(57)【要約】本発明は、条件的阻害によって目的とするトランスジーンの発現をインビボで調節するための新規な構築物、組成物および新規な方法、ならびに実験目的、臨床目的および治療目的のためのそれらの使用、または動物もしくは植物を作製するためのそれらの使用に関する。より詳細には、本発明の新規な調節方法は、目的とする転写物をコードする目的とするトランスジーンと、目的とする転写物の特異的な阻害剤転写物をコードする阻害剤トランスジーンとを同時に発現させて、目的とする転写物の活性の構成的な阻害が得られるようにし、そしてその阻害剤転写物を阻害すること、または目的とする転写物を活性化すること、またはさらには目的とする転写物を活性化し、同時にその阻害剤転写物を阻害することのいずれかによって、目的とする転写物の効率的な調節が確実に行われ得るようにすることにある。【特許請求の範囲】
【請求項１】
目的とするトランスジーンの発現をインビボで調節するための方法であって、
第１の核酸として、目的とする転写物をコードする目的とするトランスジーンの配列を含む核酸と、第２の核酸として、目的とする転写物に対して特異的な阻害転写物をコードする阻害トランスジーンの配列を含む核酸とを標的の非ヒト動物の組織または細胞に同時に導入すること（ここで、前記配列は転写プロモータの制御下にあり、阻害転写物および／または目的とする転写物の活性が外部因子により調節され得る）、
目的とする転写物の活性を阻害転写物により構成的に阻害するために、前記核酸を標的組織または標的細胞において同時に発現させること、を含む方法。
【請求項２】
目的とする転写物の活性を回復するために、前記阻害転写物の活性を阻害させる外部因子を標的の非ヒト動物の組織または細胞に投与することもまた含む、請求項１に記載の調節方法。
【請求項３】
目的とする転写物の活性を回復するために、目的とする前記転写物の活性を増大させる外部因子を標的の非ヒト動物の組織または細胞に投与することもまた含む、請求項１または２に記載の調節方法。
【請求項４】
阻害転写物が抑制性プロモータの制御下にあり、外部因子が前記プロモータの阻害を生じさせることを特徴とする、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
プロモータがテトラサイクリン応答オペレーターの１つ以上の反復を含み、外部のリプレッサー因子がテトラサイクリンまたはアナログであることを特徴とする、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
阻害転写物をコードする核酸が、活性化可能な自己触媒性アプタマー配列をも含み、外部因子が、アプタマーの活性化因子である特異的なリガンドであることを特徴とする、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
阻害転写物をコードする核酸が、リガンドに依存する活性を有するリボザイムによって認識され得る配列をも含み、外部因子が、リボザイムの触媒活性の活性化因子であるリガンドであることを特徴とする、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
目的とする転写物をコードする配列が誘導性プロモータの制御下に置かれ、外部因子が前記プロモータの活性化を生じさせることを特徴とする、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
誘導性プロモータがＰＰＡＲα応答エレメントを含み、外部因子がＰＰＡＲαリガンド（フィブラートまたはアナログなど）であることを特徴とする、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
誘導性プロモータがＰＰＡＲγ応答エレメントを含み、外部因子がＰＰＡＲγリガンド（脂肪酸またはチアゾリジンジオンなど）であることを特徴とする、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
阻害転写物が、目的とするトランスジーンのｍＲＮＡの少なくとも１つのコード部分に対して相補的であり、かつワトソン・クリック型の結合を後者と形成し得るアンチセンスＲＮＡの形態であることを特徴とする、請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
阻害転写物が、目的とするトランスジーンのｍＲＮＡの少なくとも１つの非コード部分に対して相補的であり、かつワトソン・クリック型の結合を後者と形成し得るアンチセンスＲＮＡの形態であることを特徴とする、請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
阻害転写物が、目的とするトランスジーンのｍＲＮＡの５’末端の少なくとも１つの非コード部分に対して相補的であり、かつワトソン・クリック型の結合を後者と形成し得るアンチセンスＲＮＡの形態であることを特徴とする、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
アンチセンスＲＮＡが少なくとも１０リボヌクレオチドの長さであることを特徴とする、請求項１１から１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
阻害転写物が、目的とするトランスジーンの配列を含む核酸の一部分との三重らせんを形成し得るＲＮＡの形態であることを特徴とする、請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
阻害転写物がリボザイムの形態であることを特徴とする、請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
目的とするトランスジーンが、治療的に注目されるタンパク質をコードすることを特徴とする、請求項１から１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
目的とするトランスジーンが、遺伝子の異常または欠損を正常化させることを可能にすることを特徴とする、請求項１から１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
目的とするトランスジーンが、別の遺伝子の発現に関与する活性化因子をコードすることを特徴とする、請求項１から１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
目的とするトランスジーンにより、治療活性を有する目的とする転写物が産生されることを特徴とする、請求項１から１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記核酸が１つのベクターまたは異なるベクターに担われていることを特徴とする、請求項１から２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記核酸が同じベクターの同じ鎖に担われていることを特徴とする、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
ベクターが、プラスミド、コスミド、人工染色体または任意の非カプシド化ＤＮＡであることを特徴とする、請求項２１または２２に記載の方法。
【請求項２４】
ベクターが組換えウイルスであることを特徴とする、請求項２１または２２に記載の方法。
【請求項２５】
ウイルスが、アデノウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイルス、アデノ随伴ウイルス、ファージまたはこれらの誘導体であることを特徴とする、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
ベクターが細菌または寄生体であることを特徴とする、請求項２１または２２に記載の方法。
【請求項２７】
前記核酸が、物理的または機械的な方法を使用して標的組織または標的細胞に導入されることを特徴とする、請求項１から２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
同時注入によって、遺伝子銃技術によって、エレクトロポレーションによって、ソノポレーションによって、電場もしくはマイクロ波もしくは熱もしくは圧力を介して、またはこれらの技術の組合せを介して導入される核酸が使用されることを特徴とする、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記核酸が同時注入およびエレクトロトランスファーによって標的組織または標的細胞に導入されることを特徴とする、請求項２７または２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記核酸が、化学的因子または生化学的因子と複合体化された形態で標的組織または標的細胞に同時に導入されることを特徴とする、請求項１から２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
化学的因子または生化学的因子が、ヒストンおよびプロタミンから選ばれるカチオン性タンパク質であることを特徴とする、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
化学的因子または生化学的因子が、ＤＥＡＥ−デキストラン、ポリアミドアミン、ポリリシン、ポリエチレンイミン、ポリビニルピロリドンまたはポリビニルアルコールから選ばれるポリマーであることを特徴とする、請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
前記核酸がクルードな形態またはリポソームの形態で脂質に含まれることを特徴とする、請求項３０に記載の方法。
【請求項３４】
前記核酸がナノ粒子に含まれることを特徴とする、請求項３０に記載の方法。
【請求項３５】
動物起源またはヒト起源の細胞または組織を包含することを特徴とする、請求項１から３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
筋肉細胞または骨格筋組織包含することを特徴とする、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
植物起源の細胞または組織を包含することを特徴とする、請求項１から３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
前記核酸が全身的に注入されることを特徴とする、請求項２７から３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
前記核酸が動脈内または静脈内に注入されることを特徴とする、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記核酸が、非経口的、局所的、経皮的、膣内、鼻腔内、皮下または眼内に注入されることを特徴とする、請求項２７から３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
前記核酸が、様々な投与方法のための医薬として許容可能な賦形剤もまた含有する組成物中に存在することを特徴とする、請求項３９および４０のいずれかに記載の方法。
【請求項４２】
請求項１から４１のいずれか一項に記載される方法において使用され得るコンビネーションであって、前記コンビネーションは、目的とする前記転写物をコードする目的とするトランスジーンの配列を含む核酸、および前記目的とする転写物に対して特異的な阻害転写物をコードする阻害トランスジーンの配列を含む核酸を含有し、前記コンビネーションはインビボで投与され、前記配列はそれぞれが転写プロモータの制御下に置かれ、阻害転写物および／または目的とする転写物の活性が外部因子により調節され得る、コンビネーション。
【請求項４３】
阻害転写物が、目的とするトランスジーンのｍＲＮＡの少なくとも１つのコード部分に対して相補的であり、かつワトソン・クリック型の結合を後者と形成し得るアンチセンスＲＮＡの形態であることを特徴とする、請求項４２に記載のコンビネーション。
【請求項４４】
阻害転写物が、目的とするトランスジーンのｍＲＮＡの少なくとも１つの非コード部分に対して相補的であり、かつワトソン・クリック型の結合を後者と形成し得るアンチセンスＲＮＡの形態であることを特徴とする、請求項４２に記載のコンビネーション。
【請求項４５】
阻害転写物が、目的とするトランスジーンのｍＲＮＡの５’末端の少なくとも１つの非コード部分に対して相補的であり、かつワトソン・クリック型の結合を後者と形成し得るアンチセンスＲＮＡの形態であることを特徴とする、請求項４４に記載のコンビネーション。
【請求項４６】
アンチセンスＲＮＡが少なくとも１０リボヌクレオチドの長さであることを特徴とする、請求項４２から４５のいずれか一項に記載のコンビネーション。
【請求項４７】
阻害転写物が、目的とするトランスジーンの配列を含む核酸の一部分との三重らせんを形成し得るＲＮＡの形態であることを特徴とする、請求項４２に記載のコンビネーション。
【請求項４８】
阻害転写物がリボザイムの形態であることを特徴とする、請求項４２に記載のコンビネーション。
【請求項４９】
阻害転写物が抑制性プロモータの制御下にあり、外部因子が前記プロモータの阻害を生じさせることを特徴とする、請求項４２から４８のいずれか一項に記載のコンビネーション。
【請求項５０】
プロモータがテトラサイクリン応答オペレーターの１つ以上の反復を含み、外部のリプレッサー因子がテトラサイクリンまたはアナログであることを特徴とする、請求項４９に記載のコンビネーション。
【請求項５１】
阻害転写物をコードする核酸が、活性化可能な自己触媒性アプタマー配列をも含み、外部因子が、アプタマーの活性化因子である特異的なリガンドであることを特徴とする、請求項４２から４８のいずれか一項に記載のコンビネーション。
【請求項５２】
阻害転写物をコードする核酸が、リガンドに依存する活性を有するリボザイムによって認識され得る配列をも含み、外部因子が、リボザイムの触媒活性の活性化因子であるリガンドであることを特徴とする、請求項４２から４８のいずれか一項に記載のコンビネーション。
【請求項５３】
目的とする転写物をコードする目的とするトランスジーンの配列が誘導性プロモータの制御下に置かれ、外部因子が前記プロモータの活性化を生じさせることを特徴とする、請求項４２から５２のいずれか一項に記載のコンビネーション。
【請求項５４】
誘導性プロモータがＰＰＡＲα応答エレメントを含み、外部因子がＰＰＡＲαリガンド（フィブラートまたはアナログなど）であることを特徴とする、請求項５３に記載のコンビネーション。
【請求項５５】
誘導性プロモータがＰＰＡＲγ応答エレメントを含み、外部因子がＰＰＡＲγリガンド（脂肪酸またはチアゾリジンジオンなど）であることを特徴とする、請求項５３に記載のコンビネーション。
【請求項５６】
目的とするトランスジーンが、治療的に注目されるタンパク質をコードすることを特徴とする、請求項４２から５５のいずれか一項に記載のコンビネーション。
【請求項５７】
目的とするトランスジーンが、遺伝子の異常または欠損を正常化させることを可能にすることを特徴とする、請求項４２から５６のいずれか一項に記載のコンビネーション。
【請求項５８】
目的とするトランスジーンが、別の遺伝子の発現に関与する活性化因子をコードすることを特徴とする、請求項４２から５７のいずれか一項に記載のコンビネーション。
【請求項５９】
目的とするトランスジーンにより、治療的活性を有する目的とする転写物が産生されることを特徴とする、請求項４２から５５のいずれか一項に記載のコンビネーション。
【請求項６０】
前記核酸が１つのベクターまたは異なるベクターに担われていることを特徴とする、請求項４２から５９のいずれか一項に記載のコンビネーション。
【請求項６１】
前記核酸が同じベクターの同じ鎖によって担われていることを特徴とする、請求項６０に記載のコンビネーション。
【請求項６２】
ベクターが、プラスミド、コスミド、人工染色体または任意の非カプシド化ＤＮＡであることを特徴とする、請求項６０または６１に記載のコンビネーション。
【請求項６３】
ベクターが組換えウイルスであることを特徴とする、請求項６０または６１に記載のコンビネーション。
【請求項６４】
ウイルスが、アデノウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイルス、アデノ随伴ウイルス、ファージまたはこれらの誘導体から選ばれることを特徴とする、請求項６３に記載のコンビネーション。
【請求項６５】
ベクターが細菌または寄生体であることを特徴とする、請求項６０または６１に記載のコンビネーション。
【請求項６６】
物理的または機械的な方法を使用してインビボにおいて投与され得る形態であることを特徴とする、請求項４２から６５のいずれか一項に記載のコンビネーション。
【請求項６７】
注入によって、遺伝子銃技術によって、エレクトロポレーションによって、ソノポレーションによって、電場もしくはマイクロ波もしくは熱もしくは圧力を介して、またはこれらの技術の組合せによって投与され得ることを特徴とする、請求項６６に記載のコンビネーション。
【請求項６８】
前記核酸が同時注入および／またはエレクトロトランスファーによって標的組織または標的細胞に導入され得ることを特徴とする、請求項６６に記載のコンビネーション。
【請求項６９】
標的細胞または標的組織にいて目的とするトランスジーンを調節するための、請求項４２から６８のいずれか一項に記載されるコンビネーションの使用。
【請求項７０】
標的細胞または標的組織がヒト以外の動物起源および好ましくはヒト起源であることを特徴とする、請求項６９に記載の使用。
【請求項７１】
標的細胞または標的組織が筋肉細胞または筋肉組織であることを特徴とする、請求項７０に記載の使用。
【請求項７２】
標的細胞または標的組織が植物起源であることを特徴とする、請求項６９に記載の使用。
【請求項７３】
請求項４２から６８のいずれか一項に記載されるコンビネーションと、好適な医薬賦形剤とを含む医薬組成物。
【請求項７４】
請求項４２から６８のいずれか一項に記載されるコンビネーションと、好適な賦形剤とを含む医薬品。
【請求項７５】
筋肉内または全身的もしくは動脈内もしくは静脈内に注入され得る、請求項７４に記載の医薬品。
【請求項７６】
請求項４２から６８のいずれか一項に記載されるコンビネーションと、好適な賦形剤とを含む医薬品であって、局所的、経皮的、経口的、膣内、鼻腔内、皮下または非経口的に投与され得る医薬品。
【請求項７７】
賦形剤が様々な投与法に好適な賦形剤であることを特徴とする、請求項７４から７６のいずれか一項に記載の医薬品。
【請求項７８】
遺伝子の異常または欠損を正常化させるための医薬品を製造するための、請求項４２から６８のいずれか一項に記載されるコンビネーションの使用。
【請求項７９】
ミトコンドリア遺伝子疾患を治療するための医薬品を製造するための、請求項４２から６８に記載されるコンビネーションの使用。
【請求項８０】
筋障害を治療するための医薬品を製造するための、請求項４２から６８のいずれか一項に記載されるコンビネーションの使用。
【請求項８１】
虚血および狭窄症を治療するための医薬品を製造するための、請求項４２から６８のいずれか一項に記載されるコンビネーションの使用。
【請求項８２】
リソソーム性疾患を治療するための医薬品を製造するための、請求項４２から６８のいずれか一項に記載されるコンビネーションの使用。
【請求項８３】
ホルモン障害を治療するための医薬品を製造するための、請求項４２から６８のいずれか一項に記載されるコンビネーションの使用。
【請求項８４】
血友病を治療するための医薬品を製造するための、請求項４２から６８のいずれか一項に記載されるコンビネーションの使用。
【請求項８５】
慢性関節リウマチなどの炎症性疾患を治療するための医薬品を製造するための、請求項４２から６８のいずれか一項に記載されるコンビネーションの使用。
【請求項８６】
β−サラセミアを治療するための医薬品を製造するための、請求項４２から６８のいずれか一項に記載されるコンビネーションの使用。
【請求項８７】
アポトーシスを誘導するための医薬品を製造するための、請求項４２から６８のいずれか一項に記載されるコンビネーションの使用。
【請求項８８】
抗ガン治療を行うための医薬品を製造するための、請求項４２から６８のいずれか一項に記載されるコンビネーションの使用。
【請求項８９】
神経変性疾患を治療するための医薬品を製造するための、請求項４２から６８のいずれか一項に記載されるコンビネーションの使用。
【請求項９０】
高血圧などの心臓血管疾患を治療するための医薬品を製造するための、請求項４２から６８のいずれか一項に記載されるコンビネーションの使用。
【請求項９１】
肥満などの高脂血症を治療するための医薬品を製造するための、請求項４２から６８のいずれか一項に記載されるコンビネーションの使用。
【請求項９２】
ワクチンを製造するための、請求項４２から６８のいずれか一項に記載されるコンビネーションの使用。
【請求項９３】
目的とする転写物をコードする目的とするトランスジーンの配列を含む核酸と、前記目的とする転写物に対して特異的な阻害転写物をコードする核酸とを有し、前記配列が転写プロモータの制御下にあり、阻害転写物および／または目的とする転写物の活性が外部因子により調節され得ることを特徴とするトランスジェニック動物。
【請求項９４】
阻害転写物が、遺伝子のアンチセンスＲＮＡの形態、または三重らせんを形成し得るＲＮＡの形態、またはリボザイムの形態であることを特徴とする、請求項９３に記載のトランスジェニック動物。
【請求項９５】
阻害転写物が抑制性プロモータによる負の調節を受け、外部因子が前記プロモータの阻害を生じさせることを特徴とする、請求項９３または９４に記載のトランスジェニック動物。
【請求項９６】
阻害転写物が活性化可能な自己触媒性アプタマー配列をも含み、外部因子が、アプタマー配列の活性化因子である特異的なリガンドであることを特徴とする、請求項９３または９４に記載のトランスジェニック動物。
【請求項９７】
阻害転写物が、リガンドに依存する活性を有するリボザイムによって認識され得る配列をも含み、外部因子が、リボザイムの触媒活性の活性化因子であるリガンドであることを特徴とする、請求項９３または９４に記載のトランスジェニック動物。
【請求項９８】
目的とする転写物が誘導性プロモータの制御下にあり、外部因子が前記プロモータの活性化を生じさせることを特徴とする、請求項９３から９７のいずれか一項に記載のトランスジェニック動物。
【請求項９９】
目的とする転写物をコードする目的とするトランスジーンの配列を含む核酸と、前記目的とする転写物に対して特異的な阻害転写物をコードする目的とするトランスジーンの配列を含む核酸とを有し、前記配列が転写プロモータの制御下にあり、阻害転写物および／または目的とする転写物の活性が外部因子により調節され得ることを特徴とするトランスジェニック植物。
【請求項１００】
阻害転写物が、遺伝子のアンチセンスＲＮＡの形態、または三重らせんを形成し得るＲＮＡの形態、またはリボザイムの形態であることを特徴とする、請求項９９に記載のトランスジェニック植物。
【請求項１０１】
阻害転写物が抑制性プロモータによる負の調節を受け、外部因子が前記プロモータの阻害を生じさせることを特徴とする、請求項９９または１００に記載のトランスジェニック植物。
【請求項１０２】
阻害転写物が活性化可能な自己触媒性アプタマー配列をも含み、外部因子が、このアプタマー配列の特異的なリガンドであることを特徴とする、請求項９９または１００に記載のトランスジェニック植物。
【請求項１０３】
阻害転写物が、リガンドに依存する活性を有するリボザイムによって認識され得る配列をも含み、外部因子が、リボザイムの触媒活性の活性化因子であるリガンドであることを特徴とする、請求項９９または１００に記載のトランスジェニック植物。
【請求項１０４】
目的とする転写物が誘導性プロモータの制御下にあり、外部因子が前記プロモータの活性化を生じさせることを特徴とする、請求項９９から１０３のいずれか一項に記載のトランスジェニック植物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、条件的阻害のシステムを使用して、治療的または実験的に注目されるトランスジーンのインビボでの発現を制御するための新規な組成物および新規な方法に関する。本発明は特に、改変された動物および植物を作製するために有用であり、遺伝子治療の適用において有用である。
【０００２】
遺伝子治療は、治療用トランスジーンの発現を使用して、欠損または異常（変異、異常な発現など）を正常化するか、あるいは病状を処置することにあるが、一般には、作用させる細胞または組織に外因性の遺伝子またはトランスジーンを導入することによって行われる。トランスジーンは、インビボでの量的および質的に最適な発現を確実にするために、強いプロモータ（構成的または誘導性）の制御下に置かれる。
【０００３】
しかし、これらの構成的な発現システムは、移入された目的とするトランスジーンの良好な発現レベルを得ることを可能にするが、トランスジーンの発現レベルを調節することができない。そのうえ、現在の誘導可能なシステムの場合、高すぎることが多く、治療的または実験的な使用と適合し得ないある種の毒性を生じさせることがある、目的とするトランスジーンの残存発現が一般に認められる。
