(57)【要約】本開示は、その３’末端としてヌクレオチドのランダム配列、およびそのランダムヌクレオチドの５’に一般的配列を有する第一のプライマー、ならびに第一のプライマーの一般的配列を有する第二のプライマーを用いた、ＤＮＡ増幅の方法に関する。本開示は、固体媒体上のＤＮＡを関与させて、ＤＮＡ増幅を改善する方法に関する方法にさらに関連する。好ましい実施形態において、本発明において開示される方法は、ＤＮＡサンプル（例えば、血痕または痕跡量のＤＮＡ）の高スループットの遺伝子型決定のために用いられる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＤＮＡを増幅する方法であって、該方法は、以下の工程：
（ａ）単一の反応混合物を提供する工程であって、該反応混合物は、以下：
（ｉ）ＤＮＡサンプル；
（ｉｉ）第一のプライマーであって、該第一のプライマーに３’末端のヌクレオチドのランダム配列、および該ランダムヌクレオチドの５’に一般的配列を含む、第一のプライマー；ならびに
（ｉｉｉ）第二のプライマーであって、該第一のプライマーの一般的配列を含み、そして該第一のプライマーのランダム配列を欠損する、第二のプライマー、
を含む、工程；
（ｂ）該ＤＮＡサンプルを、第一のＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ増幅に供する工程であって、ここで、該第一のプライマーが該ＤＮＡにアニーリングして、該第一のＤＮＡポリメラーゼにＤＮＡ産物を産生させる、工程；ならびに
（ｃ）工程（ｂ）のＤＮＡ産物を、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ増幅に供する工程であって、ここで該第二のプライマーは、該ＤＮＡ産物にアニーリングする、工程、
を包含する、方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、ここで、工程（ｂ）のＤＮＡ増幅は、前記ＤＮＡ産物を変性させる過程；前記第一のプライマーを前記ＤＮＡとアニーリングさせて、ＤＮＡ−プライマーハイブリッドの形成を可能にする過程；および該ＤＮＡ−プライマーハイブリッドをインキュベートして、前記第一のＤＮＡポリメラーゼにＤＮＡ産物を合成させる過程を包含する、方法。
【請求項３】
前記ＤＮＡ増幅工程が、少なくとも１回繰り返される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
請求項１に記載の方法であって、ここで、工程（ｃ）のＤＮＡ増幅は、前記ＤＮＡ産物を変性させる過程；前記第二のプライマーを前記ＤＮＡ産物とアニーリングさせて、ＤＮＡ−プライマーハイブリッドの形成を可能にする過程；および該ＤＮＡ−プライマーハイブリッドをインキュベートして、前記熱安定性ＤＮＡポリメラーゼに第二のＤＮＡ産物を合成させる過程を含む、方法。
【請求項５】
前記第二のＤＮＡ産物が、一般的配列および該一般的配列の逆相補体に隣接する、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記アニーリングの温度が、前記第一のプライマーのヌクレオチドのランダム配列の最適なアニーリング温度より高い、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記ＤＮＡ増幅工程が、約３０回〜約４０回繰り返される、請求項４に記載の方法。
【請求項８】
前記第一のＤＮＡポリメラーゼが５’から３’へのエキソヌクレアーゼ活性を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記第一のＤＮＡポリメラーゼが、プライマー置換活性を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記熱安定性ＤＮＡポリメラーゼが、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼである、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記第一のＤＮＡポリメラーゼおよび前記熱安定性ＤＮＡポリメラーゼが、同じＤＮＡポリメラーゼである、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記第一のプライマーが、その３’末端に約４〜約８のランダムヌクレオチドを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記第一のプライマーの前記一般的配列が、約１５ヌクレオチド長〜約２８ヌクレオチド長である、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記第一のプライマーの前記ランダム配列が、Ｇ：Ｃリッチである、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記第一のプライマーの前記ランダム配列が、Ａ：Ｔリッチである、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記第一のプライマーの前記一般的配列が、単一または複数の制限酵素認識部位を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
請求項１に記載の方法であって、ここで前記ＤＮＡサンプルが、ゲノムＤＮＡ、顕微切断された染色体ＤＮＡ、酵母人口染色体（ＹＡＣ）ＤＮＡ、コスミドＤＮＡ、ファージＤＮＡ、Ｐ１由来人口染色体（ＰＡＣ）ＤＮＡ、および細菌人口染色体（ＢＡＣ）ＤＮＡからなる群より選択される、方法。
【請求項１８】
前記ＤＮＡサンプルが、哺乳動物ＤＮＡ、植物ＤＮＡ、酵母ＤＮＡ、ウイルスＤＮＡ、および原核生物ＤＮＡからなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記ＤＮＡサンプルが、ヒト、ウシ、ブタ、ヒツジ、ウマ、げっ歯類、トリ、魚、エビ、植物、酵母、ウイルス、または細菌から得られる、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
前記ＤＮＡサンプルが、ウシＤＮＡである、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
前記ＤＮＡサンプルが、固体媒体上の組織である、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
前記ＤＮＡサンプルが、口腔スワブ、鼻腔スワブ、血液、臍帯血、羊水、胚組織、毛髪、内皮細胞、蹄クリッピング、また爪クリッピングから得られる、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
前記増幅されたＤＮＡ産物の遺伝子型分析をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
前記増幅されたＤＮＡ産物における一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）を同定する工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
請求項２４に記載の方法であって、ここで、前記ＳＮＰが、オリゴヌクレオチド連結１アッセイ（ＯＬＡ）、二重コードＯＬＡ、配列決定、単一塩基伸長アッセイ、対立遺伝子特異的プライマー伸長、またはミスマッチハイブリダイゼーションにより同定される、方法。
【請求項２６】
ＤＮＡを増幅する方法であって、該方法は以下の工程：
（ａ）単一の反応混合物を提供する工程であって、該反応混合物は、以下：
（ｉ）ＤＮＡサンプル；
（ｉｉ）第一のプライマーであって、該第一のプライマーの３’末端にヌクレオチドのランダム配列、および該ランダムヌクレオチドの５’に一般的配列を含む第一のプライマー；
（ｉｉｉ）第二のプライマーであって、該第一のプライマーの一般的配列を含み、そして該第一のプライマーのランダム配列を欠損する、第二のプライマー；および
（ｉｖ）熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ、
を含む、工程；
（ｂ）該ＤＮＡサンプルを、ＤＮＡ増幅に供する工程であって、ここで、該第一のプライマーが該ＤＮＡにアニーリングして、該熱安定性ＤＮＡポリメラーゼにＤＮＡ産物を産生させる、工程；ならびに
（ｃ）工程（ｂ）のＤＮＡ産物を、ＤＮＡ増幅に供する工程であって、ここで該第二のプライマーは、該ＤＮＡ産物にアニーリングする、工程、
を包含する、方法。
【請求項２７】
前記熱安定性ＤＮＡポリメラーゼが、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼである、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
請求項２６に記載の方法であって、ここで、工程（ｂ）のＤＮＡ増幅は、前記ＤＮＡ産物を変性させる過程；前記第一のプライマーを前記ＤＮＡとアニーリングさせて、ＤＮＡ−プライマーハイブリッドの形成を可能にする過程；および該ＤＮＡ−プライマーハイブリッドをインキュベートして、前記熱安定性ポリメラーゼにＤＮＡ産物の合成をさせる過程を包含する、方法。
【請求項２９】
前記ＤＮＡ増幅工程が、少なくとも１回繰り返される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
請求項２６に記載の方法であって、ここで、工程（ｃ）のＤＮＡ増幅は、前記ＤＮＡ産物を変性させる過程；前記第二のプライマーを該ＤＮＡ産物とアニーリングさせて、ＤＮＡ−プライマーハイブリッドの形成を可能にする過程；および該ＤＮＡ−プライマーハイブリッドをインキュベートして、前記熱安定性ＤＮＡポリメラーゼに第二のＤＮＡ産物の合成をさせる過程を含む、方法。
【請求項３１】
前記アニーリングの温度が、前記第一のプライマーのヌクレオチドの前記ランダム配列の最適なアニーリング温度より高い、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
多型を増幅する方法であって、該方法は以下の工程：
（ａ）単一の反応混合物を提供する工程であって、該反応混合物は、以下：
（ｉ）ＤＮＡサンプル；
（ｉｉ）第一のプライマーであって、該第一のプライマーの３’末端にヌクレオチドのランダム配列、および該ランダムヌクレオチドの５’に一般的配列を含む、第一のプライマー；および
（ｉｉｉ）第二のプライマーであって、該第一のプライマーの一般的配列を含み、そして該第一のプライマーのランダム配列を欠損する、第二のプライマー、
を含む、工程；
（ｂ）該ＤＮＡサンプルを、第一のＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ増幅に供する工程であって、ここで、該第一のプライマーが該ＤＮＡにアニーリングして、該第一のＤＮＡポリメラーゼにＤＮＡ産物を産生させる、工程；
（ｃ）工程（ｂ）のＤＮＡ産物を、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ増幅に供する工程であって、ここで該第二のプライマーは、該ＤＮＡ産物にアニーリングして、該熱安定性ＤＮＡポリメラーゼに、増幅されたＤＮＡ産物を産生させる、工程；ならびに
（ｄ）工程（ｃ）の増幅されたＤＮＡ産物を分析して、多型を同定する工程、
を包含する、方法。
【請求項３３】
前記多型が、一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
請求項３３に記載の方法であって、ここで、前記ＳＮＰが、オリゴヌクレオチド連結１アッセイ（ＯＬＡ）、二重コードＯＬＡ、配列決定、単一塩基伸長アッセイ、対立遺伝子特異的プライマー伸長、またはミスマッチハイブリダイゼーションにより同定される、方法。
【請求項３５】
ＤＮＡを増幅する方法であって、該方法は以下の工程：
（ａ）反応混合物を提供する工程であって、該反応混合物は、以下：
（ｉ）増幅されるＤＮＡサンプル；
（ｉｉ）第一のプライマーであって、該第一のプライマーの３’末端にヌクレオチドのランダム配列、および該ランダムヌクレオチドの５’に一般的配列を含む、第一のプライマー；ならびに
（ｉｉｉ）第二のプライマーであって、該第一のプライマーの一般的配列を含み、そして該第一のプライマーのランダム配列を欠損する、第二のプライマー、
を含む、工程；
（ｂ）該反応混合物を、該増幅されるＤＮＡが変性する温度まで加熱する工程；
（ｃ）該反応混合物を、該第一のプライマーの該ランダム配列を、該ランダム配列の相補的ＤＮＡにハイブリダイズさせる温度まで冷却し、そして該反応混合物をインキュベートしてＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ産物の合成を可能にする工程；
（ｄ）工程（ｂ）および工程（ｃ）を少なくとも１回繰り返す工程；ならびに
（ｅ）一連のＤＮＡ増幅反応を実施する工程であって、ここで、アニーリング工程が、該ＤＮＡ産物中の相補的ＤＮＡにハイブリダイズする該第一のプライマーのランダム配列よりも、該ＤＮＡ産物中の相補的ＤＮＡにハイブリダイズする該第二のプライマーの一般的配列を選択する温度である、工程
を包含する、方法。
【請求項３６】
固体媒体上のＤＮＡサンプルを増幅するための方法であって、該方法は、改良点として、該固体媒体上のＤＮＡサンプルを沈殿させる工程、および該沈殿したＤＮＡをＤＮＡ増幅に供して増幅したＤＮＡ産物を産生する工程、を包含する、方法。
【請求項３７】
前記固体媒体が、ろ紙である、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記ろ紙が、化学処理されている、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記ＤＮＡサンプルが、前記ろ紙上で脱水される、請求項３７に記載の方法。
【請求項４０】
前記ＤＮＡサンプルが、塩およびアルコールを用いて沈殿され、そしてアルコールを用いてリンスされる、請求項３６に記載の方法。
【請求項４１】
請求項４０に記載の方法であって、ここで、前記塩が、酢酸ナトリウム、酢酸カリウム、酢酸アンモニウム、塩化ナトリウム、および塩化カリウムからなる群より選択される、方法。
【請求項４２】
前記アルコールがエタノールまたはイソプロパノールである、請求項４０に記載の方法。
【請求項４３】
多型を同定する方法であって、該方法は以下の工程：
（ａ）固体媒体上のＤＮＡサンプルを沈殿させる工程；
（ｂ）単一の反応混合物を提供する工程であって、該反応混合物は、以下：
（ｉ）ＤＮＡサンプル；
（ｉｉ）第一のプライマーであって、該第一のプライマーの３’末端にヌクレオチドのランダム配列、および該ランダムヌクレオチドの５’に一般的配列を含む、第一のプライマー；および
（ｉｉｉ）第二のプライマーであって、該第一のプライマーの一般的配列を含み、そして該第一のプライマーのランダム配列を欠損する、第二のプライマー、
を含む、工程；
（ｃ）該ＤＮＡサンプルを、第一のＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ増幅に供する工程であって、ここで、該第一のプライマーが該ＤＮＡにアニーリングして、該第一のＤＮＡポリメラーゼにＤＮＡ産物を産生させる、工程；
（ｄ）工程（ｃ）のＤＮＡ産物を、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ増幅に供する工程であって、ここで該第二のプライマーは、該ＤＮＡ産物にアニーリングして、該熱安定性ＤＮＡポリメラーゼに、第二のＤＮＡ産物を産生させる、工程；ならびに
（ｅ）第二のＤＮＡ産物を分析して、多型を同定する工程、
を包含する、方法。
【請求項４４】
前記ＤＮＡサンプルが、塩およびアルコールを用いて沈殿され、そしてアルコールを用いてリンスされる、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
ＤＮＡを増幅する方法であって、該方法は、以下の工程：
（ａ）反応混合物を提供する工程であって、該反応混合物は、以下：
（ｉ）ＤＮＡサンプル；
（ｉｉ）第一のプライマーであって、該第一のプライマーの３’末端にヌクレオチドのランダム配列、および該ランダムヌクレオチドの５’に一般的配列を含む、第一のプライマー；ならびに
（ｉｉｉ）第二のプライマーであって、該第一のプライマーの一般的配列を含み、そして該第一のプライマーのランダム配列を欠損する、第二のプライマー、
を含む、工程；
（ｂ）該ＤＮＡサンプルを、第一のＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ増幅に供する工程であって、ここで、該第一のプライマーが該ＤＮＡにアニーリングして、該第一のＤＮＡポリメラーゼにＤＮＡ産物を産生させる、工程；ならびに
（ｃ）工程（ｂ）のＤＮＡ産物を、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ増幅に供する工程であって、ここで該第二のプライマーは、該ＤＮＡ産物にアニーリングする、工程、
を包含する、方法。
【請求項４６】
ＤＮＡを増幅する方法であって、該方法は、以下の工程：
（ａ）反応混合物を提供する工程であって、該反応混合物は、以下：
（ｉ）ＤＮＡサンプル；
（ｉｉ）第一のプライマーであって、該第一のプライマーの３’末端にヌクレオチドのランダム配列、および該ランダムヌクレオチドの５’に一般的配列を含む、第一のプライマー；
（ｉｉｉ）第二のプライマーであって、該第一のプライマーの一般的配列を含み、そして該第一のプライマーのランダム配列を欠損する、第二のプライマー；および
（ｉｖ）熱安定性ポリメラーゼ、
を含む、工程
（ｂ）該ＤＮＡサンプルを、ＤＮＡ増幅に供する工程であって、ここで、該第一のプライマーが該ＤＮＡにアニーリングして、該熱安定性ＤＮＡポリメラーゼにＤＮＡ産物を産生させる、工程；ならびに
（ｃ）工程（ｂ）のＤＮＡ産物を、ＤＮＡ増幅に供する工程であって、ここで該第二のプライマーは、該ＤＮＡ産物にアニーリングする、工程、
を包含する、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（政府支援の研究開発の記載）
適用なし
（「Ｍｉｃｒｏｆｉｃｈｅ  Ａｐｐｅｎｄｉｘ」に対する参照）
適用なし
（発明の背景）
（１.発明の分野）
本開示は、一般的に、ＤＮＡ増幅の分野に関し、より詳細には、配列依存的な様式での、ＤＮＡの任意のストレッチの増幅の分野に関する。
【背景技術】
【０００２】
（２．関連分野の説明）
以下の説明は、本開示の理解において有用であり得る情報を含む。本明細書中に提供される任意の情報が、本願発明に対する先行技術であるとも、関連するとも認められず、詳細もしくは示唆的に参照されるいずれの文献も、先行技術であると認められない。
【０００３】
遺伝的バリエーションと表現型の出現との間には、しばしば関連があることが周知である。遺伝的バリエーションとそれらに関連する表現型は、ゲノムＤＮＡの表現型を決定する種々の方法を用いて研究されている。一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）とは、異なる個体のゲノムにおける特定の位置での１つのヌクレオチドのバリエーションである。ＳＮＰは、遺伝子中に頻繁に見出される安定な遺伝的バリエーションであり、そして生物中に見出される広範な表現型のバリエーションに寄与する。ＳＮＰ遺伝子型決定は、染色体の詳細な遺伝子マップおよび物理的マップの開発に有用である。個体の異なる染色体にわたり稠密に分配されたＳＮＰマーカーの遺伝子型決定は、染色体遺伝子座と表現型発現と間の統計的に有意な関連を明らかにすることを補助し得る。しかし、広範な遺伝子型決定は、大量の遺伝物質を、獲得、運送、保存、および分類するための単純かつ迅速な方法を必要とするだけでなく、これらのサンプルから大量のＤＮＡを抽出するための簡便で高スループットの方法を必要とする。
【０００４】
組織サンプルおよび／または血液サンプルを獲得および保存するための種々の利用可能な方法が存在する。これらの代替の方法は、組織サンプルおよび血液サンプルが、遺伝子型分析のためのサンプルからゲノムＤＮＡの回収に適する形態で保存され、そして輸送されることを可能にする。ＤＮＡサンプルは、種々の固体媒体（Ｗｈａｔｍａｎｎ（登録商標）紙、Ｇｕｔｈｒｉｅカード、チューブ、スワブ、ろ紙、スライド、または他の容器を含む）上で収集および保存され得る。例えば、全血液がろ紙上に収集される場合、それは、室温で乾燥および蓄積され得る。
【０００５】
ＤＮＡを固定および保存するための１つの公知かつより頻繁に使用される方法は、米国特許第５，４９６，５６２号に記載されている。本方法は、ゲノムＤＮＡの分解を防ぐ、ＦＴＡペーパーと呼ばれる化学処理したろ紙（Ｗｈａｔｍａｎ（登録商標）によりＦＴＡＴＭペーパーとして市販されている）上で乾燥した動物の血液サンプルを保存する工程を包含する。ＦＴＡペーパーは、軽量かつ保存が容易であり、このことにより、それは、遺伝物質および遺伝子サンプルを収集するための一般的な選択肢である。ＦＴＡペーパー上のサンプルは、室温で、簡便に保存および輸送される。
【０００６】
ＤＮＡを含む血液および他の組織を保存するための当業者に利用可能な全ての物質は、制限を有する。例えば、収集される組織または血液の量が、非常に制限されており、このことは、大規模および高スループットの遺伝子型決定を実行不可能および高価にする。例えば、ＦＴＡペーパーの広範な有用性にも関わらず、保存された血痕がほんの少量のゲノムＤＮＡを含むことに起因して、その有用性は限定される。６．０ｃｍ２のＦＴＡペーパー片は、わずか約１００μｌの血液（約１．０μｇのＤＮＡと等価）を保存する。より大きなＦＴＡペーパー片からゲノムＤＮＡを抽出することは可能であるが、このサイズのペーパーは、小さなウェルである９６ウェルプレートまたは３８４ウェルプレート（これらの両方は、多数のＤＮＡサンプルの高スループットのスクリーニングのための重要なツールである）における操作を困難にする。従って、ＦＴＡペーパーのようなツールの有用性は、低容量の遺伝子型決定に制限されてきた。
【０００７】
ＦＴＡペーパー上に保存された限定された量のＤＮＡはまた、単一の生物における複数の多型および遺伝子座の遺伝子型決定を実施不可能にする。ＦＴＡペーパーのサンプルは、複数のＳＮＰを遺伝子型決定するためにより小さい小片に切断され得る；直径１．０ｍｍ２〜２．０ｍｍ２の小円のサンプルは、約１ｎｇ〜５ｎｇのゲノムＤＮＡを含み、この量は、１回のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に十分である。しかし、このアプローチは、ＦＴＡペーパーの繰り返しの切断、分類および抽出を必要とし、このことは、単調で退屈であるだけでなく、ヒューマンエラーを引き起こすので、このアプローチは望ましくない。数百または数千のＳＮＰの遺伝子スキャンのために、ＦＴＡペーパー上に保存されたＤＮＡサンプルを切断および分析する仕事は、調査者にとって克服できない壁である。
【０００８】
さらに、ＤＮＡとＦＴＡペーパーとの間の強力な粘着が、分析のためのＤＮＡの抽出を困難にする。プロテイナーゼＫ消化およびエンドヌクレアーゼ消化は、製造者により示唆されるように、ＤＮＡの放出を容易にするが、このアプローチは、高スループットの操作のためには、非常に複雑かつ高価である。市販のＦＴＡ精製試薬（ＰＣＲＴＭによる分析のためにＦＴＡペーパー上に保存されたＤＮＡを調製するために用いられ得る）は、一貫した結果をもたらさない。例えば、ＤＮＡサンプルが、この試薬を用いて処理された後、しばしば不特定のＤＮＡ増幅が達成される。このことは、高スループットの操作において受け入れがたい。製造者はまた、ＦＴＡペーパーへのＤＮＡの強力な粘着がＦＴＡペーパー上に保存されたＤＮＡの繰り返しの遺伝子型決定を可能にすることを示唆する。「リサイクルされた」ＦＴＡペーパーについてのＰＣＲ効率が完全に試験されていないという事実にも関わらず、連続的なＳＮＰ  ＰＣＲの間での小さいＦＴＡペーパーの洗浄は、高スループットのプロセスのためには非実用的である。浮遊するろ紙の小片は、従来の吸引により洗浄することは困難であり、そしてそれらは、吸引針またはピペットの先端を詰まらせる傾向がある。さらに、小片は、洗浄プロセスの間に容易に紛失される。最後に、ＰＣＲ産物の繰り返しのピペッティングは、異なるウェルの中での相互汚染の危険に結びつく。
【０００９】
生物由来の血液または組織の少量サンプルに関連する欠点は、全ゲノムＤＮＡ増幅の効率的な方法により克服される。例えば、ＦＴＡペーパー上で保存された少量のＤＮＡサンプルから増幅された全ゲノムＤＮＡが、複数のＰＣＲ反応において用いられて、高スループットのスクリーニングプロセスにおいて、単一の生物において見出される種々の多型（例えば、ＳＮＰ）を広範に遺伝子型決定し得る。それにも関わらず、過去において、全ゲノム増幅のための多くの方法が提案され、かつ種々の適用において好首尾に用いられているが、これらの方法は、一般的に、非効率的で、複雑で、かつ高価である。従って、血液または組織の少量のサンプルからのゲノムＤＮＡを増幅する、単純かつ費用に対する効果の高い方法に対する必要性が存在する。
【００１０】
ＤＮＡを増幅するための第一の方法の１つは、顕微切断した染色体に適用されるリンカーアダプター媒介ＰＣＲ（ＬＡＭ−ＰＣＲ）アプローチ（Ｚｈｏｕら、Ｂｉｏ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ２８：７６６−７７４，２０００；Ａｌｂａｎｉら、Ｐｌａｎｔ  Ｊ  ４（５）：８９９−９０３，Ｎｏｖ  １９９３）、酵母人工染色体（ＹＡＣ）ＤＮＡ（Ｓｕｔｃｌｉｆｆｅら、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  １３（４）：１３０３−６，１９９２）およびゲノムＤＮＡ（Ｋｉｎｚｌｅｒら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ２５：１７（１０）：３６４５−５３，Ｍａｙ  １９８９）である。このアプローチにおいて、開始ＤＮＡは、最初に制限酵素（通常４つの塩基の認識配列を有する酵素）で消化される。制限酵素の不活化後、既知の配列（アダプターまたは合成リンカーのいずれか）が、制限酵素消化によって生成されたＤＮＡフラグメントの末端に連結され、ＰＣＲ増幅のためのプライマー結合部位を提供する。次いで、このＤＮＡは、アダプターまたはリンカーの配列に相補的であるプライマーを使用するＰＣＲによって増幅され得る。
【００１１】
残念にも、ＬＡＭ−ＰＣＲの有用性は制限される。なぜなら、これは、ＤＮＡフラグメント化、アダプター連結またはリンカー連結、およびＰＣＲ増幅を含む、多段階工程を含むからである。これらの工程は、このプロセスをハイスループット遺伝子型決定のためには面倒かつ高価にする。この方法のさらなる欠点は、使用される制限酵素の認識配列を適切に区切られた間隔で含まないその配列が、この領域が増幅するには長すぎるので、ＰＣＲによって増幅されないことである。この方法はまた、特に、少量のＤＮＡ（例えば、顕微切断した染色体片、または血痕もしくは組織の小サンプルに見出されるＤＮＡ）に適用される場合、フラグメントの両端に既知の配列を結合するために必要な、広範なＤＮＡ操作のために時間を浪費しかつ煩わしい。
【００１２】
ゲノムＤＮＡを増幅するために利用可能な別のより限定的な方法は、インター（ｉｎｔｅｒ）−ＡＬＵ  ＰＣＲ（相互反復（ｉｎｔｅｒ−ｒｅｐｅｔｉｔｉｖｅ）エレメントＰＣＲとしてより一般に知られる）を使用し、これは、適切に区切られかつ方向付けられたＡＵＣ反復エレメントまたは他の反復配列の存在に依存する。しかし、低頻度のこれらの反復配列に起因して、より低い複雑性のＤＮＡ供給源（例えば、ＹＡＣ、コスミドまたはファージ）を用いると、相反する結果が得られる。反復配列がゲノムを通して均等に生じないので、他の相反性が生じ、よって必要な反復配列が稀であるかまたは存在しない領域に生じる目的の配列が、増幅されない。この方法の別の主要な制限は、この方法が種特異的であることである。例えば、この方法の使用は、反復エレメントが誘導される種のＤＮＡおよびＰＣＲプライマーが構築された種のＤＮＡに制限される。
