(57)【要約】本発明は、軟骨関連疾患を予防または治療するためのカルシウムL-トレオネート化合物、同化合物を含む薬学的組成物、および同化合物の使用に関する。カルシウムL-トレオネートは、軟骨細胞および骨芽細胞においてI型コラーゲンのmRNAの発現陽性率を有意に上昇させうること、関節軟骨および骨端軟骨の発現陽性率を有意に上昇させること、軟骨細胞の成長を促進すること、骨コラーゲンを増量させること、ならびに、骨基質および軟骨基質の形成とプロテオグリカンの合成とを促進することが実験により示された。カルシウムL-トレオネートはまた、骨に栄養を与える血管の形成を促進させ得、且つ、骨の微小循環を改善させ得た。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
軟骨関連疾患を予防または治療するためのカルシウムL-トレオネート化合物。
【請求項２】
軟骨関連疾患が、変形性関節症、慢性関節リウマチ、多発性軟骨炎、関節軟骨損傷、骨端症、頚椎関連疾患、および腰椎関連疾患からなる群より選択される、請求項1記載の化合物。
【請求項３】
軟骨関連疾患が慢性関節リウマチである、請求項2記載の化合物。
【請求項４】
軟骨関連疾患が変形性関節症である、請求項2記載の化合物。
【請求項５】
軟骨関連疾患が多発性軟骨炎である、請求項2記載の化合物。
【請求項６】
軟骨関連疾患が関節軟骨損傷である、請求項2記載の化合物。
【請求項７】
軟骨関連疾患が骨端症である、請求項2記載の化合物。
【請求項８】
軟骨関連疾患を予防または治療するための薬学的組成物であって、有効量の請求項1記載のカルシウムL-トレオネート化合物と薬学的に許容される担体とを含むことを特徴とする薬学的組成物。
【請求項９】
軟骨関連疾患が、変形性関節症、慢性関節リウマチ、多発性軟骨炎、関節軟骨損傷、骨端症、頚椎関連疾患、および腰椎関連疾患からなる群より選択される、請求項8記載の組成物。
【請求項１０】
軟骨関連疾患を予防または治療するための薬学的組成物の製造における、請求項1記載の化合物の使用。
【請求項１１】
軟骨関連疾患が、変形性関節症、慢性関節リウマチ、多発性軟骨炎、関節軟骨損傷、骨端症、頚椎関連疾患、および腰椎関連疾患からなる群より選択される、請求項10記載の使用。
【請求項１２】
軟骨関連疾患が慢性関節リウマチである、請求項10記載の使用。
【請求項１３】
軟骨関連疾患が変形性関節症である、請求項10記載の使用。
【請求項１４】
軟骨関連疾患が多発性軟骨炎である、請求項10記載の使用。
【請求項１５】
軟骨関連疾患が関節軟骨損傷である、請求項10記載の使用。
【請求項１６】
軟骨関連疾患が骨端症である、請求項10記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、軟骨関連疾患を予防または治療するためのカルシウムL-トレオネート化合物、同化合物を含む組成物、および、同化合物の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
軟骨関連疾患には多くの種類があり、よくみられる例としては変形性関節症、慢性関節リウマチ、多発性軟骨炎、関節軟骨損傷、および骨端症などがある。これらの疾患は多くの場合軟骨の欠損を伴う。
【０００３】
変形性関節症は退行性関節症（retrograde arthropathy）または過形成性関節症とも呼ばれ、軟骨の退行性変化を伴う新たな骨形成を主な特徴とする。予備的な疫学調査によれば、中国における膝の変形性関節症の罹患率は9.56%である。60歳を超える集団では罹患率が78.5%に達し、これは西欧諸国と同程度である。残念ながら変形性関節症の治療に有効な薬はない。主として使用されているのはイブプロフェン、ナプロキセンなどの非ステロイド性薬剤である。これらの薬剤は、疼痛緩和において一定の効果を示すものの、重篤な副作用があり、且つ、疾患の本質的な治療はできない。
