(57)【要約】薬剤を含む水溶液または懸濁液を噴霧凍結乾燥することを含む、粉体の製造方法であり、その溶液または懸濁液が20重量％以上の固形含量を有する。この噴霧凍結乾燥した粉体は、無針注射器により被験体に投与することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
粉体の製造方法であって、薬剤を含む水溶液または懸濁液を噴霧凍結乾燥する工程を含んでなり、その溶液または懸濁液が20重量％以上の固形含量を有する、上記方法。
【請求項２】
溶液または懸濁液が30重量％以上の固形含量を有する、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
固形含量が40重量％以上である、請求項2に記載の方法。
【請求項４】
医薬組成物が抗原である、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
抗原がアルミニウム塩またはカルシウム塩のアジュバントに吸着されている、請求項4に記載の方法。
【請求項６】
抗原が細菌性またはウイルス性の抗原である、請求項4または5に記載の方法。
【請求項７】
溶液または懸濁液が、更に、(a)単糖、二糖、オリゴ糖および多糖からなる群から選択される非晶質の賦形剤、ならびに(b)炭水化物、糖および糖アルコールからなる群から選択される結晶性の賦形剤、を含む、請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
溶液または懸濁液が、(a)デキストロース、スクロース、ラクトース、トレハロース、セロビオース、ラフィノース、イソマルトースおよびシクロデキストリンからなる群から選択される非晶質の賦形剤、ならびに(b)結晶性の賦形剤としてのマンニトール、を含む、請求項7に記載の方法。
【請求項９】
溶液または懸濁液が、更に(c)ポリマー、を含む、請求項7または8に記載の方法。
【請求項１０】
ポリマーがデキストランである、請求項9に記載の方法。
【請求項１１】
溶液または懸濁液が、更に、トレハロース、マンニトールおよびデキストランを約3：3：4〜約4：4：3の重量比で含む、請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
溶液または懸濁液が、更に、(d)アミノ酸またはその生理学的に許容される塩、を含む、請求項7〜11のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
溶液または懸濁液が、更に、(c)ポリマー、および(d)アミノ酸またはその生理学的に許容される塩、を含む、請求項7〜12のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
溶液または懸濁液が超音波ノズルから噴霧される、請求項1〜13のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
溶液または懸濁液が液体窒素の中に噴霧される、請求項1〜14のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
溶液または懸濁液が液化ガス中に噴霧され、生じたその溶液または懸濁液の凍結液滴を含む液化ガスが、
(i) 約-50℃〜0℃の温度にて、約20〜500mTの圧力下で、約4〜24時間にわたって行われる第1の乾燥段階；
(ii) 約5℃〜30℃の温度にて、100mT未満の圧力下で、約5〜24時間にわたって行われる第2の乾燥段階
を含んでなる二段階の乾燥プロセスに供される、請求項1〜15のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
得られた噴霧凍結乾燥粒子を回収し、洗浄し、乾燥する、請求項1〜16のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
乾燥した粒子を篩いにかける、請求項17に記載の方法。
【請求項１９】
無針注射器用の投与量収容器であって、薬剤を含む水溶液または懸濁液を噴霧凍結乾燥する工程を含む方法により得られる粉体を収容するものであり、その溶液または懸濁液が20重量％以上の固形含量を有する、上記投与量収容器。
【請求項２０】
カプセル、ホイル製パウチ、サシェおよびカセットからなる群から選択される、請求項19に記載の収容器。
【請求項２１】
薬剤を含む水溶液または懸濁液を噴霧凍結乾燥する工程を含む方法により得られる粉体が充填されている無針注射器であって、その溶液または懸濁液が20重量％以上の固形含量を有する、上記無針注射器。
【請求項２２】
薬学的に許容される担体または希釈剤と、薬剤を含む水溶液または懸濁液を噴霧凍結乾燥する工程を含む方法により得られる粉体とを含むワクチン組成物であって、その溶液または懸濁液が20重量％以上の固形含量を有する、上記ワクチン組成物。
【請求項２３】
被験体にワクチン接種する方法であって、薬剤を含む水溶液または懸濁液を噴霧凍結乾燥する工程を含む方法により得られる粉体の有効量をその被験体に投与することを含んでなり、その溶液または懸濁液が20重量％以上の固形含量を有する、上記方法。
【請求項２４】
粉体が無針注射器により投与される、請求項23に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、無針注射器システムからの経皮粒子送達に適する医薬組成物の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
皮膚表面中に、または皮膚表面を通って薬剤を送達できること（経皮送達）は、経口または非経口の送達技術と比較して多くの利点をもたらす。特に、経皮送達は、従来の投与システムの安全で簡便で非侵襲性の代替法となり、好都合なことに、経口送達に付随する主な問題（例えば、吸収速度および代謝速度のバラつき、消化管への刺激および／または苦いもしくは不快な薬物の味）や、非経口送達に付随する主な問題（例えば、針による痛み、処置した個体に感染を持ち込む危険性、不慮の針刺しや使用済の針の処理により起こる健常な医療従事者の汚染または感染の危険性）が回避できる。
【０００３】
しかし、明らかな利点があるにもかかわらず、経皮送達には、それ自体に特有の多くの輸送上の問題がある。無傷の皮膚を通っての受動送達では、薬物を血液またはリンパ系に侵入させるために、角質層、下部表皮層、真皮乳頭層および毛細管壁などの構造的に異なる多くの組織を通って分子を輸送することが必ず必要である。したがって、経皮送達システムは、各タイプの組織によって生じる様々な抵抗に打ち勝たなければならない。
【０００４】
上記に鑑みて、受動経皮送達の多くの代替法が開発されてきた。これらの代替法としては、皮膚透過性を増大させるための皮膚透過促進剤または「透過エンハンサー」の使用、ならびにイオン導入法、エレクトロポレーションまたは超音波の使用などの非化学的な形態が挙げられる。しかし、これらの代替技術は、皮膚刺激や感作などのそれら自身に特有の副作用を誘発する場合が多い。したがって、従来の経皮送達法を用いて安全且つ効率的に投与できる薬剤の範囲は依然として限られている。
【０００５】
ごく近年、制御用量の粉体（すなわち、固形薬剤含有粒子）を無傷の皮膚の中または無傷の皮膚を通って噴射させるために無針注射器を用いることを必要とする、新規な経皮薬物送達システムが記載された。特に、同じ出願人による米国特許第5,630,796号（Bellhouseら）は、薬剤粒子を超音速ガス流に飛沫同伴させて送達する無針注射器を記載している。無針注射器は、遺伝子物質を生細胞へ送達するため（例えば遺伝子治療）および生物薬剤を皮膚、筋肉、血液またはリンパへ送達するための、粉末の薬物化合物および組成物の経皮送達に使用される。また、無針注射器は、手術と併用して、薬物および生物製剤を器官表面、固形腫瘍および／または外科的窩洞（例えば、腫瘍切除後の腫瘍床または窩洞）へ送達するのにも使用できる。理論的には、実質的に固形で粒状の形態で製造できる事実上全ての薬剤が、そうした装置を用いて安全且つ容易に送達できる。
【０００６】
この新規な無針注射器法により粉末の薬物組成物が効率的に投与できるようにするためには、その粉体が特定の物理的特性を有していなければならない。特に、粉体を形成する粒子の大きさは制御可能でなければならず、好ましくは狭い粒径分布を有する。更に、粒子密度は高くなければならず、粒子は乾燥環境下で自由流動性でなければならず、それらの水分含量は低いものでなければならない。望まれる更に別の粒子の特性としては、球形の形状および平滑な表面が挙げられる。これらの特性の一つ一つが、無針注射器による送達に要する力の下で粒子自身が損傷を受けないようにしながら、良好な皮膚透過を付与するのに重要である。
【０００７】
粉体の物理的特性を決定する上で最も重要な要素の1つは、それらを製造する特定の様式である。これまでに、例えばエアロゾル送達のための粉体および慣用の薬物送達のためのミクロスフェアを製造するために、種々の噴霧凍結乾燥法が記載されてきた。これらの用途では、粒子は軽量で多孔質であることが望まれ、これらは、従来に記載されている噴霧凍結乾燥法により製造される粉体では本質的な特性である。そうした軽量で多孔質の粒子は、無針注射器装置での使用には不適当である。
【０００８】
Maaら (1999) Pharmaceuticals Research 16(2)は、噴霧凍結乾燥した粒子の物理的特性およびそれらのエアロゾルとしての性能について記載している。噴霧凍結乾燥法は、大きな比表面積を有する多孔質の高い粒子を作る、と言われている。Maaは、噴霧凍結乾燥した粒子の粒子密度が、典型的には噴霧乾燥により乾燥した対応する粒子のもののほぼ1/9であると見積もった。
【０００９】
米国特許第5,019,400号は、非常に低い温度を用いてポリマー−生物学的活性薬剤の混合物を凍結させて、生物学的活性および材料を保持している重合型ミクロスフェアにする、ミクロスフェアの製造方法を記載している。ポリマーは、溶媒に、該溶媒に溶解できるか該溶媒に微粒子の形態で分散できる活性薬剤と共に溶解させる。このポリマー／活性薬剤混合物を、そのポリマー／活性薬剤溶液の氷点よりも低い温度で、液状非溶媒のみ、または凍結されていて液化ガスを上層（overlay）してある液状非溶媒が入っている容器に霧化して吹き付ける（atomised）。
【００１０】
液化ガスとの組合せを用いると、霧化された液滴は、その冷たい液化ガスと接触したとたんに凍結してミクロスフェアになり、次いで、凍結した非溶媒層の上に沈降する。次に、凍結した非溶媒を溶かす。非溶媒が溶けると、依然として凍結したままのミクロスフェアは液状になった非溶媒中に沈降する。次に、ミクロスフェア中の溶媒が溶け、非溶媒中にゆっくり抽出されて、ポリマーと活性薬剤との均一な混合物またはポリマーと活性薬剤の領域が分かれている不均一な二相系として活性薬剤を含む、硬化したミクロスフェアが得られる。
【００１１】
冷たい溶媒だけを使用した場合は、霧化された液滴は、その溶媒と接触したとたんに凍結し、容器の底に沈降する。ポリマーに対する非溶媒を温めると、ミクロスフェア中の溶媒が溶け、非溶媒中に抽出されて、硬化したミクロスフェアが得られる。
【発明の開示】
【００１２】
発明の概要
本発明者らは、驚くべきことに、溶剤中の固形含量が高い溶液または懸濁液を噴霧凍結乾燥することにより、極めて高密度で、無針注射器装置で十分にうまく作動する粒子が得られることを見出した。固形含量が高い出発物質を使用すると、乾燥工程中に起こる空隙の形成が最低限に抑えられる。凍結した溶剤が乾燥の間に粒子から昇華することが、空隙形成の典型的な原因である。溶液または懸濁液（したがって凍結粒子）の中の固形含量をできるだけ高くすれば、乾燥中に形成される空隙の数および大きさが低減し、かくして、より密度の高い粒子が得られる。
【００１３】
また、本発明者らは、特定の賦形剤の使用が、高密度な粒子の形成を促進し得ることも見出した。適切な賦形剤の組成は、凍結乾燥中に粒子を崩壊させて密度を高める。また、特定の賦形剤組成を選択することは、特定の共存物質（例えばペプチドおよびタンパク質）の溶剤系への溶解性を増大させることにより、粒子の形成に役立ち得る、と考えられる。このことは、溶液または懸濁液中の固形含量を最大にする上で更に役立つ。
【００１４】
したがって、本発明は、噴霧凍結乾燥法を、それに付随する利点を保持しながら、無針注射器の要件に適合できるようにする。本発明の粒子は、十分に規定された大きさと高い密度、ならびに総合して無針注射器による経皮送達に適する他の機械的特性を有する。本発明の噴霧凍結乾燥法は、商業的製造レベルにまでスケールアップするのに非常に適する単純な技法である。更に、それは、今までのところ、完全に配合処方に依存しないものであることが判っている。したがって、この技法はほぼ全ての医薬製剤に適用でき、このことは、本発明の商業化の可能性に更に加味される要素である。
【００１５】
したがって、本発明は、粉体の製造方法を提供するものであり、この方法は、薬剤を含有する水溶液または懸濁液を噴霧凍結乾燥する工程を含み、この溶液または懸濁液は固形含量が20重量％以上である。
【００１６】
本発明は更に、
−無針注射器用の投与量収容器（dosage receptacle）であって、本発明の方法により製造される粉体の有効量を含む上記収容器；
−本発明の方法により製造される粉体が充填されている無針注射器；
−薬学的に許容される担体または希釈剤と本発明の方法により製造される粉体とを含むワクチン組成物；
−被験体のワクチン接種方法であって、本発明の方法により製造される粉体の有効量をその被験体に投与することを含む上記方法；ならびに
−本発明の方法により製造される粉体
を提供する。
【００１７】
図面の簡単な説明
図1a〜1dは、実施例１のサブセクション1.5.2に記載されている研究において評価した特定の粒子製剤の光学顕微鏡写真（100倍の倍率）である。図1aは、20μgのHBsAg抗原を噴霧凍結乾燥（SFD）することにより製造した製剤138-20-4Aからの粒子を示す。図1bは、SFDおよび次に篩いがけを行って、20μgのHBsAg抗原および50μgのアルミニウムアジュバントから形成される38〜53μmの粒子画分を得ることにより製造した製剤138-16-1Cからの粒子を示す。図1cは、SFDおよび次に圧縮・粉砕・篩いがけ（C/G/S）を行って20μgのHBsAg抗原から形成される38〜53μmの粒子画分を得ることにより製造した製剤138-20-4Bからの粒子を示す。図1dは、SFDおよび次にC/G/Sを行って、20μgのHBsAg抗原および50μgのアルミニウムアジュバントから形成される38〜53μmの粒子画分を得ることにより製造した製剤138-20-5Cからの粒子を示す。
【００１８】
図2a〜2dは、実施例１のサブセクション1.5.3に記載されている研究において評価した特定の粒子製剤のSEM顕微鏡写真である。図2aは、20μgのHBsAg抗原をSFDすることにより製造した製剤138-20-4Aからの粒子を示す。図2bは、SFDおよび次に篩いがけを行って、20μgのHBsAg抗原および50μgのアルミニウムアジュバントから形成される38〜53μmの粒子画分を得ることにより製造した製剤138-16-1Cからの粒子を示す。図2cは、SFDおよび次にC/G/Sを行って、20μgのHBsAg抗原から形成される38〜53μmの粒子画分を得ることにより製造した製剤138-20-4Bからの粒子を示す。図2dは、SFDおよび次にC/G/Sを行って、20μgのHBsAg抗原および50μgのアルミニウムアジュバントから形成される38〜53μmの粒子画分を得ることにより製造した製剤138-20-5Cからの粒子を示す。
【００１９】
図3aおよび3bは、実施例１のサブセクション1.5.7.に記載されている研究において評価した2種のアルミニウム含有製剤の懸濁液の光学画像である。図3aは、20μgのHBsAg抗原をSFDすることにより製造した再構成した製剤138-16-1の光学画像である。図3bは、SFDおよび次にC/G/Sを行って、20μgのHBsAg抗原および50μgのアルミニウムアジュバントから形成される38〜53μmの粒子画分を得ることにより製造した再構成した製剤138-20-5Cの光学画像である。
【００２０】
図4aおよび4bは、実施例１のサブセクション1.5.8に記載されている研究の結果を示す、非還元SDS-PAGEゲル（図4a）および還元SDS-PAGEゲル（図4b）の写真である。
【００２１】
図5は、実施例２のサブセクション2.3.1に記載されている噴霧凍結乾燥（SFD）法の概略である。
【００２２】
図6a〜6dは、実施例２のサブセクション2.5.1に記載されている研究において評価した特定の粒子製剤の光学顕微鏡写真（100倍の倍率）である。図6aは、10％のBSA、45％のトレハロース、27％のマンニトール、18％のPVP（K17）および0.1％のプルロニックF68を含有する組成物をSFDすることにより製造した製剤156-16-1からの粒子を示す。図6bは、10％のBSA、44.9％のトレハロース、26.9％のマンニトール、18％のPVP（K17）、0.1％のメチオニンおよび0.1％のプルロニックF68を含有する組成物をSFDすることにより製造した製剤156-16-2からの粒子を示す。図6cは、10％のBSA、26.9％のトレハロース、26.9％のマンニトール、35.9％のPVP（K17）、0.1％のメチオニンおよび0.1％のプルロニックF68を含有する組成物をSFDすることにより製造した製剤156-16-3からの粒子を示す。図6dは、10％のBSA、26.9％のトレハロース、26.9％のマンニトール、35.9％のPVP（K17）、0.1％のメチオニンおよび0.1％のプルロニックF68を含有する組成物をSFDすることにより製造した製剤156-16-4からの粒子を示す。
【００２３】
図7a〜7fは、実施例２のサブセクション2.5.2に記載されている研究において評価した特定の粒子製剤の光学顕微鏡写真（100倍の倍率）である。図7aは、10％のBSA、36％のラフィノース、27％のトレハロースおよび27％のマンニトールを含有する組成物をSFDすることにより製造した製剤156-35-1からの粒子を示す。図7bは、10％のBSA、36％のラフィノース、36％のマンニトールおよび18％のPVP（K17)を含有する組成物をSFDすることにより製造した製剤156-35-2からの粒子を示す。図7cは、10％のBSA、40％のラフィノースおよび30％のマンニトールを含有する組成物をSFDすることにより製造した製剤156-35-3からの粒子を示す。図7dは、10％のBSA、36％のラフィノース、27％のトレハロースおよび27％のマンニトールを含有する組成物をSFDすることにより製造した製剤156-42-1からの粒子を示す。図7eは、10％のBSA、27％のラフィノース、27％のマンニトール、18％のグリシンおよび18％のトレハロースを含有する組成物をSFDすることにより製造した製剤156-42-2からの粒子を示す。図7fは、10％のBSA、27％のラフィノース、27％のスクロースおよび36％のマンニトールを含有する組成物をSFDすることにより製造した製剤156-42-4からの粒子を示す。
【００２４】
図8a〜8fは、実施例２のサブセクション2.5.3に記載されている研究において評価した特定の粒子製剤の光学顕微鏡写真（100倍の倍率）である。図8aは、10％のBSA、27％のトレハロース、27％のマンニトールおよび36％のデキストラン（10 kDa)を含有する組成物をSFDすることにより製造した製剤156-35-4からの粒子を示す。図8bは、10％のBSA、27％のトレハロース、27％のマンニトールおよび36％のデキストラン（10 kDa)を含有する組成物をSFDすることにより製造した製剤156-42-3-1からの粒子を示す。図8cは、10％のBSA、27％のトレハロース、27％のマンニトールおよび36％のデキストラン（10 kDa)を含有する組成物をSFDすることにより製造した製剤156-42-3-2からの粒子を示す。図8dは、10％のBSA、27％のトレハロース、27％のマンニトールおよび36％のデキストラン（10 kDa)を含有する組成物をSFDすることにより製造した製剤156-53-1からの粒子を示す。図8eは、10％のBSA、27％のトレハロース、27％のマンニトールおよび36％のデキストラン（10 kDa)を含有する組成物をSFDすることにより製造した製剤156-61-1からの粒子を示す。図8fは、10％のBSA、36％のトレハロース、18％のマンニトール、18％のグルタミン酸アルギニンおよび18％のデキストラン（10 kDa)を含有する組成物をSFDすることにより製造した製剤156-65-1からの粒子を示す。
【００２５】
図9a〜9fは、実施例２のサブセクション2.5.4に記載されている研究において評価した特定の粒子製剤の光学顕微鏡写真（100倍の倍率）である。図9aは、10％のBSA、36％のトレハロース、36％のマンニトールおよび18％のアラニンを含有する組成物をSFDすることにより製造した製剤156-57-1からの粒子を示す。図9bは、10％のBSA、27％のトレハロース、27％のマンニトールおよび36％のグルタミン酸アルギニンを含有する組成物をSFDすることにより製造した製剤156-57-2からの粒子を示す。図9cは、10％のBSA、36％のトレハロース、18％のマンニトールおよび36％のグルタミン酸アルギニンを含有する組成物をSFDすることにより製造した製剤156-65-2からの粒子を示す。図9dは、10％のBSA、36％のトレハロース、18％のマンニトールおよび36％のグルタミン酸アルギニンを含有する組成物をSFDすることにより製造した製剤156-71-1からの粒子を示す。図9eは、10％のBSA、35.9％のトレハロース、18％のマンニトール、35.9％のグルタミン酸アルギニン、0.1％のプルロニックF168および0.1％のメチオニンを含有する組成物をSFDすることにより製造した製剤156-76-1からの粒子を示す。図9fは、10％のBSA、26.9％のトレハロース、26.9％のマンニトール、35.9％のグルタミン酸アルギニン、0.1％のプルロニックF168および0.1％のメチオニンを含有する組成物をSFDすることにより製造した製剤156-76-2からの粒子を示す。
【００２６】
図10a〜10cは、実施例２のサブセクション2.5.5に記載されている研究において評価した特定の粒子製剤の光学顕微鏡写真（100倍の倍率）である。図10aは、10％のBSA、27％のトレハロース、27％のマンニトールおよび36％のアスパラギン酸アルギニンを含有する組成物をSFDすることにより製造した製剤156-80-1からの粒子を示す。図10bは、10％のBSA、5％のプルロニックF168、59.5％のトレハロースおよび25.5％のマンニトールを含有する組成物をSFDすることにより製造した製剤156-80-2からの粒子を示す。図10cは、10％のBSA、35.9％のトレハロース、18％のマンニトール、35.9％のグルタミン酸アルギニン、0.1％のメチオニンおよび0.1％のTween 80を含有する組成物をSFDすることにより製造した製剤156-80-3からの粒子を示す。
