(57)【要約】本発明は、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）に特異的に結合して、その酵素活性を高める新規ペプチドリガンド、このペプチドの製造方法、ペプチドを含む医薬組成物および診断組成物、製薬および研究調製のためのペプチドの使用、種々の形態の ＰＳＡ の濃度測定についての診断検定法においてペプチドを使用する方法、ペプチドをインビトロまたはインビボで使用することにより ＰＳＡ 酵素活性および ＰＳＡ 活性依存性状態を調節する方法、および ＰＳＡ の生化学的単離および精製方法におけるペプチドの使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
前立腺特異抗原についての結合物質であって、
ａ． 一緒に結合してペプチド骨格を形成する少なくとも６アミノ酸を有し、そして少なくとも２アミノ酸数で隔たり、ジスルフィド結合により相互連結されて、システイン、中間アミノ酸およびジスルフィド結合により明確にされる環構造を形成する少なくとも１対のシステインを含むペプチド、または
ｂ． ペプチドに類似の空間的立体配座を有するペプチド様化合物、
（該ペプチドまたはペプチド様化合物は遊離の前立腺特異抗原に選択的結合を発揮する）
を含む結合物質。
【請求項２】
ペプチド骨格がジスルフィド結合により相互結合された少なくとも２対のシステインである、請求項１の結合物質。
【請求項３】
ペプチドが前立腺特異抗原の酵素活性を高め得る、請求項２の結合物質。
【請求項４】
下記式（Ｉ）のペプチド・モチーフまたは配列：
ＣＸ１Ｘ２ＸＸＸＸ６ＸＸＣ　　　（Ｉ）
（式中、Ｘ１ は Ｖ または Ｉ であり、Ｘ２ は Ｆ、Ｉ、Ｗ または Ｐ であり、Ｘ６ は Ｙ、Ｎ または Ｌ であり、Ｃ はシステインであり、各 Ｘ は独立的にアミノ酸残基を表す）。
【請求項５】
Ｘ１ が Ｖ または Ｉ、Ｘ２ が Ｆ または Ｉ、Ｘ６ が Ｙ または Ｎ である、請求項４のペプチド・モチーフまたは配列。
【請求項６】
Ｘ１ が Ｖ 、Ｘ２ が Ｆ 、Ｘ６ が Ｙ であり、各 Ｘ が、Ｔ、Ｓ、Ｄ、Ｙ、Ａ、Ｆ、Ｅ、Ｐ、Ｌ よりなる群から独立的に選ばれるアミノ酸残基である、請求項４のペプチド・モチーフまたは配列。
【請求項７】
Ｘ１ が Ｖ 、Ｘ２ が Ｉ 、Ｘ６ が Ｎ であり、各 Ｘ が、Ｙ、Ｄ、Ｇ、Ｈ、Ｗ、Ｐ、Ｖ よりなる群から独立的に選ばれるアミノ酸残基である、請求項４のペプチド・モチーフまたは配列。
【請求項８】
Ｘ１ が Ｉ 、Ｘ２ が Ｆ 、Ｘ６ が Ｙ または Ｎ であり、各 Ｘ が、Ｅ、Ｐ、Ｄ、Ｓ、Ｙ、Ｇ、Ｆ、Ｉ、Ｌ よりなる群から独立的に選ばれるアミノ酸残基である、請求項４のペプチド・モチーフまたは配列。
【請求項９】
Ｘ１ が Ｖ または Ｉ 、Ｘ２ が Ｆ、Ｉ、Ｗ または Ｐ 、Ｘ５ が Ｄ または Ｎ、Ｘ６ が Ｙ、Ｎ または Ｌ、Ｘ７ が Ａ または Ｎ、Ｘ８ が Ｆ または Ｙ であり、残りの構造単位が請求項４と同じ意味を有す、請求項４のペプチド・モチーフまたは配列。
【請求項１０】
下記式 （ＩＩ） のペプチド・モチーフまたは配列：
ＣＸ１Ｘ２ＸＸＸＸ６ＸＸ８Ｘ９Ｘ１０Ｃ　　　（ＩＩ）
（式中、Ｘ１ は Ｖ、Ｔ または Ｒ であり、Ｘ２ は Ｆ であり、Ｘ６ は Ｙ であり、Ｘ８ は Ｙ または Ｔ であり、Ｘ９ は Ｌ であり、Ｘ１０ は Ｖ または Ｍ であり、Ｘ および Ｃ は請求項１と同じ意味を有す）。
【請求項１１】
Ｘ１ が Ｖ、Ｘ２ が Ｆ、Ｘ６ が Ｙ、Ｘ８ が Ｙ、Ｘ９ が Ｌ、Ｘ１０ が Ｖ であり、Ｘ が、Ａ、Ｈ、Ｎ、Ｄ よりなる群から選ばれるアミノ酸である、請求項１０のペプチド・モチーフまたは配列。
【請求項１２】
Ｘ１ が Ｖ、Ｔ または Ｒ、Ｘ２ が Ｆ、Ｘ６ が Ｙ、Ｘ７ が Ｄ または Ｎ、Ｘ８ が Ｙ、Ｔ または Ａ、Ｘ９ が Ｌ、Ｘ１０ が Ｖ または Ｍ であり、他の単位は請求項１１と同じ意味を有する、請求項１１のペプチド・モチーフまたは配列。
【請求項１３】
下記式 （ＩＩＩ） のペプチド・モチーフまたは配列：
ＣＸ１Ｘ２Ｘ３ＣＸＸＸＸＣＸ８Ｘ９Ｃ　　　　（ＩＩＩ）
（式中、Ｘ１ は Ｖ または Ａ であり、Ｘ２ は Ａ、Ｓ、Ｅ、Ｔ、Ｖ または Ｑ であり、Ｘ３ は Ｙ であり、Ｘ８ は Ｙ または Ｗ であり、Ｘ９ は Ｖ、Ｔ、Ｍ、Ｙ、Ｇ または Ｆ であり、Ｘ および Ｃ は請求項１と同じ意味を有す）。
【請求項１４】
Ｘ１ が Ｖ、Ｘ２ が Ａ または Ｓ、Ｘ３ が Ｙ、Ｘ８ が Ｙ または Ｗ、Ｘ９ が Ｖ、Ｙ または Ｔ、各 Ｘ が、Ｌ、Ｆ、Ｅ、Ｗ、Ｇ、Ｓ、Ｉ、Ｈ、Ｄ、Ｇ、Ｌ、Ｑ、Ｙ、Ｖ、Ａ、Ｍ、Ｋ よりなる群から選ばれるアミノ酸である、請求項１３のペプチド・モチーフまたは配列。
【請求項１５】
Ｘ１ が Ｖ、Ｘ２ が Ａ、Ｘ３ が Ｙ である、請求項１３または１４のペプチド・モチーフまたは配列。
【請求項１６】
Ｘ３ が Ｙ または Ｆ、Ｘ５ が Ｅ または Ｑ であり、残りの構造単位が請求項１３と同じ意味を有する、請求項１３のペプチド・モチーフまたは配列。
【請求項１７】
下記式 （ＩＶ） のペプチド・モチーフまたは配列：
ＣＸ１ＸＸ３ＣＸＸＸＣＸ７ＸＸＸＣ　　　（ＩＶ）
（式中、Ｘ１ は Ｌ であり、Ｘ３ は Ｔ または Ｙ であり、Ｘ７ は Ｒ または Ｗ であり、Ｘ および Ｃ は請求項１と同じ意味を有する）。
【請求項１８】
Ｘ１ が Ｌ、Ｘ３ が Ｔ である、請求項１７のペプチド・モチーフまたは配列。
【請求項１９】
下記よりなる群から選ばれるペプチド・モチーフまたは配列：
ＣＶＦＴＳＤＹＡＦＣ （配列番号 １）、ＣＶＩＹＤＧＮＨＷＣ （配列番号 ２）、ＣＩＦＥＰＤＹＳＹＣ （配列番号 ３）、ＣＶＦＤＤＬＹＳＦＣ （配列番号 ４）、ＣＴＦＳＶＤＹＫＹＬＭＣ （配列番号 ５）、ＣＶＦＡＨＮＹＤＹＬＶＣ （配列番号 ６）、ＣＲＦＤＫＥＹＲＴＬＶＣ （配列番号 ７）、ＣＶＳＹＣＬＦＥＦＣＹＶＣ （配列番号 ８）、ＣＶＥＹＣＷＥＧＳＣＹＶＣ （配列番号 ９）、ＣＶＡＹＣＥＥＷＥＣＹＶＣ （配列番号 １０）、ＣＶＡＹＣＩＥＨＨＣＷＴＣ （配列番号 １１）、ＣＶＳＹＣＤＧＬＱＣＷＭＣ （配列番号 １２）、ＣＬＳＴＣＡＱＳＣＲＩＳＣ （配列番号 １３）、ＣＬＬＹＣＨＤＡＣＷＷＶＣ （配列番号 １４）、ＣＶＴＹＣＹＧＥＶＣＹＹＣ （配列番号 １５）、ＣＡＡＹＣＶＡＧＬＣＹＧＣ （配列番号 １６）、ＣＶＱＹＣＩＧＧＤＣＷＦＣ （配列番号 １７）、ＣＶＶＹＣＤＳＭＫＣＷＴＣ （配列番号 １８）、ＣＶＡＹＣＩＳＳＬＣＹＹＣ （配列番号 １９）、ＣＶＷＹＴＧＮＴＷＣ （配列番号 ２０）、ＣＶＦＤＡＬＹＴＦＣ （配列番号 ２１）、ＣＶＩＹＰＧＮＶＷＣ （配列番号 ２２）、ＣＩＦＤＧＦＹＩＬＣ （配列番号 ２３）、ＣＶＰＹＬＧＬＷＬＣ （配列番号 ２４）、ＣＭＦＤＰＭＹＭＷＭＴＣ （配列番号 ２５）。
【請求項２０】
ペプチド様化合物であって、
− β−ターンにより剛性につくられた環状分子構造を有し、環中に １０ から １２ の構造単位を含み、そしてさらに
− 位置 ３ および ７ に芳香族または脂環式剛性側置換基を含み、位置 ７ の側基は水素結合を提供する置換基を有し、
これによって、ペプチド様化合物が、遊離 ＰＳＡ に選択的に結合し、そして請求項４または１０のペプチド・モチーフまたは配列に類似の結合活性を有し得る、ペプチド様化合物。
【請求項２１】
ペプチド様化合物であって、
− 環中に少なくとも１３の構造単位を含み、位置 １ と １３ および ５ と １０ の単位の間の分子内橋により安定にされた環状分子構造を有し、そしてさらに
− 位置 ４ および １１ に芳香族または脂環式剛性側置換基を含み、位置 ４ の置換基は酸官能性または水素結合能の類似の提供を有し、
これによって、ペプチド様化合物が、遊離 ＰＳＡ に選択的に結合し、そして請求項１３のペプチド・モチーフまたは配列に類似の結合活性を有し得る、
ペプチド様化合物。
【請求項２２】
ポリ（エステルイミド）、ポリエステル、Ｎ−アルキルアミノ環状尿素、チオ尿素、二環状グアニジン、イミダゾール−ピリジノ−インドール、ヒダントイン、チオヒダントインよりなる群から選ばれるオリゴマー／ポリマーを含む、請求項２０または２１のペプチド様化合物。
【請求項２３】
フェニル、シクロペンチル、シクロペンタニル、シクロヘキセニル、シクロヘキサニル、ナフチル、インダニル、フリル、チエニル、ピロリル、ピロリニル、ピロリジニル、ピラゾリル、ピロゾリニル、ピラゾリジニル、ピリジル、イミダゾリル、イミダゾリニル、イミダゾリジニル、モルホリニル、ピペリジニル、ピラジニル、ピペラジニル、ピリミジニル、ピリダジニル、オキサゾイル、オキサゾリジニル、イソオキサゾリル、イソオキサゾリジニル、イソチアゾリジニル、チアゾリル、チアゾリジニル、イソチアゾリル、ニ環状環よりなる群から選ばれる基を含む、請求項２２のペプチド様化合物。
【請求項２４】
請求項１から１９のいずれかのペプチド・モチーフおよび／または配列を含む ＰＳＡ 結合ペプチドおよび酵素活性の調節物質。
【請求項２５】
請求項２０から２３のいずれかの少なくとも１つのペプチド様化合物を含む ＰＳＡ 結合ペプチドおよび酵素活性の調節物質。
【請求項２６】
請求項１から１９のいずれかの少なくとも１つのペプチド・モチーフおよび診断的に許容される担体および／または標識物質を含む診断組成物。
【請求項２７】
請求項２０から２３のいずれかの少なくとも１つのペプチド様化合物および診断的に許容される担体および／または標識物質を含む診断組成物。
【請求項２８】
請求項１から１９のいずれかの少なくとも１つのペプチド・モチーフおよび薬学的に許容される担体および／または標識物質を含む医薬組成物。
【請求項２９】
請求項２０から２３のいずれかの少なくとも１つのペプチド様化合物および薬学的に許容される担体および／または標識物質を含む医薬組成物。
【請求項３０】
請求項１から１９のいずれかのペプチド・モチーフを製造する方法であって、固相 Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ−型ペプチド合成を含むことを特徴とする方法。
【請求項３１】
哺乳動物における ＰＳＡ 産生細胞依存性症状の医療的処置のための方法であって、哺乳動物に請求項１から１９のいずれかのペプチド・モチーフまたは配列を、ＰＳＡ に結合するのにおよび／または該哺乳動物におけるその酵素活性を調節するのに十分な量で、投与することを含む方法。
【請求項３２】
哺乳動物における ＰＳＡ 産生細胞依存性症状の医療的処置のための方法であって、哺乳動物に請求項２０から２３のいずれかのペプチド様化合物を、ＰＳＡ に結合するのにおよび／または該哺乳動物におけるその酵素活性を調節するのに十分な量で、投与することを含む方法。
【請求項３３】
医薬としての、請求項１から１９のいずれかのペプチド・モチーフまたは配列、または請求項２０から２３のいずれかのペプチド様化合物の使用。
【請求項３４】
ＰＳＡ の酵素活性の調節に基づく症状の処置用の医薬の調製のための、請求項１から１９のいずれかのペプチド・モチーフまたは配列、または請求項２０から２３のいずれかのペプチド様化合物の使用。
【請求項３５】
診断用物質としての、請求項１から１９のいずれかのペプチド・モチーフまたは配列、または請求項２０から２３のいずれかのペプチド様化合物の使用。
【請求項３６】
良性および悪性の前立腺疾患および ＰＳＡ 産生の他の組織から誘導される疾患についての ＰＳＡ に基づく診断に使用される試薬の調製のための、請求項１から１９のいずれかのペプチド・モチーフまたは配列、または請求項２０から２３のいずれかのペプチド様化合物の使用。
【請求項３７】
種々の分子形態の ＰＳＡ の生化学的単離および精製の方法における、請求項１から１９のいずれかのペプチド・モチーフまたは配列、または請求項２０から２３のいずれかのペプチド様化合物の使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の背景
発明の分野
本発明は、前立腺特異抗原結合およびその酵素活性増加のための新規ペプチドリガンドに関する。本発明はまた、このペプチドの製造方法に関する。さらに、本発明は、ペプチドを含む医薬組成物および診断組成物、および医薬組成物および診断組成物の製造におけるペプチドの使用に関する。さらに、本発明は、医薬および診断薬、それらの製造、生化学的単離および精製方法に関する。
【０００２】
関連技術の説明
前立腺特異抗原 （ＰＳＡ） は、上皮細胞の高度に特異的な生成物である（１）。ＰＳＡ は ３０ ｋＤ セリンプロテアーゼであり、その主要な生物機能は、精液塊の主な成分であるセメノゲリンのタンパク性分解による射精後に形成される精液ゲルの液化である（２）。精液中の ＰＳＡ は遊離の ＰＳＡ から主になり、この ＰＳＡ には酵素的に活性な型およびタンパク質分解的に解裂または切開された型がある（３）。ヒト血清において、主要な免疫活性型の ＰＳＡ は、ＰＳＡ−ａ１−抗キモトリプシン複合体 （ＰＳＡ−ＡＣＴ） および遊離 ＰＳＡ （ＰＳＡ−Ｆ）である（４）。
【０００３】
血清 ＰＳＡ の測定は、前立腺癌患者の検出および管理のために広くおこなわれており、この疾患スクリーニングのための使用が増加している。スクリーニングのために ＰＳＡ を使用する主な問題は、良性の前立腺肥大による高い誤まった陽性率である。これは、全 ＰＳＡ に対する ＰＳＡ−ＡＣＴ または 遊離 ＰＳＡ の比率を検定することで減じ得る（４）。しかし、ＰＳＡ の癌特異性の改善がさらに望ましい。このことは、ＰＳＡ のマイナー変種についての特異的検定法を開発することで達成できよう。前立腺癌細胞はプロ酵素型の ＰＳＡ を優先的に分泌する（５）。一方、切断された ＰＳＡ は良性組織で形成されることが知られている（６）。従って、これらの型の ＰＳＡ 検定法は臨床的に有用であり得るが、これらの型に特異的なモノクローナル抗体 （ＭＡｂ） の開発が困難である。診断上の有用性がある他の検定法は ＰＳＡ−α−２−マクログロブリン複合体 （ＰＳＡ−Ａ２Ｍ） についてのものである（７）。しかし、この複合体において抗体のような高分子量の結合物質は、阻害物質がプロテイナーゼを取り込むので、ＰＳＡ に到達し得ない。すなわち、ＰＳＡ−Ａ２Ｍ 検定法は複合体の変性を必要とする（７）。ＰＳＡ−Ａ２Ｍ の直接的検定法の開発には、阻害物質に入り込み、ＰＳＡ を特異的に認識する小さい結合物質を必要とするであろう。
【０００４】
ＰＳＡ は、腫瘍成長を阻害して（８）、プラスミノーゲンからアンギオスタチンを生成せしめることが最近報告されている（９）。アンギオスタチンは腫瘍中の新血管形成を妨げることで腫瘍成長を阻害するので、アンギオスタチンの生成は腫瘍の発生を遅らす。従って、ＰＳＡ の酵素活性を調節する物質は前立腺癌の治療に有用であり得る。
【０００５】
ＭＡｂ は、癌の発見および治療に広く用いられている。しかし、大きいサイズの ＭＡｂ は循環系から組織に分散する能力に限界がある。さらにマウス抗体はヒトで免疫原性であり、治療での用途は限られる。ＭＡｂ はまた、循環において長いアベイラビリティを発揮することがあり、正常な組織において Ｆｃ 受容体と相互作用し、トキシンや放射性同位体が接着されると患者を危険におとすことがある（１０）。このような問題は、小さい分子量の別の結合物質を使用することで解消できる。
【０００６】
特異的結合物質の開発における ＭＡｂ についての他の方法は、ペプチド・ライブラリーおよびファージ・ディスプレイ法の使用である。ＰＳＡ−結合ペプチドは、ポリソーム選択法により以前につくられているが（１１）、このペプチドは ＰＳＡ の酵素活性を調節せず、ＰＳＡ についての検定法の部分として有用とされていない。Ｄｅｎｍｅａｄｅ ｅｔ ａｌ． が ＰＳＡ のペプチド基質を、精液中の ＰＳＡ の基質であるセメノゲリンの配列を基に開発した（１２）。しかし、このペプチドは ＰＳＡ に対する安定な結合を必要とする技法で適用できない。
【０００７】
上記の説明から分かるように、ＰＳＡ と反応するいくつかのペプチドが開発されているが、これらのペプチドは ＰＳＡ の酵素活性を調節するとはされておらず、また ＰＳＡ の検出に用いて機能的でもない。
【０００８】
発明の要旨
本発明の目的は、先行技術の問題点を解決し、新規の ＰＳＡ 結合化学物質を提供することである。特に、本発明は、ＰＳＡ の血清中への放出を含む状態を処置および診断するのに、特に治療的および診断的に有用な新規のペプチドリガンドおよびその機能的等価物を提供することを目的とする。
