(57)【要約】本発明は、新規な極性化合物、複合体、およびそれらを含んでなる組成物に関する。ここで、前記化合物は、(i) 極性頭部基スペーサー、(ii) 少なくとも１個の疎水性成分、および、(iii) 少なくとも１個の親水性ポリマー、を含んでなる化合物であって、極性頭部基スペーサーが疎水性部分および親水性ポリマーにカップリングしていることを特徴とする。【特許請求の範囲】
【請求項１】
(i)  極性頭部基スペーサー、
(ii)  少なくとも１個の疎水性部分、および
(iii)  少なくとも１個の親水性ポリマー
を含んでなる、化合物であって、
極性頭部基スペーサーが、疎水性部分および親水性ポリマーにカップリングしていることを特徴とする、化合物。
【請求項２】
極性頭部基スペーサーが、カチオン性頭部基スペーサーである、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
カチオン性頭部基スペーサーが、２〜７の正電荷を含んでなる、請求項２に記載の化合物。
【請求項４】
疎水性部分にカップリングした極性頭部基スペーサーが、カチオン性脂質である、請求項２または３に記載の化合物。
【請求項５】
カチオン性脂質が下記式Ｉを有する、請求項４に記載の化合物：
【化１】
2004528384.tif 000008
［式中、
Ｒ１およびＲ２は、同一であるかまたは異なり、直鎖状もしくは分岐鎖状の６〜２３個の炭素原子（Ｃ６〜Ｃ２３と表記）を有するアルキルもしくはアルケニル基、または直鎖状もしくは分岐鎖状の−Ｃ(＝Ｏ)−(Ｃ６〜Ｃ２３)アルキルもしくは−Ｃ(＝Ｏ)−(Ｃ６〜Ｃ２３)アルケニル基、またはさらに具体的には−Ｃ(＝Ｏ)−(Ｃ１２〜Ｃ２０)アルキルもしくは−Ｃ(＝Ｏ)−(Ｃ１２〜Ｃ２０)アルケニル、アリール基、シクロアルキル基、フルオロアルキル基、必要に応じて反復している直鎖状もしくは分岐鎖状であって必要に応じて置換基を有するオキシエチレンもしくはオキシメチレン基であり、
Ｘは、酸素原子またはアミノ基−ＮＲ３であり、ここでＲ３は水素原子または１〜４個の炭素原子を有するアルキル基であり、
ｎは、１〜６、好ましくは２〜４、の正の整数であり、
ｍは、１〜６、好ましくは２〜４、の正の整数であり、ｎ＞１のときには、ｍは前記ｎと同一でもまたは異なっていてもよい］。
【請求項６】
親水性ポリマーが、ポリアルキルエーテル、ガングリオシドＧｍ１、ポリビニルピロリドン、ポリアルキルオキサゾリン、ポリアルキルアクリルアミド、ポリアルキルアクリレート、ポリアルキルセルロース、ポリアスパルタミド、テトリトール、ペンチトール、ヘキシトール、ダルシトールからなる群より選択される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項７】
親水性ポリマーが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項８】
ポリエチレングリコールの分子量が約１，０００〜約５，０００ダルトン（Ｄａ）の範囲である、請求項７に記載の化合物。
【請求項９】
下記式VIIを有する、請求項５〜８のいずれか一項に記載の化合物：
【化２】
2004528384.tif 000009
［式中、
Ｒ１、Ｒ２、Ｘ、ｎおよびｍは請求項５に記載の通りであり、
ｐは４〜２２０の正の整数である］。
【請求項１０】
下記式VIIIを有する、請求項９に記載の化合物：
【化３】
2004528384.tif 000010
【請求項１１】
(a)  少なくとも１個の、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の化合物と、
(b)  少なくとも１個の目的の物質と
を含んでなる、複合体。
【請求項１２】
目的の物質が、タンパク質および核酸分子からなる群より選択される、請求項１１に記載の複合体。
【請求項１３】
(c)  少なくとも１個の置換部分、および／または
(d)  少なくとも１個のターゲッティング成分、および／または
(e)  膜崩壊を引き起こすことができる少なくとも１個のペプチド、および／または
(f)  カチオン性脂質およびカチオン性ポリマーからなる群より選択される少なくとも１個のカチオン性化合物、および／または
(g)  少なくとも１個のコリピド(colipid)
をさらに含んでなる、請求項１１または１２に記載の複合体。
【請求項１４】
少なくとも１個の請求項１〜１０のいずれか一項に記載の化合物、または少なくとも１個の請求項１１〜１３のいずれか一項に記載の複合体を含んでなる、組成物。
【請求項１５】
哺乳類の治療、予防またはワクチン治療用の医薬組成物を調製するための、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の化合物または請求項１１〜１３のいずれか一項に記載の複合体の使用。
【請求項１６】
目的のアニオン性物質を細胞に導入するための複合体を調製するための、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の化合物の使用。
【発明の詳細な説明】
【発明の背景】
【０００１】
発明の分野
本発明は、新規な極性化合物、複合体、およびそれらを含んでなる組成物に関する。さらに詳しくは、本発明は、目的の物質を細胞中に導入するための複合体を調製するための前記化合物または前記組成物の使用に関する。これらの複合体は、特に遺伝子導入用途で、前記物質を細胞中に送達するのに有用である。
【０００２】
従来技術
遺伝子治療は、機能的遺伝子を細胞に導入することによって患者の病気の恒久的な治癒または改善を行うことができる遺伝性の欠乏疾患（嚢胞性繊維症、ジストロフィー、血友病など）に主として応用できると一般に考えられてきた。しかしながら、極めて大きな群の疾患、特に後天性疾患（癌、ＡＩＤＳ、多発性硬化症など）は、宿主細胞を一過性の工学処理を行い有益なタンパク質を生成させることによって治療可能なことがある。遺伝子治療のもう一つの用途は予防接種である。これに関しては、脊椎動物の細胞に導入された核酸によってコードされる免疫原性産物は、主要組織適合抗原に関連して上記細胞によって発現して、分泌または提示することができ、それによって、発現した免疫原に対する免疫応答を引き出す。機能的核酸は、一過性トランスフェクションと呼ばれる目的遺伝子の一過性発現、または宿主ゲノムへの核酸の取り込みによって生じる宿主細胞の恒久的形質転換、のいずれかを生じる様々な手法によって細胞に導入することができる。
【０００３】
ヒトに応用された最初の臨床プロトコールは、アデニンデアミナーゼ（ＡＤＡ）欠損症の患者について１９９０年９月にアメリカ合衆国で開始された。この最初の有望な実験に続いて、予防接種などの数多くの新規な応用が行われてきており、遺伝子治療に基づく有望な臨床試験が現在進行中である（例えば、http://cnetdb.nci.nih.gov/trialsrch.shtmlor、http://www.wiley.co.uk/genetherapy/clinical/ に記載の臨床試験を参照されたい）。
【０００４】
好結果が得られた核酸に基づく治療法は、主として、目的の核酸、例えば遺伝子コードタンパク質、を効率的に送達して、生体の細胞中でそれを機能または発現させることができるようにすることに依存している。上記の遺伝子材料を多種多様なベクターを用いて細胞に導入して、宿主ゲノムの一過性発現または恒久的形質転換を生じさせることができる。この十年間に、多数のウイルス性および非ウイルス性ベクターが、この導入を支持する目的で開発されてきた（例えば、総説については、Robbins et al., 1998, Tibtech 16, 35-40; Rolland, 1998, Therapeutic Drug Carrier Systems 15,143-198を参照されたい）。この導入は、通常は核酸送達と呼ばれる。
【０００５】
今日まで用いられてきたほとんどの送達系は、ウイルスベクター、特にアデノウイルスベクター、ポックスウイルスベクターおよびレトロウイルスベクターである（総説については、Robbins et al., 1998, Tibtech, 16,35-40、またはWalther and Stein, 2000, Drugs, 60, 249-271を参照されたい）。ウイルスは、細胞膜の横断、エンドソームおよびリソソーム分解の回避、および最後のそれらのゲノムの核への送達に続くウイルスゲノムの発現、を包含するこの目的を達成するために多様で極めて複雑な機構を発達させてきた。結果として、ウイルスは、多くの核酸送達用途、例えば、ヒトに応用される予防接種または遺伝子治療において用いられてきた。しかしながら、上記のウイルスの使用には多数の欠点がある。すなわち、レトロウイルスベクターは大型のヌクレオチド配列（例えば、約１３ｋｂのジストロフィン遺伝子）に適応させることができず、レトロウイルスゲノムは宿主細胞ＤＮＡに組込まれて、受容細胞に遺伝子変異を引き起こし、感染性ウイルス粒子が生体内または環境中に広がることがある。アデノウイルスベクターは治療した患者で強い免疫応答を誘発する可能性があり且つ細胞に感染するときに特異性を欠いている(Mc Coy et al, 1995, Human Gene Therapy, 6, 1553-1560; Yang et al., 1996, Immunity, 1,433-442)。しかしながら、これらの欠点にも拘わらず、ウイルス性ベクターは、それらの効率性の故に現在のところ最も有用な送達系である。
【０００６】
また、細胞内核酸送達にとって一層安全な方法を提供するために、非ウイルス性の系が提案されている。１９９０年に、Wolff et al.(Science, 247,1465-1468)は、裸のＲＮＡまたはＤＮＡ、すなわち特殊な送達系を持たない核酸、をマウス骨格筋に直接投与することにより、この筋細胞内にレポーター遺伝子が発現することを示した。それにもかかわらず、これらの結果は核酸が単独でイン・ビボである種の細胞の血漿膜を横切ることができることを示しているが、実際に観察されるトランスフェクションの効率は、特に負に帯電した細胞膜の通過を制限する核酸のポリアニオン性によって大きく制限されたままである。更に、前記の「裸の」(naked)技術は、核酸を全身投与するときには、非効率的である。
【０００７】
１９８９年に、Felgner et al. (Nature, 337,387-388)は、核酸のような大きなアニオン性分子の細胞への導入を容易にするためのカチオン性脂質の使用を提案した。これらのカチオン性脂質はアニオン性分子と複合体（すなわち、リポプレックス）を形成することができ、従ってこれらの分子の負電荷を中和してそれらを複合体にぎっしり詰める傾向があり、且つ細胞へのそれらの導入を促進する。同様に、例えば、受容体依存性機構(Perales et al., 1994, Eur. J. Biochem. 226,255-266; Wagner et al., 1994, Advanced Drug Delivery Reviews, 14,113-135)、カチオン性ポリマー（アニオン性分子と複合体形成したときにポリプレックスを形成する）、例えば、ポリアミドアミン(Haensler et Szoka, 1993, Bioconjugate Chem., 4,372-379)、樹枝状ポリマー（ＷＯ９５／２４２２１号公報）、ポリエチレンイミンまたはポリプロピレンイミン（ＷＯ９６／０２６５５号公報）、ポリリシン（ＵＳ-Ａ-５,５９５,８９７号明細書またはＦＲ ２ ７１９ ３１６号明細書）、または改良脂質(Felgner et al., 1989, Nature, 337, 387-388)、例えばＤＯＴＭＡ(Felgner et al., 1987, PNAS, 84,7413-7417)、ＤＯＧＳまたはトランスフェクタム（Transfectam）（商品名）(Behr et al., 1989, PNAS, 86, 6982-6986)、ＤＭＲＩＥまたはＤＯＲＩＥ(Felgner et al., 1993, Methods 5, 67-75)、ＤＣ−ＣＨＯＬ(Gao et Huang, 1991, BBRC, 179, 280-285)、ＤＯＴＡＰ（商品名）(McLachlan et al., 1995, Gene Therapy, 2, 674-622)、リポフェクトアミン（Lipofectamine）（商品名）またはカチオン性グリセロ脂質化合物（例えば、ＥＰ９０１ ４６３号明細書およびＷＯ９８／３７９１６号公報を参照されたい）に基づく他の非ウイルス送達系が開発されている。これらの非ウイルス系は、大規模生産、安全性、それらの化学的デザインにおける柔軟性、低免疫原性、および核酸の大きな断片を送達する能力に関して潜在的な利益をもたらす。
【０００８】
しかしながら、幾つかの研究（例えば、Mahato et al., 1995, J. Pharm. Sci., 84, 1267-1271, Thierry et al., 1995, PNAS 92, 9742-9746）では、目的の複合体形成したアニオン性物質の細胞中への導入効率は、特にイン・ビボでの導入の場合には、複合体と細胞膜との相互作用、関与する細胞の種類、カチオン性成分の脂質組成、アニオン性分子により形成された複合体の大きさ、および複合体の様々な成分の陽電荷対陰電荷の比率に相関して大きく変動する可能性があることが示されている。現在のところは、複合体と細胞膜との相互作用、および複合体の細胞中への導入を可能にする機構に関してはほとんど知られておらず、現在行われている研究は極めて経験的なままである。更に詳細には、上記の非ウイルス性ベクターの細胞内送達の一つの主要な経路はエンドサイトーシスによる細胞小胞へのインターナリゼーションであることが示されている。エンドサイトーシスは、真核細胞が小エンドサイトーシス小胞、すなわちエンドソーム、の形態の血漿膜の切片を摂取し、細胞外流体や分子材料、例えば核酸分子を閉じ込める自然の過程である。従って、非ウイルス性ベクターを非特異的過程によってインターナリゼーションすることが提案されている。投与された非ウイルス性ベクターは、特にイン・ビボで全身的に投与されるときには、制御なしで治療を受ける患者中に広まることができるので、このように細胞または組織特異的トランスフェクションを全く欠いていることにより全般的な導入効率が実際的に減少する可能性がある。更に、特殊な用途（例えば、癌細胞、心細胞、免疫に関与する細胞の治療ターゲッティングなど）では、所望な導入が完全に制御され且つ具体的に特異的細胞または組織に指定されることが必要なことがある。このような非播種特性および／または特異性は、現在利用可能なベクターでは達成することができない。
【０００９】
従って、目標とするまたは限定された種類の細胞および／または組織に一層特異的に核酸を送達することができる非ウイルス並びにウイルスベクターをデザインすることが求められている。これに関して、最初に問題となるものは、ベクターの非特異的導入を細胞との非特異的相互作用を制限することによって限定することであり、第二の問題は、標的ベクターを供給することにより導入を指示することである。標的ベクターを用いることによって、選択したターゲット細胞または組織との相互作用を促進することができ、ベクターの広がりが制限されるので、所望なターゲット細胞／組織の導入効率、従って目的の導入物質の可能な治療効果を増加することができる。この方法は、主として、ほとんどの細胞および／または組織が、自然な状態または疾病状態では、独特な細胞／組織表面マーカーを発現するという事実に基づいている。例えば、速やかに増殖する腫瘍での内皮細胞は、静止内皮には存在しない細胞表面タンパク質、すなわちαｖインテグリン(Brooks et al., 1994, Science 264, 569)およびある種の血管新生増殖因子の受容体(Hanahan, 1997, Science 277, 48)を発現する。従って、これらの細胞表面マーカーは、ベクターを特異的細胞型に指定するためのターゲットとして用いることができる。細胞表面マーカーをターゲット設定することができる化合物は文献に開示されており、糖の全部または一部、グリコール、ペプチド（例えば、ＧＲＰ、ガストリン放出ペプチド）、オリゴヌクレオチド、脂質（特にＣ２〜Ｃ２２を有するもの）、ホルモン、ビタミン、抗原、抗体（またはその断片）、特異的膜受容体リガンド、アンチリガンドと反応することができるリガンド、または上記化合物の組合せ、例えば、肝細胞の表面上のアシアログリコプロテイン受容体をターゲット設定するためのガラクトシル残基、から構成されていてもよい。
【００１０】
上記のように、現在用いられているほとんどの非ウイルス性ベクターは、カチオン性化合物、特に両親媒性カチオン性化合物と負に帯電した核酸との複合体である。これらの複合体は、通常は正に帯電した細胞表面と相互作用することができる真の陽電荷を有する。しかしながら、本質的に静電相互作用に基づくこの相互作用は、非特異的である。従って、この非特異的相互作用を減少させることが望ましい。一つの可能な解決法は、複合体の表面にスクリーンを形成している親水性部分をも含む複合体を使用することによって、そのカチオン性電荷を遮蔽して、これによって細胞表面膜との非特異的相互作用を減少させることである。
【００１１】
ＷＯ９９／５８６９４号公報には、イン・ビボで保存寿命と高いトランスフェクション活性を増加したリポプレックスが開示されている。更に正確には、開示されたベクターは、ポリエチレングリコール−ホスファチジルエタノールアミンＰＥＧ−ＰＥのような安定剤が組込まれているリポプレックスである。実験データは、上記安定剤をリポプレックスに付加することにより、細胞の非特異的なイン・ビボトランスフェクションが更に阻害されることを示している。
【００１２】
ＷＯ００／３２８０３号公報には、全身投与したときに免疫系によるベクタークリアランスまたは血漿タンパク質への吸着による導入特性の喪失を限定するようにデザインされているカチオン性合成ベクターが開示されている。更に具体的には、この発明は、ポリカチオンに化学的に結合した疎水性スペーサーと少なくとも１個の親水性置換基とを含んでなる核酸導入剤に関する。
【００１３】
米国特許第５，０１３，５５６号明細書は、ポリアルキルエーテルを用いて誘導した両親媒性脂質、例えばポリエチレングリコールを用いて誘導したホスファチジルエタノールアミン、を１〜２０モル％含む薬剤を閉じ込めるリポソームを包含する、血流を介して薬剤を投与するためのリポソーム組成物に関する。
【発明の概要】
【００１４】
本出願人は、特にイン・ビボでの核酸導入に関して、目的の物質の細胞中への非特異的導入を制限するのに特に有用な新規化合物であって、ターゲッティングした非ウイルス性ベクターを開発する目的で修飾しまたは使用することもできる化合物を同定した。従って、本発明は、
(i)  極性頭部基スペーサー、
(ii)  少なくとも１個の疎水性部分、および
(iii)  少なくとも１個の親水性ポリマー
を含んでなる、化合物であって、
極性頭部基スペーサーが、疎水性部分および親水性ポリマーにカップリングしている化合物を提供する。
【発明の具体的説明】
【００１５】
本明細書で用いる「極性頭部基スペーサー」(polar headgroup spacer)という用語は、本発明の化合物の帯電した部分を表す。「極性」は常にアニオン性またはカチオン性の頭部基スペーサーのいずれを表すことができるが、後者の方が好ましい。更に具体的には、極性頭部基スペーサーのカチオン性は、例えば、アミン、酸、エステル、アルデヒド、またはアルコール基のような反応性化学基を含む基の存在に関し、好ましくは少なくとも１個の第四アンモニウム基、ポリアミン部分、アミジニウムまたはグアニジニウム基、またはそれらの組合せの存在に関することができる。このようなカチオン性頭部基スペーサーは実際には負に帯電した物質に対する結合性頭部基であり、好ましくは、これは核酸と結合することができる結合性頭部基である。
【００１６】
