(57)【要約】本発明はD-パントテン酸および／またはその塩の改良された製造方法、および動物飼料添加物としての該物質の使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
D-パントテン酸および／またはその塩の製造方法であって、
a）D-パントテン酸を産生し且つパントテン酸（pan）および／またはイソロイシン/バリン（ilv）の生合成が調節解除され且つ培養培地中で発酵によりD-パントテン酸の塩を少なくとも2 g/L生成する少なくとも１種の生物を用い、該培養培地に遊離のβ-アラニンおよび／またはβ-アラニンの塩0〜20 g/Lを供給する工程、
b）得られたD-パントテン酸塩含有発酵液を陽イオン交換体の中を通過させ、該D-パントテン酸の塩から遊離D-パントテン酸を生成させる工程、
c）カルシウム塩基および／またはマグネシウム塩基を加えて前記遊離D-パントテン酸含有溶液をpH 3〜10に調整し、パントテン酸カルシウムおよび／またはマグネシウムを含有する溶液を得る工程、および
d）前記パントテン酸カルシウムおよび／またはパントテン酸マグネシウム含有溶液を乾燥および／または剤形化する工程、
を有する上記製造方法。
【請求項２】
前記培養培地に遊離のβ-アラニンおよび／またはβ-アラニンの塩を供給しない、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記用いるD-パントテン酸産生生物が細菌、酵母または真菌である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
用いる微生物がBacillaceae科の細菌である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
Bacillus属そして好ましくはB. subtils種、B. licheniformis種またはB. amyloliquefaciens種の細菌を用いる、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法
【請求項６】
工程a）において少なくとも10 g/L培養培地、好ましくは少なくとも20 g/L、特に好ましくは少なくとも40 g/Lそして極めて好ましくは少なくとも60 g/L培養培地のD-パントテン酸および／またはその塩の含量を生成させる、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
工程b）において、一価陽イオン、好ましくはアンモニウムイオン、カリウムイオンおよび／またはナトリウムイオンの含有量を濃度≦ 1 g/kg溶液に下げる、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
工程c）において、前記溶液のpHを5〜10に調整する、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
工程c）において、前記溶液のpHを5〜9、好ましくは6〜9、そして特に好ましくは6〜8に調整する、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
中和反応のために、前記工程c）の溶液に、固形物の形態でおよび／または水性懸濁液として水酸化カルシウム、炭酸カルシウム、酸化カルシウム、水酸化マグネシウムおよび／または塩基性炭酸マグネシウムを加える、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記工程c）の溶液に、水酸化カルシウム2〜55重量%、好ましくは10〜50重量%、そして特に好ましくは20〜40重量%を含んでいる水性懸濁液を加える、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記工程c）の溶液に、炭酸カルシウム2〜65重量%、好ましくは10〜50重量%、そして特に好ましくは20〜40重量%を含んでいる水性懸濁液を加える、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記工程c）の溶液に、水酸化マグネシウム20〜60重量%、好ましくは10〜50重量%、そして特に好ましくは20〜40重量%を含んでいる水性懸濁液を加える、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記工程c）の溶液に、塩基性炭酸マグネシウム2〜25重量%、好ましくは10〜20重量%を含んでいる水性懸濁液を加える、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
工程c）において前記遊離D-パントテン酸含有の溶液に、酸性無機および／または有機カルシウム塩および／またはマグネシウム塩を加える、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
工程c）において、前記酸性無機カルシウム塩および／またはマグネシウム塩が対応するハロゲン化物である、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
工程c）において、前記酸性無機カルシウム塩および／またはマグネシウム塩がCaCl2および／またはMgCl2である、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
工程c）において、前記酸性無機カルシウム塩および／またはマグネシウム塩が蟻酸、酢酸、プロピオン酸、グリシン酸および／または乳酸カルシウムおよび／またはマグネシウムである、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
工程c）または工程d）において、パントテン酸カルシウムおよび／またはパントテン酸マグネシウムを含有する懸濁液を得るまたは使用する、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
動物飼料添加物および／または動物飼料サプリメントとして使用される組成物であって、
a）D-パントテン酸を産生し且つパントテン酸（pan）および／またはイソロイシン/バリン（ilv）の生合成が調節解除され且つ培養培地中で発酵によりD-パントテン酸の塩を少なくとも2 g/L生成する少なくとも１種の生物を用い、該培養培地に遊離のβ-アラニンおよび／またはβ-アラニンの塩0〜20 g/L、好ましくは0 g/Lを供給する工程、
b）得られたD-パントテン酸塩含有発酵液を陽イオン交換体の中を通過させ、該D-パントテン酸の塩から遊離D-パントテン酸を生成させる工程、
c）カルシウム塩基および／またはマグネシウム塩基を加えて前記遊離D-パントテン酸含有溶液をpH 3〜10に調整し、パントテン酸カルシウムおよび／またはマグネシウムを含有する溶液を得る工程、および
d）前記パントテン酸カルシウムおよび／またはパントテン酸マグネシウム含有溶液を乾燥および／または剤形化する工程、
によって製造することができる上記組成物。
【請求項２１】
工程c）において、酸性無機および／または有機カルシウム塩および／またはマグネシウム塩を加え、パントテン酸の多価塩、好ましくはパントテン酸カルシウムおよび／またはパントテン酸マグネシウムを含有する溶液を得る、請求項２０に記載の組成物。
【請求項２２】
工程c）において、前記加える酸性無機カルシウム塩および／またはマグネシウム塩がハロゲン化カルシウムおよび／または    である、請求項２０または２１に記載の組成物。
【請求項２３】
工程c）において、前記酸性無機カルシウム塩および／またはマグネシウム塩がCaCl2および／またはMgCl2である、請求項２０〜２２のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２４】
工程c）において、前記酸性有機カルシウム塩および／またはマグネシウム塩が、蟻酸、酢酸、プロピオン酸、グリシン酸および／または乳酸カルシウムおよび／またはマグネシウムである、請求項２０〜２３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２５】
工程c）または工程d）において、パントテン酸カルシウムおよび／またはパントテン酸マグネシウムを含有する懸濁液を得るまたは存在させる、請求項２０〜２４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２６】
二価陽イオンの形態で、好ましくはD-パントテン酸カルシウムおよび／またはD-パントテン酸マグネシウムの形態でD-パントテン酸塩を含んでいる、請求項２０〜２５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２７】
D-パントテン酸塩を、少なくとも1〜100重量%、好ましくは少なくとも20〜100重量%、そして特に好ましくは少なくとも50重量%の濃度で含んでいる、請求項２０〜２６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２８】
前記一価陽イオンの形態にあるD-パントテン酸塩の含有量が≦1 g/kgである、請求項２０〜２７のいずれか１項に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はD-パントテン酸および／またはその塩の改良された製造方法に関し、また動物飼料添加物としてのそれの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
補酵素Aの生合成の出発素材として、D-パントテン酸は動植物界に広く分布している。食物を通してパントテン酸の十分な量を摂取する人間とは対照的に、D-パントテン酸欠乏症の症状が植物のみならず動物についても数多く報告されている。D-パントテン酸のアベイラビリティはそれゆえに特に動物飼料産業界では大きな経済的関心事である。
【０００３】
一般的には、D-パントテン酸はD-パントラクトンとβ-アラニン酸カルシウムから化学合成反応により製造される（Ullmann’s Encyclopedia of Industrial Chemistry, 6thedition, 1999、電子出版、“Vitamins”の章）。D-パントテン酸の製造は、ジアステレオマー塩を経由しての複雑な古典的ラセミ体分離を必要とする。この化学合成反応から得られる市販の製品は通常D-パントテン酸のカルシウム塩、すなわちD-パントテン酸カルシウムである。
【０００４】
化学合成に比較して、微生物を使ったバイオテクノロジーによる製造方法の利点は、高等生物が摂取することができるパントテン酸のD体を選択的（鏡像異性体的に純粋）に産生することである。化学合成反応で必要とされる複雑なラセミ体分離は従って必要ない。
【０００５】
