(57)【要約】本発明は、相補的オリゴヌクレオチドプローブがほとんどミスマッチなくハイブリダイズすると考えられる支持体上で使用するための複数の捕捉オリゴヌクレオチドプローブの設計方法に関し、複数の捕捉オリゴヌクレオチドプローブは狭い範囲の融点を有する。本方法の第１段階は、４つのヌクレオチドが互いに結合した複数の四量体の第１のセットを提供する段階を伴い、ここで（１）セット内の各四量体は、セット内のすべての他の四量体と少なくとも２つのヌクレオチド塩基が異なり、（２）互いに相補的な２つの四量体はセット内に存在せず、（３）回文構造または２ヌクレオチドの反復である四量体はセット内に存在せず、かつ（４）１以下または３以上のヌクレオチドＧまたはＣを有する四量体はセット内に存在しない。第１のセット内の２つから４つの四量体の群を共に連結させて、多量体ユニットの集合を形成する。多量体のユニットの集合から、同じ四量体から形成された全ての多量体ユニット、および多量体ユニットを形成する四量体の数の４倍未満の温度（摂氏）の融点を有する全ての多量体ユニットを除去して、多量体ユニットの修正された集合を形成する。多量体ユニットの修正された集合を、融点の順に一覧にして並べる。融点の２℃の増分内で、多量体ユニットの修正された集合の順番を無作為化する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数の捕捉オリゴヌクレオチドプローブが狭い範囲の融点を有する、相補的オリゴヌクレオチドプローブがほとんどミスマッチなくハイブリダイズする支持体上で使用するための、複数の捕捉オリゴヌクレオチドプローブの設計方法であり、以下の段階を含む方法：
（１）セット内の各四量体は、セット内のすべての他の四量体と少なくとも２つのヌクレオチド塩基が異なり、（２）互いに相補的な２つの四量体はセット内に存在せず、（３）回文構造または２ヌクレオチドの反復である四量体はセット内に存在せず、かつ（４）１以下または３以上のヌクレオチドＧまたはＣを有する四量体はセット内に存在しない、４つのヌクレオチドが互いに結合した複数の四量体の第１のセットを提供する段階；
第１のセット内の２つから４つの四量体群を共に連結させて、多量体ユニットの集合（ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）を形成する段階；
多量体のユニットの集合から、同じ四量体から形成された全ての多量体ユニット、および多量体ユニットを形成する四量体の数の４倍未満の温度（摂氏）の融点を有する全ての多量体ユニットを除去して、多量体ユニットの修正された集合を形成する段階；
多量体ユニットの修正された集合を、融点の順に一覧にして並べる段階；
融点の２℃の増分内で、多量体ユニットの修正された集合の順番を、無作為化する（ｒａｎｄｏｍｉｚｅ）段階；
一覧中の多量体ユニットを交互に、各々が融点の順に並べられた第１および第２の亜集合（ｓｕｂ ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）に分割する段階；
第２の亜集合の順番を逆にする段階；
多量体ユニットの第１の集合を、逆にした多量体ユニットの第２の集合に順に結合させ、二重多量体ユニットの集合を形成する段階；ならびに
二重多量体ユニットの集合から、（１）四量体の数の１１倍未満および四量体の数の１５倍を上回る融点（摂氏）を有する二重多量体ユニット、（２）同じ四量体が３つ連結した二重多量体ユニット、および（３）同じ四量体が中断ありまたはなしで４つ連結した二重多量体ユニットを除去して、二重多量体ユニットの修正された集合を形成する段階。
【請求項２】
以下の段階をさらに含む、請求項１記載の方法：
支持体上で固定化されるべき相補的なオリゴヌクレオチドをその位置で捕捉できるように、二重多量体ユニットの修正された集合を支持体上の位置に配置する段階。
【請求項３】
二重多量体ユニットの集合が図２６に示される、請求項２記載の方法。
【請求項４】
二重多量体ユニットの集合が図２７に示される、請求項２記載の方法。
【請求項５】
除去される二重多量体ユニットの集合が、四量体の数の１２．５倍未満および四量体の数の１４倍を上回る融点（摂氏）を有する、請求項２記載の方法。
【請求項６】
多量体ユニットが１２ｍｅｒを有し、二重多量体ユニットが２４ｍｅｒを有し、二重多量体ユニットの融点が７５℃から８４℃である、請求項１記載の方法。
【請求項７】
以下の段階をさらに含む、請求項１記載の方法：
四量体の数の１１倍未満および四量体の数の１５倍を上回る融点（摂氏）を有する二重多量体ユニットを回収する（ｒｅｃｌａｉｍ）段階；
回収した二重多量体ユニットの連結を離して、各々が多量体ユニット対を形成する段階；
四量体の数の１１倍を上回り、四量体の数の１７倍未満の融点（摂氏）を有する多量体ユニットを選択する段階；ならびに
選択された多量体ユニットを該方法に再度組み込む段階。
【請求項８】
請求項７の方法が繰り返される、請求項７記載の方法。
【請求項９】
以下の段階をさらに含む、請求項１記載の方法：
第１のセットおよびその相補体の中の四量体の円順列（ｃｉｒｃｕｌａｒ ｐｅｒｍｕｔａｔｉｏｎ）を塩基ごとに産生することによって、複数の四量体の追加の異なるセットを作製する段階。
【請求項１０】
四量体のセットが表１に示されるものおよびその相補体である、請求項１記載の方法。
【請求項１１】
四量体のセットが、表１に示される四量体の１塩基の円順列およびその相補体である、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
四量体のセットが、表１に示される四量体の２塩基の円順列およびその相補体である、請求項１０記載の方法。
【請求項１３】
四量体のセットが、表１に示される四量体の３塩基の円順列およびその相補体である、請求項１０記載の方法。
【請求項１４】
二重多量体ユニットの集合が図２６に示される、請求項１記載の方法。
【請求項１５】
二重多量体ユニットの修正された集合が、図２７に示される、請求項１記載の方法。
【請求項１６】
二重多量体ユニットの集合が、四量体の数の１２．５倍未満および四量体の数の１４倍を上回る融点（摂氏）を有する、請求項１記載の方法。
【請求項１７】
以下を含むオリゴヌクレオチドアレイ：
支持体；ならびに
支持体上で固定化されるべき相補的オリゴヌクレオチドが異なる位置で捕捉されるような、支持体上の異なる位置にある二重多量体ユニットオリゴヌクレオチドの集合であって、ここで２４℃を上回る狭い温度範囲内で、ほとんどミスマッチなく、相補的オリゴヌクレオチドが二重多量体ユニットオリゴヌクレオチドの集合のメンバーにハイブリダイズすると考えられ、（１）セット内の各四量体は、セット内のすべての他の四量体と少なくとも２つのヌクレオチド塩基が異なり、（２）互いに相補的な２つの四量体はセット内に存在せず、（３）回文構造または２ヌクレオチドの反復である四量体はセット内に存在しない、二重多量体ユニットオリゴヌクレオチドは、四量体のセットから形成され、かつ、二重多量体ユニットオリゴヌクレオチドの集合の中から以下のオリゴヌクレオチドが除去されている：（１）四量体の数の１２．５倍未満および四量体の数の１４倍を上回る融点（摂氏）を有するオリゴヌクレオチド、（２）同じ四量体が３つ連結した二重多量体ユニット、および（３）同じ四量体が中断ありまたはなしで４つ連結した多量体ユニット。
【請求項１８】
二重多量体ユニットの集合が図２６に示される、請求項１７記載のオリゴヌクレオチドアレイ。
【請求項１９】
二重多量体ユニットの集合が、図２７に示される、請求項１７記載のオリゴヌクレオチドアレイ。
【請求項２０】
二重多量体ユニットの集合が、四量体の数の１２．５倍未満および四量体の数の１４倍を上回る融点（摂氏）を有する、請求項１７記載のオリゴヌクレオチドアレイ。
【請求項２１】
二重多量体ユニットが２４ｍｅｒを有し、二重多量体ユニットの融点が７５℃から８４℃である、請求項１７記載のオリゴヌクレオチドアレイ。
【請求項２２】
四量体のセットが表６に示されるものおよびその相補体である、請求項１７記載のオリゴヌクレオチドアレイ。
【請求項２３】
四量体のセットが、表６に示される四量体の１塩基の円順列およびその相補体である、請求項１７記載のオリゴヌクレオチドアレイ。
【請求項２４】
四量体のセットが、表６に示される四量体の２塩基の円順列およびその相補体である、請求項１７記載のオリゴヌクレオチドアレイ。
【請求項２５】
四量体のセットが、表６に示される四量体の３塩基の円順列およびその相補体である、請求項１７記載のオリゴヌクレオチドアレイ。
【請求項２６】
以下の段階を含む、複数の標的ヌクレオチド配列中で、１つまたは複数の単一塩基の変化、挿入、欠失、または転座により異なる複数の配列のうち１つまたは複数を同定する方法：
複数の配列の違いを有する１つまたは複数の標的ヌクレオチド配列を含む可能性のある試料を提供する段階；
（ａ）標的特異的部分および位置特定可能な（ａｄｄｒｅｓｓａｂｌｅ）アレイ特異的部分を有する第１のオリゴヌクレオチドプローブ、および（ｂ）標的特異的部分および検出可能なレポーター標識を有する第２のオリゴヌクレオチドプローブにより各セットが特徴づけられる、複数のオリゴヌクレオチドプローブセットを提供する段階であって、ここで特定のセット中のオリゴヌクレオチドプローブは、対応する標的ヌクレオチド配列上で互いに隣接してハイブリダイズする場合、互いに連結するのに適しているが、試料中に存在する他の任意のヌクレオチド配列にハイブリダイズする場合は、そのような連結を妨げるミスマッチを有する；
リガーゼを提供する段階；
試料、複数のオリゴヌクレオチドプローブセット、およびリガーゼを混合して、混合液を形成する段階；
任意のハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドが標的ヌクレオチド配列から分離される変性処理および、オリゴヌクレオチドプローブセットが塩基特異的にそれぞれの標的ヌクレオチド配列（試料中に存在する場合）上の隣接する位置にハイブリダイズし、互いに連結して、（ａ）位置特定可能なアレイ特異的部分、（ｂ）互いに連結された標的特異的部分、および（ｃ）検出可能なレポーター標識を含む連結産物配列を形成するハイブリダイゼーション処理を含む１回またはそれ以上のリガーゼ検出反応サイクルに混合液を供する段階であって、ここでオリゴヌクレオチドプローブセットは、各々の標的ヌクレオチド配列以外の試料中のヌクレオチド配列にハイブリダイズしてよいが、１つまたは複数のミスマッチの存在のために互いに連結せず、変性処理の間に個々に分離する；
異なる位置に固定化された異なる捕捉オリゴヌクレオチドを有する支持体を提供する段階であって、ここで、捕捉オリゴヌクレオチドは、位置特定可能なアレイ特異的部分に相補的なヌクレオチド配列を有し、かつ二重多量体ユニットオリゴヌクレオチドの集合から形成され、ここで位置特定可能なアレイ特異的部分を有するオリゴヌクレオチドは、多量体ユニット中の四量体の数の４倍を上回る狭い温度範囲内で、捕捉オリゴヌクレオチドにほとんどミスマッチなくハイブリダイズすると考えられ、二重多量体ユニットオリゴヌクレオチドは以下のような四量体のセットから形成される：（１）セット内の各四量体は、セット内のすべての他の四量体と少なくとも２つのヌクレオチド塩基が異なり、（２）互いに相補的な２つの四量体はセット内に存在せず、（３）回文構造または２ヌクレオチドの反復である四量体はセット内に存在せず、かつ、二重多量体ユニットの修正された集合を形成するために、二重多量体ユニットオリゴヌクレオチドの集合の中から以下のオリゴヌクレオチドが除去されている：（１）四量体の数の１１倍の、および四量体の数の１５倍を上回る融点（摂氏）を有するオリゴヌクレオチド、（２）同じ四量体が３つ連結した二重多量体ユニット、ならびに（３）同じ四量体が中断ありまたはなしで４つ連結した二重多量体ユニット；
供する段階の後、位置特定可能なアレイ特異的部分が塩基特異的に捕捉オリゴヌクレオチドにハイブリダイズするのに効果的な条件下で、混合液に支持体を接触させ、それによって、相補的捕捉オリゴヌクレオチドを有する部位において、位置特定可能なアレイ特異的部分を支持体上で捕捉する段階；ならびに
支持体上の特定の部位で捕捉された連結産物配列のレポーター標識を検出し、それにより試料中の１つまたは複数の標的ヌクレオチド配列の存在を示す段階。
【請求項２７】
連結接合部での完全な相補性により、対応する標的ヌクレオチド配列上で互いに隣接してハイブリダイズする場合は、セット中のオリゴヌクレオチドプローブは連結接合部で共に連結するのに適しているが、試料中に存在する他の任意のヌクレオチド配列にハイブリダイズする場合は、セット中のオリゴヌクレオチドプローブにはそのような連結を妨げる、連結接合部における塩基のミスマッチがある、請求項２６記載の方法。
【請求項２８】
ミスマッチが連結接合部の３’塩基にある、請求項２７記載の方法。
【請求項２９】
連結接合部での完全な相補性により、対応する標的ヌクレオチド配列上で互いに隣接してハイブリダイズする場合は、セット中のオリゴヌクレオチドプローブは連結接合部で共に連結するのに適しているが、試料中に存在する他の任意のヌクレオチド配列にハイブリダイズする場合は、セット中のオリゴヌクレオチドプローブにはそのような連結を妨げる、連結接合部の塩基に隣接する塩基にミスマッチがある、請求項２６記載の方法。
【請求項３０】
ミスマッチが連結接合部の３’塩基に隣接する塩基にある、請求項２９記載の方法。
【請求項３１】
試料が潜在的に、複数の配列の違いを有する複数の標的配列のうちの１つまたは複数を未知の量含む、請求項２６記載の方法であり、以下の段階をさらに含む方法：
検出段階後に、試料から作製された捕捉された連結産物配列の量を、既知の量の標的ヌクレオチド配列を含む試料から作製された捕捉された連結産物配列の検量線と比較することによって、試料中の標的ヌクレオチド配列の量を定量する段階。
【請求項３２】
試料が潜在的に、複数の配列の違いを有する複数の標的ヌクレオチド配列のうちの１つまたは複数を未知の量含む、請求項２６記載の方法であり、以下の段階をさらに含む方法：
既知の量の１つまたは複数のマーカー標的ヌクレオチド配列を提供する段階；
（ａ）マーカー標的ヌクレオチド配列に相補的な標的特異的部分および支持体上の捕捉オリゴヌクレオチドに相補的な位置特定可能なアレイ特異的部分を有する第１のオリゴヌクレオチドプローブ、および（ｂ）マーカー標的ヌクレオチド配列に相補的な標的特異的部分および検出可能なレポーター標識を有する第２のオリゴヌクレオチドプローブにより各セットが特徴づけられる、複数のマーカー特異的オリゴヌクレオチドプローブセットを提供する段階であって、ここで特定のマーカー特異的オリゴヌクレオチドセット中のオリゴヌクレオチドプローブは、対応するマーカー標的ヌクレオチド配列上で互いに隣接してハイブリダイズする場合、互いに連結するのに適しているが、試料中に存在する他の任意のヌクレオチド配列または添加されたマーカー配列にハイブリダイズする場合は、そのような連結を妨げるミスマッチを有し、混合段階は試料、マーカー標的ヌクレオチド配列、複数のオリゴヌクレオチドプローブセット、複数のマーカー特異的オリゴヌクレオチドプローブセット、およびリガーゼを混合して混合液を形成する段階を含む；
特定の部位で支持体上に捕捉された連結されたマーカー特異的オリゴヌクレオチドセットのレポーター標識を検出し、それにより、試料中の１つまたは複数のマーカー標的ヌクレオチド配列の存在を示す段階；および
既知の量のマーカー標的ヌクレオチド配列から作製された捕捉された連結産物の量を、捕捉された他の連結産物の量と比較することによって、試料中の標的ヌクレオチド配列の量を定量する段階。
【請求項３３】
１つまたは複数のマーカー標的ヌクレオチド配列が、試料中の標的ヌクレオチド配列と、１つまたは複数の単一のヌクレオチド位置で異なる、請求項３１記載の方法。
【請求項３４】
オリゴヌクレオチドプローブセットおよびマーカー特異的オリゴヌクレオチドプローブセットが、複数のオリゴヌクレオチドプローブ群を形成し、各群が単一のヌクレオチド位置での複数の対立遺伝子の違いを区別するために設計された１つまたは複数のオリゴヌクレオチドプローブセットを含み、各群のオリゴヌクレオチドプローブセット中では、第１のオリゴヌクレオチドプローブは共通の標的特異的部分を有し、かつ、第２のオリゴヌクレオチドプローブは所与の対立遺伝子またはマーカーヌクレオチド配列に塩基特異的にハイブリダイズする異なる標的特異的部分を有する、請求項３３記載の方法。
【請求項３５】
オリゴヌクレオチドプローブセットおよびマーカー特異的オリゴヌクレオチドプローブセットが、複数のオリゴヌクレオチドプローブ群を形成し、各群が単一のヌクレオチド位置での複数の対立遺伝子の違いを区別するために設計された１つまたは複数のオリゴヌクレオチドプローブセットを含み、各群のオリゴヌクレオチドプローブセット中では、第２のオリゴヌクレオチドプローブは共通の標的特異的部分を有し、かつ、第１のオリゴヌクレオチドプローブは所与の対立遺伝子またはマーカーヌクレオチド配列に塩基特異的にハイブリダイズする異なる標的特異的部分を有する、請求項３３記載の方法。
【請求項３６】
試料が潜在的に、複数の配列の違いを有する複数の標的ヌクレオチド配列のうちの２つまたはそれ以上を未知の量含む、請求項２６記載の方法であり、以下の段階をさらに含む方法：
検出段階後に、試料内の複数の標的配列の各々により作製された捕捉された連結産物配列の相対量を比較することにより試料中の複数の標的ヌクレオチド配列のそれぞれの相対量を定量し、それにより試料内の２つまたはそれ以上の標的ヌクレオチド配列の相対レベルの定量測定を提供する段階。
【請求項３７】
オリゴヌクレオチドプローブセットの標的特異的部分が、実質的に同じ融点を有し、そのため類似のハイブリダイゼーション条件下で標的ヌクレオチド配列にハイブリダイズする、請求項２６記載の方法。
【請求項３８】
単一の標的ヌクレオチド配列中の１つもしくは複数のヌクレオチド位置における複数の対立遺伝子の違い、または複数の標的ヌクレオチド配列中の１つもしくは複数の位置における複数の対立遺伝子の違いが区別され、オリゴヌクレオチドプローブセットはそれぞれ複数のオリゴヌクレオチドプローブ群を形成し、各群は単一のヌクレオチド位置における複数の対立遺伝子の違いを区別するために設計された１つまたは複数のオリゴヌクレオチドプローブセットを含み、各群のオリゴヌクレオチドプローブ中で、第２のオリゴヌクレオチドプローブは共通の標的特異的部分を有し、第１のオリゴヌクレオチドプローブは、所与の対立遺伝子に塩基特異的にハイブリダイズする異なる標的特異的部分を含み、検出段階において、異なる部位で支持体上に捕捉された各群の連結産物配列の標識が検出され、それによって、試料中の、１つまたは複数の標的ヌクレオチド配列中の１つまたは複数のヌクレオチド位置における１つまたは複数の対立遺伝子の存在を示す、請求項２６記載の方法。
【請求項３９】
連結接合部での完全な相補性により、対応する標的ヌクレオチド配列上で互いに隣接してハイブリダイズする場合は、所与のセット中のオリゴヌクレオチドプローブは連結接合部で共に連結するのに適しているが、試料中に存在する他の任意のヌクレオチド配列にハイブリダイズする場合は、第１のオリゴヌクレオチドプローブはそのような連結を妨げる連結接合部における塩基のミスマッチを有する、請求項３８記載の方法。
【請求項４０】
単一の標的ヌクレオチド配列における、２つもしくはそれ以上の隣接するヌクレオチド位置、または重複するオリゴヌクレオチドプローブセットを必要とするヌクレオチド位置における複数の対立遺伝子の違い、または複数の標的ヌクレオチド配列における、２つもしくはそれ以上の隣接するヌクレオチド位置、もしくは重複するオリゴヌクレオチドプローブセットを必要とするヌクレオチド位置における複数の対立遺伝子の違いが、重複する標的特異的部分を有するオリゴヌクレオチドプローブを有するオリゴヌクレオチドプローブ群によって区別される、請求項３８記載の方法。
【請求項４１】
連結接合部での完全な相補性により、対応する標的ヌクレオチド配列上で互いに隣接してハイブリダイズする場合は、セット中のオリゴヌクレオチドプローブは連結接合部で共に連結するのに適しているが、セット中のオリゴヌクレオチドプローブが試料中に存在する他の任意のヌクレオチド配列にハイブリダイズする場合は、そのような連結を妨げる連結接合部における塩基のミスマッチが存在する、請求項４０記載の方法。
【請求項４２】
単一の標的ヌクレオチド配列における、重複するオリゴヌクレオチドプローブセットを必要とする、１つもしくは複数のヌクレオチド位置における、挿入、欠失、マイクロサテライトリピート、転座、もしくはその他のＤＮＡ再配列からなる複数の対立遺伝子の違い、または複数の標的ヌクレオチド配列における、重複するオリゴヌクレオチドプローブセットを必要とする、１つもしくは複数のヌクレオチド位置における、挿入、欠失、マイクロサテライトリピート、転座、もしくはその他のＤＮＡ再配列からなる複数の対立遺伝子の違いが区別され、オリゴヌクレオチドプローブセットが複数のオリゴヌクレオチドプローブ群を形成し、各群は、重複するオリゴヌクレオチドプローブセットを必要とする、１つまたは複数のヌクレオチド位置における、挿入、欠失、マイクロサテライトリピート、転座、およびその他のＤＮＡ再配列からなる群より選択される、複数の対立遺伝子の違いを区別するために設計された１つまたは複数のオリゴヌクレオチドプローブセットを含み、ここで、各群のオリゴヌクレオチドプローブセット中で、第２のオリゴヌクレオチドプローブは共通の標的特異的部分を有し、第１のオリゴヌクレオチドプローブは、所与の対立遺伝子に塩基特異的にハイブリダイズする異なる標的特異的部分を含み、検出段階において、異なる部位で支持体上に捕捉された各群の連結産物配列の標識が検出され、それによって、試料中で、１つまたは複数のヌクレオチド位置における、挿入、欠失、マイクロサテライトリピート、転座、およびその他のＤＮＡ再配列からなる群より選択される、１つまたは複数の対立遺伝子の違いの存在を示す、請求項２６記載の方法。
【請求項４３】
オリゴヌクレオチドプローブセットが重複するオリゴヌクレオチドプローブセットを必要とする、１つまたは複数のヌクレオチド位置における、挿入、欠失、およびマイクロサテライトリピートからなる群より選択される複数の対立遺伝子の違いを区別するために設計され、各群のオリゴヌクレオチドプローブセット中で、第２のオリゴヌクレオチドプローブは共通の標的特異的部分を有し、第１のオリゴヌクレオチドプローブは、所与の対立遺伝子に塩基特異的にハイブリダイズする異なる長さの反復配列を含む異なる標的特異的部分を有する、請求項４２記載の方法。
【請求項４４】
過剰な正常配列の存在下で、単一の標的ヌクレオチド配列における、複数の隣接ヌクレオチド位置もしくは重複するオリゴヌクレオチドプローブセットを必要とするヌクレオチド位置における少量の複数の対立遺伝子の違い、または、過剰な正常配列の存在下で、複数の標的ヌクレオチド配列における、重複するオリゴヌクレオチドプローブセットを必要とする複数のヌクレオチド位置における少量の複数の対立遺伝子の違いが区別され、オリゴヌクレオチドプローブセットは複数のオリゴヌクレオチドプローブ群を形成し、各群は、単一のヌクレオチド位置における複数の対立遺伝子の違いを区別するために設計された１つまたは複数のオリゴヌクレオチドプローブセットを含み、群内の１つまたは複数のセットは共通の第２のオリゴヌクレオチドプローブを有し、第１のオリゴヌクレオチドプローブは正常な対立遺伝子を除く所与の対立遺伝子に塩基特異的にハイブリダイズする異なる標的特異的部分を有し、検出段階においては、異なる部位で支持体上に捕捉された各群の連結産物配列の標識が検出され、それによって、試料中の、１つまたは複数の標的ヌクレオチド配列の１つまたは複数のヌクレオチド位置における１つまたは複数の量の少ない対立遺伝子の存在を示す、請求項２６記載の方法。
【請求項４５】
連結接合部での完全な相補性により、対応する標的ヌクレオチド配列上で互いに隣接してハイブリダイズする場合は、セット中のオリゴヌクレオチドプローブは連結接合部で共に連結するのに適しているが、セット中のオリゴヌクレオチドプローブが試料中に存在する他の任意のヌクレオチド配列にハイブリダイズする場合は、第１のオリゴヌクレオチドプローブはそのような連結を妨げる連結接合部における塩基のミスマッチを有する、請求項４４記載の方法。
【請求項４６】
過剰な正常配列の存在下で、単一の標的ヌクレオチド配列内の、複数の隣接ヌクレオチド位置もしくは重複するオリゴヌクレオチドプローブセットを必要とするヌクレオチド位置における少量の複数の対立遺伝子の違い、または、過剰な正常配列の存在下で、複数の標的ヌクレオチド配列における、重複するオリゴヌクレオチドプローブセットを必要とする、複数のヌクレオチド位置における少量の複数の対立遺伝子の違いが試料中で定量される、請求項４４記載の方法であって、以下の段階をさらに含む方法：
既知の量の１つまたは複数のマーカー標的ヌクレオチド配列を提供する段階；
（ａ）マーカー標的ヌクレオチド配列に相補的な標的特異的部分および位置特定可能なアレイ特異的部分を有する第１のオリゴヌクレオチドプローブ、および（ｂ）マーカー標的ヌクレオチド配列に相補的な標的特異的部分および検出可能なレポーター標識を有する第２のオリゴヌクレオチドプローブにより各セットが特徴づけられる、複数のマーカー特異的オリゴヌクレオチドプローブセットを提供する段階、ここで特定のマーカー特異的オリゴヌクレオチドセット中のオリゴヌクレオチドプローブは、対応するマーカー標的ヌクレオチド配列上で互いに隣接してハイブリダイズする場合、共に連結するのに適しているが、試料中に存在する他の任意のヌクレオチド配列または添加されたマーカー配列にハイブリダイズする場合は、そのような連結を妨げるミスマッチを有する；
各々の群が、マーカーヌクレオチド配列を含む、単一のヌクレオチド位置での複数の対立遺伝子の違いを区別するために設計された１つまたは複数のオリゴヌクレオチドプローブセットもしくはマーカー特異的オリゴヌクレオチドプローブセットを含む、複数のオリゴヌクレオチドプローブ群を提供する段階、ここで群内の１つまたは複数のセットは共通の第２のオリゴヌクレオチドプローブを有し、第１のオリゴヌクレオチドプローブは正常な対立遺伝子を除く所与の対立遺伝子またはマーカーヌクレオチド配列に塩基特異的にハイブリダイズする異なる標的特異的部分を有し、混合段階が試料、マーカー標的ヌクレオチド配列、複数のオリゴヌクレオチドプローブセット、複数のマーカー特異的オリゴヌクレオチドプローブセット、およびリガーゼを混合して混合液を混合する段階を含む；
特定の部位で支持体上に捕捉された連結されたマーカー特異的オリゴヌクレオチドセットのレポーター標識を検出し、それによって試料中の１つまたは複数のマーカー標的ヌクレオチド配列の存在を示す段階；ならびに
既知の量のマーカー標的ヌクレオチド配列から作製された捕捉された連結産物の量と少量の未知の試料から作製されたその他の捕捉された連結産物の量を比較することによって、試料中の標的ヌクレオチド配列の量を定量する段階。
【請求項４７】
連結接合部での完全な相補性により、選択された条件下で対応する標的ヌクレオチド配列上で互いに隣接してハイブリダイズする場合は、セット中のオリゴヌクレオチドプローブは連結接合部で共に連結するのに適しているが、セット中のオリゴヌクレオチドプローブが試料中に存在する他の任意のヌクレオチド配列にハイブリダイズする場合は、第１のオリゴヌクレオチドプローブはそのような連結を妨げる連結接合部における塩基のミスマッチを有する、請求項４６記載の方法。
【請求項４８】
単一の標的ヌクレオチド配列中の１つもしくは複数のヌクレオチド位置における複数の対立遺伝子の違い、または複数の標的ヌクレオチド配列中の１つまたは複数の位置における、複数の対立遺伝子の違いが区別され、オリゴヌクレオチドセットは複数のオリゴヌクレオチドプローブ群を形成し、各群は、単一のヌクレオチド位置における複数の対立遺伝子の違いを区別するために設計された１つまたは複数のオリゴヌクレオチドプローブセットを含み、各群のオリゴヌクレオチドプローブ中で、第１のオリゴヌクレオチドプローブは共通の標的特異的部分を有し、第２のオリゴヌクレオチドプローブは、所与の対立遺伝子に塩基特異的にハイブリダイズする異なる標的特異的部分を含み、検出段階においては、特定の部位で支持体上に捕捉された各群の連結産物配列の異なるレポーター標識が検出され、それによって、試料中の、１つまたは複数の標的ヌクレオチド配列中の１つまたは複数のヌクレオチド位置における１つまたは複数の対立遺伝子の存在が示される、請求項２６記載の方法。
【請求項４９】
連結接合部での完全な相補性により、対応する標的ヌクレオチド配列上で互いに隣接してハイブリダイズする場合は、セット中のオリゴヌクレオチドプローブは連結接合部で共に連結するのに適しているが、セット中のオリゴヌクレオチドプローブが試料中に存在する他の任意のヌクレオチド配列にハイブリダイズする場合は、第２のオリゴヌクレオチドプローブはそのような連結を妨げる連結接合部における塩基のミスマッチを有する、請求項４８記載の方法。
【請求項５０】
単一の標的ヌクレオチド配列における、２つもしくはそれ以上の隣接するヌクレオチド位置、もしくは重複するオリゴヌクレオチドプローブセットを必要とするヌクレオチド位置における複数の対立遺伝子の違い、または複数の標的ヌクレオチド配列における、２つもしくはそれ以上の隣接するヌクレオチド位置、もしくは重複するオリゴヌクレオチドプローブセットを必要とするヌクレオチド位置における複数の対立遺伝子の違いが区別され、オリゴヌクレオチドプローブ群が、重複する標的特異的部分を有するオリゴヌクレオチドプローブを含む、請求項４８記載の方法。
【請求項５１】
連結接合部での完全な相補性により、対応する標的ヌクレオチド配列上で互いに隣接してハイブリダイズする場合は、セット中のオリゴヌクレオチドプローブは連結接合部で共に連結するのに適しているが、セット中のオリゴヌクレオチドプローブが試料中に存在する他の任意のヌクレオチド配列にハイブリダイズする場合は、第２のオリゴヌクレオチドプローブが、そのような連結を妨げる連結接合部における塩基のミスマッチを有する、請求項５０記載の方法。
【請求項５２】
単一の標的ヌクレオチド配列中の１つもしくは複数のヌクレオチド位置における複数の対立遺伝子の違い、または複数の標的ヌクレオチド配列中の１つもしくは複数の位置における複数の対立遺伝子の違いが区別され、オリゴヌクレオチドセットが複数のプローブ群を形成し、各群が、単一のヌクレオチド位置における複数の対立遺伝子の違いを区別するために設計された１つまたは複数のオリゴヌクレオチドプローブセットを含み、異なる群のオリゴヌクレオチドプローブ中で、第２のオリゴヌクレオチドプローブが共通の標的特異的部分を有するか、または第１のオリゴヌクレオチドプローブが共通の標的特異的部分を有し、検出段階において、特定の部位で支持体上に捕捉された各群の複数の標識された連結産物配列のうちの１つが検出され、それによって、試料中の、１つまたは複数の標的ヌクレオチド配列中の１つまたは複数のヌクレオチド位置における１つまたは複数の対立遺伝子の存在が示される、請求項２６記載の方法。
【請求項５３】
連結接合部での完全な相補性により、対応する標的ヌクレオチド配列上で互いに隣接してハイブリダイズする場合は、所与のセット中のオリゴヌクレオチドプローブは連結接合部で共に連結するのに適しているが、セット中のオリゴヌクレオチドが試料中に存在する他の任意のヌクレオチド配列にハイブリダイズする場合は、第１または第２のオリゴヌクレオチドプローブはそのような連結を妨げる連結接合部における塩基のミスマッチを有する、請求項５２記載の方法。
【請求項５４】
標的ヌクレオチド配列における、２つもしくはそれ以上の隣接するヌクレオチド位置、もしくは重複するオリゴヌクレオチドプローブセットを必要とするヌクレオチド位置における複数の対立遺伝子の違い、または複数の標的ヌクレオチド配列における、２つもしくはそれ以上の隣接するヌクレオチド位置、もしくは重複するオリゴヌクレオチドプローブセットを必要とするヌクレオチド位置における複数の対立遺伝子の違いが区別され、オリゴヌクレオチドプローブ群が、重複する標的特異的部分を有するプローブを含む、請求項５２記載の方法。
【請求項５５】
連結接合部での完全な相補性により、対応する標的ヌクレオチド配列上で互いに隣接してハイブリダイズする場合は、セット中のオリゴヌクレオチドプローブは連結接合部で共に連結するのに適しているが、セット中のオリゴヌクレオチドが試料中に存在する他の任意のヌクレオチド配列にハイブリダイズする場合は、第１または第２のオリゴヌクレオチドプローブはそのような連結を妨げる連結接合部における塩基のミスマッチを有する、請求項５４記載の方法。
【請求項５６】
単一の標的ヌクレオチド配列中の単一のコドンについての全ての可能な単一塩基変異、単一の標的ヌクレオチド配列中の複数のコドンについての全ての可能な単一塩基変異、および複数の標的ヌクレオチド配列中の複数のコドンについての全ての可能な単一塩基変異が区別され、オリゴヌクレオチドセットが複数のオリゴヌクレオチドプローブ群を形成し、各群が単一コドンについての全ての可能な単一塩基変異を区別するために設計された１つまたは複数のオリゴヌクレオチドプローブセットからなり、各群のオリゴヌクレオチドプローブにおいて、第２のオリゴヌクレオチドプローブは、連結接合部の５’塩基のみにおいて異なり、かつ異なるレポーター標識を含み、第１のオリゴヌクレオチドプローブは、連結接合部における３’塩基のみにおいて異なり、かつ異なる位置特定可能なアレイ特異的部分を含む、または第１のオリゴヌクレオチドプローブは、連結接合部の塩基に隣接する３’塩基のみにおいて異なり、かつ異なる位置特定可能なアレイ特異的部分を含む、請求項５３記載の方法。
【請求項５７】
連結接合部での完全な相補性により、対応する標的ヌクレオチド配列上で互いに隣接してハイブリダイズする場合は、セット中のオリゴヌクレオチドプローブは連結接合部で共に連結するのに適しているが、セット中のオリゴヌクレオチドプローブが試料中に存在する他の任意のヌクレオチド配列にハイブリダイズする場合は、第１のオリゴヌクレオチドプローブは連結接合部の３’塩基もしくは連結接合部の塩基に隣接する３’塩基にミスマッチを有する、または第２のオリゴヌクレオチドプローブはそのような連結を妨げる連結接合部の５’塩基にミスマッチを有する、請求項５３記載の方法。
【請求項５８】
単一の標的ヌクレオチド配列中の単一のコドンについての全ての可能な単一塩基変異、または複数の標的ヌクレオチド配列における、２つまたはそれ以上の隣接するコドンについての、もしくは重複するオリゴヌクレオチドプローブセットを必要とするヌクレオチド位置における全ての可能な単一塩基変異が区別され、オリゴヌクレオチドプローブ群が重複する標的特異的部分を有するオリゴヌクレオチドプローブを含む、請求項５７記載の方法。
【請求項５９】
変性処理が約８０℃から１０５℃の温度である、請求項２６記載の方法。
【請求項６０】
変性処理およびハイブリダイゼーション処理を含む各サイクルの長さが、約３０秒から約５分である、請求項２６記載の方法。
【請求項６１】
供する段階が、２サイクルから５０サイクル繰り返される、請求項２６記載の方法。
【請求項６２】
供する段階の合計時間が１分から２５０分である、請求項２６記載の方法。
【請求項６３】
リガーゼが、サーマス・アクアティクス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ）リガーゼ、サーマス・サーモフィルス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）リガーゼ、大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）リガーゼ、Ｔ４リガーゼ、およびピロコッカス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ）リガーゼからなる群より選択される、請求項２６記載の方法。
