(57)【要約】本発明は、lactobacilli、propionic acid菌および／またはbifidobacteriaの様々な組合せを含むプロバイオティック組合せ物に関する。好ましくは、プロバイオティックスは、適当なプレバイオティックと組み合され、シンバイオティックを形成する。この本発明の組合せ物は、例えば、免疫系を刺激するため、そして広い健康改善のために、そのままで消費すること、または食料品または医薬品と組合せることも可能である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
微生物 Lactobacillus rhamnosus LGG (ATCC 53103)、Lactobacillus rhamnosus LC705 (DSM 7061)、Propionibacterium freudenreichii ssp. shermanii PJS (DSM7067)およびbifidobacteriumのうち少なくとも３つを含むか、またはPropionibacterium freudenreichii ssp. shermanii PJS (DSM7067)およびbifidobacteriumを含むことを特徴とする、組合せ物。
【請求項２】
Lactobacillus rhamnosus LGG (ATCC 53103)、Lactobacillus rhamnosus LC705 (DSM 7061)、Propionibacterium freudenreichii ssp. shermanii PJS (DSM7067)およびbifidobacteriumを含むことを特徴とする、請求項１記載の組合せ物。
【請求項３】
Propionibacterium freudenreichii ssp. shermanii PJS (DSM7067)およびbifidobacteriumを含むことを特徴とする、請求項１記載の組合せ物。
【請求項４】
bifidobacteriumがBifidobacterium infantis Bbi99 (DSM 13692)であることを特徴とする、請求項１〜３のいずれかに記載の組合せ物。
【請求項５】
従来のスターター微生物をさらに含むことを特徴とする、請求項１〜４のいずれかに記載の組合せ物。
【請求項６】
プレバイオティックを含むか、またはプレバイオティックと共に使用することを特徴とする、請求項１〜５のいずれかに記載の組合せ物。
【請求項７】
プレバイオティックが、オリゴサッカライド、キシロ−オリゴマーまたはポリデキストロースであることを特徴とする、請求項６記載の組合せ物。
【請求項８】
プレバイオティックがガラクト-オリゴサッカライド(ＧＯＳ)であることを特徴とする、請求項７記載の組合せ物。
【請求項９】
治療用物質として使用される、請求項１〜８のいずれかに記載の組合せ物。
【請求項１０】
微生物: Lactobacillus rhamnosus LGG (ATCC 53103)、Lactobacillus rhamnosus LC705 (DSM 7061)、Propionibacterium freudenreichii ssp. shermanii PJS (DSM7067)および bifidobacterium のうち少なくとも２つを含むが、Lactobacillus rhamnosus LGG (ATCC 53103) と bifidobacterium の組合せ物は含まない、治療用物質として使用される組合せ物。
【請求項１１】
食品業、医薬産業、健康増進製品または自然製品の製造における、請求項１〜８のいずれかに記載の組合せ物の使用。
【請求項１２】
組合せ物が、乳製品、飲料、ジュース、スープまたは幼児用食(離乳食)に添加されることを特徴とする、請求項１１記載の使用。
【請求項１３】
組合せ物が単回用量形態で調製されることを特徴とする、請求項１１記載の使用。
【請求項１４】
用量形態がカプセルであることを特徴とする、請求項１３記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生菌剤（プロバイオティックス：probiotics）の組合せ物に関する。この組合せ物は、様々な組合せでlactobacilli, propionic acid bacteria および／またはbifidobacteriaを含む。プロバイオティックスは、適当なプレバイオティック(prebiotic)と組合されて、シンバイオティック(synbiotic)を生成するのが好ましい。本発明の組合せ物は、そのままで消費されるか、または適当な食料品、例えば乳製品または飲料品と組合せられ得る。このものは、例えば、免疫系を刺激したり、一般的な健康を改善するために治療上有用である。
【背景技術】
【０００２】
プロバイオティックスは、生存微生物であって、ヒトまたは動物に投与された場合に、腸内微生物バランスを改善することにより、宿主の健康を増進するものである(Fuller, R. probioics in man and animals, 1989, J. Appl. Microbiol. 66:365-378)。文献に報告されている最良のプロバイオティックスには、L. rhamnosus LGG, L. johnsonii LAl, L. casei Shirota および Bifidobacterium lactis Bbl2 が含まれる。さらに、その他のプロバイオティックスの多くは、当分野に関する文献（例えば、M. E. Sanders & J. H. in't Veld 1999. Antonie van Leeuwenhoek 76:293-315, Kluwer Academic Publishers）に記載されている。プロバイオティックスの健康増進効果には、腸内細菌叢のバランス調整および維持、免疫系の刺激および抗癌活性が含まれる。ヒト腸内におけるプロバイオティックスの有用な効果は、生存菌細胞、それらの細胞構造および代謝産物によって引起されるいくつかのファクターを基としている。プロバイオティックスは、通常、栄養物に含有されてまたはカプセルとして投与される。
【０００３】
細菌は、基本的に下記要件：消化管での支配的な必要条件(胃の低ｐＨ、消化系の酸など)で生存性を維持すること；腸管壁に結合すること；腸内で代謝すること；技術的に適用され得ること (経過に耐える)；臨床で試験され報告された健康効果を示すこと;および消費に対して安全であることを満たす場合に、プロバイオティックとして言及される(Lee, Y-K and Salminen, S. 1995 The coming age of probiotics. Trend Food Sci Technol, 6:241-245)。
【０００４】
