｓｅｒ１５３／−、Ｌｅｕ１８０／Ｐｈｅ、Ｓｅｒ２０２／Ｐｈｅ、Ｓｅｒ４０１／Ｇｌｙ、Ｓｅｒ４０８／Ａｌａ、Ｇｌｙ４０９／Ｖａｌ、Ｓｅｒ４１０／Ｌｅｕ、Ａｓｐ５２７／Ａｓｎ）が角化細胞の成熟化および落屑のプロセスにおいて重要な機能を有することを見出した。これらの多型に対するスクリーニング方法が、Ｊｅｎｉｓｃｈら（１９９９）およびＧｕｅｒｒｉｎら（２０００）によって記載される。本発明者らは、強い関連性が、コルネオデスモシンのタンパク質分解プロセスと正常皮膚の感受性との間に、そしてまたバリア機能が乱れている、乾癬、ざ瘡、湿疹を含む様々な疾患に関して存在することを示している。
【０１１２】
本発明者らは、コルネオデスモシンにおける変異が皮膚疾患（特に、低下した接着の疾患）と関連することを実施例において示している。
【０１１３】
具体的には、本発明者らは、コルネオデスモシン配列（ＡＦ０３０１３０）の＋１２４３位におけるＴヌクレオチドが、低下した皮膚接着の疾患と関連することを実施例において示している。この位置におけるＴヌクレオチドの存在は、コードされるコルネオデスモシンポリペプチドの３９４位においてトレオニン（Ｔ）残基をもたらす。そのいずれかまたは両方の検出は、疾患を診断するために使用することができる。
【０１１４】
従って、本発明者らは、個体におけるコルネオデスモシン核酸の＋１２４３位におけるＴの存在を検出することによる、個体における低下した皮膚接着の疾患（第Ｉ群疾患）またはそのような疾患に対する感受性の診断を開示する。本発明者らはまた、個体におけるコルネオデスモシンポリペプチドの３９４位におけるトレオニン（Ｔ）残基を検出することによる、そのような疾患またはそのような疾患に対する感受性の診断を提供する。第Ｉ群疾患はまた、個体におけるＣＤ５コルネオデスモシン対立遺伝子またはＣＤ６コルネオデスモシン対立遺伝子を検出することによって診断することができる。ＣＤ５対立遺伝子およびＣＤ６対立遺伝子の配列はＪｅｎｉｓｃｈら（１９９９）に記載される。
【０１１５】
好ましくは、第Ｉ群疾患は湿疹または皮膚炎である。より好ましくは、第Ｉ群疾患はアトピー性湿疹または疱疹状皮膚炎である。第Ｉ群疾患の他の例が本明細書の別の節に示される。
【０１１６】
他の変異が、実施例では、コルネオデスモシン核酸の＋６１９位および＋１８０位において開示される。これらの変化および対応するポリペプチド変化を、第Ｉ群疾患または第ＩＩ群疾患を診断するために検出することができる。コルネオデスモシンを用いる他の診断法および処置法が実施例に開示される。
【０１１７】
プロテアーゼ
本明細書に記載される方法および組成物において使用され得るプロテアーゼには下記が含まれる。アポトーシス関連システインプロテアーゼ（ＣＡＳＰ１４）ｍＲＮＡ（ＮＭ＿０１２１１４）、トランスグルタミナーゼ１（ＴＧＭ１）（Ｍ９８４４７）、ＴＧＭ２（ＸＭ＿００９４８２）、ＴＧＭ４（ＸＭ＿０５６２０３）、ＴＧＭ５（ＸＭ＿００７５２９）、ＴＧＭ７（ＮＭ＿０５２９５５）、ＴＧＭ３（Ｌ１０３８６）、ホスホリパーゼＡ（２）（ＢＣ０１３３８４）、ＣＤ４７抗原（Ｘ６９３９８）、カリクレイン８（ＡＢ００８３９０）、ＡＤ０２４タンパク質（ＸＭ＿００２６４２）、ＳＣＣＥ（ＸＭ＿００９００２）、ディフェンシンβ２（ＡＦ０７１１２１６）、インターフェロンａ誘導性タンパク質２７（Ｘ６７３２５）、脂肪酸結合タンパク質ＦＡＢＰ５（Ｍ９４８５６）、ＳＣＴＥ（ＸＭ＿００９０００）、カリクレイン１（腎臓／膵臓／唾液性）（ＫＬＫ１）（ＸＭ＿０４７３００）、ヒトカリクレイン２（前立腺性）（ＫＬＫ２）（ＸＭ＿０３１７５７）、カリクレイン３（前立腺特異的抗原）（ＫＬＫ３）（ＸＭ＿０３１７６８）、カリクレイン６（ニューロシン、ザイム）（ＫＬＫ６）（ＸＭ＿０５５６５８）、カリクレイン４（プロスターゼ、エナメルマトリックス、前立腺）（ＫＬＫ４）（ＸＭ＿００８９９７）、膜型セリンプロテアーゼ１（ＡＦ１３３０８６）、ヒト皮膚コラゲナーゼ（Ｍ１３５０９）、コラゲナーゼＭＭＰ−１（ＬＯＣ１１６３８９）、コラゲナーゼＭＭＰ−１２（Ｕ７８０４５）、コラゲナーゼＭＭＰ−９（ＮＭ＿００４９９４）、コラゲナーゼＭＭＰ−３（Ｕ７８０４５）、コラゲナーゼＭＭＰ−２８（ＡＦ２１９６２４）、カスパーゼ７（ＢＣ０１５７９９）、カスパーゼ５（ＮＭ＿００４３４７）、カスパーゼ−１４（ＮＭ＿０１２１１４）、ユビキチン特異的プロテアーゼＵＳＰ−５（ＮＭ＿００３４８１）、ユビキチン特異的プロテアーゼＵＳＰ−１１（ＮＭ＿００４６５１）、ユビキチン特異的プロテアーゼＵＳＰ−６（ＮＭ＿００４５０５）、ユビキチン特異的プロテアーゼＵＳＰ２６（ＮＭ＿０３１９０７）、ユビキチン特異的プロテアーゼ（ＵＳＰ２８）（ＮＭ＿０２０８８６）、２６Ｓプロテアーゼサブユニット４、ＬＩＬＲＢ１（ＡＦ００４２３０）、転写のシグナル変換因子／活性化因子１（９１ｋＤａ）（ＳＴＡＴ１）（９７７９３５）、プロテアソーム（プロソーム、マクロパイン）サブユニット６（ＰＳＭＡ６）（Ｘ５９４１７）、ＴＰＳ１（ＮＭ＿００３２９３）、ＴＰＳＢ１（ＸＭ＿０１６２０４）、ＴＰＳＧ１（ＸＭ＿００８１２３）、プロテアーゼネキシン−ＩＩ（ＸＭ＿０４７７９３）、グリア由来ネキシン前駆体（Ｐ０７０９３）、２６Ｓプロテアーゼ調節サブユニットＳ１０Ｂ、およびＰＣＯＬＮ３（ＸＭ＿０４７５２４）。
【０１１８】
好ましくは、プロテアーゼは、接着タンパク質（好ましくは、コルネオデスモシンなどの表皮細胞−細胞接着タンパク質）のタンパク質分解に関与するプロテアーゼ、またはそのようなタンパク質分解を行うことができるプロテアーゼである。従って、好ましい実施形態において、プロテアーゼは、角質層キモトリプシン様酵素（ＳＣＣＥ）、角質層トリプシン様酵素（ＳＣＴＥ）、カリクレイン１、カリクレイン２、カリクレイン３、カリクレイン４、カリクレイン６およびカリクレイン８からなる群から選択されるプロテアーゼを含む。
【０１１９】
角質層キモトリプシン様酵素（ＳＣＣＥ）
角質層トリプシン様酵素（ＳＣＴＥ）
角質層キモトリプシン様酵素（ＳＣＣＥ）またはカリクレイン７（ＫＬＫ７）ならびに角質層トリプシン様酵素（ＳＣＴＥ）またはカリクレイン５（ＫＬＫ５）は大きいセリンプロテアーゼファミリーのメンバーである。それらの発現プロフィルの分析により、それらの皮膚特異性が示唆される。両方の酵素は、基底上部の角化細胞および小胞間の表皮において非常に発現し、そして角質層の生理学的ｐＨにおいて最大の活性を有する（Ｅｋｈｏｌｍら、２０００；Ｅｕｇｅｌｒｕｄ、１９９２；ＥｋｈｏｌｍおよびＥｕｇｅｌｒｕｄ、１９９８）。
【０１２０】
ＳＣＣＥおよびＳＣＴＥは角質化のときに角質層の細胞外空間に輸送される。ＳＣＣＥは不活性な前駆体として産生されるので、ＳＣＣＥにそのタンパク質分解活性を付与するために活性化酵素が必要である。ＳＣＴＥは、ＳＣＣＥの活性化に関与する酵素であると考えられる。ＳＣＣＥおよびＳＣＴＥを含むカリクレイン遺伝子クラスターが染色体１９ｑ１３．３−１３．４にマッピングされている。これには、少なくとも６つの構造的および進化的に関連するメンバーが含まれる（ＫＬＫ１、ＫＬＫ２、ＫＬＫ３、ＫＬＫ４、ＳＣＣＥおよびＳＣＴＥ）。これらのカリクレイン遺伝子のそれぞれを、本明細書に記載される方法および組成物において使用することができる。
【０１２１】
それらの中で、ＳＣＣＥおよびＳＣＴＥが皮膚では主に発現している。それらはまた、脳、腎臓、乳腺および唾液腺などの他の組織でも発現している（Ｙｏｕｓｅｆら、２０００；ＹｏｕｓｅｆおよびＤｉａｍａｎｄｉｓ、１９９９）。
【０１２２】
本発明者らは、ＳＣＣＥ核酸におけるＡＡＣＣＡＡＣＣの存在が、低下した皮膚接着の疾患（特に湿疹、好ましくはアトピー性湿疹）に関連することを示している。従って、本発明者らは、個体におけるＳＣＣＥ核酸におけるＡＡＣＣ反復または配列ＡＡＣＣＡＡＣＣの存在を検出することによる、個体における低下した皮膚接着の疾患（第Ｉ群疾患）またはそのような疾患に対する感受性の診断を提供する。
【０１２３】
ＳＣＣＥおよびＳＣＴＥのホモログ（特に、皮膚に局在化し、かつ／または接着タンパク質に作用するホモログ）もまた、本明細書に記載される診断方法および処置方法において使用することができる。そのようなホモログは、ＳＣＣＥおよび／またはＳＣＴＥのプローブを使用する従来のライブラリースクリーニングによって、ならびに関連する配列を使用するデータベース検索によって同定することができる。
【０１２４】
本明細書に記載される方法および組成物において有用な他のプロテアーゼの例には、アミノペプチダーゼＭ、カルボキシペプチダーゼＰ、カルボキシペプチダーゼＹ、カスパーゼ１／カスパーゼ４／カスパーゼ５、カスパーゼ２／カスパーゼ３／カスパーゼ７、カスパーゼ６／カスパーゼ８／カスパーゼ９、キモトリプシン、第Ｘａ因子、ペプシン、ＴＥＶ、トロンビン、トリプシンなどが含まれる。
【０１２５】
プロテアーゼ阻害剤
本発明者らは、落屑の調節が、プロテアーゼ（例えば、ＳＣＣＥおよびＳＣＴＥ）によってだけでなく、その阻害剤によってもまた制御されることを明らかにしている。本明細書に記載される方法および組成物において使用され得るプロテアーゼ阻害剤には下記が含まれる。
【０１２６】
分泌型ロイコプロテアーゼ阻害剤（ＳＬＰＩ）およびエラフィン
いくつかのセリンプロテアーゼがヒトの表皮に存在し、これには抗ロイコプロテーゼ（皮膚由来の抗ロイコプロテーゼ）およびエラフィンが含まれる。抗ロイコプロテーゼはＳＣＣＥの強力な阻害剤である。エラフィンプロテアーゼ阻害剤３（ＰＩ３もしくはＳＫＡＬＰ）は、角化細胞により産生される別のセリンプロテアーゼ阻害剤である。これは、病変乾癬皮膚の角質下層において、そしてベーチェット病、スイート症候群、壊疽性膿皮症および皮膚アレルギー性血管炎などの他の皮膚障害において過剰に発現している（Ｔａｎａｋａら、２０００）。本発明者らは、ＳＫＡＬＰ発現の変化がＳＣＣＥおよびＳＣＴＥの活性に影響を及ぼし、従って、乾癬および湿疹などの皮膚障害における表皮表面層の構造を乱していることを発見した。
【０１２７】
本明細書で使用される用語「分泌型ロイコプロテアーゼ阻害剤」および用語「ＳＬＰＩ」および用語「抗ロイコプロテーゼ」は互いに同義であることが意図される。
【０１２８】
エラフィンはまた、皮膚由来の抗ロイコプロテーゼ、ＳＫＡＬＰおよびプロテアーゼ阻害剤３（ＰＩ３）として知られている。従って、これらの用語は、本明細書で使用されるとき、互いに同義であることが意図される。
【０１２９】
シスタチンＡ
実施例では、様々な多型が、シスタチンＡにおいて、特にシスタチンＡのプロモーター領域において存在することが明らかにされている。従って、本発明者らは、これらの多型の存在および／または非存在を検出することによる、疾患（好ましくは第Ｉ群疾患および／または第ＩＩ群疾患）の診断を提供する。
【０１３０】
本発明者らは、シスタチンＡが、増大した接着を有する疾患（例えば、ざ瘡および乾癬）では非常に発現しており、そして欠陥のある皮膚バリアを有する疾患（例えば、湿疹）ではダウンレギュレーションされていることを実施例において示している。従って、シスタチンＡの活性またはレベルは、第Ｉ群疾患を処置するための手段としてアップレギュレーションさせることができる。シスタチンＡのレベルおよび／または活性は、第ＩＩ群疾患を処置するための手段としてダウンレギュレーションさせることができる。
【０１３１】
従って、本発明者らは、個体におけるシスタチンＡの発現の調節（好ましくはダウンレギュレーション）を検出することによる、個体における第Ｉ群疾患または第Ｉ群疾患に対する感受性（好ましくは湿疹または湿疹に対する感受性、好ましくはアトピー性湿疹）の診断を開示する。
【０１３２】
本発明者らはさらに、個体におけるシスタチンＡの発現の調節（好ましくはアップレギュレーション）を検出することによる、個体における第ＩＩ群疾患または第ＩＩ群疾患に対する感受性（好ましくは、湿疹および／または乾癬）の診断を開示する。
【０１３３】
本発明者らは、個体におけるシスタチンＡの発現を調節（好ましくはアップレギュレーション）することによる、個体における第Ｉ群疾患（好ましくは湿疹または湿疹に対する感受性、好ましくはアトピー性湿疹）の処置または防止を提供する。
【０１３４】
本発明者らはさらに、個体におけるシスタチンＡの発現を調節（好ましくはダウンレギュレーション）することによる、個体における第ＩＩ群疾患または第ＩＩ群疾患に対する感受性（好ましくは湿疹および／または乾癬）の処置または防止を提供する。
【０１３５】
アゴニストおよびアンタゴニスト
本明細書に記載される方法および組成物は、いくつかの実施形態では、プロテアーゼまたはプロテアーゼ阻害剤の活性を阻止することに依拠する。プロテアーゼまたはプロテアーゼ阻害剤の活性を増大させることができる因子は、そのような活性のアゴニストとして示される。同様に、アンタゴニストはプロテアーゼまたはプロテアーゼ阻害剤の活性を低下させる。
【０１３６】
この分野で使用されているように、用語「アンタゴニスト」は、酵素に結合して、酵素の活性を阻害する化合物を示すことが一般には理解される。しかし、本明細書で使用されるこの用語は、分子に結合することによることは必ずしも必要なく、分子の活性を阻害する任意の因子を広く示すことが意図される。従って、アンタゴニストには、プロテアーゼなどのタンパク質の発現に影響を及ぼす因子、またはプロテアーゼ阻害剤などの分子の生合成に影響を及ぼす因子、またはプロテアーゼもしくはプロテアーゼ阻害剤の活性の調節因子の発現に影響を及ぼす因子が含まれる。阻害される特異的な活性は、酵素または分子に特徴的な任意の活性、例えば、プロテアーゼ活性またはプロテアーゼ阻害剤活性であり得る。プロテアーゼ活性およびプロテアーゼ阻害剤活性に対するアッセイはこの分野では知られている。
【０１３７】
アンタゴニストは、関連する分子（例えば、好ましくはプロテアーゼ酵素）における１つまたは複数の部位（好ましくはプロテアーゼ酵素の触媒活性部位）に結合することができ、またはそのような部位に対して競合することができる。好ましくは、そのような結合により、分子と別の実体との相互作用（例えば、プロテアーゼ酵素とその基質との相互作用）が阻止される。しかし、アンタゴニストは、触媒活性部位に対して直接的に結合する必要は必ずしもなく、その結合が酵素または分子の活性を低下させる限り、例えば、細胞表面または細胞内において隣接部位または他のタンパク質（例えば、酵素と複合体を形成するタンパク質）または別の実体に結合してもよい。
【０１３８】
プロテアーゼ酵素などの酵素のアンタゴニストが関係する場合、アンタゴニストには、酵素の基質、または酵素に結合することができる基質フラグメントを挙げることができる。さらに、天然に産生されるか、またはペプチド合成により産生される完全な基質または基質フラグメントを、酵素における結合部位に対して基質と競合させるために使用することができる。あるいは、またはさらに、プロテアーゼ酵素に結合することができる免疫グロブリン（例えば、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体）を使用することができる。アンタゴニストにはまた、結合相互作用を妨げることができるペプチドまたは他の小分子を挙げることができる。アンタゴニストの他の例がより詳しくは下記に示されるが、そのような例もまた当業者には明らかである。
【０１３９】
プロテアーゼまたはプロテアーゼ阻害剤の活性を阻止することはまた、細胞におけるプロテアーゼまたは阻害剤の発現レベルを低下させることによって達成することができる。例えば、細胞は、アンチセンス化合物で、例えば、プロテアーゼまたはプロテアーゼ阻害剤のｍＲＮＡに対して特異的な配列を有するオリゴヌクレオチドで処理することができる。接着タンパク質の病原性形態の発現レベルもまたこのようにして調節することができる。
【０１４０】
一般に、本明細書中で使用される用語「アンタゴニスト」には、原子または分子（この場合、分子は無機もしくは有機であってもよい）、生物学的エフェクター分子、および／または生物学的エフェクター分子などの因子をコードする核酸、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、核酸、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ウイルス、ウイルス様粒子、ヌクレオチド、リボヌクレオチド、ヌクレオチドの合成アナログ、リボヌクレオチドの合成アナログ、修飾ヌクレオチド、修飾リボヌクレオチド、アミノ酸、アミノ酸アナログ、修飾アミノ酸、修飾アミノ酸アナログ、ステロイド、プロテオグリカン、脂質、脂肪酸および炭水化物などの因子が含まれるが、これらに限定されない。因子は溶液状態または懸濁状態（例えば、結晶形態、コロイド形態または他の粒子状形態の状態）であってもよい。因子は、単量体、二量体、オリゴマーなどの形態であってもよく、そうでなければ複合体であってもよい。
【０１４１】
用語「アンタゴニスト」および用語「因子（ａｇｅｎｔ）」にはまた、構造タンパク質、酵素、サイトカイン（インターフェロンおよび／またはインターロイキンなど）、抗生物質、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体またはそれらの効果的な部分（Ｆｖフラグメントなど）（そのような抗体またはその部分は天然または合成またはヒト化であってもよい）、ペプチドホルモン、受容体、シグナル変換分子または他のタンパク質（これらに限定されない）を含むタンパク質またはポリペプチドまたはペプチド；オリゴヌクレオチドまたは修飾オリゴヌクレオチド、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたは修飾アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、人工または天然の染色体（例えば、酵母人工染色体）またはその一部、ＲＮＡ（ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡまたはリボザイムを含む）、あるいはペプチド核酸（ＰＮＡ）（これらに限定されない）を含む、下記に定義されるような核酸；ウイルスまたはウイルス様粒子；ヌクレオチドまたはリボヌクレオチドまたはそれらの合成アナログ（これらは修飾されてもよく、非修飾であってもよい）；アミノ酸またはそのアナログ（これらは修飾されてもよく、非修飾であってもよい）；非ペプチド（例えばステロイド）ホルモン；プロテオグリカン；脂質；あるいは炭水化物が含まれることが意図される。ポリペプチドの活性部位に結合し、かつポリペプチドの活性部位を占有し、それにより触媒作用部位を基質に利用させなくし、その結果、正常な生物学的活性が妨げられるようにする小分子（無機化学物質および有機化学物質を含む）もまた含まれる。小分子の例には、小ペプチドまたはペプチド様分子が含まれるが、これらに限定されない。
【０１４２】
アンタゴニストまたは因子はそれ自体、プロテアーゼまたはプロテアーゼ阻害剤を切断するプロテアーゼであってもよい。プロテアーゼの例には、アミノペプチダーゼＭ、カルボキシペプチダーゼＰ、カルボキシペプチダーゼＹ、カスパーゼ１／カスパーゼ４／カスパーゼ５、カスパーゼ２／カスパーゼ３／カスパーゼ７、カスパーゼ６／カスパーゼ８／カスパーゼ９、キモトリプシン、第Ｘａ因子、ペプシン、ＴＥＶ、トロンビン、トリプシンなどが含まれる。
【０１４３】
アンチセンス化合物
上記に記載されるように、アンタゴニストは、細胞におけるプロテアーゼまたはプロテアーゼ阻害剤の発現レベルを低下させることができる、アンチセンスＲＮＡおよびアンチセンスＤＮＡを含む１つ以上のアンチセンス化合物を含んでもよい。好ましくは、アンチセンス化合物は、プロテアーゼまたはプロテアーゼ阻害剤をコードするｍＲＮＡに対して相補的な配列を含む。
【０１４４】
好ましくは、アンチセンス化合物はオリゴマー状のアンチセンス化合物であり、特にオリゴヌクレオチドである。アンチセンス化合物は、好ましくは、プロテアーゼまたはプロテアーゼ阻害剤をコードする１つ以上の核酸と特異的にハイブリダイゼーションする。本明細書中で使用される用語「プロテアーゼをコードする核酸」または用語「プロテアーゼ阻害剤をコードする核酸」は、プロテアーゼまたはプロテアーゼ阻害剤をコードするＤＮＡ、そのようなＤＮＡから転写されるＲＮＡ（プレｍＲＮＡおよびｍＲＮＡを含む）、そしてまたそのようなＲＮＡに由来するｃＤＮＡを包含する。オリゴマー化合物とその標的核酸との特異的なハイブリダイゼーションにより、核酸の正常な機能が妨げられる。特異的にハイブリダイゼーションする化合物による標的核酸の機能のこの調節は、一般には「アンチセンス」と呼ばれている。妨げられるＤＮＡの機能には、複製および転写が含まれる。妨げられるＲＮＡの機能には、例えば、タンパク質翻訳部位へのＲＮＡの輸送、ＲＮＡからのタンパク質の翻訳、１つ以上のｍＲＮＡ種を生じさせるＲＮＡのスプライシング、およびＲＮＡが関わり得るか、またはＲＮＡにより促進され得る触媒活性などの、生命維持に必要な機能のすべてが含まれる。標的核酸機能とのそのような妨害の全体的な作用は、プロテアーゼまたはプロテアーゼ阻害剤の発現の調節である。本明細書に関連して、「調節」は、遺伝子の発現における増大（刺激）または低下（阻害）のいずれかを意味する。例えば、プロテアーゼ活性またはプロテアーゼ阻害剤活性の阻害剤をコードする遺伝子の発現、あるいはプロテアーゼまたはプロテアーゼ阻害剤の発現の阻害剤をコードする遺伝子の発現を増大させることができる。しかし、好ましくは、発現の阻害、具体的には、プロテアーゼまたはプロテアーゼ阻害剤の発現の阻害が遺伝子発現の調節の好ましい形態であり、ｍＲＮＡが好ましい標的である。
【０１４５】
様々なアンチセンス構築物が米国特許第６，１００，０９０号（Ｍｏｎｉａら）およびＮｅｃｋｅｒｓら、１９９２、Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｏｎｃｏｇ、３（１−２）：１７５〜２３１に詳しく記載される（これらの教示は参考として特に組み込まれる）。
【０１４６】
ポリペプチド
本明細書に記載される方法および組成物により、一般に、多数のポリペプチドが、そのフラグメント、ホモログ、変化体および誘導体とともに規定される。好適に有用なポリペプチドには、接着タンパク質またはプロテアーゼまたはプロテアーゼ阻害剤、あるいは接着タンパク質またはプロテアーゼまたはプロテアーゼ阻害剤のフラグメント、ホモログ、変化体または誘導体が含まれる。
【０１４７】
従って、本発明者らは、接着タンパク質またはプロテアーゼまたはプロテアーゼ阻害剤のアミノ酸配列の変化体またはホモログまたは誘導体、ならびにそのようなアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列の変化体またはホモログまたは誘導体を開示する。これらのそれぞれを、第Ｉ群疾患または第ＩＩ群疾患を処置または診断するために使用することができる。
【０１４８】
好ましくは、本明細書に開示されるポリペプチド、変化体、ホモログ、フラグメントおよび誘導体は、接着タンパク質またはプロテアーゼまたはプロテアーゼ阻害剤の１つ以上の性質、好ましくは１つ以上の生物学的活性を含む。従って、変化体などは、好ましくは、接着活性、プロテアーゼ活性およびプロテアーゼ阻害剤活性（これらに限定されない）を含む１つ以上の活性を含む。
【０１４９】
ホモログ
開示されるポリペプチドには、任意の供給源から得られる相同的な配列、例えば、関連するウイルス／細菌のタンパク質、細胞性ホモログおよび合成ペプチド、ならびにそれらの変化体または誘導体が含まれる。従って、ポリペプチドにはまた、哺乳動物（例えば、マウス、ラットまたはウサギ）などの動物を含む他の種、特に霊長類、より具体的にはヒトに由来する接着タンパク質またはプロテアーゼまたはプロテアーゼ阻害剤のホモログをコードするものが含まれる。より具体的には、ホモログには、ヒトホモログが含まれる。
【０１５０】
本明細書に関連して、相同的な配列は、好ましくは少なくとも５０アミノ酸または１００アミノ酸にわたって、好ましくは２００アミノ酸、３００アミノ酸、４００アミノ酸または５００アミノ酸にわたって、関連する配列と、アミノ酸レベルで、少なくとも１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％または９０％が同一であり、好ましくは少なくとも９５％または９８％が同一であるアミノ酸配列を含むことが理解される。
【０１５１】
具体的には、相同性は、典型的には、非必須な隣接配列ではなく、タンパク質機能に不可欠であることが知られている配列（例えば、タンパク質分解および／または接着に不可欠な配列）のそのような領域に関して考慮されなければならない。これは、遠縁の生物に由来する相同的な配列を検討するときには特に重要である。
【０１５２】
相同性はまた、類似性（すなわち、類似する化学的性質／機能を有するアミノ酸残基）に関して検討することができるが、本発明に関連して、相同性を配列同一性に関して表すことは好ましい。
【０１５３】
相同性の比較は、目で見ながら行うことができ、またはより通常的には、容易に得られる配列比較プログラムの助けをかりて行うことができる。これらの公開されているコンピュータープログラムおよび市販のコンピュータープログラムでは、２つ以上の配列の間における％同一性を計算することができる。
【０１５４】
％同一性は、連続した配列にわたって計算することができる。すなわち、１つの配列がもう一方の配列に関してアラインメントされ、そして一方の配列における各アミノ酸が、直接、もう一方の配列における対応するアミノ酸と、一度に１残基ずつ比較される。これは、「無ギャップ」アラインメントと呼ばれている。典型的には、そのような無ギャップアラインメントは、比較的少数の残基（例えば、５０個未満の連続したアミノ酸）について行われるだけである。
【０１５５】
これは、非常に簡便で一貫性のある方法ではあるが、例えば、それ以外の点では同一の配列ペアにおいて、１つの挿入または欠失により、その後のアミノ酸残基がアラインメントから除かれ、従って、全体的なアラインメントが行われたとき、％相同性の大きい低下が潜在的にもたらされることを考慮に入れることができない。従って、ほとんどの配列比較法は、全体的な相同性スコアに対して過度なペナルティーを課すことなく可能な挿入および欠失を考慮に入れた最適なアラインメントが得られるように設計されている。これは、局所的な同一性または類似性を最大にしようとするために「ギャップ」を配列アラインメントに挿入することによって達成される。
【０１５６】
しかし、これらのより複雑な方法では、同一アミノ酸の同じ数について、できる限り少数のギャップ（すなわち、２つの比較される配列の間におけるより大きい関連性を反映する）を有する配列アラインメントでは、多くのギャップを有する配列アラインメントよりも大きいスコアが達成されるように、「ギャップペナルティー」が、アラインメントにおいて生じる各ギャップに割り当てられる。ギャップの存在に対して比較的大きいコストを課し、ギャップにおけるその後の残基に対してはより小さいコストを課す「アフィン・ギャップ・コスト」が、典型的には使用される。これは、最も一般的に使用されているギャップスコア化システムである。大きいギャップペナルティーは、当然のことではあるが、より少ないギャップを有する最適化されたアラインメントをもたらす。ほとんどのアラインメントプログラムでは、ギャップペナルティーを変更することができる。しかし、そのようなソフトウエアを配列比較のために使用するときには既定のデフォルト値を使用することが好ましい。例えば、ＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｂｅｓｔｆｉｔパッケージ（下記参照）を使用するとき、アミノ酸配列に対するギャップペナルティーのデフォルト値はギャップに対して−１２であり、各伸長に対しては−４である。
【０１５７】
従って、最大％相同性の計算には、最初に、ギャップペナルティーを考慮に入れて最適なアラインメントを作製することが必要になる。そのようなアラインメントを行うための好適なコンピュータープログラムには、ＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｂｅｓｔｆｉｔパッケージ（ウイスコンシン大学、米国；Ｄｅｖｅｒｅｕｘら、１９８４、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１２：３８７）がある。配列比較を行うことができる他のソフトウエアの例には、ＢＬＡＳＴパッケージ（Ａｕｓｕｂｅｌら、１９９９、上掲−第１８章を参照のこと）、ＦＡＳＴＡ（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、１９９０、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４０３〜４１０）、およびＧＥＮＥＷＯＲＫＳ比較ツールセットが含まれるが、これらに限定されない。ＢＬＡＳＴおよびＦＡＳＴＡはともに、オフライン検索およびオンライン検索のために利用することができる（Ａｕｓｕｂｅｌら、１９９９、上掲、７−５８頁〜７−６０頁を参照のこと）。しかし、ＧＣＧ  Ｂｅｓｔｆｉｔプログラムを使用することが好ましい。
【０１５８】
最終的な％相同性を同一性に関して評価することができるが、アラインメント処理自体は、典型的には、妥協を許さないペア比較に基づいていない。むしろ、化学的類似性または進化的距離に基づくそれぞれのペア毎の比較にスコアを割り当てるスケール化された類似性スコア行列が一般には使用される。一般的に使用されるそのような行列の一例が、ＢＬＯＳＵＭ６２行列、すなわち、ＢＬＡＳＴプログラムセットに対するデフォルト行列である。ＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎプログラムでは、一般に、公開されたデフォルト値または供給される場合にはカスタム・シンボル比較表のいずれかが使用される（さらなる詳細についてはユーザーマニュアルを参照のこと）。ＧＣＧパッケージには公開されたデフォルト値を使用することが好ましく、または他のソフトウエアの場合には、ＢＬＯＳＵＭ６２などのデフォルト行列を使用することが好ましい。
【０１５９】
最適なアラインメントがソフトウエアにより得られると、％相同性（好ましくは％配列同一性）を計算することが可能である。ソフトウエアは、典型的には、配列比較の一部としてこれを行い、数値結果をもたらす。
【０１６０】
本発明のアミノ酸配列に関連する用語「変化体」または用語「誘導体」は、得られるアミノ酸配列が、非修飾の配列と実質的に同じ活性を保持し、好ましくは本明細書に示されるポリペプチドと少なくとも同じ活性を有するならば、配列からの、または配列に対する、１つ（または複数）のアミノ酸の任意の置換、または変化、または修飾、または取り替え、または欠失、または付加を含む。
【０１６１】
本明細書ならびに実施例に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、またはそのフラグメントもしくはホモログは、本明細書に記載される方法および組成物における使用のために修飾することができる。典型的には、配列の生物学的活性を保持する修飾が行われる。修飾された配列が非修飾配列の生物学的活性を保持するするならば、いくつかのアミノ酸置換を行うことができ、例えば、１個または２個または３個から、１０個または２０個または３０個の置換を行うことができる。あるいは、修飾は、本明細書に記載されるポリペプチドの１つ以上の機能的ドメインを意図的に不活性化するために行うことができる。プロテアーゼの機能的ドメインには、プロテアーゼドメインおよびプロテアーゼ触媒作用部位が含まれる。アミノ酸置換には、例えば、治療的に投与されたポリペプチドの血液血漿半減期を増大させるために、天然に存在しないアナログの使用を含むことができる。
【０１６２】
様々な保存的置換を、例えば、下記の表に従って行うことができる。第２欄の同じブロック内のアミノ酸を、好ましくは第３欄の同じ行内のアミノ酸を相互に置換することができる。
【表３】
2004524010.tif 000002
【０１６３】
フラグメント
ポリペプチドにはまた、本明細書に記載されるポリペプチド（例えば、接着タンパク質またはプロテアーゼまたはプロテアーゼ阻害剤）のいずれかの全長配列のフラグメントが含まれる。好ましくは、フラグメントは少なくとも１つのエピトープを含む。エピトープを同定する方法はこの分野では十分に知られている。フラグメントは、典型的には、少なくとも６個のアミノ酸を含み、より好ましくは、少なくとも１０個、２０個、３０個、５０個または１００個のアミノ酸を含む。
【０１６４】
関連する核酸配列（例えば、接着タンパク質またはプロテアーゼまたはプロテアーゼ阻害剤をコードする核酸配列）に由来する、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、３１個、３２個、３３個、３４個、３５個、３６個、３７個、３８個、３９個、４０個、４１個、４２個、４３個、４４個、４５個、４６個、４７個、４８個、４９個、５０個、５１個、５２個、５３個、５４個、５５個、５６個、５７個、５８個、５９個、６０個、６１個、６２個、６３個、６４個、６５個、６６個、６７個、６８個、６９個、７０個、７１個、７２個、７３個、７４個、７５個、７６個、７７個、７８個、７９個、８０個、８１個、８２個、８３個、８４個、８５個、８６個、８７個、８８個、８９個、９０個、９１個、９２個、９３個、９４個、９５個、９６個、９７個、９８個、９９個、１００個、１０５個、１１０個、１１５個、１２０個、１２５個、１３０個、１３５個、１４０個、１４５個、１５０個、１５５個、１６０個、１６５個、１７０個、１７５個、１８０個、１８５個、１９０個、１９５個、２００個、２０５個、２１０個、２１５個、２２０個、２２５個、２３０個、２３５個、２４０個、２４５個、２５０個、２５５個、２６０個、２６５個、２７０個、２７５個、２８０個、２８５個、２９０個、２９５個、３００個、３０５個、３１０個、３１５個、３２０個、３２５個、３３０個、３３５個、３４０個、３４５個、３５０個、３５５個、３６０個、３６５個、３７０個、３７５個、３８０個、３８５個、３９０個、３９５個、４００個、４０５個、４１０個、４１５個、４２０個、４２５個、４３０個、４３５個、４４０個、４４５個、４５０個、４５５個、４６０個、４６５個、４７０個、４７５個、４８０個、４８５個、４９０個、４９５個、５００個またはそれ以上の残基を含むフラグメント、好ましくはそのような数の残基からなるフラグメントが含まれる。
【０１６５】
接着タンパク質およびプロテアーゼおよびプロテアーゼ阻害剤、ならびにそれらのフラグメント、ホモログ、変化体および誘導体は組換え手段によって作製することができる。しかし、それらはまた、固相合成などの当業者に十分に知られている技術を使用する合成的手段によって作製することができる。タンパク質はまた、例えば、抽出および精製を助けるために、融合タンパク質として製造することができる。融合タンパク質パートナーの例には、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、６ｘＨｉｓ、ＧＡＬ４（ＤＮＡ結合および／または転写活性化ドメイン）およびβ−ガラクトシダーゼが含まれる。融合タンパク質配列の除去を可能にするために、タンパク質分解的な切断部位を融合タンパク質パートナーと目的とするタンパク質配列との間に含めることもまた好都合である。好ましくは、融合タンパク質は、目的とするタンパク質配列の機能を妨げない。タンパク質はまた、動物細胞から細胞抽出物を精製することによって得ることができる。
【０１６６】
本明細書に開示されるポリペプチド、変化体、ホモログ、フラグメントおよび誘導体は、実質的に単離された形態にすることができる。そのようなポリペプチドは、タンパク質の意図された目的を妨害しないキャリアまたは希釈剤と混合され得ることが理解され、そして依然として実質的に単離されたと見なされる。変化体、ホモログ、フラグメントまたは誘導体はまた、実質的に精製された形態にすることができ、そのような場合、一般に、調製物中のタンパク質の９０％以上（例えば、９５％、９８％または９９％）がタンパク質である調製物においてタンパク質を含む。
【０１６７】
本明細書に開示されるポリペプチド、変化体、ホモログ、フラグメントおよび誘導体は顕示用の標識で標識することができる。顕示用標識は、ポリペプチドなどが検出されることを可能にする任意の好適な標識であり得る。好適な標識には、放射性同位体（例えば、１２５Ｉ）、酵素、抗体、ポリヌクレオチドおよびリンカー（ビオチンなど）が含まれる。標識されたポリペプチドは、サンプル中のポリペプチドの量を測定するために免疫アッセイなどの診断手法において使用することができる。ポリペプチドまたは標識されたポリペプチドはまた、標準的なプロトコルを使用して、動物およびヒトにおける前記ポリペプチドに対する免疫反応性を検出するために血清学的免疫アッセイまたは細胞媒介免疫アッセイにおいて使用することができる。
【０１６８】
本明細書に開示されるポリペプチド、変化体、ホモログ、フラグメントまたは誘導体はまた、場合に応じて標識されて、固相に、例えば、免疫アッセイウエルまたはデイップスティックの表面に固定することができる。そのような標識されたポリペプチドおよび／または固定化されたポリペプチドは、好適な試薬、コントロール、説明書などと一緒に、好適な容器においてキットに包装することができる。そのようなポリペプチドおよびキットは、免疫アッセイによってポリペプチドまたはその対立遺伝子もしくは種変化体に対する抗体を検出する方法において使用することができる。
【０１６９】
免疫アッセイ方法はこの分野では十分に知られており、一般には下記を含む。（ａ）前記タンパク質に対する抗体により結合可能なエピトープを含むポリペプチドを提供すること；（ｂ）抗体−抗原複合体の形成を可能にする条件のもとで生物学的サンプルを前記ポリペプチドとインキュベーションすること；および（ｃ）前記ポリペプチドを含む抗体−抗原複合体が形成されたかどうかを測定すること。
【０１７０】
本明細書に開示される接着タンパク質またはプロテアーゼまたはプロテアーゼ阻害剤のポリペプチド、変化体、ホモログ、フラグメントおよび誘導体は、それらの対応する遺伝子およびそのホモログの細胞機能（疾患におけるそれらの機能を含む）における役割を研究するためにインビトロまたはインビボの細胞培養システムにおいて使用することができる。例えば、短縮型ポリペプチドまたは修飾ポリペプチドを、細胞内で生じる正常な機能を破壊するために細胞内に導入することができる。ポリペプチドは、組換え発現ベクターからポリペプチドをインシトゥー発現させることによって細胞内に導入することができる（下記参照）。発現ベクターは、ポリペプチドの発現を制御するために誘導性プロモーターを有してもよい。
【０１７１】
昆虫細胞または哺乳動物細胞など適切な宿主細胞の使用は、最適な生物学的活性を組換え発現産物に与えるために必要とされ得るような翻訳後修飾（例えば、ミリストイル化、グリコシル化、短縮化、脂質化、およびチロシンまたはセリンまたはトレオニンのリン酸化）をもたらすことが予想される。本明細書に開示される接着タンパク質およびプロテアーゼおよびプロテアーゼ阻害剤のポリペプチド、変化体、ホモログ、フラグメントおよび誘導体が発現させられるそのような細胞培養システムは、細胞内のポリペプチドの機能を妨害または増強する候補物質を同定するために様々なアッセイシステムにおいて使用することができる。
【０１７２】
フラグメント
本発明者らはまた、本明細書に開示される接着タンパク質またはプロテアーゼまたはプロテアーゼ阻害剤の核酸およびポリペプチドのフラグメントである核酸およびポリペプチドまたはペプチドを提供する。
【０１７３】
好ましくは、そのような核酸フラグメントおよびポリペプチドフラグメントは、好ましくは、関連する配列（すなわち、本明細書に開示される配列のいずれか）に由来する、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、３１個、３２個、３３個、３４個、３５個、３６個、３７個、３８個、３９個、４０個、４１個、４２個、４３個、４４個、４５個、４６個、４７個、４８個、４９個、５０個、５１個、５２個、５３個、５４個、５５個、５６個、５７個、５８個、５９個、６０個、６１個、６２個、６３個、６４個、６５個、６６個、６７個、６８個、６９個、７０個、７１個、７２個、７３個、７４個、７５個、７６個、７７個、７８個、７９個、８０個、８１個、８２個、８３個、８４個、８５個、８６個、８７個、８８個、８９個、９０個、９１個、９２個、９３個、９４個、９５個、９６個、９７個、９８個、９９個、１００個、１０５個、１１０個、１１５個、１２０個、１２５個、１３０個、１３５個、１４０個、１４５個、１５０個、１５５個、１６０個、１６５個、１７０個、１７５個、１８０個、１８５個、１９０個、１９５個、２００個、２０５個、２１０個、２１５個、２２０個、２２５個、２３０個、２３５個、２４０個、２４５個、２５０個、２５５個、２６０個、２６５個、２７０個、２７５個、２８０個、２８５個、２９０個、２９５個、３００個、３０５個、３１０個、３１５個、３２０個、３２５個、３３０個、３３５個、３４０個、３４５個、３５０個、３５５個、３６０個、３６５個、３７０個、３７５個、３８０個、３８５個、３９０個、３９５個、４００個、４０５個、４１０個、４１５個、４２０個、４２５個、４３０個、４３５個、４４０個、４４５個、４５０個、４５５個、４６０個、４６５個、４７０個、４７５個、４８０個、４８５個、４９０個、４９５個、５００個またはそれ以上の残基を含むフラグメント、好ましくはそのような数の残基からなるフラグメントを含む。好ましくは、そのようなフラグメントは生物学的活性を含み、好ましくは接着タンパク質またはプロテアーゼまたはプロテアーゼ阻害剤の活性を含む。
【０１７４】
本明細書に記載される方法および組成物において有用な核酸は、ウイルス性または非ウイルス性のＤＮＡベクターまたはＲＮＡベクターを含むことができる。この場合、非ウイルス性ベクターには、プラスミド、線状核酸分子、人工染色体、縮合粒子およびエピソームベクターが含まれるが、これらに限定されない。異種遺伝子の発現が、プラスミドＤＮＡを筋肉内（Ｗｏｌｆｆ  Ｊ．Ａ．ら、１９９０、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４７：１４６５〜１４６８；Ｃａｒｓｏｎ  Ｄ．Ａ．ら、米国特許第５，５８０，８５９号）、甲状腺内（Ｓｙｋｅｓら、１９９４、Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．、５：８３７〜８４４）、黒色腫内（Ｖｉｌｅら、１９９３、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、５３：９６２〜９６７）、皮膚内（Ｈｅｎｇｇｅら、１９９５、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．、１０：１６１〜１６６）、肝臓内（Ｈｉｃｋｍａｎら、１９９４、Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ、５：１４７７〜１４８３）に注入した後に、そして気道上皮の暴露後（Ｍｅｙｅｒら、１９９５、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ、２：４５０〜４６０）に認められている。
【０１７５】
本明細書中で使用される用語「核酸」は、ＤＮＡおよびＲＮＡ（合成起源および天然起源の両方）を包含することが定義される。この場合、そのようなＤＮＡまたはＲＮＡは、修飾または非修飾のデオキシヌクレオチドもしくはジデオキシヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドもしくはジデオキシリボヌクレオチドまたはそれらのアナログを含有することができる。核酸は、一本鎖もしくは二本鎖のＤＮＡもしくはＲＮＡ、ＲＮＡ／ＤＮＡのヘテロ二重鎖、またはＲＮＡ／ＤＮＡのコポリマーとして存在してもよい。この場合、用語「コポリマー」は、リボヌクレオチドおよびデオキシリボヌクレオチドの両方を含む一本鎖核酸鎖を示す。
【０１７６】
本明細書中で使用される用語「合成（された）」は、インビトロでの化学合成または酵素合成によって製造されるものとして定義される。
【０１７７】
本明細書に記載される方法および組成物に従って有用な治療用核酸配列には、接着タンパク質ならびにプロテアーゼ、プロテアーゼ阻害剤などをコードする核酸配列が含まれる。治療用核酸配列にはまた、核タンパク質、細胞質タンパク質、ミトコンドリアタンパク質、分泌タンパク質、形質膜結合タンパク質、血清タンパク質、ウイルス抗原、細菌抗原、原生動物抗原および寄生虫抗原をコードする配列が含まれる。治療用核酸配列にはまた、タンパク質、リポタンパク質、糖タンパク質、リンタンパク質、および核酸（例えば、リボゾ−ムまたはアンチセンス核酸などのＲＮＡ）をコードする配列が含まれる。ハンマーヘッドクラスのリボザイムは、知られている最小のものであり、インビトロ合成および細胞への送達の両方に役立つ（Ｓｕｌｌｉｖａｎ、１９９４、Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．１０３：８５Ｓ〜９８Ｓ；Ｕｓｍａｎら、１９９６、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．、６：５２７〜５３３によって要約される）。取り込まれ得る化合物は、所与のタンパク質またはポリペプチドをコードする核酸配列の利用性によって制限されるだけである。当業者は、ますます多くのタンパク質およびポリペプチドが同定されているので、それらの対応する遺伝子を選ばれた遺伝子発現ベクター（１つまたは複数）にクローン化して、受容患者または他の脊椎動物の組織に投与し、その組織において発現させることができることを容易に理解する。
