(57)【要約】本発明は、新しいＳＮＰを含むＩＦＮα−１４遺伝子のヌクレオチド配列から誘導された新しいポリヌクレオチド、及び本発明の少なくとも１つのＳＮＰによりひき起こされる少なくとも１つの突然変異を含む天然の野生型ＩＦＮα−１４タンパク質から誘導された新しいポリペプチドに、ならびに治療を目的としたそれらの使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）  配列番号１のヌクレオチド配列の全部又は一部分、但し、そのヌクレオチド配列はｇ４５１ｃ、ｃ５４２ｔ、ｃ７４２ｇ、ｃ８０４ｔ、ａ８７５ｇ、ｃ１２９８ａ、ｇ１３１８ａ、ｇ１３９７ａ、ｃ１４２３ｔ、ｃ１４５６ｔ、ｇ１５１２ａから成る群から選択される少なくとも１つのＳＮＰを含む；又は、
ｂ）  ａ）に基づくヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列、
を含む単離ポリヌクレオチド。
【請求項２】
その配列がｇ１３１８ａ、ｃ１４２３ｔ、ｃ１４５６ｔから成る群から選択される少なくとも１つのコーディングＳＮＰを含有することを条件として、配列番号１のヌクレオチド９３６〜１５０５を含む、請求項１に記載の単離ポリヌクレオチド。
【請求項３】
前記ポリヌクレオチドが、少なくとも１０個のヌクレオチドで構成されている、請求項１に記載の単離ポリヌクレオチド。
【請求項４】
Ｇ１２８Ｅ、Ａ１６３Ｖ、Ｓ１７４Ｆから成る群から選択される少なくとも１つのコーディングＳＮＰを有する、配列番号２のアミノ酸配列の全部又は一部分を含むポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチド。
【請求項５】
コーディングＳＮＰＳ１７４Ｆを有し、かつ、配列番号２のアミノ酸配列の全部又は一部分を含むポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチド。
【請求項６】
配列番号１のヌクレオチド配列と８０〜１００％の同一性をもつポリヌクレオチドの全部又は一部分を同定又は増幅するための方法であって、好適なハイブリダイゼーション条件下で当該ポリヌクレオチドを請求項１に記載のポリヌクレオチドとハイブリッド形成させることを含む前記方法。
【請求項７】
被験者又は被験者母集団のゲノムＤＮＡ内の着目の領域を増幅するステップ及び４５１、５４２、７４２、８０４、８７５、１２９８、１３１８、１３９７、１４２３、１４５６、１５１２から成る群から選択される配列番号１のヌクレオチド配列内の少なくとも１つの位置の対立遺伝子を決定するステップを含む、配列番号１のヌクレオチド配列と８０〜１００％の同一性を有するポリヌクレオチドの全部又は一部分の遺伝子型を特定するための方法。
【請求項８】
前記遺伝子型特定が、ミニシークエンス法により実施される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
請求項１に記載のポリヌクレオチドを含む組換えベクター。
【請求項１０】
請求項９に記載の組換えベクターを含む宿主細胞。
【請求項１１】
ポリペプチドを分離するための方法であって、培地中で請求項１０に記載の宿主細胞を培養するステップ、及び当該培地から上記ポリペプチドを分離する段階を含む前記方法。
【請求項１２】
請求項１に記載の単離されたポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド。
【請求項１３】
配列番号２のアミノ酸配列の全部又は一部分を含み、Ｇ１２８Ｅ、Ａ１６３Ｖ及びＳ１７４Ｆから成る群から選択される少なくとも１つのコーディングＳＮＰを有する単離ポリペプチド。
【請求項１４】
配列番号２のアミノ酸配列のアミノ酸２４〜１８９を含み、Ｇ１２８Ｅ、Ａ１６３Ｖ及びＳ１７４Ｆから成る群から選択される少なくとも１つのコーディングＳＮＰを有する、請求項１２に記載のポリペプチド。
【請求項１５】
配列番号２のアミノ酸配列のアミノ酸２４〜１８９を含み、コーディングＳＮＰＳ１７４Ｆを有する、請求項１２に記載のポリペプチド。
【請求項１６】
請求項１２に記載のポリペプチドで動物を免疫化するステップ及び前記動物から抗体を回収するステップを含む、免疫特異的抗体の取得方法。
【請求項１７】
請求項１６に記載の方法により得られた免疫特異的抗体。
【請求項１８】
配列番号２のアミノ酸配列の全部又は一部分を含み、かつ、Ｇ１２８Ｅ、Ａ１６３Ｖ及びＳ１７４Ｆから成る群から選択される少なくとも１つのコーディングＳＮＰを有する単離されたポリペプチドの活性を活性化又は阻害する１つの作用物質を試験対象の単数又は複数の化合物の中から同定するための方法において、
ａ）  請求項９に記載の組換えベクターを含む宿主細胞を提供するステップ、
ｂ）  試験対象の前記化合物と前記宿主細胞を接触させるステップ、
ｃ）  前記ポリペプチドの活性に対する活性化又は阻害効果を決定し、かくして前記活性化又は阻害用作用物質を同定するステップ、
を含む前記方法。
【請求項１９】
配列番号２のアミノ酸配列の全部又は一部分を含み、かつ、Ｇ１２８Ｅ、Ａ１６３Ｖ及びＳ１７４Ｆから成る群から選択される少なくとも１つのコーディングＳＮＰを有する単離されたポリペプチドによって、その活性が増強又は阻害される１つの作用物質を試験対象の単数又は複数の化合物の中から同定するための方法であって、
ａ）  請求項９に記載の組換え型ベクターを含む宿主細胞を提供するステップ、
ｂ）  試験対象の前記化合物と前記宿主細胞を接触させるステップ、
ｃ）  前記作用物質の活性に対する増強又は阻害効果を決定し、かくして前記増強又は阻害された作用物質を同定するステップ、
を含む前記方法。
【請求項２０】
被験者の生物学的特徴を分析するための方法であって、
ａ）  被験者のゲノム内で、請求項１に記載のポリヌクレオチドの存在又は不在を決定するステップ；
ｂ）  被験者の体内で、請求項１に記載のポリヌクレオチドの発現レベルを測定するステップ；
ｃ）  被験者の体内で請求項１２に記載のポリペプチドの存在又は不在を決定するステップ；
ｄ）  被験者の体内で請求項１２に記載のポリペプチドの濃度を測定するステップ；又は、
ｅ）  被験者の体内で請求項１２に記載のポリペプチドの機能性を測定するステップ、
のうちの少なくとも１つのステップを実施することを含む前記方法。
【請求項２１】
その配列がｇ４５１ｃ、ｃ５４２ｔ、ｃ７４２ｇ、ｃ８０４ｔ、ａ８７５ｇ、ｃ１２９８ａ、ｇ１３１８ａ、ｇ１３９７ａ、ｃ１４２３ｔ、ｃ１４５６ｔ、及びｇ１５１２ａから成るグループの中から選択された少なくとも１つのＳＮＰを含むことを条件として、配列番号１のヌクレオチド配列の全部又は一部分；又は、前記ヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列、を含む単離ポリヌクレオチド；前記ポリヌクレオチドを含む組換えベクター；前記組換えベクターを含む宿主細胞；配列番号２のアミノ酸配列の全部又は一部分を含み、Ｇ１２８Ｅ、Ａ１６３Ｖ及びＳ１７４Ｆから成る群から選択される少なくとも１つのコーディングＳＮＰを有する単離ポリペプチド；前記ポリペプチドに特異的な抗体から成る群から選択される単数又は複数の化合物を含む治療用剤。
【請求項２２】
癌及び腫瘍、感染症、免疫学的及び自己免疫学的関連疾患、心循環器疾患、代謝病、中枢神経疾患、及び化学療法治療に関係する障害から成る群から選択される１つの疾患を個体において予防又は治療するための方法であって、治療上有効な量の請求項２１に記載の作用物質及び薬学的に受容可能な賦形剤を前記個体に投与するステップを含む前記方法。
【請求項２３】
前記癌及び腫瘍が、転移性の腎癌、黒色腫、濾胞性リンパ腫及び皮膚Ｔ細胞性リンパ腫を含むリンパ腫、ヘアリー細胞白血病、慢性リンパ性白血病及び慢性骨髄性白血病を含む白血病、肝臓、首、頭及び腎臓の癌、多発性骨髄腫、カルチノイド腫瘍及びエイズの場合の如きカポジ肉腫を含む免疫不全症に続いて出現する腫瘍を含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記代謝病が、肥満症といったような非免疫関連疾患を含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
前記感染症が、慢性Ｂ型及びＣ型肝炎及びＨＩＶ／ＡＩＤＳを含むウイルス感染、感染性肺炎及び生殖器症といったような性病を含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２６】
中枢神経系の前記疾病には、アルツハイマー病、パーキンソン病、統合失調症及びうつ病が含まれる、請求項２２に記載の方法。
【請求項２７】
前記免疫学的又は自己免疫学的関連疾患には、組織又は器官移植片の拒絶、アレルギー、喘息、乾癬、関節リウマチ、多発性硬化症、クローン病及び潰瘍性大腸炎が含まれる、請求項２２に記載の方法。
【請求項２８】
外傷の治癒、透析患者における貧血症、及び／又は骨粗鬆症から成るグループの中から選択された１つの疾患を個体内で予防又は治療する方法であって、前記個体に対し治療上有効量の請求項２１に記載の作用物質及び薬学的に受容可能な賦形剤を投与するステップを含む前記方法。
【請求項２９】
そのヌクレオチド配列がｇ４５１ｃ、ｃ５４２ｔ、ｃ７４２ｇ、ｃ８０４ｔ、ａ８７５ｇ、ｃ１２９８ａ、ｇ１３１８ａ、ｇ１３９７ａ、ｃ１４２３ｔ、ｃ１４５６ｔ、及びｇ１５１２ａから成るグループの中から選択された少なくとも１つのＳＮＰを含むことを条件として、配列番号１のヌクレオチド配列の全部又は一部分；又は、前記ヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列、を含む単離ポリヌクレオチド；前記ポリヌクレオチドを含む組換えベクター；前記組換えベクターを含む宿主細胞（ここで、この宿主細胞は、治療対象の前記被験者から得ることができる）；配列番号２のアミノ酸配列の全部又は一部分を含み、Ｇ１２８Ｅ、Ａ１６３Ｖ及びＳ１７４Ｆから成る群から選択される少なくとも１つのコーディングＳＮＰを有する単離ポリペプチド；前記ポリペプチドに特異的な抗体及び薬学的に受容可能な賦形剤のうちの単数又は複数のものを治療上有効量を投与するステップを含む、請求項１２に記載のポリペプチドの被験者体内での活性を増加又は減少させるための方法。
【請求項３０】
ｇ４５１ｃ、ｃ５４２ｔ、ｃ７４２ｇ、ｃ８０４ｔ、ａ８７５ｇ、ｃ１２９８ａ、ｇ１３１８ａ、ｇ１３９７ａ、ｃ１４２３ｔ、ｃ１４５６ｔ、及びｇ１５１２ａから成る群から選択される少なくとも１つのＳＮＰを有する、配列番号１のヌクレオチド配列の全部又は一部分；又は、前記ヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列、を含む単離されたポリヌクレオチド；前記ポリヌクレオチドを含む組換えベクター；前記組換えベクターを含む宿主細胞；配列番号２のアミノ酸配列の全部又は一部分を含み、Ｇ１２８Ｅ、Ａ１６３Ｖ及びＳ１７４Ｆから成る群から選択される少なくとも１つのコーディングＳＮＰを有する単離ポリペプチド；前記ポリペプチドに特異的な抗体及び薬学的に受容可能な賦形剤のうちの単数又は複数のものを治療上有効量を投与するステップを含む、１個体において請求項１のポリヌクレオチドの該個体のゲノム内の存在に関連する障害または疾病を予防又は治療するための方法。
【請求項３１】
ＩＦＮα−１４遺伝子内のｇ４５１ｃ、ｃ５４２ｔ、ｃ７４２ｇ、ｃ８０４ｔ、ａ８７５ｇ、ｃ１２９８ａ、ｇ１３１８ａ、ｇ１３９７ａ、ｃ１４２３ｔ、ｃ１４５６ｔ、及びｇ１５１２ａ、から成る群から選択される少なくとも１つのＳＮＰの間の統計的に該当する関連及び疾病又は疾病に対する抵抗力を決定するための方法であって、
ａ）  個体群の遺伝子型を特定するステップ；
ｂ）  前記個体群の中の前記疾病又は疾病に対する抵抗力の分布を測定するステップ；
ｃ）  前記疾病又は疾病に対する抵抗力の分布と遺伝子型データを比較するステップ；及び
ｄ）  統計的に該当する関連について前記比較を分析するステップ；
を含む前記方法。
【請求項３２】
ＩＦＮα−１４遺伝子内のｇ４５１ｃ、ｃ５４２ｔ、ｃ７４２ｇ、ｃ８０４ｔ、ａ８７５ｇ、ｃ１２９８ａ、ｇ１３１８ａ、ｇ１３９７ａ、ｃ１４２３ｔ、ｃ１４５６ｔ、及びｇ１５１２ａから成る群から選択される少なくとも１つのＳＮＰを検出するステップを含む、１つの疾病又は疾病に対する抵抗力の予後を診断又は決定するための方法。
【請求項３３】
Ｓ１７４Ｆでの突然変異を受けたＩＦＮα−１４遺伝子産物の活性に実質的に類似する生物活性をもつ化合物を単数又は複数の試験対象化合物の中で同定するための方法であって、
ａ）  シグナル形質導入、樹状細胞の成熟、ＣＤ４＋又はＣＤ８＋Ｔリンパ球によるサイトカインの放出、単球によるサイトカインの放出、in vitro又はin vivoの抗ウイルス活性、悪性赤白血病細胞の接種を以前に受けたマウスの体内での抗腫瘍活性、Daudi Barkitt細胞系統に対する細胞抗増殖活性、ＴＦ−１細胞系統に対する細胞抗増殖活性といった、前記化合物の生物活性を測定するステップ；
ｂ）  Ｓ１７４Ｆでの突然変異を受けたＩＦＮα−１４遺伝子産物の活性と前記化合物の段階ａ）で測定された活性を比較するステップ；
ｃ）  段階ｂ）で実施された比較に基づいて、Ｓ１７４Ｆでの突然変異を受けたＩＦＮα−１４遺伝子産物に比べて前記化合物が実質的に類似の活性又は低い活性又は高い活性のいずれを有するかを決定するステップ；
を含む前記方法。
【請求項３４】
前記試験対象化合物が、合成ペプチド組合せライブラリ、高生産性スクリーニングから同定されるか又は、アミノ酸配列がＳ１７４ＦＳＮＰを含むことを条件として配列番号２のアミノ酸配列の位置２４と１８９の間に内含されるアミノ酸を含むアミノ酸配列又は配列番号２のポリペプチドのものと同じ三次元構造をもつようにコンピュータ援用薬物設計によって設計されている、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
請求項３３に記載の方法により同定される化合物。
【請求項３６】
癌及び腫瘍、感染症、免疫学的及び自己免疫学的関連疾患、心循環器疾患、代謝病、中枢神経疾患、及び化学療法治療に関係する障害から成る群から選択される１つの疾患を個体において予防又は治療するための方法であって、治療上有効な量の請求項３５に記載の化合物及び薬学的に受容可能な賦形剤を前記個体に投与するステップを含む前記方法。
【請求項３７】
前記癌及び腫瘍が、転移性の腎癌、黒色腫、濾胞性リンパ腫及び皮膚Ｔ細胞性リンパ腫を含むリンパ腫、ヘアリー細胞白血病、慢性リンパ性白血病及び慢性骨髄性白血病を含む白血病、肝臓、首、頭及び腎臓の癌、多発性骨髄腫、カルチノイド腫瘍及びエイズの場合の如きカポジ肉腫を含む免疫不全症に続いて出現する腫瘍を含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記感染症が、慢性Ｂ型及びＣ型肝炎及びＨＩＶ／ＡＩＤＳを含めたウイルス感染、感染性肺炎及び生殖器症の如き性病を含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項３９】
前記免疫学的又は自己免疫学的関連疾患には、組織又は器官移植片の拒絶、アレルギー、喘息、乾癬、関節リウマチ、多発性硬化症、クローン病及び潰瘍性大腸炎が含まれる、請求項３６に記載の方法。
【請求項４０】
中枢神経系の前記疾病には、アルツハイマー病、パーキンソン病、統合失調症及びうつ病が含まれる、請求項３６に記載の方法。
【請求項４１】
前記代謝病が、肥満症の如き非免疫関連疾患を含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項４２】
外傷の治癒、透析患者における貧血症、及び／又は骨粗鬆症から成る群から選択される１つの疾患を個体内で予防又は治療する方法において、前記個体に対し治療上有効量の請求項３５に記載の化合物及び薬学的に受容可能な賦形剤を投与するステップを含む前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願：
本発明は、「インタフェロン・アルファ１４の新しいポリヌクレオチド及びポリペプチド（Nouveaux polyrucleotides et polypeptides）」と題する２００１年５月２３日付けフランス特許出願第０１０６８２７号に基づく優先権を請求する。
発明の背景
発明の分野
本発明は、新しいＳＮＰを含むＩＦＮα−１４遺伝子のヌクレオチド配列から誘導された新しいポリヌクレオチド及びこれらのＳＮＰによりひき起こされる突然変異を含む天然の野生型ＩＦＮα−１４タンパク質から誘導された新しいポリペプチド、ならびに治療を目的としたそれらの使用、に関する。
【背景技術】
【０００２】
関連技術
以下ＩＦＮα−１４と呼ぶインタフェロン・アルファ１４遺伝子は、１７８４個のヌクレオチドから成るヌクレオチド配列を有する。この配列は、ＡＬ３５３７３２という受入れ番号をもつクローンＨＴＧ由来の最初の６５８個のヌクレオチドと、それに続くＸ０２９５９というGen Bankでの受入れ番号をもつヌクレオチド配列の１１２６個のヌクレオチドに対応している。
【０００３】
ヌクレオチド配列Ｘ０２９５９は、以下の刊行物の中で記述されている。
−  Goeddl D.V. et al.；「８個の全く異なるクローニングされたヒト白血球インタフェロンｃＤＮＡの構造」；Nature 290 (5801) ; 20-26 (1981)。
−  Lawn RM. et al. 「２つの密にリンクされたヒト白血球インタフェロン遺伝子のＤＮＡ配列」Science 212 (4499) ; 1159-1162 (1981)。
−  Olopade O.I. et al. ；「ヒトの腫瘍形成に付随する染色体９の短腕の欠失の最短重複領域の遺伝地図作製」；Genomics 14 ; 437-443 ; 1992。
ＩＦＮαは、その細胞抗増殖効果及び抗ウイルス及び抗寄生虫応答への関与で知られている。
【０００４】
ＩＦＮαは同様に、造血基幹細胞レベルにおけるその他の複数のサイトカンイの発現を阻害しかつ或る種の腫瘍の細胞増殖を阻害することでも知られている。
