(57)【要約】標的核酸サンプル中のｍＲＮＡの分析のための定量的ハイブリダイゼーションアッセイを提供する。この方法は、（ｉ）標的核酸サンプルを、固体支持体上に固定化し、（ｉｉ）標識したアンチセンスプローブを、当該標的核酸サンプルの第一部分に接触させ、そして標識したセンスプローブを、当該標的核酸サンプルの第２部分に接触させ、（ｉｉｉ）ハイブリダイズしたアンチセンスプローブおよびハイブリダイズしたセンスプローブから生成するシグナルを検出および定量し、（ｉｖ）アンチセンスプローブシグナルとセンスプローブシグナルの差によって表される値を決定することを含む。当該値は、標的核酸サンプル中のｍＲＮＡの量に比例的である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプル中の標的核酸の定量方法であって、
（ｉ）標的核酸を含むサンプルを固体支持体上に固定化する、
（ｉｉ）ハイブリダイゼーション条件下、標識したアンチセンスプローブを、標的核酸を含むサンプルの第一部分に接触させ、そして標識したセンスプローブを、標的核酸を含むサンプルの第２部分に接触させ、ここで該アンチセンスプローブは、該標的核酸の全部または一部に相補的であり、ここで該センスプローブは該標的核酸の全部または一部に同一であり、かつここで、該アンチセンスおよびセンスプローブは、実質的に同じ長さであり、かつ実質的に同じ特異的活性のシグナルを生成し得る、
（ｉｉｉ）アンチセンスプローブおよびセンスプローブから生成するシグナルを検出および定量する、
（ｉｖ）センスプローブシグナルをひいたアンチセンスプローブシグナルによって表される値を決定し、該値は、サンプル中に存在する標的核酸の量に比例的である、
方法。
【請求項２】
該標的核酸がｍＲＮＡである、請求項１の方法。
【請求項３】
該サンプルが細胞溶解物を含む請求項１の方法。
【請求項４】
該アンチセンスおよびセンスプローブが、インビトロで転写される、請求項１の方法。
【請求項５】
検出工程（ｉｉｉ）に先立ちハイブリダイズしない標識されたプローブを除去することをさらに含む、請求項１の方法。
【請求項６】
標的核酸を含むサンプルが、細胞培養物から総細胞溶解物を取得することによって調製される、請求項１の方法。
【請求項７】
該固体支持体がナイロン膜である請求項１の方法。
【請求項８】
該プローブが、非放射活性標識で標識される、請求項１の方法。
【請求項９】
該非放射活性標識がビオチンである、請求項８の方法。
【請求項１０】
請求項１のアンチセンスおよびセンスプローブおよび使用のための指示を含むキット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
技術分野
本発明は、核酸サンプル中のｍＲＮＡの分析のための定量的ハイブリダイゼーションに関する。
【０００２】
背景技術
特異的ＲＮＡ発現の誘導は、薬物または化学的化合物の生物学的活性の重要なマーカーである。サンプル中のＲＮＡの定量は、ある剤がＲＮＡ発現を誘導するのが可能であるか決定するために必要である。種々のＲＮＡ定量方法（ＲＮＡハイブリダイゼーションアッセイ）が当分野で既知である。しかし、現在使用される方法は通常、ＲＮＡの単離および精製、追加的ｃＤＮＡ合成、特別な装置の使用および/または多数（２０またはより多い）種特異的オリゴヌクレオチド（分枝ＤＮＡアッセイ）のセットの使用を要する。
【０００３】
１より多い動物種からのサンプル中の種々の剤のＲＮＡ誘導効果を決定することはしばしば望ましい。標準的方法にしたがって、RNA定量アッセイは、ミクロプレートに移動された細胞または組織スライスのモノレイヤーで実施できる。試験すべき剤を次いで、プレートのウェルに、しばしばピペッティングロボットの使用によって添加する。ミクロプレートリーダを次いで、サンプル中のRNAが標識されたプローブにハイブリダイズしたことを示す、蛍光または発光を検出するために使用する。
【０００４】
結果として、標準的ミクロプレート形式と両立可能である、かつ同じプローブを、1より多い動物種からのRNAサンプルへのハイブリダイゼーションのために使用し得る、RNA精製または特別な装置の使用を要しないシンプルで信頼できるRNA定量方法の必要性がある。
【０００５】