【０００４】
変形性関節症の発症は、肥満、骨密度、外傷および力による負荷、ならびに遺伝と関連性がある（Internal Medicine、第4版、Chen Haozhu、Li Zongmingなどを参照されたい）。関節軟骨は、太さ1〜2 mmの膠原線維、糖タンパク質（glucoprotein）、およびヒアルロン酸が凝集することによって形成され、水和により、負荷および機械力を吸収および分散させるためのクッションとして機能する。生理学的条件下において、関節軟骨は、関節および軟骨下骨を囲む筋肉の収縮に依存して前述の機能を果たす。例えば関節および軟骨下骨を囲む筋肉に何らかの異常がある場合、軟骨下骨に老年性退行性変化もしくは骨粗鬆症などの異常がある場合、または、肥満もしくは外傷などのため筋肉に過剰の負荷がかかっている場合には、軟骨の損傷につながり、ひいては変形性関節症を引き起こすことがある。言及するに値する要因として骨密度がある。軟骨下骨の小柱が菲薄化および硬直化すると、圧力に対する許容性が低下する。したがって骨粗鬆症患者では変形性関節症を生じる可能性が高くなる。
【０００５】
変形性関節症の病理学的変化から、最初に関節軟骨が変性し、次に軟骨基質中の糖タンパク質が失われて関節表層部の軟骨が軟化し、圧力を受ける部分に骨折が生じ、これによって軟骨表面がベルベット状になることが示されている。次に、軟骨が徐々に剥脱し、軟骨層が菲薄化してついには消失する場合もある。軟骨下骨に微小骨折および硬化が生じる。関節表面とそれを囲む骨とに過剰な骨形成が生じ、これにより「X」線（骨端線）上に大理石骨病、骨棘、および骨嚢胞性変性が生じる。
【０００６】
慢性関節リウマチおよび多発性軟骨炎は自己免疫と関連がある。これらの疾患に共通する特徴は軟骨の損傷および欠損である。
【０００７】
関節軟骨の損傷は急性または慢性であり、その多くはスポーツ外傷で生じる。急性損傷の例としては単純な軟骨骨折がある。慢性損傷は軟骨の退行性障害および変性として生じ、長期間を経て変形性関節症へと進行する。
【０００８】
骨端症は小児にみられる骨端の特発性疾患で、骨端の虚血性壊死と骨端の軟骨内骨化障害とを特徴とし、その結果として関節の奇形が生じうる。
【０００９】
以上のように、軟骨関連疾患はしばしば軟骨の損傷、欠損、および機能的変性と関連している。
【００１０】
本発明者らはこのことについて研究を行い、カルシウムL-トレオネートが、軟骨細胞および骨芽細胞においてI型コラーゲンのmRNAの発現陽性率を有意に上昇させうること；関節軟骨および骨端軟骨において軟骨細胞の発現陽性率を有意に上昇させうること；軟骨細胞の成長を促進させること；骨コラーゲンを増量させること；ならびに、骨の成長、軟骨基質の形成、およびムコ多糖タンパク質の合成を促進することを見出した。カルシウムL-トレオネートはまた、骨に栄養を与える血管の形成を促進させ得、且つ、骨の微小循環を改善させ得た。
【００１１】
したがって本発明の目的は、軟骨関連疾患を予防または治療する方法、特に変形性関節症、慢性関節リウマチ、多発性軟骨炎、関節軟骨損傷、および骨端症などの軟骨関連疾患を予防または治療する方法を提供することにある。
【００１２】
本発明はまた、軟骨関連疾患を予防または治療するための薬学的組成物であって、有効量の本発明のカルシウムL-トレオネートと薬学的に許容される担体とを含む薬学的組成物を提供することも目的とする。
【００１３】
本発明はさらに、軟骨関連疾患を予防または治療するためのカルシウムL-トレオネート化合物を提供することも目的とする。
【００１４】
本発明はまた、軟骨関連疾患を予防または治療するための薬学的組成物の調製におけるカルシウムL-トレオネートの新規の使用法を提供することも目的とする。
