(57)【要約】荷電した物質を含有する水性液体を脱塩するための方法であって：(i)イオン交換体と物質間の結合を許容する条件下で液体(Ｉ)をイオン交換体(１)と接触させて、該イオン交換体は物質と比較して反対の電荷を有するイオン交換リガンド(リガンド１)を保有するベースマトリックスを含むこと、(ii)該物質を該イオン交換体から液体(液体(ＩＩ))の使用により脱着させること、の工程を含む、方法。そこでは：(Ａ)イオン交換体(１)は：(ａ)０.１Ｍ  ＮａＣｌ、好ましくは０.２５Ｍ  ＮａＣｌ、に相当するイオン強度における水性参照液体中で物質を結合することができて、そして(ｂ)１０％のブレイクスルーおよび３００ｃｍ／時間の線形流速において、液体(Ｉ)によって与えられるｐＨでのブレイクスルー容量が３ｍｇ以上／ゲルｍｌであることを許容するところのイオン交換体であり；ならびに(Ｂ)工程(ii)においては、液体(ＩＩ)のｐＨが、物質、リガンドおよび／もしくはイオン交換体の間の電荷差が低下される、ｐＨ値に調整される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
荷電した物質を含有する水性液体を脱塩する方法であって：
(i)イオン交換体と物質間の結合を許容する条件下で液体(Ｉ)をイオン交換体(１)と接触させて、該イオン交換体は物質と比較して反対の電荷を有するイオン交換リガンド(リガンド１)を保有するベースマトリックスを含むこと、
(ii)該物質を該イオン交換体から液体(液体(ＩＩ))の使用により脱着させること
の工程を含み、
(Ａ)イオン交換体(１)は：
(ａ)０.１Ｍ  ＮａＣｌ、好ましくは０.２５Ｍ  ＮａＣｌに、相当するイオン強度における水性参照液体中で興味のある物質を結合する能力があり；そして
(ｂ)１０％のブレイクスルーおよび３００ｃｍ／時間の線形流速において、液体(Ｉ)によって与えられるｐＨでのブレイクスルー容量が、４ｍｇ以上／ゲルｍｌのような、２ｍｇ以上／ゲル(沈降した)ｍｌであることを許容するところの、
イオン交換体の中で選択され；ならびに
(Ｂ)工程(ii)は、液体(ＩＩ)のｐＨが、物質とリガンドおよび／もしくはイオン交換体の間の電荷差が低下されることを意味するｐＨ値に調整されることを含む、
ことを特徴とする、方法。
【請求項２】
物質が二つもしくはそれ以上の荷電した基および１０００ダルトン以上の分子量を持って生物有機性でかつ両性であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
調整が物質上においておよび／もしくはリガンド／イオン交換体上において零電荷に、またはそれら両方に対して同種の電荷(負もしくは正のどちらか)に導くことを特徴とする、請求項１〜２のいずれかに記載の方法。
【請求項４】
リガンド１が陽イオン交換リガンド、好ましくは混合モード陽イオン交換リガンド、であることを特徴とする、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
リガンド１が陰イオン交換リガンド、好ましくは混合モード陰イオン交換リガンド、であることを特徴とする、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
リガンド１がｐＨ非依存性電荷を有するかもしくはｐＨスイッチにより脱荷電され得ることを特徴とする、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
イオン交換体が確率的でありかつまた第二のリガンド(リガンド２)を含むことを特徴とする、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
請求項７に記載の方法であって、液体(Ｉ)によって与えられる条件においてリガンド２が、(ａ)非荷電であるがｐＨスイッチによって荷電可能であるか、もしくは(ｂ)非荷電でありかつ荷電可能でないか、もしくは(ｃ)ｐＨ−非依存性電荷で荷電されているか、もしくは(ｄ)ｐＨ−依存性電荷で荷電されている、ことを特徴とする、方法。
【請求項９】
リガンド２が混合モードリガンドであることを特徴とする、請求項７〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれかに記載の方法であって、
(ａ)液体(Ｉ)において、イオン強度は少なくとも０.１Ｍ  ＮａＣｌに相当するイオン強度であり、そして
(ｂ)液体(ＩＩ)において、緩衝しない成分およびそれらに関連する対イオンからのイオン強度の寄与が多くても液体(Ｉ)のイオン強度の１０％であり、
優先的には液体(ＩＩ)における該イオン強度の寄与が多くても０.０１Ｍ  ＮａＣｌのイオン強度である、
ことを特徴とする、方法。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれかに記載の方法であって、工程(ii)において用いられる緩衝液が揮発性でありそして好ましくは工程(ii)に先行する工程で蒸発させられることを特徴とする、方法。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれかに記載の方法であって、脱塩される物質が、工程(ii)の後で液体(ＩＩ)中に液体(Ｉ)における濃度の少なくとも１０倍の濃度で存在することを特徴とする、方法。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれかに記載の方法であって、
(ａ)物質がペプチド構造(例えばオリゴ−もしくはポリペプチド構造)、核酸構造、炭水化物構造、脂質構造、ステロイド構造、アミノ酸構造、ヌクレオチド構造の中で選択される構造を含む他の物質と一緒に液体(Ｉ)中に存在すること、および
(ｂ)これらの他の物質の全量が、脱塩される物質をまた含有するところの液体(ＩＩ)の画分について工程(ii)の後で少なくとも１０分の１に低減すること、
を特徴とする、方法。
【請求項１４】
液体(Ｉ)が、脱塩される物質、塩および水性溶媒から本質的になることを特徴とする、請求項１〜１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
請求項１〜１４のいずれかに記載の方法であって、工程(ii)の後で物質を含有する液体(ＩＩ)を乾燥形態に、直接的もしくは間接的のいずれかで、例えば乾燥(凍結乾燥、スプレー乾燥等)により、さらに加工することを特徴とする、方法。
【請求項１６】
請求項１〜１５のいずれかに記載の方法であって、その方法が、脱塩された物質もしくはその誘導体を含有する組成物を製造するための分析手順またはプロセスの一部であり、
該組成物が医薬品としてもしくは食品工業内で使用されるように意図されていることを特徴とする、方法。
【請求項１７】
請求項１〜１６のいずれかに記載の方法であって、イオン交換体は、イオン交換リガンドが、
(i)物質が正電荷を有するときにはＳＰ基(参照イオン交換体２ａ)、および
(ii)物質が負電荷を有するときにはＱ基(参照イオン交換体２ｂ)、
であるところの対応するイオン交換体について物質のブレイクスルー容量の、≧１２５％もしくは≧２００％もしくは≧３００％もしくは≧５００％もしくは≧１０００％のように、≧１００％である最大のブレイクスルー容量を、ｐＨ区間２〜１２において物質について許容するところのそれらのイオン交換体の中で選択されていて；
測定はイオン交換体(１)および(２ａ)ならびにイオン交換体(１)および(２ｂ)について本質的に同じ条件下で実施されている、
ことを特徴とする、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
技術分野
本発明は、塩と一緒に荷電した物質を含有する液体(Ｉ)からの塩の除去、即ち、物質の脱塩された組成物の製造もしくは物質の脱塩、のための方法に関する。
【０００２】
本発明は：
(i)イオン交換体と物質の間の結合を許容する条件下で、液体(Ｉ)をイオン交換体(１)と接触させること、
(ii)該物質を該イオン交換体から液体(液ＩＩ)の使用により脱着させること、
の工程を含む。
【０００３】
典型的に、荷電物質は生物有機性および／もしくは両性である。物質中の荷電基の数に関しては、もし一つ、二つもしくはそれ以上の正に荷電した基および／または一つ、二つもしくはそれ以上の負に荷電した基のように、二つもしくはそれ以上の荷電した基があれば、最大の利点が得られる。物質の分子量に関しては、もし分子量が、５,０００ダルトン以上もしくは１０,０００ダルトン以上のように、１,０００ダルトン以上であれば、最大の利点が得られる。
【０００４】
リガンドは、ベースマトリックスに連結されている基であり、液体(Ｉ)により与えられる条件の間、興味のある物質と引力的相互作用を発揮する。用語“リガンド”は、同じベースマトリックスに結合された同じ種類の個別のリガンド基が複数あることを含む。イオン交換体上の少なくとも一部分のイオン交換リガンドは、液体(Ｉ)により与えられる条件下で、物質の電荷に逆である電荷を有する。以下のことは、ｐＨ−依存性電荷を有するイオン交換リガンドに当てはまる：
ａ）イオン交換リガンドおよびその対応する塩基の両方は、液体(Ｉ)のｐＨが≦ｐＫａ＋２である限り同じ種類のリガンドであると考えられる。
ｂ）イオン交換リガンドおよびその対応する酸の両方は、液体(Ｉ)のｐＨが≧ｐＫａ−２である限り同じ種類のリガンドであると考えられる。
