(57)【要約】本発明は、その中の突然変異が常染色体優性くる病（ＡＤＨＲ）に関係する線維芽細胞増殖因子−２３（ＦＧＦ２３）をコードする新規核酸、およびそれによりコードされるタンパク質に関する。本発明はさらに、患者におけるＦＧＦ２３の生物学的活性をそれぞれ阻害または刺激することを含む、低リン酸血症および高リン酸血症性障害の診断および治療方法に関する。また本発明は、患者におけるＦＧＦ２３の生物学的活性を刺激することを含む、骨粗鬆症、皮膚筋炎、および冠状動脈疾患の治療方法にも関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
線維芽細胞増殖因子−２３（ＦＧＦ２３）もしくはその突然変異体、変異体、相同体またはこれらの断片をコードする単離核酸。
【請求項２】
配列番号１および配列番号３のうち少なくとも一方の核酸配列と少なくとも約５０％の配列同一性を有する、線維芽細胞増殖因子−２３（ＦＧＦ２３）をコードする単離核酸。
【請求項３】
配列番号２および配列番号４のうち少なくとも一方のアミノ酸配列と少なくとも約４０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする、線維芽細胞増殖因子−２３（ＦＧＦ２３）をコードする単離核酸。
【請求項４】
ＤＳＭＺ受託番号ＤＳＭ１３５３０に含まれる単離核酸。
【請求項５】
さらにタグポリペプチドをコードする核酸が共有結合により連結されている、請求項１記載の単離核酸。
【請求項６】
前記タグポリペプチドが、ｍｙｃ−タグポリペプチド、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ・タグポリペプチド、グリーン蛍光タンパク質タグポリペプチド、ｍｙｃ−ピルビン酸キナーゼ・タグポリペプチド、Ｈｉｓ６タグポリペプチド、インフルエンザウイルス赤血球凝集素タグポリペプチド、ｆｌａｇタグポリペプチド、およびマルトース結合性タンパク質タグポリペプチドからなる群より選択される、請求項５記載の単離核酸。
【請求項７】
さらにプロモーター／調節配列を指定する核酸が機能しうる形で連結されている、請求項１記載の単離核酸。
【請求項８】
請求項１記載の単離核酸を含むベクター。
【請求項９】
さらにプロモーター／調節配列を指定する核酸が機能しうる形で連結されている、請求項８記載のベクター。
【請求項１０】
請求項１記載の単離核酸を含む組換え細胞。
【請求項１１】
請求項８記載のベクターを含む組換え細胞。
【請求項１２】
線維芽細胞増殖因子−２３（ＦＧＦ２３）もしくはその突然変異体、変異体、相同体またはこれらの断片をコードするｃ核酸にアンチセンス方向で相補的である単離核酸。
【請求項１３】
前記相補的核酸が、配列番号１および配列番号３のうち少なくとも一方の配列を有する核酸に相補的な核酸と少なくとも約５０％の配列同一性を有する、請求項１２記載の単離核酸。
【請求項１４】
請求項１２記載の単離核酸を含むベクター。
【請求項１５】
さらにプロモーター／調節配列を指定する核酸が機能しうる形で連結されている、請求項１４記載のベクター。
【請求項１６】
請求項１２記載の単離核酸を含む組換え細胞。
【請求項１７】
線維芽細胞増殖因子−２３（ＦＧＦ２３）もしくはその突然変異体、変異体、相同体またはこれらの断片をコードする単離核酸を含むトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
【請求項１８】
線維芽細胞増殖因子−２３（ＦＧＦ２３）もしくはその突然変異体、変異体、相同体またはこれらの断片を含む単離ポリペプチド。
【請求項１９】
前記ＦＧＦ２３のアミノ酸配列が、配列番号２および配列番号４のうち少なくとも一方のアミノ酸配列と少なくとも約４０％の配列同一性を有する、請求項１８記載の単離ポリペプチド。
【請求項２０】
線維芽細胞増殖因子−２３（ＦＧＦ２３）ポリペプチドもしくはその突然変異体、変異体、相同体またはこれらの断片に特異的に結合する抗体。
【請求項２１】
ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、および合成抗体からなる群より選択される、請求項２０記載の抗体。
【請求項２２】
突然変異を含む、線維芽細胞増殖因子−２３（ＦＧＦ２３）をコードする単離核酸。
【請求項２３】
前記突然変異により前記ＦＧＦ２３が高い安定性を獲得している、請求項２２記載の単離核酸。
【請求項２４】
前記突然変異が、配列番号２における第１７６位のアミノ酸（アルギニン）をコードする核酸における突然変異および配列番号２における第１７９位のアミノ酸（アルギニン）をコードする核酸における突然変異からなる群より選択されるものである、請求項２２記載の単離核酸。
【請求項２５】
突然変異を含む単離された線維芽細胞増殖因子−２３（ＦＧＦ２３）ポリペプチド。
【請求項２６】
前記ＦＧＦ２３に対して高い安定性を付与する突然変異を含む、単離された線維芽細胞増殖因子−２３（ＦＧＦ２３）ポリペプチド。
【請求項２７】
前記突然変異が、配列番号２における第１７６位のアミノ酸（アルギニン）での突然変異および配列番号２における第１７９位のアミノ酸（アルギニン）での突然変異からなる群より選択される、請求項２６記載の単離されたポリペプチド。
【請求項２８】
ＦＧＦ２３ポリペプチドをコードするｍＲＮＡのレベルを低下させる分子、ＦＧＦ２３ポリペプチドのレベルを低下させる分子、およびＦＧＦ２３の生物学的活性を低下させる分子からなる群より選択されることを特徴とする、線維芽細胞増殖因子−２３（ＦＧＦ２３）のインヒビター。
【請求項２９】
アンチセンス核酸、リボザイム、抗体、ペプチド、およびペプチド模倣体からなる群より選択される、請求項２８記載のインヒビター。
【請求項３０】
ＦＧＦ２３に特異的に結合する抗体およびＦＧＦ２３受容体に特異的に結合する抗体からなる群より選択される抗体である、請求項２８記載のインヒビター。
【請求項３１】
ＲＮＡ干渉によりＦＧＦ２３ポリペプチドをコードするｍＲＮＡのレベルを低下させる二本鎖ＲＮＡである、請求項２８記載のインヒビター。
【請求項３２】
請求項１記載の単離核酸および製薬上許容可能な担体を含む組成物。
【請求項３３】
請求項１２記載の単離核酸および製薬上許容可能な担体を含む組成物。
【請求項３４】
請求項１８記載の単離ポリペプチドおよび製薬上許容可能な担体を含む組成物。
【請求項３５】
請求項２０記載の抗体および製薬上許容可能な担体を含む組成物。
【請求項３６】
請求項２２記載の単離核酸および製薬上許容可能な担体を含む組成物。
【請求項３７】
請求項２３記載の単離核酸および製薬上許容可能な担体を含む組成物。
【請求項３８】
請求項２４記載の単離核酸および製薬上許容可能な担体を含む組成物。
【請求項３９】
請求項２５記載の単離されたＦＧＦ２３ポリペプチドおよび製薬上許容可能な担体を含む組成物。
【請求項４０】
請求項２６記載の単離されたＦＧＦ２３ポリペプチドおよび製薬上許容可能な担体を含む組成物。
【請求項４１】
請求項２７記載の単離されたＦＧＦ２３ポリペプチドおよび製薬上許容可能な担体を含む組成物。
【請求項４２】
請求項２８記載のインヒビターおよび製薬上許容可能な担体を含む組成物。
【請求項４３】
線維芽細増殖因子−２３（ＦＧＦ２３）の生物学的活性を有する単離タンパク質の作製方法であって、（ａ）前記タンパク質が発現されるような条件下で請求項１１記載の組換え細胞を培養する工程、および（ｂ）前記タンパク質を回収する工程を含む、上記方法。
【請求項４４】
哺乳動物において低リン酸血症性障害を診断する方法であって、（ａ）前記哺乳動物から生物学的サンプルを得る工程、および（ｂ） 線維芽細増殖因子−２３（ＦＧＦ２３）をコードする核酸中の突然変異の存否を検出する試薬に前記生物学的サンプルを接触させる工程を含み、前記突然変異が存在すると前記哺乳動物が低リン酸血症性障害に罹っていることを示すことによって、前記哺乳動物における低リン酸血症性障害を診断する、上記診断方法。
【請求項４５】
前記低リン酸血症性障害が常染色体優性低リン酸血症性くる病（ＡＤＨＲ）である、請求項４４記載の方法。
【請求項４６】
前記生物学的サンプルが、血液および尿からなる群から選択される、請求項４４記載の方法。
【請求項４７】
前記試薬が核酸である、請求項４４記載の方法。
【請求項４８】
前記試薬が検出可能に標識されたものである、請求項４４記載の方法。
【請求項４９】
放射性同位元素、生物発光化合物、化学発光化合物、蛍光化合物、金属キレート、および酵素からなる群より選択される標識で前記試薬が検出可能に標識されている、請求項４４記載の方法。
【請求項５０】
哺乳動物において低リン酸血症性障害を診断する方法であって、（ａ）前記哺乳動物から生物学的サンプルを得る工程、および（ｂ）線維芽細胞増殖因子−２３（ＦＧＦ２３）ポリペプチドの突然変異体の存否を検出する試薬に前記生物学的サンプルを接触させる工程を含み、前記ＦＧＦ２３ポリペプチドの突然変異体が存在すると、前記哺乳動物が前記低リン酸血症性障害に罹っていることを示すことによって、前記哺乳動物における前記低リン酸血症性障害を診断する、上記診断方法。
【請求項５１】
前記低リン酸血症性障害が、常染色体優性低リン酸血症性くる病（ＡＤＨＲ）である、請求項５０記載の方法。
【請求項５２】
前記生物学的サンプルが、血液および尿からなる群より選択される、請求項５０記載の方法。
【請求項５３】
前記試薬が抗体である、請求項５０記載の方法。
【請求項５４】
哺乳動物において低リン酸血症性障害を診断する方法であって、前記方法が、（ａ）前記哺乳動物から生物学的サンプルを得る工程、および（ｂ）前記サンプル中の線維芽細胞増殖因子−２３（ＦＧＦ２３）ポリペプチドのレベルを検出する試薬に前記生物学的サンプルを接触させる工程を含み、前記サンプル中のＦＧＦ２３ポリペプチドのレベルが対照哺乳動物から得たサンプル中のＦＧＦ２３ポリペプチドのレベルに比べて上昇していると、前記哺乳動物が低リン酸血症性障害に罹っていることを示すことによって、前記哺乳動物における前記低リン酸血症性障害を診断する、上記診断方法。
【請求項５５】
前記低リン酸血症性障害が、Ｘ連鎖遺伝性くる病（ＸＬＨ）、遺伝性低リン酸血症性くる病（ＨＨＲＨ）、低リン酸血症性骨疾患（ＨＢＤ）、常染色体優性低リン酸血症性くる病（ＡＤＨＲ）、腫瘍誘導型骨軟化症、表皮母斑症候群、線維性異形成症、および腎石症からなる群より選択される、請求項５４記載の方法。
【請求項５６】
前記生物学的サンプルが、血液および尿からなる群より選択される、請求項５４記載の方法。
【請求項５７】
前記試薬がＦＧＦ２３抗体である、請求項５４記載の方法。
【請求項５８】
前記試薬が検出可能に標識されている、請求項５４記載の方法。
【請求項５９】
前記試薬が、放射性同位元素、生物発光化合物、化学発光化合物、蛍光化合物、金属キレート、および酵素からなる群より選択される標識で検出可能に標識されている、請求項５４記載の方法。
【請求項６０】
患者における腫瘍誘導型骨軟化症の診断方法であって、（ａ）前記患者から腫瘍サンプルを得る工程、および（ｂ）前記腫瘍中のＦＧＦ２３の発現の有無を検出する工程を含み、ＦＧＦ２３の発現が前記患者が腫瘍誘導型骨軟化症を有することを示す、上記診断方法。
【請求項６１】
哺乳動物における低リン酸血症性障害の治療方法であって、前記障害に罹った哺乳動物に治療に有効な量の線維芽細胞増殖因子−２３（ＦＧＦ２３）インヒビターを投与する工程を含み、前記インヒビターは、前記哺乳動物においてＦＧＦ２３ポリペプチドをコードするｍＲＮＡのレベルを低下させるインヒビター、前記哺乳動物においてＦＧＦ２３ポリペプチドのレベルを低下させるインヒビター、および前記哺乳動物におけるＦＧＦ２３の生物学的活性のインヒビターからなる群より選択される、上記治療方法。
【請求項６２】
前記低リン酸血症性障害が、Ｘ連鎖遺伝性くる病（ＸＬＨ）、遺伝性低リン酸血症性くる病（ＨＨＲＨ）、低リン酸血症性骨疾患（ＨＢＤ）、常染色体優性低リン酸血症性くる病（ＡＤＨＲ）、腫瘍誘導型骨軟化症、表皮母斑症候群、線維性異形成症、および腎石症からなる群より選択される、請求項６１記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の背景
血清リン酸塩レベルが低下または上昇する状態（それぞれ低リン酸血症および高リン酸血症と呼ばれる）は、多岐にわたる臨床的に深刻な疾患と関係がある。低リン酸血症（しばしば腎臓でのリン酸塩の排泄により生じる）は、Ｘ連鎖低リン酸血症性くる病（ＸＬＨ）、高カルシウム尿症を伴う遺伝性低リン酸血症性くる病（ＨＨＲＨ）、低リン酸血症性骨疾患（ＨＢＤ）、および常染色体優性低リン酸血症性くる病（ＡＤＨＲ）を含む多くの遺伝的障害によって引き起こされる。高リン酸血症（軽度の（ｍｉｌｄ）腎不全および腫瘍状石灰沈着症の患者において観察される）はしばしば、軟部組織石灰化、２次性上皮小体機能亢進症、３次性上皮小体機能亢進症、および他の代謝障害に関係する場合がある。
【０００２】
適度な血清リン酸塩濃度を維持するための分子メカニズムは、殆ど理解されていない。リン酸塩の恒常性の乱れを含む遺伝性障害の原因となる遺伝子を同定すれば、リン酸塩のバランスを調節する経路についての洞察が得られるかもしれない。現在のところ、低リン酸血症状態および高リン酸血症状態の患者における臨床的特徴が明らかであるにもかかわらず、これらの障害の早期診断、悪性度分類、および病期分類に役立つ分子マーカーがない。同様に、低リン酸血症性障害および高リン酸血症性障害の患者の効果的な治療方法が今のところ無いので、代替療法が必要とされている。本発明はこれらの必要を満たすものである。
【０００３】
発明の概要
本発明は、ＦＧＦ２３もしくはその突然変異体、変異体、相同体またはこれらの断片をコードする単離核酸を含む。
【０００４】
１つの態様において、ＦＧＦ２３をコードする単離核酸は、配列番号１および配列番号３のうち少なくとも一方の核酸配列と、少なくとも約５０％の配列同一性を有する。
【０００５】
また本発明は、配列番号２および配列番号４のうち少なくとも一方のアミノ酸配列と少なくとも４０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする、ＦＧＦ２３をコードする単離核酸も含む。
【０００６】
好適な実施形態において、本発明の単離核酸は、ＤＳＭＺ受託番号ＤＳＭ１３５３０に含まれるものである。
【０００７】
本発明の１つの態様において、ＦＧＦ２３をコードする単離核酸は、タグ（ｔａｇ）ポリペプチドをコードする核酸に共有結合により連結されている。好適な実施形態において、タグポリペプチドは、ｍｙｃ−タグポリペプチド、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ・タグポリペプチド、グリーン蛍光タンパク質タグポリペプチド、ｍｙｃ−ピルビン酸キナーゼ・タグポリペプチド、Ｈｉｓ６タグポリペプチド、インフルエンザウイルス赤血球凝集素タグポリペプチド、ｆｌａｇタグポリペプチド、またはマルトース結合性タンパク質タグポリペプチドである。
【０００８】
また本発明は、プロモーター／調節配列を指定する核酸に機能しうる形で連結されている、ＦＧＦ２３をコードする核酸も含む。
【０００９】
本発明はさらに、ＦＧＦ２３をコードする単離核酸を含むベクターを含む。好適な実施形態において、このベクターは、プロモーター／調節配列に機能しうる形で連結されているＦＧＦ２３をコードする単離核酸を含む。
【００１０】
本発明は、ＦＧＦ２３をコードする単離核酸または該単離核酸を含むベクターを含む組換え細胞を含む。
【００１１】
本発明は、ＦＧＦ２３もしくはその突然変異体、変異体、相同体またはこれらの断片をコードする核酸に対してアンチセンス方向で相補的である単離核酸を含む。好適な実施形態において、この相補的核酸は、配列番号１および配列番号３のうち少なくとも一方の配列を有する核酸に対して相補的な核酸と少なくとも５０％の配列同一性を有する。また本発明には、このアンチセンス核酸を含むベクター、およびプロモーター／調節配列を指定する核酸に機能しうる形で連結されたこのアンチセンス核酸を含むベクターも含まれる。
【００１２】
本発明はさらに、このようなアンチセンス核酸および該アンチセンス核酸を含むベクターを含む組換え細胞を含む。
【００１３】
本発明は、ＦＧＦ２３もしくはその突然変異体、変異体、相同体またはこれらの断片をコードする単離核酸を含む、トランスジェニック非ヒト哺乳動物を含む。
【００１４】
本発明はさらに、ＦＧＦ２３またはその突然変異体、変異体、相同体もしくは断片を含む単離ポリペプチドを含む。好適な実施形態において、この単離ポリペプチドは、配列番号２および配列番号４のうち少なくとも一方のアミノ酸配列と少なくとも約４０％の配列同一性を有する。
【００１５】
本発明は、ＦＧＦ２３ポリペプチドまたはその突然変異体、変異体、相同体もしくはフラグメントに特異的に結合する抗体を含む。好適な実施形態において、この抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、または合成抗体である。
【００１６】
本発明はさらに、ＦＧＦ２３をコードする単離核酸であって、その中に突然変異を含むものを含む。好適な実施形態において、この突然変異によりＦＧＦ２３がが高い安定性を獲得している。より好ましくは、この突然変異は、配列番号２の第１７６位のアミノ酸（アルギニン）または配列番号２の第１７９位のアミノ酸（アルギニン）に起こる。さらにより好ましくは、この突然変異は、配列番号１に関して５７５Ｇ＞Ａ、５３５Ｃ＞Ｔおよび５３６Ｇ＞Ａからなる群より選択される。
【００１７】
また本発明は、突然変異を含むＦＧＦ２３ポリペプチドも含む。好適な実施形態において、このＦＧＦ２３ポリペプチドは、安定性を高める突然変異を含む。より好ましくは、この突然変異は、配列番号２の第１７６位のアミノ酸（アルギニン）または配列番号２の第１７９位のアミノ酸（アルギニン）での突然変異である。
【００１８】
本発明は、ＦＧＦ２３のインヒビターを含む。このインヒビターは、ＦＧＦ２３ポリペプチドをコードするｍＲＮＡのレベルを低下させる分子、ＦＧＦ２３ポリペプチドのレベルを低下させる分子、またはＦＧＦ２３の生物学的活性を低下させる分子であってもよい。好適な実施形態において、このインヒビターは、アンチセンス核酸、リボザイム、抗体、ペプチド、またはペプチド模倣体（ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃ）である。より好ましくは、このインヒビターは、ＦＧＦ２３に特異的に結合する抗体またはＦＧＦ２３受容体に特異的に結合する抗体である。
【００１９】
本発明は、ＦＧＦ２３をコードする単離核酸および製薬上許容可能な担体を含む組成物を含む。
【００２０】
また本発明は、ＦＧＦ２３をコードする核酸に相補的な単離核酸および製薬上許容可能な担体を含む組成物も含む。
【００２１】
また本発明は、単離ＦＧＦ２３ポリペプチドおよび製薬上許容可能な担体を含む組成物も含む。
【００２２】
また本発明は、ＦＧＦ２３に特異的に結合する抗体および製薬上許容可能な担体を含む組成物も含む。
【００２３】
また本発明は、ＦＧＦ２３の突然変異型をコードする単離核酸および製薬上許容可能な担体を含む組成物も含む。
【００２４】
また本発明は、ＦＧＦ２３のより安定性の高い突然変異型をコードする単離核酸および製薬上許容可能な担体を含む組成物も含む。
【００２５】
また本発明は、配列番号２の第１７６位のアミノ酸（アルギニン）または配列番号２の第１７９位のアミノ酸（アルギニン）に突然変異を含むＦＧＦ２３の突然変異型をコードする単離核酸および製薬上許容可能な担体を含む組成物も含む。
【００２６】
また本発明は、突然変異を含む単離ＦＧＦ２３ポリペプチドおよび製薬上許容可能な担体を含む組成物も含む。
【００２７】
また本発明は、安定性を高める突然変異を含む単離ＦＧＦ２３ポリペプチドおよび製薬上許容可能な担体を含む組成物も含む。
【００２８】
また本発明は、配列番号２の第１７６位のアミノ酸（アルギニン）または配列番号２の第１７９位のアミノ酸（アルギニン）に突然変異を含む単離ＦＧＦ２３ポリペプチドおよび製薬上許容可能な担体を含む組成物も含む。
【００２９】
また本発明は、ＦＧＦ２３のインヒビターおよび製薬上許容可能な担体を含む組成物も含む。
【００３０】
本発明はさらに、哺乳動物における低リン酸血症性障害の診断方法を含む。この方法は、（ａ）前記哺乳動物から生物学的サンプルを得る工程、および（ｂ）ＦＧＦ２３をコードする核酸中における突然変異の存否を検出する試薬に前記生物学的サンプルを接触させる工程を含む。ここで、突然変異が存在すると、その哺乳動物が低リン酸血症性障害に罹っていることを示すことによって、その哺乳動物における低リン酸血症性障害を診断する。
【００３１】
好適な実施形態において、低リン酸血症性障害は、常染色体優性低リン酸血症性くる病（ＡＤＨＲ）である。
【００３２】
他の好適な実施形態において、生物学的サンプルは血液または尿である。
【００３３】
さらに他の好適な実施形態において、試薬は核酸である。より好ましくは、試薬は検出できるよう標識される。好適な標識としては、放射性同位元素、生物発光化合物、化学発光化合物、蛍光化合物、金属キレート、および酵素が挙げられる。
【００３４】
本発明は、哺乳動物における低リン酸血症性障害の診断方法を含む。この方法は、（ａ）前記哺乳動物から生物学的サンプルを得る工程、および（ｂ）ＦＧＦ２３ポリペプチドの突然変異体の存否を検出する試薬にこの生物学的サンプルを接触させる工程を含む。ここで、ＦＧＦ２３ポリペプチドの突然変異型が存在すると、その哺乳動物が低リン酸血症性障害に罹っていることを示すことによって、その哺乳動物における低リン酸血症性障害を診断する。
【００３５】
好適な実施形態において、低リン酸血症性障害は、常染色体優性低リン酸血症性くる病（ＡＤＨＲ）である。
【００３６】
他の好適な実施形態において、生物学的サンプルは血液または尿である。
【００３７】
さらに他の好適な実施形態において、試薬は抗体である。
【００３８】
本発明は、哺乳動物における低リン酸血症性障害の診断方法を含む。この方法は、（ａ）前記哺乳動物から生物学的サンプルを得る工程、および（ｂ）そのサンプル中のＦＧＦ２３ポリペプチドのレベルを検出する試薬にこの生物学的サンプルを接触させる工程を含む。ここで、サンプル中のＦＧＦ２３ポリペプチドのレベルが対照哺乳動物から得たサンプル中のＦＧＦ２３ポリペプチドのレベルに比べて上昇していると、その哺乳動物が低リン酸血症性障害に罹っていることがを示すことによって、その哺乳動物における低リン酸血症性障害を診断する。
【００３９】
好適な実施形態において、低リン酸血症性障害は、Ｘ連鎖遺伝性くる病（ＸＬＨ）、遺伝性低リン酸血症性くる病（ＨＨＲＨ）、低リン酸血症性骨疾患（ＨＢＤ）、常染色体優性低リン酸血症性くる病（ＡＤＨＲ）、腫瘍誘導型骨軟化症（ｔｕｍｏｒ ｉｎｄｕｃｅｄ ｏｓｔｅｏｍａｌａｃｉａ）、表皮母斑症候群、線維性異形成症、または腎石症からなる群より選択される。
【００４０】
他の好適な実施形態において、生物学的サンプルは血液または尿である。
【００４１】
さらに他の好適な実施形態において、試薬はＦＧＦ２３抗体である。より好ましくは、試薬は検出可能に標識されている。好適な標識としては、放射性同位元素、生物発光化合物、化学発光化合物、蛍光化合物、金属キレート、および酵素が挙げられる。
【００４２】
本発明はさらに、患者における腫瘍誘導型骨軟化症の診断方法を含む。この方法は、（ａ）患者から腫瘍サンプルを得る工程、および（ｂ）その腫瘍の中のＦＧＦ２３の発現の有無を検出する工程を含む。ここで、ＦＧＦ２３の発現が前記患者が腫瘍誘導型骨軟化症を有することを示す。
【００４３】
また本発明は、哺乳動物における低リン酸血症性障害の治療方法も含む。この方法は、この障害に罹った哺乳動物に治療に有効な量のＦＧＦ２３インヒビターを投与する工程を含む。このインヒビターは、前記哺乳動物においてＦＧＦ２３ポリペプチドをコードするｍＲＮＡのレベルを低下させるインヒビター、前記哺乳動物においてＦＧＦ２３ポリペプチドのレベルを低下させるインヒビター、または前記哺乳動物におけるＦＧＦ２３の生物学的活性のインヒビターであってもよい。
【００４４】
好適な実施形態において、低リン酸血症性障害は、Ｘ連鎖遺伝性くる病（ＸＬＨ）、遺伝性低リン酸血症性くる病（ＨＨＲＨ）、低リン酸血症性骨疾患（ＨＢＤ）、常染色体優性低リン酸血症性くる病（ＡＤＨＲ）、腫瘍誘導型骨軟化症、表皮母斑症候群、線維性異形成症、または腎石症である。
【００４５】
他の好適な実施形態において、このインヒビターは、アンチセンス核酸、リボザイム、抗体、ペプチド、またはペプチド模倣体である。
【００４６】
本発明はさらに、哺乳動物における高リン酸血症性障害の治療方法を含む。この方法は、この障害に罹った哺乳動物に、ＦＧＦ２３をコードする単離核酸を治療的有効量で投与する工程を含む。
【００４７】
好適な実施形態において、この単離核酸は、それによりコードされるＦＧＦ２３ポリペプチドの安定性を高める突然変異を含む。
【００４８】
他の好適な実施形態において、高リン酸血症性障害は、軽度の腎不全または腫瘍性石灰沈着症である。
【００４９】
また本発明は、哺乳動物における高リン酸血症性障害の治療方法も含む。この方法は、この障害に罹った哺乳動物に、治療的有効量の単離ＦＧＦ２３ポリペプチドを投与する工程を含む。
【００５０】
好適な実施形態において、単離ＦＧＦ２３ポリペプチドは、安定性を高める突然変異を含む。
【００５１】
他の好適な実施形態において、高リン酸血症性障害は、軽度の腎不全または腫瘍性石灰沈着症である。
【００５２】
本発明はさらに、哺乳動物における高リン酸血症性障害の治療方法を含む。この方法は、この障害に罹った哺乳動物に、その哺乳動物におけるＦＧＦ２３ポリペプチドのレベルを上昇させる治療的有効量の試薬を投与する工程を含む。
