(57)【要約】本発明は、コーティングされていないキャピラリーから開始する、キャピラリー電気泳動によって、分析物を高速高分解するための組成物、方法およびキットを提供する。この組成物は、非架橋アクリルアミドポリマーを含有する、シービング成分、および少なくとも１種の無電荷でかつ非架橋の水溶性シリカ吸収ポリマーを含有する表面相互作用成分を含有する。キャピラリー電気泳動にこの新規化合物を使用するための方法が、提供される。この新規な方法のおける使用のための新規化合物を含むキットもまた、提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
キャピラリー電気泳動によって分析物を分離するための組成物であって、該組成物は、以下：
約１，０００，０００ダルトン（Ｄａ）と３，０００，０００Ｄａとの間の分子量を有する非架橋アクリルアミドポリマーを含有する、シービング成分；ならびに、
Ｎ，Ｎ−二置換ポリアクリルアミドおよびＮ−置換ポリアクリルアミドからなる群より選択される１種以上の非架橋ポリマーを含有する表面相互作用成分であり、ここで、該Ｎ−置換基が、Ｃ１〜Ｃ３アルキル、ハロ置換のＣ１〜Ｃ３アルキル、メトキシ置換のＣ１〜Ｃ３アルキル、およびヒドロキシル置換のＣ１〜Ｃ３アルキルからなる群より選択される、表面相互作用成分；
を含有し、該シービング成分および該表面相互作用成分が同じかまたは異なり；
該組成物は、架橋ポリマーゲルを含まない、組成物。
【請求項２】
前記組成物が、２５℃にて１０，０００センチポイズ未満の粘度を有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記組成物が、２５℃にて５，０００センチポイズ未満の粘度を有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記組成物が、２５℃にて１０００センチポイズ未満の粘度を有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
前記組成物が、２５℃にて６００センチポイズ未満の粘度を有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
前記１種以上の非架橋ポリマーが、ポリ（Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド）を含有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
少なくとも１種の変性剤をさらに含有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
前記少なくとも１種の変性剤が、少なくとも１種のホルムアミド、尿素、および２−ピロリジノンからなる群より選択される、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
前記少なくとも１種の変性剤が尿素を含む、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
キャピラリー電気泳動によって分析物を分離するための組成物であって、該組成物は、以下：
約１，０００，０００Ｄａと３，０００，０００Ｄａとの間の分子量を有し、かつ２５℃にて１０，０００センチポイズ未満の粘度を有する、非架橋アクリルアミドポリマーを含有する、シービング成分；
ポリ（Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド）を含有する、表面相互作用成分；ならびに、
尿素を含む変性剤；
を含有し、架橋ポリマーゲルを含まない、組成物。
【請求項１１】
前記粘度が、２５℃にて５，０００センチポイズ未満である、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
前記粘度が、２５℃にて１，０００センチポイズ未満である、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１３】
前記粘度が、２５℃にて６００センチポイズ未満である、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１４】
キャピラリー電気泳動要素であって、以下：
コーティングされていないキャピラリー；
該コーティングされていないキャピラリー内に配置された分析物を分離するための組成物であって、以下：約１，０００，０００Ｄａと３，０００，０００Ｄａとの間の分子量を有し、かつ２５℃にて１０，０００センチポイズ未満の粘度を有する非架橋アクリルアミドポリマーを含有する、シービング成分；ならびに表面相互作用成分、を含有する、組成物；
を備え、
ここで、該表面相互作用成分が、１種以上の非架橋ポリマーの溶液を含有し；
そして、該キャピラリー電気泳動要素は、架橋ポリマーゲルを含まない、キャピラリー電気泳動要素。
【請求項１５】
前記組成物が、２５℃にて５０００センチポイズ未満の粘度を有する、請求項１４に記載のキャピラリー電気泳動要素。
【請求項１６】
前記組成物が、２５℃にて１０００センチポイズ未満の粘度を有する、請求項１４に記載のキャピラリー電気泳動要素。
【請求項１７】
前記組成物が、２５℃にて６００センチポイズ未満の粘度を有する、請求項１４に記載のキャピラリー電気泳動要素。
【請求項１８】
請求項１４に記載のキャピラリー電気泳動要素であって、ここで、前記１種以上の表面相互作用成分の非架橋ポリマーが、Ｎ，Ｎ−二置換ポリアクリルアミドおよびＮ−置換ポリアクリルアミドからなる群より選択され、ここで、該Ｎ−置換基が、Ｃ１〜Ｃ３アルキル、ハロ置換のＣ１〜Ｃ３アルキル、メトキシ置換のＣ１〜Ｃ３アルキル、およびヒドロキシル置換のＣ１〜Ｃ３アルキルからなる群より選択される、キャピラリー電気泳動要素。
【請求項１９】
前記表面相互作用成分の非架橋ポリマーが、ポリ（Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド）である、請求項１８に記載のキャピラリー電気泳動要素。
【請求項２０】
前記組成物が、少なくとも１種の変性剤をさらに含有する、請求項１４に記載のキャピラリー電気泳動要素。
【請求項２１】
前記少なくとも１種の変性剤が、少なくとも１種のホルムアミド、尿素、および２−ピロリジノンからなる群より選択される、請求項２０に記載のキャピラリー電気泳動要素。
【請求項２２】
前記少なくとも１種の変性剤が尿素を含有する、請求項２１に記載のキャピラリー電気泳動要素。
【請求項２３】
前記コーティングされていないキャピラリーが、シリカ、縮合シリカ、石英、ケイ酸ベースのガラス、リン酸塩ガラス、またはアルミナ含有ガラスを含む、請求項１４に記載のキャピラリー電気泳動要素。
【請求項２４】
前記コーティングされていないキャピラリーがプラスチック基板を含む、請求項１４に記載のキャピラリー電気泳動要素。
【請求項２５】
請求項１４に記載のキャピラリー電気泳動要素であって、前記組成物が、以下：
約１，０００，０００Ｄａと３，０００，０００Ｄａとの間の分子量を有し、かつ２５℃にて６００センチポイズ未満の粘度を有する直鎖アクリルアミドポリマーを含有する、シービング成分；
ポリ（Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド）を含有する、表面相互作用成分；ならびに、
尿素を含有する、変性剤；
を含有し、該組成物が架橋ポリマーゲルを含有しない、キャピラリー電気泳動要素。
【請求項２６】
前記コーティングされていないキャピラリーが、シリカ、縮合シリカ、石英、ケイ酸ベースのガラス（例えば、ホウケイ酸ガラス）、リン酸塩ガラス、またはアルミナ含有ガラスを含む、請求項２５に記載のキャピラリー電気泳動要素。
【請求項２７】
前記コーティングされていないキャピラリーがプラスチック基板を含む、請求項２５に記載のキャピラリー電気泳動要素。
【請求項２８】
キャピラリー電気泳動によって分析物を分離するための方法であって、該方法は、組成物におけるキャピラリー電気泳動によって該分析物を分離する工程を包含し、該組成物が、以下：
約１，０００，０００Ｄａと３，０００，０００Ｄａとの間の分子量を有する非架橋アクリルアミドポリマーを含有する、シービング成分；ならびに、
Ｎ，Ｎ−二置換ポリアクリルアミドおよびＮ−置換ポリアクリルアミドからなる群より選択される１種以上の非架橋ポリマーを含有する、表面相互作用成分であり、ここで、該Ｎ−置換基が、Ｃ１〜Ｃ３アルキル、ハロ置換のＣ１〜Ｃ３アルキル、メトキシ置換のＣ１〜Ｃ３アルキル、およびヒドロキシル置換のＣ１〜Ｃ３アルキルからなる群より選択される、表面相互作用成分；
