(57)【要約】標識された抗体に特異的に結合する抗原を有する組織に、標識された抗体をインビボで提供する方法を開示する。第一の光学放射をインビボで組織に発して、インビボで抗原に結合した標識された抗体を励起する。その励起に応答して該励起標識された抗体が発した第二の光学放射を、インビボで検出することができる。関連する遠隔計測用の回路および物質の組成物もまた開示する。
2004523257.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体分子を有する組織に、標識された結合分子をインビボで提供するステップであって、該標識された結合分子が該生体分子に特異的に結合するステップと、
インビボで該組織に第一の光学放射を発するステップと、これにより該生体分子に結合した該標識された結合分子をインビボで励起するステップと、
該励起に応答して、該励起された標識された結合分子が発した第二の光学放射をインビボで検出するステップと
を含む、インビボでの生体分子検出方法。
【請求項２】
前記標識された結合分子が蛍光標識された抗体である請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記生体分子が腫瘍関連抗原である請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記生体分子がシグマ２受容体である請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記検出するステップが第二の光学放射に関連するシグナルをエクスビボシステムに伝達するステップを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記励起するステップが、生物付着組織を通過して前記第一の光学放射を発するステップを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記検出するステップが、生物付着組織を通過して前記第二の光学放射を検出するステップを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
第一の光学放射を発する、インビボでの使用のために構成された光学放射源と、
励起された標識された結合分子が発する第二の光学放射を検出する、インビボでの使用のために構成された光学放射検出器と、
該光学放射源および該光学放射検出器に連結されたプロセッサ回路であって、該第一の光学放射の発生を制御し、該第二の光学放射の強度に関連する強度シグナルを受信し、該第二の光学放射の強度に関するシグナルをエクスビボシステムに伝達するプロセッサ回路と
を含む、インビボで生体分子を検出する回路。
【請求項９】
前記光学放射源が高出力のＬＥＤおよびレーザからなる群から選択される、請求項８に記載の回路。
【請求項１０】
前記光学放射検出器がフォトトランジスタ、フォトダイオード、および光電子増倍管からなる群から選択される、請求項８に記載の回路。
【請求項１１】
前記第一の光学放射が第一の周波数を有し、前記第二の光学放射が第二の周波数を有する請求項８に記載の回路。
【請求項１２】
前記第一の周波数が前記第二の周波数より大きい請求項１１に記載の回路。
【請求項１３】
前記光学放射源に連結された発光フィルターと、
前記光学放射検出器に連結された吸収フィルターと
をさらに含む、請求項８に記載の回路。
【請求項１４】
前記プロセッサに連結されたインダクタをさらに含み、該インダクタは、前記エクスビボシステムから受信した出力シグナルに応答して前記回路に出力する請求項８に記載の回路。
【請求項１５】
前記回路が、直径が約２ｍｍのプラットフォーム上に存在する請求項８に記載の回路。
【請求項１６】
前記シグナルがインダクタを介してデジタル方式でコードされる、請求項８に記載の回路。
【請求項１７】
前記回路が生体適合性の透光性層でコートされている、請求項８に記載の回路。
【請求項１８】
光学放射によって励起される標識された結合分子と、
時間の経過とともに溶解して該標識された結合分子を放出する、該標識された結合分子をカプセル化した材料と
を含む、物質の組成物。
【請求項１９】
前記標識された結合分子が蛍光標識された抗体である、請求項１８に記載の組成物。
【請求項２０】
前記材料が、前記結合分子を含む第一の部分および第二の部分と、
該第二の部分と該第一の部分とを隔離する隔離部分と
を含む、請求項１８に記載の組成物。
【請求項２１】
前記隔離部分は、前記第一の部分および第二の部分よりも組織における溶解性が低い、請求項２０に記載の組成物。
【請求項２２】
前記第一の結合分子と前記第二の結合分子とが異なる、請求項２１に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［優先権主張および関連出願のクロスリファレンス］
本出願は、２０００年１１月９日に出願された、「生体分子濃縮物をインビボで蛍光タグを使用して検出する方法、回路、および物質の組成物」というタイトルの米国仮出願番号第６０／２４７，５７４号（引用することにより本明細書の一部をなすものとする）の優先権を主張する。
【０００２】
［発明の分野］
本発明は、センサに関する。本発明はより詳細には、生体分子センサの分野に関する。
【背景技術】
【０００３】
悪性細胞群のエクスビボ研究により、いくつかの一般的な原理が確立され、臨床治療プロトコルが開発されている。これらの原理は、悪性細胞と正常細胞との間で異なり、悪性疾患治療で使用されている。全ての腫瘍細胞を死滅させて治癒率を改善するために、前臨床研究および臨床研究の両方でこれらの相違を利用することが試みられてきた。
