(57)【要約】本発明は、ヒトへの移植用の実質的に非免疫原性の粘膜下異種移植片を提供する。さらに、本発明は、異種移植片を、非ヒト科動物から粘膜下組織の少なくとも一部分を取り出し、該異種移植片を生理食塩水及びアルコールで洗浄し、該異種移植片を細胞破壊処理に付し、そして該異種移植片をグリコシダーゼで消化して表面炭水化物部分を除去することによって製造するための方法を提供する。また、本発明は、上記方法によって製造された製造物品も提供する。さらに、本発明は、非ヒト科動物からの粘膜下組織の一部分を含むヒトへの移植用の粘膜下異種移植片であって、該一部分がグリコシダーゼ消化に対して感受性のある表面炭水化物部分を実質的に有しないものを提供する。該異種移植片のそれぞれは、本来の軟組織と実質的に同一の機械的性質を有する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
次の段階：
（ａ）非ヒト科動物から粘膜下組織の少なくとも一部分を取り出して異種移植片を与え、
（ｂ）該異種移植片を水及びアルコールで洗浄し、
（ｃ）該異種移植片を細胞破壊処理に付し、及び
（ｄ）該異種移植片をグリコシダーゼで消化して該異種移植片から複数の表面炭水化物部分を実質的に除去すること
を含み、それによって該異種移植片が実質的に非免疫原性であり且つ天然の軟組織と実質的に同一の機械的性質を有することを特徴とする、ヒトへの移植用の粘膜下異種移植片の製造方法。
【請求項２】
細胞破壊処理が凍結／解凍の循環を含む請求項１に記載の方法。
【請求項３】
細胞破壊処理がγ線の照射を含む請求項１に記載の方法。
【請求項４】
グリコシダーゼがガラクトシダーゼである請求項１に記載の方法。
【請求項５】
ガラクトシダーゼがα−ガラクトシダーゼである請求項４に記載の方法。
【請求項６】
次の段階：
（ｅ）異種移植片から複数のプロテオグリカンを実質的に除去すること
をさらに含む請求項１に記載の方法。
【請求項７】
除去段階が異種移植片をコンドロイチナーゼＡＢＣ、ヒアルロニダーゼ、コンドロイチンＡＣIIリアーゼ、ケラタナーゼ、トリプシン及びフィブロネクチン断片よりなる群から選択される少なくとも１種のプロテオグリカン除去因子で消化することを含む請求項６に記載の方法。
【請求項８】
段階（ｃ）の後に、異種移植片に穴をあける段階をさらに含む請求項１に記載の方法。
【請求項９】
段階（ｃ）の後に、異種移植片を少なくとも１種の酵素で処理する段階をさらに含む請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
酵素がフィシン及びトリプシンよりなる群から選択される請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
段階（ｃ）の後に、異種移植片を石灰化防止剤、抗血栓剤、抗生物質及び成長因子よりなる群から選択される１種以上の薬剤で処理する段階をさらに含む請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
段階（ｃ）の後に、異種移植片を滅菌する段階をさらに含む請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
滅菌段階が異種移植片を酸化エチレン及び酸化プロピレンよりなる群から選択される１種以上の薬剤で滅菌することを含む請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
段階（ｃ）の後に、異種移植片を少なくとも１種の架橋剤で処理する段階をさらに含む請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
架橋剤がアルデヒド、芳香族ジアミン、カルボジイミド及びジイソシアネートよりなる群から選択される請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
少なくとも１種の架橋剤がグルタルアルデヒドである請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
異種移植片を約０．０１％〜約５％のグルタルアルデヒドを含有する溶液を使用して架橋させる請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
架橋剤が蒸気の形である請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
段階（ｃ）の後に、異種移植片をポリエチレングリコールで処理する段階をさらに含む請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
次の段階：
（ａ）非ヒト科動物から粘膜下組織の少なくとも一部分を取り出して異種移植片を与え、
（ｂ）該異種移植片を水及びアルコールで洗浄し、
（ｃ）該異種移植片を細胞破壊処理に付し、及び
（ｄ）該異種移植片をグリコシダーゼで消化して該異種移植片から複数の表面炭水化物部分を実質的に除去すること
によって製造され、それによって該異種移植片が実質的に非免疫原性であり且つある粘膜下組織の相当する部分と実質的に同一の機械的性質を有する、ヒトへの移植用の実質的に非免疫原性である粘膜下異種移植片を含む製造物品。
