(57)【要約】カルボニル基がその上に結合しており、かつ目的とするスフィンゴ糖脂質（１つまたは複数）が目的とするスフィンゴ糖脂質のアミノ基と固相反応材に結合したカルボニル基との間のアミド結合により固相反応材に連結された固相反応材を使用する工程を含む、サンプル中の目的とする１つ以上のスフィンゴ糖脂質に対する抗体を検出する方法を開示する。目的とするスフィンゴ糖脂質（１つまたは複数）に対する抗体を検出する方法は個体において自己免疫疾患を診断する方法において使用されうる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
目的とするスフィンゴ糖脂質に対する抗体を同定するための、カルボニル基がその上に結合しており、かつ目的とするスフィンゴ糖脂質が前記結合したカルボニル基に連結されている修飾型固相反応材。
【請求項２】
該反応材が、結合した対象抗原をさらに含んでなる請求項１記載の修飾型固相反応材。
【請求項３】
該反応材が、前記結合したカルボニル基に連結された複数の異なるスフィンゴ糖脂質をさらに含んでなる請求項１または２記載の修飾型固相反応材。
【請求項４】
該反応材が、マイクロタイタープレートである請求項１、２または３記載の修飾型固相反応材。
【請求項５】
請求項１、２、３または４に記載の修飾型固相反応材を含んでなる、目的とするスフィンゴ糖脂質に対する抗体の検出用キット。
【請求項６】
ａ）カルボニル基がその上に結合しており、かつ目的とするスフィンゴ糖脂質が前記結合したカルボニル基に連結されている修飾型固相反応材に試験サンプルを接触させる工程；
ｂ）存在する場合、試験サンプル中の抗体が、前記修飾型固相反応材の前記結合したカルボニル基に連結された目的とするスフィンゴ糖脂質に結合することができる条件の下で前記修飾型固相反応材を維持する工程；ならびに
ｃ）目的とするスフィンゴ糖脂質に結合した抗体の存在の有無を検出する工程、を含む、試験サンプル中の目的とするスフィンゴ糖脂質に対する抗体の存在の有無を検出する方法。
【請求項７】
ａ）カルボニル基がその上に結合しており、かつ目的とするスフィンゴ糖脂質が前記結合したカルボニル基に連結されている修飾型固相反応材に試験サンプルを接触させる工程；
ｂ）存在する場合、試験サンプル中の抗体が、前記修飾型固相反応材の前記結合したカルボニル基に連結された目的とするスフィンゴ糖脂質に結合することができる条件の下で前記修飾型固相反応材を維持する工程；ならびに
ｃ）目的とするスフィンゴ糖脂質に結合した抗体の量を測定する工程、
を含む、試験サンプル中の目的とするスフィンゴ糖脂質に対する抗体の量を測定する方法。
【請求項８】
該修飾型固相反応材が、結合したカルボニル基に連結された対照抗原をさらに含んでなり、目的とするスフィンゴ糖脂質に対する抗体の量が、以下：
前記修飾型固相反応材に結合したカルボニル基に連結された対照抗原に結合した抗体の量を測定する工程；ならびに
目的とするスフィンゴ糖脂質に結合した抗体の量から対照抗原に結合した抗体の量を差し引く工程、
により、さらに測定され、対照抗原に結合した抗体の量とスフィンゴ糖脂質に結合した抗体の量との差が目的とするスフィンゴ糖脂質に対する特異的抗体の量と等しい、請求項７記載の方法。
【請求項９】
目的とするスフィンゴ糖脂質に対する抗体に結合する薬剤と共に修飾型固相反応材をインキュベートする工程を含む方法により、抗体を検出する、または抗体の量を測定する、請求項６、７または８記載の方法。
【請求項１０】
ａ）カルボニル基がその上に結合しており、かつ目的とするスフィンゴ糖脂質が前記結合したカルボニル基に連結されている修飾型固相反応材に個体由来の試験サンプルを接触させる工程；
ｂ）存在する場合、試験サンプル中の抗体が、前記固相反応材の前記結合したカルボニル基に連結されたスフィンゴ糖脂質に結合することができる条件の下で前記修飾型固相反応材を維持する工程；ならびに
ｃ）目的とするスフィンゴ糖脂質に結合した抗体の量を測定する工程、
を含み、目的とするスフィンゴ糖脂質に対する抗体の量が、１）対照サンプル中の量よりも統計学的に有意な量だけ多い、または２）基準量以上であることにより、自己免疫疾患の存在が示される、個体において自己免疫疾患を診断する方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の背景