【０１７８】
核酸
本明細書に記載される方法および組成物により、一般に、多数の核酸が、そのフラグメント、ホモログ、変化体および誘導体とともに規定される。好適に有用な核酸には、接着タンパク質またはプロテアーゼまたはプロテアーゼ阻害剤をコードする核酸、あるいはそのフラグメント、ホモログ、変化体または誘導体が含まれる。
【０１７９】
本明細書においてこの場合に使用されるように、用語「ポリヌクレオチド」、用語「ヌクレオチド」および核酸は相互に同義であることが意図される。「ポリヌクレオチド」は、一般的には任意のポリリボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌクレオチドを示し、それらは非修飾のＲＮＡもしくはＤＮＡまたは修飾されたＲＮＡもしくはＤＮＡであってもよい。「ポリヌクレオチド」には、一本鎖および二本鎖のＤＮＡ、一本鎖領域および二本鎖領域の混合であるＤＮＡ、一本鎖および二本鎖のＲＮＡ、ならびに一本鎖領域および二本鎖領域の混合であるＲＮＡ、一本鎖であってもよく、またはより典型的には二本鎖もしくは一本鎖領域および二本鎖領域の混合であり得るＤＮＡおよびＲＮＡを含むハイブリッド分子が含まれるが、これらに限定されない。さらに、「ポリヌクレオチド」は、ＲＮＡまたはＤＮＡまたはＲＮＡとＤＮＡとの両方を含む三重鎖領域を示す。用語ポリヌクレオチドにはまた、１つ以上の修飾塩基を含有するＤＮＡまたはＲＮＡ、および骨格が安定性または他の理由のために修飾されているＤＮＡまたはＲＮＡが含まれる。「修飾」塩基には、例えば、トリチル化された塩基および非通常型の塩基（イノシンなど）が含まれる。様々な修飾がＤＮＡおよびＲＮＡに対して行われる；従って、「ポリヌクレオチド」は、典型的には自然界に見出されるような、ポリヌクレオチドの化学的または酵素的または代謝的に修飾された形態、ならびにウイルスおよび細胞に特徴的なＤＮＡおよびＲＮＡの化学的形態を包含する。「ポリヌクレオチド」はまた、オリゴヌクレオチドと呼ばれることが多い比較的短いポリヌクレオチドを包含する。
【０１８０】
多数の異なるポリヌクレオチドおよび核酸が遺伝暗号の縮重の結果として同じポリペプチドをコードし得ることが当業者によって理解される。さらに、当業者は、ポリペプチドを発現させようとする任意の特定の宿主生物のコドン使用を反映させるために、本明細書に記載されるポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド配列に影響を及ぼさないヌクレオチド置換を、日常的な技術を使用して行うことができることを理解しなければならない。
【０１８１】
本発明者らはまた、関連する核酸（例えば、接着タンパク質またはプロテアーゼまたはプロテアーゼ阻害剤をコードする核酸）のフラグメント、ホモログ、変化体または誘導体である核酸を提供する。
【０１８２】
変化体、誘導体およびホモログ
核酸の変化体、フラグメント、誘導体およびホモログはＤＮＡまたはＲＮＡを含むことができる。それらは一本鎖または二本鎖であってもよい。それらはまた、合成ヌクレオチドまたは修飾ヌクレオチドをその中に含むポリヌクレオチドであってもよい。オリゴヌクレオチドに対する多数の異なるタイプの修飾がこの分野では知られている。これらには、メチルホスホナート骨格およびホスホロチオアート骨格、分子の３’末端および／または５’末端におけるアクリジンまたはポリリシン鎖の付加が含まれる。本明細書の目的のために、ポリヌクレオチドはこの分野で利用可能な任意の方法によって修飾され得ることを理解しなければならない。そのような修飾は、目的とするポリヌクレオチドのインビボでの活性または寿命を増強するために行うことができる。
【０１８３】
ポリヌクレオチドが二本鎖である場合、二重鎖の両方の鎖が、個々に、または組み合わせのいずれかで、本明細書に記載される方法および組成物により包含される。ポリヌクレオチドが一本鎖である場合、そのポリヌクレオチドの相補的な配列もまた含まれることを理解しなければならない。
【０１８４】
ヌクレオチド配列に関連して用語「変化体」または用語「ホモログ」または用語「誘導体」は、配列からの、または配列に対する、１つ（または複数）の核酸の任意の置換、または変化、または修飾、または置き換え、または欠失、または付加を含む。好ましくは、前記の変化体またはホモログまたは誘導体は、生物学的活性を有するポリペプチドをコードする。好ましくは、接着タンパク質およびプロテアーゼおよびプロテアーゼ阻害剤のそのようなフラグメント、ホモログ、変化体および誘導体は、調節された酵素活性を含み、例えば、接着タンパク質活性（例えば、２つの細胞間の接着を可能にする能力）、またはプロテアーゼ活性、またはプロテアーゼ阻害剤活性を含む。従って、例えば、本発明者らは、非修飾のポリヌクレオチドと比較して、より低い接着タンパク質活性またはプロテアーゼ活性またはプロテアーゼ阻害剤活性を含む関連ポリペプチドのフラグメント、ホモログ、変化体および誘導体を提供する。特に、本発明者らは、低下または増強された接着活性を示す、接着タンパク質のフラグメント、ホモログ、変化体および誘導体を提供する。プロテアーゼおよびプロテアーゼ阻害剤のフラグメント、ホモログ、変化体および誘導体もまた提供されるが、これらは、低下または増強されたプロテアーゼ活性またはプロテアーゼ阻害剤活性を示す。
【０１８５】
接着活性およびプロテアーゼ活性およびプロテアーゼ阻害剤活性に対するアッセイはこの分野では知られている。
【０１８６】
上記に示されるように、配列同一性に関して、「ホモログ」は、好ましくは、配列表に示される関連の配列に対して、少なくとも５％の同一性、または少なくとも１０％の同一性、または少なくとも１５％の同一性、または少なくとも２０％の同一性、または少なくとも２５％の同一性、または少なくとも３０％の同一性、または少なくとも３５％の同一性、または少なくとも４０％の同一性、または少なくとも４５％の同一性、または少なくとも５０％の同一性、または少なくとも５５％の同一性、または少なくとも６０％の同一性、または少なくとも６５％の同一性、または少なくとも７０％の同一性、または少なくとも７５％の同一性、または少なくとも８０％の同一性、または少なくとも８５％の同一性、または少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性を有する。従って、特に、本発明者らは、第Ｉ群疾患および第ＩＩ群疾患の処置において、そのような同一性を有する接着タンパク質およびプロテアーゼおよびプロテアーゼ阻害剤のホモログの使用を提供する。
【０１８７】
より好ましくは、少なくとも９５％の同一性、より好ましくは少なくとも９６％の同一性、より好ましくは少なくとも９７％の同一性、より好ましくは少なくとも９８％の同一性、より好ましくは少なくとも９９％の同一性が存在する。ヌクレオチドの同一性比較は上記に記載されるように行うことができる。好ましい配列比較プログラムは、上記に記載されるＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｂｅｓｔｆｉｔプログラムである。デフォルトのスコア化行列は、それぞれの同一ヌクレオチドに対して１０の一致値を有し、そしてそれぞれのミスマッチに対しては−９の値を有する。デフォルトのギャップ作製ペナルティーは−５０であり、そしてデフォルトのギャップ伸長ペナルティーは各ヌクレオチドに対して−３である。
【０１８８】
ハイブリダイゼーション
本発明者らはさらに、本明細書中に示される配列のいずれかに対して、またはその任意の変化体もしくはフラグメントましくは誘導体に対して、または上記のいずれかの相補体に対して選択的にハイブリダイゼーションすることができるヌクレオチド配列を記載する。ヌクレオチド配列は、好ましくは少なくとも１５ヌクレオチドの長さであり、より好ましくは少なくとも２０ヌクレオチド、３０ヌクレオチド、４０ヌクレオチドまたは５０ヌクレオチドの長さである。
【０１８９】
本明細書中で使用される用語「ハイブリダイゼーション」には、ポリメラーゼ連鎖反応技術において行われるような増幅プロセスだけでなく、「核酸の鎖が塩基対形成によって相補鎖と結合するプロセス」が包含されるものとする。
【０１９０】
本明細書中に示されるヌクレオチド配列またはその相補体に対して選択的にハイブリダイゼーションすることができるポリヌクレオチドは、本明細書中に示される対応するヌクレオチド配列に対して少なくとも４０％の相同性、または少なくとも４５％の相同性、または少なくとも５０％の相同性、または少なくとも５５％の相同性、または少なくとも６０％の相同性、または少なくとも６５％の相同性、または少なくとも７０％の相同性、または少なくとも７５％の相同性、または少なくとも８０％の相同性、または少なくとも８５％の相同性、または少なくとも９０％の相同性、または少なくとも９５％の相同性を有し得る。好ましくは、そのようなポリヌクレオチドは、少なくとも２０個の連続したヌクレオチドの領域にわたって、好ましくは少なくとも２５個または３０個、例えば、少なくとも４０個、６０個または１００個またはそれ以上の連続したヌクレオチドの領域にわたって、本明細書中に示される対応するヌクレオチド配列に対して少なくとも７０％の相同性、好ましくは少なくとも８０％または９０％の相同性、より好ましくは少なくとも９５％または９８％の相同性を一般には有する。
【０１９１】
用語「選択的なハイブリダイゼーションが可能な（である）」により、プローブとして使用されるポリヌクレオチドが、バックグラウンドを有意に越えるレベルでプローブに対して標的ポリヌクレオチドがハイブリダイゼーションすることが見出される条件のもとで使用されることが意味される。バックグラウンドのハイブリダイゼーションは、例えば、スクリーニング中のｃＤＮＡライブラリーまたはゲノムＤＮＡライブラリーに存在する他のポリペプチドのために生じることがある。この場合、バックグラウンドは、プローブとライブラリーの非特異的なＤＮＡメンバーとの相互作用によって生じるシグナルレベルを意味し、そのようなレベルは、標的ＤＮＡで認められる特異的な相互作用の強度の１／１０（10 fold）未満（好ましくは１／１００（100 fold）未満）である。相互作用の強度は、例えば、プローブを、例えば、３２Ｐで放射能標識することによって測定することができる。
【０１９２】
ハイブリダイゼーション条件は、ＢｅｒｇｅｒおよびＫｉｍｍｅｌ（１９８７、Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、第１５２巻、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）に教示されるように、核酸結合複合体の融解温度（Ｔｍ）に基づいており、そして下記に説明されるように、規定された「ストリンジェンシー」をもたらす。
【０１９３】
最大のストリンジェンシーは、典型的には、およそＴｍ−５℃（プローブのＴｍよりも５℃低い温度）で生じる；高いストリンジェンシーはＴｍよりも約５℃〜１０℃低い温度で生じる；中間的なストリンジェンシーはＴｍよりも約１０℃〜２０℃低い温度で生じる；そして低いストリンジェンシーはＴｍよりも約２０℃〜２５℃低い温度で生じる。当業者によって理解されるように、最大のストリンジェンシーでのハイブリダイゼーションは、同一のポリヌクレオチド配列を同定または検出するために使用することができ、一方で、中間的（または低い）ストリンジェンシーでのハイブリダイゼーションは、類似または関連するポリヌクレオチド配列を同定または検出するために使用することができる。
【０１９４】
好ましい態様において、本発明者らは、ストリンジェントな条件（例えば、６５℃および０．１ｘＳＳＣ｛１ｘＳＳＣ＝０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０１５Ｍクエン酸Ｎａ３、ｐＨ７．０｝）のもとで、接着タンパク質またはプロテアーゼまたはプロテアーゼ阻害剤の核酸、フラグメント、変化体、ホモログまたは誘導体にハイブリダイゼーションすることができるヌクレオチド配列を提供する。
【０１９５】
ホモログおよび変化体および誘導体の作製
本発明の配列に対して１００％同一ではないが、同様に含まれるポリヌクレオチドは、接着タンパク質およびプロテアーゼおよびプロテアーゼ阻害剤のホモログおよび変化体および誘導体と同様に、多数の方法で得ることができる。本発明の配列の他の変化体を、例えば、様々な個体、例えば、異なる様々な集団に由来する個体から作製されたＤＮＡライブラリーをプローブ探査することによって得ることができる。例えば、ホモログを他の個体または他の種から同定することができる。さらなる組換え核酸およびポリペプチドを、ホモログにおける対応する位置を同定し、そして本明細書のどこかに記載されるようにそのような分子を合成または製造することによって製造することができる。
【０１９６】
さらに、接着タンパク質およびプロテアーゼおよびプロテアーゼ阻害剤の他のウイルス／細菌または細胞性のホモログ、特に、哺乳動物細胞（例えば、ラット、マウス、ウシおよび霊長類の細胞）に見出される細胞性ホモログを得ることができ、そしてそのようなホモログおよびそのフラグメントは、一般に、ヒトの接着タンパク質またはプロテアーゼまたはプロテアーゼ阻害剤に対して選択的にハイブリダイゼーションすることができる。そのようなホモログは、ヒト以外の接着タンパク質およびプロテアーゼおよびプロテアーゼ阻害剤の核酸、フラグメント、変化体およびホモログを設計するために使用することができる。変異誘発を、さらなる多様性を作製するためにこの分野で知られている手段によって行うことができる。
【０１９７】
ホモログの配列は、他の動物種から作製されたｃＤＮＡライブラリーまたは他の動物種に由来するゲノムＤＮＡライブラリーをプローブ探査することによって、すなわち、中程度〜高いストリンジェンシーの条件のもとで、接着タンパク質またはプロテアーゼまたはプロテアーゼ阻害剤の核酸、フラグメント、変化体およびホモログまたは他のフラグメントのいずれかのすべてまたは一部を含むプローブでそのようなライブラリーをプローブ探査することによって得ることができる。
【０１９８】
同様な検討が、本明細書に開示されるポリペプチド配列またはヌクレオチド配列の種ホモログおよび対立遺伝子変化体を得ることに対して適用される。
【０１９９】
変化体および系統／種ホモログもまた、接着タンパク質またはプロテアーゼまたはプロテアーゼ阻害剤をコードする核酸の配列内の保存されたアミノ酸をコードする変化体およびホモログの内部の標的配列に対して設計されたプライマーが使用される縮重ＰＣＲを使用して得ることができる。保存された配列は、例えば、いくつかの変化体／ホモログに由来するアミノ酸配列をアラインメントすることによって予測することができる。配列のアラインメントは、この分野で知られているコンピューターソフトウエアを使用して行うことができる。例えば、ＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  ＰｉｌｅＵｐプログラムが広く使用されている。
【０２００】
縮重ＰＣＲにおいて使用されるプライマーは１つ以上の縮重位置を含有し、既知の配列に対する単一配列プライマーを用いて配列をクローニングするために使用される条件よりも低いストリンジェンシーの条件で使用される。遠縁の生物に由来する配列間の全体的なヌクレオチド相同性は非常に低いと考えられ、従ってこのような状況では、縮重ＰＣＲは、配列の標識されたフラグメントでライブラリーをスクリーニングすることよりも優れた方法であり得ることが当業者によって理解される。
【０２０１】
さらに、相同的な配列は、ＢＬＡＳＴプログラムセットなどの検索アルゴリズムを使用してヌクレオチドおよび／またはタンパク質のデータベースを検索することによって同定することができる。
【０２０２】
あるいは、そのようなポリヌクレオチドは、特徴づけられた配列、例えば、接着タンパク質およびプロテアーゼおよびプロテアーゼ阻害剤の核酸またはその変化体、ホモログ、誘導体もしくはフラグメントの部位特異的変異誘発によって得ることができる。これは、例えば、サイレントなコドン変化が、ポリヌクレオチド配列が発現させられている特定の宿主細胞に対するコドン使用の選択を最適化するために配列に対して要求される場合には有用である。他の配列変化が、制限酵素認識部位を導入するために、またはポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドの性質もしくは機能を変化させるために望まれる場合がある。
【０２０３】
本明細書に記載されるポリヌクレオチドは、プライマー（例えば、ＰＣＲプライマー、選択的増幅反応用のプライマー）、プローブ（例えば、放射能標識または非放射能標識を使用して通常の手段によって顕示用標識で標識されたプローブ）を作製するために使用することができ、あるいはポリヌクレオチドはベクターにクローン化することができる。そのようなプライマーおよびプローブおよび他のフラグメントは、長さが少なくとも８ヌクレオチド、９ヌクレオチド、１０ヌクレオチドまたは１５ヌクレオチドであり、好ましくは少なくとも２０ヌクレオチド、例えば、少なくとも２５ヌクレオチドまたは３０ヌクレオチドまたは４０ヌクレオチドであり、そしてこれらもまた、本明細書中で使用される用語「ポリヌクレオチド」によって包含される。
【０２０４】
ＤＮＡポリヌクレオチドおよびプローブなどのポリヌクレオチドは、組換え的に、または合成的に、または当業者により利用可能な任意の手段によって製造することができる。ポリヌクレオチドはまた、標準的な技術によってクローン化することができる。
【０２０５】
一般に、プライマーは、所望する核酸配列を一度に１ヌクレオチドずつ段階毎に製造することを伴う合成的手段によって製造される。自動化された技術を使用してこれを達成するための様々な技術をこの分野では容易に利用することができる。
【０２０６】
より長いポリヌクレオチドは、一般には、組換え手段を使用して、例えば、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）クローニング技術を使用して製造される。これには、クローン化することが所望される脂質標的化配列の領域に隣接する１対のプライマー（例えば、約１５ヌクレオチド〜３０ヌクレオチドのプライマー）を作製すること、プライマーを、動物細胞またはヒト細胞から得られたｍＲＮＡまたはｃＤＮＡと接触させること、所望する領域の増幅をもたらす条件のもとでポリメラーゼ連鎖反応を行うこと、増幅されたフラグメントを単離すること（例えば、反応混合物をアガロースゲルで精製することによって）、および増幅されたＤＮＡを回収することが含まれる。プライマーは、増幅されたＤＮＡが好適なクローニングベクターにクローン化され得るように好適な制限酵素認識部位を含有するように設計することができる。
【０２０７】
ポリヌクレオチドまたはプライマーは顕示用標識を有することができる。好適な標識には、放射性同位体（３２Ｐまたは３５Ｓなど）、酵素標識、または他のタンパク質標識（ビオチンなど）が含まれる。そのような標識はポリヌクレオチドまたはプライマーに付加することができ、そしてそれ自体は知られている技術を使用して検出することができる。ポリヌクレオチドまたはプライマーまたはそのフラグメントは、標識された状態で、または標識されることなく、ヒト身体または動物身体におけるポリヌクレオチドを検出または配列決定するために核酸型試験において当業者によって使用することができる。
【０２０８】
そのような検出試験は、一般には、ＤＮＡまたはＲＮＡを含有する生物学的サンプルを、ポリヌクレオチドまたはプライマーを含むプローブと、ハイブリダイゼーション条件のもとで接触させること、およびプローブとサンプル中の核酸との間で形成された何らかの二重鎖を検出することを含む。そのような検出は、ＰＣＲなどの技術を使用して達成することができ、または固体支持体にプローブを固定化して、プローブにハイブリダイゼーションしていないサンプル中の核酸を除き、その後、プローブにハイブリダイゼーションした核酸を検出することによって達成することができる。あるいは、サンプルの核酸を固体支持体に固定化することができ、そしてそのような支持体に結合したプローブの量を検出することができる。この形式および他の形式の好適なアッセイ方法を、例えば、国際特許出願公開ＷＯ８９／０３８９１および同ＷＯ９０／１３６６７に見出すことができる。
【０２０９】
ヌクレオチドの配列決定試験には、標的のＤＮＡまたはＲＮＡを含有する生物学的サンプルを、ポリヌクレオチドまたはプライマーを含むプローブと、ハイブリダイゼーション条件のもとで接触させること、および例えば、サンガーのジデオキシ鎖停止法（Ｓａｍｂｒｏｏｋらを参照のこと）によって配列を決定することが伴う。
【０２１０】
そのような方法は、一般には、標的のＤＮＡまたはＲＮＡに対して相補的な鎖を合成することによりプライマーを好適な試薬の存在下で伸長させること、およびＡ、Ｃ、ＧまたはＴ／Ｕの残基の１つまたは複数において伸長反応を選択的に停止させること；鎖伸長反応および鎖停止反応を行わせること；選択的な停止が生じているヌクレオチドの配列を決定するために伸長生成物のサイズに従って分離することを含む。好適な試薬には、ＤＮＡポリメラーゼ酵素、デオキシヌクレオチド（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ）、緩衝液、およびＡＴＰが含まれる。ジデオキシヌクレオチドが選択的停止のために使用される。
【０２１１】
抗体
本発明者らはさらに、コルネオデスモシン遺伝子によってコードされるポリペプチド／タンパク質におけるエピトープまたは変異エピトープに対して特異的に結合する抗体（ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体のいずれか）を提供する。抗体の調製において、コルネオデスモシン遺伝子およびその多型によってコードされるタンパク質（変異型または非変異型）が、免疫原の供給源として使用される。アミノ酸配列から単離されたペプチドアミノ酸配列または変異ペプチド配列もまた免疫源として使用することができる。
【０２１２】
抗体はポリクローナルまたはモノクローナルのいずれであってもよい。好都合には、抗体は、配列に基づく合成ペプチドに対して調製され得るか、またはクローニング技術によって組換え的に調製され得るか、あるいは天然の遺伝子産物および／またはその一部が単離され、免疫原として使用され得る。そのようなタンパク質またはペプチドは、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．、１９８８）に一般的に記載されるように当業者に十分に知られている標準的な抗体製造技術によって抗体を製造するために使用することができる。
【０２１３】
ポリクローナル抗体を製造する場合、ウサギまたはヤギなどの宿主が、一般にはアジュバントとともに、そして必要な場合にはキャリアにカップリングされたタンパク質またはペプチドで免疫化される。タンパク質に対する抗体が血清から集められる。
【０２１４】
モノクローナル抗体を製造する場合、技術は、適切なドナー（一般にはマウス）をタンパク質またはペプチドフラグメントで過免疫化すること、および脾臓の抗体産生細胞を単離することを伴う。これらの細胞は、不死性を有し、かつ必要とされる抗体を分泌する融合された細胞ハイブリッドを作製するために、不死性を有する細胞（ミエローマ細胞など）に融合される。その後、細胞は塊で培養され、モノクローナル抗体が使用のために培養培地から集められる。
【０２１５】
抗体は、この分野では十分に知られているように、固体支持体基体に結合させることができ、または検出可能な成分とコンジュゲート化することができ、または結合およびコンジュゲート化の両方を行うことができる（蛍光成分または酵素成分のコンジュゲート化の一般的な議論については、ＪｏｈｎｓｔｏｎｅおよびＴｈｏｒｐｅ、Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｉｎ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ（Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｏｘｆｏｒｄ、１９８２）を参照のこと）。固体の支持体基体に抗体を結合させることもまたこの分野では十分に知られている（一般的な議論については、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９８８）を参照のこと）。検出可能な成分には、蛍光マーカー、金属マーカー、酵素マーカーおよび放射能マーカー、例えば、ビオチン、金、フェリチン、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、ペルオキシダーゼ、ウレアーゼ、フルオレセイン、ローダミン、トリチウム、１４Ｃおよびヨウ素化などが含まれるが、これらに限定されない。
【０２１６】
連鎖非平衡分析
連鎖非平衡（ＬＤ）分析は、疾患遺伝子をマッピングするための有力なツールであり、複雑な形質を調べるために特に有用であり得る。ＬＤマッピングは下記の予想に基づいている。集団の任意の２つのメンバーについて、数世代にわたって生じる組換え事象により、それらのゲノムは組換えられており、その結果、それらは祖先との共通点をほとんど有しないことが予想される。しかし、これらの個体が、共通の祖先から受け継がれた疾患に罹っている場合、その疾患の原因となる遺伝子およびそのすぐ周りに位置するマーカーは、その祖先から、変化することなく受け継がれる可能性が高く、すなわち、ＩＢＤ（「家系により同一」）である可能性が高い。共有され続けている（すなわち、ＩＢＤ）領域のサイズは、罹患者とその共通祖先とを隔てる世代数に逆比例する。従って、「古い」集団は詳細なマッピングに好適であり、そして近年には、古い集団は、疾患遺伝子をおおまかに突き止めるためにＬＤを使用することについて適していることが見出されている（Ｈｏｕｗｅｎら、１９９４、特に図３および付属する説明）。隔離された集団は、典型的には少数の創始者が存在しているので、フィンランドで行われたいくつかの成功したＬＤ研究（ｄｅ  ｌａ  Ｃｈａｐｅｌｌｅ、１９９３）によって示されるようにＬＤ法に対して特に適している。
【０２１７】
ＬＤ分析がいくつかのポジショナルクローニング研究（Ｋｅｒｅｍら、１９８９；ＭａｃＤｏｎａｌｄら、１９９２；Ｐｅｔｒｕｋｈｉｎら、１９９３；Ｈａｓｔｂａｃｋａら、１９９２および１９９４）において使用されているが、それぞれの場合において、同一の局在化が、従来の連鎖法を使用して達成されていた。ポジショナルクローニングは、その生化学的機能には関わりなく、単にその染色体位置に基づいた遺伝子の単離である。ＬａｎｄｅｒおよびＢｏｔｓｔｅｉｎ（１９８６）により、ＬＤマッピングは、従来の連鎖分析を用いることなく、疾患遺伝子座についてヒトゲノムをスクリーニングするために使用できることが提案された。この方法は、ゲノム全体に及ぶ１組のマッピングされたマーカーが利用できるまでは実際的ではなかった（Ｗｅｉｓｓｅｎｂａｃｈら、１９９２）。今回、ＬＤマッピングを使用するゲノムスクリーニングの実現可能性が本出願人らによって明らかにされる。
【０２１８】
上皮における増大または低下した細胞−細胞接着に関連する疾患を引き起こす原因となる遺伝子の染色体位置が同定されることにより、罹患家族における個体の診断および処置および遺伝カウンセンリングが容易になる。
【０２１９】
障害の重篤度およびそのような疾患の純粋に表現型の診断の限界のために、臨床的診断を確認し、そしてその遺伝子型サブタイプに基づく適切な治療を決定するために、個体の遺伝子型サブタイプを決定することが非常に求められている。
【０２２０】
疾患の診断
本発明者らは、上皮の異常な細胞−細胞接着に関連する疾患の診断方法を提供する。接着タンパク質（例えば、コルネオデスモシン）をコードする遺伝子における変異は、角質細胞などの上皮細胞間の低下した接着を生じさせることが示されている。これらの遺伝子におけるいくつかの変異は、接着タンパク質の変化した（典型的には低下した）発現を生じさせることがあり、または低下した接着活性もしくはより大きいプロテアーゼ感受性を有する接着タンパク質の発現を生じさせることがある。プロテアーゼ遺伝子およびプロテアーゼ阻害剤遺伝子における他の変異もまた、実施例に示されるように疾患と関連している。低下した細胞−細胞接着は表皮の損なわれたバリア機能をもたらすので、そのような変異は、典型的には第１群疾患と関連しており、第１群疾患を生じさせることがある。
【０２２１】
従って、第１群疾患を、接着タンパク質の発現レベルを測定することによって、疾患に罹患している患者または疾患に罹患する可能性を有する患者において診断することができる。この場合、接着タンパク質の低下した発現レベルにより、第１群疾患が診断される。さらに、本発明者らは、上皮の細胞−細胞接着に関与する接着タンパク質の接着活性を測定することによる第１群疾患の診断方法を提供するが、この場合、低下した接着活性により、第１群疾患が診断される。本発明者らはさらに、上皮の細胞−細胞接着に関与する接着タンパク質のプロテアーゼ感受性を測定することによる第１群疾患の診断方法を提供するが、この場合、増大したプロテアーゼ感受性により、第１群疾患が診断される。本発明者らはまた、接着タンパク質の低下した発現に関連する変異、または低下した接着活性および／もしくは増大したプロテアーゼ感受性を有する接着タンパク質の発現に関連する変異の存在を決定することによる第１群疾患の診断方法を提供する。
【０２２２】
コルネオデスモシンなどの接着タンパク質をコードする遺伝子における他の変異は、角質細胞などの上皮細胞間の増大した接着を生じさせる。これらの遺伝子におけるいくつかの変異は、接着タンパク質の増強された発現を生じさせることがあり、または増強された接着活性もしくは低下したプロテアーゼ感受性を有する接着タンパク質の発現を生じさせることがある。プロテアーゼ遺伝子およびプロテアーゼ阻害剤遺伝子における変異で、疾患に関連する変異もまた開示される。これらの変異は、増強された細胞−細胞接着をもたらすので、典型的には第２群疾患と関連しており、第２群疾患を生じさせることがある。
【０２２３】
従って、第２群疾患を、接着タンパク質の発現レベルを測定することによって、疾患に罹患している患者または疾患に罹患する可能性を有する患者において診断することができる。この場合、接着タンパク質の増大した発現レベルにより、第２群疾患が診断される。さらに、本発明者らは、上皮の細胞−細胞接着に関与する接着タンパク質の接着活性を測定することによる第２群疾患の診断方法を記載するが、この場合、増大した接着活性により、第２群疾患が診断される。本発明者らはさらに、上皮の細胞−細胞接着に関与する接着タンパク質のプロテアーゼ感受性を測定することによる第２群疾患の診断方法を提供するが、この場合、低下したプロテアーゼ感受性により、第２群疾患が診断される。また、接着タンパク質の増大した発現に関連する変異の存在、または増大した接着活性および／もしくは低下したプロテアーゼ感受性を有する接着タンパク質の発現に関連する変異の存在を決定することによる第２群疾患の診断方法も含まれる。
【０２２４】
好ましい実施形態によれば、第１群疾患または第２群疾患の診断は、コルネオデスモシン遺伝子におけるＨｐｈ１制限酵素部位の存在の有無を検出することによって行われる。
【０２２５】
好ましくは、第１群疾患は、コルネオデスモシン遺伝子におけるＨｐｈ１部位の非存在を検出することによって診断される。好ましくは、第２群疾患は、コルネオデスモシン遺伝子におけるＨｐｈ１部位の存在を検出することによって診断される。より好ましくは、Ｈｐｈ１部位の非存在によって診断される第１群疾患は湿疹またはクローン病であり、Ｈｐｈ１部位の存在によって診断される第２群疾患は乾癬またはざ瘡である。
【０２２６】
あるいは、または組合せにおいて、本発明者らは、コルネオデスモシン遺伝子において＋１２４３位におけるＴの存在の有無を検出することによる第１群疾患または第２群疾患の診断を提供する。好ましくは、第１群疾患は、コルネオデスモシン遺伝子において＋１２４３位におけるＴの存在を検出することによって診断される。好ましくは、第２群疾患は、コルネオデスモシン遺伝子において＋１２４３位におけるＴの非存在を検出することによって診断される。より好ましくは、＋１２４３位におけるＴの存在によって診断される第１群疾患は湿疹またはクローン病であり、＋１２４３位におけるＴの非存在によって診断される第２群疾患は乾癬またはざ瘡である。
【０２２７】
好ましくは、＋１２４３位におけるＴの存在はＣからＴへのトランジションに関連する。さらに、＋１２４３位におけるＴの非存在はＴからＣへのトランジションに関連する。
【０２２８】
この分野で知られているような、タンパク質のプロテアーゼ感受性を測定する任意の方法（Ｅｇｅｌｒｕｄ、１９９３）を、上記に示された診断方法において使用することができる。同様に、例えば、ＳＳＣＰ分析、ＲＦＬＰ分析、ＳＮＰ分析などの手段による変異の検出がこの分野では知られており、下記においてさらに詳しく記載される。
【０２２９】
接着タンパク質の異常な（すなわち、増大または低下した）タンパク質分解的分解の検出もまた、第１群疾患および第２群疾患を診断するために使用することができる。従って、接着タンパク質のタンパク質分解に関与するプロテアーゼの増大した発現レベルおよび／または活性レベルは第１群疾患に特徴的であり（従って、第１群疾患の診断となる）。従って、本発明者らは、接着タンパク質のタンパク質分解に関与するプロテアーゼの発現レベルを検出することによる第１群疾患の診断方法を提供する。本発明者らはさらに、接着タンパク質のタンパク質分解に関与するプロテアーゼの活性レベルを検出することによる第１群疾患の診断方法を提供するが、この場合、プロテアーゼの増大した活性レベルにより、第１群疾患が診断される。この方法はまた、第２群疾患の診断にも好適である。従って、第２群疾患の診断方法は、接着タンパク質のタンパク質分解に関与するプロテアーゼの発現レベルを検出することを含むが、この場合、プロテアーゼの低下したレベルにより、第２群疾患が診断される。さらに、本発明者らは、接着タンパク質のタンパク質分解に関与するプロテアーゼの活性レベルを検出することによる第２群疾患の診断方法を提供するが、この場合、プロテアーゼの低下した活性レベルにより、第２群疾患が診断される。
【０２３０】
接着タンパク質の分解に関与するプロテアーゼのタンパク質分解活性を阻害することができるプロテアーゼ阻害剤の発現レベルおよび／または活性レベルもまた、第１群疾患または第２群疾患を診断する手段として検出することができる。従って、プロテアーゼ阻害剤の低下した発現レベルおよび／または活性レベルは第１群疾患に特徴的である。従って、第１群疾患の診断方法は、患者におけるプロテアーゼ阻害剤の低下した発現レベルを検出することを含む。同様に、第１群疾患の診断方法はまた、プロテアーゼ阻害剤の活性レベルを検出することを含むことができる。この場合、プロテアーゼ阻害剤の低下した活性レベルにより、第１群疾患が診断される。
【０２３１】
さらなる実施形態において、第２群疾患の診断方法は、プロテアーゼ阻害剤の発現レベルを検出することを含むが、この場合、プロテアーゼ阻害剤の増大した発現により、第２群疾患が診断される。さらに、第２群疾患の診断方法は、プロテアーゼ阻害剤の活性レベルを検出することを含むことができ、この場合、プロテアーゼ阻害剤の増大した活性により、第２群疾患が診断される。
【０２３２】
プロテアーゼおよび／またはプロテアーゼ阻害剤の発現および／または活性の検出はまた遺伝子レベルでも行われ得ることは明かである。すなわち、プロテアーゼ／プロテアーゼ阻害剤の増大または低下した活性に関連する変異を検出することができる。
【０２３３】
好ましくは、上記の方法において検出され、またはその性質が測定される接着タンパク質はコルネオデスモシンであり、そして好ましくは、遺伝子は、コルネオデスモシンをコードする遺伝子である。好ましくは、検出などが行われるプロテアーゼは角質層キモトリプシン様酵素（ＳＣＣＥ）または角質層トリプシン様酵素（ＳＣＴＥ）である。好ましくは、検出などが行われるプロテアーゼ阻害剤は抗ロイコプロテアーゼ阻害剤（ＳＬＰＩ）またはエラフィンプロテアーゼ阻害剤３（ＰＩ３もしくはＳＫＡＬＰ）である。
【０２３４】
好ましくは、検出などが行われるプロテアーゼ阻害剤はエラフィンである。「より大きい」および「増大した」および「増強された」の用語が、活性、プロテアーゼ感受性、発現などに関連して使用される場合、これらは、同じ患者または別人に由来する正常な非疾患上皮の対応する性質に対して相対的であることが理解される。同様に、「より低い」および「低下した」および「減少した」の用語は、正常な非疾患上皮に対する相対的なレベルを示すものとする。
【０２３５】
本明細書に記載される方法および組成物に好適な診断方法の具体的な非限定的な例が下記に示される。
【０２３６】
遺伝子診断試験を、目的とする疾患に関連するＳＮＰについて、コルネオデスモソームタンパク質（例えば、コルネオデスモソーム）およびプロテアーゼ（ＳＣＣＥ、ＳＣＴＥ）およびプロテアーゼ阻害剤（すなわち、ＳＫＡＬＰ、ＳＬＰＩ）をコードする遺伝子の遺伝子型を決定することによって行うことができる。変異および／または多型に隣接する配列に対応するプライマーが設計される。プロテアーゼ（ＳＣＣＥ、ＳＣＴＥ）およびプロテアーゼ阻害剤（すなわち、ＳＫＡＬＰ、ＳＬＰＩ）の遺伝子の配列は、例えば、Ｇｅｎｅ  ＪｏｃｋｅｙＩＩソフトウエア（Ｂｉｏｓｏｆｔ、４９Ｂａｔｅｍａｎ  Ｓｔｒｅｅｔ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＣＢ２  １ＩＬ）を使用して各エキソンの両端におけるプライマーを設計するために使用することができる。ＰＣＲ増幅後、変異を、制限酵素を使用する対立遺伝子識別によって、ＴａｑＭａｎ分析（下記に記載）によって、または単に配列決定することによって検出することができる。
【０２３７】
簡単に記載すると、２５μｌのＰＣＲ反応液には、８％グリセロール、各２００μＭのｄＡＴＰおよびｄＧＴＰおよびｄＣＴＰ、４００μＭのｄＵＴＰ、１．２５ＵのＡｍｐｌｉｔａｑＧｏｌｄ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ、米国）、１．２５Ｕのウラシル−Ｎ−グリコシラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ、米国）、５ｍＭのＭｇＣｌ２、５００ｎＭ〜９００ｎＭの各プライマーが含まれた。これらの遺伝子座における対立遺伝子識別は、有効性が広範囲に認められている方法である５’ヌクレアーゼアッセイ（ＴａｑＭａｎ（商標）対立遺伝子識別試験）を使用して行われる。この試験は、Ｔａｑポリメラーゼの５’ヌクレアーゼ活性と、ＰＣＲ時にいずれかの対立遺伝子にハイブリダイゼーションするように設計された２つのプローブの切断の蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）による検出とに基づいている。二重蛍光プローブがＡＢＩ−ＰＥ（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ；Ｗａｒｒｉｎｇｔｏｎ、英国）によって提供される。プローブおよびプライマーの様々な配列が設計され、そしてプローブは５’末端がカルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）およびカルボキシ−４，７，２’，７’−テトラクロロフルオレセイン（ＴＥＴ）の蛍光色素で標識され、そして３’末端が消光基のカルボキシテトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）で標識される。ＦＡＭプローブおよびＴＥＴプローブの濃度は、使用されるプローブに依存して、それぞれ、２０ｎＭ〜５０ｎＭおよび５０ｎＭ〜３５０ｎＭの範囲であった。プレートは、ＬＳ５０−Ｂ蛍光計またはＰＥ７２００蛍光計（ＡＢＩ／Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）で走査される。
【０２３８】
本明細書中で使用される用語「ポリメラーゼ連鎖反応」または用語「ＰＣＲ」は、Ｍｕｌｌｉｓらの特許（米国特許第４，６８３，１９５号および同第４，６８３，２０２号）に記載されるＰＣＲ手法を示す。この手法は、基本的には、（１）抽出されたＤＮＡを処理して、一本鎖の相補的な鎖を形成させること；（２）プライマー対の一方がセンス鎖内の配列の一部に対して実質的に相補的であり、各プライマー対のもう一方が相補的なアンチセンス鎖内の同じ配列の異なる部分に対して実質的に相補的である１対のヌクレオチドプライマーを加えること；（３）対形成したプライマーを相補的な配列にアニーリングさせること；（４）アニーリングさせたプライマーを各プライマーの３’末端から同時に伸長させて、各プライマーにアニーリングした鎖に相補的な伸長生成物を合成すること、この場合、前記伸長生成物は、相補体から分離された後、各プライマー対のもう一方に対する伸長生成物を合成するためのテンプレートとして役立つ；（５）前記伸長生成物を前記テンプレートから分離して、一本鎖分子を作製すること；および（６）前記のアニーリング工程および伸長工程および分離工程を少なくとも１回繰り返すことによって前記一本鎖分子を増幅することを伴う。
【０２３９】
生化学的な診断試験には、タンパク質分解プロフィル、Ｎ／Ｃ末端に対するスクリーニング、酵素機能および／または酵素活性に対するスクリーニングが含まれる。
【０２４０】
タンパク質分解プロフィルは下記のように行うことができる。コルネオデスモシンの全長形態および成熟形態を認識することができるポリクローナル抗体が作製される。角質層抽出物を、患者から得られたストリップから抽出することができる。タンパク質抽出物はＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで泳動され、メンブランに転写され、そして一次抗コルネオデスモシン抗体および標識された二次抗体でハイブリダイゼーションされる。患者のプロセシングされたコルネオデスモシンの分子量が、コントロールに由来するコルネオデスモシンの分子量と比較される。
【０２４１】
Ｎ／Ｃ末端に対するスクリーニングは下記のように行うことができる。特定の形態のデスモソーム／コルネオデスモソームタンパク質（例えば、コルネオデスモシン）が、コントロールではなく、患者群に存在する場合、または逆の場合、Ｎ／Ｃ末端に特異的な抗体を、病原性形態のデスモソーム／コルネオデスモソームタンパク質（例えば、コルネオデスモシン）を検出するために製造することができる。病原性形態の同定は下記のように行うことができる。種々の形態のコルネオデスモシンが、ヒト表皮の非変性低浸透圧緩衝液抽出物（ＴＥＡ緩衝液抽出物）から、アニオン交換クロマトグラフィーおよびアフィニティークロマトグラフィーによって精製される（Ｓｉｍｏｎら、１９９７）。アフィニティーカラムからの溶出画分がまとめられ、凍結乾燥されて、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離される。病原性形態のコルネオデスモシンに対応するバンドが切り出され、内部アミノ酸配列分析およびＮＨ２末端アミノ酸分析によって特徴づけられる。
【０２４２】
酵素の機能／活性に対するスクリーニングは下記のように行うことができる。
【０２４３】
デスモソーム／コルネオデスモソームタンパク質（例えば、コルネオデスモシン）が、ｃＤＮＡからのインビトロ翻訳のときに放射能標識され、そしてプロテアーゼ酵素（ＳＣＣＥ、ＳＣＴＥ）と３７℃で１．５時間〜３時間インキュベーションされる。ＳＣＣＥおよびＳＣＴＥは、Ｅｇｅｌｒｕｄ（１９９３）そしてＢｒａｔｔｓａｎｄおよびＥｇｅｌｒｕｄ（１９９９）（Ｅｇｅｌｒｕｄ、１９９３；ＢｒａｔｔｓａｎｄおよびＥｇｅｌｒｕｄ、１９９９）によって記載されるように、分離された足底角質細胞のＫＣｌ抽出物を使用して調製することができる。ＳＣＣＥは、ＳＢＴＩアフィゲル１５でのアフィニティークロマトグラフィーによって精製することができる。代わりの方法は、融合タンパク質をインビトロで製造し、そして免疫アフィニティーカラムを使用して精製することである（Ｅｋｈｏｌｍら、２０００）。ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびオートラジオグラフィーが、加水分解ペプチドのパターンを分析するために使用される。オートラジオグラフィーバンドの強度がデンシトメーターによって定量化され、そして５６ｋＤａ（全長）未満のペプチドの割合が計算される。活性は、１秒あたり１ｇの酵素によってプロセシングされた基質のモル数として表される。
【０２４４】
デスモソームおよびコルネオデスモソーム
デスモソームは、上皮細胞間の円盤形状の細胞間接合部を形成する対称的な構造体である。表皮において、デスモソームは角化細胞間の接着を媒介する。乾癬、様々な魚鱗癬および皮膚乾燥症では、コルネオデスモソーム（表皮の上部層にけるデスモソーム）の数が角質層において増大する。免疫電子顕微鏡観察が、細胞外コアドメインのタンパク質（デスモグレインおよびデスモコリンなど）と細胞間のコルネオデスモソームタンパク質（デスモプラキンＩおよびＩＩ、プラコグロビン（ＰＧ）およびプラコフィリン（ＰＰ）を含む）との間のコルネオデスモソーム内の相互作用を明らかにするために使用されている（ＣｏｗｉｎおよびＢｕｒｋｅ、１９９６）。表皮の一体性におけるコルネオデスモソームタンパク質の重要性が、デスモプラキンのハプロタイプ不全により生じる掌蹠角皮症の線条サブタイプなどの遺伝する障害によって明らかにされている（Ａｒｍｓｔｒｏｎｇら、１９９９）。ロリクリン遺伝子における変異はカミサ（Ｃａｍｉｓａ）角皮症を生じさせる。コルネオデスモシンはコルネオデスモソームの糖タンパク質である。３３〜３６ｋＤａから４０〜４６ｋＤａおよび５２〜５６ｋＤａの異なる分子量を有するコルネオデスモシンの３つの形態が表皮から単離されている（Ｓｉｍｏｎら、１９９７）。
