(57)【要約】抗凝固剤として広く使用されている多糖類、特にヘパリンは、強い親水性及び高い陰性電荷を有するため、静脈注射または皮下注射のみにより臨床的に投与される。両親媒性ヘパリン誘導体は、胆汁酸、ステロール及びアルカン酸をそれぞれ結合させて製造される。前記ヘパリン誘導体は、軽微な疎水性を示し、水に対して良好な溶解度を持ち、高い抗凝固活性を示す。前記軽微な疎水性のヘパリン誘導体は、胃腸管内で効果的に吸収され、経口製剤形態で使用されうる。また、経口投与のための前記両親媒性ヘパリン誘導体及び類似の改変巨大分子の使用方法に対して記述している。
2004532851.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
胆汁酸(bile acid)、ステロール(sterol)、アルカン酸(alkanoic acid)及びこれらの混合物からなる群から選択された疎水性物質(hydrophbic agent)に共有結合したヘパリンを含む有効量の組成物を経口投与することを含む、抗凝固治療が要求される患者の治療方法。
【請求項２】
前記疎水性物質が、コール酸(cholic acid)、デオキシコール酸(deoxycholic acid)、ケノデオキシコール酸(chenodeoxycholic acid)、リトコール酸(lithocholic acid)、ウルソコール酸(ursocholic acid)、ウルソデオキシコール酸(ursodeoxycholic acid)、イソウルソデオキシコール酸(isoursodeoxycholic acid)、ラゴデオキシコール酸(lagodeoxycholic acid)、グリココール酸(glycocholic acid)、タウロコール酸(taurocholic acid)、グリコデオキシコール酸(glycodeoxycholic acid)、グリコケノデオキシコール酸(glycochenodeoxycholic acid)、デヒドロコール酸(dehydrocholic acid)、ヒオコール酸(hyocholic acid)、ヒオデオキシコール酸(hyodeoxycholic acid)、及びこれらの混合物からなる群から選択された胆汁酸(bile acid)であることを特徴とする、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
前記胆汁酸が、デオキシコール酸であることを特徴とする、請求項2に記載の方法。
【請求項４】
前記疎水性物質が、コレスタノール(cholestanol)、コプロスタノール(coprostanol)、コレステロール(cholesterol)、エピコレステロール(epicholesterol)、エルゴステロール(ergosterol)、エルゴカルシフェロール(ergocalciferol)及びこれらの混合物からなる群から選択されたステロールであることを特徴とする、請求項1に記載の方法。
【請求項５】
前記疎水性物質が、炭素数約4乃至20のアルカン酸であることを特徴とする、請求項1に記載の方法。
【請求項６】
前記アルカン酸が、酪酸(butyric acid)、吉草酸(valeric acid)、カプロン酸(caproic acid)、カプリル酸(caprylic acid)、カプリン酸(capric acid)、ラウリン酸(lauric acid)、ミリスチン酸(myristic acid)、パルミチン酸(palmitic acid)、ステアリン酸(stearic acid)及びこれらの混合物からなる群から選択されたことを特徴とする、請求項5に記載の方法。
【請求項７】
前記組成物が、薬学的に許容可能な担体をさらに含むことを特徴とする、請求項1に記載の方法。
【請求項８】
前記ヘパリンの分子量が、少なくとも約3,000であることを特徴とする、請求項1に記載の方法。
【請求項９】
前記ヘパリンの分子量が、少なくとも約6,000であることを特徴とする、請求項8に記載の方法。
【請求項１０】
前記ヘパリンの分子量が、約12,000未満であることを特徴とする、請求項1に記載の方法。
【請求項１１】
(a) 胆汁酸、ステロール、アルカン酸及びこれらの混合物からなる群から選択された疎水性物質と巨大分子製剤(macromolecule agent)を結合させ、疎水化された巨大分子製剤を得ること、及び
(b) 前記疎水化された巨大分子製剤をこれを必要とする患者に有効量で経口投与することを含む、巨大分子製剤の経口投与向上方法。
【請求項１２】
前記疎水性物質が、コール酸、デオキシコール酸、ケノデオキシコール酸、リトコール酸、ウルソコール酸、ウルソデオキシコール酸、イソウルソデオキシコール酸、ラゴデオキシコール酸、グリココール酸、タウロコール酸、グリコデオキシコール酸、グリコケノデオキシコール酸、デヒドロコール酸、ヒオコール酸、ヒオデオキシコール酸及びこれらの混合物からなる群から選択された胆汁酸であることを特徴とする、請求項11に記載の方法。
【請求項１３】
前記胆汁酸が、デオキシコール酸であることを特徴とする、請求項12に記載の方法。
【請求項１４】
前記疎水性物質が、コレスタノール、コプロスタノール、コレステロール、エピコレステロール、エルゴステロール、エルゴカルシフェロール及びこれらの混合物からなる群から選択されたステロールであることを特徴とする、請求項11に記載の方法。
【請求項１５】
前記疎水性物質が、炭素数約4乃至20のアルカン酸であることを特徴とする、請求項11に記載の方法。
【請求項１６】
前記アルカン酸が、酪酸、吉草酸、カプロン酸、カプリル酸、カプリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸及びこれらの混合物からなる群から選択されたことを特徴とする、請求項15に記載の方法。
【請求項１７】
前記巨大分子製剤が、ヘパリン、ヘパラン硫酸(heparan sulfate)、スルホニルポリサッカライド(sulfonyl polysaccharide)、ポリサッカライド誘導体及びこれらの混合物からなる群から選択されたことを特徴とする、請求項11に記載の方法。
【請求項１８】
前記巨大分子製剤が、ヘパリンであることを特徴とする、請求項17に記載の方法。
【請求項１９】
前記巨大分子製剤が、ペプチド(peptide)であることを特徴とする、請求項11に記載の方法。
【請求項２０】
前記巨大分子製剤が、インスリン(insuline)であることを特徴とする、請求項19に記載の方法。
【請求項２１】
前記巨大分子製剤が、カルシトニン(calcitonin)であることを特徴とする、請求項19に記載の方法。
【請求項２２】
胆汁酸、ステロール、アルカン酸及びこれらの混合物からなる群から選択された疎水性物質に共有結合されたヘパリン、ヘパラン硫酸、スルホニルポリサッカライド、ヘパリノイド及びこれらの混合物からなる群から選択された成分を含む有効量の組成物を経口投与することを含む、抗凝固治療が要求される患者の治療方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、改変されていない巨大分子または多糖類(polysaccharide)と比較して、増加した疎水性(hydrophobicity)を持った多糖類誘導体を含んだ巨大分子誘導体に関するものである。より詳細には、本発明は、巨大分子または多糖類の生理活性(bioacitivity)が維持された疎水化された巨大分子、及び両親媒性ヘパリン誘導体のような両親媒性多糖類誘導体の経口投与及び吸収に関するものである。本発明の好ましい態様において、分子量が1,000以上の疎水化された巨大分子及び両親媒性多糖類誘導体は、経口投与後吸収される。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
