(57)【要約】本発明は、式（Ｉ）：【化２４】2004504298.tif 000037（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５及びＸは明細書中の定義と同義である）で示される化合物、並びに薬学的に許容されうるそのエステル及び／又は薬学的に許容されうるその塩に関する。該化合物は、メタロプロテアーゼ、例えば亜鉛プロテアーゼ、特に亜鉛ヒドロラーゼのインヒビターとして有用であり、発生が増加している血管収縮と関連する疾病状態の処置に効果的である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式（Ｉ）：
【化１】
2004504298.tif 000034
〔式中、
Ｒ１は、水素、アルキルカルボニル又はアリールカルボニルであり；
Ｒ２は、アルキル、アルキルシクロアルキル、アルキルシクロアルキルアルキル、シクロアルキル、ハロゲンアルキル、カルボキシアルキル、アミノアルキル、（モノ−及びジアルキル）アミノアルキル、アルコキシアルキル、アルコキシカルボニルアルキル、アルキニル、アリール、アリールアルキル、アリールアルキル（アルコキシカルボニル）アルキル、アリールカルボニルアルキル、アリールオキシアルキル、アリールアルケニル、アリール（アルコキシカルボニル）アルキル、ヘテロアリール、ヘテロアリールアルキル、ヘテロシクリル又はヘテロシクリルアルキルであり；
Ｒ３は、水素、アリール、アルキル又はアリールアルキル、アリールスルホニル、ヘテロアリールスルホニルであり；
Ｒ４は、水素、アリールアルキル、アルキル、アリール、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、アルキルスルホニル、アリールスルホニル、アリールアルキルスルホニル、ヘテロアリールスルホニル、カルボキシアルキル、カルボキシアルキルスルホニル若しくはアルコキシカルボニルアルキルであるか；又は基−ＮＲ３Ｒ４若しくはＲ５−〔Ｎ−Ｎ（Ｒ４）〕−Ｒ３は、飽和若しくは不飽和の５員若しくは６員脂肪族環を形成し；
Ｒ５は、水素、アルキルスルホニル、アリールスルホニル、ヘテロアリールスルホニル、アルコキシカルボニル、アリールオキシカルボニル、ヘテロアリールオキシカルボニル、アルキルカルボニル、アリールカルボニル、ヘテロアリールカルボニル、ヘテロアリールアルキルカルボニル、ヘテロシクリル、（モノ−若しくはジアルキルアミノ）アルキルカルボニル、（モノ−及びジアルキル）アミノスルホニル、アリールアミノカルボニル、アルキル、アルキルカルボニル、アルコキシカルボニル、アリール、アリールアルキル、アリールアルコキシカルボニル又はヘテロアリールであり；
Ｒ６は、水素、アルキル、アリール又はカルボキシアルキルであり；
Ｘは、−Ｓ（Ｏ）２−、−Ｓ（Ｏ）２−ＮＨ−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ６−又は−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−である〕で示される化合物、並びに薬学的に許容されうるそのエステル及び／又は薬学的に許容されうるその塩。
【請求項２】
Ｒ１が水素である、請求項１記載の式（Ｉ）の化合物。
【請求項３】
Ｒ２が、アルキル、ハロゲンアルキル、アルキルアミノ、アルコキシ、シクロアルキル、シクロアルキルアミノ、アリール、アリールアルキル、アリールオキシ、アリールアルキルアミノ、アリールアルコキシ、ヘテロアリール、アミノ又は（モノ−及びジアルキル）アミノである、請求項１又は２のいずれか１項記載の化合物。
【請求項４】
Ｒ２が、アルキル、ハロゲンアルキル、アルキルアミノ、アルコキシ、シクロアルキル、シクロアルキルアミノ、アリール、アリールアルキル又はヘテロアリールである、請求項１〜３のいずれか１項記載の化合物。
【請求項５】
Ｒ２がアリール又はヘテロアリールである、請求項１〜４のいずれか１項記載の化合物。
【請求項６】
Ｒ２がアリールである、請求項１〜５のいずれか１項記載の化合物。
【請求項７】
Ｒ２が、ナフチル又はフェニル（ここで、フェニルは場合によりフルオロの１個以上、又はフェニル基の１個により置換されている）である、請求項１〜６のいずれか１項記載の化合物。
【請求項８】
Ｒ２が、ナフチル、２，３，４，５，６−ペンタフルオロベンゼン又はビフェニルである、請求項１〜７のいずれか１項記載の化合物。
【請求項９】
Ｒ３が水素又はアルキルである、請求項１〜８のいずれか１項記載の化合物。
【請求項１０】
Ｒ３が水素である、請求項１〜９のいずれか１項記載の化合物。
【請求項１１】
Ｒ４が、水素、アリールアルキル、アルキル、アリールスルホニル、ヘテロアリールスルホニル、シクロアルキルアルキル又はカルボキシアルキルである、請求項１〜１０のいずれか１項記載の化合物。
【請求項１２】
Ｒ４が、水素、アルキル、アリールアルキル、シクロアルキル、アリールスルホニル又はカルボキシアルキルである、請求項１〜１１のいずれか１項記載の化合物。
【請求項１３】
Ｒ４が、水素、アルキル、シクロアルキル、カルボキシアルキル又はアリールアルキルである、請求項１〜１２のいずれか１項記載の化合物。
【請求項１４】
Ｒ４が、水素、アルキル又はアリールアルキルである、請求項１〜１３のいずれか１項記載の化合物。
【請求項１５】
Ｒ４が、水素、２，４，５−トリフルオロベンジル、２，４−ジフルオロベンジル、ベンジル、メチル、エチル、イソプロピル、イソブチル、ベンジル若しくはＨＯ２Ｃ−ＣＨ２−又はシクロアルキルプロピルメチルである、請求項１〜１４のいずれか１項記載の化合物。
【請求項１６】
Ｒ５が、水素、アルキルカルボニル、アルコキシカルボニル、アルキルスルホニル、アリール、アリールアルキル、アリールカルボニル、（モノ−及びジアルキルアミノ）アルキルカルボニル、（モノ−及びジアルキル）アミノスルホニル、アリールアルコキシカルボニル、アリールアミノカルボニル、アリールスルホニル、ヘテロアリールカルボニル、ヘテロアリールアルキルカルボニル、ヘテロアリールスルホニル、アリールアミノカルボニル、ヘテロアリール又はヘテロシクリルである、請求項１〜１５のいずれか１項記載の化合物。
【請求項１７】
Ｒ５が、アリール、アリールアルキル、アリールカルボニル、アリールアルコキシ、アリールアミノカルボニル、アリールスルホニル、ヘテロアリールカルボニル、ヘテロアリールアルキルカルボニル、ヘテロアリールスルホニル、アリールアミノカルボニル、ヘテロアリール又はヘテロシクリルである、請求項１〜１６のいずれか１項記載の化合物。
【請求項１８】
Ｒ５が、アリールスルホニル、アリールアルキル、ヘテロアリールアルキルカルボニル又はヘテロアリールスルホニルである、請求項１〜１７のいずれか１項記載の化合物。
【請求項１９】
Ｒ５が、４−メチルベンゼンスルホニル、ベンジル、４−メトキシベンゼンスルホニル、（１Ｈ−インドール−３−イル）アセチル、チオフェン−２−イル又は３，５−ジメチルイソオキサゾール−４−スルホニルである、請求項１〜１８のいずれか１項記載の化合物。
【請求項２０】
Ｘが−ＳＯ２−又は−Ｃ（Ｏ）−である、請求項１〜１９のいずれか１項記載の化合物。
【請求項２１】
Ｘが−ＳＯ２−である、請求項１〜２０のいずれか１項記載の化合物。
【請求項２２】
式（ＩＩ）：
【化２】
2004504298.tif 000035
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５及びＸは、請求項１〜２１のいずれか１項記載の定義と同義である）を有する、請求項１〜２１のいずれか１項記載の化合物。
【請求項２３】
Ｒ１が水素であり；
Ｒ２が、ナフチル又はフェニル（ここで、フェニルは場合によりフルオロの１個以上又はフェニル基の１個で置換されている）であり；
Ｒ３が、水素又はアルキルであり；
Ｒ４が、水素、アルキル又はアリールアルキルであり；
Ｒ５が、アリールスルホニル、アリールアルキル、ヘテロアリールアルキルカルボニル又はヘテロアリールスルホニルであり；そして
Ｘが−ＳＯ２−である、請求項１〜２２のいずれか１項記載の化合物。
【請求項２４】
ａ）（２Ｓ，４Ｒ）−４−メルカプト−１−（ナフタレン−２−スルホニル）ピロリジン−２−カルボン酸Ｎ′−イソブチル−Ｎ′−（４−メチルベンゼンスルホニル）ヒドラジド；
ｂ）（２Ｓ，４Ｒ）−４−メルカプト−１−（ナフタレン−２−スルホニル）ピロリジン−２−カルボン酸Ｎ′−（４−メチルベンゼンスルホニル）ヒドラジド；
ｃ）（２Ｓ，４Ｒ）−４−メルカプト−１−（ナフタレン−２−スルホニル）ピロリジン−２−カルボン酸Ｎ′−ベンジルヒドラジド；
ｄ）（２Ｓ，４Ｒ）−４−メルカプト−１−（ナフタレン−２−スルホニル）ピロリジン−２−カルボン酸Ｎ′−ベンジル−Ｎ′−（４−メチルフェニルスルホニル）ヒドラジド；
ｅ）（２Ｓ，４Ｒ）−４−メルカプト−１−（ナフタレン−２−スルホニル）ピロリジン−２−カルボン酸Ｎ′−メチル−Ｎ′−（４−メチルベンゼンスルホニル）ヒドラジド；
ｆ）（２Ｓ，４Ｒ）−４−メルカプト−１−（ナフタレン−２−スルホニル）ピロリジン−２−カルボン酸Ｎ′−ベンゼンスルホニルヒドラジド；
ｇ）（２Ｓ，４Ｒ）−４−メルカプト−１−（ナフタレン−２−スルホニル）ピロリジン−２−カルボン酸Ｎ′−（４−メトキシベンゼンスルホニル）ヒドラジド；
ｈ）（２Ｓ，４Ｒ）−４−メルカプト−１−（ナフタレン−２−スルホニル）ピロリジン−２−カルボン酸Ｎ′−〔（１Ｈ−インドール−３−イル）アセチル〕ヒドラジド；
ｉ）（２Ｓ，４Ｒ）−４−メルカプト−１−（ナフタレン−２−スルホニル）ピロリジン−２−カルボン酸Ｎ′−チオフェン−２−スルホニルヒドラジド；
ｊ）（２Ｓ，４Ｒ）−４−メルカプト−１−（ナフタレン−２−スルホニル）ピロリジン−２−カルボン酸Ｎ′−（３，５−ジメチルイソオキサゾール−４−スルホニル）ヒドラジド；
ｋ）（２Ｓ，４Ｒ）−４−メルカプト−１−（ナフタレン−２−スルホニル）ピロリジン−２−カルボン酸Ｎ′−シクロプロピルメチル−Ｎ′−（４−メチルベンゼンスルホニル）ヒドラジド；
ｌ）（２Ｓ，４Ｒ）−４−メルカプト−１−（ナフタレン−２−スルホニル）ピロリジン−２−カルボン酸Ｎ′−（４−メチルベンゼンスルホニル）−Ｎ′−（２，４，５−トリフルオロベンジル）ヒドラジド；
ｍ）（２Ｓ，４Ｒ）−４−メルカプト−１−（ナフタレン−２−スルホニル）ピロリジン−２−カルボン酸Ｎ′−（２，５−ジフルオロベンジル）−Ｎ′−（４−メチルベンゼンスルホニル）ヒドラジド；
ｎ）（２Ｓ，４Ｒ）−４−メルカプト−１−（ナフタレン−２−スルホニル）ピロリジン−２−カルボン酸Ｎ′−イソプロピル−Ｎ′−（４−メチルベンゼンスルホニル）ヒドラジド；
ｏ）（２Ｓ，４Ｒ）−〔Ｎ′−〔４−メルカプト−１−（ナフタレン−２−スルホニル）ピロリジン−２−カルボニル〕−Ｎ−（４−メチル−ベンゼンスルホニル）ヒドラジノ〕酢酸；
ｐ）（２Ｓ，４Ｒ）−１−（ビフェニル−４−スルホニル）−４−メルカプトピロリジン−２−カルボン酸Ｎ′−メチル−Ｎ′−（４−メチルベンゼンスルホニル）ヒドラジド；
ｑ）（２Ｓ，４Ｒ）−４−メルカプト−１−（２，３，４，５，６−ペンタフルオロベンゼンスルホニル）ピロリジン−２−カルボン酸Ｎ′−（４−メチルベンゼンスルホニル）ヒドラジド；
ｒ）（２Ｓ，４Ｒ）−４−メルカプト−１−（ナフタレン−２−スルホニル）ピロリジン−２−カルボン酸Ｎ′−ベンジル−Ｎ′−（４−メトキシベンゼンスルホニル）ヒドラジド；
ｓ）（２Ｓ，４Ｒ）−４−メルカプト−１−（ナフタレン−２−スルホニル）ピロリジン−２−カルボン酸Ｎ−メチル−Ｎ′−（４−メチルベンゼンスルホニル）ヒドラジド；及び
ｔ）（２Ｓ，４Ｒ）−４−メルカプト−１−（ナフタレン−２−スルホニル）ピロリジン−２−カルボン酸Ｎ−メチル−Ｎ′−ベンジル−Ｎ′−（４−メチルベンゼンスルホニル）ヒドラジドからなる群より選択される、請求項１〜２３のいずれか１項記載の化合物。
【請求項２５】
請求項１〜２４のいずれか１項記載の化合物及び１種以上の薬学的に許容されうる賦形剤を含む医薬組成物。
【請求項２６】
エンドセリン変換酵素（ＥＣＥ）活性により引き起こされる疾患、特に心筋虚血症、うっ血性心不全、不整脈、高血圧症、肺高血圧症、喘息、脳血管痙攣、くも膜下出血、子癇前症、腎臓病、アテローム性動脈硬化症、バージャー病、高安動脈炎、糖尿病合併症、肺癌、前立腺癌、胃腸疾患、内毒素性ショック及び敗血症の予防及び治療のため、並びに創傷の治癒のため及び月経、緑内障、細胞増殖抑制性、眼科学及び脳保護性適応症に関連する疾病の制御及び臓器保護のための薬剤の製造における活性成分としての、請求項１〜２４のいずれか１項記載の化合物の使用。
【請求項２７】
心筋虚血症、うっ血性心不全、不整脈、高血圧症、肺高血圧症、喘息、脳血管痙攣、くも膜下出血、子癇前症、腎臓病、アテローム性動脈硬化症、バージャー病、高安動脈炎、糖尿病合併症、肺癌、前立腺癌、胃腸疾患、内毒素性ショック及び敗血症に関連する疾患の治療及び予防のため、並びに創傷の治癒のため及び月経、緑内障、細胞増殖抑制性、眼科学及び脳保護性適応症に関連する疾病の制御及び臓器保護のための、請求項１〜２４のいずれか１項記載の化合物の使用。
【請求項２８】
特に亜鉛ヒドロラーゼ活性に関連する疾患、例えば、心筋虚血症、うっ血性心不全、不整脈、高血圧症、肺高血圧症、喘息、脳血管痙攣、くも膜下出血、子癇前症、腎臓病、アテローム性動脈硬化症、バージャー病、高安動脈炎、糖尿病合併症、肺癌、前立腺癌、胃腸疾患、内毒素性ショック及び敗血症との関連において、並びに創傷の治癒のため及び月経、緑内障、細胞増殖抑制性、眼科学及び脳保護性適応症に関連する疾病の制御及び臓器保護のために治療活性物質として使用される、請求項１〜２４のいずれか１項記載の化合物。
【請求項２９】
心筋虚血症、うっ血性心不全、不整脈、高血圧症、肺高血圧症、喘息、脳血管痙攣、くも膜下出血、子癇前症、腎臓病、アテローム性動脈硬化症、バージャー病、高安動脈炎、糖尿病合併症、肺癌、前立腺癌、胃腸疾患、内毒素性ショック及び敗血症の治療及び／又は予防処置のため、並びに創傷の治癒のため及び月経、緑内障、細胞増殖抑制性、眼科学及び脳保護性適応症に関連する疾病の制御及び臓器保護のための方法であって、請求項１〜２４のいずれか１項記載の化合物をヒト又は動物に投与することを含む方法。
【請求項３０】
請求項１〜２４のいずれか１項記載の化合物の調製方法であって、式（ＩＩＩ）：
【化３】
2004504298.tif 000036
（式中、Ｒ１、Ｒ２及びＸは上記と同義であり、そしてＡはＨＳ保護基である）で示される化合物を、
ａ）ＨＮＲ３ＮＲ４Ｒ５と反応させて、ヒドラジドを導入するか、又は
ｂ）Ｒ５が保護基であるＨＮＲ３ＮＲ４Ｒ５と反応させ、続いて変換するか、若しくはＲ３及びＲ４を導入し、
場合により続いて、Ｒ５及び／若しくはＲ２−Ｘ基を異なるＲ５及び／若しくはＲ２−Ｘ基に変換し、及び／又は脱保護し、及び／又はチオール遊離する（ここで、Ｒ３、Ｒ４及びＲ５は、請求項１〜２１のいずれか１項記載の定義と同義である）ことを含む方法。
【請求項３１】
請求項３０記載の方法により調製される化合物。
【請求項３２】
上記で定義された発明。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、メタロプロテアーゼ、例えば亜鉛プロテアーゼ、特に亜鉛ヒドロラーゼのインヒビターとして有用であり、そして発生が増加している血管収縮と関連する疾病状態の予防及び治療に効果的である化合物を目的とする。そのような疾患の例は、高血圧、冠動脈疾患、心不全、腎及び心筋虚血症、腎不全、透析、脳虚血、心筋梗塞、偏頭痛、くも膜下出血、レイノー症候群及び肺高圧である。加えて、化合物は、移植片拒絶阻害のための、臓器保護のための、そして眼科疾病を処置するための細胞増殖抑制及び脳保護剤として有用である。
【０００２】
エンドセリンは、それぞれ特定の遺伝子でコード化されている３種のアイソフォームＥＴ−１、ＥＴ−２及びＥＴ−３として存在するペプチドである。これらは、ヤナギサワによりブタ内皮細胞の条件培地で１９８８年に最初に発見された（Ｙａｎａｇｉｓａｗａ Ｍ； Ｋｕｒｉｈａｒａ Ｈ； Ｋｉｍｕｒａ Ｓ； Ｔｏｍｏｂｅ Ｙ； Ｋｏｂａｙａｓｈｉ Ｍ； Ｍｉｔｓｕｉ Ｙ； Ｙａｚａｋｉ Ｙ； Ｇｏｔｏ Ｋ； Ｍａｓａｋｉ Ｔ：　Ａ ｎｏｖｅｌ ｐｏｔｅｎｔ ｖａｓｏｃｏｎｓｔｒｉｃｔｏｒ ｐｅｐｔｉｄｅ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｂｙ ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ ［ｓｅｅ ｃｏｍｍｅｎｔｓ］．　ＮＡＴＵＲＥ （１９８８ Ｍａｒ ３１）， ３３２（６１６３）， ４１１−５）。活性ＥＴは、分子内ジスルフィド架橋を２個有する２１個のアミノ酸のペプチドである。これらは、フリン様エンドペプチダーゼにより生物学的に不活性な大型エンドセリン（大型ＥＴ）に加工される、２０３〜２１２個のアミノ酸のプレプロタンパク質から産生される。大型ＥＴは、特に、それぞれＴｒｐ２１−Ｖａｌ２２（大型ＥＴ−１、大型ＥＴ−２）及び大型ＥＴ−３においてＴｒｐ２１−Ｉｌｅ２２である、アミノ酸２１と２２の間を加水分解的に切断することにより成熟ＥＴに加工される。既に１９８８年には、特定のメタロプロテアーゼがこの特異的切断の原因であると仮定されていた。１９９４年にＥＣＥ−１（エンドセリン変換酵素−１）がウシ副腎から精製され、クローンされた（Ｘｕ Ｄ， Ｅｍｏｔｏ Ｎ， Ｇｉａｉｄ Ａ， Ｓｌａｕｇｈｔｅｒ Ｃ， Ｋａｗ Ｓ， ｄｅ Ｗｉｔｔ Ｄ， Ｙａｎａｇｉｓａｗａ Ｍ： ＥＣＥ−１： ａ ｍｅｍｂｒａｎｅ−ｂｏｕｎｄ ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅａｓｅ ｔｈａｔ ｃａｔａｌｙｚｅｓ ｔｈｅ ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｂｉｇ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｎ−１． Ｃｅｌｌ （１９９４） ７８： ４７３ − ４８５．）。