【０００５】
ＩＦＮαは同様に、腎臓癌腫内でＥＧＦに対するレセプタの発現を低減させること、或る種のミトコンドリア遺伝子の発現を阻害すること、特にin vitroで線維芽細胞、単球及びＢリンパ球の増殖を阻害すること、そしてＢリンパ球による抗体の合成を遮断することでも知られている。
【０００６】
ＩＦＮαは同様に、腫瘍細胞の表面上の腫瘍特異的抗原の発現を誘発すること、そして又、ＩＳＲＥ（インタフェロン刺激応答要素）の特異的転写因子に作用することにより該ＩＳＲＥタイプのプロモータ領域の制御下に置かれた遺伝子を誘発することでも知られている。
【０００７】
ＩＦＮαは、例えば癌腫、黒色腫、リンパ腫、白血病及び肝臓、首、頭、及び腎臓の癌といった異なる癌、心循環器疾患、例えば肥満症といったような免疫系と関係しないものなどの代謝病、Ｂ型及びＣ型肝炎及びエイズ、肺炎、潰瘍性大腸炎といったような感染症、例えば、アルツハイマー病、統合失調症及びうつ病といった中枢神経系の疾病、組織又は器官移植片の拒絶、外傷の治癒、透析患者における貧血症、アレルギー、喘息、多発性硬化症、骨粗鬆症、乾癬、関節リウマチ、クローン病、自己免疫疾患及び障害、胃腸障害さらには化学療法治療と関連する障害などの異なる障害及び／又はヒトの疾病に関与しているということがわかっている。
【０００８】
ＩＦＮαは特に、或る種の白血病、転移性腎臓癌腫ならびにエイズの場合のカポジ肉腫といったような免疫不全に続いて出現する腫瘍の治療に使用される。ＩＦＮαは又、その他のタイプの腫瘍及び或る種の及び或る種のウイルス感染に対しても同様に有効である。ＩＦＮαは同じく、ＦＤＡ（食品医薬品局）によって、生殖器症又は性病の治療用にも認知されている。
【０００９】
しかしながら、ＩＦＮα、特にＩＦＮα−１４は、薬学組成物中で使用された場合、急性過敏症反応（じんましん、気管支収縮、アナフィラキシーショックなど）の反応、心臓不整脈、低血圧、てんかん性発作、甲状腺機能不全、インフルエンザに似た症候（発熱、発汗、筋肉痛）などといった数多くの副作用をもつ。
【００１０】
その上、ＩＦＮαでの治療を受ける患者は、これらの分子を中和しかくしてその有効性を低下させる抗体を発生させる可能性がある。
【００１１】
発明者らは、天然の野生型ＩＦＮα−１４タンパク質から異なる機能性をもつことのできるＩＦＮα−１４に対する新しいポリペプチド及び新しいポリヌクレオチド類似体を発見した。
【００１２】
これらの新しいポリペプチド及びポリヌクレオチドは、特に、前述の疾病又は障害を治療するか又は予防しそれらに結びついた欠点の全て又は一部分を回避するために使用することができる。
【発明の開示】
【００１３】
発明の簡単な要約
本発明の第１の目的は、単数又は複数のＳＮＰ（単一ヌクレオチド多形態）を含むという点で基準野生型ＩＦＮα−１４遺伝子のヌクレオチド配列と異なっている新しいポリヌクレオチドにある。
【００１４】
ヒト基準野生型ＩＦＮα−１４遺伝子の配列番号１のヌクレオチド配列は、１７８４個のヌクレオチドで構成され、ヌクレオチド９３６（開始コドン）からヌクレオチド１５０５（停止コドン）までの５７０個のヌクレオチドのコーディング配列を含んで成る。
【００１５】
出願人は、基準野生型ＩＦＮα−１４遺伝子のヌクレオチド配列内に１１個のＳＮＰを同定した。これらの１１個のＳＮＰは、以下の通りである：ｇ４５１ｃ、ｃ５４２ｔ、ｃ７４２ｇ、ｃ８０４ｔ、ａ８７５ｇ、ｃ１２９８ａ、ｇ１３１８ａ、ｇ１３９７ａ、ｃ１４２３ｔ、ｃ１４５６ｔ、ｇ１５１２ａ。
【００１６】
本発明の意味合いにおいては、以上で定義されたＳＮＰの位置づけに対応する番号づけは、配列番号１のヌクレオチド配列の番号付けとの関係におけるものであるということが理解される。
【００１７】
文字ａ、ｔ、ｃ及びｇは、それぞれ、窒素塩基アデニン、チミン、シトシン及びグアニンに対応している。
【００１８】
最初の文字は、野生型ヌクレオチドに対応し、一方最後の文字は突然変異を受けたヌクレオチドに対応する。
【００１９】
かくして、例えば、ＳＮＰｃ１４５６ｔは、基準野生型ＩＦＮα−１４遺伝子の配列番号１のヌクレオチド配列の位置１４５６にあるヌクレオチドシトシン（ｃ）の、ヌクレオチドチミン（ｔ）への突然変異に対応している。
【００２０】
これらのＳＮＰは、本書に参考として引用されている２０００年１２月６日付けで提出された「予め選択された機能的候補遺伝子のヌクレオチド配列内の単数又は複数の機能的多形態の決定方法及びその応用」という題の出願人の特許出願ＦＲ００２２８９４の中で記述されている決定プロセスを用いて、出願人により同定された。
【００２１】
この特許出願の中で記述されているプロセスは、個体の無作為母集団からの少なくとも１つの個体における１つ（又は複数）の既存のＳＮＰの同定を可能にする。
本発明の範囲内では、例えばコーディング配列を含むＩＦＮα−１４遺伝子のヌクレオチド配列の１フラグメントが、無作為に選択された個体母集団内の異なる個体から単離された。
次に、ＤＨＰＬＣ（「変性高性能液体クロマトグラフィ」）による分析の後、ヘテロテンプレックスプロフィール（すなわち基準野生型ＩＦＮα−１４遺伝子配列のものとは異なるプロフィール）をもつこれらの標本のうちのいくつかについて、これらのフラグメントの配列決定が実施された。
【００２２】
この要領で配列決定されたフラグメントは、次に同定された本発明と適合したＳＮＰ及び基準野生型ＩＦＮα−１４遺伝子のフラグメントのヌクレオチド配列と比較された。
かくして、ＳＮＰは天然のものであり、その各々が世界中の母集団の或る個体において存在している。
【００２３】
基準野生型ＩＦＮα−１４遺伝子は、最初の２３個のアミノ酸を内含するシグナルペプチドの分割により１６６個のアミノ酸の成熟タンパク質へと転換されることになる、配列番号２のアミノ酸配列に対応する１８９個のアミノ酸の未成熟タンパク質についてコードする。
【００２４】
本発明のコーディングＳＮＰ、すなわちｇ１３１８ａ、ｃ１４２３ｔ、ｃ１４５６ｔの各々は、アミノ酸配列のレベルで、ＩＦＮα−１４遺伝子のヌクレオチド配列によりコードされたタンパク質の修飾をひき起こす。
【００２５】
アミノ酸配列のこれらの修飾は、以下のとおりである；
ＳＮＰ ｇ１３１８ａは、グルタミン酸（Ｅ）内の配列番号２のアミノ酸配列に対応するＩＦＮα−１４遺伝子の未成熟タンパク質内の位置１２８及び成熟タンパク質の位置１０５で、アミノ酸グリシン（Ｇ）の突然変異をひき起こす。本発明の記述においては、それぞれ成熟タンパク質又は未成熟タンパク質のいずれに言及しているのかに応じてこのＳＮＰによりコードされた突然変異を無差別にＧ１０５Ｅ及びＧ１２８Ｅと呼ぶ。
【００２６】
ＳＮＰ ｃ１４２３ｔは、バリン（Ｖ）内の配列番号２のアミノ酸配列に対応するＩＦＮα−１４遺伝子の未成熟タンパク質内の位置１６３及び成熟タンパク質の位置１４０で、アミノ酸アラニン（Ａ）の突然変異をひき起こす。本発明の記述においては、それぞれ成熟タンパク質又は未成熟タンパク質のいずれに言及しているのかに応じてこのＳＮＰによりコードされた突然変異を無差別にＡ１４０Ｖ及びＡ１６３Ｖと呼ぶ。
【００２７】
ＳＮＰ ｃ１４５６ｔは、フェニルアラニン（Ｆ）内の配列番号２のアミノ酸配列に対応するＩＦＮα−１４遺伝子の未成熟タンパク質内の位置１７４及び成熟タンパク質の位置１５１で、アミノ酸セリン（Ｓ）の突然変異をひき起こす。本発明の記述においては、それぞれ成熟タンパク質又は未成熟タンパク質のいずれに言及しているのかに応じてこのＳＮＰによりコードされた突然変異を無差別にＳ１５１Ｆ及びＳ１７４Ｆと呼ぶ。
【００２８】
ＳＮＰｇ１３１８ａ、ｃ１４２３ｔ、ｃ１４５６ｔは、野生型基準ＩＦＮα−１４遺伝子のヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチドと比較した、本発明に適合したポリペプチドの空間立体配座の修飾をひき起こす。
これらの修飾は、例えば、モデリングツール折畳み認識（例えばＳＥＱＦＯＬＤ／ＭＳＩ）、相同性（例えば、ＭＯＤＥＬＥＲ／ＭＳＩ）、静電界（ＤＥＬＰＨＩ／ＭＳＩ）、及び／又は分子シミュレーション（最小エネルギー立体配座ならびに分子系の動的軌跡を決定するために力場を用いる、例えばＤＩＳＣＯＶＥＲ／ＭＳＩ）を用いて、当業者にとっては周知の方法に従って、コンピュータを利用した分子モデリングによって観察することができる。
【００２９】
かかるモデルの例は、以下、実験の部で示されている。
コンピュータを利用した分子モデリングは、突然変異を受けた成熟タンパク質上の突然変異 Ｇ１０５Ｅには、らせんＣとらせんＤをリンクさせるいわゆる「ＣＤ」ループの向所的変形が関与する、ということを示している。
【００３０】
Ｇ１０５Ｅ突然変異は、位置１０５のグルタミン酸残基からのカルボニル基の原子酸素と、位置５４のイソロイシン残基からのペプチド骨格の窒素原子間の水素結合の形成をひき起こす。この水素結合がＣＤループをより剛性の高いものにする。
かくして突然変異を受けたタンパク質は、天然の野生型ＩＦＮα−１４タンパク質と異なる三次元立体配座を有する。
【００３１】
従って、コンピュータを利用した分子モデリングは、位置１０５におけるグルタミン酸の存在には、天然野生型ＩＦＮα−１４タンパク質の構造及び機能の有意な修飾が関与することを予測している。
【００３２】
コンピュータを利用した分子モデリングは、突然変異を受けた成熟タンパク質上の突然変異Ａ１４０Ｖには、らせんＤの端部の三次元構造の修飾及び位置１３８のプロリン残基の移動が関与することを示している。
位置３２のアスパラギン酸残基、位置１３０のチロシン残基、位置１３４のリシン残基及び位置１３７のセリン残基の側鎖も同じく、突然変異に起因する立体配座の変更を有する。
【００３３】
さらに、突然変異Ａ１４０Ｖは、塩架橋（Ｄ３２−Ｋ１３４）の形成をもひき起こし、突然変異を受けたＩＦＮα−１４タンパク質の構造をより剛性の強いものにする。
かくして、突然変異を受けたタンパク質は、天然野生型ＩＦＮα−１４タンパク質とは異なる三次元立体配座を有する。
【００３４】
従って、コンピュータを利用した分子モデリングは、位置１４０におけるバリンの存在には、天然野性型ＩＦＮαー１４タンパク質の構造及び機能の有意な修飾が関与するということを予測している。
【００３５】
コンピュータを利用した分子モデリングは、突然変異を受けた成熟タンパク質上の突然変異Ｓ１５１ＦがらせんＥの強い混乱をひき起こすということを示している。実際、位置１５１にあるフェニルアラニン残基は、同じ位置のセリン残基に比べその立体障害が高いことから、周囲のアミノ酸の空間立体配座の変更をひき起こす。
【００３６】
さらに、位置１５１のフェニルアラニン芳香族環は、周囲のアミノ酸残基（Ｐｈｅ４３、Ｔｙｒ１２３）とのパイ−スタッキングの効果を増大させる。これは、らせんＥをこの部域内でより剛性の強いものにするのに寄与する。
かくして、突然変異を受けたタンパク質は、天然野性型ＩＦＮαー１４タンパク質とは異なる三次元立体配座を有する。
【００３７】
従って、コンピュータを利用した分子モデリングは、位置１５１におけるフェニルアラニンの存在には、天然野性型ＩＦＮα−１４タンパク質の構造及び機能の有意な修飾が関与することを予測している。特に、この突然変異がＩＦＮα−１４タンパク質のそのレセプタに対する親和性を変化させる確率は高い。
【００３８】
本発明に適合するその他のＳＮＰ、すなわち、ｇ４５１ｃ、ｃ５４２ｔ、ｃ７４２ｇ、ｃ８０４ｔ、ａ８７５ｇ、ｃ１２９８ａ、ｇ１３９７ａ、ｇ１５１２ａには、配列番号２のアミノ酸配列のレベルでのＩＦＮα−１４ ＧＹのヌクレオチド配列によってコードされたタンパク質の修飾は関与しない。
【００３９】
ＳＮＰ、ｃ１２９８ａ、ｇ１３９７ａは、サイレントであり、ＳＮＰ、ｇ４５１ｃ、ｃ５４２ｔ、ｃ７４２ｇ、ｃ８０４ｔ、ａ８７５ｇ、ｇ１５１２ａは、ノンコーディングである。本発明に適合したポリヌクレオチドの遺伝子型特定は、１つの母集団における、これらのポリヌクレオチドの対立遺伝子頻度を決定するような形で実施可能である。遺伝子型特定の例が、以下の実験の部で示されている。
【００４０】
本発明のポリペプチドの機能性の決定は同様に、その生物活性のテストによって実施可能である。
【００４１】
この点において、例えば、本発明に適合したポリペプチドのシグナル形質導入、樹状細胞の成熟、ＣＤ４＋又はＣＤ８＋Ｔリンパ球によるサイトカインの放出、単球によるサイトカインの放出、in vitro又はin vivoの抗ウイルス活性、悪性赤白血病細胞の接種を以前に受けたマウスの体内での抗腫瘍活性、Daudi Burkitt細胞系統に対する細胞抗増殖活性、ＴＦ−１細胞系統に対する細胞抗増殖活性といった、前記化合物の生物活性を測定し、市販用の製品の代表として選ばれた野生型ＩＦＮα−１４又は野生型ＩＦＮα−２と比較することが可能である。
【００４２】
本発明は同様に、本発明に適合したポリヌクレオチド及びポリペプチドならびにこれらのポリヌクレオチド及びポリペプチドから出発して得られかつ／又は同定された治療用分子の、或る種の人間の障害及び／又は疾病の予防及び治療のための使用をもその目的としている。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４３】
発明の詳細な説明
定義
「基準野生型遺伝子のヌクレオチド配列」は、ヒトＩＦＮα−１４ 遺伝子の配列番号１のヌクレオチド配列として理解される。
配列番号１のヌクレオチド配列は、ＡＬ３５３７３２という受入れ番号をもつクローンＨＴＧからの最初の６５８個のヌクレオチドと、それに続くＸ０２９５９というGen Bankでの受入れ番号をもつヌクレオチド配列の１１２６個のヌクレオチドに対応する１７８４個のヌクレオチドで構成されている。ヌクレオチド配列 Ｘ０２９５９は、以下の刊行物の中で記述されている。
【００４４】
−  Goeddl D.V. et al.；「８個の全く異なるクローニングされたヒト白血球インタフェロンｃＤＮＡの構造」；Nature 290 (5801) ; 20-26 (1981)。
−  Lawn RM. et al. 「２つの密にリンクされたヒト白血球インタフェロン遺伝子のＤＮＡ配列」Science 212 (4499) ; 1159-1162 (1981)。
−  Olopade O.I. et al. ；「ヒトの腫瘍形成に付随する染色体９の短腕の欠失の最短重複領域の遺伝地図作製」；Genomics 14 ; 437-443 ; 1992。
【００４５】
「天然野性型ＩＦＮαー１４タンパク質」又は「野生型ＩＦＮα−１４タンパク質」は、基準野生型ＩＦＮα−１４遺伝子のヌクレオチド配列によってコードされた成熟タンパク質として理解される。天然野生型未成熟タンパク質 ＩＦＮα−１４は、配列番号２に示されているペプチド配列に対応する。
【００４６】
「ポリヌクレオチド」は、修飾された又は未修飾のＤＮＡ又はＲＮＡでありうるポリリボヌクレオチド又はポリデオキシリボヌクレオチドとして理解される。
【００４７】
ポリヌクレオチドという語は、例えば、１本鎖又は２本鎖のＤＮＡ、単数又は複数の１本鎖領域と単数又は複数の２本鎖領域の混合物から成るＤＮＡ、１本鎖又は２本鎖ＲＮＡ及び単数又は複数の１本鎖領域と単数又は複数の２本鎖領域の混合物から成るＲＮＡを内含する。ポリヌクレオチドという語は同様に、単数又は複数の３本鎖領域を内含するＲＮＡ及び／又はＤＮＡをも内含できる。ポリヌクレオチドという語は同様に、安定性又はその他の理由で修飾された骨格をもつような形で修飾された単数又は複数の塩基を含有するＤＮＡ及びＲＮＡとも理解される。修飾された塩基というのは、例えばイノシンといったような普通でない塩基として理解される。
【００４８】
「ポリペプチド」というのは、例えばイソステリックなペプチドの場合のように通常の又は修飾されたペプチド結合によって互いに接合された少なくとも２つのアミノ酸を含むペプチド、オリゴペプチド、オリゴマー又はタンパク質として理解される。
【００４９】
ポリペプチドは、遺伝子コードによって定義される２０個のアミノ酸以外のアミノ酸で構成され得る。ポリペプチドは同様に、翻訳後突然変異プロセスといった天然プロセスか又は当業者にとって周知である化学的プロセスによって修飾されたアミノ酸で構成され得る。かかる修飾は、文献中で充分に詳述されている。これらの修飾は、ペプチド骨格内、アミノ酸鎖内さらにはカルボキシ又はアミノ末端といったように、ポリペプチド内のどこにでも現われる可能性がある。
【００５０】
ポリペプチドは、ユビキチン化後に分岐されるか又は分岐を伴って又は伴わずに環状である可能性である。このタイプの修飾は、当業者にとっては周知のものである天然又は合成の翻訳後プロセスの結果でありうる。
【００５１】
例えば、ポリペプチド修飾は、アセチル化、アシル化、ＡＤＰ−リボシル化、アミド化、フラビンの共有結合による固定、ヘムの共有固定、ヌクレオチド又はヌクレオチド誘導体の共有固定、脂質又は脂質誘導体の共有固定、ホスファチジルイノシトールの共有固定、共有又は非共有架橋、環化、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、システイン形成、ピログルタメート形成、ホルミル化、ガンマ−カルボキシル化、ＰＥＧ化、ＧＰＩアンカー形成、水酸化、ヨウ素化、メチル化、ミリストイル化、酸化、タンパク質分解プロセス、ホスホリル化、プレニル化、ラセミ化、セネロイル化、サルフェート化、アルギニル化といったようなアミノ酸付加又はユビキチン化を含むものと理解される。かかる修飾は、文献中に充分詳述されている：「タンパク質−その構造及び分子特性」第２版、T. E. Creighton, New York, 1993、「タンパク質の翻訳後共有修飾」、B. C. Johnson, Ed., Academic Press, New York, 1983、Seifter et alの「タンパク質修飾及び非タンパク質補因子についての分析」、Meth. Enzymol. (1990) 182, 626-646、及びRattan et al. の「タンパク質合成；翻訳後の修飾及びエージング」、Ann NY Acad Sci (1992) 663: 48-62.