【０２４５】
ＭＨＣ表皮遺伝子クラスター（染色体６ｐ２１）内のコルネオデスモシン／Ｓ遺伝子および関連遺伝子における変異は角質細胞間の低下した密着をもたらす。
【０２４６】
スクリーニングアッセイ
本明細書に記載される接着タンパク質およびプロテアーゼおよびプロテアーゼ阻害剤は、ポリペプチドと結合し、かつポリペプチドの活性化を活性化する化合物（アゴニスト）、またはポリペプチドの活性化を阻害する化合物（アンタゴニスト）に対するスクリーニングプロセスにおいて用いることができる。従って、接着タンパク質およびプロテアーゼおよびプロテアーゼ阻害剤はまた、例えば、細胞、無細胞調製物、化学ライブラリーおよび天然産物混合物における小分子の基質およびリガンドの結合を評価するために使用することができる。これらの基質およびリガンドは天然の基質およびリガンドであってもよく、または構造的模倣体もしくは機能的模倣体であってもよい。Ｃｏｌｉｇａｎら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１（２）：第５章（１９９１）を参照のこと。
【０２４７】
接着タンパク質およびプロテアーゼおよびプロテアーゼ阻害剤は、第Ｉ群疾患および第ＩＩ群疾患などの炎症性皮膚疾患を含む皮膚疾患などの多くの病理を含む多くの生物学的機能を担っている。従って、接着タンパク質およびプロテアーゼおよびプロテアーゼ阻害剤を刺激するか、一方では接着タンパク質およびプロテアーゼおよびプロテアーゼ阻害剤の機能を阻害し得る化合物および薬物を見出すことが望まれる。従って、アゴニストおよびアンタゴニストが、本明細書に開示される第Ｉ群疾患および／または第ＩＩ群疾患のいずれかに対する治療目的および予防目的のために用いられる。
【０２４８】
接着タンパク質およびプロテアーゼおよびプロテアーゼ阻害剤と相互作用し得ると考えられる候補化合物の合理的な設計は、本発明によるポリペプチドの分子形状の構造的研究に基づく場合がある。どの部位が特定の他のタンパク質と相互作用するかを決定するための１つの手段が物理的な構造決定であり、例えば、Ｘ線結晶学および二次元ＮＭＲ技術である。これらは、どのアミノ酸残基が分子の接触領域を形成するかに関する指針を提供する。タンパク質構造決定の詳細な説明については、例えば、ＢｌｕｎｄｅｌｌおよびＪｏｈｎｓｏｎ（１９７６）、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）を参照のこと。
【０２４９】
合理的な設計に代わる方法では、接着タンパク質またはプロテアーゼまたはプロテアーゼ阻害剤をその表面に発現する適切な細胞を作製することを一般には伴うスクリーニング法が使用される。そのような細胞には、動物、酵母、ショウジョウバエまたは大腸菌に由来する細胞が含まれる。ポリペプチドを発現する細胞（または発現したポリペプチドを含有する細胞膜）は、その後、結合、または機能的応答の刺激もしくは阻害を観測するために試験化合物と接触させられる。例えば、アフリカツメガエル卵母細胞に、接着タンパク質およびプロテアーゼおよびプロテアーゼ阻害剤またはポリペプチドのいずれか１つまたは複数をコードするｍＲＮＡを注入することができ、そして試験化合物にさらされることにより誘導される電流を、電圧クランプの使用によって測定することができる。これは、どこかにさらに詳しく記載されるように測定される。
【０２５０】
候補化合物がタンパク質（特に、抗体またはペプチド）である場合、候補化合物のライブラリーを、ファージディスプレー技術を使用してスクリーニングすることができる。ファージディスプレーは、組換えバクテリオファージを利用する分子的スクリーニングプロトコルである。この技術には、それぞれのファージまたはファージミドが特定の候補化合物を発現するように、候補化合物のライブラリーに由来する１つの化合物をコードする遺伝子でバクテリオファージを形質転換することが含まれる。形質転換されたバクテリオファージ（これは好ましくは固体支持体に固定される）は適切な候補化合物を発現し、その候補化合物をそのファージ外被に提示する。本発明のポリペプチドまたはペプチドに結合することができる特異的な候補化合物が、アフィニティー相互作用に基づく選択法によって濃縮される。成功した候補因子は、その後、特徴づけが行われる。ファージディスプレーは、標準的なアフィニティーリガンドスクリーニング技術を上回る利点を有する。ファージの表面には、候補因子が、その天然に存在する立体配座に非常に類似する三次元立体配置で提示される。これにより、より特異的で、そしてより大きい親和性の結合がスクリーニング目的のために可能になる。
【０２５１】
化合物のライブラリーをスクリーニングする別の方法では、化合物のライブラリーを発現させる組換えＤＮＡ分子で安定的に形質転換されている真核生物宿主細胞または原核生物宿主細胞が利用される。そのような細胞は、生存可能な形態または固定された形態のいずれかで、標準的な結合−パートナーアッセイのために使用することができる。Ｐａｒｃｅら（１９８９）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４６：２４３〜２４７；Ｏｗｉｃｋｉら（１９９０）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８７：４００７〜４０１１もまた参照のこと。これらには、細胞応答を検出する高感度な方法が記載される。競合的アッセイは、化合物のライブラリーを発現する細胞が、本発明のＢＡＣＨポリペプチドに結合することが知られている標識された抗体（１２５Ｉ−抗体など）と、そして結合する組成物に対するその結合親和性が測定されている候補化合物などの試験サンプルと接触させられるか、またはそれらとインキュベーションされる場合には特に有用である。ポリペプチドに対する結合した標識結合パートナーおよび遊離の標識結合パートナーが、その後、結合の程度を評価するために分離される。結合した試験サンプルの量は、ポリペプチドに結合している標識抗体の量に逆比例する。
【０２５２】
多数の技術のいずれか１つを使用して、結合の程度を評価するために、結合した結合パートナーを遊離の結合パートナーから分離することができる。この分離工程は、典型的には、フィルターへの接着、その後の洗浄、またはプラスチックへの接着、その後の洗浄、または細胞膜の遠心分離などの手順を伴うことができる。
【０２５３】
さらに別の方法は、例えば、形質転換された真核生物宿主細胞または原核生物宿主細胞から抽出され、可溶化されたポリペプチドもしくはペプチド、または非精製のポリペプチドもしくはペプチド、または可溶化された精製ポリペプチドもしくは精製ペプチドを使用することである。これは、増大した特異性、自動化できること、および大きい薬物試験処理能という利点を有する「分子」結合アッセイを可能にする。
【０２５４】
候補化合物のスクリーニングに関する別の技術は、例えば、本発明のポリペプチドに対する好適な結合親和性を有する新しい化合物に対する高処理能スクリーニングをもたらす方法を伴い、これは、国際特許出願公開ＷＯ８４／０３５６４（Ｃｏｍｍｏｎｗｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｕｍ  Ｌａｂｓ．、１９８４年９月１３日公開）に詳しく記載される。最初に、非常に多数の異なる小さいペプチド試験化合物が固体基体（例えば、プラスチックピンまたはいくつかの他の適切な表面）において合成される；Ｆｏｄｏｒら（１９９１）を参照のこと。その後、すべてのピンが本発明の可溶化されたポリペプチドと反応させられ、洗浄される。次の段階では、結合したポリペプチドを検出することが含まれる。このようにして、ポリペプチドと特異的に相互作用する化合物が同定される。
【０２５５】
リガンド結合アッセイは、薬理学を確認するための直接的な方法を提供し、高処理能形式に適合させることができる。ポリペプチドに対する精製されたリガンドは、結合研究のために高比活性（５０〜２０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）に放射能標識することができる。その場合、放射能標識プロセスがその結合パートナーに対するリガンドの活性を損なっていないということの確認が行われる。緩衝液、イオン、ｐＨおよび他の調節因子（ヌクレオチドなど）に対するアッセイ条件が、膜供給源および全細胞供給源の両方について実用的なシグナル対ノイズ比を確立するために最適化される。このようなアッセイの場合、特異的な結合は、［総結合放射能］−［過剰な非標識競合リガンドの存在下で測定された放射能］として定義される。可能な場合には、２つ以上の競合リガンドが、残存する非特異的な結合を明らかにするために使用される。
【０２５６】
アッセイでは、単純に候補化合物の結合を試験することができる。この場合、ポリペプチドを有する細胞に対する結合が、候補化合物と直接的もしくは間接的に結合した標識によって検出されるか、または標識された競合剤との競合を伴うアッセイにおいて検出される。さらに、これらのアッセイでは、候補化合物が、ポリペプチドに結合することによって生じるシグナルをもたらすかどうかを、ポリペプチドをその表面に有する細胞に適切な検出システムを使用して試験することができる。活性化の阻害剤が、一般には、既知のアゴニストの存在下でアッセイされ、そして候補化合物が存在することによる、アゴニストによる活性化に対する影響が観測される。
【０２５７】
さらに、これらのアッセイは、単純に、候補化合物を、接着タンパク質またはプロテアーゼまたはプロテアーゼ阻害剤を含有する溶液と混合して、混合物を形成する工程、混合物における関連タンパク質の活性を測定する工程、および混合物の活性を標準物と比較する工程を含むことができる。
【０２５８】
接着タンパク質およびプロテアーゼおよびプロテアーゼ阻害剤をコードするｃＤＮＡ、タンパク質、ならびにタンパク質に対する抗体はまた、細胞におけるｍＲＮＡおよびタンパク質の産生に対する添加された化合物の影響を検出するアッセイを組み立てるために使用することができる。例えば、ＥＬＩＳＡを、この分野で知られている標準的な方法によってモノクローナル抗体およびポリクローナル抗体を使用して、接着タンパク質およびプロテアーゼおよびプロテアーゼ阻害剤の分泌レベルまたは細胞結合レベルを測定するために構築することができ、そしてこれは、好適に操作された細胞または組織から、接着タンパク質またはプロテアーゼまたはプロテアーゼ阻害剤の産生を阻害または増強し得る因子（これはまた、それぞれ、アンタゴニストまたはアゴニストと呼ばれる）を発見するために使用することができる。スクリーニングアッセイを行うための様々な標準的な方法がこの分野では十分に理解されている。
【０２５９】
接着タンパク質およびプロテアーゼおよびプロテアーゼ阻害剤の潜在的なアンタゴニストの例には、抗体、あるいは場合により、ヌクレオチドおよびそのアナログ（プリン類およびプリンアナログを含む）、オリゴヌクレオチド、あるいは接着タンパク質またはプロテアーゼまたはプロテアーゼ阻害剤のリガンドに非常に関連するタンパク質、例えば、リガンドのフラグメント、あるいはポリペプチドに結合するが、応答を誘発せず、その結果、ポリペプチドの活性が阻止されるようする小さい分子が含まれる。
【０２６０】
従って、本発明はまた、本発明の接着タンパク質またはプロテアーゼまたはプロテアーゼ阻害剤および／またはペプチドに対して特異的に結合することができる化合物を提供する。
【０２６１】
用語「化合物」は、生物学的高分子（例えば、核酸、タンパク質、非ペプチドまたは有機分子）などの化学的化合物（天然に存在するか、または合成される）、または細菌、植物、菌類もしくは動物（特に哺乳動物）の細胞もしくは組織などの生物学的材料から作製される抽出物、または無機の元素もしくは分子を示す。好ましくは、化合物は抗体である。
【０２６２】
そのようなスクリーニングが行われるために必要な材料はスクリーニングキットに包装することができる。そのようなスクリーニングキットは、接着タンパク質およびプロテアーゼおよびプロテアーゼ阻害剤のポリペプチドについて、あるいは接着タンパク質およびプロテアーゼおよびプロテアーゼ阻害剤のポリペプチドの産生を低下または増強させる化合物について、アゴニスト、アンタゴニスト、リガンド、受容体、基質、酵素などを同定するために有用である。スクリーニングキットは、（ａ）接着タンパク質またはプロテアーゼまたはプロテアーゼ阻害剤のポリペプチド；（ｂ）そのようなポリペプチドを発現する組換え細胞；（ｃ）そのようなポリペプチドを発現する細胞膜；または（ｄ）そのようなポリペプチドに対する抗体を含む。スクリーニングキットは、場合により、使用に関する説明書を含むことができる。
【０２６３】
プロテアーゼの基質を、プロテアーゼ活性を調節することができる分子をアッセイするために使用することができる。例えば、ＳＣＣＥの活性を調節することができる分子を同定するためのアッセイでは、基質Ｓ−２５８６（ＭｅＯ−Ｓｕｃ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−ｐＮＡ）が用いられる。Ｓ−２５８６は、切断されたときに４０５ｎｍで吸収する。このアッセイでは、ＳＣＣＥおよびＳ−２５８６は候補分子とともにインキュベーションされ、４０５ｎｍにおける吸光度が、基質の切断を検出するために検出される。ＳＣＣＥおよび他のプロテアーゼの阻害剤として使用される好適な候補分子には、４０５ｎｍにおける吸光度を減少させる分子が含まれる。
【０２６４】
発現ベクター
本発明者らは、接着タンパク質またはプロテアーゼまたはプロテアーゼ阻害剤の遺伝子の核酸配列、およびその一部分、ならびに第１群疾患および／または第２群疾患に関連するそのようなタンパク質の様々な形態の発現をもたらす変異配列に機能的に連結された発現制御配列を含むベクターを提供する。本発明者らはさらに、好適な真核生物細胞および原核生物細胞から選択された宿主細胞で、このようなベクターで形質転換されている宿主細胞を提供する。
【０２６５】
本明細書に記載される方法および組成物を使用する際、適切なベクターを使用して、大腸菌を含む宿主細胞を形質転換し、その結果、接着タンパク質またはプロテアーゼまたはプロテアーゼ阻害剤の転写物に由来する組換えＤＮＡ配列、またはその正常な形態での完全な転写物を含有する組換えＤＮＡ配列、またはＤＮＡの点変異、欠失、挿入もしくは再編成を含む変異した配列を含有する組換えＤＮＡ配列を有するようにすることが可能である。そのような形質転換細胞により、関連する遺伝子の機能および調節の研究が可能になる。組換え的に形質転換された宿主細胞の使用により、接着タンパク質およびプロテアーゼおよびプロテアーゼ阻害剤の調節機構の研究が可能になり、そして特に、接着タンパク質またはプロテアーゼまたはプロテアーゼ阻害剤の遺伝子領域における変異によって妨げられる遺伝子機能の研究が可能になる。
【０２６６】
様々なベクターが知られているか、または当業者によって構築され得るが、これらは、配列の所望する転写を達成するために必要なすべての発現エレメントを含むことが望ましい。他の有益な特徴もまたベクターに含めることができ、例えば、核酸を回収するための機構などを異なる形態でベクターに含めることができる。ファージミドは、プラスミドとして、またはバクテリオファージベクターとして、そのいずれでも使用することができるので、そのような有益なベクターの具体的な例である。他のベクターの例には、バクテリオファージおよびバキュロウイルスおよびレトロウイルスなどのウイルス、ＤＮＡウイルス、コスミド、プラスミド、ならびに他の組換えベクターが含まれる。ベクターはまた、原核生物宿主系または真核生物宿主系のどちらでも使用されるエレメントを含有することができる。当業者は、どの宿主系が特定のベクターと適合し得るかを理解している。
【０２６７】
ベクターは、この分野における様々な知られている方法のいずれかによって細胞内または組織内に導入することができる。そのような方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９２）；Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ、Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ、Ｍｄ、１９８９）；Ｃｈａｎｇら、Ｓｏｍａｔｉｃ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ（ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ、Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ、Ｍｉｃｈ、１９９５）；Ｖｅｇａら、Ｇｅｎｅ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ（ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ、Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ、Ｍｉｃｈ、１９９５）；Ｇｉｌｂｏａら（１９８６）に一般的に記載されて見出すことができ、そしてそのような方法には、例えば、安定的または一過性のトランスフェクション、リポフェクション、エレクトロポレーション、および組換えウイルスベクターによる感染が含まれる。感染による核酸の導入は、それ以外の記載された方法を上回る利点をもたらす。より大きい効率を、その感染性のために得ることができる。米国特許第５，４８７，９９２号および同第５，４６４，７６４号もまた参照のこと。そのうえ、ウイルスは非常に特殊化されており、典型的には特定の細胞タイプにおいて感染し、増殖する。従って、その自然の特異性を、インビボで、または組織内もしくは細胞の混合培養物内において、ベクターを特定の細胞タイプに標的化するために使用することができる。ウイルスベクターはまた、受容体媒介事象による標的特異性を変化させるために、特異的な受容体またはリガンドで改変することができる。
【０２６８】
この分野で知られている組換え方法はまた、標的核酸のセンス阻害またはアンチセンス阻害または三重鎖阻害を達成するために使用することができる。例えば、アンチセンス核酸を含有するベクターを、タンパク質またはアンチセンスメッセージを発現させて、標的核酸の発現を低下させ、従ってその活性を低下させるために用いることができる。
【０２６９】
アンチセンス核酸を導入し、発現させるためのＤＮＡウイルスベクターの具体的な例には、アデノウイルス由来ベクターのＡｄｅｎｏｐ５３ＴＫがある。このベクターは、正または負のいずれかの選択のためのヘルペスウイルスのチミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子、およびアンチセンス配列などの所望する組換え配列に対する発現カセットを発現する。このベクターは、アデノウイルス受容体を有する細胞に感染させるために使用することができる。このベクターは、類似した所望の機能を示す他のベクターと同様に、細胞の混合集団（例えば、インビトロまたはエクスビボでの細胞培養物を含む）、組織、またはヒト被験体を処理するために使用することができる。
【０２７０】
さらなる特徴を、その安全性を保証し、かつ／またはその治療効率を高めるために、ベクターに加えることができる。そのような特徴には、例えば、組換えウイルスに感染した細胞に対する負の選択を行うために使用され得るマーカーが含まれる。そのような負の選択マーカーの例には、抗ウイルス剤ガンシクロビルに対する感受性を与える上記のＴＫ遺伝子がある。従って、負の選択は、抗生物質の添加により誘導可能な自殺をもたらすので、感染が制御され得る手段である。そのような保護は、例えば、ウイルスベクターまたはウイルス配列の変化した形態をもたらす変異が生じる場合、細胞の形質転換が生じないことを保証する。特定の細胞タイプに対して発現を制限する特徴もまた含めることができる。そのような特徴には、例えば、所望する細胞タイプに対して特異的であるプロモーターおよび調節エレメントが含まれる。
【０２７１】
組換えウイルスベクターは、側方感染および標的化特異性などの利点をもたらすので、所望する核酸をインビボで発現させるための有用なベクターの別の例である。側方感染は、例えば、レトロウイルスの生活環において固有であり、出芽して、隣の細胞に感染する多数の子孫ビリオンを１個の感染細胞がもたらすプロセスである。その結果は、そのほとんどが最初のウイルス粒子によって最初に感染しなかった広い面積が迅速に感染するということである。これは、感染性因子が娘子孫を介して広がるだけである垂直型の感染とは対照的である。側方に伝播することができないウイルスベクターもまた製造することができる。この特性は、所望する目的が、指定された遺伝子を局在化された数の標的化された細胞にだけ導入することであるならば、有用である場合がある。
【０２７２】
上記に記載されるように、ウイルスは、多くの場合には宿主の防御機構を免れるために進化してきた非常に特殊化した感染性因子である。典型的には、ウイルスは特定の細胞タイプにおいて感染し、増殖する。ウイルスベクターの標的化特異性は、所定の細胞タイプを特異的に標的化し、それにより組換え遺伝子を感染細胞に導入するためのその自然の特異性を利用している。本明細書に記載される方法において使用されるベクターは、標的化される所望する細胞タイプに依存する。例えば、上皮細胞に対して特異的なベクターを、皮膚疾患を処置するために使用することができる。同様に、肺の疾患または病理学的状態を処置しようとする場合、肺細胞およびその前駆体に対して、好ましくは肺細胞の特定タイプに対して特異的であるウイルスベクターを使用することが望ましい。
【０２７３】
レトロウイルスベクターを、感染性粒子として機能するように、または感染の最初の１回だけを経るように構築することができる。前者の場合、ウイルスのゲノムは、新しいウイルスのタンパク質およびＲＮＡを合成するために、すべての必要な遺伝子および調節配列およびパッケージングシグナルが維持されるように改変される。これらの分子が合成されると、宿主細胞はＲＮＡを新しいウイルス粒子にパッケージングし、このウイルス粒子はさらなる感染ラウンドを経ることができる。ベクターのゲノムはまた、所望する組換え遺伝子をコードし、かつ発現させるように操作される。非感染性ウイルスベクターの場合、ベクターのゲノムは、通常、ＲＮＡをウイルス粒子にカプセル化するために要求されるウイルスのパッケージングシグナルを破壊するように変異させられる。そのようなシグナルがない場合、形成された粒子はどれもゲノムを含有せず、従って、その後の感染ラウンドを進行させることができない。特定タイプのベクターは、意図される適用に依存する。実際のベクターもまた知られており、これらはこの分野では容易に得ることができ、または十分に知られている方法を使用して当業者によって構築することができる。
【０２７４】
ウイルスベクターが使用される場合、その手順は、その標的特異性を利用することができ、従って、疾患部位において局所的に投与する必要はない。しかし、局所的な投与は、より早く、かつより効果的な処置をもたらすことができ、投与はまた、例えば、対象への静脈内注射または皮下注射によって行うことができる。脊髄液内へのウイルスベクターの注射もまた、特に神経変性疾患の場合には投与モデルとして使用することができる。注射後、ウイルスベクターは、感染に必要な適切な標的特異性を有する宿主細胞を認識するまで循環する。
【０２７５】
リポソームなどのトランスフェクションビヒクルもまた、上記に記載される非ウイルスベクターを接種領域内の受容細胞に導入するために使用することができる。そのようなトランスフェクションビヒクルは当業者によって知られている。
【０２７６】
トランスジェニック生物
本発明者らはさらに、第１群疾患および第２群疾患の表現型徴候を示すトランスジェニック生物およびノックアウト生物の構築を開示する。
【０２７７】
従って、本発明者らは、トランスジェニック型コルネオデスモシン遺伝子および変異型コルネオデスモシン遺伝子の動物モデルおよび細胞（細胞株）モデルならびにノックアウトモデルを提供する。トランスジェニックモデルには、第１群疾患および第２群疾患に関連する遺伝子の変異だけでなく、コルネオデスモシン配列を有するモデルが含まれる。本発明者らはさらに、接着タンパク質またはプロテアーゼまたはプロテアーゼ阻害剤のトランスジェニック型遺伝子および／または変異型遺伝子を含み、かつ／または発現する動物モデルおよび細胞（細胞株）モデル、ならびにノックアウトモデルを提供する。トランスジェニックモデルには、第１群疾患および第２群疾患に関連する遺伝子の変異だけでなく、接着タンパク質またはプロテアーゼまたはプロテアーゼ阻害剤の配列を有するモデルが含まれる。
【０２７８】
これらのモデルは、この分野で知られている標準的な方法を使用して構築されるが、そのような方法は、この分野で知られており、そして米国特許第５，４８７，９９２号、同第５，４６４，７６４号、同第５，３８７，７４２号、同第５，３６０，７３５号、同第５，３４７，０７５号、同第５，２９８，４２２号、同第５，２８８，８４６号、同第５，２２１，７７８号、同第５，１７５，３８５号、同第５，１７５，３８４号、同第５，１７５，３８３号、同第４，７３６，８６６号、ならびにＢｕｒｋｅおよびＯｌｓｅｎ（１９９１）、Ｃａｐｅｃｃｈｉ（１９８９）、Ｄａｖｉｅｓら（１９９２）、Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎら（１９９３）、Ｈｕｘｌｅｙら（１９９１）、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら（１９９３）、Ｌａｍｂら（１９９３）、Ｒｏｔｈｓｔｅｉｎ（１９９１）、Ｓｃｈｅｄｌら（１９９３）、Ｓｔｒａｕｓｓら（１９９３）に示される。さらに、国際特許出願公開ＷＯ９４／２３０４９、同ＷＯ９３／１４２００、同ＷＯ９４／０６９０８、同ＷＯ９４／２８１２３にもまた情報が提供される。一般的には、Ｈｏｇａｎら、「Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｅｍｂｒｙｏ」、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（第２版、１９９４）もまた参照のこと。
【０２７９】
遺伝子診断
本発明者らは、第１群疾患または第２群疾患を引き起こす原因となるか、あるいはコルネオデスモシンなどの接着タンパク質のタンパク質分解の異常な調節に関連する、接着タンパク質またはプロテアーゼまたはプロテアーゼ阻害剤の遺伝子の欠陥の保因者を診断および検出するための方法を開示する。
【０２８０】
本発明者らはさらに、遺伝子の正常な複製体およびその遺伝子産物を検出するための方法を提供する。それらの欠陥遺伝子によって、またはそれらによりコードされるそれらの不明なタンパク質もしくは欠陥タンパク質によって、そのいずれかで保因者を同定することにより、遺伝子保因者の診断が、より早期に、かつより一貫してもたらされる。従って、疾患の保因者は第１群疾患または第２群疾患に罹りやすい可能性がより大きいので、調査および処置のより良好なプロトコルをそれらに対して開始することができる。
【０２８１】
簡単に記載すると、これらの方法は、サンプルを試験対象から得る工程、適切な試験材料をサンプルから単離する工程、および標的の核酸配列または遺伝子産物についてアッセイする工程を含む。サンプルは、この分野で標準的な方法を使用して遺伝物質および／またはタンパク質が単離される組織または体液であり得る。例えば、ＤＮＡを血液から単離することができる。
【０２８２】
より具体的には、保因者の検出方法は、対象から細胞または体液のいずれかのサンプルを最初に得ることによって行われる。細胞性サンプルを得るための好都合な方法には、口内洗浄液または毛根のいずれかを集めることが含まれ得る。細胞サンプルには、出生前診断の場合には羊膜または胎盤の細胞または組織を挙げることができる。粗ＤＮＡを、この分野で十分に知られている技術によって細胞から作製することができる（あるいはタンパク質を単離することができる）。この単離されたＤＮＡは、その後、この分野で十分に知られている技術によって遺伝子配列に由来する適切なプライマーを用いたＰＣＲ分析のために使用される（あるいはタンパク質についてはウエスタンブロット分析が使用される）。ＰＣＲ産物は、その後、対象の遺伝子型疾患状態を評価するために適切な配列変化の存在について試験される。
【０２８３】
試料は、免疫組織化学的染色および免疫細胞化学的染色（一般的には、ＳｔｉｔｅｓおよびＴｅｒｒ、Ｂａｓｉｃ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ａｐｐｌｅｔｏｎ  ａｎｄ  Ｌａｎｇｅ、１９９４）を参照のこと）、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、免疫ブロット、ウエスタンブロッティング、免疫沈殿、機能的アッセイ、そしてタンパク質短縮試験によってポリペプチド／タンパク質についてアッセイすることができる。好ましい実施形態において、ウエスタンブロッティング、機能的アッセイおよびタンパク質短縮試験（Ｈｏｇｅｒｖｏｒｓｔら、１９９５）が使用される。標的核酸配列に対して相補的なｍＲＮＡを、インシトゥーハイブリダイゼーション、ノーザンブロッティングおよび逆転写−ポリメラーゼ連鎖反応によってアッセイすることができる。核酸配列は、特異的なプライマーを使用して、インシトゥーハイブリダイゼーション、サザンブロッティング、一本鎖高次構造多型、ＰＣＲ増幅、およびＤＮＡチップ分析によって同定することができる（Ｋａｗａｓａｋｉ、１９９０；Ｓａｍｂｒｏｏｋ、１９９２；Ｌｉｃｈｔｅｒら、１９９０；Ｏｒｉｔａら、１９８９；Ｆｏｄｏｒら、１９９３；Ｐｅａｓｅら、１９９４）。
【０２８４】
様々なＥＬＩＳＡアッセイが当業者には十分に知られている。ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の両方をこれらのアッセイにおいて使用することができる。適する場合には、放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）などの他の免疫アッセイを、当業者に知られているように使用することができる。様々な利用可能な免疫アッセイが特許および科学文献に幅広く記載される。例えば、米国特許第３，７９１，９３２号、同第３，８３９，１５３号、同第３，８５０，７５２号、同第３，８５０，５７８号、同第３，８５３，９８７号、同第３，８６７，５１７号、同第３，８７９，２６２号、同第３，９０１，６５４号、同第３，９３５，０７４号、同第３，９８４，５３３号、同第３，９９６，３４５号、同第４，０３４，０７４号、同第４，０９８，８７６号、同第４，８７９，２１９号、同第５，０１１，７７１号および同第５，２８１，５２１号、ならびにＳａｍｂｒｏｏｋら（１９９２）を参照のこと。
【０２８５】
本明細書に記載されるような現在の変異データは、第１群疾患および第２群疾患が対立遺伝子の異型遺伝子性によって特徴づけられることを示している。従って、成功した変異スクリーニングは、限定されたサブセットに集中するのではなく、コルネオデスモシンもしくは他の接着タンパク質またはプロテアーゼまたはプロテアーゼ阻害剤の遺伝子におけるすべての可能なヌクレオチド変化を検出できることが重要である。ＰＣＲ増幅されたＤＮＡもしくはＲＮＡの直接的な配列決定またはＤＮＡチップハイブリダイゼーションを含む様々な方法（Ｆｏｄｏｒら、１９９３；Ｐｅａｓｅら、１９９４）を、当業者に知られている他の好適な方法と一緒に適用することができる。
【０２８６】
診断適用のためにそのような方法を使用するために、標的ポリヌクレオチド配列（あるいはタンパク質）の存在の有無を同定するための機構を含めることは好都合である。ハイブリダイゼーションに基づく多くの診断法または実験法では、標識またはタグが、特定のポリヌクレオチド配列の存在の有無を検出または可視化するために使用される。典型的には、オリゴマープローブが、オートラジオグラフィーなどのこの分野で十分に知られている方法によって検出することができる、３２Ｐまたは３５Ｓなどの放射性同位体で標識される（Ｓａｍｂｒｏｏｋ、１９９２）。オリゴマープローブはまた、オートラジオグラフィーにより検出され得る化学発光物質などの非放射能方法によって標識することができる（Ｓａｍｂｒｏｏｋ、１９９２）。また、酵素−基質に基づく標識方法および検出方法を使用することができる。標識は、末端標識（Ｓａｍｂｒｏｏｋ、１９９２）、化学的標識などのこの分野で十分に知られている機構によって、または別の標識されたオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションによって達成することができる。これらの標識方法および検出方法は例として単に示されるだけであり、この分野で知られているすべての方法の完全かつ包括的な列挙を示すことを意味しない。
【０２８７】
検出目的のための標識の導入は、ハイブリダイゼーションの前に、標識をプローブに結合させることによって達成することができる。
【０２８８】
代わりの方法は、プローブを加える前に標的ＤＮＡを固体支持体に結合させる工程を含む。固体支持体は、ビーズ、またはニトロセルロースもしくはナイロンなどのメンブラン材料などの、標的ＤＮＡを結合することができる任意の材料であり得る。標的ＤＮＡが固体支持体に結合させられた後、プローブオリゴマーが加えられる。
【０２８９】
様々な機能的アッセイを、第１群保因者および第２群保因者または罹患者を検出するために使用することができる。
【０２９０】
本発明者らはまた、欠陥コルネオデスモシン遺伝子を診断および検出するためのキットを提供する。キットには、第１群疾患または第２群疾患を引き起こす欠陥コルネオデスモシン遺伝子の遺伝子配列に対して相補的である分子プローブ、および分子プローブと欠陥遺伝子とのハイブリダイゼーションを検出し、それにより欠陥遺伝子の存在を示すための好適な標識が含まれる。分子プローブは、変異配列に対して相補的なＤＮＡ配列を有する。あるいは、キットは、変異タンパク質を検出するための試薬および抗体を含むことができる。
【０２９１】
接着タンパク質またはプロテアーゼまたはプロテアーゼ阻害剤の欠陥遺伝子を診断および検出するためのキットもまた提供される。このキットは、第１群疾患または第２群疾患を引き起こす、接着タンパク質またはプロテアーゼまたはプロテアーゼ阻害剤の欠陥遺伝子の遺伝子配列に対して相補的である分子プローブ、および分子プローブと欠陥遺伝子とのハイブリダイゼーションを検出し、それにより欠陥遺伝子の存在を示すための好適な標識を含む。分子プローブは、変異配列に対して相補的なＤＮＡ配列を有する。あるいは、キットは、変異タンパク質を検出するための試薬および抗体を含むことができる。
【０２９２】
少数の異なる方法が、多型または変異についてＤＮＡを分析するために一般にに使用されている。最も確実な方法は、実際の塩基配列を決定するためにＤＮＡを配列決定することである（ＭａｘａｍおよびＧｉｌｂｅｒｔ、１９９７；Ｓａｎｇｅｒら、１９７７）。そのような方法は最も確実であるが、最も費用がかかり、そして時間を要する方法である。
【０２９３】
制限マッピング分析もまた、多型に関してＤＮＡを分析する際に使用することができる。制限酵素に対する認識部位を変化させる、ある部位における知られている多型を探している場合、多型の存在の有無を明らかにするために、単に、ＤＮＡをこの制限酵素で消化し、そしてフラグメントをゲルにおいて分析するか、またはサザンブロットにより分析することが可能である。このタイプの分析はまた、大きい挿入または欠失の存在の有無を明らかにするためにも有用である。対立遺伝子に特異的なオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションは、知られている多型の存在を明らかにするためのさらに別の方法である。
【０２９４】
このように、個体における特定のＤＮＡ配列、例えば、コルネオデスモシンをコードする遺伝子は、多くの異なる変化、例えば、ＤＮＡ配列の欠失、二重になった配列の挿入、配列の反転、または１ヌクレオチドの別のヌクレオチドへの変換などを受けることがある。特定のＤＮＡ配列における変化は、４ヌクレオチド〜６ヌクレオチドの特定のＤＮＡ配列を認識する制限酵素を使用することによって突き止めることができる。制限酵素は、ＤＮＡをその特定の認識された配列を切断（消化）して、およそ１００万の断片をもたらす。制限酵素によって認識される配列を認識されない配列に変化させる違いが存在するとき、その領域を切断することによって生じるＤＮＡ片はサイズが異なる。従って、所与の領域に由来する様々な可能なフラグメントサイズは、その領域におけるＤＮＡの正確な配列に依存する。生じたフラグメントにおける変化は「制限断片長多型」（ＲＦＬＰ）と名付けられている。種々の変化体ＤＮＡ配列を反映する異なるサイズのフラグメントは、アガロースゲルにおけるそのサイズに従って消化ＤＮＡを分離し、そして放射能標識されたＤＮＡ「プローブ」にアニーリングすることにより個々のフラグメントを可視化することによって可視化することができる。それぞれの個体は２つの異なる形態の特定の配列を有し得る。この２つのホモログが同じ形態の多型を有するとき、１つのバンドが見られる。３つ以上の形態の多型が集団において特定のＤＮＡマーカーについて存在し得るが、１つの家族では、ちょうど４つの形態が可能である；それぞれの親から２つである。子供はそれぞれ、それぞれの親から多型の１つの形態を受け継ぐ。従って、各染色体領域の起源を突き止めることができる（母親起源または父親起源）。
【０２９５】
さらに、ＲＴ−ＰＣＲを行い、その後、制限エンドヌクレアーゼフィンガープリンティング（ＲＥＦ）を行うことができる。ＲＥＦは一本鎖高次構造多型（ＳＳＣＰ）法の改変であり、長さが２ｋｂまでのＤＮＡフラグメントにおける配列変化の効率的な検出を可能にする（ＬｉｕおよびＳｏｍｍｅｒ、１９９５）。
【０２９６】
既知の遺伝子内における多型の存在を検出するための質量分析法の使用が米国特許第５，８６９，２４２号に開示される。
【０２９７】
一本鎖高次構造多型（ＳＳＣＰ）分析は、多型を検出するための迅速かつ有効な方法である（Ｄｅａｎら、Ｃｅｌｌ、６１：８６３、１９９０；ＧｌａｖａｃおよびＤｅａｎ、Ｈｕｍ．Ｍｕｔａｔｉｏｎ、２：４０４、１９９３；Ｐｏｄｕｓｌｏら、Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．４９：１０６、１９９２）。ＳＳＣＰでは、ゲル上における鎖の異常な移動度が遺伝子内の変異事象と関連する。
【０２９８】
多型の遺伝子分析が、特に、米国特許第５，５５２，２８号、同第５，６５４，１３号、同第５，６７０，３３号、同第５，８０７，６７号、同第５，８５８，６６号、同第５，６９１，１５号、同第５，９２２，５７号、同第５，９７２，６０号、同第６，１３６，５３号および同第５，９５５，２６号に詳しく記載される。
【０２９９】
上記参考文献に記載されるこれらの方法はどれは、本明細書に記載される診断方法において使用することができる。
【０３００】
薬学的組成物
本発明者らはさらに、第１群疾患または第２群疾患を処置するための１つ以上の薬剤を含む薬学的組成物を開示する。
【０３０１】
第１群疾患を処置するための薬剤には、プロテアーゼ阻害剤およびそのフラグメントが含まれ、これらには、抗プロテアーゼ活性を含むとして実施例において同定されるプロテアーゼ阻害剤、例えば、抗ロイコプロテアーゼ（ＳＬＰＩ）およびエラフィンプロテアーゼ阻害剤３（ＰＩ３またはＳＫＡＬＰ）などの一次プロテアーゼ阻害剤および／または二次プロテアーゼ阻害剤（キモトリプシン、ダイズトリプシン阻害剤、カテプシンＧなどを含む）、ならびにこの分野で知られている他のプロテアーゼ阻害剤が含まれる。第１群疾患を処置するために有用な他の薬剤には、プロテアーゼ阻害剤のアゴニスト（例えば、上記プロテアーゼ阻害剤のいずれかのアゴニスト）、ならびに角質層キモトリプシン様酵素（ＳＣＣＥ）および／または角質層トリプシン様酵素（ＳＣＴＥ）のアンタゴニストを含むプロテアーゼのアンタゴニストが含まれる。
【０３０２】
第２群疾患を処置するための薬剤には、角質層キモトリプシン様酵素（ＳＣＣＥ）および角質層トリプシン様酵素（ＳＣＴＥ）などのプロテアーゼ、ならびにプロテアーゼのアゴニスト（上記プロテアーゼのいずれかのアゴニストを含む）が含まれる。第２群疾患を処置するための薬剤にはさらに、プロテアーゼ阻害剤のアンタゴニスト、例えば、抗ロイコプロテアーゼ（ＳＬＰＩ）およびエラフィンプロテアーゼ阻害剤３（ＰＩ３またはＳＫＡＬＰ）などのアンタゴニストが含まれる。
【０３０３】
これらの薬剤（１つまたは複数）を含む組成物を単独で投与することは可能であるが、このような有効成分を薬学的配合物として配合することが好ましい。組成物は、このような薬剤（１つまたは複数）、構造的に関連する化合物、またはそれらの酸性塩を含むことができる。薬学的配合物は、効果的な量の薬剤を、１つ以上の薬学的に受容可能なキャリアとともに含む。薬剤の「効果的な量」は、場合によって、第１群疾患または第２群疾患の少なくとも１つの症状を軽減するために十分な量である。効果的な量は、処置または軽減される特定の疾患または症候群、ならびに患者の年齢および体重、疾患などの状態の進行度、患者の全体的な健康状態、症状の重篤度、そして薬剤が単独で、または他の治療剤との組合せで投与されているかどうかを含む他の要因に依存して変化する。
【０３０４】
好適な薬学的に受容可能なキャリアはこの分野では十分に知られており、薬学的配合物の所望する投与形態および投与様式とともに変化する。例えば、薬学的に受容可能なキャリアには、希釈剤または賦形剤、例えば、充填剤、結合剤、湿潤化剤、崩壊剤、表面活性剤、滑剤などを挙げることができる。典型的には、キャリアは、固体キャリア、または液体キャリア、または揮発性キャリア、またはそれらの組合せである。それぞれのキャリアは、配合物内の他の成分との適合性を有し、かつ患者に対して有害でないという意味で「受容可能」でなければならない。キャリアは、宿主に投与されたとき、有害な反応（すなわち、免疫応答）を誘発させることなく生物学的に受容可能でなければならない。
【０３０５】
薬学的組成物には、局所投与および経口投与に好適な組成物が含まれ、患部組織が主に皮膚または表皮である場合（例えば、乾癬および他の表皮疾患）、局所用配合物が好ましい。局所用配合物には、処置される皮膚表面との直接的な接触により組成物が外用適用されるそのような薬学的形態物が含まれる。局所適用される従来の薬学的形態物には、浸液、軟膏、クリーム、ローション、ペースト、ゲル、スティック、スプレー、エアロゾル、浴用オイル、溶液などが含まれる。局所療法は様々なビヒクルによって送達され、ビヒクルの選択は重要であり得るが、一般には、急性または慢性の疾患が処置されるかどうかに関連する。一例として、急性の皮膚増殖疾患は水性の乾燥性調製剤で一般には処置され、これに対して、慢性の皮膚増殖疾患は水和性の調製物で処置される。浸液は、急性の湿性発疹を乾燥させる最も容易な方法である。ローション（水に懸濁された粉末）および溶液（溶媒に溶解された医薬品）は毛領域および間擦性領域に対して理想的である。軟膏または油中水エマルションは最も効果的な水和剤であり、乾燥した鱗状発疹に対して適するが、油性であり、そして病変部位によっては望ましくない場合がある。適する場合、それらは、病変内への薬剤組成物の浸透を増大させることが望ましいときには特に、包帯との組合せで適用することができる。クリームまたは水中油エマルションおよびゲルは吸収性であり、患者に対して最も化粧品的に受容可能である（Ｇｕｚｚｏら、Ｇｏｏｄｍａｎ＆Ｇｉｌｍａｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、第９版、１５９３頁〜１５９５０頁（１９９６））。クリーム配合物は、ワセリン、ラノリン、ポリエチレングリコール、鉱油、グリセリン、パルミチン酸イソプロピル、ステアリン酸グリセリル、セテアリルアルコール、酢酸コトフェリル、ミリスチン酸イソプロピル、ラノリンアルコール、シメチコーン、カルボメン、メチルクロルイソチアゾリノン、メチルイソチアゾリノン、シクロメチコーンおよびヒドロキシプロピルメチルセルロース、ならびにそれらの混合物を一般に含む。
【０３０６】
局所適用される他の配合物には、シャンプー、石鹸、シェイクローションなどが含まれ、頭皮などの基本的な皮膚における残留物を除くために配合された配合物が特に含まれる（Ａｒｎｄｔら、Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ  Ｉｎ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、２：２８３８（１９９３））。
【０３０７】
一般に、局所配合物における薬剤組成物の濃度は組成物の約０．５重量％〜５０重量％であり、好ましくは約１重量％〜３０重量％であり、より好ましくは約２重量％〜２０重量％であり、最も好ましくは約５重量％〜１０重量％である。使用される濃度は、最初はこの範囲の高濃度側部分にすることができるが、処置が続くに従い、濃度を低下させることができ、または配合物の適用頻度を少なくすることができる。局所適用物は、多くの場合、１日２回適用される。しかし、より大きい用量の１日に１回、またはより小さい用量のより頻繁な適用が効果的である場合がある。角質層は薬物のリザーバーとして作用して、成長可能な皮膚層内への長期間にわたる薬物の緩やかな浸透を可能にし得る。
【０３０８】