【０００４】
この目的の達成における一つの主要な障害は、正常な組織への毒性を最小にしながら腫瘍細胞の死滅を増加させること（治療指数）の困難さである。したがって、いくつかの治療ストラテジーは、悪性疾患治療における経験的アプローチを使用する。特に、細胞傷害薬の送達時間および用量は、悪性細胞群に対する効果よりも正常組織に対する応答および毒性によってより支配され得る。
【０００５】
不運なことに、このアプローチでは悪性細胞群の治療時の変化についての正確な情報を得ることができない。利用可能なこの情報の収集により、臨床医は悪性細胞と正常細胞との相違を利用して治療手順を改良することが可能である。
【０００６】
細胞群内で起こる変化を研究する試みが多数行われている。しかし、これらの試みはリアルタイムベースの変化をモニタリングする能力を示していない。実際、これらの方法は、典型的には、時間内に一つの情報を提供し、ほとんどがある特定の情報またはパラメータを提供するようにデザインされている。さらに、ほとんどの従来の方法は、高額且つ時間がかかり得る。このことは、特に積極的な治療およびその後の積極的な治療の際の変化を追跡することが望ましい場合、典型的には照射および化学療法の長期治療を受けている患者にとっては問題であり得る。
【０００７】
さらに、腫瘍は、照射または薬物療法による治療のためにより感受性の高い期間を有し得る。継続的に、または半継続的にモニタリングし、このような感受性を示す条件を識別することができる可能性のあるモニタリングシステムを得ることにより、腫瘍破壊率が増加する。
【０００８】
多数の腫瘍特異的抗原（ＴＳＡ）が同定されており、多数のこれらのＴＳＡに特異的な抗体が知られている。例えば、９Ｌラット脳腫瘍細胞株の細胞表面上で見出されるシグマ２受容体、マウス乳腺癌株６６（二倍体）および６７（異数体）、ならびにＭＣＦ−７ヒト乳癌細胞株は、腫瘍細胞増殖のマーカーであり得ることが証明されている。Ｍａｃｈ  ＲＨら、「乳癌における増殖の潜在的な生体マーカーとしてのシグマ２受容体」、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１９９７、Ｊａｎ  １、５７（１）、１５６〜６１；Ａｌ−Ｎａｂｕｌｓｉ  Ｉら、「増殖および静止腫瘍細胞におけるシグマ２受容体発現に対する倍数性、漸増、環境因子、およびタモキシフェン治療の効果」、Ｂｒ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ、１９９９、Ｎｏｖ、８１（６）、９２５〜３３を参照のこと。このようなマーカーは、非侵襲性の（non-invasive）画像処理手順による検出の影響を受け得る。したがって、シグマ２受容体に選択的に結合するリガンドを使用して腫瘍の増殖状態を評価することができるが、このようなリガンドを使用したインビボ技術はこれまで知られていない。腫瘍特異的な治療分野は依然として相対的には確立されていないが、さまざまな研究者がこのような治療に有用ないくつかの潜在的に重要な技術を提案している。例えば、生体分子のエクスビボでの検出は、有利な腫瘍の治療時期の推定に有用であり得る。多数のこれらの技術は、生体分子に関連する物理的または化学的な性質を変化させるために、「ハイブリッド形成事象」を使用する。性質が変化した生体分子を、例えば、光学的手段または化学的手段によって検出することができる。
【０００９】
酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）と呼ばれる公知の生体分子検出技術は、生体分子と、該生体分子に特異的な酵素標識された抗体との間の結合を検出するステップを含む。他の生体分子の検出法は、生体分子の存在を示すために蛍光標識された抗体を使用する免疫蛍光を使用する。これらの技術のインビボでの使用は、分析すべきインビボ部位へのセンサの侵襲性の（invasive）導入を含み得る。さらに、これらの技術は、センサおよび組織が相互作用する面がきれいでない場合に信頼することができない。特に、インビボでの使用により、センサが長期間に「生物付着」されて、センサの操作性が変化し得る。特に、タンパク質は、センサの組織への挿入から数分以内にセンサ上に生成し始めて、センサの操作が不適切になり得る。これらを考慮して、特に、インビボでの生体分子濃度を検出するための回路、物質の組成物、およびこれを使用することができる方法が必要である。
【発明の開示】
【００１０】
［発明の要約］
本発明の実施形態による方法には、標識された抗体に特異的に結合する抗原を有する組織に、標識された抗体をインビボで提供するステップを含んでもよい。第一の光学放射をインビボで組織に発して、インビボで抗原に結合する標識された抗体を励起する。その励起に反応した、励起された標識された抗体が発した第二の光学放射を、インビボで検出することができる。いくつかの実施形態では、標識された抗体は蛍光標識された抗体である。
【００１１】
別の実施形態では、前記提供するステップは、インビボで、時間の経過とともにマトリクス材料から標識された抗体を放出させるステップを含んでもよい。他の実施形態では、前記提供するステップには、インビボに存在する調節回路に応答して、マトリクス材料からインビボで標識された抗体を放出するステップを含んでもよい。
【００１２】
いくつかの実施形態では、励起するステップは、生物付着組織から第一の光学放射を発するステップを含んでもよい。他の実施形態では、検出するステップは、生物付着組織から第二の光学放射を検出するステップを含んでもよい。
【００１３】