【請求項２１】
異種移植片が段階（ｃ）の後にプロテオグリカン除去因子でさらに消化されて該異種移植片から複数のプロテオグリカンが実質的に除去された請求項２０に記載の製造物品。
【請求項２２】
異種移植片が薬剤及び酵素に対する浸透性を増大させるための複数の穿刺孔を該異種移植片に有する請求項２０に記載の製造物品。
【請求項２３】
異種移植片が滅菌された請求項２０に記載の製造物品。
【請求項２４】
異種移植片が架橋された請求項２０に記載の製造物品。
【請求項２５】
非ヒト科動物からの粘膜下組織の一部分を含むヒトへの移植用の粘膜下異種移植片組織において、
（ａ）該一部分が複数の細胞外成分及び死滅細胞を含み、ここで、該細胞外成分及び死滅細胞は、表面−ガラクトシル部分を実質的に有しないものとし、
（ｂ）それによって該粘膜下異種移植片組織の一部分が霊長類において実質的に非免疫原性であること
を特徴とする、ヒトへの移植用の粘膜下異種移植片組織。
【請求項２６】
異種移植片組織の少なくとも一部分が温血脊椎動物の空腸から切除された請求項２５に記載の異種移植片。
【請求項２７】
一部分が小腸セグメントの粘膜の粘膜下組織、粘膜筋板及び細胞層である請求項２５に記載の異種移植片。
【請求項２８】
前記粘膜下組織、粘膜筋板及び細胞層が小腸セグメントの粘膜の筋層及び管腔部分から離層された請求項２５に記載の異種移植片。
【請求項２９】
靱帯の一部分がその第１の末端部の反対側の第２末端部に固定された第２の骨塊を有する請求項２５に記載の異種移植片。
【請求項３０】
非ヒト科動物からの粘膜下組織の一部分を含むヒトへの移植用の粘膜下異種移植片において、
（ａ）該一部分が複数の細胞外成分であって減少したプロテオグリカンを有するもの、複数の実質的に死滅した細胞及び該細胞外成分の複数の蛋白質を架橋する約０．０１％〜約５％の範囲の量のアルデヒドを含み、ここで、該死滅細胞と細胞外成分は、グリコシダーゼ消化に対して感受性のある表面炭水化物部分を実質的に有しないものとし、
（ｂ）それによって該粘膜下組織の一部分が実質的に非免疫原性であり且つ天然の軟組織と実質的に同一の機械的性質を有する
ことを特徴とする、ヒトへの移植用の粘膜下異種移植片。
【請求項３１】
細胞外成分及び実質的に死滅した細胞が表面α−ガラクトシル部分を実質的に有しない請求項３０に記載の異種移植片。
【請求項３２】
異種移植片が複数の穿刺孔を有する請求項３０に記載の異種移植片。
【請求項３３】
次の段階：
（ａ）非ヒト科動物から粘膜下組織の少なくとも一部分を取り出して異種移植片を与え、
（ｂ）該異種移植片を水及びアルコールで洗浄し、
（ｃ）該異種移植片を細胞破壊処理に付し、及び
（ｄ）該異種移植片から複数のプロテオグリカンを実質的に除去すること
を含み、それによって該異種移植片が実質的に非免疫原性であり且つ天然の軟組織と実質的に同一の機械的性質を有することを特徴とする、ヒトへの移植用の粘膜下異種移植片の製造方法。
【請求項３４】
段階（ｃ）の後に、異種移植片を滅菌する段階をさらに含む請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
滅菌段階が異種移植片を酸化エチレン及び酸化プロピレンよりなる群から選択される１種以上の薬剤で滅菌することを含む請求項３３に記載の方法。
【請求項３６】
段階（ｄ）の後に、異種移植片から複数の表面炭水化物部分を実質的に除去する段階をさらに含む請求項３３に記載の方法。
【請求項３７】
除去段階が異種移植片をグリコシダーゼで消化することを含む請求項３３に記載の方法。
【請求項３８】
グリコシダーゼがガラクトシダーゼである請求項３３に記載の方法。
【請求項３９】
ガラクトシダーゼがα−ガラクトシダーゼである請求項３３に記載の方法。
【請求項４０】
非ヒト科動物からの粘膜下組織の一部分を含むヒトへの移植用の粘膜下異種移植片において、
（ａ）該一部分が死滅細胞及び複数の細胞外成分を含み、ここで、該細胞外成分は減少したプロテオグリカンを有するものとし、
（ｂ）それによって該一部分が実質的に非免疫原性であり且つ天然の軟組織と実質的に同一の機械的性質を有する
ことを特徴とする、ヒトへの移植用の粘膜下異種移植片。
【請求項４１】
細胞外成分及び実質的に死滅した細胞が表面−ガラクトシル部分を実質的に有しない請求項４０に記載の異種移植片。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、損傷の外科的修復の分野に関し、特に、非ヒト科動物からの実質的に免疫適合性のある粘膜下組織を使用して欠陥のあるヒト組織を置換及び修復することに関する。
【背景技術】
【０００２】
小腸粘膜下組織（ＳＩＳ）は、自然発生する複雑な細胞外マトリックス物質である。典型的にはブタの小腸から得られるものであるが、粘膜下組織は、小腸の粘膜と筋層の間に自然発生する。ＳＩＳは細胞を含まない。正確に言えば、この物質は、マトリックスを形成するコラーゲンの複雑な組織を有する。ＳＩＳは、主として蛋白質であり、副次的にはある量の炭水化物及び脂質を有する。
【０００３】