【０００３】
ＥＣＥ−１は、至適な中性ｐＨ及び亜鉛結合モチーフＨＥｘｘＨｘ（＞２０）Ｅを有する膜結合ＩＩ型亜鉛エンドペプチダーゼである。それはサブファミリーＭ１３に属し、活性部位を含む大規模な６８１個のアミノ酸外部ドメインを有する。Ｍ１３ファミリーの他のメンバーは、ＮＥＰ２４．１１（中性エンドペプチダーゼ）、リン酸制御性の中性エンドペプチダーゼであるＰＥＸ、及び大型ＥＴ−３プロセシング酵素として最近記載されているＫｅｌｌ血液型タンパク質である。ヒト由来のＭ１３ファミリーのメンバーは、高分子量（＞８０ｋＤａ）、多数の保存ジスルフィド架橋及び複雑なグリコシル化パターンにより特徴付けられる。ＮＥＰの構造が最近になって解明された（Ｏｅｆｎｅｒ ｅｔ ａｌ， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２０００， ２９６， ３４１−３４９）。ＥＣＥ及び関連するヒトＭ１３プロテナーセの触媒ドメインは、マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）のメンバーよりも著しく大きい（＞６５０個のアミノ酸）。メチンシン（ｍｅｔｚｉｎｃｉｎ）に属し、典型的なＨＥｘｘＨｘｘＧｘｘＨパターンを示すＭＭＰのファミリーと異なり、Ｍ１３ファミリーのメンバーは、ＨＥｘｘＨｘ（＞２０）Ｅパターンを含むグルチンシン（ｇｌｕｚｉｎｃｉｎ）である。この２個のファミリーは、触媒ドメインの大きさ、構造及びリガンドの亜鉛配位パターンにおいて明確に異なる。２個のファミリーの活性部位は明確な違いを示し、それはインヒビターの種類及び潜在的な選択性に対して明確な影響を与える。
【０００４】
したがって、本発明の１つの態様は、ＥＣＥ−１の選択的阻害に有用な化合物、特に式（Ｉ）：
【０００５】
【化４】
2004504298.tif 000002
【０００６】
〔式中、
Ｒ１は、水素、アルキルカルボニル又はアリールカルボニルであり；
Ｒ２は、アルキル、アルキルシクロアルキル、アルキルシクロアルキルアルキル、シクロアルキル、ハロゲンアルキル、カルボキシアルキル、アミノアルキル、ジアルキルアミノアルキル、アルコキシアルキル、アルコキシカルボニルアルキル、アルキニル、アリール、アリールアルキル、アリールアルキル（アルコキシカルボニル）アルキル、アリールカルボニルアルキル、アリールオキシアルキル、アリールアルケニル、アリール（アルコキシカルボニル）アルキル、ヘテロアリール、ヘテロアリールアルキル、ヘテロシクリル又はヘテロシクリルアルキルであり；
Ｒ３は、水素、アリール、アルキル又はアリールアルキル、アリールスルホニル、ヘテロアリールスルホニルであり；
Ｒ４は、水素、アリールアルキル、アルキル、アリール、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、アルキルスルホニル、アリールスルホニル、アリールアルキルスルホニル、ヘテロアリールスルホニル、カルボキシアルキル、カルボキシアルキルスルホニル若しくはアルコキシカルボニルアルキルであるか；又は基−ＮＲ３Ｒ４若しくはＲ５−〔Ｎ−Ｎ（Ｒ４）〕−Ｒ３は、飽和若しくは不飽和の５員若しくは６員脂肪族環を形成し；
Ｒ５は、水素、アルキルスルホニル、アリールスルホニル、ヘテロアリールスルホニル、アルコキシカルボニル、アリールオキシカルボニル、ヘテロアリールオキシカルボニル、アルキルカルボニル、アリールカルボニル、ヘテロアリールカルボニル、ヘテロアリールアルキルカルボニル、ヘテロシクリル、（モノ−若しくはジアルキルアミノ）アルキルカルボニル、（モノ−及びジアルキル）アミノスルホニル、アリールアミノカルボニル、アルキル、アルキルカルボニル、アルコキシカルボニル、アリール、アリールアルキル、アリールアルコキシカルボニル又はヘテロアリールであり；
Ｒ６は、水素、アルキル、アリール又はカルボキシアルキルであり；
Ｘは、−Ｓ（Ｏ）２−、−Ｓ（Ｏ）２−ＮＨ−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ６−又は−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−である〕で示される化合物、並びに薬学的に許容されうるそのエステル及び／又は薬学的に許容されうるその塩を提供することである。
【０００７】
本明細書中で単独又は組み合わされて使用される用語「アルキル」は、炭素原子を最大７個、好ましくは最大４個含む直鎖状又は分岐鎖状アルキル基を意味し、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、２−メチルプロピル（イソブチル）、１−メチルエチル（イソプロピル）、ｎ−ブチル及び１，１−ジメチルエチル（ｔ−ブチル）である。
【０００８】
用語「カルボキシ」は、基−Ｃ（Ｏ）ＯＨを言及する。
【０００９】
用語「カルバモイル」は、基−Ｃ（Ｏ）ＮＨ２を言及する。
【００１０】
用語「カルボニル」は、基−Ｃ（Ｏ）−を言及する。
【００１１】
用語「ハロゲン〕は、フルオロ、ブロモ、クロロ及びヨードの群、好ましくはフルオロ及び／又はクロロ、最も好ましくはフルオロを言及する。
【００１２】
用語「スルホニル」は、基−Ｓ（Ｏ２）−を言及する。
【００１３】
用語「アルケニル」は、オレフィン性二重結合を少なくとも１個有する、アルキルの定義と同様の炭化水素鎖を言及する（例えば、ビニル、アリル及びブテニルを含む）。
【００１４】
用語「アルキニル」は、オレフィン性三重結合を少なくとも１個有する、アルキルの定義と同様の炭化水素鎖を言及する（例えば、プロピニル、ブチン−（１）−イル等含む）。
【００１５】
用語「アルコキシ」は、単独又は組み合わされて、アルキルエーテル基を意味し（ここで用語「アルキル」は前記で示した意味を有する）、例えば、メトキシ、エトキシ、ｎ−プロポキシ、イソプロポキシ、ｎ−ブトキシ、イソブトキシ、ｓｅｃ−ブトキシ、ｔｅｒｔ−ブトキシ等である。
【００１６】
用語「アルコキシカルボニル」は、式：−Ｃ（Ｏ）Ｒｃ（式中、Ｒｃは上記と同義のアルコキシである）の基を言及する。
【００１７】
用語「ヒドロキシ」は、基−ＯＨを言及し、用語「シアノ」は基−ＣＮを言及する。
【００１８】
用語「ヒドロキシアルキル」は、ヒドロキシ基で置換されている、前記で定義されたアルキル基を意味する。
【００１９】
用語「チオアルキル」は、−ＳＨ基で置換されている、上記で定義されたアルキル基を意味する。
【００２０】
用語「ハロゲンアルキル」は、ハロゲン原子１〜３個、好ましくはフルオロで置換されている、前記で定義されたアルキル基を言及し、例えばトリフルオロメチル、２，２，２−トリフルオロエチル等である。
【００２１】
「カルボキシアルキル」は、ＨＯＯＣ−基で置換されている、上記で定義された低級アルキルを意味する。
【００２２】
用語「アルキルカルボニル」は、単独又は組み合わされて、アルカンカルボン酸、すなわちアルキル−Ｃ（Ｏ）−から誘導されるアシル基を意味し、例えば、アセチル、プロピオニル、ブチリル、バレリル、４−メチルバレリル等である。
【００２３】
用語「シクロアルキル」は、単独又は組み合わされて、炭素原子３〜８個、好ましくは３〜６個を有する飽和環式炭化水素基、すなわち、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル及びシクロヘキシル等を意味する。
【００２４】
用語「アミノ」は、基−ＮＨ２を言及する。
【００２５】
Ｒ２における用語「アリール」は、単独又は組み合わされて、芳香族炭素環式基、すなわち６〜１０員の芳香族又は部分芳香族環を言及し、例えば、フェニル、ナフチル又はテトラヒドロナフチル、好ましくはフェニル又はナフチル、最も好ましくはフェニルである。アリール部分は、場合によりハロゲン、好ましくはフルオロ、アルコキシカルボニル、例えばメチルカルボニル、カルボキシ、シアノ、アルキル、アルコキシ、フェニル、フェノキシ、トリフルオロメチル、トリフルオロメトキシ、より好ましくはフルオロ、アルオキシルカルボニル、アルキル、トリフルオロメチル及びトリフルオロメトキシ、最も好ましくはフルオロから独立して選択される基の１個以上、好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜３個で置換されている。最も好ましい芳香族基は、ナフチル又はフルオロ原子の１個以上で置換されているフェニルであり、例えば、ナフチル、２，３，４，５，６−ペンタフルオロフェニル又はビフェニルである。
【００２６】
Ｒ３及びＲ６における用語「アリール」は、単独又は組み合わされて、芳香族炭素環式基、すなわち６〜１０員の芳香族又は部分芳香族環を言及し、例えば、フェニル、ナフチル又はテトラヒドロナフチル、好ましくはフェニル又はナフチル、最も好ましくはフェニルである。アリール部分は、場合によりハロゲン、好ましくはフルオロ、アルコキシカルボニル、例えばメチルカルボニル、カルボキシ、シアノ、アルキル、アルコキシ、フェニル、フェノキシ、トリフルオロメチル、トリフルオロメトキシ、ヒドロキシ、アルキルアミド、例えばアセトアミド、ニトロ、アルキルスルホニル、例えばメチルスルホニル、より好ましくはアルキル又はアルコキシから独立して選択される基の１個以上、好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜３個で置換されている。
【００２７】
Ｒ４における用語「アリール」は、単独又は組み合わされて、芳香族炭素環式基、すなわち６〜１０員の芳香族又は部分芳香族環を言及し、例えば、フェニル、ナフチル又はテトラヒドロナフチル、好ましくはフェニル又はナフチル、最も好ましくはフェニルである。アリール部分は、場合によりハロゲン、好ましくはフルオロ、アルコキシカルボニル、例えばメチルカルボニル、カルボキシ、シアノ、アルキル、アルコキシ、フェニル、フェノキシ、トリフルオロメチル、トリフルオロメトキシ、シクロヘキシル、ヒドロキシ、アルキルアミド、例えばアセトアミド、ニトロ、アルキルスルホニル、例えばメチルスルホニル、より好ましくはフルオロ、クロロ、ブロモ、アルコキシ、カルボキシ、アルコキシカルボニル、最も好ましくはフルオロから独立して選択される基の１個以上、好ましくは１〜３個で置換されている。芳香族基の例は、フェニル、２，４，５−トリフルオロフェニル及び２，４−ジフルオロフェニルである。
【００２８】
Ｒ５における用語「アリール」は、単独又は組み合わされて、芳香族炭素環式基、すなわち６〜１０員の芳香族又は部分芳香族環を言及し、例えば、フェニル、ナフチル又はテトラヒドロナフチル、好ましくはフェニル又はナフチル、最も好ましくはフェニルである。アリール部分は、場合によりハロゲン、好ましくはフルオロ、アルコキシカルボニル、例えばメチルカルボニル、カルボキシ、シアノ、アルキル、アルコキシ、フェニル、フェノキシ、トリフルオロメチル、トリフルオロメトキシ、より好ましくはアルキル又はアルコキシ、例えばメチル又はメトキシから独立して選択される基の１個以上、好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜３個で置換されている。これらのアリール基の例は、４−メチルフェニル及び４−メトキシフェニルである。
【００２９】
用語「アリールオキシ」は、オキシ基を介して親構造に結合している、すなわちアリール−Ｏ−である、上記で定義されたアリール基を言及する。
【００３０】
Ｒ４における用語「ヘテロアリール」は、単独又は組み合わされて、例えば、窒素、酸素又は硫黄から独立して選択されるヘテロ原子１〜３個、好ましくは１個を含む、環原子５〜１０個、好ましくは５〜６個を有する芳香族一価の単環式又は二環式基を言及する。ヘテロアリール基の例は、チオフェニル、イソオキサゾリル、チアゾリル、ピリジニル、ピロリル、イミダゾリル、テトラゾリルであり、好ましくはピリジニル、イソオキサゾリル及びチアゾリルである。場合により、ヘテロアリール基は、フェニル、アルキル、アルキルカルボニル、アルコキシカルボニル、ヒドロキシ、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、カルボキシ、アルコキシカルボニルアルキル、好ましくはアルキルで独立してモノ−、ジ−又はトリ置換されうる。
【００３１】
Ｒ３又はＲ５における用語「ヘテロアリール」は、単独又は組み合わされて、例えば、窒素、酸素又は硫黄から独立して選択されるヘテロ原子１〜３個、好ましくは１個を含む、環原子５〜１０個、好ましくは５〜６個を有する芳香族一価の単環式又は二環式基を言及する。ヘテロアリール基の例は、ピリジニル、チオフェニル、イソオキサゾリル、イソキノリル、キノリル、インドリル、ピリミジン、ピリダジン及びピラジンであり、好ましくはチオフェニル、フラニル、ピロリジニル、インドリル及びイソオキサゾリルである。場合により、ヘテロアリール基は、フェニル、アルキル、アルキルカルボニル、アルコキシカルボニル、ヒドロキシ、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、カルボキシ、オキソ、アルコキシカルボニルアルキル、好ましくはアルキルで独立してモノ−、ジ−又はトリ置換されうる。
【００３２】
用語「ヘテロシクリル」は、単独又は組み合わされて、例えば、窒素、酸素又は硫黄から独立して選択されるヘテロ原子１〜３個、好ましくは１個を含む、環原子５〜１０個、好ましくは５〜６個を有する非芳香族一価の単環式又は二環式基を言及する。場合により複素環式環は、ハロゲン、アルキル、アルコキシ、オキソカルボキシ、アルコキシカルボニル等から独立して選択される基で置換され、及び／又は第二級窒素原子（すなわち−ＮＨ−）上でアルキル、アリールアルコキシカルボニル、アルキルカルボニルにより、又は第三級窒素原子（すなわち＝Ｎ−）上でオキシドにより置換されうる。複素環基の例は、モルホリニル、ピロリジニル、ピペリジル等である。
【００３３】
用語「二量体形態」は、式（Ｉ）の同一の化合物２個のＲ１基２個が、共通の単結合に置き換わっているか、あるいはＲ１がグルタチオン−Ｓ−若しくはシステイン−Ｓ−、又はそのエステル及び／又はアルキルカルボニル若しくはアリールカルボニル誘導体である化合物を意味し、例えば、アセチルシステイン−Ｓ−又はベンゾイルシステイン−Ｓ−、好ましくはグルタチオン−Ｓ−、システイン−Ｓ−、アセチルシステイン−Ｓ−又はベンゾイルシステイン−Ｓ−である。
【００３４】
用語「薬学的に許容されうる塩」は、生物学的か、そうでない理由で望ましくないものではない、遊離塩基又は遊離酸の生物学的効果及び特性を保持する塩を言及する。塩は、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸等のような無機酸、及び酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、ピルビン酸、シュウ酸、マレイン酸、マロン酸、コハク酸、フマル酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、ケイ皮酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、サリチル酸等のような有機酸により形成される。加えて、これらの塩を、無機塩基又は有機塩基を遊離酸に加えることにより調製してよい。無機塩基から誘導される塩には、ナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩、アンモニウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩等が含まれるが、これらに限定されない。有機塩基から誘導される塩には、第一級、第二級及び第三級アミン、天然に存在する置換アミンを含む置換アミン、環状アミン及び塩基イオン交換樹脂の塩、例えば、イソプロピルアミン、トリメチルアミン、ジエチルアミン、トリエチルアミン、トリプロピルアミン、エタノールアミン、リシン、アルギニン、Ｎ−エチルピペリジン、ピペリジン、ポリミン樹脂等が含まれるが、これらに限定されない。
【００３５】
「薬学的に許容されうるエステル」は、一般式（Ｉ）の化合物が官能基において誘導体化され、インビボで親化合物に再変換されうる誘導体を提供できることを意味する。そのような化合物の例には、生理的に許容され、代謝的に変化しやすいエステル誘導体が含まれ、例えば、メトキシメチルエステル、メチルチオメチルエステル及びピバロイルオキシメチルエステルである。加えて、代謝的に変化しやすいエステルと同様であり、インビボで一般式（Ｉ）で示される親化合物を産生できる、一般式（Ｉ）の化合物の生理学的に許容されうるあらゆる等価物が、本発明の範囲内である。
【００３６】
式（Ｉ）の化合物は、哺乳類メタロプロテアーゼ活性、特に亜鉛ヒドロラーゼ活性の阻害に有用である。更に詳細には、式（Ｉ）の化合物は、エンドセリン変換酵素（ＥＣＥ）活性により引き起こされる疾病と関連する疾患を治療及び予防するための医薬として有用である。この酵素を阻害することは、心筋虚血症、うっ血性心不全、不整脈、高血圧症、肺高血圧症、喘息、脳血管痙攣、くも膜下出血、子癇前症、腎臓病、アテローム性動脈硬化症、バージャー病、高安動脈炎、糖尿病合併症、肺癌、前立腺癌、胃腸疾患、内毒素性ショック及び敗血症の処置、並びに創傷の治癒及び月経、緑内障の制御のために有用であり得る。加えて、該化合物は、移植片拒絶の阻害のための、臓器保護のための、そして眼科疾病の処置のための細胞増殖抑制及び脳保護剤として有用である。