【０００４】
今回、目的とするトランスジーンの効果的な制御（具体的には、阻害）を達成できることが、トランスジーンの発現が副作用（例えば、細胞傷害性の副作用）を伴うときには特に、ある種の実験を成功させるか、または治療を成功させるための決定要因であることが明らかにされ得る。これは、ＴＮＦ−α、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８またはＧＭ−ＣＳＦなどのいくつかのサイトカインの場合（Ａｇｈａ−Ｍｏｈａｍｍａｄｉ他、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．、１０５（２０００）、１１７３〜１１７６）、抗凝固剤の場合、抗体の場合、活性な物質のいくつかの酵素的活性化因子の場合（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ他、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．、１０５（２０００）、１１６１〜１１６７）、ガンに対する毒性分子の場合、またはホルモンの場合には特に当てはまる。
【０００５】
発現を制御するための様々な人工的システムが先行技術において設計されている。１つのシステムでは、大腸菌のＬａｃリプレッサーをヘルペスウイルス（ＨＳＶ）のＶＰ１６のトランス活性化ドメインと融合することによって構築されたＬＡＰ（Ｌａｃ活性化因子タンパク質）と呼ばれる調節タンパク質が使用される。ＬＡＰは、具体的には、イソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）が存在しないときには、転写ユニットの上流または下流にｌａｃオペレーター配列を含むＳＶ４０の最小の初期プロモータを活性化することができ、これに対して、ＩＰＴＧが存在するときには、プロモータの活性化が阻害される（Ｌａｂｏｗ他、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、１０（１９９０）、３３４３〜３３５６）。
【０００６】
別のシステムでは、テトラサイクリンで制御されるトランス活性化タンパク質が使用される。このタンパク質は、大腸菌のＴｅｔリプレッサーをＨＳＶのＶＰ１６のトランス活性化ドメインと融合することによって構築されており、その結果、具体的には、テトラサイクリンが存在しないときには、テトラサイクリン応答ｔｅｔオペレーター配列を含む最小のプロモータからの転写が活性化されるようになり、しかし、この活性化はテトラサイクリンまたはその誘導体の存在下では阻害され得る（Ｇｏｓｓｅｎ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８９（１９９２）、５５４７〜５５５１；Ｇｏｓｓｅｎ他、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２６８（１９９５）、１７６６〜１７６９）。
【０００７】
しかし、これらの負の調節システムは、阻害された状態において依然として高すぎる残存発現を欠点として有する。このため、インビボにおけるそれらの有効性およびそれらの使用が制限されている。さらに、これらのシステムでは、目的とするトランスジーンの間欠的な発現のみが必要とされるときには制限的であるリプレッサー因子（テトラサイクリンまたはＩＰＴＧなど）を与えるることが要求される。
【０００８】
遺伝子の発現を阻害する他の様々な方法が開発されており、そのような方法では、組換え核酸が使用され、例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド（国際特許出願公開ＷＯ８３／０１４５１）、または内因性の標的遺伝子に対して相補的であるアンチセンスＲＮＡ（ＭｃＣａｌｌ、Ｂｉｏｃｈｉｍ　Ｂｉｐｈｙｓ　Ａｃｔａ、１３９７（１）（１９９８）、６５〜７２）などが使用される。
【０００９】
そのような方法は、今日まで、内因性の遺伝子を調節するために使用されているだけである。そのような方法は、インビトロで試験されたときには約６０％から９０％の阻害を得ることを可能にするが、それらの低毒性および免疫原性がないことにもかかわらず、内因性の遺伝子をインビボで調節することに関しては、その開発を中断させるような程度で、全く効果がない。
【００１０】
意外にも、本出願人らは、相補的なアンチセンスＲＮＡによる外因性の遺伝子またはトランスジーンのインビトロにおける阻害が、内因性の遺伝子に対して相補的なアンチセンスＲＮＡを用いて得られるのと同じ程度である（すなわち、非常に満足できるほどではない）が、この同じ外因性遺伝子のその相補的なアンチセンス転写物による阻害が、インビボで行われたときには特に強くなることを発見した。
【００１１】
さらに、本出願人らは、この阻害が、最初にトランスジーンを単独で注入し、発現させ、その後、次に、その阻害転写物をコードする配列を注入することによって再現しないこと、しかし、逆に、阻害性のアンチセンス転写物の配列を含む核酸およびトランスジーンの配列を含む核酸を同時に注入し、同時に発現させることが、後者のインビボでの効果的な阻害を得るためには必要であることを発見した。
【００１２】
最後に、本出願人らは、トランスジーンがそのアンチセンスＲＮＡによって効果的に阻害され得るだけでなく、トランスジーンの生物学的に効果的な発現レベルを再び確立すること、従って、そのアンチセンス型の特異的な阻害転写物を介して後者の発現を制御することが可能であることも発見した。
【００１３】
本発明の主題は、目的とするトランスジーンの発現をインビボで調節するための新規な方法である。この方法は、
目的とする転写物または有用な転写物をコードする目的とするトランスジーンの配列を含む核酸と、前記目的とする転写物に対して特異的な阻害転写物をコードする阻害トランスジーンの配列を含む核酸とを標的組織または標的細胞に同時に導入すること、この場合、前記配列はそれぞれが転写プロモータの制御下にあり、阻害転写物および／または目的とする転写物の活性が外部因子により阻害され得る；
目的とする転写物の活性の構成的な阻害を阻害転写物により可能にするために、前記核酸を標的組織または標的細胞において同時に発現させること
にある。
【００１４】
本発明による方法のさらなる工程において、リプレッサーと呼ばれる外部因子が標的組織または標的細胞に投与され、これにより、使用された外部のリプレッサー因子の量に比例して、阻害転写物の活性が阻害され、従って、目的とする転写物の活性が回復させられる。
【００１５】
あるいは、またはさらに、活性化因子と呼ばれる外部因子が標的組織または標的細胞に投与され、これにより、目的とする転写物の活性が増大させられる。従って、目的とする転写物の活性を、使用された外部の活性化因子の量に比例して回復させることができる。
【００１６】
本発明の主題はまた、目的とするトランスジーンをインビボで伝達するための方法である。この方法は、目的とする転写物または有用な転写物をコードする目的とするトランスジーンの配列を含む核酸と、前記目的とする転写物に対して特異的な阻害転写物をコードする阻害トランスジーンの配列を含む核酸とを標的組織または標的細胞に同時に投与し、かつ同時に発現させることからなる。この方法により、目的とするトランスジーンの発現、すなわち、目的とする転写物の活性が、阻害転写物の活性を阻害することによって、外部のリプレッサー因子を投与することによって、かつ／または目的とする転写物の活性の誘導を生じさせる外部因子を投与することによって構成的に阻害され、そして回復させることができる。
【００１７】
本発明の主題はまた、目的とするトランスジーンの残存発現をインビボで低下させるための方法である。この方法は、目的とする転写物をコードする配列およびその特異的な阻害転写物をコードする配列を同時に注入し、かつ同時に発現させることにある。
【００１８】
本発明の主題はまた、インビボで投与され、かつ本発明による方法において使用され得る新規なコンビネーションである。このコンビネーションは、目的とする転写物または有用な転写物をコードする目的とするトランスジーンの配列を含む核酸と、前記目的とする転写物に対して特異的な阻害転写物をコードする阻害トランスジーンの配列を含む核酸とを含み、これらの配列はそれぞれが転写プロモータの制御下にあり、そして目的とする転写物および／または阻害転写物の活性が外部因子により調節され得る。
【００１９】
用語「目的とするトランスジーン」は、生物学的生成物（すなわち、目的とする転写物または有用な転写物のいずれか、例えば、治療的または実験的に注目されるｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、リボザイムもしくはアプタザイム、またはタンパク質、ポリペプチドもしくはペプチドなど）をコードする任意の外部の核酸分子を意味することが意図される。本発明によれば、目的とするトランスジーンには、全体もしくは一部が天然で得られるか、または全体もしくは一部が化学合成によって得られるｇＤＮＡ、ｃＤＮＡまたはＤＮＡが含まれる。
【００２０】
用語「目的とする転写物」または用語「有用な転写物」は、上記に定義されるような目的とするトランスジーンからの転写によって産生されるＲＮＡを意味することが意図される。目的とする転写物はｍＲＮＡの形態であり、細胞内の作用または分泌型作用を有する治療用のタンパク質またはペプチドに翻訳され得る。あるいは、目的とする転写物または有用な転写物は、固有的な生物学的活性を有するＲＮＡ（アプタザイム、リボザイムもしくはアンチセンスＲＮＡなど）、またはトランスフェクションされた細胞の成分と相互作用し得るＲＮＡ（例えば、リボゾームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）またはアプタマーなど）の形態であり得る。
【００２１】
用語「阻害トランスジーン」は、目的とする転写物をその標的として有する阻害転写物を転写によって産生し得る任意の外部の核酸分子を意味することが意図される。本発明によれば、阻害トランスジーンには、全体もしくは一部が天然で得られるか、または全体もしくは一部が化学合成によって得られるｇＤＮＡ、ｃＤＮＡおよびＤＮＡが含まれる。
【００２２】
用語「特異的な阻害転写物」は、アンチセンスＲＮＡの形態、またはリボザイムの形態、または三重らせんを形成し得るＲＮＡの形態であり得るＲＮＡで、目的とする転写物とのある程度の相補性、または目的とする転写物に対してある程度の特異性を有するＲＮＡを意味することが意図される。
【００２３】
転写物は、ｍＲＮＡ型の目的とする転写物の翻訳を阻止することにより翻訳レベルで、あるいはｒＲＮＡもしくはｔＲＮＡもしくはアプタマーの目的とする転写物と細胞成分との相互作用を阻止することにより、またはアプタザイム型もしくはリボザイム型もしくはアンチセンスＲＮＡ型の目的とする転写物と標的核酸配列との相互作用を阻止することにより、あるいはその代わりとして目的とする転写物の濃度を酵素分解により減少させることによりその生物学的活性のレベルでのいずれかで、標的組織または標的細胞において同時に発現させられる目的とする転写物を効果的かつ構成的に阻害し得る限り、阻害性であると呼ばれる。さらに、このような阻害転写物は抑制性と呼ばれる。すなわち、自身が、外部のリプレッサー因子を介する阻害の対象物であり得る。
【００２４】
表現「目的とする転写物の活性」は、目的とする転写物がｍＲＮＡの形態であるときには治療的または実験的に注目されるタンパク質またはペプチドへのその翻訳、あるいは目的とする転写物がアプタザイムの形態またはリボザイムの形態またはアンチセンスＲＮＡの形態であるときにはその生物学的活性、あるいは目的とする転写物がリボゾームＲＮＡの形態または転移ＲＮＡの形態またはアプタマーの形態であるときには細胞成分とのその相互作用のいずれかを意味することが意図される。
【００２５】
用語「外部因子」は、経腸的または非経口的に投与することができ、低い毒性を有し、そして遺伝子の発現を阻害または活性化する活性を有する任意の化学的因子（好ましくは、薬理学的因子）または物理的因子（熱など）を意味することが意図される。
【００２６】
本発明による可逆的な阻害による調節方法の１つの有利な特徴は、目的とするトランスジーンのインビボでの発現、または目的とする転写物もしくは有用な転写物の活性を構成的な様式で効果的に阻止し、そしてこのような阻害が臨床的または実験的な理由から所望されるときにこの発現を再び確立することができるその能力にある。このシステムは、目的とするトランスジーンおよびその特異的な阻害転写物の同時注入およびインビボでの同時発現、ならびに目的とするトランスジーンの効果的な調節が、その特異的な阻害転写物を阻害することによって、または目的とする転写物を活性化することによって、あるいは目的とする転写物を活性化し、同時にその特異的な阻害転写物を阻害することによって行うことができるということに基づいている。
【００２７】
本発明の第１の実施形態によれば、目的とする転写物の阻害を増大させ、そして目的とする転写物の活性または目的とする転写物の十分な生物学的レベルを間接的に再び確立するために、阻害転写物は外部のリプレッサー因子によって阻害される。
【００２８】
阻害転写物の阻害は、阻害転写物をコードする阻害トランスジーンの配列を、外部のリプレッサー因子に対して抑制性または感受性であるプロモータの制御下に置くことによって得ることができる。例えば、大腸菌のテトラサイクリン耐性オペロンに由来するテトラサイクリン媒介退行システム（ＴｒＲＳ）（Ｇｏｓｓｅｎ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、８９（１９９２）、５５４７〜５５５１）を使用することが可能である。このシステムでは、ｔｅｔオペレーター（ｔｅｔＯ）の配列に対するｔｅｔリプレッサー（ｔｅｔＲ）の親和性（すなわち、テトラサイクリンに対するｔｅｔＲの親和性）、およびＶＰ１６ヘルペスウイルスのトランス活性化因子の真核生物細胞における活性が使用される。従って、このＴｒＲＳ調節システムは、ＶＰ１６のＣ末端端部をｔｅｔＲタンパク質のＣ末端端部と融合することから得られるキメラなトランス活性化因子（ｔＴＡ）を使用して機能する。
【００２９】
テトラサイクリンが存在しないとき、ｔＴＡトランス活性化因子のｔｅｔＲ部分は、例えば、テトラサイクリンオペレーターの反復配列（２回、７回または１０回の反復）を含み、かつ例えば、ヒトサイトメガロウイルス（ｈＣＭＶ）の最小の転写プロモータの上流に置かれる調節配列に結合して、阻害トランスジーンの転写および阻害転写物の産生を活性化し、これにより目的とする転写物の効果的な構成的阻害を確実にする。テトラサイクリンが存在するときには、これは、ｔＴＡのキメラなトランス活性化因子のｔｅｔＲ部分に結合して、その立体配座を変化させ、テトラサイクリン応答オペレーター（ｔｅｔＯ）の反復配列に対する親和性を喪失させる。その結果、阻害トランスジーンからの阻害転写物の産生の阻害、そして目的とするトランスジーンの発現レベルまたは目的とする転写物の活性の再確立がそのときに生じる。
【００３０】
ｔｅｔＯの反復配列を含む調節配列は組織特異的なアンプリファイア／プロモータ内に都合よく組み込まれるか、またはある種の増幅配列に対する代替物として使用することができる（Ｒｏｓｅ他、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７２（１９９７）、４７３５〜４７３９；Ａｇｈａ−Ｍｏｈａｍｍａｄｉ他、Ｇｅｎｅ　Ｔｈｅｒ．５（１９９８）、７６〜８４）。従って、このシステムにより、目的とするトランスジーンの調節を時間的に標的化するだけでなく、空間的に標的化することもまたもたらされる。
【００３１】
好ましくは、ｔＴＡトランス活性化因子のコード配列および阻害転者物の転写を行わせるＴｒＲＳプロモータは１つの核酸分子において運ばれる。後者は、例えば、ｔＴＡをコードする配列を、ウイルスプロモータまたは組織特異的プロモータの制御下で、次いで、阻害転写物をコードする配列に機能的に連結されたテトラサイクリン抑制性プロモータ（ＴｒＲＳ）カセットの制御下に含むことができる（Ｏ’Ｂｒｉｅｎ他、Ｇｅｎｅ、１８４（１９９７）、１１５〜１２０）。
【００３２】
阻害転写物をコードする配列に機能的に連結され、その後に、ＩＲＥＳ（内部リボソーム進入部位）配列およびｔＴＡのコード配列またはその逆が続くＴｒＲＳ発現カセットを含む二シストロン型の代わりの構成もまた使用することができる。さらに別の構成例では、ｔＴＡまたは阻害転写物の発現を行わせる二方向性のプロモータが含まれる。テトラサイクリンが存在しないときには、ｔＴＡが発現され、阻害トランスジーンの阻害転写物への転写を活性化し、これにより、有用な転写物または目的とする転写物が阻害される（Ｌｉａｎｇ他、Ｇｅｎｅ　Ｔｈｅｒ．、３（１９９６）、３５０〜３５６）。
【００３３】
この第１の実施形態に従って使用される外部のリプレッサー因子は、阻害トランスジーンの転写の阻害、従って、阻害転写物の活性の阻害を生じさせることできるテトラサイクリンまたはそのアナログの１つ（ドキシサイクリン、アンヒドロテトラサイクリンまたはオキシテトラサイクリンなど）であり得る（Ａｇｈａ−Ｍｏｈａｍｍａｄｉ他、Ｇｅｎｅ　Ｔｈｅｒ．、４（１９９７）、９９３〜９９７）。テトラサイクリンまたはそのアナログの１つを投与することにより、阻害転写物による阻害を増大させることが可能になり、従って、目的とする転写物の生物学的に効果的なレベルを再び確立することが可能になる。目的とする転写物の発現レベルは、テトラサイクリンおよびそのアナログの薬物動態学性質および薬効学的性質が当業者に十分に知られている限り、投与されたテトラサイクリンまたはそのアナログの量と都合よく相関させることができる。そのような性質は、なかでも、Ｖｉｄａｌに、そしてＧｏｏｄｍａｎ　ａｎｄ　Ｇｉｌａｍａｎ’ｓ　Ｔｈｅ　Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｂａｓｉｓ　ｏｆ　Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ（第９版、Ｊｏｅｌ　Ｇ．Ｈａｒｄｍａｎ、Ａｌｆｒｅｄ　Ｇｏｏｄｍａｎ　Ｇｉｌａｍｎ、Ｌｅｅ　Ｅ．Ｌｉｍｂｉｒｄ編）の章「抗菌剤：テトラサイクリン」に詳しく記載される。
【００３４】
さらに、ｔｅｔＲタンパク質に対するテトラサイクリンの大きい親和性のため、テトラサイクリンまたはそのアナログの１つは低濃度で使用することができ、従って、その副作用は最小限である。
【００３５】
さらにより好ましくは、阻害トランスジーンの配列は、チミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子またはヒトＣＭＶ遺伝子のプロモータに由来する最小のプロモータの制御下に置かれる。この場合、プロモータの上流には、国際特許出願公開ＷＯ９６／３０５１２に具体的に記載されるような調節配列が存在する。
【００３６】
阻害転写物の阻害はまた、その配列の中またはその５’末端もしくは３’末端に、欧州特許出願ＥＰ９９４０２５５２に記載され、そしてＷｅｒｓｔｕｃｋ他（Ｓｃｉｅｎｃｅ、２８２（１９９８）、２９６〜２９８）によって記載され、好ましくはリガンドの存在下で自己触媒活性を有するアプタマーなどの特異的な配列を挿入することによっても得ることができる。従って、アプタマー配列を挿入することにより、阻害転写物は、目的とする転写物の活性を再び確立することが所望されるときに、特異的なリガンドの存在下で活性化され得る自己触媒活性を獲得する。阻害転写物を阻害するために使用されるアプタマーのヌクレオチド配列は、リガンドに依存した自己触媒活性を有するＲＮＡをコードする任意の配列であり得る。これには、例えば、ハンマーヘッドリボザイム、デルタ型肝炎ウイルスリボザイム、ノイロスポラＶＳリボザイム、ピンヘッドリボザイム、Ｉ型イントロンおよびＩＩ型イントロンおよびＲＮＡｓｅＰ、または任意の人工的に得られる機能的な誘導型配列が含まれる（Ｃｌｏｕｅｔ−ｄ’Ｏｒｖａｌ他、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３４（１９９５）、１１１８６〜１１１９０；Ｏｌｉｖｅ他、ＥＭＢＯ　Ｊ、１４（１９９５）、３２４７〜３２５１；Ｒｏｇｅｒｓ他、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２５９（１９９６）、９１６〜９１５）。アプタマー配列のサイズは、その性質およびその起源に依存して変化し得るが、好ましくは２０ｂｐから２００ｂｐの間である。アプタマー配列の挿入位置は一般に、環境および立体配座の関数として最適な安定性および切断活性を確実にするために、「ＲＮＡフォールド」などのバイオコンピューティングソフトウエアパッケージを使用して決定される（Ｚｕｋｅｒ　Ｍ、Ｍｅｔｈｏｄ　Ｍｏｌ　Ｂｉｏｌ、２５（１９９４）、２６７〜９４；Ｓｔａｇｅ−Ｚｉｍｍｅｒｍａｎｎ　ＴＫ、ＲＮＡ、４（１９９８）、８７５〜８８９）。
【００３７】
阻害転写物の阻害は、阻害転写物の一部に対するその配列特異性のために、阻害転写物を認識し、かつハイブリダイゼーションすることができ、従って阻害転写物を分解することができるトランス作用のリボザイムによって最終的には行うことができる。好ましくは、トランス型リボザイムはアロステリックリボザイムの形態である。すなわち、トランス型リボザイムは、リガンドの存在下で特に活性化されるリガンド依存性の触媒活性を有する。そのようなアロステリックリボザイムは、当業者にはよく知られており、具体的には、Ｓｏｕｋｕｐ他（Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ、７（１９９９）、７８３〜７９１）によって、そして国際特許出願公開ＷＯ９４／１３７９１に記載される。
【００３８】
使用される活性化因子リガンドは、例えば、核酸、タンパク質、多糖または糖であり、あるいは分子認識機構によって阻害転写物のアプタマー配列またはアロステリックリボザイムの配列に結合することができ、従って触媒活性を活性化することができる任意の有機分子または無機分子である（Ｆａｍｕｌｏｋ　Ｍ、Ｃｕｒｒ　Ｏｐｉｎ　Ｓｔｒｕｃ　Ｂｉｏｌ、９（１９９９）、３２４〜３２９）。これらのリガンドは、当業者にはよく知られており、具体的には、なかでも、Ｃｏｗａｎ他（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．、２８（１５）（２０００）、２９３５〜２９４２）およびＷｅｒｓｔｕｃｋ他（Ｓｃｉｅｎｃｅ、２８２（１９９８）、２９６〜２９８）によって記載される。例として、抗生物質（ドキシサイクリン、ペフロキサシン、トブラマイシンまたはカナマイシンなど）、色素（ヘキスト色素のＨ３３２５８およびＨ３３３４２など）、モノヌクレオチド（ＦＭＮ（フラビンモノヌクレオチド）、ＡＴＰまたはｃＡＭＰなど）、薬物（テオフィリンなど）、アジュバントおよび代替物を挙げることができる。
【００３９】
この実施形態によれば、目的とするトランスジーンは、哺乳動物（好ましくは、ヒト）の標的組織または標的細胞において機能的である構成的プロモータの制御下に置かれる。目的とする転写物の発現を行わせる構成的プロモータは、好ましくは組織特異的である。
【００４０】
本発明の第２の実施形態によれば、目的とする転写物が活性化され、これに対して、阻害転写物の活性が、後者の発現または生物学的活性の十分なレベルを再び確立するために、一定に保たれるか、または目的とする転写物の活性化と同時に阻害されるかのいずれかである。
【００４１】
目的とする転写物の活性化は、目的とする転写物をコードする目的とするトランスジーンの配列を誘導性プロモータの制御下に置くことによって得ることができる。目的とする転写物はまた、後者の安定性に作用することによって活性化させることができる。
【００４２】
その場合、阻害転写物の活性は一定に保つことができ、この場合、阻害トランスジーンは構成的プロモータの制御下に置かれ、リガンドに依存したシス触媒活性またはトランス触媒活性を有するアプタマーまたはリボザイムによる阻害を受けない。
【００４３】
好ましい実施形態によれば、阻害転写物の活性は、目的とする転写物の活性化と同時に、上記のように抑制される。
【００４４】
これらの実施形態において使用される構成的プロモータまたは誘導性プロモータは、当業者にはよく知られている。例えば、そのようなプロモータは、異なる起源、異種起源または同種起源の任意のプロモータまたは誘導型配列であり得るが、これらは組織特異的または組織非特異的であってもよく、強い活性または弱い活性を有し、そして標的組織または標的細胞において機能的であり、従って、機能的に連結された配列の転写を行わせることができる。
【００４５】