したがって、標識された抗体は、腫瘍細胞に関連する抗原に結合することができる。放射源を使用して、抗原に結合している標識された抗体を励起することができる。標識された抗体は、励起に応答して第二の光学放射を発する。センサを使用して、標識された抗体によって発せられた光学放射レベルを検出することができる。第二の光学放射レベルを使用して、抗原の存在濃度を決定することができる。腫瘍細胞の成長または増殖は、抗原濃度に近似するであろう。本発明の実施形態は、移植可能なセンサプラットフォームを使用して蛍光標識物質を探索する能力を有利に組み込み、それにより、インビボで抗原濃度を正確にリアルタイムで決定することが可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
［本発明の実施形態の説明］
本発明を、本発明の好ましい実施形態を示す添付の図面を参照して以下に詳細に記載する。しかし、本発明は、多数の異なる形態で実施することができ、上記実施形態に制限されると解釈すべきではなく、むしろ、これらの実施形態は、本開示が詳細且つ完全であり、本発明の範囲が当業者に完全に示唆されるように提供する。本発明を通して、類似の数字は、類似の要素をいう。図では、明白にするために、一定の層、領域、成分を、強調し、または拡大することができる。
【００１５】
本発明の説明で使用する技術用語は、特定の実施形態のみの説明のためであり、本発明を制限することを意図しない。本発明の説明および添付の特許請求の範囲で使用する、「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈上明らかに別のものを示さない限り、複数形も含むことを意図する。
【００１６】
特に定義しない限り、本明細書中で使用する全ての技術用語および科学用語は、本発明に属する当業者によって一般に理解されている意味と同一である。本明細書中に記載した全ての刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献は、その全てが引用することにより本明細書の一部をなすものとする。本明細書中で使用される、用語「組織」には、細胞、器官、体液、および生体サンプルまたは被験体の体内にある他の生体物質を含みんでもよい。例えば、用語「組織」を使用して、細胞、器官、および／またはヒト体内の他の生体物質を説明することができる。用語「生体分子」には、特定の腫瘍細胞型に関連するタンパク質などの腫瘍特異的抗原（ＴＳＡ）を含み得る。本発明をインビボの用途またはエクスビボの用途に使用することができると理解される。用語「インビボ」は、インサイチュー適用を含むことを特に意図するとも理解される。
【００１７】
本発明の好ましい実施形態では、異常増殖細胞（前悪性および非新生物性または非悪性高増殖細胞と共に腫瘍、癌、および新生物性組織を含む）に関連する生体分子（例えば、抗原）を検出する。用語「腫瘍」は、一般に、当該分野で多細胞生物内の非分化細胞の異常な塊を意味すると理解される。腫瘍は、悪性または良性であり得る。好ましくは、本明細書中に開示の本発明の実施形態を使用して、悪性腫瘍に関連する生体分子を検出する。本発明の実施形態によって検出することができる生体分子に関連する腫瘍、癌、および新生物性組織の例には、乳癌；骨肉種；血管肉腫；線維肉腫および他の肉腫；洞腫瘍（sinus tumors）；卵巣癌、尿管癌、膀胱癌、前立腺癌、および他の尿生殖器癌；結腸癌、および胃癌、ならびに他の胃腸の癌；肺癌；骨髄腫；膵臓癌；肝臓癌；腎臓癌；内分泌癌；皮膚癌；ならびに神経膠種および神経芽腫を含む脳腫瘍または中枢神経系および末梢神経系（ＣＮＳ）腫瘍（悪性または良性）などの悪性腫瘍が含まれるが、これらに限定されない。前悪性および非新生物性または非悪性異常増殖組織に関連する生体分子には、骨髄異形成障害；インサイチューでの頸部癌；家族性腸ポリープ症（ガードナー症候群など）；口腔白斑症；組織球増殖症；ケロイド；血管腫；乾癬；およびウイルス感染による異常増殖性細胞（hyperproliferative：いぼなど）に関連する生体分子が含まれるが、これらに限定されない。
【００１８】
本発明を腫瘍および他の異常増殖性細胞に関連する抗原の検出に関して本明細書中に記載しているが、本発明を、グルコース、細胞壊死副産物、細胞シグナル伝達タンパク質などの測定に使用することもできる。
【００１９】
本発明の実施形態は、主にヒト被験体に関係するが、本発明の実施形態を、獣医学的目的、薬物スクリーニング、および薬物開発目的で、動物被験体、特に哺乳動物被験体（霊長類、マウス、ラット、イヌ、ネコ、家畜、およびウマなど）に使用することもできる。
【００２０】
本明細書中で使用される、用語「光学放射」には、組織におけるシグナルの伝達に使用することができる放射（可視光線、紫外線、赤外線、および／または電磁放射線スペクトルの他の部分の放射など）を含み得る。
【００２１】
本明細書中に記載の実施形態が蛍光標識された結合分子（すなわち、抗体）について説明しているが、本発明を、任意の型の標識（蛍光標識（例えば、フルオレセイン、ローダミン）、放射性標識（例えば、35Ｓ、125Ｉ、131Ｉ）、生体発光標識（例えば、ビオチン−ストレプトアビジン、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ））、および酵素標識（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ）を含む）と共に使用することができると理解される。
【００２２】
