(57)【要約】本発明は、核磁気共鳴（NMR）スペクトルなどのスペクトルデータのような化学データ、生化学データおよび生物学データのケモメトリック分析方法、ならびに分類、診断、予後などのその応用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプルを分類する方法であって、前記サンプルについての１つ以上の所定の診断スペクトルウィンドウでのNMRスペクトル強度を所定の状態と関連付けるステップを含む前記方法。
【請求項２】
被験者からのサンプルを分類する請求項１に記載の方法であって、前記サンプルについての１つ以上の所定の診断スペクトルウィンドウでのNMRスペクトル強度を前記被験者における所定の状態と関連付けるステップを含む前記方法。
【請求項３】
サンプルを分類する請求項１に記載の方法であって、前記サンプルについての１つ以上の所定の診断スペクトルウィンドウでのNMRスペクトル強度を所定の状態の有無に関連付けるステップを含む前記方法。
【請求項４】
被験者からのサンプルを分類する請求項１に記載の方法であって、前記サンプルについての１つ以上の所定の診断スペクトルウィンドウでのNMRスペクトル強度を前記被験者における所定の状態の有無に関連付けるステップを含む前記方法。
【請求項５】
サンプルを分類する請求項１に記載の方法であって、前記サンプルについての１つ以上の所定の診断スペクトルウィンドウでのNMRスペクトル強度の対照値に対する変調を所定の状態と関連付けるステップを含む前記方法。
【請求項６】
被験者からのサンプルを分類する請求項１に記載の方法であって、前記サンプルについての１つ以上の所定の診断スペクトルウィンドウでのNMRスペクトル強度の対照値に対する変調を被験者における所定の状態と関連付けるステップを含む前記方法。
【請求項７】
サンプルを分類する請求項１に記載の方法であって、前記サンプルについての１つ以上の所定の診断スペクトルウィンドウでのNMRスペクトル強度の対照値に対する変調を所定の状態の有無に関連付けるステップを含む前記方法。
【請求項８】
被験者からのサンプルを分類する請求項１に記載の方法であって、前記サンプルについての１つ以上の所定の診断スペクトルウィンドウでのNMRスペクトル強度の対照値に対する変調を前記被験者における所定の状態の有無に関連付けるステップを含む前記方法。
【請求項９】
被験者を分類する方法であって、前記被験者からのサンプルについての１つ以上の所定の診断スペクトルウィンドウでのNMRスペクトル強度を前記被験者における所定の状態と関連付けるステップを含む前記方法。
【請求項１０】
被験者を分類する請求項９に記載の方法であって、前記被験者からのサンプルについての１つ以上の所定の診断スペクトルウィンドウでのNMRスペクトル強度を前記被験者における所定の状態の有無に関連付けるステップを含む前記方法。
【請求項１１】
被験者を分類する請求項９に記載の方法であって、前記被験者からのサンプルについての１つ以上の所定の診断スペクトルウィンドウでのNMRスペクトル強度の対照値に対する変調を前記被験者における所定の状態と関連付けるステップを含む前記方法。
【請求項１２】
被験者を分類する請求項９に記載の方法であって、前記被験者からのサンプルについての１つ以上の所定の診断スペクトルウィンドウでのNMRスペクトル強度の対照値に対する変調を前記被験者における所定の状態の有無に関連付けるステップを含む前記方法。
【請求項１３】
被験者の所定の状態を診断する方法であって、前記被験者からのサンプルについての１つ以上の所定の診断スペクトルウィンドウでのNMRスペクトル強度を前記被験者における前記所定の状態と関連付けるステップを含む前記方法。
【請求項１４】
被験者の所定の状態を診断する請求項１３に記載の方法であって、前記被験者からのサンプルについての１つ以上の所定の診断スペクトルウィンドウでのNMRスペクトル強度を前記被験者における前記所定の状態の有無に関連付けるステップを含む前記方法。
【請求項１５】
被験者の所定の状態を診断する請求項１３に記載の方法であって、前記被験者からのサンプルについての１つ以上の所定の診断スペクトルウィンドウでのNMRスペクトル強度の対照値に対する変調を前記被験者における前記所定の状態と関連付けるステップを含む前記方法。
【請求項１６】
被験者の所定の状態を診断する請求項１３に記載の方法であって、前記被験者からのサンプルについての１つ以上の所定の診断スペクトルウィンドウでのNMRスペクトル強度の対照値に対する変調を前記被験者における前記所定の状態の有無に関連付けるステップを含む前記方法。
【請求項１７】
サンプルを分類する方法であって、前記サンプル中に存在する１つ以上の診断種の量または相対量を所定の状態と関連付けるステップを含む前記方法。
【請求項１８】
被験者からのサンプルを分類する請求項１７に記載の方法であって、前記サンプル中に存在する１つ以上の診断種の量または相対量を前記被験者における所定の状態と関連付けるステップを含む前記方法。
【請求項１９】
サンプルを分類する請求項１７に記載の方法であって、前記サンプル中に存在する１つ以上の診断種の量または相対量を所定の状態の有無と関連付けるステップを含む前記方法。
【請求項２０】
被験者からのサンプルを分類する請求項１７に記載の方法であって、前記サンプル中に存在する１つ以上の診断種の量または相対量を前記被験者における所定の状態の有無と関連付けるステップを含む前記方法。
【請求項２１】
サンプルを分類する請求項１７に記載の方法であって、対照サンプルと比較した前記サンプル中に存在する１つ以上の診断種の量または相対量の変調を所定の状態と関連付けるステップを含む前記方法。
【請求項２２】
被験者からのサンプルを分類する請求項１７に記載の方法であって、対照サンプルと比較した前記サンプル中に存在する１つ以上の診断種の量または相対量の変調を前記被験者における所定の状態と関連付けるステップを含む方法に関する。
【請求項２３】
サンプルを分類する請求項１７に記載の方法であって、対照サンプルと比較した前記サンプル中に存在する１つ以上の診断種の量または相対量の変調を所定の状態の有無と関連付けるステップを含む前記方法。
【請求項２４】
被験者からのサンプルを分類する請求項１７に記載の方法であって、対照サンプルと比較した前記サンプル中に存在する１つ以上の診断種の量または相対量の変調を前記被験者における所定の状態の有無と関連付けるステップを含む前記方法。
【請求項２５】
被験者を分類する方法であって、前記被験者からのサンプル中に存在する１つ以上の診断種の量または相対量を前記被験者における所定の状態と関連付けるステップを含む前記方法。
【請求項２６】
被験者を分類する請求項２５に記載の方法であって、前記被験者からのサンプル中に存在する１つ以上の診断種の量または相対量を前記被験者における所定の状態の有無と関連付けるステップを含む前記方法。
【請求項２７】
被験者を分類する請求項２５に記載の方法であって、対照サンプルと比較した前記被験者からのサンプル中に存在する１つ以上の診断種の量または相対量の変調を前記被験者における所定の状態と関連付けるステップを含む前記方法。
【請求項２８】
被験者を分類する請求項２５に記載の方法であって、対照サンプルと比較した前記被験者からのサンプル中に存在する１つ以上の診断種の量または相対量の変調を前記被験者における所定の状態の有無と関連付けるステップを含む前記方法。
【請求項２９】
被験者の所定の状態を診断する方法であって、前記被験者からのサンプル中に存在する１つ以上の診断種の量または相対量を前記被験者における前記所定の状態と関連付けるステップを含む前記方法。
【請求項３０】
被験者の所定の状態を診断する請求項２９に記載の方法であって、前記被験者からのサンプル中に存在する１つ以上の診断種の量または相対量を前記被験者における前記所定の状態の有無に関連付けるステップを含む前記方法。
【請求項３１】
被験者の所定の状態を診断する請求項２９に記載の方法であって、対照サンプルと比較した前記被験者からのサンプル中に存在する１つ以上の診断種の量または相対量の変調を前記被験者における前記所定の状態と関連付けるステップを含む前記方法。
【請求項３２】
被験者の所定の状態を診断する請求項２９に記載の方法であって、対照サンプルと比較した前記被験者からのサンプル中に存在する１つ以上の診断種の量または相対量の変調を前記被験者における前記所定の状態の有無に関連付けるステップを含む前記方法。
【請求項３３】
分類方法であって、
（ａ）モデリング方法をモデリングデータに適用することで、予測数学モデルを形成するステップ；
（ｂ）前記モデルを用いて試験サンプルを分類するステップ
を含む前記方法。
【請求項３４】
試験サンプルを分類する請求項３３に記載の方法であって、
（ａ）モデリング方法をモデリングデータに適用することで予測数学モデルを形成するステップであって、
前記モデリングデータが既知分類のモデリングサンプルについての複数のデータセットを含む前記ステップ；
（ｂ）前記モデルを用いて、前記試験サンプルを前記既知分類のいずれかのメンバーとして分類するステップ
を含む前記方法。
【請求項３５】
試験サンプルを分類する請求項３３に記載の方法であって、
（ａ）モデリング方法をモデリングデータに適用して予測数学モデルを形成するステップであって、
前記モデリングデータが複数のモデリングサンプルの各々について少なくとも１つのデータセットを含み、
前記モデリングサンプルが複数の分類からなる分類群を規定し、
前記モデリングサンプルの各々が、前記分類群から選択される既知分類のものである前記ステップ；ならびに
（ｂ）前記試験サンプルについてのデータセットと前記モデルを用いて、前記試験サンプルを前記分類群から選択される１つの分類のメンバーとして分類するステップ
を含む前記方法。
【請求項３６】
分類方法であって、
予測数学モデルを用いて試験サンプルを分類するステップを含み、
前記モデルの形成を、モデリング方法をモデリングデータに適用することで行う前記方法。
【請求項３７】
試験サンプルを分類する請求項３６に記載の方法であって、
予測数学モデルを用いて、前記試験サンプルを既知分類のいずれかのメンバーとして分類するステップを含み、
前記モデルの形成を、モデリング方法をモデリングデータに適用することで行い、
前記モデリングデータが前記既知分類のモデリングサンプルについての複数のデータセットを含む前記方法。
【請求項３８】
試験サンプルを分類する請求項３６に記載の方法であって、
予測数学モデルを前記試験サンプルについてのデータセットとともに用いて、前記試験サンプルを分類群から選択される１つの分類のメンバーとして分類するステップを含み、
前記モデルの形成を、モデリング方法をモデリングデータに適用することで行い、
前記モデリングデータが、複数のモデリングサンプルの各々について少なくとも１つのデータセットを含み、
前記モデリングサンプルが、複数の分類からなる前記分類群を規定し、
前記モデリングサンプルの各々が、前記分類群から選択される既知分類のものである前記方法。
【請求項３９】
分類方法であって、
（ａ）モデリング方法をモデリングデータに適用することで予測数学モデルを形成するステップ；
（ｂ）前記モデルを用いて被験者を分類するステップ
を含む前記方法。
【請求項４０】
被験者を分類する請求項３９に記載の方法であって、
（ａ）モデリング方法をモデリングデータに適用することで予測数学モデルを形成するステップであって、
前記モデリングデータが、既知分類のモデリングサンプルについて複数のデータセットを含む前記ステップ；
（ｂ）前記モデルを用いて、前記被験者からの試験サンプルを前記既知分類のいずれかのメンバーとして分類し、それによって前記被験者を分類するステップ
を含む前記方法。
【請求項４１】
被験者を分類する請求項３９に記載の方法であって、
（ａ）モデリング方法をモデリングデータに適用することで予測数学モデルを形成するステップであって、
前記モデリングデータが、複数のモデリングサンプルの各々について少なくとも１つのデータセットを含み、
前記モデリングサンプルが、複数の分類からなる分類群を規定し、
前記モデリングサンプルの各々が、前記分類群から選択される既知分類のものである前記ステップ；ならびに
（ｂ）前記被験者からの試験サンプルについてのデータセットとともに前記モデルを用いて、前記試験サンプルを前記分類群から選択される１つの分類のメンバーとして分類することで、前記被験者を分類するステップ
を含む前記方法。
【請求項４２】
分類方法であって、
予測数学モデルを用いて被験者を分類するステップを含み、
前記モデルの形成を、モデリング方法をモデリングデータに適用することで行う前記方法。
【請求項４３】
被験者を分類する請求項４２に記載の方法であって、
予測数学モデルを用いて前記被験者からの試験サンプルを既知分類のいずれかのメンバーとして分類することで前記被験者を分類するステップを含み、
前記モデルの形成を、モデリング方法をモデリングデータに適用することで行い、
前記モデリングデータが、前記既知分類のモデリングサンプルについて複数のデータセットを含む前記方法。
【請求項４４】
被験者を分類する請求項４２に記載の方法であって、
前記被験者からの試験サンプルについてのデータセットとともに予測数学モデルを用いて、前記試験サンプルを分類群から選択される１つの分類のメンバーとして分類することで、前記被験者を分類するステップを含み、
前記モデルの形成を、モデリング方法をモデリングデータに適用することで行い、
前記モデリングデータが、複数のモデリングサンプルの各々について少なくとも１つのデータセットを含み、
前記モデリングサンプルが、複数の分類からなる前記分類群を規定し、
前記モデリングサンプルの各々が、前記分類群から選択される既知分類のものである前記方法。
【請求項４５】
診断方法であって、
（ａ）モデリング方法をモデリングデータに適用することで予測数学モデルを形成するステップ；
（ｂ）前記モデルを用いて被験者を診断するステップ
を含む前記方法。
【請求項４６】
被験者の所定の状態を診断する請求項４５に記載の方法であって、
（ａ）モデリング方法をモデリングデータに適用することで予測数学モデルを形成するステップであって、
前記モデリングデータが、既知分類のモデリングサンプルについて複数のデータセットを含む前記ステップ；
（ｂ）前記モデルを用いて、前記被験者からの試験サンプルを前記既知分類のいずれかのメンバーとして分類することで、前記被験者を診断するステップ
を含む前記方法。
【請求項４７】
被験者の所定の状態を診断する請求項４５に記載の方法であって、
（ａ）モデリング方法をモデリングデータに適用することで予測数学モデルを形成するステップであって、
前記モデリングデータが、複数のモデリングサンプルの各々について少なくとも１つのデータセットを含み、
前記モデリングサンプルが、複数の分類からなる分類群を規定し、
前記モデリングサンプルの各々が、前記分類群から選択される既知分類のものである前記ステップ；ならびに
（ｂ）前記被験者からの試験サンプルについてのデータセットとともに前記モデルを用いて、前記試験サンプルを前記分類群から選択される１つの分類のメンバーとして分類することで、前記被験者を診断するステップ
を含む前記方法。
【請求項４８】
診断方法であって、
予測数学モデルを用いて被験者を診断するステップを含み、
前記モデルの形成を、モデリング方法をモデリングデータに適用することで行う前記方法。
【請求項４９】
被験者の所定の状態を診断する請求項４８に記載の方法であって、
予測数学モデルを用いて、前記被験者からの試験サンプルを前記既知分類のいずれかのメンバーとして分類することで、前記被験者を診断するステップを含み、
前記モデルの形成を、モデリング方法をモデリングデータに適用することで行い、
前記モデリングデータが、既知分類のモデリングサンプルについて複数のデータセットを含む前記方法。
【請求項５０】
被験者の所定の状態を診断する請求項４８に記載の方法であって、
前記被験者からの試験サンプルについてのデータセットとともに予測数学モデルを用いて、前記試験サンプルを分類群から選択される１つの分類のメンバーとして分類することで、前記被験者を診断するステップを含み、
前記モデルの形成を、モデリング方法をモデリングデータに適用することで行い、
前記モデリングデータが、複数のモデリングサンプルの各々について少なくとも１つのデータセットを含み、
前記モデリングサンプルが、複数の分類からなる前記分類群を規定し、
前記モデリングサンプルの各々が、前記分類群から選択される既知分類のものである前記方法。
【請求項５１】
前記試験サンプルが被験者からの試験サンプルであり、前記所定の状態が前記被験者における所定の状態である請求項１〜５０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５２】
前記「変調」が「増加または減少」である請求項１〜５０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５３】
前記関連付けステップが、予測数学モデルの使用を含む請求項１〜５２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５４】
前記モデリング方法が多変量統計分析モデリング方法である請求項１〜５２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５５】
前記モデリング方法が、パターン認識方法を用いる多変量統計分析モデリング方法である請求項１〜５２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５６】
前記モデリング方法がPCAであるかそれを用いる請求項１〜５２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５７】
前記モデリング方法がPLSであるかそれを用いる請求項１〜５２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５８】
前記モデリング方法がPLS-DAであるかそれを用いる請求項１〜５２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５９】
前記モデリング方法がデータフィルタリングのステップを含む請求項１〜５８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６０】
前記モデリング方法が直交データフィルタリングのステップを含む請求項１〜５８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６１】
前記モデリング方法がOSCのステップを含む請求項１〜５８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６２】
前記モデルが１つ以上の診断種を考慮する請求項１〜６１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６３】
前記モデリングデータがスペクトルデータを含む請求項１〜６２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６４】
前記モデリングデータがスペクトルデータおよび非スペクトルデータの両方を含む請求項１〜６２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６５】
前記モデリングデータがNMRスペクトルデータを含む請求項１〜６２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６６】
前記モデリングデータがNMRスペクトルデータと非NMRスペクトルデータの両方を含む請求項１〜６２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６７】
前記NMRスペクトルデータが1H NMRスペクトルデータおよび／または13C NMRスペクトルデータを含む請求項１〜６２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６８】
前記NMRスペクトルデータが1H NMRスペクトルデータを含む請求項１〜６２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６９】
前記モデリングデータがスペクトルを含む請求項１〜６２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７０】
前記モデリングデータがスペクトルである請求項１〜６２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７１】
前記モデリングデータが既知分類のモデリングサンプルについての複数のデータセットを含む請求項１〜７０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７２】
前記モデリングデータが複数のモデリングサンプルの各々についての少なくとも１つのデータセットを含む請求項１〜７０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７３】
前記モデリングデータが複数のモデリングサンプルの各々について正確に１つのデータセットを含む請求項１〜７０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７４】
前記使用ステップが、前記試験サンプルについてのデータセットとともに前記モデルを用いることで、前記試験サンプルを前記分類群から選択される１つの分類のメンバーとして分類するものである請求項１〜７０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７５】
前記各データセットがスペクトルデータを含む請求項１〜７４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７６】
前記各データセットがスペクトルデータおよび非スペクトルデータの両方を含む請求項１〜７４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７７】
前記各データセットがNMRスペクトルデータを含む請求項１〜７４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７８】
前記各データセットがNMRスペクトルデータと非NMRスペクトルデータの両方を含む請求項１〜７４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７９】
前記NMRスペクトルデータが1H NMRスペクトルデータおよび／または13CNMRスペクトルデータを含む請求項１〜７４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８０】
前記NMRスペクトルデータが1H NMRスペクトルデータを含む請求項１〜７４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８１】
前記各データセットがスペクトルを含む請求項１〜７４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８２】
前記各データセットが1H NMRスペクトルおよび／または13C NMRスペクトルを含む請求項１〜７４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８３】
前記各データセットが1H NMRスペクトルを含む請求項１〜７４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８４】
前記各データセットがスペクトルである請求項１〜７４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８５】
前記各データセットが1H NMRスペクトルおよび／または13C NMRスペクトルである請求項１〜７４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８６】
前記各データセットが1H NMRスペクトルである請求項１〜７４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８７】
前記非スペクトルデータが非スペクトル臨床データである請求項１〜８６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８８】
前記非NMRスペクトルデータは非スペクトル臨床データである請求項１〜８６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８９】
前記分類群が前記所定の状態に関連する分類を含む請求項１〜８８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９０】
前記分類群が正確に２つの分類を含む請求項１〜８８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９１】
前記分類群が前記所定の状態の存在および前記所定の状態の非存在という正確に２つの分類を含む請求項１〜８８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９２】
前記サンプルがin vivoサンプルである請求項１〜９１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９３】
前記サンプルがex vivoサンプルである請求項１〜９１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９４】
前記サンプルが血液サンプルまたは血液由来サンプルである請求項１〜９１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９５】
前記サンプルが血液サンプルである請求項１〜９１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９６】
前記サンプルが血漿サンプルである請求項１〜９１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９７】
前記サンプルが血清サンプルである請求項１〜９１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９８】
前記被験者が動物である請求項１〜９７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９９】
前記被験者が哺乳動物である請求項１〜９７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１００】
前記被験者がヒトである請求項１〜９７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０１】