具体的には、真核生物またはウイルスの遺伝子のプロモータ配列を挙げることができる。真核生物プロモータの中で、特に、下記のプロモータを使用することができる：遍在性のプロモータ（ＨＰＲＴ、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）、α−アクチン、チューブリンおよびヒストンの遺伝子のプロモータ）、中間体フィラメントのプロモータ（ＧＦＡＰ、デスミン、ビメンチン、ニューロフィラメント、ケラチンなどの遺伝子のプロモータ）、治療的遺伝子のプロモータ（例えば、ＭＤＲ、ＣＦＴＲ、第ＶＩＩＩ因子および第ＩＸ因子、ＡｐｏＡＩ、ＡｐｏＡＩＩ、アルブミン、チミジンキナーゼなどの遺伝子のプロモータ）、組織特異的プロモータ（ピルビン酸キナーゼ、ビリン、脂肪酸結合間質タンパク質および平滑筋α−アクチンの遺伝子のプロモータ）、内皮細胞に特異的なプロモータ（ビルブラント因子プロモータなど）、骨髄系統および造血系統の細胞に特異的なプロモータ（ＩｇＧプロモータなど）、ニューロン特異的エノラーゼプロモータ（Ｆｏｒｓｓ−Ｐｅｔｔｅｒ他、Ｎｅｕｒｏｎ、５（１９９０）、１８７）など、ＶＡＣｈＴのｍＲＮＡのＶ１形態を生じさせるプロモータ（アセチルコリン輸送体；Ｃｅｒｖｉｎｉ他、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０（１９９５）、２４６５４）、過増殖性細胞（ガン性、再狭窄症など）において機能的であるプロモータ（ｐ５３遺伝子のプロモータなど）、トランスフェリン受容体のプロモータ、あるいは刺激に応答するプロモータ（ステロイドホルモン受容体、レチノイン酸受容体など）。後者の場合、外部因子は、目的とする転写物の発現を行わせる誘導性プロモータの応答エレメント（ＲＥ）に、直接的に、または核受容体を介して、トランスで結合することができる特異的な転写活性化因子である。
【００４６】
ラパマイシン媒介型の調節システム（ＰＲＳ）（Ｒｉｖｅｒａ他、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．、２（１９９６）、１０２８〜１０３２）もまた使用することができる。このシステムでは、ヒト起源の２つのキメラなペプチドを含む２つに分かれた転写因子が使用される：すなわち、ＤＮＡに結合するＺＦＨＤ１−ＦＫＢＰ１２の第１のキメラなタンパク質、および短縮されたＦＲＡＰ細胞タンパク質と、ＮＦ−ｋＢ６５タンパク質の１８９アミノ酸のＣ末端配列との融合から得られる第２のキメラなタンパク質。ラパマイシンが存在するとき、ＺＦＨＤ１−ＦＫＢＰ１２タンパク質は、ＺＦＨＤ１依存性プロモータを活性化するＦＲＡＰ−ｐ６５キメラタンパク質に結合する。好ましくは、ラパマイシンの様々な不活性なアナログ（これらは、例えば、経口的または静脈内に投与され得る）が、プロモータを活性化するための外部の活性化因子として使用される（Ｙｅ他、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２８３（１９９９）、８８〜９１）。
【００４７】
好ましくは、目的とするトランスジーンに対する誘導性プロモータの配列は、フランス国特許出願ＦＲ９９０７９５７に記載される通りであるか、またはＦｒｏｈｎｅｒｔ他（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７４（１９９９）、３９７０〜３９７７）によって記載される通りであり、最小の転写プロモータに連結された１つ以上の応答エレメント（ＰＰＲＥ）を含む。目的とするトランスジーンの発現を活性化させるこのシステムは、転写調節因子としてのＰＰＡＲαまたはＰＰＡＲβ（ペルオキシソーム増殖因子により活性化される受容体）の核受容体ととも機能する。都合よいことに、様々なＰＰＡＲとヘテロ二量体を形成することができ、従って目的とするトランスジーンの活性化との相乗作用を示し得るレチノイドＸ受容体（ＲＸＲ）（ヒトＲＸＲαなど）が転写の補助調節因子として使用される（Ｍａｎｇｅｌｓｄｏｒｆ他、Ｎａｔｕｒｅ、３４５（１９９０）、２２４〜２２９；Ｍａｎｇｅｌｓｄｏｒｆ他、Ｇｅｎｅｓ　Ｄｅｖ、６（１９９２）、３２９〜３４４；Ｍａｎｇｅｌｓｄｏｒｆ他、Ｃｅｌｌ、８３（１９９５）、８４１〜８５１；Ｗｉｌｓｏｎ他、Ｃｕｒｒ　Ｏｐ　Ｃｈｅｍ　Ｂｉｏｌ、１（１９９７）、２３５〜２４１；Ｓｃｈｕｌｍａｎ他、Ｍｏｌ　ａｎｄ　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ、１８（１９９８）、３４８３〜３４９４；Ｍｕｋｈｅｒｊｅｅ他、Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ　Ｔｈｒｏｍｂ　Ｖａｓｃ　Ｂｉｏｌ、１８（１９９８）、２７２〜２７６）。一次構造を何ら変化させることなく、ＰＰＡＲαまたはＰＰＡＲγをその天然型で使用するか、または１つ以上（好ましくは２つから４つ）のリガンド結合部位もしくはＥ／Ｆドメインを含む修飾型ＰＰＡＲを使用することもまた可能である（Ｓｃｈｏｏｊａｎｓ他、Ｂｉｏｃｈｉｍ　Ｂｉｏｐｈｙｓ　Ａｃｔａ、１３０２（１９９６）、９３〜１０９）。Ｅ／Ｆドメインの範囲は１つのＰＰＡＲからそれ以外まで変化する。例として、ヒトＰＰＡＲγ２イソ型の場合、Ｅ／Ｆドメインはアミノ酸２８４からアミノ酸５０５までの領域である。目的とするトランスジーンのインビボでの発現の転写調節因子として、ＰＰＡＲγ２γ２（すなわち、ＥおよびＦの２つの反復ドメインを含む修飾されたヒトＰＰＡＲγ）が都合よく使用される。その完全なタンパク質配列は下記の配列（配列番号１）に表される。
【００４８】
【化１】
2004505647.tif 000002
【００４９】
さらに、ＰＰＡＲ応答エレメント（ＰＰＲＥ）は、従って、ＰＰＡＲと結合し、従って目的とするトランスジーンの転写を活性化させるシグナルを媒介することができる核酸領域であるが、１つ以上のＰＰＡＲ結合部位を含むことができる。そのような部位は先行技術において記載されており、例えば、様々なヒトプロモータにおいて、例えば、ヒトアポリポタンパク質ＡＩＩ（ＡｐｏＩＩ）遺伝子のプロモータ（Ｖｕ−Ｄａｃ他、Ｊ　Ｃｌｉｎ　Ｉｎｖｅｓｔ、９６（２）（１９９５）、７４１〜７５０）などにおいて記載される。例えば、＋１の転写開始点に関して、ヌクレオチド−７３４〜−７１６に位置するヒトＡｐｏＡＩＩプロモータのＪ領域（配列ＴＣＡＡＣＣＴＴＴＡＣＣＣＴＧＧＴＡＧ（配列番号２）またはこの配列の任意の他の機能的変化体）に特に対応する人工的に構築された部位を使用することもまた可能である。配列ＡＧＧＴＣＡＡＡＧＧＴＣＡ（配列番号３）のＤＲ１コンセンサス領域に対応する配列もまた、ＰＰＡＲ結合部位として使用することができる。
【００５０】
ＰＰＡＲα活性化リガンド（例えば、フィブリン酸およびそのアナログなどのフィブラート）が外部の活性化因子として使用される。フィブリン酸のアナログとして、具体的には、ゲムフィブロジル（Ａｒｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ、１１４（１）（１９９５）、６１）、ベザフィブラート（Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ、２１（１９９５）、１０２５）、シプロフィブラート（ＢＣＥ＆Ｍ、９（４）（１９９５）、８２５）、クロフィブラート（Ｄｒｕｇ　Ｓａｆｅｔｙ、１１（１９９４）、３０１）、フェノフィブラート（Ｆｅｎｏｆｉｂｒａｔｅ　Ｍｏｎｏｇｒａｐｈ、Ｏｘｆｏｒｄ　Ｃｌｉｎｉｃａｌ　Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ、１９９５）、クリノフィブラート（Ｋｉｄｎｅｙ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、４４（６）（１９９３）、１３５２）、ピリニキシン酸（Ｗｙ、１４、６４３）、または５，８，１１，１４−エイコサテトラエン酸（ＥＴＹＡ）を挙げることができる。これらの様々な化合物はインビボにおける生物学的使用および／または薬理的使用が可能である。
【００５１】
外部の活性化因子はまた、天然または合成されたＰＰＡＲγリガンドから選ぶことができる。天然のリガンドとして、脂肪酸およびエイコサノイド、例えば、リノール酸、リノレン酸、９−ＨＯＤＥまたは５−ＨＯＤＥなどを挙げることができ、そして合成リガンドとして、チアゾリジンジオン類、具体的には、ロシグリタゾン（ＢＲＬ４９６５３）、ピオグリタゾンまたはトログリタザオン（例えば、Ｋｒｅｙ　Ｇ．他、Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．、１１（１９９７）、７７９〜７９１；またはＫｌｉｅｗｅｒ　Ｓ．およびＷｉｌｌｓｏｎ　Ｔ．、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．ｉｎ　Ｇｅｎ．Ｄｅｖ．、８（１９９８）、５７６〜５８１を参照のこと）、または化合物ＲＧ１２５２５などを挙げることができる。
【００５２】
同様に、ウイルスのゲノムに由来するプロモータ配列、例えば、アデノウイルス遺伝子のＥ１ＡおよびＭＬＰのプロモータ、ＣＭＶ初期プロモータ、あるいはＲＳＶまたはＭＭＴＶのＬＴＲのプロモータ、ヘルペスウイルスのＴＫ遺伝子のプロモータなどを含むことができる。さらに、これらのプロモータ領域は、配列を付加または欠失することによって改変することができる。
【００５３】
誘導因子の寿命および／または誘導因子の拡散が困難であることのために極めて長い外因性遺伝子の脱誘導期間（すなわち、基礎レベルへの発現の復帰期間）を有する知られている誘導可能なシステムとは異なり、本発明によるシステムでは、外因性遺伝子のより速い、かつより効果的な活性化および構成的阻害が確実に行われる。具体的には、本発明による方法では、阻害転写物の阻害を増大させ、従って、目的とするトランスジーンの発現を、より迅速に、そして一般には低下した残留レベルにまで低下させることを有用な転写物の脱誘導と同時に可能にする。
【００５４】
本発明の１つの具体的な実施形態によれば、阻害転写物はアンチセンスＲＮＡの形態であり、これは「アンチセンスＲＮＡ型の阻害転写物」と呼ばれる。後者は、目的とする転写物の少なくとも一部分に対して相補的であり、かつ通常のワトソン・クリック型相互作用を介して目的とする転写物に対して選択的にハイブリダイゼーションするヌクレオチド配列を一般に含む。従って、アンチセンスＲＮＡ型の阻害転写物は、目的とする転写物に結合して、例えば、後者がｍＲＮＡであるときには、目的とする転写物の５’末端における細胞翻訳装置の利用を阻止し、タンパク質へのその翻訳を妨げ、そしてインビボにおける目的とするトランスジーンの発現の抑制を可能にすることができる（Ｋｕｍａｒ他、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．、６２（１９９３）、１４１５〜１４３４）。そのようなポリヌクレオチドが、例えば、欧州特許ＥＰ９２５７４および同ＥＰ１４０３０８に記載される。
【００５５】
阻害転写物がアンチセンスＲＮＡ型であるとき、阻害転写物は、ｍＲＮＡ型の目的とする転写物のコード配列のすべてもしくは一部を、または３’端もしくは５’端の非コード配列のすべてもしくは一部を覆うことができる。好ましくは、アンチセンス型の阻害転写物はリボゾーム結合配列および翻訳開始配列に対して相補的である（Ｃｏｌｅｍａｎ　Ｊ他、Ｎａｔｕｒｅ、３１５（１９９０）、６０１〜６０３）。好ましくは、阻害転写物は少なくとも１０リボヌクレオチドの長さである。
【００５６】
阻害転写物をコードする核酸の長さおよび配列の決定は、阻害転写物をコードする核酸と、目的とする転写物をコードする核酸とを同時に注入して、同時に発現させ、そして当業者に知られている種々の検出技術（すなわち、例えば、ＲＴ−ＰＣＲ、および目的とするタンパク質をアッセイするための種々の技術、およびウエスタンブロットにおける種々の検出技術）を使用して効果的な阻害を確認することにある日常的な実験によって行うことができる。
【００５７】
目的とする転写物をコードする核酸、およびアンチセンス型の阻害転写物をコードする核酸は、好都合には、転写を停止させるシグナル、そしてその安定化を可能にするシグナル（例えば、５’端のキャップおよび３’端のポリアデニル化部位など）、そして場合によりイントロンを含む。
【００５８】
従って、この具体的な実施形態によれば、標的組織または標的細胞において目的とするトランスジーンと同時に発現させられるアンチセンスＲＮＡ型の阻害転写物は、翻訳レベルでの目的とするトランスジーンの発現を効果的に阻止することができ、または標的組織もしくは標的細胞のレベルでの目的とする転写物の生物学的活性を効果的に阻止することができる。
【００５９】
本発明の別の具体的な実施形態によれば、阻害転写物はまた、目的とする転写物をその標的として有する触媒活性なＲＮＡまたはリボザイムの形態であり得る。この阻害転写物はリボザイム型の阻害転写物と呼ばれる。リボザイムは、例えば、シス型リボザイムであり得る：すなわち、細胞内レベルにおいてシスで作用することができる（Ｃｅｃｈ　ＴＲ、Ｂｉｏｓｃｉ　Ｒｅｐ、１０（３）（１９９０）、２３９〜２６１）。好ましくは、リボザイムはトランス型リボザイムである：すなわち、目的とする転写物のいくつかをトランスで分解することができる（Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ他、Ｎａｔｕｒｅ、３４４（１９９０）、４６７；Ｅｌｌｉｎｇｔｏｎ他、Ｎａｔｕｒｅ、３４６（１９９０）、８１８；Ｐｉｃｃｉｒｉｌｌｉ他、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５６（１９９２）、１４２０；Ｎｏｌｌｅｒ他、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５６（１９９２）、１４１６；Ｅｌｌｉｎｇｔｏｎ他、Ｎａｔｕｒｅ、３５５（１９９２）、８５０；Ｂｏｃｋ他、３５５（１９９２）、５６４；Ｂｅａｕｄｒｙ他、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５７（１９９２）、６３５）。
【００６０】
リボザイム型の阻害転写物は、一般に、２つの異なる領域を有する。第１の領域は、目的とする転写物に対してある種の親和性を示し、従って、後者に結合することができ、これに対して、第２の領域は、目的とする転写物を切断し、連結し、かつスプライシングするその触媒活性をリボザイムに与える。種々のタイプのリボザイムを使用することができ、例えば、ハンマーヘッドリボザイムまたは環状リボザイム、ヘアピンリボザイム、ラッソリボザイム、テトラヒメナリボザイムまたはＲＮＡｓｅＰなどを使用することができる（Ｃｌｏｕｅｔ−ｄ’Ｏｒｖａｌ　Ｂ．他、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３４（１９９５）、１１１８６〜９０；Ｏｌｉｖｅ　Ｊ．Ｅ．他、ＥＭＢＯ　Ｊ、１４（１９９５）、３２４７〜５１；Ｒｏｇｅｒｓ他、Ｊ　Ｍｏｌ　Ｂｉｏｌ、２５９（１９９６）、９１６〜２５）。
【００６１】
好ましくは、リボザイム型の阻害転写物はアロステリックである：すなわち、その触媒活性がリガンドによって調節される（Ｓｚｏｓｔａｋ、ＴＩＢＳ、１０（１９９２）、８９）。一部のアロステリックリボザイムは自発的な標的ＲＮＡ切断活性を有するが、これに対して、一部のアロステリックリボザイムは、立体配座の変化の後に、またはハイブリダイゼーション反応の後に活性化または阻害される。アプタザイムと呼ばれる他のアロステリックリボザイムは、リガンドの結合によって好ましくは活性化されるリガンド依存性の自己切断活性を有する。そのような調節可能なリボザイムは、なかでも、国際特許出願公開ＷＯ９４／１３７９１および同ＷＯ９６／２１７３０に記載されるが、一般には、リボザイム配列と、切断活性の制御を確実にするリガンド結合配列とを有する。本発明において使用されるリボザイム型の阻害転写物は、好ましくは、リガンドが結合することによって不活性化される。すなわち、本発明において使用されるリボザイム型の阻害転写物は、リガンドの非存在下で目的とする転写物に対して構成的な触媒活性を発揮し、そして目的とする転写物の生物学的に十分なレベルを再び確立するためにリガンドを投与することによって不活性化され得る（Ｆｏｒｔｅｒ他、Ｓｃｉｅｎｃｅ、３４９（１９９０）、７８３〜７８６）。
【００６２】
リボザイム型阻害転写物のサイズは、その性質および／またはその起源に依存して変化し得る。サイズは、一般には１０塩基対から５００塩基対の間であり、好ましくは３００塩基対未満である。リボザイム型の阻害転写物をコードする核酸は、具体的には、天然起源のＲＮＡ配列に由来し得るか、または例えば、自動合成機を使用して化学合成によって得ることができる。
【００６３】
アロステリックリボザイムを調節するために使用されるリガンドは、例えば、核酸、タンパク質、多糖もしくは糖であり、あるいはリボザイム型の阻害転写物に結合して、目的とする転写物に対する切断反応を阻害することができ、またはアプタザイム型の阻害転写物に結合し、従って自己切断反応を活性化することができる任意の有機分子または無機分子である。好ましくは、リガンドは、アロステリックリボザイムを阻害して、目的とする転写物の十分な濃度および活性を回復するために種々の外部経路によってインビボに投与することができ、従って標的細胞または標的組織に対して作用し得る外部因子（非毒性の因子または薬物など）である。リガンドは、好ましくは、投与される生物に対して有害でない抗生物質（例えば、テトラサイクリン、ドキシサイクリンもしくはペフロキサシンなど）またはアジュバントである。
【００６４】
従って、この具体的な実施形態によれば、標的組織または標的細胞において目的とするトランスジーンと同時に発現させられるリボザイム型の阻害転写物は、翻訳レベルで目的とするトランスジーンの発現を効果的に阻止することができ、またはヌクレアーゼ型、トランスフェラーゼ型およびポリメラーゼ型の酵素分解によって目的とする転写物の濃度を低下させることができ、または標的組織もしくは標的細胞のレベルで目的とする転写物の生物学的活性を低下させることができ、あるいは細胞成分とのその相互作用を低下させることができる。
【００６５】
再度ではあるが、本発明の別の実施形態により、阻害剤転写物は、三重らせんを形成するＲＮＡで、インビボで同時に発現させられる目的とするトランスジーンまたは目的とする転写物と会合し得るＲＮＡの形態である。そのようなＲＮＡは、なかでも、国際特許出願公開ＷＯ９５／１８２２３に、Ｇｉｏｖａｎｎａｎｇｅｌｉ他（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１１３（１９９１）、７７７５〜７）およびＨｅｌｅｎｅ他（ＣｉｂａＦｏｕｎｄ　Ｓｙｍｐ．、２０９（１９９７）、８４〜１０２）によって記載され、より詳細には、少なくとも下記を含む複合ＲＮＡをコードする：
目的とするトランスジーンの配列のレベルで標的化された単鎖の核酸またはその一部分と二重らせんを形成し得る第１の領域、
そのようにして形成された二重らせんと、またはその一部分と三重らせんを形成し得る第２の領域、
それぞれが連続的または不連続であり得るこの２つの領域を連結する１つまたは２つのアーム。
【００６６】
好ましくは、この具体的な実施形態によるポリヌクレオチドは、長さが１０塩基よりも大きく、より好ましくは１５塩基よりも大きい。この長さは、単鎖である標的化された目的とするトランスジーンの核酸の長さまたは目的とする転写物の長さの関数として当業者によって調節され、その結果、三重らせんの阻害転写物の安定性および特異性および選択性が確保されるようにされる。
【００６７】
上記のように、本発明による方法は、外部または外因性の遺伝子の移入を可能にし、そして効果的かつ可逆的な様式でのそれらの発現の制御を可能にする。このことは、目的とするトランスジーンの治療用生成物が、ある種のよく規定された濃度範囲内で最適な作用を有し、そしてこの濃度範囲の外側で毒性になるときには好都合である（Ｄｒａｎｏｆｆ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、（１９９３）、３５３９〜３５４３；Ｓｃｈｍｉｄｔ他、Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．Ｔｏｄａｙ、２（１９９６）、３４３〜３４８）。さらに、いくつかの臨床的適用では、インビボにおけるその活性を最適化するために、目的とするトランスジーンの発現を所定の生物学的レベルまたは治療レベルで精密に調節することが必要となる。
【００６８】
さらに、本発明による可逆的な負の調節方法は、目的とするトランスジーンの発現または目的とする転写物の活性を長時間にわたってその最小値で維持しなければならないか、または長時間にわたって消失さえもしなければならず、治療的必要性または実験的必要性のためであるとしても、迅速な誘導が正確なときに必要とされるときには特に有用である。
【００６９】
本発明による可逆的な阻害によって外因性遺伝子の発現を制御する方法は、インビボにおけるその機能、または分子機能もしくはシグナル変換（例えば、受容体、転写因子、輸送体など）におけるその関与を調べることが所望される、実験的価値を有する任意のトランスジーンの発現を制御することを可能にし、または産物が、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、リボ核酸などであるとしても、治療的に注目される生成物を特にコードする目的とする任意のトランスジーンの発現を制御することを可能にする。より詳細には、目的とするトランスジーンは、タンパク質生成物をコードするＤＮＡ配列（ｃＤＮＡ、ｇＤＮＡ、合成ＤＮＡ、ヒトＤＮＡ、動物ＤＮＡ、植物ＤＮＡなど）である。
【００７０】
目的とする転写物は、細胞ｍＲＮＡの転写または遺伝子発現を制御することが標的細胞におけるその発現によって可能になるアンチセンス配列であり得る。そのような配列は、欧州特許ＥＰ１４０３０８に記載される技術に従って、例えば、細胞ｍＲＮＡに対して相補的であるＲＮＡに標的細胞において転写され、従ってタンパク質へのその翻訳を阻止することができる。目的とする転写物はまたリガンドＲＮＡであり得る（国際特許出願公開ＷＯ９１／１９８１３）。
【００７１】
本発明は、毒性因子をコードする配列を発現させることに対して特に好適である。毒性因子としては、具体的には、細胞に対する毒物（ジフテリア毒素、シュードモナス毒素、リシンＡなど）、外部因子に対する感受性を誘導する産物（自殺因子：チミジンキナーゼ、シトシンデアミナーゼなど）、または細胞死を誘導し得る遺伝子（Ｇｒｂ３−３（国際特許出願公開ＷＯ９６／０７９８１）、抗ｒａｓのｓｃＦｖ（国際特許出願公開ＷＯ９４／２９４４６）など）を挙げることができる。従って、このようなシステムは、例えば、抗腫瘍治療法のために、例えば、その制御されない産生が非常に顕著な副作用を有し得るサイトカイン、インターフェロン、ＴＮＦまたはＴＧＦを発現させるために特に適する。
【００７２】
このようなシステムはまた、遺伝子治療法のために、例えば、ＦＧＦまたはＶＥＧＦなどの増殖因子の遺伝子を使用する血管形成などに適する。このシステムは、ホルモン（エリスロポイエチンなど）または抗サイトカイン（抗炎症治療目的のために使用される可溶性のＴＮＦ−α受容体など）の発現を制御することに対して好適である。
【００７３】
本発明の方法により、目的とする転写物をコードする目的とするトランスジーンの配列を含む核酸と、その阻害転写物をコードする配列を含む核酸とのコンビネーションが、それらの同時発現を可能にするように標的組織または標的細胞に同時に移される。様々な物理的または機械的な技術が、これらの核酸の移入を行うために存在し、例えば、注入、弾道学的技術、エレクトロポレーション、電気浸透法、エレクトロトランスファー、ソノポレーション、電場もしくはマイクロ波もしくは熱もしくは水圧を使用する技術、またはこれらの技術の任意の好適な組合せが存在する（Ｂｕｄｋｅｒ他、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、２（２０００）、７６〜８８）。好ましくは、核酸のコンビネーションは、注入およびエレクトロトランスファーによって、すなわち、電場の作用によって導入される。エレクトロトランスファー技術は、具体的には、国際特許出願公開ＷＯ９９／０１１５７および同ＷＯ９９／０１１５８に、そしてＡｉｈａｒａ他、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１６（９）（１９９８）、８６７〜８７０；Ｍｉｒ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、９６（１９９９）、４２６２〜４２６７；Ｒｉｚｚｕｔｏ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、９６（１９９９）、６４１７〜６４２２によって記載される。その移入が所望される核酸分子は、例えば、組織内に、直接的に、または局所的もしくは全身的に投与することができ、その後、強度が１ボルト／ｃｍから８００ボルト／ｃｍの間（好ましくは、２０ボルト／ｃｍから２００ボルト／ｃｍの間）である電気パルスが１つ以上加えられる。
【００７４】