ヘパリンは、硫酸化されたD-グルコサミン(D-glucosamine)とD-グルクロン酸(D-glucuronic acid)残基(residue)を含む多糖類である。ヘパリン自体のイオン化が可能なたくさんの硫酸(sulfate)基により、前記ヘパリンは強い電気陰性 (electronrgative)電荷を持っている。また、ヘパリンは、ヘパリンナトリウムのような水溶性塩(water-soluble salts)を容易に形成できる相対的に強い酸である。前記ヘパリンは肥満細胞(mast cell)内で発見され、特に、豊富な肥満細胞が存在する身体器官から抽出され得る。特に、肝臓と肺は、ヘパリンが豊富である。循環する血液は、巨大分子の完全な分裂後を除いては、ヘパリンを含有しない。ヘパリンは、抗凝血(blood anticoagulation)、平滑筋細胞の増殖抑制等、多くの生理学上の機能を有する。特に、ヘパリンは、フィブリン凝固(fibrin clot)形成を防ぐアンチトロンビン(antithrombin)III (ATIII)と強く結合する強力な抗凝固剤(anticoagulant)である。ヘパリンは、深部静脈血栓症(deep vein thrombosis)及び肺動脈塞栓症(pulmonary embolism)の治療及び予防の為に使われる最も強い抗凝固剤の一つである。しかし、インビボ(in vivo)でのヘパリンの使用は非常に制限されている。ヘパリンの親水性(hydrophilicity)及び高い陰電荷 (negative charge)により胃腸管(GI tract)、鼻(nasal)または口(buccal)の粘膜(mucosal layer)等で効率的に吸収されない。その結果、臨床では、唯一の投与経路として静脈注射と皮下注射を使用している。そして、ヘパリンは比較的少ない種類の溶媒(solvent)にしか溶解しないため、医療用器具(medical device)または送達システム(delivery system)の表面コーティング(coating)に使用するのは難しい。
【０００３】
ヘパリンの性質を向上させるために、リンハート(R.J. Linhardtら, 83 J. Pharm. Sci., 1994年、P.1034-1039)らは、ラウリル基(lauryl, C12)及びステアリル基(stearyl, C18)等を単一ヘパリン鎖に連結させ、増加した疎水性を持つ反面、低い抗凝固活性 (anticoagulation activity)を持つヘパリン誘導体を得た。このような結果は、ヘパリンに対する小さい線形脂肪族(aliphatic)鎖の結合は活性を維持する反面、ヘパリンの疎水性を向上させるには効果が無いことを示した。したがって、公知されたヘパリン誘導体は、抗凝固活性を維持するには効果的ではない。
【０００４】
リベラ(T.M. Rivera)らは、ヘパリンにN-[8-(2-ヒドロキシベンゾリル)アミノ]カプリラートナトリウム(sodium N-[8-(2-hydrozybenzolyl)amino]caprylate)を混合してヘパリンの経口送達(oral delivery)の可能性を明らかにした(Oral Delivery of Heparin in Combination with Sodium N-[8- (2-Hydroxybenzolyl)amino]caprylate: Pharmacological Considerations, 14 Pharm. Res. 1997年、P.1830-1834)。ドリスキ(M. Dryjski)らは、増進剤(enhancer)を使用して低分子量(low molecular weight)ヘパリンの経口吸収(absorption)の可能性を提示した(Investigations on Plasma Activity of Low Molecular Weight Heparin After Intravenous and Oral Administrations, 28 Br. J. Clin. Pharma., 1989年、P.188-192)。
【０００５】
分子量が1,000を上回る分子は、一般的に経口投与後の胃腸管で吸収が良くないと認識されている。その例として、ルッセルジョンズ(J.G. Russell-Jones)は、胆汁酸運搬子(bile acid transporter)を媒介にして移すことができるペプチド(peptide)の大きさが最大アミノ酸4個または約600Daであると提案したクレマー(W. Kramer)らの研究(269 J. Biol. Chem., 1994年、P.10621-10627)に言及している(Carrier-mediated Transport, Oral Drug Delivery, in 1 Encyclopedia of Controlled Drug Delivery 173, 175 [Edith Mathiowitz編、1999年])。また他の例として、スワン(P.W. Swaan)らは、6個までのアミノ酸(即ち、約900Da)を持った胆汁酸結合体(conjugate)だけが、腸の(intestinal)胆汁酸運搬子に対し親和力(affinity)を示したと報告した。但し、テストされたものの中で6-アミノ酸胆汁酸結合体だけが胆汁酸運搬子により送達されなかった(Enhanced Transepithelial Transport of Peptides by Conjugation to Cholic Acid, 8 Bioconjugate Chemistry 1997年、P.520-525)。
【０００６】
上述したように、分子量1,000を上回る巨大分子の経口投与後吸収に対する方法の開発が当技術分野において確実な発展であると理解できる。疎水化された(hydrophobized)または両親媒性のヘパリン誘導体の経口投与後の吸収に対する方法の開発が、当技術分野において確実なもう一つの発展になりうることもまた、理解できる。
【発明の開示】
【０００７】
発明の概要
本発明の目的は、経口投与後の分子量1,000を上回る分子の吸収を達成する方法を提供することである。
【０００８】
本発明の別の目的は、両親媒性ヘパリン誘導体の経口投与により抗凝血反応を得る方法を提供することである。
【０００９】
本発明のまた別の目的は、胃腸管で吸収され、これによって凝血反応を抑制する経口送達を容易にするヘパリン誘導体を提供することである。
【００１０】
本発明のさらに別の目的は、デオキシコール酸(deoxycholic acid)またはグリココール酸(glycocholic acid)のような胆汁酸、コレステロール(cholesterol)、またはアルカン酸(alkanoic acid)のような疎水性物質(hydrophobic agent)と結合したヘパリンを含むヘパリン誘導体を提供することである。
【００１１】
上記及びその他の目的は、胆汁酸、ステロール(sterol)、アルカン酸及びこれらの混合物からなる群から選択された疎水性物質と共有結合したヘパリンを含む組成物を有効量で経口投与することを含む、抗凝固治療が要求される患者を治療する方法を提供することで達成される。また、前記組成物は、薬学的に許容可能な担体をさらに含む。
【００１２】
本発明の好ましい態様によると、前記疎水性物質は、コール酸(cholic acid)、デオキシコール酸(deoxycholic acid)、ケノデオキシコール酸(chenodeoxycholic acid)、リトコール酸(lithocholic acid)、ウルソコール酸(ursocholic acid)、ウルソデオキシコール酸(ursodeoxycholic acid)、イソウルソデオキシコール酸(isoursodeoxycholic aicd)、ラゴデオキシコール酸(lagodeoxycholic acid)、グリココール酸(glycocholic acid)、タウロコール酸(taurocholic acid)、グリコデオキシコール酸(glycodeoxycholic acid)、グリコケノデオキシコール酸(glycochenodeoxycholic acid)、デヒドロコール酸(dehydrocholic acid)、ヒオコール酸(hyocholic acid)、ヒオデオキシコール酸(hyodeoxycholic acid)及びこれらの混合物からなる群から選択された胆汁酸である。
