(57)【要約】本発明は、フーリエ変換質量分析（ＦＴＭＳ）を用いて複雑な生物学的系を高情報量（ＨＩＣ）分析またはスクリーニングする方法に関する。本方法は、高分子量分子（例えば、ポリヌクレオチド、タンパク質、多糖類）および低分子量分子（例えば、オリゴヌクレオチド、ペプチド、脂質、オリゴ糖、ステロイドホルモン、異化および代謝中間体）の双方を含有する複雑な生物学的混合物を分析するのに有用であり、複雑な生物学的サンプル間の分子の差異の解明を可能にし、また、生理活性分子（例えば、治療に有効な薬物など）の同定を可能にする。【特許請求の範囲】
【請求項１】
候補生理活性物質に曝されていない細胞に由来する第１の生物学的サンプルのＦＴＭＳピークプロファイルを、上記候補生理活性物質に曝された細胞に由来する第２の生物学的サンプルのＦＴＭＳピークプロファイルと比較することを含んでなる方法。
【請求項２】
ａ） 第１の細胞集団に第１の候補生理活性物質を接触させ、
ｂ） 上記第１の細胞集団に対してＦＴＭＳ分析を行って第１のピークプロファイルを取得し、さらに
ｃ） 上記第１のプロファイルを、上記第１の物質の不在下における上記第１の細胞集団からの参照プロファイルと比較する、
ことを含んでなる方法。
【請求項３】
第１の細胞集団に対してＦＴＭＳ分析を行い、少なくとも２つのピークが異なるタイプの生体分子に対応している複数のピークを含む第１のピークプロファイルを得ることを含んでなる方法。
【請求項４】
上記の異なるタイプの生体分子がタンパク質および代謝産物を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
ａ） 少なくとも第１および第２の細胞亜集団を含む細胞集団を提供し、
ｂ） 第１の細胞亜集団に第１の候補生理活性物質を接触させ、
ｃ） 第２の細胞亜集団に第２の候補生理活性物質を接触させ、
ｄ） 上記第１および第２の細胞亜集団に対してＦＴＭＳ分析を行って、それぞれ第１および第２のピークプロファイルを取得し、
ｅ） 上記第１および第２のピークプロファイルを、上記物質の不在下における上記細胞集団からの参照プロファイルと比較する、
ことを含んでなる方法。
【請求項６】
亜集団のライブラリーを候補生理活性物質のライブラリーと接触させる、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
上記候補生理活性物質が小分子の薬物候補である、請求項５または６に記載の方法。
【請求項８】
上記候補生理活性物質がペプチドである、請求項５または６に記載の方法。
【請求項９】
上記亜集団がＦＴＭＳ分析の前に調製される、請求項５に記載の方法。
【請求項１０】
上記の調製が分離ステップである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
ａ） 第１の細胞集団に薬物を接触させ、
ｂ） 上記細胞集団に対してＦＴＭＳ分析を行ってピークプロファイルを取得し、さらに
ｃ） 上記のプロファイルを上記薬物の不在下における上記細胞集団からの参照プロファイルと比較する、
ことを含んでなる方法。
【請求項１２】
ａ） 少なくとも第１および第２の亜集団を含む細胞集団を提供し、
ｂ） 第１の細胞亜集団に第１濃度の薬物を接触させ、
ｃ） 第２の細胞亜集団に第２濃度の薬物を接触させ、
ｄ） 上記第１および第２の細胞亜集団に対してＦＴＭＳ分析を行って、それぞれ第１および第２のピークプロファイルを取得し、さらに
ｅ） 上記第１および第２のピークプロファイルを比較して、強度が異なる少なくとも１つのピークを同定し、このピークは上記薬物に対応するものではない、
ことを含んでなる方法。
【請求項１３】
上記第１および第２のピークプロファイルの少なくとも１つを、上記薬物の不在下における上記細胞集団からの参照プロファイルと比較することをさらに含んでなる、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
ａ） 第１の細胞集団に対してＦＴＭＳ分析を行って第１のピークプロファイルを取得し、
ｂ） 第２の細胞集団に対してＦＴＭＳ分析を行って第２のピークプロファイルを取得し、ここにおいて、上記第１および第２の細胞集団は異なる細胞タイプのものであり、さらに
ｃ） 上記第１および第２のピークプロファイルを比較して、強度の異なる少なくとも１つのピークを同定する、
ことを含んでなる方法。
【請求項１５】
上記の異なる強度のピークを生じる分子を同定することをさらに含んでなる、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
少なくとも５つの異なる細胞タイプに対してＦＴＭＳ分析を行うことをさらに含んでなる、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
上記細胞集団の少なくとも１つが上記ＦＴＭＳ分析の前に第１の候補生理活性物質に曝される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
上記集団がさまざまな個体に由来する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１９】
上記集団の少なくとも１つが疾病状態の動物に由来する、請求項１４に記載の方法。
【請求項２０】
上記のピークプロファイルがコンピューター記憶装置のデータベースに保存される、請求項１４に記載の方法。
【請求項２１】
ａ） 癌細胞集団に対してＦＴＭＳ分析を行って第１のピークプロファイルを取得し、
ｂ） 上記第１のピークプロファイルを非癌細胞集団からの参照プロファイルと比較して、強度の異なる少なくとも１つのピークを同定する、
ことを含んでなる方法。
【請求項２２】
ａ） 疾病状態の生物に由来する細胞集団に対してＦＴＭＳ分析を行って第１のピークプロファイルを取得し、
ｂ） 上記第１のピークプロファイルを、上記疾病状態のない生物に由来する細胞集団からの参照プロファイルと比較して、強度の異なる少なくとも１つのピークを同定し、
ｃ） 上記ピークを確認する、
ことを含んでなる方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、フーリエ変換質量分析（Ｆｏｕｒｉｅｒ ｔｒａｎｓｆｏｒｍ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ： ＦＴＭＳ）を用いて複雑な生物学的系を高情報量（ｈｉｇｈ ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｃｏｎｔｅｎｔ： ＨＩＣ）分析またはスクリーニングするための方法に関する。本方法は、複雑な生物学的サンプル間の分子の差異の解明を可能とするため、また、生理活性分子（例えば、治療に有効な薬物）の同定を可能とするために、高分子量分子（例えば、ポリヌクレオチド、タンパク質、多糖類）と低分子量分子（例えば、オリゴヌクレオチド、ペプチド、脂質、オリゴ糖、ステロイドホルモン、異化および代謝中間体）の両者を含有する複雑な生物学的混合物を分析するのに有用である。
【０００２】
（発明の背景）
質量分析は原子または分子の質量（それぞれ原子質量および分子質量という）を測定する分析技術である。分子質量はその分子内の各元素の原子質量の理論的総和であるので、実験式の異なる各々のアナライトには特徴的な測定値が与えられる。
【０００３】
分子質量の測定に用いる装置は質量分析計として知られている。典型的には、質量分析はアナライトを（気相中で）揮発させた後、アナライトをイオン化してシグナルを検出することにより行われる。ほとんどのタイプの質量分析計で、検出器は１タイプの電子増倍管からなる。このような検出器に衝突するイオンは二次電子を生み出し、これを測定可能な電流として記録する。この点でＦＴＭＳ装置はイメージ電流を測定することによりイオンを間接的かつ非破壊的に測定するという特徴を有し、独特のものである。最終的に得られたデータ、すなわち質量スペクトルは、質量／電荷比スケール（ｘ軸）と強度スケール（ｙ軸）の２つの座標を有する。
【０００４】
気相イオン（中性分子と電荷分子の両者から形成される）の分子質量は、それらの質量／電荷（ｍ／ｚ）比に基づいて決定される。気相イオンのさらなるフラグメント化が必要な場合には、それらを気体分子に衝突させることにより、いわゆる「衝突誘導解離」（ｃｏｌｌｉｓｉｏｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ： ＣＩＤ）によりこれを達成することができる。次に、その生じたサブフラグメントを質量により分離する。
【０００５】
近年では、質量分析は様々な生物学的状況において利用されており、例えば、核酸の配列決定、ペプチドの配列決定および同定（ＫｅｅｎおよびＦｉｎｄｌａｙ， ”Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，” ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ． Ｒｏｂｅｒｔ Ａ． Ｍｅｙｅｒｓ編， ＶＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ， Ｉｎｃ． １９９５， ｐ．７７１； ＣａｒｒおよびＡｎｎａｎ， ”Ｏｖｅｒｖｉｅｗ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｂｙ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ，” ｉｎ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ａｕｓｕｂｅｌら編， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．， １９９７， １０．２１）； ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏタンパク質翻訳後修飾および発現の検出（Ｒｏｗｌｅｙら， ２０００， Ｍｅｔｈｏｄｓ ２０：３８３−３９７）；タンパク質三次元構造の解明（ＬａｓｔおよびＲｏｂｉｎｓｏｎ， １９９９， Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｃｈｅｍ． Ｂｉｏｌ． ３：５６４−５７０）；不安定な非共有結合生体分子の研究（Ｂｕｄｎｉｋら， ２０００， Ｒａｐｉｄ Ｃｏｍｍｕｎ． Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．１４：５７８−５８４）；疾病診断（ＢａｒｔｌｅｔｔおよびＰｏｕｒｆａｒｚａｍ， １９９９， Ｊ． Ｉｎｈｅｒｉｔ． Ｍｅｔａｂ． Ｄｉｓ． ２２：５６８−５７１）；環境汚染の監視（Ｓｃｒｉｂｎｅｒら， ２０００， Ｓｃｉ． Ｔｏｔａｌ Ｅｎｖｉｒｏｎ． ２４８：１５７−１６７）；農業上のスクリーニング（Ｈａｕら， ２０００， Ｊ． Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ． ８７８：７７−８６）；ならびに法医学的用途（Ｈｏｌｌｅｎｂｅｃｋら， １９９９， Ｊ． Ｆｏｒｅｎｓｉｃ Ｓｃｉ． ４４：７８３−７８８； ＧａｉｌｌａｒｄｍおよびＰｅｐｉｎ， １９９９， Ｊ． Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ． Ｂ． Ｂｉｏｍｅｄ． Ｓｃｉ． Ａｐｐｌ． ７３３：１８１−２２９）が挙げられる。
【０００６】
質量分析は、フェムトモル感度と０．０１％を上回る精度があり、ペプチドの配列決定および同定のための化学的方法に代わる魅力的な代替法として登場した。質量分析の感度は、同位元素標識ペプチドを用いること、およびナノエレクトロスプレー・イオン源と四重極型飛行時間型タンデム質量分析計を組み合わせることで改良されてきた。このアプローチは四重極型飛行時間型装置の固有の特徴を活用して、他のタイプの質量分析計よりも高い感度と解像度を得るものである（Ｓｈｅｖｃｈｅｎｋｏら， １９９７， Ｒａｐｉｄ Ｃｏｍｍ． Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ． １１：１０１５−１０２４）。例えば１：１ １６Ｏ／１８Ｏ水中でのタンパク質の酵素的消化による、Ｃ末端ペプチドフラグメントの同位元素標識では、容易に同定できるこれらのフラグメントの特徴的な同位元素分布が得られ（Ｓｃｈｎｏｌｚｅｒら， １９９６， Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ， １７：９４５−９５３）、これによりアミノ酸配列が明らかとなる。
【０００７】
また、質量分析はタンパク質の構造を研究するうえでも使用できる。この技術により５００，０００ ダルトン（「Ｄａ」）までの質量をもつ微量の目的タンパク質の正確な分子質量が得られる。得られるスペクトルはまた、タンパク質の折りたたみ、タンパク質の自己会合、ならびにその他のコンホメーション変化や三次元構造を決定する助けともなる（Ｎｇｕｙｅｎら， １９９５， Ｊ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ Ａ ７０５：２１−４５）。さらに、タンパク質の翻訳時または翻訳後修飾も同定してマッピングすることができる。この方法はＣ末端配列決定などの化学的方法よりも好ましく、化学的方法ではこういったタンパク質修飾を変更または破壊することがある比較的苛酷なサンプル処理を必要とする。質量分析を用いて同定できる翻訳後修飾としては、リン酸化、グリコシル化、脱アミド化、アルキル化、イソアスパチル形成およびジスルフィド結合形成が挙げられる。
【０００８】
質量分析はまたタンパク質間相互作用の研究でも重要な適用が見出されている。標的タンパク質をｉｎ ｖｉｖｏで追跡してそれらのコンホメーション変化、活性部位の使用、リガンド認識、多量体複合体（例えばホロ酵素）への集合、およびオルガネラ間の輸送を実証することもできる。
【０００９】
フーリエ変換質量分析（ＦＴＭＳ）はフーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴（ＦＴＩＣＲ）としても知られている。ＦＴＭＳに用いられる分子質量測定の原理は、イオンの質量とそのサイクロトロン周波数との間の直線的関係に基づいている。一様な磁場では、イオンはサイクロトロン運動として知られる周期的円運動で磁場の中心の周りを回る。特定の質量／電荷比（ｍ／ｚ）を有するイオンが集合すると、同位相のサイクロトロン運動を行うことができ、イメージ電流が生じる。このイメージ電流が受信電極対の間で検出され、正弦波シグナルが生じる。フーリエ変換は多くの異なるｍ／ｚ集合からのシグナルを周波数 （質量スペクトルとしても知られる） に分けるのに用いられる数学的デコンボルーション法である。他の形態の質量分析とは異なり、ＦＴＭＳは非破壊的である。ＦＴＭＳの全般的な総論としては、ＨｅｎｄｒｉｃｋｓｏｎおよびＥｍｍｅｔｔ， １９９９， Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｐｈｙｓ． Ｃｈｅｍ． ５０：５１７−５３６を参照されたい。ＦＴＭＳの生物科学への応用は他の質量分析応用例とほぼ同じである。例えば、Ｓｍｉｔｈら， １９２６， ”Ｔｈｅ Ｒｏｌｅ ｏｆ Ｆｏｕｒｉｅｒ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍ Ｉｏｎ Ｃｙｃｌｏｔｒｏｎ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ ｉｎ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｒｅｓｅａｒｃｈ − Ｎｅｗ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ” ｉｎ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ ｉｎ ｔｈｅ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ａ．Ｌ． ＢｕｒｌｉｎｇａｍｅおよびＳ．Ａ． Ｃａｒｒ編， Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ， Ｔｏｔｏｗａ， Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ； ＭｃＬａｆｆｅｒｔｙ， １９９４， Ａｃｃ． Ｃｈｅｍ． Ｒｅｓ． ２７：３７９−３８６を参照されたい。
【００１０】
多くの研究者が生物学的サンプルの分析におけるＦＴＭＳの使用を評価し始めている； Ｊｅｎｓｅｎら， Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ２０００ ２１：１３７２−１３８０； Ｊｅｎｓｅｎら， Ａｎａｌ． Ｃｈｅｍ． １９９９ ７１：２０７６−２０８４； Ｐａｌｂｌａｄら， Ｒａｐｉｄ Ｃｏｍｍ． Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃ ２０００， １４：１０２９−１０３４； ＷＯ　９５／２５２８１； ＷＯ ００／２９９８７； ＷＯ ００／０３２４０； ＷＯ ９９／５８７２７； ＷＯ ９９／５７３１８； ＷＯ ９９／４６０４７； Ｌｉら， Ａｎａｌ． Ｃｈｅｍ． １９９９ ７１：４３９７−４４０２； Ｐｅｎｎら， Ａｎａｌ． Ｃｈｅｍ． １９９７； ６６９：２４７１−２４７７；ならびに米国特許第６，０１７，０９３および同第４，２２４，０３１号を参照されたい。
【００１１】
創薬に有用な分析方法は主として個々の終了点の観察に基づいている。生体外物質（異物）介入についての特定の生物学的相互作用（例えば、受容体−リガンド、基質−酵素）のターゲッティングは、化学ライブラリーを採掘するための一般的なパラダイムとなっている。製薬、バイオテクノロジーおよびゲノミクス会社による創薬の伝統的なアプローチは、一般に細胞フリーのアッセイを用いて単一の標的について大きな化学ライブラリーを並行スクリーニングする必要がある古典的ハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）である。ＨＴＳに用いる化学ライブラリーはほとんどの場合、コンビナトリアルケミストリーを用いて作製される。天然源から得られた化学物質や「従来の」化学を用いて生成された化学物質のコレクションはＨＴＳではあまり用いられていない。
【００１２】
ＨＴＳアプローチは確認された標的、通常はタンパク質（例えば、酵素、受容体、輸送タンパク質）または核酸（遺伝子、ｍＲＮＡ）を前提としている。従ってＨＴＳによるスクリーニングに用いる標的タンパク質または核酸は一般に知られており、疾病状態において何らかの役割を果たすと考えられる。そして、創薬のリード化合物として求められるのは標的タンパク質のモジュレーターだけである。研究者らは、その標的タンパク質が疾病とは無関係であることを後で見出すためだけに、標的に対してＨＴＳを行っているのである。例えば、受容体は様々なサブタイプの形で存在する可能性があり、その中の１つだけが決定的に重要である場合もあるので、間違った受容体のサブタイプをターゲッティングするノックアウトマウスは関係のある表現型を示さない可能性が大きい。多くの生体機能は重複した生化学経路によって支えられていることが明らかになってきている。ある経路が働かなくなれば、重複機構が引き継ぐ。特定の標的に基づいて開発された多くの薬物は、重複する生化学経路がその標的が関与する経路を迂回するので、ｉｎ ｖｉｖｏで治療活性をほとんどまたはまったく示さない。
【００１３】
ＨＴＳを成功させるには、標的は通常、適切な細胞環境または生物学的状況を必要とする。例えば、膜受容体は、その受容体が通常見られるものと同様の膜に存在すべきであり、そうでなければ受容体の特性は人工的な影響を受けかねない。適切な膜セッティングは、適当な脂質を用いて膜を再構成する必要があるかもしれない。このような状況下での適切な膜環境の再構成は、そのような環境の構成要素の十分詳細な知識が欠如しているため、あるいは天然の膜セッティングが複雑なため、最も厄介なタスクとなっている。
【００１４】
さらに、古典的なＨＴＳを成功させるには、確認ひいてはスクリーニングに好適な標的の選択を可能とする、対象の疾病または障害のメカニズムについての情報が必要である。そのような詳細な情報がなければ、古典的なＨＴＳは行えない。
【００１５】
この技術のもう１つの限定要因となるのは、確認された標的に基づくＨＴＳがその標的のモジュレーターのみを明かすものでないことである。結局、コストと労力のかかるこのスクリーニング法では、せいぜい、可能性のある試験化合物の小さなサブセットしか得られない。
【００１６】
従って、天然環境下にある複数の未確認標的のモジュレーターについての偏りのない同時スクリーニングを可能とする方法が、コストを軽減しつつ創薬のペースを大きく向上させるであろう。特に特定の状態（疾病状態、発達状態、分化状態など）において異常な量で存在する小分子を同定することができれば、これらの分子の類似体、アゴニストまたはアンタゴニストを設計する助けとなり、限定されるものではないが、医薬、獣医用薬物、農業用薬物（除草剤、寄生虫／害虫駆除剤、植物ホルモンアゴニストなど）および環境用薬物（殺菌剤、石油流出浄化のための増菌剤、イガイ増殖抑制剤、藻類増殖抑制剤など）をはじめとする、特異性の高い薬物の迅速な同定につながるだろう。
【００１７】
「バイオインフォーマティクス」とは、一般にデータの保存（情報を容易に検索できる効率的な方法でのデータの登録）と、コンピューター集中管理数学演算（統計解析、非線形解析など）を用いるデータ解析を含めた、コンピューター手段を用いる生物学的データの管理をさす。バイオインフォーマティクスは、より有効な生理活性分子をデザインすることを目的として、ハイスループットスクリーニングおよびコンビナトリアルケミストリーを用いて作成した大量のデータを用いて構造−活性相関を調べるために集中的に用いられる。バイオインフォーマティクスの状態は過去２０年で利用可能となってきた遺伝子配列情報の氾濫を体系化して利用しやすいようにする必要から発達した。バイオインフォーマティクスは、初期の頃には正常な遺伝子配列の目録を作成するために用いられたが、現在では一次配列とマイクロアレイを用いて得られた遺伝子発現データにおけるパターン認識に基づくタンパク質構造の同定を含むに至っている（例えば、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋを参照されたい）。
【００１８】
異なる細胞タイプで異なって発現または調節される遺伝子産物を同定するのに有用な遺伝子発現プロファイリング法（例えば、それらの機能を同定する手段としてのもの）は、ディファレンシャル・ディスプレー、遺伝子発現の逐次分析（ｓｅｒｉａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ： ＳＡＧＥ）、核酸アレイ法、サブトラクティブ・ハイブリダイゼーション、プロテオーム解析、および二次元タンパク質ゲルの質量分析を含む。遺伝子発現プロファイリング法は以下の参照文献のような例がある：ディファレンシャル・ディスプレー（ＬｉａｎｇおよびＰａｒｄｅｅ， １９９２， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５７：９６７−９７１）、プロテオーム解析（Ｈｕｍｐｈｅｒｙ−Ｓｍｉｔｈら， １９９７， Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ １８：１２１７−１２４２； Ｄａｉｎｅｓｅら， １９９７， Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ １８：４３２−４４２）、ＳＡＧＥ （Ｖｅｌｃｕｌｅｓｃｕら， １９９５， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７０：４８４−４８７）、サブトラクティブ・ハイブリダイゼーション（ＷａｎｇおよびＢｒｏｗｎ， １９９１， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ８８：１１５０５−１１５０９）、および核酸アレイを用いたハイブリダイゼーションに基づく方法（Ｈｅｌｌｅｒら， １９９７， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ９４：２１５０−２１５５； Ｌａｓｈｋａｒｉら， １９９７， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ９４：１３０５７−１３０６２； Ｗｏｄｉｃｋａら， １９９７， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １５：１２５９−１２６７）。
【００１９】