本明細書で用いる「疎水性部分」(hydrophobic moiety)という用語は、脂肪酸、脂肪アルコール、ステロール、または、水性媒質から脂質相に分布することができる任意の他の疎水性分子を意味する。例えば、疎水性ドメインは、ジアシルグリセロール、リン脂質、ステロール、またはジアシルアミド誘導体であることができる。好ましい態様によれば、前記疎水性部分は、少なくとも１本、好ましくは２本、の炭化水素鎖を含んでなる。更に好ましくは、この炭化水素鎖は、少なくとも１個の６〜２３個の炭素原子を有する直鎖状または分岐鎖状のアルキルまたはアルケニル基（Ｃ６〜Ｃ２３と表記）、または−Ｃ(＝Ｏ)−(Ｃ６〜Ｃ２３)アルキルまたは−Ｃ(＝Ｏ)−(Ｃ６〜Ｃ２３)アルケニル基、または更に具体的には、直鎖状または分岐鎖状の−Ｃ(＝Ｏ)−(Ｃ１２〜Ｃ２０)アルキルまたは−Ｃ(＝Ｏ)−(Ｃ１２〜Ｃ２０)アルケニル、アリール基、シクロアルキル基、フルオロアルキル基、オキシエチレンまたはオキシメチレン基であって、必要に応じて反復し、直鎖状または分岐鎖状であり、必要に応じて置換したものを含んでなる。置換は、例えば、アミジニウムまたはグアニジニウム基のようなカチオン性官能基、Ｃ１〜Ｃ５アルキル基（例えば、メチル、エチル、プロピルなど）、またはペルフルオロアルキル基において見ることができる。
【００１７】
一つの特別な態様によれば、前記疎水性部分にカップリングした極性頭部基スペーサーは、カチオン性脂質を表す。カチオン性脂質は、文献に広汎に記載されている（例えば、ＷＯ９７／２９１１８号公報、ＷＯ９８／０８４８９号公報、ＷＯ９８／１７６９３号公報を参照されたい）。更に具体的には、本発明によれば、上記カチオン性脂質は、第四アンモニウム基（例えば、ＤＯＴＭＡまたはＮ−［１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウム(Felgner, PNAS 84 (1987), 7413-7417)、ＤＯＴＡＰ(McLachlan, Gene Therapy 2 (1995), 674-622)、ＤＭＲＩＥ、ＤＬＲＩＥ、ＤＯＤＡＢなど）、ポリカチオン、例えば、リポポリアミン（ＤＯＧＳ、すなわちジオクタデシルアミドグリシルスペルミンまたはTransfectam（商品名）(Behr, PNAS 86 (1989), 6982-6986)、ＤＣ−Ｃｈｏｌまたは３−［Ｎ−（Ｎ′，Ｎ′−ジメチルアミノエタン）−カルバモイル］コレステロール(Gao, BBRC 179 (1991), 280-285)、ＷＯ９７／１８１８５号公報に開示されている脂質）、第四アンモニウム基とポリアミンを両方とも有する脂質（例えば、ＤＯＳＰＡ）、アミジニウム基を含む脂質（例えば、ＡＤＰＤＥ、ＡＤＯＰＥ、ＷＯ９７／３１９３５号公報に記載されているもの）を含む。それらは、Lipofectin（商品名）、ＤＭＲＩＥ：１，２−ジミリスチルオキシプロピル−３−ジメチル−ヒドロキシエチルアンモニウム、およびＤＯＲＩＥ：１，２−ジオレイルオキシプロピル−３−ジメチルヒドロキシエチルアンモニウム(Felgner, Methods 5 (1993), 67-75)、Lipofectamine（商品名）、スペルミンまたはスペルミジン−コレステロール、Lipofectace（商品名）（総説については、Legendre, Medecine/Science 12 (1996), 1334-1341、またはGao, Gene Therapy 2 (1995), 710-722を参照されたい）からなることもできる。本発明は、特許出願ＥＰ９０１４６３号明細書、ＷＯ９８／１４４３９号公報ＷＯ９７／１９６７５号公報、ＷＯ９７／３７９６６号公報、ＷＯ９８／３７９１６号公報またはＷＯ９８／５６４２３号公報に開示されているような「上記疎水性部分にカップリングした極性頭部基スペーサー」を含んでなる化合物、およびそれらの異性体も包含する。
【００１８】
好ましい態様によれば、上記極性頭部基スペーサーは、２〜７の陽電荷、更に具体的には３〜５の陽電荷、好ましくは５の陽電荷を含んでなる。
【００１９】
好ましい態様によれば、本発明の化合物は、下記式Ｉを有する「疎水性部分にカップリングした極性頭部基スペーサー」、すなわち、カチオン性脂質（ＥＰ９０１４６３号明細書参照）を含んでなる：
【化１】
2004528384.tif 000002
［式中、
Ｒ１およびＲ２は、同一であるかまたは異なり、直鎖状もしくは分岐鎖状の６〜２３個の炭素原子（Ｃ６〜Ｃ２３と表記）を有するアルキルもしくはアルケニル基、または直鎖状もしくは分岐鎖状の−Ｃ(＝Ｏ)−(Ｃ６〜Ｃ２３)アルキルもしくは−Ｃ(＝Ｏ)−(Ｃ６〜Ｃ２３)アルケニル基、またはさらに具体的には、−Ｃ(＝Ｏ)−(Ｃ１２〜Ｃ２０)アルキルもしくは−Ｃ(＝Ｏ)−(Ｃ１２〜Ｃ２０)アルケニル、アリール基、シクロアルキル基、フルオロアルキル基、必要に応じて反復している直鎖状もしくは分岐鎖状の、必要に応じて置換基を有するオキシエチレンもしくはオキシメチレン基であり、
Ｘは酸素原子またはアミノ基−ＮＲ３であり、ここでＲ３は水素原子または１〜４個の炭素原子を有するアルキル基であり、
ｎは１〜６、好ましくは２〜４、の正の整数であり、
ｍは１〜６、好ましくは２〜４、の正の整数であり、ｎ＞１のときには、ｍは前記ｎと同一でもまたは異なっていてもよい］。
【００２０】
「アルキル」という用語は、当該炭素鎖がこの鎖に沿って１以上の二重結合を含んでなることができることを示そうとするものである。
【００２１】
特に好ましい態様では、本発明の化合物は、それぞれII、III、IV、ＶおよびVIと番号を付けた下式から選択されるカチオン性脂質を含んでなる。
【化２】
2004528384.tif 000003
【００２２】
特に好ましい態様では、本発明の化合物は、式VIのカチオン性脂質（式中、ｎは４である）を含んでなる。好都合には、上記カチオン性脂質はC１〜Ｃ５アルキル基（例えば、メチル、エチル、プロピルなど）で更に置換されており、および／またはペルフルオロ化されている。
【００２３】
あるいは、極性頭部基スペーサーおよび疎水性部分は、少なくとも１個の極性ポリマーと少なくとも１個の疎水性ポリマーを含むコポリマーの形態で提供される。このようなコポリマーの例は、
(i)  例えば、ポリ−Ｌ−リシン、ポリスペルミン、ポリ−Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル−メタクリルアミド−ｂ−ポリ（トリメチルアンモニオエチルメタクリレートクロリド）、Ｎ−セチルピリジニウムブロミド、Ｎ−ドデシルピリジニウムブロミド、ポリアミドアミン、ポリエチレンイミン、スペルミジン、プロタミン、ポリ（４−ビニルピリジン−stat−Ｎ−エチル−４−ビニルピリジニウムブロミド）、ポリ（４−ビニルピリミジン−stat−Ｎ−エチル−４−ビニルピリジニウムブロミド−stat−Ｎ−セチル−４−ビニルピリジニウムブロミド、ポリ（４−ビニルピリミジニウム）、またはポリ（２−ジメチルアミノエチルメタクリレート）のようなカチオン性ポリマー、または
(ii)  例えば、ポリ（アルキルアクリル酸）、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド−メタクリル酸）、ポリ（乳酸）、ポリ（アクリル酸）、またはポリ（アスパラギン酸）のようなアニオン性ポリマー
からなる群より選択される極性頭部基スペーサー、および
ポリ（β−ベンジル−Ｌ−アスパルテート）、ポリ（ε−カプロラクトン）、ポリスチレン、またはポリ（メチルメタクリレート)のような疎水性部分、または上記疎水性部分の任意のもの
を含んでなるものである。
【００２４】
当業者であれば、通常の知識を用いてこれらのコポリマーを容易にデザインすることができる。
【００２５】
本発明の化合物の第三成分は、親水性ポリマー(iii)にある。本明細書で用いる「親水性ポリマー」という用語は、ヒドロキシ、アミノ、ポリオール、糖（ピラノースまたはフラノース）、または親水性ペプチド関連ポリマーを包含するがこれらに限定されないポリマーを表す。本発明の親水性ポリマーは、好ましくは、ポリアルキルエーテル、ガングリオシドＧｍ１、ポリビニルピロリドン、ポリアルキルオキサゾリン（例えば、ポリメチルオキサゾリン、ポリエチルオキサゾリン、ポリヒドロキシプロピルオキサゾリンなど）、ポリアルキルアクリルアミド（例えば、ポリヒドロキシプロピルメタクリルアミド、ポリメタクリルアミド、ポリジメチルアクリルアミドなど）、ポリアルキルアクリレート（例えば、ポリヒドロキシプロピルメタクリレート、ポリヒドロキシエチルアクリレートなど）、ポリアルキルセルロース（例えば、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロースなど）、ポリアスパルタミド、テトリトール、ペンチトール、ヘキシトール（すなわち、マンニトール、ソルビトール）、ダルシトールなどからなる群より選択される。更に好ましい態様によれば、親水性ポリマーは、例えば、ポリビニルメチルエーテルまたはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、および例えばポリメチルエチレングリコール、ポリヒドロキシプロピレングリコール、ポリプロピレンイミングリコール、ポリメチルプロピレングリコール、およびポリヒドロキシプロピレンオキシドのような関連ホモポリマー、またはポリエチレン／ポリプロピレングリコールのような低級アルコキシモノマーのヘテロポリマーである。有利には、これらのポリマーは、分子量が少なくとも約１２０ダルトン（Ｄａ）から約２０，０００ダルトン（Ｄａ）である。ポリエチレングリコールまたはポリプロピレングリコールのようなポリアルキルエーテル、またはメトキシ−またはエトキシ−キャップした類似体は、様々なポリマーサイズ、例えば、１２０〜２０，０００ダルトンの分子量で商業的に得ることができる。あるいは、ホモまたはヘテロポリマーは、所望なモノマー組成およびサイズを得るための既知のポリマー合成法によって形成することができる。一つの好ましいポリアルキルエーテルはＰＥＧであり、特に分子量が約１，０００〜約５，０００ダルトン（Ｄａ）、更に好ましくは、約２，０００Ｄａのものである。本発明の化合物は、前記分子の極性頭部基スペーサーにカップリングした１個以上の同一または異なる親水性ポリマーを含んでなることができる。
【００２６】
本発明の範囲内における「カップリングした」とは、親水性ポリマーおよび/または疎水性部分が上記極性頭部基スペーサーに共役的または非共役的に結合していることを意味する。明確化のために、本発明の化合物では、極性頭部基スペーサーと親水性ポリマーは、疎水性部分の介在によってカップリングしていないことが示される。
【００２７】
「共有結合」とは、反応性官能基を介し、必要に応じて架橋剤または他の活性剤が介在使用されているカップリングを表す（例えば、Bioconjugate techniques 1996; G Hermanson監修; Academic Pressを参照されたい）。極性頭部基スペーサー（Gao X. et al., Gene Therapy, 1995, 2, 710-722）および／または親水性ポリマーおよび／または疎水性部分を修飾して、例えば、活性化カルボニル基（イン・シテューで活性化したものなど）またはイミドエステルでの置換により、α，β−不飽和カルボニル基での付加により、飽和炭素原子またはヘテロ原子での還元的アミノ化、親核置換により、芳香族環での反応などにより親水性ポリマーおよび／または疎水性部分のカップリングを行うことができる。特に、カップリングは、ホモ二官能価またはヘテロ二官能価架橋剤を用いて行うことができる。グルタルアルデヒド、コハク酸およびＤＭＳ（ジメチルスベルイミデート）のようなビスイミドエステルなどのホモ二官能価架橋剤を用いて、極性頭部基スペーサーのアミン基を親水性ポリマーにカップリングすることができる。多数の例が、当業者には周知のBioconjugate techniques（(1996) 188-228; G Hermanson監修; Academic Press）に示されている。ヘテロ二官能価架橋剤としては、アミン反応性とスルフヒドリル反応性基、カルボニル反応性とスルフヒドリル反応性基、およびスルフヒドリル反応性基と光反応性リンカーを両方とも有する者が挙げられる。適当なヘテロ二官能価架橋剤は、例えば、Bioconjugate techniques（(1996) 229-285; G Hermanson監修; Academic Press）またはＷＯ９９／４０２１４号公報に記載されている。例は、例えば、ＳＰＤＰ（Ｎ−スクシンイミジル＝３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート）、ＳＭＢＰ（スクシンイミジル−４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチレート）、ＳＭＰＴ（スクシンイミジルオキシカルボニル−α−メチル−（α−２−ピリジルジチオ）トルエン）、ＭＢＳ（ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）、ＳＩＡＢ（Ｎ−スクシンイミジル（４−ヨードアセチル）アミノベンゾエート）、ＧＭＢＳ（γ−マレイミドブチリルオキシ）スクシンイミドエステル）、ＳＩＡＸ（スクシンイミジル−６−ヨードアセチルアミノヘキソネート、ＳＩＡＣ（スクシンイミジル−４−ヨードアセチルアミノメチル）、ＮＰＩＡ（ｐ−ニトロフェニルヨードアセテート）である。他の例は、炭水化物含有分子（例えば、env糖タンパク質、抗体）をスルフヒドリル反応性基にカップリングするのに有用である。例としては、ＭＰＢＨ（４−（４−Ｎ−マレイミドフェニル）酪酸ヒドラジド）およびＰＤＰＨ（４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシル−ヒドラジド（Ｍ２Ｃ２Ｈおよび３−２（２−ピリジルジチオ）プロピオニルヒドラジド）が挙げられる。更に、ＡＳＩＢ（ｌ−（ｐ−アジドサリチルアミド）−４−（ヨードアセタミド）ブチレート）、またはFrisch et al. (Bioconjugate Chem. 7 (1996) 180-186)の報告に記載されているチオール反応性試薬を挙げることもできる。
【００２８】
好ましい態様では、本発明の化合物は、式VIIを有する：
【化３】
2004528384.tif 000004
［式中、
Ｒ１、Ｒ２、Ｘ、ｎおよびｍは上記の通りであり、
ｐは４〜２２０、好ましくは２２〜１１０、さらに好ましくは約４４の正の整数である］。
【００２９】
有利な態様によれば、本発明の化合物は、式VIIIを有する：
【化４】
2004528384.tif 000005
［式中、
ｐは４〜２２０、好ましくは２２〜１１０、さらに好ましくは４４（ｐｃＴＧ２３１）の正の整数である］。
【００３０】
本発明は、
(a)  少なくとも１個の本発明の化合物と、
(b)  少なくとも１個の目的の物質と
を含んでなる複合体にも関する。
【００３１】
「目的の物質」とは、好ましくは電荷の数に制限がない帯電分子を意味する。好ましくは、前記分子は目的のアニオン性物質であり、更に好ましくは、これはタンパク質と核酸分子からなる群より選択される。好ましい態様によれば、前記の目的のアニオン性物質は、核酸分子である。
【００３２】
本発明の範囲で用いられる「核酸」または「核酸分子」という用語は、ＤＮＡまたはＲＮＡ、またはそれらの断片またはそれらを組み合わせたものであって、一本鎖または二本鎖の直鎖状または環状の天然または合成の改質したまたは改質していないものであり（改質した例については、米国特許第５５２５７１１号明細書、米国特許第４７１１９５５号明細書、米国特許第５７９２６０８号明細書、または欧州特許第３０２ １７５号明細書を参照）、大きさに制限はない。これは、とりわけ、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、または、これらのＲＮＡをコードするＤＮＡであることがある。「ポリヌクレオチド」、「核酸分子」、および「核酸」は、本発明に関しては同義語である。核酸は、直鎖状または環状ポリヌクレオチドの形態であることができ、好ましくは、プラスミドの形態であることができる。核酸は、例えば、アンチセンスまたはリボザイム機能について細胞に送達しようとするオリゴヌクレオチドであることもできる。本発明によれば、核酸は、好ましくは裸のポリヌクレオチド(Wolff et al., Science 247 (1990), 1465-1468)であるか、または少なくとも１個の化合物、例えば、ポリペプチド、好ましくはウイルス性ポリペプチド、またはカチオン性脂質、またはカチオン性ポリマー、またはそれらの組合せであって、ポリヌクレオチド細胞中への摂取に関与しているもの（総説については、Ledley, Human Gene Therapy 6 (1995), 1129-1144を参照されたい）、またはプロトン性の極性化合物（例は、本出願明細書で下文にまたは欧州特許第８９０３６２号明細書に示される）のような少なくとも１個の化合物を用いて処方される。あるいは、核酸は、ウイルス性ベクター（アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、ポックスウイルスベクターなど）も意味する。本発明で用いる「ウイルス性ベクター」という用語は、ベクターゲノム、ウイルス粒子（すなわち、ウイルスゲノムを包含するウイルスキャプシド）並びにエンプティーウイルスキャプシドを包含する。
【００３３】
「プラスミド」とは、染色体外の環状ＤＮＡを表す。プラスミドの選択は、極めて広範である。プラスミドは、様々な製造業者から購入することができる。適当なプラスミドとしては、ｐＢＲ３２２ (Gibco BRL)、ｐＵＣ (Gibco BRL)、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ (Stratagene)、ｐＲＥＰ４、ｐＣＥＰ４ (Invitrogene)、ｐＣＩ (Promega)、およびｐＰｏｌｙ (Lathe et al., Gene 57 (1987), 193-201)が挙げられるが、これらに限定されない。このようなプラスミドを分子生物学の手法によって作製することもできる(Sambrook et al., Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor (1989), NY)。プラスミドは、トランスフェクション細胞（例えば、細胞栄養要求性、抗生物質耐性の相補性による）、安定化要素（例えば、ｃｅｒ配列; Summers and Sherrat, Cell 36 (1984), 1097-1103)、または組込み要素（例えば、ＬＴＲウイルス配列）を選択または同定するための選択遺伝子を含んでなることもできる。
【００３４】