【００５３】
好適な実施形態において、この試薬はＦＧＦ２３ポリペプチドの分解を阻害する。
【００５４】
他の好適な実施形態において、高リン酸血症性障害は、軽度の腎不全または腫瘍性石灰沈着症である。
【００５５】
本発明はさらに、哺乳動物における高リン酸血症性障害の治療方法を含む。この方法は、この障害に罹った哺乳動物に、ＦＧＦ２３をコードする単離核酸を含む細胞集団を治療的有効量で投与する工程を含む。
【００５６】
好適な実施形態において、単離核酸は、それによりコードされるＦＧＦ２３の安定性を高める突然変異を含む。
【００５７】
他の好適な実施形態において、高リン酸血症性障害は、軽度の腎不全または腫瘍性石灰沈着症である。
【００５８】
本発明は、哺乳動物における骨粗鬆症の治療方法を含む。この方法は、哺乳動物に、その哺乳動物においてＦＧＦ２３ポリペプチドのレベルを上昇させる治療的有効量の試薬またはＦＧＦ２３を投与する工程を含む。
【００５９】
本発明はさらに、哺乳動物の動脈または軟部組織におけるカルシウムおよびリン酸塩の沈着を伴う状態を治療する方法を含む。この方法は、その哺乳動物に、ＦＧＦ２３ポリペプチドのレベルを上昇させる治療的有効量の試薬またはＦＧＦ２３を投与する工程を含む。
【００６０】
好適な実施形態において、この状態は皮膚筋炎である。
【００６１】
本発明はさらに、哺乳動物における冠状動脈疾患の治療方法を含む。この方法は、罹患した哺乳動物の冠状動脈の細胞に、ＦＧＦ２３をコードする核酸を投与する工程を含む。
【００６２】
また本発明は、哺乳動物において低リン酸血症性障害を診断するためのキットも含む。このキットは、ＦＧＦ２３をコードする核酸配列中における突然変異の存否を検出する試薬を含む。ここで、突然変異が存在すれば、その哺乳動物が低リン酸血症性障害に罹っていることが示される。このキットはさらに、それを使用するためのアプリケータおよび取扱説明書（ｉｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎａｌ ｍａｔｅｒｉａｌ）を含む。
【００６３】
また本発明は、哺乳動物において低リン酸血症性障害を診断するためのキットも含む。このキットは、ＦＧＦ２３ポリペプチドのレベルを検出する試薬を含む。ここで、ＦＧＦ２３ポリペプチドのレベルが上昇していれば、その哺乳動物が低リン酸血症性障害に罹っていることが示される。このキットはさらに、それを使用するためのアプリケータおよび取扱説明書を含む。
【００６４】
また本発明は、哺乳動物において低リン酸血症性障害を診断するためのキットも含む。このキットは、ＦＧＦ２３ポリペプチドの突然変異型の存否を検出する試薬を含む。ここで、ＦＧＦ２３の突然変異型が存在していれば、その哺乳動物が低リン酸血症性障害に罹っていることが示される。このキットはさらに、それを使用するためのアプリケータおよび取扱説明書を含む。
【００６５】
以上の発明の概要および以下の本発明の好適な実施形態の詳細な説明は、添付の図面を参照しながら読むと、より深く理解できよう。本発明を例示するために、現在好適である実施形態が図面に表されている。しかし、本発明は図示した厳密な配置および器具類に限定されないことを理解されたい。
【００６６】
発明の説明
本発明は、哺乳動物の線維芽細胞増殖因子−２３（ＦＧＦ２３）をコードする新規核酸およびそれによりコードされるタンパク質の発見に関する。本発明は、その核酸およびそれによりコードされるタンパク質が、低リン酸血症性障害および高リン酸血症性障害の診断や治療のための診断用ならびに治療用試薬の開発に有用であるような、線維芽細胞増殖因子ファミリーの新規メンバーを開示する。
【００６７】
腎臓は、適度な血清リン酸塩濃度の維持において重要な役割を果たす。リン酸塩調節悪化の極めて稀な遺伝性障害を引き起こす遺伝子が同定されれば、金属イオンバランスを制御する腎臓経路を発見する機会が得られる。
【００６８】
本明細書で開示される最初の実験において、常染色体優性低リン酸血症性くる病（ＡＤＨＲ）の原因となる遺伝子が発見され、ＦＧＦ２３と名付けられた。ＡＤＨＲは、低身長症、骨痛、骨折および下肢奇形により特徴付けられる。また、本明細書中において、腫瘍形成性（ｏｎｃｏｇｅｎｉｃ）低リン酸血症性骨軟化症（腎臓でのリン酸塩排泄の後天性障害）をもたらす腫瘍中においてＦＧＦ２３が過剰に発現されることも発見された。腫瘍形成性低リン酸血症性骨軟化症の患者は、ＡＤＨＲ患者と生化学的および臨床的な類似点を有する。しかしこれらは、患者におけるＦＧＦ２３のレベルおよび／または活性を低下させることにより治療することができる幾つかの低リン酸血症性疾患のうちの２つである。ＦＧＦ２３のインヒビターで治療することができる他の低リン酸血症性疾患としては、ＸＬＨ、ＨＨＲＨ、ＨＢＤ、表皮母斑症候群、線維性異形成症および腎石症等が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６９】
腎臓でのリン酸塩排泄および低い血清リン酸塩濃度を特徴とする低リン酸血症性疾患とは異なり、高リン酸血症性疾患（軽度の腎不全、腫瘍状石灰沈着症等を含む）は、血清リン酸塩の過剰を特徴とする。ＦＧＦ２３の投与は、尿中へのリン酸塩の排泄を刺激することにより、血清リン酸塩レベルを低下させる。このように、高リン酸塩血症性疾患は、天然ＦＧＦ２３または患者におけるＦＧＦ２３ポリペプチドのレベルを上昇させる分子を投与することにより治療することができる。さらに、突然変異型ＦＧＦ２３は、特に該突然変異体が天然ＦＧＦ２３よりも長い半減期を有する場合、高リン酸血症を治療するために用いることもできる。比較的長い半減期を有するＦＧＦ２３の具体的な突然変異体は、本明細書中に開示されている。
【００７０】
このように、本発明において、ＦＧＦ２３が、動物における低リン酸血症性状態および高リン酸血症性状態のいずれにも関与し得ることが分かった。主に、動物の体内でＦＧＦ２３レベルが異常に上昇した場合（一般に該タンパク質が遺伝子の突然変異により過剰に発現されるときまたはより高い安定性を有するとき）、その動物はリン酸塩排泄の増加により、低リン酸血症を示す。ＦＧＦ２３の異常なレベルが高リン酸血症において原因的役割を果たすか否かはまだ決まっていないが、ＦＧＦ２３が動物中の血清リン酸塩レベルを低下させる能力は、ＦＧＦ２３がリン酸塩の恒常性の調節において重要な役割を果たすことを明らかに示している。
【００７１】
本発明は、ＦＧＦ２３をコードする単離核酸を含む。本明細書で開示されるように、ＦＧＦ２３をコードする単離核酸は、ヒト細胞およびマウス細胞のいずれからも単離されている（例えば図５Ａおよび図６Ａ（それぞれ配列番号１および配列番号３）を参照されたい）。ＦＧＦ２３をコードする好適な核酸はＤＮＡである。さらに、ヒトおよびマウスＦＧＦ２３の核酸およびタンパク質が本明細書に例示されているが、本発明は、これらの哺乳動物種から得たＦＧＦ２３のみに限定されるものと考えるべきではない。むしろ、本発明は、本明細書中で定義されるＦＧＦ２３の生物学的活性を有するＦＧＦ２３またはその突然変異体、変異体もしくは相同体をコードするあらゆる単離核酸を含むものと考えるべきである。好ましくは、本発明のＦＧＦ２３をコードするＤＮＡは、配列番号１または配列番号３と約５０％の相同性を有する。配列番号１または配列番号３と、より好ましくはこのＤＮＡは、約６０％の、さらにより好ましくはこのＤＮＡは約７０％の、もっと好ましくはこのＤＮＡは約８０％の、さらに好ましくは９０％の、より好ましくは９５％の、さらにより好ましくはこのＤＮＡは約９９〜１００％の相同性を有する。
【００７２】
本発明は、ＦＧＦ２３をコードする核酸にタグポリペプチドをコードする核酸が共有結合したものを含む。つまり本発明は、タグポリペプチドをコードする核酸配列がＦＧＦ２３ポリペプチドをコードする核酸に共有結合したキメラ核酸を包含する。このようなタグポリペプチドは当分野において周知であり、例えばグリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ｍｙｃ、ｍｙｃ−ピルビン酸キナーゼ（ｍｙｃ−ＰＫ）、Ｈｉｓ６、マルトース結合性タンパク質（ＭＢＰ）、インフルエンザウイルス赤血球凝集素タグポリペプチド、ｆｌａｇタグポリペプチド（ＦＬＡＧ）、およびグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）タグポリペプチドが挙げられる。しかし本発明は、上記に挙げたタグポリペプチドをコードする核酸に限定されるものと考えるべきではない。むしろ、これらのタグポリペプチドに実質的に似た機能を果たすポリペプチドをコードするあらゆる核酸配列が本発明に含まれるものと考えるべきである。
【００７３】
タグポリペプチドをコードする核酸を含む核酸を用いて、ＦＧＦ２３を細胞内、組織内、および／または生物の体内（例えば哺乳動物胚）に局在化させること、細胞から分泌されたＦＧＦ２３を検出すること、および細胞内でのＦＧＦ２３の役割を研究することができる。さらに、本発明のタンパク質を簡単に生成および精製することができるように、タグポリペプチドを加えて、「タグ付けした」タンパク質の単離および精製を容易にする。
【００７４】
また本発明には、ＦＧＦ２３をコードする核酸にプロモーター／調節配列を指定する核酸が機能しうる形で連結されたものも含まれる。好ましくは、このプロモーター／調節配列を指定する核酸は、細胞内で所望のタンパク質の発現を駆動するように、ＦＧＦ２３コード配列の５’側末端に位置する。
【００７５】
他の関連した態様において、本発明は、ＦＧＦ２３をコードする単離核酸を含むベクターを含む。好ましくはこのベクターは、このベクターを含む細胞の中でＦＧＦ２３の発現を指令することができる。本発明で使用するのに適したベクターとしては、ＦＧＦ２３をコードする核酸の沢山のコピーを作製し易くするベクター、または原核生物細胞もしくは真核生物細胞のいずれかまたは両方においてＦＧＦ２３タンパク質を発現させ易くするベクターが挙げられるがこれらに限定されない。このように、本発明は、任意の既知のベクター系に限定されるものと考えるべきではなく、むしろ、ＦＧＦ２３コード核酸の多数のコピーを作製し易くするまたは細胞内でＦＧＦ２３を発現させ易くする全ての好適な既知のまたはこれまで知られていないベクターを含むものとする。適当なベクターの例としては、細菌内での複製および発現のためのバクテリオファージＴ７に基づく発現ベクター、哺乳動物細胞内での複製および発現のためのｐＭＳＸＮＤ発現ベクター、ならびに昆虫細胞内での複製および発現のためのバキュロウイルス由来ベクターが挙げられる。アデノウイルス、レトロウイルス、および他のウイルスベクターも本発明において想定される。
【００７６】
好ましくは、本発明の単離核酸分子は、本発明の組換えベクターの中で、プロモーター／調節エレメントおよび他の調節エレメント（例えば停止シグナルやポリアデニル化シグナル等）に機能しうる形で連結される。これらのエレメントの各々は、細胞内でのＦＧＦ２３の十分な複製および発現を請け負うものである。本発明は、ＦＧＦ２３の発現を駆動する任意の特定のプロモーター／調節配列に限定されるべきではない。むしろ本発明は、ＦＧＦ２３をコードする核酸に機能しうる形で連結されていて任意の所望の真核生物細胞もしくは原核生物細胞の中で該核酸からＦＧＦ２３を発現させることができる、あらゆる全ての好適なプロモーター／調節配列を含むものと考えるべきである。好適なプロモーター配列を核酸に連結させるための技法は当分野で周知であり、例えばＳａｍｂｒｏｏｋら， （１９８９， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）， Ａｕｓｕｂｅｌら（１９９７， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）、およびＧｅｒｈａｒｄｔら（編， １９９４， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅｒａｌ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ， Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ， Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ， ＤＣ．）に記載されている。
【００７７】
本発明はさらに、本発明のベクターを含む細胞を含む。ここで、この細胞は、原核生物または真核生物細胞（即ち、例えば哺乳動物、細菌、昆虫または酵母細胞）のいずれかである。ＦＧＦ２３タンパク質は、このようなベクター保有細胞を用いて生成することができる（本明細書中に記載）。この場合も、本発明は、ＦＧＦ２３を発現するために使用される特定の細胞型に限定されるものと考えるべきではない。
【００７８】
本発明はさらに、ＦＧＦ２３をコードする単離核酸の全てもしくは一部に対してアンチセンス方向である（即ち相補的である）配列を有する単離核酸を含む。１つの態様において、本発明は、ＦＧＦ２３をコードするｍＲＮＡに結合することによりＦＧＦ２３の合成を阻害することができることを特徴とする、アンチセンスＲＮＡ配列を含む。この場合も、プロモーター／調節エレメントに機能しうる形で連結されている該核酸を含むベクター、およびアンチセンスＦＧＦ２３単離核酸配列を含む細胞が、本発明において想定される。
【００７９】
他の態様において、本発明は、ＦＧＦ２３をコードするｍＲＮＡに相補的なＲＮＡ配列を含むリボザイムを含み、これによりこのリボザイムは、ｍＲＮＡに結合してこれを切断し、該ｍＲＮＡがコードするＦＧＦ２３の合成を阻害することができる。リボザイムは、標的ＲＮＡ（例えばＦＧＦ２３ ｍＲＮＡ）を分子間で（ｉｎｔｅｒｍｏｌｅｃｕｌａｒｌｙ）切断することができる一本鎖ＲＮＡ鎖から構成される。当分野で記載されている手法（例えばＴａｎｎｅｒら， ＩＮ： Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ， ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ ＩＮＣ． １９９３， ｐｐ４１５−４２６）に従って特定の標的部位でＲＮＡを切断することができるリボザイムを構築することが可能である。このようなリボザイムに必要な２つのものは、触媒ドメイン、および標的ＲＮＡに相補的であってこれらを基質に結合させる領域（切断の先行条件）である。アンチセンスＲＮＡおよびリボザイムは、ＦＧＦ２３発現のインヒビターとして有用である。好ましくは、本発明のアンチセンスＲＮＡおよびリボザイムは、ＦＧＦ２３をコードするｍＲＮＡの５’側末端に相補的である。アンチセンス断片およびリボザイムの作製技術に精通している当業者であれば、本明細書中に提供される配列に基づいて、ＦＧＦ２３発現を阻害するためにアンチセンス分子またはリボザイムによってどのＦＧＦ２３ ｍＲＮＡ配列をターゲッティングすることができるかが正確に分かるであろう。
【００８０】
リボザイムには２つの基本的なタイプ、つまりテトラヒメナ型（Ｈａｓｓｅｌｈｏｆｆ， １９８８， Ｎａｔｕｒｅ ３３４：５８５）およびハンマーへッド型がある。テトラヒメナ型リボザイムは４塩基長の配列を認識するが、ハンマーヘッド型リボザイムは１１〜１８塩基長の塩基配列を認識する。配列が長くなるほど、その配列が標的ｍＲＮＡ種でしか生じない可能性が高くなる。その結果、特定のｍＲＮＡ種を不活化するためには、テトラヒメナ型リボザイムよりもハンマーヘッド型リボザイムが好ましく、１８塩基認識配列は、それより短い認識配列（無関係の種々のｍＲＮＡ分子の中でランダムに生じ得る）よりも好ましい。
【００８１】
ＦＧＦ２３の発現を阻害するのに有用なリボザイムは、ＦＧＦ２３によってコードされるＦＧＦ２３のｍＲＮＡ配列に相補的な標的配列または配列番号１および配列番号３のうち少なくとも一方と少なくとも約５０％の配列同一性を有するｍＲＮＡ配列に相補的な標的配列を、基本的なリボザイム構造の中に導入することによって、設計することができる。ＦＧＦ２３を標的とするリボザイムは、市販されている試薬（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ， Ｉｎｃ．， Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ， ＣＡ）を用いて合成しても良いし、これらをコードするＤＮＡから遺伝子的に（ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ）発現させてもよい。
【００８２】
本発明はさらに、そのゲノムがＦＧＦ２３の機能的形態を失うことによりＦＧＦ２３の生物学的活性を持たなくなった非ヒトトランスジェニック哺乳動物を含む。１つの例において、非ヒトトランスジェニック哺乳動物は、そのゲノム中の所望の部位に外来核酸が挿入されたことによりＦＧＦ２３のコード領域が欠失している、即ちノックアウトトランスジェニック哺乳動物である。このような動物は、ＦＧＦ２３の中の突然変異に関係するヒト疾患状態の研究に有用なモデルとなる。好ましくは、トランスジェニック哺乳動物はマウスである。ＦＧＦ２３の機能がノックアウトされたマウスは、高リン酸血症表現型または非リン酸塩表現型（ｎｏｎ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ）のいずれかを有する。
【００８３】
さらに本発明は、ＦＧＦ２３をコードする外来核酸がそのゲノムのある部位に挿入されたトランスジェニック非ヒト哺乳動物（即ち「ノックイン（ｋｎｏｃｋ−ｉｎ）」トランスジェニック哺乳動物）を含む。挿入されたノックイン導入遺伝子は、例えばタグポリペプチド、およびＦＧＦ２３をコードする核酸に機能しうる形で連結されたプロモーター／調節領域（通常はその細胞内に存在しないまたは一般にはＦＧＦ２３に機能しうる形で連結されていない）をコードする種々の核酸を含み得る。ＦＧＦ２３ノックイン導入遺伝子の発現は、その動物において低リン酸血症を引き起こし、その結果、腫瘍形成性低リン酸血症性骨軟化症およびＡＤＨＲに似た表現型が現れる可能性がある。ＦＧＦ２３の野生型および突然変異型はいずれも、哺乳動物のゲノム中に挿入することができる。特に、本明細書中に開示された突然変異体を挿入すると、より安定した形態のＦＧＦ２３が生成するので、その動物の低リン酸血症性状態を長引かせるまたは悪化させ得る。
【００８４】
本発明の非ヒトトランスジェニック哺乳動物の作製は、好ましくは、ここで説明する方法を用いて行う。しかしながら、他の方法を用いて所望のノックアウト哺乳動物を作製することができるという意味で、本発明は、この方法の使用だけに限定されるものと考えるべきではない。
【００８５】
好適な非ヒトトランスジェニック哺乳動物の作製方法では、本発明の導入遺伝子を含むＥＳ細胞を作製した後、これらの細胞を用いて、本質的にはＮａｇｙおよびＲｏｓｓａｎｔ（１９９３： Ｇｅｎｅ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ， Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ， ｐｐ．１４６−１７９， Ｊｏｙｎｅｒ編， ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ）に記載されているようにノックアウト動物を作製する。ＥＳ細胞は、これらを宿主の胚盤胞中に注入することにより、または割球段階の胚と統合させることにより、胚環境に戻せば、正常な胚細胞として機能する。このように戻せば、細胞は、その胚の全ての系列に沿って成長する全能性（ｆｕｌｌ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ）を有する。このように、ＥＳ細胞を得、その中に所望のＤＮＡを導入した後、その細胞を胚環境に戻して、成熟哺乳動物細胞（その中で所望のＤＮＡが発現され得る）へと発生させることが可能である。
【００８６】
トランスジェニックマウスを作製するための厳密なプロトコールは、ＮａｇｙおよびＲｏｓｓａｎｔ（１９９３： Ｇｅｎｅ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ， Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ， Ｊｏｙｎｅｒ編， ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ， ｐｐ．１４６−１７９）に開示されているので、本明細書では繰り返さない。所望のＤＮＡを中に導入するためのＥＳ細胞のトランスフェクションまたは形質導入は、例えばＳａｍｂｒｏｏｋら（１９８９， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）およびＡｕｓｕｂｅｌら（１９９７， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）に記載されているような標準的なプロトコールを用いて行う。好ましくは、本発明の導入遺伝子の中に含まれる所望のＤＮＡを電気穿孔法によりＥＳ細胞の中に導入し、これらの細胞をＳｏｒｉａｎｏら（１９９１， Ｃｅｌｌ ６４：６９３−７０２）に記載されたように増殖させる。
【００８７】
哺乳動物の受精卵中への単離核酸の導入は、トランスジェニック技術における数多くの標準的技法を用いて行う（Ｈｏｇａｎら， １９８６， Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， ＮＹ）。最も一般的には、この核酸を、微量注入法によって胚の中に導入する。
【００８８】
卵の中に核酸を導入したら、この卵を短時間インキュベートした後、例えばＨｏｇａｎら（１９８６， Ｍａｎｕｐｉｌａｔｉｇ ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎ．Ｙ．）に記載されるように、その卵を得た種と同じ種の偽妊娠哺乳動物の体内に移す。典型的には、１回の実験について多くの卵を注入し、実験進行中にこれらの卵のうち約３分の２が生き残る。次に生存能力のある約２０個の卵を偽妊娠動物の体内に移し、このように移した生存能力のある卵のうち通常は４〜１０個が発生して生きた子（ｐｕｐ）となる。
【００８９】
本明細書中に記載される方法において任意の哺乳動物ＦＧＦ２３遺伝子を用いて、そのＦＧＦ２３遺伝子の全てもしくは一部が欠失した導入遺伝子を持つトランスジェニック哺乳動物またはトランスジェニック細胞を作製することができる。好ましくは、例えばマウスＦＧＦ２３（配列番号３）等のＦＧＦ２３遺伝子を用い、またヒトＦＧＦ２３（配列番号１）遺伝子も用いる。
【００９０】
本発明のトランスジェニック哺乳動物は、あらゆる種の哺乳動物であってよい。このように、本発明は、マウス、ハムスター、ラット、ウサギ、ブタ、ヒツジおよびウシを含む、キメラ核酸をコードするトランスジェニック哺乳動物を作製することを含むものと考えるべきである。本明細書中に記載される、トランスジェニックマウスの作製方法は、任意の哺乳動物種を用いて同様に適用することができる。好ましくは、本発明のトランスジェニック哺乳動物はげっ歯類であり、より好ましくは、本発明のトランスジェニック哺乳動物はマウスである。例えば、Ｌｕｋｋａｒｉｎｅｎら（１９９７， Ｓｔｒｏｋｅ ２８：６３９−６４５）は、トランスジェニックマウスを作製することができる遺伝子構築物は、他のトランスジェニックげっ歯類（ラットを含む）を作製することもできることを教示している。同様に、ある種の動物の遺伝子座におけるヌル接合性（ｎｕｌｌｉｚｙｇｏｕｓ）突然変異は、当該第一の種に対して高い相同性を有する遺伝子座を有する他の種の動物において複製することができる。
【００９１】
本発明のトランスジェニック哺乳動物を同定するために、サザンブロットハイブリダイゼーション、ＰＣＲ、および／またはＲＴ−ＰＣＲ等の標準的な技法を用いて、子の体内の単離核酸の存在について調べる。また、その哺乳動物の細胞内および組織内での核酸の発現も、本明細書中で記載する一般的な技術を用いて評価する。さらに、トランスジェニック動物の循環血液中のＦＧＦ２３の存否は、例えば本明細書中に開示されるように（例えばウェスタンブロット分析など）、または当分野で周知である標準的なタンパク質検出法を用いて、決定することができる。
【００９２】
本発明のトランスジェニック哺乳動物から得た細胞（本明細書中では用語として「トランスジェニック細胞」をも用いる）には、本明細書中で別途記載するＦＧＦ２３（＋／−）および（−／−）トランスジェニック非ヒト哺乳動物から得た細胞が含まれる。これらは、ＦＧＦ２３の発現レベルの変化に関係があると考えられる哺乳動物の疾患および症状のモデリングに有用な系である。
【００９３】
特に好適なのは、種々の組織中でＦＧＦ２３遺伝子を含む導入遺伝子が発現されるまたはＧＦＧ２３の発現を阻害することを特徴とする、本明細書中に記載する非ヒトノックアウト−もしくはノックイン−トランスジェニック哺乳動物の組織から得た細胞である。例として、このような細胞の由来元となる細胞型としては、（１）ＦＧＦ２３（＋／＋）、（＋／−）および（−／−）非ヒトトランスジェニック生産（せいざん， ｌｉｖｅｂｏｒｎ）哺乳動物、（２）ＦＧＦ２３（＋／＋）、（−／−）または（＋／−）胎児動物、ならびに（３）ＦＧＦ２３（＋／＋）、（−／−）および（＋／−）胎児および生産哺乳動物から得た胎盤細胞系の、線維芽細胞および内皮細胞が挙げられる。
【００９４】