【００２７】
図11a〜11dは、実施例３のサブセクション3.4に記載されている研究において評価した特定の粒子製剤の光学顕微鏡写真である。図11aは、-20℃で凍結し環境条件下で解凍した後のAdju-Phosアジュバント（2w/v％のプラセボAlPO4）ゲルを示す。図11bは、噴霧凍結し次に解凍した後のAdju-Phosゲルを示す。図11cは、-20℃で凍結し環境条件下で解凍した後のAlhydrogelアジュバント（2w/v％のプラセボAl(OH)3）ゲルを示す。図11dは、噴霧凍結し次に解凍した後のAlhydrogelゲルを示す。
【００２８】
図12aおよび12bは、実施例３のサブセクション3.5.1に記載されている粒径分析を示す。図12aは、(a) 出発アルミニウム吸着HBsAgゲル（グラフでは曲線（◆）で示す）；(b) 水酸化アルミニウム（3.0w/v％）、マンニトール（1.9w/v％）、グリシン（0.5w/v％）およびデキストラン（0.61w/v％）から形成される「高アルミニウムSFD」組成物（グラフでは曲線（◇）で示す）；ならびに (c) 水酸化アルミニウム（0.6w/v％）、マンニトール（2.8w/v％）、グリシン（1.2w/v％）およびデキストラン（0.58w/v％）から形成される「低アルミニウムSFD」組成物（グラフでは曲線（＊）で示す）についてのAccuSizerによる粒径分析を示す。図12bは、(a) 出発アルミニウム吸着HBsAgゲル（グラフでは曲線（◆）で示す）；および水酸化アルミニウム（3.0w/v％）、マンニトール（1.9w/v％）、グリシン（0.5w/v％）およびデキストラン（0.61w/v％）から形成される組成物を凍結乾燥しC/G/S処理したもの（グラフでは曲線（＊）で示す）についてのAccuSizerによる粒径分析を示す。
【００２９】
図13は、実施例３のサブセクション3.5.1に記載されているELISAの結果を示すものであり、「FD」（水酸化アルミニウム（3.0w/v％）、マンニトール（1.9w/v％）、グリシン（0.5w/v％）およびデキストラン（0.61w/v％)から形成されるSFD組成物）；「FD＜20μm」（水酸化アルミニウム（3.0w/v％）、マンニトール（1.9w/v％）、グリシン（0.5w/v％）およびデキストラン（0.61w/v％）から形成されるSFD組成物、粒径20μmの画分）；「FD 38〜53μm」（水酸化アルミニウム（3.0w/v％）、マンニトール（1.9w/v％）、グリシン（0.5w/v％）およびデキストラン（0.61w/v％）から形成されるSFD組成物、粒径38〜53μmの画分)；「FD 53-75μm」（水酸化アルミニウム（3.0w/v％）、マンニトール（1.9w/v％）、グリシン（0.5w/v％）およびデキストラン（0.61w/v％）から形成されるSFD組成物、粒径53〜78μmの画分）；「SFD 3％アルミニウム」（水酸化アルミニウム（3.0w/v％）、マンニトール（1.9w/v％）、グリシン（0.5w/v％）およびデキストラン（0.61w/v％)から形成されるSFD組成物）；「SFD 0.6％アルミニウム」（水酸化アルミニウム（0.6w/v％）、マンニトール（2.8w/v％）、グリシン（1.2w/v％）およびデキストラン（0.58w/v％)から形成されるSFD組成物）を投与した免疫動物；ならびに「未処理」（未処理の対照動物）において誘導される抗HBsAg抗体の応答として示す。
【００３０】
図14a〜14bは、実施例３のサブセクション3.5.2で得られたELISAの結果を示すものであり、(a) 表皮粉体注射（「EPI」）により送達された、リン酸アルミニウム（1.5w/v％）、トレハロース（1.5w/v％）、グリシン（0.4 w.v％）およびデキストラン（0.6w/v％）から形成される「SFD」組成物；(b) EPIにより送達された、リン酸アルミニウム（5w/v％）およびトレハロース（5w/v％）から形成される「SD」組成物；または(c) 筋肉内（IM）注射により投与された、液体DTワクチン組成物である「未処理」組成物、のいずれかを投与した免疫動物において誘導される抗dT（図14a）および抗tT（図14b）抗体の応答として示す。
【００３１】
図15a〜15eは、実施例４のサブセクション4.4.1に記載されている研究において採取された組織学的皮膚サンプルからのH&E染色切片のデジタル光学顕微鏡画像であり、免疫部位における組織学的変化を示す。図15aは、正常な皮膚（20倍）を示し；図15bは、EPI投与部位（24倍)を示し；図15cは、EPI投与部位（105倍)を示し；図15dは、皮内（ID）注射部位（20倍）を示し；図15eはID注射部位（105倍)を示す。
【００３２】
図16aおよび16bは、実施例４のサブセクション4.5.1に記載されているSFDアルミニウム粉末製剤の走査型電子顕微鏡写真（SEM）である。これらの製剤は、トレハロース（30％）、マンニトール（30％）およびデキストラン（40％）を35w/w％の総固形含量で含有する組成物から形成されるものとした。図16aは、水酸化アルミニウム組成物を示し、図16bは、リン酸アルミニウム組成物を示す。
【００３３】
図17a〜17dは、実施例４のサブセクション4.4.1に記載されている特定の粒子製剤におけるアルミニウム凝集を評価する光学顕微鏡写真である。図17aは、トレハロース（30％）、マンニトール（30％）およびデキストラン（40％）を35w/w％の総固形含量で用いて製剤化した再構成凍結乾燥（FD）水酸化アルミニウム組成物を示す。図17bは、トレハロース（30％）、マンニトール（30％）およびデキストラン（40％）を35w/w％の総固形含量で用いて製剤化した再構成SFD水酸化アルミニウム組成物を示す。図17cは、トレハロース（30％）、マンニトール（30％）およびデキストラン（40％）を35w/w％の総固形含量で用いて製剤化した再構成FDリン酸アルミニウム組成物を示す。図17dは、トレハロース（30％）、マンニトール（30％）およびデキストラン（40％）を35w/w％の総固形含量で用いて製剤化した再構成SFDリン酸アルミニウム組成物を示す。
【００３４】
図18a〜18bは、実施例４のサブセクション4.4.3に記載されている特定の粒子製剤におけるアルミニウム凝集を評価する光学顕微鏡写真である。図18aは、トレハロース（30％）、マンニトール（30％）、デキストラン（40％）およびポリソルベート80を0.5w/w％の総固形含量で用いて製剤化した再構成SFDリン酸アルミニウム組成物を示す（但し、出発時の総固形含量は35w/w％とした）。図18bは、トレハロース（30％）、マンニトール（30％）、デキストラン（40％）およびポリソルベート80を0.5w/w％の総固形含量で用いて製剤化した再構成SFDリン酸アルミニウム組成物を示す（但し、出発時の総固形含量は40w/w％とした）。図18cは、トレハロース（30％）、マンニトール（30％）、デキストラン（40％）およびポリソルベート80を0.5w/w％の総固形含量で用いて製剤化した再構成SFDリン酸アルミニウム組成物を示す（但し、出発時の総固形含量は30w/w％とした）。図18dは、トレハロース（30％）、マンニトール（30％）、デキストラン（40％）およびポリソルベート80を0.5w/w％の総固形含量で用いて製剤化した再構成SFDリン酸アルミニウム組成物を示す（但し、出発時の総固形含量は25w/w％とした）。
【００３５】
図19aおよび19bは、実施例４のサブセクション4.6.1で得られたELISAの結果を示すものであり、HBsAgワクチン組成物を接種した動物の抗HBsAg IgG抗体の力価を幾何学的平均として示す。図19aは、EPIにより送達されるSFD組成物を投与した動物（「SFD/EPI」）［但し、組成物は、25μgの水酸化アルミニウムに吸着させた1μgのHBsAgを含有するSFD製剤（「Al(OH)3」）、または、25μgのリン酸アルミニウムに吸着させた1μgのHBsAgを含有するSFD製剤（「AlPO4」)のいずれかとした］；再構成して液体状にし、IM注射により送達されるSFD組成物を投与した動物（「SFD/再構成/IM」）［但し、組成物は、25μgの水酸化アルミニウムに吸着させた1μgのHBsAgを含有するSFD製剤（「Al(OH)3」）、または、25μgのリン酸アルミニウムに吸着させた1μgのHBsAgを含有するSFD製剤（「AlPO4」)のいずれかとした］；または、25μgのAl(OH)3に吸着させた1μgのHBsAgを含有する市販のB型肝炎ワクチン組成物を投与した対照からの力価を示す。力価は、4週目、6週目および9週目の血清から報告する。図19bは、2.5μgのAlPO4に吸着させた2μgのHBsAgを含有する再構成したSFDワクチン製剤（「SFD/再構成」）；または50μgのAlPO4に吸着させた2μgのHBsAgを含有する慣用のIM用処方の注射液（「液体/市販品」）のいずれかを投与した動物からの力価を示す。力価は4週目および6週目の血清から報告する。
【００３６】
好ましい実施形態の詳細な説明
本発明を詳細に説明する前に、本発明が、特に例示した組成物またはプロセスパラメーターに限定されないことを理解すべきである。また、本明細書中で用いられる技術用語は、単に本発明の特定の実施形態を説明するためのものであって、限定しようとするものではないことも理解すべきである。
【００３７】
本明細書中で引用される前掲または後掲の全ての刊行物、特許および特許出願は、参照により、それらの全体が本明細書に組み込まれる。
【００３８】
本明細書および添付の特許請求の範囲で用いられているように、単数形「a」、「an」および「the」は、その内容が明確にそうでないと指示されていない限り、複数の指示対象物も包含することに注意すべきである。したがって、例えば、「粒子（a particle）」という場合は、そうした粒子の2個以上の混合物を包含し、「賦形剤（an exipient）」という場合は、そうした賦形剤の2種以上の混合物を包含する。
【００３９】
A.定義
特にそうではないと指示されていない限り、本明細書中で用いられる全ての技術的および科学的な用語は、本発明が関係する当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を持つ。本明細書中で記載されるものと類似または同等である多くの方法および物質が、本発明の実施に使用できるが、本明細書では好ましい物質および方法が記載されている。
【００４０】
本発明を説明する上で、以下の用語が用いられており、以下に示すように定義されるものとする。
【００４１】
本明細書中で用いられる「薬剤（「pharmaceutical」または「pharmaceutical agent」）という用語は、生物（ヒトまたは動物）に投与されると、局所的および／または全身的な作用によって目的とする薬理学的および／または生理学的な作用を誘導する、任意の化合物または組成物を意味するものである。したがって、この用語は、慣習的に薬物として見なされている化合物または化学物質、ならびにペプチド、ホルモン、核酸、遺伝子構築物などの分子を含む生物薬剤を包含する。更に詳細にいうと、この「薬剤」という用語は、あらゆる主要な治療分野で使用するための化合物または組成物を包含し、例えば（しかしそれらに限定されないが）、抗感染剤（例えば抗生物質、抗ウイルス剤）；鎮痛剤および鎮痛剤の組合せ；局所および全身麻酔剤；食欲減退剤；抗関節炎剤；抗喘息剤；抗痙攣剤；抗鬱剤；抗ヒスタミン剤；抗炎症剤；抗嘔吐剤；抗腫瘍剤；止痒剤；抗精神病剤；解熱剤；鎮痙剤；心血管系用製剤（カルシウムチャンネル遮断剤、ACE-阻害剤、β-ブロッカー、β-アゴニストおよび抗不整脈剤を含む）；抗高血圧剤；利尿剤；血管拡張剤；中枢神経系刺激剤；咳および風邪用製剤；鬱血除去剤；診断剤；ホルモン；骨成長刺激剤および骨再吸収阻害剤；免疫抑制剤；筋弛緩剤；精神刺激剤；鎮静剤；精神安定剤；治療用タンパク質（例えば、抗原、抗体、成長因子、サイトカイン、インターロイキン、リンホカイン、インターフェロン、酵素など）、ペプチドおよびそれらの断片（天然に存在するものでも、化学的に合成されたものでも、または組換えにより製造されたものでもよい）；ならびに、核酸分子（2個または3個のヌクレオチドが重合した形態；二本鎖および一本鎖の分子の双方を含むリボヌクレオチド（RNA）またはデオキシリボヌクレオチド（DNA）、遺伝子構築物、発現ベクター、アンチセンス分子など）などが挙げられる。
【００４２】
「抗原」とは、宿主の免疫系を刺激して細胞性の抗原特異的免疫応答または液性抗体応答を引き起こす1つ以上のエピトープを含む分子を意味する。したがって、抗原としては、抗原性タンパク質の断片を含むポリペプチド、オリゴ糖、多糖などが含まれる。更に、抗原は、任意の公知のウイルス、細菌、寄生虫、植物、原生動物または真菌に由来するものとすることができ、生物全体であってもよい。また、この用語には腫瘍抗原も含まれる。同様に、例えばDNA免疫化の用途におけるような抗原を発現するオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドもまた、抗原の定義に含まれる。また、合成抗原も含まれ、例えば、ポリペプチド、隣接するエピトープ、および他の組換えまたは合成により誘導される抗原が挙げられる（Bergmannら, (1993) Eur. J. Immunol. 23：2777-2781；Bergmannら, (1996) J. Immunol. 157：3242-3249；Suhrbier, A. (1997) Immunol. and Cell Biol. 75：402-408；Gardnerら, (1998) 12th World AIDS Conference, Geneva, Switzerland, June 28-July 3, 1998）。
【００４３】
上記の薬剤は、単独または他の薬剤と組み合わせて、典型的には医薬組成物として調製され、これは、担体、ビヒクルおよび／または賦形剤などの1種以上の追加の物質を含むことができる。「担体」、「ビヒクル」および「賦形剤」とは、一般に、非毒性で、組成物の他の成分とは有害な形で相互作用しない、実質的に不活性な物質をいう。これらの物質は、粒子状の医薬組成物中の固形分の量を増大させるために使用してもよい。好適な担体の例としては、水、シリコーン、ゼラチン、ワックス（蝋）などの物質が挙げられる。通常用いられる「賦形剤」の例としては、単糖、二糖、シクロデキストランおよび多糖（例えば、デキストロース、スクロース、ラクトース、トレハロース、ラフィノース、マンニトール、ソルビトール、イノシトール、デキストランおよびマルトデキストラン）を含む製薬等級の炭水化物；デンプン；セルロース；塩（例えば、リン酸ナトリウムもしくはカルシウム、硫酸カルシウム、硫酸マグネシウム）；クエン酸；酒石酸；グリシン；高分子量ポリエチレングリコール（PEG）；ポリビニルピロリドン（PVP）；プルロニック（Pluronics）；界面活性剤；ならびにそれらの組合せが挙げられる。一般に、担体および／または賦形剤が用いられる場合、それらは医薬組成物の約0.1〜99 wt％の範囲の量で使用される。
【００４４】
本明細書中で用いられる「粉体」という用語は、無針注射器装置を用いて経皮的に送達できる、実質的に固形粒子からなる組成物をいう。粉体を構成する粒子は、平均粒径、平均粒子密度、粒子の形態（例えば、粒子の空気力学的形状および粒子の表面特性）、ならびに粒子の透過エネルギー（P.E.）など（しかし、それらに限定されない）の多くのパラメーターに基づいて特徴付けることができる。
【００４５】
本発明による粉体の平均粒径は、広範にわたって様々なものとすることができ、通常は0.1〜250μm、例えば10〜100μm、更に典型的には20〜70μmである。粉体の平均粒径は、顕微鏡法（この場合、粒子は、一まとめにして統計学的に測定されるのではなくて、直接、個々に測定される）、気体の吸着、透過性または飛行時間などの慣用の技法を用いて、質量平均空気動力学的直径（MMAD）として測定できる。所望により、自動粒径測定装置（例えばAerosizerカウンター、コールターカウンター、HIACカウンター、またはGelman自動粒子カウンター）を用いて、平均粒径を確認することができる。
【００４６】
実際の粒子密度、すなわち「真密度」は、ヘリウムピクノメトリー（helium pycnometry）などの公知の定量法を用いて容易に確認できる。あるいはまた、エンベロープ（「タップ」）密度測定を用いて、本発明による粉体の密度を評価することができる。本発明の粉体のエンベロープ密度は、通常、0.5〜25g/cm3、好ましくは0.8〜1.5g/cm3である。
【００４７】
エンベロープ密度の情報は、大きさや形状が不規則な物体の密度の特性付けに特に有用である。エンベロープ密度は、物体の質量をその容積で除算したものであり、その場合、容量とは、その空隙と小さな窪みの容積は含むが、内部にある空隙は含まない。エンベロープ密度の多くの測定方法が当業界では公知であり、例えば、ワックス浸漬法（wax immersion）、水銀置換法、水吸収法、および見かけ比重法が挙げられる。また、エンベロープ密度を測定するための多くの適切な装置も利用可能であり、例えば、Micromeritics Instrument Corp から入手可能なGeoPycJ 1360モデルが挙げられる。医薬組成物サンプルの真密度とエンベロープ密度との差から、そのサンプルの％全孔隙率と比空隙容積についての情報が得られる。
【００４８】
粒子の形態、特に粒子の空気動力学的形状は、標準的な光学顕微鏡法を用いて容易に評価できる。本発明の粒子を構成する粒子は、実質的に球形または少なくとも実質的に楕円形の空気動力学的形状であることが好ましい。また、粒子は、棹状または針状の粒子の存在を回避するために、軸比が3以下であることが好ましい。これらの同様の顕微鏡法は、粒子の表面特性（例えば表面の空隙の量および程度または空隙度）を評価するのにも使用できる。
【００４９】
粒子の透過エネルギーは、例えばメタライズドフィルムP.E.試験のような、多くの慣用の技法を用いて確認できる。金属で被覆したフィルム材料（例えば、片側に350Åのアルミニウム層を蒸着した125μmのポリエステルフィルム）が支持体として使用され、そこに、粉体が無針注射器（例えば、Bellhouseらの米国特許第5,630,796号に記載されている無針注射器）から約100〜3000m/秒の初期速度で噴射される。金属で被覆したフィルムは、金属被覆面を上にして、適当な表面に置く。
【００５０】
粉体を搭載した無針注射器は、そのスペーサーを該フィルムと接触させて設置し、次いで噴射させる。適切な溶剤を用いて金属で被覆したフィルム表面から残留する粉体を除去する。次に、BioRad Model GS-700画像形成デンシトメーターを用いて金属で被覆したフィルムをスキャンして透過エネルギーを評価し、SCSIインターフェースを有しMultiAnalystソフトウェア（BioRad）およびMatlabソフトウェア（Release 5.1, The MathWorks, Inc.）を搭載したパーソナルコンピューターを用いて、そのデンシトメーターの読取り値を評価する。デンシトメーターの透過法または反射法のいずれかを用いて得られたデンシトメーターのスキャン値を、プログラムを用いて処理する。噴霧凍結乾燥した粉体の透過エネルギーは、同じ大きさを持つ再処理されたマンニトール粒子［同じ出願人による国際特許出願WO 97／48485（参照により本明細書に組み込まれる）の方法に従って凍結乾燥・圧縮・粉砕・篩いがけしたマンニトール粒子］と同等であるか、それよりも良好でなければならない。
【００５１】
「核酸分子」および「ポリヌクレオチド」という用語は、本明細書中では交換可能に用いられ、任意の長さのヌクレオチド（デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドのいずれか）またはそれらの類似体の重合形態をいう。ポリヌクレオチドは、どのような三次元構造を有していてもよく、既知または未知のいかなる機能を示してもよい。ポリヌクレオチドの非限定的な例としては、遺伝子、遺伝子断片、エキソン、イントロン、メッセンジャーRNA（mRNA）、トランスファーRNA、リボゾームRNA、リボザイム、cDNA、組換えポリヌクレオチド、分岐ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、あらゆる配列の単離DNA、あらゆる配列の単離RNA、核酸プローブおよびプライマーが挙げられる。
【００５２】
ポリヌクレオチドは、典型的には、4種のヌクレオチド塩基：アデニン(A)；シトシン(C)；グアニン(G)；およびチミン(T)（ポリヌクレオチドがRNAである場合はチミン(T)の代わりにウラシル(U)である）からなる特定の配列から構成される。したがって、「核酸配列」という用語は、ポリヌクレオチド分子のアルファベット表記である。このアルファベット表記は、中央演算処理装置を有するコンピューターのデータベースに入力されて、ファンクショナルゲノミックスや相同性検索などのバイオインフォーマティクスの用途に使用できる。
【００５３】
「ベクター」とは、核酸配列を標的細胞へ導入できるものである（例えば、ウイルスベクター、非ウイルスベクター、粒状担体およびリポソーム）。典型的には、「ベクター構築物」、「発現ベクター」および「遺伝子導入ベクター」とは、関心のある遺伝子の発現を指令でき、且つ遺伝子配列を標的細胞へ導入できる任意の核酸構築物を意味する。したがって、この用語には、クローニング用および発現用のビヒクルならびにウイルスベクターが含まれる。「プラスミド」とは、染色体外遺伝子エレメントの形態のベクターである。
【００５４】
特定の抗原を「コード」する核酸配列とは、適当な調節配列の制御下に置かれると、in vivoでポリペプチドへと転写（DNAの場合）および翻訳（RNAの場合）される核酸分子である。コード配列の境界は、5’（アミノ）末端にある開始コドンと3’（カルボキシ）末端にある翻訳終結コドンとによって決定される。本発明の目的のためには、そのような核酸配列としては、限定するものではないが、ウイルス、原核生物もしくは真核生物のmRNAに由来するcDNA、ウイルスもしくは原核生物のDNAもしくはRNAに由来するゲノム配列、更に合成DNA配列が挙げられる。転写終結配列は、コード配列の3’側に位置することができる。
【００５５】
