(57)【要約】本発明は、生体ホスト中で免疫反応を生じさせるＴ細胞エピトープを識別する新規な手法に関する。この新規な方法によって、所与の生物種の免疫系に曝し、関連する未修飾実在化合物と比較した時、免疫原性が全くないか、または低減された生物学的化合物を生成することができる。したがって、本発明はさらに、本発明による方法によって得られる新規な生物学的分子、特にタンパク質および抗体に関する。
2004523754.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
インビトロまたはインシリコ技術を用いるか、または生物アッセイを用いてペプチドのＭＨＣ分子への結合を測定することを含むステップにより、生物学的分子のアミノ酸配列内の１つまたは複数の潜在的なＴ細胞エピトープペプチドを識別するのに適した方法であって、前記方法が次のステップ：
（ａ）公知のアミノ酸残基配列を有するペプチド領域を選択すること；
（ｂ）選択された領域から少なくとも３つのアミノ酸残基によって構成される所定の一定サイズの重複するアミノ酸残基セグメントを連続して採取すること；
（ｃ）前記採取されたアミノ酸残基セグメント中に存在する疎水性のアミノ酸残基側鎖各々に対し割り当てられた値を合計することにより、前記採取されたセグメントの各々について、ＭＨＣクラスＩＩ分子結合スコアを計算すること；および
（ｄ）そのセグメントについて計算されたＭＨＣクラスＩＩ分子結合スコアに基づいて、採取されたセグメントのうち修飾に適した少なくとも１つを識別し、実質的にペプチドの治療上の有用性を低減させずにペプチドに対するＭＨＣクラスＩＩ結合総合スコアを変更すること
を含む方法。
【請求項２】
ステップ（ｃ）を、１２−６ファンデアワールスのリガンド−タンパク質エネルギー反発項およびリガンドコンホメーション（ｌｉｇａｎｄ  ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ）エネルギー項を含むように修正されたベームスコアリング関数（Ｂｏｅｈｍ  ｓｃｏｒｉｎｇ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ）を用い、
（１）ＭＨＣクラスＩＩ分子モデルの第１のデータベースを提供すること；
（２）前記ＭＨＣクラスＩＩ分子モデルについて許容されるペプチド骨格の第２のデータベースを提供すること；
（３）前記第１のデータベースからモデルを選択すること；
（４）前記第２のデータベースから許容されるペプチド骨格を選択すること；
（５）採取された各セグメント中に存在するアミノ酸残基側鎖を識別すること；
（６）採取された各セグメント中に存在するすべての側鎖に対する結合親和性値を決定すること；および
（７）場合によっては、前記各モデルと各骨格についてステップ（１）〜（５）を繰り返すことによって実行する、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
各芳香族側鎖に割り当てられる値が、各疎水性脂肪族側鎖に割り当てられる値の約２分の１である請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
採取されるアミノ酸残基セグメントが１３個のアミノ酸残基によって構成されている請求項１から３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
連続的な採取されるアミノ酸残基セグメントが１〜５個のアミノ酸残基で重複している請求項１から４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
連続的な採取されるアミノ酸残基セグメントが互いに実質的に重複している請求項１から４のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
連続的な採取されるアミノ酸残基セグメントが１個のアミノ酸残基以外重複している請求項１から４のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
親分子から誘導される免疫原性において修飾された生物学的分子の製造方法であって、修飾された分子は前記親分子のアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を有しており、所与の種の免疫系に曝された時、親分子に比較して低減された免疫原性を示し、該方法は；(i)親生物学的分子またはその一部のアミノ酸配列を決定すること；(ii)インビトロまたはインシリコ技術を用いるか生物アッセイを用いてペプチドのＭＨＣ分子への結合を測定することを含む任意の方法によりタンパク質のアミノ酸配列内の１個または複数の潜在的なＴ細胞エピトープを識別すること；(iii)Ｔ細胞エピトープ配列の活性または数および／または前記生物学的分子から誘導されるペプチドを結合することができるＭＨＣ分子アロタイプの数（これらはインビトロもしくはインシリコ技術を用いるか生物アッセイを用いてペプチドをＭＨＣ分子に結合させることにより、またはペプチド−ＭＨＣ複合体をＴ細胞に結合させることにより測定される）を実質的に低減するか除去するように修飾して、本来識別されたＴ細胞エピトープ配列内の少なくとも１個のアミノ酸残基を変更することにより新規な配列変異体を設計すること；(iv)組換えＤＮＡ技術によってそのような配列変異体を構成し、所望の特性を備えた１つまたは複数の変異体を識別するために前記変異体を試験すること；および(v)場合によってはステップ(ii)〜(iv)を繰り返すことを含み、ここで、ステップ(ii)によるＴ細胞エピトープ配列の識別が請求項１〜７のいずれかに特定される方法によって達成されるものであることを特徴とする方法。
【請求項９】
本来存在するＴ細胞エピトープ配列のいずれかにおいて、１〜９個のアミノ酸残基が変更される請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
本来存在するＴ細胞エピトープ配列のいずれかにおいて、１個のアミノ酸残基が変更される請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
アミノ酸の変更が、同族体タンパク質配列に関して行われる請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
アミノ酸の変更が、インシリコモデリング技術に関して行われる請求項８に記載の方法。
【請求項１３】
アミノ酸残基の変更が、特定の位置において本来存在するアミノ酸残基を他のアミノ酸残基によって置換、付加または欠失させるものである請求項８から１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
前記生物学的分子の生物活性を回復するために、さらに一層の変更が行われる請求項８から１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
さらに一層の変更が特定のアミノ酸の置換、欠失または付加により行われる請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
免疫原性が低減されたポリペプチド、タンパク質、融合タンパク質、抗体またはその断片を調製するための請求項８から１５のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
前記ポリペプチド、タンパク質、融合タンパク質または抗体が以下の群：
（ａ）モノクローナル抗体
抗−４０ｋＤ糖タンパク質抗原抗体ＫＳ  １／４、
抗ＧＤ２抗体１４．１８
抗−Ｈｅｒ２抗体４Ｄ５（マウス）およびヒト化された変型（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標））、
抗−ＩＬ−２Ｒ（抗−Ｔａｃ）抗体（Ｚｅｎａｐａｘ（登録商標））、
抗−ＣＤ５２抗体（ＣＡＭＰＡＴＨ（登録商標））、
抗−ＣＤ２０抗体（Ｃ２Ｂ８、Ｒｉｔｕｘａｎ（登録商標）；Ｂｅｘｘａｒ（登録商標））、
ヒトのＣ５補体タンパク質に向けられた抗体
（ｂ）ヒトタンパク質
ｓＴＮＦ−Ｒ１、ｓＴＮＦ−Ｒ２、ｓＴＮＦＲ−Ｆｃ（Ｅｎｂｒｅｌ（登録商標））、
タンパク質Ｃ、ａｃｒｐ３０、リシンＡ、ＣＮＴＦＲリガンド
スブチリシン、ＧＭ−ＣＳＦ、ヒト卵胞刺激ホルモン（ｈ−ｆｓｈ）
β−グルコセレブロシダーゼ、ＧＬＰ−１、アポリポタンパク質Ａ１、
から選択される請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
請求項１から１７のいずれかに記載の方法によって得られ、親と異なるアミノ酸配列を有し、所与の生物種の免疫系に曝された時、親分子に比較して低減された免疫原性を示す、親分子から誘導される免疫原性の修飾された生物学的分子。
【請求項１９】
請求項１から７のいずれかに記載の方法により識別された免疫原性の修飾されていない生物学的親分子のアミノ酸配列内にある潜在的Ｔ細胞エピトープの、低減された免疫原性を有するが、所望の生物活性は維持されている生物学的分子の製造のための使用。
【請求項２０】
前記Ｔ細胞エピトープが１３ｍｅｒペプチドである請求項１９に記載の潜在的Ｔ細胞エピトープ配列の使用。
【請求項２１】
修飾されていない親分子と比較して免疫原性が低減され、生物活性を有する生物学的分子を調製するための、請求項１９に特定される１３ｍｅｒ  Ｔ細胞エピトープの少なくとも９個の連続するアミノ酸残基からなるペプチド配列の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、コンピュータ支援の方法によって、ペプチド中のＭＨＣクラスＩＩ分子結合サイトに対する潜在的なＴ細胞エピトープ値を計算することを含む、生体ホスト中で免疫反応を生じさせるＴ細胞エピトープを識別する新規な手法に関する。本発明は、さらに、ホスト（好ましくは、ヒト）に曝された時に免疫反応を誘導する生物学的分子（とりわけ、タンパク質および抗体）の製造方法に関する。この方法によって、本来免疫原性の分子においてその配列中の潜在的なＴ細胞エピトープが低減または除去され、所与の種の免疫系に曝された時に免疫原性を有しないか、対応する修飾されていない実体と比較して免疫原性が低減された分子を製造することができる。したがって、本発明はさらに、本発明による方法によって得られる新規な生物学的分子に関する。
【０００２】
（発明の背景）
多くのペプチド、ポリペプチドおよびタンパク質の治療での使用は、哺乳動物、特に人間におけるそれらの免疫原性のために制約を受ける。例えば、免疫抑制を受けていない患者にマウス抗体を投与する場合、そうした患者の大多数は、ヒト抗マウス抗体（ＨＡＭＡ）を作ることによって導入された外来物質に免疫反応を示す（例えば、Ｓｃｈｒｏｆｆ，Ｒ．Ｗ．ｅｔ  ａｌ（１９８５）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．４５：８７９−８８５；Ｓｈａｗｌｅｒ，Ｄ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ（１９８５）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３５：１５３０−１５３５）。２つの重大な結果がある。第１は、患者の抗マウス抗体が、治療用抗体または免疫複合体と、これらが例えば腫瘍に結合してその治療機能を果たす機会を得る前に、結合してこれらを除去することがあるという点である。第２に、患者がマウス抗体へのアレルギー反応を深め、将来さらに何らかのマウス免疫グロブリンに曝された時アナフィラキシーショックを起こす危険があり得るという点である。
【０００３】
いくつかの方法がＨＡＭＡ問題に対処すべく用いられ、この結果、治療用モノクローナル抗体の人体での使用が可能になっている（例えばＷＯ−Ａ−８９０９６２２およびＥＰ−Ａ−０２３９４００、ＥＰ−Ａ−０４３８３１０、ＷＯ−Ａ−９１０９９６７を参照）。これらの組換えＤＮＡ手法は、一般に最終的な抗体構成体においてマウス遺伝子情報を低減させる一方、最終構成体中のヒト遺伝子情報を増加させるものである。それにもかかわらず、得られた「ヒト化」抗体は、依然として患者に免疫反応を誘発する場合があった［Ｉｓｓａｃｓ  Ｊ．Ｄ．（１９９０）  Ｓｅｍ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２：４４９，４５６；Ｒｅｂｅｌｌｏ，Ｐ．Ｒ．ｅｔ  ａｌ（１９９９）Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ６８：１４１７−１４２０］。
【０００４】
これらの方法論に共通する特徴は、ヒト抗体タンパク質の中に存在するのと同一のアミノ酸残基（アミノ酸残基配列の顕著な特徴領域でもよい）を、通常げっ歯類に由来する治療用抗体に導入することであった。異なる種の抗体分子中の構造的（および機能的）保存度が比較的高いため、抗体については、この方法が可能である。しかし、治療用途に使えると考えられるペプチド、ポリペプチドおよびタンパク質については、ホスト種（例えばヒト）に治療用タンパク質について構造上の同族体が存在しない場合もあり、このような方法は適用できない。さらに、これらの方法は、ヒトアミノ酸残基配列の一般的な導入は再モデル化された抗体に免疫原性を与えないであろうということを前提としていた。しかし、ある短いペプチド配列（「Ｔ細胞エピトープ」）は、細胞内でのペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の分解中に放出され得るものであり、続いて、Ｔ−細胞の活性化を起動すべく主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）分子によって提示されることが知られている。ＭＨＣクラスＩＩによって提示されたペプチドの結果として、Ｔ細胞のこのような活性化は、次いで、例えば、Ｂ細胞の直接の刺激による抗体応答を引き起こし、そうした抗体を産生する。したがって、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質から潜在的なＴ細胞エピトープを除去することが望ましいであろう。ヒトに由来する、しかも人体内に存在するのと同じアミノ酸配列を有するタンパク質でさえ、人体内で免疫反応を引き起こすことがある。顕著な例としては、とりわけ、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子［Ｗａｄｈｗａ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ（１９９９）Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５：１３５３−１３６１］やインターフェロンアルファ２［Ｒｕｓｓｏ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ（１９９６）Ｂｒｉ．Ｊ．Ｈａｅｍ．９４：３００−３０５；Ｓｔｅｉｎ，Ｒ．ｅｔ  ａｌ（１９８８）Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．Ｍｅｄ．３１８：１４０９−１４１３］の治療上の使用が挙げられる。
【０００５】
タンパク質からのＴ細胞エピトープの除去は以前にも開示されている（例えば、ＷＯ  ９８／５２９７６、ＷＯ  ００／３４３１７を参照）。先行技術に開示された一般的な方法は、次のステップを含む：
（ａ）ポリペプチドまたはその一部のアミノ酸配列を決定すること；
（ｂ）インビトロまたはインシリコ技術を用いるか生物アッセイを用いてペプチドのＭＨＣ分子への結合を測定することを含む任意の方法によりタンパク質のアミノ酸配列内の１つまたは複数の潜在的なＴ細胞エピトープを識別すること；
（ｃ）インビトロまたはインシリコ技術を用いるか生物アッセイを用いてペプチドのＭＨＣ分子への結合を測定したＴ細胞エピトープ活性を実質的に低減するか除去するように、識別された潜在的なＴ細胞エピトープ内の１つまたは複数のアミノ酸を用いて修飾した新規な配列変異体を設計する。このような配列変異体は、そのような新しい潜在的なＴ細胞エピトープが、設計ごとに、Ｔ細胞エピトープの活性を実質的に低減するか除去するように修飾されないのであれば、配列変化によって新しい潜在的なＴ細胞エピトープの生成を回避する方法で作成される。
（ｄ）組換えＤＮＡ技術によってそのような配列変異体を構築し、所望の特性を備えた１つまたは複数の変異体を識別するために前記変異体を試験すること。
【０００６】
合成ペプチドとの組合せで、ヒトまたは実験動物の末梢血試料から得られたＴ細胞クローンと結合し得る組換えＭＨＣ分子の可溶性複合体を開発する他の技術が、当技術分野で使用され［Ｋｅｒｎ，Ｆ．ｅｔ  ａｌ（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ４：９７５−９７８；Ｋｗｏｋ，Ｗ．Ｗ．ｅｔ  ａｌ（２００１）ＴＲＥＮＤＳ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｏｌｏｇｙ  ２２：５８３−５８８］、さらにエピトープ識別戦略において開発されるかもしれない。
【０００７】
潜在的Ｔ細胞エピトープ（ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｅｐｉｔｏｐｅｓ）は、ＭＨＣクラスＩＩ分子に結合する能力を備えた任意のアミノ酸残基配列として一般に定義される。このようなＴ細胞エピトープは、ＭＨＣ結合を確立することで測定できる。「Ｔ細胞エピトープ」は、暗黙的にＭＨＣ分子に結合する際、Ｔ細胞レセプター（ＴＣＲ）によって認識され、少なくとも原理的には、これらＴ細胞の活性化を引き起こし得るエピトープを意味する。しかし、ＭＨＣクラスＩＩ分子に結合することが判明しているある種のペプチドはタンパク質配列において保持されているものと通常理解されており、このようなペプチドは、最終タンパク質が投与される有機体内で免疫寛容となる。
【０００８】
本発明は、治療目的で同種（ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ）の有機体に導入された可溶性タンパク質は、免疫反応を引き起こし、その可溶性タンパク質に結合する宿主抗体の進行をもたらしうるという、実際ある現実を克服することを想定している。とりわけ１つの例を挙げれば、このタンパク質が内生的に生産されるという事実にもかかわらずある割合のヒト患者が抗体を作るインターフェロンアルファ２である［Ｒｕｓｓｏ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ（１９９６）；Ｓｔｅｉｎ，Ｒ．ｅｔ  ａｌ（１９８８）］。
【０００９】