【００５２】
「単離されたポリヌクレオチド」又は「単離されたポリペプチド」というのは、人体から単離されたか又はその他の形で技術的プロセスによって産生された、それぞれ以前に定義づけされたようなポリヌクレオチド又はポリペプチドとして理解される。
【００５３】
「同一性」は、ヌクレオチド又はポリペプチドの配列同一性の尺度として理解される。
同一性は、当業者にとっては周知の語であり、文献中で充分に記述されている。「コンピュータを利用した分子生物学」、Lesk, A.M., Ed., Oxford University Press, New York, 1998；バイオコンピュータ情報処理及びゲノムプロジェクト、Smith, D.W., Ed., Academic Press, New York, 1993；配列データのコンピュータ解析、第Ｉ部、Griffin, A.M.及びGriffin H.G., Ed., Humana Press, New Jersey, 1994；及び、分子生物学における配列分析、von Heinje, G., Academic Press, 1987を参照のこと。
【００５４】
２つの配列の間の同一性及び類似性を決定するために一般に利用される方法も同様に充分文献中で記述されている。「巨大コンピュータへの指針」Martin J. Bishop, Ed, Academic Press, San Diego, 1994、及びCarillo H. and Lipton D., Siam J Applied Math (1988) 48: 1073.を参照のこと。
【００５５】
例えば配列番号１のヌクレオチド配列と少なくとも９５％の同一性をもつポリヌクレオチドは、この配列と比べた場合１００個のヌクレオチドに対して多くとも５箇所の突然変異しか含まないポリヌクレオチドである。
【００５６】
これらの突然変異箇所は、１つ（又は複数）のヌクレオチドの１つ（又は複数の）置換、付加及び／又は欠失でありうる。
同様にして、例えば配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性をもつポリペプチドは、この配列と比べた場合１００個のアミノ酸に対して多くとも５箇所しか突然変異を含まないポリペプチドである。
【００５７】
これらの突然変異箇所は、１つ（又は複数）のアミノ酸の１つ（又は複数の）置換、付加及び／又は欠失でありうる。
それぞれ配列番号１のヌクレオチド配列又は配列番号２のアミノ酸配列と完全に同一ではない本発明に従ったポリヌクレオチド及びポリペプチドは、これらの配列が本発明のＳＮＰのうち少なくとも１つを含むものと理解して、これらの配列の変異体とみなされる。
【００５８】
通常、本発明に従ったポリヌクレオチドは、本発明のＳＮＰのうち少なくとも１つを含む配列番号１のヌクレオチド配列と同じ又は事実上同じ生物活性を有する。
同様にして、本発明に従ったポリペプチドは、通常、本発明のコーディングＳＮＰのうちの少なくとも１つを含む配列番号２のアミノ酸配列と同じ又は事実上同じ生物活性を有する。
【００５９】
本発明に従った１つの変異体は、例えば、部位特異的突然変異誘発又は直接合成によって得ることができる。
【００６０】
「ＳＮＰ」というのは、ヌクレオチド配列内の塩基のあらゆる天然の変形形態であると理解される。ヌクレオチド配列上のＳＮＰは、コーディング、サイレント又はノンコーディングでありうる。
【００６１】
コーディングＳＮＰは、１つのヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸の配列内の１つのアミノ酸の修飾が関与するこのヌクレオチド配列のコーディング配列内に内含された多形態である。この場合、ＳＮＰという語は同様に、拡大して、アミノ酸配列内の１突然変異にもあてはまる。
【００６２】
サイレントＳＮＰは、１つのヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列内の１つのアミノ酸の修飾が関与しないこのヌクレオチド配列のコーディング配列に内含された多形態である。
【００６３】
ノンコーディングＳＮＰは、１つのヌクレオチド配列のノンコーディング配列に内含された多形態である。この多形態は、特に、イントロン、スプライシングゾーン、転写プロモータ又は部位エンハンサ配列の中に見い出すことができる。
【００６４】
「機能性ＳＮＰ」というのは、１つの機能性をもつ、ヌクレオチド配列又はアミノ酸配列内に内含されている、上述のようなＳＮＰであると理解される。
【００６５】
「機能性」というのは、ポリペプチド又はポリヌクレオチドの生物活性と理解される。
本発明に従ったポリペプチド又はポリヌクレオチドの機能性は、野生型基準遺伝子のヌクレオチド配列によりコードされたポリペプチドの又はこの後者のヌクレオチド配列の生物活性の保存、増加、減少又は抑制から成り得る。
【００６６】
本発明に従ったポリペプチド又はポリヌクレオチドの機能性は同様に、基準野生型遺伝子のヌクレオチド配列によりコードされたポリペプチド又はこの後者のヌクレオチド配列の生物活性の性質の変化から成る可能性もある。
生物活性は、特に、レセプタとの本発明に従ったポリペプチドの親和性又はその不在に結びつけることができる。
【００６７】
ポリヌクレオチド
本発明の第１の目的は、
ａ）  それがｇ１３１８ａ、ｃ１４２３ｔ、ｃ１４５６ｔというコーディングＳＮＰのうちの少なくとも１つを含むものとして、配列番号１という配列又はそのコーディング配列（ヌクレオチド９３６からヌクレオチド１５０５まで）と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらに一層好ましくは少なくとも９９％の同一性をもつヌクレオチド配列、又は
【００６８】
ｂ）  ａ）に基づくヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列を含む単離されたポリヌクレオチドにある。
【００６９】
本発明の意味合い上、番号付けは、配列番号１のヌクレオチド配列内のＳＮＰの位置づけに対応している。
【００７０】
本発明は、同様に、
ａ）  その各々が、ｇ１３１８ａ、ｃ１４２３ｔ、ｃ１４５６ｔというコーディングＳＮＰのうちの少なくとも１つを含むものとして、配列番号１のヌクレオチド配列又はそのコーディング配列、又は、
【００７１】
ｂ）  ａ）に基づくヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列、
を含む単離されたポリヌクレオチドにも関する。
【００７２】
好ましくは、本発明のポリヌクレオチドは、その各々がｇ１３１８ａ、ｃ１４２３ｔ、ｃ１４５６ｔというコーディングＳＮＰのうちの少なくとも１つを含むものとして、配列番号１の配列又はそのコーディング配列から成る。
【００７３】
本発明に従うと、以上で定義したポリヌクレオチドは、ｇ１３１８ａ、ｃ１４２３ｔ及びｃ１４５６ｔから成るグループの中から選択された単一のコーディングＳＮＰを含んで成る。
【００７４】
より好ましくは、以上で定義したポリヌクレオチドは、コーディングＳＮＰｃ１４５６ｔを含んで成る。
【００７５】
以上で定義したようなポリヌクレオチドは、同様に、ｇ４５１ｃ、ｃ５４２ｔ、ｃ７４２ｇ、ｃ８０４ｔ、ａ８７５ｇ、ｃ１２９８ａ、ｇ１３９７ａ、ｇ１５１２ａというノンコーディング及びサイレントＳＮＰのうちの少なくとも１つを内含することができる。
【００７６】
本発明の目的は、同様に：
ａ）  その各々がｇ４５１ｃ、ｃ５４２ｔ、ｃ７４２ｇ、ｃ８０４ｔ、ａ８７５ｇ、ｃ１２９８ａ、ｇ１３９７ａ、ｇ１５１２ａというノンコーディング及びサイレントＳＮＰのうちの少なくとも１つを内含するものとして、配列番号１のヌクレオチド配列又必要とあらばそのコーディング配列、
又は、
【００７７】
ｂ）  ａ）に基づくヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列、
を含む、又はこれで構成された単離されたポリヌクレオチドにもある。
【００７８】
ｃ１２９８ａ、ｇ１３９７ａというサイレントＳＮＰのみが、配列番号１のヌクレオチド配列のコーディング配列中に位置特定されているということは充分に理解されている。
【００７９】
本発明は同様に：
ａ）  その各々がｇ４５１ｃ、ｃ５４２ｔ、ｃ７４２ｇ、ｃ８０４ｔ、ａ８７５ｇ、ｃ１２９８ａ、ｇ１３１８ａ、ｇ１３９７ａ、ｃ１４２３ｔ、ｃ１４５６ｔ、ｇ１５１２ａというＳＮＰのうちの少なくとも１つを内含するものとして、配列番号１のヌクレオチド配列又は、そのコーディング配列、
又は、
【００８０】
ｂ）  ａ）に基づくヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列、
の一部分から成り、少なくとも１０個のヌクレオチドで構成されている単離されたポリヌクレオチドにも関する。
【００８１】
好ましくは、上述のような単離されたポリヌクレオチドは、１０〜４０個のヌクレオチドで構成されている。
【００８２】
本発明は同様に：
ａ）  配列番号２のアミノ酸配列；又は
ｂ）  配列番号２のアミノ酸の配列中の位置２４〜１８９の間に内含されたアミノ酸を含むアミノ酸配列、
の全部又は一部分を含むポリペプチドについてコードする単離されたポリヌクレオチドにおいて、前記ポリペプチドがＧ１２８Ｅ、Ａ１６３Ｖ、Ｓ１７４ＦというコーディングＳＮＰのうちの少なくとも１つを含むアミノ酸配列を有している単離されたポリヌクレオチドをもその目的としている。
【００８３】
本発明の意味合いでは、Ｇ１２８Ｅ、Ａ１６３Ｖ、Ｓ１７４ＦというＳＮＰの位置づけに対応する番号づけは、配列番号２のアミノ酸配列の番号づけとの関係におけるものである。
【００８４】
本発明の好ましい目的に従うと、前述のポリペプチドは、上述のような単一のコーディングＳＮＰを含む。
より好ましくは、本発明に従った単離されたポリヌクレオチドは、配列番号２のアミノ酸配列の全部又は一部分を含み、コーディングＳＮＰ Ｓ１７４Ｆを有するポリペプチドについてコードする。
【００８５】
好ましくは、本発明に従ったポリヌクレオチドは、１つのＤＮＡ又はＲＮＡ分子で構成されている。
本発明に従ったポリヌクレオチドは、標準的なＤＮＡ又はＲＮＡ合成方法により得ることができる。
【００８６】
本発明に従ったポリヌクレオチドは、同様に、配列番号１のヌクレオチド配列上の各々のＳＮＰについて突然変異を受けたヌクレオチドにより野生型ヌクレオチドを修飾することによってＩＦＮα−１４遺伝子のヌクレオチド配列から出発した部位特異的突然変異誘発によっても得ることができる。
例えば、ＳＮＰｇ１３１８ａを含む本発明に従ったポリヌクレオチドは、配列番号１のヌクレオチド配列上の位置１３１８にあるヌクレオチドアデニンによりヌクレオチドグアニンを修飾することによって、ＩＦＮα−１４遺伝子のヌクレオチド配列から出発した部位特異的突然変異誘発によって得ることができる。
【００８７】
この要領で実施可能な部位特異的突然変異誘発のプロセスは、当業者には周知のものである。「Proc. Natl. Acad. Sci, USA」82:488の中での１９８５年のTA Kunkelによる発表に特に言及することができる。
【００８８】
単離されたポリヌクレオチドは同様に、例えば、プレ、プロ又はプレプロタンパク質アミノ酸配列又はヘキサヒスチジンペプチドといったようなマーカーアミノ酸配列についてコードするヌクレオチド配列をも内含しうる。
本発明のポリヌクレオチドは同様に、融合タンパク質又はその他の精製産物を得るべく、その他のタンパク質またはタンパク質フラグメントについてコードするヌクレオチド配列と会合させることができる。
【００８９】
本発明に従ったポリヌクレオチドは、同様に、例えば、転写を受けた又は受けない配列、翻訳を受けた又は受けない配列、スプライシングシグナル配列、ポリアデニル化された配列、リボソーム結合配列さらにはｍＲＮＡを安定化させる配列といったような５´及び／又は３´ノンコーディング配列といったヌクレオチド配列をも内含できる。
【００９０】
ヌクレオチド又はポリヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列は、緊縮条件下でこのヌクレオチド配列とハイブリッド形成できるものと定義することができる。
【００９１】
「ストリンジェント（緊縮）ハイブリダイゼーション条件」というのは、一般に（ただし必ずしもそうであるわけではないが）、ヌクレオチド配列が少なくとも８０％、好ましくは９０％以上、さらに一層好ましくは９５％以上、そして最も好ましくは９７％以上の同一性を有する場合に、ハイブリダイゼーションを可能にする化学的条件として理解される。
【００９２】
緊縮条件は、当業者にとって周知の方法に従って、例えば、５０％のホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭのＮａＣｌ、１５ｍＭのクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ＝７．６）、５×デンハート溶液、１０％の硫酸デキストラン及び２０μｇの変性サケ精子ＤＮＡを含む溶液中で４２℃でポリヌクレオチドをインキュベートし、その後フィルターを０．１×ＳＳＣで６５℃で洗浄することによって、得ることができる。
【００９３】
本発明の範囲内では、緊縮ハイブリダイゼーション条件が１００％に等しい同一性をもつヌクレオチド配列のハイブリダイゼーションを可能にする場合、ヌクレオチド配列は、ａ）で記述されているようなヌクレオチド配列に厳密に相補的であるとみなされる。
本発明の意味合いにおいては、ヌクレオチド配列に相補的であるヌクレオチド配列は本発明に従ったアンテセンスＳＮＰを少なくとも１つ含むものと理解される。
かくして、例えば、ヌクレオチド配列がＳＮＰｃ１４５６ｔを含む場合には、その相補的ヌクレオチド配列は、位置１４５６と等価の位置にアデニンヌクレオチド（ａ）を含む。
【００９４】
ＳＮＰを含むポリヌクレオチドの同定、ハイブリダイゼーション及び／又は増幅
本発明は同様に、
ａ）  配列番号１のヌクレオチド配列と８０〜１００％の同一性（好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは９５％、そして特に１００％の同一性）をもつポリヌクレオチド及び／又は；
ｂ）  少なくとも１つのＳＮＰを含む本発明に従ったポリヌクレオチド、
の全部又は一部分の、配列番号１のヌクレオチド配列又は必要とあらばそのコーディング配列（ヌクレオチド９３６からヌクレオチド１５０５まで）と８０〜１００％の同一性（好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは９５％そして特に１００％の同一性）をもつポリヌクレオチドの全部又は一部分を同定、ハイブリッド形成及び／又は増幅することを目的とする使用において、
これらの配列の各々が、ｇ４５１ｃ、ｃ５４２ｔ、ｃ７４２ｇ，ｃ８０４ｔ、ａ８７５ｇ、ｃ１２９８ａ、ｇ１３１８ａ、ｇ１３９７ａ、ｃ１４２３ｔ、ｃ１４５６ｔ、ｇ１５１２ａというＳＮＰのうちの少なくとも１つを含む、使用をもその目的としている。
【００９５】
ＳＮＰの頻度の決定及び遺伝子型特定
本発明は同様に、
ａ）  配列番号１のヌクレオチド配列と８０〜１００％の同一性（好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは９５％、そして特に１００％の同一性）をもつポリヌクレオチド及び／又は；
ｂ）  少なくとも１つのＳＮＰを含む本発明に従ったポリヌクレオチド、
の全部又は一部分の、配列番号１のヌクレオチド配列又は必要とあらばそのコーディング配列（ヌクレオチド９３６からヌクレオチド１５０５まで）と８０〜１００％の同一性（好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは９５％そして特に１００％の同一性）をもつポリヌクレオチドの全部又は一部分を、遺伝子型特定することを目的とする使用において、
これらの配列の各々が、ｇ４５１ｃ、ｃ５４２ｔ、ｃ７４２ｇ，ｃ８０４ｔ、ａ８７５ｇ、ｃ１２９８ａ、ｇ１３１８ａ、ｇ１３９７ａ、ｃ１４２３ｔ、ｃ１４５６ｔ、ｇ１５１２ａというＳＮＰのうちの少なくとも１つを含む、使用をもその目的としている。
【００９６】
本発明に従うと、遺伝子型特定は、１つの個体又は個体の母集団について実施できる。
本発明の意味合いにおいては、遺伝子型特定は、個体又は個体母集団の遺伝子型の決定のためのプロセスとして定義づけされる。遺伝子型は単数又は複数の特異的遺伝子座に存在する対立遺伝子から成る。
【００９７】
「個体母集団」というのは、無作為又は作為的に選択された個体の一群として理解される。これらの個体は、ヒト、動物、微生物又は植物であり得る。
【００９８】
通常、個体母集団は、少なくとも１０個体好ましくは１００〜３００個体を含んで成る。
【００９９】
個体は、その民族性に従ってか又はその表現型に従って、特に以下の障害及び／又は疾病を患っている個体が選択される：癌腫、黒色腫、リンパ腫、白血病及び肝臓、首、頭、及び腎臓の癌、心循環器疾患、例えば肥満症といったような免疫系と関係しないものなどの代謝病、感染症特にＢ型及びＣ型肝炎及びエイズ、肺炎、潰瘍性大腸炎といったような感染症、例えば、アルツハイマー病、統合失調症及びうつ病といった中枢神経系の疾病、組織又は器官移植片の拒絶、外傷の治癒、透析患者における貧血症、アレルギー、喘息、多発性硬化症、骨粗鬆症、乾癬、関節リウマチ、クローン病、自己免疫疾患及び障害、胃腸障害さらには化学療法治療と関連する障害。
【０１００】
本発明に従った機能的ＳＮＰに好ましくは、個体母集団の中で遺伝子型特定される。
ＳＮＰを遺伝子型特定するために実施できる多数の技術が存在する（特に、Kwok Pharmacogenomics, 2000、第１巻、ｐ９５〜１００、「高性能遺伝子型特定検定アプローチ」を参照のこと）。これらの技術は、以下の４つの原理のうちの１つに基づいている：すなわち、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション、任意にはデオキシヌクレオチドの存在下でのジデオキシヌクレオチドによる伸長、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドの連結又は対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドの分割。これらの技術のうちの各々は、直接又は偏光蛍光の測定又は質量分析法といったような検出システムと結合させることができる。
【０１０１】
遺伝子型特定は特に、偏光蛍光スキャナと合わせて高温ｄｄＮＴＰ（異なる蛍光体によって標識づけされた２つの異なるｄｄＮＴＰ）及び低温ｄｄＮＴＰ（標識づけされていない２つの異なるｄｄＮＴＰ）でミニシークエンス法を行うことによって実施可能である。偏光蛍光の読取りを伴うミニシークエンス法プロトコル（ＦＰ−ＴＤＩ Technology又はFluaresceヌクレオチドe Polarization Template-direct Dye-Terminator Incorporation）は、当業者にとって周知のものである。
【０１０２】
これは、各個体のＤＮＡのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による増幅の後に得られる産物について実施可能である。このＰＣＲ産物は、研究対象のＳＮＰを含有するポリヌクレオチド遺伝子領域を網羅するように選択される。ＰＣＲサーモサイクラ内の最後の段階の後、プレートは次に、蛍光体特異的励起及び発出フィルターを用いることにより標識づけされた塩基へ読取りのため偏光蛍光スキャナ上に置かれる。標識づけされた塩基の強度値はグラフ上に報告されている。
【０１０３】
ＰＣＲ増幅については、本発明のＳＮＰの場合、当業者であれば、本発明のＳＮＰの位置に従って、それぞれセンス及びアンチセンスプライマを容易に選択することができる。