ヒトゲノムプロジェクトなどのゲノムシーケンシングプロジェクトが遺伝子配列の大きなデータベースを作り上げている。しかし生物学的機能はヌクレオチド配列データからだけでは決定できず、むしろ最終的には遺伝子産物をタンパク質レベルで研究することで確立しなければならない。タンパク質それ自体を研究することによってはじめて、その発現パターン、ｉｎ ｖｉｖｏでの他の分子との会合、および正常組織や罹患組織でのその役割が理解できる。これらのゲノミクスの欠点を理解したところで、科学者らは「プロテオミクス」的アプローチをとってきた。プロテオミクスの分野は、タンパク質の電荷と質量によって何千というタンパク質を分離できる二次元ポリアクリルアミドゲル電気泳動（２−Ｄ ＰＡＧＥ）を用いて発達してきた。次に、得られたタンパク質パターンを比較して、ユニークなパターンを特定の細胞タイプまたは疾病状態に割り当てるようにする。しかし、２−Ｄ ＰＡＧＥでは複雑なサンプル中に存在する多数のタンパク質を分離することはできず、しかもこの技術には時間と労力とコストがかかる。さらに、２−Ｄ ＰＡＧＥはまた存在量の少ないタンパク質を検出することが著しく困難でもある。２−Ｄ ＰＡＧＥは相対的に、特にＦＴＭＳと比べて、ダイナミックレンジが小さい。
【００２０】
本明細書で参照文献を挙げたり説明したりしているが、それらが本発明の先行技術であることを容認するものではない。
【００２１】
（発明の概要）
上記に概説した目的に従い、本発明は、候補生理活性物質に曝されていない細胞に由来する第１の生物学的サンプルのＦＴＭＳピークプロファイルを、上記候補生理活性物質に曝された細胞に由来する第２の生物学的サンプルのＦＴＭＳピークプロファイルと比較することを含んでなる方法を提供する。
【００２２】
さらなる態様では、本発明は、第１の細胞集団に第１の候補生理活性物質を接触させ、該第１の細胞集団に対してＦＴＭＳ分析を行って第１のピークプロファイルを得ることを含んでなる方法を提供する。この第１のプロファイルを、第１の物質の不在下における第１の細胞集団からの参照プロファイルと比較する。
【００２３】
さらなる態様では、本発明は、第１の細胞集団に対してＦＴＭＳ分析を行い、複数のピーク（ここで、少なくとも２つのピークは異なるタイプの生体分子に対応する）を含む第１のピークプロファイルを得ることを含んでなる方法を提供する。
【００２４】
さらなる態様では、本発明は、少なくとも第１および第２の細胞亜集団を含む細胞集団を提供し、第１の細胞亜集団に第１の候補生理活性物質を接触させることを含んでなる方法を提供する。第２の細胞亜集団に、第２の候補生理活性物質を接触させ、第１および第２の細胞亜集団に対してＦＴＭＳ分析を行って、それぞれ第１および第２のピークプロファイルを得る。この第１および第２のピークプロファイルを、上記物質の不在下における上記細胞集団からの参照プロファイルと比較する。
【００２５】
さらなる態様では、本発明は、第１の細胞集団に薬物を接触させ、その細胞集団に対してＦＴＭＳ分析を行ってピークプロファイルを得ることを含んでなる方法を提供する。このプロファイルを、上記薬物の不在下における上記細胞集団からの参照プロファイルと比較する。
【００２６】
さらなる態様では、本発明は、少なくとも第１および第２の亜集団を含む細胞集団を提供し、第１の細胞亜集団に第１濃度の薬物を接触させ、第２の細胞亜集団に第２濃度の薬物を接触させることを含んでなる方法を提供する。この第１および第２の細胞亜集団に対してＦＴＭＳ分析を行って、それぞれ第１および第２のピークプロファイルを得る。この第１および第２のピークプロファイルを比較して、強度の異なるピークを少なくとも１つ同定する（ただし、このピークは上記薬物に対応するものではない）。
【００２７】
さらなる態様では、本発明は、第１の細胞集団に対してＦＴＭＳ分析を行って第１のピークプロファイルを得、第２の細胞集団に対してＦＴＭＳ分析を行って第２のピークプロファイルを得る（ただし、上記第１および第２の細胞集団は異なる細胞タイプのものである）ことを含んでなる方法を提供する。この第１および第２のピークプロファイルを比較して、強度の異なるピークを少なくとも１つ同定する。
【００２８】
さらなる態様では、本発明は、ＦＴＭＳ分析と組み合わせたＳＡＲ（構造−活性相関）ソフトウェアを用いて化学的仮説をたて、新規な生理活性分子を作り出す方法を提供する。
【００２９】
さらなる態様では、本発明は、疾病状態の構成成分および経路を調べる方法を提供する。これらの方法は疾病状態をもつ生物に由来する細胞集団に対してＦＴＭＳ分析を行って第１のピークプロファイルを得ることを含んでなる。次にこのピークプロファイルを、疾病状態でない生物に由来する細胞または同生物の非罹患組織に由来する細胞からの参照プロファイルと比較する。この比較によって、強度が異なるか、または一方のプロファイルには存在するが他方には存在しない、少なくとも１つのピークを同定する。次にこのピークを生じさせる細胞成分を同定する。この情報は様々な方法で用いることができる。その細胞成分の結合相手についてデータベースを検索して、その疾病状態の細胞経路を解明することもできる。その細胞成分またはその結合相手を薬物候補のスクリーニングに用いてもよい。
【００３０】
さらなる態様では、本発明は、新薬を開発するためのスクリーニング法を提供する。この方法は、細胞に候補物質を加え、表現型の変化をスクリーニングすることを含んでなる何回かの予備スクリーニング法の使用を含む。次に、表現型が変化した細胞に対してＦＴＭＳ分析を行い、関連のピークを同定する。あるいはまた、望ましい効果のピークプロファイルが得られたら、これらの望ましいピークプロファイルを模倣する候補薬物、例えば構造−活性相関（ＳＡＲ）研究で得られたものなど、のスクリーニングを行うことができる。
【００３１】
さらなる態様では、本発明は新規薬物設計方法を提供する。この方法は候補化合物の限定されたセットまたはライブラリーに対して複数回のＦＴＭＳ分析を行うことを含む。次に、得られたピークプロファイルを望ましいピークプロファイル（例えば既知の薬物または非罹患細胞を用いて作成されたもの）と比較して、関連のある「形状」、「ファーマコフォア」、または「活性部位」を同定する。その後、これらの結果を仮想の化学ライブラリーでスクリーニングし、従来のスクリーニング法およびＦＴＭＳスクリーニング法で試験するための追加の化合物を同定することができる。
【００３２】
（発明の開示）
本発明者らは、複雑な生物学的サンプルのＦＴＭＳスペクトルが、該サンプル中に存在する個々の分子の分析を可能とするのに必要な分解能と感度を有し、各分子が該サンプルのピークプロファイル中に１以上のユニークなＦＴＭＳピークを生じさせることを見出した。特定のピークに的を絞ることができるので、ピークの強度を測定することができ、それゆえに、複雑な生物学的サンプル中のそのピークに対応する分子の相対濃度を測定することができる。この特徴は比較研究に特に有用であり、様々な生物学的状態にある特定の分子を研究し、特定の生物学的状態の各々を特徴付けることが可能であり、高情報量スクリーニング（ｈｉｇｈ ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｃｏｎｔｅｎｔ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ： ＨＩＣＳ）または高情報量分析（ｈｉｇｈ ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｃｏｎｔｅｎｔ ａｎａｌｙｓｉｓ： ＨＩＣＡ）の助けとすることができる。ＦＴＭＳによる高情報量スクリーニングまたは分析は以下、ＨＩＣＳ−ＦＴＭＳおよびＨＩＣＡ−ＦＴＭＳという。このように、１度にせいぜい一握りの分子しか検討できない従来のアプローチとは異なり、ＨＩＣＳ−ＦＴＭＳおよびＨＩＣＡ−ＦＴＭＳは、これまでに利用可能であった方法よりもほとんどの生物学的課題に有用なより一般的な利用可能性を有する。これは複雑な系の種々の時点での生物学的状態を特徴付け、識別するためのＨＩＣＳ−ＦＴＭＳおよびＨＩＣＡ−ＦＴＭＳの使用を包含する。特に、この強力な技術は、正常状態と罹患状態を比較し、疾病の進行過程での特徴的なマーカーを同定して、薬物治療をモニタリングするために用いる場合には、臨床上の意味合いを持つ。さらに本発明は、タンパク質間相互作用を解明し、オルガネラおよび細胞質構成要素を突きとめ、多量体のタンパク質複合体を特徴づけることによる、ＨＩＣＳ−ＦＴＭＳを用いた薬物開発も包含する。
【００３３】
ＦＴＭＳは従来の質量分析（ＭＳ）に優る多くの明らかな利点および恩恵をもたらす。ＦＴＭＳの分解能、精度および感度は複雑な生物学的サンプルの分析に対して理想的なものである。これらのサンプルは、限定されるものではないが、リポタンパク質、プロテオグリカンや化学修飾分子（例えば、リン酸化タンパク質）をはじめとする、核酸、タンパク質、脂質およびオリゴ糖などの高分子質量成分、ならびにペプチド、中間代謝産物、薬物代謝産物および異化産物などの低分子質量成分を含み得る。このような細胞系の化学的複雑性を解読するには極めて高い分解能と質量精度が必要である。あらゆる質量分析技術の中で、ＦＴＭＳは分解能と質量精度の点で最高の性能を達成し得るものである。
【００３４】
また、ＦＴＭＳの非破壊的特性は少量サンプルの分析および再分析を可能とし、その分解能は種々の細胞成分の特異的特性決定および同定を可能とする。このように、ある特定の実施におけるこれら技術のダイナミック質量レンジは１０３から１０４のオーダーであると考えられるので、一連の分析ではこの範囲の拡大が可能となるというのが１つの利点である。ＦＴＭＳでは従来の質量分析を用いる際に必要とされていたような前処理分離（２Ｄ−ＰＡＧＥ、ＨＰＬＣ、ＧＣなど）の必要がなくなり、また、ＦＴＭＳは２Ｄ−ＰＡＧＥよりも広いダイナミックレンジをもつ。さらに、ＦＴＭＳの磁力は技術の進展とともに増加するので、ダイナミックレンジおよび分解能は高まるであろう。またＦＴＭＳの非破壊的性質により、種々のタイプの生体分子（例えば、タンパク質、脂質、炭水化物、代謝産物など）の分析を、同一のサンプルまたは同様のサンプルについて一度に、あるいは連続して実施できるようになる。すなわち、ＦＴＭＳの非破壊性は、最初の実験条件を変えることにより、また調製ステップを変えることにより、また溶媒および実施条件（質量カットオフなど）を変えることにより確固たる情報を生み出し得る。
【００３５】
このように本発明は様々な細胞成分、作用機構および経路の解明を可能とするいくつかの異なるアッセイおよび分析を提供する。本発明には３つの中心的用途がある。ある好ましい実施形態では、本発明は疾病状態の構成成分および経路を解明・発見するために用いる。例えば、罹患組織（または以下に概説するように、熱、ストレスなどの種々の処理に曝された組織または細胞）を「正常」組織と比較することで、疾病に関わる重要な分子の解明が可能となる。また、疾病の経路も解明できる。
【００３６】
第２に本発明はまた、疾病の治療に使用できる新しい薬物候補の発見／スクリーニングを提供する。例えば、関連のある効果（例えば、特定の分子の有無、疾病スペクトルまたは望ましいもしくは望ましくない作用を有する薬物のスペクトルのピーク）が同定されれば、薬物候補の化学ライブラリーを関連のある効果の倍増または回避に関してスクリーニングすることができる。従って、例えば、最初の「ヒット」に関して新しい化学ライブラリーをスクリーニングしたり、あるいは関連のある骨格が同定されたところで構造−活性相関（ＳＡＲ）を行ったりすることができる。
【００３７】
最後に、本発明はまた、以下のような新薬の設計を提供する。候補化合物の限定されたライブラリーのＦＴＭＳによる初期スクリーニングを行うと、関連のある化合物を同定することができる。この後にファーマコフォアの仮想および／または実際のライブラリーをスクリーニングして同様の活性を有し得る構造を特定することができる。次にこれらの仮想分子を合成し、その活性を試験することができる。
【００３８】
種々のサンプルからのＦＴＭＳピークプロファイルを比較することで、複雑かつ包括的なデータを解明することができ、これらの方法により、種々のサンプルに異なって存在する生体分子の同定が可能となる。なおこれにはピークの有無の変化ならびにピーク強度の変化という双方の変化が含まれる。例えば、１以上の候補物質または薬物に曝された細胞からＦＴＭＳピークプロファイルを得、未処理細胞からのプロファイルと比較して、その薬物または化合物に関連した細胞変化を同定してもよく、例えば、毒性プロファイルを得てもよいし、あるいは薬物候補のライブラリーを望ましい作用または望ましくない作用に関してスクリーニングしてもよい。同様に、心血管疾患、癌、糖尿病、肥満、炎症性疾患、アルツハイマー病、自己免疫疾患、病原体感染症などの種々の疾病状態に由来する細胞を正常組織のプロファイルと比較して、疾病によって影響を受ける経路および細胞成分を同定することもできる。もう１つの例として、さまざまな組織または細胞タイプからのプロファイルを比較して細胞特異的成分を同定し、新しい組織、疾病状態または種々の個体と比較するためのデータベースを構築してもよい。
【００３９】
本明細書に記載の方法によれば、さらに、天然分子の化学修飾の検出および／または同定、病理学的に誘導される代謝経路の改変の同定（すなわち、フラックスの変化、代謝産物の蓄積、代謝産物の枯渇、代謝産物の改変）、医原性作用の同定、生化学反応および生化学経路の同定、異化または代謝中間体の同定、重複した生化学的／代謝経路の同定、ＳＯＳ生化学的／代謝経路の同定、ならびにアポトーシス経路の同定が可能となる。目的の代謝中間体および代謝産物としては、限定されるものではないが、天然代謝産物、ｉｎ ｖｉｖｏで合成または分解された分子、細胞および生物学的液体中での酸化または還元反応の過程で修飾された分子、ならびに食品に存在する種々の小分子・高分子（例えば、ビタミン、外来物質）または食品の酵素的消化によって生じる種々の小分子・高分子（例えば、アミノ酸、特に必須アミノ酸、脂肪酸）、ならびに異化産物および生体異物が挙げられる。
【００４０】
さらに、本発明の方法はサンプルを解析する際に用いる多くのデータベースを作成するのに使用できる。例えば、本方法はｉｎ ｖｉｖｏで生じる代謝変換のデータベースを作成するのに使用できる。すなわち、目的の化学亜構造を含む参照分子（例えば、骨格分子）を投与し、新しいまたは変化した代謝産物をＦＴＭＳによって同定する。例えば、第二アミンまたは第二アルコールの代謝的変換を同定し、登録して目録データベースに入れることができる。第二アミンをもついずれの新規化合物でもこの代謝変換データベースを用いて評価できる。同様に本発明を用いて極めて正確な小分子データベースを作成することもできる。
【００４１】
このように本発明はフーリエ変換質量分析（ＦＴＭＳ）に関わる組成物および方法を提供する。ＦＴＭＳはどのようなサンプル数であっても行うことができる。当業者ならば分かるであろうが、サンプルは限定されるものではなく、細胞（初代細胞および培養細胞系の双方を含む）、組織および体液（限定されるものではないが、血液、尿、血清、リンパ液、胆汁、脳脊髄液、間質液、水様液または硝子液、初乳、痰、羊水、唾液、肛門および膣分泌液、汗および精液、漏出液（例えば、膿瘍または感染もしくは炎症のその他いずれかの部位から得られる液体）、または関節（例えば、正常な関節または慢性関節リウマチ、骨関節炎、痛風もしくは敗血症性関節炎などの疾病に罹患した関節）から得られる液体を含む）（実質的にいずれの生物のものであってもよいが、哺乳類サンプルが好ましく、ヒトサンプルが特に好ましい）；環境サンプル（限定されるものではないが、空気、農業、水および土壌サンプルを含む）；生物兵器サンプル；細胞外液、細胞培養物からの細胞外上清、細菌の封入体、細胞コンパートメント、細胞周辺腔、ミトコンドリアコンパートメントなどを含む研究用サンプル、精製サンプル、隕石などの地球外サンプルを含めて、いくつかのものが挙げられる。当業者ならば分かるであろうし、また以下でも概説されるように、これらのサンプルは、例えばさらなる操作または処理を施していない、「天然」のものであってもよいし、あるいは「処理された」ものであってもよく、処理としては、薬物のような候補物質への暴露、遺伝子操作（例えば遺伝子の付加または欠失）などが含まれる。以下でさらに記載されるように、これはＦＴＭＳ分析のためのサンプルの処理または調製とは区別すべきである。
【００４２】
ある好ましい実施形態では、ＦＴＭＳは細胞を含むサンプルに対して行う。当業者ならば分かるであろうが、本発明で使用できる細胞タイプは広範であり、真核および原核双方の細胞を含むが、前者が好ましい。好適な原核細胞としては、限定されるものではないが、大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）、バチルス属の種などの細菌、好熱生物などの極限環境菌など、および以下に挙げられるマイコプラズマ、リケッチア、 プランクトン性単細胞生物、ゾウリムシ属、シュードモナス属、ニトロソモナス属、硝化菌などをはじめとするいずれかの、またあらゆる細菌および生物が挙げられる。プリオンやクロイツフェルト・ヤコブ病を引き起こすものもこの定義に含まれる。
【００４３】
好適な真核細胞としては、限定されるものではないが、昆虫細胞；酵母などの真菌および糸状真菌（アスペルギルス、トリコデルマ、ピキアおよびニューロスポラ、マイコプラズマ属の種などを含む。なお、これらには花器構造および胞子ならびに苔癬が含まれる）；植物細胞（藻類、トウモロコシ、ソルガム、タバコ、カノーラ、ダイズ、ワタ、トマト、ジャガイモ、アルファルファ、ヒマワリなどのものを含む。なお、これらには花、茎、樹液、葉および花粉細胞などが含まれる）；および動物細胞（魚類、鳥類および哺乳類を含む）が挙げられる。好適な魚細胞としては、限定されるものではないが、サケ、マス、テラピア、マグロ、コイ、カレイ、オヒョウ、メカジキ、タラおよびゼブラフィッシュの種に由来するものが挙げられる。好適な鳥類細胞としては、限定されるものではないが、ニワトリ、アヒル、ウズラ、キジおよびシチメンチョウならびにその他のヤケイまたは猟鳥のものが挙げられる。好ましい哺乳類細胞としては、限定されるものではないが、ウマ、ウシ、バッファロー、シカ、ヒツジ、ウサギ、齧歯類（マウス、ハムスター、モルモットなど）、ヤギ、ブタ、霊長類およびヒト、イルカやクジラなどの海洋動物に由来する細胞、初代細胞ならびにいずれかの組織もしくは幹細胞タイプのヒト細胞系などの細胞系、ならびに幹細胞（多能性および非多能性幹細胞を含む）が挙げられる。さらに細胞は以下に概説されるような腫瘍細胞、心筋細胞、内皮細胞、上皮細胞、リンパ球（Ｔ細胞およびＢ細胞）、マスト細胞、好酸球、脈管内膜細胞、肝細胞、白血球（単核白血球を含む）、幹細胞（造血幹細胞、神経幹細胞、皮膚幹細胞、胚幹細胞、腎幹細胞、肝幹細胞および心筋幹細胞など）、破骨細胞、軟骨細胞およびその他の結合組織細胞、ケラチノサイト、肝細胞、腎細胞および脂肪細胞が挙げられる。また好適な細胞としては、限定されるものではないが、ジャーカットＴ細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、ＣＨＯ、Ｃｏｓなどをはじめとする公知の研究用細胞も含まれる。参照により本明細書に組み入れられるＡＴＣＣ細胞系カタログを参照されたい。当業者ならば分かるであろうが、細胞は、凍結サンプル（細胞および組織）、脱水、凍結乾燥または防腐処理した細胞および組織、ミイラ化した細胞および組織、死滅した細胞および組織（法医学的分析および民俗学）、胞子形成細菌の使用をはじめとする多くのフォーマットをもち得る。同様に、細胞は二倍体または半数体細胞、単核または多核細胞、血小板、無核細胞（赤血球、マクロファージおよび活性化マクロファージなど）、多能性細胞、分化および未分化細胞、幹細胞、染色体外物質または核酸物質を含む細胞であってもよい。細胞集団とは実際の動物が含まれる、すなわち動物は細胞集団とみなされることに留意すべきである。
【００４４】
ある好ましい実施形態において、また以下にさらに概説するように、ＦＴＭＳ分析で用いる細胞は種々の組織、特にヒト組織に由来するものである。従って例えば、種々の組織に由来する細胞のピークプロファイルを比較して、細胞特異的マーカーならびに非特異的またはハウスキーピング機能成分を解明することができる。この実施形態において、これらの細胞は脳、皮膚、肺、内皮、上皮、脂肪、筋肉、骨、胃、結腸、脾臓、膵臓、腎臓、膀胱、心臓、リンパ系、血液、肝臓などに由来する初代細胞または細胞系であってもよい。この実施形態では、異なる組織のＦＴＭＳプロファイルを比較して以下にさらに概説するようにデータベースの構築に用いることができる。同様に、同じ組織であるが、異なる個体からの細胞でデータベースを構築して正規化し、細胞特異的マーカーを評価することもできる。これらの細胞は同じまたは異なる個体、種、亜種、種々の生物型のサブグループなどに由来するものであってもよい。
【００４５】
ある実施形態においては、初代細胞を同じ組織の細胞系と比較して二者間の差異を同定する。当技術分野で公知であるように、いくつかの細胞系は初代細胞とは同じプロファイルおよび薬物感受性を示さない。従って本発明はこの二者間の細胞の差異を評価するために使用することができる。
【００４６】
ある好ましい実施形態では、異なる細胞状態間または異なる処理を施した細胞間の比較を本発明の技術を用いて評価することができる。例えば好適な処理の相違としては、限定されるものではないが、物理的処理（ストレス、熱、低温、圧力、照射など）、成長ホルモンまたは変態ホルモンによる処理（例えば、毛虫、両生類におけるもの）、化学的刺激剤（コーヒー、薬物、興奮性アミノ酸など）による処理、および電気刺激による処理（例えば、神経、筋細胞におけるもの）が挙げられる。
【００４７】
ある好ましい実施形態では、細胞は疾病状態を有する動物に由来のものである。これに関して「疾病状態」とは情報、診断または治療のいずれかが望まれるあらゆる病気が含まれる。疾病状態は遺伝的疾患（嚢胞性繊維症または鎌形赤血球貧血などのタンパク質変化、または特定の単一ヌクレオチド多型の存在、腫瘍抑制遺伝子の突然変異に基づく遺伝的疾患を含む）、体細胞変異などの結果であり得る。従って適切な疾病状態の細胞は、癌、心血管疾患、ウイルスまたは細菌感染症、肥満、糖尿病、炎症性疾患、自己免疫疾患などからのものである。同様に染色体異常（例えばトリソミーなど）を有する個体、遺伝子治療前後の個体などに由来する細胞も含まれる。
【００４８】
ある好ましい実施形態において、本発明では癌性の細胞または組織が用いられる。この実施形態において好適な腫瘍細胞としては、限定されるものではないが、メラノーマなどの皮膚癌、骨髄性白血病、肺癌、乳癌、卵巣癌、大腸癌、腎臓癌、前立腺癌、膵臓癌、胃癌、脳腫瘍、リンパ系癌、胸腺癌、甲状腺癌、精巣癌などに由来するものが挙げられる。
【００４９】
ある好ましい実施形態では、これらの細胞は心血管疾患を有する個体から得られる。従ってこの実施形態において適切な疾病状態の細胞としては、限定されるものではないが、心筋細胞、循環系の内皮細胞、マクロファージ、肝細胞、脂肪細胞、平滑筋細胞、腸管細胞などが挙げられる。
【００５０】
ある好ましい実施形態では、これらの細胞は糖尿病を有する個体から得られる。従ってこの実施形態において適切な疾病状態の細胞としては、限定されるものではないが、心筋細胞、循環系の内皮細胞、マクロファージ、膵細胞、肝細胞、脂肪細胞、平滑筋細胞、腸管細胞などが挙げられる。
【００５１】
ある好ましい実施形態では、これらの細胞は肥満個体から得られる。従ってこの実施形態において適切な疾病状態の細胞としては、限定されるものではないが、心筋細胞、循環系の内皮細胞、マクロファージ、肝細胞、脂肪細胞、平滑筋細胞、腸管細胞などが挙げられる。
【００５２】
