(57)【要約】本発明は、核酸配列中の多型性の同定のために使用できるオリゴヌクレオチドプローブを開示する。該プローブは、オリゴヌクレオチドの３’末端のアリル特異的塩基および、プローブの３’末端から４ヌクレオチドまでの位置に追加的な意図的なミスマッチ塩基を含む。このオリゴヌクレオチドは特に、アリル間の識別の特異性を増加させることによって、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）において有用である。
2004524833.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的核酸配列にハイブリダイズできる一本鎖オリゴヌクレオチドプローブであって、
ａ）該標的核酸配列にハイブリダイズする、当該オリゴヌクレオチドの５’末端の領域、
ｂ）当該オリゴヌクレオチドが該標的核酸配列にハイブリダイズするときに、当該オリゴヌクレオチドの３’末端と５’末端の間の１０ヌクレオチドまでのギャップを生ずる該標的核酸配列の隣接領域にハイブリダイズする、当該オリゴヌクレオチドの３’末端の領域、
ｃ）当該オリゴヌクレオチドの３’末端のアリル特異的塩基、
ｄ）当該オリゴヌクレオチドの３’末端から４ヌクレオチドまでの位置に位置する、該標的核酸に対する意図的な塩基ミスマッチ、
ｅ）該オリゴヌクレオチドの５’末端のリン酸基
を含むプローブ。
【請求項２】
標的核酸配列中の特異的部位の塩基の同一性を決定する方法であって、
ａ）標的核酸と請求項１のプローブとをインキュベートし、該オリゴヌクレオチドの３’末端と５’末端の間の１０ヌクレオチドまでのギャップを生じさせる工程、
ｂ）工程ａ）の生成物と、ＤＮＡポリメラーゼおよび、工程ａ）のギャップを充填することのできるヌクレオチド組成物とをインキュベートする工程、
ｃ）工程ｂ）の生成物を、ＤＮＡリガーゼでライゲートさせる工程、
ｄ）工程ｃ）のライゲーション生成物を検出する工程、
を含む方法。
【請求項３】
工程ａ）のギャップを充填できる、ＤＮＡポリメラーゼおよびヌクレオチド組成物が、該ギャップを超える合成を可能としない、請求項２の方法。
【請求項４】
ローリングサークル増幅による、工程ｃ）のライゲーション生成物の検出をさらに含む、請求項２または３の方法。
【請求項５】
標的核酸へハイブリダイズしたときのオリゴヌクレオチドの３’末端と５’末端の間のギャップが１塩基である、請求項２ないし４のいずれかの方法。
【請求項６】
工程ｂ）のヌクレオチド組成物が、ＤＮＡリガーゼによってライゲートされることの可能なターミネーターヌクレオチドを含む、請求項２ないし４のいずれかの方法。
【請求項７】
該ターミネーターヌクレオチドが３’ＮＨ２−ｄＮＴＰである、請求項６の方法。
【請求項８】
該リガーゼがＤＮＡリガーゼまたはＲＮＡリガーゼである、請求項２の方法。
【請求項９】
ライゲーションが非酵素的であるか、または化学的に誘導される、請求項２の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明は、核酸分析の領域および特に核酸配列の相違の分析に関する。
【０００２】
背景
多型性特に単一ヌクレオチド多型性（ＳＮＰ）についてゲノムまたはＤＮＡのフラグメントを試験するための要求は、ますます多くの疾患関連性遺伝子の発見で急速に増加した。現代、かかる時間および使用される試薬の両方における配列決定のコストは、ゲノムスクリーニングでの使用について酷く高い。ゲノムスクリーニングは、可能性のある多くの突然変異、およびこれらの突然変異の疾患への多様な関連性のため非常に複雑な仕事である。核酸配列中の相違を分析するための早くかつコスト効率的なシステムが、診断および研究目的ために要求される包括的ゲノムスクリーンニングのため不可欠である。
【０００３】