多数の、微生物を使ったD-パントテン酸の発酵製造方法が公知であり、例えばEP 0 590 857、WO 96/33283、US 6,013,492、WO 97/10340、DE 198 46 499、EP 1 001 027、EP 1 006 189、EP 1 006 192およびEP 1 006 193に記載のものである。
【０００６】
しかるにEP 1 006 189およびEP 1 001 027は、発酵溶液中のD-パントテン酸含有量最大1 g/Lを達成するパントテン酸の製造方法を記載している。しかしながら、そのような低い発酵溶液中のパントテン酸の含有量、すなわち固形分基準で10重量％より低いものは、D-パントテン酸含有の動物飼料サプリメントの経済的な製造には向いていない。これまでに記載されたこの方法のさらなる欠点は、発酵培地から生成物を単離するには数多くの複雑な後処理工程を必要とすることである。工業スケールでの経済的な製造方法は知られていない。
【０００７】
ドイツ国出願公開 DE 100 16 321は、D-パントテン酸含有の動物飼料サプリメントの発酵製造方法を記載している。しかしながら、この方法の重大な欠点は、上述のD-パントテン酸の発酵製造方法と同じように、目的とする生成物の経済的収量を得るためには、パントテン酸前駆体β-アラニンを、発酵培地を介して微生物に供給しなければならないことである。
【０００８】
さらに、US 6,013,492およびWO 96/332839は、培養培地から不溶構成成分（例えば細胞材料）を濾過分離し、その濾液を活性炭に吸着させ、そのあと有機溶媒（好ましくはメタノール）でD-パントテン酸を溶出させ、水酸化カルシウムで中和しそしてそのあとD-パントテン酸カルシウムを結晶化させることによる、発酵溶液からのD-パントテン酸の後処理を記載している。結晶化の際に貴重な生成物のロスが起ること、また、生成物から分離するのに困難が伴い且つ複雑な溶媒回収工程を必要とする有機溶媒を用いること、が見過ごせない欠点である。
【０００９】
EP 0 590 857は、微生物の培養にβ-アラニンのフィード(供給)を必要とするD-パントテン酸の発酵製造方法を記載している。この方法では発酵溶液を濾過してバイオマスを分離し、そのあと陽イオン交換体を通過させ次いで陰イオン交換体を通過させ、そのあと水酸化カルシウムで中和させ、蒸発により濃縮し、活性炭を加え、もう一度濾過を行いそしてメタノールおよび塩化カルシウムを加えることで結晶化させる。得られるパントテン酸カルシウム含有の生成物は、カルシウム塩の形態にあるD-パントテン酸以外に塩化カルシウムもモル比1:1で含有する。この塩化カルシウムの含有量を減らすには電気透析とそのあとのスプレー乾燥を必要とする。この工程は、複雑な工程段階が多数あることまた有機溶媒を使用することから、経済的でなくまた環境上もよくないという欠点を有する。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明の目的は、D-パントテン酸および／またはその塩を含有する動物飼料サプリメントならびに、上述の欠点を持たない、D-パントテン酸および／またはその塩の改良された製造方法を提供することにある。経済的な理由から、ここではβ-アラニンの供給が大幅に低下しているかまたは全く必要としない方法が望ましい。さらに、D-パントテン酸の二価の塩はその一価の塩よりもより低い吸湿特性を有する、従って例えば動物飼料サプリメントなどのその先の用途においてより低い凝集の傾向を示すので、D-パントテン酸をその二価の塩の形態、そして特にアルカリ土類金属塩の形態で製造するのが望ましい。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者は、この目的は本発明により有利に達成されることを見出した。
【００１２】
本発明はD-パントテン酸および／またはその塩の製造方法に関し、その方法は、
a）D-パントテン酸を産生し且つパントテン酸（pan）および／またはイソロイシン/バリン（ilv）の生合成が調節解除され且つ培養培地中で発酵によりD-パントテン酸の塩を少なくとも2 g/L生成する少なくとも１種の生物を用い、該培養培地に遊離のβ-アラニンおよび／またはβ-アラニンの塩0〜20 g/Lを供給する工程、
b）そのD-パントテン酸塩含有発酵液を陽イオン交換体の中を通過させ、該D-パントテン酸の塩から遊離D-パントテン酸を生成させる工程、
c）カルシウム塩基および／またはマグネシウム塩基を加えて前記遊離D-パントテン酸含有溶液をpH 3〜10に調整し、パントテン酸カルシウムおよび／またはマグネシウムを含有する溶液を得る工程、および
d）前記パントテン酸カルシウムおよび／またはパントテン酸マグネシウム含有溶液を乾燥および／または剤形化する工程、
を有する。
【００１３】
本発明の方法の１つの実施形態では、工程c）において、塩化カルシウムおよび／またはマグネシウムを含有する懸濁液を得ることもできる。その次の工程d）において、この懸濁液はそのあと乾燥および／または剤形化される。
【００１４】
本発明の工程a）で行う発酵はさらに、それ自体公知の、回分式、流加式[fed-batch]もしくは繰り返し流加式または連続式の方法を用いて行うことができる。得られるパントテン酸はこの場合例えば、NaOH、KOHまたはアンモニアを含有しているリン酸緩衝液などの通常の緩衝液システムを用いて中和される。
【００１５】
本発明の他の実施形態では、工程a）において、本培養培地中で発酵により少なくとも10 g/L、好ましくは少なくとも20 g/L、特に好ましくは少なくとも40 g/L、非常に好ましくは少なくとも60 g/L、とりわけ特に少なくとも70 g/LのD-パントテン酸の塩が生成される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
本発明の意味するところでは、「産生する」という表現は、生物が、それ自体の代謝ニーズに必要とされるよりもさらに多い量のD-パントテン酸および／またはその塩を合成できるということを意味する。本発明の有利な実施形態では、合成されるD-パントテン酸および／またはその塩の量は細胞の内側には存在せず、むしろ理想的には生物により培養培地中に完全に放出される。この排出は、それ自体公知の機序により、能動的あるいは受動的であり得る。
【００１７】
本発明では用いるD-パントテン酸産生生物は微生物である。これらには本発明では真菌、酵母および／または細菌が挙げられる。本発明では、例えばケカビなどの真菌、または、例えばSaccharomycesもしくはDebaromycesなどの酵母、を用いるのが好ましく、これらの中ではSaccharomyces cerevisiaeが好ましい。有利には、本発明ではコリネ型細菌またはBacillaceaeを用いる。本発明の範囲内にあるもので好ましいものは例えば、Corynebacterium属、Escherichia属、Bacillus属、Arthrobacter属、Bevibacterium属、Pseudomonas属、Salmonella属、Klebsiella属、Proteus属、Acinetobacter属、またはRhizobium属の細菌である。この場合特に好ましいのは、例えば、Corynebacterium glutamicum、Brevibacterium breveまたはBacillus subtilis、B. licheniformis、B. amyloliquefaciens、B. cereus、B. lentimorbus、B. lentus、B. firmus、B. pantothenticus、B. circulans、B. coagulans、B. megaterium、B. pumilus、B. thuringiensis、B. brevis、B. stearothermophilusおよびその16sRNAにより特徴づけられるグループ１の他のBacillus種、あるいはActinum mycetalisである。この掲載は説明のためのものであって、決して本発明を限定するものではない。
【００１８】
さらに本発明はまた、遊離のD-パントテン酸および／またはその塩を含有する動物飼料用サプリメントの改良された製法に遺伝子改変生物を用いることも含む。そのような遺伝子改変生物は、例えば化学的突然変異誘発とそのあとの適切な「スクリーニング方法」を用いる選別[selection]により単離することができる。本発明では、本発明の意味において本生成物を産生するのに好適であり且つ、細胞膜を通してのD-パントテン酸および／またはその塩の分泌に関する改変も含めて、その代謝フラックスに関してD-パントテン酸の方向に遺伝子改変を有する「産生菌」と呼ばれるものもまた含まれる。これは例えば、用いる生物の適切な代謝生合成の経路中の鍵となる位置で改変することにより達成できる。
【００１９】
目的とする生成物を合成するのに必要である、または必要とされ得る相同および／または非相同ヌクレオチド配列の導入により得られる遺伝子導入（トランスジェニック）生物を用いることも考えられる。この場合は、そのゲノム中および／またはベクター上に個々におよび／または組み合せで局在化された１つ以上の遺伝子の過剰発現および／または調節解除が考えられる。
【００２０】
このタイプの遺伝子導入生物は有利にも、panB、panC、panD、panEおよび／またはこれらの組み合せさらには／あるいはpanBCDオペロンを含有している組織ユニットから構成される群から選択される遺伝子改変された遺伝子および／または追加のコピーを含有することができる。加えて、例えばEP 1 006 189、EP 1 006 192、EP 1 006 193またはEP 1 001 027に記載されているように、例えばイソロイシン-バリン生合成経路などの他の代謝経路をこの生物中で都合良く操作することができる。その結果、パントテン酸生合成の分岐鎖前駆体物質がますます利用可能となる。有利には、適切な場合はこの生合成経路の遺伝子、すなわちilvB、ilvN、ilvCおよび／またはilvDを過剰発現させる。
【００２１】
さらに、例えば過剰発現および／または調節解除による、用いる本D-パントテン酸産生生物中のアスパラギン酸α-デカルボキシラーゼ（panD）の遺伝子改変が本発明に包含される。
【００２２】
本発明の意味するところでは、用語「調節解除[deregulation]」とは、微生物中で１つの酵素の活性を変更または改変するために、生合成の代謝経路においてその酵素をコードする少なくとも１個の遺伝子を変更または改変することを意味する。遺伝子産物がもっと多量に生成するよう、あるいはもっと高い活性をもつように、生合成代謝経路の１つの酵素をコードする少なくとも１個の遺伝子を変更するのが好ましい。用語「調節解除された代謝経路」は、１つより多くの酵素の活性が変化するようにまたは改変されるように、１つより多くの酵素をコードする１個より多くの遺伝子が変更または改変されている生合成代謝経路も包含する。