ＭＨＣクラスＩＩ分子は、ヘルパーＴ細胞の選択および活性化に中心的な役割を果たす高度に多型的なタンパク質のグループである。ヒトの白血球抗原グループＤＲ（ＨＬＡ−ＤＲ）はこのグループタンパク質で優越的なアイソタイプで、本発明の主な着目点である。しかしながら、アイソタイプＨＬＡ−ＤＱおよびＨＬＡ−ＤＰも同様の機能を果たし、したがって本発明は、これらにも等しく適用可能である。ＭＨＣ  ＨＬＡ−ＤＲ分子はホモダイマーであり、その各「半分」はα鎖とβ鎖からなるヘテロダイマーである。各ヘテロダイマーは、９〜２０個の範囲のアミノ酸長のペプチドに結合するリガンド結合領域を有するが、結合溝に収容できるのは最高９〜１１個のアミノ酸である。リガンド結合領域は、α鎖の１〜８５個のアミノ酸およびβ鎖の１〜９４個のアミノ酸が含まれる。ＤＱ分子は、相同的な（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ）構造を有することが最近示されており、ＤＰ族タンパク質も非常に類似していると予想される。ヒトでは、およそ７０種類の異なるＤＲアロタイプが知られており、ＤＱについては３０種類の異なるアロタイプが、また、ＤＰについては４７種類の異なるアロタイプが知られている。各個人は２〜４個のＤＲ対立遺伝子、２個のＤＱおよび２個のＤＰ対立遺伝子を有する。多数のＤＲ分子の構造が解明されており、それらの構造は、ペプチドの疎水性残基（ポケット残基）と結合する多数の疎水性ポケットを有する開放端のペプチド結合溝を指している［Ｂｒｏｗｎ  ｅｔ  ａｌ  Ｎａｔｕｒｅ（１９９３）３６４：３３；Ｓｔｅｒｎ  ｅｔ  ａｌ（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ  ３６８：２１５］。クラスＩＩ分子の様々なアロタイプを識別する多型は、ペプチド結合溝内の様々な異なるペプチド結合表面に寄与し、集団レベルで外来タンパク質を認識し病原性有機体への免疫反応を引き起こす能力に関する最大の柔軟性を保証する。
【００１０】
リガンド結合領域には相当な量の多型が存在し、これは異なる地理的な集団および民族グループ内で区別される「ファミリー」を備えている。この多型は、ペプチド結合領域の結合特性に影響し、したがって、ＤＲ分子の異なる「ファミリー」は、幾分かは重複があるかもしれないが、異なる配列特性を備えたペプチドに対して特異性を有するであろう。この特異性は、Ｔｈ細胞エピトープの認識（クラスＩＩ  Ｔ細胞反応）を決定し、これは最終的には、Ｔｈ細胞エピトープが由来するのと同じタンパク質上に存在するＢ細胞エピトープに対する抗体反応を駆動する原因となる。したがって、個人におけるタンパク質への免疫反応は、その個人のＨＬＡ−ＤＲアロタイプのペプチド結合特異性によって決まるＴ細胞エピトープ認識によって重大な影響を受ける。したがって、世界的な人口レベルにおいてタンパク質またはペプチド内のＴ細胞エピトープを識別するためには、ＨＬＡ−ＤＲアロタイプのできるだけ多様なセット（それにより、世界人口のできるだけ高い割合をカバーする）の結合特性を考慮することが望ましい。
【００１１】
免疫反応誘導の主要な要因は、ＭＨＣクラスＩＩ分子上で提示を介してＴ細胞活性を刺激し得るペプチドがタンパク質内に存在することである。したがって、免疫原性を除去するか低減するためには、Ｔ細胞エピトープを識別しタンパク質から除去することが望ましい。
【００１２】
非修飾生物学的分子は、種々多数の宿主細胞型を用い、それ自体は当技術分野でよく知られている遺伝子組換え法により製造できる。しかし、増強された特性を備えた前記生物学的分子の類似体が継続的に必要とされている。強化が望まれている点としては前記治療剤の発現および精製のための別スキーム及び精製の様式（ｍｏｄａｌｉｔｙ）が含まれるが、また特に、タンパク質の生物学的特性における改良も含まれる。ヒトに投与した際のインビボ特性の改善は特に必要である。この点では、対象とするヒトに免疫反応を引き起こす可能性が低減されているか可能性のない選択された生物学的分子の提供が強く望まれている。そのようなタンパク質は、対象とするヒトの体内で増加した循環時間を示すことが期待され、そうした生物学的分子について多数の例が示されている慢性または再発性の疾病状態において特に有益であろう。
【００１３】
（発明の概要）
したがって、本発明は以下の２種の一般的な態様に関する：
（ａ）ＭＨＣクラスＩＩ分子の世界的に多種多様な数のＴ細胞エピトープを識別し計算するための便利かつ有効な計算方法、および、この知識に基づいた、改善された特性を備えた生物学的分子の新しい配列変異体の設計および構築、並びに
（ｂ）新規な、特にヒトに、特に治療目的で投与される生物学的に活性な分子；前記の生物学的分子は本発明によれば、免疫原性が修飾されたポリペプチド、タンパク質または免疫グロブリン（抗体）であり、これらは本発明の方法によって製造され、修飾によりこれら生物学的分子は、対象とするヒトに投与された時に免疫反応を誘発する傾向が低減されたものである。
【００１４】
特に、本発明は、本発明による方法によって得られ、その結果、インビボで使用した際に、実質的に非免疫原性であるか非修飾の相当物に比較して免疫原性が低減されたタンパク質をもたらす、ヒト由来または非ヒト由来の治療上の有益性の高い何種類かの一般によく知られたタンパク質および抗体の修飾に関する。本発明の新規な方法によって修飾された分子は、対象とするヒトの体内で増加した循環時間を示すことが期待され、いくつかの適応症に当てはまるような慢性または再発性の疾病状態において特に有益であろう。本発明は特定の実施形態として、また、本発明方法の効果を示すために、インビボでの強化された特性を示すと期待される前記分子の修飾形を提供する。免疫原性が修飾された、つまり、免疫原性が低下したこれらの分子は、医薬組成物において使用できる。このような修飾された分子を本発明では「免疫原性において」修飾されたと呼ぶ。
【００１５】
Ｔ細胞エピトープを部分的に計算手段によって識別する方法は、理論的なＴ細胞エピトープ値を計算し、かつしたがってタンパク質内のペプチドを結合する潜在的なＭＨＣクラスＩＩ分子を識別するために利用することができる；ここで、結合サイトは、タンパク質内のアミノ酸サイトの配列を含む。次いで、識別されたペプチドを、タンパク質の治療上の価値を実質的に低減せずに、むしろおそらくは増強するように修飾することができる。この計算方法は、知られているアミノ酸残基配列を有するタンパク質領域を選択すること、所定の均一サイズを有し、少なくとも３個のアミノ酸残基によって構成される重複したアミノ酸残基セグメント（ウィンドウ）を選択された領域から連続的に採取すること、採取されたセグメントの各々についてＭＨＣクラスＩＩ分子結合スコアを計算すること、およびそのセグメントについて計算されたＭＨＣクラスＩＩ分子結合スコアに基づいて、前記サンプリングされたセグメントのうち修飾に適した少なくとも１つを識別することを含む。実質的にタンパク質の治療上の有用性を低減させずに、ペプチドに対するＭＨＣクラスＩＩ結合総合スコアを変更することができる。
【００１６】
本発明の１つの態様において、選択されたアミノ酸残基セグメントについてのＭＨＣクラスＩＩ結合スコアは、ペプチドの採取されたアミノ酸残基セグメント中に存在する各疎水性アミノ酸残基側鎖に対して割り当てられた値を合計することにより計算される。グラフとしての概観を得るためには、その合計値をセグメントの中間点付近の単一のアミノ酸残基に割り当てることができる。この操作をペプチド領域または対象とする領域において重複するセグメント（ウィンドウ）の各々について繰り返す。存在する芳香族側鎖のそれぞれに割り当てられる値は、個々の疎水性脂肪族側鎖に割り当てられる値の約２分の１である。疎水性脂肪族側鎖は、バリン、ロイシン、イソロイシンおよびメチオニン中に存在するものである。芳香族側鎖はフェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファンに存在するものである。芳香族側鎖に割り当てられる好ましい値は約１で、疎水性脂肪族側鎖に対しては約２である。もっとも、他の値を利用することもできる。
【００１７】
したがって、第１の態様では、本発明は、
インビトロまたはインシリコ技術を用いるか、または生物アッセイを用いてペプチドのＭＨＣ分子への結合を測定することを含むステップにより、生物学的分子のアミノ酸配列内の１つまたは複数の潜在的なＴ細胞エピトープペプチドを識別するのに適した計算に基づく方法であって、前記方法が次のステップを含む方法を提供する：
（ａ）公知のアミノ酸残基配列を有するペプチド領域を選択すること；
（ｂ）選択された領域から少なくとも３つのアミノ酸残基によって構成される所定の一定サイズの重複するアミノ酸残基セグメントを連続して採取すること；
（ｃ）前記採取されたアミノ酸残基セグメント中に存在する疎水性のアミノ酸残基側鎖各々に対し割り当てられた値を合計することにより、前記採取されたセグメントの各々について、ＭＨＣクラスＩＩ分子結合スコアを計算すること；および
（ｄ）そのセグメントについて計算されたＭＨＣクラスＩＩ分子結合スコアに基づいて、採取されたセグメントのうち修飾に適した少なくとも１つを識別し、実質的にペプチドの治療上の有用性を低減させずにペプチドに対するＭＨＣクラスＩＩ結合総合スコアを変更すること。
【００１８】
特定の実施形態では、本発明は、ステップ（ｃ）を、１２−６ファンデアワールスのリガンド−タンパク質エネルギー反発項およびリガンドコンホメーション（ｌｉｇａｎｄ  ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ）エネルギー項を含むように修正されたベームスコアリング関数（Ｂｏｅｈｍ  ｓｃｏｒｉｎｇ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ）を用い、
（１）ＭＨＣクラスＩＩ分子モデルの第１のデータベースを提供すること；
（２）前記ＭＨＣクラスＩＩ分子モデルについて許容されるペプチド骨格の第２のデータベースを提供すること；
（３）前記第１のデータベースからモデルを選択すること；
（４）前記第２のデータベースから許容されるペプチド骨格を選択すること；
（５）採取された各セグメント中に存在するアミノ酸残基側鎖を識別すること；
（６）採取された各セグメント中に存在するすべての側鎖に対する結合親和性値を決定すること；および
（７）場合によっては、前記各モデルと各骨格についてステップ（１）〜（５）を繰り返すことによって実行する方法に関する。
【００１９】
さらに別の実施形態では、採取された各配列の結合スコアは、(i)ＭＨＣクラスＩＩ分子モデルの第１のデータベースを提供すること；(ii)前記ＭＨＣクラスＩＩ分子について許されるペプチド骨格の第２のデータベースを提供すること；(iii)各骨格の各位置で、２０個のアミノ酸の各々について許されるアミノ酸側鎖コンホメーションの第３のデータベースを与えること；(iv)前記第１のデータベースからモデルを選択すること；(v)前記第２のデータベースから許されるペプチド骨格を選択すること；(vi)前記第３のデータベースから、各採取されたセグメントの中にあるアミノ酸残基側鎖をそれらの許されるコンホメーションと共に識別すること；(vii)各許されるコンホメーションにおいて各採取されたセグメントに存在するすべての側鎖について最適な結合親和性の値を決定すること；(viii)前記各骨格に対しステップ(v)から(vii)を繰り返し、最適の結合スコアを決定すること；および、(ix)前記各モデルに対しステップ(iv)から(viii)を繰り返すことにより計算される。
【００２０】
上記３つのデータベースは結合して１つのデータベースとできること、あるいは、いずれか２つのデータベースは結合して１つの組合せデータベースとできることが理解されるべきである。採取するアミノ酸残基セグメントの長さは変えることができる。好ましくは、採取するアミノ酸残基セグメントは、約１０個から約１５個のアミノ酸残基、より好ましくは約１３個のアミノ酸残基から構成される。
【００２１】
採取するアミノ酸残基セグメントは、重複の程度を変えることができる。好ましくは、採取するアミノ酸残基セグメントは実質的に重複する。最も好ましくは、連続する採取アミノ酸残基セグメントは、１個のアミノ酸残基以外のすべてで互いに重複する。すなわちｎ残基を有するアミノ酸残基セグメントでは、ｎ−１残基が、次の連続する採取アミノ酸残基セグメントと重複する。
【００２２】
したがって、本発明は、より詳細には、さらに次のさらに好適な実施形態に関する：
・各芳香族側鎖に対して割り当てられる値が各疎水性脂肪族側鎖に対し割り当てられる値の約２分の１である、上記に従い特定される方法；
・採取するアミノ酸残基セグメントが１３個のアミノ酸残基によって構成される、上記に従い特定される方法；
・連続する採取アミノ酸残基セグメントが１〜５個のアミノ酸残基重複する、上記に従い特定される方法；
・連続する採取アミノ酸残基セグメントは互いに実質的に重複する、上記に従い特定される方法；
・連続する採取アミノ酸残基セグメント中のアミノ酸残基のうちの１個以外のすべては重複する、上記に従い特定される方法。
【００２３】
第２の基本的態様では、本発明は、様々な生物学的分子において１個または複数のＴ細胞エピトープを除去した修飾形（ここで、前記修飾は上記および特許請求の範囲に記載した方法によって達成することができる）を提供する。こうした分子は、上に挙げた先行技術に記載されるような方法でも製造できるが、本発明の方法によって得られた分子は増強された特性を示す。先行技術の教示では、予測されたＴ細胞エピトープは、非ヒト由来およびヒト由来の両方の治療用抗体または非抗体タンパク質の１次配列内の妥当な（judicious）アミノ酸置換によって除去される。
【００２４】
本発明は、インビボで増強された特性を示すと予想されるタンパク質および免疫グロブリンの修飾形を提供する。
【００２５】
したがって、本発明の目的は、親分子から誘導される免疫原性において修飾された生物学的分子の製造方法であって、修飾された分子は前記親分子のアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を有しており、所与の種の免疫系に曝された時、親分子に比較して低減された免疫原性を示し；(i)親生物学的分子またはその一部のアミノ酸配列を決定すること；(ii)インビトロまたはインシリコ技術を用いるか生物アッセイを用いてペプチドのＭＨＣ分子への結合を測定することを含む任意の方法によりタンパク質のアミノ酸配列内の１個または複数の潜在的なＴ細胞エピトープを識別すること；(iii)Ｔ細胞エピトープ配列の活性または数および／または前記生物学的分子から誘導されるペプチドを結合することができるＭＨＣ分子アロタイプの数（これらはインビトロもしくはインシリコ技術を用いるか生物アッセイを用いてペプチドをＭＨＣ分子に結合させることにより、またはペプチド−ＭＨＣ複合体をＴ細胞に結合させることにより測定される）を実質的に低減するか除去するように修飾して、本来識別されたＴ細胞エピトープ配列内の少なくとも１個のアミノ酸残基を変更することにより新規な配列変異体を設計すること；(iv)組換えＤＮＡ技術によってそのような配列変異体を構成し、所望の特性を備えた１つまたは複数の変異体を識別するために前記変異体を試験すること；および(v)場合によってはステップ(ii)〜(iv）を繰り返すことを含み、ここで、ステップ(ii)によるＴ細胞エピトープ配列の識別が上記および下記に特定される方法によって達成されるものである方法を提供することである。
【００２６】
本発明によるステップ(iii)の特定の実施形態は以下に要約されるステップに関する：
・本来存在するＴ細胞エピトープ配列のいずれかにおいて１〜９個のアミノ酸残基が変更されている、上記に従い特定される方法；
・本来存在するＴ細胞エピトープ配列のいずれかにおいて１個のアミノ酸残基が変更されている、上記に従い特定される方法；
・変更が、同族体タンパク質配列に関して、および／またはインシリコモデリング技術において行われる、上記に従い特定される方法；
・アミノ酸残基の変更が、特定の位置において本来存在するアミノ酸残基を他のアミノ酸残基によって置換、付加または欠失させるものである、上記に従い特定される方法；
・前記生物学的分子の生物活性を回復するために、特定のアミノ酸の置換、欠失または付加によるさらに一層の変更が行われる、上記に従い特定される方法。
【００２７】
ステップ(ii)を例外として、ここに開示する方法の他のステップは、当業者によく知られた方法および技術により達成できる。修飾された生物学的分子は好ましくは組換え技術により調製されるので、対応するＤＮＡ構成体は、ステップ(i)の方法によって識別されたアミノ酸残基の交換の完了後にアミノ酸配列から推定された。ここに使用される組換え技術は、当技術分野ではよく知られている（例えばＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ，ＵＳＡ））。
【００２８】
本発明によって得られる生物学的分子は、好ましくはペプチド、タンパク質、抗体、抗体断片または融合タンパク質である。本発明はさらに、同一または同様の生物学的および／または薬理学的活性を有する前記分子の修飾、変種、変異体、断片、誘導体、グリコシル化されていないもの、部分的にまたは完全にグリコシル化された形式をさらに含む。
【００２９】
本方法において開示される方法は特定の生物学的分子に限定されないが、発明の特定の実施形態では、当技術分野で知られており治療上の有用性および有益性を示す分子が好ましくは提供される。したがって、本発明の目的は、親分子に由来した免疫原性において修飾された生物学的分子を提供することであり、ここで修飾された分子は、上記または後述する本発明による方法によって得られ、前記親のそれと異なるアミノ酸配列を有し、所与の生物種の免疫系に曝された時、親分子に比較して低減された免疫原性を示す。
【００３０】
前記方法によって得られる特に興味深い生物学的分子は以下の群から選択される：
（ａ）モノクローナル抗体：
抗−４０ｋＤ糖タンパク質抗原抗体ＫＳ１／４、
抗ＧＤ２抗体１４．１８
抗−Ｈｅｒ２抗体４Ｄ５（マウス）およびヒト化された変型（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標））、
抗−Ｈｅｒ１（ＥＧＦＲ）抗体ｃ２２５およびｈ４２５
抗−ＩＬ−２Ｒ（抗−Ｔａｃ）抗体（Ｚｅｎａｐａｘ（登録商標））、
抗−ＣＤ５２抗体（ＣＡＭＰＡＴＨ（登録商標））、
抗−ＣＤ２０抗体（Ｃ２Ｂ８、Ｒｉｔｕｘａｎ（登録商標）；Ｂｅｘｘａｒ（登録商標））、
ヒトのＣ５補体タンパク質に向けられた抗体
（ｂ）ヒトタンパク質
ｓＴＮＦ−Ｒ１、ｓＴＮＦ−Ｒ２、ｓＴＮＦＲ−Ｆｃ（Ｅｎｂｒｅｌ（登録商標））、
タンパク質Ｃ、ａｃｒｐ３０、リシンＡ、ＣＮＴＦＲリガンド
スブチリシン、ＧＭ−ＣＳＦ、ヒト卵胞刺激ホルモン（ｈ−ｆｓｈ）
β−グルコセレプロシダーゼ、ＧＬＰ−１、アポリポタンパク質Ａ１、
レプチン（ヒト肥満タンパク質）、ＫＧＦ、Ｇ−ＣＳＦ、
ＢＤＮＦ、ＥＰＯ、ＩＬ−１Ｒアンタゴニスト。
【００３１】
本発明の第３の基本的態様は、免疫原性において修飾されていない親の生物学的分子に由来するＴ細胞エピトープ配列に関する。これらのエピトープは好ましくは１３ｍｅｒペプチドである。これらのペプチド内では、連続する９個のアミノ酸残基を有する配列が好まれる。したがって、そのようなエピトープおよび配列へのアクセスを提供することが本発明の別の目的である。本発明は、より詳細には以下のものに関する：
・同一の生物活性を有するが免疫原性の低減された生物学的分子を調整するための方法として記載されるいずれかの方法によって識別される親の免疫原性において非修飾の生物学的分子のアミノ酸配列内での潜在的なＴ細胞エピトープペプチドの使用；
・前記Ｔ細胞エピトープが１３ｍｅｒペプチドである潜在的なＴ細胞エピトープペプチドの対応する使用；
・親の非修飾分子と比較して、同一の生物学活性を有する、免疫原性の低減された生物学的分子の調整により上記に特定される１３ｍｅｒ  Ｔ細胞エピトープの連続する少なくとも９個のアミノ酸残基からなるペプチド配列の使用。
【００３２】
（図面の簡単な説明）
図１  本発明の計算方法の１つの態様を示すフローチャートである
図２  本発明を実施する計算方法のためのデータベース生成を示すフローチャートである