プレバイオティックは、大腸内で１つまたはいくつかのプロバイオティック細菌の増殖および活性を選択的に刺激することによって、ヒトの健康を増進する難消化性食品成分である(Gibson, G.R. and Roberfroid, M.B. 1995. Dietary modulation of the human colonic microbiota - introducing a concept of prebiotics. J. Nutr. 125:1401-1412)。プレバイオティックは、通常、上部消化管で、分解または消化されない難消化性炭水化物(オリゴ-またはポリサッカライド)または糖アルコールである。市販製品に使用される既知のプレバイオティックには、イヌリン(フルクト-オリゴサッカライド、またはＦＯＳ)およびトランスガラクト-オリゴサッカライド(ＧＯＳまたはＴＯＳ) が包含される。
【０００５】
シンバイオティックは、プレバイオティックおよびプロバイオティックの組合せ物として定義され、プレバイオティックは、添加された微生物の生存性と腸への結合を増進し、それにより健康を増進する(Gibson and Roberfroid 1995,上掲)。小腸から通過した難消化性炭水化物が大腸で発酵される場合、短鎖脂肪酸、他の有機酸、アルコール、水素および二酸化炭素が形成される(Gibson and Roberfroid 1995, 上掲)。発酵中に生成される主要な脂肪酸は、酢酸、酪酸およびプロピオン酸である(Cummings, J.H. Short-chain fatty acids, in: Human Colonic Bacteria: Role in Nutrition, Physiology and Pathology, G.R. Gibson and G.T. Macfarlane (eds.), pp. 101 - 130, CRC Press, Boca Raton, 1995)。短鎖脂肪酸数が増加することは一般的に有利であろう。難消化性炭水化物は、腸管発酵で不利となる化合物を包含し得るが、大腸の微生物のための主な基質である(Gibson and Roberfroid, 1995, 上掲)。
【０００６】
ヒト消化管は、宿主中で共生する複数の細菌を収容している。消化管系の部分部分で微生物含量が大きく異なり、全ての腸管細菌の約９５％が結腸中にみられ、これは腸管の最も重要な部分である。４００を超える細菌種が、大腸中で繁殖していると見積もられている。該細菌種に加えて、腸は、過渡的微生物として知られている微生物をも含有する(G.R. Gibson and M.B. Roberfroid (eds.) Colonic Microbiota; Nutirition and Health. Kluwer Academic Publisher, Dordrecht, 1999)。優勢種は下記: Bacteroides、Bifidobacterium、Coprococcus、Peptostreptococcus、EubacteriumおよびRuminococcusである。Lactobacillus、Streptococcus、Fusobacterium、Veillonella、PropionibacteriumおよびEnterobacteriaceae種の数は若干少ない。そのいくつかの種は有用な微生物であるが、他の微生物は有害なものであろう。糞便中の平均的微生物含量は、１０１２ｃｆｕ/ｇ(乾燥重量あたり）である。細菌は、小腸で吸収されない食品成分を大腸で分解および発酵させ、発酵最終産物は体に使用するために腸管内で吸収される。栄養摂取に加えて、大腸の微生物バランスは、ヒトの健康状態に対して重要な意義を持つ(Tannock, G.W. 1998. Studies of the intestinal microflora: A prerequisite for the development of probiotics, Int. Dairy J. 8:527 - 533)。腸内細菌叢の組成物における変化、またはその量の突然の低下(重度の下痢、抗生物質による治療などによる)は、潜在的な病原種の伝染性を増加させ、深刻な結果(アレルギー、腸管疾患、癌の発生)を与え得ることがある。
【０００７】
腸管細菌によって産生されたβ-グルコニダーゼ酵素は、例えば、発癌性化合物の形成に寄与すると考えられている。ステロイドおよび他の発癌性化合物は、肝臓で代謝し、次いでグルクロン酸と結合する。胆汁は、結合したグルクロン化合物を小腸に移送し、そこから該化合物が、グルコニダーゼ酵素が該化合物を加水分解し得る直腸へとさらに通過し、それによって毒性化合物を大腸に放出する(Rowland, I.R. 1995. toxiology of the colon: role of the intestinal microflora, in: Human Colonic Bacteria, Role in nutrition, physiology, and pathology. Editors: Gibson, G.R. and Macfarlane, G.T., pp. 155-174, Boca Raton: CRC Press)。Eubacterium、BacteroidesおよびClostridium種は、BifidobacteriumおよびLactobacillusの代表的な種以上に、大量のこれら有害な酵素を、腸管中へ放出すると考えられる。このことが、なぜ腸内細菌叢が bifidobacteria および lactobacilli を含むことが利点となるかという１つの理由を提供する。
【０００８】
さらに、例えば、野菜および茶から生じるグリコシドは、小腸で吸収されず、大腸へ通過し、ここで、それらはβ-グルコシダーゼの作用によって加水分解され、毒性または変異原性のアグリコン化合物を形成する(Goldin, B.R. 1990. Intestinanl Microflora: metabolism of drugs and carcinogens. Annals of Medicine 22:43-48)。
【０００９】
さらに、腸内細菌叢は、尿素をアンモニアに分解するウレアーゼ酵素を産生する。高いアンモニア量は、腸管の上皮細胞に対して毒性と成り得る(Mobley, H.L.T. and Hausinger, R.P. 1989. Microbial ureases: significance, regulation and molecular characterization. Microbiological Reviews 53:85-108)。
【００１０】
ヒト腸内細菌叢は、人生の初期に形成され、その後、その組成はほとんど変化しない。種内の若干の変化のみが起こり得る(例えば、bifidobacteriaにおいて)。
【００１１】