多くの方法が記載され、核酸検出に基づくきわめて高感度の診断アッセイを可能とする。その多くは、標的またはプローブ配列の指数関数的増幅を使用する。これらは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、自己持続性配列複製（３ＳＲ）、核酸配列に基づく増幅（ＮＡＳＢＡ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、およびローリングサークル増幅（ｒｏｌｌｉｎｇ ｃｉｒｃｌｅ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ、ＲＣＡ）ＷＯ９７／１９１９３を含む。
【０００４】
ＲＣＡに基づく増幅法は、ＤＮＡライゲーション、環状ＤＮＡからのシグナル増幅、および検出工程に関係する。ＤＮＡライゲーション操作は、特別に設計された核酸プローブ分子を環形成させる。この工程は、プローブの、標的配列へのハイブリダイゼーションに依存し、そしてサンプル中に存在する標的配列の量に比例する環状プローブ分子の形成という結果となる。増幅操作は、環形成したプローブのローリングサークル複製によって起こる。これは、単一のプライマーおよびＤＮＡポリメラーゼを介して仲介され、これらは前進して鎖を置換し、環形成プローブ配列を多量に増幅し得るという結果となる。所望により、追加的増幅操作を、ローリングサークル複製の一本鎖ＤＮＡ生成物に基づき実行することができる。超分枝または指数関数的ＲＣＡ［ＥＲＣＡ］は、追加的オリゴヌクレオチドプライマーを使用して当初の（ｐｒｉｍａｒｙ）増幅生成物を複製する基本的ＲＣＡ反応の延長である。これは、分枝二本鎖ＤＮＡ生成物の指数関数的増加を指向し、そして増幅の超えられないレベルである、１０９倍を超える増幅を指向する。Ｌｉｚｚａｒｄｉ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ， Ｖｏｌｕｍｅ １９， Ｊｕｌｙ １９９８， ｐｐ２２５−２３２。
【０００５】
ＲＣＡに続いて、増幅したプローブ配列を検出し、そして核酸のための任意の慣行的検出系、例えば蛍光標識の検出、酵素連結検出系、抗体仲介標識検出、および放射性標識の検出および電気化学的検出を使用して定量することができる。
【０００６】
核酸に基づくアッセイの存率は、ほんの数分子の標的で提示されるとき、その正確さおよび迫力できまる。すべての前記増幅方法は、約１０−１００標的分子の実際的検出限界である、良好な感受性を供する。使用される方法に関係なく、該方法が高度に特異的であることは重要であり、なぜなら標的配列の増幅は、信頼性を限定する可能性があり得るからである。例えばそれぞれのＲＣＡ反応は、非特異的または余分なバックグラウンドシグナルを急速に生成および増幅することができる。
【０００７】
現行のＲＣＡアッセイの特異性は、リガーゼの忠実性およびハイブリダイゼーションの正確性に依存する。３’ミスマッチのライゲーションからのエラー率は、使用されるリガーゼ、ミスマッチに関係する塩基、およびミスマッチ周辺の配列コンテクストで変化し、Ｌｕｏ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， １９９６， Ｖｏｌｕｍｅ ２４， ｎｏ． １４， ｐｐ３０７１−３０７８、Ｈｏｕｓｂｙ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， １９９８， Ｖｏｌｕｍｅ ２６， ｐｐ４２５９−４２６そしてある場合には顕著である。これはＲＣＡ増幅の感受性と結びついて反応およびそれゆえ任意の関連するアッセイの特異性に影響する。
【０００８】
本発明はミスマッチ識別を改良することによってＲＣＡアッセイの特異性を改良する手段を提供する。
【０００９】
本発明の第一の目的は、特にプロセスのライゲーション工程のエラーのための、非特異的バックグラウンドシグナルを減少または排除することによって、ＲＣＡに基づく核酸増幅の感度および特異性を改良することである。
【００１０】