スフィンゴ糖脂質（ｇｌｙｃｏｓｐｈｉｎｇｏｌｉｐｉｄ）であるスルホグルクロニルパラグロボシド（ＳＧＰＧ）に対する抗体は多くの種々の自己免疫疾患に関与している。例えば、ＧＭガングリオシドに対する血清ＩｇＭ抗体が、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）（Ｙｏｕｎｅｓ−Ｃｈｅｎｎｏｕｆｉ，Ｂ．Ａ．他、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ．５７：１１１〜５（１９９５））患者、慢性炎症性脱髄性多発神経障害（Ｙｕｋｉ，Ｎ．他、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ．７０：１〜６（１９９６））患者、および急性ギラン−バレー症候群（Ｉｌｙａｓ，ＡＡ．他、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｌ．Ｓｃｉ．１０５：１０８〜１７（１９９１））患者において見出されている。
【０００２】
固相酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）が、抗スフィンゴ糖脂質抗体を同定するために使用されている；しかし、バックグラウンド値が高いために、そのような抗体の量を正確に評価することが頻繁に妨げられている。抗スフィンゴ糖脂質抗体の信頼できる測定が、免疫疾患の正しい診断には重要である。
【０００３】
発明の概要
本発明は、修飾された固相反応材（ｒｅａｃｔａｎｔ）を使用して、神経系の特定の抗原（１つまたは複数）に対する抗体の存在の有無または量を試験サンプル中において測定する方法に関する。この方法では、カルボニル基をその表面に結合させることによって修飾された固相反応材（マイクロタイタープレートなど）が用いられる。１つまたは２つ以上の目的とするスフィンゴ糖脂質（例えば、スルホグルクロニルパラグロボシド（ＳＧＰＧ））が、スフィンゴ糖脂質のアミノ基と、固相反応材に結合させたカルボニル基との間におけるアミド結合によって修飾型固相反応材に連結される。他のスフィンゴ糖脂質、糖脂質、糖タンパク質、ガングリオシドまたは炭水化物などの１つまたは２つ以上の対照抗原もまた修飾型固相反応材の表面に結合させることができる。目的とするスフィンゴ糖脂質（１つまたは複数）がその上に連結されている修飾型固相反応材は、試験サンプル中に存在し得る目的とするスフィンゴ糖脂質（１つまたは複数）に対する何らかの抗体が、修飾型固相反応材に連結されている目的とするスフィンゴ糖脂質（１つまたは複数）に結合することができるような条件のもとで、個体に由来する体液（例えば、血液、血清、脳脊髄液または尿）の試験サンプルなどの試験サンプルと接触させられる。その後、目的とするスフィンゴ糖脂質（１つまたは複数）に対する試験サンプル中の抗体の存在の有無または量が、固相酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）または別の適切な固相アッセイなどの標準的な方法を使用して測定される。対照抗原が修飾型固相反応材に結合している場合、対照抗原に対する試験サンプル中の抗体の存在の有無またはレベルもまた、同じ方法を使用して測定することができる。目的とするスフィンゴ糖脂質に対する抗体の特異的な反応性は、対照抗原に結合している抗体の量を上回る、目的とするスフィンゴ糖脂質に結合している抗体の量によって決定される。
【０００４】
本方法は、個体における自己免疫疾患の診断において使用することができる。個体に由来する試験サンプル中の目的とするスフィンゴ糖脂質に対する抗体の量が本方法を使用して測定される。目的とするスフィンゴ糖脂質に対する抗体の量が対照サンプル中の目的とするスフィンゴ糖脂質に対する抗体の量よりも統計学的に有意な量だけ大きいことにより、自己免疫疾患の存在が示され得る。あるいは、目的とするスフィンゴ糖脂質に対する抗体の量が確立された基準量以上であることにより、疾患の存在が示され得る。例えば、本方法は、予備的なスクリーニングアッセイとして使用することができる；目的とするスフィンゴ糖脂質に対する抗体の量が対照サンプル中の目的とするスフィンゴ糖脂質に対する抗体の量よりも統計学的に有意な量だけ大きいこと、あるいは目的とするスフィンゴ糖脂質に対する抗体の量が確立された基準量以上であることは、自己免疫疾患に関与している他の抗体のさらなる研究を具体化する「陽性」のスクリーニング結果と見なされる。
【０００５】
本発明はまた、本発明の方法において使用される、カルボニル基がその上に結合し、かつ目的とするスフィンゴ糖脂質（１つまたは複数）がそのカルボニル基に連結されている修飾された固相反応材、ならびにそのような修飾型固相反応材を含有する試験キットに関する。