腸内細菌叢の重要性に関する理解が深まるにつれて、研究は、有益な細菌種が増大し、かつ有害な細菌が低下するように、細菌叢およびその作用(生育力)の組成を作用に影響し得るファクターの発見を積極的な目的としてなされてきた。細菌の作用が有益細菌を増進するプレバイオティックによって影響され得ると考えられている。広範な研究が、ガラクトオリゴサッカライド類(ＧＯＳ)で行われてきた。これは、ジ−、トリ−、テトラ−、ペンタ−およびヘキササッカリドであり、そしてガラクトースユニットを主に含有する。それらは、ラクトースから酵素的に調製され、最終産物の含量は使用した酵素に依存する(Matsumoto, K. et al. 1993. Galactooligosaccharides, in: Oligosaccharides. Production, properties and applications. Ed. Nakakuki, T., Japanese Technology Reviews. Vol. 3. No. 2., pp. 90-116, Gordon and Breach Science Publishers, Switzerland, Australia)。ＧＯＳは、早くから、例えば bifidogenic 特性、即ち bifidobacteria の増殖を増進することを示すと説明されてきた(Ito, M. et al. 1990. Effect of administration of galactoologosaccharides on the humanfaecal microflora, stool weight and abdominal sensation. Microb. Ecol Health Dis. 3:285-292)。
【００１２】
個々のプロバイオティック株を含有する産物と複数の異なるプロバイオティックスの組合せ物の両方は、当技術分野の文献で数多く記載されている。シンバイオティックもまた当技術分野の文献に記載されている。
【００１３】
公報 EP 904 784（N. V. Nutricia) は、例えば、Bifidobacterium, Enterococcus faecium および Lactobacillus を含有するプロバイオティック製品を説明している。さらに、該製品は、プレバイオティック、例えば、ポリサッカリドまたは非分解性スターチ、そしてイムノグロブリン、ビタミンなどを含有してもよい。文献によれば、該製品は、健康増進効果、即ち、例えば免疫系を刺激する。しかし、その効果は、臨床試験で示されておらず、その他の生物活性もまた研究されていない。
【００１４】
WO 00/33854（N. V. Nutricia）は、プロバイオティックおよびオリゴサッカライドからなる製品を説明している。該プロバイオティックスは、特に、LactobacillusおよびBifidobacteriumについて言及されているが、Pediococcus、Prpionibacterium、LeuconostocおよびSaccharomycesmoも説明されている。関連のある該プレバイオティックは、トランスガラクトオリゴサッカライド（ＴＯＳ) およびフルクトオリゴサッカライド(ＦＯＳ)も包含する。公報によれば、特に、有利な組合せ物は、Lactobacillus rhamnosus およびトランスガラクトオリゴサッカライドまたはポテトガラクタンの加水分解産物を包含し、この組合せ物およびその調製物もまた、その実施例に説明されている。公報によれば、該製品は健康増進効果を持ち、特に腸管疾患の処置において有用である。しかし、その活性はなんら示されていない。
【００１５】
WO 97/34615（University of New South Wales）は、さらに１以上のプロバイオティックス、耐性物質（非分解性）スターチおよびオリゴサッカライドを含有するプロバイオティック組成物、および３つの成分間での相乗作用が得られたと説明している。該プロバイオティックスは、Saccharomyces、Bifidobacterium、Bacteroides、Clostridium、Fusobacterium、Propionibacterium、Lactococcus、Streptococcus、Enterococcus、Staphylococcus、PeptostreptococcusおよびLactobacillus、そしてオリゴサッカライドが含まれ、その他多くのものの中には、フルクト−およびガラクト-オリゴサッカライドも含まれる。この例は、bifidobacteria の量に対する、bifidobacteria、トウモロコシスターチおよびフルクトオリゴサッカライドの相乗効果を示す。しかし、全ての治療的効果は記載されていない。
【００１６】
US 5,895,648（Sitia-Yomo S.p.A.）は、１種またはそれ以上のオリゴサッカライドと組み合わせた少なくとも２種のbifidobacteriaおよびlactobacilliまたはstreptococcusの少なくとも２種の生存細菌を凍結乾燥形態で含有するプロバイオティック組成物を説明している。該組成物は、全体で４〜２０重量部のプロバイオティックスおよび５〜２２重量部のオリゴサッカライドを含有し、その中で、例えば、ガラクト−およびフルクトオリゴサッカライド、特にイヌリンが記載されている。記載されている該プロバイオティックスは、Bifidobacterium breve、Bifidobacterium infantis、Bifidobacterium longum、Bifidobacterium bifidum、Lactobacillus acidophilus、Lactobacillus bulgaricus、Lactobacillus casei、Lactobacillus plantarum、Streptococcus thermophilus および Streptococcus faecium を包含する。公報によれば、プロバイオティックスおよびプレバイオティックスを含有する混合物は、乳製品デザート、ミルクまたはジュースに添加され、腸管の機能を調整し得る。しかし、組合せ物に関する生物活性は説明されていない。
【００１７】
Milchwissenschaft (1988) Vol. 53, No. 11, pp. 603-605 は、３つの細菌株：Propionibacterium freudenreichii subsp. shermanii MTCC 1371、Lactobacillus acidoｐＨilus R. および Bifidobacterium bifidum NDRI を含有するＰＡＢ-ミルクを記載している。プレバイオティックは、製品に添加さていない。この文献によれば、ＰＡＢ-ミルクは、ラクトース過敏症に罹っているような乳児および幼児に適している。
【００１８】
WO 99/10476は、特定の細菌株、即ちLactobacillus rhamnosus HN001 (NM97/09514) および HN067 (NM97/01925)、および Lactobacillus acidophilus HN017 (NM97/09515) および Bifidobacterium lactis HN019 (NM97/09513)のファゴサイトーシスの増強として測定される免疫系に対する刺激効果を説明するものである。該株は、個々に使用され得るか、または乳製品または医薬調製品に添加され得る。
【００１９】