局所適用物では、所望する薬理学的効果を得るために、十分な量の薬剤が患者の皮膚に浸透しなければならない。皮膚内への薬物の吸収は、薬物の性質、ビヒクルの挙動および皮膚の関数であることが一般には理解されている。３つの主要な変数、すなわち、ビヒクル中の薬物濃度、角質層とビヒクルとの間における薬物の分配係数、および角質層における薬物の拡散係数により、種々の局所用薬物または異なるビヒクルにおける同じ薬物の吸収速度または流束の差異が説明される。処置について効果的であるためには、薬物は、皮膚のバリア機能を担う角質層を横断しなければならない。一般に、大きいインビトロ皮膚浸透を示す局所配合物はインビボにおいて効果的である。Ｏｓｔｒｅｎｇａら（Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．、６０：１１７５〜１１７９（１９７１））は、局所適用されたステロイドのインビボ効力がインビトロにおける採皮されたヒト皮膚内へのステロイド浸透速度に比例することを明らかにしていた。
【０３０９】
皮膚科学的に受容可能であり、薬剤との適合性を有する皮膚浸透増強剤を、皮膚表面から表皮の角化細胞内への活性な化合物の浸透を増大させるために配合物に配合することができる。皮膚内への活性な化合物の吸収を増大させる皮膚増強剤は、効果的な処置のために必要とされる薬剤の量を減らし、そして配合物のより長期にわたる効果をもたらす。皮膚浸透増強剤はこの分野では十分に知られている。例えば、ジメチルスルホキシド（米国特許第３，７１１，６０２号）；オレイン酸、１，２−ブタンジオール界面活性剤（Ｃｏｏｐｅｒ、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．、７３：１１５３〜１１５６（１９８４））；エタノールとオレイン酸またはオレイルアルコールとの組合せ（欧州特許ＥＰ２６７，６１７）、２−エチル−１，３−ヘキサンジオール（国際特許出願公開ＷＯ８７／０３４９０）；デシルメチルスルホキシドおよびアゾン（Ａｚｏｎｅ）（登録商標）（Ｈａｄｇｒａｆｔ、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｄｒｕｇ．Ｍｅｔａｂ．Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔ、２１：１６５〜１７３（１９９６））；アルコール、スルホキシド、脂肪酸、エステル、アゾン（登録商標）、ピロリドン類、尿素およびポリオール（Ｋａｌｂｉｔｚら、Ｐｈａｒｍａｚｉｅ、５１：６１９〜６３７（１９９６））。
【０３１０】
１，８−シネオール、メントン、リモネンおよびネロリドールなどのテルペン（Ｙａｍａｎｅ、Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｙ＆Ｐｈａｒｍｏｃｏｌｏｇｙ、４７：９７８〜９８９（１９９５））；アゾン（登録商標）およびトランスキュトール（Ｔｒａｎｓｃｕｔｏｌ）（Ｈａｒｒｉｓｏｎら、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｒｅｓ．１３：５４２〜５４６（１９９６））；そして、オレイン酸、ポリエチレングリコールおよびプロピレングリコール（Ｓｉｎｇｈら、Ｐｈａｒｍａｚｉｅ、５１：７４１〜７４４（１９９６））は、有効成分の皮膚浸透を改善することが知られている。
【０３１１】
薬剤または組成物の浸透レベルは、当業者に知られている技術によって測定することができる。例えば、活性な化合物を放射能標識し、その後、皮膚によって吸収された放射能標識化合物の量を測定することにより、当業者は、試験化合物の皮膚浸透を明らかにするいくつかの方法のいずれかを使用して、吸収された組成物のレベルを明らかにすることができる。皮膚浸透の研究に関する刊行物には、Ｒｅｉｎｆｅｎｒａｔｈ，ＷＧおよびＧＳ  Ｈａｗｋｉｎｓ、「経皮浸透を測定するための動物モデルとしての離乳中のヨークシャーブタ」、Ｓｗｉｎｅ  ｉｎ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｍ．Ｅ．Ｔｕｍｂｌｅｓｏｎ編）、Ｐｌｅｎｕｍ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９８６；Ｈａｗｋｉｎｓ，Ｇ．Ｓ．、「インビトロでの皮膚浸透測定を実施するための方法論」、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｓｋｉｎ  Ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ（ＢＷ  ＫｅｍｐｐａｉｎｅｎおよびＷＧ  Ｒｅｉｎｆｅｎｒａｔｈ編）、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ、Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ、１９９０、６７頁〜８０頁；Ｗ．Ｇ．Ｒｅｉｆｅｎｒａｔｈ、Ｃｏｓｍｅｔｉｃｓ＆Ｔｏｉｌｅｔｒｉｅｓ、１１０：３〜９（１９９５）が含まれる。
【０３１２】
いくつかの適用のためには、ポリマーなどのこの分野で知られている配合物を使用して、長く作用する形態の薬剤または組成物を投与することが好ましい。薬剤は、処置される領域に対する薬物の送達効率を増大させるために、この分野で知られている方法に従って、皮膚パッチに配合することができ（Ｊｕｎｇｉｎｇｅｒ，Ｈ．Ｅ．、Ａｃｔａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａ  Ｎｏｒｄｉｃａ、４：１１７（１９９２）；Ｔｈａｃｈａｒｏｄｉら、Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ、１６：１４５〜１４８（１９９５）；Ｎｉｅｄｎｅｒ  Ｒ．、Ｈａｕｔａｒｚｔ、３９：７６１〜７６６（１９８８））、または包帯に配合することができる。
【０３１３】
場合により、局所配合物はさらなる賦形剤を有することができ、例えば、保存剤、例えば、メチルパラベン、ベンジルアルコール、ソルビン酸または四級アンモニウム化合物など；安定化剤、例えば、ＥＤＴＡ、抗酸化剤（ブチル化ヒドロキシトルエンまたはブチル化ヒドロキシアニソールなど）、および緩衝剤（クエン酸塩およびリン酸塩など）などを有することができる。
【０３１４】
薬学的組成物は、錠剤またはカプセルまたは溶液剤の形態で経口用配合物において投与することができる。経口用配合物の効果的な量が、増殖性疾患またはガンまたは光老化などの症状が軽減されるまで、１日に１回〜３回、患者に投与される。薬剤の効果的な量は患者の年齢および体重および状態に依存する。一般に、薬剤の１日の経口用量は１２００ｍｇ未満で、１００ｍｇ以上である。好ましい１日経口用量は約３００ｍｇ〜６００ｍｇである。経口用配合物は好都合にはユニット投薬形態で提供され、製薬分野で知られている任意の方法によって調製することができる。組成物は、好適な薬学的に受容可能なキャリアと一緒に任意の所望する投薬形態物に配合することができる。典型的なユニット投薬形態には、錠剤、ピル、粉末剤、溶液剤、懸濁物、エマルション、顆粒、カプセル、坐薬が含まれる。一般に、配合物は、薬剤組成物を液体キャリアまたは細かく分割された固体キャリアまたはその両方と均一かつ十分に一緒にし、そして必要に応じて、製造物を成形することによって調製される。有効成分は、皮膚の増殖疾患を処置するために有効成分の効果的な量を与えるために、液体、粉末、錠剤またはカプセルの形態で様々な基剤材料に配合することができる。
【０３１５】
本明細書中の使用に好適な他の治療剤は、意図された目的に対して効果的な任意の適合し得る薬物、または薬剤配合物に対して補足的な薬物である。一例として、配合物による処置は、コルチコステロイド、カルシポトリン、コールタール調製物による局所的処置、メトトレキサート、レチノイド類、シクロスポリンＡによる全身的処置、および光化学療法などの他の処置と組み合わせることができる。混合処置は、急性または重症の皮膚増殖疾患を処置するためには特に重要である。混合療法において用いられる配合物は、組み合わせられた効果が達成されるように、他の処置と同時に、または他の処置と連続して施すことができる。
【０３１６】
本発明のさらなる態様
次に、本発明のさらなる態様が、数字を付けた下記の段落に示される。従って、本発明はこれらの態様を包含することを理解しなければならない。
【０３１７】
段落１．上皮細胞間の異常な細胞−細胞接着に関連する疾患に罹患している患者を処置する方法であって、細胞間の接着を担う接着タンパク質のタンパク質分解を調節することを含む方法。
【０３１８】
段落２．接着タンパク質がデスモソームタンパク質である、段落１に記載の方法。
【０３１９】
段落３．接着タンパク質がコルネオデスモシンである、段落１または２に記載の方法。
【０３２０】
段落４．上皮細胞が角質細胞である、前記段落のいずれかに記載の方法。
【０３２１】
段落５．接着タンパク質のタンパク質分解の調節が、接着タンパク質のタンパク質分解に関与するプロテアーゼの発現および／または活性および／または分解の調節を含む、前記段落のいずれかに記載の方法。
【０３２２】
段落７．接着タンパク質のタンパク質分解の調節が、接着タンパク質のタンパク質分解に関与するプロテアーゼの活性を阻害することを担うプロテアーゼ阻害剤の発現および／または活性および／または分解の調節を含む、前記段落のいずれかに記載の方法。
【０３２３】
段落８．上皮細胞間の異常な細胞−細胞接着に関連する疾患に罹患している患者を処置する方法であって、細胞間の接着を担う接着タンパク質の発現および／または活性を調節することを含む方法。
【０３２４】
段落９．接着タンパク質の発現が転写レベルまたは翻訳レベルまたはその両方で調節される、段落８に記載の方法。
【０３２５】
段落１０．疾患が、低下した細胞−細胞接着に関連し、そして接着タンパク質のタンパク質分解が、プロテアーゼ阻害剤を投与すること、プロテアーゼのアンタゴニストを投与すること、プロテアーゼ阻害剤のアゴニストを投与すること、プロテアーゼの発現を低下させること、プロテアーゼの活性を低下させること、プロテアーゼ阻害剤の発現を増大させること、プロテアーゼ阻害剤の活性を増大させることの１つまたは２つ以上によって低下させられる、前記段落のいずれかに記載の方法。
【０３２６】
段落１１．疾患が、増大した細胞−細胞接着に関連し、そして接着タンパク質のタンパク質分解が、プロテアーゼを投与すること、プロテアーゼのアゴニストを投与すること、プロテアーゼ阻害剤のアンタゴニストを投与すること、プロテアーゼの発現を増大させること、プロテアーゼの活性を増大させること、プロテアーゼ阻害剤の発現を低下させること、プロテアーゼ阻害剤の活性を低下させることの１つまたは２つ以上によって増大させられる、段落１〜９のいずれかに記載の方法。
【０３２７】
段落１２．上皮細胞間の異常な細胞−細胞接着に関連する疾患を診断する方法であって、個体のコルネオデスモシン遺伝子における変異を検出することを含む方法。
【０３２８】
段落１３．疾患が、低下した細胞−細胞接着に関連し、そして方法が、個体において、コルネオデスモシン遺伝子におけるＨｐｈ１制限酵素部位の非存在またはコルネオデスモシン遺伝子の＋１２４３位におけるＴの存在を検出することを含む、段落１２に記載の方法。
【０３２９】
段落１４．疾患が、アトピー性湿疹、脂漏性湿疹、刺激性接触皮膚炎、アレルギー性接触皮膚炎、肺アトピー性喘息、ウイルス感染後喘息、気管支反応亢進、慢性閉塞性肺疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎、セリアック病、消化性潰瘍化、膿痂疹、ウイルス性いぼ、伝染性軟属腫、細菌性髄膜炎、ウイルス性髄膜炎、ヘリコバクター・ピロリの侵入に関連する消化性潰瘍化、皮膚黒色腫、扁平上皮ガン、基底細胞ガン、皮膚型リンパ腫、皮膚ガン、胃腸管悪性腫瘍、および肺悪性腫瘍からなる群から選択される、段落１〜１０、１２または１３のいずれかに記載の方法。
【０３３０】
段落１５．疾患が、増大した細胞−細胞接着に関連し、そして方法が、個体において、コルネオデスモシン遺伝子におけるＨｐｈ１部位の存在またはコルネオデスモシン遺伝子の＋１２４３位におけるＴの非存在を検出することを含む、段落１２に記載の方法。
【０３３１】
段落１６．疾患が、乾癬、魚鱗癬、尋常性ざ瘡および毛孔性角化症からなる群から選択される、段落１〜９、１１、１２または１５のいずれかに記載の方法。
【０３３２】
（実施例）
実施例Ａ：接着タンパク質の多型
実施例Ａ１．コルネオデスモシン（Ｓ）遺伝子多型の同定
ゲノムＤＮＡを標準的なプロトコルに従って全血から抽出し、１００ｎｇ／μｌで貯蔵する。＋１２４３位におけるＴからＣへのトランジションをもたらす１つの報告されたエキソンの多型を分析する（Ｉｓｈｉｈａｒａら、１９９６、Ｔａｚｉ−Ａｈｎｉｎｉら、１９９９ａ、１９９９ｂ）。
【０３３３】
プライマーＳ１５（５’ＣＡＴＴＧＣＡＴＴＣＣＡＧＣＣＡＧＴＧＧ３’）およびプライマーＳ１６（５’ＡＡＣＴＧＧＡＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＡＡＧＧＡ３’）が、多型遺伝子座（＋１２４３）を増幅するために使用される。ＰＣＲ反応液はまとめて調製され、２５μｌの容量に分けられる。ＰＣＲ反応液には、５０ｍＭのＫＣＬ、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣＬ、１．５ｍＭのＭｇＣｌ２、２００μＭの各ｄＮＴＰ、１．２μＭの各プライマー、１ＵのＴａｑポリメラーゼ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ、Ｐａｉｓｌｅｙ、英国）および２００ｎｇのゲノムＤＮＡが含まれる。熱サイクル条件は、９５℃で２分間、そして９５℃で１分間、５８℃で１分間および７２℃で１５秒間の２８サイクルである。増幅は７２℃で１５分間によって終了する。
【０３３４】
制限消化を、１０μｌのＰＣＲ産物および２．５ＵのＨｐｈＩおよび製造者の適切な緩衝液（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｈｉｔｃｈｉｎ、英国）を含む２０μｌの反応液において３７℃で一晩行なう。対立遺伝子の識別を、２％アガロースを使用する電気泳動によって行なう。ＨｐｈＩ消化により、対立遺伝子１については１２３＋８９ｂｐが生じ、対立遺伝子２（２１２ｂｐ）は切断されない。
【０３３５】
対立遺伝子
以下の実施例において、「対立遺伝子１」は、＋１２４３位のヌクレオチド残基がＣである対立遺伝子をいう。そのような対立遺伝子によってコードされるタンパク質は、アクセション番号Ｌ２０８１５を有するポリペプチド配列の番号付けを用いたアミノ酸配列の３９４位においてセリン（Ｓ）残基を有する。
【０３３６】
、
同様に、「対立遺伝子２」は、＋１２４３位のヌクレオチド残基がＴである対立遺伝子をいう。このような対立遺伝子によりコードされるタンパク質は、アクセション番号Ｌ２０８１５を有するポリペプチド配列の番号付けを用いた場合、ロイシン残基をアミノ酸配列の３９４位に有する。
【０３３７】
アミノ酸位置の番号付けは、示されるように、ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号ＧＢ：Ｌ２０８１５またはＡＦ０３０１３０を有するコルネオデスモシン配列の翻訳開始コドン（＋１、ＡＴＧ）を参照する。従って、例えば、＋１２４３におけるＣからＴへの置換は、ＧＢ配列Ｌ２０８１５による３９４位におけるＳからＦへのアミノ酸変化をもたらし、一方、同じヌクレオチド置換は、ＧＢ配列ＡＦ０３０１３０による４１０位におけるＳからＦへのアミノ酸変化をもたらす。
【０３３８】
統計学的分析
疾患集団およびコントロール集団を、２ｘ３表を使用して比較し、そしてオッズ比を、コントロール集団および患者集団において、対立遺伝子１についてホモ接合である個体と、もう一方の対立遺伝子（対立遺伝子２）を保有する個体とを比較することによって計算する。対立遺伝子２についてのχ２検定もまた、それぞれの遺伝子型群における推定される疾患感受性性対立遺伝子の数による重みを付けて行われる。
【０３３９】
実施例Ａ２：コルネオデスモシン（Ｓ）遺伝子の＋１２４３における多型とアトピー性湿疹との関連
本実施例では、別途示されない限り、コルネオデスモシン配列におけるアミノ酸位置は、ＧｅｎＢａｎｋ配列Ｌ２０８１５における番号付けを参照して示される。
【０３４０】
本実施例は、＋１２４３位におけるコルネオデスモシンのヌクレオチド残基がＴであり、これによりコルネオデスモシンポリペプチド（Ｌ２０８１５）の３９４位におけるロイシン（Ｔ）残基の存在をもたらすコルネオデスモシン対立遺伝子２が、アトピー性湿疹に関連することを明らかにする。
【０３４１】
＋１２４３における多型の対立遺伝子分布が、上記に記載されるように、アトピー性湿疹群およびコントロール群（それぞれ、ｎ＝１５４および５５０）の両方において評価される。コントロールおよび患者はともにハーディ・ワインベルグ平衡にある。表Ａ２．１には、コントロール群およびアトピー性湿疹患者群におけるそれぞれの遺伝子型の実測値（Ａ）および予測値（Ｂ）が示される。
【表４】
2004524010.tif 000003
表Ａ２．１：コントロール群およびアトピー性湿疹患者群における対立遺伝子（１１および１２および２２）の対立遺伝子分布。Ａ：実測値；Ｂ：予測値。
【０３４２】
コントロール群および患者群における予測値と実測値との全体的な差は統計学的に有意ではない。しかし、稀な対立遺伝子の増大が見られる（対立遺伝子２、５２／４４．２＝１．２）。対立遺伝子１（一般的な対立遺伝子）は湿疹を防いでいるようであり、そしてこの理由から、本発明者らは、対立遺伝子１２および対立遺伝子１１を有する個体を一方のサブグループに分類し、そして対立遺伝子２２を有する個体をもう一方のサブグループに分類している（下記の表Ａ２．２を参照のこと）。
【表５】
2004524010.tif 000004
表Ａ２．２：コントロール群およびアトピー性湿疹患者群における対立遺伝子（１１および１２／２２）の対立遺伝子分布。
【０３４３】
対立遺伝子１保有に対する対立遺伝子２についてのχ２検定を行なう。有意な関連が、コルネオデスモシン遺伝子（＋１２４３）多型の対立遺伝子２とアトピー性湿疹との間に見出される［ＯＲ＝１．３６（０．９３、１．９９）］。
【０３４４】
従って、本発明者らは、個体のコルネオデスモシン核酸の＋１２４３位におけるＴの存在、または個体のコルネオデスモシンポリペプチド（Ｌ２０８１５）の３９４位におけるロイシン（Ｌ）残基の存在、またはその両方を検出することによる、個体における第Ｉ群疾患または第Ｉ群疾患に対する感受性（好ましくは湿疹または湿疹に対する感受性、好ましくはアトピー性湿疹）の診断を開示する。
【０３４５】
実施例Ａ３．コルネオデスモシン（Ｓ）遺伝子の＋１２４３における多型と皮膚炎との関連
本実施例では、別途示されない限り、コルネオデスモシン配列におけるアミノ酸位置は、ＧｅｎＢａｎｋ配列Ｌ２０８１５における番号付けを参照して示される。
【０３４６】
本実施例は、＋１２４３位におけるコルネオデスモシンのヌクレオチド残基がＴであり、これによりコルネオデスモシンポリペプチド（Ｌ２０８１５）の３９４位においてロイシン（Ｌ）残基の存在をもたらすコルネオデスモシン対立遺伝子２が、皮膚炎に関連し、そして疱疹状皮膚炎の病因の原因であり得ることを明らかにする。
【０３４７】
＋１２４３における多型の対立遺伝子分布が、上記に記載されるように、疱疹状皮膚炎群およびコントロール群（それぞれ、ｎ＝５０および５５０）の両方において評価される。コントロールおよび患者はともにハーディ・ワインベルグ平衡にある。
【表６】
2004524010.tif 000005
表Ａ３．１：コントロール群および疱疹状皮膚炎群における対立遺伝子（１１および１２および２２）の対立遺伝子分布。
【０３４８】
稀な対立遺伝子の増大が見られる（対立遺伝子２、２６／１４．６＝１．７８）。対立遺伝子１（一般的な対立遺伝子）についてホモ接合である患者は１名のみである。この対立遺伝子は、コントロール集団では非常に高頻度に存在するので、保護的であるようである。
【表７】
2004524010.tif 000006
表Ａ３．２：コントロール群および疱疹状皮膚炎群における対立遺伝子（１１および１２／２２）の対立遺伝子分布。
【０３４９】
対立遺伝子２保有に対する対立遺伝子１についてのχ２検定を行なう。有意な関連が、Ｓ遺伝子（＋１２４３）多型の対立遺伝子２と疱疹状皮膚炎との間に見出される［ＯＲ＝１３．１０（１．７９、９５．８５）；ｐ＜０．０００１］。
【０３５０】
従って、本発明者らは、個体のコルネオデスモシン核酸の＋１２４３位におけるＴの存在、または個体のコルネオデスモシンポリペプチド（Ｌ２０８１５）の３９４位におけるロイシン（Ｌ）残基の存在、またはその両方を検出することによる、個体における第Ｉ群疾患または第Ｉ群疾患に対する感受性（好ましくは皮膚炎または皮膚炎に対する感受性、好ましくは疱疹状皮膚炎）の診断を開示する。このアミノ酸は、ＧＢ配列ＡＦ０３０１３０による４１０位に存在する。
【０３５１】
＋１２４３においてヘテロ接合である個体もまた、皮膚炎を発症する危険性が高いので、対立遺伝子２、すなわち、＋１２４３位におけるＴは、アトピー性湿疹と比較した場合、疱疹状皮膚炎に対してより大きい危険性をもたらす。
【０３５２】
実施例Ａ４．連鎖不平衡分析
本実施例では、別途示されない限り、コルネオデスモシン配列におけるアミノ酸位置は、ＧｅｎＢａｎｋ配列Ｌ２０８１５における番号付けを参照して示される。
【０３５３】
＋１２４３位におけるＣは、＋６１９位および＋１２４０位において、それぞれ、ＴおよびＧと連鎖不平衡にあることが以前に示されている（Ｔａｚｉ−Ａｈｎｉｎｉら、１９９９ａ；Ａｌｌｅｎら、１９９９）。連鎖不平衡は、コルネオデスモシンのコード配列内の他の遺伝子座に及ぶ。さらに、家系分析を伝達不平衡試験（ＴＤＴ）とともに使用して、Ｊｅｎｉｓｃｈおよび共同研究者らは、コルネオデスモシン遺伝子の６つの異なるアミノ酸配列をコードする６つの異なる対立遺伝子を同定している（Ｊｅｎｉｓｃｈら、１９９９）。
【０３５４】
第Ｉ群疾患
本発明者らは、対立遺伝子５（ＣＤ５）内および対立遺伝子６（ＣＤ６）内において、＋１２４３位のＴ（ｌｅｕ）が、ＣＤ５のＡ（ａｓｐ）、ＡＧＴ（ｓｅｒ）、Ｔ（ｐｈｅ）、Ａ（ｓｅｒ）、Ｔ（ｓｅｒ）、Ｔ（ｌｅｕ）、Ｇ（ａｓｐ）およびＴ（ａｓｎ）と強い連鎖不平衡にあり、そしてＣＤ６のＡ（ａｓｐ）、欠失（−）、Ｔ（ｐｈｅ）、Ａ（ｓｅｒ）、Ｔ（ｓｅｒ）、Ｔ（ｌｅｕ）、Ｇ（ａｓｐ）およびＣ（ａｓｐ）と強い連鎖不平衡にあることを示している。これらの変化型は、それぞれ、＋４４２位、＋４６８位、＋６１９位、＋１２１５位、＋１２３６位、＋１２４３位、＋１５１５位、および＋１５９３位に存在する。
【０３５５】
本発明者らは、本発明者らの収集物において、これらの変化型がアトピー性湿疹と強く関連することを見出している。従って、上記に挙げられ、そして＋１２４３位のＴ（すなわち、対立遺伝子２）と連鎖不平衡にあることが示される変化のいずれかの検出は、ヌクレオチドＴ（＋１２４３）またはアミノ酸Ｌ（Ｌ２０８１５の３９４）の検出の代わりに、またはそれらの検出に加えて使用することができる。
【０３５６】
従って、本発明者らは、これらの変化のいずれか１つまたは２つ以上を検出することによる、個体における第Ｉ群疾患または第Ｉ群疾患に対する感受性の診断、好ましくは湿疹または皮膚炎、より好ましくはアトピー性湿疹または疱疹状皮膚炎あるいはこれらの疾患のいずれかに対する感受性の診断を提供する。
【０３５７】
従って、本発明者らは、下記の表Ａ４．１に示されるように、コルネオデスモシン核酸の関連位置における下記残基のいずれか１つまたは２つ以上を検出することによる、第Ｉ群疾患または第Ｉ群疾患に対する感受性の診断を提供する。
【表８】
2004524010.tif 000007
表Ａ４．１．コルネオデスモシンの多型および第Ｉ群疾患。（１）：ＧｅｎＢａｎｋ配列Ｌ２０８１５によるアミノ酸位置の番号付け；（２）：ＧｅｎＢａｎｋ配列ＡＦ０３０１３０によるアミノ酸位置の番号付け。
【０３５８】
第ＩＩ群疾患
本発明者らは、コルネオデスモシンの対立遺伝子２（ＣＤ２）内において、＋１２４３位のＣ（Ｓｅｒ）が、ＣＤ２のＧ（Ｓｅｒ）、ＡＧＴ（ｓｅｒ）、Ｔ（ｐｈｅ）、Ａ（ｓｅｒ）、Ｔ（ｓｅｒ）、Ｃ（Ｓｅｒ）、Ｇ（ａｓｐ）およびＴ（ａｓｎ）と強い連鎖不平衡にあることをしている。これらの変化型は、それぞれ、＋４４２位、＋４６８位、＋６１９位、＋１２１５位、＋１２３６位、＋１２４３位、＋１５１５位および＋１５９３位に存在する。
【０３５９】
本発明者らは、本発明者らの収集物において、これらの変化型が尋常性ざ瘡と強く関連することを見出している。従って、上記に挙げられ、そして＋１２４３位のＴ（すなわち、対立遺伝子１）と連鎖不平衡にあることが示される変化のいずれかの検出は、ヌクレオチドＣ（＋１２４３）またはアミノ酸Ｓ（Ｌ２０８１５の３９４）の検出の代わりに、またはそれらの検出に加えて使用することができる。
【０３６０】
従って、本発明者らは、これらの変化のいずれか１つまたは２つ以上を検出することによる、個体における第ＩＩ群疾患または第ＩＩ群疾患に対する感受性の診断、好ましくはざ瘡および／または乾癬、より好ましくは尋常性ざ瘡および／または尋常性乾癬あるいはこれらの疾患のいずれかに対する感受性の診断を提供する。
【０３６１】
従って、本発明者らは、下記の表Ａ４．２に示されるように、コルネオデスモシン核酸またはコルネオデスモシンポリペプチドの関連位置における下記残基のいずれか１つまたは２つ以上を検出することによる、第ＩＩ群疾患または第ＩＩ群疾患に対する感受性の診断を提供する。
【表９】
2004524010.tif 000008
表Ａ４．２．コルネオデスモシンの多型および第ＩＩ群疾患。（１）：ＧｅｎＢａｎｋ配列Ｌ２０８１５によるアミノ酸位置；（２）：ＧｅｎＢａｎｋ配列ＡＦ０３０１３０によるアミノ酸位置。
【０３６２】
上記の核酸変化はコルネオデスモシンのアミノ酸配列における変化をもたらす。従って、関連する核酸位置におけるヌクレオチド残基の検出はまた、それらの影響を検出することによって、すなわち、コードされているポリペプチド配列における対応する変化を検出することによって達成することができる。従って、例えば、特異的な核酸プローブまたは消化酵素（例えば、ＨｐｔＩ）を使用して核酸配列の＋１２４３位における多型を検出することの代わりに、またはそのような検出に加えて、３９４位におけるＬ残基と３９４位におけるＳ残基とを識別することができるモノクローナル抗体を使用することができる。
【０３６３】
本発明者らはまた、表Ａ４．２に示されるように、コルネオデスモシンポリペプチドの関連位置における下記残基のいずれか１つまたは２つ以上を検出することによる、第Ｉ群疾患または第Ｉ群疾患に対する感受性の診断を提供する。本発明者らはまた、表Ａ４．２に示されるように、コルネオデスモシンポリペプチドの関連位置における下記残基のいずれか１つまたは２つ以上を検出することによる、第ＩＩ群疾患または第ＩＩ群疾患に対する感受性の診断を提供する。
【０３６４】
要約
本発明者らは、アトピー性湿疹および疱疹状皮膚炎に対する感受性を増大させるコルネオデスモシン遺伝子内のマーカーの関連を示している。ここで言及すべきことは、＋１２４３にＣを有するコルネオデスモシン対立遺伝子（対立遺伝子１）は乾癬および尋常性ざ瘡に関連しており、このことは、２つの対立遺伝子により、異なる感受性が生じることを示唆しているということである。対立遺伝子２（Ｌ３９４）はバリアの機能不全（例えば、皮膚炎、クローン病）に関連し、そして対立遺伝子１（Ｓ３９４）は損なわれた落屑（例えば、乾癬、ざ瘡）に関連する。
【０３６５】
本発明者らは、コルネオデスモシン遺伝子の＋１２４３における多型がアトピー性湿疹および皮膚炎と関連することを示している。＋１２４３位における置換はアミノ酸変化Ｌ３９４Ｓをもたらす。理論によって束縛されることは望まないが、本発明者らは、この置換がコルネオデスモシンのプロセシングを妨げ、従って、増強された落屑の一因であると考えている。
【０３６６】
本発明者らは、アミノ酸変化（Ｓｅｒ１４３／Ａｓｐ、Ｓｅｒ１５３／−、Ｓｅｒ２０２／Ｐｈｅ、Ｓｅｒ４０１／Ｇｌｙ、Ｓｅｒ４０８／Ａｌａ、Ｓ４１０／Ｌ、Ａｓｐ５２７／Ａｓｎ；ＧＢ配列ＡＦ０３０１３０による位置）または（Ｓｅｒ１２７／Ａｓｐ、Ｓｅｒ１３７／−、Ｓｅｒ１８６／Ｐｈｅ、Ｓｅｒ３８５／Ｇｌｙ、Ｓｅｒ３９２／Ａｌａ、Ｓ３９４／Ｌ、Ａｓｐ５１１／Ａｓｎ；ＧＢ配列Ｌ２０８１５による位置）をもたらすコルネオデスモシン多形が、角化細胞の成熟化および落屑のプロセスにおいて重要な機能を有することを見出している。これらの多型に対するスクリーニング方法がＪｅｎｉｓｃｈら（１９９９）およびＧｕｅｒｒｉｎら（２００１）によって記載される。従って、本発明者らは、強い関係が、コルネオデスモシンのタンパク質分解プロセシングと、正常な皮膚の感受性と、そしてバリア機能が崩壊している疾患状態の皮膚（これには、乾癬、ざ瘡および皮膚炎が含まれる）の一体性との間に存在することを示している。
【０３６７】
実施例Ａ５：１８０位におけるコルネオデスモシン（Ｓ）遺伝子の多型
本実施例では、別途示されない限り、コルネオデスモシン配列におけるアミノ酸の位置は、ＧｅｎＢａｎｋ配列Ｌ２０８１５における番号付けを参照して示される。
【０３６８】
＋１８０におけるコルネオデスモシン遺伝子多型の同定
１８０位におけるＳ遺伝子変化体が、クローン化されたＳ対立遺伝子の自動化された配列決定によって同定されている（Ｇｕｅｒｒｉｎら、２００１）。＋１８０位におけるＣからＴへの核酸変化により、４０位（Ｌ２０８１５）におけるＬからＦへのアミノ酸変化が生じる。このアミノ酸は哺乳類の種において非常に保存されている。下記の表Ａ５．１に詳述されるように、ヒト、マウスおよびブタのＳ配列の配列アラインメントにより、Ｌ４０がこれらの種の間で保存されていることが示される。
【表１０】
2004524010.tif 000009
表Ａ５．１．コルネオデスモシン配列のアラインメント。アミノ酸番号は、ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号Ｌ２０８１５における配列の番号付けを参照して示される。１８０位におけるＣからＴへの核酸置換は、ＧＢ配列ＡＦ０３０１３０によるコルネオデスモシンタンパク質の５６位におけるＬからＦへのアミノ酸変化をもたらす。
【０３６９】
キモトリプシンによるタンパク質分解
コルネオデスモシンのフラグメントに対応し、４０位（Ｌ２０８１５；ヌクレオチド配列上の１８０位に対応する）のアミノ酸およびそのまわりのアミノ酸を含むペプチドを合成する。これらのポリペプチドを適切な緩衝液中においてキモトリプシンにさらし、そして消化生成物を同定する。キモトリプシンは、Ｆ残基またはＹ残基またはＷ残基のＣ末端側のペプチド結合を切断するが、Ｌ残基のＣ末端を切断しないことが知られている。
【０３７０】
ペプチドＰ１およびペプチドＰ２（サイズ：３８アミノ酸、それぞれ、Ｌ２０８１５の４０位においてＬおよびＦを含む）をキモトリプシンにさらす。ペプチドＰ１は配列ＰＴＲＩＴＳＰＮＤＰＣＬ４０ＴＧＫＧＤＳＳＧＦＳＧＳＳＳＳＧＳＳＩＳＳＡＲを有し、ペプチドＰ２は配列ＰＴＲＩＴＳＰＮＤＰＣＦ４０ＴＧＫＧＤＳＳＧＦＳＧＳＳＳＳＧＳＳＩＳＳＡＲを有する。
【０３７１】
Ｌ２０８１５の４０位にＬを有するペプチドＰ１は２つのタンパク質分解生成物（ＰＴＲＩＴＳＰＮＤＰＣＬ４０ＴＧＫＧＤＳＳＧＦおよびＳＧＳＳＳＳＧＳＳＩＳＳＡＲ）をもたらすことが見出される。しかし、Ｌ２０８１５の４０位にＦを有するペプチドＰ２は３つの小さいペプチド（ＰＴＲＩＴＳＰＮＤＰＣＦ、ＴＧＫＧＤＳＳＧＦおよびＳＧＳＳＳＳＧＳＳＩＳＳＡＲ）をもたらす。上記の結果は、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｘｐａｓｙ．ｃｈ／におけるＥｘＰＡＳｙ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｓｅｒｖｅｒを使用することによって確認される。Ｐ１およびＰ２の配列を有するペプチドは、キモトリプシンによって異なった様式で切断されることが予想される。
【０３７２】
このことは、ＬからＦへのアミノ酸変化により、新しいキモトリプシン部位がコルネオデスモシン内に作り出されることを明らかにしている。このことは、角化細胞の分化および落屑のときにおけるコルネオデスモシンの成熟化に対して重大な影響を及ぼす。従って、本発明者らは、コルネオデスモシンにおけるＬからＦへのアミノ酸多型と疾患表現型との関連を開示する。
【０３７３】
従って、本発明者らは、個体のコルネオデスモシンポリペプチドにおけるプロテアーゼ切断部位の存在を検出することによる、個体における第Ｉ群疾患または第Ｉ群疾患に対する感受性（好ましくは皮膚炎または皮膚炎に対する感受性、好ましくは疱疹状皮膚炎、好ましくは湿疹、好ましくはアトピー性湿疹）の診断方法を開示する。プロテアーゼ部位の検出はポリペプチド配列に対して行なうことができ、またはプロテアーゼ部位をコードする核酸変化を検出することによって行なうことができる。好ましくは、プロテアーゼ切断部位はＳＣＣＥまたはＳＣＴＥの切断部位である。
【０３７４】
第Ｉ群疾患
本発明者らは特に、４０位におけるＬからＦへのアミノ酸置換が第Ｉ群疾患（例えば、湿疹および／または皮膚炎）に関連することを見出している。この置換は、コルネオデスモシン核酸の１８０位におけるＣからＴへの変化によって引き起こされる。
【０３７５】
従って、本発明者らは、個体のコルネオデスモシンポリペプチドの４０位におけるＦの存在を検出することによる、個体における第Ｉ群疾患または第Ｉ群疾患に対する感受性（好ましくは皮膚炎または皮膚炎に対する感受性、好ましくは疱疹状皮膚炎、好ましくは湿疹、好ましくはアトピー性湿疹）の診断を提供する。
【０３７６】
本発明者らは、さらに、個体のコルネオデスモシン核酸の１８０位におけるＴの存在を検出することによる、個体における第Ｉ群疾患または第Ｉ群疾患に対する感受性（好ましくは皮膚炎または皮膚炎に対する感受性、好ましくは疱疹状皮膚炎、好ましくは湿疹、好ましくはアトピー性湿疹）の診断を提供する。
【０３７７】
第ＩＩ群疾患
本発明者らはまた、４０位におけるＦからＬへのアミノ酸置換が第ＩＩ群疾患（例えば、乾癬および／またはざ瘡）に関連することを見出している。この置換は、コルネオデスモシン核酸の１８０位におけるＴからＣへの変化によって引き起こされる。従って、４０位がＬであるもう一方の対立遺伝子は、ざ瘡および乾癬などの、増加した接着を有する疾患（グループＩＩ）に関連する。これは、コルネオデスモシンポリペプチドの４０位にＬが存在することにより、タンパク質がプロテアーゼによるタンパク分解プロセスに対して耐性になるからである。
【０３７８】
従って、本発明者らは、個体のコルネオデスモシンポリペプチドの４０位におけるＬの存在を検出することによる、個体における第ＩＩ群疾患または第ＩＩ群疾患に対する感受性（好ましくは乾癬またはざ瘡、あるいは乾癬またはざ瘡に対する感受性）の診断を提供する。
【０３７９】
本発明者らはさらに、個体のコルネオデスモシン核酸の１８０位におけるＣの存在を検出することによる、個体における第ＩＩ群疾患または第ＩＩ群疾患に対する感受性（好ましくは乾癬またはざ瘡、あるいは乾癬またはざ瘡に対する感受性）の診断を提供する。
【０３８０】
実施例Ａ６．＋６１９におけるコルネオデスモシン遺伝子多型の同定
本発明者らは、＋６１９位におけるＣからＴへの核酸置換が、Ｌ２０８１５における番号付けによる１８６位において、そしてＡＦ０３０１３０における番号付けによる２０２位においてＳからＦへのアミノ酸変化をもたらすことを明らかにしている。これにより、新しいキモトリプシン部位がコルネオデスモシンタンパク質内に作り出される。本発明者らは、１８６位のセリンが哺乳類の種において非常に保存されていることを見出している。
【０３８１】
本発明者らはさらに、１８６位のＦが湿疹および皮膚炎などにおける皮膚バリアの欠陥に関連することを明らかにしている。
【０３８２】
第Ｉ群疾患
従って、本発明者らは、個体のコルネオデスモシンポリペプチドの１８６位におけるＦの存在を検出することによる、個体における第Ｉ群疾患または第Ｉ群疾患に対する感受性（好ましくは皮膚炎または皮膚炎に対する感受性、好ましくは疱疹状皮膚炎、好ましくは湿疹、好ましくはアトピー性湿疹）の診断を提供する。
【０３８３】
本発明者らはさらに、個体のコルネオデスモシン核酸の６１９位におけるＴの存在を検出することによる、個体における第Ｉ群疾患または第Ｉ群疾患に対する感受性（好ましくは皮膚炎または皮膚炎に対する感受性、好ましくは疱疹状皮膚炎、好ましくは湿疹、好ましくはアトピー性湿疹）の診断を提供する。
【０３８４】
第ＩＩ群疾患
本発明者らはまた、１８６位におけるＦからＳへのアミノ酸置換が第ＩＩ群疾患（例えば、乾癬および／またはざ瘡）に関連することを見出している。この置換は、コルネオデスモシン核酸の６１９位におけるＴからＣへの変化によって引き起こされる。
【０３８５】
従って、本発明者らは、個体のコルネオデスモシンポリペプチドの１８６位におけるＳの存在を検出することによる、個体における第ＩＩ群疾患または第ＩＩ群疾患に対する感受性（好ましくは乾癬またはざ瘡、あるいは乾癬またはざ瘡に対する感受性）の診断を提供する。
【０３８６】
本発明者らはさらに、個体のコルネオデスモシン核酸の６１９位におけるＣの存在を検出することによる、個体における第ＩＩ群疾患または第ＩＩ群疾患に対する感受性（好ましくは乾癬またはざ瘡、あるいは乾癬またはざ瘡に対する感受性）の診断を提供する。
【０３８７】
処置
コルネオデスモシンもしくは他の接着タンパク質に由来するポリペプチド、またはコルネオデスモシンもしくは他の接着タンパク質を含むポリペプチド、好ましくは、さらなるプロテアーゼ切断部位を有するペプチドは、欠陥のある皮膚バリア（第Ｉ群疾患）を有する患者を処置するために使用することができる。このようなペプチドは、好ましくは、皮膚バリアを浸透することができ、そして好ましくは分子量が約８００Ｄａ以下である。ペプチドは、好ましくは、ＳＰＮＤＰＣＦ４０ＴＧＫＧＤＳＳまたはＱＳＳＳＳＳＱＴＦ１８６ＧＶＳＳＳＧＱＳＶの配列を含む。
【０３８８】
これらのペプチドは、場合により、４０位にＦを含む天然のコルネオデスモシンまたは１８６位にＦを含む天然のコルネオデスモシンを模倣しているので、プロテアーゼ（例えば、ＳＣＣＥおよびＳＣＴＥ）の標的になり得る。
【０３８９】
従って、上記の配列を含むペプチドまたは上記の配列に由来するペプチドは、コルネオデスモシンおよび他の接着タンパク質のタンパク質分解の競合的阻害剤として作用させることができ、それにより、正常な皮膚バリアを回復させることができる。
【０３９０】
実施例Ｂ：プロテアーゼ遺伝子およびプロテアーゼ阻害剤遺伝子における多型
実施例Ｂ１．角質層キモトリプシン酵素（ＳＣＣＥ）多型の同定
角質層キモトリプシン酵素（ＳＣＣＥ）をコードするＤＮＡ配列が、アクセション番号ＡＦ１６６３３０を用いてＮＣＢＩファイルサーバー（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）から得られる。同じ情報源から、ＳＣＣＥのＤＮＡ配列のエキソン配列が５つ得られ、そして、特異的なプライマーが、ＧｅｎｅＪｏｃｋｅｙプログラム（ＢＩＯＳＯＦＴ（登録商標）、英国）を使用して設計される。
【０３９１】
多型の同定
ＳＣＣＥ遺伝子の５つのエキソンを変異および／または多型についてスクリーニングする。これらの最初の発見に基づいて、エキソンＩおよびエキソンＶに集中することが決定される。これは、前者においては最初何も検出されず、そして後者ではＡＡＣＣ重複の挿入の存在が明らかにされるからである。
【０３９２】
従って、多型分析を容易にするために、本発明者らは、９名の健康な（コントロール）個体に由来するＳＣＣＥ遺伝子の２つのエキソンを、特異的なプライマー（Ｆ１、Ｒ１、Ｆ５およびＲ５）を使用して９つの異なるポリメラーゼ連鎖反応生成物において増幅している。
【０３９３】
プライマーの配列は下記の通りである。Ｆ１：５’ＣＡＣＴＡＧＣＴＣＴＣＣＣ  ＡＴＴＡＧＴＣＣＣＣ３’；Ｒ５：５’ＴＣＧＴＴＧＴＧＣＣ  ＡＡＧＣＡＧＡＣ３’；Ｆ５：５’ＣＡＣＴＡＧＣＴＣＴＣＣＣ  ＡＴＴＡＧＴＣＣＣＣ３’；Ｒ５：５’ＴＣＧＴＴＧＴＧＣＣ  ＡＡＧＣＡＧＡＣ３’（下記の表Ｂ１．１もまた参照のこと）。各エキソンの配列組成（例えば、それらのＧＣ含有量）が異なるため、異なる条件が、２つのエキソンを増幅するために使用される；これらの条件もまた表に示される。
【０３９４】
エキソンＩの場合、ゲノムＤＮＡの増幅が、２μｌのＴａｑポリメラーゼ緩衝液（ｘ１）（Ｇｉｂｃｏ；ｘ１０）、０．８μｌのＭｇＣｌ２（２ｍＭ）（Ｇｉｂｃｏ；５０ｍＭ）、１．６μｌの各ｄＮＴＰ（１０ｍＭ）（Ｐｒｏｍｅｇａ）、０．１μｌのＷ−１（Ｇｉｂｃｏ；１％）、０．１μｌのＴａｑポリメラーゼ（Ｇｉｂｃｏ；０．５ｕ）、１μｌのプライマーＦ１（２μＭ；初期濃度２０μＭ）、１μｌのプライマーＲ１（２μＭ；初期濃度２０μＭ）、１μｌのＤＮＡテンプレート（１００ｎｇ／μｌ）および１２．４μｌの滅菌Ｈ２Ｏを含む２０μｌのＰＣＲ反応液を使用して達成される。
【０３９５】
エキソンＶの場合、ゲノムＤＮＡが、２μｌのＰｆｘポリメラーゼ緩衝液（ｘ１）（Ｇｉｂｃｏ；ｘ１０）、０．８μｌのＭｇＳＯ４（２ｍＭ）（Ｇｉｂｃｏ；５０ｍＭ）、１．６μｌの各ｄＮＴＰ（１０ｍＭ）（Ｐｒｏｍｅｇａ）、２μｌのＰＣＲエンハンサー溶液（ｘ１）（Ｇｉｂｃｏ；ｘ１０）、０．０６μｌのＰｆｘポリメラーゼ（Ｇｉｂｃｏ；２５０ｕ）、１μｌのプライマーＦ５（２μＭ；初期濃度２０μＭ）、１μｌのプライマーＲ５（２μＭ；初期濃度２０μＭ）、１μｌのＤＮＡテンプレート（１００ｎｇ／μｌ）および１０．５４μｌの滅菌Ｈ２Ｏを含む２０μｌの反応液におけるＰＣＲによって増幅される。
【０３９６】
ＰＣＲ増幅は４０ウエルのサーマルサイクラー（ＴＥＣＨＮＥ−ＧＥＮＩＵＳ；Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｓｕｐｐ．Ｌｔｄ）において下記の条件のもとで行われる；９８℃で５分間（１サイクル）、９７℃で１分間、５７℃（エキソンＶ）または６０℃（エキソンＩ）のいずれかで３０秒間、７２℃で１分間（３５サイクル）、７４℃で５分間および１５℃での保持。２つのエキソンを増幅するために用いられたプライマーおよびＰＣＲ条件のまとめが表Ｂ１．１に示される。
【表１１】
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表Ｂ１．１．ＳＣＣＥ遺伝子のエキソンＩおよびエキソンＶの増幅および配列決定において使用されたプライマーおよび条件。
【０３９７】
アガロースゲル電気泳動
増幅産物をアガロースゲル電気泳動により分離する。下記の方法は、１ｘＴＡＥ（４，９００ｍｌの滅菌Ｈ２Ｏおよび１００ｍｌの５０ｘＴＡＥストック［２４２ｇのＴｒｉｓ塩基、５７．１ｍｌの氷酢酸、これは１００ｍｌの０．５Ｍ  ＥＤＴＡを用いてｐＨ８に調整される］）における１．５％アガロースゲルに関する標準的なゲル電気泳動プロトコルに基づく。
【０３９８】
１．５ｇのアガロースを、電子レンジで加熱することによって１００ｍｌの１ｘＴＡＥに完全に溶解させ、そして４μｌの臭化エチジウムを加えた後、溶液を混合して、冷水で注意深く冷却する。同時に、ゲルトレイを、ゲルトレイの両端にテープを貼ることによって準備し、そしてコームを、所望する位置にウエルを形成させるために設置する。その後、融解アガロースをゲルトレイに注入し、室温において固化させる。最初にコームをはずし、次にテープをはずし、そしてトレイ内のゲルを水平型ゲル槽に入れて、ゲルをゲル槽内において１ｘＴＡＥ緩衝液で（数ｍｍ）覆う。
【０３９９】
続いて、密度を増大させるために１０％（ｖ／ｖ）の負荷緩衝液（０．２５％ブロモフェノールブルー、０．２５％キシレンシアノールおよび２５％フィコール）を含有するＤＮＡサンプルをゲル内の形成されたウエルに注入する。通常、ウエルには、より明瞭な結果を得るためにできるだけ多くのサンプルが注入される。その後、槽の陽極端子（赤）および陰極端子（黒）を電源装置（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｐａｃ３００）に接続して、ゲルを定電圧（１００Ｖ）で泳動する。ＤＮＡは負極から正極の方に移動する。約４０分後、ＤＮＡのバンドを紫外線（ＵＶ；３０６ｎｍ）のもとで可視化する。
【０４００】
ＴＡＥアガロースゲルからのＤＮＡの抽出および精製
ゲルからＤＮＡバンドを抽出することに先立つ最初の工程は、アガロース混入物からＤＮＡを精製するために必要な材料であるガラスウールの調製である。ガラス器具だけを使用するとき、適量のガラスウール（Ｓｉｇｍａ）を、２ｍｌのジメチルクロロシタン（ｄｉｍｅｔｈｙｌｃｈｌｏｒｏｓｉｔａｎｅ）および９８ｍｌのクロロホルムを含有する１００ｍｌの溶液に浸して、換気装置内に一晩放置する。翌日、浸したガラスウールを、メタノール中で１回、その後、純水中で３回洗浄し、そして水分を吸い取って乾燥させ、その後、使用する。
【０４０１】
乾燥したガラスウールは既にチューブに入れられているので、目的とするＤＮＡバンドを同定し、そしてＤＮＡバンドを、（エタノール中で洗浄した）清浄なメスを使用してゲルから注意深く（余分なアガロースをできる限り含まないように）切り出して、０．５ｍｌのエッペンドルフチューブに入れる。このチューブには、小さいシリンジで底に穴が開けられ、そして（チューブの２／３を覆う）適量のシリコーン処理されたガラスウールが詰められている。その後、ガラスウールおよび切り取られたＤＮＡバンドを含む０．５ｍｌのエッペンドルフチューブを１．５ｍｌのエッペンドルフチューブに入れて、６，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離する。