患者の身体に移植されるときには、ＳＩＳは、患者の身体が損傷を受けた組織を置換し且つ修復するのを可能にする環境を与える組織工学用生体材料である。さらに、この生体材料は、身体自身の組織を成長させるための環境を与えつつ強さと柔軟な取り扱いを兼ね備えている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
部分的及び全体的な厚さの皮膚を喪失した損傷、尿失禁及び軟組織の修復と強化の処置のためにＳＩＳを使用することが提案されてきたが、斯界には、霊長類、特にヒトにおいて実質的に非免疫原性である組織工学用生体材料に対するニーズが存在する。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、霊長類、特にヒトへの移植用の実質的に非免疫原性の粘膜下異種移植片を提供する。また、本発明は、粘膜下異種移植片を処理して減少した免疫原性を有するが実質的に天然の弾性及び耐力能をも有する異種移植片を製造する方法も提供する。本発明の方法は、細胞破壊処理及び異種移植片の炭水化物部分のグリコシダーゼ処理を包含する。これらの段階に加えて又はその代わりに、本発明の方法は、次の段階：放射線による粘膜下組織の処理、１循環以上の凍結及び解凍、化学架橋剤による処理及びアルコール又はオゾン処理を包含する。
【０００６】
ある具体例では、本発明は、ヒトへの移植用の小腸粘膜下（「ＳＩＳ」）異種移植片を含む製造物品を提供する。別の具体例では、本発明は、非ヒト科動物からＳＩＳの少なくとも一部分を取り出して異種移植片を与え、該異種移植片を水及びアルコール中で洗浄し、該異種移植片をグリコシダーゼで消化して炭水化物部分を除去することを含み、それによって該異種移植片が天然の軟組織の一部分と実質的に同一の機械的特性を有し、しかも該異種移植片が霊長類、特にヒトにおいて実質的に非免疫原性となるヒトへの移植用の粘膜下異種移植片の製造方法を提供する。
【０００７】
この粘膜下異種移植片は、かなりの縫合保持強度を有する。個々のシートは、格別の強度のために巻かれ、折り畳まれ又は多層の形に形成できる。粘膜下異種移植片は、大きな又は慢性的な皮膚障害のために使用できる。その他の見込まれる用途は、（ａ）粘着性障壁としての用途、（ｂ）角膜用途、（ｃ）歯根膜用途、（ｄ）食道用途、（ｄ）器官用パッチとしての用途、（ｆ）止血用プラグとしての用途、（ｇ）口蓋破裂の処置に使用するための用途、（ｈ）その他の軟組織修復又は（ｉ）通常の創傷ケアである。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
定義
用語「粘膜下組織」とは、粘膜の下にある疎性結合組織の層を意味する。特に、粘膜下組織には、小腸、胃、膀胱及びその他の器官からの組織が含まれる。動物では、本発明の処理前に、粘膜下組織は、一般に、血管とリンパ管、リンパ節、神経線維及び弾性線維を含む。
【０００９】
ここで使用されるときに、用語「軟組織」とは、半月板と関節の軟骨のような軟骨構造、前十字靱帯のような靱帯及び腱をいう。
【００１０】
用語「異種移植片」とは、ある種の動物から別の種のものに移される移植片をいう。ステッドマンの医学辞典，ウィリアムズ＆ウィルキンス，バルチモア，ＭＤ（１９９５）を参照されたい。用語「異種」とは、例えば異種軟組織などの場合に、ある種の動物から別の種の動物に移される軟組織をいう。
【００１１】
用語「細胞破壊」とは、例えば細胞破壊処理などの場合に、細胞を死滅させるための処理をいう。
【００１２】
用語「一部分」とは、例えば粘膜下組織の一部分などの場合に、それぞれの粘膜下組織の全て又はその全てよりも少ないことをいう。
【００１３】
いったんある個体に移植されたならば、異種移植片は、移植片の慢性及び急性拒絶反応のような免疫原性反応を刺激する。ここで使用されるときに、用語「慢性拒絶反応」とは、ある個体に移植された異種移植片に対する該個体の免疫反応をいう。典型的には、慢性拒絶反応は、異種移植片を受け入れた個体の血清中の天然ＩｇＧ抗体と細胞上で発現する炭水化物部分及び／又は該異種移植片の細胞マトリックス及び／又は細胞外成分との相互作用によって仲介される。例えば、非霊長類動物からの軟骨異種移植片（例えば、ブタ又はウシ起源）のヒトへの移植は、主としてヒトの血清中に存在する天然ＩｇＧ抗Ｇａｌ抗体と該異種移植片で発現する炭水化物構造Ｇａｌ１−３Ｇａｌ１−４ＧｌｃＮＡｃ−Ｒ（−ガラクトシル又は−ｇａｌエピトープ）との間の相互作用によって妨害される（Ｋ．Ｒ．Ｓｔｏｎｅ他，「カニクイザルにおけるブタ及びウシ軟骨の移植」：Ｉ．「慢性異種移植片拒絶反応のモデル」，６３，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ６４０−６４５（１９９７）及びＵ．Ｇａｌｉｌｉ他，「カニクイザルにおけるブタ及びウシ軟骨の移植」：II．「慢性拒絶反応中の抗Ｇａｌ応答の変化」，６３  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ６４６−６５１（１９９７））。慢性拒絶反応では、免疫系は、異種移植片の移植の１〜２週間以内に典型的に応答する。「慢性拒絶反応」とは異なり、ここで使用されるときに「超急性拒絶反応」とは、ある個体に移植された異種移植片に対する該個体の免疫反応であって、その拒絶反応が異種移植片を受け取った個体の血清中の天然ＩｇＭ抗体と細胞上で発現する炭水化物部分との相互作用によって典型的に仲介されるものをいう。この相互作用は、数分〜２，３時間以内に受容個体の血管床の溶解及び血流の停止に起因して補体系を活性化させる。