本発明は、ミス−ライゲーション事象に対する強力な選択として２種の異なる酵素のミスマッチ識別特性を利用する。本発明は、そのようなアッセイの忠実性を改良するために使用することができる新規プローブを提供し、該プローブはハイブリダイズしたときに、ミスマッチを含み、そしてギャップを残すように設計されている。該アッセイの忠実性をさらに改良するためのヌクレオチドアナログの使用をなすことができる。
【００１１】
図面の説明
図１は、ＲＣＡアッセイのハイブリダイゼーションおよびライゲーション工程の原理を示す。Ｂａｎｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， １９９８， Ｖｏｌｕｍｅ ２６， Ｎｏ．２２， ｐｐ５０７３−５０７８。
【００１２】
図２は、指数関数的ＲＣＡ（ＥＲＣＡ）反応の原理を示す。
図３は、３’アミノｄＴＴＰの構造である。
図４は、アッセイの概略図である。
この例は、Ａ／Ｇ多型性をスコアー化するように設計されたプローブの対の１つについてのプロセスを概説する。「Ａ」プローブ反応スキームを描く。
【００１３】
発明の詳細な記載
図１は、ＲＣＡアッセイのハイブリダイゼーションおよびライゲーション工程の原理を示す。一本鎖オリゴヌクレオチドプローブは、標的核酸配列とハイブリダイズする。標的核酸配列は、必要であれば一本鎖を作成することができる。プローブの３’および５’の両方の末端のいくつかの塩基は、標的核酸配列の隣接領域にハイブリダイズする。該プローブの３’末端の実際の塩基は、調査されるＳＮＰに特異的である。正確な塩基が３’末端に存在するならば、そのときハイブリダイズしたプローブの３’および５’末端は、ＤＮＡリガーゼによって容易にライゲートすることができる。正確な塩基は、標的核酸配列中の多型性塩基に相補的である。正確な塩基がプローブの３’末端に存在しないならば、そのときハイブリダイズしたプローブの３’および５’末端のライゲーションは、もし３’塩基が多型性塩基に相補的であるばあいよりも、ずっとより効率的でない。ハイブリダイズしたライゲートした３’および５’末端の間の領域は、開環状構造を形成し、これはＲＣＡによって後に増幅されることができる。しかし、不充分なミスマッチライゲーションもなお、小量の環状増幅可能材料を生成することができ、その結果これらの場合でもなお、たとえ不正確な塩基がＳＮＰ部位に存在するとしても、増幅は起こることができる。
【００１４】
この発明は、前記で概説したような現行のＲＣＡおよびＥＲＣＡ法の固有の問題、特にライゲーション工程での問題と取り組む。本発明は、オリゴヌクレオチドプローブの３’末端のいくつかの塩基内に含まれる意図的なミスマッチ塩基の使用、およびその次の反応の間の、これが有する、２種の異なる酵素（ＤＮＡポリメラーゼおよびＤＮＡリガーゼ）に及ぼす影響に関係する。これはミスライゲーション事象に対する強い選択を提供する。ヌクレオチドアナログの、使用はまた、該アッセイの忠実性をさらに改良することができる。
【００１５】
第一側面にしたがって、本発明は新規プローブを提供する。ＲＣＡ反応で使用されてきた標準的プローブについてのように、本発明に従うプローブの３’末端塩基は、興味の持たれるＳＮＰに特異的である。これは重要な特徴であり、それは本発明にしたがうプローブに、プローブ骨格に標的化される包括的ＥＲＣＡプライマーと組み合わせて使用することを可能とするからである。１の好ましい実施態様では、本発明のプローブは、３’末端から２、３または４塩基に位置する意図的なミスマッチの塩基を含む。これは、ＤＮＡポリメラーゼによる、次のプライマー伸長反応の特異性を増加させる。このミスマッチの位置および性質は、文献で利用可能な情報および当業者に既知の情報を使用して最大識別のために最適化できる。
【００１６】