【００１５】
本発明はまた、軟骨関連疾患を予防または治療するためのカルシウムL-トレオネートの新規の使用法を提供することも目的とする。
【発明の開示】
【００１６】
発明の概要
本発明は、軟骨関連疾患を予防または治療する方法、特に変形性関節症、慢性関節リウマチ、多発性軟骨炎、関節軟骨損傷、骨端症、頚椎関連疾患、または腰椎関連疾患などの軟骨関連疾患を予防または治療する方法であって、該疾患を有する被験体に有効量のカルシウムL-トレオネートを投与する段階を含む方法を提供する。本発明はまた、軟骨関連疾患を予防または治療するための薬学的組成物であって、有効量の本発明のカルシウムL-トレオネートと薬学的に許容される担体とを含む薬学的組成物を提供する。
【００１７】
本発明はまた、軟骨関連疾患を予防または治療するためのカルシウムL-トレオネート化合物を提供する。
【００１８】
本発明はさらに、軟骨関連疾患を予防または治療するための薬学的組成物の製造におけるカルシウムL-トレオネートの新規の使用法を提供する。
【００１９】
本発明はさらに、軟骨関連疾患を予防または治療するためのカルシウムL-トレオネートの新規の使用法を提供する。
【００２０】
発明の詳細な説明
本発明のカルシウムL-トレオネートは白色の粉末で、ほぼ無臭であり、水には溶けるが、アルコール、エーテル、およびクロロホルムに対しては不溶性である。化学式はC8H14O10Caであり、化学構造式は以下のとおりである。
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【００２１】
本化合物は以下の手順により調製可能である：一定量のL-アスコルビン酸（Vc）を水に加えて溶解し、攪拌しながらこの混合液に炭酸カルシウムを徐々に加える。温度10〜60℃でこの混合液に過酸化水素を滴下して加え、1〜4時間の間、温度を40〜80℃に維持する。活性炭を加えた後、この混合物を濾過する。この濾過液を温度30〜90℃で濃縮し、室温で結晶化させる。この結晶を温度50〜100℃で乾燥させる。
【００２２】
カルシウムL-トレオネートを調製する前記過程において、二酸化炭素ガスの急激な発生により容器から内容物が飛散することを防ぐため、炭酸カルシウムの添加は非常にゆっくり行わなければならない。
【００２３】
カルシウムL-トレオネートを調製する前記過程はさらに、活性炭処理した混合液を濾過して得られるケークを80℃の湯で2回洗浄する操作、および、洗浄液と濾液とを合わせたものを濃縮する操作を含んでいてもよい。
【００２４】
カルシウムL-トレオネートを調製する前記過程は、手順が妥当である、操作が単純である、収率が90%と高い、および産生物の純度が高いという利点を有する。カルシウムL-トレオネートの調製方法は、参照として本明細書に組み込まれるKai Yuらの2000年6月20日付米国特許第6,077,872号に記載されている。
【００２５】
無論、本発明のカルシウムL-トレオネートは、先行技術において周知の他の方法によって調製してもよい。
【００２６】
本発明のカルシウムL-トレオネートは経口投与してもよい。
【００２７】
本発明のカルシウムL-トレオネートは、錠剤、カプセル剤、および薬学的に許容される組成物のその他の形態など、種々の処方形態で使用してもよい。
【００２８】
本発明の薬学的組成物は、活性成分としての一定量のカルシウムL-トレオネートと、薬学的に許容される担体とを含む。担体は、賦形剤など、先行技術において薬物に広く使用されている種々の担体であってよい。本発明の薬学的組成物は、混合、ペレット成形、およびタブレット成形など、当業者に周知の方法により調製できる。
【００２９】