決定されたRNA発現レベルを中間（internal）標準に対して相関し得ることが特に有用であり、こうして、種々のアッセイで種々の量の出発材料の使用から生じる変異を排除する。
【図面の簡単な説明】
【０００６】
【図１】図１は、マウスＩＧＦ−Ｉ遺伝子から由来するセンスおよびアンチセンスプローブ中にとりこまれたビオチンレベルの検出を示すグラフである（ＬＣＰＳ＝秒あたりの発光カウント）。
【図２】図２は、種々の量の成長ホルモン（ＧＨ）での刺激後の、マウス肝細胞中のＩＧＦ−ＩＢ  ＲＮＡの定量を示すグラフである。コントロール（ＣＴＲ）細胞は、ＧＨを受容しなかった。
【図３】図３は、種々の量の成長ホルモン（ＧＨ）での刺激後の、ラット肝細胞中のＩＧＦ−ＩＢ  ＲＮＡの定量を示すグラフである。コントロール（ＣＴＲ）細胞は、ＧＨを受容しなかった。
【０００７】
発明の開示
本発明は、改良された定量的ＲＮＡハイブリダイゼーションアッセイを提供する。本発明のハイブリダイゼーションアッセイの有利な特徴は：
（ａ）実質的に同じ長さおよび特異的活性を有する、アンチセンスおよびセンスプローブの使用であって、サンプル中の興味の持たれるＲＮＡ、例えばｍＲＮＡの量に比例的な値の容易な決定を可能とし、
（ｂ）ＲＮＡを予め精製する必要なく、ハイブリダイゼーションアッセイに直接的に細胞ライセートを使用することが可能であり、そして
（ｃ）ハイブリダイゼーション条件が、ノーザンおよびサザンブロッティングについて使用される標準条件と類似するから、いくつかの動物種からの核酸サンプルの分析のために同じプローブを使用することが可能であること
を含む。
【０００８】
より具体的には、本発明は、サンプル中の標的核酸の定量のための方法を提供し、該方法は：（ｉ）標的核酸を含むサンプルを、固体支持体上に固定化し、（ｉｉ）ハイブリダイゼーション条件下で、標識されたアンチセンスプローブを、標的核酸を含むサンプルの第１部分に接触させ、そして標識されたセンスプローブを該標的核酸を含むサンプルの第２部分に接触させ、ここで該アンチセンスプローブは、該標的核酸のすべてまたは一部と相補的であり、ここで該センスプローブは、該標的核酸の全部または一部と同一であり、かつここで該アンチセンスおよびセンスプローブは、実質的に同じ長さであり、実質的に同じ特異的活性（specific activity）のシグナルを生成でき、（ｉｉｉ）アンチセンスプローブおよびセンスプローブから生成したシグナルを検出および定量し、そして（ｉｖ）センスプローブシグナルを引いたアンチセンスプローブシグナルによって表される値を決定し、該値が、サンプル中に存在する標的核酸の量に比例的である、ことを含む。
【０００９】
該標的核酸は、ＲＮＡ、例えばｍＲＮＡである。標的核酸を含むサンプルは、細胞または細胞集団のｍＲＮＡ含量を含むことができる。例えば、サンプルは細胞ライセートを含み得る。サンプルを例えば、細胞培養物からの総細胞ライセートを取得することによって調製できる。
１実施態様では、アンチセンスおよびセンスプローブを、インビトロで転写する。さらなる例では、プローブを、固相合成法によって作成する。プローブはRNAまたはDNAであることができる。
【００１０】
１実施態様では、該方法は追加的に、検出工程（ｉｉｉ）に先立ち、ハイブリダイズしてない標識プローブを除去する工程を含む。
１実施態様では、固体支持体はナイロン膜であることができる。
プローブを、例えば、放射活性標識または非放射活性標識、例えばビオチンで標識し得る。
【００１１】
さらなる側面では、本発明は、本発明の方法を実施するための試薬を含むキットを含む。例えば、キットはここに記載のようなアンチセンスおよびセンスプローブを含み得る。このキットはまた、固体支持体材料および／または細胞ライセートを生成するためおよび分析のためのサンプルを調製するための材料を含み得る。
本発明は、以下の部でより詳細に定義かつ記載する。
【００１２】
プローブ
用語「プローブ」は、特異的塩基配列の一本鎖核酸分子をいい、これを使用し、ハイブリダイゼーションによって相補的塩基配列を検出する。本文脈では、用語「アンチセンスプローブ」は、選択のＤＮＡのアンチセンス（非コーディング）鎖の一部の転写から得られるＲＮＡプローブをいう。アンチセンスプローブは結果的に、当該ＤＮＡから転写された翻訳可能ｍＲＮＡに相補的であり、そして、そのようなｍＲＮＡにハイブリダイズし得る。用語「センスプローブ」は、センスＤＮＡ鎖の一部の転写から得られるＲＮＡプローブ、すなわち相補的ｍＲＮＡの合成のため使用されるＤＮＡ鎖をいう。こうして、センスプローブは、そのようなｍＲＮＡに顕著にはハイブリダイズできないことが理解される。