【００１３】
本発明の別の好ましい態様によると、前記疎水性物質は、コレスタノール(cholestanol)、コプロスタノール(coprostanol)、コレステロール(cholesterol)、エピコレステロール(epicholesterol)、エルゴステロール(ergosterol)、エルゴカルシフェロール(ergocalciferol)及びこれらの混合物からなる群から選択されたステロール(sterol)である。
【００１４】
本発明のまた別の好ましい態様によると、前記疎水性物質は、約4乃至20個の炭素原子を含むアルカン酸である。好ましくは、前記アルカン酸は、酪酸(butyric acid)、吉草酸(valeric acid)、カプロン酸(caproic acid)、カプリル酸 (caprylic acid)、カプリン酸(capric acid)、ラウリン酸(lauric acid)、ミリスチン酸 (myristic acid)、パルミチン酸(palmitic acid)、ステアリン酸(stearic acid)及びこれらの混合物等を含む。
【００１５】
好ましくは、前記ヘパリンは、分子量が少なくとも約3,000、好ましくは、少なくとも約6,000である。好ましい態様によると、前記ヘパリンは、分子量が約12,000未満である。
【００１６】
本発明の別の好ましい態様は、
(a) 胆汁酸、ステロール、アルカン酸及びこれらの混合物からなる群から選択された疎水性物質と巨大分子を結合させ疎水化された巨大分子製剤を得ること、そして
(b) 前記疎水化された巨大分子製剤をこれを必要とする患者に有効量で経口投与することを含む、疎水化巨大分子製剤の経口投与向上方法を含む。
【００１７】
好ましくは、前記巨大分子製剤は、ヘパリン、ヘパラン硫酸、スルホニルポリサッカライド(sulfonyl polysaccharide)、ヘパリノイド (heparinoids)、ポリサッカライド誘導体(polysaccharide derivative)及びこれらの混合物からなる群から選択する。本発明のまた他の好ましい態様によると、前記巨大分子製剤は、インスリン(insulin)またはカルシトニン(calcitonin)のようなペプチドである。
【００１８】
発明の詳細な説明
本発明の両親媒性ヘパリン誘導体の粘膜吸収を向上させるための製剤及び方法を詳細に記述するに先立ち、本発明は、特別な形態、処理過程そしてヘパリンを含む物質等、例えば形態、処理過程そして若干変更する物質に限定されないことが理解されねばならない。また、使用された用語は、単に特定の態様を記述するために使用されたものであり、本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲およびその同等物のみにより制限されるため、本発明の制限を意図したものではないことが理解されねばならない。
【００１９】
本発明の明細書及び添付の特許請求の範囲において用いられる「a」、「an」及び「the」の単数形態は、特記しない限り、複数を含むことに留意されねばならない。 例えば、「胆汁酸」は、２種またはそれ以上の胆汁酸混合物を含み、
「アルカン酸」は、２種またはそれ以上のアルカン酸混合物を含み、「ステロール」は、２種またはそれ以上のステロール混合物を含む。
【００２０】
本発明の説明および特許請求の際に用いられる用語は、下記に規定された定義にしたがって使用される。
【００２１】
本明細書において使用される「胆汁酸」は、コール酸(cholic acid)、デオキシコール酸(deoxycholic acid)、ケノデオキシコール酸(chenodeoxycholic acid)、リトコール酸(lithocholic acid)、ウルソコール酸(ursocholic acid)、ウルソデオキシコール酸(ursodeoxycholic acid)、イソウルソデオキシコール酸(isoursodeoxycholic acid)、ラゴデオキシコール酸(lagodeoxycholic acid)、グリココール酸(glycocholic acid)、タウロコール酸(taurocholic acid)、グリコデオキシコール酸(glycodeoxycholic acid)、グリコケノデオキシコール酸(glycochenodeoxycholic acid)、デヒドロコール酸(dehydrocholic acid)、ヒオコール酸(hyocholic acid)、ヒオデオキシコール酸(hyodeoxycholic acid)及びこれらの混合物を含むステロイド、コール酸の天然及び合成誘導体を意味するが、これに限定されない。
【００２２】
本明細書において使用される「ステロール」は、コレスタノール(cholestanol)、コプロスタノール(coprostanol)、コレステロール(cholesterol)、エピコレステロール(epicholesterol)、エルゴステロール(ergosterol)、エルゴカルシフェロール(ergocalciferol)及びこれらの混合物等を含むステロイドと構造的に関連したアルコールを意味するが、これに限定されない。
【００２３】
本明細書において使用される「アルカン酸」は、約4個〜20個の炭素原子からなる飽和脂肪酸を意味する。前記アルカン酸は、酪酸(butyric acid)、吉草酸(valeric acid)、カプロン酸(caproic acid)、カプリル酸(caprylic acid)、カプリン酸(capric acid)、ラウリン酸(lauric acid)、ミリスチン酸(myristic acid)、パルミチン酸(palmitic acid)、ステアリン酸(stearic acid)及びこれらの混合物等を含むが、これに限定されない。
【００２４】
本明細書において使用される「疎水性ヘパリン誘導体」及び「両親媒性ヘパリン誘導体」は、互換的(interchangeably)に使用される。ヘパリンは、非常に親水性の物質である。疎水性物質とヘパリンを結合することによってヘパリンの疎水性を増加させることを、本発明では両親媒性ヘパリン誘導体または疎水性ヘパリン誘導体として示す。固有のヘパリンに比べて前記ヘパリン誘導体は疎水性が増加され、これにより前記ヘパリン誘導体は、親水性及び疎水性部分を含み、両親媒性として言及することが好ましい。
【００２５】
本明細書において使用される「aPTT」は、活性化された部分トロンボプラスチン時間 (activated partial thromboplastin time)を意味し、「FXa」は因子Xaを意味する。
【００２６】
本明細書において使用される「DOCA」は、デオキシコール酸(deoxycholic acid)を意味し、「ヘパリン-DOCA」はヘパリンとデオキシコール酸が結合した形態を意味する。
【００２７】
本明細書において使用される「巨大分子」は、典型的に分子量が1000を上回るポリペプチド、ポリサッカライド及び核酸高分子を意味する。
【００２８】