本発明の薬学的組成物はまた、香料、着色剤、および甘味料など、薬理学において使用可能なその他の選択的な成分を含んでいてもよい。本発明の好ましい薬学的組成物は、組成として、重量比で60%、好ましくは80%、より好ましくは90%のカルシウムL-トレオネートと、その他の賦形剤および選択的な成分とを含む。
【００３０】
カルシウムL-トレオネートの用量は患者の年齢により異なりうる。指針として、成人における典型的なカルシウムL-トレオネートの用量は1日あたり0.5 g〜12 gであり、好ましくは1日あたり3 g〜7 gである。小児においては体重に応じて用量を低減させうる。
【００３１】
カルシウムL-トレオネートの薬物動態を調べた動物実験では、ラットにおけるカルシウムL-トレオネートの吸収代謝が1槽（One-Chamber）モデルを満たすことが示された。グルコン酸カルシウム、酢酸カルシウム、および炭酸カルシウムなど他のカルシウム剤と比較して、カルシウムL-トレオネートの吸収は比較的緩徐であったがより完全であり、血清カルシウム濃度のピーク到達はより遅く（Tmax = 0.79時間）、半減期はより長かった（T1/2 = 4.45時間）。カルシウムL-トレオネートは血清中により高レベルでより長時間にわたってとどまることができる。曲線下面積（AUC）は191.75 g/(ml・時間)であった。カルシウムL-トレオネートの薬物動態試験については、参照として本明細書に組み込まれるKai Yuらの2000年6月20日付米国特許第6,077,872号に記載されている。
【００３２】
本発明において、本発明者らはカルシウムL-トレオネートが軟骨細胞および骨芽細胞のmRNA発現に及ぼす影響、ならびに軟骨細胞の発現陽性率に及ぼす影響を調べた。以下にこの試験の詳細を示す。
【００３３】
実験：カルシウムL-トレオネートが軟骨細胞および骨芽細胞のmRNA発現に及ぼす影響、ならびに軟骨細胞の発現陽性率に及ぼす影響
研究の方法および結果は以下のとおりである。
【００３４】
I．実験の目的
レチノイン酸により骨粗鬆症を誘発したラットの骨組織においてカルシウムL-トレオネートがI型コラーゲンのmRNA発現を促進する効果を有するか否か、ならびに、I型コラーゲンの形成が軟骨および骨の形成を促進する効果を有するか否かを調べること。
【００３５】
II．実験の方法
1．動物群：本試験では、3ヵ月齢の雄性ラット66匹を使用した。ブランク対照群として無作為に8匹を選択し、通常の餌と水道水を与えた。残りの58匹は無作為に9群に分け、70 mg/体重kg且つ10 ml/体重kgの用量で継続的にレチノイン酸を投与し、且つ、低カルシウム食を与えた。レチノイン酸の投与を2週間後に停止し、これにより骨粗鬆症モデルを作製した。
（1）ブランク対照群：ラット8匹、通常の餌と水道水を与えた。
（2）モデル対照群：ラット6匹、生理食塩水を与えた。
（3）カルトレート-D群：ラット6匹、カルトレート-Dを300 mg/体重kgの用量で投与した（ビタミンDを62.5 IU/体重kg含有）。
（4）クエン酸カルシウム群：ラット6匹、クエン酸カルシウムを100 mg/体重kgの用量で投与した。
（5）リン酸ヒドロキシエチルナトリウム群：ラット6匹、リン酸ヒドロキシエチルナトリウムを100 mg/体重kgの用量で投与した。
（6）カルシウムL-トレオネート群I：ラット6匹、カルシウムL-トレオネートを50 mg/体重kgの用量で投与した。
（7）カルシウムL-トレオネート群II：ラット7匹、カルシウムL-トレオネートを100 mg/体重kgの用量で投与した。
（8）カルシウムL-トレオネート群III：ラット9匹、カルシウムL-トレオネートを200 mg/体重kgの用量で投与した。
【００３６】
ラットに各薬剤を10週間にわたって投与した。通常の餌を与えたブランク対照群を除き、各群に全試験期間を通じて低カルシウム食および脱イオン水を与えた。そして各ラットの右大腿骨の下部3分の1を採取し、-20℃で保管した。