【００１４】
ここで使用されるときに、用語「細胞外成分」とは、任意の細胞外の水、コラーゲン及び弾性線維、プロテオグリカン、フィブロネクチン、エラスチン及びその他の糖蛋白質をいう。
【００１５】
粘膜下異種移植片材料源
本発明の異種移植片は、小腸、胃及び膀胱のような器官の粘膜下組織から製造できる。粘膜下組織は、任意の非ヒト科動物、特に、ブタ、ヒツジ及びウシのような温血動物から採取できる。また、トランスジェニック非ヒト科動物又は遺伝学的に改変された非ヒト科動物からの粘膜下組織も異種移植片として使用できる。
【００１６】
一具体例では、異種移植片は、温血脊椎動物（鳥類若しくはほ乳類）の大腸又は小腸組織のセグメントから形成できる。異種移植片材料は、粘膜の粘膜下組織、粘膜筋板及び細胞層を含み、この粘膜下組織、粘膜筋板及び細胞層は、腸組織のセグメントの粘膜の筋層及び内腔部分から離層される。小腸粘膜下組織（ＳＩＳ）について、本発明の異種移植片を形成させるのに使用される３層の腸セグメントはそれらの離層した管状の形で使用でき、或いはこれらのセグメントを縦に又は横に切断して長くした組織セグメントを形成させることができる。いずれかの形において、このようなセグメントは、外科手術として許容できる技術を使用して既存の生理学的構造体に外科的に付着させるために形成され得る中間部分、向かい合う末端部分及び向かい合う側面部分を有する。小腸は、異種移植片材料を生じさせるためのここに記載されるようなその操作（離層）の前には、多数の別個の組織層から構成されている。本発明の好ましい具体例では、組織移植片用材料は、小腸、より好ましくは、十二指腸と回腸の間に及ぶ小腸部分である空腸のセグメントから離層された粘膜下組織及び基底粘膜組織を含む。
【００１７】
この材料は、良好な機械強度特性を有する。整形外科用途に使用される異種移植片は、典型的にはその外科装置の張力下に置かれるため、２種又はそれ以上の組織セグメントを結合させて多層移植片構造体とすることが好ましい。
【００１８】
腸のセグメントをまず採取し、そして例えば米国特許第５３７２８２１号及び同４９０２５０８号に記載されるように離層させて粘膜下組織を得るときに、異種移植片材料は、中間部分及び向かい合う末端部分を有する管状セグメントであろう。これらの末端部分は、次いで、付着のために付着点での移植片断裂の可能性を減少させる態様で形成され、操作され又は成形され得る。異種移植片材料は、腸組織のセグメントの長さに相当する縦方向の寸法と腸組織のセグメントの直径に対応する横の寸法とを有し得る。得られたセグメントは、典型的には、形成された腸組織セグメントの長さよりも長い長さに縦に引き伸ばすことによって予備調整される。例えば、このセグメントは、組織セグメントの約１０〜約２０％の伸びを可能にするのに十分な時間にわたってセグメントから重しを吊すことにより状態調整できる。随意として、異種移植片材料は、横の寸法について伸ばすことによって予備調整できる。なぜならば、この異種移植片材料は、縦と横の寸法について同様の粘弾性の割合を示すからである。次いで、この異種移植片材料は、様々な形状及び形態に成形され、例えば靱帯若しくは腱の代用物又は置換物或いは切断若しくは分断された腱又は靱帯用のパッチとして役立つ。さらに、セグメントを、移植片材料の多層を有するように形成される向かい合う末端部分及び／又は向かい合う側面部分を少なくとも有する層状又はさらに多層状の形状を有するように成形及び形成して、骨、腱、靱帯、軟骨及び筋肉を含む生理学的構造体に対する付着のための補強を与える。
【００１９】
穿孔された単一多層状ＳＩＳ異種移植片は、米国特許第５９６８０９６号又は同５９５５１１０号に記載されるように製造できる。この方法は、ここに記載されるように処理された粘膜下組織の細片を処理された粘膜下組織の他の細片と重ね合わせ、少なくとも該細片の重ね合わされた部分を二つの表面間で圧縮し（ここで、この圧縮は圧縮されるシートの脱水を可能にし又はそれを促進させる条件下で行うものとする）、得られた単一組織移植片構造物を穿孔すること含む。
【００２０】
別の具体例では、本発明の異種移植片は、米国特許第６０９９５６７号に記載されるように、温血脊椎動物の胃の粘膜の管腔部分及びその胃の外筋層の平滑筋層の両方から離層された胃粘膜下組織から形成できる。
【００２１】
さらに別の具体例では、本発明の異種移植片は、米国特許第５７６２９６６号及び同５５５４３８９号に記載されるように、温血脊椎動物の膀胱粘膜下組織から形成できる（脊椎動物の膀胱区域の粘膜のうち分離管腔筋層及び少なくとも管腔部分から離層された膀胱粘膜下組織）。
【００２２】
製造方法
異種移植片を作るために、粘膜下材料は、グリコシダーゼによる該異種移植片の試験管内消化より前に粘膜下組織の細胞を死滅させるための細胞破壊処理に付される。次いで、該異種移植片をグリコシダーゼによる該異種移植片の消化に付して異種移植片から炭水化物部分を除去する。
【００２３】