本明細書において使用される「ペプチド(peptide)」は、すべての長さのペプチドを含み、蛋白質も含む。以下、「ポリペプチド」及び「オリゴペプチド」は、特別な大きさを言及しない限り、その大きさに制限を与えない。使用可能な典型的なペプチドは、オキシトシン (oxytocin)、バゾプレッシン(vasopressin)、アドレノコルチコトロフィンホルモン(adrenocorticotrophic hormone)、上皮細胞成長因子(epidermal growth factor)、プロラクチン(prolactin)、ルリベリン(luliberin)またはルテイニシンホルモン放出ホルモン (luteinising hormone releasing hormone)、成長ホルモン(growth hormone)、成長ホルモン放出因子(growth hormone releasing factor)、インスリン(insulin)、ソマトスタチン(somatostatin)、グルカゴン(glucagon)、インターフェロン(interferon)、ガストリン(gastrin)、テトラガストリン(tetragastrin)、ペンタガストリン(pentagastrin)、ウロガストロイン(urogastroine)、セクレチン(secretin)、カルシトニン(calcitonin)、エンケパリン(enkephalins)、エンドルピン(endorphins)、アンジオテンシン(angiotensins)、レニン(renin)、ブラジキニン(bradykinin)、バシトラシン(bacitracins)、ポリミキシン(polymixins)、コリスチン(colistins)、チロシジン(tyrocidin)、グラミシジン(gramicidines)及びこれらの合成類似体(synthetic analogues)、改変物及び薬学的活性物質、モノクローナル抗体(monoclonal anitibodies)及び溶解性ワクチンからなる群から選択されたものを使用する。利用可能な前記ペプチドまたは蛋白質薬物の制限は、その機能性にかかっている。
【００２９】
本明細書において使用される「有効量(effective amount)」は、毒性がなく、すべての医療的な治療時に合理的に要求される利益/リスク比率で、局所的にシステム的な効果を示すことができる薬物濃度または薬理学的活性剤の量を意味する。したがって、一例として、ヘパリン-DOCA誘導体の有効量は、抗凝固活性の一定水準を提供する程度に充分な程度の量である。
【００３０】
ヘパリンは、血液の凝固を抑制する抗凝固性物質として知られている。ヘパリンは、スルホン基及びカルボキシル基のような陰性的な電荷の高密度により非常に親水性が高い。このような親水性のため、ヘパリンは単に注射剤や皮下注射剤としてだけ使用されてきた。微弱な疎水性または両親媒性性質を持っていながら高い生理活性を持ったヘパリン誘導体を以下に記述する。デオキシコール酸のような胆汁酸、コレステロールのようなステロール、及びラウリン酸及びパルミチン酸のようなアルカン酸等の疎水性物質は、ヘパリンと結合する。デオキシコール酸及びコレステロールは、人体内で天然的に発見されるため、すべて無毒性である。ヘパリンのアミン基は、疎水性物質のカルボキシル基と結合するようになる。DOCA、ラウリン酸及びパルミチン酸の末端カルボキシル酸が前記結合反応に直接参与する反面、コレステロールのヒドロキシ基は、結合反応前にクロロアセタート酸と反応して活性化される。このようにヘパリンのアミン基に対する疎水化基の結合は、ヘパリン活性にほとんど影響を与えない。ヘパリン及び疎水性物質間の結合は、FT-IRおよび13C-NMR分析によりアミド結合を確認することによって分かる。
【００３１】
結合反応の収率は、約70％乃至80%で、これは疎水性物質または供給されるモル比が変わっても有意義な程度に変化しなかった。ヘパリン-DOCA接合体の場合において、初期反応比を増加させることにより、結合されるDOCAの量もまた増加した。ヘパリン-DOCAにおいてヘパリンとDOCAの初期反応比が1:200の場合に、DOCAの重量%が約24%だった。このようなモル比は、ヘパリンとDOCAで結合されるアミン基に比べて非常に高い。したがって、初期反応比はDOCA過剰であると考えられる。
【００３２】
本発明による疎水性ヘパリン誘導体は、多くの医療部分に応用できる。例えば、疎水性ヘパリンは、経口投与が可能である。このようなヘパリンの経口投与は、経口用抗凝固薬物としてのヘパリンの使用を大きく増加させるものである。前記ヘパリン誘導体は、薬学的に許容可能な担体を利用して当技術分野の公知の方法で調剤できる。他の例として、疎水性ヘパリンは、カテーテル(catheters)、心肺蘇生バイパス回路(cardiopulmonary bypass circuits)、人工心肺酸素発生器(heart lung oxygenators)、腎臓透析器(kidney dialyzers)、再狭窄症(restenosis)を抑制するためのステント(stent)またはバルーンコーティング(balloon coating)等のような医療装備にコーティング物質として使用できる。疎水性ヘパリン誘導体は、一般的に担体と混合され、当技術分野に公知されたフィルムキャスティング(film casting)により前記医療装備表面にコーティングできる。
【００３３】
また、改変後に、ヘパリン-疎水性製剤はフェニルセファロース(Phenyl Sepharose（登録商標）)相の高速蛋白質液体クロマトグラフィー(fast protein liquid chromatography；FPLC（登録商標）)でリン酸緩衝溶液の代りに硫酸アンモニウム緩衝溶液を溶出させ、疎水性媒質内で疎水性相互作用が現れるという傾向が分かった。このようなヘパリン誘導体は、未改変ヘパリンより高い結合親和度を持っている。増加された改変ヘパリンのフェニルセファロース（登録商標）との相互作用は、疎水性官能基の存在の結果としての、自身の疎水性増加に起因する。このような結果は、疎水性ヘパリンが、胆汁酸、ステロールまたは、アルカン酸とヘパリンと結合していることを意味する。溶解度測定を通して、前記ヘパリン-疎水性物質を溶解させるには、極性溶媒または有機溶液が適切であることが分かった。例えば、前記ヘパリン-デオキシコール酸は、65%アセトン溶液(35%モル)で良い溶解度を示した。最後に、改変化されたヘパリン誘導体の生理活性は、前記疎水性物質との結合に影響を受けないと判定された。ヘパリンに結合した疎水性物質の機能は、２つの生理活性、即ち、抗凝固性と因子Xa分析により決定された。抗凝固活性及び抗因子Xa分析で、たとえ若干減少していたとしても、前記生理活性の減少はそれほど深刻ではなかった。このような結果は、ヘパリンのアミン基の遮断が、自身の生理活性には特別な影響がないということを示している。しかし、結合体での疎水性物質の量が20重量%を超過した時、前記ヘパリン-疎水性物質接合体の生理活性が漸次的に減少するのが見られた。前記結合体内で疎水性物質の量が20重量%未満の場合、前記結合体の生理活性は、未改変ヘパリンの80%程度であった。しかし、疎水性ヘパリンにおける前記80%の生理活性は、医療分野の応用に可能な程度として充分である。
【００３４】
実施例１
ヘパリン-DOCA接合体の合成
ジメチルホルムアミド(DMF)に溶解したN-ヒドロキシスクシンイミド(N-hydroxylsuccinimide；HOSu, 92 mg/5 ml) 5mlをDMFに溶解したジシクロヘキシルカルボジイミド(dicyclohexylcarbodiimide；DCC)(165mg/5ml)5mlと混合した後、DMFに溶解したDOCA(196mg/5ml)5mlを添加した。この時、DOCA、HOSu及びDCCのモル比は、1：1.6：1.6であった。前記HOSu及びDCCの濃度は、DOCAの活性を完全にさせるために前記DOCAの濃度より若干高くした。得られた溶液を常温真空で 5時間反応させ、反応が進行する間、沈殿する副産物のジシクロヘキシルウレア(dicyclohexylurea；DCU)を除去した。未反応のDCCは、蒸溜水を滴下した後、ろ過して除去した。また、残っているHOSuは、滅菌水15mlを添加して除去した。活性化した DOCAを沈殿させた後、凍結乾燥させた。前記活性化したDOCAをDMFに溶解させた後、ヘパリンと常温で4時間反応させた。前記反応でヘパリンの量は、40mg〜400mgの範囲で使用した。反応終了後、水溶性物質(water-soluble)及び非水溶性物質 (water-insoluble)の二種の生成物が得られた。前記生成物は、0.45μm膜フィルターでろ過分離した後、非水溶性物質すなわち活性化されたDOCAを真空下で乾燥させた。前記水溶性物質すなわちヘパリン-DOCAは、膜(MWCO 3,500)を使用して水で1日透析した後、ヘパリン-DOCAを凍結乾燥させた。