あるいは、本発明による核酸コンビネーションは、国際特許出願公開ＷＯ９０／１１０９２に記載される技術に従ってネイクドＤＮＡの形態で注入することができる。本発明による核酸コンビネーションはまた、化学的因子または生化学的因子と複合体化された形態で投与することができる。化学的因子または生化学的因子としては、例えば、リポプレックスと呼ばれる小胞を形成することによってＤＮＡと会合するリポフェクタミン、および他のポリマー、例えば、ＤＥＡＥ−デキストラン（Ｐａｇａｎｏ他、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、１（１９６７）、８９１）、ポリアミドアミン（ＰＡＭＡＭ）、ポリリシン、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）もしくはポリビニルアルコール（ＰＶＡ）など、またはさらには、会合してウイロソームを形成するウイルスタンパク質（Ｓｃｈｏｅｎ他、Ｇｅｎ　Ｔｈｅｒ、６（１９９９）、５４２４〜５４３１）、またはウイルスタンパク質に由来する分子（Ｋｉｃｈｌｅｒ他、Ｊ　Ｖｉｒｏｌ．７４（２０００）、５４２４〜５４３１）を挙げることができる。カチオン性タンパク質、例えば、ヒストン（Ｋａｎｅｄａ他、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４３（１９８９）、３７５）およびプロタミンなども挙げることができる。核酸はまた、クルード（ｃｒｕｄｅ）な形態で脂質に取り込ませることができ（Ｆｅｌｇｎｅｒ他、ＰＮＡＳ、８４（１９８７）、７４１３）、あるいはベクターに取り込ませることができ、例えば、リポソーム（Ｆｒａｌｅｙ他、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２５５（１９８０）、１０４３１）またはナノ粒子などに取り込ませることができる。リポソームは、核酸がカプセル化され得る、内部に水相を含むリン脂質の小胞である。リポソームの合成および核酸を移入するためのその使用は先行技術において知られている（国際特許出願公開ＷＯ９１／０６３０９、同ＷＯ９２／１９７５２、同ＷＯ９２／１９７３０）。ナノ粒子は、一般には５００ｎｍ未満である小さいサイズの粒子であり、活性成分（核酸など）を細胞内または血液循環内に輸送または運ぶことができる。ナノ粒子は、ポリエチレングリコールと場合により共重合される分解性ユニット（ポリ乳酸など）を主に含むポリマーから構成され得る。ナノ粒子の製造において使用され得る他のポリマーが先行技術に記載されている（欧州特許ＥＰ２７５７９６；同ＥＰ５２０８８９）。
【００７５】
本発明の別の態様は、目的とする転写物または有用な転写物をコードする目的とするトランスジーンの配列を含む核酸と、目的とする転写物に対して特異的な阻害転写物をコードする阻害トランスジーンの配列を含む核酸とを含むベクターに関する。これらの核酸は同じベクターまたは異なるベクターによって担われ得る。核酸が同じベクターによって運ばれるとき、核酸は、好ましくは、同じ鎖において担われる。
【００７６】
そのようなベクターの使用は、実際には、標的細胞への移入効率を改善することを可能にし、そしてまた、前記細胞におけるその安定性を増大させることを可能にし、それにより、長く持続する治療効果を得ることを可能にする。さらに、ベクターの使用はまた、治療分子を産生させなければならない細胞の特定集団を標的化することも可能にする。
【００７７】
使用されるベクターは、植物細胞および動物細胞（好ましくは、ヒト細胞）を形質転換することができる場合、種々の起源であり得る。同様に、ベクターは、プラスミド、エピソーム、コスミドもしくは人工染色体などの非ウイルスベクターまたはウイルスベクターであり得る。本発明の好ましい実施形態では、アデノウイルス、レトロウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、ヘルペスウイルス、サイトメガロウイルス、ワクシニアウイルスなどから選ぶことができるウイルスベクターが使用される。ベクターはまた、ファージ、浸襲性細菌または寄生体であり得る。
【００７８】
アデノウイルス、レトロウイルスまたはＡＡＶに由来し、異種の核酸配列を含む様々なベクターが文献に記載されている［Ａｋｌｉ他、Ｎａｔｕｒｅ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、３（１９９３）、２２４；Ｓｔｒａｔｆｏｒｄ−Ｐｅｒｒｉｃａｕｄｅｔ他、Ｈｕｍａｎ　Ｇｅｎｅ　Ｔｈｅｒａｐｙ、１（１９９０）、２４１；欧州特許ＥＰ１８５５７３；Ｌｅｖｒｅｒｏ他、Ｇｅｎｅ、１０１（１９９１）、１９５；Ｌｅ　Ｇａｌ　ｌａ　Ｓａｌｌｅ他、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５９（１９９３）、９８８；Ｒｏｅｍｅｒ　ｅｔ　Ｆｒｉｅｄｍａｎｎ、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２０８（１９９２）、２１１；Ｄｏｂｓｏｎ他、Ｎｅｕｒｏｎ、５（１９９０）、３５３；Ｃｈｉｏｃｃａ他、Ｎｅｗ　Ｂｉｏｌ．、２（１９９０）、７３９；Ｍｉｙａｎｏｈａｒａ他、Ｎｅｗ　Ｂｉｏｌ．、４（１９９２）、２３８；国際特許出願公開ＷＯ９１／１８０８８］。
【００７９】
好都合なことに、本発明による組み換えウイルスは不完全ウイルスである。用語「不完全ウイルス」は、標的細胞において複製することができないウイルスを意味する。従って、一般に、本発明に関連して使用される不完全ウイルスのゲノムは、感染細胞における前記ウイルスの複製のために要求される配列を少なくとも有していない。これらの領域は、（完全または部分的に）除去することができ、または非機能性にすることができ、または他の配列で、具体的には、本発明の二本鎖核酸の配列で置換することができる。しかしながら、不完全ウイルスは、好ましくは、ウイルス粒子のカプシド化のために要求されるそのゲノムの配列を保存している。
【００８０】
本発明による方法では、産生細胞に対して毒性を有することなく、さらにまた、リプレッサー因子による処置によって標的細胞におけるこれらの毒性分子の発現を選択的に誘導するために、目的とするトランスジーンの核酸配列と、特異的な阻害トランスジーンの核酸配列とを含有するベクター（具体的には、ウイルスベクター）が使用される。
【００８１】
本発明は、細胞、組織または器官の様々なタイプにおいて目的とするトランスジーンの発現をインビボで調節するために使用することができる。特に、植物起源または動物起源（好ましくは哺乳動物起源、さらにより好ましくはヒト起源）の細胞、組織または器官であり得る。例示として、筋肉細胞（または筋肉）、肝細胞（または肝臓）、心臓細胞（または心臓、動脈壁もしくは血管壁）、神経細胞（または脳、脊髄など）、あるいは腫瘍細胞（または腫瘍）を挙げることができる。好ましくは、本発明による組成物、構築物および方法は、筋肉細胞または筋肉におけるインビボでの目的とするトランスジーンの調節された発現のために使用される。様々な例に示される結果により、特に、このタイプの細胞におけるインビボでの本発明の様々な利点が例示される。
【００８２】
本発明の別の態様は、上記に記載されるような方法によって得ることができる動物起源または植物起源の細胞または組織で、目的とする転写物をコードする目的とするトランスジーンの配列を含む核酸と、目的とする転写物に対して特異的な阻害転写物をコードする阻害トランスジーンの配列を含む核酸とを含む動物起源または植物起源の細胞または組織に関する。本発明による組織は、好ましくは、例えば、本発明の制御方法に従って目的とするトランスジーンの生物学的生成物を発現するようその細胞が改変され、従って再移植することができる器官類似体または新器官類似体を得るためにエクスビボで再構成される動物起源または植物起源の組織である（Ｖａｎｄｅｎｂｕｒｇｈ他、Ｈｕｍ．Ｇｅｎ　Ｔｈｅｒ．、９（１７）（１９９８）、２５５５〜２５６４；Ｐｏｗｅｌｌ他、Ｈｕｍ．Ｇｅｎ　Ｔｈｅｒ．、１０（４）（１９９９）、５６５〜５７７；ＭａｃＣｏｌｌ他、Ｊ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．、１６２（１）（１９９９）、１〜９）。
【００８３】
本発明のさらに別の態様は、インビボで投与され得る組成物で、目的とする転写物または有用な転写物をコードする目的とするトランスジーンの核酸配列と、目的とする転写物に対して特異的な阻害転写物をコードする阻害トランスジーンの核酸配列と、好適なビヒクルとを含む組成物に関する。
【００８４】
本発明はまた、インビボで投与され得る組成物で、目的とする転写物または有用な転写物をコードする目的とするトランスジーンの核酸配列と、前記目的とする転写物に対して特異的な阻害転写物をコードする阻害トランスジーンの核酸配列とを含む少なくとも１つのベクター、および好適なビヒクルを含む組成物に関する。この場合、目的とする転写物および阻害転写物は外部因子により活性化または阻害され得る。
【００８５】
本発明はまた、インビボで投与するための医薬組成物で、目的とする転写物または有用な転写物をコードする目的とするトランスジーンの核酸配列と、前記目的とする転写物に対して特異的な阻害転写物をコードする核酸とを含む少なくとも１つのベクター、および好適なビヒクルを含む医薬組成物に関する。この場合、目的とする転写物および阻害転写物は外部因子により活性化または阻害され得る。
【００８６】
本発明はまた、目的とする転写物または有用な転写物をコードする目的とするトランスジーンの核酸配列と、前記目的とする転写物に対して特異的な阻害転写物をコードする阻害トランスジーンの核酸配列と、好適なビヒクルとを含む医薬品に関する。この場合、目的とする転写物および阻害転写物は外部因子により活性化または阻害され得る。
【００８７】
本発明によれば、例えば、局所投与、皮膚投与、経口投与、膣内投与、非経口投与、鼻腔内投与、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、眼内投与、経皮投与などに好適なビヒクルはどれも使用することができる。
【００８８】
好ましくは、医薬適合性のビヒクルが、注入用配合物のために、具体的には、所望する器官への直接的な注入のために、または任意の他の投与のために使用される。医薬適合性のビヒクルは、具体的には、滅菌された等張性の溶液、または場合により滅菌水もしくは生理学的食塩水の添加により、注入可能な溶質の調製を可能にする乾燥組成物（具体的には、凍結乾燥組成物）を含むことができる。目的とする転写物をコードする目的とするトランスジーンの配列と、阻害転写物をコードする阻害トランスジーンの配列とを含む、注入のために使用される核酸の濃度、ならびに投与回数および注入容量は、様々なパラメーターの関数として、具体的には、使用される投与方法、関係する病理、もしくはその発現を調節することが所望される目的とするトランスジーンの関数として、または処置の所望する継続期間の関数として調節することができる。
【００８９】
本発明のための目的とするトランスジーンには、より詳細には、下記をコードする遺伝子を挙げることができる：
酵素、例えば、α−１−アンチトリプシン、プロテイナーゼ（メタロプロテイナーゼ、ウロキナーゼ、ｕＰＡ、ｔＰＡおよびストレプトキナーゼ）、前駆体を切断して活性な産物を遊離させるプロテアーゼ（ＡＣＥ、ＩＣＥ）またはそのアンタゴニスト（ＴＩＭＰ−１、組織プラスミノーゲン活性化因子阻害剤ＰＡＩ、ＴＦＰＩ）など；
凝固に関与する因子などの血液誘導体：第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子および第ＩＸ因子、補体因子、トロンビン；
ホルモン、またはホルモン合成経路に関与する酵素、またはホルモンの合成、排出もしくは分泌を制御することに関与する因子、例えば、インスリン、インスリン様因子（ＩＧＦ）または成長ホルモン、ＡＣＴＨ、性ホルモンの合成に関する酵素など；
リンホカインおよびサイトカイン：インターロイキン、ケモカイン（ＣＸＣおよびＣＣ）、インターフェロン、ＴＮＦ、ＴＧＦ、走化性因子、または活性化因子、例えば、ＭＩＦ、ＭＡＦ、ＰＡＦ、ＭＣＰ−１、エオタキシン、ＬＩＦなど（フランス国特許ＦＲ２６８８５１４）；
増殖因子、例えば、ＩＧＦ、ＥＧＦ、ＦＧＦ、ＫＧＦ、ＮＧＦ、ＰＤＧＦ、ＰＩＧＦ、ＨＧＦ、プロリフェリン；
血管形成因子、ＶＥＧＦまたはＦＧＦ、アンギオポエチン１または２、エンドセリンなど；
神経伝達物質の合成に関する酵素；
栄養因子、具体的には、神経変性疾患、神経系を損傷させる外傷、または網膜変性を処置するための神経栄養因子、例えば、ニューロトロフィンファミリーのメンバー、例えば、ＮＧＦ、ＢＤＮＦ、ＮＴ３、ＮＴ４／５、ＮＴ６、それらの誘導体および関連する遺伝子−ＣＮＴＦファミリ−のメンバー、例えば、ＣＮＴＦ、アクソカインおよびＬＩＦ、ならびにそれらの誘導体−ＩＬ６およびその誘導体−カルジオトロフィンおよびその誘導体−ＧＤＮＦおよびその誘導体−ＩＧＦファミリーのメンバー、例えば、ＩＧＦ−１またはＩＧＦ−２およびそれらの誘導体−ＦＧＦファミリーのメンバー、例えば、ＦＧＦ１、ＦＧＦ２、ＦＧＦ３、ＦＧＦ４、ＦＧＦ５、ＦＧＦ６、ＦＧＦ７、ＦＧＦ８またはＦＧＦ９およびそれらの誘導体、ＴＧＦβ；
骨増殖因子；
造血因子、例えば、エリスロポイエチン、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、ＬＩＦなど；
細胞構造のタンパク質（例えば、ディストロフィンまたはミニディストロフィン（フランス国特許ＦＲ２６８１７８６）など）、自殺遺伝子遺伝子（チミジンキナーゼ、シトシンデアミナーゼ、シトクロームＰ４５０様々な酵素）、他のタンパク質輸送体のヘモグロビンの遺伝子；
脂質代謝に関与するタンパク質（例えば、Ａ−Ｉ、Ａ−ＩＩ、Ａ−ＩＶ、Ｂ、Ｃ−Ｉ、Ｃ−ＩＩ、Ｃ−ＩＩＩ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｊおよびアポ（ａ）のアポリポタンパク質から選ばれるアポリポタンパク質）、代謝性酵素（例えば、リパーゼ、リポタンパク質リパーゼ、肝臓リパーゼ、レシチン−コレステロールアセチルトランスフェラーゼ、コレステロール７−α−ヒドロキシラーゼまたはホスファチジル酸ホスファターゼなど）、あるいは脂質輸送タンパク質（コレステロールエステルの輸送タンパク質、またはリン脂質の輸送タンパク質、ＨＤＬ結合タンパク質、または例えば、ＬＤＬ受容体、キロミクロン受容体およびスカベンジャー受容体から選ばれる受容体など）、および肥満を処置するためのレプチンに対応する遺伝子；
血圧調節因子、例えば、ＮＯ代謝に関与する酵素、アンギオテンシン、ブラジキニン、バソプレッシン、ＡＣＥ、レニン、プロスタグランジン類またはトロンボキサンまたはアデノシンの合成機構または放出機構をコードする酵素、アデノシン受容体、カリクレイン類およびカリスタチン類、ＡＮＰ、ＡＮＦ、利尿因子または抗利尿因子、媒介因子（ヒスタミン、セロトニン、カテコールアミン類または神経ペプチドなど）の合成または代謝または放出に関与する因子；
抗血管形成因子、例えば、Ｔｉｅ−１リガンドおよびＴｉｅ−２リガンド、アンギオスタチン、ＡＴＦ因子、プラスミノーゲンの誘導体、エンドセリン、トロンボスポンジン１およびトロンボスポンジン２、ＰＦ−４、インターフェロンαまたはインターフェロンβ、インターロイキン１２、ＴＮＦα、ウロキナーゼ受容体、ｆｌｔ１、ＫＤＲ、ＰＡＩ１、ＰＡＩ２、ＴＩＭＰ１、プロラクチンフラグメントなど；
アポトーシスから保護する因子、例えば、ＡＫＴファミリーなど；
細胞死を誘導し得るタンパク質、本質的に活性であるタンパク質（カスパーゼなど）、他の因子による活性化を必要とする「プロドラッグ」型のタンパク質、または細胞死を生じさせる因子にプロドラッグを活性化するタンパク質（ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼまたはデアミナーゼなど）、および特に抗ガン治療が予想され得るタンパク質；
細胞間接触および接着に関与するタンパク質：ＶＣＡＭ、ＰＥＣＡＭ、ＥＬＡＭ、ＩＣＡＭ、インテグリン類、カテニン類；
細胞外マトリックスタンパク質；
細胞遊走に関与するタンパク質；
シグナル伝達型のタンパク質、ＦＡＫ、ＭＥＫＫ、ｐ３８キナーゼ、チロシンキナーゼ、セリン−トレオニンキナーゼの各タイプ；
細胞周期調節に関与するタンパク質（ｐ２１、ｐ１６、サイクリン類）、および細胞周期を阻止し、適する場合にはアポトーシスを誘導し得る優性ネガティブ変異体または誘導型タンパク質；
転写因子：ｊｕｎ、ｆｏｓ、ＡＰ１、ｐ５３、およびｐ５３シグナル変換カスケードのタンパク質；
細胞構造タンパク質、例えば、中間フィラメント（ビメンチン、デスミン、ケラチン類）、ディストロフィン、または筋肉収縮性および筋肉収縮性の制御に関与するタンパク質、特に、細胞におけるカルシウム代謝およびカルシウム流束に関与するタンパク質（ＳＥＲＣＡ）など。
【００９０】
リガンドおよび受容体のシステムを介して機能するタンパク質の場合、リガンド（例えば、ＦＧＦもしくはＶＥＧＦ）または受容体（ＦＧＦ−Ｒ、ＶＥＧＦ−Ｒ）の使用が考えられる。また、リガンドタンパク質または受容体タンパク質（特に、上記のタンパク質）のフラグメントまたは変異体をコードする遺伝子も挙げることができ、それらは、完全なタンパク質よりも大きい活性、またはアンタゴニスト活性、またはさらには最初のタンパク質と比較して「優性ネガティブ」型の活性のいずれかを有し（例えば、細胞膜における固定と比較して、これらのフラグメントの分泌を誘導する配列とおそらくは一緒になって、循環しているタンパク質の利用性を阻害する受容体のフラグメント、またはエレメントの１つの利用性を変化させるようにこれらのリガンド−受容体システムの細胞内輸送を変化させる他のシステム）、あるいは完全なタンパク質の活性とは異なるそれら自身の特定の活性さえも有する（例えば、ＡＴＦ）。
【００９１】
組織によって分泌されるタンパク質またはペプチドをコードする目的とするトランスジーンの中で、免疫療法におけるその使用のためには、例えば、感染性疾患、腫瘍または自己免疫疾患（多発性硬化症（自己イディオタイプ抗体）など）の処置のためには、抗体、単鎖抗体（ＳｃＦｖ）の様々なフラグメント、または認識能を有する任意の他の抗体フラグメント、そして慢性関節リウマチの処置のために、前炎症性サイトカイン（例えば、ＩＬ１およびＴＮＦαなど）に結合するＳｃＦｖを強調することは重要である。本発明による医薬品において使用される他の目的とするトランスジーンは、特に限定されないが、可溶性の受容体をコードし、例えば、抗ＨＩＶ治療のためには可溶性のＣＤ４受容体もしくは可溶性のＴＮＦ受容体をコードし、または慢性関節リウマチの処置のためにはＴＮＦα受容体もしくは可溶性のＩＬ１受容体をコードし、または筋無力症の処置のためには可溶性のアセチルコリン受容体をコードする；例えば、喘息、再狭窄の血栓症、転移または炎症を処置するためには、例えば、基質ペプチドもしくは酵素阻害剤、または受容体もしくは接着分子のアゴニストもしくはアンタゴニストであるペプチドをコードする；人工タンパク質またはキメラタンパク質または短縮型タンパク質をコードする。根本的に注目されるホルモンには、糖尿病の場合におけるインスリン、成長ホルモン、およびカルシトニンを挙げることができる。また、抗腫瘍免疫性を誘導し得るタンパク質または免疫応答を刺激し得るタンパク質も挙げることができる（ＩＬ２、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ１２など）。最後に、ＴＨ１応答を低下させるサイトカインを挙げることができる（例えば、ＩＬ１０、ＩＬ４またはＩＬ１３など）。
【００９２】
有益である他のトランスジーンもまた、本発明による組成物および医薬品において使用することができる。これらは、具体的には、ＭｃＫｕｓｉｃｋ，Ｖ．Ａ．（Ｍｅｎｄｅｌｉａｎ　Ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ　ｉｎ　ｍａｎ，ｃａｔａｌｏｇｓ　ｏｆ　ａｕｔｏｓｏｍａｌ　ｄｏｍｉｎａｔ，ａｕｔｏｓｏｍａｌ　ｒｅｃｅｓｓｉｖｅ，ａｎｄ　Ｘ−ｌｉｎｋｅｄ　ｐｈｅｎｏｔｙｐｅｓ（ヒトにおけるメンデル遺伝：常染色体優性表現型、常染色体劣性表現型およびＸ連鎖表現型のカタログ）、第８版、Ｊｏｈｎ　Ｈｏｐｋｉｎｓ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｐｒｅｓｓ（１９８８））によって、Ｓｔａｎｂｕｒｙ，Ｊ．Ｂ．他（Ｔｈｅ　ｍｅｔａｂｏｌｉｃ　ｂａｓｉｓ　ｏｆ　ｉｎｈｅｒｉｔｅｄ　ｄｉｓｅａｓｅ（遺伝型疾患の代謝的基礎）、第５版、ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ（１９８３））に記載される。目的とするトランスジーンは、アミノ酸、脂質および他の細胞成分の代謝に関与するタンパク質を包含する。
【００９３】
例えば、非限定的ではあるが、炭水化物代謝の疾患に関連する遺伝子を挙げることができる（例えば、フルクトース−１−リン酸アルドラーゼ、フルクトース−１，６−ジホスファターゼ、フルコース−６−ホスファターゼ、リソソームα−１，４−グルコシダーゼ、アミロ−１，６−グルコシダーゼ、アミロ−（１，４：１，６）−トランスグルコシダーゼ、筋肉ホスホリラーゼ、筋肉ホスホフルクトキナーゼ、ホスホリラーゼ−ｂキナーゼ、ガラクトース−１−リン酸ウリジルトランスフェラーゼ、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体のすべての酵素、ピルビン酸カルボキシラーゼ、２−オキソグルタル酸グリオキシラーゼカルボキシラーゼまたはＤ−グリセリン酸デヒドロゲナーゼなど）。
【００９４】
また、下記の遺伝子も挙げることができる：
アミノ酸代謝の疾患に関連する遺伝子、例えば、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ、ジヒドロビオプテリンシンセターゼ、チロシンアミノトランスフェラーゼ、チロシナーゼ、ヒスチジナーゼ、フマリルアセトアセターゼ、グルタチオンシンセターゼ、γ−グルタミルシステインシンセターゼ、オルニチン−δ−アミノトランスフェラーゼ、カルバモイルリン酸シンセターゼ、オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ、アルギニノコハク酸シンセターゼ、アルギニノコハク酸リアーゼ、アルギナーゼ、Ｌ−リシンデヒドロゲナーゼ、Ｌ−リシン−ケトグルタル酸レダクターゼ、バリントランスアミナーゼ、ロイシン−イソロイシントランスアミナーゼ、分枝鎖２−ケト酸デカルボキシラーゼ、イソバレリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ、アシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡリアーゼ、アセトアセチル−ＣｏＡ−３−ケトチオラーゼ、プロピオニル−ＣｏＡカルボキシラーゼ、メチルマロニル−ＣｏＡムターゼ、ＡＴＰ：コバラミンアデノシルトランスフェラーゼ、ジヒドロ葉酸レダクターゼ、メチレンテトラヒドロ葉酸レダクターゼ、シスタチオニンβ−シンセターゼ、サルコシンデヒドロゲナーゼ複合体、グリシン切断システムに属する酵素、β−アラニントランスアミナーゼ、血清カルノシナーゼ、脳ホモカルノシナーゼなど；
脂肪代謝および脂肪酸代謝の疾患に関連する遺伝子、例えば、リポタンパク質リパーゼ、アポリポタンパク質Ｃ−ＩＩ、アポリポタンパク質Ｅ、他のアポリポタンパク質、レシチン−コレステロールアシルトランスフェラーゼ、ＬＤＬ受容体、肝臓ステロールヒドロキシラーゼ、「フィタン酸」α−ヒドロキシラーゼなど；
リソソーム機能不全に関連する遺伝子、例えば、リソソームα−Ｌ−イズロニダーゼ、リソソームイズロン酸スルファターゼ、リソソームヘパランＮ−スルファターゼ、リソソームＮ−アセチル−α−Ｄ−グルコサミニダーゼ、アセチル−ＣｏＡ：リソソームα−グルコサミンＮ−アセチルトランスフェラーゼ、リソソームＮ−アセチル−α−Ｄ−グルコサミン−６−スルファターゼ、リソソームガラクトサミン−６−硫酸スルファターゼ、リソソームβ−ガラクトシダーゼ、リソソームアリールスルファターゼＢ、リソソームβ−グルクロニダーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミニルホスホトランスフェラーゼ、リソソームα−Ｄ−マンノシダーゼ、リソソームα−ノイラミニダーゼ、リソソームアスパルチルグリコサミニダーゼ、リソソームα−Ｌ−フコシダーゼ、リソソーム酸性リパーゼ、リソソーム酸性セラミダーゼ、リソソームスフィンゴミエリナーゼ、リソソームグルコセレブロシダーゼおよびリソソームガラクトセレブロシダーゼ、リソソームガラクトシルセラミダーゼ、リソソームアリールスルファターゼＡ、α−ガラクトシダーゼＡ、リソソーム酸性β−ガラクトシダーゼ、リソソームヘキソサミニダーゼＡα鎖など。
【００９５】
また、非限定的ではあるが、ステロイド代謝および脂質代謝の疾患に関連する遺伝子、プリン代謝およびピリミジン代謝の疾患に関連する遺伝子、ポルフィリン代謝およびヘム代謝の疾患に関連する遺伝子、結合組織および骨の代謝の疾患に関連する遺伝子、ならびに血液および造血器官の疾患、筋肉の疾患（筋障害）、神経系の疾患（神経変性疾患）または循環系の疾患（例えば、虚血および狭窄症の処置）に関連する遺伝子、そしてミトコンドリア遺伝子疾患に関与する遺伝子も挙げることができる。
【００９６】
本発明はまた、例えば、ある種の遺伝子異常または遺伝子欠損（例えば、ミトコンドリア遺伝子疾患、血友病およびβ−サラセミアなど）を処置するための医薬品を調製するための、上記に記載されたコンビネーションの使用に関する。
【００９７】