【００３７】
より詳細には、本発明は式（Ｉ）：
【００３８】
【化５】
2004504298.tif 000003
【００３９】
〔式中、
Ｒ１は、水素、アルキルカルボニル又はアリールカルボニルであり；
Ｒ２は、アルキル、アルキルシクロアルキル、アルキルシクロアルキルアルキル、シクロアルキル、ハロゲンアルキル、カルボキシアルキル、アミノアルキル、ジアルキルアミノアルキル、アルコキシアルキル、アルコキシカルボニルアルキル、アルキニル、アリール、アリールアルキル、アリールアルキル（アルコキシカルボニル）アルキル、アリールカルボニルアルキル、アリールオキシアルキル、アリールアルケニル、アリール（アルコキシカルボニル）アルキル、ヘテロアリール、ヘテロアリールアルキル、ヘテロシクリル又はヘテロシクリルアルキルであり；
Ｒ３は、水素、アリール、アルキル又はアリールアルキル、アリールスルホニル、ヘテロアリールスルホニルであり；
Ｒ４は、水素、アリールアルキル、アルキル、アリール、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、アルキルスルホニル、アリールスルホニル、アリールアルキルスルホニル、ヘテロアリールスルホニル、カルボキシアルキル、カルボキシアルキルスルホニル若しくはアルコキシカルボニルアルキルであるか；又は基−ＮＲ３Ｒ４若しくはＲ５−〔Ｎ−Ｎ（Ｒ４）〕−Ｒ３は、飽和若しくは不飽和の５員若しくは６員脂肪族環を形成し；
Ｒ５は、水素、アルキルスルホニル、アリールスルホニル、ヘテロアリールスルホニル、アルコキシカルボニル、アリールオキシカルボニル、ヘテロアリールオキシカルボニル、アルキルカルボニル、アリールカルボニル、ヘテロアリールカルボニル、ヘテロアリールアルキルカルボニル、ヘテロシクリル、（モノ−若しくはジアルキルアミノ）アルキルカルボニル、（モノ−及びジアルキル）アミノスルホニル、アリールアミノカルボニル、アルキル、アルキルカルボニル、アルコキシカルボニル、アリール、アリールアルキル、アリールアルコキシカルボニル又はヘテロアリールであり；
Ｒ６は、水素、アルキル、アリール又はカルボキシアルキルであり；
Ｘは、−Ｓ（Ｏ）２−、−Ｓ（Ｏ）２−ＮＨ−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ６−又は−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−である〕で示される化合物、並びにその二量体形態、及び／又は薬学的に許容されうるそのエステル、及び／又は薬学的に許容されうるその塩、好ましくは薬学的に許容されうるそのエステル、及び／又は薬学的に許容されうるその塩、そして最も好ましくは薬学的に許容されうるその塩に関する。
【００４０】
好ましい実施態様において、本発明は、Ｒ１が水素である化合物を言及する。
【００４１】
本発明の更に好ましい実施態様において、Ｒ２は、アルキル、ハロゲンアルキル、アルキルアミノ、アルコキシ、シクロアルキル、シクロアルキルアミノ、アリール、アリールアルキル、アリールオキシ、アリールアルキルアミノ、アリールアルコキシ、ヘテロアリール、アミノ又は（モノ−及びジアルキル）アミノであり、より好ましくはアルキル、ハロゲンアルキル、アルキルアミノ、アルコキシ、シクロアルキル、シクロアルキルアミノ、アリール、アリールアルキル又はヘテロアリールであり、そして更により好ましくはアリール又はヘテロアリールであり、最も好ましくはアリールである。Ｒ２の定義における用語アリールは、特にナフチル又はフェニル（ここで、フェニルは、場合によりフルオロの１個以上又はフェニル基の１個で置換されている）を意味し、例えば、Ｒ２は、ナフチル、２，３，４，５，６−ペンタフルオロフェニル又はビフェニルである
【００４２】
本発明によると、Ｒ３は、好ましくは水素又はアルキルであり、最も好ましくは水素である。
【００４３】
上記の化合物において、Ｒ４は、好ましくは水素、アリールアルキル、アルキル、アリールスルホニル、ヘテロアリールスルホニル、シクロアルキルアルキル又はカルボキシアルキルであり、より好ましくは水素、アルキル、アリールアルキル、シクロアルキル、アリールスルホニル又はカルボキシアルキルであり、最も好ましくは水素、アルキル、シクロアルキル、カルボキシアルキル又はアリールアルキルであり、更により好ましくは水素、アルキル又はアリールアルキルであり、例えば、水素、２，４，５−トリフルオロベンジル、２，４−ジフルオロベンジル、ベンジル、メチル、エチル、イソプロピル、イソブチル、ベンジル若しくはＨＯ２Ｃ−ＣＨ２−又はシクロアルキルプロピルメチルである。
【００４４】
本発明の好ましい実施態様において、Ｒ５は、水素、アルキルカルボニル、アルコキシカルボニル、アルキルスルホニル、アリール、アリールアルキル、アリールカルボニル、（モノ−及びジアルキルアミノ）アルキルカルボニル、（モノ−及びジアルキル）アミノスルホニル、アリールアルコキシカルボニル、アリールアミノカルボニル、アリールスルホニル、ヘテロアリールカルボニル、ヘテロアリールアルキルカルボニル、ヘテロアリールスルホニル、アリールアミノカルボニル、ヘテロアリール又はヘテロシクリルであり、より好ましくはアリール、アリールアルキル、アリールカルボニル、アリールアルコキシ、アリールアミノカルボニル、アリールスルホニル、ヘテロアリールカルボニル、ヘテロアリールアルキルカルボニル、ヘテロアリールスルホニル、アリールアミノカルボニル、ヘテロアリール又はヘテロシクリルであり、より好ましくはアリールスルホニル、アリールアルキル、ヘテロアリールアルキルカルボニル、ヘテロアリールスルホニルであり、最も好ましくは４−メチルベンゼンスルホニル、ベンジル、４−メトキシベンゼンスルホニル、（１Ｈ−インドール−３−イル）アセチル、チオフェン−２−イル又は３，５−ジメチルイソオキサゾール−４−スルホニルである。
【００４５】
上記記載の化合物において、Ｘは、好ましくは−ＳＯ２−又はＣ（Ｏ）−であり、最も好ましくは−ＳＯ２−である。
【００４６】
本発明の最も好ましい実施態様において、化合物は、式（ＩＩ）：
【００４７】
【化６】
2004504298.tif 000004
【００４８】
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５及びＸは上記記載と同義である）、並びに薬学的に許容されうるそのエステル及び／又は塩により記載され得る。
【００４９】
本発明の更に好ましい実施態様において、Ｒ１は水素であり、Ｒ２はナフチル又はフェニル（ここでフェニルは、場合によりフルオロの１個以上又はフェニル基の１個で置換されている）であり、Ｒ３は水素又はアルキルであり、Ｒ４は水素、アルキル又はアリールアルキルであり、Ｒ５はアリールスルホニル、アリールアルキル、ヘテロアリールアルキルカルボニル又はヘテロアリールスルホニルであり、そしてＸは−ＳＯ２−である。
【００５０】
本発明の好ましい実施態様は、実施例に例示される化合物である。特に本発明は、
ａ）（２Ｓ，４Ｒ）−４−メルカプト−１−（ナフタレン−２−スルホニル）ピロリジン−２−カルボン酸Ｎ′−イソブチル−Ｎ′−（４−メチルベンゼンスルホニル）ヒドラジド；
ｂ）（２Ｓ，４Ｒ）−４−メルカプト−１−（ナフタレン−２−スルホニル）ピロリジン−２−カルボン酸Ｎ′−（４−メチルベンゼンスルホニル）ヒドラジド；
ｃ）（２Ｓ，４Ｒ）−４−メルカプト−１−（ナフタレン−２−スルホニル）ピロリジン−２−カルボン酸Ｎ′−ベンジルヒドラジド；
ｄ）（２Ｓ，４Ｒ）−４−メルカプト−１−（ナフタレン−２−スルホニル）ピロリジン−２−カルボン酸Ｎ′−ベンジル−Ｎ′−（４−メチルフェニルスルホニル）ヒドラジド；
ｅ）（２Ｓ，４Ｒ）−４−メルカプト−１−（ナフタレン−２−スルホニル）ピロリジン−２−カルボン酸Ｎ′−メチル−Ｎ′−（４−メチルベンゼンスルホニル）ヒドラジド；
ｆ）（２Ｓ，４Ｒ）−４−メルカプト−１−（ナフタレン−２−スルホニル）ピロリジン−２−カルボン酸Ｎ′−ベンゼンスルホニルヒドラジド；
ｇ）（２Ｓ，４Ｒ）−４−メルカプト−１−（ナフタレン−２−スルホニル）ピロリジン−２−カルボン酸Ｎ′−（４−メトキシベンゼンスルホニル）ヒドラジド；
ｈ）（２Ｓ，４Ｒ）−４−メルカプト−１−（ナフタレン−２−スルホニル）ピロリジン−２−カルボン酸Ｎ′−〔（１Ｈ−インドール−３−イル）アセチル〕ヒドラジド；
ｉ）（２Ｓ，４Ｒ）−４−メルカプト−１−（ナフタレン−２−スルホニル）ピロリジン−２−カルボン酸Ｎ′−チオフェン−２−スルホニルヒドラジド；
ｊ）（２Ｓ，４Ｒ）−４−メルカプト−１−（ナフタレン−２−スルホニル）ピロリジン−２−カルボン酸Ｎ′−（３，５−ジメチルイソオキサゾール−４−スルホニル）ヒドラジド；
ｋ）（２Ｓ，４Ｒ）−４−メルカプト−１−（ナフタレン−２−スルホニル）ピロリジン−２−カルボン酸Ｎ′−シクロプロピルメチル−Ｎ′−（４−メチルベンゼンスルホニル）ヒドラジド；
ｌ）（２Ｓ，４Ｒ）−４−メルカプト−１−（ナフタレン−２−スルホニル）ピロリジン−２−カルボン酸Ｎ′−（４−メチルベンゼンスルホニル）−Ｎ′−（２，４，５−トリフルオロベンジル）ヒドラジド；
ｍ）（２Ｓ，４Ｒ）−４−メルカプト−１−（ナフタレン−２−スルホニル）ピロリジン−２−カルボン酸Ｎ′−（２，５−ジフルオロベンジル）−Ｎ′−（４−メチルベンゼンスルホニル）ヒドラジド；
ｎ）（２Ｓ，４Ｒ）−４−メルカプト−１−（ナフタレン−２−スルホニル）ピロリジン−２−カルボン酸Ｎ′−イソプロピル−Ｎ′−（４−メチルベンゼンスルホニル）ヒドラジド；
ｏ）（２Ｓ，４Ｒ）−〔Ｎ′−〔４−メルカプト−１−（ナフタレン−２−スルホニル）ピロリジン−２−カルボニル〕−Ｎ−（４−メチル−ベンゼンスルホニル）ヒドラジノ〕酢酸；
ｐ）（２Ｓ，４Ｒ）−１−（ビフェニル−４−スルホニル）−４−メルカプトピロリジン−２−カルボン酸Ｎ′−メチル−Ｎ′−（４−メチルベンゼンスルホニル）ヒドラジド；
ｑ）（２Ｓ，４Ｒ）−４−メルカプト−１−（２，３，４，５，６−ペンタフルオロベンゼンスルホニル）ピロリジン−２−カルボン酸Ｎ′−（４−メチルベンゼンスルホニル）ヒドラジド；
ｒ）（２Ｓ，４Ｒ）−４−メルカプト−１−（ナフタレン−２−スルホニル）ピロリジン−２−カルボン酸Ｎ′−ベンジル−Ｎ′−（４−メトキシベンゼンスルホニル）ヒドラジド；
ｓ）（２Ｓ，４Ｒ）−４−メルカプト−１−（ナフタレン−２−スルホニル）ピロリジン−２−カルボン酸Ｎ−メチル−Ｎ′−（４−メチルベンゼンスルホニル）ヒドラジド；及び
ｔ）（２Ｓ，４Ｒ）−４−メルカプト−１−（ナフタレン−２−スルホニル）ピロリジン−２−カルボン酸Ｎ−メチル−Ｎ′−ベンジル−Ｎ′−（４−メチルベンゼンスルホニル）ヒドラジドからなる群より選択される式（Ｉ）又は（ＩＩ）の化合物を含む。
【００５１】
これらの化合物は、ラジオイムノアッセイ（ＥＣＥ阻害上のＥ、下記を参照）において約５０ｎＭ〜１μＭのＩＣ５０値を示す。
【００５２】
本発明は、また、上記で定義された化合物及び薬学的に許容されうる賦形剤を含有する医薬組成物も言及する。
【００５３】
本発明の更なる実施態様は、エンドセリン変換酵素（ＥＣＥ）活性により引き起こされる疾患、特に心筋虚血症、うっ血性心不全、不整脈、高血圧症、肺高血圧症、喘息、脳血管痙攣、くも膜下出血、子癇前症、腎臓病、アテローム性動脈硬化症、バージャー病、高安動脈炎、糖尿病合併症、肺癌、前立腺癌、胃腸疾患、内毒素性ショック及び敗血症の予防及び治療のため、並びに創傷の治癒のため及び月経、緑内障、細胞増殖抑制性、眼科学及び脳保護性適応症に関連する疾病の制御及び臓器保護のための、上記で定義された化合物を含む薬剤の製造における、活性成分としての上記で定義された化合物の使用を言及する。
【００５４】
更に本発明は、心筋虚血症、うっ血性心不全、不整脈、高血圧症、肺高血圧症、喘息、脳血管痙攣、くも膜下出血、子癇前症、腎臓病、アテローム性動脈硬化症、バージャー病、高安動脈炎、糖尿病合併症、肺癌、前立腺癌、胃腸疾患、内毒素性ショック及び敗血症に関連する疾患の治療及び予防のため、並びに創傷の治癒のため及び月経、緑内障、細胞増殖抑制性、眼科学及び脳保護性適応症に関連する疾病の制御及び臓器保護のための、上記で記載された化合物の使用を言及する。
【００５５】
加えて、本発明は、特に亜鉛ヒドロラーゼ活性に関連する疾患、例えば、心筋虚血症、うっ血性心不全、不整脈、高血圧症、肺高血圧症、喘息、脳血管痙攣、くも膜下出血、子癇前症、腎臓病、アテローム性動脈硬化症、バージャー病、高安動脈炎、糖尿病合併症、肺癌、前立腺癌、胃腸疾患、内毒素性ショック及び敗血症との関連において、並びに創傷の治癒のため及び月経、緑内障、細胞増殖抑制性、眼科学及び脳保護性適応症に関連する疾病の制御及び臓器保護のための、治療活性物質として使用される、上記で定義された化合物を含む。
【００５６】
本発明は、また、心筋虚血症、うっ血性心不全、不整脈、高血圧症、肺高血圧症、喘息、脳血管痙攣、くも膜下出血、子癇前症、腎臓病、アテローム性動脈硬化症、バージャー病、高安動脈炎、糖尿病合併症、肺癌、前立腺癌、胃腸疾患、内毒素性ショック及び敗血症の治療及び／又は予防処置のため、並びに創傷の治癒のため及び月経、緑内障、細胞増殖抑制性、眼科学及び脳保護性適応症に関連する疾病の制御及び臓器保護のための方法であって、上記で定義された化合物をヒト又は動物に投与することを含む方法を含む。
【００５７】
本発明は、また、亜鉛ヒドラーゼ活性を阻害するための上記で定義された化合物の使用に関する。
【００５８】
本発明は、また、上記で定義された化合物の調製方法であって、式（ＩＩＩ）：
【００５９】
【化７】
2004504298.tif 000005
【００６０】
（式中、Ｒ１、Ｒ２及びＸは上記と同義であり、そしてＡはＨＳ保護基である）の化合物を、
ａ）ＨＮＲ３ＮＲ４Ｒ５と反応させて、ヒドラジンを導入するか、又は
ｂ）Ｒ５が保護基であるＨＮＲ３ＮＲ４Ｒ５と反応させ、続いて変換するか、若しくはＲ３及びＲ４を導入し、
場合により続いて、Ｒ５及び／若しくはＲ２−Ｘ基を異なるＲ５及び／若しくはＲ２−Ｘ基に変換し、及び／又は脱保護し、及び／又はチオール遊離する（ここで、Ｒ３、Ｒ４及びＲ５は、上記と同義である）ことを含む方法に関する。
【００６１】
本発明は、また、記載の方法により製造される上記化合物を言及する。
【００６２】
式（Ｉ）の化合物は、当該技術で既知の方法によるか、又は下記の記載の方法により調製することができる。
【００６３】
特記のない限り、置換基Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６及びＸは、上記と同義である。
【００６４】
【化８】
2004504298.tif 000006
【００６５】
スキーム１の工程ａ）は、ヒドロキシ基及びアミノ基の過シリル化、例えば、化合物１をヘキサメチルジシラザン／１４０℃と、続いてＴＨＦ中のＲ２ＳＯ２Ｃｌと反応させるか、又は下記で記載される他の全てのＲ２Ｘに、若しくはジオキサン／Ｈ２Ｏ中のジ−ｔ−ブチルジカルボナート／ＮａＨＣＯ３に変換する（ＢＯＣ保護）ことを記載している。配置を反転する（メシラートを介して）ためには、得られるアルコール２を、トルエン中のＭｅＳＯ３Ｈ／Ｐｈ３Ｐ／ＤＩＡＤ（室温〜８０℃）で、又は（臭化物を介して）ＴＨＦ中のＬｉＢｒ／ＤＥＡＤ／Ｐｈ３Ｐ（４℃〜室温）で、又は（塩化物を介して）ＣＨ２Ｃｌ２中のＰｈ３Ｐ／ＣＣｌ（３℃〜室温）で処理する。配置を保持する（メシラートを介して）場合、アルコール２を、ＭｅＳＯ２Ｃｌ／ピリジン／ＤＭＡＰ（０℃〜室温）と反応させて、式３の化合物に変換できる。
【００６６】
保護チオール部分を導入するには、式３の化合物を、例えば、ＤＭＦ中のトリフェニルメタンチオール又は４−メトキシベンジルメルカプタン及びＫ−Ｏｔ−Ｂｕ（Ｂｒでは０℃〜室温、Ｃｌでは０℃、メシラートでは室温〜１００℃）で処理する。エステル４をＴＨＦ中のＬｉＯＨ水溶液で加水分解して（０℃〜室温）、酸５を得る。
【００６７】
最終化合物の合成をスキーム２に示す。
【００６８】
合成を、酸１ａの予備活性化（ＣＨ２Ｃｌ２中のＮ−ヒドロキシ−２−ピリドン、Ｎ，Ｎ−ジシクロヘキシルカルボジイミド、４−エチルモルホリン、室温）で始め、続いてアルキルヒドラジン（ＮＨＲ３ＮＨＲ４）と反応させる（工程ａ）か、又はカルボン酸ヒドラジド２（Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５＝Ｈ）については、エステル１ｂをＥｔＯＨ中のヒドラジン（ＮＨ２ＮＨ２．Ｈ２Ｏ）により（室温で）直接処理する。遊離チオール３への変換は、次の方法で実施される：ＰＧ（保護基）がＴｒの場合、例えば、ＴＦＡ／Ｅｔ３ＳｉＨを用いて０℃から室温で反応させ、ＰＧがＰＭＢの場合、例えば、ＴＦＡ／Ｅｔ３ＳｉＨを用いて０℃〜８０℃で反応させる（工程ｂ）。
【００６９】
カルボン酸ヒドラジド２（Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５＝Ｈ）の場合、Ｒ４を還元アミン化により導入する。ＥｔＯＨ中のアルデヒドでイミン形成し、続いてＴＨＦ中のＮａＢＨ３ＣＮで還元して、化合物４を得る（工程ｃ）。Ｒ４がアルキル（Ｒ５＝Ｈ）の場合、新たなＲ５を導入するには、ＣｌＣＯＲ５、ＣｌＣＯ２Ｒ５、ＣｌＳＯ２Ｒ５又はＣｌＳＯ２ＮＲ５、ｉＰｒ２ＮＥｔ又はＨｕｅｎｉｇ塩基ＣＨ２Ｃｌ２を用いて、触媒量のＤＭＡＰ若しくはＤＭＡＰ−ポリ又はＲ５ＮＣＯの存在下、ＴＨＦ中、室温で反応させて化合物４を得て、それを脱保護して、上記で定義した最終チオール５を得る（工程ｃ及びｂ）。
【００７０】
化合物２又は４を選択的ＢＯＣ脱保護（０℃でＴＦＡ、ＣＨ２Ｃｌ２）に付し、続いてＣｌＣＯ２Ｒ２、ＮＥＭ又はｉＰｒ２ＮＥｔ、ＣＨ２Ｃｌ２又はＲ２ＮＣＯを用いて、ＴＨＦ中、０℃から室温で反応させて（又は上記のＲ５導入で記載された他の全てのＲ２Ｘに変換して）、化合物７を得る（工程ｅ）。上記で記載されたチオールの脱保護により最終チオール８を得る（工程ｂ）。