前記１つ以上の所定の診断スペクトルウィンドウが単一の所定の診断スペクトルウィンドウである請求項１〜１００のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０２】
前記１つ以上の所定の診断スペクトルウィンドウが複数の所定の診断スペクトルウィンドウである請求項１〜１００のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０３】
前記１つ以上の所定の診断スペクトルウィンドウが複数の診断スペクトルウィンドウであり；
１つ以上の所定の診断スペクトルウィンドウでの前記NMRスペクトル強度が複数のNMRスペクトル強度の組み合わせであって、その各強度が前記複数の所定診断スペクトルウィンドウのいずれかについてのNMRスペクトル強度である請求項１〜１００のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０４】
前記組み合わせが一次結合である請求項１０３に記載の方法。
【請求項１０５】
前記１つ以上の所定の診断スペクトルウィンドウが１つ以上の診断種に関連するものである請求項１〜１０４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０６】
前記１つ以上の所定の診断スペクトルウィンドウのうちの少なくとも１つが診断種のNMR共鳴に対する化学シフト値を含む請求項１〜１０４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０７】
複数の前記１つ以上の所定の診断スペクトルウィンドウのそれぞれが診断種のNMR共鳴に対する化学シフト値を含む請求項１〜１０４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０８】
前記１つ以上の所定の診断スペクトルウィンドウの各々が診断種のNMR共鳴に対する化学シフト値を含む請求項１〜１０４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０９】
前記NMR共鳴が1H NMR共鳴である請求項１０６〜１０８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１０】
前記１つ以上の診断種が内因性診断種である請求項１〜１０９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１１】
前記１つ以上の診断種が所定の診断スペクトルウィンドウでのNMRスペクトル強度に関連している請求項１〜１１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１２】
前記１つ以上の診断種が複数の診断種である請求項１〜１１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１３】
前記１つ以上の診断種が単一診断種である請求項１〜１１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１４】
前記分類を単一診断種の量または相対量に基づいて行う請求項１〜１１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１５】
前記分類を複数診断種の量または相対量に基づいて行う請求項１〜１１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１６】
前記分類を複数診断種のそれぞれの量または相対量に基づいて行う請求項１〜１１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１７】
前記分類を複数診断種の総量または相対総量に基づいて行う請求項１〜１１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１８】
前記１つ以上の診断種が複数診断種であり；
１つ以上の診断種の前記量または相対量が複数の量または相対量の組み合わせであり、その各量が前記複数の診断種のうちの１つの量または相対量である、
請求項１〜１１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１９】
前記組み合わせが一次結合である請求項１１８に記載の方法。
【請求項１２０】
前記所定の診断スペクトルウィンドウが、表2-1-HYP、表2-2-HYPおよび／または表2-3-HYPに挙げたバケット領域に相当する１つ以上の指標値δｒによって規定される請求項１〜１１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２１】
前記１つ以上の所定の診断種のうちの少なくとも１つが、表2-1-HYP、表2-2-HYPおよび／または表2-3-HYPに記載の種である請求項１〜１１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２２】
複数の前記１つ以上の所定の診断種のそれぞれが、表2-1-HYP、表2-2-HYPおよび／または表2-3-HYPに記載の種である請求項１〜１１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２３】
前記各１つ以上の所定の診断種が、表2-1-HYP、表2-2-HYPおよび／または表2-3-HYPに記載の種である請求項１〜１１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２４】
前記所定の診断スペクトルウィンドウが、表3-4-CHDに挙げたバケット領域に相当する１つ以上の指標値δｒによって規定される請求項１〜１１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２５】
前記１つ以上の所定の診断種のうちの少なくとも１つが表3-4-CHDに記載の種である請求項１〜１１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２６】
複数の前記１つ以上の所定の診断種のそれぞれが表3-4-CHDに記載の種である請求項１〜１１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２７】
前記各１つ以上の所定の診断種が表3-4-CHDに記載の種である請求項１〜１１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２８】
前記所定の診断スペクトルウィンドウが、表4-1-OPおよび／または表4-2-OPに挙げたバケット領域に相当する１つ以上の指標値δｒによって規定される請求項１〜１１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２９】
前記１つ以上の所定の診断種のうちの少なくとも１つが、表4-1-OPおよび／または表4-2-OPに記載された種である請求項１〜１１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３０】
複数の前記１つ以上の所定の診断種のそれぞれが表4-1-OPおよび／または表4-2-OPに記載された種である請求項１〜１１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３１】
前記各１つ以上の所定の診断種が表4-1-OPおよび／または表4-2-OPに記載された種である請求項１〜１１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３２】
前記所定の診断スペクトルウィンドウが、表5-1-OAおよび／または表5-2-OAに挙げたバケット領域に相当する１つ以上の指標値δｒによって規定される請求項１〜１１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３３】
前記１つ以上の所定の診断種のうちの少なくとも１つが表5-1-OAおよび／または表5-2-OAに記載の種である請求項１〜１１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３４】
複数の前記１つ以上の所定の診断種のそれぞれが表5-1-OAおよび／または表5-2-OAに記載の種である請求項１〜１１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３５】
前記各１つ以上の所定の診断種が表5-1-OAおよび／または表5-2-OAに記載の種である請求項１〜１１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３６】
所定の状態について診断種または複数診断種の組み合わせを同定する方法であって、
（ａ）多変量統計分析法を実験データに適用するステップであって、
前記実験データが複数の実験サンプルのそれぞれについて測定される実験パラメータを含む少なくとも１つのデータを含み、
前記実験サンプルが複数の分類からなる分類群を規定し、
前記複数の分類のうちの少なくとも１つが、前記所定の状態に関連する分類、例えば、前記所定の状態の存在に関連する分類であり、
前記複数の分類のうちの少なくとも１つが、前記所定の状態に関連しない分類、例えば、前記所定の状態の非存在に関連する分類であり、
前記各実験サンプルが前記分類群から選択される既知分類のものである前記ステップ；
ならびに
（ｂ）１つ以上の臨界実験パラメータを同定するステップであって、
前記各臨界実験パラメータが、前記分類群の分類に対し統計的に有意に異なっており、例えば前記分類群の分類間で区別を行う上で統計的に有意である前記ステップ；および
（ｃ）前記１つ以上の臨界実験パラメータの１つ以上のそれぞれを前記診断種と照合するステップ；
あるいは
（ｂ）複数の臨界実験パラメータの組み合わせを同定するステップであって、
前記複数の臨界実験パラメータ組み合わせが、前記分類群の分類について統計的に有意に異なっており、例えば前記分類群の分類間で区別を行う上で統計的に有意である前記ステップ；および
（ｃ）前記複数の臨界実験パラメータの１つ以上のそれぞれを複数の診断種の前記組み合わせと照合するステップ
を含む前記方法。
【請求項１３７】
前記臨界実験パラメータのうちの１つ以上がスペクトルパラメータであり；
前記確認および照合ステップが、
（ｂ）１つ以上の臨界実験スペクトルパラメータを同定し；および
（ｃ）前記１つ以上の臨界実験スペクトルパラメータの１つ以上のそれぞれとスペクトル的特徴、例えばスペクトルピークと照合し、
および前記スペクトルピークの１つ以上を前記診断種と照合するステップであり；
あるいは
（ｂ）複数の臨界実験スペクトルパラメータの組み合わせを同定し；および
（ｃ）前記複数の臨界実験スペクトルパラメータのうちの複数個のそれぞれをスペクトル的特徴、例えばスペクトルピークと照合し、
および前記スペクトルピークの１つ以上を複数の診断種の前記組み合わせと照合するステップである請求項１３６に記載の方法。
【請求項１３８】
前記多変量統計分析方法がパターン認識方法を用いる多変量統計分析方法である請求項１３６〜１３７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３９】
前記多変量統計分析方法がPCAであるかそれを用いる請求項１３６〜１３８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４０】
前記多変量統計分析方法がPLSであるかそれを用いる請求項１３６〜１３８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４１】
前記多変量統計分析方法がPLS-DAであるかそれを用いる請求項１３６〜１３８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４２】
前記多変量統計分析方法がデータフィルタリングのステップを含む請求項１３６〜１４１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４３】
前記多変量統計分析方法が直交データフィルタリングのステップを含む請求項１３６〜１４１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４４】
前記多変量統計分析方法がOSCのステップを含む請求項１３６〜１４１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４５】
前記実験パラメータがスペクトルデータを含む請求項１３６〜１４４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４６】
前記実験パラメータがスペクトルデータおよび非スペクトルデータの両方を含む請求項１３６〜１４４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４７】
前記実験パラメータがNMRスペクトルデータを含む請求項１３６〜１４４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４８】
前記実験パラメータがNMRスペクトルデータおよび非NMRスペクトルデータの両方を含む請求項１３６〜１４４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４９】
前記NMRスペクトルデータが1H NMRスペクトルデータおよび／または13C NMRスペクトルデータを含む請求項１３６〜１４８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５０】
前記NMRスペクトルデータが1H NMRスペクトルデータを含む請求項１３６〜１４８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５１】
前記非スペクトルデータが非スペクトル臨床データである請求項１３６〜１５０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５２】
前記非NMRスペクトルデータが非スペクトル臨床データである請求項１３６〜１５０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５３】
前記臨界実験パラメータがスペクトルパラメータである請求項１３６〜１５２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５４】
前記分類群が前記所定の状態に関連する分類を含む請求項１３６〜１５３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５５】
前記分類群が正確に２つの分類を含む請求項１３６〜１５４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５６】
前記分類群が前記所定の状態の存在および前記所定の状態の非存在という正確に２つの分類を含む請求項１３６〜１５４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５７】
前記所定の状態に関連する前記分類が前記所定の状態の存在に関連する分類である請求項１３６〜１５４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５８】
前記所定の状態に関連しない前記分類が前記所定の状態の非存在に関連する分類である請求項１３６〜１５４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５９】
前記方法がさらに、
（ｄ）前記診断種が何であるかを同定するというさらなるステップを含む請求項１３６〜１５８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６０】
前記所定の状態が高血圧；アテローム性動脈硬化症／冠動脈心疾患；骨粗鬆症；および骨関節炎のいずれかと関連する請求項１〜１５９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６１】
前記所定の状態が高血圧と関連する請求項１〜１５９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６２】
前記所定の状態がアテローム性動脈硬化症／冠動脈心疾患と関連する請求項１〜１５９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６３】
前記所定の状態が骨粗鬆症と関連する請求項１〜１５９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６４】
前記所定の状態が骨関節炎と関連する請求項１〜１５９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６５】
請求項１〜１６４のいずれか１項に記載の方法を実行するために機能しうる形で構成されたコンピュータまたは連結されたコンピュータなどのコンピュータシステムまたは装置。
【請求項１６６】
好適なコンピュータシステム上で請求項１〜１６４のいずれか１項に記載の方法を実行するために好適なコンピュータコード。
【請求項１６７】
前記プログラムがコンピュータ上で実行されたときに、請求項１〜１６４のいずれか１項に記載の方法を実施するように適合されたコンピュータプログラム手段を含むコンピュータプログラム。
【請求項１６８】
コンピュータ読取可能媒体に格納された請求項１６７に記載のコンピュータプログラム。
【請求項１６９】
好適なコンピュータ上で請求項１〜１６４のいずれか１項に記載の方法を実行するのに好適なコンピュータコードを記憶するデータ記憶媒体。
【請求項１７０】
請求項１〜１６４のいずれか１項に記載の予測数学モデルを表すコンピュータコードおよび／またはコンピュータ読取可能データ。
【請求項１７１】
請求項１〜１６４のいずれか１項に記載の予測数学モデルを表すコンピュータコードおよび／またはコンピュータ読取可能データを記憶するデータ記憶媒体。
【請求項１７２】
請求項１〜１６４のいずれか１項に記載の予測数学モデルを表すコンピュータコードおよび／またはコンピュータ読取可能データがプログラムされたもしくはロードされたコンピュータまたは連結されたコンピュータなどのコンピュータシステムまたは装置。
【請求項１７３】
（ａ）サンプルについてNMRスペクトル強度データを取得するための装置を含む第１の構成要素；ならびに
（ｂ）請求項１〜１６４のいずれか１項に記載の方法を実行するために機能しうる形で構成されたコンピュータまたは連結されたコンピュータなどのコンピュータシステムまたは装置を有し、前記第１の構成要素と機能可能な形で連結されている第２の構成要素
を含むシステム。
【請求項１７４】
請求項１３６〜１６４のいずれか１項に記載の方法によって同定された診断種。
【請求項１７５】
分類方法で使用される請求項１３６〜１６４のいずれか１項に記載の方法によって同定された診断種。
【請求項１７６】
請求項１３６〜１６４のいずれか１項に記載の方法によって同定された１つ以上の診断種を用いるかそれに依存する分類方法。
【請求項１７７】
請求項１３６〜１６４のいずれか１項に記載の分類方法によって同定された１つ以上の診断種の使用。
【請求項１７８】
分類方法で使用するためのアッセイであって、請求項１３６〜１６４のいずれか１項に記載の方法によって同定された１つ以上の診断種に依存する前記アッセイ。
【請求項１７９】
分類方法におけるアッセイの使用であって、前記アッセイが請求項１３６〜１６４のいずれか１項に記載の方法によって同定された１つ以上の診断種に依存する前記使用。
【請求項１８０】
請求項１〜１３５のいずれか１項に記載の分類方法を用いる、被験者の予後方法。
【請求項１８１】
請求項１〜１３５のいずれか１項に記載の分類方法を用いる、治療を受けている被験者の治療モニタリング方法。
【請求項１８２】
請求項１〜１３５のいずれか１項に記載の分類方法を用いる、薬物療法および／または薬物効力の評価方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、
（ａ）2001年４月23日出願の英国特許GB0109930.8；
（ｂ）2001年７月17日出願の英国特許GB0117428.3；
（ｃ）2001年７月20日出願の米国仮特許出願USSN60／307015；
（これら各出願の内容は、参照によって全体が本明細書に組み込まれるものとする）に関係するものである（そして、法律によって許容される場合には、それらに対する優先権を主張するものである）。
【０００２】
本願は、下記の同一出願人名にて同一日に出願された５つの出願の１つである。
【０００３】
（１）代理人整理番号WJW／LP5995600（PCT／GB02／_____）；
（２）代理人整理番号WJW／LP5995618（PCT／GB02／_____）；
（３）代理人整理番号WJW／LP5995626（PCT／GB02／_____）；
（４）代理人整理番号WJW／LP5995634（PCT／GB02／_____）；
（５）代理人整理番号WJW／LP5995642（PCT／GB02／_____）。
【０００４】
これらの各出願の内容は、参照によって全体が本明細書に組み込まれるものとする。
【０００５】
本発明は、メタボノミクスの分野に関するものであり、詳細には例えば核磁気共鳴（NMR）スペクトルなどのスペクトルデータのような化学データ、生化学データおよび生物学データのケモメトリック分析方法、ならびに分類、診断、予後などのそれの応用に関する。
【背景技術】
【０００６】
添付の特許請求の範囲を含む本願を通じて、文脈上別のものが要求される場合を除き、「含む」という用語ならびに「包含する」および「含有する」などの派生表現は、記載された整数もしくはステップあるいは整数群もしくはステップ群を包含するが、他の整数もしくはステップおよび整数群もしくはステップ群を除外するものではないことを示唆するものと理解される。
【０００７】
留意すべき点として、本願および添付の特許請求の範囲で用いられるように、「１つの」および「その」という単数形は、文脈において明瞭の他の意味が示されている場合を除き、複数の指示物を含むものである。
【０００８】
本明細書において範囲は、「約」特定値からおよび／または「約」別の特定値までと表現される場合が多い。そのような範囲を表現する場合、別の実施形態には、一方の特定の値からおよび／または他方の特定の値までなどがある。同様に、先行語である「約」を用いることで値を概略値として表す場合、その特定の値は別の実施形態を形成することは明らかであろう。
【０００９】
生体系
生体系は簡便には、生化学に基づくいくつかのレベルの生体分子機構、すなわち遺伝発現および遺伝子発現（ゲノムおよび転写）、タンパク質およびシグナル伝達（プロテオミック）および代謝制御および調節（代謝）で見ることができる。遺伝、プロテオミックおよび代謝活性に関係する重要な細胞イオン調節の変形形態もあり、細胞レベルおよび細胞以下レベルであっても、これらに関する系統的研究を行って、生体系の生体分子機構の詳細な説明を得るようにしなければならない。
【００１０】
生体系で起こる生化学プロセスを測定および定量する方法を開発する上で、かなりの進展が見られている。そのような方法は、疾患の診断、予後および治療、薬剤開発、現行薬剤についての治療方法の改善などにおいて貴重である。
【００１１】
ヒトもしくは動物身体の多くの疾患（癌、変性疾患、自己免疫疾患など）が、ある種の遺伝子の発現における変化にその基礎となるものを有する。遺伝子発現産生物であるタンパク質が、異常細胞成長、細胞死または炎症などの効果を介在する。それらの効果の一部は、タンパク質−タンパク質相互作用によって直接引き起こされる。他のものは、さらなる遺伝子発現などの効果を誘発する小分子（例えば、「第２メッセンジャー」）に対して作用するタンパク質によって引き起こされる。
【００１２】
同様に、ウィルスおよび細菌などの体外因子によって生じる疾患状態は、感染宿主において複数の複雑な応答を引き起こす。
【００１３】
同様に、薬剤投与による疾患治療によって、患者において非常に広い範囲の所望の効果と望ましくない副作用が生じ得る。
【００１４】
近年、疾患およびそれの治療に対するヒトおよび動物被験者の反応が、個体のゲノム構成に従って変動し得ることが明らかになってきた。それによって、「薬理ゲノム学」の分野が発達した。個体自体のゲノムが特定の疾患および／または薬物治療に対してどのように反応するかについての理解が進むことで、新たな治療法の開発ならびに既存の治療法の改善を行うことが可能となる。
【００１５】
遺伝子レベルでは、これらの種類の事象に応答した遺伝子発現を調べる方法は多くの場合「ゲノミック法」と称され、通常はDNAおよびRNAなどの遺伝分子を検出および／または定量することによる、「ゲノム」と総称される生物の遺伝子の発現の検出および定量に関係する。ゲノム試験は多くの場合、細胞が産生する抽出mRNAに応答する遺伝子アレーでコードされた小型の使い捨て機器である特許製品である「遺伝子チップ」を利用する（例えば、Klenk et al., 1997参照）。多くの遺伝子をチップアレーに置くことができ、遺伝子発現のパターンまたはそれの変化を迅速にモニタリングすることができる。ただし、かなりのコストを要する。
【００１６】
しかしながら、遺伝子発現または変動後の遺伝子発現変化の生物学的結果は極めて複雑である。そのために、「プロテオーム」と総称される生物の細胞タンパク質産生の半定量的測定に関係する「プロテオミック法」が開発された（例えば、Geisow, 1998参照）。プロテオミック測定は各種の技術を利用するものであるが、いずれにおいても、通常は何らかの形の質量分析法である化学的特性決定方法に関係するタンパク質分離方法、例えば2Dゲル−電気泳動などを含む。
【００１７】
現在のところ、ゲノミック法では関連する運転コストが高く、プロテオミック法では高資本コスト装置に投資する必要があり、労働集約型ではあるが、いずれの場合も生物応答を研究する上での強力な手段となる可能性がある。注意深く研究したところ、恐らくは不適切な時間点での２つの技術のためのサンプリングにより、遺伝子発現パターンとタンパク質発現パターンとの間の相関が低いことが明らかになったことから、方法の選択はなお不確定なものである（例えば、Gygi et al. 1999参照）。それらは生物全体の動的代謝状態を考慮していないことから、組み合わせたとしてもなお、ゲノミック法およびプロテオミック法によって、生体系における総合的細胞機能を理解する上で必要な情報の範囲は提供されない。
【００１８】
例えば、発現レベルが変化することから、ゲノミック試験およびプロテオミック試験によって疾患もしくは生体異物応答における特定の遺伝子またはタンパク質を示唆することができるが、遺伝子もしくはタンパク質レベルの変化は一時的であるか、あるいは下流で弱められる可能性がある。従って、細胞レベルおよび／または生化学レベルでは効果がない場合がある。逆に、ゲノミック試験およびプロテオミック試験用に不適切な時間点で組織をサンプリングすると、関連する遺伝子やタンパク質を見落とす可能性がある。