【０００９】
他の目的は、酵素活性を調節し得る前立腺特異抗原の新規なペプチドリガンドを製造する方法を提供することである。
第３の目的は、ＰＳＡ に結合し得る新規な化合物を含む医薬組成物および診断組成物を提供することである。
【００１０】
第４の目的は、新規な診断法および治療法を提供することである。
これらの目的および他の目的は、既知の結合物質や方法を越える利点とともに、下記の説明および請求項にしたがって本発明により達成できる。
【００１１】
本発明は、特殊な構造（特殊なアミノ酸配列またはモチーフ）を有する新規ペプチド群が遊離 ＰＳＡ または ＰＳＡ − Ａ２Ｍ 複合体と選択的結合をなし、そしてその酵素活性を調節し得るとの知見に基づく。本発明のペプチドは、少なくとも１対のシステインを含む。このシステインは、少なくとも２つのアミノ酸で空間的に隔たり、少なくとも１対の該システイン間のジスルフィド結合を有する環状構造を形成し得る。システイン間のジスルフィド結合形成の結果として、ペプチドの主要鎖が曲がり、三次元立体配座をとる。これを、ペプチドと同様の生物活性を有するペプチド・アナログすなわちペプチド様化合物を開発するための基礎として使用できる。
【００１２】
新規ペプチドは、本発明の結合物質を表し、設計されたジスルフィド結合により立体配座的に拘束を受けていたペプチドのファージ・ディスプレイ・ライブラリーを使用することにより見出した。驚くべきことに、予想に全く反して、最も活性なペプチドが小さい分子量の色素産生性基質および天然のタンパク基質に対する ＰＳＡ の酵素活性を高める。この ＰＳＡ 活性の増加は、特に ＰＳＡ 酵素活性の上昇を治療目的に使用するときに、多くの用途で用い得る。
【００１３】
さらに具体的に、本発明のペプチドリガンドおよびその機能的等価物は、請求項１から２３の特徴部分で述べた点を主要な特徴とする。
本発明の診断組成物は、請求項２６および２７の特徴部分で述べた点を主要な特徴とする。
本発明の医薬組成物は、請求項２８および２９の特徴部分で述べた点を主要な特徴とする。
【００１４】
本発明のペプチドリガンドの製造法は、請求項３０の特徴部分で述べた点を主要な特徴とする。
本発明の治療方法は、請求項３１および３２の特徴部分で述べた点を主要な特徴とする。
本発明のペプチドモチーフ、配列、ペプチド様化合物の使用は、請求項３３から４０の特徴部分で述べた点を主要な特徴とする。
【００１５】
本発明により非常な利点が得られる。本発明はまず、ＰＳＡ の酵素活性を調節し、さらに特異的に高め得る ＰＳＡ 結合リガンドを提供する。本発明のペプチドは、免疫ペプチド検定法またはクロマトグラフィー・マトリックスの部分として種々の形態の ＰＳＡ と特異的に結合し得る。さらに、このペプチドは抗体で得られていない結合特異性を表す。本発明のペプチドおよび対応のペプチド様化合物は、ＰＳＡ 分泌細胞依存性状態の処置のために医薬組成物として製剤できる。
【００１６】
Ｄｅｎｍｅａｄｅ ｅｔ ａｌ． が開発したペプチドは、細胞毒性薬物とコンジュゲートされて、プロドラッグを形成する。このプロドラッグは ＰＳＡ により分解されて活性となる（１３）。同様の方法で、ＰＳＡ と安定な結合を示す本発明のペプチドは、細胞毒性薬物、遺伝子治療ベクター、造影物質を前立腺癌組織に選択的に運送するのに、なんらの活性化工程を要しないで用い得る。
次ぎに、本発明を詳細な説明および図面を参照して詳しく記述する。
【００１７】
図面の簡単な説明
図１は、ＧＳＴ−ペプチドの固定化 ＰＳＡ との結合を示す。
図２は、ＧＳＴ−ペプチドの固定化 ＰＳＡ との結合に対する Ｚｎ２＋ の作用を示す。
図３は、ＧＳＴ−Ｃ−４ の固相 ＰＳＡ との結合に対する ＰＳＡ 溶液の作用を示す。
図４ａおよび４ｂは、それぞれ、ＧＳＴ−ペプチドの、ＰＳＡ に関連する種々のプロテイナーゼおよび ＰＳＡ−セルピン複合体との反応性を示す。
図５は、ゲルろ過による ＧＳＴ−Ｃ−４ の分別を示す。
【００１８】
図６は、ＧＳＴ ペプチドのプロ酵素型 ＰＳＡ および活性 ＰＳＡ との結合を示す。
図７は、化学合成ペプチドの、ＧＳＴ−Ｃ−４ の固相 ＰＳＡ との結合に対する作用を示す。
図８は、ＧＳＴ−Ｃ−４ の ＰＳＡ 酵素活性に対する作用を示す。
図９は、化学合成ペプチド Ｃ−４ の ＰＳＡ 酵素活性に対する作用を示す。
図１０は、化学合成ペプチド Ｃ−４ および Ａ−１ の、ＰＳＡ の ＩＧＦ−ＢＰ−３ へのタンパク分解活性に対する作用を示す。
【００１９】
図１１は、ＧＳＴ−Ｃ−４ と Ｚｎ２＋ の ＰＳＡ 酵素活性に対する併用効果を示す。
図１２は、化学合成ペプチド Ｃ−４ の、ＰＳＡ − Ａ２Ｍ 複合体の酵素活性に対する作用を示す。
図１３は、誘導ペプチド Ｂ２ の構造を示す。
図１４は、誘導ペプチド Ｃ４ の構造を示す。
図１５は、ＳＫＳＫＳＫＳ−テイル化ペプチド Ｃ４ の ＰＳＡ 酵素活性に対する作用を示す。
【００２０】
図１６は、ペプチド Ｃ４ の Ｅｕ−標識反応混合物のフラクション化を示す。
図１７は、図１６に示す Ｃ１８ クロマトグラフィーの種々のフラクションの、ＰＳＡ 酵素活性に対する作用を示す。
図１８は、テクネチウム標識の、Ｃ４−ペプチドの結合活性に対する作用を示す。
図１９は、ヨウ素化の、Ｃ４ ペプチドの ＰＳＡ 結合活性に対する作用を示す。
図２０は、１００ μＭ Ｚｎ２＋ の存在下での Ｂ２ ペプチド アフィニティークロマトグラフィーによる精液血漿サンプルのフラクション化を示す。
【００２１】
図２１は、Ｚｎ２＋ 不存在で上記図２０の精液血漿サンプルのフラクション化を示す。
図２２は、異なるｐＨ値での Ｃ４−ペプチドカラムからの ＰＳＡ の溶出を示す。
図２３は、ペプチド Ｂ２ のアフィニティーカラムから得られた ＰＳＡ−含有フラクションの、非還元条件下での ＳＤＳ−ＰＡＧＥ 後のイムノブロット分析を示す。
図２４は、還元条件下での ＳＤＳ−ＰＡＧＥ 後の対応する（参照、図２３）イムノブロット分析を示す。
図２５は、ペプチド Ｂ２ カラムによりフラクション化された精液の、非還元条件下での ＳＤＳ−ＰＡＧＥ を示す。
【００２２】
図２６ａ−ｃは、Ａ−１ （ａ）、Ｂ−２ （ｂ）、Ｃ−４ （ｃ） についてランダムコイルにおける ＣαＨ 化学シフト値と ＤＭＳＯ−ｄ６ において実験的に測定された値との相違を示す。
図２７ａ−ｃは、ＤＭＳＯ−ｄ６ におけるペプチド Ａ−１、Ｂ−２、Ｃ−４ の有意の ＮＯＥ−相関関係を示す。
図２８は、ペプチド Ａ−１ の三次元構造を示す。
図２９は、ペプチド Ｂ−２ の三次元構造を示す。
図３０は、ペプチド Ｃ−４ の三次元構造を示す。
【００２３】
発明の詳細な説明
定義：
本発明の目的にとって、用語 ”リガンド” は、ホルモンなどの大きいポリペプチド分子または細胞の表面に存在する結合ドメインに結合し得る化合物または化合物部分を表す。本ペプチドリガンドは、ＰＳＡ に結合し、合成および天然の ＩＧＦ−ＢＰ−３ 基質に対するその酵素活性を調節、または多くの場合に増加すらする。本明細書において、”リガンド” を ”結合物質” と同義的に使用する。
【００２４】
一般的に、リガンドは化学的化合物、例えばペプチドであって、生理的溶液に溶解し、あるいは水または血清に混合し得る。本リガンドの ＰＳＡ との結合は、表面プラスモン共鳴法や免疫ペプチド検定法 （ＩＦＭＡ−検定法） などにより結合を測定または決定できる程度に、リガンドが ＰＳＡ の結合ドメインに接着しているという点で ”安定” （これに反し、例えば、酵素反応） であることを特徴とする。さらに、結合したリガンドは、生理的緩衝液で洗出または流出されない。本リガンドの結合強度は乳癌を標的とするのに使用されるペプチド剤の強度に匹敵する（１４）。
【００２５】
本リガンドの ＰＳＡ との結合は ”選択的” である。この選択性は、遊離 ＰＳＡ および ＰＳＡ との複合体中のセリンプロテイナーゼ阻害剤に特異的である ＭＡｂ がリガンドの ＰＳＡ との結合を妨げるとの事実により表される。本リガンドは活性部位の周辺に位置する ＰＳＡ の部位に結合するようであるが、これは単に理論であって、われわれはこれに拘束される意図はない。典型的には、本ペプチドおよび対応のペプチド様化合物は、”遊離” ＰＳＡ またはα２−マクログロブリンとの複合体中の ＰＳＡ と結合する。遊離 ＰＳＡ は前立腺上皮細胞により合成され分泌される ＰＳＡ の形態である。
【００２６】
”ペプチド” は、ペプチド骨格を形成するアミド結合により一緒に結合されたいくつかのアミノ酸のひとつの鎖を表す。一般的に、ペプチドは、１０ ｋＤａ 以下の分子量の分子、すなわち約 ９０ 以下のアミノ酸を含有する分子を含む。ペプチドは、約 ６−３０ アミノ酸単位からなるとき、”小ペプチド” といい得る。上記のように、本ペプチドは一般的にシステイン間のジスルフィド結合により形成される架橋を少なくともひとつ含む。ペプチドが複数対のシステインを含有していると、複数の架橋ができることがある。ジスルフィド結合に加え、ペプチド内に他の架橋が同様にでき得る。いくつかの例示的ペプチドの特異的な構造については、下記で詳細に説明する。
【００２７】
“ペプチド・アナログ” は、環付加、縮合反応、求核反応などの種々の化学反応によるペプチドの修飾を基にするペプチドの誘導体である。
【００２８】
“ペプチド様化合物” は、上記した元のペプチドに類似する化合物である。このものは、元のペプチドを形成するアミノ酸と異なる化学的建造体から作り得る。例えば、元のペプチドの主要な配列に基づいて、ベンゾラクタムやピペラジンを基とするアナログのような非ペプチド化合物を用い得る （１５， １６）。ペプチド様化合物と元のペプチドとの類似は、構造的および機能的な類似性に基づく。すなわち、ペプチド様化合物は、元のペプチドとバイオ活性配座が似ており、本願の目的について、ＰＳＡ 結合部位に関する結合活性が、その類似するペプチドのものと同様である。ペプチド様化合物は、元のペプチドに見られないアミノ酸（例えば、Ｄ−アミノ酸） からも作ることができ、また、アミド結合やエステル結合を形成する他の化合物からも作ることができる。合成ペプチド様化合物の例には、ポリ（エステルイミド）、ポリエステル、Ｎ−アルキルアミノ環状尿素、チオ尿素、ニ環状グアニジン、イミダゾール−ピリジノ−インドール、ヒダントイン、チオヒダントインがある（１５， １６）。これらは、例えば、下記の基を含有する。フェニル、シクロペンチル、シクロペンタニル、シクロヘキセニル、シクロヘキサニル、ナフチル、インダニル、フリル、チエニル、ピロリル、ピロリニル、ピロリジニル、ピラゾリル、ピロゾリニル、ピラゾリジニル、ピリジル、イミダゾリル、イミダゾリニル、イミダゾリジニル、モルホリニル、ピペリジニル、ピラジニル、ピペラジニル、ピリミジニル、ピリダジニル、オキサゾイル、オキサゾリジニル、イソオキサゾリル、イソオキサゾリジニル、 イソチアゾリジニル、チアゾリル、チアゾリジニル、イソチアゾリル、二環状環。
【００２９】
ペプチド様化合物は、ペプチドに構造的および機能的に等価であることを特徴とし得る。
一般的に、前立腺特異抗原 （ＰＳＡ） についての新規な結合物質は、下記のいずれかを含む：
ａ． ペプチド骨格を形成するために一緒になって結合した少なくとも ６ アミノ酸、および１対のシステイン（このシステインは少なくとも２つのアミノ酸で空間的に隔たり、システインと中間アミノ酸とジスルフィド結合による環状構造を形成するジスルフィド結合で連結されている）を有するペプチド、または
ｂ． ペプチドに類似の空間的配座を有するペプチド様化合物 （元のペプチドのバイオ活性配座に似る）。
該化合物の両者とも、遊離の前立腺特異抗原および ＰＳＡ−Ａ２Ｍ （上記に定義）に対して選択的結合を発揮する。
【００３０】
本発明の第１の好ましい実施態様において、新規の ＰＳＡ 結合ペプチドリガンドは、下記式 （Ｉ） によるペプチド・モチーフの環状構造 （システイン間のジスルフィド結合） に基づく：
ＣＸ１Ｘ２ＸＸＸＸ６ＸＸＣ　　　（Ｉ）
（式中、Ｘ１ は Ｖ または Ｉ であり、Ｘ２ は Ｆ、Ｉ、Ｗ または Ｐ であり、Ｘ６ は Ｙ、Ｎ または Ｌ であり、Ｃ はシステインであり、各 Ｘ は独立的にアミノ酸残基を表す）。
【００３１】
特に、式 （Ｉ） において、Ｘ１ は Ｖ または Ｉ、Ｘ２ は Ｆ または Ｉ、Ｘ６ は Ｙ または Ｎ である。Ｘ１ が Ｖ で、Ｘ２ が Ｆ であるとき、Ｘ６ は Ｙ が好ましく、各 Ｘ は、Ｔ、Ｓ、Ｄ、Ｙ、Ａ、Ｆ、Ｅ、Ｐ、Ｌ よりなる群から独立的に選ばれるアミノ酸残基である。Ｘ１ が Ｖ で、Ｘ２ が Ｉ であるとき、Ｘ６ は Ｎ が好ましく、各 Ｘ は、Ｙ、Ｄ、Ｇ、Ｈ、Ｗ、Ｐ、Ｖ よりなる群から独立的に選ばれるアミノ酸残基である。さらに、Ｘ１ が Ｉ で、Ｘ２ が Ｆ であるとき、Ｘ６ は Ｙ または Ｎ が好ましく、各 Ｘ は、Ｅ、Ｐ、Ｄ、Ｓ、Ｙ、Ｇ、Ｆ、Ｉ、Ｌ よりなる群から独立的に選ばれるアミノ酸残基である。
【００３２】
式 （Ｉ） のペプチドについての別の特に好ましい実施態様において、Ｘ１ は Ｖ または Ｉ であり、Ｘ２ は Ｆ、Ｉ、Ｗ または Ｐ であり、Ｘ５ は Ｄ または Ｎ であり、Ｘ６ は Ｙ、Ｎ または Ｌ であり、Ｘ７ は Ａ または Ｎ であり、Ｘ８ は Ｆ または Ｙ であり、残りの構造単位は上記と同じ意味を有す。
【００３３】
ペプチドの例を配列番号で表示する： 表１における Ａ−１ （配列番号 １）、Ａ−２ （配列番号 ２）、Ａ−４ （配列番号 ４）、Ｚ−６ （配列番号 ２０）、Ｚ−７ （配列番号 ２１）、Ｚ−８ （配列番号 ２２）、Ｚ−１０ （配列番号 ２４）、および Ａ−３ （配列番号 ３）、Ｚ−９（配列番号 ２３）。
【００３４】
表１．ＰＳＡ−結合ペプチドのアミノ酸配列
【表１】
2004509976.tif 000002
一本鎖 ＤＮＡ をファージクローンから、ＰＳＡ について３回の選択後に精製した。ペプチド配列は、ファージゲノムの対応領域の ＤＮＡ 配列から演繹した。いくつかのクローン中の共通残基を太字で示す。グルタチオン Ｓ−トランスフェラーゼ （ＧＳＴ） 融合タンパク質として発現されたペプチドをアステリスクで示す。
【００３５】
本発明の第２の好ましい実施態様において、新規の ＰＳＡ 結合ペプチドリガンドは、下記式 （ＩＩ） によるペプチド・モチーフの環状構造に基づく：
ＣＸ１Ｘ２ＸＸＸＸ６ＸＸ８Ｘ９Ｘ１０Ｃ　　　（ＩＩ）
（式中、Ｘ１ は Ｖ、Ｔ または Ｒ であり、Ｘ２ は Ｆ であり、Ｘ６ は Ｙ であり、Ｘ８ は Ｙ または Ｔ であり、Ｘ９ は Ｌ であり、Ｘ１０ は Ｖ または Ｍ であり、Ｘ および Ｃ は上記と同じ意味を有す）。
【００３６】
好ましくは、式 （ＩＩ） において、Ｘ１ は Ｖ、Ｘ２ は Ｆ、Ｘ６ は Ｙ、Ｘ８ は Ｙ、Ｘ９ は Ｌ、Ｘ１０ は Ｖ であり、Ｘ は、Ａ、Ｈ、Ｎ、Ｄ よりなる群から選ばれるアミノ酸である。好ましい配列を下記に配列番号で例示する： 表１における Ｂ−１ （配列番号 ５）、Ｂ−２ （配列番号 ６）、Ｂ−３ （配列番号 ７）。
【００３７】
式 （ＩＩ） の構造単位はまた、下記の意味を有する： Ｘ１ は Ｖ、Ｔ または Ｒ、Ｘ２ は Ｆ、Ｘ６ は Ｙ、Ｘ７ は Ｄ または Ｎ、Ｘ８ は Ｙ、Ｔ または Ａ、Ｘ９ は Ｌ、Ｘ１０ は Ｖ または Ｍ であり、他の単位は上記と同じ意味を有する。
【００３８】
本発明の第３の好ましい実施態様において、新規の ＰＳＡ 結合ペプチドリガンドは、下記式 （ＩＩＩ） によるペプチド・モチーフの環状構造に基づく：
ＣＸ１Ｘ２Ｘ３ＣＸＸＸＸＣＸ８Ｘ９Ｃ　　　　（ＩＩＩ）
（式中、Ｘ１ は Ｖ または Ａ であり、Ｘ２ は Ａ、Ｓ、Ｅ、Ｔ、Ｖ または Ｑ であり、Ｘ３ は Ｙ であり、Ｘ８ は Ｙ または Ｗ であり、Ｘ９ は Ｖ、Ｔ、Ｍ、Ｙ、Ｇ または Ｆ であり、Ｘ および Ｃ は上記と同じ意味を有す）。
【００３９】
特に、式 （ＩＩＩ） のペプチドモチーフまたは配列は下記のアミノ酸残基を含む：Ｘ１ は Ｖ、Ｘ２ は Ａ または Ｓ、Ｘ３ は Ｙ、Ｘ８ は Ｙ または Ｗ、Ｘ９ は Ｖ、Ｙ または Ｔ、各 Ｘ は、Ｌ、Ｆ、Ｅ、Ｗ、Ｇ、Ｓ、Ｉ、Ｈ、Ｄ、Ｇ、Ｌ、Ｑ、Ｙ、Ｖ、Ａ、Ｍ、Ｋ よりなる群から選ばれるアミノ酸である。詳細に下記するように、ＰＳＡ との強い結合は、ＣＶＡＹＣ （配列番号 １１） モチーフを含有するクローンで達成できる。すなわち、式（ＩＩＩ）において、好ましくは、Ｘ１ が Ｖ、Ｘ２ が Ａ、Ｘ３ が Ｙ である。
【００４０】