【０００６】
本方法の高い感度および特異性は自己免疫疾患の示差的な診断を明確にすることができる。さらに、カルボニル基がその表面に結合している修飾型固相反応材により、このような修飾を有しない固相反応材を用いる類似するアッセイを行うためにさもなくば必要な量よりも少ない量のスフィンゴ糖脂質の使用が可能になる。また、カルボニル基がその表面に結合している修飾型固相反応材は、毒性の溶媒を必要とすることなく、目的とするスフィンゴ糖脂質でコーティングすることができる；このコーティングは、湿度による影響を受けず、従って、再現性のある安定したアッセイ結果をもたらす。
【０００７】
発明の詳細な説明
本発明の好ましい実施形態の説明を下記に示す。
【０００８】
本明細書中に記載される発明は、サンプル中の１つまたは２つ以上の目的とするスフィンゴ糖脂質に対する抗体の存在の有無または量を決定する方法に関する。本発明はさらに、個体に由来するサンプル中の１つまたは２つ以上の目的とするスフィンゴ糖脂質に対する抗体の量を測定することによって個体における自己免疫疾患を診断する方法に関する。出願人は、ある種のスフィンゴ糖脂質の抗体に対する著しく増大した感度が、スフィンゴ糖脂質をプレートにアミド結合させることができるカルボニル基で修飾されたマイクロタイタープレートを使用して固相酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）を行うことによって達成され得ることを発見した。
【０００９】
この発見の結果、サンプル中の１つまたは２つ以上の目的とするスフィンゴ糖脂質に対する抗体の存在の有無および／または量を決定する非常に高感度で特異的な方法を今や利用することができる。本方法では、修飾型固相反応材が使用される。本明細書中で使用されている用語「固相反応材」は、マイクロタイタープレート、メンブラン（例えば、ニトロセルロース）、ビーズ、ディップステッィク、薄層クロマトグラフィープレートまたは他の固体媒体などの固体媒体を示す。好ましい実施形態において、固相反応材は、固相酵素免疫測定法などの固相免疫アッセイにおいて使用され得るマイクロタイタープレートである。固相反応材は、カルボニル基が反応材に接合される（ｇｒａｆｔｅｄ）ように修飾される。カルボニル基が存在する結果、スフィンゴ糖脂質などのある種の抗原を固相反応材上のカルボニル基と抗原のアミノ基との間のアミド結合によって固相反応材の表面に連結させることができる。このような方法で抗原をその表面に結合させることができる代表的な固相反応材は、Ｃｏ−ｓｔａｒ　ＤＮＡ−ＢＩＮＤ共有結合（ｃｏｖａｌｅｎｔ）プレート（Ｃｏ−ｓｔａｒ、Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＮＹ）である。カルボニル基がその上に結合している固相反応材、従って、抗原をその表面にアミド結合によって結合させることができる能力を有する固相反応材は、本明細書中では「修飾型固相反応材」という。
【００１０】
１つまたは２つ以上の目的とするスフィンゴ糖脂質が修飾型固相反応材に結合させられる。修飾型固相反応材に「連結（ｌｉｎｋｅｄ）」または「結合（ａｔｔａｃｈｅｄ）」している目的とするスフィンゴ糖脂質は、アミド結合をスフィンゴ糖脂質のアミノ基と修飾型固相反応材に結合しているカルボニル基との間において形成しているスフィンゴ糖脂質である。代表的なスフィンゴ糖脂質には、スルホグルクロニルパラグロボシド（ＳＧＰＧ）が含まれる。１つのタイプのスフィンゴ糖脂質を使用することができる；あるいは、２つ以上のタイプのスフィンゴ糖脂質を共有結合（ｃｏｖａｌｅｎｔ−ｌｉｎｋａｇｅ）固相反応材に連結させることができる。本明細書中で使用されている、「少なくとも１つ」の目的とするスフィンゴ糖脂質がその上に連結されている固相反応材は、１つのタイプの目的とするスフィンゴ糖脂質のみがその表面に存在し得るか、または２つ以上のタイプの目的とするスフィンゴ糖脂質がその表面に存在し得る。好ましい実施形態では、ＳＧＰＧを修飾型固相反応材に連結させる。代表的な連結方法では、メタノール中で再構成され、リン酸塩緩衝生理食塩水に希釈された目的とするスフィンゴ糖脂質が使用される。所望する場合には、ＥＤＡＣ（１−エチル−３−（３−ジエチルアミノプロピル）カルボジイミド）もまた含まれ得る；例えば、１つの実施形態において、目的とするスフィンゴ糖脂質がＳＧＰＧである場合、ＥＤＡＣが、スフィンゴ糖脂質を含有する溶液に含まれる；その後、スフィンゴ糖脂質を含有する溶液は修飾型固相反応材をコーティングすることができる。修飾型固相反応材はカルボニル基を含有するので、スフィンゴ糖脂質に存在するアミノ基は、修飾型固相反応材上のカルボニル基にさらされたときにカルボニル基との間でアミド結合を形成する。１つまたは２つ以上のスフィンゴ糖脂質が結合している修飾型固相反応材は、本明細書中では「スフィンゴ糖脂質修飾型固相反応材」という。