【００７１】
【化９】
2004504298.tif 000007
【００７２】
スキーム３はヒドラジド合成の異なる方法を示す。
【００７３】
酸１を予備活性化し（ＣＨ２Ｃｌ２中のＮ−ヒドロキシ−２−ピリドン、Ｎ，Ｎ−ジシクロヘキシルカルボジイミド、４−エチルモルホリン、室温）、続いてアルキルヒドラジンカルボン酸ベンジルエステル（ＮＨＲ３ＮＨＲ４）で反応させて（工程ａ）、ヒドラジド２を得て、それをＡｃＯＨ中のＨＢｒにより０℃で３に変換する（工程ｂ）。予備活性化し、ＮＨＲ３ＮＲ４Ｒ５で反応させて、１から３へ直接変換することも可能である（工程ｃ）。新たなＲ３の導入は、ＤＭＦ中のＲ３ハロゲン化物／ＮａＨを用いて実施される（０℃〜室温；→４、工程ｅ）。チオール５への脱保護は、次の方法で実施される：ＰＧがＴｒｂｙの場合、例えば、ＴＦＡ／Ｅｔ３ＳｉＨを用いて０℃から室温で反応させ、又はＰＧがＰＭＢの場合、例えば、ＴＦＡ／Ｅｔ３ＳｉＨを用いて０℃〜８０℃で反応させる（工程ｄ）。
【００７４】
【化１０】
2004504298.tif 000008
【００７５】
スキーム４はヒドラジド合成の別の方法を示す。
【００７６】
酸１を予備活性化し（ＣＨ２Ｃｌ２中のＮ−ヒドロキシ−２−ピリドン、Ｎ，Ｎ−ジシクロヘキシルカルボジイミド、４−エチルモルホリン、室温）、続いてｔｅｒｔ−ブチル２−アルキルヒドラジンカルボキシラート（ＮＨＲ３ＮＨＢＯＣ）で反応させて（工程ａ）、ヒドラジド２を得て、それをＴＦＡ中のトリエチルシランにより０〜８０℃で処理してチオール３を得る（工程ｂ）。アルキルハロゲン化物（Ｒ５ハロゲン化物）及びＤＭＦにより、塩基としてＮａＨを用いて（０℃〜室温で）アルキル化し、化合物４を得て、それをＥｔ３ＳｉＨ／ＴＦＡで脱保護（スキーム１で記載されたように）した後、チオール５を得る（工程ｃ、ｂ）。
【００７７】
選択的ＢＯＣ脱保護に付し（ＣＨ２Ｃｌ２中ＴＦＡ→６）、続いてＣｌＣＯ２Ｒ４、ＣｌＳＯ２Ｒ４、ｉＰｒ２ＮＥｔ又はＮＥＭを用いて、ＣＨ２Ｃｌ２中、触媒量のＤＭＡＰ又はＤＭＡＰ−ポリの存在下、室温で反応させて、化合物７（Ｒ４＝Ｒ５）及び８を得て、それを分離し、脱保護して（スキーム１で記載されたＥｔ３ＳｉＨ／ＴＦＡ）、チオール５を得る（工程ｅ、ｆ及びｄ）。完全に置換されていないヒドラジド８を、更にアルキル化し（Ｒ５ハロゲン化物及びＤＭＦ／ＮａＨ、０℃〜室温）、脱保護して（スキーム１で記載されたＥｔ３ＳｉＨ／ＴＦＡ）、チオール５を得る（工程ｇ及びｄ）。
【００７８】
【化１１】
2004504298.tif 000009
【００７９】
スキーム５はヒドラジド１の更なる変換を示す。γ−ブロモアルカノイルクロリドを用いて、ｉＰｒ２ＥｔＮの存在下、ＴＨＦ中（０℃〜室温）でアシル化して、化合物２を得て、それを（ＤＭＦ中のＮａＨ、室温で）環化する。２個の異性体を分離し、チオールを脱保護して（スキーム１で記載されたＥｔ３ＳｉＨ／ＴＦＡ）、ヒドラジト３及び４を得る。
【００８０】
【化１２】
2004504298.tif 000010
【００８１】
式５の化合物の調製では、スキーム６の反応経路は以下に従うことができる。ヒドロキシプロリンからの出発材料１の合成は、スキーム１に記載されている。ＴＦＡ／トリイソプロピルにより還流下、３０分間脱保護して、チオール２を得て、それを樹脂に結合させた。最終Ｒ２Ｘを、ＮＲ３ＮＲ４Ｒ５における処理の前又は後のいずれかで導入する（スキーム７）。２番目の場合、出発酸１のＲ２Ｘ（＝ＢＯＣ）を当該技術で既知であり、例えば”Ｔｈｅ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”， Ｍ． Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ ａｎｄ Ａ． Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ， Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ， Ｂｅｒｌｉｎ， １９８４に記載の方法により、非酸易分解性保護基に変換する（例えば、Ｒ２Ｘ＝ＦＭＯＣ、工程ａ：最初にＣＨ２Ｃｌ２中の４０％ＴＦＡにより室温で選択的ＢＯＣ脱保護に付し、続いてジオキサン／水中のＦｍｏｃ−ＯＳｕ及び塩基としてＮａＨＣＯ３を用いて反応させる）。
【００８２】
【化１３】
2004504298.tif 000011
【００８３】
樹脂を次のように調製する（工程ｂ）：リンカー４−（α，α−ジフェニルヒドロキシメチル）安息香酸を、ＤＭＦ中のＴＰＴＵ、ＤＩＥＡを使用して活性化し、ベンズヒドリルアミン３に加える。次に樹脂をＣＨ２Ｃｌ２／ＴＦＡ中のチオール２で処理して、樹脂装填出発材料５を得る。
【００８４】
【化１４】
2004504298.tif 000012
【００８５】
樹脂１上の最終化合物の合成をスキーム７に示す。合成を、酸１の予備活性化（ＤＭＦ中ＴＰＴＵ、Ｈｕｅｎｉｇ塩基、室温）で始め、続いてアルキルヒドラジン（ＮＨ２ＮＨＲ４）で反応させて（工程ａ）、中間体２ａ、２ｂ又は４を得る（Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５＝Ｈ、工程ｃ）。樹脂を脱離して遊離チオール３を得るには、ＣＨ２Ｃｌ２中のＴＦＡ／ｉＰｒ３ＳｉＨを用いて室温で実施する（工程ｂ）。カルボン酸ヒドラジト４の場合、新たなＲ５の導入は、ＤＭＦ中のＣｌＣＯＲ５、ＣｌＣＯ２Ｒ５、ＣｌＳＯ２Ｒ５又はＣｌＳＯ２ＮＲ５と反応させて、化合物２を得て、それを場合によりアルキル化して（ＤＭＦ中アルキルハロゲン化物／ＤＢＵ）、ジ置換ヒドラジド６を得る（工程ｄ及びｆ）。上記で記載したように樹脂を脱離して、最終チオール３を得る。ヒドラジド４をＣｌＳＯ２Ｒ５と反応させる場合、化合物２ａ及び２ｂの二重スルホニル化を実施し（工程ｄ）、樹脂から離脱させた後、これらの化合物を対応するチオール３として分離できる。
【００８６】
Ｒ２ＸがＦＭＯＣの場合は、化合物２の脱保護により（２０％ピペリジン／ＤＭＦ、次にＤＭＦ中のＣｌＣＯ２Ｒ２、ピリジン、ＤＭＦ又はＲ２ＮＣＯと室温で反応させるか、又は上記のＲ４導入で記載された他の全てのＲ２Ｘに変換する）、化合物５を得る（工程ｅ）。上記記載のアルキル化（ＤＭＦ中アルキルハロゲン化物／ＤＢＵ）及び樹脂の脱保護により、最終チオール３を得る（工程ｆ及びｂ）。
【００８７】
式（Ｉ）の化合物のメタロプロテアーゼ活性、特に亜鉛ヒドロラーゼ活性を阻害する能力は、当業者に既知の多様なインビトロ及びインビボアッセイにより示すことができる。
【００８８】
Ａ）細胞培養
安定したヒト臍帯静脈内皮細胞株（ＥＣＶ３０４）を、コンフルエントの状態になるまで、記載されたような「細胞工場」（ｃｅｌｌ ｆａｃｔｏｒｉｅｓ）で培養した（Ｓｃｈｗｅｉｚｅｒ ｅｔ ａｌ． １９９７， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｊ． ３２８： ８７１−８７８）。コンフルエント細胞をトリプシン／ＥＤＴＡ溶液を用いて脱離させ、低速遠心分離により収集した。細胞ペレットをｐＨ７．０のリン酸緩衝食塩水で１回洗浄し、使用するまで−８０℃で保存した。
【００８９】
Ｂ）ＥＣＶ３０４細胞からのＥＣＥの可溶化
特記のない限り、操作は全て０〜４℃で実施した。１×１０９細胞の細胞ペレットを、緩衝液Ａ（５ｍＭ　ＭｇＣｌ２、１００μＭ　ＰＭＳＦ、２０μＭ　Ｅ６４、２０μＭ　ロイペプチンを含有する２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ７．５）５０ｍｌに懸濁し、超音波処理した。得られた細胞ホモジネートを、１００，０００ｇａｖで６０分間遠心分離した。上澄みを廃棄し、得られた膜ペレットを緩衝液Ａ　５０ｍｌ中で均質化し、記載されたように遠心分離した。膜画分の洗浄を緩衝液Ａで２回繰り返した。膜最終調製物を、緩衝液Ｂ（緩衝液Ａ＋０．５％Ｔｗｅｅｎ　２０（ｖ／ｖ）、０．５％ＣＨＡＰＳ（ｗ／ｖ）、０．５％ジギトニン（ｗ／ｖ））５０ｍｌ中で均質化し、４℃で２時間撹拌した。その後、残留膜画分を記載されたように沈殿させた。可溶化ＥＣＥを含有する得られた透明な上澄みを、使用するまで１．０ｍｌアリコート、−１２０℃で保存した。
【００９０】
Ｃ）ＥＣＥアッセイ
このアッセイは、ヒト大型ＥＴ−１からのＥＴ−１の産生を測定した。多数のサンプルを測定するため、９６ウエルプレートで実施するアッセイを考案した。産生されたＥＴ−１の酵素反応及び放射免疫検出を、特別に開発され、最適化されたコーティング技術を使用して、同じウエルで実施した。
【００９１】
Ｄ）ペレットのコーティング
Ｆｌｕｏｒｏｎｕｎｃ Ｍａｘｉｓｏｒｐ Ｗｈｉｔｅ（コード：４３７７９６）９６ウエルプレートを、ＵＶ Ｓｔｒａｔａｌｉｎｋｅｒ ２４００ （Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）により１ジュールで３０分間照射した。次に９６ウエルプレートを、１プレート当たり３００μｌのタンパク質Ａ溶液（０．１Ｍ　Ｎａ２ＣＯ３中２μｇ／ｍｌ、ｐＨ９．５）で充填し、４℃で４８時間インキュベートした。被覆プレートは、使用するまで４℃で最大３週間保存できた。
【００９２】
使用する前に、タンパク質Ａ溶液を廃棄し、プレートを、０．１Ｍ　Ｎａ２ＣＯ３、ｐＨ９．５中の０．５％ＢＳＡを用いて、４℃で２時間ブロックした。
【００９３】
プレートを二重蒸留水（ｂｉｄｅｓｔｉｌｌｅｄ ｗａｔｅｒ）で洗浄し、ＥＣＥアッセイを実施するための準備をした。
【００９４】
Ｅ）スクリーニングアッセイ
試験化合物をＤＭＳＯに溶解し、希釈した。ＤＭＳＯ　１０μｌをウェルに加え、続いて大型ＥＴ−１　２００ｎｇを含有するアッセイ緩衝液（５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ７．０、１μＭ　チオルファン、０．１％ＮａＮ３、０．１％ＢＳＡ）１２５μｌを加えた。酵素反応を、可溶化ＥＣＥ（アッセイ緩衝液中１：３０〜１：６０倍（ｖ／ｖ）に希釈）５０μｌを加えて開始させた。酵素反応を３７℃で３０分間実施した。酵素反応を、１５０ｍＭ　ＥＴＤＡ（ｐＨ７．０）１０μｌを加えて停止させた。
【００９５】
ラジオイムノアッセイ：
ＥＴ−１のラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）を、主に以前に記載されたように実施した（Ｌｏｆｆｌｅｒ， Ｂ．−Ｍ． ａｎｄ Ｍａｉｒｅ， Ｊ．−Ｐ． １９９４， Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｕｍ １： ２７３−２８６）。ＥＤＴＡ停止酵素反応混合物を含有するプレートに、（３−（１２５Ｉ）Ｔｙｒ）エンドセリン−１　２００００ｃｐｍ及びＥＴ特異的抗血清ＡＳ−３（アッセイ緩衝液中１：１０００に希釈）２５μｌを含有するアッセイ緩衝液２５μｌを加えた。プレートを混合しながら４０℃で一晩インキュベートした。その後、液体相をプレート洗浄剤と共に吸引し、プレートを二重蒸留水で１回洗浄した。洗浄したプレートに、シンチレーションカクテル（Ｍｉｃｒｏｓｃｉｎｔ ４０ ＬＳＣ−Ｃｏｃｋｔａｉｌ， Ｐａｃｋａｒｄ， ｃｏｄｅ ６０１３６４１）２００μｌを加え、プレートをＴｏｐｃｏｕｎｔで１プレート当たり２分間カウントした。
【００９６】
合成ＥＴ−１を有し、１ウエル当たり０〜３００ｐｇの最終濃度を有するプレートで標準曲線を作成した。全てのプレートにおいて、最大ＥＣＥ活性（ＤＭＳＯ　１０μｌの存在下）及びＥＴ−１免疫反応性のバックグラウンド産生（１０ｍＭ　ＥＤＴＡ又は１００μＭ　ホスホラミドンの存在下）のコントロールを実施した。アッセイを３重に実施した。
【００９７】
Ｆ）動態アッセイ
記載のアッセイ形態を使用して、アッセイに使用した基質濃度の変化により、使用したＥＣＥ調製物ならびに異なるＥＣＥインヒビターの速度論的特性（すなわちＫｍ、Ｋｉ）を測定することができた。
【００９８】
Ｇ）細胞に基づくＥＣＥアッセイ
ヒトＥＣＥ−１ｃは、記載されたようにＭＤＣＫ細胞で安定して発現した（Ｓｃｈｗｅｉｚｅｒ ｅｔ ａｌ． １９９７． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｊ． ３２８： ８７１−８７８）。細胞を、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、ジェネティシン０．８ｍｇ／ｍｌ、ペニシリン１００ｉ．ｕ．／ｍｌ及びストレプトマイシン１００μｇ／ｍｌを補充したＤｕｌｂｅｃｃｏ改質Ｅａｇｌｅｓ培地（ＤＭＥＭ）で、加湿空気／ＣＯ２（１９：１）雰囲気下、２４ウエルプレートで培養してコンフルエント状態にした。ＥＣＥアッセイの前に、培地を０．１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡを補充した、ＤＭＥＭ−ＨＢＳＳ　１：１（１０ｍＭ　ＨＥＰＥＳを含有、ｐＨ７．０）０．５ｍｌに代えた。インヒビターを最終濃度１％でＤＭＳＯに加えた。酵素反応を０．４２μＭ　ヒト大型ＥＴ−１を加えて開始させ、インキュベーター中、３７℃で１．５時間実施した。インキュベーションの終了時に、インキュベーション培地を素早く除去し、アリコートを、上記で記載された産生ＥＴ−１のラジオイムノアッセイにより分析した。
【００９９】
ＥＣＥスクリーニングアッセイを、ホスホラミドン（ＩＣ５０　０．８±０．２μＭ）及びＣＧＳ３１４４４７（ＩＣ５０　２０±４ｎＭ）の特徴的な阻害定数の測定により検証した［Ｄｅ Ｌｏｍｂａｅｒｔ， Ｓｔｅｐｈａｎｅ； Ｓｔａｍｆｏｒｄ， Ｌｉｓａ Ｂ．； Ｂｌａｎｃｈａｒｄ， Ｌｏｕｉｓ； Ｔａｎ， Ｊｅｎｎｙ； Ｈｏｙｅｒ， Ｄｅｎｔｏｎ； Ｄｉｅｆｅｎｂａｃｈｅｒ， Ｃｌｉｖｅ Ｇ．； Ｗｅｉ， Ｄｏｎｇｃｈｕ； Ｗａｌｌａｃｅ． Ｅｌｉ Ｍ．； Ｍｏｓｋａｌ， Ｍｉｃｈａｅｌ Ａ．； ｅｔ ａｌ．　Ｐｏｔｅｎｔ ｎｏｎ−ｐｅｐｔｉｄｉｃ ｄｕａｌ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｏｆ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｎ−ｃｏｎｖｅｒｔｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅ ａｎｄ ｎｅｕｔｒａｌ ｅｎｄｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ ２４．１１． Ｂｉｏｏｒｇ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． Ｌｅｔｔ． （１９９７）， ７（８）， １０５９−１０６４］。２個のインヒビターを、文献の記載と著しく異なるＩＣ５０値を用いて測定するのではなく、異なるアッセイプロトコールを用いて測定した。細胞に基づくアッセイにおいて、ホスホラミドンは４μＭのＩＣ５０を示した。このアッセイは、例えば、ＥＣＥが正常な原形質膜環境で包埋されているようなより著しい生理学的な条件下において、インヒビターの阻害能力に関する追加的な情報を示した。スクリーニングアッセイがチオルファン１μＭの存在下で実施され、ＮＥＰ２４．１１の作用のため、大型ＥＴ−１分解のあらゆる可能性を阻害することを記載することは重要である。ＥＴ−１産生をチオルファンの存在下、又は不在下で測定すると、予備実験では、ＭＤＣＫ−ＥＣＥ−１ｃトランスフェクション細胞においてＮＥＰ活性は存在しなかった。続く実験では、チオルファンをインキュベーション培地に添加しなかった。
【０１００】
上記の方法によると、本発明の化合物は、ラジオイムノアッセイ（ＥＣＥ阻害上のＥ）において約５０ｎＭ〜約１０００μＭのＩＣ５０値を示す。好ましい化合物は、５０ｎＭ〜１μＭの値を示す。
【０１０１】
前述したように、式（Ｉ）の化合物を含有する医薬も、そのような医薬の調製方法であって、式（Ｉ）の化合物１個以上及び所望であれば他の治療上価値のある物質１個以上を、製剤的形態にすることを含む方法と同様に、本発明の目的である。
【０１０２】
医薬組成物は、例えば錠剤、コーティング錠、糖衣錠、硬若しくは軟ゼラチンカプセル剤、液剤、乳濁剤又は懸濁剤の形態で経口投与してよい。投与は、例えば座剤を使用して直腸的に；例えば軟膏、クリーム剤、ゲル剤又は液剤を使用して局部的又は経皮的に；例えば注射用液剤を使用して非経口的に実施することもできる。
【０１０３】
錠剤、コーティング錠、糖衣錠又は硬ゼラチンカプセル剤の調製のため、本発明の化合物を薬学的に不活性な無機又は有機賦形剤と混合してよい。錠剤、糖衣錠又は硬ゼラチンカプセル剤に適切な賦形剤の例には、乳糖、トウモロコシデンプン若しくはその誘導体、タルク、又はステアリン酸若しくはその塩が含まれる。
【０１０４】
軟ゼラチンカプセル剤に使用される適切な賦形剤には、例えば、植物油、蝋、脂肪、又は半固体若しくは液体ポリオール等が含まれるが、活性成分の性質に応じて、軟ゼラチンカプセル剤に賦形剤が全く必要ない場合もある。
【０１０５】
液剤及びシロップ剤の調製のため、使用してよい賦形剤には、例えば水、ポリオール類、サッカロース、転化糖及びグルコースが含まれる。
【０１０６】
注射用液剤のため、使用してよい賦形剤には、例えば水、アルコール類、ポリオール類、グリセリン及び植物油が含まれる。
【０１０７】
座剤及び局部若しくは経皮適用のため、使用してよい賦形剤には、例えば天然若しくは硬化油、蝋、脂肪及び半固体若しくは液体ポリオールが含まれる。
【０１０８】
医薬組成物は、また、防腐剤、酸化防止剤、可溶化剤、安定剤、湿潤剤、乳化剤、甘味料、着色剤、着臭剤、浸透圧を変える塩、緩衝剤、被膜剤又は酸化防止剤を含んでよい。他の治療上価値のある薬剤を含んでもよい。