さらに、本発明の主題は、ある種の疾患を処置および／または防止するための医薬品を調製するための、本発明によるコンビネーションの使用である。そのような疾患には、例えば、虚血、狭窄症、筋障害、神経変性疾患、代謝性疾患（リソソーム性疾患など）、炎症性疾患（慢性関節リウマチなど）、ホルモン障害（糖尿病など）、心臓血管疾患（高血圧など）または高脂血症（肥満など）などがある。
【００９８】
本発明の主題はまた、抗ガン用の医薬品（例えば、抗腫瘍ＤＮＡ）を調製するための、またはワクチンを調製するための、上記に記載されるコンビネーションの使用である。
【００９９】
上記の多くの例および下記の例により、本発明の適用分野の潜在的範囲が例示される。
【０１００】
本発明の別の態様は、目的とする転写物をコードする目的とするトランスジーンと、目的とする転写物に対して特異的な阻害転写物をコードする阻害トランスジーンとを１つ以上の細胞タイプにおいて発現するトランスジェニック動物に関する。トランスジェニック動物（具体的には、トランスジェニックマウス）の作製方法は、今や、当業者に十分に知られており、具体的には、Ｈｏｇａｎ他（１９８６、Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）によって記載される。
【０１０１】
本発明によれば、上記に記載された核酸は、非ヒトの受精した卵母細胞に顕微注入によって移され、そして卵母細胞を発達させるために、卵母細胞がキャリアのメスに移植される。一般に、核酸は、トランスジェニック動物が発達する細胞のゲノムに組み込まれ、そしてトランスジェニック動物の１つ以上の細胞または組織における目的とするトランスジーンおよび阻害トランスジーンの発現が認められ得るように成体動物のゲノムに維持される。目的とするトランスジーンの核酸配列および阻害トランスジーンの核酸配列を有するトランスジェニック動物はまた、他のトランスジーンを有するトランスジェニック動物と交配させることができる。
【０１０２】
そのようにして作製されたトランスジェニック動物として、例えば、マウス、ヤギ、ヒツジ、ブタ、ウシまたは任意の他の家畜を挙げることができる。そのようなトランスジェニック動物は、野生型動物と類似する表現型を有するが、阻害転写物のリプレッサーである外部因子、および／または目的とする転写物の活性の活性化因子である因子が動物に投与されたときに、目的とするトランスジーンまたは転写物が回復させられる。
【０１０３】
これらのトランスジェニック動物は、いくつかのヒト疾患または動物疾患の生理病理学を模擬するために使用され、従って、ヒト疾患または動物疾患の実験モデルになる。例えば、宿主動物において、病理に関与すると考えられる目的とするトランスジーンを、特定の表現型を出現させることなく、その特異的な阻害トランスジーンとともに導入することができる。調べられる目的とするトランスジーンの発現を、その後、この遺伝子の発現と病理学的表現型の出現との間に存在する関係を明らかにするために、阻害転写物のリプレッサーである外部因子および／または目的とする転写物の活性化因子である外部因子を投与することによって調節することができる。そのような方法は、通常のノックアウト技術を上回るある種の利点を有する。これは、本発明によるトランスジェニック動物は、完全であるだけでなく、可逆的でもある目的とするトランスジーンの不活性化を可能にし、そしてその発現をより効果的に調節することができるからである。
【０１０４】
本発明の最後の態様は、目的とする転写物をコードする目的とするトランスジーンの配列を含む核酸と、目的とする転写物に対して特異的な阻害転写物をコードする阻害トランスジーンの配列を含む核酸とをそのゲノムに含むトランスジェニック植物およびトランスジェニック植物細胞に関する。これらの植物は、植物への遺伝子導入の従来技術によって得ることができる。目的とするトランスジーンまたは転写物をコードする核酸および阻害転写物をコードする核酸を、植物において自然の状態で機能的な転写プロモータの制御下に置かれて有するプラスミドが、例えば、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓの菌株に導入される。その後、植物の形質転換を、標準的な形質転換プロトコルおよび再生プロトコルを使用して行うことができる（Ｄｅｂｌａｅｒｅ他、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１３（１９８５）、４７７７〜４７８８；Ｄｉｎａｎｔ他、Ｅｕｒｏｐｅａｎ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｐｌａｎｔ　Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ、１０４（１９９８）、３７７〜３８２）。
【０１０５】
構成的プロモータ（例えば、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）の３５Ｓプロモータ（Ｏｄｅｌｌ他、Ｎａｔｕｒｅ、３１３（１９８５）、８１０〜８１２）など）を使用することができる。目的とする転写物の発現を行わせるために、誘導性プロモータ、例えば、とりわけデキサメタゾンによって活性化されるグルココルチコイド誘導性プロモータ（Ａｏｙａｍａ他、Ｐｌａｎｔ　Ｊ．、１１（１９９７）、６０５〜６１２；Ａｏｙａｍａ他、Ｇｅｎｅ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｉｎ　Ｐｌａｎｔｓ、（１９９９）、４４〜５９）、エタノール誘導性システム（Ｃａｄｄｉｃｋ他、Ｎａｔ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、１６（１９９８）、１７７〜１８０）、またはβ−エストラジオールなどのステロイドホルモンによる転写活性化システム（Ｂｒｕｃｅ他、Ｐｌａｎｔ　Ｃｅｌｌ、１２（２０００）、６５〜８０）などを使用することが可能である。あるいは、Ｍａｒｔｉｎｅｚ他（Ｐｌａｎｔ　Ｊ、１９（１９９９）、９７〜１０６）によって記載されるようなエクジソン誘導性の転写システムが使用される。これは、グルココルチコイド受容体（ＧＲ）配列およびＶＰ１６トランス活性化配列、すなわち、ＧＲのＤＮＡ結合ドメインおよびエクジソン受容体のホルモン依存性調節ドメインを含有するハイブリッド活性化因子とともに機能する。後者のシステムは、とりわけ非ステロイド性エクジソンアゴニストのＲＨ５９９２で活性化され得る。従って、後者のシステムでは、活性化された状態で目的とするトランスジーンの発現レベルを回復させることが可能になる。しかし、この調節システムは、非活性化状態で大きい基礎レベルをもたらすが、本発明に従って、目的とするこのトランスジーンに対する阻害転写物との同時発現で目的とするトランスジーンの発現を行わせるために使用されたときには、目的とするトランスジーンの基礎レベルは大きく低下する。
【０１０６】
この後者の態様により、細胞傷害的である外来遺伝子または致死的でさえある外来遺伝子を、形質導入された植物の再生を阻害することなく、そして細胞死を制限しながら短期間にわたって制限された様式で発現させることができる。従って、目的とするトランスジーンの発現を可逆的に阻害するこのシステムは、植物作製バイオテクノロジーのいくつかの適用のために、そして基礎的な農学研究に関連して極めて有用である。
【０１０７】
従って、本発明は、その過剰発現が、または基礎的な発現でさえも、その遺伝子を発現する生物にとって有害な作用を有する遺伝子を研究するために特に有用である。例として、植物におけるサイトカインの制御されない産生は、例えば、異常な表現型を発達途中で生じさせる（例えば、無根、頂芽優性の喪失、不稔性、または植物の場合には植物組織の再生を阻止するか、もしくは致死性の問題さえ生じさせる細胞毒性など）。
【０１０８】
さらに、外因性の遺伝子を本発明に従って可逆的に阻害する方法は、目的とするトランスジーンの生成物の安定性を研究するために（Ｇｉｌ他、ＥＭＢＯ　Ｊ．、１５（１９９６）、１６７８〜１６８６）、または外因性遺伝子の生成物の代謝回転を評価するために有用であることが証明され得る。
【０１０９】
目的とする転写物をコードする目的とするトランスジーンと、目的とする転写物に対して特異的な阻害転写物をコードする阻害トランスジーンとの構築物を有する本発明によるトランスジェニック植物は、本発明に従って、いくつかの分子機構および遺伝子相互作用を研究するためにも使用することができる。具体的には、いくつかの遺伝子の発現が細胞死をもたらすとき、目的とする致死性トランスジーンの配列とその阻害転写物の配列との両方を有するトランスジェニック系統は、細胞死の分子機構および分子相互作用を続いて研究することを可能にする変異体を単離するために使用することができる。致死性の表現型を回避することに加えて、本発明によるシステムは、いくつかの遺伝子、および表現型の出現におけるそれらの関与、ならびにいくつかのシグナル伝達経路におけるそれらの可能な関係の機能的分析を容易にする。
【０１１０】
また、本発明による方法は、植物の発達に初期段階で影響を及ぼしやすいが、後期の発達段階で役割を果たし得る植物遺伝子の研究を容易にすることを可能にする。これらの遺伝子の変異は植物の発達に影響を及ぼし、従って、これらの遺伝子の考えられる後期機能の研究を妨げる。目的とするトランスジーンおよびその阻害転写物を有する配列で形質転換された植物は正常な初期の発達を続けることができ、そして好適な外部因子をその後の発達段階で投与することにより、問題とする遺伝子の発現を回復させて、それらの後期機能を明らかにすることが都合よく可能になる。従って、本発明による植物キメラは、例えば、植物におけるシグナル変換機構に関して新規な情報をもたらすことができる。
【０１１１】
本出願は下記の実施例の助けによってより詳しく記載されるが、下記の実施例は、例示的で、非限定的であると見なさなければならない。
【０１１２】
（図面の簡単な説明）
図１Ａから図１Ｅは、ｐＸＬ３０３１（図１Ａ）、ｐＸＬ３０１０（図１Ｂ）、ｐＳｅＡＰａｎｔｉｓｅｎｓｅ（図１Ｃ）、ｐＸＬ３２９６（図１Ｄ）およびｐＬｕｃＡｔｉｓｅｎｓｅ（図１Ｅ）の各プラスミドの概略図である。
【０１１３】
図２Ａから図２Ｅは、ｐＴｅｔ−Ｓｐｌｉｃｅ（図２Ａ）、ｐＴｅｔＬｕｃＡｎｔｉｓｅｎｓｅ（図２Ｂ）、ｐＴｅｔＬｕｃ（図２Ｃ）、ｐＴｅｔＳｐｌｉｃｅ−ＳｅＡＰａｎｔｉｓｅｎｓｅ（図２Ｄ）およびｐＴｅｔ−ｔＴＡＫ（図２Ｅ）の各プラスミドの概略図である。
【０１１４】
図３Ａから図３Ｄは、ｐＧＪＡ１（図３Ａ）、ｐＧＪＡ２（図３Ｂ）、ｐＧＪＡ３（図３Ｃ）およびｐＪＡ９（図３Ｄ）の各プラスミドの概略図である。
【０１１５】
図４Ａから図４Ｄは、ｐＧＪＡ１５−２（図４Ａ）、ｐＧＪＡ１５（図４Ｂ）、ｐＧＪＡ１４（図４Ｃ）およびｐＪＡ１４−２（図４Ｄ）の各プラスミドの概略図である。
【０１１６】
図５Ａおよび図５Ｂは、ｐＲＤＡ０２（図５Ｂ）およびｐＳＧ５−ｈＰＰＡＲγ２（図５Ａ）の各プラスミドの概略図である。
【０１１７】
図６Ａおよび図６Ｂは、ｐＩＮＤ（図６Ａ）、ｐＩＮＤＳｅＡＰ（図６Ｂ）およびｐＶｇＲＸＲ（図６Ｃ）の各プラスミドの概略図である。
図７（Ａ）は、下記のプラスミドによるＮＩＨ３Ｔ３細胞の同時トランスフェクションの４８時間後に測定されたＳｅＡＰの活性を例示する：
１：０．２５μｇのｐＸＬ３０１０（Ｓ）＋０．７５μｇのｐＸＬ３２９６（Ｖ）；
２：０．２５μｇのｐＸＬ３０１０（Ｓ）＋０．２５μｇのｐＳｅＡＰａｎｔｉｓｅｎｓｅ（Ａ）＋０．５０μｇのｐＸＬ３２９６（Ｖ）；
３：０．２５μｇのｐＸＬ３０１０（Ｓ）＋０．５０μｇのｐＳｅＡＰａｎｔｉｓｅｎｓｅ（Ａ）＋０．２５μｇのｐＸＬ３２９６（Ｖ）；
４：０．２５μｇのｐＸＬ３０１０（Ｓ）＋０．７５μｇのｐＳｅＡＰａｎｔｉｓｅｎｓｅ（Ａ）；および
５：０．２５μｇのｐＳｅＡＰａｎｔｉｓｅｎｓｅ（Ａ）＋０．７５μｇのｐＸＬ３２９６（Ｖ）。
【０１１８】
図７（Ｂ）は、下記プラスミドの同時トランスフェクションの２４時間後に測定されたルシフェラーゼの相対的活性を例示する：
１：０．１２５μｇのｐＸＬ３０３１＋０．７５μｇのｐＸＬ３２９６。
【０１１９】
２：０．１２５μｇのｐＸＬ３０３１＋０．１２５μｇのｐＬｕｃＡｎｔｉｓｅｎｓｅ＋０．２５μｇのｐＸＬ３２９６。
【０１２０】
３：０．１２５μｇのｐＸＬ３０３１＋０．２５μｇのｐＬｕｃＡｎｔｉｓｅｎｓｅ＋０．１２５μｇのｐＸＬ３２９６。
【０１２１】
４：０．１２５μｇのｐＸＬ３０３１＋０．３７５μｇのｐＬｕｃＡｎｔｉｓｅｎｓｅ。
【０１２２】
５：０．１２５μｇのｐＬｕｃＡｎｔｉｓｅｎｓｅ＋０．３７５μｇのｐＸＬ３２９６。
【０１２３】
図８は、ＲＴ−ＰＣＲによるセンスＲＮＡおよびアンチセンスＲＮＡのインビトロでの存在を例示する電気泳動ゲルの写真を表す。
【０１２４】
レーン１および９：１００塩基対マーカー（Ｇｉｂｃｏ　ＢＲＬ）。
【０１２５】
レーン２：マトリックスとしてプラスミドｐＸＬ３０１０を使用するＰＣＲコントロール。
【０１２６】
レーン３：０．２５μｇのｐＸＬ３０１０＋０．７５μｇのｐＸＬ３２９６でトランスフェクションされた細胞から抽出された総ＲＮＡに対するＲＴ−ＰＣＲ。
【０１２７】
レーン４：０．２５μｇのｐＸＬ３０１０＋０．２５μｇのｐＳｅＡＰａｎｔｉｓｅｎｓｅ＋０．５０μｇのｐＸＬ３２９６でトランスフェクションされた細胞から抽出されたＲＮＡに対するＲＴ−ＰＣＲ。
【０１２８】
レーン５：０．２５μｇのｐＸＬ３０１０＋０．７５μｇのｐＳｅＡＰａｎｔｉｓｅｎｓｅでトランスフェクションされた細胞から抽出されたＲＮＡに対するＲＴ−ＰＣＲ。
【０１２９】
レーン６から８：３、４および５でそれぞれ使用されたＲＮＡに対して行われたＰＣＲコントロール（ＲＴ非存在）。
【０１３０】
図９Ａは、下記のプラスミド組の同時トランスフェクションの２４時間後に測定されたインビトロでのＳｅＡＰ活性を例示する：
条件１：２５％ｐＸＬ３０１０＋７５％ｐＸＬ３２９６。
【０１３１】
条件３：２５％ｐＸＬ３０１０＋２５％ｐＳｅＡＰａｎｔｉｓｅｎｓｅ＋５０％ｐＸＬ３２９６。
【０１３２】
条件５：２５％ｐＸＬ３０１０＋２５％ｐＬｕｃＡｎｔｉｓｅｎｓｅ＋５０％ｐＸＬ３２９６。
【０１３３】
図９Ｂは、下記のプラスミド組のインビトロでの独立したトランスフェクションの２４時間後に測定されたルシフェラーゼの相対的活性を例示する：
条件２：２５％ｐＸＬ３０３１＋７５％ｐＸＬ３２９６。
【０１３４】
条件４：２５％ｐＸＬ３０３１＋２５％ｐＬｕｃａｎｔｉｓｅｎｓｅ＋５０％ｐＸＬ３２９６。
【０１３５】
条件６：２５％ｐＸＬ３０３１＋２５％ｐＳｅＡＰａｎｔｉｓｅｎｓｅ＋５０％ｐＸＬ３２９６。
【０１３６】
図１０は、同時（バッチ２）または２２日後（バッチ１）のいずれかで、ＳｅＡＰレポーター遺伝子のセンス配列をコードするプラスミド（ｐＸＬ３０１０）およびそのアンチセンス配列をコードするプラスミド（ｐＳｅＡＰａｎｔｉｓｅｎｓｅ）の脛骨頭側骨格筋内への両側筋肉内注入およびエレクトロトランスファーの後に測定された循環ＳｅＡＰの相対的レベルを例示する。
【０１３７】
バッチ１：３０μｇのプラスミドｐＸＬ３０１０の注入＋エレクトロトランスファー、その後、３０μｇのｐＳｅＡＰａｎｔｉｓｅｎｓｅの注入＋エレクトロトランスファーが行われた１０匹のマウス（２２日目に２回目の注入）；
バッチ２：３０μｇのプラスミドｐＸＬ３０１０＋３０μｇのプラスミドｐＳｅＡＰａｎｔｉｓｅｎｓｅ＋エレクトロトランスファーが同時に注入された１０匹のマウス（同時注入）；
バッチ３：３０μｇのプラスミドｐＳｅＡＰａｎｔｉｓｅｎｓｅの注入＋エレクトロトランスファーが行われた１０匹のマウス（コントロール群）。
【０１３８】
図１１Ａは、図６のバッチ１から３のＲＴ−ＰＣＲによるＳｅＡＰレポーター遺伝子のセンスＲＮＡおよびアンチセンスＲＮＡのインビボにおける存在を例示する電気泳動ゲルの写真を表す。
【０１３９】
レーン１および１３：１００ｂｐのＤＮＡマーカー（Ｇｉｂｃｏ）；
レーン２および３：それぞれ、バッチ１（ｐＸＬ３０１０、その後、２２日後のｐＳｅＡＰａｎｔｉｓｅｎｓｅの再注入）のマウスの筋肉におけるセンスＲＮＡおよびアンチセンスＲＮＡ；
レーン４および５：それぞれ、バッチ２（ｐＸＬ３０１０およびｐＳｅＡＰａｎｔｉｓｅｎｓｅの同時注入）のマウスの筋肉におけるセンスＲＮＡおよびアンチセンスＲＮＡ；
レーン６および７：それぞれ、バッチ３（ｐＳｅＡＰａｎｔｉｓｅｎｓｅ単独）のマウスの筋肉におけるセンスＲＮＡおよびアンチセンスＲＮＡ；
レーン８〜１０：レーン２から７で使用されたＲＮＡのＰＣＲコントロール（ＲＴ非存在）；
レーン１１：コントロール：マトリックスとしてプラスミドｐＸＬ３０１０を使用するＰＣＲ；
レーン１２：プラスミドｐＸＬ３０１０
図１１Ｂは、図７Ａで写真撮影されたアガロースゲルのニトロセルロースメンブランにおける転写、およびＳｅＡＰレポーター遺伝子のセンス配列（Ｓ）およびアンチセンス配列（ＡＳ）に対して特異的な３２Ｐ標識オリゴヌクレオチドプローブの存在下でのハイブリダイゼーションによって得られたＸ線フィルムの写真を表す。
【０１４０】
図１２は、下に記載される時間間隔で下記プラスミドの脛骨頭側骨格筋内への両側筋肉内注入およびエレクトロトランスファーの後のマウス血漿における循環ＳｅＡＰの相対的活性をモニターした結果を示す：
バッチ１：１５μｇのプラスミドｐＸＬ３０１０の注入＋エレクトロトランスファーが行われた１０匹のマウス；
バッチ２：１５μｇのプラスミドｐＸＬ３０１０の注入＋エレクトロトランスファー、その後、２１日後の４５μｇのｐＸＬ３２９６の注入＋エレクトロトランスファーが行われた１０匹のマウス；
バッチ３：１５μｇのプラスミドｐＸＬ３０１０の注入＋エレクトロトランスファー、その後、２１日後の１５μｇのｐＳｅＡＰａｎｔｉｓｅｎｓｅ＋３０μｇのｐＸＬ３２９６の注入＋エレクトロトランスファーが行われた１０匹のマウス；
バッチ４：１５μｇのプラスミドｐＸＬ３０１０の注入＋エレクトロトランスファー、その後、２１日後の３０μｇのｐＳｅＡＰａｎｔｉｓｅｎｓｅ＋１５μｇのｐＸＬ３２９６の注入＋エレクトロトランスファーが行われた１０匹のマウス；
バッチ５：１５μｇのプラスミドｐＸＬ３０１０の注入＋エレクトロトランスファー、その後、２１日後の４５μｇのｐＳｅＡＰａｎｔｉｓｅｎｓｅの注入＋エレクトロトランスファーが行われた１０匹のマウス。
【０１４１】
図１３は、下記プラスミドの同時注入およびエレクトロトランスファー（ＥＴ）の後のマウス血漿における循環ＳｅＡＰの相対的活性をモニターした結果を示す：
バッチ１：３０μｇのプラスミドｐＸＬ３０１０の注入＋ＥＴが行われた９匹のマウス；
バッチ２：３０μｇのプラスミドｐＸＬ３０１０の注入＋ＥＴが行われた９匹のマウス；
バッチ３：３０μｇのプラスミドｐＸＬ３０１０＋３０μｇのｐＳｅＡＰａｎｔｉｓｅｎｓｅの同時注入＋ＥＴが行われた９匹のマウス；
バッチ４：３０μｇのプラスミドｐＸＬ３０１０の注入＋ＥＴが行われた９匹のマウス；
バッチ５：３０μｇのプラスミドｐＸＬ３０１０の注入＋ＥＴが行われた９匹のマウス。
【０１４２】
図１４Ａは、下記のプラスミドによるＮＩＨ３Ｔ３細胞のトランスフェクションの後に測定されたインビトロにおけるＳｅＡＰの相対的活性を、その後のテトラサイクリン処理の有無に関して示す：
カラム１：１μｇのｐＸＬ３０１０＋１μｇのｐＸＬ３２９６（空）；
カラム２：１μｇのｐＸＬ３０１０＋０．５μｇのｐＸＬ３２９６（空）＋０．５μｇのｐＳｅＡＰａｎｔｉｓｅｎｓｅ；
カラム３：１μｇのｐＸＬ３０１０＋１μｇのｐＳｅＡＰａｎｔｉｓｅｎｓｅ；
カラム４：１μｇのｐＸＬ３０１０＋０．５μｇのｐＴｅｔＳｅＡＰａｎｔｉｓｅｎｓｅ＋０．５μｇのｐＴｅｔ−ｔＴＡＫ、テトラサイクリン：非存在；
カラム５：１μｇのｐＸＬ３０１０＋０．５μｇのｐＴｅｔＳｅＡＰａｎｔｉｓｅｎｓｅ＋０．５μｇのｐＴｅｔ−ｔＴＡＫ、テトラサイクリン：存在（１ｍｇ／ｍｌ）；
カラム６：１μｇのｐＸＬ３０１０＋１μｇのｐＴｅｔＳｅＡＰａｎｔｉｓｅｎｓｅ＋０．５μｇのｐＴｅｔ−ｔＴＡＫ、テトラサイクリン：非存在；
カラム７：１μｇのｐＸＬ３０１０＋１μｇのｐＴｅｔＳｅＡＰａｎｔｉｓｅｎｓｅ＋０．５μｇのｐＴｅｔ−ｔＴＡＫ、テトラサイクリン：存在（１ｍｇ／ｍｌ）。
【０１４３】
図１４Ｂは、下記のプラスミドによるＮＩＨ３Ｔ３細胞のトランスフェクションの後に測定されたインビトロにおけるＳｅＡＰの相対的活性を、その後のテトラサイクリン処理の有無に関して示す：
カラム１：０．５μｇのｐＸＬ３０１０＋０．５μｇのｐＴｅｔ−ｔＴＡＫ＋０．５μｇのｐＸＬ３２９６（空）；
カラム２：０．５μｇのｐＸＬ３０１０＋０．５μｇのｐＴｅｔ−ｔＴＡＫ＋０．５μｇのｐＳｅＡＰａｎｔｉｓｅｎｓｅ；
カラム３：０．５μｇのｐＸＬ３０１０＋０．５μｇのｐＴｅｔ−ｔＴＡＫ＋０．５μｇのｐＴｅｔＳｅＡＰａｎｔｉｓｅｎｓｅ、テトラサイクリン：非存在；
カラム４：０．５μｇのｐＸＬ３０１０＋０．５μｇのｐＴｅｔ−ｔＴＡＫ＋０．５μｇのｐＴｅｔＳｅＡＰａｎｔｉｓｅｎｓｅ、テトラサイクリン：存在（１ｍｇ／ｍｌ）；
カラム５：０．５μｇのｐＸＬ３０１０＋２．５μｇのｐＸＬ３２９６（空）；
カラム６：０．５μｇのｐＸＬ３０１０＋０．５μｇのｐＴｅｔ−ｔＴＡＫ＋２．５μｇのｐＴｅｔＳｅＡＰａｎｔｉｓｅｎｓｅ、テトラサイクリン：非存在；
カラム７：０．５μｇのｐＸＬ３０１０＋０．５μｇのｐＴｅｔ−ｔＴＡＫ＋２．５μｇのｐＴｅｔＳｅＡＰａｎｔｉｓｅｎｓｅ、テトラサイクリン：存在（１ｍｇ／ｍｌ）。
【０１４４】
図１５は、下記のプラスミド（ウエルあたり０．７μｇまたは１．１μｇのＤＮＡ）によるＮＩＨ３Ｔ３細胞（８００００細胞／ウエル）の同時トランスフェクションの２４時間後におけるルシフェラーゼの相対的活性を、テトラサイクリン投与の有無に関して示す：
１：０．１μｇのｐＸＬ３０３１＋０．３μｇのｐＴｅｔ−ｔＴＡＫ＋０．３μｇのｐＸＬ３２９６。
【０１４５】
２：０．１μｇのｐＸＬ３０３１＋０．３μｇのｐＴｅｔ−ｔＴＡＫ＋０．３μｇのｐＬｕｃＡｎｔｉｓｅｎｓｅ。
【０１４６】
３：０．１μｇのｐＸＬ３０３１＋０．３μｇのｐＴｅｔ−ｔＴＡＫ＋０．３μｇのｐＴｅｔＬｕｃＡｎｔｉｓｅｎｓｅ、テトラサイクリン：非存在。
【０１４７】
４：０．１μｇのｐＸＬ３０３１＋０．３μｇのｐＴｅｔ−ｔＴＡＫ＋０．３μｇのｐＴｅｔＬｕｃＡｎｔｉｓｅｎｓｅ、テトラサイクリン：存在（１ｍｇ／ｍｌ）。
【０１４８】
５：１μｇのｐＸＬ３０３１＋０．５μｇのｐＴｅｔ−ｔＴＡＫ＋０．５μｇのｐＸＬ３２９６。
【０１４９】
６：０．１μｇのｐＸＬ３０３１＋０．５μｇのｐＴｅｔ−ｔＴＡＫ＋０．５μｇのｐＴｅｔＬｕｃＡｎｔｉｓｅｎｓｅ、テトラサイクリン：非存在。
【０１５０】
７：０．１μｇのｐＸＬ３０３１＋０．５μｇのｐＴｅｔ−ｔＴＡＫ＋０．５μｇのｐＴｅｔＬｕｃＡｎｔｉｓｅｎｓｅ、テトラサイクリン：存在（１ｍｇ／ｍｌ）。
【０１５１】
図１６Ａは、下記のプラスミドを６週齢のメスＳＣＩＤマウスに筋肉内同時注入した後のインビボにおける循環ＳｅＡＰの相対的レベルを、様々な時間間隔でのテトラサイクリン投与の有無に関して示す：
バッチ１：２０μｇのプラスミドｐＸＬ３０１０＋４０μｇのｐＴｅｔ−ｔＴＡＫが注入された１０匹のマウス；
バッチ２：２０μｇのプラスミドｐＸＬ３０１０＋２０μｇのｐＴｅｔ−ｔＴＡＫ＋２０μｇのｐＳｅＡＰａｎｔｉｓｅｎｓｅが注入された１０匹のマウス；
バッチ３：２０μｇのプラスミドｐＸＬ３０１０＋２０μｇのｐＴｅｔ−ｔＴＡＫ＋２０μｇのｐＴｅｔＳｅＡＰａｎｔｉｓｅｎｓｅが注入された１０匹のマウス。
【０１５２】
図１６Ｂは、下記のプラスミドを６週齢のメスＳＣＩＤマウスに筋肉内同時注入した後のインビボにおける循環ＳｅＡＰの相対的レベルを、様々な時間間隔でのテトラサイクリン投与の有無に関して示す：
バッチ１：２０μｇのプラスミドｐＸＬ３０１０＋２０μｇのｐＴｅｔ−ｔＴＡＫ＋２０μｇのｐＳｅＡＰａｎｔｉｓｅｎｓｅが注入された１０匹のマウス；
バッチ２：２０μｇのプラスミドｐＸＬ３０１０＋２０μｇのｐＴｅｔ−ｔＴＡＫ＋２０μｇのｐＴｅｔＳｅＡＰａｎｔｉｓｅｎｓｅが注入された１０匹のマウス；
バッチ３：バッチ２＋テトラサイクリン含有飲み水（２ｍｇ／ｍｌ＋２ｍｇ／ｍｌのスクロース）で９日間、その後、１０日目にテトラサイクリンを止める。２２日目にテトラサイクリンに戻し（５００μｇ／マウスで２日毎のＩＰ注入）、３０日目に止める。ドキシサイクリンを６３日目に始める（飲み水において４００ｍｇ／ｌ）。
【０１５３】
図１７は、下記のプラスミドによるＮＩＨ３Ｔ３細胞の同時トランスフェクションの４８時間後に測定されたＳｅＡＰの発現を測定した結果を示す：
Ｔ＋：１μｇのｐＸＬ３０１０＋１μｇのｐＸＬ３２９６；
Ｔ−：１μｇのｐＸＬ３０１０＋１μｇのｐＳｅＡＰａｎｔｉｓｅｎｓｅ；
１：１μｇのｐＸＬ３０１０＋１μｇのｐＧＪＡ１；
２：１μｇのｐＸＬ３０１０＋１μｇのｐＧＪＡ２；
３：１μｇのｐＸＬ３０１０＋１μｇのｐＧＪＡ３。
【０１５４】
図１８は、下記のプラスミドによるＮＩＨ３Ｔ３細胞の同時トランスフェクションの４８時間後に測定されたＳｅＡＰの発現を測定した結果を示す：
カラム１および２：非トランスフェクション細胞のコントロール（４および５と名づけられた２つの異なる実験）；
Ｔ＋：１μｇのｐＸＬ３０１０＋１μｇのｐＸＬ３２９６（実験４および実験５のそれぞれ）；
Ｔ−：１μｇのｐＸＬ３０１０＋１μｇのｐＳｅＡＰａｎｔｉｓｅｎｓｅ（実験４および実験５のそれぞれ）；