まず、そのままの小腸が非ヒト科動物から取り出される。小腸の採取は、軟組織の酵素分解を最小にするために、動物（例えば、ブタ、ヒツジ又はウシ）の屠殺後できるだけ早く行うべきであり、好ましくは低温で、即ちおよそ約５℃〜約２０℃の範囲で実施すべきである。粘膜下組織は、厳格な滅菌技術の下で低温で採取される。次いで、この異種移植片を約１０倍容量の滅菌冷水で洗浄して残余の血液蛋白質及び水溶性物質を除去する。次いで、この異種移植片を室温で約５分間アルコールに浸漬して組織を滅菌し且つ非膠原物質を取り除く。別法としては、本発明の異種移植片を上述のように凍結／解凍循環に付して軟組織の細胞を破壊、即ち死滅させる。
【００２４】
典型的には、表面炭水化物部分が有核細胞及び細胞外マトリックスから除去された後に、有核、即ち生細胞は、炭水化物部分を再度発現させ、これは異種移植片の継続した免疫原性拒絶反応を誘発し得る。対照的に、死滅細胞は表面炭水化物部分を再発現させることができず、そのため、次いで異種移植片の非有核細胞及び細胞外成分から抗原性の表面炭水化物部分を除去すると、異種移植片の免疫原性拒絶反応源としての抗原性表面炭水化物部分が実質的に恒久的に除去される。
【００２５】
次いで、この異種移植片をグリコシダーゼ、特に−ガラクトシダーゼのようなガラクトシダーゼによる試験管内消化に付して抗原性の表面炭水化物部分を酵素的に除去する。特に、−ｇａｌエピトープは、次の反応式：
【化１】
2004529711.tif 000002
に表されるように、−ガラクトシダーゼによる酵素処理によって除去される。
【００２６】
Ｎ−アセチルアクトサミン残基は、ヒト及びほ乳類細胞上で通常発現するエピトープであるため、免疫原性ではない。グリコシダーゼによる異種移植片の試験管内消化は、様々な方法で達成できる。例えば、異種移植片は、グリコシダーゼを含有する緩衝液中に浸漬でき又はこの中でインキュベートできる。別法として、グリコシダーゼを含有する緩衝液を加圧下で拍動性の洗浄方法によって異種移植片に押し入れることができる。
【００２７】
異種移植片からの−ｇａｌエピトープの除去は、異種移植片に対する免疫応答を減少させる。−ｇａｌエピトープは、非霊長目ほ乳類及び新世界ザル（南アメリカのサル）中で細胞当たり１×１０6〜３５×１０6個のエピトープとして発現し、並びに細胞外成分のプロテオグリカンのような高分子上で発現する（Ｕ．Ｇａｌｉｌｉ他，「ヒト、類人猿及び旧世界ザルは、有核細胞上の−ガラクトシルエピトープの発現の点でその他のほ乳類とは異なる」，２６３  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１７７５５（１９８８））。このエピトープは、旧世界霊長類（アジアとアフリカのサル及び類人猿）及びヒトには存在しないが、イディオタイプである抗Ｇａｌは、胃腸内細菌上の−ｇａｌエピトープの炭水化物構造に対する免疫応答の結果としてヒト及び霊長類で産生される（Ｕ．Ｇａｌｉｌｉ他，「ヒト天然抗−ガラクトシル免疫グロブリンＧとヒト寄生菌のバクテリアとの間の相互作用」，５６  Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．１７３０（１９８８）、Ｒ．Ｍ．Ｈａｍａｄｅｈ他，「ヒト天然抗ＧａｌＩｇＧは、細菌表面上で別の補体活性化経路の活性化を調節する」，８９  Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１２２３（１９９２））。非霊長類動物は−ｇａｌエピトープを産生するので、これらの動物からの異種移植片の霊長類への異種移植は、霊長類の抗Ｇａｌが異種移植片上のこれらのエピトープに結合するため拒絶反応を生じさせる。この結合は、補体結合及び抗体依存性細胞毒性によって異種移植片の破壊を生じさせる（Ｕ．Ｇａｌｉｌｉ他，「天然抗Ｇａｌ抗体と−ガラクトシルエピトープとの相互作用：ヒトにおける異種移植についての大きな障害」），１４  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ  ４８０（１９９３）、Ｍ．Ｓａｎｄｒｉｎ他，「ヒト血清中の抗ブタＩｇＭ抗体は、主としてＧａｌ１−３Ｇａｌエピトープと反応する」，９０  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １１３９１（１９９３）、Ｈ．Ｇｏｏｄ他，「ヒト抗ブタ抗体と結合する炭水化物構造の同定：ヒトにおける不調和移植の示唆」，２４  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．Ｐｒｏｃ．５５９（１９９２）、Ｂ．Ｈ．Ｃｏｌｌｉｎｓ他，「霊長類種間での心臓異種移植は、超急性拒絶反応における−ガラクトシル決定因子の重要性の証拠となる」，１５４  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．５５００（１９９５））。さらに、異種移植は、免疫系の大きな活性化を生じさせて減少量の高親和性抗Ｇａｌを産生させる。従って、異種移植片の細胞及び細胞外成分から−ｇａｌエピトープを実質的に除去し且つ細胞性−ｇａｌエピトープの発現を防止すると、−ｇａｌエピトープと結合する抗Ｇａｌ抗体に関連する異種移植片に対する免疫応答を減少させることができる。