ある好ましい実施形態では、疾病状態の細胞はウイルスまたは細菌感染によるものに分類される。従って適切なウイルスとしては、限定されるものではないが、オルソミクソウイルス（例えば、インフルエンザウイルス）、パラミクソウイルス（例えば、ＲＳウイルス（ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｃｙｔｉａｌ ｖｉｒｕｓ）、流行性耳下腺炎ウイルス、麻疹ウイルス）、アデノウイルス、ライノウイルス、コロナウイルス、レオウイルス、トガウイルス（例えば、風疹ウイルス）、パルボウイルス、ポックスウイルス（例えば、天然痘ウイルス、ワクシニアウイルス）、エンテロウイルス（例えば、ポリオウイルス、コクサッキーウイルス）、肝炎ウイルス（Ａ型、Ｂ型およびＣ型を含む）、ヘルペスウイルス（例えば、単純ヘルペスウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、サイトメガロウイルス、エプスタイン・バーウイルス）、ロタウイルス、ノーウォークウイルス、ハンタウイルス、アレナウイルス、ラブドウイルス（例えば、狂犬病ウイルス）、レトロウイルス（ＨＩＶ、ＨＴＬＶ−Ｉおよび−ＩＩを含む）、パポバウイルス（例えば、パピローマウイルス）、ポリオーマウイルスおよびピコルナウイルスが挙げられる。適切な細菌としては、限定されるものではないが、バチルス属、ビブリオ属（例えば、コレラ菌（Ｖｉｖｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ））、エシュリキア属（例えば、病原性大腸菌（Ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｇｅｎｉｃ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ））、シゲラ属（例えば、例えば志賀赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｄｙｓｅｎｔｅｄａｅ））、サルモネラ属（例えば、チフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉ））、マイコバクテリウム属（例えば、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、らい菌（Ｍ． ｌｅｐｒａｅ））、クロストリジウム属（例えば、ボツリヌス菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）、破傷風菌（Ｃ． ｔｅｔａｎｉ）、Ｃ．ディフィシル（Ｃ． ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）、ウェルシュ菌（Ｃ． ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ））、コリネバクテリウム属（例えば、ジフテリア菌（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ））、連鎖球菌属（例えば、化膿連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、肺炎連鎖球菌（Ｓ． ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ））、ブドウ球菌属（例えば、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ））、ヘモフィルス属（例えば、インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ））、ナイセリア属（例えば、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ）、淋菌（Ｎ． ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ））、エルジニア属（例えば、ランブル鞭毛虫（Ｇ． ｌａｍｂｌｉａ）、ペスト菌（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｐｅｓｔｉｓ））、マイコプラズマ、リケッチア、シュードモナス属（例えば、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、Ｐ．プチダ（Ｐ． ｐｕｔｉｄａ））、リューシュマニア属（Ｌｅｉｓｃｈｍａｎｉａ）、クラミジア属（例えば、トラコーマクラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ））、ボルデテラ属（例えば、百日咳菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ））、およびトレポネーマ属（例���ば、梅毒トルポネーマ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｐａｌｌａｄｉｕｍ））が挙げられる。しかし、実施形態によっては、疾病状態は細菌またはウイルス感染を含まないものがある。
【００５３】
ある実施形態では、これらの細胞は遺伝子操作されていてもよく、すなわち外因性の核酸を含んでいてもよいし（例えば、「ノックイン」細胞またはトランスジェニック動物）、あるいは欠損または改変された核酸（遺伝子を含む）を有していてもよい（例えば、「ノックアウト」細胞またはトランスジェニック動物）。
【００５４】
以下でさらに詳しく概説するが、ある好ましい実施形態では、疾病状態に由来する細胞を、それと対応するその疾病のない組織、すなわち正常組織に由来する細胞と比較してその差異を明らかにする。正常サンプルは同じ個体に由来するものであってもよいし、あるいは家族、双子などの第２の個体であってもよい。さらに正常サンプルは治療後、例えば骨髄移植、化学療法などを受けた後からのものであってもよい。
【００５５】
ある好ましい実施形態では、これらの細胞をＦＴＭＳ分析の前に１以上の候補生理活性物質（本明細書では「薬物」または「バイオモジュレーター」という場合もある）に曝す。本明細書で用いる「候補生理活性物質」または「バイオモジュレーター」とは、本発明の系で試験される、特に細胞系において応答または摂動を誘発する能力に関して試験される、あらゆる天然または合成の分子（例えばタンパク質、有機小分子、炭水化物（多糖類を含む）、ポリヌクレオチド、脂質など）をさす。例としては薬物、アンチセンスまたは三重らせん核酸、リボザイム、ホルモン、成長因子、サイトカイン、リガンド、抗体、フェロモン、アゴニスト、アンタゴニスト、類似体、チャネル遮断剤、毒素、除草剤、臭気または他のいずれかの化学分子が挙げられる。
【００５６】
候補物質としては多くの化学種を包含するが、典型的にはそれらは有機分子、好ましくは小さい有機化合物で、分子量が１００を超え、約２，５００ダルトンより小さいものであり、約１００から約１０００〜１５００までの範囲の分子が好ましい。候補物質はタンパク質との構造的相互作用（特に水素結合）に必要な官能基を含み、典型的にはアミン、カルボニル、ヒドロキシルまたはカルボキシル基のうちの少なくとも１つを含み、上記官能化学基の少なくとも２つを含むことが好ましい。これらの候補物質は１つ以上の上記官能基で置換された炭素環または複素環構造および／または芳香族もしくは多環芳香族構造を含む場合が多い。また、候補物質は、ペプチド、糖類、脂質、脂肪酸、ステロイド、プリン、ピリミジン、それらの誘導体、構造類似体またはその組合せを含む生体分子にも見出せる。特に好ましいものとしては、小分子、ペプチド、ペプチド類似体、脂質類似体および炭水化物類似体がある。
【００５７】
候補物質は合成化合物または天然化合物のライブラリーをはじめ多様な供給源から得られる。例えば、ランダム化オリゴヌクレオチドの発現を含めて、多種多様な有機化合物および生体分子のランダム合成および定方向合成には、多くの手段が利用できる。あるいはまた、細菌、真菌、植物および動物抽出物の形態の天然化合物のライブラリーが利用できるか、または容易に作製できる。さらに、候補物質の新規なライブラリーまたは種は、前駆体分子（例えば、化学骨格分子）を微生物（細菌、酵母菌など）または他の生物（植物、放線菌、真菌など）に供給して、新しい化学物質または人工的に合成するのが難しい化学物質／分子を生成させることによっても作製できる。
【００５８】
さらにまた、天然のまたは合成したライブラリーおよび化合物は従来の化学的、物理的および生化学的手段により容易に修飾される。既知の薬理物質は、構造類似体を得るために、アシル化、アルキル化、エステル化、アミド化などの定方向またはランダム化学修飾にかけることができる。化合物はラセミ混合物または異性体であってもよい。
【００５９】
さらに、１以上のライブラリーを同時または逐次にスクリーニングすることもできる。なお、これらのライブラリーは関連のもの（例えば、直交ライブラリー、関連骨格の合成ライブラリー、植物抽出物の天然ライブラリー）であってもよいし、関連のないものであってもよい。
【００６０】
ある好ましい実施形態では、候補生理活性物質はタンパク質である。本明細書において「タンパク質」とは、共有結合で結合された少なくとも２つのアミノ酸を意味し、タンパク質、ポリペプチド、オリゴペプチドおよびペプチドが含まれる。タンパク質は天然のアミノ酸とペプチド結合からなっていてもよいし、あるいはペプトイドなどの合成ペプチドミメチック構造からなっていてもよい。従って、本明細書で用いる「アミノ酸」または「ペプチド残基」とは、天然に存在するアミノ酸と合成アミノ酸の双方を意味する。例えば、ホモフェニルアラニン、シトルリンおよびノルロイシンは本発明の目的ではアミノ酸と考えられる。
【００６１】
「アミノ酸」にはまた、プロリンやヒドロキシプロリンなどのイミノ酸残基も含まれる。これらの側鎖は（Ｒ）または（Ｓ）配置のいずれであってもよい。好ましい実施形態では、アミノ酸は（Ｓ）またはＬ配置である。天然には存在しないアミノ酸側鎖を用いる場合は、例えばｉｎ ｖｉｖｏ分解を防ぐかまたは遅らせるようにアミノ酸以外の置換基を用いてもよい。また、化学ブロッキング基またはその他の化学置換基を付加してもよい。
【００６２】
ある好ましい実施形態では、候補生理活性物質は天然に存在するタンパク質または天然に存在するタンパク質の断片である。従って、例えば、タンパク質を含有する細胞抽出物、またはタンパク質性細胞抽出物のランダムもしくは定方向消化物が用いられる。この方法では、本明細書に記載の系でのスクリーニングのために原核生物および真核生物タンパク質のライブラリーを作製してもよい。本実施形態で特に好ましいのは細菌、真菌、ウイルスおよび哺乳類タンパク質のライブラリーであり、後者が好ましく、ヒトタンパク質が特に好ましい。
【００６３】
ある好ましい実施形態では、候補生理活性物質は約５〜約３０個のアミノ酸からなるペプチドであり、約５〜約２０個のアミノ酸が好ましく、約７〜約１５個が特に好ましい。これらのペプチドは上で概説したような天然に存在するタンパク質の消化物であってもよいし、ランダムペプチドまたは「バイアスをかけた」（ｂｉａｓｅｄ）ランダムペプチドであってもよい。本明細書において「ランダム化」または文法上同等の表現は、核酸およびペプチドがそれぞれ実質的にランダムなヌクレオチドおよびアミノ酸からなることを意味する。一般に、これらのランダムペプチド（または以下で述べる核酸）は化学的に合成されるので、任意のヌクレオチドまたはアミノ酸を任意の位置に組み込むことができる。この合成法は、ランダム化タンパク質または核酸を生成し、その配列の全長にわたってあらゆるまたはほとんどの可能な組合せを生じさせて、ランダム化されたタンパク質性の候補生理活性物質のライブラリーを作製するように、設計することができる。従って、例えば、らせん形の両親媒性ペプチド、βシートペプチド、両親媒性βシートペプチドなどのライブラリーを作製することができる。
【００６４】
ある実施形態では、ライブラリーは完全にランダム化されており、いずれの位置にも優先的な配列あるいは一定の配列が存在しない。ある好ましい実施形態では、このライブラリーにはバイアスをかける。すなわち、配列内のいくつかの位置が一定に保持されるか、あるいは限定された数の可能性の中から選択される。例えば、ある好ましい実施形態では、ヌクレオチドまたはアミノ酸残基は、例えば疎水性アミノ酸、親水性残基、立体的にバイアスのある（小さいまたは大きい）残基の特定クラス内で、架橋のためのシステイン、ＳＨ−３ドメインのためのプロリン、リン酸化部位のためのセリン、トレオニン、チロシンもしくはヒスチジンなどの生成方向で、またはプリンの生成方向などでランダム化される。
【００６５】
ある好ましい実施形態では、候補生理活性物質は核酸である。本明細書において「核酸」または「オリゴヌクレオチド」または文法上同等な表現は、少なくとも２つのヌクレオチドが共有結合していることを意味する。本発明の核酸は一般にホスホジエステル結合を含むが、いくつかの場合には、以下に概説するように、下記の結合を含む代替バックボーンを含んでもよい核酸類似体が含まれる：ホスホルアミド（Ｂｅａｕｃａｇｅら， Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ， ４９（１０）：１９２５ （１９９３）およびその中の参照文献； Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ， Ｊ． Ｏｒｇ． Ｃｈｅｍ．， ３５：３８００（１９７０）； Ｓｐｒｉｎｚｌら， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， ８１：５７９ （１９７７）； Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， １４：３４８７ （１９８６）； Ｓａｗａｉら， Ｃｈｅｍ． Ｌｅｔｔ．， ８０５（１９８４）， Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら， Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ．， １１０：４４７０（１９８８）；およびＰａｕｗｅｌｓら， Ｃｈｅｍｉｃａ Ｓｃｒｉｐｔａ， ２６：１４１（１９８６））、ホスホロチオエート（Ｍａｇら， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， １９：１４３７（１９９１）；および米国特許第５，６４４，０４８号）、ホスホロジチオエート（Ｂｒｉｕら， Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． ，１１１：２３２１（１９８９））、Ｏ−メチルホスホロアミダイト結合（Ｅｃｋｓｔｅｉｎ， Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ａｎａｌｏｇｕｅｓ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ， Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ参照）、ならびにペプチド核酸バックボーンおよび結合（例えば、Ｅｇｈｏｌｍ， Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ．， １１４：１８９５（１９９２）； Ｍｅｉｅｒら， Ｃｈｅｍ． Ｉｎｔ． Ｅｄ． Ｅｎｇｌ．， ３１：１００８（１９９２）； Ｎｉｅｌｓｅｎ， Ｎａｔｕｒｅ， ３６５：５６６（１９９３）； Ｃａｒｌｓｓｏｎら， Ｎａｔｕｒｅ， ３８０：２０７（１９９６）（なお、これらはすべて参照により本明細書に組み入れられる）。他の核酸類似体としては下記のバックボーンをもつものが含まれる：正電荷バックボーン（Ｄｅｎｐｃｙら， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ９２：６０９７（１９９５））、非イオン性バックボーン（米国特許第５，３８６，０２３号、同第５，６３７，６８４号、同第５，６０２，２４０号、同第５，２１６，１４１号および同第４，４６９，８６３号； Ｋｉｅｄｒｏｗｓｈｉら， Ａｎｇｅｗ． Ｃｈｅｍ． Ｉｎｔｌ， Ｅｄ． Ｅｎｇｌｉｓｈ， ３０：４２３ （１９９１）； Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら， Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ．， １１０：４４７０（１９８８）； Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら， Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ ＆ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ， １３：１５９７（１９９４）； ＡＳＣ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ Ｓｅｒｉｅｓ ５８０ 第２および３章 ”Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ”， Ｙ．Ｓ． ＳａｎｇｈｕｉおよびＰ． Ｄａｎ Ｃｏｏｋ編； Ｍｅｓｍａｅｋｅｒら， Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ ＆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍ． Ｌｅｔｔ．， ４：３９５（１９９４）； Ｊｅｆｆｓら， Ｊ． Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ ＮＭＲ， ３４：１７（１９９４）； Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．， ３７：７４３ （１９９６））および非リボースバックボーン（米国特許第５，２３５，０３３号および同第５，０３４，５０６号、ならびにＡＳＣ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ Ｓｅｒｉｅｓ ５８０ 第６および７章， ”Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ”， Ｙ．Ｓ． ＳａｎｇｈｕｉおよびＰ． Ｄａｎ Ｃｏｏｋ編に記載のものを含む）。また、１個以上の炭素環式糖を含有する核酸も核酸の定義の中に含まれる（Ｊｅｎｋｉｎｓら， Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． Ｒｅｖ．， （１９９５） １６９−１７６頁参照）。数種の核酸類似体がＲａｗｌｓ， Ｃ ＆ Ｅ Ｎｅｗｓ， １９９７年６日２日号３５頁に記載されている。これらの参照文献は参照により本明細書に組み入れられる。リボース−リン酸バックボーンのこれらの修飾は、標識などの追加成分の付加を容易にしたり、あるいは生理的環境下でかかる分子の安定性を高めたり半減期を延ばしたりするために行われる。また、天然の核酸と類似体が混ざり合ったものを作製することもできる。あるいは、種々の核酸類似体が混ざり合ったものや、天然の核酸と類似体が混ざり合ったものを作製してもよい。これらの核酸は一本鎖であっても二本鎖であってもよく、あるいはある場合には二本鎖および一本鎖配列の双方の部分を含んでいてもよい。核酸はＤＮＡ（ゲノムＤＮＡおよびｃＤＮＡの双方）、ＲＮＡまたはハイブリッドであってもよく、この場合には核酸はデオキシリボヌクレオチドとリボヌクレオチドの任意の組合せ、およびウラシル、アデニン、チミン、シトシン、グアニン、イノシン、キサンチン、ヒポキサンチン、イソシトシン、イソグアニンのような塩基の任意の組合せを含む。
【００６６】
タンパク質に関して上記で一般的に述べたように、核酸の候補生理活性物質は天然に存在する核酸、ランダム核酸、または「バイアスをかけた」ランダム核酸であってよい。タンパク質に関して上記で概説したように、例えば、真核生物または原核生物ゲノムの消化物を使用することができる。
【００６７】
ある好ましい実施形態では、候補生理活性物質は有機化学種であり、その多様なものが文献で入手できる。
【００６８】
ある好ましい実施形態では、種々の候補生理活性物質のライブラリーを用いる。好ましくは、このライブラリーは、特定の標的と結合させるのに確率的に十分な多様性範囲をもたらすランダム化物質の十分構造的に多様な集団を提供すべきである。従って、相互作用ライブラリーは、そのメンバーの少なくとも１つがそれに標的親和性を与える構造を有するように十分大きなものでなければならない。要求される相互作用ライブラリーの絶対的なサイズをはかることは難しいが、自然は免疫応答によってヒントをくれている。すなわち、１０７〜１０８個の異なる抗体の多様性は、生物が出くわす可能性のあるほとんどの抗原と相互作用するのに十分な親和性を持つ少なくとも１つの組合せをもたらす。また発表されているｉｎ ｖｉｔｒｏ選択技術も、１０７〜１０８個というライブラリーサイズが標的親和性を有する構造を見出すのに十分であるということを示している。一般に本明細書で提案しているような７〜２０個のアミノ酸からなるペプチドのあらゆる組合せのライブラリーは、２０７（１０９）〜２０２０をコードしている可能性がある。従って１０７〜１０８個の異なる分子のライブラリーを用いると、本方法は７アミノ酸についての理論上完全な相互作用ライブラリーの「ワーキング」サブセット、および２０２０ライブラリーについての形状のサブセットを許容する。従ってある好ましい実施形態では、少なくとも１０３個の異なる候補物質がスクリーニングされるが、少なくとも１０４とすることが好ましく、少なくとも１０５〜１０６とすることが特に好ましく、いくつかの場合には、スクリーニング技術に応じて、１０７、１０８または１０９個もの多数の異なる候補物質が本方法で同時に分析される。好ましい方法はライブラリーのサイズおよび多様性を最大にする。
【００６９】
ある好ましい実施形態では、候補物質は既知の薬物、例えば、少なくとも１つの望ましい作用を有することが分かっている生理活性物質である。しかし、以下でさらに詳しく概説するように、多くの薬物が副作用または毒性の問題を抱えており、本発明を用いてこれらの毒性のメカニズムを解明することができ、また、同数の副作用またはいずれかの副作用を持たない第二世代の薬物類似体をスクリーニングすることができる。例えば、スペクトルのピークは、古典的なマーカー、または生存能染料などの染料、または当技術分野で公知のような質量タグの使用によって特定されるような、毒性と関連づけることができる。さらに、ある実施形態では、２以上の薬物を同時または逐次にサンプルに加えて、薬物相互作用メカニズムおよび複雑性を解明したり、ある生物学的／代謝経路またはある酵素をブロックしたりすることが可能である。
【００７０】
当業者ならば分かるであろうが、そのアッセイおよび望ましい特徴に応じて本発明における使用を見出すことができる可能性のある薬物としては広範なものがある。例えば癌への適用では、好適な癌治療薬としては、限定されるものではないが、アルキル化剤、例えばアルキルスルホネート（ブスルファン、インプロスルファン、ピポスルファン（ｐｉｐｏｓｕｌｆａｎ））；アジリジン（ベンゾデパ（ｂｅｎｚｏｄｅｐａ）、カルボコン、メツレデパ（ｍｅｔｕｒｅｄｅｐａ）、ウレデパ（ｕｒｅｄｅｐａ））；エチレンイミンおよびメチルメラミン（アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホルアミド、トリエチレンチオホスホルアミド、トリメチロールメラミン）；ナイトロジェンマスタード（クロラムブシル、クロルナファジン、シクロホスファミド、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシド塩酸塩、メルファラン、ノベムビチン（ｎｏｖｅｍｂｉｃｈｉｎ）、フェネステリン（ｐｈｅｎｅｓｔｅｒｉｎｅ）、プレドニマスチン、トロホスファミド（ｔｒｏｆｏｓｆａｍｉｄｅ）、ウラシルマスタード）；ニトロソウレア（カルムスチン、クロロゾトシン、フォテンムスチン（ｆｏｔｅｎｍｕｓｔｉｎｅ）、ロムスチン、ニムスチン、ラニムスチン）；ダカルバジン、マンノムスチン（ｍａｎｎｏｍｕｓｔｉｎｅ）、ミトブラニトール（ｍｉｔｏｂｒａｎｉｔｏｌ）、ミトラクトール（ｍｉｔｏｌａｃｔｏｌ）；ピポブロマン；ドキソルビシンおよびシスプラチン（誘導体を含む）を含む抗腫瘍薬が挙げられる。
【００７１】
特に心血管疾患については、作用機構を解明し、その応答を生体分子レベルで特性決定するか、あるいは薬物作用経路において関連のある生体分子を同定するために細胞に加える好適な薬物が多数ある。これらのものとしては、限定されるものではないが、スタチン（ＨＭＧＣｏＡレダクターゼを阻害することでコレステロール合成を遮断するコレステロール低下剤、アトルバスタチン、パラバスタチン、ロバスタチン、セリバスタチン、シンバスタチンを含む）、フィブラート（フェノフィブラート、ベザフィブラート、ゲムフィブロジル）、ナイアシン、ニコチン酸、エストロゲン、胆汁酸結合樹脂（コレスチルアミンおよびコレスチポール塩酸塩を含む）、ＡＣＡＴ阻害剤、コレステロール腸管吸収阻害剤、ＰＰＡＲリガンド（α、γなど）、およびＲＸＲ、ＦＸＲ、ＲＯＲなどのような核因子リガンドが挙げられる。
【００７２】
好適な糖尿病薬としては、限定されるものではないが、ビグアニド（限定されるものではないが、メトホルミン、フェンホルミンおよびブフォミン（ｂｕｆｏｍｉｎ）を含む）；スルホニルウレア（限定されるものではないが、トルブタミド、アセトヘキサミド、トラザミド、クロロプロパミド、グリプルジド（ｇｌｉｐｌｚｉｄｅ）およびグリブリドを含む）；チアゾリジンジオン（ｔｈａｚｏｌｉｄｉｎｅｄｉｏｎｅ）誘導体（限定されるものではないが、シグリタゾン（ｃｉｇｌｉｔａｚｏｎｅ）、プログリタゾン（ｐｌｏｇｌｉｔａｚｏｎｅ）、エングリタゾン（ｅｎｇｌｉｔａｚｏｎｅ）、およびトログリタゾンを含む）；およびその他のその全体が参照により本明細書に組み入れられるＣｏｒｎｉｃｅｌｌｉ， Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ ２（２）： ４３ （１９９９）に記載のものが挙げられる。
【００７３】
好適な高血圧薬としては、限定されるものではないが、βブロッカー、ＡＣＥ阻害剤、利尿薬；ロサルタンなどのアンギオテンシン阻害剤が挙げられる。
【００７４】