を含有し、ここで該シービング成分および該表面相互作用成分が同じかまたは異なり；そしてここで、該組成物が架橋ポリマーゲルを含まない、方法。
【請求項２９】
複数のコーティングされていないキャピラリーを用いて並列に行われる、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記非架橋アクリルアミドポリマーが、２５℃にて１０００センチポイズ未満の粘度を有する、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
前記非架橋アクリルアミドポリマーが、２５℃にて５００センチポイズ未満の粘度を有する、請求項２８に記載の方法。
【請求項３２】
前記組成物が少なくとも１種の変性剤をさらに含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３３】
前記少なくとも１種の変性剤が、少なくとも１種のホルムアミド、尿素、および２−ピロリジノンからなる群より選択される、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記少なくとも１種の変性剤が尿素を含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
キャピラリー電気泳動によって分析物を分離するための方法であって、請求項１４に記載のキャピラリー電気泳動要素を用いたキャピラリー電気泳動によって、該分析物を分離する工程を包含する、方法。
【請求項３６】
複数のコーティングされていないキャピラリーを用いて並列に行われる、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記コーティングされていないキャピラリーが、シリカ、縮合シリカ、石英、ケイ酸ベースのガラス、リン酸塩ガラス、またはアルミナ含有ガラスを含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記コーティングされていないキャピラリーがプラスチック基板を含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項３９】
キャピラリー電気泳動によって分析物を分離するための方法であって、請求項２５に記載のキャピラリー電気泳動要素を用いたキャピラリー電気泳動によって、該分析物を分離する工程を包含する、方法。
【請求項４０】
複数のキャピラリーを用いて並列に行われる、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記キャピラリーが、シリカ、縮合シリカ、石英、ケイ酸ベースのガラス、リン酸塩ガラス、またはアルミナ含有ガラスを含む、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記キャピラリーがプラスチック基板を含む、請求項４０に記載の方法。
【請求項４３】
キャピラリー電気泳動によって分析物を分離するための方法であって、該方法は、以下：
第一端部および第二端部を有するコーティングされていないキャピラリーに、組成物を挿入する工程であり、該組成物は、約１，０００，０００Ｄａと３，０００，０００Ｄａとの間の分子量を有する非架橋アクリルアミドポリマーを含有する、シービング成分、ならびに、Ｎ，Ｎ−二置換ポリアクリルアミドおよびＮ−置換ポリアクリルアミドからなる群より選択される１種以上の非架橋ポリマーを含有する、表面相互作用成分を含有し、ここで、該Ｎ−置換基は、Ｃ１〜Ｃ３アルキル、ハロ置換のＣ１〜Ｃ３アルキル、メトキシ置換のＣ１〜Ｃ３アルキル、およびヒドロキシル置換のＣ１〜Ｃ３アルキルからなる群より選択され；ここで、該シービング成分および該表面相互作用成分が同じかまたは異なり；ここで、該組成物が架橋ポリマーゲルを含まない、工程；
異なるサイズの分析物のサンプルを該キャピラリーに充填する工程；ならびに、
該サンプル中の該異なるサイズの分析物が該キャピラリーを通って移動するように、該キャピラリーの該第一端部と該第二端部との間に電場を印加し、それによって該分析物を分離する、工程、
を包含する、方法。
【請求項４４】
前記組成物が、少なくとも１種の変性剤をさらに含有する、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記少なくとも１種の変性剤が尿素である、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記表面相互作用の非架橋ポリマーが、ポリ（Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド）である、請求項４３に記載の方法。
【請求項４７】
複数のコーティングされていないキャピラリーを用いて並列に行われる、請求項４３に記載の方法。
【請求項４８】
前記コーティングされていないキャピラリーが、シリカ、縮合シリカ、石英、ケイ酸ベースのガラス、リン酸塩ガラス、またはアルミナ含有ガラスを含む、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記コーティングされていないキャピラリーがプラスチック基板を含む、請求項４７に記載の方法。
【請求項５０】
キャピラリー電気泳動によって分析物を分離するためのキットであって、該キットは、組成物を備え、該組成物は、以下：
約１，０００，０００Ｄａと３，０００，０００Ｄａとの間の分子量を有し、かつ１０００センチポイズ未満の粘度を有する非架橋アクリルアミドポリマーを含有する、シービング成分；ならびに、
Ｎ，Ｎ−二置換ポリアクリルアミドおよびＮ−置換ポリアクリルアミドからなる群より選択される１種以上の非架橋ポリマーを含有する、表面相互作用成分であって、ここで、該Ｎ−置換基が、Ｃ１〜Ｃ３アルキル、ハロ置換のＣ１〜Ｃ３アルキル、メトキシ置換のＣ１〜Ｃ３アルキル、およびヒドロキシル置換のＣ１〜Ｃ３アルキルからなる群より選択される、表面相互作用成分；
を含有し、ここで、該シービング成分および該表面相互作用成分が同じかまたは異なり；ここで、該組成物が架橋剤を含まない、キット。
【請求項５１】
キャピラリー電気泳動によって分析物を分離するためのキットであって、該キットは、組成物を備え、該組成物は、約１，０００，０００Ｄａと３，０００，０００Ｄａとの間の分子量を有し、かつ２５℃にて１０００センチポイズ未満の粘度を有する非架橋アクリルアミドポリマーを含有する、シービング成分を含有し、ここで、該組成物が架橋ポリマーゲルを含有しない、キット。
【請求項５２】
請求項５１に記載のキットであって、Ｎ，Ｎ−二置換ポリアクリルアミドおよびＮ−置換ポリアクリルアミドからなる群より選択される１種以上の非架橋ポリマーを含有する、表面相互作用成分をさらに備え、ここで、該Ｎ−置換基が、Ｃ１〜Ｃ３アルキル、ハロ置換のＣ１〜Ｃ３アルキル、メトキシ置換のＣ１〜Ｃ３アルキル、およびヒドロキシル置換のＣ１〜Ｃ３アルキルからなる群より選択される、キット。
【請求項５３】
前記表面相互作用成分が、ポリ（Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド）である、請求項５２に記載のキット。
【請求項５４】
少なくとも１種のホルムアミド、尿素、および２−ピロリジノンからなる群より選択される少なくとも１種の変性剤をさらに備える、請求項５３に記載のキット。
【請求項５５】
前記少なくとも１種の変性剤が尿素である、請求項５４に記載のキット。
【請求項５６】
キャピラリー電気泳動によって分析物を分離するための組成物であって、約１，０００，０００ダルトン（Ｄａ）と３，０００，０００Ｄａとの間の分子量を有する非架橋アクリルアミドポリマーを含有する、シービング成分を含有し、該組成物は、架橋ポリマーゲルを含有しない、組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、キャピラリー電気泳動によって分析物を分離するための組成物、キャピラリー電気泳動要素、および方法に関する。キャピラリー電気泳動によって分析物を分離するためのキットもまた提供される。
【０００２】
（発明の背景）