「プロモーター」とは、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの転写を開始し調節するヌクレオチド配列である。プロモーターとしては、誘導性プロモーター（そのプロモーターに機能し得る形で連結されているポリヌクレオチド配列の発現がアナライト、共因子、調節タンパク質などにより誘導される）、抑制性プロモーター（そのプロモーターに機能し得る形で連結されているポリヌクレオチド配列の発現がアナライト、共因子、調節タンパク質などにより抑制される）、および構成的プロモーターを挙げることができる。「プロモーター」または「調節エレメント」という用語は、全長プロモーター領域およびこれらの領域の機能性の（例えば転写または翻訳を調節する）セグメントを含むものとする。
【００５６】
「機能し得る形で連結されている」とは、そのように記載されている成分がそれらの通常の機能を発揮するように配置されているエレメントの並びをいう。したがって、核酸配列に機能し得る形で連結されている所与のプロモーターは、適切な酵素が存在する場合に、その配列を発現させることができる。プロモーターは、それが配列の発現を指令するように機能する限りは、必ずしもその配列と共に配置されなくてもよい。したがって、例えば、プロモーター配列と核酸配列との間に、翻訳されていないが転写されている介在配列が存在することができ、それでも、そのプロモーター配列はコード配列に「機能し得る形で連結されている」と考えることができる。
【００５７】
「核酸免疫化」という用語は、本明細書では、1つ以上の特定の抗原をin vivoで発現させるための、その抗原をコードする核酸分子の宿主細胞への導入をいうのに用いられる。その核酸分子は、経皮粒子送達によってレシピエント被験体に直接導入することができる。あるいはまた、その分子は、被験体から取り出した細胞にex vivoで導入することも可能である。この後者の場合、関心のある核酸分子を含む細胞は、その被験体に再導入されて、その核酸分子をコードする抗原に対して免疫応答が誘導できるようにする。そのような免疫化に用いられる核酸分子は、本明細書中では一般に「核酸ワクチン」と呼ぶ。
【００５８】
「固形含量」という用語は、使用される溶剤に溶解または懸濁している固体の量を示す。
【００５９】
「被験体」という用語は、脊索動物（cordata）亜門の任意のメンバーをいい、限定するものではないが、例えば、ヒト、ならびにチンパンジーおよび他のサルおよびサル種などのヒト以外の霊長類などの霊長類；ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギおよびウマなどの農用動物；イヌおよびネコなどの家庭動物；マウス、ラットおよびモルモットなどの齧歯類動物を含む実験用動物；ニワトリ、七面鳥および他の家禽鳥、カモ、ガチョウなどの家庭、野生および狩猟の鳥を含む鳥類などが挙げられる。この用語は、特定の年齢を示していない。したがって、成体の個体および新生の個体の両者が包含されるものとする。本明細書中で記載される方法は、上記の脊索動物種のいずれかにおいて使用されるものとする。何故ならば、これらの脊索動物の全ての免疫系がほぼ同じ様に作動するからである。
【００６０】
「経皮送達」という用語は、経皮的（transdermal (「percutaneous」)経路および経粘膜経路の両者での投与、すなわち、皮膚および粘膜組織を通っての送達を含む。例えば、Transdermal Drug Delivery：Developmental Issues and Research Initiatives, Hadgraft and Guy (eds.), Marcel Dekker, Inc., (1989)；Controlled Drug Delivery：Fundamentals and Applications, RobinsonおよびLee (編), Marcel Dekker Inc., (1987)；ならびにTransdermal Delivery of Drugs, 第1-3巻, KydonieusおよびBerner (編), CRC Press, (1987)を参照されたい。
【００６１】
B.一般的方法
本発明は、無針注射器による経皮送達に適する粉体の製造方法に関する。そうした場合、粉末組成物を構成する粒子は、音速の数倍までの急な加速ならびに皮膚および組織との衝撃およびそれらの通過に耐えるのに十分な物理的強度を有する必要がある。
【００６２】
これらの特性を有する粉体を達成するために、本発明の方法は、目的とする薬剤を含み、且つ溶剤系中での総固形含量が20重量％以上である溶液または懸濁液を用いて実施される。好ましくは、溶剤系中での固形含量は25重量％以上であり、更に好ましくは28重量％もしくは30重量％以上であり、特に好ましくは40重量％以上である。固形含量が20重量％以上の溶液または懸濁液を使用すると、乾燥プロセス中の空隙の形成が最低限に抑えられ、形成される粒子の密度が増大する。この密度の増大は、粒子が無針注射器からの経皮送達の過酷な条件を生き抜くのに十分に強固であることを確実にする上で重要である。溶液または懸濁液の固形含量は、50重量％以下、60重量％以下、更には70重量％以下とすることができる。この上限は、例えば、溶液または懸濁液の特定の成分や、得られる噴霧凍結乾燥粒子の目的とする特性に応じて異なる。
【００６３】
本発明の粉体の製造に用いられる薬剤は、関心の持たれる任意の小分子の薬物物質、有機もしくは無機化学物質、ワクチン、またはペプチド（ポリペプチドおよび／もしくはタンパク質）とすることができる。特定の実施形態では、薬剤は、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質または任意の他のそうした生物学的分子の生物薬剤製剤である。典型的なペプチドおよびタンパク質の製剤としては、限定するものではないが、インスリン；カルシトニン；オクトレオチド；エンドルフィン；リプレシン；下垂体ホルモン（例えば、ヒト成長ホルモンおよび組換えヒト成長ホルモン（hGHおよびrhGH）、HMG、酢酸デスモプレシン、等）；卵胞ルテオイド（follicle luteoids）；成長因子［成長ホルモン放出因子（GHRF)、ソマトスタチン、ソマトトロピンおよび血小板由来成長因子）；アスパラギナーゼ；絨毛性ゴナドトロピン；コルチコトロピン（ACTH）；エリトロポイエチン（EPO）；エポプロステノール（血小板凝集抑制剤）；グルカゴン；インターフェロン；インターロイキン；メノトロピン（ウロホリトロピン、卵胞刺激ホルモン（FSH）および黄体形成ホルモン（LH）を含む）；オキシトシン；ストレプトキナーゼ；組織プラスミノーゲンアクチベーター（TPA）；ウロキナーゼ；バソプレシン；デスモプレシン；ACTH類似体；アンジオテンシンIIアンタゴニスト；抗利尿ホルモンアゴニスト；ブラジキニンアンタゴニスト；CD4分子；抗体分子および抗体断片（例えば、Fab、Fab2、FvおよびsFv分子）；IGF-1；神経栄養因子；コロニー刺激因子；副甲状腺ホルモンおよびアゴニスト；副甲状腺ホルモンアンタゴニスト；プロスタグランジンアンタゴニスト；プロテインＣ；プロテインＳ；レニン阻害剤；血栓溶解剤；腫瘍壊死因子（TNF）；ワクチン（特に、サブユニットおよび合成ペプチド調整物を含むペプチドワクチン）；バソプレシンアンタゴニスト類似体；ならびにα-1アンチトリプシンが挙げられる。更に、その後の遺伝子送達で使用するためのベクターまたは遺伝子構築物などの核酸調製物が使用可能である。
【００６４】
ここで使用するための特に好適な薬剤は抗原である。本明細書中で定義されるいずれの好適な抗原も使用できる。抗原はウイルス性抗原とすることができる。したがって、抗原は、特に、ピコナウイルス科（Picornaviridae）（例えばポリオウイルスなど）；カリシウイルス科（Caliciviridae）；トガウイルス科（Togaviridae）（例えば風疹ウイルス、デングウイルスなど）；フラビウイルス科（Flaviviridae）；コロナウイルス科（Coronaviridae）；レオウイルス科（Reoviridae）；ビルナウイルス科（Birnaviridae）；ラボドウイルス科（Rhabodoviridae）（例えば狂犬病ウイルスなど）；フィロウイルス科（Filoviridae）；パラミクソウイルス科（Paramyxoviridae）（例えば流行性耳下腺炎（おたふく風邪）ウイルス、麻疹ウイルス、呼吸器多核体ウイルスなど）；オルトミクソウイルス科（Orthomyxoviridae）（例えばインフルエンザウイルスA型、B型およびC型など）；ブニヤウイルス科（Bunyaviridae）；アレナウイルス科（Arenaviridae）；レトロウイルス科（Retroviradae）（例えばHTLV-I；HTLV-II；HIV-1およびHIV-2）；ならびにサル免疫不全ウイルス（SIV）のメンバーに由来するものとすることができる。
【００６５】
あるいはまた、ウイルス性抗原は、パピローマウイルス（例えばHPV）；ヘルペスウイルス；肝炎ウイルス（例えば、A型肝炎ウイルス（HAV）、B型肝炎ウイルス（HBV）、C型肝炎ウイルス（HCV）、デルタ肝炎ウイルス（HDV）、E型肝炎ウイルス（HEV）もしくはG型肝炎ウイルス（HGV）；ならびにダニ媒介性脳炎ウイルスに由来するものとすることができる。これらのウイルスの説明については、例えば、Virology, 第3版 (W.K. Joklik編. 1988)；Fundamental Virology, 第2版 (B.N. FieldsおよびD.M. Knipe,編. 1991)を参照されたい。
【００６６】
本発明で使用するための細菌性抗原は、ジフテリア、コレラ、結核、破傷風、百日咳、髄膜炎、および他の病原性状態を引き起こす生物に由来するものとすることができ、例えば、髄膜炎菌（Meningococcus）A型、B型およびC型、インフルエンザ菌（Hemophilus influenza）B型（HIB）、ならびにヘリコバクター・ピロリ（Helicobacter pylori）が挙げられる。細菌性抗原の組合せが提供でき、例えば、ジフテリア、百日咳および破傷風の抗原が挙げられる。好適な百日咳抗原は、百日咳毒素および／または糸状菌ヘマグルチニンおよび／またはパータクチン（あるいはP69とも呼ばれる）である。抗寄生虫性抗原は、マラリアおよびライム病を引き起こす生物に由来するものとすることができる。
【００６７】
本発明で使用するための抗原は、当業者に公知の種々の方法を用いて製造できる。特に、抗原は、標準的な精製法を用いて天然の供給源から直接単離することができる。あるいはまた、殺傷、弱毒化または不活性化された細菌、ウイルス、寄生虫または他の微生物の全体を用いることも可能である。更に、抗原は、公知の技法を用いて組換えにより製造することもできる。例えば、Sambrook, Fritsch & Maniatis, Molecular Cloning：A Laboratory Manual, 第IおよびII巻 (D.N. Gloverら. 1985)を参照されたい。
【００６８】
また、ここで使用するための抗原は、記載されているアミノ酸配列に基づいて、固相ペプチド合成などの化学的な重合体合成により合成することも可能である。そのような方法は、当業者には公知である。例えば、固相ペプチド合成法については、J.M. StewartおよびJ.D. Young, Solid Phase Peptide Synthesis,第2版, Pierce Chemical Co., Rockford, IL (1984)およびG. BaranyおよびR. B. Merrifield, The Peptides：Analysis, Synthesis, Biology, E. GrossおよびJ. Meienhofer編, 第2巻, Academic Press, New York, (1980), pp. 3-254を；そして古典的な溶液重合については、M. Bodansky, Principles of Peptide Synthesis, Springer-Verlag Berlin (1984)およびE. GrossおよびJ. Meienhofer,編, The Peptides：Analysis, Synthesis, Biology,（前掲）, 第1巻を参照されたい。
【００６９】
あるいはまた、薬剤は、核酸分子とすることができる。したがって、薬剤は、例えばDNA免疫化の用途におけるような、抗原を発現するポリヌクレオチドとすることができる。したがって、抗原などの目的とするポリペプチドをコードする核酸配列がプロモーターに機能し得る形で連結されている発現ベクターを用いることができる。
【００７０】
典型的には、核酸分子は、被験体への送達のための治療上適切なヌクレオチド配列を含む。したがって、核酸分子は、標的細胞のゲノムから欠損している、すなわち失われているタンパク質をコードする1つ以上の遺伝子、または目的とする生物学的作用もしくは治療作用（例えば抗ウイルス機能）を有する非天然のタンパク質をコードする1つ以上の遺伝子を含むことができる。この分子は、免疫性を付与できる配列（例えば被験体内で液性および／または細胞性応答を誘発するのに役立つ免疫原性の配列）、またはアンチセンスもしくはリボザイム機能を有する分子に対応する配列を含み得る。遺伝的障害の治療の場合、その特定の障害で欠失していることが判っている遺伝子に相当する機能性遺伝子を被験体に投与することができる。
【００７１】
送達のための好適な核酸としては、例えば、AIDS、癌、神経学的疾患、心血管系疾患、高コレステロール血症などの障害；種々の貧血、地中海貧血および血友病を含む種々の血液障害；嚢胞性線維腫、ゴーシェ病、アデノシンデアミナーゼ（ADA）欠損症、気腫などの遺伝的欠陥などの、炎症性疾患、自己免疫疾患、慢性疾患および感染性疾患の治療に用いられるものが挙げられる。癌およびウイルス性疾患のためのアンチセンス療法において有用な多くのアンチセンスオリゴヌクレオチド（例えばmRNAの翻訳開始部位（AUGコドン）近傍の配列に相補的な短鎖オリゴヌクレオチド）が当業界では記載されている。例えば、Hanら (1991) Proc. Natl. Acad. Sci USA 88：4313；Uhlmannら (1990) Chem. Rev. 90：543, Heleneら (1990) Biochim. Biophys. Acta. 1049：99；Agarwalら (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85：7079；およびHeikkilaら (1987) Nature 328：445を参照されたい。また、本明細書中での使用に適する多くのリボザイムも記載されている。例えば、Checら (1992) J. Biol. Chem. 267：17479および米国特許第5,225,347号（Goldbergら）を参照されたい。
【００７２】
例えば、固形腫瘍の治療方法では、有毒ペプチド（すなわち、リシン、ジフテリア毒素およびコブラ毒因子などの化学療法剤）をコードする遺伝子、p53などの腫瘍抑制遺伝子、トランスフォームしている癌遺伝子に対してアンチセンスであるmRNA配列、腫瘍壊死因子（TNF）および他のサイトカインなどの抗腫瘍ペプチドをコードする遺伝子、またはトランスフォームしている癌遺伝子のトランスドミナントネガティブ突然変異体を、腫瘍部位またはその近傍で発現させるために送達することができる。
【００７３】
同様に、抗ウイルス活性および／または抗細菌活性を示すか宿主の免疫系を刺激することが判っているペプチドをコードする核酸も投与できる。この核酸は、インターロイキン、インターフェロン、ケモカイン、化学走性因子（chemotaxic factors）およびコロニー刺激因子などの種々のサイトカイン（またはそれらの機能性断片）の1つをコードするものとすることができる。この核酸は、例えば（しかしそれらに限定されないが）、癌、アレルギー、毒性、ならびに真菌、ヒト・パピローマウイルス（HPV）、HIV、HSV2／HSV1、インフルエンザウイルス（A型、B型およびC型）、ポリオウイルス、RSVウイルス、ライノウイルス、ロタウイルス、A型肝炎ウイルス、ノーウォークウイルス群、エンテロウイルス、アステロウイルス、麻疹ウイルス、パラインフルエンザ（Par Influenza）ウイルス、流行性耳下腺炎（おたふく風邪）ウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、サイトメガロウイルス、エプスタイン・バーウイルス、アデノウイルス、風疹ウイルス、ヒトT細胞リンパ種I型ウイルス（HTLV-I）、B型肝炎ウイルス（HBV）、C型肝炎ウイルス（HCV）、D型肝炎ウイルス、天然痘ウイルス、マルブルグおよびエボラなどのウイルス； M. ツベルクローシス（M. tuberculosis）（結核菌）、クラミジア（Chlamydia）、N. ゴノレエ（N. gonorrhoeae）（淋菌）、シゲラ（Shigella）（赤痢菌）、サルモネラ（Salmonella）,ビブリオ・コレラ（Vibrio Cholera）（コレラ菌）、トレポネーマ・パリデュア（Treponema pallidua）（梅毒菌）、シュードモナス（Pseudomonas）、ボルデテラ・パートゥッシス（Bordetella pertussis）（百日咳菌）、ブルセラ（Brucella）、フランシセラ・ツラレンシス（Franciscella tulorensis）（野兎病菌）、ヘリコバクター・ピロリ（Helicobacter pylori）、レプトスピラ・エンテロガンス（Leptospria interrogaus）（レプトスピラ病菌）、レジオネラ・ニューモフィラ（Legionella pnumophila）、エルシニア・ペスチス（Yersinia pestis）（ペスト菌）、ストレプトコッカス（Streptococcus）（A型およびB型）、ニューモコッカス（Pneumococcus）（肺炎球菌）、メニンゴコッカス（Meningococcus）（髄膜炎菌）、ヘモフィルス・インフルエンザ（Hemophilus influenza）（インフルエンザ菌）（b型）、トキソプラズマ・コンディ（Toxoplama gondic）、キャンピリバクテリオシス（Complybacteriosis）（キャンピリバクター症菌）、モラクセラ・カタラーリス（Moraxella catarrhalis）、ドノヴァン症（Donovanosis）および放線菌症（Actinomycosis）などの細菌；カンジダ症（Candidiasis）およびアスペルギルス症（Aspergillosis）などの真菌病原体；テニア属（Taenia）、吸虫、回虫、アメーバ、ジアルジ属（Giardia species）、クリプトスポリジウム（Cryptosporidium）、シストソーマ属（Schitosoma species）、ニューモシスチス・カリニ（Pneumocystis carinii）、鞭虫症属（Trichuriasis species）および旋毛虫属（Trichinella species）などの寄生虫病原体など（しかし、それらに限定されない）の病原体による感染症などの多くの症状を治療または予防するための抗原をコードするものとすることができる。また、この核酸は、口蹄疫、コロナウイルス、パスツレラ・マルトシダ（Pasteurella multocida）、ヘリコバクター（Helicobacter）、ストロンギルス・ウルガリス（Strongylus vulgaris）、アクチノバチルス・プルロニューモニア（Actinobacillus pleuropneumonia）、ウシ・ウイルス性下痢ウイルス（BVDV）、クレブシエラ・ニューモニエ（Klebsiella pneumoniae）、E.コリー（E. Coli）（大腸菌）、ボルデテラ・パートゥッシス（Bordetella pertussis）、, ボルデテラ・パラパートゥッシス（Bordetella parapertussis）およびブロキセプティカ（brochiseptica）などの多くの獣医学的疾患に対して適切な免疫応答をもたらすのにも使用できる。したがって、1つの態様において、本発明の粒子は、ワクチンとしての使用が見出される。
【００７４】
また、本発明は、例えば特定の相補的配列にハイブリダイズすることによってこれらの配列の転写および／または翻訳を抑制できるオリゴヌクレオチドを送達するための、アンチセンス療法における使用が見出される。したがって、特定の疾患の進行に必要なタンパク質をコードするDNAまたはRNAをターゲティングし、それにより疾患プロセスを破壊することができる。アンチセンス療法、および疾患の原因となる遺伝子の発現を抑制または調節するために特定の核酸標的配列に特異的且つ予期どおりに結合できる多くのオリゴヌクレオチドは公知であり、当業者であれば容易に入手可能である。Uhlmannら (1990) Chem Rev. 90：543；Neckersら (1992) Int. Rev. Oncogenesis 3, 175；Simonsら (1992) Nature 359, 67；Bayeverら (1992) Antisense Res. Dev. 2：109；Whitesellら (1991) Antisense Res. Dev. 1：343；Cookら (1991) Anti-cancer Drug Design 6：585；Eguchiら (1991) Ann. Rev. Biochem. 60：631。したがって、アンチセンス療法において使用するための、宿主細胞内の標的配列に選択的に結合できるアンチセンスオリゴヌクレオチドが、本明細書で提供される。
【００７５】
本発明で用いられる抗原または他の薬剤は、場合によっては、アルミニウム塩アジュバントまたはカルシウム塩アジュバントなどのアジュバントに吸着されていてもよい。あるいはまた、抗原または他の薬剤は、アジュバントを用いずに使用することができる。好適なアジュバントとしては、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、硫酸アルミニウムおよびリン酸カルシウムが挙げられる。
【００７６】
薬剤は、典型的には、適当な水性担体、ならびに好適な賦形剤、保護剤、溶剤、塩、界面活性剤、緩衝化剤などを用いて、水性の医薬組成物として調製される。好適な賦形剤としては、個体に投与されても無害であり、薬剤とはその薬学的活性を変化させるようには有意に相互作用しない任意の物質を挙げることができる。通常用いられる賦形剤の例としては、限定するものではないが、製薬等級のデキストロース、スクロース、ラクトース、トレハロース、マンニトール、ソルビトール、イノシトール、デキストラン、デンプン、セルロース、リン酸ナトリウムもしくはカルシウム、炭酸カルシウム、硫酸カルシウム、クエン酸ナトリウム、クエン酸、酒石酸、グリシン、高分子量ポリエチレングリコール（PEG）、およびそれらの組合せが挙げられる。好適な溶剤としては、限定するものではないが、塩化メチレン、アセトン、メタノール、エタノール、イソプロパノール、および水が挙げられる。典型的には、水が溶剤として用いられる。一般に、約1mM〜2Mの範囲のモル濃度を有する薬学的に許容される塩が使用できる。薬学的に許容される塩としては、例えば、塩酸塩、臭素酸塩、リン酸塩、硫酸塩などの無機酸の塩；酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩、安息香酸塩などの有機酸の塩が挙げられる。薬学的に許容される賦形剤、ビヒクルおよび補助物質についての十分な説明は、REMINGTON’S PHARMACEUTICAL SCIENCES (Mack Pub. Co., N.J. 1991)（参照により本明細書に組み入れられるものとする）に掲載されている。