例えば、ＩＦＮα−１４コーディング配列を含むヌクレオチド配列のＰＣＲ増幅のために使用されるプライマに対応するセンス及びアンチセンスヌクレオチド配列は、それぞれ以下の通りでありうる。
配列番号３：センスプライマ：  AGTGTTACCCCTCATCAACC
配列番号４：アンチセンスプライマ：  TCATGAAAGTGTGAGATGATGT
これらのヌクレオチド配列は、配列番号１のヌクレオチド配列内のヌクレオチド８８９からヌクレオチド１５６５までの６７７ヌクレオチドの長さをもつフラグメントの増幅を可能にする。
【０１０４】
このとき、個体の母集団の中のＳＮＰを含む遺伝子によりコードされた各々の対立遺伝子の頻度（対立遺伝子頻度）の統計的分析が達成され、これにより、異なるサブグループ特にこの個体母集団を構成するさまざまな民族グループの中のそれらの分布及びそれらの影響の大きさを決定することが可能となる。
【０１０５】
研究対象の母集団の中に見られる異なる対立遺伝子の分布頻度を推定するためには、遺伝子型特定データを分析する。対立遺伝子頻度の計算は、ＳＡＳ−ｓｕｉｔe（商標）（ＳＡＳ）又はＳＰＬＵＳ（商標）（Math-Soft）といったようなソフトウェアを援用して実施可能である。個体母集団の異なる民族グループ全体にわたる本発明のＳＮＰの対立遺伝子分布の比較は、ソフトウェアＡＲＬＥＱＵＩＮ（商標）及びＳＡＳ−ｓｕｉｔｅ（商標）を用いて実施可能である。
【０１０６】
遺伝子マーカーとしての本発明のＳＮＰ
遺伝子の機能的配列を修飾するＳＮＰ（例えば、プロモータ、スプライシング部位、コーディング領域）は、罹病性又は抵抗力に直接関連づけされる確率が高いが、全てのＳＮＰ（機能的であるか否かに関わらず）は、これらの疾病状態に関与する単数又は複数の遺伝子の同定のための貴重なマーカーを提供する可能性があり、その結果、これらの疾病状態に間接的に関係づけされ得る（Cargill at al. (1999). Nature Genetics 22: 231-238; Riley et al. (2000). Pharmacogenomics 1: 39-47; Roberts L. (2000). Science 287: 1898-1899を参照のこと）。
【０１０７】
かくして、本発明は同様に、ＩＦＮα−１４遺伝子の中にｇ４５１ｃ、ｃ５４２ｔ、ｃ７４２ｇ、ｃ８０４ｔ、ａ８７５ｇ、ｃ１２９８ａ、ｇ１３１８ａ、ｇ１３９７ａ、ｃ１４２３ｔ、ｃ１４５６ｔ、ｇ１５１２ａというＳＮＰのうちの少なくとも１つを含むデータバンクにも関する。
前記ＳＮＰが配列番号１のヌクレオチド配列に従って番号づけされるということは充分に理解される。
【０１０８】
このデータバンクは、次のものの間の統計的に該当する関連を決定するために分析され得る。
（ｉ）  ＩＦＮα−１４遺伝子のポリヌクレオチド内のｇ４５１ｃ、ｃ５４２ｔ、ｃ７４２ｇ、ｃ８０４ｔ、ａ８７５ｇ、ｃ１２９８ａ、ｇ１３１８ａ、ｇ１３９７ａ、ｃ１４２３ｔ、ｃ１４５６ｔ、ｇ１５１２ａというＳＮＰのうちの少なくとも１つ、と
（ｉｉ）  疾病又は疾病に対する抵抗力。
本発明は同様に、１つの疾病又は疾病に対する抵抗力のための診断／予後キットを開発するための、ＩＦＮα−１４遺伝子のポリヌクレオチド内のｇ４５１ｃ、ｃ５４２ｔ、ｃ７４２ｇ、ｃ８０４ｔ、ａ８７５ｇ、ｃ１２９８ａ、ｇ１３１８ａ、ｇ１３９７ａ、ｃ１４２３ｔ、ｃ１４５６ｔ、ｇ１５１２ａといったＳＮＰのうちの少なくとも１つの使用にも関する。
【０１０９】
上述のような本発明のＳＮＰは、疾病又は疾病に対する抵抗力に直接又は間接的に関連づけることができる。
好ましくは、これらの疾病は、以下で言及するように定義づけされるものでありうる。
【０１１０】
発現ベクターと宿主細胞
本発明は同様に、本発明に従った少なくとも１つのポリヌクレオチドを含む組換え型ベクターをもその目的としている。
【０１１１】
制限的な意味なく染色体、エピソーム及び誘導されたウイルスを含めて、数多くの発現系を使用することができる。より特定的には、使用される組換え型ベクターは、細菌プラスミド、トランスポゾン、酵母エピソーム、挿入要素、酵母染色体要素、バキュロウイルス、ＳＶ４０のような乳頭腫ウイルス、ワクチニアウイルス、アデノウイルス、キツネ痘疹ウイルス、仮性狂犬病ウイルス、レトロウイルスといったウイルスから誘導可能である。
【０１１２】
これらの組換え型ベクターは、同様に、コスミド又はファージミド誘導体でありうる。例えば「分子クローニング；実験室マニュアル、Sambrook et al., 第４版Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 2001」に記述されているような当業者にとって周知の方法により組換え型発現ベクター内にヌクレオチド配列を挿入することが可能である。
【０１１３】
組換え型ベクターは、ポリヌクレオチド発現の調節を制御するヌクレオチド配列ならびに本発明のポリヌクレオチドの発現及び転写そして本発明のポリペプチドの翻訳を可能にするヌクレオチド配列を内含することができ、これらの配列は、使用される宿主細胞に従って選択される。
【０１１４】
かくして、例えば、本発明のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドが小胞体の管腔に向かって、周辺質空間に向かって、膜上で又は細胞外環境に向かって導かれることになるように組換え型ベクターの中に適切な分泌シグナルを組込むことができる。
本発明は同様に、本発明に従った組換え型ベクターを含む宿主細胞をもその目的としている。
【０１１５】
宿主細胞内への組換え型ベクターの導入は、「分子生物学における基本的方法」Daris et al., 第２版、McGraw-Hill Professional Publishing, 1995及び「分子クローニング：実験室マニュアル」、前出、の中で記述されているような当業者にとって周知である方法、例えばリン酸カルシウムによるトランスフェクション、ＤＥＡＥデキストランによるトランスフェクション、トランスフェクション、マイクロインジェクション、カチオン脂質によるトランスフェクション、形質導入又は感染、に従って実施可能である。
宿主細胞は例えば、連鎖球菌、ブドウ球菌、大腸菌又はBacillus subtilisの細胞といったような細菌細胞、酵母細胞及びAspergillus、Streptomycesの細胞といったような真菌細胞、Drosophila S2及びSpodoptera Sf9の細胞といったような昆虫細胞、ＣＨＯ、ＣＯＳ、ＨｅＬａ、Ｃ１２７、ＢＨＫ、ＨＥＫ２９３細胞といったような動物の細胞及び治療対象のヒト細胞さらには植物細胞でありうる。
宿主細胞は、例えば、本発明のポリペプチドを発現するために、又は以下で見ていくように、薬学組成物中の活性生成物として使用可能である。
【０１１６】
ポリペプチド
本発明は同様に、それがＧ１２８Ｅ、Ａ１６３Ｖ、Ｓ１７４ＦというコーディングＳＮＰのうちの少なくとも１つを含むものとして：
ａ）  配列番号２のアミノ酸配列、又は
ｂ）  配列番号２のアミノ酸配列の位置２４と１８９の間に内含されたアミノ酸を含むアミノ酸配列、
の全て又は一部と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さりに一層好ましくは少なくとも９９％の同一性をもつアミノ酸配列を含む単離されたポリヌクレオチドをもその目的としている。
【０１１７】
本発明はポリペプチドは同様に、それがＧ１２８Ｅ、Ａ１６３Ｖ、Ｓ１７４ＦというコーディングＳＮＰのうちの少なくとも１つを含むものとして：
ａ）  配列番号２のアミノ酸配列、又は
ｂ）  配列番号２のアミノ酸配列の位置２４と１８９の間に内含されたアミノ酸を含むアミノ酸配列、
の全て又は一部を含んで成ることもできる。
【０１１８】
本発明のポリペプチドは、より特定的には、それがＧ１２８Ｅ、Ａ１６３Ｖ、Ｓ１７４ＦというコーディングＳＮＰのうちの少なくとも１つを含むものとして：
ａ）  配列番号２のアミノ酸配列、又は
ｂ）  配列番号２のアミノ酸配列の位置２４と１８９の間に内含されたアミノ酸を含むアミノ酸配列、
の全て又は一部で構成され得る。
【０１１９】
好ましくは、本発明に従ったポリペプチドは、Ｇ１２８Ｅ、Ａ１６３Ｖ、Ｓ１７４Ｆから成るグループの中から選択された単一のコーディングＳＮＰを含有する。
より好ましくは、本発明に従ったポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸配列のアミノ酸２４〜１８９を含み、コーディングＳＮＰ Ｓ１７４Ｆを有する。
【０１２０】
本発明の目的は又、先に定義した宿主細胞が培地内で培養され、前記ポリペプチドが培地から単離される、上述のポリペプチドの調製のためのプロセスにもある。
【０１２１】
該ポリペプチドは、塩、特に硫酸アンモニウム、エタノール、アセトン又はトリクロロ酢酸といったカオトロピック剤を用いた沈殿、酸抽出；イオン交換クロマトグラフィ；ホスホセルロースクロマトグラフィ；疎水的相互作用クロロマトグラフィ；アフィニティクロマトグラフィ；ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィ又は排除クロマトグラフィといったような当業者にとって周知の方法に従って、宿主細胞の培地から出発して精製可能である。
【０１２２】
「培地」は、内部で本発明のポリペプチドが単離又は精製される媒質として理解される。この媒質は、細胞外媒質及び／又は細胞リゼイトで構成され得る。当業者にとって周知の技術は同様に、単離又は精製中に前記ポリペプチドの立体配座が改変された場合に、この培地がポリペプチドに対し活性立体配座を戻すことができるようにする。
【０１２３】
抗体
本発明の目的は、免疫特異的抗体を得るためのプロセスにもある。
「抗体」は、モノクローナル、ポリクローナル、キメラ、１本鎖、ヒト化抗体ならびに、Ｆａｂ又は免疫グロブリン発現ライブラリ産物を含めたＦａｂフラグメントとして理解される。
【０１２４】
免疫特異的抗体は、本発明に従ったポリペプチドでの動物の免疫化によって得ることができる。
【０１２５】
本発明は同様に、以前に定義されたような本発明に従ったポリペプチドのための免疫特異的抗体にも関する。
【０１２６】
本発明に従ったポリペプチド、そのフラグメントの１つ、類似体、その変異体の１つ又はこのポリペプチドを発現する細胞を、免疫特異的抗体を産生するために使用することもできる。
【０１２７】
「免疫特異的」という語は、抗体が、先行技術において既知のその他のポリペプチドに対してよりも本発明のポリペプチドに対してより優れた親和性を有することを意味する。
免疫特異的抗体は、当業者にとって周知の方法に従って、好ましくは人間でない哺乳動物の中で、本発明のポリペプチド、そのフラグメントの１つ、類似体又はエピトープフラグメント又はこのポリヌクレオチドを発現する細胞を投与すことによって得ることができる。
【０１２８】
モノクローナル抗体の調製のためには、ハイブリドーマ技術（Kohler et al., Nature (1975) 256: 495-497）、トリオーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Kozbor et al., Immunology Today (1983) 4: 72）及びＥＢＶハイブリドーマ技術（Cole et al., モノクローナル抗体及び癌療法）第２７巻、ＵＣＬＡ分子及び細胞生物学シンポジウム、ニューリーズ）中の「ＥＢＶ−ハイブリドーマ技術とヒトの肺癌に対するその応用」（編集R.A. Reisfeld and S.Sell）、pp. 77-96, Alan R. Liss, Inc. N.Y., 1985, pp. 77-96）といったような抗体産生のための標準的方法を、細胞系統から出発して使用することができる。
【０１２９】
例えば、米国特許第４．９４６．７７８号で記述されているような１本鎖抗体産生技術も同様に使用可能である。
例えば、マウスといったような遺伝子導入動物も、ヒト化抗体の産生のために、同じく使用可能である。
【０１３０】
本発明のポリペプチドと相互作用する作用物質
本発明の目的は同様に、本発明に従ったポリペプチドを活性化するか又は阻害する作用物質を同定するためのプロセスにおいて
ａ）  少なくとも１つのコーディングＳＮＰを含む本発明に従ったポリヌクレオチドを含む組換え型ベクターの調製、
ｂ）  ａ）に従った組換え型ベクターを含む宿主細胞の調製、
ｃ）  テストすべき作用物質とｂ）に従った宿主細胞の接触、及び
ｄ）  テストすべき作用物質により生成される活性化又は阻害効果の決定、
を含んで成るプロセスにもある。
【０１３１】
本発明に従ったポリペプチドは同様に、それと相互作用する化合物をスクリーニングするためのプロセスのためにも使用できる。
これらの化合物は、本発明に従ったポリペプチドの固有の活性の活性化（アゴニスト）又は阻害（アンタゴニスト）用作用物質であり得る。これらの化合物は同様に、本発明のポリペプチドのリガント又は基質でもありうる。Coligan et al.、免疫学における現行プロトコル１（２）、第５章（１９９１）を参照のこと。
【０１３２】
一般的には、かかるプロセスを実行するためには、まず第１に、本発明に従ったポリペプチドを発現する適切な宿主細胞を産生することが望ましい。かかる細胞は、例えば、哺乳動物、酵母、Drosophilaといったような昆虫又はE. coliといったような細菌でありうる。
【０１３３】
これらの細胞又はこれらの細胞の膜抽出物はその後、テストすべき化合物の存在下に置かれる。
本発明のポリペプチドでテストすべき化合物の結合能力ならびに、機能的応答の阻害又は活性化をこのとき観察することができる。
【０１３４】
上述のプロセスの段階ｄ）は、直接又は間接的に標識づけられているテストすべき作用物質を使用することによって実現可能である。それは同様に、標識づけされた又はされていない作用物質及び標識づけされた競合的作用物質を使用することによる競合試験をも含み得る。
【０１３５】
検出すべきシグナルに従って適切に選ばれた検出手段を用いることにより、テストすべき作用物質が、本発明のポリペプチドを発現する細胞上で活性化又は阻害シグナルを生成するか否かを決定することも同様に可能である。
【０１３６】
かかる活性化又は阻害用作用物質は、ポリヌクレオチド、そして場合によっては例えばタンパク質又は抗体といったようなオリゴヌクレオチド又はポリペプチドであり得る。
【０１３７】
本発明は又、本発明に従ったポリペプチドによって活性化又は阻害される作用物質を同定するためのプロセスにおいて：
ａ）  少なくとも１つのコーディングＳＮＰを含む本発明に従ったポリヌクレオチドを含む組換え型ベクターの調製、
ｂ）  ａ）に従った組換え型ベクターを含む宿主細胞の調製、
ｃ）  テストすべき作用物質をｂ）に従った宿主細胞の存在下に置くこと、及び
ｄ）  テストすべき作用物質に対してポリペプチドが生成する活性化又は阻害効果の決定、
を含んで成るプロセスをもその目的とする。
【０１３８】
本発明のポリペプチドにより活性化又は阻害される作用物質は、それぞれこのポリペプチドの存在下での活性化又は阻害によって応答する作用物質である。
本発明のポリペプチドによって直接的又は間接的に活性化又は阻害される作用物質は、例えば膜又は核レセプタ、キナーゼ及びより好ましくはチロシンキナーゼ、転写因子又はポリヌクレオチドといったようなポリペプチドで構成され得る。
【０１３９】
疾病の検出
本発明は同様に、１被験体における本発明に従ったポリヌクレオチド及び／又は本発明に従ったポリペプチドの生物学的特性を分析するためのプロセスにおいて：
ａ）  被験者のゲノム内で、本発明のポリヌクレオチドの存在又は不在を決定する段階；
ｂ）  被験者の体内で、本発明に記載のポリヌクレオチドの発現レベルを決定する段階；
ｃ）  被験者の体内で本発明のポリペプチドの存在又は不在を決定する段階；
ｄ）  被験者の体内で本発明のポリペプチドの濃度を決定する段階；及び／又は、
ｅ）  被験者の体内で本発明のポリペプチドの機能性を決定する段階、
のうちの少なくとも１つの段階を実施することを含んで成るプロセスをもその目的としている。
【０１４０】
これらの生物学的特性は、被験者の体内又は被験者由来の標本の中で分析することができる。
これらの生物学的特性は、遺伝的診断を実施すること及び、被験者が罹患しているか又は罹患のリスクをもつか或いは又逆に本発明に従ったポリヌクレオチド及び／又は本発明に従ったポリペプチドの存在に関係する疾病、不具合又は障害の発生に対する部分的抵抗力を呈しているかを決定することを可能にする。
【０１４１】
これらの疾病は、癌及び腫瘍、感染症、性病、免疫学的関連疾患及び／又は自己免疫疾患及び障害、心循環器疾患、代謝病、中枢神経疾患、及び化学療法治療に関係する障害といった障害及び／又は人間の疾病であり得る。
【０１４２】
前記癌及び腫瘍には、転移性の腎癌を含む癌腫、黒色腫、濾胞性リンパ腫及び皮膚Ｔ細胞性リンパ腫を含むリンパ腫、ヘアリー細胞白血病、慢性リンパ性白血病及び慢性骨髄性白血病を含む白血病、肝臓、首、頭及び腎臓の癌、多発性骨髄腫、カルチノイド腫瘍及びエイズの場合のようなカポジ肉腫を含む免疫不全症に続いて出現する腫瘍が含まれる。
前記感染症には、慢性Ｂ型及びＣ型肝炎及びＨＩＶ／ＡＩＤＳを含めたウイルス感染、感染性肺炎及び生殖器症といったような性病が含まれる。
【０１４３】
前記免疫学的又は自己免疫学的関連疾患には、組織又は器官移植片の拒絶、アレルギー、喘息、乾癬、関節リウマチ、多発性硬化症、クローン病及び潰瘍性大腸炎が含まれる可能性がある。
前記代謝病には、肥満症といったような非免疫関連疾患が含まれる可能性がある。
中枢神経系の前記疾病には、アルツハイマー病、パーキンソン病、統合失調症及びうつ病が含まれる可能性がある。
【０１４４】
前記疾病及び障害には又、外傷の治癒、透析患者における貧血症、及び／又は骨粗鬆症が含まれる可能性がある。
このプロセスは同様に、本発明に従ったＳＮＰによってコードされる突然変異体対立遺伝子が被験者の体内に存在することに関連づけされる、１つの疾病の又は１つの疾病に対する抵抗力の遺伝的診断を可能にする。
【０１４５】
好ましくは、段階ａ）では、先に定義づけしたような少なくとも１つのコーディングＳＮＰを含有するポリヌクレオチドの存在又は不在が検出されようとしている。
ポリヌクレオチドの検出は、細胞、血液、尿、唾液といったような研究対象の被験者に由来する生体標本から出発して、又は研究対象の被験者の生検又は検死から出発して実施され得る。ＰＣＲ増幅の後にか又は直接的に検出するためにゲノミックＤＮＡを使用することができ、例えばＲＮＡ又はｃＤＮＡを類似の要領で同様に使用することもできる。
【０１４６】
このとき、被験者のゲノム内で検出されたヌクレオチド配列と本発明に従ったポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を比較することが可能である。
【０１４７】
ＮＳＰの比較は、配列決定によって、ＤＮＡ ハイブリダイゼーション方法によって、変性剤を伴うか又は伴わない電気泳動ゲル上のＤＮＡフラグメントの移動度の差によって、又は融解温度の差によって実施できる。Myers et al., Science (1985) 230: 1242を参照のこと。精確な点におけるヌクレオチド配列の構造のかかる修飾は、ＲＮアーゼ及びＳ１ヌクレアーゼといったようなヌクレアーゼ防御試験によっても、又化学的分割剤によっても顕示されうる。Cotton at al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA (1985) 85: 4397-4401を参照のこと。本発明のポリヌクレオチド フラグメントを含むオリゴヌクレオチドプローブも同様に、スクリーニングを行なうのに使用することができる。