【００２３】
変更または改変としては、限定するものではないが、以下のようなものが含まれ得る：内因性プロモーターまたは調節エレメントの除去；強力プロモーター、誘導プロモーターの導入あるいは複数プロモーターの同時導入；遺伝子産物の発現を変えるために行う調節配列の除去；遺伝子の染色体上の位置の変更；遺伝子の近辺または遺伝子中、例えばリボソーム結合部位（RBS）におけるDNA塩基配列の変更；ゲノム中の遺伝子のコピー数を増大させることまたは様々なコピー数のプラスミドを導入すること；遺伝子の転写および／または遺伝子産物を生じるその翻訳に関与するタンパク質（例：調節タンパク質、サプレッサー、エンハンサー、転写活性化因子など）の改変。これには、例えばアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いること、あるいはリプレッサータンパク質をブロックすることなど、先行技術に属する、遺伝子の発現を調節解除する他の全ての可能性も含まれる。
【００２４】
調節解除は、例えば、遺伝子産物のフィードバック調節の除去につながる、あるいは遺伝子産物のより大きいまたはより小さい特異的活性につながる、遺伝子のコード領域に対する変更も含み得る。
【００２５】
さらに、本発明では、パントテン酸前駆体の流出および／または補酵素Aを生じるパントテン酸のフラックスに作用する、酵素の遺伝子改変が有利である。そのような酵素をコードする遺伝子の例は：alsD、avtA、ilvE、ansB、coaA、coaX 等である。この掲載は説明のためだけであって、断じて本発明を制限するものではない。
【００２６】
加えて、補因子（例えば、メチレンテトラヒドロ葉酸、レドックス等価体など）の細胞産生を、パントテン酸産生に至適な量で確保する遺伝子改変が有利である。
【００２７】
有利なことには、対応する遺伝子改変されていない生物と比較して、β-アラニンが細胞中に高められた濃度で既に存在し、その結果、例えばEP-A 0 590 857で必要とされているようには、培養培地に前駆体として加える必要はない。パントテン酸（pan）および／またはイソロイシン-バリン（ilv）および／またはアスパラギン酸-α-デカルボキシラーゼ（panD）の生合成が調節解除されている微生物が有利である。さらに、微生物中のケトパント酸レダクターゼ（panE）の付加的な過剰発現が有利である。
【００２８】
本発明では、適切ならば、補酵素Aの合成に必要とされるcoaA遺伝子がその活性において低くなっている、あるいは完全にスイッチが切られている（例えばBacillus種において）場合はさらに有利である。これは、Bacillusが、coaAに加えて、この酵素作用のための別の遺伝子（= coaX）を含有しているためである。この遺伝子coaXまたはその対応する酵素の活性もまた、coaA自体が、低下した酵素活性ではあるがなお十分な酵素活性を有している場合、すなわちcoaAの酵素活性が完全には失われていない場合は、変更する、好ましくは低減する、あるいは削除することさえもできる。各種遺伝子の過剰発現に加えて、これら遺伝子のプロモーター領域の遺伝子操作もまた、この操作が遺伝子産物の過剰発現を引き起こす場合は、有利である。
【００２９】
本発明の１つの実施形態では、PCT/US 出願番号 0025993に記載されている細菌株、例えばBacillus subtilis[枯草菌] PA 824および／またはその派生株、が用いられる。本発明の別の実施形態では、US 出願番号 60/262,995に記載されている微生物Bacillus subtilis PA 668が本発明の方法において使用される。これらの菌株Bacillus subtilis PA 824およびPA 668は以下のようにして作成した。
【００３０】
遺伝子型trpC2（Trp-）をもつ菌株Bacillus subtilis 168（Marburg株 ATCC 6051）から出発して、菌株PY79を、Trp+マーカー（Bacillus subtilis 野生型 W23由来）の形質導入を経て作成した。この菌株PY79中に古典的遺伝子工学手法（例えば、Harwood, C.R. and Cutting, S.M. (editors), Molecular Biological Methods for Bacillus (1990) John Wiley & Sons, Ltd., Chichester, England に記載されている）により変異ΔpanBおよびΔpanE1を導入した。
【００３１】
得られた菌株を、Bacillus subtilis 菌株 PA221（遺伝子型 P26panBCD、trpC2（Trp-））のゲノムDNAおよびBacillus subtilis 菌株 PA303（遺伝子型 P26panE1）のゲノムDNAで形質転換した。結果として得られる菌株PA327は遺伝子型P26panBCD、P26panE1を有し、トリプトファン栄養要求株（Trp-）である。Bacillus subtilis 菌株 PA327を、前もってβ-アラニン5 g/Lとα-ケトイソ吉草酸5 g/Lが補充されているSVY培地（水 740 mL中に、Difco Veal Infusion Broth 25 g/L、Difco Yeast Extract 5 g/L、グルタミン酸Na 5 g/L、硫酸アンモニウム 2.7 g/Lを投入し、得られた混合液を高圧加熱滅菌しそのあとpH 7.0の1 M リン酸カリウム 200 mLと50% 滅菌グルコース溶液 60 mLを加えた）を含有する培養液10 mL中で用いて、最高3.0 g/L（24 時間）のパントテン酸力価を達成した。
【００３２】
Bacillus subtilis 菌株 PA221（遺伝子型 P26panBCD、trpC2（Trp-））の作成は次のようにして行った。
【００３３】
古典的遺伝子工学手法により、Bacillus subtilis GP275プラスミドライブラリーから出発して、E. coliのpanBCDオペロンの塩基配列情報（参照：Merkel et al., FEMS Microbiol. Lett., 143, 1996:247-252）の助けを借りて、BacillusのpanBCDオペロンのクローニングを行った。このクローニングには、E. coli 菌株 BM4062（birts）および、Bacillusオペロンは birA 遺伝子の近くにあるという情報を用いた。panBCDオペロンを、E. coli中で複製することができるプラスミド中に導入した。このpanBCDオペロンの発現を改善するために、Bacillus subtilis ファージ SP01（P26）の強力な構成性プロモーターを用い、またpanB遺伝子の前にあるリボソーム結合部位（=RBS）を人工RBSで置き換えた。Bacillusの天然のpanB遺伝子の直ぐ上流にあるDNA断片を、上記プラスミド上のP26panBCDカセットの前に連結した。このプラスミドをBacillus subtilis 菌株 RL-1（古典的突然変異誘発により得られたBacillus subtilis 168の派生株（Marburg株 ATCC 6051）、遺伝子型 trpC2（Trp-））中に形質転換し、そして相同的組み換えにより、天然のpanBCDオペロンをp26panBCDオペロンで置き換えた。得られた菌株はPA221と呼び、遺伝子型P26panBCD、trpC2（Trp-）を有する。
【００３４】
このBacillus subtilis 菌株 PA221を、前もってβ-アラニン5 g/Lとα-ケトイソ吉草酸5 g/Lが補充されているSVY培地を含有する培養液10 mL中で用いて、最高0.92 g/L（24 時間）のパントテン酸力価を達成した。
【００３５】
Bacillus subtilis 菌株 PA303（遺伝子型 P26panE1）の作成は次のようにして行った。
【００３６】
E. coli panE 遺伝子塩基配列を用いて、Bacillus panE 塩基配列を同じようにしてクローニングした。B. subtilis には、panE1 および panE2と呼ばれるE. coli panE遺伝子の二つの相同体が存在することを見出した。欠失解析によりpanE1遺伝子がパントテン酸産生の90％を担い、panE2遺伝子を欠失させてもパントテン酸の産生には有意な影響がないことが分かった。ここでもまた、panBCD オペロンのクローニングと同様に、プロモーターを強力構成プロモーターP26で置き換え、panE1遺伝子の前にあるリボソーム結合部位を人工結合部位で置き換えた。このP26panE1 断片を、P26panE1断片がBacillus subtilisゲノムの元のpanE1遺伝子座中に組込まれることができるように作成されたベクター中にクローニングした。形質転換および相同組み換えの後に得られた菌株はPA303と呼ばれ、遺伝子型 P26panE1を有している。このBacillus subtilis 菌株 PA303を、前もってβ-アラニン5 g/Lとα-ケトイソ吉草酸5 g/Lが補充されているSVY培地を含有する培養液10 mL中で用いて、最高1.66 g/L（24 時間）のパントテン酸力価を達成した。
【００３７】
PA327を、P26ilvBNCオペロンとスペクチノマイシンのマーカー遺伝子を有しているプラスミドで形質転換することにより別の菌株を構築した。P26ilvBNC オペロンはamyE遺伝子座中に組込まれたことがPCRにより確認された。１つの形質転換株をPA340と呼んだ（遺伝子型 P26panBCD、P26panE1、P26ilvBNC、specR、trpC2（Trp-））。
【００３８】
このBacillus subtilis 菌株 PA340を、前もってβ-アラニン5 g/Lだけが補充されている、SVY培地を含有している培養液10 mL中で用いて、最高3.6 g/L（24 時間）のパントテン酸力価を達成した；前もってβ-アラニン5 g/Lとα-ケトイソ吉草酸5 g/Lが補充されている、SVY培地を含有する培養液10 mL中では、最高4.1 g/L（24 時間）のパントテン酸力価を達成した。
【００３９】
さらに、菌株PA340中に調節解除されたilvDカセットを導入した。このために、人工RBS2を含んでいる、P26プロモーターのコントロール下にあるilvD遺伝子を含んでいるプラスミドをPA340中に導入した。このP26ilvD遺伝子を元のilvD遺伝子座中に相同組み換えにより組み込んだ。この結果得られた菌株 PA374は、遺伝子型 P26panBCD、P26panE1、P26ilvBNC、P26ilvD、specRおよびtrpC2（Trp-）を有する。
【００４０】
このBacillus subtilis 菌株 PA374を、前もってβ-アラニン5 g/Lだけが補充されている、SVY培地を含有する培養液10 mL中で用いて、最高2.99 g/L（24 時間）のパントテン酸力価を達成した。