候補生理活性物質は細胞または細胞集団と組み合わせるか、あるいは細胞または細胞集団に添加する。種々の実施形態について好適な細胞タイプは上記に概説されている。これら候補生理活性物質と細胞とを組み合わせる。当業者ならば分かるであろうが、これは候補物質を細胞表面に、細胞を含有する培地に、またはそこで細胞が増殖している、もしくは接触している表面に加えること；例えば物質を細胞に導入するベクターを用いて細胞に物質を添加する（すなわち、物質が核酸またはタンパク質である場合）ことを含めて、多数の方法によって行ってもよい。当業者ならば分かるであろうが、リポソーム、有機溶液、分散液、懸濁液、エレクトロポレーションなどのようなベシクルおよびその他のビヒクルの使用を含めた利用可能な多様な送達方法がある。
【００７５】
一般に候補物質は物質−標的相互作用に適切な反応条件下で細胞に加える（上記に概説したように細胞外または細胞内のいずれか）。通常にはこれは生理学的条件であろう。インキュベーションは至適活性を容易にするいずれの温度で行ってもよいが、典型的には４〜４０℃である。インキュベーション時間は至適活性となるように選択されるが、迅速なハイスループットスクリーニングを容易にするように至適化してもよい。典型的には０．１〜４時間で十分であり、好ましくは０．１〜１時間であろう。通常、過剰な試薬は除去されるか、または洗い流される。
【００７６】
以下で概説する反応およびアッセイには他の種々の試薬も含まれうる。これらには、塩、中性タンパク質（例えば、アルブミン）、界面活性剤など最適なタンパク質間結合を促進する、および／または非特異的もしくはバックグラウンド相互作用を軽減するために使用できる試薬が含まれる。あるいはまた、プロテアーゼ阻害剤、ヌクレアーゼ阻害剤、抗菌剤などのようなアッセイ効率を改善する試薬も使用できる。必要に応じて分析およびスクリーニングのために供給する成分の混合物はいずれの順序で加えてもよい。当業者ならば分かるであろうが、細胞の洗浄またはすすぎは種々の時間で行い、濾過および遠心分離の使用を含んでもよい。
【００７７】
ある好ましい実施形態では、候補物質として化学または生化学的部分を用いるのではなく、「摂動因子」（ｐｅｒｔｕｒｂａｔｏｒ）を用いる。これに関して摂動因子という用語は、ある生物系で（細胞、組織または生物レベルで）応答または摂動を誘発する物理的または非物理的パラメーターまたは刺激をさす。物理的刺激としては、限定されるものではないが、環境条件（限定されるものではないが、ガス、臭気、感電死、照射およびその他の物理的作用など）、生きている生物（限定されるものではないが、細菌、ウイルス、酵母、植物または動物寄生虫を含む）および外来物質（例えば、移植器官または組織、インプラント）が挙げられる。非物理的刺激としては、限定されるものではないが、環境条件（限定されるものではないが、低温または高温、圧力を含む）、または感情の状態（限定されるものではないが、恐れ、ストレス、精神的挑戦、感情的苦痛、性的誘引、および喜びを含む）が挙げられる。
【００７８】
細胞を候補物質に曝していくらかの時間インキュベートしたところで、いくつかのステップを行うことができる。ある好ましい実施形態では、例えば候補物質のライブラリーを細胞に加えた場合には、表現型の変化で細胞をスクリーニングして望ましい表現型を示す細胞を単離することができる。次に、これらの単離細胞に対してＦＴＭＳを行い、その基礎にある生体分子レベルでの作用を解明および特性付ける。すなわち望ましい表現型の生化学的「フィンガープリント」を生成し、例えば創薬プログラムで使用できる。あるいはライブラリーが小さいか、または単一の薬物もしくは薬物セットを用いた場合には、以下で概説するように全ての細胞集団に対してＦＴＭＳ分析を行い、薬物作用の「フィンガープリント」を解明する。以下で概説するように、再度このタイプの分析を用いて種々の組織、種々の薬物などのデータベースを構築することができる。
【００７９】
このようにある好ましい実施形態では、候補物質のライブラリーを細胞集団へ導入した後に細胞を表現型の変化に関してスクリーニングする。本明細書において「表現型の変化」または「生理機能の変化」またはその他文法上同等な表現は、細胞の表現型が何らかの方法で（好ましくは、何らかの検出可能および／または測定可能な方法で）変化されたことを意味する。望ましい表現型（例えば、癌細胞の場合には分化の出現）および望ましくない表現型（例えば、脱分化）の双方が有用であることに注意すべきである。当業者ならば分かるであろうが、本発明の長所は本発明の方法を用いて試験できる細胞タイプおよび潜在的な表現型変化が広範なことにある。従って観察、検出または測定できる表現型変化のいずれのものでも本明細書のスクリーニング方法の基礎となり得る。好適な表現型の変化としては、限定されるものではないが、細胞形態、細胞増殖、細胞生存能、支持体もしくは他の細胞への接着、脂質封入体の出現、および細胞密度の変化などの全体的な物理的変化；１以上のＲＮＡ、タンパク質、脂質、ホルモン、サイトカインまたはその他の分子の発現の変化；平衡状態（すなわち半減期）あるいは１以上のＲＮＡ、タンパク質、脂質、ホルモン、サイトカインまたはその他の分子の変化；１以上のＲＮＡ、タンパク質、脂質、ホルモン、サイトカインまたはその他の分子の局在性の変化；１以上のＲＮＡ、タンパク質、脂質、ホルモン、サイトカイン、受容体またはその他の分子の生理活性または比活性の変化；イオン、サイトカイン、ホルモン、増殖因子またはその他の分子の分泌の変化；細胞膜の電位、分極、完全性または輸送の変化；ウイルスおよび細菌病原体の感染性、感受性、潜伏性、接着、および取り込みの変化などが挙げられる。本明細書において「表現型を変化させ得る」とは、生理活性物質が検出可能かつ／または測定可能な何らかの方法で細胞の表現型を変化させることができることを意味する。
【００８０】
当業者ならば分かるであろうが、表現型の変化は多様な方法で検出でき、一般に変化させる表現型によって異なり、また、変化させる表現型に対応したものであろう。一般に表現型の変化は、例えば細胞形態の顕微鏡分析；標準的な細胞生存能アッセイ（細胞死の増加と細胞生存能の増加（例えば、ウイルス、細菌、または細菌毒もしくは合成毒による細胞死に耐性のある細胞）の双方を含む）；ＦＡＣＳまたはその他の色素染色技術を含めた、特定の細胞または分子の存在またはレベルに関する蛍光分析指示薬アッセイなどの標準的な標識アッセイ；細胞を死滅させた後の標的化合物の発現の生化学的検出などを用いて検出される。場合によっては、例えば大きな表現型の変化を示さない疾患や他の疾病状態では、表現型の変化がＦＴＭＳスペクトル自体の変化となる場合もあり、この変化の解明はＦＴＭＳを用いて行うことができる。
【００８１】
ある好ましい実施形態では、表現型の変化した細胞が検出されれば、その細胞を表現型の変化を有さない複数の細胞から単離する。これは当技術分野で公知のように多数の方法で行ってもよく、ある場合にはアッセイまたはスクリーニングに依存するだろう。好適な単離技術としては、限定されるものではないが、ＦＡＣＳ、補体を用いた溶解選択、細胞クローニング、フルオルイメージャーによるスキャニング、「生き残った」タンパク質の発現、細胞表面タンパク質または物理的単離のために蛍光を与える、またはタグ付けを可能とする他の分子の誘導発現；非蛍光分子の蛍光分子へと変える酵素の発現；増殖しないかまたは増殖の遅いバックグラウンドに対する過剰な増殖；細胞死およびＤＮＡの単離またはその他の細胞生命力指示薬の染色などが挙げられる。
【００８２】
次に、単離された細胞、例えば、おそらく候補物質の存在によって表現型の変化を示す細胞について以下に説明するようにＦＴＭＳ分析を行う。
【００８３】
本発明の１つの著しい利点は、ＦＴＭＳが単一細胞または小さな細胞集団を分析できることである。このことはサンプルの不均一性をあいまいにできるので特に癌の分野で適切である。組織および転移の顕微解剖により単一細胞を含め極めて小さなサンプルを考慮することができ、次にこれを本発明の方法で分析することができる。さらに、本発明の技術と組み合わせることができる単一細胞分析が可能な種々の実験技術がある（例えば、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ））。
【００８４】
いくつかの実施形態では、候補物質（薬物を含む）を完全な細胞に対してではなく細胞溶解物に対して加えることができる。例えば、薬物が吸収されにくい場合に細胞溶解物に直接加えると作用を促進することができる。さらに、薬物安定性または代謝の研究は細胞ホモジネートを用いて行う場合が多い。
【００８５】
さらにまた、候補物質をスクリーニングするのに用いるスクリーニング法は多数のハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）技術を用いてもよいことに注目すべきである。ある好ましい実施形態では、本発明のシステムは各ステーションまたはステーションセットで液体をローディングする、およびローディングしないという構成要素を含む液体ハンドリング構成要素を含んでなる。この液体ハンドリングシステムは多数の構成要素を含むロボットシステムを含むことができる。さらに、本明細書で概説したいずれかの、または全てのステップは自動化可能であり、従って例えばこのシステムは完全に自動化してもよいし、または部分的に自動化してもよい。
【００８６】
当業者ならば分かるであろうが、使用できる構成要素としては広範にあり、限定されるものではないが、１以上のロボットアーム；マイクロプレートの配置のためのプレートハンドラー；カートリッジおよび／またはキャップ付きホルダー；非クロスコンタミネーションプレート上のウェルに蓋を移動および置換する自動の蓋またはキャップハンドラー；ディスポーザブルチップを備えたサンプル分配のためのチップアセンブリ；サンプル分配のための洗浄可能なチップアセンブリ；９６ウェル（またはそれ以上）のローディング・ブロック；冷却試薬ラック；マイクロタイタープレート・ピペット・ポジション（場合により冷却）；プレートおよびチップ用のスタッキングタワー；ならびにコンピューターシステムを含む。
【００８７】
完全ロボットまたは微細流動（ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ）システムとしては、スクリーニングアプリケーションの全てのステップを行うためのハイスループットピペット操作を含む自動液体、粒子、細胞および生物ハンドリングが挙げられる。これには液体、粒子、細胞および生物の操作、例えば吸引、分配、混合、希釈、洗浄、正確な容量測定運搬；ピペットチップの回収および廃棄；ならびに一回のサンプル吸引から複数に送達するための等量反復ピペット操作が含まれる。これらの操作はクロスコンタミネーションのない液体、粒子、細胞および生物の運搬である。この装置はフィルター、膜、および／または娘プレートへのマイクロプレートサンプルの自動反復、高密度運搬、全プレートの連続希釈、および高容量操作を遂行する。
【００８８】
ある好ましい実施形態では、化学誘導体化粒子、プレート、カートリッジ、チューブ、磁気粒子、またはアッセイ成分に対して特異性のある他の固相マトリックスを用いる。マイクロプレート、チューブ、またはいずれかの固相マトリックスの結合表面としては、非極性表面、高極性表面、共有結合を促進するための改変デキストランコーティング、抗体コーティング、融合タンパク質またはペプチドと結合するアフィニティー媒体、組換えプロテインＡまたはＧなどの表面固定されるタンパク質、ヌクレオチド樹脂またはコーティングが挙げられ、およびその他のアフィニティーマトリックスが本発明において有用である。
【００８９】
ある好ましい実施形態では、マルチウェルプレート、マルチチューブ、ホルダー、カートリッジ、ミニチューブ、ディープウェルプレート、微小遠心分離管、クリオバイアル（ｃｒｙｏｖｉａｌ）、スクエアーウェルプレート、フィルター、チップ、光ファイバー、ビーズ、および他の固相マトリックスのプラットフォーム、または様々な容量のプラットフォームをさらなる容量のため、アップグレード可能なモジュラープラットフォームに適合させる。このモジュラープラットフォームとしては、変速軌道シェーカー、およびソースサンプルのためのマルチポジション・ワーク・デッキ、サンプルおよび試薬希釈、アッセイプレート、サンプルおよび試薬貯蔵槽、ピペットチップ、ならびにアクティブ・ウォッシュ・ステーションが挙げられる。
【００９０】
ある好ましい実施形態では、制御ブロックまたはプラットフォームなどの熱交換器の温度を安定化し、サンプルをインキュベートする温度を４℃〜１００℃に厳密に制御するため、Ｐｅｌｔｉｅｒシステムなどのサーモサイクラーおよびサーモレギュレートシステムを用いる。
【００９１】
ある好ましい実施形態では、単一または複数の磁気プローブ、アフィニティープローブまたはピペッターを備えた互換性ピペットヘッド（単一またはマルチチャネル）が液体、粒子、細胞および生物をロボット操作する。単一または複数サンプル形式においては、マルチウェルもしくはマルチチューブ磁気セパレーターまたはプラットフォームが、液体、粒子、細胞および生物を操作する。
【００９２】
いくつかの実施形態では、装置は検出器を含み、これは標識の存在もしくは不在およびアッセイに応じて多様な種々の検出器であってよい。ある好ましい実施形態では、有用な検出器としては、蛍光の複数チャネルを備えた顕微鏡；単波長および二波長エンドポイントおよび動的容量を有する蛍光、紫外線および可視の分光光度法検出、蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）、発光、消光、二光子励起および強度再分配を提供するプレートリーダー；データおよび画像をキャプチャーして定量可能な形式へと変換するＣＣＤカメラ；コンピューターワークステーション；および１以上のバーコードリーダーが挙げられる。
【００９３】
これらの装置はマルチウェルプレートもしくはチューブ内での細胞培養増殖および形質転換のため、また、危険な操作のために無菌層流または換気フード内に設置可能であるか、あるいは閉鎖型の独立系である。同様に不活性ガス（例えば液体の酸化を防ぐため）などの制御環境下で操作を行うこともできる。生細胞は、生細胞アッセイの時系列に即した温度、湿度およびガスの制御を伴った制御された増殖条件下で増殖するだろう。自動細胞形質転換および自動コロニーピッカー（ｐｉｃｋｅｒ）が所望の細胞の迅速なスクリーニングを容易にするだろう。
【００９４】
磁気ビーズおよびその他のビーズ、粒子、細胞および生物の個々のキャプチャーにはフローサイトメトリーまたはキャピラリー電気泳動形式が使用できる。
【００９５】
フレキシブルなハードウエアおよびソフトウェアによって装置は複数の適用に適応できるようになる。ソフトウェアプログラムモジュールにより方法の作出、改善および実施が可能となる。このシステム診断モジュールにより装置のアライメント、正しい接続、およびモーター作動が可能となる。カスタマイズしたツール、実験器具、ならびに液体、粒子、細胞および生物運搬パターンにより種々のアプリケーションが実施できる。データベースには方法およびパラメーターの保存ができる。ロボットおよびコンピューターインターフェースにより装置間のコミュニケーションが可能となる。
【００９６】
ある好ましい実施形態では、ロボット装置は、バスによって記憶装置および入力／出力ディバイスセット（例えば、キーボード、マウス、モニター、プリンターなど）と連絡する中央処理装置（ＣＰＵ）を含む。本明細書で論じるように、ＦＴＭＳデータ解析のためにはこれをＣＰＵに加えるか、ＣＰＵの代わりに用いる。中央処理装置、記憶装置、入力／出力ディバイス、およびバス間の全体的な相互作用については当技術分野において公知である。従って、実施する実験に応じた種々の様々な手法をＣＰＵ記憶装置に保存する。
【００９７】
これらのロボット液体ハンドリングシステムはバッファー、試薬、超臨界溶液およびガス（特に抽出用）、サンプル、洗浄液、アッセイ成分などを含む、多数の様々な試薬を使用できる。同様にサンプルが限られている場合には全ての構成要素（キャピラリー、接続など）を最小にして大きなデッドボリュームや希釈作用を回避することができる。
【００９８】
細胞が同定され、任意の候補物質（薬物を含む）を加えれば、細胞はＦＴＭＳ分析のために調製される。当業者ならば分かるであろうが、これは評価する分子の種類に応じて、単純な溶解からより精巧な分離技術までに及び得る。当業者ならば分かるであろうが、異なる分子は、分子のタイプ（例えば、タンパク質性、脂質、核酸、炭水化物、代謝産物、小分子など）、分子の大きさ（例えば、「小分子」とは通常、ほぼ２５００〜１５００ダルトン未満の分子をさす）、またはその他の分子の特徴に基づくもの（例えば、非極性に対する極性、電荷、金属イオンの含有、結合特性など）を含む多くの様々なパラメーターによって分類することができる。例えば評価に好適な分子としては、酵素反応または酸化／還元反応の生成物として生じる代謝産物（異化代謝産物を含む）が挙げられる。かかる代謝産物としては、食品中に存在する様々な小分子（例えば、ビタミン、外来物質、生体異物、毒素、酸化脂質、殺虫剤、生体異物から分解された分子など）、食品の酵素消化によって生成された様々な小分子（例えば、アミノ酸、特に必須アミノ酸、脂肪酸、特に必須脂肪酸、解糖の中間体および最終産物）、細胞によって合成された様々な小分子（ホルモン、神経伝達物質、毒素、プロスタグランジンなど）、またはそれ以外に存在する様々な小分子（部分的に代謝された薬物など）が挙げられる。
【００９９】
さらに、当業者ならば分かるであろうが、安定な同位元素標識または枯渇も同様に行うことができる。
【０１００】
一般に、ＦＴＭＳに好適な溶媒中での細胞または細胞溶解物の抽出などの最小限の調製を行うが、必要に応じて、または所望であればバッファー、塩、およびその他の試薬を添加する。
【０１０１】
ある好ましい実施形態では、ＦＴＭＳのためのサンプル調製は当業者に公知のいずれの方法によって行ってもよい。サンプル調製にはＦＴＭＳの感度および分解能を高めるための脱塩ステップを含むことが好ましい。さらに、当業者ならば分かるであろうが、調製ステップ、溶媒、精製および分離スキームの組合せは、すべて評価する生体分子の種類に依存するだろう。しかし、ほとんどの場合で予備的な分離の必要はない。
【０１０２】
１つの実施形態では、サンプルは、タンパク質沈殿の後に脱塩処理を行うことで調製される。各サンプルにメタノールおよび水（４９：４９：２、水：メタノール：酢酸ｖ：ｖ：ｖ）の溶液を加えて、サンプルを冷却する。これによりチューブの底にタンパク質が沈殿する。次に各チューブを遠心分離し、上清をデカントする。脱塩ステップにおいては、各バイアルに少量（約１００ｍｇ）のＤＯＷＥＸイオン交換樹脂を加え、約１０分間静置する。次にこのサンプルを遠心分離して上清を取り出す。次にこの溶液を質量分析計へ導入する。
【０１０３】
本発明の実施においてはイオン源とともに当業者に公知のいずれの溶媒を使用してもよい。好適な溶媒の例としては、ジメチルスルホキシド、アセトニトリル、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、プロピレンカーボネート、塩化メチレン、ニトロメタン、ニトロベンゼン、ヘキサン、メタノールおよび水が挙げられる。溶媒は１種を超える溶媒を含んでもよい。ある好ましい実施形態では、溶媒はメタノールおよび水（４９：４９：２、水：メタノール：酢酸 ｖ：ｖ：ｖ）の溶液である。
【０１０４】
好適な溶媒の選択はＦＴＭＳによって検出を行う生体分子のタイプに依存するだろう。例えば、ＦＴＭＳによって可溶性分子の検出を行う場合には溶媒としてメタノールおよび水の溶液を用い、一方脂質などの無極性分子の検出を行う場合にはヘキサンを使用できる。本発明の１つの実施形態では、サンプル源（例えば組織、細胞）を種々の溶媒で抽出し、各抽出物に対してＦＴＭＳを行えば、サンプル源に存在する分子のより完全な分析を行うことができる。
【０１０５】
サンプルは場合により、ＦＴＭＳ法を始める前に精製または分離される。有用な分離技術としては、限定されるものではないが、乱流（ｔｕｒｂｕｌｅｎｔ ｆｌｏｗ）クロマトグラフィーを用いるＨＰＬＣ、液体クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、超臨界溶液クロマトグラフィー、ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）、電気泳動（限定されるものではないが、キャピラリー電気泳動、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、アガロースゲル電気泳動を含む）、固相抽出、および液相抽出（好ましくは種々の溶媒（例えば脂質にはクロロホルム／メタノール、極性分子には水）を用いる）が挙げられる。イオン源のキャピラリーにはシリカビーズ（誘導体化されたもの、または誘導体化されていないもの）またはクロマトグラフィー／分離を行うためのその他の材料を充填できる。
【０１０６】
さらに、サンプルに対する精製および分離技術は様々な順序また様々な組合せで同時に実施してもよいし、または連続して実施してもよいことに注意すべきである。従って例えば、サンプルの一部に対して単純なタンパク質沈殿法を実施した後にＨＰＬＣステップを行ってもよい。同様に、ピークの解明または同定の際にサンプルの一部（例えば細胞集団の一部）に対して異なる技術を行ってもよい。
【０１０７】
ある好ましい実施形態では、ある特定のＦＴＭＳの実行で１タイプの生体分子だけを評価する。例えば、ある所定の質量のタンパク質だけを評価するような精製／分離スキームを作製してもよい。その後のＦＴＭＳの実行では、同じサンプルに対して異なる技術を用いて異なるサブセットの生体分子を評価できるようにしてもよい。
【０１０８】
あるいは、また好ましくは、１回のＦＴＭＳの実行中に１タイプ以上の生体分子を評価する。すなわち、本発明ではタンパク質と脂質、タンパク質と炭水化物、タンパク質と小さな代謝産物などを同時に評価することができる。
【０１０９】
当業者ならば分かるであろうが、ＦＴＭＳを用いて多数の生体分子を分析することができる。生体分子はある１タイプの中の全てのもの（例えばタンパク質）でもよいし、あるいは混合物でもよい。これに関して好適な生体分子としては、上記で規定したタンパク質、核酸、脂質、炭水化物、および代謝産物がある。
【０１１０】
生物学的サンプルはそのサンプルを質量分析に供する前にイオン化する。生物学的サンプルに存在する分子を損なわないいずれのイオン化法を用いてもよい。このような方法はＢａｒｋｅｒ， １９９９，「Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ」，第２版， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｌｔｄ．， Ｅｎｇｌａｎｄに記載されている。
【０１１１】
１つの実施形態では、生物学的サンプルは化学イオン化によりイオン化することができる。化学イオン化は電子衝撃源を用いて電子でメタンに衝撃を与えることで作製される試薬イオンを用い、プロトンまたはヒドリド転移によって生物学的サンプル分子をイオン化する。あるいは、電子ビームを用いて気相原子または分子をイオン化する電子衝撃を直接使用することもできる。通常はタングステンフィラメントから作製されたビームの電子が原子または分子から電子を奪い取ることで生物学的サンプルの分子をイオン化する。
【０１１２】
もう１つの実施形態では、生物学的サンプルをプラズマおよびグロー放電によってイオン化することができる。プラズマおよびグロー放電には、２つの電極間で加熱し、部分的にイオン化したガスを低圧で用いて原子を励起およびイオン化する必要がある。
【０１１３】
もう１つの実施形態では、中性原子（典型的にはＸｅまたはＡｒ）の高エネルギービームを用いた生物学的サンプルの高速原子衝撃を用いて生物学的サンプルに存在する分子をイオン化する。高エネルギー原子のビームはイオン源から電荷交換セルを介してイオンを加速することで生じ、ここで起こる衝撃が中性原子のイオン化をもたらす。
【０１１４】
さらにもう１つの実施形態では、フィールドイオン化を用いて生物学的サンプルに存在する分子をイオン化する。フィールドイオン化では分子に電子を失わせるのに十分に高い電場を用いる。このような電場はフィールドエミッターと呼ばれるカソードとアノードの間に高電圧をかけることでイオン源の中に作製することができる。フィールドエミッターは微小カーボンデンドライトで覆ったワイヤからなり、カーボンポイントで有効電場が著しく増幅される。
【０１１５】
さらにもう１つの実施形態では、プラズマ脱離イオン化を用いて生物学的サンプルに存在する分子をイオン化する。プラズマ脱離イオン化は２５２Ｃｆの崩壊を用い、これにより逆方向に動く２つの核分裂片が生じる。一方のフラグメントは生物学的サンプルに当たってサンプル中の分子からイオンを奪い取り、もう一方のフラグメントは検出器に当たってデータ取得の開始の引き金となる。
【０１１６】
さらにもう１つの実施形態では、生物学的サンプルに存在する分子をレーザーイオン化によりイオン化する。要するにレーザーパルスがサンプルの表面から物質を融除してマイクロプラズマを発生させ、これがサンプルの構成要素のいくつかをイオン化する。このレーザーパルスはサンプルの気化とイオン化の双方を行う。
【０１１７】