【００３５】
前記合成したヘパリン-DOCAは、さらに逆相クロマトグラフィーを行って精製した。フェニル-セファロースCL-4Bカラム(HR 16/30 I.D.)を100mlの蒸留水、50 mMリン酸緩衝溶液(pH7.0)40ml、1.7M硫酸アンモニウムを含有した50mMリン酸緩衝溶液(pH7.0)40ml、及び50mMリン酸緩衝溶液40ml順に洗浄した。ヘパリン-DOCA溶液(1mg/ml)5mlを前記カラムに注入し、硫酸アンモニウム溶液を段階溶出液にして前記ヘパリン-DOCAを分別した。20分間リン酸緩衝溶液を溶出させ、1ml/分の流速でリン酸緩衝溶液(50mMリン酸緩衝溶液(pH7.0)+1.7Mの硫酸アンモニウム)を溶出させた。ヘパリン-DOCAを硫酸アンモニウム溶液内で溶出された。前記精製したヘパリン-DOCA溶液は、蒸留水で透析した後、凍結乾燥させた。
【００３６】
前記方法で製造したヘパリン誘導体は、当技術分野で公知されている方法に従ってFT-IR及びNMRにより特徴付けられ、ヘパリン及び疎水性物質の結合が成功したことを立証できた(Y. Lee, H.T. Moon &Y. Byun, Preparation of Slightly Hydrophobic Heparin Derivatives Which Can Be Used for Solvent Casting in Polymeric Formulation, 92 Thromb. Res., 1998年、P.149-156)。
【００３７】
実施例２
ヘパリン-コレステロール(heparin-cholesterol)接合体の製造
コレステロールのヒドロキシル基は、クロロ酢酸と反応して活性化され遊離カルボキシル基が生じた。続いて、前記改変されたコレステロールを、前記実施例1の方法により、10mlのDMF内でHOSu及びDCCと反応させた。コレステロール、HOSu及びDCCのモル比は1：1.6：1.6で、5時間常温で反応させた。未反応のDCC及びHOSuを除去するために、水を添加し、得られた溶液を0.45μmの膜フィルターでろ過した。続いて、前記活性化されたコレステロールをヘパリン溶液と4時間反応させた。前記反応後、水溶性物質及び非水溶性物質の二種類の物質を得た。前記生成物は実施例1に記載した方法により処理した。
【００３８】
実施例３
ヘパリン-アルカン酸(heparin-alkanoic acid)接合体の製造
前記実施例1の方法により、ラウリン酸及びパルミチン酸をヘパリンと結合させた。前記アルカン酸のカルボキシル基は、ヘパリンのアミン基と結合してアミド結合を形成した。また、結合剤はHOSu及びDCCを使用した。
【００３９】
実施例４
ヘパリン-コール酸(heparin-colic acid)接合体の製造
本実施例は、DOCAの代りにコール酸を使用したことを除外して実施例1と同一の方法で行なった。
【００４０】
実施例５
ヘパリン-ケノデオキシコール酸(heparin-chenodeoxycholic acid)接合体の製造
本実施例は、DOCAの代りにケノデオキシコール酸を使用したことを除外して実施例1と同一の方法で行なった。
【００４１】
実施例６
ヘパリン-エルゴステロール (heparin-ergosterol)接合体の製造
本実施例は、コレステロールの代りにエルゴステロールを使用したことを除外して実施例2と同一の方法で行なった。
【００４２】
実施例７
インスリン-DOCA接合体の製造
本実施例は、ヘパリンの代りにインスリン(insulin)を使用したことを除外して実施例1と同一の方法で行った。インスリンのアミン基すなわちGlyAl、PheB1及びLysB29は、DOCAのカルボキシル基と結合した。
【００４３】
実施例８
カルシトニン-DOCA接合体の製造
本実施例は、ヘパリンの代りにカルシトニン(calcitonin)を使用したことを除外して実施例1と同一の方法で行った。カルシトニンのアミン基は、DOCAのカルボキシル基と結合した。
【００４４】
実施例９
ヘパリン誘導体の生理活性測定
前記実施例1〜3で製造したヘパリン-DOCA、ヘパリン-コレステロール及びヘパリン-アルカン酸は、生成物の収率、分子量及びヘパリンと疎水性物質間の結合モル比が反応物のモル比により変化した。ヘパリン-DOCA接合体の収率は、71%〜77%だった。改変されたヘパリン誘導体の疎水性物質の量は、ヘパリン誘導体の分子量からヘパリンの分子量(光散乱器で測定された分子量: 12,386ダルトン)を引くことによって計算される。デオキシコール酸及びヘパリンの反応初期比率は、1:6から1:200に増加するにしたがって、ヘパリン-DOCA接合体内DOCAの量が7%から24%に増加した。ヘパリン-コレステロール接合体の場合には、収率が 73%〜78%だった。しかし、疎水性ヘパリン誘導体のコレステロールの量は、ヘパリン-DOCA接合体でのDOCA量より少なかった。ヘパリン-ラウリン酸及びヘパリン-パルミチン酸の場合では、よく似た量のアルカン酸が結合されていた。
【００４５】
ヘパリン誘導体の抗凝固活性は、aPTT分析とFXa色素生産分析により決定した。フィブリン塊の形成を防止するヘパリン誘導体の活性は、aPYFにより測定した。ヘパリン標準溶液(0.1U/mlから0.7U/ml, 0.1ml)を含む血小板が少ない血漿とヘパリン誘導体(0.1ml)を含む血漿を0.1mlのaPTT溶液で37℃で2分間インキュベーションした。インキュベーション後、0.1mlの0.02MのCaCl2を添加した。この時点からフィブリン塊の形成されるまでの時間を記録した。ヘパリン誘導体の生理活性は、凝固時間とヘパリン基準線を比較することによって計算した。凝固時間は血漿内のヘパリンの活性と直線的に比例した。
【００４６】
また、ヘパリン誘導体の濃度及び活性をFXa色素生産(chromogenic)分析で測定した。ヘパリン誘導体(25μl)を含む血漿とヘパリン標準溶液は、ヘパリン濃度に比べて過剰な濃度を持ったATIII溶液(0.1 IU/ml)200μlと混合した。前記溶液を37℃で2分間インキュベーションした後、200μlのFXa(4nkcat/ml)を添加した。得られた溶液をさらに1分間インキュベーションした。FXaの濃度もまたヘパリン濃度に比べて過剰であった。FXa基質(200μl、0.8μmol/ml)を添加した後、37℃で5分間インキュベーションした。前記反応は、200μlの酢酸(50%溶液)を添加して終結させた。血漿内のヘパリンの生物活性及び濃度は、405nmの吸光度を測定して得られた。このようなデータを下記表1に示した。
【００４７】
【表１】
2004532851.tif 000003
aヘパリンに対する疎水性物質のモル比
【００４８】
実施例１０
ヘパリン-DOCAの経口投与
スプラグダウリ(Sprague-Dawley)系ラット(雄、250g〜260g)を投与前12時間禁食させた。前記ラットをジエチルエーテルで麻酔した後、ヘパリン誘導体を経口形チューブを利用して注意深く食道を通過して胃まで単独投与した。前記チューブは、錆びないステンレススチール材質で、組織表面の病変の原因とならないように、平滑な末端を有していた。ヘパリン誘導体を含む溶液は、炭酸水素ナトリウム緩衝溶液(pH7.4)で製造した。総投与されたヘパリン誘導体を含む溶液の容積は、0.3mlだった。投与量を50mg/kg、80mg/kg、100mg/kg及び200mg/kgに変化させながら投与した。各々のグループに9匹のラットを使用した。各時間毎に眼窩静脈から血液450μlを採取し、採取した血液は50μlのクエン酸ナトリウム(3.8%溶液)に直接注入して混合した。血液サンプルはすぐに2500xg、4℃で5分間遠心分離した。血漿内ヘパリン誘導体の凝固時間及び濃度は、aPTTとFXa分析で各々測定した。