【００４１】
β-アラニンを供給することなく菌株 PA374を用いてパントテン酸を産生させるために、アスパラギン酸-α-デカルボキシラーゼをコードする遺伝子panDのさらなるコピーを菌株 PA374中に導入した。このためには、菌株 PA401の染色体DNAをPA374中に導入した。菌株PA377をテトラサイクリン選別により得た。
【００４２】
結果として得られた菌株 PA377は遺伝子型 P26panBCD、P26panE1、P26ilvBNC、P26ilvD、specR、tetRおよびtrpC2（Trp-）を有する。
【００４３】
Bacillus subtilis 菌株 PA377をSVY培地を含有する培養液10 mL中で用いて、最高1.31 g/L（24 時間）のパントテン酸力価を達成した。
【００４４】
Bacillus subtilis 菌株 PA401（遺伝子型 P26panD）の調製は次のようにして行った。
【００４５】
Bacillus subtilis panD遺伝子をpanBCDオペロンから、テトラサイクリンマーカー遺伝子を持つベクター中にクローニングした。プロモーターP26および上記した人工RBSをpanD遺伝子の前にクローニングした。制限消化により、テトラサイクリンマーカー遺伝子とP26panD遺伝子を含んでいる断片を調製した。この断片を再ライゲーションし、上述の菌株 PA221を形質転換した。断片は菌株 PA211のゲノム中に組み込まれていた。この結果得られた菌株 PA401は遺伝子型P26panBCD、P26panD、tetRおよびtrpC2（Trp-）を有している。
【００４６】
このBacillus subtilis 菌株 PA401を、前もってα-ケトイソ吉草酸5 g/Lが補充されているSVY培地を含有する培養液10 mL中で用いて、最高0.3 g/L（24 時間）のパントテン酸力価を達成した。前もってD-パントテン酸5 g/LとL-アスパラギン酸10 g/Lが補充された、SVY培地を含有する培養液10 mL中ででは、最高2.2 g/L（24 時間）のパントテン酸力価を達成した。
【００４７】
菌株 PA377から出発して、菌株 PY79由来の染色体DNAによる形質転換によりトリプトファン原栄養菌株を作成した。この菌株PA824は遺伝子型P26panBCD、P26panE1、P26ilvBNC、P26ilvD、specR、tetRおよびTrp+を有する。
【００４８】
Bacillus subtilis 菌株 PA824を、SVY培地の培養液10 mL中で用いて前駆体の供給なしで最高4.9 g/L（48 時間）のパントテン酸力価を達成した（PA377との比較：48時間で最高3.6 g/L）。
【００４９】
PA668の調製は次のように行った。
【００５０】
Bacillus panB遺伝子を野生型panBCD オペロンからクローニングし、クロラムフェニコール耐性遺伝子に加えてvpr遺伝子座のB. subtilis 塩基配列も含んでいるベクター中に挿入した。
【００５１】
強力構成プロモーターP26をpanB遺伝子の5'末端の前に導入した。P26panB遺伝子、クロラムフェニコール耐性のマーカー遺伝子ならびにBacillus subtilis vpr 塩基配列を含んでいる１つの断片を制限消化により得た。単離した断片を再ライゲーションし、菌株PA824を形質転換するのに用いた。結果として得られた菌株をPA668と呼んだ。PA668の遺伝子型は：P26panBCD、P26panE1、P26ilvBNC、P26ilvD、P26panB、specR、tetR、CmRおよびTrp+である。
【００５２】
PA668の２つのコロニーを単離し、１つをPA668-2Aと呼び、もう１つの方をPA668-24と呼んだ。
【００５３】
B. subtilis 菌株 PA668-2Aを用いて、前駆体の供給なしのSVY培地の培養液10 mL中48時間で1.5 g/Lのパントテン酸力価が達成される。アスパラギン酸10 g/Lが補充されている培養液10 mL中では、最高5 g/Lの力価が達成される。
【００５４】
B. subtilis 菌株 PA668-24を用いて、前駆体の供給なしのSVY培地の培養液10 mL中48時間で1.8 g/Lのパントテン酸力価が達成される。L-アスパラギン酸10 g/Lが補充されている培養液10 mL中では、最高4.9 g/Lの力価が達成される。
【００５５】
菌株の正確な作成法についてはPCT/US出願番号0025993およびUS出願番号60/262,995を参照されたい。
【００５６】
上述の菌株PA377を用いて、グルコース溶液が連続供給されている10 L規模でのSVY培地（Difco Veal Infusion Broth 25 g/L、Difco Yeast Extract 5 g/L、トリプトファン5 g/L、グルタミン酸Na 5 g/L、(NH4)2SO42 g/L、KH2PO410 g/L、K2HPO420 g/L、CaCl20.1 g/L、MgSO41 g/L、クエン酸ナトリウム1 g/L、FeSO4・7H2O 0.01 g/L、ならびに以下の組成の微量塩溶液 1 mL/L：Na2MoO4・2H2O 0.15 g、H3BO32.5 g、CoCl2・6H2O 0.7 g、CuSO4・5H2O 0.25 g、MnCl2・4H2O 1.6 g、ZnSO4・7H2O 0.3 g、水で1 Lにする）中のグルコース制限発酵において、36時間（48時間）で発酵ブロス中のパントテン酸濃度18-19 g/L（122-25 g/L）が達成される。
【００５７】
酵母エキス培地（Difco Yeast Extract 10 g/L、グルタミン酸Na 5 g/L、(NH4)2SO48 g/L、KH2PO410 g/L、K2HPO420 g/L、CaCl20.1 g/L、MgSO41 g/L、クエン酸ナトリウム 1 g/L、FeSO4・7H2O 0.01 g/L、ならびに上記の微量塩溶液1 mL/L）中での、PA377のトリプトファン原栄養派生株であるPA824のグルコース制限発酵の場合は、グルコース溶液が連続供給されている10 L規模において、36時間、48時間および72時間で、発酵ブロス中以下のパントテン酸濃度が達成される：20 g/L、28 g/Lおよび36 g/L。
【００５８】
培地のさらなる至適化により、Difco Yeast Extract 10 g/L、NZアミンA（Quest International GmbH, Erftstadt） 10 g/L、グルタミン酸ナトリウム 10 g/L、(NH4)2SO44 g/L、KH2PO410 g/L、K2HPO420 g/L、CaCl20.1 g/L、MgSO41 g/L、クエン酸ナトリウム 1 g/L、FeSO4・7H2O 0.01 g/Lおよび上記の微量塩溶液1 mL/Lから構成される培地中のグルコース制限発酵に菌株PA824を用いて、グルコース溶液が連続供給されている10 L規模において36時間（48時間）で、発酵ブロス中パントテン酸濃度37 g/L（48 g/L）が達成される。
【００５９】
さらなる培地の至適化により、また発酵時間を長くすることにより、また工程と菌株の改良により、またこれらの個々の段階を組み合せることにより、発酵ブロス中のパントテン酸濃度をさらに増大させることが考えられる。例えば、上述のパントテン酸濃度は、上記PA824の派生株である菌株の発酵によっても達成可能である。派生株は古典的な菌株生育により、またさらなる遺伝子工学的な操作により調製することができる。培地、菌株および発酵方法の開発により、発酵ブロス中のパントテン酸力価を40、45、50、55、60、65、70、75、80、85および90 g/Lよりも大きくすることができる。
【００６０】
本発明の方法の重要な優位点は、出発化合物として、少なくとも１種の炭素源および窒素源以外には他の前駆体を含んでいない培養培地中で発酵を行うことにある。すなわちD-パントテン酸の生合成は、他の前駆体の供給には依存しないことである。本発明の意味するところでは、そのような前駆体は、β-アラニンおよび／またはL-アスパラギン酸および／またはL-バリンおよび／またはα-ケトイソ吉草酸および／またはこれらの組み合せのような物質である。
【００６１】
本発明の好ましい実施形態では、D-パントテン酸産生生物の発酵を、炭素源と窒素源を含有し、発酵の過程で遊離のβ-アラニンおよび／またはβ-アラニンの塩を加えないまたは供給しない培養培地中で行う。すなわちD-パントテン酸を、少なくとも10 g/L培養培地、好ましくは少なくとも20 g/L、特に好ましくは少なくとも40 g/L、非常に好ましくは少なくとも60 g/L、そしてなかでも少なくとも70 g/Lの範囲で製造するのに、本発明では遊離のβ-アラニンおよび／またはβ-アラニンの塩の供給を必要としない。
【００６２】
前駆体の供給に依存しないということは、前駆体の多くは大変高価であるので、公知の方法と比較した場合、本発明の方法の特に重要な経済的優位点である。
【００６３】
しかしながら、本発明はβ-アラニンおよび／またはβ-アラニン塩を添加することを排除するものではなく、従ってD-パントテン酸の収率はβ-アラニンおよび／またはβ-アラニン塩を加えることによりさらに増大させることができる。例えばパントテン酸の必要とされる全ての前駆体が十分な量存在するとすると、panD遺伝子の活性のみがパントテン酸産生のさらなる増加を制限するので、パントテン酸の収率は、遊離のβ-アラニンおよび／またはβ-アラニンの塩を加えることにより、例えばさらに50％増やすことができる。
【００６４】
本発明の有利な実施形態では、パントテン酸の収率をさらに50％増やすために培養培地に最高20 g/Lの遊離のβ-アラニンおよび／またはβ-アラニンの塩を加えることができる。培養培地には約15 g/Lの遊離のβ-アラニンおよび／またはβ-アラニンの塩を加えるのが好ましい。
【００６５】
上述の生物を発酵させる培養培地に用いるのに本発明で適切な炭素源の例は、デンプン加水分解物（単糖類、二糖類、オリゴ糖類）などの糖類（グルコースもしくはスクロースが好ましい）、ならびにビート糖蜜もしくはサトウキビ糖蜜、タンパク質、タンパク質加水分解物、ダイズミール、コーン・スティープ・リカー[corn steep liquor]、脂肪、遊離脂肪酸、前の発酵からの再循環細胞もしくはその加水分解物、および酵母エキス、である。この掲載は本発明に対して限定を行うものではない。
【００６６】
さらに、本発明の方法は、全糖質含有量を発酵の終点まで最低限に抑えられるという点が、さもなければ粘着のため後に行なわれる発酵溶液の乾燥および／または剤形化が困難になると考えられるので、有利な特徴である。これは本発明では、（流加式、繰り返し流加式または連続工程式の場合）炭素源の濃度が実質的にゼロとなるように、（回分式培養の場合）炭素源が消費されたあと、あるいは（流加式もしくは繰り返し流加式の工程方式の場合）炭素の供給を停止および／または調節したあと、発酵をさらにしばらくの間続けることにより達成できる。
