(57)【要約】本発明は、カルシウムチャンネルのａ２ｄサブユニットに結合する試験物質を同定するための方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）カルシウムチャンネルのα２δサブユニットを含有する神経芽細胞腫細胞膜サンプルをガバペンチンおよび試験物質と接触させ；
（ｂ）細胞膜へのガバペンチンの結合を検出し；そして
（ｃ）ガバペンチンの結合レベルを試験物質を欠如する対照サンプルと較べて比較する
：という段階を含んでなる、カルシウムチャンネルのα２δサブユニットへの試験物質の結合を検出する方法。
【請求項２】
細胞膜がインタクト細胞の一部である、請求項１の方法。
【請求項３】
細胞膜が単離された細胞膜調製物から得られる、請求項１の方法。
【請求項４】
神経芽細胞腫細胞膜が、ＩＭＲ３２、ＳＫ−Ｎ−ＭＣもしくはＮＧ  １０８細胞膜である、請求項１の方法。
【請求項５】
神経芽細胞腫細胞膜が分化した神経芽細胞腫細胞膜である、請求項１の方法。
【請求項６】
分化した細胞膜がＢｒｄＵとの培養に続いて得られる、請求項５の方法。
【請求項７】
未結合のガバペンチンから細胞膜を分離する段階をさらに含む、請求項１の方法。
【請求項８】
比較する段階が、細胞膜に結合された標識ガバペンチンの結合を測定することを含む、請求項１の方法。
【請求項９】
請求項１の方法を用いて同定される化合物。
【請求項１０】
（ａ）カルシウムチャンネルのα２δサブユニットを含有する神経芽細胞腫細胞膜サンプルをガバペンチンおよび試験物質と接触させ；
（ｂ）細胞膜へのガバペンチンの結合を検出し；そして
（ｃ）ガバペンチンの結合レベルを試験物質を欠如する対照サンプルと較べて比較する：という段階を含んでなる方法によって同定される試験物質。
【請求項１１】
（ａ）ＩＭＲ３２細胞膜を放射性ガバペンチン（ＧＢＰ）および試験物質とともにインキュベートし、この場合の膜はカルシウムチャンネルのα２δサブユニットを含有し、そして接触は細胞膜におけるカルシウムチャンネルのα２δサブユニットへのＧＢＰ結合を可能にするのに十分な時間であり；
（ｂ）未結合の放射性ＧＢＰから細胞膜を分離し；
（ｃ）細胞膜への放射性ＧＢＰの結合を測定し；そして
（ｄ）確定した対照に対する段階（ｃ）における放射性ＧＢＰの量の低下によって、ＧＢＰ結合を阻害する化合物を同定する
：という段階を含んでなる、カルシウムチャンネルのα２δサブユニットに結合可能な試験物質を同定する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、カルシウムチャンネルのα２δサブユニットを発現する神経芽細胞腫細胞に関する。本発明のその他の態様では、本発明は、神経芽細胞腫細胞および神経芽細胞腫細胞膜を用いる方法およびアッセイに関する。本発明の細胞は、カルシウムチャンネルのα２δサブユニットの機能を調節する新規化合物を発見するために有用である。
【背景技術】
【０００２】
カルシウムチャンネルのα２δサブユニットの数種のサブタイプは、既にクローン化されている（非特許文献１；非特許文献２；および特許文献１）。
【０００３】
神経芽細胞腫細胞膜はＮ型カルシウムチャンネルを含有し、そして神経芽細胞腫細胞は、ニューロン分化についてのモデルとして使用されている（非特許文献３；非特許文献４；非特許文献５；および非特許文献６）。５−ブロモ−２’−デオキシウリジン（ＢｒｄＵ）は、神経芽細胞腫細胞の形態学的および機能的分化を誘導し、そして神経伝達物質受容体の増強と神経伝達物質の放出をもたらす（非特許文献７）。［１２５Ｉ］ω−コノトキシン結合部位は、分化した神経芽細胞腫ＩＭＲ３２細胞において増加されたが、これは、Ｎ型カルシウムチャンネルが細胞において増加されたことを示している（非特許文献８）。近年、ウエスタンブロット解析は、カルシウムチャンネルのβ１ｂサブユニットがＩＭＲ３２細胞において発現される顕著なイソ型であることを示した（非特許文献９）。
【０００４】