本発明はさらに、ＦＧＦ２３核酸によってコードされる単離ポリペプチドを含む。ヒトおよびマウスＦＧＦ２３ＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列は、本願の図５Ｂおよび図６Ｂにそれぞれ配列番号２および配列番号４として記載する。先に記載したように、本発明は、ヒトおよびマウス種から単離されたＦＧＦ２３に限定されるものと考えるべきではない。むしろ本発明は、本明細書中で定義するＦＧＦ２３の生物学的活性を有するあらゆる単離ＦＧＦ２３ポリペプチドまたはその突然変異体、変異体、もしくは相同体を含むものと考えるべきである。
【００９５】
ヒトＦＧＦ２３タンパク質の好適なアミノ酸配列は配列番号２であり、マウスＦＧＦ２３タンパク質の好適なアミノ酸配列は配列番号４であるが、本発明はこれらの配列に限定されるものと考えるべきではない。むしろ、ヒトおよびマウスＦＧＦ２３のアミノ酸配列は、本明細書中に記載するＦＧＦ２３の生物学的活性を有するその突然変異体、変異体、もしくは相同体であってもよいと考えるべきである。好ましくは、ＦＧＦ２３のアミノ酸配列は、配列番号２または配列番号４に対して約４０％の配列同一性を有する。より好ましくは、配列番号２または配列番号４に対して、このアミノ酸配列は約５０％の配列相同性を共有し、さらにより好ましくはこのアミノ酸は約６０％の配列相同性を共有し、さらに好ましくはこのアミノ酸は約７０％の配列相同性を共有し、もっと好ましくは８０％、さらにより好ましくは９０％、もっと好ましくは９５％、またさらにより好ましくはこのアミノ酸は約９９〜１００％の配列相同性を有する。
【００９６】
また本発明は、ＦＧＦ２３遺伝子によりコードされるタンパク質またはペプチドの類似体も提供する。本明細書中で定義する類似体は、保存的アミノ酸配列の相違、もしくは配列に影響を及ぼさない修飾、またはこれらの両方により天然に存在するタンパク質またはペプチドと異なっていてよい。
【００９７】
全長ペプチドの他にも、本発明は、本明細書中で定義するＦＧＦ２３の生物学的活性を有するペプチドを提供する。当業者であれば、本明細書中に開示される配列に基づいて、例えばＳａｍｂｒｏｏｋら（１９８９， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）およびＡｕｓｕｂｅｌら（１９９７， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｇｒｅｅｎ ＆ Ｗｉｌｅｙ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）に記載された標準的な組換え技術を用いて、ＦＧＦ２３の重複断片を作成することができることが分かるであろう。当業者であれば、本明細書中で示す開示内容に基づいて、マウス中にＦＧＦ２３断片を注射し、注射後のマウスがリン酸塩の排泄を示すか否かを評価することにより、ＦＧＦ２３断片の生物学活性をテストすることができることが分かるであろう。リン酸塩排泄の誘導は、ＦＧＦ２３断片が生物学的活性を維持していることを示す指標となる。さらに、ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイを用いて、ＦＧＦ２３の生物学的活性をテストすることができる。例えば、単離した尿細管中にＦＧＦ２３断片を潅流させ、野生型ＦＧＦ２３と比べて、リン酸塩輸送の変化を評価することができる。同様に、必要なＦＧＦ２３シグナル伝達装置（即ちＦＧＦ受容体およびナトリウム輸送体）を有する細胞培養モデルを、ＦＧＦ２３断片でトランスフェクトした後、野生型ＦＧＦ２３と比べて、リン酸塩輸送の変化をテストすることができる。
【００９８】
先に記載した通り、本発明は、ＦＧＦ２３によりコードされるタンパク質またはペプチドの類似体も提供する。類似体は、保存的アミノ酸配列の相違、もしくは配列に影響を及ぼさない修飾、またはこれらの両方により、天然に存在するタンパク質またはペプチドと異なっている。例えばＳａｍｂｒｏｏｋら（１９８９， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）およびＡｕｓｕｂｅｌら（１９９７， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｇｒｅｅｎ ＆ Ｗｉｌｅｙ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）に記載されたもの等の当分野で周知である組換えＤＮＡ法を用いる多くの手法が、ＦＧＦ２３の突然変異体、誘導体、または変異体を作製するために用いることができる。
【００９９】
例えば、そのタンパク質またはペプチドの一次配列を変更するが、通常はその機能を変えない、保存的なアミノ酸の変更を行うことができる。保存的なアミノ酸置換は典型的には以下の基の間での置換を含む。
【０１００】
グリシン、アラニン；
バリン、イソロイシン、ロイシン；
アスパラギン酸、グルタミン酸；
アスパラギン、グルタミン、
セリン、トレオニン；
リシン、アルギニン（タンパク質分解酵素認識部位以外の位置にあるもの）；
フェニルアラニン、チロシン。
【０１０１】
（通常は一次配列を変更しない）修飾には、ｉｎ ｖｉｖｏもしくはｉｎ ｖｉｔｒｏでのポリペプチドの化学的誘導体化（例えばアセチル化およびカルボキシル化）が含まれる。また、グリコシル化の改変も含まれる。例えば、ポリペプチドの合成およびプロセッシング中または更なる処理工程中にそのポリペプチドのグリコシル化パターンを改変することにより、例えば、哺乳動物のグリコシル化酵素もしくは脱グリコシル化酵素（ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｎｇ ｏｒ ｄｅｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅ）などのグリコシル化に影響を及ぼす酵素にポリペプチドを曝露する工程により、作製されるものがある。また、リン酸化されたアミノ酸残基（例えばホスホチロシン、ホスホセリンまたはホスホトレオニン等）を有する配列も包含される。
【０１０２】
また、タンパク質分解に対する耐性を向上させるため、可溶度を最適化するため、または治療薬としてより適したものとするために通常の分子生物学的技法を用いて修飾したポリペプチドも含まれる。このようなポリペプチドの類似体には、天然のＬ−アミノ酸以外の残基、例えばＤ−アミノ酸または天然には生じない合成アミノ酸が含まれる。本発明のペプチドは、本明細書中に記載する特定の例示的プロセスのうちいずれかの生成物に限定されない。
【０１０３】
本明細書中で使用される「ＦＧＦ２３の生物学的活性」という用語は、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、ある分子がＦＧＦ受容体に結合してリン酸塩輸送を変化させる能力を意味する。当業者であればさらに、本開示内容に基づいて、本発明が、ある特定のＦＧＦ２３活性評価方法に限定されないこと、および当分野において既知のまたは将来開発されるであろうあらゆるＦＧＦ２３活性評価アッセイを包含することを理解するであろう。
【０１０４】
本発明は、単離ＦＧＦ２３タンパク質、ペプチド、ならびにそれらの類似体および断片を提供するだけでなく、それらの製造方法も提供する。本発明の１つの態様において、ＦＧＦ２３タンパク質、ペプチド、ならびにそれらの類似体および断片は、ＦＧＦ２３タンパク質の合成を可能とする条件下でＦＧＦ２３核酸を含むベクターを含む細胞を培養することにより、生成させることができる。組換えにより生成されたＦＧＦ２３タンパク質、ポリペプチド、断片等の単離および精製は、クロマトグラフィー、アフィニティーおよび免疫学に基づく分離法（例えば抗ＦＧＦ２３抗体を用いるもの）等を含む従来手段により行うことができる。これらの方法の各々は、標準的なテキストブック（例えばＳａｍｂｒｏｏｋら（１９８９， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）、ｉｎ Ａｕｓｕｂｅｌら（１９９７， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）、およびＧｅｒｈａｒｄｔら（編， １９９４， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅｒａｌ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ， Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ， Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ， ＤＣ））に記載されている。
【０１０５】
本発明はさらに、ＦＧＦ２３に特異的に結合する抗体またはそのフラグメントを含む。好適な実施形態において、本発明は、ＦＧＦ２３の生物学的活性を阻害する抗体を含む。抗体は、ＦＧＦ２３レベルに関係する疾患を有する哺乳動物においてＦＧＦ２３レベルを測定する診断用アッセイにおいて、ＦＧＦ２３を識別するために有用である。さらに、ＦＧＦ２３に特異的に結合する抗体は、ＦＧＦ２３とそのコグネイト受容体との相互作用を遮断するのに有用であり、従って、本明細書中に記載されているようなＦＧＦ２３関連疾患を治療するための治療場面において有用である。
【０１０６】
これまでにＦＧＦ２３の２つの受容体が同定されており、これらはＦＧＦＲ２およびＦＧＦＲ４である。ただし、ＦＧＦ２３の受容体はこれら２つのみであると考えるべき根拠はない。他のＦＧＦ受容体を同定するために、以下のアッセイを用いることができる。ＦＧＦ２３のその受容体への結合は、標準的なタンパク質結合アッセイ（市販されているＦＧＦ受容体−Ｆｃキメラを沈殿させるための固定化プロテインＡの使用を含む）を用いて検出することができる。さらに、発現ライブラリーを、当分野で公知である標準的な方法によりスクリーニングして、ＦＧＦに結合することが分かっているこれらの受容体以外の受容体へのＦＧＦ２３の結合を検出することができる。このように、本明細書中に記載されている実験に従って、他のＦＧＦ２３受容体を同定することができる。
【０１０７】
本明細書中に記載された遺伝子によるもしくは遺伝子によらない手段によって、ＦＧＦＲ２およびＦＧＦＲ４または他のＦＧＦ２３受容体を患者に投与することによって、ＦＧＦ２３の相互作用およびその後の活性化を阻害することにより、低リン酸血症を治療することができる。同様に、ＦＧＦ２３とその受容体との相互作用を遮断する抗体および他の小分子も、ＦＧＦ２３またはその受容体に結合することにより、ＦＧＦ２３活性を阻害する働きをすることができる。当業者であれば、本明細書中に提示された開示内容に基づき、特徴付けが十分なされた沢山のタンパク質結合アッセイのうちいずれかを用いて、ＦＧＦ２３／受容体間の相互作用を遮断する能力について複数の化合物をスクリーニングすることによって、ＦＧＦ２３受容体ブロッカーを同定することができることは、分かるであろう。
【０１０８】
ＦＧＦ２３に特異的に結合する抗体の作製は、本明細書中の実験の詳細を記載した節において記載されている。しかし、本発明は、本明細書中に具体的に開示されたこれらの抗体のみに限定されるものと考えるべきではなく、むしろ、ＦＧＦ２３に特異的に結合するようにすることができるあらゆる全ての抗体を含むべきである。例えば、ポリクローナル抗体の作製は、所望の動物に該抗原を接種し、該抗原に特異的に結合する抗体をその動物から単離することによって行われる。
【０１０９】
全長タンパク質もしくはペプチドまたはそれらのペプチドフラグメントに対するモノクローナル抗体は、任意の周知のモノクローナル抗体調製法（例えばＨａｒｌｏｗら（１９８８， Ｉｎ； Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， ＮＹ）およびＴｕｓｚｙｎｓｋｉら（１９８８， Ｂｌｏｏｄ， ７２：１０９−１１５）に記載された方法等）を用いて製造することができる。化学合成技術を用いて、所望のペプチドを大量に合成することもできる。あるいは、所望のペプチドをコードするＤＮＡをクローニングし、大量のペプチドの作製に適した細胞内で適当なプロモーター配列から発現させることができる。該ペプチドに対するモノクローナル抗体は、本明細書中で言及されている標準的手法を用いて該ペプチドで免疫したマウスから産生される。
【０１１０】
本明細書中で記載された手法を用いて得られたモノクローナル抗体をコードする核酸は、例えばＷｒｉｇｈｔら（１９９２， Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖ． ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ． １２（３，４）：１２５−１６８）および本明細書中に引用された参考文献に記載された当分野において利用可能である技術を用いてクローニングおよび配列決定を行うことができる。さらに本発明の抗体は、Ｗｒｉｇｈｔら（前掲）、本明細書中に引用された参考文献、およびＧｕら（１９９７， Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ ａｎｄ Ｈｅｍａｔｏｃｙｓｔ ７７（４）：７５５−７５９）に記載された技術を用いて「ヒト化」することができる。
【０１１１】
「ファージ抗体ライブラリー」を作製するために、まずはそのファージ表面上に発現させたい所望のタンパク質（例えば所望の抗体等）を発現している細胞（例えばハイブリドーマ等）から単離されたｍＲＮＡからｃＤＮＡライブラリーを得る。逆転写酵素を用いてｍＲＮＡのｃＤＮＡコピーを作製する。ＰＣＲにより免疫グロブリンフラグメントを指定しているｃＤＮＡを得、得られたＤＮＡを適当なバクテリオファージベクター中にクローニングして、免疫グロブリン遺伝子を指定しているＤＮＡを含むバクテリオファージＤＮＡライブラリーを作製する。異種ＤＮＡを含むバクテリオファージライブラリーを作製するための手法は当分野において周知であり、例えばＳａｍｂｒｏｏｋら（１９８９， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， ＮＹ）に記載されている。
【０１１２】
所望の抗体をコードするバクテリオファージは、その抗体タンパク質がそれに対応する結合タンパク質（例えばその抗体が標的とする抗原）に結合することができるようなかたちで該タンパク質がその表面に提示されるように、遺伝子操作することができる。このようにして、特定の抗体を発現するバクテリオファージを、対応する抗原を発現する細胞の存在下でインキュベートすると、バクテリオファージはその細胞に結合する。前記抗体を発現しないバクテリオファージは、その細胞に結合しない。このようなパンニング技法は当分野において周知であり、例えばＷｒｉｇｈｔら（前掲）に記載されている。
【０１１３】
Ｍ１３バクテリオファージ提示法（Ｂｕｒｔｏｎら， １９９４， Ａｄｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ５７：１９１−２８０）を用いてヒト抗体を産生するためのプロセス（例えば上記に記載したようなもの）が開発されている。基本的に、ｃＤＮＡライブラリーは、抗体産生細胞の集団から得たｍＲＮＡから作製される。ｍＲＮＡは、再配列された免疫グロブリン遺伝子をコードし、従ってこのｃＤＮＡはそれと同じものをコードする。増幅されたｃＤＮＡをＭ１３発現ベクター中にクローニングし、その表面上にヒトＦａｂフラグメントを発現しているファージのライブラリーを作製する。目的の抗体を提示しているファージを、抗原結合によって選択し、細菌中で増殖させて、可溶性ヒトＦａｂ免疫グロブリンを作製する。このように、従来のモノクローナル抗体合成法とは対照的に、この手法は、ヒト免疫グロブリンを発現する細胞ではなく、ヒト免疫グロブリンをコードするＤＮＡを不死化する。
【０１１４】
ここまで記載してきたこれらの手法は、抗体分子のＦａｂ部分をコードするファージの作製について述べている。しかし、本発明は、Ｆａｂ抗体をコードするファージの作製のみに限定されるものと考えるべきではない。むしろ、一本鎖抗体をコードするファージ（ｓｃＦｖ／ファージ抗体ライブラリー）も本発明に含まれる。Ｆａｂ分子は、Ｉｇ軽鎖全体を含む（つまり軽鎖の可変領域および定常領域の両方を含む）が、重鎖に関しては可変領域と第１定常領域ドメイン（ＣＨ１）しか含まない。一本鎖抗体分子は、Ｉｇ Ｆｖフラグメントを含む一本鎖タンパク質を含む。Ｉｇ Ｆｖフラグメントは、抗体の重鎖および軽鎖の可変領域のみを含み、定常領域はその中に含まない。ｓｃＦｖ ＤＮＡを含むファージライブラリーは、Ｍａｒｋｓら， １９９１， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２２２： ５８１−５９７に記載された手法に従って作製することができる。所望の抗体を単離するためのこのように作製されたファージのパンニングは、Ｆａｂ ＤＮＡを含むファージライブラリーについて記載された方法と同様にして行われる。
【０１１５】
また本発明は、重鎖および軽鎖の可変領域がほぼ全ての可能な特異性を含めるように合成される合成ファージ提示ライブラリーを含むものと考えるべきである（Ｂａｒｂａｓ， １９９５， Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ １：８３７−８３９； ｄｅ Ｋｒｕｉｆら， １９９５， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．２４８：９７−１０５）。
【０１１６】
本発明はさらに、ＦＧＦ２３の突然変異型を含む。つまり、本発明は、ＦＧＦ２３の突然変異型をコードする単離核酸、ならびにそれによりコードされるタンパク質を包含する。本発明は、ＦＧＦ２３タンパク質の生物学的活性または安定性に影響を及ぼす全ての突然変異を意図するものと理解されたい。好ましくは、これらの突然変異は低リン酸血症性もしくは高リン酸血症性状態と関連があり、本明細書中に提示されるデータが示す通り、これらのうち幾つかは遺伝性のもの（例えばＡＤＨＲ）である。本明細書中の実験の詳細を記載した節において立証されている通り、ＦＧＦ２３の幾つかの突然変異型は、このタンパク質の天然に存在する野生型に比べて高い安定性をＦＧＦ２３に与える。従って、ＦＧＦ２３のこのような安定形態は、血清リン酸塩レベルの上昇が原因となって生じるＦＧＦ２３関連疾患の治療のための治療用化合物として有用である。プロモーター／調節エレメントに機能しうる形で連結された該核酸を含むベクター、およびＦＧＦ２３のより安定な形態をコードする核酸を含む細胞も、本発明において意図されている。
【０１１７】
本明細書中に開示されるように、ＦＧＦ２３タンパク質の安定性を高める結果をもたらすＦＧＦ２３中の突然変異が同定された。このような突然変異（Ｒ１７６Ｑ、Ｒ１７９Ｗ、およびＲ１７９Ｑを含むがこれらに限定されない）は、共通プロテアーゼ切断部位を喪失させることによりタンパク質の安定性を高めることによって、タンパク質の分解を妨げることが分かった。ＦＧＦ２３のこれらの突然変異型がより長い半減期を有することは、有効な治療に必要な突然変異型ＦＧＦ２３の投与頻度が天然ＦＧＦ２３のそれよりも大幅に少なくてすむので、高リン酸血症性状態の治療に関して明らかに有利である。任意のアミノ酸による第１７６位および第１７９位のアルギニンのいずれかにおける置換突然変異もまた、タンパク質の安定性を高める。本発明は、本明細書中に例を挙げた突然変異のみに限定されるものと考えるべきではない。本明細書中の実験の詳細を記載した節は、当業者が野生型ＦＧＦ２３に比べて高い安定性を有する突然変異型ＦＧＦ２３遺伝子中のさらなる突然変異を同定することができるような適切な教示を提供している。
【０１１８】
本発明は、哺乳動物の細胞内または体液内におけるＦＧＦ２３の発現および／または活性を調節することができる分子を提供する。
【０１１９】
哺乳動物は、好ましくはヒトである。
【０１２０】
本明細書中において使用されるＦＧＦ２３活性の「モジュレータ」という用語は、本明細書中で定義するようなＦＧＦ２３の生物学的活性に影響を及ぼす化合物を意味する。この場合、モジュレータの存在下での前記活性は、モジュレータの不在下でのＦＧＦ２３の活性に比べて高いかまたは低い。
【０１２１】
このように、モジュレータは、ＦＧＦ２３の発現もしくは活性のインヒビターまたはエンハンサーである。ＦＧＦ２３発現を阻害するモジュレータには、ＦＧＦ２３をコードする核酸に結合するおよび／またはこれを切断するアンチセンス分子ならびにリボザイムが含まれるが、これらに限定されない。
【０１２２】
本発明は、ＦＧＦ２３タンパク質分子を減少させるまたは除去する働きをするＦＧＦ２３のインヒビターを提供する。このようなインヒビターは、上記に記載したようなアンチセンス核酸またはリボザイムであってもよい。インヒビターは、文献（Ｅｌｂａｓｈｉｒら， ２００１， Ｎａｔｕｒｅ， ４１１：４２８−４２９； Ｃａｒｔｈｅｗ， ２００１， Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．， １３：２４４−２４８）に記載されるように、ＲＮＡ干渉によりＦＧＦ２３ ｍＲＮＡのレベルを低下させる働きをする二本鎖ＲＮＡ分子であってもよい。
【０１２３】
本発明はさらに、ＦＧＦ２３の生物学的活性を阻害する働きをするＦＧＦ２３のインヒビター（ＦＧＦ２３とその受容体との相互作用を遮断する分子またはＦＧＦ２３受容体の活性化を阻害する分子を含むがこれらに限定されない）を提供する。具体的な例としては、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ４および他のＦＧＦ２３受容体、ならびにＦＧＦ２３もしくはその受容体に結合してＦＧＦ２３の生物学的活性を阻害する抗体、ペプチド、およびペプチド模倣体が含まれるが、これらに限定されない。このように、ＦＧＦ２３の発現または生物学的活性を阻害するあらゆるタイプのＦＧＦ２３インヒビターが、本発明において意図される。
【０１２４】
本明細書中に開示されるＦＧＦ２３の配列に基づいて、当業者は、ＦＧＦ２３のインヒビターとして有用なペプチド模倣体および他の小分子を作製することができる。特に、ペプチド模倣体は、国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ９３／０１２０１に記載された技法を用いて作製することができる。
【０１２５】
本発明の開示内容を参照すれば、ＦＧＦ２３の発現またはその生物学的活性のモジュレータを同定することは、比較的簡単なことである。例えば、天然にＦＧＦ２３を発現する細胞、またはＦＧＦ２３をコードする核酸でトランスフェクトした後にＦＧＦ２３を発現する細胞を、テスト化合物と接触させる。そしてテスト化合物の存在下または不在下でＦＧＦ２３の発現レベルを測定する。テスト化合物の不在下でのＦＧＦ２３の発現レベルと比較してテスト化合物の存在下でのＦＧＦ２３の発現レベルが高いまたは低い場合は、そのテスト化合物がＦＧＦ２３発現のモジュレータであることを示す。テスト化合物の不在下でのＦＧＦ２３の発現レベルと比べてテスト化合物の存在下でのＦＧＦ２３のレベルが高い場合、その化合物はＦＧＦ２３発現のエンハンサーであると考えられる。反対に、テスト化合物の不在下でのＦＧＦ２３の発現レベルと比べてテスト化合物の存在下でのＦＧＦ２３の発現レベルが低い場合、そのテスト化合物はＦＧＦ２３発現のインヒビターであると考えられる。
【０１２６】
同様に、哺乳動物の細胞中、血清中、または尿中のＦＧＦ２３生物学的活性を測定することができる。この場合、テスト化合物の存在下または不在下において細胞によって生成されたＦＧＦ２３の生物学的活性のレベルを測定する。テスト化合物の不在下におけるＦＧＦ２３活性レベルと比べてテスト化合物の存在下におけるＦＧＦ２３の活性レベルが高いかまたは低い場合、そのテスト化合物がＦＧＦ２３の生物学的活性のモジュレータであることを示す。テスト化合物の不在下におけるＦＧＦ２３の活性レベルと比べてテスト化合物の存在下におけるＦＧＦ２３の活性レベルが高い場合、そのテスト化合物はＦＧＦ２３の生物学的活性のエンハンサーであると考えられる。反対に、テスト化合物の不在下でのＦＧＦ２３の活性レベルと比べてテスト化合物の存在下でのＦＧＦ２３の活性レベルが低い場合、その化合物はＦＧＦ２３生物学的活性のインヒビターであると考えられる。
【０１２７】
ＦＧＦ２３の発現は、任意の通常の分子生物学技術（例えばＲＴ−ＰＣＲ技術、ＲＮアーゼプロテクション法、ノーザンブロットなど）を用いて測定することができる。あるいは、適当なレポーター遺伝子にＦＧＦ２３プロモーター配列を機能しうる形で連結し、得られたＤＮＡ構築物で細胞をトランスフェクトすることにより、発現に及ぼす影響を測定することができる。テスト化合物に対して応答性のプロモーター活性は、テスト化合物に接触させた細胞内でのレポーター遺伝子の発現レベルを測定し、これらの細胞内でのレポーター遺伝子の発現レベルをテスト化合物と接触させていない細胞内でのそれと比較することによって、測定することができる。好適なレポーター遺伝子には、β−ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、グリーン蛍光タンパク質等が含まれるが、これらに限定されない。
【０１２８】
本発明は、本明細書中に記載されるような、ＦＧＦ２３の生物学的活性を有する単離ポリペプチドを作製する方法を提供する。この方法では、該タンパク質の合成を可能とする条件下でＦＧＦ２３をコードするベクターを含む宿主細胞を培養する。次にこの培養細胞および／または培養培地からこのタンパク質を単離する。組換えにより生成されたタンパク質の単離および精製は、分取クロマトグラフィー、アフィニティー分離法および免疫分離法（ＦＧＦ２３に特異的に結合する抗体を用いたアフィニティークロマトグラフィー等）等を含む従来手段によって行うことができる。
【０１２９】