US 5,902,578（Abbott Laboratories）は、Lactobacillus reuterii、Lactobacillus acidophilus および Bifidobacterium infantis の混合物を用いた下痢を予防および治療する方法に関し、そして該混合物は粉末、液体またはピルとして調製され得る。
【００２０】
上記タイプのプロバイオティックスおよびシンバイオティックスの生物学的および治療的効果は、従来技術にも記載されている。例として、Gallagher, D. et al. Journal of Nutrition (1996) Vol. 126, No. 5, pp. 1362-1371 があり、これは、ラットでの大腸癌に対する bifidobacteria および Lactobacillus acidophilus を説明するものであり、最良の結果が、細菌およびフルクトオリゴサッカライドの両方を用いて得られたことを記載している。Kirjavainen, P. et al.  Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology (Nov 1999) Vol. 6, No. 6, pp. 799-802は、リンパ球レベル、それによるマウスの免疫応答に対して、別々に試験された２つの乳酸株 Lactobacillus rhamnosus GG および Propionibacterium freudenreichii subsp. shermanii JS の陽性効果について記載している。これら２つの細菌の組合せ物は、記載も試験もされていない。
【００２１】
プロバイオティックスと治療効果を有する他の物質との組合せが、当技術分野の文献で説明されている。例えば、WO 97/29762 および WO 97/29763(Procter & Gamble Company)では、Ericaceae 属の植物と共に、ガラクトまたはフルクトオリゴサッカライドを組み合わせた lactobacilli および bifidobacteria の使用、または尿道感染および腸管疾患の処置用にそれらの抽出物の使用が説明されており、そしてWO 00/29007（Reddy）では、プロバイオティックス、例えば Lactococcus、Lactobacillus、Pediococcus、Streptococcus、Propionibacterium、Brevibacterium、Penicillium および Saccharomyces とハーブを基にした自然製品および薬物様物質との組合せを記載している。
【００２２】
プロバイオティックスおよびシンバイオティックスが広く研究されているが、良好かつ多用途の製品は、いずれも有意な程度には利用可能でない。結果として、消費者に、明確にプロバイオティック効果が示され、また簡便な部分または補添物（例えば、日々の食事など）として使用されることが可能な形態で製造された新規製品が提供されることは、継続的で明白な必要性がある。
【発明の開示】
【００２３】
すなわち、本発明の目的は、明白に提示されたプロバイオティック効果を含有する新規プロバイオティック含有製品が提供されることであり、このものは、消費者に快適に使用され、健康的である。
【００２４】
これらの目的は、複数のプロバイオティックスを含有する本発明の新規組合せ物の使用で達成された。即ち、本発明は、(2) lactobacilli 株、propionic acid bacteriumおよび／または bifidobacterium を含む新規な組合せ物を基にしている。さらに、該組合せ物は、上記微生物の増殖を支持するプレバイオティックを含むのが好ましい。
【００２５】
本発明に従って、２つの株のlactobacilli、即ち Lactobacillus rhamnosus LGG (ATCC 53103) および Lactobacillus rhamnosus LC705 (DSM 7061)が、主に使用される。該 propionic acid bacteriumは、Propionibacterium freudenreichii ssp. shermanii PJS (DSM 7067)が普通である。該 bifidobacterium は、プロバイオティック効果を持ついかなるbifidobacterium でもよいが、通常、該種のBifidobacterium breve、Bifidobacterium infantis、Bifidobacterium longum、Bifidobacterium bifidum および Bifidobacterium adolescentis に属する株が用いられる。
【００２６】
これら細菌の少なくとも３つが通常含まれ、該組合せは、Lactobacillus rhamnosus LGG および／または Propionibacterium freudenreichii ssp. shermanii PJS を包含するのが好ましい。
【００２７】
もっとも好ましい組合せ物は、４つの株、Lactobacillus rhamnosus LGG (ATCC 53103)、Lactobacillus rhamnosus LC705 (DSM 7061)、Propionibacterium freudenreichii ssp. shermanii PJS (DSM 7067) および Bifidobacterium infantis Bbi99 (DSM 13692)に関する混合物である。しかし、任意の bifidobacterium (例えばBbl2)が、所望によりこの組合せに包含されてもよい。使用するプレバイオティックは、ガラクトオリゴサッカライド(ＧＯＳ)が好ましい。
【００２８】
他の好ましい組成物は、bifidobacterium および propionic acid bacteriumの組合せ物であり、この中で任意の bifidobacterium が、Propionibacterium freudenreichii ssp. shermanii PJS (DSM 7067)と共に使用され得る。
【００２９】
この新規な組合せ物は、そのままで、または他の製品、例えば医薬品または食品の一部として使用され得る。本発明の組合せ物は、ヒト腸管バランスに対する有利な効果を持つ、即ち、エンテロ−ラクトン産出を増加させ、不都合な高ｐＨ値を低下させる。また、該組合せ物は、リンパ球の量とγ-インターフェロン (ＩＦＮ)の量を増加させ、発癌性物質の形成を低下させることによる免疫応答に影響を与える。即ち、本発明の組合せ物は、腸管疾患、アレルギーおよび癌に関する予防および治療、そして広義の健康増進に有用である。
【００３０】
即ち、本発明に従って、組合せ物は、治療用物質として、および治療用物質の調製の際に、適用され得る。
【００３１】
（本発明の詳細）