ある好ましい実施形態では、生物学的サンプルに存在する分子をマトリックス支援レーザー脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）を用いてイオン化する。生物学的サンプルをニコチン酸などの固相マトリックスに分散させ、ＵＶレーザーパルスがこのマトリックスを融除する。このマトリックスはそれと一緒にイオン化形態の大きな分子のいくらかを気相へと運び、その後それらを質量分析計へと導くことができる。
【０１１８】
最も好ましい実施形態では、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）を用いて生物学的サンプルに存在する分子をイオン化する。ＥＳＩ源は極めて微細なニードルと一連のスキマーからなる。サンプル溶液をＥＳＩ源チャンバーへスプレーすると液滴を形成する。これらの液滴はキャピラリーを出ると電荷を持ち、溶媒が気化すると液滴が消えて高度に荷電した分子が生物学的サンプル中に残る。ＥＳＩは気化またはイオン化が難しい大きな生物学的分子に有用であるので好ましい。さらに、ナノスプレー技術および装置が当技術分野で公知であり、本発明において使用が見出せる。
【０１１９】
本発明の実施においては当業者に公知のその他のイオン化法も使用できる。このような方法としては、限定されるものではないが、共鳴イオン化、二次イオン化、およびスパーク源が挙げられる。
【０１２０】
上記の各イオン源では、陽イオン化または陰イオン化モードが使用できる。陽イオン化モードではサンプル分子のプロトン化を助けるために微量の蟻酸を添加することが多く、陰イオン化モードではサンプル分子の脱プロトン化を助けるために微量のアンモニア溶液または揮発性アミンを加える。タンパク質およびペプチドは通常陽イオン化条件下で分析し、糖類およびオリゴヌクレオチドは陰イオン化条件下で分析する。
【０１２１】
次にサンプルをＦＴＭＳへ導入する。フーリエ変換質量分析（ＦＴＭＳ）はフーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴（ＦＴＩＣＲ）としても知られている。この技術による分子質量測定の原理はイオンの質量とそのサイクロトロン周波数の間の線形逆相関に基づくものである。強い磁場に供されたイオン（または荷電粒子）はサイクロトロン旋回と呼ばれる自然回転型の運動を受け、反対の電荷を持つイオンは逆向きに旋回する。ＦＴＭＳでは、サイクロトロン旋回はイオンを放射状に限定し、磁場の軸に対して垂直方向に電場をかけることでイオンを軸状に限定する。この構成は通常「トラップイオン（ｔｒａｐｐｅｄ−ｉｏｎ）」セルと呼ばれるものを含む。イオンのサイクロトロン旋回の周波数はその質量電荷比（ｍ／ｚ）に反比例し、適用した磁場の強度に正比例する。従ってｍ／ｚが低いイオンのサイクロトロン周波数は高いｍ／ｚのイオンのものよりも高い。
【０１２２】
ｍ／ｚを有するイオンがトラップイオンセルに存在する場合、イオンアンサンブルは掃引高周波励起（ｓｗｅｐｔ ｒａｄｉｏ ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ）を適用することでより大きなサイクロトロン軌道へと励起される。掃引高周波励起は目的のサイクロトロン周波数範囲に対応する周波数成分を含む。軌道上にあるイオン雲（すなわち、各ｍ／ｚのイオンが固有のサイクロトロン周波数で軌道を回っている）は分光計の２以上の検出電極にイメージ電流を発生させる。このイメージ電流は励起した各イオン雲のサイクロトロン周波数を有するサイン波を作り出す。このシグナルは重畳サイン波であって、フーリエ変換を行った際にイオンアンサンブルの各構成要素のサイクロトロン周波数の極めて正確な測定値をもたらす。特にこの非破壊的イメージ電流検出スキームはＦＴＭＳに特有のものであり、従来の破壊型検出法に比べ感度および融通性という点で著しい利点をもたらすものである。この非破壊的ＦＴＭＳ検出スキームはイオンの再測定に使用でき、同じイオン集団を複数回測定して感度を高めることができる。シグナル／ノイズ比は測定回数の平方根だけ逆に増加し、例えば４回測定すればシグナル／ノイズ比は２倍高まる。シグナルを増加する別の方法としては、シグナルを増加するために十分なイオンをセル内に「汲み上げる」ことである。セルが「一杯に」なったところで分析を行う。また目的のフラグメントイオンがＦＴＭＳセルに選択的に保持され、さらに解離して再び検出できるようなイオン集団に対してはＭＳｎ（ｎ＞２）、例えば、タンデムまたは拡張多段階質量分析研究を行うことができる。これらの多段階研究は構造上の情報を増加させ、全体の感度も著しく向上させる。ＦＴＭＳはフェントモル感度の検出を提供することができる。
【０１２３】
イオンフラグメンテーションを行う場合には、質量分析者の経験が重要な役割を果たす。強度の低いピークに対応する分子のフラグメンテーションができたとしても、その強度が小さすぎてどのフラグメントも同定できない場合がある。フラグメントが多すぎれば、いくつかを他で「消去」することができる。
【０１２４】
ＨＩＣＳ−ＦＴＭＳはＦＴＭＳを、比較的狭い質量範囲内の数百までのピークを提供することができる極めて複雑な生物学的混合物を分析するために応用したものである。予期しないことに、ＦＴＭＳはｍ／ｚが接近しうる複雑な混合物の成分を識別するのに必要な高い分解能を実現することができる。ＦＴＭＳはよりよく識別できる質量のための「チャネル」を設けることでより高い分解能を提供する。このタイプの分析で認められるピークに対応する生物学的分子はほとんどのものが少なくとも最初は（ＨＩＣＳ−ＦＴＭＳピークプロファイルのデータベースとそれら個々のピークに対応する分子の正体をコンパイルするまでは）同定できない。ＦＴＭＳによって達成できる高い質量測定精度を用いると、化学構造および／または配列を同定することができる。ＦＴＭＳが日常的に生じ得る質量測定誤差は（±）３ｐｐｍ未満であり、従って極めて小さな質量差を決定することができる。例えば、Ｃ１３Ｈ２０Ｎ２Ｏ３およびＣ１４Ｈ２４Ｎ２Ｏ２は同じ見かけの質量（それぞれＭＷ ＝ ２５２．１４６８および２５２．１８３２）を有するが、ＦＴＭＳを用いれば、それらの実際の質量の０．０３６４Ｄａ（または１４４ｐｐｍの相対誤差）の差に基づいて分析可能である。
【０１２５】
市販のフーリエ変換質量分析計はいずれもＨＩＣスクリーニングおよび／または分析に使用できる。１つの実施形態では、質量分析計はＵｌｔｉｍａ ＦＴ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ（ＥＳＩおよびＭＡＬＤＩイオン化システムの組合せを搭載し、４．７、７．０または９．４Ｔマグネットで使用できる； ＩｏｎＳｐｅｃ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ， Ｉｒｖｉｎｅ， Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）である。別の実施形態では、本発明の実施に用いる質量分析計はＦＴ／ＭＳ（登録商標）１０００、２０００； ＦＴ／ＭＳ ２００１； Ｔ３０ ＦＴ／ＭＳ、Ｔ７０ ＦＴ／ＭＳまたはＮｅｗＳｔａｒ （Ｆｉｎｎｉｇａｎ Ｓａｎ Ｊｏｓｅ， Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）である。ある好ましい実施形態では、質量分析計はＡＰＥＸ ＩＩＩ （Ｂｒｕｋｅｒ Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ， Ｉｎｃ．； Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ， Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）であり、９．４ＴマグネットならびにＥＳＩおよびＭＡＬＤＩ源とともに使用できる。
【０１２６】
ＦＴＭＳはＮａｔｉｏｎａｌ Ｈｉｇｈ Ｍａｇｎｅｔｉｃ Ｆｉｅｌｄ Ｌａｂ（Ｔａｌｌａｈａｓｓｅｅ， Ｆｌｏｒｉｄａ） などのＦＴＭＳサービスラボで行うことができ； ｔｈｅ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ （ＥＭＳＬ： Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｅｎｅｒｇｙ， Ｐａｃｉｆｉｃ Ｎｏｒｔｈｗｅｓｔ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ （ＰＮＮＬ）， Ｒｉｃｈｌａｎｄ， Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ）は、一般使用可能なＦＴＭＳ施設（１１．５Ｔ大孔径高性能フーリエ変換質量分析計および７Ｔ ＥＳＩフーリエ変換質量分析計を設置）を提供する。
【０１２７】
質量分析計の磁場容量はＦＴＭＳによるＨＩＣ分析およびスクリーニングに必要な分解能を達成するのに重要なものである。少なくとも７テスラのマグネット（約６６ｋＤａの検出の質量上限）を用いるのが好ましい。９．４テスラのマグネットを用いるのがよりいっそう好ましい（約１２０ｋＤａの検出の質量上限）。
【０１２８】
本発明の生物学的サンプルは質量分析計に手動で（例えば、手動ピペットまたはシリンジを用いる）導入することもできるし、またはロボットで導入することもできる。ＨＩＣＳ−ＦＴＭＳによる大規模スクリーニングでは、効率を向上させるためにロボットによるローディングが好ましい。
【０１２９】
１つの典型的な実施形態では、生物学的サンプルを、オートサンプリングロボット（ＧＩＬＳＯＮ，モデル２１５）に接続した６４μ内径ＰＥＥＫチューブにより質量分析計に導入する。このオートサンプリングロボットは９６０ものサンプルウェルから少量（３０μｌ）を採取するようにプログラムすることができる。各サンプルを１００μｌ抽出液として調製するとすれば、７０μｌはその後の使用のために保存しておくことができる。トランスファーラインへインジェクションするごとに、ニードルとインジェクターは５００μｌの溶液で洗浄してクロスコンタミネーションを防ぐ。一定流量の移動相（４９：４９：２のメタノール：水：酢酸 ｖ：ｖからなる３０μｌ／分）をＥＳＩ源に送り込む。オートサンプラーによって回収されたサンプルアリコートをこの流れへループインジェクションする。これらの条件の下で、３分につき約１サンプルというサンプリング速度が達成できる。９６０サンプルのスペクトルが収集され、デジタル保存されれば、別の９６０サンプルを質量分析計に導入することができる。ロボットは複数の実行をプラグロム可能である。
【０１３０】
さらに、種々のプログラムを用いて現行の技術を最大化および活用することができる。例えば再現可能な少量のサンプルのローディングは、「Ｔ」字型のキャピラリー接合部を用いてサンプルをローディングするキャピラリー電気泳動技術を含めた種々の微細流動技術を用いて達成することができる。これによりサンプルの分割が可能となり、一部をＦＴＭＳにインジェクションし、一部を保存するか、または他の分析に使用する（例えば、サンプルの一部で生物学的アッセイを実行してもよい）。また流量も調節可能で、例えば注目するピークがＨＰＬＣカラムから溶出したところで流量を低減し、例えば次のフラグメンテーションを行わせてもよい。
【０１３１】
上記で概説したように場合により質量分析計に導入する前にサンプルを分離するため、ＨＰＬＣロボットに質量分析計を接続する。この系の標準的な較正を別途行う。
【０１３２】
大量の情報を迅速に回収することができるハイスループット法では、データ管理は重要な問題である。本明細書に記載の発明では、主要な情報の種類は種々の細胞タイプ（試験分子で処理したものと処理していないもの；疾患状態のものと正常なもの；種々の組織；種々の患者のサンプル；分化またはストレスにおける様々な状態の細胞など）におけるＦＴＭＳプロファイル、ならびに間接的にはそれら種々の細胞タイプ間で異なる分子、従ってその分子や疾患状態に対するある薬物の作用に関するものである。
【０１３３】
当業者ならば分かるであろうが、これらの情報収集および加工に使用できる多様な方法およひシステムがある。
【０１３４】
ＨＩＣＳ−ＦＴＭＳまたはＨＩＣＡ−ＦＴＭＳスペクトルの取得および基本分析は、複雑なデータの解析用に設計された容易に入手できる市販のソフトウェアを使用することができる。 ある実施形態では、フーリエ変換質量スペクトル（ＩｏｎＳｐｅｃ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ， Ｉｒｖｉｎｅ， Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）の取得および解析にＯｍｅｇａバージョン７、３２ビットＷｉｎｄｏｗｓ ９８ソフトウェアを用いる。別の実施形態では、３２ビットプロセッサ（Ｗｉｎｄｏｗｓ ９５、９８またはＮＴ）に至適化されたソフトウェアであるＭａｓｓＳｐｅｃ Ｃａｌｃｕｌａｔｏｒ（商標） Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ （ＣｈｅｍＳＷ， Ｆａｉｒｆｉｅｌｄ， Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を用いる。ＭａｓｓＳｐｅｃ Ｃａｌｃｕｌａｔｏｒ（商標） Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌはドローイング、フラグメンテーション、オートフラグメンテーション能を提供する。このソフトウェアは全ての元素の質量データ、同位元素の番号、および各同位元素の質量と相対存在量をはじめとする７９エレメントをサポートしている。さらにもう１つの実施形態では、フーリエ変換質量スペクトル（Ｂｒｕｋｅｒ Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ， Ｉｎｃ．； Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ， Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）の取得および解析にＸＭＡＳＳ（商標）またはＨＹＳＴＡＲ（商標）などのソフトウェアを用いた。また別の実施形態では、Ｃｈａｒｉｓｍａ Ｓｏｆｔｗａｒｅを用いた（Ｆｉｎｎｉｇａｎ Ｓａｎ Ｊｏｓｅ， Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）。
【０１３５】
基本ソフトウェアを用いて得られたデータは標準的なリレーショナルまたはスプレッドシート形式を用いて取り扱うのが便宜である。さらに、多くの場合で、ローカルデータベースに対して（例えば、非公開の実験によって同定された構造）、および最終的には世界的データベースに対して、新たに得られた各分子の配列について検索を行うのが有効である。
【０１３６】
遺伝子およびタンパク質発現のパターン、ならびに特定の処理または疾患状態が特定の細胞または生物種で起こす生物作用（代謝作用を含む）を解釈するために、本方法から得られるデータを視覚化する特殊なツールを考案することもできる。例えばこのようなツールは、例えば特定の種類の薬物による処理によって最も頻繁に影響を受けるか、あるいは種々の治療の副産物としての特定の副作用と最も頻繁に関わるＨＩＣＳ−ＦＴＭＳピークを同定するための、マルチプルペア比較またはいくつかの実験の結果を累積したものを表す平均化法もしくは合計法を含み得る。多くのデータベース、解析パッケージ、検索エンジンおよびグラフィックインターフェースがＨＩＣＳ−ＦＴＭＳに採用でき、またはこれらの目的でのために特別の設計を施すことができる。例えば、ベースラインの調整、シグナル／ピーク認識プログラム、ピーク加算プログラム、多数の統計分析プログラム（平均または中間ピークの算出、質量スペクトル平均、標準偏差、仮説試験、信頼区間、クラスター分析などを含む）。多様な統計分析は一般にＦｒｅｕｎｄおよびＷａｌｐｏｌｅ，「数学統計学（Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃａｌ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ）」， Ｐｒｅｎｔｉｃｅ Ｈａｌｌ， Ｉｎｃ． Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ， １９８０（参照によりそのまま本明細書に組み入れる）などのテキストに記載されている。
【０１３７】
一例として種々の細胞タイプでレベルが変わる細胞の構成成分を同定する好ましい方法は以下のステップを含む。
【０１３８】
１．　目的とする各スペクトルから所定の基準を満たすピークを選択し、そのピーク情報ファイルに書き出す（図１参照）。
【０１３９】
２．　種々のスペクトルデータディレクトリからピークを抽出し、必須の処理と実験条件を関連づけ、データを１つのファイルにまとめる。クラスタリングアルゴリズムを用いてスペクトル間のピークをマッチさせ、各ピークを対応するクラスターからのメッセージの平均で再ラベルする（図２および３参照）。
【０１４０】
３．　各質量クラスター（化学的成分）の相対強度（存在量）に及ぼす種々の処理の影響に関して得られたデータ（処理条件、クラスターの平均質量、および相対強度）を分析する。
【０１４１】
ピークの選択： 図１参照。ステップ１１０でＡｐｅｘ ＩＩ質量分析計からスペクトルを取得して処理する。ＸＭＡＳＳソフトウェア（バージョン５．０．１０， Ｂｒｕｋｅｒ Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ， Ｉｎｃ．）に書かれているマクロは、ステップ１２０で一度に一回（ステップ１１５、１３５および１４０参照）所定の質量スペクトルセットを開く助けをするＸＭＡＳＳ内部マクロを使用する。「Ｓｐｅｃ［ｉ］」は全てのスペクトルの間の当該スペクトルを表す。
【０１４２】
ステップ１２５で、ピークを選択するための感度（ＰＣ）、数（ＭａｘＰｋｓ）および範囲（ｐｐ）を制御するパラメーターを設定する。ＰＣとはピークピッキング感度であり、許容されるシグナル／ノイズ比に関連する。ＰＣの値を大きくするほど（≧１０）、スペクトルから高く際だったピークだけが選択される。ＰＣの値を低くすると（≦２．５）、バックグラウンドから識別しにくいより多くのピークがピックアップされ、ノイズとともに存在量の低いピークが選択できる。ある好ましい実施形態では、２．５、５および１０という値を用いる。これらの値は経験的な観測をもとに選択されたものである。ＭａｘＰｋｓとは選択されるピークの最大数である。ＭａｘＰｋｓ ＝ １であれば、他のパラメーターの設定に関わらず、１つのピーク（通常最も明瞭なもの）だけが選択される。ある好ましい実施形態では、この値は非常に高い数値に（例えば１０，０００）に設定してあり、他のパラメーターの制約を満たす全てのピークを選択するようになっている。ｐｐとは実際にピークをピックアップするために用いられる関数である。これを用いると、考慮すべきスペクトルの範囲がｘおよびｙ座標として与えられる。ある好ましい実施形態では、認められるピークの全てが１０００ｍ／ｚ未満であって、１．５を超えるピークが存在しなかったので、これらの値はｘ０ ＝ ０、ｙ０ ＝ ０、ｘ１ ＝ １０００およびｙ１ ＝ ２．０と設定する。
【０１４３】
ステップ１３０で、スペクトルに対してＸＭＡＳＳピークピッキングアルゴリズム（ｐｐ）を用い、ステップ１２５で設定したパラメーターに基づいてピークを選択する。得られたピークは ＡＳＣＩＩテキストファイル（ｗｒｉｔｅＰｅａｋｓ）に書き出す。これらのファイルのデータは各選択されたピークの質量およびそれが測定された相対度を含む。
【０１４４】
全スペクトルからのピークデータの合成： 図２参照。ステップ２１０で、各スペクトルのピークをＸＭＡＳＳにより、対応するスペクトルを有するサブディレクトリの独立ファイルとして保存する。
【０１４５】
どのようにしてＸＭＡＳＳソフトウェアがスペクトルを体系化するか順を追って簡単に説明する。この体系化は全てディレクトリ階層に基づいている。サンプルが処理された際のデータが保存すべきものであればディレクトリを選択する。サンプルが処理される際、それらには１からサンプル総数の番号が付けられ、各サンプルの結果（スペクトルおよび補助情報）がそのサンプル番号（ＸＭＡＳＳではこれを実験番号という）の名称のサブディレクトリに入れられる。これらの実験番号のディレクトリの中にはｐ ｄａｔａと呼ばれるサブディレクトリがあり、１から始まってそのサンプルが何回目に分析されたかというサブディレクトリ番号が付けられている（各々その固有のスペクトルを含む）。このディレクトリの中にＡＳＣＩＩピークファイルが書き込まれている。ＸＭＡＳＳソフトウェアは従来の方法で実験条件を追跡する従来の方法を有するものではないので、サンプルの処理中に、付けられた実験番号とこれらの条件との関連づけに注意しなければならない。
【０１４６】
ステップ２２０で、これらのファイルからのデータを取り出し、各スペクトルが表す測定されたサンプルについての処理および実験条件に関する関連情報とともに１つのファイルに合成する。本発明のある好ましい実施形態は、実験番号に対して実験条件をマッピングし、各ピークファイルを開き、そのファイルの内容を読み込み、質量および相対強度データとともに実験条件を１つのファイルに書き出すＰｅｒｌプログラミング言語（Ｐｅｒｌ，バージョン５．０．６， Ｃｏｐｙｒｉｇｈｔ １９８７−２０００， Ｌａｒｒｙ Ｗａｌｌ）のプログラム（以下に示す）を含む。目的とする全てのサンプルを、それらのデータを１つの共通ファイルに書き込むには、一度に処理しなければならない。この処理を、ピークが感度パラメーターについて異なる値で再処理される度に繰り返す。
【０１４７】
Ｐｅｒｌプログラム：
説明： この記述はＸＭＡＳＳピークセットを解釈し、サンプル処理条件に関する補助的な情報を追加し、コンマで区切った１つのデータファイルにそれらを追加する。
【０１４８】
2004503749.tif 000002
2004503749.tif 000003
【０１４９】
次にこの合成ファイルのデータを統計プログラミング環境（Ｒ， バージョン１．０１， Ｉｈａｋａ ＆ Ｇｅｎｔｌｅｍａｎ （１９９６）， 「Ｒ： データ解析およびグラフィクスの言語（Ｒ： Ａ Ｌａｎｇｕａｇｅ ｆｏｒ Ｄａｔａ Ａｎａｌｙｓｉｓ ａｎｄ Ｇｒａｐｈｉｃｓ）」， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ ａｎｄ Ｇｒａｐｈｉｃａｌ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ ５：２９９−３１４）にインポートする。
【０１５０】
スペクトルの中で同じ化学的成分を表すものと報告されたピーク質量にも小さな変動がある場合が非常に多い。従ってスペクトルの間のピークを有意義に比較するには、同じ化学的成分に対応すると考えられるピークを識別し、適宜ラベルしなければならない。このタスクはクラスタリングアルゴリズムを用いて行う。
【０１５１】
図２を参照すると、ステップ１３０で、ピーククラスター感度パラメーターを設定する。ピーククラスター感度パラメーターは用いるクラスタリングアルゴリズムに関わらず、データを用いて実際の実験に基づいて好ましい選択を行う。この目的としては、同じ化学的成分を表すと考えられるスペクトル間の全ての質量を合成し、他のものは合成しないということである。ステップ１４０では、クラスタリングアルゴリズムを用いてスペクトルの中の共通のピークを見つけ出す。このステップのクラスタリングプロセス（図３でさらに説明する）および複数の実験からデータの迅速入手のためにはｍａｘＤｉｓｔ値０．０００８が著しく優れていることが分かっている。隣接するピークが混成していることは稀であり、対応すると考えられえるピークはクラスタリングされる。
【０１５２】
カスタムコード機能を用いると、特定の感度パラメーターで、比較的歪みのないクラスタリングアルゴリズムを用いて質量スペクトル間で共通するピークが同定される（図３に示す）。
【０１５３】
図３を参照すると、ステップ３１０で、変数ｍａｘＤｉｓｔ、すなわちクラスター内のピーク質量間の最大許容距離を設定する。ステップ３１５では、ｍａｓｓＶｅｃ、すなわち全スペクトルから選択された全ピークの固有質量のベクトルを作成し、数値によってソートする。ある好ましい実施形態では、Ｒにより提供されるソーティングアルゴリズムを用いるが、当業者ならば、本発明の精神を逸脱しない限り、これに関してはその他のソーティングアルゴリズムも使用できることが分かるであろう。全スペクトルから選択されるピークは、合成データファイルのピークであり、その作成についてはステップ２１０および２２０に記載されている（図２参照）。ステップ２２０では、ベクトルｍａｓｓＶｅｃに関して繰り返し用いられるカウンターｍＧｎｔは２に初期化し、ベクトルｇｒｏｗＣｌｕｓｔは最初はスカラー値ｍａｓｓＶｅｃ［１］に設定し、変数ｃｌｕｓｔＤｉｃｔは空の仮想配列（ハッシュ（ｈａｓｈ）またはリストともいう）として初期化する。
【０１５４】