【０１０９】
式（Ｉ）の化合物が有効量として投与される用量は、特定の活性成分の性質、患者の年齢と要件及び投与方法によって決まる。一般的に、１日当たり０．１〜１００ｍｇ／ｋｇ体重の投与量が考慮されるが、必要性が示される場合、引用された上限を超えることが可能である。
【０１１０】
下記の特定の実施例は本発明の実施するために助けとなる指針として提供され、本発明の範囲を制限することを意図していない。
【０１１１】
【実施例】
概説
全ての反応はアルゴン下で実施された。
【０１１２】
略語：ＥｔＯＨ：エタノール、ＴＨＦ：テトラヒドロフラン、Ｅｔ２Ｏ：ジエチルエーテル、ＭｅＯＨ：メタノール、ＣＨ２Ｃｌ２、ＥＤＣＩ：Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ′−エチルカルボジイミド塩酸塩、ＨＯＢＴ：１−ヒドロキシベンゾトリアゾール、ＤＢＴ：１，８−ジアザビシクロ〔５．４．０〕ウンデカ−７−エン（１，５−５）、ＬＡＨ：水素化リチウムアルミニウム、ＬＤＡ：リチウムジイソプロピルアミド、ＤＥＡＤ：ジエチルアゾジカルボキシラート、ＤＩＡＤ：ジイソプロピルアゾジカルボキシラート、ＤＭＡＰ：４−ジメチルアミノピリジン、ＤＭＡＰ−ポリ：ポリマー支持化４−（Ｎ−ベンジル−Ｎ−メチルアミノ）ピリジン（ポリスチロールに基づく２％ＤＶＢ、約１．６ｍｍｏｌ ”ＤＭＡＰ”／ｇ樹脂）、ＮＥＭ：Ｎ−エチルモルホリン、ＮＭＭ：Ｎ−メチルモルホリン、ＴＢＡＦ：フッ化テトラブチルアンモニウム、ＤＩＥＡ：ジエチルアミン、ＤＭＦ：ジメチルホルムアミド、ＴＦＡ：トリフルオロ酢酸、ＴＰＴＵ：２−（２−ピリドン−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムテトラフルオロボラート、ｉＰｒ２ＮＥｔ：Ｈｕｅｎｉｇｓ塩基又はＮ−エチルジイソプロピルアミン、ＦＭＯＣ−ＯＳｕ：９−フルオレニルメチルオキシカルボニル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル。
【０１１３】
実施例１：出発材料（エステル−スキーム１）
Ｌ−ヒドロキシプロリンメチルエステル塩酸塩（トルエンに２回懸濁し、減圧下で蒸発させて水を除去した）４０ｇ（２２０ｍｍｏｌ）を、ヘキサメチルジシラザン６００ｍｌに懸濁し、２時間還流した。溶液を減圧下で蒸発させ、ＴＨＦ　１００ｍｌに溶解した。ＴＨＦ　２００ｍｌ中の２−ナフタレンスルホニルクロリド４９．９ｇ（２２０ｍｍｏｌ）をゆっくりと加え、室温で１６時間撹拌した。Ｈ２Ｏ　１５０ｍｌを加え、１時間後、溶媒を蒸発させた。残渣を水／酢酸エチル（３×）に分配し、有機相を１０％ＮａＣｌで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させて、（２Ｓ，４Ｒ）−４−ヒドロキシ−１−（ナフタレン−２−スルホニル）ピロリジン−２−カルボン酸メチルエステル６０．４ｇ（８２％）を得た。ＭＳ： ３３５ （Ｍ＋）
【０１１４】
【化１５】
2004504298.tif 000013
【０１１５】
同様にして、
Ｌ−ヒドロキシプロリンベンジルエステル塩酸塩及び１−ナフタレンスルホニルクロリドから、（２Ｓ，４Ｒ）−４−ヒドロキシ−１−（ナフタレン−２−スルホニル）ピロリジン−２−カルボン酸ベンジルエステルを得た。ＭＳ：４１１ （ＭＨ＋）
Ｌ−ヒドロキシプロリンベンジルエステル塩酸塩及びメタンスルホニルクロリドから、（２Ｓ，４Ｒ）−４−ヒドロキシ−１−メタンスルホニルピロリジン−２−カルボン酸ベンジルエステルを得た。融点：１３２〜１３３℃、ＭＳ： ３００ （ＭＨ＋）
Ｌ−ヒドロキシプロリンエステル塩酸塩及びメタンスルホニルクロリドから、ＣＨ２Ｃｌ２で抽出した後、（２Ｓ，４Ｒ）−４−ヒドロキシ−１−メタンスルホニルピロリジン−２−カルボン酸メチルエステルを得た。融点：１１５．５〜１１７℃、ＭＳ： １６４ （Ｍ−ＣＯＯＭｅ）
【０１１６】
メシラート経由：トルエン１５０ｍｌ中のメタンスルホン酸１３．９ｍｌ（２１５ｍｍｏｌ）、トリエチルアミン２９．８ｍｌ（２１５ｍｍｏｌ）及びトリフェニルホスフィン５８．７ｇ（２２４ｍｍｏｌ）の二相性溶液を、トルエン３００ｍｌ中の（２Ｓ，４Ｒ）−４−ヒドロキシ−１−（ナフタレン−２−スルホニル）ピロリジン−２−カルボン酸メチルエステル６０ｇ（１７９ｍｍｏｌ）の懸濁液に加え、機械的に撹拌した。ジイソプロピルアゾジカルボキシラート４４．９ｍｌ（２３３ｍｍｏｌ）を加えた後（発熱）、溶液を８０℃で２．５時間加熱した。水３００ｍｌを室温で加え、酢酸エチル（３×３００ｍｌ）で抽出した。有機相を１０％ＫＨＳＯ４水溶液（２×１００ｍｌ）、１０％ＮａＣｌ（２×１５０ｍｌ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、蒸発させて、粗生成物１８０ｇを得た。フラッシュクロマトグラフィー（酢酸エチル／ヘキサン１：１）に付して、（４Ｓ，２Ｓ）−４−メタンスルホニルオキシ−１−（ナフタレン−２−スルホニル）ピロリジン−２−カルボン酸メチルエステル６３．７ｇ（８６％）を得た。
【０１１７】
トリフェニルメタンチオール６４．２ｇ（１６７ｍｍｏｌ）を、ＤＭＦ　３００ｍｌ中のカリウムｔｅｒｔ−ブチラート１７．９ｇ（１６０ｍｍｏｌ）の溶液に室温でゆっくりと加え、３０分間機械的に撹拌した。次にＤＭＦ　３００ｍｌ中の（４Ｓ，２Ｓ）−４−メタンスルホニルオキシ−１−（ナフタレン−２−スルホニル）ピロリジン−２−カルボン酸メチルエステル６３ｇ（１５２ｍｍｏｌ）を、端を氷浴で冷却ながら２０℃で加えた。反応を１００℃で１．３時間加熱し、冷却し、蒸発させて４００ｍｌにして、飽和ＮＨ４Ｃｌ水溶液／酢酸エチル（３×３００）２５０ｍｌで抽出した。有機相を１０％ ＮａＣｌ水溶液で洗浄し、乾燥させ（Ｎａ２ＳＯ４）、蒸発させた。フラッシュクロマトグラフィー（ＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ　９９：１）に付して、（２Ｓ，４Ｒ）−１−（ナフタレン−２−スルホニル）−４−トリチルスルファニルピロリジン−２−カルボン酸メチルエステルを５８．６ｇ〔６５％、（２Ｓ，４Ｒ）／（２Ｒ，４Ｒ）−異性体　約４：１、１Ｈ−ＮＭＲ〕及び９．２ｇ〔１０％、（２Ｓ，４Ｒ）／（２Ｒ，４Ｒ）−異性体　約１：１、１Ｈ−ＮＭＲ〕を得た。ＭＳ： ５９４ （ＭＨ＋）
【０１１８】
同様にして、
（２Ｓ，４Ｒ）−４−ヒドロキシ−１−メタンスルホニルピロリジン−２−カルボン酸メチルエステルから、８０℃で３．７５時間後、（４Ｓ，２Ｓ）−４−メタンスルホニルオキシ−１−（メチルスルホニル）ピロリジン−２−カルボン酸メチルエステルを得て、それをトリフェニルメタンチオラートと共に１００℃で４５分間加熱して、（２Ｓ，４Ｒ）−１−メタンスルホニル−４−トリチルスルファニルピロリジン−２−カルボン酸メチルエステル〔（２Ｓ，４Ｒ）／（２Ｒ，４Ｒ）−異性体　約９：１、１Ｈ−ＮＭＲ〕を得た。 ＭＳ： ４８２ （ＭＨ＋）
（２Ｓ，４Ｒ）−４−ヒドロキシ−１−メタンスルホニルピロリジン−２−カルボン酸ベンジルエステルから、８０℃で５時間後、（２Ｓ，４Ｓ）−１−メタンスルホニル−４−メタンスルホニルオキシピロリジン−２−カルボン酸ベンジルエステルを得て、それを４−メトキシベンジルチオール／カリウムｔｅｒｔ−ブチラートと共に３０分間加熱して、（２Ｓ，４Ｓ）−１−メタンスルホニル−４−メタンスルホニルオキシピロリジン−２−カルボン酸ベンジルエステルを得た。融点：９１〜９２℃、ＭＳ： ４５３ （Ｍ＋ＮＨ４＋）
【０１１９】
臭化物経由：ＴＨＦ　６５０ｍｌ中のトリフェニルホスフィン７６．５ｇ（２９１．６ｍｍｏｌ、６当量）の溶液に、ＴＨＦ　７０ｍｌ中のＤＥＡＤ　４４．６ｍｌ（２８６．８ｍｍｏｌ、５．９当量）を１．５〜４．５℃の温度で０．５時間かけて加えた。溶液を０．５時間撹拌し、その後ＬｉＢｒ　４２．２ｇ（４８６．１ｍｍｏｌ、１０当量）を加え、反応混合物を４℃に再冷却し、ＴＨＦ　７５ｍｌ中の（２Ｓ，４Ｒ）−４−ヒドロキシ−１−（ナフタレン−２−スルホニル）ピロリジン−２−カルボン酸ベンジルエステル２０ｇ（４８．６ｍｍｏｌ）を加えた。室温で３時間撹拌した後、水を加え、懸濁液を濃縮し、酢酸エチル及び水７００ｍｌに再溶解した。層を分離し、無機層を酢酸エチル１００ｍｌ（３×）で抽出し、合わせた有機層をブラインで洗浄し、ＭｇＳＯ４上で乾燥させ、蒸発させた。トリフェニルホスフィンオキシドを酢酸エチル／ヘキサンから結晶化させて除去し、母液を、ヘキサン：酢酸エチル３：１を用いて、シリカゲル上のカラムクロマトグラフィーにより精製して、（２Ｓ，４Ｓ）−４−ブロモ−１−（ナフタレン−２−スルホニル）ピロリジン−２−カルボン酸ベンジルエステル１３．４ｇ（６２％）を無色の固体として得た。融点：９７〜９８℃、ＭＳ： ４７３ （ＭＨ＋）
【０１２０】
ＤＭＦ　１５０ｍｌ中のカリウムｔｅｒｔ−ブチラート３．３８ｇ（３０．１ｍｍｏｌ、１．１当量）を、４−メトキシベンジルメルカプタン４．４ｍｌ（３１．５ｍｍｏｌ、１．１５当量）により０℃で処理した。溶液を室温で１時間撹拌し、その後、ＤＭＦ　１００ｍｌ中の（２Ｓ，４Ｓ）−４−ブロモ−１−（ナフタレン−２−スルホニル）ピロリジン−２−カルボン酸ベンジルエステル１２．９９ｇ（２７．４ｍｍｏｌ）を加えた。反応を室温で一晩撹拌し、ＤＭＦを減圧下で除去し、残渣を酢酸エチル及び１Ｍ　ＫＨＳＯ４水溶液に再溶解した。層を分離し、有機層をブラインで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、蒸発させた。粗油状物を、ヘキサン／酢酸エチル（３：１〜２：１）を溶離剤として用いるシリカゲル上のフラッシュクロマトグラフィーにより精製して、（２Ｓ，４Ｒ）−４−（４−メトキシベンジルスルファニル）−１−（ナフタレン−２−スルホニル）ピロリジン−２−カルボン酸ベンジルエステル７．２３ｇ（４８％）を明黄色の固体として得た。融点：９０〜９１℃、ＭＳ： ５４７ （Ｍ＋）
【０１２１】
同様にして、
（２Ｓ，４Ｒ）−４−ヒドロキシピロリジン−１，２−ジカルボン酸１−ｔｅｒｔ−ブチルエステル２−メチルエステル及び４−メトキシベンジルチオール／カリウムｔｅｒｔ−ブチラートを用いて、（２Ｓ，４Ｒ）−４−（４−メトキシベンジルスルファニル）ピロリジン−１，２−ジカルボン酸１−ｔｅｒｔ−ブチルエステル２−メチルエステルを得た。ＭＳ： ３８２ （ＭＨ＋）
（２Ｓ，４Ｒ）−４−ヒドロキシ−１−（ナフタレン−２−スルホニル）ピロリジン−２−カルボン酸メチルエステル及び４−メトキシベンジルチオール／カリウムｔｅｒｔ−ブチラートを用いて、（２Ｓ，４Ｒ）−４−（４−メトキシベンジルスルファニル）−１−（ナフタレン−２−スルホニル）ピロリジン−２−カルボン酸メチルエステルを無色の油状物として得た。ＭＳ： ４７２ （ＭＨ＋）
【０１２２】
塩化物経由：（２Ｓ，４Ｒ）−４−トリチルスルファニルピロリジン−１，２−ジカルボン酸１−ｔｅｒｔ−ブチルエステル２−メチルエステル：本発明の中間体の合成は、当該技術で既知であり、例えば、国際特許公報第ＷＯ　９８２０００１号及びヨーロッパ特許第ＥＰ−Ａ−６９６５９３号に記載されている。
【０１２３】
ＣＨ２Ｃｌ２　１．６Ｌ中の（２Ｓ，４Ｒ）−４−ヒドロキシピロリジン−１，２−ジカルボン酸１−ｔｅｒｔ−ブチルエステル２−メチルエステル３７４ｇ（１．４８ｍｏｌ）の溶液を、トリフェニルホスフィン６８０ｇ（２．６ｍｏｌ）で処理し、３〜５℃に冷却し、ＣＣｌ４　１．２４Ｌ（１２．８ｍｏｌ）で１０分間処理し、この温度で２時間後、冷却を停止し、反応温度を２時間かけて３５℃に上昇させた。２０℃に冷却し、更に４５分間撹拌した。ｎ−ヘプタン４Ｌを加えた後、反応を蒸発させて２．９Ｌにし、０℃に冷却し、濾過し、残渣を同様に２回処理し、３回目に残渣をＣＨ２Ｃｌ２　２Ｌに再び溶解した。溶媒を蒸発させ、ヘキサン／ｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル９：１を溶離剤として用いて、シリカゲルに通して濾過した。溶媒を蒸発させて、（２Ｓ，４Ｓ）−４−クロロピロリジン−１，２−ジカルボン酸１−ｔｅｒｔ−ブチルエステル２−メチルエステル３４７ｇ（８９％）を得た。ＭＳ： ２４６ （ＭＨ＋）
【０１２４】
ＤＭＦ　１．５Ｌ中のカリウムｔｅｒｔ−ブチラート７６ｇ（０．６８ｍｍｏｌ）の溶液を冷却し（−３℃）、ＤＭＦ　０．８Ｌ中のトリフェニルメタンチオール２０２ｇ（０．７３ｍｏｌ）により（最大１℃で）ゆっくりと（１．５時間）処理した。０℃で２．５時間後、ＤＭＦ　０．３５Ｌ中の（２Ｓ，４Ｓ）−４−クロロピロリジン−１，２−ジカルボン酸１−ｔｅｒｔ−ブチルエステル２−メチルエステル１６１ｇ（０．６１ｍｏｌ）の溶液を加えた。反応を２℃で一晩撹拌し、蒸発させ、酢酸エチル１．５Ｌに溶解し、飽和ＮＨ４Ｃｌ水溶液２．７Ｌに注ぎ、酢酸エチル（２×）で抽出した。有機相を飽和ＮａＨＣＯ３水溶液で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、蒸発させた。ヘキサン／酢酸エチル（９５：５〜７：３）を用いるシリカゲル上のＨＰＬＣに付して、（２Ｓ，４Ｒ）−４−トリチルスルファニルピロリジン−１，２−ジカルボン酸１−ｔｅｒｔ−ブチルエステル２−メチルエステル２６８ｇ（８７％）を得た。ＭＳ： ５０４ （ＭＨ＋）
【０１２５】
実施例２：加水分解（スキーム１）
ＴＨＦ　９５０ｍｌ中の（２Ｓ，４Ｒ）−４−（４−メトキシベンジルスルファニル）−１−（ナフタレン−２−スルホニル）ピロリジン−２−カルボン酸メチルエステル１４．８ｇ（３１．６ｍｍｏｌ）の溶液に、０．１Ｍ　ＬｉＯＨ　９５０ｍｌ（９５ｍｍｏｌ）を０℃で加えた。溶液を室温で２時間撹拌し、氷水で希釈し、１Ｍ　ＫＨＳＯ４を加えて酸性化し（ｐＨ２）、酢酸エチルで抽出した。合わせた有機相をブラインで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、蒸発させた。生成物を酢酸エチル／ヘキサンから結晶化させて、（２Ｓ，４Ｒ）−４−（４−メトキシベンジルスルファニル）−１−（ナフタレン−２−スルホニル）ピロリジン−２−カルボン酸１３．１５ｇ（９０％）を無色の固体として得た。ＭＳ： ４５６ （ＭＨ＋）
【０１２６】
同様にして、下記の化合物を調製した：
明褐色の泡状物として、（２Ｓ，４Ｒ）−１−メタンスルホニル−４−トリチルスルファニルピロリジン−２−カルボン酸、ＭＳ： ４６６ （Ｍ−Ｈ−）；
（２Ｓ，４Ｒ）−４−（４−メトキシベンジルスルファニル）ピロリジン−１，２−ジカルボン酸−１−ｔｅｒｔ−ブチルエステル、ＭＳ： ３６６ （Ｍ−Ｈ−）。
【０１２７】
さらなる化合物を下記の参考に従って調製した：
ｔｅｒｔ−ブチル２−（イソブチル）ヒドラジンカルボキシラート（Ｆａｅｓｓｌｅｒ， Ａｌｅｘａｎｄｅｒ； Ｂｏｌｄ， Ｇｕｉｄｏ； Ｃａｐｒａｒｏ， Ｈａｎｓ−Ｇｅｏｒｇ； Ｃｏｚｅｎｓ， Ｒｏｂｅｒｔ； Ｍｅｓｔａｎ， Ｊｕｅｒｇｅｎ； Ｐｏｎｃｉｏｎｉ， Ｂｅｒｎａｒｄ； Ｒｏｅｓｅｌ， Ｊｏｈａｎｎｅｓ； Ｔｉｎｔｅｌｎｏｔ−Ｂｌｏｍｌｅｙ． Ｍａｒｉｎａ； Ｌａｎｇ， Ｍａｒｃ．　Ａｚａ−Ｐｅｐｔｉｄｅ Ａｎａｌｏｇｓ ａｓ Ｐｏｔｅｎｔ Ｈｕｍａｎ Ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ Ｖｉｒｕｓ Ｔｙｐｅ−１ Ｐｒｏｔｅａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｗｉｔｈ Ｏｒａｌ Ｂｉｏａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ． Ｊ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． （１９９６）， ３９（１６）， ３２０３−３２１６）。
ｔｅｒｔ−ブチル２−（メチル）ヒドラジンカルボキシラート（Ｌｅｎｍａｎ， Ｍｏｒａｇ Ｍ．； Ｌｅｗｉｓ， Ａｒｗｅｌ； Ｇａｎｉ， Ｄａｖｉｄ．　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｆｕｓｅｄ １，２，５−ｔｒｉａｚｅｐｉｎｅ−１，５−ｄｉｏｎｅｓ ａｎｄ ｓｏｍｅ Ｎ２− ａｎｄ Ｎ３−ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｄ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ：　ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ ｍｉｍｅｔｉｃｓ ｆｏｒ ｃｉｓ−ｐｅｐｔｉｄｙｌ ｐｒｏｌｉｎａｍｉｄｅｓ． Ｊ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ．， Ｐｅｒｋｉｎ Ｔｒａｎｓ． １ （１９９７）， Ｉｓｓｕｅ １６， ２２９７−２３１１）。
Ｎ−メチルヒドラジンカルボン酸ベンジルエステル（Ｌｅｎｍａｎ， Ｍｏｒａｇ Ｍ．； Ｌｅｗｉｓ， Ａｒｗｅｌ； Ｇａｎｉ， Ｄａｖｉｄ．　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｆｕｓｅｄ １，２，５−ｔｒｉａｚｅｐｉｎｅ−１，５−ｄｉｏｎｅｓ ａｎｄ ｓｏｍｅ Ｎ２− ａｎｄ Ｎ３−ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｄ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ：　ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ ｍｉｍｅｔｉｃｓ ｆｏｒ ｃｉｓ−ｐｅｐｔｉｄｙｌ ｐｒｏｌｉｎａｍｉｄｅｓ． Ｊ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ．， Ｐｅｒｋｉｎ Ｔｒａｎｓ． １ （１９９７）， Ｉｓｓｕｅ １６， ２２９７−２３１１）。