ｐＧＪＡ９：１μｇのｐＸＬ３０１０＋１μｇのｐＸＬ３２９６＋１μｇのｐＧＪＡ９（実験４および実験５のそれぞれ）。
【０１５５】
図１９は、完全なアンチセンス配列ＳｅＡＰａｎｔｉｓｅｎｓｅを含むプラスミドによってもたらされる阻害と比較して、ｐＧＪＡ１、ｐＧＪＡ２、ｐＧＪＡ３およびｐＧＪＡ９のプラスミドをＮＩＨ３Ｔ３細胞にトランスフェクションすることによって得られるＳｅＡＰ発現の阻害をまとめた表である。
【０１５６】
図２０は、下記プラスミドの脛骨頭側骨格筋内への両側筋肉内注入およびエレクトロトランスファーを行い、続いて下記の時間間隔でのドキシサイクリン投与を行った後のマウスの血漿における循環ＳｅＡＰの相対的活性をモニターした結果を示す：
バッチ３：２０μｇのｐＸＬ３０１０＋２０μｇのｐＴｅｔ−ｔＴＡＫ＋２０μｇのｐＴｅｔＳｅＡＰａｎｔｉｓｅｎｓｅが注入され、４００ｍｇ／ｌのドキシサイクリンが１７０日目にだけ与えられたマウス群；
バッチ４：２０μｇのｐＸＬ３０１０＋２０μｇのｐＴｅｔ−ｔＴＡＫ＋２０μｇのｐＴｅｔＳｅＡＰａｎｔｉｓｅｎｓｅが注入され、そして４００ｍｇ／ｌのドキシサイクリンが、示された時期に７日間にわたって与えられたマウス群；
図２１は、下記のプラスミドによるＮＩＨ３Ｔ３細胞のトランスフェクションの４８時間後に測定されたＳｅＡＰの発現を測定した結果を示す（１μｇのｐＸＬ３０１０に対して等価なコピー数について、ｐＸＬ３２９６については十分）：
カラム１：ｐＧＪＡ１４；
カラム２：ｐＧＪＡ１４−２；
カラム３：ｐＧＪＡ１５；および
カラム４：ｐＧＪＡ１５−１。
【０１５７】
図２２は、下記のプラスミドによるＮＩＨ３Ｔ３細胞の同時トランスフェクションの２４時間後に測定されたＳｅＡＰの発現を測定した結果を示す（０．５μｇのｐＸＬ３０１０に対して等価なコピー数について、ｐＸＬ３２９６については十分）：
カラム１：ｐＧＪＡ１５；
カラム２：ｐＧＪＡ１５＋ｐＴｅｔ−ｔＴＡＫ；
カラム３：ｐＧＪＡ１５＋ｐＴｅｔ−ｔＴＡＫ＋テトラサイクリン（１μｇ／ｍｌ、最終）；
カラム４：ｐＧＪＡ１５−２；
カラム５：ｐＧＪＡ１５−２＋ｐＴｅｔ−ｔＴＡＫ；
カラム６：ｐＧＪＡ１５−２＋ｐＴｅｔ−ｔＴＡＫ＋テトラサイクリン（１μｇ／ｍｌ、最終）。
【０１５８】
図２３は、下記のプラスミドによるＮＩＨ３Ｔ３細胞のトランスフェクションの４８時間後に測定されたＳｅＡＰの発現を測定した結果を示す（０．５μｇのｐＸＬ３０１０に対して等価なコピー数について、ｐＸＬ３２９６については十分）：
カラム１：ｐＸＬ３０１０；
カラム２：ｐＸＬ３０１０＋ｐＳｅＡＰａｎｔｉｓｅｎｓｅ；
カラム３：ｐＸＬ３０１０＋ｐＴｅｔ−ｔＴＡＫ；
カラム４：ｐＸＬ３０１０＋ｐＴｅｔ−ｔＴＡＫ＋テトラサイクリン（１μｇ／ｍｌ、最終）；
カラム５：ｐＧＪＡ１４；
カラム６：ｐＧＪＡ１４＋ｐＴｅｔ−ｔＴＡＫ；
カラム７：ｐＧＪＡ１４＋ｐＴｅｔ−ｔＴＡＫ＋テトラサイクリン（１μｇ／ｍｌ、最終）。
【０１５９】
図２４は、下記のプラスミドによるＣ２Ｃ１２細胞におけるトランスフェクションの５日後における、１０−７Ｍ（最終）の化学的誘導因子ＢＲＬ４９６５３の存在下または非存在下でのＳｅＡＰの発現を測定した結果を示す：
バッチ３：５００ｎｇのｐＲＤＡ２＋５００ｎｇのｐＳＧ５−ｈＰＰＡＲγ２＋ｐＸＬ３２９６（カラム１：ＢＲＬ４９６５３非存在；カラム２：ＢＲＬ４９６５３存在）；
バッチ４：バッチ３＋５０ｎｇのｐＳｅＡＰＡＳ（カラム３：ＢＲＬ４９６５３非存在；カラム４：ＢＲＬ４９６５３存在）；
バッチ５：バッチ３＋１００ｎｇのｐＳｅＡＰＡＳ（カラム５：ＢＲＬ４９６５３非存在；カラム６：ＢＲＬ４９６５３存在）；
バッチ６：バッチ３＋２５０ｎｇのｐＳｅＡＰＡＳ（カラム７：ＢＲＬ４９６５３非存在；カラム８：ＢＲＬ４９６５３存在）；
バッチ７：バッチ３＋５００ｎｇのｐＳｅＡＰＡＳ。
【０１６０】
図２５は、下記のプラスミドによるＮＩＨ３Ｔ３細胞のトランスフェクションの４８時間に測定された、エクジソンシステムの化学的誘導因子（パノステロンまたはＰａｎ；図２６、Ｎｏ他、ＰＮＡＳ、１９９６、３３４６頁から３３５１頁）の存在下または非存在下でのＳｅＡＰの発現を測定した結果を示す：
カラム１：ｐＶｇＲＸＲ、ｐＩＮＤ、ｐＩＮＤＳｅＡＰの各プラスミドの０．５μｇ、化学的誘導因子：非存在；
カラム２：ｐＶｇＲＸＲ、ｐＩＮＤ、ｐＩＮＤＳｅＡＰの各プラスミドの０．５μｇ、化学的誘導因子：存在；
カラム３：ｐＶｇＲＸＲ、ｐＩＮＤＳｅＡＰ、ｐＳｅＡＰａｎｔｉｓｅｎｓｅの各プラスミドの０．５μｇ、化学的誘導因子：非存在；
カラム４：ｐＶｇＲＸＲ、ｐＩＮＤＳｅＡＰ、ｐＳｅＡＰａｎｔｉｓｅｎｓｅの各プラスミドの０．５μｇ、化学的誘導因子：存在。
【０１６１】
図２６はポナステロン（ｐａｎ）を表す。
【０１６２】
図２７は、Ｐｈｏｓｐｈａ　Ｌｉｇｈｔキット（Ｔｒｏｐｉｘ）を使用してアッセイされた、下記プラスミドの脛骨頭側骨格筋内への両側筋肉内注入およびエレクトロトランスファーの後のマウスの血漿における循環ＳｅＡＰの相対的活性をモニターした結果を、飲み水におけるドキシサイクリン投与の有無に関して示す：
バッチ１：２０μｇのｐＸＬ３０１０＋２０μｇのｐｃＤＮＡが注入されたマウス群；
バッチ２：２０μｇのｐＧＪＡ１４＋２０μｇのｐＴｅｔ−ｔＴＡＫが注入されたマウス群；
バッチ３：２０μｇのｐＧＪＡ１４＋２０μｇのｐＴｅｔ−ｔＴＡＫの注入＋飲み水における４００ｍｇ／ｍｌのドキシサイクリンのマウス群；
バッチ４：２０μｇのｐＧＪＡ１５−２＋２０μｇのｐＴｅｔ−ｔＴＡＫが注入されたマウス群；
バッチ５：２０μｇのｐＧＪＡ１５−２＋２０μｇのｐＴｅｔ−ｔＴＡＫの注入＋飲み水における４００ｍｇ／ｍｌのドキシサイクリンのマウス群。
【０１６３】
（実施例）
実施例１：サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）の初期アンプリファイア／プロモータを有するプラスミドの構築
１．１　プラスミドｐＸＬ３０３１（ルシフェラーゼプラスミド）
プラスミドｐＸＬ３０３１は、ｐＣＯＲ（Ｓｏｕｂｒｉｅｒ他、Ｇｅｎ　Ｔｈｅｒ、６（１９９９）、１４８２〜１４８８）において記載されるｐＣＯＲプラスミドでもあり、具体的には、ルシフェラーゼレポーターをＣＭＶプロモータの制御下に含む。このプラスミドの概略図が図１Ａに示される。
【０１６４】
１．２　プラスミドｐＸＬ３０１０（ＳｅＡＰプラスミド）
プラスミドｐＸＬ３０１０は、ｐＧＬ３−ｂａｓｉｃ（Ｐｒｏｍｅｇａ）のＭｌｕＩ／ＳａｌＩフラグメントに、ヒトサイトメガロウイルスの初期プロモータ（ｈＣＭＶ−ＩＥ）を含むｐＣＤＮＡ３−ｂａｓｉｃ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のＭｌｕＩ／ＳｐｈＩフラグメント、ＳｐｈＩ／ＣｌａＩを用いてｐＳｅＡＰ−ｂａｓｉｃ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）から取り出されたＳｅＡＰ遺伝子、および下記プライマー（５’−ＡＴＧＣＡＴＣＧＡＴＧＧＣＣＧＣＴＴＣＧＡＧＣＡＧＡＣＡＴＧ−３’および５’−ＡＴＧＣＧＴＣＧＡＣＴＣＴＡＧＣＣＧＡＴＴＴＴＡＣＣＡＣＡＴＴＴＧＴＡＧＡＧＧ−３’）を用いたポリメラーゼ連鎖反応によりｐＧＬ３−ｂａｓｉｃから増幅されたシミアンウイルスの後期ポリアデニル化シグナル（ＳＶ４０ポリＡ）を含むＣｌａＩ／ＳａｌＩフラグメントを連結することによって構築された。このプラスミドの概略図が図１Ｂに示される。
【０１６５】
１．３　プラスミドｐＳｅＡＰａｎｔｉｓｅｎｓｅ（ｐＣＯＲにおけるアンチセンスＳｅＡＰのプラスミド）
ＳｅＡＰ遺伝子を含むＤＮＡフラグメントを、マトリックスとしてのプラスミドｐＸＬ３０１０と、プライマーとしてのオリゴヌクレオチド１（５’ＣＧＡＧＣＡＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＧＧＣＣ３’）およびオリゴヌクレオチド２（５’ＧＧＧＴＣＴＡＧＡＴＴＡＡＣＣＣＧＧＧＴＧＣＧＣＧＧＣＧＴＣＧＧＴ３’）を使用するＰＣＡによって調製する。これらのオリゴヌクレオチドは、プラスミドｐＸＬ３０１０における７６５位から７９７位および２２９０位から２２６７位にそれぞれ位置する。
【０１６６】
その後、このフラグメントをＸｂａＩおよびＳｐｈＩの制限酵素で消化して、０．８％アガロースゲルで精製し、Ｊｅｔｓｏｒｂキットを使用して抽出し、次いで、ＳｐｈＩおよびＸｂａＩで前もって消化されたプラスミドｐＸＬ３２９６に、ＣＭＶプロモータに関してアンチセンス方向でクローン化して、その結果、プラスミドｐＳｅＡＰａｎｔｉｓｅｎｓｅを得た。このプラスミドの概略図が図１Ｃに示される。
【０１６７】
１．４　プラスミドｐＸＬ３２９６（空のｐＣＯＲプラスミド）
プラスミドｐＸＬ３２９６は、ｐＣＯＲプラスミド（Ｓｏｕｂｒｉｅｒ他、Ｇｅｎ　Ｔｈｅｒ、６（１９９９）、１４８２〜１４８８）であり、Ｒ６ＫのＯＲＩγ（フェニルアラニンサプレッサーｔＲＮＡ（ｓｕｐＰｈｅ）の発現カセット）およびＣＭＶウイルスの初期プロモータ／エンハンサーの−５２２／＋７２部分を含む。このプラスミドの概略図が図１Ｄに示される。
【０１６８】
１．５　プラスミドｐＬｕｃＡｎｔｉｓｅｎｓｅ（ｐＣＯＲにおけるアンチセンスルシフェラーゼのプラスミド）
プラスミドｐＸＬ３０３１をＨｉｎｄＩＩＩで消化し、そして両端を平滑端にするためにクレノウフラグメントで処理した。エタノール沈殿の後、フラグメントをＸｂａＩで３７℃において２時間消化した。０．８％アガロースゲルで精製した後、ルシフェラーゼ遺伝子を含む約１．６ｋｂのフラグメントを、Ｊｅｔｓｏｒｂキットを使用して抽出した。ルシフェラーゼ遺伝子のこの１．６ｋｂのＸｂａＩフラグメントを、その後、ＸｈｏＩで前もって消化され、そして末端を平滑端にするために、デオキシヌクレオチド三リン酸の存在下、３７℃で３０分間、クレノウフラグメントで処理されたプラスミドｐＸＬ３２９６に、ＣＭＶプロモータに関してアンチセンス方向でクローン化し、その結果、プラスミドｐＬｕｃＡｎｔｉｓｅｎｓｅを得た。このプラスミドの概略図が図１Ｅに示される。
【０１６９】
実施例２：テトラサイクリン抑制性プロモータ（ＴｒＲＳ）を有するプラスミドの構築
２．１　プラスミドｐＴｅｔＬｕｃＡｎｔｉｓｅｎｓｅ（ｐＴｅｔ−Ｓｐｌｉｃｅにおけるアンチセンスルシフェラーゼのプラスミド）およびプラスミドｐＴｅｔＬｕｃ（ｐＴｅｔ−Ｓｐｌｉｃｅにおけるルシフェラーゼのプラスミド）
ルシフェラーゼ遺伝子を含む約１．７ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ−ＸｂａＩフラグメントをプラスミドｐＸＬ３０３１から消化して、両端を埋めるようにクレノウフラグメントで処理し、そしてＥｃｏＲＩで前もって消化され、クレノウフラグメントで処理され、脱リン酸化されたプラスミドｐＴｅｔＳｐｌｉｃｅ（Ｇｉｂｃｏ　ＢＲＬ；図２Ａ）に、センス方向およびアンチセンス方向でクローン化して、その結果、ｐＴｅｔＬｕｃおよびｐＴｅｔＬｕｃＡｎｔｉｓｅｎｓｅのプラスミドをそれぞれ得た。この２つのプラスミドの概略図が図２Ｃおよび図２Ｂにそれぞれ示される。
【０１７０】
２．２　プラスミドｐＴｅｔＳｅＡＰａｎｔｉｓｅｎｓｅ（ｐＴｅｔ−ＳｐｌｉｃｅにおけるアンチセンスＳｅＡＰのプラスミド）
ＳｅＡＰ遺伝子を含む約１．６ｋｂのＣｌａＩ−ＥｃｏＲＶフラグメントをプラスミドｐＸＬ３０１０から消化し、そしてＣｌａＩおよびＥｃｏＲＶで前もって消化されたプラスミドｐＴｅｔ−Ｓｐｌｉｃｅ（そのマップが図２Ａに示される）（Ｇｉｂｃｏ　ＢＲＬ）にクローン化して、その結果、プラスミドｐＴｅｔＳｅＡＰａｎｔｉｓｅｎｓｅを得た。このプラスミドの概略図が図２Ｄに示される。
【０１７１】
２．３　プラスミドｐＴｅｔ−ｔＴａＫ
トランス活性化因子ｔＴＡの配列を含むフラグメントを、Ｇｏｓｓｅｎ他（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、８９（１９９２）、５５４７〜５５５１）によって記載されるようなプラスミドｐＵＨＤ１５−１から得て、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＳｐｅＩで前もって消化されたプラスミドｐＴｅｔ−Ｓｐｌｉｃｅ（図２Ａ）（Ｇｉｂｃｏ　ＢＲＬ）にクローン化して、その結果、プラスミドｐＴｅｔ−ｔＴＡＫを得た。このプラスミドの概略図が図２Ｅに示される。
【０１７２】
実施例３：ＳｅＡＰａｎｔｉｓｅｎｓｅ遺伝子のより短いフラグメントを含むプラスミドの構築
３．１　プラスミドｐＧＪＡ１（ＳｅＡＰａｎｔｉｓｅｎｓｅの５’末端のプラスミド）
プラスミドｐＧＪＡ１は、ＤｒａＩＩＩおよびＳｐｈ１の酵素を使用してプラスミドｐＣＯＲＳｅＡＰａｎｔｉｓｅｎｓｅ（実施例１．３および図１Ｃ）からＳｅＡＰａｎｔｉｓｅｎｓｅ遺伝子の５’端部分の大部分を除くことによって構築された。両端が、両端を平滑端にするクレノウ酵素で処理された後、連結によって連結された。除かれたフラグメントは、ＳｅＡＰａｎｔｉｓｅｎｓｅ遺伝子の７３７位から２１３９位の部分に対応する。従って、残った部分は、ＳｅＡＰａｎｔｉｓｅｎｓｅ遺伝子の３’末端の端部の最初の１２５塩基（５’）を含む。これは６１２位から７３７位（１２５ヌクレオチド）の間であり、ＣＭＶプロモータの制御下に置かれている。このプラスミドの概略図が図３ａに示される。
【０１７３】
３．２　プラスミドｐＧＪＡ２（ＳｅＡＰａｎｔｉｓｅｎｓｅの５’末端のプラスミド）
プラスミドｐＧＪＡ２は、Ｓｐｈ１およびＮａｅ１の制限酵素を使用してプラスミドｐＣＯＲＳｅＡＰａｎｔｉｓｅｎｓｅからＳｅＡＰａｎｔｉｓｅｎｓｅ遺伝子の３’端部分の大部分を除くことによって構築された。両端が、両端を平滑端にするクレノウ酵素で処理された後、連結によって連結された。除かれたフラグメントは、ＳｅＡＰａｎｔｉｓｅｎｓｅ遺伝子の６４７位から２１３９位の部分に対応する。従って、残った部分は、ＳｅＡＰａｎｔｉｓｅｎｓｅ遺伝子の５’端の最初の３５塩基を含む。これは６１２位から６４７位（３５ヌクレオチド）の間であり、ＣＭＶプロモータの制御下に置かれている。このプラスミドの概略図が図３Ｂに示される。
【０１７４】
３．３　プラスミドｐＧＪＡ３（ＳｅＡＰａｎｔｉｓｅｎｓｅの３’末端のプラスミド）
プラスミドｐＧＪＡ３は、ＸｂａＩおよびＰｖｕＩＩの制限酵素を使用してプラスミドｐＣＯＲＳｅＡＰａｎｔｉｓｅｎｓｅからＳｅＡＰａｎｔｉｓｅｎｓｅ遺伝子の５’端部分の大部分を除くことによって構築された。両端が、両端を平滑端にするクレノウ酵素で処理された後、連結によって連結された。除かれたフラグメントは、ＳｅＡＰａｎｔｉｓｅｎｓｅ遺伝子の６４７位から２１３９位の部分に対応する。残った部分は、ＳｅＡＰａｎｔｉｓｅｎｓｅ遺伝子の３’端における最後の２０３塩基を含む。これは１９３６位から２１６９位（２０３ヌクレオチド）の間であり、ＣＭＶプロモータの制御下に置かれている。このプラスミドの概略図が図３Ｃに示される。
【０１７５】
３．４　プラスミドｐＧＪＡ９（ＳｅＡＰａｎｔｉｓｅｎｓｅの５’末端および３’末端のプラスミド）
プラスミドｐＧＪＡ９は、ＤｒａＩＩＩおよびＰｖｕＩＩの制限酵素を使用してプラスミドｐＣＯＲＳｅＡＰａｎｔｉｓｅｎｓｅからＳｅＡＰａｎｔｉｓｅｎｓｅ遺伝子の５’末端と３’末端との間の中間部分を除くことによって構築された。両端が、両端を平滑端にするクレノウ酵素で処理された後、連結によって連結された。除かれたフラグメントは、ＳｅＡＰａｎｔｉｓｅｎｓｅ遺伝子の７３７位から１９３６位の部分に対応する。従って、残った部分は、ＳｅＡＰａｎｔｉｓｅｎｓｅ遺伝子の５’末端および３’端に対応する。これらは、それぞれ、６１２位から７３７位（アンチセンスＳｅＡＰ遺伝子の５’端における最初の１２５ヌクレオチド）および１９３６位から２１３９位（ＳｅＡＰａｎｔｉｓｅｎｓｅ遺伝子の３’端における最後の２０３塩基）であり、この２つの部分は一緒にＣＭＶプロモータの制御下に置かれている。このプラスミドの概略図が図３Ｄに示される。
【０１７６】
実施例４：転写物およびそのアンチセンス転写物の同時産生を可能にするプラスミドの構築
４．１　プラスミドｐＧＪＡ１５−２（構成的プロモータおよび３’端における逆向きの条件的プロモータによって囲まれた１個のＳｅＡＰコード配列）
このプラスミドは、ポリＡ配列の後、Ｅｃｏ４７ＩＩＩ制限部位においてプラスミドｐＸＬ３０１０にテトラサイクリン抑制性プロモータ（Ｔｅｔｐ）を挿入することによって構築された。Ｔｅｔｐプロモータは、ＳｅＡＰ遺伝子の上流に位置するＣＭＶプロモータの向きとは逆向きに置かれた。このようにして、ＣＭＶプロモータはＳｅＡＰ転写物の合成を構成的に誘導し、そして先端から最後まで置かれたＴｅｔｐプロモータは、テトラサイクリンが存在しないときにはアンチセンス転写物の産生を誘導する。テトラサイクリンが存在しないとき、ＳｅＡＰ活性が阻害される。このプラスミドの概略図が図４Ａに示される。
【０１７７】
４．２　プラスミドｐＧＪＡ１５（構成的プロモータおよび同じ向きの条件的プロモータによって囲まれた１個のＳｅＡＰコード配列）
このプラスミドは、プラスミドｐＧＪＡ１５−２の場合と同じ位置において、しかしＳｅＡＰ遺伝子の上流に位置するＣＭＶプロモータと同じ方向で、同じＴｅｔｐプロモータを挿入することによって構築された。このプラスミドは、このようにして配向させられたＴｅｔｐプロモータがＳｅＡＰの発現を変化させないことを確認するためのコントロールとして役立つ。このプラスミドの概略図が図４Ｂに示される。
【０１７８】
４．３　プラスミドｐＧＪＡ１４（逆向きに置かれた構成的プロモータ−ＳｅＡＰおよび逆にされた条件的プロモータ−ＳｅＡＰａｎｔｉｓｅｎｓｅ）
このプラスミドは、プラスミドｐＧＪＡ１５の場合と同じ位置において、「ＣＭＶプロモータ＋ＳｅＡＰ配列」の組とは逆向きに、「Ｔｅｔｐプロモータ＋ＳｅＡＰａｎｔｉｓｅｎｓｅ遺伝子配列」の組をプラスミドｐＸＬ３０１０に挿入することによって構築された。このようにして、ＣＭＶプロモータはＳｅＡＰ転写物の合成を構成的に誘導し、そして逆向きに置かれたＴｅｔｐプロモータは、テトラサイクリンが存在しないとき、「Ｔｅｔｐプロモータ＋ＳｅＡＰａｎｔｉｓｅｎｓｅ配列」の組に含まれるアンチセンス転写物の産生を誘導する。これらの条件下では、ＳｅＡＰ活性が、テトラサイクリンの非存在下で阻害される。このプラスミドの概略図が図４Ｃに示される。
【０１７９】
４．４　プラスミドｐＧＪＡ１４−２（同じ向きに置かれた構成的プロモータ−ＳｅＡＰおよび逆にされた条件的プロモータ−ＳｅＡＰａｎｔｉｓｅｎｓｅ）　このプラスミドは、プラスミドｐＧＪＡ１５の場合と同じ位置において、「ＣＭＶプロモータ＋ＳｅＡＰ配列」の組と同じ方向で、「Ｔｅｔｐプロモータ＋ＳｅＡＰａｎｔｉｓｅｎｓｅ遺伝子配列」の組をｐＸＬ３０１０プラスミドに挿入することによって構築された。このようにして、ＣＭＶプロモータはＳｅＡＰ転写物の合成を構成的に誘導し、そしてＴｅｔｐプロモータは、テトラサイクリンが存在しないとき、「Ｔｅｔｐプロモータ＋ＳｅＡＰａｎｔｉｓｅｎｓｅ配列」の組に含まれるアンチセンス転写物の産生を誘導する。テトラサイクリンが存在しないとき、ＳｅＡＰ活性が阻害される。このプラスミドの概略図が図４Ｄに示される。
【０１８０】
実施例５：ｈＰＰＡＲγ２誘導性プラスミドの構築
５．１：プラスミドｐＳＧ５−ｈＰＰＡＲγ２（ヒトトランス活性化因子ＰＰＡＲγ２プラスミド）
プラスミドｐＳＧ５−ｈＰＰＡＲγ２は、レチノイド受容体ＲＸＲをコードするプラスミドｐＶｇＲＸＲ（図６Ｃ）と同時に発現したとき、逆向きに１０回繰り返されたヒトＡｐｏＡＩＩプロモータのＪ領域（Ｊｘ１０ＡＳ）を上流に含む最小のプロモータを活性化し得るヒト起源のトランス活性化因子ｈＰＰＡＲγ２の遺伝子を含む。トランス活性化因子はＳＶ４０プロモータの制御下にある。トランス活性化因子は、その５’端部分において、ｒｂ−グロビン（ウサギ）に由来するイントロンが隣接し、その３’端部分において、ＳＶ４０ウイルスに由来するポリＡ転写終結配列が隣接する。このプラスミドの概略図が図５Ａに示される。
【０１８１】
５．２：プラスミドｐＲＤＡ０２（Ｊｘ１０ＡＳ誘導性プロモータの制御下にあるＳｅＡＰのプラスミド）
プラスミドｐＲＤＡ０２は、ｈＰＰＡＲγ２遺伝子の生成物によって誘導され得る、Ｊｘ１０ＡＳ領域を上流に含むＣＭＶプロモータの制御下に置かれたＳｅＡＰレポーター遺伝子を含む。ＳｅＡＰ遺伝子は、その３’部分において、ＳＶ４０ウイルスに由来するポリＡ転写終結配列が隣接する。このプラスミドの概略図が図５Ｂに示される。
【０１８２】
実施例６：エクジソン誘導性プラスミドの構築
６．１：プラスミドｐＩＮＤＳｅＡＰ（エクジソン誘導性ＰＨＳＰプロモータの制御下にＳｅＡＰ遺伝子を含むプロモータ）
プラスミドｐＩＮＤＳｅＡＰは、ベクターｐＩＮＤ（図６Ａ；ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ）のマルチクローニング部位内のＥｃｏＲＩ制限部位およびＸｈｏＩ制限部位の間に、ＳｅＡＰをコードする遺伝子を挿入することによって構築された。従って、ＳｅＡＰをコードする遺伝子の発現は、エクジソン受容体（ＶｇＥＣＲ）およびレチノイドＸ受容体（ＲＸＲ）のヘテロ二量体を使用するエクジソンシステムの制御下にある。このヘテロ二量体はエクジソン応答エレメント（プラスミドＩＮＤにおけるＥ／ＧＲＥ）に結合する。ＰＨＳＰプロモータはショウジョウバエの最小の熱ショックプロモータである（Ｎｏ他、ＰＮＡＳ、１９９６、３３４６頁から３３５１頁）。このプラスミドの概略図が図６Ｂに示される。
【０１８３】
６．２：プラスミドｐＶｇＲＸＲ（図６Ｃ；ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ）
プラスミドｐＶｇＲＸＲは、従って、最初にＲＸＲ受容体を、次にＶＰ１６／ＥＣＲ融合タンパク質をコードする。従って、エクジソンまたはそのアナログ（例えば、ポナステロンＡ（Ｐａｎ；図２６）など）の存在下で転写を活性化する、ＶＰ１６を含むヘテロ二量体が形成され得る（Ｎｏ他、ＰＮＡＳ、１９９６、３３４６頁から３３５１頁）。
【０１８４】
実施例７：アンチセンス型の阻害転写物をコードする配列を含むプラスミドのインビトロでの機能性
実施例７．１　細胞培養
使用された細胞はＮＩＨ３Ｔ３ネズミ繊維芽細胞（ＡＴＣＣ：ＣＲＬ−１６５８）である。細胞は、トランスフェクションの２４時間前に、６ウエルプレートまたは２４ウエルプレートに、１ｍｌの培地に５×１０４細胞／ウエルの密度で、または２ｍｌに２．５×１０５細胞／ウエルの密度で播種される。使用された培養培地は、１０％のウシ血清が補充されたＤＭＥＭ（商標）培地（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ　Ｉｎｃ．）である。細胞培養物は、加湿雰囲気中、５％のＣＯ２分圧のもと、３７℃のインキュベーターでインキュベーションされる。トランスフェクションは、５０％から８０％のコンフルエンスが得られる播種の約２４時間後に行われる。
Ｃ２Ｃ１２細胞はネズミ筋芽細胞（ＡＴＣＣ：ＣＲＬ１７７２）であり、Ｌ−グルタミン（２ｍＭ、最終）および抗生物質（５０単位（最終）のペニシリンおよび５０μｇ／ｍｌのストレプトマイシン）が添加される、１０％のウシ胎児血清が補充されたＤＭＥＭ（商標）培地（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ　Ｉｎｃ．）で培養される。
【０１８５】
実施例７．２：カチオン性リポフェクタントを使用して行われる細胞のトランスフェクション
ＤＮＡおよびカチオン性脂質ＲＰＲ１２０５３５（Ｂｉｋ　Ｇ他、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４１（１９９８）、２２４〜２３５）の希釈された溶液が、約６ｎｍｏｌの脂質ＲＰＲ１２０５３５Ｂ／μｇ・ＤＮＡの濃度をトランスフェクションのために得るために別々に調製される。それぞれの溶液を最初に２０ｍＭ（最終）重炭酸ナトリウム／１５０ｍＭ（最終）ＮａＣｌの溶液で希釈し、室温（Ｒ．Ｔ．）で１０分間インキュベーションする。その後、カチオン性脂質溶液をＤＮＡ溶液に容量比で分注する。再度、インキュベーションをＲ．Ｔ．で１０分間行い、形成された複合体を、血清が補充された培養培地で１０倍に希釈する。最後のインキュベーションを１０分間行った後、プレート内の培養培地を除き、１ｍｌ／ウエルまたは２ｍｌ／ウエルのこれらの溶液を、２４ウエルプレートまたは６ウエルプレートがそれぞれ使用されるかどうかに依存して分注する。
【０１８６】
実施例７．３：ルシフェラーゼアッセイの測定
ルシフェラーゼ活性はトランスフェクションの２４時間後に測定される。ルシフェラーゼは、ルシフェリンの酸化をＡＴＰおよびＭｇ２＋およびＯ２の存在下で触媒し、同時に光子を生じさせる。光の総放射量がルミノメーターによって測定されるが、これはサンプルのルシフェラーゼ活性に比例している。培養培地を事前に除き、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、その後、細胞が、ウエルあたり２００μｌの細胞溶解緩衝液（Ｐｒｏｍｅｇａ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を用いて室温で１５分間溶解される。その後、ルシフェラーゼアッセイシステム（商標）キット（Ｐｒｏｍｅｇａ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）が、推奨されるプロトコルに従って活性測定のために使用される。ルシフェラーゼ活性は細胞溶解物上清のタンパク質濃度に関連する。細胞抽出物のタンパク質濃度の測定は、ビシンコニン酸を使用するＢＣＡ法（Ｐｉｅｒｃｅ）（Ｗｉｅｃｈｅｌｍａｎ他、Ａｎａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍ、１７５（１９９８）、２３１〜２３７）を使用して行われる。