ステップ３２５では、カウンターｍＣｎｔをｍａｓｓＶｅｃの長さと比較する。ｍＣｎｔがｍａｓｓＶｅｃの長さ（エレメントの数）を超えなければ、ステップ３３０でｍａｓｓＶｅｃ［ｍＣｎｔ］ − ｍａｓｓＶｅｃ［ｍＣｎｔ − １］の値をｍａｘＤｉｓｔと比較する。ＭａｓｓＶｅｃ［ｍＣｎｔ］ − ｍａｓｓＶｅｃ［ｍＣｎｔ − １］の値がｍａｘＤｉｓｔを超えなければ、ｍａｓｓＶｅｃ［ｍＣｎｔ］で表されるピークはｍａｓｓＶｅｃ［ｍＣｎｔ − １］と同じクラスターピークに属するものと推定される。そこでステップ３３５では、このｍａｓｓＶｅｃ［ｍＣｎｔ］成分を、すでにｍａｓｓＶｅｃ［ｍＣｎｔ − １］を含んでいるベクトルｇｒｏｗＣｌｕｓｔの終点に近づけていくことにより１つの成分によってｇｒｏｗＣｌｕｓｔの長さを増加させる。ステップ３４０では、カウンターｍＣｎｔは１だけ増えてステップ３２５が繰り返される。
【０１５５】
ステップ３３０でｍａｓｓＶｅｃ［ｍＣｎｔ］ − ｍａｓｓＶｅｃ［ｍＣｎｔ − １］の値がｍａｘＤｉｓｔを超えれば、ｍａｓｓＶｅｃ［ｍＣｎｔ］で表されるピークは新しいピーククラスターに属すものと推定される。そこでステップ３４５では、ベクトルｇｒｏｗＣｌｕｓｔに含まれている既存のクラスターに対応するピーク質量をクラスターディクショナリーｃｌｕｓｔＤｉｃｔ に加え、クラスター名としてｇｒｏｗＣｌｕｓｔ の単純非加重平均を与える。ステップ３５０では、変数ｇｒｏｗＣｌｕｓｔはｍａｓｓＶｅｃ［ｍＣｎｔ］に割り付けられ、それまでのｇｒｏｗＣｌｕｓｔのコンテンツに上書きされる。ステップ３４０では、カウンターｍＣｎｔが１だけ増えてステップ３２５が繰り返される。
【０１５６】
ステップ３２５で、ｍＣｎｔの値がｍａｓｓＶｅｃの長さを超えて全てのピーク質量がクラスタリングされれば、ステップ３４５と同様、ステップ３５５でｇｒｏｗＣｌｕｓｔの最終的なコンテンツをｃｌｕｓｔＤｉｃｔに加える。ステップ３６０では、クラスターディクショナリーｃｌｕｓｔＤｉｃｔを用い、ステップ２２０で作成された全選択ピークのデータセットの各ピーク質量を再ラベルする（図２参照）。
【０１５７】
当業者ならば、本発明において図３で示されたもの以外のクラスタリングアルゴリズムも使用できることが分かるであろう。クラスター解析のその他の方法に関する標準的な参照文献としては、Ｋａｕｆｍａｎ， Ｌ．およびＲｏｕｓｓｅｅｕｗ， Ｐ．Ｊ． （１９９０） 「データ内の群の決定（Ｆｉｎｄｉｎｇ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｄａｔａ）」： Ａｎ Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｃｌｕｓｔｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ． Ｗｉｌｅｙ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ．がある。本発明のもう１つの好ましい実施形態では、上記の参照文献（または当業者に公知のその他の参照文献）に開示されているクラスタリングアルゴリズム（各々調整のために独自の感度パラメーターセットを用いる）を適用して異なる実験の分析から得られたピークパターンに適用する場合の非管理下での再現性の許容レベルを得る。
【０１５８】
再び図２を参照して、ピーククラスターの全てが同定されたところで、各スペクトルの各ピークの質量を対応するクラスター内の質量の加重平均として再ラベルする。関連の処理および実験条件の情報（例えば、薬物、薬物濃度、およびサンプルの種類）、クラスター平均質量ならびに相対強度によって、ステップ２６０においてデータは十分な分析情報となる。
【０１５９】
相対ピーク強度に対する処理の作用の分析： ある好ましい実施形態では、最初に行う分析で、各ピーク（化学物質）についての実験条件と相対強度（化学物質の量）の間の関係を同時に組み合わせて求める。例としては、限定されるものではないが、ある薬物について種々の薬物濃度での作用を分析すること、薬物に曝す時間を変えること、多数の薬物の薬物濃度および／または曝露時間を変えて比較すること、および生物学上かつ医学上関連のある多種のサンプルおよび実験条件の間での薬物応答を比較することが挙げられる。Ｒプログラミング環境を用いると、高レベルのグラフィック、一般的な直線モデル、ならびにクラスター解析の方法およびパターン認識を用いて目的のピークおよびピークパターンが識別できる。
【０１６０】
当業者ならば、この種のデータを用いて製薬およびバイオテクノロジー産業において注目される問題を解決する他の多くの方法があることが分かるであろう。開示の方法が適用できる他の文書の例としては以下の第５．６〜５．１０節に開示されおり、限定されるものではないが、以下のもの： （１） 代謝経路全体に及ぼす薬物の影響の同時測定および同時分析； （２） 既知および／または未知の薬物および化学化合物の、代謝活性への全体的な影響に基づく官能基へのアサインメント；（３） 新規生化学代謝産物もしくは異化産物または経路の同定；（４） 薬物および化学化合物の代謝ピークプロファイルの定義；（５） 治療計画の感度のカスタマイズを可能とするため、基礎代謝プロファイルおよび／または薬物治療応答プロファイルに基づく患者の細分類化；および（６） データマイニングを実行する、かつ／または新規な活性分子を作出するＣａｔａｌｙｓｉｓ （ＭＳＩ）などのソフトウェアと組み合わせた、あるいはそれを用いないＳＡＲ分析；に関する生物学的に関連のある細胞に基づくモデルおよび患者サンプルを用いることが挙げられる。
【０１６１】
プロファイルのピークの同定は種々の方法で行うことができる。生物学的サンプルに存在し得る分子としては、タンパク質性分子（限定されるものではないが、糖タンパク質、リポタンパク質、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、ペプトイド、およびアミノ酸が挙げられる）、核酸（限定されるものではないが、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ヌクレオチド、ヌクレオシド、ＤＮＡもしくはその誘導体、またはＲＮＡもしくはその誘導体が挙げられる）、炭水化物（限定されるものではないが、多糖、オリゴ糖、および糖類が挙げられる）、脂質（限定されるものではないが、飽和および不飽和リン脂質、糖脂質、リポ多糖、リポタンパク質、コレステロールおよびその類似体、ならびにグリセリドが挙げられる）、ならびに小分子（限定されるものではないが、有機分子および無機分子が挙げられる）。これらの分子はいずれもそれらの天然の状態または化学修飾された形で存在してもよい。
【０１６２】
試験サンプルた（例えば、疾患の可能性がある細胞または試験化合物で処理した細胞）からの抽出物の質量スペクトルを対照または参照サンプル（例えば、正常細胞または非処理細胞）のものと比較することで、上昇または低下する（例えば、薬物量や疾病の重篤度による）ピークならびに変化しないピークが確認できる。ピークの正確な質量が判明すれば、その分子は容易に同定できる（小分子の場合ならば直接的に、あるいは大分子の場合は１以上のフラグメントの化学式を解明することによる）。第１のステップは小分子のピークを決定することである。一般式を決定するには少なくとも２つの方法がある。その１つは、限定されるものではないがＣ、Ｎ、ＨおよびＯなどの一般元素を一次結合で用いて分子を再構成する。当業者ならば分かるであろうが、分子質量は余分のプロトンや余分の原子 （例えば、化合物がナトリウム塩になっている場合にはナトリウム原子）を考慮に入れることもある。可能性が複数ある場合には関連の統計確率を用いて評価する。もう１つのアプローチは、既知の分子質量をもとに同位元素の存在量を考慮して適当なデータベースを検索することである。可能性のある候補のうち、生物学的なものだけを考慮する。大分子については、フラグメンテーションステップを用いて分子の同定を可能にする。さらにまた、複合的にチャージしたピーク（ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｃｈａｒｇｅｄ ｐｅａｋ）も考慮する。
【０１６３】
生物系の代謝経路はほとんどの場合で十分特性解析されており、確認されたピーク（分子）は全て代謝経路を表すチャートに配置することができる。薬物により、または疾患状態において変化する代謝経路の分子を同定すれば、その作用のメカニズムが示唆され得る。分子が未知のものである場合には、それを同定すれば新たな代謝産物または経路の発見につながり得る。また、多面的な作用が発見できることもある。
【０１６４】
目的の大分子の化学構造を解明するには、分子をフラグメントにしてその１以上のフラグメントの構造を同定するのが好ましい。しかし、フラグメンテーションに先だって２つのアプローチのいずれかによって分子の性質を調べることができる。
【０１６５】
その１つめは、生化学的アプローチである。特定のＦＴＭＳピークのサンプルを、核酸を加水分解するヌクレアーゼなどの酵素で処理してもよい。処理したサンプルに対して再びＦＴＭＳを行う。ピークの存否はそのサンプルが核酸を含んでいるかどうかで決定される。このサンプルを１以上のプロテアーゼ、グルコシダーゼおよびリパーゼで同様に処理して、目的のピークを生じる分子中のタンパク質、糖または脂質が存在しているかどうかを調べてもよい。１種類以上の化合物（例えば、糖脂質、リポタンパク質）を含んでなる分子がこのようにタンパク質と糖であると確認できるように多種類の酵素を用いるのが好ましい。２つめの方法は化学的アプローチであり、場合によっては、これが用いられる。サンプルをその化学反応特性によって同定可能である。
【０１６６】
目的イオン（前駆イオン）のフラグメンテーションにより、ＦＴＭＳ装置で構造解明が行える。これを行うには、まず分離パルスを用いて前駆イオン集団以外の全てのイオンを「掃引」する。ここでもサイクロトロン周波数の関係による利点があり、ｒｆフィールドが適用されるが、これはセルから排出される全てのイオンの周波数にある。イオンはこの放射線を共鳴吸収し、十分な力でセル領域から励起される。これによって、セル内に捕捉された親イオンだけが残る。
【０１６７】
次のステップはイオン活性化プロセス（フラグメンテーションステップ）と呼ばれる。これは基本的にいくつかの方法により行えるが、ＦＴＭＳにおいて用いられるのはほとんどの場合、衝突活性化解離（ｃｏｌｌｉｓｉｏｎａｌｌｙ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ， ＣＡＤ）か赤外多光子解離（ｉｎｆｒａｒｅｄ−ｍｕｌｉｔｐｈｏｔｏｎ ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ， ＩＲＭＰＤ）である。ＣＡＤ法はｒｆ周波数を前駆イオンの周波数と共鳴するようにすることで達成される。そのサイクロトロン軌道を励起するに十分な力がイオンに送られる。イオンの周波数は保持されているので、その角速度は上昇する（すなわち運動エネルギーを得る）。パルスバルブはイオンが閉じ込められたセル領域に衝突気体をバーストさせる引き金となる。さらに、当業者ならば分かるであろうが、異なる気体を用いてもよい（一般に重い気体を用いるほど多くのフラグメントができる）。励起した前駆イオンはこの気体とエネルギー衝突し、これによってフラグメンテーションが起こる。少し送り込みを遅らせると（中性物質の排気のため）、上記第５．２節に記載したような全ての通常の能力によって生成物またはフラグメントが検出される。
【０１６８】
ＩＲＭＰＤ （赤外多光子解離）の実施は基本的には、より簡単である。分離したイオンにＩＲ光子の強いビームを当てる。これらの光子が吸収され、イオンは活性点に対して振動的に「ホット」な状態となる。ここで生じたフラグメンテーション生成物を検出する。
【０１６９】
どちらの方法もフラグメンテーションスペクトル（ＭＳ／ＭＳスペクトルという）を生じる。このようなデータは構造解明の手段となる。例えば、Ｃ１３Ｈ２０Ｎ２Ｏ３またはＣ１４Ｈ２４Ｎ２Ｏ２の１つからなる前駆イオンについてＭＳ／ＭＳ実験を行った場合には、前駆体から質量にして４６．００５Ｄａ低いピークが見られるが、これはこの構造が Ｃ Ｈ２Ｏ２を失い、少なくとも１つのカルボキシル基を有する（すなわち、カルボン酸、糖、脂質）ことを示唆するものである。
【０１７０】
分離およびフラグメンテーションのサイクルは次のフラグメントイオン（うすなわちＭＳｎ）ごとに何度も行うことができる。ＦＴＭＳおよびその他のイオントラップ法は数段階のフラグメンテーションを行うことができる。
【０１７１】
単離されたタンパク質の全アミノ酸配列または部分的アミノ酸配列が実験により決定されていれば、コンピューターを用いてマッチするアミノ酸配列、またはその推定アミノ酸配列が実験的に決定されたアミノ酸配列にマッチする発現配列タグ（ＥＳＴ）などのヌクレオチド配列について利用可能なデータベースを検索することができる。マッチするヌクレオチド配列が見つからなければ、実験的に決定されたアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列の縮重セットを当業者に周知の方法により逆に操作することができ、このようなヌクレオチドの縮重セットは単離されたタンパク質をコードする遺伝子のクローニング、および配列決定されたタンパク質またはペプチドフラグメントの発現に有用である。あるいは、ＦＴＭＳピークがある核酸に対応すれば、その核酸をフラグメントにし、そのフラグメントを配列決定する。フラグメント配列は、それに対応する遺伝子を同定するために使用できる（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ）。フラグメント配列が既知の遺伝子に対応しなければ、核酸を合成するか、当業者に周知の方法（例えば、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，第１５２巻， ”Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，’ ＢｅｒｇｅｒおよびＫｉｍｍｅｌ編 （Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ １９８７）； Ｍａｎｉａｔｉｓら， ”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，” （Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ １９８２）参照。双方とも参照によりそのまま本明細書に組み入れる）に従ってＰＣＲにより増幅することができる。このようにして作製した核酸を用いて、そのフラグメントに対応する全長遺伝子を同定するためのゲノムライブラリーまたはｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることができる。あるいは、目的とする元のＨＩＣＳ−ＦＴＭＳピークの重複している核酸フラグメントを配列決定することによって得られた情報を蓄積することで、その核酸に対応する遺伝子配列またはその少なくとも１つのオープンリーディングフレームを同定することもできる。
【０１７２】
このような組換えタンパク質を発現するように遺伝子操作した細胞を用いて、例えば治療投与を目的に、その組換えタンパク質を大量生産することができる。クローニング遺伝子が得られれば、不在または発現の低下が疾病と関連するタンパク質を置換または補充する遺伝子療法が可能となる。同様にクローニング遺伝子が得られれば、存在または発現の増大が疾病に関連するタンパク質の発現を抑制するアンチセンスまたは三重らせん療法の使用も可能であり、免疫療法に十分な量のタンパク質の組換え発現を用いることができ、または、例えばそれに対するモノクローナル抗体（なおこれは、治療投与に先立ってキメラ化することもできるし（Ｍｏｒｒｉｓｏｎら， １９８４． Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．， ８１，６８５１−６８５５； Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら， １９８４， Ｎａｔｕｒｅ ３１２， ６０４−６０８； Ｔａｋｅｄａら， １９８５， Ｎａｔｕｒｅ ３１４， ４５２−４５４）、ヒト化することもできる（例えば、Ｑｕｅｅｎ， 米国特許第５，５８５．０８９号およびＷｉｎｔｅｒ， 米国特許第５，２２５，５３９号参照））を作製することもできる。
【０１７３】
ＦＴＭＳ分析によりピークプロファイルが得られる。ピークプロファイルは、種々の生体分子に対応する複数のピーク（種々の同位元素を有する同じ分子の異なるピークも）および生物分子のフラグメントならびに多価分子を含む、ＦＴＭＳのデテクターによって検出されたものを図示したものである。特定の方法で処理された特定のサンプルのピークプロファイルは実質的にそのサンプルの状態の「フィンガープリント」であり、２つの状態が同じように存在するある特定の生体分子を含んでいる限り、いくつかの生体分子を同時に評価することで、細胞の状態に固有のピークプロファイルを作成することができる。これはバイオチップで作成される遺伝子発現プロファイルの「フィンガープリント」に似ている。すなわち、乳癌組織から正常組織が識別でき、乳癌組織内で予後の状態の差異（例えば長期的な生存見込みの良し悪し）が決定できる。同様に、肺組織のピークプロファイルを腎臓組織と比較することもできるし、異なる患者由来の乳癌サンプルのプロファイルを調べることもできるし、薬物処置前、処置中、処置後のサンプルプロファイルまたは種々の薬物濃度でのプロファイルをいずれも本明細書に記載のようにして評価することができる。
【０１７４】
当業者ならが分かるであろうが、これらのタイプの比較はサンプルに由来する単一のピークまたは複数のピークプロファイルを用いて行うことができ、例えばいくつかの方法でサンプルを調製または分離し、ピークを個々に分析するか、または重ね合わせて合成する。
【０１７５】
種々の状態のサンプルのピークプロファイルを比較することで、これらの各状態においてどの生体分子が重要かということについての情報が得られる（アップレギュレーションとダウンレギュレーションの双方を含む）。存在に関して異なる（出現または消失またはピーク強度の変化を含む）生体分子を同定することで、本明細書に概説したようないくつかの方法でこの情報の使用が可能となる。例えば、診断および疾病のモニタリングを行うことができ、特定の治療計画が評価でき、ある化学療法薬が特定の患者の長期的予後を改善する作用があるかどうかを評価できる。同様に既知のピークプロファイルを持つ患者サンプルを比較することで診断を行ったり確認したりすることができる。また、これらのプロファイルにより、特定のピークプロファイルを模倣または変更する目的で薬物候補のスクリーニングが可能となる。例えば、乳癌ピークプロファイルを抑制するか、または不良な予後プロファイルをより良い予後プロファイルへ変える薬物についてスクリーニングすることができる。
【０１７６】
このように本発明は多様な適用に有用性が見い出せる。ある好ましい実施形態では、本明細書に概説した方法を用いてサンプルを分析し、データベースを構築し、これを利用する。ある好ましい実施形態では、これらの方法は多様なデータベース、特に限定されるものではないが、ＦＴＭＳがこのように極めて正確であることから小分子のデータベースの作成を可能とする。
【０１７７】
このようにある好ましい実施形態では、本発明は細胞またはサンプル成分を迅速に同定するために使用される。ＦＴＭＳを、ＭＳＩ ＣＡＴＡＬＹＳＴなどの他の化学用コンピュータソフトウェアとともに用いることで新規な活性分子の迅速な同定および特性決定が行える。ＣＡＴＡＬＹＳＴは薬物候補のあり得る有効な形状を探索するプログラムである。化合物の小型ライブラリーをモニタリングして望ましいスペクトル属性を探すことで、ＣＡＴＡＬＹＳＴまたは同等のプログラムを用いて「薬理作用団の概要」を得ることができる。次にこの「概要」を用いて作成されたさらなる候補について仮想ライブラリーをスクリーニングした後に、それを試験することができる。
【０１７８】
さらにまた、様々な方法で種々のスペクトルの定量および比較を行えることに注目すべきである。ある実施形態では、サンプルをエレクトロスプレーし（２スプレー源の使用が好ましい）、参照サンプルも同時にスプレーして定量および比較を可能とする。あるいは、参照をサンプルに加えてもよい。最後に別法としては、対象とするサンプル中ではほぼ同等であることが分かっている成分を用い（例えばホメオスタシスの下にある種々の細胞ハウスキーピング遺伝子またはタンパク質または代謝産物を用い）標準化してもよい。
【０１７９】
このように、種々の異なる供給源に由来する、異なる条件下の多数のサンプルをモニタリングすることでデータベースを作成する。これらは種々の方法で使用できる。ある好ましい実施形態では、これらのデータベースをピークの同定のためのさらなる実験で用いる。あるいは、サンプルまたはサンプルに対する薬物または候補物質の作用を比較し、シグナル伝達経路および治療上適切な化合物を同定するために使用することもできる。
【０１８０】
さらに、データベースを構築する際、ＳＰＯＴＦＩＲＥ（登録商標）、３Ｄ 外観マッピング（ｃｏｎｔｏｕｒ ｍａｐｐｉｎｇ）、トポロジーマッピング、三角測量法などのような視覚化ソフトウェアをはじめとするグラフィック表示ソフトウェアをいくつか用いてそれらを視覚化してもよい。
【０１８１】
本発明はサンプルに対してＦＴＭＳを行ってサンプルのピークプロファイルを得、このサンプルのピークプロファイルを評価することを含んでなる、複雑な生物学的サンプルを分析する方法を提供する。ある実施形態では、これらの方法はさらにサンプルのピークプロファイルと参照サンプルのピークプロファイルを比較することを含んでなる。よって、この生物学的サンプルは試験サンプルであり得る。参照サンプルは予め決定することができ、すなわち組織学的サンプルである、参照サンプルのピークプロファイルは１つのサンプルのピークプロファイルであっても、あるいは２以上のサンプルの平均ピークプロファイルであってもよい。ある実施形態では、参照サンプルは正常細胞に由来するものであり、試験サンプルは同じタイプの疾患細胞に由来するものである。もう１つの実施形態では、参照サンプルは疾患または正常細胞に由来するものであり、試験サンプルは疾患細胞を薬物またはホルモンなどの生体分子に曝した後の疾患細胞に由来するものである。
【０１８２】
本発明はさらに、バイオモジュレーターに曝さなかった細胞の由来する第１の生物学的サンプルのＦＴＭＳピークプロファイルを、バイオモジュレーターに曝された細胞の由来する第２の生物学的サンプルのＦＴＭＳピークプロファイルと比較することを含んでなる、バイオモジュレーターに対する細胞の応答を検出する方法を提供する。
【０１８３】
本発明はさらに、バイオモジュレーターに対する細胞応答のマーカーを同定する方法であって、本明細書の請求項に記載の方法によってバイオモジュレーターに対する細胞応答を検出し、第１および第２の生物学的サンプルのピークプロファイル間で強度が異なるピークを同定する（なお、このピークは該バイオモジュレーターの分子質量に対応するものではない）ことを含んでなり、このようにして同定されたピークがバイオモジュレーターに対する細胞応答のマーカーに対応する、方法を提供する。
【０１８４】
本発明はさらに、バイオモジュレーターに対する細胞応答のマーカーを特性決定する方法であって、本明細書に記載の方法によりバイオモジュレーターに対する細胞応答のマーカーを同定し、該マーカーのｍ／ｚ比を有するマーカーイオンを単離し、さらに該イオンまたはそのフラグメントの分子配列または化学構造を得ることを含んでなる、方法を提供する。
【０１８５】
本発明はさらに、細胞がバイオモジュレーターと接触した際にその細胞内での濃度が変化する分子を同定する方法であって、バイオモジュレーターに曝さなかった細胞に由来する第１の生物学的サンプルのＦＴＭＳピークプロファイルを、バイオモジュレーターに曝された細胞に由来する第２の生物学的サンプルのＦＴＭＳピークプロファイルと比較し、第１および第２の生物学的サンプルのピークプロファイル間で強度が異なるピークを同定する（なお、このピークは該バイオモジュレーターの分子質量に対応するものではない）ことを含んでなり、ここで同定されたピークが細胞がバイオモジュレーターと接触した際にその細胞内での濃度が変化する分子に対応する、方法を提供する。
【０１８６】
本発明はさらに、疾病または症状の少なくとも１つのマーカーを同定する方法であって、正常細胞に由来する第１生物学的サンプルのＦＴＭＳピークプロファイルを、その疾病または症状を有する細胞に由来する第２生物学的サンプルのＦＴＭＳピークプロファイルと比較し、第１および第２の生物学的サンプルのピークプロファイルの間で強度が異なるピークを同定する（なお、このピークは該疾病または症状のに対応するものではない）ことを含んでなる、方法を提供する。
【０１８７】
本発明はさらに、患者の疾病または病的状態を診断する方法であって、本明細書に記載の方法によって該疾病または病的状態の（少なくとも１つの）マーカーを同定し、該患者の細胞から得た生物学的サンプルにおいて該マーカーに対応するピークの強度を測定することを含んでなり、そのピークの強度が該患者の疾病または病的状態の存在または程度を示す、前記方法を提供する。