好ましくは、核酸分子は、転写および翻訳を行って目的のポリペプチドとそれを発現できるようにする要素（すなわち、発現カセット）を生成することができる少なくとも１個の目的のコード遺伝子配列（すなわち、転写単位）を含む。核酸を遺伝子発現に適当な環境に置くとき核酸がこの適正な遺伝情報を含む場合には、転写単位はコードされた遺伝子産物を発現する。発現のレベルおよび細胞特異性は、かなりの程度までは関連プロモーターの強度と起源および関連エンハンサー要素の存在と活性化によって変化する。従って、好ましい態様では、転写調節要素としてはＣＭＶプロモーター／エンハンサーのようなプロモーター／エンハンサー配列が挙げられる。しかしながら、当該技術分野で熟練した者であれば、様々な他のプロモーターおよび／またはエンハンサー配列が知られており、これらは、任意のウイルス性生物、原核生物、例えば細菌、または真核生物から得ることができ、構成的または調節可能であり、真核細胞、特にターゲット細胞または組織での発現に適当であることを理解するであろう。更に正確には、ターゲット細胞または組織による発現に必要なこの遺伝情報は、（遺伝子配列がＤＮＡであるときには）この遺伝子配列のＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡへの転写、および必要ならば、ｍＲＮＡのポリペプチドへの翻訳に必要な総ての要素を含んでなる。様々な脊椎動物系での使用に適当なプロモーターは、広く文献に記載されている。適当なプロモーターとしては、アデノウイルスＥ１ａ、ＭＬＰ、ＰＧＫ（ホスホグリセロキナーゼ；Adra et al. Gene 60 (1987) 65-74; Hitzman et al. Science 219 (1983) 620-625）、ＲＳＶ、ＭＰＳＶ、ＳＶ４０、ＣＭＶまたは７．５ｋ、ワクシニアプロモーター、誘導プロモーター、ＭＴ（メタロチオネイン; Mc Ivor et al., Mol. Cell Biol. 7 (1987), 838-848）、α−１アンチトリプシン、ＣＦＴＲ、免疫グロブリン、α−アクチン(Tabin et al., Mol. Cell Biol. 2 (1982), 426-436)、ＳＲ(Takebe et al., Mol. Cell. Biol. 8 (1988), 466-472)、初期ＳＶ４０（シミアン(Simian)ウイルス）、ＲＳＶ（ラウス肉腫ウイルス）、ＬＴＲ、ＴＫ−ＨＳＶ−１、ＳＭ２２（ＷＯ９７／３８９７４号公報）、デスミン（ＷＯ９６／２６２８４号公報）および初期ＣＭＶ（サイトメガロウイルス; Boshart et al. Cell 41 (1985) 521）などが挙げられるが、これらに限定されない。あるいは、Chakrabarti et al. (1997, Biotechniques 23,1094-1097), Hammond et al. (1997, J. Virological Methods 66,135-138)またはKumar and Boyle (1990, Virology 179, 151-158)に記載されているような合成プロモーター、並びに初期および後期ポックスウイルスプロモーターの間のキメラプロモーターを用いることができる。あるいは、腫瘍細胞で活性なプロモーターを用いることができる。適当な例としては、ＭＵＣ−１（乳癌および前立腺癌で過剰発現; Chen et al., J. Clin. Invest. 96 (1995), 2775-2782）、ＣＥＡ（癌胎児性抗原;結腸癌で過剰発現; Schrewe et al., Mol. Cell. Biol. 10 (1990), 2738-2748）、トリプシナーゼ（黒色腫で過剰発現; Vile et al., Cancer Res. 53 (1993), 3860-3864）、ＥｒｂＢ−２（乳癌および膵臓癌で過剰発現; Harris et al., Gene Therapy 1 (1994), 170-175）、およびα−フェトプロテイン（肝臓癌で過剰発現; Kanai et al., Cancer Res. 57 (1997), 461-465）からなる群より選択されるタンパク質、またはそれらの組合せをコードする遺伝子から単離さ��たプロモータが挙げられるが、これらに限定されない。本発明に関しては、初期ＣＭＶプロモーターが好ましい。
【００３５】
核酸は、イントロン配列、ターゲッティング配列、輸送配列、複製または組込みに関与する配列を含むこともできる。これらの配列は文献に報告されており、当業者であれば容易に得ることができる。核酸は、特異的成分、例えばスペルミン、を用いて修飾して、安定化させることもできる。例えば本発明のペプチドのような特異的ポリペプチドとの核酸の結合を容易にするために、例えば化学修飾によって核酸を置換することもできる。本発明によれば、核酸は、これが導入されるターゲット細胞に対して相同性または非相同性であることができる。
【００３６】
好ましい態様では、核酸は、治療分子（すなわち、治療遺伝子）である遺伝子産物をコードする少なくとも１個の目的の遺伝子配列を含む。「治療分子」は、患者、特に疾患または疾病症状を示している患者またはこの疾患または症状から保護すべき患者、に投与しまたは発現するときに、薬理または防御活性を有する分子である。このような薬理または防御活性は、疾患または疾病の経過または症状に対する有益な効果に関係することが予想されるものである。当業者が本発明の応用の経過において治療分子をコードする遺伝子を選択するするときには、一般に当業者の選択を以前に得られた結果に関連させ、請求した発明の実施以外に過度の実験を行うことなく、このような薬理特性を得ることを合理的に期待することができる。本発明によれば、目的の配列は、これが導入されるターゲット細胞に対して相同性または非相同性であることができる。有利なことには、目的の配列は、ポリペプチド、特に治療または予防効果を示す治療または予防ポリペプチドの全部または一部をコードする。ポリペプチドは、大きさおよびグリコシル化されているかまたはいないかとは関係ないポリヌクレオチドの任意の翻訳産物であると理解され、ペプチドおよびタンパク質を包含する。治療ポリペプチドとしては、主な例として動物またはヒト生体における欠陥または欠損タンパク質を保証することができるポリペプチド、または毒性効果を介して体内から有害な細胞を制限しまたは除去する作用を行うものが挙げられる。それらは、体液性または細胞性応答、または両方を刺激する内在性抗原として作用する免疫付与ポリペプチドであることもできる。
【００３７】
下記のコード遺伝子配列は、特に興味深いものである：  例えば、サイトカイン（α、βまたはγ−インターフェロン、インターロイキン（ＩＬ）、特にＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−１０またはＩＬ−１２、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、コロニー刺激因子（例えば、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｃ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ）、免疫刺激ポリペプチド（例えば、Ｂ７．１、Ｂ７．２、ＣＤ４０、ＣＤ４、ＣＤ８、ＩＣＡＭなど）、細胞または核受容体、受容体リガンド（例えば、ｆａｓリガンド、凝固因子（例えば、FVIII、FIX）、増殖因子（例えば、トランスフォーミング増殖因子ＴＧＦ、繊維芽細胞増殖因子ＦＧＦなど）、酵素（例えば、ウレアーゼ、レニン、トロンビン、メタロプロテイナーゼ、酸化窒素シンターゼＮＯＳ、ＳＯＤ、カタラーゼ）、酵素阻害剤（例えば、α１−アンチトリプシン、アンチトロンビンIII、ウイルスプロテアーゼ阻害剤、プラスミノーゲンアクチベーターインヒビターＰＡＩ−１）、ＣＦＴＲタンパク質、インスリン、ジストロフィン、クラスＩまたはIIのＭＨＣ抗原（主要組織適合遺伝子複合体）または１個以上の細胞遺伝子の発現を調節／調整することができるポリペプチド、細菌、寄生生物またはウイルス感染またはその展開を阻害することができるポリペプチド（例えば、抗原性ポリペプチド、抗原性エピトープ、競合により固有タンパク質の作用を阻害するトランスドミナント変異体(transdominant variants)）、アポトーシスインデューサーまたはインヒビター（例えば、Ｂａｘ、Ｂｃｌ２、ＢｃｌＸ）、細胞分裂抑制剤（例えば、ｐ２１、ｐｌ６、Ｒｂ）、アポリポタンパク質（例えば、ＡｐｏＡＩ、ＡｐｏＡIV、ＡｐｏＥ）、血管新生の阻害剤（例えば、アンギオスタチン、エンドスタチン）、血管新生ポリペプチド（例えば、血管内皮増殖因子ＶＥＧＦのファミリー、ＦＧＦファミリー、ＣＴＧＦ、Ｃｙｒ６１およびＮｏｖなどのＣＣＮファミリー）、酸素ラジカル掃去剤、抗腫瘍効果を有するポリペプチド、抗体、毒素、免疫毒素、およびマーカー（例えば、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ）をコードする遺伝子、または、臨床症状の治療または予防に有用であると当該技術分野で認められている任意の目的の他の遺伝子。遺伝性機能不全の治療に関しては、欠陥遺伝子の機能的対立遺伝子、例えば、血友病ＡまたはＢに関して遺伝子コード因子VIIIまたはIX、筋疾患に関してジストロフィン（またはミニジストロフィン）、糖尿病に関してインスリン、嚢胞性繊維症に関してＣＦＴＲ（嚢胞性繊維症膜貫通調節タンパク質を用いることができる。適当な抗腫瘍遺伝子としては、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、単純ヘルペスウイルス１型のチミジンキナーゼ（ＴＫ−ＨＳＶ−１）のような細胞傷害性産物、リシン、細菌毒素、それぞれＵＰＲＴアーゼ（ウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼ）およびＣＤアーゼ（シトシンデアミナーゼ）活性を有する酵母遺伝子ＦＣＹ１および／またはＦＵＲ１の発現産物、抗体、細胞分割または形質導入シグナルを阻害するポリペプチド、癌抑制遺伝子（ｐ５３、Ｒｂ、ｐ７３）、宿主免疫系を活性化するポリペプチド、腫瘍関連抗原（ＭＵＣ−１、ＢＲＣＡ−１、ＨＰＶ初期または後期抗原（Ｅ６、Ｅ７、Ｌ１、Ｌ２）をコードする遺伝子であって、必要に応じてサイトカイン遺伝子と組み合わせたものが挙げられるが、これらに限定されない。ポリヌクレオチドも、抗体をコードすることができる。これに関して、「抗体」という用語は、二重または多重抗原またはエピトープ特異性を有する任意のクラスのキメラ抗体およびハイブリッド抗体の全免疫グロブリン、およびハイブリッド断片および抗イディオタイプなどのＦ(ａｂ)′２、Ｆａｂ′、Ｆａｂのような断片を包含する（米国特許第４，６９９，８８０号明細書）。有利なことには、上記核酸は免疫付与ポリペプチドであるポリペプチドの全部または一部をコードし、内在性免疫原として作用し、細胞内ウイルスなどの感染性病原体または腫瘍細胞に対して体液性または細胞性応答、または両方を誘発する。「免疫付与ポリペプチド」とは、上記ポリペプチドがトランスフェクション細胞で産生されるときに、治療を受ける患者の免疫応答に関与することを意味する。更に具体的には、ＡＰＣのようなマクロ飲細胞(macropinocytecells)で産生されまたはこれによって吸収される上記ポリペプチドは処理され、生成断片はＭＨＣクラスＩおよび／またはII分子によりこれらの細胞の表面に提示され、特異免疫応答を誘発する。
【００３８】
核酸は、１個以上の目的の遺伝子を含んでなることができる。このとき、自殺遺伝子産物をコードする遺伝子とサイトカイン遺伝子（例えば、α、βまたはγインターフェロン、インターロイキン、好ましくはＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−１０またはＩＬ−１２、ＴＮＦ因子、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｃ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦなどから選択されるもの）、免疫刺激遺伝子（例えば、Ｂ７．１、Ｂ７．２、ＩＣＡＭ）またはケモカイン(chimiokine)遺伝子（例えば、ＭＩＰ、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＣＰ１）との組合せが有利である。異なる遺伝子発現は、ユニークプロモーター（ポリシストン性カセット）または独立プロモーターによって制御することができる。更に、それらは、同一または反対方向での核酸のユニーク部位または様々な部位に挿入することができる。
【００３９】
目的のコード遺伝子配列は、分子生物学の通常の手法（ＰＣＲ、適当なプローブを用いるクローニング、化学合成）によって任意の生物または細胞から単離することができ、また必要であれば、その配列を突然変異誘発、ＰＣＲまたは任意の他のプロトコールによって変更することができる。
【００４０】
あるいは、「目的の物質」とは、変異または修飾されたペプチド、ペプチド様分子、抗体またはその断片、キメラ抗体などのペプチド（ポリペプチド、タンパク質およびペプチドは同義語である）である。本発明に関連して、好ましいタンパク質は、再狭窄、高血圧を阻害して、心臓収縮活性または心臓細胞生存を改良することができるもの（例えば、脈管形成因子、細胞性受容体またはイオンホメオスターシスに関与するチャンネル）である。
【００４１】
「複合体」という用語は、少なくとも１個の本発明の化合物と少なくとも１個の帯電した、好ましくはアニオン性物質との分子の集合であって、例えば、イオン的相互作用によって、ジスルフィドまたは水素結合を形成することによって、疎水性相互作用または共有結合によって好ましくは可逆的に互いに結合しているものを表す。好ましくは、本発明の化合物は、少なくともイオン的相互作用の中間生成物によって目的のアニオン性物質と相互作用し、結合することができる。このような複合体は、以下に記載する要素を含むこともできる。
【００４２】
実施例に示されるように、本発明の複合体は、目的の物質の細胞への非特異的導入を減少させ、好ましい場合には除去するための有利な特性を提示する（例えば、図２を参照されたい）。
【００４３】
特定の態様によれば、本発明の複合体は、
(c)  少なくとも１個の置換部分、および／または
(d)  少なくとも１個のターゲッティング成分、および／または
(e)  膜崩壊を引き起こすことができる少なくとも１個のペプチド、および／または
(f)  カチオン性脂質およびカチオン性ポリマーからなる群より選択される少なくとも１個のカチオン性化合物、および／または
(g)  少なくとも１個のコリピド(colipid)
をさらに含んでなる。
【００４４】
置換部分(c)は、本発明の複合体に含まれる要素のいずれかに存在することができる。好ましい態様によれば、上記複合体に含まれる少なくとも１個の本発明の化合物は、少なくとも１個の置換部分で置換される。広義には、従って、本発明は更にこのような置換された本発明の化合物にも関する。上記置換は、実際には、例えば化合物、またはイン・ビトロまたはイン・ビボ投与後にそれらを組込む複合体の分布を可視化することができる少なくとも１個の標識分子（例えば、ＵＳ-Ａ-４７１１９５５号明細書に開示の分子を参照）、組織および／または細胞ターゲッティング分子（すなわち、リガンド）またはアンカーリング(anchoring)分子の付加であることができる。科学文献に広く記載されているこのような置換要素により、特異的細胞および／または組織型をターゲッティングすることができ、細胞中への浸透、エンドソームのリーシス、または核への細胞内輸送が促進される。これらの要素は、全部または一部が、糖、グリコール、ペプチド（例えば、ＧＲＰ、ガストリン放出ペプチド）、オリゴヌクレオチド、脂質、ホルモン、ビタミン、抗原、抗体（またはその断片）、特異的膜受容体リガンド、アンチリガンドと反応することができるリガンド、フソゲン(fusogen)ペプチド、核局在化ペプチド、または上記化合物の組合せ、 例えば肝細胞の表面上のアシアログリコプロテイン受容体に標的設定するためのガラクトシル部分、膜融合のためのインフルエンザウイルス血球凝集素のＨＡ−２サブユニットから誘導されるＩＮＦ−７フソゲンペプチド(Plank et al. 1994, J. Biol. Chem. 269, 12918-12924)、またはＳＶ４０ウイルスのＴ抗原(Lanford and Butel, 1984, Cell 37, 801-813)またはエプスタイン−バーウイルスのＥＢＮＡ−１タンパク質(Ambinder et al., 1991, J. Virol. 65, 1466-1478)から誘導した核シグナル配列から構成されていてもよい。
【００４５】
一つの具体的態様では、置換は、本発明による化合物の極性頭部基スペーサーの第二または第一窒素原子の少なくとも一方で起こる。あるいは、置換は、ＣＨまたはＣＨ２の炭素原子のような非反応性基で起こる。好ましい態様では、上記置換は、開示された化合物で構成された親水性ポリマーのレベルで、更に好ましくは上記ポリマーの一方の末端で行われる。
【００４６】
置換部分の組込みは、本発明の複合体を形成する要素の一つの合成、更に具体的には当業者には周知の方法（例えば、反応性基の使用など）を用いて特許請求の化合物の合成中に行うことができる。あるいは、本発明の新たに合成した化合物または新たに形成した複合体について行うこともできる。
【００４７】
特別な態様によれば、置換部分は、上記のように、ホモ二官能価またはヘテロ二官能価架橋剤を包含するまたは包含しない共有にまたは非共有結合によって親水性、疎水性または極性領域、またはそれらの組合せのいずれかのレベルで、本発明の化合物にカップリングすることができる。
【００４８】
本発明の好ましい態様では、置換部分は、細胞および／または組織を認識して結合することができるリガンド部分である。本発明の特定の態様では、本発明の化合物は、細胞および／または組織を認識して結合することができるリガンド部分で置換される。「細胞および／または組織を認識して結合することができるリガンド部分」という用語は、細胞膜受容体を認識して、特異的にこれと結合することができるリガンド部分（すなわち、アンチリガンド）を表す。上記細胞膜表面受容体は、上記リガンドに高親和性で、好ましくは高特異性で結合することができる分子または構造である。上記細胞膜表面受容体は、好ましくは特定の細胞または組織に特異的であり、すなわちこれは、大部分は別の種類の細胞および／または組織よりはむしろ一つの種類の細胞および／または組織（例えば、肝細胞の表面上のアシアログリコプロテイン受容体を標的設定するためのガラクトシル残基）に見られる。細胞膜表面受容体は、上記リガンド（すなわち、本発明の化合物または複合体）にカップリングした任意の分子の細胞および／または組織ターゲッティングを促進する。
【００４９】
本発明に関連して用いることができる多数の対リガンド部分／アンチリガンドは、広く文献に記載されている。このようなリガンド部分は、本発明の化合物または複合体に所定のアンチリガンド分子または少なくとも１個のターゲット細胞および／またはターゲット組織の表面に局在化したアンチリガンドのクラスに結合する能力を付与することができる。適当なアンチリガンド分子としては、細胞特異的マーカー、組織特異的マーカー、細胞性受容体、ウイルス性抗原、抗原性エピトープおよび腫瘍関連マーカーからなる群より選択されるポリペプチドが挙げられるが、これらに限定されない。アンチリガンド分子は、更に１種類以上の糖、脂質、糖脂質または抗体分子からなるかまたはを含んでなることがある。本発明によれば、リガンド部分は、例えば脂質、糖脂質、ホルモン、糖、ポリマー（例えば、ＰＥＧ、ポリリシン、ＰＥＩ）、オリゴヌクレオチド、ビタミン、抗原、レクチンの全部または一部、ＪＴＳ１（ＷＯ９４／４０９５８号公報）などのようなポリペプチド、抗体またはその断片、またはそれらの組合せであることができる。
【００５０】
一態様によれば、本発明で用いられるリガンド部分は、最小長さが７アミノ酸のペプチドまたはポリペプチドである。これは、天然ポリペプチド、または天然ポリペプチドから誘導されたポリペプチドである。「誘導されたポリペプチド」とは、上記ポリペプチドが、（ａ）天然ポリペプチドの配列に関して１個以上の修飾（例えば、１個以上の残基の付加、欠失および／または置換）、（ｂ）天然に存在するアミノ酸を含まないアミノ酸類似体、または（ｃ）置換結合、または（ｄ）当該技術分野で知られている他の修飾、または（ａ）〜（ｄ）の場合の組合せを含んでいることを意味する。リガンド部分として適当なポリペプチドは、様々な起源の配列を融合することによって得られる変異およびキメラポリペプチド、例えば、マウス抗体の可変領域とヒト免疫グロブリンの定常領域を組み合わせているヒト化抗体などを包含する。更に、このようなポリペプチドは、直鎖状または環状構造を有することができる（例えば、システイン残基によりポリペプチドリガンドの両端でのフランキングによる）。更に、リガンド部分として用いられるポリペプチドは、化学的基の置換または付加によるその元の構造の修飾（例えば、グリコシル化、アルキル化、アセチル化、アミド化、リン酸化、スルフヒドリル基の付加など）を包含することができる。本発明は、リガンド部分を検出可能にする修飾も企図する。このため、検出可能な部分を用いる修飾を考えることができる（すなわち、シンチレーショングラフ、放射能または蛍光部分、または色素標識など）。適当な放射能標識としては、Ｔｃ９９ｍ、Ｉ１２３およびＩｎ１１１が挙げられるが、これらに限定されない。このような検出可能な標識は任意の通常の手法によってリガンド部分に結合することができ、診断目的に用いることができる（例えば、腫瘍細胞の画像化）。