【００２８】
上記の処理に加えて、追加の段階が使用できる。異種移植片は、次の処理：放射線処理、アルコールによる処理、オゾン処理、凍結と解凍の１回以上の循環処理及び／又は化学架橋剤による処理の少なくとも一つに付され得る。これらの処理の一つ以上を異種移植片に適用するときには、これらの処理は任意の順序で行うことができる。
【００２９】
ある具体例では、異種移植片は、グリコシダーゼによる処理の前に又はそれと同時にポリエチレングリコール（ＰＥＧ）で処理できる。ＰＥＧは、酵素とコラーゲン細胞外成分とに共有結合することによってグリコシダーゼのためのキャリヤーとして作用する。さらに、ＰＥＧで処理された異種移植片は、減少した免疫原性も有する。
【００３０】
別の具体例では、随意として異種移植片の外部表面（例えば、半月板軟組織異種移植片の外側面）に穴をあけて異種移植片を実質的に非免疫原性にさせるのに使用される薬剤に対する浸透性を増大させることができる。この穴あけ段階を実施するために、１８ゲージ針のような滅菌外科用針が使用でき、或いは、別法として複数の針を含む櫛様装置が使用できる。穴あけは、異種移植片内部への所望の浸入を達成させるために、様々なパターン及び様々な穴あけ〜穴あけ間隔で実施できる。また、穴あけはレーザーで実施してもよい。本発明の一つの形態では、およそ３ミリメートル離れた穿刺孔の１つ以上の直線が異種移植片の外側面の周辺に達成される。
【００３１】
さらに別の具体例では、本発明の異種移植片は、組織の柔軟性を増大させるためにフィシン又はトリプシンのような蛋白質加水分解酵素による制限消化により処理でき、或いは石灰化防止剤、抗血栓被覆剤、抗生物質、成長因子又は異種移植片の受容体関節部への取り込みを促進させ得るその他の薬剤で被覆できる。本発明のＳＩＳ異種移植片は、既知の方法を使用して、例えば、追加のグルタルアルデヒド又はホルムアルデヒド処理、酸化エチレン滅菌法、酸化プロピレン滅菌法などによってさらに滅菌できる。異種移植片は、使用されるときまで凍結保存できる。
【００３２】
さらに別の具体例では、粘膜下異種移植片材料は、受容体への移植前に免疫原性を低下させるために化学的に処理され得る。例えば、米国特許第４７５５５９３号明細書に詳述されるように、免疫原性を低下させるためにグルタルアルデヒドを使用して異種移植片組織を架橋又は「なめす」。脂肪族及び芳香族ジアミン化合物のようなその他の薬剤は、コラーゲンポリペプチドのアスパラギン酸及びグルタミン酸残基の側鎖カルボキシル基を介して追加の架橋を与え得る。また、グルタルアルデヒド及びジアミンによるなめしは、異種移植片組織の安定性も増大させる。さらに別の具体例では、異種移植片を随意に化学薬品に曝して細胞外成分内の蛋白質をなめし又はそれを架橋させ、異種移植片中に存在する免疫原性決定因子をさらに減少又は低減させることができる。任意のなめし剤又は架橋剤をこの処理のために使用してよく、また、完全な架橋を保証し、しかして異種移植片の免疫原性を随意に低減させるために一つ以上の架橋段階を実施してよく又は１種以上の架橋剤を使用してもよい。例えば、グルタルアルデヒド、ホルムアルデヒド、アジピン酸ジアルデヒドなどのようなアルデヒド類が本発明の方法に従って異種移植片の細胞外コラーゲンを架橋させるために使用できる。その他の好適な架橋剤としては、脂肪族及び芳香族ジアミン、カルボジイミド、ジイソシアネートなどが挙げられる。
【００３３】
グルタルアルデヒドが架橋剤として使用されるときに、例えば、異種移植片は、約０．０５〜約５．０％のグルタルアルデヒドを含有し且つ約７．４のｐＨを有する緩衝液中に置かれ得る。燐酸緩衝化生理食塩水又はトリスヒドロキシメチルアミノメタンなどのような任意の好適な緩衝液が、架橋反応の持続期間中ずっと（１日〜１４日間、好ましくは３日〜５日間であり得る）該溶液のｐＨの制御を保持するのが可能な限り使用できる。
【００３４】
別法として、異種移植片は、例えば、気化ホルムアルデヒドのような気化アルデヒド架橋剤（これに限定されない）を含めて、蒸気の形の架橋剤に曝され得る。この気化架橋剤は、ある濃度及びｐＨを有することができ、異種移植片は、架橋反応を生じさせるのに好適な時間にわたって該気化架橋剤に曝され得る。例えば、異種移植片は、約０．０５〜約５．０％の濃度及び約７．４のｐＨを有する気化架橋剤に１日〜１４日、好ましくは３日〜５日であることができる時間にわたって曝され得る。気化架橋剤に曝されると、この架橋剤暴露により異種移植片中の残余の化学物質が減少し得る。
【００３５】
架橋反応は、免疫原性決定因子が異種移植片軟組織から実質的に除去されるまで持続されるが、この反応は、異種移植片の機械的性質が有意に変化する前に終了される。ジアミンが架橋剤として使用されるときでも、グルタルアルデヒド架橋はジアミン架橋後に行う。架橋反応が完了するまで進行した後に、異種移植片をリンスして残余の化学物質を除去し、そして０．０１〜０．０５Ｍのグリシンを添加して残留するいかなる未反応アルデヒド基とも反応させることができる。
【００３６】
代わりの具体例では、異種移植片は、紫外線を約１５分間にわたって照射し又は約０．２〜３メガラド量のγ線を照射することによって処理できる。このような放射線は異種移植片を滅菌する。