【０１８８】
本発明はさらに、ある疾病または病的状態を患う患者における治療処置の効力をモニタリングする方法であって、本明細書に記載の方法によって該疾病または病的状態のマーカーを同定し、該患者に治療処置を施した後に該患者の細胞から得た生物学的サンプルにおいて該マーカーに対応するピークの強度を測定することを含んでなり、そのピークの強度が該患者の疾病もしくは病的状態の存在または程度および該治療処置の効力の反映を示す、前記方法を提供する。
【０１８９】
本発明はさらに、薬物開発のためのリード分子を同定する方法であって、（薬物開発のためのリード分子の同定が望まれている）疾病または病的状態のマーカーを本明細書に記載の方法によって同定し、該疾病または病的状態に特徴的なそのマーカーをある濃度で示す細胞に由来するサンプル（このサンプルは試験分子に曝された後の細胞に由来するものである）のＦＴＭＳピークプロファイルを取得し、さらに細胞の該マーカーの濃度が試験分子によって変化したかどうかを決定する（この決定はマーカーに対応するピークの強度の測定を含む）ことを含んでなり、該マーカーの濃度の変化（この変化は該マーカーの通常レベルに近づく変化である）が、その試験分子が該疾病もしくは病的状態の治療または予防を目的とする薬物開発のためのリード分子であることを示す、前記方法を提供する。
【０１９０】
さらにまた、本発明は構造活性相関（ＳＡＲ）におけるリード化合物の開発に使用することができる。すなわち、関連化合物からのスペクトルの分析は化合物の構造をその所望の活性に関連づける助けとすることができる。
【０１９１】
本発明はさらに、薬物の毒理学的標的を同定する方法であって、３つのＦＴＭＳピークプロファイルを比較し（なお、この３つのＦＴＭＳピークプロファイルとは、有毒な副作用を有する第１の薬物に曝された細胞から得た第１の生物学的サンプル；有毒な副作用を持たない第２の薬物に曝された細胞から得た第２の生物学的サンプル（この第１の薬物と第２の薬物は同じ薬物クラスに属するものである）；および該薬物クラスのいずれのメンバーにも曝されていない細胞から得た第３の生物学的サンプル、に対応するものである）、第２および第３のサンプルのＦＴＭＳプロファイル間では強度は同等であるが、第１のサンプルのＦＴＭＳプロファイルとは強度が異なるピークを同定する（なお、このようにして同定されたピークは薬物開発に関して毒性作用と相関する）ことを含んでなる、前記方法を提供する。
【０１９２】
本発明はさらに、薬物の毒理学的標的を同定する別の方法であって、３つのＦＴＭＳピークプロファイル（なお、この３つのＦＴＭＳピークプロファイルとは、有毒な副作用を有する第１の薬物に曝された細胞から得た第１の生物学的サンプル；同じ有毒な副作用を有する第２の薬物に曝された細胞から得た第２の生物学的サンプル；および該有毒な副作用を有するいずれの薬物にも曝されていない細胞から得た第３の生物学的サンプル、に対応するものである）を比較し、第１および第２のサンプルのＦＴＭＳプロファイル間では強度は同等であるが、第３のサンプルのＦＴＭＳプロファイルとは強度が異なるピークを同定する（なお、このようにして同定されたピークは薬物開発に関して毒性作用と相関する）ことを含んでなる、前記方法を提供する。
【０１９３】
本発明はさらに、試験因子の毒性を特性決定する方法であって、該試験因子に曝された細胞から得た生物学的サンプルのＦＴＭＳピークプロファイルにおけるピーク強度を測定することを含んでなり（なお、該ピークは本明細書に記載の１以上の方法によって毒理学的標的として同定されたものである）、このピーク強度がその試験因子の毒性の指標となる、前記方法を提供する。
【０１９４】
本発明はなおさらに、複雑な生物学的サンプルの高情報量（ＨＩＣ）分析方法であって、サンプルを複数事例のフーリエ変換質量分析（ＦＴＭＳ）に供し、各ＦＴＭＳ事例についてサンプルのＦＴＭＳピークプロファイル情報を作成し、作成されたそのピークプロファイル情報にピークピッキングアルゴリズムを適用して所定の基準を満たすピークを選択し、さらに選択されたピークにクラスタリングアルゴリズムを適用して同じ化学実体に対応すると思われるピークを同定することを含んでなる、前記方法を提供する。
【０１９５】
ある実施形態では、このピークプロファイル情報はＦＴＭＳの各事例について別個のファイルに書き込まれ、さらにピークピッキングアルゴリズムによって選択されたピークに関するそれらの別個のファイルの各々からの情報を含む単一のファイルを作成するステップが含まれる。この実施形態のある様式では、ピークピッキングアルゴリズムによって選択されたピークに関する前記の別個のファイルの各々からの情報を含む単一のファイルに含まれている情報にクラスタリングアルゴリズムを適用する。
【０１９６】
もう１つの実施形態では、選択されたピークの各々を、対応するピーククラスターからの質量平均値で再ラベルする。
【０１９７】
本発明は、複雑な生物学的サンプルのＦＴＭＳスペクトルを作成し、そのスペクトルのピークプロファイルを分析する方法を提供する。複雑な生物学的サンプルとしては、限定されるものではないが、血清、培養細胞、組織生検を含む生物材料に由来するサンプルが挙げられる。異なる状態または異なるタイプの細胞に関して作成したスペクトルを比較解析することは、正常と異常との間、例えば非疾患性および疾患性の同じタイプの細胞および／または組織の間で存在する特定の表現型の違いに関して有用である。さらにまた、特定の表現型の違いが強度差のあるＦＴＭＳピークの形で識別されれば、そのピークに対応する分子を同定し、さらに／またはその分子を診断および／または医薬の開発を目的とするリード生体分子として使用することができる。
【０１９８】
本発明の方法はさらに、特定の病理または病理クラスに特徴的なＨＩＣＳ−ＦＴＭＡのピークまたはパターンを同定することを含む。このようなピークプロファイルは病理学的サブタイプをより完全かつ正確に定義および分類するのに有用な価値ある情報を提供する。
【０１９９】
本発明の原理を用いれば、健康状態が判明している多くの異なる患者に由来するサンプルを集めて、それらをＨＩＣＡ−ＦＴＭＳに供することができる。作成したプロファイルを解析して、さまざまな健康状態の患者の細胞に由来するサンプルに特有に存在する、または存在しないピークを同定し、得られたデータを用いて、このようにして同定されたピークの全てを組み込んだデータベースを作成する。次に、目的とする病理または疾病を示す患者に由来するサンプルに関するデータを解析のために抽出し、そのデータベース中の残りの記録と比較し、その病理または疾病状態を予測する目的のピークまたはピークパターンを同定する。
【０２００】
従ってある実施形態では、ＨＩＣＡ−ＦＴＭＳは、ピークプロファイルを作成し、特定の病理または病理クラスに特徴的な分子ピークまたはマーカーピークのパターンを同定するためのツールとなる。疾病の治療応答の経過のモニタリングおよび疾病に対する標的主導型創薬の際には、同じサンプル源から異なる条件下または異なる時点で作成したピークプロファイルにおいてマーカーピークに対応するマーカー分子の相対量を表す該マーカーピークの強度のモニタリングを利用することができる。
【０２０１】
本発明の原理を用いれば、疾病の管理または治療に用いる公知の治療法の１つで処置した疾病モデルの実験動物に由来する組織もしくは細胞サンプル、またはこれらの処置を受けているヒトもしくはその細胞培養モデルからの生物学的サンプルをＨＩＣＳ−ＦＴＭＳに供し、得られたデータを用いて、非処置の対照と比較して処置被験体（動物モデルまたはヒト）のサンプルに存在しているかまたは存在していない共通ピークおよび特有のピークの全てを組み込んだデータベースを作成することができる。マーカーピークに対応するマーカー分子は治療法または医薬の開発標的として用いることができる。同様に正常植物に由来する生物学的サンプルのピークプロファイルを、植物衛生用薬剤、除草剤もしくはホルモン剤で処理した植物、またはウイルスなどの病原体に感染した植物に由来する生物学的サンプルのピークプロファイルと比較することもできる。これらのスクリーニングで同定されたマーカーピークに対応するマーカー分子は殺虫剤の開発の標的となり得る。また同様に、抗生物質で処理した微生物に由来する生物学的サンプルのピークプロファイルを同じ種の非処理の微生物に由来する生物学的サンプルのピークプロファイルと比較して、例えば薬物スクリーニングマーカーとして使用できる抗生物質耐性のマーカー分子を同定することもできる。
【０２０２】
薬物応答のモニタリングの他、ＨＩＣＳ−ＦＴＭＳはその薬物自体をモニタリングすることにも使用できる。すなわち、クリアランスプロファイル、分子相互作用および分子修飾、薬物代謝、作用機序ならびに細胞内局在など、標的薬物の特定の性質を明らかにすることができる。
【０２０３】
本発明は、例えば効力が増強され、許容量がより高い薬物を同定するために、現行の薬物がすでに知られている疾病または疾患の治療に有用な新規薬物を同定する方法を提供する。ＨＩＣＳ−ＦＴＭＳスペクトルを（ｉ）非処理、（ｉｉ）既知の薬物で処理、もしくは（ｉｉｉ）試験分子で処理した、細胞、組織または培養細胞サンプルの抽出物について作成する。そして、既知の薬物で処理した培養細胞サンプルの抽出物でみとめられるものと同様のＦＴＭＳピークの変化を誘発する試験分子が、創薬のための候補リード化合物である。本発明の実施において、例えば創薬のためのモデル系として培養細胞または組織を用いる場合、特性解析を容易にし、感度を高めるために、その細胞を同位体枯渇させてもよいし、同位体富化標識してもよい。
【０２０４】
本発明のスクリーニングアッセイでは、個々の薬物の標的であるピーク、および目的の薬物クラス、例えば抗高脂血症薬のさまざまなメンバーに曝した細胞、またはそれらで処置した生物に由来するサンプルに存在する共通ピーク、を同定することができる。一方、１種類の薬物のみで、またはその薬物クラスのサブセットのみで処理したサンプルに存在するかまたは存在しない標的ピークに着目してもよく、これらのピークはこれらの薬物に特有の活性と関連していた。このようなピークの強度の増加および低下は薬物の望ましい活性または特性（例えば抗高脂血症薬のグルコース低減活性）、または望ましくない活性または特性（治療の副作用としての悪心または目眩を誘発する傾向）と関連づけることができる。この情報は生体系に曝された際に望ましい応答だけを誘発する薬物の探索に使用できる。
【０２０５】
多数の細胞標的を会して作用を発揮する薬物もあれば、数種の標的にだけ影響を及ぼすようなより限定された作用を持つ薬物もある。同様に、複数の細胞タイプで作用を発揮する薬物もあれば、１種または数種の細胞タイプにだけ作用する薬物もある。
【０２０６】
以下に示すようないくつかの例がある。
代謝症候群またはＸ症候群は、グルコース代謝の欠陥（インスリン耐性）、血圧上昇（高血圧）、血中脂質の不均衡（高レベルの循環トリグリセリド、および低レベルの循環「善玉」またはＨＤＬコレステロールを含む、異常脂質血症）および 中心性肥満（腹部の過剰な脂肪組織）により示される（例えば、 Ｒｅａｖｅｎ， １９９３， Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｍｅｄ． ４４：１２１−１３１参照）。Ｘ症候群患者には現在のところ、市販の薬物がある特定の標的を調節するように、あるいは疾病状態のある特定のパラメーターを調節するように最適化されていることから、個々の症状を治療するために別々の薬物が投与されている。複数の薬物を使用すると重大な副作用のリスクが高まり、 生活の質が損なわれる。ＨＩＣＳ−ＦＴＭＳによれば複数の同時的な治療効果を有する新薬の同定が可能となる。このようなことは単一の標的に基づくＨＴＳアプローチを用いたのでは事実上不可能である。
【０２０７】
Ｘ症候群患者の数は急速に増えており、これは西洋的なライフスタイルに関連しているものと思われるが、特に高いリスク因子は年齢と食生活である。多面的な作用を示すＸ症候群薬、すなわちＸ症候群の複数の症状または好ましくはあらゆる症状を抑制する薬物が早急に必要とされている。
【０２０８】
またＨＩＣＳ−ＦＴＭＳによれば、組織特異的なマーカー分子の同定が可能となり、これは次に組織特異的薬物のスクリーニングを行うためのマーカーとして使用できる。このような薬物は治療計画において高い有用性を示すことになろう。例えばインスリン耐性糖尿病患者は疾病管理のためにチアゾリジンジオン（ＴＺＤ）薬を投与されている。ＴＺＤはペルオキシソーム増殖因子活性化受容体γ（ＰＰＡＲγ）を活性化する。ＴＺＤで処置した後はインスリン増感作用が高まるが、脂肪組織の脂肪沈着も高まる。最近では、ＴＺＤの先駆けであるレズリンが、黄疸、悪心、嘔吐、腹痛、倦怠感、食欲不振、および褐色尿を特徴とし、死および／または肝臓移植の必要にもつながる重大な肝疾患の副作用のため、回収された。ＨＩＣＳ−ＦＴＭＳは、ＴＺＤと同様にインスリン増感作用を促進するがＴＺＤとは異なり肝疾患をもたらさない薬物をスクリーニングおよび同定するための、選択方法である。
【０２０９】
もう１つの実施形態では、薬物が複数の標的を介してその作用を発揮する場合、ＨＩＣＳ−ＦＴＭＳは改良された類似体の同定を可能とする。同じ作用をより効果的に発揮し、かつ／または非特異的作用が低減され、早急にクリアランスされる分子を同定することができる。基本的には、既知の薬物または薬物クラスに曝したサンプルに対してＨＩＣＳ−ＦＴＭＳピークプロファイルを作成し、その薬物の治療特性と関連するピークを同定する。コンビナトリアルケミストリーを用いてその薬物の類似体のライブラリーを作製することができ、さらにこれらの類似体を、親薬物と関連する有用なピークを同定するのに用いたような実験モデルを用いるＨＩＣＳ−ＦＴＭＳアッセイで使用することができる。次に、親薬物より高い効力を持つ類似体、例えば親薬物よりも低い濃度で標的ピークに影響を与える類似体を、薬物開発のためのリード化合物として用いる。
【０２１０】
本発明のある実施形態では、既知の薬物と比較することなく、極めて低濃度（ナノモル範囲）でＦＴＭＳピークプロファイルにおいて特定の変化を誘発する試験分子の能力にのみ基づいて、創薬を達成する。次に、試験分子によって影響を受けるピークが何であるかを、第５．５節に先に記載のようにして同定する。このことは、試験分子がどの経路を調節するかという点について、および従ってその試験分子がどの疾患に対する薬物として試験されうるかという点について指針を与えるものである。試験分子のｉｎ ｖｉｖｏ試験は、臨床試験を進める前に、細胞培養モデル、好ましくは細胞代表物または疾病状態（例えば腫瘍細胞系）を用いるか、あるいは動物、好ましくは該疾病の動物モデル、最も好ましくはラットまたはマウスで、まず行うことができる。抗生物質として用いる薬物は細菌培養物に対して試験することができる。植物用薬物（例えば、抗ウイルス剤）は生態系に放出する前に管理された実験室設備で試験することができる。
【０２１１】
ヌクレオチド、ペプチドまたはその他の高分子などの、天然産物コレクション、合成化学コレクション、および合成コンビナトリアルケミカルライブラリーをはじめとするリード化合物（薬物候補）のいくつかの一般的供給源がある。
【０２１２】
本発明の試験分子は、生物学的ライブラリー、空間的にアドレス可能な並行固相または液相ライブラリー（ｓｐａｔｉａｌｌｙ ａｄｄｒｅｓｓａｂｌｅ ｐａｒａｌｌｅｌ ｓｏｌｉｄ ｐｈａｓｅ ｏｒ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ｐｈａｓｅ ｌｉｂｒａｌｉｅｓ）、デコンボルーションを要する合成ライブラリー法、「１ビーズ−１化合物」ライブラリー法、およびアフィニティークロマトグラフィー選択を用いる合成ライブラリー法を含む、当技術分野で公知のコンビナトリアルライブラリー法における多くの手法のいずれかを用いて、得ることができる。生物学的ライブラリー手法はペプチドライブラリーに限られるが、他の４つの手法はペプチド、非ペプチドオリゴマー、または化合物の小分子ライブラリーに適用できる （Ｌａｍ， １９９７， Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓ． １２：１４５）。
【０２１３】
分子ライブラリーの合成方法の例は当技術分野において見出すことができ、例えばＤｅＷｉｔｔら， １９９３， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９０：６９０９； Ｅｒｂら， １９９４， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９１：１１４２２； Ｚｕｃｋｅｒｍａｎｎら， １９９４， Ｊ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． ３７：２６７８； Ｃｈｏら， １９９３， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６１：１３０３； Ｃａｒｒｅｌｌら， １９９４， Ａｎｇｅｗ． Ｃｈｅｍ． Ｉｎｔ． Ｅｄ． Ｅｎｇｌ． ３３：２０５９； Ｃａｒｅｌｌら， １９９４， Ａｎｇｅｗ． Ｃｈｅｍ． Ｉｎｔ． Ｅｄ． Ｅｎｇｌ． ３３：２０６１；およびＧａｌｌｏｐら， １９９４， Ｊ， Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． ３７：１２３３に示されている。
【０２１４】
化合物のライブラリーは溶液中（例えば、Ｈｏｕｇｈｔｅｎ， １９９２， Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １３：４１２−４２１）、またはビーズ上（Ｌａｍ， １９９１， Ｎａｔｕｒｅ ３５４：８２−８４）、チップ上（Ｆｏｄｏｒ， １９９３， Ｎａｔｕｒｅ ３６４：５５５−５５６）、細菌上（米国特許第５，２２３，４０９号）、胞子上（米国特許第５，５７１，６９８号、同第５，４０３，４８４号、および同第５，２２３，４０９号）、プラスミド上（Ｃｕｌｌら， １９９２， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８９：１８６５−１８６９）またはファージ上（ＳｃｏｔｔおよびＳｍｉｔｈ， １９９０， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：３８６−３９０； Ｄｅｖｌｉｎ， １９９０， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：４０４−４０６； Ｃｗｉｒｌａら， １９９０， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８７：６３７８−６３８２；およびＦｅｌｉｃｉ， １９９１， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２２２：３０１−３１０）で提供してもよい。
【０２１５】
本発明の方法は薬物による治療に対する患者の選択にも適用できる。
例えばこのような個々の患者由来のサンプルをＨＩＣＳ−ＦＴＭＳに供し、それらのＦＴＭＳピークプロファイル中に薬物に対する特定の感受性もしくは耐性、またはある薬物クラスに対するアレルギーに関連したピークが存在するか存在しないかを調べることができる。薬物に対する特定の感受性と関連したピークは、薬物または薬物クラスで処置した個々の患者のＨＩＣＳ−ＦＴＭＳスペクトルを比較し、その相対強度が治療感受性または治療耐性に関連するピークを同定することによって予め決定される。
【０２１６】
本明細書に示される方法を用いて薬物の至適用量を決定することもできる。種々の濃度の薬物で処理した細胞の抽出物のＨＩＣＳ−ＦＴＭＳピークプロファイルを、その薬物に対する好ましい応答（例えば該薬物の標的分子の応答）に対応する１以上のピークの強度について比較する。また同ピークプロファイルを分析して、薬物に対する好ましくない応答（例えば毒性）に関連する１以上のピークの強度も測定する。それにより前記薬物が毒性を最小とし好ましい応答を最大に誘発する用量または用量範囲を同定する。
【０２１７】
またＨＩＣＳ−ＦＴＭＳ技術は、ホルモン、増殖因子、サイトカインおよび神経伝達物質などのシグナル伝達分子に対する細胞応答または生物応答を特徴付けするために一般的に用いることができる。すなわち、特定の増殖因子で処理した細胞の細胞抽出物を含むサンプルから得られたピークプロファイルを比較すれば、その増殖因子に関連するパターンを明らかにすることができる。経時的な研究を行って、例えばその増殖因子の初期応答と後期応答に関連するピークを調べることができる。特有のピークを同定することによってマーカーが同定され、さらにその対応するイオンが続いて化学的に解明されることによって、最終的には医薬デザインに役立つと思われる。
【０２１８】
疾病研究へのＨＩＣＳ−ＦＴＭＳの適用と同様に、遺伝的摂動の導入に対する生物応答を細胞レベルまたは生物レベルで評価することもできる。遺伝的摂動は、天然遺伝子の低形質（ｈｙｐｏｍｏｒｐｈｉｃ）突然変異、高形質（ｈｙｐｅｒｍｏｒｐｈｉｃ）突然変異、または新形質（ｎｅｏｍｏｒｐｈｉｃ）突然変異であってもよく、対象となる細胞で正常に発現されうるかまたは発現されない天然遺伝子の組換え過剰発現、外来遺伝子の組換え発現、遺伝子産物に対する抗体の使用、その遺伝子を阻害するアンチセンス核酸または三重らせん分子の導入であってもよい。ある遺伝子について野生型であるか、ヘテロ接合性および／またはホモ接合性であるか、および／または遺伝子が過剰発現されている細胞の抽出物のピークプロファイルの比較によって、その遺伝子が関わる生化学経路、該遺伝子の摂動の結果としてのその系の摂動の程度、突然変異型遺伝子産物の細胞標的（例えば、受容体、酵素複合体、基質）などの、その遺伝子座に関する有用な情報が得られる。ＨＩＣＳ−ＦＴＭＳ法が突然変異の結果として一連の対象分子に影響を及ぼす未知遺伝子をスクリーニングできるようにするために、突然変異した遺伝子を予め同定する必要はない。この方法はその突然変異が天然に生ずる場合にも同様に適用できる。
【０２１９】
ある特定の用途としては、ＨＩＣＳ−ＦＴＭＳを用いて植物または動物性供給源の食物または食品をモニタリングすることができる。各製品のピークプロファイルを取得して、品質管理試験の参照としたり、経時的な遺伝的変異をモニタリングすることにより在庫品の品質を確保したりすることができる。薬物スクリーニング試験と同様に、ＨＩＣＳ−ＦＴＭＳを用いて好ましくない形質を確認しながら好ましい形質を選抜および維持することができる。
【０２２０】
この技術は水生生態系、土壌組成物および大気系といった系のレベルでも適用の可能性を持つ。これらの複雑な生物系をＨＩＣＳ−ＦＴＭＳにより特徴付けて経時的にピークプロファイルを取得し、自然的変化または人間の介入による変化をモニタリングすることができる。
【０２２１】
本発明は診断分野を大いに促進するものである。ある実施形態では、患者の血清サンプルをＨＩＣＳ−ＦＴＭＳに供することができ、そのピークプロファイル、すなわちそれにより作成される「ピークプロファイル」が、そうでなければ個々の試験が必要となる患者の血清パラメーターの寸評を提供する。目的のパラメーターを表すことが分かっている個々のピークを、正常個体からの対応する範囲のピークと比較して、血清中のそれらの濃度を求める。アッセイ可能なパラメーターとしては、限定されるものではないが、コレステロール、脂肪酸、リポタンパク質、グルコース、ヘモグロビン、サイトカイン、ホルモン（例えば、インスリン、ＴＳＨ、Ｔ４、Ｔ３）、抗体（例えば、全身エリマトーデス、橋本病などの自己免疫疾患に関するもの）、腫瘍抗原（例えばＰＳＡ）が挙げられる。
【０２２２】
もう１つの実施形態では、患者の脳脊髄液を、アルツハイマー病、パーキンソン病、プリオン病（ｐｒｉｏｒ ｄｉｓｅａｓｅｓ）、前頭側頭型痴呆などの神経変性疾患のマーカーの存在または強度に関して試験する。これらの疾患の特定のマーカーはすでに知られているが（例えば、アルツハイマー病では、リン酸化タウタンパク質または４２アミノ酸形態のＡβ（アミロイドβ）ペプチド）、本明細書に開示されている方法によってさらなるマーカーまたはマーカーピークを同定することができる。マーカーピークは、その強度が神経変性疾患の進行とともに増加または低下するピークであってよい。
【０２２３】
本発明の方法はまた、患者の疾病の進行または患者の治療応答をモニタリングするために適用してもよい。疾病リスクが高いという指標または患者が疾病に罹っているという診断（さらに、その疾病が治療を要するか否かについて）に続いて、患者のサンプル（血清、組織生検）のＨＩＣＳ−ＦＴＭＳピークプロファイルを複数回作成する。例えば、１以上の神経変性疾患関連マーカーを中程度のレベル（このレベルは、未だ疾病状態を示すほど高くはないが平均値を超えるものである）を示す者を定期的にモニタリングして、これらのマーカーピークが疾病状態を示すレベルにまで上昇しているかどうかを判定し、その結果により治療を開始することができる。あるいは、疾病に罹っていると診断された患者をモニタリングし、例えば神経変性疾患であるという診断の後に神経変性疾患関連抗原のレベルをモニタリングすることにより、薬物治療（治療中の場合）の有効性あるいはその疾病の進行（その疾病が不治のものの場合）を調べることができる。