本発明の第一側面の代替的実施態様は、標的配列にハイブリダイズしたとき、プローブの５’および３’末端（すなわち、プローブの２座の特異的なアーム）の間にギャップがある、そのようなプローブを提供する。このギャップは、それが、該プローブの３’および５’アームが、二重らせんを安定化するスタッキング相互作用なく独立的にハイブリダイズすることを可能とする点で重要である。このギャップは、好適には１ないし１０塩基長である。２、３または４塩基のギャップは、特に好適であり、そして単一塩基ギャップが好ましい。簡便な、ギャップのないプローブは、該２つの腕は互いに密着し、そしてこれらは、まるでこれらが共有結合し非常に安定な二重らせんを生じるように振るまい、たとえ該３’塩基がミスマッチであるとしてもである。これは先行技術のプローブのミスライゲーション事象の尤度を増加させる。該プローブ５’末端は、５’リン酸を有して合成される。
【００１７】
特に好ましい実施態様では、本発明は、３’末端から幾つかの塩基の位置に意図的なミスマッチを含み、かつ、標的配列にハイブリダイズしたとき、少なくとも１ヌクレオチドの、５’および３’末端の間にギャップが存在するように設計されている、プローブを提供する。
【００１８】
第二側面では、本発明は、ＲＣＡまたはＥＲＣＡアッセイにおいて本発明に従うプローブを使用することによって、標的核酸中の特異的部位の塩基の同一性を決定する方法を提供する。ここでプローブがギャップを有する実施態様では、標的配列へのハイブリダイゼーション後に、プローブの３’および５’末端の間のギャップが次いで、ＤＮＡポリメラーゼ活性によって充填される。該ギャップ中の塩基（複数含む）の同一性は知られ、そしてそのため、正確な塩基がＳＮＰ部位に存在するとき、プローブの５’末端を超える合成またはプローブの５’末端の置換を防止する態様で、合成を実行することができる。これは、いくつかのやりかたで達成でき、そして図３に例示する。ギャップが単一ヌクレオチドであるときの好ましい実施態様では、該ギャップを、プローブの３’末端にとりこまれるときさらなるＤＮＡポリメラーゼ活性のためのターミネーターとして作用するヌクレオチドで充填する。プローブにとりこまれるときのこのターミネーターの不可欠の特徴は、それがＤＮＡリガーゼによってプローブの５’末端にライゲートとされることの可能なことである。好適なライゲート可能ターミネーターは３’アミノｄＮＴＰである。該３’アミノ基は、ＤＮＡリガーゼのための基質であるが（米国特許５５９３８２６）、しかしＤＮＡポリメラーゼのためのターミネーターとして作用する。したがって、１より多いヌクレオチドをプローブの３’末端に付加することは可能ではない。
【００１９】
もし正確なヌクレオチドがＳＮＰの部位のプローブ中に存在するならば、系にわずか一塩基のミスマッチ（−１ないし−４位に、ここに意図的なミスマッチが位置した）が存在し、そして該ＤＮＡポリメラーゼは効率的に次の塩基を取り込み、ギャップ、すなわちターミネーターヌクレオチドを充填する。もし不正確なヌクレオチドがＳＮＰの部位のプローブに存在するならば、系中に２塩基ミスマッチが存在する（そのＳＮＰ部位に、および前記―１ないし−４位に）。プローブの３’末端に非常に近い２つのミスマッチの存在は、ＤＮＡポリメラーゼ活性を有意に阻害し、そしてゆえに、そのギャップがターミネーターヌクレオチドで充填されるのはずっと減少された程度になる。
【００２０】
ＤＮＡポリメラーゼ反応の生成物を次いで、ＤＮＡリガーゼで処理し、そして任意のミスマッチの影響を大きく増強する。２つミスマッチ（すなわち、ミスマッチＳＮＰおよび意図的なミスマッチ）が存在するときに、ギャップ充填された生成物のレベルは減少し、なおも存在するものは、プローブの３’末端に近い２つのミスマッチを有する。この構成は、ＤＮＡリガーゼによるプローブの５’末端ヘのライゲーションに資することはない。
【００２１】