【００４９】
胃腸(GI)管内でのヘパリン-DOCAの吸収は、50mg/kg〜200mg/kgの投与量で測定した。本実験でヘパリン-DOCA接合体内ヘパリンと結合したDOCAのモル比は、10だった。原料ヘパリンが前記ラットに経口投与された時、aPTT分析により測定された凝固時間は18秒で、これは経時的に変化しなかった。前記基準線の平均値は、18秒で、原料ヘパリンが胃腸(GI)内でまったく吸収されないことを示す。ヘパリン及びDOCAを物理的に混合して経口投与した時、aPTTの値は約20秒で、前記数値は経時的に変化しなかった。反面、ヘパリン-DOCA接合体を経口投与した場合、図1に図示したように凝固時間が増加した。血液採取を1時間間隔で遂行するので、最大凝固時間は1時間で測定されたが、実際最大凝固時間は測定されなかった。しかし、1時間での凝固時間は、投与量が増加するにつれて線形的に増加した。ヘパリン-DOCA接合体を、50mg/kg、80mg/kg、100mg/kg及び200mg/kgで測定した時、1時間での凝固時間は各々25.8±2.6、43.1±4.0、51.2±9.3及び136±33だった。ヘパリン-DOCA接合体が200mg/kgで投与された時、1時間での凝固時間は基準線より7倍も大きく増加した。ヘパリンの薬物治療濃度は、基準線の1.5〜2.5倍であるため、治療効果は投与量が80mg/kg〜100mg/kgにおいて現れた。したがって、前記ヘパリン-DOCAは、胃腸でのヘパリンの吸収を大きく向上させ、これと反対にヘパリンと物理的に混合されたDOCAは、ヘパリンの吸収を向上させなかった。
【００５０】
ヘパリン-DOCA接合体の濃度は、図2に図示したように、FXa分析で測定した。時間によるヘパリン-DOCA接合体の濃度分布は、図1に示したaPTT分析結果と類似していた。吸収されたヘパリン-DOCAの濃度は、投与量が増加すると同時に増加した。治療可能範囲は、0.1 IU/ml〜0.2 IU/mlだった。ヘパリン-DOCAの200mg/kgの投与時、1時間での平均濃度ピークは、基準線より約9倍〜10倍程度で、この時、その濃度は1.0 IU/mlだった。ヘパリン-DOCA接合体の血漿濃度は、3時間後に基準線に回帰した。その結果、胃腸内でのヘパリン-DOCA接合体の吸収を確認した。
【００５１】
実施例１１
ラットの胃腸(GI)管内でのヘパリン-DOCA接合体吸収
胃腸管内でヘパリンに対するDOCA比の関数としてヘパリン-DOCA接合体の吸収を測定するために、実施例1に記述した方法にしたがってDOCA：ヘパリンのモル比を2.5、5.0及び10.0にしてヘパリン-DOCA接合体を製造した。表1に示したように、ヘパリン-DOCA接合体の生理活性は、ヘパリンに対するDOCAのモル比が増加するにつれて若干減少した。しかし、ヘパリン-DOCAの分子量は、ヘパリンに対するDOCAのモル比が増加するにつれて増加したため、モル比によるヘパリン-DOCA接合体の生理活性は約5%減少した。即ち、ヘパリン及びヘパリン-DOCA接合体（10:1モル比）の生理活性は、各々1,734 IU/mol及び1,632±7 IU/molであった。
【００５２】
図3は、ヘパリンに対するDOCAの結合モル比による凝固時間の変化を示す。本実験で、ヘパリン-DOCA接合体の投与量は100mg/kgだった。ヘパリンと結合したDOCAのモル比が増加する場合、前記ヘパリン-DOCAの生理活性は若干減少する反面、最大凝固時間は増加した。このような結果は、ヘパリン-DOCA接合体がラットの胃腸内でヘパリンの吸収を容易にすることを示している。
【００５３】
実施例１２
疎水性物質と結合したヘパリンのラットの胃腸内での影響
疎水性物質と結合したヘパリンの胃腸内吸収効果を調べるために、実施例1〜3で製造したヘパリン-DOCA、ヘパリン-コレステロール、ヘパリン-パルミチン酸及びヘパリン-ラウリン酸で測定した。表1に示したように、ヘパリンに対する疎水性物質のモル比は、4〜4.5に調節した。このようなヘパリン誘導体の生理活性は互いに類似しており、113 IU/mg〜123 IU/mgであった。図4は、ヘパリン誘導体の100mg/kg経口投与後に得られた吸収値を示す。aPTT分析で測定された経口投与後1時間での最大凝固時間は、ヘパリン-コレステロールが32±6.1秒、ヘパリン-パルミチン酸が29±8.3秒、及びヘパリン-ラウリン酸が25.9±6.6秒だった。コレステロール、パルミチン酸及びラウリン酸の炭素数は、各々24、16及び12で、前記疎水性物質の疎水性は炭素数に比例する。したがって、最大凝固時間は結合した疎水性物質の疎水性にともなって増加するようになる。このような結果は、ヘパリン誘導体の疎水性が胃腸内でヘパリンの吸収を増加させる重要な特徴になる。たとえコレステロールがDOCAより疎水性程度が大きくても、ヘパリン-DOCAがヘパリン-コレステロールの凝固時間よりさらに高かった。このような結果は、(1)ヘパリン-DOCAの両親媒性が胃腸内で透過度を向上させ、(2)胃腸壁でヘパリン-DOCAのDOCAグループ及びDOCA受容体、特に、回腸部分との相互作用により胃腸壁でヘパリン-DOCAの接着を増加させ、これにより吸収の可能性を増加させるものと説明し得る。
【００５４】
実施例１３
胃腸管(GI Tract)内での組織検査
実施例10に記載した方法により、ヘパリン-DOCA接合体を経口用チューブを利用してラットに投与した。ヘパリン-DOCA接合体でヘパリンに対する結合したDOCAのモル比は、10だった。即ち、ヘパリン1モルに10モルのDOCAが結合した。投与量は200mg/kgだった。投与後1、2及び3時間後に、ラットをジエチルエーテルで麻酔して横隔膜(diaphragm)を切断して致死させた。前記ラットから胃 (gastric)、十二指腸(duodenal)、空腸(jejunal)及び回腸(ileal)組織を除去して中性ホルマリン溶液に固定した。対照群にヘパリン-DOCA接合体が投与されていない胃腸組織を準備した。前記組織試片(tissue specimens)は、アルコールを利用して水を除去した。試片は、着色されたシリコンを塗布して染色し、パラフィン内に包埋(embed)させた。前記包埋した組織は、マイクロトーム(microtome)を利用して-20℃で5μm厚に切断してスライドガラス上に載せた。続いて各々の組織断片をキシレンと無水アルコールで洗浄しパラフィンを除去した。製造された5μm厚の組織断片は、当技術分野で公知の方法によりヘマトキシリン(hematoxylin)及びエオシン(eosin)(H&E)を利用して染色した。少なくとも各4匹のラットを各々の試験用に使用した。
【００５５】
透過電子顕微鏡(TEM)で測定するために、胃、十二指腸、空腸そして回腸組織をPBS(0.1M、pH7.4)内1%四酸化オスミウム(osmium tetroxide)で固定した後、アルコールの濃度を50%〜100%まで徐々に変化させながら水和させた。前記水和させた組織に酸化プロピレン(propylene oxide)を浸透させ、エポン(epon)混合物に包埋させた。前記包埋された組織は、50nm〜60nm厚に切断した。このようなスライドは、酢酸ウラニル(uranyl acetate)及びクエン酸鉛(lead citrate)で1分間うすく染色した後、透過電子顕微鏡(Hitachi 7100、Tokyo、Japan)で観察した。
【００５６】
図5は、上皮細胞の露出、絨毛の融解, 粘膜微細管と血管の充血または外傷のような胃壁損傷が、胃、十二指腸、空腸及び回腸部分のどこにも発見されないことを示す。このような結果は、増加したヘパリン誘導体の吸収が胃腸の上皮細胞の破壊により発生しないということを確認させるものである。