図３  潜在的なＴ細胞エピトープ用のペプチドのプロファイルを描くためにデータベース問合せ（ｄａｔａｂａｓｅ  ｉｎｔｅｒｒｏｇａｔｉｏｎ）を示すフローチャートである
図４  本発明の計算方法を示す別のフローチャートである
図５  グルタミン酸デカルボキシラーゼ（ＭＷ：６５０００）アイソフォーム（ＧＡＤ  ６５）のＴ−細胞エピトープ可能性指数（Ｔ−ｃｅｌｌ  ｅｐｉｔｏｐｅ  ｌｉｋｅｌｉｈｏｏｄ  ｉｎｄｅｘ）対アミノ酸残基座標（位置）のプロットである
図６  エリスロポエチン（ＥＰＯ）についてのＴ−細胞エピトープ可能性指数対アミノ酸残基座標（位置）のプロットである
図７  ヒト化された抗Ａ３３モノクローナル抗体軽鎖についてのＴ−細胞エピトープ可能性指数対アミノ酸残基座標（位置）のプロットである
図８  ヒト化された抗Ａ３３モノクローナル抗体重鎖についてのＴ−細胞エピトープ可能性指数対アミノ酸残基座標（位置）のプロットである。
【００３３】
図５〜８において、実線(−)は、図１において示されるフローチャートに従った計算方法によって計算されたＴ細胞エピトープ指数を描いている。また、点線(…)は、本発明の別の態様である図３において示されるフローチャートに従った計算方法によって計算されたＴ細胞エピトープの予測数を描いている。
【００３４】
（発明の詳細な説明）
「Ｔ細胞エピトープ」という用語は、本発明についての理解によれば、然るべき程度にＭＣＨ  ＩＩ分子（またはヒト以外の種におけるその等価物）を結合可能で、Ｔ細胞を刺激するおよび／または（必ずしも測定可能な程度に活性化せずに）Ｔ細胞を複合体中でＭＨＣ  ＩＩに結合可能であるアミノ酸配列を意味する。
【００３５】
本明細書および添付する特許請求の範囲において「ペプチド」という用語は、２個以上のアミノ酸を含む化合物である。アミノ酸はペプチド結合（以下に定義される）によって互いに連結される。ペプチドの生物学的生産に関わる２０個の異なる天然アミノ酸が存在し、これらが任意の数、任意の順序で連結して、ペプチド鎖または環を形成する。ペプチドの生物学的生産で使用される天然アミノ酸はすべてＬ‐配置である。合成ペプチドは、Ｌ−アミノ酸、Ｄ−アミノ酸またはこれら２種の異なる配置のアミノ酸の様々な組合せを使用して従来の合成方法を用いて調製できる。ペプチドによっては数単位のアミノ酸しか含まないものもある。短いペプチド、例えばアミノ酸単位が１０個未満のものは、時に「オリゴペプチド」と呼ばれる。他のペプチドは多数のアミノ酸残基、例えば１００個以上を含み「ポリペプチド」と呼ばれる。従来、「ポリペプチド」は３個以上のアミノ酸を含む任意のペプチド鎖と考えられ、「オリゴペプチド」は通常、特に「短い」タイプのポリペプチドと見なされる。したがって、本願では「ポリペプチド」へのどのような言及もオリゴペプチドを含むと理解される。さらに、「ペプチド」へのどのような言及もポリペプチド、オリゴペプチドおよびタンパク質を含む。アミノ酸の個々の異なる配置は異なるポリペプチドまたはタンパク質を形成する。形成することができるポリペプチドの数、したがって異なるタンパク質の数は、実際上無制限である。
【００３６】
これまでに使用し以下に使用する「免疫原性の低減された」という用語は、相対的な用語であり、本発明によって修飾された分子と比較して、同じタイプの種に生体内で曝露された時にそれぞれの本来の出所分子が示す免疫原性と関連する。本発明において「修飾されたタンパク質」という用語は、Ｔ細胞エピトープの数が低減され、したがって所与の種の免疫系に曝露された時、親タンパク質に対して誘発される免疫原性が低減されたタンパク質をいう。本発明において「非修飾タンパク質」という用語は、「修飾されたタンパク質」と比較して「親」タンパク質をいうもので、多数のＴ細胞エピトープを有し、したがって、所与の種の免疫系に曝された時、修飾されたタンパク質に比べ強い免疫原性を有する。
【００３７】
「アルファ炭素（Ｃα）」はペプチド鎖中の炭素水素（ＣＨ）部分の炭素原子である。「側鎖」はＣαへの吊り下がり（ペンダント）基であり、ペプチドの寸法と比較して著しく変動幅の広い物理的な寸法を有する、単純もしくは複雑な基または部分を含むことができる。
【００３８】
Ｔ細胞エピトープは、特定のＴ細胞エピトープのＭＨＣクラスＩＩ分子への結合にとって重要なアミノ酸残基を考慮することによる、本発明の計算方法を用いて識別できる。一度識別されると、その配列中のキーアミノ酸残基の変異などの変更によって、識別された潜在的なＴ細胞エピトープは、アミノ酸残基配列から取り除くか削除することができる。Ｔ細胞エピトープを含みそうな領域におけるペプチドの配列に対して行われ、全結合スコアをより小さくする欠失、付加または置換による任意の修飾は、アミノ酸残基配列の免疫原性をより小さくする効果があるであろう。場合によっては、ＭＨＣクラスＩＩ分子へのあるペプチドの結合を増強することが望ましいかもしれない。例えば、自己免疫疾患に罹患している個体では、Ｔ細胞エピトープを含むと知られている自己抗原（ａｕｔｏａｎｔｉｇｅｎ）領域のペプチド類似体でこうした個体を治療すれば、ある種の自己抗原に対する寛容が回復することができることが提案されている。自然なエピトープは、通常ＭＨＣクラスＩＩ分子への適度な親和性を有するが、一方でペプチド類似体はＭＨＣクラスＩＩ分子に相対的により高い親和性を有するようになる。この高い親和性は、この高親和性エピトープを発現するこうしたＴ細胞を取り除くか、またはそれらをアネルギー性にする（ａｎｅｒｇｉｓｅ）免疫監視の促進において重要である。Ｔ細胞エピトープへのこの修飾はさらにペプチドのタンパク質レベルで行うことも可能であり、全タンパク質を、治療剤として投与することもできる。
【００３９】
タンパク質やポリペプチドの全体的構造を決定するのに重要な役割を果たす要因は多数存在する。第１に、ペプチド結合、アミノ酸を鎖状に互いに連結するその結合は、共有結合である。この結合は平面構造であり実質的に置換アミドである。「アミド」は以下の基を含む有機化合物の任意の基である。
【００４０】
【化１】
2004523754.tif 000003
隣接アミノ酸のＣαを連結する平面状ペプチド結合は以下に示すように表すことができる：
【００４１】
【化２】
2004523754.tif 000004
Ｏ＝ＣおよびＣ−Ｎ原子は比較的剛性な平面内にあるので、これらの軸の周りに自由な回転は生じない。このため、破線によって模式的に描いた平面は時として「アミド平面」または「ペプチド平面」と呼ばれ、この平面にはペプチド骨格の酸素（Ｏ）、炭素（Ｃ）、窒素（Ｎ）および水素（Ｈ）原子が載る。このアミド平面の相対する両隅にはＣα原子が位置する。ペプチド平面すなわちアミド平面内では、Ｏ＝ＣおよびＣ−Ｎ原子の周りの回転が実質的にないので、ポリペプチド鎖はＣα原子を連結する一連の平面状ペプチド結合を含む。
【００４２】
ポリペプチドまたはタンパク質の全体構造または立体構造を規定する上で重要な役割を果たす第２の要因は、共通なＣα連結の周りの各アミド平面の回転角である。「回転角」および「ねじり角」という用語は以下では同義語と見なされる。アミド平面にＯ、Ｃ、ＮおよびＨ原子が載ると仮定すると（立体構造によってはこれらの原子のうちいくつかは平面から若干ずれるかもしれないが、これは通常有効な仮定である）、これらの回転角はＮとＲポリペプチドの骨格の立体構造、つまり隣接残基間に存する構造を定義する。これらの２つの角度はφおよびψとして知られている。したがって、１組の角度、φiおよびψi（ここで添字ｉはポリペプチド鎖の特定の残基を表す）はポリペプチドを有効に規定する。
【００４３】
角度φおよびψを定義するのに使用される慣用規則、すなわち、所与のポリペプチドについてのアミド平面が角度０を形成する参照ポイント、並びに角度φの定義および角度ψの定義は、文献に定義される。例えば、Ｒａｍａｃｈａｎｄｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．Ａｄｖ．Ｐｒｏｔ．Ｃｈｅｍ．２３：２８３−４３７（１９６８）、特に２８５−９４ページ参照（これらのページは言及によって本願に組み込まれる）。
【００４４】
本発明の方法は任意のタンパク質に適用することができ、ヒトでは、ＭＨＣクラスＩＩ分子結合溝の主要なポケット１アンカー位置が、特定のアミノ酸側鎖に対してよく設計された特異性を有するという発見に部分的に基づいている。このポケットの特異性は、ＭＨＣクラスＩＩ分子のベータ鎖の位置８６でのアミノ酸の同一性によって決定される。このサイトはポケット１の底に位置し、このポケットに収容され得る側鎖の大きさを決定する（Ｍａｒｓｈａｌｌ，Ｋ．Ｗ．、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５２：４９４６−４９５６（１９９４））。この残基がグリシンである場合、すべての疎水性脂肪族および芳香族アミノ酸（疎水性脂肪族は以下のものである：バリン、ロイシン、イソロイシンおよびメチオニン、また芳香族は以下のものである：フェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファン）は、ポケット内に収容され得る（芳香族側鎖が優先される）。このポケット残基がバリンである場合、このアミノ酸側鎖はポケット内部に突出するので、収容できるペプチド側鎖のサイズを制限する（例えば疎水性脂肪族側鎖だけが収容可能である）。したがって、アミノ酸残基配列において、疎水性脂肪族および芳香族側鎖を有するアミノ酸が存在する場合にはいつでも、ＭＨＣクラスＩＩ制限Ｔ細胞エピトープが存在する可能性がある。しかし、側鎖が疎水性脂肪族である場合は、芳香族側鎖の場合と比較して、（全人口において、ポケット１タイプの分布がほぼ均一であると定すれば）Ｔ細胞エピトープに関連する可能性はおよそ２倍である。
【００４５】
本発明を具体化する計算方法は、以下のようにＴ細胞エピトープを含むペプチド領域の可能性を特徴づける：
（１）予め定義した長さのペプチドセグメントの１次配列を走査し、存在する疎水性脂肪族と芳香族側鎖をすべて識別する。（２）疎水性脂肪族側鎖には芳香族側鎖用のそれより大きな値、好ましくは芳香族側鎖に割り当てる値の約２倍を割り当てる（例えば、疎水性脂肪族側鎖に対しては値２を、芳香族側鎖に対しては値１を割り当てる）。（３）ペプチド内の予め定義した一定の長さの各重複するアミノ酸残基セグメント（ウィンドウ）について存在が決定された値を合計し、特定のセグメント（ウィンドウ）に対する値の合計を、セグメント（ウィンドウ）の中間位置で単一のアミノ酸残基、好ましくは、サンプリングされたセグメント（ウィンドウ）の中間点付近の残基に割り当てる。この手続きを、サンプリングされた各重複するアミノ酸残基セグメント（ウィンドウ）について繰り返す。したがって、ペプチドの各アミノ酸残基は、特定のセグメント（ウィンドウ）内に存在するＴ細胞エピトープの可能性に関係のある値を割り当てられる。（４）上記ステップ３に記載するように計算し割り当てた値は、評価するアミノ酸残基配列全体のアミノ酸座標に対してプロットすることができる。（５）予め定義した値（例えば値１）のスコアを有する配列のすべての部分は、Ｔ細胞エピトープを含むと認められ、必要であれば、修飾することができる。
【００４６】
本発明のこの特定の実施態様は、Ｔ細胞エピトープを含むであろうペプチド領域を記述できる一般的な方法を提供する。これらの領域内のペプチドに対する修飾は、ＭＨＣクラスＩＩ結合特性を修飾する可能性を有する。
【００４７】
本発明の別の実施態様によれば、ＭＨＣクラスＩＩ対立遺伝子モデルによりペプチドの相互作用を考慮に入れたより精巧な計算方法を使用して、Ｔ細胞エピトープをより高精度で予想できる。
【００４８】
特にこの実施態様によるペプチド内に存在するＴ細胞エピトープの計算上の予想では、すべての公知のＭＨＣクラスＩＩ分子の構造に基づく少なくとも４２個のＭＨＣクラスＩＩ対立遺伝子のモデルの構築が考えられ、Ｔ細胞エピトープの計算による識別におけるこれらのモデルの使用、相対的なペプチド骨格アルファ炭素（Ｃα）位置の知られた変わりやすさを考慮に入れるための各モデルのペプチド骨格のライブラリーの構築、ペプチドとＭＨＣクラスＩＩ分子との間の相互作用において重要な位置での２０個のアミノ酸置換各々のための各モデルを備えた各骨格ドック（ｄｏｃｋ）のアミノ酸側鎖コンホメーションのライブラリーの構築、および特定のＭＨＣクラスＩＩ分子に収容（ｄｏｃｋ）された特定のペプチドについての最適な骨格および側鎖コンホメーション選択のための、これら骨格および側鎖コンホメーションライブラリーの使用、並びにこの相互作用からの結合スコアの誘導が考えられる。
【００４９】
ＭＨＣクラスＩＩ分子のモデルは相同モデリングによって、ブルックヘブン（Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ）タンパク質データバンク（「ＰＤＢ」）で見出された多数の同様の構造から誘導できる。これらは、エネルギー最小化のためのＣＨＡＲＭｍ力場（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ  Ｉｎｃ．、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、Ｃａ．から入手可能）と共に、シミュレートされたアニーリング機能を組み込んだ半自動的な相同モデリングソフトウェア（Ｍｏｄｅｌｌｅｒ，Ｓａｌｉ  Ａ．＆  Ｂｌｕｎｄｅｌｌ  ＴＬ．、１９９３．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ  ２３４：７７９−８１５）によって形成できる。別のモデリング方法も同様に利用できる。
【００５０】
本願の方法は、ＭＨＣクラスＩＩ分子の小さな集合について結合溝内の各位置での各アミノ酸選択肢の実験により得た結合データのライブラリーを使用する他の計算方法（Ｍａｒｓｈａｌｌ，Ｋ．Ｗ．、ｅｔ  ａｌ．、Ｂｉｏｍｅｄ．Ｐｅｐｔ．Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ、１（３）：１５７−１６２）（１９９５）や溝内の特定タイプの結合ポケットの結合特性を定義するために実験による同様の結合データを使用し（ここでもまたＭＨＣクラスＩＩ分子の比較的小さな部分集合を使用する）次いでこのポケットライブラリーからポケットタイプを「混合およびマッチング」して人為的に別の「仮想的な」ＭＨＣクラスＩＩ分子を生成するさらに別の計算方法（Ｓｔｕｒｎｉｏｌｏ  Ｔ．、ｅｔ  ａｌ．、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ、１７（６）：５５５−５６１（１９９９）と著しく異なる。先行技術は両方とも分析が複雑である点および多数のペプチド変異体を合成する必要がある点の不利益を被り、少数のＭＨＣクラスＩＩ分子しか実験的に走査できない。したがって、第１の先行技術の方法は少数のＭＨＣクラスＩＩ分子の予想しかできない。第２の先行技術の方法は、異なるクラスＩＩ対立遺伝子間においては、１個の分子中で類似したアミノ酸で裏打ちされているポケットは同じ結合特性を持つという仮定も前提としており、ポケットライブラリーに含まれるポケットを含むそうしたＭＨＣクラスＩＩ分子だけが「仮想的に」生成されるという欠点をさらに有する。本明細書に述べるモデリング手法を使用すれば、任意の数およびタイプのＭＨＣクラスＩＩ分子の構造を推定でき、したがって全集団を代表する対立遺伝子を特異的に選択できる。さらに、走査されるＭＨＣクラスＩＩ分子の数は、複雑な実験によって追加データを生成する必要以上にさらにモデルを生成することにより増加させることができる。
【００５１】
骨格ライブラリーの使用により、走査されている様々なペプチドについて、特定のＭＨＣクラスＩＩ分子に収容された時のＣα原子位置における変化を考慮に入れることができる。この点もまた、上記の先行技術における計算方法（これらは特定のポケット中でアミノ酸結合を走査するため単純化されたペプチド骨格の使用に依存している）と対照的である。これらの単純化された骨格は、「実際の」ペプチドで見つかる骨格構成の代表ではないであろうし、その結果、ペプチド結合の予想が不正確になる。本発明の骨格ライブラリーは、タンパク質データバンク内で見出されるＭＨＣクラスＩＩ分子に結合するすべてのペプチドの骨格を重ね、結合溝内に位置する１１個のアミノ酸各々のＣα原子間の２乗平均平方根（ＲＭＳ）偏差を記録することにより生成される。このライブラリーは、より大きな変動の可能性までも考慮に入れるために、少数（現在１３個）の適切な利用可能なマウスおよびヒト構造から誘導できる一方、各Ｃ”−αについてのＲＭＳ数値は、５０％増加する。その後、各アミノ酸の平均のＣα位置が決定され、その半径がその位置でのＲＭＳ偏差プラス５０％と等しい球がこの点のまわりに描かれる。この球体は許容されるＣα位置をすべて表す。
【００５２】
最小のＲＭＳ偏差を有するＣα（これは、上記のポケット１中のアミノ酸であり、結合溝中の１１個の残基の位置２と等価である）を動かして、球体は３次元的にグリッド化され、次いでグリッド内の各頂点はそのアミノ酸のＣαのために可能な位置として使用される。結果として得られるアミド平面は、引き続きアミノ酸へのペプチド結合に対応し、これらのＣαの各々にグラフトされ、次のＣαを位置付けるためにφおよびψ角を所定の間隔で回転させる。引き続きＣαがＣαに対して「許容される位置の球」内にある場合にはジペプチドの向きが許容され、それが球の外部になる場合には、ジペプチドは拒絶される。その後、先行するＣαのあらゆる組合せから９個の後続Ｃαがすべて位置付けられるまで、ペプチドがポケット１  Ｃα「種子」から成長するように後続Ｃα位置の各々についてこのプロセスを繰り返す。次いで、ポケット１の前の単一Ｃαについてこのプロセスをもう一度繰り返して結合溝内に位置する骨格Ｃα位置のライブラリーを生成する。
【００５３】
生成された骨格の数はいくつかの要因に依存する：「許容される位置の球」の大きさ；ポケット１位置の「１次球」のグリッドの精密さ；後続Ｃαを位置付けるために用いるφおよびψの段階的回転角の精密さ。このプロセスを使用すると、大きな骨格ライブラリーを生成できる。骨格ライブラリーが大きい程、ＭＨＣクラスＩＩ分子の結合溝内の特定のペプチドに対して最もよく適合するものが見つかる可能性は大きくなる。各対立遺伝子について、結合領域のアミノ酸との衝突により、必ずしもすべての骨格がＭＨＣクラスＩＩ分子のすべてのモデルに収容されるのには適さないため、その対立遺伝子によって収容され得る骨格を含むライブラリーの部分集合が生成される。骨格ライブラリーの使用は、ＭＨＣクラスＩＩ分子モデルと共に、各許容される骨格に収容される各ＭＨＣクラスＩＩ分子について結合溝の各位置の各アミノ酸の許容される側鎖コンホメーションからなる徹底的なデータベースを作成する。このデータセットは、単純な立体的重なり関数を用いて生成され、ここで、ＭＨＣクラスＩＩ分子は骨格と結合し、アミノ酸側鎖は所望の位置で骨格上にグラフトされる。各々の側鎖の回転可能な結合を設定した間隔で段階的に回転させ、得られる原子位置は注目する結合に依存する。原子と結合溝の側鎖の原子との相互作用が注目され、位置は次の基準によって許容されるか拒絶される：ここまでに位置付けられたすべての原子の重なりの合計は、予め決めた値を超過してはならない。
【００５４】
したがって、コンホメーション探索の厳格性は、結合の段階的回転で用いる間隔と全重なりについて予め決めた限界の関数である。特定のポケットが剛性であると知られている場合、この後者の値は小さくなり得るが、ポケット側鎖の位置に比較的柔軟性があると知られている場合は、比較的緩和である。したがって、許容は結合溝ポケット内の柔軟性における変化を模倣するようになすことができる。次いで、ＭＨＣクラスＩＩ分子の各々に収容された時、このコンホメーション探索を各骨格のすべての位置にあるすべてのアミノ酸について繰り返し、側鎖コンホメーションの徹底的なデータベースを作成する。