【０４０２】
続いて、０．５ｍｌのエッペンドルフチューブを捨て、溶出されたＤＮＡを、（溶出ＤＮＡ容量に関して）０．１容量の３Ｍ酢酸ナトリウム、２容量の１００％エタノールおよび１μｌのグリコーゲンをそれぞれの溶出ＤＮＡ溶液に加えることによってエタノール沈澱する。その後、溶液を、−７０℃で６０分間または４℃で一晩放置して沈澱させる。その後、沈澱させた溶液を１４，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離し、上清を捨て、そしてペレットを２００μｌの７０％エタノール中でさらに洗浄する。後者の溶液を１４，０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清を再び捨て、そしてペレットを２、３時間室温で放置して乾燥させる。ペレットが完全に乾燥したとき（エタノールの痕跡が全く検出されなくなったとき）、ペレットを１０μｌのＨ２Ｏに再懸濁する。
【０４０３】
精製されたＰＣＲ産物の配列決定分析
精製ＰＣＲ産物を配列決定にまわす前に、十分な量のＤＮＡ（すなわち、＞５００ｎｇ）が再懸濁サンプルに存在するかどうかを確認することが必要である。この目的のために、それぞれの再懸濁液からの２μｌおよび９８μｌの滅菌水を含む１００μｌの分光測定用の溶液を調製し、その吸光度を分光光度計によってブランクサンプルに対して測定する。その後、ＤＮＡ濃度を下記の式を使用することによって計算する。
ＤＮＡ濃度（ｎｇ）＝Ｏ．Ｄ．ｘ０．０５ｘ希釈倍率ｘ残ったＤＮＡ溶液のμｌ
【０４０４】
適量のＤＮＡを有することが見出された再懸濁サンプルは、Ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎの１つである、ＢｉｇＤｙｅ（商標）を使用するジデオキシ配列決定にまわされ、解析がＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ（商標）３７７ＤＮＡシーケンサー（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（商標））において行われる。最後に、考えられる多型を検出するために、得られた配列が、ＧｅｎｅＪｏｃｋｅｙプログラム（ＢＩＯＳＯＦＴ（登録商標）、英国）から得られるヌクレオチドマルチアラインメントプログラムを使用して互いに比較され、そしてＳＣＣＥの対応する配列（アクセション番号ＡＦ１６６３３０）と比較される。
【０４０５】
患者およびコントロール個体の募集
本研究の基礎となる２０名のアトピー性湿疹者がシェフィールド（英国）の皮膚科診療所から集められる。患者はそれぞれ、アトピー性湿疹の診断を確認するために、経験を積んだ皮膚科医によって個別に検査される。
【０４０６】
本研究において使用される、疾患集団（白人、北部イングランド人）と人種的に一致する健康なコントロールに由来するＤＮＡは、Ｔｒｅｎｔ輸血サービス（Ｓｈｅｆｆｉｅｌｄ）に由来する献血者から得られる。ゲノムＤＮＡを、上記の個体から得られた全血から標準的なプロトコルに従って抽出し、９９ウエルマイクロタイタープレートにおいて保存する。それぞれのウエルには、５００μｌの異なるＤＮＡ溶液（１００ｎｇ／μｌ）が含まれる。
【０４０７】
ＤＮＡ分析およびＰＣＲに基づくアッセイ
検出された４ｂｐ（ＡＡＣＣ）の挿入／欠失多型（下記を参照のこと）の対立遺伝子を識別するために、２つの異なるプライマーが設計される。一方（Ｉ／Ｄ  Ｒ１）は１つのＡＡＣＣの反復からなり、もう一方（Ｉ／Ｄ  Ｒ２）は、２つのＡＡＣＣからなる反復を含む。
【表１２】
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表Ｂ１．２．ＰＣＲに基づくアッセイ−適用されたプライマーおよび条件。
【０４０８】
プライマーの調製
そのようなプライマーは、２つの異なるＰＣＲ反応におけるリバースプライマーとして使用されるが、溶液乾燥物で得られるので、使用前にそれらをエタノール沈澱する必要がある。各プライマーを２００μｌのＴＥ緩衝液に再懸濁し、そして十分に混合した後、１００μｌのプライマー溶液を１．５ｍｌエッペンドルフチューブに入れる。このチューブにおいて、１０μｌの３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．８）および３３０μｌの１００％エタノールを加えて、溶液全体を−７０℃で６０分間または一晩放置して沈澱させる。沈澱が完了した後、溶液を５分間強く遠心分離して、上清を捨て、そしてペレットを２００μｌの７０％エタノール中で洗浄する。後者を２分間強く微量遠心分離して、上清を除き、そしてペレットを乾燥させる。次の工程は、ペレットを１００μｌのＨ２Ｏに再懸濁することである。上記のように、分光分析を用いて、溶液におけるＤＮＡの吸光度を調べる。下記の式を使用して、プライマー溶液のμｍｏｌ／ｌを計算する。
（Ｏ．Ｄ２６０ｘ希釈倍率ｘ０．０３３）／分子量（プライマー）ｘ１０６＝μｍｏｌ／ｌ
【０４０９】
得られた数字を２０で割り、２０μＭの溶液をもたらすプライマー溶液の希釈倍率を求める。それぞれのリバースプライマーは、エキソンＶ全体を増幅する際に用いられるフォワードプライマー（Ｆ５）と組み合わせて使用され、そして、エキソンＶにおいて使用される同じパターンのＰＣＲ反応混合物および熱サイクル条件が、上記の表Ｂ１．２に詳述されるように、アニーリング温度およびＭｇ＋＋濃度に関する変更とともに利用される。
【０４１０】
統計学的分析
疾患群およびコントロール群を、２ｘ３表を使用して比較する。コントロール群では、ＳＣＣＥ対立遺伝子Ｉ／対立遺伝子ＩＩの多型の対立遺伝子分布はハーディ・ワインベルグ平衡にある。量効果の可能性を調べるために、ヘテロ接合体およびホモ接合体についてのオッズ比（Ｏｒ）が、それらの危険率を、もう一方の対立遺伝子についてホモ接合である個体についての危険率と比較することによって別々に計算される。
【０４１１】
稀な対立遺伝子（対立遺伝子ＩＩ）についてホモ接合である個体についてのオッズ比（ＯＲ）が、同じ対立遺伝子についてヘテロ接合である個体よりも大きい場合には、量効果は明らかである。従って、傾向についてのχ２解析が、それぞれの遺伝子型群における推定される感受性対立遺伝子の数による重みを付けて行われ、そしてフィッシャーの直説法によるｐ値が計算される。
【０４１２】
実施例Ｂ２．角質層キモトリプシン酵素（ＳＣＣＥ）多型とアトピー性湿疹との関連
イントロンＩＶおよびエキソンＶのＳＮＰ多型の同定
本発明者らは、変異または多型の存在についてＳＣＣＥ遺伝子のエキソンＩおよびエキソンＶをスクリーニングした。それらの多型を検出するために、適切なプライマーを設計し、そして適切な熱サイクル条件を最適化して、理想的な増幅を達成する。予想サイズのバンド（エキソンＩおよびエキソンＶについて、それぞれ、３８２ｂｐおよび８００ｂｐ）を選択し、そして上記の実施例において記載されるように精製し、そして対応する配列が、続いて、その増幅のために使用された同じプライマーを用いてＡＢＩ  ＤＮＡシーケンサーから得られる。
【０４１３】
ＧｅｎｅＪｏｃｋｅｙソフトウエアパッケージ（ＢＩＯＳＯＦＴ、英国）からのマルチアラインメントプログラムを使用して、本発明者らは、数人の正常者および罹患者に由来するエキソンＶのＤＮＡ配列のアラインメントを行った。結果が下記に示される。
【表１３】
2004524010.tif 000012
【０４１４】
ＡＥ２、ＫＬＫｅｘ５−３ＦおよびＫＬＫ７ｅｘ５ＡＥ７／Ｆはアトピー性湿疹の患者に対応し、これに対して、３、７および９はコントロールの個体から得られ、Ｆ５プライマーを使用して配列決定されている。考えられるＳＮＰを示唆する重要な異なるヌクレオチド部分が太字で強調され、これに対して、ＡＡＣＣの挿入または欠失には下線が付されている。
【０４１５】
３つのコントロールサンプルを配列決定することによって、エキソン１にはＳＮＰが検出されない。アラインメントにより、いくつかの著しい差異が、種々の個体に由来するＳＣＣＥ遺伝子の配列の特定のヌクレオチド間に存在することが示され、このことはＳＮＰの存在を示唆している（下記の表Ｂ２．１を参照のこと）。例えば、ＳＮＰ（Ａ→Ｃ）がイントロンＩＶのコンセンサス領域の塩基２５３に見出される。２つのさらなるＳＮＰ（Ｇ→ＴおよびＡ→Ｃ）が、エキソンＶのコンセンサス配列の塩基５８０および６０７においてそれぞれ同定される。これらはともに、ＳＣＣＥ遺伝子によってコードされるｍＲＮＡにおけるアミノ酸の変化を生じさせる。
【表１４】
2004524010.tif 000013
表Ｂ２．１．ＳＣＣＥ遺伝子のエキソンＩおよびエキソンＶにおけるＳＮＰの位置。
【０４１６】
アトピー性湿疹サンプルにおけるエキソンＶのＡＡＣＣ挿入／欠失多型の同定
上記に示されるような配列アラインメントにより、アトピー性湿疹患者（ＡＥ２と称される）のＳＣＣＥ配列のエキソンＶにおける４ｂｐの反復（ＡＡＣＣ）の存在（ゲノム位置：７，６３４ｂｐ〜７，６３７ｂｐ）が明らかにされる。これは、データベースから得られるＳＣＣＥの配列と一致する。
【０４１７】
しかし、この反復はそれ以外のアラインメントされた配列の一部には検出されない。このことは、参照している配列に依存して、この反復が挿入または欠失であり得ることを示唆している。
【０４１８】
図１には、この挿入／欠失を示す、ＳＣＣＥ遺伝子のエキソンＶに対応するＡＥ２配列の一部のクロマトグラムが示される。コントロールの個体から得られた対応するクロマトグラムが図２に示される。ＧＧＴＴとして示される２番目の反復（ＡＡＣＣ）が存在しないことが、クロマトグラムの配列から明らかである。
【０４１９】
ケースコントロール研究
本発明者らはさらに、１反復（ＡＡＣＣ）の対立遺伝子を有する個体と２反復（ＡＡＣＣＡＡＣＣ）の対立遺伝子を有する個体とを識別するために、特異的なプライマーを使用するＰＣＲ型アッセイを設計した。プライマーは、ＤＮＡ配列に対して相補的であるように設計された。２番目の反復（ＡＡＣＣ）が一方のプライマーには存在しないことを除いて、プライマーは同じ配列を有する（上記の実施例Ｂ１を参照のこと）。
【０４２０】
従って、調査中のサンプルの配列が１反復を有しない場合、ハイブリダイゼーションは不完全であり、増幅は起こらないと考えられる。その場合、そのような配列の増幅は、もう一方の対立遺伝子（すなわち、配列中に２反復を有する対立遺伝子）を使用して行われる。両方のプライマーを用いた増幅により、検査されたサンプルに対応する個体が両方の対立遺伝子についてヘテロ接合であることが示される。簡略化するために、本発明者らは、配列中に１反復を有する対立遺伝子を対立遺伝子１と呼び、２反復（ＡＡＣＣＡＡＣＣ）を有する対立遺伝子を対立遺伝子２と呼ぶ。
【０４２１】
２つの対立遺伝子を区別するＰＣＲの最適化
対立遺伝子１（１反復の対立遺伝子）および対立遺伝子２（２反復の対立遺伝子）の対立遺伝子分布を測定するために、本発明者らは、特異的なプライマー（上記の実施例Ｂ１を参照のこと）を使用する直接的なＰＣＲアッセイを設計した。健康な個体および患者個体をスクリーニングする前には、ＰＣＲ条件の最適化が、正確かつ有効な結果を得るために必要である。
【０４２２】
第１の最適化
第１の最適化のために、Ｆ５およびＩ／Ｄ  ＲＩＩのプライマーが、２．５ｍＭのＭｇ＋＋および６０℃（アニーリング温度）の特定の条件とともに、エキソンＶに対する熱サイクル条件のもとで使用される。この目的のために、１０個のＤＮＡサンプルが調べられる。そのうちの１つはＡＥ２配列（これは、その配列内に２反復の対立遺伝子を含むことが既に示されている−図１を参照のこと）であり、そして９個は、Ｐｏｌｙ１〜９と称されるコントロール個体であり、Ｐｏｌｙ９は、配列内に１反復の対立遺伝子を含むことが既に見出されている（図２を参照のこと）。
【０４２３】
結果は、２、３、７および９のサンプルでは増幅されないことを示している。しかし、これは、それらの配列中に２番目の反復が存在しないためではなく、ＤＮＡの品質が悪いためであるか、または非特異的なＰＣＲ条件のためである可能性がある。この可能性を排除するために、本発明者らは、エキソン５全体の増幅産物である８００ｂｐの「コントロール」増幅産物を含む、もう一組のＰＣＲ反応を行った（すなわち、プライマーＦ５およびプライマーＲ５、２ｍＭのＭｇ＋＋および５７℃）。得られたゲルが図３に示される。このゲルは、本発明者らの先の最適化が正確であり、そして対立遺伝子識別の結果が有効であることを明らかにしている。
【０４２４】
第２の最適化
第２の最適化には、同じＤＮＡサンプル、プライマーＦ５およびプライマーＩ／Ｄ  ＲＩ、そして２．５ｍＭのＭｇ＋＋および６１℃のＰＣＲ条件の使用が伴う。予想されるように、ＡＥ２のレーンにはバンドが存在せず、これに対して、以前には増幅が起こらなかったサンプル（２、３、７および９）に対するバンドが存在する。第２の最適化に対する結果が図４に示される。
【０４２５】
最適化された条件を使用するコントロールサンプルおよびアトピー性湿疹サンプルの遺伝子型決定
両方のプライマーについて上記の最適化された条件を使用する直接的なＰＣＲ法によって、本発明者らは、ＳＣＣＥ遺伝子の２つの異なる対立遺伝子の対立遺伝子分布を解明するために、健康者サンプルおよびアトピー性湿疹サンプルをスクリーニングした。
【０４２６】
実際のスクリーニング結果とともに、コントロールのバンドが存在する反応の結果が下記の表Ｂ２．２に示される。
【表１５】
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表Ｂ２．２．アトピー性湿疹群およびコントロール群におけるＳＣＣＥのＡＡＣＣ／ＡＡＣＣＡＡＣＣ多型の対立遺伝子分布。
【０４２７】
統計学的分析
アトピー性湿疹群およびコントロール群の両方におけるＳＣＣＥのＡＡＣＣ／ＡＡＣＣＡＡＣＣ多型の対立遺伝子分布が上記の表Ｂ２．２に示される。コントロール群と比較した場合、患者群では、稀な対立遺伝子（対立遺伝子２）の対立遺伝子頻度が有意に増大している。コントロール群における稀な対立遺伝子（頻度＝０．４３）は、疾患群では、より一般的な対立遺伝子（頻度＝０．７５）である。量効果がこの多型について明らかであるため、この稀な対立遺伝子についてのオッズ比（ＯＲ）は、ヘテロ接合の場合よりも有意に大きい。従って、χ２検定が行われる。強い関連が、ＳＣＣＥ−対立遺伝子ＩＩ変化体とアトピー性湿疹との間に見出される［ｐ＝０．０１０４、ＯＲ＝７．００（９５％の信頼区間（１．７４、２８．１７））］。
【０４２８】
結論
本発明者らは、ＡＡＣＣＡＡＣＣの挿入を有するＳＣＣＥ対立遺伝子が、患者コホートでは一般的であることを示している。８０％の湿疹患者がＳＣＣＥのＡＡＣＣＡＡＣＣ対立遺伝子の１つまたは２つを有しており、７０％がこの対立遺伝子についてホモ接合である。しかし、コントロール群では、６０％がＳＣＣＥのＡＡＣＣＡＡＣＣ対立遺伝子についてヘテロ接合であり、２５％のみがこの対立遺伝子についてホモ接合である。従って、ＡＡＣＣＡＡＣＣを含むＳＣＣＥ対立遺伝子は湿疹と関連することが示される。
【０４２９】
本発明者らは、３’ＵＴＲにおける挿入がｍＲＮＡの安定性に対して強い影響を有すると推測している。従って、ＳＣＣＥの量が変化し、これにより、コルネオデスモソームのタンパク質分解プロセスが影響を受ける。これは皮膚バリアの恒常性を破壊し、そして湿疹性の臨床的表現型をもたらす。
【０４３０】
ＳＣＣＥの挿入は、過敏な皮膚（例えば、湿疹）を有する患者を診断するために使用することができる。この診断は治療的処置のためには極めて有用である。例えば、この挿入がＳＣＣＥのより少ないタンパク産生と関連している場合、処置は、ＳＣＣＥの生理学的濃度を増加させることに集中する（例えば、皮膚に対する薬用ローションにおけるＳＬＰＩの阻害またはＳＣＣＥの使用）。しかし、ＳＣＣＥ遺伝子におけるこの挿入が皮膚内のＳＣＣＥ濃度の増大と関連している場合、処置は、例えば、皮膚に対するローションにおいてＳＬＰＩおよび／またはＳＬＰＩペプチドおよび／またはＳＣＣＥ抗体を適用することによってＳＣＣＥの内因性濃度を減少させることに集中する。
【０４３１】
従って、本発明者らは、個体のＳＣＣＥ核酸におけるＡＡＣＣＡＡＣＣ配列の存在を検出することによる、個体における第Ｉ群疾患または第Ｉ群疾患に対する感受性（好ましくは湿疹または湿疹に対する感受性、好ましくはアトピー性湿疹）の診断を開示する。本発明者らはさらに、ＳＣＣＥゲノム配列（ＧＢ：ＡＦ１６６３３０）における７６３４位〜７６３７位に対応する位置におけるＡＡＣＣ配列を検出することによるそのような診断を開示する。好ましくは、診断は、個体のｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡに対して実施される。好ましくは、ＡＡＣＣ配列がＳＣＣＥゲノム配列（ＧＢ：ＡＦ１６６３３０）の７６３４位〜７６３７位において検出される。
【０４３２】
指定された位置におけるＡＡＣＣＡＡＣＣの非存在の検出はまた、第ＩＩ群疾患（好ましくは、乾癬および／またはざ瘡に対する感受性）を診断または検出するために使用することができる。
【０４３３】
実施例Ｂ３．分泌型ロイコプロテアーゼ阻害剤（ＳＬＰＩ）多型の同定
ＳＬＰＩのプロモーターにおける変異の検出
本発明者らは、ＴＡＴＡシグナル、ＣＡＡＴシグナルおよび２つのＣＲＥ様配列を含むＳＬＰＩのプロモーター領域の約１５００ｂｐをスクリーニングした。
【０４３４】
１０個のサンプルが異なる人種群から得られ、これらは皮膚疾患の病歴を有さず、そして１０個のサンプルが、アトピー性湿疹および尋常性ざ瘡および尋常性乾癬の各患者から得られる。これらのサンプルはそれぞれが、適切なプライマーを使用してＰＣＲによってスクリーニングされる。最初に、ＳＬＰＩプロモーター配列（ＧｅｎｅＢａｎｋアクセション番号、Ｍ７４４４４）が調節エレメントについてスクリーニングされる。２つのＣＲＥ（環状ＡＭＰ応答エレメント）様配列が見出される。環状ＡＭＰ応答エレメント（ＣＲＥ）は、ＮＦ−ＩＬ６およびＣＲＥＢなどの転写因子によって認識される（Ｔｓｕｋａｄａら、１９９４）。ＣＲＥ内の変異点はＩＬ−１βの刺激を著しく低下させる（Ｐｏｔｔｅｒら、２０００）。ＳＰＬＩがＩＬ−１βおよびＴＮＦ−αの両方によってアップレギュレーションされることが知られている（Ｔａｎａｋａら、２０００；本研究の処置の節もまた参照のこと）。
【０４３５】
サンプルは、ＴＡＴＡシグナル（−２７／−２１）、ＣＡＡＴシグナル（−８７／−８３）（これはＡｂｅら（１９９１）により報告される）、ならびにＣＲＥ様１（ｔｔｇｃｔｇｔｃａ；−９０７／−８９８）およびＣＲＥ様２（ｔａｃｇｔａｃｇｔｃａ；−１１５７／−１１４６）の２つの配列を含むＳＬＰＩプロモーター領域の周りがスクリーニングされる。これらの位置は、転写開始点（＋１；配列内の１３７４位のＣ）の位置に対する参照により示される。ＳＬＰＩのプロモーター領域の配列を下記に示す：
【表１６】
2004524010.tif 000015
【０４３６】
ＣＲＥ様の位置は太字で示される。ＴＡＴＡボックスおよびＡＴＧには下線が付されている。
【０４３７】
ＰＣＲ条件は下記の通りである。９４℃／３分の１サイクル；９４℃／３０秒、アニーリング温度／３０秒、７２℃／４５秒の４５サイクル；７２℃／１０分の１サイクル；以降４℃。ＰＣＲに使用されたプライマーが下記の表Ｂ３．１に示される。
【表１７】
2004524010.tif 000016
表Ｂ３．１
【０４３８】
ＳＬＰＩプロモーターのフラグメントのそれぞれを増幅するための最適化されたＭｇ２＋濃度およびアニーリング温度が下記の表Ｂ３．２に示される。
【表１８】
2004524010.tif 000017
表Ｂ３．２
【０４３９】
ＰＣＲスクリーニング法を使用して、本発明者らは、下記の表Ｂ３．３に示されるようなＳＬＰＩ内の変異を同定している。
【表１９】
2004524010.tif 000018
表Ｂ３．３．ヒトＳＬＰＩ配列内の変異。多型の位置には下線が付されている。＊＊−これらは、使用された第２のＰＣＲフラグメントに由来する。＊＊＊−付属Ｂにおける基準配列を参照のこと。
【０４４０】
これらの様々な多型と、同定された対立遺伝子との間における疾患関連性が下記の表Ｂ３．４に示される。
【表２０】
2004524010.tif 000019
表Ｂ３．４．ＳＬＰＩにおける疾患関連性。なし：両方の対立遺伝子が同じ頻度で存在する。空欄：そのようなカテゴリーのサンプルがその位置において存在しない。＊＊＊：この対立遺伝子のみがこの位置およびこのサンプル組において存在する。
【０４４１】
疾患を診断するためのＳＬＰＩ多型の検出
本発明者らは、一般的には、上記の表Ｂ３．４において同定されるようなＳＬＰＩ内の多型のいずれかを検出することによる疾患（好ましくは、炎症性の皮膚疾患）の診断方法を提供する。
【０４４２】
特に、本発明者らは、下記の表Ｂ３．５に示されるようなＳＬＰＩ内の多型のいずれかを検出することによる疾患（好ましくは、炎症性の皮膚疾患）の診断方法を提供する。
【表２１】
2004524010.tif 000020
表Ｂ３．５
【０４４３】
本節および次の３つの節では、位置番号は、好ましくは、アクセション番号Ｍ７４４４４または付属Ｂにおける基準ＳＬＰＩ配列を参照して付けられる。
【０４４４】
ざ瘡の診断
特に、本発明者らは、個体における第ＩＩ群疾患（好ましくはざ瘡）の診断方法を開示するが、この方法は、ＳＬＰＩの１３００位におけるＧ残基の存在、またはＳＬＰＩの１４１８位におけるＣ残基の存在、またはその両方を検出することを含む。
【０４４５】
乾癬の診断
本発明者らは、個体における第ＩＩ群疾患（好ましくは乾癬）の診断方法を開示するが、この方法は、ＳＬＰＩの２９１位におけるＧ残基の存在、ＳＬＰＩの２９２／２９３位におけるＧ残基の非存在、ＳＬＰＩの１３２５位におけるＧ残基の存在、ＳＬＰＩの１４１８位におけるＣ残基の存在からなる群から選択される１つ以上の多型の存在を検出することを含む。
【０４４６】
湿疹の検出
本発明者らは、個体における第ＩＩ群疾患（好ましくは湿疹、より好ましくはアトピー性湿疹）の診断方法を開示するが、この方法は、ＳＬＰＩの２８０位におけるＴ残基の存在、ＳＬＰＩの２９２／２９３位におけるＧ残基の存在、ＳＬＰＩの１２３５／１２３６位におけるＣ残基の存在、ＳＬＰＩの１３８４／１３８５位におけるＣ残基またはＡ残基の非存在からなる群から選択される１つ以上の多型の存在を検出することを含む。
【０４４７】
実施例Ｂ４．シスタチンＡ（ＣＳＴＡ）プロモーター多型の同定
シスタチンＡ（ＣＳＴＡ）は、染色体位置３ｑ２１に位置する、角質層において発現するシステインプロテアーゼ阻害剤である。この領域には、乾癬、アトピー性皮膚炎および他の自己免疫疾患の両方の感受性遺伝子座が含まれる（Ｃｏｏｋｓｏｎら、２００１；Ｌｅｅら、２０００；Ｂｅｃｋｅｒら、１９９８）。
【０４４８】
ヒトシスタチンＡのプロモーターにおける変異の検出
本発明者らは、異なる人種群に由来し、皮膚疾患の病歴を有しない１０個のサンプルと、アトピー性湿疹および尋常性ざ瘡および尋常性乾癬の各患者に由来する１０個のサンプルとにおいて、ＴＡＴＡシグナルおよびＣＡＡＴ配列を含むシスタチンＡ（ＣＳＴＡ）プロモーター領域の５００ｂｐ〜１０００ｂｐをスクリーニングした。
【０４４９】
ＰＣＲ条件は下記の通りである。９４℃／３分の１サイクル；９４℃／３０秒、アニーリング温度／３０秒、７２℃／４５秒の４５サイクル；７２℃／１０分の１サイクル；以降４℃。ＰＣＲに使用されたプライマーが下記の表Ｂ４．１に示される。
【表２２】
2004524010.tif 000021
表Ｂ４．１
【０４５０】
４つの領域のそれぞれを増幅するための最適化されたＭｇ２＋濃度およびアニーリング温度が下記の表Ｂ４．２に示される。
【表２３】
2004524010.tif 000022
表Ｂ４．２
【０４５１】
ＰＣＲスクリーニング法を使用して、本発明者らは、下記の表Ｂ４．３に示されるような、ヒトシスタチンＡの様々な領域における変異を同定している。
【表２４−１】
2004524010.tif 000023
【表２４−２】
2004524010.tif 000024
表Ｂ４．３．ヒトシスタチンＡ配列内の変異。＊＊−この表に示された位置は、１位としてエキソン１の５’末端が使用される。すべての他の位置はこの位置に対する相対的なものである。
【０４５２】
発表された配列には、イントロン１の５’部分と３’部分との間にギャップが存在するので、ヌクレオチド位置のそのような番号付けは、ＣｙｓｔＡ．１およびＣｙｓｔＡ．２の２つのシスタチンＡ配列を参照してなされる。配列ＣｙｓｔＡ．２の１位は、イントロン１の発表された３’部分の開始部である。位置の番号付けのために使用された配列は、セミコロンの前に「１」（ＣｙｓｔＡ．１の場合）または「２」（ＣｙｓｔＡ．２の場合）によって示される。従って、例えば、「２；２４４６」は、ＣｙｓｔＡ．２について配列内の２４４６位を示す。ＣｙｓｔＡ．１およびＣｙｓｔＡ．２の基準配列は下記の付属Ａに示される。
【０４５３】
これらの様々な多型と、同定された対立遺伝子との間における疾患関連性が下記の表Ｂ４．４に示される。
【表２５−１】
2004524010.tif 000025
【表２５−２】
2004524010.tif 000026
表Ｂ４．４．シスタチンＡ対立遺伝子における疾患関連性。なし：両方の対立遺伝子が同じ頻度で存在する。空欄：そのようなカテゴリーのサンプルがその位置において存在しない。＊＊＊：この対立遺伝子のみがこの位置およびこのサンプル組において存在する。
【０４５４】
＊＊−この表に示された位置は、１位としてエキソン１の５’末端が使用される。すべての他の位置はこの位置に対して相対的なものである。発表された配列には、イントロン１の５’部分と３’部分との間にギャップが存在するので、ヌクレオチド位置のそのような番号付けは、ＣｙｓｔＡ．１およびＣｙｓｔＡ．２の２つのシスタチンＡ配列を参照してなされる。配列ＣｙｓｔＡ．２の１位は、イントロン１の発表された３’部分の開始部である。位置の番号付けのために使用された配列は、セミコロンの前に「１」（ＣｙｓｔＡ．１の場合）または「２」（ＣｙｓｔＡ．２の場合）によって示される。従って、例えば、「２；２４４６」は、ＣｙｓｔＡ．２について配列内の２４４６位を示す。ＣｙｓｔＡ．１およびＣｙｓｔＡ．２の基準配列は下記の付属Ａに示される。
【０４５５】
疾患を診断するためのシスタチンＡ多型の検出
本発明者らは、一般的には、上記の表Ｂ４．４において同定されるシスタチンＡ内の多型のいずれかを検出することによる疾患（好ましくは、炎症性の皮膚疾患）の診断方法を提供する。
【０４５６】
ざ瘡の診断
特に、本発明者らは、個体における第ＩＩ群疾患（好ましくはざ瘡）の診断方法を開示する。この方法は、ＣｙｓｔＡ．１の１１０位におけるＧ残基の存在、ＣｙｓｔＡ．１の９６位のＣ残基の存在、ＣｙｓｔＡ．１の７１位におけるＡ残基の存在、ＣｙｓｔＡ．１の２０位におけるＧ残基の存在、ＣｙｓｔＡ．１の１７位におけるＴ残基の存在、ＣｙｓｔＡ．１の１３位におけるＣ残基の存在、ＣｙｓｔＡ．１の１０位におけるＴ残基の存在、またはＣｙｓｔＡ．１の８位におけるＴ残基の存在からなる群から選択されるいずれか１つまたは２つ以上の多型を検出することを含む。
【０４５７】
本発明者らはさらに、個体における第ＩＩ群疾患（好ましくはざ瘡）の診断方法を開示する。この方法は、ＣｙｓｔＡ．１の７３位におけるＧ残基の非存在、ＣｙｓｔＡ．１の７６位および７７位におけるＴＧの非存在、ならびにＣｙｓｔＡ．１の６位におけるＣ残基の非存在からなる群から選択されるいずれか１つまたは２つ以上の多型を検出することを含む。
【０４５８】
上記の２つの段落における診断方法は組み合わせることができる。
【０４５９】
乾癬の診断
本発明者らは、個体における第ＩＩ群疾患（好ましくは乾癬）の診断方法を開示する。この方法は、ＣｙｓｔＡ．１の２７０位におけるＧ残基の非存在、ＣｙｓｔＡ．１の７３位のＧ残基の存在、ＣｙｓｔＡ．１の１５位におけるＣ残基の非存在、ＣｙｓｔＡ．１の６位におけるＣ残基の非存在、ＣｙｓｔＡ．１の４位におけるＧ残基の非存在、およびＣｙｓｔＡ．１の７位におけるＧ残基の非存在からなる群から選択される１つ以上の多型を検出することを含む。
【０４６０】
湿疹の診断
本発明者らは、個体における第Ｉ群疾患（好ましくは湿疹、より好ましくはアトピー性湿疹）の診断方法を開示する。この方法は、ＣｙｓｔＡ．１の１２２位および１２１位におけるＡＣの非存在、ＣｙｓｔＡ．１の１１０位のＧ残基の非存在、ＣｙｓｔＡ．１の８５位におけるｔ残基の存在、ＣｙｓｔＡ．１の７３位におけるＧ残基の存在、ＣｙｓｔＡ．１の７２位におけるＡ残基の非存在、ＣｙｓｔＡ．１の６０位におけるＴ残基の非存在、ＣｙｓｔＡ．１の１５位におけるＣ残基の非存在、ＣｙｓｔＡ．１の１４位におけるＡ残基の非存在、ＣｙｓｔＡ．１の１３位におけるＣ残基の非存在、ＣｙｓｔＡ．１の６位におけるＣ残基の非存在、ＣｙｓｔＡ．１の５位におけるＴ残基の非存在、ＣｙｓｔＡ．１の４位におけるＧ残基の非存在、ならびにＣｙｓｔＡ．１の７位におけるＧ残基の非存在からなる群から選択される１つ以上の多型を検出することを含む。
【０４６１】
実施例Ｂ５．シスタチンＡ（ＣＳＴＡ）コード配列多型の同定
ヒトシスタチンＡのコード配列における変異の同定
シスタチンＡのコード配列が、上記に記載されるように、多型についてＰＣＲを使用してスクリーニングされる。同定された多型が上記の表Ｂ４．３および表Ｂ４．４に示される。
【０４６２】
実施例Ｂ６．プロモーター活性の分析
本発明者らは、ヒトゲノムデータベースにおける検索を行うためにエキソン１の配列を使用し、そしてＲＰ１１−２９９Ｊ３クローン（ＡＣ０８３７９８）におけるＣＳＴＡプロモーター領域を同定している。本発明者らは、潜在的なＴＡＴＡシグナルおよびＣＡＡＴシグナルをその配列において同定している。これらのシグナルは、下記のＣＳＴＡの５’配列において太字で示される。
【０４６３】
４つの調節領域がプロモーター配列内に存在する。３つのＴＰＡ応答性エレメント（ＴＲＥ−１、ＴＲＥ−２およびＴＲＥ−３）および１つのＡｐ−２部位。ＴＰＡまたは１２−Ｏ−テトラデカノイルホルボル−１３−アセタートは強力なタンパク質キナーゼＣ活性化因子であり、ＡＰ−２はエンハンサー結合タンパク質である。
ＣＳＴＡの５’領域
【表２６】
2004524010.tif 000027
【０４６４】
プロモーター領域１
コントロールおよび患者に由来するＣＳＴＡのプロモーター領域１の配列がアラインメントされ、下記に示される。
【表２７】
2004524010.tif 000028
【０４６５】
上記のアラインメントにおいて、ＴＲＥ−１配列およびＴＲＥ−２配列には下線が付されている。＊は変異位置を示す。ｃｓｔａｃｏｎｒはＧＢのＡＣ０８３７９８配列に由来する配列である。ｃｓｔａｐｅ２ｆ、ｃｓｔａｐｅ１ｒｆおよびｃｓｔａｐｅ８ｆは湿疹患者由来の配列である。ｃｓｔａｐｐ６ｆおよびｃｓｔａｐｐ８ｆは乾癬患者由来の配列である。
【０４６６】
プロモーター領域２
コントロールおよび患者に由来するＣＳＴＡのプロモーター領域２の配列がアラインメントされ、下記に示される。
【表２８】
2004524010.tif 000029
【０４６７】
上記のアラインメントにおいて、ＡＰ−２配列には下線が付されている。＊は変異位置を表す。ｃｓｔａｐｐｏｌｙ７ｒ、ｃｓｔａｐｏｌｙｐ３ｒ、ｃｓｔａｐｐｏｌｙ４ｒ、ｃｓｔａｐｐｏｌｙ６ｒは、異なる人種群に由来するコントロール由来の配列である。ｃｓｔａｃｏｎｒはＧｅｎＢａｎｋのＡＣ０８３７９８配列に由来する配列である。ｃｓｔａｐａ２ｒおよびｃｓｔａｐａ１ｒはざ瘡患者由来の配列である。ｃｓｔａｐｅ５ｒ、ｃｓｔａｐｅ７ｒおよびおよびｃｓｔａｐａ９ｒは湿疹患者由来の配列である。ｃｓｔａｐｐ７ｒ、ｃｓｔａｐｐ６ｒおよびｃｓｔａｐｐ４ｒは乾癬患者由来の配列である。
【０４６８】
シスタチンＡのプロモーター領域には、患者だけに存在し、コントロールサンプルには存在しない数個の変異点が含まれることが明かである。ざ瘡および湿疹に由来するサンプルはプロモーター配列において非常に大きい変化を示す。従って、この領域は、正常者と比較した場合、患者では変化している。ざ瘡患者のシスタチンＡプロモーター（ｃｓｔａｐａ３ｆ）および湿疹患者のシスタチンＡプロモーター（ｃｓｔａｐｅ８）におけるＴＲＥ−２領域にはＧの挿入が存在しており、このことは、ＣＳＴＡプロモーター活性が、異常なバリアを伴う疾患（例えば、ざ瘡、湿疹）では変化していることを示唆している。
【０４６９】
従って、本発明者らは、シスタチンＡ核酸のＴＲＥ−２領域におけるＧ残基の存在を検出することを含む、疾患（好ましくは皮膚疾患、好ましくは皮膚の炎症性疾患）の診断方法を提供する。
【０４７０】
プロモーター活性
下記の実験が、シスタチンＡの発現におけるこれらのプロモーター配列多型およびコード配列多型の影響を明らかにするために行われる。
【０４７１】
ＰＣＲクローニング法
本発明者らは、プロモーター領域において、フォワード：５’ＧＣＴＴＣＣＴＣＣＡＴＡＴＣＴＧＴＡ３’およびリバース：５’ＡＧＡＴＡＡＧＣＣＴＣＣＡＧＧＴＡＴＣ３’の２つのプライマーを設計し、そして正常者由来のＤＮＡ（ｃｓｔａｐｐｏｌｙ４ｒ、ｃｓｔａｐｐｏｌｙ３ｒおよびｃｓｔａｐｐｏｌｙ７ｒ）および湿疹患者由来のＤＮＡ（ｃｓｔａｐｅ８ｆ、ｃｓｔａｐｅ５ｒ、ｃｓｔａｐｅ７ｒ）を使用してＰＣＲを行った。クローニング法は、Ｔａｋａｈａｓｈｉら（１９９８）によって記載されるクローニング法に類似する。ＰＣＲ産物はｐＣＲ（商標）２．１ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）にサブクローン化されて、組換えプラスミドからのＨｉｎｄＩＩＩ／ＸｂａＩ消化フラグメントがプロモーター非保有０−ＣＡＴプラスミドに挿入される。
【０４７２】
５μｇのフラグメント−ＣＡＴプラスミドが、リポフェクチンを使用するリポソーム法によって１０５個のＳＶＨＫ細胞をトランスフェクションするために使用される。４８時間後、細胞を集めて、ＣＡＴアッセイが行われる。
【０４７３】
結果
結果が図５に示される。
【０４７４】
湿疹患者のシスタチンプロモーターの活性は、コントロールのプロモーターと比較して著しく低下している（図５を参照のこと）。これらの結果より、ＣＳＴＡが皮膚バリアの恒常性に関与していることが示唆される。ＣＳＴＡは、皮膚バリアが損なわれた疾患（例えば、湿疹）ではダウンレギュレーションされる。ＣＳＴＡのアップレギュレーションはまた、上皮細胞間の接着の増大を誘導し得る。このことは、ＣＳＴＡはまた、皮膚バリアが増強された疾患にも関与することを示唆している。
【０４７５】
従って、ＣＳＴＡのプロモーター領域内における変異の検出は、皮膚バリアが異常な患者（例えば、湿疹または任意の第Ｉ群疾患）を診断するために使用することができる。この診断は、適切な処置を確認するための重要な工程である。例えば、湿疹患者における変異（例えば、ＴＲＥ−２配列ＴＧＧＡＴＧＣＡにおけるＧの挿入）の検出は、ＣＳＴＡが非常に弱い活性を有すること、そして、ＣＳＴＡの阻害活性を模倣するペプチドの１つまたは組合せを患者皮膚に適用することがこの場合には最も適切な処置であることを示唆する。
【０４７６】
実施例Ｃ：デスモソームおよびコルネオデスモソームのタンパク質のタンパク質分解プロフィル／プロテアーゼ媒介成熟化
実施例Ｃ１．組換えＳＣＴＥの産生
角質層トリプシン様酵素（ＳＣＴＥ）をクローン化して、完全な酵素活性を有するように活性な形態で発現させる。
【０４７７】
使用された発現ベクター
発現は、高レベルでのタンパク質発現を達成し、そして精製を可能にするために種々のベクターシステムを使用して達成される。３つのベクターシステムが使用される。
【０４７８】
昆虫細胞システム：Ｈｉｓタグを末端に有しない場合；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社のベクター（ｐＭＴ／Ｖ５−ＨｉｓＡ、ｐＭＴ／Ｖ５−ＨｉｓＢまたはｐＭＴ／Ｖ５−ＨｉｓＣ）が、読み枠に依存して使用される。Ｓ２昆虫（ショウジョウバエ）細胞における発現；Ｈａｎｓｓｏｎら（１９９４）に記載されるような精製。
【０４７９】
レトロウイルスシステム：Ｈｉｓタグを有しない場合；Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社のレトロウイルスベクター（ｐＬＮＣＸ２）タンパク質をネズミ乳房細胞において発現させ、そしてＨａｎｓｓｏｎら（１９９４）に記載されるように精製する。
【０４８０】
ｐｃＤＮＡ３．１システム：ＨｉｓタグをＣ末端に有する場合；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社のベクター（ｐｃＤＮＡ３．１、３つのＯＲＦを有するＡＢＣ）が使用される。タンパク質の発現がＣＯＳ−７細胞（アフリカミドリサル腎臓細胞）において達成される。逆転写−ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）
【０４８１】
オープンリーディングフレームを覆うＰＣＲプライマーが、ＳＣＴＥ配列（ＧＢ：ＡＦ１６８７６８）を使用して、手作業により、すなわち、目で見ながら設計される。すべてのプライマーがＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社から得られる。
フォワード（５’から３’に）：ＧＧＡ  ＡＡＴ  ＣＡＧ  ＧＴＧ  ＣＡＧ  ＣＧ
リバース（５’から３’に）：ＧＡＴ  ＧＡＣ  ＴＣＡ  ＧＧＡ  ＧＴＴ  ＧＧＣ
【０４８２】
ヒト表皮の総ＲＮＡを、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社のＧｏｌｄ  ＲＮＡ  ＰＣＲキットを用いてｃＤＮＡに逆転写する。ＲＴサイクルは、２５℃で１０分間のハイブリダイゼーション、その後、４２℃で１２分間の逆転写を含む。ＰＣＲは、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社のＧｏｌｄ  Ｔａｑポリメラーゼを２．０ｍＭのＭｇ２＋とともに使用して４０サイクル行われる。各ＰＣＲサイクルは、９５℃で１０分間のＴａｑ活性化、９４℃で３０秒間の変性、５８．８℃で１分間のアニーリング、７２℃で２０秒間の伸長、および７２℃で７分間のアニーリング／伸長からなる。
【０４８３】
ＰＣＲ増幅は１．５％アガロースゲルで確認される。ＰＣＲ産物を、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社のＳｔｒａｔａｐｒｅｐ  ＰＣＲ精製キットを使用してそれ以外のＰＣＲ混合物成分から精製する。精製されたＳＣＴＥ  ＰＣＲ産物は、制限酵素ＰＣＲ制限酵素部位隣接ＰＣＲのためのテンプレートとして使用される。
【０４８４】
昆虫細胞ベクターｐＭＴ／Ｖ５−Ｈｉｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ＃Ｋ４１２０−２０）がクローニングのために選ばれる。このベクターは３つの読み枠（Ａ、ＢおよびＣ）で利用することができる。それぞれの読み枠により、Ｃ末端ペプチドの発現を伴うクローニングが容易になる。正しい読み枠が、ＳＣＴＥのＤＮＡ挿入物の開始コドンに関して選ばれる。
【０４８５】
ベクターのマルチクローニング部位付近の制限酵素（ＲＥ）部位が、ＳＣＴＥの開始コドンとの読み枠を合わせるために選ばれる。ＳＣＴＥのＤＮＡ配列を、ＮＩＨのウェッブサイト（ｗｗｗ．ｎｉｈ．ｇｏ．ｊｐ／〜ｊｕｎ／ｒｅｓｅａｒｃｈ／ａｎａｌ．ｈｔｍｌ）において見出されるＷｅｂｃｕｔｔｅｒプログラムを使用して制限酵素部位の存在についてスクリーニングする。ＳＣＴＥ配列内に見出されず、しかしベクターにおいて見出されるそのような制限酵素部位が、使用のために利用できる可能性がある。
【０４８６】
ＳＣＴＥの開始コドンは、ｐＭＴ／Ｖ５−ＨｉｓＣベクターと読み枠が一致していることが見出される。Ｋｐｎ１が開始コドンにおける最初の制限酵素として選ばれる。Ｎｏｔ１が停止コドンの後における第２のプライマーとして選ばれる。制限酵素部位は、Ｋｐｎ１およびＮｏｔ１が両端に存在するＳＣＴＥのＰＣＲ産物を得るために、ＳＣＴＥのフォワードＰＣＲプライマーおよびリバースＰＣＲプライマーに含められる。これらの部位は、配列をベクター内に挿入することを可能にする。
ＳＣＴＥのフォワード制限酵素プライマー（５’から３’に）
ＡＴＴＡＧＴＡ−ＧＧＧＴＡＧ−ＡＴＧＧＣＴＡＣＡＧＣＡＡＧＡＣＣＣ
ランダム配列−Ｋｐｎ１制限酵素配列−ＳＣＴＥ開始コドン配列
ＳＣＴＥフォワードＲＥプライマー（５’から３’に）
ＡＴＴＡＧＴＡ    ＧＧＴＡＣＣ        ＡＴＧＧＣＴＡＣＡＧＣＡＡＧＡＣＣＣ
・ランダム配列    Ｋｐｎ１ＲＥ配列    ＳＣＴＥ開始コドン配列
ＳＣＴＥリバースＲＥプライマー（３’から５’に）
１）ＴＣＣＡＧＧＣＣＡＡＣＴＣＣＴＧＡ    ＧＣＧＧＣＣＧＣ    ＡＴＡＴＴＡ
２）ＳＣＴＥ停止コドン配列                Ｎｏｔ１ＲＥ配列    ランダム配列
ＳＣＴＥリバースＲＥプライマー（５’から３’に）（相補体）
ＴＡＡＴＡＴＧＣＧＧＣ  ＣＧＣＴＣＡＧＧＡＧ  ＴＴＧＧＣＣＴＧＧＡ
【０４８７】
標準的なプライマーＰＣＲから得られるＳＣＴＥのＰＣＲ産物が、制限酵素−プライマーＰＣＲのためのテンプレートとして使用される。ＰＣＲ条件は、５７℃〜６７℃の間の任意のアニーリング温度において２．５ｍＭのＭｇ２＋である。ＳＣＴＥ−制限酵素ＰＣＲ産物を製造者の推奨プロトコル（Ｐｒｏｍｅｇａ）に従って対応する制限酵素（Ｋｐｎ１およびＮｏｔ１）で消化する。消化されたＳＣＴＥ−制限酵素ＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動によって制限酵素混合物から精製し、そしてＤＮＡを、Ｑｉａｇｅｎ社のＱｉａｅｘＩＩアガロースゲル抽出キットを使用してゲルから精製する。これにより、ＳＣＴＥ挿入物は、調製されたベクターとの連結に利用することができる。
【０４８８】
ｐＭＴ／Ｖ５−ＨｉｓＣベクターの増殖および制限酵素消化
ｐＭＴ／Ｖ５−ＨｉｓＣベクターをＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社のＴＯＰ１０化学修飾大腸菌細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ＃Ｃ４０４０−１０）において増殖させる。プロトコルはＴＯＰ１０情報小冊子に記載される。１μｌのベクターを（氷上で解凍された）ＴＯＰ１０細胞のバイアルに加える。穏やかに混合する。氷上で５分間〜３０分間インキュベーションする。細胞に４２℃で３０秒間の熱ショックを、振とうすることなく与える。直ちに氷に戻す。２５０μｌの室温のＳＯＣ緩衝液を加える。チューブにきつく栓をして、チューブを水平に３７℃で１時間振とうする。５０μｌの形質転換混合物をアンピシリン含有の新しい寒天平板に均一に広げる。３７℃で一晩インキュベーションする。単一コロニーを選び、これを使用して、アンピシリン−ＬＢに接種し、培養物を３７℃で一晩インキュベーションする。グリセロール保存物を培養物から作製する。増殖させたｐＭＴ／Ｖ５−ＨｉｓＣベクターは、製造者の推奨プロトコルに従ってＱｉａｇｅｎ社のＤＮＡミニプレップキットを使用して細菌から精製される。
【０４８９】
精製されたベクターを、ＳＣＴＥ−制限酵素ＰＣＲ産物の場合のようにＫｐｎ１およびＮｏｔ１で消化する。消化されたベクターもまたアガロースゲル電気泳動によって制限酵素混合物から精製され、そしてＤＮＡを、Ｑｉａｇｅｎ社のＱｉａＥｘＩＩアガロースゲル抽出キットを使用してゲルから精製する。これにより、ベクターは、調製されたＳＣＴＥ挿入物との連結に利用することができる。
【０４９０】
ｐＭＴ／Ｖ５−ＨｉｓＣおよびＳＣＴＥのベクター連結
ＳＣＴＥを、Ｔ４−ＤＮＡリガーゼ酵素（Ｇｉｂｃｏ、カタログ＃１５２２４−０１７）を使用してｐＭＴ／Ｖ５−ＨｉｓＣベクターに連結する。連結は、下記のプロトコルに従って５：１のＤＮＡ挿入物：ベクターの比率で行われる。１μｌのＤＮＡリガーゼ（１Ｕ／μｌ）、４μｌの５ｘ連結緩衝液、ＳＣＴＥ挿入物（Ｘμｇ／μｌ）、ｐＭＴベクター（Ｘμｇ／μｌ）、水（２０μｌにするまで）。連結反応物を（１６℃の氷水に浮かせながら）１６℃で一晩インキュベーションする。連結反応物を０．７％アガロースゲルによって評価する（未連結のコントロールサンプルと比較する）。コンピテント大腸菌細胞を、連結されたＳＣＴＥ／ベクター構築物で増殖のために形質転換する。
【０４９１】
大腸菌細胞におけるＳＣＴＥ／ベクター構築物の増殖  ＴＯＰ１０細胞を、上記に記載される製造者プロトコルに従って構築物で形質転換する。形質転換細胞をアンピシリン寒天平板に画線培養し、３７℃で一晩インキュベーションする。単一コロニーを使用して、アンピシリン−ＬＢに接種し、培養物を３７℃で一晩インキュベーションする。グリセロール保存物を培養物から作製する。構築物は、Ｑｉａｇｅｎ社のＤＮＡミニプレップキットを使用して精製される。
【０４９２】
Ｓ２昆虫細胞の脂質トランスフェクション
Ｓ２昆虫細胞（ショウジョウバエ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社から得られる、カタログ＃Ｒ６９０−０７）を、ウシ胎児血清およびペニシリン−ストレプトマイシンが補充されたショウジョウバエ発現培地（ＤＥＳ、カタログ＃Ｑ５００−０１）において、製造者によって推奨されるように培養する。トランスフェクションを、再び製造者のプロトコルに従ってリポソーム配合物のセルフェクチン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ＃１０３６２−０１０）を使用して行う。
【０４９３】