Ｘ３ はまた、Ｙ または Ｆ であり、Ｘ５ が Ｅ または Ｑ であり得、残りの構造単位は上記、特に前パラグラフと同じ意味を有する。
式 （ＩＩＩ） のペプチドは、表Ｉにおいて下記の配列番号で示す： 配列 Ｃ−１ （配列番号 ８）、Ｃ−５ （配列番号 １２）、Ｚ−１ （配列番号 １５）、Ｚ−６ （配列番号 ２０）、Ｚ−８ （配列番号 ２２）。
【００４１】
本発明の第４の好ましい実施態様において、新規の ＰＳＡ 結合ペプチドリガンドは、下記式 （ＩＶ） によるペプチド・モチーフの環状構造に基づく：
ＣＸ１ＸＸ３ＣＸＸＸＣＸ７ＸＸＸＣ　　　（ＩＶ）
（式中、Ｘ１ は Ｌ であり、Ｘ３ は Ｔ または Ｙ であり、Ｘ７ は Ｒ または Ｗ であり、Ｘ および Ｃ は上記と同じ意味を有する）。
【００４２】
好ましくは、Ｘ１ は Ｌ であり、Ｘ３ は Ｔ である。表１での対応配列は、Ｄ−１ （配列番号 １３） および Ｄ−２ （配列番号 １４） である。
【００４３】
本発明はまた、別の特徴を有する結合物質の開発のためにリード配列としての上記のモチーフの使用に関する。
【００４４】
本発明の他の目的は、表１に記載の配列に基づく新規の ＰＳＡ 結合ペプチドリガンドを提供することである。ペプチド Ａ−１ （配列番号 １） − Ａ−４ （配列番号 ４）、Ｂ−１ （配列番号 ５） − Ｂ−３ （配列番号 ７）、Ｃ−１ （配列番号 ８） − Ｃ−５ （配列番号 １２）、Ｄ−１ （配列番号 １３） − Ｄ−２ （配列番号 １４）を、下記の方法の項に記載のように単離した。ペプチド Ｚ−１ （配列番号 １５） − Ｚ−１１ （配列番号 ２５） を、Ａ−、Ｂ−、Ｃ−、Ｄ−シリーズのペプチドと同様に単離した。ただし、ふるい分けに使用した緩衝液中に２００ μＭ の ＺｎＣｌ２ を含む。
【００４５】
ペプチド Ａ１ （ＣＶＦＴＳＮＹＡＦＣ、配列番号 １）、Ｂ２ （ＣＶＦＡＨＮＹＤＹＬＶＣ、配列番号 ６）、Ｃ４ （ＣＶＡＹＣＩＥＨＨＣＷＴＣ、配列番号 １１） は、特に強い結合を表した。それらの性質および構造をさらに詳細に調べた。検討結果を実施例４および５で示す。
【００４６】
実施例５で説明する構造分析によると、２ペプチド Ａ−１ および Ｂ−２ （各々、一般式 Ｉ および ＩＩ に対応する） は非常に類似の構造と類似あるいは同一の生物活性とを有する。Ａ−１ ペプチド中の好ましい側鎖は、３ 位のフェニルアラニン （Ｐｈｅ、Ｆ） および ７ 位のチロシン （Ｔｙｒ、Ｙ） である。ペプチド Ｂ−２ での好ましいアミノ酸は、同じく ３ 位のフェニルアラニン （Ｐｈｅ、Ｆ） および ７ 位のチロシン （Ｔｙｒ、Ｙ） である。
【００４７】
配列 Ａ−１ および Ｂ−２ において、剛性βターン（ｔｕｒｎ）が、３ 位のフェニルアラニン （Ｐｈｅ、Ｆ） および ７ 位のチロシン （Ｔｙｒ、Ｙ） の芳香族側鎖の位置を安定にする。その構造は、ペプチド Ａ−１ において、４ 位のトレオニン （Ｔｈｒ、Ｔ） のカルボニル酸素と ７ 位のチロシン（Ｔｙｒ、Ｙ）のアミドの水素との水素結合により安定になる。ペプチド Ｂ−２ においては、４ 位のアラニン （Ａｌａ、Ａ） のカルボニル酸素と ７ 位のチロシン（Ｔｙｒ、Ｙ）のアミドの水素との水素結合により安定になる。
【００４８】
ペプチド Ｃ−４ での好ましいアミノ酸は、４ 位のチロシン （Ｔｙｒ、Ｙ） および １１ 位のトリプトファン （Ｔｒｐ、Ｗ） である。この構造は２ジスルフィド橋により安定になる； 第１が部位 Ｃｙｓ１ と Ｃｙｓ１３ の間、および第２が部位 Ｃｙｓ５ と Ｃｙｓ１０ の間である。
【００４９】
しかし、注意すべきことに、表示の位置での好ましい上記アミノ酸に加えて、類似の構造を有し、式の関連代替表に記載された別のアミノ酸も所望の活性を発揮する。記載の位置は、ペプチドの全長から計算し、システインも数えた。このことは、例えば、ペプチド Ａ−１ の ３ 位の Ｆ が式Ｉの Ｘ２ に対応することを意味する。
【００５０】
得たデータに基づいて、式 Ｉ または ＩＩ の本ペプチドの活性に類似する活性を有する本発明のペプチド様化合物は、１０ − １２ 構造単位を含み、特に ３ および ７ 位で芳香族または脂環式の剛性基を有する基本構造を表し、その構造はβターンで剛性につくられる。７ 位で構造単位に連結している側基は水素結合を提供する基をさらに有さなければならない。式 ＩＩＩ の本ペプチドの活性に類似の活性を有する本発明のペプチド様化合物は、１３ 構造単位の基本構造を表し、これは夫々 １ と １３ および ５ と １０ 位の細胞内橋により安定になる。さらに、４ と １１ 位において、ペプチド様化合物は、芳香族または脂環式の剛性置換基 （側基）を表し、４ 位の置換基はさらに酸官能基または水素結合能を提供する類似の基を有する。
【００５１】
ペプチド様化合物および実際のペプチドは、モチーフ （または対応する機能性パターン） が存在する限り、上記に開示のものよりも長い分子鎖を有することがある。
【００５２】
本発明はまた、ある量の新規 ＰＳＡ 結合ペプチド量を含む診断組成物に関する。本発明ペプチドおよび診断的に許容される担体を含む診断組成物は、それ自体で、または検定法の固相マトリクスに固定されたペプチド・コンジュゲートとして、または標識ペプチド・トレーサー試薬として使用し得る。本発明の診断組成物は、種々の分子形態の ＰＳＡ の測定を基にした検定法において用途がある。診断組成物は、活性成分を液相、好ましくは水相中に濃度 ０．１ − ５００ μｇ／ｌ で含有する。組成物は Ｔｗｅｅｎ やポリソルベートなどの洗剤および安定化剤を含有し得る。他の成分の濃度は組成物の約 ０ − ５０ 重量 ％ であり得る。
【００５３】
実施例４の結果からして、本ペプチドは、ＰＳＡ の精製および種々の形態の遊離 ＰＳＡ 間の分化に使用し得る。これらのペプチドが ＰＳＡ に対する新規の結合特異性を保有しており、すなわち、無傷形態の遊離 ＰＳＡ に特異的に結合するので、前立腺癌の改善された正確な検定法の開発に有用性を持ち得る。
【００５４】
本発明はまた、ある量の新規の ＰＳＡ 結合ペプチドリガンドを含む医薬組成物に関する。本発明の新規の ＰＳＡ 結合ペプチドは、全身的、局部的および／または局所的に使用でき、例えば、非経口的に、経静脈的に、皮下的に、筋肉内に、鼻腔内に、肺エアゾールで、デポ形態で投与できる。組成物は、標識試薬、造影試薬、薬物などの化学物や分子とペプチドとの組合せをも含み得る。
【００５５】
本発明はまた、ＰＳＡ 発現細胞または ＰＳＡ 発現細胞の近辺の細胞への遺伝子運送を調節するためにペプチドを使用することに関する。遺伝子運送の調節のためにペプチドを使用することは、一般的に参考文献 １７ に記述されている。
【００５６】
静脈注入または注射に適した医薬組成物は特に好ましく、活性成分の濃度が一般的に約 ０．１ − ５００ ｇ／ｌ、好ましくは約 １ − ２５０ ｇ／ｌ である。過剰量が患者に負担とならなければ、幾分高い濃度 （例えば、約 ２０ − ２００ ｇ／ｌ） が好ましい。その製剤は、凍結乾燥し、投与前に再構築するか、投与用溶液として貯蔵できる。溶液産物の ｐＨ は、約 ５ から約 ８ の範囲にあり、好ましくは生理的 ｐＨ の近辺である。溶液の浸透圧は、好ましい値が少なくとも ２００ ｍｏｓｍｏｌ／ｌ であって、塩化ナトリウムおよび／または糖、ポリオール、アミノ酸またはこれらの類似成分を用いて調整できる。組成物は、さらに薬学的に許容される賦形剤および安定剤、例えば、アルブミン、糖、種々のポリオールを含有し得る。これらの成分の量は、活性成分の約 ０ − ５０ 重量 ％ の範囲で大きく変り得る。液体製剤は再構築なしに投与できるという追加の利点を提供する。
経口投与のために、本発明のペプチドの誘導体を調製するのが必要なことがある。
【００５７】
特に興味深い実施態様において、ペプチド （およびペプチド様化合物） を、細胞毒性薬物であるドキソルビシンやメトトレキセートなどの診断／治療化合物を含有するリポソーム・パッケージ中に組込む。ペプチドを包含するリポソームは参考文献 １８、１９ に開示されている。ペプチドのリポソーム表面へのカップリングは、その ＰＳＡ 産生細胞への標的化を可能にする。
【００５８】
本発明はまた、良性および悪性の前立腺疾患および ＰＳＡ を生成する他の組織に由来する疾患について ＰＳＡ を基にする診断のための試薬を製造するのに新規の ＰＳＡ 結合ペプチドを用いることを含む。
【００５９】
本発明はまた、本発明の使用を基にする症状の処置および標的化のために上記医薬組成物の製造に新規の ＰＳＡ 結合ペプチドを用いることを含む。本発明はまた、ＰＳＡ 酵素活性の調節を基にする症状の処置のために新規の ＰＳＡ 結合ペプチドを用いることを含む。すなわち、一般的に、新規のペプチドおよび構造的かつ機能的に等価のペプチド様化合物 （＝ 活性成分） を医薬組成物で用いて、哺乳動物の癌や他の症状を処置できる。それには、有効量のペプチドまたはペプチド様化合物またはそれらの医療的に許容される酸、塩、誘導体を薬学的に許容される担体で投与する。薬学的に許容される担体との投与における用量は、１日当り体重 ｋｇ につき約 １ から約 １，０００ μｇ であり得る。上記のように、組成物は、非経口的に、経静脈的に、皮下的に、筋肉内に、鼻腔内に、肺エアゾールで、デポ形態で投与できる。
【００６０】
本発明はまた、種々の形態の ＰＳＡ の生化学的単離および精製法に新規の ＰＳＡ 結合ペプチドを用いることに関する。
本発明はまた、標準的な固相 Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ ペプチド合成により、これらの ＰＳＡ 結合ペプチドを製造する方法に関する。
【００６１】
本発明のペプチドは、そのままでまたは標識誘導体で、種々の分子形態の ＰＳＡ についての定量検定法の部分として、ＰＳＡ の活性を調節する化合物として、または ＰＳＡ 産生細胞の標的化のために使用し得る。
【００６２】
さらに、これらのペプチドは、上記の目的のためにペプチド様化合物を設計するのにリード化合物として使用し得る。ペプチドはまた、上記のようにおよび実施例４で述べるように、種々の形態の ＰＳＡ の生化学的単離および精製のためにカラムクロマトグラフィー・マトリクスで使用できる。さらに、本発明のモチーフを、他の特徴を有する結合物質の開発のためのリード配列として使用できる。
【００６３】
本ペプチドはまた、ＰＳＡ 酵素活性および ＰＳＡ 活性依存性状態を調節するために ｉｎ ｖｉｖｏ または ｉｎ ｖｉｔｒｏ でこれらのペプチドを用いる方法で使用できる。さらに、本発明のペプチドは、ＰＳＡ 生化学的単離および精製の方法に使用できる。
【００６４】
本発明のペプチドはまた、ＰＳＡ の ＩＧＦ−ＢＰ−３ に対する活性を増加する。そして、ＰＳＡ の天然基質に対する活性にも作用する。本ペプチドは、前立腺の病理および生理における ＰＳＡ の生物機能の調節に有用であり得る。興味深いことに、この同定されたペプチドのいずれもが酵素活性を阻害しなかった。
【００６５】
ＰＳＡ は、内皮細胞の増殖および侵入を阻害し ［８， １９９９ ＃６２６］、プラスミノーゲンをアンギオスタチンに対応の断片に分解する。このものは内皮細胞の成長および血管形成を阻害する（９）。本ペプチドは、ＰＳＡ に結合し、その合成および天然の基質に対する酵素活性を増加する。このように、本ペプチドはまた、アンギオスタチンをつくり、癌進行に関連の血管成長を阻害する ＰＳＡ の能力を増加する。
【００６６】
高い前立腺特異的発現からして、ＰＳＡ は前立腺癌治療の有望な標的である。Ｄｅｎｍｅａｄｅ ｅｔ ａｌ． は、ＰＳＡ により特異的に解裂されるペプチド基質を開発した （１２）。このペプチドは細胞毒性薬物とコンジュゲートされて、プロドラッグを形成し、これが ＰＳＡ により解裂されたときに活性となる（１３）。同様に、本発明のペプチドを用いて、細胞毒性薬物、遺伝子治療ベクター、造影剤を前立腺癌組織に選択的に運送できる。小さいサイズのペプチドは前立腺組織に効率的に移行できる。特異的標的臓器の内皮へのペプチドの選択的回帰は、ファージ・ディスプレイにより、前に開発されていた （２０）。同じく、本発明の ＰＳＡ 結合ペプチドは、前立腺特異性によって ＰＳＡ産生細胞に特異的に局在化される。
下記の非限定的実施例で本発明をさらに説明する。
【００６７】
実施例１．ＰＳＡ 結合ファージの同定
種々の標的のための新規な結合物質を開発するのに便利な方法は、ランダムペプチドのライブラリーをスクリーニングすることである。ファージ・ディスプレイは、酵素、抗体、受容体を含む種々の標的タンパク質 （２１） のための新規リガンドの選択にとって強力な方法である。ファージ・ディスプレイ・ライブラリーは、抗体によりディスプレイされたものと異なる結合特異性を保持する特異的リガンドを同定する方法を提供する。
【００６８】
ファージ・ディスプレイ・ライブラリー
ｆＵＳＥ ５−ファージにおけるファージ・ディスプレイ・ペプチド・ライブラリーが報告されている （２１）。構造 ＣＸ８Ｃ、ＣＸ１０Ｃ、ＣＸ３ＣＸ３ＣＸ３Ｃ、ＣＸ３ＣＸ４ＣＸ２Ｃ（Ｃ はシステイン、Ｘ は ２０ 天然アミノ酸のいずれか）を用いた。
【００６９】
抗体およびタンパク質
ＭＡｂ ５Ｅ４ の開発は別個に報告される （Ｌｅｉｎｏｎｅｎ、作成中）。ＭＡｂ Ｈ１１７ を Ａｂｂｏｔｔ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ （Ｎｏｒｔｈ Ｃｈｉｃａｇｏ， ＩＬ， ＵＳＡ） から、５Ａ１０ を ＥＧ＆Ｇ−Ｗａｌｌａｃ， Ｔｕｒｋｕ， Ｆｉｎｌａｎｄ から入手した。抗ファージモノクローナル抗体を Ｄｒ． Ｐｅｔｒｉ Ｓａｖｉｒａｎｔａ， Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｔｕｒｋｕ， Ｔｕｒｋｕ， Ｆｉｎｌａｎｄ から贈呈を受けた。ポリクローナル抗 ＧＳＴ 抗体を Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ から入手した。ＰＳＡ をヒト精液から以前の発表 （３） のように精製した。ＨＫ２ を Ｄｒ． Ｊａｎｉｔａ Ｌｏｅｖｇｒｅｎ， Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｔｕｒｋｕ， Ｔｕｒｋｕ， Ｆｉｎｌａｎｄ から贈呈を受けた。プロテイナーゼ、キモトリプシン、カテプシン Ｇ を Ａｔｈｅｎｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ａｔｈｅｎｓ， ＧＡ， ＵＳＡ から入手した。トリプシンを報告 （２２） のように精製した。カリクレインを Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ， ＣＡ， ＵＳＡ から入手した。キモトリプシンおよびカテプシン Ｇ に対する抗体を Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ， ＭＡ， ＵＳＡ から入手した。ヒト血漿カリクレインに対する抗体を Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ， ＣＡ， ＵＳＡ から入手した。トリプシンに対する抗体を報告 （２３） のように調製した。抗−ＡＣＴ および抗−ＡＰＩ 抗体 を Ｄａｋｏ， Ｇｌｏｓｔｒｕｐ， Ｄｅｎｍａｒｋ から入手した。
【００７０】
ファージペプチドの選択
ファージ・ディスプレイ・ペプチド・ライブラリーのスクリーニングを基本的に Ｋｏｉｖｕｎｅｎ ｅｔ ａｌ．（２１） に記載のように行った。簡単にいうと、遊離および複合の両 ＰＳＡ を結合するモノクローナル抗体 ５Ｅ４ で被覆されたミクロタイターウエル上に捕捉された ＰＳＡ でもって、各ファージ・ライブラリーを選択的にスクリーンした（２４）。１０ ｇ／Ｌ ＢＳＡ を含有する ＴＢＳ 緩衝液 （ＢＳＡ−ＴＢＳ） 中の ３３ ｎＭ ＰＳＡ を、ＭＡｂ ５Ｅ４ で被覆されたウエル中で １ 時間インキュベートし、ついでウエルを洗って、非結合の ＰＳＡ を除去した。一定量の各ファージ・ライブラリー （１０１１−１０１２ 感染粒子） をウエルに加え、３ 時間 ２２ ℃ でふるい分け第１ラウンド、１ 時間第２ラウンドインキュベートした。ファージ溶液を取りだし、ウエルを ０．５％ Ｔｗｅｅｎ ２０ 含有の ＴＢＳ で洗った。ふるい分けを ２００ μＭ ＺｎＣｌ２ 存在でも行った。結合ファージを ０．１ Ｍ グリシン緩衝液、ｐＨ ２．２ で溶出し、１ Ｍ Ｔｒｉｓ 塩基で中性とした。溶出ファージを Ｅ． ｃｏｌｉ Ｋ９１ ｋａｎ 細胞の感染により増殖し、ポリエチレングリコールでの沈降により精製した。選択および増殖の３ラウンド後に個々のファージクローン由来の一本鎖 ＤＮＡ を調製し、配列決定をウイルス ＤＮＡ の関連部分の配列決定により行った。配列決定は、ＡＢＩ ３１０ Ｇｅｎｅｔｉｃ ａｎａｌｙｚｅｒ および Ｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｃｏｒｅ Ｋｉｔ （ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ， Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ， ＣＡ， ＵＳＡ） で、プライマーとしてオリゴヌクレオチド５’ ＣＣＣＴＣＡＴＡＧＴＴＡＡＧＣＧＴＡＡＣＧ ３’ を用いて行った。