本発明で使用した株のうち、Lactobacillus rhamnosus GG (LGG)、Lactobacillus casei ssp. rhamnosus LC705 および Propionibacterium freudenreichii ssp. shermanii JS (PJS) は、従来技術で説明されている。組合せ物中に包含され得る Bifidobacterium infantis Bbi99 は、新規株であり、下記に詳細に説明される。
【００３２】
Lactobacillus rhamnosus GG (LGG)は、例えば、US Patent 5,032,399, Gorbach & Goldin で説明されている。該株は、ヒトの糞便から単離され、ｐＨ３で良好に生育し、より低いｐＨおよび高胆汁酸含量でも生存する。該株は、粘液および上皮細胞の両方に卓越した接着性を示す。グルコースからの乳酸産生は良好である: ＭＲＳブロスで増殖された場合、該株は１.５−２％の乳酸を産生する。該株は、ラクトースを発酵しない、即ち、ラクトースから乳酸を産生しない。該株は、下記の炭水化物を利用する: Ｄ-アラビノース、リボース、ガラクトース、Ｄ-グルコース、Ｄ-フルクトース、Ｄ-マンノース、ラムノース、ズルシトール、イノシトール、マンニトール、ソルビトール、Ｎ-アセチルグルコサミン、アミグダリン、アルブチン、エスクリン、サリシン、セロビオース、マルトース、サッカロース、トレハロース、メレジトース、ゼンチビオース（gentibiose）、Ｄ-タガトース、Ｌ-フコースおよびグルコネート。該株は、＋１５−４５℃で良好に生育する。この至適温度は３０−３７℃である。Lactobacillus rhamnosus GGは、American Type Culture Collection 寄託機関で寄託番号ATCC 53103として寄託されている。
【００３３】
Lactobacillus casei ssp. Rhamnosusは、FI Patent 92498（Valio Oy. LC705）でより詳細に説明されている。LC705 はグラム陽性で繋がったショート・ロッド（短い棒状）である；ホモ型発酵; 弱いタンパク質分解性があり；＋１５−４５℃で良好に増殖する；アルギニンからのアンモニアを産生しない; カタラーゼ陰性である; ＭＲＳブロス(ＬＡＢ Ｍ)で増殖した場合、該株は、Ｌ(＋)立体配位の光学活性を持つ１.６％乳酸を産生する；該株はクエン酸を分解 (０.１６９％)する、それによって、ジアセチルおよびアセトインを産生する；該株は、少なくとも１つの下記炭水化物 (糖、糖アルコール): リボース、ガラクトース、Ｄ-グルコース、Ｄ-フルクトース、Ｄ‐マンノース、Ｌ-ソルボース、ラムノース、マンニトール、ソルビトール、メチル-Ｄ−グルコシド、Ｎ-アセチルグルコサミン、アミグダリン、アルブチン、エスクリン、サリシン、セロビオース、マルトース、ラクトース、スクロース、トレハロース、メレジトース、ゲンチオビオース、Ｄ-ツラノースおよびＤ-タガトースを発酵する。ＬＣ７０５は、粘液細胞には弱く接着するが、上皮細胞には適度に接着する。該株の生存性は、低いｐＨ値かつ高い胆汁酸含量で良好である。該株は、５％の塩濃度で良好に生存し、１０％の塩濃度でも良好に生育する。Lactobacillus casei ssp. rhamnosus LC705 は、Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSM)で、寄託番号DSM 7061として寄託されている。
【００３４】
また、Propionibacterium freudenreichii ssp. shermanii JS (PJS)は、FI Patent 92498（Valio Oy）において詳細に説明されている。ＰＪＳは、グラム陽性のショート・ロッドであり；グルコース、フルクロース、ガラクトースおよびラクトースを発酵させる；十分にラクテートを発酵させる; 至適増殖温度は３２℃である。低いｐＨ値かつ高い胆汁含量での該株の生存性は優れている。Propionibacterium freudenreichii ssp. shermanii JS は、Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSM)で、寄託番号DSM 7067で寄託されている。
【００３５】
Bifidobacterium infantis Bbi99 は、健康な新生児の糞便から単離されている。B.infantis Bbi99は、グラム陽性多形性ロッドである。該株は、カタラーゼ陰性、フルクトース-６-ホスフェート-ホスホケトラーゼ−陽性(F6PPK)、およびαおよびβ−ガラクトシダーゼとαおよびβ−ガラクトシダーゼの両方で陽性である。B.infantis Bbiは、下記炭水化物:リボース、ガラクトース、Ｄ-グルコース、Ｄ-フルクトース、Ｄ-マンノース、メチル-Ｄ-マンノース、Ｎ-アセチルグルコサミン、エスクリン、サリシン、セロビオース、マルトース、ラクトース、メリビオースおよびゲンチオビオースを発酵する。至適増殖温度は、３０−４０℃、ｐＨ６.５−７.０である。ヘキソースを含有するブロス中で増殖する場合、該株は、Ｌ-乳酸と酢酸(２：３の比)を産生する。ＤＮＡのＧ＋Ｃ含量は、５５−６７モル％（mol％）を産生する。Bifidobacterium infantis Bbi99 は、Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSM)で、ブタペスト条約に従って、寄託番号DSM 13692として、２０００年８月２８日に寄託された。
【００３６】
本発明の組合せ物は、他の微生物、例えば、乳製品業で用いるスターターに含まれている微生物およびプロバイオティックスを包含する。多くの文献に記載されたスターター株があり、これは、例えば、Hansen A/S, Denmark, and Danisco/Wiesby GmbH, Germanyから入手可能である。
【００３７】
本発明の組合せ物を調製するために、該微生物は、従来の方法を用いて培養された。それらは、純粋培養または異種混合培養として培養され得る。該培養物は、そのまま用いられるか、またはそれらは、所望により、精製、濃縮、凍結乾燥またはフィニシングにより処理され、様々な製品を製造し得る。
【００３８】
十分量のプロバイオティックスが組合せ物中で使用されて、所望のプロバイオティック効果が生成される。即ち、各プロバイオティックの量は、例えば、用いた株およびそれらの数、プロバイオティックスの細胞総量、１日総用量、製品の他の特性および成分によって広い範囲で変化する。該組合せ物の１日用量は、約１０６-１０１０ｃｆｕのプロバイオティックスを含有するのが普通である。
【００３９】