【００１１】
別のスフィンゴ糖脂質または糖タンパク質または炭水化物などの対照抗原もまた、修飾型固相反応材に結合させることができる。２つ以上の対照抗原を使用することができる。対照抗原は、例えば、既知の疾患状態を有する個体に由来する多数のサンプルを評価することによって同定することができる。「特異的な結合」は、サンプルの臨床的状態（疾患状態）に関して、目的とする抗原に対するサンプル中の抗体の統計学的に明らかにされた結合（例えば、特定の疾患状態を有する個体に由来する統計学的に有意な数のサンプルにおける、特定の抗原に対する抗体の結合）であることを意味する。既知の臨床的状態を有する個体に由来するサンプルによる特定の抗原に対する結合がないことは、非反応性（対照）の抗原であることを示していると一般に受けとめられる。
【００１２】
対照抗原（１つまたは複数）は、目的とするスフィンゴ糖脂質（１つまたは複数）を修飾型固相反応材上にコーティングするために使用される方法と類似する方法を使用して修飾型固相反応材に結合させることができる。対照抗原は、通常、目的とするスフィンゴ糖脂質（１つまたは複数）とは異なる位置において修飾型固相反応材に結合させる。例えば、固相反応材がマイクロタイタープレートである場合、目的とするスフィンゴ糖脂質をプレートの特定のウエルに結合させることができ、そして対照抗原をプレートの他のウエルに結合させることができる。別の例において、２つ以上の目的とするスフィンゴ糖脂質をプレートに結合させる場合、対照抗原をプレートの特定のウエルに結合させる；第１の目的とするスフィンゴ糖脂質をプレートの他のウエルに結合させる；第２の目的とするスフィンゴ糖脂質を、対照抗原または目的とする第１のスフィンゴ糖脂質のいずれか等とは異なる、プレートのウエルに結合させる。あるいは、対照抗原を別の固相反応材に結合させることができる。この場合、別の固相反応材は、目的とするスフィンゴ糖脂質（１つまたは複数）がコーティングされているのと同じタイプの固相反応材である。用語「スフィンゴ糖脂質修飾型固相反応材」は、１つまたは２つ以上の目的とするスフィンゴ糖脂質がその上に結合しているそのような修飾型固相反応材、ならびに１つまたは２つ以上の目的とするスフィンゴ糖脂質がその上に結合し、かつ１つまたは２つ以上の対照抗原がその上の異なる位置で結合しているそのような修飾された共有結合固相反応材をいう。用語「対照抗原固相反応材」は、対照抗原（１つまたは複数）だけがその上に結合している固相反応材をいうために使用される。
【００１３】
スフィンゴ糖脂質修飾型固相反応材（および使用される場合には対照抗原固相反応材）は、試験サンプル中の１つまたは２つ以上の目的とするスフィンゴ糖脂質に対する抗体の存在の有無および／または量を決定するためのアッセイにおいて使用される。目的とするスフィンゴ糖脂質に対する抗体の存在、非存在および／または量についてのアッセイ対象の試験サンプルは、個体から得られる体液または組織のサンプルであり得る。例えば、試験サンプルは、血液、血清、脳脊髄液、尿、鼻腔分泌物、唾液、あるいは任意の他の体液または組織を含み得る。あるいは、試験サンプルは、個体から得られた体液または組織のサンプルから単離された抗体、特にＩｇＭ抗体、ＩｇＧ抗体および／またはＩｇＡ抗体を含み得る。好ましい実施形態において、試験サンプルは、神経障害を有することが疑われる個体に由来する血清サンプルである。
【００１４】
試験サンプル中における抗スフィンゴ糖脂質抗体の存在の有無および／または量を決定するために、スフィンゴ糖脂質修飾型固相反応材を試験サンプルと接触させる。試験サンプルと接触させたスフィンゴ糖脂質修飾型固相反応材は、本明細書中では「接触させたスフィンゴ糖脂質修飾型固相反応材」という。接触させたスフィンゴ糖脂質修飾型固相反応材は、試験サンプル中に存在し得る目的とするスフィンゴ糖脂質（１つまたは複数）に対する何らかの抗体が、固相反応材に結合している目的とするスフィンゴ糖脂質（１つまたは複数）に結合することができる適切な条件のもとで維持される。用語「目的とするスフィンゴ糖脂質に対する抗体」は、目的とするスフィンゴ糖脂質に優先的に結合する抗体（１つまたは複数）をいう。例えば、目的とするスフィンゴ糖脂質に対する抗体は、統計学的に有意な量だけ、対照抗原（例えば、糖脂質、糖タンパク質または炭水化物）に対するよりも多い量で、かつ／または他のスフィンゴ糖脂質に対するよりも多い量で目的とするスフィンゴ糖脂質に優先的に結合する。