【００５５】
適切な数式を用いて、上記骨格／側鎖コンホメーションの大きなデータベースの走査により経験的に導き出されるペプチドリガンドコンホメーションと組み合うＭＨＣクラスＩＩ分子モデル間の結合エネルギーを評価する。したがって、９〜２０アミノ酸の範囲で長さが変化する（もっとも、長さは各走査に対しては一定にしておく）可能なペプチドに、以下の計算を施すことにより、タンパク質を潜在的なＴ細胞エピトープについて走査する：ＭＨＣクラスＩＩ分子をその分子に許容されるペプチド骨格とともに選択し、所望のペプチド配列に対応する側鎖をグラフトする。骨格上の特定の位置での原子の識別および特定の側鎖に関する原子間距離データを、そのアミノ酸の許容される各コンホメーションについて集める（上記データベースから得られる）。これを骨格に沿って各側鎖に対して繰り返し、スコアリング関数を用いてペプチドスコアを導く。その骨格のための最良のスコアを保持し、選択されたモデルについて各許容される骨格に対してこのプロセスを繰り返す。すべての許容される骨格から得られたスコアを比較し、最高のスコアをそのＭＨＣクラスＩＩモデル中の所望のペプチドについてのペプチドスコアであると見なす。次いで、このプロセスを、走査されているタンパク質に由来するあらゆる可能なペプチドを備えた各モデルについて繰り返し、ペプチド対モデルのスコアを表示する。
【００５６】
本発明の状況では、結合親和性計算のために提示される各リガンドは、上に議論されるようなペプチドまたはタンパク質から選択されるアミノ酸断片である。したがって、リガンドは、公知の配列のペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質から得られ、長さがおよそ９〜２０個のアミノ酸である選択されたアミノ酸伸張物である。「アミノ酸」および「残基」という用語は以下においては同義語と見なされる。リガンドは、骨格ライブラリーから得た骨格上にグラフトされて検査されるペプチドの連続アミノ酸の形をしており、ペプチド骨格のＣ”−α原子の座標を介して、ＭＨＣクラスＩＩ分子モデルライブラリーから得られるＭＨＣクラスＩＩ分子の結合溝中に位置し、各側鎖に対して許容されるコンホメーションは許容されるコンホメーションデータベースから選択される。関連する原子同一性および原子間距離もこのデータベースから検索し、ペプチド結合スコアを計算するために使用する。ＭＨＣクラスＩＩ結合ポケットへの高い結合親和性を備えたリガンドには、部位指図突然変異生成に対する候補としてフラグが立てられる。フラグが立てられたリガンド（したがって対象タンパク質）でアミノ酸置換を行い、これはその後、結合親和性を予め定義した閾値以下に低減する変更を決定するためにスコアリング関数を使用して再試験する。次いで、これらの変更を対象タンパク質に組み入れ、Ｔ細胞エピトープを除去する。
【００５７】
ＭＨＣクラスＩＩ分子のペプチドリガンドと結合溝の間は、非共有結合性の相互作用（水素結合、静電気的相互作用、疎水性（親油性）相互作用およびファンデアワールス相互作用を含むが、これらに限定されない）を含む。これらは、以下に詳細に述べるペプチドスコアリング関数に含まれている。水素結合は極性または帯電基間で形成され得るもので、２つの他の原子によって共有された水素原子からなる非共有結合であることが理解されるべきである。水素受容体が部分的に負帯電を有する一方で、水素供与体の水素は正電荷を有する。ペプチド／タンパク質相互作用のために、水素結合供与体は、水素と結合した窒素または酸素もしくは窒素に結合した水素のいずれでもよい。水素結合受容体原子は水素と結合していない酸素、水素が全く結合しておらず１個か２個の結合がある窒素、または１つの結合のみある硫黄でもよい。水素を結合した酸素またはイミン窒素（例えばＣ＝ＮＨ−）などのある種の原子は、水素受容体とも供与体ともなり得る。水素結合エネルギーは３〜７ｋｃａｌ／ｍｏｌの範囲であり、ファンデアワールス結合よりはるかに強いが共有結合よりは弱い。水素結合はまた指向性が強く、供与体原子、水素原子および受容体原子が同一直線上にある場合に最も強い。静電的結合は反対荷電のイオン対間で形成され、相互作用の強さはクーロンの法則による原子間の距離の二乗に反比例する。イオン対間の最適距離は約２．８Åである。タンパク質／ペプチド相互作用では、静電的結合がアルギニン、ヒスチジンまたはリジンとアスパラギン酸塩またはグルタミン酸塩との間で形成され得る。それらは水素結合と強さがほぼ似ているが、結合の強さはイオン化基のｐＫａおよび媒体の誘電率に依存するであろう。
【００５８】
親油性（脂肪親和性）相互作用は、タンパク質とペプチドリガンド間に生じる良好な疎水性−疎水性接触である。通常、これらは結合溝のポケット内に埋没したペプチドの疎水性アミノ酸側鎖間に、それらが溶媒に露出しないように生じる。疎水性残基の溶媒への露出は、周囲の溶分子が互いに水素結合を強いられ、かご状のクラスレート構造を形成するので非常に不利である。結果として生じるエントロピーの減少は非常に不利である。
【００５９】
脂肪親和性の強い原子は、極性でもなく水素受容体でもない硫黄や非極性の炭素原子などである。
【００６０】
ファンデアワールス結合は３〜４Å離れた原子間で見られる非特異的な結合である。これは水素結合や静電的結合より弱く特異性も低い。原子のまわりの電荷分布は時間とともに変化し、どの瞬間でも、電荷分布は対称ではない。電荷分布におけるこの一時的な非対称性は、近隣の原子にも同様の非対称性を引き起こす。この結果生じる原子間引力は、ファンデアワールス接触距離で最大に達するが、約２Å〜約１Åに至ると非常に急速に低減する。
【００６１】
逆に、原子間の隔たりが接触距離未満になるとともに、原子の外殻電子雲が重なるため、強い斥力が支配的になる。引力は静電的結合や水素結合に比べて比較的弱いが（約０．６Ｋｃａｌ／ｍｏｌ）、斥力は特に、ペプチドリガンドがタンパク質に成功裡に結合するかどうか決する上で非常に重要であろう。
【００６２】
１つの実施形態では、ベーム（Ｂｏｅｈｍ）スコアリング関数（ＳＣＯＲＥ１手法）が結合定数を評価するために使用される（Ｂｏｅｈｍ，Ｈ．Ｊ．、Ｊ．Ｃｏｍｐｕｔ  Ａｉｄｅｄ  Ｍｏｌ．Ｄｅｓ．、８（３）：２４３−２５６（１９９４）、その内容は言及によってその全体が本願に組み入れられる）。別の実施形態では、スコアリング関数（ＳＣＯＲＥ２手法）が、Ｔ細胞エピトープを含むリガンドの指標として結合親和力を評価するために使用される（Ｂｏｅｈｍ，Ｈ．Ｊ．、Ｊ．Ｃｏｍｐｕｔ  Ａｉｄｅｄ  Ｍｏｌ．Ｄｅｓ．、１２（４）：３０９−３２３（１９９８）、その内容は言及によってその全体が本願に組み入れられる）。しかし、上記の文献に記述されているベーム（Ｂｏｅｈｍ）スコアリング関数は、タンパク質へのリガンドの結合親和力を評価するために使用されるが、この場合、リガンドがタンパク質に成功裡に結合することが既に知られており、タンパク質／リガンド複合体はその構造が解明されタンパク質データバンク（「ＰＤＢ」）の中に存在するものである。したがって、スコアリング関数は、陽性であることが知られた結合データを利用して開発されている。陽性および陰性バインダー間の区別を考慮に入れるために、方程式に反発項を加えなければならない。さらに、結合エネルギーのより満足な評価は、上記のベーム（Ｂｏｅｈｍ）関数の領域ベースのエネルギー項を用いるのではなく対同士の方法で脂肪親和性の強い相互作用を計算することで達成される。したがって、好ましい実施形態では、結合エネルギーは修正されたベーム（Ｂｏｅｈｍ）スコアリング関数を使用して評価される。修正されたベーム（Ｂｏｅｈｍ）スコアリング関数では、タンパク質とリガンド間の結合エネルギー（ΔＧbind）は、以下のパラメーターを考慮して評価される：リガンド（ΔＧo）の並進エントロピーと回転エントロピーの全面的な喪失による結合エネルギーの低減；少なくとも１個のパートナーが中性である、理想的な水素結合からの寄与（ΔＧhb）；摂動のないイオン間相互作用（ΔＧionic）からの寄与；脂肪親和性リガンド原子と脂肪親和性受容体原子の間の脂肪親和性相互作用（ΔＧlipo）；リガンド中の内部自由度の凍結による結合エネルギーの喪失、つまり、各Ｃ−Ｃ結合の周りの回転自由度が低減する（ΔＧrot）；タンパク質とリガンド間の相互作用エネルギー（ＥvdW）。これらの項を考慮すると方程式１が与えられる：
（ΔＧbind）＝（ΔＧo）＋（ΔＧhbｘＮhb）＋（ΔＧionicｘＮionic）＋（ΔＧlipoｘＮlipo）＋（ΔＧrot＋Ｎrot）＋（ＥvdW）
式中、Ｎは特定の項の相互作用を特徴付ける数であり、１つの実施形態では、ΔＧo、ΔＧhb、ΔＧionic、ΔＧlipoおよびΔＧrotは、それぞれ５．４、−４．７、−４．７、−０．１７および１．４の値を与えられる定数である。
【００６３】
Ｎhbは方程式２：
Ｎhb＝Σh-bondsｆ（ΔＲ，Δα）×ｆ（Ｎneighb）×ｆpcs
によって計算される。
【００６４】
ｆ（ΔＲ，Δα）は、理想状態からの水素結合の大きな偏差を説明し、方程式３によって計算されるペナルティ関数である：
ｆ（ΔＲ，Δ−□）＝ｆ１（ΔＲ）×ｆ２（Δα）
ここで、ｆ１（ΔＲ）＝１（ΔＲ＜＝ＴＯＬの場合）、
または      ＝１−（ΔＲ−ＴＯＬ）／０．４（ΔＲ＜＝０．４＋ＴＯＬの場合）、
または      ＝０（ΔＲ＞０．４＋ＴＯＬの場合）。
さらに、ｆ２（Δα）＝１（Δα＜３０°の場合）
または    ＝１−（Δα−３０）／５０（Δα＜＝８０°の場合）
または    ＝０（Δα＞８０°の場合）。
【００６５】
ＴＯＬは水素結合長さ（＝０．２５Å）で許容される偏差、
ΔＲはＨ−Ｏ／Ｎ水素結合長さの理想的な値（＝１．９Å）からの偏差、
Δαは水素結合角度∠N/O-H,O/Nの理想的な値（＝１８０°）からの偏差、
ｆ（Ｎneighb）は、タンパク質表面の凹面と凸面の部分を識別し、したがってタンパク質表面で見られるものではなくポケットで見られる極性相互作用に大きな重みを割り当てる。この関数は下記方程式４：
ｆ（Ｎneighb）＝（Ｎneighb／Ｎneighb,0）α（ここで、α＝０．５）
によって計算される。
【００６６】
Ｎneighbは任意の所与のタンパク質原子に５Åより接近している非水素タンパク質原子の数であり、
Ｎneighb,0＝定数２５である。
【００６７】
ｆpcsは１つの水素結合当たり極性接触表面積を考慮に入れた関数であり、したがって強い水素結合と弱い水素結合を区別し、その値は次の基準によって決定される：
ｆpcs＝β（Ａpolar／ＮHB＜１０Å2の場合）、
またはｆpcs＝１（Ａpolar／ＮHB＞１０Å2の場合）
Ａpolarはタンパク質リガンド接触表面の大きさであり、
ＮHBは水素結合の数であり、
βは定数＝１．２である。
【００６８】
修正されたベーム（Ｂｏｅｈｍ）スコアリング関数の実行のためには、イオン相互作用からの寄与、ΔＧionicを上記水素結合からの寄与と同様の方法で計算する（同じ幾何学依存性が仮定されるため）。
【００６９】
Ｎlipo項は方程式５によって計算される：
Ｎlipo＝ΣILｆ（ｒIL）
ｆ（ｒIL）はすべての脂肪親和性リガンド原子について、１また、すべての脂肪親和性タンパク質原子についてＬであり、以下の基準により計算される：
ｆ（ｒIL）＝１（ｒIL＜＝Ｒ１ｆ（ｒIL）＝（ｒIL−Ｒ１）／（Ｒ２−Ｒ１）でＲ２＜ｒIL＞Ｒ１の場合、
ｆ（ｒIL）＝０（ｒIL＞＝Ｒ２の場合）。
【００７０】
ここで、Ｒ１はｒ１vdw＋ｒLvdw＋０．５および
Ｒ２＝Ｒ１＋３．０であり、
ｒ１vdwは、原子１のファンデアワールスの半径であり、
ｒLvdwは、原子Ｌのファンデアワールスの半径である。
【００７１】
Ｎrotはアミノ酸側鎖の回転可能な結合の数であり、非環式のｓｐ3−ｓｐ3結合およびｓｐ3−ｓｐ2結合の数である。末端ＣＨ3またはＮＨ3の回転は考慮に入れない。
【００７２】
最後の項Ｅvdwは方程式６によって計算される：
Ｅvdw＝ε1ε2（（ｒ1vdw＋ｒ2vdw）12／ｒ12−（ｒ1vdw＋ｒ2vdw）6／ｒ6）。
【００７３】
ここでε1とε2は原子同一性に依存する定数であり、
ｒ1vdw＋ｒ2vdwはファンデアワールスの原子半径であり、
ｒは１対の原子間の距離である。
【００７４】
方程式６に関して、１つの実施形態では、定数ε1とε2はそれぞれ原子ごとに以下の値を与えられる：Ｃ：０．２４５、Ｎ：０．２８３、Ｏ：０．３１６、Ｓ：０．３１６（つまり、炭素、窒素、酸素および硫黄のそれぞれの原子について）。方程式５および６については、ファンデアワールスの半径はそれぞれ原子ごとに以下の値を与えられる：Ｃ：１．８５、Ｎ：１．７５、Ｏ：１．６０、Ｓ：２．００Å。
【００７５】
タンパク質リガンド相互作用についての現時点での理解の制約内ではあるが、上記の方程式に現われるすべての所定の値および定数がすべて決定されることは理解されるべきである（特に本願で試みられている計算のタイプについて）。したがって、分子相互作用のモデリングの分野における進歩の結果、このスコアリング関数がさらに精緻化された場合には、これらの値および定数を変更することが可能で、したがって、リガンドへのタンパク質の結合エネルギーを評価する項において所望の結果を与える適当な数値を使用してもよく、したがって、本発明の範囲内である。
【００７６】
上記のように、スコアリング関数は、側鎖コンホメーション、原子同一性および原子間の距離のデータベースから抽出されたデータに適用される。本発明を説明する目的のために言えば、このデータベースに含まれるＭＨＣクラスＩＩ分子の数は４２個のモデルと４つの解決された構造である。本発明の計算方法の構築はモジュール化された性質を有するため、新しいモデルを加えペプチド骨格ライブラリーと側鎖コンホメーション関数を用いて走査するだけで、上記のペプチドスコアリング関数によって処理できる追加のデータセットを作成できることは上記の説明から明らかである。これにより、走査されたＭＨＣクラスＩＩ分子のレパートリーを容易に増加させることが可能になり、あるいは、データが入手できる場合には構造および関連データを置き換えて、既存の対立遺伝子のより正確なモデルを作成することができる。
【００７７】
利用可能ないくつかの精巧な方法論と比較して、上記のスコアリング関数は比較的単純であるが、計算が非常に急速に実行される、ということが理解されるべきである。また、目的が、選択されたＭＨＣクラスＩＩタンパク質の結合溝に収容される各ペプチドについて真の結合エネルギーそれ自身計算するものではないことも理解されるべきである。根本的な目的は、選択されたタンパク質の１次構造（すなわち、アミノ酸配列）に基づいてＴ細胞エピトープの位置を予想する助けとして相対的な結合エネルギーデータを得ることである。比較的高い結合エネルギー、すなわち選択された閾値以上の結合エネルギーは、リガンド中のＴ細胞エピトープの存在を示唆するだろう。次いで、リガンドに少なくとも１回のアミノ酸置換を施し、結合エネルギーを再計算すればよい。計算が迅速性を有するため、ペプチド配列のこれらの操作はコストに見合う利用可能なコンピューターハードウェアにおいてプログラムのユーザインターフェース内で対話形式に実行できる。したがって、コンピューターハードウェアへの大きな投資は要求されない。
【００７８】
同じ目的のために他の利用可能なソフトウェアを使用できるかもしれないことは当業者には明白であろう。特に、タンパク質結合サイト内にリガンドをドッキングさせ得るより精巧なソフトウェアを、エネルギー最小化と共に使用してもよい。ドッキングソフトウェアの例は次の通りである：ＤＯＣＫ（Ｋｕｎｔｚ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１６１：２６９−２８８（１９８２））、ＬＵＤＩ（Ｂｏｅｈｍ，Ｈ．Ｊ．、Ｊ．Ｃｏｍｐｕｔ  Ａｉｄｅｄ  Ｍｏｌ．Ｄｅｓ．、８：６２３−６３２（１９９４））およびＦＬＥＸＸ（Ｒａｒｅｙ  Ｍ．、ｅｔ  ａｌ．、ＩＳＭＢ、３：３００−３０８（１９９５））。分子モデリングおよび操作ソフトウェアの例としては：ＡＭＢＥＲ（Ｔｒｉｐｏｓ）およびＣＨＡＲｍ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ  Ｉｎｃ．）。これらの計算方法の使用は、必要な計算を行うために要求される処理時間の長さにより本発明方法の処理能力を厳しく制限するだろう。しかし、本発明の方法によって「陽性なバインダー」であると判明したペプチドについて結合エネルギーのより正確な計算結果を得るために「第２のスクリーン」として、このような方法を使用し得るというのもあり得ることである。
【００７９】
洗練された分子の機械的または分子の動的な計算のための処理時間の制限は、これらの計算を行うソフトウェアの設計およびコンピューターハードウェアの現在の技術制限の両者によって決まる。将来的には、より効率的なコードが書かれ、さらにコンピュータープロセッサー速度の持続的な増加によって、より扱いやすい時間枠内でそのような計算を行うことが実現可能になるかもしれない。巨大分子に適用されるエネルギー関数および折り畳まれたタンパク質構造内で起こる様々な相互作用についての考慮に関するさらに詳しい情報は以下に見られる：Ｂｒｏｏｋｓ，Ｂ．Ｒ．，ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｃｏｍｐｕｔ．Ｃｈｅｍ．、４：１８７−２１７（１９８３）。一般的なタンパク質−リガンド相互作用に関するさらに詳細な情報は以下に見られる：Ｄａｕｂｅｒ−Ｏｓｇｕｔｈｏｒｐｅ  ｅｔ  ａｌ．、ｐｒｏｔｅｉｎｓ４（１）：３１−４７（１９８８）。その内容の全体は言及によって本願に組み入れられる。有用な背景的事項は、例えば以下に見られる：Ｆａｓｍａｎ，Ｇ．Ｄ．、ｅｄ．、Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｔｈｅ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ、Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ＩＳＢＮ：０−３０６  ４３１３−９。
【００８０】
本発明の予測方法は、様々なＭＨＣクラスＩＩ分子への親和性が予め実験的に測定されている多数のペプチドを含むデータセットに対して較正することができる。
【００８１】
本方法の好適実施形態によれば、各ペプチド／ＭＨＣクラスＩＩ対について数値スコアを算出する方法である、ここに記載した具体的予測方法のうちのいずれも、また他のコンピュータに基づくペプチド−ＭＨＣクラス相互作用予測方法のいずれも、様々なＭＨＣクラスＩＩ分子へのその親和性が予め実験的に測定されている多数のペプチドを含むデータセットに対して較正される。実験データと計算値を比較することにより、すべての実験的に測定したＴ細胞エピトープが正確に予測されることが知られているカット値（ｃｕｔ  ｏｆ  ｖａｌｕｅ）を決定できる。
【００８２】