【請求項６４】
検出可能なレポーター標識が、発色団（ｃｈｌｏｍｏｐｈｏｒｅ）、蛍光部分、酵素、抗原、重金属、磁気プローブ、色素、リン光基、放射性物質、化学発光部分、および電気化学検出部分からなる群より選択される、請求項２６記載の方法。
【請求項６５】
オリゴヌクレオチドプローブの標的特異的部分が、それぞれ２０℃から８５℃のハイブリダイゼーション温度を有する、請求項２６記載の方法。
【請求項６６】
オリゴヌクレオチドプローブの標的特異的部分の長さが、２０ヌクレオチドから２８ヌクレオチドである、請求項２６記載の方法。
【請求項６７】
混合液がさらに担体ＤＮＡを含む、請求項２６記載の方法。
【請求項６８】
混合段階の前に試料中の標的ヌクレオチド配列を増幅する段階をさらに含む、請求項２６記載の方法。
【請求項６９】
増幅段階が、試料をポリメラーゼに基づく増幅手順に供することによって行われる、請求項６８記載の方法。
【請求項７０】
ポリメラーゼに基づく増幅手順が、ＤＮＡポリメラーゼを用いて行われる、請求項６８記載の方法。
【請求項７１】
ポリメラーゼに基づく増幅手順が、逆転写酵素を用いて行われる、請求項６８記載の方法。
【請求項７２】
ポリメラーゼに基づく増幅手順が、ＲＮＡポリメラーゼを用いて行われる、請求項６８記載の方法。
【請求項７３】
増幅段階が、試料中の標的ヌクレオチド配列をリガーゼ連鎖反応過程に供することによって行われる、請求項６８記載の方法。
【請求項７４】
オリゴヌクレオチドプローブセットが、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、修飾リボヌクレオチド、修飾デオキシリボヌクレオチド、ペプチド核酸、修飾ペプチド核酸、修飾リン酸−糖骨格オリゴヌクレオチド、ヌクレオチド類似体、およびそれらの混合物からなる群より選択される、請求項２６記載の方法。
【請求項７５】
細菌性、ウイルス性、寄生性（ｐａｒａｓｉｔｉｃ）、および真菌性の感染病原体（ａｇｅｎｔ）によって引き起こされる感染症を検出するために使用される、請求項２６記載の方法。
【請求項７６】
感染症が、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、サルモネラ菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、リステリア菌（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、マイコバクテリウム・アビウム−イントラセルラーレ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｖｉｕｍ−ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ）、エルシニア（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）、フランシセラ（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ）、パスツレラ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ）、ブルセラ（Ｂｒｕｃｅｌｌａ）、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ）、百日咳菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）、バクテロイデス（ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）、肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）、β型溶血連鎖球菌（β−Ｈｅｍｏｌｙｔｉｃ ｓｔｒｅｐ．）、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉａ）、レジオネラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ）、マイコプラズマ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）、ウレアプラズマ（Ｕｒｅａｐｌａｓｍａ）、クラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ）、淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｅａ）、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ）、インフルエンザ菌（Ｈｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ）、エンテロコッカス・フェカーリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）、プロテウス・ブルガリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ ｖｕｌｇａｒｉｓ）、プロテウス・ミラビリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ ｍｉｒａｂｉｌｉｓ）、ヘリコバクター・ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ）、梅毒トレポネーマ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｐａｌｌａｄｉｕｍ）、ボレリア・バーグドーフェリ（Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）、回帰熱ボレリア（Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｒｅｃｕｒｒｅｎｔｉｓ）、リケッチア（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａｌ）病原菌、ノカルジア（Ｎｏｃａｒｄｉａ）、およびアクチノミセス（Ａｃｉｔｎｏｍｙｃｅｔｅｓ）からなる群より選択される細菌によって引き起こされる、請求項７５記載の方法。
【請求項７７】
感染症が、クリプトコッカス・ネオフォルマンス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ）、ブラストミセス・デルマティティディス（Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｓ ｄｅｒｍａｔｉｔｉｄｉｓ）、ヒストプラスマ・カプスラーツム（Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ ｃａｐｓｕｌａｔｕｍ）、コクシジオイデス・イミチス（Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ ｉｍｍｉｔｉｓ）、ブラジルパラコクシジオイデス（Ｐａｒａｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）、アスペルギルス・フミガーツス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）、藻菌類（Ｐｈｙｃｏｍｙｃｅｔｅｓ）（クモノスカビ（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ））、スポロトリックス・シェンキィ（Ｓｐｏｒｏｔｈｒｉｘ ｓｃｈｅｎｃｋｉｉ）、クロモミコーシス（Ｃｈｒｏｍｏｍｙｃｏｓｉｓ）、およびマズラミコーシス（Ｍａｄｕｒｏｍｙｃｏｓｉｓ）からなる群より選択される真菌性感染病原体によって引き起こされる、請求項７５記載の方法。
【請求項７８】
感染症が、ヒト免疫不全ウイルス、ヒトＴリンパ球好性ウイルス、肝炎ウイルス（例えば、Ｂ型肝炎ウイルスおよびＣ型肝炎ウイルス）、エプスタイン−バーウイルス、サイトメガロウイルス、ヒトパピローマウイルス、オルソミクソウイルス、パラミクソウイルス、アデノウイルス、コロナウイルス、ラブドウイルス、ポリオウイルス、トガウイルス、ブンヤウイルス、アレナウイルス、風疹ウイルス、およびレオウイルスからなる群より選択されるウイルス性感染病原体によって引き起こされる、請求項７５記載の方法。
【請求項７９】
感染症が、熱帯熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）、四日熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｍａｌａｒｉａ）、三日熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｖｉｖａｘ）、卵形マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｏｖａｌｅ）、回旋糸状虫（Ｏｎｃｈｏｃｅｒｃａ ｖｏｌｖｕｌｕｓ）、リーシュマニア（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ）、トリパノソーマ種（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｓｐｐ．）、住血吸虫種（Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ ｓｐｐ．）、赤痢アメーバ（Ｅｎｔａｍｏｅｂａ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ）、クリプトスポリジウム（Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）、ジアルジア種（Ｇｉａｒｄｉａ ｓｐｐ．）、トリコモナス種（Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ ｓｐｐ．）、大腸バランチジウム（Ｂａｌａｎｔｉｄｉｕｍ ｃｏｌｉ）、バンクロフト糸状虫（Ｗｕｃｈｅｒｅｒｉａ ｂａｎｃｒｏｆｔｉ）、トキソプラズマ種（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ ｓｐｐ．）、蟯虫（Ｅｎｔｅｒｏｂｉｕｓ ｖｅｒｍｉｃｕｌａｒｉｓ）、回虫（Ａｓｃａｒｉｓ ｌｕｍｂｒｉｃｏｉｄｅｓ）、鞭虫（Ｔｒｉｃｈｕｒｉｓ ｔｒｉｃｈｉｕｒａ）、メジナ虫（Ｄｒａｃｕｎｃｕｌｕｓ ｍｅｄｉｎｅｓｉｓ）、吸虫類（ｔｒｅｍａｔｏｄｅｓ）、広節裂頭条虫（Ｄｉｐｈｙｌｌｏｂｏｔｈｒｉｕｍ ｌａｔｕｍ）、条虫種（Ｔａｅｎｉａ ｓｐｐ．）、ニューモシスチス・カリニ（Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ ｃａｒｉｎｉｉ）、およびアメリカ鉤虫（Ｎｅｃａｔｏｒ ａｍｅｒｉｃａｎｉｓ）からなる群より選択される寄生性感染病原体によって引き起こされる、請求項７５記載の方法。
【請求項８０】
遺伝病を検出するために使用される、請求項２６記載の方法。
【請求項８１】
遺伝病が、２１ヒドロキシラーゼ欠損症、嚢胞性線維症、脆弱Ｘ症候群、ターナー症候群、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、ダウン症候群、心臓病、単一遺伝子疾患、ＨＬＡ型判定（ＨＬＡ ｔｙｐｉｎｇ）、フェニルケトン尿症、鎌形赤血球貧血、テイ・サックス（Ｔａｙ−Ｓａｃｈｓ）症候群、地中海貧血、クラインフェルター症候群、ハンチントン病、自己免疫疾患、リピドーシス、肥満疾患（ｏｂｅｓｉｔｙ ｄｅｆｅｃｔ）、血友病、先天性代謝異常、および糖尿病からなる群より選択される、請求項８０記載の方法。
【請求項８２】
癌遺伝子、腫瘍抑制遺伝子、またはＤＮＡの増幅、複製、組み換え、もしくは修復に関与する遺伝子が関与する癌を検出するために使用される、請求項２６記載の方法。
【請求項８３】
癌が、ＢＲＣＡ１遺伝子、ｐ５３遺伝子、家族性大腸ポリポーシス、Ｈｅｒ２／Ｎｅｕ増幅、Ｂｃｒ／Ａｂ１、Ｋ−ｒａｓ遺伝子、１６型および１８型のヒトパピローマウイルス、白血病、大腸癌、乳癌、肺癌、前立腺癌、脳腫瘍、中枢神経系腫瘍、膀胱腫瘍、メラノーマ、肝臓癌、骨肉腫およびその他の骨癌、精巣癌および卵巣癌、ＥＮＴ腫瘍、ならびに異型接合性の喪失からなる群より選択される遺伝子に関連している、請求項８２記載の方法。
【請求項８４】
環境モニタリング、法医学、ならびに食品および飼料の業界のモニタリングに使用される、請求項２６記載の方法。
【請求項８５】
検出する段階が以下の段階を含む、請求項２６記載の方法：特定の部位で支持体をスキャンして、オリゴヌクレオチドプローブセットの連結が起こったかどうかを同定する段階；および
同定した連結を標的ヌクレオチド配列の有無に相関させる段階。
【請求項８６】
スキャンする段階が、走査電子顕微鏡、電子顕微鏡、共焦点顕微鏡、電荷結合素子、操作トンネル電子顕微鏡、赤外顕微鏡、原子間力顕微鏡、電気伝導度、および蛍光またはリン光体の画像化によって行われる、請求項８５記載の方法。
【請求項８７】
相関させる段階が、コンピュータを用いて行われる、請求項８５記載の方法。
【請求項８８】
混合液を支持体に接触させる段階が、４５℃〜９０℃の温度で最高６０分間までの期間である、請求項２６記載の方法。
【請求項８９】
複数の捕捉オリゴヌクレオチドの一部が同じヌクレオチド配列を有し、かつ異なる標的ヌクレオチド配列の一部について異なる標識が使用される、請求項２６記載の方法。
【請求項９０】
複数の捕捉オリゴヌクレオチドがそれぞれ異なるヌクレオチド配列を有する、請求項２６記載の方法。
【請求項９１】
各々の捕捉オリゴヌクレオチドが、連結したオリゴヌクレオチドプローブセットが接触段階の際にハイブリダイズしない仕切り（ｂａｒｒｉｅｒ）オリゴヌクレオチドによって、隣接する捕捉オリゴヌクレオチドと分割された、隣接する捕捉オリゴヌクレオチドを有する、請求項８９記載の方法。
【請求項９２】
オリゴヌクレオチドプローブセットの位置特定可能なアレイ特異的部分に捕捉オリゴヌクレオチドがハイブリダイズする温度よりも低い温度で、オリゴヌクレオチドプローブセットが標的ヌクレオチド配列にハイブリダイズする、請求項２６記載の方法。
【請求項９３】
以下の段階をさらに含む、請求項２６記載の方法：
混合液を一連のリガーゼ検出反応サイクルに供する段階の後に、混合液を化学的または酵素的に処理して、連結しなかったオリゴヌクレオチドプローブを破壊する段階。
【請求項９４】
処理する段階がエキソヌクレアーゼを用いて行われる、請求項９３記載の方法。
【請求項９５】
以下の段階をさらに含む、請求項２６記載の方法：
捕捉オリゴヌクレオチドに結合したオリゴヌクレオチドを除去して、固定化された捕捉オリゴヌクレオチドを有する支持体の再利用を可能にする段階。
【請求項９６】
支持体が、異なる部位に固定化された異なる捕捉オリゴヌクレオチドを含み、異なる捕捉オリゴヌクレオチドは異なる位置特定可能なアレイ特異的部分に相補的であり、それによって、異なるオリゴヌクレオチドプローブセットが支持体上の異なる部位で捕捉されて検出される、請求項２６記載の方法。
【請求項９７】
支持体が、支持体上に固定化された同じ捕捉オリゴヌクレオチドを含み、捕捉オリゴヌクレオチドはすべての位置特定可能なアレイ特異的部分に相補的であり、オリゴヌクレオチドプローブセットに結合した標識が異なっており、それによって、異なるオリゴヌクレオチドプローブセットが異なる標識により検出されて区別される、請求項２６記載の方法。
【請求項９８】
二重多量体ユニットの集合が図２６に示される、請求項２６記載の方法。
【請求項９９】
二重多量体ユニットの集合が図２７に示される、請求項２６記載の方法。
【請求項１００】
除去された二重多量体ユニットの集合が、四量体の数の１２．５倍未満および四量体の数の１４倍を上回る融点（摂氏）を有する、請求項２６記載の方法。
【請求項１０１】
二重多量体ユニットが２４ｍｅｒを有し、かつ二重多量体ユニットの融点が７５℃〜８４℃である、請求項２６記載の方法。
【請求項１０２】
四量体のセットが表１に示されたものおよびその相補体である、請求項２６記載の方法。
【請求項１０３】
四量体のセットが、表１に示される四量体の１塩基の円順列およびその相補体である、請求項２６記載の方法。
【請求項１０４】
四量体のセットが、表１に示される四量体の２塩基の円順列およびその相補体である、請求項２６記載の方法。
【請求項１０５】
四量体のセットが、表１に示される四量体の３塩基の円順列およびその相補体である、請求項２６記載の方法。
【請求項１０６】
複数の標的ヌクレオチド配列における単一塩基の変化、挿入、欠失、または転座により異なる複数の配列のうち１つまたは複数を同定するためのキットであり、以下を含むキット：
リガーゼ；
特定のセット中のオリゴヌクレオチドプローブは、各々の標的ヌクレオチド配列上で互いに隣接してハイブリダイズする場合、共に連結するのに適しているが、試料中に存在する他の任意のヌクレオチド配列にハイブリダイズする場合は、そのような連結を妨げるミスマッチを有する、（ａ）標的配列特異的部分および位置特定可能なアレイ特異的部分を有する第１のオリゴヌクレオチドプローブ、および（ｂ）標的配列特異的部分および検出可能なレポーター標識を有する第２のオリゴヌクレオチドプローブにより各々が特徴づけられる、複数のオリゴヌクレオチドプローブセット；ならびに
異なる位置に固定化された異なる捕捉オリゴヌクレオチドを有する支持体、ここで、捕捉オリゴヌクレオチドは、位置特定可能なアレイ特異的部分に相補的なヌクレオチド配列を有し、二重多量体ユニットオリゴヌクレオチドの集合から形成されており、ここで位置特定可能なアレイ特異的部分を有するオリゴヌクレオチドは、多量体ユニット中の四量体の数の４倍を上回る狭い温度範囲内で、ほとんどミスマッチなく捕捉オリゴヌクレオチドのメンバーにハイブリダイズすると考えられ、二重多量体ユニットオリゴヌクレオチドは以下のような四量体のセットから形成され：（１）セット内の各四量体は、セット内のすべての他の四量体と少なくとも２つのヌクレオチド塩基が異なり、（２）互いに相補的な２つの四量体はセット内に存在せず、（３）回文構造または２ヌクレオチドの反復である四量体はセット内に存在せず、かつ、捕捉オリゴヌクレオチドが位置特定可能なアレイ特異的部分に相補的なヌクレオチド配列を有する、二重多量体ユニットオリゴヌクレオチドの集合の中から以下のオリゴヌクレオチドが除去されている：（１）四量体の数の１１倍未満および四量体の数の１５倍を上回る融点（摂氏）を有するオリゴヌクレオチド、（２）同じ四量体が３つ連結した二重多量体ユニット、ならびに（３）同じ四量体が中断ありまたはなしで４つ連結した多量体ユニット。
【請求項１０７】
それぞれの標的ヌクレオチド配列以外のヌクレオチド配列に対するオリゴヌクレオチドプローブセットのミスマッチがそれぞれの標的ヌクレオチド配列にハイブリダイズする場合に、各セットのオリゴヌクレオチドプローブが互いに連結する連結接合部の塩基にある、請求項１０６記載のキット。
【請求項１０８】
ミスマッチが、連結接合部に３’末端を有するオリゴヌクレオチドプローブセットのオリゴヌクレオチドプローブ上にある、請求項１０６記載のキット。
【請求項１０９】
それぞれの標的ヌクレオチド配列以外のヌクレオチド配列に対するオリゴヌクレオチドプローブセットのミスマッチがそれぞれの標的ヌクレオチド配列にハイブリダイズする場合に、各セットのオリゴヌクレオチドプローブが互いに連結する連結接合部に隣接する塩基にある、請求項１０６記載のキット。
【請求項１１０】
ミスマッチが、連結接合部に３’末端を有するオリゴヌクレオチドプローブセットのオリゴヌクレオチドプローブ上にある、請求項１０９記載のキット。
【請求項１１１】
リガーゼが、サーマス・アクアティクス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ）リガーゼ、サーマス・サーモフィルス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）リガーゼ、大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）リガーゼ、Ｔ４リガーゼ、およびピロコッカス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ）リガーゼからなる群より選択される、請求項１０６記載のキット。
【請求項１１２】
標的ヌクレオチド配列の予備増幅に適した増幅プライマー、および
ポリメラーゼ
をさらに含む、請求項１０６記載のキット。
【請求項１１３】
支持体が、異なる特定の部位に固定化された異なる捕捉オリゴヌクレオチドを含み、異なる捕捉オリゴヌクレオチドは異なる位置特定可能なアレイ特異的部分に相補的であり、それによって異なるオリゴヌクレオチドプローブセットが支持体上の異なる部位でハイブリダイズして検出される、請求項１０６記載のキット。
【請求項１１４】
支持体が、支持体上に固定化された同じ捕捉オリゴヌクレオチドを含み、捕捉オリゴヌクレオチドはすべての位置特定可能なアレイ特異的部分に相補的であり、かつオリゴヌクレオチドプローブセットに結合した標識は異なり、それによって、オリゴヌクレオチドプローブセットが異なる標識によって検出されて区別される、請求項１０６記載のキット。
【請求項１１５】
オリゴヌクレオチドプローブセットの位置特定可能なアレイ特異的部分に捕捉オリゴヌクレオチドがハイブリダイズする温度よりも低い温度で、オリゴヌクレオチドプローブセットがそれぞれ標的ヌクレオチド配列に対してハイブリダイズするように、オリゴヌクレオチドプローブセットおよび捕捉オリゴヌクレオチドが構成されている、請求項１０６記載のキット。
【請求項１１６】
二重多量体ユニットの集合が図２６に示される、請求項１０６記載のキット。
【請求項１１７】
二重多量体ユニットの集合が図２７に示される、請求項１０６記載のキット。
【請求項１１８】
除去された二重多量体ユニットの集合が、四量体の数の１２．５倍未満および四量体の数の１４倍を上回る融点（摂氏）を有する、請求項１０６記載のキット。
【請求項１１９】
二重多量体ユニットが２４ｍｅｒを有し、二重多量体ユニットの融点が７５℃〜８４℃である、請求項１０６記載のキット。
【請求項１２０】
四量体のセットが表１に示されるものまたはその相補体である、請求項１０６記載のキット。
【請求項１２１】
四量体のセットが、表１に示される四量体の１塩基の円順列およびその相補体である、請求項１０６記載のキット。
【請求項１２２】
四量体のセットが、表１に示される四量体の２塩基の円順列およびその相補体である、請求項１０６記載のキット。
【請求項１２３】
四量体のセットが、表１に示される四量体の３塩基の円順列およびその相補体である、請求項１０６記載のキット。
【請求項１２４】
固体支持体上で捕捉オリゴヌクレオチドに対して不適切に交差ハイブリダイズすると考えられるリガーゼ検出反応オリゴヌクレオチドの合成を避けるための方法であり、以下の段階を含む方法：
リガーゼ検出反応オリゴヌクレオチドを捕捉オリゴヌクレオチドと比較する段階；および
リガーゼ検出反応オリゴヌクレオチドに交差ハイブリダイズする可能性のある任意の捕捉オリゴヌクレオチドを同定する段階。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、国立衛生研究所補助金番号ＧＭ−４１３３７−０６、ＧＭ−４３５５２−０５、ＧＭ−４２７２２−０７およびＧＭ−５１６２８−０２の政府資金を用いて開発された。合衆国政府は一定の権利を有しうる。
【０００２】
発明の属する分野
本発明は、複数の捕捉オリゴヌクレオチドプローブが狭い範囲の融点を有し、相補的オリゴヌクレトチドがほとんどミスマッチなくハイブリダイズする支持体上で使用するための複数の捕捉オリゴヌクレオチドプローブを設計する方法に関する。本発明の別の局面は、支持体上に固定された複数のオリゴヌクレオチドプローブを有する支持体、複数の標的ヌクレオチド配列における単一塩基変化、挿入、欠失または転座を検出するために支持体を使用する方法、およびオリゴヌクレオチドが固定されている支持体を含むそのような検出用のキットに関する。
【０００３】
発明の背景
配列の差異の検出
多型度の高い遺伝子座の大規模多重分析は、実父確定検査および法科学（Ｒｅｙｎｏｌｄｓら、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．、６３：２〜１５（１９９１））、臓器移植におけるドナーとレシピエントの組み合わせ（Ｂｕｙｓｅら、Ｔｉｓｓｕｅ Ａｎｔｉｇｅｎｓ、４１：１〜１４（１９９３）ならびにＧｙｌｌｅｎｓｔｅｎら、ＰＣＲ Ｍｅｔｈ．Ａｐｐｌ． １：９１〜９８（１９９１））、遺伝病の診断、予後ならびに出生前カウンセリング（Ｃｈａｍｂｅｒｌａｉｎら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、１６：１１１４１〜１１１５６（１９８８）ならびにＬ．Ｃ．Ｔｓｕｉ、Ｈｕｍａｎ Ｍｕｔａｔ．、１：１９７〜２０３（１９９２））、および発癌性変異の研究（Ｈｏｌｌｓｔｅｉｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５３：４９〜５３（１９９１））などにおける個人の同定に役立てるために必要とされている。また、核酸分析による感染症診断の費用効果は、パネルテストの多重度により大きく変動する。上述の適用の多くでは、空間的に近接する場合もある様々な遺伝子座における一塩基の差の識別を基礎としている。
【０００４】
多数の配列からなる領域を含む試料中の一つまたは複数のポリヌクレオチド配列の存在を検出するには、様々なＤＮＡハイブリダイゼーション法を利用することができる。断片の捕獲および標識に基づく簡単な方法では、特定の配列を含む断片を、固定化したプローブに対するハイブリダイゼーションで捕獲する。捕獲断片は、検出用レポーター部分を含む別のプローブとのハイブリダイゼーションで標識される。
【０００５】
広く用いられている他の方法にはサザンブロット法がある。本方法では、試料中のＤＮＡ断片の混合物をゲル電気泳動で分画した後にニトロセルロースフィルターに固定する。ハイブリダイゼーション条件下でフィルターを一つまたは複数の標識プローブと反応させることで、プローブ配列を含むバンドの存在を同定することができる。本方法は、制限酵素によるＤＮＡ切断物中の断片（任意のプローブ配列を含む）の同定、および制限断片長多型（「ＲＦＬＰ」）の分析に特に有用である。
【０００６】
ポリヌクレオチド試料に含まれる任意の配列または配列群の存在を検出する別の方法には、ポリメラーゼ連鎖反応（ムリス（Ｍｕｌｌｉｓ）らによる米国特許第４，６８３，２０２号、およびサイキ（Ｒ．Ｋ．Ｓａｉｋｉ）らによる論文（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３０：１３５０（１９８５）））による配列（または配列群）の選択的な増幅がある。本方法では、特定配列（または配列群）の反対側の端に相補的なプライマーを用いて、プライマーから開始される連続的な複製を加熱サイクルで進める。増幅後の配列は、種々の方法で容易に同定することができる。本方法は例えば、体液試料中の病原体配列の検出といった、ポリヌクレオチド試料に含まれる低コピー配列を検出する際に特に有用である。
【０００７】
さらに最近では、プローブ連結法で既知の標的配列を同定する方法が、ホワイトリー（Ｎ．Ｍ．Ｗｈｉｔｅｌｅｙ）らによる米国特許第４，８８３，７５０号、ウー（Ｄ．Ｙ．Ｗｕ）らによる論文（Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ４：５６０（１９８９））、ランデグレン（Ｕ．Ｌａｎｄｅｇｒｅｎ）らによる論文（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４１：１０７７（１９８８））、およびウィンディーン（Ｅ．Ｗｉｎｎ−Ｄｅｅｎ）らによる論文（Ｃｌｉｎ． Ｃｈｅｍ． ３７：１５２２（１９９１））に記載されている。オリゴヌクレオチド連結アッセイ法（ＯＬＡ）として知られている方法では、対象標的領域にまたがる２本のプローブまたはプローブエレメントと標的領域との間でハイブリッドを形成させる。プローブエレメントが、隣接する標的塩基と、プローブエレメントの直面する端で対合する（塩基対を形成する）と、２本のエレメントを例えばリガーゼで処理して連結させることができる。連結したプローブエレメントを対象として次にアッセイ法を行い、標的配列の存在を明らかにする。
【０００８】
本アプローチの変法では、連結プローブエレメントを、相補的なプローブエレメント対の鋳型として働かせる。変性、ハイブリダイゼーションおよび連結のサイクルを２通りの相補的なプローブエレメント対の存在下で続けることで、標的配列は幾何級数的（すなわち指数関数的）に増幅されて、微量の標的配列が検出および／または増幅される。本方法はリガーゼ連鎖反応（「ＬＣＲ」）と呼ばれる（Ｆ．Ｂａｒａｎｙ 「クローニングされた熱耐性リガーゼを用いた遺伝病検出およびＤＮＡ増幅（Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ＤＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｕｓｉｎｇ Ｃｌｏｎｅｄ Ｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｌｅ Ｌｉｇａｓｅ）」（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ． ８８：１８９〜９３（１９９１）および、Ｆ．Ｂａｒａｎｙ、「ＰＣＲ界におけるリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）（Ｔｈｅ Ｌｉｇａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ（ＬＣＲ）ｉｎ ａ ＰＣＲ Ｗｏｒｌｄ）」（ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、１：５〜１６（１９９１））。
【０００９】
検出用標識をもち、［電荷］／［並進運動に伴う摩擦抵抗］比が顕著な配列特異的プローブと標的をハイブリダイズさせて相互に連結可能であるグロスマン（Ｇｒｏｓｓｍａｎ）らによる米国特許第５，４７０，７０５号において、核酸配列差の多重検出に関する他の方式が開示されている。本方法はグロスマンらによる論文（「Ｈｉｇｈ−ｄｅｎｓｉｔｙ Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ： Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ ａｎｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｃｏｄｅｄ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ」Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、２２（２１）：４５２７〜３４（１９９４））において、嚢胞性線維症の膜貫通調節遺伝子を対象とした大規模多重分析に使用されている。
【００１０】
ジョー（Ｊｏｕ）らによる論文（「Ｄｅｌｅｔｉｏｎ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｉｎ Ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ Ｇｅｎｅ ｂｙ Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ Ｇａｐ Ｌｉｇａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃ Ｓｔｒｉｐ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ」Ｈｕｍａｎ Ｍｕｔａｔｉｏｎ ５：８６〜９３（１９９５））では、複数のエキソンの特定領域を増幅して、各エキソンに対するプローブ上の様々なハプテンの差に特異的な抗体を有する免疫クロマトグラフィー・ストリップ上で増幅産物を読み取る、いわゆる「ギャップリガーゼ連鎖反応」の過程の利用について記載されている。
【００１１】
例えば遺伝子スクリーニングの分野において、標的ポリヌクレオチドに含まれる多くの配列のそれぞれの有無の検出に有用な方法はますます必要とされている。例えば嚢胞性線維症には４００種もの多様な変異が関与している。この疾患の遺伝的素因に対するスクリーニングでは、被験者のゲノムＤＮＡ中に含まれうる遺伝子配列上の多様な変異を調べることで「嚢胞性線維症」陽性者を同定することが最適である。生じうるあらゆる変異部位の有無を１回のアッセイ法で調べることが理想的であろう。しかしながら、上述の先行技術の方法を簡便かつ自動化された１回のアッセイ法で特定配列群の検出に応用することは困難である。
【００１２】
固相ハイブリダイゼーションアッセイ法では、複数の液体処理段階が必要であり、一部のインキュベーション温度および洗浄温度を注意深く制御して、一ヌクレオチドの誤対合を識別するために必要な厳密さを保たなければならない。本方法の多重化は、最適なハイブリダイゼーション条件がプローブ配列により大きく変わることから困難である。
【００１３】
対立遺伝子に特異的なＰＣＲ産物は一般にサイズが同じであり、任意の増幅用チューブは、各反応チューブと関連するゲル・レーンにおける産物バンドの有無により評価される（Ｇｉｂｂｓら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、１７：２４３７〜２４４８（１９８９））。このような方法は、多様なプライマーの組み合わせを用いた複数の反応チューブ中の試験試料の分離を必要とすることから、アッセイ法に要する費用は増大する。ＰＣＲでもまた、競合する対立遺伝子用プライマーに様々な蛍光色素を結合させることで、１本の反応チューブで対立遺伝子を識別することができる（Ｆ．Ｆ．Ｃｈｅｈａｂら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ． ８６：９１７８〜９１８２ （１９８９））が、このような方式による多重分析は、既存の装置および色素化学の知見を利用して経済的な方法でスペクトルに分解可能な色素種がそれほど多くないことから規模の拡大は限られる。大きな側鎖をもつように修飾した塩基の取り込みを、電気泳動の移動度を元に対立遺伝子のＰＣＲ産物を識別する際に利用することができるものの、本方法は、修飾塩基がポリメラーゼにより良好に取り込まれることと、これらの基の一つのサイズが異なる比較的大きなＰＣＲ産物を分解する電気泳動の能力による制限を受ける（Ｌｉｖａｋら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、２０：４８３１〜４８３７（１９８９））。各ＰＣＲ産物は一つの変異のみを探索するために用いられ、多重化は困難である。
【００１４】