【００３７】
2．試薬および方法
（1）インサイチューハイブリダイゼーションおよび免疫組織化学アッセイ
キットの指示に従って、I型コラーゲンをインサイチューハイブリダイゼーションにより染色した。特異的ハイブリダイゼーション後、3,3'-ジアミノベンジジン（DAB）によりI型コラーゲンのmRNAを発色させた。スライドを通常の操作で脱水およびマウントした。（検出キットはWuhan Doctor Microbiologic Engineering社（中国）製、カタログ番号MK1171。）
【００３８】
キットの指示に従って、I型コラーゲンをABC法により免疫組織化学的に染色した。I型コラーゲンをDABにより発色させた。スライドを通常の操作で脱水およびマウントした。（検出キットはWuhan Doctor Microbiologic Engineering社（中国）製、カタログ番号BA0325。）
【００３９】
（2）組織化学染色
a  Masson-Goldner Lrichrone染色（M-S染色）
b  トルイジンブルー染色（T-B染色）
c  ヘマトキシリン‐エオシン（HE）染色
d  部分切片のフォン・コッサ銀染色（V-K銀染色）
【００４０】
III．統計処理
結果は顕微鏡で観察し、陽性率で表現した。実験データに対してχ2検定を行った。
【００４１】
IV．結果
1．I型コラーゲンmRNAのインサイチューハイブリダイゼーションにおいて、陽性の物質は明るい茶色を呈し、皮質骨（図18）および海綿骨（図12）の骨細胞の細胞質中に見出された。陽性の物質は関節軟骨および骨端軟骨板の軟骨細胞の核および細胞質中にも見出された。軟骨包からも陽性の物質がある程度検出された（図2、14、17）。各群の発現の結果を表1に示す。
【００４２】
（表１）インサイチューハイブリダイゼーションによる各群のI型コラーゲンmRNAの陽性率
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注：モデル対照群との比較、* P＜0.05、** P＜0.01
【００４３】
ブランク対照群、ならびにカルシウムL-トレオネート群IおよびIIでは他群と比較して陽性率が高く、カルシウムL-トレオネート群Iでは陽性率がモデル対照群より有意に高かった（P＜0.05）。インサイチューハイブリダイゼーションによる骨細胞のI型コラーゲンmRNAの発現陽性と同様に、インサイチューハイブリダイゼーションによる骨細胞のI型コラーゲンmRNAの陽性率もブランク対照群、ならびにカルシウムL-トレオネート群IおよびIIにおいて比較的高く、カルシウムL-トレオネート群では発現率がモデル対照群より有意に高かった（P＜0.05）。
【００４４】
2．I型コラーゲンの免疫組織化学染色において、陽性の物質は主として関節軟骨および骨端軟骨板の軟骨細胞中に見出され（図2および7）、特に関節軟骨において顕著であった。陽性の物質は骨端軟骨板中からもある程度検出され（図5、6、および11）、分散して分布していた。各群の発現の結果を表2にまとめた。
【００４５】
（表２）免疫組織化学染色による各群のI型コラーゲンの陽性率
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注：モデル対照群との比較、** P＜0.01
ブランク対照群との比較、△△ P＜0.01
【００４６】
免疫組織化学法によるI型コラーゲンの陽性率は、ブランク対照群、カルシウムL-トレオネート群I、およびカルシウムL-トレオネート群IIにおいて比較的高かったが、統計有意差はなかった。カルトレート-D群およびクエン酸カルシウム群では陽性率がブランク対照群と比較して顕著に低かった（p＜0.01）。
【００４７】