【００５１】
一つの特別な態様では、アンチリガンド分子は抗原（例えば、ターゲット細胞特異抗原、疾患特異抗原、遺伝子工学処理したターゲット細胞の表面で特異的に発現した抗原）であり、リガンド部分は抗体、その断片または最小認識単位（すなわち、まだ抗原特異性を提示している断片）、例えばマニュアルに詳細に記載されているもの（例えば、Immunology, third edition 1993, Roitt, Brostoff and Male, Gambli, Mosby監修）である。リガンド部分はモノクローナル抗体であることができる。これらの抗原の多くに結合するモノクローナル抗体は既知のものであるが、とにかくモノクローナル抗体の手法に関する現在の手法を用いて、ほとんどの抗原に対して抗体を調製することができる。リガンド部分は、抗体の一部（例えば、Ｆａｂ断片）または合成抗体断片（例えば、ＳｃＦｖ）であることができる。
【００５２】
選択した抗原に対する適当なモノクローナル抗体は、既知の手法、例えば「Monoclonal Antibodies: A manual of techniques」, H. Zola (CRC Press, 1988)および「Monoclonal Hybridoma Antibodies: Techniques and Applications」, J. G. R. Hurrell (CRC Press, 1982)に開示されている手法によって調製することができる。適当に調製された非ヒト抗体は、例えば、マウス抗体のＣＤＲ領域をヒト抗体の枠組に挿入することによって「ヒト化」することができる。更に、抗体の可変重（ＶＨ）と可変軽（ＶＬ）ドメインは抗原認識に関与しており、齧歯類起源の可変ドメインをヒト起源の定常ドメインに融合させ、生成する抗体が齧歯類の親の抗体の抗原特異性を保持するようにすることができる(Morrison et al (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81,6851-6855)。
【００５３】
抗体の抗原特異性は、Ｆａｂ様分子(Better et al (1988) Science 240,1041)、Ｆｖ分子(Skerra et al (1988) Science 240, 1038)、ＳｃＦｖ分子であって、ＶＨおよびＶＬパートナードメインが柔軟なオリゴペプチド(Bird et al (1988) Science 242,423; Huston et al (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85,5879)と単離したＶドメインを含んでなるｄＡｂ(Ward et al (1989) Nature 341,544)を介して結合しているものを包含する可変ドメインによって賦与される。特異的結合部位を保持する抗体断片の合成に関与する手法の一般的総説については、Winter & Milstein (1991) Nature 349,293-299を参照されたい。
【００５４】
有利な態様によれば、 リガンド部分は全抗体よりは抗体断片から選択される。補体結合のような全抗体の有効な機能は除去される。ＳｃＦｖおよびｄＡｂ抗体断片は、１個以上の他のポリペプチドとの融合体として発現されることがある。最小認識単位は、Ｆｖ断片の相補性決定領域（ＣＤＲ）の１個以上の配列から誘導することができる。全抗体およびＦ(ａｂ′)２断片は「二価」である。「二価」とは、上記抗体およびＦ(ａｂ′)２断片が２個の抗原結合部位を有することを意味する。対照的に、Ｆａｂ、Ｆｖ、ＳｃＦｖ、ｄＡｂ断片および最小認識単位は一価であり、１個の抗原結合部位しか持たない。
【００５５】
もう一つの態様では、リガンド部分はウイルス感染細胞をターゲット設定することができ、ウイルス成分（例えば、エンベロープ糖タンパク質）を認識して結合することができ、またはウイルス生物学により干渉することができる（例えば、エントリーまたは複製）。例えば、ＨＩＶ（ヒト免疫不全ウイルス）に感染した細胞は、ＨＩＶエンベロープのエピトープに特異的なリガンド部分、例えば、膜貫通糖タンパク質ｇｐ４１の高度に保存されたエピトープを認識する２Ｆ５抗体(Buchacher et al., 1992, Vaccines 92,191-195)から誘導したリガンド部分を用いて、または細胞性受容体ＣＤ４（例えば、ＣＤ４分子の細胞外ドメイン）へのＨＩＶ結合を妨げるリガンド部分を用いてターゲッティングすることができる。
【００５６】
もう一つの態様では、リガンド部分により腫瘍細胞をターゲット設定することができ、腫瘍状態に関係した分子、例えば、腫瘍特異抗原、腫瘍細胞で示差的にまたは過剰発現した細胞タンパク質、または癌関連ウイルスの遺伝子産物を認識して結合することができる。
【００５７】
腫瘍特異抗原の例としては、乳癌に関係したＭＵＣ−１（Hareuveni et al., 1990, Eur. J. Biochem 189, 475-486）、乳癌および卵巣癌に関係した突然変異したＢＲＣＡ１およびＢＲＣＡ２遺伝子によってコードされる産物（Miki et al., 1994, Science 226, 66-71; Futreal et al., 1994, Science 226, 120-122; Wooster et al., 1995, Nature 378, 789-792）、結腸癌に関係したＡＰＣ（Polakis, 1995, Curr. Opin. Genet. Dev. 5, 66-71）、前立腺癌に関係した特異抗原（ＰＳＡ）（Stamey et al., 1987, New England J. Med. 317, 909）、結腸癌に関係した癌胎児性抗原（ＣＥＡ）(Schrewe et al., 1990, Mol. Cell. Biol. 10,2738-2748)、黒色腫に関係したトリプシナーゼ(Vile et al., 1993, Cancer Res. 53, 3860-3864)、黒色腫細胞で多数発現するメラニン細胞刺激ホルモン（ＭＳＨ）の受容体、乳癌および膵臓癌に関係したＥｒｂＢ−２（Harris et al., 1994, Gene Therapy 1, 170-175）、および肝臓癌に関係したα−フェトプロテイン（Kanai et al., 1997, Cancer Res. 57, 461-465）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５８】
本発明で用いられる特別なリガンド部分は、ＭＵＣ−１抗原を認識して結合することができ、従ってＭＵＣ−１陽性の腫瘍細胞をターゲッティングすることができる抗体の断片である。更に好ましいリガンド部分は、ＭＵＣ−１抗原の縦列反復領域を認識するＳＭ３モノクローナル抗体のｓｃＦｖ断片である（Burshell et al., 1987, Cancer Res. 47, 5476-5482; Girling et al., 1989, Int J. Cancer 43, 1072-1076; Dokurno et al., 1998, J. Mol. Biol. 284, 713-728）。
【００５９】
腫瘍細胞で示差的にまたは過剰発現した細胞タンパク質の例としては、ある種のリンパ腫で過剰発現したインターロイキン２（ＩＬ−２）、肺癌細胞、膵臓、前立腺および胃腫瘍で過剰発現したＧＲＰ（ガストリン放出ペプチド）(Michael et al., 1995, Gene Therapy 2, 660-668)の受容体、ＴＮＦ（腫瘍壊死因子）受容体、上皮増殖因子受容体、Ｆａｓ受容体、ＣＤ４０受容体、ＣＤ３０受容体、ＣＤ２７受容体、ＯＸ−４０、αｖインテグリン(Brooks et al., 1994, Science 264, 569)、およびある種の血管新生増殖因子の受容体（Hanahan, 1997, Science 277, 48）が挙げられるが、これらに限定されない。これらの記載に基づけば、これらのタンパク質を認識して結合することができる適当なリガンド部分を定義することは当業者であれば可能である。例を示すと、ＩＬ−２はＩＬ−２受容体に結合するのに適当なリガンド部分である。
【００６０】
癌関連ウイルスの適当な遺伝子産物としては、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）Ｅ６およびＥ７初期ポリペプチド並びにＬ１およびＬ２後期ポリペプチド（欧州特許第０４６２１８７号明細書、米国特許第５,７４４,１３３ここうおよびＷＯ９８／０４７０５号公報）であって子宮頸癌で発現するもの、およびバーキットリンパ腫に関連したエプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）のＥＢＮＡ−１抗原（Evans et al., 1997, Gene Therapy 4,264-267）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６１】
更にもう一つの態様では、リガンド部分により組織特異的分子をターゲット設定することができる。例えば、肝細胞のターゲッティングに適当なリガンド部分としては、ＬＤＬ受容体に結合することができるＡｐｏＢ（アポリポタンパク質）、ＬＰＲ受容体に結合することができるα−２−マクログロブリン、アシアログリコプロテイン受容体に結合することができるα−１酸性糖タンパク質、およびトランスフェリン受容体に結合することができるトランスフェリンから誘導されたものが挙げられるが、これらに限定されない。活性化した内皮細胞のターゲッティングのためのリガンド部分は、シアリル−ルイス−Ｘ抗原（ＥＬＡＭ−１に結合することができる）、ＶＬＡ−４（ＶＣＡＭ−１受容体に結合することができる)、またはＬＦＡ−１（ＩＣＡＭ−１受容体に結合することができる）から誘導することができる。ＣＤ３４から誘導されるリガンド部分は、造血前駆細胞をＣＤ３４受容体への結合を介してターゲット設定するのに有用である。ＩＣＡＭ−１から誘導されるリガンド部分は、ＬＦＡ−１受容体への結合を介してリンパ細胞をターゲッティングを一層意図したものである。最後に、Ｔヘルパー細胞のターゲッティングには、ＨＩＶｇｐ−１２０またはＣＤ受容体へ結合することができるクラスIIＭＨＣ抗原から誘導されるリガンド部分を用いることができる。
【００６２】
本発明の好ましい態様では、本発明の化合物を、細胞膜受容体であって上記膜受容体がアドレナリン受容体であるものを認識して特異的に結合することができるリガンドで置換する。
【００６３】
アドレナリン受容体は、神経伝達物質およびカテコールアミンファミリーに属するホルモンの細胞膜受容体である。実際に、アドレナリン受容体は、２つのサブタイプ、αおよびβアドレナリン受容体に分割することができる。
【００６４】
αアドレナリン受容体（α１およびα２アドレナリン受容体サブタイプを包含する）は、中枢および抹消神経系の細胞または組織に見出される。例えば、α１アドレナリン受容体は、血管および血管以外の平滑筋、心臓および肝臓の細胞または組織に見出される。α２アドレナリン受容体は、シナプス前および後ニューロンに見出される。
【００６５】
βアドレナリン受容体としては、β１、β２、β３およびβ４サブタイプが挙げられる。β１アドレナリン受容体は、心臓の細胞または組織および脂肪組織に見出される。β２アドレナリン受容体は、血管、子宮および気道平滑筋の細胞または組織に見出される。β３アドレナリン受容体は、脂肪組織の細胞に見出される。β４アドレナリン受容体は、心臓の細胞または組織に見出される。
【００６６】
アドレナリン受容体を認識して特異的に結合することができるリガンドは文献に開示されているが、その既知の応用はアドレナリン受容体作動薬またはアドレナリン受容体拮抗薬としての医薬での使用に限定されており、目的の物質の細胞の方向または中への導入をターゲッティングし、それらを発現するリガンドとしてのそれらの応用は開示も示唆もされていない。本出願人らは、この後者の応用が、特にアドレナリン受容体を発現する細胞、例えば心筋細胞への核酸導入のフレームにおいて完全に実行可能であることを示した。従って、本発明は、アドレナリン受容体（すなわち、αアドレナリン受容体またはβアドレナリン受容体）を認識して特異的に結合することができるリガンドの目的の物質をそれらを発現する細胞または組織の方向または中への導入をターゲッティングするためのリガンドとしての使用にも関する。
【００６７】
アドレナリン受容体を表面で発現する細胞または組織をターゲット設定することができるリガンドの例を、下記表Ｉに示す。
【００６８】
【表１】
2004528384.tif 000006
【００６９】
上記リガンド由来の誘導体が元のリガンドと同様にアドレナリン受容体を認識して結合することができる限り、これらの誘導体を本発明に従って用いることができる。この特性は、例えば競争実験により、本出願明細書の実施例と同様に容易に分析することができる。上記化合物の化学構造は当業者にとって容易に利用でき、それらの合成は可能である。リガンドは市販されている。例えば、Sigma (St Louis, USA)カタログ(http://www.sigma-aldrich.com/)を参照されたい:
・  ５−メチルウラピジル, Sigmaリファレンス：Ｕ１０１；  正式名：５−メチル−６［［３−［４−（２−メトキシフェニル）−１−ピペラジニル］プロピル］アミノ］−１，３−ジメチルウラシル、
・  ＣＬ ３１６２４３，Sigmaリファレンス：Ｃ５９７６；  正式名：５−［（２Ｒ）−２−（［（２Ｒ）−２−（３−クロロフェニル）−２−ヒドロキシエチル］アミノ）プロピル］−１，３−ベンゾジオキソール−２，２−ジカルボキシレート、
・  オキシメタゾリン, Sigmaリファレンス：Ｏ２３７８；  正式名：２−（３−ヒドロキシ−２，６−ジメチル−４−ｔ−ブチルベンジル）−２−イミダゾリン、
・  ＢＭＹ ７３７８, Sigmaリファレンス：Ｂ１３４；  正式名：８−（２−［４−（２−メトキシフェニル）−１−ピペラジニル］エチル）−８−アザスピロ（４．５）デカン−７，９−ジオン、
・  ＢＲＬ ３７３４４Ａ, Sigmaリファレンス：Ｂ１６９；  正式名：（Ｒ＊，Ｒ＊）−（４−［２−（［２−（３−クロロフェニル）−２−ヒドロキシエチル］アミノ）プロピル］フェノキシ）酢酸、
・  ＣＧＰ−２０７１２Ａ, Sigmaリファレンス：Ｃ２３１；  正式名：（±）−２−ヒドロキシ−５−［２−［［２−ヒドロキシ−３−［４−［ｌ−メチル−４−（トリフルオロメチル）−ｌＨ−イミダゾール−２−イル］フェノキシ］プロピル］アミノ］エトキシ］−ベンズアミドメタンスルホネート、
・  フェノテロール, Sigmaリファレンス：Ｆ１０１６;  正式名：２−（３，５−ジヒドロキシフェニル）−２−ヒドロキシ−２′−（４−ヒドロキシフェニル）−ｌ′−メチルジエチルアミン臭化水素塩、
・  クレンブテロール, Sigmaリファレンス：Ｃ５４２３；  正式名：４−アミノ−α−（ｔ−ブチルアミノメチル）−３，５−ジクロロベンジルアルコール、
・  クロニジン, Sigmaリファレンス：Ｃ７８９７；  正式名：２−（２，６−ジクロロアニリン）−２−イミダゾリン、
・  ＩＣＩ−１１８，５５１, Sigmaリファレンス：Ｉ１２７；  正式名：（±）−１−［２，３−（ジヒドロ−７−メチル−１Ｈ−インデン−４−イル）オキシ］−３−［（ｌ−メチルエチル） アミノ］−２−ブタノール、
・  プラゾシン, Sigmaリファレンス：Ｐ７７９１；  正式名：１−（４−アミノ−６，７−ジメトキシ−２−キナゾリニル）−４−（２−フラニルカルボニル）ピペラジン、
・  サルブタモール, Sigmaリファレンス: S8260;  正式名：α−（［ｔ−ブチルアミノ］メチル）−４−ヒドロキシ−ｍ−キシレン−α，α’−ジオール、
・  ＵＫ １４,３０４, Sigmaリファレンス：Ｕ １０４；  正式名：ブリモニジンまたは５−ブロモ−Ｎ−（４，５−ジヒドロ−ｌＨ−イミダゾール−２−イル）−６−キノキサリンアミン。
【００７０】
好ましい態様では、アドレナリン受容体を認識して結合することができるリガンドはアテノロールまたはその誘導体の一つである（例えば、Sigmaリファレンス：A7655を参照されたい）。アテノロールの完全な名称は、４−（２′−ヒドロキシ−３′−［イソプロピルアミノ］プロポキシ）フェニルアセタミドまたは分子式：Ｃ１４Ｈ２２Ｎ２Ｏ３である。その分子量は２６６．３である（Allibardi et al., Pharmacol. Res., 39, 43 (1999); Smith and Teitler, Cardiovasc. Drugs Ther., 13, 123-126 (1999)）。更に具体的には、アテノロール誘導体は、アドレナリン受容体の認識および結合に関与する上記分子の一部であることができる。例えば、上記アテノロール誘導体リガンドは、下記の式IXを有することができる：
【化５】
2004528384.tif 000007
【００７１】
好ましい態様では、 式IXのリガンドは、ベンゼン環の炭素原子を介して、より好ましくはメタ位の炭素原子を介して、本発明の化合物に結合する。
【００７２】
好ましい態様によれば、本発明は、上記で定義した通りの複合体であって、上記で開示した少なくとも１個の本発明の置換化合物を含んでなるもの、特にアテノロールから誘導されるリガンドを含んでなるものに関する。
【００７３】
あるいは、本発明の化合物および／または複合体にカップリングした置換リガンドは、アドレナリン受容体と結合することができる特異抗体の全部または一部であることができる。このような抗体は当業者には周知であり、市販されている。例えば、Affinity BioReagents, Inc.（Golden, USA）製の抗体ＰＡ１−０４７、ＰＡ１−０４８またはＰＡ１−０４９を参照されたい。更に、このような特異抗体は、当該技術分野で広く用いられている手法に準じて製造することができる（例えば、Antibodies-A Laboratory Manual, Harlow and Lane監修, Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1988)）。
【００７４】
「ターゲット細胞」とは、本発明の複合体または化合物が選択的にターゲット設定することができる細胞を表す。リガンド部分および／またはアンチリガンド分子の性質によって、「ターゲット細胞」は、本発明の複合体に含まれる（１または複数の）リガンド部分によって認識される（１または複数の）アンチリガンド分子を表面の共通の特徴として有する、単一種類の細胞または異なる種類の細胞の群（例えば組織）を表すことがある。本発明の目的においては、ターゲット細胞は、適当なリガンド部分を有する本発明の複合体とターゲット設定することができる任意の哺乳類細胞（好ましくは、ヒト細胞）である。「ターゲット設定」(to target)という用語は、本発明の複合体と接触している細胞の全体の残りの部分のために目的の物質の導入のためのある種の細胞または一群の種類の細胞（または組織）を検討することを表す。ターゲット細胞は一次細胞、形質転換細胞または腫瘍細胞であることができる。好適なターゲット細胞としては、造血細胞（全能、幹細胞、白血球、リンパ球、単球、マクロファージ、ＡＰＣ、樹状細胞、非ヒト細胞など）筋細胞（付随体、単球、筋芽細胞、骨格または平滑筋細胞、心臓細胞）、肺細胞、気管細胞、肝細胞、上皮細胞、内皮細胞または繊維芽細胞が挙げられるが、これらに限定されない。
【００７５】
置換部分はさらに、核ターゲッティングを行うことができるリガンドであることもできる。このようなリガンドは、核受容体（核アンチリガンド）に結合することができる特定のリガンドを表している。この核受容体は、リガンドに結合することができる、核膜中および／または上に局在化した分子または構造であり、それによって核への本発明の化合物または複合体の細胞内輸送および核へのそのインターナリゼーションを促進する。核ターゲッティングに関与するこのようなリガンドは、ＳＶ４０ウイルスのＴ抗原（Lanford and Butel, 1984, Cell 37, 801-813）およびエプスタイン−バーウイルスのＥＢＮＡ−１タンパク質（Ambinder et al., 1991, J. Virol. 65, 1466-1478）から誘導される核シグナル配列である。