本明細書中に記載の実施形態は、特に抗体をいい、本発明を検出すべき生体分子に結合する他の分子と共に使用することもできると理解される。さらに、本発明を抗原濃度の検出に関して説明するが、本発明を使用して、検出が望まれる任意の生体分子（タンパク質、ポリペプチド、核酸、多糖類などが含まれるが、これらに限定されない）の濃度を検出することもできる。
【００２３】
本明細書中で使用される、用語「抗体」は、この用語が当該分野で理解される全ての抗体（ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、および一本鎖抗体、Ｆａｂフラグメント、ならびにＦａｂ発現ライブラリーから産生されるフラグメントが含まれるが、これらに限定されない）を含むと理解される。培地中の連続細胞株による抗体分子の産生のための任意の技術を使用して、モノクローナル抗体を調製することができる。これらには、ハイブリドーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術、およびＥＢＶハイブリドーマ技術が含まれるが、これらに限定されない。例えば、Ｇ．Ｋｏｈｌｅｒら、１９７５、Ｎａｔｕｒｅ、２５６、４９５〜４９７；Ｄ．Ｋｏｚｂｏｒら、１９８５、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、８１、３１〜４２；Ｒ．Ｊ．Ｃｏｔｅら、１９８３、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８０、２０２６〜２０３０；およびＳ．Ｐ．Ｃｏｌｅら、１９８４、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．、６２、１０９〜１２０を参照のこと。
【００２４】
キメラ抗体を、例えば、Ｓ．Ｌ．Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、１９８４、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、８１、６８５１〜６８５５；Ｍ．Ｓ．Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら、１９８４、Ｎａｔｕｒｅ、３１２、６０４〜６０８；およびＳ．Ｔａｋｅｄａら、１９８５、Ｎａｔｕｒｅ、３１４、４５２〜４５４に記載の方法に従って産生することができる。あるいは、当該分野で公知の方法を使用して一本鎖抗体の産生のために記載された技術を適用して、抗原特異的一本鎖抗体を産生することができる。文献に開示されるように、リンパ球集団のインビボ産生の誘導または免疫グロブリンライブラリーのスクリーニングまたは特異性の高い結合試薬パネルによって抗体を産生することもできる。例えば、Ｒ．Ｏｒｌａｎｄｉら、１９８９、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、８６、３８３３〜３８３７；およびＧ．Ｗｉｎｔｅｒら、１９９１、Ｎａｔｕｒｅ、３４９、２９３〜２９９を参照のこと。関連する特異性を有するがイディオタイプ組成が異なる抗体を、ランダムコンビナトリアル免疫グロブリンライブラリー由来のチェインシャフリング（chain shuffling）によって作製することができる。例えば、Ｄ．Ｒ．Ｂｕｒｔｏｎ、１９９１、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、８８、１１１２０〜１１１２３を参照のこと。
【００２５】
抗原の特異的結合部位を含む抗体フラグメントを使用することもできる。例えば、このようなフラグメントには、抗原分子のペプシン消化によって産生することができるＦ（ａｂ’）２フラグメントおよびＦ（ａｂ’）２フラグメントのジスルフィド結合の還元によって作製することができるＦ（ａｂ’）２フラグメントが含まれるが、これらに限定されない。あるいは、Ｆａｂ発現ライブラリーを、所望の特異性を有するモノクローナルＦａｂフラグメントを迅速且つ簡単に識別できるように構築することができる。Ｗ．Ｄ．Ｈｕｓｅら、１９８９、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５４、１２７５〜１２８１を参照のこと。
【００２６】
エクスビボ研究用の蛍光ベースのアッセイは十分に確立されており、多数のフルオロフォアおよびタグ化抗体系が市販されている。本発明の実施で有用な市販のｐＨ依存性フルオロフォアの広範なリストを、Ｒ．Ｐ．Ｈａｕｇｌａｎｄ、第二３章（「ｐＨインジケーター」）、「蛍光プローブおよび研究試薬ハンドブック」、第６版（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｅｕｇｉｎｅ、Ｏｒｅｇｏｎ、１９９６およびｗｗｗ．ｐｒｏｂｅｓ．ｃｏｍに記載のＨＴＭＬバージョン）に見出すことができる。
【００２７】
本発明の実施形態によれば、抗体などの蛍光標識された結合分子を、腫瘍細胞に関連する抗原などの生体分子に結合させることができる。光学放射源を使用して、抗原に結合した蛍光標識された抗体を励起することができる。蛍光標識された抗体は、励起に応答して第二の光学放射を発する。センサを使用して、蛍光標識された抗体が発した光学放射レベルを検出することができる。発した光学放射レベルを使用して、抗原の存在濃度を決定することができる。次いで、抗原濃度を、腫瘍特異的抗原濃度とこれらのパラメータとの間の既知の関係に基づいて、または当業者により決定しうる関係に従って、腫瘍細胞の量、存在、成長もしくは増殖挙動を相関させることができる。
【００２８】