3．ブランク対照群（添付の図1および2を参照）を「正常な」比較基準として使用した、組織化学染色の観察結果
（1）モデル対照群とブランク対照群との比較：関節軟骨は退行性の変化を示していた。関節軟骨および骨端軟骨板が菲薄化していた。軟骨基質中において骨コラーゲンの形成およびグリコーゲンの合成が低減していた。添付の図3、4、5、および6を参照されたい。新規の骨形成が低減し、骨粗鬆症の病理学的変化に対応して微小骨折が生じていた。
【００４８】
（2）カルトレート-D群：関節軟骨および骨端軟骨における細胞の石灰化はブランク対照群と同程度であったが、軟骨基質には退行性の変化がわずかに認められ、骨コラーゲンの形成およびグリコーゲンの合成が低減していた。図7および8を参照されたい。銀染色された線維は少なく、点として現れた（図9）。ブランク対照群と比較して骨形成が少なかった。
【００４９】
（3）リン酸ヒドロキシエチルナトリウム群：関節軟骨に退行性の変化が生じていた。骨端軟骨細胞が顕著に増殖していたが、その構造は不規則で類骨状を呈していた。骨端軟骨細胞は骨化の過程を経ておらず、骨が成熟していなかった。銀染色された物質が密に且つ不規則に存在していた。図10および11を参照されたい。骨内膜が肥厚し、骨コラーゲンの形成およびグリコーゲンの合成が低減していた。図12および13を参照されたい。
【００５０】
（4）カルシウムL-トレオネート群：関節軟骨および骨端軟骨板の軟骨細胞の量、体積、および組織微細構造が、程度に差はあるものの（ブランク対照群と比較して）改善していた。軟骨膠原線維および軟骨基質が肥厚していた（図15および16を参照）。骨細胞の量が増加し、体積が大きくなった。コラーゲン形成が増強していた。グリコーゲン含有量がブランク対照群より顕著に多かった。新規の骨形成が促進された（図14、17、18、19、および20を参照）。同時に、骨小管が増殖し、骨に栄養を与える血管も増加していた。
【００５１】
（5）クエン酸カルシウム群：関節軟骨および骨端軟骨における基質およびコラーゲンの形成、ならびに、グリコーゲンの合成が増強していた。しかし、石灰化および骨化の進行は緩徐であった。新規の骨形成はブランク対照群より少なかった。
【００５２】
IV．結論
以上の実験結果から下記のことが示された。
【００５３】
1．I型コラーゲンmRNAのインサイチューハイブリダイゼーションにより、カルシウムL-トレオネートが骨細胞中のI型コラーゲンmRNAの発現陽性率を有意に上昇させることが示された。これにより、骨コラーゲンの形成が増強され骨形成が促進された。
【００５４】
2．I型コラーゲンmRNAのインサイチューハイブリダイゼーションとI型コラーゲンの免疫組織化学試験とから、カルシウムL-トレオネート群Iにおいて関節軟骨および骨端軟骨中の軟骨細胞の発現陽性率が有意に上昇することが示された。カルシウムL-トレオネート群IIおよびIIIでも同様の結果が認められた。
【００５５】
関節軟骨細胞の発現が増加したことにより、関節軟骨基質の形成が促進された。骨端軟骨板中の軟骨細胞の発現が増加したことにより、骨端軟骨板中の軟骨基質の形成が促進され、その結果、一次小柱の形成が促進され且つ骨量が増加した。
【００５６】
3．グリコーゲンのT-B染色、コラーゲンのM-S染色、およびV-K銀染色による組織化学的試験から、カルシウムL-トレオネートが、骨コラーゲンの形成およびプロテオグリカンの合成を促進する効果を有すること；関節軟骨の正常構造を保護すること；関節軟骨の退行性変化を遅延させること；骨端軟骨の増殖および発達を助けること；ならびに、骨端軟骨の骨格形成過程を改善することが示された。新たに形成された骨の物理的な配置は生体力学的構造と対応していた。
【００５７】