ＳＣＴＥタンパク質発現の誘導／安定な細胞株の形成
ｐＭＴ／Ｖ５−ＨｉｓＣベクターは金属誘導性（硫酸銅により誘導可能）プロモーターのメタロチオネイン（ＭＴ）を有しており、これにより、Ｓ２細胞における高レベルの標的遺伝子の発現が可能になる。この細胞におけるタンパク質発現は、５００μＭの最終濃度に添加される硫酸銅により誘導される。細胞は１日間〜４日間インキュベーションされる。誘導後、細胞は集められ、さらなる分析まで保存される。ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）分析が、誘導された細胞と非誘導細胞の総タンパク質を比較することによって、組換えタンパク質発現が生じているかどうかを確認するために使用される。
【０４９４】
安定な細胞株の形成
ＳＣＴＥタンパク質がＳ２細胞において発現することが明らかにされた後、発現は、安定な細胞株を作製することによって拡大される。細胞は、原核生物系および真核生物系における強力な翻訳阻害剤であるブラスチシジンを産生する。ブラスチシジンに対する耐性が、ＳＣＴＥ／ｐＭＴ／Ｖ５−ＨｉｓＣ構築物およびｐＣｏＢｌａｓｔ選択ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ＃１Ｋ５１５０−０１）をＳ２細胞に同時トランスフェクションした後に付与される。このプロトコルはショウジョウバエ発現システム（ＤＥＳ）のマニュアルに見出され、これにはすべてのＤＥＳ試薬が伴う。ブラスチシジン（２５μｇ／ｍｌ）が、安定な形質転換体を選択するために使用される。
【０４９５】
タンパク質発現の規模拡大
発現は、より大きい容量／フラスコを使用することによってタンパク質精製のために規模が拡大される。Ｓ２細胞とともに同封されるＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社のマニュアルには、これを行うためのプロトコルが詳しく示される。精製はＦＰＬＣによって行われる。種々の画分が集められ、組換えタンパク質の存在について分析される。
【０４９６】
実施例Ｃ２．組換えＳＣＣＥの産生
角質層キモトリプシン様酵素（ＳＣＣＥ）をクローン化して、完全な酵素活性を有するように活性な形態で発現させる。
【０４９７】
逆転写−ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）
オープンリーディングフレームを覆うＰＣＲプライマーが、ＳＣＣＥ配列（ＧＢ：ＮＭ００５０４６）を使用して、手作業により、すなわち、目で見ながら設計される。すべてのプライマーがＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社から得られる。
フォワード（５’から３’に）：ＣＧＧ  ＧＣＴ  ＣＣＡ  ＴＧＧ  ＣＡＡ  ＧＡＴ  Ｃ
リバース（５’から３’に）：ＧＣＧ  ＴＣＣ  ＴＣＡ  ＣＴＣ  ＣＴＧ  ＴＧＣ
【０４９８】
ヒト表皮の総ＲＮＡを、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社のＧｏｌｄ  ＲＮＡ  ＰＣＲキットを用いてｃＤＮＡに逆転写する。ＲＴサイクルは、２．０ｍＭのＭｇ２＋、４０サイクルを使用して、ＳＣＴＥについて前記に記載される通りである。ＰＣＲサイクルは、アニーリングが６０℃で１分間行われることを除いて、ＳＣＴＥについて記載される通りである。
【０４９９】
制限酵素部位隣接ＰＣＲ
正しい読み枠およびマルチクローニング部位付近の制限酵素部位が、ＳＣＣＥのＤＮＡ挿入物の開始コドンに関して選ばれる。ＳＣＣＥのＤＮＡ配列を、Ｗｅｂｃｕｔｔｅｒプログラムを使用して制限酵素部位の存在についてスクリーニングして、制限酵素部位が前記のように選ばれる。ＳＣＣＥの開始コドンは、ｐＭＴ／Ｖ５−ＨｉｓＡベクターと読み枠が一致していることが見出される。ＥｃｏＲ１が開始コドンにおける最初の制限酵素として選ばれ、Ｘｈｏ１が停止コドンの後における第２のプライマーとして選ばれる。
【０５００】
制限酵素部位は、ＥｃｏＲ１およびＸｈｏ１を両端に有するＳＣＣＥのＰＣＲ産物を得るために、ＳＣＣＥのフォワードＰＣＲプライマーおよびリバースＰＣＲプライマーに含められる。これらの部位は、配列をベクター内に挿入することを可能にする。
ＳＣＣＥのフォワード制限酵素プライマー（５’から３’に）
ＧＣＣ  ＡＧＣ−ＧＡＡ  ＴＴＣ−ＡＴＧＧＣＡ  ＡＧＡ  ＴＣＣ  ＣＴＴ  ＣＴＣ
ランダム配列−ＥｃｏＲ１制限酵素配列−ＳＣＣＥ開始コドン配列
ＳＣＣＥリバース制限酵素プライマー（３’から５’に）
ＡＴＧＡＡＡＡＡＧＣＡＴＣＧＣＴＡＡ−ＣＴＣＧＡＧ−ＡＧＣＡＣＴ
ＳＣＣＥ停止コドン配列−Ｘｈｏ１制限酵素配列−ランダム配列
ＳＣＣＥリバース制限酵素プライマー（５’から３’に）（相補体）
ＡＧＴＧＣＴＣＴＣＧ  ＡＧＴＴＡＧＣＧＡＴ  ＧＣＴＴＴＴＴＣＡＴ
【０５０１】
標準的なプライマーＰＣＲから得られるＳＣＣＥのＰＣＲ産物が、制限酵素−プライマーＰＣＲのためのテンプレートとして使用される。ＰＣＲ条件は、６２℃のアニーリング温度において２．０ｍＭのＭｇ２＋である。ＳＣＣＥ−制限酵素ＰＣＲ産物を製造者の推奨プロトコル（Ｐｒｏｍｅｇａ）に従って対応する制限酵素（ＥｃｏＲ１およびＸｈｏ１）で消化する。消化されたＳＣＣＥ−制限酵素ＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動によって制限酵素混合物から精製し、そしてＤＮＡを、Ｑｉａｇｅｎ社のＱｉａｅｘＩＩアガロースゲル抽出キットを使用してゲルから精製する。これにより、ＳＣＣＥ挿入物は、調製されたｐＭＴ／Ｖ５−ＨｉｓＡベクターとの連結に利用することができる。
【０５０２】
発現は、より大きい容量／フラスコを使用することによってタンパク質精製のために規模が拡大される。Ｓ２細胞とともに同封されるＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社のマニュアルには、詳細が示される。精製はＦＰＬＣによって行われる。種々の画分が集められ、組換えタンパク質の存在について分析される。ＳＣＣＥの発現および精製に関するさらなる詳細は、プロテアーゼ酵素ＳＣＣＥの精製を記載する、Ｈａｎｓｓｏｎら（１９９４）（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９（３０）、１９４２０〜１９４２６）に開示される。
【０５０３】
実施例Ｃ３．組換えＳＣＣＥおよび組換えＳＣＴＥによる接着タンパク質の切断
組換えプロＳＣＣＥを上記に記載されるように産生し、精製する。組換えプロＳＣＣＥを、Ｂｒａｓｔｔｓａｎｄ＆Ｅｇｅｌｒｕｄ（１９９９）に記載されるようにアガロース結合トリプシンで活性化する。
【０５０４】
タンパク質を界面活性剤の存在下でヒト表皮から抽出し（ＴＥＮＰ−４０緩衝液抽出物）、活性なＳＣＣＥとともに３７℃で４時間インキュベーションする。反応を、Ｌａｅｍｍｌｉサンプル緩衝液を加えた後、２分間煮沸することによって停止させる。タンパク質を、様々なコルネオデスモソームタンパク質に対する抗体と免疫ブロッティングする。
【０５０５】
ＳＣＣＥによる接着タンパク質の切断
本発明者らは、組換えＳＣＣＥが接着タンパク質（特に、コルネオデスモシン、プラコグロビン、デスモグレイン、デスモプラキン、エンボプラキンおよびデスモコリン）が切断され得ることを本実施例により明らかにしている。従って、これらの接着タンパク質はこのプロテアーゼの基質である。
【０５０６】
ＳＣＣＥおよびコルネオデスモシン：コルネオデスモシンは、組換えＳＣＣＥによりタンパク質分解されることが見出される。コルネオデスモシンの天然型形態は５０ｋＤａ〜５６ｋＤａの間の分子量を有する。２時間のインキュベーションの後、コルネオデスモシンの主要な形態は３６ｋＤａおよび４６ｋＤａ〜４３ｋＤａである。
【０５０７】
ＳＣＣＥおよびプラコグロビン：プラコグロビンは、組換えＳＣＣＥによりタンパク質分解されることが見出される。プラコグロビンの天然型形態は８５ｋＤａ〜７５ｋＤａの間の分子量を有する。２時間〜４時間のインキュベーションの後、プラコグロビンの主要な形態は７０ｋＤである。
【０５０８】
ＳＣＣＥおよびデスモグレイン：デスモグレインは、ＳＣＣＥによりタンパク質分解されることが見出される。２時間〜４時間のインキュベーションの後、デスモグレインの主要な形態は９５ｋＤａおよび８０ｋＤａであり、これらは１６０ｋＤａ形態のタンパク質分解産物である。
【０５０９】
ＳＣＣＥおよびデスモプラキン：デスモプラキンは、ＳＣＣＥによりタンパク質分解されることが見出される。デスモプラキンの天然型形態は１９０ｋＤａ〜２５０ｋＤａの間の分子量を有する。２時間〜４時間のインキュベーションの後、デスモプラキンの主要な形態は１２０ｋＤａ〜１８０ｋＤａおよび７５ｋＤａ〜８０ｋＤａである。
【０５１０】
ＳＣＣＥおよびエンボプラキン：エンボプラキンは、ＳＣＣＥによりタンパク質分解されることが見出される。エンボプラキンの天然型形態は１２４ｋＤａ〜２０９ｋＤａの間の分子量を有する。２時間〜４時間のインキュベーションの後、エンボプラキンの主要な形態は、１００ｋＤａ〜１２０ｋＤａ、６０ｋＤａ〜８０ｋＤａおよび５０ｋＤａ〜５５ｋＤａである。
【０５１１】
ＳＣＣＥおよびデスモコリン：デスモコリンは、ＳＣＣＥによりタンパク質分解されることが見出される。デスモコリンの天然型形態は７０ｋＤａ〜８０ｋＤａの間の分子量を有する。２時間〜４時間のインキュベーションの後、デスモコリンの主要な形態は６０ｋＤａ〜７０ｋＤａおよび５０ｋＤａ〜６０ｋＤａである。
【０５１２】
ＳＣＴＥによる接着タンパク質の切断
本発明者らは、組換えＳＣＴＥが接着タンパク質（特に、コルネオデスモシン、プラコグロビン、デスモグレイン、デスモプラキン、エンボプラキンおよびデスモコリン）が切断され得ることを本実施例により明らかにしている。従って、これらの接着タンパク質はこのプロテアーゼの基質である。
【０５１３】
ＳＣＴＥおよびコルネオデスモシン：コルネオデスモシンは、組換えＳＣＴＥによりタンパク質分解されることが見出される。２時間のインキュベーションの後、コルネオデスモシンの主要な形態は３６ｋＤａおよび４６ｋＤａ〜４３ｋＤａである。
【０５１４】
ＳＣＴＥおよびプラコグロビン：プラコグロビンは、組換えＳＣＴＥによりタンパク質分解されることが見出される。２時間〜４時間のインキュベーションの後、プラコグロビンの主要な形態は７０ｋＤである。
【０５１５】
ＳＣＴＥおよびデスモグレイン：デスモグレインは、ＳＣＴＥによりタンパク質分解されることが見出される。２時間〜４時間のインキュベーションの後、デスモグレインの主要な形態は９５ｋＤａおよび８０ｋＤａであり、これらは１６０ｋＤａ形態のタンパク質分解産物である。
【０５１６】
ＳＣＴＥおよびデスモプラキン：デスモプラキンは、ＳＣＴＥによりタンパク質分解されることが見出される。２時間〜４時間のインキュベーションの後、デスモプラキンの主要な形態は１２０ｋＤａ〜１８０ｋＤａおよび７５ｋＤａ〜８０ｋＤａである。
【０５１７】
ＳＣＴＥおよびエンボプラキン：エンボプラキンは、ＳＣＴＥによりタンパク質分解されることが見出される。２時間〜４時間のインキュベーションの後、エンボプラキンの主要な形態は、１００ｋＤａ〜１２０ｋＤａ、６０ｋＤａ〜８０ｋＤａおよび５０ｋＤａ〜５５ｋＤａである。
【０５１８】
ＳＣＴＥおよびデスモコリン：デスモコリンは、ＳＣＴＥによりタンパク質分解されることが見出される。２時間〜４時間のインキュベーションの後、デスモコリンの主要な形態は６０ｋＤａ〜７０ｋＤａおよび５０ｋＤａ〜６０ｋＤａである。
【０５１９】
実施例Ｃ４．タンパク質分解プロフィルの材料および方法
ポリクローナル抗体の作製
コルネオデスモシン、ＳＣＣＥ、エンボプラキン、デスモプラキン、デスモコリン１およびＳＬＰＩに対する各抗体を、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）に結合させた合成ペプチドの注射によってウサギにおいて作製した。
【０５２０】
ペプチドは、標準的な手法を使用してキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）にカップリングされる。ペプチドは、下記の表Ｃ４．１に示されるように関連ＧｅｎＢａｎｋ配列に由来する下記のアミノ酸配列を含んで設計される。
【表２９】
2004524010.tif 000030
表Ｃ４．１．太字のＣ残基はカップリングのために合成され、天然型配列には存在しない。
【０５２１】
ウサギは、ＫＬＨにカップリングされたペプチドが１日目のウサギに注射される。簡単なプロトコルを下記に示す。１日目：約１５０μｌ（３００μｇの結合体を含有する）と等容量のフロイント完全アジュバントとを、エマルション（これは放置したときに分離しない）が形成されるまで２３Ｇニードルに数回通すことによって混合する。２５Ｇニードルを使用してウサギに皮下注射する。２２日目：上記を繰り返すが、フロント不完全アジュバントを使用する。４３日目：上記を正確に繰り返す。５３日目：耳静脈から最初の試験血液を採血する。追加免疫および再採血を必要に応じて行う。
【０５２２】
モノクローナル抗体
接着タンパク質抗原に対するモノクローナル抗体が市販品としてＢｉｏｔｅｃｈｎｉｃ（ドイツ）から得られる。これらには、ＰＧ５．１（プラコグロビン（ＮＭ−０２１９９１））に対する抗プラコグロビン抗体、そしてＤｓｇ１およびＤｓｇ２に対する抗デスモグレイン１（ＸＭ−００８８１０）抗体が含まれる。
【０５２３】
表皮からのタンパク質抽出
タンパク質を、きれいな線状瘢痕を生じさせるために除かれた皮膚の三角状片である「イヌの耳」形態の生検物から抽出する。これは、診断のために病理医に送られた乳房切除標本から取り出された皮膚ではない。すべてのサンプルは、乳ガンのための乳房切除を受けている、シェフィールド大学の診療所にかかっている女性患者に由来する。インフォームドコンセントが患者から得られている。
【０５２４】
表皮を、乳房手術から得られた乳房生検物をトリプシン溶液Ａ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、フランス）と４℃で１８時間インキュベーションすることによって真皮から分離する。表皮を２つの部分に分割する。一方がタンパク質抽出のために使用され、もう一方がＲＮＡ抽出のために使用される（下記を参照のこと）。剥離された表皮をリン酸塩緩衝化生理的食塩水中において５６℃で５分間加熱する（Ｓｉｍｏｎら、１９９７）。表皮を等容量の下記緩衝液において氷上でホモジネートする（それぞれの緩衝液において３回）：４０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭのＥＤＴＡ、０．２５ｍＭのフェニルメチルスルホニルフッ化物、ならびにそれぞれ２μｇ／ｍｌのアプロチニンおよびペプスタチンＡおよびロイペプチン（ＴＥ緩衝液）、０．５％のＮｏｎｉｄｅｔ  Ｐ−４０を含有するＴＥ緩衝液（ＴＥ−Ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ−４０緩衝液）。
【０５２５】
その後、ペレットを３つに分割して、これらを、様々な濃度の尿素（４Ｍ、６Ｍおよび８Ｍ）を含有するＴＥ緩衝液（ＴＥＵ緩衝液）の最初の容量の１／３で抽出する。それぞれの抽出の後、ホモジネートを１５，０００ｘｇで１５分間遠心分離し、そして上清を使用まで−３０℃で保存する。最後に、８Ｍ尿素における最後の抽出に対応するペレットを、３５ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．８）、８Ｍ尿素、５０ｍＭジチオスレイトール、５％グリセロール、０．２５ｍＭフェニルメチルスルホニルフッ化物、ならびにそれぞれ２μｇ／ｍｌのアプロチニンおよびペプスタチンＡおよびロイペプチン（ＴＵＤＴＴ緩衝液）においてホモジネートして、９５℃で３０分間インキュベーションし、そして上記に記載されるように遠心分離する（この方法はＳｉｍｏｎら（１９９７）によって最初に記載される）。タンパク質濃度を、クーマシープラスタンパク質アッセイキット（Ｐｉｅｒｒｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）を使用して測定する。
【０５２６】
角質層からのタンパク質抽出
接着タンパク質を、Ｇｕｅｒｒｉｎら（１９９８）により記載される方法に従って角質層から抽出する。簡単に記載すると、テープストリップを、乾癬患者の正常な皮膚または病変部および非病変部からの生検物に適用する。テープストリップをアセトン中でインキュベーションし、組織を遠心分離（５００ｘｇ、１分）によって回収し、アセトンで洗浄して、空気乾燥する。この粉末を、２％のＳＤＳおよび５０ｍＭのＤＴＴを含有する６２．５ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．８）において１０分間煮沸して、溶液を遠心分離する（１０，０００ｘｇ、１０分間）。
【０５２７】
タンパク質を上記に記載されるように正常者群および乾癬患者群の角質層から抽出し、そしてコルネオデスモソームの様々なタンパク質に対する特異的な抗体を使用するウエスタンブロットによって分析する。本発明者らは、表皮抽出タンパク質のプロフィルが正常者および疾患（乾癬）者との間で異なることを示している。
【０５２８】
ウエスタンブロット
表皮および角質層の生検物に由来するタンパク質（約１μｇ）を１０％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）によって分離する。電気泳動後、タンパク質をニトロセルロースメンブランに電気的に転写する。メンブランを、Ｂｌｏｔｔｏ（３％粉ミルク、２％ＢＳＡ、０．１％ツイーン２０を含むＴＢＳ）において４℃で一晩ブロッキングする。メンブランを、下記に記載される一次抗体と、撹拌しながら室温で３時間プローブする。プラコグロビンおよびデスモグレンに対する各マウスモノクローナル抗体はＰｒｏｇｅｎ（Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、ドイツ）から得られ、Ｂｌｏｔｔｏで希釈されて５μｇ／ｍｌの濃度で使用される。デスモコリン、デスモプラキン、ＳＬＰＩ、ＳＣＣＥ、Ｓタンパク質およびエンボプラキンのタンパク質配列から設計されたペプチドに対する各ウサギポリクローナル抗体（Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｃｅｎｔｒｅ、シェフィールド大学、英国）は１：２５０の希釈度で使用される。メンブランを、Ｂｌｏｔｔｏで５分間ずつ３回洗浄し、そして１：１０００希釈の二次抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．（Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、米国）から得られる抗マウスＩｇＧＨＲＰまたは抗ウサギＩｇＧＨＲＰのいずれか）の存在下、撹拌しながら室温で１時間インキュベーションする。メンブランをＴＢＳ−ツイーン２０（０．１％）で５分間ずつ３回洗浄し、そしてタンパク質を、ＥＣＬ＋プラス（商標）ウエスタンブロッティング検出システム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｌｉｔｔｌｅ  Ｃｈａｌｆｏｎｔ、英国）を使用して検出する。
【０５２９】
実施例Ｃ５．表皮から抽出されたタンパク質の乾癬タンパク質分解プロフィル
タンパク質を上記に記載されるように正常者群の表皮および乾癬患者群の表皮（病変皮膚および非病変皮膚）から抽出し、そしてコルネオデスモソームの様々なタンパク質に対する特異的な抗体を使用するウエスタンブロットによって分析する。本発明者らは、表皮抽出タンパク質のプロフィルが正常な皮膚と乾癬の病変皮膚および非病変皮膚との間で異なることを示している。
【０５３０】
コルネオデスモシンのタンパク質分解プロフィル
デスモソーム／コルネオデスモソームの様々なタンパク質のタンパク質分解が不完全であることは、正常な皮膚と比較して、乾癬皮膚におけるコルネオデスモソームタンパク質の成熟形態の量の著しい低下において反映される。タンパク質分解の欠陥は細胞を接着させる。これは、正常な皮膚と比較して、乾癬皮膚におけるコルネオデスモソームタンパク質の成熟形態の量の著しい低下からなる。タンパク質分解の欠陥は細胞を表皮表面において接着させ、細胞の生え替わりを妨げる。
【０５３１】
例えば、３６ｋＤａ形態および４６ｋＤａ〜４３ｋＤａ形態のコルネオデスモシンが正常な皮膚では角質層における主要な形態であり、５２ｋＤａ〜５６ｋＤａ形態は正常な角質層では非常に希である。乾癬皮膚におけるコルネオデスモシンのタンパク質分解プロフィルは異なる。従って、乾癬皮膚では、５２ｋＤａ〜５６ｋＤａ形態のコルネオデスモシンが乾癬患者の表皮において優勢な形態であり、角質層においても同様に優勢である。このことは、乾癬皮膚にはタンパク質分解の欠陥が存在することを示唆している。
【０５３２】
結果が図６に示される。
【０５３３】
従って、本発明者らは、上記に記載される変化のいずれかを検出すること、好ましくは１つ以上の５２ｋＤａ〜５６ｋＤａのコルネオデスモシンポリペプチドの存在または調節されたレベル（好ましくは、より大きいレベル）を個体において検出することによる、個体における第ＩＩ群疾患またはそのような疾患に対する感受性（好ましくは乾癬または乾癬に対する感受性）の診断を開示する。本発明者らはまた、３６ｋＤａおよび４６ｋＤａ〜４３ｋＤａのコルネオデスモシンポリペプチドの１つまたは両方の非存在または調節されたレベル（好ましくは、より低いレベル）を個体において検出することによる、個体における第ＩＩ群疾患またはそのような疾患に対する感受性（好ましくは乾癬または乾癬に対する感受性）の診断を開示する。
【０５３４】
この診断はまた、３６ｋＤａおよび４６ｋＤａ〜４３ｋＤａおよび５２ｋＤａ〜５６ｋＤａのポリペプチドの相対的存在量をアッセイすることによって達成することができる。
【０５３５】
好ましくは、これらの関連するポリペプチドは、インビボであっても、またはエクスビボ（例えば、生検物で）であっても、個体の表皮で検出される。
【０５３６】
デスモグレンＩのタンパク質分解プロフィル
類似する結果がデスモグレンＩ（ＤＧＩ）に関して得られる。正常な皮膚の表皮において、ＤＧＩの最も多い形態は９５ｋＤａおよび８０ｋＤａであり、これらは１６０ｋＤａ形態のタンパク質分解産物である。しかし、乾癬皮膚の角質層では、最も多い形態は１６０ｋＤａである。このことは、乾癬皮膚ではＤＧＩのタンパク質分解の欠陥が存在することを示唆している。
【０５３７】
従って、本発明者らは、上記に記載される変化のいずれかを検出すること、好ましくは１６０ｋＤａのデスモグレンＩポリペプチドの存在または調節されたレベル（好ましくは、より大きいレベル）を個体において検出することによる、個体における第ＩＩ群疾患またはそのような疾患に対する感受性（好ましくは乾癬または乾癬に対する感受性）の診断を開示する。そのような診断はまた、９５ｋＤａおよび８０ｋＤａのデスモグレンＩポリペプチドの１つまたは両方の非存在または調節されたレベル（好ましくは、より低いレベル）を個体において検出することによって行うことができる。
【０５３８】
この診断はまた、８０ｋＤａおよび９５ｋＤａおよび１６０ｋＤａのデスモグレンＩポリペプチドの相対的存在量をアッセイすることによって達成することができる。この診断は、１６０ｋＤａのデスモグレンＩポリペプチドのタンパク質分解がないことを個体において検出することによって行うことができる。
【０５３９】
好ましくは、これらの関連するポリペプチドは、インビボであっても、またはエクスビボ（例えば、生検物で）であっても、個体の表皮で検出される。
【０５４０】
デスモグレイン３のタンパク質分解プロフィル
デスモグレイン３（Ｄｅｇ３）もまたタンパク質分解の低下を示す。５５ｋＤａおよび１００ｋＤａの２つのタンパク質分解フラグメントに対応するバンドが、正常な皮膚の角質層と比較して、乾癬皮膚の角質層では弱くなっている。両方のフラグメントは、細胞質ドメインに対する同じ抗体と反応する。８０ｋＤａの別のバンドが、乾癬の表皮と比較して、正常な表皮では、Ｄｅｇ３のタンパク質分解産物として、より強く現れる。
【０５４１】
従って、本発明者らは、上記に記載される変化のいずれかを検出すること、好ましくは５５ｋＤａのデスモグレン３ポリペプチドおよび８０ｋＤａのデスモグレン３ポリペプチドおよび１００ｋＤａのデスモグレン３ポリペプチドのいずれか１つまたはいずれか２つまたはすべての非存在または調節されたレベル（好ましくは、より低いレベル）を個体において検出することによる、個体における第ＩＩ群疾患またはそのような疾患に対する感受性（好ましくは乾癬または乾癬に対する感受性）の診断を開示する。
【０５４２】
好ましくは、これらの関連するポリペプチドは、インビボであっても、またはエクスビボ（例えば、生検物で）であっても、個体の表皮で検出される。
【０５４３】
プラコグロビンのタンパク質分解プロフィル
プラコグロビンもまた、正常な皮膚と比較して、乾癬患者の表皮ではタンパク質分解の著しい低下を示す。
【０５４４】
結果が図７に示される。
【０５４５】
プラコグロビンに対する抗体により、３つのバンド（８５ｋＤａ、７５ｋＤａおよび７０ｋＤａ）が明らかにされる。７０ｋＤａおよび７５ｋＤａは、角化細胞が分化しているときにＳＣＣＥおよびＳＣＴＥなどのプロテアーゼによって切断される天然型タンパク質（８５ｋＤａ）のタンパク質分解形態である。７０ｋＤａは乾癬皮膚（病変および非病変の両方）では非常に強く、正常な表皮にはほとんど存在しない。乾癬皮膚および正常な皮膚は２つの異なるプロフィルを有する。７０ｋＤａのバンドを乾癬の診断のために使用することができる。
【０５４６】
従って、本発明者らは、上記に記載される変化のいずれかを検出すること、好ましくは７０ｋＤａのプラコグロビンポリペプチドの存在または調節されたレベル（好ましくは、より大きいレベル）を個体において検出することによる、個体における第ＩＩ群疾患またはそのような疾患に対する感受性（好ましくは乾癬または乾癬に対する感受性）の診断を開示する。本発明者らはまた、７５ｋＤａのプラコグロビンポリペプチドの非存在または調節されたレベル（好ましくは、より低いレベル）を検出することによる、個体における第ＩＩ群疾患またはそのような疾患に対する感受性（好ましくは乾癬または乾癬に対する感受性）の診断を開示する。
【０５４７】
この診断はまた、８５ｋＤａおよび７５ｋＤａおよび７０ｋＤａのポリペプチドの相対的存在量をアッセイすることによって達成することができる。
【０５４８】
好ましくは、これらの関連するポリペプチドは、インビボであっても、またはエクスビボ（例えば、生検物で）であっても、個体の表皮で検出される。
【０５４９】
デスモプラキンのタンパク質分解プロフィル
デスモプラキンはコルネオデスモソームの細胞質斑の成分である。デスモプラキンは、角化細胞間の接着およびシグナルの伝達に関与すると考えられる糖タンパク質である。
【０５５０】
結果が図８に示される。
【０５５１】
デスモプラキンに対するポリクローナル抗体を使用して、本発明者らは３つのバンド（１９０ｋＤａ〜２５０ｋＤａ、１２０ｋＤａ〜１８０ｋＤａおよび７５ｋＤａ〜８０ｋＤａ）を認めている。１９０ｋＤａ〜２５０ｋＤａおよび／または１２０ｋＤａ〜１８０ｋＤａが、疾患と比較して、正常者では強く発現している。７５ｋＤａ〜８０ｋＤａは１９０ｋＤａ〜２５０ｋＤａおよび／または１２０ｋＤａ〜１８０ｋＤａのタンパク質分解形態であると考えられ、このことは、デスモプラキンが乾癬皮膚（病変皮膚および非病変皮膚）では正しくタンパク質分解されないことを示唆している。これらのプロフィルは、乾癬などの、増大した接着を有する疾患を同定するために使用することができる。
【０５５２】
従って、本発明者らは、上記に記載される変化のいずれかを検出すること、好ましくはデスモプラキンの１９０ｋＤａ〜２５０ｋＤａおよび１２０ｋＤａ〜１８０ｋＤａのポリペプチドのいずれかまたは両方の非存在または調節されたレベル（好ましくは、より低いレベル）を個体において検出することによる、個体における第ＩＩ群疾患またはそのような疾患に対する感受性（好ましくは乾癬または乾癬に対する感受性）の診断を開示する。この診断はまた、７５ｋＤａ〜８０ｋＤａおよび／または１９０ｋＤａ〜２５０ｋＤａおよび／または１２０ｋＤａ〜１８０ｋＤａのポリペプチドの相対的存在量をアッセイすることによって達成することができる。この診断はまた、８５ｋＤａのデスモプラキンポリペプチドのタンパク質分解がないことを個体おいて検出することによって行うことができる。
【０５５３】
好ましくは、これらの関連するポリペプチドは、インビボであっても、またはエクスビボ（例えば、生検物で）であっても、個体の表皮で検出される。
【０５５４】
デスモコリン１のタンパク質分解プロフィル
デスモコリン１（Ｄｓｃ１）は正常な表皮の基底下層で強く発現する。
【０５５５】
結果が図９に示される。
【０５５６】
デスモコリンに対する抗体により、正常な表皮における３つのＤｓｃ１イソ型が７０ｋＤａ〜８０ｋＤａおよび６０ｋＤａ〜７０ｋＤａおよび５０ｋＤａ〜６０ｋＤａの分子量において明らかにされる。２つのバンドのみが、病変皮膚および非病変皮膚を含む乾癬皮膚の表皮で検出されるだけであり、このことは、タンパク質分解プロセスが乾癬皮膚では損なわれていることを示唆している。５０ｋＤａ〜６０ｋＤａのバンドが存在しないことは、乾癬などの、増強された接着を有する疾患のプロテオミック診断のために使用することができる。
【０５５７】
従って、本発明者らは、上記に記載される変化のいずれかを検出すること、好ましくは５０ｋＤａ〜６０ｋＤａのデスモコリン１ポリペプチドの非存在または調節されたレベル（好ましくは、より低いレベル）を個体において検出することによる、個体における第ＩＩ群疾患またはそのような疾患に対する感受性（好ましくは乾癬または乾癬に対する感受性）の診断を開示する。
【０５５８】
この診断はまた、７０ｋＤａ〜８０ｋＤａおよび６０ｋＤａ〜７０ｋＤａおよび５０ｋＤａ〜６０ｋＤａのポリペプチドの相対的存在量をアッセイすることによって達成することができる。
【０５５９】
好ましくは、これらの関連するポリペプチドは、インビボであっても、またはエクスビボ（例えば、生検物で）であっっても、個体の表皮で検出される。
【０５６０】
エンボプラキンのタンパク質分解プロフィル
エンボプラキンは、角化した外被のタンパク質である。エンボプラキンは、角化細胞間の密着において重要なタンパク質である。
【０５６１】
結果が図１０に示される。
【０５６２】
エンボプラキンに対する抗体により、４つのバンド（１２４ｋＤａ〜２０９ｋＤａ、１００ｋＤａ〜１２０ｋＤａ、６０ｋＤａ〜８０ｋＤａおよび５０ｋＤａ〜５５ｋＤａ）が明らかにされる。１００ｋＤａ〜１２０ｋＤａ、６０ｋＤａ〜８０ｋＤａおよび５０ｋＤａ〜５５ｋＤａは天然型エンボプラキンのタンパク質分解形態に対応すると考えられる。乾癬皮膚（病変）では、６０ｋＤａ〜８０ｋＤａおよび５０ｋＤａ〜５５ｋＤａのバンドのみが発現している。これらの２つの形態は、乾癬などの、増強された接着を有する疾患を診断するために使用することができる。
【０５６３】
従って、本発明者らは、上記に記載される変化のいずれかを検出すること、好ましくは６０ｋＤａ〜８０ｋＤａおよび／または５０ｋＤａ〜５５ｋＤａのエンボプラキンポリペプチドの存在または調節されたレベル（好ましくは、より大きいレベル）を個体において検出することによる、個体における第ＩＩ群疾患またはそのような疾患に対する感受性（好ましくは乾癬または乾癬に対する感受性）の診断を開示する。本発明者らはまた、上記に記載される変化のいずれかを検出すること、好ましくは１２４ｋＤａ〜２０９ｋＤａおよび／または１００ｋＤａ〜１２０ｋＤａのエンボプラキンポリペプチドの非存在または調節されたレベル（好ましくは、より低いレベル）を個体において検出することによる、個体における第ＩＩ群疾患またはそのような疾患に対する感受性（好ましくは乾癬または乾癬に対する感受性）の診断を開示する。
【０５６４】
この診断はまた、１２４ｋＤａ〜２０９ｋＤａ、１００ｋＤａ〜１２０ｋＤａ、６０ｋＤａ〜８０ｋＤａおよび５０ｋＤａ〜５５ｋＤａのエンボプラキンポリペプチドの相対的存在量をアッセイすることによって達成することができる。
【０５６５】
好ましくは、これらの関連するポリペプチドは、インビボであっても、またはエクスビボ（例えば、生検物で）であっても、個体の表皮で検出される。
【０５６６】
ＳＣＣＥイソ型
ＳＣＣＥは、正常な皮膚と比較した場合、乾癬皮膚の角質層において示差的に発現している。
【０５６７】
ＳＣＣＥに対する抗体により、正常な皮膚における２つの強いバンドが８０ｋＤａ〜９０ｋＤａおよび７０ｋＤａ〜７５ｋＤａにおいて明らかにされる。乾癬の病変皮膚では、７０ｋＤａ〜７５ｋＤａのバンドのみが検出され、そして高分子量側におけるさらなるバンド（１２４ｋＤａ〜２０９ｋＤａ）が乾癬病変皮膚において検出される。ＳＣＣＥの予想サイズは約３０ｋＤａである。ＳＣＣＥは、角化した外被の中にトランスグルタミナーゼによって挿入され得る。これにより、ＳＣＣＥには、予想されるよりも大きいＭＷがもたらされる。１２４ｋＤａ〜２０９ｋＤａのバンドは、乾癬などの、増大した接着を有する疾患の診断において使用することができる。
【０５６８】
結果が図１１に示される。
【０５６９】
従って、本発明者らは、上記に記載される変化のいずれかを検出すること、好ましくは１２４ｋＤａ〜２０９ｋＤａのＳＣＣＥポリペプチドの存在または調節されたレベル（好ましくは、より大きいレベル）を個体において検出することによる、個体における第ＩＩ群疾患またはそのような疾患に対する感受性（好ましくは乾癬または乾癬に対する感受性）の診断を開示する。本発明者らはまた、上記に記載される変化のいずれかを検出すること、好ましくは８０ｋＤａ〜９０ｋＤａのＳＣＣＥポリペプチドの非存在または調節されたレベル（好ましくは、より低いレベル）を個体において検出することによる、個体における第ＩＩ群疾患またはそのような疾患に対する感受性（好ましくは乾癬または乾癬に対する感受性）の診断を開示する。
【０５７０】
この診断はまた、８０ｋＤａ〜９０ｋＤａおよび７０ｋＤａ〜７５ｋＤａのＳＣＣＥポリペプチドの相対的存在量をアッセイすることによって達成することができる。
【０５７１】
好ましくは、これらの関連するポリペプチドは、インビボであっても、またはエクスビボ（例えば、生検物で）であっても、個体の表皮で検出される。
【０５７２】
ＳＬＰＩのプロフィル
ＳＬＰＩは、正常な角質層と比較した場合、乾癬皮膚の角質層において強く発現している。
【０５７３】
ＳＬＰＩに対する抗体により、２つのバンドが９０ｋＤａ〜１００ｋＤａおよび７０ｋＤａ〜８０ｋＤａにおいて明らかにされる。７０ｋＤａ〜８０ｋＤａは、ＳＬＰＩが、乾癬皮膚において、主に病変皮膚においてアップレギュレーションされていることを示している。
【０５７４】
結果が図１２に示される。
【０５７５】
ＳＬＰＩタンパク質の予想Ｍｗは２０ｋＤａである。再度ではあるが、ＳＬＰＩは、トランスグルタミナーゼにより、角化した外被の中に挿入され、他のコルネオデスモソームタンパク質に対して架橋され得る。９０ｋＤａ〜１００ｋＤａのバンドは、病変皮膚および非病変皮膚を含む乾癬皮膚において検出されるだけである。これは、乾癬などの、増大した接着を有する疾患を診断するために使用することができる。
【０５７６】
従って、本発明者らは、上記に記載される変化のいずれかを検出すること、好ましくは９０ｋＤａ〜１００ｋＤａのＳＬＰＩポリペプチドの存在または調節されたレベル（好ましくは、より大きいレベル）を個体において検出することによる、個体における第ＩＩ群疾患またはそのような疾患に対する感受性（好ましくは乾癬または乾癬に対する感受性）の診断を開示する。本発明者らはまた、上記に記載される変化のいずれかを検出すること、好ましくは２０ｋＤａのＳＬＰＩポリペプチドの非存在または調節されたレベル（好ましくは、より低いレベル）を個体において検出することによる、個体における第ＩＩ群疾患またはそのような疾患に対する感受性（好ましくは乾癬または乾癬に対する感受性）の診断を開示する。
【０５７７】
この診断はまた、９０ｋＤａ〜１００ｋＤａおよび２０ｋＤａのポリペプチドの相対的存在量をアッセイすることによって達成することができる。
【０５７８】
好ましくは、これらの関連するポリペプチドは、インビボであっても、またはエクスビボ（例えば、生検物で）であっても、個体の表皮で検出される。
【０５７９】
実施例Ｃ６．角質層から抽出されたタンパク質の乾癬タンパク質分解プロフィル
タンパク質を上記に記載されるように正常者群の角質層および乾癬患者群の角質層（病変皮膚および非病変皮膚）から抽出し、そしてコルネオデスモソームの様々なタンパク質に対する特異的な抗体を使用するウエスタンブロットによって分析する。本発明者らは、表皮抽出タンパク質のプロフィルが正常な皮膚と乾癬の病変皮膚および非病変皮膚との間で異なることを示している。
【０５８０】
コルネオデスモシンのタンパク質分解プロフィル
デスモソーム／コルネオデスモソームの様々なタンパク質のタンパク質分解が不完全であることは、正常な皮膚と比較して、乾癬皮膚におけるコルネオデスモソームタンパク質の成熟形態の量の著しい低下において反映される。タンパク質分解の欠陥は細胞を表皮表面において接着させ、細胞の生え替わりを妨げる。例えば、３６ｋＤａ形態および４６ｋＤａ〜４３ｋＤａ形態のコルネオデスモシンが正常な皮膚では角質層において主要な形態であり、５２ｋＤａ〜５６ｋＤａ形態は正常な角質層では非常に希である。乾癬皮膚におけるコルネオデスモシンのタンパク質分解プロフィルは異なる。従って、乾癬皮膚では、５２ｋＤａ〜５６ｋＤａ形態のコルネオデスモシンが乾癬患者の表皮において量が多く、角質層においても同様に量が多い。このことは、乾癬皮膚ではタンパク質分解の欠陥が存在することを示唆している。
【０５８１】
従って、本発明者らは、上記に記載される変化のいずれかを検出すること、好ましくは１つ以上の５２ｋＤａ〜５６ｋＤａのコルネオデスモシンポリペプチドの存在または調節されたレベル（好ましくは、より大きいレベル）を個体において検出することによる、個体における第ＩＩ群疾患またはそのような疾患に対する感受性（好ましくは乾癬または乾癬に対する感受性）の診断を開示する。本発明者らはまた、３６ｋＤａおよび４６ｋＤａ〜４３ｋＤａのコルネオデスモシンポリペプチドの１つまたは両方の非存在または調節されたレベル（好ましくは、より低いレベル）を個体において検出することによる、個体における第ＩＩ群疾患またはそのような疾患に対する感受性（好ましくは乾癬または乾癬に対する感受性）の診断を開示する。
【０５８２】
この診断はまた、３６ｋＤａおよび４６ｋＤａ〜４３ｋＤａおよび５２ｋＤａ〜５６ｋＤａのポリペプチドの相対的存在量をアッセイすることによって達成することができる。
【０５８３】
好ましくは、これらの関連するポリペプチドは、インビボであっても、またはエクスビボ（例えば、生検物で）であっても、個体の角質層で検出される。
【０５８４】
デスモグレンＩのタンパク質分解プロフィル
類似する結果がデスモグレンＩ（ＤＧＩ）に関して得られる。正常な皮膚の表皮において、ＤＧＩの最も多い形態は９５ｋＤａおよび８０ｋＤａであり、これらは１６０ｋＤａ形態のタンパク質分解産物である。しかし、乾癬皮膚の角質層では、最も多い形態は１６０ｋＤａである。このことは、乾癬皮膚ではＤＧＩのタンパク質分解の欠陥が存在することを示唆している。
【０５８５】
従って、本発明者らは、上記に記載される変化のいずれかを検出すること、好ましくは１６０ｋＤａのデスモグレンＩポリペプチドの存在または調節されたレベル（好ましくは、より大きいレベル）を個体において検出することによる、個体における第ＩＩ群疾患またはそのような疾患に対する感受性（好ましくは乾癬または乾癬に対する感受性）の診断を開示する。そのような診断はまた、９５ｋＤａおよび８０ｋＤａのデスモグレンＩポリペプチドの１つまたは両方の非存在または調節されたレベル（好ましくは、より低いレベル）を個体において検出することによって行うことができる。
【０５８６】
この診断はまた、８０ｋＤａおよび９５ｋＤａおよび１６０ｋＤａのポリペプチドの相対的存在量をアッセイすることによって達成することができる。この診断は、１６０ｋＤａのデスモグレンＩポリペプチドのタンパク質分解がないことを個体において検出することによって行うことができる。
【０５８７】
好ましくは、これらの関連するポリペプチドは、インビボであっても、またはエクスビボ（例えば、生検物で）であっても、個体の角質層で検出される。
【０５８８】
デスモグレイン３のタンパク質分解プロフィル
デスモグレイン３（Ｄｅｇ３）もまたタンパク質分解の低下を示す。５５ｋＤａおよび１００ｋＤａの２つのタンパク質分解フラグメントに対応するバンドが、正常な皮膚の角質層と比較して、乾癬皮膚の角質層では弱くなっている。両方のフラグメントは、細胞質ドメインに対する同じ抗体と反応する。８０ｋＤａの別のバンドが、乾癬の表皮と比較して、正常な表皮では、Ｄｅｇ３のタンパク質分解産物として、より強く現れる。
【０５８９】
従って、本発明者らは、５５ｋＤａのデスモグレン３フラグメントおよび８０ｋＤａのデスモグレン３フラグメントおよび１００ｋＤａのデスモグレン３フラグメントのいずれか１つまたは２つ以上の非存在を個体において検出することによる、個体における第ＩＩ群疾患またはそのような疾患に対する感受性（好ましくは乾癬または乾癬に対する感受性）の診断を開示する。
【０５９０】
好ましくは、これらの関連するポリペプチドは、インビボであっても、またはエクスビボ（例えば、生検物で）であっても、個体の角質層で検出される。
【０５９１】
デスモプラキンのタンパク質分解プロフィル
デスモプラキンに対するポリクローナル抗体を使用して、本発明者らは３つのバンド（１９０ｋＤａ〜２５０ｋＤａ、１２０ｋＤａ〜１８０ｋＤａおよび７５ｋＤａ〜８０ｋＤａ）を明らかにした。１９０ｋＤａ〜２５０ｋＤａおよび／または１２０ｋＤａ〜１８０ｋＤａが、疾患と比較して、正常者では強く発現している。７５ｋＤａ〜８０ｋＤａは１９０ｋＤａ〜２５０ｋＤａおよび／または１２０ｋＤａ〜１８０ｋＤａのタンパク質分解形態であると考えられ、このことは、デスモプラキンが乾癬皮膚（病変皮膚および非病変皮膚）では正しくタンパク質分解されないことを示唆している。これらのプロフィルは、乾癬などの、増大した接着を有する疾患を同定するために使用することができる。
【０５９２】
従って、本発明者らは、上記に記載される変化のいずれかを検出すること、好ましくはデスモプラキンの１９０ｋＤａ〜２５０ｋＤａおよび１２０ｋＤａ〜１８０ｋＤａのポリペプチドのいずれかまたは両方の非存在または調節されたレベル（好ましくは、より低いレベル）を個体において検出することによる、個体における第ＩＩ群疾患またはそのような疾患に対する感受性（好ましくは乾癬または乾癬に対する感受性）の診断を開示する。この診断はまた、７５ｋＤａ〜８０ｋＤａおよび／または１９０ｋＤａ〜２５０ｋＤａおよび／または１２０ｋＤａ〜１８０ｋＤａのポリペプチドの相対的存在量をアッセイすることによって達成することができる。この診断は、８５ｋＤａのデスモプラキンポリペプチドのタンパク質分解がないことを個体おいて検出することによって行うことができる。
【０５９３】
好ましくは、これらの関連するポリペプチドは、インビボであっても、またはエクスビボ（例えば、生検物で）であっても、個体の角質層で検出される。
【０５９４】
プラコグロビンのタンパク質分解プロフィル
プラコグロビンに対する抗体により、３つのバンド（８５ｋＤａ、７５ｋＤａおよび７０ｋＤａ）が明らかにされた。７０ｋＤａおよび７５ｋＤａは、角化細胞が分化しているときにＳＣＣＥおよびＳＣＴＥなどのプロテアーゼによって切断される天然型タンパク質（８５ｋＤａ）のタンパク質分解形態である。７０ｋＤａは、角質層で認められるプラコグロビンの主要な形態であり、乾癬皮膚（変および非病変の両方）では非常に強く、正常な表皮にはほとんど存在しない。乾癬皮膚および正常な皮膚は２つの異なるプロフィルを有する。７０ｋＤａのバンドは、増大した接着を有する疾患（例えば、乾癬およびざ瘡）を診断するために使用することができる。
【０５９５】
従って、本発明者らは、上記に記載される変化のいずれかを検出すること、好ましくは７０ｋＤａのプラコグロビンポリペプチドの存在または調節されたレベル（好ましくは、より大きいレベル）を個体において検出することによる、個体における第ＩＩ群疾患またはそのような疾患に対する感受性（好ましくは乾癬または乾癬に対する感受性）の診断を開示する。本発明者らはまた、好ましくは７５ｋＤａのプラコグロビンポリペプチドの非存在または調節されたレベル（好ましくは、より低いレベル）を検出することによる、個体における第ＩＩ群疾患またはそのような疾患に対する感受性（好ましくは乾癬または乾癬に対する感受性）の診断を開示する。
【０５９６】
この診断はまた、８５ｋＤａおよび７５ｋＤａおよび７０ｋＤａのポリペプチドの相対的存在量をアッセイすることによって達成することができる。この診断は、８５ｋＤａのプラコグロビンポリペプチドのタンパク質分解がないことを個体おいて検出することによって行うことができる。
【０５９７】
好ましくは、これらの関連するポリペプチドは、インビボであっても、またはエクスビボ（例えば、生検物で）であっても、個体の角質層で検出される。
【０５９８】
デスモコリン１のタンパク質分解プロフィル
デスモコリン１（ＤＧＩＶ／Ｖ）は正常な表皮の基底下層で強く発現する。
【０５９９】