【００１９】
遺伝子に基づく予後はなお、罹患性に関係する遺伝子群を確認するのを困難にする複数遺伝子モードの遺伝および重大な環境的影響を有する主要な一般的疾患に対し臨床的に実現されなければならない。
【００２０】
ゲノミック法およびプロテオミック法は、例えば薬剤開発において有用な手段となり得るが、実質的限界を有する。例えば、ゲノミック法およびプロテオミック法は最終的に、毒性機序についての深い理解を提供し、疾患の新たな代替バイオマーカーを提供することができるが、現時点では、ゲノミック法およびプロテオミック法の知見を従来の細胞もしくは生化学の指標もしくはエンドポイントに関連付けることは非常に難しい。その簡単な理由の１つは、現在の技術および手法では、薬剤曝露に対する時間−応答の相関が困難であるという点である。in vitroでの細胞に基づく試験では、さらなる問題が生じる。それらの問題は、化合物の代謝が毒性効果の前提条件である多くの既知の場合に特に重要であり、標的臓器が一次代謝の部位ではない場合に特に当てはまる。それは特に、何らかの形態のin situでの化学的（例えば酵素的）改変が活性に必要であるプロドラッグに対し当てはまる。
【００２１】
メタボノミクス
ゲノミクスおよびプロテオミクスによって提供される情報を増強および補完することを目的とした新たな「メタボノミック」手法が開発されている。「メタボノミクス」は従来においては、「病態生理学的刺激または遺伝子修飾に対する生体系の多パラメータ代謝応答の定量的測定」と定義される（例えば、Nicholson et al., 1999参照）。この考え方は主として、生体液、細胞および組織の代謝組成物を調べるための1H NMRスペクトル測定の応用から、ならびに複雑なNMR作成代謝データセットを解釈および分類するためのパターン認識（PR）、専門システムおよび他の化学情報手段を利用する研究から出たものである。メタボノミック法は最終的に、生物の動的代謝構成の全体を決定する可能性を有するものである。
【００２２】
上記のように、生体分子機構の各レベルで、個々の種類の生体分子データの収集に適切な一連の分析バイオテクノロジーが必要とされる。ゲノミック、プロテオミックおよびメタボノミック技術は定義によると、データマイニングおよび有用な生物情報の抽出のための適切な多変量統計手段（ケモメトリック、バイオインフォマティクス）を必要とする多量のデータセットをもたらす。これらのデータ利用手段によっても、異なる技術からの多変量データセット間における相互関係を調べることが可能であり、それは次元の縮減および潜在的特性の抽出を促進し、多次元的視覚化を可能とするものである。
【００２３】
それによって、生体分子機構の全ての主要なレベルでの生物学的系の集積的機能（および機能異常）についての定量的測定および理解である「バイオノミクス」という概念が生じる。変化した遺伝子発現の研究（トランスクリプトミクスとも称される）において、変量は遺伝子チップを用いて測定されるmRNA応答であり、プロテオミクスにおいては代表的には、タンパク質合成および関連する翻訳後修飾を（主として）質量分析と組み合わせたゲル電気泳動を用いて測定する。いずれの場合も、数千に及ぶ変量を測定し、統計的方法を用いて生物学的エンドポイントと関連付けることができる。代謝（メタボノミック）試験では、NMR（特に1H）および質量分析のみを用いて、生体材料に関するそのレベルのデータ密度が提供されている。ただしそのデータには、従来の生化学アッセイによる補足を行うことができる。
【００２４】
in vivo哺乳動物試験において、血漿、CSFおよび尿などの生体液についてメタボノミック試験を行う能力は、それによって生物全体における集積的な系に基づく情報が得られることから非常に重要である。さらに臨床場面では、患者のスクリーニング、診断および予後において機能的ゲノミック知見を十分に利用するには、ヒト組織生検を行い、遺伝子応答を測定するより、生体液サンプルを分析する方が、はるかに実用的であって、倫理的に許容されるものである。
【００２５】
病理状態または生体異物は薬理的レベルのみで作用し得ることから、遺伝子の調節または発現に直接影響を与えないと考えられる。あるいは、重大な疾患または毒性効果は、遺伝子スイッチとは全く無関係である可能性がある。例えば、in vivoでのエタノールに対する曝露は、遺伝子発現において多くの変化を生じ得るが、それらの事象のいずれによっても酩酊は説明されない。そのような場合には、ゲノミック法およびプロテオミック法は有効ではないと考えられる。しかしながら、全ての疾患または薬剤誘発の病態生理学的変動によって、直接の化学反応または代謝を制御する主要な酵素もしくは核酸への結合のいずれかにより、内因性生化学物質の比率および濃度、結合または流れにおける乱れが生じる。これらの乱れが十分な規模のものである場合、生物全体の有効な機能に影響を与える効果を生じる。体液では、代謝物が細胞および組織内のものと動的平衡状態にあり、結果的に有毒攻撃後のあるいは疾患の結果としての生物全体の組織における異常な細胞プロセスが、生体液組成の変化に反映される。
【００２６】
所定の生体液の組成は、該体液の製造および分泌に密接に関係する細胞機能の結果であることから、分泌、排泄その他の形での生物由来の液体（「生体液」）は、その生化学的状態を探る特有のウィンドウを提供する。例えば特定の液（例えば、尿、血漿、乳汁など）の組成は、例えば生体異物、疾患および／または遺伝子修飾の結果としての臓器機能（または機能異常）の詳細に関する生化学的情報を有し得るものである。同様に、生物の組織の組成および状態も、その生物の生化学的状態の指標となる。
【００２７】
一般的に、生体異物とは、生物に投与される物質、または生物が曝露を受ける物質（例えば化合物、組成）である。一般的に、生体異物は、その生物に通常は存在しないか、通常は存在するが投与／曝露後に得られるレベルでは存在しない化学種、生化学種もしくは生物種（例えば、化合物）である。生体異物の例には、薬物、製剤された医薬およびその成分（例えば、ワクチン、免疫刺激物、不活性担体媒体）、感染因子、農薬、除草剤、食品中に存在する物質（例えば、動物に投与される植物化合物）ならびに環境に存在する物質などがある。
【００２８】
一般的に、疾患状態は、生物の通常の健常状態からの逸脱に関係するものである。疾患状態の例には、細菌、ウィルスおよび寄生虫感染；全ての形態の癌；変性疾患（例えば、関節炎、多発性硬化症）；外傷（例えば、怪我の結果として）；臓器不全（糖尿病など）；心血管疾患（例えば、アテローム性動脈硬化、血栓症）；ならびに遺伝子組成によって生じる遺伝疾患（例えば、鎌状赤血球貧血）などがあるが、これらに限定されるものではない。
【００２９】
一般的に、遺伝子修飾は、生物の遺伝子組成の変化に関係するものである。遺伝子修飾の例には、別の動物種からある動物種への遺伝子または遺伝子群の組み込み；生物における既存の遺伝子または遺伝子群のコピー数の増加；生物からの遺伝子または遺伝子群の除去；ならびに生物における遺伝子または遺伝子群の非機能化などがあるが、これらに限定されるものではない。
【００３０】
生体液は多くの場合、外部刺激に応じた代謝物プロファイルにおいてごく小さな変化を示す。それは、例えば細胞傷害攻撃に曝された場合に、身体の細胞系がホメオスタシス（体内環境の恒常性）を維持しようとするためである。それを達成する１つの手段は、生体液組成の調節である。従って、細胞ホメオスタシスが維持される場合であっても、疾患または毒性に対するわずかな応答が、生体液組成の変化において発現される。しかしながら、食事、日周およびホルモンの変動も生体液組成に影響を与え得るものであり、詳細な生化学的推定をその分析から導き出そうとする場合には、それらの効果を区別することが重要であることは明らかである。
【００３１】
メタボノミクスは、臨床的状況において多くの明瞭な利点（ゲノミクスおよびプロテオミクスと比較して）を提供するものである。第１に、それは多くの場合、標準的試料（例えば、血清、血漿、尿などのもの）について行うことができ、ゲノミクスおよびプロテオミクスにおいてそれぞれ必要な細胞RNAおよびタンパク質の専門家による準備を行う必要がない。第２に、すでに確認されているリスク因子の多く（例えば、血液中での各脂質のレベル）は、メタボノミックデータセットに寄与する小分子代謝物である。
【００３２】
NMRのメタボノミクスへの応用
生体液分析に対する最も良好な手法の１つは、NMRスペクトル測定の使用であった（例えば、Nicholson et al., 1989参照）。同様に、無傷害組織がマジック角回転1H NMRスペクトル測定を用いて良好に分析されている（例えば、Moka et al., 1998；Tomlins et al., 1998参照）。
【００３３】
生体液のNMRスペクトルは、その生体液が得られた生物の代謝フィンガープリントまたはプロファイルを提供するものであり、その代謝フィンガープリントまたはプロファイルは、疾患、毒性プロセスまたは遺伝子修飾によって特徴的に変化する。例えばNMRスペクトルは、生物の各種状態（例えば、別個もしくは組み合わせとしての１つ以上の生体異物の投与前および各種時点の投与後；健常（対照）および罹患動物；未修飾（対照）および遺伝子修飾動物）について収集することができる。
【００３４】
例えば薬剤の望ましくない毒性副作用の評価においては、各化合物または化合物類によって、毒性プロセスの部位および基本的機序に関する情報を提供する生体液中の内因性代謝物の濃度およびパターンにおける特徴的変化が生じる。生体液の1H NMR分析によって、実験ラットにおける臓器特異的毒性の新たな代謝マーカーを解明することに奏功しており、分析生化学法としてのNMRが優れているのは、この「探索的」役割においてである。しかしながら、多くの経路を代表する数百の化合物を同時に測定する場合が多いことから、生体液のNMRスペクトルにおける生体マーカー情報は非常にとらえにくく、病変を非常に良く特徴付けるのは、毒性刺激に対するその全体的なメタボノミック応答である。
【００３５】
ゲノミクスやプロテオミクスと比較したNMRに基づくメタボノミクスの別の重要な利点は、NMRスペクトル測定の固有の分析精度である。1H NMRスペクトル測定による同一サンプルの再分析では、スペクトルにおけるピーク強度測定の典型的な変動係数が、ピーク範囲全体にわたって５％未満となる。従って、適切な実験が行われれば、各ピーク強度の値は平均で、真の値の0.95〜1.05の範囲となる。さらに、NMRスペクトル測定を用いると多数のアナライトの絶対量または濃度を測定できるのに対し、遺伝子チップ技術を用いた場合は、倍数変化を求めることができるのすぎない。遺伝子チップを用いて得られる最も良好な可能精度は２倍変化である。すなわち、各パラメータの値は「真の」値の0.50〜2.00倍の範囲にあり、プロテオミック技術は本質的にさらに精度が低い。同様の限界がプロテオミック試験にも当てはまる。
【００３６】
技術が急速に向上していることは明らかであるが、NMRスペクトル測定と遺伝子チップ技術の間の固有精度のギャップは非常に大きいことから、NMRスペクトル測定の精度に対抗できるようになるには、遺伝子発現定量方法における漸進的改善ではなく革命的改善が必要である。
【００３７】
NMRの固有精度は、パターン認識技術を応用する場合に特に有利である。NMRデータの多変量性は、データにおける分析変動性が本質的に低いことから、１つの記述子が十分でない場合であっても、記述子の組み合わせを用いてサンプルの分類が可能であることを意味している。
【００３８】
全ての生体液および組織は、それ自体の特徴的な生理化学的特性を有しており、それが有効に使用可能なNMR実験の種類に影響する。複雑な生体混合物を調べるのにNMRスペクトル測定を用いることの主要な利点の１つは、測定を最少のサンプル調製（通常は５〜10％D2Oを添加するのみ）で行うことが可能であり、詳細な分析プロファイルを生体サンプル全体について得ることができるという点である。サンプル容量は少なく、典型的には標準的なプローブで0.3〜0.5mLであり、マイクロプローブでは3μLという少量である。簡単なNMRスペクトルの取得は、フローインジェクション法を用いて迅速かつ効果的に行われる。通常は、水NMR共鳴を抑制する必要がある。
【００３９】
多くの生体液が化学的に安定ではないことから、その収集および保存には注意を払う必要がある。例えば、赤血球での細胞溶解が容易に起こり得る。かなりの量のD2Oを加えると、ある種の1H NMR共鳴がH／D交換によって失われる可能性がある。生体液サンプルの凍結乾燥も、アセトンなどの揮発性成分の損失を生じる。生体液はまた、特に無菌状態で回収することが困難である尿などの液体のように、微生物汚染を非常に受けやすい。多くの生体液が、通常の状態であるいは疾患状態もしくは臓器損傷のために、かなりの量の活性酵素を含んでおり、その酵素によってサンプリング後の生体液の組成が変わる場合がある。サンプルは急速冷凍して、そのような汚染の影響を最小としなければならない。尿には、採取時にアジ化ナトリウムを加えて、抗菌剤として作用させるのが普通である。金属イオンおよび／またはキレート剤（例えば、EDTA）を加えて、内因性の金属イオン（例えば、Ca2+、Mg2+およびZn2+）およびキレート剤（例えば、遊離アミノ酸、特にグルタミン酸、システイン、ヒスチジンおよびアスパラギン酸；クエン酸）に結合させて、意図的にNMRスペクトルを変更および／または増強することができる。
【００４０】
いずれの場合も、分析上の問題として、通常、妨害物となり得るものの非常に複雑なマトリクス中で、「痕跡量」のアナライトを検出することが挙げられる。従って、例えば生体液や組織などでありうる特定の生体マトリクス中の特定の種類の対象アナライトに対する好適な分析法を選択することが非常に重要である。高分解能NMRスペクトル測定（特定の1H NMRでの）が、特に適切であるように思われる。この分野において1H NMRスペクトル測定を用いることの主要な利点は、該方法のスピード（スペクトルが５〜10分で得られる）、必要なサンプルが少量であること、ならびに構造の種類とは無関係に、生体液中の全ての代謝物に対して、非選択的検出手段をもたらす（ただし、それらの代謝物がNMR実験の検出限界より多く存在し、それらが非交換性水素原子を含む場合に限られる）という点である。患者の臨床状態によっては迅速な診断が必要な場合があり、その状態が非常に急速に変化し得ることから、提供される治療法に対してそれに応じた迅速な変更を加える必要があるため、スピード上の長所はその作業分野においては非常に重要である。
【００４１】
体液のNMR試験は理想的には、利用可能な最も高い磁場で行って、最大の分散および感度を得るようにすべきであり、ほとんどの1H NMR試験が400MHz以上で行われている。利用可能なスペクトル装置周波数が新たに高くなるごとに、生体液で解像可能な共鳴数が多くなり、それには一部の帰属上の問題を解決する効果があるが、それによって新たな問題も生じる。さらに、血漿や胆汁などの一部の生体液に存在する組織的な巨大分子ドメインにおける小分子の区画化および結合のために生じるスペクトル解釈の重要な問題もなお存在する。この複雑さが全て、この方法の診断上の能力および可能性を低下させるとは限らないが、生体変動および診断上の確実性に対する変動の影響という問題を示している。
【００４２】
生体液スペクトルの情報内容は非常に高度で、ほとんどの生体液の1H NMRスペクトルの完全な帰属を行うことは通常は不可能である（900MHz NMRスペクトル測定を用いたとしても）。しかしながら帰属の問題は、生体液の種類間でかなり変動するものである。一部の液はほぼ一定の組成および濃度を有しており、それらにおいてはNMRシグナルの大半について帰属が行われる。それとは対照的に、尿組成は非常に変動性が高い可能性があり、NMR検出可能代謝物の濃度範囲にかなりの変動がある。その結果、完全な分析はさらに困難である。一次元（1D）NMRスペクトル測定における検出限界近くで存在する代謝物（代表的には、800MHzで約100nM）では、重大なNMRスペクトル帰属上の問題が生じる（絶対的には、検出限界は約4nmolであると考えられ、例えば、サンプル容量0.5mL中では250g/molの化合物で１μｇである）。NMRにおける現在の技術レベルであっても、感度、線幅、分散およびダイナミックレンジのために、体液中での多くの重要な生化学物質（例えば、ホルモン類、一部のタンパク質、核酸）を検出することはまだ不可能であり、その研究分野ではなおも、技術的限界がある。さらに、生体液のNMRスペクトルの収集は、相対的な水強度、サンプル粘度、タンパク質含有量、脂質含有量および低分子量ピークの重なりによって複雑化され得る。
【００４３】
通常、1H NMRスペクトルの帰属を行うには、認定材料のスペクトルと、ないしは認定された基準標準のサンプルへの標準添加によって比較を行う。例えば、二次元（2D）NMR法、特にCOSY（相関スペクトル測定）、TOCSY（総相関スペクトル測定）、HMBC（ヘテロ核多結合相関）、HSQC（ヘテロ核単一量子コヒーレンス）およびHMQC（ヘテロ核多量子コヒーレンス）などの逆検出ヘテロ核相関法、2D-J分解（JRES）法、スピン−エコー法、緩和編集、拡散編集（例えば、拡散編集TOCSYなどの1D-NMRおよび2D-NMRの両方）および多量子フィルタリングのような他のNMR法を利用することで、割り当てをさらに確認するのが普通である。生体液で認められる広範囲の代謝物および生体分子についての詳細な1H NMRスペクトル測定データが発表されており（例えば、Lindon et al., 1999参照）、追補情報がいくつかの文献データ編集で入手可能である（例えば、Fan, 1996; Sze et al., 1994参照）。
【００４４】
例えば、各種の代謝疾患および毒性プロセスを調べる上での生体液の良好な1H NMRスペクトル測定利用は十分に確立されており、臓器特異的毒性の多くの新たな代謝マーカーが発見されている（例えば、Nicholson et al., 1989; Lindon et al., 1999参照）。例えば、尿のNMRスペクトルは、腎臓または肝臓への損傷が起こった状況で識別可能な形で変化する。毒性病変の部位である臓器を区別する特異的かつ識別可能な変化を認めることが可能であることが明らかになっている。さらに、腎臓の皮質などの臓器の特定部分に、好ましい場合にはその皮質の非常に局所的な部分を対象とすることが可能である。
【００４５】
尿における変化の生化学的解釈に基づいて、生体異物毒性の生化学的機序を推定することも可能である。ほとんどの腎臓毒および肝臓毒、さらには睾丸毒、ミトコンドリア毒および筋肉毒などの広範囲の毒について、研究が行われている。
【００４６】
パターン認識
しかしながら、組織および生体液の1Dおよび2D-NMRスペクトルの両方からの生化学情報を理解する上での制限因子は、その複雑さである。その複雑な多パラメータデータを調べる上で最も有効な方法は、コンピュータ利用「パターン認識」（PR）法および専門システムと併用した1Dおよび2D-NMRメタボノミック手法の使用である。これらの統計手段は、ゲノミクスおよびプロテオミクスの分野で研究者に現在利用されているものと類似している。
【００４７】
パターン認識（PR）法を用いて、データセットの複雑さを軽減して、科学的仮説を立て、仮説を検証することができる。通常、パターン認識アルゴリズムの使用によって、系を規定するパラメータにおけるノイズまたはランダム変動によって不明瞭となり得る複雑な系における何らかの非ランダム挙動の確認および一部の方法ではその解釈が可能である。さらに、使用されるパラメータの数は、ヒトの脳の場合に３次元以下で最も良好である規則性の視覚化が困難となるほど非常に大きい場合がある。通常、測定される記述子の数は３よりかなり大きいことから、簡単な散布図を用いてサンプル間の類似性を視覚化することはできない。パターン認識方法は、例えば言語学、フィンガープリンティング、化学および心理学にわたる多くの異なる種類の問題を特徴付ける上で広く用いられている。本明細書に記載の方法の文脈では、パターン認識は、パラメトリックおよびノンパラメトリックの両方の多変量統計学を使用してスペクトル測定データを分析し、そうしてサンプル分類および観察された測定値の範囲に基づいて何らかの関連する変数の値の予測を行うことである。２種類の主要な手法がある。一方の方法組み合わせは「未管理」と称され、それらは単に合理的な方法でデータの複雑さを軽減し、さらにはヒトの目で解釈することができる画像表示プロットを作る。他の手法は「管理」と称され、それによって既知の分類または結果とともにサンプルのトレーニング群を用いて数学モデルを形成し、それを次に独立のバリデーションデータセットで評価する。
【００４８】
未管理PR法は、例えば生体異物またはそれの作用形態の本質または性質とは無関係に、他の独立の知見を参照することなく、データを分析するのに用いられる。未管理パターン認識法の例には、主成分分析（PCA）、階層型クラスター分析（HCA）および非線形マッピング（NLM）などがある。
【００４９】
最も有用で容易に利用される未管理PR技術の１つは、主成分分析（PCA）（例えば、Kowalski et al, 1986参照）である。主成分（PCs）は、初期変量と適切な加重係数との一次結合から得られる新たな変量である。これらのPCの性質は、（ｉ）各PCが他の全てのPCに対して（非相関で）直交しており、（ii）最初のPCがデータセット（情報内容）の分散の最大部分を含み、それ以後のPCがそれより相応に小さい量の分散を有することである。
【００５０】
次元低減法であるPCAは、それぞれがＫ次元での値（記述ベクトル）によって説明されるｍ個の対象またはサンプルを取り、記述ベクトルの一次結合である１組の固有ベクトルを抽出する。データの共分散行列の対角化によって、固有ベクトルおよび固有値が得られる。固有ベクトルは、直交プロット軸の新たな組み合わせであると考えることができ、主成分（PC）と称される。データにおける系統的変動の抽出は、データ行列の分散および共分散構造の投影およびモデリングによって行う。主軸はデータにおける最大分散を記述する単一の固有ベクトルであり、主成分１（PC1）と称される。その後のPCは固有値を減らすことで並べられ、順次小さくなる変動性を記述する。PCによって記述されていないデータにおける分散は残差分散と称され、そのモデルがデータにどの程度良好に適合しているかを示す。記述ベクトルのPCへの投影はスコアと定義され、それはサンプル間もしくは対象間の関係を明らかにするものである。グラフ表示では（「スコアプロット」または固有ベクトル投影）、類似の記述ベクトルを有する対象またはサンプルは、クラスター内に一緒に分類される。別のグラフ表示は負荷プロットと称され、それはPCを個々の記述ベクトルに関連付けるものであり、PCの解釈に対する各記述ベクトルの重要性とそのPCにおける記述ベクトル間の関係の両方を示す。実際には負荷値は、単に元の記述ベクトルがPCと形成する角度のコサインである。そのプロットで原点に近い記述ベクトルはPCにおける情報をほとんど持たないが、原点から遠い記述ベクトル（高負荷）は解釈において重要である。
【００５１】
そこで、最初の２個または３個のPCスコアのプロットから、情報内容に関して、それぞれ２次元または３次元でのデータセットの「最も良好な」表示が得られる。最初の２つの主成分スコアPC1およびPC2のプロットによって、２次元におけるデータの最大情報内容が得られる。そのようなPCマップを用いて、例えばメタボノミック応答、従って作用機序の類似性に基づいた薬剤および毒物についての固有のクラスタリング挙動を視覚化することができる。当然のことながら、クラスタリング情報は、低PCでのものであると考えられ、それらについても調べる必要がある。
【００５２】
別の未管理パターン認識方法である階層型クラスター分析によって、いずれかの多次元空間で互いに「近い」ということで類似しているデータ点の分類が可能となる。個々のデータ点は、例えばNMRスペクトルでの特定の割り当てピークについてのシグナル強度でありうる。「類似度行列」Sを成分sij=1-rij／rijmaxで構築する。式中、rijは点ｉとｊの間の点間距離（例えば、ユークリッド点間距離）であり、rijmaxは全ての点についての最大点間距離である。最も離れた点のペアは、rijがrijmaxに等しいことから、０に等しいsijを有する。逆に、最も近い点のペアは、最大のsijを有する。２つの同一点の場合、sijは１である。
【００５３】
最も近い点のペアについて、類似度行列を走査する。その点ペアを分離距離とともに報告し、次にその２点を削除し、単一の結合点で置き換える。そうして、１つの点のみが残るまで、そのプロセスを繰り返し行う。多くの異なる方法を用いて、２つのクラスターがどのように結合するかを確認することができ、それには例えば最隣接法（単一リンク法とも称される）、最遠近隣方法および重心法（重心リンク、漸増リンク、メジアンリンク、群平均リンクおよびフレキシブルリンク変動など）などがある。
【００５４】
次に、報告された結合性をサンプル−サンプル結合性−分離距離増加（あるいは等価な意味で、類似性の減少）を示すデンドログラム（クラスタリングの視覚化を可能とする樹状図）としてプロットする。そのデンドログラムは、枝の長さが各種クラスター間の距離に比例する性質を有することから、１つのサンプルを次のサンプルに連結させる分岐の長さはそれらの類似性の尺度となる。このようにして、類似のデータ点をアルゴリズムで確認することができる。
【００５５】
非線形マッピング（NLM）は、元のＫ次元における全ての点間の距離の計算を含む簡単な概念である。その後、二次元または三次元での点のマップの構築を行い、そのマップではサンプル点をランダムな位置に置くか、あるいは事前の主成分分析によって求めた値に置く。最小二乗基準を用いて、低次元マップでのサンプル点を移動させて、低次元空間での点間距離をＫ次元空間でのものに適合させる。従って非線形マッピングは、真の点間距離に対する近似であるが、Ｋ次元空間で近接している点は、２次元または３次元空間でも近接しているはずである（例えば、Brown et al., 1996； Farrant et al., 1992参照）。
【００５６】
この簡単なメタボノミック手法では、毒性未知の化合物を投与した動物からのサンプルを、対照動物および毒物投与動物からのNMRによる代謝データのデータベースと比較する。効果既知のサンプルに対するPRマップ上でのそれの位置を観察することで、未知毒物を分類することが可能な場合が多い。同じ手法をヒトサンプルに用いて、疾患に応じた分類を行うことができる。しかしながら、そのようなデータは比較的複雑な場合が多く、NMRによって検出される経時的な生化学的変化を伴う。さらに、元のＫ次元NMRメタボノミック空間での生体異物の効果を比較することは、より厳密である。
【００５７】