【００１３】
縮重オリゴヌクレオチドプライムＰＣＲ（ＤＯＰ−ＰＣＲ）と称される方法は、部分的に縮重された配列（２１個中６個）および反復熱サイクリング（Ｔｅｌｅｎｉｕｓら、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  １３（３）：７１８−２５，１９９２）を利用する。ＤＯＰ−ＰＣＲ法において、第一ラウンドのＰＣＲ増幅は、約３０℃の低いプライマーアニーリング温度を有する。使用したプライマーは、規定されたヘキサマーが３’側に隣接しかつ規定された配列が５’側に隣接するランダムヘキサマーから構成される。このプライマーの３’末端は規定されたヘキサマーを有するので、標的配列は、増幅されるためにこのヘキサマーに一致しなければならない。よって、この方法によって増幅される配列の数は制限される。ＤＯＰ−ＰＣＲ法の欠点は、制限された複雑性のＤＮＡ供給源（例えば、ＹＡＣ、コスミドまたはファージ挿入物）に適用される場合にさらに実証される。生じた産物は、エチジウムブロミド染色したアガロースゲル上で（ランダムに増幅されたＤＮＡを用いて生じるような）スメアではなくむしろ明瞭なバンドであり、このことは、ハイブリダイゼーションが比較的少ない部位で生じ、よって配列非依存的な増幅が得られない、ということを示す。
【００１４】
ゲノムＤＮＡを増幅する別の試みは、プライマー伸長前増幅（ｐｒｅａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）（ＰＥＰ）（Ｚｈａｎｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：５８４７−５８５１，１９９２）であった。このＰＥＰ法は、１５塩基対（ｂｐ）のランダムオリゴヌクレオチドおよび反復熱サイクリングを利用して、ＰＣＲのためのゲノムＤＮＡ中の複数の部位をランダムにプライムする。６塩基対（ｂｐ）のランダムオリゴヌクレオチドおよびＰＣＲを利用する方法がまた、報告されている（Ｐｅｎｇら、Ｃｌｉｎ．Ｐａｔｈｏｌ  ４７：６０５−６０８，１９９４）。ＰＥＰおよびＤＯＰ−ＰＣＲの両方が、いくつかの特定の用途において使用されるが、これらは、比較的低い増幅効率よって一貫して妨害される（Ｗｅｌｌｓら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ２７：１２１４−１２１８，１９９９）。この低効率に対する可能な説明は、プライマーがランダムヌクレオチドを含みよって異なるオリゴヌクレオチドの大きなスペクトルを形成するので、任意の特異的プライマーの効果的な濃度が非常に低いということである（これは、ＰＣＲの指数的増幅を制限し得る）。さらに、ランダムオリゴヌクレオチドの非特異的結合は、前のラウンドのＰＣＲ産物内にＤＮＡ合成を開始する傾向がある。よって、ＰＣＲ産物のサイズは、さらなるラウンドのＰＣＲ増幅の各々によって絶えず減少し、これは、特に、大多数のＰＣＲサイクルが行われる場合、ＰＣＲ最終産物を非常に小さくする。これらの小さなＰＣＲ産物は、引き続くＤＮＡの遺伝子分析または遺伝子型決定分析のための、増幅されたＤＮＡの大片として有用ではない。
【００１５】
タグ化ランダムＰＣＲと呼ばれるゲノムＤＮＡ増幅の別の方法が、Ｇｒｏｔｈｕｅｓら（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ２１：１３２１−１３２２，１９９３）およびＷｏｎｇら（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ２４：３７７８−８３，１９９６）によって記載された。この方法は、ランダムプライミングおよびＰＣＲ増幅を２工程に分離しそしてゲノムＤＮＡ全体を単一のＰＣＲプライマーを用いて増幅することによって、ＰＥＰおよびＤＯＰ−ＰＣＲに関連する欠点を克服することを試みる。第一の増幅工程において、６ｂｐまたは９〜１５ｂｐのランダムな３’テールおよび１７〜２２ｂｐの一定な５’ヘッドから構成されるタグ化ランダムプライマーが、ゲノムＤＮＡを無差別にプライムする。次に、組み込まれなかったタグ化プライマーが、Ｂｉｏｇｅｌ  Ｐ１００スピンカラムまたはＣｅｎｔｒｉｃｏｎ−１００スピンカラムを使用するゲル濾過によって除去される。第二の増幅工程において、５’の一定なヘッドおよびその逆相補体を両端に備えたＤＮＡ分子が、ＰＣＲによって増幅される。このスキームは、ゲノムＤＮＡ全体を増幅し得るが、反応および精製のその複数工程は、ハイスループットスクリーニングにはかなり複雑かつ高価である。
【００１６】
顕微切断した染色体バンドからのライブラリーの構築は、特に目的とするゲノム領域からＤＮＡプローブを得るための鮮やかな方法である。このアプローチの適合可能性は、時間の浪費および顕微切断した材料からのＤＮＡを増幅する技術的に困難なプロセスによって制限されてきた。伝統的には、２０〜３０個の顕微切断した染色体バンドからのＤＮＡを、小滴中に回収する。次いで、ＤＮＡを、ＰＣＲ増幅に使用する前に種々の操作に供する。これらの操作としては、フェノール／クロロホルム抽出、制限酵素消化およびベクターまたはリンカーへの連結（ＬＡＭ−ＰＣＲ）が挙げられる。これらの工程は、この技術の有用性を厳密に制限する特殊化された装置を備えた顕微鏡のステージ上で非常に少量で行われなければならない（Ｋａｏら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １：８８（５）：１９８４−８，１９９１）。
【００１７】
酵母人工染色体（ＹＡＣ）は、ＤＮＡの大きな広がりを詳細にマッピングするために理想的なベクターである。ＹＡＣクローニング系の主要な不利益の１つは、ＹＡＣ  ＤＮＡを多量に精製するために利用可能な方法が存在しなかったことである。高分子量ＤＮＡは、酵母クローンを保有するＹＡＣから調製され得、そしてこのＹＡＣは、パルスフィールドゲルで単離され得る。しかし、このアプローチは、非常に少量の精製ＹＡＣ  ＤＮＡのみを得る。これは、主要な不利益である。なぜなら、これらの大きな挿入物の多くの重要な用途（例えば、ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング、またはインサイチュハイブリダイゼーションにおける蛍光（ＦＩＳＨ）分析）は、多量の精製ＹＡＣ  ＤＮＡを必要とする。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１８】
従って、ハイスループットスクリーニングに適合可能であり、配列非依存的であり、任意の型のＤＮＡに適合可能であり、任意の種からのＤＮＡの増幅に有用であり、そして最も重要なことに、かなり制限された量のＤＮＡを増幅し得る、ＤＮＡサンプルを増幅するためのより効果的で安価な方法についての必要性が存在する。また、単純であり（ＰＣＲ汚染問題を回避するため）、遺伝物質を再生する高忠実度を有し、そして低率の増幅配列の歪みを有する、増幅プロセスについての必要性が存在する。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
（発明の簡単な説明）
本開示は、ＤＮＡを増幅するための単純かつ直接的な方法を提供することによって、他のＤＮＡ増幅法に固有の欠点を克服しようと努める。本開示の方法は、好ましくは、単一の反応混合物および単一のプログラム可能な熱サイクリング反応を使用する配列非依存的様式でＤＮＡを増幅する。本方法を使用して、微量のＤＮＡ（小組織または血液サンプル（例えば、鋭利な針での吸引物または単一の組織切片）からのゲノムＤＮＡまたはまさに単一細胞からのゲノムＤＮＡを含む）を増幅し得る。本方法において使用される単一の反応混合物はまた、サンプルの汚染の危険性を非常に低減し、ハイスループットスクリーニングを容易にし、そして好ましい実施形態において、この単一の反応混合物中の全てのＤＮＡを増幅するために単一の熱安定ＤＮＡポリメラーゼが含まれる。本方法は、任意の種または生物由来のＤＮＡを増幅し得る。本開示が任意の供給源（ヒトＤＮＡ、動物ＤＮＡ、植物ＤＮＡ、酵母ＤＮＡ、ウイルスＤＮＡ、真核生物ＤＮＡおよび原核生物ＤＮＡが挙げられるが、これらに限定されない）からのＤＮＡの配列非依存的増幅を含むことが、理解される。
【００２０】
本開示はまた、固体媒体上でＤＮＡサンプルを処理するための改善された方法を提供する。遺伝子分析またはＤＮＡ増幅のための固体媒体上で保管されたＤＮＡサンプルを調製する他の既知の方法は、不十分でありかつ相反するので、ＤＮＡサンプルから得られる情報の有用性を制限する。本開示の方法は、ＤＮＡサンプルの調製を非常に単純化しそして引き続く分析のためのＤＮＡを改善することによって、これらの他の方法において固有の欠点を克服しようと努める。本開示の方法は、当業者に周知の方法を使用して固体媒体上にＤＮＡサンプルを沈殿させる。好ましい実施形態において、ＤＮＡサンプルは、固体媒体上の血痕である。本開示の方法に従って処理されたＤＮＡは、引き続いて本開示の方法および／または遺伝子分析を使用するＤＮＡ増幅に供され得る。本開示の沈殿方法は、より一定な結果を精製し、ハイスループット操作のコストを減らし、そしてＤＮＡサンプルから増幅したＤＮＡの質を改善する。
【００２１】
本開示は、ＤＮＡサンプルからＤＮＡを増幅する方法を含む。好ましい実施形態において、ＤＮＡを増幅する方法は、以下を含む反応混合物を使用する：ＤＮＡサンプル；３’末端にランダムなヌクレオチド配列およびそのランダムヌクレオチドの５’に一般的配列を有する第一のプライマー；ならびに、この第一のプライマーの一般的配列を有するがこの第一のプライマーのランダム配列を欠く第二のプライマー。好ましい実施形態において、単一の反応混合物が使用される。第一のプライマーの例は、配列番号１に示される配列であり；第二のプライマーの例は、配列番号２に示される配列である。好ましくは、反応混合物は、ＤＮＡ増幅に必要な他の成分を含み、この成分は、当業者に周知である。
【００２２】
反応混合物中のＤＮＡサンプルは、第一のＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ増幅に供され、ここで、この第一のプライマーは、ＤＮＡにアニーリングして、第一のＤＮＡポリメラーゼがこの第一のプライマーの３’末端から相補的ＤＮＡ鎖を合成してＤＮＡ産物を生成することを可能にする。第一のＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ増幅のための工程は、以下である：ＤＮＡ産物を変性する工程；第一のプライマーをこのＤＮＡにアニーリングさせてＤＮＡ−プライマーハイブリッドの形成を可能にする工程；および、このＤＮＡ−プライマーハイブリッドをインキュベートして、この第一のＤＮＡポリメラーゼがこのプライマーを伸長しかつＤＮＡ産物を合成することを可能にする工程。好ましくは、これらのＤＮＡ増幅工程が、少なくとも１回反復される。好ましい実施形態において、アニーリング温度およびインキュベーション温度は同一である。別の好ましい実施形態において、ＤＮＡ増幅によって生成されたＤＮＡ産物は、一般的配列およびこの一般的配列の逆相補体に隣接する。
【００２３】
次いで、このＤＮＡ産物は、熱安定ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ増幅に供される。ここで、第二のプライマーは、ＤＮＡ産物にアニーリングして、この熱安定ＤＮＡポリメラーゼがこの第二のプライマーの３’末端から相補的ＤＮＡ鎖を合成して第二のＤＮＡ産物を生成する。熱安定ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ増幅のための工程は、以下である：ＤＮＡ産物を変性する工程；第二のプライマーをこのＤＮＡ産物とアニーリングさせてＤＮＡ−プライマーハイブリッドの形成を可能にする工程；および、このＤＮＡ−プライマーハイブリッドをインキュベートして、この熱安定ＤＮＡポリメラーゼが第二のＤＮＡ産物を合成することを可能にする工程。好ましくは、これらのＤＮＡ増幅工程が、約３０〜約３５回反復され、より好ましくは、約４０回反復される。好ましい実施形態において、第二のＤＮＡ産物は、一般的配列およびこの一般的配列の逆相補体に隣接する。別の好ましい実施形態において、アニーリング温度は、第一のプライマーの３’末端でのランダムなヌクレオチド配列の最適アニーリング温度より高い。
【００２４】
好ましい実施形態において、第一のＤＮＡポリメラーゼは、５’から３’へのエキソヌクレアーゼ活性またはプライマー置換活性を有する。この第一のＤＮＡポリメラーゼは、好ましくは、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡポリメラーゼＩであり、熱安定ＤＮＡポリメラーゼは、好ましくは、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼである。別の好ましい実施形態において、第一のＤＮＡポリメラーゼおよび熱安定ＤＮＡポリメラーゼは同一のＤＮＡポリメラーゼであり、このＤＮＡポリメラーゼは、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼである。
【００２５】
別の好ましい実施形態において、第一のプライマーは、約４個〜約８個のランダムなヌクレオチドをその３’末端で有する。より好ましい実施形態において、第一のプライマーは、約６個のランダムなヌクレオチドをその３’末端で有する。好ましくは、第一のプライマーの一般的配列は、約１５〜約２８ヌクレオチド長であり、より好ましくは、約２０〜約２５ヌクレオチド長である。第一のプライマーのランダムヌクレオチドはまた、Ｇ：ＣリッチであるかまたはＡ：Ｔリッチであり得、好ましくは、このＤＮＡサンプルの特定の領域を増幅する。最終的に、第一のプライマーの一般的配列は、好ましくは、単一または複数の制限酵素認識部位を有し、これは、増幅したＤＮＡ産物のサブクローニングを容易にする。
【００２６】
好ましい実施形態において、ＤＮＡサンプルは、ゲノムＤＮＡ、顕微切断した染色体ＤＮＡ、酵母人工染色体（ＹＡＣ）ＤＮＡ、コスミドＤＮＡ、ファージＤＮＡ、Ｐ１由来人工染色体（ＰＡＣ）ＤＮＡ、または細菌人工染色体（ＢＡＣ）ＤＮＡである。別の好ましい実施形態において、ＤＮＡサンプルは、哺乳動物ＤＮＡ、植物ＤＮＡ、酵母ＤＮＡ、ウイルスＤＮＡ、または原核生物ＤＮＡである。なお別の好ましい実施形態において、ＤＮＡサンプルは、ヒト、ウシ、ブタ、ヒツジ、ウマ、げっ歯類、トリ、魚、エビ、植物、酵母、ウイルスまたは細菌より得られる。好ましくは、ＤＮＡサンプルは、ゲノムＤＮＡであり、ここでＤＮＡを増幅する方法は、蛍光標識を用いるＤＮＡ標識を含む。別の好ましい実施形態において、ＤＮＡサンプルは、ウシＤＮＡである。好ましくは、ＤＮＡサンプルは、固体媒体上の組織であり、ここで、この組織は血液、好ましくは、血痕の形態である。好ましい実施形態において、固体媒体は、ろ紙であり、ここで、このろ紙は、化学的に処理される（例えば、ＦＴＡＴＭ紙）。好ましい実施形態において、血痕は、哺乳動物由来であり、この哺乳動物は、好ましくは、ヒト、ウシまたはブタである。ＤＮＡサンプルとしては、以下が挙げられるがこれらに限定されない当業者に周知の多くの供給源より得られ得る：口腔スワブ、鼻スワブ、血液、臍帯血、羊水、胎児組織、髪、内皮細胞、蹄クリッピング、または爪クリッピング。
【００２７】
別の好ましい実施形態において、ＤＮＡを増幅する方法は、増幅したＤＮＡ産物のさらなる遺伝子型分析を含む。あるいは、ＤＮＡを増幅する方法は、好ましくは、増幅したＤＮＡ産物中の一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）を同定する工程を包含する。好ましい実施形態において、ＳＮＰを同定するための当業者に周知の多くの方法（以下が挙げられるが、これらに限定されない）によって、ＳＮＰは、生物のＤＮＡ中に同定され得る：ＤＮＡ配列決定、ＰＣＲ産物を増幅しそしてＰＣＲ産物を配列決定すること、オリゴヌクレオチド連結アッセイ（ＯＬＡ）、二重コードＯＬＡ、単一塩基伸長アッセイ、対立遺伝子特異的プライマー伸長、またはミスマッチハイブリダイゼーション。好ましくは、同定されたＳＮＰは、疾患表現型および所望の表現型特性を含む表現型に関連する。本開示のＤＮＡ増幅法を使用することによって生成された増幅ＤＮＡをまた使用して、ＤＮＡライブラリー（以下が挙げられるが、これらに限定されない）を生成し得る：ゲノムＤＮＡライブラリー、顕微切断した染色体ＤＮＡライブラリー、ＢＡＣライブラリー、ＹＡＣライブラリー、ＰＡＣライブラリー、ｃＤＮＡライブラリー、ファージライブラリー、およびコスミドライブラリー。
【００２８】
本開示の別の局面は、以下を含む反応混合物を使用する好ましいＤＮＡ増幅法である：ＤＮＡサンプル；３’末端にランダムなヌクレオチド配列およびそのランダムヌクレオチドの５’に一般的配列を有する第一のプライマー；この第一のプライマーの一般的配列を有するがこの第一のプライマーのランダム配列を欠く第二のプライマー；ならびに、熱安定ＤＮＡポリメラーゼ。好ましい実施形態において、単一の反応混合物が使用される。好ましくは、この反応混合物はまた、ＤＮＡ増幅に必要な他の成分を含み、この成分は、当業者に周知である。好ましい実施形態において、この熱安定ＤＮＡポリメラーゼは、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼであり、ＤＮＡサンプルは、固体媒体上の血痕であり、そしてこのＤＮＡサンプルは、好ましくは、固体媒体上で脱水される。
【００２９】
反応混合物中のＤＮＡサンプルは、ＤＮＡ増幅に供される。ここで、第一のプライマーは、ＤＮＡにアニーリングして、熱安定ＤＮＡポリメラーゼに、この第一のプライマーの３’末端から相補的ＤＮＡ鎖を合成させてＤＮＡ産物を産生させる。熱安定ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ増幅のための工程は、以下である：ＤＮＡ産物を変性する工程；第一のプライマーをこのＤＮＡとアニーリングさせてＤＮＡ−プライマーハイブリッドの形成を可能にする工程；および、このＤＮＡ−プライマーハイブリッドをインキュベートして、この熱安定ＤＮＡポリメラーゼがＤＮＡ産物を合成することを可能にする工程。好ましくは、これらのＤＮＡ増幅工程が、少なくとも１回反復される。好ましい実施形態において、アニーリング温度およびインキュベーション温度は同一である。別の好ましい実施形態において、このＤＮＡ増幅によって生成されるＤＮＡ産物は、一般的配列およびこの一般的配列の逆相補体に隣接する。
【００３０】
次いで、このＤＮＡ産物は、熱安定ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ増幅に供される。ここで、第二のプライマーは、ＤＮＡ産物にアニーリングして、この熱安定ＤＮＡポリメラーゼがこの第二のプライマーの３’末端から相補的ＤＮＡ鎖を合成して第二のＤＮＡ産物を産生する。熱安定ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ増幅のための工程は、以下である：ＤＮＡ産物を変性する工程；第二のプライマーをこのＤＮＡ産物とアニーリングさせてＤＮＡ−プライマーハイブリッドの形成を可能にする工程；および、このＤＮＡ−プライマーハイブリッドをインキュベートして、この熱安定ＤＮＡポリメラーゼに第二のＤＮＡ産物を合成させる工程。好ましくは、これらのＤＮＡ増幅工程が、約３０〜約３５回反復され、より好ましくは、約４０回反復される。好ましい実施形態において、第二のＤＮＡ産物は、一般的配列およびこの一般的配列の逆相補体に隣接する。別の好ましい実施形態において、アニーリング温度は、第一のプライマーの３’末端でのランダムなヌクレオチド配列の最適アニーリング温度より高い。
【００３１】
別の好ましいＤＮＡ増幅法において、以下を含む反応混合物を提供する：ＤＮＡサンプル（ここで、このＤＮＡサンプルは、固体媒体上の組織である）；３’末端にランダムなヌクレオチド配列およびそのランダムヌクレオチドの５’に一般的配列を有する第一のプライマー；この第一のプライマーの一般的配列を有するがこの第一のプライマーのランダム配列を欠く第二のプライマー；ならびに、熱安定ＤＮＡポリメラーゼ。好ましい実施形態において、単一の反応混合物が使用される。好ましい実施形態において、好ましくは、固体媒体上の組織は、血液である。別の好ましい実施形態において、固体媒体は、ろ紙であり、このろ紙は、化学的に処理される。このＤＮＡサンプルは、好ましい実施形態において、ろ紙上で脱水される。好ましくは、反応混合物はまた、ＤＮＡ増幅に必要な他の成分を含み、この成分は、当業者に周知である。好ましくは、この熱安定ＤＮＡポリメラーゼは、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼであり、このＤＮＡサンプルは、固体媒体上の血痕であり、そしてこのＤＮＡサンプルは、好ましくは、固体媒体上で脱水される。
【００３２】
反応混合物中のＤＮＡサンプルは、熱安定ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ増幅に供される。ここで、第一のプライマーは、ＤＮＡにアニーリングして、熱安定ＤＮＡポリメラーゼに、この第一のプライマーの３’末端から相補的ＤＮＡ鎖を合成させてＤＮＡ産物を産生させる。熱安定ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ増幅のための工程は、以下である：ＤＮＡ産物を変性する工程；第一のプライマーをこのＤＮＡとアニーリングさせてＤＮＡ−プライマーハイブリッドの形成を可能にする工程；および、このＤＮＡ−プライマーハイブリッドをインキュベートして、この熱安定ＤＮＡポリメラーゼがＤＮＡ産物を合成することを可能にする工程。好ましくは、これらのＤＮＡ増幅工程が、少なくとも１回反復される。好ましい実施形態において、アニーリング温度およびインキュベーション温度は同一である。別の好ましい実施形態において、このＤＮＡ増幅によって生成されるＤＮＡ産物は、一般的配列およびこの一般的配列の逆相補体に隣接する。
【００３３】
次いで、このＤＮＡ産物は、熱安定ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ増幅に供される。ここで、第二のプライマーは、ＤＮＡ産物にアニーリングして、この熱安定ＤＮＡポリメラーゼがこの第二のプライマーの３’末端から相補的ＤＮＡ鎖を合成して第二のＤＮＡ産物を生成する。熱安定ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ増幅のための工程は、以下である：ＤＮＡ産物を変性する工程；第二のプライマーをこのＤＮＡ産物とアニーリングさせてＤＮＡ−プライマーハイブリッドの形成を可能にする工程；および、このＤＮＡ−プライマーハイブリッドをインキュベートして、この熱安定ＤＮＡポリメラーゼが第二のＤＮＡ産物を合成することを可能にする工程。好ましくは、これらのＤＮＡ増幅工程が、約３０〜約３５回反復され、より好ましくは、約４０回反復される。好ましい実施形態において、第二のＤＮＡ産物は、一般的配列およびこの一般的配列の逆相補体に隣接する。別の好ましい実施形態において、アニーリング温度は、第一のプライマーの３’末端でのランダムなヌクレオチド配列の最適アニーリング温度より高い。
【００３４】
本開示の別の局面は、以下を用いる多型を同定する好ましい方法である：ＤＮＡサンプル；３’末端にランダムなヌクレオチド配列およびそのランダムヌクレオチドの５’に一般的配列を有する第一のプライマー；ならびに、この第一のプライマーの一般的配列を有するがこの第一のプライマーのランダム配列を欠く第二のプライマー。好ましい実施形態において、単一の反応混合物が使用される。好ましくは、この反応混合物はまた、ＤＮＡ増幅に必要な他の成分を含み、この成分は、当業者に周知である。好ましい実施形態において、増幅したＤＮＡ産物は、多型を同定するために分析され、好ましくは、この多型は、一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）である。ＳＮＰを同定する方法は、当業者に周知である。ＳＮＰを同定する好ましい実施形態において、ＳＮＰは、ＤＮＡ配列決定、オリゴヌクレオチド連結アッセイ（ＯＬＡ）、二重コードＯＬＡ、単一塩基伸長アッセイ、対立遺伝子特異的プライマー伸長、またはミスマッチハイブリダイゼーションによって同定される。
【００３５】
反応混合物中のＤＮＡサンプルは、第一のＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ増幅に供される。ここで、第一のプライマーは、ＤＮＡにアニーリングして、この第一のＤＮＡポリメラーゼに、この第一のプライマーの３’末端から相補的ＤＮＡ鎖を合成させてＤＮＡ産物を生成させる。第一のＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ増幅のための工程は、以下である：ＤＮＡ産物を変性する工程；第一のプライマーをこのＤＮＡとアニーリングさせてＤＮＡ−プライマーハイブリッドの形成を可能にする工程；および、このＤＮＡ−プライマーハイブリッドをインキュベートして、この第一のＤＮＡポリメラーゼがＤＮＡ産物を合成することを可能にする工程。好ましくは、これらのＤＮＡ増幅工程が、少なくとも１回反復される。好ましい実施形態において、このＤＮＡ増幅によって生成されるＤＮＡ産物は、一般的配列およびこの一般的配列の逆相補体に隣接する。
【００３６】
次いで、このＤＮＡ産物は、熱安定ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ増幅に供される。ここで、第二のプライマーは、ＤＮＡ産物にアニーリングして、この熱安定ＤＮＡポリメラーゼが増幅ＤＮＡ産物を生成することを可能にする。熱安定ＤＮＡポリメラーゼがＤＮＡ産物にアニーリングした第二のプライマーの３’末端から相補的ＤＮＡ鎖を合成する場合に、この増幅ＤＮＡ産物が生成される。熱安定ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ増幅のための工程は、以下である：ＤＮＡ産物を変性する工程；第二のプライマーをこのＤＮＡ産物とアニーリングさせてＤＮＡ−プライマーハイブリッドの形成を可能にする工程；および、このＤＮＡ−プライマーハイブリッドをインキュベートして、この熱安定ＤＮＡポリメラーゼが増幅ＤＮＡ産物を合成することを可能にする工程。次いで、この増幅ＤＮＡ産物は、好ましくは、多型を同定するために分析される。好ましくは、これらのＤＮＡ増幅工程が、約３０〜約３５回反復され、より好ましくは、約４０回反復される。好ましい実施形態において、この増幅ＤＮＡ産物は、一般的配列およびこの一般的配列の逆相補体に隣接する。別の好ましい実施形態において、アニーリング温度は、第一のプライマーの３’末端でのランダムなヌクレオチド配列の最適アニーリング温度より高い。
【００３７】
本開示の別の局面は、増幅されるべきＤＮＡサンプル；その３’末端にヌクレオチドのランダム配列を有し、そしてそのランダム配列の５’側に一般的配列を有する、第一プライマー；ならびにこの第一プライマーの一般的配列を有し、そしてこの第一プライマーのランダム配列を欠く、第二プライマー、を含む反応混合物を使用する、ＤＮＡを増幅するための好ましい方法である。好ましくは、この反応混合物はまた、当業者に周知のＤＮＡ増幅に必要な他の成分を含む。好ましい実施形態において、このＤＮＡサンプルは、固体媒体上の組織であり、そしてこのＤＮＡサンプルは、好ましくは固体媒体上で脱水されている。
【００３８】