【００７７】
本発明での使用のために選択される賦形剤は、例えばタンパク質の安定化または表面保護などの特定の機能を果たすものであってもよいし、あるいは、バルキング剤として、もしくは粉体の吸湿性を低く維持するために使用してもよい。本発明は任意の特定の賦形剤の使用に限定されるものではないが、特に好適な賦形剤としては、糖（非晶質の糖でも結晶性の糖でもよい）、ポリマー、またはアミノ酸もしくはそれらの生理学的に許容される塩が挙げられる。これらの特定の賦形剤組成を用いれば、凍結の間に粒子を崩壊させ密度を高めて、無針注射器による注入に特に適する粉体を提供することが可能になる。糖は、単糖、二糖、またはそれより大きなオリゴ糖もしくは多糖とすることができる。賦形剤は、炭水化物、糖および糖アルコールから選択することができる。そうした賦形剤は、結晶性であっても非晶質であってもよい。
【００７８】
好ましくは、これらの添加剤の1種、2種または3種が、溶液中または懸濁液中に少なくとも15重量％、好ましくは少なくとも20重量％（例えば少なくとも25重量％、28重量％または30重量％）、更に好ましくは少なくとも40重量％の量で存在する。そのような添加剤は、50重量％以下、60重量％以下、更には70重量％以下の量で存在できる。この上限は、例えば、用いられる特定の添加剤や、得られる噴霧凍結乾燥粒子の目的とする特性に応じて異なる。最も好ましくは、1種または2種の異なる賦形剤が用いられる。
【００７９】
好適な非晶質の糖類としては、糖（sugar）が挙げられる。したがって、非晶質の賦形剤は、デキストロース、スクロース、ラクトース、トレハロース、セロビオース、ラフィノース、イソマルトース、およびシクロデキストリンなどの他の炭水化物から選ぶことができる。そのような糖は、噴霧凍結乾燥プロセスおよび長期保存の間に、薬剤として用いられるタンパク質を安定化することができる。
【００８０】
好適な結晶性の炭水化物、糖および糖アルコールとしては、マンニトール、ソルビトール、およびアリトールが挙げられる。そのような結晶性の賦形剤と非晶質の賦形剤（典型的には非晶質の糖）との組合せは、凍結乾燥中での粒子の崩壊を促進し、高密度の粒子の形成を補助する。
【００８１】
好適なポリマーとしては、デキストランまたはマルトデキストランなどの多糖；デンプン；セルロース；ポリビニルピロリドン（PVP）、特にPVP K-17；ポリビニルアルコール（PVA）；ならびにポリエチレングリコール（PEG）、特に分子量が8,000のPEGが挙げられる。デキストランが好ましい。種々の等級のデキストランが入手可能である。好適なデキストランは、分子量が約15,000以上のもの、例えば約15,000〜約45,000、約60,000〜約90,000、または約100,000〜約200,000のものである。ポリマーを賦形剤として添加すると、流動性が改善された粉体が得られる傾向があり、また、タンパク質の安定性が向上したものも得ることができる。
【００８２】
好適なアミノ酸およびそのアミノ酸の生理学的に許容される塩としては、グリシン、アラニン、グルタミン、アルギニン、リシンおよびヒスチジン、ならびにそれらの塩、例えばナトリウム塩、カリウム塩もしくはマグネシウム塩などのアルカリ金属塩またはアルカリ土類金属塩、またはグルタミン酸塩もしくはアスパラギン酸塩などの他のアミノ酸との塩が挙げられる。
【００８３】
本発明で使用するための最も好ましい賦形剤の組合せは、非晶質の糖および結晶性の糖、ならびに場合によってはポリマーおよび／またはアミノ酸もしくはその塩を含む。賦形剤は、典型的には10〜90重量％、好ましくは50〜80重量％、更に好ましくは60〜75重量％の量で存在する非晶質の糖と、典型的には10〜90重量％、好ましくは20〜50重量％、更に好ましくは25〜40重量％の量で存在する結晶性の糖とを含むことができる。この賦形剤の組合せは、好ましくは、典型的には1〜5重量％の量で存在する界面活性剤と共に使用される。あるいはまた、これらの添加剤は、典型的には10〜80重量％、好ましくは20〜50重量％、更に好ましくは25〜35重量％の量で存在する非晶質の糖と；典型的には10〜80重量％、好ましくは20〜50重量％、更に好ましくは25〜35重量％の量で存在する結晶性の糖と；それぞれ10〜80 重量％、好ましくは30〜60重量％、更に好ましくは30〜50重量％の量で存在するポリマーまたはアミノ酸もしくはその塩とを含むことができる。
【００８４】
最も好ましい添加剤の組合せとしては、トレハロース／マンニトール（典型的には約70／30の重量比）；トレハロース／マンニトール／デキストラン（典型的には約30／30／40の重量比）；トレハロース／マンニトール／PVP（約30／30／40の重量比）；トレハロース／マンニトール／PEG（典型的には約30／30／40の重量比）；またはトレハロース／マンニトール／グルタミン酸アルギニン（典型的には約30／30／40の重量比）が挙げられる。特に好適な粒子は、更にトレハロース、マンニトールおよびデキストランを約3：3.：4〜約4：4：3の重量比で含む薬剤の水溶液または懸濁液から製造できる。
【００８５】
これらの好ましい添加剤の組合せを上記で記載されている量で使用することは、高密度の粒子の製造に役立つ。したがって、本発明の2つの主要な要素が粒子の密度を増大させる方向に作用する。まず第1は、凍結乾燥の前に、溶液中または懸濁液中の固形分が少なくとも20重量％存在することであり、第2は、特定の賦形剤の組合せを選択することである。
【００８６】
上記に記載されている賦形剤の組合せは、本発明での使用に必須ではないが、それらは、溶液中または懸濁液中の固形分の合計量が20重量％に近い場合（例えば40重量％未満、特に30重量％未満または25重量％未満）に特に好ましい。溶液または懸濁液の固形含量がこのように低い場合、粒子の密度は、本発明の目的には十分ではあるが、上記の賦形剤の組合せを使用することにより更に増大させることができる。しかし、固形含量が30重量％を超えるか、更に好ましくは40重量％を超える場合は、製造される粒子は十分に高密度であるので、好ましい賦形剤を上記で記載した割合で使用することにより達成される上乗せの密度はそれほど重要ではない。
【００８７】
本発明の粒子は、更に、界面活性剤などの他の添加剤を含むことができる。本発明で使用するための好適な界面活性剤としては、非イオン性の界面活性剤が挙げられる。界面活性剤は、Tween 20およびTween 80などのポリソルベート、F68などのプルロニック（Pluronics）界面活性剤またはスパン（Span）界面活性剤とすることができる。界面活性剤は、上記で挙げた賦形剤の組合せのいずれかと組み合わせて使用できる。
【００８８】
本発明の粒子は、まず、薬剤および任意の必要な添加剤を水に溶解または懸濁することにより形成される。形成される水溶液または懸濁液は、水中の総固形含量が少なくとも20重量％でなければならない。次に、この水溶液または懸濁液を噴霧凍結乾燥する。当業界で公知の任意の方法（例えば、Mumenthalerら, Int. J. Pharmaceutics (1991) 72, 97-110頁およびMaaら, Phar. Res. (1999) Vol. 16, 249頁に記載されている方法)を用いて、この噴霧凍結乾燥工程を行うことができる。
【００８９】
典型的な噴霧凍結乾燥法は、水溶液または懸濁液を液化ガス（通常は撹拌下にある）に霧化することを含む。液化ガスは、液体アルゴン、液体窒素、または霧化した水溶液または懸濁液の液滴を瞬時に凍結させる任意の他の気体とすることができる。好ましくは、液化ガスは、液体窒素などの不活性の液化ガスである。
【００９０】
次に、凍結した水溶液または懸濁液の液滴を含む液化ガスを、凍結乾燥する。それは、メタノール、エタノール、エチルエーテル、アセトン、ペンタン、塩化メチレン、クロロホルムまたは酢酸エチルなどの有機溶剤と接触させない。したがって、乾燥は、米国特許第5,019,400号に記載されている手順に従って行われるものではない。
【００９１】
典型的には、凍結した液滴を含む液化ガスは、凍結乾燥のために凍結乾燥器に移す。凍結した液滴を含む液化ガスは、通常は、金属トレイに注いで、凍結乾燥器に投入する。凍結した液滴は、そのトレイの中で凍結乾燥される。液体窒素を蒸発させ、液滴に含まれる凍結した水を昇華により除去する。得られた粒子を回収する。それらは、所望により洗浄することができる。
【００９２】
更に詳細に述べると、霧化した溶液または懸濁液の凍結液滴を含む液化ガスは、低温（例えば約-60℃〜-40℃）で保持される。典型的には、それに続いて、2段階の減圧乾燥を、好ましくは約20〜500mT（2.666〜66.65 Pa）の圧力下で行う。第1の乾燥段階は、通常は、低温（例えば約-50℃〜0℃）で約4〜24時間にわたり行われる。凍結した水は、氷の昇華により除去する。第2の乾燥段階では、乾燥は、通常、高温（例えば約5〜30℃）で低圧（好ましくは100mT未満から約10mTまで下げる）にて、約5〜24時間にわたって行う。用いられる正確な噴霧凍結乾燥条件は、製造しようとする粒子の目的とする特性に応じて選択すればよい。したがって、温度、圧力および他の条件は、所望どおりに変えることができる。
【００９３】
好ましくは、溶液または懸濁液を霧化するのに使用されるノズルは、超音波ノズルである。これには、本発明において治療剤としてよく用いられる生体分子に対して殆どストレスを与えない穏やかなプロセスである、という利点がある。更に、超音波ノズルを使用することにより、液体の供給を補助するための加圧ガスが不要になり、結果としてプロセスの収率を増大させるのに役立つ。超音波ノズル系で液滴の大きさを制御するための主な変数はノズルの振動数であるが、液体供給物の表面張力、粘度および密度も、液滴の大きさを制御するために操作できる更なる変数である。したがって、例えば、ノズルの振動数を上げれば、それだけ小さい粒子が得られ、その逆を行えば、それだけ大きい粒子が得られる。超音波ノズル系を使用する場合、正確で低パルスの供給ポンプを使用して液体供給物を送達することができる。この場合、そのようなポンプは、実験室規模での粒子の製造に通常付随する低い供給速度（例えば約3〜5ml／分）で操作する場合に特に適している。霧化は、低パルスポンプ系の「限界出力（critical power）」レベルよりも約1〜2Watt高いところでうまく進行することが判っている。幾つかの乾燥サイクルでは、約2.9〜3.1Wattで操作すれば最も効率的に霧化できることが判っているが、正確な操作条件もまた、供給物の液体特性（粘度、密度、総固形含量、表面張力、等）に応じて異なる。
【００９４】
2段階噴霧凍結乾燥プロセスも使用できる。このプロセスは、薬剤が水への溶解性が低いタンパク質である場合に特に有用である。この2段階プロセスは、液状タンパク質を噴霧凍結乾燥して乾燥した粉体を形成することを含む。次に、この粉体を水で再構成して、目的とする固形含量を有する懸濁液を得て、2回目の凍結乾燥を行う。
【００９５】
本発明により得られる噴霧凍結乾燥粒子は、回収し、洗浄し、乾燥することができる。次に、乾燥した粒子を篩いにかけ、目的の大きさの粒子を得ることができる。
【００９６】
本発明の粒子は、被験体への（典型的には角質層または粘膜透過膜（transmucosal membrane）を通っての）高速経皮送達に適する大きさを有する。粒子の質量平均空気動力学的直径（MMAD）は、約0.1〜250μmである。MMADは、5〜100μmまたは10〜100μm、好ましくは10〜70μmまたは20〜70μmとすることができる。一般に、粒子の10重量％未満が、MMADよりも少なくとも5μm大きいか、あるいはMMADよりも少なくとも5μm小さい粒径を有する。好ましくは、粒子の5重量％以下が、MMADよりも5μm以上大きい粒径を有する。また、好ましくは、粒子の5重量％以下が、MMADよりも5μm以上小さい粒径を有する。粒径は、溶液または懸濁液を霧化するのに使用する超音波ノズルの振動数を変えることによって制御される。
【００９７】
粒子は、典型的には、0.5〜25g/cm3、好ましくは0.6〜1.8g/cm3のエンベロープ密度を有する。更に好ましくは、エンベロープ密度は、0.7〜1.5g/cm3である。上記の最低限のエンベロープ密度に達していることが好ましい。何故ならば、密度が低い粒子ほど、皮膚を透過する際の性能が悪い傾向があり、経皮的な無針注射器システムでの使用に適しない可能性があるからである。粒子は、低い空隙率を有し、典型的には、粒子の少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも85％または少なくとも90％が空隙によって占められていない。
【００９８】
個々の粒子の形状は、顕微鏡下で観察した場合に異なっていてもよいが、粒子は、好ましくは実質的に球形である。長軸：短軸の平均比率は、典型的には3：1〜1：1、例えば2：1〜1：1である。
【００９９】
粉体の個々の粒子は、実質的に均一で非孔性の表面を有する、実質的に球形の空気動力学的形状である。また、粒子は、無針注射器装置からの経皮送達に適する粒子透過エネルギーを有する。また、粒子は、乾燥した環境下で自由流動性でなければならない。例えば、粒子は、30％未満の相対湿度で回転させた時にバイアル内で自由に流動するものでなければならない。好ましくは、粒子は、例えば相対湿度が60％未満などの環境条件下で自由流動性である。粒子の水分含量は、凍結乾燥後に、好ましくは5％未満、更に好ましくは2％未満でなければならず、この水分レベルは、30％未満の湿度で、例えば少なくとも1ヶ月間、好ましくはそれ以上に長期にわたって保存される間ずっと維持されていなければならない。
【０１００】
本発明において有用な無針注射器装置の詳細な説明は、本明細書中で述べる従来技術に載っている。これらの装置は無針注射器装置と呼ばれ、これらの装置の代表例は、皮膚PowderJect（登録商標） 無針注射器装置および経口PowderJect（登録商標） 無針注射器装置（PowderJect Technologies Limited, Oxford, UK）である。これらの装置を使用することにより、本発明の粉体の有効量が被験体に送達される。有効量とは、十分な量の目的の抗原を送達してワクチン接種を達成するのに必要な量である。この量は、抗原の性質によって異なり、送達しようとする抗原の既知の活性に基づく臨床試験により容易に決定できる。「Physicians Desk Reference」および「Goodman and Gilman’s The Phamacological Basis of Therapeutics」が、必要な量を決定する目的に有用である。
【０１０１】
粒子を送達するための無針注射器装置は、最初は、同じ出願人による米国特許第5,630,796号（Bellhouseら）（参照により本明細書に組み入れられる）に記載された。現在では、多くの具体的な装置構造が利用できるが、そのような装置は、典型的には、上部から底部に向かって順番に、ガスシリンダー、粒子カセットもしくはパッケージ、およびサイレンサー要素が連結されている超音波ノズルを備えるペン形の装置として提供される。適切な粉体（この場合、本発明の噴霧凍結乾燥した粉体）は、適切な容器（例えば、ワッシャー形のスペーサーに熱封着されて独立型の密閉ユニットを形成している2枚の破断性ポリマー膜により形成されるカセット）の中に収容する。膜の材料は、超音波噴流がスタートする条件に合う特定モードの開放圧および破壊圧を達成するように選択できる。操作において、この装置は、装置内で圧縮ガスを該シリンダーから膨張チャンバーに放出するように駆動される。放出されたガスは粒子カセットと接触し、十分な圧力が蓄積されると、そのカセットの膜を突然に破り、その後の送達のために粒子を超音波ノズルに押し流す。このノズルは、特定のガス速度および流動パターンを達成するように設計されて、ある量の粒子を所定領域の標的表面へ送達するようになっている。サイレンサーは、瞬間的な超音波噴流および／または膜の破断により生じるノイズを減じるために使用される。
【０１０２】
粒子を送達するための第2の無針注射器装置は、同じ出願人による国際特許出願WO 96/20022に記載されている。この送達システムもまた、粉末組成物を加速して送達するのに圧縮ガス供給源のエネルギーを利用する。しかし、米国特許第5,630,796号のシステムとは、粒子を加速するのに、ガス流ではなく衝撃波を利用する点が異なる。更に詳細に述べると、可撓性ドームの背部で生じる衝撃波により起こる瞬間圧力上昇がそのドームの後部に当たり、その可撓性ドームを急に標的表面の方向に外転させる。この急な外転によって、粉末組成物（該ドームの外側に配置されている）が十分な速度で放出され、こうした勢いによって標的組織（例えば口腔粘膜組織）を透過する。粉末組成物は、十分なドームの外転が起こった時点で放出される。このドームは、高圧ガス流を完全に封じ込めるのにも役立っており、そのため、その高圧ガス流は組織と接触しないようになっている。この送達操作中にガスは放出されないので、システムは本質的に静かである。この設計は、他の閉じた系での用途またはデリケートな用途、例えば極めて侵襲性が低い手術によって達した部位へ粒子を送達するための用途にも使用可能である。
【０１０３】
本発明の更にもう1つの態様において、使用前に本発明の粉体を封入できる単回投与または複数回投与のための容器は、適切な投与量を構成する適切量の粉体が封入されている密閉型容器を含むことができる。粉体は、無菌の製剤として封入することができ、したがって、その密閉型容器は、使用するまでその製剤の無菌性を維持するように設計できる。所望により、その容器は、上記で引用した無針注射器システムで直接使用するように適合させることができる。
【０１０４】
したがって、本発明の粉体は、無針注射器により送達するための個々の単回投与量で封入され得る。本明細書中で用いられる「単回投与量（unit dosage）」とは、本発明の粉体の治療上有効量を収容している投与量収容器（dosage receptacle）をいう。投与量収容器は、典型的には、無針注射器装置からの経皮送達を可能にするように該装置の内部に装着される。そのような容器は、カプセル、ホイル製パウチ、サシェおよびカセットなどとすることができる。
【０１０５】
粉体が封入されている容器は更に、組成を明確にし、適切な投薬情報を提供するために、ラベルを付けることができる。更に、この容器は、例えば米国食品・医薬品局（この場合、注意書は、ヒトへの投与に関して、その中に収容されている粉体の製造、使用および販売についての米国連邦法の元に該局により承認されていることを示す）などの政府機関により指定された形式の注意書をラベル表示することができる。
【０１０６】
送達された粒子が標的表面を透過する実際の距離は、粒径（例えば、ほぼ球形の粒子形状であると想定した場合の公称粒径）、粒子密度、粒子が表面に衝突する初期速度、ならびに標的とされる皮膚組織の密度および運動力学的粘度に応じて異なる。これに関して、無針注射器で使用する場合の最適な粒子密度は、一般に約0.5〜25g/cm3、好ましくは約0.7〜1.5g/cm3の範囲であり、注入速度は、一般に約100〜3,000m/secの範囲である。適当なガス圧があれば、平均粒径10〜70μmの粒子は、流れるガス流の超音速に近い速度でノズルから加速できる。
【０１０７】
所望により、無針注射器システムは、本発明の粉体の適切な投与量を含んだ、予め充填されている状態で提供することができる。この充填されているシリンジは密閉容器に封入することができ、この密閉容器は上記で記載したように更にラベル付けすることができる。
【０１０８】
無針注射器装置の性能を特性付けるために、多くの新規な試験方法の開発や、確立されている試験方法の修正が行われている。これらの試験の範囲は、粉末組成物の特性決定、ガス流および粒子の加速の評価、人工的もしくは生物学的な標的に対する衝撃、ならびに総合的なシステム性能の測定に及ぶ。したがって、以下の試験の1つ、数種または全部を用いて、本発明の粉体の、無針注射器システムで使用するための物理的および機能的適性を評価することができる。
【０１０９】
人工膜の標的に対する作用の評価
粉体注入システムの多くの面を同時に測定する機能性試験は、「メタライズドフィルム」試験または「透過エネルギー」（PE）試験と呼ばれている。それは、粒子が、プラスチック製フィルム支持体により支持されている精密な薄い金属層に対して与え得る損傷を定量的に評価することに基づく。損傷は、粒子の運動エネルギーおよび特定の他の特性と相関する。試験からの応答が高いほど（すなわち、フィルムの損傷／破壊が大きいほど）、それだけ高いエネルギーを装置が粒子に与えている。反射モードまたは透過モードでの電気的抵抗の変化の測定または画像形成デンシトメトリーのいずれかが、調節可能で再現性のある試験において装置または製剤の性能を評価するための信頼性のある方法となる。
【０１１０】
フィルム試験台は、圧力、投与量、粒径分布、および材料などの全ての主要な装置パラメーターの粒子送達変動には感度を示すが、ガスには感度を示さないことが判っている。現在では、60バール以下のヘリウム圧で操作される装置を試験するために、125μmのポリエステル製支持体上の厚み約350オングストロームのアルミニウムが使用されている。
【０１１１】
工学的発泡体の標的に対する衝撃作用の評価
無針注射器装置により送達された場合の粒子の性能を評価するもう1つの手段は、硬質ポリメチルイミド発泡体（Rohacell 5 IIG、密度は52 kg/m3、Rohm Tech Inc., Malden, MA）に及ぼす衝撃の影響を測定することである。この試験の実験設備は、メタライズドフィルム試験で使用したものとほぼ同じである。精密カリパスを用いて透過の深度を測定する。各実験では、比較として処理済のマンニトール基準物質について行い、装置の圧力、粒径範囲などの全ての他のパラメーターは一定に保つ。データから、この方法が、粒径および圧力の差にも感度を示すことが示される。薬物の賦形剤としての処理済マンニトール基準物質は、前臨床実験（動物実験）において、全身的濃度（systemic concentrations）を送達することが明らかにされており、かくして、発泡体透過試験におけるこの相対的な性能の尺度には、in vivoで実用的であることの根拠がある。有望な粉体であれば、前臨床研究または臨床研究で適切な性能を示す見込みに関して、マンニトールと同等またはそれより優れた透過を示すことが予測できる。この単純で迅速な試験は、粉体の相対的な評価方法として有用であり、無関係ではないと考えるものである。