【００６７】
これは本発明では、炭素源（例えば砂糖水）の添加を中断したあと、発酵溶液中で溶解酸素濃度（pO2）がその飽和値の少なくとも80％、好ましくは90％、そして特に好ましくは95％に到達するまで発酵を続けることにより達成される。
【００６８】
本発明で好適な窒素源の例は、アンモニア、硫酸アンモニウム、尿素、タンパク質、タンパク質加水分解物あるいは酵母エキスである。この掲載もまた本発明に対して限定的なものではない。
【００６９】
さらに、本発酵培地にはアミノ酸やビタミンなどの無機塩類および／または微量元素を含ませる。適切な発酵培地の正確な組成は当業者には十分知られており、また入手可能である。
【００７０】
発酵培地に適当なD-パントテン酸産生生物を接種したあと（当業者には知られている細胞密度で）、適切ならば消泡剤を加えて、その生物を培養する。培地のpHの必要な調節は、各種の無機もしくは有機のアルカリもしくは酸（例えば、NaOH、KOH、アンモニア、リン酸、硫酸、塩酸、蟻酸、コハク酸、クエン酸など）を用いて行うことができる。
【００７１】
発酵の際に用いる緩衝液システムのため（これは、先に述べたように、例えばNaOH、KOH、アンモニア、リン酸、硫酸、塩酸、蟻酸、コハク酸、クエン酸などであり得る）、生成するD-パントテン酸は、発酵溶液中で、用いる緩衝液システムに依存して、それぞれの塩の形態で存在する。この場合、特に一価陽イオンの形態にあるD-パントテン酸の塩は不利であるので、発酵溶液は本発明では陽イオン交換体を用いて処理される。
【００７２】
本発明ではこの場合全ての市販されている、入手可能な陽イオン交換体が含まれる。本発明でパントテン酸塩を脱塩してパントテン酸を得るのに好適な陽イオン交換体は、カルボン酸官能基を有するアクリルベースの樹脂および／またはスルホン酸基を有するポリスチレン樹脂などの、H+の形態で存在する酸性樹脂であり、例えば、Lewatit CNP 80、CNP LF、S 100、S1468およびSP 112 Monopulus（Bayer, Leverkusen, Germany）、Diaion PK 216（Mitsubishi Chemical Corp, Tokyo, Japan）、Amberlite 200およびAmberlite 252（Rohm and Haas, Philadelphia, USA）である。
【００７３】
好ましい陽イオン交換体は、スルホン化ポリスチレンをベースとしたH+の形態にある強酸性イオン交換体である。単分散型の陽イオン交換体、例えばLewatit S1468が特に好ましい。上記の陽イオン交換体の掲載は例示であって、本発明を限定するものではない。当業者にはよく知られているように、イオン交換体は、交換基枯渇のあと無機酸を用いて元のH+型に再生することができる。従って何回も使用することができる。
【００７４】
この陽イオン交換体を用いることで一価陽イオン、例えばアンモニア、カリウム、ナトリウムが都合よく実質的に完全に発酵溶液から除去され、その結果溶液中にはD-パントテン酸塩から遊離D-パントテン酸が生成される。本発明では、一価陽イオンの含有量、好ましくはアンモニウムイオン、カリウムおよび／またはナトリウムイオンの含有量は、濃度≦1 g/kg溶液に下がる。
【００７５】
得られた遊離パントテン酸の溶液は、本発明ではカルシウム塩基および／またはマグネシウム塩基を加えることによりpH 3〜10に調整する。pH 5〜10が有利である。好ましくは、溶液はpH 5〜9、特に好ましくは6〜9、なかでも特に好ましくは6〜8に調整する。このようにして、パントテン酸カルシウムおよび／またはパントテン酸マグネシウムの溶液もしくは懸濁液が得られる。好ましくは、中和反応には、この溶液に、固形物の形態でおよび／または水性懸濁液として水酸化カルシウム、炭酸カルシウム、酸化カルシウム、水酸化マグネシウムおよび／または塩基性炭酸マグネシウムを加える。
【００７６】
本発明ではこの場合、遊離D-パントテン酸を含有している溶液を、水性懸濁液の形態にあるカルシウム塩基および／またはマグネシウム塩基で中和するのが好ましい。水性懸濁液を用いる結果、上記中和反応は、対応する固体が用いられる場合に比べて、より迅速に、また比較的大きなpHの変動もなく行なわれる。
【００７７】
本発明では、本方法は、工程c）の溶液に、水酸化カルシウム2〜55重量%、好ましくは10〜50重量%、そして特に好ましくは20〜40重量%を含んでいる水性懸濁液を加えることを特徴としている。本発明はさらに、工程c）の溶液に、炭酸カルシウム2〜65重量%、好ましくは10〜50重量%、そして特に好ましくは20〜40重量%を含んでいる水性懸濁液を加える方法を含む。本発明のさらなる実施形態では、本発明の工程c）の溶液に、水酸化マグネシウム2〜60重量%、好ましくは10〜50重量%、そして特に好ましくは20〜40重量%を含んでいる水性懸濁液を加える。本発明はまた、工程c）の溶液に、塩基性炭酸マグネシウム2〜25重量%、好ましくは10〜20重量%を含んでいる水性懸濁液を加える方法も含む。
【００７８】
さらなる実施形態では、工程b）の遊離D-パントテン酸含有溶液に、後続の工程c）において、酸性無機および／もしくは有機カルシウム塩および／またはマグネシウム塩を加えることができ、パントテン酸カルシウムおよび／またはパントテン酸マグネシウムを含有する溶液もしくは懸濁液が得られる。
【００７９】
有利には、本発明の目的に対しては、酸性無機カルシウム塩および／またはマグネシウム塩はその対応するハロゲン化カルシウムおよび／またはマグネシウムである。好ましくは本発明では、それらはCaCl2および／またはMgCl2である。本発明の目的に対しては、上記酸性有機カルシウム塩基および／またはマグネシウム塩基は、例えば有機陰イオンの高水溶性塩である。好ましくはそれらは、例えば、蟻酸、酢酸、プロピオン酸、グリシン酸および／または乳酸カルシウムおよび／またはマグネシウムである。
【００８０】
その次の工程d）において、パントテン酸カルシウムおよび／またはパントテン酸マグネシウムの溶液もしくは懸濁液を次に乾燥および／または剤形化する。
【００８１】
得られたD-パントテン酸カルシウムおよび／またはマグネシウム含有溶液もしくは懸濁液は、それ自体公知の方法、例えばスプレー乾燥、スプレー顆粒化、流動層乾燥、流動層顆粒化、ドラム乾燥あるいは遠心脱水フラッシュ乾燥（(Ullmann’s Encyclopedia of Industrial Chemistry, 6thedition, 1999、電子出版、“Drying of Solid Materials”の章）、を用いて乾燥および／または剤形化する。対流乾燥のガス入口温度は100〜280℃、好ましくは120〜210℃の範囲内である。ガス出口温度は50〜180℃、好ましくは60〜150℃である。望ましい粒子径分布、またそれと関係する製品特性を得るためには、微細粒子を分離して再循環することもできる。加えて、粒の粗い材料は粉砕機で粉砕して同様にそのあと再循環することもできる。
【００８２】
本発明では、上述の方法において、複雑な後処理工程が減ること、特に高い生物学的価値をもつ所望製品の製造を行いながら同時に有機溶媒の使用が避けられることが有利な点である。加えて、本発明では、生成する廃水の量が顕著に少なくなる。従ってこれは、複雑な後処理プラントおよび廃棄処理プラントのさらなる節約につながる。従って本発明の方法は、従来の方法に比べて、より簡単であること、誤りをより起しにくいこと、時間がよりかからないこと、際立ってより安価であること従ってより経済的であることを有利な特徴としている。
【００８３】
しかしながらこれは、本発明の方法を変えることができるということを排除するものではない。冒頭に記載した本発明の方法の工程a）〜d）は、それ自体当業者にはよく知られている以下の工程段階の１つ以上を補充することができる。この場合、付加される（操作）工程段階と本（必須）工程段階a）〜d）との考えられ得る全ての組み合せは本発明に包含される。
【００８４】
例えば、本工程段階a）〜c）で得られた溶液もしくは懸濁液は、例えば加熱（滅菌）あるいは例えばパスツール式低温滅菌または滅菌濾過などの他の方法により殺菌することができる。
【００８５】
本発明の他の実施形態では、上記溶液もしくは懸濁液の乾燥および／または剤形化の前に、溶菌および／またはバイオマスの滅菌および／または発酵溶液からのバイオマスの除去および／またはさらなる添加剤の添加および／または発酵溶液の濃縮（好ましくは水の除去による）等の工程の少なくとも１つおよび／またはそれらを組み合せたものを行うことができる。
【００８６】
従って本発明はまた、溶菌および／またはバイオマスの滅菌を、まだ発酵溶液中に在る時に、あるいはバイオマスが発酵溶液から分離される前に行う方法にも関する。これは、例えば温度処理により（好ましくは80〜200℃）、および／または酸処理により（好ましくは硫酸または塩酸により）、および／または酵素的に（好ましくはリゾチームで）行うことができる。
【００８７】
本発明のさらなる実施形態では、発酵した微生物の細胞は、本発明の方法の工程a）、b）またはc）の溶液もしくは懸濁液から、濾過、分離（例えば遠心分離）および／またはデカンテーションにより分離することができる。また工程a）、b）またはc）の溶液もしくは懸濁液を、存在する微生物を分離することなく、直接陽イオン交換体を通過させることも考えられる。バイオマスを、本発明の方法の陽イオン交換体による後処理工程（工程b））の前に分離しない場合は、このバイオマス含有の発酵溶液を有利にも本イオン交換ベッドの中を底部から頂部に、すなわち重力とは反対の方向に通過させることもできる。この方法は一般には、精製すべき溶液中に懸濁物質が存在する場合有利である。
【００８８】
陽イオン交換体による後処理で得られた溶液もしくは懸濁液は、中和の後、適当な蒸発器、例えば流下膜式蒸発器、薄膜型蒸発器あるいはロータリーエバポレータにより濃縮することができる。さらなる実施形態では、上述の本発明の方法の工程d）の溶液もしくは懸濁液は、前もって濃縮しておくことができる。このためには工程c）の溶液もしくは懸濁液を、例えば流下膜式蒸発器および／または薄膜型蒸発器で濃縮する。そのような蒸発器は、例えば、GIG社（4800 Attnang Puchheim, Austria）、GEA Canzier社（52303 Deuren, Germany）、Diessel社（31103 Hildesheim, Germany）、Pitton社（35274 Kirchhain, Germany）等の会社が製作している。
【００８９】