別法として、自動分類法を開発するために、NMRデータ分析に対して「管理」手法を用いることが有効であることが認められている。そこで、NMRメタボノミックデータの「トレーニングセット」を用いて、各サンプルの「分類」を正確に予測する統計モデルを構築する。次に、このトレーニングセットを独立のデータ（検定セットまたはバリデーションセットと称される）で検定して、コンピュータ使用モデルの堅固性を確認する。それらのモデルは、「専門システム」と称される場合があるが、広範囲の異なる数学的手順に基づいたものでありうる。管理方法では、低減した次元を有するデータセット（例えば、最初の数個の主成分）を用いることができるが、代表的には全次元を有する未低減のデータを用いる。いずれの場合も、その方法によって、各分類、例えば代謝効果に関する生体異物の各分類を特徴付け、分離する多変量境界の量的記述が可能となる。予測に関する信頼限界、例えば、適合の妥当性に与えられる確率のレベルを得ることも可能である（例えば、Kowalski et al., 1986参照）。分析から特定のサンプルを除外することで、交差バリデーションを用いて、予測モデルの堅固性を調べることもできる。
【００５８】
専門システムを動作させて、各種の有用な出力、例えば（ｉ）「正常」または「異常」としてのサンプルの分類（これは、例えば順次フロー注入NMRスペクトル測定を用いたスペクトル装置自動化の制御における有用な手段である）；（ii）毒性および組織内での作用部位に関する標的臓器の分類（一定の場合には、毒性作用の機序も分類可能である）；ならびに（iii）試験下の特定化合物についての病的疾患状態または毒性効果の生体マーカーの確認を得ることができる。例えばサンプルは、単一の毒性分類または複数の毒性分類（複数の標的臓器）に属するか、あるいは属する分類がないものと分類することができる。後者の場合は、トレーニングセットに基づく正規性（対照）からの逸脱であるが、トレーニングセットでモデリングされた毒性分類とは類似しない代謝効果を有するもの（未知の毒性型）を示すものと考えられる。（ii）下においては、毒性ではなく臨床医学（例えば、薬物の効力）に関する決断を支持するために、システムを形成することができる。
【００５９】
管理パターン認識法の例には、下記のものなどがある。
【００６０】
ソフト非依存過多分類分析モデリング（SIMCA）（例えば、Wold, 1976参照）；
部分最小二乗分析（PLS）（例えば、Wold, 1966； Joreskog, 1982； Frank, 1984； Bro, R., 1997参照）；
線形判別式分析（LDA）（例えば、Nillson, 1965参照）；
Ｋ−最隣接分析（KNN）（例えば、Brown et al., 1996参照）；
人工神経ネットワーク（ANN）（例えば、Wasserman, 1989； Anker et al., 1992； Hare, 1994参照）；
確率的神経ネットワーク（PNNs）（例えば、Parzen, 1962； Bishop, 1995； Speckt, 1990； Broomhead et al., 1988； Patterson, 1996参照）；
規則誘導（RI）（例えば、Quinlan, 1986参照）；および
ベイズ法（例えば、Bretthorst, 1990a, 1990b, 1988参照）。
【００６１】
NMRサンプルの急速スループットにおける改善とともにメタボノミックデータベースのサイズが大きくなるに連れて（第１世代のフロー注入システムを用いた場合、現在では＞300サンプル／日／スペクトル測定装置が可能である）、例えば決定境界においてさらに大きいフレキシビリティーが可能な「ファジー論理」などの技術を用いるような、より微細な専門システムが必要になると考えられる。
【００６２】
メタボノミクスへの応用
パターン認識方法は、メタボノミックデータの分析に応用されてきた（例えば、Lindon et al., 2001参照）。多くのスペクトル測定法を用いてデータが得られており、それにはNMRスペクトル測定および質量分析などがある。一部の場合において、そのようなデータセットのパターン認識分析が奏功している。良好な研究には例えば、生体液からの複雑なNMRデータなどがある（例えば、Anthony et al., 1994； Anthony et al., 1995； Beckwith-Hall et al., 1998； Gartland et al., 1990a； Gartland et al., 1990b； Gartland et al., 1991； Holmes et al., 1998a； Holmes et al., 1998b； Holmes et al., 1992； Holmes et al., 1994； Spraul et al., 1994； Tranter et al., 1999参照）、組織サンプルからの従来のNMRスペクトル（Somorjai et al., 1995）、組織のマジック角スピニング（MAS）NMRスペクトル（Garrod et al., 2001）、in vivoNMRスペクトル（Morvan et al., 1990； Howells et al., 1993； Stoyanova et al., 1995； Kuesel et al., 1996； Confort-Gouny et al., 1992； Weber et al., 1998）、ワイン（Martin et al., 1998、1999）および植物組織（Kopka et al., 2000）などがある。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００６３】
メタボノミック手法の有用性は良好に確立されているが、それの完全な能力は未だに利用されていない。代謝変動は多くの場合で小さく、特定のアナライトの検出には、特にデータ（例えば、NMRスペクトル）が非常に複雑な場合には、強力な分析法が必要とされる。例えば、過去に提案されたもの全てが、疾患の臨床的に有用な診断を行う上で十分であるとは限らない。生体液から有用な代謝情報を抽出する新たな方法が必要とされている。
【００６４】
本発明者らは、後に試験サンプルもしくは被験者を分類したり、ないしは診断において用いることができる正確な数学的モデルを与える試験群からのデータ（例えば、NMRスペクトル）を分析する新規な方法（多変量統計分析およびパターン認識（PR）技術、ならびに場合によりデータフィルタリング技術を用いるもの）を開発した。
【００６５】
前述の方法とは異なり、本明細書に記載の方法は、医療場面において臨床的に有用かつ正確な診断および予後情報を提供する能力を有する。
【００６６】
本明細書に記載の方法は、前述のケモメトリック方法と比較してかなりの進歩をもたらすものである。ケモメトリクスによってこれまでに、一部の種類の分類が得られてきたが、その研究では、一連の制限下で分類を行う必要があった。その制限とは、疾患の実際の診断／予後のために該方法を適用する必要がありそれが臨床的に有用であると考えられる複雑なデータセットの分析に、その方法を適用する能力を制限するものである。
【００６７】
例えば、いくつかの研究が、尿または血漿のNMRスペクトルに基づいた動物の分類について報告している。それらの研究はその技術の可能性を明瞭に示すものであるが、各分類を含む動物が遺伝的に均質である（近交系群）ことから、それらの方法には限界がある。結果的に、それらの方法は、「低ノイズ」バックグラウンドに対してのみパターンを検出することができることが示されている。メタボノミクスの「現実の」群への応用（例えば、ヒト臨床実務で）では、非近交系群の遺伝的変動性による、さらには食事およびホルモンの差異によるかなりのノイズに対してパターンを検出する能力が要求される。
【００６８】
同様に、今日までに報告されている研究の多くが、例えば腎臓作用性毒物と肝臓作用性毒物とを区別する能力などの群間の比較的主要な差を調べている。試験対象のそれら２群は代謝物の広いスペクトルで異なっていて、パターンを比較的に容易に検出することができた。近交系の動物群を用いるという制限とともに、今日までに発表されているほとんどの研究が、ヒトの臨床環境とは非常に異なる条件である、高「信号／ノイズ」比の条件下でメタボノミクスが実施可能であることを示しているに過ぎなかった。
【００６９】
一部の研究では、データ変動性が高い非近交系ヒト群分類の試みが始まっている。しかしながら現在までのところ、これらの研究のいずれも、系を単純化して、実質的に具体的な分子に焦点を当てている。例えば一部の試験は、具体的にリポタンパク質に関連する共鳴に着目している。リポタンパク質は血漿の主要構成成分であることから、それが寄与する分散は、個体間の遺伝的および環境的差異によるバックグラウンド分散を容易に超える。残念ながらそのような手法は、バックグラウンドの生化学的ノイズに対して弱いパターンを識別するだけのパワーを持たず、例えば冠動脈心疾患の程度を確認したり、一卵性双生児と非一卵性双生児を区別するのに用いることができなかった。そのような低「信号／ノイズ」比パターンを確認するには、過去に報告された方法と比較してかなりの進歩を示す本発明の方法を利用する必要がある。
【課題を解決するための手段】
【００７０】
本発明の１態様は、本明細書に記載のサンプルを分類する方法に関する。
【００７１】
本発明の１態様は、本明細書に記載の被験者を分類する方法に関する。
【００７２】
本発明の１態様は、本明細書に記載の被験者を診断する方法に関する。
【００７３】
本発明の１態様は、本明細書に記載の所定の状態について、診断種または複数診断種の組み合わせを同定する方法に関する。
【００７４】
本発明の１態様は、明細書に記載の方法によって同定された診断種に関する。
【００７５】
本発明の１態様は、分類方法で使用するための、本明細書に記載の方法によって同定された診断種に関する。
【００７６】
本発明の１態様は、本明細書に記載の方法によって同定された１つ以上の診断種を用いるかそれに基づく分類方法に関する。
【００７７】
本発明の１態様は、本明細書に記載の分類方法によって同定された１つ以上の診断種の使用に関する。
【００７８】
本発明の１態様は、分類方法で用いるためのアッセイであって、そのアッセイが本明細書に記載の方法によって同定された１つ以上の診断種に基づくものである前記アッセイに関する。
【００７９】
本発明の１態様は、分類方法で用いられるアッセイの使用であって、そのアッセイが本明細書に記載の方法によって同定された１つ以上の診断種に基づくものである前記使用に関する。
【００８０】
本発明の１態様は、本明細書に記載の分類方法を用いる、治療中の被験者の治療モニタリング方法に関する。
【００８１】
本発明の１態様は、本明細書に記載の分類方法を用いる、薬物療法および／または薬物効力を評価する方法に関する。
【００８２】
本発明の１態様は、本明細書に記載の方法を実行するよう動作可能な構成を有するコンピュータまたは連結されたコンピュータなどのコンピュータシステムもしくは装置、ならびに関連するコンピュータコードコンピュータプログラム、そのようなコードおよびプログラムを記録したデータ記録媒体などに関する。
【００８３】
上記および他の本発明の態様を、本明細書に記載している。
【００８４】
当業者には明らかなように、本発明の１態様の特徴および好ましい実施形態も、本発明の他の態様に関係するものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００８５】
緒言
本発明者らは、試験群からのデータ（例えば、NMRスペクトル）を分析する新規な方法（多変量統計分析およびパターン認識（PR）技術、ならびに場合によりデータフィルタリング技術を用いるもの）を開発した。該方法は、後に試験サンプルもしくは被験者を分類したり、ないしは診断において用いることができる正確な数学的モデルを与えるものである。
【００８６】
NMRスペクトルは、それが関係するサンプルについてのフィンガープリントまたはプロファイルを提供する。そのようなスペクトルは、サンプル中に存在する全てのNMR検出可能種（特定のいくつかではなく）を提供し、有る程度までそれら可能種間の相互作用の尺度をも提供するものである。従ってそのスペクトルは、高データ密度を特徴とするが、これまでのところ十分には利用されていない。
【００８７】
本明細書に記載の方法は、そのようなスペクトルを分析し、続いて該分析結果を使用して以前には決して得られなかった識別レベルで、１つ以上の識別基準に従って、試験スペクトル（従って適用される場合には、関連するサンプルおよび被験者）を分類することを促進するものである。
【００８８】
これらの方法は、医学分野で特定の用途を有する。例えば、ある状態を特徴とする群から採取したサンプルについてのNMRスペクトルの分析によって数学モデルを得て、それを用いて、高信頼度にて陽性（その状態を有する）または陰性（その状態を持たない）被験者からのサンプルへとNMRスペクトルを分類することができる。
【００８９】
実際にそれらの方法によって、その状態の存在と常に関連する（例えば内因性の）種の量の特定の組み合わせを同定することが容易になる。代表的には、一体となって診断に用いられる多くの（多くの場合、小さい）相関性のない分散を有するそれらの組み合わせ（パターン）が、高データ密度のNMRスペクトル内にコードされている。本明細書に記載の方法によって、その同定とその後の分類への使用が可能となる。
【００９０】
しかしながら強調しておくべき点として、NMRスペクトルに基づくメタボノミック分析の方が、既知代謝物のレベルを測定するための先端技術の分析手段（NMRスペクトル測定装置）を単に用いるよりはるかに強力である。すなわち、本明細書に記載の方法は、別個の化学的項目（例えば、LDLコレステロール濃度）の複数の独立の測定を単に実行するのみの方法とは区別されるものである。
【００９１】
例えば、特定の規定された化学シフト領域（バケットまたはビンと称される）でのNMRスペクトル強度（総ピーク強度）における分散を考慮すると、その分散の一部は、そのレベルが検討下の状態の結果として常に変動する所定の分子（生体マーカー）と関連する可能性がある。その分散の残りの部分は、その全体領域でピークを与えるが検討下の状態には無関係である他の分子のレベルにおける差によるものであると考えられる（例えば、食事関係の要素、年齢、性別などの個人差）。
【００９２】
パターン認識法を用いる本明細書に記載の方法によって、スペクトル領域（バケット）における分散のごく小さな部分のみが検討下の状態に関連している可能性がある場合であっても、検討下の状態に関係するNMRピーク強度を確認することが可能となる。対象の状態に無関係の変動を有するバケットの影響を小さくすることができるデータフィルタリング技術（例えば、直交シグナル補正、OSC）を利用することで、同定力が高まる。重要なバケットに寄与する分子生体マーカーの実際の同定は、NMR専門家が元のNMRスペクトルの再検討を行うことで行うものであり、２次元NMRスペクトル測定；推定物質の分離とHPLC-NMR-MSを用いたそれの同定；基準物質のサンプルへの添加とNMRスペクトルの再測定によるNMRピークの信頼性の調査などの追加のNMRスペクトル測定実験を含むことになると考えられる。
【００９３】
例えば血漿のNMRスペクトルでは、δ1.2〜1.3当たりの領域に、多くのピークが認められる。該ピークは、いずれもδ1.30（例えば、化学シフト領域δ1.32〜1.28）、δ1.26（例えば、領域δ1.28〜1.24）およびδ1.22（例えば、領域δ1.24〜1.20）で標識されたバケットにおける強度に寄与する0.04ppm（すなわち、600MHzで24Hz）のバケット幅を考慮すると、NMR共鳴のローレンツ線の両翼は、ピーク最大値が単一のバケットに認められる場合であっても、それらのバケットのほとんどまたは全てにおいて寄与を有する。スペクトルのその領域における２つの主要な広いNMRピークエンベロープは、リポタンパク質の脂肪族アシル鎖の長鎖メチレン基に割り当てられており、さらにはその領域でNMR共鳴を有する多くの小分子代謝物があり、その共鳴のうちの一部は帰属が行われている（例えば、Nicholson et al, 1995参照）。それには、ラクテート（δ1.33での二重線）、スレオニン（δ1.32での二重線）、フコース（δ1.31での二重線）、場合によっては３−ヒドロキシブチレート（δ1.20での二重線）のメチル共鳴およびイソロイシンのメチレン共鳴の一部（δ1.28での多重線）などがある。２つの重複リポタンパク質ピークは、δ1.29では主としてVLDL、δ1.25では主としてLDLと割り当てられている。しかしながら、これらのシグナルのいずれも見かけは非対称であり、多くの重複共鳴からなる。個々のリポタンパク質画分の1H NMRスペクトルを調べることで、数学的逆畳み込み技術を用いて、δ1.3〜1.2領域でのその複合エンベロープがVLDLからの２つのバンド、LDLからの３つのバンドおよびHDLからの２つのバンドからなることを示すことが可能となっている（例えば、M. Ala-Korpela, Progress in NMR Spectroscopy, 27, 475-554 (1995)参照）。実際に本発明者らは、δ1.30のバケットでのスペクトル強度における分散が、患者100名のパネルについて独立に測定したLDLレベルとごく弱い相関しかないことを明らかにしている。従来の方法によって測定されるLDLレベルと同一サンプルのNMRスペクトルでのδ1.30におけるバケット強度との間の相関係数（ｒ）は、わずか0.45である。従って、患者100名のパネルにおけるサンプル全体でのLDL濃度の変化は、分散がｒ２に比例することから、そのバケット強度における分散の約20％を説明するのみである。従って、前記サンプル群全体でのδ1.30バケットにおける強度の分散は、LDL濃度における分散のみの場合よりはるかに多くの情報を含む。本発明の方法によって、現時点ではわかっていない追加情報の確認および説明を行うことができる。
【００９４】
さらにその方法は、単一のデータセット（例えば、単一サンプルについてのNMRスペクトル）に基づく複数のカテゴリーへの分類に用いることができる。超高データ密度の入力データセットのため、その分析方法は、別個に（すなわち、並列で）または順次に（すなわち、直列で）複数の分類を行うことができる。例えば単一の血液サンプルを用いて、いくつかのあるいは実際には多くの（例えば、無関係の）状態または疾患の有無を決定（例えば、診断）することができると考えられる。
【００９５】
そこで本発明の１態様は、例えば核磁気共鳴（NMR）および他の種類のスペクトルのようなスペクトルなどの化学的、生化学的および生物学的データの改良された分析方法に関する。
【００９６】
分類、診断方法
本発明の１態様は、本明細書に記載のサンプルを分類する方法に関する。
【００９７】
本発明の１態様は、被験者からのサンプルを分類することで被験者を分類する方法であって、前記サンプルの分類方法が本明細書に記載のものである前記方法に関する。
【００９８】
本発明の１態様は、被験者からのサンプルを分類することで被験者を診断する方法であって、前記サンプルの分類方法が本明細書に記載のものである前記方法に関する。
【００９９】
NMRスペクトル強度によるサンプルの分類
本発明の１態様は、サンプルを分類する方法であって、前記サンプルについての１つ以上の所定の診断スペクトルウィンドウでのNMRスペクトル強度を所定の状態と関連付けるステップを含む前記方法に関する。
【０１００】
本発明の１態様は、被験者からのサンプルを分類する方法であって、前記サンプルについての１つ以上の所定の診断スペクトルウィンドウでのNMRスペクトル強度を前記被験者における所定の状態と関連付けるステップを含む前記方法に関する。
【０１０１】
本発明の１態様は、サンプルを分類する方法であって、前記サンプルについての１つ以上の所定の診断スペクトルウィンドウでのNMRスペクトル強度を所定の状態の有無に関連付けるステップを含む前記方法に関する。
【０１０２】
本発明の１態様は、被験者からのサンプルを分類する方法であって、前記サンプルについての１つ以上の前記被験者における所定の診断スペクトルウィンドウでのNMRスペクトル強度を所定の状態の有無に関連付けるステップを含む前記方法に関する。
【０１０３】
本発明の１態様は、サンプルを分類する方法であって、前記サンプルについての１つ以上の所定の診断スペクトルウィンドウでのNMRスペクトル強度の対照値に対する変調を所定の状態と関連付けるステップを含む前記方法に関する。
【０１０４】
本発明の１態様は、被験者からのサンプルを分類する方法であって、前記サンプルについての１つ以上の所定の診断スペクトルウィンドウでのNMRスペクトル強度の対照値に対する変調を前記被験者における所定の状態と関連付けるステップを含む前記方法に関する。
【０１０５】
本発明の１態様は、サンプルを分類する方法であって、前記サンプルについての１つ以上の所定の診断スペクトルウィンドウでのNMRスペクトル強度の対照値に対する変調を所定の状態の有無に関連付けるステップを含む前記方法に関する。
【０１０６】
本発明の１態様は、被験者からのサンプルを分類する方法であって、前記サンプルについての１つ以上の所定の診断スペクトルウィンドウでのNMRスペクトル強度の対照値に対する変調を前記被験者における所定の状態と関連付けるステップを含む前記方法に関する。
【０１０７】
NMRスペクトル強度による被験者の分類
本発明の１態様は、被験者を分類する方法であって、前記被験者からのサンプルについての１つ以上の所定の診断スペクトルウィンドウでのNMRスペクトル強度を前記被験者における所定の状態と関連付けるステップを含む前記方法に関する。
【０１０８】
本発明の１態様は、被験者を分類する方法であって、前記被験者からのサンプルについての１つ以上の所定の診断スペクトルウィンドウでのNMRスペクトル強度を前記被験者における所定の状態の有無に関連付けるステップを含む前記方法に関する。
【０１０９】
本発明の１態様は、被験者を分類する方法であって、前記被験者からのサンプルについての１つ以上の所定の診断スペクトルウィンドウでのNMRスペクトル強度の対照値に対する変調を前記被験者における所定の状態と関連付けるステップを含む前記方法に関する。
【０１１０】
本発明の１態様は、被験者を分類する方法であって、前記被験者からのサンプルについての１つ以上の所定の診断スペクトルウィンドウでのNMRスペクトル強度の対照値に対する変調を前記被験者における所定の状態の有無に関連付けるステップを含む前記方法に関する。
【０１１１】
NMRスペクトル強度による被験者の診断
本発明の１態様は、被験者の所定の状態を診断する方法であって、前記被験者からのサンプルについての１つ以上の所定の診断スペクトルウィンドウでのNMRスペクトル強度を前記被験者における前記所定の状態と関連付けるステップを含む前記方法に関する。
【０１１２】
本発明の１態様は、被験者の所定の状態を診断する方法であって、前記被験者からのサンプルについての１つ以上の所定の診断スペクトルウィンドウでのNMRスペクトル強度を前記被験者における前記所定の状態の有無に関連付けるステップを含む前記方法に関する。
【０１１３】
本発明の１態様は、被験者の所定の状態を診断する方法であって、前記被験者からのサンプルについての１つ以上の所定の診断スペクトルウィンドウでのNMRスペクトル強度の対照値に対する変調を前記被験者における前記所定の状態と関連付けるステップを含む前記方法に関する。
【０１１４】
本発明の１態様は、被験者の所定の状態を診断する方法であって、前記被験者からのサンプルについての１つ以上の所定の診断スペクトルウィンドウでのNMRスペクトル強度の対照値に対する変調を前記被験者における前記所定の状態の有無に関連付けるステップを含む前記方法に関する。
【０１１５】
診断種の量によるサンプルの分類
本発明の１態様は、サンプルを分類する方法であって、前記サンプル中に存在する１つ以上の診断種の量または相対量を所定の状態と関連付けるステップを含む前記方法に関する。
【０１１６】
本発明の１態様は、被験者からのサンプルを分類する方法であって、前記サンプル中に存在する１つ以上の診断種の量または相対量を前記被験者における所定の状態と関連付けるステップを含む前記方法に関する。
【０１１７】
本発明の１態様は、サンプルを分類する方法であって、前記サンプル中に存在する１つ以上の診断種の量または相対量を所定の状態の有無と関連付けるステップを含む前記方法に関する。
【０１１８】
本発明の１態様は、被験者からのサンプルを分類する方法であって、前記サンプル中に存在する１つ以上の診断種の量または相対量を前記被験者における所定の状態の有無と関連付けるステップを含む前記方法に関する。
【０１１９】
本発明の１態様は、サンプルを分類する方法であって、対照サンプルと比較した前記サンプル中に存在する１つ以上の診断種の量または相対量の変調を所定の状態と関連付けるステップを含む前記方法に関する。
【０１２０】
本発明の１態様は、被験者からのサンプルを分類する方法であって、対照サンプルと比較した前記サンプル中に存在する１つ以上の診断種の量または相対量の変調を前記被験者における所定の状態と関連付けるステップを含む前記方法に関する。
【０１２１】
本発明の１態様は、サンプルを分類する方法であって、対照サンプルと比較した前記サンプル中に存在する１つ以上の診断種の量または相対量の変調を所定の状態の有無と関連付けるステップを含む前記方法に関する。
【０１２２】
本発明の１態様は、被験者からのサンプルを分類する方法であって、対照サンプルと比較した前記サンプル中に存在する１つ以上の診断種の量または相対量の変調を前記被験者における所定の状態の有無と関連付けるステップを含む前記方法に関する。
【０１２３】
診断種の量による被験者の分類
本発明の１態様は、被験者を分類する方法であって、前記被験者からのサンプル中に存在する１つ以上の診断種の量または相対量を前記被験者における所定の状態と関連付けるステップを含む前記方法に関する。
【０１２４】
本発明の１態様は、被験者を分類する方法であって、前記被験者からのサンプル中に存在する１つ以上の診断種の量または相対量を前記被験者における所定の状態の有無と関連付けるステップを含む前記方法に関する。
【０１２５】
本発明の１態様は、被験者を分類する方法であって、対照サンプルと比較した前記被験者からのサンプル中に存在する１つ以上の診断種の量または相対量の変調を前記被験者における所定の状態と関連付けるステップを含む前記方法に関する。
【０１２６】
本発明の１態様は、被験者を分類する方法であって、対照サンプルと比較した前記被験者からのサンプル中に存在する１つ以上の診断種の量または相対量の変調を前記被験者における所定の状態の有無と関連付けるステップを含む前記方法に関する。
【０１２７】
診断種の量による被験者の診断
本発明の１態様は、被験者の所定の状態を診断する方法であって、前記被験者からのサンプル中に存在する１つ以上の診断種の量または相対量を前記被験者における前記所定の状態と関連付けるステップを含む前記方法に関する。
【０１２８】
本発明の１態様は、被験者の所定の状態を診断する方法であって、前記被験者からのサンプル中に存在する１つ以上の診断種の量または相対量を前記被験者における前記所定の状態の有無に関連付けるステップを含む前記方法に関する。
【０１２９】