本発明は、被験者における低リン酸血症性および高リン酸血症性障害を診断する方法を提供する。本明細書中に提供される１つの実施例において、データは、ＡＤＨＲ患者がＦＧＦ２３中に突然変異を有すること、およびＦＧＦ２３はＡＤＨＲ検出のための診断用ツールとして有用であることを立証している。本明細書中に例示される方法は、ＦＧＦ２３、またはＦＧＦ２３中の突然変異を検出する試薬に、患者から得た生物学的サンプル（すなわちＦＧＦ２３タンパク質をコードする核酸または該タンパク質自体のいずれか）を接触させる工程を含む。サンプル中でＦＧＦ２３が検出された場合、またはＦＧＦ２３が検出されない場合は、ＦＧＦ２３に関係する低リン酸血症性および高リン酸血症性状態であることを示す。
【０１３０】
被験者から得た生物学的サンプルは、ＦＧＦ２３核酸またはタンパク質が検出される任意の体液または組織であってもよい。好ましくは、サンプルは血液または尿である。しかし、本発明は、被験者から得た特定の生物学的サンプルのいずれのものにも限定されるとは考えるべきではない。
【０１３１】
ＦＧＦ２３核酸検出のための好適な試薬としては、ＦＧＦ２３をコードする核酸に相補的な核酸が挙げられるが、これに限定されない。ＦＧＦ２３タンパク質検出のための好適な試薬としては抗体が挙げられるが、これに限定されない。さらに、ＦＧＦ２３核酸またはタンパク質を検出し易くするためにこれらの試薬を標識することが好ましい。当業者であれば、本明細書の開示内容に基づいて、放射性同位元素、生物発光化合物、化学発光化合物、蛍光化合物、金属キレートまたは酵素等を含む種々の好適な標識を用いて、ＦＧＦ２３検出用試薬を標識することができることが分かるであろう。
【０１３２】
また本発明には、低リン酸血症性状態についての血清アッセイ、血漿アッセイもしくは他の血液アッセイ、および尿または他の体液のアッセイも含まれる。このアッセイは、上記に挙げた低リン酸血症性疾患を有する患者を診断するために使用することができる。ＦＧＦ２３アッセイは、ＦＧＦ２３だけでなくＦＧＦ２３の一部に対応する特定のペプチドを測定するために設計された競合アッセイである。このアッセイは、各反応混合物中のＦＧＦ２３ペプチドに対して特異的な限られた量の抗体に結合する、標識された１２５Ｉ−ＦＧＦ２３ペプチドと未標識ペプチド（標準量または未知量の体液性ＦＧＦ２３）の競合に基づく。反応中の標準量または未知量が増大するにつれて、前記ペプチドに結合することができる１２５Ｉ−ＦＧＦ２３ペプチドの量は減少する。標準反応混合物中の未標識ＦＧＦ２３ペプチドの濃度の関数として１２５Ｉ−ＦＧＦ２３ペプチドの量を測定することにより、標準曲線を作製して、この曲線から体液中のＦＧＦ２３の濃度を決定することができる。
【０１３３】
上記競合アッセイは、患者の生物学的サンプル中に存在するＦＧＦ２３のレベルを定量するように設計される。所与の患者のサンプル中のＦＧＦ２３ポリペプチドのレベルを、リン酸塩障害に罹っていないことが分かっている患者のそれと比較することにより、ＦＧＦ２３レベルの上昇を、所与の患者が低リン酸血症性障害に罹っていることの指標として用いることができる。このアッセイは、多くの低リン酸血症性障害（利用可能な遺伝学的診断手段がない障害を含む）に対して有用である。このアッセイが有用であると思われる低リン酸血症性疾患には、ＸＬＨ、ＨＨＲＨ、ＨＢＤ、ＡＤＨＲ、腫瘍誘導型骨軟化症、表皮母斑症候群、線維性異形成症、および腎石症が含まれる。例えば、本明細書中に開示されるように、ＡＤＨＲ患者は、前記タンパク質中の突然変異がその分解を阻害するために、ＦＧＦ２３のレベルが上昇している。
【０１３４】
また本発明は、患者における腫瘍誘導型骨軟化症の診断方法も含む。この方法では、患者の腫瘍サンプル中のＦＧＦ２３の存在は、本明細書中に開示されるように、その病気に罹っていることを示す。患者から切り出した腫瘍サンプルは、ＦＧＦ２３を検出するために設計された種々の方法（ＲＴ−ＰＣＲ、ノーザンブロット分析、およびＲＮアーゼプロテクションアッセイを含むがこれらに限定されない）にかけることができる。このように、腫瘍誘導型骨軟化症の臨床症状を示す患者を、このＦＧＦ２３ベースの手法を用いてより明確に診断することができる。
【０１３５】
本発明は、低リン酸血症性疾患に罹った動物においてこれを治療する方法を提供する。この方法では、ＦＧＦ２３の発現および／または生物学的活性を低下させる治療的有効量の試薬を哺乳動物に投与する。治療することができる低リン酸血症性疾患としては、Ｘ連鎖低リン酸血症性くる病（ＸＬＨ）、高カルシウム尿症を伴う遺伝性低リン酸血症くる病（ＨＨＲＨ）、低リン酸血症性骨疾患（ＨＢＤ）、常染色体優性低リン酸血症性くる病（ＡＤＨＲ）、腫瘍誘導型骨軟化症（ＴＩＯ）、腫瘍形成性低リン酸血症性骨軟化症（ＯＨＯ）、表皮母斑症候群、線維性異形成症、および腎石症等が挙げられるが、これらに限定されない。本明細書中に開示されるように、低リン酸血症性疾患は、ＦＧＦ２３の過剰発現、ＦＧＦ２３を分解させるような酵素突然変異もしくは他の酵素阻害、またはＦＧＦ２３中におけるそのタンパク質安定性を高める突然変異によって特徴付けることができ、これらの特徴は全て、血清リン酸塩レベルの低下を伴うリン酸塩排泄の増大をもたらす。このように、ＦＧＦ２３の発現および／または生物学的活性を低下させる試薬は、低リン酸血症性患者において正常なリン酸塩恒常性を回復するであろう。ＦＧＦ２３の発現を低下させる試薬の例としては、アンチセンス核酸およびリボザイムが挙げられるが、これらに限定されない。ＦＧＦ２３の生物学的活性を低下させる試薬の例としては、ＦＧＦ２３とその受容体との相互作用を遮断する抗体および他の小分子が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１３６】
また本発明は、哺乳動物における高リン酸血症性疾患の治療方法も提供する。この方法では、治療的有効量のＦＧＦ２３（核酸またはそれによりコードされるポリペプチド）またはＦＧＦ２３ポリペプチドのレベルを上昇させる試薬を、哺乳動物に投与する。ＦＧＦ２３ポリペプチドのレベルを上昇させる試薬の例としては、プロテアーゼインヒビターが挙げられる。本明細書中に提示される実施例に記載されているように、ＦＧＦ２３はＳＰＣプロテアーゼによって分解され、ＦＧＦ２３のＳＰＣ切断の阻害はその半減期を延長させて、その結果、ＦＧＦ２３のレベルが上昇する。治療することができる高リン酸血症性疾患としては、軽度の腎不全、腫瘍状石灰沈着症等の患者が挙げられるが、これらを有する患者に限定されない。高リン酸血症性患者における血清リン酸塩レベルの上昇は、ＦＧＦ２３またはＦＧＦ２３のレベルを上昇させる試薬（いずれもリン酸塩の排泄を刺激することにより血清リン酸塩レベルを低下させる）を投与することにより克服することができる。ＦＧＦ２３は、標準的な遺伝子療法によって、ならびに静脈内、皮下、および筋肉内注射を含む（ただしこれらに限定されない）方法によるＦＧＦ２３ポリペプチドの直接注射によって、投与することができる。本発明は、天然ＦＧＦ２３およびＦＧＦ２３の突然変異型（ＦＧＦ２３タンパク質の安定性を高める働きをする本明細書中に開示された突然変異体を含むがこれらに限定されない）の投与を含むものと考えるべきである。
【０１３７】
また本発明は、治療的有効量のＦＧＦ２３を発現する細胞集団を用いた高リン酸血症性障害の治療方法も含む。本明細書中に示すようにＦＧＦ２３は分泌タンパク質であるので、この方法は有効なＦＧＦ２３投与法であり得る。また本発明には、この目的のためのＦＧＦ２３ポリペプチドの突然変異型を発現する細胞の投与も含まれる。好適な突然変異としては、ＦＧＦ２３ポリペプチドの安定性を高めるもの（例えば本明細書中に開示された突然変異等）が挙げられる。
【０１３８】
本発明はさらに、治療的有効量のＦＧＦ２３またはＦＧＦ２３の発現を増大させる試薬を哺乳動物に投与する、哺乳動物における骨軟化症の治療方法を提供する。低リン酸血症性疾患ＸＬＨに罹った患者が骨折する頻度は、この疾患に罹っていない患者が骨折する頻度に比べて低い（Ｅｃｏｎｓら， １９９４， Ｂｏｎｅ　ａｎｄ Ｍｉｎ．，２４：１７−２４）。ＦＧＦ２３、またはＦＧＦ２３のレベルを上昇させる試薬を投与すると、付随的に骨密度および強度に対して影響を及ぼす一時的な低リン酸血症をもたらす。このようにＦＧＦ２３は、リン酸塩の恒常性の調節において役割を果たす以外にも、ｉｎ ｖｉｖｏでの骨硬化作用を有し得る。そのことに制限されることは望まないが、低リン酸血症が骨量の増加につながるメカニズムには、１，２５ジヒドロキシビタミンＤが関与するようである。具体的には、ＦＧＦ２３（もしくは突然変異型ＦＧＦ２３）またはＦＧＦ２３の発現を増加させる試薬の断続的投与は、リン酸塩の再吸収（種々の骨疾患に対して有効な治療薬である１，２５ジヒドロキシビタミンＤの生成の増加およびリン酸塩の再吸収の増加を刺激する反応）を一時的に減少させ得る。
【０１３９】
本発明はさらに、以下に記載するように、治療的有効量のＦＧＦ２３（もしくは突然変異型ＦＧＦ２３）またはＦＧＦ２３の発現を増加させる試薬を哺乳動物に投与する、哺乳動物の動脈または軟部組織中のカルシウムおよびリン酸塩の沈着を伴う状態を治療する方法を提供する。軽度の腎不全に罹った患者は、血清リン酸塩レベルの上昇により、一般的に、冠状動脈および他の動脈中にカルシウムおよびリンの沈着を示す。動脈壁へのカルシウムとリン酸塩の両方の付着（冠状動脈疾患と呼ぶ）により、これらの動脈を流れる血流が減少し、心筋梗塞につながる可能性がある。このように、冠状動脈疾患の治療は、心筋梗塞の発症の危険度を低下させる。
【０１４０】
ＦＧＦ２３またはＦＧＦ２３のレベルを上昇させる試薬は、血清リン酸塩のレベルを低下させることにより、高リン酸血症患者を心臓血管および冠状動脈の疾患の加速進行から守る。ＦＧＦ２３をコードする核酸を、遺伝子療法を含む（ただしこれに限定されない）方法によって冠状動脈の細胞に送達することができる。さらに、組織特異的プロモーターの使用により、血管の平滑筋細胞または内皮細胞におけるＦＧＦ２３の選択的発現を促進することができる。
【０１４１】
同様に、ＦＧＦ２３またはＦＧＦ２３のレベルを上昇させる試薬は、軟部組織内のカルシウムおよびリン酸塩の沈着を伴う他の状態（皮膚筋炎および腫瘍状石灰沈着症を含むがこれらに限定されない）の治療において有用である。腫瘍状石灰沈着症は、腎臓でのリン酸塩再吸収の増大および１，２５ジヒドロキシビタミンＤの濃度の増大を特徴とする障害である。結果として、患者は軟部組織の石灰化（カルシウムおよびリン酸塩の沈着）を発症する。本明細書中に記載される手段のうち任意のものを用いた軟部組織へのＦＧＦ２３（天然型または突然変異型）の投与は、これらの生化学的欠陥を改善する。
【０１４２】
本発明は、ＦＧＦ２３をコードする核酸、ＦＧＦ２３に特異的に結合する抗体、ＦＧＦ２３をコードする核酸に相補的（ただし転写に関してアンチセンス方向）である核酸、および／または本発明の組成物等の化合物と、アプリケータと、本発明の方法を実施するための該化合物の使用方法を説明する取扱説明書と、を含む様々なキットを含む。このようなキットの例を以下に記載するが、本発明の開示内容を照らせば、他の有用なキットの内容が当業者には自明であろう。これらのキットの各々は、本発明の範囲内に含まれる。
【０１４３】
１つの態様において、本発明は、ＦＧＦ２３の発現不良（ｍａｌｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）が原因となる疾患を軽減するためのキットを含む。このキットは、本発明で開示される方法に従って使用される。簡潔に説明すると、このキットを用いて、ＦＧＦ２３をコードする核酸に相補的な核酸（この核酸は、ＦＧＦ２３の発現を低下させるために、転写に関してアンチセンス方向である）、またはＦＧＦ２３に特異的に結合する抗体に、細胞を接触させることができる。こうしてＦＧＦ２３の発現、量および活性を低下させることにより、有益な効果を得る。さらにこのキットは、アプリケータおよびそのキットを使用するための取扱説明書等を含む。これらの教示は、本明細書中に提供される実施例を単純に具体化したものである。
【０１４４】
このキットは、製薬上許容可能な担体を含む。組成物は、本明細書中の他の箇所に記載された適宜量で提供される。さらに、投与経路および投与頻度は本明細書中の他の箇所に既に記載してある。
【０１４５】
当業者であれば、本明細書中に提供された開示内容に基づいて、本発明が、ＦＧＦ２３のレベルを低下させるためのＦＧＦ２３に特異的に結合するリボザイム、アンチセンス組成物、抗体等が含まれるキットを包含することが分かるであろう。
【０１４６】
さらに、本発明は、哺乳動物のＦＧＦ２３をコードする核酸を含むキットを含む。このようなキットは、高レベルのＦＧＦ２３が望ましいどのような場合であっても、本発明の方法に従って使用することができる。つまり、疾患、障害、または病的状態が、ＦＧＦ２３の正常な非疾患レベルと比較してＦＧＦ２３のレベルが低下したことに関係するかまたはそれを原因とする場合、本明細書中の他の箇所に開示される教示に従ってこのキットを用いて、これにより、他の点では同一であるが正常な（すなわち病気でない）細胞内のＦＧＦ２３レベルに比べてＦＧＦ２３のレベルが低い細胞に、および／またはこのような細胞を含む動物に、ＦＧＦ２３を提供することができる。本明細書中に開示されるＦＧＦ２３の突然変異型（非突然変異型よりも安定である）は、このようなキットにおいて特に有用である。
【０１４７】
医薬組成物
また本発明は、本発明の方法を実施するのに適したＦＧＦ２３モジュレータの医薬組成物の使用も包含する。この組成物は、適当なＦＧＦ２３モジュレータおよび製薬上許容可能な担体を含む。
【０１４８】
本明細書中に用いられる「製薬上許容可能な担体」という用語は、適当なＦＧＦ２３モジュレータと組み合わせることができる化学組成物であって、組み合わせた後に、該適当なＦＧＦ２３モジュレータを哺乳動物に投与するために用いることができる化学組成物を意味する。
【０１４９】
本発明を実施するために有用な医薬組成物は、１ｎｇ／ｋｇ／日〜１００ｍｇ／ｋｇ／日の用量で送達されるように投与することができる。
【０１５０】
本発明の方法において有用な医薬組成物は、経口用固形製剤、エアロゾル、局所製剤または他の同様の製剤として全身投与することができる。適当なＦＧＦ２３モジュレータ以外に、このような医薬組成物は、製薬上許容可能な担体、および薬物投与を促進し容易にすることが知られている他の成分を含み得る。本発明の方法に従って適当なＦＧＦ２３モジュレータを投与するために、他の可能な製剤（例えばナノ粒子、リポソーム、再シール赤血球（ｒｅｓｅａｌｅｄ ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅ）、および免疫学ベースの系等）を用いてもよい。
【０１５１】
本明細書中に記載される方法のいずれかを用いて同定される化合物を製剤化し、本明細書中に開示される疾患を治療するために哺乳動物に投与することができる。以下に記載する。
【０１５２】
本発明は、本明細書中に開示される疾患の治療に有用な化合物を有効成分として含む医薬組成物の製造および使用を包含する。このような医薬組成物は、被験者への投与に適した形態として、活性成分のみからなるものであってもよいし、また該医薬組成物は、有効成分、および１種以上の製薬上許容可能な担体、１種以上の追加的な成分、またはこれらの幾つかの組み合わせを含むものであってもよい。有効成分は、当分野で周知であるような、生理学的に許容可能なエステルまたは塩（例えば生理学的に許容可能な陽イオンまたは陰イオンとの組み合わせ）の形態で医薬組成物の中に存在してもよい。
【０１５３】
本明細書中で使用される「製薬上許容可能な担体」という用語は、有効成分と組み合わせることができる化学組成物であって、組み合わせた後に、被験者に有効成分を投与するために使用することができる化学組成物を意味する。
【０１５４】
本明細書中で使用される「生理学的に許容可能な」エステルまたは塩という用語は、医薬組成物の他のどの成分とも相容性のある有効成分のエステルまたは塩であって、その組成物を投与する被験者に対して有害ではないものを意味する。
【０１５５】
本明細書中に記載される医薬組成物の製剤は、薬理学の分野で公知である方法もしくは今後開発される方法によって調製することができる。一般に、このような調製法は、担体または１種以上の他の補助成分と有効成分とを一緒にする工程、および必要なもしくは望ましい場合には、その後で所望の一回用量単位もしくは複数回用量単位に製品を成形またはパッケージングする工程を含む。
【０１５６】
本明細書中に提供される医薬組成物は、ヒトへの医療上の投与に適した医薬組成物に関して主に記載されているが、当業者であれば、このような組成物はほぼ全ての種類の動物への投与に適していることが理解できよう。ヒトへの投与に適した医薬組成物を種々の動物への投与に適したものとするような変更は、十分理解されており、通常の知識を有する獣医薬理学者であれば、必要であれば単に通常の実験を行うだけで、このような改変を設計および実施することができる。本発明の医薬組成物の投与が想定される被験者としては、ヒトおよび他の霊長類ならびに他の哺乳動物が挙げられるがこれらに限定されない。
【０１５７】
本発明の方法に有用な医薬組成物は、経口、非経口、肺、鼻腔内、口腔内、または他の投与経路に適した製剤として調製、パッケージング、または販売されてもよい。想定される他の製剤としては、有効成分を含む発射型（ｐｒｏｊｅｃｔｅｄ）ナノ粒子、リポソーム調製物、再シール赤血球、および免疫学ベースの製剤が挙げられる。
【０１５８】
本発明の医薬組成物は、一回分単位服用量として、または複数個の一回分単位服用量として大量に調製、パッケージングまたは販売されてもよい。本明細書中で使用される「単位服用量」とは、所定量の有効成分を含む医薬組成物の個別量である。有効成分の量は一般に、被験者に投与される有効成分の用量、またはこの用量の便宜的な分数（例えばこのような用量の１／２または１／３等）に等しい。
【０１５９】
本発明の医薬組成物中の有効成分、製薬上許容可能な担体、および他の成分の相対的な量は、治療対象となる被験者の正体、その大きさ、および体調によって異なり、さらに、組成物の投与経路によっても異なる。例として、組成物は０．１〜１００重量％の有効成分を含み得る。
【０１６０】
有効成分の他に、本発明の医薬組成物は、１種以上の追加的な医薬有効成分をさらに含み得る。特に想定される追加的な成分としては、制吐薬およびスカベンジャー（例えばシアン化物やシアン酸塩スカベンジャーなど）が挙げられる。
【０１６１】
本発明の医薬組成物の制御放出製剤または持続性放出製剤は、通常の技術を用いて調製することができる。
【０１６２】
経口投与に適した本発明の医薬組成物の製剤は、錠剤、硬カプセル剤、軟カプセル剤、カシェ剤、トローチ剤またはロゼンジ剤等を含む（ただしこれらに限定されない）個別の固形用量単位の形態（各々が所定量の有効成分を含む）として調製、パッケージングまたは販売されてもよい。経口投与に適した他の製剤としては、粉末状もしくは顆粒状製剤、水性もしくは油性懸濁液、水性もしくは油性溶液、またはエマルジョンが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１６３】
本明細書中で使用される「油性」液体は、水よりも低い極性を示す、炭素含有液体分子を含むものである。
【０１６４】
有効成分を含む錠剤は、例えば、有効成分を、任意で１種以上の追加的な成分と共に圧縮または成形することにより作製することができる。圧縮型錠剤は、好適なデバイスの中で、粉末状もしくは顆粒状調製物等の自由流動形態（ｆｒｅｅ−ｆｌｏｗｉｎｇ ｆｏｒｍ）の有効成分を、任意で１種以上の結合剤、潤滑剤、賦形剤、界面活性剤、および分散剤と一緒に圧縮することによって、調製することができる。成形型錠剤は、好適なデバイスの中で、有効成分と製薬上許容可能な担体との混合物を、および少なくともこの混合物を湿らせるのに十分な液体と一緒に成形することにより、作製することができる。錠剤の製造に使用される製薬上許容可能な賦形剤としては、不活性希釈剤、顆粒化および崩壊剤（ｇｒａｎｕｌａｔｉｎｇ ａｎｄ ｄｉｓｉｎｔｅｇｒａｔｉｎｇ ａｇｅｎｔ）、結合剤、ならびに潤滑剤が挙げられるが、これらに限定されない。公知の分散剤としては、じゃがいもデンプン、デンプングリコール酸ナトリウムが挙げられるが、これらに限定されない。公知の界面活性剤としてはラウリル硫酸ナトリウムが挙げられるが、これに限定されない。公知の希釈剤としては、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、ラクトース、微結晶性セルロース、リン酸カルシウム、リン酸水素カルシウム、およびリン酸ナトリウム等が挙げられるが、これらに限定されない。公知の顆粒化および崩壊剤としては、コーンスターチおよびアルギン酸が挙げられるがこれらに限定されない。公知の結合剤としては、ゼラチン、アカシア、α−トウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドン、およびヒドロキシプロピルメチルセルロースが挙げられるが、これらに限定されない。公知の潤滑剤としては、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、シリカおよびタルクが挙げられるがこれらに限定されない。
【０１６５】
錠剤は、コーティングされていないものであってもよいし、または、被験者の消化管内での消化を遅らせるための公知方法によりコーティングすることによって、有効成分の放出および吸収を持続させてもよい。例として、モノステアリン酸グリセリンまたはジステアリン酸グリセリンなどの物質を用いて錠剤をコーティングすることができる。さらに例として、錠剤は、米国特許番号第４，２５６，１０８号、第４，１６０，４５２号および第４，２６５，８７４号に記載された方法を用いてコーティングし、浸透圧性放出制御型錠剤を形成してもよい。錠剤はさらに、医薬として洗練された味の良い調製物を提供するために、甘味料、着香料、着色料、保存剤、またはこれらの組合せを含んでもよい。
【０１６６】
ゼラチン等の生理学的に分解性の組成物を用いて、有効成分を含む硬カプセル剤を作製することができる。このような硬カプセル剤は有効成分を含み、さらに、追加的な成分（例えば炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、カオリンなどの不活性固形希釈剤）を含み得る。
【０１６７】
ゼラチン等の生理学的に分解可能な組成物を用いて、有効成分を含む軟ゼラチンカプセルを作製することができる。このような軟カプセルは有効成分を含む。この有効成分は、落花生油、パラフィン油またはオリーブ油等の油性媒体または水と混合されていてもよい。
【０１６８】
経口投与に適した本発明の医薬組成物の液体製剤は、使用前に水または他の好適なビヒクルで再構成するための乾燥製品として、または液体形状で、調製、パッケージングおよび販売されてもよい。
【０１６９】
液体懸濁液は、水性または油性ビヒクル中に有効成分を懸濁するための従来法を用いて調製することができる。水性ビヒクルとしては例えば水および等張食塩水が挙げられる。油性ビヒクルとしては、例えば扁桃油、油性エステル、エチルアルコール、植物油（例えば落花生、オリーブ、ごま、またはココヤシ油等）、精留植物油、および鉱油（例えばパラフィン油等）が挙げられる。懸濁液はさらに、１種以上の追加的な成分（例えば懸濁剤、分散もしくは湿潤剤、乳化剤、緩和剤、保存剤、緩衝剤、塩、着香料、着色料、および甘味料が挙げられるがこれに限定されない）を含み得る。油性懸濁液はさらに、増粘剤を含み得る。公知の懸濁化剤としては、ソルビトールシロップ、硬化食用油脂、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン、トラガカントゴム、アカシアゴム、およびセルロース誘導体（例えばナトリウムカルボキシメチルセルロース、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース等）が挙げられるが、これらに限定されない。公知の分散もしくは湿潤剤としては、天然リン脂質（例えばレシチン）や、脂肪酸との、長鎖脂肪族アルコールとの、脂肪酸およびヘキシトールから得た部分エステルとの、または脂肪酸およびヘキシトール無水物（ｈｅｘｉｔｏｌ ａｎｈｙｄｒｉｄｅ）から得た部分エステルとのアルキレンオキシドの縮合物（例えば、それぞれについて、ステアリン酸ポリオキシエチレン、ヘプタデカエチレンオキシセタノール（ｈｅｐｔａｄｅｃａｅｔｈｙｌｅｎｅｏｘｙｃｅｔａｎｏｌ）、ポリオキシエチレンソルビトール−モノオレエート、およびポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート）が挙げられるが、これらに限定されない。公知の乳化剤としては、レシチンおよびアカシアが挙げられるがこれに限定されない。公知の保存剤としては、メチル、エチルもしくはｎ−プロピル−パラ−ヒドロキシベンゾエート、アスコルビン酸、およびソルビン酸が挙げられるが、これらに限定されない。公知の甘味料としては、例えばグリセロール、プロピレングリコール、ソルビトール、スクロース、およびサッカリンなどが挙げられる。油性懸濁液用の公知の増粘剤としては、例えば蜜蝋、固形パラフィンおよびセチルアルコールが挙げられる。
【０１７０】
有効成分を含有する水性もしくは油性溶媒である液体溶液は、液体懸濁液と実質的に同じように調製することができる。主な違いは、有効成分を溶媒中に懸濁させるのではなく溶解させることである。本発明の医薬組成物の液体溶液は、液体懸濁液に関して記載された成分の各々を含み得る。懸濁化剤は溶媒中への有効成分の溶解を必ずしも補助するわけではないことを理解されたい。水性溶媒としては、例えば水および等張食塩水が挙げられる。油性溶媒としては、例えば扁桃油、油性エステル、エチルアルコール、植物油（例えば落花生、オリーブ、ごま、またはココヤシ油）、精留植物油、ならびに鉱油（パラフィン油など）が挙げられる。