【００１５】
修飾型固相反応材上において目的とするスフィンゴ糖脂質（１つまたは複数）に結合している、試験サンプル中の目的とするスフィンゴ糖脂質（１つまたは複数）に対する抗体の存在の有無および／または量が、存在する場合には決定される。その量は、目的とするそれぞれのスフィンゴ糖脂質に対して別々に測定される。抗体は、目的とするスフィンゴ糖脂質と特異的に相互作用することが予想される；すなわち、抗体は、目的とする１つのスフィンゴ糖脂質と優先的に相互作用するが、目的とする別のスフィンゴ糖脂質とは優先的に相互作用しない。
【００１６】
抗体の存在の有無および／または量は、固相酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、固相放射免疫アッセイまたは他の固相免疫アッセイを含む標準的な技術を使用する様々な方法で決定することができる（Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．他編、Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，１９９６年、特にユニット１１．２（ＥＬＩＳＡ）およびユニット１１．１６（特異的抗体力価の測定）を参照のこと；この参考文献の全教示は参照により本明細書中に組み込まれる）。例えば、典型的な固相免疫アッセイでは、修飾型固相反応材に結合した目的とするスフィンゴ糖脂質に結合している抗体の存在の有無または量が、目的とするスフィンゴ糖脂質に対する抗体に結合する検出抗体などの顕色試薬を使用して決定される。検出抗体は、検出を容易にするために、酵素または蛍光基（ｆｌｕｏｒｏｐｈｏｒｅ）などの別の分子に連結または結合させることができる。あるいは、検出抗体はヨウ素化される。２つ以上の目的とするスフィンゴ糖脂質が使用される場合、異なる検出抗体を、それぞれの目的とするスフィンゴ糖脂質に対する各抗体を検出するために使用することができる。例えば、１つの目的とするスフィンゴ糖脂質に対する抗体に結合する検出抗体を第１の蛍光基に結合させることができ、そして第２の目的とするスフィンゴ糖脂質に対する抗体に結合する検出抗体を、第１の蛍光基とは識別可能な第２の蛍光基に結合させることができる。あるいは、同じ検出試薬が使用される場合、特定の位置における検出試薬の存在が、その位置において修飾型固相反応材に結合している目的とするスフィンゴ糖脂質に対する抗体の存在に対応するように、異なる目的とするスフィンゴ糖脂質を異なる同定可能な位置で修飾型固相反応材に結合させることができる。
【００１７】
好ましい実施形態では、ＥＬＩＳＡアッセイが、西洋ワサビペルオキシダーゼなどの酵素に連結されている検出抗体を顕色試薬として使用して行われる。接触させたスフィンゴ糖脂質修飾型固相反応材は顕色試薬とともにインキュベーションされ、顕色処理された、接触させた固相反応材が得られる。続いて、酵素の基質が、顕色処理された、接触させた固相反応材に加えられ、そして酵素のその基質に対する活性量（例えば、基質の加水分解量）が光学密度の測定などの適切な手段により測定される。
【００１８】
目的とするスフィンゴ糖脂質（１つまたは複数）に対する抗体の力価は、標準的な変換アルゴリズムを使用して、目的とするスフィンゴ糖脂質に対する抗体に結合した検出抗体の量から計算することができる。例えば、顕色試薬が西洋ワサビペルオキシダーゼを含む場合、抗体の力価は、Ｐｅｓｔｒｏｎｋ他（Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．２．７：３１６〜３２６（１９９０））に示されているように計算することができる。
【００１９】