１以上のプレバイオティックが、シンバイオティックの形成のために組合せ物に添加されるのが好ましい。該プレバイオティックは、該微生物の増殖を保持するように配慮された組合せ物に含まれる微生物に従って選択される。適当なプレバイオティックは、例えば、オリゴサッカライド、特にガラクトオリゴサッカライド(ＧＯＳ)、パラチノースオリゴサッカライド、大豆オリゴサッカライド、ゲンチオオリゴサッカライド、キシロオリゴマー、非分解性スターチ、ラクトサッカロース、ラクチュロース、ラクチトール、マルチトール、ポリデキストロースなどを包含し得る。プレバイオティック効果を生むように十分量のプレバイオティックが、シンバイオティックに添加される。十分量というのは、例えば、関与する株、含まれるプレバイオティックの量、他の含量および製品の用途によって決定される。それゆえ、その十分量は広い範囲内で変化する; １日用量で、例えば０.５〜５g変化してもよい。
【００４０】
プレバイオティックは、必ずしもその組合せ物に含まれる必要はない。最終製品および使用目的によって、プロバイオティック組合せ物とほぼ同時に、プレバイオティックを別々に消費されることがよりよいことも有り得る。ある場合において、プロバイオティック組合せ物を消費されるだけで十分なこともあり、その場合、このプレバイオティックは全く必要でない。この例は、宿主の腸管状態が、必要なプレバイオティックの添加なしにプロバイオティックスの増殖に適切である場合およびプレバイオティックが通常の食事に含まれる場合である(例えば、ポリッジまたはライ麦パン中にある場合)。
【００４１】
本発明は、使用される微生物がプロバイオティックスについての判定基準に適合することを示した：該微生物は、消化管の必要な条件下で十分に生存し、腸管細胞に十分に接着し、腸内で十分に増殖する。また、該微生物は、卓越した生物学的効果を提示する；例えば、該微生物は、腸内で健康の観点から望ましい微生物数を増加させ、有害な微生物数を減少させ、有害な酵素活性を低下させ、それにより、有害なまたは発癌性の物質の形成を低下させ、免疫応答に対する刺激的な促進効果を持っている。
【００４２】
本発明の組合せ物は、そのままで使用するか、カプセル、ピル、錠剤の形態、例えば、医薬組成物を調製する従来方法で製造された形態で使用され得る。本発明の組合せ物は、食材などの食料品、飲料または製菓業の製品、健康増進食品、天然食品などに添加されてもよい。本発明において、本発明の組合せ物を含有する製品、例えば、乳業、特にヨーグルトおよびその他の発酵乳製品；チーズおよびスプレッド；乳幼児用食品；ジュースおよびスープ；およびカプセルが好ましい。カプセルの形態にある製品は、通常プロバイオティック組合せ物を含有するのみであり、プレバイオティックは別個に消費される。
【００４３】
最終製品は従来の方法で調製されるが、その組合せ物は、調製時に、またはその後の最終製品の仕上げ過程のいずれかで添加される。
【００４４】
本発明は下記実施例に引例と共に非常に詳細に説明されているが、これらの実施例は、本発明を説明することを意図しており、いずれにしても本発明を制限するものではない。
【実施例１】
【００４５】
組合せ物の調製
組合せ物を細菌混合物から調製し、所望によりプレバイオティックスとしてガラクト-オリゴサッカライド(ＧＯＳ) を添加した。細菌混合物を、４株、即ちLactobacillus rhamnosus LGG (ATCC 53103)、Lactobacillus rhamnosus LC705 (DSM 7061)、Propionibacterium freudenreichii ssp. shermanii PJS (DSM 7067) および Bifidobacterium infantis Bbi99 (DSM 13692)の細菌培養物(濃縮物または凍結乾燥粉末)から形成した。
【００４６】
ＬＧＧおよび bifidobacterium の両方を、別々に培養した。
【００４７】
ＬＧＧを、５.０％ のホエイ透過物(Valio Oy)、０.５％のカゼイン加水分解物(Valio Oy)、０.５％の工業用のイーストおよび０.００１５％のＭｎＳＯ4 x Ｈ２Ｏを含む培地で培養した。培地成分を水に溶解し、この培地を滅菌した(２０分間、１２０℃)。培養を、３７℃、ｐＨ５.８(ＮＨ4ＯＨで調整した) 、約１８時間、混合速度１００rpmで行った。培養後、１０％(v/v)保護剤補添物、例えば４６％のサッカロースブロス、または当業者には既知の類似代替物を用いて、細菌細胞を濃縮し、洗浄し、凍結乾燥した。最終細菌含量は、培養物中では、＞１x１０９cfu/ml、濃縮物中では、＞１x１０１０cfu/g、凍結乾燥粉末中では、＞１x１０１１cfu/gであった。
【００４８】
bifidobacteria の増殖培地の組成を下記する：ホエイ透過物４％(Valio Ltd.)、カゼイン加水分解物１.０％ (Valio Ltd.)、工業用イースト抽出物１.０％ (LAB M)、システイン−ＨＣｌ ０.０３％ (Merck, Darmstadt, Germany)。培地中の他の成分を、まず水に溶解し、次いでシステイン-ＨＣｌを添加し、培地を滅菌した(２０分間、１２０℃)。培養を、約１８-２０時間、３７℃、ｐＨ６.７(ＮＨ4ＯＨで調整した)、混合速度１００ｒｐｍで行った。培養物の細菌含量は、＞１x１０９cfu/mlであった。培養後、１０％(v/v)保護剤補添物、例えば４６％のサッカロースブロス、または当業者には既知の類似代替物を用いて、細菌細胞を濃縮し、洗浄し、凍結乾燥した。濃縮物中の細菌量は、＞１x１０１０cfu/gであり、凍結乾燥粉末中では、＞１×１０cfu/gであった。
【００４９】
ＬＣ７０５およびＰＪＳを、細菌細胞と、ホエイを基にした増殖ブロスとを１：２の比で埴菌することにより、共培養した。ホエイを基にした増殖培地は、３.５−５％のホエイ透過物(Valio Oy)、１.０％のカゼイン加水分解物および１.０％のイースト抽出物(Valio Oy)を含有する。該株を、３日間、３０℃で、自動ｐＨ調整機を用いてｐＨを４.５で維持した。培養後、各細菌株の含量は＞１x１０９cfu/mlであった。培養後、１０％(v/v)保護剤補添物、例えば４６％のサッカロースブロス、または当業者には既知の類似代替物を用いて、細菌細胞を濃縮し、洗浄し、凍結乾燥した。各細菌の含量は、濃縮物中では ＞１ｘ１０１０cfu/gであり、凍結乾燥粉末中では＞１ｘ１０cfu/gであった。
【００５０】
また、株を別々に培養してもよい。その場合、ＬＣ７０５は、継代培養との関連で上記と同様に培養した。ただし培養時間は３０℃で１日である。ＰＪＳを、２％のホエイ透過物、１.０％のカゼイン加水分解物および１％のイースト抽出物を含有するホエイを基にした増殖培地中で培養した。該株を、３日間、３０℃、ｐＨ値６.３で培養し、その後このプロセスを上記のように実施した。
【００５１】
濃縮物または粉末を１:１:１の比で混合した。ＬＣ７０５およびＰＪＳを別々に培養した場合、この混合比は１：１:１:１である。濃縮物または凍結乾燥粉末の得られた混合物を、組合せ物の様々な製品用途におけるプロバイオティックの一部として使用した。この混合物を製品に添加して、製品中下記最終細菌含量を得た：
ＬＧＧ                ＞１０６ cfu/製品ｇ
ＬＣ７０５            ＞１０６ cfu/製品ｇ
ＰＪＳ                ＞１０６ cfu/製品ｇ
Bifidobacterium       ＞１０６ cfu/製品ｇ