【０１１２】
粒子の磨耗試験
粒子の性能の更にもう1つの指標は、種々の候補組成物の、高速粒子注入法に伴う力（すなわち、静止状態の粒子が突然の高速ガス流と接触することにより生じる力、粒子が無針注射器を通過する際の粒子同士の衝突により生じる力、および粉体が装置を通過する際に生じる粒子と装置との衝突により生じる力）に持ちこたえる能力を試験することである。したがって、元の組成物と無針注射器装置から送達された後の組成物との粒径分布の変化を測定する、簡易な粒子磨耗試験が考案されている。
【０１１３】
この試験は、粒子組成物を上記で記載したような無針注射器に充填し、次にその装置を、粒子組成物が不溶性であるキャリア流体(例えば、鉱油、シリコーン油など)が入っているフラスコに放出することにより行われる。次に、キャリア流体を回収し、元の組成物および放出された組成物の双方における粒径分布を、適当な粒径測定装置（例えばAccuSizer（登録商標）780モデル光学粒径測定装置）を用いて算出する。装置を作動させた後で質量平均粒径が約50％未満、更に好ましくは約20％未満の低下（AccuSizer装置で測定した場合）を示す組成物は、本明細書中で記載する無針注射器システムでの使用に適すると見なす。
【０１１４】
in vitroでのヒト皮膚への送達および経表皮水分喪失
最終的な実際の使用により近く対応する粉体の性能試験では、候補の粉体組成物は、採皮刀で採取したヒト腹部皮膚全層のサンプルに注入できる。注入後の再現皮膚サンプルは、32℃の水、生理食塩水または緩衝液を含む改変Franz拡散細胞に載せることができる。界面活性剤などの添加剤を用いて、拡散細胞成分への結合を防止することができる。2種類の測定を行って、皮膚での製剤の性能を評価できる。
【０１１５】
物理的作用（すなわち、皮膚のバリア機能に及ぼす粒子注入の作用）を測定するために、経表皮水分喪失量（TEWL）を測定することができる。測定は、平衡状態（約1時間）にて、約12mmの煙突のように作用する拡散細胞キャップの上部に設置したTewameter TM 2107（Courage & Khazaka, Koln, Germany）を用いて行う。粒子が大きく注入圧が高いほど、それに比例して高いin vitroでのTEWL値が得られ、これはin vivoでの結果と相関することが示されている。粒子をin vitroで注入すると、TEWL値は、粒径およびヘリウムガス圧に応じて約7（g/m2h）から約27（g/m2h）へと増大する。粉体を用いずにヘリウムだけを注入した場合は、何の作用も起こらない。in vivoでは、皮膚のバリア特性は急速に正常値に戻り、これは、大部分の粉体の粒径ではTEWLが約1時間で前処理の値に戻ることから示される。最も大きな粒子（53〜75μm）の場合、皮膚サンプルは1時間で50％の回復を示し、24時間までに完全な回復を示す。
【０１１６】
in vitroでのヒト皮膚への送達および薬物の拡散速度
製剤の性能をin vitroで測定するためには、候補粉体の薬物または抗原成分は、HPLCまたは他の適当な分析法を用いる化学的アッセイ用として、所定時間間隔でFranz細胞受液の全部または一部を置き換えることにより回収できる。濃度のデータを用いて、送達プロファイルを作成し、定常状態での透過速度を算出することができる。この方法は、in vivoでの研究を行う前に、皮膚に結合している薬物または抗原の早期指標、薬物または抗原の分解、角質層の粒子透過効率などについて製剤をスクリーニングするのに用いることができる。
【０１１７】
これらおよび他の定性的および定量的試験を用いて、高速粒子注入装置での使用に対する本発明の粉体の物理的および機能的適性を評価することができる。粉体の粒子は次の特性を持つことが好ましい（しかし必須ではない）：実質的に球形の形状（例えば、アスペクト比が可能な限り1に近いこと）；平滑な表面；適切な活性充填含量；粒子摩砕試験を用いた場合の粒径の低下が20％未満であること；エンベロープ密度が可能な限り構成成分の真密度に近いこと（例えば、約0.5g/ml以上）；そして、MMADが約20〜70μmであり、粒径分布が狭いこと。組成物は、典型的には自由流動性である（例えば、50％の相対湿度で8時間保存した後で自由流動性であり、40％の相対湿度で24時間保存した後で自由流動性である）。これらの基準は全て、上記の方法を用いて測定することができ、以下の刊行物（参照により本明細書に組み入れられる）に更に詳細に説明されている。Etzlerら (1995) Part. Part. Syst. Charact.12：217；Ghadiriら (1992) IFPRI Final Report, FRR 16-03 University of Surrey, UK；Bellhouseら (1997) “Needleless delivery of drugs in dry powder form, using shock waves and supersonic gas flow,” Plenary Lecture 6, 21st International Symposium on Shock Waves, Australia；Kwonら (1998) Pharm. Sci. suppl.1 (1), 103；and Burkothら. (1999) “Transdermal and Transmucosal Powdered Drug Delivery,” in Critical Reviews in the Therapeutic Drug Carrier Systems 16(4)：331-384, STephen Bruck Ed., Begell House Inc., New York, NY。
【０１１８】
あるいはまた、本発明の粉体は、他の経路で被験体に接種するのに使用できる。この目的のために、粉体は、注射用水や生理食塩水などの適切な担体または希釈剤と組み合わせることができる。こうして得られたワクチン組成物は、典型的には注射（例えば皮下または筋肉内）により投与される。
【０１１９】
どの投与経路を選択しても、有効量の抗原が接種しようとする被験体に送達される。一般に、免疫応答を引き起こすのには、50ng〜1mg、更に好ましくは1μg〜約50μgの抗原が有用である。正確な必要量は、治療しようとする被験体の年齢や全体的な状態、選択される特定の抗原、投与部位および他の要因に応じて決まる。適切な有効量は、当業者であれば容易に決定できる。
【０１２０】
投薬治療は、単回投与スケジュールまたは複数回投与スケジュールとすることができる。複数回投与スケジュールとは、初回のワクチン接種を1〜10回に分けて行い、続いて別の投薬を次の時間間隔をあけて行う（これは免疫応答を維持および／または増強するように選択され、例えば1〜4ヶ月目に2回目の投与を行い、必要であれば数ヵ月後に次の投薬を行う）ものをいう。また、投与計画は、少なくとも一部は、被験体の必要性により決定され、医師の判断に依存する。ワクチン接種は、勿論、一般には防護が望まれる病原体に初感染する前に実施する。
【０１２１】
C.実験
以下は、本発明を実施するための具体的な実施形態の実施例である。これらの実施例は、説明の目的のために提供されるものに過ぎず、本発明の範囲を如何様にも限定しようとするものではない。
【０１２２】
使用した数字（例えば、量、温度など）に関しては、精度を確実なものにするよう努力を払ったが、勿論、ある程度の実験誤差および偏差は予め考慮に入れるべきである。
【実施例１】
【０１２３】
B型肝炎ワクチン組成物の噴霧凍結乾燥（「SFD」）
1.1 目的：
B型肝炎ワクチン粉体を製造するためのSFD法を評価すること、特に次の配合パラメーターを評価すること：(a) ワクチンに及ぼす濃度の影響；および(b) 粒子密度に及ぼす固形含量の影響。
【０１２４】
1.2 材料：
B型肝炎表面抗原（HBsAg、Lot # 64850）は、Rhein Americana S.A.（Argentine Republic）から入手した。添付のQuality Control Certificate of Analysisでは、この抗原の公称濃度は1.37mg/mLと報告されていた。本研究で用いる材料を下記の表1.1に示す。
【表１】
2004532277.tif 000002
【０１２５】
1.3 製剤：
下記の表1.2には、出発液体製剤のパーセント（w/w）組成を示し、目的とする組成物は1.0mgのペイロード（payload）とする。主な賦形剤は、トレハロース、マンニトールおよび分子量10kDaのデキストランとした。トレハロースは、凍結乾燥中および長期保存中にタンパク質を安定化できるので使用し、マンニトールとトレハロースとの組合せは、噴霧凍結乾燥の際に高密度の粒子の製造を可能にする。デキストランは、粉体の流動性、粒子の機械的特性、そして（おそらく）ワクチン組成物の全体的な安定性を向上させるために使用した。全ての液体製剤は、総固形含量が30％となるようにした。
【表２】
2004532277.tif 000003
【０１２６】
1.4 方法：
1.4.1 ワクチンの濃縮
10kD限界の再生セルロース膜および15mL容サンプル容器を備える遠心濾過装置Centriprep（Millipore, Bedford, MA）を用いて、アルミニウム不含バルクワクチンを濃縮した。濾膜を15mLの純水（nanopure water）で2回すすぎ、3000rpmで5〜10℃での遠心分離（Allegra 6（登録商標）、Beckman, Fullerton, CA）により濾膜に残存する微量のグリセリンを除去した。次に、濾膜を特定のpHのブランク緩衝液で1回すすいだ。ワクチン溶液を、目的量の透過物が回収されるまで遠心分離した。3種の粉体製剤に対して、それぞれ3つのバッチを調製した。
【０１２７】
アルミニウムアジュバント添加バルクワクチンをバイアルからプールし、3,000rpmで10分間遠心分離した（Allegra 6R, Beckman, Palo Alto, CA）。ケーキをボルテックス処理により新しい水に再懸濁した後、賦形剤と配合した。
【０１２８】
1.4.2 噴霧凍結乾燥
SFD装置は、噴霧ノズル（#05793モデル）および電源（#06-05108モデル）を備えた超音波霧化器（Sono-Tek Corporation, Milton, NY）を特徴とするものであった。ノズルには、液滴の大きさを決定する特定の振動数で振動することができる準弾性（quasi-electric）水晶が備わっている。60kHzの振動数で、大部分が20〜80μmの範囲内である液滴ができる。円形の金属パン（直径16cm、高さ6cm）を用いて液体窒素を入れた。凍結乾燥には、棚式凍結乾燥機（#TDS2C2B5200モデル, Dura-Stop, FTS System, Stone Ridge, NY）を用いた。この乾燥機は、1回のバッチ操作に6つの金属パンを収容できる。それ以外の装置としては、磁気撹拌子を備えた磁気撹拌器および蠕動ポンプ（#77120-70モデル, MasterFlex C／L, Barnant Company, Barrington, IL）を含める。
【０１２９】
液体供給物（ワクチン製剤）を蠕動ポンプにより1.5mL/分の流速で超音波霧化器（60 kHz）へ送り、そこで、液体製剤を液体N2が入ったパンに噴霧した。噴霧後、液体窒素中に凍結した粒子を含むパンを、予備冷却しておいた凍結乾燥機（-55℃)に移した。液体窒素は数分で蒸発した。凍結乾燥サイクルを様々に変えて粒子の特性を調節したが、典型的な凍結乾燥サイクルを下記の表1.3に示す。
【表３】
2004532277.tif 000004
【０１３０】
乾燥後、粉体が入ったパンを、窒素でパージされ相対湿度が最初は20％未満に保持されている乾燥箱に移した。相対湿度を徐々に約40％まで上げて粉体を平衡にした後、粉体を回収した。
【０１３１】
1.5 粉体の特性決定
1.5.1 粒径分析
容積分布における粒子の平均幾何学的直径は、AccuSizer 780（Particle Sizing Systems, Santa Barbara, California）を用いて測定した。光オブスキュレーション法（light obscuration technique）に基づいて、AccuSizerは、粒子の形状分布を推定せずに、粒径分布を測定する。更に、10％〜90％（容積）の粒子集団の大きさも測定した。それぞれの分析には約5mgの粉体サンプルが必要であった。粉体サンプルは軽鉱油に懸濁し、5〜10秒間超音波処理して粒子の凝集を除去した後で、分析を行った。
【０１３２】
また、容積分布における粒子の平均空気動力学的直径についても、乾燥粉体分散液による粒径分析装置（Aerosizer, API）を用いて測定した。この場合もまた、それぞれの分析には約5mgの粉体サンプルが必要であった。
【０１３３】
下記の表1.4に報告されているように、試験した全ての粉体の粒径は、Aerosizer測定に基づけば、20〜60μmの範囲であった。
【表４】
2004532277.tif 000005
【０１３４】
1.5.2 画像分析
粒子の視覚的分析は、10倍の接眼レンズと10倍の対物レンズを備えた光学顕微鏡（DMRモデル, Leica,Germany）を用いて行った。このシステムは、画像出力のためのポラロイドカメラ装置を備えていた。デジタル画像を取込み、格納した。
【０１３５】
特定の製剤の画像の写真を図1a〜1dに示す。図から判るように、粒子の形状は概ね球形であり、推定粒径はAerosizerにより測定したものと一致していた。
【０１３６】
1.5.3 走査型電子顕微鏡法（SEM）
SEMは、粉体サンプルを金でスパッタ被覆した後、Amray 1810T装置で行った。測定は、Friedrich-Alexander大学（Erlangen, Germany）のGeoffrey Lee博士およびChristine Sonner氏のご厚意によるものであった。
【０１３７】
SEMによる顕微鏡写真を図2a〜2dに示す。図から判るように、全てのSFD粒子（図2aおよび2b）は形が球形で、シワが寄った形態であり、粒子が乾燥中に収縮したことが示唆されるが、圧縮・粉砕・篩いがけ（C/G/S）法により形成された粒子は不規則な形状と表面形態を有していた。
【０１３８】
1.5.4 タップ密度
各粉体サンプルをガラスバイアルに秤量し、実験台に対して20回軽く叩いた。目視により、粉体と同容量の水を同じタイプの空のバイアルに入れた。粉体サンプルのタップ密度は、粉体サンプルの重量を水サンプルの重量（水の密度＝1g/mLと仮定）で除算することにより算出できた。
【０１３９】
下記の表1.5にまとめたように、全ての粉体のタップ密度は0.4g/mLを上回っていた。高い固形含量を用いるほど、高いタップ密度が達成され、例えば、固形含量を35％まで増大させると、0.6g/mLを超えるタップ密度が見られた。
【表５】
2004532277.tif 000006
【０１４０】
1.5.5 水分含量分析
約4〜5mgの粉体サンプルを三層積層カセットから回収し、アルミニウムで重み付けした容器に移し、重量を記録した。サンプルを、乾燥オーブン（707モデル）を備えたカールフィッシャー電量計（737モデル, Brinkmann）にかけた。サンプルを、乾燥オーブン内で100mL/分のガス流速にて150℃まで150秒間加熱した。
【０１４１】
下記の表1.6に報告されているように、粉体中の水分含量は3.3％〜4.1％の範囲であった。同じ乾燥条件下で、水分含量と化学組成との明らかな相関関係はなかった。
【表６】
2004532277.tif 000007
【０１４２】
1.5.6 粒子磨耗試験
この方法によれば、例えば、粉体注入装置内での粒子の衝突から生じる粒子磨耗が定量できる。この方法は、無針注射器（粉体注入）装置から噴射した後の粉体の平均粒径の低下および粒径分布の変化を測定することにより、透過前の皮膚と接触した際の粒子構造を間接的に評価するのに使用できる。対照サンプル（噴射前）は、40mL容の容器内で5mgの粉体を鉱油（約30mL）に懸濁することにより調製した。混合物をボルテックス処理／超音波処理して、均一な懸濁液にした。粒径分布は、粒径分析装置（AccuSizer 780, Particle Sizing Systems, Santa Barbara, CA)を用いて測定した。噴射後のサンプルについては、粉体を装置（PowderJect（登録商標）粉体注入装置, PowderJect Pharmaceuticals plc, Oxford, United Kingdom）から、三層積層カセットおよび20μmのポリカーボネート膜を用いて（それぞれ2mgのペイロードで5ショット）駆動させて、1L容の三角フラスコに粉体を入れた。このフラスコは、25mLの軽鉱油で被覆されており、上部は、中心に3/16インチの穴が開いているラテックスシートで覆った。飛散粒子が見えなくなるまで、フラスコを約2〜3分間静置した。フラスコの内壁を25mLの新しい鉱油で洗浄し、強くボルテックス処理または振盪して、均一な懸濁液を得た。15mLの粉体懸濁液を、15mLの鉱油で更に希釈し、40cc容の試験管に分配した。磨耗前のサンプルおよび磨耗後のサンプルの双方を光オブスキュレーション分析に供した。実験は3回繰り返し、各サンプルについて3重に測定した。噴射後のサンプルからの粒径分布プロファイルを、対照サンプルのものと比較した。それぞれの平均粒径の低下率が粒子の磨耗程度を表わす。
【０１４３】
下記の表1.7に報告されているように、3種の選択した製剤の粒径の低下はほぼ同じであり、全て30％未満であることが判った。
【表７】
2004532277.tif 000008
【０１４４】
1.5.7 アルミニウム含有粉体の再構成
アルミニウム含有粉体サンプル（2mg）を0.5mLの水に溶解（再構成）した。懸濁液の光学画像を撮影した。この手順により、アルミニウムの凝集が測定できる。
【０１４５】
2種のアルミニウム含有製剤（バッチ番号138-16-1および138-20-5C）を水で再構成し、それらの光学顕微鏡写真を図3aおよび3bに示す。バッチ番号138-16-1（図3a）の砂様の外観は、SFD後のアルミニウムの凝集が最低限であることを示唆している。これは、SFD法に付随する高速凍結現象によるものである。バッチ138-16-1と同じ処方であるが圧縮・粉砕・篩いがけ法により更に処理したバッチ番号138-20-5C（図3b）では僅かな凝集が見られる。これは、圧縮によりアルミニウムが僅かに凝集を起こす、という先の知見と一致する。
【０１４６】
1.5.8 SDS-PAGE分析
クーマシーコロイド染色SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）は、Novex（San Diego, CA）製のNu-PAGEゲル（4〜12％のMES、流出緩衝液、サンプル緩衝液、および／またはジチオトレイトール、DTT還元剤）で行った。アルミニウムアジュバント粉末製剤を水で再構成し、遠心分離して、上清を除去した。アルミニウムペレットを、0.1％ SDSを含む200 mM リン酸ナトリウム（pH 7）に再懸濁した。次に、この懸濁液を、Novexゲルキットのサンプル緩衝液と混合した。次に、サンプル液を95℃で5分間加熱し、ボルテックス処理した後で、ゲルにかけた。ゲルを、Novex PowerEase 500電源を用いて200V／120mA／25Wにて35分間流し、次にクーマシー染色し（Novex Colloidal Blue Stain）、水で脱色した。ゲルの画像をBioRadゲルスキャナー（GS-700モデル画像形成デンシトメーター）でスキャンした。このスキャナーには、定量用ソフトウェア（Quantity One）が備わっており、これがゲルのバンドの強度を定量化できる。シグナル強度の単位は光学密度（O.D.）である。全てのサンプルを、分子量マーカー（Mark 12, Novex)と比較した。
【０１４７】
非還元ゲルと還元ゲルの双方の結果を図4に示す。図から判るように、濃縮した液体サンプルとSFDサンプルとの間には有意な差は見られず、このことは、本発明の噴霧凍結乾燥法が抗原の質に影響を及ぼさないことを示している。
【実施例２】
【０１４８】
生物薬剤（タンパク質）組成物の噴霧凍結乾燥（「SFD」）
2.1 目的：
生物薬剤（タンパク質製剤）粉体の製造での使用についてSFD法を評価すること、および粉末製剤を次の基準について更に評価すること：(a) 粒子（タップ密度)；(b) 粒径分布；および(c) 粒子の物理的安定性。
【０１４９】
モデルタンパク質であるウシ血清アルブミン（BSA）を、本発明に従って製造されたSFDタンパク質粉体についてのこの研究の基準として用い、これらの粉体の評価は、粒径、タップ密度、ならびに吸湿性および粉体の流動性についての物理的外観を含む物理的特性に基づいて行った。この方法の考慮されるもう1つの重要な観点は、凍結乾燥条件／サイクルであった。乾燥時間を短縮すること、およびより高い乾燥温度を適用して乾燥中の粒子の崩壊を促進すること、という2つの目的で、過酷な乾燥サイクルを試みた。
【０１５０】
噴霧凍結乾燥により、霧化された製剤の液滴は、液体窒素中で瞬時に凍結され、次いで凍結乾燥される。乾燥粉体は、粒径が制御されており、粒子の形は球形である。この方法は非常に有効であり、タンパク質やペプチドなどの生物薬剤に対して良い作用を及ぼすことが実証されている。多くの配合組成物を、得られる粒子密度に対する影響について評価した。そこにおいて、ある範囲の適切な賦形剤組成を用いると、許容される特性を持つ粒子が多種多様に異なるタンパク質およびペプチドから製造できるようになる。典型的な配合処方は、タンパク質の安定性を付与するための非晶質の糖、粒子の強度を付与するための結晶性の成分、および粒子の統合性を付与するためのポリマーの組合せである。これらの賦形剤は、液体製剤中での高い固形含量（許容される密度を持つ粒子を製造するのに必要不可欠なパラメーター）を達成するために、水溶解性が高くなければならない。特定の賦形剤の組合せの選択は、得られた粉体の吸湿性と共存する生物薬剤の短期および長期にわたる物理的安定性とのバランスをとらなければならない。したがって、これらの基準は、本研究で用いられる種々の賦形剤組成の評価でも適用した。本研究で使用した全ての賦形剤は、非経口的に許容でき、ヒトにおける使用が承認されるものである。
【０１５１】
2.2 超音波霧化の理論的考察
霧化法はかなり狭い粒径分布を達成する上で重要な前提条件なので、幾つかの基礎的な理論的考察を行った。
【０１５２】