【００１３】
本発明にしたがって、アンセンスおよびセンスプローブは、本質的に同じ長さ、例えば１００、５０、２５、２０、１５、１０、５、４、３、２またはを超えない長さによって異なる長さを有する。プローブの長さは、好適には、近似的に１００ないし１０００ヌクレオチド長の範囲である。
【００１４】
好適なセンスおよびアンチセンスプローブは、標準的方法によって興味の持たれるＤＮＡから調製できる。１つの好適な方法は、このましくは１００−１０００、たとえば約３００の興味のもたれる遺伝子のヌクレオチドを含むｃＤＮＡクローンを調製し、その結果プロモーターを該ｃＤＮＡのいずれかの末端にライゲートし、それを両方の方向からのｃＤＮＡをインビトロ転写するのを可能とする。ｃＤＮＡクローンは、好適な制限酵素で線形化し、その結果プロモーターから制限部位までの距離は、ｃＤＮＡのいずれかの末端から類似である。ＲＮＡプローブ（センスおよびアンチセンス）は、例えば商業的に入手可能な転写キット、例えばＭＡＸＩｓｃｒｉｐｔ（登録商標）、In Bitro Transcription Kit(Ambion Cat. No. 1308-1326)を使用してインビトロ転写によって調製できる。インビトロ転写反応で使用される普通のＲＮＡポリメラーゼは、ＳＰ６、Ｔ７、およびＴ３ポリメラーゼであり、これらがクローン化されたバクテリオファージについて名づけられる。
【００１５】
標識およびシグナルシステム
用語「標識された（センスまたはアンチセンス）プローブ」は、直接的にまたはシグナル生産システムの１または２以上の追加的メンバーでの相互作用を介して検出可能シグナルを提供することのできる、プローブをいう。直接的に検出可能である標識は、放射活性および蛍光標識を含む。シグナル生産系を介して検出可能である標識は、例えばビオチン、フルオレセイン、および低エネルギー放射活性を含む。ビオチニル化プローブは、Leary et al. (1983)Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 80: 4145に記載のようなニトロセルロースフィルター上の標的核酸配列の感受性発色性検出についての当分野、およびLanger-Safer(1982) et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:4381における標的ＤＮＡのインサイチュ検出の分野で既知である。
【００１６】
以下に提供する例において、プローブを、製造者の推奨にしたがってBrightStar(登録商標)Psoralen-Biotin(登録商標)(Ambion Cat. No. 1480)を使用する架橋化によって標識した。BrightStar(登録商標)Psoralen-Biotin(登録商標)は、ビオチンに共有結合されている三環式インターカレーティング部分、プロラレンからなる。このプソラレン−ビオチンを核酸内に差し込み、そして次いで、長波長ＵＶ光での短い照射によって共有結合する。
【００１７】
本発明にしたがって、アンチセンスおよびセンスプローブを、実質的に同じ特異的活性で標識する。語句「同じ特異的活性」は、標的核酸サンプルにハイブリダイズしたプローブの量について、同じ強度のシグナルを生成する、センスおよびアンチセンスプローブの能力をいう。語句「同じ特異的活性」はまた、プローブが本質的に同じ長さおよび塩基組成を有すること、および標識されたヌクレオチドの数が、両方のプローブで同じであることをいう。
【００１８】
プローブが同じ特異的活性に標識されていることを確認するのが有用である。標識が放射活性である場合、その取りこみは、精製されたプローブのアリコートのシンチレーションカウンティングによって決定できる。非放射性標識の取りこみは、アンチセンスおよびセンスプローブの一連希釈物を、フィルター上にスポッティングし、次いで蛍光を検出する（もし標識がフルオレセインであるなら）こと、または標識がビオチンなら、検出系例えばBrightStar（登録商標）BioDetect（登録商標）Nonisotopic Detection Kit(Ambion Cat. No. 1930)によって決定できる。アンチセンスおよびセンスプローブ濃度が、例えば260nmでの光学的密度を決定し、または標準的方法で蛍光を決定し、その結果それぞれのプローブの同じ量が、それぞれのハイブリダイゼーション反応で使用されることによって正確に決定されることがまた有用である。