対立遺伝子特異的プローブの連結では、固相捕獲法（Ｕ．Ｌａｎｄｅｇｒｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４１：１０７７〜１０８０（１９８８）；Ｎｉｃｋｅｒｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ． ８７：８９２３〜８９２７（１９９０））またはサイズに依存した分離法（Ｄ．Ｙ．Ｗｕら、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、４：５６０〜５６９（１９８９）および、Ｆ．Ｂａｒａｎｙ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、８８：１８９〜１９３（１９９１））を利用して対立遺伝子のシグナルを分解することが一般的である。しかし後者の方法は、連結用プローブのサイズ幅が狭いことから多重化において制限を受ける。ギャップリガーゼ連鎖反応では、追加的なステップ、すなわちポリメラーゼによる伸長が必要である。より複雑な多重化に対して電荷／並進運動に伴う摩擦抵抗の比が顕著なプローブを使用する場合は、電気泳動時間を長くする必要があるほか、別の検出法の利用が求められる。
【００１５】
したがって、ポリヌクレオチド試料に含まれる複数の特定配列の有無を検出するための迅速な単回アッセイ法が必要であることは変わらない。
【００１６】
核酸分析のためのオリゴヌクレオチドアレイの利用
固相支持体に固定化したオリゴヌクレオチドが整然と並んだアレイは、ＤＮＡの配列決定、分類（ｓｏｒｔｉｎｇ）、単離および操作における利用が提案されている。任意の長さのあらゆるオリゴヌクレオチドプローブに対する、クローン化された１本鎖ＤＮＡ分子のハイブリダイゼーションでは、分子内に存在する対応する相補的ＤＮＡセグメントを理論的に同定可能であることが認められている。このようなアレイでは、個々のオリゴヌクレオチドプローブは、固相支持体上のあらかじめ決めた様々な位置に固定化される。ＤＮＡ分子中のあらゆるオリゴヌクレオチドセグメントは、このようなアレイを利用して調べることができる。
【００１７】
オリゴヌクレオチドアレイを用いてＤＮＡ分子の配列を決定する手順の一例が、ドルマナク（Ｄｒｍａｎａｃ）らによる米国特許第５，２０２，２３１号に開示されている。この特許は、複数のオリゴヌクレオチドを結合させた固相支持体に対する標的ＤＮＡの利用に関する。配列は、標的ＤＮＡセグメントとオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションおよびハイブリッドを形成したオリゴヌクレオチドの重複セグメントの集合により読み取られる。アレイには１１〜２２程度のヌクレオチドの長さのあらゆるオリゴヌクレオチドを利用することができるが、この種のアレイの構築法に関する情報は極めて少ない。本件に関しては、チェトベリン（Ａ．Ｂ．Ｃｈｅｔｖｅｒｉｎ）らによる論文（「Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｏｆ Ｐｏｏｌｓ ｏｆ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ ｏｎ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ａｒｒａｙｓ」 ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ、３０：２１５〜３１（１９９３））、クラプコ（Ｋｈｒａｐｋｏ）らによる国際公開公報第９２／１６６５５号、クズネツォバ（Ｋｕｚｎｅｔｓｏｖａ）らによる論文（「ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｂｙ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ ｉｎ Ｇｅｌ． Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｌｉｇａｔｉｏｎ ａｓ ａ Ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ Ｅｘｐａｎｄｉｎｇ ｔｈｅ Ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｍｅｔｈｏｄ」 Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ． ２８（２０）； ２９０〜９９（１９９４））、リビッツ（Ｍ．Ａ．Ｌｉｖｉｔｓ）らによる論文（「Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｏｆ Ｄｕｐｌｅｘｅｓ Ｆｏｒｍｅｄ ｂｙ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ＤＮＡ ｗｉｔｈ Ｇｅｌ−Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ」Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌｅｃ．Ｓｔｒｕｃｔ． ＆ Ｄｙｎａｍ．、１１（４）：７８３〜８１２（１９９４））も参照されたい。
【００１８】
サザン（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ）による国際公開公報第８９／１０９７７号では、既知の点変異、ゲノムフィンガープリント法、連鎖解析および配列決定に関する核酸試料の分析に利用するハイブリダイゼーション反応が可能なオリゴヌクレオチドアレイをもつ支持体の利用について開示されている。ヌクレオチド塩基を、特定のパターンで支持体上に配してマトリックスを作製することができる。国際公開公報第８９／１０９７７号では、ペンプロッターまたはマスキングにより集合させるオリゴヌクレオチドを有する支持体に水酸基リンカーを利用することができることが記載されている。
【００１９】
キャンター（Ｃａｎｔｏｒ）による国際公開公報第９４／１１５３０号もまた、ハイブリダイゼーションによる配列決定の過程を実施するためのオリゴヌクレオチドアレイの利用に関する。オリゴヌクレオチドは突出部分をもつ２本鎖であり、この突出部分に標的核酸が結合して２本鎖の非突出部分と連結される。このようなアレイは、ビオチン化されたオリゴヌクレオチドを捕獲するストレプトアビジン被覆濾紙を用いて構築され、集合後に結合させる。
【００２０】
チェトベリン（Ｃｈｅｔｖｅｒｉｎ）による国際公開公報第９３／１７１２６号では、核酸を分類して調べる目的で区分化した２成分からなるオリゴヌクレオチドアレイを使用している。このアレイでは、不変ヌクレオチド配列が、可変ヌクレオチド配列に隣接して結合しており、いずれの配列も共有結合部を介して固相支持体に結合される。不変ヌクレオチド配列には、ハイブリッドを形成した鎖をＰＣＲで増幅可能とするプライミング領域がある。次に、可変領域に対するハイブリダイゼーションによる分類を行う。２成分アレイ上における断片化核酸の、配列決定、単離、分類、および操作についても開示されている。感度を強化した一つの態様では、固定化されたオリゴヌクレオチドには、それとハイブリッドを形成して、カバーされていないオリゴヌクレオチドの部分を残す短い相補的領域がある。このアレイを次にハイブリダイゼーション条件下におくと、固定化されたオリゴヌクレオチドに相補的な核酸がアニールする。次にＤＮＡリガーゼを用いて、短い相補的領域と、アレイ上にある相補的な核酸を連結する。オリゴヌクレオチドアレイの調製法に関してはほとんど開示されていない。
【００２１】
フォドル（Ｆｏｄｏｒ）らによる国際公開公報第９２／１０５８８号では、オリゴヌクレオチドアレイに対するハイブリダイゼーションによる核酸の配列決定、フィンガープリント法、およびマッピングの過程が開示されている。オリゴヌクレオチドアレイは、大規模かつ多様なオリゴヌクレオチドの合成が可能な極めて大規模に固定化された重合体合成により調製される。この手法では、基盤表面を機能状態とし、オリゴヌクレオチドを基盤上に集合させるためのリンカー基を導入する。オリゴヌクレオチドを結合させる領域には、選択的に活性化される保護基が（基盤または各ヌクレオチドサブユニット上に）ある。通常本方法では、曝露領域を脱保護するための多様な形状のマスクを用いて、光によるアレイの画像化が必要である。脱保護領域では保護されたヌクレオチドと化学反応が起きて、オリゴヌクレオチド配列が伸長することで画像化される。２成分マスキング法を用いることで、任意の時間内に２種またはそれ以上のアレイを構築することができる。検出は、ハイブリッドが形成された領域の位置を決めることでなされる。これについては、フォドルらによる米国特許第５，３２４，６３３号および第５，４２４，１８６号、ピルング（Ｐｉｒｒｕｎｇ）らによる米国特許第５，１４３，８５４号および５，４０５，７８３号、ピルングによる国際公開公報第９０／１５０７０号、ピース（Ａ．Ｃ．Ｐｅａｓｅ）らによる論文（「Ｌｉｇｈｔ−ｇｅｎｅｒａｔｅｄ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ａｒｒａｙｓ ｆｏｒ Ｒａｐｉｄ ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ」 Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ ９１：５０２２〜２６（１９９４））も参照されたい。ビーティー（Ｋ．Ｌ．Ｂｅａｔｔｉｅ）らによる論文（「Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｇｅｎｏｓｅｎｓｏｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ」Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．、４１（５）：７００〜０９（１９９５））では、集合済みのオリゴヌクレオチドプローブを固相支持体に結合させる方法について説明されている。
【００２２】
アレイに対するハイブリダイゼーションに基づく上述の配列決定法には欠点が多い。第一に、極めて多数のオリゴヌクレオチドを合成する必要がある。第二に、正しくハイブリダイズしたもの、相応に対合した２本鎖、および誤対合したもの、の識別が困難である。さらに、ある種のオリゴヌクレオチドは、標準的な条件下でハイブリッドを形成しにくく、オリゴヌクレオチドが同定能力を得るようになるためには、詳細なハイブリダイゼーション条件の検討が必要となる。
【００２３】
本発明は、先行技術における欠点を克服することを目的としている。
【００２４】
発明の概要
本発明は、複数の捕捉オリゴヌクレオチドプローブが狭い範囲の融点を有し、相補的オリゴヌクレトチドがほとんどミスマッチなくハイブリダイズする支持体上で使用するための複数の捕捉オリゴヌクレオチドプローブを設計する方法に関する。本方法の第１段階は、（１）セット内の各四量体がセット内の他の全ての四量体と少なくとも２ヌクレオチド塩基異なり、（２）互いに相補的な２つの四量体はセット内に存在せず、（３）回文構造または２ヌクレオチドの反復である四量体はセット内に存在せず、かつ（４）１以下または３以上のヌクレオチドＧまたはＣを有する四量体はセット内に存在しない、互いに連結された４個のヌクレオチドである、複数の四量体の第１のセットを提供する段階を含む。第１のセットの２個から４個の四量体の群は多量体ユニットの集合を形成するために互いに連結される。多量体ユニットの集合から、同じ四量体から形成された全ての多量体ユニット、および多量体ユニットを形成する四量体の数の４倍未満の融点（摂氏）を有する全ての多量体ユニットが、多量体ユニットの修飾型集合を形成するために除去される。多量体ユニットの修飾型集合は一覧において融点順に配置される。多量体ユニットの修飾型集合の順番は、融点の２℃の増分内で無作為化される。一覧中の交互の多量体ユニットはその後、第１および第２の亜集合に分割され、各々は融点順に配置される。２番目の亜集合の順番を反転させた後、２倍の多量体ユニットの集合を形成するために、反転された２番目の集合に第１の集合が順に連結される。２倍の多量体ユニットの修飾型集合を形成するために、２倍の多量体ユニットの集合から、（１）四量体の数の１１倍未満および四量体の数の１５倍超の融点（摂氏）を有する、（２）同じ３個の四量体が相互に連結された２倍の多量体ユニット、および（３）同じ４個の四量体が分断ありでまたはなしで相互に連結された２倍の多量体ユニットを有するそれらのユニットが除去される。
【００２５】
本発明の別の局面は、支持体および支持体上の異なる部位の２倍の多量体ユニットオリゴヌクレオチドの集合を含むので、固体支持体上に固定された相補的オリゴヌクレオチドが異なる位置に捕捉されることができる、オリゴヌクレオチドアレイに関する。相補的オリゴヌクレオチドは、２４℃超の狭い温度範囲内で２倍の多量体ユニットオリゴヌクレオチドの集合の構成員にほとんどミスマッチなくハイブリダイズすると考えられる。（１）セット内の各四量体がセット内の他の全ての四量体と少なくとも２ヌクレオチド塩基異なり、（２）互いに相補的な２つの四量体はセット内に存在せず、および（３）回文構造または２ヌクレオチドの反復である四量体はセット内に存在しない、四量体セットから２倍の多量体ユニットオリゴヌクレオチドが形成され、２倍の多量体ユニットオリゴヌクレオチドの集合はそれから以下のオリゴヌクレオチドを除去した：（１）四量体の数の１２．５倍未満および四量体の数の１４倍超の融点（摂氏）を有するオリゴヌクレオチド、（２）同じ３つの四量体が相互に連結された２倍の多量体ユニット、および（３）同じ４つの四量体が分断ありでまたはなしで相互に連結された多量体ユニット。
【００２６】
本発明のさらに別の局面は、複数の標的ヌクレオチド配列における一つまたは複数の単一塩基変化、挿入、欠失または転座により異なる、一つまたは複数の配列を同定する方法に関する。この方法は複数の配列差異を有する一つまたは複数の標的ヌクレオチド配列を潜在的に含む試料を提供することを含む。複数のオリゴヌクレオチドプローブセットにはまた、（ａ）標的特異的部分および位置特定可能なアレイ特異的部分を有する第１のオリゴヌクレオチドプローブ、および（ｂ）標的特異的部分および検出可能なレポーター標識を含む第２のオリゴヌクレオチドプローブにより特徴付けられる各セットが提供される。特定のセットにおけるオリゴヌクレオチドプローブは、相当する標的ヌクレオチド配列上で互いに隣接してハイブリダイズする時には、相互連結されるのに適切であるが、しかし試料中に存在するその他の任意のヌクレオチド配列にハイブリダイズする場合はそのような連結を妨害するミスマッチを有する。リガーゼにはまた、試料、複数のオリゴヌクレオチドプローブセット、および混合液を形成するために混濁されたリガーゼが提供される。任意のハイブリダイズしているオリゴヌクレオチドが標的ヌクレオチド配列から分離される変性処理、および、もし試料中に存在するならば各々の標的ヌクレオチド配列に、塩基特異的な様式でオリゴヌクレオチドプローブセットが隣接部位でハイブリダイズし、および（ａ）位置特定可能なアレイ特異的部分、（ｂ）互いに連結された標的特異的部分、および（ｃ）検出可能なレポーター標識を含む、連結産物配列を形成するために互いに連結される、ハイブリダイゼーション処理を含む一回または複数のリガーゼ検出反応サイクルにこの混合液は供される。オリゴヌクレオチドプローブセットは各々の標的ヌクレオチド配列以外の、試料中に存在するヌクレオチド配列にハイブリダイズしうるが、しかし一つまたは複数のミスマッチの存在のために相互に連結されず、変性処理で個々に分離される。捕捉オリゴヌクレオチドが位置特定可能なアレイ特異的部分に相補的なヌクレオチド配列を有し、２倍の多量体ユニットオリゴヌクレオチドの集合から形成される、異なる部位に固相化された異なる捕捉オリゴヌクレオチドが支持体に提供される。位置特定可能なアレイ特異的部分を有するオリゴヌクレオチドは、多量体ユニット内の四量体の数の４倍超の狭い温度範囲内で、捕捉オリゴヌクレオチドの集合の構成員に、ほとんどミスマッチなくハイブリダイズすると考えられる。（１）セット内の各四量体がセット内の他の全ての四量体と少なくとも２ヌクレオチド塩基異なり、（２）互いに相補的な２つの四量体はセット内に存在せず、および（３）回文構造または２ヌクレオチドの反復である四量体はセット内に存在しない四量体セットから２倍の多量体ユニットオリゴヌクレオチドが形成される。２倍の多量体ユニットの修飾型集合を形成するために、２倍の多量体ユニットオリゴヌクレオチドの集合はそれから以下のオリゴヌクレオチドを除去している：（１）四量体の数の１１倍未満および四量体の数の１５倍超の融点（摂氏）を有するオリゴヌクレオチド、（２）同じ３つの四量体が相互に連結された２倍の多量体ユニット、および（３）同じ４つの四量体が分断ありでまたはなしで相互に連結された２倍の多量体ユニット。混合液を一回または複数のリガーゼ検出反応サイクルに供した後に、位置特定可能なアレイ特異的部分が捕捉オリゴヌクレオチドプローブに塩基特異的様式でハイブリダイズし、それにより位置特定可能なアレイ特異的部分が、相補的捕捉オリゴヌクレオチドを有する部位に支持体上で捕捉されるのに有効な条件下で混合液が支持体に接触される。特定部位において支持体に捕捉された連結産物のレポーター標識が検出され、試料中に一つまたは複数の標的ヌクレオチド配列が存在することを示す。
【００２７】
本発明の別の局面は、複数の標的ヌクレオチド配列における１塩基の変化、挿入、欠失または転座により異なる一つまたは複数の配列を同定するキットに関する。リガーゼに加えて、そのキットは、特定のセットにおけるオリゴヌクレオチドプローブは、各々の標的ヌクレオチド配列上で互いに隣接してハイブリダイズする時は互いに連結されるのに適切であるが、しかしに存在するその他のヌクレオチド配列にハイブリダイズする時はそのような連結を妨害するミスマッチを有する、（ａ）標的配列特異的部分および位置特定可能なアレイ特異的部分を有する第１のオリゴヌクレオチドプローブ、および（ｂ）標的配列特異的部分および検出可能なレポーター部分を含む第２のオリゴヌクレオチドプローブにより各々が特徴付けられる複数のオリゴヌクレオチドプローブセットを含む。捕捉オリゴヌクレオチドが位置特定可能なアレイ特異的部分に相補的なヌクレオチド配列を有し、２倍の多量体ユニットオリゴヌクレオチドの集合から形成される、異なる部位に固相化された異なる捕捉オリゴヌクレオチドを有する支持体もまたキット中に見出される。位置特定可能なアレイ特異的部分を有するオリゴヌクレオチドは、多量体ユニット内の四量体の数の４倍超の狭い温度範囲内で、捕捉オリゴヌクレオチドの集合の構成員にほとんどミスマッチなくハイブリダイズすると考えられる。（１）セット内の各四量体がセット内の他の全ての四量体と少なくとも２ヌクレオチド塩基異なり、（２）互いに相補的な２つの四量体はセット内に存在せず、および（３）回文構造または２ヌクレオチドの反復である四量体はセット内に存在しない、四量体セットから、２倍の多量体ユニットオリゴヌクレオチドが形成される。２倍の多量体ユニットオリゴヌクレオチドの集合はそれから以下のオリゴヌクレオチドを除去している：捕捉オリゴヌクレオチドが位置特定可能なアレイ特異的部分に相補的なヌクレオチド配列を有する、（１）四量体の数の１１倍未満および四量体の数の１５倍超の融点（摂氏）を有するオリゴヌクレオチド、（２）同じ３つの四量体が相互に連結された２倍の多量体ユニット、および（３）同じ４つの四量体が分断ありまたはなしで相互に連結された２倍の多量体ユニット。
【００２８】
本発明の別の局面は、固体支持体上で捕捉オリゴヌクレオチドに不適切に交叉ハイブリダイゼーションすると考えられるリガーゼ検出反応オリゴヌクレオチドを合成することを避ける方法に関する。この方法は、リガーゼ検出反応オリゴヌクレオチドを捕捉オリゴヌクレオチドと比較すること、およびリガーゼ検出反応オリゴヌクレオチドと交叉ハイブリダイゼーションする可能性が高い任意の捕捉オリゴヌクレオチドを同定することを含む。
【００２９】
発明および図面の詳細な説明
本発明は、複数の捕捉オリゴヌクレオチドプローブが狭い範囲の融点を有し、相補的オリゴヌクレトチドがほとんどミスマッチなくハイブリダイズする支持体上で使用するための複数の捕捉オリゴヌクレオチドプローブを設計する方法に関する。本方法の第１段階は、（１）セット内の各四量体がセット内の他の全ての四量体と少なくとも２ヌクレオチド塩基異なり、（２）互いに相補的な２つの四量体はセット内に存在せず、（３）回文構造または２ヌクレオチドの反復である四量体はセット内に存在せず、かつ（４）１以下または３以上のヌクレオチドＧまたはＣを有する四量体はセット内に存在しない、互いに連結された４個のヌクレオチドである、複数の四量体の第１のセットを提供する段階を含む。第１のセットの２個から４個の四量体の群は多量体ユニットの集合を形成するために互いに連結される。多量体ユニットの集合から、同じ四量体から形成された全ての多量体ユニット、および多量体ユニットを形成する四量体の数の４倍未満の融点（摂氏）を有する全ての多量体ユニットが、多量体ユニットの修飾型集合を形成するために除去される。多量体ユニットの修飾型集合は一覧において融点順に配置される。多量体ユニットの修飾型集合の順番は、融点の２℃の増分内で無作為化される。一覧中の交互の多量体ユニットはその後、第１および第２の亜集合に分割され、各々は融点順に配置される。２番目の亜集合の順番を反転させた後、２倍の多量体ユニットの集合を形成するために、反転された２番目の集合に第１の集合が順に連結される。２倍の多量体ユニットの修飾型集合を形成するために、２倍の多量体ユニットの集合から、（１）四量体の数の１１倍未満および四量体の数の１５倍超の融点（摂氏）を有する、（２）同じ３個の四量体が相互に連結された２倍の多量体ユニット、および（３）同じ４個の四量体が分断ありでまたはなしで相互に連結された２倍の多量体ユニットを有するそれらのユニットが除去される。
【００３０】
本発明の別の局面は、支持体および支持体上の異なる部位の２倍の多量体ユニットオリゴヌクレオチドの集合を含むので、固体支持体上に固定された相補的オリゴヌクレオチドが異なる位置に捕捉されることができる、オリゴヌクレオチドアレイに関する。相補的オリゴヌクレオチドは、２４℃超の狭い温度範囲内で２倍の多量体ユニットオリゴヌクレオチドの集合の構成員にほとんどミスマッチなくハイブリダイズすると考えられる。（１）セット内の各四量体がセット内の他の全ての四量体と少なくとも２ヌクレオチド塩基異なり、（２）互いに相補的な２つの四量体はセット内に存在せず、および（３）回文構造または２ヌクレオチドの反復である四量体はセット内に存在しない、四量体セットから２倍の多量体ユニットオリゴヌクレオチドが形成され、２倍の多量体ユニットオリゴヌクレオチドの集合はそれから以下のオリゴヌクレオチドを除去した：（１）四量体の数の１２．５倍未満および四量体の数の１４倍超の融点（摂氏）を有するオリゴヌクレオチド、（２）同じ３つの四量体が相互に連結された２倍の多量体ユニット、および（３）同じ４つの四量体が分断ありでまたはなしで相互に連結された多量体ユニット。
【００３１】
本発明のさらに別の局面は、複数の標的ヌクレオチド配列における一つまたは複数の単一塩基変化、挿入、欠失または転座により異なる、一つまたは複数の配列を同定する方法に関する。この方法は複数の配列差異を有する一つまたは複数の標的ヌクレオチド配列を潜在的に含む試料を提供することを含む。複数のオリゴヌクレオチドプローブセットにはまた、（ａ）標的特異的部分および位置特定可能なアレイ特異的部分を有する第１のオリゴヌクレオチドプローブ、および（ｂ）標的特異的部分および検出可能なレポーター標識を含む第２のオリゴヌクレオチドプローブにより特徴付けられる各セットが提供される。特定のセットにおけるオリゴヌクレオチドプローブは、相当する標的ヌクレオチド配列上で互いに隣接してハイブリダイズする時には、相互連結されるのに適切であるが、しかし試料中に存在するその他の任意のヌクレオチド配列にハイブリダイズする場合はそのような連結を妨害するミスマッチを有する。リガーゼにはまた、試料、複数のオリゴヌクレオチドプローブセット、および混合液を形成するために混濁されたリガーゼが提供される。任意のハイブリダイズしているオリゴヌクレオチドが標的ヌクレオチド配列から分離される変性処理、および、もし試料中に存在するならば各々の標的ヌクレオチド配列に、塩基特異的な様式でオリゴヌクレオチドプローブセットが隣接部位でハイブリダイズし、および（ａ）位置特定可能なアレイ特異的部分、（ｂ）互いに連結された標的特異的部分、および（ｃ）検出可能なレポーター標識を含む、連結産物配列を形成するために互いに連結される、ハイブリダイゼーション処理を含む一回または複数のリガーゼ検出反応サイクルにこの混合液は供される。オリゴヌクレオチドプローブセットは各々の標的ヌクレオチド配列以外の、試料中に存在するヌクレオチド配列にハイブリダイズしうるが、しかし一つまたは複数のミスマッチの存在のために相互に連結されず、変性処理で個々に分離される。捕捉オリゴヌクレオチドが位置特定可能なアレイ特異的部分に相補的なヌクレオチド配列を有し、２倍の多量体ユニットオリゴヌクレオチドの集合から形成される、異なる部位に固相化された捕捉オリゴヌクレオチドが支持体に提供される。位置特定可能なアレイ特異的部分を有するオリゴヌクレオチドは、多量体ユニット内の四量体の数の４倍超の狭い温度範囲内で、捕捉オリゴヌクレオチドの集合の構成員に、ほとんどミスマッチなくハイブリダイズすると考えられる。（１）セット内の各四量体がセット内の他の全ての四量体と少なくとも２ヌクレオチド塩基異なり、（２）互いに相補的な２つの四量体はセット内に存在せず、および（３）回文構造または２ヌクレオチドの反復である四量体はセット内に存在しない四量体セットから２倍の多量体ユニットオリゴヌクレオチドが形成される。２倍の多量体ユニットの修飾型集合を形成するために、２倍の多量体ユニットオリゴヌクレオチドの集合はそれから以下のオリゴヌクレオチドを除去している：（１）四量体の数の１１倍未満および四量体の数の１５倍超の融点（摂氏）を有するオリゴヌクレオチド、（２）同じ３つの四量体が相互に連結された２倍の多量体ユニット、および（３）同じ４つの四量体が分断ありでまたはなしで相互に連結された２倍の多量体ユニット。混合液を一回または複数のリガーゼ検出反応サイクルに供した後に、位置特定可能なアレイ特異的部分が捕捉オリゴヌクレオチドプローブに塩基特異的様式でハイブリダイズし、それにより位置特定可能なアレイ特異的部分が、相補的捕捉オリゴヌクレオチドを有する部位に支持体上で捕捉されるのに有効な条件下で混合液が支持体に接触される。特定部位において支持体に捕捉された連結産物のレポーター標識が検出され、試料中に一つまたは複数の標的ヌクレオチド配列が存在することを示す。
【００３２】
本発明の別の局面は、複数の標的ヌクレオチド配列における１塩基の変化、挿入、欠失または転座により異なる一つまたは複数の配列を同定するキットに関する。リガーゼに加えて、そのキットは、特定のセットにおけるオリゴヌクレオチドプローブは、各々の標的ヌクレオチド配列上で互いに隣接してハイブリダイズする時は互いに連結されるのに適切であるが、しかしに存在するその他のヌクレオチド配列にハイブリダイズする時はそのような連結を妨害するミスマッチを有する、（ａ）標的配列特異的部分および位置特定可能なアレイ特異的部分を有する第１のオリゴヌクレオチドプローブ、および（ｂ）標的配列特異的部分および検出可能なレポーター部分を含む第２のオリゴヌクレオチドプローブにより各々が特徴付けられる複数のオリゴヌクレオチドプローブセットを含む。捕捉オリゴヌクレオチドが位置特定可能なアレイ特異的部分に相補的なヌクレオチド配列を有し、２倍の多量体ユニットオリゴヌクレオチドの集合から形成される、異なる部位に固相化された異なる捕捉オリゴヌクレオチドを有する支持体もまたキット中に見出される。位置特定可能なアレイ特異的部分を有するオリゴヌクレオチドは、多量体ユニット内の四量体の数の４倍超の狭い温度範囲内で、捕捉オリゴヌクレオチドの集合の構成員にほとんどミスマッチなくハイブリダイズすると考えられる。（１）セット内の各四量体がセット内の他の全ての四量体と少なくとも２ヌクレオチド塩基異なり、（２）互いに相補的な２つの四量体はセット内に存在せず、および（３）回文構造または２ヌクレオチドの反復である四量体はセット内に存在しない、四量体セットから、２倍の多量体ユニットオリゴヌクレオチドが形成される。２倍の多量体ユニットオリゴヌクレオチドの集合はそれから以下のオリゴヌクレオチドを除去している：捕捉オリゴヌクレオチドが位置特定可能なアレイ特異的部分に相補的なヌクレオチド配列を有する、（１）四量体の数の１１倍未満および四量体の数の１５倍超の融点（摂氏）を有するオリゴヌクレオチド、（２）同じ３つの四量体が相互に連結された２倍の多量体ユニット、および（３）同じ４つの四量体が分断ありまたはなしで相互に連結された２倍の多量体ユニット。
【００３３】
しばしば、複数の異なる単一塩基の変異、挿入、もしくは欠失が、目的配列の同一ヌクレオチド位置で起こることがある。この方法は、第２のオリゴヌクレオチドプローブが共通で検出可能な標識を含み、かつ第１のオリゴヌクレオチドプローブが異なる位置特定可能なアレイに特異的な部分および標的特異的な部分を有するオリゴヌクレオチドセットの使用を含む。第１のオリゴヌクレオチドプローブは、ミスマッチなしに被検配列にハイブリダイズする場合には、第１の連結接合部で第２の隣接したオリゴヌクレオチドプローブに連結させるために好ましいものである。異なる第１の隣接するオリゴヌクレオチドプローブは、接合部位に別の識別塩基を含み、ミスマッチを含まないハイブリダイゼーションのみが接合部位置で連結可能となるものである。各々の第１の隣接したオリゴヌクレオチドは、異なる位置特定可能なアレイに特異的な部分を含み、従って、特異的塩基の変化が異なるアドレス（ａｄｄｒｅｓｓ）での捕獲によって識別される。このスキームでは、少なくとも１つの塩基により、他の核酸と異なる別の核酸配列の多重検出を行うために、複数の異なる捕獲オリゴヌクレオチドを、固体支持体上の異なる位置に結合させてある。または、第１のオリゴヌクレオチドプローブは、共通の位置特定可能なアレイに特異的な部分を含み、第２のオリゴヌクレオチドプローブは異なる検出可能な標識および標的特異的な部分を有する。
【００３４】
このような配置により、少なくとも１つの塩基が他の核酸と異なる別の核酸配列の多重検出が可能となる。このような多重検出を実施する際には、該核酸配列が同一もしくは異なる対立遺伝子上に存在する。
【００３５】
本発明はまた、リガーゼを含む本発明の方法を実施するためのキット、複数の異なるオリゴヌクレオチドプローブのセット、および捕獲オリゴヌクレオチドを固定化した固体支持体に関する。標的塩基配列の予備的増幅に用いるプライマーもキットに含まれる。増幅をポリメラーゼ連鎖反応で実施する場合には、ポリメラーゼもキットに含まれる。
【００３６】
図１および図２には、キャピラリー電気泳動もしくはゲル電気泳動／蛍光の定量化を利用した先行技術のリガーゼによる検出反応と比較した本発明の方法の流れ図を示す。図１は生殖系列の変異検出に関し、図２は癌の検出を示す。
【００３７】
図１は、リ−フラウメニ症候群（Ｌｉ−Ｆｒａｕｍｅｎｉｓｙｎｄｒｏｍｅ）の原因となるｐ５３変異等の生殖系列における点突然変異の検出を示す。段階１において、ＤＮＡ試料の調製後、Ｔａｑ（すなわち、Ｔｈｅｒｍｕｓａｑｕａｔｉｃｕｓ）ポリメラーゼを用いホットスタートの条件下でエキソン５〜８をＰＣＲ増幅した。反応の最後に、プロテイナーゼＫを用いた処理によりＴａｑポリメラーゼを失活させる。段階２では、該産物を対立遺伝子特異的および共通のＬＤＲプローブを含む新しいＬＤＲ緩衝液で２０倍に希釈する。チューブは、通常、各プライマーを約５００フェムトモル含む。段階３では、リガーゼによる検出反応は、Ｔａｑリガーゼの添加によりホットスタート条件下で開始する。ＬＤＲプローブは、接合部部位における完全な相補性を示す標的配列の存在下でのみ隣接したプローブと連結する。産物は２つの異なる形態で検出される。第１の形態４ａでは、当先行技術分野において用いられる、蛍光標識されたＬＤＲプローブは、異なる長さのポリＡもしくは酸化ヘキサエチレン・テールを含む。従って、僅かに異なる易動度を有する正常ＤＮＡに対する連結で生じる各々のＬＤＲ産物はピークのラダーを与える。生殖系列の突然変異によって、電気泳動像に新たなピークが生成する。新しいピークのサイズは、概ねもとの試料に存在する変異の量に相当する。ホモ接合体の正常で０％、ヘテロ接合体の担体で５０％、ホモ接合体の変異体では１００％である。第２の形態４ｂにおいては、本発明に従って、各々の対立遺伝子特異的プローブは、例えば、付加的な２４ヌクレオチド塩基をその５’末端に含む。これらの配列は、位置特定可能なアレイ上で相補的アドレス配列に特異的にハイブリダイズする単一の位置特定可能な配列である。ＬＤＲ反応では、各々の対立遺伝子特異的プローブは、対応する標的配列の存在下で隣接する蛍光標識した共通プローブに対して連結を行うことができる。野生型および変異体の対立遺伝子は、アレイ上の隣接したアドレスに捕獲される。未反応のプローブを洗い流す。黒いドットは、野性型対立遺伝子に関して１００％のシグナルを示す。白いドットは、変異体の対立遺伝子に関して０％のシグナルを示す。斜線で示されたドットは、生殖系列の突然変異における１つの位置での各々の対立遺伝子に関して５０％のシグナルを示す。
【００３８】
図２は、ｐ５３腫瘍抑制性遺伝子における体細胞変異の検出を表すが、いずれも通常、低感度の変異検出に関するものである。段階１では、ＤＮＡ試料を調製し、蛍光ＰＣＲプライマーを用いてエキソン５〜９を３つの断片としてＰＣＲで増幅する。これにより、段階２でのキャピラリー電気泳動もしくはゲル電気泳動を用いたＰＣＲ産物の蛍光の定量化が可能となる。段階３では、マーカーＤＮＡの１／１００希釈（３つの断片の各々に対し）で産物が急増する。癌細胞では観察されない変異を含むが、適当なＬＤＲプローブで容易に検出されること以外は、このＤＮＡは、野性型ＤＮＡに相同である。段階４の混合したＤＮＡ産物を変異体もしくはマーカー対立遺伝子に対してのみ特異的な全ＬＤＲプローブを含む緩衝液で２０倍に希釈する。段階５では、リガーゼ検出反応を、Ｔａｑリガーゼの添加によりホットスタート条件下で開始した。接合部部位における完全な相補性を与える標的配列の存在下でのみ、隣接したプローブに対してＬＤＲプローブの連結が起こる。図１に記載される同一の２つの形態で、産物が検出される。段階６ａの当先行技術分野において用いられる形態では、産物はキャピラリー電気泳動もしくはゲル電気泳動で分離し、蛍光シグナルを定量する。変異体ピークのマーカーピークに対する比は、１００分割したもとの試料に存在する癌の突然変異量の概算を与える。段階６ｂの形態では、本発明に基づいて、位置特定可能なアレイ上の相補的配列に対する特異的ハイブリダイゼーションで産物を検出する。マーカードットに対する変異体ドットの蛍光シグナル比は、１００分割したもとの試料に存在する癌の突然変異量の概算を与える。
【００３９】