【００７６】
好ましい他の態様によれば、本発明の複合体はターゲッティング成分(d)を含んでなる。このような成分(d)は、複合体のターゲッティングに関与する第一の成分と、上記ターゲッティング成分を複合体に組込むことができるキャリヤーである第二の成分との少なくとも２種類の異なる部分から形成されている。「ターゲッティング部分」は、上記の置換部分の全部または一部、好ましくは上記リガンドの全部または一部であることができる。好ましくは、上記ターゲッティング部分は、例えば上記で開示したものような、細胞および／または組織を認識して結合することができるリガンドである。「キャリヤー部分」は、複合体に組込むことができる任意のキャリヤーであることができる。更に具体的には、上記キャリヤーは、帯電性、双性イオン性または非帯電性の化合物であってもよい。これはアルキルまたはアルケニル鎖を含んでいてもよく、例えば上記したような親水性要素を含んでいてもよく、任意のスペーサー分子を含んでいてもよい。
【００７７】
好ましい態様では、本発明の複合体は、ターゲッティング部分がアテノロール誘導体リガンドである、ターゲッティング成分(d)を含んでなる。更に好ましくは、本発明の複合体は、図５に示されている式Ｘ（式中、ｐは４〜２２０の正の整数であり、好ましくは２２〜１１０であり、更に好ましくは約４４である）のターゲッティング成分(d)（すなわち、ｐｃＴＧ２３８）を含んでなる。
【００７８】
一つの特別な態様では、本発明の複合体は、(e)膜崩壊を引き起こすことができる少なくとも１個のペプチド、を含んでなることができる。このようなペプチドの例は、ＪＴＳ−１、ＪＴＳ−１−Ｋ１３、ＧＡＬＡ、ＫＡＬＡ、ｐｐＴＧ１および関連ペプチドである（Mahato et al., 1999, Current Opinion in Mol. Therapeutics 1, 226-243；ＷＯ９６／４０９５８号公報；ＷＯ９８／５００７８号公報；Gottschalk et al., 1996, Gene Therapy, 3, 448-457；Haensler & Szoka, 1993, Bioconjugate Chem., 4, 372-379；Wyman et al., 1997, Biochemistry, 36, 3008-3017、特許出願ＥＰ０１４４００４９．３号明細書を参照されたい）。
【００７９】
もう一つの態様では、本発明の複合体は、(f)カチオン性脂質とカチオン性ポリマーからなる群より選択される少なくとも１個のカチオン性化合物、を含んでなることができる。カチオン性化合物は、科学文献に広く記載されている（例えば、上記の非ウイルス性送達系に関する文献、またはＷＯ９７／２９１１８号公報、ＷＯ９８／０８４８９号公報、ＷＯ９８／１７６９３号公報、および本明細書で先に引用した文献を参照されたい）。本発明で用いることができるカチオン性脂質またはカチオン性脂質の混合物としては、リポフェクチン（Lipofectin）（商品名）、ＤＯＴＭＡ：Ｎ−［ｌ−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウム (Felgner, PNAS 84 (1987), 7413-7417)、ＤＯＧＳ：ジオクタデシルアミドグリシルスペルミン、またはトランスフェクタム（商品名）(Behr, PNAS 86 (1989), 6982-6986)、ＤＭＲＩＥ：１，２−ジミリスチルオキシプロピル−３−ジメチル−ヒドロキシエチルアンモニウム、およびＤＯＲＩＥ：１，２−ジオレイルオキシプロピル−３−ジメチル−ヒドロキシエチルアンモニウム(Felgner, Methods 5 (1993), 67-75)、ＤＣ−ＣＨＯＬ：３−［Ｎ−（Ｎ′，Ｎ′−ジメチルアミノエタン）−カルバモイル］コレステロール(Gao, BBRC 179 (1991), 280-285)、ＤＯＴＡＰ (McLachlan, Gene Therapy 2 (1995), 674-622)、リポフェクタミン（商品名）、スペルミンまたはスペルミジン−コレステロール、リポフェクテース（Lipofectace）（商品名）（総説については、例えばLegendre, Medecine/Science 12 (1996), 1334-1341またはGao, Gene Therapy 2 (1995), 710-722を参照されたい）、特許出願ＷＯ９８／３４９１０号公報、ＷＯ９８／１４４３９号公報、ＷＯ９７／１９６７５号公報、ＷＯ９７／３７９６６号公報に開示されているカチオン性脂質、およびそれらの異性体からなる群より選択されるカチオン性脂質が挙げられる。しかしながら、このリストは総てを網羅しているものではなく、当該技術分野で周知の他のカチオン性脂質を同様に本発明に関連して用いることができる。本発明で用いることができるカチオン性ポリマーまたはカチオン性ポリマーの混合物としては、キトサン；ポリリシンのようなポリ（アミノ酸）（ＵＳ-Ａ-５,５９５,８９７号明細書およびＦＲ２７１９３１６号明細書）；ポリ第四化合物；プロタミン；ポリイミン；ポリエチレンイミンまたはポリプロピレンイミン（ＷＯ９６／２６５５号明細書）；ポリビニルアミン、プルーラン、セルロースのようなＤＥＡＥで誘導体形成したポリカチオン性ポリマー；ポリビニルピリジン；ポリメタクリレート；ポリアクリレート；ポリオキセタン；ポリチオジエチルアミノメチルエチレン（Ｐ（ＴＤＡＥ））；ポリヒスチジン；ポリオルニチン；ポリ−ｐ−アミノスチレン；ポリオキセタン；コポリメタクリレート（例えば、ＨＰＭＡ：Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）−メタクリルアミドのコポリマー）；ＵＳ−Ａ−３，９１０，８６２号明細書に開示の化合物、ＤＥＡＥとメタクリレート、デキストラン、アクリルアミド、ポリイミン、アルブミン、オンジメチルアミノメチルメタクリレート（onedimethylaminomethylmethacrylates）およびポリビニルピロリドンメチルアクリルアミノプロピルトリメチルアンモニウムクロリドとのポリビニルピロリド複合体；ポリアミドアミン；テロマー化合物からなる群より選択されるカチオン性ポリマーが挙げられる。しかしながら、このリストは総てを網羅しているものではなく、当該技術分野で周知の他のカチオン性ポリマーも同様に本発明に関連して用いることができる。
【００８０】
コリピド(g)を必要に応じて本発明の複合体に包含させ、核酸が細胞に入ることを容易にすることができる。本発明によれば、コリピドは、正または負に帯電した、中性または双性イオン性脂質からなる群より選択される。これらのコリピドは、例えば、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、ホスファチジルコリン、ホスホコリン、ジオレイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、スフィンゴミエリン、セラミドまたはセレブロシド、およびそれらの誘導体の一つからなる群より選択される。
【００８１】
複合体の様々な要素（すなわち、リガンド、アニオン性またはカチオン性化合物、コリピド、本発明の化合物、目的のアニオン性物質）を当業者によって広く用いられている化学的または天然の過程によって修飾または置換して、上記で開示したように、複合体をイン・ビトロまたはイン・ビボ投与した後、核酸によって発現されたポリペプチド、核酸、または本発明の複合体の分布を可視化することができる修飾または置換した化合物を得ることができる。
【００８２】
本発明の特定の態様では、本発明による複合体のサイズは小さい（すなわち、その直径は２μｍ未満であり、好ましくは５００ｎｍ未満であり、最も好ましくは２０〜１００ｎｍの範囲である）。複合体のサイズは、特定の用途で最適使用について選択することができる。複合体のサイズの測定は、動的レーザー光散乱（光子相関分光分析法，ＰＣＳ）、および当業者に知られている他の手法を包含する多くの手法（これらに限定されない）（Washington, Particle Size Analysis in Pharmaceutics and other Industries, Ellis Horwood, New York, 1992, 135-169を参照されたい）により行うことができる。特定の複合体のサイズを選択するために、サイズ決定手順を複合体に応用してもよい。このサイズ決定段階で用いることができる方法としては、押出、超音波処理および微小流動化、サイズ排除クロマトグラフィー、電界流れ分別（field flow fractionation）、電気泳動、および超遠心が挙げられるが、これらに限定されない。
【００８３】
本発明のカチオン性成分または化合物対コリピドの比（モル対モルベース）は、これら二種類の化合物が複合体に同時に存在するときには、１：０〜１：１０の範囲とすることができる。好ましい態様では、この比は１：０．５〜１：４の範囲であり、有利にはこの比は約１：２である。
【００８４】
本発明の化合物対カチオン性成分（例えば、カチオン性脂質）の比（モル対モルベース）は、これら二種類の化合物が複合体に同時に存在するときには、１：０〜１：０．００５の範囲とすることができる。好ましい態様では、この比は１：０．５〜１：０．０５の範囲である。最も好ましい態様では、この比は本発明の化合物が１００％である。
【００８５】
複合体がカチオン性成分（例えば、カチオン性脂質、例えばｐｃＴＧ９０）およびリガンドとカップリングした本発明の化合物を含んでなる場合には、上記化合物の比は１：０．００５〜１：０．５の範囲であり、好ましくは１：０．０１〜１：０．２の範囲とすることができる。
【００８６】
複合体が本発明の化合物（例えば、ｐｃＴＧ２３１）とターゲッティング成分（例えば、ｐｃＴＧ２３８）を含んでなる場合には、上記化合物の比は１：０．００５〜１：０．５、好ましくは１：０．０１〜１：０．２の範囲とすることができる。有利には、この比は、１：０．０６〜１：０．１８の範囲である。
【００８７】
複合体がカチオン性成分（例えば、ｐｃＴＧ９０）とターゲッティング成分（例えば、ｐｃＴＧ２３８）を含んでなる場合には、上記化合物の比は１：０．００５〜１：０．５、好ましくは１：０．０１〜１：０．２の範囲とすることができる。有利には、この比は１：０．０６〜１：０．１８の範囲である。
【００８８】
本発明の複合体はまた、その理論電荷比（＋／−）を特徴とすることもできる。この理論電荷比は、総ての潜在的にカチオン性の基が実際にカチオン状態であり且つ総ての潜在的にアニオン性の基が実際にアニオン状態であると仮定して、少なくとも正に帯電した化合物によって供給される正電荷に対する複合体のアニオン性物質によって供給される負電荷の比である。このような比を得るには、計算はアニオン性物質の総ての負電荷を考慮に入れ、次いでトランスフェクション化合物、最後に上記の所望な理論電荷比を得るのに必要なカチオン性化合物の量を調整する。他成分の量および濃度を、それらのモル質量およびそれらの正電荷の数によって調節する。この比は特に制限されず、カチオン性脂質の正電荷の数とアニオン性物質の負電荷の数との比が０．０５〜２０、好ましくは２．５〜１５、最も好ましくは約２．５〜１０となるように量を選択する。更に、本発明の化合物に加えて上記の本発明の複合体を形成することができる負に帯電したアニオン性物質の濃度は１０μｇ／ｍｌ〜１００００μｇ／ｍｌの範囲とすることができる。本発明の好ましい態様では、アニオン性物質の濃度は１００μｇ／ｍｌ〜１０００μｇ／ｍｌの範囲である。
【００８９】
本発明は、前記の複合体の調製方法であって、
少なくとも１個の本発明の化合物を少なくとも１個の目的の物質と接触させ、
必要に応じて精製または選択段階の後に、前記複合体を回収する
段階を含んでなる、方法にも関する。
【００９０】
好ましい態様では、上記の目的の物質と接触した化合物の少なくとも一部を、好ましくは細胞膜受容体を認識して特異的に結合することができるリガンド、好ましくはアドレナリン受容体、更に好ましくはβ１−アドレナリン受容体で置換する。
【００９１】
本発明の複合体が、
(c) 少なくとも１個の置換部分、および／または
(d) 少なくとも１個のターゲッティング成分、および／または
(e) 膜崩壊を引き起こすことができる少なくとも１個のペプチド、および／または
(f) カチオン性脂質とカチオン性ポリマーからなる群より選択される少なくとも１個のカチオン性化合物、および／または
(g) 少なくとも１個のコリピド(colipid)
をさらに含んでなるとき、
この方法は、
最初に前記化合物(a)を前記の追加要素(c)および/または(d)および/または(e)および/または(f)および/または(g)と混合した後、目的のアニオン性物質(b)を加えて、複合体を形成させるか、または
最初に前記化合物(a)を目的のアニオン性物質(b)と複合体形成させた後、形成した複合体を前記の追加要素(c)および/または(d)および/または(e)および/または(f)および/または(g)と混合する
段階を含んでなる。
【００９２】
この方法は、更にサイズ決定手順を含んでなることもできる。サイズ決定手順に用いることができる方法としては、押出、超音波処理および微小流動化、サイズ排除クロマトグラフィー、電界流れ分別（field flow fractionation）、電気泳動、および超遠心が挙げられるが、これらに限定されない。
【００９３】
本発明は、少なくとも１個の前記した本発明の複合体または化合物を含んでなる組成物、好ましくは目的の物質を細胞および／または組織に導入するための該組成物をさらに包含する。前記組成物は、核酸導入に基づく治療方法に関連する患者の細胞または組織への核酸の送達に特に有用であるが、このような使用に限定されない。「遺伝子治療法またはワクチン治療」という用語は、好ましくは核酸をイン・ビボでの導入またはイン・ビトロで細胞に導入した後、患者に再移植する方法と理解される。「遺伝子治療」は、特に遺伝子産物が組織で発現する場合、および、遺伝子産物が特に血流中に排泄される場合に関する。目的のアニオン性物質の細胞への導入または移行過程は、それだけで周知である。「導入または移行」とは、物質が細胞に導入され、その過程の終了時に上記細胞内またはその膜の内部または上に配置されることを意味する。物質が核酸である場合には、「導入または移行」は「トランスフェクション」としても表される。トランスフェクションは、任意の適当な方法、例えば上記核酸によってコードされる遺伝子の発現を測定することによって、または発現したタンパク質またはそのｍＲＮＡの濃度を測定することによって、またはその生物学的効果を測定することによって立証することができる。
【００９４】
好ましい態様では、組成物は、本発明の化合物および／または複合体の少なくとも一部を含んでなり、上記化合物および／または複合体は、好ましくは細胞膜受容体を認識して特異的に結合することができるリガンド、好ましくはアドレナリン受容体、更に好ましくはβ１−アドレナリン受容体で置換される。
【００９５】
本発明のこの組成物は、様々な形態で、例えば、固形、液状、粉末状、水性、凍結乾燥形態で処方することができる。好ましい態様では、この組成物は、薬学上許容可能なキャリヤーをも含んでなり、ヒトまたは動物の治療方法に用いることができる。この特別な場合には、キャリヤーは好ましくは薬学上適当な注射可能なキャリヤーまたは希釈剤である（例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences, 16 ed. 1980, Mack Publishing Coを参照されたい）。このようなキャリヤーまたは希釈剤は、薬学上許容可能であり、すなわち用いる投薬量および濃度で受容者に対して毒性を持たない。これは、好ましくは等張性、低張性または弱高張性であり、スクロース溶液によって供給されるような比較的低いイオン強度を有する。更に、これは、任意の関連溶媒を含むことができ、水性または部分水性液体キャリヤーは、滅菌した発熱物質不含水、分散媒、コーティングおよび同等なもの、または希釈剤（例えば、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、アセテート、ホスフェート）、乳化剤、可溶化剤またはアジュバントを含んでなる。医薬製剤のｐＨを適当に調整して、緩衝し、イン・ビボでの応用に用いることができるようにする。これは、液体溶液として、または投与前に溶液に懸濁することができる固形形態（例えば、凍結乾燥）で調製することができる。注射用組成物のキャリヤーまたは希釈剤の代表例としては、水、等張食塩溶液であって、好ましくは生理学的ｐＨで干渉したもの（例えば、リン酸緩衝食塩水またはＴｒｉｓ緩衝食塩水）、マンニトール、デキストロース、グリセロールおよびエタノール、並びにポリペプチドまたはタンパク質、例えばヒト血清アルブミンが挙げられる。例えば、このような組成物は、１０ｍｇ／ｍｌマンニトール、１ｍｇ／ｍｌ ＨＳＡ、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．２および１５０ｍＭ ＮａＣｌを含んでなる。
【００９６】
本発明は、更に具体的には、少なくとも１個の上記複合体と、上記複合体のトランスフェクション能を改良することができる少なくとも１個のアジュバントを含んでなる組成物に関する。アジュバントは、クロロキン；プロトン性の極性化合物、例えばプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、グリセロール、ＥｔＯＨ、１−メチル−Ｌ−２−ピロリドンまたはそれらの誘導体；または、非プロトン性の極性化合物、例えばジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ジエチルスルホキシド、ジ−ｎ−プロピルスルホキシド、ジメチルスルホン、スルホラン、ジメチルホルムアミド、ジメチルアセタミド、テトラメチル尿素、アセトニトリル、またはそれらの誘導体からなる群より選択することができる。
【００９７】
本発明の組成物は、脊椎動物の組織に局所的におよび／または体系的に投与することができる。この投与は、注射器または他の装置による皮内、皮下、静脈内、筋肉内、鼻内、大脳内、気管内、動脈内、腹腔内、膀胱内、胸膜内、冠動脈内、または腫瘍内注射によって行うことができる。吸入、エアゾール経路、滴下、または局所投与のような経皮投与も考察される。本明細書で用いられる「脊椎動物」とは、当業者によって普通に理解されるのと同じ意味を有するものと解釈される。特に、「脊椎動物」は、哺乳類、更に具体的には、ヒトを包含する。
【００９８】
本発明によれば、該組成物を、筋、皮膚、脳、肺、肝臓、脾臓、骨髄、胸腺、心臓、リンパ、骨、軟骨、膵臓、腎臓、胆嚢、胃、腸、精巣、卵巣、子宮、直腸、神経系、目、腺、結合組織、血液、腫瘍の組織などの脊椎動物の組織に投与することができる。
【００９９】
イン・ビボでの核酸導入療法に応用することにより、本発明は、投与した製剤が有意な免疫反応を誘発する危険なしに患者に繰り返し投与することができる。更に、本発明は、複合体が体中に広がり、目的の物質が望ましくない細胞および／または組織に非特異的に導入されるのを著しく制限する。投与は、一回または反復用量によって、所定時間の後に一回または数回行うことができる。反復投与により、一回に投与される活性物質、特にＤＮＡの用量を減少させることができる。投与経路と適当な用量は、幾つかのパラメーター、例えば、個々の患者、治療する疾患、または導入される核酸によって変化する。
【０１００】
本発明によれば、「細胞」とは、原核細胞および真核細胞、酵母細胞、植物細胞、ヒトまたは動物細胞、特に哺乳類細胞が挙げられる。特に、癌細胞が挙げられる。本発明は、肺、気管、皮膚、筋、脳、肝臓、心臓、脾臓、骨髄、胸腺、膀胱、リンパ系、血液、膵臓、胃、腎臓、卵巣、精巣、直腸、末梢または中枢神経系、目、リンパ様器官、軟骨、または内皮の組織の間質または内腔空間にイン・ビボで応用することができる。好ましい態様では、細胞は筋細胞、造血系の幹細胞または気道細胞であり、更に具体的には気管または肺細胞であり、好ましくは呼吸上皮の細胞である。