具体的には、コンピュータによる数値スコアは、データセット中の各ペプチド／ＭＨＣクラスＩＩ対について計算される。スコアは、より高いスコアで結合の可能性がより大きく表されるように計算される。実験的に見出されるペプチド／ＭＨＣクラスＩＩ対についてのコンピュータに基づく最低スコアは、分割値（ｃｕｔ−ｏｆｆ）と見なされる。この分割スコアを有意に下回るコンピュータに基づくスコアはすべて非結合なペプチド／ＭｌＩＣクラスＩＩ対を表わすと考えられ、他方、この分割スコア以上のコンピュータに基づくスコアは潜在的な結合ペプチド／ＭＨＣクラスＩＩ対を表わす。一般に、所与のコンピュータに基づくスコアリングアルゴリズムでは、分割値以上のスコアを与えるが、現実に結合しないペプチド／ＭＨＣクラスＩＩの組合せもあるであろう。したがって、本方法のこの好適実施形態は偽陽性を生じるかもしれないが、偽陰性を生じることは全くないか稀にしかない。
【００８３】
最終目標がタンパク質から変異によってＴ細胞エピトープの大部分またはすべてを除去することである場合、本方法のこの分割に基づく実施形態は特に有用である。具体的には、本発明の方法のより好ましい実施形態によれば、Ｔ細胞エピトープの大部分またはすべては、タンパク質から以下のように取り除かれる。タンパク質配列は潜在的なＴ細胞エピトープについてコンピュータに基づくアルゴリズムによって走査される。個々の潜在的なＴ細胞エピトープは、ＭＨＣクラスＩＩに結合する可能性が高いほど、より大きなスコアを与えられる。分割スコアより大きなスコアを有する各ペプチドセグメントを、変異セグメントのスコアが分割値未満であるように変化させる。変異は、タンパク質活性がその所与の目的に必要な活性未満に低減しないように優先的に選択される。そのコンピュータで予測されたＴ細胞エピトープの大部分またはすべてを欠く、多重変異させたタンパク質が設計される。このような多重変異タンパク質を「脱免疫（ＤｅＩｍｍｕｎｉｚｅｄ）タンパク質」と呼ぶ。
【００８４】
脱免疫タンパク質は標準的方法によって合成される。例えば、脱免疫タンパク質をコードする人工ＤＮＡ配列を、合成オリゴヌクレオチドから組み立て、発現ベクターにライゲートし、脱免疫タンパク質の発現を促進する要素に機能的に結合させる。次いで、脱免疫タンパク質を標準的方法によって精製する。生じる脱免疫タンパク質は本来のＴ細胞エピトープが除去されるそのような変異がなされたアミノ酸を含む。さらに、脱免疫タンパク質は、しばしば、Ｔ細胞エピトープであることがアルゴリズムによって予側されるが、実際にはＴ細胞エピトープではないセグメント中に変異がなされたアミノ酸を含むであろう。しかし、誤って予測されたエピトープ中の変異からは著しく有害な結果は生じない。これは、変異がタンパク質活性にほとんど影響を及ぼさないように選択されるためである。さらに、タンパク質中に新しいＢ細胞エピトープを導入する可能性からも有害な結果は生じない。これは、Ｔ細胞エピトープが欠けていることから、修飾されたタンパク質に対するＢ細胞応答が防止されるためである。
【００８５】
治療目的のためにＭＨＣクラスＩＩ結合を強化する修飾を目的として、脱免疫のために考えられる様々なペプチドへの上記方法論の適用を以下に例示する。
【００８６】
本発明は、実質的にここに開示されたものと同一の１次アミノ酸配列を有し、定義された生物学的および／または薬学的活性を有する任意の生物学的分子に適用し得るものであり、したがって、遺伝子工学的手段または他の方法によって得られる分子を含むであろう。「生物学的分子」という用語は、本発明では、生物学的機能を有しており、生物学、薬学または医薬上の効果または活性を引き起こす分子に使用される。好ましくは、本発明による生物学的分子はペプチド、ポリペプチド、タンパク質である。この中でタンパク質、免疫グロブリンが好まれる。本発明はさらに基本的に同一の生物活性を有するが免疫原性は同様である（低減された）、特定のポリペプチド、タンパク質、融合タンパク質、免疫グロブリンの変異体および他の修飾形を含む。さらに、ｓＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２およびＦｃなどの抗体の断片、およびタンパク質の生物学上有効な断片を含む。ヒト起源の抗体またはヒト化された抗体はヒトにおいて、それ自体、非ヒト抗体と比較して、免疫原性を示さないか示すとしても低く、免疫原性エピトープも含まないか数がより少ない。しかし、それらの中にはヒトにおいて顕著な免疫反応を誘発することが示されたものもあるため、こうした分子についても脱免疫の必要がある。さらに望ましくない、または、あまりにも強い免疫反応を誘発する抗原は、本発明の方法によって修飾することができ、免疫原性は低減されているが抗原（例えば、ワクチン）としての使用するための強さは十分に有する抗原を得ることができる。
【００８７】
分子によっては、レプチンのように、他の哺乳類出所から識別されたものでも、本発明の開示のペプチド配列の多くを共通して有し、開示されたリストにおけるのと実質的に同一の配列を持つペプチド配列の多くを共通して有するものもある。したがって、そのようなタンパク質配列は、等しく本発明の範囲に入る。
【００８８】
本発明は、タンパク質からの１個または複数の潜在的なＴ細胞エピトープ活性の実質的な低減または除去をもたらす位置で少なくとも１個のアミノ酸残基の置換がなされた、本発明による生物学的分子の類似体に関する。
【００８９】
実施例の表において識別される潜在的なＭＨＣクラスＩＩリガンドのいずれかにおける特定点で１個または複数のアミノ酸を置換することで、ヒト受容者に治療剤として投与された時に免疫原性が低下する分子を得ることができる。アミノ酸置換は、好ましくは、予測されたペプチド配列内の適切な各点で行い、Ｔ細胞エピトープ活性の実質的な低減または除去を達成する。実際上、適切な点は、ＭＨＣクラスＩＩ結合溝内にもたらされる疎水性ポケットのうちの１つの内部で結合するアミノ酸残基と好ましくは一致するであろう。ＭＨＣ結合間隙内の他のポケット領域内での結合と一致する位置のペプチド中のアミノ酸残基も考えられ、本発明の範囲に入る。
【００９０】
所与の潜在的なＴ細胞エピトープ内の単一のアミノ酸置換が、エピトープを除去する最も好ましい経路であることが理解される。単一のエピトープ内での置換の組合せも考えられ、例えば、個別に定義されたエピトープが互いに重複する場合には特に適している。さらに、アミノ酸置換は、所与のエピトープ内において１個でも、または単一のエピトープ内における組合せでも、ＭＨＣクラスＩＩ結合溝に関して「ポケット残基」と一致しない位置であってもペプチド配列内の任意点で行うことができる。そのような置換はすべて本発明の範囲内に入る。
【００９１】
特に、リストに挙げたペプチド内でなされた置換と組合せて行う場合、上に識別されたペプチド内以外のアミノ酸置換を考えることもできる。例えば、変異分子の構造または生物活性を回復するために変更を考えてもよい。所望の活性を有し、開示するペプチドのうちのいずれかの変化と組み合わせる変異体をもたらす本発明による分子からの特定のアミノ酸残基の欠失または付加を含むそのような補償のための変化および変化は、本発明の範囲に入る。
【００９２】
別の態様では、本発明は、免疫原性を低減した前記生物学的分子をコードする核酸に関する。遺伝子構成体および遺伝子産物を生成する方法は当技術分野においてよく知られている。最後の態様としては、本発明は、本発明で開示された方法によって得ることのできる前記生物学的分子を含む医薬組成物、並びに修飾された分子および医薬組成物を使用するヒトの治療的処置方法に関する。
【００９３】
以下の例からわかるように、本発明においてこれまでに述べた計算方法は、任意のペプチドにおいてＴ細胞エピトープがどこで見つかるかを示す非常によい指標を提供する。したがって、これは、もし１個以上アミノ酸残基によって変更すればＴ細胞エピトープを削除する効果があり、したがってペプチドの治療上の価値を増大させるアミノ酸残基配列領域の識別を可能にする。この方法によって、増強された特性および薬学的価値を有するペプチド、タンパク質、免疫グロブリンおよび融合タンパク質その他の生物学的分子を製造できる。
【００９４】
これまでの記載およびその例は、説明を目的としたものであり限定的な意味に解してはならない。また、当業者には、本発明の技術思想および範囲内でさらに別の変更を行うことも可能かつ容易なことであろう。
【００９５】
（実施例１）
この例は、自己抗原グルタミン酸デカルボキシラーゼアイソフォーム（ＧＡＤ  ６５；ＭＷ：６５．０００）（これはタイプＩ糖尿病の発症に関係する）のＴ細胞エピトープ見込みプロファイルを示す。この特定のタンパク質は、Ｔ細胞エピトープの親和性を増加させる潜在的な目標となり、さらに比較的長いペプチド（５８５アミノ酸残基）であるためにＴ細胞エピトープ見込み指数を示すために良い例となり、したがってプロファイルのための比較的大きな試料サイズを与える。
【００９６】
図５にＧＡＤ６５についてのＴ細胞エピトープ見込みプロファイルを示す。実線は、図１に示す計算方法を使用して計算したＴ細胞エピトープ指数を表わし、点線は、図３および４に示す計算方法を使用して予測したＴ細胞エピトープ指数を表わす。
【００９７】
（実施例２）
この例は、エリスロポエチン（ＥＰＯ）のＴ細胞エピトープ見込みプロファイルを示す。エリスロポエチンは赤血球数を増大させる静脈内（ＩＶ）投与薬剤として広く使用されている１９３アミノ酸残基長のサイトカインである。これは、治療価値を有するが、特にＩＶ投与ルートを使用する際に不適当であるか、望ましくない免疫反応を引き起こすおそれがあり、したがって、その潜在的なＴ細胞エピトープが識別されれば、脱免疫によって有益となり得る生物学的薬剤の良い例を表わす。
【００９８】
ＥＰＯについてのＴ細胞エピトープ見込みプロファイルを図６に示す。実線は、図１に示す計算方法を使用して計算したＴ細胞エピトープ指数を表わし、点線は、図３および４に示す計算方法を使用して予測したＴ細胞エピトープ指数を表わす。
【００９９】
（実施例３）
図７および８は、Ａ３３抗原に対するマウスヒト化モノクローナル抗体の重鎖および軽鎖についてのＴ細胞エピトープ指数を示す。後者は９５％超の腸癌の表面で発現される膜貫通糖タンパク質であり、したがって、癌治療剤としての可能性を有する。
【０１００】
図７および８では、実線は、図１に示す計算方法を使用して計算したＴ細胞エピトープ指数を表わし、点線は、図３および４に示す計算方法を使用して予測したＴ細胞エピトープ指数を表わす。
【０１０１】
（実施例４（レプチン））
これらの治療上価値のある分子のうちの１つは、「レプチン」と呼ばれるヒトの肥満タンパク質である。レプチンは脂肪量を維持するホメオスタシス機構に関わる１４６アミノ酸残基のシグナル伝達性の分泌タンパク質である（例えばＷＯ  ００／４０６１５、ＷＯ  ９８／２８４２７、ＷＯ  ９６／０５３０９）。タンパク質（およびそのアンタゴニスト）は、糖尿病、高血圧症およびコレステロール代謝の治療のために重要な治療上の可能性を示す。このタンパク質は組換え技術によって多くの様々な宿主Ｔ細胞タイプを使用して生産することができる。レプチンのアミノ酸配列は、以下の通りである（１文字コードで表わす）：
【０１０２】
【表１】
2004523754.tif 000005
免疫原性が修飾されていないヒト肥満タンパク質（レプチン）の配列の一部であって、潜在的なＭＨＣクラスＩＩ結合活性を有するアミノ酸配列は、本発明の方法によって識別された以下の群から選択される：
【０１０３】
【表２】
2004523754.tif 000006
上に挙げたペプチド配列のうちのいずれも、免疫原性のない、または低減された配列を得るために１個または複数のアミノ酸を交換することにより修飾するために使用することができる。
【０１０４】
【表３】
2004523754.tif 000007
（実施例５（Ｉｌ−ｌＲアンタゴニスト））
ＩＬ−１は様々な組織に対する多面発現効果を有する重要な炎症および免疫調整サイトカインであるが、慢性関節リウマチおよび局所的組織損害を伴う他の疾病に関連した病理的態様の原因ともなっている。ＩＬ−１の作用を阻害できるＩｌ−１受容体アンタゴニストが精製され、遺伝子がクローン化されている［Ｅｉｓｅｎｂｕｒｇ  Ｓ．Ｐ．ｅｔ  ａｌ（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ，３４３：３４１−３４６；Ｃａｒｔｅｒ，Ｄ．Ｂ．ｅｔ  ａｌ（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ，３４４：６３３−６３７］。他にもＩＬ−１Ｒａ分子が提供されている［例えば、米国特許第５，０７５，２２２号］。Ｉｌ−ｌＲａのアミノ酸配列は、以下の通りである（１文字コードで表わす）：
【０１０５】
【表４】
2004523754.tif 000008
免疫原として修飾されていないＩＬ−ｌＲａの配列の一部であり、潜在的なＭＨＣクラスＩＩ結合活性を有するアミノ酸配列は、以下の群から選択される：
【０１０６】
【表５】
2004523754.tif 000009
免疫原性を有しないか低減された配列を得るために、上に挙げたペプチド配列のうちのいずれかを用いて１個または複数のアミノ酸を交換することにより修飾することができる。潜在的なＴ細胞エピトープの除去をもたらす置換は以下の通りである。
【０１０７】
【表６】
2004523754.tif 000010
（実施例６（ＢＤＮＦ））
別の治療上有益な分子は、ヒト脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ：ｂｒａｉｎ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｃ  ｆａｃｔｏｒ）である。ＢＮＤＦはタンパク質の神経成長因子ファミリーの糖タンパク質である。成熟した１１９個のアミノ酸糖タンパク質は、神経細胞集団の生存を促進する神経成長因子を産生するために、より大きな前駆体のプロセシングで得られる［Ｊｏｎｅｓ  Ｋ．Ｒ．＆  Ｒｅｉｃｈａｒｄｔ，Ｌ．Ｆ．（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  Ｕ．Ｓ．Ａ．８７：８０６０−８０６４］。そのような神経細胞はすべて中枢神経系に位置するか、これに直接に接続するものである。ＢＮＤＦの組換え調製により、該タンパク質の治癒力を神経再生の促進および変性疾患の治療のために検討することが可能になった。
【０１０８】
ヒト脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）のアミノ酸配列は、以下の通りである（１文字コードで表わす）：
【０１０９】
【表７】
2004523754.tif 000011
他の研究によっても、修飾ＢＮＤＦ分子［米国特許第５，７７０，５７７号］および組換えＢＮＤＦ分子の商用生産への手法［米国特許５，９８６，０７０号］が提供されている。
免疫原として修飾されていないヒト脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）の配列の一部であり、潜在的なＭＨＣクラスＩＩ結合活性を有するアミノ酸配列は、以下の群から選択される：
【０１１０】
【表８】
2004523754.tif 000012
免疫原性を有しないか低減された配列を得るために、上に挙げたペプチド配列のうちのいずれかを用いて１個または複数のアミノ酸を交換することにより、上記ペプチド配列のいずれもが修飾することができる。
【０１１１】
ヒト脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）（ＷＴ＝野生型）の潜在的なＴ細胞エピトープの除去をもたらす置換は以下の通りである。
【０１１２】
【表９】
2004523754.tif 000013
【０１１３】
【表１０】
2004523754.tif 000014
（実施例７（ＥＰＯ））
別の治療上有益な分子は、エリスロポエチン（ＥＰＯ）である。ＥＰＯは赤血球前駆細胞の赤血球への成熟に関わる糖タンパク質ホルモンである。天然に存在するＥＰＯは、胎児期の肝臓によって、および成人の腎臓によって生産され、血中を循環して骨髄中の赤血球の生産を刺激する。貧血は、腎臓からのＥＰＯが減少することによる、ほとんど常に腎不全の結果である。組換えＥＰＯは慢性腎不全からくる貧血の治療において効果的であるとされている。ヒトエリスロポエチンのアミノ酸配列１〜１６５を有する組換えＥＰＯ（哺乳類細胞の中で発現されたもの）［Ｊａｃｏｂｓ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ，３１３：８０６−８１０；Ｌｉｎ，Ｆ．−Ｋ．ｅｔ  ａｌ（１９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８２：７５８０−７５８５］は、いずれも末端にシアル酸残基を含む３個のＮ結合、および１個のＯ結合オリゴ糖鎖を含む。後者は、肝アシアロ糖タンパク質結合タンパク質による循環系からのＥＰＯの迅速除去を回避し得る際に重要である。
ＥＰＯのアミノ酸配列は、以下の通りである（１文字コードで表わす）：
【０１１４】
【表１１】
2004523754.tif 000015
免疫原として修飾されていないヒトエリスロポエチン（ＥＰＯ）の配列の一部であり、潜在的なＭＨＣクラスＩＩ結合活性を有するアミノ酸配列は、以下の群から選択される：
【０１１５】
【表１２】
2004523754.tif 000016
ヒトエリスロポエチン（ＥＰＯ）（ＷＴ＝野生型）の潜在的なＴ細胞エピトープの除去をもたらす置換は以下の通りである。
【０１１６】
【表１３】
2004523754.tif 000017
【０１１７】
【表１４】
2004523754.tif 000018
（実施例８（Ｇ−ＣＳＦ））
顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）は重要な造血性サイトカインであり、好中球の増加が有益と思われる適応症の治療に現在使用されている。これらは癌療法、様々な感染症、および敗血症のような関連症状を含む。骨髄移植用造血細胞のエクスビボ（ｅｘ  ｖｉｖｏ）での増殖においても、Ｇ−ＣＳＦは単独で、あるいは他の化合物およびサイトカインと組み合わせて使用される。
【０１１８】
２種のヒトＧ−ＣＳＦが、一般にこのサイトカインに認識されている。１つは１７７個のアミノ酸のタンパク質であり、他方は１７４個のアミノ酸のタンパク質であり［Ｎａｇａｔａ  ｅｔ  ａｌ．（１９８６），ＥＭＢＯ  Ｊ．５：５７５−５８１］、１７４アミノ酸形態は、インビボで最大の特異的生物活性を有することが判明した。組換えＤＮＡ技術は、商用規模の量でのＧ−ＣＳＦの生産を可能にし、そのために真核および原核の両宿主細胞発現系が利用されている。
【０１１９】
顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）のアミノ酸配列は、以下の通りである（１文字コードで表わす）：
【０１２０】
【表１５】
2004523754.tif 000019
Ｇ−ＣＳＦの他のポリペプチド類似体およびペプチド断片は、サイト特異的アミノ酸置換およびまたは化学的付加物による修飾によって修飾された形を含め、以前に開示されている。したがって、米国特許第４，８１０，６４３号は、特定のＣｙｓ残基を別のアミノ酸で置換した類似体、および第１の（Ｎ−末端）位置にＡｌａ残基を有するＧ−ＣＳＦを開示する。ＥＰ  ０  ３３５  ４２３は、Ｇ−ＣＳＦ活性を有するポリペプチド中の少なくとも１個のアミノ基の修飾を開示する。ＥＰ  ０  ２７２  ７０３は、Ｎ−末端の近くでアミノ酸を除去または置換したＧ−ＣＳＦ誘導体を開示する。ＥＰ  ０  ４５９  ６３０は、Ｃｙｓ  １７およびＡｓｐ２７をＳｅｒ残基に置換したＧ−ＣＳＦ誘導体を開示する。ＥＰ  ０  ２４３  １５３は、組換え生成物の収率を増すために、少なくとも１個の酵母ＫＥＸ２プロテアーゼプロセッシングサイトの不活性化により修飾されたＧ−ＣＳＦを開示し、米国特許第４，９０４，５８４号は、リジンが変更されたタンパク質を開示する。ＷＯ  ９０／１２８７４はＣｙｓに変更された変種をさらに開示し、オーストラリア特許文献ＡＵ  １０９４８／９２は、原核生物の発現の後の分子フォールディングを支援するためにＧ−ＣＳＦ分子のいずれかの末端にアミノ酸を付加して例を開示する。ＡＵ  ７６３８０／９１は、Ｇ−ＣＳＦ  １７４アミノ酸形の位置５０〜５６、および１７７アミノ酸形のうちの５３〜５９の位置におけるＧ−ＣＳＦ変異体を開示する。さらに特にＨｉｓ残基での変更も開示されている。