もし標的ヘのハイブリダイゼーション後の、プローブの３’および５’末端の間の１より多いヌクレオチドのギャップが存在するならば、そのときギャップはターミネーターヌクレオチドを使用することなく充填し得る。ターミネーターヌクレオチドを使用する要件は必須ではない。標的配列に相補的なギャップ領域中の塩基の配列が既知であろうから、非常に低濃度でのｄＮＴＰαＳまたはｄＮＴＰ類またはＮＴＰのものを含むヌクレオチド組成物を使用することができる。当業者はまた、ＤＮＡポリメラーゼのためのターミネーターとして作用する任意のヌクレオチドおよびリガーゼの基質を本発明の範囲内で使用し得ることを認識する。ギャップを充填する反応のためのＤＮＡポリメラーゼは、好適には、Ｅ Ｃｏｌｉ ＤＮＡポリメラーゼＩ（クレノーフラグメント）、Ｅ Ｃｏｌｉ ＤＮＡポリメラーゼＩ（ストッフェルフラグメント）、Ｔ７ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｕｓ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓＤＮＡポリメラーゼまたは逆転写酵素、例えばＡＭＶ逆転写酵素のＤＮＡポリメラーゼ活性から選択され、Ｔ７ ＤＮＡポリメラーゼが好ましい。理想的には使用されるポリメラーゼは、低修飾であり、その結果テンプレートから急速に脱着し、ＤＮＡリガーゼヘの接近を可能とする。
【００２２】
こうして本発明は、標的核酸配列にハイブリダイズできる一本鎖オリゴヌクレオチドプローブであって、
ａ）該標的核酸配列にハイブリダイズする、当該オリゴヌクレオチドの５’末端の領域、
ｂ）当該オリゴヌクレオチドが該標的核酸配列にハイブリダイズしたときに、当該オリゴヌクレオチドの３’末端と５’末端の間の１０ヌクレオチドまでのギャップを生ずる該標的核酸配列の隣接領域にハイブリダイズする、当該オリゴヌクレオチドの３’末端の領域、
ｃ）当該オリゴヌクレオチドの３’末端のアリル特異的塩基、
ｄ）当該オリゴヌクレオチドの３’末端から４ヌクレオチドまでの位置に位置する、該標的核酸に対する意図的な塩基ミスマッチ、
ｅ）該オリゴヌクレオチドの５’末端のリン酸基
を含むプローブを提供する。
【００２３】
本発明の方法は、２つのアリル特異的プローブであって、２対の包括的、プローブ特異的ＥＲＣＡプライマーのうちの１対でその選択的増幅を促進化する、異なるバックボーン配列をそれぞれが有する２つのアリル特異的プローブで実施し得る。該３’末端塩基は、ＳＮＰ特異的である。該５’末端はホスホリル化されている。その標的にハイブリダイズされたとき、該プローブ末端は、ＳＮＰ部位のすぐ３’側のヌクレオチドに対応する単一塩基ギャップによって分離されている。意図的なミスマッチを、アリルを識別する［ＳＮＰ］塩基の、２塩基５’側のプローブ配列内に設計する。
【００２４】
好ましくは、ＥＲＣＡを使用するＳＮＰ分析は、同じ反応、すなわち単一のマイクロタイタープレートウェル中で興味の持たれるＳＮＰのアリルの両方に質問するべきであり、そして好適な検出系へ結合される検出可能な終点を使用して結果をスコアー化するべきである。蛍光は終点として理想的には適合し、そして選択される検出機構である。アッセイが、ホモ接合性野生型、ヘテロ接合性およびホモ接合性突然変異体の間の相違を「指摘できる（ｃａｎ ｃａｌｌ）」ことが重要である。アリルを指摘することは、種々の配列コンテクスト中のミスマッチの範囲に対応するのに十分確実であるべきである。不正確なアリルからのシグナルを減少させることによってアリル識別を最大化することは不可欠である。本発明の方法が同じアッセイで単一および多重（＞２）アリルを質問することへ等しく適用可能であることは、当業者には明らかであるべきである。本発明はまた、蛍光と異なる検出の方法、例えば、質量分析、放射活性および他の当業者に自明なものを利用できる。
【００２５】
ここに引用される例の目的のために、−３ミスマッチが使用されることが仮定される。好ましい実施態様にしたがうプローブは、核酸標的、例えばゲノムＤＮＡ、ＰＣＲ生成物、ＲＮＡまたはｍＲＮＡ標的にハイブリダイズする。プローブ１とアリル１の「正確な」二重らせん対形成は、−３位の単一の意図的なミスマッチをもたらす。ＤＮＡポリメラーゼは、−３位にミスマッチを有するオリゴからの合成を効率的に始動する（ｐｒｉｍｅ）ことができる。不正確なプローブ／テンプレート組み合わせは、２つのその３末端のミスマッチ塩基、すなわち−１および−３位を有し、ここで−１位はＳＮＰミスマッチを示す。この構成は、ＤＮＡポリメラーゼの、鎖伸長を開始させる能力を顕著に減少させる。
【００２６】