【０１４８】
本発明のポリヌクレオチドの発現を見極め、このポリヌクレオチドの遺伝的可能性を同定するために、当業者にとって周知の数多くの方法を使用することができる（Chee et al., Science (1996)、第２７４巻、ｐ６１０〜６１３を参照のこと）。
【０１４９】
段階ｂ）では、ポリヌクレオチドの発現レベルは、例えばＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、ＲＮアーゼ防御、ノーザンブロット及びその他のハイブリダイゼーション方法といったような当業者にとって周知の方法に従ってこのポリヌクレオチドによりコードされ（かつ１つのポリペプチドについてコードする）ＲＮＡのレベルを定量化することによって測定可能である。
【０１５０】
段階ｃ）及びｄ）では、被験者の体内又は被験者からの標本中の本発明に従ったポリペプチドの存在又は不在ならびにその濃度は、例えば放射免疫検定、競合結合試験、ウェスタンブロット及びＥＬＩＳＡ試験などといった周知の方法によって実施することができる。
【０１５１】
段階ｄ）に続いて、本発明に従ったポリペプチドの決定された濃度を、被験者の体中に通常見い出される天然の野生型タンパク質濃度と比較することができる。
当業者であれば、先に言及したもののような従来の試験又は検定によってか又は先行技術の刊行物を援用して、それ以上又は以下になると上述のような疾病、不具合又は障害に対する感応性又は反対に抵抗力が現われる閾値を同定することができる。
段階ｅ）では、本発明に従ったポリペプチドの機能性の決定は、例えば上述のようなin vitro試験又は前記ポリペプチドを発現する宿主細胞の使用などといった、当業者にとって周知の方法により実施することができる。
【０１５２】
治療用化合物及び疾病の治療
本発明は同様に、活性作用物質として本発明に従ったポリペプチドを含む治療用化合物をもその目的としている。
本発明は同様に、異なる人間の障害及び／又は疾病の予防又は治療のために意図された治療用化合物の製造のための本発明に従ったポリペプチドの使用にも関する。これらの疾病は、癌及び腫瘍、感染症、性病、免疫学的関連疾患及び／又は自己免疫疾患及び障害、心循環器疾患、代謝病、中枢神経疾患、及び化学療法治療に関係する障害といった障害及び／又は人間の疾病であり得る。
【０１５３】
前記癌及び腫瘍には、転移性の腎癌を含む癌腫、黒色腫、濾胞性リンパ腫及び皮膚Ｔ細胞性リンパ腫を含むリンパ腫、ヘアリー細胞白血病、慢性リンパ性白血病及び慢性骨髄性白血病を含む白血病、肝臓、首、頭及び腎臓の癌、多発性骨髄腫、カルチノイド腫瘍及びエイズの場合のようなカポジ肉腫を含む免疫不全症に続いて出現する腫瘍が含まれる。
前記感染症には、慢性Ｂ型及びＣ型肝炎及びＨＩＶ／ＡＩＤＳを含めたウイルス感染、感染性肺炎及び生殖器症といったような性病が含まれる。
【０１５４】
前記免疫学的又は自己免疫学的関連疾患には、組織又は器官移植片の拒絶、アレルギー、喘息、乾癬、関節リウマチ、多発性硬化症、クローン病及び潰瘍性大腸炎が含まれる可能性がある。
前記代謝病には、肥満症といったような非免疫関連疾患が含まれる可能性がある。
中枢神経系の前記疾病には、アルツハイマー病、パーキンソン病、統合失調症及びうつ病が含まれる可能性がある。
【０１５５】
前記疾病及び障害には又、外傷の治癒、透析患者における貧血症、及び／又は骨粗鬆症が含まれる可能性がある。
好ましくは、本発明に従ったポリペプチドは、慢性Ｂ型及びＣ型肝炎といった或る種のウイルス感染症、ヘアリー細胞白血病や慢性骨髄性白血病といったような白血病、多発性骨髄腫、濾胞性リンパ腫、カルチノイド腫瘍、悪性黒色腫、代謝性腎臓癌腫、アルツハイマー病、パーキンソン病ならびにエイズの場合のようなカポジ肉腫といったような免疫不全症に続いて出現する腫瘍及び生殖器疣又は性病といったような、異なる人間の障害及び／又は疾病の予防又は治療を意図した治療用化合物の製造のためにも用いることができる。
【０１５６】
本発明に従ったポリペプチドを得ることを可能にする化合物のいくつかならびにこのポリペプチドによって又はこれから得られる又は同定される化合物は同様にして、人体の治療のために使用することもできる。
このような理由から、本発明は、少なくとも１つの前述のコーディングＳＮＰを含む本発明に従ったポリヌクレオチド、前述の組換え型ベクター、前述の宿主細胞及び／又は前述の抗体を活性作用物質として含む薬剤をもその目的としている。
【０１５７】
本発明は同様に、少なくとも１つの前述のコーディングＳＮＰを含有する本発明に従ったポリヌクレオチド、前述の組換え型ベクター、前述の宿主細胞及び／又は前述の抗体の、異なる人間の障害及び／又は疾病の予防又は治療に意図された薬剤の製造のための使用にも関する。これらの疾病は、癌及び腫瘍、感染症、性病、免疫学的関連疾患及び／又は自己免疫疾患及び障害、心循環器疾患、代謝病、中枢神経疾患、及び化学療法治療に関係する障害といった障害及び／又は人間の疾病であり得る。
【０１５８】
前記癌及び腫瘍には、転移性の腎癌を含む癌腫、黒色腫、濾胞性リンパ腫及び皮膚Ｔ細胞性リンパ腫を含むリンパ腫、ヘアリー細胞白血病、慢性リンパ性白血病及び慢性骨髄性白血病を含む白血病、肝臓、首、頭及び腎臓の癌、多発性骨髄腫、カルチノイド腫瘍及びエイズの場合のようなカポジ肉腫を含む免疫不全症に続いて出現する腫瘍が含まれる。
【０１５９】
前記感染症には、慢性Ｂ型及びＣ型肝炎及びＨＩＶ／ＡＩＤＳを含めたウイルス感染、感染性肺炎及び生殖器症といったような性病が含まれる。
前記免疫学的又は自己免疫学的関連疾患には、組織又は器官移植片の拒絶、アレルギー、喘息、乾癬、関節リウマチ、多発性硬化症、クローン病及び潰瘍性大腸炎が含まれる可能性がある。
【０１６０】
前記代謝病には、肥満症といったような非免疫関連疾患が含まれる可能性がある。
中枢神経系の前記疾病には、アルツハイマー病、パーキンソン病、統合失調症及びうつ病が含まれる可能性がある。
前記疾病及び障害には同様に、外傷の治癒、透析患者における貧血症、及び／又は骨粗鬆症が含まれる可能性がある。
【０１６１】
好ましくは、本発明は、慢性Ｂ型及びＣ型肝炎といったウイルス感染症、ヘアリー細胞白血病や慢性骨髄性白血病といったような白血病、多発性骨髄腫、濾胞性リンパ腫、カルチノイド腫瘍、悪性黒色腫、代謝性腎臓癌腫、アルツハイマー病、パーキンソン病ならびにエイズの場合のようなカポジ肉腫といったような免疫不全症に続いて出現する腫瘍及び生殖器疣又は性病といったような、異なる人間の障害及び／又は疾病の予防又は治療を意図した薬剤の製造のための、少なくとも１つの前述のＳＮＰを含有する本発明に従ったポリヌクレオチド、前述の組換え型ベクター、前述の宿主細胞及び／又は前述の抗体の使用に関する。
【０１６２】
活性作用物質として有用な本発明のポリペプチド及びその他の化合物の用量は、化合物の選択、治療上の適応性、投与様式、処方の性質、被験者の性質及び医師の判断によって左右される。
【０１６３】
活性作用物質として使用される場合、本発明に従ったポリペプチドは一般に、被験者の体重１ｋｇあたり１〜１００μｇの範囲内の用量で投与される。
本発明は同様に、活性作用物質として、少なくとも１つの上述の化合物、例えば本発明に従ったポリペプチド、少なくとも１つの前述のＳＮＰを含有する本発明に従ったポリヌクレオチド、前述の組換え型ベクター、前述の宿主細胞及び／又は前述の抗体ならびに薬学的に受容可能な賦形剤を含有する薬学組成物をも目的としている。
【０１６４】
これらの薬学組成物の中では、活性作用物質は、有利には生物学的に有効な用量で存在する。
これらの薬学組成物は、例えば、固体又は液体であり得、例えば単純な又は被覆された錠剤、ジェルカップ、キャラメル、座薬及び好ましくは注射可能な調整物及び注射剤用粉末といったような、現在人間の医療において用いられている剤形で存在しうる。これらの剤形は、通常の方法に従って調製可能である。
【０１６５】
活性作用物質（単複）は、タルク、アラビアゴムラクトース、でんぷん、デキストロース、グリセロール、エタノール、ステアリン酸マグネシウム、ココアバター、水性又は非水性ビヒクル、動物又は植物性の脂肪性物質、パラフィン誘導体、グリコール、さまざまな湿潤剤、分散剤又は乳化剤、保存剤といったような薬学組成物の中で通常利用される賦形剤の中に取込むことができる。
【０１６６】
本発明に従った活性作用物質は、単独でも又は、例えばインターロイキン又はインタフェロンといったようなその他のサイトカインといった治療用化合物などのその他の化合物と組合わせた形で利用することもできる。
薬学組成物の異なる処方は、投与様式に応じて適合される。
【０１６７】
薬学組成物は、当業者にとって既知の異なる投与経路によって投与可能である。
本発明は同様に、活性作用物質として、少なくとも１つの上述の化合物例えば本発明に従ったポリペプチド、本発明に従ったポリヌクレオチド、前述の組換え型ベクター、前述の宿主細胞及び／又は前述の抗体ならびに薬学的に受容可能な賦形剤を含有する診断用組成物をもその目的としている。
【０１６８】
この診断用組成物は、例えば、緩衝液及び防腐剤といったような診断用組成物中で一般に使用されるもののような適切な賦形剤を含有する可能性がある。
【０１６９】
本発明は同様に、本発明に従ったポリペプチドの被験者体内での発現又は活性を増大させることを意図された治療用化合物を調製するための：
ａ）  本発明に従った治療上有効量のポリペプチド、及び/又は
ｂ）  本発明に従ったポリヌクレオチド、
ｃ）  前述の通りの、治療対象である被験者からの宿主細胞、
の使用をもその目的としている。
【０１７０】
かくして、本発明のポリペプチドの発現又は活性の増大を必要とする被験者を治療するためには、複数の方法が可能である。
被験者に対して、薬学的に受容可能な賦形剤と共に本発明のポリペプチドを治療上有効量だけ投与することが可能である。
【０１７１】
同様にして、本発明に従ったポリヌクレオチドを被験者に投与することにより、本発明のポリペプチドの内因性産生を増大させることが可能である。例えば、このポリヌクレオチドは、レトロウイルス発現ベクタ内に挿入すことができる。かかるベクターは、形質導入された細胞が問題の遺伝子を含む感染性ウイルス粒子を産生するような形で、本発明のポリペプチドについてコードするＲＮＡを含有するレトロウイルスプラスミドベクターによる感染を受けた細胞から出発して、単離可能である。人間分子遺伝子、Strachan and Read. BIOS Scientifics Publishers Ltd. (1996)中、第２０章「遺伝子療法とその他の分子遺伝学に基づく治療アプローチ」を参照のこと。
【０１７２】
発明に従うと、好ましくは、前述のような少なくとも１つのコーディングＳＮＰを含有するポリヌクレオチドが使用されることになる。
被験者に対しこの被験者に属する宿主細胞を投与することも同様に可能であり、これらの宿主細胞は、予め取り出され上述のとおり本発明のポリペプチドを発現するべく修飾されている。
【０１７３】
本発明は同様に、本発明に従ったポリペプチドの被験者の体内での発現又は活性を減少させることを意図した治療用化合物を調製するための、
ａ）  治療上有効量の前述の免疫特異的抗体及び／又は
ｂ）  本発明に従ったポリヌクレオチドの発現の阻害を可能にするポリヌクレオチド
の使用にも関する。
かくして、被験者に対して、場合によっては薬学的に受容可能な賦形剤と組合わせた形で、治療上有効量の阻害剤及び／又は上述の通りの抗体を投与することが可能である。
同様に、本発明のポリヌクレオチドの発現の阻害を可能にする本発明に従った相補的ポリヌクレオチドを被験者に投与することにより、本発明のポリペプチドの内因性産生を低減させることも可能である。
【０１７４】
好ましくは、前述のもののような少なくとも１つのコーディングＳＮＰを含有する相補的ポリヌクレオチドを使用することができる。
【０１７５】
本発明は同様に、ヌクレオチド配列がｇ４５１ｃ、ｃ５４２ｔ、ｃ７４２ｇ、ｃ８０４ｔ、ａ８７５ｇ、ｃ１２９８ａ、ｇ１３１８ａ、ｇ１３９７ａ、ｃ１４２３ｔ、ｃ１４５６ｔ、ｇ１５１２ａというＳＮＰのうちの１つを含むことを条件として、配列番号１のヌクレオチド配列と少なくとも９５％の同一性（好ましくは９７％、より好ましくは９９％、そして特に１００％の同一性）をもつヌクレオチド配列がその患者のゲノム内に存在することに結びつけられるＩＦＮα−１４変異体によりひき起こされた障害又は疾病を有する患者の予防又は治療向けの薬剤の調製のためのＩＦＮα−１４タンパク質の使用にも関する。
【０１７６】
好ましくは、前記薬剤は、癌及び腫瘍、感染症、性病、免疫学的関連疾患及び／又は自己免疫疾患及び障害、心循環器疾患、代謝病、中枢神経疾患、及び化学療法治療に関係する障害から成るグループの中から選択された疾病の１つの予防又は治療のために使用される。
【０１７７】
前記癌及び腫瘍には、転移性の腎癌を含む癌腫、黒色腫、濾胞性リンパ腫及び皮膚Ｔ細胞性リンパ腫を含むリンパ腫、ヘアリー細胞白血病、慢性リンパ性白血病及び慢性骨髄性白血病を含む白血病、肝臓、首、頭及び腎臓の癌、多発性骨髄腫、カルチノイド腫瘍及びエイズの場合のようなカポジ肉腫を含む免疫不全症に続いて出現する腫瘍が含まれる。
【０１７８】
前記感染症には、慢性Ｂ型及びＣ型肝炎及びＨＩＶ／ＡＩＤＳを含めたウイルス感染、感染性肺炎及び生殖器症といったような性病が含まれる。
前記免疫学的又は自己免疫学的関連疾患には、組織又は器官移植片の拒絶、アレルギー、喘息、乾癬、関節リウマチ、多発性硬化症、クローン病及び潰瘍性大腸炎が含まれる可能性がある。
【０１７９】
前記代謝病には、肥満症といったような非免疫関連疾患が含まれる可能性がある。
中枢神経系の前記疾病には、アルツハイマー病、パーキンソン病、統合失調症及びうつ病が含まれる可能性がある。
前記疾病及び障害には又、外傷の治癒、透析患者における貧血症、及び／又は骨粗鬆症が含まれる可能性がある。
【０１８０】
本発明のＳＮＰ Ｓ１７４Ｆを含むＩＦＮα−１４ポリペプチドの模倣化合物
本発明は同様に、ａ）及びｂ）のアミノ酸配列がＳＮＰ Ｓ１７４Ｆを含むことを条件として、
ａ）  配列番号２のアミノ酸配列又は
ｂ）  配列番号２のアミノ酸配列の位置２４と１８９の間に内含されるアミノ酸を含むアミノ酸配列
のポリペプチドのものに実質的に類似する生物活性をもつ新しい化合物にも関する。
【０１８１】
前記生物活性は、実験の部で記述されているように、シグナル形質導入、樹状細胞成熟、ＣＤ４＋又はＣＤ８＋Ｔ−リンパ球によるサイトカイン放出、単球によるサイトカイン放出、in vitro及びin vivo抗ウイルス活性、以前に悪性フレンド赤白血症細胞の接種を受けたマウス体内の抗腫瘍活性、Daudi Burkitt 細胞系統上の細胞抗増殖活性を測定することによって評価され得る。
【０１８２】
実験の部で言及されているように、Ｓ１７４Ｆで突然変異されたＩＦＮα−１４は、以下の性質を示す：
−  樹状細胞突然変異を刺激する弱い能力、
−  ＳＥＢ抗原により予め活性化されたＣＤ８＋Ｔ−リンパ球及びＣＤ４＋Ｔ−リンパ球によるサイトカイン放出（ＩＦＮガンマ及びＩＬ−１０）を刺激する高い能力、
−  単球によるサイトカイン（ＩＬ−１０、ＩＬ−１２及びＴＮＦ−α）放出を刺激する能力、
【０１８３】
−  Daudi細胞増殖を阻害する能力、
−  ＴＦ−１細胞上の弱い抗増殖活性、
−  ＶＳＶに感染した細胞培養におけるin vitroでの高い抗ウイルス活性、
−  ＥＭＣＶに感染したマウス内での高いin vivo抗ウイルス活性、
−  ＦＬＣの接種を受けたマウスにおける抗腫瘍活性。
【０１８４】
同様に実験の部で言及されているように、野生型ＩＦＮα−２と比べて、Ｓ１７４Ｆでの突然変異を受けたＩＦＮα−１４は、以下の性質を有する：
−  シグナル形質導入を活性化する類似の能力、
−  ＳＥＢ抗原により予め活性化されたＣＤ４＋Ｔ−リンパ球及びＣＤ８＋Ｔ−リンパ球によるＩＦＮガンマ放出を刺激する、さらに高い能力、
−  単球によるＩＬ−１０及びＴＮＦ−α放出を刺激する、さらに高い能力、
−  ＴＦ−１ 細胞上の類似の抗増殖活性、
−  ＶＳＶに感染した細胞培養中のin vitroでのさらに高い抗ウイルス活性、
−  ＥＭＣＶに感染したマウスにおけるin vivoでのさらに高い抗ウイルス活性、
−  ＦＬＣの接種を受けたマウスにおける、さらに高い抗腫瘍活性。
【０１８５】
同様に、実験の部で言及されているように、野生型ＩＦＮα−１４に比べて、Ｓ１７４Ｆでの突然変異を受けたＩＦＮα−１４タンパクシ質は、次の能力をもつ：
−  シグナル形質導入を活性化する、さらに低い能力、
−  Daudi 細胞の増殖を阻害する、わずかに低い能力。
【０１８６】
前述のような本発明の新しい化合物は、Ｓ１７４Ｆでの突然変異を受けたＩＦＮα−１４のものと実質的に類似の生物活性を有することができる。
前記化合物は同様に、Ｓ１７４Ｆでの突然変異を受けたＩＦＮα−１４のものよりもさらに高い抗腫瘍活性、及び／又は、in vitro及び／又はin vivoでの抗ウイルス活性、単球によるＩＬ−１０及びＴＮＦ−α放出、Ｔ−リンパ球によるＩＦＮ−ガンマ放出といった生物活性を有する可能性もある。
【０１８７】
前記化合物は同様に、Ｓ１７４Ｆでの突然変異を受けたＩＦＮα−１４のものよりもさらに低いDaudi 細胞増殖及び／又はシグナル形質導入といったような生物活性を有する可能性もある。
前記化合物は、例えばポリペプチド又はペプチドといったような生化学化合物又は例えば合成ペプチド模倣物といったような有機化学化合物であり得る。
【０１８８】
本発明は、同様に、上述のような化合物の同定のためのＳ１７４ＦＳＮＰを含有する本発明のポリペプチドの使用にも関する。
本発明は同様に、以下の段階を含む、本発明の化合物の同定のためのプロセスにも関する：
ａ）  例えば、シグナル形質導入、樹状細胞成熟、ＣＤ４＋又はＣＤ８＋Ｔ−リンパ球によるサイトカイン放出、単球によるサイトカイン放出、in vitro及びin vivo抗ウイルス活性、以前に悪性フレンド赤白血症細胞の接種を受けたマウス体内の抗腫瘍活性、Daudi Burkitt 細胞系統上の細胞抗増殖活性といったような、試験対象化合物の生物活性を決定する段階；
【０１８９】
ｂ）  ｉ）  テストすべき化合物の段階ａ）に決定されている活性；と
ｉｉ）  そのアミノ酸配列がＳ１７４ＦＳＮＰを含んでいることを条件とする、配列番号２のアミノ酸配列の位置２４〜１８９の間に含まれたアミノ酸を含むアミノ酸配列又は配列番号２のアミノ酸配列のポリペプチドの活性、
を比較する段階；及び
【０１９０】
ｃ）  段階ｂ）で実施された比較に基づいて、テストすべき化合物が、そのアミノ酸配列がＳ１７４ＦＳＮＰを含んでいることを条件とする配列番号２のアミノ酸配列の位置２４と１８９の間に含まれたアミノ酸を含むアミノ酸配列又は配列番号２のアミノ酸配列のポリペプチドの活性と比べて、実質的に類似の、又は低い又は高い活性のいずれを有するかを決定する段階。
【０１９１】
好ましくは、テストすべき化合物は、合成ペプチド組合せライブラリ、高生産性スクリーニングから予め同定されていてもよいし、又は、そのアミノ酸配列がＳ１７４Ｆ ＳＮＰを含むことを条件とする、配列番号２のアミノ酸配列の位置２４及び１８９の間に内含されたアミノ酸を含むアミノ酸配列又は配列番号２のアミノ酸配列のポリペプチドのものと同じ３次元構造を有するべくコンピュータ援用薬物設計によって設計されてもよい。
化合物を同定し設計する方法は、当業者にとって周知である。
【０１９２】
これらの方法に言及している刊行物としては例えば、以下のようなものがあると考えられる。
- Silverman R.B. (1992).「薬物設計及び薬物作用の有機化学」Academic Press, 第１版（１９９２年１月１５日）
- Anderson S及びChiplin J. (2002). 「構造ゲノミクス；薬物設計の未来」Drug Discov. Today. 7(2): 105-107.