【００３７】
別の具体例では、異種移植片は、アルコール溶液中に再度置くことによって処理できる。任意のアルコール溶液を使用してこの処理を実施することができる。好ましくは、異種移植片は、イソプロパノールの７０％溶液中に室温で置かれる。
【００３８】
別の具体例では、異種移植片はオゾン処理に付され得る。
【００３９】
別の具体例では、異種移植片は、凍結／解凍循環によって処理できる。例えば、異種移植片は、該移植片が完全に凍結する限り、即ち、軟組織を凍結させない内部温点が全く残らない限り、任意の凍結法を使用して凍結できる。好ましくは、異種移植片を液体窒素に約５分間浸漬してこの方法の段階を実施する。さらに好ましくは、異種移植片は、冷凍室中に置くことによって穏やかに凍結される。凍結／解凍循環処理の次の段階では、異種移植片は、等張生理食塩水浴中に室温で（約２５℃）約１０分間浸漬させることによって解凍される。線維の分解を最小にするために、外部加熱又は放射線源は使用しない。
【００４０】
また、粘膜下異種移植片組織は、移植の準備の際に様々な物理的処理にも付され得る。例えば、米国特許第４７５５５９３号は、より厚くて硬い移植用生体材料を作るために異種移植片組織を延伸させることによる機械的な引っ張りに付すことを開示している。同種移植片移植用の組織は、一般に、例えば米国特許第５０７１７４１号、同第５１３１８５０号、同第５１６０３１３号及び同５１７１６６０号に開示されるように、保存中の細胞生存度を最適にするために冷凍保存される。米国特許第５０７１７４１号は、組織を凍結させると、細胞外又は細胞内での氷の結晶の生成及び浸透性脱水のため、その中の細胞に機械的傷害が生じることを開示している。
【００４１】
従って、本発明の方法に従って作られる粘膜下異種移植片は、ヒトへの移植に対して実質的に非免疫原性であると同時に、一般に天然の軟組織の機械的性質を保持する。
【００４２】
使用方法
本発明の異種移植片又はそのセグメント又はその一部分は、当業者であれば、既知の関節鏡視下手術の技術を使用して損傷を受けたヒト関節に移植できる。関節鏡視下技術を実行するための特定の器具は当業者に周知であり、このものは軟組織移植片の正確且つ再現可能な配置を確実なものにさせる。
【００４３】
いったん異種移植片が体内に置かれたならば、このものは新たな血管増殖に役立つが、これは創傷治癒プロセスにとって重要である。血管は移植片に栄養分を与え、身体が損傷を受けた組織を再構築するのに必要な必須分子を供給する。また、この材料は、ストレスに対する応答も強化させるが、これは天然の軟組織と殆ど同様である。
【００４４】
本発明の一つ以上の具体例の詳細は、上の説明に表されている。ここに記載されたものと類似の又は均等な任意の方法及び材料が本発明の実施又は試験で使用できるが、ここでは好ましい方法及び材料を記載している。本発明のその他の特徴、目的及び利点は、明細書及び特許請求の範囲から明らかになるであろう。明細書及び添付した特許請求の範囲では、単数形には文脈に明らかに指示がない限り複数の対象が含まれるものとする。特に定義されていない限り、ここに使用される技術及び科学用語は、本発明の属する技術分野において通常の知識を有する者が一般的に理解するのと同一の意味を有する。本明細書で引用した全ての特許及び文献は、参照によってここに含まれる。
【００４５】
次の実施例は、本発明の好ましい具体例をより十分に例示するために与えられる。この実施例は、添付した特許請求の範囲を定義するときに、決して本発明の範囲を限定するものと解釈すべきではない。
【実施例】
【００４６】
例１：
−ガラクトシダーゼで処理された移植ＳＩＳ移植片に対する霊長類応答の評価
この例では、ブタＳＩＳ移植片を−ガラクトシダーゼで処理して−ガラクトシルエピトープを除去し、この移植片をカニクイザルに移植し、そして軟組織移植片に対する霊長類応答を評価する。
【００４７】
ブタＳＩＳ異種移植片を無菌的に調製する。それぞれのＳＩＳ標本を慎重に特定し且つ接着組織から離すように解離させ、それによって異種移植片を形成させる。このＳＩＳ異種移植片を少なくとも５分間にわたってエタノール又はイソプロパノールのようなアルコールで洗浄して流動性及び脂溶性の汚染物を除去する。次いで、ＳＩＳ異種移植片を約−３５℃〜約−９０℃の範囲にある温度で、好ましくは約−７０℃までの温度で凍結させる。
【００４８】
それぞれのＳＩＳ異種移植片標本を２つの部分に切断する。それぞれの第１部分を所定濃度の−ガラクトシダーゼを含有する緩衝液中に浸漬させる。この標本を該緩衝液中で所定時間にわたって所定温度でインキュベートする。それぞれの第２部分を対応する第１部分と同様の条件下で−ガラクトシダーゼが存在しない緩衝液中でインキュベートし、これを対照とする。
【００４９】
このインキュベーションの終了時に、ＳＩＳ異種移植片を酵素が外部に拡散するような条件下で洗浄する。−ｇａｌエピトープの完全な除去を確認するためのアッセイを実施する。
【００５０】
それぞれのＳＩＳ異種移植片を６個体のカニクイザルの膝蓋骨上嚢に移植する。この動物を一般的な吸気麻酔下に置き、約１ｃｍの切開をこの膝蓋骨上嚢に直接ほぼ平行に延びる内側上縁でなす。長さが約０．５ｃｍ〜約１ｃｍのブタＳＩＳ異種移植片の断片をマーキングタグとしての単一３−０ナイロン縫合で該嚢に置く。