ガバペンチン（Ｇａｂａｐｅｎｔｉｎ）（ＧＢＰ）は、神経障害性疼痛の治療において有用性を示した抗痙攣薬である（非特許文献１０；非特許文献１１；および非特許文献１２）。ＧＢＰは神経伝達物質の放出を抑制し（非特許文献１３）、そして脳ニューロンにおけるカルシウムの流れを抑制する（非特許文献１４；非特許文献１５；および非特許文献１６）。興味あることには、ＧＢＰに対する高親和力の結合部位が脳組織において発見され、そして標的タンパク質がカルシウムチャンネルのサブユニットのα２δサブユニットとして同定された（非特許文献１７；非特許文献１８；および非特許文献１９）。オートラジオグラフィーによる結合の研究は、ＧＢＰ結合部位が、ラットの脳領域、例えば前頭皮質、線条、海馬および小脳に広く分布していることを示した（非特許文献２０；非特許文献２１）。したがって、α２δサブユニットへのガバペンチン結合と競合する化合物は、抗痙攣薬として、そして神経障害性および慢性の疼痛の治療において有用であろう。
【特許文献１】
ＰＣＴ特許出願ＷＯ９９／２３５１９
【非特許文献１】
Ａｎｇｅｌｏｎｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ  １４：５３−５４，２０００
【非特許文献２】
Ｇａｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：１２２３７−１２２４２，２０００
【非特許文献３】
Ｂｒｕｈｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １３７：５７２−９，１９９６
【非特許文献４】
Ｇｏｔｔｉ，ｅｔ  ａｌ．，Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ（Ｂｅｒｌｉｎ）３４：１４４−５５，１９８７
【非特許文献５】
Ｈｏｇｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，３１２：２５７−２６１，１９９６
【非特許文献６】
Ｋｕｒａｔａ，ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，３２１：２０１−４，１９９３
【非特許文献７】
Ｃｌｅｍｅｎｔｉ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｄｖ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．２９６：９１−１０２，１９９１
【非特許文献８】
Ｃａｒｂｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｆｌｕｅｇｅｒｓ  Ａｒｃｈ．，４１６：１７０−９，１９９０
【非特許文献９】
ＭｃＥｎｅｒｙ，ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，４２０：７４−７８，１９９７
【非特許文献１０】
Ｂａｃｋｏｎｉｙ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｍｅｄ．Ａｓｓｏｃ．２８０：１８３１−１８３６，１９９８
【非特許文献１１】
Ｌａｉｒｄ  ａｎｄ  Ｇｉｄａｌ，Ａｎｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒ．３４：８０２−８０７，２０００
【非特許文献１２】
Ｒｏｗｂｏｔｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．Ｍ．，Ｊ．Ａｍ．Ｍｅｄ．Ａｓｓｏｃ．，２８０：１８３７−１８４２，１９９８
【非特許文献１３】
Ｄｏｏｌｅｙ，ｅｔ  ａｌ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｌｅｔｔ．２８０：１０７−１１０，２０００
【非特許文献１４】
Ｆｉｎｋ，ｅｔ  ａｌ．Ｂｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１３０：９００−９０６，２０００
【非特許文献１５】
Ｌａｉｒｄ  ａｎｄ  Ｇｉｄａｌ，前出
【非特許文献１６】
Ｓｔｅｆａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｎｅｕｒｏｐｈａｒｍａｃｏｌｇｙ  ３７：８３−９１，１９９８
【非特許文献１７】
Ｂｒｏｗｎ  ａｎｄ  Ｇｅｅ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７３：２５４５８−２５４６５，１９９８
【非特許文献１８】
Ｄｉｓｓａｎａｙａｋｅ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，１２０：８３３−８４０，１９９７
【非特許文献１９】
Ｇｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７１：５７６８−７６，１９９６
【非特許文献２０】
Ｈｉｌｌ  ａｎｄ  Ｗｏｏｄｒｕｆｆ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏ．Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｅｃｔ．，２４４：３０３−９，１９９３
【非特許文献２１】
Ｔｈｕｒｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，１１８：４５７−４６５，１９９６
【発明の開示】
【０００５】
本発明は、α２δサブユニットを含有する神経芽細胞腫細胞膜サンプルをガバペンチンおよび試験物質と接触させ；細胞膜へのガバペンチンの結合を検出し；そしてガバペンチンの結合レベルを試験物質を欠如する対照サンプルと較べて比較する：という段階を含んでなる、α２δサブユニットへの試験物質の結合を検出する方法に関する。
【０００６】
１つの態様では、細胞膜はインタクト細胞の一部であり、そしてその他の態様では、細胞膜は単離された細胞膜調製物から得られる。１つの態様では、細胞は神経芽細胞腫細胞ＩＭＲ３２である。好ましくは、神経芽細胞腫細胞膜は分化した神経芽細胞腫細胞膜であり、そして１つの態様では、分化した細胞膜はＢｒｄＵとの細胞培養に続いて得られる。
【０００７】
好適な方法では、本発明の方法は、さらに、未結合のガバペンチンから細胞膜を分離する段階を含む。その他の好適な方法では、比較する段階は、細胞膜に結合された標識ガバペンチンの結合を測定することを含む。本発明は、さらに、本発明の方法を用いて同定される化合物に関する。
【０００８】
その他の態様では、本発明は、さらに、カルシウムチャンネルのα２δサブユニットを含有する神経芽細胞腫細胞膜サンプルをガバペンチンおよび試験物質と接触させ；細胞膜へのガバペンチンの結合を検出し；そしてガバペンチンの結合レベルを試験物質を欠如する対照サンプルと較べて比較する：という段階を含んでなる方法によって同定される試験物質に関する。
【０００９】
本発明は、さらに、ＩＭＲ３２細胞膜を放射性ガバペンチン（ＧＢＰ）および試験物質とともにインキュベートし、この場合の膜はカルシウムチャンネルのα２δサブユニットを含有し、そして接触は細胞膜におけるカルシウムチャンネルのα２δサブユニットへのＧＢＰの結合を可能にするのに十分な時間であり；未結合の放射性ＧＢＰから細胞膜を分離し；細胞膜への放射性ＧＢＰの結合を測定し；そして確定した対照に対する測定段階における放射性ＧＢＰの量の低下によって、ＧＢＰ結合を阻害する化合物を同定する：という段階を含んでなる、カルシウムチャンネルのα２δサブユニットに結合可能な試験物質を同定する方法に関する。
【００１０】
本発明の方法は、カルシウムチャンネルのα２δサブユニットと相互作用する化合物を同定するために有用である。本発明の方法を用いて同定された化合物は、次に、カルシウムチャンネルのα２δサブユニットによって媒介される生物学的症状を治療するためのそれらの能力について試験することができる。
【００１１】
本発明は、神経芽細胞腫細胞、および好ましくは分化した神経芽細胞腫細胞におけるカルシウムチャンネルのα２δサブユニットの機能を調節する化合物を同定する方法を提供する。
【００１２】