本発明のリガーゼによる検出反応の方法は、図３〜図１５を参照することによって最もよく理解される。一般的には、これは、Ｂａｒａｎｙらの国際公開公報第９０／１７２３９号；Ｆ．Ｂａｒａｎｙらの「耐熱性ＤＮＡリガーゼをコードする遺伝子のクローニング、過剰発現および塩基配列（Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ａ Ｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｌｅ ＤＮＡ Ｌｉｇａｓｅ−ｅｎｃｏｄｉｎｇ Ｇｅｎｅ）」（Ｇｅｎｅ． １０９：１−１１（１９９１））、およびＦ．Ｂａｒａｎｙらの「クローン化耐熱のリガーゼを用いた遺伝病の検出およびＤＮＡ増幅（Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ＤＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｕｓｉｎｇ Ｃｌｏｎｅｄ Ｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｌｅ Ｌｉｇａｓｅ）」（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ． ８８：１８９−１９３（１９９１））等に記載されており、これらの開示は参照として本明細書に組み入れられる。本発明のリガーゼによる検出反応には、２セットの相補的オリゴヌクレオチドを用いることができる。これは、直ぐ上に示した３つの参考文献に記載のリガーゼ連鎖反応として知られるものであり、参照として本明細書に組み入れられる。または、リガーゼによる検出反応は、オリゴヌクレオチド連結アッセイ法として知られる単一サイクルを含む。Ｌａｎｄｅｇｒｅｎらの「リガーゼによる遺伝子検出技術（Ａ Ｌｉｇａｓｅ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｇｅｎｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ）」Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４１：１０７７−８０（１９８８）；Ｌａｎｄｅｇｒｅｎ  らの「ＤＮＡ診断薬−分子技術と自動化（ＤＮＡ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ−Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｎｄ Ａｕｔｏｍａｔｉｏｎ）」、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：２２９−３７（１９８８）；およびＬａｎｄｅｇｒｅｎらの米国特許第４，９８８，６１７号を参照のこと。
【００４０】
方法のリガーゼによる検出反応期の際、ハイブリダイゼーションは５０〜８５℃で起こるが、変性処理は８０〜１０５℃で実施する。各々のサイクルは、変性処理および全体として約１〜５分の加熱ハイブリダイゼーション処理からなる。通常、連結による検出反応は、２〜５０サイクルの繰り返し変性とハイブリダイゼーションを行うことを含む。該方法のリガーゼによる検出反応段階にかかる全体の時間は１〜２５０分である。
【００４１】
オリゴヌクレオチドプローブのセットは、リボヌクレオチド、デオキシヌクレオチド、修飾リボヌクレオチド、修飾デオキシリボヌクレオチド、ペプチドヌクレオチド類縁体、修飾ペプチドヌクレオチド類縁体、修飾リン酸塩・糖鎖骨格オリゴヌクレオチド、ヌクレオチド類縁体、およびその混合物の形態であってもよい。
【００４２】
一つの変法において、オリゴヌクレオチドプローブのセットのオリゴヌクレオチドは、各々が６６〜７０℃のハイブリダイゼーションもしくは融解温度（すなわち、Ｔｍ）を有する。これらのオリゴヌクレオチドは２０〜２８ヌクレオチドの長さである。
【００４３】
ＤＮＡアレイ上に連結産物を捕獲する前に位置特定可能なヌクレオチドアレイ特異的な部分を含む未変換のＬＤＲオリゴヌクレオチドプローブを化学的もしくは酵素的に破壊することが望ましい。これを行わない場合、このような未変換のプローブは、相補的配列を含む固体支持体のアレイ上のアドレスで、結合に関して連結産物と競合する。破壊はエキソヌクレアーゼＩＩＩ等（Ｌ−Ｈ Ｇｕｏ ａｎｄ Ｒ．Ｗｕ、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １００：６０−９６（１９８５）、これは参照として本明細書に組み入れられる）のエキソヌクレアーゼを利用し、端でブロックされ、互いにプローブの連結には含まれないＬＤＲプローブと組み合わせることによって達成できる。ブロッキング部分は、レポーター基もしくはホスホロチオエート基を含むことができる（Ｔ．Ｔ．Ｎｉｋｉｆｏｒｏｗ  らの「単一鎖ＰＣＲ産物の調製のためのホスホロチオエートプライマーおよびエキソヌクレアーゼ加水分解の利用と固相ハイブリダイゼーションによる検出（Ｔｈｅ Ｕｓｅ ｏｆ Ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ Ｐｒｉｍｅｒｓ ａｎｄ Ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ Ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ ＰＣＲ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｂｙ Ｓｏｌｉｄ−ｐｈａｓｅ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）」、ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．３：ｐ．２８５−２９１（１９９４）、これは参照として本明細書に組み入れられる）。ＬＤＲ法の後に、連結の起こらなかったプローブは、反応混合物をエキソヌクレアーゼと反応させて選択的に破壊する。連結の起こったプローブは、エキソヌクレアーゼ反応の開始に必要なフリーの３’末端の除去により保護される。このアプローチにより、特にＬＤＲ反応が少量の産物のみを形成する場合にシグナル対雑音比の増加が起こる。連結の起こらなかったオリゴヌクレオチドは、捕獲に関して捕獲オリゴヌクレオチドと競合するので、このような連結の起こったオリゴヌクレオチドとの競合はシグナルを低下させる。このアプローチの別の利点は、ハイブリダイズしていない標識を含む配列が分解し、したがって、標的に依存しないバックグラウンドシグナルを生じづらくなることである。何故ならば、洗浄によってＤＮＡアレイからより容易に除去され得るからである。
【００４４】
上記のオリゴヌクレオチドプローブのセットは、検出に好ましいレポーター標識を有する。有用な標識は、発色基、蛍光部分、酵素、抗原、重金属、磁気プローブ、色素、燐光基、放射線物質、化学発光部位、および電気化学的検出部位を含む。捕獲オリゴヌクレオチドは、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、修飾リボヌクレオチド、修飾デオキシリボヌクレオチド、ペプチドヌクレオチド類縁体、修飾ペプチドヌクレオチド類縁体、修飾リン酸塩−糖骨格オリゴヌクレオチド、ヌクレオチド類縁体、およびその混合物の形態であり得る。本発明の方法が複数のオリゴヌクレオチドセットの使用を含む場合、第２のオリゴヌクレオチドプローブは同一でもよいが、第１のオリゴヌクレオチドプローブの位置特定可能なアレイに特異的な部位は異なっている。または、第１のオリゴヌクレオチドプローブの位置特定可能なアレイに特異的な部位は同一でもよいが、第２のオリゴヌクレオチドプローブのレポーター標識は異なる。
【００４５】
本発明の連結による検出反応期前に、好ましくは、最初の標的核酸の増幅法で試料を増幅する。これにより、試料中の標的塩基配列の量が増加する。例えば、最初の標的核酸の増幅が、ポリメラーゼ連鎖反応法、配列の自己複製、もしくはＱ−βレプリカーゼによって媒介されるＲＮＡ増幅を用いて達成される。ポリメラーゼ連鎖反応法は、好ましい増幅法であり、Ｈ．Ｅｒｌｉｃｈらの「ポリメラーゼ連鎖反応における最近の進歩（Ｒｅｃｅｎｔ Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）」（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５２：１６４３−５０（１９９１）；Ｍ．Ｉｎｎｉｓらの「ＰＣＲプロトコール：方法と応用の指針（Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）」（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ： Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９０））；およびＲ．Ｓａｉｋｉらの「耐熱性ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡのプライマー特異的な酵素的増幅（Ｐｒｉｍｅｒ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＤＮＡ ｗｉｔｈ ａ Ｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｌｅ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）」（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：４８７−９１（１９８８））等に詳細に記載されており、これらは参照として本明細書に組み入れられる。参照として本明細書に組み入れられるＪ．Ｇｕａｔｅｌｌｉらの「レトロウイルスの複製をモデルにしたマルチ酵素反応による核酸の等熱インビトロ増幅（Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ， ｉｎｖｉｔｒｏ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ ｂｙ ａ Ｍｕｌｔｉｅｎｚｙｍｅ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｍｏｄｅｌｅｄ Ａｆｔｅｒ Ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ）」（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：１８７４−７８（１９９０））には、配列の自己複製法に関して記載がある。Ｑβレプリカーゼによって媒介されるＲＮＡ増幅は、Ｆ．Ｋｒａｍｅｒらの「複製可能なＲＮＡレポーター（Ｒｅｐｌｉｃａｔａｂｌｅ ＲＮＡ Ｒｅｐｏｒｔｅｒｓ）」（Ｎａｔｕｒｅ ３３９：４０１−０２（１９８９））に開示されており、これは参照として本明細書に組み入れられる。
【００４６】
本発明のポリメラーゼ連鎖反応法の使用およびその後のリガーゼによる検出法の使用を図３に示す。ここで二つの多型におけるホモもしくはヘテロ接合性（すなわち、対立遺伝子としての差異）は、同一遺伝子上にある。または、このような対立遺伝子の差異は異なる遺伝子上にあってもよい。
【００４７】
図３に示されるように、標的核酸が二本鎖ＤＮＡ分子の形態である場合、変性して鎖を分離させる。これは、８０〜１０５℃程度の温度に加熱することによって達成する。次に、ポリメラーゼ連鎖反応のプライマーを加え、通常、２０〜８５℃程度の温度で鎖にハイブリダイズさせる。また、耐熱性ポリメラーゼ（例えば、Ｔｈｅｒｍｕｓａｑｕａｔｉｃｕｓポリメラーゼ）を添加し、温度を５０〜８５℃に調整して、プライマーがハイブリダイズする核酸の長さに沿ってプライマーを伸長させる。ポリメラーゼ連鎖反応の伸長の段階後に、得られた二本鎖分子を８０〜１０５℃の温度に加熱し、分子を変性させ鎖を分離させる。これらのハイブリダイゼーション、伸長、および変性の段階を、何回も繰り返して標的を適当なレベルに増幅する。
【００４８】
方法のポリメラーゼ連鎖反応期が完了すると、図３に示す連結による検出反応期が開始される。二本鎖ＤＮＡ分子の状態であれば、８０〜１０５℃の温度、好ましくは９４℃で標的核酸を変性させた後、標的塩基配列の一方の鎖に対する連結による検出反用のオリゴヌクレオチドプローブをリガーゼ（例えば、図３に示す耐熱性リガーゼ様のＴｈｅｒｍｕｓａｑｕａｔｉｃｕｓリガーゼ）とともに加える。次に、オリゴヌクレオチドプローブを標的核酸分子にハイブリダイズさせ、通常、４５−８５℃、好ましくは６５℃の温度で連結を行う。連結接合部に完全な相補性があれば、オリゴヌクレオチドはともに連結することができる。置換可能なヌクレオチドがＴまたはＡであるとき、標的塩基配列にＴが存在すれは、位置特定可能なアレイに特異的な部位Ｚ１を有するオリゴヌクレオチドプローブがレポーター標識Ｆを有するオリゴヌクレオチドプローブに連結し、また標的塩基配列にＡが存在すれば、位置特定可能なアレイに特異的な部位Ｚ２を有するオリゴヌクレオチドプローブがレポーター標識Ｆを有するオリゴヌクレオチドプローブに連結する。同様に、変化可能なヌクレオチドがＡまたはＧであるときには、標的塩基配列にＴが存在すれば、位置特定可能なアレイに特異的な部位Ｚ４を有するオリゴヌクレオチドプローブがレポーター標識Ｆを有するオリゴヌクレオチドプローブに連結し、また標的塩基配列にＣが存在すれば、位置特定可能なアレイに特異的な部位Ｚ３を有するオリゴヌクレオチドプローブがレポーター標識Ｆを有するオリゴヌクレオチドプローブと連結する。連結後に、材料を再び変性させてハイブリダイズしている鎖を分離する。ハイブリダイゼーション／連結および変性の段階は、一つもしくは複数のサイクル（例えば、１〜５０サイクル）を経て標的シグナルを増幅する。蛍光連結産物（同様に、位置特定可能なアレイに特異的な部位を有する、連結されなかったオリゴヌクレオチドプローブ）は、位置特定可能なアレイ上の特定のアドレスにおけるＺ１、Ｚ２、Ｚ３、およびＺ４部位に相補的な捕獲プローブへのハイブリダイゼーションにより捕獲される。次に、オリゴヌクレオチドの一方に前もって存在する標識Ｆで、連結の起こったオリゴヌクレオチドの存在を検出する。図３において、連結産物の配列は、位置特定可能なアレイに特異的な部位Ｚ１およびＺ３に相補的な捕獲オリゴヌクレオチドでアレイのアドレスにハイブリダイズするが、連結の起こらなかった位置特定可能なアレイに特異的な部位Ｚ２およびＺ４を有するオリゴヌクレオチドプローブは、その相補的捕獲オリゴヌクレオチドにハイブリダイズする。しかしながら、連結産物の配列のみが標識Ｆを有するので、それらのみの存在が検出される。
【００４９】
図４において、共通のオリゴヌクレオチドプローブが位置特異的な部分を有する一方で対立遺伝子特異的なプローブが異なる標識を有する、ということを除いては、図４は図３に類似している。
【００５０】
図５は、本発明のＰＣＲ／ＬＤＲの段階に関する流れ図であり、与えらた部位がいずれの塩基あっても識別できる。位置特定可能なアレイに特異的な部位Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３、およびＺ４に相補的なアドレスの蛍光シグナルの出現は、標的塩基配列における、それぞれ、Ａ、Ｇ、Ｃ、およびＴ対立遺伝子の存在を示す。ここで、標的塩基配列Ａ、およびＣ対立遺伝子の存在は、部位Ｚ１およびＺ３にそれぞれ相補的な捕獲オリゴヌクレオチドプローブで固体支持体上のアドレスの蛍光で示される。図５では、位置特定可能なアレイに特異的な部位が識別オリゴヌクレオチドプローブ上にあり、識別塩基がこれらのプローブの３’末端にあることに留意されたい。
【００５１】
図６において、共通のオリゴヌクレオチドプローブが位置特異的な部分を有する一方で対立遺伝子特異的なプローブが異なる標識を有する、ということを除いては、図６は図５に類似している。
【００５２】
図７は、本発明の２カ所の近接部位における可能な塩基の存在の検出に関するＰＣＲ／ＬＤＲの段階の流れ図である。ここで、ＬＤＲプライマーは重複していてもよいが、接合部に完全な相補性がある場合に連結が可能である。このことが、重複プライマーが互いに阻害を起こす対立遺伝子特異的ＰＣＲ等のほかのアプローチと、ＬＤＲが異なる点である。図７においては、第１のヌクレオチドの位置は、ＡおよびＣの対立遺伝子でヘテロ接合体であるが、第２のヌクレオチドの位置はＧ、ＣおよびＴの対立遺伝子でヘテロ接合体である。図５に示すように、位置特定可能なアレイに特異的な部位は識別オリゴヌクレオチドプローブ上にあり、識別塩基はこれらのプローブの３’末端にある。レポーター基（例えば、蛍光標識）は、共通オリゴヌクレオチドプローブの３’末端にある。例えば、各々の個体が、２つの正常遺伝子および２つの偽遺伝子を有し、２カ所のスプライス部位（ヌクレオチド６５６）に３つの可能な単一塩基（Ｇ、Ａ、およびＣ）が存在する場合の２１ヒドロキシラーゼ遺伝子に関して、これが可能である。また、これを用いて薬剤耐性（例えば、ＡＺＴに対する）株の出現を示すＨＩＶ感染における低レベルの変異を検出できる。図７に戻って、位置特定可能なアレイに特異的な部位Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５、Ｚ６、Ｚ７、およびＺ８に相補的なアドレスの蛍光シグナルの出現は、ヘテロ接合体の部位のＡおよびＣ対立遺伝子における、それぞれ、Ａ、Ｇ、Ｃ、およびＴの存在、およびヘテロ接合体部位のＧ、Ｃ、およびＴ対立遺伝子における、それぞれＡ、Ｇ、Ｃ、およびＴの存在を示す。
【００５３】
図８において、共通のオリゴヌクレオチドプローブが位置特異的な部分を有する一方で対立遺伝子特異的なプローブが異なる標識を有する、ということを除いては、図８は図７に類似している。
【００５４】
図９は、本発明のＰＣＲ／ＬＤＲの段階に関する流れ図であり、挿入（左上部のプローブセット）および欠失（右下部のプローブセット）を識別する。左では、正常配列がポリＡテールに５つのＡを含む。変異体の配列は、さらに２つのＡがテール内に挿入されている。したがって、位置特定可能なアレイに特異的な部位Ｚ１（正常の配列を表す）およびＺ３（２塩基対の挿入を表す）を有するＬＤＲ産物は、共通プライマーに連結することによって蛍光標識されている。ＬＤＲ法（例えば、耐熱性リガーゼ酵素を用いる）は、単一ヌクレオチド反複における単一塩基の挿入もしくは欠失を簡単に識別できるが、対立遺伝子特異的ＰＣＲでは、このような差異を識別できない。なぜならば、３’塩基が両方の対立遺伝子に存在するためである。右では、正常配列は５つの（ＣＡ）反復（すなわち、ＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡ）である。変異体では、正常配列と比較して２つ少ないＣＡ塩基を含む（すなわち、ＣＡＣＡＣＡ）。これらは、特定位置特定可能なアレイに特異的な部位Ｚ８（正常の配列を表す）およびＺ６（２つのＣＡ欠失を表す）アドレスにおける、蛍光ＬＤＲ産物として検出される。また、さまざまな感染病原体の薬剤に対する耐性は、本発明を用いて調べることができる。図９では、Ｚ１およびＺ３に相補的な捕獲オリゴヌクレオチドを有するアドレスにおける蛍光標識Ｆで示される連結産物の配列の存在は、正常および変異体のポリＡ配列の両方の存在を示す。同様に、Ｚ６およびＺ８に相補的な捕獲オリゴヌクレオチドを有するアドレスの蛍光標識Ｆで示される連結産物の配列の存在は、正常なＣＡの繰り返し配列および繰り返しユニットが１つ欠失した配列の両方の存在を示す。
【００５５】
図１０において、共通のオリゴヌクレオチドプローブが位置特異的な部分を有する一方で対立遺伝子特異的なプローブが異なる標識を有する、ということを除いては、図１０は図９に類似している。
【００５６】
図１１は、過剰の正常配列の存在における低レベルの変異を検出する位置特定可能なアレイに特異的な部位を用いた  本発明のＰＣＲ／ＬＤＲの段階に関する流れ図である。図１１は、Ｋ−ｒａｓ遺伝子のグリシン（Ｇｌｙ）をコードするコドン１２の配列ＧＧＴを示す。ごく一部の細胞が、アスパラギン酸（Ａｓｐ）をコードするＧＡＴにおけるＧからＡへの変異を含む。野生型のＬＤＲプローブ（すなわち、正常配列）は、反応から除外される。正常ＬＤＲプローブ（識別塩基＝Ｇを有する）を含む場合、これらを共通プローブに対して連結さることによって、変異体の標的に由来するシグナルより強めることができる。代わりに、図１１に示されるように、蛍光標識Ｆを有する連結産物の配列の存在は、位置特定可能なアレイに特異的な部位Ｚ４に相補的な捕獲オリゴヌクレオチドを有するアドレスにおけるアスパラギン酸をコードする変異体の存在を示す。
【００５７】
図１２において、共通のオリゴヌクレオチドプローブが位置特異的な部分を有する一方で対立遺伝子特異的なプローブが異なる標識を有する、ということを除いては、図１２は図１１に類似している。
【００５８】
図１３は、本発明のＰＣＲ／ＬＤＲの段階に関する流れ図であり、位置特定可能なアレイに特異的な部位が、共通のオリゴヌクレオチドプローブに配置されおり、識別オリゴヌクレオチドプローブはレポーター標識を有する。対立遺伝子の差異は、異なる蛍光シグナルＦ１、Ｆ２、Ｆ３、およびＦ４で識別される。この方法により、より高密度なアレイの使用が可能となる。なぜならば、各々の位置は、特定の基で発光すると予測されるからである。エミッションスペクトルにおいて最小重複を有し、多重走査が必要な蛍光基を必要とするという不利な点を有する。これは低レベルの対立遺伝子（例えば、癌に関連した変異）の検出に理想的といえるほど好適ではない。
【００５９】
図１４は、本発明のＰＣＲ／ＬＤＲの段階に関する流れ図であり、隣接および近傍の対立遺伝子の両方が検出される。隣接した変異は、互いの右隣にあり、１セットのオリゴヌクレオチドプローブが接合部の３’末端の塩基を識別する（異なる位置特定可能なアレイに特異的な部位Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３、およびＺ４の使用によって）が、もう一方のオリゴヌクレオチドプローブのセットは、接合部の５’末端の塩基を識別する（異なる蛍光レポーター標識Ｆ１、Ｆ２、Ｆ３、およびＦ４の使用）。図１４では、疾患遺伝子（例えば、嚢胞性線維症ＣＦＴＲ）のＧｌｙおよびアルギニン（Ａｒｇ）をコードするコドンが、それぞれ、生殖系列の突然変異の候補である。図１４の検出結果は、Ｇｌｙ（ＧＧＡ；連結産物の配列を有する部位Ｚ２および標識Ｆ２で示される）がグルタミン酸（Ｇｌｕ）（ＧＡＡ；部位Ｚ２および標識Ｆ１を有する連結産物の配列で示される）に突然変異を起こしており、Ａｒｇ（ＣＧＧ；部位Ｚ７および標識Ｆ２を有する連結産物の配列で示される）がトリプトファン（Ｔｒｐ）（ＴＧＧ；部位Ｚ８および標識Ｆ２を有する連結産物の配列で示される）に突然変異を起こしていることを示している。したがって、患者は、複合ヘテロ接合型の個体である（すなわち、両方の遺伝子に変異体対立遺伝子を有する）。
【００６０】
図１５は、本発明のＰＣＲ／ＬＤＲの段階に関する流れ図であり、単一コドンに関して可能な単一塩基の変異すべてが検出される。通常アミノ酸のコドンは３番目の塩基が縮重しているのでこれら可能な変異すべてについて、蛋白質レベルで最初の２つの位置を決定できる。これらのアミノ酸には、アルギニン、ロイシン、セリン、トレオニン、プロリン、アラニン、グリシン、およびバリンを含む。しかしながら、幾つかのアミノ酸については、コドンの３つの塩基すべてを調べるので、３箇所の隣接した位置の変異を識別するオリゴヌクレオチドプローブが必要となる。図１５に示すように、３’末端に対する最後から２番目の位置に４種の可能な塩基を含む４つのオリゴヌクレオチドプローブを設計し、また３’末端に４種の考え得る塩基を含む別の４つの捕獲オリゴヌクレオチドを設計し、この問題を解決する。レポーター標識のみを有する共通オリゴヌクレオチドプローブはコドンの縮重に対応し、同一のアレイアドレスで捕獲され異なる連結産物の配列間の識別ができる２つの蛍光基を有している。例えば、図１５に示されるように、グルタミン（Ｇｌｎ）をコードするコドン（すなわち、ＣＡＡおよびＣＡＧ）の存在が、部位Ｚ１および標識Ｆ２を含む連結産物の配列の存在によって示される。同様に、ヒスチジン（Ｈｉｓ）をコードする変異（コドンＣＡＣでコードされる）に対するＧｌｎの存在は、部位Ｚ１および標識Ｆ２を有する連結産物の配列の存在ならびに部位Ｚ７および標識Ｆ２を有する連結産物の配列の存在によって示される。プライマーＺ１およびＺ７が同一の配列を有するという事実に起因し、このアッセイ法に冗長性が内在する。
【００６１】
本発明の特に重要な局面は、試料中の標的塩基配列の量が定量可能であることである。内部（すなわち、該試料を用いた増幅・検出により得られる標準材料）もしくは外部（すなわち、得られる標準物質は増幅されないが該試料を用いて検出される）標準を得ることによって、これを様々な方法で達成することができる。
【００６２】
ある定量法に従って、レポーター標識により生成したシグナルは、分析試料より生産された連結産物の配列の捕獲によって生じ検出されるものである。このシグナル強度は、生成した既知の量の標的塩基配列を有する試料中に存在する連結産物の配列の捕獲によって生じるシグナルによって得られる検量線と比較する。その結果、分析試料中の標的塩基配列の量を調べることができる。本技術は、外部標準の使用を含む。
【００６３】
本発明の別の定量法は、内部標準に関する。ここでは、既知の量の一つもしくは複数のマーカー標的塩基配列を試料に添加する。さらに、複数のマーカー特異的オリゴヌクレオチドプローブのセットをリガーゼ、上記のオリゴヌクレオチドプローブのセットおよび試料とともに混合物に添加する。マーカー特異的オリゴヌクレオチドプローブのセットは、（１）マーカー標的塩基配列に相補的な標的特異的な部位ならびに支持体上の捕獲オリゴヌクレオチドに相補的な位置特定可能なアレイに特異的な部位を有する第１のオリゴヌクレオチドプローブ、（２）マーカー標的塩基配列に相補的な標的特異的な部位ならびに検出可能なレポーター標識を有する第２のオリゴヌクレオチドプローブを含む。特定のマーカー特異的オリゴヌクレオチドセットにおけるオリゴヌクレオチドプローブは、対応するマーカー標的塩基配列上で相互に隣接してハイブリダイズし、互いに連結することにおいて適切である。しかしながら、試料中の他のヌクレオチド配列または添加したマーカー配列にハイブリダイズする場合には、このような連結を阻害するミスマッチが存在する。支持体上に捕獲された連結産物の配列の存在は、レポーター標識の検出によって同定される。次に、既知の量のマーカー標的塩基配列から生成し捕獲された連結産物の量を捕獲された他の連結産物の配列の量と比較することによって、試料中の標的塩基配列の量を決定する。
【００６４】
本発明の別の定量法は、複数の配列上の差異を有する２つもしくはそれ以上の複数の標的塩基配列を含む試料の解析を含む。ここでは、標的塩基配列に対応する連結産物の配列が、上記のいずれかの技術によって検出・識別される。次に、生成し捕獲された連結産物の配列の相対量を比較して、試料中の標的塩基配列の相対量を定量する。これは、試料における標的塩基配列の相対的レベルの定量的尺度を提供する。
【００６５】
本発明のリガーゼによる検出反応法の段階の前に、リガーゼ連鎖反応法を行い、オリゴヌクレオチド産物を増幅することもできる。本方法は、Ｆ．Ｂａｒａｎｙらの「耐熱性ＤＮＡリガーゼをコードする遺伝子のクローニング、過剰発現および塩基配列（Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ａ Ｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｌｅ ＤＮＡ Ｌｉｇａｓｅ−ｅｎｃｏｄｉｎｇ Ｇｅｎｅ）」、Ｇｅｎｅ １０９：１−１１（１９９１）、およびＦ．Ｂａｒａｎｙらの「クローン化耐熱のリガーゼを用いた遺伝病の検出およびＤＮＡ増幅（Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ＤＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｕｓｉｎｇ Ｃｌｏｎｅｄ Ｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｌｅ Ｌｉｇａｓｅ）」（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：１８９−９３（１９９１））に完全な記載があり、これらは参照として本明細書に組み入れられる。増幅にリガーゼ連鎖反応を用いる代わりに、転写に基づく増幅法を利用することもできる。
【００６６】
好ましい耐熱性リガーゼはＴｈｅｒｍｕｓａｑｕａｔｉｃｕｓ由来のものである。本酵素はこの生物から単離できる（Ｍ．Ｔａｋａｈａｓｈｉら「好熱性ＤＮＡリガーゼ（Ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｌｉｃ ＤＮＡ ｌｉｇａｓｅ）」（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２５９：１００４１−４７（１９８４））；これは参照として本明細書に組み入れられる）。または、リコンビナントで調製することもできる。このような単離法は、リコンビナントＴｈｅｒｍｕｓａｑｕａｔｉｃｕｓリガーゼの産生（およびＴｈｅｒｍｕｓｔｈｅｍｏｐｈｉｌｕｓリガーゼ）とともに、Ｂａｒａｎｙらの国際公開公報第９０／１７２３９号、およびＦ．Ｂａｒａｎｙらの「耐熱性ＤＮＡリガーゼをコードする遺伝子のクローニング、過剰発現および塩基配列（Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ａ Ｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｌｅ ＤＮＡ Ｌｉｇａｓｅ−ｅｎｃｏｄｉｎｇ Ｇｅｎｅ）」（Ｇｅｎｅ．１０９：１−１１（１９９１））等に開示されており、参照として本明細書に組み入れられる。これらの文献は、このリガーゼおよびこれをコードするＤＮＡの完全な配列情報を含む。他の好ましいリガーゼとしては、Ｅ．ｃｏｌｉリガーゼ、Ｔ４リガーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓｓｐ．ＡＫ１６リガーゼ、Ａｑｕｉｆｅｘａｅｏｌｉｃｕｓリガーゼ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａｍａｒｉｔｉｍａリガーゼおよび、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓリガーゼを含む。
【００６７】
連結増幅混合物は、サケ精子ＤＮＡ等の担体ＤＮＡを含んでいてもよい。
【００６８】
好ましくは加熱ハイブリダイゼーション処理であるハイブリダイゼーションの段階では、連結接合部における識別ヌクレオチドに基づく塩基配列間での識別を行う。標的塩基配列間の差異は、例えば、単一核酸塩基の差、核酸の欠失、再構成である。１塩基以上を含むこのような配列の差異も検出できる。好ましくは、オリゴヌクレオチドプローブのセットは実質的に同一の長さを有し、それらを実質的に同様なハイブリダイゼーション条件で標的塩基配列にハイブリダイズする。その結果、本発明の方法は、感染性疾患、遺伝病、および癌を検出できる。また、環境モニタリング、法医科学、および食品科学においても有用である。
【００６９】
広く多様な感染性疾患は、本発明の方法で検出できる。通常、これらは細菌性、ウイルス性、寄生性、および真菌性の感染病原体によっておこる。また、さまざまな感染病原体の薬剤に対する耐性は、本発明を用いて調べることができる。
【００７０】
本発明で検出する細菌性感染病原体は、大腸菌、サルモネラ菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、リステリア菌（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、ミコバクテリアアビウム−イントラセルラ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｖｉｕｍ−ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ）、エルシニア（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）、フランシセラ（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ）、パスツレラ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ）、ブルセラ（Ｂｒｕｃｅｌｌａ）、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ）、百日咳菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）、バクテロイド（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）、スタフィロコッカスニューモニア（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）、Ｂ−溶連菌（Ｂ−Ｈｅｍｏｌｙｔｉｃｓｔｒｅｐ．）、コリネバクテリア（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉａ）、レジオネラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ）、ミコプラズマ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）、ウレアプラズマ（Ｕｒｅａｐｌａｓｍａ）、クラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ）、淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａｇｏｎｏｒｒｈｅａ）、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ）、ヘモフィルスインフルエンザ（Ｈｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ）、エンテロコッカスファエカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）、プロテウスブルガリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ ｖｕｌｇａｒｉｓ）、プロテウスミラビリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ ｍｉｒａｂｉｌｉｓ）、ヘリコバクターピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ）、梅毒トレポネーマ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｐａｌｌａｄｉｕｍ）、ボレリアバーグドーフェリ（Ｂｏｒｒｅｌｉａｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）、ボレリアレクレンティス（Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｒｅｃｕｒｒｅｎｔｉｓ）、リケッチア（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａｌ）の病原、ノカルジア（Ｎｏｃａｒｄｉａ）、およびアシトノマイセス（Ａｃｉｔｎｏｍｙｃｅｔｅｓ）を含む。
【００７１】