最終製品の色調を良くするには、本方法で得られた溶液もしくは懸濁液に少量の活性炭を加え、そして得られた懸濁液をそのあと濾過するさらなる濾過工程を実施することでできる。あるいは、本発酵中に得られた溶液を、小型の活性炭ベッドの中に通すこともできる。これに必要とされる、使用される活性炭の量は溶液の数重量％の範囲内であり、当業者の知識と経験の範囲内のものである。
【００９０】
これらの濾過操作は、濾過操作の前にそれぞれの溶液に市販の凝集助剤（例えばBASF AG社(Ludwigshafen)のSedipur CF 902あるいはSedipur CL 930）を加えることにより簡易化することができる。
【００９１】
本発明の１つの有利な実施形態では、発酵産物（発酵ブロス）を加熱により滅菌し、そしてそのあと細胞塊を、遠心分離、濾過あるいはデカンテーションにより分離する。この発酵産物を基準にして市販の在来の凝集助剤50〜1000 mg/kg、好ましくは100〜200 mg/kgを加えた後、得られた混合物を活性炭と砂の短いベッドを通過させて濾過することにより、高D-パントテン酸含量の、バイオマス無しの溶液を得る。この処理された溶液を次にイオン交換ベッド（H+の形態）の中を通過させる。
【００９２】
上記バイオマスが、本発明の陽イオン交換体による後処理工程の前に分離されない場合は、このバイオマス含有の発酵溶液を有利にも本イオン交換ベッドの中を底部から頂部に、すなわち重力とは反対の方向に通過させることもできる。
【００９３】
パントテン酸カルシウムおよび／またはパントテン酸マグネシウムを含有している溶液もしくは懸濁液は次に例えばスプレー乾燥により乾燥させることができる。これは並流で、向流であるいは混成流で行うことができる。噴霧化(atomization)には、いずれの公知の噴霧器(atomizer)も用いることができ、特に一流体型噴霧ノズルまたは二流体型噴霧ノズルの遠心噴霧器（アトマイザーディスク）がよい。好ましい乾燥温度条件は、塔入口温度を150〜250℃、塔出口温度を70〜130℃とする。しかしながら、乾燥をもっと高い温度レベルで、あるいはもっと低い温度レベルで行うこともできる。非常に低い残留水分率を達成するには、流動床の下流にさらなる乾燥工程を設けることができる。
【００９４】
このスプレー乾燥は、スプレー乾燥器と流動床を組み合せたものであり、Niro社（Copenhagen, Denmark）およびAPV-Anhydro社（Copenhagen, Denmark）で製作されているFSD乾燥機またはSBD乾燥機（FSD: fluidized spray dryer[流動スプレー乾燥機]; SBD: spray bed dryer[スプレー床式乾燥機]）で行うことができる。
【００９５】
このスプレー乾燥においては固化防止剤を加えることができる。これにより、特に微細粉末の場合、乾燥機壁への付着を減らすことができまた流動特性を良くすることができる。使用できる固化防止剤は、なかでもケイ酸塩、ステアリン酸塩、リン酸塩、コーンスターチである。
【００９６】
原理的には上記乾燥はスプレー流動床でも行うことができ、この場合これは連続式のみならず回分式にも運転することができる。溶液もしくは懸濁液を上部から（上部スプレー）ならびに底部から（底部スプレー）のみならず、側部から（側部スプレー）もスプレーすることができる。
【００９７】
本発明はさらに動物飼料添加物および／または動物飼料サプリメントとして使用される組成物にも関し、この場合それは以下の工程によって調製され得る：
a）D-パントテン酸を産生し且つパントテン酸（pan）および／またはイソロイシン/バリン（ilv）の生合成が調節解除され且つ培養培地中で発酵によりD-パントテン酸の塩を少なくとも2 g/L生成する少なくとも１種の生物を用い、該培養培地に遊離のβ-アラニンおよび／またはβ-アラニンの塩0〜20 g/L、好ましくは0 g/Lを供給する工程、
b）得られたパントテン酸塩含有発酵液を陽イオン交換体の中を通過させ、該D-パントテン酸の塩から遊離D-パントテン酸を生成させる工程、
c）カルシウム塩基および／またはマグネシウム塩基を加えて前記遊離D-パントテン酸含有溶液をpH 3〜10に調整し、パントテン酸カルシウムおよび／またはマグネシウムを含有する溶液を得る工程、および
d）前記パントテン酸カルシウムおよび／またはパントテン酸マグネシウム含有溶液を乾燥および／または剤形化する工程。
【００９８】
有利な実施形態では、工程c）または工程d）において、パントテン酸カルシウムおよび／またはパントテン酸マグネシウムを含有する懸濁液が得られるまたは使用する。
【００９９】
さらなる実施形態では、工程b）の遊離D-パントテン酸含有溶液に、次の工程c）において酸性無機および／もしくは有機カルシウム塩および／またはマグネシウム塩を加えることができ、パントテン酸カルシウムおよび／またはパントテン酸マグネシウムを含有する溶液もしくは懸濁液が得られる。
【０１００】
有利には、本発明の目的に対しては、酸性無機カルシウム塩および／またはマグネシウム塩は、その対応するハロゲン化カルシウムおよび／またはマグネシウムである。本発明ではこれらはCaCl2および／またはMgCl2である。酸性有機カルシウム塩および／またはマグネシウム塩の中では、本発明の目的に対しては、例えば易水溶性の有機陰イオンの塩がある。好ましくはこれらは例えば、蟻酸、酢酸、プロピオン酸、グリシン酸および／または乳酸カルシウムおよび／またはマグネシウムである。
【０１０１】
次の工程d）において、パントテン酸カルシウムおよび／またはパントテン酸マグネシウムの溶液もしくは懸濁液を乾燥および／または剤形化する。
【０１０２】
さらに本発明の組成物は、D-パントテン酸の塩を少なくとも1-100重量%、好ましくは少なくとも20-100重量%、そして特に好ましくは少なくとも50重量%の濃度で含んでいることを特徴としている。本発明は、二価陽イオンの形態、好ましくはD-パントテン酸カルシウムおよび／またはマグネシウムの形態でD-パントテン酸の塩を含んでいる組成物に関する。本発明では、一価陽イオンの形態でのD-パントテン酸の塩の含有量が≦1 g/kgであることを特徴としている組成物が好ましい。
【０１０３】
本発明では上述の方法により、飼料添加物の要求事項を満足するD-パントテン酸カルシウムまたはD-パントテン酸マグネシウムが得られる。これらの要求事項は、例えば、D-パントテン酸塩の比較的高い含有量およびその標的生物に対する高い適合性ならびに、本発明製品の「ビタミン活性」の意味においての生物学的価値である。
【実施例】
【０１０４】
以下の実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、これらは本発明を限定するものではない。
【０１０５】
実施例１
撹拌機と14 L容量のガス導入装置を有する実験室発酵槽中に、以下の組成の水性発酵培地を投入した。
【表１】
2004529626.tif 000002
滅菌のあと、以下の滅菌培地成分をさらに加えた。
【表２】
2004529626.tif 000003
表中の微量塩溶液は次のような組成を有する：Na2MoO4・2H2O 0.15 g、H3BO32.5 g、CoCl2・6H2O 0.7 g、CuSO4・5H2O 0.25 g、MnCl2・4H2O 1.6 g、ZnSO4・7H2O 0.3 gを水で合計1 Lとする。この微量塩溶液は滅菌濾過を経て加える。初期液体容量を6 Lとする。上記で設定された含有量はこの値に基づく。
【０１０６】
この溶液に、Bacillus subtilis PA824の接種培養菌（OD = 10）60 mLを加え、そしてこの懸濁液を、ガス導入流量12 L/分で激しく撹拌しながら43℃で発酵させる。この菌株はPCT/US Application 0025993に記載されている。
【０１０７】
47時間で、滅菌水溶液6.5 Lを加える。その組成は以下のとおりである。
【表３】
2004529626.tif 000004
発酵をグルコース制限条件下で行う。発酵中はpHを25%濃度のアンモニア溶液または20％濃度のリン酸を加えることにより7.2に保つ。アンモニアは本発酵に対しては同時に窒素源として役立たせる。撹拌羽根の回転スピードを制御して溶解酸素含有量をその飽和値の30%に保つ。炭素源の添加を停止した後、発酵を、溶解酸素含有量（pO2）がその飽和値の95%の値に到達するまで続ける。発酵をこのあと終わらせ、そして微生物を熱により破壊する。このためには発酵溶液を45分間滅菌する。破壊がうまくいったことがプレートアウト[plating out]により示される。
【０１０８】
細胞をそのあと遠心分離により取り除く。細胞分離のあと、48時間後のD-パントテン酸塩濃度は22.8 g/Lである。
【０１０９】
同様にして、β-アラニンフィード無しのパントテン酸力価が20よりも大きい、25よりも大きい、30よりも大きい、35よりも大きい、40よりも大きい、45よりも大きい、50よりも大きい、55よりも大きい、60よりも大きい、65よりも大きい、70よりも大きい、75よりも大きい、80よりも大きい、85よりも大きい、そして90 g/Lよりも大きい発酵ブロスを製造することもできる。
【０１１０】
上述したように加熱により滅菌され且つ遠心分離によりバイオマスを実質的に分離した発酵産物をさらなるD-パントテン酸と混ぜ、そしてそのpHを、25%濃度の水酸化アンモニウム溶液（分散液）で約7に調整する。
【０１１１】
得られた溶液もしくは懸濁液を小型の砂/活性炭のベッドを通過させて濾過する。濾液中のD-パントテン酸の含有量は70 g/Lであり、このD-パントテン酸は主としてアンモニウム塩の形態にある。
【０１１２】
この濾液1000 mLを、静水圧により、約100 mLのイオン交換体Lewatit S100 G1が装填されている250 mLのガラスカラムの中を通過させる。流量を約20 mL/分にコントロールする。
【０１１３】
この流出液の分画液100 mLを回収し、そのpH、およびD-パントテン酸塩ならびにCa2+イオン、Mg2+イオン、NH4+イオン、K+イオンおよびNa+イオンの濃度について分析した。以下の表に例示として分画液1〜3を掲載する。
【表４】
2004529626.tif 000005
パントテン酸塩4.8 gを含有する分画液２ 75 mLを、撹拌しながら固体水酸化カルシウムを加えることによりpH 7にもっていった。得られたD-パントテン酸カルシウム溶液もしくは懸濁液を次にロータリー蒸発器で水を蒸発さすことにより乾燥し、薄茶色のD-パントテン酸カルシウムの粉末8.98 g（D-パントテン酸カルシウムの含有量57 %）を得た。この粉末は互いに粘着するという傾向はなく、優れた製品特性を有する。
【０１１４】
実施例２
撹拌機と容量14 Lのガス導入装置を有する実験室発酵槽中に以下の組成の水性発酵培地を投入した。
【表５】
2004529626.tif 000006
滅菌ののち、以下の滅菌培地成分をさらに加えた。
【表６】