キャピラリー電気泳動は、以下のいくつかの技術的利点に起因して、分析技術として広く適用されてきた：（ｉ）キャピラリーが、高い表面対容量比を有し、これが、より効率的な熱損失を可能にし、次いで、このことが、より迅速な分離のために高い電場が使用されるのを可能にする；（ｉｉ）この技術は、最小限のサンプル容量を必要とする；（ｉｉｉ）大部分の分析物の優勢な分解が達成可能である；（ｉｖ）この技術は、自動化に受け入れやすい（例えば、Ｃａｍｉｌｌｅｒｉ編、Ｃａｐｉｌｌａｒｙ　Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ：Ｔｈｅｏｒｙ　ａｎｄ　Ｐｒａｃｔｉｃｅ（ＣＲＣ　Ｐｒｅｓｓ、Ｂｏｃａ　Ｒａｔｏｎ、１９９３）；およびＧｒｏｓｓｍａｎら編、Ｃａｐｉｌｌａｒｙ　Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ（Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ、１９９２）を参照のこと）。これらの利点に起因して、生体分子（特に、核酸）の分離へのキャピラリー電気泳動の適用に、大きな関心が持たれてきた。核酸（特に、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ））の迅速かつ正確な分離に対する必要性が、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）産物の分析およびＤＮＡ配列決定において存在している（例えば、Ｗｉｌｌｉａｍｓ、Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ａ　Ｃｏｍｐａｎｉｏｎ　ｔｏ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、４：２２７−２３２（１９９２）；Ｄｒｏｓｓｍａｎら、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．、６２：９００−９０３（１９９０）；Ｈｕａｎｇら、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．、６４：２１４９−２１５４（１９９２）；およびＳｗｅｒｄｌｏｗら、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１８：１４１５−１４１９（１９９０）を参照のこと）。
【０００３】
電荷対摩擦抵抗比が、自由溶液中の異なるサイズのポリヌクレオチドについて同じであるので、ポリヌクレオチドの電気泳動分離は、代表的には、シービング（ｓｉｅｖｉｎｇ）媒体を含む。初期の選り抜きのシービング媒体は、代表的には、架橋化ゲルであったが、いくつかの例では、安定性および生産性の問題が、非ゲル液体ポリマーシービング媒体（例えば、直鎖ポリアクリルアミド、ヒドロキシアルキルセルロース、アガロース、およびセルロースアセテートなど）の試験を導いてきた（例えば、Ｂｏｄｅ、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、８３：２０４−２１０（１９７７）；Ｂｏｄｅ、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、８３：３６４−３７１（１９７７）；Ｂｏｄｅ、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、９２：９９−１１０（１９７９）；Ｈｊｅｒｔｅｎら、Ｊ．Ｌｉｑｕｉｄ　Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ、１２：２４７１−２４７７（１９８９）；Ｇｒｏｓｓｍａｎ、米国特許第５，１２６，０２１号；Ｚｈｕら、米国特許第５，０８９，１１１号；Ｔｉｅｔｚら、Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ、１３：６１４−６１６（１９９２））。
【０００４】
キャピラリー電気泳動による分離を複雑にし得る別の因子は、電気浸透（ｅｌｅｃｔｒｏｅｎｄｏｏｓｍｏｓｉｓ）の現象である。この現象は、時折、電気浸透（ｅｌｅｃｔｒｏｏｓｍｏｓｉｓ）または電気浸透流（ＥＯＦ）とも呼ばれ、これは、電場によって誘導されるキャピラリー中の流体の流れである。この現象は、高分解能分離が代表的に要求される状況（例えば、ＤＮＡ配列決定フラグメントの分析において）に対するキャピラリー電気泳動の適用を妨害する。この現象は、キャピラリー電気泳動において、そのキャピラリーの内壁が固定された電荷を含む場合に生じ得る。このような電荷は、対イオンの移動層の形成を生じ得、次いで、これが、電場の存在下で移動して、液体のバルクフローを生じる。不幸にも、ＥＯＦの程度は、多くの因子（電荷の分布における変動、分析物および／または分離媒体の成分の選択的吸着、分離媒体のｐＨなどを含む）に依存して変化し得る。この可変性は、接近して離れている分析物のバンドを分解する能力を減少し得るので、多くの試みが、このような流れを直接的または間接的に制御するためになされてきた。これらの試みには、荷電基を抑制するためのキャピラリーの内壁の共有結合性のコーティングまたは改変、高粘性ポリマーの使用、緩衝液のｐＨおよび／または濃度の調整、キャピラリー壁を共有結合的にコーティングするためのゲル分離媒体の使用、ならびにキャピラリーの軸に対して半径方向の電場の適用が含まれた。
【０００５】
現在、核酸フラグメントのキャピラリー電気泳動は、しばしば、プレコーティングされたキャピラリーを使用して行われる。プレコーティングされたキャピラリー管は、一般に、作製するのに高価であり、限定された寿命を有し、そして再現性の問題にさらされ得る。これらの問題は、平行な複数のキャピラリー泳動を使用する、大規模のキャピラリー電気泳動に特に重要である。
【０００６】
（発明の要旨）
本発明は、サンプル中の分析物を分離（例えば、ＤＮＡ配列決定フラグメントまたは他のポリヌクレオチドフラグメントの一塩基分解）するための組成物を提供する。シービング成分、および必要に応じて、表面相互作用成分を含む、組成物が提供され、シービング成分は、少なくとも１つの低粘性の高分子量非架橋化アクリルアミドポリマーを含み、そして表面相互作用成分は、少なくとも１つの非架橋化ポリマーを含む。好ましい実施形態において、これらの組成物は、架橋化ポリマーゲルを含まない。
【０００７】
別の局面において、本発明は、キャピラリー電気泳動要素を含む。キャピラリー電気泳動要素は、分析物を分離するための組成物が挿入される、コーティングされていないキャピラリーを含む。このキャピラリー内に配置される組成物は、シービング成分および表面相互作用成分を含む。
【０００８】
別の局面において、本発明の組成物を、キャピラリー電気泳動によって分析物を分離するために使用する、方法を提供する。特定の実施形態において、本発明の方法は、複数のコーティングされていないキャピラリー、または本明細書中に開示される新規組成物を含むキャピラリー電気泳動要素を使用して、平行して行われる。
【０００９】
別の局面において、本発明は、とりわけ、プレコーティングされたキャピラリーと共に使用するための、表面相互作用成分を含まない、低粘性の高分子量非架橋化アクリルアミドポリマーシービング成分を含む組成物を提供する。プレコーティングされたキャピラリーは、例えば、ＢｉｏＲａｄ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓから市販されている（例えば、Ｂｉｏｃａｐ　ＸＬキャピラリー、カタログ番号１４８−３０８１）。キャピラリーはまた、当該分野で周知の方法を使用してプレコーティングされ得る。このような手順は、例えば、Ｃｏｂｂら、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．６２：２４７８（１９９０）およびＧｒｏｓｓｍａｎ、米国特許第５，３４７，５２７号に記載される。
【００１０】
キャピラリー電気泳動によって分析物を分離するためのキットもまた、提供される。特定の実施形態において、これらのキットは、本明細書中に提供される組成物のうちの１つを備える。１以上のこれらの組成物または方法と共に使用するための、コーティングされていないキャピラリーを備えるキットもまた、提供される。
【００１１】
（定義）
「アクリルアミド」および「アクリルアミドモノマー」とは、式Ｈ２Ｃ＝ＣＲ−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ１Ｒ２を有する構造であって、Ｒが−Ｈまたは−ＣＨ３であり得、そしてＲ１およびＲ２が、独立して、−Ｈ、−ＣＨ３、−（ＣＨ２）ｘＯＨ、−ＣＨ２ＣＨ（ＯＨ）（ＣＨ２）ｙＯＲ３、−ＣＨ（ＣＨ２ＯＨ）ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ３、−ＣＨ２ＣＨ２（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｐ−ＯＲ３、−ＣＨ２ＣＯＮＨ２、
【００１２】
【化１】
2004509343.tif 000002
であり得、そしてＲ３が、独立して、−Ｈ、−ＣＨ３、または−ＣＨ２ＣＨ３であり得る、構造をいう。ｘおよびｙの値は、１〜３の範囲であり、そしてｐの値は、１〜２００の範囲である。