本発明で検出される真菌性感染病原体は、クリプトコッカスネオフォルマンス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ）、ブラストミセスデルマティティディス（Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｓ ｄｅｒｍａｔｉｔｉｄｉｓ）、ヒストプラズマカプスラタム（Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ ｃａｐｓｕｌａｔｕｍ）、コクシジウムイミティス（Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ ｉｍｍｉｔｉｓ）、パラコクシシオイデスブラシリアンシス（Ｐａｒａｃｏｃｃｉｃｉｏｉｄｅｓ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）、カンジダアルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａａｌｂｉｃａｎｓ）、アスペルギルスフミガーツス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｕｔｕｓ）、フィコマイセテス（Ｐｈｙｃｏｍｙｃｅｔｅｓ）（リゾプス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ））、スポロスリックスシェンキー（Ｓｐｏｒｏｔｈｒｉｘ ｓｃｈｅｎｃｋｉｉ）、クロモミコシス（Ｃｈｒｏｍｏｍｙｃｏｓｉｓ）、およびマズロミコシス（Ｍａｄｕｒｏｍｙｃｏｓｉｓ）を含む。
【００７２】
本発明で検出されるウイルス性感染病原体は、ヒト免疫不全症ウイルス、ヒトＴ細胞リンパ球親和性ウイルス、肝炎ウイルス（例えば、Ｂ型肝炎ウイルスおよびＣ型肝炎ウイルス）、エプスタイン・バーウイルス、サイトメガロウイルス、ヒトパピローマウイルス、オルトミクソウイルス、パラミクソウイルス、アデノウイルス、コロナウイルス、ラブドウイルス、ポリオウイルス、トガウイルス、バンヤウイルス、アレナウイルス、ルベラウイルス、およびレオウイルスを含む。
【００７３】
本発明で検出される寄生性作用病原体は、プラスモジウムファルシパラム（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）、プラスモジウムマラリア（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｍａｌａｒｉａ）、プラスモジウムビバックス（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｖｉｖａｘ）、プラスモジウムオーバル（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｏｖａｌｅ）、オンコバルバボルブラス（Ｏｎｃｈｏｖｅｒｖａｖｏｌｖｕｌｕｓ）、レーシュマニア（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ）、トリパノソーマ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ）種、住血吸虫（Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ）種、エンタモエバヒストリチカ（Ｅｎｔａｍｏｅｂａｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ）、クリプトスポリジウム（Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｕｍ）、ギアルディア（Ｇｉａｒｄｉａ）種、トリチモナス（Ｔｒｉｃｈｉｍｏｎａｓ）、バラチジウムコーライ（Ｂａｌａｔｉｄｉｕｍｃｏｌｉ）、ウチェレリアバンクロフティ（Ｗｕｃｈｅｒｅｒｉａｂａｎｃｒｏｆｔｉ）、トキソプラズマ（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ）種、エンテロビウスバーミキュラシス（Ｅｎｔｅｒｏｂｉｕｓｖｅｒｍｉｃｕｌａｒｉｓ）、アスカリスラムブリコイデス（Ａｓｃａｒｉｓｌｕｍｂｒｉｃｏｉｄｅｓ）、トリチュリストリチウラ（Ｔｒｉｃｈｕｒｉｓｔｒｉｃｈｉｕｒａ）、ドラカムクルスメディネシス（Ｄｒａｃｕｎｃｕｌｕｓｍｅｄｉｎｅｓｉｓ）、吸虫（ｔｒｅｍａｔｏｄｅｓ）、ジフィロボツリウムラタン（Ｄｉｐｈｙｌｌｏｂｏｔｈｒｉｕｍｌａｔｕｍ）、条虫（Ｔａｅｎｉａ）種、ニューモシスティスカリニー（Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓｃａｒｉｎｉｉ）、及びネカターアメリカニス（Ｎｅｃａｔｏｒａｍｅｒｉｃａｎｉｓ）を含む。
【００７４】
本発明はまた、感染性因子による薬剤耐性の検出にも有用である。例えば、バンコマイシン耐性エンテロコッカスファエシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ）、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌、ペニシリン耐性肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、多剤耐性結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、およびＡＺＴ耐性ヒト免疫不全ウイルスはいずれも本発明で同定できる。
【００７５】
遺伝性疾患は、本発明の方法で検出できる。これは染色体および遺伝的異常の出生前スクリーニングもしくは遺伝病の出生後スクリーニングで実施可能である。検出可能な遺伝病の例としては、２１ヒドロキシラーゼ欠損、嚢胞性線維症、脆弱Ｘ症候群、ターナー症候群、デュシェーヌ筋ジストロフィー、ダウン症候群もしくはその他のトリソミー、心臓疾患、単一遺伝子疾患、ＨＬＡタイピング、フェニルケトン尿症、鎌状細胞貧血、テイ−サックス病、タラセミア、クラインフェルトラー症候群、ハンチントン病、自己免疫疾患、脂肪代謝異常症、肥満症、血友病、先天性代謝異常、および糖尿病があげられる。
【００７６】
本発明の方法で検出される癌は、通常、癌遺伝子、腫瘍抑制性遺伝子、もしくはＤＮＡ増幅に関与する遺伝子、複製、組換え、もしくは修復を含む。これらの例は、ＢＲＣＡ１遺伝子、ｐ５３遺伝子、家族性大腸ポリポーシス、Ｈｅｒ２／Ｎｅｕ増幅、Ｂｃｒ／ＡｂＩ、Ｋ−ｒａｓ遺伝子、ヒトパピローマウイルスのタイプ１６および１８、白血病、大腸癌、乳癌、肺癌、前立腺癌、脳腫瘍、中枢神経系腫瘍、膀胱腫瘍、メラノーマ、肝癌、骨肉腫およびその他の骨癌、睾丸癌および卵巣癌、耳鼻咽喉科の腫瘍、およびヘテロ接合性の消失を含む。
【００７７】
環境モニタリングの分野においては、本発明は、都市廃水浄化システムおよび貯水器等の天然の、および工学的な生態系ならびに微小生態系もしくは生物的環境浄化を行っている汚染域における病原性および常在微生物の検出、同定、およびモニタリングに用いられる。集団動態研究における特異的標的微生物のモニタリング、または環境および工業用植物における改変微生物における遺伝学的検出、同定、もしくはモニタリングのいずれかのために、非生体物質を代謝する遺伝子を含むプラスミドの検出をおこなうことも可能である。
【００７８】
本発明は、軍人、および犯罪捜査におけるヒトの識別、父性検査および家族関係解析、ＨＬＡ適合性タイピング、および血液、精子、もしくは移植臓器の汚染スクリーニングを含む多様な法医学的分野においても用いることができる。
【００７９】
食品および飼料工業においては、本発明は広く多様な応用を有する。例えば、ビール、ワイン、チーズ、ヨーグルト、パン、その他の産生に関わる酵母等の産生用微生物の同定および特徴付けに用いることができる。利用に関する別の分野は、産物の品質管理および検定ならびに工法（例えば、家畜、殺菌、および食肉加工）における汚染に関する。その他の利用としては、育種目的の植物、球根、および種子の特徴付け、植物特異的病原体の存在同定、ならびに家畜感染の検出および同定があげられる。
【００８０】
望ましくは、オリゴヌクレオチドプローブは、連結接合部において完全な相補性に基づき、対応する標的塩基配列上で相互に隣接してハイブリダイズする場合の、連結接合部における連結に好ましいものである。しかしながら、該セットにおけるオリゴヌクレオチドプローブは、試料中の他のいずれかのヌクレオチド配列にハイブリダイズする場合には、連結を阻害する連結接合部位置の塩基にミスマッチが存在する。最も好ましくは、ミスマッチは連結接合部の３’塩基に隣接した位置の塩基に存在する。または、ミスマッチは、連結接合部の塩基に隣接した塩基にあってもよい。
【００８１】
本発明の方法は、第１および第２の塩基配列を１００アトモルから２５０フェムトモルの量で試料中に検出することができる。ＬＤＲ段階を第１のポリメラーゼ特異的増幅段階とカップルさせ、本発明の完全な方法では、単一分子程度を含む試料において標的塩基配列を検出することができる。さらに、ピコモル量であることの多いＰＣＲ増幅産物は上記範囲で容易に希釈できる。このリガーゼによる検出反応では、ミスマッチ連結産物の配列の形成速度は、マッチした連結産物の配列の形成速度の０．００５より低い。
【００８２】
連結期が完了すると、捕獲期が開始される。本方法の捕獲期では、混合物は２５〜９０℃、好ましくは６０℃〜８０℃の温度で、かつ１０〜１８０分間、好ましくは６０分までので時間、固体支持体と接触させる。ハイブリダイゼーションは、ハイブリダイゼーション中に連結混合物を混合すること、または容積排除、カオトロピック薬剤、テトラメチルアンモニウム塩、もしくはＮ，Ｎ，Ｎ，トリメチルグリシン（ベタイン一水和物）を添加することによって加速もしくは改善される。アレイが数十から数百のアドレスからなる場合、正しい連結産物が適当なアドレスでハイブリダイズする機会を有することが重要である。これは、用いる高い温度におけるオリゴヌクレオチドの熱運動、アレイ表面と接触する液体の機械的運動、もしくは電界によるアレイ全域にわたるオリゴヌクレオチドの運動によって達成することができる。ハイブリダイゼーショ後にハイブリダイズしていないプローブを除去し、捕獲されたプローブの検出の最適化を図るために、アレイを緩衝液で洗浄する。または、アレイを順次洗浄する。
【００８３】
ハイブリダイゼーションの特異性は、ハイブリダイゼーション溶液への、非特異的競合ＤＮＡ（例えばニシン精子ＤＮＡ）の添加および／またはホルムアミドの添加により促進されてもよい。洗浄の厳密度はまた洗浄温度の上昇および／または洗浄緩衝液へのホルムアミドの添加により増大されうる。図１６は標準的ハイブリダイゼーションおよび洗浄条件への上記の変更の様々な組み合わせによる結果を示す。
【００８４】
好ましくは、固体支持体は、アクリルアミドとカルボン酸塩、アルデヒド、もしくはアミノ基を含む機能性のモノマーとの組み合わせで構成される親水性ポリマーの多孔性表面を有する。この表面は、支持体を、ポリアクリルアミドに基づくゲルでコーティングするによって形成する。好ましい配合は、アクリルアミド／アクリル酸およびＮ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド／グリセロールモノメタクリレートである。クロスリンカーＮ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミドは、５０：１以下のレベル、好ましくは５００：１以下のレベルである。
【００８５】
固体支持体を連結混合物に接触させている間の陰性電荷のマスキングに関する一態様は、二価カチオンの利用によって達成される。二価カチオン、Ｍｇ２＋、Ｃａ２＋、ＭＮ２＋、もしくはＣｏ２＋でよい。通常、二価カチオンによるマスキングは、カチオンを含むハイブリダイゼーション緩衝液により１０ｍＭの最小濃度で室温で１５分間、固体支持体のプレハイブリダイゼーションを行うことによって実施する。
【００８６】
固体支持体を連結混合物に接触させている間の陰性電荷のマスキングに関する別の態様は、ｐＨ６．０もしくはそれ以下のｐＨで接触させることによって実施する。これを固体支持体に接触させる前もしくは接触中に連結混合物に緩衝液を添加することが効果的である。好ましい緩衝液は、２−（Ｎ−モルフォリノ）エタンスルフォン酸（ＭＥＳ）、リン酸ナトリウム、およびリン酸カリウムを含む。
【００８７】
固体支持体を連結混合物に接触させている間の陰性電荷のマスキングに関する別の態様は、ポリマーの親水性を抑えながら遊離のカルボン酸基を中和剤でキャッピングすることによって実施する。好ましい中和剤は、エタノールアミン、ジエタノールアミン、プロパノールアミン、ジプロパノールアミン、イソプロパノールアミン、およびジイソプロパノールアミンを含む。通常、中和剤によるマスキングは、１−［（３−ジメチルアミノ）プロピル］−３−エチルカルボジイミド塩酸塩およびＮ−ヒドロキシこはく酸イミドを用い固体支持体内でカルボン酸基を活性化した後、クロロフォルム、ジクロロメタン、もしくはテトラヒドロフラン等の極性非プロトン性溶媒中で中和剤溶液による処理を行うことによって実施する。
【００８８】
本発明による陰性電荷のマスキングによって、連結の起こらなかったオリゴヌクレオチドプローブの存在下における連結された産物の存在の検出が向上する。特に、連結の起こらなかったオリゴヌクレオチドプローブに対する比が１：３００未満、好ましくは１：９００未満、さらに好ましくは１：３０００未満、最も好ましくは１：９０００未満である場合の連結産物の存在の検出に、本発明は効果的である。
【００８９】
さらに、本発明による陰性電荷のマスキングによって、非標的ヌクレオチド配列とは異なる標的塩基配列を有する標的塩基配列の存在を非標的ヌクレオチド配列から単一塩基の差によって識別検出する能力が向上する。特に、標的塩基配列の非標的ヌクレオチド配列に対する比が１：２０未満、好ましくは１：５０未満、より好ましくは１：１００未満、最も好ましくは１：２００未満である場合の標的塩基配列の検出に、本発明は有効である。
【００９０】
安定にハイブリダイズする捕獲オリゴヌクレオチドおよび位置特定可能な塩基配列の選択が重要である。このために、オリゴヌクレオチドセットおよび捕獲オリゴヌクレオチドを、位置特定可能なアレイに特異的な部位に捕獲オリゴヌクレオチドがハイブリダイズする温度以下の温度で標的塩基配列にオリゴヌクレオチドセットハイブリダイズするように設計する必要がある。オリゴヌクレオチドをこのように設計しなかった場合、標的にハイブリダイズする同一のオリゴヌクレオチドセットから隣接した未反応のオリゴヌクレオチドを捕獲してしまうことで偽陽性シグナルが生じる。
【００９１】
特定のオリゴヌクレオチドセットの連結が起こり、連結が被検試料中の標的塩基配列の有無と相関する場合には、本方法の検出期は走査と同定を含む。走査は、走査電子顕微鏡法、共焦点顕微鏡法、電荷結合素子、走査トンネル電子顕微鏡法、赤外線顕微鏡法、原子間力顕微鏡法、電導度、および蛍光もしくは燐光撮像技術によって実施可能である。相関付けはコンピュータで行う。
【００９２】
本発明の別の局面は、支持体上のオリゴヌクレオチドのアレイ形成法に関する。この方法は、各々がオリゴヌクレオチドの付加に適切である部位のアレイを有する支持体を提供することを含む。各々のアレイ位置において支持体へのオリゴヌクレオチドの結合に好ましいリンカー、もしくは支持体（好ましくは非加水分解性）は固体支持体に結合している。固体支持体上のオリゴヌクレオチドのアレイは、多量体ヌクレオチドの付加のための選択されたアレイ位置の活性化および活性アレイ位置における多量体ヌクレオチドの付加の一連のサイクルによって形成される。
【００９３】
本発明のさらに別の局面は、支持体上のオリゴヌクレオチドのアレイそのものに関する。支持体は、オリゴヌクレオチドの付加に各々好適である部位のアレイを有する。オリゴヌクレオチドの支持体への結合に好ましいリンカー、もしくは支持体（好ましくは非加水分解性）は、アレイの各々の位置において支持体に結合している。オリゴヌクレオチドのアレイは、支持体上の１６ヌクレオチド以上を有するオリゴヌクレオチドで占められる少なくとも一部のアレイの位置に配置される。
【００９４】
アレイ形成法においては、異なる多量体オリゴヌクレオチドセットに由来する多量体オリゴヌクレオチドは、支持体上の異なるアレイ位置で結合する。その結果、支持体は異なる位置に結合した多量体オリゴヌクレオチドの異なる基を有する位置のアレイを含む。
【００９５】
異なる１，０００のアドレスは、ＬＤＲオリゴヌクレオチドプローブの標的特異的配列（例えば、約２０〜２５ｍｅｒ）と共有結合で連結したユニークな捕獲オリゴヌクレオチド（例えば、２４ｍｅｒ）であってもよい。捕獲オリゴヌクレオチドプローブの配列は、試料中に存在するゲノム上の標的配列もしくは他の配列のいずれかに対して如何なる相同性をも示さないものである。次に、このオリゴヌクレオチドプローブを、位置特定可能なアレイに特異的な部位、位置特定可能な支持体アレイ上の捕獲オリゴヌクレオチドに相補的な配列に捕獲させる。この概念を、可能な２つの形態で示し、例えば、ｐ５３Ｒ２４８変異（図１７Ａ〜図１７Ｃ）の検出があげられる。
【００９６】
図１７Ａ〜図１７Ｃには、ｐ５３腫瘍抑制性遺伝子のコドン２４８における生殖系列変異の存在を同定するためのオリゴヌクレオチドプローブの設計に関するほかの２つの形態を示す。野性型配列はアルギニン（Ｒ２４８）をコードするが、癌の変異では、トリプトファン（Ｒ２４８Ｗ）をコードする。下部の図は捕獲オリゴヌクレオチドの模式図である。太い水平の線は位置特定可能なアレイを含むメンブレンもしくは表面を表す。細い曲線は、柔軟なリンカーアームを示す。さらに太い線は、ＣからＮ方向で固体表面に結合した捕獲オリゴヌクレオチド配列を示す。例示の目的において、部分Ｂにおけるリンカーアームが「引き延ばされた」ように捕獲オリゴヌクレオチドを垂直に描いている。アームは柔軟なため、塩基対相補性により捕獲オリゴヌクレオチドは各々において５’をＣにおよび３’をＮにハイブリダイズすることができる。オリゴヌクレオチドがＮ末端においてメンブレンに結合する場合、同一方向のオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションが可能となる。この場合、ＤＮＡ／ＰＮＡハイブリダイゼーションは、通常５’から３’、および３’から５’への逆平行にある。他の修飾された糖リン酸骨格も同様に用いられる。図１７Ｂは、３’末端における塩基ＣもしくはＴの識別を含むことにより野生型および変異体ｐ５３を識別するように設計された２つのＬＤＲプローブを示す。正しい標的ＤＮＡおよびＴｔｈリガーゼの存在においては、識別プローブは共有結合で下流の共通オリゴヌクレオチドに結合する。下流のオリゴヌクレオチドは、蛍光標識されている。識別オリゴヌクレオチドは、各々の５’末端における単一の位置特定可能なアレイに特異的な部位Ｚ１およびＺ２の存在によって識別される。黒いドットは、標的依存性の連結が起こっていることを示す。連結後に、オリゴヌクレオチドプローブを、アレイ上での単一アドレスにおける相補的な位置特定可能アレイに特異的な部位によって捕獲してもよい。連結したオリゴヌクレオチドプローブおよび未反応のオリゴヌクレオチドプローブのいずれもが、オリゴヌクレオチドアレイによって捕獲される。未反応の蛍光標識した共通プライマーおよび標的ＤＮＡを、高温（約６５℃〜８０℃）および低塩濃度で洗い流す。変異シグナルは、位置特定可能なアレイに特異的な部位Ｚ１に相補的な捕獲オリゴヌクレオチドにおける蛍光シグナルの検出によって識別するが、野性型シグナルは、位置特定可能なアレイに特異的な部位Ｚ２に相補的な捕獲オリゴヌクレオチドに出現する。ヘテロ接合性は、位置特定可能なアレイに特異的な部位Ｚ１およびＺ２に相補的な捕獲オリゴヌクレオチドにおける同程度のシグナルによって示されるのである。シグナルは蛍光撮影装置を用いて定量される。この形態では各々の対立遺伝子に関して単一アドレスを用い、低レベルのシグナル（３０〜１００アトモルのＬＤＲ産物）の非常に正確な検出の達成に好適である。図１７Ｃは、識別シグナルが蛍光撮影装置を用いて定量できることを示す。この形態では、異なる蛍光基をＦ１およびＦ２を５’末端に有することによってオリゴヌクレオチドプローブを識別する単一アドレスを用いる。オリゴヌクレオチドプローブのいずれかが、３’末端に位置特定可能なアレイに特異的な部位Ｚ１を含む共通の下流オリゴヌクレオチドプローブに連結することができる。この形態においては、野性型および変異体ＬＤＲの両方がアレイ上の同一のアドレスに捕獲され、異なる蛍光で識別される。この形態では、アレイのより好ましい利用が可能であり、数百もの潜在する生殖系列の突然変異を検出する場合には好適である。
【００９７】
支持体は、広く多様な材料から作製することが可能である。基質は、生物学的、非生物学的、有機、無機、もしくはこれらのいずれの組み合わせでもよく、粒子、鎖、沈殿、ゲル、シート、管状材料、球状、容器、毛細管、パッド、スライス、フィルム、プレート、スライド、ディスク、メンブレン、その他として存在するものである。基質は、盤、四角形、円形、その他等の通常の形状を有する。基質は、好ましくは平坦なものであるが、様々な異なる表面配置をとってもよい。例えば、基質は合成の起こる隆起もしくは陥没した領域を有していてもよい。基質およびその表面は、好ましくはその上で本明細書に記載の反応を起こさせる固い支持体を形成する。また、基質およびその表面は、適当な光吸収特性を提供するように選択したものである。例えば、基質は、重合Ｌａｎｇｍｕｉｒ Ｂｌｏｄｇｅｔｔフィルム、機能化ガラス、Ｓｉ、Ｇｅ、ＧａＡｓ、ＧａＰ、ＳｉＯ２、ＳｉＮ４、修飾シリコン、または広く多様なゲルのいずれか、もしくは（ポリ）テトラフルオロエチレン、（ポリ）ビニリデンジフルオリド、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリエチレン、ポリプロピレン、塩化ポリビニル、ポリ（メチルアクリレート）、ポリ（メチルメタクリレート）、もしくはその組み合わせ等のポリマーでもよい。当業者であれば、他の基質材料についても、本開示の記載により容易に理解できる。好ましい態様においては、基質は平坦なガラスもしくは単一結晶シリコンである。
【００９８】
幾つかの態様においては、所望の表面特性を与えるように、基質表面を既知の技術を用いてエッチングする。例えば、トレンチ、Ｖ字溝、丘段構造、切り上がりプラットフォーム等の方法で形成し、合成領域は蛍光源等からの集光を最大限にするための反射「鏡」構造で得られる照射光の焦点内により近接して配置する。
【００９９】
基質上の表面は、常にではないが通常は、基質と同一材料で構成する。従って、表面は、広汎な材料、例えば、ポリマー、プラスチック、セラミック、多糖、シリカもしくはシリカに基づく材料、炭素、金属、無機ガラス、メンブレン、もしくはそれらの組み合わせのいずれかで構成される。基質表面にしっかりと結合した結合部材で表面を官能基化する。好ましくは、表面の官能基は、シラノール、オレフィン、アミノ、ヒドロキシル、アルデヒド、ケト、ハロ、ハロゲン化アシルもしくはカルボキシル基等の反応基である。ある場合においては、このような官能基は予め基質に内在する。例えば、シリカに基づく材料はシラノール基を有し、多糖はヒドロキシル基を有し、また合成ポリマーは、それを生じるモノマーに依存して多様な官能基を含む。または、基質が所望の官能基を含まない場合には、このような基は、１段階もしくは複数の段階において基質に結合させることができる。
【０１００】
好適に修飾されたガラス、プラスチック、または炭水化物による表面もしくは多様なメンブレンを含む多様な市販材料を用いることができる。材料に依存して、表面の官能基（例えば、シラノール、ヒドロキシル、カルボキシル、アミノ）は（おそらく、コーティング・ポリマーの一部として）最初から存在する、もしくは、官能基の導入のために別の方法（例えば、プラズマアニメーション、クロム酸酸化、官能基化側鎖のアルキルトリクロロシランによる処理を必要とする）。複数の方法でヒドロキシル基を安定なカルバミン酸（ウレタン）結合に組み込む。アミノ官能基は直接アセチル化することができるが、カルボキシル基は活性化（例えば、Ｎ，Ｎ’−カルボジイミダゾールもしくは水溶性カルボジイミド）し、アミノで官能基化した化合物と反応させる。図１８に示すように、支持体は出発官能基Ｘを有するメンブレンもしくは表面であってもよい。官能基の変換は、基Ｙ＊との共有結合における１つのパートナーを表す基Ｘ＊を提供する（必要に応じて）多様な方法で行うことができる。図１８は、ＰＥＧ（すなわち、ポリエチレングリコール）のグラフトを具体的に示すが、同一レパートリーの反応を、炭水化物（ヒドロキシルを有する）、リンカー（カルボキシルを有する）、および／もしくは好ましい官能基（アミノもしくはカルボキシル）によって伸長したオリゴヌクレオチドを付加させるために用いることができる（ただし、必要であれば）。ある場合においては、基Ｘ＊もしくはＹ＊は予め活性化される（別の反応で単離可能な種）。または、活性化はインサイチューで起こる。図１８に記載のＰＥＧを参照すると、ＹおよびＹ＊は同一（同一二元官能基）でも異なって（異質二元官能基）いてもよい。後者の場合、Ｙはさらに化学的コントロールを行うために保護することができる。未反応のアミノ基をアセチル化、スクシニル化でブロックし、過剰のハイブリダイズしていないＤＮＡを「排除する」中性もしくは陰性に荷電した環境を保つ。負荷レベルは、標準的な分析法で調べることができる。Ｆｉｅｌｄｓらの「固相ペプチド合成の原理および実施（Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｓｏｌｉｄ−Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）」（合成ペプチド：ユーザー指針（Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ： Ａ Ｕｓｅｒ’ｓ Ｇｕｉｄｅ）Ｇ．Ｇｒａｎｔ、Ｅｄｉｔｏｒ、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．： Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ．ｐ．７７−１８３（１９９２））、これは参照として本明細書に組み入れられる。
【０１０１】
シリカに基づく支持体表面に官能基を付加する一つのアプローチとしては、所望の官能基（例えば、オレフィン、アミノ、ヒドロキシル、アルデヒド、ケト、ハロ、ハロゲン化アシルもしくはカルボキシル）を有する分子、もしくは所望の官能基を含む別の分子Ｂに結合することのできる分子Ａのいずれかでシラン化することがあげられる。前者の場合、ガラスもしくはシリカに基づく支持体の、例えば、アミノ基による官能基化は、３−アミノプロピルトリエトキシシラン、３−アミノプロピルメチルジエトキシシラン、３−アミノプロピルジメチルエトキシシラン、３−アミノプロピルトリメトキシシラン、Ｎ−（２−アミノエチル）−３−アミノプロピルメチルジメトキシシラン、Ｎ−（２−アミノエチル−３−アミノプロピル）トリメトキシシラン、アミノフェニルトリメトキシシラン、４−アミノブチルジメチルメトキシシラン、４−アミノブチルトリエトキシシラン、アミノエチルアミノメチルフェネチルトリメトキシシラン、もしくはその混合物等のアミン化合物で実施する。後者の場合には、分子Ａは、好ましくはビニル、アクリレート、メタクリレート、もしくはアリル等のオレフィン基を含むが、分子Ｂはオレフィン基および所望の官能基を含む。この場合、分子ＡおよびＢは、互いに重合する。ある場合においては、その性質を修飾するために（例えば、生体適合性を付与するおよび機械的安定性を向上させるために）。シラン化した表面を修飾することが好ましい。これは、分子Ａ、Ｂ、およびＣを含むポリマーネットワークを得るために、分子Ｂとともにオレフィン分子Ｃを添加することによって達成できる。
【０１０２】
分子Ａは、以下の化学式で定義される：
【化１】
2004526402.tif 000002
式中、Ｒ１はＨもしくはＣＨ３である。
Ｒ２は（Ｃ＝Ｏ）−Ｏ−Ｒ６で、官能置換基を有するもしくは有さない脂肪族基、官能置換基を有するもしくは有さない芳香族基、または官能置換基を有するもしくは有さない脂肪族／芳香族基の混合したものである。
Ｒ３はＯ−アルキル、アルキルもしくはハロゲン基である。
Ｒ４は、Ｏ−アルキル、アルキルもしくはハロゲン基である。
Ｒ５はＯ−アルキル、アルキルもしくはハロゲン基であり、また
Ｒ６は、官能置換基を有するもしくは有さない脂肪族基、官能置換基を有するもしくは有さない芳香族基、または官能置換基を有するもしくは有さない脂肪族／芳香族基の混合したものである。分子Ａの例は、３−（トリメトキシシリル）プロピルメタクリレート、Ｎ−［３−（トリメトキシシリル）プロピル］−Ｎ’−（４−ビニルベンジル）エチレンジアミン、トリエトキシビニルシシラン、トリエチルビニルシシラン、ビニルトリクロロシシラン、ビニルトリメトキシシラン、およびビニルトリメチルシシランを含む。
【０１０３】
分子Ｂは、上記の一つもしくは複数の官能基を含むモノマーである。分子Ｂは、以下の化学式で定義される：
【化２】
2004526402.tif 000003
式中、（ｉ）Ｒ１はＨもしくはＣＨ３であり、
Ｒ２は（Ｃ＝Ｏ）、および
Ｒ３はＯＨもしくはＣｌである；
または
（ｉｉ）Ｒ１はＨもしくはＣＨ３、およびＲ２は（Ｃ＝Ｏ）−Ｏ−Ｒ４、官能置換基を有するもしくは有さない脂肪族基、官能置換基を有するもしくは有さない芳香族基、または官能置換基を有するもしくは有さない脂肪族／芳香族基の混合したものである。また、Ｒ３はＯＨ、ＣＯＯＨ、ＮＨ２、ハロゲン、ＳＨ、ＣＯＣ１、もしくは活性エステル等の官能基、およびＲ４は官能置換基を有するもしくは有さない脂肪族基、官能置換基を有するもしくは有さない芳香族基、または官能置換基を有するもしくは有さない脂肪族／芳香族基の混合したものである。分子Ｂの例は、アクリル酸、アクリルアミド、メタクリル酸、ビニル酢酸、４−ビニル安息香酸、イタコン酸、アリルアミン、アリルエチルアミン、４−アミノスチレン、２−アミノエチルメタクリレート、塩化アクリロイル、塩化メタクリロイル、クロロスチレン、ジクロロスチレン、４−ヒドロキシスチレン、ヒドロキシメチルスチレン、ビニルベンジルアルコール、アリルアルコール、２−ヒドロキシエチルメタクリラート、もしくはポリ（エチレングリコール）メタクリレートを含む。
【０１０４】
分子Ｃは、分子Ａ、分子Ｂ、もしくは両方に重合可能な分子であり、選択的に上記の一つもしくは複数の官能基を含む。分子Ｃは、アクリル酸、メタクリル酸、ビニル酢酸、４−ビニル安息香酸、イタコン酸、アリルアミン、アリルエチルアミン、４−アミノスチレン、２−アミノエチルメタクリレート、塩化アクリロイル、塩化メタクリロイル、クロロスチレン、ジクロロスチレン、４−ヒドロキシスチレン、ヒドロキシメチルスチレン、ビニルベンジルアルコール、アリルアルコール、２−ヒドロキシエチルメタクリラート、ポリ（エチレングリコール）メタクリレート、アクリル酸メチル、メチルメタクリレート、エチルアクリレート、エチルメタクリレート、スチレン、１−ビニルイミダゾール、２−ビニルピリジン、４−ビニルピリジン、ジビニルベンゼン、エチレングリコールジメタクリルアクリレート、Ｎ，Ｎ’−メチレンジアクリルアミド、Ｎ，Ｎ’−フェニレンジアクリルアミド、３，５−ビス（アクリロイルアミド）安息香酸、ペンタエリスリトールトリアクリレート、トリメチロールプロパントリメタクリレート、ペンタエリスリトールテトラアクリレート、トリメチロールプロパンエトキシレート（１４／３ＥＯ／ＯＨ）トリアクリレート、トリメチロールプロパンエトキシレート（７／３ＥＯ／ＯＨ）トリアクリレート、トリエチロールプロパンプロポキシレート（１ＰＯ／ＯＨ）トリアクリレート、もしくはトリメチロールプロパンプロポキシレート（２ＰＯ／ＰＨトリアクリレート）等のモノマーもしくはクロスリンカーであってもよい。
【０１０５】
通常、官能基は最終的には支持体に結合するオリゴヌクレオチドのための出発点として働く。これらの官能基は、支持体に結合する有機基に反応性であるか、またはリンカーもしくはハンドルの利用によってこのような基に反応性となるように修飾することができる。官能基は、支持体にさまざまな所望の性質を付与することができる。
【０１０６】
支持体を（必要に応じて）官能基化した後、相補的オリゴヌクレオチド捕獲プローブの担体部位として働く活性化された官能基を含むテーラーメイドのポリマーネットワークを支持体に植え込む。従って、このアプローチの利点としては、捕獲プローブの負荷容量を有意に増加させることができ、中間体としての固相対液相の物理的性質が制御しやすくなる。最適化を受けるパラメータは、官能基を含むモノマーの種類と濃度、および用いるクロスリンカーの種類と相対的濃度を含む。
【０１０７】
リンカー分子は本発明に必要な要素ではないものと理解されるが、官能基化した基質表面は、好ましくはリンカー分子層とともに提供される。作製した基質においてポリマーが基質に暴露された分子と自由に相互作用できるように、リンカー分子は、好ましくは充分な長さのものである。充分に暴露されるように、リンカー分子は、６〜５０原子の長さであることが必要である。リンカー分子、例えば、アリールアセチレン、２〜１０モノマーユニットを含むエチレングリコールオリゴマー、ジアミン類、２価酸、アミノ酸類、もしくはその組み合わせである。
【０１０８】
別の態様においては、リンカー分子をその親水性／疎水性の性質に基づいて選択し、特定の受容体に対する合成ポリマーの提示について改善する。例えば、親水性受容体の場合には、親水性リンカー分子は、受容体が合成ポリマーにより近接して近づくことが可能であることが好ましい。
【０１０９】
もう一つの別の態様においては、リンカー分子は中間位置に光開裂性の基を有するものとして提供される。光開裂性の基は、保護基とは異なる波長で開裂することが好ましい。これにより、異なる光波長に暴露する方法で合成完了後に、さまざまなポリマーの除去を可能にする。
【０１１０】
リンカー分子は、炭素と炭素の間の結合で、例えば、（ポリ）トリフルオロクロロエチレン表面を用いて、もしくは、好ましくは、シロキサン結合（例えば、ガラスもしくは酸化シリコン表面を用いて）で基質に結合できる。基質表面とのシロキサン結合は、一態様においては、トリクロロシリル基を有するリンカー分子の反応によって形成する。リンカー分子は、選択的に整列アレイ（すなわち、重合化単層にその頭部が平らに並んだものとして）に結合していてもよい。別の態様においては、リンカー分子は基質表面に吸着している。
【０１１１】
多量体を用いてアレイを組み立てる例として、そのような組み立てが四量体を用いて達成されることが可能である。４つの塩基が四量体として配置されることが可能である２５６（４４）の可能な方法のうち、固有の配列を有する３６個を選択することができる。選択された四量体のおのおのは他の全てのものと少なくとも２塩基異なり、どの２つの二量体も互いに相補的ではない。さらにアドレスの自己対合またはヘアピン形成につながると考えられる四量体は除去された。
【０１１２】
最終的な四量体は表１に列記されており、１から３６に任意に番号付けされている。この固有の四量体セットは、時に所望の２４ｍｅｒ捕捉オリゴヌクレオチドアドレス配列の設計モジュールとして使用される。その構造は段階的に（一度に１塩基）または収束的（四量体構築ブロック）合成戦略により組み立てられることが可能と考えられる。上記の規則に従う多くの他の四量体セットが設計されてもよい。区分化法は四量体のみに制限されたものではなく、他のユニット、すなわち二量体、三量体、五量体または六量体も使用できると考えられる。
【０１１３】
【表１】互いに少なくとも２塩基異なる四量体ＰＮＡ配列および相補的ＤＮＡ配列のリスト
2004526402.tif 000004
【０１１４】
四量体の番号付けスキームでは、各々のアドレスが６つの数字で略称されることに留意されたい（例えば、下記の表２第２列）。３６の四量体単一セットで設計された２４ｍｅｒアドレスの概念（表１）から、可能な構造は膨大な数となる（３６６＝２，１７６，７８２，３３６）。