【００５２】
ＧＯＳ(Valio Oy)を、所望により、製品用途についての別々の製品として添加し、製品中、約０.５−５g/用量のＧＯＳ濃度を得た。
【実施例２】
【００５３】
該株の接着特性および腸管条件におけるその耐性
プロバイオティック株の粘液への接着性を、Ouweland ら (Ouwehand, A. C., Kirjavainen, P. V., Groenlund, M.-M., Isolauri, E., and Salminen, S. J. 1999．Adhesion of probioric micro-organisms to intestinal mucus. Int. Dairy J. 9:623-630) にしたがって試験した。ＬＧＧおよび probionic bacterium PJSは腸管粘液に非常によく接着し、Ｂｂｉ９９ は適度に、ＬＣ７０５は弱く接着する。接着は、微生物が腸管における価値のある効果を生み出すための前提条件である。一方、ＬＣ７０５は、ＬＧＧと同様、上皮細胞へ十分に接着することが知られている(Lehto, E. and Salminen S. 1997. Adhesion of two lactobacillus strais, one lactococcus strain and one propionibacterium strain to cultured human intestinal CaCO-2 cell lines. Bioscience Microflora 16: 13 - 17)。この特性は、腸管内のバランスが崩れたとき、そして保護粘液が弱くなったときに有益である。
【００５４】
表１．プロバイオティック株の接着特性
【表１】
2004524836.tif 000002
【００５５】
イン・ビトロでの試験は、該株(複数を含む)が生理学的胆汁塩含量および胃の低ｐＨに耐えることを示した。
【００５６】
これらの株を、ＭＲＳブロス中、乳酸を用いて、ｐＨ４、ｐＨ３およびｐＨ２に調整した様々なｐＨ値で試験した。試験すべき株(新規培養)を、１％のｐＨ調整したブロスに埴菌し、３７℃、３時間で増殖させ、その後、生存細胞の含量を該株に適するアガーを用いて測定した(表５を参照されたい)。該株は、ｐＨ３において３時間のプロセスで、その生存能を維持した。propionic bacterium は、ｐＨ２であっても生存しつづけていた。この試験で、食品(例えば、脂肪)と共に運搬された成分は、細菌を保護しなかった。従って、細菌は、イン・ビボで食品と共に消費された場合であっても、良好に保護されると考え得る。
表２. ｐＨ調整したＭＲＳブロス中で培養した株の細胞含量
【表２】
2004524836.tif 000003
【００５７】
胆汁塩耐性に関して、この株を、研究される胆汁塩ＭＲＳブロス中に１％の新しい培地に接種することによって、０.３％と０.５％のOxgal (Sigma)胆汁塩を含有するＭＲＳブロスで試験した。該株を、３時間、３７℃で、ブロス中で培養し、その後生存細胞の含量を、該株に適切なアガーを用いて測定した(参照、表５)。全ての株はこの処置に十分耐えた。
表３．０.３％および０.５％の胆汁塩含量で培養した株の細胞含量
【表３】
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【実施例３】
【００５８】
組合せに適するプレバイオティックの選択
個々の株について代わりのプレバイオティックを、糖を含まないＭＲＳブロス中の各株を培養することによって試験し、１％のプレバイオティックを添加した。各株を、その至適温度で１-２日間培養した。細菌増殖は、光学的測定法により、濁度を測定することによって試験中観察した。表４に示したように、全４種の株において増殖のための最良のプロモーターは、１％のガラクト-オリゴサッカライド(ＧＯＳ)補添物であった。
表４．細菌増殖に対するプレバイオティックの効果
【表４】
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【実施例４】
【００５９】
最終製品の調製
０.１gの凍結乾燥混合物の細菌/用量(＝６５ml)および３.８gの７０％ＧＯＳシロップ/用量(=６５ml)を添加したジュース(用量６５ ml/日)の調製のために、機能ドリンク(in Finnish tehojuoma'; Valio Oy)を基として使用した。ＧＯＳシロップまたは細菌混合物を添加しない同ジュースを、対照として使用した。
【００６０】
最終ジュースの細菌含量は以下であった:
ＬＧＧ          ＞１０７ cfu/ml
ＬＣ７０５      ＞１０７ cfu/ml
ＰＪＳ          ＞１０８ cfu/ml
Ｂｂｉ          ＞１０７ cfu/ml
【００６１】
製品を、pro = ジュース＋プロバイオティック補添物、syn = ジュース + プロバイオティック＋プレバイオティック補添物として、下記の臨床試験で使用した。
【実施例５】
【００６２】
本発明の組合せ物の臨床効果
上記のプロオティック組合せ物(Pro)またはプロバイオティック組合せ物およびプレバイオティック(Syn)を含有した実施例４に記載のドリンクを、２０人の男性で臨床的に試験した。被験者は、試験計画にしたがって毎日ドリンクを摂取した。試験中は、その他のプロバイオティック含有製品の摂取を認めない。試験スキームは、試験が、助走期間で始まり、２週間のプロバイオティックス期間、続くシンバイオティック期間と続き、そしていわゆる洗浄期間で終結するものであった。
試験スキームおよびスケジュール
【表５】
2004524836.tif 000006
【００６３】
各期間の最後に、被験者は糞便試料および血液試料(＝Ｎ)を提供した。
【００６４】
微生物および酵素を糞便試料から分析し、エンテロラクトン含量および免疫応答を血液から分析した。
【００６５】
５.１．微生物
微生物の量
全乳酸細菌含量、ＬＧＧ、ＬＣ７０５、全 propionic acid bacterium含量、ＰＪＳ および 全 bifidobacteria 含量を、当業者に既知の方法および表５に示したパラメ−ターを用いて決定した。
表５. 微生物を決定するための方法
【表６】
2004524836.tif 000007
【００６６】
イン・ビボで腸管細菌細胞含量に対する影響
ＬＧＧ、ＬＣ７０５およびＰＪＳの含量は、被験者がプロバイオティック含有製品を使用した期間中、試料で顕著に増加した (表６)。bifidobacteria含量は、試験開始時から非常に高いので、おそらく、この変化はその種内のみで起こるのであろう。
表６. 細菌含量(log, cfu/糞便のｇ; ± 標準)
【表７】
2004524836.tif 000008
【００６７】
摂取試験で消費した製品へのシンバイオティックの添加は、腸において、添加されたプロバイオティックスの生存率を改善した。これは、例えば、シンバイオティック期間中のＬＧＧ含量における増加によって明らかになる。
【００６８】
ｐＨ値の効果