本発明の方法において使用できる種々の神経芽細胞腫一次細胞および細胞系が存在する。本発明の目的のために、用語「神経芽細胞腫細胞系」は、細胞系、腫瘍の体外移植組織から単離された細胞、および神経芽細胞腫細胞と細胞の融合によって調製された細胞ハイブリッドを含む。本発明の好適な神経芽細胞腫細胞はヒト起源のものであるが、また動物起源のものであってもよい。代表的な細胞および細胞系は、限定されるものではないが、ＩＭＲ３２細胞、ＳＫ−Ｎ−ＭＣ細胞およびＮＧ１０８細胞（マウス神経芽細胞腫／ラット神経膠腫ハイブリッド細胞系）を含む。これらの細胞は、ＡＴＣＣ（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）を含む多くの起源から得ることができる。確立された細胞系が好適であるけれども、本発明のために有用な細胞は、また、種々の脊椎動物起源、例えば動物もしくはヒト腫瘍の体外移植組織から単離されてもよい。
【００１３】
好適な態様では、ＩＭＲ３２細胞が使用され、そしてその他の好適な態様では、神経芽細胞腫細胞は、分化促進剤、例えばＢｒｄＵに曝露される。本発明において使用できる他の分化促進剤は、限定されるものではないが、ジブトリルサイクリックＡＭＰ、神経成長因子（ＮＧＦ）およびレチノイン酸を含む。分化した神経芽細胞腫細胞は、未分化細胞と比較して増加したレベルのα２δサブユニットタンパク質を発現する傾向にある。  未分化のニューロン細胞、例えば神経芽細胞腫細胞を分化させるために、文献において知られている多くの方法があり、代表的な方法は、以下に示される実施例の項において見いだされる。しかしながら、一般には、細胞が、細胞培養において分化を誘導するのに十分な時間、細胞毒性のない量の分化促進剤に曝露される。分化は、例えば、神経プロセスの成長（ｏｕｔｇｒｏｗｔｈ）をとおして、または基質への接着の増大、成長制御の改善および細胞形態の一般的偏平化を含む、より分化した表現型の発現において肉眼的に決定することができる。あるいはまた、細胞分化は、当該技術分野において既知であるように、より分化した細胞表現型に伴うことが知られているタンパク質を検出することによって決定することができる。
【００１４】
本発明のアッセイは、インタクトの細胞アッセイとして使用されてもよく、あるいは本アッセイは、カルシウムチャンネルα２δサブユニットを発現している細胞からの膜溶解物または精製した膜調製物を用いて実施されてもよい。細胞膜が使用される場合、カルシウムチャンネルのα２δサブユニットは神経芽細胞腫細胞膜の成分として単離される。単離される細胞膜は、慣用の手段を用いて、例えば機械的応力により細胞をホモジナイズして調製される。
【００１５】
ガバペンチン（ＧＢＰ）（ＣＡＳナンバー６０１４２−９６−３）は、カルシウムチャンネルのα２δサブユニットに対する特異的リガンドとして使用される。好適な態様では、ＧＢＰは、α２δサブユニットへのＧＢＰ結合の検出を容易にするために標識される。ＧＢＰは、蛍光標識、放射能標識などを含む、当該技術分野において既知のいずれの方法を用いて標識されてもよい。好適な態様では、市販されている［３Ｈ］ＧＢＰが、本発明の置換アッセイにおける検出可能なリガンドとして使用される。
【００１６】
本発明のアッセイにおいて、細胞膜はＧＢＰおよび試験物質と組み合わされる。試験物質は、α２δサブユニットに結合できるであろうと仮定されるいずれの候補分子であってもよい。これらは低分子、ペプチド、抗体を含むポリペプチド、などを含む。
【００１７】
ＧＢＰおよび試験物質を含有する細胞膜混合液は、次に、細胞膜中に含有されるα２δサブユニットにＧＢＰを結合させるのに十分な時間、水性バッファー中でインキュベートされる。必要なインキュベーション時間量は、使用される試薬量、温度、および他のファクターに依存する。当該技術分野において周知の方法を用いて反応条件を変えることは、細胞膜中への標識組み入れ量を変化させ、そしてこれらの条件は当業者によって容易に最適化することができる。インキュベーション後、細胞膜は、濾過もしくは遠心分離を含む慣用手段を用いて未結合ＧＢＰから単離される。
【００１８】