本発明の１態様は、被験者の所定の状態を診断する方法であって、対照サンプルと比較した前記被験者からのサンプル中に存在する１つ以上の診断種の量または相対量の変調を前記被験者における前記所定の状態と関連付けるステップを含む前記方法に関する。
【０１３０】
本発明の１態様は、被験者の所定の状態を診断する方法であって、対照サンプルと比較した前記被験者からのサンプル中に存在する１つ以上の診断種の量または相対量の変調を前記被験者における前記所定の状態の有無に関連付けるステップを含む前記方法に関する。
【０１３１】
数学的モデリングによるサンプルの分類
本発明の１態様は、分類方法であって、
（ａ）モデリング方法をモデリングデータに適用することで、予測数学モデルを形成するステップ；
（ｂ）前記モデルを用いて試験サンプルを分類するステップ
を含む前記方法に関する。
【０１３２】
本発明の１態様は、試験サンプルを分類する方法であって、
（ａ）モデリング方法をモデリングデータに適用することで予測数学モデルを形成するステップであって、
前記モデリングデータが既知分類のモデリングサンプルについての複数のデータセットを含む前記ステップ；
（ｂ）前記モデルを用いて、前記試験サンプルを前記既知分類のいずれかのメンバーとして分類するステップ
を含む前記方法に関する。
【０１３３】
本発明の１態様は、試験サンプルを分類する方法であって、
（ａ）モデリング方法をモデリングデータに適用して予測数学モデルを形成するステップであって、
前記モデリングデータが複数のモデリングサンプルの各々について少なくとも１つのデータセットを含み、
前記モデリングサンプルが複数の分類からなる分類群を規定し、
前記モデリングサンプルの各々が、前記分類群から選択される既知分類のものである前記ステップ；ならびに
（ｂ）前記試験サンプルについてのデータセットと前記モデルを用いて、前記試験サンプルを前記分類群から選択される１つの分類のメンバーとして分類するステップ
を含む前記方法に関する。
【０１３４】
本発明の１態様は、分類方法であって、
予測数学モデルを用いて試験サンプルを分類するステップを含み、
前記モデルの形成を、モデリング方法をモデリングデータに適用することで行う前記方法に関する。
【０１３５】
本発明の１態様は、試験サンプルを分類する方法であって、
予測数学モデルを用いて、前記試験サンプルを既知分類のいずれかのメンバーとして分類するステップを含み、
前記モデルの形成を、モデリング方法をモデリングデータに適用することで行い、
前記モデリングデータが前記既知分類のモデリングサンプルについての複数のデータセットを含む前記方法に関する。
【０１３６】
本発明の１態様は、試験サンプルを分類する方法であって、
予測数学モデルを前記試験サンプルについてのデータセットとともに用いて、前記試験サンプルを分類群から選択される１つの分類のメンバーとして分類するステップを含み、
前記モデルの形成を、モデリング方法をモデリングデータに適用することで行い、
前記モデリングデータが、複数のモデリングサンプルの各々について少なくとも１つのデータセットを含み、
前記モデリングサンプルが、複数の分類からなる前記分類群を規定し、
前記モデリングサンプルの各々が、前記分類群から選択される既知分類のものである前記方法に関する。
【０１３７】
数学的モデリングによる被験者の分類
本発明の１態様は、分類方法であって、
（ａ）モデリング方法をモデリングデータに適用することで予測数学モデルを形成するステップ；
（ｂ）前記モデルを用いて被験者を分類するステップ
を含む前記方法に関する。
【０１３８】
本発明の１態様は、被験者を分類する方法であって、
（ａ）モデリング方法をモデリングデータに適用することで予測数学モデルを形成するステップであって、
前記モデリングデータが、既知分類のモデリングサンプルについて複数のデータセットを含む前記ステップ；
（ｂ）前記モデルを用いて、前記被験者からの試験サンプルを前記既知分類のいずれかのメンバーとして分類し、それによって前記被験者を分類するステップ
を含む前記方法に関する。
【０１３９】
本発明の１態様は、被験者を分類する方法であって、
（ａ）モデリング方法をモデリングデータに適用することで予測数学モデルを形成するステップであって、
前記モデリングデータが、複数のモデリングサンプルの各々について少なくとも１つのデータセットを含み、
前記モデリングサンプルが、複数の分類からなる分類群を規定し、
前記モデリングサンプルの各々が、前記分類群から選択される既知分類のものである前記ステップ；ならびに
（ｂ）前記被験者からの試験サンプルについてのデータセットとともに前記モデルを用いて、前記試験サンプルを前記分類群から選択される１つの分類のメンバーとして分類することで、前記被験者を分類するステップ
を含む前記方法に関する。
【０１４０】
本発明の１態様は、分類方法であって、
予測数学モデルを用いて被験者を分類するステップを含み、
前記モデルの形成を、モデリング方法をモデリングデータに適用することで行う前記方法に関する。
【０１４１】
本発明の１態様は、被験者を分類する方法であって、
予測数学モデルを用いて前記被験者からの試験サンプルを既知分類のいずれかのメンバーとして分類することで前記被験者を分類するステップを含み、
前記モデルの形成を、モデリング方法をモデリングデータに適用することで行い、
前記モデリングデータが、前記既知分類のモデリングサンプルについて複数のデータセットを含む前記方法に関する。
【０１４２】
本発明の１態様は、被験者を分類する方法であって、
前記被験者からの試験サンプルについてのデータセットとともに予測数学モデルを用いて、前記試験サンプルを分類群から選択される１つの分類のメンバーとして分類することで、前記被験者を分類するステップを含み、
前記モデルの形成を、モデリング方法をモデリングデータに適用することで行い、
前記モデリングデータが、複数のモデリングサンプルの各々について少なくとも１つのデータセットを含み、
前記モデリングサンプルが、複数の分類からなる前記分類群を規定し、
前記モデリングサンプルの各々が、前記分類群から選択される既知分類のものである前記方法に関する。
【０１４３】
数学的モデリングによる被験者の診断
本発明の１態様は、診断方法であって、
（ａ）モデリング方法をモデリングデータに適用することで予測数学モデルを形成するステップ；
（ｂ）前記モデルを用いて被験者を診断するステップ
を含む前記方法に関する。
【０１４４】
本発明の１態様は、被験者の所定の状態を診断する方法であって、
（ａ）モデリング方法をモデリングデータに適用することで予測数学モデルを形成するステップであって、
前記モデリングデータが、既知分類のモデリングサンプルについて複数のデータセットを含む前記ステップ；
（ｂ）前記モデルを用いて、前記被験者からの試験サンプルを前記既知分類のいずれかのメンバーとして分類することで、前記被験者を診断するステップ
を含む前記方法に関する。
【０１４５】
本発明の１態様は、被験者の所定の状態を診断する方法であって、
（ａ）モデリング方法をモデリングデータに適用することで予測数学モデルを形成するステップであって、
前記モデリングデータが、複数のモデリングサンプルの各々について少なくとも１つのデータセットを含み、
前記モデリングサンプルが、複数の分類からなる分類群を規定し、
前記モデリングサンプルの各々が、前記分類群から選択される既知分類のものである前記ステップ；ならびに
（ｂ）前記被験者からの試験サンプルについてのデータセットとともに前記モデルを用いて、前記試験サンプルを前記分類群から選択される１つの分類のメンバーとして分類することで、前記被験者を診断するステップ
を含む前記方法に関する。
【０１４６】
本発明の１態様は、診断方法であって、
予測数学モデルを用いて被験者を診断するステップを含み、
前記モデルの形成を、モデリング方法をモデリングデータに適用することで行う前記方法に関する。
【０１４７】
本発明の１態様は、被験者の所定の状態を診断する方法であって、
予測数学モデルを用いて、前記被験者からの試験サンプルを既知分類のいずれかのメンバーとして分類することで、前記被験者を診断するステップを含み、
前記モデルの形成を、モデリング方法をモデリングデータに適用することで行い、
前記モデリングデータが、前記既知分類のモデリングサンプルについて複数のデータセットを含む前記方法に関する。
【０１４８】
本発明の１態様は、被験者の所定の状態を診断する方法であって、
前記被験者からの試験サンプルについてのデータセットとともに予測数学モデルを用いて、前記試験サンプルを分類群から選択される１つの分類のメンバーとして分類することで、前記被験者を診断するステップを含み、
前記モデルの形成を、モデリング方法をモデリングデータに適用することで行い、
前記モデリングデータが、複数のモデリングサンプルの各々について少なくとも１つのデータセットを含み、
前記モデリングサンプルが、複数の分類からなる前記分類群を規定し、
前記モデリングサンプルの各々が、前記分類群から選択される既知分類のものである前記方法に関する。
【０１４９】
ある種の好ましい実施形態
１実施形態において、前記サンプルは被験者からのサンプルであり、前記所定の状態は前記被験者における所定の状態である。
【０１５０】
１実施形態において、前記試験サンプルは被験者からの試験サンプルであり、前記所定の状態は前記被験者における所定の状態である。
【０１５１】
１実施形態において、前記１つ以上の所定の診断スペクトルウィンドウは１つ以上の診断種に関連している。
【０１５２】
１実施形態において、前記関連付けステップには、例えば本明細書に記載のものなどの予測数学モデルの使用が含まれる。
【０１５３】
予測数学モデルの性質は主として、そのモデルを形成する際に用いられるモデリング方法によって決まる。
【０１５４】
１実施形態において、前記モデリング方法は多変量統計分析モデリング方法である。
【０１５５】
１実施形態において、前記モデリング方法は、パターン認識方法を用いる多変量統計分析モデリング方法である。
【０１５６】
１実施形態において、前記モデリング方法はPCAであるかそれを用いる。
【０１５７】
１実施形態において、前記モデリング方法はPLSであるかそれを用いる。
【０１５８】
１実施形態において、前記モデリング方法はPLS-DAであるかそれを用いる。
【０１５９】
１実施形態において、前記モデリング方法はデータフィルタリングのステップを含む。
【０１６０】
１実施形態において、前記モデリング方法は直交データフィルタリングのステップを含む。
【０１６１】
１実施形態において、前記モデリング方法はOSCのステップを含む。
【０１６２】
１実施形態において、前記モデルは１つ以上の診断種を考慮する。
【０１６３】
予測数学モデルの正確な詳細は主として、モデリングデータ（例えば、モデリングデータセット）によって決まる。
【０１６４】
１実施形態において、前記モデリングデータはスペクトルデータを含む。
【０１６５】
１実施形態において、前記モデリングデータはスペクトルデータおよび非スペクトルデータの両方を含む（「複合データ」と称される）。
【０１６６】
１実施形態において、前記モデリングデータはNMRスペクトルデータを含む。
【０１６７】
１実施形態において、前記モデリングデータはNMRスペクトルデータと非NMRスペクトルデータの両方を含む。
【０１６８】
１実施形態において、前記NMRスペクトルデータは1H NMRスペクトルデータおよび／または13C NMRスペクトルデータを含む。
【０１６９】
１実施形態において、前記NMRスペクトルデータは1H NMRスペクトルデータを含む。
【０１７０】
１実施形態において、前記モデリングデータはスペクトルを含む。
【０１７１】
１実施形態において、前記モデリングデータはスペクトルである。
【０１７２】
１実施形態において、前記モデリングデータは既知分類のモデリングサンプルについての複数のデータセットを含む。
【０１７３】
１実施形態において、前記モデリングデータは複数のモデリングサンプルの各々についての少なくとも１つのデータセットを含む。
【０１７４】
１実施形態において、前記モデリングデータは複数のモデリングサンプルの各々について正確に１つのデータセットを含む。
【０１７５】
１実施形態において、前記使用ステップは、前記試験サンプルについてのデータセットとともに前記モデルを用いることで、前記試験サンプルを前記分類群から選択される１つの分類のメンバーとして分類するものである。
【０１７６】
１実施形態において、前記各データセットはスペクトルデータを含む。
【０１７７】
１実施形態において、前記各データセットはスペクトルデータおよび非スペクトルデータの両方を含む（「複合データセット」と称される）。
【０１７８】
１実施形態において、前記各データセットはNMRスペクトルデータを含む。
【０１７９】
１実施形態において、前記各データセットはNMRスペクトルデータと非NMRスペクトルデータの両方を含む。
【０１８０】
１実施形態において、前記NMRスペクトルデータは1H NMRスペクトルデータおよび／または13CNMRスペクトルデータを含む。
【０１８１】
１実施形態において、前記NMRスペクトルデータは1H NMRスペクトルデータを含む。
【０１８２】
１実施形態において、前記各データセットはスペクトルを含む。
【０１８３】
１実施形態において、前記各データセットは1H NMRスペクトルおよび／または13C NMRスペクトルを含む。
【０１８４】
１実施形態において、前記各データセットは1H NMRスペクトルを含む。
【０１８５】
１実施形態において、前記各データセットはスペクトルである。
【０１８６】
１実施形態において、前記各データセットは1H NMRスペクトルおよび／または13C NMRスペクトルである。
【０１８７】
１実施形態において、前記各データセットは1H NMRスペクトルである。
【０１８８】
１実施形態において、前記非スペクトルデータは非スペクトル臨床データである。
【０１８９】
１実施形態において、前記非NMRスペクトルデータは非スペクトル臨床データである。
【０１９０】
１実施形態において、前記分類群は前記所定の状態に関連する分類を含む（例えば、存在、非存在、程度など）。
【０１９１】
１実施形態において、前記分類群は正確に２つの分類を含む。
【０１９２】
１実施形態において、前記分類群は前記所定の状態の存在および前記所定の状態の非存在という正確に２つの分類を含む。
【０１９３】
分類
前述のように本発明の多くの態様が、例えばサンプル、被験者などの何らかのものを分類する方法に関する。そのような方法では、その対象を分類する。すなわちそれは結果に関連するか、あるいはより具体的にはそれは、特定の分類に割り当てられたメンバーシップであり（すなわち、割り当てられた分類メンバーシップである）、ある特定の分類「のもの」、「に属する」、「のメンバーである」と記載される。
【０１９４】
分類は、診断基準に基づいて行われる（すなわち、分類メンバーシップが割り当てられる）。そのような診断基準を検討し、分類メンバーシップを割り当てるステップは、「関連付け」という用語で説明される。例えば、「前記サンプルについての１つ以上の所定の診断スペクトルウィンドウ（すなわち、診断基準）でのNMRスペクトル強度を所定の状態の有無（すなわち、分類メンバーシップ）と関連付ける」という表現での場合である。
【０１９５】
例えば、「所定の状態の存在」は１つの分類であり、「所定の状態の非存在」は別の分類である。そのような場合において、分類（すなわち、それら分類のうちの１つへの割り当て）は診断と等価である。
【０１９６】
サンプル
前述のように本発明の多くの態様が、例えば試験下の特定サンプル（「試験サンプル」）などのサンプルが関与する方法に関する。
【０１９７】
一般的に、サンプルは好適な形態であればいかなるものであってもよい。サンプルについて得られるまたは記録されるスペクトルを含む方法の場合、そのサンプルは、特定の種類のスペクトル測定と適合性であればいかなる形態のものであってもよいことから、適宜に、例えば気体、液体、液晶、ゲルおよび固体のいずれかまたはそれらの組み合わせを含む均一もしくは不均一なものでありうる。
【０１９８】
生物（例えば、被験者、患者）由来のサンプルはin vivoでありうる。すなわち、その生物から除去されたり分離されたりしない。そこである実施形態では、前記サンプルはin vivoサンプルである。例えばサンプルは、循環血液であることができ、それを例えばNMR法を用いてin situ、in vivoで「調査(probe)」する。
【０１９９】
生物由来のサンプルはex vivoでありうる。すなわち、生物から除去または分離される（例えば、ex vivo血液サンプル、ex vivo尿サンプル）。そこで１実施形態では、前記サンプルはex vivoサンプルである。
【０２００】
１実施形態において前記サンプルは、ex vivo血液サンプルもしくは血液由来サンプルである。
【０２０１】
１実施形態において、前記サンプルはex vivo血液サンプルである。
【０２０２】
１実施形態において、前記サンプルはex vivo血漿サンプルである。
【０２０３】
１実施形態において、前記サンプルはex vivo血清サンプルである。
【０２０４】
１実施形態において、前記サンプルはex vivo尿サンプルである。
【０２０５】
１実施形態において、前記サンプルをある生物／前記生物から除去または分離し、その生物には戻さない（例えば、ex vivo血液サンプル、ex vivo尿サンプル）。
【０２０６】
１実施形態において、前記サンプルをある生物／前記生物から除去または分離し、その生物に戻す（すなわち、「一時的」）（例えば、透析法の場合など）。そこで１実施形態において、前記サンプルは一時ex vivoサンプルである。
【０２０７】
サンプルの例には、
生物の全体（生存または死亡、例えば生存しているヒト）；
生物の一部または複数部分（例えば、組織サンプル、臓器）；
腫瘍などの病理組織；
組織ホモジネート（例えば、肝臓ミクロソーム画分）；
生物または生物の一部から得られる抽出物（例えば、過塩素酸抽出物などの組織サンプル抽出物）；
生物または生物の一部から得られる浸出液（例えば、茶、漢方生薬）；
回転楕円体（spheroid）などのin vitro組織；
特定細胞種の懸濁液（例えば、肝細胞）；
生物からの排泄物、分泌物または放出物（特に、体液）；
投与または回収される材料（例えば、透析液）；
病気の機能として発達する材料（例えば、嚢胞、水疱）；ならびに
細胞培養物からの上清などがある。
【０２０８】
流体サンプルの例には、例えば血漿、血液血清、全血、尿、（胆嚢）胆汁、脳脊髄液、乳汁、唾液、粘液、汗、胃液、膵液、精液、前立腺液、精嚢液、精漿、羊水、胎児液、濾胞液、滑液、水様液、腹水液、嚢胞液、水疱液および細胞懸濁液ならびにそれらの抽出液などがある。
【０２０９】
組織サンプルの例には、肝臓、腎臓、前立腺、脳、腸、血液、血球、骨格筋、心筋、リンパ球、骨、軟骨および生殖組織などがある。
【０２１０】
さらに別のサンプル例には、空気（例えば、排気）、水（例えば、海水、地下水、例えば工場からの廃水）、食品産業からの液体（例えば、ジュース、ワイン、ビール、他のアルコール飲料、茶、牛乳）、固体様食品サンプル（例えば、チョコレート、ペースト、果皮、バナナのような果肉および野菜肉部、葉、肉（調理済みまたは生を問わず）など）などがある。
【０２１１】
以下に、いくつかの好ましいサンプルについて述べる。
【０２１２】
血液、血漿、血清
血液は、身体の血管を循環する流体である。すなわち、心臓、動脈、静脈および毛細血管を通って循環する流体である。血液および循環の機能は、他の組織の必要性を満たすこと、すなわち酸素および養分をその組織に輸送し、二酸化炭素および各種代謝老廃生成物を輸送して排出し、ホルモンを身体のある場所から別の場所に導き、そして全ての組織液で細胞の至適な生存性および機能を得るための適切な環境を維持することである。
【０２１３】
血液は、液体成分である血漿とその中に懸濁されている固体成分である血球および形成された要素（例えば、赤血球、白血球および血小板）からなる。赤血球は、ヒト血液に懸濁している血球の約99.9％を占める。それは、酸素および二酸化炭素の輸送に関与するヘモグロビンを含む。白血球は、ヒト血液に懸濁している血球の約0.1％を占める。それは、身体の防御機構および修復機構において役割を果たし、無顆粒球または顆粒球として分類することができる。無顆粒白血球には、単球ならびに小型、中型および大型リンパ球などがあり、小型リンパ球がヒト血液中の白血球の約20〜25％を占める。Ｔ細胞およびＢ細胞は、リンパ球の重要な例である。それらの種類の顆粒白血球は公知であり、好中球、好酸球および好塩基球であり、好中球がヒト血液中の白血球の約60％を占める。血小板は血球ではないが、循環血液中に大量に存在する長さ約３μｍの小型の紡錘体または棒状体である。血小板は、凝血塊形成において主要や役割を果たす。
【０２１４】
血漿は、血液の液体成分である。それは細胞系、組織系および臓器系ならびにそれらの各種外部環境間で材料の輸送を行うための主要な媒体として働き、正常な止血を維持する上で必須である。主要な組織系および臓器系の多くのものの最も重要な機能の１つが、血漿の特定の成分を許容される生理的範囲内に維持することである。
【０２１５】
血漿は、懸濁血球および形成要素の除去後に残る血液の残留液体である。代表的には、全血を処理して懸濁血球および形成要素を除去して（例えば、遠心によって）、血漿を得る。血清は、血液を凝固させ、その凝血塊を除去した後に得られる液体である。血清は、凝血塊を形成し（例えば、適宜にトロンビンおよびカルシウムイオンを加えることで開始）、次に凝血塊を除去することで（例えば、遠心によって）得ることができる。血清と血漿は主として、凝血プロセスで除去されるフィブリノーゲンおよびいくつかの成分の含有量において異なる。血漿は、抗凝血剤（例えば、クエン酸ナトリウム、ヘパリン、ヘパリンリチウム）を加えることで効果的に凝固が回避され、取り扱いまたは貯蔵可能とすることができる。血漿は主として水（約90%）からなり、約７％のタンパク質、0.9％の無機塩類および少量の炭水化物、脂質および有機塩類を含む。
【０２１６】
本明細書で使用される「血液サンプル」という用語は、全血のサンプルに関する。
【０２１７】
本明細書で使用される「血液由来サンプル」という用語は、試験下にある被験者の血液由来のex vivoサンプルに関する。
【０２１８】
血液および血液由来サンプルの例には、全血（WB）、血漿（例えば、新鮮な冷凍血漿（FFP）など）、血液血清、血液画分、血漿画分、血清画分、赤血球（RBC）、血小板（PLT）、白血球などを含む血液画分、ならびにそれらの画分を含む血球溶解物（例えば、赤血球、白血球などの血球を回収し、溶解させて細胞溶解物を得ることができる）などがあるが、それらに限定されるものではない。
【０２１９】
血液および血液由来サンプル（例えば、血漿、血清）を取得、調製、取り扱いおよび保存する方法は、当業界で公知である。代表的には血液は、通常は食事前に従来の方法を用いて被験者から採取する（例えば、肘前窩から）。
【０２２０】
本明細書に記載の方法で使用する場合、血液画分（例えば、血清）を取得するのに用いる方法は、ある被験者から次の被験者で行うのに、できるだけ注意深く再現しなければならない。全ての被験者において、同一または同様の手順を用いることが重要である。（ａ）血清取得の方が血漿取得の場合より個体間の再現性が高く、（ｂ）血漿取得には、NMRメタボノミックプロファイルで観察されて、使用可能なデータ密度を低下させ得る抗凝固剤（例えば、EDTA、クエン酸またはヘパリン）を加える必要があるという２つの理由のために、（血漿その他の血液画分と比較して）血清取得が好ましいと考えられる。
【０２２１】
本明細書に記載の方法による分析に好適な血清の代表的な取得方法は以下の通りである。血液10mLを18ゲージの蝶型針を用いて、終夜絶食していた個体の肘前窩から抜き取る。その血液を直ちにポリプロピレン製試験管中に入れ、室温で３時間凝固させる。凝固した血液について遠心を行い（例えば、4500×ｇで５分間）、血清上清を透明な試験管に移し入れる。必要に応じてその遠心ステップを繰り返して、血清が効果的に凝結塊から分離されるようにすることができる。血清上清を「新鮮な状態」で分析してもよいが、あるいは冷凍保存して後の分析に用いてもよい。
【０２２２】
本明細書に記載の方法による分析に好適な血漿の代表的な取得方法は次の通りである。止血器を用いることなく19ゲージ蝶型針を用いて肘前窩から血液を抜き取ることで、高品質の血小板欠乏血漿を得る。抜き取った血液の最初の2mLは廃棄し、残りを直ちに混合し、ダイアチューブ（Diatube）Ｈ抗凝血剤入り試験管（Becton Dickinson）中に小分けする。反転させることで緩やかに混合した後、抗凝血剤処理した血液を15分間氷で冷却し、遠心を行って血球および血小板をペレット化する（約1200×ｇで15分間）。血小板欠乏血漿上清を注意深く取り、上清の中央部１／３を抜き取って、上側１／３（浮遊する血小板を含む可能性がある）と血球ペレットの上部の上にある容易に乱される血小板層に非常に近い下側１／３を廃棄する。次に、血漿を小分けし、-20℃以下で冷凍保存し、アッセイに必要な時に解凍する。
【０２２３】
サンプルは直ちに（「新鮮な状態で」）分析してもよいし、あるいは後に行う分析用に冷凍および保存してもよい（例えば、-80℃で）（「新鮮冷凍」）。冷凍されている場合、サンプルを完全に解凍してからNMR分析を行う。
【０２２４】
１実施形態において、前記サンプルは血液サンプルまたは血液由来サンプルである。
【０２２５】
１実施形態において、前記サンプルは血液サンプルである。
【０２２６】
１実施形態において、前記サンプルは血漿サンプルである。
【０２２７】
１実施形態において、前記サンプルは血清サンプルである。
【０２２８】
尿
尿の組成は複雑であり、生物種間および生活様式に応じて生物種内の両方で非常に変動しやすい。非常に広い範囲の有機酸および塩基、単糖類および多糖類、複素環化合物、多価アルコール、低分子量タンパク質およびポリペプチドが、Na+、K+、Ca2+、Mg2+、HCO3-、SO42-およびリン酸塩などの無機化学種とともに存在する。
【０２２９】
本明細書で使用される「尿」という用語は、in vivo（例えば、胎児尿）であるか例えば排泄もしくはカテーテル採取によってex vivoであるかとは無関係に、全（または未処理）尿に関する。
【０２３０】
本明細書で使用される「尿由来サンプル」という用語は、試験下にある被験者の尿に由来するex vivoサンプル（例えば、希釈、濃縮、添加剤の添加、溶媒もしくは固相抽出などによって得られるもの）に関する。分析は、例えば新鮮な尿；冷凍してあって解凍した尿；乾燥させてあって（例えば凍結乾燥）、例えば水もしくはD2Oで再生させた尿を用いて行うことができる。
【０２３１】
多くの種類のサンプル、特に生体サンプル（例えば、生体液）の採取、取り扱い、保存および分析前準備の方法は当業界で公知である（例えば、Lindon et al., 1999参照）。
【０２３２】
１実施形態において、前記サンプルは尿サンプルまたは尿由来サンプルである。
【０２３３】