【０１２１】
免疫原として修飾されていないヒト顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）の配列の一部であり、潜在的なＭＨＣクラスＩＩ結合活性を有するアミノ酸配列は、以下の群から選択される：
【０１２２】
【表１６】
2004523754.tif 000020
免疫原性を有しないか低減された配列を得るために、上に挙げたペプチド配列のうちのいずれかを用いて１個または複数のアミノ酸を交換することにより修飾することができる。
【０１２３】
ヒト顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）（ＷＴ＝野生型）の潜在的なＴ細胞エピトープの除去をもたらす置換は以下の通りである。
【０１２４】
【表１７】
2004523754.tif 000021
（実施例９（ＫＧＦ））
別の有益な分子は、ケラチノサイト成長因子（ＫＧＦ）である。ＫＧＦはタンパク質の繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）／ヘパリン結合成長因子ファミリーのメンバーである。これは主に肺中で発現される分泌型糖タンパク質で、ケラチノサイトおよび他の上皮細胞の成長を刺激することにより傷の治癒を促進する［Ｆｉｎｃｈ  ｅｔ  ａｌ  （１９８９），Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４：７５２−７５５；Ｒｕｂｉｎ  ｅｔ  ａｌ  （１９８９），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８６：８０２−８０６］。糖タンパク質の成熟（被加工）形は１６３個のアミノ酸残基を含み、特別の細胞系の培養後、調整した培地から分離でき［Ｒｕｂｉｎ  ｅｔ  ａｌ，（１９８９）上掲箇所］、あるいは組換え技術を用いて製造できる［Ｒｏｎ  ｅｔ  ａｌ（１９９３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：２９８４−２９８８］。
【０１２５】
このタンパク質は、多数の重要な疾病および傷修復において、上皮細胞成長の刺激する治療上の価値がある。この開示は特に１６３個のアミノ酸残基の成熟（被加工）形であるヒトＫＧＦタンパク質に関する。他にもＫＧＦ分子を提供した例はあり［例えば米国、６，００８，３２８；ＷＯ９０／０８７７１；］修飾されたＫＧＦも含まれる［Ｒｏｎ  ｅｔ  ａｌ（１９９３）、上掲箇所；ＷＯ９５０１４３４］。しかし、このような教示は、タンパク質の免疫原性に対するＴ細胞エピトープの重要性を認識していないし、本発明のスキームによる特定の制御された方法で、こうした性質に直接影響を及ぼすとは想定されていなかった。
【０１２６】
ケラチノサイト成長因子（ＫＧＦ）のアミノ酸配列は、以下の通りである（１文字コードで表わす）：
【０１２７】
【表１８】
2004523754.tif 000022
免疫原として修飾されていないヒトケラチノサイト成長因子（ＫＧＦ）の配列の一部であり、潜在的なＭＨＣクラスＩＩ結合活性を有するアミノ酸配列は、以下の群から選択される：
【０１２８】
【表１９】
2004523754.tif 000023
免疫原性を有しないか低減された配列を得るために、上に挙げたペプチド配列のうちのいずれかを用いて１個または複数のアミノ酸を交換することにより修飾することができる。
【０１２９】
ヒトケラチノサイト成長因子（ＫＧＦ）（ＷＴ＝野生型）の潜在的なＴ細胞エピトープの除去をもたらす置換は以下の通りである。
【０１３０】
【表２０】
2004523754.tif 000024
（実施例１０（可溶性ＴＮＦ  ＲＩ）
ｓＴＮＦ−ＲＩ（可溶性腫瘍壊死因子レセプタータイプＩ）は、これまでに記載例のあるヒト腫瘍壊死因子レセプターの誘導体であり［Ｇｒａｙ，Ｐ．Ｗ．ｅｔ  ａｌ（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８７：７３８０−７３８４；Ｌｏｅｔｓｃｈｅｒｅ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ，（１９９０）Ｃｅｌｌ  ６１：３５１−３５９；Ｓｃｈａｌｌ，Ｔ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ（１９９０）Ｃｅｌｌ  ６１：３６１−３７０］、未処置のレセプターの細胞外領域を含み、およそ３０ＫＤａ分子量を示す。別の可溶性ＴＮＦ阻害剤、特に４０ＫＤａ形も知られている［米国特許第６，１４３，８６６号］。可溶性型は腫瘍壊死因子アルファと高い親和性で結合し、サイトカインの細胞毒素活性をインビトロで阻害する。腫瘍壊死因子レベルが過大となって病態的な結果を惹起している場合には、ｓＴＮＦ−ＲＩの組換体の製造は、疾病の治療に重要な治療上の価値を有する。悪液質、敗血症および慢性関節リウマチなどを含む自己免疫疾患などの症状が、ｓＴＮＦ−ＲＩのこうした治療剤の標的となり得る。Ｂｒｅｗｅｒら（米国特許第６，１４３，８６６号）を含む他の人たちは修飾されたｓＴＮＦ−ＲＩ分子を提供している。
潜在的ヒトＭＨＣクラスＩＩ結合活性を有するヒト３０ＫＤａ  ｓＴＮＦ−ＲＩ中のペプチド配列：
【０１３１】
【表２１】
2004523754.tif 000025
免疫原性を有しないか低減された配列を得るために、上に挙げたペプチド配列のうちのいずれかを用いて１個または複数のアミノ酸を交換することにより修飾することができる。
【０１３２】
（実施例１１（可溶性ＴＮＦ−Ｒ２））
可溶性腫瘍壊死因子レセプター２（ｓＴＮＦ−Ｒ２）はこれまでに記載例のあるヒト腫瘍壊死因子レセプター２の誘導体であり［Ｓｍｉｔｈ，Ｃ．Ａ．ｅｔ  ａｌ（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４８：１０１９−１０２３；Ｋｏｈｎｏ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８７：８３３１−８３３５；Ｂｅｌｔｉｎｇｅｒ，Ｃ．Ｐ．ｅｔ  ａｌ（１９９６）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ３５：９４−１００］、未処置のレセプターの細胞外領域を含む。可溶性型は腫瘍壊死因子と高い親和性で結合し、サイトカインの細胞毒素活性をインビトロで阻害する。腫瘍壊死因子レベルが過大となって病態的な結果を惹起している場合には、ＴＮＦ−Ｒ２の組換体の製造は、疾病の治療に重要な治療上の価値を有する。エタナーセプト（ｅｔｈａｎｅｒｃｅｐｔ）と名付けられた特別の組換え製剤は、慢性関節リウマチの治療のための臨床的な承認を獲得しており、これおよび他の同様の薬剤は悪液質、敗血症および自己免疫疾患その他の症状の治療に有益である。エタナーセプトは、ヒトＩｇＧ１分子のＦｃ領域と組み合わさったヒトＴＮＦＲ２分子の細胞外の領域を含む二量体の融合タンパク質である。二量体の分子は９３４個のアミノ酸を含む［米国特許第５，３９５，７６０号；米国特許第５，６０５，６９０号；米国特許第５，９４５，３９７号；米国特許再発行第３６，７５５号］。
【０１３３】
潜在的ヒトＭＨＣクラスＩＩ結合活性を有するヒトＴＮＦＲ２タンパク質中のペプチド配列は以下の通りである。
【０１３４】
【表２２】
2004523754.tif 000026
（実施例１２（β−ＧＣＲ））
ベータ−グルコセレブロシダーゼ（ｂ−Ｄ−グルコシル−Ｎ−アシルスフィンゴシングルコヒドロラーゼ（Ｅ．Ｃ．３．２．１．４５））は、４９７個のアミノ酸残基からなる単量体糖タンパク質である。この酵素は糖脂質グルコセレプロシドのグルコースとセラミドへの加水分解を触媒する。ＧＣＲ活性の欠乏は、ゴーシェ病と呼ばれるリソソーム蓄積症をもたらす。疾病は、肝臓、脾臓、骨髄および他の器官に蓄積するグルコセレブロシド充満−組織マクロファージ（ｇｌｕｃｏｃｅｒｅｂｒｏｓｉｄｅ  ｅｎｇｏｒｇｅｄ  ｔｉｓｓｕｅ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ）の蓄積によって特徴付けられる。この疾病は、重篤さにより段階があり、血液に関する問題はあるが神経には関わらないタイプｌから神経に広範囲に関与する誕生後初期に現われるタイプ２があり、例外なく進行的で２歳以内に致死する。タイプ３疾病もいくつかの分類によって認められ、やはり神経への関与を示す。従来、ゴーシェ病の唯一の有用な治療法はヒト胎盤（アルグセラーゼ（ａｌｇｌｕｃｅｒａｓｅ）として知られている）に由来したＧＣＲの投与であったが、最近では、組換えＧＣＲ（「セレダーゼ（Ｃｅｒｅｄａｓｅ）および「セレザイム（Ｃｅｒｅｚｙｍｅ）」）製剤が、タイプＩの治療に効果があることが示されている［Ｎｉｅｄｅｒａｕ，Ｃ．ｅｔ  ａｌ（１９９８）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｒｅｓ．３：２５−３０］。
【０１３５】
潜在的ヒトＭＨＣクラスＩＩ結合活性を有するヒトＧＣＲ中のペプチド配列は以下の通りである。
【０１３６】
【表２３】
2004523754.tif 000027
【０１３７】
【表２４】
2004523754.tif 000028
（実施例１３（タンパク質Ｃ））
タンパク質Ｃは、血液凝固の調節に関わるビタミンＫ依存セリンプロテアーゼである。このタンパク質はトロンビンによって活性化され、活性化されたタンパク質Ｃを生じ、これが凝固カスケードにおいて因子ＶａおよびＶＩＩＩａを分解する。タンパク質Ｃは単鎖の前駆体として肝臓内で発現され、一連のプロセシングイベントを経て、ジスルフィド結合によって互いに連結された軽鎖および重鎖を含む分子となる。タンパク質Ｃは、トロンビンによる重鎖のＮ−末端からのテトラデカペプチドの開裂によって活性化される。タンパク質Ｃの医薬製剤は本来の形か活性化された形で、血管疾患に罹患している患者の治療、またはタンパク質Ｃの中の好転的欠乏に効果がある。したがって、こうした患者は、血栓症の発作、または、敗血症、移植手術、妊娠、重篤な火傷、大手術または他の大きな外傷に伴うタンパク質Ｃ欠乏症に罹患した個体を含む。タンパク質Ｃはまた、遺伝的にタンパク質Ｃ欠乏である個人の治療において使用される。この開示は特に、１５５個のアミノ酸残基の軽鎖および２６２個のアミノ酸残基の重鎖を含む成熟した（プロセシングされた）ヒトタンパク質Ｃ［Ｆｏｓｔｅｒ，Ｄ．Ｃ．ｅｔ  ａｌ（１９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８２：４６７３−４６７７；Ｂｅｃｋｍａｎ，Ｒ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ（１９８５）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１３：５２３３−５２４７］に関する。他にも、活性化されたタンパク質Ｃの処方および使用方法を含むタンパク質Ｃ分子が提供されている［米国特許第６，１５９，４６８号；米国特許第６，１５６，７３４号；米国特許第６，０３７，３２２号；米国特許第５，６１８，７１４号］。潜在的なヒトＭＨＣクラスＩＩ結合活性を有するヒトタンパク質Ｃ重鎖中のペプチド配列は以下の通りである：
【０１３８】
【表２５】
2004523754.tif 000029
潜在的なヒトＭＨＣクラスＩＩ結合活性を有するヒトタンパク質Ｃ軽鎖中のペプチド配列は以下の通りである：
【０１３９】
【表２６】
2004523754.tif 000030
（実施例１４（スブチリシン））
スブチリシンは、経済的および産業上かなり重要なプロテアーゼ酵素クラスである。これらは、洗剤または化粧品成分として、または織物その他の産業および消費者用製品の生産で使用できる。特定のヒト対象を細菌スブチリシンに曝すと、各人に望ましくない過敏反応を惹起することがある。増強された特性、特にタンパク質の生物学的特性が改良されたスブチリシン類似体が必要とされている。この点では、ヒト対象で免疫反応を引き起こす能力が低減されているか、存在しないスブチリシンが強く望まれている。細菌、真菌またはほ乳動物およびヒトを含む脊椎動物源を含めた他の起源から識別されたスブチリシンタンパク質は、本発明で開示するペプチド配列の多くを共有し、また、開示するリストのものと実質的に同一の配列を含む多くのペプチド配列を共有している。したがって、そのようなタンパク質配列は、等しく本発明の範囲に入る。他にも、修飾されたスブチリシンを含むスブチリシン分子が提供されている［米国特許第５，７００，６７６号；米国特許第４，９１４，０３１号；米国特許第５，３９７，７０５号；米国特許第５，９７２，６８２号］。
【０１４０】
潜在的なＭＨＣクラスＩＩ結合活性を有するＢ．ｌｅｎｔｕｓスブチリシン中のペプチド配列は以下の通りである：
【０１４１】
【表２７】
2004523754.tif 000031
潜在的なヒトＭＨＣクラスＩＩ結合活性を有するＢ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓスブチリシン中のペプチド配列は以下の通りである：
【０１４２】
【表２８】
2004523754.tif 000032
潜在的なヒトＭＨＣクラスＩＩ結合活性を有するＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓスブチリシン中のペプチド配列は以下の通りである：
【０１４３】
【表２９】
2004523754.tif 000033
潜在的なヒトＭＨＣクラスＩＩ結合活性を有するＢ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓスブチリシン中のペプチド配列は以下の通りである：
【０１４４】
【表３０】
2004523754.tif 000034
（実施例１５（ＣＮＴＦのリガンド））
本発明は、人体内における毛様神経栄養因子（ＣＮＴＦ）レセプター複合体のためのヘテロダイマーリガンドを含むタンパク質サブユニットの修飾形を提供する。レセプター複合体は、ＣＮＴＦおよびカルディオトロフィン（ｃａｒｄｉｏｔｒｏｐｈｉｎ）様サイトカイン（ＣＬＣ）と可溶性レセプターサイトカイン様因子１（ＣＬＦ）とを含むヘテロダイマー複合体を含む少なくとも２個のリガンドによって活性化される［Ｅｌｓｏｎ  Ｇ．Ｃ．Ａ．ｅｔ  ａｌ（２０００）Ｎａｔｕｒｅ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  ３：８６７−８７２］。ＣＬＣはサイトカインのＩＬ−６ファミリーのタンパク質で、新規ニューロトロフィン（ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｎ）−１／Ｂ細胞刺激因子−３として知られている［Ｓｅｎａｌｄｉ，Ｇ．ｅｔ  ａｌ（１９９９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９６：１１４５８−１１４６３、米国特許第５，７４１，７７２号］。ＣＬＣはサイトカインタイプＩレセプターファミリーのタンパク質と相同であり［Ｅｌｓｏｎ，Ｇ．Ｃ．Ａ．ｅｔ  ａｌ（１９９８）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６１：１３７１−１３７９］、ＮＲ６としても識別されている［Ａｌｅｘａｎｄｅｒ  Ｗ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ（１９９９）Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．９：６０５−６０８］。ＣＬＣとＣＬＦの会合によって形成されたヘテロダイマーは直接ＣＮＴＦＲと相互作用することが示され、このようにして形成された三量体複合体は、ｇｐ１３０やＬＩＦＲのようなＣＮＴＦＲ複合体の他の認識された成分を発現する細胞内のシグナルイベントを刺激することができる。［上掲、Ｅｌｓｏｎ  Ｇ．Ｃ．Ａ．ｅｔ  ａｌ（２０００）］。
【０１４５】
潜在的なヒトＭＨＣクラスＩＩ結合活性を有するヒトＣＬＣの中のペプチド配列は以下の通りである：
【０１４６】
【表３１】
2004523754.tif 000035
潜在的なヒトＭＨＣクラスＩＩ結合活性を有するヒトＣＬＦの中のペプチド配列は以下の通りである：
【０１４７】
【表３２】
2004523754.tif 000036
（実施例１６（卵胞刺激ホルモン））
本発明は、１個または複数のＴ細胞エピトープが除去されたヒトｈＦＳＨの修飾形を提供する。ｈＦＳＨは２個の糖タンパク質サブユニットを含む二量体の構造の糖タンパク質ホルモンである。このタンパク質は、ヒトの不妊処置の治療に使用されており、このタンパク質の組換え形は多くの治験の対象物であった［Ｏｕｔ，Ｈ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ（１９９５）Ｈｕｍ．Ｒｅｐｒｏｄ．１０：２５３４−２５４０；Ｈｅｄｏｎ，Ｂ．ｅｔ  ａｌ（１９９５）Ｈｕｍ．Ｒｅｐｒｏｄ．１０：３１０２−３１０６；Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｈｕｍａｎ  ＦＳＨ  ｓｔｕｄｙ  Ｇｒｏｕｐ（１９９５）Ｆｅｒｔｉｌ．Ｓｔｅｒｉｌ．６３：７７−８６；Ｐｒｅｖｏｓｔ，Ｒ．Ｒ．（１９９８）Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒａｐｙ  １８：１００１−１０１０］。
【０１４８】
潜在的なヒトＭＨＣクラスＩＩ結合活性を有するヒトｈＦＳＨ中のペプチド配列は以下の通りである：
【０１４９】
【表３３】
2004523754.tif 000037
（実施例１６（リシンＡ））
本発明は、１個または複数のＴ細胞エピトープが除去されたリシン毒素Ａ鎖（ＲＴＡ）の修飾形を提供する。リシンは本来トウゴマの種子から分離された細胞毒素で、タイプＩＩリボソーム不活性化タンパク質（ＲＩＰ）の例である。天然に存在する成熟タンパク質は、２６２個のアミノ酸残基を有するリシンＢ鎖とジスルフィド結合している２６７個アミノ酸残基のＲＴＡを含むヘテロダイマーである。Ｂ鎖はガラクトシドへの結合親和性を有するレクチンである。天然のタンパク質はＢ鎖によって細胞を結合することができ、エンドサイトーシスによって細胞内に入る。細胞内では、ジスルフィド結合の還元によってＲＴＡはＢ鎖から開放され、未知のメカニズムによって細胞質へエンドソームから放出される。細胞質では、毒素はＮ−グリコシラーゼ特異的作用によってリボソームを分解し、タンパク質翻訳および細胞死の停止を急激にもたらす。特定の細胞集団の除去が必要な場合、ＲＴＡおよび他のＲＩＰの極端な細胞毒性が癌および他の疾病を治療するための実験的治療で使用されるようになっている。ＲＴＡと結合した抗体分子を含む免疫毒分子が生産され、多数の治験で使用されている［Ｇｈｅｔｉｅ，Ｍ．Ａ．ｅｔ  ａｌ（１９９１）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ５１：５８７６−５８８０；Ｖｉｔｅｔｔａ，Ｅ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ（１９９１）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５１：４０５２−４０５８；Ａｍｌｏｔ，Ｐ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ（１９９３）Ｂｌｏｏｄ  ８２：２６２４−２６３３；Ｃｏｎｒｙ，Ｒ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ（１９９５）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．Ｅｍｐｈａｓｉｓ  Ｔｕｍｏｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８：２３１−２４１；Ｓｃｈｎｅｌｌ，Ｒ．ｅｔ  ａｌ（２０００）Ｌｅｕｃｋａｅｍｉａ  １４：１２９−１３５］。免疫毒において、抗体領域は所望の標的細胞の表面に結合し、ＲＴＡへは化学的な架橋によりまたは組換え融合タンパク質として結合し得る。