初期ｐＨ７以上を示す被験者のｐＨレベルは、プロバイオティック混合物およびシンバイオティックを摂取したグループで低下したが、この低下は、初期ｐＨ値が７以下の被験者では認めなかった(表７)。
表７
プロバイオティックおよびシンバイオティック補添物後のｐＨにおける変化
【表８】
2004524836.tif 000009
【００６９】
５.２. 酵素
糞便試料を、Ling ら (Ling, W-H., Korpela, R., Mykkaenen, H., Salminen, S., and Haenninen, O. 1994 Lactobacillus GG supplementation decreases colonic hydrolytic and reductive activities in healthy female adults. Journal of Nutrition 124, 18-24) に記載のように処理した。
【００７０】
β-グルコニダーゼおよびβ-グルコシダーゼを、Freemanら(Freeman, H. J. 1986. Effects of differing purified cellulose pectin, and hemicellulose fibre on faecal enzymes in 1,2-dimethyl -hydrazine-induced rat colon carcinogenesis. Cancer Research 46: 5529 - 5532)に記載のように測定し、ウレアーゼを製造者(Boehringer Mannheim cat. no. 542946)の指示にしたがって測定した。
【００７１】
試験期間に、プロバイオティック摂取およびシンバイオティック摂取中、β-グルクロニダーゼ、ウレアーゼおよびβ-グルコシダーゼ含量が低下した(表８)。摂取後、酵素レベルが正常に戻った。シンバイオティックは、酵素レベルに対してプロバイオティック混合物よりも強い低下効果を有した。
表８．酵素含量の変化(nmol/min/g糞便)
【表９】
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【００７２】
グルコシダーゼおよびグルクロニダーゼの代謝は、発癌性化合物を作り出す。酵素活性における顕著な低下は、プロバイオティックによっておこり、本発明のシンバイオティックの組合せ物は、発癌性物質の形成の低下に関して、明らかな陽性効果を示す。
【００７３】
５.３  エンテロラクトン含量
エンテロラクトン含量を、Adlercreutz ら (Adlercreutz, H., Fostis, T., Lampe, J., Waehaelae, K., Maekelae, T., Brunow, G. and Hase, T. 1993. Quantitative determination of lignans and isoflavonoids in plasma of omnivorous and vegetarian women by isotope dilution gas-chromatograｐＨy mass-spectrometry. Scan J. Clin Lab Invest 53: 5 - 18.)の方法を用いて測定した。
【００７４】
＜１０ nmol/lの初期エンテロラクトンレベルを呈する被験者のエンテロラクトンレベルは、シンバイオティック摂取(１１.２のレベルまで)の結果、顕著に増加した。
【００７５】
血清エンテロラクトンレベルが試験開始時にすでに正常(１０＜ｘ＞３０)であった患者のエンテロラクトンレベルにおいて、試験中の変化を認めなかった。結果は表９に示した。
【００７６】
表９. 試験期間中のエンテロラクトン含量 (初期レベルに対するグループ化)
【表１０】
2004524836.tif 000011
【００７７】
エンテロラクトン含量は、明らかに癌を生じるリスクと明白な相関関係を示した。含量が高い程、リスクが低い。即ち、この結果は、癌リスクの減少について、本発明のプロバイオティックとシンバイオティックの組合せ物の有益な効果を示すものである。
【００７８】
５.４.  免疫学的研究
リンパ球機能に対する効果
白血球の機能を製品の摂取開始前と４週間後に試験した。
【００７９】
白血球の機能を下記のように試験した:
【００８０】
リンパ球を、Ficollグラジエントを用いて、末梢血液から単離した。リンパ球を、５％の不活性化ＡＢ＋血清(Finnish Red Cross)およびＬ-グルタミンを含有したＲＰＭＩ培養ブロス中ＰＨＡマイトジェン(Sigma)によって刺激した(National Public Health Institute; department of nutrient broths)。４８時間後、細胞培養培地を、マイトジェンの添加または無添加のウェル中、２００μｌの培養ブロスあたり２００,０００細胞密度を持つ４つの隣接した培養ウェルからサイトカイン測定のために回収した。該細胞を、チミジンの添加１６時間後に収集し、ＤＮＡ(cpm)に取込まれた放射性物質であるチミジンを測定した。サイトカインＩＬ−４、ＩＬ−５、ＴＧＦβ１およびＩＦＮ−γの量を、ＥＬＩＳＡ法を用いて、細胞培養ブロスから測定した。
【００８１】
追跡中、リンパ球によって分泌されたＩＬ‐４、ＩＬ‐５およびＴＧＦβ１含量に変化を検出できなかった。ＰＨＡ刺激リンパ球によって分泌されたＩＦＮ-γ含量は、追跡中有意に増加した(ｐ=０.００９, Wilcoxon test, 図１を参照されたい)。自発的およびＰＨＡ刺激の両方によるリンパ球の増殖は、追跡中に高まった(両ケースでｐ=０.０００２, Wilcoxon test, 図１および２)。
【００８２】
即ち、試験結果によれば、シンバイオティック製品の使用により、被験者のリンパ球増殖およびＩＦＮ-γサイトカイン分泌が高まる。ＩＦＮ‐γは、細胞毒性のリンパ球機能を増強するＴｈ１サイトカインとして知られる類に属し、ＩＬ-４およびＴＧＦ-β１サイトカインのアンタゴニストである。低度のＩＦＮ‐γ分泌がアレルギーの傾向を持つ患者で報告されている。さらに、アトピーおよびアレルギー反応に対する疾病素質を持つ子供は、ＩＦＮ-γ分泌の発達が遅い障害があると考えらえる。即ち、本発明の組合せ物のＩＦＮ-γ分泌に対する有意な刺激効果は、アレルギーの予防および治療における有効性を証明するものである。
【図面の簡単な説明】
【００８３】
【図１】図１は、ＰＨＡ刺激Ｔ細胞によるＩＦＮ−γ分泌を示す。
【図２】図２は、ＰＨＡ刺激Ｔ細胞におけるチミジンの導入を示す。
【図１】
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【図２】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004524836.tif 000068
【国際調査報告】
2004524836.tif 000069
2004524836.tif 000070
2004524836.tif 000071