反応混合物中のＤＮＡサンプルは、増幅されるべきＤＮＡを変性させる温度まで加熱され、第一プライマーのランダム配列がその相補的ＤＮＡにハイブリダイズすることを可能にする温度まで冷却され、そしてＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ産物の合成を可能にするようにインキュベーションされる。好ましい実施形態において、このＤＮＡポリメラーゼは、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼである。好ましくは、この反応混合物を加熱、冷却およびインキュベートする工程は、少なくとも１回繰り返される。別の好ましい実施形態において、このＤＮＡ産物は、一般的配列および一般的配列の逆相補体によって隣接される。
【００３９】
一連のＤＮＡ増幅反応は、このＤＮＡ産物を用いて実施され、ここで、このアニーリング工程は、このＤＮＡ産物中の相補的ＤＮＡにハイブリダイズする第一プライマーのランダム配列よりも、このＤＮＡ産物中の相補的ＤＮＡにハイブリダイズする第二プライマーの一般的配列を選択する温度で行われる。好ましくは、このＤＮＡ増幅反応は、第二プライマーの３’末端から相補的なＤＮＡ鎖を合成して、増幅ＤＮＡ産物を生成する、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを含む。熱安定性ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ増幅のための工程は、ＤＮＡ産物を変性させる工程；このＤＮＡ産物に第二のプライマーをアニーリングさせて、ＤＮＡ−プライマーハイブリッドの形成を可能にする工程；ならびにＤＮＡ−プライマーハイブリッドをインキュベートして、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼに増幅ＤＮＡ産物を合成させる工程、である。好ましくは、一連のＤＮＡ増幅反応は、約３０〜約３５回の反応、そしてより好ましくは約４０回の反応を含む。好ましい実施形態において、ＤＮＡ増幅反応の産物は、一般的配列および一般的配列の逆相補体によって隣接される。
【００４０】
本開示の好ましい実施形態は、固体媒体上のＤＮＡサンプルを増幅する方法であり、この方法は、この固体媒体上のＤＮＡサンプルを沈殿させる工程、およびこの沈殿したＤＮＡを、増幅ＤＮＡ産物を生成するためのＤＮＡ増幅に供する工程、を包含する。好ましくは、この固体媒体は、ろ紙であり、このろ紙は、化学的に処理されている。好ましい実施形態において、このＤＮＡサンプルは、このろ紙上で脱水されている。別の好ましい実施形態において、このＤＮＡサンプルは組織であり、この組織は血液である。
【００４１】
固体媒体上のＤＮＡサンプルは、好ましくは、塩およびアルコールによって沈殿され、そしてアルコールによってリンスされる。好ましくは、ＤＮＡを沈殿させるために使用される塩は、酢酸ナトリウム、酢酸カリウム、酢酸アンモニウム、塩化ナトリウムまたは塩化カリウムであり；好ましくは、使用されるアルコールは、エタノールまたはイソプロパノールである。好ましい実施形態において、生成された増幅ＤＮＡ産物は、遺伝子型決定分析に供されるか、またはＤＮＡ産物中の多型（好ましくは、一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ））が同定される。このＳＮＰは、当業者に周知の多数の技術（好ましくは、ＤＮＡ配列決定、オリゴヌクレオチド連結アッセイ（ＯＬＡ）、二重コードＯＬＡ、一塩基伸長アッセイ、対立遺伝子特異的プライマー伸長またはミスマッチハイブリダイゼーションを含む）によって同定され得る。
【００４２】
本開示の別の局面は、多型を同定する好ましい方法であり、この方法は、固体媒体上のＤＮＡサンプルを沈殿させ、そして、沈殿したＤＮＡサンプル；その３’末端にヌクレオチドのランダム配列を有し、そしてこのランダムヌクレオチドの５’側に一般的配列を有する第一プライマー；ならびにこの第一プライマーの一般的配列を有し、かつ第一プライマーのランダム配列を欠く第二プライマー、を含む反応混合物を使用する。好ましい実施形態において、単一の反応混合物が使用される。好ましくは、この反応混合物はまた、当業者に周知の、ＤＮＡ増幅のために必要な他の成分を含む。好ましい実施形態において、この増幅ＤＮＡ産物は、多型を同定するために分析され、そして好ましくはこの多型は、一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）である。ＳＮＰを同定する方法は、当業者に周知である。ＳＮＰを同定する好ましい実施形態において、このＳＮＰは、ＤＮＡ配列決定、オリゴヌクレオチド連結アッセイ（ＯＬＡ）、二重コードＯＬＡ、一塩基伸長アッセイ、対立遺伝子特異的プライマー伸長またはミスマッチハイブリダイゼーションによって同定される。
【００４３】
反応混合物中のＤＮＡサンプルは、第一のＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ増幅に供され、ここで、第一プライマーは、ＤＮＡにアニールして、この第一のＤＮＡポリメラーゼが、第一プライマーの３’末端から相補的ＤＮＡ鎖を合成して、ＤＮＡ産物を生成する。第一のＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ増幅のための工程は、ＤＮＡ産物を変性させる工程；第一プライマーをこのＤＮＡにアニールさせて、ＤＮＡ−プライマーハイブリッドの形成を可能にする工程；および第一のＤＮＡポリメラーゼにＤＮＡ産物を合成させるように、このＤＮＡ−プライマーハイブリッドをインキュベートする工程、である。好ましくは、これらのＤＮＡ増幅工程は、少なくとも１回繰り返される。好ましい実施形態において、このＤＮＡ増幅によって生成されるＤＮＡ産物は、一般的配列および一般的配列の逆相補体によって隣接される。
【００４４】
次いで、このＤＮＡ産物は、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ増幅に供され、ここで、第二プライマーは、このＤＮＡ産物に結合して、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼに第二のＤＮＡ産物を生成させる。この第二のＤＮＡ産物は、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼが、このＤＮＡ産物にアニールした第二プライマーの３’末端から相補的ＤＮＡ鎖を合成する場合に生成される。この熱安定性ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ増幅のための工程は、ＤＮＡ産物を変性させる工程；第二プライマーをこのＤＮＡ産物にアニールさせて、ＤＮＡ−プライマーハイブリッドの形成を可能にする工程；およびこの熱安定性ＤＮＡポリメラーゼに第二のＤＮＡ産物を合成させるように、このＤＮＡ−プライマーハイブリッドをインキュベートする工程、である。次いで、増幅ＤＮＡ産物は、好ましくは、多型を同定するために分析される。好ましくは、これらのＤＮＡ増幅工程は、約３０〜約３５回、そしてより好ましくは約４０回繰り返される。好ましい実施形態において、第二のＤＮＡ産物は、一般的配列および一般的配列の逆相補体によって隣接される。別の好ましい実施形態において、アニーリング温度は、第一プライマーの３’末端のヌクレオチドのランダム配列の最適なアニーリング温度よりも高い。
【００４５】
好ましい実施形態において、この固体媒体は、ろ紙であり、このろ紙は、化学的に処理されている。別の好ましい実施形態において、このＤＮＡサンプルは、このろ紙上で脱水されている。好ましくは、このＤＮＡサンプルは組織であり、この組織は血液である。この固体媒体上のＤＮＡサンプルは、好ましくは、塩およびアルコールによって沈殿され、そしてアルコールによってリンスされる。好ましくは、ＤＮＡを沈殿させるために使用される塩は、酢酸ナトリウム、酢酸カリウム、酢酸アンモニウム、塩化ナトリウムまたは塩化カリウムであり；好ましくは、使用されるアルコールは、エタノールまたはイソプロパノールである。
【００４６】
本開示のＤＮＡ増幅方法は、少量のＤＮＡを増幅するために有用であり、ＤＮＡサンプル中の複数の部位が、高スループットスクリーニングのために遺伝子型決定されることを可能にする。さらに、本発明の方法は、任意の染色体領域についての、バンド特異的なペインティング（ｐａｉｎｔｉｎｇ）プローブの迅速な構築を可能にし、そして異常な核型中の同定不能な染色体領域またはマーカー染色体を微小裁断および増幅するために、使用され得る。本開示の方法は、また、ＤＮＡライブラリーを配列決定または生成するための、増幅ＤＮＡの迅速なクローニングを可能にする。従って、本方法は、遺伝子型決定分析および高スループットスクリーニングのための有益なツールであるだけでなく、細胞遺伝学的診断においても有益なツールであるはずである。
【００４７】
（発明の詳細な説明）
限定された量のゲノムＤＮＡの遺伝的分析は、しばしば、ＤＮＡ法医学、古生物学、遺伝的疾患分析および遺伝子連鎖分析、ならびに遺伝的多様性分析の分野において生じる。これらの分野の各々における分析および研究は、ゲノムＤＮＡおよび他の型のＤＮＡサンプルを配列非依存的な様式で増幅するための有効かつ安価な方法が利用可能であれば、大いに改善される。増幅されたゲノムＤＮＡを使用する、少量のＤＮＡサンプルのより広範な遺伝的分析は、上記の分野の各々において広範な利点を提供する。さらに、一倍体または二倍体のいずれかの単一細胞由来のゲノムＤＮＡを増幅し得る方法は、例えば、移植前の胚、妊娠女性の末梢血中の胎児細胞、精子または卵母細胞由来の個々の細胞の、より完全な遺伝的分析を可能にする。本開示において示されるＤＮＡ増幅方法は、限定された出発物質からＤＮＡを増幅するために、上記の分野のいずれかにおいて利用され得、それにより、広い範囲のＤＮＡサンプルのより完全な遺伝的分析を可能にする。さらに、これらの方法は、ＤＮＡサンプルの、広範な高スループットスクリーニングのために実用的である。
【００４８】
当業者は、ＤＮＡ増幅における基本的な工程が、熱変性、オリゴヌクレオチドプライマーのアニーリング、ならびにＤＮＡポリメラーゼによる相補的ＤＮＡの伸長であることを理解する。変性、アニーリングおよび伸長の工程は、ＤＮＡ増幅の１サイクルを構成する。熱変性工程において、温度は、二重鎖ＤＮＡを一本鎖ＤＮＡへと変性させるのに十分な温度まで上昇される。次に、アニーリング工程の間、この温度は、一本鎖ＤＮＡへのオリゴヌクレオチドプライマーのアニーリングを容易にする温度まで低下される。最後に、伸長の間、インキュベーション温度は、ＤＮＡポリメラーゼが、アニールしたプライマーの３’末端から相補的ＤＮＡを合成することを可能にする。ＤＮＡ増幅のための本開示の方法において、サンプルＤＮＡ、その３’末端にランダムヌクレオチドおよびその５’末端に一般的配列を有する第一プライマー、ならびに第一プライマーの一般的配列を有する第二プライマーが、単一の反応混合物中に一緒に配置される。次いで、このサンプルＤＮＡは、第一セットの反応および第二セットの反応を使用して増幅され、これらの反応の各々は、変性、アニーリングおよび伸長の工程を含む。
【００４９】
第一セットのＤＮＡ増幅反応は、二本鎖ＤＮＡサンプルを一本鎖状態に変性することによって開始し、これにより、プライマーがこのＤＮＡにアニーリングできるようになる。次に、反応温度は、第一プライマーの３’末端のランダムヌクレオチドがこのＤＮＡにアニールして、ハイブリッド二重鎖を形成することを可能にする温度まで低下される。ハイブリッド二重鎖の形成後、反応混合物中に存在するＤＮＡポリメラーゼが、インキュベーション時間の間に、第一プライマーの３’末端から相補的ＤＮＡ鎖を伸長する。このＤＮＡポリメラーゼは、好ましくは、５’から３’方向のエキソヌクレアーゼ活性を有し、その結果、このポリメラーゼは、同じＤＮＡ鎖のさらに下流にアニーリングした他の第一プライマーを除去し得、従って、第一セットの反応の間に、より長い相補的ＤＮＡ鎖が合成されることを可能にする。あるいは、このＤＮＡポリメラーゼは、類似の結果を達成するプライマー置換活性を有し得る。プライマー置換活性は、ＤＮＡポリメラーゼが相補的ＤＮＡ鎖を合成しながらＤＮＡ鎖に沿って移動し、そしてこのＤＮＡにアニールした別のプライマーに遭遇する場合に、プライマーが置換され、そしてポリメラーゼ反応が進行することを意味する。この活性はまた、より長い重合産物を生じる。アニーリング工程よびインキュベーション工程は、好ましくは異なる温度で実施されるが、アニーリング工程およびインキュベーション工程の両方は、ＤＮＡポリメラーゼが第一セットの反応における温度で活性である場合には、同じ温度で生じ得る。
【００５０】
上記のＤＮＡ増幅の最初のサイクルの後、新たに合成された相補的ＤＮＡ鎖は、その５’末端に第一プライマーの一般的配列（この配列は、第一プライマーの３’末端が相補的ＤＮＡ鎖を合成するための出発点として使用された場合に、この鎖に組み込まれた）を有する（図１を参照のこと）。変性、アニーリングおよび伸長の上記工程は、繰り返され得、そして一般的には、第一セットの反応の間に少なくとも１回繰り返されるべきである。第一セットの反応の第二サイクルの変性工程は、５’側の一般的配列を有する新たな第一サイクルのＤＮＡ鎖を、元のＤＮＡ鎖から区別する。変性後、新たな第一サイクルのＤＮＡ鎖は、別のラウンドのアニーリングおよび伸長のために、この反応混合物中に存在する第一プライマーにとって利用可能である。
【００５１】
第一セットの反応の第二サイクルの間、第一プライマーは、第一サイクルのＤＮＡ鎖にアニールし、ＤＮＡポリメラーゼは、第一プライマーの３’末端から相補鎖を伸長し、そして新たに合成された相補的ＤＮＡは、もう一度、その配列へと第一プライマーの５’末端を組み込む。この新たな第二サイクルのＤＮＡフラグメントはまた、その３’末端に一般的配列の逆相補体を有する。なぜなら、ＤＮＡポリメラーゼは、その５’末端に一般的配列を有する、第一サイクルのＤＮＡ鎖の全長相補的ＤＮＡ産物を合成するからである。従って、第一セットの反応の間に増幅されたＤＮＡフラグメントは、フラグメントの一端に一般的配列を有し、そして他端にその逆相補体を有する。一般的配列およびその逆相補体に隣接する、第一セットの反応のこれらのＤＮＡ産物は、ここで、第二プライマーを用いる第二セットの反応の間に、容易に増幅され得る。この第二プライマーは、第一プライマーと同じ一般的ＤＮＡ配列を有するが、その３’末端にランダムヌクレオチドを有さない。
【００５２】
第一セットの反応のＤＮＡ産物は、引き続き、単一の反応混合物中に存在する第二プライマーを用いて増幅される。これらのＤＮＡ産物の変性後、反応温度は、この第二プライマーがこのＤＮＡ産物の末端にて一般的配列にアニーリングするように低下される。第二セットの反応に使用されるアニーリング温度は、一般に、第一セットの反応において使用されるアニーリング温度よりも高い。第二セットの反応において使用されるアニーリング温度は、第一プライマーのヌクレオチドのランダム配列の最適なアニーリング温度よりも高くあるべきである。より高い温度は、第二セットの反応において、その３’末端に位置するランダムヌクレオチド配列を介して、第一プライマーによるランダムプライミングを最小化または防止する。この特徴は、第二セットの反応の間に、単一反応混合物から、任意の残留する第一プライマーが除去される必要性を排除する。
【００５３】
第二プライマーがＤＮＡ産物の末端にアニールした後、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼが、第二プライマーの３’末端から相補的ＤＮＡ鎖を伸長する。第二セットの反応は、好ましくは合計約３０〜約４０サイクルを使用して、このＤＮＡ産物の指数関数的な増幅を達成するために、変性、アニーリングおよび伸長の上記工程を繰り返すことを含む。最終的な増幅ＤＮＡは、ＤＮＡ中の複数の部位（ＳＮＰ、単一縦列反復（ＳＴＲ）、制限フラグメント長多型（ＲＦＬＰ）、変動性縦列反復数（ＶＮＴＲ）、複合縦列反復（ＣＴＲ）、マイクロサテライト、欠失、置換または挿入のような多型を含む）を遺伝子型決定するために増幅ＤＮＡを利用するような、種々の技術を使用する広範な分析の用意ができている。あるいは、増幅ＤＮＡは、種々の供給源からＤＮＡライブラリーを生成するために使用され得る。
【００５４】
任意の型のＤＮＡサンプルが、本開示の方法を使用して増幅され得る。なぜなら、この方法は、ごく微量のＤＮＡを増幅し得る配列非依存的なＤＮＡ増幅方法であるからである。１つの好ましい実施形態において、このＤＮＡサンプルは、ゲノムＤＮＡ、微小裁断された染色体ＤＮＡ、酵母人工染色体（ＹＡＣ）ＤＮＡ、Ｐ１由来の人工染色体（ＰＡＣ）ＤＮＡ、コスミドＤＮＡ、ファージＤＮＡまたは細菌性人工染色体（ＢＡＣ）ＤＮＡである。別の好ましい実施形態において、このＤＮＡサンプルは、組織、血液または単一細胞である。好ましくは、このＤＮＡサンプルは、生物から容易に獲得され得、そして保存が容易である。このＤＮＡサンプルは、任意の種または生物（ヒト、哺乳動物、ウシ、ブタ、ヒツジ、ウマ、げっ歯類、鳥類、魚類、ゼブラフィッシュ、エビ、植物、酵母、ウイルスまたは細菌が挙げられるが、これらに限定されない）から獲得され得る。
【００５５】
開示された方法によるＤＮＡ増幅のために適切なゲノムＤＮＡを含む組織または血液のＤＮＡサンプルは、例えば、頬のスワブ、鼻のスワブ、髪、マウスウォッシュ、臍帯血、羊水、胎児組織、内皮細胞、足のクリッピング（ｈｏｏｆ  ｃｌｉｐｐｉｎｇ）、または指の爪のクリッピング（ｆｉｎｇｅｒｎａｉｌ  ｃｌｉｐｐｉｎｇ）から簡便に得られ得る。パラフィン包埋した組織中のゲノムＤＮＡはまた、開示される方法を用いて増幅され得る。本開示のＤＮＡ増幅法は、単一細胞（着床前の胚、妊婦の末梢血中の胎児細胞、精子もしくは卵細胞から単離された単一細胞、または任意の組織由来の単一細胞が挙げられるが、これらに限定されない）由来のゲノムＤＮＡを増幅させ得る。単一細胞は、フローサイトメトリー（Ｈｅｒｚｅｎｂｅｒｇら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ７６：１４５３−５５，１９７９；Ｉｖｅｒｓｏｎら、Ｐｒｅｎａｔａｌ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  １：６１−７３，１９８１；Ｂｉａｎｃｈｉら、Ｐｒｅｎａｔａｌ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  １１：５２３−２８，１９９１）を含む種々の方法（これらは、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）、磁気活性化細胞選別（ＭＡＣＳ，Ｇａｎｓｈｉｒｔ−Ａｈｌｅｒｔら、Ａｍ  Ｊ  Ｏｂｓｔｅｔ  Ｇｙｎｅｃｏｌ  １６６：１３５０，１９９２）、または両方の手順の組み合わせを利用し得る）を用いて単離され得る。さらに、勾配遠心分離法およびフローサイトメトリー法の組み合わせはまた、単離効率または選別効率を増加させるために使用され得る。１つの好ましい実施形態において、ＤＮＡサンプルは、開示された方法を用いるＤＮＡ増幅の前に、精製されるか、またはプロテイナーゼＫによって処理される必要はない。
【００５６】
本発明の開示のＤＮＡ増幅法において使用される第一プライマーは、好ましくは、その３’末端に約４〜約９のランダムヌクレオチドを有する。好ましい実施形態において、第一プライマーは、その３’末端に、５、６、７、または８のランダムヌクレオチドを有する。第一プライマーはまた、その５’末端に、約１０〜約３０、そして好ましくは、約１５〜約２５のヌクレオチドの一般的な配列を有する。好ましい実施形態において、この第一プライマーは、その５’末端に１６ヌクレオチド、１７ヌクレオチド、１８ヌクレオチド、１９ヌクレオチド、２０ヌクレオチド、２１ヌクレオチド、２２ヌクレオチド、２３ヌクレオチドまたは２４ヌクレオチドの一般的な配列を有する。ヌクレオチドのランダム配列、およびランダムヌクレオチドの５’側の一般的な配列は、第一プライマーに隣接し得る。あるいは、１つ以上のヌクレオチドは、ヌクレオチドのランダム配列と第一プライマーにおけるランダムヌクレオチドの５’側の一般的な配列との間に挿入され得る。第一プライマーはまた、５’側に一般的な配列のさらなるヌクレオチドを有し得る。第一プライマーの例としては、配列番号１と指定された配列であり、ここで、Ｎは、ランダムヌクレオチドを示す。ヌクレオチドのランダム配列は、任意のヌクレオチドから構成され得、例えば、任意の順のＧ、Ａ、ＴまたはＣである。これらの文字記号は、グアニンヌクレオチドについてはＧ，アデニンヌクレオチドについてはＡ、チミンヌクレオチドについてはＴ、そしてシトシンヌクレオチドについてはＣを示すことが理解される。ランダムヌクレオチドはまた、ヌクレオチドアナログ、および当業者に周知の他の改変されたヌクレオチドを含み得る。
【００５７】
理論上、第一プライマーは、プライマーのランダム部分の各位置において、これらのヌクレオチドの全組み合わせを含み得る。従って、第一プライマーの３’末端のランダムヌクレオチドは、標的ＤＮＡセグメントの至る所のランダムな部位に相補的であり得る。ヌクレオチドのランダム配列が、第一プライマー中により長いほど、標的配列はゲノム中により低頻度で生じ、従って、第一プライマーは標的ＤＮＡセグメントにより低頻度でアニーリングする。さらに、第一プライマーのランダム配列は、ヌクレオチドＡおよびＴ、またはヌクレオチドＧおよびＣが豊富になるように設計され得、サンプルＤＮＡにおける特定領域（例えば、Ａ：Ｔリッチ領域あるいはＧ：Ｃリッチ領域）の優先的な増幅を可能にする。ヌクレオチドのランダム配列を生成するために、４つのヌクレオチドの任意の比を使用することは、当業者において周知である。
【００５８】
例として、第一プライマーの３’末端が５つのランダムヌクレオチドを有する場合、特定の増幅について第一プライマーのランダムセグメント内に４５（すなわち、１，０２４）の異なる配列が存在する。これらの配列の相補体は、ＤＮＡサンプルの変性したＤＮＡセグメント全体に両方向でランダムに生じる。両方向によって、プライミングは、増幅されるべき溶解したＤＮＡ二重鎖の両鎖において生じることが意味される。
【００５９】
本明細書中において使用されるように、用語「一般的な配列」は、有用なＤＮＡ増幅プライマーである任意のＤＮＡ配列をいう。第二プライマーの例は、配列番号２に示される配列である。従って、一般的な配列は、好ましくは、任意の明らかな自己相同性も、同一のヌクレオチドの並びも有さず、そして、一般的な配列は、好ましくは、過度にＧ：ＣリッチまたはＡ：Ｔリッチでない。自己相同性、またはプライマーの別の領域における配列に対して相補的である１領域中の配列を含むプライマーは、内部ヘアピン二重鎖を形成し、従って、サンプルＤＮＡにハイブリダイズすることが不可能である。また、Ｇ：Ｃ対は３つの水素結合を含み、そしてＡ：Ｔ対は２つの水素結合を含むので、ヌクレオチドＧまたはＣ（単独または組み合わせ）の不均等な高含有量を有するプライマーは、高含有量のＡおよびＴから構成されるプライマーよりもより高い融点を有する。当業者は、開示されるＤＮＡ増幅方法において、より高いかまたはより低い温度に対して、第一プライマーおよび第二プライマーのアニーリング温度を操作するこの特長を使用し得る。上記の限定において、開示される方法を用いてＤＮＡを増幅するために使用され得る任意の一般的な配列は、本発明の開示の範囲内であることが企図される。
【００６０】
反応の第二セットにおいて使用される第二プライマーの配列は、第一プライマーのランダムヌクレオチド配列の５’側の一般的なヌクレオチド配列と同一である。第二プライマーは、その５’末端にさらなるヌクレオチドを有し得るものの、これは、ＤＮＡ増幅反応のアニーリング温度に影響し得る。第二プライマーはまた、その３’末端にさらなるヌクレオチドを有し得るが、これらは、反応の第一セットのＤＮＡ産物に普遍的に結合および増幅する第二プライマーの能力を減少させることによって、ＤＮＡ増幅反応の第二セットの間に、ＤＮＡ産物を均質に増幅させるプライマーの能力を妨害し得る。従って、第二プライマーは、好ましくは、その３’末端にさらなるヌクレオチドを有さない。
【００６１】
上の段落において記載されるような開示された方法の、反応の第一セットにおいて、アニーリング反応のためにより低い温度が使用される。なぜなら、第一プライマーは、その３’末端にランダムヌクレオチドの短い配列を介してサンプルＤＮＡにアニーリングするからである。このインキュベーション温度は、好ましくは、ＤＮＡポリメラーゼに、アニーリングされたプライマーの３’末端から相補的なＤＮＡ鎖を首尾良く合成させ得る。Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼは、反応の第一セットにおいて使用される場合、Ｔａｑがポリメラーゼ活性を有することを可能にする伸長温度が使用されるべきである。反応の第一セットのＤＮＡ産物は、第一プライマーの一般的配列およびその逆相補体によって隣接される。
【００６２】
ＤＮＡ増幅反応の第二セットの間、この第二プライマーは、これらの隣接配列にハイブリダイズする。一般的ＤＮＡ配列は、第一プライマーの３’末端においてランダムヌクレオチドの伸長より長いので、反応の第二セットにおけるアニーリング温度は、一般的により高い温度である。より高いアニーリング温度は、一般的に、任意の第一プライマー（反応の第一セットのＤＮＡ産物中に取り込まれない）が残留するのを最小化または防ぐが、ＤＮＡ産物へのアニーリングから反応混合物においてなお存在し、そしてＤＮＡ合成のランダムに開始する。より高い温度は一般的に、熱安定性のポリメラーゼの使用を必要とし、これは、このポリメラーゼが高温でＤＮＡを合成し得ることを意味する。熱安定性（ｈｅａｔ−ｓｔａｂｌｅ）ＤＮＡポリメラーゼの１つの周知の例は、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼである。多くの熱安定性ＤＮＡポリメラーゼまたは耐熱（ｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｌｅ）ＤＮＡポリメラーゼは市販されており、これらとしては、組換えＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼおよびネイティブＴａｑ  DNAポリメラーゼが挙げられる（表２を参照のこと）。別の選択肢は、より長いＤＮＡ産物を生成するために、例えば、ＴａｑＰｌｕｓ  ＤＮＡポリメラーゼを用いる長い範囲のＰＣＲを使用することである。長い範囲のＰＣＲは、反応の第一セット、反応の第二セット、または反応の両方のセットのいずれかにおいて使用され得る。１つの実施形態において、Ｔｕｂ  ＤＮＡポリメラーゼは、本開示のＤＮＡ増幅方法において長いＤＮＡ配列を増幅するために使用され得る。Ｔｕｂ  ＤＮＡポリメラーゼを使用するためおよびＤＮＡの長い領域を増幅させるためのプロトコルは、ＦｏｒｒｅｓｔｅｒおよびＲｅｄｆｏｒｄ（Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．６７：３１−３８，１９９７）に見出され，本明細書中に参考として援用される。
【００６３】
本開示の方法において、反応の第一セットにおいて増幅されるべきＤＮＡは、１〜約５分間、そして好ましく約２分間、約９０℃と約１００℃の間、そして好ましくは約９５℃まで、反応混合物を加熱することによって最初に変性される。この工程の間、第一プライマーおよび第二プライマーの両方は、反応混合物に存在する。あるいは、第二プライマーは、反応の第一セット後であるが、反応の第二セットの前に、反応混合物に添加され得る。第一プライマーおよび第二プライマーは、反応の第一セットの第一サイクルの加熱変性工程前、または変性工程の任意のときに、増幅されるべきＤＮＡを含有する反応混合物に添加され得る。好ましい実施形態において、第一プライマーおよび第二プライマーは、同じモル比で単一反応混合物に添加される。しかし、２つのプライマーのモル比はまた、ＤＮＡ増幅を最適化するために互いに関連して変動し得る。増幅されるＤＮＡと、第一プライマーおよび第二プライマーとのモル比は、ＤＮＡ増幅を最適化するための当業者によって変動され得る。