【００７１】
ＰＳＡ−結合ペプチドを単離するために、ファージタンパク質 ＩＩＩ の Ｎ−末端に １０、１２ または １３ のアミノ酸を含有する環状ジフルフィド拘束ペプチドを発現する４ファージ・ライブラリーをスクリーンした。各ライブラリーから単離されたペプチドは、固定の位置で処理されたシステインに加えて特徴的な共通アミノ酸を含有していた （表 １）。ＣＸ８Ｃ、ＣＸ１０Ｃ、ＣＸ３ＣＸ４ＣＸ２Ｃ ライブラリーから誘導された大部分のペプチド （１２ 中 ９） が Ｘ１ 位にバリンを含有していた。加えるに、フェニルアラニンが ＣＸ８Ｃ および ＣＸ１０Ｃ ライブラリーの Ｘ２ 位にしばしば見られた。ＣＸ３ＣＸ４ＣＸ２Ｃ ライブラリー・ペプチドにおいて、Ｘ３ 位がチロシンに、Ｘ９ 位が Ｖ に優先されていた。ファージ ＩＦＭＡ （データは示さず）および ＧＳＴ−ペプチド ＩＦＭＡ において、ＣＶＡＹＣ （配列番号 ２９） モチーフを含有するクローンが ＰＳＡ に最も強い結合を示した（参照、図１、表１）。
【００７２】
図１は、種々の量の各 ＧＳＴ−ペプチドを、ＭＡｂ ５Ｅ４ により捕捉された ＰＳＡ 含有のウエルに加えた実験の結果を示す。洗浄後、ＧＳＴ−ペプチド結合を ＩＦＭＡ で、トレーサーとして Ｅｕ−標識抗 ＧＳＴ 抗体を用いて定量した。データを２ウエルからの平均値 ± 標準誤差 （ＳＥ） で示す。
【００７３】
チロシン残基が ＣＸ８Ｃ および ＣＸ１０Ｃ ペプチドの Ｘ６ または Ｘ８ 位で、および ＣＸ３ＣＸ４ＣＸ２Ｃ ペプチドの Ｘ８ 位で富んでいた。ふるい分け緩衝液に Ｚｎ２＋ を加えた後、いくつかの ＰＳＡ 結合ペプチドを単離できた （表１、ペプチド Ｚ−１ （配列番号 １５） − Ｚ−１１ （配列番号 ２５））。これらのペプチドの大部分が Ｚｎ２＋ なしで単離されたペプチドとして類似のモチーフを含有していた。
【００７４】
実施例２．ペプチドの特徴解明
選択されたペプチドを含有する ＧＳＴ 融合タンパク質の構築
一本鎖ファージ ＤＮＡ を精製し、挿入領域を、融合 ５ 遺伝子ＩＩＩ配列 （２０） の上流プライマー （５’ＡＧＧＣＴＣＧＡＧＧＡＴＣＣＴＣＧＧ ＣＣＧＡＣＧＧＧＧＣＴ ３’）（配列番号 ２７）および下流プライマー （５’ＡＧＧＴＣＴＡＧＡＡＴＴＣＧＣＣＣＣＡＧＣ ＧＧＣＣＣＣ ３’）（配列番号 ２８） で ＰＣＲ により増幅した。増幅 ＤＮＡ を、選択されたペプチドを ＧＳＴ 融合タンパク質として発現さすために、単離し、ＰＧＥＸ−２ＴＫ ベクター （Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ， Ｈｅｌｓｉｎｋｉ， Ｆｉｎｌａｎｄ） の ＢａｍＨ Ｉ と ＥｃｏＲ Ｉ 部位の間にサブクローンした。組換え体を ＤＮＡ 配列決定により確認した。融合タンパク質を Ｅ． ｃｏｌｉ ＢＬ ２１ 細胞中で発現せしめ、報告（２５）のようにグルタチオン・アフィニティークロマトグラフィー （Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ） で精製した。融合タンパク質の精度を、ＰｈａｓｔＳｙｓｔｅｍ （Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ） 上の １２．５％ 均質ゲルにおける ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分析した。その ＰＳＡ に対する結合能を免疫蛍光検定法 （ＩＦＭＡ）（下記参照）で測定した。
【００７５】
トロンビン解裂により ＧＳＴ 融合パートナーからペプチドが放出された。２０ 単位のトロンビン （Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ） を、１ ｍｇ ＧＳＴ−Ｃ−４ とともに ＰＢＳ 緩衝液中で ２２ ℃で １２ 時間インキュベートした。解裂された無傷の ＧＳＴ−Ｃ−４ 融合タンパク質を Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ ＨＲ １０／３０ カラムでのゲルろ過により分析した。これは、５０ ｍＭ リン酸ナトリウムを用い、ｐＨ ７．４ で、１５０ ｍＭ ＮａＣｌ を含有し流速 ３０ ｍｌ／ｈ であった。吸収を ２８０ ｎｍ でモニターし、タンパク質含有フラクションの ０．５ ｍｌ 量を集め、下記のように ＧＳＴ−ペプチド ＩＦＭＡ で分析した。
【００７６】
免疫蛍光検定法 （ＩＦＭＡ）
ＩＦＭＡ に用いられる固相抗体をミクロタイターウエルに、濃度 ５ μｇ／ｍＬ で ＴＢＳ 中で １６ 時間 ２２ ℃で被覆した。溶液を除去し、ウエルを １０ ｇ／Ｌ ウシ血清アルブミン ＴＢＳ 液で ３ 時間 ２２ ℃で飽和した。トレーサーとして使用される抗体を、発表 （２６） されているように Ｅｕ３＋ キレートで標識した。検定緩衝液は ５０ ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ、ｐＨ ７．７、１５０ ｍＭ ＮａＣｌ、３３．３ μＭ ウシ血清アルブミン、１ μＭ ウシグロブリンである。
【００７７】
個々のファージクローンの ＰＳＡ との結合を ＩＦＭＡ （ファージ ＩＦＭＡ） で試験した。ファージ ＩＦＭＡ において、約 ３０ ｎｇ の ＰＳＡ を ＭＡｂ ５Ｅ４ 被覆ウエルに １ 時間で加えた。洗った後 （緩衝液： １５０ ｍＭ ＮａＣｌ、７．７ ｍＭ ＮａＮ３、０．２ ｇ／Ｌ Ｔｗｅｅｎ ２０）、１５ μＬ のファージおよび ２００ μｌ の検定緩衝液を加えた。１ 時間のインキュベーション後、ウエルを洗って、ファージの Ｍ１３ 被覆タンパク質を認識する ５０ ｎｇ ユウロピウム標識抗ファージモノクローナル抗体を含有する ２００ μｌ の検定緩衝液で満たした。６０ 分間インキュベーション後、ウエルを ４ 回洗い、エンハンスメント溶液 （ＥＧ＆Ｇ−Ｗａｌｌａｃ） を加えた。蛍光を １２３４ ＤＥＬＦＩＡ Ｒｅｓｅａｒｃｈ 蛍光計 （ＥＧ＆Ｇ−Ｗａｌｌａｃ） で定量した。
【００７８】
ＧＳＴ−ペプチドの ＰＳＡ との結合を、ファージペプチドの場合と類似の ＩＦＭＡ （ＧＳＴ−ペプチド ＩＦＭＡ） で測定した。ただし、ＧＳＴ に対する Ｅｕ３＋−標識抗体を使用した。種々の量の ＧＳＴ−ペプチドまたは野生型 ＧＳＴ を、２００ μＬ の検定緩衝液中の捕捉 ＰＳＡ を含有するウエルに加え、１ 時間インキュベートした。ＧＳＴ−ペプチドと ＰＳＡ との結合に対する Ｚｎ２＋ の作用を試験するために、種々の濃度の Ｚｎ２＋ （１−２００ μＭ） を緩衝液に ＧＳＴ−ペプチド および ＰＳＡ のインキュベーション工程で加えた。競合試験において、ＧＳＴ−ペプチド （１６７ ｎＭ） または野生型 ＧＳＴ をまず増加量の ＰＳＡ （０−３３３ ｎＭ） とともに ０．５％ ＢＳＡ−ＴＢＳ 緩衝液中で ６０ 分間インキュベートし、ついで ＭＡｂ ５Ｅ４ に捕捉された ＰＳＡ を含有するウエルに加えた。１ 時間インキュベーション後、ウエルを洗浄し、Ｅｕ３＋−標識抗 ＧＳＴ 抗体を加えた。さらにインキュベーションと洗浄を行った後、結合の蛍光を上記のように測定した。キモトリプシン、カテプシン Ｇ、トリプシン、カリクレインなどの他のプロテイナーゼとの ＧＳＴ−ペプチドの結合を検査するときに、これらのプロテイナーゼをミクロタイターウエルに被覆されたその特異的抗体により捕捉した。組換え ｈＫ２ が、ｈＫ２ との結合が知られている ＭＡｂ ５Ｅ４ （２４） により捕捉した。ＰＳＡ−ＡＣＴ および ＰＳＡ−α１−プロテアーゼ阻害剤 （ＰＳＡ−ＡＰＩ）（２８） を含む ＰＳＡ 複合体と ＧＳＴ−ペプチドとの結合を調べるために、各々 ＡＣＴ および ＡＰＩ に対する抗体により捕捉した。種々のプロテイナーゼまたは ＰＳＡ 複合体を捕捉後、ＧＳＴ−ペプチド を加え、ＧＳＴ−ペプチド ＩＦＭＡ について上記のようにモニターした。
【００７９】
表面プラスモン共鳴
選択されたペプチドの ＰＳＡ に対する結合速度を、ＢＩＡｃｏｒｅ ２０００（登録商標） 機器 （Ｂｉａｃｏｒｅ ＡＢ， Ｕｐｐｓａｌａ， Ｓｗｅｄｅｎ） で ＰＳＡ 上の表面プラスモン共鳴 （２９） で調べた。ＰＳＡ を固相に、ＭＡｂ ５Ｅ４ （３０） と同じエピトープに結合する ＭＡｂ Ｈ１１７ により捕捉した。捕捉抗体は、５０００ 共鳴単位 （ＲＵ） のカップリングレベルを用いて、製造業者の指示にしたがい ＣＭ５ センサーチップに共有結合でカップリングせしめた。ＰＳＡ を ＰＢＳ 中 ４１６ ｎＭ の ＰＳＡ の注入、４ 分間の接触時間 （５ μｌ／分）、６０ 分間の洗浄 （２０ μｌ／分） で捕捉すると、５００−６００ ＲＵ 範囲のリガンドレベルを得た。各分析物 （ＧＳＴ−ペプチド） を種々の濃度で、１ 分間 ２０ μｌ／分の流速で注入した。Ｚｎ２＋ のペプチド・アフィニティーに対する作用を特徴解明するために、センサーグラムを一定量のペプチドについて Ｚｎ２＋ の存在下、流動およびサンプル緩衝液 （０−３０ μＭ） の両方において記録した。ＰＳＡ−結合を化学的に活性化／非活性化ブランク表面または ＭＡｂ Ｈ１１７ 単独を非特異的相互作用として差し引いた。各測定後の再製を １０ ｍＭ ＨＣｌ の ３ ｘ ０．５ 分間注入により行った。結合データを ＢＩＡＥＶＡＬＵＡＴＩＯＮ ソフトウエアーで分析した。
【００８０】
ＧＳＴ 融合タンパク質から解裂されたペプチドの活性を競合試験で調べた。ゲルろ過による消化融合タンパク質のフラクション化後、ＭＡｂ ５Ｅ４ により捕捉された ＰＳＡ 含有のウエル中で ６０ 分間インキュベートした。ウエルを空にした後、ＧＳＴ−ペプチド （１６７ ｎＭ） を加え、１ 時間インキュベートした。ＧＳＴ−ペプチドと ＰＳＡ との結合に対する解裂ペプチドの作用を ＧＳＴ−ペプチド ＩＦＭＡ によりモニターした。
【００８１】
ＰＳＡ 上のペプチド結合部位の特徴解明のために、ＰＳＡ 上の種々のエピトープを認識するモノクローナル抗 ＰＳＡ 抗体を用いた （３０）。各 ＭＡｂ （３３ ｎＭ） を、ＭＡｂ ５Ｅ４ に捕捉された ＰＳＡ 含有のウエルでインキュベートした。洗浄後、１６７ ｎＭ ＧＳＴ−ペプチドを加え、結合を上記のように ＧＳＴ−ペプチド ＩＦＭＡ でモニターした。
【００８２】
種々の形態の遊離 ＰＳＡ でのペプチドの再活性
プロ ＰＳＡ および無傷 ＰＳＡ での ＧＳＴ−ペプチドの再活性化を、活性 ＰＳＡ （３） およびプロ ＰＳＡ （３１） を用いて比較した。１００ ｎｇ のプロ ＰＳＡ または無傷 ＰＳＡ をミクロタイターウエル上に被覆された ＭＡｂ ５Ｅ４ と反応せしめた。洗浄後、１ μｇ の各 ＧＳＴ−ペプチドを、固定 ＰＳＡ 含有のウエルに加えた。ＧＳＴ−ペプチドの結合を、トレーサーとして Ｅｕ−標識抗−ＧＳＴ 抗体を用いる ＩＦＭＡ で定量した。
【００８３】
合成ペプチドの ＰＳＡ との結合
ペプチド Ａ１ および Ｃ４ を、ｆｍｏｃ−化学を用いる標準的固相 Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ ペプチド合成により合成した。ＰＳＡ との結合についてペプチドを、合成ペプチドが対応の ＧＳＴ ペプチドと ＰＳＡ との結合を阻害する能力を調べることにより、検定した。合成ペプチド （０ − ３３３ ｎＭ） および対応の ＧＳＴ ペプチド （１６７ ｎＭ） を、ＭＡｂ ５Ｅ４ により捕捉された ＰＳＡ とともに １ 時間インキュベートした。その後、ウエルを洗い、Ｅｕ３＋−標識抗 ＧＳＴ 抗体を加えた。さらにインキュベーションおよび洗浄を行った後、結合蛍光を上記のように測定した。
【００８４】
ＧＳＴ 融合タンパク質を ４ ペプチドから構築した。これらのペプチドはファージ ＩＦＭＡ で最も強い結合を表す。うち、配列 ＣＶＡＹＣＩＥＨＨＣＷＴＣ を有するペプチド Ｃ−４ （配列番号 １１） が ＧＳＴ−ペプチド （図１、表２） として、およびファージ上で発現されたときに （データは示さず）、ＰＳＡ に対する最強の結合を示した。
【００８５】
【表２】
2004509976.tif 000003
表２．ＧＳＴ−タンパク質の ＰＳＡ との結合についての速度およびアフィニティー
ＧＳＴ−タンパク質の ＰＳＡ との結合速度定数 （ｋａ）、解離速度定数 （ｋｄ）、平衡解離定数 （ＫＤ） を表面プラスモン共鳴で測定した。示す値は、３ 相違濃度の分析物（ＧＳＴ−ペプチド）の平均 ｋａ、ｋｄ、ＫＤ である。
＊ＧＳＴ−ペプチド ＩＦＭＡ からのデータ。実験手法は図１の説明に記載。
＃ＰＳＡ の酵素活性の半最大促進に必要なペプチド濃度。実験手法は図６の説明に記載。
【００８６】
別の ２ 選択ペプチド、Ｂ−２ （配列番号 ６） （ＣＶＦＡＨＮＹＤＹＬＶＣ） および Ａ−１ （配列番号 １） （ＣＶＦＴＳＤＹＡＦＣ） は ＰＳＡ に結合したが、効率が Ｃ−４ （配列番号 １１） より低い。ＰＳＡ との結合が知られているカチオン Ｚｎ２＋ が検定緩衝液に含まれるとき、ペプチドの結合活性が増加した。Ｚｎ２＋ は用量依存性作用を有し、結合応答における最大増加を濃度 ２００ μＭ で認めた （図 ２）。試験結果を図２に示す。各 ＧＳＴ−ペプチドを ＰＳＡ−含有ウエルで種々の濃度の Ｚｎ２＋ の存在下でインキュベートした。ＧＳＴ−ペプチドの結合を ＩＦＭＡ で定量した。対照は Ｚｎ２＋ 不存在での ＧＳＴ−ペプチドの結合を示す。データは２ウエルの平均 ± ＳＥ である。しかし、有効 Ｚｎ２＋ 濃度は、緩衝液中の ＢＳＡ が Ｚｎ２＋ についていくつもの結合部位を含有しているので、より低い。ＧＳＴ 融合タンパク質としてつくられた第４ペプチド、Ｄ−１ （配列番号 １３）（ＣＬＳＴＣＡＱＳＣＲＩＳＣ） は、ＰＳＡ に結合の対応ファージを介しても ＰＳＡ との有意の結合を示さなかった（データは示さず）。野生型 ＧＳＴ は、融合タンパク質の結合が挿入ペプチドにより仲介されたことを確認する ＰＳＡ と結合しなかった。
【００８７】
ＰＳＡ−結合ペプチドの特徴解明をさらに行った。ペプチドの固定 ＰＳＡ との結合を ５０％ 低下するのに要する ＰＳＡ 濃度（ＩＣ５０） を検定した。これに関連して、図３についても述べる。ＧＳＴ−Ｃ−４ を増加濃度の ＰＳＡ 液と １ 時間、予備インキュベートした。ついで、混合物のサンプルを、ＰＳＡ が抗 ＰＳＡ ＭＡｂ により捕捉されているウエルに加えた。結合を ＩＦＭＡ で測定した。データは２ウエルの平均 ± ＳＥ である。ペプチド Ａ−１ （配列番号 １） および Ｂ−２ （配列番号 ６） の対応値は夫々 ３．３ ｎＭ および １ ｎＭ である（データは示さず）。過剰の遊離 ＰＳＡ との ＧＳＴ−ペプチドの予備インキュベーションは固相 ＰＳＡ との結合を阻害した。ペプチド Ｃ−４ （配列番号 １１） の捕捉 ＰＳＡ との結合が ＰＳＡ 濃度 ０．７ ｎＭ で ５０ ％ 低下した。この結果は、選択されたペプチドが ＭＡｂ ５Ｅ４ により捕捉された ＰＳＡ のみでなく、溶液中の遊離 ＰＳＡ にも結合することを確認した。
【００８８】
ペプチドの特異性を、抗体によりミクロタイターウエルに捕捉された種々のプロテイナーゼおよび ＰＳＡ 複合体とペプチドの反応によって調べた。ＰＳＡ、カリクレイン、カテプシン Ｇ、キモトリプシン、トリプシン−２、組換え ｈＫ２ を、各プロテイナーゼに対する抗体で被覆されたウエル上に捕捉した。ＧＳＴ−ペプチド結合を ＩＦＭＡ により測定した。得た結果を図４ａに示す。試験したプロテイナーゼのいずれも ＧＳＴ−ペプチドの有意の結合を示さなかった。ＰＳＡ、ＰＳＡ−ＡＣＴ、ＰＳＡ−ＡＰＩを、夫々 ＰＳＡ、ＡＣＴ、ＡＰＩ に対する抗体で被覆したウエル上に捕捉した。ＧＳＴ−ペプチドの ＰＳＡ 複合体との結合を ＩＦＭＡ により測定した。得た結果を図４ｂに示す。ペプチドは、夫々 ＡＣＴ および ＡＰＩ に対する抗体により捕捉された ＰＳＡ−ＡＣＴ および ＰＳＡ−ＡＰＩ と結合しなかった。