図１は、インビボ腫瘍組織１１０の抗原レベルを決定するために使用することができる本発明の実施形態の概略図である。腫瘍組織１１０を、腫瘍組織１１０の表面１００に存在する腫瘍特異的抗原（ＴＳＡ）１９５のタイプによって特徴付けることができる。例えば、ＴＳＡ１９５を、細胞組織１１０の表面上に見出すことができる。一般に、腫瘍細胞増殖の指標となる適切な生体分子（すなわち、ＴＳＡ）は、固形腫瘍で見出される多数の生物学的、生理学的、および／または環境の性質から実質的に独立している。たった一つの組織１１０表面しか示されなくても、本発明の実施形態を使用して複数の組織１１０についての生体分子濃度を検出することができると解される。
【００２９】
表面１００でのＴＳＡ１９５の濃度レベルに基づいて腫瘍組織１１０を検出することができる。例えば、腫瘍の「成長」期を比較的高濃度のＴＳＡ１９５によって特徴付けることができ、「寛解（remission）」期を比較的低濃度のＴＳＡ１９５によって特徴付けることができる。
【００３０】
プラットフォーム１０５はインビボで腫瘍組織１１０に接近するように存在し、生物付着組織１９０で長期にわたり付着されていてもいなくてもよい。プラットフォーム１０５は、マトリクス材料１４０に懸濁された蛍光標識された抗体１３０を含むことができるマトリクス材料１４０を有する。マトリクス材料１４０は、蛍光標識された抗体１３０がマトリクス材料１４０から時間の経過とともに放出されるように可溶性であってもよい。マトリクス材料１４０は、例えば、図３および４に示すようにシリンダーの形状であってもよい。他の形状を使用することもできる。プラットフォーム１０５はまた、システムへの、またはシステムからのシグナルを、エクスビボで伝達および受信する遠隔測定システムを含んでもよい。
【００３１】
蛍光標識された抗体１３０を、腫瘍組織１１０を特徴付けるが正常組織には関連しないＴＳＡ１９５と特異的に相互作用するか結合するように選択する。一以上のＴＳＡ１９５は、腫瘍組織１１０を特徴付けることができる。蛍光標識された抗体１３０はマトリクス材料１４０から放出され、蛍光標識された抗体１３０のうちのいくつかはプラットフォーム１０５付近の表面１００上でＴＳＡ１９５と結合して結合している複合体１６０を形成する。非結合蛍光標識された抗体１５０は長期間にわたって浮遊してプラットフォーム１０５からはなれる。
【００３２】
光学放射源１２０は、結合複合体１６０の蛍光レベルをより高いエネルギー状態に励起する第一の光学放射１７０を発する。本発明の一つの実施形態では、第一の光学放射は、生物付着組織１９０を通って発せられる。一旦励起されると、結合複合体の蛍光標識は、第二の光学放射１８０を発する。第一の光学放射１７０および第二の光学的１８０の各波長を、生物付着組織１９０の浸透を促進するように選択することができる。光学放射源は、本明細書中でさらに記載のように、例えば、レーザダイオード、高出力発光ダイオード（ＬＥＤ）などであり得る。
【００３３】
光学放射検出器１１５は、生物付着組織１９０を通過した第二の光学放射１８０を検出し、それにより従来技術に関するいくつかの欠点を回避することができる。第一の光学放射１７０の発光と第二の光学放射１８０の検出との間の時間間隔を、表面１００上で蛍光標識された抗体１３０がＴＳＡ１９５に結合するように選択することができる。光学放射検出器１１５は、フォトダイオードまたはフォトトランジスタであり得る。本明細書中にさらに記載されており、そして／または当業者に公知の他のデバイスも使用することができる
【００３４】
光学放射検出器１１５は、バックグラウンドノイズの影響を減少させるための光学的吸収フィルターを含んでもよい。光学放射源１２０および光学放射検出器１１５を、シールドで分離して光学放射検出器１１５に到達する第一の光学放射１７０の量を減少させることができる。いくつかの実施形態では、光学放射検出器１１５は、結合複合体１６０から約５００μｍの場所に存在する。他の実施形態では、光学放射検出器１１５は、光学放射検出器１１５と結合複合体１６０との間の分離が増加されるように第二の光学放射１８０を収集するか焦点に集めるレンズを含む。
【００３５】
第二の光学放射１８０の強度を使用して、ＴＳＡ１９５の濃度を決定することができる。特に、プラットフォーム１０５付近のＴＳＡ１９５は、これに結合している蛍光標識された抗体１３０を有してもよい。したがって、蛍光標識は、第一の光学放射１７０の励起後に第二の光学放射１８０を発することができる。
【００３６】
図２は、本発明の実施形態の概略図である。図２によれば、プラットフォーム２００は、インビボで抗原２０５を含む組織２９０付近に存在することができる。生物付着組織２２５は、プラットフォーム２００の一部に長期にわたり付着し得る。プラットフォーム２００は、それぞれ第一のマトリクス材料２４０および第二のマトリクス材料２１５を含んでもよい。第一のマトリクス材料２４０は、非標識された抗体２２０を含んでもよい。第二のマトリクス材料２１５は、蛍光標識された抗体２１０を含んでもよい。いくつかの実施形態では、さらなるマトリクス材料を使用することができる。本明細書中に記載のように、マトリクス材料は、異なる濃度の抗体および／または抗体の混合物を含むことができ、これらの抗体は標識することができるものも標識することができないものもある。
【００３７】
標識されていない抗体２２０および蛍光標識された抗体２１０を、時間の経過とともに連続的にまたは本明細書中に記載の段階に放出させることができる。各抗体の放出は、互いに時期が異なってもよい。例えば、標識されていない抗体２２０を第一の時間間隔中に放出させることができ、蛍光標識された抗体２１０を第二の時間間隔中に放出させることができる。本明細書中にさらに記載の各マトリクス材料に連結した装置２７０を使用して、抗体を放出させることもできる。各々のマトリクス材料に連結した装置２７０は、異なっていてもよい。いくつかの実施形態では、装置２７０を使用して、標識されていない抗体および／または標識された抗体の放出速度を調節することができる。放出調節ストラテジーを使用して、プラットフォーム２００が機能しなければならない動的生物学的環境において有利であり得る蛍光標識された抗体２３０の連続供給源を提供することができる。