【００１３】
「平均分子量」とは、種々の分子量を有するポリマー種から構成されたサンプル集団の、重量平均分子量（Ｍｗ）をいう。この量は、以下の式：
【００１４】
【化２】
2004509343.tif 000003
により規定され、ここで、ｎｉは、種ｉの分子数を示し、そしてＭｉは、ｉ番目の種の分子量である。本明細書中で使用される場合、用語「分子量」とは、他のように特定されない限り、重量平均分子量をいう。
【００１５】
用語「キャピラリー」とは、本明細書中で使用される場合、一定体積の分離媒体（例えば、本明細書中に開示されるような、分析物を分離するための組成物）を支持可能である、電気泳動を実行するための管もしくはチャネルまたは他の構造をいう。キャピラリーの幾何学的構造は、広範に変動し得、そしてその幾何学的構造としては、円形断面を備えた管、矩形断面を備えた管、または四角形断面を備えた管、チャネル、溝、プレートなどが挙げられるが、これらに限定されず、そしてこの幾何学的構造は、広範な技術により製造され得る。本発明の特定の実施形態とともに使用するためのキャピラリーの重要な特徴は、分離媒体の体積と接触した表面の表面−体積比である。この比が高い値であることは、代表的には、電気泳動の間にその分離媒体からのより良好な熱転移を可能にする。好ましくは、特定の実施形態において、約０．８〜０．０２μｍ−１の範囲にある値が、使用される。これらは、約５μｍ〜約２００μｍの範囲内の内径を有する、円形断面を備えた管状キャピラリーの表面−体積比に対応する。用語「コーティングされていないキャピラリー」とは、そのキャプラリーが、本発明の組成物の導入前にコーティングされていないこと、すなわち、使用前に共有結合によりコーティングされていないことを、意味する。特定の実施形態において、本発明とともに使用するためのキャピラリーは、シリカ、縮合シリカ、石英、ケイ酸ベースのガラス（例えば、ホウケイ酸ガラス、リン酸塩ガラス、アルミナ含有ガラスなど）または他のシリカ様材料から作製される。特定の実施形態において、プラスチック物質中に形成されたキャピラリーが、使用される。プラスチック物質は、例えば、例えば、ポリアクリレートおよびポリオレフィン（例えば、ＬＵＣＲＹＬ（登録商標）（ＢＡＳＦ、ドイツ）、ＴＰＸ（商標）（Ｍａｔｓｕｉ　Ｐｌａｓｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．、Ｗｈｉｔｅ　Ｐｌａｉｎｓ、ＮＹ）、ＴＯＰＡＳ（登録商標）（Ｈｏｅｃｈｓｔ　Ｃｅｌａｎｅｓｅ　Ｃｏｒｐ．、Ｓｕｍｍｉｔ，ＮＪ）、およびＺＥＯＮＯＲ（登録商標）（Ｚｅｏｎ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｌｏｕｉｓｖｉｌｌｅ，ＫＹ））を包含し得る。チャネルキャピラリーのためのプラスチック物質の記載は、とりわけ、米国特許第５，７５０，０１５号に見出され得る。
【００１６】
本明細書中で使用される場合、用語「分析物を分離するための組成物」は、低粘性で高分子量のシービング成分と、必要に応じて、表面相互作用成分とを、含む。このような組成物は、キャピラリー電気泳動を使用して、ポリヌクレオチド、または異なるサイズを有するが遊離溶液中で類似するかもしくは同じ電荷−摩擦抵抗比を有する他の生体分子を分離するために、特に有用である。当業者は、電荷保有成分、または電解質が、代表的には、このような組成物に含まれることを、認識する。この電荷保有成分は、通常は、一定ｐＨにて分離媒体を維持するための緩衝系の一部である。分析物を分離するための組成物は、１つ以上の非架橋アクリルアミドポリマーを含む。
【００１７】
用語「ＤＮＡ配列決定フラグメント」とは、選択されたＤＮＡ標的配列に関する配列情報を得るために生成された、ＤＮＡポリヌクレオチドをいう。このようなフラグメントは、例えば、サンガージデオキシ法によって酵素的にか、または例えばマクサム−ギルバート法によって化学的に、生成され得る。このフラグメントは、１つの配列決定反応（例えば、ジデオキシシチジン三リン酸の存在下で実施されるジデオキシ配列決定反応）において生じ得るか、または１つを超える配列決定反応から（例えば、各フラグメントの３’末端塩基を同定するために適切に標識された５’−プライマーを含む、４つの異なるジデオキシ配列決定反応から）生じ得る。
【００１８】
「ポリマー」は、その伝統的意味にて使用され、一緒に共有結合されて鎖を形成する、より小さいモノマーサブユニットまたはオリゴマーサブユニットから構成された、大きな分子を指す。「ホモポリマー」は、１つのモノマー反復単位のみから構成された、ポリマーである。「コポリマー」とは、２種以上のモノマー反復単位から構成された、ポリマーを指す。線状ポリマーは、連続して一本の状態で一緒に連結されてポリマー分子を形成する、モノマー反復単位から構成される。分枝型ポリマーは、線状ポリマーと類似するが、主ポリマーに沿って種々の分枝点から突出した側鎖を有する。星型ポリマーは、１つの分枝部位から複数の側枝が放射状に延びて、星型の外見または車輪およびスポーク状の外見を生じること以外は分枝型ポリマーと類似する。
【００１９】
架橋されたポリマーは、例えば、末端以外の点で互いに共有結合したポリマー分子を含む。架橋は、架橋剤の存在下で重合反応の間に生じ得る。ある程度の架橋（ゲル化点として公知）で、ゲル化が生じる。このゲル化点で、明らかなゲルまたは不溶性ポリマーが形成し、そしてこの系は流動性を失う。架橋されて巨視的な分子を形成するポリマー分子の網目構造の形成に対応する、この架橋されたポリマーゲルは、全ての溶媒中で、上昇した温度でさえ不溶性である。アクリルアミドポリマーおよびポリマーゲルの考察は、当該分野で公知の参考文献（例えば、Ｏｄｉａｎ、Ｐｒｉｃｉｐｌｅｓ　ｏｆ　Ｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ、第三版（Ｗｉｌｅｙ　Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、１９９１）に見出され得る。
【００２０】
本明細書中で使用される場合、「非架橋アクリルアミドポリマー」とは、アクリルアミドモノマーを含有する、分枝を有しているかまたは有していないポリマーをいうが、一緒に架橋されるポリマー分子を除外する。従って、非架橋ポリマーは、末端以外の点で連結したポリマー分子を含まず、そして重合の間にゲル化をしない。
【００２１】
用語「ポリヌクレオチド」とは、本明細書中で使用される場合、天然ヌクレオシドモノマーまたは修飾ヌクレオシドモノマーの線状ポリマーをいい、二本鎖および一本鎖のデオキシリボヌクレオシド、リボヌクレオシド、それらのα−アノマー形態などを含む。代表的に、ヌクレオシドモノマーは、ホスホジエステル結合またはそのアナログによって連結されてポリヌクレオチドを形成するが、ペプチド核酸もまた意図される。特定の実施形態において、ポリヌクレオチドは、数モノマー単位（例えば、２０）〜数千モノマー単位の範囲の大きさである。ポリヌクレオチドが、文字列（例えば、「ＡＴＧＣＣＴＧ」）によって示されるときにはいつでも、他に示されない限り、ヌクレオチドは、左から右へ５’→３’の順であり、そして「Ａ」はデオキシアデノシンを示し、「Ｃ」は、デオキシシチジンを示し、「Ｇ」は、デオキシグアニンを示し、そして「Ｔ」は、デオキシチミジンを示すことが、理解される。ホスホジエステル結合のアナログとしては、ホスホチオエート、ホスホジチオエート、ホスホセレネート（ｐｈｏｓｐｈｏｓｅｌｅｎａｔｅ）、ホスホジセレネート、ホスホロアニロチオエート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏａｎｉｌｏｔｈｉｏａｔｅ）、ホスホロアニリデート（ｐｈｏｓｐｈｏｒａｎｉｌｉｄａｔｅ）、ホスホロアミダイトなどが挙げられる。
【００２２】
用語「一塩基分解」（Ｒ一塩基）とは、大きさが１ヌクレオチド異なる２つのポリヌクレオチドフラグメントから生じる、２つのピークの間の分解の測定をいう。一塩基分解は、以下の式：
【００２３】
【化３】
2004509343.tif 000004
を使用して数学的に決定され得、ここで、ｔｎは、ｎヌクレオチド長のポリヌクレオチドフラグメントの移動時間であり；ｔｎ＋１は、ｎ＋１ヌクレオチド長のポリヌクレオチドフラグメントの移動時間であり；Ｗｎは、ｎヌクレオチド長のポリヌクレオチドフラグメントからのピークの基底での全幅であり；そしてＷｎ＋１は、ｎ＋１ヌクレオチド長のポリヌクレオチドフラグメントからのピークの基底での全幅である。「移動時間」は、ポリヌクレオチドフラグメントが、キャピラリーまたは微小チャネルの長さ（すなわち、注入点から検出器まで）を移動するのにかかる時間である。