【００６４】
次いで、反応混合物の温度は、第一プライマーが一本鎖ＤＮＡにアニーリングすることを可能にする温度より低くされる。反応混合物中に存在する第二プライマーは、反応の第一セットにおける一本鎖ＤＮＡに全体的にはアニーリングしない。なぜなら、プライマーをアニーリングするのに必要なより長い一般的なＤＮＡ配列の逆相補体は、たとえあったとしても、一本鎖ＤＮＡ中にはほとんど存在しない。好ましくは、第一プライマーのヌクレオチドのランダム配列のアニーリング温度は、約３７℃および約５０℃の間、好ましく約４２℃および約４５℃の間であるべきである。好ましくは、アニーリング温度とは異なる温度は、ＤＮＡポリメラーゼが第一プライマーの３’末端からＤＮＡを合成し得る相補的なＤＮＡ鎖伸長のための、インキュベーション期間に使用され得る。ＤＮＡポリメラーゼがアニーリング温度で機能する場合、この温度はインキュベーション期間の間維持され得る。インキュベーション期間は、好ましくは約２分〜約７分、より好ましくは約５分である。
【００６５】
反応の第一セットのこれらの工程は、少なくとも１回繰り返されるべきであり、その結果、好ましくは、これらの最初のＤＮＡ増幅工程の２サイクルが実行されるが、反応のこの第一セットにおけるＤＮＡ増幅の２サイクル以上が企図される。例えば、３または４サイクルは、反応の第一セットにおいて実施され得る。しかし、変性、アニーリングおよび伸長の各さらなるサイクルについて、ＤＮＡ増幅反応の第二セットにおいて利用可能なＤＮＡ産物は、一般的に短くされる。これは、第一プライマーによるランダムプライミングの各々の継続的なラウンドが、その前に増幅されたＤＮＡ産物をさらに短くさせるからである。この効果は、ＤＮＡ増幅反応の第二セットの間に克服される。なぜなら、第二プライマーが、ＤＮＡ産物（一般的な配列および反応の第一セットにおいて産生される一般的な配列の逆相補体に隣接する）の末端にアニーリングするからである。
【００６６】
反応の第一セットのＤＮＡ産物（これは、一般的な配列およびその逆相補体によって隣接される）は、その後、開示される方法におけるＤＮＡ増幅反応の第二セットにおいて指数関数的に増幅される。反応の第二セットにおいて、反応の第一セットのＤＮＡ産物は、約１５秒〜約２分間、好ましくは約３０〜約１分間、約９０℃および約１００℃との間まで、そして好ましくは、約９５℃まで、反応混合物を加熱することによって最初に変性される。次いで、反応混合物の温度は、第二プライマーが一本鎖ＤＮＡ産物にアニーリングすることを可能にする温度まで低下させる。第二プライマーのアニーリング温度は、好ましくは、約５５℃と約６８℃との間、好ましくは約６０℃と約６５℃との間である。第二プライマーのアニーリング温度は、反応混合物に残存する、組み込まれていない第一プライマーによるランダムプライミングを最小化または防ぐために、十分にストリンジェントでなければならない。従って、反応の第二セットの間に反応混合物から第一プライマーを除去することは必要ではなく、このこと、開示される方法の有効性を増大する。これはまた、他の公知の方法と比較して、高スループットスクリーニングのために、本ＤＮＡ増幅法を非常に簡略化する。
【００６７】
ＤＮＡポリメラーゼがアニーリング、温度で活性である場合にインキュベーション温度は、反応の第二セットにおけるアニーリング温度と同一であり得るが、好ましくは、インキュベーション工程の温度は、ＤＮＡを合成するために熱安定性ＤＮＡポリメラーゼに対してより最適な温度まで上昇される。伸長工程に最適な温度は、反応の第二セットにおいて使用されるＤＮＡポリメラーゼに依存する。例えば、反応の第二セットのインキュベーション工程の間、この温度は、約６８℃〜約７５℃まで、そして好ましくは、約７０℃〜約７２℃まで上昇され、そして約３０秒〜約１０分、そして約４分〜約６分間維持される。反応の第二セットの、変性、アニーリングおよび伸長工程は、約３０〜約４０回繰り返され、そして好ましくは、約３３〜約３５回繰り返される。次いで、この反応は、任意の初期のポリメラリゼーションを完全にするために、約７２℃で約７分〜約１０分間維持され得る。熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ）が使用される場合、各変性工程後、新鮮な酵素に添加される必要性はない。なぜなら、Ｔａｑは、変性工程によって完全に変性されず、そして好ましくはより高温で機能するからである。非熱安定性ＤＮＡポリメラーゼはまた、これがそれぞれのサイクルの各変性工程後に添加される場合、反応の第二セットにおいても使用されるが、この不十分な方法は、高スループットスクリーニングについて非現実的である。
【００６８】
反応の第一セットおよび第二セットの各工程について最適な温度は、増幅されるサンプルＤＮＡのサイズによって、およびプライマーのサイズおよび配列によって、（通常、経験的に）決定されることは、当業者に周知である。例えば、プライマーのＧ：Ｃ含有量に基づく、完全に一致した二重鎖の融点を決定するため簡単な公式は当該分野で周知である。プライマーの最適アニーリング温度は、種々の利用可能なコンピューターソフトフェアプログラム（例えば、Ｏｌｉｇｏ  Ａｎａｌｙｚｅｒ）を用いることによって当業者によって計算され得、これは、ウェブサイトｗｗｗ．ｉｄｔｄｎａ．ｃｏｍで利用可能である。反応の第一セットおよび／または反応の第二セットにおける任意の工程間の温度が、約１〜約８分間の時間にわたって、そして好ましくは約３分間の時間にわたって、徐々に増加または減少され得ることもまた、当業者に周知である。
【００６９】
当業者はまた、増幅された産物のその後のクローニングのために、一般的な配列中に１つ以上の制限酵素部位を組み込ませることを所望し得る。制限酵素部位は、制限エンドヌクレアーゼ酵素によって特異的な位置で認識され、そして切断されるＤＮＡ配列である。特定の制限酵素の使用は、当業者に周知であり（表１を参照のこと）、そして増幅されたＤＮＡをクローニングするためのベクターの選択に適合性の特定の制限酵素が選択され得る。利用可能なベクターの数は、列挙するには過度に多すぎ、そして当業者に周知である。有名なベクター（例えば、ｐＢＲ３２２、あるいはプラスミドのｐＧｅｍシリーズまたはＰＵＣシリーズ）は、それらのポリクローナル領域中に特定の特異的制限酵素認識を含む。一般的な配列は、選択されたクローニングベクターにおける部位に適合性の１つ以上の認識配列が、一般的なプライマーに含まれるように設計され得る。
【００７０】
特定の実施形態において、本発明の開示は、ＤＮＡ増幅において使用されるための第一プライマーおよび第二プライマーを包含する。好ましくは、第一プライマーは、その３’末端に、約４〜約８のランダムヌクレオチド領域、およびランダムヌクレオチド配列５’側に、一般的なＤＮＡの約１５ｂｐ〜約２５ｂｐの領域を有する。この第一プライマーはさらに、約３７℃および約４２℃との間の温度でＤＮＡ配列にハイブリダイズする、ヌクレオチドのランダム配列の能力によって特徴付けられる。第二プライマーは、好ましくは、約１５ｂｐ長と２５ｂｐ長との間であり、そして第一プライマーにおけるヌクレオチドのランダム配列の５’側に、一般的な配列と同一の配列を有する。第二プライマーはまた、特に、反応の第二セットにおける高ストリンジェントなアニーリング工程に関連して、ＤＮＡ増幅の方法を容易にするためのさらなるヌクレオチドを有し得る。第二プライマーはさらに、選択のベクター中への増幅されたＤＮＡ産物のサブクローニングを容易にするための制限酵素認識部位、または例えば、「Ｃｌｏｎｅ  Ａｍｐ」プロトコル（ＢＲＬ）によって、クローニングを容易にするためのＣＵＡリピートのストレッチを含み得る。
【００７１】
好ましい実施形態において、反応の第一セットにおいてＤＮＡを増幅するために使用されるＤＮＡポリメラーゼは、反応の第二セットにおける使用される熱安定性ＤＮＡポリメラーゼと同一である。反応の第一および第二セットの両方に対して同一のＤＮＡポリメラーゼを使用することは、ＤＮＡ増幅の開示された方法を非常に単純化する。なぜなら、１つの反応混合物のみが、単一の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを用いて調製されるからであり、これは、高スループットスクリーニングを非常に容易にする。同一のＤＮＡポリメラーゼを用いることは、酵素が開始反応混合物に単に添加され、そしてさらなる酵素が、ＤＮＡ増幅反応の第一または第二セットの間に添加される必要はないことを意味する。
【００７２】
しかし、１つのＤＮＡポリメラーゼが反応の第一セットにおいて使用され得、そして第二の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼが反応の第二セットにおいて使用され得ることもまた、企図される。反応の第一セットの間に、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼが使用されない場合、新鮮な酵素は、各変性工程後に反応混合物に添加されなければならない、なぜなら、そのＤＮＡポリメラーゼはＤＮＡを変性させるために必要な熱によって破壊されるからである。反応の第一セットのＤＮＡ増幅工程は、各変性工程後に添加される新鮮な酵素をさらに用いて、１〜３回、好ましくは上に議論されるように１回繰り返される。次いで、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼは、ＤＮＡ増幅反応の第二セットのために、反応の第二セットの最初の変性工程の、工程前、工程中、または工程後のいずれかで添加されなければならない。
【００７３】
本発明の開示された方法において使用される好ましいＤＮＡポリメラーゼは、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性、または代替的に、プライマー置換活性を有する熱安定性酵素である。例えば、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼは、開示される方法の反応の第一セットおよび反応の第二セットの両方においてＤＮＡを増幅するために開始の反応混合物に添加され得る。Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼは、本質的な５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有し、これは、Ｔａｑに相補的なＤＮＡを合成する間に下流で出会う、オリゴヌクレオチドプライマーを消化させ得る（Ｌｏｎｇｌｅｙら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  １８（２４）：７３１７−２２，１９９０）。反応の第一セットにおいて使用され得るＤＮＡポリメラーゼとしては、５’→３’エキソヌクレオチド活性、あるいはエキソヌクレアーゼ活性を有するかまたは有さない代替的なプライマー置換活性を有する、任意のポリメラーゼが挙げられ得る。反応の第一セットにおいて使用され得る酵素としては、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、改変されたＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、Ａｍｐｌｉｔａｑ  Ｇｏｌｄ，Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡ  ポリメラーゼＩ、Ｔｕｂ  ＤＮＡポリメラーゼおよびＤＮＡポリメラーゼＩ）が挙げられるが、これらに限定されない（表２を参照のこと）。
【００７４】
反応の第一セットにおいて使用されるＤＮＡポリメラーゼが、反応の第二セットにおいて使用される熱安定性ＤＮＡポリメラーゼと異なる場合、反応の第一セットの最終ＤＮＡ産物は、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを好ましく実施させ得る緩衝液中に希釈されなければならない。特に、サンプルＤＮＡが、顕微解剖された染色体において、およびパルスフィールドゲルから単離されたＹＡＣにおいてか、あるいは小さな組織もしくは血液サンプル、または単一細胞からと同じほど少ない量で存在する場合、反応の第一セットは、相対的に少ない容量で実施され得る。反応の第一セットおよび反応の第二セットの容量が、特定の適用に依存して広範に変動し得、そしてより高いかまたはより低い反応容量が本発明の開示によって包含されることが企図される。反応の第一セットの小さなアリコートは、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼおよび反応の第二セットにおけるその緩衝液と共に使用され得るが、特に、同じＤＮＡポリメラーゼが反応の両方のセットについて利用される場合、好ましくは反応の第一セットおよび反応の第二セットの両方に対する反応容量が、同一である。
【００７５】
ＤＮＡポリメラーゼおよびその緩衝液が、本方法の単一反応混合物に添加される場合、ＤＮＡ増幅について必須の他の成分は、反応混合物において存在することが企図される。ＤＮＡ増幅のための必須の反応成分は、当業者に周知であり、そしてこれらとしては、、ウシ血清アルブミン、約１．５ｍＭ〜約５ｍＭの最終濃度のＭｇＣｌ２、４つのデオキシヌクレオチド塩基（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰおよびｄＣＴＰ）、ならびに精製水（例えば、蒸留水、脱イオン水または超濾過水）が挙げられるが、これらに限定されない。使用される緩衝液は、以下のような成分を含む：Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ（約７．０〜約９．０のｐＨ）、ＭｇＣｌ２、ＮａＣｌ、およびＤＴＴ（ジチオスレイトール）。緩衝液はまた、ＫＣｌおよびゼラチンを含み得る。ＰＣＲおよびＤＮＡ増幅のための緩衝液の成分は、当業者に周知であり、そして特定成分（例えば、ＭｇＣｌ２）の濃度は、各反応について経験的に容易に決定され得る。
【００７６】
ＤＮＡ増幅工程の温度、インキュベーション期間、およびランプ時間は、ＤＮＡ増幅の効率および他の結果を有意に変更させることなしに、非常に変動させ得ることもまた、当業者に理解される。あるいは、当業者は、ＤＮＡ増幅反応を最適化するためにこれらのパラメーターを変動させ得る。反応条件およびパラメーターにおけるこれらのわずかな改変は、本発明の開示の範囲内である。上記反応のＤＮＡ産物は、アガロースまたはアクリルアミドの電気泳動ゲル、好ましくは、１．５％〜２．０％のアガローズゲル上でそれらを泳動することによって可視化され得る。エチジウムブロマイドを用いてゲルを染色した後、ランダムな配列非依存性の増幅産物は、好ましくはスメアとして出現する。
【００７７】
１つの実施形態において、本開示は、ＤＮＡの配列に依存せずにＤＮＡを増幅するための方法を含有し、この方法は、以下の工程を包含する：
（ａ）単一反応混合物（約５０μＭの総容量に対して、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５０ｍＭ  ＫＣｌ、０．００１％ゼラチン、３００μＭ  ｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、およびｄＴＴＰ）、配列番号１の配列を有する第一プライマー（３００ｎＭ）、配列番号２の配列を有する第二プライマー（３００ｎＭ）および１．２５単位のＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ）にＤＮＡサンプルを添加する工程；
（ｂ）約９５℃の温度で、約５分間、反応混合物を加熱することによって、ＤＮＡを変性させる工程；
（ｃ）約９５℃の温度で、約１分間、反応混合物を加熱することによって、ＤＮＡを変性させ、次いで４２℃の温度で約５分間、反応混合物を冷却させ、それによって、第一プライマーが、ＤＮＡ−プライマーハイブリッドを形成するために、変性したＤＮＡにアニーリングすることを可能にし、かつＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼが、第一プライマーの３’末端からＤＮＡの相補鎖を合成することを可能する工程；
（ｄ）工程（ｃ）を１回繰り返す工程；
（ｅ）約９５℃の温度で、約１５秒間、反応混合物を加熱することによって、ＤＮＡ産物を変性させ、約６５℃の温度まで反応混合物を冷却させ、それによって、第二プライマーが、ＤＮＡ−プライマーハイブリッドを形成するために、変性したＤＮＡにアニーリングすることを可能にする工程；および約６８℃の温度まで反応混合物を上昇させ、それによって、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼが、第二プライマーの３’末端からＤＮＡの相補鎖を合成することを可能する工程；
（ｆ）工程（ｅ）を約３９回繰り返す工程。
【００７８】
第一プライマーの例は、配列５’−ＴＡＧＣＡＧＴＧＧＴＡＡＣＡＡＣＧＣＡＧＡＧＡＮＮＮＮＮ−３’（配列番号１）である。第二プライマーの例は、配列５’−ＴＡＧＣＡＧＴＧＧＴＡＡＣＡＡＣＧＣＡＧＡＧＡ−３’（配列番号２）である。本発明で示されたＤＮＡを増幅させるための方法において第二プライマーとして使用され得る、一般的な配列のさらなる例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：
５’−ＡＣＡＡＣＧＣＡＧＡＧＴＡＡＧＣＡＧＴＧＧＴＡ−３’（配列番号３）；
５’−ＡＣＡＡＣＧＧＴＡＧＣＡＧＡＧＴＡＡＧＣＡＧＴ−３’（配列番号４）；
５’−ＧＡＧＴＡＡＧＣＡＧＴＡＣＡＡＣＧＧＴＡＧＣＡ−３’（配列番号５）；
５’−ＧＡＧＧＣＡＴＡＡＧＣＡＧＴＡＣＡＡＣＧＧＴＡ−３’（配列番号６）；
５’−ＣＡＡＣＧＧＴＡＧＡＧＧＣＡＴＡＡＧＣＡＧＴＡ−３’（配列番号７）；
５’−ＧＧＣＡＴＡＡＧＣＡＧＴＡＣＡＡＣＧＧＴＡＧＡ−３’（配列番号８）；
５’−ＡＡＣＧＧＴＡＧＡＧＧＣＡＴＡＡＧＣＡＧＴＡＣ−３’（配列番号９）；
５’−ＡＧＴＡＣＡＡＣＧＧＴＡＧＡＧＧＣＡＴＡＡＧＣ−３’（配列番号１０）；
５’−ＡＡＧＣＡＧＴＡＣＡＡＣＧＧＴＡＧＡＧＧＣＡＴ−３’（配列番号１１）；
５’−ＣＧＧＴＡＧＡＧＧＣＡＴＡＡＧＣＡＧＴＡＣＡＡ−３’（配列番号１２）。
【００７９】
ＤＮＡ増幅のための同じ反応混合物において上記の各第二プライマーと共に使用される第一プライマーは、その３’末端にさらなるランダム配列のヌクレオチドを有する同じ一般的配列を含む。第一セットのＤＮＡ増幅反応および第二セットのＤＮＡ増幅反応の最適アニーリング温度は、一般的ＤＮＡ配列および第一プライマーの３’末端でのランダムなヌクレオチドの数に基づき、当業者により決定され得る。好ましくは、各セットの反応の最適アニーリング温度は、第二プライマーのアニーリングが第一セットの反応において、最小とされるかまたは妨げられ、かつ第一プライマーのランダム配列のヌクレオチドを介した第一プライマーのアニーリングが第二の組の反応において最小とされるかまたは妨げられるような温度である。
【００８０】
本発明で開示されたＤＮＡ増幅方法において利用されるＤＮＡサンプルが固体媒体上で保存される場合、増幅および／または遺伝子分析のためにＤＮＡサンプルを調整することは、不十分であり得るだけでなく、不一致の結果も生じ得、これよって、ＤＮＡサンプルから得られる情報を限定する。本開示は、ＤＮＡ増幅および／または遺伝子分析のために、固体媒体上に保存されたＤＮＡサンプルを調製する他の方法において固有の欠点を克服することを探求する。本発明で開示される方法（沈殿方法ともいわれる）は、不要なＤＮＡ精製工程を除外することによって、固体媒体上に保存されるＤＮＡサンプルの調製を大いに単純化する。開示される方法において、固体媒体上のＤＮＡサンプルは、当業者に周知の方法によって調製され、次いで、ＤＮＡ増幅および／または遺伝子分析に直接供される。この方法は、より一致した結果を生じ、高スループットの操作のコストを低減し、そしてＤＮＡサンプルから増幅されたＤＮＡの品質を改善する。
【００８１】
本開示は、組織サンプルおよび血液サンプルとして含まれる、ＤＮＡを保存するために、当業者に周知の種々の固体媒体を包含する。好ましくは、この固体媒体は乾燥しており、そして固体マトリクスまたは固体支持体を有する（例えば、好ましくは、吸収性セルロースベースの紙（例えば、濾紙）、または合成プラスチック材料のマイクロメッシュ）。この固体マトリクスはまた、錠剤またはペレットの形態でもあり得る。好ましくは、この固体媒体は、このマトリクスまたは支持体上に組み込まれるかまたは吸着されたＤＮＡサンプルの分解に対して保護する。固体媒体は、ＤＮＡサンプルが、遺伝子型分析のために、サンプル中でのＤＮＡ回収に適切な形態で保存または輸送されることを可能にする。ＤＮＡサンプルは、例えば、ＦＴＡＴＭペーパー、Ｗｈａｔｍａｎｎ（登録商標）ペーパー、Ｇｉｂｓｏｎペーパー、Ｇｕｔｈｒｉｅカード、スワブおよび濾紙の上に収集され得そして保存され得る。好ましい実施形態において、ＤＮＡサンプルはＦＴＡペーパー上で保存される。濾紙上に収集された血液または組織を、乾燥し得、そして室温で保存し得る。
【００８２】
塩およびアルコールの溶液を使用してＤＮＡを沈殿する方法は、当業者に周知であり、そして本開示の範囲内に包含される。好ましい実施形態において、本開示の沈殿方法は、引き続くＤＮＡ増幅反応を阻害し得る任意の化学物質を取り除くために、固体媒体上のＤＮＡサンプルを水（例えば、蒸留水、脱イオン水または超濾過水）で洗浄する工程で開始する。好ましい実施形態において、ＤＮＡサンプルは水で繰り返し洗浄される。次に、この固体媒体を塩およびアルコールを含む溶液で処理する（これはサンプル中のＤＮＡを沈殿する）。沈殿工程の後、このＤＮＡは、固体支持体上に固定される。好ましい実施形態において、ＤＮＡを沈殿するために使用される塩は、好ましくは約０．１Ｍ〜約０．５Ｍの濃度、より好ましくは約０．２Ｍ〜約０．３Ｍの濃度の酢酸ナトリウムまたは酢酸カリウムまたは酢酸アンモニウムである。別の好ましい実施形態において、ＤＮＡを沈殿するために使用されるアルコールは、好ましくは、約７０％〜約１００％の純度レベル、より好ましくは約９５％の純度レベルの、イソプロパノール、エタノール、またはｎ−プロパノールのような他の同様な水混和性溶媒である。ＤＮＡを沈殿するための沈殿溶液中のアルコールに対する塩の適切な比率を決定することは、当業者の範囲内で十分である。好ましい実施形態において、この比率は５０／５０（ｖ／ｖ）である。
【００８３】
ＤＮＡを沈殿した後、このＤＮＡを、沈殿工程からのサンプル中に残存する任意の塩を溶解するために、アルコールで洗浄する。この工程はまた、サンプルの脱水を加速し得る。好ましい実施形態において、沈殿したＤＮＡを洗浄するために使用されるアルコールは、好ましくは約８０％〜約９５％の純度レベル、より好ましくは約７０％の純度レベルの、イソプロパノール、エタノール、またはｎ−プロパノールのような他の同様な水混和性溶媒である。興味深いことに、ＦＴＡペーパー上のＤＮＡサンプルが、開示される沈殿方法を使用して処理される場合、最終的なＤＮＡペーパーは赤褐色の血液を残すのみであり得る。それにもかかわらず、ＦＴＡペーパー上で処理されたＤＮＡを、ここで、当業者に公知のＤＮＡ増幅の多くの方法のうちの任意の１つによって効率的かつ予測可能に増幅し得、それらの方法としては、本開示のＤＮＡ増幅方法ならびにＰＣＲＴＭが挙げられるが、これらに限定されない。従って、本発明で開示された方法は、固体支持体上に保存されたＤＮＡサンプルを市販の試薬を使用して処理する場合に見出される、ＤＮＡ増幅効率の多様性を大いに低減する。
【００８４】
さらに、本発明で開示された沈殿方法において使用される溶液（水、アルコール、および塩を含む）は、高価でなくかつ作製するのに容易である。従って、この開示された沈殿方法はまた、特に、他の市販の試薬と比較する場合、高スループット操作のコストを大いに低減する。例えば、このエタノール洗浄は、水ベースのＦＴＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔプロトコルと比較した場合、ＦＴＡペーパーの脱水のための時間を少なくとも５０％低減し得る。さらに、ＦＴＡペーパー上に保存されたＤＮＡサンプルを分析するための、沈殿およびＤＮＡ増幅のための本願で開示された方法は、全て、９６ウェルプレートまたは３８４ウェルプレート中で行われ得、このことは、高スループット操作を大いに容易にする。
【００８５】
開示される沈殿方法および／またはＤＮＡ増幅方法を使用して処理される、固体支持体上のサンプルＤＮＡの遺伝子型分析、または本開示の好ましい方法によって増幅されるＤＮＡの遺伝子型分析は、当業者に周知である種々の方法および技術を使用して、実施され得る。高スループットスクリーニングのためのＤＮＡ増幅の開示される方法によって提供される利点は、非常に多くの生物の遺伝子型が診断目的または研究目的のために迅速にスクリーニングされ得るということである。用語「遺伝子型分析」とは、遺伝的分類（ｇｅｎｅｔｉｃ  ｔｙｐｉｎｇ）、遺伝子型分類（ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ）、フィンガープリンティング、ハプロタイプ分類（ｈａｐｌｏｔｙｐｉｎｇ）、ＤＮＡ分類、または任意の類似の語句のいずれかの型をいう。この用語は、１つ以上の遺伝子座で個体の遺伝子型（ハプロタイプを同定することを含む）を決定するための、当業者に公知の任意の方法またはプロトコルの使用を包含する。核酸ベースの技術としては、サイズ分画、ＳＮＰ分析、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）ハイブリダイゼーション、配列決定、ＲＦＬＰ分析、変性温度分析、および質量分析が挙げられるが、これらに限定されない。当業者に利用可能な方法論は、数多くあり、そして継続的に発展しており、そして本明細書中で詳述することはできない。多型の多くの型は、増幅したＤＮＡを使用して決定され得、これらの型としては、ＳＮＰ、ＲＦＬＰ、ＶＮＴＲ、ＳＴＲ、ＣＴＲおよびミクロサテライトが挙げられるが、これらに限定されない。
【００８６】
一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）は、多くの遺伝子病ならびに所望され得る表現型特性を同定することにおいて、予測的に有益なヌクレオチド配列改変体であり、これらはしばしば集団において限定された数の異なる変異によって原因とされる。ＳＮＰはゲノムＤＮＡのコード領域および非コード領域の両方に見出される。スコア付け可能（ｓｃｏｒａｂｌｅ）な表現型は小数ではあるが、ＳＮＰはヒトゲノム全体に非常に多数見出される（Ｃｏｏｐｅｒら、Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅｔ  ６９：２０１−２０５、１９８５）。特定のＳＮＰは、例えば、遺伝性乳癌のような疾患原因性変異を生じる（Ｃａｎｎｏｎ−ＡｌｂｒｉｇｈｔおよびＳｋｏｌｎｉｃｋ、Ｓｅｍｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  ２３：１−５、１９９６）。開示される方法によるＤＮＡ増幅が、個体におけるＳＮＰまたは他の多型の検出において有用であり得ることが特に企図される。多型についてスクリーニングする現在の方法は、公知である（例えば、米国特許第６，２２１，５９２号、および同第５，６７９，５２４号を参照のこと）。しかし、これら技術の制限は、シグナルを増強しそして検出を容易にするための複数のコピーのゲノムＤＮＡを提供することが不可能であることである。開示される方法は、例えば個体のゲノムの全長にわたりランダムにプライマー付けされた（ｐｒｉｍｅｄ）核酸配列の、迅速で高スループットのＤＮＡ増幅を容易にすることによって、この問題を克服する。ＳＮＰまたは多型を含有する各領域の複数のコピーが、開示される方法を使用するＤＮＡ複製の後にサンプル中の存在するので、標準的なＳＮＰ検出方法を利用して、検出可能なシグナルを生成する可能性が、増加する。