【００８９】
ペプチドの ＰＳＡ との結合速度およびアフィニティーを表面プラスモン共鳴により調べた。増加濃度の ＧＳＴ−ペプチドを、ＭＡｂ Ｈ１１７ により捕捉された ＰＳＡ 上に注入した。バックグラウンド補正センサーグラムを ＧＳＴ−ペプチドと ＰＳＡ との単一部位相互作用に、相違する ３ ＧＳＴ−ペプチド濃度および速度式で合わせた：
ｄ（ＧＳＴ−ペプチド：ＰＳＡ）／ｄｔ ＝ ｋａ（ＧＳＴ−ペプチド） ｘ （ＰＳＡ） − ｋｄ（ＧＳＴ−ペプチド：ＰＳＡ）
【００９０】
ペプチド Ａ−１、Ｂ−２、Ｃ−４ の平均平衡解離定数 （ＫＤ） は、２．９ − ７．８ μＭ であった（表２）。Ｚｎ２＋ は濃度 １−３０ μＭ で結合および解離の両速度を低下した。アフィニティーは ３−７ 倍増加した。ｋｄ が ｋａ よりも大きく減少したからである（表３）。捕捉 ＭＡｂ からの ＰＳＡ の遅い解離はベースラインの低下をもたらし、結合定数をベースラインにつき補正した。ゲルろ過において、ＧＳＴ−Ｃ−４ は ４ ピークを示した （表４、図５）。
【００９１】
【表３】
2004509976.tif 000004
表３．ＧＳＴ−ペプチドの ＰＳＡ との結合についての結合速度およびアフィニティーに対する Ｚｎ２＋ の作用
ＧＳＴ−タンパク質の ＰＳＡ との結合速度定数 （ｋａ）、解離速度定数 （ｋｄ）、平衡解離定数 （ＫＤ） を表面プラスモン共鳴で測定した。
†検定は濃度 ３．４ − ８．５μＭ での ３ 単一点の平均に基づく。値に標準偏差を入れる。
＊検定は表示の Ｚｎ２＋ の濃度 ３．４ μＭ での単一点に基づく。値に標準誤差を入れる。
【００９２】
【表４】
2004509976.tif 000005
表４．異なる分子サイズ形態の ＧＳＴ−Ｃ−４ 活性の比較
ゲルろ過において、ＧＳＴ−Ｃ−４ およびトロンビン解裂 ＧＳＴ−Ｃ−４ が夫々 ４ および ２ のピークを表した。各ピークでのタンパク質 ％ を ２８０ ｎｍ の吸収で調べた。結合活性を ＧＳＴ−ペプチド ＩＦＭＡ 法から計算した。
＊トロンビン処置後に残る結合活性を意味する。
【００９３】
ＧＳＴ−Ｃ−４ またはトロンビン処置 ＧＳＴ−Ｃ−４ のフラクション化後、５ μｌ の各フラクションを、ＭＡｂ ５Ｅ４ により捕捉された ＰＳＡ を含有するウエル中で最初にインキュベートした。結合を ＧＳＴ−ペプチド ＩＦＭＡ で測定した。矢印は分子サイズ標準物の溶出 （６６９ ｋＤ、１５０ ｋＤ、４３ ｋＤ、１．３ ｋＤ）を示す。
【００９４】
ピークの分子サイズは ＞ ５００ ｋＤ、１００ ｋＤ、３０ ｋＤ、約 ３ ｋＤ であった。３ ｋＤ ピークを除きこれらすべてが ＰＳＡ に結合した（表４、図５）。このことから、融合タンパク質が ３０ ｋＤ モノマー、オリゴマー （約 １００ ｋＤ） およびポリマーとして存在している。ポリマー融合タンパク質が ＰＳＡ に最も強い結合を示し、タンパク質吸収に関して ２８０ ｎｍ での応答である。ＧＳＴ−Ｃ−４ のトロンビン処置が ３０ ｋＤ および ３ ｋＤ 成分へのほとんど完全な解離を起こした。後者は ＧＳＴ 融合タンパク質からトロンビンにより解離された測定 ３１−残基長のペプチドよりなっていた。３０ ｋＤ 成分は、非解離 ＧＳＴ−Ｃ−４ に比して ＧＳＴ−ペプチド ＩＦＭＡ における応答がわずか約 ５％ であった（表４）。
【００９５】
阻害試験において、３ ｋＤ ピークが ＧＳＴ−ペプチド の ＰＳＡ との結合を約 ３０％ 低下した（図５）。これはトロンビン解離ペプチドが ＰＳＡ 結合活性を保持することを表す。クロス記号 （ｘ） は、ペプチド解離型 ＧＳＴ−ペプチドにより誘導された ＧＳＴ−ペプチド の結合阻害を示す。遊離ペプチドを含有する各フラクション ２００ μｌ を、ＭＡｂ ５Ｅ４ により捕捉された ＰＳＡ を含有するウエルで最初にインキュベートした。１ 時間後、ウエルを空にし、ＧＳＴ−Ｃ−４ （１６７ ｎＭ） を加えた。１ 時間インキュベーション後、ＧＳＴ−ペプチドの結合を ＧＳＴ−ペプチド ＩＦＭＡ により測定した。データを ２ ウエルの平均値で示す。
【００９６】
ペプチドの ＰＳＡ に対する結合部位を決定するために、阻害実験を ＰＳＡ 上の種々のエピトープとの ＭＡｂ 結合で行った。複合された ＰＳＡ 中においてセリンプロテイナーゼ阻害剤によりカバーされるエピトープ領域との抗体結合 （いわゆる遊離−特異的抗体） がペプチドの結合を最も強く阻害した （＞８０％）。ＰＳＡ の活性部位から離れたエピトープとの ＭＡｂ 結合が低程度の阻害を示した （表５）。
【００９７】
【表５】
2004509976.tif 000006
表５．抗 ＰＳＡ ＭＡｂ による ＧＳＴ−ペプチドの ＰＳＡ との結合の阻害
ＰＳＡ 上の ４ エピトープ基を表す ＰＳＡ ＭＡｂ を用いて、ＰＳＡ との結合について ＧＳＴ−ペプチドと競合せしめた。ＭＡｂ ５Ｅ４ が属する群６からの抗体を陰性対照として使用した。各 ＭＡｂ （３３．３ ｎＭ） をマイクロタイターウエル上に被覆の ５Ｅ４ に捕捉された ＰＳＡ とともにインキュベートした。洗浄後、ＧＳＴ−ペプチドを加えた。ＧＳＴ−ペプチドの結合を ＩＦＭＡ で定量した。
ＧＳＴ−ペプチドの固相 ＰＳＡ との結合の低下（％）
＋＋ ＝ ＞ ８０ ％
＋ ＝ ６０−８０ ％
− ＝ 阻害なし
【００９８】
ＧＳＴ ペプチドは、活性 ＰＳＡ に比して有意に低いプロ ＰＳＡ との結合を示した。実験において、１００ ｎｇ のプロ ＰＳＡ または無傷の ＰＳＡ が、ミクロタイターウエル上に被覆された ＭＡｂ ５Ｅ４ と反応した。洗浄後、１ μｇ の各 ＧＳＴ−ペプチド（Ａ−１ （配列番号 １）、Ｂ−２ （配列番号 ６）、Ｃ−４ （配列番号 １１）、表１） を、固定 ＰＳＡ を含有するウエルに加えた。ＧＳＴ−ペプチドの結合を、トレーサーとして Ｅｕ−標識抗−ＧＳＴ 抗体を用いる ＩＦＭＡ により定量した。
【００９９】
プロ ＰＳＡ との反応性は活性 ＰＳＡ の ３０ − ６０ ％ であった （図６）。いずれかの型の ＰＳＡ に優先的に結合する能力について ８０ ＭＡｂ を調べた後に、プロ ＰＳＡ または無傷の ＰＳＡ を優先的に認識する ＭＡｂ は見つからなかった。従って、ペプチドは ＰＳＡ についての新規の結合特異性を提供できる。
【０１００】
標準的固相 Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ ペプチド合成法により化学的に合成されたペプチドは、ＧＳＴ ペプチドの ＰＳＡ との結合を効率的に阻害する（図７）。このことは、このペプチドが ＧＳＴ−ペプチドと同様に ＰＳＡ と結合することを示す。化学的合成のペプチド Ｃ−４ （配列番号 １１） （ＧＡＣＶＡＹＣＩＥＨＨＣＷＴＣＧＡ） は、２０ 倍のモル過剰で対応の ＧＳＴ−ペプチドの ＰＳＡ との結合を約 ７０ ％ 阻害した。ペプチドの Ｎ−および Ｃ−末端にフランキング ＧＡ−モチーフ を欠く Ｃ−４ の短い誘導体は、ＧＳＴ−ペプチドの ＰＳＡ との結合を効率的に阻害した（図７）。ＰＳＡ を抗−ＰＳＡ ＭＡｂ によりミクロタイターウエル中で捕捉した。結合を ＩＦＭＡ で測定した。
【０１０１】
実施例３．ＰＳＡ の酵素活性に対するペプチドの作用
ＰＳＡ の酵素活性を、ペプチドのみの存在または Ｚｎ２＋ とともに、キモトリプシン基質 Ｓ−２５８６ （ＭｅＯ−Ｓｕｃ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−ｐＮＡ） （Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｘ， Ｍｏｅｌｎｄａｌ， Ｓｗｅｄｅｎ）を用いて調べた。さらに、酵素活性を、標準的固相 Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ ペプチド合成法により合成されたペプチドの存在で、ビオチン−コンジュゲート型のペプチドを含む ｆｍｏｃ−化学を用いて調べた。ＰＳＡ （３３３ ｎＭ） を １−１００ 倍モル過剰の ＧＳＴ−ペプチドまたは １００ 倍過剰の合成ペプチドとともに、０．５ ｇ／Ｌ ＢＳＡ を含有する ｐＨ ７．８ の ＴＢＳ 緩衝液中 １ 時間２２℃ でインキュベートした。ＰＳＡ の酵素活性に対する Ｚｎ２＋ の作用を、１−２００ μＭ の ＺｎＣｌ２ を反応緩衝液に含めて調べた。ＰＳＡ の酵素活性に対するペプチドと Ｚｎ２＋ との組合せ作用を、ＰＳＡ （３３３ ｎＭ） をペプチド （３３３ ｎＭ） とともに １−２００ μＭ Ｚｎ２＋ 含有の緩衝液中で １ 時間インキュベートした。基質を最終濃度 ０．２ ｍＭ まで加えた後、吸収を ５ 分間隔で ２ 時間、４０５ ｎｍ で Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ ＭＣＣ／３４０ 光度計 （Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ， Ｈｅｌｓｉｎｋｉ， Ｆｉｎｌａｎｄ） によりモニターした。対照として、ＰＳＡ の酵素活性に対する野生型 ＧＳＴ の作用を調べた。
【０１０２】
キモトリプシン、カテプシン Ｇ、トリプシンの酵素活性に対するペプチドの作用を上記のように ＰＳＡ について調べた。基質として、Ｓ−２５８６ をキモトリプシンおよびカテプシン Ｇ に、Ｓ−２２２２ （ＣＯ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−（ＯＲ）−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ｐＮＡ） （Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｘ） をトリプシンに用いた。
【０１０３】
高分子量タンパク質基質についての酵素活性に対するペプチドの作用を、ＰＳＡ がインスリン様成長因子−結合タンパク質 ３ （ＩＧＦ−ＢＰ−３） （３２） を単独でまたは合成ペプチド Ｃ−４ および Ａ１ の存在下でタンパク分解的に解裂するのを用いて、調べた。基質の解裂程度を、タンパク分解的解裂による ＩＧＦ−ＢＰ−３ 免疫反応性をモニターして定量した。ＰＳＡ （５ μｇ／ｍＬ） を ＩＧＦ−ＢＰ−３ （７０ ｎｇ／ｍＬ） とともに、１６ 時間 ３７ ℃ で、ＰＳＡ に対して １００ 倍モル過剰のペプチドでインキュベートし、発表 （３３） のように、ＩＧＦ−ＢＰ３ 免疫反応性を ＩＦＭＡ で測定した。対照として、ペプチドを ＰＳＡ および ＩＧＦ−ＢＰ３ 含有の反応混合物に、免疫検定法の開始直前に加え、ＩＧＦ−ＢＰ−３ について ＩＦＭＡ でのペプチドの可能な干渉を定量した。
【０１０４】
α−２−マクログロブリン （Ａ２Ｍ） との複合体中の ＰＳＡ の酵素活性に対する化学的合成ペプチド Ｃ−４ の作用を、発表 （７） のように調製した精製 ＰＳＡ−Ａ２Ｍ 複合体を用いて分析した。Ａ２Ｍ との複合体中 １ μｇ の ＰＳＡ を、単独でまたは標準的固相 Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ 合成法により合成された ２．５ μｇ の ペプチド Ｃ４ （配列番号 １１）（ＧＡＣＶＡＹＣＩＥＨＨＣＷＴＣＧＡ） とともに、１ 時間 ２２ ℃ で、１ ｇ／Ｌ の ＢＳＡ を含有する １００ μＬ の ＴＢＳ 緩衝液中でインキュベートした。１０ μｇ のモノクローナル 抗体 ４Ｇ１０ を含めて、複合体から放出される ＰＳＡ による活性を阻害した。対照として、１ μｇ の 遊離 ＰＳＡ の酵素活性を測定した。酵素活性は、上記のように基質として Ｓ−２５８６ （Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｘ） を用いてモニターした。
【０１０５】
ＰＳＡ 酵素活性が ＧＳＴ−ペプチドにより有意に高められた。ＧＳＴ−Ｃ−４ が最も活性であり、色素基質に対する ＰＳＡ 活性を約 ５ 倍強くした（図８）。この実験において、ＰＳＡ （０．３３ μＭ） を増加濃度の ＧＳＴ−Ｃ−４ （０−１００ 倍モル過剰） とともに、色素基質 Ｓ−２５８６ を加えた後 １ 時間インキュベートし、吸収を ４０５ ｎｍ で測定して酵素活性をモニターした。データを ２ ウエルからの平均 ± ＳＥ で表す。
【０１０６】
作用は ＧＳＴ−ペプチド濃度に依存性であり、半最大促進をマイクロモル範囲の濃度で検出した（表２）。活性に影響する最小ペプチド濃度は、Ｃ−４ について ２０ ｎＭ であり、Ａ−１ および Ｂ−２ について ３００ ｎＭ であった。野生型 ＧＳＴ は ＰＳＡ の活性に影響を及ぼさなかった（データは示さず）。このペプチドは、キモトリプシン、カテプシン Ｇ、トリプシンを含む試験した他のプロテイナーゼの酵素活性に影響を及ぼさなかった（データは示さず）。標準的ペプチド合成法により調製されたペプチドは、同様に酵素活性を高めた（図９）。さらに、ビオチンコンジュゲートペプチド Ｃ−４ も非コンジュゲート型の Ｃ−４ と同様に酵素活性を高めた（図９）。図９において、試験した Ｃ−４ の誘導体には、Ｎ−および Ｃ−末端に ＧＡ−フランキング残基を有しまたは有さないペプチドおよびビオチンコンジュゲート形態の Ｃ−４ がある。ＰＳＡ （０．３３ μＭ） を化学的合成のペプチド （１００ 倍モル過剰） とともに、色素基質 Ｓ−２５８６ を加えた後 １ 時間インキュベートし、吸収を ４０５ ｎｍ で測定して酵素活性をモニターした。
【０１０７】
高分子量タンパク質基質についての酵素活性に対するペプチドの作用を、ＰＳＡ がインスリン様成長因子−結合タンパク質 ３ （ＩＧＦ−ＢＰ−３） を単独でまたは合成ペプチド Ｃ−４ （配列番号 １１） および Ａ−１ （配列番号 １） の存在下でタンパク分解的に解裂する能力を用いて調べた。この実験において、ＰＳＡ （５ μｇ／ｍＬ） の ＴＢＳ 緩衝液、ｐＨ ７．８ 単独で、または １００ 倍モル過剰のペプチドとともに、ＩＧＦ−ＢＰ−３ （７０ ｎｇ／ｍＬ） とともに １６ 時間 ３７ ℃ でインキュベートし、無傷 ＩＧＦ−ＢＰ−３ の濃度を ＩＦＭＡ で測定した。対照として、ペプチドを ＰＳＡ および ＩＧＦ−ＢＰ３ 含有の反応混合物に、免疫検定法の開始直前に加え、ＩＧＦ−ＢＰ−３ （ＢＰ−３＋ＰＳＡ＋（Ｃ−４／Ａ−１）として ０ 時間標識）について ＩＦＭＡ でのペプチドの可能な干渉を定量した。ＰＳＡ 単独が徐々に ＩＧＦ−ＢＰ−３ を解裂し、免疫反応性が ３０ ％ 低下した （図１０）。ペプチド Ｃ−４ および Ａ−１ は、ＩＧＦ−ＢＰ−３ についての ＰＳＡ の活性を高め、ＩＧＦ−ＢＰ−３ を約 ７０ ％ 解裂した。
【０１０８】
亜鉛が ＰＳＡ の酵素活性を阻害することが知られているので、ペプチドと Ｚｎ２＋ の組合せ作用を検査して、ＰＳＡ の酵素活性に対する ＧＳＴ−ペプチドの作用の解明を行った。Ｚｎ２＋ は、Ｃ−４ の増加作用を無効にし、用量依存的に ＰＳＡ 活性を低下した。ＧＳＴ−Ｃ−４ と Ｚｎ２＋ の酵素活性に対する作用を、ＰＳＡ （０．３３ μＭ） を同じモル濃度の ＧＳＴ−Ｃ−４ および種々の濃度の Ｚｎ２＋ とともにインキュベートして調べた。色素基質 Ｓ−２５８６ の添加後、吸収を ４０５ ｎｍ で測定して反応をモニターした。対照は、ペプチドおよび Ｚｎ２＋ の不存在での ＰＳＡ 活性である。データを ２ ウエルの平均 ± ＳＥ で示す。Ｚｎ２＋ 濃度 ７５ μＭ で、その活性が亜鉛およびペプチドの不存在での ＰＳＡ 活性と類似であり、濃度 ２００ μＭ で酵素活性のほとんどすべての阻害を認めた（図１１）。
【０１０９】