【０１７１】
本発明の医薬調製物の粉末状製剤および顆粒状製剤は、公知方法を用いて調製することができる。このような製剤は、被験者に直接投与することもできるし、また例えば錠剤を形成するため、カプセルを充填するため、あるいは水性もしくは油性ビヒクルを加えることにより水性もしくは油性の懸濁液または溶液を調製するために用いることができる。これらの製剤の各々はさらに、分散もしくは湿潤剤、懸濁化剤、および保存剤のうちの１種以上を含み得る。これらの製剤中には、充填剤、甘味料、着香料、または着色料などの追加的な賦形剤が含まれていても良い。
【０１７２】
また、本発明の医薬組成物は、水中油エマルジョンまたは油中水エマルジョンとして調製、パッケージングまたは販売されてもよい。油性相は、オリーブ油もしくは落花生油などの植物油、パラフィン油などの鉱油、またはこれらの組合せであってもよい。このような組成物はさらに、天然ゴム（アカシアゴムやトラガカントゴム等）、天然リン脂質（大豆リン脂質やレシチンリン脂質等）、脂肪酸およびヘキシトール無水物の組合せから得たエステルまたは部分エステル（例えばソルビタンモノオレエート）、ならびにこのような部分エステルとエチレンオキシドとの縮合物（例えばポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート）等の１種以上の乳化剤を含み得る。またこれらのエマルジョンは、例えば甘味料または着香料等の追加的な成分も含み得る。
【０１７３】
本明細書中で使用される、医薬組成物の「非経口投与」とは、被験者の組織の物理的切開（ｐｈｙｓｉｃａｌ ｂｒｅａｃｈｉｎｇ）によって、および組織内の裂け目（ｂｒｅａｃｈ）を介した医薬組成物の投与によって特徴付けられるあらゆる投与経路を含む。このように、非経口投与は、医薬組成物の注射による組成物の投与、外科的切開による組成物の適用、組織を貫通する非外科的創傷部からの組成物の適用等を含むがこれらに限定されない。特に非経口投与は、皮下、腹膜内、筋肉内、胸骨内注射、および腎臓透析注入技法を含むと考えられるが、これらに限定されない。
【０１７４】
非経口投与に適した医薬組成物の製剤は、有効成分と製薬上許容可能な担体（例えば滅菌水または滅菌等張食塩水等）との組合せを含む。このような製剤は、ボーラス投与または連続投与に適した形態で、調製、パッケージングまたは販売されてもよい。注射用製剤は、例えば保存剤を含む複数回分の用量を収容する容器またはアンプルの中に入った単位剤形として調製、パッケージングまたは販売されてもよい。非経口投与用製剤としては、懸濁液、溶液、エマルジョン、油性もしくは水性ビヒクル中の懸濁液、溶液、またはエマルジョン、ペースト剤、および植込型持続放出性もしくは生分解性製剤が挙げられるがこれらに限定されない。このような製剤はさらに、懸濁化剤、安定化剤、または分散剤等を含む（ただしこれらに限定されない）１種以上の追加的成分をさらに含み得る。非経口投与用製剤の１つの実施形態において、有効成分は、非経口投与する前に好適なビヒクル（例えば発熱物質を含まない滅菌水など）で再構成するための乾燥状（すなわち粉末または顆粒状）形態で提供される。
【０１７５】
医薬組成物は、滅菌した注射用の水性もしくは油性の懸濁液または溶液として調製、パッケージング、または販売されてもよい。この懸濁液または溶液は、公知技術に従って製剤化することができ、このような懸濁液または溶液は、有効成分のほかに、本明細書中に記載される分散剤、湿潤剤、または懸濁化剤などの追加的な成分を含み得る。このような滅菌注射用製剤は、毒性の無い、非経口投与が可能な希釈剤または溶媒（例えば水または１，３−ブタンジオール等）を用いて調製することができる。他の許容可能な希釈剤および溶剤としては、リンゲル液、等張塩化ナトリウム水、および不揮発性油（例えば合成モノ−もしくはジ−グリセリド等）が挙げられるがこれらに限定されない。他の有用な非経口投与可能製剤としては、有効成分をリポソーム調製物中の微結晶形態として含むもの、または生分解性ポリマー系の成分として含むものが挙げられる。持続性放出用または移植用の組成物は、製薬上許容可能なポリマー材料または疎水性材料（例えばエマルジョン、イオン交換樹脂、難溶性ポリマー、または難溶性塩等）を含み得る。
【０１７６】
本発明の医薬組成物は、口腔を介した肺投与に適した製剤として調製、パッケージング、または販売されてもよい。このような製剤は、有効成分を含む直径約０．５〜約７ナノメートル（好ましくは約１〜６ナノメートル）の乾燥粒子を含み得る。このような組成物は通常、粉末を分散させるように推進剤の噴射流を方向付ける乾燥粉末リザーバを含むデバイスを用いて、または自動噴射式溶媒／粉末分配容器（例えば密封容器中の低沸点（ｌｏｗ−ｂｏｉｌｉｎｇ）推進剤中に有効成分を溶解または懸濁させたものを含むデバイス）を用いて投与するための、乾燥粉末形態である。好ましくは、このような粉末は、該粒子の少なくとも９８重量％が０．５ナノメートルを超える直径を有し、該粒子の数の少なくとも９５％が７ナノメートル未満の直径を有するような粒子である。より好ましくは、該粒子の少なくとも９５重量％が１ナノメートルを超える直径を有し、該粒子の数の少なくとも９０％が６ナノメートル未満の直径を有する。乾燥粉末組成物は、好ましくは砂糖などの固体微粉末状希釈剤を含み、通常はユニット剤形として提供される。
【０１７７】
低沸点推進剤は一般に、大気圧で華氏６５度未満の沸点を有する液体推進剤を含む。一般に、推進剤は組成物の５０〜９９．９重量％を占め、有効成分は組成物の０．１〜２０重量％を占める。推進剤はさらに、液体の非イオン界面活性剤、固体の陰イオン界面活性剤、または固体希釈剤（好ましくは有効成分を含む粒子と同じくらいの粒径を有する）などの追加的な成分を含み得る。
【０１７８】
また、肺送達用に製剤化された本発明の医薬組成物は、溶液または懸濁液の液滴として有効成分を提供することもできる。このような製剤は、有効成分を含む水性または希アルコール溶液または懸濁液（任意で滅菌したもの）等として、調製、パッケージングまたは販売されてもよい、通常は、任意のネブライザーまたはアトマイザーデバイスを用いて投与することができる。このような製剤はさらに、１種以上の追加的な成分（例えばサッカリンナトリウム等の着香料、揮発性油、緩衝剤、界面活性剤、またはメチルヒドロキシベンゾエート等の保存剤などが挙げられるがこれらに限定されない）を含み得る。この投与経路により提供される液滴は好ましくは約０．１〜約２００ナノメートルの平均直径を有する。
【０１７９】
本明細書中で肺送達に有用であるとして記載される製剤は、本発明の医薬組成物の鼻腔内送達にも有用である。
【０１８０】
鼻腔内投与に適した他の製剤は、有効成分を含み約０．２〜５００μｍの平均粒径を有する粗い粉末である。このような製剤は、嗅剤を摂取する方法で（すなわち鼻通路を通して外鼻孔の近くに保持された粉末の容器から素早く吸入することにより）投与される。
【０１８１】
鼻投与に適した製剤は、例えば有効成分の少なければ約０．１重量％から多ければ１００重量％を占め、さらに、本明細書中に記載された追加的な成分の１種以上を含み得る。
【０１８２】
本発明の医薬組成物は、口腔内投与に適した製剤として調製、パッケージング、または販売されてもよい。このような製剤は、例えば、従来法を用いて作成される錠剤またはロゼンジ剤の形態であってもよく、例えば０．１〜２０重量％の有効成分（口の中で溶けるもしくは分解される組成物となるようなバランス）、および任意で本明細書中に記載される追加的成分の１種以上を含む。あるいは、口腔内投与に適した製剤は、有効成分を含む粉末あるいはエアロゾル用もしくはアトマイズ用（ａｅｒｏｓｏｌｉｚｅｄ）の溶液または懸濁液を含み得る。このような粉末状、エアロゾル用、またはアトマイズ用製剤は、分散させた時に、好ましくは約０．１〜約２００ナノメートルの平均粒径または液滴サイズを有し、本明細書中に記載される追加的成分のうち１種以上をさらに含み得る。
【０１８３】
本明細書中で使用される「追加的成分」としては、以下に挙げるもののうち１種以上（ただしこれらに限定されない）を含む：賦形剤、界面活性剤、分散剤、不活性希釈剤、顆粒化および崩壊剤、結合剤、潤滑剤、甘味料、着香料、着色料、保存剤、ゼラチン等の生理学的に分解性の組成物、水性ビヒクルおよび溶媒、油性ビヒクルおよび溶媒、懸濁化剤、分散もしくは湿潤剤、乳化剤、粘滑剤、緩衝剤、塩、増粘剤、充填剤、乳化剤、抗酸化剤、抗生物剤、抗真菌剤、安定化剤、および製薬上許容可能なポリマー性もしくは疎水性材料。本発明の医薬組成物に含まれ得る他の「追加的成分」は、当分野において公知であり、例えばＧｅｎａｒｏ編， １９８５， Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．， Ｅａｓｔｏｎ， ＰＡ（本明細書中に参照として組み込まれる）に記載されている。
【０１８４】
動物（好ましくはヒト）に投与され得る本発明の化合物の典型的な投薬量は、その動物の体重１キログラムあたり１μｇ〜約１００ｇである。投与される正確な投薬量は、治療される動物の種類および疾患の種類、動物の年齢ならびに投与経路を含む（ただしこれらに限定されない）様々な要因によって異なる。好ましくは、化合物の投薬量は、動物の体重１キログラムあたり約１ｍｇ〜約１０ｇである。より好ましくは、投薬量は、動物の体重１キログラムあたり約１０ｍｇ〜約１ｇである。
【０１８５】
化合物は、１日数回の頻度で頻繁に動物に投与されてもよいし、それより少ない頻度、例えば１日１回、１週間に１回、２週間毎に１回、１ヶ月に１回、またはそれより低い頻度で（例えば数ヶ月に１回、１年に一回、またはそれより少ない頻度で）投与されるものであってもよい。投薬頻度は、当業者には簡単に明らかになろうし、また多数の要因（治療する疾患の種類および重篤度、動物の種類および年齢等があるがこれらに限定されない）によって異なるであろう。
【０１８６】
寄託：特許手続上の微生物寄託の国際的承認に関するブダペスト条約の約定のもとに、２０００年６月１４日にＧｅｒｍａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ （ＤＳＭＺ）に寄託番号ＤＳＭ１３５３０として、ＦＧＦ２３ ＤＮＡを含む核酸の寄託が行われた。
【０１８７】
寄託されたクローンのヌクレオチド配列は、公知方法に従ってこの寄託されたクローンを配列決定することによって簡単に決定することができる。次に、このような寄託物からアミノ酸配列を確かめることができる。さらに、寄託されたクローンによりコードされるタンパク質のアミノ酸配列も、ペプチドの配列決定によって直接、または寄託されたＦＧＦ２３コードＤＮＡを含む好適な宿主細胞中でこのタンパク質を発現させて該タンパク質を回収し、その配列を決定することによって、決定することができる。
【０１８８】
出願人の譲受人であるＡｄｖａｎｃｅｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ａｎｄ ＬＭＵ Ｍｕｎｃｈｅｎは、ＤＳＭＺが、寄託供与の永続性を保証するもの（ｄｅｐｏｓｉｔｏｒｙ ａｆｆｏｒｄｅｄ ｐｅｒｍａｎｅｎｃｅ）であり、特許が与えられれば一般入手可能となる準備ができていると表明している。当該寄託微生物（ｍａｔｅｒｉａｌ）を一般入手可能とするのを制限している全ての制約は、特許が与えられると共に取り除かれる（これは取り消しできない）。当該微生物は、本願の係属中には、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．第１．１４節および３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．第１２２節のもとに委員（Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎｅｒ）により資格を与えると決定された者には簡単に入手可能である。当該寄託微生物（ｍａｔｅｒｉａｌ）は、それを汚染させることなく生存させておくために必要なあらゆる注意を払いつつ、いかなる場合にも寄託の日の後少なくとも３０年間または特許権の存続期間の間のいずれか長い方の期間の間、当該微生物を保管するものとし、当該寄託微生物の試料の分譲に係る請求があった場合には、当該最新の請求を受領した後少なくとも５年間は、当該微生物が保管される。出願人の譲受人は、もしも受託機関が、要請されたときに受託の条件によって試料を分譲することができない場合、再寄託する義務について同意している。
【０１８９】
定義
本明細書で使用される以下の用語の各々は、この節にそれに関して記載される意味を有する。
【０１９０】
本明細書中において、冠詞「ａ」または「ａｎ」は、その冠詞の文法的な目的語のうち１つ以上（すなわち少なくとも１つ）を指す。例として、「ａｎ ｅｌｅｍｅｎｔ」と言った場合、１つ（１種）以上のエレメントを意味する。
【０１９１】
本明細書で使用される「対立遺伝子変異体（ａｌｌｅｌｉｃ ｖａｒｉａｎｔ）」という表現は、所与の遺伝子座に生じるヌクレオチド配列、または該ヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチドを指す。
【０１９２】
本明細書で使用される「アミノ酸」は、そのフルネーム、それに対応する３文字コード、またはそれに対応する１文字コードにより表される（以下の表に記載）。
【０１９３】
フルネーム　　　　　３文字コード　　　１文字コード
アルパラギン酸　　　　Ａｓｐ　　　　　　　Ｄ
グルタミン酸　　　　　Ｇｌｕ　　　　　　　Ｅ
リシン　　　　　　　　Ｌｙｓ　　　　　　　Ｋ
アルギニン　　　　　　Ａｒｇ　　　　　　　Ｒ
ヒスチジン　　　　　　Ｈｉｓ　　　　　　　Ｈ
チロシン　　　　　　　Ｔｙｒ　　　　　　　Ｙ
システイン　　　　　　Ｃｙｓ　　　　　　　Ｃ
アスパラギン　　　　　Ａｓｎ　　　　　　　Ｎ
グルタミン　　　　　　Ｇｌｎ　　　　　　　Ｑ
セリン　　　　　　　　Ｓｅｒ　　　　　　　Ｓ
トレオニン　　　　　　Ｔｈｒ　　　　　　　Ｔ
グリシン　　　　　　　Ｇｌｙ　　　　　　　Ｇ
アラニン　　　　　　　Ａｌａ　　　　　　　Ａ
バリン　　　　　　　　Ｖａｌ　　　　　　　Ｖ
ロイシン　　　　　　　Ｌｅｕ　　　　　　　Ｌ
イソロイシン　　　　　Ｉｌｅ　　　　　　　Ｉ
メチオニン　　　　　　Ｍｅｔ　　　　　　　Ｍ
プロリン　　　　　　　Ｐｒｏ　　　　　　　Ｐ
フェニルアラニン　　　Ｐｈｅ　　　　　　　Ｆ
トリプトファン　　　　Ｔｒｐ　　　　　　　Ｗ
本明細書で用いられる、ＦＧＦ２３によって媒介されるまたはこれに関係する疾患、障害または状態を「緩和」する。
【０１９４】
本明細書で用いられる「抗体」という用語は、抗原上の特定のエピトープに特異的に結合することができる免疫グロブリン分子を指す。抗体は、天然起源または組換え起源に由来する完全な免疫グロブリンであってもよいし、完全な免疫グロブリンの免疫反応性部分であってもよい。抗体は、典型的には、免疫グロブリン分子の４量体である。本発明の抗体は、例えばポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、Ｆｖ、ＦａｂおよびＦ（ａｂ）２、ならびに一本鎖抗体およびヒト化抗体を含む種々の形態で存在し得る（Ｈａｒｌｏｗら， １９９９， Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， ＮＹ； Ｈａｒｌｏｗら， １９８９， Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ； Ｈｏｕｓｔｏｎら， １９８８， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８５： ５８７９−５８８３； Ｂｉｒｄら， １９８８， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３−４２６）。
【０１９５】
本明細書で使用される「合成抗体」という用語は、組換えＤＮＡ技術を用いて作製される抗体（例えば本明細書に記載されるようなバクテリオファージによって発現される抗体）を意味する。またこの用語は、その抗体をコードするＤＮＡ分子（このＤＮＡ分子は抗体タンパク質を発現する）または該抗体特有のアミノ酸配列の合成によって作製された抗体を意味するものと考えるべきである。該ＤＮＡまたはアミノ酸配列は、当技術分野において利用可能且つ周知であるＤＮＡまたはアミノ酸配列合成技術を用いて得られたものである。
【０１９６】
「アンチセンス」は特に、タンパク質をコードする二本鎖ＤＮＡ分子の非コード鎖の核酸配列、または該非コード鎖に実質的に相同な配列を指す。本明細書に定義されるように、アンチセンス配列は、タンパク質をコードする二本鎖ＤＮＡ分子の配列に相補的である。アンチセンス配列は、ＤＮＡ分子のコード鎖のコード部分に完全に相補的である必要はない。アンチセンス配列は、タンパク質をコードするＤＮＡ分子のコード鎖上の特定の調節配列（コード配列の発現を制御する）に相補的であってもよい。
【０１９７】
本明細書で用いられる「アプリケータ」という用語は、皮下注射器、ピペット、ネブライザー等を含む（ただしこれらに限定されない）、本発明の核酸、タンパク質、および／または組成物を哺乳動物に投与するための任意のデバイスを意味する。
【０１９８】
遺伝子の「コード領域」は、その遺伝子のコード鎖のヌクレオチド残基およびその遺伝子の非コード鎖のヌクレオチド（それぞれ、その遺伝子の転写によって生成されるｍＲＮＡ分子のコード領域に相同、および相補的である）からなる。
【０１９９】
またｍＲＮＡ分子の「コード領域」も、そのｍＲＮＡ分子の翻訳中にトランスファーＲＮＡ分子のアンチコドン領域にマッチするｍＲＮＡ分子または停止コドンをコードするｍＲＮＡ分子のヌクレオチド残基からなる。このように、コード領域は、ｍＲＮＡ分子によってコードされる成熟タンパク質中には存在しないアミノ酸残基（例えばタンパク質輸送シグナル配列中のアミノ酸残基等）に対応するヌクレオチド残基を含み得る。
【０２００】
「ＦＧＦ２３をコードする核酸の一部または全てに相補的な」とは、ＦＧＦ２３タンパク質をコードしない核酸配列を意味する。というよりむしろ、ＦＧＦ２３をコードする核酸の非コード鎖と同じであり、従ってＦＧＦ２３タンパク質をコードしない配列である。
【０２０１】
本明細書で用いられる「相補的」および「アンチセンス」という用語は、完全に同意語というわけではない。「アンチセンス」は特に、タンパク質をコードする二本鎖ＤＮＡ分子の非コード鎖の核酸配列、または非コード鎖に実質的に相同な配列を指す。本明細書で用いられる「相補的」とは、２つの核酸（例えば２つのＤＮＡ分子）の間のサブユニット配列相補性の広い概念を指す。これらの分子の両方において、あるヌクレオチド位が、通常互いに塩基対を形成することができるヌクレオチドによって占められている場合、その核酸は、その位置において互いに相補的であるとみなされる。このように、２つの核酸は、これらの分子の各々の中でかなりの数（少なくとも５０％）の対応位置が、通常互いに塩基対を形成するヌクレオチド（例えばＡ：ＴおよびＧ：Ｃヌクレオチド対）によって占められている場合、互いに相補的である。本明細書で定義されるように、アンチセンス配列は、二本鎖ＤＮＡ分子のタンパク質をコードする配列に相補的である。アンチセンス配列は、該ＤＮＡ分子のコード鎖のコード部分に完全に相補的である必要はない。アンチセンス配列は、タンパク質をコードするＤＮＡ分子のコード鎖上の特定の調節配列（コード配列の発現を制御する）に相補的であってもよい。
【０２０２】
「相同な」とは、２つのポリマー分子間（例えば２つのＤＮＡ分子や２つのＲＮＡ分子等の２つの核酸分子間または２つのポリペプチド分子間）のサブユニット配列類似性を指す。２つの分子の両方の中のあるサブユニット位置が、同じモノマーサブユニットにより占められている場合（例えば２つのＤＮＡ分子の各々の中のある位置がアデニンで占められている場合）、これらはその位置において相同である。２つの配列間の相同性が、マッチする即ち相同である位置の数の一次関数である場合、例えば２つの複合配列（ｃｏｍｐｏｕｎｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）中の位置の数の半分（例えば１０サブユニット長のポリマー中の５つの位置）が相同である場合、これら２つの配列は５０％相同であり、これらの位置の９０％（例えば１０個中９個）がマッチする即ち相同である場合、これら２つの配列は９０％相同である。例として、ＤＮＡ配列３’ＡＴＴＧＣＣ５’および３’ＴＡＴＧＣＧ５’は、５０％相同である。
【０２０３】
第１オリゴヌクレオチドと第２オリゴヌクレオチドは、これら２つのオリゴヌクレオチドが少なくとも約６０％、より好ましくは少なくとも約６５％、さらにより好ましくは少なくとも約７０％、さらにより好ましくは少なくとも約８０％、およびさらに好ましくは少なくとも約９０％、またはより好ましくは少なくとも約９５％相補的なオリゴヌクレオチドのみが互いにアニールする条件下でアニールするとき、「高ストリンジェンシー」でアニールするという。２つのオリゴヌクレオチドをアニールさせるために使用される条件のストリンジェンシーは、他の要因の中でも特に、温度、アニーリング培地のイオン強度、インキュベーション時間、オリゴヌクレオチドの長さ、オリゴヌクレオチドのＧＣ含量、および（分かれば）予測される２つのオリゴヌクレオチドの間の非相同性の程度の関数である。アニーリング条件のストリンジェンシーを調節する方法は公知である（例えばＳａｍｂｒｏｏｋら，１９８９ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを参照されたい）。
【０２０４】
２つのヌクレオチド配列間またはアミノ酸配列間の同一性のパーセンテージは、数学的アルゴリズムを用いて決定することができる。例えば、２つの配列を比較するのに有用な数学的アルゴリズムは、ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌのアルゴリズム（１９９０， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ８７： ２２６４−２２６８）をＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌ（１９９３， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９０：５８７３−５８７７）に記載のように修正したものである。このアルゴリズムは、ＡｌｔｓｃｈｕｌらのＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラム（１９９０， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２１５：４０３−４１０）に取り入れられており、例えばＵＲＬ （ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ｒｅｓｏｕｒｃｅ ｌｏｃａｔｏｒ）「ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／」を有するＮａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ （ＮＣＢＩ）ワールドワイドウェブサイトでアクセス可能である。本明細書に記載される核酸に相同なヌクレオチド配列を得るために、ＮＢＬＡＳＴプログラム（ＮＣＢＩウェブサイトで「ｂｌａｓｔｎ」で示される）で、以下のパラメータを用いてＢＬＡＳＴヌクレオチド検索を行うことができる：ギャップペナルティ＝５；ギャップ伸長ペナルティ＝２；ミスマッチペナルティ＝３；一致スコア値（ｍａｔｃｈ ｒｅｗａｒｄ）＝１；期待値＝１０．０；およびワードサイズ＝１１。本明細書に記載されるタンパク質分子に相同なアミノ酸配列を得るために、ＸＢＬＡＳＴプログラム（ＮＣＢＩウェブサイトで「ｂｌａｓｔｎ」で示される）またはＮＣＢＩ「ｂｌａｓｔｐ」プログラムで、以下のパラメータを用いて、ＢＬＡＳＴタンパク質検索を行うことができる：期待値１０．０、ＢＬＯＳＵＭ６２スコアリング行列。
【０２０５】
比較目的でギャップ付きアラインメント（ｇａｐｐｅｄ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ）を得るために、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９７， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２５：３３８９−３４０２）に記載されるようにギャップ付きＢＬＡＳＴ（Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴ）を利用することができる。あるいは、ＰＳＩ−ＢｌａｓｔまたはＰＨＩ−Ｂｌａｓｔを用いて、分子間の位置関係（Ｉｄ．）および共通パターンを共有する分子間の関係を検出する繰返し検索を行うことができる。ＢＬＡＳＴ、キャップ付きＢＬＡＳＴ、ＰＳＩ−Ｂｌａｓｔ、およびＰＨＩ−Ｂｌａｓｔプログラムを利用する場合、それぞれのプログラムのデフォルトパラメータ（例えばＸＢＬＡＳＴおよびＮＢＬＡＳＴ）を用いることができる。ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ．を参照されたい。
【０２０６】
上記に記載した技法に似た技法（ギャップを許容するものまたは許容しないもの）を用いて２つの配列間の同一性のパーセンテージを決定することができる。同一性のパーセンテージを計算する際には、一般的には正確にマッチするものがカウントされる。