【０２２４】
ＨＩＣＳ−ＦＴＭＳを、薬物治療の毒性結果を特徴付けするために一般的に使用することもできる。例えば、特定のタイプの薬物副作用を被っている被験体からＨＩＣＳ−ＦＴＭＳピークプロファイルを得てもよい。実質的に同等の副作用を生じるあらゆる既知の薬物のピークプロファイルを比較することにより、特定の毒性副作用を診断または特徴付けられることが明らかとなるであろうパターンを、発見することができる。この分析は、組合せ治療によって引き起こされる副作用を特徴付けするように拡張可能であり、そのＨＩＣＳ−ＦＴＭＳピークプロファイルにより望ましくない薬物の組合せを予測できる。さらにまた、ある特定の薬物の多くの異なる用量についてピークプロファイルを取得して、適切な用量に関する予測可能性を引き出すこともできる。
【０２２５】
被験体はヒト、実験動物、培養細胞、酵母モデル、細菌モデル、無細胞系またはその他のｉｎ ｖｉｔｒｏ系であってよい。
【０２２６】
ピークプロファイルは生検、組織外植体、培養細胞または体液を分析することにより得てもよい。毒理学的マーカーは、その薬物が治療効果を発揮する細胞または組織でみとめられるものである必要はない。例えば、ある薬物は限局性の作用を示すが、その薬物の毒性は肝臓、血流および／または尿中にみとめられるその代謝産物によって生ずる場合がある。
【０２２７】
特定の副作用を特徴付けるＨＩＣＳ−ＦＴＭＳピークプロファイルが得られれば、特定のピークをその副作用に対する毒理学的マーカーとして指定することができる。これらのマーカーは迅速な診断法として使用できる。さらに、これらのマーカーの同定により毒理学的経路が解明され、従って最終的には治療薬の設計に役立つであろう。一部の被験体においてのみ存在する特定のマーカーがあれば、それは薬物療法に対する個体の感受性を示す。このような薬物感受性の変動性は、異なるサブグループとして毒理学的マーカーをさらに定義するために利用できる。
【０２２８】
治療経過全体にわたる複数の時点でＨＩＣＳ−ＦＴＭＳピークプロファイルを構築することにより、毒性症状発現における中間段階を識別することができる。すなわち、特徴的なＨＩＣＳ−ＦＴＭＳピークプロファイルが最終結果（副作用 対 副作用なし）についてみとめられるだけでなく、ＨＩＣＳ−ＦＴＭＳピークプロファイルはいずれかの最終結果に向かういくつかの中間段階の識別を可能にすることができる。次に、これらの識別可能な中間段階を用いて治療計画における毒性作用およびその鎮静化をモニタリングすることができる。
【０２２９】
ＨＩＣＳ−ＦＴＭＳによって得られた種々の薬物応答のスペクトルのデータベースが作成されれば、新規薬物または新しい治療計画に曝露された被験体から得られたＨＩＣＳ−ＦＴＭＳピークプロファイルによって可能性のある有害な副作用が予測され得る。このように治療または用量を投与前に調節することができる。
【０２３０】
この技術の実際的用途としては、血清コレステロールを低下させる治療経過を例にとることができる。高血清コレステロールの治療には多くの薬物が用いられてきており、例えば胆汁酸結合樹脂（例えば、コレスチラミン（Ｑｕｅｓｔｒａｎ Ｌｉｇｈｔ（登録商標）， Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ）、塩酸コレスチポール（Ｃｏｌｅｓｔｉｄ（登録商標）， Ｔｈｅ Ｕｐｊｏｈｎ Ｃｏｍｐａｎｙ）、スタチン（例えば、ロバスタチン（Ｍｅｖａｃｏｒ（登録商標）， Ｍｅｒｃｋ ＆ Ｃｏ．， Ｉｎｃ．）、プラバスタチン（Ｐｒａｖａｃｈｏｌ（登録商標）， Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ Ｃｏ．）、アトバスタチン（Ｌｉｐｉｔｏｒ， Ｐａｒｋｅ Ｄａｖｉｓ））、ニコチン酸、フィブレート（例えば、クロフィブレート（Ａｔｒｏｍｉｄ−Ｓ（登録商標）， Ｗｙｅｔｈ−Ａｙｅｒｓｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ））、ゲムフィブロジル（Ｌｏｐｉｄ（登録商標）， Ｐａｒｋｅ−Ｄａｖｉｓ）、経口エストロゲン、長鎖カルボン酸（例えば、長鎖α，ω−ジカルボン酸、β，β，β’，β’−四置換−α，ω−アルカンジオン酸）が挙げられる。不都合なことに、これらの投薬は、胃腸障害、選択的ビタミン欠乏症、肝臓および腎臓の機能不全、癌、胆嚢疾患、血栓塞栓性疾患、肝細胞腺腫、横紋筋融解症（ｒａｂｄｏｍｙｏｌｙｓｉｓ） 、高血圧、グルコース不耐症、および高カルシウム血症をはじめとする多くの副作用と関連している。抗高コレステロール血症薬の開発のためのリード化合物をはじめ、ｉｎ ｖｉｖｏおよび／またはｉｎ ｖｉｔｒｏ活性を有する他の多くの分子が様々な理由から未だ治療計画に用いられていない。こうしたことから、副作用がなく、高血清コレステロールや望ましくない脂質代謝から生ずる疾病に対抗する治療薬を開発する明確な必要性が存在する。
【０２３１】
ＨＩＣＳ−ＦＴＭＳピークプロファイルは各々の治療計画についても、また所望の活性を有する各々の前臨床化合物についても得ることができる。治療間でピークプロファイルを比較すれば、その薬物の有害な作用に関連する特定のピークを識別することができる。これらの特徴的なピークにより、高血清コレステロールの治療に用いるために提示された、望ましくない副作用を有する化合物を、スクリーニングによって排除するアッセイが提供される。さらにまた、これらのピークによって示される化合物の同定は、副作用を回避する薬物設計を行う手がかりをもたらす。さらに薬物治療の時間経過をＨＩＣＳ−ＦＴＭＳで調べることによって、作用機序が明らかになったり、新たな介入点が示唆されたりする。
【０２３２】
薬物毒性を研究するために提案されたものと同様の戦略を、発癌性物質、毒物および放射線に対する有害な生物応答にも適合させることができる。これらの作用因子に対する応答の特徴的なピークプロファイルを決定し、非処理サンプルと比較してマーカーピークを同定し、次にそれらを用いて生物応答をモニタリングしたり、有害因子の可能性について未知因子をスクリーニングしたりすることができる。特徴的なピークが同定されれば、特性が分からない試験因子を、例えばその発癌性に関して、その因子が目的のピークを増強するか阻害し得る程度（もしあるとすれば）を測定することによってアッセイすることができる。
【０２３３】
ＨＩＣＳ−ＦＴＭＳは正常および疾患性の同じタイプの細胞および／または組織の間で、あるいは薬物などの試験分子で処理した細胞と非処理のそれらの対応物との間で生じるあらゆる分子的な違いを、実質的に特徴付けることができる。本発明のＨＩＣＳ−ＦＴＭＳ法は、ゲノミクス、または遺伝子型変化の検出に焦点を当ててＤＮＡまたはｍＲＮＡの変化だけを検出する示差的発現技術などの、既存の標的探索法よりも遙かに多くの情報をもたらす。また、プロテオミクスは非タンパク質性の薬物または疾病標的を検出せず、従って特定の配列にコードされているタンパク質に関するものでしかない。細胞の代謝産物含量の差を評価できる方法として現在利用できるものはない。これに対し、本発明の方法はあらゆるタイプの薬物または疾病標的の検出が可能となり、このことから標的は、タンパク質、小分子、炭水化物、核酸、代謝産物、またはＦＴＭＳにより検出できる質量または構造を有するいずれの分子であってもよい。ＨＩＣＳ−ＦＴＭＳによって得られる情報は、後のＨＩＣＳ−ＦＴＭＳスクリーニングにおける参照点として用いるため、多数のピークプロファイルの複雑な比較のためにデータベースに構成することができる。
【０２３４】
本発明の方法はさらに、細胞または生物のストレス応答をモニタリングし、ストレス応答を模倣または阻害する作用因子を発見するための標的として使用できる主要な構成要素を同定するために使用できる。本明細書においてストレスとは、細胞もしくは生物の環境または完全性に対する全てのタイプの傷害をさす。このような傷害としては、限定されるものではないが、極端な温度、感情ストレス（恐怖、ショック）、創傷、栄養欠乏、代謝応答、細胞内病原体の感染および酸素ラジカルが挙げられる。
【０２３５】
簡潔に述べると、ＦＴＭＳピークプロファイルは、それらの正常状態および傷害を受けた後の種々の時点での細胞または生物に対して取得する。傷害された細胞において有意に高レベルで存在するピークは、その傷害に対する細胞または生物応答のエフェクターの可能性がある。エフェクターが特定されれば、そのエフェクターの類似体／アゴニストおよびアンタゴニストの探索に、ＨＩＣＳ−ＦＴＭＳまたは合理的薬物設計をさらに用いることができる。その応答が有益なものであれば（例えば、害虫の攻撃に応答して生じた天然植物性殺虫剤）、将来の傷害を治療または予防するためにそのエフェクターの類似体またはアゴニストを開発することができる。その応答が有害なものであれば（例えば、昆虫の食い破りに応答したアナフィラキシーショック）、将来の傷害の際の有害な応答を予防するため、そのエフェクターのアンタゴニストを開発すればよい。このようにして同定された薬物を、同じ傷害に曝されている動物モデルの応答を調節する上でのそれらの効力に関して試験することができる。
【０２３６】
実施例
方法および装置
ラット初代肝細胞の単離およびロバスタチン処理
雄のＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットを、ペントバルビタールナトリウムを５０ｍｇ／体重ｋｇ重で腹腔内注射で投与することにより麻酔した。肝臓のｉｎ ｓｉｔｕ潅流を以下のようにして行った。動物の腹部を開き、門脈にカニューレを挿入し、肝臓をＷＯＳＨ溶液（１４９ｍＭ ＮａＣｌ、９．２ｍＭ Ｎａ ＨＥＰＥＳ、１．７ｍＭフルクトース、０．５ｍＭ ＥＧＴＡ、１０Ｕ／ｍｌヘパリン、ｐＨ７．５）で流速３０ｍｌ／分にて６分間潅流した。肝臓を消化するため、肝臓をＤＳＣ溶液（６．７ｍＭ ＫＣｌ、１４３ｍＭ ＮａＣｌ、９．２ｍＭ Ｎａ ＨＥＰＥＳ、５ｍＭ ＣａＣｌ２−２Ｈ２０、１．７ｍＭフルクトース、０．２％ ＢＳＡ、１００Ｕ／ｍｌ Ｉ型コラゲナーゼ、８０Ｕ／ｍｌ １６０ ＢＡＥＥ／ｍｌトリプシン阻害剤、ｐＨ７．５）で流速３０ｍｌ／分にて６分間、３７℃で潅流した。消化後、細胞をＤＭＥＭ−（２ｍＭ ＧｌｕｔＭａｘ−１、０．２％ ＢＳＡ、５％ ＦＢＳ、１２ｎＭインスリン、１．２μＭヒドロコルチゾンを含有するＤＭＥＭ）溶液に分散させて消化プロセスを停止させた。粗細胞懸濁液を、それぞれ２５０μｍ、１０６μｍおよび７５μｍの孔径の３層のステンレススチールメッシュで濾過した。濾過した細胞を５０×ｇにて２分間遠心分離し、上清を廃棄した。この細胞ペレットをＤＭＥＭ−に再懸濁し、再び遠心分離した。この最終的な細胞ペレットをＤＭＥＭ＋ＨＳ溶液（２ｍＭ ＧｌｕｔＭａｘ−１、２０ｎＭ δ−アミノレブリン酸、１７．４ｍＭ ＭＥＭ非必須アミノ酸、２０％ ＦＢＳ、ｌ２ｎＭインスリン、１．２μＭヒドロコルチゾンを含有するＤＭＥＭ）に再懸濁し、コラーゲン被覆培養ディッシュに１００×１０３細胞／ｃｍ２の密度で単層培養物を形成するようにプレーティングした。最初のプレーティングから４時間後、培地をＳＦ−ＤＭＥＭ＋（２ｍＭ ＧｌｕｔＭａｘ−１、２０ｎＭ δ−アミノレブリン酸、１７．４ｍＭ ＭＥＭ非必須アミノ酸、１２ ｎＭインスリン、１．２μＭヒドロコルチゾンを含有するＤＭＥＭ）に交換し、一晩細胞上に保持した。
【０２３７】
肝細胞に対するロバスタチンの作用を評価するため、細胞を０．０３〜３０μＭの範囲で増加させた濃度に４時間曝した。対照細胞はロバスタチンを含まない同じ培地に曝した。ロバスタチンを含有する培地を調製するため、３０ｍＭロバスタチン含有ジメチルスルホキシド溶液を無菌条件下で調製した。無菌のバイオセーフティーキャビネット中で、ＤＭＳＯストック製剤をＳＦ−ＤＭＥＭ＋中に１：１０００希釈することによって３０μＭ濃度を調製した。より低い濃度は、この０．１％ＤＭＳＯの３０μＭストック液をＳＦ−ＤＭＥＭ＋中に希釈することによって調製した。細胞を処理するため、培地を除去し、調剤したロバスタチンを１００μＬ／ウェルで加えた。細胞を、加湿した９５％空気／５％ＣＯ２環境下、３７℃で４時間インキュベートした。インキュベーション完了時に培地を除去し、氷上にて２容量のメタノール：水：酢酸（ＭｅＯＨ：ＤｌＷ：ＨＡｃ；４９：４９：２）で抽出した。細胞を各々２００μｌのＭｅＯＨ：ＤｌＷ：ＨＡｃで３回抽出した。培地および細胞抽出物の両者から陽イオン樹脂ＡＧ（登録商標）５０Ｗ−Ｘ９ （Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｈｅｒｃｕｌｅｓ， ＣＡ）を用いて塩を除去した。樹脂を除去するため、サンプルを１００ｒｐｍで遠心分離し、上清をＨＰＬＣサンプルバイアルに移した。
【０２３８】
ロバスタチン処理したラット肝細胞抽出物のＦＴＭＳ
測定は全て７．０テスラのマグネットを備えたＢｒｕｋｅｒ ＡＰＥＸ ＩＩ ＦＴＭＳで行った。培地および細胞を種々の溶媒で抽出し、個々のサンプルバイアルに移し、オートサンプリングのトレーに置いた。全２００ウェルのオートサンプリングにはＧｉｌｓｏｎ ２１５リキッドハンドラーを用いた。 Ｇｉｌｓｏｎ ２１５の制御はＸＭＡＳ Ｓパッケージによって管理したが、このＸＭＡＳ ＳパッケージはまたＦＴＭＳ分光計を制御するメインソフトウェアプラットフォームとしてもはたらいた。正確な質量検出は外部較正を用いて行った。質量分析計は、標準ペプチド混合物を用い、オートサンプリングを実施する前に較正した。次に、正確な質量データを、代謝産物の化学組成について各々ウェルからの質量スペクトルを連続的に検索するＴｃｌ／Ｔｋルーチンを用いて解析した。
【０２３９】
結果
正確なＦＴＭＳスペクトルを収集および解析した後、ＨＩＣＳ−ＦＴＭＳデータ解析ソフトウェア（上記第５．３．１節に記載）を用いてそのスペクトルのピークを選択、比較および解析した。作成したスペクトルのサンプル部分を図４に示す。矢じり印は強度がロバスタチン処理によって増幅されたピークの例を示している。
【０２４０】
ＨＩＣＳ−ＦＴＭＳデータ解析ソフトウェアを用い、種々の濃度のロバスタチンで処理した肝細胞のサンプルのＦＴＭＳスペクトルデータを解析した。８２の低分子質量ピークが選択され、さらに各ロバスタチン濃度におけるピークの相対強度として表されるグラフ形式（濃度（μＭ）に対する非処理動物から得られた測定値に対し正規化されたもの（図５ａ〜５ｈ参照））で解析した。ＬＯＷＥＳＳ（頑健な局所平滑化法である）を用いて線形および非線形曲線の平滑化を行った。またロジスティック回帰を用いて曲線の平滑化を精密化し、正確な統計測度を得た。なお、この目的で線形回帰も用いた。
【０２４１】
ロバスタチン濃度と相対強度の間に良好な相関が示されたグラフもあるが、あまり相関が見られないものもあった。低い相関を示すグラフまたは無相関を示すグラフは人為的夾雑である可能性があり、この時点では注目度が低いものである。実用上重要な分子は薬物濃度と相対強度の間で強い相関を示すものである。そのような目的とするピークは、薬物濃度とともに線形的にまたはＳ字曲線を描いて増加または低下するであろう。これらのピークは治療活性、毒性作用および／またはそれに関するその他の生物学的作用に最も関連があるものと考えることができる。
【０２４２】
この注目に値する結果の１つの側面は、この複雑な細胞系においてピークを分離する上でのＦＴＭＳの感度である。例えば、分子質量８５．０２８１５と８５．６４４０５において２つのピークが同定されたが、その質量差は０．７％である。分子質量８５．０２８１５におけるピークはロバスタチン濃度の上昇とともに低下傾向を示したが、分子質量８５．６４４０５におけるピークは増加傾向を示した。異なってはいるが近接した分子質量を有する２つの分子がそれぞれ２つの異なる様式で薬物により影響を受けたこと、およびこれらの差異がＨＩＣＳ−ＦＴＭＳによって成功裡に分解されたことは、明らかである。
【０２４３】
考察
このデータは、細胞内および細胞外成分中の処理依存的変化と処理非依存的変化の両方が検出されることを立証している。親化合物およびいくつかの代謝産物の存在量はウェル中に存在する他の小分子の存在量の変動性と相関する。さらに、サンプルの各々について示される質量精度（＜２ｐｐｍ）は代謝産物の構造および構造式に関する明確な情報をもたらす。
【０２４４】
血清中の生物応答のモニタリングのためのＨＩＣＳ−ＦＴＭＳの適用
３個体のラットを、１００ｍｇ／ｋｇの６−（６−ヒドロキシ−５，５−ジメチルヘキシルオキシ）−２，２−ジメチル−ヘキサン−１−オールを経口胃管栄養で与えることにより、一週間にわたって毎日処理した。６−（６−ヒドロキシ−５，５−ジメチルヘキシルオキシ）−２，２−ジメチル−ヘキサン−１−オールはＨＤＬ−コレステロールを増加させ、実験ラットにおけるグルコース利用を改善させる（２０００年３月３１日出願の米国出願番号０９／５４０，７３８参照）。その一週間の終わりに、３個体のラットの各々、および３個体の対照（非処理）ラットから、採血した。血液を凝血させ、水およびメタノール溶液（４９：４９：２，水：メタノール：酢酸 ｖ：ｖ：ｖ）を各血漿調製物に加えることによりＦＴＭＳ用に血漿を調製した。その混合物を冷蔵してチューブの底にタンパク質を沈殿させた。各チューブを遠心分離し、上清をデカンテーションし、各バイアルに ＤＯＷＥＸイオン交換樹脂約１００ｍｇを加えて、約１０分間サンプルをその樹脂とともにインキュベートすることによってサンプルを脱塩した。次にこのサンプルを遠心分離して上清を取り出した。そして、この溶液をＦＴ質量分析計へ導入した。
【０２４５】
このサンプルについてのピークプロファイルの選択領域を図６に示す。図６Ａ〜Ｃは非処理ラットの血漿に由来するサンプルのスペクトルであり、図６Ｄ〜Ｆは６−（６−ヒドロキシ−５，５−ジメチルヘキシルオキシ）−２，２−ジメチル−ヘキサン−１−オールで処理したラットの血漿に由来するサンプルのスペクトルである。６−（６−ヒドロキシ−５，５−ジメチルヘキシルオキシ）−２，２−ジメチル−ヘキサン−１−オールで処理したラットの血漿に由来するサンプルのスペクトルにおいて、約７６６．４および７６６．８ ダルトンの分子質量の分子に対応する少なくとも２つのピークは、再現性よく高い強度を示す。
【０２４６】
この実験は哺乳動物組織から得られた生物材料において薬物に対する生物応答のマーカーをスクリーニングする上で本発明の方法が有用であることを示すものである。
【０２４７】
新規な抗糖尿病薬の同定
インスリン耐性およびＸ症候群の罹患率は人口中で増大しつつある。インスリン耐性、高血圧、高トリグリセリド血症および低血漿ＨＤＬコレステロールの連鎖的発生はＸ症候群の特徴である（Ｃｏｒｎｉｃｅｌｌｉ， １９９７， Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ ２（２）：４３−４９）。
【０２４８】
Ｘ症候群患者の治療には、スルホニルウレア薬剤、ビグアニドおよびＴＺＤ誘導体をはじめとするいくつかの薬物が使用できる。スルホニルウレア薬剤は無理なく十分に許容されるものであるが、数年の処置を行った後はこの薬物によるグルコース調節能は著しく低下する。ビグアニドは広く用いられているが、例えば乳酸アシドーシスおよび胃腸障害などの重大な副作用を引き起こす可能性がある。ＴＺＤ誘導体は体重増加と肝不全を引き起こす。Ｘ症候群関連疾患の治療に向けて現在開発中の薬物は一般に核受容体リガンド／アクチベーターである。Ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏにおけるいくつかの研究では、ＰＰＡＲγアゴニストがトリグリセリドを減少させ、インスリン増感作用を高めることを示している。
【０２４９】
ＴＺＤはＰＰＡＲγアクチベーターである。コレステロールおよび胆汁のホメオスタシス、脂肪細胞機能およびグルコース代謝を調節することによってＸ症候群を治療するのに有用なその他の薬物は、他の核受容体、例えばＲＸＲ（レチノイン酸受容体）、ＦＸＲ（胆汁酸受容体）、ＬＹＲ（オキシステロール受容体）を活性化する。
【０２５０】
ヒト肝細胞、腸細胞、脂肪細胞および筋細胞の培養物を、（ｉ）ヒトにおいてＸ症候群の少なくとも１つの局面を管理するのに有用な化合物（例えばトリグリセリドおよびＬＤＬコレステロールを低下させ、同時にＨＤＬを増加させるのに有効な薬物、例えばフェノフィブレート、ベザフィブレートおよびゲムフィブロジル）；（ｉｉ）ｉｎ ｖｉｔｒｏで活性があることが分かっており、動物モデルで実証されているが、ヒトでの使用には至っていない化合物（ＦＭＯＣ−Ｌ−ロイシン（第１２回国際シンポジウム・ストックホルム・アテローム性動脈硬化症ではＰＰＡＲγアクチベーターとして示された）、レチノイン酸、および６−（６−ヒドロキシ−５，５−ジメチルヘキシルオキシ）−２，２−ジメチル−ヘキサン−１−オール）；および（ｉｉｉ）活性がｉｎ ｖｉｔｒｏでは確立されているが、動物モデルについてはまだ示されていない化合物、でそれぞれ処理する。
【０２５１】
本明細書に記載の多重ＨＩＣＳ−ＦＴＭＳスクリーニングを用いた場合、ピークプロファイルは上記の各化合物クラスの複数のメンバーに個々に曝した細胞の細胞内容物および細胞上清に由来するサンプルのものであり、３回試験することが好ましく、さまざまな細胞タイプを用いることが好ましく、各化合物に対して各々一定の濃度範囲および一定のインキュベーション時間とすることが好ましい。ピークプロファイルは、各化合物クラス内および化合物クラス間で細胞タイプ毎に比較する。
【０２５２】
フィブレート、グリタゾンおよびブイグアニドに接触させた細胞から調製したサンプル中に共通して存在するピークを同定および特徴付けする。
【０２５３】
レチノイン酸、ｅｓｐ ２４２３２、ＦＭＯＣ−Ｌ−ロイシンに共通するピークを同定および特徴付けする。
【０２５４】
好ましくは、３つの薬物クラスの全てで処理した細胞に由来するサンプルのピークプロファイルに共通して存在するかまたは存在しないピークを同定する。
【０２５５】
共通のピークを同定した後、実験モデル動物（Ｚｕｃｋｅｒラット、糖尿病ラットモデル（ストレプトゾトシン注射）、ｏｂ／ｏｂマウス、ストレプトゾトシン処理Ｓｙｒｉａｎハムスター（ヒトには存在し、ラットおよびマウスには存在しない、ＨＤＬ代謝に不可欠なＣＥＴＰコレステロールエステル転移タンパク質を有する））を、種々の薬物で２〜４週間処理し、さまざまな時点で血液サンプルを採取し、上記第７節に記載のようにしてＦＴＭＳにより分析する。異なる質量スペクトル中のピークを比較する。ここでも全ての薬物に共通するピークを同定する。
【０２５６】
化合物コレクション（コンビナトリアルライブラリー由来および市販のライブラリー由来）を、種々のヒト細胞系（脂肪細胞、肝細胞、腸細胞、筋細胞）とともにインキュベートする。
【０２５７】
細胞内容物および上清をＦＴＭＳで分析する。細胞および動物において参照分子と同様のピークを増大させる化合物を比較し、構造活性相関を決定する。分子はＣａｔａｌｙｓｔ（ＭＳＩ）などのコンピューター化学ソフトウェアを用いて比較する。薬理作用団を同定し、仮説を立てる。
【０２５８】
次に仮説を用いて化合物の仮想ライブラリーをスクリーニングする。そして最も活性なものを反復法で動物において試験する。
【０２５９】
新規な化学実体の薬理作用団／仮説作成合成を試験し、最も活性な化合物を同定する。このようにして同定された新規化合物が薬物開発のためのリード化合物である。
【０２６０】
以下の実施例は、上記の発明を用いる方法をさらに詳しく説明するとともに、本発明の種々の態様を実施するために考えられる最良の形態を示すのに役立つものである。これらの実施例は本発明の真の範囲を何ら限定するものではなく、例証のために示されるものである。本明細書に挙げられた参照文献は全て参照により本明細書に組み入れられる。
【図面の簡単な説明】
【図１】
ピークを選択するための好適なプロセスのステップを示す。
【図２】
生物学的サンプルのＨＩＣＳ−ＦＴＭＳ結果を分析するための好適なプロセスのステップを示す。
【図３】
質量スペクトル間に共通のピークを同定するための好適なプロセスのステップを示す。
【図４】
未処理肝細胞から得られたサンプルのスペクトル（スペクトルＡ−Ｃ）と、ロバスタチンで処理したサンプルのスペクトル（スペクトルＤ−Ｈ）を示す。
【図５】
ＨＩＣＳ−ＦＴＭＳデータ解析ソフトウェアを用いて、種々の濃度のロバスタチンで処理した後のラット肝細胞抽出物から作成したＨＩＣＳ−ＦＴＭＳスペクトルの８２の低分子質量ピークを分析した。ｘ軸のロバスタチン濃度（μＭ）に対して各ピークの相対強度（未処理肝細胞からのピーク強度に対して正規化したもの）をｙ軸上にプロットした。各グラフの上部の数字は対応する分子の分子質量である。ＬＯＷＥＳＳを用いて線形および非線形曲線のフィッティングを行った。論理的回帰を用いて曲線のフィッティングを精密化し、正確な統計的測度を得た。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004503749.tif 000095
【国際調査報告】
2004503749.tif 000096
2004503749.tif 000097