【００１９】
標的核酸サンプルの調製および固定化
用語「標的核酸サンプル」は、動物組織または細胞培養物から取得されるサンプルをいい、このサンプルは核酸を含み、ここでｍRNAの量を定量するのが望ましい。
【００２０】
本発明にしたがって、標的核酸サンプルは好ましくは、細胞カルチャーの総ライセートとして調製する。そのような総細胞ライセートは、既知方法によって調製でき、例えばKaabache, T. et al.,(1995)Direct Solution Hybridization of Guanidine Thiocyanate Solubilized Cells for Quantitation of mRNAs in Hepatocytes. Anal. Biochem/ 232:225-230参照。
【００２１】
通常は細胞を、好適な密度に培養し、それから好適な剤、例えばグアニジンチオシアネートの添加によって溶解する。細胞溶解後、アリコートの細胞性ライセートを、好適な固体支持体に移す。好適な固体支持体の例は、ミクロプレート形式ナイロンフィルター、例えば「Nylon Membrane Filtermat」である。Fitermat(Perkin-Elmer; Product No. 1450-423）は、プリントされたパターンを有する９６位置ナイロン膜であり、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリダイゼーションアッセイのためのマニホルドとの使用を意図する。典型的には、５−１０μｌのライセートを、ドライフィルター上にスポットする。８レプリカフィルターを、この態様で調製できる。このライセートを次いで、標準的方法にしたがってＵＶ架橋化によってまたはベイキングによってフィルター上に固定化する。
【００２２】
プローブの、固定化標的サンプルへのハイブリダイゼーション
用語「ハイブリダイゼーション条件」は、ＲＮＡプローブ（複数もある）と標的核酸サンプルに含まれる相補的核酸間の検出可能なハイブリダイゼーションを生産するのに十分な条件を言う。当業者は、例えば周知実験マニュアルから、好適なハイブリダイゼーション条件を決定できる。
【００２３】
以下に与える例では、レプリカフィルターは、商業的に入手可能なULTRAhyb(登録商標）Ultrasensitive hybridization Buffer(Ambion Cat. No. 8670)ローリングボトル中の高ストリンジェンシー条件で、ハイブリダイズした。ハイブリダイゼーション後、フィルターを、ULTRAhyb(登録商標）プロトコルにしたがって高ストリンジェンシーで洗浄した。
【００２４】
シグナルの検出および定量
標的核酸サンプルにハイブリダイズしたプローブの量は、標準的方法によって決定できる。固体支持体が、標準的ミクロプレート形式を有する膜またはフィルターであるとき、シグナルは肝便意は、ミクロプレートリーダーを使用することによって検出できる。
【００２５】
プローブは、放射活性標識で標識されたならば、フィルターを乾燥し、そしてハイブリダイゼーションを、オートラジオグラフィーまたはホスホイメージャー分析によって直接的に定量できる。代替的には、シンチレーションメディウム（例えばmeltiLex(登録商標）固体シンチレーター（Perkin-Elmer; Product No. 1450-441-442)またはフォす液体シンチレーションメディウム）を、フィルターに添加し、これをプラスチックバッグ中にシールでき、そしてシンチレーションカウンチングのため装着されたミクロプレートリーダーでカウントできる。
【００２６】