ｐＫａは、(ａ)リガンド(選択肢ａ)もしくはリガンドに相当する酸(選択肢ｂ)のｐＫａを意味する。もし液体(Ｉ)のｐＨがこれらの判定基準に適合しなければ、リガンドの荷電型は非−本質的な量で存在する。
【０００５】
別に指示されないかぎり、用語“電荷”とは、それぞれ物質もしくはリガンドの実効電荷をいう。
本発明の文脈における用語“塩”は、液体(Ｉ)もしくは液体(ＩＩ)のどちらかに溶解されるとき、正に荷電した部分および負に荷電した部分を形成する化合物を意味する。脱塩される(吸着される)物質と同じ電荷を有する塩の部分は、好ましくは非ポリマー性でありかつその物質と同じ種類の少数(例えば、一つ、二つもしくは三つ)の電荷を帯びる。塩の他の部分は、大抵は非ポリマー性部分のみを含有する塩が意図されるけれども、これらの限定を有さない。
塩の種々の荷電部分は、緩衝するであっても緩衝しないであってもよい。
【０００６】
背景技術
荷電した生物有機物質の脱塩された組成物は、生物有機物質がさらに加工されなければならない多くの場合において必要とされる。伝統的なイオン交換クロマトグラフィーは、例えば、物質がそこから吸着されるべきところの溶液のイオン強度が、その物質、存在する他のイオン、使用されるイオン交換体等に依存するところの特定の値以下のイオン強度を有していなければならないことを必要とする。生物有機物質について使用される分析法は、塩の存在によって妨害され、不正確な結果に至り得る。典型的な例は、質量分析、元素分析等である。脱塩は、薬学的に許容される純度のおよび／もしくは食品工業のために許容される純度の生物有機物質の製造において、しばしば重要なプロセスである。
【０００７】
生物有機物質のための従来の脱塩手順は、これまではゲルろ過、膜ろ過、限外ろ過、透析等である。また、(ａ)吸着された物質とイオン交換体の電荷相互作用を低減させるためには、生物有機物質の脱着のためのｐＨスイッチと組合せてイオン交換体を、および(ｂ)揮発性緩衝液による脱着と組合せて強アンモニウムイオン交換体を使用することが示唆されている。例えば、アミノ酸および短いペプチドの脱塩を記載しているところのHirs et al., J. Biol. Chem 195 (1952) 669-683 and 219 (1956) 623-642; Hirs, Methods in Enzymology XI (ed. Hirs) (1967) 386-390; Dreze et al., and Analytical Chim Acta 11 (1954) 554-558を参照されたい。また、タンパク質の脱塩を提案するところのＷＯ  ９４０６８２２(Upfront Chromatography)およびＷＯ  ９９６５６０７(Amersham Pharmacia Biotech AB)を参照されたい。
【０００８】
ＵＳ  ５６５２,３４８(Burton等)は、疎水的相互作用の条件下で荷電可能なリガンドを利用することにより、加塩もしくは脱塩無しで脱着を達成し得ることを提案している。疎水的相互作用は、リガンドが非荷電型にあることおよび塩濃度が高いことを意味する。
【０００９】
発明の目的
一つの主な目的は、少なくとも一つの以下の特徴が工程(i)から工程(ii)に移行するとき存在するところの、表題“技術分野”において記述されている種類の単純で信頼性のある脱塩方法を提供することである：即ちこれらは、
(ａ)単純性、種々の形式への拡張性(例えば、微小形式への)、再現性等；
(ｂ)生物有機物質の一次、二次、三次および／もしくは四次の構造が本質的に未変化で維持され得るような緩和な条件；
(ｃ)例えば、少なくとも０.２５Ｍもしくは少なくとも０.５Ｍのように、少なくとも０.１Ｍであるところの液体(Ｉ)中の全塩濃度から出発して、脱着された物質の主要部分を含有する工程(ii)からの溶出液中では、最大で０.０５Ｍもしくは最大で０.０１Ｍのように、最大で０.１Ｍであるところの全塩濃度にまで低下することにより、少なくとも１０分の１、好ましくは少なくとも１００分の１(モル／モル)、に全塩濃度の低減；
(ｄ)少なくとも１０２もしくは少なくとも１０３のように、少なくとも１０倍の生物有機物質の濃度の増加；
(ｅ)本質的に零になるまで非緩衝性の塩成分の濃度の低減(静電的均衡を維持するために必要とされるところの緩衝性の成分に対する対イオンを除く)；
(ｆ)例えば、少なくとも１００分の１(重量／重量)のように少なくとも１０分の１で、例えば同じ一般構造を持つ、他の生物有機化合物の量の低減；
(ｇ)多くても７５％のように多くても６０％、または、本質的には１００％を優先して、少なくとも８０％もしくは少なくとも９０％、の興味のある生物有機物質の収率である。
【００１０】
第二の目的は、薬学的に許容される純度のおよび／もしくは食品工業のために許容される純度の生物有機物質を得ることを補佐する脱塩手順を提供することである。
【００１１】
第三の目的は、上で議論したように分析されるべき生物有機化合物のための脱塩プロセス、即ち脱塩工程を含む上述の種類の生物有機化合物のために意図された分析方法、を提供することである。
【００１２】
第四の目的は、
(ａ)逆相クロマトグラフィー、および／または
(ｂ)塩濃度の増加、例えば、段階的もしくは連続的な勾配として起こる変化を優先して、塩の０〜０.５Ｍの区間、例えば塩の０〜０.１、０.０７５〜０.１５および／もしくは０.１２５〜０.５Ｍの副区間内の一部分、内において起こる変化による脱着の援助による、従来のイオン交換体上でのイオン交換クロマトグラフィーに先立って、ここで説明したように荷電した物質を含有する組成物に使用され得るところの新しい脱塩手順を提供することである。
この目的は、また対応するバッチ式手順を含む。使用される塩勾配は、２〜３Ｍ塩にまで拡張し得る。従来のイオン交換体とは、革新的な本脱塩手順において使用されるイオン交換体に要求されるブレイクスルー容量未満のブレイクスルー容量を有するところのイオン交換体を意味する。下記を参照されたい。
【００１３】
発明
本発明者らは、もし吸着工程(工程(i))に用いられるｐＨでの十分に高いイオン強度において、十分に高いブレイクスルー容量を有するところのイオン交換体が選択されるならば、上記の目的が少なくとも部分的に満たされ得ることを発見した。
【００１４】
革新的な本方法の特色の一つは、二つの重要な特徴(それぞれ、ＡおよびＢ)の一つもしくは両方を含むことである：
特徴Ａ：イオン交換体(１)は、
(ａ)０.１Ｍ  ＮａＣｌ、好ましくは０.２５Ｍ  ＮａＣｌ、に相当するイオン強度において水性参照液体中で興味のある物質を結合させる能力がある；そして
(ｂ)１０％のブレイクスルーおよび３００ｃｍ／時間の線形流速において、液体(Ｉ)によって与えられるｐＨでのブレイクスルー容量が、４ｍｇ以上／ゲルｍｌのような、２ｍｇ以上／ゲル(沈降した)ｍｌであることを許容するところのイオン交換体の中で選択される。
特徴Ｂ：工程(ii)は、液体(ＩＩ)のｐＨが、物質とリガンドおよび／もしくはイオン交換体の間の電荷差が低下されることを意味するｐＨ値に調整されることを含む。好ましくは、この調整は、物質上および／もしくはリガンド／イオン交換体上において零電荷に、またはそれら両方について同種の電荷(負もしくは正のどちらか)に至る。
【００１５】
特徴Ｂの項目(ｂ)におけるさらに別の選択基準は、イオン交換体は、イオン交換リガンドが、
(i)物質が正電荷を有するときにはＳＰ基(参照イオン交換体２ａ)、および
(ii)物質が負電荷を有するときにはＱ基(参照イオン交換体２ｂ)、
であるところの対応するイオン交換体について物質のブレイクスルー容量の、≧１２５％もしくは≧２００％もしくは≧３００％もしくは≧５００％もしくは≧１０００％のように、≧１００％である最大のブレイクスルー容量を、ｐＨ区間２〜１２において物質について許容するところのものの中で選択される；ということである。
【００１６】
用語“ＳＰ基”は、アリル基を亜硫酸水素塩と反応させることにより得ることができるスルホプロピル基を意味する、即ちＳＰ基としては、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＳＯ３−およびそのスルホン酸異性体が挙げられる。
用語“Ｑ基”は、−ＯＣＨ２ＣＨ(ＯＨ)ＣＨ２ＯＣＨ２ＣＨ＝ＣＨ２をハロゲンと反応させた後トリメチルアミンと反応させることにより得ることができる第四級アンモニウム基を意味する、即ちＱ基としては、−ＯＣＨ２ＣＨ(ＯＨ)ＣＨ２ＯＣＨ２ＣＨ(ＯＨ)ＣＨ２Ｎ＋(ＣＨ３)３および第四級トリメチルアンモニウム基を含有するその異性体が挙げられる。
【００１７】
上の比較とは、イオン交換体(１)および(２ａ)ならびにイオン交換体(１)および(２ｂ)について本質的に同じ条件下で実施される測定をいう、即ち、ｐＨ、温度、溶媒組成、流速等は(１)および(２ａ)の間でならびに(１)および(２ｂ)の間で同じである。ブレイクスルー容量は、流動において物質の同じ相対濃度で(例えば、ｃ／ｃ０＝１０％、ｃ／ｃ０については実験の部を参照)測定される。
【００１８】
“対応するイオン交換体”は、支持マトリックスが同じであることを意味する、即ち、支持材料、ビーズ径、孔径、孔容積、充てん手順等は同じである。イオン交換体１の一つ以上の荷電リガンドについての全置換度は参照イオン交換体(２ａもしくは２ｂ)(それぞれ、塩化物およびナトリウムイオンとして測定される)におけるのと本質的に同じである。対イオンもまた同じであるべきである。スペーサーおよびカップリング化学は異なってもよい。特定の種類のカップリング化学は支持マトリックスの架橋に至り、さらに硬質のマトリックスをもたらすかもしれない。この場合には、比較を行う流れの条件はマトリックスが本質的に非圧縮されているレベルで選択される。