【０１２８】
実施例３：ヒドラジド合成
実施例３ａ：シーケンスＡ（スキーム２）
（工程１）ＣＨ２Ｃｌ２　２００ｍｌ中の（２Ｓ，４Ｒ）−４−（４−メトキシベンジルスルファニル）−１−（ナフタレン−２−スルホニル）ピロリジン−２−カルボン酸４．４ｇ（９．６ｍｍｏｌ）の溶液に、Ｎ−ヒドロキシ−２−ピリドン１．２ｇ（１０．８ｍｍｏｌ、１．１当量）、続いてＣＨ２Ｃｌ２　２５ｍｌ中のＮ，Ｎ−ジシクロヘキシルカルボジイミド２．２ｇ（１０．７ｍｍｏｌ、１．１当量）を０℃で３０分間かけて加えた。懸濁液をこの温度で更に４時間撹拌し、その後、ＮＥＭ　４．２ｍｌ（３３．０ｍｍｏｌ、３．４当量）及びイソブチルヒドラジンスルファート１．９ｇ（１．０５当量）を加えた。反応混合物を室温で一晩撹拌した。懸濁液を水１０ｍｌ中の氷酢酸０．５５ｍｌ（９．６ｍｍｏｌ、１．０当量）で処理し、１．５時間撹拌し、ＮａＨＣＯ３水溶液（５％）で希釈し、ＣＨ２Ｃｌ２で抽出した。合わせた有機相を１Ｍ　ＫＨＳＯ４溶液、水及びブラインで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、蒸発させた。ヘキサンで粉砕して、（２Ｓ，４Ｒ）−４−（４−メトキシベンジルスルファニル）−１−（ナフタレン−２−スルホニル）ピロリジン−２−カルボン酸Ｎ′−イソブチルヒドラジド５．０２ｇ（定量）を得て、それを続く反応に直接付した。
【０１２９】
【化１６】
2004504298.tif 000014
【０１３０】
（工程２）ＴＦＡ　１０ｍｌ中の（２Ｓ，４Ｒ）−４−（４−メトキシベンジルスルファニル）−１−（ナフタレン−２−スルホニル）ピロリジン−２−カルボン酸Ｎ′−イソブチルヒドラジド２２２ｍｇ（０．４２ｍｍｏｌ）を、トリエチルシラン０．６８ｍｌ（４．２ｍｍｏｌ、１０当量）により８０℃で９０分間処理した。溶媒を真空下で蒸発させ、粗生成物をフラッシュクロマトグラフィーにより精製して、（２Ｓ，４Ｒ）−４−メルカプト−１−（ナフタレン−２−スルホニル）ピロリジン−２−カルボン酸Ｎ′−イソブチルヒドラジド１４８ｍｇ（８６％）を明黄色の結晶として得た。 ＭＳ： ４０８ （ＭＨ＋）
【０１３１】
同様にして、下記の化合物を調製した：
（２Ｓ，４Ｒ）−４−（４−メトキシベンジルスルファニル）−１−（ナフタレン−２−スルホニル）ピロリジン−２−カルボン酸及び
ｂ）ベンジルヒドラジンから、続いて脱保護により、（２Ｓ，４Ｒ）−４−メルカプト−１−（ナフタレン−２−スルホニル）ピロリジン−２−カルボン酸Ｎ′−ベンジルヒドラジドを白色の固体として、ＭＳ： ４４２ （ＭＨ＋）；
ｃ）ｐ−トルエンスルホニルヒドラジンから、続いて脱保護により、（２Ｓ，４Ｒ）−４−メルカプト−１−（ナフタレン−２−スルホニル）ピロリジン−２−カルボン酸Ｎ′−（４−メチルベンゼンスルホニル）ヒドラジドを白色の固体として、ＭＳ：５０６ （ＭＨ＋）；
ｄ）メチルヒドラジンから、続いて脱保護により、（２Ｓ，４Ｒ）−４−メルカプト−１−（ナフタレン−２−スルホニル）ピロリジン−２−カルボン酸Ｎ′−メチルヒドラジドを白色の結晶として、ＭＳ： ３６６ （ＭＨ＋）；
（２Ｓ，４Ｒ）−１−メタンスルホニル−４−トリチルスルファニルピロリジン−２−カルボン酸及びｐ−トルエンスルホニルヒドラジンから、続いて脱保護により、（２Ｓ，４Ｒ）−４−メルカプト−１−メタンスルホニルピロリジン−２−カルボン酸Ｎ′−（４−メチルベンゼンスルホニル）ヒドラジドを白色の結晶として、ＭＳ：３９４ （ＭＨ＋）。
【０１３２】
実施例３ｂ：シーケンスＢ（シーケンスＡから工程１、続く工程３、４−スキーム２）
（工程３）ＣＨ２Ｃｌ２　４５０ｍｌ中の（２Ｓ，４Ｒ）−４−（４−メトキシベンジルスルファニル）−１−（ナフタレン−２−スルホニル）ピロリジン−２−カルボン酸Ｎ′−イソブチルヒドラジド４．３ｇ（３．１５ｍｍｏｌ）を、Ｎ−エチルジイソプロピルアミン５．６ｍｌ（３２．６ｍｍｏｌ、４当量）、ｐ−トルエンスルホニルクロリド３．１ｇ（１６．３ｍｍｏｌ、２当量）及びＤＭＡＰ　１００ｍｇ（０．８ｍｍｏｌ、０．１当量）により０℃で処理し、室温で一晩撹拌した。ＭｅＮＨＣＨ２ＣＯ２Ｋ　２．０５ｇ（１６．１ｍｍｏｌ、２当量）を加え、溶液を室温で１時間撹拌し、１Ｍ　ＫＨＳＯ４溶液を加え、相を分離した。有機層を飽和ＮａＨＣＯ３で抽出し、無機層をＣＨ２Ｃｌ２で洗浄した。合わせた有機相をブラインで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、蒸発させた。粗残渣を、ヘキサン：酢酸エチル２：１を溶離剤として用いるフラッシュクロマトグラフィーにより精製して、（２Ｓ，４Ｒ）−４−（４−メトキシベンジルスルファニル）−１−（ナフタレン−２−スルホニル）ピロリジン−２−カルボン酸Ｎ′−イソブチル−Ｎ′−（４−メチルベンゼンスルホニル）ヒドラジド２．６８ｇ（４８％）を得て、それを続く反応に直接付した。
【０１３３】
（工程４）ＴＦＡ　１００ｍｌ中の（２Ｓ，４Ｒ）−４−（４−メトキシベンジルスルファニル）−１−（ナフタレン−２−スルホニル）ピロリジン−２−カルボン酸Ｎ′−イソブチル−Ｎ′−（４−メチルベンゼンスルホニル）ヒドラジド２．６８ｇ（３．９ｍｍｏｌ、１当量）に、トリエチルシラン６．２ｍｌ（３９ｍｍｏｌ、１０当量）を加え、混合物を８０℃で１．５時間加熱し、真空下で濃縮し、トルエンに再溶解し、蒸発させた。ヘキサンで粉砕して粗生成物を得て、それを、ヘキサン：酢酸エチル１：１を用いるフラッシュクロマトグラフィーにより更に精製して、（２Ｓ，４Ｒ）−４−メルカプト−１−（ナフタレン−２−スルホニル）ピロリジン−２−カルボン酸Ｎ′−イソブチル−Ｎ′−（４−メチルベンゼンスルホニル）ヒドラジド１．６５ｇ（７４％）を白色の結晶として得た。ＭＳ： ５６２ （ＭＨ＋）
【０１３４】
同様にして、下記の化合物を調製した（工程１、３、４）：
（２Ｓ，４Ｒ）−４−（４−メトキシベンジルスルファニル）−１−（ナフタレン−２−スルホニル）ピロリジン−２−カルボン酸及び
ｂ）メチルヒドラジンから、続いてｐ−トルエンスルホニルクロリドとの反応及び脱保護により、（２Ｓ，４Ｒ）−４−メルカプト−１−（ナフタレン−２−スルホニル）ピロリジン−２−カルボン酸Ｎ′−メチル−Ｎ′−（４−メチルフェニルスルホニル）ヒドラジドを白色の結晶として、ＭＳ： ５２０ （ＭＨ＋）；
ｃ）イソブチルヒドラジンスルファートから、続いて４−ｔ−ブチルフェニルスルホニルクロリドとの反応及び脱保護により、（２Ｓ，４Ｒ）−４−メルカプト−１−（ナフタレン−２−スルホニル）ピロリジン−２−カルボン酸Ｎ′−（４−ｔｅｒｔ−ブチルベンゼンスルホニル）−Ｎ′−イソブチルヒドラジドを白色の結晶として、ＭＳ： ６０４ （ＭＨ＋）；
ｄ）メチルヒドラジンから、続いてメタンスルホニルクロリドとの反応及び脱保護により、（２Ｓ，４Ｒ）−４−メルカプト−１−（ナフタレン−２−スルホニル）ピロリジン−２−カルボン酸Ｎ′−メタンスルホニル−Ｎ′−メチルヒドラジドを白色の固体として、ＭＳ：４４４ （ＭＨ＋）；
ｅ）イソブチルヒドラジンスルファートから、続いてメタンスルホニルクロリドとの反応及び脱保護により、（２Ｓ，４Ｒ）−４−メルカプト−１−（ナフタレン−２−スルホニル）ピロリジン−２−カルボン酸Ｎ′−イソブチル−Ｎ′−メタンスルホニルヒドラジドを白色の結晶として、ＭＳ：４８６ （ＭＨ＋）；
ｆ）ベンジルヒドラジンから、続いてメタンスルホニルクロリドとの反応及び脱保護により、（２Ｓ，４Ｒ）−４−メルカプト−１−（ナフタレン−２−スルホニル）ピロリジン−２−カルボン酸Ｎ′−ベンジル−Ｎ′−メタンスルホニルヒドラジドを白色の結晶として、ＭＳ： ５２０ （ＭＨ＋）；
ｇ）メチルヒドラジンから、続いてｐ−トルエンスルホニルクロリドとの反応及び脱保護により、（２Ｓ，４Ｒ）−４−メルカプト−１−（ナフタレン−２−スルホニル）ピロリジン−２−カルボン酸Ｎ′−メチル−Ｎ′−（４−メチルフェニルスルホニル）ヒドラジドを白色の結晶として、ＭＳ： ５９６ （ＭＨ＋）；
（２Ｓ，４Ｒ）−１−メタンスルホニル−４−トリチルスルファニルピロリジン−２−カルボン酸及び
ａ２）ベンジルヒドラジンから、続いてメタンスルホニルクロリドとの反応及び脱保護により、（２Ｓ，４Ｒ）−４−メルカプト−１−メタンスルホニルピロリジン−２−カルボン酸Ｎ′−ベンジル−Ｎ′−メタンスルホニルヒドラジドを白色の固体として、ＭＳ： ４０８ （ＭＨ＋）；
ｂ２）イソブチルヒドラジンから、続いてメタンスルホニルクロリドとの反応及び脱保護により、（２Ｓ，４Ｒ）−４−メルカプト−１−メタンスルホニルピロリジン−２−カルボン酸Ｎ′−イソブチル−Ｎ′−メタンスルホニルヒドラジドを無色の固体として、ＭＳ：４５０ （ＭＨ＋）；
ｃ２）イソブチルヒドラジンから、続いてｐ−トルエンスルホニルクロリドとの反応及び脱保護により、（２Ｓ，４Ｒ）−４−メルカプト−１−メタンスルホニルピロリジン−２−カルボン酸Ｎ′−イソブチル−Ｎ′−（４−メチルベンゼンスルホニル）ヒドラジドを無色の固体として、ＭＳ： ３７４ （ＭＨ＋）；
ｄ２）イソブチルヒドラジンスルファートから、続いて４−ｔｅｒｔ−ブチルベンゼンスルホニルクロリドとの反応及び脱保護により、（２Ｓ，４Ｒ）−４−メルカプト−１−メタンスルホニルピロリジン−２−カルボン酸Ｎ′−（４−ｔｅｒｔ−ブチルベンゼンスルホニル）−Ｎ′−イソブチルヒドラジドを白色の結晶として、ＭＳ： ４９２ （ＭＨ＋）。
【０１３５】
実施例３ｃ：シーケンスＣ（スキーム２）
シーケンスＡ、Ｂ（工程１、３）と同様にして、（２Ｓ，４Ｒ）−４−（４−メトキシベンジルスルファニル）ピロリジン−１，２−ジカルボン酸１−ｔｅｒｔ−ブチルエステル及びメチルヒドラジンから、続いてｐ−トルエンスルホニルクロリドで処理して、（２Ｓ，４Ｒ）−２−〔Ｎ′−メチル−Ｎ′−（４−メチルフェニルスルホニル）ヒドラジノカルボニル〕−４−（４−メトキシベンジルスルファニル）ピロリジン−１−カルボン酸１−ｔｅｒｔ−ブチルエステルを得て、それを続く反応に直接付した。
【０１３６】
（工程５）ＣＨ２Ｃｌ２　１０ｍｌ中の（２Ｓ，４Ｒ）−２−〔Ｎ′−メチル−Ｎ′−（４−メチルフェニルスルホニル）ヒドラジノカルボニル〕−４−（４−メトキシベンジルスルファニル）ピロリジン−１−カルボン酸１−ｔｅｒｔ−ブチルエステル２．３７ｇ（４．３ｍｍｏｌ）を、ＴＦＡ　４ｍｌにより０℃で処理し、冷凍庫に一晩保存した。溶媒を蒸発させ、粗物質を溶解し、トルエン（２×）及びヘキサン（３×）を用いて蒸発させて、（２Ｓ，４Ｒ）−２−〔Ｎ′−メチル−Ｎ′−（４−メチルフェニルスルホニル）ヒドラジノカルボニル〕−４−（４−メトキシベンジルスルファニル）ピロリジンを粗生成物であるＴＦＡ塩として得て、それを更に精製しないで続く反応に付した。
【０１３７】
（工程６）ＣＨ２Ｃｌ２　５ｍｌ中の（２Ｓ，４Ｒ）−２−〔Ｎ′−メチル−Ｎ′−（４−メチルフェニルスルホニル）ヒドラジノカルボニル〕−４−（４−メトキシベンジルスルファニル）ピロリジン・ＴＦＡ　２５０ｍｇ（０．４４ｍｍｏｌ、１．０当量）に、Ｎ−エチルジイソプロピルアミン３６０μｌ（２．１ｍｍｏｌ、４．８当量）及びクロロギ酸フェニル７０μｌ（０．５６ｍｍｏｌ、１．２当量）を加えた。溶液を室温で一晩撹拌し、１Ｎ　ＫＨＳＯ４を加え、相を分離し、無機相をＣＨ２Ｃｌ２で抽出し、有機層を１Ｎ　ＫＨＳＯ４及びブラインで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、蒸発させた。
【０１３８】
（工程７）粗物質をＴＦＡ　１０ｍｌに再溶解し、トリエチルシラン７００μｌ（４．４ｍｍｏｌ、１０当量）を室温で加え、溶液を８０℃で７０分間撹拌した。蒸発させ、ヘキサン：酢酸エチル１：１を用いるフラッシュクロマトグラフィーに付し、続いて凍結乾燥して、（２Ｓ，４Ｒ）−２−〔Ｎ′−メチル−Ｎ′−（４−メチルフェニルスルホニル）ヒドラジノカルボニル〕−４−メルカプトピロリジン−１−カルボン酸フェニルエステル１４９．２ｍｇ（７５％）を白色の固体として得た。ＭＳ： ４５０ （ＭＨ＋）
【０１３９】
同様の方法（工程６，７）にして、下記の化合物を調製した：
（２Ｓ，４Ｒ）−２−〔Ｎ′−メチル−Ｎ′−（４−メチルフェニルスルホニル）ヒドラジノカルボニル〕−４−（４−メトキシベンジルスルファニル）ピロリジン・ＴＦＡから、クロロギ酸ｎ−ブチル、クロロギ酸イソプロピル、ブチルスルファモイルクロリド、シクロプロピルスルファモイルクロリド、ベンジルスルファモイルクロリドを用いて：
（２Ｓ，４Ｒ）−２−〔Ｎ′−メチル−Ｎ′−（４−メチルフェニルスルホニル）ヒドラジノカルボニル〕−４−メルカプトピロリジン−１−カルボン酸ブチルエステルを無色のガムとして、ＭＳ： ４３０ （ＭＨ＋）；
（２Ｓ，４Ｒ）−２−〔Ｎ′−メチル−Ｎ′−（４−メチルフェニルスルホニル）ヒドラジノカルボニル〕−４−メルカプトピロリジン−１−カルボン酸イソプロピルエステルを無色の固体として、ＭＳ： ４１６ （ＭＨ＋）；
（２Ｓ，４Ｒ）−２−〔Ｎ′−メチル−Ｎ′−（４−メチルフェニルスルホニル）ヒドラジノカルボニル〕−４−メルカプトピロリジン−１−スルホン酸ブチルアミドを凍結乾燥した白色の固体として、ＭＳ：４６３ （Ｍ−Ｈ）−；
（２Ｓ，４Ｒ）−２−〔Ｎ′−メチル−Ｎ′−（４−メチルフェニルスルホニル）ヒドラジノカルボニル〕−４−メルカプトピロリジン−１−スルホン酸シクロプロピルアミドを凍結乾燥した白色の固体として、ＭＳ： ４４７ （Ｍ−Ｈ）−；
（２Ｓ，４Ｒ）−２−〔Ｎ′−メチル−Ｎ′−（４−メチルフェニルスルホニル）ヒドラジノカルボニル〕−４−メルカプトピロリジン−１−スルホン酸ベンジルアミドを凍結乾燥した白色の固体として、ＭＳ： ４９７ （Ｍ−Ｈ）−。
【０１４０】
プロトコール（工程５〜７）に従って、（２Ｓ，４Ｒ）−２−〔Ｎ′−イソブチル−Ｎ′−（４−メチルフェニルスルホニル）ヒドラジノカルボニル〕−４−（４−メトキシベンジルスルファニル）ピロリジン−１−カルボン酸１−ｔｅｒｔ−ブチルエステルを、クロロギ酸イソプロピル、クロロギ酸ｎ−ブチル、クロロギ酸ベンジル、クロロギ酸フェニル、キノリン−８−塩化スルホニル、チオフェン−２−塩化スルホニル、ベンジルスルファモイルクロリド、ブチルスルファモイルクロリド又はシクロプロピルスルファモイルクロリドで処理して、下記の化合物を得た：
（２Ｓ，４Ｒ）−２−〔Ｎ′−イソブチル−Ｎ′−（４−メチルフェニルスルホニル）ヒドラジノカルボニル〕−４−メルカプトピロリジン−１−カルボン酸イソプロピルエステルを無色の固体として、ＭＳ： ４５８ （ＭＨ＋）；
（２Ｓ，４Ｒ）−２−〔Ｎ′−イソブチル−Ｎ′−（４−メチルフェニルスルホニル）ヒドラジノカルボニル〕−４−メルカプトピロリジン−１−カルボン酸ブチルエステルを無色の固体として、ＭＳ：４７２ （ＭＨ＋）；
（２Ｓ，４Ｒ）−２−〔Ｎ′−イソブチル−Ｎ′−（４−メチルフェニルスルホニル）ヒドラジノカルボニル〕−４−メルカプトピロリジン−１−カルボン酸ベンジルエステルを無色の固体として、ＭＳ： ５０６ （ＭＨ＋）；
（２Ｓ，４Ｒ）−２−〔Ｎ′−イソブチル−Ｎ′−（４−メチルフェニルスルホニル）ヒドラジノカルボニル〕−４−メルカプトピロリジン−１−カルボン酸フェニルエステルを無色の固体として、ＭＳ： ４９２ （ＭＨ＋）；
（２Ｓ，４Ｒ）−４−メルカプト−１−（キノリン−８−スルホニル）ピロリジン−２−カルボン酸Ｎ′−イソブチル−Ｎ′−（４−メチルベンジル）ヒドラジドを白色の固体として、ＭＳ： ５６３ （ＭＨ＋）；
（２Ｓ，４Ｒ）−４−メルカプト−１−（チオフェン−２−スルホニル）ピロリジン−２−カルボン酸Ｎ′−イソブチル−Ｎ′−（４−メチルベンジル）ヒドラジドを白色の固体として、ＭＳ： ５１８ （ＭＨ＋）；
（２Ｓ，４Ｒ）−２−〔Ｎ′−イソブチル−Ｎ′−（４−メチルフェニルスルホニル）ヒドラジノカルボニル〕−４−メルカプトピロリジン−１−スルホン酸ベンジルアミドを凍結乾燥した白色の固体として、融点：６７℃、ＭＳ： ５３９ （Ｍ−Ｈ）−；
（２Ｓ，４Ｒ）−２−〔Ｎ′−イソブチル−Ｎ′−（４−メチルフェニルスルホニル）ヒドラジノカルボニル〕−４−メルカプトピロリジン−１−スルホン酸ブチルアミドを凍結乾燥した白色の固体として、ＭＳ： ４６７ （Ｍ−Ｈ）−；
（２Ｓ，４Ｒ）−２−〔Ｎ′−イソブチル−Ｎ′−（４−メチルフェニルスルホニル）ヒドラジノカルボニル〕−４−メルカプトピロリジン−１−スルホン酸シクロプロピルアミドを凍結乾燥した白色の固体として、ＭＳ： ４８９ （Ｍ−Ｈ）−。
【０１４１】
実施例３ｄ：シーケンスＤ−エステルからの直接形成（スキーム３）
Ｒｕｙｅ Ｘｉｎｇ ａｎｄ Ｒｏｂｅｒｔ Ｐ． Ｈａｎｚｌｉｋ， Ｊ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． １９９８， ４１， １３４４−１３５１と同様にして、下記の反応を実施した：
（工程８）メタノール２０ｍｌ中の（２Ｓ，４Ｒ）−４−（４−メトキシベンジルスルファニル）−１−（ナフタレン−２−スルホニル）ピロリジン−２−カルボン酸メチルエステル５ｇ（１０．６ｍｍｏｌ、１当量）の溶液に、ヒドラジン無水物６．４５ｍｌ（１１０ｍｍｏｌ、１０当量）を加え、溶液を室温で３日間撹拌した。溶媒を蒸発させ、続いてＥｔＯＨ、エーテル及びヘキサンを用いて溶解し、蒸発させた。明黄色の固体を真空下で乾燥させて、（２Ｓ，４Ｒ）−４−（４−メトキシベンジルスルファニル）−１−（ナフタレン−２−スルホニル）ピロリジン−２−カルボン酸ヒドラジドを得た。融点：１３０℃、ＭＳ： ４７２ （ＭＨ＋）
【０１４２】