【０１０１】
本発明は、核酸を細胞または組織に導入する方法であって、上記細胞または上記組織を少なくとも１個の本発明による複合体または組成物と接触させることを含んでなる上記方法も包含する。この方法は、前記複合体または組成物を動物の細胞または組織にイン・ビボで直接投与により、または動物から回収した後動物体に再導入した細胞のイン・ビトロ処理（エクス・ビボ法）により用いることができる。イン・ビトロでの応用では、適当な培地で培養した細胞を、本発明の複合体または組成物を含む懸濁液と接触させる。インキュベーション時間の後、細胞を洗浄して回収する。活性物質の導入は、任意の適当な方法によって（最終的に細胞をリーシスした後に）明らかにすることができる。
【０１０２】
本発明によるイン・ビボ処理の場合には、トランスフェクション率を改良するために、上記のような医薬製剤を投与する前に、患者にマクロファージ枯渇治療を施すことができる。このような手法は文献に記載されている（特に、Van Rooijen et al., 1997, TibTech, 15, 178-184を参照されたい）。
【０１０３】
最後に、本発明は、哺乳類の治療、予防またはワクチン治療用の医薬組成物を調整するための、本発明による化合物または複合体の使用も提供する。好ましくは、このような組成物は、核酸導入、更に好ましくはヒトまたは動物体の遺伝子治療による治療を目的としている。本発明の意味では、「遺伝子治療」は、任意の治療遺伝子を細胞に導入する方法と理解されなければならない。従って、これは、潜在的に抗原性のエピトープを細胞に導入して、細胞性または体液性または両方であることができる免疫応答を誘発することに関する免疫療法をさらに含む。本明細書で用いられる「治療」とは、予防および治療を表す。これは、ヒトおよび動物の両方の治療に関する。「治療上有効量の化合物、複合体または組成物」は、治療が望まれる疾患に通常関連している１以上の症状の緩解に十分な用量である。本発明による方法は、好ましくは上記の疾患の治療を目的としている。
【０１０４】
本発明はさらに、ヒトまたは動物、好ましくは哺乳類の治療、予防またはワクチン治療用の、更に具体的には遺伝子治療用途用の、組成物を調製するための前記した化合物または複合体の使用にも関する。
【０１０５】
本発明はさらに、目的の物質を細胞に導入するための複合体を調製するための、本発明の化合物の使用にも関する。
【０１０６】
前記したように、本発明は、アドレナリン受容体、特にβ１−アドレナリン受容体を認識して反応することができるリガンドまたは誘導体の使用であって、このような膜受容体を発現する細胞および／または組織へベクターをターゲッティングするための使用にまで敷衍される。上記発現は、例えば、心筋細胞または神経細胞の場合には天然であることができ（上記参照）、または上記発現がターゲッティングした細胞の遺伝子修飾によって指令されるときには人工的であることができる。上記の具体的態様によれば、ベクターは、前記したように、プラスミド、非ウイルス性およびウイルス性ベクターを示すものと理解すべきである。これに関して、特に適当な１個のウイルス性ベクターはアデノウイルスベクターである（総説については、例えば、Hitt et al. Advances in Pharmacology 40 (1997) 137-206を参照されたい）。好ましくは、これは、特にそれぞれの領域が全部または一部欠失によってＥ１機能について、複製欠陥である。更に、ベクターのアデノウイルス主鎖は、１個以上のウイルス遺伝子の欠失、挿入または突然変異のような追加修飾を含んでなることがある（ＷＯ９４／２８１５２号公報、ＷＯ９７／０４１１９号公報、ＥＰ９８４０１７２２．８号明細書参照）。更に、アデノウイルスビリオンまたはエンプティーアデノウイルスキャプシドを用いて、米国特許第５，９２８，９４４号明細書に記載のウイルス依存性コインターナリゼーション法によって核酸（すなわち、プラスミドベクター）を導入することもできる。この方法は、本発明の化合物の存在で完成させることができる。
【０１０７】
非病原性、広汎な向性および感染性、および長期持続性を併せ持つアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを用いることもできる。本発明に関連して、アデノ随伴ウイルスベクターは、総てのＡＡＶ血清型から誘導することができる。ＡＡＶベクターの製剤は、当該技術分野で利用可能である（例えば、Viral Vectors: Basic Science and Gene Therapy. (2000) 11-96. Cid-Arregui and Garcia-Carranca監修, Eaton Publishing.を参照されたい）。
【０１０８】
レトロウイルスベクターも適当である。レトロウイルスは、ウイルスによってコードされる逆転写酵素を用いて複製し、ウイルスＲＮＡゲノムを、感染細胞の染色体ＤＮＡに組込まれる二本鎖ＤＮＡに複製する組込みウイルスのクラスである。文献記載の多数のベクター、特にネズミ白血病ウイルス、特にMoloney (Gilboa et al., 1988, Adv. Exp. Med. Biol. 241, 29)またはFriendのＦＢ２９株（ＷＯ９５／０１４４７号公報）由来のものを本発明の枠内で用いることができる。
【０１０９】
最後に、ポックスウイルスベクターは、それらのＤＮＡゲノムが大きいことと複製の細胞質部位とによって上記ウイルスとは区別される複雑なエンベロープ付きウイルスの一群である。好ましいポックスウイルスベクターはワクシニアウイルスであり、例えば、Copenhagen株(Goebel et al., 1990, Virol. 179, 247-266 and 517-563)、Wyeth株、および改質Ankara（ＭＶＡ）株(Antoine et al., 1998, Virol. 244, 365-396)である。
【０１１０】
これらおよび他の態様は、本発明の説明および例に開示されており、またはこれから明らかであり、これらに包含される。本発明で用いられる方法、使用および化合物の任意のものに関する他の文献は、電子装置などを用いて公開ライブラリーから取り出すことができる。例えば、インターネット上でhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/PubMed/medline.html.で利用可能な公開データベースである「Ｍｅｄｌｉｎｅ」を利用することができる。他のデータとアドレス、例えばhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov、http://www.infobiogen.fr、http://www.fmi.ch/biology/research_tools.html、http://www.tigr.org は当業者に知られており、例えばhttp://www.lycos.com.を用いて得ることもできる。バイオテクノロジーにおける特許情報の総説や遡及検索および最新の知見に有用な特許情報の関連供給源の調査は、Berks, TIBTECH 12 (1994), 352-364に記載されている。
【０１１１】
本発明の方法、組成物および使用は、治療および／または診断が細胞の核酸の導入に関係しまたは依存している総ての種類の疾患の治療に応用することができる。本発明の組成物および使用は、望ましくはヒトで用いることができるが、動物の治療も本明細書に記載の使用によって包含される。
【０１１２】
本発明を例示的に説明してきたが、用いてきた用語は、制限的であるよりは記載の単語の性質を示しているものと解釈されると理解すべきである。明らかに、前記の教示から、本発明の多くの改変および変更が可能である。従って、特許請求の範囲内で、本発明を具体的に本明細書に記載しているのとは異なって実施することができることを理解すべきである。
【０１１３】
本出願明細書に引用されている総ての特許明細書、公表文献、公表された特許明細書、およびデータベース記載の開示内容は、個々それぞれの特許明細書、公表文献およびデータベース記載の内容が具体的且つ個別的にその開示の一部として本明細書に引用されているのと同程度に、その開示の一部として本明細書に引用されている。
【実施例】
【０１１４】
１．  本発明による化合物の合成（ｐｃＴＧ２３１）  （図１〜３参照）
１．１．  ジニトリル１の合成
アクリロニトリル（１．６ｍｌ，１６．１３ミリモル）をエタノール（１６ｍｌ）に溶解したものを、ジプロピレントリアミン（１．０１ｇ，７．６８ミリモル）をエタノール（７７ｍｌ）に溶解した氷冷溶液に滴加した。混合物を、室温で一晩攪拌した。次に、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（３．９７ｇ，３０．７３ミリモル）およびジ第三ブチルジカーボネート（６．７１ｇ，３０．７３ミリモル）をテトラヒドロフラン（ＴＨＦ，１６ｍｌ）を加えた。反応媒質を室温で４時間攪拌し、真空濃縮し、シリカゲルカラム（エーテル／ヘキサン６０／４０，次いで７５／２５）上でクロマトグラフィーによって精製し、ジニトリル１を無色油状生成物として２．２９ｇ（５５％）得た。
１Ｈ ＮＭＲ（２００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ  ３．４６（ｔ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，４Ｈ，＞Ｎ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＮ），３．３０−３．００（ｍ，８Ｈ，−ＣＨ２−Ｎ（Ｂｏｃ）−），２．５９（ｍ，４Ｈ，−ＣＨ２−ＣＮ），１．７２（ｍ，４Ｈ，＞Ｎ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｎ＜），１．４６および１．４５（２ｓ，２７Ｈ，ｔ−Ｂｕ−）．
【０１１５】
１．２．  ジアミン２の合成
ジニトリル１（２．２９ｇ，４．２６ミリモル）をエタノール（２０ｍｌ）と水（２ｍｌ）に溶解したものに水酸化ナトリウム（０．４３ｇ，１０．７ミリモル）を加えて塩基性にして、ラネーニッケル（０．５４ｇ）上で室温にて１６時間水素化した。反応物をセライト上で濾過し、触媒をメタノール（２ｘ２０ｍｌ）で洗浄し、濾液を真空濃縮した。次に、水（２０ｍｌ）を加えて、混合物をエーテル（５０ｍｌ）で抽出し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥し、真空濃縮して、シリカゲルカラム（ＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ／ＮＨ４ＯＨ  ５５／４０／５）上でクロマトグラフィー処理を行い、ジアミン２を無色油状生成物として２．２８ｇ（９８％）得た。
１Ｈ ＮＭＲ（２００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ３．３５−３．１０（ｍ，１２Ｈ，−ＣＨ２−Ｎ（Ｂｏｃ）−）；２．６８（ｔ，Ｊ＝６．７Ｈｚ，４Ｈ，−ＣＨ２−ＮＨ２）；１．８５−１．５０（ｍ，８Ｈ，＞Ｎ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｎ＜）；１．４５（ｓ，２７Ｈ，ｔ−Ｂｕ−）．
【０１１６】
１．３．  ブロモアセタミド３の合成 （Nazih et al., 2000, D. Synlett, 635）
Ａ：  （Ｓ）−３−［（Ｎ−第三ブトキシカルボニル）アミノ］プロパン−１，２−ジオール Ａの合成
ジ第三ブチルジカーボネート（０．９５８ｇ，４．３９ミリモル）をテトラヒドロフラン（ＴＨＦ，２ｍｌ）に溶解したものを、（Ｓ）−３−アミノプロパン−１，２−ジオール（０．２００ｇ，２．１９ミリモル）およびジイソプロピルエチルアミン（０．５６７ｇ，４．３９ミリモル）をＴＨＦ／水（５／１，ｖ／ｖ，６ｍｌ）に溶解したものに加えた。室温で３時間攪拌した後、媒質を１０％水性ＨＣｌで酸性にし（ｐＨ３）、エーテル（３０ｍｌ）で２回抽出した。一緒に合わせた有機相を塩水で洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥し、真空濃縮し、シリカゲルカラム（溶離剤：酢酸エチル）上でクロマトグラフィー処理を行い、ジオールＡ（０．４０８ｇ；９７％）を無色液体として得た。
１Ｈ ＮＭＲ（２００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ４．９６（ｍ，１Ｈ，−ＣＯ−ＮＨ−）；３．７３（quint.，Ｊ＝５．０Ｈｚ，１Ｈ，＞ＣＨ−Ｏ−）；３．５８（ｍ，２Ｈ，−ＣＨ２−Ｏ−）；３．２７（ｍ，２Ｈ，−ＮＨ−ＣＨ２−）；１．４５（ｓ，９Ｈ，ｔ−Ｂｕ−）．
【０１１７】
Ｂ：  ジエステル２′の合成
ジシクロヘキシルカルボジイミド（１．１０ｇ，５．３３ミリモル）をジクロロメタン（２ｍｌ）に溶解したものを、ジオールＡ（０．４０８ｇ，２．１３ミリモル）、オレイン酸（１．５１ｇ，５．３３ミリモル）および４−（ジメチルアミノ）ピリジン（０．０２６ｇ，０．２１ミリモル）をジクロロメタン（２０ｍｌ）に溶解したものに加えた。室温にて１６時間攪拌した後、沈澱したジシクロヘキシル尿素を濾去し、濾液を真空濃縮し、シリカゲルカラム（溶離剤：ジクロロメタン）上でクロマトグラフィー処理を行い、ジエステル２′（１．２８ｇ；８３％）を無色油状生成物として得た。
１Ｈ ＮＭＲ（２００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ５．３４（ｍ，４Ｈ，−ＣＨ＝）；５．０９（quint.，Ｊａｐｐ＝５．３Ｈｚ，１Ｈ，＞ＣＨ−Ｏ−）；４．７３（ｍ，１Ｈ，−ＣＯ−ＮＨ−）；４．２７および４．１１（２ｄｄ，Ｊ＝１２．０，４．２，５．７Ｈｚ，２Ｈ，−ＣＨ２−Ｏ−）；３．３５（ｍ，２Ｈ，−ＮＨ−ＣＨ２−）；２．３１（ｔ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，４Ｈ，−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ２−）；２．０１（ｍ，８Ｈ，−ＣＨ２−ＣＨ＝）；１．６１（ｍ，４Ｈ，−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ２−ＣＨ２−）；１．４４（ｓ，９Ｈ，ｔ−Ｂｕ−）；１．３０および１．２７（２ｂｒｓ，４０Ｈ，−ＣＨ２−）；０．８８（ｔ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，６Ｈ，Ｍｅ−）．
【０１１８】
Ｃ：  ブロモアセタミド３の合成
ブロモアセチルブロミド（０．５３ｍｌ，６．１１ミリモル）を、ジエステル２′（１．０１ｇ，１．５３ミリモル）とメタノール（０．１３ｍｌ，３．０６ミリモル）をジクロロメタン（１５ｍｌ）に溶解したものに加えた。室温で２０分間攪拌した後、炭酸カリウム（２．２０ｇ，１５．９ミリモル）を加えて、アシル化が完了するまで行った（薄層クロマトグラフィーによる観察；約１時間）。次に、懸濁液をセライト上で濾過した。濾液を真空濃縮し、シリカゲルカラム（溶離剤：エーテル／ヘキサン  ３０／７０〜４０／６０）上でクロマトグラフィー処理を行って、ブロモアセタミド３（１．０７ｇ；９４％）を無色油状生成物として得た。
１Ｈ ＮＭＲ（２００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ６．８１（ｍ，１Ｈ，−ＣＯ−ＮＨ−）；５．３４（ｍ，４Ｈ，−ＣＨ＝）；５．１４（ｍ，１Ｈ，＞ＣＨ−Ｏ−）；４．２８および４．１３（２ｄｄ，Ｊ＝１２．０，４．４，５．４Ｈｚ，２Ｈ，−ＣＨ２−Ｏ−）；３．８８（ｓ，２Ｈ，Ｂｒ−ＣＨ２−）；３．５３（ｍ，２Ｈ，ＮＨ−ＣＨ２−）；２．３４および２．３３（２ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，４Ｈ，−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ２−）；２．０１（ｍ，８Ｈ，−ＣＨ２−ＣＨ＝）；１．６２（ｍ，４Ｈ，−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ２−ＣＨ２−）；１．３０および１．２７（２ｂｒｓ，４０Ｈ，−ＣＨ２−）；０．８８（ｔ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，６Ｈ，Ｍｅ−）．
【０１１９】
１．４．  アルコール４の合成
ブロモアセタミド３（３５０ｍｇ，０．４７２ミリモル）をクロロホルム（１ｍｌ）に溶解したものを、１−アミノ−３−プロパノール（７１ｍｇ，０．９４ミリモル）をアセトニトリル（５ｍｌ）に溶解したものに加えた。室温で２４時間攪拌した後、混合物をエーテル（３０ｍｌ）で希釈し、水で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥し、真空濃縮した。残渣をＴＨＦ（８ｍｌ）に溶解し、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（６１ｍｇ，０．４７ミリモル）をＴＨＦ（１ｍｌ）に溶解したものを加えた後、ジ−第三−ブチルジカーボネート（６７ｍｇ，０．５７ミリモル）をＴＨＦ（１ｍｌ）に溶解したものを加えた。溶液を室温にて３時間攪拌し、真空濃縮し、シリカゲルカラム（溶離剤：エタノール）上でクロマトグラフィー処理を行い、アルコール４を無色油状生成物として３３２ｍｇ（８４％）得た。
１Ｈ ＮＭＲ（２００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３−ＣＤ３ＣＯ２Ｄ）：δ５．３４（ｍ，４Ｈ，−ＣＨ＝）；５．１１（ｍ，１Ｈ，＞ＣＨ−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−）；４．２６および４．１０（２ｄｄ，Ｊ＝１２．０，５．９，４．１Ｈｚ，２Ｈ，−ＣＨ２−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−）；３．８６（ｓ，２Ｈ，−Ｎ（Ｂｏｃ）−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−）；３．６６（ｔ，Ｊ＝５．６Ｈｚ，２Ｈ，ＨＯ−ＣＨ２−）；３．４７（ｍ，４Ｈ，−ＣＨ２−Ｎ（Ｂｏｃ）−および−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ２−）；２．３１（ｔ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，４Ｈ，−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ２−）；２．０１（ｍ，８Ｈ，−ＣＨ２−ＣＨ＝）；１．７４（ｍ，２Ｈ，−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｎ（Ｂｏｃ）−）；１．６０（ｍ，４Ｈ，−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ２−ＣＨ２−）；１．４５（ｓ，９Ｈ，ｔ−Ｂｕ−）；１．２９および１．２７（２ｂｒｓ，４０Ｈ，−ＣＨ２−）；０．８８（ｔ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，６Ｈ，Ｍｅ−）．
元素分析：
Ｃ４９Ｈ９０Ｎ２Ｏ８に対する計算値：  Ｃ：７０．４６；Ｈ：１０．８６；Ｎ：３．３５、
実測値：  Ｃ：７０．０；Ｈ：１１．０；Ｎ：３．３．
【０１２０】
１．５．  アルデヒド５の合成