【００２４】
用語「一塩基分解限界」とは、一塩基分解値が特定の系において０．５８未満に落ちる、ポリヌクレオチドフラグメントの大きさをいう。
【００２５】
（例示的実施形態の詳細な説明）
本明細書中で使用されるこの節の見出しは、組織的目的のみのためであり、記載される主題を限定するとは解釈されるべきでない。本出願において引用される全ての参考文献は、各参考文献が具体的かつ個々に参考として援用されたのと同程度に、任意の目的のための参考として明示的に援用される。
【００２６】
特定の実施形態において、本発明は、低粘度、高分子量の非架橋アクリルアミドポリマーシービング成分を含有する組成物を提供する。他の実施形態において、組成物は、表面相互作用成分（例えば、ポリジメチルアクリルアミド（ｐＤＭＡ））をさらに含有する。さらに、本発明の組成物は、架橋されたポリマーゲルを含まない。分析物（特に、ポリヌクレオチド配列）の高速、高分解能のキャピラリー電気泳動のための方法が提供され、この方法は、この新規の組成物を使用することによる。これらの方法を使用するキットもまた提供される。
【００２７】
本発明の組成物の１つの利点は、１，０００，０００Ｄａと３，０００，０００Ｄａとの間の分子量を有する非架橋アクリルアミドポリマーが、開示された方法および電気泳動要素において使用された場合に、公知の電気泳動組成物と比較して、予測できない利点を提供することである。約１，０００，０００Ｄａ未満の分子量を有する線状アクリルアミドポリマーは、本発明の組成物よりも乏しい分解能を提供する。約３，０００，０００Ｄａより大きい分子量を有する線状アクリルアミドポリマーは、粘度の問題を示し、そして操作（例えば、キャピラリーに挿入し、そしてキャピラリーから除去する）のが困難である。従って、本発明の組成物は、２５℃で１０，０００センチポイズ未満、好ましくは５，０００センチポイズ未満、より好ましくは１，０００センチポイズ未満、そして最も好ましくは６００センチポイズ未満の粘度を有する。非架橋アクリルアミドポリマーとしては、例えば、線状ポリマー（例えば、ポリアクリルアミド（ＬＰＡ））、分枝ポリマーおよび星型ポリマーが挙げられ得る。
【００２８】
シービング成分は、ポリアクリルアミド以外の親水性Ｎ置換アクリルアミドポリマー（すなわち、この置換基は、アクリルアミド窒素に結合している）を含み得る。例示的な親水性Ｎ置換アクリルアミドポリマーとしては、以下のホモポリマーおよびそれらのコポリマーが挙げられる：
【００２９】
【化４】
2004509343.tif 000005
ここで、Ｒ３は、−Ｈまたは−ＣＨ３であり得、そしてＲ４およびＲ５は、独立して、−Ｈ、−ＣＨ３、−（ＣＨ２）ｘＯＨ、−ＣＨ２ＣＨ（ＯＨ）（ＣＨ２）ｙＯＲ６、−ＣＨ（ＣＨ２ＯＨ）ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ３、−ＣＨ２ＣＨ（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｐＯＲ６、−ＣＨ２ＣＯＮＨ２、
【００３０】
【化５】
2004509343.tif 000006
であり得、そしてＲ６は、独立して、−Ｈ、−ＣＨ３、または−（ＣＨ２ＣＨ３）であり得る。ｘおよびｙの値は１〜３の範囲であり、ｐの値は１〜２００の範囲であり、そしてｑはポリマーの分子量に正比例し、かつ数百〜数十万の範囲である。平均分子量は、１００，０００Ｄａ〜２５，０００，０００Ｄａ、好ましくは、１，０００，０００Ｄａ〜３，０００，０００Ｄａの範囲である。
【００３１】
開示された組成物中のシービング成分としての使用に適切な、１つの例示的な親水性Ｎ置換アクリルアミドコポリマーは、以下：
【００３２】
【化６】
2004509343.tif 000007
であり、ここで、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５およびコポリマーの分子量は、上記の通りであり、そしてｍ：ｎの比は、約１００：１〜約１：１００の範囲である。
【００３３】
特定の実施形態において、このシービング成分は、約１，０００，０００Ｄａと約３，０００，０００Ｄａとの間の平均分子量を有する、非架橋ポリアクリルアミドポリマーを含む。１，０００，０００Ｄａ以上の平均分子量の非架橋ポリアクリルアミドポリマーは、改善された分解能を提供する。３，０００，０００Ｄａ以下の平均分子量の非架橋ポリアクリルアミドポリマーは、改善された流動性を提供し、このようなポリマーの取り扱いおよびコーティングされていないキャピラリーへの充填を容易にする。
【００３４】
特定の実施形態において、本発明の組成物の表面相互作用成分は、１つ以上の非架橋ポリマーを含む。このような成分は、種々の化学分類（例えば、以下の参考文献において記載される化学分類）に属し得る：Ｍｏｌｙｎｅｕｘ，Ｗａｔｅｒ−Ｓｏｌｕｂｌｅ　Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ　Ｐｏｌｙｍｅｒｓ：Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ　ａｎｄ　Ｂｅｈａｖｉｏｒ，第１巻および第２巻（ＣＲＣ　Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ　Ｒａｔｏｎ，１９８２）；Ｄａｖｉｄｓｏｎ，Ｅｄｉｔｏｒ，Ｈａｎｄｂｏｏｋ　ｏｆ　Ｗａｔｅｒ−Ｓｏｌｕｂｌｅ　Ｇｕｍｓ　ａｎｄ　Ｒｅｓｉｎｓ（ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ，１９８０）；Ｆｒａｎｋｓ，ｅｄｉｔｏｒ，Ｗａｔｅｒ：Ａ　Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ　Ｔｒｅａｔｉｓｅ（Ｐｌｅｎｕｍ　Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ，１９７３）など。
【００３５】
表面相互作用成分として適切であり得る例示的な非架橋ポリマーとしては、ポリビニルピロリドン、Ｎ，Ｎ−二置換ポリアクリルアミド、Ｎ−単置換ポリアクリルアミドなどが挙げられる。特定の実施形態において、この表面相互作用成分は、０．０５〜０．５％、好ましくは０．１〜０．４％、そして最も好ましくは０．２％の範囲で、ポリ（Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド）（ｐＤＭＡ）を含む。
【００３６】
Ｎ置換ポリアクリルアミドの例示的なＮ置換基としては、Ｃ１〜Ｃ１２アルキル；ハロ置換Ｃ１〜Ｃ１２アルキル；メトキシ置換Ｃ１〜Ｃ１２アルキル；ヒドロキシル置換Ｃ１〜Ｃ１２アルキルなどが挙げられる。好ましくは、ハロ置換基は、フルオロであり、そしてヒドロキシル置換Ｃ１〜Ｃ１２アルキルは、単置換である。上記モノマー置換基が代表的に選択され、その結果、得られたポリマーは、水溶性であることが理解される。例えば、Ｃ１２アルキル含有モノマーは、しばしば、コポリマーの小画分成分としてのみ存在する。より好ましくは、例示的な置換基は、Ｃ１〜Ｃ３アルキル；ハロ置換Ｃ１〜Ｃ３アルキル；メトキシ置換Ｃ１〜Ｃ３アルキル；およびヒドロキシル置換Ｃ１〜Ｃ３アルキルからなる群より選択される。このようなポリマーは、例えば、Ｏｄｉａｎ，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ　ｏｆ　Ｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ、第３版（Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ，１９９１）、Ｇｌａｓｓ，ｅｄｉｔｏｒ，Ｗａｔｅｒ−Ｓｏｌｕｂｌｅ　Ｐｏｌｙｍｅｒｓ；Ｂｅａｕｔｙ　ａｎｄ　Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ（Ａｄｖ．Ｃｈｅｍ．Ｓｅｒ．，＃２１３、Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｓｏｃｉｅｔｙ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．，１９８６）、およびＭｏｌｙｎｅｕｘ，Ｗａｔｅｒ−Ｓｏｌｕｂｌｅ　Ｐｏｌｙｍｅｒｓ：Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ　ａｎｄ　Ｂｅｈａｖｉｏｒ，第Ｉ巻および第ＩＩ巻（ＣＲＣ　Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ　Ｒａｔｏｎ，ＦＬ，１９８２）において開示されるような、従来の技術によって合成される。