【００１９】
典型的には、物質についての有用なブレイクスルー容量は、物質が
(ａ)０.１８〜０.２５ｍｍｏｌ／ゲルｍｌの塩化物イオン容量を有する、市販で入手可能な陰イオン交換体であるQ-Sepharose Fast Flow (Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden)および／もしくは
(ｂ)０.１８〜０.２５ｍｍｏｌ／ゲルｍｌのナトリウムイオン容量を有する、市販で入手可能な陰イオン交換体であるSP-Sepharose Fast Flow (Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden)の上に有する最高ブレイクスルー容量より高い。
これら二つの参照イオン交換体におけるベースマトリックスはビーズ化形状のエピクロロヒドリン架橋アガロースである。ビーズは４５〜１６５μｍの区間の直径を有する。球状タンパク質についての排除限界は４×１０６である。
すべてのブレイクスルー容量とは、室温(約２５°)で行われた測定をいう。
【００２０】
物質の実効電荷を変化させることによって、工程(ii)における電荷差の低下を達成し得る。もしリガンドがｐＨ依存性の電荷を有するならば、その変化はまたリガンドの電荷の変化を伴い得る。もし例えば物質上でおよびリガンド上で同種の電荷を達成するために、リガンド上で反対の種類の電荷に切り替えが望まれるならば、リガンドは両性でなければならない。
【００２１】
リガンド
イオン交換リガンドは、陰イオンもしくは陽イオン交換リガンドであり得る。実効電荷が陽イオン交換リガンドについては負であり、負イオン交換リガンドについては正である限り、リガンドは両方の電荷を含有し得る。
【００２２】
陰イオン交換リガンドは典型的には：
(ａ)第一級アンモニウム、第二級アンモニウム、第三級アンモニウム、第四級アンモニウムおよびアミジニウム基のようなアンモニウム基；ならびに
(ｂ)スルホニウム、の中で選択される荷電した基を含む。
用語“第三級アンモニウム”基には、芳香環中に窒素原子があるところの複素環式芳香族基が含まれる。同じ様に、“第四級アンモニウム”基には、そのような複素環式芳香族基のＮ−アルキル化型が含まれる。
【００２３】
陽イオン交換リガンドは典型的には、
(ｃ)カルボキシレート(−ＣＯＯ−)、ホスホネートもしくはホスフェート(それぞれ、−ＰＯ３２−、−Ｐ(ＯＨ)Ｏ２−および−ＯＰ(ＯＨ)Ｏ２−、−ＯＰＯ３２−)、スルホネートもしくはスルフェート(それぞれ、−ＳＯ３−および−ＯＳＯ３−)、−アリール−Ｏ−(フェノレート／アリーロレート)等
の中で選択される荷電した基を含む。
この遊離結合(原子価)は、基をベースマトリックスに取り付けている鎖の一部である炭素に直接結合する。
【００２４】
混合モードもしくは二頂種類であるイオン交換リガンドは、比較的高いイオン強度において極めて高いブレイクスルー容量を与え得ることが最近見出されている。我々の同時係続国際特許出願のＰＣＴ／ＥＰ００／１１６０５(Amersham Pharmacia Biotech AB)およびＰＣＴ／ＥＰ００／１１６０６(Amersham Pharmacia Biotech AB)(両方とも陰イオン交換リガンド)、ならびに２０００年７月１７日に出願したＳＥ  ０００２６８８−０(陽イオン交換リガンド)を参照されたい。また、所謂確率論的イオン交換体に焦点を絞り、かつこの出願と並行して出願されているところの、我々の同時継続ＳＥ出願“混合モード吸着方法および混合モード吸着剤”を参照されたい。これらの出願を、出典明示により本明細書の一部とする。
【００２５】
用語“混合モードリガンド”および“二項リガンド”は、リガンドが結合される物質と相互作用するところの少なくとも二つの異なるが共同的な部位を供給する能力のあることを意味する。これらの部位は機能性および／もしくは種類に関して異なる。
【００２６】
典型的な混合モードイオン交換リガンドは、工程(i)においてイオン交換体に吸着されるべき物質と引力的相互作用に関与する能力のあるところの、一つ、二つ、三つ、四つもしくはそれ以上の原子または基を有する。これらの原子もしくは基は優先的に、荷電した原子もしくは基からせいぜい７原子の距離に位置する。疎水的相互作用および電子−供与体受容体相互作用は、引力的相互作用の例である。
【００２７】
典型的には、純粋な疎水的相互作用はリガンド中の炭化水素構造と物質中の疎水性領域の間にある。典型的な疎水性構造は、一つの芳香族構造ならびに／または二つ、三つ、四つもしくはそれ以上の一緒に連結したＳＰ、ＳＰ２−および／もしくはＳＰ３−混成炭素原子を含む。後者のバリアントでは、それぞれの炭素原子は、他の炭素原子に結合し、そして可能ならばまた一つもしくはそれ以上の水素原子に結合する。かくして、この種類の好ましい構造は、２、３、４、５、６もしくはそれ以上の炭素原子を含む純粋なアルキル基、純粋なアルケニル基、純粋なアリール、純粋なアラアルキル、純粋なアルキルアリール基、純粋なアルケニル基等、および二つもしくはそれ以上の遊離結合(原子価)を有する対応する基である。
【００２８】
電子−供与体受容体相互作用は典型的には、リガンド中の電子受容原子もしくは基および物質中の電子供与原子もしくは基、またはその逆を必要とする。この種類の相互作用には、水素結合、π−π、電荷移動、等が挙げられる。電子供与体受容体相互作用に関する議論については、Karger et al.、「分離科学入門」、John Wiley & Sons (1973)４２頁を参照されたい。
【００２９】
電子供与体原子／基の例示的な例は：
(ａ)ヒドロキシ、エーテル、カルボニルおよびエステル(−Ｏ−および−ＣＯ−Ｏ−)ならびにアミドにあるような、自由電子対を持つ酸素、
(ｂ)チオエーテル(−Ｓ−)にあるような、自由電子対を持つ硫黄、
(ｃ)シアノ、アミン、スルホンアミド、カルバミド、カルバメート、アミジン等を含むアミドにあるような、自由電子対を持つ窒素、
(ｄ)ハロゲン(フッ素、塩素、臭素およびヨウ素)、ならびに
(ｅ)ｓｐ−およびｓｐ２−混成炭素
である。
【００３０】
典型的な受容体原子／基は、金属イオン、シアノ、ニトロ中の窒素のような、電子不足原子もしくは基であり、そしてまたヒドロキシおよびカルボキシにあるＨＯ−、アミドおよびアミンにある−ＮＨ−、チオールにあるＨＳ−等のような陰性原子に結合した水素を含む。
【００３１】
吸着されるべき物質との混合モード相互作用に関与する原子もしくは基は、
・  荷電原子もしくは荷電基をベースマトリックスに連結する鎖、
・  該鎖に結合した分枝、または
・  荷電した原子もしくは基(特に陰イオン交換基／リガンドについて)に直接結合した別の置換基
の中に位置し得る。
電子供与体／受容体の原子もしくは基は、リガンドをベースマトリックスに連結する鎖に取り付けられた分枝中にそして荷電原子もしくは荷電基から７もしくはそれ以上の原子の距離において存在し得る。そのような場合には、完全な分岐は別のリガンドと考えられる。
【００３２】
特に興味深い混合モード荷電リガンドは、荷電した原子もしくは基の上述の距離以内に、チオエーテル(−Ｓ−)および／または、芳香族炭素のような、ｓｐ２−混成炭素を有する。例えば、我々の同時係続国際特許出願のＰＣＴ／ＥＰ００／１１６０５(Amersham Pharmacia Biotech AB)およびＰＣＴ／ＥＰ００／１１６０６(Amersham Pharmacia Biotech AB)(両方とも陰イオン交換リガンドに言及する)、ならびに２０００年７月１７日に出願したＳＥ  ０００２６８８−０(陽イオン交換リガンド)およびＷＯ  ９９６５０７(Amersham Pharmacia Biotech AB)(陽イオン交換リガンド)を参照されたい。ＷＯ  ９７２９８２５(ＵＳ６,０９０,２８８)(Amersham Pharmacia Biotech AB)は、一つもしくはそれ以上のヒドロキシおよび／または、第一級、第二級もしくは第三級アンモニウム窒素から２〜３炭素の位置におけるアミノ／アンモニウム窒素を有するところの混合モード陰イオン交換リガンドを開示している。本特許の方法で潜在的に有用である混合モードイオン交換リガンドは、ＷＯ  ９８０８６０３(Upfront Chromatography)、ＷＯ  ９６００７３５、ＷＯ  ９６０９１１６およびＵＳ  ５,６５２,３４８(Burton等)に記載されている。このパラグラフで参照した全ての出版物は出典明示により本明細書の一部とする。
【００３３】
上で意図したチオエーテル(−Ｓ−)において、自由結合(原子価)のそれぞれは、芳香族もしくは非芳香族であってもなくともよい環状構造の部分でであってもなくともよいところのｓｐ２−もしくはｓｐ３−混成炭素に結合する。ここで意図したような用語“チオエーテル”はかくしてチオフェンおよび環原子として硫黄を含む他の複素環式芳香族環を含む。
【００３４】