五酸化リン（１６４ｍｇ，１．１５ミリモル）をアルコール４（３２０ｍｇ，０．３８３ミリモル）およびＤＭＳＯ（０．０６８ｍｌ，０．９６ミリモル）をＣＨ２Ｃｌ２（４ｍｌ）に溶解した氷冷溶液に加え、混合物を室温で２時間激しく攪拌した。Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（１９８ｍｇ，１．５３ミリモル）を０℃で添加した後、混合物を室温にて更に２時間放置した。次いで、これを水（２０ｍｌ）で反応停止し、ＣＨ２Ｃｌ２（２×２５ｍｌ）で抽出した。合わせた有機相をＮａ２ＳＯ４上で乾燥し、真空濃縮した。黄色油状生成物として得られた粗製アルデヒド５を、更に精製することなく下記の段階に用いた。
１Ｈ ＮＭＲ（２００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ９．７９（ｓ，１Ｈ，−ＣＨＯ），５．３４（ｍ，４Ｈ，−ＣＨ＝）；５．０９（ｍ，１Ｈ，＞ＣＨ−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−）；４．２５および４．１１（２ｄｄ，Ｊ＝１１．８，５．６，４．３Ｈｚ，２Ｈ，−ＣＨ２−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−）；３．８５（ｓ，２Ｈ，−Ｎ（Ｂｏｃ）−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−）；３．７０−３．３０（ｍ，４Ｈ，−ＣＨ２−Ｎ（Ｂｏｃ）−および−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ２−）；２．７５（ｔ，Ｊ＝６．３Ｈｚ，２Ｈ，ＯＨＣ−ＣＨ２−）；２．３１（ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，４Ｈ，−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ２−）；２．００（ｍ，８Ｈ，−ＣＨ２−ＣＨ＝）；１．５９（ｍ，４Ｈ，−Ｏ−Ｃ（Ｏ）ＣＨ２−ＣＨ２−）；１．４５（ｓ，９Ｈ，ｔ−Ｂｕ−）；１．２９および１．２７（２ｂｒｓ，４０Ｈ，−ＣＨ２−）；０．８８（ｔ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，６Ｈ，Ｍｅ−）．
【０１２１】
１．６．  アミン６の合成
ポリエチレングリコール２０００モノメチルエーテル（１．５０ｇ）および１，１′カルボニルジイミダゾール（１３４ｍｇ，０．８２５ミリモル）をアセトニトリル（８ｍｌ）に溶解したものを、室温で２時間攪拌した。次いで、ジアミン２（６１４ｍｇ，１．１２ミリモル）をアセトニトリル（２ｍｌ）で希釈したものを加え、混合物を室温で更に３時間放置した。溶液を真空濃縮し、シリカゲルカラム（ＭｅＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２：５／９５〜２０／８０）上でクロマトグラフィー処理を行い、化合物６を白色粉末として７８７ｍｇ（４１％）得た。
１Ｈ ＮＭＲ（２００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ４．１９（ｍ，２Ｈ，−ＣＨ２−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−）；３．９８（ｔ，Ｊ＝４．９Ｈｚ，２Ｈ，−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−）；３．６４（ｓ，−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−）；３．３６（ｓ，３Ｈ，Ｍｅ−Ｏ−）；３．３０−３．０５（ｍ，１４Ｈ，−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ２−および−Ｎ（Ｂｏｃ）−ＣＨ２−）；２．６８（ｔ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，２Ｈ，−ＣＨ２−ＮＨ２）；１．８５−１．５５（ｍ，８Ｈ，＞Ｎ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｎ＜）；１．４４（ｓ，２７Ｈ，ｔ−Ｂｕ−）．
【０１２２】
１．７  ジエステル７の合成
アミン６（２８０ｍｇ，０．１０９ミリモル）とアルデヒド５（１００ｍｇ，０．１２ミリモル）をＣＨ３ＣＮ／ＣＨ２Ｃｌ２  ２／１（３ｍｌ）に混合したものを、ＮａＢＨ（ＯＡｃ）３（３２ｍｇ，０．１５ミリモル）の存在下で室温にて１６時間攪拌した。混合物を飽和ＮａＨＣＯ３（１０ｍｌ）水溶液で加水分解し、ＣＨ２Ｃｌ２（２×２０ｍｌ）で抽出した。合わせた有機相をＮａ２ＳＯ４上で乾燥し、真空濃縮し、シリカゲルカラム（ＭｅＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２  ５／９５〜１０／９０）上でクロマトグラフィー処理を行い、ジエステル７を１４６ｍｇ（３９％）得た。
１Ｈ ＮＭＲ（２００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ５．３３（ｍ，４Ｈ，−ＣＨ＝）；５．０７（ｍ，１Ｈ，＞ＣＨ−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−）；４．１９（ｍ，２Ｈ，ＣＨ２−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−）；４．２４および４．０９（２ｄｄ，Ｊ＝１２．２，５．８，４．３Ｈｚ，２Ｈ，−ＣＨ２−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−）；３．９７（ｔ，Ｊ＝４．９Ｈｚ，２Ｈ，−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−）；３．８３（ｂｒｓ，２Ｈ，−Ｎ（Ｂｏｃ）−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−）；３．６４（ｓ，−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−）；３．４５（ｍ，２Ｈ，−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ２−）；３．３７（ｓ，３Ｈ，ＭｅＯ−）；３．３２−３．００（ｍ，１６Ｈ，−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ２−および−ＣＨ２−Ｎ（Ｂｏｃ）−）；２．６２（ｍ，４Ｈ，−ＣＨ２−ＮＨ−）；２．３０（ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，４Ｈ，−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ２−）；２．００（ｍ，８Ｈ，−ＣＨ２−ＣＨ＝）；１．８８−１．５０（ｍ，１４Ｈ，＞Ｎ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｎ＜および−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ２−ＣＨ２−）；１．４４（ｓ，３６Ｈ，ｔ−Ｂｕ−）；１．２８および１．２６（２ｂｒｓ，４０Ｈ，−ＣＨ２−）；０．８７（ｔ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，６Ｈ，Ｍｅ−）．
【０１２３】
１．８．  ｐｃＴＧ２３１の合成
ジエステル７（１１０ｍｇ，０．０３２ミリモル）をＣＨ２Ｃｌ２（２ｍｌ）に溶解したものを、トリフルオロ酢酸とＣＨ２Ｃｌ２の１／１混合物（４ｍｌ）に加えた。０℃で３時間攪拌した後、ヘキサン（１０ｍｌ）を加え、混合物を真空濃縮した。このようにして得た固形生成物を真空で１時間放置した後、蒸留エーテルに懸濁し（ボルテックスミキサー）、濾過して、白色粉末生成物を得て、これをエーテルで洗浄し、真空乾燥し、カチオン性脂質ｐｃＴＧ ２３１を１１３ｍｇ（９９％）得た。
１Ｈ ＮＭＲ（２００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３−ＣＦ３ＣＯ２Ｄ）：δ５．３３（ｍ，４Ｈ，−ＣＨ＝）；５．２０（ｍ，１Ｈ，＞ＣＨ−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−）；４．４０−３．９０（ｍ，６Ｈ，−ＣＨ２−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−，−ＣＨ２−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−および−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−）；４．０３（ｍ，２Ｈ，−ＮＨ２＋−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−）；３．７１（ｓ，−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−）；３．４７（ｓ，３Ｈ，ＭｅＯ−）；３．４０−２．９０（ｍ，２０Ｈ，−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ２−および−ＣＨ２−ＮＨ２＋−）；２．４０−２．１０（ｍ，１４Ｈ，−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ２−および−Ｈ２Ｎ＋−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ２＋−）；２．００（ｍ，８Ｈ，−ＣＨ２−ＣＨ＝）；１．５７（ｍ，４Ｈ，−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ２−ＣＨ２−）；１．２８および１．２６（２ｂｒｓ，４０Ｈ，−ＣＨ２−）；０．８７（ｔ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，６Ｈ，Ｍｅ−）．
【０１２４】
２．  βアドレナリン作動性リガンドをベースとする脂質ｐｃＴＧ２３８の合成
略号：
Ｂｏｃ：第三ブチルオキシカルボニル；  Ｃｂｚ：ベンジルオキシカルボニル； ＤＣＣ：１，３−ジシクロヘキシルカルボジイミド； ＤＭＡＰ：４−（ジメチルアミノ）ピリジン； ＤＭＦ：ジメチルホルムアミド； ＨＯＢｔ：１−ヒドロキシベンゾトリアゾール； ＰＥＧ：ポリ（エチレングリコール）； ＴＨＦ：テトラヒドロフラン。
【０１２５】
実験手続き：
出発化合物１および６は、以前に報告されている：
Ｃｂｚ−チラミン１： Rocchiccioli, F.; Jarreau, F.-X.; Pais, M. Tetrahedron 1978, 34, 2917-2926；
２−（トリメチルシリル）エチルヘミスクシネート６： Pouzar, V.; Drasar, P.; Cerny, I.; Havel, M. Synth. Commun. 1984, 14, 501-505。
【０１２６】
エポキシド２
Schlecker, R.; Thieme, P. C. Tetrahedron 1988, 44, 3289-3294に準じる反応。
ジエチルアゾジカルボキシレート（３８２ｍｇ，２．１９ミリモル）をＴＨＦ（２ｍｌ）に溶解したものを、Ｃｂｚ−チラミン１（５６７ｍｇ，２．０９ミリモル）、（Ｒ）−グリシドール（１６３ｍｇ，２．１９ミリモル）およびトリフェニルホスフィン（５７５ｍｇ，２．１９ミリモル）をＴＨＦ（１０ｍｌ）に０℃で溶解したものに加えた。溶液を室温で１６時間攪拌した後、真空濃縮し、残渣をエーテル（１０ｍｌ）で粉砕し、濾過して、エーテルで洗浄した。濾液を濃縮して、シリカゲルカラム（溶離剤：ＣＨ２Ｃｌ２、次いでＣＨ２Ｃｌ２／Ｅｔ２Ｏ  ９８／２）上でクロマトグラフィー処理を行い、エポキシド２を白色固形生成物として４６９ｍｇ（６９％）得た。
融点： ９９〜１００℃。
１Ｈ ＮＭＲ（２００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ７．３４（ｓ，５Ｈ，−Ｐｈ）；７．０９および６．８６（２ｄ，Ｊ＝８．６Ｈｚ，４Ｈ，−Ｃ６Ｈ４−）；５．０９（ｓ，２Ｈ，−ＣＨ２−Ｐｈ）；４．７３（ｍ，１Ｈ，−ＮＨ−Ｃｂｚ）；４．２０および３．９４（２ｄｄ，Ｊ＝１１．０，３．２，５．６Ｈｚ，２Ｈ，−Ｃ６Ｈ４−Ｏ−ＣＨ２−）；３．５０−３．３０（ｍ，３Ｈ，−ＣＨ２−ＮＨ−Ｃｂｚ，＞ＣＨ−Ｏ−）；２．９０および２．７６（apparent t，Ｊ＝４．５Ｈｚ，およびｍ，４Ｈ，−Ｏ−ＣＨ２−，−Ｃ６Ｈ４−ＣＨ２−）．
【０１２７】
カルバメート３
エポキシド２（０．４４ｇ，１．３ミリモル）およびイソプロピルアミン（２．８５ｍｌ，３３．４ミリモル）をメタノール（２ｍｌ）中で混合したものを、室温にて一晩攪拌した。真空濃縮した後、生成物をＴＨＦ（５ｍｌ）に溶解し、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（０．１７ｇ，１．３ミリモル）を加え、次いでジ第三ブチルジカーボネート（０．３５ｇ，１．６ミリモル）を加えた。室温で４時間攪拌した後、溶液を真空濃縮し、シリカゲルカラム（溶離剤：ＣＨ２Ｃｌ２／Ｅｔ２Ｏ  ９８／２〜９５／５）上でクロマトグラフィー処理を行い、カルバメート３を４６３ｍｇ（７１％）得た。
１Ｈ ＮＭＲ（２００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ７．３４（ｓ，５Ｈ，−Ｐｈ）；７．０９および６．８４（２ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，４Ｈ，−Ｃ６Ｈ４−）；５．０９（ｓ，２Ｈ，−ＣＨ２−Ｐｈ）；４．７４（ｍ，１Ｈ，−ＮＨ−Ｃｂｚ）；４．２４−３．８０（ｍ，４Ｈ，−Ｃ６Ｈ４−Ｏ−ＣＨ２−，＞ＣＨ−ＯＨ，−Ｎ（Ｂｏｃ）−ＣＨＭｅ２）；３．４８−３．３２（ｍ，４Ｈ，−ＣＨ２−ＮＨ−Ｃｂｚ，−ＣＨ２−Ｎ（Ｂｏｃ）−）；２．７５（ｂｒｔ，Ｊ＝６，９Ｈｚ，２Ｈ，−Ｃ６Ｈ４−ＣＨ２−）；１．４９（ｓ，９Ｈ，ｔ−Ｂｕ）；１．１７および１．１４（２ｄ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，６Ｈ，−ＣＨＭｅ２）．
【０１２８】
アミン４
カルバメート３（４２５ｍｇ，０．８７ミリモル）をエタノール（１０ｍｌ）に溶解したものを１０％パラジウム／炭素（４３ｍｇ）の存在下、１気圧の水素圧にて、室温で６時間水素化分解を行った。反応混合物をセライト（商標）上で濾過し、濾液を真空濃縮し、シリカゲルカラム（ＭｅＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２  ４／９６〜１５／８５）上でクロマトグラフィー処理を行い、アミン４を黄色油状生成物として２３５ｍｇ（７６％）得た。
１Ｈ ＮＭＲ（２００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ７．１１および６．８５（２ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，４Ｈ，−Ｃ６Ｈ４−）；４．２５−３．７５（ｍ，４Ｈ，Ｃ６Ｈ４−Ｏ−ＣＨ２−，＞ＣＨ−ＯＨ，−Ｎ（Ｂｏｃ）−ＣＨＭｅ２）；３．３８（ｍ，２Ｈ，−ＣＨ２−Ｎ（Ｂｏｃ）−）；２．９５（ｔ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，２Ｈ，ＣＨ２−ＮＨ２）；２．７１（ｔ，Ｊ＝６．９Ｈｚ，２Ｈ，−Ｃ６Ｈ４−ＣＨ２−）；１．４８（ｓ，９Ｈ，ｔ−Ｂｕ）；１．１７および１．１４（２ｄ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，６Ｈ，−ＣＨＭｅ２）．
【０１２９】
酸５
アミン４（２１７ｍｇ，０．６２ミリモル）と無水コハク酸（６５ｍｇ，０．６５ミリモル）をＴＨＦ（８ｍｌ）に溶解したものを、室温で４時間攪拌した。次に、溶液を真空濃縮し、シリカゲルカラム（溶離剤：ＭｅＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２  １０／９０〜２０／８０）上でクロマトグラフィー処理を行い、酸５を黄色の粘稠な油状生成物として２７２ｍｇ（９８％）得た。
１Ｈ ＮＭＲ（２００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ７．０９および６．８５（２ｄ，Ｊ＝８．６Ｈｚ，４Ｈ，−Ｃ６Ｈ４−）；５．９０（ｍ，１Ｈ，−ＮＨＣ（Ｏ）−）；４．２７−３．８０（ｍ，４Ｈ，−Ｃ６Ｈ４−Ｏ−ＣＨ２−，＞ＣＨ−ＯＨ，−ＣＨＭｅ２）；３．４９（ｍ，２Ｈ，−ＣＨ２−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−）；３．３８（ｍ，２Ｈ，−ＣＨ２−Ｎ（Ｂｏｃ）−）；２．７６（ｔ，Ｊ＝６，８Ｈｚ，２Ｈ，−ＣＨ２−Ｃ６Ｈ４−）；２．６６および２．４４（２ｍ，４Ｈ，−ＮＨＣ（Ｏ）−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＯ２Ｈ）；１．４８（ｓ，９Ｈ，ｔ−Ｂｕ）；１．１７および１．１４（２ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，６Ｈ，ＣＨＭｅ２）．
【０１３０】
２−（トリメチルシリル）エチルエステル ７
ＤＣＣ（２５７ｍｇ，１．２５ミリモル）を２−（トリメチルシリル）エチルヘミスクシネート ６（２４９ｍｇ，１．１４ミリモル）、（Ｓ）−１−アミノプロパン−２，３−ジオール（１５６ｍｇ，１．７１ミリモル）、およびＨＯＢｔ（１６９ｍｇ，１．２５ミリモル）をＤＭＦ（２ｍｌ）に溶解したものに加え、媒質を室温で１６時間攪拌した。ＤＭＦを、トルエン（２５ｍｌ）を連続的に添加し、真空濃縮（２回）することによって除去した。残渣をジクロロメタン（２×５ｍｌ）に溶解し、濾過した。オレイン酸（９６６ｍｇ，３．４２ミリモル）、ＤＭＡＰ（１４ｍｇ，０．１１ミリモル）、およびＤＣＣ（７０６ｍｇ，３．４２ミリモル）を濾液に加え、混合物を室温で１６時間攪拌した。次に、これを再度濾過して、真空濃縮し、シリカゲルカラム（溶離剤：Ｅｔ２Ｏ／ヘキサン６０／４０〜８０／２０）上でクロマトグラフィー処理を行い、２−（トリメチルシリル）エチルエステル ７を無色油状生成物として４６９ｍｇ（５２％）得た。
１Ｈ ＮＭＲ（２００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ６．００（ｍ，１Ｈ，−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−）；５．３４（ｍ，４Ｈ，−ＣＨ＝）；５．１０（ｍ，１Ｈ，＞ＣＨ−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−）；４．３２−４．０５（ｍ，４Ｈ，−ＣＨ２−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−）；３．５０（ｍ，２Ｈ，−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ２−）；２．６４および２．４６（２ｍ，４Ｈ，−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−）；２．３３および２．３１（２ｔ，Ｊ＝７．５，４Ｈ，−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ２−）；２．０１（ｍ，８Ｈ，−ＣＨ２−ＣＨ＝）；１．６０（ｍ，４Ｈ，−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ２−ＣＨ２−）；１．３０および１．２７（２ｂｒｓ，４０Ｈ，−ＣＨ２−）；０．９８（ｍ，２Ｈ，ＣＨ２−ＳｉＭｅ３）；０．８８（ｔ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，６Ｈ，Ｍｅ−）；０．０４（ｍ，９Ｈ，Ｍｅ３Ｓｉ−）．
【０１３１】
酸８