【００３７】
好ましい表面相互作用成分は、ｐＤＭＡである。特定の実施形態に従って、ｐＤＭＡ以外の疎水性ポリマーは、表面相互作用成分として使用され得る。これらとしては、以下のホモポリマーが挙げられるが、これに限定されない：Ｎ−アルキル−置換アクリルアミドおよびこれらのコポリマー、
【００３８】
【化７】
2004509343.tif 000008
ここで、Ｒ７は、−Ｈまたは−ＣＨ３であり得、Ｒ８およびＲ９は、独立して、−Ｈ、−ＣＨ３、−ＣＨ２ＣＨ３、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３、−ＣＨ（ＣＨ３）２または−ＣＨ２ＣＯＮＨ２であり得、そしてｚは、約２０００〜５０，０００の範囲である。平均分子量は、２００，０００Ｄａ〜５，０００，０００Ｄａ、好ましくは３００，０００Ｄａ〜２，５００，０００Ｄａの範囲である。アミド基はまた、
【００３９】
【化８】
2004509343.tif 000009
のような環状化合物であり得る。表面相互作用成分として使用され得るコポリマーの別の例としては、以下の構造、
【００４０】
【化９】
2004509343.tif 000010
が挙げられ、ここで、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、および分子量は、以前に記載されており、そしてｊ：ｋの比は、１：９〜９：１の範囲である。
【００４１】
特定の実施形態において、分離媒体の表面相互作用成分を含むポリマーは、約０．００１％〜約１０％重量：重量（ｗ：ｗ）の濃度で存在し得る。好ましくは、このようなポリマーは、約０．０１％〜約１％ｗ：ｗの範囲の濃度で存在する。
【００４２】
特定の実施形態において、組成物は、変性剤のようなさらなる成分を含み得る。このような変性剤は、例えば、ポリヌクレオチドを含む分析物との、二重鎖または二次構造の形成を防ぐことが所望である場合に有用であり得る。例示的な変性剤としては、ホルムアミド（例えば４０〜９０％）、尿素（例えば６〜８Ｍ）、市販のラクタム（例えば、ピロリドン、２−ピロリジノン）などが挙げられる。特定の実施形態において、変性剤は、単独または組み合わせて、尿素、ホルムアミド、または２−ピロリジノンを含む。電気泳動における変性剤の使用の指導は、周知の分子生物学の参考文献（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，第２版（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ，１９８９））において見出され得る。
【００４３】
特定の実施形態において、組成物は、２５℃で１０，０００センチポイズ（ｃｐ）未満の粘度を有する。他の実施形態において、組成物の粘度は、２５℃で５，０００ｃｐ未満、２５℃で１，０００ｃｐ未満、または２５℃で６００ｃｐ未満である。全ての粘度測定を、Ｂｒｏｏｋｆｉｅｌｄ　Ｍｏｄｅｌ　ＤＶ−ＩＩ粘度計（Ｂｒｏｏｋｆｉｅｌｄ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｍｉｄｄｌｅｂｏｒｏ，ＭＡ）を使用して行なった。４０００ｃｐ未満の粘度を有する組成物について、スピンドル番号１８を、小サンプルアダプターと共に使用した。スピンドル速度は、１０００ｃｐ未満の粘度のサンプルについて３ｒｐｍ、１０００ｃｐと２０００ｃｐとの間の粘度のサンプルについて１．５ｒｐｍ、および２０００ｃｐと４０００ｃｐとの間の粘度のサンプルについて０．６ｒｐｍであった。４０００ｃｐより大きい粘度のサンプルについて、より小さいスピンドルおよび異なるアダプターが必要である。
【００４４】
キャピラリー電気泳動を実施するための装置が周知である。基本的装置を記載する多数の参考文献が利用可能であり、いくつかのキャピラリー電気泳動機器（例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ　Ｃｉｔｙ，ＣＡ）モデル２７０Ａ、モデル３１０、モデル３１００、またはモデル３７００機器）が、市販されている。キャピラリー電気泳動装置およびこれらの操作を記載する例示的な参考文献としては、Ｊｏｒｇｅｎｓｏｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ａ　Ｃｏｍｐａｎｉｏｎ　ｔｏ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，４：１７９−１９０（１９９２）；Ｃｏｌｂｕｒｎら、Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｎｅｗｓ，１号（１９９０年冬）；Ｇｒｏｓｓｍａｎら（上記引用）などが挙げられる。
【００４５】
特定の実施形態において、緩衝液系は、ｐＨを制御するため、そして電荷保有成分として使用される。例示的な緩衝液としては、以下が挙げられる：有機酸（例えば、クエン酸、酢酸、ギ酸）；双性イオン（例えば、ＴＥＳ（Ｎ−トリス［ヒドロキシメチル］−２−アミノエタンスルホン酸）、ＢＩＣＩＮＥ（Ｎ，Ｎ−ビス［２−ヒドロキシエチル］グリシン）、ＡＣＥＳ（Ｎ−［２−アセトアミド］−２−アミノエタンスルホン酸）、ＴＡＰＳ（Ｎ−トリス［ヒドロキシメチル］メチル−３−アミノプロパンスルホン酸）、またはグリシルグリシン）；無機酸（例えば、リン酸）；および有機塩基（例えば、トリス（トリス［ヒドロキシメチル］アミノメタン）緩衝液（例えば、ＳｉｇｍａまたはＣａｌｂｉｏｃｈｅｍより入手可能））の水溶液。緩衝液の濃度は、例えば、約１ｍＭと１Ｍとの間で、広範に変化し得る。特定の実施形態において、本発明のキャピラリー電気泳動法における使用のための例示的な緩衝液は、以下を含む：（ｉ）１００ｍＭ　ＴＡＰＳ、７Ｍ尿素（ｐＨ８．０）；または（ｉｉ）ＴＴＥ（５０ｍＭトリス−５０ｍＭ　ＴＡＰＳ）、７Ｍ尿素（ｐＨ８．０）。
【００４６】
特定の実施形態において、二本鎖ポリヌクレオチド（例えば、ＰＣＲまたはＬＣＲ増幅によるＤＮＡフラグメント、酵素消化物など）は、標準的なプロトコルまたはメーカーの推奨するプロトコルによって分離され、ここで市販のキャピラリー電気泳動装置（例えば、モデル２７０−ＨＴ、３１０、３１００または３７００装置（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ　Ｃｉｔｙ）が用いられる。このような標準的または推奨されるプロトコル以外で、本発明の組成物および／またはキャピラリー電気泳動要素が用いられる。特定の実施形態において、キャピラリー電気泳動によって分析物を分離するための方法は、コーティングされていないキャピラリー（第１の末端および第２の末端を有する）に、シービング成分および表面相互作用成分を含む組成物を挿入する工程を包含する。異なるサイズの分析物のサンプルを、このキャピラリーに充填し、そしてこのキャピラリーの第１の末端と第２の末端との間に、電場を印加する。このサンプル中の異なるサイズの分析物は、キャピラリー内の組成物を通って移動し、分析物が分離される。他の実施形態において、予めコーティングされたキャピラリーを使用する。特定の実施形態において、この組成物は、本明細書中で開示される組成物の１つを含む。
【００４７】
本発明の特定の方法は、ＤＮＡ配列決定のために用いられ得る。特定の実施液体において、このような配列決定は、ＤＮＡ配列決定プロトコルによって調製された一本鎖ポリヌクレオチドを分離する工程を包含する。ＤＮＡ配列決定プロトコルの詳細な説明は、とりわけ、Ａｕｔｏｍａｔｅｄ　ＤＮＡ　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　Ｇｕｉｄｅ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｘｙｘｔｅｍｓ，Ｐａｒｔ　Ｎｏ．４３０５０８０）；Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，第２版（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ，１９８９）；Ａｕｓｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　Ｓｏｎｓ，１９９３，２０００年８月までの補遺を含む）などに見出され得る。
【００４８】