【０１１５】
図１９には、少なくとも２塩基互いに異なる３６の四量体で多数の可能な設計のうちの１つを示す。チェッカーボード・パターンは、２５６の可能な全四量体を示す。四角形は、チェッカーボードにおける左の最初の２塩基とそれに続く上部の２塩基を表す。各々の四量体は少なくとも互いに２塩基異なる必要があり、非相補的である必要がある。四量体を白いボックスで示し、その相補鎖を（番号）としてリストに載せた。従って、このスキームにおいて、相補的配列ＧＡＣＣ（２０）およびＧＧＴＣ（２０’）はお互いに排除的である。さらに、四量体は、非回文構造的でなくてはならない、例えば、ＴＣＧＡ（黒い対角線のボックス）、および非繰り返しでなくてはならない、例えば、ＣＡＣＡ（黒い対角線のボックス、上部の左から下部右）。３６の四量体とは、僅か１塩基しか異ならないその他の配列はいずれも、明るい灰色で斜線付けされている。４つの潜在的四量体（白いボックス）は、すべてがＡ＊ＴもしくはすべてがＧ＊Ｃである塩基のいずれかであるために選択されなかった。しかしながら、下記に示されるように、Ａ＊Ｔ塩基のＴｍ値をほぼＧ＊Ｃ塩基のレベルに上げることは可能である。従って、すべてがＡ＊ＴもしくはすべてがＧ＊Ｃ塩基である四量体（白ボックス中のものを含む）は、潜在的に四量体設計用いることができる。さらに、捕獲オリゴヌクレオチドアドレスの配列内で、およびオリゴヌクレオチドプローブの位置特定可能なアレイに特異的な部位であれば、チミンは５−プロピニルウリジンで置換できる。これにより、Ａ＊Ｔ塩基対のＴｍは約１．７℃増加する。従って、個々の四量体のＴｍ値は、約１５．１℃から１５．７℃となるはずである。完全長２４ｍｅｒのＴｍ値は９５℃以上となるはずである。
【０１１６】
この概念を例示する目的で、３６の四量体配列のうちで６つからなるサブセットを用いて、アレイ：１＝ＴＧＣＧ；２＝ＡＴＣＧ；３＝ＣＡＧＣ；４＝ＧＧＴＡ；５＝ＧＡＣＣ；および６＝ＡＣＣＴを構築した。所望の２４ｍｅｒの位置特定可能なアレイに特異的な部位および２４ｍｅｒの相補的捕獲オリゴヌクレオチドのアドレス配列設計モジュールとして、この単一の四量体セットを用いることができる。この態様は、５つの位置特定可能なアレイに特異的な部位（表２のリストに載せた配列）の合成を含む。四量体の番号付けスキームで、各々の部位の略称（「Ｚｉｐ＃」と称する）が６つの数字で示されている（「Ｚｉｐコード」と称する）ことに留意されたい。
【０１１７】
【表２】５つのＤＮＡ／ＰＮＡオリゴヌクレオチドアドレス配列全ての一覧
2004526402.tif 000005
【０１１８】
これらのオリゴマーは各々、５’末端に酸化ヘキサエチレン・リンカーアーム（Ｐ．Ｇｒｏｓｓｍａｎら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、２２：４５２７−４５３４（１９９４）は参照として本明細書に組み入れられる）、およびスライドグラス表面への結合に好適である最終的なアミノ官能基、もしくは別の物質を含む。結合方法は、フリーの表面官能基に依存する（Ｙ．Ｚｈａｎｇら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、１９：３９２９−３９３３（１９９１）およびＺ．Ｇｕｏら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、３４：５４５６−５４６５（１９９４）は参照として本明細書に組み入れられる）。
【０１１９】
合成オリゴヌクレオチド（正常および相補的方向、捕獲ハイブリダイゼーションもしくはハイブリダイゼーション／連結のいずれか）は、天然の塩基もしくはヌクレオチド類似体のいずれかを有するＤＮＡもしくはＰＮＡのいずれかとして調製する。このような類似体は完全な相補性で天然の塩基と対をなすが、Ｔｍ値は増加する（例えば、５−プロピニルウラシル）。
【０１２０】
本発明にしたがって、ＤＮＡ合成エラーから生じる偽ハイブリダイゼーションシグナルは避けられる。アドレスは、正しくないアドレスに対してはハイブリダイゼーションＴｍ値に非常に大きな差異があるように設計することができる。対照的に、直接ハイブリダイゼーション法は微細な差異に依存する。本発明はまた、ＤＮＡ合成エラー、バンド拡張、または偽バンド移動のいずれかに起因するゲル電気泳動またはキャピラリー電気泳動を用いた誤ったデータ解釈の問題も除去する。
【０１２１】
連結産物の存在を検出するための捕捉オリゴヌクレオチドの使用は、差異的ハイブリダイゼーションを用いてオリゴヌクレオチドの一塩基差異を検出する必要性を除去する。対立遺伝子特異的ＰＣＲ、差異的ハイブリダイゼーションまたはハイブリダイゼーションによる配列決定法に依存する先行技術の他の既存の方法は、解析される新規配列の各々に対して個別にハイブリダイゼーション条件を最適化しなければならない。多数の変異を同時に検出することを試みるとき、ハイブリダイゼーション条件を最適化することは困難または不可能になる。対照的に、本発明は、標的配列に依存せず、均一のハイブリダイゼーション条件下で、正しいシグナルを高精度に検出する一般的方法である。本発明は、先行技術内で現在利用可能な任意の方法によるよりも、有意に高い精度で異なるオリゴヌクレオチド配列間を識別する柔軟な方法を生み出す。
【０１２２】
本発明のアレイは普遍的であり、癌変異、遺伝性（生殖細胞系列）変異、および伝染病の検出に有用である。さらなる恩典はアレイを再利用できることから得られ、試料あたりの費用を低下させる。
【０１２３】
本発明はまたオリゴヌクレオチドの合成および支持体へのその固着において大きな柔軟性もまた提供する。オリゴヌクレオチドは支持体から離れて合成され、それから支持体上の固有の表面に付着されることができる。中間介在物のバックボーン保護（たとえばＰＮＡ）を必要としない、オリゴヌクレオチド多量体の分節を合成し、固体支持体上に連結することができる。これらの合成法を捕捉オリゴヌクレオチドアドレスの設計と統合することが可能であることにより、更なる利点が達成される。固体支持体のそのような作製は自動化作製になじみやすく、ヒトの介入の必要性およびその結果としての汚染の懸念を未然に防ぐ。
【０１２４】
本発明のアレイの重要な利点は、以前に固着された捕捉オリゴヌクレオチドとともにアレイが再利用可能であることである。そのような再利用のための固体支持体を調整するために、捕捉されたオリゴヌクレオチドを固体支持体に連結している連結成分を除去することなく、捕捉されたオリゴヌクレオチドは除去されなければならない。この目的を達成するためには多様な手段が利用可能である。例えば、固体支持体を９５℃〜１００℃の蒸留水中で処理する、室温で０．０１Ｎ水酸化ナトリウムに供する、９０℃〜９５℃で５０％ジメチルホルムアミドに接触する、または９０℃〜９５℃で５０％ホルムアミドで処理することが可能である。一般的には、この手段は捕捉されたオリゴヌクレオチドを約５分で除去するために使用することができる。これらの条件はＤＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーションを破壊するのに適している。ＤＮＡ−ＰＮＡハイブリダイゼーションは他の破壊条件を必要とする。
【０１２５】
本発明は、これに制限されないが、以下の実施例により説明される。
【０１２６】
実施例
実施例１  物質および方法
オリゴヌクレオチド合成および精製
オリゴヌクレオチドはＩＤＴ社（コラルビル（Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ）、アイオワ州）のカスタム合成産物として獲得され、または標準的なホスホアミダイト化学を用いてＡＢＩ３９４ＤＮＡ合成機（ＰＥバイオシステムズ社、フォスターシティ、カリフォルニア州）上で組織内で合成された。スペーサーホスホアミダイト１８、３’−アミノ−修飾基Ｃ３ ＣＰＧおよび３’−フルオレセインＣＰＧはグレンリサーチ（Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）（スターリング（Ｓｔｅｒｌｉｎｇ）、バージニア州）から購入した。その他全ての試薬はＰＥバイオシステムズから購入した。標識および非標識オリゴヌクレオチドの両者は１２％変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動により精製された。バンドはＵＶ付影処理により可視化され、ゲルから切り出され、０．５Ｍ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０中で３７℃にて一晩溶出された。オリゴヌクレオチド溶液はＣ１８ Ｓｅｐ−Ｐａｋｓ（ウォーターズコーポレーション（Ｗａｔｅｒｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、ミルフォード、マサチューセッツ州）上でメーカーの指示書に従い精製され、続いてオリゴヌクレオチドが乾燥するまで濃縮され（スピードバック（Ｓｐｅｅｄ−Ｖａｃ））および−２０℃で保存された。
【０１２７】
顕微鏡スライドの洗浄
ガラス顕微鏡スライド（ＶＷＲ、前清浄化、３ｉｎ．×１ｉｎ．×１．２ｍｍ）を沸騰した濃ＮＨ４ＯＨ−３０％Ｈ２Ｏ２−Ｈ２Ｏ（１：１：５、ｖ／ｖ／ｖ）中で１０分間インキュベーションし、蒸留水で洗浄した。２回目のインキュベーションは沸騰した濃ＨＣｌ−３０％Ｈ２Ｏ２−Ｈ２Ｏ中で１０分間実施された。参照として本明細書に組み入れられる、Ｕ．Ｊｏｎｓｓｏｎら、「良く特性化されたシリカ表面におけるフィブロネクチンの吸収挙動（Ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ Ｂｅｈａｖｉｏｒ ｏｆ Ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ ｏｎ Ｗｅｌｌ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｄ Ｓｉｌｉｃａ Ｓｕｒｆａｃｅｓ）」、Ｊ．Ｃｏｌｌｏｉｄ Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ Ｓｃｉ．９０：１４８〜１６３（１９８２）を参照されたい。スライドは蒸留水、メタノールおよびアセトンで完全に洗浄され、室温で風乾された。
【０１２８】
ポリマー被膜スライド
清浄に続いてすぐに、スライド（フィッシャーサイエンスティフィック（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、前洗浄化、３ｉｎ．×１ｉｎ．×１．２ｍｍ）は、ＣＨＣｌ３中２％メタクリルオキシプロピルトリメトキシシラン、０．２％トリエチルアミン中に２５℃３０分間浸され、その後ＣＨＣｌ３で洗浄された（１５分を２回）。単量体溶液（２０μＬ：８％アクリルアミド、２％アクリル酸、０．０２％Ｎ，Ｎ’−メチレン−ビスアクリルアミド（単量体：架橋剤比は５００：１の比）、０．８％過硫酸アンモニウムラジカル重合開始剤）をスライドの一端に付着させ、事前にシラン化処理（ＣＨＣｌ３中５％（ＣＨ３）２ＳｉＣｌ２）されたカバースリップ（２４×５０ｍｍ）を用いて広げた。重合はスライドを７０℃ホットプレート上で４．５分間加熱することにより達成された。ホットプレートからスライドを取り除いて、カバースリップを直ちに単一切れ刃のかみそり刃を用いて引き剥がした。被膜化されたスライドを脱イオン水で洗浄し、開放空気中で乾燥させ、周囲条件下で保存した。
【０１２９】
Ｚｉｐコード（Ｚｉｐ−Ｃｏｄｅ）アレイの調製
重合体被膜化スライドはそれらを、０．１Ｍ Ｋ２ＨＰＯ４／ＫＨ２ＰＯ４、ｐＨ６．０中において０．１Ｍである１−［３−（ジメチルアミノ）プロピル］−３−エチルカルボジイミド塩酸塩に２０ｍＭ Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドを添加した溶液に２５℃３０分間浸すことにより事前に活性化された。活性化されたスライドを水で洗浄し、その後６５℃オーブンで乾燥させた。それらはドライアライト（Ｄｒｉｅｒｉｔｅ）を入れたデシケーター内で２５℃にて６ヶ月またはそれより長く保存において安定であった。
【０１３０】
アレイはカルテシアンテクノロジーピクシス（Ｃａｒｔｅｓｉａｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｐｉｘｓｙｓ）５５００ロボットにて、０．２Ｍ Ｋ２ＨＰＯ４／ＫＨ２ＰＯ４、ｐＨ８．３中５００μＭのＺｉｐコードオリゴヌクレオチド溶液を用いて、２５℃および７０％相対湿度下でスポットされた。各アドレスは４重にスポットされた。加えて、Ｃｙ３、Ｃｙ５およびフルオレセイン基準が各アレイの右手上下に沿って印刷された。スポッテイングに続いて、未結合オリゴヌクレオチドが、スライドを３００ｍＭビシン、ｐＨ８．０、３００ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％ＳＤＳ中に６５℃３０分間浸すこと、水で洗浄すること、および乾燥することにより、重合体表面から除去された。アレイは必要となるまでスライド箱中で２５℃で保存された。
【０１３１】
Ｋ−ｒａｓ ＤＮＡ試料のＰＣＲ増幅
ＰＣＲ増幅は、１０ｍＭトリスＨＣｌ、ｐＨ８．３、４ｍＭ ＭｇＣｌ２、５０ｍＭ ＫＣｌ、８００μＭ ｄＮＴＰｓ、１μＭのフォワードおよびリバースプライマー（各プライマー５０ｐｍｏｌ、Ｋ−ｒａｓＥｘ１フォワードおよびＫ−ｒａｓＥｘ１リバース（表３））、１Ｕのアンプリタックゴールド（Ａｍｐｌｉ Ｔａｑ Ｇｏｌｄ）およびパラファイン包埋腫瘍または細胞株から抽出された１００ｎｇのゲノムＤＮＡを含む５０μＬ反応混合液中でパラフィンオイル下で実施された。反応液は９５℃１０分間、前インキュベーションされた。増幅は４０ラウンドの９４℃３０秒間、６０℃１分間、および７２℃１分間の温度サイクル、続く７２℃５分間の最終伸長により達成された。ＰＣＲ後、１μＬのプロテイナーゼＫ（１８ｍｇ／ｍＬ）を添加し、反応液を７０℃で１０分間加熱し、その後９５℃で１５分間反応を停止させた。予測された大きさの増幅産物の存在を確認するために各ＰＣＲ産物２μＬを３％アガロースゲル上で解析した。
【０１３２】
Ｋ−ｒａｓ ＤＮＡ試料のＬＤＲ
ＬＤＲは、２０ｍＭトリスＨＣｌ、ｐＨ８．５、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、１００ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ ＤＴＴ、１ｍＭ ＮＡＤ＋、１０ｐｍｏｌ総ＬＤＲプローブ（５００ｆｍｏｌの各蛍光標識識別プローブ（Ｃｙ３、Ｃｙ５および蛍光標識のＫ−ｒａｓｃ３２Ｗｔ、Ｃｙ３標識Ｋ−ｒａｓｃ１２．２Ｄ、Ｃｙ５標識Ｋ−ｒａｓｃ１２．２Ａ、蛍光標識Ｋ−ｒａｓｃ１２．２Ｖ、Ｃｙ３標識Ｋ−ｒａｓｃ１２．１Ｓ、Ｃｙ５標識Ｋ−ｒａｓｃ１２．１Ｒ、蛍光標識Ｋ−ｒａｓｃ１２．１Ｃ、Ｃｙ３標識Ｋ−ｒａｓｃ１３．４Ｄ）に、合計５ｐｍｏｌの共通プローブ（各１５００ｆｍｏｌのＫ−ｒａｓｃｄ３２Ｃｏｍ９ｃＺｉｐ１、Ｋ−ｒａｓｃｄ１２Ｃｏｍ２ｃＺｉｐ２、およびＫ−ｒａｓｃｄ１２Ｃｏｍ１ｃＺｉｐ３、および５００ｆｍｏｌのＫ−ｒａｓｃｄ１３Ｃｏｍ４ｃＺｉｐ４（表３））、細胞株または腫瘍試料由来の２μＬのＰＣＲ産物を含む２０μＬ容量中でパラフィンオイル下で実施された。反応混合液は９４℃２分間事前加熱され、その後２５ｆｍｏｌの野生型ＴｔｈＤＮＡリガーゼが添加された。ＬＤＲ反応混合液は９４℃３０秒および６５℃４分で２０ラウンドサイクルされた。
【０１３３】
Ｋ−ｒａｓ ＬＤＲ産物のＤＮＡアレイへのハイブリダイゼーション
ＬＤＲ反応混合液は最終緩衝液濃度３００ｍＭ ＭＥＳ、ｐＨ６．０、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．１％ＳＤＳになるように２０μＬの２×ハイブリダイゼーション緩衝液を用いて希釈され、９４℃で３分間変性され、氷上で冷却された。アレイは１×ハイブリダイゼーション緩衝液中で２５℃１５分間事前インキュベーションされた。カバーウェル（グレイス（Ｇｒａｃｅ）社、サンリバー、オレゴン州）をアレイに付着させ、３０μＬの希釈ＬＤＲ反応混合液で満たした。アレイは加湿された培養チューブ中に設置され、６５℃で１時間、２０ｒｐｍで、回転式ハイブリダイゼーション用オーブン中でインキュベーションされた。ハイブリダイゼーションに続いて、アレイは３００ｍＭビシン、ｐＨ８．０、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．１％ＳＤＳ中に２５℃１０分間洗浄された。蛍光シグナルはスキャンアレイ（Ｓｃａｎａｒｒａｙ）５０００（ＧＳＩルモニクス（Ｌｕｍｏｎｉｃｓ））を用いて測定された。
【０１３４】
位置特定可能なユニバーサルマイクロアレイ上の７種の特定のＫ−ｒａｓ変異のＬＤＲ検出は図３６中に示されている。各アレイの右側の上部に沿った３つのシグナルおよび下部のそれらは位置決めに使用される基準である。第２列に渡る続く４つのアドレスは、各々ｃＺｉｐ１、ｃＺｉｐ２、ｃＺｉｐ３、およびｃＺｉｐ４に相補的であるアドレス＃１、＃２、＃３および＃４に相当する。８種の、細胞株（すなわちＣＯＬＯ２０５、ＬＳ１８０、ＳＷ１１１６、ＳＷ４８０およびＤＬＤ１）および腫瘍試料（Ｇ１２Ｓ、Ｇ１２ＲおよびＧ１２Ｃ）は存在する変異が正確に同定された。野生型細胞株ＣＯＬＯ２０５はＣｙ３、Ｃｙ５およびフルオレセインシグナルをアドレス＃１に与える。アドレス＃１の野生型シグナルは全試験の対照として使用された。Ａｓｐ１２変異を含むＬＳ１８０細胞株はアドレス＃２にＣｙ３シグナルを与えた。Ａｌａ１２変異を含むＳＷ１１１６細胞株はアドレス＃２にＣｙ５シグナルを与えた。Ｖａｌ１２変異を含むＳＷ４８０細胞株はアドレス＃２にフルオレセインシグナルを与えた。Ｓｅｒ１２変異を含むＧ１２Ｓ腫瘍試料はアドレス＃３にＣｙ３シグナルを与えた。Ａｒｇ１２変異を含むＧ１２Ｒ腫瘍試料はアドレス＃３にＣｙ５シグナルを与えた。Ｃｙｓ１２変異を含むＧ１２Ｃ腫瘍試料はアドレス＃３にフルオレセインシグナルを与えた。Ａｓｐ１３変異を含むＤＬＤ１細胞株はアドレス＃４にＣｙ３シグナルを与えた。ＬＳ１８０およびＳＷ１１１６試料のＺｉｐ４に見られる不正確なシグナルは試料の汚染によるものであった。
【０１３５】
【表３】ＰＣＲ／ＬＤＲ／アレイハイブリダイゼーションによるＫ−ｒａｓ変異検出用に設計されたプライマー
2004526402.tif 000006
増幅は４０ラウンドの９４℃１５秒間および６０℃２分間の温度サイクル、続く６５℃５分間の最終伸長段階により達成された。ＰＣＲ後、１μＬのプロテイナーゼＫ（１８ｍｇ／ｍＬ）を添加し、反応液を７０℃１０分間加熱し、その後９５℃で１５分間反応を停止させた。予測された大きさの増幅産物の存在を確認するために各ＰＣＲ産物１μＬが３％アガロースゲル上で解析された。
【０１３６】
Ｋ−ｒａｓ ＤＮＡ試料のＬＤＲ
ＬＤＲ反応は、２０ｍＭトリスＨＣｌ、ｐＨ８．５、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、１００ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ ＤＴＴ、１ｍＭ ＮＡＤ＋、合計８ｐｍｏｌのＬＤＲプローブ（５００ｆｍｏｌの各識別プローブに４ｐｍｏｌの蛍光標識共通プローブを加えたもの）、細胞株または腫瘍試料由来の１ｐｍｏｌのＰＣＲ産物を含む２０μＬ容量中でパラフィンオイル下で実施された。各々が７個の変異特異的プローブ、３つの共通プローブおよびコドン１２に対する野生型識別プローブまたはコドン１３に対するもののいずれかを各々含む、２つのプローブ混合物が調整された（表３）。
【０１３７】
反応混合液は９４℃２分間事前加熱され、その後２５ｆｍｏｌの野生型ＴｔｈＤＮＡリガーゼが添加された。ＬＤＲ反応は９４℃１５秒および６５℃４分で２０ラウンドサイクルされた。各反応液の２μＬアリコートを２μＬのゲルローディング緩衝液（８％ブルーデキストラン、５０ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０−ホルムアミド（１：５））と混合し、９４℃で２分間変性させ、氷上で冷却した。各混合液の１μＬを１０％変性ポリアクリルアミドゲルにロードし、ＡＢＩ３７７ ＤＮＡシークエンサー上で１５００Ｖで電気泳動させた。
【０１３８】
Ｋ−ｒａｓ ＬＤＲ産物のＤＮＡアレイへのハイブリダイゼーション
ＬＤＲ反応液（１７μＬ）は最終緩衝液濃度３００ｍＭ ＭＥＳ、ｐＨ６．０、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．１％ＳＤＳになるように４０μＬの１．４×ハイブリダイゼーション緩衝液を用いて希釈された。アレイは１×ハイブリダイゼーション緩衝液中で２５℃１５分間事前インキュベーションされた。カバーウェル（グレイス社、サンリバー、オレゴン州）を３０μＬの希釈したＬＤＲ反応液で満たし、アレイに付着させた。アレイは加湿された培養チューブ中に設置され、６５℃で１時間および回転式ハイブリダイゼーション用オーブン中で２０ｒｐｍでインキュベーションされた。ハイブリダイゼーションに続いて、アレイは３００ｍＭビシン、ｐＨ８．０、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．１％ＳＤＳ中に２５℃１０分間洗浄された。蛍光シグナルは以下の段落で記載されているように、顕微鏡／ＣＣＤを用いて測定された。
【０１３９】
画像化
アレイはモレキュラーダイナミクスフルオロイメージャー５９５（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ ＦｌｕｏｒＩｍａｇｅｒ ５９５）（サニーベール（Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ）、カリフォルニア州）またはプリンストンインスツルメント（Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）ＴＥ／ＣＣＤ−５１２ ＴＫＢＭ１カメラ（トレントン、ニュージャージー州）を備えたオリンパスＡＸ７０落射けい光顕微鏡（メルビル、ニューヨーク州）を用いて画像化された。フルオロイメージャー上の蛍光標識プローブの解析に関しては、４８８ｎｍ励起が５３０／３０発光フィルターとともに使用された。スキャニングの空間的分解能はピクセルあたり１００μｍである。結果は、機器とともに提供されたＩｍａｇｅＱｕａＮＴソフトウェアを用いて解析された。落射蛍光顕微鏡は１００Ｗ水銀ランプ、ＦＩＴＣフィルターキューブ（励起４８０／４０、二色性ビーム分離器５０５、発光５３５／５０）、テキサスレッドフィルターキューブ（励起５６０／５５、二色性ビーム分離器５９５、発光６４５／７５）および１００ｍｍのマクロ対物レンズを装備している。マクロ対物レンズは直径１５ｍｍまでの対象視野の図解を可能にし、７×７ｍｍのアレイ面積を１２．３×１２．３ｍｍのＣＣＤマトリックスに投影する。画像はカメラとともに提供されたＷｉｎｖｉｅｗ３２ソフトウェアを用いて１６ビットモードで収集された。解析はスキオン（Ｓｃｉｏｎ）画像（スキオン社、フレドリック、メリーランド州）を用いて実施された。
【０１４０】
実施例２  野生型および変異体対立遺伝子ＰＣＲ／ＰＣＲ／ＬＤＲ検出用ＢＲＣＡ１およびＢＲＣＡ２エキソンの増幅
リガーゼ検出反応（「ＬＤＲ」）（参照として本明細書に組み入れられる、Ｋｈａｎｎａ、Ｍら、「原発大腸腫瘍のＫ−ｒａｓ変異検出のための多重ＰＣＲ／ＬＤＲ（Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ＰＣＲ／ＬＤＲ ｆｏｒ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｋ−ｒａｓ Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｐｒｉｍａｒｙ Ｃｏｌｏｎ Ｔｕｍｏｒｓ）」Ｏｎｃｏｇｅｎｅ、１８：２７〜３８（１９９９））が引き続く、各アンプリコンを均等に増幅する修飾型ＰＣＲ（ＰＣＲ／ＰＣＲ）（参照として本明細書に組み入れられる、Ｂｅｌｇｒａｄｅｒら、「ヒト同一性テスト用の多重ＰＣＲ−リガーゼ検出反応アッセイ法（Ａ Ｍｕｌｉｔｐｌｅｘ ＰＣＲ−Ｌｉｇａｓｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ ｆｏｒ Ｈｕｍａｎ Ｉｄｅｎｔｉｔｙ Ｔｅｓｔｉｎｇ）」、Ｇｅｎｏｍｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １：７７〜８７（１９９６））を用いて小さな挿入および欠失を検出するために、多重アッセイ法が使用された。全産物を均等に増幅することを確実にするためにいかに適切なエキソンの多重増幅が実施されるかを図２０は示している：遺伝子特異的プライマーを用いて限られた数のＰＣＲサイクルが実施され、ＰＣＲプライマーの最も５’端に位置する普遍的配列からプライミングする更なる数ラウンドの増幅がされた。この方法はプライマー特異的効果に基づく増幅バイアスを最小限にする。ＬＤＲは次に、照会配列の野生型および変異体版の両方を検出するために使用される。連結オリゴヌクレオチドプローブは野生型および変異体産物の両方にハイブリダイズするが、しかし両方のプローブがギャップまたは重複なく完全に一致したときのみ連結される。産物は同定のために、電気泳動的に分離されるかまたはマイクロアレイにハイブリダイズされるのいずれかが可能である。
【０１４１】
ＰＣＲはＢＲＣＡ１エキソン２およびエキソン２０およびＢＲＣＡ２エキソン１１を同時に増幅するために単一チューブ多重反応として実施された。ゲノムＤＮＡはアシュケナジーム（Ａｓｈｋｅｎａｚｉ）ユダヤ人の個人の血液試料から抽出され、１００ｎｇ ＤＮＡ、４００μＭの各ｄＮＴＰ、４ｍＭ ＭｇＣｌ２を補完された１×ＰＣＲ緩衝液ＩＩ（１０ｍＭトリスＨＣｌ、２５℃でｐＨ８．３、５０ｍＭ ＫＣｌ）、１Ｕアンプリタックゴールドおよび５’端にユニバーサルプライマーＡまたはＢのいずれかを含む各遺伝子特異的プライマー２ｐｍｏｌを有する２５μＬ反応混合液中で増幅された。表４は以下のようにＰＣＲ／ＬＤＲ／アレイハイブリダイゼーションを用いたＢＲＣＡ１およびＢＲＣＡ２変異の検出用のプライマーおよびプローブを示す。
【０１４２】
【表４】ＰＣＲ／ＬＤＲ／アレイハイブリダイゼーションによるＢＲＣＡ１およびＢＲＣＡ２変異検出用に設計されたプライマーおよびプローブ
2004526402.tif 000007
2004526402.tif 000008
【０１４３】
反応液はミネラルオイルで重層され、９５℃で１０分間事前インキュベーションされた。増幅は以下のように１５サイクル実施された：９４℃１５秒、６５℃１分間。各ユニバーサルプライマーＡおよびＢを含む２番目の反応混合液の２５μＬアリコートが２５ｐｍｏｌのミネラルオイルを通して添加された。サイクルは５５℃アニーリング温度を用いて反復された。反応液は続いて、１ｍｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫ／５０ｍＭ ＥＤＴＡの２μＬ溶液を用いて５５℃で１０分間消化された。プロテイナーゼＫは９０℃１５分間の最終インキュベーションにより消去された。ＬＤＲに関しては、オリゴヌクレオチド合成および精製は以前に記載されているように（参照として本明細書に組み入れられる、Ｋｈａｎｎａ、Ｍら、「原発大腸腫瘍のＫ−ｒａｓ変異検出のための多重ＰＣＲ／ＬＤＲ（Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ＰＣＲ／ＬＤＲ ｆｏｒ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｋ−ｒａｓ Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｐｒｉｍａｒｙ Ｃｏｌｏｎ Ｔｕｍｏｒｓ）」Ｏｎｃｏｇｅｎｅ １８：２７〜３８（１９９９））実施された。Ｔｔｈ ＤＮＡリガーゼは別に記載されているように過剰生産および精製された（参照として本明細書に組み入れられる、Ｌｕｏら、「サーマスサーモフィルスＤＮＡリガーゼの必須残基の同定（Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｒｅｓｉｄｕｅｓ ｉｎ Ｔｈｅｒｍｕｓ Ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＤＮＡ Ｌｉｇａｓｅ）」、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２４：３０７９〜３０８５（１９９６）およびＢａｒａｎｙら「耐熱性ＤＮＡリガーゼ遺伝子のクローン化、過剰発現およびヌクレオチド配列（Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ， ａｎｄ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ａ Ｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｌｅ ＤＮＡ Ｌｉｇａｓｅ Ｇｅｎｅ）」Ｇｅｎｅ １０９：１〜１１（１９９１））。ＬＤＲは、５００ｆｍｏｌの各プローブ、２μＬの増幅されたＤＮＡおよび２０ｍＭトリスＨＣｌ、ｐＨ７．６、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１００ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ ＤＴＴ、１ｍＭ ＮＡＤ＋を含む２０μＬの反応液中で実施された。反応液は２５ｆｍｏｌのＴｔｈ ＤＮＡリガーゼ添加前に９４℃まで１．５分間加熱され、その後９４℃１５秒および６５℃４分に２０サイクル供された（表４を参照されたい）。
【０１４４】
モデル系としてアシュケナジームユダヤ人集団の３つのＢＲＣＡ１およびＢＲＣＡ２の創始変異（ｆｏｕｎｄｅｒ ｍｕｔａｔｉｏｎ）（ＢＲＣＡ１ １８５ｄｅｌＡＧ、ＢＲＣＡ１ ５３８２ｉｎｓＣ、ＢＲＣＡ２ ６１７４ｄｅｌＴ）（参照として本明細書に組み入れられる、Ｒａｈｍａｎら、「乳癌感受性の遺伝学（Ｔｈｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ｏｆ Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ）」、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．３２：９５〜１２１（１９９８））を用いて、そのアッセイ法は８０超のＤＮＡ試料における多重化反応内でこれらの変異を容易に検出した。図２１Ａは３つのＢＲＣＡ変異を検出する代表的なＬＤＲゲルを示す。識別上流オリゴヌクレオチドをＦＡＭ（野生型に対して）またはＴＥＴ（変異体に関して）のいずれかを用いて蛍光末端標識することにより、かつＬＤＲオリゴヌクレオチドプローブに異なる長さの「尾」を添加することにより、連結産物は標識およびポリアクリルアミドゲル上の移動度に基づいて容易に識別された。野生型産物はゲルの右側に同定される。変異体産物はゲルの上部に同定される。電気泳動分離は８Ｍ尿素−１０％ポリアクリルアミドゲルおよびＡＢＩ３７３ ＤＮＡシークエンサーを用いて１４００Ｖで実施された。蛍光連結産物はＡＢＩジーンスキャン（ＧｅｎｅＳｃａｎ）６７２ソフトウェアを用いて解析および定量された。
【０１４５】
解析は続いてＤＮＡのプールされた試料における変異を検出するために拡張された。既知の変異を有するＤＮＡが、ＰＣＲ増幅の前に野生型ＤＮＡを用いて１：２、１：５、１：１０および１：２０で希釈され、その後ＬＤＲに供された。これらの模擬実験は、増幅の前に野生型ＤＮＡを用いて既知の変異体ＤＮＡが１：２０に希釈された時、ＰＣＲ／ＰＣＲ／ＬＤＲが成功裏に全ての３つの変異の存在を検出できたことを示していた。図２１Ｂは、プールされたＤＮＡ試料のＢＲＣＡ１およびＢＲＣＡ２の変異検出を示す。既知の変異を有するＤＮＡが、増幅の前に野生型ＤＮＡ中に希釈された。多重ＬＤＲの連結産物が各希釈に対して示される。ＢＲＣＡ１ｄｅｌＡＧ、ＢＲＣＡ１ｉｎｓＣ、およびＢＲＣＡ２ｄｅｌＴは、ただ１つの変異のみが存在することを意味する。変異体配列のみに向けられた多重ＬＤＲは５００ｆｍｏｌの各ＬＤＲオリゴヌクレオチドプローブを使用する。３変異は全３個の変異が存在することを意味する。変異配列のみに向けられた多重ＬＤＲは５００ｆｍｏｌの各ＬＤＲオリゴヌクレオチドを使用する。１：２０の３変異＋野生型対照は全３個の変異が存在することを意味する。多重ＬＤＲは、各々５００ｆｍｏｌおよび２５ｆｍｏｌの各ＬＤＲオリゴヌクレオチドプローブを使用して、変異体および野生型配列の両方に向けられる。プールされた実験は２４９個の盲検化されたアシュケナジームユダヤ人のＤＮＡ試料を用いて繰り返された。盲検化されたＤＮＡを含むチューブは９×９格子形式に配置され、各行および各列の統合されたＤＮＡを１つのチューブに生産するために、各チューブからのアリコートは行にわたって、次に列を下って統合された。格子形式における交差点を用いて各試料を一意に分類するためにこれがなされた。プールされたＤＮＡはその後上述のように増幅およびＬＤＲに供された。２４９個の試料のうち２４８個が正確にタイピングされた。野生型として不正確に同定された１つの試料は非常に希釈されすぎていることが証明され、より濃度の高い他の９個の試料と混合したとき検出限界以下に落ちた。実施された個々の反応の数は、この戦略により２４９から９６に減少された（５５個のプール試料および確認用に使用された４１個の個別の試料）。
【０１４６】
ゲルに基づく検出に加えて、変異同定はまた普遍的ＤＮＡマイクロアレイを用いて反応産物をスクリーニングすることによっても達成された（参照として本明細書に組み入れられる、Ｇｅｒｒｙら、「少量の点変異の多重検出のための普遍的ＤＮＡマイクロアレイ法（Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＤＮＡ Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｌｏｗ Ａｂｕｎｄａｎｃｅ Ｐｏｉｎｔ Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ）」Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ． ２９２：２５１〜２６２（１９９９））。マイクロアレイは、加湿チャンバー（カルテシアンテクノロジー、アーバイン、カリフォルニア州）内に封入されたピクシス５５００ロボットを用いて以前に記載されたように処理およびスポットされた（参照として本明細書に組み入れられる、Ｇｅｒｒｙら、「少量の点変異の多重検出のための普遍的ＤＮＡマイクロアレイ法」Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ． ２９２：２５１〜２６２（１９９９））。簡単には、ＬＤＲ反応液は回転チャンバー内で６５℃１時間、３００ｍＭ ＭＥＳ、ｐＨ６．０、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．１％ＳＤＳを含む３２μＬ中でハイブリダイズされた。３００ｍＭ ビシン、ｐＨ８．０、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．１％ＳＤＳ中で２５℃１０分間洗浄された後、１００Ｗ水銀バーナー、テキサスレッドフィルターキューブ、およびプリンストンインスツルメントＴＥＫ５１２／ＣＣＤカメラを用いてオリンパスプロビスＡＸ７０顕微鏡上で画像化された。１６ビットグレイスケール画像はメタモルフ（ＭｅｔａＭｏｒｐｈ）イメージングシステム（ユニバーサルイメージングコーポレーション、ウエストチェスター、ペンシルベニア州）を用いて捕捉され、８ビットグレイスケールに変換する前により狭くＬＤＲシグナルを区分するために再スケリーングされた。８ビット画像はアドビ（Ａｄｏｂｅ）フォトショップを用いてＣｙ３シグナルに赤を与えるためにカラー化された。