（工程９）ＴＦＡ　５ｍｌとトリイソプロピルシラン０．６５ｍｌ中の（２Ｓ，４Ｒ）−４−（４−メトキシベンジルスルファニル）−１−（ナフタレン−２−スルホニル）ピロリジン−２−カルボン酸ヒドラジド１５０ｍｇ（０．３ｍｍｏｌ、１．０当量）を室温で３日間撹拌した。溶媒を蒸発させ、残渣を飽和ＮａＨＣＯ３溶液：酢酸エチルに再溶解し、相を分離し、無機相を酢酸エチルで抽出した。合わせた有機相を水及びブラインで洗浄した。カラムクロマトグラフィーに付して、（２Ｓ，４Ｒ）−４−メルカプト−１−（ナフタレン−２−スルホニル）ピロリジン−２−カルボン酸ヒドラジド６８ｍｇ（６１％）を白色の泡状物として得た。ＭＳ： ３５２ （ＭＨ＋）
【０１４３】
【化１７】
2004504298.tif 000015
【０１４４】
実施例３ｅ：シーケンスＥ−中間体（スキーム３）
シーケンスＤ、工程８と同様にして、（２Ｓ，４Ｒ）−１−（ナフタレン−２−スルホニル）−４−トリチルスルファニルピロリジン−２−カルボン酸メチルエステル及びヒドラジン水和物から下記の化合物を調製した：
（２Ｓ，４Ｒ）−１−（ナフタレン−２−スルホニル）−４−トリチルスルファニルピロリジン−２−カルボン酸ヒドラジドをオフホワイトの固体として、融点：１７２℃、ＭＳ： ５９４ （ＭＨ＋）。
【０１４５】
（工程１０）エタノール中の（２Ｓ，４Ｒ）−１−（ナフタレン−２−スルホニル）−４−トリチルスルファニルピロリジン−２−カルボン酸ヒドラジド３．０ｇ（５．０５ｍｍｏｌ）の懸濁液に、ベンズアルデヒド０．５６ｍｌ（５．６ｍｍｏｌ、１．１当量）を室温で加え、反応混合物を８０℃で３時間加熱した。溶媒を蒸発させ、残渣を、酢酸エチル：ヘキサン１：１を溶離剤として用いるシリカゲル上のフラッシュクロマトグラフィーにより精製して、（２Ｓ，４Ｒ）−１−（ナフタレン−２−スルホニル）−４−トリチルスルファニルピロリジン−２−カルボン酸ベンジリデンヒドラジド２．７５ｇ（８０％）を白色の泡状物として得た。ＭＳ： ６８２ （ＭＨ＋）
【０１４６】
（工程１１）（２Ｓ，４Ｒ）−１−（ナフタレン−２−スルホニル）−４−トリチルスルファニルピロリジン−２−カルボン酸ベンジリデンヒドラジド２．４８ｇ（３．６４ｍｍｏｌ）に、ＴＨＦ　１２．４ｍｌ中のＮａＢＨ３ＣＮ　２２８．６ｍｇ（３．６４ｍｍｏｌ、１．０当量）、続いてＴＨＦ　８．７ｍｌ中のトルエン−４−スルホン酸６９１．８ｍｇ（３．６４ｍｍｏｌ、１．０当量）を加えた。溶液を室温で２時間撹拌し、追加のＮａＢＨ３ＣＮ（０．３当量）を加え、反応を室温で一晩撹拌した。混合物を酢酸エチルで希釈し、ブライン、飽和ＮａＨＣＯ３溶液及びブラインで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、溶媒を蒸発させた。
【０１４７】
残渣を１Ｍ　ＮａＯＨ　１１ｍｌ及びＴＨＦ　１５ｍｌに溶解し、１時間撹拌し、酢酸エチルで希釈し、１Ｍ　ＫＨＳＯ４　９ｍｌ、続いて５％ＮａＨＣＯ３溶液を加えた。僅かに塩基性の溶液を酢酸エチルで抽出した。有機相を水及びブラインで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、蒸発させて、（２Ｓ，４Ｒ）−１−（ナフタレン−２−スルホニル）−４−トリチルスルファニルピロリジン−２−カルボン酸Ｎ′−ベンジルヒドラジド２．４５ｇ（９８％）を白色の泡状物として得た。ＭＳ：６８４ （ＭＨ＋）（Ａｌｅｘａｎｄｅｒ Ｆａｓｓｌｅｒ， Ｇｕｉｄｏ Ｂｏｌｄ， Ｈａｎｓ−Ｇｅｏｒｇ Ｃａｐｒａｒｏ， Ｒｏｂｅｒｔ Ｃｏｚｅｎｓ， Ｊｕｒｇｅｎ Ｍｅｓｔａｎ， Ｂｅｒｎａｒｄ Ｐｏｎｃｉｏｎｉ， Ｊｏｈａｎｎｅｓ Ｒｏｓｅｌ， Ｍａｒｉｎａ Ｔｉｎｔｅｌｎｏｔ−Ｂｌｏｍｌｅｙ， ａｎｄ Ｍａｒｃ Ｌａｎｇ， Ｊ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． １９９６， ３９， １６， ３２０３−３２１６と同様。
）
【０１４８】
同様にして、（２Ｓ，４Ｒ）−１−（ナフタレン−２−スルホニル）−４−トリチルスルファニルピロリジン−２−カルボン酸ヒドラジド及び２，５−ジフルオロベンズアルデヒドから下記の化合物を調製した：
（２Ｓ，４Ｒ）−１−（ナフタレン−２−スルホニル）−４−トリチルスルファニルピロリジン−２−カルボン酸Ｎ′−（２，５−ジフルオロベンジル）ヒドラジドを白色の泡状物として、ＭＳ： ７２０ （ＭＨ＋）。
【０１４９】
実施例３ｅ：シーケンスＥ−最終生成物（スキーム３）
（工程１２）ＣＨ２Ｃｌ２　３ｍｌ中の（２Ｓ，４Ｒ）−１−（ナフタレン−２−スルホニル）−４−トリチルスルファニルピロリジン−２−カルボン酸Ｎ′−ベンジルヒドラジド２００ｍｇ（０．３ｍｍｏｌ）に、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン６０μｌ（０．３５ｍｍｏｌ、１．２当量）、４−メトキシベンゼンスルホニルクロリド７２．５ｍｇ（０．３５ｍｍｏｌ、１．２当量）及びＤＭＡＰ−ポリ２２．５ｍｇ（０．１２当量）を０℃で加えた。懸濁液を室温で３日間振とうし、追加のＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン２５μｌ（０．１５ｍｍｏｌ、０．５当量）、４−メトキシベンゼンスルホニルクロリド３１ｍｇ（０．１５ｍｍｏｌ、０．５当量）及びＤＭＡＰ−ポリ２２．５ｍｇ（０．１２当量）を加え、反応を１日続けた。濾過し、樹脂をＣＨ２Ｃｌ２で洗浄した後、有機相を濃縮し、粗物質をフラッシュクロマトグラフィーにより精製して、（２Ｓ，４Ｒ）−１−（ナフタレン−２−スルホニル）−４−トリチルスルファニルピロリジン−２−カルボン酸Ｎ′−ベンジル−Ｎ′−（４−メトキシベンゼンスルホニル）ヒドラジド１５２ｍｇ（６１％）を得て、それを続く反応に直接付した。
【０１５０】
（工程１３）ＴＦＡ　３．０ｍｌ中の（２Ｓ，４Ｒ）−１−（ナフタレン−２−スルホニル）−４−トリチルスルファニルピロリジン−２−カルボン酸Ｎ′−ベンジル−Ｎ′−（４−メトキシベンゼンスルホニル）ヒドラジド１４８ｍｇ（０．１７ｍｍｏｌ）に、トリエチルシラン２７６μｌ（１．７３ｍｍｏｌ、１０当量）を０℃で加えた。混合物を室温で３０分間撹拌し、溶媒を蒸発させ、残渣を酢酸エチル、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液に再溶解し、層を分離し、無機層を酢酸エチルで抽出した。合わせた有機層をブラインで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、蒸発させた。残渣を、酢酸エチル：ヘキサン（１：１．５〜１：１）の勾配を用いるフラッシュクロマトグラフィーにより精製して、（２Ｓ，４Ｒ）−４−メルカプト−１−（ナフタレン−２−スルホニル）ピロリジン−２−カルボン酸Ｎ′−ベンジル−Ｎ′−（４−メトキシベンゼンスルホニル）ヒドラジト７６ｍｇ（７２％）を白色の泡状物として得た。ＭＳ： ６１２ （ＭＨ＋）
【０１５１】
同様にして、（２Ｓ，４Ｒ）−１−（ナフタレン−２−スルホニル）−４−トリチルスルファニルピロリジン−２−カルボン酸Ｎ′−ベンジルヒドラジド及び　ｐ−トルオイルクロリド、塩化アセチル、ｐ−アニソイルクロリドから、続いて脱保護により下記の化合物を調製した：
（ｂ）（２Ｓ，４Ｒ）−４−メチル安息香酸Ｎ−ベンジル−Ｎ′−〔４−メルカプト−１−（ナフタレン−２−スルホニル）ピロリジン−２−カルボニル〕ヒドラジドを白色の泡状物として、ＭＳ： ５６０ （ＭＨ＋）；
（ｃ）（２Ｓ，４Ｒ）−４−メルカプト−１−（ナフタレン−２−スルホニル）ピロリジン−２−カルボン酸Ｎ′−アセチル−Ｎ′−ベンジルヒドラジドを白色の固体として、融点：６４℃、ＭＳ：４８４ （ＭＨ＋）；
（ｄ）（２Ｓ，４Ｒ）−４−メトキシ安息香酸Ｎ−ベンジル−Ｎ′−〔４−メルカプト−１−（ナフタレン−２−スルホニル）ピロリジン−２−カルボニル〕ヒドラジドを白色の泡状物として、ＭＳ： ５７６ （ＭＨ＋）。
（２Ｓ，４Ｒ）−１−（ナフタレン−２−スルホニル）−４−トリチルスルファニルピロリジン−２−カルボン酸Ｎ′−（２，５−ジフルオロベンジル）ヒドラジド及び
２，４−ジフルオロベンゾイルクロリド、２−チオフェンカルボニルクロリド、メタンスルホニルクロリド、メトキシベンゼンスルホニルクロリド、２−チオフェンスルホニルクロリド、ベンゼンスルホニルクロリド、４−フルオロベンゼンスルホニルクロリドから：
（ｅ）（２Ｓ，４Ｒ）−２，４−ジフルオロ安息香酸Ｎ−（２，５−ジフルオロベンジル）−Ｎ′−〔４−メルカプト−１−（ナフタレン−２−スルホニル）ピロリジン−２−カルボニル〕ヒドラジドを白色の泡状物として、ＭＳ： ６１８ （ＭＨ＋）；
（ｆ）（２Ｓ，４Ｒ）−チオフェン−２−カルボン酸Ｎ−（２，５−ジフルオロベンジル）−Ｎ′−〔４−メルカプト−１−（ナフタレン−２−スルホニル）ピロリジン−２−カルボニル〕ヒドラジドを白色の泡状物として、ＭＳ： ５８８ （ＭＨ＋）；
（ｇ）（２Ｓ，４Ｒ）−１−（ナフタレン−２−スルホニル）−４−トリチルスルファニルピロリジン−２−カルボン酸Ｎ′−（２，５−ジフルオロベンジル）−Ｎ′−メタンスルホニルヒドラジドを白色の泡状物として、ＭＳ： ５５６ （ＭＨ＋）；
（ｈ）（２Ｓ，４Ｒ）−１−（ナフタレン−２−スルホニル）−４−トリチルスルファニルピロリジン−２−カルボン酸Ｎ′−（２，５−ジフルオロベンジル）−Ｎ′−（４−メトキシベンゼンスルホニル）ヒドラジドを白色の泡状物として、ＭＳ： ６４８ （ＭＨ＋）；
（ｉ）（２Ｓ，４Ｒ）−１−（ナフタレン−２−スルホニル）−４−トリチルスルファニルピロリジン−２−カルボン酸Ｎ′−（２，５−ジフルオロベンジル）−Ｎ′−（チオフェン−２−スルホニル）ヒドラジドを白色の泡状物として、ＭＳ： ６２４ （ＭＨ＋）；
（ｊ）（２Ｓ，４Ｒ）−１−（ナフタレン−２−スルホニル）−４−トリチルスルファニルピロリジン−２−カルボン酸Ｎ′−（２，５−ジフルオロベンジル）−Ｎ′−ベンゼンスルホニルヒドラジドを白色の泡状物として、ＭＳ： ６１８ （ＭＨ＋）；
（ｋ）（２Ｓ，４Ｒ）−１−（ナフタレン−２−スルホニル）−４−トリチルスルファニルピロリジン−２−カルボン酸Ｎ′−（２，５−ジフルオロベンジル）−Ｎ′−（４−フルオロベンゼンスルホニル）ヒドラジドを白色の泡状物として、ＭＳ： ６３６ （ＭＨ＋）。
【０１５２】
実施例３ｆ：スキーム４による合成
シーケンスＡ−工程１と同様にして、（２Ｓ，４Ｒ）−４−（４−メトキシベンジルスルファニル）−１−（ナフタレン−２−スルホニル）ピロリジン−２−カルボン酸及びＮ−メチルヒドラジンカルボン酸ベンジルエステルから中間体
（２Ｓ，４Ｒ）−Ｎ′−〔４−（４−メトキシベンジルスルファニル）−１−（ナフタレン−２−スルホニル）ピロリジン−２−カルボニル〕−Ｎ−メチルヒドラジンカルボン酸ベンジルエステルをオフホワイトの結晶として調製した。ＭＳ： ６２０ （ＭＨ＋）
【０１５３】
（工程１４）（２Ｓ，４Ｒ）−Ｎ′−〔４−（４−メトキシベンジルスルファニル）−１−（ナフタレン−２−スルホニル）ピロリジン−２−カルボニル〕−Ｎ−メチルヒドラジンカルボン酸ベンジルエステル２．４５ｇ（１．５２ｍｍｏｌ）を酢酸９ｍｌに溶解し、ＨＢｒ（酢酸中３３％）９ｍｌを０℃で加え、０℃で４時間撹拌した。溶液を濃縮し、残渣をＣＨ２Ｃｌ２及び飽和ＮａＨＣＯ３水溶液に溶解し、層を分離し、無機層をＣＨ２Ｃｌ２で抽出し、合わせた有機相をブラインで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させた。粗生成物を、酢酸エチル：ヘキサン１：１を用いるフラッシュクロマトグラフィーにより精製して、（２Ｓ，４Ｒ）−４−（４−メトキシベンジルスルファニル）−１−（ナフタレン−２−スルホニル）ピロリジン−２−カルボン酸Ｎ−ベンジル−Ｎ−メチルヒドラジド３８０ｍｇ（４４％）を白色の固体として得た。融点：８３．２℃、ＭＳ： ５７６ （ＭＨ＋）
【０１５４】
スキーム２（工程４）に従い脱保護して、
（２Ｓ，４Ｒ）−４−メルカプト−１−（ナフタレン−２−スルホニル）ピロリジン−２−カルボン酸Ｎ−ベンジル−Ｎ−メチルヒドラジドを白色の固体として得た。融点：６９℃、ＭＳ： ４５６ （ＭＨ＋）
【０１５５】
（工程１６）ＤＭＦ　７．５ｍｌ中の（２Ｓ，４Ｒ）−４−（４−メトキシベンジルスルファニル）−１−（ナフタレン−２−スルホニル）ピロリジン−２−カルボン酸Ｎ−ベンジル−Ｎ−メチルヒドラジド１８０ｍｇ（０．３１ｍｍｏｌ）を、ＮａＨ　１６．５ｍｇ（０．３４ｍｍｏｌ、１．１当量）及びヨウ化メチル２１μｌ（０．３４ｍｍｏｌ、１．１当量）により０℃で処理し、溶液を室温で３時間撹拌した。溶液を水及びＣＨ２Ｃｌ２で希釈した。相を分離し、無機層をＣＨ２Ｃｌ２で抽出し、合わせた有機層をブラインで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、蒸発させた。粗物質を、酢酸エチル：ヘキサン２：１〜酢酸エチルの勾配を用いるフラッシュクロマトグラフィーにより精製して、（２Ｓ，４Ｒ）−４−（４−メトキシベンジルスルファニル）−１−（ナフタレン−２−スルホニル）ピロリジン−２−カルボン酸Ｎ′−ベンジル−Ｎ，Ｎ−ジメチルヒドラジド１１０ｍｇ（６０％）を得て、それをスキーム２（工程４）で記載されたプロトコールを使用して脱保護して、
【０１５６】
【化１８】
2004504298.tif 000016
【０１５７】
（２Ｓ，４Ｒ）−４−メルカプト−１−（ナフタレン−２−スルホニル）ピロリジン−２−カルボン酸Ｎ′−ベンジル−Ｎ，Ｎ−ジメチルヒドラジドを白色の固体として得た。融点：１３３．２℃、ＭＳ： ４７０ （ＭＨ＋）
【０１５８】
実施例３ｇ：スキーム５による合成
シーケンスＡ−工程１と同様にして、（２Ｓ，４Ｒ）−４−（４−メトキシベンジルスルファニル）−１−（ナフタレン−２−スルホニル）ピロリジン−２−カルボン酸及びｔｅｒｔ−ブチル２−（メチル）ヒドラジンカルボキシラートから、中間体（２Ｓ，４Ｒ）−Ｎ′−〔４−（４−メトキシベンジルスルファニル）−１−（ナフタレン−２−スルホニル）ピロリジン−２−カルボニル〕−Ｎ′−メチルヒドラジンカルボン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステルを白色の結晶として調製した。ＭＳ： ５８６ （ＭＨ＋）
【０１５９】
（工程１９）ＴＦＡ　１０ｍｌ中の（２Ｓ，４Ｒ）−Ｎ′−〔４−（４−メトキシベンジルスルファニル）−１−（ナフタレン−２−スルホニル）ピロリジン−２−カルボニル〕−Ｎ′−メチルヒドラジンカルボン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル２００ｍｇ（０．３４ｍｍｏｌ）に、トリエチルシラン０．５４ｍｌ（３．４ｍｍｏｌ、１０当量）を室温で加え、溶液を８０℃で１時間撹拌した。溶媒を真空下で蒸発させ、粗物質を、酢酸エチル／ヘキサンを用いるフラッシュクロマトグラフィーにより精製して、（２Ｓ，４Ｒ）−４−メルカプト−１−（ナフタレン−２−スルホニル）ピロリジン−２−カルボン酸Ｎ−メチル−Ｎ′−トリフルオロアセチルヒドラジド６１．６ｍｇ（４０％）を白色の固体として得た。ＭＳ： ４６１ （ＭＨ＋）
【０１６０】
（工程２０、２１）手順に従って（スキーム４、工程１６）、（２Ｓ，４Ｒ）−Ｎ′−〔４−（４−メトキシベンジルスルファニル）−１−（ナフタレン−２−スルホニル）ピロリジン−２−カルボニル〕−Ｎ′−メチルヒドラジンカルボン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル及び臭化ベンジルから、（２Ｓ，４Ｒ）−Ｎ′−〔４−（４−メトキシベンジルスルファニル）−１−（ナフタレン−２−スルホニル）ピロリジン−２−カルボニル〕−Ｎ′−メチル−Ｎ−ベンジルヒドラジンカルボン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステルを調製して、それをスキーム２（工程４）に従って直接ＢＯＣ及びＰＭＢ脱保護して、（２Ｓ，４Ｒ）−４−メルカプト−１−（ナフタレン−２−スルホニル）ピロリジン−２−カルボン酸Ｎ−ベンジル−Ｎ−メチルヒドラジドを無色の油状物として得た。ＭＳ： ４５６ （ＭＨ＋）
【０１６１】
（工程２２）ＣＨ２Ｃｌ２　９ｍｌ中の（２Ｓ，４Ｒ）−Ｎ′−〔４−（４−メトキシベンジルスルファニル）−１−（ナフタレン−２−スルホニル）ピロリジン−２−カルボニル〕−Ｎ′−メチルヒドラジンカルボン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル２ｇ（３．４ｍｍｏｌ）をＴＦＡ　３．４ｍｌで２時間処理した。溶液を濃縮し、トルエンに再溶解し、蒸発させた。残渣を酢酸エチル及び飽和ＮａＨＣＯ３水溶液に溶解し、層を分離し、無機層を酢酸エチルで抽出し、合わせた有機層をブラインで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、濃縮して、（２Ｓ，４Ｒ）−４−（４−メトキシベンジルスルファニル）−１−（ナフタレン−２−スルホニル）ピロリジン−２−カルボン酸Ｎ−メチルヒドラジド１．６７ｇ（定量）を白色の固体として得た。ＭＳ： ４８６ （ＭＨ＋）
【０１６２】
（工程２３）（２Ｓ，４Ｒ）−４−（４−メトキシベンジルスルファニル）−１−（ナフタレン−２−スルホニル）ピロリジン−２−カルボン酸Ｎ−メチルヒドラジド１．６７ｇ（３．４ｍｍｏｌ）に、トルエンスルホニルクロリド０．７８ｇ（４．０８ｍｍｏｌ、１．２当量）、Ｎ−エチルジイソプロピルアミン０．７ｍｌ（４．０８ｍｍｏｌ、１．２当量）及びＤＭＡＰ樹脂１０６ｍｇ（０．１７ｍｍｏｌ、０．０５当量）を加え、３日後、追加のトルエンスルホニルクロリド３２４ｍｇ（１．７ｍｍｏｌ、０．５当量）を加えた。反応を濾過し、１Ｍ　ＨＣｌを加え、無機相をＣＨ２Ｃｌ２で抽出した。合わせた有機相をブラインで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、濃縮した。粗生成物を、酢酸エチル：ヘキサン１：２を用いるフラッシュクロマトグラフィーにより精製して、（２Ｓ，４Ｒ）−４−（４−メトキシベンジルスルファニル）−１−（ナフタレン−２−スルホニル）ピロリジン−２−カルボン酸Ｎ−メチル−Ｎ′，Ｎ′−ビス（４−メチルベンゼンスルホニル）ヒドラジド３５０ｍｇ〔１３％　ＭＳ：７９４ （ＭＨ＋）〕を白色の固体として、及び（２Ｓ，４Ｒ）−４−（４−メトキシベンジルスルファニル）−１−（ナフタレン−２−スルホニル）ピロリジン−２−カルボン酸Ｎ−メチル−Ｎ′−（４−メチルベンゼンスルホニル）ヒドラジト６３０ｍｇ〔２９％　ＭＳ： ６４０ （ＭＨ＋）〕を白色の固体として得た。