【００５７】
図6は、ヘパリン誘導体により露出された後の、微細絨毛の形態を示した電子顕微鏡写真である。対照群は健康な密着結合(tight junction)、微細絨毛及びミトコンドリアを示している。1、2及び3時間後に、前記細胞等の外観は微細絨毛の融解、気孔や細胞毒性がある細胞等の不規則性等の損傷を示さなかった。組織損傷の不在は、胃腸管(GI Tract)内で結合したDOCAのヘパリン吸収に対する効果の増加が、前記組織構造の変化によるものではないことを示すものである。
【００５８】
実施例１４
低分子量ヘパリンとDOCAの結合
ヘパリンとDOCAの結合は、分別されない(unfractionated)ヘパリン(「UFH」)（すなわち、以前の実施例で単純に「ヘパリン」と言及する化合物）、分子量が6000のヘパリン（「LMWH(6K)」）、分子量が3000のヘパリン（「LMWH(3K)」）を使用したことを除外して、実施例1の方法により製造した。得られた接合体UFH-DOCA、LMWH(6K)-DOCA及びLMWH(3K)-DOCAの特徴を下記表2に示した。
【００５９】
【表２】
2004532851.tif 000004
a光散乱法で測定
【００６０】
DOCAに対するUFHの供給比率(FEED RETIO)が1:200の場合、UFH-DOCAで得られたヘパリンに対するDOCAの最大比率は10だった。このような条件で低分子量ヘパリンを用いた場合、LMWH(3K)-DOCAの比が1.3、LMWH(6K)-DOCAの比が3.6だった。
【００６１】
ヘパリンに対するDOCAのモル比は、ヘパリンの分子量が減少するほど減少する。これは、DOCAが結合できるアミン基が狭く分布されているためである。また、FXa分析によりたとえすべてのヘパリン-DOCA接合体が116.9±1.6から134.3±0.8と類似の生理活性を有すると示されても、ヘパリン-DOCA接合体の生理活性は、ヘパリンの分子量の減少と共に減少する。DOCAと結合後、すべてのヘパリン-DOCA接合体は未改変ヘパリンと比較して70%以上の相対的な生理活性を示した。
【００６２】
実施例１５
低分子量ヘパリン-DOCA接合体の経口吸収
実施例14で製造した低分子量のヘパリン-DOCA接合体を、実施例10の方法に基づき、ラットに経口投与後の胃腸管(GI Tract)内での吸収について試験した。図7は、胃腸管内ヘパリン-DOCA接合体吸収に対するヘパリン分子量の影響を示している。LMWH(3K)-DOCA、LMWH(6K)-DOCA及びUFH-DOCA（すなわちヘパリン-DOCA）は、各経口形チューブを利用して100mg/kgで投与した。LMWH(3K)-DOCA及びUFH-DOCAの凝固時間がLMWH(6K)-DOCAの凝固時間より低かった。1時間での平均aPTT時間は、各々31.0±6.01及び51.0±8.7であった(p<0.005)。このような結果は、LMWH(6K)-DOCAの凝固時間がLMWH(3K)-DOCA及びUFH-DOCAより各々1.5倍及び3倍程度高いことを示す。ヘパリン-DOCA接合体の時間による濃度変化は、aPTT分析の結果と類似していた。UFH-DOCAを100mg/kgで投与した場合、血漿の最大濃度は4.10±1.3μg/mlで、同一の投与量でのLMWH(6K)-DOCAの濃度と比較してみれば非常に低かった。
【００６３】
図8に示したように、胃腸管内でのLMWH(6K)-DOCAの吸収は、投与量を20mg/kg〜100mg/kgの範囲で測定した。100mg/kgのLMWH(6K)をラットに経口投与する場合、aPTT分析により測定された凝固時間は、投与後1時間で約30秒と測定された。このような曲線は、投与後2時間で基準線より低かった。反面、LMWH(6K)-DOCAの経口送達は、大きく上昇したaPTT値に見られるように、ラットでのヘパリン吸収の増加をもたらした。LMWH(6K)-DOCAを100mg/kgで投与した場合、最大血漿aPTT値は、基準aPTT値が平均20秒の場合、約87.8±11.1秒だった。20mg/kg及び50mg/kgで投与したヘパリン誘導体は、平均aPTT最大反応時間が各々52.5±4.7秒及び68.4±7.2秒であった(p＜0.005)。図8Aに図示したように、ヘパリンの治療範囲はaPTT基準線の約1.5〜2.5倍であり、20mg/kg投与時と一致した。
【００６４】
血漿内ヘパリン誘導体の濃度は、FXa分析により測定した。100mg/kgのLMWH(6K)-DOCAを経口投与した場合、LMWH(6K)の濃度は1.34±0.28μg/mlだった。この濃度が低いと、抗凝固活性が促進される。しかし、図8Bで示したように、用量100mg/kgにおいて、LMWH(6K)-DOCAの最大濃度は8.21±1.6μg/mlだった。治療対象範囲は、0.1 IU/ml〜0.2 IU/mlだった。最大平均濃度は、基準線より約9倍〜10倍程度高かった。このような結果は、ヘパリン誘導体が、深部静脈血栓症及び肺動脈塞栓症の危険がある患者に対して経口用抗凝固剤として作用できることを示すものである。
【００６５】
実施例１６
低分子量ヘパリン-DOCA接合体経口投与後の胃腸管組織検査
実施例14の方法により製造した低分子量のヘパリン-DOCA接合体をラットに100mg/kgで単独投与後、得られた胃腸管組織を実施例13の方法に基づいて組織検査を行なった。その結果、前記実施例13と実質的に類似した結果を示した。即ち、胃腸壁組織のどこにも損傷の痕跡が測定されなかった。
【図面の簡単な説明】
【００６６】
【図１】ラットに経口投与後、ヘパリン-DOCA接合体のaPTT分析により測定した凝固時間を示したグラフである(平均±SD, n=9)。 □- 100mg/kg 原料(raw) ヘパリン(対照群) ◆- ヘパリン(200mg/kg)及びDOCA(200mg/kg)の物理的20混合物 ▼- 50mg/kg ヘパリン-DOCA接合体 ▲- 80mg/kg ヘパリン-DOCA接合体 ■- 100mg/kg ヘパリン-DOCA接合体 ●- 200mg/kg ヘパリン-DOCA接合体
【図２】ラットに経口投与後、ヘパリン-DOCA接合体のFXa分析により測定した濃度を示したグラフである(平均±SD, n=9)。 □- 100mg/kg 原料ヘパリン(対照群) ▼- 50mg/kg ヘパリン-DOCA接合体 ▲- 80mg/kg ヘパリン-DOCA接合体 ■- 100mg/kg ヘパリン-DOCA接合体 ●- 200mg/kg ヘパリン-DOCA接合体
【図３】ヘパリンに対するDOCAモル比の関数として、ヘパリン-DOCA接合体のラットでの経口投与後の凝固時間を示したグラフである(平均±SD, n=9)。 ▼- 原料ヘパリン ▲- 2.5モル比■- 5.0モル比 ●- 10.0モル比
【図４】ヘパリンと結合した疎水性物質の関数として、ヘパリン誘導体のラットでの経口投与後の凝固時間を示したグラフである(平均±SD, n=9)。 ▼- ヘパリン-ラウリン酸接合体 ▲- ヘパリン-パルミチン酸接合体  ■- ヘパリン-コレステロール接合体  ●- ヘパリン-DOCA接合体
【図５】ヘパリン-DOCA接合体100mg/kgを経口投与した後ラットから切り取った、ヘマトキシリンヘマトキシリン及びエオシンで染色した胃腸組織の顕微鏡写真(micrograph)であり(全て×100)、 パネル A、B、C及びDは、各々0、1、2、3時間後の胃の横断面、 パネル E、F、G及びHは、各々0、1、2、3時間後の十二指腸の横断面、パネル I、J、K及びLは、各々0、1、2、3時間後の空腸の横断面、 パネル M、N、O及びPは、各々0、1、2、3時間後の回腸の横断面である。