もし、以下に例示するように、プローブが非放射性標識、例えばビオチンで標識されたならば、フィルターを、シグナルの発展中にローリングボトル（ハイブリダイゼーション中に使用される）中に保持することができる。シグナルを、例えばBrightStar(登録商標）Nonisotopic Detection Kitを使用して検出できる。発光基質の添加後、フィルターをプラスチック、例えば商業的入手可能のSanple bag(Perkin-Elmer; Product No.1450-432)中にシールし、そしてフィルターホルダーに移動することができる。発光を次いで、シグナルが最大に達したときに、ミクロプレートリーダーで定量する。
【００２７】
アンチセンスプローブから生成したシグナルは、ライセートに存在する特異的ＲＮＡ、並びに総細胞性ライセートへのバックグラウンドハイブリダイゼーション（一部はライセート中に存在するＤＮＡへの特異的ハイブリダイゼーションに由来する）を表す。対照的に、センスプローブから生成したシグナルは、バックグラウンドハイブリダイゼーションのみを表し、そしてライセート中の細胞性材料の量に比例的である。アンチセンスおよびセンスプローブが同じ長さかつ同じ特異的活性のものであるとき、センスハイブリダイゼーションからのシグナルの量は、アンチセンスシグナルから検出でき、特異的遺伝子のフォールド誘導の真の評価という結果である。さらに、この結果は、細胞溶解工程に先立つ細胞または組織の異なる量のために、出発材料の量の可能な変異についての更正という結果となる。
【００２８】
本記載を通して、「標準的プロトコル」および「標準的手法」は、分子生物学的技法の文脈で使用するとき、通常の実験マニュアルで見出されるプロトコルおよび手法として理解されるべきであり、例えばCurrent Protocols in Molecular iology , editors F. Ausubel et al., John Wiley and Sons, Inc. 1994,またはSambrook, J., Fritsch, E.F. and Maniatis, T., Molecular Cloning: Alaboratory manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboatory Press, Cold Spring Harbor, NY 1989.
【００２９】
特に定義しないかぎり、ここで使用される技術的および科学的用語は、この発明の属する当業者によって通常理解されるのと同じ意味を有する。ここに記載されるものと類似または均等な方法および材料を、本発明の実施化または試験で使用できるが、好適な方法および材料は、以下に記載する。すべての刊行物、特許出願、特許およびここに述べる他の引用は、引用によりここに含める。加えて、記載された材料および方法は、例示目的で限定を意図しない。本発明は、例示目的のみで含まれる、実施例によって記載し、とにかく限定として見られるべきでない。
【００３０】
実施例
実施例１：ＩＧＦ−ＩＢ  ＲＮＡの決定のためのプローブの調製
マウスＩＧＦ−ＩＢ遺伝子エキソン２からの６０ヌクレオチド、並びにエキソン３からの１７９ヌクレオチドを含むｃＤＮＡ（GenBank Accession No. X04482;配列番号１および２）を、ｐＧＥＮ（登録商標）−４Ｚ標準クローニングベクター（Promega;Cat.No. P2161)内にクローニングした。ＥｃｏＲＩでプラスミドを線形化して、Ｔ７ポリメラーゼ（MAXIscript(登録商標)T7キット；Ambion Cat. No 1308）を使用して約２５０ヌクレオチド長アンチセンスプローブの転写を可能とする。ＨｉｎｄＩＩＩでの線形化して、ＳＰポリメラーゼ（MAXIscript(登録商標)SP6キット；Ambion Cat. No.1312）。転写したＩＧＦ−ＩＢフラグメントのｃＤＮＡ配列（小文字）、並びにフランキングプラスミド配列（大文字）を以下に与える（配列番号３）：
【化１】2004535803.tif 000002
【００３１】
プローブを、ＮＩＣＫ−カラム（Amersham Pharmacia Biotech; Cat.No. 17-0855-02）で精製し、そしてそれらの濃度を、２６０ｎｍの光学的密度によって、並びに標準的方法にしたがって臭化エチジウム可視化によって決定した。同じ量（０．５μｇ）のアンチセンスおよびセンスプローブを、プソラレン−ビオチンで架橋することによって標識した。一連希釈の２反復サンプルを、フィルター上にスポットし、そして標識の量を製造者指示にしたがってBrightStar(登録商標)BioDetect(登録商標)（Nonisotopic Detection）キット（Ambion Cat. No.1930）を使用して決定した。結果（図１）は、標識の量が、アンチセンスおよびセンスプローブの対応する量に類似であることを示した。