対照抗原が修飾型固相反応材に結合している場合、対照抗原に結合している抗体の力価は、目的とするスフィンゴ糖脂質に結合している抗体の力価から差し引かれる。目的とするスフィンゴ糖脂質に結合している抗体の力価と、対照抗原（１つまたは複数）に結合している抗体の力価との差は、目的とするスフィンゴ糖脂質に対する抗体が特異的（選択的）に結合していることを示している。対照抗原が別の修飾型固相反応材に結合している場合、対照抗原修飾型固相反応材は、スフィンゴ糖脂質修飾型固相反応材と同じ様式で試験サンプルと接触させられ、そして同じ条件下で維持される。対照抗原に対する抗体の量が、目的とするスフィンゴ糖脂質に対する抗体の量を決定するために使用されているのと同じ方法によって決定される。
【００２０】
自己免疫疾患（特に、免疫媒介性神経障害）が、目的とするスフィンゴ糖脂質に対する抗体の量を測定するこれらの方法を使用して診断され得る。目的とする疾患を診断するために、試験サンプルは、神経障害の存在についての試験対象の個体から得られたサンプルである。試験サンプル中の目的とするスフィンゴ糖脂質（１つまたは複数）に対する抗体の量が、少なくとも１つの比較可能な対照サンプル（すなわち、目的とする疾患に罹患していない個体に由来する同じタイプ（１つまたは複数）の抗体（ＩｇＭ、ＩｇＧおよび／またはＩｇＡ）のサンプル）における目的とするスフィンゴ糖脂質（１つまたは複数）に対する比較可能な抗体の量と比較される。対照サンプルは、目的とする疾患に悩まされていない任意の個体に由来するサンプルであり得る；しかし、対照サンプルが、疾患を有しない個体に由来することは必ずしも必要ない。例えば、対照サンプルは、異なる免疫媒介性疾患または全身性免疫障害を有する個体に由来するサンプルであり得る。「比較可能」な正常なサンプルは、試験サンプルと同じタイプの体液または組織のサンプルである；あるいは、試験サンプルが、体液または組織のサンプルから単離されたＩｇＭ抗体である場合、比較可能な正常なサンプルまたは対照サンプルは、同じタイプの体液または組織から単離されたＩｇＭ抗体のサンプルである。２つ以上の対照サンプルを使用することができる。試験サンプル中の結合している特異的（選択的）なスフィンゴ糖脂質抗体の量が、比較可能な対照サンプル中の結合している特異的（選択的）なスフィンゴ糖脂質抗体の量よりも統計学的に有意な量だけ多く存在することにより、神経障害の診断と相関され得る「陽性」の結果が示される。あるいは、「陽性」の結果はまた、初期のスクリーニングアッセイに対する「陽性」の結果と見なされ得る；陽性の初期スクリーニングアッセイは、神経障害に寄与するか、または神経障害について診断される同じ自己抗体またはさらなる自己抗体の存在を検出するために試験をさらに行うべきであることを示している。
【００２１】
あるいは、試験サンプル中の目的とするスフィンゴ糖脂質（１つまたは複数）に対する抗体の量は「基準量」と比較することができる。本明細書中で使用されている基準量は、特定の疾患状態と相関することが以前に明らかにされている目的とするスフィンゴ糖脂質に対する抗体の量（たとえば、力価）である。例えば、基準量は、上記に記載されているような比較可能な対照サンプルだけでなく、既知の疾患（例えば、神経障害）を有する個体に由来する１組のサンプルにおける目的とするスフィンゴ糖脂質（１つまたは複数）に対する抗体の量を評価し、そしてどのくらいの抗体量が疾患と相関するかを決定することによって決定することができる。試験サンプル中の目的とするスフィンゴ糖脂質（１つまたは複数）に対する抗体の量が基準量以上であることは、疾患の診断と相関され得る「陽性」の結果を示している。あるいは、上記において議論されているように、「陽性」の結果はまた、初期スクリーニングアッセイについて「陽性」の結果であると見なすことができる。このことは、神経障害に寄与するか、または神経障害について診断される同じ自己抗体またはさらなる自己抗体の存在を検出するために試験をさらに行うべきであることを示している。
【００２２】
本発明はまた、本発明の方法において使用され得るキットを包含する。キットは下記の構成成分を含む：（１）カルボニル基を有し、かつアミド結合によって結合している１つまたは２つ以上の目的とするスフィンゴ糖脂質をも有する修飾型固相反応材；および（２）目的とするスフィンゴ糖脂質（１つまたは複数）に対する抗体に結合する標識された検出抗体。検出抗体は、抗体のタイプ（例えば、ＩｇＭ、ＩｇＧまたはＩｇＡ）に対して特異的であり得る。検出抗体は、酵素、放射活性分子または蛍光剤などの検出可能な薬剤に結合した抗体を含むことができる。検出抗体が、添加された基質と反応して着色生成物をもたらす酵素（西洋ワサビペルオキシダーゼなど）に結合している場合、キットはその基質を含むことができる。
【００２３】
次に、本発明を下記の実施例によってさらに説明する。