【０１５０】
潜在的なヒトＭＨＣクラスＩＩ結合活性を有するリシン毒素鎖中のペプチド配列は以下の通りである：
【０１５１】
【表３４】
2004523754.tif 000038
（実施例１７（脂肪細胞補体関連タンパク質（ａｄｉｐｏｃｙｔｅ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ））
本発明は、１個または複数のＴ細胞エピトープが除去されたヒトまたはマウスＡｃｒｐ３０の修飾形に提供する。Ａｃｒｐ３０はおよそ３０ｋＤａの豊富に存在する血清タンパク質であり、もっぱら脂肪細胞内で発現する［Ｓｃｈｅｒｅｒ，Ｐ．Ｅ．ｅｔ  ａｌ（１９９５）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：２６７４６−２６７４９］。ヒトの遺伝子Ａｃｒｐ３０タンパク質配列は、例えば、米国特許第５，８６９，３３０号において開示されている。タンパク質の分泌はインシュリンによって増強され、タンパク質量は肥満対象において減少する。タンパク質は、エネルギーバランスの調節、特に脂肪酸代謝の調節に関わる。開裂されたＮ−末端シグナル、他のタンパク質への認識された相同性を有しない領域、コラーゲン様領域および球状領域を含む４つの配列領域が、マウスおよびヒトのタンパク質中で識別されている。球状領域はプロテアーゼ処理によってマウスタンパク質から取り除かれ、ｇＡｃｒｐ３０を生じ得る。マウスｇＡｃｒｐ３０製剤は医薬特性を有し、高脂肪給餌の投与または脂肪のｉ．ｖ注入後におけるマウス血清中の増加した遊離脂肪酸量を減少させることが示された［Ｆｒｕｅｂｉｓ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ（２００１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９８：２００５−２０１０］。
【０１５２】
潜在的なマウスＭＨＣクラスＩＩ結合活性を有するマウスＡｃｒｐ３０中のペプチド配列は以下の通りである：
【０１５３】
【表３５】
2004523754.tif 000039
潜在的なヒトＭＨＣクラスＩＩ結合活性を有するヒトＡｃｒｐ３０中のペプチド配列は以下の通りである：
【０１５４】
【表３６】
2004523754.tif 000040
（実施例１８（抗Ｃ５抗体））
本発明は、ヒトのＣ５補体タンパク質に対する特異的結合性を有するモノクローナル抗体の修飾形を提供する。本発明は１個または複数のＴ細胞エピトープが除去された修飾された抗体を提供する。Ｃ５補体タンパク質に対する結合特異性を備えた抗体は、Ｃ５転換酵素の開裂活性化をブロックし、それにより、炎症誘発性（ｐｒｏ−ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ）成分Ｃ５ａおよびＣ５ｂ−９の生産を阻害する。
【０１５５】
補体システムの活性化は、多数の急性・慢性疾患の病因において重要な寄与をする因子であリ、また、Ｃ５レベルにおける補体カスケードの阻害は、これらのうちのいくつかについて治療手段としての大きな可能性を提示する［Ｍｏｒｇａｎ  Ｂ．Ｐ．（１９９４）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．２４：２１９−２２８］。多数の抗Ｃ５抗体およびそれらを治療用途において使用する方法は当技術分野において記載されている［Ｗｕｒｚｎｅｒ  Ｒ．ｅｔ  ａｌ（１９９１）Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ  Ｉｎｆｌａｍｍ．８：３２８−３４０；Ｔｈｏｍａｓ，Ｔ．Ｃ．ｅｔ  ａｌ（１９９６）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ３３：１３８９−１４０１２；米国特許第５，８５３，７２２号；米国特許第６，０７４，６４号］。５Ｇ１．１と呼ばれる抗体［上掲Ｔｈｏｍａｓ，Ｔ．Ｃ．ｅｔ  ａｌ（１９９６）］および単一鎖ヒト化変異体は、心肺のバイパスや慢性関節リウマチを含む多数の疾病症状に対する治験が進行中である［Ｆｉｔｃｈ，Ｊ．Ｃ．Ｋ．ｅｔ  ａｌ（１９９９）Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １００：２４９９−２５０６］。本発明は、５Ｇ１．１［上掲Ｔｈｏｍａｓ，Ｔ．Ｃ．ｅｔ  ａｌ］と呼ばれる抗Ｃ−５抗体内に識別された配列を開示する。開示された配列は、ＭＨＣクラスＩＩ結合可能性の故に潜在的なＴ細胞エピトープである抗体配列の軽鎖および重鎖の両方の可変領域に由来する。開示は、さらに単一鎖および「ヒト化された」５Ｇ１．１抗体変異体［上掲Ｔｈｏｍａｓ，Ｔ．Ｃ．ｅｔ  ａｌ（１９９６）］のタンパク質配列内の潜在的なエピトープを識別する。
【０１５６】
潜在的なヒトＭＨＣクラスＩＩ結合活性を有する抗体５Ｇ１．１の重鎖可変領域内のペプチド配列は以下の通りである：
【０１５７】
【表３７】
2004523754.tif 000041
潜在的なヒトＭＨＣクラスＩＩ結合活性を有する抗体５Ｇ１．１の軽鎖可変領域内のペプチド配列は以下の通りである：
【０１５８】
【表３８】
2004523754.tif 000042
（実施例１９（抗ＣＤ２０抗体））
本発明は、ヒトのＣＤ２０抗原に対して結合特異性を有するモノクローナル抗体の修飾形を提供する。ＣＤ２０は、Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）の９０％以上を含むＢ細胞前駆体および成熟Ｂ細胞上で発現するＢ細胞特異的表面分子である。ＣＤ２０のモノクローナル抗体および放射免疫コンジュゲートの標的はＮＨＬの新しい治療法として出現した。顕著な例としてはモノクローナル抗体２Ｂ８［Ｒｅｆｆ，Ｍ．Ｅ．ｅｔ  ａｌ（１９９４）Ｂｌｏｏｄ  ８３：４３５−４４５］およびＢ１［米国特許第６，０９０、３６５号］が含まれる。２Ｂ８の可変領域がクローン化され、ヒト定常領域と組み合わされてＣ２Ｂ８と呼ばれるキメラ抗体が製造されており、これはアメリカではＲｉｔｕｘａｎ（商標）として［米国特許第５，７７６，４５６号］、またヨーロッパではＭａｂＴｈｅｒａ（登録商標）（ｒｉｔｕｘｉｍａｂ）として市場に出ている。Ｃ２Ｂ８はＮＨＬおよび他のＢ細胞疾患の治療に有益な治療剤として認められている［Ｍａｌｏｎｅｙ，Ｄ．Ｇ．ｅｔ  ａｌ（１９９７）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．１５：３２６６−３２７４；Ｍａｌｏｎｅｙ，Ｄ．Ｇ．ｅｔ  ａｌ（１９９７）Ｂｌｏｏｄ  ９０：２１８８−２１９５］。Ｂ１抗体は、ＮＨＬ治療剤として同様に使用のための登録が達成されているが、この事例では、分子（Ｂｅｘｘａｒ（商標））は131Ｉ放射免疫コンジュゲートである。もっとも、本来の（コンジュゲート化されていない）抗体は、リンパ腫および難治白血病の治療のための自己由来の骨髄移植治療法のためにｅｘ  ｖｉｖｏで有用性を有する［Ｆｒｅｅｄｍａｎ，Ａ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ（１９９０），Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．８：７８４］。Ｃ２Ｂ８（ｒｉｔｕｘｉｍａｂ）およびＢｅｘｘａｒ（商標）のような抗体の成功にもかかわらず、増強された特性を有する抗ＣＤ２０類似体は今なお必要とされている。
【０１５９】
潜在的なヒトＭＨＣクラスＩＩ結合活性を有する抗体２Ｂ８の重鎖可変領域内のペプチド配列は以下の通りである：
【０１６０】
【表３９】
2004523754.tif 000043
潜在的なヒトＭＨＣクラスＩＩ結合活性を有する抗体２Ｂ８の軽鎖可変領域内のペプチド配列は以下の通りである：
【０１６１】
【表４０】
2004523754.tif 000044
（実施例２０）
本発明は、ヒトのＩＬ−２レセプターに対して特異的結合性を有するモノクローナル抗体の修飾形を提供する。モノクローナル抗体は抗Ｔａｃと呼ばれ、修飾形では１個または複数のＴ細胞エピトープが除去されている。抗Ｔａｃ抗体は、ＴおよびＢのリンパ細胞の表面上で発現されるヒト高親和性ＩＬ−２レセプターのアルファサブユニット（ｐ５５−アルファ、ＣＤ２５またはＴａｃ）に高い特異性をもって結合する。抗体結合は、ＩＬ−２がレセプターを結合し、Ｔ細胞活性化を達成する能力を阻害する。抗Ｔａｃ抗体がＩＬ−２アンタゴニストとして働く能力は、器官移植拒絶の治療において重要な臨床的可能性を有する。マウス抗体を使用する臨床的研究では、患者において高い割合でＨＡＭＡ応答が生じるため、従来の免疫抑制剤を上回る長期の効果は期待されていないが、腎臓移植を経験した患者には当初ある程度有益であった［Ｋｉｒｋｈａｍ，Ｒ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ  （１９９１）Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ５１：１０７−１１３］。タンパク質のかなりの部分がヒトの抗体遺伝子から識別されたタンパク質配列を含むように組換えられた「ヒト化された」抗Ｔａｃ抗体が開発されている［Ｑｕｅｅｎ，Ｃ．ｅｔ  ａｌ（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）８６：１００２９−１００３３；米国特許第５，５３０，１０１号；米国特許第５，５８５，０８９号；米国特許第６，０１３，２５６号］。「ヒト化された」抗Ｔａｃ（Ｚｅｎａｐａｘ（商標）またはダクリズマブ（ｄａｃｌｉｚｕｍａｂ））は、腎臓移植拒絶の抑制および急性移植片対宿主病の管理のための免疫抑制剤として治験を受けてきた［Ａｎａｓｅｔｔｉ，Ｃ．ｅｔ  ａｌ（１９９４），Ｂｌｏｏｄ  ８４：１３２０−１３２７；Ａｎａｓｅｔｔｉ，Ｃ．ｅｔ  ａｌ（１９９５）Ｂｌｏｏｄ  ８６：Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  １：６２ａ；Ｅｃｋｈｏｆｆ，Ｄ．Ｅ．ｅｔ  ａｌ（２０００）Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ６９：１８６７−１８７２；Ｅｋｂｅｒｇ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ（１９９９）Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  Ｐｒｏｃ．３１：２６７  ２６８］。
【０１６２】
潜在的なヒトＭＨＣクラスＩＩ結合活性を有するマウス抗−Ｔａｃ抗体の重鎖可変領域内のペプチド配列は以下の通りである：
【０１６３】
【表４１】
2004523754.tif 000045
潜在的なヒトＭＨＣクラスＩＩ結合活性を有するマウス抗−Ｔａｃ抗体の軽鎖可変領域内のペプチド配列は以下の通りである：
【０１６４】
【表４２】
2004523754.tif 000046
潜在的なヒトＭＨＣクラスＩＩ結合活性を有するヒト化抗−Ｔａｃ抗体の重鎖可変領域内のペプチド配列は以下の通りである：
【０１６５】
【表４３】
2004523754.tif 000047
潜在的なヒトＭＨＣクラスＩＩ結合活性を有するヒト化抗−Ｔａｃ抗体の軽鎖可変領域内のペプチド配列は以下の通りである：
【０１６６】
【表４４】
2004523754.tif 000048
（実施例２１（１４．１８抗体））
特に断らない限り、可変重鎖および軽鎖中のアミノ酸はすべてＫａｂａｔら（１９９１年）（免疫学的に興味のあるタンパク質の配列、米国保健福祉省）に従ってナンバリングしている。潜在的なＴ細胞エピトープは、エピトープの最初のアミノ酸を重鎖および軽鎖の最初のアミノ酸から線状に数えて番号を付けている。
【０１６７】
１．マウス・サブグループフレームワークとの比較
マウス１４．１８のＶＨ（重鎖）およびＶＫ（軽鎖）のアミノ酸配列を、Ｋａｂａｔマウス重鎖および軽鎖サブグループ（Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１）についてコンセンサス配列と比較した。１４．１８ＶＨはマウス重鎖サブグループＩＩ（Ａ）に割り当てることができる。１４．１８ＶＨの配列を配列番号１に示す。このサブグループについてのコンセンサス配列との比較は、位置８１でのヒスチジン（通常グルタミン）、位置８２ａでのリジン（通常セリンまたはアスパラギン）、位置９３でのバリン（通常アラニン）および位置９４でのセリン（通常アルギニン）がこのサブグループについて異常（ａｔｙｐｉｃａｌ）であることを示す。位置１９、４０および６６での残基もこのサブグループではしばしば見出されるが、抗体結合および構造への影響は小さいと考えられる。１４．１８ＶＫはマウスカッパ鎖サブグループＩｌに割り当てることができる。このサブグループについてコンセンサス配列との比較は、位置４９のヒスチジンがこのサブグループでは異常なことを示す。この残基は最も普通にはチロシンである。
【０１６８】
２．ヒトフレームワークとの比較
マウス１４．１８ＶHおよびＶKのアミノ酸配列を、ヒト生殖細胞系ＶH（Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，（１９９２）２２７：７７６−７９８）のディレクトリーの配列およびＶＫ（Ｃｏｘ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９４，１−４−：８２７−８３６）配列、そしてさらにヒト生殖細胞系Ｊ領域配列（Ｒｏｕｔｌｅｄｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎ「Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｍａｎ」，Ｃｌａｒｋ，Ｍ．ｅｄ．Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｔｉｔｌｅｓ，Ｎｏｔｔｉｎｇｈａｍ，ＵＫ，ｐｐ１３−４４，１９９３）と比較した。１４．１８ＶHに対し選択される参照ヒトフレームワークは、ヒトＪH６を有するＤＰ２５とした。この生殖細胞系配列は、アミノ酸が変更されていない再配置された成熟抗体遺伝子中に見出された。フレームワーク３としては、成熟したヒト抗体２９の配列を用いた。この配列は、ＣＤＲ３の直近に隣接しているマウス配列と同一である。１４．１８ＶＫに対し選択される参照ヒトフレームワークは、ＤＰＫ２２とした。この生殖細胞系配列は、アミノ酸が変更されていない再配置された成熟抗体遺伝子中に見出された。フレームワーク２としては、成熟したヒト抗体１６３．５配列を使用した。この配列は、ＣＤＲ２の直近に隣接しているマウス配列と同一である。Ｊ領域配列はヒトＪＫ２とした（Ｒｏｕｔｌｅｄｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３）。
【０１６９】
３．「張り合わせ」配列の形成
参照ヒトフレームワーク配列の識別に続いて、１４．１８ＶHおよびＶKフレームワーク内の一定の異なったアミノ酸残基を、ヒト参照フレームワーク配列の対応するアミノ酸に変更した。抗体構造および結合のために重要と考えられる残基はこの方法では除外し変更しなかった。この段階で保持されたマウス残基は大部分、非表面性の埋没残基で、例えばＮ−末端の残基（これは最終抗体のＣＤＲに近い）から離れている。この方法により、表面の残基が主としてヒト性となり埋没残基が元のマウス配列内となるので「張り合わせ」（「ｖｅｎｅｅｒｅｄ」）抗体に広く類似した配列を生じる。
【０１７０】
４．ペプチドスレッディング分析
マウスおよび張り合わせ１４．１８ＶHおよびＶK配列を本発明による方法を用いて分析した。アミノ酸配列はすべての可能な１３ｍｅｒに分割する。引き続いて、１３ｍｅｒペプチドをＨＬＡ−ＤＲアロタイプ結合溝モデルに提示し、各対立遺伝子について各ペプチドに対し結合スコアを割り当てる。ペプチドの各ポケット結合側鎖についてコンホメーションスコアを計算する。このスコアは立体的な重なり、結合溝内のペプチドと残基間に起こり得る水素結合、ペプチドとポケット残基の間の静電的相互作用および優先的な接触に基づく。次いで、各側鎖のコンホメーションを変更し、スコアを再計算する。最も高いコンホメーションスコアを決定し、次いで、結合溝疎水性残基、非溝の親水性残基、および結合溝に嵌まり込む残基の数に基づいて結合スコアを計算する。ＮＭＣクラスＩＩに知られている結合剤は、ほとんど偽陰性のない高い結合スコアを達成する。したがって、この分析で重要な結合スコアを達成するペプチドは潜在的なＴ細胞エピトープであると考えられる。ペプチドスレッディング分析の結果を、マウスおよび張り合わせ配列について表１に示す。
【０１７１】
【表４５】
2004523754.tif 000049
５．潜在的なＴ細胞エピトープの除去
エピトープを構成する特定のペプチドにおいてアミノ酸置換を行うことにより潜在的なＴ細胞エピトープを除去する。置換は、可能な場合には同様の物理化学的特性のアミノ酸を挿入することにより行った。しかし、いくつかの潜在的なエピトープを除去するために、異なる大きさ、電荷または疎水性のアミノ酸に置換する必要があってもよい。結合に影響を及ぼし得るＣＤＲ内で変更を行う必要がある場合には、特定のアミノ酸置換を伴うまたは伴わない変異体を作る必要がある。置換するアミノ酸残基の線形的な番号は、Ｋａｂａｔ番号に従い括弧内に示す。潜在的なＴ細胞エピトープは、１３ｍｅｒの最初の残基の線形的な番号によって示す。
【０１７２】
張り合わせ１４．１８重鎖可変領域からＴ−細胞エピトープを除去するために必要なアミノ酸置換は、以下の通りであった：
１．残基４１（Ｋａｂａｔ番号４１）のプロリンをイソロイシンに置換し、ＣＤＲ２の残基５０のアラニンのロイシンへの置換と組み合わせることで、残基番号４３における潜在的なエピトープが除去される
２．（１）に代えて、残基４５（Ｋａｂａｔ番号４５）のロイシンをトレオニンに、および残基４１（Ｋａｂａｔ番号４１）のプロリンを置換することで、位置４３における潜在的なエピトープが除去される
３．ＣＤＲ２の残基６６（Ｋａｂａｔ番号６５）のグリシンをセリンに置換し、残基６８（Ｋａｂａｔ番号６７）のアラニンをバリンに置換することで、位置５８における潜在的なエピトープが除去される。セリンはヒトおよびマウス抗体配列の位置に見出される