【０２０７】
本明細書で使用される「遺伝子」および「組換え遺伝子」という用語は、本発明のポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを含む核酸分子を指す。このような天然対立遺伝子変異体は、典型的には所与の遺伝子のヌクレオチド配列に１〜５％の変化をもたらし得る。他の対立遺伝子は、多くの異なる個体の中の目的の遺伝子の配列決定によって同定することができる。これは、種々の個体の中の同じ遺伝子座を同定するためのハイブリダイゼーションプローブを用いて簡単に行うことができる。天然の対立遺伝子の変異種により生じ且つ機能的活性を変更しないあらゆる全てのこのようなヌクレオチド変化およびそれにより生じるアミノ酸多型もしくは変化は、本発明の範囲内に含まれるものとする。
【０２０８】
「（を）コード（する）」とは、定義されたヌクレオチド配列（すなわちｒＲＮＡ、ｔＲＮＡおよびｍＲＮＡ）または定義されたアミノ酸配列およびそれらに起因する生物学的特性を有する生物学的プロセスにおいて他のポリマーおよび高分子の合成のための鋳型として働くという、ポリヌクレオチド（例えば遺伝子、ｃＤＮＡまたはｍＲＮＡ等）の中の特定のヌクレオチド配列の固有の特性を指す。このように、ある遺伝子に対応するｍＲＮＡの転写および翻訳により細胞または他の生物学的システムの中でタンパク質が生成する場合、その遺伝子はそのタンパク質をコードするという。コード鎖（ｍＲＮＡ配列と同じヌクレオチド配列を持ち、通常配列表に表示される）、および非コード鎖（遺伝子またはｃＤＮＡの転写のための鋳型として用いられる）はいずれも、その遺伝子またはｃＤＮＡのタンパク質または他の産物を「コードする」ということができる。
【０２０９】
特にことわらない限り、「アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列」とは、互いに縮重関係にあり同じアミノ酸配列をコードする全てのヌクレオチド配列を含む。タンパク質およびＲＮＡをコードするヌクレオチド配列はイントロンを含み得る。
【０２１０】
「発現ベクター」とは、発現されるヌクレオチド配列に機能しうる形で連結された発現制御配列を含む組換えポリヌクレオチドを含むベクターを指す。発現ベクターは、発現のための十分なシス（ｃｉｓ）エレメントを含む。発現のための他のエレメントは、宿主細胞またはｉｎ ｖｉｔｒｏ発現系において、供給され得る。発現ベクターは、組換えポリヌクレオチドが組み込まれたコスミド、プラスミド（例えば裸のプラスミドまたはリポソーム中に含まれたプラスミドなど）およびウイルス（例えばレトロウイルス、アデノウイルス、およびアデノ随伴ウイルス）等の当分野で公知である全ての発現ベクターを含む。
【０２１１】
本明細書中で用いられる「断片（またはフラグメント）」という用語は、核酸について用いられる場合、通常は、少なくとも約１０ヌクレオチド長、典型的には少なくとも約２０ヌクレオチド、より典型的には約２０〜約５０ヌクレオチド、好ましくは少なくとも約５０〜約１００ヌクレオチド、さらにより好ましくは少なくとも約１００ヌクレオチド〜約５００ヌクレオチド、さらにもっと好ましくは少なくとも約５００〜約１，０００、および最も好ましくは核酸断片は約１，５００ヌクレオチド長を超えるものであってもよい。
【０２１２】
本明細書中で用いられる「断片（またはフラグメント）」という用語は、ポリペプチドについて用いられる場合、通常は少なくとも約７つの連続するアミノ酸、典型的には少なくとも約１５連続アミノ酸、より典型的には少なくとも約３０連続アミノ酸、典型的には少なくとも約４０連続アミノ酸、好ましくは少なくとも約５０アミノ酸、さらにより好ましくは少なくとも約６０アミノ酸、および最も好ましくは、ペプチド断片は約７０連続アミノ酸長を超えるものであってもよい。
【０２１３】
本明細書中で用いられる「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」という用語は、互いに少なくとも６０％（６５％、７０％、好ましくは７５％）同一であるヌクレオチド配列が典型的に互いにハイブリダイズされたままとなるハイブリダイゼーション条件および洗浄条件を述べるものとする。このようなストリンジェントな条件は、当業者に公知であり、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， ａｔ ６．３．１−６．３．６， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｎ．Ｙ． （１９８９）に記載されている。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の例としては、約４５℃にて６×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）中でハイブリダイゼーションした後、５０〜６５℃にて０．２×ＳＳＣ， ０．１％ ＳＤＳ中で１回以上洗浄するものがある。好ましくは、ストリンジェントな条件下で、配列番号１もしくは配列番号３またはそれらの相補体のいずれかの配列にハイブリダイズする本発明の単離核酸分子は、天然に生じる核酸分子に対応する。本明細書中で用いられる「天然に存在する」核酸分子とは、自然に生じる（例えば天然のタンパク質をコードする）ヌクレオチド配列を有するＲＮＡまたはＤＮＡ分子を指す。
【０２１４】
「ゲノムＤＮＡ」とは、遺伝子と相同なヌクレオチド配列を有するＤＮＡ鎖である。例として、染色体の断片および哺乳動物ｍＲＮＡの逆転写により得られるｃＤＮＡはいずれもゲノムＤＮＡである。
【０２１５】
本明細書中で用いられる「相同性」とは、「同一性」と同義で用いられる。
【０２１６】
さらに、「相同性」という用語が本明細書中で核酸およびタンパク質について用いられる場合、核酸レベルおよびアミノ酸レベルの両方における相同性に適用されるものと考えるべきである。
【０２１７】
本明細書中で用いられる「取扱説明書（ｉｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｍａｔｅｒｉａｌ）」とは、出版物、記録、図、またはその指定された用途のための本発明の組成物の有用性を伝えるために用いることができる他のあらゆる表現媒体を含む。本発明のキットの取扱説明書は、例えば、組成物を含む容器に添付されてもよいし、または組成物を含む容器と一緒に出荷されてもよい。あるいは取扱説明書は、その取扱説明書と組成物が受容者にともに用いられることを意図しつつ容器とは別に出荷されてもよい。
【０２１８】
「単離核酸」とは、天然に存在する状態においてその核酸の両側にある配列から単離された核酸セグメントもしくは断片、例えば通常はその断片に隣接している配列（例えばそれが天然に生じるゲノムの中でその断片に隣接する配列）から取り除かれたＤＮＡ断片を指す。またこの用語は、天然にその核酸に付着している他の成分（例えばＲＮＡもしくはＤＮＡ）または細胞の中で天然にその核酸に付着しているタンパク質から実質的に精製された核酸に適用される。したがってこの用語は、例えばベクター中、自律複製プラスミドもしくはウイルスまたは原核生物もしくは真核生物のゲノムＤＮＡ中に挿入される組換えＤＮＡ、あるいは別個の分子として存在する組換えＤＮＡ（例えば、ｃＤＮＡまたはＰＣＲもしくは制限酵素消化によって生成されるゲノムもしくはｃＤＮＡ断片）であって、他の配列から独立したものを含む。またこの用語は、付加的ポリペプチド配列をコードするハイブリッド遺伝子の一部である組換えＤＮＡを含む。
【０２１９】
本発明の文脈において、一般に生じる核酸塩基を表す以下の省略形が用いられる。「Ａ」はアデノシンを指し、「Ｃ」はシチジンを指し、「Ｇ」はグアノシンを指し、「Ｔ」はチミジンを指し、および「Ｕ」はウリジンを指す。
【０２２０】
本発明のペプチド（またはこれをコードするＤＮＡ）の「誘導体」および「変異体」は、そのペプチド（またはＤＮＡ）が本明細書中に記載される配列と同一でなく且つ本明細書中に開示されるペプチドと同じ特性を有する（つまりそのペプチドがＦＧＦ２３の生物学的活性を有する）ように、１つ以上のアミノ酸（または１つ以上の塩基対）が変更されていてもよいペプチドである。
【０２２１】
「ＦＧＦ２３をコードする核酸中の突然変異」という用語は、そのタンパク質の構造または機能を変更するしないにかかわらず、その核酸配列中の任意の塩基対変更を意味する。幾つかの突然変異（Ｒ１７６Ｑ、Ｒ１７９Ｑ、Ｒ１７９Ｗおよびこれら２つのアルギニンのうちのいずれかにおける他の突然変異を含むがこれらに限定されない）は、タンパク質の安定性に影響を及ぼし、従って血液中における半減期または他の生物学的作用に影響を及ぼし得る。
【０２２２】
２つのポリヌクレオチドが「機能しうる形で連結された」というとき、ある一本鎖もしくは二本鎖核酸成分が、これら２つポリヌクレオチドのうち少なくとも一方のポリヌクレオチドがその特徴的な生理学的作用を他方に対して発揮することができるようにその核酸成分の中に配置されたこれら２つのポリヌクレオチドを含むことを意味する。例として、遺伝子のコード領域に機能しうる形で連結されたプロモーターは、コード領域の転写を促進することができる。
【０２２３】
好ましくは、所望のタンパク質をコードする核酸は、プロモーター／調節配列をさらに含み、このプロモーター／調節配列は、細胞内で所望のタンパク質の発現を駆動するように、所望タンパク質コード配列の５’側末端に位置する。
【０２２４】
本明細書中で用いられる「プロモーター／調節配列」という用語は、そのプロモーター／調節配列に機能しうる形で連結された遺伝子産物の発現に必要な核酸配列を意味する。場合によっては、この配列はコアプロモーター配列であり得、また、この配列は、遺伝子産物の発現に必要なエンハンサー配列および他の調節エレメントも含み得る場合もある。このプロモーター／調節配列は、例えば組織特異的に遺伝子産物を発現するものであってもよい。
【０２２５】
「恒常性」プロモーターは、遺伝子産物をコードもしくは指定するポリヌクレオチドに機能しうる形で連結されているときに、細胞内でその細胞の殆どまたは全ての生理学的条件下において遺伝子産物の生成を引き起こす、ヌクレオチド配列である。
【０２２６】
「誘導性」プロモーターは、遺伝子産物をコードもしくは指定するポリヌクレオチドに機能しうる形で連結されているときに、実質的に、そのプロモーターに対応する誘導物質が細胞内に存在するときのみ、その細胞内で遺伝子産物の生成を引き起こす、ヌクレオチド配列である。
【０２２７】
「組織特異的」プロモーターは、遺伝子産物をコードもしくは指定するポリヌクレオチドに機能しうる形で連結されているときに、実質的に、細胞がそのプロモーターに対応する組織型の細胞であるときのみ、その細胞内で遺伝子産物の生成を引き起こす、ヌクレオチド配列である。
【０２２８】
本明細書中で用いられる「核酸の発現」という用語は、その核酸によってコードされるタンパク質産物の合成を意味する。
【０２２９】
「（を）コードするＤＮＡ」という用語を用いる場合は、所望のタンパク質をコードするＤＮＡ配列および実際のコード配列に付随する必要な５’側または３’側の非翻訳領域を含むものと考えるべきである。
【０２３０】
本明細書中で用いられる「５’側末端に位置する」という用語は、そのプロモーター／調節配列が、発現調節の対象となる核酸の５’側末端に、その核酸の転写の５’側開始部位にその発現を駆動するのに十分近い位置で共有結合されていることを意味する。
【０２３１】
ヌクレオチドが新生短鎖ＲＮＡ転写体に５’側から３’側へと付加される方向は、転写方向と呼ばれる。ｍＲＮＡと同じ配列を有するＤＮＡ鎖は、「コード鎖」と呼ばれ、そのＤＮＡ上の基準点の５’側に位置するＤＮＡ鎖上の配列は、「上流配列」と呼ばれ、そのＤＮＡ上の基準点の３’側に位置するＤＮＡ鎖上の配列は、「下流配列」と呼ばれる。
【０２３２】
「ポリアデニル化配列」は、転写されたメッセンジャーＲＮＡ配列上へのポリＡテールの付加を指令するポリヌクレオチド配列である。
【０２３３】
「ポリヌクレオチド」とは、核酸の一本鎖もしくは平行および逆平行鎖を意味する。このように、ポリヌクレオチドは、一本鎖核酸であっても二本鎖核酸であってもよい。
【０２３４】
「核酸」という用語は、一般には大きなポリヌクレオチドを指す。
【０２３５】
「オリゴヌクレオチド」という用語は、典型的には、短いポリヌクレオチド（一般には約５０ヌクレオチド以下）を指す。ヌクレオチド配列がＤＮＡ配列（すなわちＡ、Ｔ、Ｇ、Ｃ）で表されるとき、これは「Ｔ」が「Ｕ」に置き換わったＲＮＡ配列（すなわちＡ、Ｕ、Ｇ、Ｃ）も含むことを理解されたい。
【０２３６】
本明細書中では、ポリヌクレオチド配列を表すために、通常の表記法が用いられる。一本鎖ポリヌクレオチド配列の左側端部は５’側末端であり、二本鎖ポリヌクレオチド配列の左手方向は、５’側方向と呼ばれる。
【０２３７】
「プライマー」は、指定されたポリヌクレオチド鋳型に特異的にハイブリダイズして相補的ポリヌクレオチドの合成開始地点を提供することができるポリヌクレオチドを指す。このような合成は、ポリヌクレオチドプライマーが、合成が誘導される条件下（すなわちヌクレオチド、相補的なポリヌクレオチド鋳型、およびＤＮＡポリメラーゼ等の重合試薬の存在下）に置かれたときに生じる。プライマーは、典型的には一本鎖であるが、二本鎖であってもよい。プライマーは、典型的にはデオキシリボ核酸であるが、種々の合成プライマーおよび天然に存在するプライマーが多くの用途で有用である。プライマーは、合成開始部位として機能するために鋳型に対して相補的で、鋳型にハイブリダイズするように設計されているが、その鋳型の正確な配列を反映する必要はない。このような場合、鋳型へのプライマーの特異的ハイブリダイゼーションは、ハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーに依存する。プライマーは、例えば色素成分、放射性成分、または蛍光成分などで標識して、検出可能成分として用いることができる。
【０２３８】
「プローブ」とは、他のポリヌクレオチドの指定された配列に特異的にハイブリダイズすることができるポリペプチドを指す。プローブは、標的の相補的ポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズするが、その鋳型の正確な相補的配列を反映する必要はない。このような場合、標的へのプローブの特異的ハイブリダイゼーションは、ハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーに依存する。プローブは、例えば色素成分、放射性成分、または蛍光成分等で標識し、検出可能成分として用いることができる。
【０２３９】
「組換えポリヌクレオチド」とは、天然では互いに結合されない複数の配列を有するポリヌクレオチドを指す。増幅されたまたはアセンブルされた組換えポリヌクレオチドは、好適なベクターの中に含まれていても良く、このベクターは、適切な宿主細胞を形質転換するために用いることができる。
【０２４０】
組換えポリヌクレオチドは、非コード鎖の機能（例えばプロモーター、複製起点、リボソーム結合部位等）も果たす。
【０２４１】
「組換えポリペプチド」は、組換えポリヌクレオチドの発現で生成されるものである。
【０２４２】
本明細書中で用いられる「レポーター遺伝子」という用語は、公知の方法を用いてその発現を検出することができる遺伝子を意味する。例として、大腸菌ｌａｃＺ遺伝子は、培地に色素原物質である基質ｏ−ニトロフェニル−β−ガラクトシダーゼを加えることにより公知方法によって該ｌａｃＺ遺伝子の発現を検出することができるため、培地中でレポーター遺伝子として用いることができるので、培地中でレポーター遺伝子として用いることができる（Ｇｅｒｈａｒｄｔら編， １９９４， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅｒａｌ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ， Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ， Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ， ＤＣ， ｐ．５７４）。
【０２４３】
「ポリペプチド」とは、アミノ酸残基からなるポリマー、それに関連する天然に存在する構造変異体、およびその人工的に生じた合成類似体がペプチド結合により結合されたもの、関連する天然に存在する構造変異体、ならびにその人工的に生じた合成類似体を指す。合成ポリペプチドは、例えば自動ポリペプチド合成装置を用いて合成することができる。
【０２４４】
「タンパク質」という用語は、典型的には大きなポリペプチドを指す。
【０２４５】
「ペプチド」という用語は、典型的には短いポリペプチドを指す。
【０２４６】
本明細書では、ポリペプチド配列を表すために、通常の表記法が用いられる：ポリペプチド配列の左側端部はアミノ末端であり、ポリペプチド配列の右側端部はカルボキシ末端である。
【０２４７】
「制限部位」は、制限エンドヌクレアーゼにより認識される二本鎖核酸の一部である。
【０２４８】
二本鎖核酸をある制限エンドヌクレアーゼと接触させたときに二本鎖核酸のある位置でそのエンドヌクレアーゼがその核酸の両鎖を切断することができるとき、その二本鎖核酸の部分が、その制限エンドヌクレアーゼによって「認識」されるという。
【０２４９】
本明細書中に用いられる「特異的に結合する」という用語は、サンプル中において、特定の分子を認識しこれに結合するが他の分子を実質的に認識もしくは結合しない化合物（例えばタンパク質、核酸および抗体等）を意味する。
【０２５０】
少なくとも約６０％、好ましくは少なくとも約６５％、より好ましくは少なくとも約７０％、さらにより好ましくは少なくとも約７５％、および好ましくは少なくとも約９０％または少なくとも約９５％相補的であるオリゴヌクレオチドのみが互いにアニールする条件下において、２つのオリゴヌクレオチドがアニールすれば、第１オリゴヌクレオチドは、「高いストリンジェンシーで」第２オリゴヌクレオチドにアニールする、という。２つのオリゴヌクレオチドをアニールさせるために用いられる条件のストリンジェンシーは、温度、アニール培地のイオン強度、インキュベーション時間、オリゴヌクレオチドの長さ、そのオリゴヌクレオチドのＧＣ含量、および（分かれば）２つのオリゴヌクレオチド間の非相同性の推定度合の関数などである。アニーリング条件のストリンジェンシーの調節方法は、公知である（例えばＳａｍｂｒｏｏｋら， １９８９， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを参照されたい）。
【０２５１】
本明細書中で用いられる「実質的に純粋な」という用語は、天然において付着している成分から分離された化合物（例えば核酸、タンパク質またはポリペプチド）を指す。典型的には、サンプル中の物質全体のうちの少なくとも約１０％、好ましくは少なくとも約２０％、より好ましくは少なくとも約５０％、さらにより好ましくは少なくとも約７５％、さらにより好ましくは少なくとも約９０％、および最も好ましくは少なくとも約９９％（体積％、湿量もしくは乾量％、またはモル％もしくはモル分率）が目的の化合物である場合、その化合物は実質的に純粋である。純度は、任意の適当な方法によって（例えばカラムクロマトグラフィー、ゲル電気泳動またはＨＰＬＣ分析によって）測定することができる。
【０２５２】
また、化合物（例えば核酸、タンパク質またはポリペプチド）は、その化合物が天然に会合している成分を本質的に含まないとき、または天然の状態では化合物に付着している天然の混在物からその化合物が分離されるとき、「実質的に精製されている」という。このように、本明細書中で用いられる核酸の「実質的に純粋な」調製物は、天然に存在する状態においてその両側にある配列から精製された核酸配列（例えばＤＮＡ断片であって、その断片が天然に存在するゲノム中において通常その断片に隣接している配列から取り出されたもの）を指す。
【０２５３】
同様に、本明細書中において用いられるタンパク質またはポリペプチドの「実質的に純粋な」調製物は、それが天然に存在する状態において通常会合している成分から精製されたタンパク質またはポリペプチドを指す。実質的に純粋なペプチドは、以下の公知のタンパク質精製手法（この手法における各段階では精製をモニターするために免疫アッセイ、酵素アッセイまたは他のアッセイが用いられる）によって精製することができる。タンパク質精製法は、当分野において周知であり、例えばＤｅｕｔｓｃｈｅｒら（１９９０， Ｉｎ： Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ， Ｈａｒｃｏｕｒｔ Ｂｒａｃｅ Ｊｏｖａｎｏｖｉｃｈ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ）に記載されている。
【０２５４】
「タグ」ポリペプチドとは、ペプチド結合により目的のタンパク質に結合させて、そのタンパク質の局在化、細胞抽出物からのタンパク質の精製、結合アッセイで使用するタンパク質の固定化、またはタンパク質の生物学的特性および／または機能の研究に用いることができる任意のタンパク質を意味する。「タグ」エピトープを含むキメラ（すなわち融合）タンパク質は、そのタグに結合する樹脂に固定化することができる。このようなタグエピトープおよびこれらに特異的に結合する樹脂は、当分野において周知であり、例えば複数の連続ヒスチジン残基（Ｈｉｓ６）を含むタグエピトープ（ニッケル−ニトリロ３酢酸−アガロース上にこのようなエピトープを含むキメラタンパク質の単離を可能とする）、赤血球凝集素（ＨＡ）タグエピトープ（このようなエピトープを含むキメラタンパク質を抗−ＨＡ−モノクローナル抗体アフィニティー基質に結合させる）、ｍｙｃ−タグエピトープ（このようなエピトープを含むキメラタンパク質を抗−ｍｙｃ−モノクローナル抗体アフィニティー基質に結合させる）、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ−タグエピトープおよびマルトース結合性タンパク質（ＭＢＰ）タグエピトープ（それぞれこのようなエピトープを含むタンパク質とグルタチオン−もしくはマルトース−セファロースカラムとの結合を誘導することができる）が挙げられる。このようなタグエピトープを含むタンパク質の生成は当分野において周知であり、基本的な論文、例えばＳａｍｂｒｏｏｋら， １９８９およびＡｕｓｕｂｅｌら（前掲）に記載されている。同様に、タグエピトープに対する抗体（例えば抗−ＨＡ、抗−ｍｙｃ抗体９Ｅ１０など）は、例えばウェスタンブロット、ＥＬＩＳＡアッセイ、および細胞の免疫染色において、融合タンパク質の検出および局在化を可能とする。
【０２５５】
本明細書中で用いられる「治療」という用語は、患者が症状を経験する頻度を少なくすることを意味する。
【０２５６】
本明細書中で用いられる「ＦＧＦ２３のインヒビター」という用語は、ＦＧＦ２３タンパク質分子またはこれらの生物学的活性を低下させるまたは消失させる働きをする任意の分子として定義される。このようなインヒビターは、アンチセンス核酸もしくはリボザイム、ＦＧＦ２３とその受容体との相互作用を遮断する分子、またはＦＧＦ２３受容体の活性化を阻害する分子であってもよい。具体的な例は上記に記載してある。
【０２５７】
本明細書で使用される「ベクター」という用語は、外来の核酸をコードするプラスミドまたはウイルスを意味する。またこの用語は、ビリオンまたは細胞に核酸を輸送し易くする非プラスミドおよび非ウイルス性化合物（例えばポリリシン化合物等）を含むものと考えるべきである。ベクターは、所望のタンパク質をコードする核酸もしくはその変異体を細胞に送達するための送達ビヒクルとして適したウイルスベクターであってもよいし、またはこれと同じ目的に適した非ウイルスベクターであってもよい。ＤＮＡを細胞および組織に送達するためのウイルスベクターおよび非ウイルスベクターの例は当分野において周知であり、例えばＭａら（１９９７， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ９４：１２７４４−１２７４６）に記載されている。ウイルスベクターの例としては、組換えワクチンウイルス、組換えアデノウイルス、組換えレトロウイルス、組換えアデノ随伴ウイルス、組換えトリポックスウイルス等（Ｃｒａｎａｇｅら， １９８６， ＥＭＢＯ Ｊ． ５：３０５７−３０６３；１９９４年８月１８日に公開された国際特許出願公開番号第ＷＯ９４／１７８１０号；１９９４年１０月２７日に公開された国際特許出願公開番号第ＷＯ９４／２３７４４号）が挙げられるが、これらに限定されない。非ウイルスベクターの例としては、リポソームやＤＮＡのポリアミン誘導体等が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２５８】
本発明を、以下の実施例を参照してさらに詳細に記載する。これらの実施例は例示目的のためのみに提供されるのであって、特に明記しない限りは限定的なものではない。このように、本発明は、以下の実施例に限定されるものと考えるべきではなく、むしろ、本明細書中に提供される教示から自明となるあらゆる全てのバリエーションを包含するものと考えるべきである。
【０２５９】
実施例１：ＡＤＨＲファミリーの連鎖および突然変異分析
この実施例のデータは、新規遺伝子ＦＧＦ２３の発見を示す。また以下に示すのは、ＡＤＨＲが第１２番染色の１２ｐ１３．３の短いアームにマッピングされ、ＦＧＦ２３がこの領域にマッピングされ、およびＦＧＦ２３がＡＤＨＲに罹患した個体において突然変異を起こしている、という発見である。
【０２６０】
この実施例において提供される実験で用いられる材料および方法について以下に記載する。