複合体での ＰＳＡ の酵素活性に対する化学的合成ペプチド Ｃ−４ の作用を、精製された ＰＳＡ−Ａ２Ｍ 複合体を用いて分析した。他のプロテイナーゼが Ａ２Ｍ と結合後になお小分子量の基質を解裂し得ることが明らかにされている（３４）。１ μｇ の ＰＳＡ の Ａ２Ｍ との複合体を、単独でまたは ５０ 倍モル過剰の化学的合成ペプチド Ｃ−４ （表１） とともに、 １ 時間 ２２ ℃ で、１ ｇ／Ｌ の ＢＳＡ を含有する １００ μＬ の ＴＢＳ 緩衝液中でインキュベートした。１０ μｇ のモノクローナル抗体 ４Ｇ１０ を含み、複合体から放出された ＰＳＡ による活性を阻害した。対照として、１ μｇ の 遊離 ＰＳＡ の酵素活性を測定した。光学濃度を ４０５ ｎｍ で、基質として ０．２ ｍＭ Ｓ−２５８６ （ＭｅＯ−Ｓｕｃ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−ｐＮＡ） （Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｘ， Ｍｏｅｌｎｄａｌ， Ｓｗｅｄｅｎ） で測定して、酵素活性をモニターした。Ａ２Ｍ との複合体中の ＰＳＡ 酵素活性は、遊離 ＰＳＡ に比して約 ４ 倍低下したが、有意の活性をなお検出できた（図１２）。すなわち、Ａ２Ｍ との複合体中の ＰＳＡ 活性部位は遮断されない。複合体から放出される ＰＳＡ から活性が誘導され得るとの可能性を、遊離 ＰＳＡ の活性を完全に阻害する ＭＡｂ を含めることにより排除した（図１２）。Ｃ−４ ペプチドを加えた後、Ａ２Ｍ−複合 ＰＳＡ の酵素活性が約 ２ 倍高められたことは、このペプチドが、阻害剤により閉じ込められた ＰＳＡ と結合することができ、遊離 ＰＳＡ に対するのと同じ作用を Ａ２Ｍ−複合 ＰＳＡ に対して発揮することを表す（図１２）。
【０１１０】
本発明は最初に、ＰＳＡ の酵素活性を特異的に高め得る ＰＳＡ 結合リガンドを提供する。いくつかの ＰＳＡ−結合ペプチドの同定を、ランダムファージ−ディスプレイペプチド・ライブラリーを用いて、モノクローナル抗体を介する結合 ＰＳＡ でスクリーニングすることにより行った。ＰＳＡ を最初にミクロタイターウエルに被覆したとき、ＰＳＡ−結合ファージを単離できなかった。しかし、ＰＳＡ をモノクローナル固相抗体に捕捉することにより、特異的 ＰＳＡ 結合ファージを単離できた。ＰＳＡ の捕捉に用いたモノクローナル抗体は、ＰＳＡ の活性部位を遮断せず（２７）、ＰＳＡ−結合ファージの単離を容易にする。明らかに、プラスチック上への ＰＳＡ の直接被覆がその構造を変え、バイオパニングにとって好ましくない方向に進める。
【０１１１】
いくつかの典型的なアミノ酸残基を、選択したペプチドペプチドの大部分で同定できた。アミノ酸配列 ＣＶＦ または ＣＶＡ を退行 ＣＸ８Ｃ、ＣＸ１０Ｃ、ＣＸ３ＣＸ４ＣＸ２Ｃ ライブラリーから誘導された １２ ペプチドのうち ５ で、チロシンを １４ ペプチドのうち １２ で認めた。高いアフィニティーをもつペプチドは ４ システインを含有していた。このペプチドを発現し、ＧＳＴ 融合タンパク質として特徴を解明した。このタンパク質は結合アフィニティーおよび特異性についての研究を容易にする。融合タンパク質として発現されたとき、ペプチドはその結合活性を保持し、ＩＦＭＡ で測られる相対的アフィニティーはファージおよび融合タンパク質で類似であった。表面プラスモン共鳴実験によると、ペプチドが ＰＳＡ にかなりのアフィニティーをもって結合していた （表２）。
【０１１２】
ＰＳＡ が Ｚｎ２＋ を結合することが知られ、選択されたペプチドが亜鉛フィンガータンパク質上の Ｚｎ２＋ 結合部位に似る配列も含有する （３５）。Ｚｎ２＋ の存在で、ＧＳＴ−ペプチドの一定のアフィニティー定数が ３−７ 倍増加し、ＰＳＡ とペプチドとの結合における Ｚｎ２＋ の関与を示唆した。アフィニティーの増加は、ペプチドと ＰＳＡ との複合体の会合速度よりも解離速度における強い低下で説明できる。これは、ＰＳＡ とペプチドのアミノ酸残基の間にキレートされた Ｚｎ２＋ により仲介され得る。興味深いことに、Ｚｎ２＋ は、他のセリンプロテイナーゼ、トリプシンとその小分子サイズ阻害剤との高いアフィニティー結合を仲介することが知られている （３６）。他の可能性は、Ｚｎ２＋ がペプチドの ３−Ｄ 構造を、Ｚｎ２＋ が ＤＮＡ−結合亜鉛フィンガータンパク質と相互作用するのと同じように安定にする。
【０１１３】
ＰＳＡ−結合ペプチドは以前にポリソーム選択法により製造されている （１１）。これらのペプチドは、環状というよりは直線状であり、本発明で単離されたペプチドと類似していない。さらに、これらのペプチドは、ＰＳＡ の酵素活性に作用がなく、ビオチンとコンジュゲートしたとき、ＰＳＡ との一貫した結合を示さなかった。本発明ペプチドのアフィニティーは、ファージ・ディスプレイ・ペプチドに明らかに典型的であるが （３７）、ポリソーム選択法により開発されたペプチド （１１）のものより低い。しかし、アフィニティーの相違は、測定法の相違により明らかにできる。
【０１１４】
ファージ・ディスプレイ・ペプチドをミクロタイターウエル壁の抗 ＰＳＡ ＭＡｂ に捕捉された ＰＳＡ に対して選択した。捕捉に用いられた抗体は、酵素の立体配座に影響して ＰＳＡ の酵素活性を高める（３０）。このことはペプチド結合の増加に役立ち得た。しかし、ＰＳＡ 溶液は ＧＳＴ−ペプチドの固相 ＰＳＡ との結合を完全に阻害した。すなわち、捕捉抗体により誘導された立体配座の変化は ＧＳＴ−ペプチドの結合に必要でなかった。
【０１１５】
ペプチドを ＧＳＴ 融合タンパク質として発現さしたとき、３ 分子サイズ形態を認めた：ポリマー、オリゴマー、モノマーである。ポリマーが ＰＳＡ に最も強い結合を表し、オリゴマーもモノマーよりも強く結合した。この結果から、多価結合が結合性を高める。ファージ ｆＵＳＥ ５ が同じ配列のペプチド挿入物の ３ − ５ 複製を発現するので、その結合も多価である （３８）。ＧＳＴ−ペプチドの明白な多価結合にもかかわらず、ＧＳＴ 融合パートナーから解裂されたモノマータンパク質は、ＧＳＴ−ペプチドの ＰＳＡ との結合を実質的に阻害した。
【０１１６】
ペプチドがキモトリプシンおよびカテプシン Ｇ に結合しなかったが、それらの酵素特異性は ＰＳＡ のものと類似である。また、Ｃ−末端をアルギニンまたはリシン残基に解裂するトリプシンおよび ｈＫ２ のいずれにも結合しなかった。ＨＫ２ は、アミノ酸レベルで ７９ ％ の同一性を示す ＰＳＡ と構造的に密接に関係している。すなわち、本発明で選択されたペプチドは、ＰＳＡ に高い特異性を示す。ＧＳＴ−ペプチドは、血清中で生じる ＰＳＡ−セルピン複合体、すなわち ＰＳＡ−ＡＣＴ および ＰＳＡ−ＡＰＩ のいずれとも結合しなかった。ここでは、セルピンが ＰＳＡ 上のペプチド結合領域を覆っている。ペプチド結合も、ＰＳＡ−セルピン複合体中で覆われたエピトープを介して遊離 ＰＳＡ と反応する抗体により遮断された。これらの ＭＡｂ も酵素活性を阻害する （３０）。ＰＳＡ 上の他のエピトープとのいくつかの ＭＡｂ 結合も、結合を阻害するが、程度が低い。これらのことを合わせて、結果は、ペプチドが ＰＳＡ の活性部位に密接に結合することを示唆する。
【０１１７】
ＰＳＡ は、その天然基質、セメノゲリン Ｉ のチロシンおよびロイシンに Ｃ−末端的に解裂する制限的キモトリプシン様酵素活性を有す （３９）。しかし、ＰＳＡ はキモトリプシンよりもこれらのアミノ酸をとりまく配列に依存的であり、そして好ましい Ｐ１ 残基、チロシンおよびロイシンをとりまくいくつかの残基が基質の特異性および効率の決定に重要な役割を演じる （４０）。ＰＳＡ はまた、グルタミン後を解裂でき、この型のペプチド基質は、Ｐ１ でチロシンおよびロイシンを含有するものよりも ＰＳＡ に特異的である（１２）。ファージ・ディスプレイにより選択されたすべてのペプチドはチロシンおよびロイシンを含有し、しばしば、他のアミノ酸 （Ｙ−Ｓ、Ｙ−Ａ、Ｙ−Ｄ、Ｌ−Ｖ） と組合されてセメノゲリン Ｉ 中に解裂部位を形成する（３９）。しかし、ペプチドは、セメノゲリン Ｉ 中の解裂部位に同じである ３ を越えるアミノ酸を含有していなかった。すべてのペプチドが ２ または ４ のシステインを含有していた。ペプチドはおそらく剛性ループを形成し、天然基質、セメノゲリン Ｉ がいかなるジスルフィド橋をも含有していない。
【０１１８】
調べた ４ ＧＳＴ−ペプチドのうち ３ が合成ペプチド基質 Ｓ−２５８６ に対する ＰＳＡ の酵素活性を高め、その作用はアフィニティーに相関した。従って、ペプチドは、ＰＳＡ の触媒的トリアド（三つ組）と相互作用しないようであり、むしろ立体配座を変える活性部位の近辺に結合し、合成基質にさらに接近し得る触媒的ポケットをつくる可能性がある。酵素活性に対する作用は、野生型 ＧＳＴ および ＧＳＴ−Ｄ−１ が作用を持たないので、ペプチド特異的である。 ＰＳＡ の酵素活性を阻害する Ｚｎ２＋ が用量依存的にペプチドの促進作用を逆転させた。
【０１１９】
実施例４．アフィニティークロマトグラフィーにおける ＰＳＡ 結合ペプチドの標識化および使用
標識化ペプチドコンジュゲートの調製
ペプチドの合成を固相合成および ｆｍｏｃ−化学で行った。ビオチンを固相合成中にペプチドのアミノ末端に付着した。ペプチドの Ｅｕ−キレートでの標識化は Ｈｅｍｍｉｌａｅ ｅｔ ａｌ．， １９８４ （４１） に記載のとおりである。５０−１００ μｇ のペプチドを ３−１０ 倍モル過剰の Ｅｕ−キレートで標識した。Ｅｕ−標識後、ペプチドを逆相クロマトグラフィーで、ＮｏｖａＰａｋ または Ｓｅｐ−Ｐａｋ Ｃ１８−カラム （Ｗａｔｅｒｓ， ＭＡ， ＵＳＡ） を用いて精製した。カラムを ５０ ｍＭ 酢酸トリエチルアンモニウム、ｐＨ ７ で平衡にし、アセトニトリルで勾配溶出した。９９ｍ−テクネチウム標識のために、ペプチドを最初に ０．２ Ｍ メルカプトエタノールで還元した。還元後、ペプチドの精製を、０．１ Ｍ リン酸緩衝液で平衡にした Ｓｅｐ−Ｐａｋ Ｃ１８ カラム、ｐＨ ７．５ により、そして溶出にアセトニトリルを用いて行った。テクネチウム・ヒドロキシルメチレン・ジリン酸塩 （ＨＤＰ） 法を ９９ｍＴｃ でペプチド標識に使用した。２０ μｇ の還元 Ｃ４−ペプチドを ３ ｍＣｉ の ９９ｍＴｃ で標識した。標識後、ペプチドの精製を、０．１ Ｍ リン酸緩衝液で平衡にした Ｓｅｐ−Ｐａｋ Ｃ１８ カラム、ｐＨ ７．５ により、そして溶出にアセトニトリルを用いて行った。ペプチドをヨードゲン法 （４２） によりヨード化した。
【０１２０】
ＰＳＡ の酵素活性に対するペプチドの作用をモニターして検定するように、合成ペプチドをビオチンで ＰＳＡ 結合活性の低下なしに標識できた （図９）。ペプチドの Ｅｕ 標識効率を増加するために、Ｂ２ （ＣＶＦＡＨＮＹＤＹＬＶＣ） および Ｃ４ （ＣＶＡＹＣＩＥＨＨＣＷＴＣ） ペプチドに、セリンおよびリシンからなるアミノ末端のテイルを加えた。対応の Ｂ２−ペプチド誘導体の構造は、ＳＫＳＫＳＫＳ−アミノカプロン酸 （ａｃａ）−ＣＶＦＡＨＮＹＤＹＬＶＣ であり、Ｃ４−ペプチド誘導体の構造は ＳＫＳＫＳＫＳ−ａｃａ−ＣＶＡＹＣＩＥＨＨＣＷＴＣ である。これらの誘導 Ｂ２ および Ｃ４ ペプチドの構造を、夫々図１３および１４に示す。
【０１２１】
図１５は、ＰＳＡ の酵素活性に対する ＳＫＳＫＳＫＳ−テイル化ペプチド Ｃ４ の作用を示す。ＰＳＡ （０．３３ μＭ） を非テイル化および ＳＫＳＫＳＫＳ−テイル化 Ｃ４ （３０ 倍モル過剰） とともに １ 時間インキュベートし、ついで色素基質 Ｓ−２５８６ を加え、酵素活性を、４０５ ｎｍ で吸収を測定してモニターした。データを ２ ウエルの平均値 ± ＳＥ で表す。この結果によると、テイルの付加はペプチドの結合活性に影響を及ぼさなかった。
【０１２２】
Ｅｕ−標識後、ペプチドを Ｃ１８ クロマトグラフィーで精製した。図１６は、５０ μｇ Ｃ４ ペプチド含有の Ｅｕ−標識反応混合物の Ｃ１８ Ｓｅｐ−Ｐａｋ カラムでのフラクション化を示す。アセトニトリル （ＡｃＮ） で勾配溶出した。流速は ０．５ ｍＬ／分であり、１ ｍＬ フラクションを採取した。比較のために、同じカラムでの非標識 Ｃ４ ペプチドの溶出曲線を示す。この結果によると、Ｅｕ−標識ペプチドを非標識ペプチドから Ｃ１８ クロマトグラフィーで単離できる。
【０１２３】
図１７は、ＰＳＡ の酵素活性に対する Ｃ１８ クロマトグラフィー由来のフラクション（図１６）の作用を示す。ＰＳＡ （０．３３ μＭ） を、Ｃ４ の Ｅｕ−標識反応混合物の Ｃ１８ クロマトグラフィーにより得たフラクション（図１６）の １００ μＬ アリコットとともに １ 時間インキュベートし、ついで、色素基質 Ｓ−２５８６ を加え、酵素活性を、４０５ ｎｍ で吸収を測定してモニターした。フラクション ２６−２８ は、ＰＳＡ の酵素活性を大きく高めたので、Ｅｕ−標識 Ｃ４−ペプチドを含有していた （図１７）。対照として ＰＳＡ 単独の酵素活性を測定した。Ｅｕ−標識 Ｃ４ の溶出位置を図１６中に矢印で示す。この結果からして、Ｅｕ−キレートをペプチドに、その ＰＳＡ 結合活性に影響を及ぼさないで付着できる。
【０１２４】
図１８は、Ｃ４−ペプチドの結合活性に対するテクネチウム標識の作用を示す。ＰＳＡ （０．３３ μＭ） を Ｔｃ９９ｍ−標識 Ｃ４ （３０ 倍モル過剰） とともに １ 時間インキュベートし、ついで色素基質 Ｓ−２５８６ を加え、酵素活性を、４０５ ｎｍ で吸収を測定してモニターした。データを ２ ウエルの平均値 ± ＳＥ で表す。非標識 Ｃ４ の ＰＳＡ に対する作用を比較のために示す。対照として、直線状 Ｃ４ （メルカプトエタノールによる還元）の ＰＳＡ 活性に対する作用および ＰＳＡ 活性単独を示す。この結果によると、Ｃ４−ペプチドのチオール−硫黄間のテクネチウム標識は結合を約 ５０ ％ 低下した。
【０１２５】
図１９は、Ｃ４ ペプチドの ＰＳＡ 結合活性に対するヨード化の作用を示す。２０ μｇ のペプチドをヨードゲン法によりヨード化した。ヨード化後、ペプチドを Ｃ１８ Ｓｅｐ−Ｐａｋ カラムで精製した。ＰＳＡ （０．３３ μＭ） を １２５Ｉ−標識 Ｃ４ （３０ 倍モル過剰） とともに １ 時間インキュベートし、ついで、色素基質 Ｓ−２５８６ を加え、酵素活性を、４０５ ｎｍ で吸収を測定してモニターした。比較のために、非標識 Ｃ４ の ＰＳＡ 活性に対する作用および ＰＳＡ 単独の作用を示す。この結果によると、Ｃ４−ペプチド （ＣＶＡＹＣＩＥＨＨＣＷＴＣ） のヨードゲン法による １２５−ヨード化は、その結合活性をほとんど完全に破壊した。このことは、このペプチド中の単一の Ｔｙｒ 残基が結合に重要であることを示唆する。
【０１２６】
これらの結果によると、種々の標識基が ＰＳＡ 結合ペプチドに、その結合活性に影響を及ぼさないでカップルできる。特に、カップリングがアミノ末端または元のペプチド配列に加えられたテイルに関するときにできる。ペプチドのチオール基間の Ｔｃ９９ｍ をキレート後、Ｃ４ ペプチドは、その活性の約半分を保持した。
【０１２７】
アフィニティークロマトグラフィーでの ＰＳＡ 結合ペプチド
ペプチド・アフィニティーゲルを、 ペプチド Ｂ２ および Ｃ４ リシン−セリン−テイル誘導体 （図１３および１４） を活性化 ＣＨ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂ （Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ） に製造業者の説明に従いカップリングすることにより調製した。カップリングは、カップリング部位の濃度に等しいモル濃度のペプチドを Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ で用いて行った。ペプチド・アフィニティークロマトグラフィーでは、カラムを Ｔｒｉｓ−緩衝液、ｐＨ ７．８ で、または １００ μＭ ＺｎＣｌ２を含有する同じ緩衝液でカラムを平衡にした。サンプルに適用した後、カラムを Ｔｒｉｓ 緩衝液、ｐＨ ７．８ で洗浄した。カラムを、１０ ｍＭ 酢酸アンモニウム、ｐＨ ６．５ および １０ ｍＭ 酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ ３．５ を用いて直線勾配的に ｐＨ を下げて溶出するか、溶出に ｐＨ ６ および ４ の緩衝液を段階勾配的に用いた。ＰＳＡ のこれらのゲルへの結合を ＰＳＡ 免疫検定法でモニターした。ペプチド・アフィニティーカラムから溶出された ＰＳＡ の同定をさらに ＳＤＳ−ＰＡＧＥ （４３） およびイムノブロッティング法 （４４） で調べた。イムノブロッティング試験において、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ で単離されたタンパク質が ＰＶＤＦ 膜に移行し、ポリクローナル抗−ＰＳＡ 抗体 （Ｄａｋｏ， Ｄｅｎｍａｒｋ）と免疫反応した。