１実施形態において、前記サンプルは尿サンプルである。
【０２３４】
生物、被験者、患者
前述のように、多くの場合でサンプルは、生物 （例えば、被験者、患者）であるか、あるいは生物起源であるか、あるいは生物からの抜き取りもしくは由来によるものである。そのような場合、生物は下記でのように定義できる。
【０２３５】
１実施形態において生物は、原核生物（例：細菌）か真核生物（例：原生生物、真菌、植物、動物）である。
【０２３６】
１実施形態において生物は、原核生物（例：細菌）か真核生物（例：原生生物、真菌、植物、動物）である。
【０２３７】
１実施形態において生物は、原生生物、海草または原生動物である。
【０２３８】
１実施形態において生物は、植物、被子植物、双子葉植物、単子葉植物、裸子植物、針葉樹、イチョウ、ソテツ、シダ、トクサ、ヒカゲノカズラ、ゼニゴケまたはコケである。
【０２３９】
１実施形態において生物は、動物である。
【０２４０】
１実施形態において生物は、脊索動物、無脊椎動物、棘皮動物（例：ヒトデ、北紫ウニ、クモヒトデ）、節足動物、環形動物（環形動物）（例：ミミズ、タマシキゴカイ、ヒル）、軟体動物（頭足類（例：イカ、イイダコ）、斧足類（例：カキ、ムラサキガイ、ハマグリ）、 腹足類（例：巻貝、ナメクジ））、線虫（線形動物）、扁形動物（扁形動物）（例：プラナリア、吸虫、条虫）、刺胞類（例：クラゲ、イソギンチャク、サンゴ）または海綿動物（例：海綿）である。
【０２４１】
１実施形態において生物は、節足動物、昆虫（例：甲虫、蝶、蛾）、唇脚類（ムカデ）、倍脚類（ヤスデ）、甲殻類（例：エビ、カニ、ロブスター）またはクモ形類動物（例：クモ、サソリ、ダニ）である。
【０２４２】
１実施形態において生物は、脊索動物、脊椎動物、哺乳動物、鳥、爬虫類の動物（例：ヘビ、トカゲ、ワニ）、両生類（例：カエル、ヒキガエル）、硬骨魚（例：サケ、ツノガレイ、ウナギ、肺魚）、軟骨魚類（例：サメ、エイ）または無顎魚（例：ヤツメウナギ、メクラウナギ）である。
【０２４３】
１実施形態において生物（例：被験者、患者）は哺乳動物である。
【０２４４】
１実施形態において生物（例：被験者、患者）は、胎盤哺乳動物、有袋類（例：カンガルー、ウォンバット）、単孔目（例：カモノハシ）、齧歯類（例：モルモット、ハムスター、ラット、マウス）、ネズミ科（例：マウス）、ウサギ目（例：ウサギ）、鳥類（例：鳥）、犬科（例：イヌ）、ネコ科（例：ネコ）、ウマ科（例：ウマ）、ブタ類（例：ブタ）、ヒツジ類（例：ヒツジ）、ウシ類（例：ウシ）、霊長類、類人猿（例：サルまたは類人猿）、サル（例：キヌザル、ヒヒ）、類人猿（例：ゴリラ、チンパンジー、オランウータン、テナガザル）またはヒトである。
【０２４５】
さらに前記生物は、その発達型、例えば胞子、種子、卵、幼虫、さなぎまたは胎仔であってもよい。
【０２４６】
１実施形態において生物（例：対象、患者）は、ヒトである。
【０２４７】
被験者（例：ヒト）は、例えば性別、年齢（例：40歳以上、50歳以上、60歳以上など）、民族、病歴、生活様式（例：喫煙者、非喫煙者）、ホルモン状態（例：閉経前、閉経後）などの１つ以上の基準によって特徴付けることができる。
【０２４８】
本明細書で使用される「集団（群）」という用語は、生物群（例：被験者、患者）を指す。所望に応じて、群（例えば、ヒト群）は、上記の基準の１つ以上に従って選択することができる。
【０２４９】
状態
上記のように、本発明の多くの方法において、分類メンバーシップの割り当て、例えば１つ以上の分類への、例えば（ｉ）所定の状態の存在または（ii）所定の状態の非存在という２つの分類の一方への割り当てが関与する。
【０２５０】
「所定の」状態とは、それに関連して本発明を実行する状態であるという点で「所定」である。ある状態は、検討、試験のために状態を選択するステップによって予め決定される。
【０２５１】
本明細書で使用される場合の「状態」という用語は、少なくとも１つの事項において、好適な対照群によって決定される正常状態と区別される状態に関する。
【０２５２】
状態は、病的（例：疾患）または生理的（例：表現型、遺伝子型、絶食、水分摂取、運動、ホルモン周期（例えば発情期）など）でありうる。
【０２５３】
状態の中には、やはり好適な対照群によって決定される正常状態と比較した、状態への「危険」段階、状態への「素因のある」段階などがある。このようにして、骨粗鬆症、骨粗鬆症の危険および骨粗鬆症の素因はいずれも状態である（そして、骨粗鬆症関連の状態でもある）。
【０２５４】
ある状態に対し「危険」、「素因のある」段階などである場合、診断方法は予後方法であると考えることができる。
【０２５５】
この文脈において、「危険」、「素因」という表現は、相当する対照より大きい（例えば、1.5倍、２倍、５倍、10倍など）所定の状態を有すると分類／診断される（または分類／診断できる）確率を示すものである。多くの場合、期間（例えば、５年以内、10年以内、20年以内など）がその確率に関連する。例えば、好適な対照と比較して今後５年以内に所定の状態であると診断される可能性が２倍である被験者は、その状態の「危険」がある。
【０２５６】
状態には、状態の程度、例えば疾患の進行もしくは段階またはそれからの回復などが含まれる。例えば、疾患の進行または疾患からの回復における異なる各状況自体が状態である。そのようにして、ある状態の程度は、その状態が時間的にどのように進行するかを指すことができる。状態の程度の別の例は、それの最大重度に関係するものである。例えば疾患は、軽度、中等度または重度に分類することができる。状態の程度のさらに別の例は、その状態の性質に関係する（例えば、解剖学的部位、組織関与の程度など）。
【０２５７】
適応症
本明細書で使用される「適応症」という用語は、世界中で約100名を超える個体に影響を与える状態（例えば、病理状態、生理状態）に関するものであり、医学研究によって今後確認される状態または症候群を含む。「約100名」という下限は、有効なモデルを構築および検証することができる十分に大きい群についての必要性によって決まる。
【０２５８】
かなり多くの適応症が知られている。
【０２５９】
適用症の具体例には下記のものなどがあるが、これらに限定されるものではない。
【０２６０】
アテローム性動脈硬化ならびに心筋梗塞、卒中、アテローム性動脈硬化後の急性虚血のような疾患；局所性もしくは全身性脈管炎、例えばベーチェット症候群、巨細胞性動脈炎、リウマチ性多発性筋痛、ヴェグナー肉芽腫、チャーグ−ストラウス症候群脈管炎、ヘノッホ−シェーンライン紫斑病、川崎病、顕微鏡的多発動脈炎、高安動脈炎、本態性低温クリオグロブリン血性脈管炎、皮膚白血球破砕性血管炎、結節性多発動脈炎、原発性肉芽腫性中枢神経系脈管炎、薬物誘発抗好中球細胞質自己抗体（ANCA）関連脈管炎、低温クリオグロブリン血性脈管炎、狼瘡性脈管炎、リウマチ性脈管炎、シェーグレン症候群脈管炎、低補体血蕁麻疹性脈管炎、グッドパスチャー症候群、血清病性脈管炎、薬物誘発免疫複合体性脈管炎、腫瘍随伴性小血管脈管炎（例：リンパ増殖性腫瘍誘発脈管炎、骨髄増殖性腫瘍誘発脈管炎および癌誘発脈管炎）および炎症性大腸疾患脈管炎など；高血圧；広範囲の組織であるが、特に脳および心臓への再潅流損傷；大動脈瘤；静脈移植過形成；血管新生；黄色腫などの高コレステロール血症；鬱血性心不全；川崎病；特に血管形成術を受けた患者、またはステント、または動静脈吻合術もしくは瘻管における狭窄または再狭窄；血栓塞栓症；深部静脈血栓症；突然死症候群；不整脈；拡張蛇行静脈などを含む心血管系の疾患。
【０２６１】
骨粗鬆症および病的に低い骨密度に関連する関連疾患；骨関節炎；大理石骨病；ページェット病；および異所性化骨などを含む骨格の疾患。
【０２６２】
肥満、食欲不振、片頭痛、慢性痛、神経痛、臨床的抑鬱、癲癇；躁病性抑鬱、精神分裂症、強硬症、破瓜病、窃盗癖、アルコール依存症、サドマゾヒズムおよび常習行為などの精神障害；男性勃起不全などの性的機能不全；アルツハイマー病および特発性痴呆；クロイツフェルト−ヤコブ病および新種のCJDなどの海綿状脳症（CJD）；パーキンソン病；多発筋炎；メニエール病；ギランバレー症候群；筋萎縮性側索硬化症；筋肉脊髄炎；孤立性神経炎；神経根疾患などを含む中枢神経系障害。
【０２６３】
喘息、慢性閉塞性肺疾患（COPD）；特発性肺線維症などの肺線維症；嚢胞性線維症；例えば呼吸器多核細胞（syncicial）ウイルス感染、または肺損傷による肺病（Lukacs et al.,Adv. Immunol.,62, 257 (1996)）；成人呼吸窮迫症候群（Robbins,Pathologic Basis of Disease, Cotran et al. (Eds.), 5th ed.）；レフラー症候群；慢性好酸球性肺炎；急性間質性肺炎；肺線維症；肺気腫；胸膜炎などを含む呼吸器系疾患。
【０２６４】
例えば、常染色体優性腎多嚢胞性、糖尿病性腎障害、IgA腎症、間質性線維症または狼瘡などによる腎炎炎；糸球体腎炎（Gesualdo et al,Kidney International,51, 155 (1997)）；溶血性尿毒症症候群（Van Setten et al.,Pediatr. Res.,43, 759 (1998)）；腎石；尿失禁などを含む腎臓障害。
【０２６５】
蕁麻疹；湿疹；乾癬；皮膚筋炎；尋常性白斑；光過敏症；皮膚Ｔ細胞リンパ腫などを含む皮膚障害。
【０２６６】
ブドウ膜炎もしくは失明性ヘルペス間質性角膜炎；白内障；近視、乱視および関連障害；網膜剥離；黄斑変性；角膜損傷；眼球鉄沈着症；網膜炎；色素変性症などを含む眼球疾患。
【０２６７】
クロロシスおよび薬剤誘発線維症などの他の形態の肝臓線維症；胆石などの胆嚢の疾患などを含む肝臓および関連臓器の疾患。
【０２６８】
アトピー、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎、アナフィラキシー、アレルギー性気管支肺アスペルギルス症および過敏性肺炎（ハト飼い主病、農夫肺疾患、加湿器肺疾患、麦芽労働者肺症）などのアレルギー性疾患； 家畜、例えば、イヌおよびネコなどの家畜などの哺乳動物におけるノミアレルギー皮膚炎、カ刺しその他の昆虫刺しアレルギー、毒ツタ、アメリカツタウルシ、ウルシ毒その他の皮膚アレルゲンなどの接触アレルゲンなどのアレルギー；自己免疫性異状、包含、他、Ｉ型糖尿病、クローン病、多発性硬化症、関節炎、慢性関節リウマチ（Ogata et at.,J. Pathol.,182, 106 (1997); Gong et al.,J. Exp. Med.,186, 131 (1997)）、全身性紅斑性狼瘡、自己免疫性（橋本）甲状腺炎、肝炎および原発性胆汁性肝硬変などの自己免疫肝疾患、甲状腺機能亢進症（グレーブス病、甲状腺中毒症）、インシュリン抵抗性糖尿病、自己免疫性副腎機能不全（アジソン病）、自己免疫性卵巣炎、自己免疫性精巣炎、自己免疫溶血性貧血、発作性寒冷血色素尿症、ベーチェット病、自己免疫性血小板減少症、自己免疫性好中球減少症、悪性貧血、真正赤血球性貧血、自己免疫性凝血異常、重症筋無力症、実験アレルギー性脳脊髄炎、自己免疫性多発神経炎、天疱瘡および他の水疱性疾患、リウマチ性心臓炎、グッドパスチャー症候群、心臓切開後症候群、シェーグレン症候群、多発性筋炎、皮膚筋炎および強皮症などの自己免疫障害（これらに限定されるものではない）；例えば、刺激性もしくは炎症性腸症候群（Mazzucchelli et al.,J. Pathol.,178, 201 (1996)）、乾癬および扁平苔癬などの皮膚疾患、遅延型過敏症、慢性肺炎症（例：肺胞炎および肺肉芽腫）、歯肉炎その他の歯周病ならびに歯内療法的起源の病変に関連する骨性炎症（Volejnikova et al.,Am. J. Pathol.,150, 1711 (1997)、過敏性肺炎などの過敏症性肺疾患（Sugiyama et al.,Eur. Respir. J.,8, 1084 (1995)）、ならびに花粉症などの好塩基球からのヒスタミン放出（Dvorak et al.,J. Allergy Clin.Immunol.,98, 355 (1996)）または肥満細胞からのヒスタミン放出（Martin et al., 1989）に関連する炎症、あるいは肥満細胞腫、１型過敏反応類（アナフィラキシー、皮膚アレルギー、蕁麻疹、アレルギー性鼻炎およびアレルギー性胃腸炎）などの局所性もしくは全身性の不適切な炎症によって生じる疾患状態；潰瘍性大腸炎などを含む炎症要素もしくは自己免疫要素を有する疾患。
【０２６９】
ウイルス、原虫、真菌類および細菌など（これらに限定されるものではない）の１つ以上の病原体による感染。例えば、ヒト免疫不全ウイルス（HIV）、他のレンチウイルスまたはレトロウイルス感染、あるいはサイトメガロウイルス、ヘルペスウイルス、ウイルス性髄膜炎などの他のウイルス感染；風邪；インフルエンザ；発熱；一般的なウイルス血症；はしか；おたふくかぜ；疱瘡；灰白髄炎；マラリア、脳マラリアおよびマラリア原虫関連の寄生虫による感染の他の結果などの原生動物感染；例えばトリパノソーム感染、癩菌またはヒト結核菌感染、線虫（線形動物）などの蠕虫感染（鞭虫病、蟯虫症、蛔虫症、十二指腸虫症、糞線虫症、旋毛虫症、フィラリア症）などの寄生虫感染；吸虫類（フラックス（fluxes））（住血吸虫病、肝吸虫症）、条虫類（条虫）（包虫症、無鉤条虫症、有鉤嚢虫症）；臓器作用（works）、臓器幼虫移行症（例えば、小回虫）、好酸球性胃腸炎（例：アニサキス類（Anisaki）、フォカネマ類（Phocanema））、皮膚幼虫移行症（ブラジル鉤虫、イヌ鉤虫）；細菌性腹膜炎、髄膜炎またはグラム陰性敗血症などの細菌感染；毒物ショック症候群；致死性エンドトキシン血症；ミコバクテリア症、ニューモシスチス症、ヒストプラスマ症、ブラストミセス症、コクシジウム症、クリプトコッカス症、アスペルギルス症、肉芽腫性腸炎などの肉芽腫性疾患；異物性の肉芽腫および腹膜炎、肺肉芽腫症；梅毒および性感染症；猫爪病；エーリキア症またはライム関節炎などのライム病；ピロリ菌感染および同様の慢性感染；クラミディア種による感染；敗血症ショックおよび非敗血症ショック；鵞口瘡カンジダ、足部白癬、股部白癬などの真菌感染など。
【０２７０】
組織球腫、神経膠腫、星状細胞腫、肉腫、骨腫（Zheng et al.,J. Cell Biochem.,70, 121 (1998)）、黒色腫、カポシ肉腫、卵巣癌、乳癌、腸癌、肺癌、小細胞肺癌、各種白血病、睾丸癌、前立腺癌、そして化学療法関連の骨髄抑制および粘膜炎；ならびに肺の炎症性偽腫瘍などの良性の成長および腫瘍などを含む原発性腫瘍および転移の両方としての臓器系における腫瘍。
【０２７１】
非インシュリン依存性糖尿病（すなわちII型糖尿病）；リポタンパク質血症；痛風；栄養失調（ビタミン欠乏症、無機質欠乏症、バランスの悪い食物摂取など）；甲状腺機能低下症；甲状腺機能亢進症；バセドー氏病；アジソン病などを含む代謝障害。
【０２７２】
異常造血症；貧血；外耳炎；すい臓炎；結核もしくは癌の悪液質；を含む歯の異状が病気、齲蝕症、歯肉疾患、歯肉炎などの歯科障害；美容上の障害（例えば、口臭、無毛、脱毛症、過度の体臭など）；不妊および関連する生殖機能不全；下痢；頭痛などを含むその他の疾患。
【０２７３】
急性移植拒絶反応もしくは移植機能遅延、同種移植片拒絶反応および移植片対宿主病などの臓器移植の合併症；移植片血管症；手術後、特には婦人科手術もしくは腸管手術後に発症する腹膜内付着（Zeyneloglu et al.,Am. J. Obstet. Gynecol.,179, 438 (1998)）；手術後瘢痕；放射線誘発線維症；歯科用インプラントなどの整形外科術ならびにアテローム切除術、循環器手術および組織置換術後炎症などの手術後炎症のような外傷後炎症；腹膜透析関連の合併症（炎症など；Sach et at.,Nephol. Dial. Transplant,12, 315 (1997)）；椎間板手術後などの脳もしくは脊髄の外傷（Ghirnikar et al.,J. Neurosci. Res.,46, 727 (1996); Berman et al.,J. Irnmunol.,156, 3017 (1996)）；通常の創傷治癒時の瘢痕；骨折およびヒビ割れ、内臓損傷などの外部からは分からない外傷に関連する合併症；内出血、浮腫（特に脳腫脹）、腎臓、膵臓もしくは肝臓の破裂、脳損傷、持続的植物状態；昏睡；薬品熱傷の存在または重度；熱傷の存在または重度などを含む手術起源または非手術起源の外傷誘発の病気。
【０２７４】
珪肺、サルコイドーシス（Iida et al.,Thorax.,52, 431 (1997); Car et al.,Am. J. Respir. Crit. Care Med.,149, 655 (1994)）およびベリリウム中毒；中毒（例：鉛もしくはカドミウムなどの重金属による；ヒ素または第二水銀塩による；ストリキニーネ、麦角などの有機物による）；薬物乱用（例：パラセタモールなどの治療薬あるいはアルコールもしくはニコチンなどの他の一般的物質の過量摂取、あるいはヘロイン、コカインもしくはLSDなどの非合法薬物ならびに同化ステロイドの使用などの中毒または薬物乱用によって生じる状態。
【０２７５】
１実施形態において前記適応症は、神経変性（アルツハイマー病、パーキンソン病およびクロイツフェルトヤコブ病（CJD）など）；骨粗鬆症；骨関節炎；アテローム性動脈硬化（冠動脈心疾患および卒中）；高血圧；呼吸器疾患（喘息、COPD、肺気腫および呼吸窮迫症候群など）；自己免疫疾患（慢性関節リウマチ、多発性硬化症、全身性紅斑性狼瘡および各種アレルギー）；癌（原発性腫瘍および転移疾患）；全身性もしくは局所性線維症；ならびに感染（ウイルス、細菌、真菌または原虫など）から選択される。
【０２７６】
１実施形態において前記適応症は、高血圧；アテローム性動脈硬化／冠動脈心疾患；骨粗鬆症；および骨関節炎から選択される。
【０２７７】
１実施形態において前記所定の状態は、前記適応症のいずれか、例えば適応症、適応症の程度、適応症への素因などに関連するものである。
【０２７８】
所定の状態
１実施形態において前記所定の状態は、遺伝性および／または二卵性双子出産に関連するものである。
【０２７９】
１実施形態において前記所定の状態は、高血圧に関連するものである。
【０２８０】
１実施形態において前記所定の状態は、アテローム性動脈硬化／冠動脈心疾患に関連するものである。
【０２８１】
１実施形態において前記所定の状態は、骨粗鬆症に関連するものである。
【０２８２】
１実施形態において前記所定の状態は、骨関節炎に関連するものである。
【０２８３】
高血圧
高血圧すなわち血圧が高い状態は、西欧世界において最も罹患率の高い臨床的に重大な異常の１つである。20％を超える個体が、血圧の軽度ないし中等度の上昇を患っている。高血圧の結果には、直接的な結果としての頭痛、吐き気および視覚障害ならびにアテローム性動脈硬化（従って、心臓発作および虚血性卒中）の危険性上昇 ならびに糖尿病、出血性卒中および腎不全などがある。
【０２８４】
ほとんどの場合、高血圧の原因はあまりわからない。少数の症例で、高血圧の単一の明瞭な原因を確認することができる（例えば、副腎の腫瘍によって、アドレナリンなどの血圧ホルモンの過剰産生が生じ、それによって血圧が慢性的に上昇する可能性がある）。しかしながら大半の症例で、高血圧の原因は臨床担当者には不明なままであり、その障害は「本態性高血圧」と分類される。
【０２８５】
小児時の群サンプル内で最も高い血圧を有する個体は、成人としての群サンプルで最も高い血圧を有する場合がほとんどであることから、高血圧の危険性のかなりの部分が遺伝性であると考えられる。血圧は誰であっても加齢とともに上昇することから（動脈壁が硬くなって、血管の弾性およびコンプライアンスが低下する）、その個体は加齢に伴って高血圧を発症する危険性が最も高い被験者であると容易に確認される。
【０２８６】
血圧計を用いて血圧を測定するのは、安価で、簡単で非侵襲的である。従って冠動脈疾患とは異なり、高血圧の治療における主要な問題は、その疾患の患者やその疾患の危険性がある患者を確認することではなく、異常の根本原因を治療する点にある。患者の大半において高血圧の原因が何であるかが不明であることから、治療は症状緩和からなる。例えばアンギオテンシンIIが主要な急性昇圧シグナルであり、アンギオテンシンII産生の減少によって血圧が低下することから、高血圧患者の治療は多くの場合、酵素ACE（アンギオテンシン変換酵素）の阻害薬を用いて行う。代表的なACE阻害薬であるカプトプリルによって、高血圧の急速かつ効果的な症状管理を行うことができる。
【０２８７】
高血圧の表現型を緩和することで、結果的な合併症状の一部が低減され、例えば高血圧が直接の原因となる出血性卒中の危険性が低下することは明らかであるが、介入による血圧降下が高血圧に関連する糖尿病または冠動脈疾患の危険性を正常化するか否かについてはあまりはっきりしない。すなわち高血圧患者では、血圧を降下させる薬剤による治療が成功するか否かとは無関係に、冠動脈心疾患の危険性は同じように高い可能性がある。それについて考えられる理由としては、高血圧と冠動脈疾患の両方に共通の病理機序があり、血圧降下治療は、その２つの問題の根本原因を攻撃することで血圧を下げるわけではないというものである。
【０２８８】
アテローム性動脈硬化症／冠動脈心疾患
冠動脈心疾患(CHD)は、先進国における死亡率及び罹患率の主要な原因であり、70歳前の3人に1人が罹患する(例えば、Kannelら、1974)。
【０２８９】
アテローム性動脈硬化症(一般的には「動脈硬化」と呼ばれる)は、動脈が狭くなる血管状態である。これは動脈壁上への酸化脂質の蓄積に関連し、蓄積し、やがて硬化してプラークとなる。動脈が石灰化し、弾力性を失い、そして、このプロセスが続くにつれて、血流が遅くなる。これは、例えば、冠動脈を含む任意の動脈で起こり得る。
【０２９０】
血液を押し出すたゆみない仕事を実行するために、心臓の筋肉は酸素に富む血液の豊富な供給を必要とするが、それは冠動脈のネットワークを介して提供される。冠動脈疾患はアテローム性動脈硬化症の最終的な結果であり、十分な酸素に富む血液が心臓へ到達するのを妨げる。生きた細胞での酸素の剥奪(虚血と呼ばれる)は心臓の組織への損傷を引き起こす。動脈が完全に遮断されるようになった場合、損傷は細胞死、心臓発作が起こるほどに大きくなる。心臓発作は通常、血餅が冠動脈における血液の通過の完全な密封を形成する場合に起こる。これは、典型的にはプラーク自体が割れ目又は裂け目を作り、血小板がプラークを密封する部位に接着し、及び血餅(血栓)が形成される場合に起こる。
【０２９１】
狭心症は、それ自体は病気ではないが、冠動脈疾患の初期症状である。それは、典型的には、軽度、中程度、又は重度であってもよいが、胸部を押しつぶす物体に似ていることがある、鈍く、重い圧迫感としてしばしば報告される胸部の疼痛として経験される。疼痛はしばしば首、顎、又は左肩及び腕へと広がる。一般的ではないが、軽度の焼きつくような胸部の不快感、鋭い胸部の疼痛、又は右腕もしくは背中に広がる疼痛を報告する患者もいる。時には、患者は疼痛の代わりに呼吸の欠乏、疲労、又は動悸を経験することもある。古典的な狭心症は、激しい運動、ストレス、又は寒さへの曝露により突然引き起こされ、休息又はニトログリセリンの投与により軽減される。狭心症はまた、心臓をより多くの酸素を即時に要求する状態に置く、大量の食事によっても突然引き起こされる。疼痛の強度は医学的な問題の重篤度に常に関連しているわけではない。軽度の虚血から圧倒的な疼痛を感じる人もいれば、重篤な虚血から軽度の不快感のみを経験する人もいる。狭心症の開始と共に皮膚上での熱に対するより高い感受性を報告した人もいる。
【０２９２】
アテローム性動脈硬化症は狭心症の主要な原因からは遠いが、他の症状は心筋への酸素の送達を悪化させ、疼痛を引き起こし得る。そのような症状としては、冠動脈の痙攣、心筋自体の異常、甲状腺機能亢進、貧血、脈管炎(血管の炎症を引き起こす障害の群)、及び、稀な事例では、高地への曝露などが挙げられる。多くの症状が、心臓又は血管の異常とは関連しない胸部の疼痛を引き起こし得る。このリスト上で高いのは、不安発作、胃腸障害(胆石発作、消化性潰瘍疾患、裂孔ヘルニア、胸やけ)、肺障害(喘息、血餅、気管支炎、肺炎、虚脱肺)、並びに肋骨及び胸部の筋肉に影響する問題(筋肉の損傷、骨折、関節炎、痙攣、感染)である。
【０２９３】
安定した狭心症は激しい疼痛を伴うことがあるが、その発生は予測可能である；それは通常、激しい運動又はストレスにより引き起こされ、休息により軽減される。安定した狭心症は医学的治療によく応答する。酸素要求を増加させる任意の事象、例えば、運動、寒い天気、感情的な緊張、及び大量の食事が、狭心症を引き起こし得る。狭心症発作は1日中いつでも起こり得るが、午前6時から正午までの時間に起こる確率が高いようである。
【０２９４】
不安定な狭心症はより重篤な状況であり、安定な狭心症と心臓発作の間の中間段階であることが多い。患者は通常、以下の条件下で不安定な狭心症を有すると診断される：疼痛が患者を目覚めさせるか、もしくは休息中に起こる、狭心症を経験したことがない患者が軽い運動(2ブロックを歩くこと、もしくは1階分の階段を登ること)中に重篤もしくは中程度の疼痛を感じる、又は安定した狭心症が2ヶ月以内に重篤かつ頻繁に進行した。不安定な狭心症の疼痛の軽減には医薬はあまり有効ではない。
【０２９５】
異型狭心症又はプリンズメタル型狭心症と呼ばれる、別の型の狭心症は、冠動脈の痙攣により引き起こされる。それは、患者が休息しているときにでもほとんどいつも起こる。不規則な心拍が一般的であるが、疼痛は一般的には治療によりすぐに軽減される。
【０２９６】
重篤な冠動脈疾患を有するいくらかの人々は、無症候性虚血として知られる症状である、狭心症の疼痛を経験しないが、これについては、脳による心臓の疼痛の異常な処理が原因であるとする専門家もいる。
【０２９７】
冠動脈疾患(1つ以上の冠動脈の早発性遮断)は、1996年に475,000人以上の死者を招いた、米国の男性及び女性の双方における主要な死因である。前向きな側面では、冠動脈疾患に由来する死亡率は、工業国においては過去数十年に渡って有意に減少してきたが、開発途上国においては上昇している。適当な医学的又は外科的治療と組合せて、生活習慣の変化の必要を規定する場合、狭心症及び心臓病を罹患した人は通常の生活を送る良い機会を有する。専門家は、例えば、不安定な狭心症は心臓発作後の極めて高い死亡の危険性を示すと信じているが、最近の研究では、治療の最初の1年後には、そのような患者の死亡の危険性は正常な集団の危険性よりわずかに1.2％高いのみであることを示唆している。事実、心臓発作前の48時間以内での狭心症の開始は、おそらくその発作の結果起こる損傷に抵抗するように心臓を条件化することにより、実際に保護的であるという多くの証拠が存在する。ある研究では、胸部の疼痛を感じない人々は、疼痛を感じる人々よりも高い合併症率及び死亡率を経験している。
【０２９８】