【０２６１】
系図分析
イギリス人（ファミリー２３１８）、ドイツ人（ファミリー３２９）およびアメリカ人（ファミリー１４０６および１４７８）起源のファミリー系図を分析した。ＡＤＨＲ＋ファミリー１４０６、１４７８および２３１８については以前に記載されている（Ｅｃｏｎｓら， １９９２， Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ． Ｍｅｔａｂ． ８２：６７４−６８１； Ｂａｉｎｃｈｉｎｅら， １９７１， Ｂｉｒｔｈ Ｄｅｆｅｃｔｓ Ｏｒｉｇ． Ａｒｉｃ． Ｓｅｒ． ７：２８７−２９５； Ｒｏｗｅら， １９９２， Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅｔ． ８９：５３９−５４２）。この研究は、ｔｈｅ Ｉｎｄｉａｎａ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅおよびｔｈｅ Ｌｕｄｗｉｇ−Ｍａｘｉｍｉｌｉａｎｓ−Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔａｔ Ｆａｃｕｌｔｙ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ｒｅｖｉｅｗ Ｂｏａｒｄｓによって承認されており、全ての患者は参加前に告知に基づいて同意している。
【０２６２】
突然変異のスクリーニング
患者のＤＮＡを以下のように評価した。イントロンプライマーを用いてエキソンを増幅し（表２）、増幅断片を直接的な配列決定またはＳＳＣＰによって分析した。ＳＳＣＰは、標準的なポリアクリルアミドまたはＳｅｒｄｏｇｅｌ ＳＳＣＰ ２ｘ（Ｓｅｒｖａ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ＧｍｂＨ，ドイツ国ハイデルベルグ）を用いて２０℃にてグリセロール有りまたは無しで行った。Ｔｔ４ｃｓｌｉｓｔｒａＧｒｅｅｎで染色してＦｌｕｏｒｌｍａｇｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ， カリフォルニア州サニーヴェール）で検出することにより、または［３２Ｐ］ｄＣＴＰの存在下でエキソンをＰＣＲ増幅した後にオートラジオグラフィーを行うことにより、サンプルを可視化した。変異体のバンドを、配列決定のために再び増幅した。Ｔａｑ ＤｙｅＤｅｏｘｙ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ配列決定キット（ＡＢＩ）を用いて、またはシークエナーゼ・キット（ＵＳＢ）および［３３Ｐ］ジデオキシヌクレオチドの取込みを用いて、センスプライマーおよびアンチセンスプライマーの両方を用いて直接配列決定した。突然変異分析は、雄性間で遺伝する（ｍａｌｅ ｔｏ ｍａｌｅ ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ）ＡＤＨＲに相当する臨床的特徴を有する４つのファミリー１４０６、１４７８、２３１８および３２９のインデックス患者から得たＤＮＡ、ならびにＰＨＥＸ遺伝子の突然変異について陰性である低リン酸血症性くる病患者１８人から得たＤＮＡを用いて行った。さらに、低リン酸血症、大頭蓋顔面異常（ｍａｊｏｒ ｃｒａｎｉｏｆａｃｉａｌ ａｂｎｏｒｍａｌｉｔｙ）、短上肢症および短下肢症（ｓｈｏｒｔ ｕｐｐｅｒ ａｎｄ ｌｏｗｅｒ ｅｘｔｒｅｍｉｔｉｅｓ）（Ｃａｂｒａｌら， ８０ｔｈ Ａｎｎｕａｌ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ Ｓｏｃｉｅｔｙ Ｍｅｅｔｉｎｇ １９９８）を有するファミリー、ならびに雄性間で遺伝するＨＢＤを有するファミリーについて分析した。
【０２６３】
ＲＴ−ＰＣＲ／ＲＡＣＥ
ＲＴ−ＰＣＲは、１〜２ ｎｇのヒトもしくはマウスＦＧＦ２３ ｃＤＮＡ（図５または図６）を鋳型として用いて行った。ＲＡＣＥは、マラソンｃＤＮＡ増幅キット（ＣｌｏｎＴｅｃｈ Ｉｎｃ． Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ， ＣＡ）を用いて行った。推定ｃＤＮＡ配列から設計したプライマーを０．２〜３．５ｋｂ産物の増幅に使用した（表２）。これらのプライマーは必要に応じて入手することができる。Ｂｏｎａｖｅｎｔｕｒｅら， １９９４， Ｅｘｐ． Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ ２１２：９７−１０４によって記載されているように、ヒト胎児軟骨細胞培養物を調製し、ＣＯＬ２Ａ１の発現について調べた。
【０２６４】
この実施例で示された結果についてこれから記載する。
【０２６５】
大きなＡＤＨＲ系図（ファミリー１４０６）において連鎖解析を行ったところ、染色体１２ｐ１３．３上のマーカーＤ１２Ｓ１００とＤ１２Ｓ３９７との間にある１８ｃＭの間隔について大きなＬＯＤスコアが得られた。マーカーＤ１２Ｓ１６２４についての２ポイントＬＯＤスコアは７．６８であった。第２の小さい方のＡＤＨＲ血縁ファミリー１４７８は、Ｄ１２Ｓ１６２４におけるＬＯＤスコアが１．１であった。このファミリーの疾患遺伝子座は同じインターバルにリンクしていると仮定して、これら２つのファミリーにおける単一の組換え事象についてスクリーニングし、この疾患遺伝子座をマーカーＤ１２Ｓ１６８５とＳ１２Ｓ１５９４の間の１．５ＭＢ領域にマッピングした（図２）。ファミリー１４０６において、個体１３０６および０１４２は、Ｄ１２Ｓ１６８５に近位組換え事象を、Ｄ１２Ｓ３９７に遠位組換え事象を有していた。ファミリー１４７８は、個体００１および０１００においてそれぞれＤ１２Ｓ１０５０およびＤ１２Ｓ１５９４に組換えを示した（図１Ａ）。
【０２６６】
１２ｐ１３．３からのゲノム配列は、ヒトゲノム研究プロジェクトから入手可能である。Ｄ１２Ｓ６８５とＤ１２Ｓ１６２３との間の配列決定済み配列または配列決定が終っていない配列をみると、この領域の中に３７個の遺伝子があることが分かった。そのうち１３個は新規遺伝子である。これら新規遺伝子の完全なコード配列を、ＩＭＡＧＥクローンのＲＴ−ＰＣＲ、ＲＡＣＥおよび／または配列決定によって取得した。
【０２６７】
上記連鎖解析に基づいて、Ｄ１２Ｓ１６８５とＤ１２Ｓ１５９４との間の１．５ＭＢ領域に絞って突然変異をスクリーニングした。この領域は、７個の既知遺伝子、４個の新規遺伝子および１個の遺伝子断片を含む（表１）。以下の遺伝子を、エキソン−イントロン境界に基づくプライマーを用いてエキソンを増幅することにより、突然変異についてスクリーニングした：（ｉ）ＭＩＢＯＯ３（ＡＪ２７２２０６）；（ｉｉ）ＤＹＲＫ４プロテインキナーゼ（ＡＦ２６３５４１）；（ｉｉｉ）プロテインキナーゼＡ結合タンパク質ＡＫＡＰ１１Ｏ（ＡＦ０９３４０８）；（ｉｖ）ＧａｌＮＡｃ−Ｔ８（ＡＪ２７１３８５）９。さらに、この領域の外側の幾つかの遺伝子を候補として考慮した。これらのうち２つの増殖分化因子３（ｇｒｏｗｔｈ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ３）（ＧＤＦ３、ＡＦ２６３５３８）、ならびに新規Ｇタンパク質共益型受容体（ＧＰＣＲ４６、ＡＪ２７２２０７）を調査した。変異は少ししか検出されず、対照の対立遺伝子を配列決定したところ、これら全てが多型であることが分かった（表１）。
【０２６８】
2004504063.tif 000002
この領域に由来する新規線維芽細胞増殖因子ファミリーのメンバーであるＦＧＦ２３についても調べた。上記ＡＤＨＲファミリーに由来するＦＧＦ２３エキソンを直接配列決定したところ、３アミノ酸残基離れた２つのアルギニンに影響を及ぼす３つのミスセンス変化があることが分かった。ファミリー１４０６および１４７８は、ＡｃｉＩ部位を破壊する同じ変異Ｒ１７６Ｑ（５２７＞Ａ）を共有していた。アガロースゲル電気泳動で分析したところ、対照のＰＣＲ産物は１１２ｂｐ、４９ｂｐおよび３３ｂｐの断片へと消化されていたが、突然変異型対立遺伝子では、１１２ｂｐおよび８２ｂｐ断片のみが生されていた。ファミリー２３１８において、突然変異型ＦＧＦ２３の中に新しいＢｍｐＩ部位を作製するＲ１７９Ｗ（５３５Ｃ＞Ｔ）の変化が見られた。ＲＦＬＰ分析により、正常な対立遺伝子からのＰＣＲ産物は消化されずに１９４ｂｐ産物として原型のまま残るが、突然変異型対立遺伝子は１ヶ所で切断されて１１８ｂｐおよび８７ｂｐ断片となることが分かった（図１Ｂ）。ファミリー３２９においては、変異型ＦＧＦ２３において制限部位の生成・破壊を生じないＲ１７９Ｑ（５３６Ｇ＞Ａ）の変化が見られた。さらに、エキソン３中に多型が存在していた（７１６／Ｔ（２３９／Ｍ））。２１４個の対立遺伝子のうち１８２個の中にトレオニンが見られ、２１４個の対立遺伝子のうち２２個の中にメチオニンが見られた。全コード領域および開始コドンの上流にある領域（４５０ｂｐ）の配列決定を行ったところ、ＨＢＤを有するファミリー、低リン酸血症および多発性先天性異常（ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｃｏｎｇｅｎｉｔａｌ ａｂｎｏｒｍａｌｉｔｙ）を有するファミリー、ならびにＸＬＨを有する１８人の患者において突然変異は見られなかった。ミスセンス変異は各ファミリーにおける疾患で相違し、２１４個の配列決定された対照遺伝子の中には見られない。さらに、ファミリー１４０６および１４７８における突然変異ならびにファミリー２３１８における突然変異はそれぞれ、８００個および７５２個の対照対立遺伝子におけるＲＦＬＰ分析から除外された（図１Ｂ）。同じＦＧＦ２３突然変異を有する家系１４０６と１４７８は、別々の地域出身であり、血縁があるとは考えられない。これを支持するものとして、これら２つのファミリーはＤ１２Ｓ１６２４およびＤ１２Ｓ１７２５（これらの遺伝子座はこの突然変異型遺伝子からそれぞれ２００ｋｂおよび７０ｋｂしか離れていない）に異なる対立遺伝子を有する。上記をまとめると、ＦＧＦ２３突然変異Ｒ１７６Ｑ、Ｒ１７９ＱおよびＲ１７９ＷはＡＤＨＲの原因となることが明らかである。
【０２６９】
ＦＧＦ２３はヒトゲノムの中のＦＧＦ６の５４ｋｂ末端側（ｔｅｌｏｍｅｒｉｃ）にあり、ゲノム配列のおよそ１０ｋｂにまたがる３つのエキソンから構成される。得られた中で最も長いＦＧＦ２３ＲＴ−ＰＣＲ産物は１６１２ｂｐであり、２５１個のアミノ酸からなる推定オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含む。５’−ＵＴＲは１４６ｂｐからなり、推定開始部位の上流にあるインフレーム停止コドンを持たない。３’−ＵＴＲは７１０ｂｐからなり、停止コドンの８３１ｂｐ（推定）下流にポリアデニル化シグナルを持つ。ヒトおよびマウスＦＧＦ２３は、ＰＦＡＭデータベースのＦＧＦプロフィールによって同定された（４．６ｅ−１４， １．９ｅ−１６）。ＣＬＵＳＴＡＬおよびＰＲＥＴＴＹＢＯＸを用いて、ＦＧＦ２３とＦＧＦファミリーの他のメンバーとの間で、アミノ酸配列アラインメントを作製した（図３Ａ〜３Ｃ）。これらは、共通コア配列の中のＦＧＦファミリーの他のメンバーと２５％〜３６％のアミノ酸同一性を有する。ツリー解析は、ＦＧＦ２３がＦＧＦ２１に最も近い関係にあることを示す。ＦＧＦ２３が２５１個のアミノ酸を有するという事実を考えると、今のところ、ＦＧＦ２３は、そのタンパク質のＣ末端部分が大きいことを特徴とする最も大きなＦＧＦである。シグナルＰを用いて分析を行ったところ、ＦＧＦ２３がシグナルペプチドを含み、このペプチドの切断は第２４位のアラニン残基と第２５位のチロシン残基との間で起こる可能性が最も高いことが示された。
【０２７０】
マウス第６番染色体に由来するＢＡＣを、ヒト染色体１２ｐ１３．３に相同な領域内で配列決定した。これらのＢＡＣのうちの１つ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＣＯ１５５３８）は、ＦＧＦ２３のマウス相同体を含んでいた。対応する領域から得たプライマーを用いて、１７日目のマウス胚ｃＤＮＡからＦＧＦ２３を増幅した。このマウスｃＤＮＡは、ヒトタンパク質と同じ長さの推定ＯＲＦを有し、ヌクレオチドレベルで７３％の同一性、およびアミノ酸レベルで７０％の同一性を有している。さらに、ドットプロット解析により、開始コドンの５００ｂｐ上流にあるマウス配列とヒト配列との間に実質的に保存された配列があることが示された。
【０２７１】
実施例２：ＦＧＦ２３の発現
この実施例のデータは、ヒト組織および癌細胞系におけるＦＧＦ２３の発現を示す。また、この実施例では、ＦＧＦ２３に特異的な抗体の作製、ならびに細菌および哺乳動物細胞の中で生成されるＦＧＦ２３を検出するためのその使用を示す。この実施例で提供されるデータはさらに、ＦＧＦ２３が分泌タンパク質であること、およびＦＧＦ２３が腫瘍形成性低リン酸血症性骨軟化症（ＯＨＯ）腫瘍において豊富に発現されることを示す。
【０２７２】
この実施例において提供される実験で用いられる材料および方法について以下に記載する。
【０２７３】
ノーザンブロット分析
各組織から得た２μｇのポリＡ＋−ＲＮＡを含む多数の組織ノーザンブロット（ＣｌｏｎＴｅｃｈ Ｉｎｃ． Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ， ＣＡ）を、ハイブリダイゼーション緩衝液（２７０ ｍＭ ＮａＣｌ， １５ ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、１５ ｍＭ ＥＤＴＡ、１％ ＳＤＳ、１０％ 硫酸デキストラン、０．５％ 脱脂粉乳）中の全長ＦＧＦ２３（図５Ａまたは６Ａ）プローブと一緒に、６０℃の０．０１ Ｘ ＳＳＣで洗浄しながら６５℃にてインキュベートした。
【０２７４】
細菌によるＦＧＦ２３の産生
Ｐｆｕポリメラーゼ（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ， Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ， ＭＤ）を用いて、ヒト心臓から得たＲＮＡ（ＣｌｏｎＴｅｃｈ Ｉｎｃ． Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ， ＣＡ）をＰＣＲ増幅することにより、ヒトＦＧＦ２３ｃＤＮＡを生成した。Ｔｙｐｅ ＩＶ Ｑｉａｅｘｐｒｅｓｓ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ， Ｉｎｃ．， Ｖａｌｅｎｃｉａ， ＣＡ）を用いて、第７番〜第７５６番ヌクレオチドを含む挿入体（推定シグナルペプチドを含まない全長ＦＧＦ２３をコードする）を、方向を合わせてｐＱＥ３０ベクター中にＮ末端６ｘＨｉｓタグにインフレームでクローニングした。次に、Ｍ１５［ｐＲＥＰ４］細胞を形質転換するためにプラスミドＦＧＦ２３−６ｘＨｉｓ ｐＱＥを用い、４時間かけてＩＰＴＧを加えてタンパク質発現を誘導した。ニッケルクロマトグラフィーミニプレップによってその製造業者（Ｑｉａｇｅｎ Ｉｎｃ．， Ｖａｌｅｎｃｉａ， ＣＡ）の指示どおりに、ＦＧＦ２３−６ｘＨｉｓタンパク質を精製した。
【０２７５】
ウェスタンブロット分析
タンパク質のサンプルおよび標準物質を１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥミニ−ゲル（ＢｉｏＲａｄ）上で電気泳動にかけ、ニトロセルロース膜にエレクトロブロット（ｅｌｅｃｔｒｏｂｌｏｔ）を行った。膜を２．５μｇ／ｍｌの抗ヒトＦＧＦ２３抗体およびマウス抗５ｘＨｉｓ抗体と一緒にインキュベートした後、ＨＲＰ標識ヤギ抗ウサギもしくは抗マウス２次抗体（１：１０００）（Ａｍｅｒｓｈａｍ， Ｉｎｃ．， Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ， ＮＪ）と一緒にインキュベートし、化学発光増幅法（ＥＣＬ）（Ａｍｅｒｓｈａｍ， Ｉｎｃ．， Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ， ＮＪ）によって可視化した。
【０２７６】
哺乳動物細胞内でのＦＧＦ２３の産生
哺乳動物細胞内でＦＧＦ２３を産生するために、ヒトＦＧＦ２３を発現するプラスミド（ｐＦＧＦ２３と呼ぶ）でＯＫ−Ｅ、ＣＯＳ−７およびＨＥＫ２９３細胞を一過的にトランスフェクトした。ｐＦＧＦ２３を構築するために、ＲＴ−ＰＣＲにより心臓全長ＲＮＡからコザック配列（ｂｐ３〜７５６）後方のＦＧＦ２３のＯＲＦを増幅した。得られたｃＤＮＡを、方向を合わせて発現プラスミドｐｃＤＮＡ３．１（＋）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中に挿入した。ｐＦＧＦ２３の完全性をＤＮＡ配列決定によって確認した。
【０２７７】
ＯＨＯ腫瘍サンプルの調製
ＯＨＯ患者からの６つの異なる腫瘍を、以下に挙げる部位から外科手術により取り出した：ａ）左大腿（血管周囲細胞腫）；ｂ） 下顎骨（混合型結合組織腫瘍）；ｃ）左大腿（血管形成異常）；ｄ）足裏（血管周囲細胞腫）；ｅ）鼻（血管周囲細胞腫）；およびｆ） 遠位大腿（骨芽細胞骨肉腫）（図８Ａ）。全ての患者は、ＯＨＯに特徴的な生化学的異常を示し、これらは腫瘍を除去した後に消散した。約１００ｍｇの腫瘍サンプルを、７５μｇ／ｍｌ ＡＥＢＳＦプロテアーゼインヒビターを加えた０．５ｍｌの氷冷リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）の中に再懸濁した。サンプルを氷上で３０秒間ホモジナイズした後、１５００ ｘ ｇで遠心分離し、その後、上清のホモジネートを更なる実験で用いた。ウシ血清アルブミンを標準物質として用いてブラッドフォード・プロテインアッセイ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ， Ｉｎｃ．， Ｈｅｒｃｕｌｅｓ， ＣＡ）によってタンパク質濃度を測定した。
【０２７８】
この節で提供された実験の結果を以下に記載する。
【０２７９】
特定のヒト組織中および癌細胞系中におけるＦＧＦ２３の発現を評価するために、従来法に従って、ヒト組織および癌細胞系から得たＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲおよびハイブリダイゼーション分析を行った。ＦＧＦ２３が特定の組織（例えばヒト心臓、肝臓、および甲状腺／副甲状腺）内では低レベルで転写されることが分かった（図４Ａ）。さらに、胎児の全身、胎児軟骨細胞、小腸、精巣および骨格筋からは、より微量の生成物が増幅された。肺、脳、腎臓、骨肉種細胞（ＳａＯＳ）および内皮細胞（ＨＭＥＣ−１）は、ＦＧＦ２３転写体について陰性であった。マウスにおいて、ネスティッドＲＴ−ＰＣＲは、１７日目のマウス胚において陽性であったが、頭蓋冠、肢芽細胞、骨芽細胞（ＭＣ３Ｔ３細胞）、および刺激した軟骨細胞系からの初代骨細胞培養物中においては陽性ではなかった。異なる発生段階のマウス胚の矢状断でのパラフィン切片、ならびに種々の組織（例えば成体肺、卵巣、膵臓、精巣、胸腺、腎臓、脳、および心臓等）のパラフィン切片およびＥ１８．５脛骨の冷凍切片での、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションにおける放射活性は、ＦＧＦ２３転写産物について陰性であった。１６個の特定の器官から得た多数の組織ノーザンブロットのハイブリダイゼーションは、陰性であった。癌細胞系から得たＲＮＡのノーザンブロット分析は、ＦＧＦ２３ｃＤＮＡでプローブしたときに、慢性骨髄性白血病細胞系Ｋ５６２の中のおよそ３ｋｂおよび１．３ｋｂの陽性シグナルを示したが、幾つかの他の腫瘍細胞系は、３．０ｋｂまたは１．３ｋｂの転写産物のみを発現した（図４Ｂ）。
【０２８０】
ＦＧＦ２３の検出に有用な免疫試薬を作製するために、標準的なプロトコールを用いて、ヒトＦＧＦ２３の第２０６番残基〜第２２２番残基に対応するペプチドＣＳＱＥＬＰＳＡＥＤＮＳＰＭＡＳＤ−ＣＯＯＨ（配列番号５）（Ｚｙｍｅｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｉｎｃ．， Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ， ＣＡ）に対するウサギ抗ヒトＦＧＦ２３ポリクローナル抗体を作成した。このペプチドに対する抗血清をアフィニティー精製した。
【０２８１】
抗ＦＧＦ２３抗体の特異性を評価するために、上記に記載したように細菌内で組換えヒトＦＧＦ２３を生成した。ＦＧＦ２３−６ｘＨｉｓ ｐＱで形質転換した細菌から調製した溶菌液を、アフィニティー精製した抗ＦＧＦ２３抗体を用いたウェスタンブロット分析によって分析した。抗ＦＧＦ２３抗体は、ＩＰＴＧで誘導した細菌からの約２７ｋＤａのタンパク質を認識したが、誘導していない培地中ではタンパク質は検出されなかった（図７Ａ）。また、抗Ｈｉｓ抗体を用いて同じタンパク質が検出された。これは、これらの抗体がいずれも同一タンパク質を認識したことを示している。免疫前血清は、全ての実験においてタンパク質を検出しなかった。これらの結果は、アフィニティー精製した抗ＦＧＦ２３抗体が組換えヒトＦＧＦ２３タンパク質を認識したことを確認するものである。
【０２８２】
トランスフェクトした細胞内でのＦＧＦ２３の発現を評価するために、トランスフェクションの２４時間後に細胞を回収し、全長ＲＮＡを抽出し、３２Ｐ標識ＦＧＦ２３ｃＤＮＡプローブを用いてノーザンブロット分析を行った。ｐＦＧＦ２３でトランスフェクトした３つの細胞系全てにおいて、１．１ｋｂの単一ｍＲＮＡ種がＦＧＦ２３プローブにハイブリダイズしたが、空のｐｃＤＮＡ３．１でトランスフェクトした細胞は、ＦＧＦ２３転写体を発現しなかった（図７Ｂ）。
【０２８３】
ＦＧＦ２３が分泌タンパク質であるか否かを決めるために、３つのトランスフェクトした細胞系および抗ＦＧＦ２３抗体から得た馴化培地を用いてウェスタンブロット分析を行った。ｐＦＧＦ２３でトランスフェクトした細胞から得た馴化培地中において約３２ｋＤａおよび１２ｋＤａの免疫反応性のタンパク質が検出されたが、ｐｃＤＮＡ３．１でトランスフェクトした細胞から得た馴化培地中では検出されなかった（図７Ｃ）。３２ｋＤａバンドはＦＧＦ２３の成熟型であり、１２ｋＤａ種はＦＧＦ２３のＣ末端分解産物を表す。なぜなら、この小さい方のバンドは、血清を含まない培地中でより長い時間細胞をインキュベートした後にしか検出されなかったからである。さらに、ＦＧＦ２３の分泌型は、その推定サイズよりも大きかった。これは、膵臓ミクロソームの存在下でｐＦＧＦ２３のｉｎ ｖｉｔｒｏでの転写および翻訳によりテストしたところ、コアグリコシル化によるものと考えられる。これらの結果をまとめると、ＦＧＦ２３を一過的に発現する哺乳動物細胞は、ＦＧＦ２３転写体を生成し、該タンパク質を効率良く分泌することができることを示している。
【０２８４】
ＯＨＯ腫瘍中でのＦＧＦ２３発現を評価するために、６つの腫瘍のうち５つから単離した全長ＲＮＡを用いてノーザンブロット分析を行った。放射能標識したＦＧＦ２３プローブは、５つ全ての腫瘍の中で、３．０ｋｂおよび１．３ｋｂのＦＧＦ２３転写産物、ならびに約２．０ｋｂの位置のわずかなバンドとハイブリダイズした。これに対し、幾つかの他の組織から得た対照ＲＮＡでは、ハイブリダイズしているバンドは見られなかった（図８Ａ）。ＦＧＦ２３タンパク質がＯＨＯ腫瘍中に存在するか否かを決定するために、６番目の腫瘍から得た抽出物を、抗ＦＧＦ２３抗体を用いたウェスタンブロット分析によって調べた。ＦＧＦ２３抗体は、腫瘍抽出物から３２ｋＤａのタンパク質を検出した（図８Ｂ）。上記をまとめると、ノーザンブロットおよびウェスタンブロット分析は、ＦＧＦ２３がＯＨＯ腫瘍中で高レベルで発現される分泌タンパク質であることを示している。
【０２８５】
実施例３：ＦＧＦ２３タンパク質の切断およびヘパリン結合性に及ぼすＡＤＨＲ突然変異の影響
この実施例のデータは、ＡＤＨＲに関係するＦＧＦ２３突然変異により、プロテアーゼが共通ＳＰＣ部位でＦＧＦ２３を効率良く切断することができなくなるので、ＦＧＦ２３の大きい方のタンパク質種のレベルが上昇することを示している。またこの実施例では、ＦＧＦ２３突然変異型が野生型ＦＧＦ２３に匹敵するレベルでヘパリンに結合し得ることが示される。
【０２８６】
この実施例において提供される実験で使用される材料および方法について以下に記載する。
【０２８７】
ＦＧＦ２３の突然変異誘発
ｎｅｓｔｅｄ−ＰＣＲ、部位特異的突然変異誘発法を用いて、ＦＧＦ２３ ｃＤＮＡ中にＡＤＨＲミスセンス変異Ｒ１７６Ｑ、Ｒ１７９Ｗ、Ｒ１７９Ｑを導入した。全てのＰＣＲ反応において、ｐＦＧＦ２３（ｐｃＤＮＡ３．１主鎖）と鋳型として用い、高性能再現性（ｈｉｇｈ−ｆｉｄｅｌｉｔｙ）ＤＮＡポリメラーゼＰｆｕ（Ｐｒｏｍｅｇａ， Ｉｎｃ．， Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩ）を用いた。ＰＣＲの最初のサイクルでは、適当なミスセンスを含む各順方向突然変異誘発プライマーを逆方向３’ＦＧＦ２３プライマーと塩基対形成させ、各逆方向突然変異誘発プライマーを順方向５’ＦＧＦ２３プライマーと塩基対形成させた。突然変異誘発プライマーを以下の表２に挙げる。５’ＦＧＦ２３および３’ＦＧＦ２３プライマーの中に位置しているＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩ部位はそれぞれ、イタリック体およびアンダーラインで示される。各プライマーの中の突然変異塩基にはアンダーラインを付してある。
【０２８８】
2004504063.tif 000003