【００８７】
ＳＮＰは、当業者に周知の多くの方法によって生物体のＤＮＡ中に同定され得る。これら方法としては、以下によってＳＮＰを同定することが挙げられるが、これらに限定されない：ＰＣＲＴＭまたはＤＮＡ増幅、オリゴヌクレオチドライゲーションアッセイ（ＯＬＡ）（Ｌａｎｄｅｇｒｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４１：１０７７、１９８８）、二重コードＯＬＡ、ミスマッチハイブリダイゼーション、質量分析、１塩基伸長アッセイ、対立遺伝子特異的制限エンドヌクレアーゼ切断に基づくＲＦＬＰ検出（ＫａｎおよびＤｏｚｙ、Ｌａｎｃｅｔ  ｉｉ：９１０−９１２、１９７８）、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプローブとのハイブリダイゼーション（Ｗａｌｌａｃｅら、Ｎｕｃｌ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ６：３５４３−３５５７、１９７８）（固定化オリゴヌクレオチド（Ｓａｉｋｉら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８６：６２３０−６２３４、１９８９）またはオリゴヌクレオチドアレイ（ＭａｓｋｏｓおよびＳｏｕｔｈｅｒｎ、Ｎｕｃｌ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ２１：２２６９−２２７０、１９９３）を含む）、対立遺伝子特異的ＰＣＲＴＭ（Ｎｅｗｔｏｎら、Ｎｕｃｌ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  １７：２５０３−１６、１９８９）、ミスマッチ修復検出（ＭＲＤ）（ＦａｈａｍおよびＣｏｘ、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ  ５：４７４−４８２，１９９５）、ＭｕｔＳタンパク質の結合（Ｗａｇｎｅｒら、Ｎｕｃｌ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ２３：３９４４−３９４８、１９９５）、一本鎖構造多型検出（Ｏｒｉｔａら、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ５：８７４−８７９、１９８３）、ミスマッチ塩基対でのＲＮＡａｓｅ切断（Ｍｙｅｒｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３０：１２４２、１９８５）、ヘテロ二重鎖ＤＮＡの化学的切断（Ｃｏｔｔｏｎら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８５：４３９７−４４０１、１９８８）または酵素的切断（Ｙｏｕｉｌら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９２：８７−９１、１９９５）、対立遺伝子特異的プライマー伸長に基づく方法（Ｓｙｖａｎｅｎら、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ８：６８４−６９２、１９９０）、遺伝子のビット分析（ＧＢＡ）（Ｎｉｋｉｆｏｒｏｖら、Ｎｕｃｉ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ２２：４１６７−４１７５、１９９４）、ならびに当該分野で周知の標準的手順を使用する放射性ＤＮＡ配列決定および／または蛍光ＤＮＡ配列決定。
【００８８】
好ましくは、同定されたＳＮＰは、表現型（疾患表現型および所望の表現型特性を含む）に関連される。開示される方法の増幅されたＤＮＡ産物もまた使用して、特に第一プライマーおよび第二プライマーの一般的な配列がＤＮＡ産物のクローニングを容易にするための制限酵素部位を含む場合、ゲノムＤＮＡライブラリーを含むＤＮＡライブラリーを生成し得る。さらに、現在開示される方法は、任意の染色体領域に対するバンド特異的ペインティングプローブの迅速な構築を可能とし、そしてまたこの方法を使用して異常な核型において、同定できない染色体領域またはマーカー染色体をミクロ解剖し得、そして増幅し得る。従って、開示される方法は、遺伝子型分析および高スループットスクリーニングのために価値あるツールであるだけでなく、また、細胞遺伝的診断において価値あるツールでもある。
【００８９】
一塩基伸長アッセイを、相補的な核酸にオリゴヌクレオチドプライマーをアニーリングすることによって、そして鎖終結ヌクレオチド（ＤＮＡポリメラーゼにより触媒されるテンプレート指向性反応において添加される）と共に、アニーリングされたプライマーの３’末端を伸長することによって、実施する。一塩基プライマー伸長反応の選択性および感度は、オリゴヌクレオチドプライマーの長さおよび反応条件（例えば、アリーリング温度および塩濃度）によって影響される。プライマー伸長反応の選択性は、サンプル中のオリゴヌクレオチドプライマーと核酸との間の正確な相補的ハイブリダイゼーションの量を反映する。高度に選択性の反応は、正確な相補配列を有する核酸にのみプライマーのハイブリダイゼーションを促進する（すなわち、ハイブリダイズしたプライマーと核酸との間に塩基ミスマッチは存在しない）。対照的に、非選択性反応において、このプライマーはまた、部分的に相補的な配列を有する核酸にハイブリダイズする（すなわち、ハイブリダイズしたプライマーと核酸との間に塩基ミスマッチが存在する）。一般的に、選択的プライマーハイブリダイゼーション（例えば、より短いプライマーおよびより高いアニーリング温度）に好都合であるパラメーターは、より低いレベルのハイブリダイズしたプライマーを生じる。従って、選択的一塩基プライマー伸長アッセイに好都合なパラメーターは、アッセイの選択性を低下させる結果となる。
【００９０】
さらに、サイクル化一塩基伸長反応は、検出される一塩基を含む領域に対して５’に、核酸プライマーを迅速にアニーリングすることによって実施され得る。２つの分離した反応が行われる。第一反応において、プライマーは相補的な核酸にアニーリングされ、そして検出される１塩基で非野生型改変体に相補的な標識化核酸、および野生型に相補的な非標識化ジデオキシ核酸を組み合わせる。プライマー伸長を、塩基がプライマーに付加される第一時間に停止する。伸長されたプライマー中の標識の存在は、非野生型改変体の存在の指標である。ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、ＳｅｑｕｅｎａｓｅＴＭ（Ａｍｅｒｓｈａｍ））をプライマー伸長のために使用する。好ましい実施形態において、より効率的なサイクル化を可能とするために、熱安定性ポリメラーゼ（例えば、Ｔａｑまたは熱シーケナーゼ（ｓｅｑｕｅｎａｓｅ））が使用される。一旦、伸長反応が完了すると、標的核酸に結合した第一プローブおよび第二プローブは、そのハイブリッドの融解温度より高く反応混合物を加熱することによって、解離される。次いで、反応混合物は、ハイブリッドの融解温度より下に冷やし、そしてさらなるプライマーは、伸長反応の別の回のために、標的核酸と会合することが可能とされる。全てのサイクルの完了後、伸長生成物を単離し、そして分析する。あるいは、ジデオキシヌクレオチド以外の鎖終結方法を使用し得る。例えば、鎖終結は、プライマー上で次に利用可能なヌクレオチドで、さらなる塩基が組み込みに対して利用可能でない場合に生じる。
【００９１】
開示された方法を使用して増幅されたＤＮＡからの遺伝子情報を分析する、特に強力な手段は、ＤＮＡチップ技術である。オリゴヌクレオチドプローブまたはポリヌクレオチドプローブのアレイを含むＤＮＡチップおよびＤＮＡマイクロアレイを使用して、標的ヌクレオチド核酸が、特定の参照配列と同一なヌクレオチド配列を有するか、または異なるヌクレオチド配列を有するかどうかを決定し得る。基本的なチップまたはマイクロアレイは、固体支持体上に固定化されたオリゴヌクレオチドプローブまたはポリヌクレオチドプローブのアレイを包含する。スクリーニングおよび検出のためのチップは、配列が公知である１つ以上の選択配列に対して相補性を示すプローブを含むよう設計される。参照配列自体またはその配列の改変体のいずれかを含む標的配列を読むために、チップを使用する。標的配列は、１つ以上の位置で参照配列とは異なり得るが、参照配列と、全体で高度な配列同一性を示す（例えば、少なくとも、７５％、９０％、９５％、９９％、９９．９％、９９．９９％）。標的配列の固定化プローブへのハイブリダイゼーションは、検出可能なシグナルを生じる。シグナルは、例えば、プローブにおいて生じる構造変化、結合したプローブ中に組み込まれた標識の消光もしくは励起、または標的中に組み込まれた標識の消光もしくは励起によって、送達され得る。シグナルの送達は、手動でか、機械でか、デジタル的に読まれ得る。本明細書中で参考として援用される多くの特許は、ＤＮＡチップおよびＤＮＡマイクロアレイの調製および使用を開示し、これらの特許としては、米国特許第５，８３７，８３２号、同第６，１５６，５０１号、同第６，１７４，６８３号、および同第５，９８５，５６７号が挙げられる。さらに、対立遺伝子特異的プライマー伸長を、ＳＮＰの高スループット遺伝子型分類のために、プライマーアレイと組み合わせ得る（Ｐａｓｔｉｎｅｎら、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ  １０（７）：１０３１−４２、２０００（これは、本明細書中で参考として援用される）を参照のこと）。
【００９２】
本開示の内容において、開示される方法のＤＮＡ増幅産物が、例えばＳＮＰのような遺伝子多型または変異を含む、特定の遺伝子配列を検出するために、ＤＮＡチップまたはＤＮＡマイクロアレイを使用して分析され得ることが企図される。１つの実施形態において、ゲノムＤＮＡが本開示の方法を利用して増幅されて、理論上全ゲノム配列を包含するＤＮＡ配列のライブラリーを作製することが想起される。次いで、増幅されたＤＮＡ産物を、オリゴヌクレオチドプローブまたはポリヌクレオチドプローブを含有するＤＮＡチップまたはＤＮＡマイクロアレイの上を通過させ得る。増幅されたＤＮＡが、そのマイクロアレイまたはＤＮＡチップにハイブリダイズ可能であること、または不可能であることは、ＤＮＡサンプル中に存在する、特定の配列およびそれらの多型の特徴付けを容易にする。
【００９３】
本開示の１つの実施形態は、染色体の蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）分析を包含する。最初に、目的の染色体ＤＮＡサンプルを入手する。このサンプルは、ＹＡＣ染色体のインサート、ミクロ解剖された染色体のサンプル、コスミドＤＮＡのインサート、ＰＡＣ  ＤＮＡのインサート、プラスミドのインサート、またはファージ（例えば、ラムダファージ）のインサートであり得る。例えば、ＹＡＣ  ＤＮＡは、パルスフィールド電気泳動ゲル上で、他の酵母染色体から単離され得る。一旦入手すると、このＤＮＡを、開示される方法によって増幅する。次いで、この増幅されたＤＮＡを、増幅産物中に組み込まれる標識化ヌクレオチド塩基を含むさらなるＰＣＲによって標識し得る。ＤＮＡを標識するためにＰＣＲを使用することは、当業者に周知である。この標識としては、ビオチン、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ−ＯｒａｎｇｅまたはＳｐｅｃｔｒｕｍ−Ｇｒｅｅｎが挙げられ得るが、これらに限定されない。ＤＮＡを増幅するために開示される方法を使用することは、ＤＮＡの前精製を必要とせず、そしてこの方法は、他のＤＮＡ増幅ストラテジー以上に、プローブ調製の速度およびＦＩＳＨシグナルの質において実質的な改善を生じる。このような信頼性のあるＦＩＳＨシグナルを入手可能なことは、種々のヒト腫瘍における共通の転座の存在についてのスクリーニングの新規方法を可能とする。
【００９４】
さらに、標識化増幅ＤＮＡを、間期または、好ましくは分裂中期の広がりのような染色体調製物にハイブリダイズさせ得る。分裂中期の広がりにおいて、染色体を、短くしそして濃縮し（ｔｈｉｃｋｅｎ）、そしてより容易に視認化しそして同定する。標識化プローブとのハイブリダイゼーションは、特定の染色体、および増幅されたプローブが由来する染色体上の位置を決定することを、可能にする。増幅された標識化プローブをまた、中期核にハイブリダイズさせて、核内のハイブリダイゼーション部位の数を決定し得る。ビオチンで標識化された、ハイブリダイズしたプローブは、フルオレセイン−イソチオシアネート結合体化アビジンを用いて、蛍光顕微鏡下で視認され得る。Ｓｐｅｃｔｒｕｍ−ＯｒａｎｇｅまたはＳｐｅｃｔｒｕｍ−Ｇｒｅｅｎで標識されたプローブは、蛍光顕微鏡によって直接視認される。
【００９５】
本開示の方法および好ましい実施形態は、上に記載した。多くの技術および方法が、当業者に周知であり、そしてこれらを使用して、実行者が本開示の方法を実行するのを支援し得る。以下は、これら技術のうちのいくつかの一般的な記載である。
【００９６】
（核酸：）
遺伝子は、情報をコードする生物体のゲノム中のＤＮＡ配列であり、この情報は、細胞全体を構成する種々の産物へと転換される。遺伝子は転写のプロセスによって発現され、このプロセスはＤＮＡの配列をＲＮＡにコピーする工程を包含する。大部分の遺伝子はタンパク質を作製するための情報をコードするが、いくつかは他のプロセスに関与するＲＮＡをコードする。遺伝子がタンパク質をコードする場合、その転写産物はｍＲＮＡ（「メッセンジャー」ＲＮＡ）と呼ばれる。核内（ここにＤＮＡが位置する）での転写の後、このｍＲＮＡは翻訳プロセスのために細胞質中へと輸送され、この翻訳プロセスはｍＲＮＡのコードをアミノ酸の配列へと転換し、タンパク質を形成する。ｍＲＮＡの輸送を細胞質中へと向けるために、ｍＲＮＡ分子の３’末端はいくつかのアデニル化残基の付加によって転写後修飾されて「ポリＡ」テールを形成する。この特徴的な修飾は、タンパク質を作製するよう決定付けられた遺伝子発現産物を、細胞中のほかの分子と区別し、これによって、細胞の遺伝子発現活性を検出およびモニターするための１つの手段を提供する。
【００９７】
（１．オリゴヌクレオチドのプローブおよびプライマー）
「相補的」である核酸配列は、標準的なワトソン−クリックの相補性規則に従って塩基対合可能である核酸配列である。すなわち、より大きなプリンは、より小さなピリミジンと塩基対合して、シトシンと対合したグアニン（Ｇ：Ｃ）および、ＤＮＡの場合はチミンと対合したアデニン（Ａ：Ｔ）、またはＲＮＡの場合はウラシルと対合したアデニン（Ａ：Ｕ）のいずれかの組み合わせを形成する。ハイブリダイズする配列中に、イノシン、５−メチルシトシン、６−メチルアデニン、ヒポキサンチンなどのような、余り一般的でない塩基を含むことは、対合することを阻害しない。本明細書中で使用される場合、用語「相補的」配列とは、上記の同じ核酸比較によって評価され得るように、または本明細書中に記載される条件のような、比較的ストリンジェントな条件下で記載される核酸セグメントにアニーリングし得るものとして規定されるように、実質的に相補的である核酸配列を意味する。
【００９８】
本明細書中に規定されるように、用語プライマーは、テンプレート依存的プロセスにおいて新生の核酸の合成を開始（ｐｒｉｍｅ）し得る任意の核酸を含むことが意味される。
配列特異的プライマーは、標的化されたＲＮＡ配列またはＤＮＡ配列への特異的なアニーリングを提供するのに十分な長さであるべきである。以下の長さの間のヌクレオチドのプライマーの使用は、安定かつ選択的の両方である二重鎖分子の形成を可能とするが、本開示の内容においてより短いプライマーおよびより長いプライマーが具体的に企図される：約５ヌクレオチド長、約６ヌクレオチド長、約７ヌクレオチド長、約８ヌクレオチド長、約９ヌクレオチド長、約１０ヌクレオチド長、約１１ヌクレオチド長、約１２ヌクレオチド長、約１３ヌクレオチド長、約１４ヌクレオチド長、約１５ヌクレオチド長、約１６ヌクレオチド長、約１７ヌクレオチド長、約１８ヌクレオチド長、約１９ヌクレオチド長、約２０ヌクレオチド長、約２１ヌクレオチド長、約２２ヌクレオチド長、約２３ヌクレオチド長、約２４ヌクレオチド長、約２５ヌクレオチド長、約２６ヌクレオチド長、約２７ヌクレオチド長、約２８ヌクレオチド長、約２９ヌクレオチド長、約３０ヌクレオチド長、約３１ヌクレオチド長、約３２ヌクレオチド長、約３３ヌクレオチド長、約３４ヌクレオチド長、約３５ヌクレオチド長、約３６ヌクレオチド長、約３７ヌクレオチド長、約３８ヌクレオチド長、約３９ヌクレオチド長、約４０ヌクレオチド長、約４１ヌクレオチド長、約４２ヌクレオチド長、約４３ヌクレオチド長、約４４ヌクレオチド長、約４５ヌクレオチド長、約４６ヌクレオチド長、約４７ヌクレオチド長、約４８ヌクレオチド長、約４９ヌクレオチド長、約５０ヌクレオチド長、約５１ヌクレオチド長、約５２ヌクレオチド長、約５３ヌクレオチド長、約５４ヌクレオチド長、約５５ヌクレオチド長、約５６ヌクレオチド長、約５７ヌクレオチド長、約５８ヌクレオチド長、約５９ヌクレオチド長、約６０ヌクレオチド長、約６１ヌクレオチド長、約６２ヌクレオチド長、約６３ヌクレオチド長、約６４ヌクレオチド長、約６５ヌクレオチド長、約６６ヌクレオチド長、約６７ヌクレオチド長、約６８ヌクレオチド長、約６９ヌクレオチド長、約７０ヌクレオチド長、約７５ヌクレオチド長、約８０ヌクレオチド長、約８５ヌクレオチド長、約９０ヌクレオチド長、約９５ヌクレオチド長、および約１００ヌクレオチド長以上。最初のＤＮＡ増幅工程について、５〜９ヌクレオチド塩基ほどのヌクレオチド塩基のハイブリダイゼーションが企図される。ハイブリッドの安定性および選択性を増大させるために、２０塩基長より多いストレッチにわたる相補的配列が一般的に、引き続く増幅工程のために好ましく、これよって、得られる特定のハイブリッド分子の質および程度を向上させる。
【００９９】
より短いプライマーは、インビボでの接近し易さを作り、そして増大するのがより容易であるが、多くの他の因子がハイブリダイゼーションの特異性を決定するのに関与する。
プライマーの、その相補的標的に対する結合親和性および配列特異性の両方が、長さが増加するにつれて増大する。以下のヌクレオチド塩基対の例示的なプライマーを使用することが企図されるが、他のものも同様に企図される：約５ヌクレオチド塩基対、約６ヌクレオチド塩基対、約７ヌクレオチド塩基対、約８ヌクレオチド塩基対、約９ヌクレオチド塩基対、約１０ヌクレオチド塩基対、約１１ヌクレオチド塩基対、約１２ヌクレオチド塩基対、約１３ヌクレオチド塩基対、約１４ヌクレオチド塩基対、約１５ヌクレオチド塩基対、約１６ヌクレオチド塩基対、約１７ヌクレオチド塩基対、約１８ヌクレオチド塩基対、約１９ヌクレオチド塩基対、約２０ヌクレオチド塩基対、約２１ヌクレオチド塩基対、約２２ヌクレオチド塩基対、約２３ヌクレオチド塩基対、約２４ヌクレオチド塩基対、約２５ヌクレオチド塩基対、約２６ヌクレオチド塩基対、約２７ヌクレオチド塩基対、約２８ヌクレオチド塩基対、約２９ヌクレオチド塩基対、約３０ヌクレオチド塩基対、約３１ヌクレオチド塩基対、約３２ヌクレオチド塩基対、約３３ヌクレオチド塩基対、約３４ヌクレオチド塩基対、約３５ヌクレオチド塩基対、約３６ヌクレオチド塩基対、約３７ヌクレオチド塩基対、約３８ヌクレオチド塩基対、約３９ヌクレオチド塩基対、約４０ヌクレオチド塩基対、約４１ヌクレオチド塩基対、約４２ヌクレオチド塩基対、約４３ヌクレオチド塩基対、約４４ヌクレオチド塩基対、約４５ヌクレオチド塩基対、約４６ヌクレオチド塩基対、約４７ヌクレオチド塩基対、約４８ヌクレオチド塩基対、約４９ヌクレオチド塩基対、約５０ヌクレオチド塩基対、約５１ヌクレオチド塩基対、約５２ヌクレオチド塩基対、約５３ヌクレオチド塩基対、約５４ヌクレオチド塩基対、約５５ヌクレオチド塩基対、約５６ヌクレオチド塩基対、約５７ヌクレオチド塩基対、約５８ヌクレオチド塩基対、約５９ヌクレオチド塩基対、約６０ヌクレオチド塩基対、約６１ヌクレオチド塩基対、約６２ヌクレオチド塩基対、約６３ヌクレオチド塩基対、約６４ヌクレオチド塩基対、約６５ヌクレオチド塩基対、約６６ヌクレオチド塩基対、約６７ヌクレオチド塩基対、約６８ヌクレオチド塩基対、約６９ヌクレオチド塩基対、約７０ヌクレオチド塩基対、約７５ヌクレオチド塩基対、約８０ヌクレオチド塩基対、約８５ヌクレオチド塩基対、約９０ヌクレオチド塩基対、約９５ヌクレオチド塩基対、および約１００ヌクレオチド塩基対以上。
従って、ヌクレオチド配列は、遺伝子、ＤＮＡもしくはＲＮＡの相補的ストレッチとの二重鎖分子を選択的に形成するその配列の能力について、またはより具体的には、細胞、細胞溶解物および組織に直接的もしくは間接的に由来するＤＮＡもしくはＲＮＡを含む、ＤＮＡ調製物もしくはＲＮＡ調製物の増幅のためのプライマーを提供するその配列能力について、選択され得る。本開示のプローブおよびプライマーを使用して、ＤＮＡを増幅し、そして遺伝子、遺伝子発現の変化、遺伝子多型、一ヌクレオチド多型、そして任意の種から目的の任意の遺伝子が視覚的に検出され得る場合のｍＲＮＡ発現の変化を検出する。標的ポリヌクレオチドは、ＲＮＡ分子、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ＤＮＡまたは増幅されたＤＮＡである。アニーリングのストリンジェンシーおよびプライマーの領域を変動することによって、異なる標的を発見し得る。
【０１００】
プライマーは、当該分野で周知の方法によって化学的に合成され得る。化学合成方法は、ポリ核酸配列内の実質的に任意の場所に配置される、蛍光標識、放射性標識などのような検出可能な標識の配置を可能とする。当業者に公知の、オリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドを合成する固相方法ならびに他の方法が、本開示の内容中で使用され得る。
【０１０１】
広範な種々の適切な検出手段または認識手段が当該分野で公知であり、そしてプライマー中に組み込まれ得ることが特に企図される。そのような標識としては：蛍光標識、放射性標識、質量標識、親和性標識、色素団、色素、電気的発光、化学発光、酵素タグ、または他のリガンド（例えば、アビジン／ビオチンもしくは抗体）が挙げられるがこれらに限定されず、これらは検出され得、そして以下に記載される。
【０１０２】
（２．ＤＮＡ増幅）
最も知られた増幅方法の一つは、ＰＣＲＴＭであり、ＰＣＲＴＭは、米国特許第４，６８３，１９５号、同第４，６８３，２０２号および同第４，８００，１５９号（各々が本明細書中に参考として援用される）に詳細に記載される。ＰＣＲＴＭがＤＮＡ増幅を実施する受容可能な手段であると考えられる一方、本開示の方法は、当業者に周知であり、そして以下に簡単に考察される代替の増幅技術を使用して実施され得ることが具体的に企図される。ＰＣＲＴＭにおいて、核酸に選択的にハイブリダイズするプライマーの対は、選択的ハイブリダイゼーションを可能にする条件下で使用される。本明細書中で使用される場合、用語プライマーは、鋳型依存的プロセスにおいて、新生の核酸の合成をプライムし得る任意の核酸分子を含む。プライマーは、二本鎖形態または一本鎖形態で提供され得るが、一本鎖形態が好ましい。プライマーは、所定の鋳型サンプル中に存在する標的遺伝子配列を増幅するために、多くの鋳型依存的プロセスの任意の１つにおいて使用される。
【０１０３】
開示されるＤＮＡ増幅方法のための核酸標的は、当該分野で周知の技術によって増幅され得る任意の核酸または任意の核酸アナログであると一般的に考えられる。一例として、本開示の文脈において具体的に企図される標的核酸としては、以下が挙げられ得るがこれらに限定されない：ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、コスミドＤＮＡ、ＢＡＣ  ＤＮＡ、ＰＡＣ  ＤＮＡ、ＹＡＣ  ＤＮＡおよび合成ＤＮＡ。企図される実施形態において、ゲノムＤＮＡは、原核生物あるいは真核生物の細胞または組織由来であり、そして開示されるＤＮＡ増幅方法においてサンプルＤＮＡとして利用される。他の実施形態において、ポリＡ  ｍＲＮＡが単離され、そしてｃＤＮＡを得るために逆転写（ＲＴと呼ばれる）され、次いでｃＤＮＡは、本発明の開示される方法を使用するＤＮＡ増幅のためのサンプルＤＮＡとして使用される。他の企図される実施形態において、ｃＤＮＡが得られ得、そして増幅されるべきサンプルＤＮＡとして使用され得る。なお別の実施形態において、ＲＮＡまたはｍＲＮＡは、開示されるＤＮＡ増幅方法を使用して直接増幅される（ここで出発材料は、ＤＮＡサンプルではなくＲＮＡサンプルである）。
【０１０４】
（ｉ．ＰＣＲＴＭ）
ＰＣＲＴＭにおいて、標的遺伝子配列の、反対の相補鎖における領域に相補的である２つのプライマー配列が調製される。標的遺伝子配列がサンプル中に存在する場合、このプライマーは、ハイブリダイズしてＤＮＡ：プライマーハイブリッドを形成する。過剰のデオキシリボヌクレオシド三リン酸が、鋳型依存的核酸合成を促進するＤＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｔａｑポリメラーゼ）とともに反応混合物に添加される。
【０１０５】
ＤＮＡ：プライマーハイブリッドが形成される場合、ポリメラーゼは、ヌクレオチドを付け足すことによって、標的遺伝子配列に沿ってプライマーを伸長させる。反応混合物の温度を上昇および低下させることによって、伸長されたプライマーが標的遺伝子から解離して反応産物を形成し、過剰のプライマーが標的遺伝子および反応産物に結合し、そしてこのプロセスが繰り返される。これらの多重ラウンドの増幅（「サイクル」と呼ばれる）が、十分量の増幅産物が産生されるまで行われる。
【０１０６】
次に、増幅産物が検出される。特定の用途において、この検出は、視覚的手段によって実施され得る。あるいは、この検出は、蛍光標識、化学発光、取り込まれた放射標識または標識されたヌクレオチドの取り込みの放射活性シンチグラフィー、質量標識を介してか、または電気的インパルスシグナルまたは温度インパルスシグナルを使用するシステムまでも介して、産物の間接的同定を含み得る。
【０１０７】
（ｉｉ  ＬＣＲ）
増幅のための別の方法は、リガーゼ連鎖反応（「ＬＣＲ」）である（本明細書中に参考として援用される欧州特許出願第３２０，３０８号に開示される）。ＬＣＲにおいて、２つの相補的プライマー対が調製され、そして標的配列の存在下で各対が、隣接するように標的の反対の相補鎖に結合する。リガーゼの存在下で、この２つのプローブ対が連結して、単一の単位を形成する。ＰＣＲＴＭのような温度サイクリングによって、結合された連結化単位は標的から解離し、次いで過剰のプローブ対のライゲーションのための「標的配列」として働く。本明細書中に参考として援用される米国特許第４，８８３，７５０号は、標的配列へのプローブ対の結合に関する、ＬＣＲに類似の方法を記載する。
【０１０８】
（ｉｉｉ．Ｑβ  レプリカーゼ）
ＰＣＴ特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ８７／００８８０に記載されるＱβ  レプリカーゼはまた、本開示におけるなお別の増幅方法として使用され得る。この方法において、ＲＮＡポリメラーゼの存在下で、標的配列の領域に相補的な領域を有するＲＮＡの複製的配列が、サンプルに添加される。このポリメラーゼは、複製的配列（これは、次いで検出され得る）をコピーする。
【０１０９】
（ｉｖ．等温増幅）
等温増幅方法（制限部位の１つの鎖においてヌクレオチド５’−［α−チオ］−三リン酸を含む標的配列の増幅を達成するために、制限エンドヌクレアーゼおよびリガーゼが使用される）はまた、ＤＮＡ増幅において有用であり得る。このような増幅方法は、Ｗａｌｋｅｒら（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ  ２０（７）：１６９１〜１６９６，１９９２）（本明細書中に参考として援用される）によって記載される。
【０１１０】
（ｖ．鎖置換増幅）