【０１２８】
図２０は、Ｂ２ ペプチド・アフィニティークロマトグラフィーによる １００ μＭ Ｚｎ２＋ の存在下での精液サンプルのフラクション化を示す。ＰＳＡ は、精液から硫酸アンモニウムにより沈降せしめ、ついで平衡緩衝液に稀釈し、カラムに用いた。カラム洗浄後、ＰＳＡ を勾配的に低下の ｐＨ で溶出した。流速は ０．５ ｍＬ／分であり、フラクション １ ｍＬ を採取した。約 ８０ ％ の ＰＳＡ がカラムに結合しており、ｐＨ を下げてこれを溶出した （図２０）。
【０１２９】
図２１で、Ｚｎ２＋ を緩衝液から除外した以外は、図２０と同じ精液のフラクション化を示す。Ｚｎ２＋ を除くと、ほぼ半分の精液 ＰＳＡ がカラムに結合し、勾配的に低下の ｐＨ で溶出すると、２ つのピークを回復した （図２１）。また、精液を Ｃ４−ペプチド−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ で Ｚｎ２＋ の存在下でフラクション化すると、約 ８０ ％ の ＰＳＡ がカラムに結合し、勾配的に低下の ｐＨ で、２ つのピークとして溶出した （図２２）。Ｚｎ を除くと、約 ８０ ％ の適用 ＰＳＡ が非結合であった。
【０１３０】
Ｂ２−ペプチド・アフィニティークロマトグラフィーにより分離された ＰＳＡ 形態の同定を ＳＤＳ−ＰＡＧＥ およびイムノブロッティングにより、ポリクローナル抗−ＰＳＡ 抗体を用いて調べた。図２３は、Ｂ２ ペプチド・アフィニティーカラムからのフラクション（図２０および２１）を含有する ＰＳＡ の非還元状態での ＳＤＳ−ＰＡＧＥ 後のイムノブロッティング分析を示す。サンプルは下記のとおり：レーン １： ＭＷ−マーカー、レーン ２： 非結合 ＰＳＡ； Ｚｎ２＋ を含む （図２０のフラクション ４）、レーン ３： 非結合 ＰＳＡ； Ｚｎ２＋ を含まない （図２１のフラクション ４）、レーン ５： 結合 ＰＳＡ； Ｚｎ２＋ を含む （図２０のフラクション ２４）、レーン ６： 結合 ＰＳＡ； Ｚｎ２＋ を含まない （図２１のフラクション ３０）。
【０１３１】
図２４は、Ｂ２ ペプチド・アフィニティーカラムからのフラクション（図２０および２１）を含有する ＰＳＡ の還元状態での ＳＤＳ−ＰＡＧＥ 後のイムノブロッティング分析を示す。サンプルは下記のとおり：レーン １： ＭＷ−マーカー、レーン ２： 非結合 ＰＳＡ； Ｚｎ２＋ を含む （図２０のフラクション ４）、レーン ３： 非結合 ＰＳＡ； Ｚｎ２＋ を含まない （図２１のフラクション ４）、レーン ５： 結合 ＰＳＡ； Ｚｎ２＋ を含む （図２０のフラクション ３０）、レーン ６： 結合 ＰＳＡ； Ｚｎ２＋ を含まない （図２１のフラクション ３０）。
【０１３２】
Ｂ２−ペプチド・カラムからのフラクションについて非還元状態でのイムノブロッティング分析において、ＭＷ 約 ３０ ｋＤ のバンドが ＰＳＡ 免疫反応活性の非結合および結合フラクションで表れた （図２３）。これは 遊離 ＰＳＡ のサイズに対応する。しかし、還元条件下での ＳＤＳ−ＰＡＧＥ 後のイムノブロッティングにおいて、非結合 ＰＳＡ を含有のフラクションで、分子量約 １０ および ２０ ｋＤ に対応するバンドが表れた（図２４）。このことは、タンパク質分解的に解裂または切断された ＰＳＡ から誘導された ＰＳＡ の断片のサイズに対応する。いくつかの無傷 ＰＳＡ を ＰＳＡ の非結合フラクション中に検出した （図２４）。ＰＳＡ の結合型のみが還元状態で ３０ ｋＤ バンドを含有し、無傷の ＰＳＡ のみからなることを示した。
【０１３３】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ 分析によっても、ペプチド・カラムを用いて、精液からの ＰＳＡ を精製できる。図２５は、Ｂ２ ペプチド・カラムによりフラクション化された精液について還元状態での ＳＤＳ−ＰＡＧＥ を示す。サンプルは下記のとおり： レーン １、２、３： 非結合 ＰＳＡ、レーン ４： ＭＷ マーカー、レーン ５、６、７： ＰＳＡ の溶出は夫々 ｐＨ ６、５、４、レーン ８： 精液。この結果によると、ＰＳＡ 結合ペプチド・カラムでの精液のフラクション化により汚染精液タンパク質の大部分を １ 工程のペプチド・アフィニティークロマトグラフィーで除去できた。
【０１３４】
これらの結果からして、これらのペプチドを、ＰＳＡ の精製および種々の形態の遊離 ＰＳＡ 分別に使用できる。これらのペプチドは、ＰＳＡ について新規の結合特異性を保持しているので、すなわち、無傷型の遊離 ＰＳＡ に特異的に結合するので、前立腺癌についての改善的正確性をもつ検定法の開発に有用であり得る。
【０１３５】
実施例５．セリンプロテアーゼ活性を調節する環状ペプチドについての配座的および生化学的分析
材料および方法
ペプチド合成：ペプチドを、ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ ９０５０ Ｐｌｕｓ 自動ペプチド機、Ｆｍｏｃ法、カップリング試薬として ＴＢＴＵ／ ＤＩＰＥＡ、および固相として ４−ヒドロキシメチルフェノキシ酢酸リンカーを有する ＮｏｖａＳｙｎ ＴＧＡ （Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ， Ｌａｅｕｆｅｌｆｉｎｇｅｎ， Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ） を用いて合成した。合成で使用した側鎖保護基は、Ａｓｎ、Ｑｌｎ、Ｈｉｓ についてトリチル （Ｔｒｔ） であり、Ｇｌｕ、Ａｓｐ について Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチル （ＯｔＢｕ） であり、Ｔｙｒ について ｔ−ブチルオキシカルボニル （Ｂｏｃ） であり、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ について ｔｅｒｔ−ブチル （ｔＢｕ） であった。Ｃｙｓ についてはアセタミドメチル （Ａｃｍ） および Ｔｒｔ 保護基を用いた。ペプチド Ａ−１、Ｂ−２ およびこれらの改変について Ｃｙｓ（Ａｃｍ） を Ｃｙｓ 位置 １： Ｃ（Ａｃｍ）ＶＦＴＳＤＹＡＦＣ（Ｔｒｔ） および Ｃ（Ａｃｍ）ＶＦＡＨＮＹＤＹＬＶＣ（Ｔｒｔ） で用い、ペプチド Ｃ−４ およびその改変について Ｃｙｓ（ａｃｍ） を位置 ２ および ３： Ｃ（Ｔｒｔ）ＶＡＹＣ（Ａｃｍ）ＩＥＨＨＣ（Ａｃｍ）ＷＴＣ（Ｔｒｔ） で用いた。樹脂からの ９６ ％ ＴＦＡ での解裂の際に、Ａｃｍ−保護基が Ｃｙｓ−側鎖に残留する。１ システイン橋を有するヘッドからテイル環状 Ｃ−４ ペプチドの合成に Ｃｙｓ（ｔｒｔ） およびα−アリル Ｆｍｏｃ−グルタミン酸（Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ−Ｏａｌｌ） を用いた。Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ−Ｏａｌｌ を最初に樹脂上に側鎖カルボニル基を介して付着した。合成を Ｇｌｕ（７） から Ｈｉｓ（８） （元の配列中） ＮＨ２−ＨＨＣＷＴＶＡＹＣＩＥ−Ｏａｌｌ へ続けた。環化が樹脂上で解裂の前に起きた。
【０１３６】
ペプチドを、ＨＰＬＣ （Ｓｈｉｍａｄｚｕ， Ｊａｐａｎ） により Ｃ１８ 逆相カラムおよび溶出液としてアセトニトリル （ＡＣＮ） （０．１ ％ＴＦＡ の Ｈ２Ｏ／０−６０ ％ ＡＣＮ 勾配溶液、６０ 分間） で精製し、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ 質量分析計 （Ｂｒｕｅｋｅｒ， Ｇｅｒｍａｎｙ） で確認し、純度を分析 ＨＰＬＣ、２４０ ｘ １．４ ｍｍ Ｃ１８ カラム ０　６０ ％ ＡＣＮ で ３０ 分間測定した。
【０１３７】
ペプチドの環状化：システインを有するペプチド （Ａｃｍ） をヨード化法で環状にした。凍結乾燥ペプチドを ５０ ％ 酢酸 （ＡｃＯＨ） に濃度 ２ ｍｇ ／ ｍｌ に溶解した。１ Ｍ ＨＣｌ （０．１ ｍｌ／ ｍｇ のペプチド） を加え、すぐに ０．１ Ｍ ヨウ素の ５０ ％ ＡｃＯＨ 溶液（５ ｅｑ．／ Ａｃｍ） を加えた。溶液を激しく室温で ３０ から ４０ 分間攪拌した。反応を ０．１ Ｍ チオ硫酸ナトリウムで停止した。ろ過後 （０．４５ μｍ）、ペプチドを上記のように ＨＰＬＣ で精製した。硫黄橋の形成を ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ 質量分析計 （Ｂｒｕｅｋｅｒ ａｎａｌｙｔｉｃ ＧＭＢＨ， Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ， Ｇｅｒｍａｎｙ） で確認した。
【０１３８】
ヘッドからテイルへの環状化を Ｇｌｕ のカルボニル基からの Ｏａｌｌ 基の解裂で開始した。３ 等量のパラジウム （Ｐｄ（ＰＰｈ３）４ を ＣｈＣｌ３−ＡｃＯＨ−Ｎ−メチルモルホリン中にアルゴン下で溶解した。パラジウムを樹脂上に加え、２ 時間、室温でアルゴン下攪拌した。インキュベーション後に樹脂を ０．５ ％ ジイソプロピル−エタノールアミン ＤＩＰＥＡ の ＤＭＦ 溶液および ０．５ ％ ジエチルチオカルバミン酸ナトリウムの ＤＭＦ 溶液で洗い、触媒を除去した。アリル基の除去後、ヘッドからテイルへのペプチド結合を等モル濃度の ０．６ Ｍ ＨＴＢＵ と ０．９ Ｍ ＤＩＰＥＡ の ＤＭＦ 溶液で、２ 時間、室温で攪拌して形成せしめた。カップリング後、樹脂を ＤＭＦ、ＤＣＭ で洗い、乾燥した。解裂後、ペプチドを ＨＰＬＣ で精製し、０．１ Ｍ （ＮＨ４）ＨＣＯ３ に溶解した。空気酸化により硫黄橋が形成した。ペプチド結合および硫黄橋の形成を ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ で確認した。
【０１３９】
ＰＳＡ 活性の測定：ＰＳＡ の活性に対する種々のペプチドの作用を、キモトリプシン基質 Ｓ−２５８６ （ＭｅＯ−Ｓｕｃ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−ｐＮＡ） （Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｘ， Ｍｏｅｌｎｄａｌ， Ｓｗｅｄｅｎ） を用いて調べた。７７ ｐモル （２ μｇ） の ＰＳＡ、基質、１０ μモルの種々のペプチドを、Ｔｒｉｓ−緩衝液 （１０ ｍＭ Ｔｒｉｓ、１５０ ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ ７．８） 中で ０．２ ｍＭ 濃度の基質とともに室温でインキュベートした。ペプチドを有さない ＰＳＡ 反応物を基礎レベルの対照として使用した。反応物を ６０ 分インキュベーション後に ４０５ ｍｍ で Ｍｕｌｔｉｓｃａｎ ＲＣ 光度計 （Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ， Ｆｉｎｌａｎｄ） で測定した。ペプチドの作用を、６０ 分インキュベーション後の ＰＳＡ 単独に対する ＰＳＡ−ペプチド複合体の ＯＤ 値の比率として計算した。
【０１４０】
ＮＭＲ 分光法：ＮＭＲ サンプルを、精製および凍結乾燥ペプチドを ６００ μｌ ＤＭＳＯ−ｄ６ に ５−１０ ｍＭ で溶解して調製した。サンプルの ｐＨ は調べなかった。すべてのスペクトルを ３００ − ３２０ Ｋ で Ｂｒｕｅｋｅｒ Ａｖａｎｃｅ ５００ ＮＭＲ 分光計 （Ｂｒｕｅｋｅｒ 分析 ＧＭＢＨ， Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ， Ｇｅｒｍａｎｙ） により、１Ｈ についての周波数 ５００ ＭＨｚ で作動して記録した。すべての １ 次元試験を ５ つの異なる温度で範囲 ３００ Ｋ から ３２０ Ｋ で記録した。アミドプロトンの温度係数 （ｄδ／ｄＴ） を、これらの ５ 温度での化学的シフトを分析して、計算した。すべての ２ 次元試験を、スペクトルの性質および明瞭性に依存して、３０５ Ｋ または ３１０ Ｋ で記録した。すべての化学シフトを ２．５０ ｐｐｍ での ＤＭＳＯ ピークに関して報告する。
【０１４１】
すべての ２Ｄ 試験について、Ｂｒｕｅｋｅｒ ソフトウエアー・ライブラリーからの標準的パルス・プログラムを使用した。ＴＯＣＳＹ スペクトルを混合時間 ８０ ｍｓ で、ＴＰＰＩ 相サイクリングを持つ ＭＬＥＶＴＰ （４５） 混合配列の手段により記録した。ＮＯＥＳＹ（４８） スペクトルを主に、混合時間、Ａ−１ につき ４００ ｍｓ、Ｂ−２ につき ４２０ ｍｓ、Ｃ−４ につき ３００ ｍｓで、ＴＰＰＩ 相サイクリングを用いて、記録した。種々の混合時間を調べ、最上のものをスペクトルの性質および明瞭性に基づき決定した。ＮＯＥ−形成曲線は決定しなかった。いくつかの ＣＯＳＹ （ｃ） スペクトルも混合時間 ３０ 分で記録した。データセットを相−シフト正弦ベル関数で処理した。典型的に、データを ｔ１ および ｔ２ の両者について １０２４ の分解で記録した。
【０１４２】
構造計算：構造計算を ＤＹＡＮＡ ソウフトウエアー （４６） で行った。ＮＯＥ−強度を、Ａ−１ における Ｔｙｒ７ および Ｃｙｓ１０ のβ−プロトンと Ｔｙｒ７ の芳香族環プロトン、Ｂ−２ における Ｔｙｒ７ の芳香族環プロトン、Ｃ−４ おける Ｔｒｐ１１ の芳香族環プロトンに関して、大略目盛りつけした。ＮＯＥ 相関を、強い （１．８ − ２．７ Å）、中程度 （１．８ − ３．５Å）、弱い （１．８ − ５．０Å） のいずれかに分類した。メチルについて １．５ Å、メチレンプロトンについて １．０ Å、チロシン環プロトンについて ２．０ Å のプソイド原子補正を、必要なときに （５２）、加えた。二面角は、３−Ｄ 構造の変動 （５２） により大きくは制限されていなかった。
【０１４３】
結果
ＮＭＲ 測定から誘導される最も重要なデータは、アミドプロトンの連続的長期間の核 Ｏｖｅｒｈａｕｓｅｒ 効果、ＣαＨ 配座シフト、温度係数であった。連続的 ＮＨ（ｉ） ／ ＮＨ（ｉ＋１） ＮＯＥ 交差ピークは常に、多かれ少なかれ回転された配座についての証拠である。アミドプロトン間の距離が、その間の二極接触から生じる ＮＯＥ を観測することが可能である前に ３ Å 以下であるべきことが示唆されている。この理解は、この二極接触が主に右手のα配座から起きることである。観測された強い継続的 ＣαＨ（ｉ） ／ ＮＨ（ｉ＋１） 交差ピークはβ−配座の証拠である。この両者が同じ残基に存在するとき、２つの配座間に動力学的な平衡が存在した。継続的 ＮＨ（ｉ） ／ ＮＨ（ｉ＋１）、ＣαＨ（ｉ） ／ ＮＨ（ｉ＋１）、残基内 ＣαＨ（ｉ） ／ ＮＨ（ｉ） ＮＯＥ−相関の強さは、骨格構造の剛性または動力学的挙動の主要事象についての指標であった。
【０１４４】
ＤＭＳＯ−ｄ６ などの強い水素結合−受容溶媒を用いると、ペプチドにおける溶媒曝露 ＮＨ 基のダウンフィールドシフトが起きる （５０）。大部分の ＮＨ 化学シフトは、ランダムコイル化学シフトと同じ位置か、それからのダウンフィールドに存する。ＮＨ 化学シフトには顕著なアップフィールドシフトもある。ＮＨ 基の溶媒曝露は、ＮＨ 基の温度係数を測定して、検出した。検査したすべてのペプチドは、強い溶媒シールディングに特徴的な （Ｒａｇｈｏｔｈａｍａ ｅｔ ａｌ． １９９６） ＮＨ 基または非常に低い△δ／△Ｔ−値 （＜３ ｐｐｍ／Ｋ） を示す基を有していた。また、説明することを要する対の中程度△δ／△Ｔ−値 （３−５ ｐｐｍ／Ｋ） も認めた。各ペプチドについての ＮＨ 基の化学的シフトおよび△δ／△Ｔ−値を表６に示す。ＮＨ ピークの部分を広げて、溶媒−曝露 ＮＨ 基または配座波動および動力学的挙動 （５２， ５０）を表示した。すべての ３ＪＮＨＣαＨ を広げることについて、よく検出できなかった。検出されたカップリング定数は常に ６．０ − ８．０ Ｈｚ の間にあり、構造について情報をさらには表さなかった。
【０１４５】
低い水溶性からして、（特に Ｃ−４） スペクトルを ＤＭＳＯ−ｄ６ 中で記録したが、顕著な Ｈ２Ｏ−ピークをすべてのスペクトルで認めた。これは特に ＣαＨ−ピーク領域に干渉し、ＣαＨ（ｉ） ／ ＣαＨ（ｊ） 交差ピークを通常認めなかった。第２の主要な散乱は ｔ１−ノイズ （Ｗｕｅｔｈｒｉｃｈ， １９８６， ５２） であった。これは、特に ＮＨ ／ ＮＨ 交差ピーク強度の決定を困難にする。