- Selick HE, Beresford AP, Tarbit MH. (2002). 「薬物発見において出現している予言的ＡＤＭＥシュミレーションの重要性」Drug Discov. Today. 7(2): 109-116.
- Burbidge R, Trotter M. Buxton B, Holden S. (2001). 「機械学習による薬物設計；薬学データ分析のためのサポートベクターマシン」Comput. Chem. 26(1): 5-14.
- Kauvar L.M. (1996). 「ペプチド模倣薬物；進歩と見込みについてのコメント」14(6): 709.
【０１９３】
本発明の化合物は、癌及び腫瘍、感染症、性病、免疫学的関連疾患及び／又は自己免疫疾患及び障害、心循環器疾患、代謝病、中枢神経疾患、及び化学療法治療に関係する障害から成るグループの中から選択された疾病の１つの予防及び治療のために意図された薬剤の調製のためにも使用可能である。
【０１９４】
前記癌及び腫瘍には、転移性の腎癌を含む癌腫、黒色腫、濾胞性リンパ腫及び皮膚Ｔ細胞性リンパ腫を含むリンパ腫、ヘアリー細胞白血病、慢性リンパ性白血病及び慢性骨髄性白血病を含む白血病、肝臓、首、頭及び腎臓の癌、多発性骨髄腫、カルチノイド腫瘍及びエイズの場合のようなカポジ肉腫を含む免疫不全症に続いて出現する腫瘍が含まれる。
前記感染症には、慢性Ｂ型及びＣ型肝炎及びＨＩＶ／ＡＩＤＳを含めたウイルス感染、感染性肺炎及び生殖器症といったような性病が含まれる。
【０１９５】
前記免疫学的又は自己免疫学的関連疾患には、組織又は器官移植片の拒絶、アレルギー、喘息、乾癬、関節リウマチ、多発性硬化症、クローン病及び潰瘍性大腸炎が含まれる可能性がある。
前記代謝病には、肥満症といったような非免疫関連疾患が含まれる可能性がある。
中枢神経系の前記疾病には、アルツハイマー病、パーキンソン病、統合失調症及びうつ病が含まれる可能性がある。
【０１９６】
前記疾病及び障害には又、外傷の治癒、透析患者における貧血症、及び／又は骨粗鬆症が含まれる可能性がある。
好ましくは、本発明の化合物は、慢性Ｂ型及びＣ型肝炎といった或る種のウイルス感染症、ヘアリー細胞白血病や慢性骨髄性白血病といったような白血病、多発性骨髄腫、濾胞性リンパ腫、カルチノイド腫瘍、悪性黒色腫、代謝性腎臓癌腫、アルツハイマー病、パーキンソン病ならびにエイズの場合のようなカポジ肉腫といったような免疫不全症に続いて出現する腫瘍及び生殖器疣又は性病から成るグループの中から選択された疾病の１つの予防又は治療のために意図された薬剤の調製のためにも用いることができる。
【実施例】
【０１９７】
実験の部
例１：ＳＮＰ ｇ１３１８ａ、ｃ１４２３ｔ、ｃ１４５６ｔ、を含有するヌクレオチド配列のポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質及び野生型基準遺伝子のヌクレオチド配列によりコードされるタンパク質のモデリング
第１の段階においては、ＩＦＮα−１４の三次元構造を、その構造がＰＤＢデータベース（コードＩＩＴＦ）の中で入手可能であるＩＦＮα−２のものから出発して、ソフトウェアModeler（ＭＳ１、San Diego、ＣＡ）を使用することによって構築した。
次に、該成熟ポリペプチド フラグメントを、突然変異Ｇ１２８Ｅ、Ａ１６３Ｖ、Ｓ１７４Ｆを産生するような形で修飾した。
【０１９８】
プログラムＡＭＢＥＲ及びＤＩＳＣＯＶＥＲ（ＭＳ１：Molecular Simulations Inc.）を用いることによって、この突然変異を受けたフラグメントについて１０００の分子最小化段階を実施した。
その後、同じプログラム及び同じ力場で、２回の分子力計算ランを行なった。
各ケースにおいて、５０，０００段階を３００°Ｋで計算し、３００の平衡化段階で終結した。
このモデリングの結果は、図１、２、及び３上で視覚化されている。
【０１９９】
例２：個体母集団内のＳＮＰ ｇ１３１８ａ、ｃ１４２３ｔ、ｃ１４５６ｔの遺伝子型特定
ＳＮＰの遺伝子型特定は、産物が偏光蛍光の読取りによって検出されるミニシークエンス法の原理に基づいている。この技術は、蛍光ミニシークエンス法から成る（ＦＰ−ＴＤＩ技術又は蛍光偏光鋳型−直接−染料ターミネータ取込み）。
ミニシークエンス法は、該母集団の各個人のゲノミックＤＮＡからＰＣＲにより増幅された産物について実施される。このＰＣＲ産物は、遺伝子型特定されるべきＳＮＰを含有する遺伝子領域を網羅するような形で選択される。使用されなかったＰＣＲプライマ及び取込まれなかったｄＮＴＰを除去した後、ミニシークエンス法を実施する。
【０２００】
ミニシークエンス法は、ポリメラーゼ酵素及び蛍光標識づけされたジデオキシヌクレオチドを使用することによって、ＳＮＰの部位のすぐ上流側に置かれたオリゴヌクレオチドプライマを伸長させることから成る。この伸長プロセスの結果として得た産物を、偏光蛍光の読取りにより直接分析する。
【０２０１】
これらの段階全てならびに読取りは、同じＰＣＲプレート内で実施される。
かくして遺伝子型特定には５つの段階が必要とされる：
１）  ＰＣＲによる増幅、
２）  酵素消化によるＰＣＲ産物の精製、
３）  オリゴヌクレオチドプライマの伸長、
４）  読取り、
５）  読取りの解釈。
遺伝子型特定段階１及び２は、ＳＮＰ ｇ１３１８ａ、ｃ１４２３ｔ、ｃ１４５６ｔの各々について同じ条件下で実施される。段階３、４、５は、これらの多形現象のうちの各々に特定的なものである。
１）  ＩＦＮα−１４のヌクレオチド配列のＰＣＲ増幅は、民族的にさまざまな由来をもつ２６８人の個体からのゲノミックＤＮＡから出発して行なわれる。
これらのゲノミックＤＮＡは、米国内のCoriell Instituteによって提供されたものである。
【０２０２】
【表１】
2004535181.tif 000002
【０２０３】
これらの個体の各々に由来するゲノミックＤＮＡは、１つの標本を構成する。
全てのＳＮＰについて、ＰＣＲ増幅は、以下のプライマから出発して実施される：
配列番号３：センスプライマ：  AGTGTTACCCCTCATCAACC
配列番号４：アンチセンスプライマ：  TCATGAAAGTGTGAGATGATGT
【０２０４】
これらのヌクレオチド配列は、配列番号１のヌクレオチド配列内でヌクレオチド８８９からヌクレオチド１５６５までの６７７ヌクレオチド長さのフラグメントの増幅を可能にする。
各々のＳＮＰについて、ＰＣＲ産物は、ミニシークエンス法のための鋳型として役立つことになる。
ＰＣＲ反応の合計反応体積は、標本１つにつき５μｌである。
【０２０５】
この反応体積は、下表中に示されている試薬から成る。
【０２０６】
【表２】
2004535181.tif 000003
【０２０７】
これらの試薬は、ＡＢＧｅｎｅ（照会番号ＴＦ−０３８４−ｋ）により提供された３８４個のウェルをもつ黒色ＰＣＲプレート内に分配される。プレートを密封し、遠心分離し、次に３８４ウェルのプレート用のサーモサイクラ（ＭＪ ResearchのTerrad）の中に置き、以下のインキュベーションを受ける：９４℃で１分、その後３段階（９４℃で１５秒、５６℃で３０秒、６８℃で１分）から成るサイクルが３６回が続く。
【０２０８】
２）  ＰＣＲ増幅した産物を次に、２つの酵素；シュリンプアルカリホスファターゼ（ＳＡＰ）及びエキソヌクレアーゼＩ（ＥｘｏＩ）を用いて精製する。これらの酵素のうちの第１のものは、ＰＣＲ増幅の間に取込まれなかったｄＮＴＰの脱ホスホリル化を可能にし、一方第２のものは、１本鎖のＤＮＡ残基、特にＰＣＲ中に使用されなかったプライマを除去する。
【０２０９】
この消化は、標本１つにつき５μｌの反応混合物をＰＣＲプレートの各ウェル内で添加することによって行なわれる。この反応混合物は、以下の試薬で構成されている。
【０２１０】
【表３】
2004535181.tif 000004
【０２１１】
ひとたび充てんされると、プレートは密封され、遠心分離され、次に３８４ウェルプレート用サーモサイクラ（ＭＪ ResearchのTetrad）の中に置かれ、以下のインキュベーションを受ける：消化ＳＡＰ−ＥＸＯ：３７℃で４５分、８０℃で１５分。
【０２１２】
その後、調製された標本１つあたり５μｌの反応混合物を添加することにより消化されたＰＣＲ産物に対し、伸長又はミニシークエンス法段階を実施する。
ミニシークエンス法３）及び読取り段階４）及び読取りの解釈５）は、ＳＮＰ ｇ１３１８ａ、ｃ１４２３ｔ及びｃ１４５６ｔに特定的である。
これらの段階全てを以下で、これらの多形現象の各々について用いられた特定的条件を明示しながら記述する。
【０２１３】
３）  ミニシークエンス法
遺伝子型特定のために必要なミニシークエンス法用プライマの配列を、本発明に従ったＳＮＰの部位の上流側にあるヌクレオチドの配列に対応するような形で決定した。ＳＮＰを含有するＰＣＲ産物は、２本鎖ＤＮＡ産物であることから、センスストランド又はアンチセンスストランドのいずれについても遺伝子型特定を行なうことができる。選択されたプライマは、Life Technologies Incにより製造される。
【０２１４】
下表は、各ＳＮＰについて、テストされたミニシークエンス法用プライマの配列及び遺伝子型特定のために選定された最適な条件を示している：
【０２１５】
【表４】
2004535181.tif 000005
【０２１６】
ＳＮＰのミニシークエンス法は最初に１６の標本全体で認証され、次に、２６８の個体と１０の対照から成る個体母集団のセット全体にわたり遺伝子型特定された。
【０２１７】
次に、伸長又はミニシークエンス法段階を、下表で示されている通りに実施する。
【０２１８】
【表５】
2004535181.tif 000006
【０２１９】
１．  ５Ｘの伸長緩衝液は、２５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ ｐＨ９、２５０ｍＭのＫＣｌ、２５ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＭｇＣｌ2及び４０％のグリセロールで構成されている。
２．  ｄｄＮＴＰについては、４塩基の混合が、研究対象の多形現象に従って実施される。機能的ＳＮＰを構成する２つの問題の塩基（野生型ヌクレオチド／突然変異を受けたヌクレオチド）のみが、Ｔａｍｒａ内又はＲ１１０内で標識づけされる。例えば、ＳＮＰｃ１４５６ｔについては、ｄｄＮＴＰの混合物は、以下のもので構成されている：
−  ２．５μＭの無標識ｄｄＣＴＰ、
−  ２．５μＭの無標識ｄｄＴＴＰ、
−  ２．５μＭのｄｄＡＴＰ（１．８７５μＭの無標識ｄｄＡＴＰ及び０．６２５μＭのＴａｍｒａ標識付きｄｄＡＴＰ）
−  ２．５μＭのｄｄＧＴＰ（１．８７５μＭの無標識ｄｄＧＴＰ及び０．６２５μＭのＲ１１０標識付きｄｄＧＴＰ）。
【０２２０】
ひとたび充てんされると、プレートは密封され、遠心分離され、次に３８４ウェルプレート用サーモサイクラ（ＭＪ ResearchのTetrad）の中に置かれ、以下のインキュベーションを受ける：伸長サイクル；９３℃で１分、その後、２段階（９３℃で１０秒、５５℃で３０秒）から成る３５サイクルが続く。
【０２２１】
サーモサイクラ内での最後の段階の後、プレートを、ＬＪＬ Biosystems IncのAralyst（商標）ＨＴタイプの偏光蛍光読取り装置上に直接置く。２つの方法を用いることによってCriterion Host（商標）ソフトウェアでプレートを読取る。最初の方法は、該蛍光体に特異的な発出及び励起フィルタ（励起５５０−１０ｎｍ、発出５８０−１０ｎｍ）を使用することによりＴａｍｒａ標識付き塩基を読取ることを可能にし、第２の方法は、該蛍光体に特異的な励起及び発出フィルタ（励起４９０−１０ｎｍ、発出５２０−１０ｎｍ）を使用することによりＲ１１０標識付き塩基を読取ることを可能にする。２つのケースにおいて、ダイクロイック２重ミラー（Ｒ１１０／Ｔａｍｒａ）が用いられ、その他の読取りは、以下のとおりである：
【０２２２】
Ｚ高さ：１．５ｍｍ
減衰器：アウト
積分時間：１００，０００マイクロ秒
生データ単位：計数／秒
スイッチ偏光：ウェル毎
プレート沈降時間：０ｍｓｅｃ
ＰＭＴセットアップ：Smart Read（＋）、感度２
動的偏光子：発出
静止偏光子：Ｓ
【０２２３】
Ｔａｍｒａフィルターについて及びＲ１１０フィルターについてのｍＰ（ミリポラライゼーション）の計算値を含むファイル結果がかくして得られる。これらのｍＰ値は、平行な平面（‖）及び垂直な平面（⊥）上で得られた強度値から出発して、以下の式に従って計算される：
【０２２４】
【数１】
2004535181.tif 000007
【０２２５】
この計算式において、値⊥は、ｇという係数で重みづけされる。これは、予め実験的に決定されなくてはならない機械パラメータである。
【０２２６】
４）及び５）読取り値の解釈及び遺伝子型の決定。
ｍＰ値は、Microsoft Inc.のExcelソフトウェア及び／又はＬＩＬ、Biosystems Inc.により開発されたAllele Caller（商標）ソフトウェアを用いたグラフ上に報告されている。
横座標には、Ｔａｍｒａ標識付き塩基のｍＰ値が示され、縦座標には、Ｒ１１０標識付き塩基のｍＰ値が示されている。強いｍＰ値は、この蛍光体で標識づけされた塩基が取込まれていることを表わし、逆に弱いｍＰ値は、この塩基の取込みがないことを顕示している。
【０２２７】
異なる遺伝子型をもつヌクレオチド配列の最高３つの均質なグループを得ることができる。
Allele Caller（商標）ソフトウェアを使用すると、異なるグループの同定がひとたび実施された時点で、各個体について定義された遺伝子型を表の形態で直接抽出することが可能となる。
例えばＳＮＰ ｃ１４５６ｔについては、アンチセンスで読取られた対立遺伝子ｇがセンスで読取られた対立遺伝子ｃに対応し、未成熟のＩＦＮα−１４タンパク質配列の位置１７４でのセリン（Ｓ）の存在に関係づけされ、従って、アンチセンスで読取られた対立遺伝子ａが、対応するタンパク質の配列内のこの位置についてのフェニルアニン（Ｆ）に対応するセンスで読取られた対立遺伝子ｔに対応するということを明記しておく必要がある。
【０２２８】
ＳＮＰ ｇ１３１８ａ、ｃ１４２３ｔ及びｃ１４５６ｔについてのミニシークエンス法の結果
遺伝子型特定プロセスが完了した後、ここで研究対象となっているＳＮＰについての個体母集団の個体の遺伝子型の決定が、上述のグラフを用いて実施された。
ＳＮＰ ｇ１３１８ａについては、遺伝子型は、理論的に、テスト対象の個体において、同型接合体ＧＧ又は異型接合体ＧＡ又は同型接合体ＡＡのいずれかである。実際には、以下で示すように、同型接合体遺伝子型ＡＡは、個体母集団中には検出されない。
【０２２９】
ＳＮＰ ｃ１４２３ｔについては、遺伝子型は理論的に、テスト対象の個体において、同型接合体ＣＣ又は異型接合体ＣＴ又は同型接合体ＴＴのいずれかである。実際には、以下で示すように、同型接合体遺伝子型ＴＴは、個体母集団中には検出されない。
ＳＮＰ ｃ１４５６ｔについては、遺伝子型は、理論的に、テスト対象の個体において、同型接合体ＣＣ又は異型接合体ＣＴ又は同型接合体ＴＴのいずれかである。実際には、以下で示すように、同型接合体遺伝子型ＴＴは、個体母集団中には検出されない。
【０２３０】
個体母集団中の決定された遺伝子型の内訳及び研究対象の３つのＳＮＰについての異なる対立遺伝子頻度の計算の結果は、下表に提示されている。
【０２３１】
【表６】
2004535181.tif 000008
【０２３２】
【表７】
2004535181.tif 000009
【０２３３】
【表８】
2004535181.tif 000010
【０２３４】
以上の表では、