鎖置換増幅（ＳＤＡ）は、核酸の等温増幅を実施する別の方法であり、鎖置換および合成（すなわち、ニックトランスレーション）の多重ラウンドを含む。ＳＤＡ技術は、米国特許第５，７１２，１２４号、同第５，６４８，２１１号および同第５，４５５，１６６号（本明細書中に参考として援用される）に記載される。同様の方法（修復連鎖反応（ＲＣＲ）と呼ばれる）は、増幅のために標的化された領域全体にわたっていくつかのプローブをアニールする工程を包含し、これに４塩基のうち２塩基だけが存在する修復反応が続く。他方の２塩基は、容易な検出のためにビオチン化誘導体として添加され得る。同様のアプローチがＳＤＡにおいて使用される。
【０１１１】
（ｖｉ．環状プローブ反応）
標的特異的配列はまた、環状プローブ反応（ＣＲＰ）を使用して検出され得る。ＣＲＰにおいて、非特異的ＤＮＡの３’配列および５’配列を有する配列ならびに特異的ＲＮＡの中央の配列は、サンプル中に存在するＤＮＡにハイブリダイズされる。ハイブリダイゼーションの際に、この反応物は、ＲＮａｓｅＨで処理され、そして特有の産物として同定されたプローブの産物が、消化後に放出される。元の鋳型は、別の環状プローブにアニールされ、そしてこの反応が繰り返される。
【０１１２】
（ｖｉｉ．転写に基づく増幅）
本開示の文脈において具体的に企図される他の核酸増幅手順として、転写に基づく増幅系（ｒＡＳ）（核酸配列に基づく増幅（ＮＡＳＢＡ）および３ＳＲ、Ｋｗｏｈら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃｓｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、８６：１１７３〜１１７７、１９８９；ＰＣＴ特許出願ＷＯ８８／１０３１５など、１９８９（各々は本明細書中に参考として援用される）を含む）が挙げられる。
【０１１３】
ＮＡＳＢＡにおいて、核酸は、標準的なフェノール／クロロホルム抽出、臨床サンプルの熱変性、溶解緩衝液での処理ならびにＤＮＡおよびＲＮＡの単離用のミニスピンカラムまたはＲＮＡの塩酸グアニジン抽出によって増幅用に調製され得る。これらの増幅技術は、標的特異的配列を有するプライマーをアニーリングする工程を包含する。重合の後、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドは、ＲＮａｓｅＨで消化され、一方二本鎖ＤＮＡ分子は、再び熱変性される。いずれの場合においても、一本鎖ＤＮＡは、第二の標的特異的プライマーを添加することによって完全な二本鎖にされ、次いで、重合される。次いで、この二本鎖ＤＮＡ分子は、Ｔ７またはＳＰ６のようなポリメラーゼによって多数回転写される。等温のサイクル反応において、ＲＮＡは、二本鎖ＤＮＡに逆転写され、そしてＴ７またはＳＰ６のようなポリメラーゼによって、もう一度転写される。得られた産物は、（短縮されていても完全であっても）標的特異的配列を示す。
【０１１４】
（ｖｉｉｉ．他の増幅方法）
英国特許出願ＧＢ２，２０２，３２８、およびＰＣＴ特許出願ＰＣＴ／ＵＳ８９／０１０２５（各々は本明細書中に参考として援用される）に記載されるような他の増幅方法が、本開示に従って使用され得る。前者の出願では、「改変された」プライマーが、ＰＣＲＴＭのような鋳型および酵素に依存的な合成において使用される。これらのプライマーは、捕捉部分（例えば、ビオチン）および／または検出部分（例えば、酵素）で標識されることによって改変され得る。後者の用途において、過剰の標識化プローブが、サンプルに添加される。標的配列の存在下で、このプローブは結合し、そして触媒的に切断される。切断後、この標的配列は過剰のプローブによって結合されるようにインタクトで離される。標識化プローブの切断は、標的配列の存在を知らしめる。
【０１１５】
Ｄａｖｅｙら、欧州特許出願番号３２９，８２２（本明細書中に参考として援用される）は、一本鎖ＲＮＡ（「ｓｓＲＮＡ」）、ｓｓＤＮＡ、および二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）（本開示に従って使用され得る）を循環的に合成する工程を包含する核酸増幅プロセスを開示する。このｓｓＲＮＡは、第一プライマーオリゴヌクレオチドのための第一鋳型であり、これは逆転写酵素（ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ）によって伸長される。次いで、このＲＮＡは、リボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅＨ、ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれかとの二重鎖中のＲＮＡに特異的なＲＮａｓｅ）の作用によって、得られたＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖から取り除かれる。得られたｓｓＤＮＡは、第二プライマーのための第二鋳型であり、これは、第二プライマーの、鋳型に対して相同な部分の５’側にＲＮＡポリメラーゼプロモーターの配列（Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼによって例示される）もまた含む。次いで、これらのプライマーは、ＤＮＡポリメラーゼ（Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡポリメラーゼＩの大きい「クレノウ」フラグメントによって例示される）によって伸長され、プライマー間に元のＲＮＡの配列と同一の配列を有し、加えて一方の末端においてプロモーター配列を有する二本鎖ＤＮＡ分子を生じる。このプロモーター配列は、ＤＮＡの多くのＲＮＡコピーを作製するために、適切なＲＮＡポリメラーゼによって使用され得る。次いで、これらのコピーは、非常に速い増幅に導くサイクルに再び入り得る。酵素を適切に選択して、この増幅は、各サイクルにおいて酵素を添加することなく等温で行われ得る。このプロセスの周期性の性質に起因して、出発核酸配列は、ＤＮＡであってもＲＮＡであってもよい。
【０１１６】
Ｍｉｌｌｅｒら、ＰＣＴ特許出願ＷＯ８９／０６７００（本明細書中に参考として援用される）は、標的一本鎖ＤＮＡへのプロモーター／プライマー配列のハイブリダイゼーション（この配列の多くのＲＮＡコピーの転写が後に続く）に基づく核酸配列増幅スキームを開示する。このスキームは、循環性のスキームではない。すなわち、得られたＲＮＡ転写物から、新たな鋳型が産生されない。
【０１１７】
他の適切な増幅方法は、「ｒａｃｅＰＣＲＴＭおよび「片側（ｏｎｅ−ｓｉｄｅｄ）ＰＣＲＴＭ」を含む（Ｆｒｏｈｍａｎ、ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ中のＡ  Ｇｕｉｄｅ  Ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．，１９９０、各々は本明細書中に参考として援用される）。得られた「ジ−オリゴヌクレオチド」の配列を有する核酸配列の存在下での、２つの（またはそれより多い）オリゴヌクレオチドのライゲーションに基づく方法（それによってジ−オリゴヌクレオチドを増幅する）はまた、本開示に従いＤＮＡを増幅するために使用され得る（Ｗｕら、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ４：５６０〜５６９，１９８９、本明細書中に参考として援用される）。
【０１１８】
（３．制限酵素）
制限酵素は、４〜８ヌクレオチド長の特定の短いＤＮＡ配列（以下の表１を参照のこと）を認識し、そしてこの配列内の部位でＤＮＡを切断する。本発明の開示の文脈において、制限酵素は、増幅反応の前かまたは増幅反応に続いて、種々の制限酵素認識部位に対応する部位においてＤＮＡ分子を切断するために使用され得る。
【０１１９】
種々の制限酵素についての認識部位に配列（例えば、以下の表１を参照のこと）は、当該分野で周知であるので、認識配列に対応するヌクレオチドを含むプライマーが設計され得る。プライマーセットは、制限認識配列に加えて、ヌクレオチド配列の異なる組合せに対応する変性配列を有し得る。以下の表１は、本開示において有用であり得る制限酵素およびそれらの切断部位を例示する。
【０１２０】
【表１−１】
2004532643.tif 000002
【０１２１】
【表１−２】
2004532643.tif 000003
【０１２２】
【表１−３】
2004532643.tif 000004
【０１２３】
【表１−４】
2004532643.tif 000005
【０１２４】
【表１−５】
2004532643.tif 000006
【０１２５】
【表１−６】
2004532643.tif 000007
（４．他の酵素）
ポリメラーゼは、予め存在する核酸鋳型上で核酸の合成を触媒して、リボヌクレオチドからＲＮＡ、またはデオキシリボヌクレオチドからＤＮＡを組み立てる酵素である。本開示の文脈において具体的に企図されるポリメラーゼは、天然に単離されたポリメラーゼ、改変されたポリメラーゼ、または合成ポリメラーゼであり得る。使用されるポリメラーゼは、熱安定性であることが一般的に企図されるが、非熱安定性ポリメラーゼもまた、本開示の文脈において使用され得る。表２および表３は、本開示の文脈において使用され得る例示的なポリメラーゼおよび核酸改変酵素を示す。
表２
ポリメラーゼ
熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ：
ＯｍｎｉＢａｓｅＴＭ配列決定酵素
Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ
Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ
Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、配列決定等級
ＴａｑＢｅａｄＴＭ  ホットスタートポリメラーゼ
ＡｍｐｌｉＴａｑ  Ｇｏｌｄ
Ｖｅｎｔ  ＤＮＡポリメラーゼ
Ｔｕｂ  ＤＮＡポリメラーゼ
ＴａｑＰｌｕｓ  ＤＮＡポリメラーゼ
Ｔｆｌ  ＤＮＡポリメラーゼ
Ｔｌｉ  ＤＮＡポリメラーゼ
Ｔｔｈ  ＤＮＡポリメラーゼ
ＤＮＡポリメラーゼ：
ＤＮＡポリメラーゼＩ、クレノウフラグメント、エキソヌクレアーゼマイナス
ＤＮＡポリメラーゼＩ
ＤＮＡポリメラーゼＩ  大（クレノウ）フラグメント
ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ
Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼ
Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ
逆転写酵素
ＡＭＶ逆転写酵素
Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素
表３
ＤＮＡ／ＲＮＡ改変酵素
リガーゼ：
Ｔ４ＤＮＡリガーゼ
キナーゼ：
Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ
（５．標識）
プライマーに組み込まれた認識部分、増幅の間に増幅産物に組み込まれた認識部分またはプローブに結合される認識部分は、増幅された分子の同定において有用である。以下のような多くの異なる標識が、この目的のために使用され得る：例えば、発蛍光団、発色団、放射性同位元素、酵素タグ、抗体、化学発光、電気発光、アフィニティー標識など。当業者は、これらの発蛍光団および本明細書中で述べられない他の発蛍光団もまた、本開示において首尾よく使用され得ることを認識する。
【０１２６】
アフィニティー標識の例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：抗体、抗体フラグメント、レセプタータンパク質、ホルモン、ビオチン、ＤＮＰまたはアフィニティー標識に結合し、そして増幅された遺伝子の分離のために使用され得る任意のポリペプチド／タンパク質分子。
【０１２７】
酵素タグの例としては、ウレアーゼ、アルカリホスファターゼ、またはペルオキシダーゼのような酵素が挙げられる。さらに、相補的核酸を含むサンプルとの特異的なハイブリダイゼーションを同定するために、比色分析の指標基質が、ヒトの目に可視であるかまたは分光光度測定的な検出手段を提供するために使用され得る。これらの例はすべて、当該分野において一般的に公知であり、そして当業者は、本開示が上記に記載の例に限定されないことを認識する。
【０１２８】
以下の発蛍光団は、本開示において有用であることが具体的に企図される：Ａｌｅｘａ  ３５０、Ａｌｅｘａ  ４３０、ＡＭＣＡ、ＢＯＤＩＰＹ  ６３０／６５０、ＢＯＤＩＰＹ  ６５０／６６５、ＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ、ＢＯＤＩＰＹ−Ｒ６Ｇ、ＢＯＤＩＰＹ−ＴＭＲ、ＢＯＤＩＰＹ−ＴＲＸ、Ｃａｓｃａｄｅ  Ｂｌｕｅ、Ｃｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ５、６−ＦＡＭ、フルオレセイン、ＨＥＸ、６−ＪＯＥ、Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ  ４８８、Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ  ５００、Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ  ５１４、Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｌｕｅ、ＲＥＧ、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ  Ｇｒｅｅｎ、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ  Ｒｅｄ、ＲＯＸ、ＴＡＭＲＡ、ＴＥＴ、テトラメチルローダミン、およびＴｅｘａｓ  Ｒｅｄ。
【０１２９】
（６．分離方法および定量化方法）
増幅後、分析目的または、より具体的には特異的な増幅が起こったかどうかを決定するために、互いに異なり、鋳型と異なり、そして過剰のプライマーと異なるいくつかの長さの増幅産物を分離することが望ましくあり得る。
【０１３０】
（ｉ．ゲル電気泳動）
一つの実施形態において、増幅産物は、標準的な方法（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ」、Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１３．７〜１３．９：１９８９）を使用するアガロースゲル電気泳動、アガロース−アクリルアミドゲル電気泳動またはポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分離される。ゲル電気泳動技術は、当該分野で周知である。
【０１３１】
（ｉｉ．クロマトグラフィー技術）
あるいは、クロマトグラフィー技術が、分離をもたらすために使用され得る。本開示において使用され得る多くの種類のクロマトグラフィーがある：吸着クロマトグラフィー、分配クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、および分子篩クロマトグラフィー、ならびにそれらを使用するための多くの特殊な技術（カラムクロマトグラフィー、紙クロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィーおよびガスクロマトグラフィーを含む）（Ｆｒｅｉｆｅｌｄｅｒ、Ｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｔｏ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、第２版、Ｗｍ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．、１９８２）。なお別の代替物は、例えば、ビオチンまたは抗原で標識された核酸生成物を、それぞれアビジンまたは抗体を保有するビーズで捕捉することである。
【０１３２】
（ｉｉｉ．微量流体技術）
微量流体技術は、マイクロキャピラリー（例として、ＡＣＬＡＲＡ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ  Ｉｎｃ．によって設計されたマイクロキャピラリーまたはＣａｌｉｐｅｒ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．によって設計されたＬａｂＣｈｉｐＴＭを含む）のようなプラットフォーム上での分離を含む。これらの微量流体プラットフォームは、他の分離技術に必要とされるマイクロリットル容量と対照的に、ナノリットル容量のサンプルのみを必要とする。遺伝子の分析に含まれるいくつかのプロセスの縮小化が、微量流体デバイスを使用して達成されている。例えば、ＮｏｒｔｈｒｕｐおよびＷｈｉｔｅに対する公開されたＰＣＴ出願番号ＷＯ９４／０５４１４（本明細書中に参考として援用される）は、試料から核酸を回収および増幅するための一体型微量ＰＣＲＴＭ装置を報告する。米国特許第５，３０４，４８７号、同第５，２９６，３７５号、および同第５，８５６，１７４号は、核酸分析に含まれる種々の処理操作および分析操作を組み入れる装置および方法を記載し、そして本明細書中で参考として援用される。
【０１３３】
（ｉｖ．キャピラリー電気泳動）
いくつかの実施形態において、増幅されたＤＮＡを解析するためのさらなる手段または代替の手段を提供することが望ましくあり得る。これらの実施形態において、マイクロキャピラリーアレイは、分析に使用されることが企図される。マイクロキャピラリーアレイ電気泳動は、一般的に、粒子状分離媒体で充填されても充填されなくてもよい細いキャピラリーまたはチャネルの使用を含む。キャピラリーを通すサンプルの電気泳動は、そのサンプルに関する、サイズに基づく分離プロフィールを提供する。マイクロキャピラリーアレイ電気泳動は、一般的に、サイズに基づく配列決定、ＰＣＲＴＭ産物分析、および制限フラグメントサイズ決定（ｓｉｚｉｎｇ）のための迅速な方法を提供する。これらのキャピラリーの容量に対する表面の高い比は、キャピラリー全体で実質的な温度の変動なしに、キャピラリー全体へのより高い電場の適用を可能にし、結果として、より迅速な分離を可能にする。さらに、共焦点画像化方法と組み合わされた場合、これらの方法は、アットモルの範囲内の感度（これは、放射活性配列決定方法の感度に匹敵する）を提供する。マイクロキャピラリー電気泳動デバイスを含む微量流体デバイスの微小製造（ｍｉｃｒｏｆａｂｒｉｃａｔｉｏｎ）は、例えば以下に詳細に議論される：Ｊａｃｏｂｓｏｎら、Ａｎａｌ  Ｃｈｅｍ，６６：１１０７〜１１１３，１９９４；Ｅｆｆｅｎｈａｕｓｅｒら、Ａｎａｌ  Ｃｈｅｍ，６６：２９４９〜２９５３，１９９４；Ｈａｒｒｉｓｏｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６１：８９５〜８９７，１９９３：Ｅｆｆｅｎｈａｕｓｅｒら、Ａｎａｌ  Ｃｈｅｍ，６５：２６３７  ２６４２，１９９３；Ｍａｎｚら  Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ  ５９３：２５３  ２５８，１９９２；および米国特許第５，９０４，８２４号（これらは、本明細書中に参考として援用される）。代表的には、これらの方法は、シリカ、シリコン、または他の結晶基材もしくはチップ上でのミクロン規模のチャネルの写真平版エッチングを含み、本開示における使用に容易に適応され得る。
【０１３４】
Ｔｓｕｄａら（Ａｎａｌ  Ｃｈｅｍ，６２：２１４９〜２１５２，１９９０）は、長方形のキャピラリー（円筒形のキャピラリーガラスチューブの代替物）を記載する。これらの系のいくつかの利点は、幅に対する高さ（ｈｅｉｇｈｔ−ｔｏ−ｗｉｄｔｈ）の大きな比、故に、それらの容量に対する表面（ｓｕｒｆａｃｅ−ｔｏ−ｖｏｌｕｍｅ）の高い比に起因するそれらの効率的な熱放散ならびに光学的なカラム上（ｏｎ−ｃｏｌｕｍｎ）検出様式のための、それらの高い検出感度である。これらの平面分離チャネルは、２次元分離（１つの力が分離チャンネルを横切って適用され、そしてサンプルゾーンが多重チャネルアレイ検出器の使用によって検出される）を実施する能力を有する。
【０１３５】
多くのキャピラリー電気泳動方法において、キャピラリー（例えば、ヒューズド（ｆｕｓｅｄ）シリカキャピラリーまたは平面の基材に加工されエッチングされたか、加工されるたもしくは成形されたチャネル）は、適切な分離／篩い分け（ｓｉｅｖｉｎｇ）マトリックスで満たされる。代表的には、当該分野で公知の種々のマトリックスが、マイクロキャピラリーアレイに使用され得る。このようなマトリックスの例としては、例えば、ヒドロキシエチルセルロース、ポリアクリルアミド、アガロースなどが挙げられる。一般に、特定の適用の分離特性（例えば、核酸フラグメントのサイズ、所望の分解能、およびネイティブの核酸分子または未変性の核酸分子の存在）を最大化するために、特定のゲルマトリックス、泳動緩衝液、および泳動条件が選択される。例えば、泳動緩衝液は、サンプル中の核酸を変性するために尿素のような変性剤、カオトロピック剤を含み得る。
【０１３６】
（ｖ．質量分析）
質量分析は、真空で分子をイオン化し、そしてそれらを揮発によって「飛ばす（ｆｌｙ）」ことにより、個々の分子を「秤量」する手段を提供する。電場および磁場の組合せの影響を受けて、イオンは、それらの個々の質量（ｍ）および電荷（ｚ）に依存して軌道をたどる。低分子量の分子について、質量分析法は、親分子イオンの質量を決定することによる有機分子の分析および特徴付けのための、慣用的な物理的有機レパートリーの一部である。さらに、この親分子イオンを他の粒子（例えば、アルゴン原子）と衝突させることによって、この分子イオンは、いわゆる衝突誘導化解離（ＣＩＤ）によってフラグメント化され、２次イオンを形成する。フラグメント化のパターン／経路は、頻繁に詳細な構造の情報の導出を可能にする。当該分野における質量分析方法の他の適用は、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１９３巻：「Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ」（Ｊ．Ａ．ＭｃＣｌｏｓｋｅｙ、編）、１９９０、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋに要約されている。
【０１３７】
ＭＳ／ＭＳ配置と連動したＣＩＤによる高い検出感度、質量測定の精度、詳細な構造の情報および速度、ならびにコンピューターへのオンラインデータ転送を提供することにおける、質量分析法の明らかな分析上の利点によって、核酸の構造解析のための質量分析法の使用は、かなりの関心が抱かれている。この分野をまとめた総説としては、（Ｓｃｈｒａｍ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ａｎａｌ，３４：２０３〜２８７，１９９０）および（Ｃｒａｉｎ，Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，９：５０５〜５５４，１９９０）（本明細書中に参考として援用される）が挙げられる。核酸に質量分析法を適用するための最大の難点は、これらの非常に極性のバイオポリマーを揮発させることの難しさである。従って、「配列決定」は、親分子イオンの質量を決定し、このことを介して既知の配列を確認するか、あるいは、特に、イオン化および揮発のために迅速な原子の衝撃（ＦＡＢ質量分析法）またはプラズマ脱離（ＰＤ質量分析法）の方法を利用するＭＳ／ＭＳ配置におけるＣＩＤを介しての２次イオン（フラグメントイオン）の産生を介して既知の配列を確認することによる、低分子量の合成オリゴヌクレオチドに限定される。例として、オリゴデオキシヌクレオチドの化学合成のための保護化二量体ブロックの分析へのＦＡＢの適用が記載されている（Ｋｏｓｔｅｒら、Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ  １４：１１１〜１１６，１９８７）。
【０１３８】
２つのイオン化／脱離技術は、電気スプレー／イオンスプレー（ＥＳ）およびマトリックス支援レーザー脱離／イオン化（ＭＡＬＤＩ）である。ＥＳ質量分析法は、Ｆｅｎｎら、Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．８８；４４５１〜４４５９、１９８４；ＰＣＴ出願第ＷＯ９０／１４１４８によって紹介され、その適用は、総論（例えば、Ｓｍｉｔｈら、Ａｎａｌ  Ｃｈｅｍ  ６２：８８２〜８９，１９９０、およびＡｒｄｒｅｙ、Ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ，Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ  Ｅｕｒｏｐｅ，４：１０〜１８，１９９２）中にまとめられている。質量分析器として、四重極が最も頻繁に使用される。フェムトモル量のサンプルにおける分子量の決定は、質量計算に使用され得る多くのイオンピークが存在するために、非常に正確である。
【０１３９】
対照的に、ＭＡＬＤＩ質量分析法は、質量分析器として飛行時間（ＴＯＦ）配置が使用される場合、特に魅力的であり得る。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法は、（Ｈｉｌｌｅｎｋａｍｐら、Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ  ＢｕｒｌｉｎｇａｍｅおよびＭｃＣｌｏｓｋｅｙ編者，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，４９〜６０頁、１９９０）によって紹介された。多くの場合、この技術では多重の分子イオンピークは産生されないので、原則的に質量スペクトルは、ＥＳ質量分析法と比較して、より単純に見える。４１０，０００ダルトンの分子量までのＤＮＡ分子は、脱離および揮発され得た（Ｗｉｌｌｉａｍｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４６：１５８５〜１５８７，１９８９）。より最近では、この技術での（ＵＶレーザーとは対照的な）赤外レーザー（ＩＲ）の使用が、２１８０ヌクレオチドまでのサイズの合成ＤＮＡ，プラスミドＤＮＡの制限酵素フラグメントおよびＲＮＡ転写物のようなより大きい核酸の質量スペクトルを提供することが示されている（Ｂｅｒｋｅｎｋａｍｐら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８１：２６０〜２６２，１９９８）。Ｂｅｒｋｅｎｋａｍｐはまた、ＤＮＡサンプルおよびＲＮＡサンプルが、ＭＡＬＤＩ―ＴＯＦ  ＩＲを使用する、制限されたサンプル精製によって解析され得る方法を記載する。
【０１４０】
日本国特許第５９−１３１９０９号において、電気泳動、液体クロマトグラフィーまたは高速ゲル濾過のいずれかによって分離された核酸フラグメントを検出する機器が記載される。質量分析の検出は、通常はＤＮＡ中に存在しない原子（例えば、Ｓ、Ｂｒ、ＩまたはＡｇ、Ａｕ、Ｐｔ、Ｏｓ、Ｈｇ）を核酸に取り込むことによって達成される。
【０１４１】
（ｖｉｉ、エネルギー移動）