【００３８】
標識されていない抗体２２０を組織２９０に放出させて、遊離の標識されていない抗体２３５を提供する。蛍光標識された抗体２１０を放出させて、蛍光標識された抗体２３０を提供する。いくつかの遊離の蛍光標識された抗体２３０を抗原２０５に結合させて、結合抗原２３１を提供する。いくつかの結合抗原２３１を、第二のマトリクス材料２４０の表面で標識されていない抗体２２０に結合させて、第二のマトリクス材料２４０の表面に結合構造体２９０を提供する。光学放射エミッター／検出器２８５は第二のマトリクス材料２８５に隣接し、これを使用して結合構造体体２９０を励起し、上記のようにシグナルを検出することができる。
【００３９】
図３は、本発明の物質の組成物の概略図である。図３によれば、蛍光標識された抗体３３０を時間の経過とともにマトリクス材料３３５から放出させる。生体適合性、放出時間の特徴、分解、懸濁した蛍光標識された抗体３３０との相互作用、自己蛍光の欠如などの要因に基づいてマトリクス材料を選択することができる。
【００４０】
他の蛍光標識された抗体をマトリクス材料３３５中に含めて、異なる抗体型の混合物を提供することができると理解される。用語「異なる抗体型」は、一つの抗体型がより多くの種類の標識（すなわち、標識Ａおよび標識Ｂ）を有してもよいことを意味すると理解される。あるいは、一以上の抗体型（すなわち、抗体Ａおよび抗体Ｂ）が同一の標識を有してもよい。例えば、マトリクス材料３３５は、Ａ型およびＢ型の蛍光標識された抗体３３０を含んでもよい。さらに、Ａ型およびＢ型蛍光標識された抗体３３０は、異なる濃度であってもよい。例えば、Ａ型蛍光標識された抗体３３０は蛍光標識された抗体３３０の２０％となるように含まれ、Ｂ型蛍光標識された抗体３３０は蛍光標識された抗体３３０の８０％となるように含まれてもよい。さらなる型の蛍光標識された抗体３３０もまた、種々の濃度で含んでもよい。
【００４１】
マトリクス材料３５はこれに懸濁した蛍光標識された抗体３３０と反応しないかこれを損傷しないことが好ましい。マトリクス材料３３５は蛍光標識された抗体３３０が過度の干渉を与えられることなく、時間の経過とともに放出されるように、相互作用表面３４０で生物付着を促進しないことが好ましい。マトリクス材料３３５は、いくつかのポリマーの一以上を含んでもよい。組織中のポリマーのカプセル化、分解、および放出特性が被験体ごとに、細胞ごとに、またはサンプルごとに変化し得るようにポリマーの選択を経験的に決定することができる。適切な生体分解性ポリマーは、ポリマー中のエステル結合の加水分解に基づくことができる。この型の種々のポリマーは市販されており、十分に特徴付けられている。これらのポリマーの多数は、小さな無毒の分子に分解する。最も一般的な生分解性ポリマーのうちのいくつかは、ポリ乳酸およびポリグリコール酸である。Ｆｒｉｅｄ，Ｊｏｅｌ  Ｒ．、Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｅｎｇｌｅｗｏｏｄ  Ｃｌｉｆｆｓ、ＮＪ、Ｐｒｅｎｔｉｃｅ  Ｈａｌｌ、１９９５、ｐ．２４６〜２４９。本発明のいくつかの実施形態では、マトリクス材料３３５は、ポリ乳酸とポリグリコール酸との組み合わせといった異なる材料の混合物である。異なる材料は、ある濃度範囲に存在してもよい。例えば、マトリクス材料３３５は、約０〜約５０％との間のポリ乳酸および／または約１０％〜約５０％との間のポリグリコール酸を含んでもよい。
【００４２】
いくつかの実施形態では、蛍光標識された抗体３３０の時間放出を、検出すべき抗体または生体分子との材料３３５の生体適合性、ポリマー型、ポリマーの構造（例えば、ポリマー放出ビーズの物理的サイズおよび多孔度）、マトリクス材料３３５の分子量、マトリクス材料３３５の多孔度、および／または他の材料のパラメータに基づいたマトリクス材料３３５の選択によって調節することができる。
【００４３】
他の実施形態では、マトリクス材料３３５を、マトリクス材料３３５が蛍光標識された抗体３３０を放出する速度に影響を与えることができる装置３５０に連結することができる。例えば、装置３５０は、マトリクス材料３３５を振動させ、それにより蛍光標識された抗体３３０が種々の速度で放出される圧電性回路であり得る。放出速度および経時時間を調節するためのいくつかのパラメータ（例えば、ポリマーの構造、分離用、多孔度など）を利用することが可能であるが、他の放出調節技術も使用することができる。例えば、圧電性素子の頂部にマウントし、エレメントの作動（例えば、圧電性回路へのシヌソイド入力を使用したポリマーの機械的震盪）により、放出速度を増加させることができる。放出速度を調整するための別の選択肢は、ポリマーの電気化学的酸化および還元により導電性ポリマー（例えば、ポリピロール）とマトリクス材料３３５とをブレンドし、ブレンドの多孔性を調節することである（Ｋｏｎｔｔｕｒｉら、「薬物送達のモデル膜としてのポリピロール」、Ｊｏｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｅｌｅｃｔｒｏａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１９９８、４５３（１〜２）、２３１〜２３８；Ｈｅｐｅｌ，Ｍ．