ＤＮＡポリメラーゼおよびｄＮＴＰ混合品（ｃｏｃｋｔａｉｌ）を添加する。ｄＮＴＰミックスは、該ＳＮＰの３’側の塩基を補足する低濃度のアミノ−ｄＮＴＰと、通常レベルの他の３種のｄＮＴＰを含む。該ポリメラーゼは、アミノ−ｄＮＴＰを添加することという、このテンプレート上の重合化を終結させる事象によって、３’−ＯＨのマッチしたプローブを伸長させる。プローブの隣接５’末端の鎖置換という結果となり得る多重塩基付加は、こうして防止する。鎖置換は、いくつかの、ギャップを満たす戦略における顕著な問題となり得る（例えばＥＰ４３９１８２に記載されるとおりである）。
【００２７】
ミスマッチのテンプレート／プローブ二重らせんは、その二重のミスマッチのためにずっと低い効率で伸長する。ゆえに、正確なプローブ／アリル対形成のおかげで、高度の選択がある。次の段階で、ＤＮＡリガーゼを使用し、伸長が起こる場合にミスマッチのプローブのその小フラクションに対してさらに識別する。
【００２８】
ポリメラーゼ忠実性は、アミノｄＮＴＰの使用によって促進される。酵素が「正確な」塩基（すなわちアミノ−ｄＮＴＰ）を付加するとき、それはＤＮＡリガーゼが作用するためのニックのある二重らせんを創出する。酵素が不正確な、非アミノｄＮＴＰを付加するならば、鎖終結はなく、そしてプローブの５’末端の鎖置換によってさらなる塩基を挿入しつづけることができる。得られたフラップ構造はその後ライゲートすることができず、そしてしたがってポリメラーゼミスとりこみ事象が選択される。
【００２９】
ＤＮＡリガーゼは、マッチしたテンプレート／プローブにニックのある二重らせんの３’末端ＮＨ２基を受け入れる。「マッチした」二重らせんは単一のミスマッチを−４位になお含むが、しかしこれは顕著にはライゲーション効率に影響しないべきである。しかし、先行する段階でポリメラーゼによってあやまって伸長した１塩基であった任意のミスマッチプローブは、リガーゼのためのもはや劣等な基質となり、なぜならこれらは−２および−４位のミスマッチの両方を含むからである。種々の源からのＤＮＡまたはＲＮＡリガーゼ、例えばＴｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｌｕｓまたはバクテリオファージＴ４をこの方法で使用し得、バクテリオファージＴ４ＤＮＡリガーゼが好ましい。
【００３０】
ライゲートした生成物をここで、種々のやり方で検出し得るが、ローリングサークル増幅に基づく方法が好ましい。これは、ライゲートした生成物の急速、感受性かつ均質な検出を可能とし、したがって、決定されるべき多型性の部位の塩基の同一性を可能とする。
【００３１】
ポリメラーゼおよびリガーゼ類似物によるこの二重の選択は、別の方法によるならば、慣行のＥＲＣＡで容易に増幅される誤りのライゲーションを最小化する。全体のアッセイのシグナル対ノイズ比率および感受性を顕著に改善することが予測される。
【００３２】
ＥＲＣＡ反応は、３’アミノｄＮＴＰによって影響を受けず、増幅混合物中の４００μＭの３’−ＯＨｄＮＴＰの付加が、効率的にそれらを希釈するからである。
【００３３】
実施例
実施例１．ＤＮＡポリメラーゼ鎖ターミネーターとしての３’アミノＴＴＰの使用。
鎖ターミネーターシーケンシング反応を、３’アミノｄＴＴＰまたはｄｄＴＴＰを使用して実施した。反応物（２０μｌ）は、１ｘＳｅｑｕｅｎａｓｅ（登録商標）反応バッファー（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）、４０単位のＳｅｑｕｅｎａｓｅ（登録商標）Ｖ２．０ＤＮＡポリメラーゼ、０．５ｐｍｏｌのＭ１３ｍｐ１８＋鎖ｓｓＤＮＡテンプレート、１ｐｍｏｌの５’３２Ｐ標識されたユニバーサルシーケンシングプライマー、７μＭの３’アミノｄＴＴＰ、０．８μＭまたは８μＭのｄＴＴＰ、２μＭのｄＣＴＰ、２μＭのｄＧＴＰおよび２μＭのｄＡＴＰを含んでいた。コントロール反応物は、７μＭの３’アミノｄＴＴＰのかわりに７μＭのｄｄＴＴＰ反応物を含んだ。３７℃で１０分間インキュベートした。３μｌをホルムアミド負荷色素中で加熱変成し、そして８％ポリアクリルアミド／尿素シーケンシングゲル上で電気泳動した。ゲルをホスホルスクリーンに曝露し、スキャンしそしてＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ’Ｓｔｏｒｍ’ＰｈｏｓｐｈｏｒＩｍａｇｅｒを使用して捕捉した。