ハイブリダイゼーションオリゴヌクレオチドプローブを蛍光標識で標識する技術は、当該分野で周知の技術であり、プローブハイブリダイゼーションの検出を促進するための高感度な、非放射活性の方法である。より最近開発された検出方法では、プローブハイブリダイゼーションの検出のために、蛍光強度の直接検出ではなく蛍光エネルギー移動（ＦＥＴ）のプロセスを使用する。ＦＥＴは、一方（アクセプター）の吸収スペクトルが、他方（ドナー）の発光スペクトルと重複し、そして２つの色素が近接している場合に、ドナー発蛍光団とアクセプター色素（これは発蛍光団であってもなくてもよい）との間で生じる。これらの特性を有する色素は、ドナー／アクセプター色素対またはエネルギー移動色素対と呼ばれる。ドナー発蛍光団の励起状態のエネルギーは、共鳴双極子に誘導された隣接のアクセプターとの双極子相互作用によって転移される。このことは、ドナーの蛍光のクエンチングを生じる。いくつかの場合において、アクセプターもまた発蛍光団である場合、その蛍光の強度は増強され得る。エネルギー移動の効率は、ドナーとアクセプターとの間の距離に大きく依存しており、そしてこれらの関係を予測する式がＦｏｒｓｔｅｒ，Ａｎｎ  Ｐｈｙｓ  ２：５５〜７５，１９４８によって開発されている。エネルギー移動効率が５０％である、ドナーとアクセプター色素との間の距離は、Ｆｏｒｓｔｅｒ距離（Ｒｏ）と呼ばれる。蛍光クエンチングの他のメカニズム（例えば、電荷移動および衝突クエンチングを含む）もまた、当該分野で公知である。
【０１４２】
クエンチングを生じさせるための、近接した２つの相互作用の関係に依存したエネルギー移動および他のメカニズムは、ヌクレオチド配列を検出または同定するための魅力的な手段である。なぜなら、このようなアッセイは、均一な形式で行われ得るからである。均一なアッセイ形式は、単一の発蛍光団標識の蛍光の検出による、従来のプローブハイブリダイゼーションアッセイと異なる。なぜなら、不均一のアッセイは、一般的に、遊離の標識からハイブリダイズした標識を分離するためのさらなる工程を必要とするからである。ＦＥＴハイブリダイゼーションアッセイに関するいくつかの形式が、Ｎｏｎｉｓｏｔｏｐｉｃ  ＤＮＡ  Ｐｒｏｂｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．、３１１〜３５２頁、１９９２）に概説される。
【０１４３】
核酸増幅の検出のための蛍光クエンチングのエネルギー移動または他のメカニズムを使用する均一な方法もまた記載されている。Ｈｉｇｕｃｈｉら（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：４１３〜４１７，１９９２）は、エチジウムブロマイドの増加された蛍光のモニタリングによってリアルタイムでＤＮＡ増幅を検出する（エチジウムブロマイドは、二本鎖ＤＮＡに結合するので）ための方法を開示する。エチジウムブロマイドの結合は、標的特異的ではなく、バックグラウンドの増幅産物もまた検出されるので、この方法の感度は制限される。Ｌｅｅら（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ  ２１：３７６１〜３７６６，１９９３）は、二重に標識された検出プローブがＰＣＲＴＭの間に標的増幅に特異的な様式で切断されるリアルタイム検出方法を開示する。この検出プローブは、増幅プライマーの下流にハイブリダイズされ、その結果、Ｔａｑポリメラーゼの５’−３’エキソヌクレアーゼ活性がその検出プローブを消化して、エネルギー移動対を形成する２つの蛍光色素を分離する。プローブが切断されるにつれて、蛍光強度は増加する。公開されたＰＣＴ出願ＷＯ９６／２１１４４は、核酸の酵素介在切断が増加された蛍光を生じる連続的な蛍光測定的アッセイを開示する。蛍光エネルギー移動は、標的へのハイブリダイゼーションによってクエンチされる単一の蛍光標識を使用する方法の状況においてのみの使用について示唆される。
【０１４４】
増幅プライマーのハイブリダイゼーション部位の下流の標的配列にハイブリダイズするシグナルプライマーまたは検出プローブは、核酸増幅の検出における使用について記載されている（米国特許第５，５４７，８６１号）。シグナルプライマーは、増幅プライマーの伸長と同様の様式で、ポリメラーゼによって伸長される。増幅プライマーの伸長は、標識の増幅に依存した様式でシグナルプライマーの伸長産物を置き換え、標的増幅の指標として検出され得る２本鎖の２次増幅産物を産生する。シグナルプライマーから産生された２次増幅産物は、種々の標識およびレポーター基、シグナルプライマー内の制限部位（これは、切断されて、特徴的なサイズのフラグメントを産生する）、捕捉基、ならびに３重らせんおよび２本鎖ＤＮＡ結合タンパク質の認識部位のような構造的特徴の手段によって検出され得る。
【０１４５】
多くのドナー／アクセプター色素対が当該分野で公知であり、そして本開示において使用され得る。ドナー／アクセプター色素対として、以下が挙げられるがこれらに限定されない：フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）／テトラメチルローダミンイソチオシアネート（ＴＡＬＩＣ）、ＦＩＴＣ／Ｔｅｘａｓ  ＲｅｄＴＭＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、ＦＩＴＣ／Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル（ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｍｉｍｉｄｙｌ）１−ピレンブチレート（ＰＹＢ）、ＦＩＴＣ／エオシンイソチオシアネート（ＥＩＴＣ）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル１−ピレンスルホネート（ＰＹＳ）／ＦＩＴＣ、ＦＩＴＣ／Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ  Ｘ、ＦＩＴＣ／テトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）など。特定のドナー／アクセプター発蛍光団対の選択は、重要ではない。エネルギー移動クエンチングメカニズムについて、ドナー発蛍光団の発光波長が、アクセプターの励起波長と重複すること（すなわち、効率的なエネルギー移動、電荷移動、または蛍光クエンチングを可能にするために２つの色素の間に十分なスペクトルの重複がなければならない）のみが必要とされる。Ｐ−（ジメチルアミノフェニルアゾ）安息香酸（ＤＡＢＣＹＬ）は、隣接の発蛍光団（例えば、フルオレセインまたは５−（２’−アミノエチル）アミノナフタレン（ＥＤＡＮＳ））からの蛍光を効率的にクエンチする非蛍光アクセプター色素である。検出核酸において蛍光クエンチングを生じさせる任意の色素対が、クエンチングを起こすメカニズムに関わらず、本開示の方法における使用に適切である。末端標識方法および内部標識方法は、共に当該分野で公知であり、そして検出核酸中の各々の部位でドナー色素とアクセプター色素とを連結させるために慣用的に使用され得る。
【０１４６】
（ｖｉｉｉ、マイクロアレイおよびチップ技術）
特に、マイクロアレイおよび／またはチップに基づくＤＮＡ技術（例えば、（Ｈａｃｉａら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ，１４：４４１〜４４９、１９９６）および（Ｓｈｏｅｍａｋｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１４：４５０〜４５６，１９９６）によって記載される技術）による増幅産物の使用または分析が、本開示で企図される。これらの技術は、多くの遺伝子を迅速かつ正確に分析するための定量的方法を包含する。チップ技術は、オリゴヌクレオチドで遺伝子をタギングするか、または固定化プローブアレイを使用することにより、標的分子を高密度アレイとして隔離し、ハイブリダイゼーションに基づいてこれらの分子をスクリーニングするために使用され得る（Ｐｅａｓｅら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，９１：５０２２〜５０２６，１９９４；Ｆｏｄｏｒら、Ｎａｔｕｒｅ，３６４：５５５〜５５６，１９９３）。
【０１４７】
（ｉｘ．ＯＩＡ）
増幅産物を定量するための、ＢｉｏＳｔａｒのＯＩＡ技術の使用もまた企図される。ＯＩＡは、基材としてシリコンウエハーの鏡様の表面を使用する。薄膜光学コーティングおよび捕捉抗体が、シリコンウエハーに接着される。コーティングを通って反射した白色光が、金色の背景色として現れる。この色は、光学的分子薄膜の厚さが変化するまで、変わらない。
【０１４８】
陽性のサンプルが、ウエハーに適用された場合、リガンドと抗体との間に結合が生じる。基質が添加されて質量の増大が完了された場合、分子薄膜における増加された厚さの結果として、金色から紫色／青色への対応する変色が生じる。この技術は、米国特許第５，５４１，０５７号（本明細書中に参考として援用される）に記載される。
【０１４９】
（ｘ．リアルタイムＰＣＲ）
増幅されたＲＮＡまたはＤＮＡは、リアルタイムＰＣＲ技術（Ｈｉｇｕｃｈｉら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：４１３〜４１７，１９９２）を使用して定量され得る。増幅産物（これは、同数のサイクルを完了し、そしてその直線範囲内にある）の濃度を決定することによって、元々のＤＮＡ混合物中の特異的標的配列の相対濃度を決定することが可能である。例えば、このＤＮＡ混合物が、異なる組織または細胞から単離されたＲＮＡから合成されたｃＤＮＡである場合、標的配列が由来する特異的ｍＲＮＡの相対存在量が、各組織または各細胞について決定され得る。増幅産物の濃度と相対的ｍＲＮＡ存在量との正比例は、増幅反応の直線範囲内でのみあてはまる。
【０１５０】
曲線のプラトー部分における標的ＤＮＡの最終濃度は、反応混合物中における試薬の利用可能性によって決定され、そして標的ＤＮＡの元々の濃度に依存しない。従って、ＲＮＡ集団またはＤＮＡ集団の収集物についてリアルタイムＰＣＲによってＲＮＡ種またはＤＮＡ種の相対的存在量が決定され得る前に満たさなくてはならない第一の条件は、反応産物が、それらの曲線のうちの直線部分にあるときに、増幅産物の濃度がサンプリングされなければならないということである。特定のｍＲＮＡ種の相対的存在量を首尾よく決定するためにＲＴ−ＰＣＲ実験について満たされなければならない第二の条件は、増幅可能なｃＤＮＡの相対濃度が、いくつかの独立した標準物質によって標準化されなければならないということである。リアルタイムＰＣＲ実験の目的は、サンプル中の全てのＲＮＡ種またはＤＮＡ種の平均存在量と相対的な、特定のＲＮＡ種またはＤＮＡ種の存在量を決定することである。
【０１５１】
（ｘｉ．ルミネックス（Ｌｕｍｉｎｅｘ））
ルミネックス技術は、色分けされたミクロスフィア上に固定された核酸産物の定量を可能にする。生体分子反応の大きさは、レポーターと呼ばれる第二の分子を使用して測定される。このレポーター分子は、ミクロスフィア上に分子を接着させることによって、反応の程度を知らしめる。ミクロスフィアおよびレポーター分子の両方が色分けされているので、デジタル信号処理が、各反応についてのリアルタイムの定量的データへのシグナルの変換を可能にする。標準的な技術は、米国特許第５，７３６，３０３号および同第６，０５７，１０７号（本明細書中に参考として援用される）に記載される。
【０１５２】
（８．同定方法）
標的遺伝子配列の増幅を確認するために、増幅産物は、可視化されなければならない。一つの代表的な可視化方法は、蛍光色素（例えば、エチジウムブロマイドまたはＶｉｓｔｒａ  Ｇｒｅｅｎ）でのゲルの染色およびＵＶ光の下での可視化を包含する。あるいは、増幅産物が、放射標識化ヌクレオチドまたは蛍光定量的に標識されたヌクレオチドによって組み込み標識される場合、増幅産物は、ｘ線フィルムに曝され得るか、または分離の後に適切な刺激スペクトルの下で可視化され得る。
【０１５３】
一つの実施形態において、可視化は、核酸プローブを使用して間接的に達成される。増幅産物を分離した後に、標識された核酸プローブが、増幅産物と接触される。このプローブは、好ましくは発色団に結合体化されるが、これは、放射性標識され得る。別の実施形態において、このプローブは、抗体またはビオチンのような結合パートナー（結合対の他方のメンバーが検出可能な部分を有する）に結合体化される。他の実施形態において、プローブは、蛍光色素または蛍光標識を取り込む。さらに他の実施形態において、プローブは、増幅された分子を検出するために使用され得る質量標識を有する。他の実施形態はまた、ＴａｑｍａｎＴＭプローブおよびＭｏｌｅｃｕｌａｒ  ＢｅａｃｏｎＴＭプローブの使用を企図する。なお他の実施形態において、標準プローブと組み合わされた固相捕捉方法が使用され得る。
【０１５４】
ＤＮＡ増幅産物中に取り込まれる標識の型は、分析に使用される方法によって決定される。キャピラリー電気泳動、微量流体電気泳動、ＨＰＬＣ、またはＬＣ分離が使用される場合、取り込まれる蛍光色素またはインターカレートされる蛍光色素のいずれかが、増幅産物を標識および検出するために使用される。サンプルは、標識種が検出器を通過して移動するにつれ、蛍光が定量されるという点で動的に検出される。任意の電気泳動方法、ＨＰＬＣまたはＬＣが分離に使用される場合、ＵＶ光の吸収（ＤＮＡに固有の特性であり、従って標識の付加を必要としない）によって産物が検出され得る。ポリアクリルアミドゲル電気泳動またはスラブゲル電気泳動が使用される場合、増幅反応のためのプライマーは、発蛍光団、発色団または放射性同位体で標識され得るか、または付随する酵素的反応によって標識され得る。酵素的検出は、プライマーへの酵素の結合（例えば、ビオチン：アビジン相互作用を介した結合）、次いでゲルにおける増幅産物の分離、次いで化学反応（例えば、ルミノールを用いて産生される化学発光）による検出を包含する。蛍光シグナルは、動的にモニターされ得る。放射性同位体または酵素反応での検出は、解析の前にゲル電気泳動での最初の分離、次いで固体支持体へのＤＮＡ分子のトランスファー（ブロット）を必要とする。ブロットが作製された場合、ブロットをプローブし、剥がし、次いで再プローブすることによって、そのブロットは複数回分析され得る。増幅産物が、質量分析器を使用して分離される場合、核酸は直接検出されるので、標識は必要とされない。
【０１５５】
２つの異なる特性に基づいて分離を達成するために、上記の多くの分離プラットフォームが結合され得る。例えば、いくつかのＰＣＲＴＭプライマーは、アフィニティー捕捉を可能にする部分と結合され得、一方いくつかのプライマーは、未改変のままである。改変としては、糖（レクチンカラムへの結合のため）、疎水性基（逆相カラムへの結合のため）、ビオチン（ストレプトアビジンカラムへの結合のため）、または抗原（抗体カラムへの結合のため）が挙げられ得る。サンプルは、アフィニティークロマトグラフィーカラムを通される。フロースルー画分が収集され、そして結合分画が（化学的切断または塩溶出などによって）溶出される。次いで、各サンプルは、個々の成分を同定するために、質量のような特性に基づいてさらに分画される。
【０１５６】
（１０．キット）
開示される増幅方法に必要な物質および試薬は、キット中に共に集められ得る。本開示のキットは、プライマーセットとともに、少なくとも本願方法を実施するために必要な酵素およびヌクレオチドを備える。好ましい実施形態において、このキットはまた、ＤＮＡサンプルからＤＮＡを増幅するための指示書を備える。
【０１５７】
本開示のキットはまた、一般的に予め選択された１つ以上のプライマーセットおよび／またはプローブ（これらは、増幅されるべき遺伝子に特異的であっても非特異的であってもよい）を備える。好ましくは、このキットは、適切な容器中に、１つ以上の核酸プローブおよび／またはプライマーセットならびに核酸を検出するための手段を備える。特定の実施形態において、増幅反応における使用のためのキットなどにおいて、核酸を検出するための手段は、発蛍光団、放射標識、酵素タグなどのような標識（これは核酸プライマーまたはヌクレオチド自体に連結される）であり得る。キットが本開示の各ＤＮＡ増幅工程のためのプライマーセットの対を備え得ることが想定される。キットが、本開示の沈殿方法に従って固体媒体上で保存されるＤＮＡサンプルを処理するための沈殿溶液を備え得ることがまた想定される。
【０１５８】
好ましいキットは、全ゲノムＤＮＡを増幅する際の使用に適切なキットである。好ましいキットにおいて、第一プライマーは、好ましくは、その３’末端に無作為配列のヌクレオチドおよび無作為配列の一般的な５’を有するように提供される（これは、ＤＮＡに無作為にハイブリダイズする）。このキットはまた、好ましくは、第一プライマーの一般的な配列と同じ一般的な配列を有する第二プライマーを備える。例えば、このキットは、全ての遺伝子ならびに染色体領域、生物由来の未知および／または既知の全ゲノムＤＮＡまたは染色体ＤＮＡを増幅するために使用され得る。増幅のために必須の単回反応混合物を提供するために、核酸の増幅に適切な酵素（種々のポリメラーゼ（ＲＴ、Ｔａｑなど）を含む）、デオキシリボヌクレオチド、および緩衝液もまた、キット中に備えられ得る。
【０１５９】
本開示のキットはまた、上記のような種々の他の部分のうちの１つ以上を有するプライマーを備え得る。
【０１６０】
各場合において、このキットは、好ましくは個々の試薬および酵素について、ならびに各プローブまたはプライマー対について異なる容器を有する。各生物学的因子は、一般的にそれらのそれぞれの容器中に適切に等分される。このキットの容器手段は一般に、少なくとも１つのバイアルまたは試験チューブを備える。試薬を入れて、そして等分するフラスコ、ボトル、および他の容器手段もまた、あり得る。このキットの個々の容器は、好ましくは、市販のために厳重に封じ込めて維持される。より大きい適切な容器としては、注射用プラスチック容器またはブロー成形プラスチック容器（その中に所望のバイアルが保持される）が挙げられ得る。好ましくは、指示書がキットと共に提供される。
【実施例】
【０１６１】
以下の実施例は、本開示の好ましい実施形態を明示するために盛り込まれる。以下の実施例中に開示される技術は、本発明者らによって発見された技術が本発明の実施においてうまく機能することを表し、そして故に本発明の実施のための好ましい様式を構成するとみなされ得ることが当業者によって理解されるべきである。しかし、当業者は、本開示に照らして、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、開示される具体的な実施形態において、多くの変更が成され得、そしてなお類似の結果または同様の結果が得られ得ることを理解するべきである。
【０１６２】
（実施例１）
ここに開示される沈殿方法および商業的に製造されるＦＴＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｗｈａｔｍａｎにより製造される）プロトコールを使用して処理されたＦＴＡペーパー上に保存されたＤＮＡサンプルのＰＣＲＴＭ増幅の効率を比較した。第一にＦＴＡペーパー上に保存された４つの血痕ＤＮＡサンプルを、開示される沈殿方法を以下のプロトコールに従って使用して処理した：ＦＴＡペーパーサンプルの小さな円（１〜３ｍｍ）を、市販のＨａｒｒｉｓ  Ｍｉｃｒｏ−Ｐｕｎｃｈ（Ｓｈｕｎｄｅｒｓｏｎ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ，Ｏｔｔａｗａ，Ｏｎｔａｒｉｏ，Ｃａｎａｄａにより製造される）によって切り出し、そして蒸留水で洗浄した。この円を、９６ウェルプレートに移し、そして２００μｌのＤＤ水に２０分間浸した。水を取り替え、そしてこの円を再び５分間水に浸した。次に水を、２００μｌの０．３ＭのＮａＯＡｃ／エタノール（５０／５０  ｖ／ｖ）溶液に取替え、そしてこのペーパーを５分間浸して、ゲノムＤＮＡをペーパー上に固定した。この溶液を除去し、そしてこのペーパーを２００μｌの８０％エタノールで５分間洗浄して、塩を除き、そして脱水を促進した。エタノールを除去し、そしてこのペーパーを室温で１５分間乾燥させた。このエタノール洗浄は、ＦＴＡペーパーサンプルの脱水時間を少なくとも５０％低減した。次いで、脱水した紙を、ＰＣＲ増幅のためのＤＮＡとして直接使用した。
【０１６３】
第二に、ＦＴＡペーパー上に保存された４つの同じ血痕ＤＮＡサンプルを、市販のＦＴＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔを製造者のプロトコールに従って処理した。簡単にいうと、各サンプルについて、ＦＴＡペーパーサンプル中の小さな円（１〜３ｍｍ）を、Ｈａｒｒｉｓ  Ｍｉｃｒｏ−Ｐｕｎｃｈによって切り出した。この円を、９６ウェルプレートに移し、そして２００μｌのＦＴＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔに５分間浸した。ＦＴＡ試薬を取り替え、そして洗浄を２回繰り返した。ＦＴＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔを３回取り替えた後、２００μｌのＴＥ緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０および０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ）を、このペーパーに添加した。ＦＴＡペーパーを、ＴＥに５分間浸し、次いでＴＥ溶液を取り除き、そしてこのペーパーを１時間風乾した。次いで、脱水されたペーパーをＰＣＲ増幅に直接使用した。
【０１６４】
両方の脱水紙サンプルのセットを、以下の条件で増幅した。各々のＰＣＲのための反応混合物は、ＤＮＡ−ペーパーサンプル、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５０ｍＭ  ＫＣｌ、０．００１％  ゼラチン、３００μＭ  ｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＴＴＰ）、５’−ＣＣＴＴＴＴＣＣＴＣＴＡＧＣＡＴＣＡＡＧＴＴＡ−３’（配列番号１３）の配列を有する３００ｎＭのフォワードプライマー、５’−ＣＡＧＡＣＴＧＴＧＴＧＣＴＴＣＣＴＡＣＡＧ−３’（配列番号１４）の配列を有する３００ｎＭのリバースプライマー、および１．２５ユニットのＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（全量で５０μＭ）を含む。この反応液に対するサーモサイクルプログラム（ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｉｎｇ  ｐｒｏｇｒａｍ）は、９５℃で２分間；９５℃で３０秒、６６〜５１℃で３０秒間、および７２℃で３０秒間を１５「タッチダウン」サイクル；および９５℃で３０秒間、５０℃で３０秒間、および７２℃で３０秒間を３５サイクルであった。このＰＣＲ産物を、精製せずに、２．０％アガロースゲル電気泳動に供した。
【０１６５】
図２は、ＦＴＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔプロトコルト比較した、開示される沈殿方法を用いて処理したＦＴＡペーパー上に保存されるＤＮＡサンプルのダイレクトＰＣＲ増幅の結果を示す。図２は、開示される沈殿与方法は、市販のＦＴＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ＲｅａｇｅｎｔをＤＮＡサンプルの処理に用いる場合に見出されるＰＣＲ増幅効率の変動を大きく下げることを、明瞭に実証する。ここで開示される沈殿方法は、簡便さだけでなく、ＦＴＡペーパー上に保存されるＤＮＡサンプルをより速く処理する方法をも提供し、そのことはまた、サンプル処理のコストを下げ、そして引き続き行うＰＣＲ増幅およびＤＮＡサンプルの遺伝的分析を多いに最適化する。
【０１６６】
（実施例２）
本開示のゲノムＤＮＡ全体の増幅方法を、ＦＴＡペーパー上に保存されるウシ血痕サンプルからのゲノムＤＮＡを増幅するのに用いた。この方法は、ウシ血痕サンプル中のゲノムＤＮＡを、単一のサーモサイクル反応を用いて、単一の反応混合物中で増幅させることにより、単一の操作において、ＤＮＡの抽出および増幅を組み合わせる。従って、この方法は、サンプルの混入の危険性を大幅に下げ、そして高スループットスクリーニングを容易にする。さらに、９６ウェルまたは３８４ウェルプレートを、本開示方法を用いて、ＦＴＡペーパー上に保存されるゲノムＤＮＡの増幅に対して利用し得、高スループットスクリーニングを非常に容易にする。開示されるＤＮＡ増幅の方法の有用性および効率を、開示される方法により増幅したＤＮＡおよびＦＴＡペーパーに直接的に結合したＤＮＡを用いて、公知のウシＳＮＰ座のＰＣＲ増幅と比較することにより試験した。両実験とも、ＦＴＡペーパー上に保存されるＤＮＡサンプルを、実施例１に記載されるように、開示される沈殿方法を用いて処理した。従って、本実施例は、特に遺伝的分析のための、ＤＮＡ増幅の本開示方法の有効性を試験するために設計される。
【０１６７】
１３頭の個々のウシ動物について、血痕サンプルを収集し、そしてＦＴＡペーパー上に保存した。ＦＴＡペーパーサンプルを、開示される沈殿方法を用いて処理し、ゲノムＤＮＡを、開示されるＤＮＡ増幅方法を用いて、１セットのサンプルから増幅した。脱水した各々の紙サンプルを、以下の条件で増幅した。初めに、ＤＮＡサンプルを、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ（ｐＨ  ８．３）、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５０ｍＭ  ＫＣｌ、０．００１％ゼラチン、３００μＭ  ｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＴＴＰ）、配列番号１の配列を有する３００ｎＭの第一プライマー、配列番号２の配列を有する３００ｎＭの第二プライマー、および１．２５ユニット  Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼを含む増幅反応混合物（全量で約５０μｌ）に入れた。反応液全体を９５℃で５分間加熱してサンプルを変性した。
【０１６８】
次いで、第一セットのＤＮＡ増幅反応の間、反応混合物を９５℃の温度で１分間加熱し、そして４２℃の温度で５分間冷却した。これらの工程は、第一プライマーを、変性したサンプルＤＮＡおよびＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼにアニーリングさせ、第一プライマーの３’末端からのＤＮＡの相補的な鎖を合成した。この変性、アニーリング、および伸長の工程を、９５℃で１分間の反応混合物の加熱、次いで４２℃で５分間の反応混合物の冷却により、再び繰り返した。
【０１６９】
第二セットのＤＮＡ増幅反応は、引き続き、反応混合物を９５℃の温度で１５秒間の加熱し、反応混合物を６５℃の温度まで冷却して第二プライマーを一本鎖ＤＮＡ産物にアニーリングさせ、混合物の温度を６８℃まで上げることを含み、それによってＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼは、第二プライマーの３’末端からのＤＮＡの相補鎖を合成した。これらの変性、アニーリング、および伸長の工程を３９回（全体で４０回）繰り返した。
【０１７０】
脱水したＤＮＡサンプルのセットを、開示される沈殿方法のみを用いて処理し、そして、開示される沈殿方法を用いて処理し、そして開示されるＤＮＡ増幅方法を用いて増幅しをＤＮＡサンプルのセットを、次いで以下の条件を用いたＰＣＲ増幅に供した。各々のＰＣＲのための反応混合物は、脱水したＤＮＡ−ペーパーサンプルまたは２０ｎｇの増幅ゲノムＤＮＡいずれか、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５０ｍＭ  ＫＣｌ、０．００１％  ゼラチン、３００μＭ  ｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＴＴＰ）、配列５’−ＣＣＡＧＣＡＧＴＴＣＴＧＡＡＴＧＡＡＡＧＴ−３’（配列番号１５）を有する３００ｎＭのフォワードプライマー、配列５’−ＡＣＡＣＡＣＡＧＡＧＧＣＣＧＴＧＴＡ−３’（配列番号１６）を有する３００ｎＭのリバースプライマー、および１．２５ユニットのＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（全量で５０μｌ）を含む。この反応液に対するサーモサイクルプログラムは、９５℃で２分間；９５℃で３０秒間、６６〜５１℃で３０秒間、および７２℃で３０秒間を１５「タッチダウン」サイクル；および９５℃で３０秒間、５０℃で３０秒間、および７２℃で３０秒間を３５サイクルであった。