１ＭテトラブチルアンモニウムフルオリドをＴＨＦ（１．２ｍｌ，１．２０ミリモル）に溶解したものを２−（トリメチルシリル）エチルエステル ７（０．４９ｍｇ，０．６０ミリモル）をＴＨＦ（６ｍｌに溶解したものに加え、室温で１６時間反応させた。反応混合物を１０％ＨＣｌ水溶液で酸性にし、エーテルで抽出した。エーテル相を飽和ＮａＣｌ水溶液で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥し、真空濃縮し、シリカゲルカラム（溶離剤：ＭｅＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２  ２／９８〜１０／９０）上でクロマトグラフィー処理を行い、酸８を無色油状生成物として２９７ｍｇ（６９％）得た。
１Ｈ ＮＭＲ（２００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ５．３４（ｍ，４Ｈ，−ＣＨ＝）；５．１０（ｍ，１Ｈ，＞ＣＨ−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−）；４．２７および４．１２（２ｄｄ，Ｊ＝１２．１，５．９，４．０Ｈｚ，２Ｈ，−ＣＨ２−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−）；３．４８（ｍ，２Ｈ，−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ２−）；２．６４および２．４８（２ｍ，４Ｈ，ＨＯ２Ｃ−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−）；２．３１（ｂｒｔ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，２Ｈ，−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ２−）；２．００（ｍ，８Ｈ，−ＣＨ２−ＣＨ＝）；１．６０（ｍ，４Ｈ，−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ２−ＣＨ２−）；１．２９および１．２７（２ｂｒｓ，４０Ｈ，−ＣＨ２−）；０．８８（ｔ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，６Ｈ，Ｍｅ−）．
【０１３２】
アミン９
ＤＣＣ（７９ｍｇ，０．３８ミリモル）を、酸８（２５０ｍｇ，０．３５ミリモル）、ジアミノ−ＰＥＧ［平均分子量約１０００］（５２０ｍｇ，０．５２ミリモル）およびＨＯＢｔ（５２ｍｇ，０．３８ミリモル）を１／１  ＴＨＦ／ＣＨ２Ｃｌ２（６ｍｌ）に溶解したものに加えた。室温２４時間攪拌した後、沈澱したジシクロヘキシル尿素を濾去した。濾液を真空濃縮し、シリカゲルカラム（ＭｅＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２  ３／９７〜１０／９０）上でクロマトグラフィー処理を行い、アミン９を３２３ｍｇ（５４％）得た。
１Ｈ ＮＭＲ（２００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ５．３４（ｍ，４Ｈ，−ＣＨ＝）；５．１０（ｍ，１Ｈ，＞ＣＨ−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−）；４．２６および４．０９（２ｄｄ，Ｊ＝１２．４，５．７，４．１Ｈｚ，２Ｈ，−ＣＨ２−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−）；３．９５−３．２５（ｍ，８Ｈ，−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−，−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ２−）；３．６４（ｓ，−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−）；３．１８（ｍ，２Ｈ，Ｈ２Ｎ−ＣＨ２−）；２．７５−２．４５（ｍ，４Ｈ，−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−）；２．３２および２．３０（２ｔ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，４Ｈ，−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ２−）；２．００（ｍ，８Ｈ，−ＣＨ２−ＣＨ＝）；１．６０（ｍ，４Ｈ，−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ２−ＣＨ２−）；１．２９および１．２７（２ｂｒｓ，４０Ｈ，−ＣＨ２−）；０．８８（ｔ，Ｊ＝６．３Ｈｚ，６Ｈ，Ｍｅ−）．
【０１３３】
脂質１０
ＤＣＣ（２０ｍｇ，０．０９６ミリモル）を、酸５（４３ｍｇ，０．０９６ミリモル），アミン ９（１５０ｍｇ，０．０８７ミリモル）、およびＨＯＢｔ（１３ｍｇ，０．０９６ミリモル）を１／１ ＴＨＦ／ＣＨ２Ｃｌ２（２ｍｌ）に溶解したものに加えた。室温２４時間攪拌した後、沈澱したジシクロヘキシル尿素を濾過によって回収した。濾液を真空濃縮し、クロロホルム（２５ｍｌ）に溶解して、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液（５ｍｌ）と飽和ＮａＣｌ水溶液（１０ｍｌ）の混合物で洗浄した。有機相をＮａ２ＳＯ４上で乾燥し、真空濃縮して、シリカゲルカラム（溶離剤：ＭｅＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２  ３／９７〜８／９２）上でクロマトグラフィー処理を行い、次の段階の後に除かれる若干極性が低い化合物が混入した脂質１０を１５３ｍｇ（８２％）得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ７．０９および６．８３（２ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，４Ｈ，−Ｃ６Ｈ４−）；６．６７，６．５５，および６．２２（３ｍ，４Ｈ，−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−）；５．３３（ｍ，４Ｈ，−ＣＨ＝）；５．０９（ｍ，１Ｈ，＞ＣＨ−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−）；４．２４および４．０９（２ｄｄ，Ｊ＝１２．０，５．９，３．８Ｈｚ，２Ｈ，−ＣＨ２−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−）；４．０８−３．９３（ｍ，２Ｈ，−Ｃ６Ｈ４−Ｏ−ＣＨ２−）；３．６３（ｓ，−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−）；３．５４（ｔ，Ｊ＝５．１Ｈｚ，４Ｈ，−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−）；３．５７−３．３５（ｍ，［３．４２にｂｒｑ，Ｊ＝５．１Ｈｚを含む］，１０Ｈ，−ＣＨ２−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−，−ＣＨ２−Ｎ（Ｂｏｃ）−）；２．７３（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，２Ｈ，−Ｃ６Ｈ４−ＣＨ２−）；２．５４−２．４４（ｍ，８Ｈ，−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−）；２．３１および２．２９（２ｔ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，４Ｈ，−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ２−）；２．００（ｍ，８Ｈ，−ＣＨ２−ＣＨ＝）；１．６０（ｍ，４Ｈ，−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ２−ＣＨ２−）；１．４８（ｓ，９Ｈ，ｔ−Ｂｕ）；１．２９および１．２６（２ｂｒｓ，４０Ｈ，ＣＨ２−）；１．１７および１．１３（２ｄ，Ｊ＝６．７Ｈｚ，６Ｈ，−ＣＨＭｅ２）；０．８７（ｔ，Ｊ＝６．９Ｈｚ，６Ｈ，Ｍｅ−）．
【０１３４】
脂質ｐｃＴＧ２３８
化合物１０（１００ｍｇ，０．０４６ミリモル）をジクロロメタン（１ｍｌ）に溶解したものを、トリフルオロ酢酸と乾燥ジクロロメタンの１／１混合物（２ｍｌ）で０℃で２時間処理した。次に、ヘキサン（５ｍｌ）を加え、混合物を真空濃縮した。残渣をクロロホルム（２０ｍｌ）に溶解し、飽和ＮａＨＣＯ３（１０ｍｌ）で洗浄した。水性相を追加のクロロホルム（２０ｍｌ）で抽出し、合わせた有機相をＮａ２ＳＯ４上で乾燥し、真空濃縮し、シリカゲルカラム（溶離剤：ＭｅＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２  ８／９２〜１５／８５）上でクロマトグラフィー処理を行い、脂質ｐｃＴＧ２３８を６９ｍｇ（７３％）得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ７．０９および６．８４（２ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，４Ｈ，−Ｃ６Ｈ４−）；６．７２，６．６４，および６．３４（３ｍ，４Ｈ，−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−）；５．３４（ｍ，４Ｈ，−ＣＨ＝）；５．０９（ｍ，１Ｈ，＞ＣＨ−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−）；４．２５および４．０９（２ｄｄ，Ｊ＝１１．９，５．９，４．０Ｈｚ，２Ｈ，−ＣＨ２−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−）；４．１５（ｍ，１Ｈ，＞ＣＨ−ＯＨ）；４．０１および３．９６（２ｄｄ，Ｊ＝９．７，５．４，５．３Ｈｚ，２Ｈ，−Ｃ６Ｈ４−Ｏ−ＣＨ２−）；３．６４（ｓ，−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−）；３．５４（ｔ，Ｊ＝５．１Ｈｚ，４Ｈ，−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−）；３．５１−３．３７（ｍ，８Ｈ，−ＣＨ２−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−）；３．０４および２．８６（ｍおよびｄｄ，Ｊ＝１１．９，８．３Ｈｚ，３Ｈ，−ＮＨ−ＣＨ＜，−ＣＨ２−ＮＨ−）；２．７３（ｔ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，２Ｈ，−Ｃ６Ｈ４−ＣＨ２−）；２．５４−２．４２（ｍ，８Ｈ，−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−）；２．３２および２．３０（２ｔ，Ｊ＝７．７Ｈｚ，４Ｈ，−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ２−）；２．００（ｍ，８Ｈ，−ＣＨ２−ＣＨ＝），１．６０（ｍ，４Ｈ，−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ２−ＣＨ２−）；１．２９および１．２６（２ｂｒｓ，４０Ｈ，−ＣＨ２−），１．２１（ｄ，Ｊ＝６．２Ｈｚ，６Ｈ，−ＣＨＭｅ２）；０．８８（ｔ，Ｊ＝６．９Ｈｚ，６Ｈ，−Ｍｅ）．
【０１３５】
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳα−シアノ−４−ヒドロキシ桂皮酸マトリックス）。スペクトルは、２つのシリーズのピークを示す（それぞれのシリーズに４４Ｄａの間隔がある）最も多量のシリーズ(Most abundant series)：主ピーク ｍ／ｚ＝２１０８．７；［Ｃ１０９Ｈ２０２Ｎ５Ｏ３３］＋  についての計算値：２１０９．４（ｐｃＴＧ２３８＋Ｈ＋；ｎ＝２３）。最小量シリーズ(Least abundant series)：主ピーク ２１７４．７；［Ｃ１１１Ｈ２０５Ｎ５ＮａＯ３４］＋  についての計算値：２１７５．４（ｐｃＴＧ２３８＋Ｎａ＋；ｎ＝２４）。
【０１３６】
３．  カチオン性脂質／核酸複合体の調製
脂質をクロロホルムに混合し、溶媒除去をＲａｐｉｄｖａｐボルテックスエバポレーター(Labconco, Uniequip, Martinsried, Germany)を用いて４５℃で一晩行った。生成する脂質フィルムを５％グルコース（ｗ／ｖ）溶液（５〜１５ｍｇ／ｍｌカチオン性脂質）で水和し、脂質が完全に再懸濁するまで超音波処理を行った(Bransonic 221超音波処理水槽、Branson Ultrasonics Corp.製, Danbury, CT, USA)。Lipex Biomembranes押出機(Vancouver, Canada)を用いる４００および２００ｎｍ細孔径のポリカーボネート膜(Nuclepore, Costar, Cambridge, MA, USA)を介する逐次押出によって、小さなリポソームが形成した。予備成形したリポソームを、使用まで不活性雰囲気下で４℃で保管した。
【０１３７】
プラスミドＤＮＡ（ルシフェラーゼをコードする遺伝子を含んでなる）をカチオン性リポソームと混合することによって、相当する複合体を形成した。プラスミドＤＮＡを最初に５％グルコースで所望な濃度まで希釈して、複合体形成は、押し出したリポソーム懸濁液をプラスミド溶液に速やかに添加することによって行った（リポソーム懸濁液の容積／プラスミドＤＮＡ溶液の容積は約１／３）。総ての複合体を、２４０μｇ／ｍｌの最終プラスミド濃度で調製し、使用前に少なくとも一晩４℃に保持した。
【０１３８】
４．  カチオン性脂質とプラスミドＤＮＡの複合体形成効率の決定
カチオン性脂質／核酸複合体試料（０．２μｇＤＮＡ）を、ＴＥＡ−緩衝液（４０ｍＭ Ｔｒｉｓ、０．９ｍＭ ＥＤＴＡ、５ｍＭ酢酸ナトリウム／酢酸、ｐＨ７．８）中の１％アガロースゲル（９０Ｖ，２時間）に加えた。ＤＮＡバンドを臭化エチジウム（１０μｇ／ｍｌ）で染色した。ドデシル硫酸ナトリウム１０容量％で前処理したそれぞれの試料を、ネガティブプローブとして平行して処理した。
【０１３９】
核酸と本発明によるトランスフェクション化合物ｐｃＴＧ２３１を含んでなる複合体はアガロースゲルでは移動することができず、核酸が完全に複合体形成していることを示した。同一結果は、更にコリピド（ＤＯＰＥ）を含んでなる複合体で得られる。
【０１４０】
５．  細胞培養およびトランスフェクション
β１アドレナリン受容体を発現する心筋細胞は、Chien et al (J Clin Invest 75 (1985) 1770-80)およびAdams et al (J Biol Chem 271 (1996) 1179-86)の方法に準じて抽出した。心筋細胞の一次培養物を、C57BL/6マウス胎児の全心臓から調製した。動物を断頭によって屠殺し、心臓を平衡した塩溶液［０．８ｍＭ ＭｇＳＯ４−７Ｈ２Ｏ，１１６ｍＭ ＮａＣｌ，１ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４−Ｈ２０，５．４ｍＭ ＫＣｌ，５．５ｍＭグルコース，２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ ｐＨ７．４］で１ｍｍ断片に細かく切り刻んだ。組織を、この緩衝液中０．０３％ コラゲナーゼII（Worthington）−０．０６％パンクレアチン(Life Technologies)中で３７℃で２０分間機械攪拌下で解離した。上清を廃棄し、２回目の２０分間に新たなプロテアーゼ溶液に代えた。懸濁液を２０％ＦＣＳに調整し、パスツールピペットで緩やかに粉砕することによって解離を完了した。細胞を２５０×ｇで５分間遠心分離し、ペレットに、コーティングを施していない皿で完全培地［５％ウマ血清（Life Technologies）、５％ＦＣＳ（Hyclone）、２ｍＭグルタミンおよび４０μｇ／ｍｌゲンタマイシンを補足したDulbeccoの改良Eagle培地／Medium 199 （Life Technologies）の比率が４／１のもの］中で２×３０分間予備培養を施した。非結合細胞を集めて、０．１％ゼラチンをコーティングした４８穴プレートに７．５×１０４細胞／ウェルを播種し、５％ＣＯ２／９５％空気を含む雰囲気で３７℃にて完全培地に保持した。培地は翌日取り換えた。
【０１４１】
培地を一回交換した後、カチオン性脂質／核酸複合体によるトランスフェクションを１．２５μｇＤＮＡ／ウェル（０．２５ｍｌ）の用量で血清の非存在下で２４時間〜４８時間後に行った。細胞を２４時間後に洗浄し、完全培地で更に２４時間培養した後、ルシフェラーゼ発現を測定した。ルシフェラーゼ活性（ＲＬＵ／ｍｇ）は、照度計（Microlumat LB96P, Berthold, Evry, France）で測定した。基質溶液のみについて測定した光単位を、総ての読みから差し引いた。タンパク質濃度をＢＣＡタンパク質分析法（Pierce, Monlu輟n, France）によって測定し、ルシフェラーゼ活性をＲＬＵ／分／ｍｇタンパク質として計算した。ルシフェラーゼ基質溶液は、Ｐｒｏｍｅｇａ製であった。
【０１４２】
競争実験の場合には、過剰量の遊離アテノロール（１０−５Ｍ）をカチオン性脂質／核酸複合体と同時インキュベーションしたこと以外は、同じ手続きを行った。
【０１４３】
図４は、本発明によるトランスフェクション化合物（ｐｃＴＧ２３１）を含んでなる複合体によってトランスフェクションした細胞は、親水性部分のないカチオン性脂質（ｐｃＴＧ９０）を含んでなる複合体によってトランスフェクションした細胞と比較してルシフェラーゼの発現量は少ない（１／１０００未満）ことを示している。この結果は、本発明によるターゲッティング化合物を含んでなる複合体は、非特異的トランスフェクション効率が極めて低いことを明らかに示している。
【０１４４】
ターゲッティングリガンド（ｐｃＴＧ２３８）と本発明の化合物（ｐｃＴＧ２３１）を含んでなる複合体でトランスフェクションしたβ１−アドレナリン受容体をその表面で発現する細胞は、いずれもルシフェラーゼを発現し、この結果ルシフェラーゼ遺伝子の細胞への導入を示している。これらの結果は、アテノロール（アドレナリン受容体拮抗薬）の存在下でトランスフェクションが起こるときには、上記ルシフェラーゼ発現は阻害されることも示している。この結果は、本発明によるターゲッティング化合物により、アドレナリン受容体を発現する細胞をターゲッティングすることができ、本発明によるトランスフェクション化合物は、ターゲッティング要素と組み合わせて用いるときには、細胞をトランスフェクションすることができることを示している。
【図面の簡単な説明】
【０１４５】
【図１】ｐｃＴＧ２３１およびｐｃＴＧ２３８の合成を示す。
【図２】ｐｃＴＧ２３１およびｐｃＴＧ２３８の合成を示す。
【図３】ｐｃＴＧ２３１およびｐｃＴＧ２３８の合成を示す。
【図４】本発明によるトランスフェクション化合物（ｐｃＴＧ２３１）および／または本発明によるターゲッティング化合物（ｐｃＴＧ２３８）を含んでなるカチオン性脂質／核酸複合体によってトランスフェクションしたアドレナリン受容体を発現する細胞によるルシフェラーゼ遺伝子の発現を示す。トランスフェクション手続きは、β１−アドレナリン受容体結合の競合体の存在下または非存在下で行った。
【図５】式Ｘ（式中、ｐは４〜２２０、好ましくは２２〜１１０、更に好ましくは約４４の正の整数である（本明細書の２７頁参照））のターゲッティング成分（ｄ）（すなわち、ｐｃＴＧ２３８）である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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