【０１４６】
本発明ペプチドの各々についてさらに詳細な研究を下記の章で説明する。すべての下記のデータでは、構造計算において配座拘束として ＮＯＥ−データを使用した。
【０１４７】
ペプチドの配座
Ａ−１：
すべての Ａ−１ 変化ペプチドの ＮＭＲ−測定において、Ａ−１−４（表 ７） を、その均一の優れた生物活性からして使用した。Ｔｙｒ７ （３．４ ｐｐｂ） および特に Ａｌａ８ （１．８ ｐｐｂ） のアミドプロトンについての温度係数は低く、溶媒から保護されていることを示す （表 ６）。Ｔｙｒ７ のアミドプロトンの低い ３．７ ｐｐｂ／Ｋ （ｄδ／ｄＴ） （表 ６） はβ−ターンの存在を表す。Ｔｙｒ７ は残基 ｉ＋３ であり、Ｓｅｒ５ はＩＩ型β−ターンの位置 ｉ＋１ にある。これは、なぜ Ｓｅｒ５ がランダムコイル値に関して高いフィールドで ＣαＨ 化学シフトを有しているかを説明する。Ａｓｎ６ と Ｔｙｒ７ 間の強い ＮＨ（ｉ） ／ ＮＨ（ｉ＋１） および Ａｓｎ６ と Ｔｙｒ７ についての強い残基内 ＣαＨ（ｉ） ／ ＮＨ（ｉ） は型ＩＩβ−ターンを表す。ターン残基 ４−７ での配座はペプチド Ｂ−２ 構造に似る。
【０１４８】
強い ＣαＨ（ｉ） ／ ＮＨ（ｉ＋１） ＮＯＥ−相関を残基 ２ − ６ の間に認め、これはターン領域の外側の可能なβ−型／伸張構造を表している。ＣαＨ の化学シフトは残基 ２−４ および ８−１０ の間のランダムコイル値にほとんど等しい（表１）。残基 Ｓｅｒ５、Ａｓｎ６、Ｔｙｒ７ 間でのみ ＣαＨ の化学シフトがペプチドのこの部分のβ−配座の出現を支持するアップフィールドを動かした （４９， ５１）。残基 Ｐｈｅ９ と Ｃｙｓ１０ の間の中程度の ＮＨ（ｉ） ／ ＮＨ（ｉ＋１） 相関は、α−配座隣接のジスルフィド橋の証拠である。
【０１４９】
ＮＨ についての比較的強いダウンフィールドシフトを、Ｖａｌ２ および Ｃｙｓ１０ について検出した。これは、それらの溶媒曝露配座を表す。強いアップフィールドシフトのアミドプロトンを、溶媒シールディングを表す残基 ４−９ について認めた （表 ６）。
【０１５０】
Ｂ−２：
最初に、Ｔｙｒ７ のアミドプロトンについての低い温度係数（０，７ ｐｐｍ／Ｋ） に興味の焦点を絞った。その溶媒シールド構造を示している。これは、Ｔｙｒ７ のアミドプロトンと通常的に骨格のカルボニル基との間の水素結合を表す。クラシカルβターンにおいて、ターン中の第４残基の温度係数は、ターン中の第１残基のカルボニルとの水素結合の形成によって下げられなければならない。また、Ｔｙｒ９ ＮＨ に対する中程度の温度係数（４．０ ｐｐｍ／Ｋ） を認めた。ＮＨ についての強いダウンフィールドを、溶媒曝露の配座を示す Ｖａｌ２ および Ｃｙｓ１２ について検出した。強くアップフィールドにシフトされたアミドプロトンは、Ａｓｎ６、Ｔｙｒ７、Ｔｙｒ９であって、その溶媒−シールディングを表す （表６）。
【０１５１】
ＮＨ（ｉ） ／ ＮＨ（ｉ＋１） 相関関係について、残基 Ｈｉｓ５−Ａｓｎ６ の間に強い関係を、Ａｓｎ６−Ｔｙｒ７ の間に弱い関係を認めた。このデータは残基 ４ − ７ の間の 型 Ｉ β−ターンに適合する（５２）。継続的 ＣαＨ（ｉ） ／ ＮＨ（ｉ＋１） 相関関係についても、残基 １ − ４ および ９ − １２ の間に非常に強い関係を、残基 ６ − ９ の間に中程度または弱い関係のみを検出した。これは、β−ターン領域の外側のβ−シート型構造を表す。さらに、Ａｌａ４ ＣβＨ３−プロトンと Ｔｙｒ７ および Ｔｙｒ９ アミドプロトンの間の弱い ＮＯＥ−相関関係が型 Ｉ β−ターンを示す （５２）。ＣαＨ のシフトがアップフィールドに強く、ターン領域を示す残基 ５−８ （４９）の間のランダムコイル値と異なる（図２６）。
【０１５２】
しかし、同時の強力または中程度の ＮＨ（ｉ） ／ ＮＨ（ｉ＋１） および強力な ＣαＨ（ｉ） ／ ＮＨ（ｉ＋１） ＮＯＥ−相関関係は、配座変化の存在を示した。ＮＨ（ｉ） ／ ＮＨ（ｉ＋１）−相関関係を、残基 ７−８ および ８−９ （中程度）、９−１０ および １１−１２ （弱い） の間に認めた。さらに強力な残基内 ＣαＨ（ｉ） ／ ＮＨ（ｉ） 相関関係が Ａｓｐ８ および Ｔｙｒ９ についてのα−配座の存在示す。しかしペプチド環の長期間 ＮＯＥ−相関関係が配座間の構造的類似性を示す。顕著な ＮＨ（ｉ）−ＮＨ（ｊ） ＮＯＥ−相関関係を Ｖａｌ２−Ｖａｌ１１ および Ａｌａ４−Ｔｙｒ９ の間に認めた。
【０１５３】
Ｃ−４：
Ｃ−４ ペプチドは Ａ−１ および Ｂ−２ ペプチドと ２ ジスルフィド橋で異なる。Ｈｉｓ９ のアミドプロトンについて非常に低い温度係数を、Ｔｙｒ４、Ｔｒｐ１１、Ｃｙｓ１３ のアミドプロトンについて比較的低い温度係数を検出した。Ｈｉｓ９ のアミドプロトンは、β−ターンの存在を示す Ｉｌｅ６ のカルボニルと水素結合している。Ｃｙｓ５ と Ｃｙｓ１０ の間のジスルフィド橋がこの部分のペプチドをさらに剛性にした。ＮＨ についての強力なダウンフィールドシフトを、Ｖａｌ２、Ｃｙｓ５、Ｉｌｅ６、Ｃｙｓ１０ について、非常に強力なのを、溶媒−曝露された配座を示す Ｇｌｕ７ および Ｔｒｐ１１ について検出した。強くアップフィールドシフトされたアミドプロトンは、溶媒−シールディングを示す Ｔｙｒ４、Ｈｉｓ９、Ｃｙｓ１３ であった（表６）。
【０１５４】
残基 Ｉｌｅ６ − Ｈｉｓ９ 間のターン型を型ＩＩβ−ターンと同定した。Ｈｉｓ８ − Ｈｉｓ９ 間の強力な ＮＨ（ｉ） ／ ＮＨ（ｉ＋１） 相関関係および Ｈｉｓ８ についての強力な残基内 ＣαＨ（ｉ） ／ ＮＨ（ｉ） 相関関係は型ＩＩターンを示す。Ｇｌｕ７ ＮＨ についての非常に強力なダウンフィールドシフトが溶媒−曝露された配座を示す。これは型ＩＩターンに特有である。ＮＯＥ を、剛性ターンを示す Ｉｌｅ６ ＮＨ − Ｔｙｒ９ ＮＨ 間に認めた。配座的不一致のみが、ターン領域で波動を示す Ｇｌｕ７ − Ｈｉｓ８ 間の弱い ＮＨ（ｉ） ／ ＮＨ（ｉ＋１） 相関関係であった。
【０１５５】
Ｇｌｕ７ および Ｈｉｓ８ についての ＣαＨ の化学的シフトが、ターン領域を示す強力なアップフィールドに移動された。強力な ＣαＨ（ｉ） ／ ＮＨ（ｉ＋１） ＮＯＥ−相関関係を、β−ターン領域の外側のβ−配座を示す残基 １ − ６ および ９ − １３ 間で認めた。主な不一致は、Ｖａｌ２ − Ａｌａ３ 間の比較的強力な ＮＨ（ｉ） ／ ＮＨ（ｉ＋１） 相関関係、および骨格の動力学的挙動を示す Ｔｙｒ４ − Ｃｙｓ５、Ｉｌｅ６ − Ｇｌｕ７、Ｔｒｐ１１ − Ｔｈｒ１２ 間の弱い ＮＨ（ｉ） ／ ＮＨ（ｉ＋１） 相関関係であった。
【０１５６】
いくらか顕著な中程度および長期的 ＮＯＥ−相関関係を認めた。非常に明確な ＮＯＥ−交差ピークを、Ａｌａ３ と Ｔｈｒ１２ の ＣαＨプロトン間および Ｔｙｒ４ と Ｉｌｅ６ の側鎖プロトン間に検出した。Ｔｙｒ４、Ｔｒｐ１１、Ｃｙｓ１３ のアミドプロトンの中程度の温度係数は、それぞれ Ｔｒｐ１１、Ｔｙｒ４、Ｖａｌ２ のカルボニル酸素との部分的水素結合の結果である。
【０１５７】
ＮＭＲ−データが Ｃｙｓ１ − Ｃｙｓ１３ および Ｃｙｓ５ − Ｃｙｓ１０ 間の橋形成を証明した。強力な ＮＯＥ−交差ピークを残基 Ｃｙｓ５ および Ｃｙｓ１０ 中の ＣαＨ プロトン間で検出した。さらに、Ｃｙｓ５ および Ｃｙｓ１０ 中の ＣαＨ プロトンの化学シフトがダウンフィールドに移動したのは、興味深い （表６）。化学シフト値は、これらのプロトン近接の芳香族環の環カレント作用により説明できる（Ｗｕｅｔｈｒｉｃｈ， １９８６， ５２）。同じ挙動を Ｉｌｅ６ および Ｔｒｐ１１ のアミドプロトンについて検出できた。これらのシフトを誘発した芳香族環は、Ｔｒｐ１１ のインドール環である。ＮＯＥ を Ｉｌｅ６ ＨＮ　− Ｔｒｐ１１ Ｈ５ 間に認めた。
【０１５８】
修飾ペプチドの活性
１．１ 以上の ＰＳＡ−ペプチド／ＰＳＡ 比を有するペプチドを活性、１．１ 以下のものを不活性とした（表７）。
【０１５９】
下記の修飾は、ペプチド Ａ−１、Ｂ−２、Ｃ−４ の活性に影響を及ぼさなかった。ペプチド Ａ−１−４ および Ｂ−２−２ における負性電荷の移動 Ｄ → Ｎ および Ｃ−４−３ における Ｅ → Ｑ 。ペプチド Ａ−１ における電荷 Ｆ（９） → Ｙ（９） （Ａ−１−２） および Ａ（８） → Ｎ（８） （Ａ−１−３） は、活性に影響を及ぼさなかった。ペプチド Ｂ−２ において、活性が Ｙ（９） → Ａ（９）（Ｂ−２−３） の修飾とともに残存した。Ａ−１ と Ｂ−２ の配列は、長さの相違にかかわらず互いに類似する。Ｂ−２ を １０ アミノ酸 （Ｂ−２−４） に短くすると、配列間の相違は、Ｂ−２−４ 中の Ａ（４）Ｈ（５） に対するに Ａ−１−３ 中の Ｔ（４）Ｓ（５） である。ペプチド Ｃ−４ における Ｙ（４） → Ｆ（４） の修飾 （Ｃ−４−３） を持つペプチドは活性であった。
【０１６０】
下記の修飾は不活性であった：ペプチド Ａ−１ における Ｆ（３） → Ｙ（３）、およびペプチド Ａ−１ および Ｂ−２ の両方における修飾 Ｙ（７） → Ａ（７）。ペプチド Ｃ−４ における修飾 Ｙ（４） → Ａ（４） および Ｗ（１１） → Ａ（１１） は不活性であった。さらに、１システイン結合を有する １０ アミノ酸配列 Ｃ−４−４ およびペプチド結合表面による環化 Ｃ−４−６ は不活性であった。
【０１６１】
結論
３ペプチド Ａ−１、Ｂ−２、Ｃ−４ の配列およびアミノ酸部位を表８に示す。２ペプチド Ａ−１ および Ｂ−２ は類似の構造および同じ生物活性を示す。Ａ−１ ペプチドにおける特に重要な側鎖は ３ 位のフェニルアラニン （Ｐｈｅ） および ７ 位のチロシン （Ｔｙｒ） である。ペプチド Ｂ−２ における対応のアミノ酸は ３ 位のフェニルアラニン （Ｐｈｅ） および ７ 位のチロシン （Ｔｙｒ） である。
【０１６２】
配列 Ａ−１ および Ｂ−２ において、剛性β−ターンが ３ 位のフェニルアラニン （Ｐｈｅ） および ７ 位のチロシン （Ｔｙｒ） の芳香族側鎖の位置を安定にする。この構造は、ペプチド Ａ−１ において、４ 位のトレオニン （Ｔｈｒ） のカルボニルと ７ 位のチロシン （Ｔｙｒ） のアミドの水素との水素結合により安定となる。この構造は、ペプチド Ｂ−２ において、４ 位のアラニン （Ａｌａ） のカルボニルと ７ 位のチロシン （Ｔｙｒ） のアミドの水素との水素結合により安定となる。
【０１６３】
ペプチド Ｃ−４ の特に重要なアミノ酸は ４ 位のチロシン（Ｔｙｒ） および １１ 位のトリプトファン （Ｔｒｐ） である。この構造は２ジスルフィド橋により安定となる：第１は位置 Ｃｙｓ１ と Ｃｙｓ１３ の間、第２は位置 Ｃｙｓ５ と Ｃｙｓ１０ の間。
【０１６４】
図 ２７ａ − ２７ｃ は、ＤＭＳＯ−ｄ６ 中のペプチド Ａ−１、Ｂ−２、Ｃ−４ の有意の ＮＯＥ−相関関係を示す。相対的交差ピーク強度を量積分から検査した。記号 ｓ および ｍ は残基内 ｄＨαＮＨ（ｉ，ｉ） の相対的に強いおよび中程度の強度を意味する。記号 ＊ はなんらかの他の ＮＯＥ により妨害された ＮＯＥ 相関関係を意味する。“他の”相互作用として表示された ＮＯＥ は、長期間主鎖−主鎖、側鎖−主鎖、側鎖−側鎖の相互作用を含む。
【０１６５】
図 ２８ はペプチド Ａ−１ の三次元構造を、図 ２９ はペプチド Ｂ−２ の三次元構造を、図 ３０ はペプチド Ｃ−４ の三次元構造を示す。構造は、上記のデータおよび下記の表から計算した。
【０１６６】
表６．ＰＳＡ−結合ペプチドの １Ｈ 化学シフトおよびアミドプロトン温度係数
【表６】
2004509976.tif 000007
【０１６７】
表７．ペプチド Ａ−１、Ｂ−２、Ｃ−４ およびこれらの修飾の活性。ＰＳＡ−ペプチド／ＰＳＡ 比 ＞１．１ のペプチドを活性とする。
【表７】
2004509976.tif 000008
【０１６８】
表８．ＮＭＲ 試験およびアミノ酸位置のための合成ペプチド
【表８】
2004509976.tif 000009
【０１６９】
参考文献
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【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、ＧＳＴ−ペプチドの固定化 ＰＳＡ との結合を示す。
【図２】図２は、ＧＳＴ−ペプチドの固定化 ＰＳＡ との結合に対する Ｚｎ２＋ の作用を示す。
【図３】図３は、ＧＳＴ−Ｃ−４ の固相 ＰＳＡ との結合に対する ＰＳＡ 溶液の作用を示す。
【図４ａ】図４ａは、それぞれ、ＧＳＴ−ペプチドの、ＰＳＡ に関連する種々のプロテイナーゼおよび ＰＳＡ−セルピン複合体との反応性を示す。
【図４ｂ】図４ｂは、それぞれ、ＧＳＴ−ペプチドの、ＰＳＡ に関連する種々のプロテイナーゼおよび ＰＳＡ−セルピン複合体との反応性を示す。
【図５】図５は、ゲルろ過による ＧＳＴ−Ｃ−４ の分別を示す。
【図６】図６は、ＧＳＴ ペプチドのプロ酵素型 ＰＳＡ および活性 ＰＳＡ との結合を示す。
【図７】図７は、化学合成ペプチドの、ＧＳＴ−Ｃ−４ の固相 ＰＳＡ との結合に対する作用を示す。
【図８】図８は、ＧＳＴ−Ｃ−４ の ＰＳＡ 酵素活性に対する作用を示す。
【図９】図９は、化学合成ペプチド Ｃ−４ の ＰＳＡ 酵素活性に対する作用を示す。
【図１０】図１０は、化学合成ペプチド Ｃ−４ および Ａ−１ の、ＰＳＡ の ＩＧＦ−ＢＰ−３ へのタンパク分解活性に対する作用を示す。
【図１１】図１１は、ＧＳＴ−Ｃ−４ と Ｚｎ２＋ の ＰＳＡ 酵素活性に対する併用効果を示す。
【図１２】図１２は、化学合成ペプチド Ｃ−４ の、ＰＳＡ − Ａ２Ｍ 複合体の酵素活性に対する作用を示す。
【図１３】図１３は、誘導ペプチド Ｂ２ の構造を示す。
【図１４】図１４は、誘導ペプチド Ｃ４ の構造を示す。
【図１５】図１５は、ＳＫＳＫＳＫＳ−テイル化ペプチド Ｃ４ の ＰＳＡ 酵素活性に対する作用を示す。
【図１６】図１６は、ペプチド Ｃ４ の Ｅｕ−標識反応混合物のフラクション化を示す。
【図１７】図１７は、図１６に示す Ｃ１８ クロマトグラフィーの種々のフラクションの、ＰＳＡ 酵素活性に対する作用を示す。
【図１８】図１８は、テクネチウム標識の、Ｃ４−ペプチドの結合活性に対する作用を示す。
【図１９】図１９は、ヨウ素化の、Ｃ４ ペプチドの ＰＳＡ 結合活性に対する作用を示す。
【図２０】図２０は、１００ μＭ Ｚｎ２＋ の存在下での Ｂ２ ペプチド アフィニティークロマトグラフィーによる精液血漿サンプルのフラクション化を示す。
【図２１】図２１は、Ｚｎ２＋ 不存在で上記図２０の精液血漿サンプルのフラクション化を示す。
【図２２】図２２は、異なるｐＨ値での Ｃ４−ペプチドカラムからの ＰＳＡ の溶出を示す。
【図２３】図２３は、ペプチド Ｂ２ のアフィニティーカラムから得られた ＰＳＡ−含有フラクションの、非還元条件下での ＳＤＳ−ＰＡＧＥ 後のイムノブロット分析を示す。
【図２４】図２４は、還元条件下での ＳＤＳ−ＰＡＧＥ 後の対応する（参照、図２３）イムノブロット分析を示す。
【図２５】図２５は、ペプチド Ｂ２ カラムによりフラクション化された精液の、非還元条件下での ＳＤＳ−ＰＡＧＥ を示す。
【図２６】図２６ａ−ｃは、Ａ−１ （ａ）、Ｂ−２ （ｂ）、Ｃ−４ （ｃ） についてランダムコイルにおける ＣαＨ 化学シフト値と ＤＭＳＯ−ｄ６ において実験的に測定された値との相違を示す。
【図２７】図２７ａ−ｃは、ＤＭＳＯ−ｄ６ におけるペプチド Ａ−１、Ｂ−２、Ｃ−４ の有意の ＮＯＥ−相関関係を示す。
【図２８】図２８は、ペプチド Ａ−１ の三次元構造を示す。
【図２９】図２９は、ペプチド Ｂ−２ の三次元構造を示す。
【図３０】図３０は、ペプチド Ｃ−４ の三次元構造を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４ａ】
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【図４ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２６】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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