【０１７１】
図３は、開示される沈殿方法に従って処理したＤＮＡサンプル（パネル上段）ならびに開示される沈殿方法およびＤＮＡ増幅方法に従って処理した同一のＤＮＡサンプル（パネル下段）を用いた、既知のウシＳＮＰ座のダイレクトＰＣＲの産物を示す。ＰＣＲ産物は、長さが約２００ｂｐであり、公知のＤＮＡ配列から算出し長さと同じである。アガロースゲルの視覚的な画像は、ここに開示されるＤＮＡ増幅方法が、ＰＣＲを用いて容易に遺伝子型が決定され得る、ＤＤＮＡを生成することを示す。さらに、ＤＮＡ増幅方法は、ＦＴＡペーパーから直接単離し得るより、有意により多くの量のゲノムＤＮＡを生成する。遺伝子型の決定ためのＤＮＡ増幅による利用可能なゲノムＤＮＡ量の増加は、生物の遺伝子型のより広範な分析を可能にする。
【０１７２】
（実施例３）
本開示のＤＮＡ増幅方法の効率を比較するために、初めに、本開示沈殿方法または市販のＦＴＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔプロトコルを用いてＦＴＡペーパー上に保存したＤＮＡサンプルを処理し、次いで、開示したＤＮＡ増幅方法に従って増幅した。初めに、ＦＴＡペーパー上に保存した異なる６つの血痕から２セットのパンチ（ｐｕｎｃｈ）を、開示した沈殿方法またはＦＴＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔプロトコルのいずれか一方を用いて、実施例１に概略が記載されるように処理した。次いで、実施例２に概略が記載されるように、２セットのＤＮＡサンプルを、開示したＤＮＡ増幅方法に従って増幅した。
【０１７３】
図４は、開示したＤＮＡ増幅方法を用いた、増幅したゲノムＤＮＡ増幅の結果を例示する。この図は、ＤＮＡサンプルをＦＴＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔプロトコルを用いて処理する場合（レーン２〜７）対ＤＮＡサンプル開示した沈殿方法を用いて処理する場合（レーン８〜１３）の、開示したＤＮＡ増幅方法の効率を比較する。図４は、本開示ＤＮＡ増幅方法が、市販のＦＴＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔシステムよりも、開示した沈殿方法で処理したＦＴＡペーパー上の血痕から、非常に大量のゲノムＤＮＡを生成することを、明確に実証する。
【０１７４】
（実施例４）
ＤＮＡを増幅するための、本開示のＤＮＡ増幅方法の一般的な適応性を実証するために、ゲノムＤＮＡの増幅のための第一プライマーおよび第二プライマーを作製するために、一連の属特有のＤＮＡ配列を用いた。初めに、ＦＴＡペーパー上の各々のＤＮＡサンプルを、実施例１に概略が記載されるようように、本開示の沈殿方法を用いて処理した。次いで、各々の反応において異なるプライマーセットを用いたことを除いて、実施例２に概略が記載されるようように、開示したＤＮＡ増幅方法に従って、処理したＤＮＡサンプルを増幅した。プライマーの各々のセットは、下記に並べた第二プライマーならびに、５’末端に第二プライマーと同じ共通の配列、および３’に６つのランダムなヌクレオチドを有する第一プライマーを含む：
５’―ＡＣＡＡＣＧＣＡＧＡＧＴＡＡＧＣＡＧＴＧＧＴＡ―３’、配列番号３；
５’―ＡＣＡＡＣＧＧＴＡＧＣＡＧＡＧＴＡＡＧＣＡＧＴ―３’、配列番号４；
５’―ＧＡＧＴＡＡＧＣＡＧＴＡＣＡＡＣＧＧＴＡＧＣＡ―３’、配列番号５；
５’―ＧＡＧＧＣＡＴＡＡＧＣＡＧＴＡＣＡＡＣＧＧＴＡ―３’、配列番号６；
５’―ＣＡＡＣＧＧＴＡＧＡＧＧＣＡＴＡＡＧＣＡＧＴＡ―３’、配列番号７；
５’―ＧＧＣＡＴＡＡＧＣＡＧＴＡＣＡＡＣＧＧＴＡＧＡ―３’、配列番号８；
５’―ＡＡＣＧＧＴＡＧＡＧＧＣＡＴＡＡＧＣＡＧＴＡＣ―３’、配列番号９；
５’―ＡＧＴＡＣＡＡＣＧＧＴＡＧＡＧＧＣＡＴＡＡＧＣ―３’、配列番号１０；
５’―ＡＡＧＣＡＧＴＡＣＡＡＣＧＧＴＡＧＡＧＧＣＡＴ―３’、配列番号１１；
５’―ＣＧＧＴＡＧＡＧＧＣＡＴＡＡＧＣＡＧＴＡＣＡＡ―３’、配列番号１２；
例えば、配列番号３の配列を有する第二プライマーを含むプライマーセットにおいて、同じＤＮＡ増幅反応における第一プライマーは、配列５’―ＡＣＡＡＣＧＣＡＧＡＧＴＡＡＧＣＡＧＴＧＧＴＡＮＮＮＮＮＮ―’（配列番号１７）を有した。
図５に示されるように、全てのプライマーセットは、ＦＴＡペーパー上に保存したサンプル由来のゲノムＤＮＡを増幅し得た。図５の各々のレーンのゲノムＤＮＡの増幅に用いたプライマーセットは、以下の第二プライマーを用いた：レーン２、配列番号３；レーン３、配列番号４；レーン４、配列番号５；レーン５、配列番号６；レーン６、配列番号７；レーン７、配列番号８；レーン８、配列番号９；レーン９、配列番号１０；レーン１０、配列番号１１；およびレーン１１、配列番号１２。図５は、当業者が、本開示のＤＮＡ増幅方法に従って、効果的および均一な様式でＤＮＡを増幅するための第一および第二プライマーのための、広い範囲の適切な共通の配列を設計し得ることを実証する。
（実施例５）
ＤＮＡ増幅の開示方法のヌクレオチド配列レベルの確実性を、実施例２においてなされた比較と同様に、開示した方法で増幅したＤＮＡ、およびＦＴＡペーパーから直接増幅したＤＮＡを用いて、公知のウシＳＮＰ座のＰＣＲ増幅産物分析によって実験した。両実験において、ＦＴＡペーパー上に保存されたＤＮＡサンプルを、実施例１に記載したように、開示した沈殿方法を用いて処理した。８頭の個々のウシ動物について、血痕サンプルを収集し、ＦＴＡペーパー上に保存した。ＦＴＡペーパーサンプルを、開示した沈殿方法を用いて処理し、そしてゲノムＤＮＡを、実施例２に記載されるように、開示したＤＮＡ増幅方法を用いて１セットのサンプルから増幅した。次いで、脱水したＤＮＡサンプルおよび増幅したＤＮＡサンプルのセットを、実施例２に記載したようにＰＣＲ増幅に供した。その後、８頭の異なる個々のウシ動物の間で、ＳＮＰの変化量を検出するように設計したＤｏｕｂｌｅｃｏｄｅ  ＯＬＡ反応のセットにおいて、各々のセットに対するＰＣＲ産物を分析した。
ＳＮＰ検出に対するＤｏｕｂｌｅｃｏｄｅ  ＯＬＡは、参考として本明細書中に援用される米国出願番号０９／７５５，６２８に記載されており、図６で例証される。図６に記載されるように、Ｄｏｕｂｌｅｃｏｄｅ  ＯＬＡは、ＳＮＰ検出のために、４つの異なるオリゴヌクレオチドを必要とする。約５５℃の溶解温度（Ｔｍ）を、Ｄｏｕｂｌｅｃｏｄｅ  ＯＬＡにおいて利用した４つの各々のオリゴヌクレオチドに対して用いた。しかし、Ｄｏｕｂｌｅｃｏｄｅ  ＯＬＡ方法において用いたオリゴヌクレオチドは、ハイブリダイゼーションおよびＯＬＡ反応を促進する、任意の設計のオリゴヌクレオチドであり、そして特定のＴｍに依存しない。オリゴヌクレオチドのＴｍは算出され得、長さは多様なコンピュータソフトウェアプログラム（例えば、ウェブサイトｗｗｗ＠ｉｄｔｄｎａ．ｃｏｍで利用できるオリゴアナライザー（Ｏｌｉｇｏ  Ａｎａｌｙｚｅｒ））を用いて、当業者によって調整される。Ｄｏｕｂｌｅｃｏｄｅ  ＯＬＡで利用される全てのオリゴヌクレオチドおよびそれらの改変体は、市販されている。
第一ヌクレオチドは、部位（ａｄｄｒｅｓｓ）特異的Ｚｉｐｃｏｄｅオリゴヌクレオチドである。Ｚｉｐｃｏｄｅオリゴヌクレオチドの配列は、ランダムに選択したヌクレオチドから誘導され、Ｚｉｐｃｏｄｅの５’末端は、Ｃ１２スペーサーを有するアミノ基によって置換される。カラーコードビーズは、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドヒドロクロリド（ＥＤＣ）によって触媒されるカップリング反応を介して、Ｚｉｐｃｏｄｅオリゴヌクレオチドの５’末端に結合される。１つの実施形態において、カラーコードビーズは、Ｌｕｍｉｎｅｘ  カラーコードビーズである。Ｌｕｍｉｎｅｘ  カラーコードビーズは、それらの表面がカルボキシル基で特異的に改変されている。カルボジイミドは、カルボキシルを活性化してＯ−尿素誘導体を形成することにより、カルボン酸とアミンとの間での、アミド結合の形成を触媒する。この誘導体は、求核試薬（例えば、アミン）と容易に反応して、Ｚｉｐｃｏｄｅオリゴヌクレオチドをビーズの表面と結合する。
第二ヌクレオチドは、Ｃａｐｔｕｒｅオリゴヌクレオチドであり、これはその３’末端に標的ＳＮＰの５’側の相補的配列および二つのＳＮＰヌクレオチドの一つを含む。このＣａｐｔｕｒｅオリゴヌクレオチドは、その５’末端で、上記で選択したＺｉｐｃｏｄｅ配列の逆相補鎖であるＡｎｔｉＺｉｐｃｏｄｅ配列に適合する。Ｃａｐｔｕｒｅオリゴヌクレオチドの５’末端のＡｎｔｉＺｉｐｃｏｄｅ配列は、カラーコードビーズを有するＺｉｐｃｏｄｅオリゴヌクレオチドとハイブリダイズし、その一方で、Ｃａｐｔｕｒｅオリゴヌクレオチドの３’末端は、標的ＤＮＡ中の特定の部位にハイブリダイズする。
第三オリゴヌクレオチドは、Ｒｅｐｏｒｔｅｒオリゴヌクレオチドであり、これは、標的ＳＮＰの３’側（下流）の相補的配列を含む。このＲｅｐｏｒｔｅｒオリゴヌクレオチドは、その３’末端で、Ｓｉｇｎａｌｃｏｄｅという別のランダムに選択した配列に適合する。このＲｅｐｏｒｔｅｒオリゴヌクレオチドの５’末端ヒドロキシル基は、ホスフェート基で置換され、これにより、後者が３’末端において、標的ＤＮＡ中のＳＮＰと完全にアニーリングする場合、Ｔａｑリガーゼにより触媒されるＣａｐｔｕｒｅオリゴヌクレオチドとのライゲーション反応が促進される。第４オリゴヌクレオチドは、ＡｎｔｉＳｉｇｎａｌｃｏｄｅオリゴヌクレオチドであり、これは、上記で選択したランダムＳｉｇｎａｌｃｏｄｅ配列の逆相補鎖である。このＡｎｔｉＳｉｇｎａｌｃｏｄｅオリゴヌクレオチドの３’末端は、ストレパビジン−フィコエリスリン（ｓｔｒｅｐａｖｉｄｉｎ−ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ）複合体により後に染色され得るビオチンと適合する。
８頭の異なる個々のウシの、２組のＰＣＲ増幅産物においてＳＮＰを検出するためのＤｏｕｂｌｅｃｏｄｅ  ＯＬＡを、Ｚｉｐｃｏｄｅオリゴヌクレオチド、Ｃａｐｔｕｒｅオリゴヌクレオチド、Ｒｅｐｏｒｔｅｒオリゴヌクレオチド、ＡｎｔｉＳｉｇｎａｌｃｏｄｅオリゴヌクレオチド、およびＴａｑリガーゼを含む反応混合物において実施した。オリゴヌクレオチドによって検出されるように設計した特定のＳＮＰが、ＰＣＲ産物中に存在する場合、Ｃａｐｔｕｒｅオリゴヌクレオチドは、Ｔａｑリガーゼによって、Ｒｅｐｏｒｔｅｒオリゴヌクレオチドにライゲーションされ、そして単一のハイブリダイゼーション反応において、Ｚｉｐｃｏｄｅオリゴヌクレオチド上のカラーコードビーズによって同時に分類され、ならびに蛍光（ｆｌｕｏｒ）標識またはビオチン標識化ＡｎｔｉＳｉｇｎａｌｃｏｄｅオリゴヌクレオチドによって染色される。染色されたビーズの蛍光をフローサイトメーターで測定した。
反応で用いた３つのＺｉｐＣｏｄｅオリゴヌクレオチドは、５’−ＮＨ２−ＣＧＡＣＴＣＣＣＴＧＴＴＴＧＴＧＡＴＧＧＡＣＣＡＣ−３’（配列番号１８）；５’−ＮＨ２−ＣＴＴＴＴＣＣＣＧＴＣＣＧＴＣＡＴＣＧＣＴＣＡＡＧ−３’（配列番号１９）；および５’−ＮＨ２−ＧＧＣＴＧＧＧＴＣＴＡＣＡＧＡＴＣＣＣＣＡＡＣＴＴ−３’（配列番号２０）であった。Ｚｉｐｃｏｄｅオリゴヌクレオチドを、以下の手順に従ってビーズに結合した。ビーズを、１００μＬの０．１Ｍ  ＭＥＳ（ｐＨ４．５）中に分散させた。アミノ置換オリゴヌクレオチドを添加して最終濃度２μＭとした。次いで、５μｌの新たに処理したＥＤＣ溶液（１−エチル−３−［３−ジメチルアミノプロピル］カルボジイミドヒドロクロリド、１００μｇ／μｌ）を反応系に添加し、暗所で、室温で２０分間インキュベートした。ＥＤＣ溶液の添加および２０分間のインキュベートを繰り返した。その後、ビーズを０．０２％  Ｔｗｅｅｎ  ２０で洗浄し、次いで、０．１％  ＳＤＳで洗浄した。次いで、ビーズを、ＴＥ緩衝液中に再懸濁した。
反応で用いたＣａｐｔｕｒｅオリゴヌクレオチドは、
【０１７５】
【化１】
2004532643.tif 000008
であった。配列番号２３中の「Ｍ」は、ＡまたはＣに対する縮重ヌクレオチドコードである。Ｃａｐｔｕｒｅオリゴヌクレオチドにおいて、小文字の配列は、ＡｎｔｉＺｉｐｃｏｄｅ配列であり、大文字の配列は、検出されるＳＮＰの標的配列５’上流である。配列番号２１および配列番号２２の配列を有するオリゴヌクレオチドは、１つ目の配列が、その３’末端にヌクレオチドＧを有し、２つ目の配列が、その３’末端にヌクレオチドＴを有すること以外は同一であり、このことは、ウシゲノム上のその位置に位置する２つの交互（ａｌｔｅｒｎａｔｅ）ＳＮＰヌクレオチドを反映している。用いたＲｅｐｏｒｔｅｒオリゴヌクレオチドの配列は、Ｒｅｐｏｒｔｅｒの中にあり、小文字の配列は、Ｓｉｇｎａｌｃｏｄｅ配列であり、大文字の配列は、標的ＳＮＰの３’下流の標的配列である。
Ｄｏｕｂｌｅｃｏｄｅ  ＯＬＡ反応は、各々、以下を含む２０μｌの反応混合物中で実施した：１×Ｔａｑリガーゼ緩衝液、０．５ｐｍｏｌのＣａｐｔｕｒｅオリゴヌクレオチド、５’Ｓｉｇｎａｌｃｏｄｅ領域を含むＲｅｐｏｒｔｅｒオリゴヌクレオチド５．０ｐｍｏｌおよび２０ｎｇのＰＣＲ産物。反応混合物のためのサーモサイクルプログラムは、９６℃で２分間、次いで、９４℃で１５秒間、および３７℃で１分間を５５サイクルであった。
サーモサイクルプログラムが完了した後、その産物を、８頭のウシ個体の各々の遺伝子型で分類しそして染色した。反応産物の分類に用いたＡｎｔｉＳｉｇｎａｌｃｏｄｅオリゴヌクレオチドは、５’−ｃｔｇａａｃｇｇｔａｇｃａｔｃｔｔｇａｃ−ビオチン−３’（配列番号２４）であった。ＡｎｔｉＳｉｇｎａｌｃｏｄｅオリゴヌクレオチドの配列は、ＳｉｇｎａｌＣｏｄｅ  Ｒｅｐｏｒｔｅｒオリゴヌクレオチドの５’末端におけるＳｉｇｎａｌｃｏｄｅ配列と、逆相補的である。この反応産物を、Ｚｉｐｃｏｄｅオリゴヌクレオチド上のカラーコードビーズによって同時に分類し、単一のハイブリダイゼーションにおいて、ビオチン化したＡｎｔｉＳｉｎｇｌｅｃｏｄｅオリゴヌクレオチドにハイブリダイズした。これらの反応を、各々、以下を含む５０μｌのハイブリダイゼーション混合物内で実施した：１×ＴＭＡＣ緩衝液（２．５Ｍ  ＴＭＡＣ（塩化テトラメチルアンモニウム）、０．１５％  ＳＤＳ、３  ｍＭ  ＥＤＴＡ、および７５  ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ  ８．０））、各々のＳＮＡに対するカラーコードビーズを有する５０００  Ｚｉｐｃｏｄｅオリゴヌクレオチド、２．５  ｐｍｏｌのビオチン化ＡｎｔｉＳｉｇｎａｌｃｏｄｅオリゴヌクレオチド、および２０μｌのＤｏｕｂｌｅｃｏｄｅ  ＯＬＡ反応混合物。ハイブリダイゼーション反応混合物を９５℃で５分間、インキュベートし、次いで、５０℃で１５分間、インキュベートした。
ハイブリダイズしたビオチン化ＡｎｔｉＳｉｇｎａｌｃｏｄｅオリゴヌクレオチドを、１×ＴＥ緩衝液および蛍光ストレパビジン−フィコエリスリン複合体（１０μｇ／ｍｌ）を含む反応系において、この複合体で染色した。この反応を、室温で５分間、インキュベートし、カラーコードビーズの蛍光シグナルを、Ｌｕｍｉｎｅｘ  １００フローサイトメーターで測定した。表４は、８頭の個々のウシ動物について、開示された沈殿方法およびＤＮＡ増幅方法に従って処理したＤＮＡサンプルの遺伝子型決定（ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ）の結果をまとめる。表５は、同じ８頭のウシ動物についてのみ、開示された沈殿方法に従って処理したＤＮＡサンプルの遺伝子型決定の結果をまとめる。以下に示すように、両方法ともに、各々のウシ動物に対して、同一遺伝型の結果を与えた：
【０１７６】
【表４】
2004532643.tif 000009
＊相対的蛍光強度
【０１７７】
【表５】
2004532643.tif 000010
＊相対的蛍光強度
上記の結果は、開示されたＤＮＡ増幅方法が、高い忠実度でゲノムＤＮＡを確実に増幅し得ることを実証し、このことは、例え非常に限られた量のＤＮＡしか利用可能でない場合でも、この方法を使用して、単一の生物中の複数の遺伝子座を、正確に遺伝子型決定し得る。
【０１７８】
（実施例６）
さらに、ここで開示されるＤＮＡ増幅方法の忠実度を調べるために、ゲノムＤＮＡを、個々の８頭のウシ動物の精子から単離した。２つの異なるプライマーを、ＤＮＡ：５’−ＣＣＡＧＡＴＴＣＴＴＴＣＧＧＣＡＧＧＴＡ−３’（配列番号２５）、および５’−ＣＡＴＧＧＧＡＡＣＣＡＧＧＣＴＧＡＡＴ（配列番号２６）の増幅に用いたことを除いては、この精子から単離したゲノムＤＮＡを実施例２に記載したプロトコルを用いて、ＰＣＲ増幅に供した。ＰＣＲ産物を、Ｓａｎｇｅｒら（Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ７４：５４６３〜６７，１９７７）に記載される、ジデオキシヌクレオチド連鎖停止法を用いて配列決定した。８頭の各々の個々のウシ動物に対する遺伝子型を、以下の表６に列挙した。
【０１７９】
【表６】
2004532643.tif 000011
次いで、同じ８頭の個々のウシ動物の精子から単離したゲノムＤＮＡを、実施例２に記載した、開示されたＤＮＡ増幅方法を用いてＤＮＡ増幅に供した。２０ｎｇのカイしゲノムＤＮＡを増幅した。次いで、増幅したＤＮＡサンプルを、上記に記載したように、ＰＣＲ増幅に供し、最後に、実施例５に記載したように、ＰＣＲ産物を１組のＤｏｕｂｌｅｃｏｄｅ  ＯＬＡ反応において分析した。これらの反応を、８頭の異なる個々のウシ動物の間のＳＮＰバリエーションを検出するように設計した。表７は、本開示のＤＮＡ増幅方法に従って増幅した精子ＤＮＡの遺伝子型決定の結果をまとめる。
【０１８０】
【表７】
2004532643.tif 000012
＊相対的蛍光強度
表６および表７の結果の比較は、ＤＮＡ産物が、開示されたＤＮＡ増幅方法を用いて厳格にそして一貫して、ゲノムＤＮＡから増幅されることを実証する。ゲノムＤＮＡから生成したＰＣＲ産物の直接の配列決定は、本開示のＤＮＡ増幅方法を用いて増幅したＤＮＡから生成したＰＣＲ産物のＤｏｕｂｌｅｃｏｄｅ  ＯＬＡ分析と、正確に同じ遺伝子型の結果を与える。これらの結果は、開示されたＤＮＡ増幅方法が、高い忠実度で厳格にゲノムＤＮＡを増幅し得ることを再び実証する。
本明細書中で開示されそして特許請求の範囲に記載される全ての組成物および方法は、本開示に照らして、過度の実験をすることなく作製され得、そして実行され得る。本発明の組成物および方法は、好ましい実施形態によって記載されているが、本発明の概念、精神および範囲を逸脱することなく、本明細書中に記載した組成物および／または方法ならびに変更が、工程または工程の順番において適用され得ることは、当業者に明らかである。さらに詳細に、化学的または生理学的に関連のある特定の薬剤は、同じかまたは同様の結果を達成しつつ、本明細書に記載される薬剤と置換され得ることが明らかである。当業者に明らかな、このような類似の置換および改変は全て、添付の特許請求の範囲により規定される、本発明の精神、範囲および概念の範囲内であるとみなされる。
【図面の簡単な説明】
【０１８１】
以下の図面は、本明細書の一部をなし、そして本開示の特定の局面をさらに示すために含まれる。この開示は、本明細書中に示される特定の実施形態の詳細な記載と組み合わせて、これらの図面の１つ以上を参照してよりよく理解され得る。
【図１】図１は、ＤＮＡ増幅方法の第一セットの反応を示す図である。示されるように、ＤＮＡ増幅の最初のサイクルの間に、サンプルＤＮＡが変性され、そして第一プライマーが、ＤＮＡ合成のために一本鎖ＤＮＡがランダムにプライムされる。第一プライマーの５’末端の特定の一般的ＤＮＡ配列は、ＤＮＡ鎖にランダムにアニールしない。次に、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼが、ランダムにアニールした第一プライマーの３’末端から、相補的なＤＮＡ鎖を合成する。第一セットの反応におけるＤＮＡ増幅の第二サイクルにおいて、その５’末端に一般的配列を有する、新たに合成されたＤＮＡ鎖が、このサンプルＤＮＡ鎖から変性される。次に、第一プライマーが、この新たに合成されたＤＮＡ鎖を再びランダムにプライムし、そしてＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼが、ランダムにアニールした第一プライマーの３’末端から、相補的なＤＮＡ鎖を合成する。これにより、その５’末端の一般的配列およびその３’末端の一般的配列の逆相補体が隣接する、ＤＮＡ鎖の最終産物が生じる。このＤＮＡ産物は、このＤＮＡ産物に隣接する一般的配列にハイブリダイズする第二プライマーを使用する、ＤＮＡ増幅の第二セットの反応において増幅される。
【図２】図２は、ＦＴＡペーパー上に保存されたＤＮＡサンプル（血痕）のＰＣＲ増幅である。市販のＦＴＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔを使用して処理されたサンプルのＰＣＲ増幅の効率が、本開示の好ましい方法を使用して処理されたサンプルと比較される。ＦＴＡペーパー上の同じウシの血痕から得られた同一のパンチを、市販のＦＴＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔまたは本開示の沈殿方法のいずれかを使用して処理した。ＤＮＡサンプルの処理後、これらのサンプルを、実施例１に記載されるようにＰＣＲ増幅に供した。レーン１、ＤＮＡ分子サイズマーカー；レーン２〜５、市販のＦＴＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔを用いて処理した４つの血痕サンプルの直接的ＰＣＲ産物；レーン７〜１０、本開示の沈殿方法を用いて最初に処理された、それぞれ、レーン２〜５と同一の４つの血痕サンプルの直接的ＰＣＲ産物。本開示の沈殿方法を使用して処理されたＤＮＡサンプルは、ＦＴＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔを用いて処理されたサンプルよりも、ＰＣＲによってより一貫して最適に増幅されることは明らかである。
【図３】本開示の沈殿方法を用いて処理されたＦＴＡペーパー上の血痕のＰＣＲ産物を、本開示の沈殿方法およびＤＮＡ増幅方法を使用してＦＴＡペーパー上の血痕から生成された、増幅されたゲノムＤＮＡのＰＣＲ産物と比較した。上のパネル：本開示の沈殿方法を用いて処理されたＦＴＡペーパー上の血痕から直接的に生成された、ウシＰＣＲ産物のアガロースゲル電気泳動。レーン１、ＤＮＡ分子サイズマーカー；レーン２〜１４、１３の個々の動物の血痕サンプル由来の直接的ＰＣＲ産物。下のパネル：開示された沈殿方法を用いて処理されたＦＴＡペーパー上の血痕をＤＮＡサンプルとして使用する、開示されたＤＮＡ増幅方法を用いて増幅されたゲノムＤＮＡを使用して生成された、ウシＰＣＲ産物のアガロースゲル電気泳動。レーン１、ＤＮＡ分子サイズマーカー；レーン２〜１４、１３の個々の動物のゲノムＤＮＡサンプルから増幅されたＤＮＡの直接的ＰＣＲ産物。本開示の方法により増幅されたＤＮＡは、ＰＣＲによってＤＮＡサンプルを正確に特徴付けるために使用され得ることは明らかである。
【図４】市販のＦＴＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ系を本開示の沈殿方法と比較する、ＦＴＡペーパー上の血痕からのゲノムＤＮＡ増幅。同一セットのＤＮＡサンプルを、市販のＦＴＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ系または本開示の沈殿方法によって最初に処理し、次いで、これらのＤＮＡサンプルを、本開示のＤＮＡ増幅方法を使用して増幅した。レーン１、ＤＮＡ分子サイズマーカー；レーン２〜７、市販のＦＴＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔを使用して処理されたＦＴＡペーパー上の６つの血痕のゲノムＤＮＡ増幅；レーン８〜１３、本開示の沈殿方法を使用して処理されたＦＴＡペーパー上の６つの血痕のゲノムＤＮＡ増幅。本開示のＤＮＡ増幅方法は、本開示の沈殿方法がＦＴＡペーパー上のＤＮＡサンプルを処理するために使用される場合、ＦＴＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔが使用される場合よりも、かなりより増幅されたゲノムＤＮＡ産物を生じることは容易に明らかである。
【図５】本開示のＤＮＡ増幅方法を使用する、ＦＴＡペーパー上に保存された血痕のゲノムＤＮＡ増幅。ゲノムＤＮＡを増幅するための第一プライマーおよび第二プライマーを生成するために使用される、一連の一般的ＤＮＡ配列の効率を比較した。以下に列挙される第二プライマーを用いたＤＮＡ増幅のための反応混合物の各々において、使用された第一プライマーは、その３’末端にさらに６個のランダムヌクレオチドを有する第二のプライマーと同じ一般的配列を含んだ。レーン１、ＤＮＡ分子サイズマーカー；レーン２、配列番号３の配列を有する第二プライマーを用いたゲノムＤＮＡ増幅；レーン３、配列番号４の配列を有する第二プライマーを用いたゲノムＤＮＡ増幅；レーン４、配列番号５の配列を有する第二プライマーを用いたゲノムＤＮＡ増幅；レーン５、配列番号６の配列を有する第二プライマーを用いたゲノムＤＮＡ増幅；レーン６、配列番号７の配列を有する第二プライマーを用いたゲノムＤＮＡ増幅；レーン７、配列番号８の配列を有する第二プライマーを用いたゲノムＤＮＡ増幅；レーン８、配列番号９の配列を有する第二プライマーを用いたゲノムＤＮＡ増幅；レーン９、配列番号１０の配列を有する第二プライマーを用いたゲノムＤＮＡ増幅；レーン１０、配列番号１１の配列を有する第二プライマーを用いたゲノムＤＮＡ増幅；およびレーン１１、配列番号１２の配列を有する第二プライマーを用いたゲノムＤＮＡ増幅。本開示に従って設計された一般的配列が、このＤＮＡ増幅方法を使用してＤＮＡを増幅する一般的能力は、レーン２〜１１に示される均一なＤＮＡ増幅によって実証される。
【図６】図６は、ＤＮＡサンプル中のＳＮＰバリエーションを検出するための二重コード（Ｄｏｕｂｌｅｃｏｄｅ）ＯＬＡ（オリゴヌクレオチド連結アッセイ）反応を例示する図である。上の図は、標識されたレポーターオリゴヌクレオチド使用する、ＯＬＡを実施するための１つの選択肢を示す。この技術の欠点は、単一のＳＮＰに特異的なレポーターオリゴヌクレオチドが、蛍光によって個々に標識されなければならないことである。新たに標識されたレポーターオリゴヌクレオチドが、遺伝子型決定された各ＳＮＰについて生成されなければならないので、この方法は、大規模な遺伝子型決定のためには高価な選択肢である。下の図は、二重コードＯＬＡ反応を示し、これは、大量に生成されて任意のＳＮＰを検出するために利用され得る、標識された一般的アンチシグナルコード（ＡｎｔｉＳｉｇｎａｌｃｏｄｅ）オリゴヌクレオチドを使用するので、この反応は、上記の方法を上回る有意な改善を提供する。このアンチシグナルコードオリゴヌクレオチドは、アンチシグナルコードの逆相補体（シグナルコード（Ｓｉｇｎａｌｃｏｄｅ）配列）を含むレポーターオリゴヌクレオチド、ならびに単一のＳＮＰに対して相補的な領域と共に使用される。従って、この技術は、上のパネルに示される技術よりも、ＳＮＰを検出するためのより安価な選択肢を提供する。
【図１】
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【図６】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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