デスモコリンに対する抗体により、正常な表皮における３つのＤｓｃ１イソ型が７０ｋＤａ〜８０ｋＤａおよび６０ｋＤａ〜７０ｋＤａおよび５０ｋＤａ〜６０ｋＤａの分子量において明らかにされる。２つのバンドのみが、病変皮膚および非病変皮膚を含む乾癬皮膚の表皮で検出されるだけであり、このことは、乾癬皮膚におけるデスモコリン１の異常なタンパク質分解を示唆している。５０ｋＤａ〜６０ｋＤａのバンドが存在しないことは、乾癬などの、増強された接着を有する疾患のプロテオミック診断のために使用することができる。
【０６００】
従って、本発明者らは、上記に記載される変化のいずれかを検出すること、好ましくは５０ｋＤａ〜６０ｋＤａのデスモコリン１ポリペプチドの非存在または調節されたレベル（好ましくは、より低いレベル）を個体において検出することによる、個体における第ＩＩ群疾患またはそのような疾患に対する感受性（好ましくは乾癬または乾癬に対する感受性）の診断を開示する。
【０６０１】
この診断はまた、７０ｋＤａ〜８０ｋＤａおよび６０ｋＤａ〜７０ｋＤａおよび５０ｋＤａ〜６０ｋＤａのポリペプチドの相対的存在量をアッセイすることによって達成することができる。
【０６０２】
好ましくは、これらの関連するポリペプチドは、インビボであっても、またはエクスビボ（例えば、生検物で）であっても、個体の角質層で検出される。
【０６０３】
実施例Ｃ７．角質層から抽出されたタンパク質の湿疹タンパク質プロフィル
タンパク質を上記に記載されるように正常者群の角質層および湿疹性患者群の角質層から抽出し、そしてコルネオデスモソームの様々なタンパク質に対する特異的な抗体を使用するウエスタンブロットによって分析する。本発明者らは、表皮抽出タンパク質のプロフィルが正常者と疾患（湿疹）者との間で異なることを示している。
【０６０４】
コルネオデスモソームのタンパク質分解プロフィル
湿疹におけるデスモソーム／コルネオデスモソームの様々なタンパク質のタンパク質分解の増大は、正常な皮膚と比較して、湿疹性皮膚におけるコルネオデスモソームタンパク質の成熟形態の量の著しい増大において反映される。増大したタンパク質分解は細胞を表皮表面において接着させ、細胞の生え替わりを妨げる。
【０６０５】
例えば、３６ｋＤａ形態および４６ｋＤａ〜４３ｋＤａ形態のコルネオデスモシンが正常な皮膚では角質層において主要な形態であり、５２ｋＤａ〜５６ｋＤａ形態は角質層では非常に希である。湿疹性皮膚ではコルネオデスモシンのタンパク質分解が増大しており、その結果、３６ｋＤａ形態および４６ｋＤａ〜４３ｋＤａ形態のコルネオデスモシンが湿疹患者の角質層では優勢な形態である。このことは、湿疹性皮膚ではタンパク質分解が増大していることを示している。
【０６０６】
従って、本発明者らは、上記に記載される変化のいずれかを検出すること、好ましくは１つ以上の３６ｋＤａおよび４６ｋＤａ〜４３ｋＤａのコルネオデスモシンポリペプチドの存在または調節されたレベル（好ましくは、より大きいレベル）を個体において検出することによる、個体における第Ｉ群疾患または第Ｉ群疾患に対する感受性（好ましくは湿疹または湿疹に対する感受性）の診断を開示する。本発明者らはまた、５２ｋＤａ〜５６ｋＤａのコルネオデスモシンポリペプチドの非存在または調節されたレベル（好ましくは、より低いレベル）を個体において検出することによる、個体における第Ｉ群疾患またはそのような疾患に対する感受性（好ましくは湿疹または湿疹に対する感受性）の診断を開示する。
【０６０７】
この診断はまた、３６ｋＤａおよび４６ｋＤａ〜４３ｋＤａおよび５２ｋＤａ〜５６ｋＤａのポリペプチドの相対的存在量をアッセイすることによって達成することができる。
【０６０８】
好ましくは、これらの関連するポリペプチドは、インビボであっても、またはエクスビボ（例えば、テープストリップの形態で）であっても、個体の角質層で検出される。
【０６０９】
デスモグレンＩのタンパク質分解プロフィル
類似する結果がデスモグレンＩ（ＤＧＩ）に関して得られる。正常な皮膚の角質層において、ＤＧＩの最も多い形態は９５ｋＤａおよび８０ｋＤａであり、これらは１６０ｋＤａ形態のタンパク質分解産物である。しかし、湿疹皮膚の角質層では、９５ｋＤａおよび８０ｋＤａの形態が増大しており、このことは、ＤＧＩのタンパク質分解プロセスが湿疹性皮膚では増強されることを示唆している。
【０６１０】
従って、本発明者らは、上記に記載される変化のいずれかを検出すること、好ましくは９５ｋＤａおよび８０ｋＤａのポリペプチドの１つ以上の存在または調節されたレベル（好ましくは、より大きいレベル）を個体において検出することによる、個体における第Ｉ群疾患または第Ｉ群疾患に対する感受性（好ましくは湿疹または湿疹に対する感受性）の診断を開示する。そのような診断はまた、１６０ｋＤａのデスモグレンＩポリペプチドの非存在または調節されたレベル（好ましくは、より低いレベル）を個体において検出することによって行うことができる。
【０６１１】
この診断はまた、８０ｋＤａおよび９５ｋＤａおよび１６０ｋＤａのポリペプチドの相対的存在量をアッセイすることによって達成することができる。この診断は、１６０ｋＤａのデスモグレンＩポリペプチドのタンパク質分解がないことを個体において検出することによって行うことができる。
【０６１２】
好ましくは、これらの関連するポリペプチドは、インビボであっても、またはエクスビボ（例えば、テープストリップの形態で）であっても、個体の角質層で検出される。
【０６１３】
デスモグレイン３のタンパク質分解プロフィル
デスモグレイン３（Ｄｅｇ３）により、タンパク質分解の増大が示される。５５ｋＤａおよび１００ｋＤａの２つのタンパク質分解フラグメントに対応するバンドが、正常な皮膚の角質層と比較して、湿疹皮膚の角質層では強い。両方のフラグメントは、細胞質ドメインに対する同じ抗体と反応する。Ｄｅｇ３のタンパク質分解産物として現れる８０ｋＤａの別のバンドは、湿疹性の角質層と比較して、正常な角質では弱くなっている。
【０６１４】
従って、本発明者らは、上記に記載される変化のいずれかを検出すること、好ましくは５５ｋＤａのデスモグレン３ポリペプチドおよび８０ｋＤａのデスモグレン３ポリペプチドおよび１００ｋＤａのデスモグレン３ポリペプチドのいずれか１つまたは２つまたはすべての存在または調節されたレベル（好ましくは、より大きいレベル）を個体において検出することによる、個体における第Ｉ群疾患または第Ｉ群疾患に対する感受性（好ましくは湿疹または湿疹に対する感受性）の診断を開示する。
【０６１５】
好ましくは、これらの関連するポリペプチドは、インビボであっても、またはエクスビボ（例えば、テープストリップの形態で）であっても、個体の角質層で検出される。
【０６１６】
プラコグロビンのタンパク質分解プロフィル
プラコグロビンに対する抗体により、３つのバンド（８５ｋＤａ、７５ｋＤａおよび７０ｋＤａ）が明らかにされた。７０ｋＤａおよび７５ｋＤａは、角化細胞が分化しているときにＳＣＣＥおよびＳＣＴＥなどのプロテアーゼによって切断される天然型タンパク質（８５ｋＤａ）のタンパク質分解形態である。７０ｋＤａは、湿疹性皮膚（病変および非病変の両方）では非常に弱く、正常な表皮にはほとんど存在しない。８５ｋＤａおよび７５ｋＤａは、正常な皮膚と比較して、湿疹皮膚では非常に強い。湿疹皮膚および正常な皮膚は２つの異なるプロフィルを有する。８５ｋＤａおよび７５ｋＤａのバンドは、湿疹を診断するために使用することができる。
【０６１７】
従って、本発明者らは、上記に記載される変化のいずれかを検出すること、好ましくは７０ｋＤａのプラコグロビンポリペプチドの非存在または調節されたレベル（好ましくは、より低いレベル）を個体において検出することによる、個体における第Ｉ群疾患または第Ｉ群疾患に対する感受性（好ましくは湿疹または湿疹に対する感受性）の診断を開示する。本発明者らはまた、８５ｋＤａのプラコグロビンポリペプチドおよび／または７５ｋＤａのプラコグロビンポリペプチドの存在または調節されたレベル（好ましくは、より大きいレベル）を検出することによる、個体における第Ｉ群疾患または第Ｉ群疾患に対する感受性（好ましくは湿疹または湿疹に対する感受性）の診断を開示する。
【０６１８】
この診断はまた、８５ｋＤａおよび７５ｋＤａおよび７０ｋＤａのポリペプチドの相対的存在量をアッセイすることによって達成することができる。
【０６１９】
好ましくは、これらの関連するポリペプチドは、インビボであっても、またはエクスビボ（例えば、テープストリップの形態で）であっても、個体の角質層で検出される。
【０６２０】
デスモコリン１のタンパク質分解プロフィル
デスモコリン１（ＤＧＩＶ／Ｖ）は正常な表皮の基底下層で強く発現する。
【０６２１】
デスモコリンに対する抗体により、正常な表皮における３つのＤｓｃ１イソ型が７０ｋＤａ〜８０ｋＤａおよび６０ｋＤａ〜７０ｋＤａおよび５０ｋＤａ〜６０ｋＤａの分子量において明らかにされた。５０ｋＤａ〜６０ｋＤａのバンドが、病変皮膚および非病変皮膚を含む湿疹皮膚では強く発現しており、このことは、湿疹皮膚におけるデスモコリン１の増大したタンパク質分解を示唆している。５０ｋＤａ〜６０ｋＤａのバンドの大きい発現は、湿疹などの、皮膚バリアの欠陥を有する疾患のプロテオミック診断のために使用することができる。
【０６２２】
従って、本発明者らは、上記に記載される変化のいずれかを検出すること、好ましくは５０ｋＤａ〜６０ｋＤａのデスモコリン１ポリペプチドの存在または調節されたレベル（好ましくは、より大きいレベル）を個体において検出することによる、個体における第Ｉ群疾患または第Ｉ群疾患に対する感受性（好ましくは湿疹または湿疹に対する感受性）の診断を開示する。
【０６２３】
この診断はまた、７０ｋＤａ〜８０ｋＤａおよび６０ｋＤａ〜７０ｋＤａおよび５０ｋＤａ〜６０ｋＤａのポリペプチドの相対的存在量をアッセイすることによって達成することができる。
【０６２４】
好ましくは、これらの関連するポリペプチドは、インビボであっても、またはエクスビボ（例えば、テープストリップの形態で）であっても、個体の角質層で検出される。
【０６２５】
実施例Ｄ：遺伝子調節
実施例Ｄ１．オリゴヌクレオチドアレイを使用して分析された接着タンパク質遺伝子およびプロテアーゼ遺伝子およびプロテアーゼ阻害剤遺伝子の乾癬における発現
本発明者らは、デスモソームおよびコルネオデスモソームの接着タンパク質およびプロテアーゼおよびプロテアーゼ阻害剤の遺伝子を含むＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘオリゴヌクレオチドアレイを使用した。これらの遺伝子は実施例Ｄ２〜Ｄ７において下記の表に示される。
【０６２６】
乾癬、尋常性ざ瘡、魚鱗癬、毛孔性角化症、アトピー性湿疹、クローン病、皮膚黒色種、扁平上皮ガン、基底細胞ガン、皮膚性リンパ腫、皮膚ガン、胃腸管悪性腫瘍、肺悪性腫瘍の各患者の関与皮膚および非関与皮膚からのパンチ生検物を皮膚から得る。生検物はまた、非関連のコントロール献血者からも得られる。
【０６２７】
ＲＮＡを各サンプルから抽出する。平均して、５０μｇ、２０μｇおよび１５μｇが、それぞれ、病変皮膚、非病変皮膚および正常な皮膚から得られる。約１０μｇを使用して、ビオチン化ｃＲＮＡを調製して、２μｇを、表に示されるような遺伝子に対するプローブを含有するＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｕ９５Ａアレイに対するハイブリダイゼーションのために使用する。
【０６２８】
ＧＥＮＥＣＨＩＰソフトウエアが、平均差に対する画像強度を発現レベルに変換することによって各遺伝子の発現レベルを反映させるために使用される。正常な皮膚における遺伝子の発現が基準として使用され、結果が下記の表に示される。
【０６２９】
実施例Ｄ２．オリゴヌクレオチドアレイを使用して分析されたコルネオデスモソームの遺伝子の乾癬における発現
コルネオデスモソームの様々な遺伝子の発現が、乾癬病変皮膚（「関与」）および乾癬非病変皮膚（「非関与」）を使用して、乾癬患者において、記載されるようにアッセイされる。疾患における各遺伝子の発現レベル（関与および非関与）が、正常な皮膚におけるその発現と比較される。
【０６３０】
結果が下記の表Ｄ２．１に示される。記号：＋＋：通常の発現；＋＋＋：強い発現；＋＋＋＋：大きい発現；＋：ダウンレギュレーション。
【表３０】
2004524010.tif 000031
表Ｄ２．１
【０６３１】
従って、本発明者らは、Ｓ／コルネオデスモシン（ＡＦ０３０１３０）、デソプラキン（ＸＭ＿００４４６３）、プラコグロビン（ＮＭ＿００２２３０；ＧＢ：ＮＭ＿０２１９９１）、デスモグレイン１（ＸＭ＿００８８１０）、デスモコリン１（ＭＸ＿００８６８７）、エンボプラキン（ＸＭ＿００８１３５；Ｕ７２５４３）、プレクチン１（ＮＭ０００４４５）、Ｓ１００Ａ２（ＡＩ５３９４３９；Ｍ８７０６８）、ケラチン６Ａ（Ｌ４２６１１）、ケラチン１７（Ｚ１９５７４）、Ｓ１００Ａ８（ＡＩ１２６１３４）、Ｓ１００Ａ７（ＡＡ５８６８９４）、Ｓ１００Ａ９（ＧＢ：Ｗ７２４２４）、ＳＰＲＲ２Ａ（ＧＢ：Ｍ２１３０２）、ＳＰＲＲ１Ｂ（Ｍ１９８８８）、ＳＰＲＫ（ＡＩ９２３９８４）、ＨＣＲ（ＢＡＡ８１８９０）、ＳＥＥＫ１（ＢＡＡ８８１３０）、ＳＰＲ１（ＢＡＢ６３３１５）、ＳＴＧ（ＢＡＡ８８１３２）、インボルクリン（ＮＭ＿００５５４７）、アネキシンＡ１／リポコルチン（Ｘ０５９０８）、ＶＩ型コラーゲンα３（ＣＯＬ６Ａ３）（ＮＭ＿００４３６９）、トリコヒアリン（ＮＭ＿００５５４７）およびロリクリン（ＸＭ＿０４８９０２）からなる群から選択されるポリペプチドまたは核酸の発現の調節（好ましくは、発現のアップレギュレーション）を検出することによる、個体における第ＩＩ群疾患または第ＩＩ群疾患に対する感受性（好ましくは乾癬または乾癬に対する感受性）の診断を提供する。
【０６３２】
実施例Ｄ３．オリゴヌクレオチドアレイを使用して分析されたプロテアーゼ遺伝子の乾癬における発現
様々なプロテアーゼ遺伝子の発現が、乾癬病変皮膚（「関与」）および乾癬非病変皮膚（「非関与」）を使用して、乾癬患者において、記載されるようにアッセイされる。疾患における各遺伝子の発現レベル（関与および非関与）が、正常な皮膚におけるその発現と比較される。
【０６３３】
結果が下記の表Ｄ３．１に示される。記号：＋＋：通常の発現；＋＋＋：強い発現；＋＋＋＋：大きい発現；＋：ダウンレギュレーション。
【表３１−１】
2004524010.tif 000032
【表３１−２】
2004524010.tif 000033
表Ｄ３．１
【０６３４】
従って、本発明者らは、トランスグルタミナーゼ１（ＴＧＭ１）（Ｍ９８４４７）、ＴＧＭ２（ＸＭ＿００９４８２）、ＴＧＭ４（ＸＭ＿０５６２０３）、ＴＧＭ５（ＸＭ＿００７５２９）、ＴＧＭ７（ＮＭ＿０５２９５５）、ＴＧＭ３（Ｌ１０３８６）、ホスホリパーゼＡ（２）（ＢＣ０１３３８４）、ＣＤ４７抗原（Ｘ６９３９８）、カリクレイン８（ＡＢ００８３９０）、ＡＤ０２４タンパク質（ＸＭ＿００２６４２）、ディフェンシンβ２（ＡＦ０７１１２１６）、インターフェロンａ誘導性タンパク質２７（Ｘ６７３２５）、脂肪酸結合タンパク質ＦＡＢＰ５（Ｍ９４８５６）、ＳＣＴＥ（ＸＭ＿００９０００）、カリクレイン１（腎臓／膵臓／唾液性、ＫＬＫ１）（ＸＭ＿０４７３００）、ヒトカリクレイン２（前立腺性、ＫＬＫ２）（ＸＭ＿０３１７５７）、カリクレイン３（前立腺特異的抗原）（ＫＬＫ３）（ＸＭ＿０３１７６８）、カリクレイン６（ニューロシン、ザイム）（ＫＬＫ６）（ＸＭ＿０５５６５８）、カリクレイン４（プロスターゼ、エナメルマトリックス、前立腺）（ＫＬＫ４）（ＸＭ＿００８９９７）、膜型セリンプロテアーゼ１（ＡＦ１３３０８６）、コラゲナーゼＭＭＰ−１（ＬＯＣ１１６３８９）、コラゲナーゼＭＭＰ−１２（Ｕ７８０４５）、コラゲナーゼＭＭＰ−９（ＮＭ＿００４９９４）、コラゲナーゼＭＭＰ−３（Ｕ７８０４５）、コラゲナーゼＭＭＰ−２８（ＡＦ２１９６２４）、カスパーゼ７（ＢＣ０１５７９９）、カスパーゼ５（ＮＭ＿００４３４７）、カスパーゼ−１４（ＮＭ＿０１２１１４）、ユビキチン特異的プロテアーゼＵＳＰ−５（ＮＭ＿００３４８１）、ユビキチン特異的プロテアーゼＵＳＰ−１１（ＮＭ＿００４６５１）、ユビキチン特異的プロテアーゼＵＳＰ−６（ＮＭ＿００４５０５）、ユビキチン特異的プロテアーゼＵＳＰ２６（ＮＭ＿０３１９０７）、ユビキチン特異的プロテアーゼ（ＵＳＰ２８）（ＮＭ＿０２０８８６）、２６Ｓプロテアーゼサブユニット４（Ｌ０２４２６）、ＬＩＬＲＢ１（ＡＦ００４２３０）、転写のシグナル変換因子／活性化因子１（９１ｋＤａ）（ＳＴＡＴ１）（９７７９３５）、プロテアソーム（プロソーム、マクロパイン）サブユニット６（ＰＳＭＡ６）（Ｘ５９４１７）、ＴＰＳＢ１（ＸＭ＿０１６２０４）、プロテアーゼネキシン−ＩＩ（ＸＭ＿０４７７９３）、グリア由来ネキシン前駆体（Ｐ０７０９３）、ならびに２６Ｓプロテアーゼ調節サブユニットＳ１０ＢおよびＰＣＯＬＮ３（ＸＭ＿０４７５２４）からなる群から選択されるポリペプチドまたは核酸の発現の調節（好ましくは、発現のアップレギュレーション）を検出することによる、個体における第ＩＩ群疾患または第ＩＩ群疾患に対する感受性（好ましくは乾癬または乾癬に対する感受性）の診断を提供する。
【０６３５】
本発明者らはさらに、アポトーシス関連システインプロテアーゼ（ＣＡＳＰ１４）ｍＲＮＡ（ＮＭ＿０１２１１４）、ＳＣＣＥ（ＸＭ＿００９００２）、ヒト皮膚コラゲナーゼ（Ｍ１３５０９）、ＴＰＳ１（ＮＭ＿００３２９３）、およびＴＰＳＧ１（ＸＭ＿００８１２３）からなる群から選択されるポリペプチドまたは核酸の発現の調節（好ましくは、発現のダウンレギュレーション）を検出することによる、個体における第ＩＩ群疾患または第ＩＩ群疾患に対する感受性（好ましくは乾癬または乾癬に対する感受性）の診断を提供する。
【０６３６】
実施例Ｄ４．オリゴヌクレオチドアレイを使用して分析されたプロテアーゼ阻害剤遺伝子の乾癬における発現
様々なプロテアーゼ阻害剤遺伝子の発現が、乾癬病変皮膚（「関与」）および乾癬非病変皮膚（「非関与」）を使用して、乾癬患者において、記載されるようにアッセイされる。疾患における各遺伝子の発現レベル（関与および非関与）が、正常な皮膚におけるその発現と比較される。
【０６３７】
結果が下記の表Ｄ４．１に示される。記号：＋＋：通常の発現；＋＋＋：強い発現；＋＋＋＋：大きい発現；＋：ダウンレギュレーション。
【表３２−１】
2004524010.tif 000034
【表３２−２】
2004524010.tif 000035
【表３２−３】
2004524010.tif 000036
表Ｄ４．１
【０６３８】
従って、本発明者らは、ＳＬＰ１（Ｘ０４５０２）、ＳＫＡＬＰ（ＸＭ＿００９５２４；Ｌ１０３４３）、ＣＳＴＡ（ＮＭ＿００５２１３；ＡＡ５７０１９３）、ＳＣＣＡ（Ｓ６６２９６）、ＳＣＣＡ２（Ｕ１９５５７）、１型プラスミノーゲン活性化因子阻害剤（Ｘ０４７２９；Ｘ０４７３１）、ＰＡＩ２（ＡＦ０７１４００）、ＳＥＲＰＩＮＡ５（ＮＭ＿０００６２４）、２型プラスミノーゲン活性化因子阻害剤（Ｌ１９０６６）、ＴＩＭＰ（Ｄ１１１３９）、ＴＩＭＰ−１（ＮＭ＿００３２５４）、ＴＩＭＰ−２（ＮＭ＿００３２５５）、ＴＩＭＰ−３（Ｅ１３８８０）、ＴＩＭＰ−４（ＮＭ＿００３２５６）、ＴＩＭＰ９ａ（ＡＦ１５０１００）、ＴＩＭ９ｂ（ＡＦ１５０１０５）、シスタチンＡ（ＡＡ５７０１９３）、シスタチンＭ／Ｅ（ＮＭ＿００１３２３）、多価プロテアーゼ阻害剤ＷＦＩＫＫＮ（ＡＦ４２２１９４）、Ｃ１阻害剤（ＳＥＲＰＩＮＧ１）（ＸＭ＿０４６２１８）、プロテアーゼ阻害剤（Ｋｕｎｉｔｚ型２）（ＳＰＩＮＴ２）（ＸＭ＿０３２２８０）、セリンプロテアーゼ阻害剤（Ｋａｚａｌ型４）（ＳＰＩＮＫ４）（ＸＭ＿００５５３９）、プロテイナーゼ阻害剤（ｃｌａｄｅＢ［オバルブミン］）（メンバー９）（ＸＭ＿０５３６４２）、セリン（またはシステイン）プロテイナーゼ阻害剤（ｃｌａｄｅＢ［オバルブミン］）（メンバー６）（ＸＭ＿０４７９８４）、エピン−１（ＥＰＰＩＮ）（ＡＦ２８６３６８）、エピン−２（ＥＰＰＩＮ）（ＡＦ２８６３６９）、エピン−３（ＥＰＰＩＮ）（ＡＦ２８６３７０）、ＫｕｎｉｔｚドメインおよびＷＡＰドメインを有するセリンプロテアーゼ阻害剤様１（エピン）（ＳＰＩＮＬＷ１）（ＮＭ＿０２０３９８）、ｓｐａｒｃ／オステオネクチン（ｃｗｃｖ様ドメインおよびｋａｚａｌ様ドメインのプロテオグリカン［テスティカン］）（ＳＰＯＣＫ）（ＮＭ＿００４５９８）、プロテアーゼ阻害剤（Ｋｕｎｉｔｚ型１）（ＳＰＩＮＴ１）（ＸＭ＿０５６８３６）、ＰＩ１２（ＡＨ００９７５６）、ＨＩＶ−１プロテアーゼのＩ型ヒト免疫不全症ウイルス遺伝子（ＡＢ０２０９２３）、ＨＩＶ−１プロテアーゼのＩ型ヒト免疫不全症ウイルス遺伝子（ＡＢ０２０９２４）、組織因子経路阻害剤２（ＴＦＰＩ２）（ＮＭ＿００６５２８）、分泌型リンタンパク質２（２４ｋＤ、ＳＰＰ２）（ＮＭ＿００６９４４）、カテプシンＦ（ＣＴＳＦ）（ＮＭ＿００３７９３）、セリン（またはシステイン）プロテイナーゼ阻害剤（ｃｌａｄｅＡ［α−１抗プロテイナーゼ、アンチトリプシン］）（メンバー６）（ＳＥＲＰＩＮＡ６）（ＮＭ＿００１７５６）、セリン（またはシステイン）プロテイナーゼ阻害剤（ｃｌａｄｅＢ［オバルブミン］）（メンバー３）（ＳＥＲＰＩＮＢ３）（ＮＭ＿００６９１９）、セリン（またはシステイン）プロテイナーゼ阻害剤（ｃｌａｄｅＡ［α−１抗プロテイナーゼ、アンチトリプシン］）（メンバー３）（ＳＥＲＰＩＮＡ３）（ＮＭ＿００１０８５）、ヒトセリン（またはシステイン）プロテイナーゼ阻害剤（ｃｌａｄｅＢ［オバルブミン］）（メンバー１３）（ＸＭ＿００８７４３）、セリン（またはシステイン）プロテイナーゼ阻害剤（ｃｌａｄｅＢ［オバルブミン］）（メンバー５）（ＳＥＲＰＩＮＢ５）（ＸＭ＿��０８７４２）、ＲｅｌＡ結合型阻害剤（ＸＭ＿０５７６９３）、ＤＮＡ結合阻害剤１（優性ネガティブなヘリックス−ループ−ヘリックスタンパク質［ＩＤ１］）（ＸＭ＿０４６１７９）、セリン（またはシステイン）プロテイナーゼ阻害剤（ｃｌａｄｅＥ［ネキシン、１型プラスミノーゲン活性化因子阻害剤］）（メンバー）（ＳＥＲＰＩＮＥ１）（ＸＭ＿０５４８５０）、サイクリン依存性キナーゼ阻害剤２Ｂ（ｐ１５、ＣＤＫ４を阻害する）（ＣＤＫＮ２Ｂ）（ＮＭ＿００４９３６）、サイクリン依存性キナーゼ阻害剤２Ｂ（ｐ１５、ＣＤＫ４を阻害する）に類似するもの（ＢＣ０１４４６９）、セリン（またはシステイン）プロテイナーゼ阻害剤（ｃｌａｄｅＢ［オバルブミン］）（メンバー７）（ＳＥＲＰＩＮＢ７）（ＸＭ＿００８７４５）、活性化ＳＴＡＴタンパク質ＰＩＡＳｙのタンパク質阻害剤（ＰＩＡＳＹ）（ＮＭ＿０１６１４９）、活性化ＳＴＡＴタンパク質ＰＩＡＳｙのタンパク質阻害剤に類似するもの（ＬＯＣ９５８３０）（ＸＭ＿０１６８６４）、ＰＫＣにより強化されるＰＰ１阻害タンパク質（ＰＰＰ１Ｒ１４Ａ）（ＡＹ０５０６６８）、ＤＮＡ結合阻害剤３（優性ネガティブなヘリックス−ループ−ヘリックスタンパク質［ＩＤ３］）（ＮＭ＿００２１６７）、ＣｌａｄｅＡ（α−１抗プロテイナーゼ、アンチトリプシン）（ＸＭ＿０２８３５８）、セリン（またはシステイン）プロテイナーゼ阻害剤（ｃｌａｄｅＨ［熱ショックタンパク質４７］）（メンバー１）（ＳＥＲＰＩＮＨ１）（ＮＭ＿００４３５３）、フルピン（セリンプロテアーゼ阻害剤）に対するＰＩ１３遺伝子（ＡＪ２７８７１７）、プロテアーゼ阻害剤５（マスピン）（ＰＩ５）（ＸＭ＿００８７４２）、ＰＡＩ−２（Ａ３２４１５）からなる群から選択されるポリペプチドまたは核酸の発現の調節（好ましくは、発現のアップレギュレーション）を検出することによる、個体における第ＩＩ群疾患または第ＩＩ群疾患に対する感受性（好ましくは乾癬または乾癬に対する感受性）の診断を提供する。
【０６３９】
本発明者らはさらに、ｈｂｃ７５０ヒト膵臓小島（Ｔ１１１４１；Ｔ１０９２０）のポリペプチドまたは核酸の発現の調節（好ましくは、発現のダウンレギュレーション）を検出することによる、個体における第ＩＩ群疾患または第ＩＩ群疾患に対する感受性（好ましくは乾癬または乾癬に対する感受性）の診断を提供する。
【０６４０】
実施例Ｄ５．オリゴヌクレオチドアレイを使用して分析されたコルネオデスモソームの遺伝子の湿疹における発現
コルネオデスモソームの様々な遺伝子の発現が、湿疹病変皮膚（「関与」）および湿疹非病変皮膚（「非関与」）を使用して、湿疹患者において、記載されるようにアッセイされる。疾患における各遺伝子の発現レベル（関与および非関与）が、正常な皮膚におけるその発現と比較される。
【０６４１】
結果が下記の表Ｄ５．１に示される。記号：＋＋：通常の発現；＋＋＋：強い発現；＋＋＋＋：大きい発現；＋：ダウンレギュレーション。
【表３３】
2004524010.tif 000037
表Ｄ５．１
【０６４２】
従って、本発明者らは、ケラチン６Ａ（Ｌ４２６１１）、ケラチン１７（Ｚ１９５７４）、アネキシンＡ１／リポコルチン（Ｘ０５９０８）、およびＶＩ型コラーゲンα３（ＣＯＬ６Ａ３）（ＮＭ＿００４３６９）からなる群から選択されるポリペプチドまたは核酸の発現の調節（好ましくは、発現のアップレギュレーション）を個体において検出することによる、個体における第Ｉ群疾患または第Ｉ群疾患に対する感受性（好ましくは湿疹または湿疹に対する感受性）の診断を提供する。
【０６４３】
さらに、本発明者らは、Ｓ／コルネオデスモシン（ＡＦ０３０１３０）、デソプラキン（ＸＭ＿００４４６３）、プラコグロビン（ＮＭ＿００２２３０；ＮＭ＿０２１９９１）、デスモグレイン１（ＸＭ＿００８８１０）、デスモコリン１（ＭＸ＿００８６８７）、エンボプラキン（ＸＭ＿００８１３５；Ｕ７２５４３）、プレクチン１（ＮＭ０００４４５）、Ｓ１００Ａ２（ＡＩ５３９４３９；Ｍ８７０６８）、Ｓ１００Ａ８（ＡＩ１２６１３４）、Ｓ１００Ａ７（ＡＡ５８６８９４）、Ｓ１００Ａ９（ＧＢ：Ｗ７２４２４）、ＳＰＲＲ２Ａ（ＧＢ：Ｍ２１３０２）、ＳＰＲＲ１Ｂ（Ｍ１９８８８）、ＳＰＲＫ（ＡＩ９２３９８４）、ＨＣＲ（ＢＡＡ８１８９０）、ＳＥＥＫ１（ＢＡＡ８８１３０）、ＳＰＲ１（ＢＡＢ６３３１５）、ＳＴＧ（ＢＡＡ８８１３２）、インボルクリン（ＮＭ＿００５５４７）、トリコヒアリン（ＮＭ＿００５５４７）およびロリクリン（ＸＭ＿０４８９０２）からなる群から選択されるポリペプチドまたは核酸の発現の調節（好ましくは、発現のダウンレギュレーション）を検出することによる、個体における第Ｉ群疾患または第Ｉ群疾患に対する感受性（好ましくは湿疹または湿疹に対する感受性）の診断を提供する。
【０６４４】
実施例Ｄ６．オリゴヌクレオチドアレイを使用して分析されたプロテアーゼ遺伝子の湿疹における発現
湿疹患者における様々なプロテアーゼ遺伝子の発現が、関与皮膚（湿疹病変皮膚）および湿疹非病変皮膚（湿疹非病変皮膚）および正常な皮膚を使用してアッセイされる。疾患における各遺伝子の発現レベル（関与および非関与）が、正常な皮膚におけるその発現と比較される。
【０６４５】
結果が下記の表Ｄ６．１に示される。記号：＋＋：通常の発現；＋＋＋：強い発現；＋＋＋＋：大きい発現；＋：ダウンレギュレーション。
【表３４−１】
2004524010.tif 000038
【表３４−２】
2004524010.tif 000039
表Ｄ６．１
【０６４６】
従って、本発明者らは、アポトーシス関連システインプロテアーゼ（ＣＡＳＰ１４）ｍＲＮＡ（ＮＭ＿０１２１１４）、ＴＧＭ５（ＸＭ＿００７５２９）、ホスホリパーゼＡ（２）（ＢＣ０１３３８４）、ＣＤ４７抗原（Ｘ６９３９８）、カリクレイン８（ＡＢ００８３９０）、ＡＤ０２４タンパク質（ＸＭ＿００２６４２）、ＳＣＣＥ（ＸＭ＿００９００２）、ディフェンシンβ２（ＡＦ０７１１２１６）、インターフェロンａ誘導性タンパク質２７（Ｘ６７３２５）、脂肪酸結合タンパク質ＦＡＢＰ５（Ｍ９４８５６）、ＳＣＴＥ（ＸＭ＿００９０００）、カリクレイン１（腎臓／膵臓／唾液性、ＫＬＫ１）（ＸＭ＿０４７３００）、ヒトカリクレイン２（前立腺性、ＫＬＫ２）（ＸＭ＿０３１７５７）、カリクレイン３（前立腺特異的抗原）（ＫＬＫ３）（ＸＭ＿０３１７６８）、カリクレイン６（ニューロシン、ザイム）（ＫＬＫ６）（ＸＭ＿０５５６５８）、カリクレイン４（プロスターゼ、エナメルマトリックス、前立腺）（ＫＬＫ４）（ＸＭ＿００８９９７）、膜型セリンプロテアーゼ１（ＡＦ１３３０８６）、ヒト皮膚コラゲナーゼ（Ｍ１３５０９）、コラゲナーゼＭＭＰ−１（ＬＯＣ１１６３８９）、コラゲナーゼＭＭＰ−１２（Ｕ７８０４５）、コラゲナーゼＭＭＰ−９（ＮＭ＿００４９９４）、コラゲナーゼＭＭＰ−３（Ｕ７８０４５）、コラゲナーゼＭＭＰ−２８（ＡＦ２１９６２４）、カスパーゼ７（ＢＣ０１５７９９）、カスパーゼ５（ＮＭ＿００４３４７）、カスパーゼ−１４（ＮＭ＿０１２１１４）、ユビキチン特異的プロテアーゼＵＳＰ−５（ＮＭ＿００３４８１）、ユビキチン特異的プロテアーゼＵＳＰ−１１（ＮＭ＿００４６５１）、ユビキチン特異的プロテアーゼＵＳＰ−６（ＮＭ＿００４５０５）、ＴＰＳ１（ＮＭ＿００３２９３）、ＴＰＳＢ１（ＸＭ＿０１６２０４）、ＴＰＳＧ１（ＸＭ＿００８１２３）、プロテアーゼネキシン−ＩＩ（ＸＭ＿０４７７９３）、グリア由来ネキシン前駆体（Ｐ０７０９３）、２６Ｓプロテアーゼ調節サブユニットＳ１０Ｂ（Ｑ９２５２４）およびＰＣＯＬＮ３（ＸＭ＿０４７５２４）からなる群から選択されるポリペプチドまたは核酸の発現の調節（好ましくは、発現のアップレギュレーション）を検出することによる、個体における第Ｉ群疾患または第Ｉ群疾患に対する感受性（好ましくは湿疹または湿疹に対する感受性）の診断を提供する。からなる群から選択されるポリペプチドまたは核酸
【０６４７】
本発明者らはさらに、トランスグルタミナーゼ１（ＴＧＭ１）（Ｍ９８４４７）、ＴＧＭ２（ＸＭ＿００９４８２）、ＴＧＭ４（ＸＭ＿０５６２０３）、ＴＧＭ７（ＮＭ＿０５２９５５）、ＴＧＭ３（Ｌ１０３８６）、ユビキチン特異的プロテアーゼＵＳＰ２６（ＮＭ＿０３１９０７）、ユビキチン特異的プロテアーゼ（ＵＳＰ２８）（ＮＭ＿０２０８８６）、２６Ｓプロテアーゼサブユニット４（Ｌ０２４２６）、ＬＩＬＲＢ１（ＡＦ００４２３０）、転写のシグナル変換因子／活性化因子１（９１ｋＤａ）（ＳＴＡＴ１）（９７７９３５）、およびプロテアソーム（プロソーム、マクロパイン）サブユニット６（ＰＳＭＡ６）（Ｘ５９４１７）からなる群から選択されるポリペプチドまたは核酸の発現（好ましくは、発現のダウンレギュレーション）を検出することによる、個体における第Ｉ群疾患または第Ｉ群疾患に対する感受性（好ましくは湿疹または湿疹に対する感受性）の診断を提供する。
【０６４８】
実施例Ｄ７．オリゴヌクレオチドアレイを使用して分析されたプロテアーゼ阻害剤遺伝子の湿疹における発現
湿疹患者における様々なプロテアーゼ阻害剤遺伝子の発現が、関与皮膚（湿疹病変皮膚）および湿疹非病変皮膚（湿疹非病変皮膚）および正常な皮膚を使用してアッセイされる。疾患における各遺伝子の発現レベル（関与および非関与）が、正常な皮膚におけるその発現と比較される。
【０６４９】
結果が下記の表Ｄ７．１に示される。記号：＋＋：通常の発現；＋＋＋：強い発現；＋＋＋＋：大きい発現；＋：ダウンレギュレーション。
【表３５−１】
2004524010.tif 000040
【表３５−２】
2004524010.tif 000041
【表３５−３】
2004524010.tif 000042
表Ｄ７．１
【０６５０】
従って、本発明者らは、ｈｂｃ７５０ヒト膵臓小島（Ｔ１１１４１；Ｔ１０９２０）、ＴＩＭＰ−４（ＮＭ＿００３２５６）、ＴＩＭ９ａ（ＡＦ１５０１００）、２型プラスミノーゲン活性化因子阻害剤（Ｌ１９０６６）、多価プロテアーゼ阻害剤ＷＦＩＫＫＮ（ＡＦ４２２１９４）、エピン−１（ＥＰＰＩＮ）（ＡＦ２８６３６８）、エピン−２（ＥＰＰＩＮ）（ＡＦ２８６３６９）、エピン−３（ＥＰＰＩＮ）（ＡＦ２８６３７０）、ｓｐａｒｃ／オステオネクチン（ｃｗｃｖ様ドメインおよびｋａｚａｌ様ドメインのプロテオグリカン［テスティカン］）（ＳＰＯＣＫ）（ＮＭ＿００４５９８）、ＰＩ１２（ＡＨ００９７５６）、ＨＩＶ−１プロテアーゼのＩ型ヒト免疫不全症ウイルス遺伝子（ＡＢ０２０９２３）、分泌型リンタンパク質２（２４ｋＤ）（ＳＰＰ２）（ＮＭ＿００６９４４）、およびサイクリン依存性キナーゼ阻害剤２Ｂ（ｐ１５、ＣＤＫ４を阻害する）（ＣＤＫＮ２Ｂ）（ＮＭ＿００４９３６）からなる群から選択されるポリペプチドまたは核酸の発現の調節（好ましくは、発現のダウンレギュレーション）を検出することによる、個体における第Ｉ群疾患または第Ｉ群疾患に対する感受性（好ましくは湿疹または湿疹に対する感受性）の診断を提供する。
【０６５１】
従って、本発明者らは、ＳＬＰ１（Ｘ０４５０２）、ＳＫＡＬＰ（ＸＭ＿００９５２４；Ｌ１０３４３）、ＣＳＴＡ（ＮＭ＿００５２１３；ＡＡ５７０１９３）、ＳＣＣＡ（Ｓ６６２９６）、ＳＣＣＡ２（Ｕ１９５５７）、１型プラスミノーゲン活性化因子阻害剤（Ｘ０４７２９；Ｘ０４７３１）、ＰＡＩ２（ＡＦ０７１４００）、ＳＥＲＰＩＮＡ５（ＮＭ＿０００６２４）、ＴＩＭＰ（Ｄ１１１３９）、ＴＩＭＰ−１（ＮＭ＿００３２５４）、ＴＩＭＰ−２（ＮＭ＿００３２５５）、ＴＩＭＰ−３（Ｅ１３８８０）、ＴＩＭ９ｂ（ＡＦ１５０１０５）、シスタチンＡ（ＡＡ５７０１９３）、シスタチンＭ／Ｅ（ＮＭ＿００１３２３）、Ｃ１阻害剤（ＳＥＲＰＩＮＧ１）（ＸＭ＿０４６２１８）、プロテアーゼ阻害剤（Ｋｕｎｉｔｚ型２）（ＳＰＩＮＴ２）（ＸＭ＿０３２２８０）、セリンプロテアーゼ阻害剤（Ｋａｚａｌ型４）（ＳＰＩＮＫ４）（ＸＭ＿００５５３９）、プロテイナーゼ阻害剤（ｃｌａｄｅＢ［オバルブミン］）（メンバー９）（ＸＭ＿０５３６４２）、セリン（またはシステイン）プロテイナーゼ阻害剤（ｃｌａｄｅＢ［オバルブミン］）（メンバー６）（ＸＭ＿０４７９８４）、ＫｕｎｉｔｚドメインおよびＷＡＰドメインを有するセリンプロテアーゼ阻害剤様１（エピン）（ＳＰＩＮＬＷ１）（ＮＭ＿０２０３９８）、プロテアーゼ阻害剤（Ｋｕｎｉｔｚ型１）（ＳＰＩＮＴ１）（ＸＭ＿０５６８３６）、ＨＩＶ−１プロテアーゼのＩ型ヒト免疫不全症ウイルス遺伝子（ＡＢ０２０９２４）、組織因子経路阻害剤２（ＴＦＰＩ２）（ＮＭ＿００６５２８）、カテプシンＦ（ＣＴＳＦ）（ＮＭ＿００３７９３）、セリン（またはシステイン）プロテイナーゼ阻害剤（ｃｌａｄｅＡ［α−１抗プロテイナーゼ、アンチトリプシン］）（メンバー６）（ＳＥＲＰＩＮＡ６）（ＮＭ＿００１７５６）、セリン（またはシステイン）プロテイナーゼ阻害剤（ｃｌａｄｅＢ［オバルブミン］）（メンバー３）（ＳＥＲＰＩＮＢ３）（ＮＭ＿００６９１９）、セリン（またはシステイン）プロテイナーゼ阻害剤（ｃｌａｄｅＡ［α−１抗プロテイナーゼ、アンチトリプシン］）（メンバー３）（ＳＥＲＰＩＮＡ３）（ＮＭ＿００１０８５）、ヒトセリン（またはシステイン）プロテイナーゼ阻害剤（ｃｌａｄｅＢ［オバルブミン］）（メンバー１３）（ＸＭ＿００８７４３）、セリン（またはシステイン）プロテイナーゼ阻害剤（ｃｌａｄｅＢ［オバルブミン］）（メンバー５）（ＳＥＲＰＩＮＢ５）（ＸＭ＿００８７４２）、ＲｅｌＡ結合型阻害剤（ＸＭ＿０５７６９３）、ＤＮＡ結合阻害剤１（優性ネガティブなヘリックス−ループ−ヘリックスタンパク質［ＩＤ１］）（ＸＭ＿０４６１７９）、セリン（またはシステイン）プロテイナーゼ阻害剤（ｃｌａｄｅＥ［ネキシン、１型プラスミノーゲン活性化因子阻害剤］）（メンバー）（ＳＥＲＰＩＮＥ１）（ＸＭ＿０５４８５０）、サイクリン依存性キナーゼ阻害剤２Ｂ（ｐ１５、ＣＤＫ４を阻害する）に類似するもの（ＢＣ０１４４６９）、セリン（またはシステイン）プロテイナーゼ阻害剤（ｃｌａｄｅＢ［オバルブミン］）（メンバー７）（ＳＥＲＰＩＮＢ７）（ＸＭ＿００８７４５）、活性化ＳＴＡＴタンパク質ＰＩＡＳｙのタンパク質阻害剤（ＰＩＡＳＹ）��ＮＭ＿０１６１４９）、活性化ＳＴＡＴタンパク質ＰＩＡＳｙのタンパク質阻害剤に類似するもの（ＬＯＣ９５８３０）（ＸＭ＿０１６８６４）、ＰＫＣにより強化されるＰＰ１阻害タンパク質（ＰＰＰ１Ｒ１４Ａ）（ＡＹ０５０６６８）、ＤＮＡ結合阻害剤３（優性ネガティブなヘリックス−ループ−ヘリックスタンパク質［ＩＤ３］）（ＮＭ＿００２１６７）、ＣｌａｄｅＡ（α−１抗プロテイナーゼ、アンチトリプシン）セリン（またはシステイン）プロテイナーゼ阻害剤（ｃｌａｄｅＨ［熱ショックタンパク質４７］）（メンバー１）（ＳＥＲＰＩＮＨ１）（ＮＭ＿００４３５３）、フルピン（セリンプロテアーゼ阻害剤）に対するＰＩ１３遺伝子（ＡＪ２７８７１７）、プロテアーゼ阻害剤５（マスピン）（ＰＩ５）（ＸＭ＿００８７４２）、ＰＡＩ−２（Ａ３２４１５）からなる群から選択されるポリペプチドまたは核酸の発現（好ましくは、発現のアップレギュレーション）を検出することによる、個体における第Ｉ群疾患または第Ｉ群疾患に対する感受性（好ましくは湿疹または湿疹に対する感受性）の診断を提供する。
【０６５２】
実施例Ｄ８．半定量的ＲＴ−ＰＣＲ
表皮からのＲＮＡ抽出
ＲＮＡ抽出を、ＲＮｅａｓｙキット（ＱＩＡＧＥＮ）を使用して製造者の説明書に従って行う。ＲＮＡを、増殖性の分化した角化細胞から、そしてまた正常な表皮ならびに乾癬の病変表皮および非病変表皮から抽出する。定量は、それぞれのサンプルについて、ＲＴの３つの異なる希釈物を使用してＰＣＲを行うことによって行われる。
【０６５３】
正常皮膚および乾癬皮膚および湿疹性皮膚におけるコルネオデスモソームおよびプロテアーゼおよびプロテアーゼ阻害剤のＲＴ−ＰＣＲ
コルネオデスモソームおよびプロテアーゼおよびプロテアーゼ阻害剤の様々な遺伝子の発現レベルを、正常皮膚および乾癬皮膚および湿疹性皮膚（関与および非関与）に対するＲＴ−ＰＣＲによってアッセイする。個体から得られた関与皮膚および非関与皮膚における発現レベルが、正常な非疾患皮膚における対応する発現レベルと比較される。アッセイされたコルネオデスモソームおよびプロテアーゼおよびプロテアーゼ阻害剤の遺伝子は、それぞれ、表Ｄ２．１および表Ｄ５．１、表Ｄ３．１および表Ｄ６．１、ならびに表Ｄ４．１および表Ｄ７．１に示される遺伝子である。
【０６５４】
結果
ＲＴ−ＰＣＲの結果は、大まかには、上記の実施例において詳しく記載されるような発現の変化を示している。従って、オリゴヌクレオチドアレイによってアッセイされた、コルネオデスモソームおよびプロテアーゼおよびプロテアーゼ阻害剤の様々な遺伝子の発現レベル研究の結果が、発現したメッセージのレベルを直接アッセイすることによって確認される。
【０６５５】
実施例Ｅ：処置
実施例Ｅ１．テープストリップを使用してアッセイされるコレネオデスモソーム密度
透過電子顕微鏡観察用のテープストリップの調製
テープストリップを、Ｇｕｅｒｒｉｎら（１９９８）によって記載される方法に従って得る。
【０６５６】
湿疹、乾癬、皮膚炎および乾癬の皮膚状態に罹患している患者とともに、コントロール患者から得られたテープストリップの小片を、カルノフスキー固定液（２％パラホルムアルデヒド、２．５％グルタルアルデヒドを含む０．１Ｍリン酸塩緩衝液、ｐＨ７．４）において４℃で２時間固定する。その後、サンプルを、１０％スクロースを含有する０．１Ｍリン酸塩緩衝液（ｐＨ７．４）において、３回、それぞれ３０分間、４℃で洗浄する。
【０６５７】
二次固定を２％四酸化オスミウム水溶液において室温で１時間行う。脱水を室温において段階的なエタノール系列によって行う（７５％エタノールで１５分間；９５％エタノールで１５分間；１００％エタノールで１５分間の洗浄を２回；無水硫酸銅で乾燥した１００％エタノールで１５分間）。
【０６５８】
樹脂包埋のために、サンプルを最初に中間溶媒のプロピレンオキシドに入れ、１５分間ずつ２回交換する。この後、プロピレンオキシド：アラルダイト樹脂の５０：５０混合物における浸潤を室温で一晩行う。サンプルを室温で１００％濃度のアラルダイト樹脂に６時間〜８時間入れる。生検物を新しいアラルダイト樹脂に６０℃で４８時間包埋する。包埋用のアラルダイト樹脂は、ＣＹ２１２アラルダイト：ドデセニルコハク酸無水物（ＤＤＳＡ）硬化剤の５０：５０混合物および１ｍｌの樹脂混合物あたり１滴のｎ−ベンジルジメチルアミン（ＢＤＭＡ）促進剤からなった。
【０６５９】
超薄切片（７０ｎｍ〜９０ｎｍ）をウルトラミクロトームで切断する。切片を３％酢酸ウラニル／５０％エタノールで５分間染色し、その後、レイノルズクエン酸鉛で２分間染色する。切片を、Ｐｈｉｌｉｐｓ  ＣＭ１０透過電子顕微鏡を８０Ｋｖの加速電圧で使用して調べる。電子顕微鏡写真をＡｇｆａ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ２３Ｄ５６ＥＭフィルムに記録する。
【０６６０】
コルネオデスモソーム密度（顕微鏡写真の総面積により除されたコルネオデスモソーム占有面積）を各状態のテープストリップの電子顕微鏡写真において測定する。
【０６６１】
プロテアーゼによる患者角質層の処理
正常な角質層および疾患状態の角質層に由来する３ｘ３ｍｍのテープストリップを１０ｘ濃縮タンパク質分解緩衝液（１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．２）、０．１５ＭのＮａＣｌ）中で２２ｎＭ〜５０ｎＭの組換えＳＣＣＥまたは組換えＳＣＴＥとともに３７℃で１時間〜６時間インキュベーションする。反応を停止させ、そして上記に記載されるように、ストリップを、コルネオデスモソームを計数するための電子顕微鏡分析のために固定する。
【０６６２】
結果
この実験の結果が図１３に示される。
【０６６３】
乾癬患者およびざ瘡患者の上部角質層におけるコルネオデスモソーム密度は、正常な皮膚と比較した場合、著しく増大している。皮膚炎患者および湿疹患者の角質層におけるコルネオデスモソーム密度は著しく低下している。
【０６６４】
実施例Ｅ２．プロテアーゼによる乾癬皮膚由来のテープストリップの処理
正常者および乾癬者に由来するテープストリップを得て、上記に記載されるように処理する。コルネオデスモソーム密度を上記のようにアッセイする。
【０６６５】
結果
この実験の結果が図１４に示される。
【０６６６】
コルネオデスモソームの数が、非処理の角質層と比較した場合、処理された角質層では著しく減少していることが見出される。これらの実験により、コルネオデスモソームの数とＳＣＣＥまたはＳＣＴＥによるタンパク質分解との間には直接的な関係が存在することが明らかにされる。
【０６６７】
考察
プロテアーゼ（例えば、ＳＣＣＥ／ＳＣＴＥ）を使用して、本発明者らは、増大した皮膚バリア（すなわち、第ＩＩ群疾患）を有する患者の角質層におけるコルネオデスモソームの数の減少を明らかにしている。従って、本発明者らは、角質層の接着が増大した患者において正常な皮膚バリアの形成を促進させるための新しい処置を提案する。
【０６６８】
実施例Ｅ３．プロテアーゼによる乾癬患者由来の皮膚生検物の処理
募集
乾癬患者がＲｏｙａｌ  Ｈａｌｌａｍｓｈｉｒｅ  Ｈｏｓｐｉｔａｌの皮膚科学診療科を介して確認され、集められた。患者は、年齢が４０歳を越え、明白な活動性乾癬を有し、かつ全身的な抗乾癬剤を服用していない場合に選ばれる。リウマチ熱または人工心臓弁置換または人工関節置換の病歴を有する患者は自動的に除かれる。完全な文書化されたインフォームドコンセントがＭＲＥＣ承認（ＭＲＥＣ／９８／４／０１８）とともに各患者から得られている。生検部位の局所的処置は手法の２週間前から省略される。
【０６６９】
手法
すべての生検は手術室において皮膚科医によって行われる。無菌技術が用いられ、そして滅菌／使い捨て器具が手法中を通して使用される。２つの皮膚生検物が各患者の下部背中から採取される。１つは活動性の斑乾癬の領域からであり、もう１つは少なくとも１０ｃｍ離れた非関与部位からである。下部背中は無菌溶液で清浄化され、局所麻酔が生検の意図された領域に導入される。約１．５ｃｍｘ０．５ｃｍの楕円部を病変皮膚および非病変皮膚の両方から切除して、ＰＢＳ溶液を含む容器に入れる。傷部は、深部縫合のためにカットグートを使用して、そして表面付近の縫合のためにエチロンを使用して縫合される（傷あたり２針または３針を用いる）。手術後、傷部を滅菌包帯で覆い、患者を３０分間観察し、その後、帰宅させる。縫合糸は２週間後に抜糸される。
【０６７０】
プロテアーゼ処理
下記の手法が無菌条件のもとで行われる。乾癬皮膚生検物を、滅菌メスを使用して２片に切る。生検物の一方の半分を２４ウエルプレートの１つのウエルにおいて２ｍｌの０．２５％キモトリプシン（皮膚維持培地（Ｓｋｉｎｅｔｈｉｃ）に１０ｘストック液から希釈したもの）に入れる。もう一方の半分を、何も添加されていない維持培地の２ｍｌでインキュベーションする。ウエルプレートを３７℃で１６時間インキュベーションする。その後、両方の生検物セグメントを、下記のような電子顕微鏡観察のために、ＰＢＳで２回交換しながら洗浄して、固定する。
【０６７１】
電子顕微鏡観察のための加工
皮膚生検物サンプルをカルノフスキー固定液（２％パラホルムアルデヒド、２．５％グルタルアルデヒドを含む０．１Ｍリン酸塩緩衝液、ｐＨ７．４）において４℃で２時間固定する。その後、サンプルを、１０％スクロースを含有する０．１Ｍリン酸塩緩衝液（ｐＨ７．４）において、３回、それぞれ３０分間、４℃で洗浄する。
【０６７２】
二次固定を２％四酸化オスミウム水溶液において室温で１時間行う。脱水を室温において段階的なエタノール系列によって行う（７５％エタノールで１５分間；９５％エタノールで１５分間；１００％エタノールで１５分間の洗浄を２回；無水硫酸銅で乾燥した１００％エタノールで１５分間）。
【０６７３】
樹脂包埋のために、サンプルを最初に中間溶媒のプロピレンオキシドに入れ、１５分間ずつ２回交換する。この後、プロピレンオキシド：アラルダイト樹脂の５０：５０混合物における浸潤を室温で一晩行う。サンプルを室温で１００％濃度のアラルダイト樹脂に６時間〜８時間入れる。生検物を新しいアラルダイト樹脂に６０℃で４８時間包埋する。包埋用のアラルダイト樹脂は、ＣＹ２１２アラルダイト：ドデセニルコハク酸無水物（ＤＤＳＡ）硬化剤の５０：５０混合物および１ｍｌの樹脂混合物あたり１滴のｎ−ベンジルジメチルアミン（ＢＤＭＡ）促進剤からなった。
【０６７４】
超薄切片（７０ｎｍ〜９０ｎｍ）をウルトラミクロトームで切断する。切片を３％酢酸ウラニル／５０％エタノールで５分間染色し、その後、レイノルズクエン酸鉛で２分間染色する。切片を、Ｐｈｉｌｉｐｓ  ＣＭ１０透過電子顕微鏡を８０Ｋｖの加速電圧で使用して調べる。電子顕微鏡写真をＡｇｆａ  Ｓｃｉｅｎｔｉａ２３Ｄ５６ＥＭフィルムに記録する。