【００２４】
実施例：
共有結合固相酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）プレートを使用する抗体力価の比較抗体の共有結合プレートへの連結
新しい１％ＥＤＡＣを含むＰＢＳ（１ｍｌのＰＢＳに対して０．０１ｇＥＤＣ）を各アッセイプレートについて５．５ｍｌ調製した。ＳＧＰＧ保存溶液のアリコートを１％ＥＤＡＣに希釈して、所望する濃度の抗原コーティング溶液を作製した。
【００２５】
各プレートには、５．５ｍｌの抗原コーティング溶液が必要であった。プレートを、プレートを損傷させ得る直射光を避けるホイル袋から使用直前に取り出した。抗原コーティング溶液（１００μｌ／ウエル）をＡ列、Ｂ列、Ｅ列およびＦ列に加え、Ｃ列、Ｄ列、Ｇ列およびＨ列は、抗原ブランクウエルとして未コーティングのままにした。コーティングされたプレートを暗所において４℃で一晩（１６時間）インキュベーションした。その後、コーティング溶液を吸引して、プレートを１％ＢＳＡで３回洗浄した。３回目の洗浄が終わった後、すべてのプレートウエルを１％ＢＳＡで満たして、プレートを暗所において４℃で少なくとも１６時間ブロッキングした。
【００２６】
サンプルの添加
Ｔｅｃａｎ社のロボット（Ｔｅｃａｎ　ＵＳＡ、Ｄｕｒｈａｍ、ＮＣ）を使用して、希釈されたサンプルおよび対照をプレートに加えた。その後、プレートを暗所において４℃で一晩インキュベーションした。
【００２７】
検出抗体プローブおよび比色定量反応
検出抗体（ペルオキシダーゼ結合ヤギ抗ヒトＩｇＭ）を１％ＢＳＡで希釈して、使用前の抗体の各ロットについて決定されている所望の希釈度にした。１１ｍｌの希釈された検出抗体を各プレートについて使用した。アッセイプレートを吸引して、１％ＢＳＡで６回洗浄し、その後、ブロットした。希釈された検出抗体溶液（１００μｌ／ウエル）をすべてのアッセイプレートに加えて、プレートを暗所において室温で２時間インキュベーションした。そのとき、基質溶液を調製した：１００ｍｇのＯＰＤおよび１２μｌの３０％過酸化水素を１００ｍｌの０．１Ｍクエン酸（ｐＨ４．５）に加えて、基質溶液（１枚のアッセイプレートあたり１１ｍｌ）を作製した。その後、すべてのアッセイプレートを吸引して、１％ＢＳＡで６回洗浄し、その後、ブロットした。基質溶液（１００μｌ／ウエル）をすべてのアッセイプレートに加え、その後、遮光するためにカバーを置いた。プリージズ（Ｐｌｅａｓｅｓ）を室温でインキュベーションして、両方の陽性対照が使用中の陽性対照について確認されている確立された最少ＯＤに達するまで、４０５ｎｍにおいて基質添加後の約２０分間の読み取りを行った。
【００２８】
結果
バックグラウンドノイズ
結果
カルボニル基で修飾されたプレート（Ｃｏ−ｓｔａｒ　ＤＮＡ−Ｂｉｎｄ）と第二級アミノ基で修飾されたプレート（Ｎｕｎｃ　Ｃｏｖａｌｉｎｋ）とのバックグラウンドノイズの比較を上記のように行った。陽性の臨床的ＳＧＰＧ対照を、シグナルを表すために使用し、バックグランドはＢＳＡ緩衝液ブランク（サンプルなし）とした。結果を表１および図に示す。
【００２９】
【表１】
2004505261.tif 000002
【００３０】
図には、カルボニル基がその上に結合しているプレート（Ｃｏ−ｓｔａｒ　ＤＮＡ−Ｂｉｎｄプレート）と第二級アミノ基がその表面に結合しているプレート（ＮＵＮＣ　Ｃｏａｔｉｎｇプレート、Ｎｕｎｃ；Ｒｏｓｋｉｌｄｅ、デンマーク）とのシグナル対バックグラウンドノイズを比較した結果が示されている。カルボニル基を有するプレートは、第二級アミノ基を有するプレートと比較して低いバックグラウンドノイズを示したことが理解され得る。
【００３１】
再現性および感度
共有結合プレートに連結させたＳＧＰＧでの実験により、並外れた再現性が明らかにされた。共有結合プレートの日間変動性を測定するために、２５個のＳＧＰＧ臨床サンプル（ＳＧＰＧに対する抗体が存在する血清）を２日離して上記のようにアッセイした。サンプルについての生データの平均変動は、限界分散（ｃｒｉｔｉｃａｌ ｖａｒｉａｎｃｅ）（Ｃ．Ｖ．）によって評価される場合、７％に等しかった（表２参照）。この値は、２０％（例えば、Ｔｏｒｂｅｃｋ，Ｌ．Ｄ．、Ａｓｓａｙ　Ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ　Ｂａｓｉｃｓ（Ｓｕｆｆｉｅｌｄ　Ｐｒｅｓｓ、Ｓｋｏｋｉｅ　ＩＬ、１９９６年５月）を参照のこと）である臨床ＥＬＩＳＡアッセイについて通常的に受け入れられ得るＣ．Ｖ．よりも十分に小さい。