【０１８７】
実施例７．４：ＳｅＡＰ活性の測定
ＳｅＡＰ活性は、Ｐｈｏｓｐｈａ−Ｌｉｇｈｔ（商標）キット（Ｔｒｏｐｉｘ，Ｉｎｃ．）を使用して、トランスフェクションの４８時間後の培養上清で測定される。
【０１８８】
実施例７．５：アンチセンス型の阻害転写物によるＳｅＡＰレポーター遺伝子（図７Ａ）またはルシフェラーゼレポーター遺伝子（図７Ｂ）の発現のインビトロでの阻害
トランスフェクションの様々な条件のもとでのインビトロにおけるルシフェラーゼおよびＳｅＡＰの相対的活性の結果（図７Ａおよび図７Ｂ）は、最初に、ルシフェラーゼおよびＳｅＡＰのレポーター遺伝子がＮＩＨ３Ｔ３細胞において十分に発現していることを示している（図７Ａおよび図７Ｂのカラム１）。次に、細胞が、同じレポーター遺伝子を含有するセンスプラスミドおよびアンチセンスプラスミドの両方と同時にトランスフェクションされたとき、発現の阻害は、１のセンス／アンチセンス比を使用して約９０％である（カラム２）。使用されたセンス／アンチセンス比が２（カラム３）または３（カラム４）であるとき、阻害の程度は９５％および９７％まで増大する。
【０１８９】
カラム５は、ＳｅＡＰをコードするセンスプラスミド（図７Ａ）およびルシフェラーゼをコードするセンスプラスミド（図７Ｂ）が注入されない負のコントロールを表す。
【０１９０】
実施例７．６：アンチセンス型の阻害転写物およびセンス転写物のインビトロでの発現の確認
トランスフェクションの４８時間後に、総ＲＮＡを、ＮＩＨ３Ｔ３細胞を使用してＴｒｉｚｏｌ法（Ｇｉｂｃｏ　ＢＲＬ）によって調製した。プラスミドｐＸＬ３０１０およびプラスミドｐＳｅＡＰａｎｔｉｓｅｎｓｅに由来する転写産物が、プラスミドｐＸＬ３０１０において１８１２位から１８３１位および２２４９位から２２３０位にそれぞれ位置するプライマー１１（５’ＣＧＡＴＣＡＴＧＴＴＣＧＡＣＧＡＣＧＣＣ３’）およびプライマー１２（５’ＣＣＡＧＧＴＣＧＣＡＧＧＣＧＧＴＧＴＡＧ３’）を、「ワンステップＲＴ−ＰＣＲシステム」キット（Ｇｉｂｃｏ　ＢＲＬ）の助けをかりて、供給者の説明書に従い、そして下記の条件に従って使用するＲＴ−ＰＣＲによって明らかにされた：５０℃で４０分、その後、３０サイクル（９４℃で２分；９４℃で１分；５５℃で１分；７２℃で１分３０秒；停止、７２℃で３分）。その後、ＲＴ−ＰＣＲ産物は０．８％アガロースゲルに負荷された。４１８ｂｐの予想されるサイズのバンドの存在を認めることができる（レーン２、図８）。このことは、センスＳｅＡＰ遺伝子の転写（レーン３、図８）を正しく反映し、そしてＳｅＡＰセンスおよびＳｅＡＰアンチセンスの転写を、様々な割合で、１：１（レーン４、図８）および１：３（レーン５、図８）で正しく反映している。
【０１９１】
レーン６から８は、事前の逆転写を伴わないＰＣＲが行われた実験の負のコントロールに対応する。
【０１９２】
実施例７．７：アンチセンス型の阻害転写物の特異性
ＳｅＡＰをコードするプラスミド（ｐＸＬ３０１０）およびＳｅＡＰのアンチセンスをコードするプラスミド（ｐＳｅＡＰａｎｔｉｓｅｎｓｅ）またはルシフェラーゼのアンチセンスをコードするプラスミド（ｐＬｕｃＡｎｔｉｓｅｎｓｅ）の一連の交差同時トランスフェクションの結果、そして逆に、ルシフェラーゼをコードするプラスミド（ｐＸＬ３０３１）およびＳｅＡＰのアンチセンスをコードするプラスミド（ｐＳｅＡＰａｎｔｉｓｅｎｓｅ）またはルシフェラーゼのアンチセンスをコードするプラスミド（ｐＬｕｃＡｎｔｉｓｅｎｓｅ）の同時トランスフェクションの結果が図９Ａおよび図９Ｂに示される。
これらの結果により、非特異的な交差反応が存在しないこと、すなわち、ＳｅＡＰのアンチセンスはルシフェラーゼの発現に対する影響を有しないこと、同様に、ルシフェラーゼのアンチセンスはＳｅＡＰの発現に対する影響を有しないことが明瞭に明らかにされる。これらの結果はまた、観測された阻害は、何らかのセンス配列およびアンチセンス配列の同時発現のためであるとは考えられず、これに反して、特異的なセンス配列に対してアンチセンスである転写物の同時発現を必要とすることを示している。
【０１９３】
実施例８：センスＳｅＡＰレポーター遺伝子の２２日後に注入されたとき、ＳｅＡＰの発現はＳｅＡＰアンチセンスによりインビボで阻害されない
実施例８．１　骨格筋へのエレクトロトランスファー
６週齢のＳＣＩＤマウスをケタミン／キシラジン混合物（２５０μｌ／マウス）で最初に麻酔する。その後、１５０ｍＭのＮａＣｌにおける溶液において、様々なプラスミドがマウスの脛骨頭側の筋肉に筋肉内注入される。注入後、一連の電気パルスが加えられる：２０ｍｓ、２００Ｖ／ｃｍ、１Ｈｚの８パルス（Ｍｉｒ他、ＰＮＡＳ、９６（１９９９）、４２６２〜６７）。循環ＳｅＡＰの量が、血液サンプルを採取し、そしてＰｈｏｓｐｈａ−Ｌｉｇｈｔキット（Ｔｒｏｐｉｘ）を使用してホスファターゼ活性をアッセイすることによって定期的にモニターされる。
【０１９４】
実施例８．２：ＳｅＡＰレポーター遺伝子と同時に注入されたとき、またはＳｅＡＰ遺伝子を注入した２２日後に後注入されたときのアンチセンス型の阻害転写物に対する阻害率の比較
図１０に示される結果は、ｐＳｅＡＰａｎｔｉｓｅｎｓｅプラスミドの注入が、２２日前に注入されたＳｅＡＰレポーター遺伝子（ｐＸＬ３０１０）の効果的な阻害を生じさせないことを示している。詳細には、アンチセンス転写物が注入された後の２０日以上、観測されたＳｅＡＰの発現はわずかに６０％低下しただけであった（バッチ１、図１０）。従って、このことは、アンチセンス転写物は事前に投与された外因性のＳｅＡＰ遺伝子を効果的に阻害することができず、しかし、後者は、注入およびエレクトロトランスファーの後の約９ヶ月間にわたってインビボで安定かつ機能的であり続けていることが認められたことを明瞭に示している（Ｍｉｒ他、ＰＮＡＳ、９６（８）（１９９９）、４２６２〜４２６７；Ｍｉｒ他、Ｃ　Ｒ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＩＩＩ、３２１（１１）（１９９８）、８９３〜８９９）。実際には、外因性ＳｅＡＰ遺伝子の約３０％の残存発現が観測される。他方で、図６は、アンチセンス型の阻害転写物および外因性ＳｅＡＰレポーター遺伝子のセンス配列の同時注入がＳｅＡＰの発現の非常に強い阻害をもたらすことを明瞭に示している。これは、この遺伝子の残存発現を検出することができないからである。センスＳｅＡＰ遺伝子およびアンチセンスＳｅＡＰ遺伝子の同時発現により、ＳｅＡＰレポーター遺伝子のインビボでの発現を無効にすることが可能になる（バッチ２、図１０）。
【０１９５】
コントロールとしてのアンチセンス単独の注入は活性を全くもたらさない（バッチ３、図１０）。
【０１９６】
実施例８．３：センス転写物およびアンチセンス転写物のインビボにおける発現の確認
マウスの筋肉を取り出し、粉砕して、総ＲＮＡを抽出した。ＲＴ−ＰＣＲ反応を、上記の実施例３．６に記載されるプロトコルに従って行った。反応産物をアガロースゲルで分離して、臭化エチジウムで可視化した。図１１Ａに示されるこのゲルの写真は、センスＲＮＡおよびアンチセンスＲＮＡの両方が、プラスミドｐＸＬ３０１０の最初の注入、そしてアンチセンス型の阻害転写物の配列を有するプラスミド（ｐＳｅＡＰａｎｔｉｓｅｎｓｅ）のその後の注入を受けているマウスの筋肉で発現していることを示している（レーン２および３）。
【０１９７】
逆に、ｐＸＬ３０１０およびｐＳｅＡＰａｎｔｉｓｅｎｓｅの同時注入が行われたとき、アンチセンスＲＮＡのみが存在し、ＳｅＡＰのｍＲＮＡは検出されない（レーン４および５）。これにより、センス配列およびそのアンチセンス阻害転写物の同時注入によって得られる阻害の有効性が確認される。
【０１９８】
プラスミドｐＳｅＡＰａｎｔｉｓｅｎｓｅがコントロールとして単独で注入されたとき、ＳｅＡＰのアンチセンスＲＮＡのみが検出される（レーン６および７）。
【０１９９】
アガロースゲルをＨｙｂｏｎｄ　Ｎ＋ナイロンメンブラン（Ａｍｅｒｓｈａｍ）に転写し、そしてＳｅＡＰレポーター遺伝子のセンス転写物およびアンチセンス転写物に特異的な３２Ｐ標識オリゴヌクレオチドプローブによるハイブリダイゼーションに供した。その後、メンブランをＸ線フィルムに感光させて、フィルムを３時間後に現像する。図１１Ｂに示されるこのフィルムの写真により、上記の結果が確認される。具体的には、ＳｅＡＰレポーター遺伝子の転写産物の存在が、レポーター遺伝子のセンス配列を含むプラスミド（ｐＸＬ３０１０）およびアンチセンス配列を含むプラスミド（ｐＳｅＡＰａｎｔｉｓｅｎｓｅ）の同時注入に対応するレーン４では検出されず、これに対して、ＳｅＡＰレポーター遺伝子の転写産物が、これらの同じプラスミドの後注入の実験に対応するレーン２において検出される。
【０２００】
実施例８．４：ＳｅＡＰ遺伝子のセンス配列を含むプラスミド（ｐＸＬ３０１０）を注入し、その後、ＳｅＡＰレポーター遺伝子のアンチセンス型の阻害転写物の配列を含むプラスミド（ｐＳｅＡＰａｎｔｉｓｅｎｓｅ）の後注入を行った後におけるインビボでの循環ＳｅＡＰの相対的活性のモニターリング
５０匹の６週齢のメスＳＣＩＤマウスを、１０匹からなる５群に分けて、上記の実施例３．２および実施例３．３に記載されるように処置する。
【０２０１】
図１２に示される結果は、センス転写物をコードする配列を最初の注入し、その後、アンチセンスＲＮＡ型の阻害転写物をコードする配列を次に注入することによって手順を行ったとき、阻害作用を明らかにすることができないことを、明瞭に、そして再現可能な様式で示している。
【０２０２】
実施例８．５：プラスミドｐＸＬ３０１０およびプラスミドｐＳｅＡＰａｎｔｉｓｅｎｓｅの同時注入後のインビボにおける循環ＳｅＡＰの相対的活性のモニターリング
５０匹の６週齢のメスＳＣＩＤマウスを、１０匹からなる５群に分けて、上記の実施例３．２および実施例３．３に記載されるように処置する。
【０２０３】
図１３に示される結果は、これらの２つのプラスミドの同時注入（バッチ３）は、非常に低いか、または０でさえある、外因性ＳｅＡＰレポーター遺伝子の発現を得ることを可能にすることを示している。このことは、アンチセンスＲＮＡ型の阻害転写物が、同時に注入されたＳｅＡＰレポーター遺伝子の転写を強く阻害することによって作用し、そして阻害が、構成的な様式で、同時注入の７日後から８５日後に及ぶ一定しない期間にわたっていることを示している。
【０２０４】
コントロールバッチの１、２、４および５は、レポーター遺伝子のセンス配列を単独で有するプラスミドの注入に対応するが、評価期間中を通して様々なレベルで遺伝子の発現を示している。
【０２０５】
実施例９：テトラサイクリン抑制性プロモータの制御下に置かれたときのアンチセンス型の阻害転写物の阻害の機能性、およびインビトロにおける阻害の測定　実施例９．１：テトラサイクリン抑制性プロモータのインビトロにおける機能性
実験を、ＳｅＡＰレポーター遺伝子およびルシフェラーゼレポーター遺伝子を用いてＮＩＨ３Ｔ３細胞で行った（これらの２つのレポーター遺伝子は上記に記載されている）。
【０２０６】
実施例９．２：アンチセンス型の阻害転写物によるインビトロにおけるＳｅＡＰレポーター遺伝子の調節
図１４Ａに示される結果は、ＣＭＶの強い構成的プロモータの制御下にあるアンチセンス型の阻害転写物（ｐＳｅＡＰａｎｔｉｓｅｎｃｅ）は、ＳｅＡＰレポーター遺伝子のセンス配列と０．５および１の割合で同時発現したとき、それぞれ、インビトロにおいて遺伝子の発現の７０％から８３％の阻害をもたらすことを示している（カラム２および３）。他方で、アンチセンス型の阻害転写物がテトラサイクリンプロモータの制御下に置かれたとき（ｐＴｅｔＳｅＡＰａｎｔｉｓｅｎｓｅ）、インビトロでの阻害は弱くなり、同じ比率で、それぞれ、４５％から６０％で不完全である（カラム４および５）。
【０２０７】
テトラサイクリンなどの外部のリプレッサー因子が存在するとき、ＳｅＡＰの発現の誘導が認められる（カラム５および７）。
【０２０８】
図１４Ｂに示される結果は、ＳｅＡＰのセンス配列を含むプラスミド（ｐＸＬ３０１０）を注入した後で測定されるＳｅＡＰレポーター遺伝子の発現レベル（カラム１および５）に関して、ＣＭＶプロモータの制御下にＳｅＡＰ遺伝子のアンチセンス型の阻害転写物の配列を含むプラスミド（ｐＳｅＡＰａｎｔｉｓｅｎｓｅ）と１：１の割合（カラム２）で同時注入したとき、またはテトラサイクリン抑制性プロモータの制御下のプラスミド（カラム３および６）と同時注入したときのＳｅＡＰレポーター遺伝子の部分的な阻害を示している。
【０２０９】
テトラサイクリンの投与は、ＳｅＡＰレポーター遺伝子の非常に満足できる発現を再び確立することを可能にしている（カラム４および７）。
【０２１０】
実施例９．３：アンチセンス型の阻害転写物によるインビトロにおけるルシフェラーゼレポーター遺伝子の調節
図１５に示される結果は、まず最初に、ルシフェラーゼレポーター遺伝子のセンス配列およびアンチセンス配列をテトラサイクリン抑制性プロモータの制御下に含むプラスミド（ｐＴｅｔＬｕｃＡｎｔｉｓｅｎｓｅ、ｐＴｅｔＬｕｃおよびｐＴｅｔＳｐｌｉｃｅＡｎｔｉｓｅｎｓｅ）のインビトロにおける機能性を明らかにしている。
【０２１１】
テトラサイクリンが存在しないとき、アンチセンス型の阻害転写物が発現して、６０％から７０％の不完全な阻害をもたらし（カラム３および６）、これに対して、アンチセンス型の阻害転写物がＣＭＶプロモータの制御下に置かれているときには、阻害は、１：１のセンス／アンチセンス比を使用して約９０％である（カラム２）。
【０２１２】
テトラサイクリンが存在するとき、ルシフェラーゼレポーター遺伝子の発現が、ルシフェラーゼレポーター遺伝子のセンス配列を含む単一プラスミド（ｐＸＬ３０３１）のトランスフェクションにより得られるルシフェラーゼのレベル（カラム１）に関して、満足できるレベルにまで回復される（カラム４および７）。これらの結果は、阻害転写物のリプレッサーである外部因子（テトラサイクリンなど）が存在するとき、外因性レポーター遺伝子の発現を間接的に調節することが可能であることを示している。
【０２１３】
実施例１０：抑制性プロモータの制御下に置かれたアンチセンス型の阻害転写物によるインビボにおける強い阻害の測定
４０匹のＳＣＩＤマウスを、ｐＸＬ３０１０、ｐＳｅＡＰａｎｔｉｓｅｎｓｅ、ｐＴｅｔＳｅＡＰａｎｔｉｓｅｎｓｅおよびｐＴｅｔ−ｔＴＡｋのプラスミドを使用して上記のように処置した。
【０２１４】
図１６Ａに示される結果は、インビトロにおける阻害の結果とは異なり、そしてＳｅＡＰレポーター遺伝子のインビボにおける発現レベル（バッチ１）に関して、ＳｅＡＰレポーター遺伝子のセンス配列を含むプラスミド（ｐＸＬ３０１０）と、ＣＭＶの強いプロモータの制御下にＳｅＡＰアンチセンス配列を含むプラスミド（ｐＳｅＡＰａｎｔｉｓｅｎｓｅ）とを同時に注入して、同時に発現させたとき（バッチ２）、あるいはＳｅＡＰレポーター遺伝子のセンス配列を含むプラスミド（ｐＸＬ３０１０）と、テトラサイクリン抑制性プロモータの制御下にＳｅＡＰのアンチセンス配列を含むプラスミド（ｐＴｅｔＳｅＡＰａｎｔｉｓｅｎｓｅ）とを同時に注入して、同時に発現させたとき（バッチ３）、ＳｅＡＰの発現の効果的な阻害が得られることを明瞭に示している。
【０２１５】
実施例１１：抑制性プロモータの制御下に置かれたアンチセンス型の阻害転写物によるインビボにおける調節
図１６Ｂに示される結果は、ＳｅＡＰレポーター遺伝子のセンス配列を含むプラスミド（ｐＸＬ３０１０）と、テトラサイクリン抑制性プロモータの制御下に遺伝子のアンチセンス配列を含むプラスミド（ｐＴｅｔＳｅＡＰａｎｔｉｓｅｎｓｅ）との同時注入が、外部のリプレッサー因子（テトラサイクリンなど）が存在するとき、ＳｅＡＰレポーター遺伝子の満足できる生物学的レベルを得ることを可能にすることを示している（バッチ３、Ｄ８）。
【０２１６】
外因性ＳｅＡＰレポーター遺伝子の発現の阻害を、テトラサイクリンの投与が１０日目に停止されたときに再び認めることができる（バッチ３；Ｄ１５、Ｄ２２、Ｄ３０およびＤ６３）。これらの結果により、この阻害が可逆的であることもまた確認される。これは、テトラサイクリンのアナログ（ドキシサイクリン）であるリプレッサー因子を６３日目に投与することにより、ＳｅＡＰレポーター遺伝子の発現を再び確立することが可能になるからである。
【０２１７】
実施例１２：リボザイム型の阻害転写物による調節
ｐＴｅｔＳｅＡＰａｎｔｉｓｅｎｓｅおよびｐＴｅｔＬｕｃＡｎｔｉｓｅｎｓｅのプラスミドの構築に関して上記のように、ハンマーヘッドリボザイム配列を含むプラスミドが、プラスミドｐＸＬ３０１０（ＳｅＡＰレポーター遺伝子）での９５８位、１０５８位、１１２７位、１２０５位、１２４３位、１６００位、１６２０位、１７５８位、１７７３位、１８８０位、１９０１位、１９８８位、２００７位、２０８５位および２２０１位において選ばれる少なくとも１つのＧＴＣ部位を含む配列を、テトラサイクリン抑制性プロモータＴｅｔＲＳの下流において、事前に消化されたプラスミドｐＴｅｔ−Ｓｐｌｉｃｅ（Ｇｉｂｃｏ　ＢＲＬ）にクローニングして、プラスミドｐＴｅｔＳｅＡＰｒｉｂｏｚｙｍｅが得られるようにすることによって構築される。
【０２１８】
３０匹の６週齢のＳＣＩＤマウスが、上記の実施例４に記載されるように処置され、１０匹からなる３つの群に分けられる。
【０２１９】
第１群は、プラスミドｐＸＬ３０１０を用いて上記のように処置される。
【０２２０】
第２群には、ｐＸＬ３０１０、ｐＴｅｔ−ｔＴＡＫおよびｐＴｅｔＳｅＡＰｒｉｂｏｚｙｍｅのプラスミドが同時注入によって与えられる。第３群は、群２と同様に処置されるが、マウスには、ドキシサイクリン（４００ｍｇ／ｌ）を含有する飲み水が与えられる。循環ＳｅＡＰレベルが、上記のように測定される。
【０２２１】
第２群では、ＳｅＡＰレポーター遺伝子のセンス配列を含むプラスミド（ｐＸＬ３０１０）と、ＳｅＡＰに対して特異的なリボザイム型阻害転写物の配列をテトラサイクリン抑制性プロモータの制御下に含むプラスミド（ｐＴｅｔＳｅＡＰｒｉｂｏｚｙｍｅ）との同時注入およびエレクトロトランスファーの後、ＳｅＡＰの発現の効果的な阻害が、試験されたマウスの第１群におけるＳｅＡＰレポーター遺伝子の観測された発現に関して認められる。このことは、リボザイム型の阻害転写物が、同時に投与された外因性ＳｅＡＰ遺伝子の転写をインビボにおいて強力に阻害し得ることを示している。テトラサイクリンアナログ（ドキシサイクリン）をリプレッサー因子として経口投与することにより、ＳｅＡＰの発現を回復することが可能になる。
【０２２２】
実施例１３：アプタマー配列を含むアンチセンス型の阻害転写物による調節
実施例１．３に記載されるプラスミドｐＳｅＡＰａｎｔｉｓｅｎｓｅ（図１Ｃ）が、Ｃｏｗａｎ他（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．、２８（１５）（２０００）、２９３５〜２９４２）によって記載されるようにネオマイシンＢにより認識される配列５’ＧＧＣＣＵＧＧＧＣＧＡＧＡＡＧＵＵＵＡＧＧＣＣ３’を有するリガンド依存性のアプタマー配列をアンチセンス阻害転写物の配列の５’末端に挿入して、その結果、ｐＳｅＡＰａｐｔａｍｅｒＡＳと名付けられたプラスミドが得られるようにするために改変される。
【０２２３】
３０匹の６週齢のＳＣＩＤマウスが、上記の実施例４に記載されるように処置されて、１０匹からなる３つの群に分けられる。
【０２２４】
第１群は、プラスミドｐＸＬ３０１０を用いて上記のように処置される。第２群には、ｐＸＬ３０１０およびｐＳｅＡＰａｐｔａｍｅｒＡＳのプラスミドが、同時注入、その後のエレクトロトランスファーによって与えられる。第３群は、群２と同様に処置されるが、約５００μｇ／マウスの割合でネオマイシンＢのＩＰ注射も受ける。その後、循環ＳｅＡＰレベルが、上記のようにモニターされる。
【０２２５】
第１群の場合、ＳｅＡＰレポーター遺伝子の一定した発現が検出されるが、第２群では、アプタマー配列を含む阻害転写物によるＳｅＡＰ遺伝子の効果的な阻害が認められる。プラスミドｐＳｅＡＰａｐｔａｍｅｒＡＳによって運ばれたアプタマー配列を認識するネオマイシンＢの効果的な量が投与される第３群では、ＳｅＡＰの発現を回復させることができる。循環ＳｅＡＰレベルの大きい増大、従って、ＳｅＡＰレポーター遺伝子の発現の阻害を、ネオマイシンＢの投与が停止されたときに再び認めることができる。
【０２２６】
実施例１４：アプタマー配列を含むリボザイム型の阻害転写物による調節
ハンマーヘッドリボザイム配列を含むプラスミドが、プラスミドｐＸＬ３０１０での９５８位、１０５８位、１１２７位、１２０５位、１２４３位、１６００位、１６２０位、１７５８位、１７７３位、１８８０位、１９０１位、１９８８位、２００７位、２０８５位および２２０１位において選ばれる少なくとも１つのＧＴＣ部位を含む配列を、ＣＭＶプロモータの下流において、事前に消化されたプラスミドｐＸＬ３２９６（Ｓｏｕｂｒｉｅｒ他）にクローニングして、その結果、ｐＳｅＡＰｒｉｂｏｚｙｍｅが得られるようにすることによって構築される。その後、後者は、Ｗｅｒｓｔｕｃｋ他（Ｓｃｉｅｎｃｅ、２８２（１９９８）、２９６〜２９８）によって記載され、そしてＨｏｅｃｈｓｔ３３２５８色素（Ｈ３３２５８）によって認識される配列：５’ＧＧＵＧＡＵＣＡＧＡＵＵＣＵＧＡＵＣＣＡＡＵＧＵＵＡＵＧＣＵＵＣＵＣＵＧＣＣＵＧＧＧＡＡＣＡＧＣＵＧＣＣＵＧＡＡＧＣＵＵＵＧＧＡＵＣＣＧＵＣＧＣ３’のアプタマーをリボザイム型の阻害転写物の配列の５’末端に挿入して、その結果、ｐＳｅＡＰａｐｔａｚｙｍｅと名付けられたプラスミドが得られるようにするために改変される。
【０２２７】
１０匹の６週齢ＳＣＩＤマウスからなる３つの群が処置される：第１群には、プラスミドｐＸＬ３０１０が、注入、その後のエレクトロトランスファーによって与えられる。第２群には、ｐＸＬ３０１０およびｐＳｅＡＰａｐｔａｚｙｍｅのプラスミドが、同様に、同時注入、その後のエレクトロトランスファーによって与えられる。最後に、第３群は、群２と同様に処置されるが、飲料水により、所定量のＨ３３２５８色素（４００ｍｇ／ｌ）も与えられる。循環ＳｅＡＰレベルのモニターリングにより、ＳｅＡＰ活性のインビボにおける効果的な阻害が明らかにされ、そしてＳｅＡＰ活性は、Ｈ３３２５８色素、すなわち、プラスミドｐＳｅＡＰａｐｔａｚｙｍｅに存在するアプタマー配列に対して特異的なリガンドが与えられる第３群のマウスにおいては著しいレベルにまで回復される。
【０２２８】
実施例１５：阻害剤転写物ＳｅＡＰａｎｔｉｓｅｎｓｅのより短いフラグメントによるＳｅＡＰレポーター遺伝子の発現のインビトロにおける阻害
実施例１５．１：ｐＧＪＡ１、ｐＧＪＡ２およびｐＧＪＡ３の各プラスミド（それぞれ、ＳｅＡＰａｎｔｉｓｅｎｓｅ遺伝子の配列の５’端における最初の１２５塩基および最初の３５塩基ならびにＳｅＡＰａｎｔｉｓｅｎｓｅ遺伝子の配列の３’端における最後の２０３塩基を含む転写物フラグメント）で得られる阻害
インビトロでのトランスフェクションに対する様々な条件のもとでのＳｅＡＰ活性を測定することにより、ＳｅＡＰａｎｔｉｓｅｎｓｅ転写物の部分フラグメントの阻害効果を完全なＳｅＡＰａｎｔｉｓｅｎｓｅ転写物の阻害効果と比較することが可能になる。図１３の結果は、完全なアンチセンス転写物ｐＳｅＡＰａｎｔｉｓｅｎｓｅについて観測される阻害（カラム２）に達することなく、ｐＧＪＡ１およびｐＧＪＡ２のプラスミドによって運ばれるＳｅＡＰａｎｔｉｓｅｎｓｅ転写物の５’末端の１２５ヌクレオチドおよび３５ヌクレオチドの各フラグメント、そしてまたプラスミドｐＧＪＡ３によって運ばれるＳｅＡＰａｎｔｉｓｅｎｓｅ転写物の３’末端の２０３ヌクレオチドのフラグメントは、ＮＩＨ３Ｔ３細胞において測定されるＳｅＡＰ活性の著しい阻害をもたらすことを示している（それぞれ、図１７のカラム３、４および５）。
【０２２９】
実施例１５．２：プラスミドｐＧＪＡ９（ＳｅＡＰａｎｔｉｓｅｎｓｅ転写物の５’末端および３’末端の両方を含む転写物フラグメント）で得られる阻害
ＳｅＡＰａｎｔｉｓｅｎｓｅ転写物の３’末端（２０３ヌクレオチド）および５’末端（１２５ヌクレオチド）の両方を融合することによって生じる阻害が図１８のカラム７およびカラム８に示される。この転写物はプラスミドｐＧＪＡ９から産生される。この転写物は、完全なＳｅＡＰａｎｔｉｓｅｎｓｅ転写物で得られる最大阻害（カラム５および６）との比較により、細胞において測定されるＳｅＡＰ活性を著しく阻害する。より短いフラグメントで得られる結果は、ＳｅＡＰａｎｔｉｓｅｎｓｅ遺伝子の開始部（ｐＧＪＡ１およびｐＧＪＡ２）から、末端部（ｐＧＪＡ３）から、または開始部および末端部の配列の融合（ｐＧＪＡ９）からのいずれでも、ＳｅＡＰトランスジーンの活性の著しい阻害レベルが、阻害転写物のより短い部分を使用してもたらされ得ることを明瞭に示している。ｐＧＪＡ１、ｐＧＪＡ２、ｐＧＪＡ３およびｐＧＪＡ９の４つのプラスミドを使用して得られる阻害率をまとめた表が図１９に示される。
【０２３０】