−  Ｎは、個体の数を表わしている。
−  ％は、特定の亜母集団内の個体の百分率を表わす。
−  対立遺伝子頻度は、特定の亜集団内の突然変異を受けた対立遺伝子の百分率を表わす。
−  ９５％のＩＣというのは、９５％における最大及び最小信頼区間を表わす。
系統発生的母集団及びＳＮＰ毎にこれらの結果を検討することにより、以下のことが観察される。
−  ＳＮＰ ｇ１３１８ａについては、２つの異型接合体個体ＧＡは、ヨーロッパコーカソイド及びメキシコ人の亜母集団に由来する。
−  ＳＮＰ ｃ１４２３ｔについては、６つの異型接合体個体ＣＴは、アフリカ系アメリカ人及びヨーロッパコーカソイドの亜母集団に由来する。
−  ＳＮＰ ｃ１４５６ｔについては、唯一の異型接合体個体ＣＴは、アフリカ系アメリカ人の亜母集団に由来する。
【０２３５】
例３：  天然の野生型ＩＦＮα−１４タンパク質及び突然変異を受けたＩＦＮα−１４タンパク質の酵母内での発現
ａ）  真核性発現ベクターｐＰｉｃＺα−ｔｏｐｏ内での、天然の野生型ＩＦＮα−１４及び突然変異を受けたＩＦＮα−１４のクローニング
天然の野生型ＩＦＮα−１４、Ｇ１０５Ｅでの突然変異を受けたＩＦＮα−１４又はＳ１５１Ｆでの突然変異を受けたＩＦＮα−１４の成熟部分についてコードするヌクレオチド配列は、ＳＮＰについての異型接合体である個体からのゲノミックＤＮＡを鋳型として用いるＰＣＲにより増幅される。
【０２３６】
かかる増幅を可能にするＰＣＲプライマは、以下の通りである：
配列番号１１：センスプライマ：  TGTAATCTGTCTCAAACCCACAGC
配列番号１２：アンチセンスプライマ：  TCAATCCTTCCTCCTTAATCTTTTTTG
【０２３７】
ＰＣＲ産物は、メタノールにより誘発可能なハイブリットプロモータＡＯＸＩの制御下で真核生物発現ベクターｐＰｉｃＺα−ＴＯＰＯの中に挿入される（ＴＯＰＯTM−クローニング：Invitrogen Corp.）。
このベクターは、酵母Pichia pastoris内の真核生物タンパク質の異種発現を可能にする。
組換え型タンパク質についてコードするベクターの領域のヌクレオチド配列をチェックした後、ベクターはＰｍｅｌ制限酵素により線形化され、P. pastoris酵母菌株（Invitrogen）は、これらの組換え型発現ベクターで形質転換される。
【０２３８】
ｂ）  P. pastoris内での異種発現及び天然の野生型ＩＦＮα−１４及び突然変異を受けたＩＦＮα−１４タンパク質の精製。
天然の野生型ＩＦＮα−１４についてコードするクローン又はＧ１０５Ｅでの突然変異を受けたＩＦＮα−１４についてコードするクローン又はＳ１５１Ｆでの突然変異を受けたＩＦＮα−１４についてコードするクローンを含有するＢＭＧＹ培地（２％のペプトン、１％の酵母エキス、１．３４％のＹＮＢ、１％のグリコール、１００ｍＭのリン酸カリウム、０．４ｍｇ／リットルのビオチン、ｐＨ６．０）５０ｍＬの２回の飽和予備培養を、毎分２００回転（ｒｐｍ）で攪拌しながら３０℃で２４〜４８時間実施した。
【０２３９】
培養が飽和する細胞密度（６００ｎｍの波長で測定された１２の光学密度に対応するもの）に達した時点で、５０Ｄ／ｍＬで２５０ｍＬのＢＭＭＹ培地（２％のペプトン、１％の酵母エキス、１．３４％のＹＮＢ、０．５％のメタノール、１００ｍＭのリン酸カリウム、０．４ｍｇ／リットルのビオチンｐＨ６．０）に接種するためにこれを使用する。
次に、１８０ｒｐｍで培養フラスコを攪拌しながら、３０℃で２４時間、１％の最終濃度でメタノールによりタンパク質の発現を誘発する。
【０２４０】
「アルファ因子」のシグナルペプチド配列がコーディング配列の上流側に存在することに起因して、タンパク質は、培地内で酵母により分泌される。アルファ因子は、プロセッシング中に天然に分割される。
【０２４１】
懸濁液を遠心分離し、得られた上清から出発してＨＰＬＣによりタンパク質を精製する。
予め開始された段階では、限外ろ過（Labscale、カットオフ５０００Ｄａ、Millipore）とそれに続く透析が、５０ｍＭのトリス−Ｃｌ ｐＨ９．０、２５ｍＭのＮａＣｌの緩衝液中の酵母上清の１０倍濃縮を可能にする。
【０２４２】
第１のクロマトグラフィ段階は、ブルーセファロースカラム（Amersham Pharmacia）上での親和性によるタンパク質回収を可能にする。収集した画分中のタンパク質の存在は、一方ではＳＤＳＰＡＧＥの電気泳動によってかつ他方ではＩＦＮα−１４タンパク質に対して向けられた特異的抗体による免疫検出によって確認される。この段階では、問題のタンパク質の純度は７５％より高い。
第２の精製段階では、ゲルろ過が、５０ｍＭトリスｐＨ９．０、２５ｍＭＮａＣｌに対するＩＦＮα−１４タンパク質に対応する収集された画分の緩衝液交換を可能にする。
【０２４３】
精製の最終段階は、イオン交換クロマトグラフィカラム上でのタンパク質の分離から成る。
組換え型タンパク質を含有する画分を、予めトリス５０ｍＭ、ｐＨ９、ＮａＣｌ２５ｍＭの緩衝液内で平衡化されたアニオン交換カラム（Resource Q 6.0mL, Pharmacia）上に注入する。タンパク質の溶出を、トリス５０ｍＭｐＨ９緩衝液内の０．０２５〜１ＭのＮａＣｌの間の勾配の移動によって実施する。
ＳＤＳ／ＰＡＧＥゲル上で、問題のタンパク質の純度を推定し、密度計（Quantity one, Biorad）及びＢＣＡ検定（ビシンコニン酸及び硫酸銅、Sigma）により、タンパク質の濃度を測定する。
【０２４４】
場合によってさらに多量のタンパク質を産生するべくスケールアップした、このプロトコルに従って得た精製済みの天然の野生型ＩＦＮα−１４、Ｇ１０５Ｅでの突然変異を受けたＩＦＮα−１４、及びＳ１５１Ｆでの突然変異を受けたＩＦＮα−１４を、以下で記述する機能的試験のために使用する。
【０２４５】
例４：シグナル形質導入を活性化する野生型及びＳ１５１Ｆでの突然変異を受けたＩＦＮα−１４の能力の評価
インタフェロンは、ＪＡＫ（ヤヌスキナーゼ）及びＳＴＡＴ（シグナル形質導入体及び転写活性体）タンパク質が関与するシグナリング経路を通して作用することがわかっている。インタフェロンがそのレセプタと結合することで、ＪＡＫタンパク質のホスホリル化が誘発され、これらのタンパク質が今度は、ＳＴＡＴタンパク質をホスホリル化により活性化する。活性化されたＳＴＡＴタンパク質は、核まで転位し、ここでそれらは遺伝子プロモータ上のインタフェロン応答要素に結合し、それらのプロモータはそれぞれの遺伝子の転写を刺激する。インタフェロンにより開始されたシグナリング経路を研究するためには、リポータ遺伝子技術を使用した。この手順について以下で記述する。
【０２４６】
インタフェロン応答性キメラプロモータの制御下でルシフェラーゼリポータ遺伝子でのトランスフェクションを受けたヒト細胞系統の使用は、このin vitro検定のための基礎を提供する。かくして、検出されたルシフェラーゼ活性は、核レベルでシグナルを誘発するＩＦＮの能力を反映している。
【０２４７】
このリポータ遺伝子検定を使用して、Ｓ１５１Ｆでの突然変異を受けたＩＦＮα−１４、野生型ＩＦＮα−１４、及び野生型ＩＦＮα−２が示す用量応答曲線が分析され、結果は、ＩＦＮαタンパク質１ｍｇあたりのイントロンＡ（インタフェロンアルファ２ｂに対応する市販の製品）の活性を基準にした国際単位で表わされている。
【０２４８】
この検定は、以下の結果を提供する：
−  Ｓ１５１Ｆでの突然変異を受けたＩＦＮα−１４については５０６ＩＵ／ｍｇ、
−  野生型ＩＦＮα−１４については２８２５ＩＵ／ｍｇ、
−  野生型ＩＦＮα−２については６９８ＩＵ／ｍｇ。
これらの結果は、シグナル形質導入を活性化するＳ１５１Ｆでの突然変異を受けたＩＦＮα−１４の能力が、野生型ＩＦＮα−１４のものよりも低く、かつ野生型ＩＦＮα−２のものとかなり類似していることを表わしている。
【０２４９】
例５．Ｓ１５１Ｆでの突然変異を受けたＩＦＮα−１４の免疫調節活性の評価
ＩＮＦｓＩ型（ＩＦＮアルファ及びＩＦＮベータ）は、免疫系の或る種の機能を変調させることができる。これらは、樹状細胞（ＤＣ）成熟すなわちＭＨＣクラスＩ（ＨＬＡ−ＡＢＣ）及びＩＩ（ＨＬＡ−ＤＲ）分子の発現の増加、Ｔ−リンパ球；ＣＤ８０；ＣＤ８６及びＣＤ８３分子の同時刺激に関与する分子の発現の増加及びＴ−リンパ球の刺激機能の増加、を増大させることが実証されてきた。
【０２５０】
ａ）  樹状細胞の成熟に対するＳ１５１Ｆでの突然変異を受けたＩＦＮα−１４の効果
Ｓ１５１Ｆでの突然変異を受けたＩＦＮα−１４の免疫調節活性を、樹状細胞の成熟時点でまず調査し、市販のイントロンＡ製品の代表として選ばれた野生型ＩＦＮα−２のものと比較した。
それを行なうために、まず、ＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ−４サイトカインの存在下で培養された成人の末梢血単球から樹状細胞を生成させた。ＣＤ１４＋細胞精製キットを用いて精製した後、これらの樹状細胞を、１００ｎｇ／ｍＬのＳ１５１Ｆでの突然変異を受けたＩＦＮα−１４又は野生型ＩＦＮα−２の存在下に置き、その表現型を、ＭＨＣクラスＩ及びＩＩ分子及びＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ８３及びＣＤ１ａマーカーの発現を探求することを目的とするＦＡＣＳ分析によって決定した。これらの樹状細胞の成熟状態も同様に、刺激を受けていない樹状細胞を伴う対照を提供するべくＩＦＮα処理無しで得られたものと比較した。
【０２５１】
任意の単位として表わされた４つの実験条件及び各マーカーについての蛍光強度の尺度の中央値は下表に紹介されている。
【０２５２】
【表９】
2004535181.tif 000011
【０２５３】
この試験の結果は、Ｓ１５１Ｆでの突然変異を受けたＩＦＮα−１４タンパク質が樹状細胞の成熟を刺激する弱い能力を有することを実証している。
【０２５４】
ｂ）  Ｔ−リンパ球によるサイトカイン放出に対するＳ１５１Ｆでの突然変異を受けたＩＦＮα−１４の効果
Ｓ１５１Ｆでの突然変異を受けたＩＦＮα−１４の免疫調節活性も同様に、攻撃に対する免疫応答を模倣するべく強い抗原（ＳＥＢ）を伴って又は伴わずに、突然変異を受けたＩＦＮα−１４タンパク質の存在下に置かれたＴ−リンパ球によるサイトカイン放出を測定することによって調査した。この試験は同様に、対照として用いられイントロンＡ市販製品を代表するものとして選ばれた野生型ＩＦＮα−２の存在下でも行なわれた。
【０２５５】
このためには、健康なドナーから末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を単離し、抗−ＣＤ３及び抗−ＣＤ２８抗体又はＳＥＢを含有する適切な培地内で１６時間刺激した。各培養中に、４μｇ／ｍＬのＳ１５１Ｆでの突然変異を受けたＩＦＮα−１４又は野生型ＩＦＮα−２を添加した。Ｔ−リンパ球を抗−ＣＤ３、抗−ＣＤ４、及び抗ＣＤ６９抗体又は抗−ＣＤ３、抗−ＣＤ２８及び抗−ＣＤ６９抗体で細胞外で標識付けし、Ｔｈ１型サイトカイン（ＩＦＮ−ガンマ）又はＴｈ２型サイトカイン（ＩＬ−１０）に対して向けられた特異的抗体で細胞内で標識づけした。蛍光細胞を、ＦＡＣＳcalibur 及びCell Questソフトウェアを用いて分析した。
【０２５６】
得られた結果は、ＳＥＢの不在下でＳ１５１Ｆでの突然変異を受けたＩＦＮα−１４及び野生型ＩＦＮα−２がＩＬ−１０及びＩＦＮ−ガンマ放出を刺激せず、かくしてＴリンパ球を活性化しないということを表わしている。これとは対照的に、Ｓ１５１Ｆでの突然変異を受けたＩＦＮα−１４及び野生型ＩＦＮα−２ タンパク質は、下表で示されているようにＳＥＢで活性化されたＴ−リンパ球によるサイトカイン（ＩＬ−１０及びＩＦＮ−ガンマ）放出を刺激する。この表は、それぞれＣＤ４＋Ｔ−リンパ球及びＣＤ８＋Ｔ−リンパ球についてのＣＤ４＋ＣＤ６９＋細胞又はＣＤ８＋ＣＤ６９＋細胞の百分率及び合計細胞に基づくＣＤ６９＋細胞の百分率として表わされた、ＳＥＢの存在下でのＴ−リンパ球によるサイトカイン放出を表わしている。
【０２５７】
【表１０】
2004535181.tif 000012
【０２５８】
これらの結果は、Ｓ１５１Ｆでの突然変異を受けたＩＦＮα−１４が、ＳＥＢ抗原により予め活性化されたＣＤ４＋Ｔ−リンパ球及びＣＤ８＋Ｔ−リンパ球によるサイトカイン放出（ＩＦＮガンマ及びＩＬ−１０）を刺激する高い能力を有することを明らかに実証している。特に、ＣＤ４又はＣＤ８＋Ｔ−リンパ球によるインタフェロンガンマ産生は、野生型ＩＦＮα−２の存在下よりもＳ１５１Ｆでの突然変異を受けたＩＦＮα−１４の存在下の方が高い。
【０２５９】
ｃ）  単球によるサイトカイン放出に対すＳ１５１Ｆでの突然変異を受けたＩＦＮα−１４の効果
最後に、細菌毒性作用物質（ＬＰＳ）の不在下又は存在下での単球によるサイトカイン放出を測定することによって、Ｓ１５１Ｆでの突然変異を受けたＩＦＮα−１４の免疫調節活性を調査した。この試験は同様に、対照として使用されイントロンＡ市販製品の代表として選択された野生ＩＦＮα−２の存在下でも実施された。
【０２６０】
これを行なうために、健康なドナーからヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を単離し、それらの表現型を分析して、ＣＤ６４＋ＣＤ４ｄｉｍ細胞の相対量を決定した（ＣＤ６４及びＣＤ４ｄｉｍは、血液単球のためのマーカーである）。一晩培養した後、これらのＰＢＭＣを、培地単独（刺激を受けていない細胞）の中又はＬＰＳの存在下（刺激を受けた細胞）でインキュベートした。各培養中に、４μｇ／ｍＬのＳ１５１Ｆでの突然変異を受けたＩＦＮα−１４又は野生型ＩＦＮα−２を添加した。培養後、細胞を、抗−ＣＤ６４及び抗ＣＤ４ｄｉｍで細胞外で標識づけし、Ｔｈ１型サイトカイン（ＴＮＦ−アルファ）、ＩＬ−１２及びＩＬ−１０に対して向けられた特異的抗体で細胞内で標識づけした。
【０２６１】
蛍光細胞を、ＦＡＣＳcalibur及びCell Questソフトウェアを用いて分析した。
得られた結果は、Ｓ１５１Ｆでの突然変異を受けたＩＦＮα−１４及び野生型ＩＦＮα−２が、ＬＰＳの存在下でサイトカイン（ＩＬ−１０、ＩＬ−１２及びＴＮＦ−アルファ）放出を刺激しないことを表わしている。
【０２６２】
これとは対照的に、ＬＰＳの存在下では、単球はサイトカイン（ＩＬ−１０、ＩＬ−１２及びＴＮＦ−２）を放出し、この放出は、下表に示されているように、Ｓ１５１Ｆでの突然変異を受けたＩＦＮα−１４タンパク質又は野生型ＩＦＮα−２の存在下でさらに増大される。この表は、合計細胞に対するＣＤ４ｄｉｍＣＤ６４＋細胞の百分率及びＣＤ６４＋ＣＤ４ｄｉｍ細胞の百分率として表わされた、ＬＰＳの存在下での単球によるサイトカイン放出を表わしている。
【０２６３】
【表１１】
2004535181.tif 000013
【０２６４】
これらの結果は、ＬＰＳの存在下で、Ｓ１５１Ｆでの突然変異を受けたＩＦＮα−１４タンパク質が単球によるサイトカイン放出を刺激できることを実証している。特に、単球によるＩＬ−１０及びＴＮＦ−α放出の刺激は、野生型ＩＦＮα−２の存在下よりもＳ１５１Ｆでの突然変異を受けたＩＦＮα−１４の存在下の方が高い。
【０２６５】
例６．Ｓ１５１Ｆでの突然変異を受けたＩＦＮα−１４のin vitro抗増殖活性の評価
ａ）  Daudi Burkittの細胞系統のヒトリンパ芽球について
これらの試験は、Ｓ１５１Ｆでの突然変異を受けたＩＦＮα−１４及び天然の野生型ＩＦＮα−１４細胞という２つの異なるタイプのＩＦＮα−１４について実施される。予め（１０％のウシ胎児血清及び２ｍＭのＬ−グルタミンで補足された）ＲＰＭＩ１６４０培地中で培養された細胞（以下「Daudi 細胞」と呼ぶヒトDaudi Burkittリンパ腫細胞系統）を、４・１０4細胞／ウェルの細胞密度で９６ウェルのプレート内で接種する。