４．残基７０（Ｋａｂａｔ番号６９）のロイシンをイソロイシンに置換することで、位置６２における潜在的なエピトープに結合するＭＨＣアロタイプの数が１１から４に低減される
５．残基７２（Ｋａｂａｔ番号７１）のバリンをアラニンに置換することで、位置６２における潜在的なエピトープが除去される。この位置におけるアミノ酸の大きさは重要であり、アラニンはバリンと大きさおよび疎水性の点で類似している
６．残基９１（Ｋａｂａｔ番号８７）のセリンをトレオニンに置換することで、位置８１および８４における潜在的なエピトープが除去される。
【０１７３】
張り合わせ１４．１８軽鎖可変領域から潜在的なＴ−細胞エピトープを除去するために必要なアミノ酸置換は、以下の通りであった：
１．残基３２（Ｋａｂａｔ番号２７ｅ）のアルギニンをセリンに置換することで、位置２７における潜在的なエピトープが除去される。この残基はＣＤＲ２内にあるが、セリンはしばしばマウスおよびヒト抗体においてｔＷｓ位置に見出される。ＣＤＲ外で潜在的なエピトープを除去する変更はない
２．残基５４（Ｋａｂａｔ番号４９）のヒスチジンをチロシンに置換することで、位置４３における潜在的なエピトープが除去される。チロシンはマウスおよびヒト抗体において位置４９に最も高頻度に見出されるアミノ酸である
３．位置４３における潜在的なエピトープを除去するため、（２）に代えて、残基５１（Ｋａｂａｔ番号４６）のロイシンをメチオニンに置換する。メチオニンはロイシンと大きさおよび疎水性の点で類似している
４．残基８８（Ｋａｂａｔ番号８３）のロイシンをメチオニンに置換することで、位置８６における潜在的なエピトープが除去される
５．ＣＤＲＨ３において残基１０２（Ｋａｂａｔ番号９６）のロイシンをトレオニンに置換し、この際に残基１０５（Ｋａｂａｔ番号１００）のグリシンのグルタミンへの組み合わせにより、位置９７における潜在的なエピトープに結合するＭＨＣアロタイプの数が１１から５に低減される
６．位置９７における潜在的なエピトープを除去するため、（５）に代えて、残基１０２（Ｋａｂａｔ番号９６）のロイシンをプロリンに置換する
７．残基１１０（Ｋａｂａｔ番号１０４）のロイシンをバリンに置換することで、位置１００における潜在的なエピトープが除去される。
【０１７４】
６．脱免疫配列の設計
脱免疫された重鎖および軽鎖配列を、潜在的なＴ細胞エピトープの除去に必要な変更を参考とし、また抗体構造および結合に肝要と思われるフレームワーク残基を考慮して設計した。張り合わせ配列に基づく脱免疫配列に加え、マウス配列に基づくＶＨおよびＶＫそれぞれについて追加的な配列を設計し、マウスペプチドのスレッディング（ＭｏＰＴ）変型（ｖｅｒｓｉｏｎ）と名付けた。この変型については、Ｔ−細胞エピトープを除去するためにマウス配列に直接変更を行ったが、結合に有害であると考えられないＣＤＲ外の変更のみである。この脱免疫配列変型では表面（Ｂ−細胞）エピトープを除去する試みは行わなかった。
【０１７５】
この主要な脱免疫化ＶＨは、上記第５項における１，３，４，５および６の置換を含み、潜在的Ｔ細胞エピトープは含まない。必要な様々な置換の抗体結合に対する影響を試験するために、さらに４個の脱免疫化ＶＨＳを設計した。変型２は、同じ潜在的Ｔ細胞エピトープを別の置換（上記２．５節の２）で除去した変型１の代替物である。主要な脱免疫化配列（１４．１８ＤＩＶＨ１）に行われた累積的な変更および残っている潜在的なＴ細胞エピトープを表２に詳しく示す。マウススレッディド変型を、比較のために含む。
【０１７６】
【表４６】
2004523754.tif 000050
主要な脱免疫化ＶＫは、上記第５項の置換１，２，４，６および７を含む。主要な脱免疫化ＶＫは、潜在的なＴ細胞エピトープは含まない。必要な様々な置換の抗体結合に対する影響を試験するためさらに５個の脱免疫化ＶＫＳを設計した。変型２は、位置４３の潜在的Ｔ細胞エピトープを別の置換を用いて除去した変型１の代替物である。変型３は、別の置換（上記２．５節の６）で除去した代替物であり、位置９７における潜在的なエピトープに結合するＭＨＣアロタイプの数が１１から５に低減する。主要な脱免疫化配列（１４．１８ＤＩＶＫ１）に行われた累積的な変更および残っている潜在的なＴ細胞エピトープを表３に詳しく示す。
【０１７７】
【表４７】
2004523754.tif 000051
修正エピトープ変型の配列：
【０１７８】
【表４８】
2004523754.tif 000052
【０１７９】
【表４９】
2004523754.tif 000053
（実施例２２（ＫＳ抗体））
１．マウスサブグループフレームワークとの比較
マウスＫＳ  ＶＨおよびＶＫのアミノ酸配列を、Ｋａｂａｔマウス重鎖および軽鎖サブグループ（Ｋａｂａｔ、１９９１年）についてのコンセンサス配列と比較した。マウスＫＳ  ＶＨはサブグループのいずれにも割り当てることができないが、サブグループＩＩ（Ａ）およびＶ（Ａ）に近似している。異常な残基は、通常はバリンである位置２、通常グルタミン酸である４６、通常トレオニンである６８に見出される。残基６９はより一般的にはロイシンまたはイソロイシンである。８２ｂでは、セリンが最もしばしば見出される。マウスＫＳ  ＶＫはサブグループＶＩ（「図２」に割り当てることができる。異常な残基は、一般には両方ともロイシンである４６および４７に見出される。残基５８は異常である、この位置で通常見出されるのはロイシンまたはバリンのいずれかである。
【０１８０】
２．ヒトフレームワークとの比較
マウスＫＳ  ＶＨおよびＶＫのアミノ酸配列をヒト生殖細胞系ＶＨ（Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ、１９９２年）およびＶＫ（ＣＯＸ  ｅｔ  ａｌ、１９９４）配列ディレクトリ、およびさらにヒト生殖細胞系Ｊ領域配列（Ｒｏｕｔｌｅｄｇｅ  ｅｔ  ａｌ、１９９３年）配列と比較した。ＫＳ  ＶＨに対して選択される参照ヒトフレームワークはヒトＪＨ６を有するＤＰ１０とした。この生殖細胞系配列は、アミノ酸変更を持たない再配置された成熟抗体遺伝子で見出される。ＫＳ  ＶＫに対して選択される参照ヒトフレームワークはＢ１とした。フレームワーク−２としては、成熟したヒト抗体ＩＭＥＶ配列を使用した（Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ、１９９１における）。この配列は、ＣＤＲ２の直近に隣接しているマウス配列と同一である。Ｊ領域配列はヒトＪＫ４とした。この生殖細胞系配列は再配置された成熟抗体軽鎖としては見つかっていない。
【０１８１】
３．「張り合わせ」配列の形成
参照ヒトフレームワーク配列の識別に続いて、４２５ＶＨおよびＶＫフレームワーク内の一定の異なったアミノ酸残基を、ヒト参照フレームワーク配列の対応するアミノ酸に変更した。抗体構造および結合のために重要と考えられる残基はこの方法では除外し変更しなかった。この段階で保持されたマウス残基は大部分、非表面性の埋没残基で、例えばＮ−末端の残基（これは最終抗体中のＣＤＲに近い）から離れている。この方法により、表面の残基が主としてヒト性となり埋没残基が元のマウス配列内となるので「張り合わせ」（「ｖｅｎｅｅｒｅｄ」）抗体に広く類似した配列を生じる。
【０１８２】
４．ペプチドスレッディング分析
マウスおよび張り合わせＫＳ  ＶＨおよびＶＫ配列を本発明による方法を用いて分析した。アミノ酸配列はすべての可能な１３ｍｅｒに分割する。引き続いて、１３ｍｅｒペプチドをＨＬＡ−ＤＲアロタイプ結合溝モデルに提示し、各対立遺伝子について各ペプチドに対し結合スコアを割り当てる。ペプチドの各ポケット結合側鎖についてコンホメーションスコアを計算する。このスコアは立体的な重なり、結合溝内のペプチドと残基間に起こり得る水素結合、ペプチドとポケット残基の間の静電的相互作用および優先的な接触に基づく。次いで、各側鎖のコンホメーションを変更し、スコアを再計算する。最も高いコンホメーションスコアを決定し、次いで、結合溝疎水性残基、非溝の親水性残基、および結合溝に嵌まり込む残基の数に基づいて結合スコアを計算する。ＭＨＣクラスＩＩに対する既知の結合剤であるペプチドは、ほとんど偽陰性のない高い結合スコアを達成する。したがって、この分析でかなりの結合スコアを達成するペプチドは潜在的なＴ細胞エピトープであると考えられる。マウスおよび張り合わせ配列のためのペプチドスレッディング分析の結果を表１に示す。
【０１８３】
【表５０】
2004523754.tif 000054
５．潜在的なＴ細胞エピトープの除去
エピトープを構成する特定のペプチドにおいてアミノ酸置換を行うことにより潜在的なＴ細胞エピトープを除去する。置換は、可能な場合には同様の物理化学的特性のアミノ酸を挿入することにより行った。しかし、いくつかの潜在的なエピトープを除去するために、異なる大きさ、電荷または疎水性のアミノ酸に置換する必要があってもよい。結合に影響を及ぼし得るＣＤＲ内で変更を行う必要がある場合には、特定のアミノ酸置換を伴うまたは伴わない変異体を作る必要がある。置換するアミノ酸残基の番号付けは、Ｋａｂａｔに従う。潜在的なＴ細胞エピトープは、１３ｍｅｒの最初の残基の線形的な番号によって示す。
【０１８４】
張り合わせＫＳ重鎖可変領域からＴ−細胞エピトープを除去するために必要なアミノ酸置換は、以下の通りであった：
１．残基３８（Ｋａｂａｔ番号３８）のリジンをアルギニンに置換することで、残基番号３０における潜在的なエピトープが除去される
２．残基７２（Ｋａｂａｔ番号７１）のロイシンをアラニンに、および残基７０（Ｋａｂａｔ番号６９）のフェニルアラニンをイソロイシン置換することで、残基番号６２における潜在的なエピトープが除去される。Ｋａｂａｔ番号６９のイソロイシンおよびＫａｂａｔ番号７１のアラニンは、ヒト生殖細胞系  ＶＨ配列ＤＰ１０に見出される
３．残基７９（Ｋａｂａｔ番号７８）のアラニンをロイシンに置換することで、残基番号７８における潜在的なエピトープが除去される
４．残基９１（Ｋａｂａｔ番号８７）のメチオニンをトレオニンに置換することで、残基番号８９における潜在的なエピトープが除去される
５．ＣＤＲＨ３において、イソロイシン残基１００（Ｋａｂａｔ番号９６）をメチオニンに置換することで、残基番号９８における潜在的なエピトープが除去される。ＣＤＲＨ３外にはこの潜在的なエピトープを除去する変更はない。
【０１８５】
張り合わせＫＳ軽鎖可変領域から潜在的なＴ−細胞エピトープを除去するために必要なアミノ酸置換は、以下の通りであった：
１．残基３２（Ｋａｂａｔ番号３３）のメチオニンをイソロイシンに置換することで、残基番号２７における潜在的なエピトープが除去される。この残基はＣＤＲ２の内にある。イソロイシンはヒト抗体で一般にこの位置に見出される
２．残基（Ｋａｂａｔ番号３）のロイシンをバリンに置換することで、位置１の残基における潜在的なエピトープが除去される
３．残基５９（Ｋａｂａｔ番号６０）のアラニンをセリンに置換することで、残基番号５１における潜在的なエピトープが除去される。
【０１８６】
６．脱免疫配列の設計
脱免疫された重鎖および軽鎖領域配列を、潜在的なＴ細胞エピトープの除去に必要な変更を参考とし、また抗体構造および結合に肝要と思われるフレームワーク残基を考慮して設計した。張り合わせ配列に基づく脱免疫配列に加え、マウス配列に基づくＶＨおよびＶＫそれぞれについて追加的な配列を設計し、マウスペプチドのスレッディング（ＭｏＰＴ）変型（ｖｅｒｓｉｏｎ）と名付けた。この変型については、Ｔ−細胞エピトープを除去するためにマウス配列に直接変更を行ったが、結合に有害であると考えられないＣＤＲ外の変更のみである。この脱免疫配列変型では表面（Ｂ−細胞）エピトープを除去する試みは行わなかった。主要な脱免疫化ＶＨは、上記第５項の置換１〜５を含み、さらに残基４３（Ｋａｂａｔ番号４３）の変更を含む。マウス配列に見られるリジンでヒトフレームワーク由来のグルタミンを置き換えた。リジンは正電荷を持ち、したがってグルタミンとは著しく異なる。この領域はＶＨ／ＶＬ接点を含んでもよい。主要な脱免疫ＶＨは潜在的なＴ細胞エピトープを含まない。必要な様々な置換の抗体結合に対する影響を試験するためさらに４個の脱免疫化ＶＨ配列を設計した。主要な脱免疫化配列（ＫＳＤＩＶＨｖ１）に行われた累積的な変更および残っている潜在的なＴ細胞エピトープを表２に詳しく示す。
【０１８７】
【表５１】
2004523754.tif 000055
主要な脱免疫化ＶＫは、上記第５項の置換１〜３を含む。必要な様々な置換の抗体結合に対する影響を試験するためさらに３個の脱免疫化ＶＫ配列を設計した。主要な脱免疫化配列（ＫＳＤＩＶＫｖ１）およびに行われた累積的な変更および残っている潜在的なＴ細胞エピトープを表３に詳しく示す。
【０１８８】
【表５２】
2004523754.tif 000056
修飾されたエピトープ変型の配列：
【０１８９】
【表５３】
2004523754.tif 000057
【０１９０】
【表５４】
2004523754.tif 000058
【図面の簡単な説明】
【０１９１】
【図１】本発明の計算方法の１つの態様を示すフローチャートである。
【図２】本発明を実施する計算方法のためのデータベース生成を示すフローチャートである。
【図３】潜在的なＴ細胞エピトープ用のペプチドのプロファイルを描くためにデータベース問合せ（ｄａｔａｂａｓｅ  ｉｎｔｅｒｒｏｇａｔｉｏｎ）を示すフローチャートである
【図４】本発明の計算方法を示す別のフローチャートである。
【図５】グルタミン酸デカルボキシラーゼ（ＭＷ：６５０００）アイソフォーム（ＧＡＤ  ６５）のＴ−細胞エピトープ見込み指数（Ｔ−ｃｅｌｌ  ｅｐｉｔｏｐｅ  ｌｉｋｅｌｉｈｏｏｄ  ｉｎｄｅｘ）対アミノ酸残基座標（位置）のプロットである。
【図６】エリスロポエチン（ＥＰＯ）についてのＴ−細胞エピトープ見込み指数対アミノ酸残基座標（位置）のプロットである。
【図７】ヒト化された抗Ａ３３モノクローナル抗体軽鎖についてのＴ−細胞エピトープ見込み指数対アミノ酸残基座標（位置）のプロットである。
【図８】ヒト化された抗Ａ３３モノクローナル抗体重鎖についてのＴ−細胞エピトープ見込み指数対アミノ酸残基座標（位置）のプロットである。
【図１】
2004523754.tif 000059
【図２】
2004523754.tif 000060
【図３】
2004523754.tif 000061
【図４】
2004523754.tif 000062
【図５】
2004523754.tif 000063
【図６】
2004523754.tif 000064
【図７】
2004523754.tif 000065
【図８】
2004523754.tif 000066
【国際公開パンフレット】
2004523754.tif 000067
2004523754.tif 000068
2004523754.tif 000069
2004523754.tif 000070
2004523754.tif 000071
2004523754.tif 000072
2004523754.tif 000073
2004523754.tif 000074
2004523754.tif 000075
2004523754.tif 000076
2004523754.tif 000077
2004523754.tif 000078
2004523754.tif 000079
2004523754.tif 000080
2004523754.tif 000081
2004523754.tif 000082
2004523754.tif 000083
2004523754.tif 000084
2004523754.tif 000085
2004523754.tif 000086
2004523754.tif 000087
2004523754.tif 000088
2004523754.tif 000089
2004523754.tif 000090
2004523754.tif 000091
2004523754.tif 000092
2004523754.tif 000093
2004523754.tif 000094
2004523754.tif 000095
2004523754.tif 000096
2004523754.tif 000097
2004523754.tif 000098
2004523754.tif 000099
2004523754.tif 000100
2004523754.tif 000101
2004523754.tif 000102
2004523754.tif 000103
2004523754.tif 000104
2004523754.tif 000105
2004523754.tif 000106
2004523754.tif 000107
2004523754.tif 000108
2004523754.tif 000109
2004523754.tif 000110
2004523754.tif 000111
2004523754.tif 000112
2004523754.tif 000113
2004523754.tif 000114
2004523754.tif 000115
2004523754.tif 000116
2004523754.tif 000117
2004523754.tif 000118
2004523754.tif 000119
2004523754.tif 000120
2004523754.tif 000121
2004523754.tif 000122
2004523754.tif 000123
2004523754.tif 000124
2004523754.tif 000125
2004523754.tif 000126
2004523754.tif 000127
2004523754.tif 000128
2004523754.tif 000129
2004523754.tif 000130
2004523754.tif 000131
2004523754.tif 000132
2004523754.tif 000133
2004523754.tif 000134
2004523754.tif 000135
2004523754.tif 000136
2004523754.tif 000137
2004523754.tif 000138
2004523754.tif 000139
2004523754.tif 000140
2004523754.tif 000141
2004523754.tif 000142
2004523754.tif 000143
2004523754.tif 000144
2004523754.tif 000145
2004523754.tif 000146
2004523754.tif 000147
2004523754.tif 000148
2004523754.tif 000149
2004523754.tif 000150
2004523754.tif 000151
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004523754.tif 000152
2004523754.tif 000153
【国際調査報告】
2004523754.tif 000154
2004523754.tif 000155
2004523754.tif 000156
2004523754.tif 000157
2004523754.tif 000158
2004523754.tif 000159
2004523754.tif 000160
2004523754.tif 000161
2004523754.tif 000162
2004523754.tif 000163
2004523754.tif 000164