【図６】ヘパリン-DOCA接合体100mg/kgを経口投与した後、切り取られた胃腸組織における膜または微細絨毛の電子顕微鏡写真であり(全て×25,000)、 パネル A、B、C及びDは、各々0、1、2、3時間後の胃の横断面、 パネル E、F、G及びHは、各々0、1、2、3時間後の十二指腸の横断面、 パネル I、J、K及びLは、各々0、1、2、3時間後の空腸の横断面、 パネル M、N、O及びPは各々0、1、2、3 時間後の回腸の横断面である。
【図７】図7A及び図7Bは、ラットに経口投与した後の、ヘパリン-DOCA接合体の凝固時間(図7A)及び濃度(図7B)を示したグラフである。 ▲- LMWH (3K)-DOCA ●- LMWH (6K)-DOCA ■- ヘパリン-DOCA (また、ヘパリンはUFH-DOCAにも置き換えられる)。
【図８】図8A及び図8Bは、ラットに経口投与した後の、LMWH (6K)-DOCAの凝固時間(図8A)と濃度(図8B)を示したグラフである。 ◆- 20 mg/kg LMWH (6K) 対照群 ▼- 100mg/kg LMWH (6K) 対照群 ▲- 20 mg/kg LMWH (6K)-DOCA ■- 50mg/kg LMWH (6K)-DOCA ●- 100mg/kg LMWH (6K)-DOCA
【図１】
2004532851.tif 000005
【図２】
2004532851.tif 000006
【図３】
2004532851.tif 000007
【図４】
2004532851.tif 000008
【図５−１】
2004532851.tif 000009
【図５−２】
2004532851.tif 000010
【図５−３】
2004532851.tif 000011
【図６−１】
2004532851.tif 000012
【図６−２】
2004532851.tif 000013
【図６−３】
2004532851.tif 000014
【図７】
2004532851.tif 000015
【図８】
2004532851.tif 000016
【国際公開パンフレット】
2004532851.tif 000017
2004532851.tif 000018
2004532851.tif 000019
2004532851.tif 000020
2004532851.tif 000021
2004532851.tif 000022
2004532851.tif 000023
2004532851.tif 000024
2004532851.tif 000025
2004532851.tif 000026
2004532851.tif 000027
2004532851.tif 000028
2004532851.tif 000029
2004532851.tif 000030
2004532851.tif 000031
2004532851.tif 000032
2004532851.tif 000033
2004532851.tif 000034
2004532851.tif 000035
2004532851.tif 000036
2004532851.tif 000037
2004532851.tif 000038
2004532851.tif 000039
2004532851.tif 000040
2004532851.tif 000041
2004532851.tif 000042
2004532851.tif 000043
2004532851.tif 000044
2004532851.tif 000045
2004532851.tif 000046
2004532851.tif 000047
2004532851.tif 000048
2004532851.tif 000049
2004532851.tif 000050
2004532851.tif 000051
2004532851.tif 000052
2004532851.tif 000053
2004532851.tif 000054
2004532851.tif 000055
2004532851.tif 000056
2004532851.tif 000057
2004532851.tif 000058
2004532851.tif 000059
2004532851.tif 000060
2004532851.tif 000061
2004532851.tif 000062
2004532851.tif 000063
2004532851.tif 000064
2004532851.tif 000065
2004532851.tif 000066
2004532851.tif 000067
2004532851.tif 000068
2004532851.tif 000069
2004532851.tif 000070
2004532851.tif 000071
2004532851.tif 000072
2004532851.tif 000073
【手続補正書】
【提出日】平成15年7月2日(2003.7.2)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
(a) 胆汁酸、ステロール、アルカン酸及びこれらの混合物からなる群から選択された疎水性物質と巨大分子製剤(macromolecule agent)を結合させ、疎水化された巨大分子製剤を得ること、及び
(b) 前記疎水化された巨大分子製剤をこれを必要とする患者に有効量で経口投与することを含む、巨大分子製剤の経口投与向上方法。
【請求項２】
前記疎水性物質が、コール酸、デオキシコール酸、ケノデオキシコール酸、リトコール酸、ウルソコール酸、ウルソデオキシコール酸、イソウルソデオキシコール酸、ラゴデオキシコール酸、グリココール酸、タウロコール酸、グリコデオキシコール酸、グリコケノデオキシコール酸、デヒドロコール酸、ヒオコール酸、ヒオデオキシコール酸及びこれらの混合物からなる群から選択された胆汁酸であることを特徴とする、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
前記胆汁酸が、デオキシコール酸であることを特徴とする、請求項2に記載の方法。
【請求項４】
前記疎水性物質が、コレスタノール、コプロスタノール、コレステロール、エピコレステロール、エルゴステロール、エルゴカルシフェロール及びこれらの混合物からなる群から選択されたステロールであることを特徴とする、請求項1に記載の方法。
【請求項５】
前記疎水性物質が、炭素数約4乃至20のアルカン酸であることを特徴とする、請求項1に記載の方法。
【請求項６】
前記アルカン酸が、酪酸、吉草酸、カプロン酸、カプリル酸、カプリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸及びこれらの混合物からなる群から選択されたことを特徴とする、請求項5に記載の方法。
【請求項７】
前記巨大分子製剤が、スルホニルポリサッカライド(sulfonyl polysaccharide)、ポリサッカライド誘導体及びこれらの混合物からなる群から選択されたことを特徴とする、請求項1に記載の方法。
【請求項８】
前記巨大分子製剤が、ペプチド(peptide)であることを特徴とする、請求項1に記載の方法。
【請求項９】
前記巨大分子製剤が、インスリン(insuline)であることを特徴とする、請求項8に記載の方法。
【請求項１０】
前記巨大分子製剤が、カルシトニン(calcitonin)であることを特徴とする、請求項8に記載の方法。
【請求項１１】
胆汁酸、ステロール、アルカン酸及びこれらの混合物からなる群から選択された疎水性物質に共有結合された、スルホニルポリサッカライド、ヘパリノイド及びこれらの混合物からなる群から選択された成分を含む有効量の組成物を経口投与することを含む、抗凝固治療が要求される患者の治療方法。
【国際調査報告】
2004532851.tif 000074
2004532851.tif 000075
2004532851.tif 000076