ら、「誘導性ポリマーマトリクスからのクロロプロマジンの電気化学的に調節された結合および放出のための電気化学的水晶結晶板マイクロバランスの適用」、Ｍｉｃｒｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ、１９９７、５６、５４〜６４；Ｙａｎｏ，Ｓ．ら、「浸透圧衝撃による導電性膜に固定した微細藻類からの組換え遺伝子産物の細胞外放出」、Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｅｒｇｅｔｉｃｓ、１９９６、３９、８９〜９３；Ｂｉｄａｎら、「ポリピロールへのスルホン化シクロデキストリンの組み込み−中性薬物の電気調節送達へのアプローチ」、Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ  ＆  Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ、１９９５、１０、２１９〜２２９；Ｈｅｐｅｌ，Ｍ．ら、「複合ポリマーフィルムからの薬物の電気放出」、ＡＣＳ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  Ｓｅｒｉｅｓ、１９９４、５４５、７９〜９７）。
【００４４】
図４は、本発明による物質の組成物の概略図である。図４によれば、第一、第二、および第三のマトリクス材料切片４３５、４４０、４４５内に蛍光標識された抗体４３０が放出される。第一のマトリクスおよび第二のマトリクス材料切片４３５、４４０は、蛍光標識された抗体４３０を欠くものであってもよい第一の分離材料４５０によって分離されている。第二および第三のマトリクス材料切片４４０、４４５は、蛍光標識された抗体４３０を欠くものであってもよい第二の分離材料４５５によって分離されている。異なるマトリクス材料切片により、異なる時間で放出される標識材料の「パルス」を提供することができる。特に、バリア溶解後、下にあるマトリクス切片により、標識抗体が短時間で放出され得る。例えば、これを使用して時間の経過とともに抗原発現レベルを測定することができる。さらに、第一、第二、および第三のマトリクス材料切片４３５、４４０、４４５は、それぞれ異なる速度の長期放出を提供するための蛍光標識された抗体４３０の異なる組成物を有してもよい。
【００４５】
図５は、本発明によるインビボ回路およびシステムの実施形態を示す図である。マトリクス材料５３０は、例えば図３および図４に記載されているように組織５００中に放出される蛍光標識された抗体を含む。マトリクス材料５３０を、例えば、図３および図４に記載されているように蛍光標識された抗体の放出速度を変化させることができる装置５８０に連結することができる。
【００４６】
光学放射源５０５は、光学放射５１５を発する高出力発光ダイオードを通る出力電流を提供するための調節入力Ａに応答する増幅器を含んでもよい。光学放射５１５は、生物付着組織５７０を通過して、蛍光標識された抗体上の蛍光標識を励起することができる。
【００４７】
励起された蛍光標識は、生物付着組織５７０を通過することができる光学放射５２０を発生して光学放射検出器５１０に到達する。例えば、光学放射５２０は、光検出器に突き当たる。反応の際、光検出器は電流を発生し、これを光学放射５２０のレベルを示す電圧レベルに変換することができる。本発明によるいくつかの実施形態では、光検出器は光電子増倍管である。光学放射検出器５１０は、バックグラウンドノイズを低減するための吸収フィルターを含み得る。
【００４８】
光学放射源５０５、光学放射検出器５１０、およびマトリクス材料５３０は、プロセッサ回路５２５と連動して操作することができる。プロセッサ回路５２５は、例えば、マトリクス材料５３０を振動させて蛍光標識された抗体の放出速度を変化させる装置５８０の調節によって、マトリクス材料５３０からの蛍光標識された抗体の放出を調節することができる。
【００４９】
プロセッサ回路５２５は、光学放射源５０５に入力することができる。プロセッサ回路５２５は、光学放射源５０５からの出力シグナルＣをモニタリングして、例えばその出力を決定することができる。他の機能をモニタリングし、そして／または調節することができる。
【００５０】
プロセッサ回路５２５は、光学放射検出器５１０からの電圧レベルＢを受信して、例えば光学放射５２０の強度を決定することができる。プロセッサにより遠隔測定システム（５２６）への出力Ｅを提供することができる。遠隔測定システム５２６は、エクスビボシステムへ／エクスビボシステムから、データを伝達／受信することができる（図示せず）。エクスビボシステムは、インビボシステムによる受信のための身体へのシグナル伝達による蛍光標識された抗体の放出を調節することができる。インビボシステムは、エクスビボシステムからのシグナルに応答して、蛍光標識された抗体を放出することができる。エクスビボシステムから他のシグナルを伝達することができる。いくつかの実施形態では、伝達／受信したデータをデジタルでコードする。他のデータ伝達のタイプを使用することができる。
【００５１】
インビボシステムは、エクスビボシステムにデータを伝達することができる。例えば、インビボシステムは、光学放射５２０の強度に関連するデータを伝達することができる。インビボシステムは、他のデータをエクスビボシステムへ伝達することができる。したがって、インビボで使用するためにインビボシステムを埋め込み、それによりエクスビボシステムは関連する侵入手順を使用することなくインビボシステムからのデータの受信を含むインビボシステムの操作を調節することができる。
【００５２】