4．骨コラーゲン形成タンパク質はカルシウムに対する結合活性を有しており、これによりカルシウムL-トレオネートが担体として作用してカルシウムを所定の標的まで運び且つ骨コラーゲンと結合させる。このことにより骨が形成された。
【００５８】
5．カルシウムL-トレオネートは栄養血管の形成を促進し骨の微小循環を向上させた。
【００５９】
以上の結論より、カルシウムL-トレオネートが、骨および関節軟骨の老年性退行性変化を予防および治療する効果；軟骨損傷の治癒および軟骨組織の修復を促進する効果；微小循環系を改善する効果；ならびに、骨格の老化進行を遅延させる効果を有することが示された。
【図面の簡単な説明】
【００６０】
【図１】ブランク対照群の骨幹端の海綿骨のMS組織化学染色像である。成熟した骨内膠原線維が示されている。
【図２】ブランク対照群の骨幹端の海綿骨中のグリコーゲンの染色像である。グリコーゲンの分布が均一であることが示されている。
【図３】モデル群の海綿骨のMS組織化学染色像である。微小骨折を伴う骨小柱の疎性化が示されている。
【図４】モデル群の海綿骨中のグリコーゲンの組織化学染色像である。微小骨折を伴う、骨小柱の疎性化およびグリコーゲン合成の減弱が示されている。
【図５】モデル群の銀染色像である。骨内膠原線維の疎性化が示されている。
【図６】モデル群の骨幹端の銀染色像である。骨内膠原線維の合成の減弱が示されている。
【図７】カルトレート-D群の海綿骨のMS染色像である。骨小柱が疎性化していることおよび骨内膠原線維の分布が不均一であることが示されている。
【図８】カルトレート-D群の海綿骨のグリコーゲンの組織化学染色像である。骨小柱が疎性化していることおよびグリコーゲンが陽性（+）であることが示されている。
【図９】カルトレート-D群の皮質骨の組織化学的銀染色像である。骨内膠原線維が短く、細く、且つ散乱していることが示されている。
【図１０】リン酸ヒドロキシエチルナトリウム群の銀染色像である。骨内膠原線維の疎性化が示されている。
【図１１】リン酸ヒドロキシエチルナトリウム群の銀染色像である。不明瞭な構造をもつ無秩序で密な骨内膠原線維が示されている。
【図１２】リン酸ヒドロキシエチルナトリウム群のMS組織化学染色像である。成熟した海綿骨と疎な骨内膠原線維とが示されている。
【図１３】リン酸ヒドロキシエチルナトリウム群のグリコーゲンの組織化学染色像である。海綿骨中の骨小柱が過剰且つ無秩序であること、およびグリコーゲンが少ないことが示されている。
【図１４】カルシウムL-トレオネート群のグリコーゲンの染色像である。海綿骨中の骨小柱が太く密で且つ規則的であること、およびグリコーゲンが豊富であること（++）が示されている。
【図１５】カルシウムL-トレオネート群の骨端軟骨のMS組織化学染色像である。軟骨細胞が増加していること、血管が豊富であること、および膠原線維が増加していることが示されている。
【図１６】カルシウムL-トレオネート群の関節軟骨のMS組織化学染色像である。軟骨基質の肥厚および軟骨細胞の増加が示されている。
【図１７】カルシウムL-トレオネート群のMS組織化学染色像である。海綿骨中に骨小柱がより高密度で規則正しく存在していること、およびコラーゲンの合成が増強していることが示されている。
【図１８】カルシウムL-トレオネート群の銀染色像である。明瞭な境界をもつ新しい骨細胞が豊富に存在することが示されている。
【図１９】カルシウムL-トレオネート群の銀染色像である。骨基質および骨細胞が増加していること、ならびに微小構造が修復されていることが示されている。
【図２０】カルシウムL-トレオネート群の銀染色像である。豊富な骨内膠原線維が平行且つ規則的に存在することが示されている。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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