試験物質のα２δサブユニットに結合する能力は、試験物質を含有せず、そして好ましくは両無標識および標識ＧＢＰを含有する対照反応と比較して、両ＧＢＰおよび試験物質を含有するサンプルにおいて細胞膜に結合するＧＢＰ量における低下を測定することによって決定される。ＧＢＰが放射能標識されている場合、対照膜に較べた処理細胞膜における放射能レベルが測定される。
【００１９】
結合についてＧＢＰと競合できる候補化合物が本発明の方法を用いて同定される。次いで、これらの化合物は、カルシウムチャンネルのα２δサブユニットによって媒介される多くの生物学的症状に影響を与えるそれらの能力について試験することができる。
【００２０】
本発明は次の実施例によって例証される。これらの実施例が本発明を限定することを意図しない。
【００２１】
実施例１
【００２２】
ＩＭＲ３２細胞の分化およびカルシウムチャンネルのα２δサブユニットの発現の解析
材料および方法
ＩＭＲ３２細胞、ＳＫ−Ｎ−ＭＣ細胞およびＮＧ１０８細胞ならびに１０μＭＢｒｄＵとともに培養において１０〜１２日間処理された細胞が使用された。細胞が収穫され、そしてホモジネートがＨＥＰＥＳ／ＫＯＨバッファー，ｐＨ７．４において作成された。ホモジネートを１０００ｘｇにおいて１５分間遠心し、そして上澄液を４００００ｘｇで１５分間遠心して細胞膜を得た。
【００２３】
［３Ｈ］ＧＢＰ結合アッセイは、Ｇｅｅら（前出）によって記述されているように実施された。非特異的結合は１００μＭ無標識ＧＢＰの存在下で決定された。遊離リガンドから結合リガンドの分離は、０．３％ポリエチレンイミンに浸漬したＧＦ／Ｂフィルターを通す濾過によって実施した。フィルターは１０ｍＭＨＥＰＥＳ，ｐＨ７．４の３ｘ４ｍｌにより洗浄した。フィルター上の放射能をシンチレーションカウンターによって決定した。
［３Ｈ］ＧＢＰ結合は細胞膜濃度の増加とともに増加した。［３Ｈ］ＧＢＰは、試験されたすべての神経芽細胞腫細胞系由来の細胞膜に結合した。結合における増加は１００μｇタンパク質／ｍｌまで膜濃度について直線的であった（図１）。
【００２４】
分化したＩＭＲ３２細胞における［３Ｈ］ＧＢＰ結合部位の密度に及ぼすＢｒｄＵの影響を試験する１つの例では、飽和実験が、両未分化および分化ＩＭＲ３２細胞膜を用いて実施された（図２）。飽和結合データのスキャッチャード解析は、Ｋｄ値３７ｎＭおよびＢｍａｘ値１１８６ｆｍｏｌ／ｍｇタンパク質を有するＩＭＲ３２細胞膜における単一の高親和力ＧＢＰ結合部位を示唆している。ＢｒｄＵは、その親和力（Ｋｄ＝３９ｎＭ）を変えることなく［３Ｈ］ＧＢＰ結合部位の発現を増大した（Ｂｍａｘ＝２２４５ｆｍｏｌ／ｍｇタンパク質）。
【００２５】
［３Ｈ］ＧＢＰ結合部位の薬理学が、無標識ＧＢＰおよびＬ−メチオニンの結合阻害能を研究することによって試験された。１０ｎＭ［３Ｈ］ＧＢＰが試験では使用された。Ｋｉ値は１−部位結合モデルを用いて得られ、そして表１に総括される。図３は、無標識ＧＢＰおよびＬ−メチオニンが、ＩＭＲ３２細胞膜への［３Ｈ］ＧＢＰ結合を用量依存様式で阻害したことを示している。ＢｒｄＵは、細胞膜についてのＧＢＰおよびＬ−メチオニンのＫｉ値を有意には変えなかった（表１）。
【００２６】
【表１】
2004532637.tif 000002
【００２７】
神経芽細胞腫細胞におけるＢｒｄＵによる［３Ｈ］ＧＢＰ結合の増大は、カルシウムチャンネルのα２δサブユニットがヒト神経芽細胞腫細胞の分化の間に増加することを示唆している。α１およびβ１ｂサブユニットがまたＢｒｄＵによって増加されたことを示した従来の結果（Ｃａｒｂｏｎｅ，ｅｔ  ａｌ．，前出およびＭｃＥｎｅｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，前出）に加えて、この増加は、カルシウムチャンネルの主要サブユニットのほとんどが、ヒト神経芽細胞腫細胞の分化の間に上方制御されることを示唆する。カルシウムチャンネルの完全活性化は、両βおよびα２δサブユニットを必要とする（Ｓｈｉｓｔｉｋ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．（Ｌｏｎｄｏｎ）：４８９：５５−６２，１９９５およびＷａｌｋｅｒ  ａｎｄ  ＤｅＷａａｒｄ，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，２１：１４８−１５４，１９９８）。本結果は、カルシウムチャンネルがヒト神経芽細胞腫細胞の分化において重要な役割を演じていることを暗示する。