【０１４７】
ゲルに基づく形式で設計されたプローブ（すなわち差異的に標識された識別プローブおよび同じ共通プローブ）を用いた予備的なマイクロアレイ実験は３つのＢＲＣＡ配列の野生型および変異体版がアレイ上で容易に検出されることを証明した（参照として本明細書に組み入れられる、Ｂａｒａｎｙらに与えられたＷＯ９７／３１２５６を参照されたい）。この版においては、両配列型は同じアドレスに向けられた（例えばＢＲＣＡ１ １８５ｄｅｌＡＧおよびＢＲＣＡ１ １８５野生型は両者ともＺｉｐコード１に向けられた）。この形式は成功することが証明されたが、ＰＣＲ／ＰＣＲ／ＬＤＲは単一チューブ反応において数１００の変異を検出する能力を有しており、かつこの設計はそのような大規模変異同定実験用のアレイの最良の適用ではない。将来の研究のために実験パラダイムを確立するために、ＬＤＲ連結産物を対照として使用する配列を各アンプリコンの中で選択することにより位置特定可能な形式は拡張された。したがって、各変異体ＬＤＲ産物に対して野生型配列を検出する必要があるというよりも、この形式はあるアンプリコン内の多数の異なる配列変異体の陽性対照として機能する単一産物を使用する（図２２を参照されたい）。この形式の１つの利点はオリゴヌクレオチド合成を最小化することである。付加的には、６４部位の各々の使用が最大化される。単一のアドレスで検出可能なＬＤＲ連結産物の数は現在利用可能なスペクトルで分離されている蛍光標識の数で制限されているので、対照をアレイの特定の領域に制限することは、残りの各々のアドレスにおいてさらに１つの配列変異体の検出を可能にする。下記に記載される実験においては、紹介された部位に対する対照および変異体ＬＤＲ連結産物は、６４部位アレイ上の６個の離れたアドレスに向けられた。
【０１４８】
全部で３つのフレームシフト変異が普遍的アレイへのハイブリダイゼーションにより検出可能であった（図２３）。図２３Ａは対照および変異体配列の各々をアレイ表面上の特定のアドレスに配置することを示している。対照シグナルは上部の３つのアドレスに向けられた。変異体シグナルは下部の３つに向けられた。図２３Ｂは野生型ＤＮＡにより生じるシグナルを示す。図２３Ｃ、ＥおよびＧは個々のＤＮＡ試料の代表的ハイブリダイゼーションを示す。図２３Ｄ、ＦおよびＨはアシュケナジーム個人由来のプールされたＤＮＡ試料を用いた各変異の代表的ハイブリダイゼーションを示す。変異は最も右に同定されている。
【０１４９】
６個の可能なアドレスの組み合わせのみがハイブリダイゼーションに続いて可視化可能になり、他のいかなる未使用アドレスにおいても付加的なシグナルは検出されなかった。したがって、Ｚｉｐコードハイブリダイゼーションは非常に特異的である。対照および変異体シグナルは、単一の個人由来のＤＮＡ試料に由来する各変異に対して明確に存在していた（図２３Ｃ、ＥおよびＧ）。上記の２４９個のＤＮＡ試料を解析する際に使用されたプールされたＤＮＡは、ゲルに基づくアッセイ法で見出されたものと同じ変異シグナルを生じた（図２３Ｄ、ＦおよびＨ）。各々のケースにおいて、アレイはゲルの結果を再現した。
【０１５０】
これらの結果は、ＰＣＲ／ＰＣＲ／ＬＤＲ産物の普遍的マイクロアレイ解析が、臨床診断および集団研究の両方の状況において、小さな挿入および欠失変異の迅速な同定を可能にすることを証明している。
【０１５１】
実施例３  ｐ５３チップハイブリダイゼーションおよび洗浄条件
どの方法がシグナルを有意に失うことなく最小のバックグラウンドノイズを生じうるかを決定するために、３つのパラメーター（非特異的競合ＤＮＡの存在または非存在、温度、および洗浄緩衝液組成）を異なる組み合わせで変更したた。ハイブリダイゼーションは１００μｇ／ｍｌのせん断サケ精子ＤＮＡ（図１６Ｂ、Ｄ、ＪおよびＬ）、２５０μｇ／ｍｌのせん断サケ精子ＤＮＡ（図１６Ｆ、Ｈ、ＮおよびＰ）、または非特異的競合ＤＮＡ（図１６Ａ、Ｃ、Ｅ、Ｇ、Ｉ、Ｋ、ＭおよびＯ）を用いて実施された。洗浄は４つの異なる条件を用いて１０分間実施された。標準洗浄緩衝液（３００ｍＭビシン、ｐＨ８．０、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．１％ＳＤＳ）を用いて室温（図１６Ａ、Ｂ、ＥおよびＦ）。１０％ホルムアミドを追加した標準洗浄緩衝液を用いて室温（図１６Ｉ、Ｊ、ＭおよびＮ）。標準洗浄緩衝液を用いて５０℃（図１６Ｃ、Ｄ、ＧおよびＨ）または１０％ホルムアミドを追加した標準洗浄緩衝液を用いて５０℃（図１６Ｋ、Ｌ、ＯおよびＰ）。各パネルの右上の数は各条件に対するｐ５３エキソン５対照（Ｚｉｐコード１）のピクセル密度を示す。数字の右側に示された損失割合は計算された割合に直接隣接する左および右のパネルを比較している。基準（Ｃｙ３、Ｃｙ５およびフルオレセイン）は方向性を与えるために、チップの左上に水平におよび右下の領域に垂直にスポットされている。Ｚｉｐコード１は左上領域の基準の直下に位置している。引き続くＺｉｐコードは数字の順に左から右の様式でスポットされている。
【０１５２】
ｐ５３エキソン５および７を同時に増幅するために、ＰＣＲは単一チューブ多重反応として実施された。白血球由来の市販のゲノムＤＮＡは、１００ｎｇ ＤＮＡ、４００μＭの各ｄＮＴＰ、４ｍＭ ＭｇＣｌ２を補完された１×ＰＣＲ緩衝液ＩＩ（１０ｍＭトリスＨＣｌ、２５℃でｐＨ８．３、５０ｍＭ ＫＣｌ）、１Ｕアンプリタックゴールドおよび５’端にユニバーサルプライマーＡまたはＢのいずれかを持つ２ｐｍｏｌの各々の遺伝子特異的プライマーを含む２５μＬ反応混合液中で増幅された（表５を参照されたい）。反応液をミネラルオイルで重層し、９５℃で１０分間事前加熱処理された。増幅は以下を１５サイクル実施した：９４℃１５秒、６５℃１分間。２５ｐｍｏｌの各ユニバーサルプライマーＡおよびＢを含む、２番目の反応混合液の２５μＬアリコートが、ミネラルオイルを通して添加された。サイクルは５５℃アニーリング温度を用いて反復された。反応液は続いて、１ｍｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫ／５０ｍＭ ＥＤＴＡの２μＬ溶液を用いて５５℃で１０分間消化された。プロテイナーゼＫは９０℃１５分間の最終インキュベーションにより消去された。ＬＤＲに関しては、オリゴヌクレオチド合成および精製は以前に記載されているように（参照として本明細書に組み入れられる、Ｋｈａｎｎａ、Ｍら、「原発大腸腫瘍のＫ−ｒａｓ変異検出のための多重ＰＣＲ／ＬＤＲ（Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ＰＣＲ／ＬＤＲ ｆｏｒ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｋ−ｒａｓ Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｐｒｉｍａｒｙ Ｃｏｌｏｎ Ｔｕｍｏｒｓ）」Ｏｎｃｏｇｅｎｅ １８：２７〜３８（１９９９））実施された。Ｔｔｈ ＤＮＡリガーゼは別に記載されているように過剰生産および精製された（参照として本明細書に組み入れられる、Ｌｕｏら、「サーマスサーモフィルスＤＮＡリガーゼの必須残基の同定（Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｒｅｓｉｄｕｅｓ ｉｎ Ｔｈｅｒｍｕｓ Ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＤＮＡ Ｌｉｇａｓｅ）」、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２４：３０７９〜３０８５（１９９６）およびＢａｒａｎｙら「耐熱性ＤＮＡリガーゼ遺伝子のクローン化、過剰発現およびヌクレオチド配列（Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ， ａｎｄ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ａ Ｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｌｅ ＤＮＡ Ｌｉｇａｓｅ Ｇｅｎｅ）」Ｇｅｎｅ １０９：１〜１１（１９９１））。ＬＤＲは、５００ｆｍｏｌの各プローブ、２μＬの増幅されたＤＮＡおよび２０ｍＭトリスＨＣｌ、ｐＨ７．６、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１００ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ ＤＴＴ、１ｍＭ ＮＡＤ＋を含む２０μＬの反応液中で実施された。反応物を９４℃で１．５分間加熱して２５ｆｍｏｌのＴｔｈ ＤＮＡリガーゼを添加し、その後９４℃１５秒および６５℃４分の２０サイクルに供した。以下のようにＰＣＲ／ＬＤＲ／アレイハイブリダイゼーションによるｐ５３変異の検出用に設計されたオリゴヌクレオチドプライマーおよびプローブを示す表５を参照されたい。
【０１５３】
【表５】ＰＣＲ／ＬＤＲ／アレイハイブリダイゼーションによるｐ５３変異検出用に設計されたプライマーおよびプローブ
2004526402.tif 000009
2004526402.tif 000010
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【０１５４】
ＰＣＲプライマーはｐ５３遺伝子内および周囲の領域を増幅するために特異的に設計される。より長い遺伝子特異的プライマー（各反応につき１〜２ｐｍｏｌ）を用いて高いＴｍ（すなわち６５℃）での１５ラウンドの増幅の後、２つのユニバーサルプライマー（太大文字）が５０μＬ中に５０ｐｍｏｌで添加され、かつ産物はさらに２０ラウンドの増幅にサイクルされる。
【０１５５】
対立遺伝子特異的ＬＤＲプローブは５’端に蛍光標識（Ｆａｍ、Ｔｅｔ、Ｃｙ３またはＣｙ５）および３’端に識別塩基を含んでいた。ゲルに基づくアッセイ用に最終の連結産物の大きさを調節するためにいくつかのプローブの５’端に非ゲノム配列が付加された（太小文字で指定されている）。共通ＬＤＲプローブはその３’端に５’リン酸基（ｐ）およびＣ−３封鎖基（Ｂ）を含んでいた。アレイに基づく検出で使用される共通ＬＤＲプローブはその３’端にＺｉｐコード配列を有している（小文字で指定されている）。
【０１５６】
ＬＤＲ反応液は回転チャンバー内で６５℃１時間、１００μｇ／ｍｌのせん断サケ精子ＤＮＡを含むまたは含まない、３００ｍＭ ＭＥＳ、ｐＨ６．０、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．１％ＳＤＳを含む３２μＬ中でハイブリダイズされた。１０％ホルムアミドを含むまたは含まない、３００ｍＭ ビシン、ｐＨ８．０、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．１％ＳＤＳ中で２５℃１０分間または５０℃１０分間洗浄された後、１００Ｗ水銀バーナー、テキサスレッドフィルターキューブ、およびプリンストンインスツルメントＴＥＫ５１２／ＣＣＤカメラを用いてオリンパスプロビスＡＸ７０顕微鏡上で画像化された。１６ビットグレイスケール画像はメタモルフイメージングシステム（ユニバーサルイメージングコーポレーション）を用いて捕捉され、８ビットグレイスケールに変換する前により狭くＬＤＲシグナルを区分するために再スケリーングされた。この８ビット画像はアドビフォトショップを用いてＣｙ３シグナルに黒を与えるために反転された。
【０１５７】
実施例４  大腸腫瘍由来ＤＮＡにおける変異の存在を示すｐ５３チップハイブリダイゼーション
ｐ５３チップはエキソン５、６、７および８に存在する７５個の異なる変異の存在を検出することが可能であり、１４４個のＬＤＲオリゴヌクレオチドを使用する（表５を参照されたい）。図２４は大腸腫瘍由来ＤＮＡを用いたマイクロアレイに基づくｐ５３変異検出の例である。各試料の変異の状態およびシグナルを捕捉することが期待されるＺｉｐコードは各パネルの右に示されている。その図は、スポットされたＺｉｐコード内の汚染蛍光に起因するＣｙ３バックグラウンドを右側最下のパネルに示している（図２４Ｈ）。ｐ５３エキソン５、６、７および８を同時に増幅するために、ＰＣＲは単一チューブ多重反応として実施された。大腸腫瘍から抽出されたゲノムＤＮＡは、１００ｎｇ ＤＮＡ、４００μＭの各ｄＮＴＰ、４ｍＭ ＭｇＣｌ２を補完された１×ＰＣＲ緩衝液ＩＩ（１０ｍＭトリスＨＣｌ、２５℃でｐＨ８．３、５０ｍＭ ＫＣｌ）、１Ｕアンプリタックゴールドおよび５’端にユニバーサルプライマーＡまたはＢのいずれかを持つ２ｐｍｏｌの各遺伝子特異的プライマーを含む２５μＬ反応混合液中で増幅された（表５を参照されたい）。反応液にはミネラルオイルが重層され、９５℃で１０分間事前加熱処理された。増幅は以下のように１５サイクル実施された：９４℃１５秒、６５℃１分間。２５ｐｍｏｌの各ユニバーサルプライマーＡおよびＢを含む２番目の反応混合液の２５μＬアリコートがミネラルオイルを通して添加された。サイクルは５５℃アニーリング温度を用いて反復された。反応液は続いて、１ｍｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫ／５０ｍＭ ＥＤＴＡの２μＬ溶液を用いて５５℃で１０分間消化された。プロテイナーゼＫは９０℃１５分間の最終インキュベーションにより消去された。ＬＤＲに関しては、オリゴヌクレオチド合成および精製は以前に記載されているように（参照として本明細書に組み入れられる、Ｋｈａｎｎａ、Ｍら、「原発大腸腫瘍のＫ−ｒａｓ変異検出のための多重ＰＣＲ／ＬＤＲ（Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ＰＣＲ／ＬＤＲ ｆｏｒ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｋ−ｒａｓ Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｐｒｉｍａｒｙ Ｃｏｌｏｎ Ｔｕｍｏｒｓ）」Ｏｎｃｏｇｅｎｅ １８：２７〜３８（１９９９））実施された。Ｔｔｈ ＤＮＡリガーゼは別に記載されているように過剰生産および精製された（参照として本明細書に組み入れられる、Ｌｕｏら、「サーマスサーモフィルスＤＮＡリガーゼの必須残基の同定（Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｒｅｓｉｄｕｅｓ ｉｎ Ｔｈｅｒｍｕｓ Ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＤＮＡ Ｌｉｇａｓｅ）」、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２４：３０７９〜３０８５（１９９６）およびＢａｒａｎｙら「耐熱性ＤＮＡリガーゼ遺伝子のクローン化、過剰発現およびヌクレオチド配列（Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ， ａｎｄ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ａ Ｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｌｅ ＤＮＡ Ｌｉｇａｓｅ Ｇｅｎｅ）」Ｇｅｎｅ １０９：１〜１１（１９９１））。ＬＤＲは、５００ｆｍｏｌの各プローブ、２μＬの増幅されたＤＮＡおよび２０ｍＭトリスＨＣｌ、ｐＨ７．６、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１００ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ ＤＴＴ、１ｍＭ ＮＡＤ＋を含む２０μＬの反応液���で実施された。ｐ５３配列の上側鎖または下側鎖にハイブリダイズするように設計されたＬＤＲプローブを含む各試料に関して２つの反応が実施された。反応液は２５ｆｍｏｌのＴｔｈ ＤＮＡリガーゼ添加前に９４℃で１．５分間加熱され、その後９４℃１５秒および６５℃４分に２０サイクル供された（表５を参照されたい）。ＬＤＲ反応液は回転チャンバー内で６５℃１時間、１００μｇ／ｍｌのせん断サケ精子ＤＮＡを含む、３００ｍＭ ＭＥＳ、ｐＨ６．０、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．１％ＳＤＳを含む３２μＬ中でハイブリダイズされた。３００ｍＭ ビシン、ｐＨ８．０、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．１％ＳＤＳ中で５０℃１０分間洗浄された後、１００Ｗ水銀バーナー、テキサスレッドフィルターキューブ、およびプリンストンインスツルメントＴＥＫ５１２／ＣＣＤカメラを用いてオリンパスプロビスＡＸ７０顕微鏡上で画像化された。１６ビットグレイスケールイメージはメタモルフイメージングシステム（ユニバーサルイメージングコーポレーション）を用いて捕捉され、８ビットグレイスケールに変換する前により狭くＬＤＲシグナルを区分するために再スケリーングされた。８ビット画像はアドビフォトショップを用いて最初Ｃｙ３シグナルに黒を与えるために反転され、その後ｐ５３配列の上側鎖または下側鎖を標的としたＬＤＲを用いたハイブリダイゼーションに由来する各試料の画像が重層および重ね合わせされた。この処理の結果は図２４に示されている。
【０１５８】
実施例５  四量体を用いた最適化Ｚｉｐコード配列構築
普遍的ＤＮＡアレイは、各々が固有の部位に捕捉されるようにＬＤＲ産物をユニークにタグ付けするために、拡散した配列を用いるというコンセプトに基づいて設計されている。このコンセプトの中心は、各々が他のいずれとも少なくとも２塩基異なる３６個の四量体の設計である（表６を参照されたい）。
【０１５９】
【表６】
2004526402.tif 000015
これらの３６個の四量体を６個のセットに組み合わせることにより、２４塩基長のアドレスを構築することが可能である。
【０１６０】
１２９６アレイは、所定の四量体セットの交互タイリング（ａｌｔｅｒｎａｔｅ ｔｉｌｉｎｇ）のコンセプトに基づいて設計することが可能である。これらの捕捉オリゴヌクレオチドはその近傍物と３つの交互部位において異なるが、しかし他の３つの部位においては同じである、すなわち（第１＝Ａ、第３＝Ｃおよび第５＝Ｅ部位）。したがって、各捕捉オリゴヌクレオチドは他の任意の１つと２４部位のうち少なくとも６個異なっていた。さらにこれらの差異は捕捉オリゴヌクレオチドの長さに渡り分布していた。正しい捕捉オリゴヌクレオチドを誤ったアドレスに配置する時、Ｔｍの差異は２４℃超になると予測された。それにもかかわらず、この設計型の可能性の１つは、所定の部位のセットにおける３つの隣接する四量体（すなわちＡＢＣ）が別の捕捉オリゴヌクレオチドに一致するが、しかし異なる部位のセット（すなわちＢＣＤ）においてであることである。
【０１６１】
最適表面は３次元多孔性表面であるので、所定のＬＤＲ産物が正確なアドレスに捕捉される多大な機会を有する。たとえＬＤＲ産物が一過性に正確なアドレス内の所定のオリゴヌクレオチドから解離したとしても、同じアドレス内の別のオリゴヌクレオチドを迅速に発見し、ハイブリダイズする。予備試験的な研究において、Ｔｍを変化させると予測される変化（すなわちプロピニル誘導体の使用）は正確にハイブリダイズした産物の収量には大きくは影響しなかった。したがってハイブリダイゼーションは速度論的に制御可能でありうる。２つのよく関連したオリゴヌクレオチド間の低いレベルの交互ハイブリダイゼーションでさえ、その可能性を最小化するためには、２４ｍｅｒ捕捉オリゴヌクレオチドを有する四量体の順序間の差異を最大化するように配列を設計することが可能である。
【０１６２】
そのような配列を設計するための概要は以下のとおりである。
【０１６３】
１． ３６個の四量体の３セットの、全４６，６５６個（＝３６×３６×３６）の順列を含む３つの列を作製する。
【０１６４】
２． モレキュラーバイオロジーインサイト（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｉｎｓｉｇｈｔｓ）社（カスケード、コロラド州）のオリゴ６．０プログラムを用いて４６，６５６個の１２ｍｅｒのＴｍをコンピューター計算し、予測Ｔｍ値に従い一覧を並び替える。
【０１６５】
３． 各四量体に１つのＧＣ塩基を含む１２ｍｅｒ（四量体＃１〜＃７）または各四量体に３つのＧＣ塩基を含む１２ｍｅｒ（四量体＃２８〜＃３６）を取り除く。この過程はＴｍ値の極値を取り除く。２４℃未満のＴｍ値の１２ｍｅｒ取り除く。３つの反復された四量体を有する、残る１２ｍｅｒ（すなわち９−９−９）を取り除く。
【０１６６】
４． Ｔｍが２度上がるごとに新しい群として、１２ｍｅｒのセットをＴｍにより群分けする。Ｔｍを２で割って、整数に切り捨てることによって値を決定した。
【０１６７】
５． 一覧を無作為化し、奇数および偶数の１２ｍｅｒに分割する。２番目の一覧を反転させ、最初の一覧の最後に追加し、６個の四量体＝１２，８８０個のアドレス候補を形成する。配列を連結し、２４ｍｅｒのＴｍ値を決定する。
【０１６８】
６． Ｔｍ値が７５から８４の間である６個の四量体のみを選抜する。未使用の三量体を再生し、Ｔｍを増加させた新規の６個の四量体を作成し、一覧に戻し加える。
【０１６９】
７． 表７に記載されているような１３個の選抜条件を用いて、一覧を削る。「１」はその部位で一致していることを示し、「０」は一致がないことを示す。２つの候補アドレスが条件の１つにおいて一致する時はいつでも、それは候補一覧から除去され、未使用三量体一覧に戻された。
【０１７０】
【表７】
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【０１７１】
８． 上記の１３条件は一覧を９，６５０個のアドレス候補に減少させた。
【０１７２】
９． 上記の１３条件は連続した４個の一致を取り除き、別の１つと同じ配置である連続した３つの一致を取り除く。しかし、類似しているが１個または２個の四量体ユニットによって転換された配列は取り除かれない。これらの種類のアーチファクトを消去するために、もともとの６個の四量体の下にコピーし、以下の図８にあるように１つまたは２つの四量体によって補正した。
【０１７３】
【表８】
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【０１７４】
１０． これら３つの選抜は、６４×６４アドレスアレイの４，０９６個の標的より４，７９８個多い８，８９４個の候補捕捉オリゴヌクレオチドを一覧から精選した。これらの捕捉オリゴヌクレオチド配列は以下の特性を有している。（１）捕捉オリゴヌクレオチド配列が互いに配置されたとき、または互いに補正または分割したときのいずれかで、同一である連続した４個の四量体の例はない。（２）捕捉オリゴヌクレオチド配列が１つの端から互いに配置されたとき、行において同一である３個の四量体の例はない。（３）６個の四量体のうち４個の四量体が同一部位にある例はない。
【０１７５】
１１． 更なる選抜には、補正された連続する３つの配列を表９のように消去した。
【０１７６】
【表９】
2004526402.tif 000018
【０１７７】
１２． これらの６個の選抜は、５０×５０アドレスアレイの２，５００個のより選択的な標的より多い３，０３８個の候補捕捉オリゴヌクレオチドを一覧から精選した。これらの捕捉オリゴヌクレオチド配列は以下の特性を有している。（１）捕捉オリゴヌクレオチド配列が互いに配置されたとき、または互いに補正されたときのいずれかにおいて同一である連続した４個の四量体の例はない。（２）捕捉オリゴヌクレオチド配列が１つの端から互いに配置されたとき、または互いに補正されたいずれかのときに、同一である連続した３個の四量体の例はない。（３）６個の四量体のうち４個の四量体が同一部位にある例はない。
【０１７８】
１３． 四量体の順番は反転され、新しいＴｍ値が計算され、（６，０７６）に足し戻され、その後、上の７〜１１の段階に記載されているように余計なものを取り除かれた。候補一覧は３，２７０個とわずかに増加した。したがって、未使用三量体を濃縮する方法が必要とされた。
【０１７９】
１４． 全ての部位において使用された三量体の一覧が、利用可能な（未使用の）三量体を決定し、新しい６個の四量体セットを構築するために使用された。Ｔｍ値が７５℃〜８４℃の範囲の６個の四量体の割合を増加させるために、予測Ｔｍ値が３４℃〜５０℃の三量体が互いに反転され、使用された（すなわちＴｍ３４の三量体ＡＢＣがＴｍ５０の三量体ＤＥＦに融合され、Ｔｍ３８の三量体ＡＢＣがＴｍ４６の三量体ＤＥＦに融合された、など）。
【０１８０】
１５． ６個の四量体のセットが構築され、接合部に作製された三量体（すなわち部位ＢＣＤおよびＣＤＥ）が使用済み三量体一覧に対して再試験され、それらの一致しなかった６個の四量体が再利用された。それらの不一致でなかった６個の四量体は３，２７０個の候補一覧に付加され、再度並び替えられ、段階７〜１１に記載されているように余計なものを取り除かれた。候補一覧は４，０３５に拡大した。
【０１８１】
１６． ６４×６４アドレスアレイの４，０９６の標的より５３７配列多い、４，６３３個の捕捉オリゴヌクレオチドの最終一覧を作製するために、もう２回この過程が繰り返された（表６の四量体を参照する図２５）。これらの捕捉オリゴヌクレオチド配列は以下の特性を有している。（１）捕捉オリゴヌクレオチド配列が互いに配置されたとき、または互いに補正されたときのいずれかで、同一である連続した４個の四量体の例はない。（２）捕捉オリゴヌクレオチド配列が１つの端から互いに配置されたとき、または互いに補正されたときのいずれかで、同一である連続した３個の四量体の例はない。（３）６個の四量体のうち４個の四量体が同一部位にある例はない。
【０１８２】
１７． ４，６３３個の捕捉オリゴヌクレオチド一覧を用いて、８×８＝６４アドレスアレイ、８×１２＝９６アドレスアレイ、１６×２４＝３８４アドレスアレイ、および２０×２０＝４００アドレスアレイのためのより小さな一覧が作成された。選抜基準として、四量体対を共通に共有する捕捉オリゴヌクレオチドは選択的に一覧から除かれた。所定の部位において同一である全ての二量体対（すなわちＡＢ＝ＡＢ）を淘汰することで一覧は４６５個の捕捉オリゴヌクレオチド配列に減少した（表６の四量体を参照する図２６）。隣接部位において類似している二量体対（すなわちＡＢ＝ＢＣ、ＢＣ＝ＣＤなど）の２度目の淘汰により、および２回超使用されている全ての二量体対を取り除くことにより、セットは９６個の捕捉オリゴヌクレオチド配列に減少した（表６の四量体を参照する図２７）。最終的にどの二量体も１回超使用されないことを保証することで６５個の捕捉オリゴヌクレオチド配列の一覧が作製された（表６の四量体を参照する図２８）。
【０１８３】
１８． ４，６３３個のそのような捕捉オリゴヌクレオチドの一覧を含む図２９（表６の四量体を参照する）に示されているように、捕捉オリゴヌクレオチドはまたＰＮＡ（すなわち、ペプチドヌクレオチド類似体）であることもできる。ＰＮＡ捕捉オリゴヌクレオチドは２０ｍｅｒユニットの型である。ＰＮＡは平均で１塩基につき１．０℃から１．５℃オリゴヌクレオチドのＴｍを増加させる利点を提供する。そのため図２９に列記されたオリゴマーのＴｍ値はＰＮＡ型として合成されるとき平均で２０℃（またはそれを超えて）高いと考えられる。したがってアドレスはＰＮＡ型ではわずか２０ｍｅｒ以下であれさえすえればよいと考えられる。これらの配列は、２つの代替法を考慮することにより、より迅速な合成に適合しやすい。最初の方法では、表６に列記された３６個の四量体が最初に合成され、その後、図２９に列記されている配列を形成するために正確な順に５個の四量体が連結される。または、ＰＮＡオリゴマーはリソグラフィック合成法を用いて合成されると考えられる。標準的なリソグラフィック合成では４塩基、すなわちＡ−Ｃ−Ｇ−Ｔを第１の部位に、Ａ−Ｃ−Ｇ−Ｔを第２の部位になどが何度となく使用され、４×２０＝８０のマスキングが必要とされると考えられる。図２９に列記されている現在の配列は６２回の、またはマスキングの順番を変更することにより更に少ない、マスキングにより合成に適合しやすい。６２回のマスキングは以下の順番でＰＮＡ単量体を付加することを可能にすると考えられる。
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【０１８４】
所定の配列に関して、次の塩基においてその配列を許すマスキングはそのアドレスにおいて開放されている。一例として、もし配列が
2004526402.tif 000020
であれば、ちょうど２０回のマスキングを用いて終了することが可能と考えられる。異なる配列はより多くのマスキングを必要とすると考えられる。したがって、２０ｍｅｒは異なる数のマスキングを用いて終了する。６２回未満のマスキングを必要とする５個の異なるアドレスＺｉｐＩＤ＃１、２、３、４および２６の合成のための例が以下に提供される。これらの例では、正しい配列を達成するために、マスキングの使用はその塩基に下線を引くことで指示される。
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これにより、２０ｍｅｒを合成するための標準的アプローチに必要とされる８０マスクよりもずっと少なく、それどころか１６ｍｅｒの標準ＰＮＡの作製に必要な６４マスクよりも少ない、６２マスク以下を用いる平板アプローチを用いて、２０ｍｅｒのＰＮＡアドレスが合成されうる。
【０１８５】
全アドレスは７５〜８４℃の間のＴｍ値を有するように選択された。Ｔｍ値の分布は多かれ少なかれ捕捉オリゴヌクレオチドの数とは独立している。一般的には高いＧ＋Ｃ含量を有するアドレスがより高いＴｍ値を与えた一方で、単純なＴｍ＝４（Ｇ＋Ｃ）＋２（Ａ＋Ｔ）則は多くの例において最大１０℃まで狂う。９６、４６５および４，６３３個の捕捉オリゴヌクレオチドの値が図３０、３１および３２にそれぞれ示されている。捕捉オリゴヌクレオチドプローブの４，６３３個の一覧の並び替えられたＴｍ値は図３３に示されている。Ｔｍ値の勾配は相対的に平坦であり、大部分の捕捉オリゴヌクレオチド（８０％）は両端を含む７５℃から８０℃からのＴｍ値を有する。図３４は、本発明にしたがって作製された６５、９６、４６５および４６３３個の捕捉オリゴヌクレオチドの一覧における四量体の利用度を示す。もし四量体の分布が完全に無作為であれば、各四量体は２．７％の回数で提示されるはずである。しかしながら選抜はより高いＴｍの捕捉オリゴヌクレオチドプローブの側に偏向されている。したがって、Ｔｍ値を減少させる傾向のある四量体、すなわち＃７＝ＴＡＣＡは過小提示される一方、Ｔｍ値を増加させる傾向のある四量体、すなわち＃２９＝ＴＧＣＧは過剰提示される。
【０１８６】
変異検出の本方法は３つの直交する構成要素を有する。（１）第１のＰＣＲ増幅、（２）液相ＬＤＲ検出、および（３）固相ハイブリダイゼーション捕捉。したがって、各段階からのバックグラウンドシグナルは最小化することが可能であり、結果として本方法の全体の感度および精度は、他の戦略で提供されるそれらに対して有意に増強される。例えば「ハイブリダイゼーションによる配列決定」法は、処理能力を制限する、（１）複数ラウンドのＰＣＲまたはＰＣＲ／Ｔ７転写、（２）それらを断片化または１本鎖にするためにＰＣＲ増幅産物を処理すること、および（３）長いハイブリダイゼーション時間（１０時間またはそれ以上）、を必要とする（参照として本明細書に組み入れられる、Ｇｕｏら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２２：５４５６〜５４６５（１９９４）、Ｈａｃｉａら、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ． １４４４１〜４４７（１９９６）、Ｃｈｅｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７４：６１０〜６１４（１９９６）、Ｃｒｏｎｉｎら、Ｈｕｍａｎ Ｍｕｔａｔｉｏｎ ７：２４４〜２５５（１９９６）、Ｗａｎｇら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８０：１０７７〜１０８２（１９９８）、Ｓｃｈｅｎａら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９３：１０６１４〜１０６１９（１９９６）およびＳｈａｌｏｎら、Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ． ６：６３９〜６４５（１９９６））。付加的には、これらのアレイ上の固相化プローブは広範囲のＴｍを有するので、ハイブリダイゼーションを０℃から４４℃の温度で実施する必要がある。結果として、例えば反復配列における小さな挿入および欠失に関して、ミスマッチハイブリダイゼーションおよび非特異的結合に起因するバックグラウンドノイズの増加および偽シグナルを生じる（参照として本明細書に組み入れられる、Ｈａｃｉａら、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ． １４４４１〜４４７（１９９６）、Ｃｒｏｎｉｎら、Ｈｕｍａｎ Ｍｕｔａｔｉｏｎ ７：２４４〜２５５（１９９６）、Ｗａｎｇら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８０：１０７７〜１０８２（１９９８）、およびＳｏｕｔｈｅｒｎ Ｅ．Ｍ．、Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｇｅｎｅｔ、１２：１１０〜１１５（１９９６））。対照的に本発明の方法は単一反応における多重ＰＣＲを可能にし（参照として本明細書に組み入れられる、Ｂｅｌｇｒａｄｅｒら、Ｇｅｎｏｍｅ Ｓｃｉ．Ｔｅｃｈｎｏｌ． １：７７〜８７（１９９６））、産物を１本鎖型に変換する付加的な段階を必要とせず、反復配列におけるずれを含む全ての点変異を容易に識別することが可能である（参照として本明細書に組み入れられる、Ｄａｙら、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、２９：１５２〜１６２（１９９５））。別のＤＮＡアレイは、配列の変動または試料中に存在する標的の量に起因する、異なるハイブリダイゼーション効率の影響を受ける。類似した熱力学的特性を有する拡散したアドレス配列を設計する本方法を用いることにより、ハイブリダイゼーションは６５℃で実施することが可能であり、より厳密および迅速なハイブリダイゼーションに結果としてなる。変異検出段階をハイブリダイゼーション段階から脱共役することで、すでにゲルに基づくＬＤＲ検出を用いて達成されているＬＤＲ産物の定量の目途を提供する。
【０１８７】