【０６７５】
結果
結果が、図１５、図１６、図１７および図１８に示される。
【０６７６】
図１５には、未処理の乾癬生検物が示される。図１６には、０．２５％キモトリプシンで１６時間処理された乾癬生検物は角質細胞層の分裂（棘細胞離開）を生じさせることが示される。これは、キモトリプシンによるコルネオデスモソームの分解によって生じる。図１７には、未処理の乾癬生検物（角質層）の断面が示される。多数のコルネオデスモソームを認めることができるが、これらの一部が白矢印によって示される。図１８には、０．２５％キモトリプシンで１６時間処理された乾癬生検物の角質層では、はるかに少数のコルネオデスモソームがプロテアーゼ処理の後に認められ得ること（実線の白矢印）が示される。分解されたコルネオデスモソームの残骸もまたいくつか認めることができる（破線の白矢印）。
【０６７７】
考察
キモトリプシンで処理された乾癬病変生検物とコントロール（未処理の病変乾癬皮膚）とを比較したとき、キモトリプシンで処理されたサンプルでは表皮細胞層の分裂（棘細胞離開）が顕著である。これは、角質層の下部部分の内部に、そして角質層と生存表皮との接合部に存在する。皮膚バリアの破壊を、バリア機能が増大した疾患（すなわち、第ＩＩ群疾患）、例えば、乾癬（本明細書に詳しく記載されるように）およびざ瘡を処置するために使用することができる。
【０６７８】
実施例Ｅ４．プロテアーゼによる皮膚等価物の処理
材料
再構成されたヒト表皮培養物および維持培地をＳｋｉｎｅｔｈｉｃ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｎｉｃｅ）から購入する。キモトリプシンをＳｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓから購入する。
【０６７９】
方法
１ｍｌの室温のＳｋｉｎＥｔｈｉｃ維持培地を６ウエル組織培養プレートの各ウエルに加える（皮膚等価物あたり１つのウエル）。皮膚等価物を含有する細胞培養挿入物を、滅菌メスを使用してアガロース輸送培地から除き、そして気泡を形成させることなくウエルに入れる。ウエルプレートを、３７℃、５％ＣＯ２の加湿インキュベーターに入れる。２４時間後、培地を交換して、適切な処理が加えられる。２００μｌの各処理液が下記のように皮膚等価物の表面に加えられる。コントロール−緩衝化塩溶液；１０％ウシ胎児血清；０．２５％キモトリプシン；６μＭのペプチド６４３。
【０６８０】
すべての試薬は、下記の成分を１リットルに含む緩衝化塩溶液（ｐＨ７．４）において正しい濃度に作製される。０．１４２ｇのＮａ２ＨＰＯ４、１．８０２ｇのグルコース、７．１４９ｇのＨＥＰＥＳ、０．２２４ｇのＫＣｌ、７．５９７ｇのＮａＣｌ。
【０６８１】
処理は、３７℃で１６時間にわたって培養物に対して作用させられる。
【０６８２】
光学顕微鏡観察のための加工
皮膚等価物および膜を、メスを使用して細胞培養挿入物から切断する。等価物を１０％ホルマリン（３．７％ホルムアルデヒド）／リン酸塩緩衝化生理的食塩水において４℃で２４時間固定する。サンプルを、ＰＢＳを３回交換して洗浄する。ＰＢＳをサンプルからデカンテーションにより除き、その後、サンプルを、７５％エタノール中で５分間ずつ３回の交換、９５％エタノール中で５分間ずつ２回の交換、そして１００％エタノール中で５分間ずつ２回の交換で脱水する。その後、サンプルをキシレンに５分間入れ、その後、溶融パラフィンに入れて５分間浸潤させる。サンプルをそれぞれの工程のときに時々ゆする。その後、等価物を包埋用鋳型においてより多くの溶融パラフィン内に整列させて、１時間硬化させる。
【０６８３】
５μｍの切片を各ブロックから得て、ガラス製顕微鏡スライドガラスに集める。スライドガラスを５０℃で一晩乾燥させる。
【０６８４】
組織学のためのヘマトキシリン染色およびエオシン染色
スライドガラスをラックに固定して、キシレンに入れ、５分間の洗浄を２回行い、望ましくないパラフィンを除く。その後、スライドガラスを、１００％エタノールに２回、９５％エタノールに１回、７０％エタノールに１回、それぞれ５分間入れることによって再水和させる。その後、スライドガラスを流水で１分間洗浄する。染色をＧｉｌｌヘマトキシリンで（２分間）行い、続いて水で２分間洗浄し、その後、１％エオシンに５分間浸け、そして水で簡単に洗浄する。サンプルを、７０％エタノールに３０秒間、９５％エタノールに３０秒間、そしてそれぞれ１分間および２分間の２回の交換を行いながら１００％エタノールに入れることによってもう一度脱水する。その後、スライドガラスをキシレンに１分間入れ、その後、顕微鏡観察のためにＤＰＸマウンタントでカバーガラスを固定する。
【０６８５】
スライドガラスを、４０倍の対物レンズを使用して光学顕微鏡で調べ、典型的な像を、Ｓｙｎｏｐｔｉｃｓ  Ａｃｑｕｉｓ  Ｐｒｏを使用してＰＣに取り込む。
【０６８６】
結果
キモトリプシン（０．２５％）は角質層のバリアを分解する。層は「より緩く」なっているようであり、生存細胞層から離れ始めている。従って、キモトリプシンはコルネオデスモソームを分解することが示される。
【０６８７】
類似する作用が、皮膚等価物をＳＣＣＥまたはＳＣＴＥで処理したときに認められる。従って、キモトリプシン、ＳＣＣＥおよびＳＣＴＥなどのプロテアーゼは、角質層の厚さが増大しているとき、乾癬およびざ瘡などの疾患を処置するために使用することができる。ここで示されたこれらの酵素は、細胞層と接触しているコルネオデスモソームを分解することによって角質層バリアの厚さを低下させる。
【０６８８】
実施例Ｅ５．ＳＬＰＩプロテアーゼ阻害剤ペプチドによる皮膚等価物の処理
材料
１７日目の再構成ヒト表皮培養物および維持培地をＳｋｉｎｅｔｈｉｃ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｎｉｃｅ）から購入する。ＮＵＮＣ組織培養プラスチック器具をＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから得る。
【０６８９】
皮膚バリアの形成において重要なタンパク質の様々な領域に対応する多数のペプチドを、標準的な技術を使用して合成する。これらのペプチドは下記の表Ｅ５．１に示される通りである。
【０６９０】
ペプチド６４３、ペプチド６５１およびペプチド６５３は、同じタンパク質（ＳＬＰＩ）の異なる領域に対応する。腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）およびインターロイキン−１β（ＩＬ−１β）はＣａｌｂｉｏｃｈｅｍから購入される。
【表３６】
2004524010.tif 000043
表Ｅ５．１
【０６９１】
方法
１ｍｌの室温のＳｋｉｎＥｔｈｉｃ維持培地を６ウエル組織培養プレートの各ウエルに加える（皮膚等価物あたり１つのウエル）。皮膚等価物を含有する細胞培養挿入物を、滅菌メスを使用してアガロース輸送培地から除き、そして気泡を形成させることなくウエルに入れる。ウエルプレートを、３７℃、５％ＣＯ２の加湿インキュベーターに入れる。２４時間後、培地を交換して、適切な処理が加えられる。
【０６９２】
すべての試薬は、下記の成分を１リットルに含む緩衝化塩溶液（ｐＨ７．４）において正しい濃度に作製される。０．１４２ｇのＮａ２ＨＰＯ４、１．８０２ｇのグルコース、７．１４９ｇのＨＥＰＥＳ、０．２２４ｇのＫＣｌ、７．５９７ｇのＮａＣｌ。
【０６９３】
２００μｌの下記の処理液が皮膚等価物の表面に加えられる。（１）コントロール−緩衝化塩溶液；（２）６μＭのペプチド６４１；（３）６μＭのペプチド６４２；（４）６μＭのペプチド６４３；（５）６μＭのペプチド６５１；（６）６μＭのペプチド６５３。
【０６９４】
下記の処理液は、培地交換のときに、ストック溶液（１０μｇ／ｍｌのＴＮＦ−α、１μｇ／ｍｌのＩＬ−１β）から、直接、１ｍｌの培地に希釈され、ウエルに加えられる。（７）２．５ｎｇ／ｍｌのＴＮＦ−α；および（８）７５ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１β。
【０６９５】
処理は、３７℃で１６時間にわたって培養物に対して作用させられる。
【０６９６】
結果
結果が図１９〜図２５に示される。
【０６９７】
血清には、トリプシンおよびキモトリプシンの阻害剤を含む多数のプロテアーゼ阻害剤が含有される。皮膚等価物に加えたとき、１０％血清は、角質層の厚さを増大させることが認められる。
【０６９８】
図１９は、６μＭのペプチド６４１の添加により、角質層がより透過性になることを示す。
【０６９９】
図２０は、６μＭのペプチド６４２の添加により、角質層がより透過性になることを示す。
【０７００】
図２１は、より顕著な作用が、ペプチド６４３を皮膚培養物に添加した後に認められることを示す。このペプチドはＳＬＰＩの短い領域を模倣する。その短い長さ（７アミノ酸）のために、このペプチドは、ＳＣＣＥおよびＳＣＴＥを含むプロテアーゼ酵素がこのペプチドによって特異的に阻害される角質層に浸透することができる。観測された全体的な作用は角質層の肥厚化であり、従って、増大した皮膚バリアである。
【０７０１】
図２２は、６μＭのペプチド６５１（ＳＬＰＩ）の添加により、角質層の厚さの増大、従って、増大した皮膚バリアが生じることを示す。
【０７０２】
図２３は、６μＭのペプチド６５３（ＳＬＰＩ）の添加により、角質層の厚さの増大、従って、増大した皮膚バリアが生じることを示す。
【０７０３】
従って、プロテアーゼ阻害剤およびそのフラグメントは、損なわれた皮膚バリア機能を含む症状を有する疾患（例えば、皮膚炎、湿疹）に対する新しい処置を提供する。本明細書に含まれるこれらの新規なペプチドは、それらの小さいサイズおよび浸透性ならびに皮膚バリア機能を改善することに対するそれらの効果のために、皮膚バリアが不完全な皮膚障害に対する処置として使用することができる。
【０７０４】
図２４は、２．５ｎｇ／ｍｌのＴＮＦ−αの添加により、角質層の厚さの増大、従って、増大した皮膚バリアが生じることを示す。
【０７０５】
図２５は、２．５ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１βの添加により、角質層の厚さの増大、従って、増大した皮膚バリアが生じることを示す。
【０７０６】
考察
ペプチド６４１およびペプチド６４２はデスモコリンおよびデスモプラキン（角質層における細胞密着に関与する細胞構造体であるコレネオデスモソームのタンパク質成分の２つ）の領域を模倣する。ペプチド６４１およびペプチド６４２は、落屑時の切断に関与するタンパク質の領域を模倣する。
【０７０７】
皮膚等価物がこれらのペプチドで処理されたとき、皮膚バリアの組織構造が変化し、透過性が大きくなるようであった。従って、ペプチド６４１およびペプチド６４２は、増大した角質層密着を含む症状を有する疾患（例えば、乾癬およびざ瘡、すなわち、任意の第ＩＩ群疾患）に対する新しい処置として使用することができる。
【０７０８】
従って、本発明者らは、個体における第ＩＩ群疾患（好ましくは乾癬および／またはざ瘡）を処置または防止する方法で、接着タンパク質またはそのフラグメントを個体に投与することを含む方法を提供する。好ましくは、デスモコリンのフラグメントまたはデスモプラキンのフラグメントが投与される。より好ましくは、ペプチド６４１および／またはペプチド６４２の配列を含むフラグメントが投与される。
【０７０９】
ペプチド６４３、ペプチド６５１およびペプチド６５３を皮膚等価物に添加したとき、角質層の厚さの増大が認められる。これらのペプチドは、角質層キモトリプシン酵素および角質層トリプシン酵素（それぞれ、ＳＣＣＥおよびＳＣＴＥ）のプロテアーゼの阻害剤であるＳＬＰＩの領域を模倣するように設計されている。これらの酵素は角質層におけるデスモソームを分解し、従って細胞密着を低下させる。角質層の厚さの増大は、ペプチド６４３、ペプチド６５１およびペプチド６５３がそのようなプロテアーゼを阻害していることを示す。最も顕著な効果が、ペプチド６４３を皮膚培養物に添加した後に認められる。このペプチドはＳＬＰＩの短い領域を模倣する。その短い長さ（７アミノ酸）のために、このペプチドは、おそらくは、ＳＣＣＥおよびＳＣＴＥのプロテアーゼ酵素がこのペプチドにより特異的に阻害される角質層に浸透することができる。
【０７１０】
ＴＮＦａおよびＩＬ−１βもまた、ＳＬＰＩなどのプロテアーゼ阻害剤の活性化因子であるので、湿疹および皮膚炎などの、接着が低下した疾患を処置するために使用することができる。
【０７１１】
従って、本発明者らは、個体における第Ｉ群疾患（好ましくは湿疹および／または皮膚炎、より好ましくはアトピー性湿疹および／または疱疹状皮膚炎）を処置または防止する方法で、プロテアーゼ阻害剤またはそのフラグメントを個体に投与することを含む方法を提供する。好ましくは、ＳＬＰＩのフラグメントが投与される。より好ましくは、ペプチド６４３および／またはペプチド６５１および／またはペプチド６５３の配列を含むフラグメントが投与される。
【０７１２】
ＳＬＰＩの阻害作用を模倣する、ＳＬＰＩのＧｅｎＢａｎｋ配列（Ｘ０４５０２）に由来するペプチドの完全なリストは下記の通りである。ＣＧＫＳ（ＳＢ７ａ）およびＣＧＫＳＣＶＳＰＶＫＡ（ＳＢ７ｂ）、ＫＩＩＤＧＡ、ＧＤＫＩＩＤＧＡ、ＧＤＫＩＩＤ、ＫＩＩ、ＫＩＩＤ、ＫＩＩＤＧ、ＫＩＩＤＧＡ、ＬＤＰＶＤ（６５１）、ＫＲＤＬＫ（６５２）、ＬＤＰＶＤＴＰＮＰ（６５３）、ＬＤＰＶＤＴＰＮＰＴＲＲＫＰＧ（６５４）、ＣＧＫＳＣＶＳＰＶＫＡ（６４４）、ＣＶＳＰＶＫＡ（６４３）。従って、これらのペプチドのいずれかを、第Ｉ群疾患の処置または防止において使用することができる。
【０７１３】
実施例Ｅ６．他のプロテアーゼ阻害剤による皮膚等価物の処理
方法
皮膚等価物（＋阻害剤および−阻害剤）を阻害剤とともに２４時間培養する。皮膚等価物の組織学切片を調製する。その後、切片を光学顕微鏡および電子顕微鏡によって分析する。
【０７１４】
ＳＬＰＩ
ＳＬＰＩ（５００ｎＭ）を培養された皮膚等価物に加え、２４時間培養する。皮膚等価物（＋ＳＬＰＩおよび−ＳＬＰＩ）の切片を調製する。その後、切片を光学顕微鏡および電子顕微鏡において分析する。
【０７１５】
ＳＬＰＩによる処理は、角質層の厚さを増大させること、そして皮膚バリアを増強させることが認められる。従って、ＳＬＰＩは、湿疹および皮膚炎などの任意の第Ｉ群疾患を処置するために使用することができる。
【０７１６】
抗ＳＣＣＥ抗体
ＳＣＣＥ抗体を培養された皮膚等価物に加え、２４時間培養する。ヒト等価物（＋ＳＣＣＥ抗体および−ＳＣＣＥ抗体）の切片を調製する。その後、切片を光学顕微鏡および電子顕微鏡において分析する。
【０７１７】
抗ＳＣＣＥ抗体による処理は、角質層の厚さを増大させること、そして皮膚バリアを増強させることが認められる。従って、抗ＳＣＣＥ抗体は、湿疹および皮膚炎などの任意の第Ｉ群疾患を処置するために使用することができる。
【０７１８】
抗ＳＣＴＥ抗体
ＳＣＴＥ抗体を培養された皮膚等価物に加え、２４時間培養する。皮膚等価物（＋ＳＣＴＥ抗体および−ＳＣＴＥ抗体）の切片を調製する。その後、切片を光学顕微鏡および電子顕微鏡において分析する。
【０７１９】
抗ＳＣＴＥ抗体による処理は、角質層の厚さを増大させること、そして皮膚バリアを増強させることが認められる。従って、抗ＳＣＴＥ抗体は、湿疹および皮膚炎などの任意の第Ｉ群疾患を処置するために使用することができる。
【０７２０】
実施例Ｅ７．プロテアーゼ阻害剤による湿疹罹患者の処置
方法
ＳＬＰＩプロテアーゼ阻害剤を志願者の正常なヒト皮膚から抽出する。あるいは、個体由来のプロテアーゼ阻害剤をコードする核酸配列を、ＰＣＲまたはライブラリースクリーニングによってクローン化する。個体のプロテアーゼ阻害剤配列を発現ベクターにクローン化し、そして従来の方法および知られている方法を使用して、組換えプロテアーゼ阻害剤を発現させ、精製する。
【０７２１】
その後、阻害剤を皮膚軟化クリーム基剤に配合する。この配合物の２回分の指先量を、志願者の腕における皮膚領域（２ｘ２ｃｍの大きさ）に塗布する。この領域を、綿包帯で所定位置に固定されたプラスチックカプセルで覆う。クリームが、１４日間連続して毎日、同じ領域に再び塗布される。
【０７２２】
１４日目にキャップを除き、１ｘ０．５ｃｍの楕円皮膚生検物を処置領域から採取し、そして類似する生検物が反対側の腕の非処置領域から採取される。
【０７２３】
結果
コントロールと比較された処置生検物の組織学的検査により、角質層の肥厚が、角質層の表面部分における緩く接着した鱗片とともに明らかにされる。これは乾癬斑の上部部分の特徴を連想させる。成長可能な表皮内には錯角化および肥厚が見られる。これらの特徴もまた、乾癬病変において見られる特徴に類似する。
【０７２４】
考察
従って、ＳＰＬＩプロテアーゼ阻害剤の添加に応答する皮膚の肥厚は、損なわれた皮膚バリア機能を含む症状を有する疾患（例えば、湿疹、皮膚炎）に対する有用な処置であることを示している。
【０７２５】
実施例Ｆ：トランスジェニック生物
実施例Ｆ１．コルネオデスモシンを過剰発現するトランスジェニックマウス
本発明者らは、皮膚バリアが異常なトランスジェニックマウスを作製するために、コルネオデスモシン遺伝子をマウスにおいて過剰発現させた。
【０７２６】
コルネオデスモシンフラグメントの作製
ｃＤＮＡを、５’ＵＴＲおよびＯＲＦ全体および３’ＵＴＲを含有する、フォワード５’ｃｃｇｔｇｃａｇｔｃｃｇａｇａｔｇ３’およびリバース５’ｇａｔａｔａｇｔｇｔａｔｇｔｇｃｔｔｇ３’を含むプライマー組を使用して、表皮から単離されたｍＲＮＡから作製する。ＰＣＲ産物（１６５９ｂｐ）を（上記に記載されるように）精製する。精製された生成物は、修飾プライマーを使用するテンプレートとして使用される。これらのプライマーはその５’末端にＮｏｔＩ部位を含有する。
【０７２７】
ＰＣＲ産物を１％アガロースゲルから精製して、ＮｏｔＩ制限酵素と３７℃で４時間インキュベーションする。消化された生成物をインボルクリン発現カセットに挿入して、トランスジーンフラグメントを元のプラスミドから切り出し、精製する。精製されたフラグメントは、卵母細胞への注入のために、滅菌ＰＢＳに５ｍｇ／ｍｌの濃度で懸濁される。
【０７２８】
インボルクリン発現カセット
インボルクリン発現カセットには、Ｃａｒｒｏｌｌら（１９９３および１９９６）によって記載されるように、３．７ｋｂのインボルクリン配列（２．５ｋｂのインボルクリンプロモーター）、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）イントロン、およびＳＶ４０ポリアデニル化配列が含まれる。簡単に記載すると、−２５００から＋１２４０までの３７４０ｂｐのＨｉｎｄＩＩＩフラグメント（数字は転写開始部位（＋１）の上流方向（−）および下流方向（＋）のその配列距離に基づく）は、遠位領域、近位領域ＴＡＴＡＡ、第１エキソン、そして第１イントロンのドナー部位とアクセプター部位とを含むインボルクリン遺伝子の第１イントロンを含有する（Ｃａｒｒｏｌｌら、１９９３）。
【０７２９】
動物の表現型
コルネオデスモシンを過剰発現するマウスは、鱗片状表面を有する肥厚した皮膚を有する。これらの特徴は、四肢、耳および頭において非常に顕著である。病変皮膚の組織学により、底部で細長く、棍棒状になった表皮隆起部の棘細胞離開が明らかにされる。錯角化および過角化もまた表皮内に見られる。角質層は、鱗片状表面を伴って肥厚している。これらの特徴は、乾癬皮膚において見られるいくつかの変化に類似している。
【０７３０】
広汎性脱毛がコルネオデスモシンマウスにおいて発生する。これは、２ヶ月後に、より明らかになる。
【０７３１】
組織学および免疫組織化学
性別および身体部位に従って一致させたトランスジェニックマウスおよびトランスジーン陰性マウスに由来する組織がすべての組織研究のための使用される。組織学的分析のために、組織をホルモール−生理的食塩水において一晩固定し、パラフィンに包埋し、切片化して、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色する。クロロアセタートエステラーゼが、好中球に対する組織化学マーカーとして使用される。ＴＵＮＥＬが正常マウスおよびトランスジェニックマウスのパラフィン切片に対して行われる（Ｃａｒｒｏｌｌら（１９９５）を参照のこと）。皮膚は厚く、マウスの背側皮膚の組織学切片は表皮の厚さの著しい増大を示している。皮膚バリアは、乾癬皮膚において認められるように、これらの動物では増強されている。
【０７３２】
免疫組織化学が、マウスコルネオデスモシンに対して特異的な抗体（１：４０希釈）を用いて行われる。一次抗体が、アビジンＤＨおよびビオチン化染色システム（Ｖｅｃｔａｓａｔａｉｎ  ＡＢＣキット、米国）を使用して二次抗体によって検出される。染色は、一致するコントロールと比較したとき、トランスジェニック動物の皮膚におけるコルネオデスモシンの発現が大きいことを示している。コルネオデスモシンのこの過剰発現は、トランスジェニック動物の皮膚の基底上部層において主に見られる。
【０７３３】
実施例Ｆ２．ＳＣＣＥを過剰発現するトランスジェニックマウス
本発明者らは、重度の異常な（欠陥）皮膚バリアを有するトランスジェニックマウスを作製するために、ＳＣＣＥをマウスにおいて過剰発現させた。
【０７３４】
種々のＳＣＣＥハプロタイプを、５’ＵＴＲおよびＯＲＦ全体および３’ＵＴＲを含有する、フォワード（５’から３’に）ＣＧＧＧＣＴＣＣＡＴＧＧＣＡＡＧＡＴＣおよびリバース（５’から３’に）ＧＣＧＴＣＣＴＣＡＣＴＣＣＴＧＴＧＣを含むプライマー組を使用して、疾患表皮に由来するＲＮＡを使用して増幅する。ＰＣＲ産物を（上記に記載されるように）精製する。精製された生成物は、修飾プライマーを使用するテンプレートとして使用される。これらのプライマーはその５’末端にＮｏｔＩ部位を含有する。ＰＣＲ産物を１％アガロースゲルから精製して、ＮｏｔＩ制限酵素と３７℃で４時間インキュベーションする。消化された生成物をインボルクリン発現カセットに挿入して、トランスジーンフラグメントを元のプラスミドから切り出し、精製する。精製されたフラグメントは、卵母細胞への注入のために、滅菌ＰＢＳに５ｍｇ／ｍｌの濃度で懸濁される。
【０７３５】
動物の表現型
ＳＣＣＥを過剰発現する成体マウスは皮膚バリアにおける様々な異常を有する。ＳＣＣＥを層上部において過剰発現する動物は広範囲にわたる皮膚の水疱形成を示す。皮膚バリアの欠陥が、ＳＣＣＥの非疾患対立遺伝子を過剰発現する動物と比較した場合、これらの動物ではより顕著である。
【０７３６】
組織学および免疫組織化学
トランスジェニックマウスおよびトランスジーン陰性マウスに由来する組織を、上記に記載されるように一致させ、処理する。
【０７３７】
皮膚は厚く、マウスの背側皮膚の組織学切片は表皮の厚さの著しい増大を示している。皮膚バリアは、湿疹性皮膚で認められるように、これらの動物では損なわれている。
【０７３８】
皮膚バリアの欠陥を有するマウスにおける水疱の組織学は、表皮の表面層における細胞接着の喪失を示している。
【０７３９】
免疫組織化学が、マウスＳＣＣＥに対して特異的な抗体（１：４０希釈）を用いて行われる。一次抗体が、アビジンＤＨおよびビオチン化染色システム（Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ  ＡＢＣキット、米国）を使用して二次抗体によって検出される。染色は、一致するコントロールと比較したとき、トランスジェニック動物の皮膚におけるＳＣＣＥの発現が大きいことを示している。ＳＣＣＥのこの過剰発現は、トランスジェニック動物の皮膚の基底上部層において主に見られる。
【０７４０】
基底上部層においてＳＣＣＥを過剰発現する動物は、乾燥した薄片状の皮膚を有する。皮膚の組織化学的検査により、表皮の分裂が明らかにされる。この棘細胞離開は、キモトリプシンで処理された皮膚等価物培養物で見られる棘細胞離開と類似している（本研究における処置の節を参照のこと）。分裂は、顆粒層内、顆粒層と棘層との間、および角質化層と顆粒層との間において生じる。分裂はまたは角質層内にも存在する。
【０７４１】
ＳＣＣＥトランスジェニック（＋／＋）マウスの表皮は同腹子の表皮よりも厚くなっている。この肥厚はすべての身体部位で見出される。本発明者らは、色素浸透アッセイ（Ｈａｒｄｍａｎら、１９９８；Ｍａｒｓｈａｌｌら、２０００）を使用して、ＳＣＣＥトランスジェニックマウスにおける表皮バリアの一体性を試験した。ＳＣＣＥの＋／＋トランスジェニックマウスは多数の暗点を示しており、これはバリア機能の局在的な喪失を示している。
【０７４２】
実施例Ｆ３．ＳＬＰＩを過剰発現するランスジェニックマウス
ｃＤＮＡを、５’ＵＴＲおよびＯＲＦ全体および３’ＵＴＲを含有する、フォワード５’ｃｔｃｃｔｇｃｃｔｔｃａｃｃａｔｇａａｇ３’およびリバース５’ｃａｇａｇｃｃｔｃｃｔｃｃａｔａｔｇ３’を含むプライマー組を使用して、表皮から単離されたｍＲＮＡから作製する。ＰＣＲ産物を（上記に記載されるように）精製する。
【０７４３】
精製された生成物は、修飾プライマーを使用するテンプレートとして使用される。これらのプライマーはその５’末端にＮｏｔＩ部位を含有する。ＰＣＲ産物を１％アガロースゲルから精製して、ＮｏｔＩ制限酵素と３７℃で４時間インキュベーションする。消化された生成物をインボルクリン発現カセットに挿入して、トランスジーンフラグメントを元のプラスミドから切り出し、精製する。精製されたフラグメントは、卵母細胞への注入のために、滅菌ＰＢＳに５ｍｇ／ｍｌの濃度で懸濁される。
【０７４４】
動物の表現型
ＳＬＰＩを過剰発現する成体マウスは皮膚の様々な異常を有する。ＳＬＰＩはトランスジェニック動物において表皮の基底上部層で主に発現しており、このことは、トランスジェニックマウスが乾癬皮膚と類似する表現型を示すことを示している。
【０７４５】
組織学および免疫組織化学
性別および身体部位に従って一致させたトランスジェニックマウスおよびトランスジーン陰性マウスに由来する組織がすべての組織研究のための使用される。組織学的分析のために、組織をホルモール−生理的食塩水において一晩固定し、パラフィンに包埋し、切片化して、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色する。クロロアセタートエステラーゼが、好中球に対する組織化学マーカーとして使用される。ＴＵＮＥＬが正常マウスおよびトランスジェニックマウスのパラフィン切片に対して行われる（Ｃａｒｒｏｌｌら（１９９５）を参照のこと）。皮膚は厚く、マウスの背側皮膚の組織学切片は表皮の厚さの著しい増大を示している。皮膚バリアは、乾癬皮膚において認められるように、これらの動物では増強されている。
【０７４６】
免疫組織化学が、マウスＳＬＰＩに対して特異的な抗体（１：４０希釈）を用いて行われる。一次抗体が、アビジンＤＨおよびビオチン化染色システム（Ｖｅｃｔａ  ｓｔａｉｎ  ＡＢＣキット、米国）を使用して二次抗体によって検出される。染色は、一致するコントロールと比較したとき、トランスジェニック動物の皮膚におけるＳＬＰＩの発現が大きいことを示している。ＳＬＰＩのこの過剰発現は、トランスジェニック動物の皮膚の基底上部層において主に見られる。
【０７４７】
付属Ａ：シスタチンＡの基準配列
ＣｙｓｔＡ．１（シスタチンＡ配列１）の配列
１位は第１エキソンの開始である。エキソンには下線が付されている。
【表３７】
2004524010.tif 000044
【０７４８】
ＣｙｓｔＡ．２（シスタチンＡ配列２）の配列
１位は第１イントロンの３’部分の開始である。ギャップが、発表された配列には第１イントロンの５’部分と３’部分との間にあり、従って、２つの配列が本明細書では使用される。
【表３８−１】
2004524010.tif 000045
【表３８−２】
2004524010.tif 000046
【表３８−３】
2004524010.tif 000047
【０７４９】
付属Ｂ：ＳＬＰＩの基準配列
ＳＬＰＩの基準配列。この配列における１位はＮＣＢＩ  Ｍ７４４４の１位に対応する。
【表３９】
2004524010.tif 000048
【０７５０】
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Ｆｒａｎｚｋｅ  Ｃ−Ｗ、Ｂａｉｃｉ  Ａ、Ｂａｒｔｅｌｓ  Ｊ、Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈｅｒｓ  Ｅ、Ｗｉｅｄｏｗ  Ｏ．（１９９６）、抗ロイコプロテアーゼは角質層キモトリプシン様酵素を阻害する。落屑における調節機能に関する証拠、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７１（３６）；２１８８６〜２１８９０。
Ｇａｎ  Ｌ、Ｌｅｅ  Ｉ、Ｓｍｉｔｈ  Ｒ、Ａｒｇｏｎｚａ−Ｂａｒｒｅｔｔ  Ｒ、Ｌｅｉ  Ｈ、ＭｃＣｕａｉｇ  Ｊ、Ｍｏｓｓ  Ｐ、Ｐａｅｐｅｒ  Ｂ、Ｗａｎｇ  Ｋ．（２０００）、染色体１９ｑ１３領域に位置するセリンプロテアーゼ遺伝子クラスターの配列決定および発現分析、Ｇｅｎｅ、１７；２５７（ｌ）：ｌ１９〜１３０。
Ｇｕｅｒｒｉｎ  Ｍ、Ｖｉｎｃｅｎｔ  Ｃ、Ｓｉｍｏｎ  Ｍ、Ｔａｚｉ  Ａｈｎｉｎｉ  Ｒ、Ｆｏｒｔ  Ｍ、Ｓｅｒｒｅ  Ｇ．（２００１）、ヒトコルネオデスモシン遺伝子における６個の新規な多型の同定、Ｔｉｓｓｕｅ  Ａｎｔｉｇｅｎｓ、５７（１）：３２〜８。
Ｇｕｅｒｒｉｎ，Ｍ．、Ｓｉｍｏｎ，Ｍ．、Ｍｏｎｔｅｚｉｎ，Ｍ．、Ｈａｆｔｅｋ，Ｍ．、Ｖｉｎｃｅｎｔ，Ｃ．およびＳｅｒｒｅ，Ｇ．（１９９８）、ヒトコルネオデスモシンの発現クローニングはＳ遺伝子の産物とのその一致をもたらし、角化細胞分化時におけるそのプロセシングの改善された特徴づけを可能にする、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７３：２２６４０〜２２６４７。
Ｈａｎｓｓｏｎ  Ｌ、Ｓｔｒｏｍｑｖｉｓｔ  Ｍ、Ｂａｃｋｍａｎ  Ａ、Ｗａｌｌｂｒａｎｄｔ  Ｐ、Ｃａｒｌｓｔｅｉｎ  Ａ、Ｅｇｅｌｒｕｄ  Ｔ．（１９９４）、角質層キモトリプシン様酵素（皮膚特異的ヒトセリンプロテイナーゼ）のクローニング、発現および特徴づけ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６９（３０）：１９４２０〜６。
Ｉｓｈｉｈａｒａ  Ｍ、Ｙａｍａｇｕａｔａ  Ｎ、Ｏｈｎｏ  Ｓ、Ｎａｒｕｓｅ  Ｔ、Ａｎｄｏ  Ａ、Ｋａｗａｔａ  Ｈ、Ｏｚａｗａ  Ａ、Ｏｈｋｉｄｏ  Ｍ、Ｍｉｚｕｋｉ  Ｎ、Ｓｈｉｉｎａ  Ｔ、Ａｎｄｏ  Ｈ、Ｉｎｏｋｏ  Ｈ、ヒト主要組織適合性複合体内のケラチン様Ｓ遺伝子における遺伝子多型および尋常性乾癬に対する感受性に関する関連、（１９９６）、Ｔｉｓｓｕｅ  Ａｎｔｉｇｅｎｓ、４８：１８２〜１８６。
Ｊｅｎｉｓｃｈ  Ｓ、Ｋｏｃｈ  Ｓ、Ｈｅｎｓｅｌｅｒ  Ｔ、Ｎａｉｒ  ＲＰ、Ｅｌｄｅｒ  ＪＴ、Ｗａｔｔｓ  ＣＥ、Ｗｅｓｔｐｈａｌ  Ｅ、Ｖｏｏｒｈｅｅｓ  ＪＪ、Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈｅｒｓ  Ｅ、Ｋｒｏｎｋｅ  Ｍ．（１９９９）、コルネオデスモシン遺伝子の多型はＨＬＡとの強い連鎖不平衡および乾癬との関連を明らかにする、Ｔｉｓｓｕｅ  Ａｎｔｉｇｅｎｓ、５４：４３９〜４４９。
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Ｌｅｅ  ＹＡ、Ｗａｈｎ  Ｕ、Ｋｅｈｒｔ  Ｒ、Ｔａｒａｎｉ  Ｌ、Ｂｕｓｉｎｃｏ  Ｌ、Ｇｕｓｔａｆｓｓｏｎ  Ｄ、Ａｎｄｅｒｓｓｏｎ  Ｆ、Ｏｒａｎｊｅ  ＡＰ、Ｗｏｌｋｅｒｔｓｔｏｒｆｅｒ  Ａ、ｖ  Ｂｅｒｇ，Ａ、Ｈｏｆｆｍａｎｎ  Ｕ、Ｋｕｓｔｅｒ  Ｗ、Ｗｉｅｎｋｅｒ  Ｔ、Ｒｕｓｃｈｅｎｄｏｒｆ  Ｆ、Ｒｅｉｓ  Ａ．（２００１）、アトピー性皮膚炎に対する主要な感受性遺伝子座が染色体３ｑ２１にマッピングされる、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．、２６（４）：４７０〜３。
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Ｍ．Ｇｕｅｒｒｉｎ、Ｃ．Ｖｉｎｃｅｎｔ、Ｍ．Ｓｉｍｏｎ、Ｒ．Ｔａｚｉ  Ａｈｎｉｎｉ、Ｍ．ＦｏｒｔおよびＯ．Ｓｅｒｒｅ（２０００）、ヒトコルネオデスモシン遺伝子における６個の新規な多型の同定、Ｔｉｓｓｕｅ  Ａｎｔｉｇｅｎｓ、印刷中。
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Ｍｕｒｐｈｙ  Ｒ、Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＨＣ、Ｄｕｆｆ  ＧＷ、Ｃｏｒｋ  ＭＪ、アトピー性皮膚炎における総ＩＧＥおよび特異的ＩＧＥ：連鎖分析に関するいくつかの検討（投稿中、２０００）。
Ｎｏｒｔｈ  ＡＪ、Ｂａｒｄｓｌｅｙ  ＷＧ、Ｈｙａｍ  Ｊ、Ｂｏｒｎｓｌａｅｇｅｒ  ＥＡ、Ｃｏｒｄｉｎｇｌｅｙ  ＨＣ、Ｔｒｉｎｎａｍａｎ  Ｂ、Ｈａｌｚｆｅｌｄ  Ｍ、Ｇｒｅｅｎ  ＫＪ、Ｍａｇｅｅ  ＡＩ、Ｇａｒｒｏｄ  ＤＲ、デスモソーム斑の分子地図、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、１１２、４３２５〜４３３６（１９９９）。
Ｏｂｅｒ  Ｃ、Ｔｓａｌｅｎｋｏ  Ａ、Ｐａｒｒｙ  Ｒ、Ｃｏｘ  ＮＪ、始祖集団における喘息感受性対立遺伝子に対する第二世代ゲノムワイドスクリーニング、（２０００）、Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．、６７（５）：１１５４〜１１６２。
Ｐｏｔｔｅｒ  Ｓ、Ｍｉｔｃｈｅｌｌ  ＭＤ、Ｈａｎｓｅｎ  ＷＲ、Ｍａｒｖｉｎ  ＫＷ．（２０００）、ＮＦ−ＩＬ６およびＣＲＥエレメントにより、原理的には、羊膜由来ＡＶ３細胞におけるＰＧＨＳ−２プロモーターの近傍５２８ｂｐの基礎転写活性およびインターロイキン−１β誘導転写活性の両方が説明される。Ｃ／ＥＢＰβの関与に関する証拠、Ｍｏｌ．Ｈｕｍ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｓｅｐ；６（９）：７７１〜８。
Ｓｅｒｒｅ，Ｇ．、Ｍｉｌｓ，Ｖ．、Ｈａｆｆｔｅｋ，Ｍ．、Ｖｉｎｃｅｎｔ，Ｃ．、Ｃｒｏｕｔｅ，Ｆ．、Ｒｅａｎｏ，Ａ．、Ｏｕｈａｙｏｕｎ，Ｊ−Ｐ．、Ｂｅｔｔｉｎｇｅｒ，Ｓ．、Ｓｏｌｅｉｌｈａｖｏｕｐ，Ｊ−Ｐ．（１９９１）、Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．、９７：１０６１〜１０７２。
Ｓｈｉｒａｋａｗａ，Ｔ．、Ｌｉ，Ａ．、Ｄｕｂｏｗｉｔｚ，Ｍ．ら（１９９４）、アトピーと高親和性免疫グロブリンＥ受容体のβサブユニットの変化体との関連、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．、７：１２５〜１３０。
Ｓｉｍｏｎ，Ｍ．、Ｍｏｎｔｅｚｉｎ，Ｍ．、Ｇｕｅｒｒｉｎ，Ｍ．、Ｄｕｒｉｅｕｘ，Ｊ．Ｊ．およびＳｅｒｒｅ，Ｇ．（１９９７）、ヒトコルネオデスモシン（角質細胞特異的な修飾されたデスモソームと結合する表皮の塩基性糖タンパク質）の特徴づけおよび精製、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７２、３１７７０〜３１７７６。
Ｓｕｎｄｂｅｒｇ  ＪＰ、Ｆｒａｎｃｅ  Ｍ、Ｂｏｇｇｅｓｓ  Ｄ、Ｓｕｎｄｂｅｒｇ  ＢＡ、Ｊｅｎｓｏｎ  ＡＢ、Ｂｅａｍｅｒ  ＷＧ、Ｓｈｕｌｔｚ  ＬＤ．（１９９７）、薄片状皮膚（ｆｓｎ）マウス変異体における乾癬状皮膚炎および全身性病変の発生および進行、Ｐａｔｈｏｂｉｏｌｏｇｙ、６５：２７１〜２８６。
Ｔａｋａｈａｓｈｉ  ｈ、Ａｓａｎｏ  Ｋ、Ｋｉｎｏｕｃｈｉ  Ｍ、Ｉｓｈｉｄａ−Ｙａｍａｍｏｔｏ  Ａ、Ｗｕｅｐｐｅｒｓ  ＫＤ、Ｌｉｚｕｋａ  Ｈ、ヒトシスタチンＡ遺伝子の構造および転写調節、（１９９８）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７３；１７３７５〜８０。
Ｔａｚｉ  Ａｈｎｉｎｉ  Ｒ、Ｃａｍｐ  ＮＪ、Ｍｅｅ  ＪＢ、Ｄｕｆｆ  ＧＷ、Ｃｏｒｋ  Ｍ、ｄｉ  Ｇｉｏｖｉｎｅ  ＦＳ（１９９９ａ）、コルネオデスモシン（ＭＨＣ）Ｓ遺伝子と感染感受性との間における遺伝的関連、Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．、８（６）：１１３５〜１１４０。
Ｔａｚｉ  Ａｈｎｉｎｉ  Ｒ、ｄｉ  Ｇｉｏｖｉｎｅ  ＦＳ、Ｃｏｘ  Ａ、ＫｅｏｈａｎｅおよびＣｏｒｋ  ＭＪ、滴状乾癬におけるコルネオデスモシン（ＭＨＣ  Ｓ）遺伝子、Ｌａｎｃｅｔ、１９９９、１４；３５４：５９７。
Ｔｓｕｋａｄａ  Ｊ、Ｓａｉｔｏ  Ｋ、Ｗａｔｅｒｍａｎ  ＷＲ、Ｗｅｂｂ  ＡＣ、Ａｕｒｏｎ  ＰＥ．（１９９４）、転写因子（ＮＦ−ＩＬ６およびＣＲＥＢ）はヒトプロインターロイキン−１β遺伝子における共通の必須部位を認識する、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、１１：７２８５〜７２９７。
Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＨＣ、Ｂｕｒｎｅｙ  ＰＧ、Ｈａｙ  ＲＪら、英国作業部会のアトピー性皮膚炎診断基準Ｉ：アトピー性皮膚炎に対する最少識別群の誘導、Ｂｒ．Ｊ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．、１９９４；１３１：３８３〜３９６。
Ｙａｍａｚａｋｉ  Ｍ、Ｉｓｈｉｄｏｈ  Ｋ、Ｋｏｍｉｎａｍｉ  Ｅ、Ｏｇａｗａ  Ｈ．（１９９７）、ヒトシスタチンＡのゲノム構造、ＤＮＡ  Ｓｅｑ．、８（１−２）：７１〜７６。
Ｚｈｏｕ，Ｙ．およびＣｈａｐｌｉｎ，Ｄ．Ｄ．（１９９３）、角化細胞分化の後期で発現する遺伝子のＨＬＡクラスＩ領域における同定、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９０、９４７０〜９４７３。
【０７５１】
本明細書において言及される特許出願および特許のそれぞれ、そして上記の特許出願および特許のそれぞれにおいて引用または参照されるそれぞれの文献（これには、特許出願および特許のそれぞれの審査時に引用または参照されるそれぞれの文献（「出願引用文献」）を含む）、ならびに特許出願および特許のそれぞれにおいて、そして出願引用文献のいずれかにおいて引用または言及される何らかの製品に対する製造者の何らかの説明書またはカタログは、本明細書により、参考として本明細書中に組み込まれる。さらに、本明細書において引用されるすべての文献、および本明細書で引用される文献において引用または参照されるすべての文献、そして本明細書で引用または言及される何らかの製品に対する製造者の何らかの説明書またはカタログは、本明細書により、参考として本明細書中に組み込まれる。
【０７５２】
本発明の記載された方法およびシステムの様々な改変および変化が、本発明の範囲および精神から逸脱することなく当業者には明らかになる。本発明は特定の好ましい実施形態に関連して記載されているが、請求項に記載される本発明は、そのような特定の実施形態に対して不当に限定されるべきではないことを理解しなければならない。実際、分子生物または関連分野の当業者には自明である、本発明を実施するための記載された態様の様々な改変は請求項の範囲に含まれるものとする。
【図面の簡単な説明】
【０７５３】
【図１】図１は、アトピー性湿疹患者から得られたＳＣＣＥ遺伝子のエキソンＶに対応するＡＥ２配列のクロマトグラムの一部を示す。４ｂｐの反復が矢印により示される。
【図２】図２は、第２の反復（ＡＡＣＣ）が存在しない、図２に対応するポリ９（コントロール）配列のクロマトグラムの一部を示す。４ｂｐの１回の反復が矢印により示される。
【図３】図３は、プライマーのＦ５およびＩ／Ｄ  ＲＩＩ（最初の最適化）を使用したときの１０個のＤＮＡサンプルのＰＣＲ産物の電気泳動ゲルを示す。予想されるＰＣＲ産物（４５７ｂｐ）が矢印により示される。
【図４】図４は、エキソン５全体の増幅産物（最初の最適化）である８００ｂｐの「コントロール」増幅産物を含むＰＣＲ反応生成物のゲル電気泳動を示す。この図により、内部コントロール（矢印により示される８００ｂｐ）を使用して、結果が有効であることが確認される。
【図５】図５は、コントロール患者および湿疹患者におけるシスタチンＡプロモーターの転写活性を示すグラフである。プロモーター領域のＰＣＲ産物がレポーターベクター（ＣＡＴ）にクローン化される。これらには、コントロール患者および湿疹患者にそれぞれ由来する、ｐｃｓｔａｐｐｏｌｙ７ｒＣＡＴ、ｐｃｓｔａｐｐｏｌｙ３ｒＣＡＴ、ｐｃｓｔａｐｐｏｌｙ４ｒＣＡＴ、およびｐｃｓｔａｐｅ８ｆＣＡＴ、ｐｃｓｔａｐｅ５ｒＣＡＴ、ｐｃｓｔａｐｅ７ｒＣＡＴの配列が含まれる。トランスフェクションされたＳＶＨＫ細胞が集められ、抽出物がＣＡＴ活性についてアッセイされる。
【図６】図６は、抗コルネオデスモシン抗体でプローブされたウエスタンブロットであり、乾癬表皮から抽出されたタンパク質のタンパク質分解プロフィルを示す。ＰＮＬ：乾癬非病変皮膚、ＰＬ：乾癬病変皮膚、Ｎ：正常皮膚。
【図７】図７は、抗プラコグロビン抗体でプローブされたウエスタンブロットであり、乾癬表皮から抽出されたタンパク質のタンパク質分解プロフィルを示す。ＰＮＬ：乾癬非病変皮膚、ＰＬ：乾癬病変皮膚、Ｎ：正常皮膚。
【図８】図８は、抗デスモプラキン抗体でプローブされたウエスタンブロットであり、乾癬表皮から抽出されたタンパク質のタンパク質分解プロフィルを示す。ＰＮＬ：乾癬非病変皮膚、ＰＬ：乾癬病変皮膚、Ｎ：正常皮膚。
【図９】図９は、抗デスモコリンＩ抗体でプローブされたウエスタンブロットであり、乾癬表皮から抽出されたタンパク質のタンパク質分解プロフィルを示す。ＰＮＬ：乾癬非病変皮膚、ＰＬ：乾癬病変皮膚、Ｎ：正常皮膚。
【図１０】図１０は、抗エンボプラキン抗体でプローブされたウエスタンブロットであり、乾癬表皮から抽出されたタンパク質のタンパク質分解プロフィルを示す。ＰＮＬ：乾癬非病変皮膚、ＰＬ：乾癬病変皮膚、Ｎ：正常皮膚。
【図１１】図１１は、抗ＳＣＣＥ抗体でプローブされたウエスタンブロットであり、乾癬表皮から抽出されたタンパク質のタンパク質分解プロフィルを示す。ＰＮＬ：乾癬非病変皮膚、ＰＬ：乾癬病変皮膚、Ｎ：正常皮膚。
【図１２】図１２は、抗ＳＬＰＩ抗体でプローブされたウエスタンブロットであり、乾癬表皮から抽出されたタンパク質のタンパク質分解プロフィルを示す。ＰＮＬ：乾癬非病変皮膚、ＰＬ：乾癬病変皮膚、Ｎ：正常皮膚。
【図１３】図１３は、皮膚バリア機能が変化した皮膚状態の角質層表面におけるコルネオデスモソーム密度の定量化を示すグラフである。
【図１４】図１４は、プロテアーゼ酵素の存在下または非存在下で処理された乾癬患者由来のテープストリップにおけるコルネオデスモソーム密度の定量化を示すグラフである。
【図１５】図１５は、処理されなかった乾癬生検物の断面を示す。厚くなった角質層（ＳＣ）に存在する多数のコルネオデスモソームにより、角質細胞の層が強固に保持されている。角質層の下に存在する成長可能な細胞には印が付けられている（Ｖ）。３３００倍の倍率での透過電子顕微鏡写真。
【図１６】図１６は、０．２５％キモトリプシンで１６時間処理された乾癬生検物の断面を示す。角質細胞層の分裂（棘細胞離開）が、キモトリプシンによるコルネオデスモソームの分解のために明らかに認められる。３３００倍の倍率での透過電子顕微鏡写真。
【図１７】図１７は、処理されなかった乾癬生検物（角質層）の断面を示す。多数のコルネオデスモソームを認めることができるが、その一部が白矢印により示される。２３０００倍の倍率での透過電子顕微鏡写真。
【図１８】図１８は、０．２５％キモトリプシンで１６時間処理された乾癬生検物の角質層の断面を示す。はるかに少数のコルネオデスモソームをプロテアーゼ処理の後において認めることができる（実線の白矢印）。分解されたコルネオデスモソームのいくつかの残骸もまた認めることができる（点線の白矢印）。２３０００倍の倍率での透過電子顕微鏡写真。
【図１９】図１９は、再構成されたヒト表皮培養物（皮膚等価物）の断面を示す。左側パネル：緩衝化塩溶液による処理（コントロール）、右側パネル：６μＭのペプチド６４１による処理。
【図２０】図２０は、再構成されたヒト表皮培養物（皮膚等価物）の断面を示す。左側パネル：緩衝化塩溶液による処理（コントロール）、右側パネル：６μＭのペプチド６４２による処理。
【図２１】図２１は、再構成されたヒト表皮培養物（皮膚等価物）の断面を示す。左側パネル：緩衝化塩溶液による処理（コントロール）、右側パネル：６μＭのペプチド６４３による処理。
【図２２】図２２は、再構成されたヒト表皮培養物（皮膚等価物）の断面を示す。左側パネル：緩衝化塩溶液による処理（コントロール）、右側パネル：６μＭのペプチド６５１による処理。
【図２３】図２３は、再構成されたヒト表皮培養物（皮膚等価物）の断面を示す。左側パネル：緩衝化塩溶液による処理（コントロール）、右側パネル：６μＭのペプチド６５３による処理。
【図２４】図２４は、再構成されたヒト表皮培養物（皮膚等価物）の断面を示す。左側パネル：緩衝化塩溶液による処理（コントロール）、右側パネル：２．５ｎｇ／ｍｌのＴＮＦ−αによる処理。
【図２５】図２５は、再構成されたヒト表皮培養物（皮膚等価物）の断面を示す。左側パネル：緩衝化塩溶液による処理（コントロール）、右側パネル：２．５ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１βによる処理。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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