特定の現在利用可能なＤＮＡ配列決定プロトコルの重要な特徴は、一本鎖ポリヌクレオチドまたはＤＮＡ配列決定フラグメント（これはサイズによって分離され得る）の「ネスト化種（ｎｅｓｔｅｄ　ｓｅｒｉｅｓ）」または「ラダー」の生成である。ＤＮＡ配列決定の鎖の終結法は、（１）オリゴヌクレオチドプライマー、およびその配列が決定されるべき標的核酸を含むテンプレート核酸を提供する工程、（２）このオリゴヌクレオチドプライマーをこのテンプレート核酸にハイブリダイズさせる工程、（３）このプライマーを、ヌクレオシド三リン酸前駆体および少なくとも１つの鎖終結ヌクレオチドを含む反応混合物中で、核酸ポリメラーゼ（例えば、Ｔ７　ＤＮＡポリメラーゼ、ＳｅｑｕｅｎｎａｓｅＴＭ、逆転写酵素など）を用いて伸長させて、ネスト化種のＤＮＡフラグメント集団を形成する工程であって、この結果、全ての短いＤＮＡフラグメントが全ての長いＤＮＡフラグメントとのサブ配列となり、そしてその結果、同じサイズの各ＤＮＡフラグメントが、同じ鎖終結ヌクレオチドで終結する、工程、（４）このＤＮＡフラグメント集団を、サイズに従って分離する工程、および（５）各ＤＮＡフラグメント集団に関連する鎖終結ヌクレオチドを同定する工程、を包含する。しかし、当業者は、ＤＮＡ配列決定法に対する多くの変形物が利用可能であることを理解する。
【００４９】
受容可能なテンプレートとしては、当該分野で議論されるテンプレート（例えば、Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ　Ｍａｎｕａｌ　ｆｏｒ　ＡＢＩ　Ｍｏｄｅｌ　３７０Ａ　ＤＮＡ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ　Ｃｉｔｙ，ＣＡ））が挙げられる。例えば、標的配列は、適切なクローニングベクター（例えば、複製形態のＭ１３クローニングベクター）に挿入され得、これは次いで、標的配列のコピー数を増幅するために、増殖される。一本鎖形態のＭ１３は、テンプレートとして使用するために単離される。また、テンプレートは、当該分野で教示されるように、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって提供され得る（例えば、Ｉｎｎｉｓら（上で引用される）；Ｗｉｌｓｏｎら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，第８巻、１８４〜１８９ページ（１９９０）；Ｇｙｌｌｅｎｓｔｅｎ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，第７巻、７００〜７０８ページ（１９８９）など）。特定の実施形態において、増幅の後、このテンプレートは、液相における重合反応に使用され得るか、または固相支持体に結合され得るかのいずれかである（例えば、Ｓｔａｈｌら、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，第１６巻、３０２５〜３０３８ページ（１９８８）；Ｈｕｌｔｍａｎら、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，第１７巻、４９３７〜４９４６ページ（１９８９）などにより教示される）。
【００５０】
一旦、ネスト化腫のＤＮＡフラグメントが生成されると、これらは、本発明の、組成物、キャピラリー電気泳動要素または方法を使用するキャピラリー電気泳動によって、分離される。
【００５１】
上で記載された本発明は、実施例を参照することによってよりよく理解され得る。以下の実施例は、例示のみの目的のためであることが意図され、いずれの様式でも本発明の範囲を限定すると解釈されるべきではない。
【００５２】
（実施例）
（実施例１）
（溶液重合による非架橋アクリルアミドポリマーの調製）
９４．５０ｇの蒸留水（１８ＭΩ・ｃｍ）および３２．０２ｇ（０．１２９ｍｏｌ）の２８．５７重量％　アクリルアミド溶液（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を含む溶液を、機械的撹拌用の２”Ｔｅｆｌｏｎブレード、パージのための排出チューブおよび温度計を取り付けた５００ｍＬ３つ口丸底フラスコ中で調製した。絶え間なく機械的に撹拌しながら、１５０ｍＬ／分の速度で１２０分間、超純粋なヘリウム（９９．９９％）をこの溶液にバブリングし、この溶液を脱酸素した。この脱酸素した溶液に、１．０ｍＬ（１３．０６ｍｍｏｌ）の２−プロパノール（イソプロパノール）および４．０ｍＬ（０．３５ｍｍｏｌ）の１．９９重量％　過硫酸アンモニウム（純度９９．９９％、Ａｌｄｒｉｃｈ）の溶液を、シリンジで添加した。このフラスコを、１５０ｒｐｍで絶え間なく機械的に撹拌し、１５０ｍｌ／分でヘリウムをパージしながら、５０±１℃の油浴に１２０分間浸けた。この反応を、２００ｍＬの蒸留水を撹拌しながら添加することによってクエンチし、１０分間空気でバブリングした。得られた無色透明の溶液を、５０Ｋ分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ−７再生セルロース膜に入れ、そして３日間、４．５ガロンの蒸留水（１８ＭΩ・ｃｍ）に対して透析した。水は、一日に二回交換した。この透析した溶液を、凍結乾燥し、そして８．４１ｇの非架橋アクリルアミドポリマーを得た（収率９２％）。
【００５３】
このポリマーを、Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｐｏｒｉｍｅｒ　Ｓｔａｎｄａｒｄｓ（Ｍｅｎｔｏｒ，Ｏｈｉｏ）によるポリアクリルアミド一次基準を使用するゲル透過クロマトグラフィー（ＧＰＣ）によって特徴付けた。分離を、１ｍｌ／分の流速の０．０５ｍ　ＮａＮＯ３を使用する、直列の３つのクロマトグラフィーカラム（Ｕｌｔｒａｈｙｄｒｏｇｅｌ（Ｗａｔｅｒｓ　Ｃｏｒｐ．，Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ）２０００　Ａｎｇｓｔｒｏｍカラム、Ｕｌｔｒａｈｙｄｒｏｇｅｌ　１０００　Ａｎｇｓｔｒｏｍカラム、およびガードカラム）を用いて、３０℃で行った。注入容量は、１００μｌであり、そして検出器は、Ｋｎａｕｅｒ　ＤＲＩ　８Ｘであった。この非架橋アクリルアミドポリマーは、５８９キロダルトン（ｋＤａ）のＭｎ、２５１７ｋＤａのＭｗ（図１〜３において２．５Ｍ）、および４．２３の多分散性を有することが見出された。バッチ様式の光散乱により決定されるように、Ｍｗは、１９３６ｋＤａであった（表１の調製番号１）。当業者は、ポリマーの観察された分子量が特徴付けの方法に依存して変わり得ることを理解する。添付の特許請求の範囲に記載される分子量は、上記のＧＰＣ法に基づく。
【００５４】
このポリマーを、使用前に、４０℃で少なくとも４時間真空乾燥した。
【００５５】
（実施例２）
（別の架橋されていないアクリルアミドの調製）
（溶液重合によるポリマー）
第２の架橋されていないアクリルアミドポリマーを、２．０ｍＬ（２６．１２ｍｍｏｌ）のイソプロパノールをこの脱酸素化溶液に添加したことを除いて、実施例１に記載されるように調製した。当業者は、イソプロパノールが連鎖移動剤として役立ち、調製されるポリマーの分子量を制限することを理解する。従って、イソプロパノールの量を変化させることによって、このポリマーのモル重量が変化され得る。
【００５６】
得られた無色透明な溶液を、実施例１でのように透析しそして凍結乾燥した。架橋されていないアクリルアミドポリマーの収量は、９．０ｇ（収率９８％）であった。このポリマーを、ゲル浸透クロマトグラフィーによって特徴付けし、そして３１０ｋＤａのＭｎ、１３７６ｋＤａのＭｗ（図１−３において１．４Ｍ）および４．４０の多分散性を有することを見出した。バッチモードの光散乱によって決定されたＭｗは、９７５ｋＤａであった（表１の調製番号２）。
【００５７】
実施例１および２に記載される溶液重合手順に従って、さらに、異なる分子量を有する架橋されていないアクリルアミドポリマーを、イソ−プロパノールの濃度を変化させることによって調製した（表１の調製番号１−４を参照のこと）。
【００５８】
（表１．架橋されていないアクリルアミドポリマー調製物）
【００５９】
【表１】
2004509343.tif 000011
（実施例３）
（逆乳化重合による架橋されていないアクリルアミドポリマーの調製）