【００３４】
３’アミノＴＴＰは、ｄｄＴＴＰと同じシーケンシングラダーを与え、ユニバーサルプライマーから最初の２０位のテンプレートのＡ位置で正確に終結し、これによってその３’アミノＴＴＰがＤＮＡポリメラーゼのための効率的な基質であり、かつ鎖終結が可能であることを示した。
【００３５】
実施例２．ＤＮＡリガーゼによるアミノで終結するプローブのライゲーションおよび環形成
直鎖状プローブ５’ＡＡＧＡＡＡＣＣＡＴＧＴＡＧＴＴＴＧＴＡＴＴＣＧＡＡＴＧＴＣＣＴＡＴＣＣＴＣＡＧＣＴＧＴＣＡＧＡＡＣＴＣＡＣＣＴＧＴＴＡＧＡＣＧＴＣＧＡＴＣＴＣＴＣＴＣＴＡＧＴＧＧＡＡＧＴＴＡＧＣＴ−ＮＨ２３’、（配列番号１）であって３’末端アミノ基を有するものを、標準的ホルホルアミダイト化学を使用して合成した。２５ｍｏｌのプローブを、１ｘＰＮＫバッファーと６μｌのＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．）および４μｌの１０ｍＣｉ／ｍｌ、６０００Ｃｉ／ｍｍｏｌの３２ＰγＡＴＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）中のその５’末端を、１００μｌの反応物中で３０分間３７℃でホスホリル化した。該キナーゼを８０℃５分間不活性化した。アニーリング反応（５０μｌ）をセットアップし、２０ｎＭの３２Ｐ標識したプローブ、１００ｎＭの相補的オリゴヌクレオチド５’ＡＴＡＣＡＡＡＣＴＡＣＡＴＧＧＴＴＴＣＴＴＡＧＣＴＡＡＣＴＴＣＣＡＣＴＡＧＡＧＡＧＡＧＡ３’（配列番号２）および１ｘＴ４ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を含んだ。これらを９５℃２分間加熱し、次いで室温に１．５時間にわたりゆっくり冷却した。１、２または５Ｗｅｉｓｓ単位のＴ４ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）をアニーリング後添加した。ライゲーション反応物を３７℃終夜インキュベートした。次に、直鎖状および斉一ライゲートプローブ分子を、１時間３７℃で０、１または３時間の１０単位のエキソヌクレアーゼＩと５０単位のＴ７遺伝子６エキソヌクレアーゼ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）での消化によって除去した。３２Ｐ標識した生成物を、８％の変性ポリアクリルアミドゲル上で分離した。Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ「Ｓｔｏｒｍ」ＰｈｏｓｈｏｒＩｍａｇｅｒで終夜曝露後、環状プローブサイズマーカーのそれに同一の移動性を有するライゲートした生成物を、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを含むすべての反応中で観察した。これは、３’アミノ終結化プローブが、ＤＮＡリガーゼのための基質であり、そしてそれによってライゲートされることができたことを示した。
【００３６】
実施例３．ＤＮＡポリメラーゼおよび３’アミノＴＴＰによって伸長および終結されたプローブのＤＮＡリガーゼによるライゲーションおよび環形成