【０２６６】
各ウェル内で、Daudi 細胞を、０．００３ｐＭ〜６００ｎＭの範囲内の増大する濃度の天然野生型又は突然変異を受けたＩＦＮα−１４のいずれかと接触した状態に置く。
その後、Daudi 細胞を、５％のＣＯ2下で３７℃で６６時間インキュベートし、その後、培養に対しUptiblue試薬（Uptima）を添加する。４時間というさらなるインキュベーション期間の後、５９０ｎｍで発出された蛍光を測定することによって（励起５６０ｎｍ）、細胞増殖速度を定量化する。
【０２６７】
Ｓ１５１Ｆでの突然変異を受けたＩＦＮα−１４又は野生型ＩＦＮα−１４の抗増殖活性は、５０％の細胞成長を阻害するＩＦＮα−１４の濃度に対応するＩＣ５０の測定に基づいている。
３回反復された少なくとも３回の実験が、両方のタンパク質及び各々の濃度について実施された。
【０２６８】
Ｓ１５１Ｆでの突然変異を受けたＩＦＮα−１４について測定された平均ＩＣ５０値は、１．１３ｐＭであり、一方野生型ＩＦＮα−１４について測定された平均ＩＣ５０値は０．４２ｐＭである。天然の野生型タンパク質の値に対する突然変異を受けたタンパク質のＩＣ５０の値に対応する比率は、２．３４（標準偏差０．２１）に達する平均値を有する。
この試験は、Ｓ１５１Ｆでの突然変異を受けたＩＦＮα−１４タンパク質がDaudi細胞増殖を阻害するということを実証している。その上、細胞抗増殖活性は、野生型ＩＦＮα−１４に比べてＳ１５１Ｆでの突然変異を受けたＩＦＮα−１４の場合、わずかに減少している。
【０２６９】
ｂ）  ＴＦ−１赤白血病細胞系統について
Ｓ１５１Ｆでの突然変異を受けたＩＦＮα−１４の効果は、ＴＦ−１赤白血病細胞系統についても評価された。この試験は、対照として使用されイントロンＡ市販製品の代表として選択された野生型ＩＦＮα−２の存在下でも実施された。
これを行なうため、ＴＦ−１細胞を増大する濃度のＳ１５１Ｆでの突然変異を受けたＩＦＮα−１４又は野生型ＩＦＮα−２（０．００１〜１０００ｎｇ／ｍＬ）と接触状態に置き、細胞増殖を測定した。
この実験を３回反復し、１つの代表的実験の結果は、図４に提示されている。
このデータは、Ｓ１５１Ｆでの突然変異を受けたＩＦＮα−１４がＴＦ−１細胞に対し弱い抗増殖効果しかもたないことを表わしている。特に、Ｓ１５１Ｆでの突然変異を受けたＩＦＮα−１４の抗増殖効果は、野生型ＩＦＮα−２のものに類似している。
【０２７０】
例７．Ｓ１５１Ｆでの突然変異を受けたＩＦＮα−１４の抗ウイルス活性の評価
ＩＦＮは、抗ウイルス防御において重要な役割を果たす。ＩＦＮ抗ウイルス活性は、一部には、以下のようなＩＦＮ誘発される酵素系に起因している：
−  アデノシンオリゴマー合成の触媒として作用する酵素である２’５’オリゴアデニレートシンテターゼ。これらのオリゴマーは、ひとたび活性化された状態でウイルスＲＮＡを破壊するエンドリボヌクレアーゼであるＲＮアーゼＬを活性化させる。
−  ウイルス写しの合成及び／又は成熟を阻害するＭｘタンパク質（ＧＴＰアーゼ）。
この活性は、主としてインフルエンザウイルスに対して及ぼされる。
−  ２本鎖ＲＮＡにより活性化されるＰＫＲタンパク質（又はｐ６８キナーゼ）。
活性化されたＰＫＲはタンパク質合成を阻害する。
【０２７１】
ＩＦＮｓ抗ウイルス活性は同様に、レトロウイルスの場合、細胞内へのウイルス粒子の進入の阻害、粒子の複製、結合、退出、及びウイルス粒子の感染力といったようなその他のメカニズムによっても誘発される。
最後に、ＩＦＮは、免疫系の或る種の機能を変調させること、特に（中でもＭＨＣクラスＩ及びＩＩ分子の増大、ＩＬ−１２及びＩＦＮ−ガンマ産生の増大、ＣＴＬ活性の増大を含めた）細胞媒介に対する応答に有利に作用することによって、間接的な抗ウイルス活性を及ぼす。
【０２７２】
Ｓ１５１Ｆでの突然変異を受けたＩＦＮα−１４の抗ウイルス活性は、細胞培養内でin vitroでそしてマウスモデル内でin vivoでの両方で評価された。両方の試験共、対照として用いられイントロンＡ市販製品の代表として選択された野生型ＩＦＮα−１４と並行して行なわれた。
【０２７３】
ａ）  細胞培養中でのin vitroの抗ウイルス活性
この検定により、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）を用いた細胞培養内のＳ１５１Ｆでの突然変異を受けたＩＦＮα−１４の抗ウイルス活性の評価及び野生型ＩＦＮα−２のものとの比較が可能になる。
このために、ＷＩＳＨヒト上皮細胞を、減少する濃度のＳ１５１Ｆでの突然変異を受けたＩＦＮα−１４又は野生型ＩＦＮα−２の存在下で２４時間培養した。その後、細胞を、さらに２４〜４８時間水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）で感染させ、細胞溶解を測定した。
【０２７４】
試験対象の異なるＩＦＮαの抗ウイルス効果は、ＶＳＶで誘発された細胞溶解の５０％を阻害するＩＦＮ濃度に対応するＩＣ５０値を比較することによって決定される。
類似の実験を３回実施し、１つの代表的実験内で測定されたＩＣ５０値は、以下のとおりである：
−  Ｓ１５１Ｆでの突然変異を受けたＩＦＮα−１４についてＩＣ５０＝２．８ｎｇ／ｍＬ、
−  野生型ＩＦＮα−２について、ＩＣ５０＝４ｎｇ／ｍＬ。
この実験の結果は、Ｓ１５１Ｆでの突然変異を受けたＩＦＮα−１４タンパク質が、細胞培養中でin vitroで抗ウイルス活性を有することを表わしている。その上、ＶＳＶに感染した細胞培養内で、Ｓ１５１Ｆでの突然変異を受けたＩＦＮα−１４は、野生型ＩＦＮα−２よりも高い抗ウイルス活性を有する。
【０２７５】
ｂ）  マウスモデル内でのin vivoの抗ウイルス活性
このin vivo試験は、ＥＭＣＶ（脳心筋炎ウイルス）マウスモデル内で実施される。
ヒトＩＦＮは、同量のマウスＩＦＮが示すものに比べ一般に１００〜１０００分の１低いものである用量依存性抗ウイルス活性をマウス内で示す（Meister et al. (1986). J. Gen. Viral. 67. 1633〜1644）。
【０２７６】
脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣＶ）をマウスに腹腔内注射すると、中枢神経系の関与及び脳炎を特徴とする急速進行性の致命的疾患が発生する（Finter NB (1973). Front Biol. 2: 295-360）。マウス及びヒトインタフェロン−アルファは両方共、致命的ＥＭＣＶ感染に対してマウスを防御する上で有効であることが示されてきた（Tovey及びMaury (1999). J. IFN Cytokine Res. 19: 145-155）。
【０２７７】
生後６週目のSwissマウス２０匹のグループを１００λＬＤ50のＥＭＣＶで腹腔内投与にて感染させ、その１時間後、そしてその後は３日間一日一回ずつ、２μｇのＳ１５１Ｆでの突然変異を受けたＩＦＮα−１４又は野生型ＩＦＮα−１４の調整物で処置した。対照グループは、賦形剤のみで処置された動物を用いて実施された。動物を、２１日間生存について毎日追跡調査した。
結果は図５に提示されており、Ｓ１５１Ｆでの突然変異を受けたＩＦＮα−１４で処置されたマウスの相対生存率が、未処置のマウスの生存率よりもはるかに高く、マウスモデルにおけるin vivoでのＳ１５１Ｆでの突然変異を受けたＩＦＮα−１４の抗ウイルス活性を実証している、ということを示している。その上、マウスモデル内でのin vivoのＳ１５１Ｆでの突然変異を受けたＩＦＮα−１４の抗ウイルス活性は、野生型ＩＦＮα−１４で処置されたマウスについて観察されたものよりも高いものである。
【０２７８】
例８．悪性フレンド赤白血病細胞が予め接種されたマウス内でのＳ１５１Ｆでの突然変異を受けたＩＦＮα−１４の抗腫瘍活性の評価
ＩＦＮαは、ＩＦＮ感応性親フレンド白血病細胞に対してと同じ程度に、ＩＦＮαの直接的抗増殖活性に対する抵抗力をもつフレンド白血病細胞のクローンの成長に対してマウスを防御する上で有効であることが示されてきており（Belardelli et al., Int. J. Cancer, 30, 813-820, 1982; Belardelli et al. Int. J. Cancer, 30, 821-825, 1982）、これは、ＩＦＮαの抗腫瘍活性における間接的免疫媒介メカニズムの重要性を反映している。
【０２７９】
以下の実験は、フレンド赤白血症細胞での接種を予め受けたマウスにおけるＳ１５１Ｆでの突然変異を受けたＩＦＮα−１４の抗腫瘍活性の評価、及び市販のイントロンＡ製品の代表として選択された野生型ＩＦＮα−１４のものとの比較を可能にする。
これを行なうためには、生後６週間目の１２匹のＤＢＡ／２マウスのグループに１００，０００のＩＦＮ抵抗力フレンド赤白血症細胞（３Ｃ１８）（２０，０００ＬＤ50）を腹腔内接種し、１時間後、そしてその後は２１日間１日１回ずつ２．０μｇの野生型ＩＦＮα−１４又は２．０μｇのＳ１５１Ｆでの突然変異を受けたＩＦＮα−１４又は等量の賦形剤のみで処置した。その後毎日、動物を生存について追跡調査し、一次効力分析は、賦形剤のみのグループと比べた各処置グループの４０日目の相対的生存率であった。
【０２８０】
図６で提示されているこの実験の結果は、ＩＦＮαで処置されなかったマウスに比べて、Ｓ１５１Ｆでの突然変異を受けたＩＦＮα−１４でのマウスの処置は、きわめて悪性の高いフレンド赤白血症（ＦＬＣ）の接種後に生存しているマウスの数の増大を結果としてもたらす。その上、ＦＬＣの接種を受けたマウスの生存率の増加は、Ｓ１５１Ｆでの突然変異を受けたＩＦＮα−１４での処置後及び野生型ＩＦＮα−１４での処置後でほぼ類似している。
これらの結果はすべて、Ｓ１５１Ｆでの突然変異を受けたＩＦＮα−１４が独特の生物学的特性を有することを実証している。
【０２８１】
例９．Daudi Burkittの細胞系統のヒトリンパ芽球上でのＧ１０５Ｅでの突然変異を受けたＩＦＮα−１４のin vitro抗増殖活性の評価
これらの試験は、Ｇ１０５Ｅでの突然変異を受けたＩＦＮα−１４及び天然の野生型ＩＦＮα−１４細胞という２つの異なるタイプのＩＦＮα−１４について実施される。予め（１０％のウシ胎児血清及び２ｍＭのＬ−グルタミンで補足された）ＲＰＭＩ１６４０培地中で培養された細胞（以下「Daudi 細胞」と呼ぶヒトDaudi Burkittリンパ腫細胞系統）を、４・１０4細胞／ウェルの細胞密度で９６ウェルのプレート内で接種する。
【０２８２】
各ウェル内で、Daudi 細胞を、０．００３ｐＭ〜６００ｎＭの範囲内の増大する濃度の天然野生型又は突然変異を受けたＩＦＮα−１４のいずれかと接触した状態に置く。
その後、Daudi 細胞を、５％のＣＯ2下で３７℃で６６時間インキュベートし、その後、培養に対しUptiblue試薬（Uptima）を添加する。４時間というさらなるインキュベーション期間の後、５９０ｎｍで発出された蛍光を測定することによって（励起５６０ｎｍ）、細胞増殖速度を定量化する。
【０２８３】
Ｇ１０５Ｅでの突然変異を受けたＩＦＮα−１４又は野生型ＩＦＮα−１４の抗増殖活性は、５０％の細胞成長を阻害するＩＦＮα−１４の濃度に対応するＩＣ５０の測定に基づいている。
３回反復された少なくとも３回の実験が、両方のタンパク質及び各々の濃度について実施された。
【０２８４】
Ｇ１０５Ｅでの突然変異を受けたＩＦＮα−１４について測定された平均ＩＣ５０値は、０．６７ｐＭであり、一方野生型ＩＦＮα−１４について測定された平均ＩＣ５０値は０．４２ｐＭである。天然の野生型タンパク質の値に対する突然変異を受けたタンパク質のＩＣ５０の値に対応する比率は、２．３７（標準偏差０．６８）に達する平均値を有する。
この試験は、Ｇ１０５Ｅでの突然変異を受けたＩＦＮα−１４タンパク質がDaudi細胞増殖を阻害するということを実証している。その上、細胞抗増殖活性は、野生型ＩＦＮα−１４に比べてＧ１０５Ｅでの突然変異を受けたＩＦＮα−１４の場合、わずかに減少している。
【図面の簡単な説明】
【０２８５】
【図１Ａ】図１Ａは、ＳＮＰ Ｇ１０５Ｅ及び天然野性型ＩＦＮαー１４タンパク質を含む本発明に従ったコードされたタンパク質のモデルを表わしている。
【図１Ｂ】図１Ｂは、図１Ａに表わされたタンパク質の各々の上部部分のモデルの拡大図を表わす。  図１Ａ及び１Ｂにおいては、黒色リボンは、天然野性型ＩＦＮαー１４タンパク質の構造を表わし、白色リボンは、Ｇ１０５Ｅでの突然変異を受けたＩＦＮα−１４タンパク質の構造を表わす。
【０２８６】
【図２Ａ】図２Ａは、ＳＮＰ Ａ１４０Ｖ及び天然野性型ＩＦＮαー１４タンパク質を含む本発明に従ったコードされたタンパク質のモデルを表わしている。
【図２Ｂ】図２Ｂは、図２Ａに表わされたタンパク質の各々の下部部分のモデルの拡大図を表わす。  図２Ａ及び２Ｂにおいては、黒色リボンは、天然野性型ＩＦＮα−１４タンパク質の構造を表わし、白色リボンは、Ａ１４０Ｖでの突然変異を受けたＩＦＮα−１４タンパク質の構造を表わす。
【０２８７】
【図３Ａ】図３Ａは、ＳＮＰ Ｓ１５１Ｆ及び天然野性型ＩＦＮαー１４タンパク質を含む本発明に従ったコードされたタンパク質のモデルを表わしている。
【図３Ｂ】図３Ｂは、図３Ａに表わされたタンパク質の各々の中央部分のモデルの拡大図を表わす。  図３Ａ及び３Ｂにおいては、黒色リボンは、天然野性型ＩＦＮα−１４タンパク質の構造を表わし、白色リボンは、Ｓ１５１Ｆでの突然変異を受けたＩＦＮα−１４タンパク質の構造を表わす。
【０２８８】
【図４】図４は、ＴＦ−１細胞系統に対するＳ１５１Ｆでの突然変異を受けたＩＦＮα−１４の抗増殖効果を測定するための試験の結果を表わす。この図では、横座標は、ＩＦＮα（ｎｇ／ｍＬ）の濃度に対応し、縦座標は、細胞増殖の阻害（％）に対応する。Ｓ１５１Ｆでの突然変異を受けたＩＦＮα−１４（黒色菱形）の抗増殖効果が、野生型ＩＦＮα−２のもの（白色正方形）と比較されている。
【０２８９】
【図５】図５は、野生型ＩＦＮα−２で治療されたもの又は治療を受けなかったものと比較した、以前にＶＳＶウイルスに感染しＳ１５１Ｆでの突然変異を受けたＩＦＮα−１４タンパク質で治療されたマウスの生存率を表わしている。この図では、横座標は、生存時間（日数）に対応し、縦座標は、ＶＳＶに感染したマウスの相対的生存率に対応している。黒色菱形は、Ｓ１５１Ｆでの突然変異を受けたＩＦＮα−１４で治療されたＶＳＶ感染マウスについてのデータを表わす。黒色正方形は、野生型ＩＦＮα−２で治療されたＶＳＶ感染マウスについてのデータを表わし、白色三角形は、治療を受けなかったＶＳＶ感染マウスについてのデータを表わしている。
【０２９０】
【図６】図６は、野生型ＩＦＮα−２で治療されたもの又は治療を受けなかったものと比較した、以前に悪性フレンド赤白血病細胞（ＦＬＣ）の接種を受け、Ｓ１５１Ｆでの突然変異を受けたＩＦＮα−１４タンパク質で治療されたマウスの生存率を表わしている。この図では、横座標は、生存時間（日数）に対応し、縦座標は、ＦＬＣ接種マウスの相対的生存率に対応している。黒色菱形は、Ｓ１７４Ｆでの突然変異を受けたＩＦＮα−１４で治療されたＦＬＣ接種マウスについてのデータを表わす。黒色正方形は、野生型ＩＦＮα−２で治療されたＦＬＣ接種マウスについてのデータを表わし、白色三角形は、治療を受けなかったＦＬＣ接種マウスについてのデータを表わしている。
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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