2004529626.tif 000007
表中の微量塩溶液は次のような組成を有する：Na2MoO4・2H2O 0.15 g、H3BO32.5 g、CoCl2・6H2O 0.7 g、CuSO4・5H2O 0.25 g、MnCl2・4H2O 1.6 g、ZnSO4・7H2O 0.3 gを水で合計1 Lとする。この微量塩溶液は滅菌濾過を経て加える。初期液体容量を5.5 Lとする。上記で設定された含有量はこの値に基づく。
【０１１５】
この溶液に、Bacillus subtilis PA824の接種培養菌（OD = 10）55 mLを加え、そしてこの懸濁液を、ガス導入流量12 L/分で激しく撹拌しながら43℃で発酵させる。この菌株はPCT/US Application 0025993に記載されている。
【０１１６】
48時間で、滅菌水溶液 6 Lを加える。その組成は以下のとおりである。
【表７】
2004529626.tif 000008
発酵をグルコース制限条件下で行う。発酵中はpHを、25%濃度のアンモニア溶液または20％濃度のリン酸を加えることにより7.2に保った。アンモニアは本発酵に対しては同時に窒素源として役立たせる。撹拌羽根の回転スピードを制御して溶解酸素含有量をその飽和値の30%に保つ。炭素源の添加を停止した後、発酵を、溶解酸素含有量（pO2）がその飽和値の95%の値に到達するまで続ける。発酵をこのあと終わらせ、そして微生物を熱により破壊した。このためには発酵溶液を30分間滅菌した。破壊がうまくいったことはプレートアウトにより示される。
【０１１７】
細胞を次に遠心分離により取り除いた。細胞分離のあとの、48時間で停止した時点のD-パントテン酸塩濃度は24.1 g/Lである。
【０１１８】
同様にして、β-アラニンフィード無しのパントテン酸力価が20よりも大きい、25よりも大きい、30よりも大きい、35よりも大きい、40よりも大きい、45よりも大きい、50よりも大きい、55よりも大きい、60よりも大きい、65よりも大きい、70よりも大きい、75よりも大きい、80よりも大きい、85よりも大きい、そして90 g/Lよりも大きい発酵ブロスを製造することもできる。
【０１１９】
この発酵産物の内2817 mLを、濃度178.9 g/Lのパントテン酸溶液1183 mLと混ぜ、25%濃度のアンモニア溶液で中和した。この混合液を次に砂／活性炭を通過させて濾過した。濾液中のD-パントテン酸の含有量は67 g/Lであり、存在しているD-パントテン酸は主にアンモニウム塩の形態にある。
【０１２０】
この濾液1300 mLを、イオン交換体Lewatit S100 G1（H+の形態）のベッド（容量約1リッター）の中を移動させ、そして水で洗い流した。流量を約20 mL/分に調節する。
【０１２１】
最初の200 mLを流したあと、この溶出液1810 gを回収した。D-パントテン酸の含有量は45 g/Lであった。液中のイオン濃度は次のとおりであった：NH4+= 66 mg/kg溶出液；K+＜ 0.001 g/100 g溶出液。リン含有量は0.072 g/100 g溶出液である。
【０１２２】
この遊離パントテン酸を、撹拌しながら固体水酸化カルシウムで中和する、すなわち約7のpHに調整する。
【０１２３】
D-パントテン酸カルシウムの含有量が49 g/LのD-パントテン酸カルシウムの水溶液もしくは水性懸濁液1840 gを得た。
【０１２４】
この水性D-パントテン酸カルシウム溶液もしくは懸濁液をNiro Minor実験室用スプレー乾燥機で乾燥させる。入口温度は約200℃である。出口温度は85〜90℃である。噴霧は、二流体型ノズルを用いて圧力4 barで行った。水分含有量測定はカールフィッシャー法で行った。この粉末生成物は以下のスペック（データの単位は重量%）を有していた：
水分含有量：2%
D-パントテン酸カルシウム：56.3%
アンモニウムイオン：0.049%
カリウムイオン：＜ 0.01%
ナトリウムイオン：＜ 0.01%。
【０１２５】
実施例３
撹拌機と300 L容量のガス導入装置を有する実験室発酵槽中に、以下の組成の水性発酵培地を投入した。
【表８】
2004529626.tif 000009
滅菌のあと、以下の滅菌培地成分をさらに加えた。
【表９】
2004529626.tif 000010
表中の微量塩溶液は次のような組成を有する：Na2MoO4・2H2O 0.15 g、H3BO32.5 g、CoCl2・6H2O 0.7 g、CuSO4・5H2O 0.25 g、MnCl2・4H2O 1.6 g、ZnSO4・7H2O 0.3 gを水で合計1 Lとする。この微量塩溶液は滅菌濾過を経て加える。初期液体容量を100 Lとする。上記で設定された含有量はこの値に基づく。
【０１２６】
この溶液に、Bacillus subtilis PA824の接種培養菌（OD = 120）4 Lを加え、そしてこの懸濁液を、ガス導入流量1.8 m3/時で激しく撹拌しながら43℃で発酵させる。この菌株はPCT/US Application 0025993に記載されている。
【０１２７】
43時間で、滅菌水溶液113 Lを加える。その組成は以下のとおりである。
【表１０】
2004529626.tif 000011
発酵をグルコース制限条件下で行う。発酵中はpHを25%濃度のアンモニア溶液または20％濃度のリン酸を加えることにより7.2に調節する。アンモニアは本発酵に対しては同時に窒素源として役立たせる。撹拌羽根の回転スピードを制御して溶解酸素含有量をその飽和値の30%に保つ。炭素源の添加を停止した後、発酵を、溶解酸素含有量（pO2）がその飽和値の95%の値に到達するまで続ける。43時間後、発酵を終わらせる。細胞をディスク型遠心分離機で分離することで取り除く。この細胞の入っていない発酵溶液をこのあと60分間滅菌する。破壊がうまくいったことがプレートアウト[plating out]により示される。
【０１２８】
細胞分離および滅菌のあとのD-パントテン酸塩の濃度は21 g/Lである。
【０１２９】
同様にして、β-アラニンフィード無しのパントテン酸力価が20よりも大きい、25よりも大きい、30よりも大きい、35よりも大きい、40よりも大きい、45よりも大きい、50よりも大きい、55よりも大きい、60よりも大きい、65よりも大きい、70よりも大きい、75よりも大きい、80よりも大きい、85よりも大きい、そして90 g/Lよりも大きい発酵ブロスを製造することもできる。
【０１３０】
得られた発酵産物の3270 mLを次に、濃度170 g/Lのパントテン酸ナトリウム溶液1750 mLで成分強化する。この溶液中に約7 gの粉末活性炭を撹拌混入する。この懸濁液の濾過性をよくするために、これの半分をSedipur CF 902（1%濃度溶液48 g）と混ぜ、そしてもう１つの半分をSedipur CL 930（1%濃度溶液30 g）と混ぜる。軽くかき混ぜたあと、この２つの半分をそれぞれ小型のセライトベッドを通過させて濾過し、そのあと再び１つにした。
【０１３１】
得られたD-パントテン酸含有量65.4 g/Lの濾液のうち1800 mLをイオン交換体Lewatit S100 G1（H+の形態）のベッド（容量1リットル）を通過させ、そして水で洗い流した。この時の流量は約20 mL/分である。
【０１３２】
最初の250 mLを流したあと（これは捨てる）、溶出液2.2 Lを回収し、そしてそのpHを、20%濃度の水酸化カルシウム水性分散液（石灰ミルク）を加えることにより約7に調整する。この溶出液を再度濾紙を通過させて濾過し、そして濾液として、サンプル除去のあと、D-パントテン酸カルシウム含有量58 g/LのD-パントテン酸カルシウム水溶液もしくは水性懸濁液2174 gを得る。
【０１３３】
このあとのスプレー乾燥を、Niro Minor実験室用スプレー乾燥機中で行う。入口温度を約185℃とし、出口温度を約95℃とする。噴霧を、二流体型ノズルを用いて圧力2 barで行う。水分含有量測定はカールフィッシャー法で行った。得られた粉末生成物は以下のスペックである（データの単位は重量%）：
水分含有量：1.4%
D-パントテン酸カルシウム：63.2%
アンモニウムイオン：0.043%
カリウムイオン：＜ 0.01%
ナトリウムイオン：＜ 0.01%。
【０１３４】
実施例４
撹拌機と20 L容量のガス導入装置を有する発酵槽中で、ダイズミール200 g、50%濃度酵母エキス50 g、グルタミン酸Na 25 g、硫酸アンモニウム40 gおよび消泡剤Tego KS911 5 mLを脱イオン水3.9 Lと混ぜ、そして内容物を121℃で30分間滅菌した。
【０１３５】
溶液１、２、３および４を次に加えた。
【０１３６】
溶液１は次のようにしてつくった：グルコース12.5 g、CaCl2・2 H2O 0.5 gおよびMgCl2・6 H2O 5 gを脱イオン水100 mL中に溶解し、そして滅菌濾過した。
【０１３７】
溶液２は次のようにしてつくった：クエン酸-鉄溶液（クエン酸ナトリウム200 g/L、FeSO4・7 H2O 2 g/L、滅菌濾過）25 mLを微量塩溶液（Na2MoO4・2 H2O 0.15 g、H3BO32.5 g、CoCl2・6 H2O 0.7 g、CuSO4・5 H2O 0.25 g、MnCl2・4 H2O 1.6 g、ZnSO4・7 H2O 0.3 gを水で1 Lとし、滅菌濾過した）5 mLと混ぜた。
【０１３８】
溶液３は次のようにしてつくった：グルコース87.5 gを水で500 mLとし、そして滅菌した。
【０１３９】
溶液４は次のようにしてつくった：KH2PO425 g、K2HPO450 g、NaH2PO425 g、Na2HPO450 gを水で500 mLとし、そして滅菌した。
【０１４０】
この混合媒体（全溶液１〜４を加えたあとの容量：5 L）に、Bacillus subtilis PA668-2Aの接種培養菌（OD = 9.5、SVY培地［SVY 培地：Difco Veal Infusion ブロス 25 g、Difco Yeast Extract 5 g、グルタミン酸ナトリウム 5 g、(NH4)2SO42.7 gを、H2O 740 mL中に溶解させ、そして滅菌した；滅菌 1M K2HPO4（pH 7）200 mLおよび滅菌50%グルコース溶液 60 mLを加えた（最終容量 1L）］中）100 mLを加え、そしてガス導入流量12 L/分で激しく撹拌しながら43℃で発酵させた。この菌株はUS出願番号60/262,995に記載されている。
【０１４１】
48時間で、約3.5 Lの滅菌グルコース水溶液を加えた。この溶液は次のようにしてつくった：グルコース・H2O 5 kgおよびCaCl2・2 H2O 3.6 gを脱イオン水1.2 kgと混ぜ、そして30分間滅菌した。このあと、微量塩溶液（組成については上記を参照）9 mLおよびクエン酸-鉄溶液（組成については上記を参照）37.5 mLを加えた。滅菌濾過した375 g/Lグルタミン酸ナトリウム溶液60 mLを次に加えた。