上で意図した芳香族環構造は、一つもしくはそれ以上の芳香族環、例えば、フェニル、ビフェニルまたはナフチル構造ならびに単環、縮合環および／または二環式構造を含む他の芳香族環システムを含んでもよい。芳香族環は、複素環式であっても、即ち一つもしくはそれ以上の窒素、酸素または硫黄原子を含有してもよく、そして置換基を有してもよい。置換基は、上で議論したような炭化水素ならびに／または、例えば水素結合および／もしくは他の電子供与体−受容体相互作用を可能にする、電子供与体もしくは受容体の原子または基を含有してもよい。例示的な芳香族環構造は、ヒドロキシフェニル(２−、３−および４−)、２−ベンツイマドゾイル、メチルチオキシフェニル(２−、３−および４−)、３−インドリル、２−ヒドロキシ−５−ニトロフェニル、アミノフェニル(２−、３−および４−)、４−(２−アミノエチル)フェニル、３,４−ジヒドロキシフェニル、４−ニトロフェニル、３−トリフルオロメチルフェニル、４−イミダゾリル、４−アミノピリジン、６−アミノピリミジル、２−チエニル、２,４,５−トリアミノフェニル、４−アミノトリアジニル、４−スルホンアミドフェニル等である。
【００３５】
好ましい陰イオン交換リガンドのおよび好ましい陽イオン交換リガンドについて対応する酸のｐＫａは３からおよびそれ以上の区間に見出すことができ、そして、イオン交換リガンドの適切な脱荷電を可能にするために、好ましくは１１以下、好ましくは４〜９の区間にある。
【００３６】
特に興味のある陰イオン交換リガンドはｐＨ依存性電荷を有しそして、≦１０.５のような、≦１２.０であるｐＫａ値を有する。これは、これらのリガンドは、好ましくは第一級もしくは第二級アンモニウム基または第三級アンモニウム基の中で選択される荷電基を含むことを意味する。窒素が芳香族構造の部分である第三級アンモニウム基およびそのα−もしくはβ−位に芳香族炭素を有するアンモニウム基は、８以下のｐＫａ値を有してもよい。通常、陰イオン交換リガンドのｐＫａは≧４のような、≧３である。
【００３７】
特に興味のある負に荷電したリガンドはｐＨ依存性電荷を帯びている。対応する酸についてのｐＫａ値は通常≧４のような、≧３である。かくして、これらの種類のリガンドは、カルボキシレート(−ＣＯＯ−)、ホスホネートもしくはホスフェート(それぞれ、−ＰＯ３２−、−Ｐ(ＯＨ)Ｏ２−および−ＯＰ(ＯＨ)Ｏ２−、−ＯＰＯ３２−)、−アリール−Ｏ−(フェノレート／アリーロレート)ならびに他の弱酸基の中で選択される荷電基を含むべきである。
【００３８】
これは、
・  強酸(ｐＫａ、≦２もしくは≦０のような、≦３)(対応する塩基は陽イオン交換リガンドとして作用する)および
・  弱酸(ｐＫａ、≧１２のような、≧１０、等)もしくはｐＨに依存しない電荷を帯びているリガンドに対応するイオン交換リガンドはまた、我々の新しくかつ革新的な脱塩方法で使用されるべきイオン交換体中にそれらが組み入れられるときに、利点を有するであろうことを除外しない。他のイオン交換基については、これらの利点は脱塩される特定の物質の性質、例えば、その等電点およびイオン交換体とのその相互作用の強度、に依存する。
リガンドのｐＫａ値は、問題のリガンドの５０％が滴定されるｐＨとして得られる。
【００３９】
確率的イオン交換体
この創造的な方法において使用される適当なイオン交換体はまた、二つもしくはそれ以上の異なるリガンド(リガンド１、リガンド２等)を含有し得る。この場合には、リガンドのうち少なくとも一つ(リガンド１)は、他のリガンド(例えば、リガンド２)とは異なるイオン交換体リガンドである。この種類のイオン交換体を確率的と呼んで、この出願と並行して提出した表題“混合モード吸着方法および混合モード吸着剤”のＳＥ出願の中に十分記載されている。このＳＥ出願は出典明示により本明細書の一部とする。
【００４０】
リガンド１は、一般的にイオン交換体について上で議論されたのと同じ種類の構造部分を有し得る。リガンド１は、上で議論したようなｐＨ依存性の電荷を有しても有さなくてもよい。
【００４１】
リガンド２は、イオン交換リガンドまたは脱塩される物質と疎水的相互作用および／もしくは電子供与体−受容体相互作用により単に相互作用するところのリガンドであり得る。もし荷電しているならば、リガンド２は、リガンド１と同じもしくは反対の種類の電荷を有し得る。
【００４２】
リガンド１およびリガンド２は、吸着される物質との疎水的および／もしくは電子供与体−受容体相互作用を与えるところの原子もしくは基の存在ならびに組合せに関して異なり得る。上を参照されたい。
【００４３】
リガンド２は、液体(Ｉ)により与えられる条件において、非荷電であり得る。主として二種類の荷電されないリガンドがある：即ち
(ａ)ｐＨスイッチにより荷電され得るリガンド(クラスＩ)および
(ｂ)ｐＨスイッチにより荷電され得ないリガンド(クラスＩＩ)
である。
【００４４】
クラスＩは、ｐＨ−依存性電荷を有することができる非荷電型リガンドを含む。上記を参照されたい。
クラスＩＩリガンドは、上で議論したように、疎水性相互作用および電子供与体−受容体相互作用を引き起こすことができる一つもしくはそれ以上の構造要素を含有する。典型的なクラスＩＩリガンドにおいては、上で規定したように、二つ、三つ、四つもしくはそれ以上の電子供与体−受容体原子または基がある。原子もしくは基のそれぞれは、電子供与体−受容体原子または基から二つ、三つ、四つもしくはそれ以上のお互いに直接連結したｓｐ３−混成炭素だけ離れている。
【００４５】
クラスＩＩのリガンドは、ベースマトリックから突き出ていてかつ先行のパラグラフにおける規定に適合する基の最も外側の部分として規定される。用語“最も外側”は電子供与体−受容体相互作用にもしくは上で規定したようなアルキル基を伴う疎水性相互作用に関与する能力のある最も外側の原子から１〜７原子の距離にある原子を意図する。
【００４６】
かくして、第二のカテゴリーのそれぞれのリガンドは、リガンドが電子供与体−受容体相互作用および／もしくは疎水性相互作用を可能にする一つまたはそれ以上の原子を含むという条件で、イオン交換体においてリガンド２として使用されることができる。存在し得る原子ならびに／または基の例は：フェニル基を含み、置換もしくは未置換であってもよいアリ−ル、純粋なアルキルおよび純粋なアルキレン(Ｃ８以下を優先してＣ３およびそれより多く)、チオエーテル、エーテル、未荷電のアミノ、ヒドキシ、アミド(スルホンアミド、カルバミド、カルバメート等を含むカルボキサミド)、ニトロ、スルホン、未荷電のカルボキシ等、である。この種類のリガンドにおいて、直接一緒に連結された二つもしくはそれ以上のｓｐ３−混成炭素原子はしばしば原子または基をお互いから隔てている。
【００４７】
確率的イオン交換体における種々のリガンドは、支持マトリックスでもしくはその部分でお互いに関して多少とも無作為に存在し得る。導入方法に依存して、リガンドの量の間の比率は変動してもよいが、マトリックスの実質的な部分において少なくとも二つのリガンドについて常に、０.０２〜５０を優先して、０.０１〜１００でなければならない。支持体内で種々のリガンドの不均一なもしくは層状の分布を達成するために、ＷＯ  ９８３９３６４(Amersham Pharmacia Biotech AB)に略述された一般原理を用いることができる。これら二つの特許出版物で主なゴールである鋭い層が導入されないように、リガンド形成試薬の反応性、拡散率および濃度に関してしかるべき配慮を取らねばならない。ＷＯ  ９８３９３６４は出典明示により本明細書の一部とする。
【００４８】
確率的イオン交換体では、以下のこと：
・  同じ試薬および条件の使用により、例えば同じ条件を通して並列に、導入されるリガンドは、たとえそれらが構造的に異なっていても、同じ種類であると考えられる。特にこれは、形成されるリガンドが異性体であるととしても、当てはまる。
・  それらの存在を最少限にするために大過剰の誘導化試薬を使用した後でさえ残存基(未反応基)であるリガンドは非存在と考えられる。典型的には、残存基は、誘導化される基の出発量に比較して５％以下のように１０％以下のモル量で存在する。
が当てはまる。
【００４９】
特に興味がある確率的イオン交換体は、リガンド１として強イオン交換リガンドをそしてリガンド２としてｐＨでのスイッチにより荷電／脱荷電され得るリガンドを含む。二つの典型的な組合せは：
(ａ)リガンド２として弱陰イオン交換リガンドを組合せたリガンド１として強陽イオン交換リガンド、もしくは
(ｂ)リガンド１として強陰イオン交換リガンドおよびリガンド２として弱陽イオン交換リガンド
である。
この文脈において、強陽イオン交換リガンドはｐＫａ＜３〜４を持つ対応する酸を有する。強陰イオン交換リガンドの例は、第四級アンモニウムリガンドおよび、≧１１もしくは≧１２のようなｐＫａ＞１０を有する陰イオン交換リガンドである。他の種類のイオン交換リガンドは弱と考えられる。
【００５０】
他の興味ある組合せは、例えば、同じベースマトリックス上で同様なｐＫａを持つ二つの異なる弱の陰イオン−もしくは陽イオン−交換リガンド、または同じマトリックスに結合した弱陰イオン−および弱陽イオン−交換リガンドを有する確率的イオン交換体である。ｐＫａにおける差が、２、３もしくは４のｐＨ単位より小さい、より大きいまたはと同一であるように、リガンドを選択することができる。
【００５１】
異なる種類のリガンドを組合せる最大の利点は両性物質の脱塩に関する。典型的に、リガンドは、一つのリガンドは荷電される(リガンド１)一方で、他の一つ(リガンド２)は工程(i)の間は荷電されないで、工程(ii)の間に放出される物質と同じ電荷で荷電されるようになるような方式で組合される。それは、適切な組合せは脱塩される物質の等電点(ｐＩ)に依存することから起る。さらに下を参照されたい。
【００５２】
支持マトリックス／ベースマトリックス
支持マトリックスはベースマトリックスおよびベースマトリックスにリガンドを取り付ける任意のスペーサーを含む。
ベースマトリックスは有機のおよび／もしくは無機の材料をベースにする。