全ての実験におけるＰＣＲ条件は、以下の通りであった：９５℃にて１分間、続いて９５℃にて１分間、５５℃にて１分間、７２℃にて２分間を３５サイクル繰り返し、最後に７２℃にて７分間伸長を行った。一回目のＰＣＲのサイクルで得られたｃＤＮＡ産物を、Ｗｉｚａｒｄ Ｐｒｅｐ Ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．， Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩ）を用いてゲル精製した。２回目のＰＣＲを用いて全長突然変異型ｃＤＮＡを生成した。特定の突然変異について最初の２回のＰＣＲ反応の各々から１μｌを取り出し、単一の反応試験管の中で合わせて、５’ＦＧＦ２３および３’ＦＧＦ２３プライマーを用いてこれら２つのｃＤＮＡの混合物を増幅した。次に、得られた生成物をＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩで消化し、方向を合わせて発現プラスミドｐｃＤＮＡ３．１（＋）中にライゲートし、突然変異型クローンｐＲ１７６Ｑ、ｐＲ１７９Ｗ、ｐＲ１７９Ｑを作製した。適当な突然変異が導入されたことを確認するため、およびＯＲＦの完全性を確認するために、各突然変異型クローン挿入体を配列決定した。
【０２８９】
ＦＬＡＧタグ付けＦＧＦ２３の構築
以下のプライマーを用いてｐＦＧＦ２３およびｐＲ１７６Ｑを別々に増幅した：
順方向プライマー（ＥｃｏＲＩ部位（下線部）を含む）
５’ＧＧＡＡＴＴＣＡＴＡＴＣＣＣＡＡＴＧＣＣＴＣＣＣＣＡ３’（配列番号７）；および
逆方向プライマー（ＢａｍＨＩ部位（下線部）を含む）
５’ＣＧＧＧＡＴＣＣＣＴＡＧＡＴＧＡＡＣＴＴＧＧＣＧＡＡ３’（配列番号６）。得られたｃＤＮＡをＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで消化し、方向を合わせてｐＦＬＡＧ−ＣＭＶ−３発現ベクター（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ， Ｉｎｃ．， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ）中にライゲートし、ＦＬＡＧ−ＦＧＦ２３およびＦＬＡＧ−Ｒ１７６Ｑを発現するプラスミドを作製した。親ｐＦＬＡＧ−ＣＭＶ−３ベクターは、Ｎ末端ＦＬＡＧタグ付け融合タンパク質の分泌を可能とするためにプレプロトリプシン（ｐｒｅｐｒｏｔｒｙｐｓｉｎ）リーダー配列を用いることに留意されたい。クローン挿入体を配列決定し、この融合タンパク質の正しいリーディングフレームを確認した。
【０２９０】
ヘパリン結合アッセイ
トランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞から得た馴化培地（０．５ｍｌ）を、１×ＰＢＳ（ｐＨ７．４）（１：１）およびヘパリンセファロースの１×ＰＢＳ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ， Ｉｎｃ．， Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ， ＮＪ）懸濁液（１：１）５０μｌと一緒にインキュベートした。この混合物を４℃の回転台（ｒｏｔａｔｉｎｇ ｐｌａｔｆｏｒｍ）に４時間載せた後、１分間遠心分離した。上清を取り出し、氷冷した１×ＰＢＳでセファロースを４回洗浄した。Ｌａｅｍｍｌｉサンプル緩衝液（５０μｌ）をセファロースに加え、懸濁液をボルテックス装置で短時間攪拌した後、５分間沸騰させた。このサンプルを１分間遠心分離にかけ、上清を取り出した。この上清１０μｌ（ヘパリンセルロースに結合した物質）を、抗−ＦＧＦ２３抗体を用いたウェスタンブロット分析により分析した。
【０２９１】
この実施例において提供された実験の結果について以下に記載する。
【０２９２】
哺乳動物細胞中でのＦＧＦ２３のＡＤＨＲ突然変異型の発現および分泌を評価するために、ＡＤＨＲミスセンス変異（Ｒ１７６Ｑ、Ｒ１７９Ｗ、Ｒ１７９Ｑ）を含むＦＧＦ２３発現プラスミドを上記記載の通りに構築した。推定シグナル配列および推定プロテアーゼ切断部位は、ＦＧＦ２３アミノ酸配列の中に示されている（図９）。野生型ＦＧＦ２３、Ｒ１７６Ｑ、Ｒ１７９ＱおよびＲ１７９Ｗを発現するプラスミドでＨＥＫ２９３細胞をトランスフェクトすることにより、突然変異型ＦＧＦ２３の発現および分泌を分析した。馴化培地、およびトランスフェクトした細胞から得た全細胞溶解液に対し、ヒトＦＧＦ２３に対するポリクローナル抗体を用いて、ウェスタンブロット分析を行った。ｐＦＧＦ２３でトランスフェクトした細胞から得た馴化培地において約３２ｋＤａの免疫反応性のタンパク質および１２ｋＤａにダブレットのバンドが検出された（図１０Ａ）。これに対し、突然変異型ｐＦＧＦ２３でトランスフェクトした細胞から得た馴化培地中では３２ｋＤａバンドのみが検出され、野生型ＦＧＦ２３と突然変異型ＦＧＦ２３との間に発現レベルの明らかな差は無かった（図１０Ａ）。さらに、対照のベクターのトランスフェクションと同様に、全細胞溶解液は、野生型または突然変異型ＦＧＦ２３タンパク質について陰性であった（図１０Ａ）。突然変異型ＦＧＦ２３タンパク質の中のアミノ酸変異を図１０Ｂに示す。これらの結果は、一過性トランスフェクションを行った哺乳動物細胞系が、ヒトＡＤＨＲ突然変異を含むＦＧＦ２３を分泌することを示す。しかし、ポリクローナル抗体を用いて、ＦＧＦ２３の突然変異型の細胞発現から得た培地の中で、大きい方のタンパク質種のみしか検出することができなかった。抗−ＦＧＦ２３抗体のエピトープは、野生型ＦＧＦ２３タンパク質の中に存在する第１７６番〜第１７９番目の残基に位置する潜在的なＳＰＣ切断部位のＣ末側にあり、従って、１２ｋＤａバンドはＦＧＦ２３ ３２ｋＤａ種のＣ末端フラグメントであり得ることに留意されたい。１２ｋＤａ種が３２ｋＤａバンドの破壊生成物であれば、ＳＰＣ切断部位の上流にある抗体は、大きい方のタンパク質種およびＮ末端タンパク質フラグメントの両方に結合するに違いない。
【０２９３】
この可能性は、上記記載のように構築したＮ末端ＦＬＡＧエピトープ・タグ付け野生型および突然変異型（Ｒ１７６Ｑ）ＦＧＦ２３を発現するプラスミドを用いて決定的にテストした。ＦＧＦ２３タンパク質種がそのタンパク質のＮ末端に対する抗体を用いて検出することが可能であるか否かを決定するために、ＨＥＫ２９３細胞を、ベクター対照、またはＦＬＡＧ−ＦＧＦ２３およびＦＬＡＧ−Ｒ１７６Ｑを発現するプラスミドで一過的にトランスフェクトした。トランスフェクトした細胞から得た馴化培地を、抗ＦＬＡＧモノクローナル抗体（Ｍ５；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ， Ｉｎｃ．， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ）を用いたウェスタンブロットによって分析した。ＦＬＡＧ−ＦＧＦ２３でトランスフェクトした細胞から得た馴化培地において、抗ＦＬＡＧ抗体は、３６ｋＤａおよび２６ｋＤａの２つのバンドを認識したが、ＦＬＡＧ−Ｒ１７６Ｑでトランスフェクトした細胞から得た培地中では、抗体は主に３６ｋＤａバンドを認識し、２６ｋＤａで非常に小さなバンドが検出された（図１１Ａ）。ベクター対照培地は、反応性バンドを生成せず、また細胞溶解液のいずれも反応性バンドを生成しなかった。上記で観察された３２ｋＤａとは反対に、培地中で検出された大きい方のＦＬＡＧ−ＦＧＦ２３タンパク質種は、ＦＬＡＧタグからの追加的残基の存在により、３６ｋＤａで泳動した。これは、ポリクローナル抗−ＦＧＦ２３抗体を用いた同培地のウェスタンブロット分析（３６ｋＤａの野生型および突然変異型ＦＬＡＧ−タグ付けＦＧＦ２３を検出した）によって確認された。ＦＬＡＧエピトープ、抗−ＦＧＦ２３エピトープ、およびＳＰＣ切断部位の位置を図１１Ｂに示す。これらの結果は、野生型ＦＧＦ２３からウェスタンブロットで得た小さい方のバンドが実際にＦＧＦ２３のＣ末端およびＮ末端断片であること、ならびにＦＧＦ２３のＡＤＨＲ突然変異型が主として大きい方のタンパク質種として分泌されることを示す。これらの結果は、第１７６番および第１７９番アミノ酸でのＡＤＨＲ突然変異が、３２ｋＤａ ＦＧＦ２３タンパク質種を安定化させることを示す。ＡＤＨＲ患者におけるリン酸塩排泄と関係があるＦＧＦ２３の突然変異型が野生型ＦＧＦ２３ほど効率良くは切断されないという観察結果に基づいて、タンパク質分解による断片の分泌とは反対に、全長ＦＧＦ２３の安定化および分泌は、腎臓でのリン酸塩の排泄につながる可能性がある。さらにこれらの結果は、ＡＤＨＲ突然変異が、リン酸塩排泄の役割において、ＦＧＦ２３の生物学的活性を不活化するのではなくむしろ強化する可能性があることを示唆している。
【０２９４】
ＨＥＫ２９３細胞を用いて観察されたＦＧＦ２３の切断が細胞内で起こるか細胞外で起こるかを決定するために、ＦＧＦ２３馴化培地を、細胞の不在下または対照ＨＥＫ２９３細胞（ＦＧＦ２３を発現しない）と一緒に５％ＣＯ２中で３７℃にて２４時間インキュベートした。インキュベート後、培地を回収し、同体積に濃縮し、Ｃ末端抗−ＦＧＦ２３抗体を用いたウェスタンブロット分析にかけた。処理の有無にかかわらず、１２ｋＤａバンドに対する３２ｋＤａバンドの比率に変化はなかった（図１２Ａ）。このことは、ＦＧＦ２３の切断が、細胞の分泌前または分泌中に細胞内で起こったのであって、ＨＥＫ２９３細胞上に発現される細胞外プロテアーゼによって起こったのではないことを示す。並行して電気泳動を行ったサンプルのクーマシーブルー染色でゲルにのせたサンプル量が等しいことを確認した（図１２Ｂ）。
【０２９５】
Ｒ１７６およびＲ１７９のＡＤＨＲ突然変異は、ＦＧＦのヘパリン結合性モチーフを含むβ鎖に隣接している。ヘパリンへのＦＧＦ２３の結合能をＡＤＨＲ突然変異が妨げるか否かをテストするために、ＦＧＦ２３の野生型または突然変異型を発現するプラスミドでトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞から得た馴化培地を、上記記載のようにヘパリンセファロースと一緒にインキュベートした。３２ｋＤａタンパク質種は、野生型ＦＧＦ２３および突然変異型ＦＧＦ２３でトランスフェクトした細胞培地のサンプルの中で検出されたが、空のベクターでトランスフェクトした細胞培地のサンプルは陰性であった。このことは、ＦＧＦ２３の野生型および突然変異型がいずれもヘパリンに効率良く結合したことを示す（図１３）。ＦＬＡＧ−タグＦＧＦ２３を発現するプラスミドでトランスフェクトした細胞から得た培地を用いた似たような実験において、ＦＬＡＧタグを付した野生型および突然変異型ＦＧＦ２３の３６ｋＤａ種もヘパリンに結合した（図１３）。これらの結果は、ＦＧＦ２３ ３２ｋＤａ種がヘパリンに特異的に結合することを示し、ＦＧＦ２３が実際にヘパリン結合性ＦＧＦファミリーのメンバーであることの生化学的証拠を提供するものである。さらに、ＦＧＦ２３の突然変異型がヘパリン結合性を維持するという観察結果は、ＡＤＨＲミスセンス変異がＦＧＦ２３のタンパク質構造を大きく変えることはないということを示す。
【０２９６】
実施例４：マウスにおけるＦＧＦ２３分析
この実施例のデータは、ＦＧＦ２３を過剰発現するマウス、ＦＦ２３の突然変異型を発現するマウス、またはリン酸塩欠乏食（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ｄｅｐｌｅｔｅｄ ｄｉｅｔ）またはリン酸塩増量食（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ｅｎｒｉｃｈｅｄ ｄｉｅｔ）を与えたマウスの作製および分析を示す。
【０２９７】
マウスにおけるＦＧＦ２３発現とリン酸塩恒常性の変化との相関関係を評価するために、肝臓内でマウスＦＧＦ２３を過剰発現するトランスジェニックマウスを作成し、トランスジェニックマウスおよび対照マウスから得た血清および尿サンプル中のリン濃度を比較する。マウスの体重を測定し、外観的な表現型の差があるか否かを測定するために、定期的に検査した。腎臓でのリン酸塩排泄と関連のあるヒト腫瘍中のＦＧＦ２３の過剰発現と一致して、ＦＧＦ２３を過剰発現するトランスジェニックマウスは腎臓におけるリン酸塩排泄およびそれにより引き起こされる低リン酸血症を示すに違いない。さらに、これらのマウスは、腎臓内のＮｐｔ２（主なナトリウム依存型リン酸塩輸送体）のｍＲＮＡおよびタンパク質のレベルの低下を示すに違いない。血清中の１，２５ジヒドロキシビタミンＤ濃度のレベルを、ＦＧＦ２３トランスジェニックマウスと、対照マウスと、食餌によるリン酸塩の涸渇または過剰によって誘導される同等の血清リン酸塩濃度を有する対照マウスと、の間で比較する。同様に、精製ＦＧＦ２３を注射したマウスは、腎臓中でのリン酸塩排泄を示して低リン酸血症になるに違いない。
【０２９８】
ヒトＡＤＨＲ患者において観察される同じ突然変異（Ｒ１７６Ｑ、Ｒ１７９Ｑ、Ｒ１７９Ｗ、またはアルギニン１７６もしくは１７９における他の突然変異）を含むトランスジェニックマウスを作製する。これは、ヒト疾患の良い動物モデルとなるであろう。上記に記載したように、血清および尿中のリンならびに血清中の１，２５ジヒドロキシビタミンＤ濃度を調べる。この突然変異についてヘテロ接合性であるマウスは、ＡＤＨＲを有するヒトに共通して見られる腎臓でのリン酸塩の排泄および低リン酸血症を示すに違いないが、この突然変異についてホモ接合性であるマウスは、より重度の表現型を有するに違いない。また突然変異型マウスは、腎臓内でのＮｐｔ２ ｍＮＲＡおよびタンパク質のレベルの低下も示すに違いない。
【０２９９】
マウスにリン酸塩涸渇食またはリン酸塩豊富食を与えると、血清中のリン酸塩濃度が変化し、甲状腺／副甲状腺、心臓または肝臓中のＦＧＦ２３発現レベルが変化する。高リン酸血症では、これらの組織内でＦＧＦ２３ ｍＲＮＡの発現を増加させるべきであるが、低リン酸血症では、これらの組織内でＦＧＦ２３ ｍＲＮＡの発現を低下させるべきである。
【０３００】
雄および雌のＨｙｐマウス（Ｐｈｅｘ遺伝子中に突然変異を有し、ヒトＸ連鎖低リン酸血症性くる病のマウスモデルである）におけるＦＧＦ２３発現レベルを、正常な同腹子対照中またはリン酸塩調整食を与えた同腹子中におけるそれと比較する。Ｈｙｐマウスは、ＦＧＦ２３の発現および血清濃度の上昇を示すであろう。
【０３０１】
実施例５：腫瘍誘導型骨軟化症患者におけるＦＧＦ２３の検出
この実施例で提供されるデータは、患者において腫瘍誘導型骨軟化症を診断するためのＦＧＦ２３検出プロトコールの使用を示す。
【０３０２】
腫瘍誘導型骨軟化症の臨床症状を示す患者から腫瘍を外科手術により摘出する。次に腫瘍細胞を、細胞培養フラスコ中で４８時間培養する。標準的なプロトコールを用いて腫瘍細胞からＲＮＡを単離する。ＦＧＦ２３に特異的なＰＣＲプライマーを用いて、腫瘍から得たＲＮＡに対してＲＴ−ＰＣＲを行う。腫瘍由来ＲＮＡからは、適当なサイズのｃＤＮＡバンドが増幅されるが、ＰＣＲ前に逆転写にかけなかった腫瘍細胞ＲＮＡからは増幅されない（陰性対照）。このように、腫瘍サンプル中のＦＧ２３ ｍＲＮＡの検出は腫瘍誘導型骨軟化症を示し、ゆえに、この疾患の貴重な診断ツールとして役立つ。
【０３０３】
実施例６：ヒトにおけるＦＧＦ２３の安全性
この実施例で示すデータは、ヒトにおけるＦＧＦ２３の安全性を示す。
【０３０４】
腫瘍誘導型骨軟化症を有する一部の患者において、腫瘍は検出されない。高用量の１，２５ジヒドロキシビタミンＤおよびリン酸塩で治療すると、これらの患者の状態が改善する。これらの患者において低リン酸血症が中和されると、彼等の血液中のＦＧＦ２３濃度が非常に高いにもかかわらず、症状が残らなくなる。ＡＤＨＲ患者においてもこれは同じであり、彼等のうちおそらく全員が高い血清ＦＧＦ２３濃度を有するが、これは、彼等が突然変異型ＦＧＦ２３を分解することができないということに比べれば２次的なものである。このように、ＦＧＦ２３レベルが高いことは、ヒトにおいて明白な悪影響を持たない。
【０３０５】
本明細書中に引用される各々のおよび全ての特許、特許出願、ならびに出版物の開示内容は、本明細書中に参考として全て組み込まれる。
【０３０６】
本発明は特定の実施形態を参照して開示されたが、本発明の真の精神および範囲を逸脱することなく、この発明の他の実施形態およびバリエーションが当業者によって考案され得ることは明らかである。特許請求の範囲は、このような実施形態および同等のバリエーションの全てを含むと考えられるものとする。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１Ａは、２つの異なるＡＤＨＲファミリー（１４０６および１４７８）の系図の中の連鎖解析を表す図である。図１Ｂは、３つの異なるＡＤＨＲファミリー（１４０６、１４７８および２３１８）における突然変異分析を表す一連のアガロースゲルの画像およびツリーである。
【図２】図２は、ＡＤＨＲ領域の物理的マップを表す図である。ＤＮＡマーカーおよびＢＡＣｓ／ＰＡＣｓの位置を、未完了の配列データ（Ｂａｙｌｏｒ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｃｅｎｔｅｒ）により予測される比率で描いてある。矢印は、クローンＲＰ１１−３０３Ｅ５とＲＰ１１−３２０Ｎ７との間、およびクローンＲＰ１１−１０３Ａ１１とＲＰ１１−９３５Ｃ２との間のゲノム配列の中のギャップを示す。Ｄ１２Ｓ１６２４とＤ１２Ｓ１５９４との間の遺伝子ならびにＧＰＲ４６およびＧＤＦ２のおよその位置を示す。
【図３】図３Ａ〜３Ｃは、ＦＧＦ２３および他の哺乳動物ＦＧＦファミリーメンバーのアミノ酸配列（図中に表れる順に配列番号１４〜３４）のアラインメントである。このアラインメントは、１２の逆平行β鎖からなるコア配列に制限される。ＦＧＦ−２結晶構造の中のβシートコンホメーションを有するセグメントの位置に下線を付してある。ＦＧＦ２３中の突然変異した２つのアルギニン（図３Ｃ：アスタリスクで示す）は、ＦＧＦ２３のマウス相同体の中で保存されている。このアラインメントは、ＣＬＵＳＴＡＬおよびＰＲＥＴＴＹＢＯＸを用いて作製した。ヒトおよびマウスＦＧＦ２３は、ＰＦＡＭデータベースのＦＧＦプロフィール（４．６ｅ−１４、１．９ｅ−１６）により同定された。これらは、共通コア配列内においてそのＦＧＦファミリーの他のメンバーと２５％〜３６％のアミノ酸同一性を有する。
【図４】図４Ａは、ＦＧＦ２３の組織発現を表すアガロースゲルの画像である。イントロンスパニングプライマー（ｉｎｔｒｏｎ−ｓｐａｎｎｉｎｇ ｐｒｉｍｅｒｓ）を用いたヒト組織由来ＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ分析では、ヒトの心臓（Ｈ）、肝臓（Ｌ）、甲状腺／副甲状腺（ＴＰ）、小腸（ＳＩ）、精巣（Ｔ）、および骨格筋（ＳＭ）の中で６５０ｂｐの生成物が明らかとなったが、脳（Ｂ）および腎臓（Ｋ）は陰性であった。図４Ｂは、７日間曝露した後の複数の癌細胞系中でのＦＧＦ２３発現を表すノーザンブロットの画像である。ストリンジェントな洗浄条件下において、慢性骨髄性白血病細胞系Ｋ５６２（レーン３）中において３ｋｂおよび１．３ｋｂの転写体が観察された。他の細胞系は、３ｋｂまたは１．３ｋｂ転写体のいずれかを生成した。（レーン１＝ＨＬ−６０；レーン２＝ＨｅＬａＳ３；レーン４＝ＭＯＬＴ−４；レーン５＝ＲＡＪＩ；レーン６＝ＳＷ４８０；レーン７＝Ａ５４９；レーン８＝Ｇ−３６１）。
【図５】図５Ａは、ヒトＦＧＦ２３のｃＤＮＡ配列である（配列番号１）。図５Ｂは、ヒトＦＧＦ２３のアミノ酸配列である（配列番号２）。
【図６】図６Ａは、マウスＦＧＦ２３のｃＤＮＡ配列である（配列番号３）。図６Ｂは、マウスＦＧＦ２３のアミノ酸配列である（配列番号４）。
【図７】図７Ａは、細菌により生成されるＦＧＦ２３のｉｎ ｖｉｔｒｏ発現を表すウェスタンブロットの画像である。抗ＦＧＦ２３抗体は、ＩＰＴＧ誘導型（＋）細菌から２７ｋＤａのタンパク質を認識したが、非誘導型（−）細菌からは認識しなかった（細菌はヒスチジン・タグ付けＦＧＦ２３（ＦＧＦ２３−６ｘＨｉｓ）で形質転換した）。図７Ｂは、トランスフェクトされた細胞からのＦＧＦ２３の発現を表すノーザンブロットの画像である。ＦＧＦ２３プローブを用いたＦＧＦ２３発現ベクター（ｐＦＧＦ２３；レーン３）でトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞に由来する全長ＲＮＡのノーザンブロット解析により、１．１ｋｂの単一の転写体が現れた（レーン１＝非トランスフェクトＨＥＫ２９３細胞；レーン２＝対照ベクターｐｃＤＮＡ３．１でトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞）。図７Ｃは、トランスフェクトされた細胞からのＦＧＦ２３の分泌を表すウェスタンブロットの画像である。抗ＦＧＦ２３抗体は、ｐＦＧＦ２３でトランスフェクトした細胞から得た濃縮馴化培地中において３２ｋＤａおよび１２ｋＤａの２つのタンパク質バンドを認識した（レーン２、４、６）が、トランスフェクトしなかった細胞から得た培地中では認識しなかった（レーン１、３、５）。
【図８】図８Ａは、腫瘍形成性低リン酸血症性骨軟化症（ＯＨＯ）腫瘍中のＦＧＦ２３の発現を表すノーザンブロットの画像である。５つの異なるＯＨＯ腫瘍（レーン３〜７）に由来する全長ＲＮＡのノーザンブロット分析では、３０分間の曝露後、強力にハイブリダイズする１．３ｋｂおよび３ｋｂのＦＧＦ２３転写体ならびに微かな２ｋｂバンドが現れたが、対照組織は陰性であった。（レーン１＝ヒト肝臓；レーン２＝ヒト副甲状腺、レーン８＝マウス脳；レーン９＝マウス心臓；レーン１０＝マウス腎臓）。図８Ｂは、ＯＨＯ腫瘍サンプル中のＦＧＦ２３タンパク質発現を表すウェスタンブロットの画像である。ＯＨＯ腫瘍からの抽出物（２μｇ）を分析したところ、３２ｋＤａのタンパク質は、抗ＦＧＦ２３抗体（＋）によって検出されるが、免疫前血清（−）によっては検出されないことが示された。
【図９】図９は、ヒトＦＧＦ２３のアミノ酸配列（配列番号２）であり、推定シグナルペプチドおよびＲＸＸＲ／５プロテアーゼ切断部位を示す。
【図１０】図１０Ａは、ＦＧＦ２３タンパク質の野生型およびＡＤＨＲ突然変異型の発現ならびに分泌を表すウェスタンブロットの一連の画像である。抗ＦＧＦ２３抗体および２μｇの馴化培地（Ｍ）またはＦＧＦ２３の野生型（ＦＧＦ２３）もしくはＡＤＨＲ突然変異（Ｒ１７６Ｑ、Ｒ１７９Ｗ、Ｒ１７９Ｑ）形態を発現するプラスミドでトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞から得た細胞ライゼート（Ｌ）（５０μｇ）を用いたウェスタンブロット分析。馴化培地中において、野生型ＦＧＦ２３の場合、３２ｋＤａおよび１２ｋＤａのバンドが検出されたが、ＡＤＨＲ突然変異体の場合は、３２ｋＤａ種のみが検出された。細胞ライゼートは、全てのＦＧＦ２３トランスフェクションについて陰性であり、全ての構築物は、同様のトランスフェクション効率を示した。図１０Ｂでは、ヒトＦＧＦ２３の野生型およびＡＤＨＲ突然変異（Ｒ１７６Ｑ、Ｒ１７９Ｗ、Ｒ１７９Ｑ）形態の第１７２番〜第１８４番アミノ酸を列記する。
【図１１】図１１Ａは、ＦＬＡＧでタグ付けしたＦＧＦ２３の発現を表すウェスタンブロットの画像である。ＦＬＡＧに対して特異的なモノクローナル抗体（Ｍ２）を使用したウェスタン分析を用いて、ＦＧＦ２３の野生型もしくはＲ１７６Ｑ突然変異型を発現するプラスミドでトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞から得た馴化培地中において、Ｎ末端をＦＬＡＧでタグ付けした野生型（２つの別個のクローン、左側２つのレーン）またはＲ１７６Ｑ突然変異型（２つの別個のクローン、右側２つのレーン）のＦＧＦ２３を検出した。野生型ＦＬＡＧ−ＦＧＦ２３は、３６ｋＤａバンドおよび明瞭な２６ｋＤａフラグメントとして検出されたのに対して、ＦＬＡＧ−Ｒ１７６Ｑ突然変異体は、主に３６ｋＤａ種として解像され、２６ｋＤａのところに微かなバンドが解像された。図１１Ｂは、ＦＧＦ２３タンパク質を表す図であり、ＦＬＡＧエピトープ、抗−ＦＧＦ２３エピトープ、およびＳＰＣ部位の相対位置を示す。
【図１２】図１２Ａは、ＨＥＫ２９３細胞にＦＧＦ２３タンパク質を細胞外で曝露したものを表すウェスタンブロットの画像である。５ｘ１０６ ＨＥＫ２９３細胞と一緒に（＋）または空の培養皿中で（−）２４時間インキュベートしたＦＧＦ２３馴化培地について、ＦＧＦ２３に対して特異的な抗体を用いたウェスタンブロット分析を行った。処理後の３２ｋＤａおよび１２ｋＤａバンドの強度において差は見られなかった。図１２Ｂは、クーマシーブルーで染色したゲルの画像である。図１２Ａに示したサンプルを並行に電気泳動させ、クーマシー染色で等しいゲル負荷を確認した。
【図１３】図１３は、野生型ＦＧＦ２３およびＡＤＨＲ突然変異型ＦＧＦ２３のヘパリンへの結合を表すウェスタンブロットの画像である。ＦＧＦ２３の野生型または突然変異型およびＦＬＡＧでタグ付けしたＦＧＦ２３の野生型または突然変異型でトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞から得た馴化培地を、ヘパリン−セファロースと一緒にインキュベートし、結合した物質を、抗ＦＧＦ２３抗体を用いたウェスタンブロット分析にかけた。野生型ＦＧＦ２３または突然変異型ＦＧＦ２３に対応する３２ｋＤａ種がヘパリンに結合した。対照ベクターの場合、培地は陰性であった。幾つかのサンプル中の約２８ｋＤａの微かなバンドの起源は不明である（レーン１＝野生型ＦＧＦ２３；レーン２＝Ｒ１７６Ｑ、レーン３＝Ｒ１７９Ｗ；レーン４＝Ｒ１７９Ｑ；レーン５＝ＣＭＶベクター；レーン６＝ＦＬＡＧ−ＦＧＦ２３；レーン７＝ＦＬＡＧ−１７６Ｑ；レーン８＝ＦＬＡＧベクター）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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