５０μｌのアニーリング反応物を、実施例２のように実施し、これは１００ｎＭの直鎖状プローブ５’ＡＡＧＡＡＡＣＣＡＴＧＴＡＧＴＴＴＧＴＡＴＴＣＧＡＡＴＧＴＣＣＴＡＴＣＣＴＣＡＧＣＴＧＴＣＡＧＡＡＣＴＣＡＣＣＴＧＴＴＡＧＡＣＧＴＣＧＡＴＣ ＴＣＴＣＴＣＴＡＧＴＧＧＡＡＧＴＴＡＧＣ３’（配列番号３）、２００ｎＭの相補的オリゴヌクレオチド標的５’ＡＴＡＣＡＡＡＣＴＡＣＡＴＧＧＴＴＴＣＴＴＡＧＣＴＡＡＣＴＴＣＣＡＣＴＡＧＡＧＡＧＡＧＡ３’（配列番号４）および１ｘＳｅｑｕｅｎａｓｅ（登録商標）バッファーを含んでいた。この直鎖状プローブおよび素保的オリゴヌクレオチド標的を、アニーリングしたときに、このプローブ末端が標的鎖中のＡに反対の単一塩基ギャップによっていっしょに分離されるように、設計した。このギャップを、酵母無機ピロフォスファターゼ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）および１０μＭの３’アミノＴＴＰを含む３２．５単位のＳｅｑｕｅｎａｓｅ（登録商標）Ｖ２．０  ＤＮＡポリメラーゼによって充填し、そして３７℃１０分間インキュベートした。このポリメラーゼを、７０℃でインキュベートし、そしてＴ４  ＤＮＡリガーゼで実施例２のようにライゲーションを実施した。
【００３７】
ゲル分析は、ＤＮＡポリメラーゼのない反応物が、直鎖状プローブに対応する３２Ｐ標識された種を与えることを明かにした。ＤＮＡポリメラーゼでの反応は、３’アミノＴＴＰの３’末端付加のために１ヌクレオチド分より大きい生成物をもたらした。ＤＮＡリガーゼを有するがＤＮＡポリメラーゼのない反応はまた、リガーゼによるその５’末端のアデニル部分の付加のために、当初物よりもより大きい生成物を与えた。直鎖状種よりもずっとゆっくりのゲル移動を示す環形成したプローブ生成物は、リガーゼとポリメラーゼが両方存在したこれらの反応物中に観察された。
【００３８】
このことは、ＤＮＡポリメラーゼが、３’アミノＴＴＰを利用し、ギャップのある環状プローブを充填すること、および得られたニックのある環が、ＤＮＡリガーゼによって首尾良くライゲートされ、共有結合的に閉じた、一本鎖で、環状のＤＮＡ分子であってローリングサークル増幅用のテンプレートとして作用し得るものを形成できることを実証する。
【００３９】
実施例４．３’アミノＴＴＰを含む環状ＤＮＡプローブのローリングサークル増幅
環形成したプローブを、実施例２および３にしたがうライゲーションによって調製した。すなわち、３’アミノＴ残基と予め合成された南京錠のライゲーションまたは、３’アミノＴＴＰの、ギャップのあるプローブヘのＳｅｑｕｅｎａｓｅ（登録商標）による付加、次いでライゲーション。
【００４０】
３０μｌのＥＲＣＡ反応物は、５μｌのライゲーション反応物、１ｘＢｓｔＤＮＡポリメラーゼバッファー（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）、５％ｖ／ｖのＤＭＳＯ、４００μＭのそれぞれのｄＡＴＰ／ｄＴＴＰ／ｄＧＴＰ／ｄＣＴＰ、１μＭのプライマー５’ＣＡＧＣＴＧＡＧＧＡＴＡＧＧＡＣＡＴＴＣＧＡ３’（配列番号５）、１μＭのプライマー５’ＴＣＡＧＡＡＣＴＣＡＣＣＴＧＴＴＡＧＡＣＧ３’（配列番号６）および８単位のＢｓｔＤＮＡポリメラーゼを含んだ。反応物を、６５℃２時間インキュベートし、それからアガロースゲル電気泳動によって分析した。プローブは、９０塩基対から２３ｋｂ以上の範囲の多量の特徴的ＲＣＡ生成物を生産するいずれかの方法によって環形成した。こうして、３’アミノヌクレオチドの環形成プローブ中の存在は、ローリングサークル増幅に不利に影響を与えることはない。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、ＲＣＡアッセイのハイブリダイゼーションおよびライゲーション工程の原理を示す。Ｂａｎｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， １９９８， Ｖｏｌｕｍｅ ２６， Ｎｏ．２  ， ｐｐ５０７３−５０７８
【図２】図２は、指数関数的ＲＣＡ（ＥＲＣＡ）反応の原理を示す。
【図３】図３は、３’アミノｄＴＴＰの構造である。
【図４】図４は、アッセイの概略図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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