【００２８】
数種のＬ−アミノ酸、例えばロイシン、メチオニン、フェニルアラニンおよびバリンは、シナプス原形質膜への［３Ｈ］ＧＢＰ結合を阻害する。Ｌ−メチオニンは最強のインヒビターの１つである（Ｔｈｕｒｌｏｗ，ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｅｃｔ．，２４７：３４１−５，１９９３）。本発明者らは、ＧＢＰおよびＬ−メチオニンがＩＭＲ３２細胞膜への［３Ｈ］ＧＢＰ結合を阻害することを見い出した。ＧＢＰおよびＬ−メチオニンのＫｉ値は未分化および分化細胞膜の間では有意には異なることがなく、このことは、ＢｒｄＵが細胞膜結合に対するＧＢＰとＬ−メチオニンの親和力を変えなかったことを示している。
【００２９】
カルシウムチャンネルへのＧＢＰ結合は、両α２およびδサブユニットを要求する（Ｗａｎｇ，ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，３４２：３１３−３２０，１９９９）。α２のＮ末端と第１のトランスメンブランドメインとの間の領域、ならびにスプライシングアクセプター部位間の領域は、ＧＢＰ結合のための構造的な完全性を維持する上で重要な役割を演じているかもしれない。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】図１．［３Ｈ］ＧＢＰ結合に及ぼす膜タンパク質濃度の影響。ヒト神経芽細胞腫ＩＭＲ３２細胞の膜が、２５℃で６０分間、［３Ｈ］ＧＢＰ（１０ｎＭ）とともにインキュベートされた。データは、２並列においてアッセイされた各点における２実験を代表している。黒四角＝総結合カウント；白四角＝特異的結合；白三角＝非特異的結合。
【図２】図２．ＩＭＲ３２細胞膜への［３Ｈ］ＧＢＰの飽和結合。（Ａ）種々の濃度の［３Ｈ］ＧＢＰが、未分化ＩＭＲ３２細胞由来の膜（４０μｇタンパク質／ｍｌ）とともにインキュベートされた。黒四角＝総結合カウント；黒丸＝特異的結合；白四角＝非特異的結合。（Ｂ）種々の濃度の［３Ｈ］ＧＢＰが、１０μＭＢｒｄＵによって分化されたＩＭＲ３２細胞由来の膜（４０μｇタンパク質／ｍｌ）とともにインキュベートされた。黒四角＝総結合カウント；黒丸＝特異的結合；白四角＝非特異的結合。（Ｃ）図２Ａおよび図２Ｂのデータからのスキャッチャードプロット。白四角＝分化したＩＭＲ３２細胞；黒四角＝未分化ＩＭＲ３２細胞。
【図３】図３．ＧＢＰおよびＬ−メチオニンによるヒト神経芽細胞腫ＩＭＲ３２細胞膜への［３Ｈ］ＧＢＰ結合の阻害。種々の濃度の無標識ＧＢＰおよびＬ−メチオニンが、１０ｎＭ［３Ｈ］ＧＢＰの存在下で、未分化および分化ＩＭＲ３２細胞の膜（２０μｇタンパク質／ｍｌ）とともにインキュベートされた。示される結果は、２並列においてアッセイされた各点における２実験を代表している。黒四角＝未分化ＩＭＲ３２細胞へのＧＢＰ結合；黒三角＝未分化ＩＭＲ３２細胞へのＬ−メチオニン結合；白四角＝分化ＩＭＲ３２細胞へのＧＢＰ結合；白三角＝分化ＩＭＲ３２細胞へのＬ−メチオニン結合。
【図１】
2004532637.tif 000003
【図２Ａ】
2004532637.tif 000004
【図２Ｂ】
2004532637.tif 000005
【図２Ｃ】
2004532637.tif 000006
【図３】
2004532637.tif 000007
【国際公開パンフレット】
2004532637.tif 000008
2004532637.tif 000009
2004532637.tif 000010
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2004532637.tif 000027
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004532637.tif 000028
【国際調査報告】
2004532637.tif 000029
2004532637.tif 000030