実施例１６：ドキシサイクリン抑制性プロモータの制御下に置かれたＳｅＡＰａｎｔｉｓｅｎｓｅ型の阻害転写物によるインビボにおける調節の速度論
図２０に示される結果により、実施例７に記載される調節システムと類似する調節システムの有効性が明らかにされる。この場合、テトラサイクリンがアナログのドキシサイクリンに置換されている。ＳＣＩＤマウスを、前記に記載されるように処置した。外因性ＳｅＡＰレポーター遺伝子の発現の誘導が２つの時間スケールについて得られる。バッチ３の場合、マウスは、１７０日目を除き、水を飲むが、１７０日目にはドキシサイクリンを飲む。ドキシサイクリンが存在しないとき、ＳｅＡＰの発現は０であり、そしてこの発現の非常にわずかな増大が、ドキシサイクリンを１日間摂取した後に認められる。
【０２３１】
バッチ４では、マウスは、ドキシサイクリンを７日間飲み、その後、２０日、３０日または４０日の中断が続く。ドキシサイクリンを１週間摂取することにより、今回は、ＳｅＡＰの発現の相当の増大が生じるが、ＳｅＡＰの発現は、水を摂取している期間中は著しく退行する。
【０２３２】
実施例１７：ＳｅＡＰを発現させるための、ｐＧＪＡ１４、ｐＧＪＡ１４−２、ｐＧＪＡ１５およびｐＧＪＡ１５−２の各プラスミドの機能性の確認
ｐＧＪＡ１４、ｐＧＪＡ１４−２、ｐＧＪＡ１５およびｐＧＪＡ１５−２の各プラスミドによってコードされる転写物によるＳｅＡＰの発現を、トランス活性化因子ｔＴＡの非存在下で行われた一連の実験を使用して評価した。
【０２３３】
図２１には、ＳｅＡＰの発現レベルが、プラスミドｐＸＬ３０１０によってもたらされる発現レベルと比較して示される。発現は顕著であり、プラスミドｐＸＬ３０１０によって含有されるＳｅＡＰの発現よりも大きい。これらのプラスミドは、実際にＳｅＡＰの発現を可能にする。
【０２３４】
実施例１８：プラスミドｐＴｅｔ−ｔＴＡＫと同時に注入されたｐＧＪ１４、ｐＧＪ１５およびｐＧＪＡ１５−２の各プラスミドによるＳｅＡＰの発現の調節　実施例１８．１：プラスミドｐＴｅｔ−ｔＴＡＫと同時に注入されたｐＧＪＡ１５およびｐＧＪＡ１５−２の各プラスミドによるＳｅＡＰの発現の調節
図２２に示される結果により、プラスミドｐＴｅｔ−ｔＴＡＫと、そしてプラスミドｐＧＪＡ１５およびプラスミドｐＧＪＡ１５−２のそれぞれと同時にトランスフェクションされた細胞におけるＳｅＡＰの発現の阻害が評価される。ｐＴｅｔプロモータの向きがＳｅＡＰａｎｔｉｓｅｎｓｅ転写物の合成をもたらさないプラスミドｐＧＪＡ１５の場合、テトラサイクリンの存在下または非存在下のいずれでも阻害は認められない。他方で、ｐＴｅｔ誘導性プロモータがＳｅＡＰａｎｔｉｓｅｎｓｅ遺伝子に機能的に連結されているプラスミドｐＧＪＡ１５−２は、テトラサイクリンの非存在下でＳｅＡＰの発現の著しい阻害をもたらす。テトラサイクリンが存在するとき、ＳｅＡＰの部分的な回復が認められる。これらの結果は、プラスミドｐＧＪＡ１５−２が、外因性レポーター遺伝子の発現を調節する方法で、２つのプラスミドの同時注入に基づき、そしてアンチセンス体およびセンス体が同じプラスミドで運ばれ、同じプラスミド上の同じ配列から産生される方法のために使用され得ることを示している。
【０２３５】
実施例１８．２：プラスミドｐＴｅｔ−ｔＴＡＫと同時に注入されたプラスミドｐＧＪＡ１４によるＳｅＡＰの発現の調節
実施例１６．１に記載される実験と同じ実験を、プラスミドｐＧＪＡ１４およびプラスミドｐＴｅｔ−ｔＴＡＫで同時にトランスフェクションされた細胞で行った（図２３）。カラム６および７は、ＳｅＡＰの発現が、カラム５の構成的な発現との比較により、テトラサイクリンの非存在下で阻害されることを示している。この阻害は、トランス活性化因子ｔＴＡがｐＴｅｔプロモータを活性化することを妨げるテトラサイクリンを添加することによって部分的に上昇する。従って、これらの実験により、２つのプラスミドの同時注入に基づく別の調節システムが明らかにされる。この場合、アンチセンス体およびセンス体が同じプラスミドで運ばれるが、２つの異なる配列から産生される。
【０２３６】
実施例１９：ＳｅＡＰａｎｔｉｓｅｎｓｅ遺伝子のアンチセンス転写物を添加することによる、ｈＰＰＡＲγ２誘導性システムの状況におけるＳｅＡＰ遺伝子の残存発現の調節
図２４に示されるデータは、外因性ＳｅＡＰレポーター遺伝子（プラスミドｐＲＤＡ０２）の発現が、トランス活性化因子ｈＰＰＡＲγ２（プラスミドｐＳＧ５−ｈＰＰＡＲγ２）の存在下で、ＢＲＬフィブラート（ＲＰＲ１３１３００Ａ、水において１０−２Ｍ）の非存在下では０でないことを示す（カラム１）。続くカラムのデータ（カラム３、５、７）は、この基礎レベルが、プラスミドｐＳｅＡＰＡＳをトランスフェクションすることにより得られるアンチセンス転写物の量を増大させながら加えることによって低下し得ることを示している。さらに、アンチセンス転写物の存在は、フィブラートによるＳｅＡＰの発現の誘導性を少しも妨げていない（それぞれ、カラム３および４；カラム５および６；カラム７および８の比率）。従って、ｐＲＤＡ０２、ｐＳＧ５−ｈＰＰＡＲγ２およびｐＳｅＡＰＡＳの３つのプラスミドの混合システムは、外因性ＳｅＡＰレポーター遺伝子の発現を制御し、同時に、フィブラートなどの誘導因子が存在しないときには残存漏出からの発現を最小限に抑えることを可能にする。
【０２３７】
実施例２０：アンチセンス転写物を添加することによる、エクジソン誘導性システムの状況におけるＳｅＡＰ遺伝子の残存発現の調節
図２５には、カラム１および２において、エクジソンシステムの誘導因子（パノステロン、図２６；Ｎｏ他、ＰＮＡＳ、１９９６、３３４６頁から３３５１頁）の存在下および非存在下における、プラスミドｐＩＮＤＳｅＡＰによって運ばれたＳｅＡＰ遺伝子の発現レベルが示される。エクジソン誘導因子が存在しないとき、発現レベルは低いが、０ではない。このレベルは、ＳｅＡＰのアンチセンス転写物を発現するプラスミドｐＳｅＡＰＡＳがプラスミドｐＩＮＤＳｅＡＰと同時にトランスフェクションされたときに０になる（カラム３）。従って、ｐＩＮＤＳｅＡＰ、ｐＶｇＲＸＲおよびｐＳｅＡＰＡＳの３つのプラスミドの混合システムは、外因性ＳｅＡＰレポーター遺伝子の発現を制御し、同時に、エクジソン誘導因子が存在しないときに認められる残存漏出からの発現を除くことを可能にする。
【０２３８】
実施例２１：ドキシサイクリン抑制性プロモータの制御下に置かれたＳｅＡＰａｎｔｉｓｅｎｓｅ型の阻害転写物によるインビボにおける調節の速度論
３０匹の６週齢のＳＣＩＤマウスを、前記に記載されるように処置して、５つの群に分ける。
【０２３９】
第１のマウス群（バッチ１；図２７）はプラスミドｐＸＬ３０１０で処置される。ＳｅＡＰ遺伝子の残存発現が、後者を構成的なＣＭＶプロモータの制御下に置いたときに認められる。
【０２４０】
第２のマウス群（バッチ２；図２７）には、同時注入、その後のエレクトロトランスファーによって、プラスミドｐＧＪＡ１４およびプラスミドｐＴｅｔ−ｔＴＡＫが与えられる。図２７に示される結果は、ドキシサイクリンが存在しないとき、ＳｅＡＰ遺伝子のインビボにおける残存発現が０であることを示している。これにより、ＳｅＡＰ遺伝子を構成的なＣＭＶプロモータの制御下に含み、かつＳｅＡＰａｎｔｉｓｅｎｓｅをコードする配列を、条件的なＴｅｔｐプロモータの制御下で、同じベクターにおいて逆向きに含むｐＧＪＡ１４などのプラスミドの使用から生じるＳｅＡＰ遺伝子の阻害の有効性が明らかにされる。
【０２４１】
第３のマウス群（バッチ３；図２７）には、同時注入、その後のエレクトロトランスファーによって、プラスミドｐＧＪＡ１４およびプラスミドｐＴｅｔ−ｔＴＡＫが与えられ、そしてドキシサイクリンを含む飲料水が与えられる。ＳｅＡＰ遺伝子の発現が８日目に測定されたが、その場合、ドキシサイクリンの存在下で著しく活性化されている。そのレベルは、バッチ１について得られたＳｅＡＰの構成的な発現レベルよりも明らかに大きい。
【０２４２】
第４のマウス群（バッチ４；図２７）には、同時注入、その後のエレクトロトランスファーによって、プラスミドｐＧＪＡ１５−２およびプラスミドｐＴｅｔ−ｔＴＡＫが与えられる。ドキシサイクリンが存在しないとき、ＳｅＡＰの残存発現は、バッチ１において観測される構成的な発現と比較して大きく低下しているが、０ではない。具体的には、ＳｅＡＰの残存発現が、同じベクターの相補的な鎖において、ＳｅＡＰ遺伝子およびアンチセンス転写物の配列を同時に発現させたときに、同じベクターの同じ鎖に両方の配列を含むプラスミドの使用（バッチ２）と比較して認められる。
【０２４３】
第５のマウス群（バッチ５；図２７）には、同時注入、その後のエレクトロトランスファーによって、プラスミドｐＧＪＡ１５−２およびプラスミドｐＴｅｔ−ｔＴＡＫが与えられ、そしてドキシサイクリンを含む飲料水が与えられる。バッチ３の場合のように、ドキシサイクリンが存在するとき、８日目に測定されたＳｅＡＰの発現は著しく活性化されている。
【０２４４】
これらの結果は、ＳｅＡＰ遺伝子の発現の阻害が、後者が、同じ鎖または相補鎖であっても、アンチセンス阻害転写物の配列として同じベクターで投与されたときにもたらされ得ることを明瞭に示している。さらに、この阻害は、アンチセンス転写物を阻害する外部因子が投与されたときには明らかに可逆的である。
【図面の簡単な説明】
【図１Ａ】ｐＸＬ３０３１のプラスミドの概略図である。
【図１Ｂ】ｐＸＬ３０１０のプラスミドの概略図である。
【図１Ｃ】ｐＳｅＡＰａｎｔｉｓｅｎｓｅのプラスミドの概略図である。
【図１Ｄ】、ｐＸＬ３２９６のプラスミドの概略図である。
【図１Ｅ】ｐＬｕｃＡｔｉｓｅｎｓｅのプラスミドの概略図である。
【図２Ａ】ｐＴｅｔ−Ｓｐｌｉｃｅのプラスミドの概略図である。
【図２Ｂ】ｐＴｅｔＬｕｃＡｎｔｉｓｅｎｓｅのプラスミドの概略図である。
【図２Ｃ】ｐＴｅｔＬｕｃのプラスミドの概略図である。
【図２Ｄ】ｐＴｅｔＳｐｌｉｃｅ−ＳｅＡＰａｎｔｉｓｅｎｓｅのプラスミドの概略図である。
【図２Ｅ】ｐＴｅｔ−ｔＴＡＫのプラスミドの概略図である。
【図３Ａ】、ｐＧＪＡ１のプラスミドの概略図である。
【図３Ｂ】ｐＧＪＡ２のプラスミドの概略図である。
【図３Ｃ】ｐＧＪＡ３のプラスミドの概略図である。
【図３Ｄ】ｐＪＡ９のプラスミドの概略図である。
【図４Ａ】ｐＧＪＡ１５−２のプラスミドの概略図である。
【図４Ｂ】ｐＧＪＡ１５のプラスミドの概略図である。
【図４Ｃ】ｐＧＪＡ１４のプラスミドの概略図である。
【図４Ｄ】ｐＪＡ１４−２のプラスミドの概略図である。
【図５Ａ】ｐＳＧ５−ｈＰＰＡＲγ２のプラスミドの概略図である。
【図５Ｂ】ｐＲＤＡ０２のプラスミドの概略図である。
【図６Ａ】ｐＩＮＤのプラスミドの概略図である。
【図６Ｂ】ｐＩＮＤＳｅＡＰのプラスミドの概略図である。
【図６Ｃ】ｐＶｇＲＸＲのプラスミドの概略図である。
【図７Ａ】下記のプラスミドによるＮＩＨ３Ｔ３細胞の同時トランスフェクションの４８時間後に測定されたＳｅＡＰの活性。
【図７Ｂ】下記プラスミドの同時トランスフェクションの２４時間後に測定されたルシフェラーゼの相対的活性。
【図８】ＲＴ−ＰＣＲによるセンスＲＮＡおよびアンチセンスＲＮＡのインビトロでの存在を例示する電気泳動ゲル写真。
【図９Ａ】下記のプラスミド組の同時トランスフェクションの２４時間後に測定されたインビトロでのＳｅＡＰ活性。
【図９Ｂ】下記のプラスミド組のインビトロでの独立したトランスフェクションの２４時間後に測定されたルシフェラーゼの相対的活性。
【図１０】同時（バッチ２）または２２日後（バッチ１）のいずれかで、ＳｅＡＰレポーター遺伝子のセンス配列をコードするプラスミド（ｐＸＬ３０１０）およびそのアンチセンス配列をコードするプラスミド（ｐＳｅＡＰａｎｔｉｓｅｎｓｅ）の脛骨頭側骨格筋内への両側筋肉内注入およびエレクトロトランスファーの後に測定された循環ＳｅＡＰの相対的レベル。
【図１１Ａ】図６のバッチ１から３のＲＴ−ＰＣＲによるＳｅＡＰレポーター遺伝子のセンスＲＮＡおよびアンチセンスＲＮＡのインビボにおける存在を例示する電気泳動ゲル写真。
【図１１Ｂ】図７Ａで写真撮影されたアガロースゲルのニトロセルロースメンブランにおける転写、およびＳｅＡＰレポーター遺伝子のセンス配列（Ｓ）およびアンチセンス配列（ＡＳ）に対して特異的な３２Ｐ標識オリゴヌクレオチドプローブの存在下でのハイブリダイゼーションによって得られたＸ線フィルムの写真。
【図１２】下記時間間隔で下記プラスミドの脛骨頭側骨格筋内への両側筋肉内注入およびエレクトロトランスファーの後のマウス血漿における循環ＳｅＡＰの相対的活性。
【図１３】下記プラスミドの同時注入およびエレクトロトランスファー（ＥＴ）の後のマウス血漿における循環ＳｅＡＰの相対的活性。
【図１４Ａ】下記プラスミドによるＮＩＨ３Ｔ３細胞のトランスフェクションの後に測定されたインビトロにおけるＳｅＡＰの相対的活性とその後のテトラサイクリン処理との関係。
【図１４Ｂ】下記プラスミドによるＮＩＨ３Ｔ３細胞のトランスフェクションの後に測定されたインビトロにおけるＳｅＡＰの相対的活性とその後のテトラサイクリン処理との関係。
【図１５】下記プラスミド（ウエルあたり０．７μｇまたは１．１μｇのＤＮＡ）によるＮＩＨ３Ｔ３細胞（８００００細胞／ウエル）の同時トランスフェクションの２４時間後におけるルシフェラーゼの相対的活性とテトラサイクリン投与の有無との関係。
【図１６Ａ】下記プラスミドを６週齢のメスＳＣＩＤマウスに筋肉内同時注入した後のインビボにおける循環ＳｅＡＰの相対的レベルと各時間間隔でのテトラサイクリン投与との関係。
【図１６Ｂ】下記プラスミドを６週齢のメスＳＣＩＤマウスに筋肉内同時注入した後のインビボにおける循環ＳｅＡＰの相対的レベルと各時間間隔でのテトラサイクリン投与との関係。
【図１７】下記プラスミドによるＮＩＨ３Ｔ３細胞の同時トランスフェクションの４８時間後に測定されたＳｅＡＰの発現。
【図１８】下記プラスミドによるＮＩＨ３Ｔ３細胞の同時トランスフェクションの４８時間後に測定されたＳｅＡＰの発現。
【図１９】ｐＧＪＡ１、ｐＧＪＡ２、ｐＧＪＡ３およびｐＧＪＡ９のプラスミドのＮＩＨ３Ｔ３細胞へのトランスフェクションにより得られるＳｅＡＰ発現の阻害（完全なアンチセンス配列ＳｅＡＰａｎｔｉｓｅｎｓｅを含むプラスミドによってもたらされる阻害との比較）。
【図２０】下記プラスミドの脛骨頭側骨格筋内への両側筋肉内注入およびエレクトロトランスファーを行い、続いて下記時間間隔でのドキシサイクリン投与を行った後のマウスの血漿における循環ＳｅＡＰの相対的活性。
【図２１】下記プラスミドによるＮＩＨ３Ｔ３細胞のトランスフェクションの４８時間後に測定されたＳｅＡＰの発現。
【図２２】下記プラスミドによるＮＩＨ３Ｔ３細胞の同時トランスフェクションの２４時間後に測定されたＳｅＡＰの発現。
【図２３】下記プラスミドによるＮＩＨ３Ｔ３細胞のトランスフェクションの４８時間後に測定されたＳｅＡＰの発現。
【図２４】下記プラスミドによるＣ２Ｃ１２細胞におけるトランスフェクションの５日後における、１０−７Ｍ（最終）の化学的誘導因子ＢＲＬ４９６５３の存在下または非存在下でのＳｅＡＰの発現。
【図２５】下記プラスミドによるＮＩＨ３Ｔ３細胞のトランスフェクションの４８時間に測定された、エクジソンシステムの化学的誘導因子の存在下または非存在下でのＳｅＡＰの発現。
【図２６】図２６はポナステロン（ｐａｎ）を表す。
【図２７】下記プラスミドの脛骨頭側骨格筋内への両側筋肉内注入およびエレクトロトランスファーの後のマウスの血漿における循環ＳｅＡＰの相対的活性（Ｐｈｏｓｐｈａ　Ｌｉｇｈｔキット使用）。
【図１Ａ】
2004505647.tif 000003
【図１Ｂ】
2004505647.tif 000004
【図１Ｃ】
2004505647.tif 000005
【図１Ｄ】
2004505647.tif 000006
【図１Ｅ】
2004505647.tif 000007
【図２Ａ】
2004505647.tif 000008
【図２Ｂ】
2004505647.tif 000009
【図２Ｃ】
2004505647.tif 000010
【図２Ｄ】
2004505647.tif 000011
【図２Ｅ】
2004505647.tif 000012
【図３Ａ】
2004505647.tif 000013
【図３Ｂ】
2004505647.tif 000014
【図３Ｃ】
2004505647.tif 000015
【図３Ｄ】
2004505647.tif 000016
【図４Ａ】
2004505647.tif 000017
【図４Ｂ】
2004505647.tif 000018
【図４Ｃ】
2004505647.tif 000019
【図４Ｄ】
2004505647.tif 000020
【図５Ａ】
2004505647.tif 000021
【図５Ｂ】
2004505647.tif 000022
【図６Ａ】
2004505647.tif 000023
【図６Ｂ】
2004505647.tif 000024
【図６Ｃ】
2004505647.tif 000025
【図７Ａ】
2004505647.tif 000026
【図７Ｂ】
2004505647.tif 000027
【図８】
2004505647.tif 000028
【図９Ａ】
2004505647.tif 000029
【図９Ｂ】
2004505647.tif 000030
【図１０】
2004505647.tif 000031
【図１１Ａ】
2004505647.tif 000032
【図１１Ｂ】
2004505647.tif 000033
【図１２】
2004505647.tif 000034
【図１３】
2004505647.tif 000035
【図１４Ａ】
2004505647.tif 000036
【図１４Ｂ】
2004505647.tif 000037
【図１５】
2004505647.tif 000038
【図１６Ａ】
2004505647.tif 000039
【図１６Ｂ】
2004505647.tif 000040
【図１７】
2004505647.tif 000041
【図１８】
2004505647.tif 000042
【図１９】
2004505647.tif 000043
【図２０】
2004505647.tif 000044
【図２１】
2004505647.tif 000045
【図２２】
2004505647.tif 000046
【図２３】
2004505647.tif 000047
【図２４】
2004505647.tif 000048
【図２５】
2004505647.tif 000049
【図２６】
2004505647.tif 000050
【図２７】
2004505647.tif 000051
【国際公開パンフレット】
2004505647.tif 000052
2004505647.tif 000053
2004505647.tif 000054
2004505647.tif 000055
2004505647.tif 000056
2004505647.tif 000057
2004505647.tif 000058
2004505647.tif 000059
2004505647.tif 000060
2004505647.tif 000061
2004505647.tif 000062
2004505647.tif 000063
2004505647.tif 000064
2004505647.tif 000065
2004505647.tif 000066
2004505647.tif 000067
2004505647.tif 000068
2004505647.tif 000069
2004505647.tif 000070
2004505647.tif 000071
2004505647.tif 000072
2004505647.tif 000073
2004505647.tif 000074
2004505647.tif 000075
2004505647.tif 000076
2004505647.tif 000077
2004505647.tif 000078
2004505647.tif 000079
2004505647.tif 000080
2004505647.tif 000081
2004505647.tif 000082
2004505647.tif 000083
2004505647.tif 000084
2004505647.tif 000085
2004505647.tif 000086
2004505647.tif 000087
2004505647.tif 000088
2004505647.tif 000089
2004505647.tif 000090
2004505647.tif 000091
2004505647.tif 000092
2004505647.tif 000093
2004505647.tif 000094
2004505647.tif 000095
2004505647.tif 000096
2004505647.tif 000097
2004505647.tif 000098
2004505647.tif 000099
2004505647.tif 000100
2004505647.tif 000101
2004505647.tif 000102
2004505647.tif 000103
2004505647.tif 000104
2004505647.tif 000105
2004505647.tif 000106
2004505647.tif 000107
2004505647.tif 000108
2004505647.tif 000109
2004505647.tif 000110
2004505647.tif 000111
2004505647.tif 000112
2004505647.tif 000113
2004505647.tif 000114
2004505647.tif 000115
2004505647.tif 000116
2004505647.tif 000117
2004505647.tif 000118
2004505647.tif 000119
2004505647.tif 000120
2004505647.tif 000121
2004505647.tif 000122
2004505647.tif 000123
2004505647.tif 000124
2004505647.tif 000125
2004505647.tif 000126
2004505647.tif 000127
2004505647.tif 000128
2004505647.tif 000129
2004505647.tif 000130
2004505647.tif 000131
2004505647.tif 000132
2004505647.tif 000133
2004505647.tif 000134
2004505647.tif 000135
2004505647.tif 000136
2004505647.tif 000137
2004505647.tif 000138
2004505647.tif 000139
2004505647.tif 000140
2004505647.tif 000141
2004505647.tif 000142
2004505647.tif 000143
2004505647.tif 000144
2004505647.tif 000145
2004505647.tif 000146
2004505647.tif 000147
2004505647.tif 000148
2004505647.tif 000149
2004505647.tif 000150
2004505647.tif 000151
2004505647.tif 000152
2004505647.tif 000153
2004505647.tif 000154
2004505647.tif 000155
2004505647.tif 000156
2004505647.tif 000157
2004505647.tif 000158
2004505647.tif 000159
2004505647.tif 000160
2004505647.tif 000161
2004505647.tif 000162
2004505647.tif 000163
2004505647.tif 000164
2004505647.tif 000165
2004505647.tif 000166
2004505647.tif 000167
2004505647.tif 000168
2004505647.tif 000169
2004505647.tif 000170
2004505647.tif 000171
2004505647.tif 000172
2004505647.tif 000173
2004505647.tif 000174
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004505647.tif 000175
【国際調査報告】
2004505647.tif 000176
2004505647.tif 000177
2004505647.tif 000178
2004505647.tif 000179
2004505647.tif 000180
2004505647.tif 000181
2004505647.tif 000182
2004505647.tif 000183
2004505647.tif 000184
2004505647.tif 000185