【０１４２】
発酵をグルコース制限条件下で行った。発酵の間はpHを、25%濃度のアンモニア溶液または20%濃度のリン酸を加えることで7.2に保った。アンモニアは本発酵に対しては同時に窒素源として役立たせた。撹拌羽根の回転スピードを制御して溶解酸素含有量をその飽和値の20%に保った。泡が立つのを時々消泡剤Tego KS 911を加えることで抑えた。炭素源の添加を停止した後、発酵を、溶解酸素含有量（pO2）がその飽和値の95%の値に到達するまで続けた。発酵をこのあと終わらせた。細胞を遠心分離により取り除いた。上澄み液中に残っている細胞を殺菌により熱的に破壊した。破壊されたことはプレートアウトにより示された。分離および滅菌を行ったあとの、D-パントテン酸塩濃度は35.8 g/Lであった。同様に、β-アラニンフィード無しのパントテン酸力価が15よりも大きい、20よりも大きい、25よりも大きい、30よりも大きい、35よりも大きい、40よりも大きい、45よりも大きい、50よりも大きい、55よりも大きい、60よりも大きい、65よりも大きい、70よりも大きい、75よりも大きい、80よりも大きい、85よりも大きい、そして90 g/Lよりも大きい発酵ブロスを製造することもできる。
【０１４３】
実施例５
実施例４の遠心分離された材料1000 mLを合成パントテン酸ナトリウムで70 g/Lに成分強化し、そしてイオン交換体Lewatit S100 G1約1000 mLが装填されている1000 mLのグラスカラムの中を頂部から底部にポンプ送入した。流量を約20 mL/分にコントロールした。
【０１４４】
この流出液から分画液250 mLを回収し、そのpH、D-パントテン酸塩濃度に関し、ならびにCa2+イオン、Mg2+イオン、NH4+イオン、K+イオンおよびNa+イオンについて分析した。以下の表に例示として分画液1〜3を掲載する。
【表１１】
2004529626.tif 000012
分画液２ 250 mLを、撹拌しながら固体水酸化カルシウムを加えることによりpH 7にもっていった。白色沈殿物が生成し、これを、Sedipur CF902を加えた後濾過除去した。得られた濾液を次にロータリー蒸発器で水を蒸発さすことにより乾燥し、薄茶色のD-パントテン酸カルシウムの粉末25 g（パントテン酸塩の含有量55 %）を得た。この粉末は互いに粘着するという傾向はなく、優れた製品特性を有する。
【０１４５】
実施例６
実施例５の成分強化された遠心分離処理済材料1000 mLを、イオン交換体Lewatit S100 G1（H+の形態）ベッド（容量約1リットル）の中を底部から頂部へポンプ送入した。これをこのあと水で洗い出した。流量は約20 mL/分にコントロールした。
【０１４６】
最初に500 mLを流したあと、流出液1750 gを回収した。D-パントテン酸含有量は35 g/Lであった。流出液中のイオン濃度は次のとおりであった：NH4+＜ 0.01%、Na+= 0.0064%、K+= 0.006%、PO43-= 0.29%、SO42-= 0.1%、Cl-= 0.043%。
【０１４７】
遊離パントテン酸を、撹拌しながら固体水酸化カルシウムで中和した、すなわち約7のpHに調整した。
【０１４８】
パントテン酸塩含有量約35 g/LのD-パントテン酸カルシウム水性懸濁液約1800 gを得た。
【０１４９】
この水性D-パントテン酸カルシウム懸濁液をNiro Minor実験室用スプレー乾燥機で乾燥した。入口温度は約200℃であり、出口温度は85〜90℃であった。噴霧は、二流体型ノズルを用いて圧力4 barで行った。水分含有量測定はカールフィッシャー法で行った。得られた粉末生成物は以下のスペック（データの単位は重量%）であった：
水分含有量：2%
D-パントテン酸塩：56.3%
アンモニウムイオン：0.03%
カリウムイオン：＜ 0.015%
ナトリウムイオン：＜ 0.019%
カルシウムイオン：9.5%。
【０１５０】
実施例７
実施例４で得られた発酵産物3270 mLを、パントテン酸塩の濃度125.6 g/Lのパントテン酸ナトリウム溶液1750 mLで成分強化した。次にこの溶液に粉末活性炭約7 gを撹拌混入した。得られた懸濁液の濾過性をよくするため、これの半分にSedipur CF 902（1%濃度溶液48 g）を混ぜた。これを軽くかき混ぜたあと、上記両方の半分をそれぞれ小型セライトベッドを通過させて濾過し、そしてそのあと一緒にした。
【０１５１】
得られたD-パントテン酸含有量66.5 g/Lの濾液の1000 mLを、イオン交換体Lewatit S100 G1（H+の形態）のベッド（容量1リットル）の中を通過させた。これを水で洗い出した。流量は約20 mL/分であった。
【０１５２】
最初に500 mLを流したあと（これは捨てた）、流出液2 Lを回収し、そのpHを、20%濃度の水酸化カルシウム水性分散液（石灰ミルク）を加えて約7に調整した。この流出液をもう一度濾紙を通過させて濾過し、そしてサンプリングのあと濾液として、D-パントテン酸塩含有量16 g/Lの水性D-パントテン酸カルシウム溶液もしくは懸濁液約1960 mLを得た。
【０１５３】
以下のスプレー乾燥をNiro Minor実験室用スプレー乾燥機中で行った。入口温度は約185℃であり、出口温度は約95℃であった。噴霧は、二流体型ノズルを用いて圧力2 barで行った。水分含有量測定はカールフィッシャー法で行った。得られた粉末生成物は以下のスペック（データの単位は重量%）であった：
水分含有量：1.4%
D-パントテン酸塩：51%
アンモニウムイオン：0.01%
カリウムイオン：0.012%
ナトリウムイオン：0.01%
カルシウムイオン：7.7%。
【０１５４】
実施例８
実施例４と同じようにして、菌株PA668-2Aを用いてのさらなる発酵において、パントテン酸濃度22 g/Lの発酵ブロスを得た。
【０１５５】
得られた遠心分離処理済材料1000 mLを、パントテン酸ナトリウムで70 g/Lに成分強化し、そしてイオン交換体Amberlite 200（H+の形態）のベッド（容量約1リットル）の中を通過させ、そして水で洗い出した。
【０１５６】
最初の500 mLを流したあと、この流出液2000 mLを回収した。これのD-パントテン酸含有量は32.6 g/Lであった。流出液中のイオン濃度は次のとおりであった：NH4+＜0.01%、Na+= 0.0062%、K+= 0.00045%、PO43-= 0.06%、SO42-= 0.06%、Cl-= 0.02%。このイオン交換カラムを、再生のため、先ず1N水酸化ナトリウム溶液1000 mLおよび水2500 mLでフラッシングした。このイオン交換体を次に10%濃度の塩酸1000 mLで再生し、そしてカラムをそのあと水2500 mLで洗って中性とした。
【０１５７】
得られた遊離パントテン酸を、撹拌しながら固体水酸化カルシウムで中和した、すなわちpHを約7に調整した。
【０１５８】
パントテン酸塩含有量27.35 g/LのD-パントテン酸カルシウム水性懸濁液約2000 gを得た。
【０１５９】
このD-パントテン酸カルシウム水性懸濁液をNiro Minor実験室用スプレー乾燥機中で乾燥させた。入口温度は約200℃であり、出口温度は85〜90℃であった。噴霧は、二流体型ノズルにより圧力4 barで行った。水分含有量測定はカールフィッシャー法で行った。得られた粉末生成物は以下のスペック（データの単位は重量%）であった：
水分含有量：1.7%
D-パントテン酸塩：64.6%
アンモニウムイオン：0.08%
カリウムイオン：0.006%
ナトリウムイオン：0.086%
カルシウムイオン：6.5%。
【０１６０】
実施例９
実施例４と同じようにして、PA668-2A菌株を用いての40時間発酵で発酵ブロスを得た。これからバイオマスを遠心分離により分離し、パントテン酸濃度は42.9 g/Lであった。この殺菌されていない発酵ブロス1000 mLを、イオン交換体S1468（H+の形態）のベッド（容量約1.0リットル）の中を通過させ、そして水で洗い出した。流量は約20 mL/分に調節した。
【０１６１】
最初の500 mLを流したあと、得られた流出液2100 mLを回収した。これのD-パントテン酸含有量は19.2 g/Lであった。このイオン交換カラムを、再生のため、先ず1N水酸化ナトリウム溶液1000 mLおよび水2500 mLでフラッシングした。このイオン交換体を次に10%濃度の塩酸1000 mLで再生し、そしてカラムをこのあと水2500 mLで洗って中性とした。
【０１６２】
遊離のパントテン酸を撹拌しながら固体水酸化カルシウムで中和した、すなわちpHを約７に調整した。D-パントテン酸カルシウムの水性懸濁液約2000 gを得、この懸濁液を60分間殺菌した。破壊がうまくいったことがプレートアウトにより示された。
【０１６３】
このD-パントテン酸カルシウム水性懸濁液をNiro Minor実験室用スプレー乾燥機中で乾燥させた。入口温度は約200℃であり、出口温度は85〜90℃であった。噴霧は、二流体型ノズルにより圧力4 barで行った。水分含有量測定はカールフィッシャー法で行った。得られた粉末生成物は以下のスペック（データの単位は重量%）であった：
水分含有量：2.6%
D-パントテン酸塩：8.5%
アンモニウムイオン：＜0.01%
カリウムイオン：0.003%
ナトリウムイオン：0.016%
カルシウムイオン：0.61%。
【０１６４】
実施例１０
D-パントテン酸含有量35.8 g/Lの、実施例４で得られた遠心分離処理済材料2305 mLに、パントテン酸塩含有量158.6 g/Lのパントテン酸ナトリウム溶液895 mLを加えた。このブロス1000 mLを、イオン交換体Lewatit S100 G1（H+の形態）のベッド（容量1リットル）の中を通過させ、そして水で洗い出した。流量は約20 mL/分であった。
【０１６５】
最初の500 mLを流したあと（これは捨てた）、この流出液2 Lを回収した。この流出液のD-パントテン酸塩含有量は25.3 g/Lであった。パントテン酸を基準にして、塩化カルシウムの形態にあるカルシウムイオン1当量を加えた。
【０１６６】
次のスプレー乾燥をNiro Minor実験室用スプレー乾燥機中で行った。入口温度は約185℃であり、出口温度は約95℃であった。噴霧は、二流体型ノズルにより圧力2 barで行った。水分含有量測定はカールフィッシャー法で行った。得られた粉末生成物は以下のスペック（データの単位は重量%）であった：
水分含有量：2.1%
D-パントテン酸塩：50%
アンモニウムイオン：＜0.01%
カリウムイオン：0.015%
ナトリウムイオン：＜0.01%
カルシウムイオン：8.0%。
【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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