簡単に述べると、超音波霧化法は、高振動数の振動の形態で表面に与えられるエネルギーにより霧化して吹付けられる表面で生じる液体の表面張力波（liquid capillary wave）において起こる不安定さからできるものである。次に、超音波エネルギーが液体の表面張力を超えると、液滴が形成される。液滴の粒径分布は、基本的にノズルの振動数ならびに表面張力および比重に応じて異なるが、これらはあまり重要でない要素である。式2.1は、振動数、比重および表面張力に対する数メジアン（number median）直径の関係を示すものである。
【０１５３】
dN,0.5＝0.34（8πs／ρf2)1／3                （2.1)
［式中、ｓは液体の表面張力であり、ρは比重であり、ｆは振動数である。］したがって、式2.1から、振動数は、この式に二乗で入力されるので、液滴の大きさを決定する上で重要な要素であるが、一方、表面張力および比重は一乗で入力されるだけであることが判る。
【０１５４】
式2.1で一番重要なことは、液滴の径がf2／3に比例することである。これは、操作振動数が高いほど、小さな液滴ができることを示している。
【０１５５】
2.3 噴霧凍結乾燥（SFD）の装置および方法
2.3.1 SFDの装置
SFD装置は、噴霧ノズル（#05793モデル）および電源（#06-05108モデル）を備えた超音波霧化器（Sono-Tek Corporation, Milton, NY）を特徴とするものであった。ノズルには、液滴の大きさを決定する特定の振動数で振動を与えることができる準弾性水晶が備わっていた。60kHzおよび48kHzの振動数の超音波ノズルを用いた。液体窒素を収容するのに、円形の金属パン（直径16cm、高さ6cm）を用いた。凍結乾燥には、棚式凍結乾燥機（#TDS2C2B5200モデル, Dura-Stop, FTS System, Stone Ridge, NY）を用いた。この乾燥機は、1回のバッチ操作に6つの金属パンを収容できる。それ以外の装置としては、磁気撹拌子を備えた磁気撹拌装置、および蠕動ポンプ（#77120-70モデル, MasterFlex C／L, Barnant Company, Barrington, IL)を含めた。噴霧凍結乾燥プロセスの概略を図5に示す。
【０１５６】
2.3.2 SFD法
液体タンパク質製剤は、蠕動ポンプ（1〜5mL/分の流速）により、超音波霧化器（48または60 kHz)に送り出した。次に、液体N2を含むパンに液体製剤を噴霧した。噴霧後、液体窒素中に凍結粒子を含んでいるパンを、予備冷却しておいた凍結乾燥機（-55℃)に移した。次に、液体窒素は蒸発する。本研究で用いた4種類の凍結乾燥条件のセットを下記の表2.1〜2.4に示す。
【表８】
2004532277.tif 000009
【表９】
2004532277.tif 000010
【表１０】
2004532277.tif 000011
【表１１】
2004532277.tif 000012
【０１５７】
乾燥後、粉体が入ったパンを、窒素でパージしてある乾燥箱に移して相対湿度を30％未満に維持した。
【０１５８】
2.4 粉体の特性決定
2.4.1 粒径分析
容積分布における粒子の平均幾何学的直径は、AccuSizer 780（Particle Sizing Systems, Santa Barbara, California）を用いて測定できる。光オブスキュレーション法に基づいて、AccuSizerは、粒子の形状分布を推定せずに、粒径分布を測定する。更に、10％〜90％（容積）の粒子集団の大きさも測定できる。それぞれの分析には約5mgの粉体粒子が必要であった。粉体サンプルは軽鉱油に懸濁し、5〜10秒間超音波処理して、粒子の凝集を除去した後で、分析を行った。
【０１５９】
容積分布における粒子の平均空気動力学的直径は、乾燥粉体分散液による粒径分析装置（Aerosizer, API）を用いて測定した。更に、それぞれの粒径分布について、10％〜90％（容積分布中）の粒子集団の大きさについても報告した。それぞれの分析には約5mgの粉体サンプルが必要であった。
【０１６０】
2.4.2 画像分析
粒子の視覚的分析は、10倍の接眼レンズと10倍の対物レンズを備えた光学顕微鏡（DMRモデル, Leica,Germany）を用いて行った。このシステムは、画像出力のためのポラロイドカメラ装置を備えていた。デジタル画像を取込み、格納した。
【０１６１】
2.4.3 タップ密度
各粉体サンプルをガラスバイアルに秤量し、実験台に対して20回軽く叩いた。目視により、粉体と同容量の水を同じタイプの空バイアルに入れた。粉体サンプルのタップ密度は、粉体サンプルの重量を水サンプルの重量（水の密度＝1g/mLと仮定）で除算することにより算出できた。
【０１６２】
2.4.4 水分含量分析
約4〜5mgの粉体サンプルを三層積層カセットから回収し、アルミニウムで重み付けした容器に移し、重量を記録した。サンプルを、乾燥オーブン（707モデル）を備えたカールフィッシャー電量計（737モデル, Brinkmann）にかけた。サンプルを、乾燥オーブン内で100mL/分のガス流速にて150℃まで150秒間加熱した。サンプルの抽出時間は120秒とした。
【０１６３】
2.5 医薬製剤および結果
下記で述べる一連の実験では、2種の賦形剤（すなわち、マンニトールとトレハロース）を一定にして、各種の製剤を試験した。トレハロースは、主に凍結乾燥および長期保存の間にタンパク質を安定化するために選んだ。マンニトールは、結晶性の物質なので、粒子に強度を付与するために製剤に添加した。
【０１６４】
粉末製剤は、本発明のSFD法ならびに上記の特定の装置および方法を用いて製造した。最初の一連の実験では、ポリビニルピロリドン（PVP）を含む製剤を評価した。PVPは、非経口用に許容されている賦形剤であり、製剤に可塑性（plasticity）を付与するので、好ましいバルキング剤として選んだ。
【０１６５】
2.5.1 PVP製剤
下記の一連の実験において、目的は、バルキング剤PVPの濃度を18％w/wから36％w/wへと変化させた場合の粒子の物理的特性を測定することであった。試験した特定の製剤を下記の表2.5に示す。
【表１２】
2004532277.tif 000013
【０１６６】
画像分析の結果：
表2.5に規定されるSFD製剤の顕微鏡写真（図6a〜6d）から、粒子が球形の形態でかなり均一な粒径を有することが明らかになった。中には凝集した粒子もあり、これは製剤中のPVPの存在によるものである。PVPは有効な結合剤であり、この賦形剤を含む製剤は、この高分子量の賦形剤の付着性により凝集する傾向が多少ある。
【０１６７】
粒径の結果：
下記の表2.6から判るように、PVP製剤の平均粒径はほぼ同じであったが、バッチ番号156-16-3の平均粒径はそれより小さかった。バッチ156-16-1および156-16-3は、共に60kHzの超音波ノズルを使用して製造したものであるが（これら2種の製剤の唯一の相違点は賦形剤の割合である）、これらを比較したところ、賦形剤の割合が3：3：4であるとより小さな粒径ができることが判明した。同様に、バッチ156-16-2と156-16-4とを比較したところ、同じ傾向が示されたが、効果はそれほど顕著ではなかった。
【表１３】
2004532277.tif 000014
【０１６８】
水分含量分析：
下記の表2.7に示すカールフィッシャーの結果から、全てのPVP製剤の水分含量が3％未満であることが明らかである。これらの結果から、更に、賦形剤の割合を3：3：4とするとより乾燥が進んだ生成物が得られることが示される。
【表１４】
2004532277.tif 000015
【０１６９】
粒子密度の結果：
下記の表2.8に示す結果から判るように、4種のPVP製剤の全てのタップ密度はほぼ同じであり、許容範囲内であった。
【表１５】
2004532277.tif 000016
【０１７０】
2.5.2 種々の糖製剤
次の一連の実験において、目的は、糖（ラフィノース、スクロース）と他の一般的な賦形剤（グリシン）との異なる組合せを用いた場合の粒子の物理的特性を測定することであった。試験した特定の製剤を下記の表2.9に示す。
【表１６】
2004532277.tif 000017
【０１７１】
画像分析の結果：
図7a-7fから判るように、表2.9に規定される製剤からSFD法により製造した粒子は、球形の形状とかなり均一な粒径を有する。しかし、バッチ番号156-35-1、156-35-2および156-35-3（それぞれ図7a、7bおよび7c）は、粒径が大きすぎる粒子を若干有すると思われる。バッチ番号156-42-2（図7e）は、形態が不規則であり、潮解の途中であると思われ、この製剤が吸湿性が高いことが示唆される。
【０１７２】
粒径の結果：
表2.9の製剤の粒径の結果を表2.10に示すが、これらは顕微鏡写真から得られた推定粒径とほぼ一致している。
【表１７】
2004532277.tif 000018
【０１７３】
水分含量分析：
下記の表2.11に示すカールフィッシャーの結果から、試験した全ての製剤の水分含量が5％未満であることが明らかである。表から判るように、バッチ番号156-35-2は最も低い残留水分量を有していたが、これは、おそらくその製剤中のマンニトールの量が増大したことによるものと思われる。
【表１８】
2004532277.tif 000019
【０１７４】
粒子密度の結果：
下記の表2.12に示す結果から判るように、試験した全ての製剤のタップ密度はほぼ同じであり、許容範囲内であった。また、表から判るように、バッチ番号156-42-2では、製剤にグリシンを添加したことにより、他の製剤と比較して、タップ密度が顕しく増大した。粉体のタップ密度を変化させ得る変数は様々であり、基本的に粒径、粒径分布、結晶挙動およびシワの寄り方に応じて異なる。別の賦形剤の導入または賦形剤／活性製剤の量の増大によりこれらの変数を変えることによって、粒子のタップ密度に予測可能な変化が生じる。
【０１７５】
これらの製剤においてラフィノースをバルキング剤として使用すると、許容される物理的特性を持つ粒子が得られ、PVP製剤と比較して凝集の発生が低かった。
【表１９】
2004532277.tif 000020
【０１７６】
2.5.3 種々のデキストラン製剤
以下の一連の実験では、目的は、バルキング剤としてデキストランを用いて粒子の物理的特性を測定することであった。デキストランは、高いガラス転移温度（TG）を有するガラスを形成する。試験した特定のデキストラン含有製剤を下記の表2.13に示す。
【表２０】
2004532277.tif 000021
【０１７７】
画像分析の結果：
図8a〜8fから判るように、SFDデキストラン製剤（表2.13で規定）から、球形の形状と狭い粒径分布を持つ粒子が得られ、また凝集した粒子の顕著な低下が見られた。
【０１７８】
粒径の結果：
各種のデキストランバッチ（表2.13の製剤）の評価から得られた粒径の結果を、下記の表2.14に示すが、顕微鏡写真から得られた推定粒径とほぼ一致していた。表から判るように、バッチ番号156-53-1の平均粒径は、バッチ番号156-42-3-1と比較して著しく増大したが、これはAerosizerにより得られたPSDによって説明でき、これは、バッチ番号156-42-3-1のPSDと比較してもっと右に偏っており、これは大きな粒子であることの指標である。バッチ番号156-61-1は、バッチ番号156-53-1をスケールアップした製剤であるが、ほぼ同じPSDが得られた。バッチ番号156-53-1および156-42-3-1は、ほぼ同じBSAおよび賦形剤組成を含んでいるが、前者では16時間という凍結乾燥サイクルを用いた。
【０１７９】
これらのAerosizerによるデータから、より短い乾燥サイクルを用いた場合に平均粒径は著しく増大したことが判るが、図8cおよび8fの考察からは形態についても大きさについても有意な差異は示されない。これらのデータから、乾燥サイクルが長いほど、粒子が崩壊すると仮定でき、これは粒子内の空隙率に影響を及ぼす可能性がある。この場合、空気動力学的直径は粒子内空隙率に依存するので、Aerosizerで測定した場合の粒径に影響を及ぼすであろう。バッチ番号156-65-1は最も大きな平均粒径を有していた。このことは、表2.13の他のデキストラン製剤と比較して固形含量が増大していることに起因している可能性がある。
【表２１】
2004532277.tif 000022
【０１８０】
粒子密度の結果：
下記の表2.15に示す結果から判るように、試験した全てのデキストラン製剤のタップ密度はほぼ同じであり、許容範囲内であった。これらの密度を見たところ、凍結乾燥時間がタップ密度に対して全体的に殆ど影響しないことも示される。
【０１８１】
バッチ番号156-42-3-1と比較してバッチ番号156-53-1の平均粒径が著しく増大したことは、より崩壊が進んだ粒子の生成によるものとすることはできない。何故ならば、タップ密度および光学顕微鏡法の顕微鏡写真からは、これら2種のバッチの差異は示されていないからであり、したがって、これら2種のバッチの平均粒径の差はサンプリングのバラつきに起因するものである。
【表２２】
2004532277.tif 000023
【０１８２】
2.5.4 種々の塩製剤
以下の一連の実験では、目的は、塩のバルキング剤（グルタミン酸アルギニン）と他の一般的な賦形剤（アラニン、プルロニック、メチオニン)の異なる組合せを含む製剤の粒子の物理的特性を測定することであった。試験した特定の製剤を下記の表2.16に示す。
【表２３】
2004532277.tif 000024
【０１８３】
画像分析の結果：
図9a〜9fから判るように、表2.16で規定されるSFD塩製剤では、形状が球形で粒径分布が狭い粒子が得られた。図9aはバッチ番号156-57-1の顕微鏡写真であり、凍結乾燥プロセス後に粒子が凝集したこと、更に図9aに示す粒子の縁部が厚く丸くなっていること（これは潮解の指標である）を示している。他の塩製剤は、いかなる凝集の兆候も示していない。
【０１８４】
したがって、グルタミン酸アルギニンおよび上記の賦形剤を含む噴霧凍結乾燥製剤についてＸ線粉末回析（XRPD）を行った。これは、凍結乾燥前および凍結乾燥後の賦形剤の形状を解明するために行った。凍結乾燥前のグルタミン酸アルギニンのXRPDパターンを分析したところ、結晶性の物質であることの指標である独特のピークが示された。バッチ番号156-76-1のXRPDパターンを分析したところ、拡散したハローが示され、非晶質の製剤であることが示唆された。
【０１８５】
粒径の結果：
各種の塩製剤（表2.16の製剤）の粒径の結果を、下記の表2.17に示すが、これは顕微鏡写真から得られた推定粒径とほぼ一致する。
【表２４】
2004532277.tif 000025
【０１８６】
粒子密度の結果：
下記の表2.18に示す結果から判るように、試験した全ての製剤のタップ密度は、唯一バッチ番号156-76-1を除いて比較的高いものであり、全てが許容範囲内であった。これらの結果から、本発明の製剤において、バルキング剤としてグルタミン酸アルギニンを使用すれば、許容される物理的特性を持つ粒子が得られることが示されるが、アラニンの使用は、製剤の潮解を起こすため、最適とは見なされなかった。
【表２５】
2004532277.tif 000026
【０１８７】
2.5.5 更に別の塩製剤
上記の一連の実験と同様に、この一連の実験の目的は、種々の別のバルキング剤（アスパラギン酸アルギニン）と他の一般的な賦形剤（プルロニックF168、メチオニン、Tween80)との組合せを含む製剤の粒子の物理的特性を測定することであった。試験した特定の製剤を下記の表2.19に示す。
【表２６】
2004532277.tif 000027
【０１８８】
画像分析の結果：
図10a〜10cから判るように、表2.19で規定されるSFD塩製剤から、球形の形状の粒子が得られた。しかし、特にバッチ番号156-80-3では、多数の大きすぎる粒子が明らかに存在する。更に、バッチ番号156-80-2（図10b）では、いっしょになって融合しているように見える粒子があり、おそらく、製剤中の高いプルロニック濃度によるものと考えられる。
【０１８９】
粒径の結果：
各種の塩製剤（表2.19の製剤）の粒径の結果を、下記の表2.20に示すが、図10a〜10cに示す顕微鏡写真から得られた推定粒径とほぼ一致する。バッチ番号156-80-1では、最も小さい平均粒径が得られたが、これは使用した固形含量が低いことによるものであり、一方、バッチ番号156-80-2では最も大きな粒径が得られ、これはある程度は粒子の凝集／融合によるものであった（図10bを参照)。
【表２７】
2004532277.tif 000028
【０１９０】
粒子密度の結果：
下記の表2.21に示す結果から判るように、試験した全ての製剤のタップ密度は比較的高く、許容範囲内であった。バッチ番号156-80-1の製剤は、出発時の固形含量が低い（35％）ために、密度が比較的低かった。これらの結果から、本発明の製剤において、バルキング剤としてアスパラギン酸アルギニンを使用すると、許容される物理的特性を有する粒子が得られることが示される。
【表２８】
2004532277.tif 000029
【実施例３】
【０１９１】
アルミニウムアジュバント添加ワクチン組成物の噴霧凍結乾燥
3.1 目的：
アルミニウムアジュバント添加ワクチン粉体の製造での使用に関してSFD法を評価すること、および、粉末製剤を、表皮粉体免疫化（「EPI」）および慣用の針・シリンジ投与法を用いてin vivoでの性能について更に評価すること。これらの研究のために、B型肝炎ワクチン（アルミニウム-HBsAg）およびジフテリア／破傷風毒素ワクチン（アルミニウム-DT）を選んだ。この理由は、アルミニウム-HBsAg組成物は水酸化アルミニウムアジュバントを含み、アルミニウム-DT組成物はリン酸アルミニウムアジュバントを含んでいるからである。
【０１９２】
3.2 材料：
本研究において用いられる各種のワクチン組成物を製造するのに用いた化学物質および賦形剤を、下記の表3.1にまとめて示す。全てのアルミニウム製剤は、使用前に遠心分離（Allergra 6R Centrifuge, Beckman Instrument, Palo Alto, CA）により濃縮した。
【表２９】
2004532277.tif 000030
【０１９３】
3.3 方法：
3.3.1 噴霧凍結（SF）および噴霧凍結乾燥（SFD)
液体製剤は、蠕動ポンプ（#77120-70モデル, MasterFlex C／L, Barnant Company, Barrington, IL）により2.0mL/分の流速で、噴霧ノズル（#05793モデル）および電源（#06-05108モデル)から構成される超音波霧化装置（Sono-Tek Corporation, Milton, NY）に送り込んだ。ノズルには、液滴の大きさを決定する特定の振動数で振動を起こすことができる準弾性水晶が備わっている。60kHzの噴霧ノズルにより、大部分が20〜80μmの範囲にある液滴ができる。霧化した液滴を液体N2を含むパン（直径16cm、高さ6cm）に噴霧した。噴霧凍結／解凍実験に供する製剤では、凍結した粉体をガラスバイアルに移し、環境条件にて解凍した。乾燥にかける凍結液滴では、液体窒素中に凍結粒子を含むパンを予備冷却（-55 ℃）した棚式凍結乾燥機（#TDS2C2B5200モデル, Dura-Stop, FTS System, Stone Ridge, NY)に移した。液体窒素は数分で蒸発した。凍結乾燥条件は、-25℃で18時間、そして20℃で10時間に設定した。勾配速度は常に1℃/分とした。真空圧はサイクル全体を通して100mTとした。乾燥後、粉体が入っているパンを、粉体回収のために窒素でパージしてある乾燥箱（30％未満の相対湿度）に移した。SFは行わないが凍結は-20℃の凍結機で一夜保存することにより行う液体製剤では、同じ凍結乾燥サイクルを用いた。
【０１９４】
3.3.2 圧縮・粉砕・篩いがけ（C/G/S）法による粉体の形成
表皮粉体免疫化（EPI）研究のための高密度の粉体を製造するために、凍結乾燥（FD）した製剤およびSFD製剤を、直径13mmのステンレス鋼製の金型（Carver Press, Wabash, IN）で、12,000〜15,000ポンドの圧力で5〜10分間圧縮した。圧縮したディスクを、乳鉢と乳棒を用いて手作業で粉砕し、次に、粉砕した粉体を、4種のサイズ（20μm、38μm 、53μmおよび75μm）の3インチの篩いの積層体（Fisher Scientific Products, Pittsburgh, PA）で手作業で篩った。
【０１９５】
3.3.4 噴霧乾燥（SD)
卓上小型噴霧乾燥機（Buchi B-191, Brinkmann, Westbury, NY）を用いて、プラセボアルミニウム製剤を調製した。内部供給装置からの圧縮空気（約80psi）を用いて、二流式ノズル（0.5mm）により水性供給溶液を霧化した。標準的な操作条件は次の通りとした：注入口での空気温度が130℃、乾燥空気をフルスケールで吹き付け、霧化空気の流速が500L/時で、液体の供給速度が10mL/分。この条件により、排出口での空気温度は70℃になった。
【０１９６】
実験室用噴霧乾燥機（Mobile Minor, Niro A／S, Soeborg, Denmark）を用い、次の条件でアルミニウム-DT製剤を調製した。二流式ノズルは、2バールの霧化圧力で操作した。注入口での空気温度は160℃に設定し、乾燥空気はフルスケールで吹き付ける乾燥空気を用いた。液体を30mL/分で供給したところ、空気の排出口での温度は65〜70℃と測定された。
【０１９７】
3.3.5 空気乾燥（AD)
液状アルミニウムアジュバントワクチン製剤を、ポリスチレンで重み付けしたボート形容器に入れ、環境条件下で一夜放置乾燥した。層分離を最低限に抑えるために、プロセスの間ずっと、磁気撹拌子で撹拌することにより穏やかに撹拌した。
【０１９８】
3.3.6 光学顕微鏡法
粒子の視覚的分析は、10倍の接眼レンズおよび10倍の対物レンズが備わった光学顕微鏡（DMRモデル, Leica, Germany）を用いて行った。このシステムには、画像を出力するためのポラロイドカメラ装置が備わっていた。
【０１９９】
3.3.7 粒径分析
容積分布における粒子の平均幾何学的／空気動力学的直径は、飛行時間粒径分析装置（Aerosizer, API, Minneapolis, MN)を用いて測定した。平均容積サイズ（mean volumetric size）はソフトウェアにより1.0の密度を用いて算出し、10％（D10）〜90％（D90）の粒子集団は粒径分布について示した。各分析には約3〜5mgの粉体サンプルが必要であった。懸濁液では、粒径分布は光オブスキュレーションに基づく粒径分析装置（AccuSizer 780, Particle Sizing Systems, Santa Barbara, CA)を用いて測定した。
【０２００】
3.3.8 SDS-PAGE