【００５３】
ベースマトリックスは、好ましくは親水性でそして、水に不溶性でかつ多少膨潤性であるポリマーの形状にある。親水性になるように誘導化されている疎水性ポリマーはこの規定に含まれる。適当なポリマーは、例えば、アガロース、デキストリン、セルロース、でんぷん、プルラン等のような多糖をベースにするポリヒドロキシポリマーならびに、ポリアクリルアミド、ポリメタクリルアミド、ポリ(ヒドロキシアルキルビニルエーテル)、ポリ(ヒドロキシアルキルアクリレート)およびポリメタクリレート(例えば、ポリグリシジルメタクリレート)、ポリビニルアルコールならびにスチレンおよびジビニルベンゼンをベースにするポリマー、および上述のポリマーに相当する二つもしくはそれ以上のモノマーが含まれるコポリマーのような、完全に合成的なポリマーである。水に可溶性であるポリマーは、例えば、架橋によりおよび吸着もしくは共有結合による不溶性体へのカップリングにより、不溶性になるように誘導化され得る。疎水性ポリマー上に(例えば、モノビニルおよびジビニルベンゼン上に)親水性基を、ＯＨに転換され得る基を示すモノマーの重合により、もしくは、例えば親水性ポリマーのような適当な化合物の吸着による、最終ポリマーの親水性化により、導入することができる。
【００５４】
ベースマトリックに使用される適当な無機材料はシリカ、酸化ジルコニウム、黒鉛、酸化タンタラム等である。
好ましいマトリックスは、シラン、エステル、アミド基およびシリカにそれ自体で存在する基のように、加水分解に対して不安定である基を欠如する。これは特に、使用される液体に直接接触する基に関して当てはまる。
【００５５】
マトリックスは多孔性もしくは非−多孔性であってもよい。これは、マトリックスは、除去される物質(非−多孔性)に十分にもしくは部分的に浸透性である(多孔性)かまたは完全に不浸透性であってもよいことを意味する、即ち、マトリックスは除去される物質について０.４０〜０.９５の区間でＫａｖを有しなければならない。これは、Ｋａｖはさらに低く、例えば０.１０にまでもしくは、例えば増量剤を有する特定のマトリックスについてはなおより低くてもよいことを除外しない。例えば、ＷＯ  ９８３３５７２(Amersham Pharmacia Biotech AB)を参照されたい。
【００５６】
本発明の特に興味深い実施態様において、マトリックスは、1〜１０００μｍ、好ましくは高速の応用には５〜５０μｍで分取目的には５０〜３００μｍの範囲のサイズを持つ不規則なもしくは球状の形状にある。
これに代えて、マトリックスは、管もしくは或る他の種類の容器、多孔性プラグ、多孔性膜またはフィルターの形状におけるように、一体構造であってもよい。
【００５７】
マトリックスは、工程(i)で使用される液体よりも大きい密度を持つビーズ／粒子の形状にあってもよい。この種類のマトリックスは、流動もしくはエクスパンデッド床クロマトグラフィーの、ならびに種々のバッチ様手順の、例えば攪拌タンク中での、大規模操作において特に応用可能である。流動およびエクスパンデッド床手順はＷＯ  ９２１８２３７(Amersham Pharmacia Biotech AB)およびＷＯ  ９２００７９９(Kem-En-Tek)に記載されている。
【００５８】
用語“親水性マトリックス”は、マトリックスのアクセス可能な表面が、水性液体はマトリックスに浸透できるという意味で、親水性であることを意味する。典型的には、親水性ベースマトリックス上のアクセス可能な表面は、例えば酸素および／もしくは窒素原子を含む、複数の極性基を露出する。そのような極性基の例は、ヒドキシル、アミノ、カルボキシ、エステル、低級アルキルのエーテル(ｎが整数である、(−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−)ｎＨのような)である。
【００５９】
スペーサーはベースマトリックスで始まり、上で規定したようなリガンドへ伸びる。
スペーサーはそれ自体では、伝統的なイオン交換体におけるように従来型であり、かくして、上で議論したように、線状の、分岐した、環状飽和の、不飽和および芳香族の炭化水素基(例えば、１〜１０個のような、１〜２０個の炭素原子)を含んでもよい。これらの基は、上で議論したタイプの純粋な炭化水素基、ヒドロキシ基、アルコキシおよびアリールオキシならびに対応するチオ類似体、ならびに／もしくはアミノ基、を含んでもよい。炭化水素基における炭素鎖は、一つもしくはそれ以上の位置においてエーテル酸素およびチオエーテル硫黄により中断されてもよい。また、アミドおよびケトン基におけるようなカルボニル基ならびに加水分解に対して遜色のない安定性を持った基であってもよい。酸素、硫黄および窒素から選択されるせいぜい一つの原子が好ましくは、一つのかつ同じｓｐ３−混成炭素原子に結合される。
【００６０】
スペーサーは、上で議論したように、例えば水素結合に関与することにより、望ましい物質のイオン交換体への結合を強化する、一つもしくはそれ以上の電子供与体もしくは受容体の原子または基を供給し得ることは明らかである。簡単のために、この種類の原子もしくは基はスペーサーの部分と考えられる。また、二つ以上のリガンドを一つで同じスペーサーに取り付けてもよい。上の“分岐”を参照されたい。
【００６１】
リガンドの密度
本発明で使用される吸着剤のイオン交換リガンドのレベルは、０.００５〜０.３ｍｍｏｌ／マトリックスｍＬを優先して、０.００２〜０.５ｍｍｏｌ／マトリックスｍＬのような、０.００１〜４ｍｍｏｌ／マトリックスｍＬの区間で普通選択される。好ましい範囲は、マトリックスの種類、リガンドの種類、吸着される物質等によりとりわけ決定される。表現“ｍｍｏｌ／マトリックスｍＬ”は水で飽和された十分に沈渣したマトリックスを指す。リガンド密度の範囲は、十分にプロトン化した／荷電した型のマトリックスがナトリウムイオンおよび／もしくは塩化物イオンのような普通の対イオンを結合させる能力を指し、とりわけ、存在する陰イオンおよび／もしくは陽イオンのリガンドに依存する。
【００６２】
最良モード
本発明の最良モードバリアントは興味のある物質により変動する。これまで発見された最良モードは実験の部で提示される。
【００６３】
吸着／脱着
吸着および／もしくは脱着工程(工程(i)および工程(ii))を、一体構造の形状でのイオン交換体マトリックスによるクロマトグラフィー手順としてまたは充てんもしくは流動床の形状での粒子として行ってもよい。粒状のマトリックスについては、これらの工程を、液体中で多少とも完全に分散している粒子によるバッチ様モードで行ってもよい。
工程(ｉ)および(ii)で使用される液体は水性、即ち、できれば水混和性溶媒と混合される、水である。
【００６４】
吸着(工程(i))
吸着の間、荷電物質を含有する液体試料は、吸着(結合)をさせる条件下で、例えば、イオン交換により、上に規定したイオン交換体と接触させられる。換言すれば、物質は、イオン交換リガンド／イオン交換体に比較して反対に荷電される少なくとも一つの基もしくは原子を保有する。
【００６５】
好ましくは、物質の実効電荷は工程(i)の間イオン交換体の実効電荷に反対である。水性液体中に存在する両性物質については、これは、陰イオン交換条件のためのｐＨは、≧ｐＩ−０.５、好ましくは≧ｐＩ、そして陽イオン交換条件のためには、≦ｐＩ＋０.５、好ましくは≦ｐＩを意味する。
【００６６】
本発明の利点の一つは、従来のイオン交換体(例えば、上で規定したような参照陰イオン交換体)で通常行われてきたものに比較してより高いイオン強度においてもまた吸着／結合を行うことが可能であろうことである。絶対的数字では、これは、本発明にしたがう吸着は１５もしくは２０ｍＳ／ｃｍの上または下のイオン強度で実施され得ることを意味する。イオン強度は３０ｍＳ／ｃｍを越えてもよく、或る場合には４０ｍＳ／ｃｍを越えることさえあり得る。有用なイオン強度はしばしば、≧０.３もしくは≧０.５さえのような、≧０.１のＮａＣｌ濃度(純水)に相当する。使用される伝導率／イオン強度は合計のリガンド、マトリックス上のそれらの密度、結合される物質およびその濃度等に依存するであろう。
【００６７】
脱着(工程(ii))
脱着プロセス、即ち液体(Ｉ)の液体(ＩＩ)による置換は、望ましい物質とリガンドの間の相互作用を弱めるためにｐＨを変化させることを含む。同時にイオン強度もしくは塩濃度を、好ましくは存在している唯一の塩が緩衝する成分であり、そしてもし必要ならばまたそれらの緩衝しない対イオンであるようなレベルにまで、低減させる。
【００６８】
ｐＨの変化による相互作用の低下は、(ａ)望ましい物質へイオン−イオン引力相互作用により結合するリガンドの電荷を消去すること、および／もしくは(ｂ)反対の電荷を有するリガンドへ結合する望ましい物質上の基の電荷を消去すること、を含む。ｐＨの変更は、脱塩されるリガンドおよび物質が工程(ii)の間同じ電荷を有するであろうように、何度も行うことができる。
【００６９】
工程(ii)におけるｐＨの変化は、工程(i)における液体(Ｉ)のイオン強度と比較して顕著に低下したイオン強度を必要とするであろうことを意味する。かくして物質を、低濃度、例えば≦１００ｍＭもしくは≦１０ｍＭさえ、の塩の溶液中に濃縮された形態で溶出することができるる。濃度因子は、本発明の目的の下で与えられると同じサイズであり得る。
【００７０】
吸着工程が陰イオン交換条件下で実施されている場合には、工程(ii)における適切なｐＨは、ｐＩ＋２未満もしくはｐＩ＋１未満、優先的にはｐＨ≦ｐＩ、である。