いくつかの実施形態では、移植された組織を介してインビボシステムを遠隔で出力する。例えば、インビボシステムは、エクスビボシステムからの誘導結合出力シグナルを介してインビボシステムに出力を提供するインダクタを含んでもよい。いくつかの実施形態では、インビボシステムの直径は約２ｍｍである。
【００５３】
上記の本発明の実施形態では、発光ダイオード（ＬＥＤ）またはレーザダイオード（より高い励起強度のため）を励起源として使用することができ、フォトダイオードを使用して対応する発光シグナルを検出することができる。集積発光および吸収フィルターを、必要ならばダイオードエレメント上に誘電性コーティングの形態で導入することができる。発光ダイオードおよび光検出器は、現在市販されている。これらのデバイスは、非常に小型であり、典型的にはレーザダイオードが１００μｍ未満である。当業者に公知の薄膜蒸着および光ファイバーテクノロジーにより、非常に高感度の光学フィルターを構築可能である。
【００５４】
上記の光学的埋め込み装置用の外部センサパッケージは、約２ｍｍ×１０ｍｍの円柱形であってもよい。この形状は、生検ニードル類似のデバイスと共に使用する場合に被験体に容易に挿入することができる。パッケージサイズおよび結合構造体の標準化により、種々の範囲のコーティング（ダイヤモンド様カーボン（ＤＬＣ）または種々の組成のガラスおよびプラスチックなど）が可能である。パッケージの内側の部分を使用し、密封して身体の水分および攻撃の影響からデバイスを隔離することができる。
【００５５】
いくつかの実施形態では、レーザダイオードを放熱板にあて、回路基板と垂直方向の前方および後方のファセットから発光させる。後方のファセットからの光の強度を、回路基板の反対側に装備した光検出器によって測定することができる。これにより、光強度がフィードバック調節される。前記円柱を分割する光学バリアの片側で、シグナルフォトダイオードは、酸素測定の場合に比で示される戻りの蛍光または吸収シグナルを受信する。光除去フィルターを光検出器上に置いてバックグラウンドノイズを低減することができる。遠隔測定コイル、ドライバー、および他の電子部品は、回路基板のいずれかの側面に配置することができる。
【００５６】
本明細書中に記載の実施形態は、本発明の実施において潜在的に重要な検討材料であるベースラインを有効に修正することができる。時間の関数としてのダイオードレーザ出力の変化を、標準的なフォトダイオードフィードバック技術の使用によって適応させることができる。挿入前および挿入後の測定を用いて、最初のベースラインを提供することができる。これは、バックグラウンド蛍光および非特異的結合の程度の評価において有用であり得る。パラメータとしての外部発光の影響もまた評価することができる。移植片の寿命は、場合によっては、６ヶ月またはそれ以上であり得る。
【００５７】
この検出スキームの一つの利点は、センサ外面の物質の付着（「生物付着」）に対して比較的耐性を示し得るという点である。本発明の一つの態様は、層上のどんなものでもセンサ表面をカバーすることにより発光波長および吸収波長を提供する。センサへの標的フルオロフォアの近接が好ましいにもかかわらず、センサ移植部位から離れたシグナルの検出に有意な余地が得られる。本明細書中で考察されるように、一つの実施形態は、時間放出タグ化抗体または事象活性化ハイブリダイゼーション反応を含む。反応速度も評価することができるように、移植センサの継続的なモニタリングが可能である。
【００５８】
本発明の実施形態では、レンズシステムは存在してもよく、存在しなくてもよいが、検出器は蛍光源付近（例えば、５００μｍ）に置くことが好ましい。この方法では、検出器は画面であってよい。あるいは、センサは非画像処理であってもよいので、これを蛍光シグナルの有無についての二進法検出器として使用することができる。
【００５９】
上記で開示のように、本発明の実施形態によれば、蛍光標識された抗体を腫瘍細胞に関連する抗原に連結することができる。光学放射源を使用して、抗原に連結した蛍光標識された抗体を励起することができる。蛍光標識された抗体は、励起に応答して光学放射を発する。センサを使用して、蛍光標識された抗体によって発せられた光学放射レベルを検出することができる。光学放射レベルを使用して、組織表面に存在する抗原の濃度を決定することができる。次いで、抗原濃度を、組織の増殖状態または成長挙動に相関させることができる。図面および明細書では、本発明の典型的な好ましい実施形態および方法を開示している。特定の用語を使用しているが、これらは一般的な意味および説明の意味でのみ使用しており、特許請求の範囲に記載されている本発明の範囲を制限することを目的としない。
【図面の簡単な説明】
【００６０】
【図１】図１は本発明による実施形態の概略図である。
【図２】図２は本発明による実施形態の概略図である。
【図３】図３は本発明による物質のマトリクス組成物の概略図である。
【図４】図４は本発明による物質のマトリクス組成物の概略図である。
【図５】図５は本発明による実施形態を例示する回路図である。
【国際公開パンフレット】
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2004523257.tif 000022
2004523257.tif 000023
2004523257.tif 000024
2004523257.tif 000025
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004523257.tif 000026
【国際調査報告】
2004523257.tif 000027
2004523257.tif 000028
2004523257.tif 000029