多量体表面にスポットされたアレイは、ガラス表面にスポットまたは直接インサイチュー合成されたアレイと比較して、シグナル捕捉において大きな改善を提供する（参照として本明細書に組み入れられる、Ｄｒｏｂｙｓｈｅｖら、Ｇｅｎｅ、１８８：４５〜５２（１９９７）、Ｙｅｒｓｈｏｖら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９４：４９１３〜４９１８（１９９６）およびＰａｒｉｎｏｖら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２４：２９９８〜３００４（１９９６））。しかしながら、本発明の多量体表面は容易に２４ｍｅｒの捕捉オリゴヌクレオチドが浸透および共有結合することを可能にする一方で、他者により記載された多量体は８から１０ｍｅｒのアドレスを使用することに制限されている。さらに６０から７５ヌクレオチド塩基長のＬＤＲ産物もまた浸透し、引き続いて正確なアドレスにハイブリダイズすることが見出された。付加的な利点として、多量体はほとんどまたは全くバックグラウンド蛍光を生じず、蛍光標識オリゴヌクレオチドの非特異的結合を示さない。最後に、別個のアドレスにスポットおよび共有結合された捕捉オリゴヌクレオチドは近接スポットに「流出（ｂｌｅｅｄ ｏｖｅｒ）」せず、例えばゲルパッドを切断することなどにより、物理的に部位を隔離する必要性を取り除く。
【０１８８】
本発明は、文献で以前に提示された他のアレイに基づく検出システムとは大きく異なる、高処理変異検出のための戦略に関連する。溶液で実施されるポリメラーゼ連鎖反応／リガーゼ検出反応（ＰＣＲ／ＬＤＲ）アッセイ法と共同して、遺伝的およびその遺伝子の配列の５０％として存在する、または散発性および野生型の配列の１％以下で存在するのいずれかであれ、本発明のアレイは一塩基変異の正確な検出を可能にする。ＬＤＲプローブの拡散した位置特定可能なアレイ特異的部分は各ＬＤＲ産物をＤＮＡアレイ上の指定されたアドレスに導く一方で、耐熱性ＤＮＡリガーゼは変異識別の特異性を提供するので、この感度が達成される。アドレス配列は一定のままで、相補体は任意のＬＤＲプローブセットに付加することができるので、本発明の位置特定可能なアレイは普遍的である。したがって、単一アレイ設計は広範囲の遺伝的変異を検出するようにプログラムされることができる。
【０１８９】
多数の遺伝子の多量の潜在的部位における迅速な変異検出の確固とした方法は、癌患者の診断および治療の改善を強く約束する。唾液、喀痰、尿および糞の脱落（ｓｈｅｄ）細胞の変異解析のための非侵襲試験は、高危険度集団のサーベランスを有意に簡便化および改善し、内視鏡検査の費用および不快さを減少させ、早期で治療可能な段階のより効果的な癌診断につながることが可能と考えられる。脱落変異の検出の実現可能性は既知および遺伝的に特性化された腫瘍を有する患者において明確に証明されたが（参照として本明細書に組み入れられる、Ｓｉｄｒａｎｓｋｙら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５６：１０２〜１０５（１９９２）、Ｎｏｌｌａｕら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ、６６：３３２〜３３６（１９９６）、Ｃａｌａｓら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、５４：３５６８〜７３（１９９４）、Ｈａｓｅｇａｗａら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ １０：１４１３〜１６（１９９５）およびＷｕら、「癌分子マーカーの早期検出（Ｅａｒｌｙ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍａｒｋｅｒ）」（Ｌｉｐｐｍａｎら編集）（１９９４））、症状が現れる前の効果的なスクリーニングは、無数の低頻度の潜在的な変異が最小の偽陽性および偽陰性シグナルで同定されることが必要となろう。さらに、腫瘍の遺伝的変化を決定する技術を、治療応答の可能性についての臨床情報と統合することは、より進行した腫瘍を有する患者を治療のためにいかに選択するかに関して、根本的に変更しうる。信頼度の高い遺伝的マーカーの同定および確認には、多くの候補遺伝子が大規模臨床試験において試験される必要がある。高費用の微細加工チップは１００，０００アドレスを有する形で作製可能であるが、それらのどれも、そのような臨床試験において変異プロファイルを正確にスコア化することひ必要とされているような低頻度の変異を同定する能力は証明されていない（参照として本明細書に組み入れられる、Ｈａｃｉａら、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ． １４４４１〜４４７（１９９６）、Ｃｈｅｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７４：６１０〜６１４（１９９６）、Ｋｏｚａｌら、Ｎａｔ．Ｍｅｄ． ２：７５３〜７５９（１９９６）および、Ｗａｎｇら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８０：１０７７〜１０８２（１９９８）。本発明の普遍的位置特定可能なアレイ法は、腫瘍進行に関連する多数の遺伝子の欠失および増幅の定量ならびに、無数の遺伝子において多数のコドンにおける低頻度変異を迅速および高信頼度で同定する能力を有する。加えて、ｍＲＮＡ発現プロファイルに関しては、ＬＤＲ普遍的アレイはＫ−、Ｎ−およびＨ−ｒａｓのような非常に類似した遺伝子を識別することを可能にする。さらに、特定の遺伝子または特定の変異タンパク質を標的とした新しい治療が開発されるにつれて、迅速および正確な高処理能力の遺伝的試験の重要性は間違いなく増加すると考えられる。
【０１９０】
実施例６：標的配列への結合を回避する位置特定可能なアレイの設計用のコンピューターソフトウェア
位置特定可能なアレイの設計において、標的配列がアレイ上の捕捉プローブにハイブリダイズしないことを保証することが重要である。以下に記載されているように、コンピュータープログラムがこの目的のために設計された。プログラムは、任意のアレイ配列に一致する一続きの配列をＮ個の隣接ヌクレオチド部位のＮ−ｘ個に位置させる。パラメーターｘおよびＮは使用者により設定される。
【０１９１】
プログラムは出力をスクリーンおよびファイルに送達する。スクリーン出力は、最長の一致がＭ塩基のうちのｉである、ＭがＮよりも大きいまたは等しい、かつ、ｉがＭ−ｘよりも大きいまたは等しい、配列比較の数を要約している。出力ファイルは、スクリーンに提供された情報の概要を与えることならびに各配列セットの実際の一致を示す。ファイル出力の例は以下に示される。
2004526402.tif 000022
大文字の対立遺伝子が実際に一致した部位を表し、小文字の対立遺伝子が許容されるミスマッチを示しており、括弧内の領域は同定された最長の一致を表す。
【０１９２】
プログラムはプラットフォーム間の可搬性を目的として、ＡＮＳＩ Ｃにて記載されている。使用された正確なソフトウェアは図３５に記載されている。プログラムは一直線のテキスト形式の入力ファイルを受け入れる。配列は標準的な不明瞭コード（例えば、コードＹはＣまたはＴのいずれかに相当する）を含んでもよい。
【０１９３】
入力ファイル＃１のＦ１配列の各々は入力ファイル＃２のＦ２配列の各々と比較され、全体でＦ１×Ｆ２比較となる。各セットに関して、２つの配列が全ての可能性のある配置に関して一時にＮ個の連続した部位で比較される。Ｎ個の隣接部位のうち少なくともＮ−ｘ個の一致が検出されるならば、比較される部位は１ずつ増加される（すなわち、ｉ増加の後、一致基準はＮ＋ｉ部位のうちＮ−ｘ＋ｉとなる）。この処理は、一致基準を満たす一致が見出されなくなるまで繰り返される。配列対の最長一致は、Ｎ−ｘ＋ｉの最長値に対立するものとして、Ｎ＋ｉの最長値を含む一致として定義される。したがって、使用者は、異なるレベルの厳密度を有する全ての解析を明らかに繰り返すべきである（すなわち、ｘ＝０、ｘ＝１、ｘ＝２．．．．）。もし使用者が、完全な、または完全に近い一致がより長い範囲に渡るより低い完成度の一致によりマスキングされてしまうかもしれないとの懸念を有している場合に、これは重要である。例えば、７一致部位中の７個は、（１）１セットの配列が１０部位中８で一致している、および（２）一致基準が２つのミスマッチを許容する、ならば報告されないと考えられる。
【０１９４】
発明は例示の目的で詳細に記載されているが、そのような詳細は単にその目的のためだけであること、および、添付の特許請求の範囲のみにより定義される発明の精神および範囲を逸脱することなく当業者により変更可能であることが、理解される。
【図面の簡単な説明】
【図１】先行技術および本発明のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）／リガーゼ検出反応（ＬＤＲ）の各過程を示す流れ図であり、点変異などの生殖系列上の変異の検出に関するものである。
【図２】先行技術および本発明のＰＣＲ／ＬＤＲ過程を示す流れ図であり、癌に関連した変異の検出に関するものである。
【図３】同一遺伝子の２種の多型（すなわち対立遺伝子の差）におけるホモ接合体またはへテロ接合体の検出を目的とした、対立遺伝子特異的なプローブ上のアドレスを用いる本発明のＰＣＲ／ＬＤＲ過程を示す略図である。
【図４】同一遺伝子上の２種の多型（すなわち対立遺伝子の差）におけるホモ接合体またはへテロ接合体の検出を目的とした、共通プローブ上のアドレスを用いる本発明のＰＣＲ／ＬＤＲ過程を示す略図である。
【図５】所与の部位において可能なすべての塩基を識別する対立遺伝子特異的なプローブ上のアドレスを用いる、本発明のＰＣＲ／ＬＤＲ過程を示す略図である。
【図６】任意の部位において生じうるすべての塩基を識別する共通プローブ上のアドレスを用いる本発明のＰＣＲ／ＬＤＲ過程を示す略図である。
【図７】近傍の２か所の部位に存在しうる任意の塩基の有無の検出を目的として、対立遺伝子特異的なプローブ上のアドレスを用いる本発明のＰＣＲ／ＬＤＲ過程を示す略図である。
【図８】近傍の２か所の部位に存在しうる任意の塩基の有無の検出を目的として、共通プローブ上のアドレスを用いる本発明のＰＣＲ／ＬＤＲ過程を示す略図である。
【図９】挿入および欠失を識別する対立遺伝子特異的なプローブ上のアドレスを用いる本発明のＰＣＲ／ＬＤＲ過程を示す略図である。
【図１０】挿入および欠失を識別する共通プローブ上のアドレスを用いる本発明のＰＣＲ／ＬＤＲ過程を示す略図である。
【図１１】正常配列が大半を占める中で、数度が低い変異（コドン内）を検出するために対立遺伝子特異的なプローブ上のアドレスを用いる本発明のＰＣＲ／ＬＤＲ過程を示す略図である。
【図１２】正常配列が大半を占める中で、数度が低い変異（コドン内）を検出するために共通プローブ上のアドレスを用いる本発明のＰＣＲ／ＬＤＲ過程を示す略図である。
【図１３】アドレスが共通プローブ上に位置し、かつ対立遺伝子の差が異なる蛍光シグナルＦ１、Ｆ２、Ｆ３、およびＦ４により識別される、本発明のＰＣＲ／ＬＤＲ過程を示す略図である。
【図１４】隣接する対立遺伝子および近接する対立遺伝子の両方を検出する、本発明のＰＣＲ／ＬＤＲ過程を示す略図である。
【図１５】ひとつのコドンに対して可能な全ての一塩基変異を検出する、本発明のＰＣＲ／ＬＤＲ過程を示す略図である。
【図１６Ａから図１６Ｐ】ｐ５３チップハイブリダイゼーションおよび洗浄の条件を示す。
【図１７】オリゴヌクレオチドプローブの捕獲に関する別のフォーマットを示す。図１７Ｂでは、位置特定可能なアレイに特異的な部分が、対立遺伝子特異的なプローブ上にある。各対立遺伝子は、それぞれアドレスＺ１およびＺ２上の蛍光シグナルの捕獲により識別される。図１７Ｃでは、位置特定可能なアレイに特異的な部分は共通プローブ上にあり、各対立遺伝子は各２本の対立遺伝子に対応する蛍光シグナルＦ１およびＦ２の捕獲により識別される。
【図１８】共有結合修飾、グラフト、固体支持体へのオリゴマー接着のための化学反応を示す。
【図１９】一連の固有の２４ｍｅｒを作製するために使用されることができる、少なくとも２塩基異なる３６個の四量体を用いた本発明にしたがった設計を示す。
【図２０】ＢＲＣＡ１およびＢＲＣＡ２の変異を検出するためのＰＣＲ／ＰＣＲ／ＬＤＲ法の概要を示す。
【図２１】ゲルに基づくアッセイ法におけるＢＲＣＡ１およびＢＲＣＡ２の３つの特定の変異を検出するための多重ＬＤＲ検出を示す。
【図２２】普遍的ＤＮＡマイクロアレイを用いたＢＲＣＡ１およびＢＲＣＡ２の３つの特定の変異を検出するための多重ＬＤＲ検出の概要を示す。
【図２３】位置特定可能な普遍的マイクロアレイ上のＢＲＣＡ１およびＢＲＣＡ２の３つの特定の変異を検出するためのＬＤＲ検出を示す。
【図２４】大腸腫瘍由来のＤＮＡにおける変異の存在を示すｐ５３チップハイブリダイゼーションを示す。
【図２５Ａから図２５ＭＭＭＭ】本発明にしたがって作製された４６３３個の捕捉オリゴヌクレオチドの一覧を示す。
【図２６Ａから図２６Ｊ】本発明にしたがって作製された４６５個の捕捉オリゴヌクレオチドの一覧を示す。
【図２７Ａおよび図２７Ｂ】本発明にしたがって作製された９６個の捕捉オリゴヌクレオチドの一覧を示す。
【図２８Ａおよび図２８Ｂ】本発明にしたがって作製された６５個の捕捉オリゴヌクレオチドの一覧を示す。
【図２９Ａから図２９ＳＳＳＳ】本発明にしたがって作製された４６３３個の捕捉オリゴヌクレオチド（２０ｍｅｒＰＮＡの形で）の一覧を示す。
【図３０】本発明にしたがって作製された９６個の捕捉オリゴヌクレオチドの一覧に対する融点（すなわちＴｍ）の分布を示す。
【図３１】本発明にしたがって作製された４６５個の捕捉オリゴヌクレオチドの一覧に対する融点（すなわちＴｍ）の分布を示す。
【図３２】本発明にしたがって作製された４６３３個の捕捉オリゴヌクレオチドの一覧に対する融点（すなわちＴｍ）の分布を示す。
【図３３】本発明にしたがって作製された４６３３個の捕捉オリゴヌクレオチドの一覧に対する融点（すなわちＴｍ）の並び替えられた分布を示す。
【図３４】本発明にしたがって作製された６５、９６、４６５および４６３３個の捕捉オリゴヌクレオチドの一覧における四量体使用度を示す。
【図３５Ａから図３５Ｒ】アレイ捕捉プローブが標的配列にハイブリダイズしないように設計されることを確実にするための、標的配列をアレイ捕捉プローブと比較するコンピュータープログラムを記載する。
【図３６】位置特定可能な普遍的マイクロアレイにおける７個の特定のＫ−ｒａｓ変異のＬＤＲ検出を示す。
【図１】
2004526402.tif 000023
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
2004526402.tif 000030
【図９】
2004526402.tif 000031
【図１０】
2004526402.tif 000032
【図１１】
2004526402.tif 000033
【図１２】
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【図１３】
2004526402.tif 000035
【図１４】
2004526402.tif 000036
【図１５】
2004526402.tif 000037
【図１６Ａ】
2004526402.tif 000038
【図１６Ｂ】
2004526402.tif 000039
【図１６Ｃ】
2004526402.tif 000040
【図１６Ｄ】
2004526402.tif 000041
【図１６Ｅ】
2004526402.tif 000042
【図１６Ｆ】
2004526402.tif 000043
【図１６Ｇ】
2004526402.tif 000044
【図１６Ｈ】
2004526402.tif 000045
【図１６Ｉ】
2004526402.tif 000046
【図１６Ｊ】
2004526402.tif 000047
【図１６Ｋ】
2004526402.tif 000048
【図１６Ｌ】
2004526402.tif 000049
【図１６Ｍ】
2004526402.tif 000050
【図１６Ｎ】
2004526402.tif 000051
【図１６Ｏ】
2004526402.tif 000052
【図１６Ｐ】
2004526402.tif 000053
【図１７】
2004526402.tif 000054
【図１８】
2004526402.tif 000055
【図１９】
2004526402.tif 000056
【図２０】
2004526402.tif 000057
【図２１】
2004526402.tif 000058
【図２２】
2004526402.tif 000059
【図２３】
2004526402.tif 000060
【図２４】
2004526402.tif 000061
【図２５Ａ】
2004526402.tif 000062
【図２５Ｂ】
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【図２５Ｃ】
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【図２５Ｄ】
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【図２５Ｅ】
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【図２５Ｆ】
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【図２５Ｇ】
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【図２５Ｈ】
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【図２５Ｉ】
2004526402.tif 000070
【図２５Ｊ】
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【図２５Ｋ】
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【図２５Ｌ】
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【図２５Ｍ】
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【図２５Ｎ】
2004526402.tif 000075
【図２５Ｏ】
2004526402.tif 000076
【図２５Ｐ】
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【図２５Ｑ】
2004526402.tif 000078
【図２５Ｒ】
2004526402.tif 000079
【図２５Ｓ】
2004526402.tif 000080
【図２５Ｔ】
2004526402.tif 000081
【図２５Ｕ】
2004526402.tif 000082
【図２５Ｖ】
2004526402.tif 000083
【図２５Ｗ】
2004526402.tif 000084
【図２５Ｘ】
2004526402.tif 000085
【図２５Ｙ】
2004526402.tif 000086
【図２５Ｚ】
2004526402.tif 000087
【図２５ＡＡ】
2004526402.tif 000088
【図２５ＢＢ】
2004526402.tif 000089
【図２５ＣＣ】
2004526402.tif 000090
【図２５ＤＤ】
2004526402.tif 000091
【図２５ＥＥ】
2004526402.tif 000092
【図２５ＦＦ】
2004526402.tif 000093
【図２５ＧＧ】
2004526402.tif 000094
【図２５ＨＨ】
2004526402.tif 000095
【図２５ＩＩ】
2004526402.tif 000096
【図２５ＪＪ】
2004526402.tif 000097
【図２５ＫＫ】
2004526402.tif 000098
【図２５ＬＬ】
2004526402.tif 000099
【図２５ＭＭ】
2004526402.tif 000100
【図２５ＮＮ】
2004526402.tif 000101
【図２５ＯＯ】
2004526402.tif 000102
【図２５ＰＰ】
2004526402.tif 000103
【図２５ＱＱ】
2004526402.tif 000104
【図２５ＲＲ】
2004526402.tif 000105
【図２５ＳＳ】
2004526402.tif 000106
【図２５ＴＴ】
2004526402.tif 000107
【図２５ＵＵ】
2004526402.tif 000108
【図２５ＶＶ】
2004526402.tif 000109
【図２５ＷＷ】
2004526402.tif 000110
【図２５ＸＸ】
2004526402.tif 000111
【図２５ＹＹ】
2004526402.tif 000112
【図２５ＺＺ】
2004526402.tif 000113
【図２５ＡＡＡ】
2004526402.tif 000114
【図２５ＢＢＢ】
2004526402.tif 000115
【図２５ＣＣＣ】
2004526402.tif 000116
【図２５ＤＤＤ】
2004526402.tif 000117
【図２５ＥＥＥ】
2004526402.tif 000118
【図２５ＦＦＦ】
2004526402.tif 000119
【図２５ＧＧＧ】
2004526402.tif 000120
【図２５ＨＨＨ】
2004526402.tif 000121
【図２５ＩＩＩ】
2004526402.tif 000122
【図２５ＪＪＪ】
2004526402.tif 000123
【図２５ＫＫＫ】
2004526402.tif 000124
【図２５ＬＬＬ】
2004526402.tif 000125
【図２５ＭＭＭ】
2004526402.tif 000126
【図２５ＮＮＮ】
2004526402.tif 000127
【図２５ＯＯＯ】
2004526402.tif 000128
【図２５ＰＰＰ】
2004526402.tif 000129
【図２５ＱＱＱ】
2004526402.tif 000130
【図２５ＲＲＲ】
2004526402.tif 000131
【図２５ＳＳＳ】
2004526402.tif 000132
【図２５ＴＴＴ】
2004526402.tif 000133
【図２５ＵＵＵ】
2004526402.tif 000134
【図２５ＶＶＶ】
2004526402.tif 000135
【図２５ＷＷＷ】
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【図２５ＸＸＸ】
2004526402.tif 000137
【図２５ＹＹＹ】
2004526402.tif 000138
【図２５ＺＺＺ】
2004526402.tif 000139
【図２５ＡＡＡＡ】
2004526402.tif 000140
【図２５ＢＢＢＢ】
2004526402.tif 000141
【図２５ＣＣＣＣ】
2004526402.tif 000142
【図２５ＤＤＤＤ】
2004526402.tif 000143
【図２５ＥＥＥＥ】
2004526402.tif 000144
【図２５ＦＦＦＦ】
2004526402.tif 000145
【図２５ＧＧＧＧ】
2004526402.tif 000146
【図２５ＨＨＨＨ】
2004526402.tif 000147
【図２５ＩＩＩＩ】
2004526402.tif 000148
【図２５ＪＪＪＪ】
2004526402.tif 000149
【図２５ＫＫＫＫ】
2004526402.tif 000150
【図２５ＬＬＬＬ】
2004526402.tif 000151
【図２５ＭＭＭＭ】
2004526402.tif 000152
【図２６Ａ】
2004526402.tif 000153
【図２６Ｂ】
2004526402.tif 000154
【図２６Ｃ】
2004526402.tif 000155
【図２６Ｄ】
2004526402.tif 000156
【図２６Ｅ】
2004526402.tif 000157
【図２６Ｆ】
2004526402.tif 000158
【図２６Ｇ】
2004526402.tif 000159
【図２６Ｈ】
2004526402.tif 000160
【図２６Ｉ】
2004526402.tif 000161
【図２６Ｊ】
2004526402.tif 000162
【図２７Ａ】
2004526402.tif 000163
【図２７Ｂ】
2004526402.tif 000164
【図２８Ａ】
2004526402.tif 000165
【図２８Ｂ】
2004526402.tif 000166
【図２９Ａ】
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【図２９Ｂ】
2004526402.tif 000168
【図２９Ｃ】
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【図２９Ｄ】
2004526402.tif 000170
【図２９Ｅ】
2004526402.tif 000171
【図２９Ｆ】
2004526402.tif 000172
【図２９Ｇ】
2004526402.tif 000173
【図２９Ｈ】
2004526402.tif 000174
【図２９Ｉ】
2004526402.tif 000175
【図２９Ｊ】
2004526402.tif 000176
【図２９Ｋ】
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【図２９Ｌ】
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【図２９Ｍ】
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【図２９Ｎ】
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【図２９Ｏ】
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【図２９Ｐ】
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【図２９Ｑ】
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【図２９Ｒ】
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【図２９Ｓ】
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【図２９Ｔ】
2004526402.tif 000186
【図２９Ｕ】
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【図２９Ｖ】
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【図２９Ｗ】
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【図２９Ｘ】
2004526402.tif 000190
【図２９Ｙ】
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【図２９Ｚ】
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【図２９ＡＡ】
2004526402.tif 000193
【図２９ＢＢ】
2004526402.tif 000194
【図２９ＣＣ】
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【図２９ＤＤ】
2004526402.tif 000196
【図２９ＥＥ】
2004526402.tif 000197
【図２９ＦＦ】
2004526402.tif 000198
【図２９ＧＧ】
2004526402.tif 000199
【図２９ＨＨ】
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【図２９ＩＩ】
2004526402.tif 000201
【図２９ＪＪ】
2004526402.tif 000202
【図２９ＫＫ】
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【図２９ＬＬ】
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【図２９ＭＭ】
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【図２９ＮＮ】
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【図２９ＯＯ】
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【図２９ＰＰ】
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【図２９ＱＱ】
2004526402.tif 000209
【図２９ＲＲ】
2004526402.tif 000210
【図２９ＳＳ】
2004526402.tif 000211
【図２９ＴＴ】
2004526402.tif 000212
【図２９ＵＵ】
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【図２９ＶＶ】
2004526402.tif 000214
【図２９ＷＷ】
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【図２９ＸＸ】
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【図２９ＹＹ】
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【図２９ＺＺ】
2004526402.tif 000218
【図２９ＡＡＡ】
2004526402.tif 000219
【図２９ＢＢＢ】
2004526402.tif 000220
【図２９ＣＣＣ】
2004526402.tif 000221
【図２９ＤＤＤ】
2004526402.tif 000222
【図２９ＥＥＥ】
2004526402.tif 000223
【図２９ＦＦＦ】
2004526402.tif 000224
【図２９ＧＧＧ】
2004526402.tif 000225
【図２９ＨＨＨ】
2004526402.tif 000226
【図２９ＩＩＩ】
2004526402.tif 000227
【図２９ＪＪＪ】
2004526402.tif 000228
【図２９ＫＫＫ】
2004526402.tif 000229
【図２９ＬＬＬ】
2004526402.tif 000230
【図２９ＭＭＭ】
2004526402.tif 000231
【図２９ＮＮＮ】
2004526402.tif 000232
【図２９ＯＯＯ】
2004526402.tif 000233
【図２９ＰＰＰ】
2004526402.tif 000234
【図２９ＱＱＱ】
2004526402.tif 000235
【図２９ＲＲＲ】
2004526402.tif 000236
【図２９ＳＳＳ】
2004526402.tif 000237
【図２９ＴＴＴ】
2004526402.tif 000238
【図２９ＵＵＵ】
2004526402.tif 000239
【図２９ＶＶＶ】
2004526402.tif 000240
【図２９ＷＷＷ】
2004526402.tif 000241
【図２９ＸＸＸ】
2004526402.tif 000242
【図２９ＹＹＹ】
2004526402.tif 000243
【図２９ＺＺＺ】
2004526402.tif 000244
【図２９ＡＡＡＡ】
2004526402.tif 000245
【図２９ＢＢＢＢ】
2004526402.tif 000246
【図２９ＣＣＣＣ】
2004526402.tif 000247
【図２９ＤＤＤＤ】
2004526402.tif 000248
【図２９ＥＥＥＥ】
2004526402.tif 000249
【図２９ＦＦＦＦ】
2004526402.tif 000250
【図２９ＧＧＧＧ】
2004526402.tif 000251
【図２９ＨＨＨＨ】
2004526402.tif 000252
【図２９ＩＩＩＩ】
2004526402.tif 000253
【図２９ＪＪＪＪ】
2004526402.tif 000254
【図２９ＫＫＫＫ】
2004526402.tif 000255
【図２９ＬＬＬＬ】
2004526402.tif 000256
【図２９ＭＭＭＭ】
2004526402.tif 000257
【図２９ＮＮＮＮ】
2004526402.tif 000258
【図２９ＯＯＯＯ】
2004526402.tif 000259
【図２９ＰＰＰＰ】
2004526402.tif 000260
【図２９ＱＱＱＱ】
2004526402.tif 000261
【図２９ＲＲＲＲ】
2004526402.tif 000262
【図２９ＳＳＳＳ】
2004526402.tif 000263
【図３０】
2004526402.tif 000264
【図３１】
2004526402.tif 000265
【図３２】
2004526402.tif 000266
【図３３】
2004526402.tif 000267
【図３４】
2004526402.tif 000268
【図３５Ａ】
2004526402.tif 000269
【図３５Ｂ】
2004526402.tif 000270
【図３５Ｃ】
2004526402.tif 000271
【図３５Ｄ】
2004526402.tif 000272
【図３５Ｅ】
2004526402.tif 000273
【図３５Ｆ】
2004526402.tif 000274
【図３５Ｇ】
2004526402.tif 000275
【図３５Ｈ】
2004526402.tif 000276
【図３５Ｉ】
2004526402.tif 000277
【図３５Ｊ】
2004526402.tif 000278
【図３５Ｋ】
2004526402.tif 000279
【図３５Ｌ】
2004526402.tif 000280
【図３５Ｍ】
2004526402.tif 000281
【図３５Ｎ】
2004526402.tif 000282
【図３５Ｏ】
2004526402.tif 000283
【図３５Ｐ】
2004526402.tif 000284
【図３５Ｑ】
2004526402.tif 000285
【図３５Ｒ】
2004526402.tif 000286
【図３６】
2004526402.tif 000287
【国際公開パンフレット】
2004526402.tif 000288
2004526402.tif 000289
2004526402.tif 000290
2004526402.tif 000291
2004526402.tif 000292
2004526402.tif 000293
2004526402.tif 000294
2004526402.tif 000295
2004526402.tif 000296
2004526402.tif 000297
2004526402.tif 000298
2004526402.tif 000299
2004526402.tif 000300
2004526402.tif 000301
2004526402.tif 000302
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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