吸着工程が陽イオン交換条件下で実施されている場合には、工程(ii)における適切なｐＨは、ｐＩ−２以上もしくはｐＩ−１以上、優先的にはｐＨ≧ｐＩ、となるべきである
先の二つの項における用語ｐＩとは、脱着(脱塩)されるべき物質のｐＩをいう。
【００７１】
イオン強度を変更するために使用される典型的な塩は、アルカリ金属もしくはアンモニウムイオンの塩化物、リン酸塩、硫酸塩等の中で選択される。
ｐＨを変更するために使用される典型的な緩衝成分は関与するリガンドの種類に依存する。例えば、もしもイオン交換リガンドが陽イオン性であるならば、緩衝する酸−塩基対は、好ましくは、緩衝成分がリガンドに結合できない酸−塩基対、即ち、ピペラジン、１,３−ジアミノプロパン、エタノールアミン等、の中で選択される。同様に、イオン交換リガンドが陰イオン性である場合における緩衝する酸−塩基対は、リン酸塩、クエン酸塩、酢酸塩等である。
【００７２】
好ましい緩衝する酸塩基対は、揮発性および／もしくは非荷電であるところの少なくとも一つの緩衝する成分(酸もしくは塩基)を含有する。このことは、緩衝成分を工程(ii)の後で蒸発により単純に除去することができることを意味する。揮発性緩衝成分は典型的には、２５℃において、≧１０ｍｍ  Ｈｇのような、≧１ｍｍ  Ｈｇであるところの蒸気圧を有する。
【００７３】
脱着はまた、液体(ＩＩ)の極性を吸着液体(Ｉ)の極性より低い値に調整することにより補佐され得る。これは、液体ＩＩの中に水混和性のおよび／もしくはより少ない親水性の有機溶媒を含有させることにより達成され得る。そのような溶媒の例は、アセトン、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド、アクリロニトリル等である。水性液体ＩＩの極性の減少(水性液体Ｉに比較して)は恐らく脱着を手助けし、かくしてまたマトリックスから物質の放出に必要なイオン強度を減少させる。好ましくは有機溶媒は、２５℃において、≧１０ｍｍ  Ｈｇのような、≧１ｍｍ  Ｈｇの蒸気圧をもって揮発性である。
【００７４】
脱着はまた、使用されるリガンドの一つもしくはそれ以上の可溶性構造類似体を含有させることにより補佐され得る。液体(ＩＩ)中の構造類似体の濃度は水性液体(Ｉ)中のその濃度より高くなければならない。“リガンドの構造類似体”もしくは“リガンドの類似体”は、リガンドと構造的類似性を有し、可溶性型でリガンドおよび除去される物質の間の結合を阻害する能力のある物質である。構造的なリガンド類似体は、脱着に用いられるときには、有機溶媒について定義されたように、中性でかつ好ましくは揮発性であるべきである。
ｐＨ変化による脱着はまた、イオン強度の増加(塩の添加)により、それが液体(Ｉ)のイオン強度の半分を超えるという条件で、補佐され得る。
【００７５】
一つもしくはそれ以上の段階において(段階的勾配)または連続的に(連続勾配)、液体(Ｉ)から液体(ＩＩ)への変化を達成することができる。マトリックスと接触している液体の種々の変数を、一つずつもしくは組合せで変化させてもよい。このことは、他のｐＨ値および／もしくはイオン強度において溶出する他の吸着された物質を含有することなく、所望の物質を何回も溶出することができることを意味する。
【００７６】
確率的イオン交換体を利用する重要なバリアント
バリアント１：リガンド１はｐＨ−依存性の負電荷を有する陽イオン交換リガンドであり、そしてリガンド２は、荷電され得ないかもしくは相当な部分が工程(i)のｐＨでは未荷電である荷電可能な塩基かのどちらかである。リガンド１に相当する酸のｐＫａはリガンド２(荷電可能であれば)に相当する酸のｐＫａより低い。吸着される物質はリガンド２のｐＫａ以上であるｐＩを有する。液体(Ｉ)のｐＨは物質が正の実効電荷を有する、即ちイオン交換体に吸着するであろうように選択される。ｐＨを減少させることにより、物質および恐らくまたリガンド２はプロトン化されて、増加した正電荷を受け取るであろう。これは、中度のｐＨで物質の放出を助成して、液体(ＩＩ)中で低下した塩濃度において脱着をさせるであろう。
【００７７】
バリアント２：リガンド１はｐＨ−依存性の正電荷を有する陰イオン交換リガンドを含み、そしてリガンド２は、完全に荷電され得ないかもしくは相当な部分が工程(i)のｐＨでは未荷電である荷電可能な酸型かのどちらかである。リガンド２のｐＫａはリガンド１のｐＫａより高い。吸着される(脱塩される)物質のｐＩはリガンド１のｐＫａおよびリガンド２のｐＫａの両方より低い。液体(Ｉ)(工程(i))のｐＨは、物質は負の実効電荷を有しそしてリガンド１は、リガンド２が本質的に未荷電である一方で、正電荷を有するようにある。かくして、物質は工程(i)で吸着されるであろう。ｐＨを増加させることにより、リガンド２は負に荷電されるようになるであろうが、これは液体(ＩＩ)中でさらに低い塩濃度における物質の脱着を意味する。
【００７８】
回収率
本発明の脱塩方法は、吸着された物質の高回収率、例えば８０％以上もしくは９０％以上のような６０％以上の回収率(工程(i)から工程(ii)へ)を可能にする。回収率は、９５％さえを越える、即ち本質的に定量的であることができる。典型的には、イオン交換体に加える物質の量は、物質についてのイオン交換体の全結合容量の、２０〜６０％のような、１０〜８０％の区間内にある。
【００７９】
液体(Ｉ)から除去される物質
本発明は主として、上で規定したリガンドと相互作用できる幾らかの構造ユニットを有するところの高分子量物質用に意図されている。適切な物質は１０００ダルトン以上である分子量を有し、生物有機性であり高分子性である。一分子当りの荷電基の数は典型的に一つもしくはそれ以上であり、ｐＨに依存する。分子量および電荷の数に関するさらなるコメントは見出し“技術分野”に呈示されている。物質は両性でもよい。典型的に、物質はペプチド構造(例えば、オリゴ−もしくはポリペプチド構造)、核酸構造、炭水化物構造、脂質構造、ステロイド構造、アミノ酸構造、ヌクレオチド構造および、荷電されているかもしくはｐＨ−スイッチにより荷電され得る任意の他の生物有機性構造の中で選択される、構造を含む。
【００８０】
物質は水性基材に溶解され得るかもしくは小さい生物粒子の、例えばコロイドディメンションの、形状にあり得る。生物粒子の例示的な例は、ウイルス、細胞(細菌および他の単細胞生物を含む)ならびに細胞凝集体および細胞小器官を含む細胞の部分である。
本発明は特に、興味のある物質を高濃度の塩と一緒に含む生物学的流体から得られる水性液体に適用可能であるであろうと信じられている。
【００８１】
上で議論した種類の生物有機物質を含有する、高イオン強度の典型的な液体は、例えば細胞の培養からの発酵ブロス／液、およびそれから得られる液体である。細胞は、哺乳動物のような、脊椎動物、または無脊椎動物(例えば、チョウおよび／もしくはそれらの幼虫からの細胞のような培養昆虫細胞)、または微生物(例えば、培養真菌、細菌、酵母等)から由来してもよい。また含まれるのは、植物細胞および、好ましくは培養された、他の種類の生体細胞である。
【００８２】
液体(Ｉ)がまた望ましくない異物を含有する場合なら、エキスバンデッド床技術を利用することが有益であろう。これは特に、液体(Ｉ)が(ａ)細胞の培養からの発酵ブロス／液、(ｂ)溶菌細胞を含有する液体、(ｃ)細胞および／もしくは組織のホモジネートを含有する液体、ならびに(ｄ)細胞から得られるペーストから由来するときに当てはまる。
今回説明される革新的な脱塩手順は、第二〜第四の目的において提示したように使用されることができる。
【００８３】
本発明を特許実施例で今や例示する。本発明は添付の特許請求の範囲でさらに規定される。
【実施例】
【００８４】
実施例
実験の部
１．イオン交換体の合成
その多くが我々の目的に応用可能であるところの、リガンド−形成化合物を表面に固定化するための多様なの方法[Hermanson, G. T., Mallia, A. K. & Smith, P. K., (Eds.)、「アフィニティーリガンドの固定化技法」、Academic Press, INC, 1992.]がある。以下に、実施例として役立てるために、我々が新しいシリーズの弱陽イオン交換体(カルボン酸をベースとする)を作製するために採用してきた方法を説明する。ベースマトリックスとして、我々は、エピクロルヒドリンで架橋されているところのビーズ化されたアガロースである、Sepharose 6 Fast Flow(Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden)を用いている。
【００８５】
１．１．アリルグリシジルエーテルによるSepharose 6 Fast Flowの活性化
本質的にはＷＯ  ９７／２９８２５(Amersham Pharmacia Biotech AB)に記載されているように、アルカリ性条件下でアリルグリシジルエーテルをSepharose 6 Fast Flowと反応させることにより、活性化を実施する。適当な反応容器中で、Sepharose 6 Fast Flow８０ｇをＮａＢＨ４０.５ｇ、Ｎａ２ＳＯ４１３ｇおよび５０％(重量／重量)ＮａＯＨ水溶液４０ｍＬと混合した。混合液を５０℃で１時間撹拌し、アリルグリシジルエーテル１００ｍＬを加えた。懸濁液を５０℃でさらに１８時間撹拌した。混合液をろ過して、ゲルを蒸留水５００ｍＬ、エタノール５００ｍＬ、蒸留水２００ｍＬ、０.２Ｍ酢酸２００ｍＬおよび最終的に蒸留水５００ｍＬで順次洗浄した。