【０１６３】
これらの化合物をスキーム２（工程４）に従って脱保護して下記を得た：
（２Ｓ，４Ｒ）−４−メルカプト−１−（ナフタレン−２−スルホニル）ピロリジン−２−カルボン酸Ｎ−メチル−Ｎ′，Ｎ′−ビス（４−メチルベンゼンスルホニル）ヒドラジドを白色の結晶として、融点：１１０℃、ＭＳ：６７４ （ＭＨ＋）；
（２Ｓ，４Ｒ）−４−メルカプト−１−（ナフタレン−２−スルホニル）ピロリジン−２−カルボン酸Ｎ−メチル−Ｎ′−（４−メチルベンゼンスルホニル）ヒドラジドを白色の結晶として、融点：１０３．５℃、ＭＳ： ５２０ （ＭＨ＋）。
【０１６４】
（工程２５、２６）手順（スキーム４、工程１６）に従って、（２Ｓ，４Ｒ）−４−（４−メトキシベンジルスルファニル）−１−（ナフタレン−２−スルホニル）−ピロリジン−２−カルボン酸Ｎ−メチル−Ｎ′−（４−メチルベンゼンスルホニル）ヒドラジド及び臭化ベンジルから、（２Ｓ，４Ｒ）−４−（４−メトキシベンジルスルファニル）−１−（ナフタレン−２−スルホニル）ピロリジン−２−カルボン酸Ｎ−メチル−Ｎ′−ベンジル−Ｎ′−（４−メチルベンゼンスルホニル）ヒドラジドを調製し、それをスキーム２（工程４）に従って直接脱保護して、（２Ｓ，４Ｒ）−４−メルカプト−１−（ナフタレン−２−スルホニル）ピロリジン−２−カルボン酸Ｎ−メチル−Ｎ′−ベンジル−Ｎ′−（４−メチルベンゼンスルホニル）ヒドラジドを白色の固体として得た。融点８２．５℃、ＭＳ： ６１０ （ＭＨ＋）
【０１６５】
【化１９】
2004504298.tif 000017
【０１６６】
実施例３ｈ：環式化合物の合成（スキーム６）
（工程２７）ＴＨＦ　６５ｍｌ中の（２Ｓ，４Ｒ）−１−（ナフタレン−２−スルホニル）−４−トリチルスルファニルピロリジン−２−カルボン酸ヒドラジド１５０ｍｇ（０．２５ｍｍｏｌ）に、ｉＰｒ２ＥｔＮ　５２μｌ（０．３ｍｍｏｌ、１．２当量）及び４−ブロモブチリルクロリド２９μｌ（０．２５ｍｍｏｌ）を０℃で加えた。溶液を室温で２時間撹拌し、溶液を濃縮し、酢酸エチル／Ｈ２Ｏに再溶解した。無機相を酢酸エチルで抽出し、有機相をブラインで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させた。酢酸エチル：ヘキサン１：１を用いるカラムクロマトグラフィーに付して、（２Ｓ，４Ｒ）−１−（ナフタレン−２−スルホニル）−４−トリチルスルファニルピロリジン−２−カルボン酸Ｎ′−（４−ブロモブチリル）ヒドラジド１７０ｍｇ（９２％）を得て、それをＤＭＦ　１２０ｍｌに溶解し、ＮａＨ　１７ｍｇ（０．３８ｍｍｏｌ、鉱油中５５％）で処理し、溶液を２時間撹拌し、濃縮し、酢酸エチル／Ｈ２Ｏに溶解した。無機相を酢酸エチルで抽出し、有機相をブラインで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させた。粗生成物をカラムクロマトグラフィーにより精製して、（２Ｓ，４Ｒ）−４−トリチルスルファニル−１−（ナフタレン−２−スルホニル）ピロリジン−２−カルボン酸（２−オキソピロリジン−１−イル）アミド７５ｍｇ（４５％）を白色の泡状物として、（２Ｓ，４Ｒ）−１−〔４−トリチルスルファニル−１−（ナフタレン−２−スルホニル）ピロリジン−２−カルボニル〕テトラヒドロピリダジン−３−オン４０ｍｇ（２５％）を白色の泡状物として得た。２個の化合物を、抽出物が検出されなくなるまで、ＴＦＡ（トリチルスルファニル２ｍｌ／ｍｍｏｌ）中の１０当量のトリエチルシランにより、０℃から室温で個別に処理して、（２Ｓ，４Ｒ）−４−メルカプト−１−（ナフタレン−２−スルホニル）ピロリジン−２−カルボン酸（２−オキソピロリジン−１−イル）アミドを白色の泡状物〔ＭＳ：４２０ （ＭＨ＋） 〕として、（２Ｓ，４Ｒ）−１−〔４−メルカプト−１−（ナフタレン−２−スルホニル）ピロリジン−２−カルボニル〕テトラヒドロピリダジン−３−オンを白色の泡状物〔ＭＳ： ４２０ （ＭＨ＋） 〕としてそれぞれ得た。
【０１６７】
【化２０】
2004504298.tif 000018
【０１６８】
実施例４：ヒドラジド誘導体の固相合成
ビルディングブロックの合成（スキーム７）：
（２Ｓ，４Ｒ）−４−（４−メトキシベンジルスルファニル）ピロリジン−１，２−ジカルボン酸１−ｔｅｒｔ−ブチルエステル（１９．４８ｇ、５３ｍｍｏｌ）をＣＨ２Ｃｌ２（１２０ｍｌ）中のＴＦＡ（８０ｍｌ）で１５分間処理した。反応混合物を減圧下で濃縮し、得られた暗赤色の油状物をジエチルエーテル／ｎ−ヘキサン（１：４ｖ／ｖ、８６０ｍｌ）中で粉砕した。沈殿した塩を収集し、減圧下で乾燥させ（１８．９ｇ）、次の工程に直接使用した。
【０１６９】
ＮａＨＣＯ３（１７．８ｇ、２１２ｍｍｏｌ）を含有する１，４−ジオキサン／Ｈ２Ｏ（３００ｍｌ）中の（２Ｓ，４Ｒ）−４−（４−メトキシベンジルスルファニル）ピロリジン−２−カルボン酸のＴＦＡ塩（１８．９ｇ、５３ｍｍｏｌ）を、Ｆｍｏｃ−ＯＳｕ（１９．７ｇ、５８．３ｍｍｏｌ）で処理し、１６時間電磁的に撹拌した。反応混合物を水（４００ｍｌ）で希釈し、ジエチルエーテル（２×）で洗浄した。酢酸エチル（４００ｍｌ）及びＨＣｌ（２５％、５０ｍｌ）を加えた。有機相を抽出し、Ｈ２Ｏ、飽和ＮａＣｌで洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥させた。濾過し、減圧下で濃縮して、泡状物（２２．５ｇ）を得た。
【０１７０】
【化２１】
2004504298.tif 000019
【０１７１】
上記泡状物（２０．７ｇ、４２．３ｍｍｏｌ）をＴＦＡ（３５０ｍｌ）に溶解し、トリイソプロピルシラン（４３．５ｍｌ）を加えた。混合物を０．５時間還流し、減圧下で濃縮した。ジエチルエーテル（１００ｍｌ）及びｎ−ヘキサン（３００ｍｌ）を加えて、沈殿物を得た。上澄みをデカントし、沈殿物を減圧下及び高真空下で乾燥させて、白色の泡状物（２Ｓ，４Ｒ）−４−スルファニル−１−（フルオレニルメトキシカルボニル）ピロリジン−２−カルボン酸（９．６ｇ、ＭＳ： ３７０ ＭＨ＋）を得た。
【０１７２】
樹脂誘導体化（スキーム８）
リンカー４−（α，α−ジフェニルヒドロキシメチル）安息香酸（１８．３ｇ、６０ｍｍｏｌ）を、ＤＭＦ（無水、２５０ｍｌ）中のＴＰＴＵ（１７．８ｇ、６０ｍｍｏｌ）、ＤＩＥＡ（３０．８ｍｌ、１８０ｍｍｏｌ）を使用して３分間活性化した。混合物を、ベンズヒドリルアミン樹脂（ＮＨ２負荷０．９ｍｍｏｌ／ｇ、４４．４ｇ）を含有するフラスコに加え、フラスコを１時間振とうした。樹脂をフィルタ上で収集し、ＤＭＦ／イソプロパノールで交互に３回、ＣＨ２Ｃｌ２、エーテルで洗浄し、乾燥させた：５４．６５ｇ、０．６５ｍｍｏｌ／ｇ（質量増加に基づく負荷）。
【０１７３】
ＣＨ２Ｃｌ２で洗浄した上記の樹脂（４６．９ｇ、３０ｍｍｏｌ）に、ＣＨ２Ｃｌ２（無水、５５０ｍｌ）、ＴＦＡ（８０ｍｌ）中の（２Ｓ，４Ｒ）−４−スルファニル−１−（ナフタレン−２−スルホニル）ピロリジン−２−カルボン酸（１２．２ｇ、３６ｍｍｏｌ）の混合物を加えた。赤色の混合物を１．５時間振とうし、次に樹脂を濾過し、ＣＨ２Ｃｌ２／イソプロパノールで交互に３回、ＣＨ２Ｃｌ２、エーテルで洗浄し、乾燥させた：４２ｇ、０．６５ｍｍｏｌ／ｇ（質量増加に基づく負荷）。
【０１７４】
ＣＨ２Ｃｌ２で洗浄した上記の樹脂（３３．５ｇ、２２ｍｍｏｌ）に、ＣＨ２Ｃｌ２（無水、４５０ｍｌ）、ＴＦＡ（６７ｍｌ）中の（２Ｓ，４Ｒ）−４−スルファニル−１−（フルオレニルメトキシカルボニル）ピロリジン−２−カルボン酸（９．７ｇ、２６ｍｍｏｌ）の混合物を加えた。赤色の混合物を１．５時間振とうし、次に樹脂を濾過し、ＣＨ２Ｃｌ２／イソプロパノールで交互に３回、ＣＨ２Ｃｌ２、エーテルで洗浄し、乾燥させた：４２ｇ、０．５９ｍｍｏｌ／ｇ（質量増加に基づく負荷）。
【０１７５】
【化２２】
2004504298.tif 000020
【０１７６】
実施例５：固相におけるパラレル化学（スキーム９）
典型的手順：工程１、２
上記の（２Ｓ，４Ｒ）−４−スルファニル−１−（ナフタレン−２−スルホニル）ピロリジン−２−カルボン酸で誘導体化された樹脂（０．４ｇ、０．２６ｍｍｏｌ）を、ＤＭＦ（無水、５ｍｌ）、ＴＰＴＵ（０．１８ｇ、０．６１ｍｍｏｌ）、ＤＩＥＡ（０．２１ｍｌ、１．２１ｍｍｏｌ）で１０分間処理した。ＤＭＦ溶液を真空下で除去し、反応フラスコに、ＤＭＦ（無水、３ｍｌ）中のベンジルオキシカルボニルヒドラジド（０．１３ｇ、０．７７ｍｍｏｌ）を装填した。反応混合物を０．５時間振とうし、樹脂をフィルタで収集し、ＤＭＦ／イソプロパノールで交互に３回、ＣＨ２Ｃｌ２、エーテルで洗浄し、乾燥させた。
【０１７７】
樹脂（４４０ｍｇ）を、４０％ＴＦＡ／ＣＨ２Ｃｌ２（１０ｍｌ）、トリイソプロピルシラン（０．５ｍｌ）で１０分間処理し、濾液を収集し、減圧下で濃縮し、残渣を酢酸（１０ｍｌ）から凍結乾燥して、（２Ｓ，４Ｒ）−Ｎ′−〔４−メルカプト−１−（ナフタレン−２−スルホニル）ピロリジン−２−カルボニル〕ヒドラジンカルボン酸ベンジルエステル４１ｍｇを白色の凍結乾燥物として得た。ＭＳ： ５０８．３ （ＭＮａ＋）
【０１７８】
上記の手順を経由して平行して調製した他の化合物を表１に示した。
【０１７９】
【化２３】
2004504298.tif 000021
【０１８０】
典型的手順：工程３、２
上記の（２Ｓ，４Ｒ）−４−スルファニル−１−（ナフタレン−２−スルホニル）ピロリジン−２−カルボン酸で誘導体化された樹脂（０．５ｇ、０．３３ｍｍｏｌ）を、ＤＭＦ（無水、５ｍｌ）、ＴＰＴＵ（０．１９ｇ、０．６５ｍｍｏｌ）、ＤＩＥＡ（０．２２ｍｌ、１．３ｍｍｏｌ）で１０分間処理した。ＤＭＦ溶液を真空下で除去し、反応フラスコに、ＤＭＦ（無水、５ｍｌ）中の４−メトキシベンゼンスルホニルヒドラジド（０．２０ｇ、１．００ｍｍｏｌ）を充填した。反応混合物を１時間振とうし、樹脂をフィルタで収集し、ＤＭＦ／イソプロパノールで交互に３回、ＣＨ２Ｃｌ２、エーテルで洗浄し、乾燥させた。
【０１８１】
樹脂（５４０ｍｇ）を、４０％ＴＦＡ／ＣＨ２Ｃｌ２、トリイソプロピルシラン（０．５ｍｌ）で１５分間処理し、濾液を収集し、減圧下で濃縮し、残渣を分取ＲＰ−ＨＰＬＣにより精製し、目的画分をプールし、酢酸（１０ｍｌ）から凍結乾燥して、（２Ｓ，４Ｒ）−４−メルカプト−１−（ナフタレン−２−スルホニル）ピロリジン−２−カルボン酸Ｎ′−（４−メトキシベンゼンスルホニル）ヒドラジドを白色の凍結乾燥物として得た。ＭＳ： ５２０．１ （ＭＨ−）
【０１８２】
上記の手順を経由して平行して調製した他の化合物を表１に示した。
【０１８３】
典型的手順：工程３、６、２
上記の（２Ｓ，４Ｒ）−４−スルファニル−１−（ナフタレン−２−スルホニル）ピロリジン−２−カルボン酸で誘導体化された樹脂（４．３ｇ、２．７５ｍｍｏｌ）を、ＤＭＦ（無水、３０ｍｌ）、ＴＰＴＵ（１．６３ｇ、５．５０ｍｍｏｌ）、ＤＩＥＡ（１．４１ｍｌ、８．２５ｍｍｏｌ）で１５分間処理した。ＤＭＦ溶液を真空下で除去し、反応フラスコに、ＤＭＦ（無水、３０ｍｌ）中のトルエン−４−スルホンヒドラジド（１．５４ｇ、８．２５ｍｍｏｌ）を充填した。反応混合物を１６時間振とうし、樹脂をフィルタで収集し、ＤＭＦ／イソプロパノールで交互に３回、ＣＨ２Ｃｌ２、エーテルで洗浄し、乾燥させた。
【０１８４】
典型的アルキル化工程（例）
樹脂（０．８ｇ、０．４５ｍｍｏｌ）に、ＤＭＦ（無水、１０ｍｌ）、ジアゾビシクロ〔５．４．０〕ウンデク−７−エン（０．０８ｍｌ、０．５４ｍｍｏｌ）、２，５−ジフルオロベンジルブロミド（０．１１ｇ、０．５４ｍｍｏｌ）を加え、混合物を１６時間振とうし、樹脂をフィルタで収集し、ＤＭＦ／イソプロパノールで交互に３回、ＣＨ２Ｃｌ２、エーテルで洗浄し、乾燥させた。
【０１８５】
樹脂（０．１６ｇ）を、４０％ＴＦＡ／ＣＨ２Ｃｌ２（１０ｍｌ）、トリイソプロピルシラン（０．５ｍｌ）で１５分間処理し、濾液を収集し、減圧下で濃縮し、残渣を分取ＲＰ−ＨＰＬＣにより精製し、目的画分をプールし、酢酸から凍結乾燥して、（２Ｓ，４Ｒ）−４−メルカプト−１−（ナフタレン−２−スルホニル）ピロリジン−２−カルボン酸Ｎ′−（２，５−ジフルオロベンジル）−Ｎ′−（４−メチルベンゼンスルホニル）ヒドラジドを白色の凍結乾燥物として得た。ＭＳ： ６３２．０ （ＭＨ＋）
【０１８６】
上記の手順を経由して平行して調製した他の化合物を表１に示した。二置換生成物も示した。
【０１８７】
典型的手順：工程４、５、２
上記の（２Ｓ，４Ｒ）−４−スルファニル−１−（ナフタレン−２−スルホニル）ピロリジン−２−カルボン酸で誘導体化された樹脂（１．０ｇ、０．６５ｍｍｏｌ）を、ＤＭＦ（無水、１０ｍｌ）、ＴＰＴＵ（０．３９ｇ、１．３ｍｍｏｌ）、ＤＩＥＡ（０．４５ｍｌ、２．６ｍｍｏｌ）で１０分間処理した。ＤＭＦ溶液を真空下で除去し、反応フラスコに、ＤＭＦ（無水、８ｍｌ）中のヒドラジン水和物（２５％、０．４２ｍｌ、３．２５ｍｍｏｌ）を充填した。反応混合物を１時間振とうし、樹脂をフィルタで収集し、ＤＭＦ／イソプロパノールで交互に３回、ＣＨ２Ｃｌ２、エーテルで洗浄し、乾燥させた。
【０１８８】
この樹脂（０．２２ｇ、０．１４ｍｍｏｌ）に、ＤＭＦ（無水、３ｍｌ）、ＤＩＥＡ（０．１０ｍｌ、０．６０ｍｍｏｌ）、４−フルオロベンゼンスルホニルクロリド（０．１１ｇ、０．５６ｍｍｏｌ）を加え、混合物を３．５時間振とうし、樹脂をフィルタで収集し、ＤＭＦ／イソプロパノールで交互に３回、ＣＨ２Ｃｌ２、エーテルで洗浄し、乾燥させた。
【０１８９】
樹脂（０．２５ｇ）を、４０％ＴＦＡ／ＣＨ２Ｃｌ２（１０ｍｌ）、トリイソプロピルシラン（０．５ｍｌ）で１５分間処理し、濾液を収集し、減圧下で濃縮し、残渣を分取ＲＰ−ＨＰＬＣにより精製し、目的画分をプールし、酢酸（１０ｍｌ）から凍結乾燥して、（２Ｓ，４Ｒ）−４−メルカプト−１−（ナフタレン−２−スルホニル）ピロリジン−２−カルボン酸Ｎ′−（４−フルオロベンゼンスルホニル）ヒドラジドを白色の凍結乾燥物として得た。ＭＳ： ５１０．２ （ＭＨ−）
【０１９０】
上記の手順を経由して平行して調製した他の化合物を表１に示した。
【０１９１】
典型的手順：工程３、７、２
上記の（２Ｓ，４Ｒ）−４−スルファニル−１−（フルオレニルメトキシカルボニル）ピロリジン−２−カルボン酸で誘導体化された樹脂（２０．１ｇ、１１．９ｍｍｏｌ）を、ＤＭＦ（無水、１５０ｍｌ）、ＴＰＴＵ（７．１ｇ、２３．８ｍｍｏｌ）、ＤＩＥＡ（６．１ｍｌ、３５．７ｍｍｏｌ）で１０分間処理した。ＤＭＦ溶液を真空下で除去し、反応フラスコに、ＤＭＦ（無水、１００ｍｌ）中のトルエン−４−スルホンヒドラジド（６．６５ｇ、３５．７ｍｍｏｌ）を充填した。反応混合物を１６時間振とうし、樹脂をフィルタで収集し、ＤＭＦ／イソプロパノールで交互に３回、ＤＭＦで洗浄した。
【０１９２】
Ｆｍｏｃ基の除去を、２０％ピペリジン／ＤＭＦ（２×５分）で達成した。
【０１９３】
その後に続くピロリジン置換反応（例）
この樹脂（０．６０ｇ、０．３０ｍｍｏｌ）に、ＤＭＦ（無水、６ｍｌ）、ピリジン（０．１２ｍｌ、１．５０ｍｍｏｌ）、８−キノリンスルホニルクロリド（０．０８ｇ、０．３６ｍｍｏｌ）を加え、混合物を１６時間振とうし、樹脂をフィルタで収集し、ＤＭＦ／イソプロパノールで交互に３回、ＣＨ２Ｃｌ２、エーテルで洗浄し、乾燥させた。
【０１９４】
樹脂（０．２５ｍｇ）を、４０％ＴＦＡ／ＣＨ２Ｃｌ２（１０ｍｌ）、トリイソプロピルシラン（０．５ｍｌ）で１５分間処理し、濾液を収集し、減圧下で濃縮し、残渣を分取ＲＰ−ＨＰＬＣにより精製し、目的画分をプールし、酢酸（１０ｍｌ）から凍結乾燥して、（２Ｓ，４Ｒ）−４−メルカプト−１−（ナフタレン−２−スルホニル）ピロリジン−２−カルボン酸Ｎ′−（４−フルオロベンゼンスルホニル）ヒドラジドを白色の凍結乾燥物として得た。ＭＳ： ５０５．３ （ＭＨ−）
【０１９５】
上記の手順を経由して平行して調製した他の化合物を表１に示した。
【０１９６】
【表１】
2004504298.tif 000022
2004504298.tif 000023
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【０１９７】
実施例Ａ
下記の成分を含有する錠剤は常法により製造できた。
【０１９８】
【表２】
2004504298.tif 000031
【０１９９】
実施例Ｂ
下記の成分を含有するカプセルは常法により製造できた。
【０２００】
【表３】
2004504298.tif 000032
【０２０１】
実施例Ｃ
注射用液剤は下記の組成を有することができた。
【０２０２】
【表４】
2004504298.tif 000033
【０２０３】
実施例Ｄ
式（Ｉ）の化合物５００ｍｇを、Ｍｙｇｌｙｏｌ ８１２　３．５ｍｌ及びベンジルアルコール０．０８ｇに懸濁した。この懸濁液を、投薬弁を有する容器に充填した。５ｇのＦｒｅｏｎ １２を圧力下、弁を通して容器に充填した。振とうしてＦｒｅｏｎをＭｙｇｌｙｏｌ・ベンジルアルコール混合物に溶解した。このスプレー容器は、個別に適用できる一回量を約１００回分含有した。
【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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