【００５１】
また、ＳＩＳ異種移植片を次の移植手順を使用して６個体のカニクイザルにも移植する。この動物を一般的な吸気麻酔下に置き、異種移植片についての解剖挿入部位を特定し、そしてこれを長さ４０ｍｍの骨プラグにつき実質的に９ｍｍの直径を収容するようにドリルで穿孔する。異種移植片をこのドリル孔に持っていき、締め付けねじで固定する。
【００５２】
移植手順を無菌的な外科技術下で実施し、創傷を３−０ビクリル又は当業者に周知の好適な等価物で閉じる。この動物に制限のないケージ活動を許し、不安感、腫脹、感染又は拒絶反応の任意の兆候について監視する。血液試料（例えば、２ｍｌ）を抗体の監視のために定期的に（例えば、２週間毎に）抜き取る。
【００５３】
異種移植片に対する免疫応答の発生を、移植されたサルからの血清試料中の抗Ｇａｌ及び非抗Ｇａｌ抗軟組織抗体（即ち、−ｇａｌエピトープ以外の軟組織抗原に結合する抗体）を決定することによって評価する。少なくとも２ｍｌの血液試料を、移植されたサルから移植手術の日及び移植後定期的（例えば２週間）な間隔で抜き取る。血液試料を遠心分離し、血清試料を凍結し、そして抗Ｇａｌ及びその他の抗体の活性について評価する。
【００５４】
抗Ｇａｌ活性を、例えば、Ｇａｌｉｌｉ他，「カニクイザルにおけるブタ及びウシ軟骨移植：II．慢性拒絶反応中の抗Ｇａｌ応答の変化」，６３  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ６４５−６５１（１９９７）に記載された方法のような斯界に周知の方法に従って、固相抗原としての−ｇａｌ・ＢＳＡによるＥＬＩＳＡで血清試料中で決定する。
【００５５】
−ガラクトシダーゼで処理された異種移植片が抗軟組織抗体の形成を誘導するかどうかを決定するためのアッセイを実施する。抗軟組織抗体活性を測定するために、例えば、Ｋ．Ｒ．Ｓｔｏｎｅ他，「カニクイザルにおけるブタ及びウシ軟骨移植：Ｉ．慢性異種移植片拒絶反応のモデル」，６３  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ６４０−６４５（１９９７）に記載された方法のような斯界に周知の方法に従ってＥＬＩＳＡアッセイを実施する。
【００５６】
異種移植片標本を移植後１〜２週目に随意に外植し、そして炎症性浸潤物の組織学的評価のために薄片を作製し且つ染色する。移植後の抗Ｇａｌ及びその他の抗軟骨軟組織抗体活性の変化を、例えば、Ｋ．Ｒ．Ｓｔｏｎｅ他，「カニクイザルにおけるブタ及びウシ軟骨移植：Ｉ．慢性異種移植片拒絶反応のモデル」，６３  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ６４０−６４５（１９９７）に記載された方法のような斯界に周知の方法を使用して、移植後１〜２ヶ月目の異種移植片内における炎症の組織学的特徴（即ち、顆粒球又は単核球浸潤巣）と相関させる。
【００５７】
異種移植片を移植した動物を回復させ、そしてその切開部が治癒し、歩行が正常になるまで注意深く監視する。異種移植片試料を回収し、処理加工し、そして顕微鏡で検査する。
【００５８】
異種移植片移植物の一部分と周囲の組織を、斯界に周知の方法に従って免疫組織化学的な評価を行うために凍結組織標本用の包埋用媒体で包埋型中で凍結させる。約１０％ｗ／ｗのポリビニルアルコール、約４％ｗ／ｗのポリエチレングリコール及び約８６％ｗ／ｗの非反応性成分を含み且つサクラフィンテック社（トレンス，カリフォルニア，米国）によって製造されている「ＴＩＳＳＵＥ−ＴＥＫ（登録商標）」Ｏ．Ｃ．Ｔ．化合物が本発明で使用するための見込まれる包埋用媒体の一例である。また、当業者に周知のその他の包埋用媒体を使用してもよい。残余の移植片と周囲の組織を組織病理学的試験のために１０％中性緩衝化ホルマリン中に集める。
【００５９】
先の記載は例示の目的にのみ与えられるものであり、ここに添付した特許請求の範囲に関して、本発明を開示された厳格な形に限定することを意図するものではない。
【国際公開パンフレット】
2004529711.tif 000003
2004529711.tif 000004
2004529711.tif 000005
2004529711.tif 000006
2004529711.tif 000007
2004529711.tif 000008
2004529711.tif 000009
2004529711.tif 000010
2004529711.tif 000011
2004529711.tif 000012
2004529711.tif 000013
2004529711.tif 000014
2004529711.tif 000015
2004529711.tif 000016
2004529711.tif 000017
2004529711.tif 000018
2004529711.tif 000019
2004529711.tif 000020
2004529711.tif 000021
2004529711.tif 000022
2004529711.tif 000023
【国際調査報告】
2004529711.tif 000024
2004529711.tif 000025