滴定による分析は、アリル基０.３ｍｍｏｌ／ゲルｍＬの置換度という結果であった。以下、アリル−誘導体化されたSepharose 6 Fast Flowを生成物１と呼ぶ。
【００８６】
１．２．カルボキシル基の導入(選択肢１)
カルボキシル基を含有する反応性求核試薬(例えばメルカプトプロピオン酸)を生成物１へカップリングさせることにより、カルボキシル基の導入を達成することができる。また、アルカリ性条件下でのクロロ酢酸によるSepharose 6 Fast Flowの従来のカルボキシ−メチル化によりそれを達成することができる。ここで得られる生成物は、それ自体で陽イオン交換体として使用されるか、もしくはアミド結合を経由して他の陽イオン交換体を合成するための中間体として役立つことができる。下記の手順は、メルカプトプロピオン酸を生成物１(アリル−誘導体化Sepharose 6 Fast Flow)へカップリングさせるための実施例を提供する。
【００８７】
１．２．１．生成物１(アリル−Sepharose 6 Fast Flow)の活性化
典型的な手順においては、１００ｍＬの生成物１、酢酸ナトリウム４ｇおよび蒸留水１００ｍＬの撹拌した懸濁液に、持続的な黄色が得られるまで臭素水を加えた。かすかな黄色が消失するまで、懸濁液にギ酸ナトリウムを加えることにより、過剰の臭素の還元を達成した。反応混合液をろ過し、そしてアリル−誘導体化ゲルを蒸留水５００ｍＬで洗浄した。
【００８８】
１．２．２．活性化生成物１へのメルカプトプロピオン酸のカップリング
活性化ゲル(生成物１)を反応容器に移し、次いでメルカプトプロピオン酸１７.５ｍＬ(アリル基当たり６当量)および４Ｍ  ＮａＣｌ５０ｍＬの混合液を加えた。混合液のｐＨを、それを活性化ゲルに加える前に、５０％(重量／重量)ＮａＯＨ水溶液でｐＨ１１.５に調整した。懸濁液を５０℃で１８時間撹拌して、次いでろ過した。ゲルを蒸留水５００ｍＬで洗浄して、そのカルボキシル基の含量を滴定により測定した。ＣＯＯＨ基約０.２９ｍｍｏｌ／ゲルｍＬの置換度が得られた。この生成物を生成物ＩＩと呼ぶ。
【００８９】
１．３．カルボキシル基の導入(選択肢２)
これは、固体支持体にアミド結合を経由してリガンド−形成化合物(アミノおよびカルボキシル官能基を含む)をカップリングするための代替法を提供する。この手順は、二つの工程を伴い、以下に説明される。
【００９０】
１．３．１．Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミドによるメルカプトプロピオン酸−Sepharose 6 Fast Flow(生成物ＩＩ)の活性化
１００ｍＬのメルカプトプロピオン酸−Sepharose 6 Fast Flow(生成物ＩＩ)を１Ｍ  ＮａＣｌ３００ｍＬ、０.１Ｍ  ＨＣｌ５００ｍＬ、５０％水性アセトン５００ｍＬおよびアセトン５００ｍＬで順次洗浄した。ゲルを沈めさせて、上澄みを吸引除去した。次いで、ゲルを定量的に反応容器に移し、引き続きＮ−ヒドロキシコハク酸イミド１５.２ｇのアセトン８０ｍＬ中の溶液およびジシクロヘキシルカルボジイミド２９.９ｇのアセトン８０ｍＬ中の別溶液を加えた。スラリーを３０℃で１８時間撹拌した。混合液をろ過し、ゲルを１０分量のイソプロパノール１５０ｍＬで約８時間の期間洗浄(重力流により)した。
生成物ＩＩの活性化度は、ＮＨ４ＯＨとの反応により評価されると、凡そ７５％であった。ここで得られた生成物(即ち、ＮＨＳ−活性化メルカプトプロピオン酸−Sepharose 6 Fast Flow)を生成物ＩＩＩと呼ぶ。
【００９１】
１．３．２．生成物ＩＩＩへのチエニルセリン(リガンド１１)のカップリング
ここに概略される手順は、リガンド−形成化合物をアミド結合を経由してカップリングする一般的方法の実施例を提供する。チエニルセリンの溶液(蒸留水８ｍＬ中２ｇ)を１Ｍ  ＮａＨＣＯ３８ｍＬおよびエタノール１０ｍＬと混合し、５０％ＮａＯＨ水溶液の注意深い添加によりｐＨをｐＨ８.５に調整した。２５ｍＬの生成物ＩＩＩ(ＮＨＳ−活性化メルカプトプロピオン酸−Sepharose 6 Fast Flow)を焼結ガラス漏斗上で氷冷１ｍＭ  ＨＣｌ溶液５０ｍＬで速やかに洗浄した。次いで、三角フラスコにゲルを移し、チエニルセリンの溶液をそれに加えた。次いで、反応混合液を穏やかな速度で室温にて１８時間振り混ぜた。
【００９２】
反応混合液をろ過し、ゲルを蒸留水１００ｍＬ、エタノール５０ｍＬ、０.２５Ｍエタノールアミン水溶液５０ｍＬ、蒸留水５０ｍＬ、１Ｍ  ＮａＣｌ５０ｍＬおよび最後に蒸留水５０ｍＬで順次洗浄した。チエニルセリンのカップリング効率は硫黄元素分析により約７０％であると測定され、それはゲルｍＬ当たりチエニルセリンの０.１５ｍｍｏｌの置換度に相当する。この方法により、脱塩のために使用される大部分の陽イオン交換体を作製した。
【００９３】
２．クロマトグラフィー
この検討においては、二つの精製タンパク質、即ちヒト免疫グロブリン(ＩｇＧ)およびウシ血清アルブミン(ＢＳＡ)を用いて、二つの重要なパラメーターに関して新しいシリーズの脱塩用陽イオン交換体を特性化した。それらは、高塩条件におけるブレイクスルー容量(Ｑｂ１０％)および低塩条件において発明の陽イオン交換体に加えられたタンパク質の、回収率であった。緩衝成分に加えて、比較的高い濃度の塩(０.２５Ｍ)を含有する移動層を用いて、ＩｇＧをｐＨ４.５で結合した。次いで、ＩｇＧをｐＨ７.０に調整された０.１０Ｍリン酸緩衝液で溶出した。ＢＳＡをｐＨ４.０でまた高塩条件(下の緩衝溶液を参照)で結合して、ＩｇＧの場合におけるように、ｐＨを７.０に上昇させて溶出した。新しいシリーズの脱塩用リガンドについてのブレイクスルー容量およびそれらに結合されたタンパク質の回収率を測定するために用いる手順を、以下に概略する。
【００９４】
２．１．“高塩”条件におけるブレイクスルー容量(Ｑｂ１０％)
脱塩手順に適する陽イオン交換リガンドについての主な判定基準の一つは、同一の条件下で操作される参照イオン交換体と比較して比較的高い濃度の塩(例えば０.２５Ｍ  ＮａＣｌ)の存在下におけるタンパク質についてのその結合容量である。これは、下で説明される前端分析の方法を用いて測定される。
【００９５】
２．１．１．実験
緩衝溶液
緩衝液１：２０ｍＭ酢酸ナトリウム、０.２５Ｍ塩化ナトリウム、ｐＨ４.０
緩衝液２：２０ｍＭ酢酸ナトリウム、０.２５Ｍ塩化ナトリウム、ｐＨ４.５
緩衝液３：１００ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７.０(ＢＳＡおよびＩｇＧの溶出のため)
タンパク質溶液
１．ＢＳＡ：緩衝液１中に４ｍｇ／ｍＬ
２．ＩｇＧ：緩衝液２中に４ｍｇ／ｍＬ
全ての緩衝液およびタンパク質溶液を、使用前に、０.４５μｍのMillipore Millex HAフィルターを通してろ過した。
【００９６】
クロマトグラフィーシステム
全ての実験は、Unicorn 3.1ソフトウエアを装備したAekta Explorer 100クロマトグラフィーシステムを用いて室温で実施された。試料を１５０ｍＬスーパーループを経由してカラムに加えた。溶出液を１０ｍｍフローセルを用いて２８０ｎｍにおける吸光度測定により連続的にモニターした。
【００９７】
２．１．２．前端分析
それぞれのプロトタイプの陽イオン交換体をＨＲ５／５カラム(充てん床容積＝１ｍＬ、Amersham Pharmacia Biotech AB)中に充てんし、適切なｐＨおよび塩濃度の緩衝液で平衡化した。システムのボイド容積を非結合条件下でカラムに適当なタンパク質の溶液を加えることにより測定した。溶出液のＡ２８０が加えたタンパク質溶液のＡ２８０の１０％に到達するに要する時間を、システムのボイド容積(分で表現される)とする。
【００９８】
適切な緩衝液(緩衝液１もしくは２)で平衡化されたカラムに、適切な平衡緩衝液(上を参照)に溶解した試料タンパク質を１ｍＬ／分(即ち３００ｃｍ／時間)の流速で(例えば、１５０ｍＬスーパーループを経由して)連続的に供給した。試料の添加を、溶出液のＡ２８０がカラムに加えた試料のＡ２８０の１０％レベルに達するまで、継続した。そのように得られたデータに基づいて、それに加えたタンパク質の濃度の１０％レベルにおける充てんゲルのブレイクスルー容量(Ｑｂ１０％)を計算できる。そのようにして得られた結果は、数多くの脱塩用の候補をスクリーニングするための基礎を形成しており、二つのタンパク質、即ち、ウシ血清アルブミン(ＢＳＡ)およびヒト免疫グロブリン(ＩｇＧ)、について下に提示する。
【００９９】
評価
最高吸光度の１０％レベルにおけるブレイクスルー(Ｑｂ１０％)を以下の関係式を用いて計算した。
Ｑｂ１０％＝(ＴＲ１０％−ＴＲＤ)×Ｃ／ＶＣ
Ｒ１０％＝最高吸光度の１０％における保持時間(分)
ＴＲＤ＝システムのボイド容積(分)
Ｃ＝供給タンパク質の濃度(４ｍｇ／ｍＬ)
ＶＣ＝カラムの充てん床容積(ｍＬ)
【０１００】
２．２．“高塩”陽イオン交換リガンドに結合されたタンパク質の回収率
陽イオン交換リガンドをまた、それらに結合されたタンパク質の低塩条件下における回収率に関してスクリーニングする。これは、高塩条件における比較的高い吸着容量とそれらに適用されるタンパク質の低塩条件下における高度のもしくは定量的な回収率を兼備するところの、正しい種類のリガンドを選択するためのさらに別のかつ重要な判定基準である。回収率は、下に概略されるように測定された。
【０１０１】
２．２．１．実験