血管造影X線画像診断(「血管造影法」)は、時が経つにつれてX線画像診断の固有の分類に成長してきた。その基礎的な原理は従来のX線走査と同じである：X線はX線管により生成され、それらが画像化しようとする身体部分を通過するとき、異なるレベルで減衰(弱体化)される。次いで、X線の減衰におけるこれらの差異を画像増強装置により測定し、得られた画像をTVカメラにより拾う。現代の血管造影システムにおいては、その後、アナログTV信号の各フレームをデジタルフレームに変換し、コンピュータによりメモリー及び／又はハードディスク上に保存する。これらのX線「映画」を、血管造影を行う際にリアルタイムで見ることができ、又はデジタルメモリーからの呼び出しを用いて後で見ることもできる。
【０２９９】
血管造影中に、医師がカテーテルを用いて目的の領域に造影剤又は染料の流れを注入して、リアルタイムで血管の詳細な画像を作製する。血管造影法の間に、医師はカテーテルを目的の領域に導いて、血管の狭窄(遮断)を取り除くことができる。例えば、脚部の主要な血管が遮断された患者は、そのような血管造影を行って狭窄部を取り除いた後、ほとんど完全に回復し得る。
【０３００】
X線血管造影を行って、脳及び心臓などの身体の血管を特異的に画像化し、その疾患を診断する。伝統的には、血管造影を用いて、プラークの形成により引き起こされる遮断などのこれらの血管の病理を診断した。しかしながら、最近の数十年において、放射線学者、心臓病学者及び血管外科医はX線血管造影法を用いて、血管及び心臓の動脈の最低限の侵襲的手術を導いてきた。ここ数年では、しばしば診断的血管画像を磁気共鳴造影法、コンピュータ化されたX線断層撮影法又は超音波を用いて作製するが、X線血管造影法を治療のために保存する。従来のX線血管造影は心臓病、心臓発作、急性卒中及び卒中をもたらし得る血管疾患の検出、診断及び治療において主要な役割を果たしている。
【０３０１】
最も一般的なX線血管造影法は類似している。患者の準備は、衣服及び宝石類を除去し、患者用ガウンを着ることを含む。全ての事例において、血管造影術には造影剤を静脈内投与することが必要である。介入的もしくは治療的な血管造影のために、鼠径部もしくは腕に小さな切込みを作製して、試験中にカテーテルを挿入することができるようにする。技師により患者を試験テーブル上に配置して、目的の組織(例えば、冠動脈)がX線管及び画像増強装置の間の適切な領域に来るようにする。技師及び放射線学者はこの手順の間にテーブルの側に残って、血管造影システムを操作し、カテーテル、造影剤注入装置及び関連装置を用いて仕事をする。典型的には、血管造影中に患者は単にリラックスして安静にしていればよい。いくつかの血管造影法には2時間かかるが、他の手順では1時間未満しかかからない。一度この手順が終了すれば、患者には回復するための時間が与えられる。この期間の間に、この患者の事例をフィルム又はモニター上で精査する。血管造影法のタイプ及び患者の医学的状態に応じて、入院患者の回復が必要であるか、又は患者を短時間の後に解放することができる。いくつかの事例においては、より多くの画像を取得する必要がある。
【０３０２】
身体の内側を見るために血管造影を用いて、医師は外科用メス及び完全に侵襲的な外科的方法を使用せずに血管を修復することができる。カテーテル(鼠径部又は上腕部での小さな切込みを介して血管中に導かれる小さな管)の設計及び使用法における進歩により、医師は血管内での非常に複雑な治療手順を実行することができるようになった。腕及び脚、首及び脳、並びに心臓におけるプラークの形成などの血管の病理を、種々の介入的血管造影手術(例えば、冠状血管形成術)を用いて治療することができる。
【０３０３】
冠状血管造影法はCHDについては最も標準的であるが(検出、診断、及び治療を含む)、この技術には問題がないわけではない。冠状血管造影法は極度に侵襲的な技術であり、1％の罹患率及び0.1％の死亡率を伴う。血管造影法の侵襲的な性質に加えて、この技術は非常に費用がかかり、時間も消費する。英国においては、冠状血管造影術の平均コストは、1例あたり約8000〜10000ポンドである。冠状血管造影術に関連する欠点は、この技術を日常的なスクリーニング手順としては不適当なものにしている。
【０３０４】
過去30年間に渡って、CHDの発達に関する様々な環境的及び生化学的危険因子がクロスセクショナル研究において同定されてきた(例えば、Kjelsbergら、1997)。例を表3-1-CHDに列挙する。例えば、喫煙はCHDの危険性がほぼ2倍に増加することに関連している(例えば、Kullerら、1991を参照)。同様に、巨大な、トリグリセリドに富むリポタンパク質粒子(主にVLDL及びLDL)における高レベルのコレステロール並びにHDL粒子における低レベルのコレステロールは、CHDの危険性の増加に関連していることが公知である(例えば、MRFIT Research Group, 1986; Despresら、2000を参照)。
【表１】
2004528559.tif 000002
【０３０５】
これらの疫学的研究はいくつかの方法において非常に有用であった。第1に、これらは様々な刊行物上で公衆衛生政策に根拠を与え、喫煙をやめさせ、低コレステロールの食事を促進してきた(例えば、Mcllvainら、1992；Dolecekら、1986を参照)。第2に、これらは、アテローム性動脈硬化症及びCHDを引き起こす分子機構の基礎をなす生命的手がかりを提供してきた(例えば、Ross, 1999を参照)。例えば、一度LDL-コレステロールレベルの上昇とCHDとの間の関連が同定されると、LDL-コレステロールの増加がマウスにおける逆遺伝子技術により実際にアテローム性動脈硬化症を引き起こすことを証明することが可能になった(例えば、Plumpら、1992；Yokodeら、1990；Breslow, 1993)。次いで、これらの研究を拡張して、LDL-コレステロールを低下させるその能力に基づいて、治療法が設計された。これらの脂質低下治療は、現在ではLDL-コレステロールレベルが正常である人々の間でさえ、心筋梗塞の危険性を低下させるのに広く有効であることが示されている。
【０３０６】
しかしながら、クロスセクショナルな疫学的研究から現在までに同定された危険因子は、CHDの臨床的に有用な診断を提供するには十分に強力ではない。年齢、性別、リポタンパク質レベル及び血圧などの様々な危険因子に基づいて、非常に有意に過剰なCHDの危険性があるサブ集団を同定することができるアルゴリズムが設計されたが、Munster, Germanyにおける優れたPROCAMに基づくこれらのうちの最もよいものでさえ、個人でのCHDの存在を個人ベースで診断することはできない(例えば、Cullenら、1998を参照)。CHDは非常に多数の環境的、生理的及び生化学的変数と弱く関連しており、結果として、現在までに見出された全範囲の危険因子でさえ十分な密度のデータを含んでおらず、健康な対照からCHD患者を個人ベースで正確に区別することができないようである(例えば、Islesら、2000)。
【０３０７】
最近、技術が進歩して、極めて高いデータ密度を有する個体からデータセットを構築することができるようになった。ゲノミクス(数千もの遺伝子の細胞遺伝子発現パターンを同時に試験すること、例えば、Collinsら、2001を参照)、プロテオミクス(複数のタンパク質の細胞含量を同時に試験すること、例えば、Duttら、2000を参照)及びメタボノミクス(無傷の組織又は生物学的流体中での数百もしくは数千の低分子量代謝物の変化を試験すること)などの技術は、特定の疾患又は毒性状態を有する個体を効率良く識別する見込みを与える(例えば、Nicholsonら、1999)。
【０３０８】
現在では、CHDのフィルム診断は、高価であり侵襲的である血管造影術の適用を介してのみ行うことができるが、本明細書に記載されるようなメタボノミックスクリーニングの導入により、単一の血液サンプルに基づく診断、例えば、CHDの非侵襲的診断を簡便かつ安価に行うことができるようになる。心筋梗塞の危険性を低下させるのに広く有効であるが、治療の必要があるほとんどのものを標的化するのが難しい、スタチンなどの薬剤の広範囲の集団のスクリーニング及び効率的な標的化を可能にする、そのような変化はCHDに関する健康管理の提供に大変革をもたらすであろう。
【０３０９】
アテローム性動脈硬化負荷及びアテローム性動脈硬化状態
一実施形態においては、所定の条件をアテローム性動脈硬化負荷、例えば、異常に高いアテローム性動脈硬化負荷の状態に関連させる。
【０３１０】
本明細書で用いる用語「アテローム性動脈硬化負荷(load)」及び「アテローム性動脈硬化負荷(burden)」は、被験者の血管樹全体に見出されるアテローム性動脈硬化プラーク組織の総量に関する。血管造影法などのほとんどの直接的な診断法は特定の部位(例えば、冠動脈)のみを試験するものであるが、血液の分析に依存するほとんどの生化学試験は血管樹の全体にわたる総アテローム性動脈硬化負荷に関連している。しかしながら、ほとんどの事例においては、1つの器官系におけるアテローム性動脈硬化の存在は他の器官におけるその存在を示す。かくして、冠動脈のアテローム性動脈硬化を有する被験者は、一般的には、冠動脈のアテローム性動脈硬化を有しない被験者よりも高い総アテローム性動脈硬化負荷を有する。逆もまた真である：高い総アテローム性動脈硬化負荷を有する個体は、低いアテローム性動脈硬化負荷を有する個体よりも冠動脈疾患を有する可能性が高い。異なる症状が特定の動脈におけるアテローム性動脈硬化の存在に関連しており、例えば、冠動脈心疾患は、少なくとも部分的には、冠動脈におけるアテローム性動脈硬化に関連し；卒中は、少なくとも部分的には、頸動脈におけるアテローム性動脈硬化に関連している。
【０３１１】
一実施形態においては、所定の状態をアテローム性動脈硬化状態に関連させる。
【０３１２】
本明細書で用いる用語「アテローム性動脈硬化状態」は、好適な対照集団と比較して、異常に高いアテローム性動脈硬化負荷を伴う状態に関する。
【０３１３】
アテローム性動脈硬化状態の例としては、限定されるものではないが、以下のものが挙げられ、これは影響されるか、又は最も影響されるか、又は最も関係のある動脈系により系統化される。
【０３１４】
末梢血管疾患(PVD)。これは末端部における虚血をもたらし、疼痛、病的状態、及び重篤な事例では切断をもたらす。
【０３１５】
深静脈血栓症(DVT)。これは、一般的な虚血の原因であり、しばしばPVDに従属的であるが、他の原因(例えば、長時間の飛行での長時間の活動停止)もあり得る。
【０３１６】
糖尿病性大血管アテローム性動脈硬化症。これは糖尿病の最も一般的な合併症である。それはまた、特定の血管床での合併症、最も一般的には、それぞれ眼及び腎臓の血管床が特に悪影響を受ける糖尿病性網膜症及び糖尿病性腎症を含む。
【０３１７】
冠動脈疾患(CAD)。これは心臓発作の最も一般的な原因であり、1つ以上の主要な冠動脈のアテローム性動脈硬化症である。
【０３１８】
狭心症。これはCADの特定の症状を説明するものであり、安定性又は不安定性のものがある。
【０３１９】
虚血性卒中。卒中の最も一般的な原因は、脳に供給する主要な動脈のアテローム性動脈硬化症に従属的な虚血である。これは、出血性卒中以外のあらゆる形態の卒中を含む。
【０３２０】
一過性虚血発作症候群(TIA)。これは狭心症の脳における等価物であり、脳への血液の供給が低下し-梗塞(組織の死)を引き起こすには不十分であるが、てんかんに似た症状をもたらすには十分なものである。
【０３２１】
腎性高血圧。高血圧の最も一般的な原因の一つは、腎動脈のアテローム性動脈硬化であり、腎臓の灌流を低下させ、血液量の調節機構のバランスを狂わせる。
【０３２２】
マルファン症候群。フィブリリン遺伝子の突然変異に起因する比較的一般的な単一遺伝子障害であり、アテローム性動脈硬化症に似た血管の変化をもたらす。
【０３２３】
モヤモヤ病。この症状はマルファン症候群に類似するが、主に脳血管系に影響する。
【０３２４】
モンケブルグ症候群。アテローム性動脈硬化症において認められるものと同様、血管の石灰化が大動脈に及ぶ稀な単一遺伝子障害である。この症状はマルファン症候群に類似し、血管の解体及び死をもたらし得る。
【０３２５】
骨の機能
骨の機能は、関節、腱及び靭帯のための機械的支持を提供して、損傷から生体器官を保護し、正常なミネラルの恒常性の保持におけるカルシウム及びリン酸の貯蔵器として働くことである。骨の疾患はこれらの機能を弱め、骨折、骨の疼痛、骨変形並びにカルシウム及びリン酸の恒常性の異常などの臨床的問題をもたらす。
【０３２６】
骨のタイプ
正常な骨格は2つのタイプの骨を含む；皮質骨もしくは緻密骨は、大腿骨及び脛骨などの長い骨の長幹(骨幹)の大部分を作り上げ、並びに海綿質骨は椎骨体及び長骨の末端部の大部分を作り上げる。
【０３２７】
全ての骨は絶え間ない代謝回転を受け、古い骨は活発に骨吸収され、新しい骨は蓄積される。この代謝回転、又は「リモデリング」は、連続的負荷が、チェックされないままである場合、骨の破局的欠損、すなわち、臨床的に明らかな骨折をもたらす弱点となり得る骨マトリックスにおける多数の微小骨折の形成をもたらすので、構造的能力の維持にとって必須である。そのようなプロセスは自動車の前面ガラス上での石片になぞらえることができる：小さな亀裂が構造全体の突然の欠損に関する触媒として作用し得る。
【０３２８】
従って、リモデリングは、骨の強度を維持するのに必須のプロセスである。骨が骨吸収及び再蓄積されるとき、微小骨折及び構造的欠陥は除去される。
【０３２９】
海綿質骨は皮質骨よりも大きな表面積を有し、このため、より急速にリモデリングされる。その結果、骨の代謝回転の増加に関連する症状は皮質骨よりも急速かつ深く海綿質骨に影響する傾向がある。皮質骨は、血管を含む中心管を取り囲むコラーゲン線維の一連の同心円性骨層板からなる、いわゆるハヴァース系中に配列される。栄養素は骨マトリックス内に深く埋まった骨細胞と、骨表面上の管壁細胞との間を走る小管の相連結系によって、骨の中心部分に到達する。海綿質骨は同様の構造を有するが、ここでは層板は、皮質骨においてと同様、同心円的ではなく、骨表面と平行に走る。
【０３３０】
骨の組成
骨マトリックスの有機成分は、主にI型コラーゲンを含んでなる：3つのタンパク質鎖から形成される線維性タンパク質が一緒になって3本鎖を形成する。I型コラーゲンは組織化された平行シート(層板)中の骨形成細胞(骨芽細胞)により配置される。I型コラーゲンは関連タンパク質のコラーゲンスーパーファミリーのメンバーであり、全て左手型3重らせんのユニークな構造モチーフを有する。コラーゲンシートの機械的強度を担う、この構造モチーフが存在するには、該タンパク質の一次アミノ酸配列に関して特定の絶対的な要件が必要である。これらの要求が満たされない場合、このタンパク質はコラーゲンに特徴的である3重らせんを形成することができない。最も重要な構造的要求は、らせん上での構造的剛性及び周期性の双方を提供するための、3つの位置ごとでのグリシンアミノ酸残基(ここでアミノ酸側鎖は3重らせんの中心に向いている)及び3つの位置ごとでのプロリン残基の存在である。グリシンは、それが全てのタンパク新生アミノ酸のうちで最も小さい側鎖(1個の水素原子のみ)を有するため必要であり、そのため、らせんの空間的に拘束された内部に収容することができる。プロリンは、それが20種のタンパク新生アミノ酸のうちで唯一の第2アミンであり、ポリペプチド中で固定した「湾曲部」を導入するため必要であり、繰り返される間隔でのプロリン残基の存在はらせんコンフォメーションを取らせるであろう。
【０３３１】
合成後、コラーゲンタンパク質は骨において必要とされる構造的剛性にとって必須である翻訳後修飾の対象である。第1に、コラーゲンは特定のプロリン及びリジン残基上で水酸化される(例えば、それぞれヒドロキシプロリン及びヒドロキシリジンを形成する)。この水酸化はコファクターとしてビタミンCを要求する酵素の活性に依存する。ビタミンCの欠損は、骨及び他のコラーゲン含有組織(皮膚、腱及び結合組織)が構造的に弱くなる疾患である壊血病をもたらす。これは正常なコラーゲン水酸化が必須であることを示す。
【０３３２】
骨中に蓄積された後、コラーゲン鎖は骨に引っ張り強さを与えるのを助ける特殊化された共有結合(ピリジニウム架橋)により架橋されるようになる。これらの架橋はコラーゲン中の水酸化されたアミノ酸(特に、ヒドロキシリジン)上での酵素の活性により形成される。水酸化が十分なビタミンCの不在により阻害される場合、壊血病における組織の弱まった状態をもたらすのは、これらの架橋の不在である。
【０３３３】
コラーゲンの生化学的構造は骨の強度において重要な因子であるが、それが配置されるパターンもまた重要である。コラーゲン線維は最大の引っ張り強さのために秩序あるシート中に配置されるべきである。しかしながら、骨が急速に形成される場合(例えば、パジェット病、又は骨転移において)、層板は無秩序な様式で配置されて、機械的に弱く、容易に骨折してしまう「網状骨」になる。
【０３３４】
骨マトリックスは、少量の他のコラーゲン並びにいくつかの非コラーゲン性タンパク質及び糖タンパク質をも含む。非コラーゲン性骨タンパク質の機能は不明であるが、それらは骨細胞の骨マトリックスへの付着を媒介し、骨のリモデリングのプロセス中に骨細胞の活性を調節することに関与すると考えられる。骨の有機成分は鉱化作用が起こる際に構造物(類骨と呼ばれる)を形成する。約10年の遅延期間の後、ヒドロキシアパタイト((Ca10(PO4)6(OH)2)結晶がコラーゲン原線維間の空間に蓄積されるにつれて、マトリックスはミネラル化されるようになる。ミネラル化により、骨は引っ張り強さを補う機械的剛性、及び骨コラーゲンに由来する弾性の特性を与えられる。
【０３３５】
骨細胞の機能及び骨のリモデリング
骨格の機械的完全性は、損傷された骨を新しい骨に置き換えるための、生涯を通して起こる骨のリモデリングのプロセスにより維持される。リモデリングを4つの段階に分けることができる；骨吸収期、逆転期、形成期、及び静止期である(例えば、Raisz, 1988; Mundy, 1996を参照)。任意のある時点において、成人骨格において約10％の骨表面が活発なリモデリングを受けるが、残りの90％は静止期にある。
【０３３６】
破骨細胞の形成及び分化
リモデリングは、骨吸収される部位への骨吸収細胞(破骨細胞)の誘引から始まる。これらは多核食細胞であり、酒石酸耐性酸ホスファターゼ酵素に富み、単球／マクロファージ系列の細胞から誘導される前駆細胞の融合により形成される。破骨細胞の形成及び活性化は、破骨細胞前駆体と骨髄間質細胞との密接な接触に依存する。間質細胞は、共通の前駆細胞からの破骨細胞及びマクロファージの分化にとって必須であるサイトカインM-CSFを分泌する。
【０３３７】
成熟破骨細胞は骨表面上で堅い封印を形成し、「襞のある境界」を通して塩酸及びタンパク質溶解酵素を破骨細胞の下の空間(ハウシップ凹窩)に分泌することにより骨吸収する。破骨細胞により分泌された塩酸はヒドロキシアパタイトを溶解し、タンパク質溶解酵素(主にカテプシンK及びマトリックスメタロプロテイナーゼ)がコラーゲン及び他のマトリックスタンパク質を分解することが可能となる。これらのタンパク質の欠損は、骨密度の増加及び破骨細胞の機能障害に関連する疾患である大理石骨病を引き起こす。骨吸収が完了した後、破骨細胞は骨形成の開始の先触れをするいわゆる逆相 (reversal phase) において、プログラムされた細胞死(アポトーシス)を受ける。
【０３３８】
骨芽細胞の形成及び分化
骨の形成は、骨髄中の間葉幹細胞に由来する骨芽細胞前駆体の骨表面への誘引から始まる。これらの細胞は脂肪細胞、筋細胞及び軟骨細胞などの多くの細胞型に分化する能力を有するが、骨マトリックス中ではそれらは骨芽細胞の運命へと向けられる。成熟骨芽細胞は、骨マトリックスの生成を担う丸々とした立方体型細胞である。それらは、骨芽細胞活性の血清マーカーとして臨床的に用いられるアルカリホスファターゼ酵素及びオステオカルシンタンパク質に富む。骨芽細胞は、最初はミネラル化されていないが、続いて約10日後に石灰化されて成熟骨を形成する骨マトリックス(類骨)の下に配置される。骨形成の間、いくらかの骨芽細胞はマトリックス内に捕捉され、骨細胞に分化するが、他の骨芽細胞は骨表面を被覆する平らな「管壁細胞」に分化する。骨細胞は、骨マトリックス内の細管を通っている、細胞質プロセスの複雑なネットワークにより、骨表面上で互いに結合し、また管壁細胞と結合する。骨細胞は、骨格における機械的張力のセンサーとして働き、近隣の骨細胞の機能を調節するプロスタグランジン及び一酸化窒素(NO)などのシグナリング分子を放出するようである。
【０３３９】
骨のリモデリングの調節
骨のリモデリングは高度に組織化されたプロセスであるが、どこで、いつリモデリングが起こるかを決定する機構についてはあまり理解されていない。機械的刺激及び微小損傷の面積が、正常な骨格においてリモデリングが起こる部位を決定するのに重要であるようである。骨のリモデリングの増加は、炎症性疾患における炎症性サイトカイン様インターロイキン-1及び腫瘍壊死因子の局所的又は全身的放出の結果起こる。副甲状腺ホルモン(PTH)及び1,25-ジヒドロキシビタミンDなどのカルシウム指向性ホルモンは一緒になって働いて、全身ベースでの骨のリモデリングを増加させ、血漿カルシウム恒常性の維持のために骨格カルシウムを固定させる。骨のリモデリングはまた、甲状腺ホルモン及び増殖ホルモンなどの他のホルモンによっても増加するが、エストロゲン、アンドロゲン及びカルシトニンによって抑制される。平衡を保って骨吸収を調節するプロセスに関してはかなりの研究がなされてきたが、骨の蓄積速度を調節する因子はほとんど理解されていない。
【０３４０】
骨の障害
骨の代謝回転を支配する代謝プロセスが適切に調節されない結果起こる骨の障害が多く存在する(例えば、代謝性骨障害)。
【０３４１】
骨粗鬆症(OP)は最も一般的な代謝性骨疾患である。これは、例えば、臀部、背骨、及び手首などの骨密度(BMD)の低下、骨組織の劣化、及び骨折の危険性の増加を特徴とする。粗末な食事、運動不足、喫煙、及び過剰のアルコール摂取などの多くの因子が骨粗鬆症の病因に寄与する。また、骨粗鬆症は慢性関節リウマチなどの炎症性疾患、甲状腺中毒症などの内分泌疾患、及び糖質コルチコイドなどの特定の薬物治療と関連して発生する場合もある。しかしながら、骨粗鬆症の病因には強力な遺伝的要素も存在する。
【０３４２】
骨粗鬆症は先進国において主要な健康上の問題である。世界保健機関(WHO)により明らかにされたように、60％もの女性が骨粗鬆症に罹患し、そのうち半数が臨床的に関連する骨折をも有する。かくして、先進国における全女性の3人に1人が骨粗鬆症に起因する骨折を有することになる。これは、罹患率及び死亡率の主要な原因であり、大きな健康管理コストをもたらす(米国のみにおいて年間140億ドルであると評価されている)(例えば、Meltonら、1992を参照)。
【０３４３】
骨粗鬆症とは逆に、大理石骨病は、過剰な骨密度を特徴とする。しかしながら、それは骨粗鬆症よりもかなり稀であり、25,000人に1人の女性しか罹患しない。
【０３４４】
骨粗鬆症の後、次に最も一般的な骨疾患は変形性関節症である。変形性関節症(OA)は成人における関節炎の最も一般的な形態であり、30歳以上の米国人の約10％が罹患する症候性疾患である(例えば、Felsonら、1998を参照)。OAは他の関節よりも頻繁に膝及び臀部の重さを受ける関節に影響するため、変形性関節症は任意の他の疾患よりも年長者の間で物理的な身体障害の原因となる(例えば、Guccioneら、1994を参照)。変形性関節症は膝及び臀部の総置換手術の最も一般的な原因であり、従って有意な経済的重荷並びに生活の質の重荷を与える。最近の評価は、労働日数の損失、早期の退職及び医学的治療を考慮に入れた経済に対する骨関節炎の総コストは国内総生産の2％を超えると示唆している(例えば、Yelin、1998を参照)。
【０３４５】
変形性関節症を引き起こす生理学的機構は依然として活発に議論されているが(例えば、Folsonら、2000を参照)、関節の過剰な機械的負荷、急性的な関節の損傷、及び食事、並びに強力な遺伝的要素などのいくつかの環境因子が寄与していることは確実なようである。この疾患は、関節中の滑液空間が狭くなること、結合組織への炎症性及び線維性変化、並びに一次結合組織II型コラーゲンを含む結合組織タンパク質の代謝回転の変化を特徴とする。最も最近の研究は、骨関節炎は、骨粗鬆症が骨のリモデリングの誤った調節の結果起こるのとほとんど同じ様式で、結合組織のリモデリングの誤った調節の結果起こることを示唆している。骨粗鬆症は量的に低い骨密度の疾患であり、変形性関節症は空間的に不適当な骨の鉱化作用の疾患である。
【０３４６】
以下のような他のあまり一般的ではない様々な骨の障害も存在する。
【０３４７】
くる病及び骨軟化症はビタミンDの欠乏の結果である。ビタミンDはカルシウム及びリン酸の吸収並びに骨のミネラルへのそれらの適切な取込みに必要である。ビタミンDの欠乏(子供においてはくる病、成人においては骨軟化症と呼ばれる)は、低い骨密度、骨の変形、及び重篤な事例では細胞外カルシウムイオン貯蔵の枯渇に起因する筋肉の強直などの様々な症状を引き起こす。
【０３４８】
上皮小体機能亢進症(副甲状腺ホルモン又はPTHの過剰産生)はくる病と類似した症状を有する。これは、遊離カルシウムイオン濃度を維持するために、PTH産生がくる病において刺激されるので驚くべきことではない。PTHは、破骨細胞の活性を促進することにより骨吸収を刺激するので、骨粗鬆症と類似した症状をもたらし得る。骨軟化症及び上皮小体機能亢進症は合わせても成人骨粗鬆症の全事例のうちの極めて少数を占めるにすぎない。ほとんど全ての事例において、成人骨粗鬆症は活発すぎる骨吸収よりもむしろ骨の蓄積の欠陥に起因している(例えば、Guyton、1991を参照)。
【０３４９】
骨のパジェット病は原因不明の比較的一般的症状であり(世界のいくつかの地域においては1000人に1人が罹患している)、破骨細胞及び骨芽細胞の活性が増加した領域を有する、骨の代謝回転の増加及び組織化されていない骨のリモデリングを特徴とする。パジェット骨は正常な骨よりも密度が高いことが多いが、異常な構造が骨の機械的な弱さを引き起こし、骨の変形及び病理学的骨折の疑いの増加をもたらす。
【０３５０】
多発性骨髄腫は形質細胞の癌である。ほとんどの他の血液性悪性腫瘍とは対照的に、この腫瘍細胞は血液中を循環しないが、骨髄中に蓄積し、そこでそれらが破骨的骨吸収を活性化する高レベルのサイトカイン(例えば、インターロイキン-6)を生じる。この疾患は全ての血液性癌の約20％を占め、主に年長者の疾患である。
【０３５１】
骨の蓄積と骨吸収との間の平衡
上記に列挙した骨の病理は全て、骨の蓄積と骨吸収との間の不均衡の結果である。これらの2つのプロセスを調節する機構が連動しなくなれば、骨密度における病理学的変化が起こる。ほんのいくつかの事例では、この不均衡の原因は明らかであるようである：例えば、エストロゲン欠損の延長(外科的不妊手術に起因するものなど)又は糖質コルチコイドによる長い治療(喘息など)は共に平衡を崩し、骨の急速な無機質脱落及び骨粗鬆症をもたらし得る。
【０３５２】
不幸なことに、大多数の事例において、平衡の喪失をもたらす機構は明らかではない。原因を同定する困難さは、起こる必要がある小規模の不均衡の一部に由来する。例えば、ほとんどの骨粗鬆症による骨折は閉経後20〜30年まで発生しない。もし、一般的に推測されているように、骨粗鬆症が閉経後のエストロゲンレベルの低下によって開始したとすれば、無機質脱落は20年又は30年に渡って安定して発生しているであろう。骨のリモデリングプロセスは比較的速い(任意の所与の骨単位において28日以内に完了する)ので、我々は無機質脱落を促進する不均衡は非常に小さいと推定しなければならない。