【００３２】
【表２】
2004505261.tif 000003
【００３３】
％Ｃ．Ｖ．＝（標準偏差）÷（平均）ｘ１００
【００３４】
ＳＧＰＧに対するＥＬＩＳＡは、神経学的症状の病因を同定することにおいて、ＭＡＧウエスタンなどの別の臨床アッセイに対する予備的なスクリーニング試験として使用することができる。ＭＡＧウエスタンは、ミエリン結合糖タンパク質に対する抗体を検出するために使用される；抗ＭＡＧ抗体は末梢神経障害（例えば、Ｑｕａｒｌｅｓ，Ｒ．Ｈ．およびＷｅｉｓｓ，Ｍ．Ｄ．、Ｍｕｓｃｌｅ　Ｎｅｒｖｅ、２２（７）：８００〜２２（１９９９）に記載されているＭＡＧ抗体に関連する脱髄性の感覚神経障害または感覚運動神経障害を参照のこと）と関連する。ＳＧＰＧに対するＥＬＩＳＡは予備的なスクリーニングアッセイである；ＳＧＰＧアッセイにおいて陽性であると評価されるサンプルは、その後、ＭＡＧウエスタンアッセイにおいて試験される。ＳＧＰＧアッセイにおいて陽性の結果、その後のＭＡＧウエスタンアッセイにおいて陰性の結果の場合は、偽陽性と見なされる。しかし、ＳＧＰＧアッセイにおいて陽性の結果、その後のＭＡＧウエスタンアッセイにおいて陽性の結果は、神経学的症状に対する自己免疫的病因を示唆している（従って、神経障害について診断され得る）。
【００３５】
ＭＡＧウエスタンを用いて以前に試験された個体に由来する一連の臨床サンプルを、従来のプレート（Ｆａｌｃｏｎ社のポリスチレンプレート）と、スフィンゴ糖脂質をプレートにアミド連結させることができるカルボニル基で修飾されたプレート（Ｃｏ−ｓｔａｒ　ＤＮＡ−ＢＩＮＤプレート）との両方を使用して上記のように試験した。その結果、ＭＡＧ陰性サンプル（ＭＡＧウエスタンアッセイにおいて抗体の結合を有しないサンプル）は両方のプレートについて同一の陰性ＳＧＰＧ値を示すことが示された。しかし、驚くべきことに、ＭＡＧ陽性サンプル（ＭＡＧウエスタンアッセイにおいて抗体の結合を示すサンプル）の９０％（２７／３０）は、修飾されたプレートにおいて、従来のプレートよりも大きな抗体力価を有していた。結果を表３に示す。
【００３６】
【表３】
2004505261.tif 000004
【００３７】
これらの結果により、スフィンゴ糖脂質をプレートにアミド結合させることができるカルボニル基で修飾されたプレートを使用するアッセイは、ＭＡＧウエスタン陽性サンプルにおける抗体に対して著しくより大きな感度を有することが明らかにされる。従って、このアッセイは、ＭＡＧウエスタンアッセイを使用して試験しなければならないサンプルに対するより高感度なスクリーニング試験として役に立つ。
【００３８】
本発明がその好ましい実施形態を参照して具体的に示され、かつ説明されているが、形態および細部における様々な変化が、添付された特許請求の範囲によって包含される本発明の範囲から逸脱することなく本発明において行われ得ることが当業者により理解されるであろう。本明細書中に引用されているすべての参考文献の教示はその全体が参照により組み込まれる。
【図面の簡単な説明】
【図１】
図は、２種類の固相反応材のシグナル対バックグラウンドノイズの比較を示すグラフである。黒：シグナル；灰色：バックグラウンド。
【図１】
2004505261.tif 000005
【国際公開パンフレット】
2004505261.tif 000006
2004505261.tif 000007
2004505261.tif 000008
2004505261.tif 000009
2004505261.tif 000010
2004505261.tif 000011
2004505261.tif 000012
2004505261.tif 000013
2004505261.tif 000014
2004505261.tif 000015
2004505261.tif 000016
2004505261.tif 000017
2004505261.tif 000018
2004505261.tif 000019
2004505261.tif 000020
2004505261.tif 000021
2004505261.tif 000022
2004505261.tif 000023
2004505261.tif 000024
2004505261.tif 000025
2004505261.tif 000026
【国際調査報告】
2004505261.tif 000027
2004505261.tif 000028