カラムのタイプ、充てん床容積、緩衝液、タンパク質溶液、流速および器具のタイプに関する詳細は、セクション２．１．１．および２．１．２．において概略されている。ＢＳＡについては、カラムを緩衝液１で平衡化し、結合されたタンパク質を緩衝液３で溶出し、そしてＩｇＧについては、カラムを緩衝液２で平衡化し、結合されたタンパク質を緩衝液３で溶出した。
【０１０２】
適切な緩衝液(緩衝液１もしくは２)で平衡化したカラムに、５０ｍＬスーパールーフから、タンパク質の溶液(ＢＳＡもしくはＩｇＧ)をそのブレイクスルー容量の３０％に相当する量が加えられるまで、加えた。次いで、カラムを２床容積の平衡緩衝液で洗浄し、結合したタンパク質を適切な脱着緩衝液(緩衝液３)で溶出した。溶出されたタンパク質を２０ｍＬメスフラスコ中に定量的に収集し、その容積および２８０ｎｍにおける吸光度(ＢＳＡおよびＩｇＧについて)を正確に測定した。それぞれの溶出された試料における全吸光度に基づいて、溶出液中のタンパク質の量を適切な検量線(下を参照)を用いて計算した。
【０１０３】
２．２．２．評価
それぞれのタンパク質についての標準溶液を、カラム平衡緩衝液中で０〜１０ｍｇ／ｍＬの濃度範囲にわたって調製した。一連の希釈液のＡ２８０(ＢＳＡもしくはＩｇＧ)を測定して、ｘ−軸上にタンパク質濃度(ｍｇ／ｍＬ)をそしてｙ−軸上に吸光度を取り検量線を作製した。それぞれの検量線の直線式および回帰係数を計算した。これらの標準曲線に基づいて、溶出された試料中のタンパクの濃度(ｍｇ／ｍＬで)を、該試料のＡ２８０を測定することにより以下の関係式を用いて計算した：
ＣＳ＝Ａ／ε・ｂ
ＣＳ：溶出された試料中のタンパク質の濃度(ｍｇ／ｍＬ)
Ａ：吸光度(Ａ２８０における)
ε：特定の波長におけるモル吸光率(Ｍ−１ｃｍ−１)
ｂ：セル通路長(ｃｍ)
【０１０４】
次いで、以下の関係式を用いて、結合されたタンパク質の回収率を計算する：
回収率、％＝ＣＳ・ＶＳ／ＣＬ・ＶＬ
ＶＳ：溶出されたタンパク質試料の容積(ｍＬ)
ＣＬ：加えた試料中のタンパク質の濃度(ｍｇ／ｍＬ)
ＶＬ：加えた試料の容積(ｍＬ)
【０１０５】
結果
１．高塩条件におけるブレイクスルー容量
一連の代表的な脱塩陽イオン交換リガンドについてのブレイクスルー容量および回収率について得られた結果を表１にまとめる。表１に示す実施例は、種々のリガンドの幾つかの特異的な性質を例示するものであり、本発明の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。大多数のこれらの新しい陽イオン交換体上のリガンド置換度は、約０.１８〜０.２０ｍｍｏｌ／充填ゲルｍＬであった。２、３の交換体は、０.２７ｍｍｏｌ／充填ゲルｍＬのような大きさを有した。参照陽イオン交換体として、そのリガンド濃度がこの新しいシリーズの陽イオン交換体と同じ範囲(即ち、０.１８〜０.２５ｍｍｏｌ／充填ゲルｍＬ)にあるところの、市販で入手可能なSP Sepharose 6 Fast Flowを使用した。結果は、以下の傾向を示す：
１．この新しい脱塩陽イオン交換リガンドは、参照陽イオン交換体SP Sepharose 6 Fast Flowと比較して、両方のタンパク質について、はるかに高いＱｂ１０％を有する。SP Sepharose 6 Fast FlowについてのＱｂ１０％値は、ＢＳＡおよびＩｇＧについて、それぞれ２.６ｍｇ／ｍＬおよび０.８ｍｇ／ｍＬであった。
２．リガンド１３は、ＢＳＡについて最高値(５７ｍｇ／ｍＬ)を与え、リガンド１は、ＩｇＧについて最高値(３３ｍｇ／ｍＬ)を与えた。これらの値は、参照陽イオン交換体(SP Sepharose 6 Fast Flow)と比べて上の二つのリガンド(１３および１)上で、それぞれＢＳＡおよびＩｇＧの２１９２％および４１２５％に相当するブレイクスルー容量の増加に相当する。
３．下に提示される１７個のリガンドの全てが、参照陽イオン交換体と比較して、両方のタンパク質について有意により高いＱｂ１０％を示した。これは、これらのリガンドが将来の脱塩リガンドを構築するための基礎を形成することができることを示す。
４．幾つかのリガンドは、ＩｇＧについて比較的低いＱｂ１０％値(８ｍｇ／ｍＬより低い)を示すが、ＢＳＡ(例えばリガンド１１、１２、１４、１５、１６および１７)については高いＱｂ１０％値を示す。かくして、これらの結果は“特異的な”タイプの脱塩陽イオン交換体を構築するための手引きとして将来役立ち得る。
【０１０６】
２．“高塩”陽イオン交換リガンドに結合されたタンパク質の回収率
ＢＳＡについての回収率のデータは完全である一方、ＩｇＧについてのそれらは約５０％のリガンドについて測定されている。得られた結果は以下を示す：
１．すべてのリガンドは、７９％より良好なＢＳＡの回収率を与える。
２．リガンド１は、ＢＳＡおよびＩｇＧについて、それぞれ９３％および８８％の回収率を表すということに関して、最も最適なリガンドである。
３．結果はまた、ｐＨによる段階的な溶出が高収率をもたらすことを示す。
【０１０７】
リガンドの構造
陽イオン交換リガンド(表１)は、
(ａ)リガンド−形成化合物１〜１３、１５および１７をＮＨＳ−活性化形態の生成物ＩＩと、もしくは
(ｂ)リガンド−形成化合物１４および１６を臭素活性化形態の生成物Ｉと、
反応させることにより創製された。
バリアント(ａ)は、リガンド−形成化合物がアミド基を経由してマトリックスに連結されたことを意味する。バリアント(ｂ)は、チオエーテルを経由する連結を意味する。
Ｑｂは、流動中の１０％ブレイクスルーにおけるブレイクスルー容量を表す。
ｍＬは、ゲルｍＬを意味する。
【０１０８】
表１．イオン交換脱塩に使用された陽イオン交換リガンド
【化１】
2004532182.tif 000002
リガンド１．ＱｂＢＳＡ＝５０ｍｇ／ｍＬ、ＱｂＩｇＧ＝３３ｍｇ／ｍＬ、回収率ＢＳＡ＝９３％、回収率ＩｇＧ＝８８％。
【化２】
2004532182.tif 000003
リガンド２．ＱｂＢＳＡ＝４４ｍｇ／ｍＬ、ＱｂＩｇＧ＝２０ｍｇ／ｍＬ、回収率ＢＳＡ＝８６％、回収率ＩｇＧ＝６８％。
【化３】
2004532182.tif 000004
リガンド３．ＱｂＢＳＡ＝４２ｍｇ／ｍＬ、ＱｂＩｇＧ＝２７ｍｇ／ｍＬ、回収率ＢＳＡ＝９３％、回収率ＩｇＧ＝７９％。
【化４】
2004532182.tif 000005
リガンド４．ＱｂＢＳＡ＝４４ｍｇ／ｍＬ、ＱｂＩｇＧ＝２４ｍｇ／ｍＬ、回収率ＢＳＡ＝９１％、回収率ＩｇＧ＝測定せず。
【化５】
2004532182.tif 000006
リガンド５．ＱｂＢＳＡ＝４１ｍｇ／ｍＬ、ＱｂＩｇＧ＝２７ｍｇ／ｍＬ、回収率ＢＳＡ＝９３％、回収率ＩｇＧ＝測定せず。
【化６】
2004532182.tif 000007
リガンド６．ＱｂＢＳＡ＝５０ｍｇ／ｍＬ、ＱｂＩｇＧ＝２２ｍｇ／ｍＬ、回収率ＢＳＡ＝９３％、回収率ＩｇＧ＝７５％。
【化７】
2004532182.tif 000008
リガンド７．ＱｂＢＳＡ＝４０ｍｇ／ｍＬ、ＱｂＩｇＧ＝２３ｍｇ／ｍＬ、回収率ＢＳＡ＝９３％、回収率ＩｇＧ＝７６％。
【化８】
2004532182.tif 000009
リガンド８．ＱｂＢＳＡ＝３８ｍｇ／ｍＬ、ＱｂＩｇＧ＝２３ｍｇ／ｍＬ、回収率ＢＳＡ＝９３％、回収率ＩｇＧ＝８６％。
【化９】
2004532182.tif 000010
リガンド９．ＱｂＢＳＡ＝４３ｍｇ／ｍＬ、ＱｂＩｇＧ＝１４ｍｇ／ｍＬ、回収率ＢＳＡ＝７９％、回収率ＩｇＧ＝６６％。
【化１０】
2004532182.tif 000011
リガンド１０．ＱｂＢＳＡ＝４４ｍｇ／ｍＬ、ＱｂＩｇＧ＝１１ｍｇ／ｍＬ、回収率ＢＳＡ＝９３％、回収率ＩｇＧ＝６５％。
【化１１】
2004532182.tif 000012
リガンド１１．ＱｂＢＳＡ＝４５ｍｇ／ｍＬ、ＱｂＩｇＧ＝５ｍｇ／ｍＬ、回収率ＢＳＡ＝９２％、回収率ＩｇＧ＝測定せず。
【化１２】
2004532182.tif 000013
リガンド１２．ＱｂＢＳＡ＝４９ｍｇ／ｍＬ、ＱｂＩｇＧ＝６ｍｇ／ｍＬ、回収率ＢＳＡ＝９２％、回収率ＩｇＧ＝測定せず。
【化１３】
2004532182.tif 000014
リガンド１３．ＱｂＢＳＡ＝５７ｍｇ／ｍＬ、ＱｂＩｇＧ＝１０ｍｇ／ｍＬ、回収率ＢＳＡ＝９３％、回収率ＩｇＧ＝測定せず。
【化１４】
2004532182.tif 000015
リガンド１４．ＱｂＢＳＡ＝５１ｍｇ／ｍＬ、ＱｂＩｇＧ＝４ｍｇ／ｍＬ、回収率ＢＳＡ＝９２％、回収率ＩｇＧ＝測定せず。
【化１５】
2004532182.tif 000016
リガンド１５．ＱｂＢＳＡ＝４６ｍｇ／ｍＬ、ＱｂＩｇＧ＝３ｍｇ／ｍＬ、回収率ＢＳＡ＝８７％、回収率ＩｇＧ＝測定せず。
【化１６】
2004532182.tif 000017
リガンド１６．ＱｂＢＳＡ＝５１ｍｇ／ｍＬ、ＱｂＩｇＧ＝４ｍｇ／ｍＬ、回収率ＢＳＡ＝９１％、回収率ＩｇＧ＝測定せず。
【化１７】
2004532182.tif 000018
リガンド１７．ＱｂＢＳＡ＝３７ｍｇ／ｍＬ、ＱｂＩｇＧ＝７ｍｇ／ｍＬ、回収率ＢＳＡ＝９３％、回収率ＩｇＧ＝測定せず。
【国際公開パンフレット】
2004532182.tif 000019
2004532182.tif 000020
2004532182.tif 000021
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2004532182.tif 000056
2004532182.tif 000057
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004532182.tif 000058
【国際調査報告】
2004532182.tif 000059
2004532182.tif 000060
2004532182.tif 000061