５番目の架橋されていないアクリルアミドポリマーを、以下のように、逆乳化重合（ＩＥＰ）によって調製した。１Ｌのポリプロピレンビーカーに、１００．０５ｇのＰｅｔｒｏｌｕｍ　Ｓｐｅｃｉａｌ（ｂｐ　１８０−２２０℃，Ｆｌｕｋａ）、１００．０１ｇの２８．５７重量％のアクリルアミド溶液（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）、２．５０ｇのソルビタンモノオレエート（Ｆｌｕｋａ）、および１．０１０９重量％の過硫酸アンモニウム溶液（１．００ｍＬ）（９９．９９％、Ａｌｄｒｉｃｈ）を添加した。この混合物を、２インチのマグネチックスターラーバーを用いて、１０分間、８００ｒｐｍで攪拌することによって乳化した。次いで、このエマルジョンを、機械的攪拌のために２インチのＴｅｆｌｏｎ（登録商標）製の攪拌ブレード、パージのためのブリーディングチューブ（ｂｌｅｅｄｉｎｇ　ｔｕｂｕ）および温度計を備えた１Ｌの３つ口丸底フラスコに移した。このエマルジョンを、３００ｒｐｍで機械により一定に攪拌した状態で、１２０分間、１５０ｍＬ／分の速度で、超純粋ヘリウム（９９．９９％）でパージした。このエマルジョンに、マイクロシリンジを使用して、０．０１０ｍＬのＮ，Ｎ，Ｎ，Ｎ−テトラメチルエチレンジアミン（超純粋、Ａｒｍｅｓｃｏ）を添加した。このフラスコを、３００ｒｐｍで機械により一定に攪拌し、１５０ｍＬ／分で１９時間、ヘリウムでパージした状態で、３５±１℃の油浴に下げた。重合の間、エマルジョンの温度は、決して３５℃を越えなかった。
【００６０】
１９時間後、４００ｍＬのアセトンを添加し、そしてこのエマルジョンを３００ｒｐｍで２時間攪拌した。このポリマー粉末を沈殿させ、そして上清の層をデカンテーションした。この沈殿したポリマーに、３００ｍＬのアセトンを添加し、このメカニカルスターラーを、１．５インチの卵型マグネチックスターラーバーと交換し、そして８００ｒｐｍで３時間攪拌した。この沈殿したポリマーは、以上に微細な粉末となった。この粉末を静置させ、そして有機層をデカンテーションした。このポリマー粉末を３００ｍＬのアセトンで粉砕し、そして８００ｒｐｍでさらに３時間攪拌した。このポリマーを吸引濾過し、そして大量のアセトンでリンスした。約５．４グラムの湿潤ポリマー粉末を、４５０ｍＬの蒸留水に添加し、そしてこの溶液を、１インチのマグネットスターラーバーを用いて２日間７５ｒｐｍで攪拌した。得られた混合物を、５つの５０ｍＬ　Ｆａｌｃｏｎ管に分け、そして２日間振り続け（ｔｕｍｂｌｅ）、非常に粘性の溶液を得た。この溶液を、５０Ｋ　ＭＷＣＯ　Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ−７再生セルロース膜に入れ、そして３日間、４．５ガロンの蒸留水（１８Ｍ　Ω・ｃｍ）に対して透析した。水を、１日に２回交換した。透析した溶液を凍結乾燥し、４．５０ｇの架橋していないアクリルアミドポリマーを得た。バッチモードの光散乱によって決定される場合のＭｗは、１２５００ｋＤａであり、そしてゲル浸透クロマトグラフィーによって決定される場合のＭｗは、６３７７ｋＤａであった（表１の調製５；６．４Ｍ（図１〜３））。
【００６１】
（実施例４）
（例示的な成分の調製）
本発明の組成物における使用のために、例示的な篩成分を、以下のように調製した。表１に示される架橋されていないアクリルアミドポリマーのいずれか（１００ｍｇ）を、２．４４ｇの水、０．０７５ｇの１２．３％　ｐＤＭＡ溶液、および０．５ｇの１Ｍ　Ｎａ−ＴＡＰＳ／１０ｍＭ　ＥＤＴＡ緩衝液（ｐＨ　８．０）に添加した。この混合物を、一晩、ローターホイール上での回転によって溶解させた。この手順に続いて、５つの異なる篩成分（それぞれ、表１に示される架橋されていない異なるアクリルアミドポリマーを含む）を調製した。
【００６２】
（実施例５）
（キャピラリー電気泳動による分析物の分離）
分析物を分離するための５つの例示的な組成物は、実施例４からの５つの篩成分のうちの１つを０．２％　ｐＤＭＡと合わせることによって調製した。これらの５つの組成物を分析して、４７ｃｍのコーティングされていないキャピラリー（注入口から検出器まで３６ｃｍ）を備えたＡＢＩ　３１０キャピラリー電気泳動装置（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ　Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を使用してポリヌクレオチド分析物を分離するそれらの能力を評価した。キャピラリー電気泳動エレメントを、各分析の前に、４００秒間コーティングされていないキャピラリーを通して５つの組成物のうちの１つをポンピングすることによって調製した。
【００６３】
蛍光標識したＤＮＡ配列のフラグメントおよび蛍光色素ＴＥＴで標識された一本鎖ＤＮＡ配列決定ラダー（ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　ｌａｄｄｅｒ）（公知の大きさの１８ＤＮＡフラグメントを含む）を含む検体を、ホルムアルデヒド中に溶解した。この分析物溶液を、１．５ｋＶで１０秒間かけて、このキャピラリー電気泳動エレメント中に注入した。分離を、２００Ｖ／ｃｍの電界を使用して、５０℃、６０℃、または７０℃の使用温度で実施した。
【００６４】
このピーク幅（Ｇａｕｓｓｉａｎピークの標準偏差の４倍として定義される）ならびにＤＮＡ配列決定ラダーおよびフラグメント由来のピークの移動時間を測定した。これらの値を、一塩基分解値（ｓｉｎｇｌｅ　ｂａｓｅ　ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ　ｖａｌｕｅ）を計算するために使用した。この一塩基分解値および各々の使用温度で実施される３または４つの反復ラン（ｒｕｎ）についての移動時間を、図１、２、および３に示した。
【００６５】
５つの組成物および３つの使用温度に関する一塩基分解の制限を、図４に示す。使用温度に関係なく、この一塩基分解は、ポリマーの分子量が増加するにつれて約３，０００，０００Ｄａまで増加する（図４を参照のこと）。しかし、この３つの分解温度の曲線のそれぞれは、このポリマーの分子量が約３，０００，０００Ｄａを超えて増加する場合、プラトーに達する。従って、約３，０００，０００Ｄａを越えるポリマーの分子量の増加は、一塩基分解を顕著に増加させない。しかし、約３，０００，０００Ｄａを越えるポリマーの分子量の増加は、ポリマー溶液の粘度を急激に増加させる。例えば、本実施例で使用される２，５００，０００Ｄａポリマーの粘度は、約５００センチポイズであり、一方６，４００，０００Ｄａポリマーの粘度は、５０，０００センチポイズより大きかった。従って、１，０００，０００〜３，０００，０００Ｄａの分子量を有する篩組成物は、効率的な一塩基分解を提供するが、キャピラリーに充填するために十分低い粘度のままである。
【００６６】
本発明は、種々の適用、方法、および組成物に関して記載されるが、本発明から逸脱することなく、種々の変化および改変がなされ得ることが理解される。上記の実施例は、本発明をよりよく例示するために提供されるのであって、本発明の範囲を制限することを意図しない。
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は、標識ポリヌクレオチド分子量ラダーのキャピラリー電気泳動により収集された、一塩基分解データを示し、このキャピラリー電気泳動は、泳動温度５０℃と、平均分子量約７４４，０００ダルトン（Ｄａ）（０．７５Ｍ）；１，３７６，０００Ｄａ（１．４Ｍ）；２，０１５，０００Ｄａ（２．０Ｍ）；２，５１７，０００Ｄａ（２．５Ｍ）；または６，３７７，０００Ｄａ（６．４Ｍ）非架橋アクリルアミドポリマーのシービング成分を含む組成物とを使用する。図１Ａ（上段）は、一塩基分解　対　フラグメントサイズ（ヌクレオチド塩基で測定）のグラフを示す。図１Ｂは、フラグメント移動時間（分）　対　フラグメントサイズ（ヌクレオチド塩基で測定）のグラフを示す。
【図２】
図２は、標識ポリヌクレオチド分子量ラダーのキャピラリー電気泳動により収集された、一塩基分解データを示し、このキャピラリー電気泳動は、図１に記載された同じ５つの組成物を、泳動温度６０℃にて使用する。図２Ａ（上段）は、一塩基分解　対　フラグメントサイズ（ヌクレオチド塩基で測定）のグラフを示す。図２Ｂは、フラグメント移動時間（分）　対　フラグメントサイズ（ヌクレオチド塩基で測定）のグラフを示す。
【図３】
図３は、標識ポリヌクレオチド分子量ラダーのキャピラリー電気泳動により収集された、一塩基分解データを示し、このキャピラリー電気泳動は、図１に記載された同じ５つの組成物を、泳動温度７０℃にて使用する。図３Ａ（上段）は、一塩基分解　対　フラグメントサイズ（ヌクレオチド塩基で測定）のグラフを示す。図３Ｂは、フラグメント移動時間（分）　対　フラグメントサイズ（ヌクレオチド塩基で測定）のグラフを示す。
【図４】
図４は、図１に記載された５つのシービング成分を含む組成物を、泳動温度５０℃、６０℃、または７０℃にて使用して観察された、一塩基分解限界を示す。この一塩基分解限界は、図１、図２、および図３に示された一塩基分解データの視覚的点検により評価した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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