クーマシーコロイド染色SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）は、Novex（San Diego, CA）製のNu-PAGEゲル（4〜12％のMES、流出緩衝液、サンプル緩衝液、および／またはジチオトレイトール還元剤）で行った。アルミニウムアジュバント粉末ワクチン製剤を水で再構成し、遠心分離して上清を除去した。アルミニウムペレットを、0.1％のSDSを含む200mMリン酸ナトリウム（pH 7）に再懸濁した。次に、この懸濁液を、Novexゲルキットのサンプル緩衝液と混合した。次に、サンプル液を95℃で5分間加熱し、ボルテックス処理した後で、ゲルにかけた。ゲルを電源（PowerEase 500, Novex）を用いて200V／120mA／25Wにて35分間流し、次にクーマシー染色し（Novex Colloidal Blue Stain）、水で脱色した。ゲルの画像をゲルスキャナー（GS-700モデル画像形成デンシトメーター, BioRad）でスキャンした。このスキャナーには、定量用ソフトウェア（Quantity One）が備わっており、これがゲルのバンドの強度を定量化できる。シグナル強度の単位は光学密度（O.D.）である。全てのサンプルを、分子量マーカー（Mark 12, Novex)と比較した。
【０２０１】
3.3.9 PowderJect（登録商標）粉体注射装置を用いたEPI
PowderJect（登録商標）粉体注入装置（無針注射器）を用いて、ヘアレスモルモットを免疫した。この装置は、長さが約15cmであり、ガスシリンダー（容積5ml）、破断チャンバー、三層積層粒子カセット、ノズルおよびサイレンサー要素が組み込まれている。ステンレス鋼製のガスシリンダーに、医薬品等級のヘリウムガスを40バールの圧力まで充填する。三層積層カセット（外径11mm、内径6mm、高さ4mm）は、厚みのあるエチレン酢酸ビニル製ワッシャーと、各側部に熱封止されている破断膜（その中に粉末ワクチンサンプルが収容される）から構成されている。破断膜は、半透明のポリマーボネートから作られた厚い膜（20μm）から形成されている。駆動させると、ガスシリンダーからヘリウムガスが放出されて、破断チャンバー内の圧力を上昇させる。漏れたガスが破断膜の破断強度に打ち勝って膜を破断させ、それによりガスが三層積層カセット中に広がって、ワクチン粉体を発射物として皮膚に噴射する。ヘリウムガスは皮膚から跳ね返され、サイレンサー要素から排気される。粉体が透過する深度は、粉体を皮膚の表皮層に送達させるように最適の耐性（optimal tolerance）および最大の効率について実験により最適化した。
【０２０２】
3.3.10 マウスの免疫化および血清の採取
5〜7週間齢の雌性BALB/cマウス（Harlen-Sprague-Dawley, Indianapolis, Indiana）を用いて、粉末アルミニウム吸着B型肝炎ワクチンの免疫原性を評価した。FDおよびSFD粉末製剤を蒸留水で再構成し、26 1/5針を用いて腹腔内（IP）注射により投与した。それぞれの注射により、アルミニウムに吸着させた2μgのB型肝炎表面抗原を含む200μlの溶液が投与された。対照マウスは、同じ用量の未処理の液体B型肝炎ワクチンで免疫した。追加免疫は28日目に投与した。
【０２０３】
各回の接種の前および追加免疫の2週間後に、麻酔下での眼窩後放血により採血した。
【０２０４】
3.3.11 モルモットの免疫化および血清の採取
ヘアレスモルモット（Charles River, Wilmington, MA）を用いて、EPIの後で、アルミニウムに吸着させたジフテリア毒素（dT）および破傷風毒素（tT）の粉末製剤の免疫原性を評価した。EPIの概略的方法は、本明細書の上記および当技術分野で詳細に記載されている。簡単に述べると、試験しようとする粉末ワクチン組成物１mgを三層積層カセットに分配した。免疫化する時点で、このカセットをPowderJect粉体注入装置に挿入した。この装置をこの動物の左鼠蹊部の皮膚に設置し、ガスシリンダーから圧縮ヘリウムを40バールの圧力で放出することにより駆動させた。対照動物は、食塩水中のDTワクチン0.20mLで、26 1/2ゲージの針を用いた筋肉内（IM）注射により免疫した。
【０２０５】
各回の接種の前および追加免疫の2週間後に、頚動脈血管から採血した。
【０２０６】
3.3.12 ELISA
アルミニウム-DTワクチンのジフテリア毒素（dT）成分および破傷風毒素（tT）成分ならびにアルミニウム-HBsAgワクチンのHBsAg抗原成分に対する抗体応答は、変更を加えたELISA法を用いて測定した。96ウェルプレート（Costar, Fisher Scientific Products, Pittsburgh, PA）を、ウェル当たり、30mMリン酸緩衝化食塩水（PBS）（pH 7.4）中の抗原（HBsAg、dTまたはtT）0.1μgで、4℃にて一夜被覆した。プレートを0.1％のBrij-35を含有するトリス-緩衝化食塩水（TBS）（pH 7.4）で3回洗浄し、5％の粉末ミルクを含有するPBSで希釈した被験血清と共に1.5時間インキュベートした。dT、tTまたはHBsAgに対する抗体の既知レベルを含有する標準血清を各プレートに添加し、最終的なデータ分析において力価を標準化するのに使用した。次に、プレートを洗浄し、ビオチン標識ヤギ抗マウス抗体（PBS中で1：8,000, Southern Biotechnology Associate, Birmingham, AL）と共に室温で1時間インキュベートした。最後に、プレートを洗浄し、TMB基質（Bio-Rad Laboratories, Melville, NY)で展開した。血清の終点力価を、4つのパラメーターによる分析により、Softmax Pro 4.1プログラム（Molecular Devices, Sunnyvale, CA）を用いて測定し、ODの読み値がバックグラウンドを0.1以上超える最大血清希釈率の逆数として定義した。各プレートについて所定の力価を有する基準血清を用いて、力価を較正し、アッセイ間およびプレート間のバラつきの調整を行った。
【０２０７】
3.4 粉体の特性決定
現在市販されているアルミニウムアジュバント添加ワクチンは、注射用として、食塩水中の約2w/v％のアルミニウム塩で配合されている。したがって、市販のワクチン組成物は、光学顕微鏡を用いて、凍結前および凍結後に調べた。この研究の結果を図11a〜11dに示す。光学顕微鏡法によれば、Adju-Phosアジュバント（2w/v％のプラセボAlPO4ゲル）は、平滑で砂様の組織（texture）を示し、観察可能な粒子はなかった。-20℃で凍結後、解凍したゲルは、直ちに有意な凝集を起こしたが（図11aを参照）、噴霧凍結後の同じゲルは僅かな凝集（明るいドット）を示しただけであった（図11bを参照)。Alhydrogelアジュバント（3w/v％のプラセボAl(OH)3）についても、-20℃で凍結した後（図11cを参照）および噴霧凍結後（図11dの黒い粒子を参照）で同様の差異が見られた。外観では、-20℃の凍結機で凍結させたゲル溶液では大きな粒子が見えたが、それらは直ちに容器の底に沈降した。更に、沈降したアルミニウム粒子の容積は、出発ゲルのものよりも有意に大きかった。これらの全ての知見から、アルミニウムゲルは通常の凍結の後で凝集することが示唆される。凝集したアルミニウムゲルは、超音波やボルテックス処理などの機械的力の下でも可逆的ではない。一方、噴霧凍結したゲルでは凝集が起こらなかったことから、バルキング剤または安定化剤の不在下であっても、その塩のタイプによらず、極めて迅速な凍結によりアルミニウムゲルの凝集傾向が有意に低下することが確認される。凍結したゲルを凍結乾燥した後、再構成したアルミニウムの凝集程度は、凍結／解凍サンプルとほぼ同じであると思われ、凍結がアルミニウムの凝集の主な原因であることが示唆される。
【０２０８】
3.5 in vivoでの性能
3.5.1 アルミニウム-HBsAgの免疫原性に及ぼすアルミニウム凝集の影響
マウスモデルを用いて、アルミニウム-HBsAgワクチン組成物の免疫原性が乾燥法および凝集粒子の大きさによって影響を受けるか否かを試験した。下記の表3.2に、本研究をまとめる。
【表３０】
2004532277.tif 000031
【０２０９】
本研究で用いた製剤は次のとおりとした。製剤Q：水酸化アルミニウム（3.0w/v％)／マンニトール（1.9w/v％)／グリシン（0.5w/v％)／デキストラン（0.61w/v％）（アルミニウム濃度はアルミニウム-HBsAgをプラセボ・水酸化アルミニウムゲルと組み合わせることにより達成した）。製剤R：水酸化アルミニウム（0.6w/v％)／マンニトール（2.8w/v％)／グリシン（1.2w/v％)／デキストラン（0.58w/v％)。対照：市販のアルミニウム-HbsAg製品（Rhein Biotech）を製造元から供給されたまま使用。
【０２１０】
製剤QおよびRから製造したSFD粉体は、アルミニウム塩の濃度が異なる。群#2-4での粉体は、FD製剤Qを圧縮し、続いて粉砕し、次に篩いがけして、3種の異なる粒径画分を得ることにより製造した。全ての粉末組成物は、上記の実施例1および2に記載したようにして十分に特性決定した。再構成した粉体の光学顕微鏡写真からもまた、SFD粉体は水に容易に再懸濁できたが、FD製剤は高度に凝集したことが示唆される。もう1つの特性決定法は、粉体サンプルを水で再懸濁し、光散乱粒径分析（AccuSizer)に供することを含む。粒径分析の結果を図12aおよび12bに示す。図12aから、2種のSFD粉体のアルミニウム粒径分布が出発ゲルのものと同じ粒径範囲にあることが示され、検出可能な凝集粒子が存在しないことが示唆される。しかし、再構成したFD／圧縮／粉砕／篩いがけ粉体（38〜45μm、表3.2中の群#3 in）は、45μmを最大値とする5〜50μmの粒径範囲を示し（図12b）、これは、再水和化前の乾燥粒子の大きさと重複する。
【０２１１】
乾燥した際のアルミニウム-HBsAg組成物の安定性を評価するために、SDS-PAGE分析を、非還元条件下および還元条件下の両者において行った。非還元SDS-PAGE分析の光学密度スキャンから得た結果を下記の表3.3に示す。
【表３１】
2004532277.tif 000032
【０２１２】
自然の状態では、HbsAgは、径が22nmの高度に凝集した粒子である。非還元条件下では、製剤は単量体の形態に分解しない。しかし、SDS-PAGEゲルの上部にある1つのバンドの光強度は製剤間で異なる（表3.3)。例えば、上記の2種のSFD製剤の光強度は、対照（出発液体製剤）の場合よりも僅かに低い。FD製剤は最も明るいバンドを示したが、FD製剤をC/G/Sを用いて粒子に製剤化した場合はバンドの強度は増大した。興味深いことに、バンドの強度は粒径が小さくなるほど増大した。この知見は、アルミニウムゲルの凝集と関連すると思われる。何故ならば、凝集したアルミニウム粒子の表面からの抗原の脱着は制限されるか遮断される可能性があるからである。FDアルミニウムゲルを粉砕すると、抗原にもっと暴露される表面が現れた。粉体の比表面積は、粒径が小さくなるほど増大する。還元条件下では、HbsAg粒子は、約24kDaの単量体へと分解した。全ての製剤間では、バンドのパターンおよび強度に差異は見られなかった。これは、おそらく、単量体形のHbsAgがぎっしり詰め込まれたアルミニウム凝集体から拡散できる容易性によると思われる。
【０２１３】
上記の表3.2に記載されている各種のアルミニウム-HBsAg製剤の免疫原性を、マウスモデルで試験した。それぞれの動物に投与したHbsAgの用量は、1mgの粉体当たり2μgとし、これは水で再構成し、IP注射により送達した。血清サンプルは、プライミングの4週間後および追加免疫の2週間後に採取した。血清抗体は標準的なELISAを用いて測定し、結果を図13にまとめて示す。
【０２１４】
図13から判るように、未処理の液体ワクチン（対照）と比較して、FD HBsAgワクチン組成物（第1群）は、低い免疫原性を示した。更に、アルミニウム含有粉体の粒径は、アルミニウム-HbsAgの免疫原性に著しく影響を及ぼした。凍結乾燥製剤の免疫原性は、粒子（第2、3および4群)の大きさと負の相関関係があった。粒径が大きな画分は、粒径が小さな画分よりも免疫原性が低かった。これは、SDS-PAGEの結果と一致し、凝集したアルミニウムマトリックスからのHBsAgの利用性（アベイラビリティ）によって説明できると思われる。小さい粒子ほど比表面積が大きく、そのため、in vivoでより多くのHBsAgがアルミニウムマトリックスから放出されるようになる。もう1つの解釈は、大きな凝集粒子は抗原提示細胞の食作用を受けるには大きすぎるので、吸着させたワクチン抗原（HBsAg）は免疫系に利用できない、ということである。機構はいずれにしても、このデータは、凝集に伴って生じる大きな粒子がワクチンの効力の低下とも相関することを明確に示している。
【０２１５】
SFD製剤（QおよびR）は、対応するFD製剤よりも有意に高い抗体応答を示した。この結果から、アルミニウムの凝集がHBsAgの免疫原性の低下の原因であったこと、そして、SFDにより凍結速度を速めることが、アルミニウムアジュバントの活性を保持するための有効な方法であることが確認される。免疫原性に及ぼすSFD粉末製剤中のアルミニウム濃度の影響は重大である。3.0w/v％のアルミニウム HBsAgを含有するSFD製剤Qでは明らかに検出可能な凝集は見られなかったが、この製剤は、IM注射の対照よりも約1-log低い抗体力価を誘導した。アルミニウム含量が0.6％のSFD製剤では凝集は起こらず、IM注射した動物とほぼ同様の抗体力価を誘導した（p＞0.05、スチューデント検定)。この結果から、低いアルミニウム濃度および急速な凍結が、アルミニウム粒子の凝集を最低限に抑え、そうしてワクチンの免疫原性を最大にする上で、最も有効な製剤化パラメーターであることが示唆される。
【０２１６】
3.5.2 粉末アルミニウム-DTを用いるEPI
市販のDTワクチンを用いて、リン酸アルミニウムアジュバント含有ワクチン組成物に及ぼすSFD法の影響を実証した。アルミニウム-DTワクチンを慣用の噴霧乾燥（「SD」）またはSFDのいずれかにより乾燥し、次に乾燥した粉体を用いて、ヘアレスモルモットをEPIを用いて免疫した。EPIは、乾燥粉体を表皮層に直接送達するものであり、そこでは、多量の抗原提示細胞（APC）が活性化されて、溶解している抗原の食作用または飲食作用を起こすことができる。モルモットでの研究の研究設計を下記の表3.4に示す。
【表３２】
2004532277.tif 000033
【０２１７】
本研究で用いた製剤は次のとおりとした。製剤S：リン酸アルミニウム（5w/v％)／トレハロース（5w/v％)。製剤T：リン酸アルミニウム（1.5w/v％)／トレハロース（1.5w/v％)／グリシン（0.4w/v％)／デキストラン（0.6w/v％)。対照：市販のアルミニウム-HBsAg製品（Rhein Biotech）を製造元から供給されたまま使用。
【０２１８】
製剤S（トレハロースベース）は、実験室規模の噴霧乾燥装置（Mobile Minor, Niro, Inc)を用いて噴霧乾燥した。製剤T（トレハロース、グリシンおよびデキストランの組合せをベースとする）は、本発明のSFD法を用いて製造した。両者の粉末製剤（製剤SおよびT）では、乾燥粉体をC/G/S法（38〜53μmの大きさの画分に篩いがけ）に供して、SD粉体と一致させた。dTおよびtTの両者とも、1.5 Lfの用量を用いた。これは、全タンパク質分析によれば約0.5mgのSD粉体および0.7mgのSFD粉体に相当する。
【０２１９】
光学顕微鏡法および粒径分析によりアルミニウム凝集を更に評価したところ、SD粉体ではアルミニウム粒子が高度に凝集したが、SFD粉体では、再水和した際によりゲル状の懸濁液が得られた、という同様の知見が明らかになった。血清サンプルはプライミングの4週間後および追加免疫の2週間後に採取した。血清抗体は、標準的な抗dTおよび抗tT ELISAを用いて測定した。結果を図14a（抗dT応答）および14b（抗tT応答)にまとめて示す。SD製剤は抗体応答を全く誘導しなかったか（dTの場合、図14aを参照）、または弱い抗体応答しか誘導しなかった（tTの場合、図14bを参照）ことが判る。しかし、これに対して、SFD製剤は、筋肉内注射された未処理の液体ワクチン（対照）により誘導されるものと実質的に同等の有意に高い応答を誘導した。
【実施例４】
【０２２０】
SFDにより製造したアルミニウムアジュバントワクチン組成物の最適化
4.1 目的：
SFDアルミニウムアジュバントワクチン粉体の性能を最適化し、最終組成物中のアルミニウム含量を低減することにより生成物の安全性プロファイルを増強すること、および特に次の問題に対処すること：(a) ゲル凝集の更なる低減；(b) アルミニウムアジュバントに付随する局所的耐性（local tolerability）の低減；および (c) EPIにより投与した場合のワクチン組成物のin vivoでの有効性の増大。
【０２２１】
4.2 材料：
本研究で使用した化学物質および賦形剤を下記の表4.1にまとめて示す。全てのアルミニウム製剤は、使用前に、遠心分離（Allergra 6R centrifuge, Beckman Instrument, Palo Alto, CA）により目的濃度まで濃縮した。
【表３３】
2004532277.tif 000034
【０２２２】
4.3 方法：
通常、プラセボ・アルミニウムゲルは、種々の製剤用賦形剤と共に配合し、SFDにより脱水した。乾燥後、乾燥粉体を再構成し、光学顕微鏡下で検査して、ゲルの凝集をモニタリングした。また、凝集の程度についても、ゲルの沈降速度により測定した。次に、最適化した製剤化プロセスを適用してリン酸アルミニウムアジュバントB型肝炎表面抗原（AlPO4-HBsAg）を製造したが、ここで、アルミニウム含量は市販の製品の1/20とした。抗原の量は、SDS-PEGEまたは微量BCAタンパク質アッセイによりin vitroで測定し、抗原のin vivoでの有効性は、マウスの筋肉内針／シリンジ注射およびEPIにより測定した。EPIにより投与したSFDアルミニウム吸着ジフテリア-破傷風毒素（DT）ワクチンの局所的耐性はブタで評価し、皮内（ID）注射と比較した。
【０２２３】
4.3.1 噴霧凍結乾燥（SFD)
液体製剤は、蠕動ポンプ（#77120-70モデル, MasterFlex C／L, Barnant Company, Barrington, IL）により2.0mL/分の流速で、噴霧ノズル（#05793モデル）および電源（#06-05108モデル)から構成される超音波噴霧化装置（Sono-Tek Corporation, Milton, NY）に送り込んだ。ノズルには、液滴の大きさを決定する特定の振動数で振動を起こすことができる準弾性水晶が備わっている。60kHzの振動数の噴霧ノズルにより、大部分が20〜80μmの範囲にある液滴ができる。霧化した液滴を液体N2を含むパン（直径16cm、高さ6cm）に噴霧した。噴霧凍結／解凍実験に供する製剤では、凍結した粉体をガラスビンに移し、環境条件にて解凍した。乾燥にかける凍結液滴では、液体窒素中に凍結粒子を含むパンを、予備冷却（-55 ℃）した棚式凍結乾燥機（#TDS2C2B5200モデル, Dura-Stop, FTS System, Stone Ridge, NY)に移した。液体窒素は数分で蒸発した。凍結乾燥条件は、-25℃で18時間、そして20℃で10時間に設定した。勾配速度は常に1℃/分とした。真空圧はサイクル全体を通して100mTとした。乾燥が完了した時点で、粉体が入っているパンを、粉体回収のために窒素でパージしてある乾燥箱（30％未満の相対湿度）に移した。液体製剤を凍結乾燥するのに、凍結乾燥サンプルと同じ凍結乾燥サイクルを用いた。
【０２２４】
4.3.2 C/G/S法による粉体の形成
EPI用の高密度の粉体を製造するために、いくらかのSFD製剤を、直径13mmのステンレス鋼製の金型（Carver Press, Wabash, IN）で、12,000〜15,000ポンドの圧力で5〜10分間圧縮した。圧縮したディスクを、乳鉢と乳棒を用いて手作業により粉砕し、次に、粉砕した粉体を、3インチの篩い（Fisher Scientific Products, Pittsburgh, PA）を用いて手作業により篩いがけして、53〜75μmのサイズ画分にした。
【０２２５】
4.3.3 光学顕微鏡法
粒子の視覚的分析は、10倍の接眼レンズおよび10倍の対物レンズが備わった光学顕微鏡（DMRモデル, Leica, Germany）を用いて行った。このシステムには、画像を出力するためのポラロイドカメラ装置が備わっていた。
【０２２６】
4.3.4 走査型電子顕微鏡法
粒子の外面的な形態は、Amray 1810T走査型電子顕微鏡（Amray, Bedford, MA）を用いて調べた。まず、粉体サンプルをHummer JR Technics装置（Pergamon Corporation, King of Prussia, PA)を用いて金でスパッタ被覆した。
【０２２７】
4.3.5 粒径分析
容積分布における粒子の平均幾何学的／空気動力学的直径は、飛行時間粒径分析装置（Aerosizer, API, Minneapolis, MN)を用いて測定した。平均容積サイズは、装置のソフトウェアを用い1.0の密度を適用して算出して、10％（D10）〜90％（D90）の粒子集団が粒径分布について測定できるようにした。各分析には約3〜5mgの粉体サンプルが必要であった。
【０２２８】
4.3.6 Ｘ線粉末回析（XRD)
XRDの測定は、35kV×15mA Rigaku（D/max-β, CuKα放射）Ｘ線回析装置を用いて、室温で周囲湿度にて行った。サンプルは、0.1°/秒で、1秒のカウント時間/増加分にてスキャンした。スキャンした範囲は5〜40°とした。
【０２２９】
4.3.7 アルミニウムゲル凝集分析
光学顕微鏡法とゲル沈降法の2種類の方法を用いて、アルミニウムゲルの凝集を測定した。まず、粉体サンプルを撹拌せずに水で再構成して100mg/mLの濃度にした。ゲル溶液をピペッティングによりスライドガラス上に載せ、光学顕微鏡（DMRモデル, Leica, Germany)下で調べた。次に、同じゲル溶液を15mL容のポリスチレン製丸底試験管（Falcon, Becton Dickinson, Franlkin Lakes, NJ）に入れ、アルミニウムゲルの沈降速度をモニタリングした。
【０２３０】
4.3.8リン酸アルミニウムへのHBsAgの吸着
各投与物が100μmL中に25μgのAIPO4に吸着させた20μgのHBsAgを含む500のワクチン投与物を調製するために、8.9mLのHBsAg抗原（1.4mg/mL、pH 5.5）を2.83mLのAIPO4アジュバント（Adju-Phos、2％ AIPO4）、25mLの1.8％NaClおよび13.3mLの二重蒸留水と混合した。混合物を5回反転させ、次に室温（RT）で一夜穏やかに撹拌した。次に、pHを7.2まで上げ、混合物を室温にて4,500rpmで20分間遠心分離した。上清をデカンテーションし、ペレットを0.9％生理食塩水溶液に再懸濁した。懸濁液中のタンパク質の量をBCAタンパク質アッセイにより測定した。