【００３２】
実施例２：マウス肝細胞のＩＧＦ−Ｉ  ＲＮＡの決定
マウス肝細胞をかん流によって調製し、９６ウェルミクロプレートにプレートした。プレートの日後、細胞を終夜の血清飢餓の対象とした。その後培養培地を、新鮮血清フリー培地に交換し、そして細胞を、一連希釈のヒト成長ホルモンで６時間刺激した。培養培地を除去し、そして１００μｌ細胞溶解バッファー（４．０−４．２Ｍグアニジンチオシアネートおよび０．１Ｍ  ＥＤＴＡ）を、それぞれのウェルに添加し、これらは、近似的に３００００細胞のモノレイヤーを含んだ。
【００３３】
プレート融解後、細胞の溶解を、ピペッティングロボットを使用して溶解バッファーを数回挙げ下げすることによって達成した。等量（１０μｌ）のライセートを、同じピペッティングロボットを使用してナイロン膜（Nylon Membrane Filtermat; Perkin-Elmer; Product No. 1450-423)に移動させた。レプリカフィルターを、調製した。溶解物を、ＵＶ架橋化によってフィルター上に固定化した。
【００３４】
ハイブリダイゼーションをULTRAhyb（登録商標）Ultrasensitive Hybridization Buffer(Ambion Cat. No. 8670)を使用して製造者推奨にしたがって、６８℃でローリングボトル中で高ストリンジェンシーで実施した。１時間の前ハイブリダイゼーション後、実施例１にしたがって調製したアンチセンスおよびセンスプローブ（０．５ｎｇ／ｍｌ）を、それぞれ第１および第２フィルターに添加した。ハイブリダイゼーション後、フィルターを、ULTRAhyb(登録商標)プロトコルにしたがって高ストリンジェンシーで洗浄した。ハイブリダイズしたプローブからのシグナルを、BrightStar(登録商標)BioDetec(登録商標)（Nonisotopic Detection）キット(Ambion Cat. No. 1930)および発光リーダを使用して決定した。
【００３５】
結果（図２）は、ＩＧＦ−ＩＢ  ＲＮＡの成長ホルモン依存性誘導を示し、ラット肝細胞について示されたものと類似であるTollet P. et al.,(1990)Moleculae Endocrinology 4:1934-1942）。同じハイブリダイゼーションは、細胞性モノレイヤーがイーブンであったことを示した。センス−プローブによって取得されたバックグラウンドハイブリダイゼーションレベルは、アンチセンスハイブリダイゼーションから演繹したとき、ＲＮＡ誘導は、インビボおよびインビトロの可溶性ハイブリダイゼーション研究（Tollet P. et al., 前掲）から報告されたものと類似（５ないし８倍）であると示された。
【００３６】
実施例３：ラット肝細胞におけるＩＧＦ−Ｉ  ＲＮＡの決定
実施例２に記載の実験をラット肝細胞で反復した。図３に示すように、類似の結果がマウス肝細胞についてのように取得された。このことは、プローブの同じ対を、１より多い動物種からのサンプルでＲＮＡ定量のため使用し得る。
【図１】
2004535803.tif 000003
【図２】
2004535803.tif 000004
【図３】
2004535803.tif 000005
【国際公開パンフレット】
2004535803.tif 000006
2004535803.tif 000007
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2004535803.tif 000022
2004535803.tif 000023
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004535803.tif 000024
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004535803.tif 000025
【国際調査報告】
2004535803.tif 000026
2004535803.tif 000027
2004535803.tif 000028