【０２３１】
4.3.9 SDS-PAGE
クーマシーコロイド染色SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）は、Novex（San Diego, CA）製のNu-PAGEゲル（4〜12％のMES、流出緩衝液、サンプル緩衝液、および／またはジチオトレイトール還元剤）で行った。アルミニウムアジュバント粉末製剤を水で再構成し、遠心分離して上清を除去した。アルミニウムペレットを、0.1％ SDSを含む200mMリン酸ナトリウム（pH 7）に再懸濁した。次に、この懸濁液を、Novexゲルキットのサンプル緩衝液と混合した。次に、サンプル液を95℃で5分間加熱し、ボルテックス処理した後で、ゲルにかけた。ゲルを電源（PowerEase 500, Novex）を用いて200V／120mA／25Wにて35分間流し、次にクーマシー染色し（Novex Colloidal Blue Stain）、水で脱色した。ゲルの画像をゲルスキャナー（GS-700モデル画像形成デンシトメーター, BioRad）でスキャンした。このスキャナーには、定量用ソフトウェア（Quantity One）が備わっており、これがゲルのバンドの強度を定量化できる。シグナル強度の単位は光学密度（O.D.）である。全てのサンプルを、分子量マーカー（Mark 12, Novex)と比較した。
【０２３２】
4.3.10 免疫化および血清の採取
ヘアレスモルモット（Charles River, Wilmington, MA）を用いて、上記の実施例３で記載されているようにして、表皮粉体注射した後で、粉末製剤の免疫原性を評価した。通常、、免疫化の方法は次のようにした。粉体１mgを三層積層カセットに分配した。免疫化する時点で、このカセットを無針注射器送達装置に挿入した。この装置をこの動物の左鼠蹊部の皮膚に設置し、ガスシリンダーから圧縮ヘリウムを40バールの圧力で放出することにより駆動させた。対照動物は、食塩水中の液体ワクチン0.20mLで、26 1/2ゲージの針を用いた筋肉内（IM）注射により免疫した。各回の接種の前および追加免疫の2週間後に、頚動脈血管から採血した。
【０２３３】
4.3.11 局所反応性（local reactogenicity）試験
ブタをロンパンとテラゾールの1：1混合物で麻酔した。各ブタの腹部の両脇のショット部位に印を付けた。各部位に、EPIにより2mgの粉末製剤を投与した。対照部位には、再構成した粉体または未処理の液体ワクチンの内皮（ID）注射を投与した。免疫後、各注射部位を、週に一度、触診により調べた。
【０２３４】
42日目に免疫部位から皮膚生検を切除し、10％のホルマリンで固定し、パラフィンで包埋した。厚み6μmの切片を切り出し、ヘマトキシリンおよびエオシン（H&E）で染色し、光学顕微鏡（Nikon, Melville, N.Y.)下で可視化した。
【０２３５】
4.3.12 ELISA
HBsAgに対する抗体応答は、変更を加えたELISA法（例えば、Chenら. (2000) Nature Med 6：1187-1190を参照）を用いて測定した。特に、96ウェルプレート（Costar, Fisher Scientific Products, Pittsburgh, PA）を、ウェル当たり、30mMリン酸緩衝化食塩水（PBS）（pH 7.4）中の抗原0.1μgで被覆し、4℃にて一夜静置した。プレートを0.1％のBrij-35を含有するトリス-緩衝化食塩水（TBS）（pH 7.4）で3回洗浄し、5％の粉末ミルクを含有するPBSで希釈した被験血清と共に1.5時間インキュベートした。HBsAgに対する抗体の既知レベルを含有する標準血清を各プレートに添加し、最終的なデータ分析で力価を標準化するのに使用した。次に、プレートを洗浄し、マウス免疫グロブリンIgGまたはIgGサブクラスに特異的なビオチン標識ヤギ抗体（PBS中で1：8,000, Southern Biotechnology Associate, Birmingham, AL）と共に室温で1時間インキュベートした。更に3回洗浄した後、プレートをストレプトアビジン−西洋ワサビ・ペルオキシダーゼコンジュゲート（Southern Biotechnology）と共に室温で1時間インキュベートした。最後に、プレートを洗浄し、TMB基質（Bio-Rad Laboratories, Melville, NY)で展開した。血清の終点力価を、4つのパラメーターによる分析により、Softmax Pro 4.1プログラム（Molecular Devices, Sunnyvale, CA）を用いて測定し、ODの読み値がバックグラウンドを0.1以上超えた最大血清希釈率の逆数として定義した。各プレートについて所定の力価を有する基準血清を用いて力価を較正し、アッセイ間およびプレート間のバラつきの調整を行ったを行った。
【０２３６】
4.4 in vivoでの性能、安全性の増強
以下の研究は、本発明のSFD法を用いて製造したアルミニウムアジュバントワクチンの安全性が向上していることを実証するために行った。特に、肉芽腫の形成について評価した。肉芽腫の形成は、皮内または皮下投与されたアルミニウムアジュバントワクチンに付随する最も広く見られる副作用である。
【０２３７】
4.4.1 局所反応性
EPIを用いて送達したSFDアルミニウムアジュバントdTワクチンの局所反応性を調べ、ID注射の場合と比較した。この試験の動物モデルとして、家畜白ブタを選んだ。この理由は、その表皮がヒトの表皮と構造的に類似しているからである。アルミニウム吸着dTのEPIおよびID注射により、赤斑応答（局所的な皮膚反応）が起こった。赤斑領域の大きさは、大きくて、EPI投与では一層強く見えた。全ての場合において、赤斑は48時間以内に完全に消えた。EPI投与の部位は、更に2〜3日間は黄色味を帯びて見えたが、その後は正常な色に戻り、処置後7日目には正常な皮膚と視覚的に区別がつかなくなった。この反応性研究の研究マトリックスおよび結果を下記の表4.2に示す。
【表３４】
2004532277.tif 000035
【０２３８】
表から判るように、水酸化アルミニウムまたはリン酸アルミニウムのアジュバントを含有する粉末組成物のEPI投与では、目視検査により判定したところ、肉芽腫は生じなかった（表4.2)。これに対して、ID注射した部位の多くには、7日目から始まって本研究の終点に至るまで、触診により検出可能な固い塊があった。本研究の終点（処置の42日後）の時点で、ID液体ワクチン注射を投与した動物の塊の大きさは、直径が0.3〜0.5mm、厚みが0.2〜0.3mmの範囲であった。
【０２３９】
処置の42日後のEPI部位の組織学的検査の結果を図15a〜15eに示す。特に、組織学的検査から、正常な皮膚（図15aを参照)とほぼ変わらない皮膚構造（図15bを参照）および細胞組成（図15c）が示された。ID注射部位からの塊は、結合組織被膜を有する炎症性細胞からなる典型的な肉芽腫であることが判明した（図15d)。炎症性細胞は、正常な組織と完全に置き換わった結合組織の被膜で包囲されており、これもまた肉芽腫形成の特徴であった。精密検査から、炎症性細胞の主なクラスはマクロファージであることが判った（図15eを参照)。水酸化アルミニウム液体ワクチン組成物およびリン酸アルミニウム液体ワクチン組成物は両者とも、ID注射により導入されると肉芽腫を誘発した。これらの結果から、本発明の粉末ワクチン組成物のEPI投与が、慣用の投与経路と比較して特有の安全性の利点を付与することが実証される。
【０２４０】
4.5 粉末製剤の最適化
アルミニウムゲルの安定性に影響を及ぼす製剤化パラメーターを評価し、表皮粉体注射法に適する最低限のアルミニウムゲル凝集と優れた粒子特性有するSFD粒子が得られるように最適化した。これに関して、SFD法は、既に、アルミニウム含有液体製剤を液体窒素中で霧化することにより可能な最大の凍結速度を達成するように調整されており、これにより、大規模なアルミニウム凝集の発生が最低限に抑えられる。本研究では、各種の賦形剤の組合せの増強効果を調べた。
【０２４１】
4.5.1 賦形剤の組成の影響
高い粒子密度および適切な粒径は、EPIのような経皮粒子投与において使用するためには最適化しなければならない2つの重要な粉体特性である。賦形剤の組成は、SFD粉体の密度に定量可能な影響を及ぼす。何故ならば、氷の結晶の蒸発により粒子内に残った空隙が乾燥中に陥没する可能性があるからである。したがって、トレハロース、マンニトールおよびデキストランの賦形剤の各種重量の組合せによって安定化した一連の水酸化アルミニウムおよびリン酸アルミニウムの組成物を製造し、次にゲルの性能および粒子の特性について評価した。SFD粒子は、まず、SEMを用いて目視評価し、この研究の結果を図16aおよび16bに示す。特に、トレハロース／マンニトール／デキストラン＝30％／30％／40％の組合せと35w/w％の総固形含量により、シワが寄った形態の粒子ができる。SEMから、水酸化アルミニウムを36μg/粉体1mgで含有する粒子（図16a）およびリン酸アルミニウムを50μg/粉体1mgで含有する粒子（図16b）では、そのような形状であることが示され、そこにおいて、粒子は乾燥プロセス中に収縮して緻密になっていると思われる。
【０２４２】
次に、FD法またはSFD法により製造した粉体を再構成したものについて、アルミニウムの凝集を光学顕微鏡法を用いて評価した。結果を図17a〜17dに示す。図17aはFD水酸化アルミニウム組成物を示し、図17cはFDリン酸アルミニウム組成物を示し、図17bはSFD水酸化アルミニウム組成物を示し、図17dはSFDリン酸アルミニウム組成物を示す。図から判るように、双方のFD製剤は、対応するSFD製剤と比較して高度に凝集していた。沈降実験により、FD懸濁液が1分で沈降した（すなわち、上層の液が清澄になった）が、SFD溶液では清澄になるのに約5時間かかったことが確認された。トレハロース／マンニトール／デキストラン賦形剤の組成を変えたところ、対応するSFD粉体の密度も変化した。しかし、凝集の差異は、光学顕微鏡法では区別ができなかった。興味深いことに、再構成したゲルは、マンニトールの含量を減らすほど、それだけ速い速度で沈降した。40％／20％／40％のトレハロース／マンニトール／デキストラン中で配合したリン酸アルミニウム（50μg/粉体1mg）の沈降は、例えば、約2時間で完了した。
【０２４３】
4.4.2 界面活性剤の影響
本発明のSFDアルミニウム含有粒子に及ぼす、4種の一般的な界面活性剤の賦形剤の安定化作用を評価した。特に、ポリソルベート80（786Å、MW＝1310）、ラウリル硫酸ナトリウム（SDS）、（53Å、MW＝288）、プルロニックF68、ポリオキシエチレンとポリオキシプロピレンとのブロックコポリマー（MW＝9,000）、およびTriton X-100（オクチルフェノールエチレンオキシド縮合物、平均MW＝625）を本研究のために選んだ。4種の界面活性剤は全て、トレハロース／マンニトール／デキストラン賦形剤（30％／30％／40％で存在）と、固形分が0.5、2および5％という3種の異なる濃度で配合した。それぞれの再構成懸濁液を光学顕微鏡法および沈降法により調べたところ、各種の界面活性剤間で、アルミニウム凝集の有意な差異は見られなかった。しかし、ポリソルベート80、SDSおよびTriton X-100の薬剤を含有する粒子は、特に高濃度において、粉体の流動性が低下した。
【０２４４】
4.4.3 アルミニウム塩の臨界濃度
アルミニウム濃度が低い（＜0.1w/v％）アルミニウム吸着ワクチンは、免疫原性が保たれたまま凍結乾燥されると報告されているが（例えば、米国特許第4,578,270号および欧州特許第0130619 B1号を参照）、多くの市販のアルミニウムアジュバントワクチンがもっと高いアルミニウム濃度（典型的には約2〜3w/v％）で投与されることを考慮すると、これらの製剤は実用的ではない。しかし、上記の実施例３に示すように、米国特許第4,578,270号および欧州特許第0130619 B1号に記載されている特定の製剤は、1％を上回るアルミニウム塩濃度で凍結乾燥した場合は、アルミニウム塩を凝集しないように安定化できない。したがって、アルミニウム塩の濃度は、アルミニウムの凝集において非常に重要な役割を担っている可能性がある。本発明者らの仮説は、アルミニウム濃度が臨界レベルを超えた場合は、SFDにより急速に凍結させるという効果があるにもかかわらず、アルミニウム塩の凝集は避け難いだろう、というものである。この臨界濃度を確定するために、多くのリン酸アルミニウムおよび水酸化アルミニウムの製剤を、SFDにより、各種のSFD前のアルミニウム塩濃度、賦形剤組成、総固形分濃度およびペイロードで製造した。これらの製剤の幾つかを下記の表4.3にまとめて示す。
【表３５】
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【０２４５】
SFDの後、各種のサンプル製剤を、光学顕微鏡法を用いて評価して、アルミニウムゲルの凝集程度を測定した。本研究の結果を図18a〜18dに示す。評価の結果、SFD前の液体製剤中のアルミニウム塩の濃度は非常に重要な要因であると思われることが判った。これに関して、液体（出発）製剤中のアルミニウム塩濃度が26〜34mg/mLの範囲で、アルミニウムゲルの凝集形態への明らかな移行が見られる。特定の再構成した粉末製剤（表4.3に示すサンプル）の光学顕微鏡観察から、次のことが明らかになった。製剤A（26.5mg/mL）では凝集は起こらなかった（図18aを参照)。30.3mg/mLの製剤Bでは、多少の凝集したアルミニウム粒子が見られた（図18bを参照)。しかし、出発液体中のアルミニウム濃度を更に34.0mg/mLまで上げると（製剤C）、アルミニウムの凝集は更に一層顕著になった（図18cを参照)。アルミニウムの凝集は、粉体中のアルミニウム塩の量と直接的な相関関係がなかった。何故ならば、製剤CおよびDは同じアルミニウム含量（114μg/粉体mg）を有し、製剤Dでは凝集は見られなかったからである（図18dを参照)。これは、製剤Dが、28.4mg/mLのアルミニウム塩の懸濁液から製造されたためである。したがって、SFD法の臨界アルミニウム塩濃度は、液体ゲル中で30mg/mLであると思われた。これについての有望な解釈は、高濃度のアルミニウムゲルが緻密なマトリックスを形成し、氷形成パターンに影響を及ぼし、そこにおいて、氷の結晶は、アルミニウムゲルの濃度が低い場合と比較して、凍結濃縮物を狭いコンパートメントに押しやる可能性が低い、ということである。更に、アルミニウムの凝集は、SFD前の液体ゲル中の総固形含量と何の相関関係も示さなかった（表4.3を参照)。総固形含量が高いほど密度の高いSFD粒子が得られ、EPIでの使用では、粉体を製造するのには35％以上の総固形含量であることが好ましい。
【０２４６】
4.6 SFDワクチン組成物のin vivoでの性能
上記の最適化評価に基づいて、SFD製剤化は、少なくとも約30mg/mLのアルミニウムゲル濃度を含む液体製剤を用いれば最適に出発し、35％の総固形含量を有するべきである、と判断された。市販のアルミニウム吸着HBsAgワクチン（500μgのアルミニウムアジュバントを含有）の一回のヒト用の用量をSFDすることにより、約28mgの乾燥粉体が得られた。したがって、乾燥質量を低減するためには、ワクチン用量中のアルミニウムの量を減らさなければならない。耐性の研究ならびに本明細書の上記で示されたように、ワクチン中のアルミニウムを減らすことは、SFDワクチン組成物の耐性の向上に更に有利になるはずである。したがって、SFD粉末ワクチン組成物は、25μgのリン酸アルミニウムアジュバントに吸着させた20μgのHBsAg抗原を用いて製造し、この製剤の免疫原性を、SFDワクチン組成物のEPIまたはIM注射（再構成後）を用いて測定し、同じHBsAg用量を含むが20倍以上のアルミニウムアジュバントを含む市販のワクチンと比較した。
【０２４７】
4.6.1 免疫原性の研究
まず最初に、ヘアレスモルモットにおいて、リン酸アルミニウムまたは水酸化アルミニウムのいずれかをアジュバントとするHBsAgの粉末製剤（HBsAg：アルミニウムの割合は1：25）（（表4.3）中でそれぞれ製剤EおよびFと命名）の免疫原性を比較した。これらの製剤は、SFD粒子を再構成した後の液体をEPIまたはIM注射することにより投与した。本研究の結果を図19aに示す。図から判るように、全ての群が、初回接種および追加接種（それぞれ、プライミングの6週間後および9週間後）を投与した後で、有意な抗体応答の増大を示した（図19aを参照)。再構成した粉体を接種した動物における抗体力価は、未処理の液体製剤ワクチンにより誘導されるものと同等であり（P＞0.05）、このことから、乾燥アルミニウム製剤の安定化にSFDが適していることが示唆された。EPIにより接種した全ての動物が、有意な抗体力価を生じた。興味深いことに、これら2種のアルミニウム塩は、乾燥粉体として皮膚に送達した場合、等しい免疫原性であると思われる。
【０２４８】
次の研究では、AlPO4を通常のアルミニウム含量の1/20を含有する乾燥粉末製剤（すなわち、25μgのアルミニウムに吸着させた20μg HBsAg）の免疫原性を評価した。この高用量のワクチンはモルモットにおいて免疫応答を抑制するので、被験体はこの用量の僅か1/10（2.0μgのHBsAg／2.5μgのALPO4)で接種した。この研究の結果を図19bに示す。この図において、このSFD製剤が、再構成した粉体としてIM注射することにより抗体応答を誘発するのに十分であることが判る。追加免疫の2週間後、幾何学的平均力価（GMT）が5.6（log10)であるSFD再構成製剤を投与した動物では、最大の抗体力価が検出された。これらの力価は、20倍多いアルミニウムを水酸化アルミニウムの形態で含有する未処理の液体ワクチン製剤（GMT＝5.5 log 10）を投与した動物において検出されるものとほぼ同じであり、このことから、市販のワクチン中のアルミニウム用量を有効性を損なうことなく減らすことができることが示唆された。このアルミニウムの用量の有意な低減は、EPIにより送達されるアルミニウムアジュバントワクチンに更なる安全性の特徴を付与する。
【０２４９】
したがって、新規な噴霧乾燥粉末組成物およびこれらの組成物の製造方法を記載した。主題とする発明の好ましい実施形態をある程度詳細に説明したが、添付する特許請求の範囲に規定される本発明の精神および範囲を逸脱することなしに、自明の変更を加えることが可能であると理解される。
【図面の簡単な説明】
【０２５０】
【図１】図1a〜1dは、実施例１のサブセクション1.5.2に記載されている研究において評価した特定の粒子製剤の光学顕微鏡写真（100倍の倍率）を示す。
【図２】図2a〜2dは、実施例１のサブセクション1.5.3に記載されている研究において評価した特定の粒子製剤のSEM顕微鏡写真を示す。
【図３】図3aおよび3bは、実施例１のサブセクション1.5.7.に記載されている研究において評価した2種のアルミニウム含有製剤の懸濁液の光学画像を示す。
【図４】図4aおよび4bは、実施例１のサブセクション1.5.8に記載されている研究の結果を示す、非還元SDS-PAGEゲル（図4a）および還元SDS-PAGEゲル（図4b）の写真を示す。
【図５】図5は、実施例２のサブセクション2.3.1に記載されている噴霧凍結乾燥（SFD）法の概略を示す。
【図６】図6a〜6dは、実施例２のサブセクション2.5.1に記載されている研究において評価した特定の粒子製剤の光学顕微鏡写真（100倍の倍率）を示す。
【図７】図7a〜7fは、実施例２のサブセクション2.5.2に記載されている研究において評価した特定の粒子製剤の光学顕微鏡写真（100倍の倍率）を示す。
【図８】図8a〜8fは、実施例２のサブセクション2.5.3に記載されている研究において評価した特定の粒子製剤の光学顕微鏡写真（100倍の倍率）を示す。
【図９】図9a〜9fは、実施例２のサブセクション2.5.4に記載されている研究において評価した特定の粒子製剤の光学顕微鏡写真（100倍の倍率）を示す。
【図１０】図10a〜10cは、実施例２のサブセクション2.5.5に記載されている研究において評価した特定の粒子製剤の光学顕微鏡写真（100倍の倍率）を示す。
【図１１】図11a〜11dは、実施例３のサブセクション3.4に記載されている研究において評価した特定の粒子製剤の光学顕微鏡写真を示す。
【図１２】図12aおよび12bは、実施例３のサブセクション3.5.1に記載されている粒径分析を示す。
【図１３】図13は、実施例３のサブセクション3.5.1に記載されているELISAの結果を示す。
【図１４】図14a〜14bは、実施例３のサブセクション3.5.2で得られたELISAの結果を示す。
【図１５】図15a〜15eは、実施例４のサブセクション4.4.1に記載されている研究において採取された組織学的皮膚サンプルからのH&E染色切片のデジタル化光学顕微鏡画像を示す。
【図１６】図16aおよび16bは、実施例４のサブセクション4.5.1に記載されているSFDアルミニウム製剤の走査型電子顕微鏡写真を示す。
【図１７】図17a〜17dは、実施例４のサブセクション4.4.1に記載されている特定の粒子製剤におけるアルミニウム凝集を評価する光学顕微鏡写真を示す。
【図１８】図18a〜18bは、実施例４のサブセクション4.4.3に記載されている特定の粒子製剤におけるアルミニウム凝集を評価する光学顕微鏡写真を示す。
【図１９】図19aおよび19bは、実施例４のサブセクション4.6.1で得られたELISAの結果を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2004532277.tif 000043
【図８】
2004532277.tif 000044
【図９】
2004532277.tif 000045
【図１０】
2004532277.tif 000046
【図１１】
2004532277.tif 000047
【図１２】
2004532277.tif 000048
【図１３】
2004532277.tif 000049
【図１４】
2004532277.tif 000050
【図１５】
2004532277.tif 000051
【図１６】
2004532277.tif 000052
【図１７】
2004532277.tif 000053
【図１８】
2004532277.tif 000054
【図１９】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004532277.tif 000181
【国際調査報告】
2004532277.tif 000182
2004532277.tif 000183
2004532277.tif 000184
2004532277.tif 000185
2004532277.tif 000186