【０３５３】
現在の治療
現在、骨粗鬆症の予防及び治療において用いられる薬剤には2つの主要なクラスが存在する：(1) ホルモン活性薬剤(エストロゲン、選択的エストロゲン受容体モジュレーター(SERM))；及び(2) 抗骨吸収剤である。
【０３５４】
現在、女性の閉経後にホルモン活性薬剤(通常、エストロゲン、エストロゲン類似体又はコンジュゲート化エストロゲン)を長期間使用することにより、骨の無機質脱落を予防し、従って骨粗鬆症の開始を遅延させることができることを示唆する良好なデータが存在する。関与する分子機構は、おそらく非常に複雑であるため、明確に定義されていない。しかしながら、骨の蓄積の刺激及び骨吸収の抑制の双方に関与するもっともらしい機構は存在する。
【０３５５】
現在まで、骨及び心血管系に対する有益な効果を有するが、癌の危険性を増加させ得る乳房及び子宮の過形成の副作用を有しないRaloxifene(商標)などの新世代のSERMを含む、そのようなホルモン活性薬剤は、存在する骨粗鬆症の治療のための幅広い使用を達成していない。
【０３５６】
現在では、公知又は考えられる骨塩の欠損の治療は、最も一般的には破骨細胞活性を抑制する薬剤の使用によるものである。このクラスにおける2つの最も重要な薬剤群はビスホスホナート(BP)及び非ステロイド系抗炎症剤(NSAID)である。
【０３５７】
ビスホスホナート(ジホスホナートとしても知られる)は、過剰な骨の破壊又は骨吸収を含む骨疾患、例えば、パジェット病、腫瘍関連骨溶解、及び欠陥が骨の蓄積又は骨吸収のいずれかである閉経後の骨粗鬆症の治療に用いられる薬剤の重要なクラスである。ビスホスホナートは天然のホスホナートの構造類似体である。ピロホスホナートは酸素原子により連結された2個のリン酸基(P-O-P)からなるが、ビスホスホナートは炭素原子により連結された2個のリン酸基(P-C-P)を有する。これによりビスホスホナートは非常に安定し、分解に対する耐性を獲得している。さらに、ピロホスホナートと同様、ビスホスホナートはカルシウムに対する非常に高い親和性を有し、従ってin vivoにおいて骨塩を標的化する。2個のリン酸基を連結する炭素原子は、それに結合した2個の側鎖を有し、構造において変化させることができる。これは様々な抗骨吸収能力を有する複数のビスホスホナート化合物を生じさせる。骨吸収は高度に特殊化された多核破骨細胞により媒介される。ビスホスホナート薬剤はこれらの細胞の活性及び生存能力を特異的に阻害する。第1に、静脈内又は経口投与の後、ビスホスホナートは循環から速やかに消失し、骨塩に結合する。次いで、ミネラルが破骨細胞により骨吸収及び溶解されるにつれて、該薬剤が骨塩から放出され、破骨細胞により内在化されると考えられる。前記薬剤の細胞内蓄積は、前記細胞が骨を吸収する能力を阻害し(おそらくシグナル伝達経路又は細胞性代謝を妨害することによる)、破骨細胞のアポトーシスを引き起こす(例えば、Hughesら、1997を参照)。
【０３５８】
NSAIDは炎症性疾患の治療に広く用いられているが、それがプロスタグランジン生成酵素シクロオキシゲナーゼ(COX)を阻害するため、胃腸(GI)に対する重篤な副作用を引き起こすことが多い。近年開発された選択的シクロオキシゲナーゼ-2(COX-2)阻害剤は、GI管に対して毒性が低いかもしれない新しい治療戦略を提供する。Nicox SA(Sophia Antipolis, France)により開発されたNSAIDは、一酸化窒素(NO)供与基を含み(NO-NSAID)、GI副作用を引き起こすことなく抗炎症特性を示す。骨に対するNSAIDの有益な作用を担う機構については明確に同定されていないが、骨吸収する破骨細胞は循環している単球プールから誘導されるため、何故、一般化された抗炎症治療が抗骨吸収作用を有するかを想像するのは難しいことではない。しかしながら、別のクラスの強力な抗炎症分子であるグルカコルチコイド及びその類似体、例えばデキサメタゾンは、NSAIDとは逆の作用を有する：長期的デキサメタゾン治療(例えば、喘息において)は、無機質脱落を誘導し、骨粗鬆症の急速な開始の症状をもたらす。結果として、NSAIDは経験的には抗骨吸収特性を有するが、これらの薬剤の作用の詳細な機構についてのさらなる精査が必要であることは明らかである。
【０３５９】
最近、ビスホスホナート及びエストロゲンなどの骨吸収を阻害するのに臨床的に用いられる薬剤の多くが、破骨細胞のアポトーシスを促進することにより、骨吸収を阻害することが発見された(例えば、Hughesら、1997を参照)。現在、これらの疾患において破骨細胞活性を抑制するのに用いられる最も一般的に使用される型の薬剤はビスホスホナート(BP)及び非ステロイド系抗炎症剤(NSAID)である。
【０３６０】
現在の治療の制限
全ての利用可能な治療的及び予防的様式の臨床的利用性に影響するいくつかの制限が存在する。例えば、ホルモン剤(HRT及びSERM)並びに抗骨吸収剤(BP及びNSAID)は共に、主として骨吸収を標的化する。これは、例えばパジェット病などにおいては有用であるが、大多数の事例において主な欠陥として蓄積速度が低下する骨粗鬆症においてはあまり有用ではないようである。勿論、骨密度は蓄積速度と骨吸収速度の間の平衡であるため、抗骨吸収戦略は主な欠陥が蓄積速度にある場合でもある程度の効力を有し得る。
【０３６１】
おそらく、現在の治療剤は抑制された蓄積が骨粗鬆症における主な欠陥である場合に骨吸収を標的化するため、現在の薬剤は骨を構築できず、その代わりにさらなる無機質脱落を停止させるにすぎない。診断技術、特に集団スクリーニングの制限された利用可能性のために、骨が既に危険なほどに無機質脱落されてしまっている時点である臨床的な症状(骨折など)が現れる時点まで、通常は治療を始めることができない。そのような事例では(それが大部分である)、骨密度を増加させる治療が望ましい。プロリン欠損を無効にすることに基づく新しい治療は蓄積速度を刺激し、従って、新しい治療カテゴリーとなる：骨吸収よりも優先的に蓄積を標的化するものである。このカテゴリーの治療は骨密度を増加させることができないという制限を克服することが期待される。
【０３６２】
存在する治療法の別の制限は、病理の基礎となる原因を治療するというよりもむしろ症状を緩和しようとすることの失敗である。部分的には、これは骨粗鬆症の直接的原因がほとんど同定されていないためである。本発明者らは、骨粗鬆症の発達に対する新規な寄与的機構を同定し、従って、病理学的に低い骨密度をもたらす直接的機構の一つを標的化するための第1の治療的手法を提供した。
【０３６３】
骨の障害の診断
骨の障害の早期診断は良好な治療管理にとって必須であることは長い間明らかであった。現在、骨粗鬆症のための有効な治療法がいくつか存在するが、その各々は骨密度のさらなる喪失を抑制することができるにすぎない。現在までに、既に発生してしまった喪失を逆転させるのに有効である治療法はない。かくして、骨密度の低下の早期で信頼できる診断は臨床的に最も重要である。
【０３６４】
骨の障害の存在する診断法は2つのカテゴリーに分けられる：
(a) 直接的観察(例えば、骨粗鬆症のための骨密度の走査又は骨関節炎のための放射線写真評価)；及び
(b) リモデリングの分子マーカー(例えば、コラーゲン破壊産物)の間接的観察。
【０３６５】
骨折の主要な決定因子のうち、現在、任意の厳密性及び正確性をもって測定することができるのは骨密度のみである。
【０３６６】
骨密度測定器は、典型的には、絶対値(すなわち、骨密度、BMD、典型的にはg/cm2の単位)又はBMD値から誘導される相対値(TスコアもしくはZスコア)で結果を与える。Zスコアは患者のBMDの結果と、通常は性別及び年齢、並びにおそらくは体重も一致させた健康な人の群である好適な対照集団から取ったBMD測定値とを比較する。Tスコアは患者のBMDの結果と、性別について一致させた健康な若者の対照集団から取ったBMD測定値とを比較する。換言すれば、Zスコアについては、年齢及び性別について一致させた対照を用いる；Tスコアについては性別のみを一致させた対照を用いる。世界保健機関(WHO)は、年齢及び性別について一致させた対照(Zスコア)の平均値から標準偏差(SD)の 1.5倍低いカットオフ値以下の骨密度(BMD)、又は性別について一致させた対照(Tスコア)の平均値から標準偏差(SD)の 2.5倍低いカットオフ値以下の骨密度を骨粗鬆症として定義している(例えば、世界保健機関、1994を参照)。
【０３６７】
骨密度(BMD)を評価するための2つの最も広く用いられている方法はDEXA走査(二重放出X線吸収走査)及び超音波である。DEXA法は骨密度の最も標準的な診断ツールであると考えられており、g/cm3の単位で平均骨密度の信頼できる評価を提供する。これをいくつかの異なる骨に対して適用することができるが、最も一般的には、腰椎密度(皮質骨の尺度として)及び大腿首密度(海綿質骨密度の尺度として)を測定するのに用いられる。超音波はDEXA走査よりも容易かつ安価に実施することができるが、骨密度の評価に対する信頼性は低く、その正確性は周囲の軟組織により弱められる。結果として、超音波は通常、軟組織による干渉が最少化されるかかとに対して行われるが、これが全身の骨密度の典型であるかどうかは明確ではなく、いかなる事例においても皮質骨の評価が可能になるわけではない。例えば、Pocockら、2000；Prince、2001を参照。
【０３６８】
現在用いられている分子診断はほとんど全て、骨の破壊産物の測定に基づいている。破壊産物の安定状態レベルは骨のリモデリング速度と関連しているべきであるが、不活発な蓄積よりもむしろ活発すぎる骨吸収の検出に偏向しているであろう。それは、部分的には、たとえ骨粗鬆症の多くの事例が活発すぎる骨吸収に起因するものではないとしても(上記のように)、骨粗鬆症について現在行われている全ての療法(エストロゲン受容体モジュレーター又はビスホスホナート)は蓄積の促進よりもむしろ抗骨吸収戦略に基づいているという理由のためである。
【０３６９】
分子診断の例としては、血清又は尿中の遊離架橋、ヒドロキシプロリン、コラーゲンプロペプチド、もしくはアルカリホスファターゼの測定が挙げられる。遊離架橋はコラーゲンが骨吸収中に分解されるときに産生される。コラーゲンの大部分は破壊されて遊離アミノ酸になるが、架橋を形成した三量体化されたヒドロキシリジン残基はさらに代謝されることができず、尿中に腎臓により分泌されるまで血液中に蓄積する。かくして、血清又は尿中の架橋のレベルはコラーゲンの破壊速度に関連しているであろう(全てではないが、その大部分が骨中で起こる)。ヒドロキシプロリンに関する試験も同様の原理に基づく：遊離プロリン(すなわち、タンパク質に組み込まれていないプロリン)は決してヒドロキシル化された形態のヒドロキシプロリンではない。結果として、血中遊離ヒドロキシプロリンの唯一の起源はコラーゲン破壊に由来する。架橋についても同様に、破壊中に生成された遊離ヒドロキシプロリンはさらに代謝されることができず、腎臓により排出されるまで蓄積する。不幸なことに、これらの代謝物のレベルは共に(血清中でも尿中でも)、腎臓機能により有意に影響を受ける。
【０３７０】
コラーゲンは、細胞外マトリックス中への取込みの前に切断されるN末端及びC末端伸長部を有するプロタンパク質として産生される。次いで、これらの伸長部、もしくはプロペプチドは代謝されるか、又は排出される。しかしながら、安定状態レベルのこのプロペプチドは、全てではないが、そのうちのいくらかは骨中で発生するようであるコラーゲン蓄積のマーカーであると示唆されてきた。
【０３７１】
現在の診断法に関する問題
最も標準的な骨密度測定法DEXA走査は骨粗鬆症の臨床的徴候のない女性における日常的スクリーニング手法としてはあまりに面倒かつ高価である。これには特殊な装置(設備及び維持するには大きく、高価である)並びにその操作のための特殊な訓練が必要である。骨密度を正確に測定すること、従って、骨粗鬆症の指標となる診断を提供することは、それが将来の骨折の危険性を正確に予測できないにもかかわらず、骨の品質並びに密度も重要であることを示唆している(例えば、上記のコメントを参照)。
【０３７２】
かかと上での超音波測定はより安価な装置を用いて、あまり操作者の訓練も必要とせずに簡単に行うことができるが、その結果は一般的には骨粗鬆症又は将来の骨折の危険性の存在を予測することはできない。
【０３７３】
分子診断はかなり容易に行うことができるが、多くの事例ではアッセイに必要な試薬を取得するのに費用がかかる。現在までに評価されているマーカーの主な欠点は、血清又は尿中の破壊産物のレベルが特に経時的に安定ではなく、1日ごとのリズムで、また日々変化することである。結果として、スポット測定(すなわち、無作為に選択した時間で取得した単一の標本)は、診断的又は予防的な力は事実上ほとんどない。一連の測定値を用いて骨粗鬆症に関する相対的危険性のいくつかの示唆を提供することができるが、骨粗鬆症を有するオッズ比は高いレベルの代謝回転マーカーを有する個体間でわずかに約2倍でしかない(例えば、Garnero、1996)。そのような弱い関連は実用的な臨床的価値はほとんど又は全くなく、結果として、骨代謝の生化学的マーカーは臨床領域における幅広い用途はなく、集団スクリーニングとして認知されていない。
【０３７４】
現在の分子診断の別の重要な制限は、骨代謝の生成物(例えば、架橋、ヒドロキシプロリン、及びコラーゲンプロペプチドなど)に関する焦点である。これらの種は診断的な潜在能力を提供し得るが、蓄積と骨吸収との間の不均衡の根本的原因に関する情報は全く提供しない。骨の代謝回転の直接的マーカーではなかった危険因子の同定は治療上の標的を同定し、並びに予防的潜在能力を有する見込みを提供し得る。
【０３７５】
骨関節炎
骨関節炎(OA)は、特に65歳以上の成人において最も一般的な型の関節炎である。OAは慢性的疼痛及び身体障害をもたらすことが多い慢性変性関節症である。集団の加齢と共に、この症状はますます一般的になり、その治療は財政的にますます厄介になる。OAのためのより良い治療を見出すことはこの時点で研究の主要な焦点である。特定の関節におけるOAの報告された発生率及び罹患率は、OAの事例定義における差異に起因して広く変化する。OAを、放射線写真基準のみ(放射線写真的OA)、典型的な症状(徴候的OA)、又はその両方により定義することができる。放射線写真基準を用いて、手の遠位及び近位の指節関節がOAにより最も一般的に影響される関節として同定されたが、それらが徴候的である可能性は極めて低い。対照的に、放射線写真的OAの2番目及び3番目に最も一般的な位置を構成する膝及び臀部はそれぞれ、ほとんど常に徴候的である。第1中足指節関節及び手根中手骨関節も放射線写真的OAのよくある部位であるが、肩、肘、手首及び中手指節関節は特発性OAを生じることはめったにない。
【０３７６】
人口統計学的研究において、関節が研究されているにもかかわらず、年齢は最も一貫して同定されるOAの危険因子である。放射線写真的OA及び、ある程度まで、徴候的OAの双方の罹患率は男性においては50歳、女性においては40歳を過ぎた後に急に上昇する。女性であることもOAの広く認識された危険因子である。手のOAは特に女性において罹患率が高い。さらに、多関節OA及び単離された膝OAは男性よりも女性においてより一般的であるが、臀部OAは男性においてより一般的に発生する。女性は、男性よりも臀部を含む全ての罹患した関節における疼痛を報告するようである。コホートによる研究は女性における放射線写真的膝OAの発生と肥満との明確な関連、及び臀部OAと肥満との弱い関連を証明している。肥満が手OAの発生の危険因子であるか否かは依然として議論の余地がある。
【０３７７】
職業関連反復的損傷及び身体的外傷は、中手指節関節、手首及び足根関節などの一次(特発性)OAにより影響されない関節において起こることがある二次(非特発性)OAの発生に寄与する。反復的な屈曲運動及び激しい活動を必要とする職業に従事している成人においては膝OAの罹患率はより高いが、通常の激しい運動との関連は依然として議論の余地がある。ジョギングする人における初期の研究はジョギングしない人と比較してジョギングする人において膝のOAの罹患率がより高いことを見出せなかったが、年長の成人におけるFraminghamデータベースの最近の研究は高いレベルの身体運動と偶発的な膝OAとの第1の縦軸方向の関連を提供した。低い衝撃及び休養のための運動は膝OAの危険因子を構成せず、心血管系にとって有益であるようである。従来の半月板切除術は男性において膝OAの発生の有意な危険因子である。
【０３７８】
OAの徴候及び症状
OAは典型的症状、身体的所見及び放射線写真の変化の三徴候により診断される。The American College of Rheumatologyは、全面的に信頼できるものではないが、放射線写真的所見を含む徴候的OAを有する患者の同定において助けとなる分類基準を説明している。早期の疾患を有する患者は活動と共に悪化し、休息により軽減される局在化された関節の疼痛を経験するが、重篤な疾患を有する患者は休息中でも疼痛を有することがある。重量を支える関節は、進行した疾患の結果である内部障害に起因して「固定する」又は「衰える」かもしれない。朝における硬直又はその後の不活発(「ゲル現象」)は稀に30分を超える。
【０３７９】
骨関節炎の関節における身体的所見としては、骨の膨張、関節摩擦音、冷たい滲出液、及び行動範囲の減少が挙げられる。関節系の触診での圧痛及び受動的行動での疼痛も一般的であるが、OAにユニークであるというわけではない。OAにおける放射線写真的所見としては、骨棘の形成、関節空間の狭窄、肋軟骨下の硬化及び嚢腫が挙げられる。骨棘の存在はOAの最も特異的な放射線写真マーカーであるが、それは比較的進行した疾患であることを示すものである。
【０３８０】
診断
患者が上記のような典型的症状及び放射線写真的特徴を有する場合、OAの診断は比較的確実であり、他の存在と混同する恐れはほとんどない。しかしながら、確実性の低い事例の場合、他の診断法を考慮すべきである。例えば、受動的行動又は関節の触診により再現されない関節周囲の疼痛は滑液嚢炎、腱炎又は骨膜炎などの別の病因を示唆であろう。疼痛の多い関節の分布がMCP、手首、肘、足根関節又は肩を含む場合、OAである可能性は低い。長時間の硬直(1時間を超えるもの)は慢性関節リウマチなどの炎症性関節炎の疑いを生じる。関節における顕著な温感及び紅斑は感染性又は微結晶性の病因を示唆する。体重の減少、疲労、発熱及び食欲の低下はリウマチ性多発性筋痛、慢性関節リウマチ、狼瘡もしくは敗血症又は悪性腫瘍などの全身性疾患を示唆する。
【０３８１】
放射線写真はOAの診断にとって「最も標準的な」試験であると考えられているが、放射線写真的変化は疾患においては相対的に遅すぎることは明らかである。OAの早期診断、及びその進行のモニタリングを可能にする感受性の高い、特異的な生物学的マーカーの必要性は大きい。堆積速度及びc-反応タンパク質などの日常的実験室試験はOAのマーカーとしては有用ではないが、最近の研究はCRPの上昇がより迅速に進行性疾患を予測することを示唆している。
【０３８２】
しかしながら、軟骨成分のいくつかのエピトープがOAのマーカーとしてのいくつかの可能性を有することが報告されている。例えば、通常は胎児及び新生児の軟骨においてのみ発現されるコンドロイチンエピトープ846がOAにおいて観察されたが、正常な成人の軟骨及び滑液においては観察されなかった。II型コラーゲンに独特なエピトープがOAの軟骨において記載されたが、正常な軟骨をMMPに曝露することにより、in vitroでそれを解明することができる。このエピトープは、血液及び尿中で測定することができ、OAの進行を診断又はモニタリングするのに有用であることが証明されている。放射線写真的OAといくらか相関させることにより、血清ヒアルロン酸レベルの上昇も認められた。外傷的関節損傷後の滑液中の軟骨オリゴマータンパク質(COMP)レベルの上昇に関する所見は損傷された関節におけるOAの発生を予告し得る。OAの他の可能性あるマーカーも列挙されたが、容易に入手できず、またそれらを可能性あるOAマーカーとして考えるのに必要とされる感受性及び特異性も欠いている。
【０３８３】
OAの現在の治療は比較的制限されている。現在、疾患を遅延させるか、又は予防することができる薬剤はないので、治療は主に疼痛の緩和、生活の質及び機能的独立の維持に焦点が当てられている。
【０３８４】
OA疼痛の短期間の管理にとって、アセトアミノフェン(パラセタモール)が偽薬よりも優れており、非ステロイド系抗炎症剤(NSAID)と同等であることがいくつかの研究により示された。現在では、アセトアミノフェン(最大4,000 mg/日)が徴候的OAの第1選択鎮痛剤として推奨されている。しかしながら、多くの患者が、疼痛を制御するために最終的にはNSAID又はより強力な鎮痛剤を必要とする。
【０３８５】
NSAIDがその抗炎症作用及び鎮痛作用を示す機構は、プロスタグランジン生成酵素シクロオキシゲナーゼ(COX)の阻害を介するものである。その炎症性能力に加えて、プロスタグランジンは胃腸の整列、腎臓血流、及び血小板凝集の維持などの重要な恒常性機能にも寄与している。これらの器官におけるプロスタグランジンレベルの低下は、伝統的な非選択的NSAIDのよく認知された副作用、すなわち、胃潰瘍、腎不全、及び出血時間の延長をもたらし得る。年長者はこれらの副作用についてより高リスクである。例えば、NSAIDを摂取している60歳以上の成人は、年齢を一致させた成人より4〜5倍高い胃腸出血又は潰瘍の危険性を有する。NSAIDにより誘導されたGI出血の他の危険因子としては、従来の消化性潰瘍疾患及びそれに付随するステロイドの使用が挙げられる。NSAIDの潜在的腎毒性としては、窒素血症、タンパク尿、及び入院を要する腎不全が挙げられる。いくつかのNSAIDに関しては、血液及び認識力の異常も報告されている。従って、年長者の患者、及びNSAIDにより誘導される潰瘍の既往歴を有する患者においては、伝統的な非選択的NSAIDを用いる際には注意が必要であり、通常、プロトンポンプ阻害剤と組合せてより低用量で使用するべきである。年長者においては腎機能をモニターするべきである。さらに、消化性潰瘍疾患の既往歴；3ヶ月を超える予想治療期間；中程度〜高い用量のNSAID；及び併存するコルチコステロイドを有する60歳を超える患者においては、胃腸潰瘍、穿孔及び出血の危険性を低下させるための予防的治療が推奨されている。1日4回、200 mgの用量のミソプロストールは効果的な抗潰瘍予防法であるが、下痢に起因して寛容されないことが多い。オメプラゾール、及び他のプロトンポンプ阻害剤も、非常に有効な抗潰瘍予防用薬剤であるが、費用が制限となりうる。選択的シクロオキシゲナーゼ-2(COX-2)阻害剤の最近の開発はGI管に対して毒性が低い可能性がある疼痛及び炎症の管理のための新しい戦略を提供する。
【０３８６】
上記で考察したように、選択的COX-2阻害剤の開発は疼痛及び炎症の管理において直接的な進歩をもたらした。特異的COX-2阻害剤の安全性プロフィールが非選択的COX阻害剤より優れていることが追加的な長期間の試験において確認された場合、それらは関節炎及び他の疼痛のある炎症症状の管理において伝統的なNSAIDに取って代わるであろう。しかしながら、その選択性の程度がどのようなものであっても、COX阻害剤(NSAID)はOAのこれまでの歴史を変えるものではなく、「疾患改変」剤が依然として決定的に必要とされていることに留意すべきである。
【０３８７】
局所鎮痛剤としては、局所用カプサイシン及びサリチル酸メチルクリームが挙げられる。後期段階の疾患においては時々、患者は疼痛を制御するために麻酔鎮痛剤を必要とするであろう。経口用グルコサミン及び硫酸コンドロイチンはいくつかの二重盲検、偽薬対照試験において軽度〜中程度の鎮痛作用を有することが示された(それぞれ個別に)。
【０３８８】
糖質コルチコイドの関節内注入の慎重な使用は、経口鎮痛剤及び抗炎症剤を許容できないか、又は疼痛をそれらの薬剤によりよく制御できないOA患者にとって好適である。関節周囲での注入はOAに付随し得る滑液嚢炎又は腱炎を効果的に治療できる。4回以上の関節内注入の必要性は、整形外科的介入の必要性を示唆している。
【０３８９】
ヒアルロン酸調製物の関節内注入がいくつかの小規模臨床試験において膝のOAにおける疼痛を軽減することが証明された。これらの注入物を、一連の3又は5週間の注入で投与し(特定の調製物に依存する)、いくらかの患者においては最大6ヶ月間、疼痛を軽減し得る。
【０３９０】
非薬剤的管理
肥満患者における体重減少は、おそらく重量を支える関節に対する生物機械的ストレスを低下させることにより、有意に疼痛を軽減することが示された。運動もOAの管理において安全かつ有益であることが示された。関節の負荷及び流動性が関節の完全性にとって必須であることが示唆されている。さらに、OAにおいて早期に発生する大腿四頭筋の弱体化は関節の損傷に独立に寄与し得る。徴候的膝OAを有する年長者におけるいくつかの試験により、エアロビクス運動又は抵抗運動の3ヶ月後に、肉体的行動、疼痛及び自覚的身体障害が安定して改善されることが示された。他の試験により、抵抗力の強化が足取り、力強さ及び機能全体を改善することが示された。水抵抗運動又は自転車トレーニングなどの低衝撃性運動は、関節に対する過剰な力、又は損傷を引き起こすことなく、末梢筋肉の緊張及び強度並びに心血管系の持久力を増強し得る。養護施設及び高齢者共同住宅の試験は、運動の1つのさらなる重要な利益はいくつかの下落の減少であることを明らかに証明している。
【０３９１】
外科的管理
最大限の薬物療法にもかかわらず機能及び運動性が依然として悪化している患者、並びに関節が構造的に不安定である患者については、外科的介入を考慮すべきである。疼痛が許容できないレベル、すなわち休息中の疼痛及び／又は夜中の疼痛にまで進行した患者についても、手術の候補として考慮すべきである。外科的オプションとしては、関節鏡検査、骨切り術及び関節形成術が挙げられる。
【０３９２】
関節内遊離体の関節鏡による除去及び変性半月板の修復を、膝OAを有するいくらかの患者において指示することができる。脛骨骨切り術は比較的小さい内反角形成(10度未満)及び安定な靭帯支持を有するいくらかの患者にとってのオプションである。総合膝関節形成術は、より重篤な内反、又は任意の外反の変形及び靭帯の不安定性を有する患者に推奨される。関節形成術はまた、脛骨骨切り術後に疼痛の軽減が無効であった患者、及び進行した臀部OAを有する患者に指示される。容易に感知できる筋肉の弱体化、一般化された、もしくは心血管系の減退をまだ起こしていない患者及び手術のストレスに医学的に抵抗する患者は理想的な手術候補である。対照的に、有意な認識力の悪化又は徴候的心肺疾患を有する患者においては、これらの症状が術後のリハビリテーションを妨げ得るため、完全な運動性及び機能は現実的には期待できない。
【０３９３】
関節炎を有する患者における機能的結果を評価するための有効な、信頼できる研究器具として、いくつかの質問表が確立された。これらのものとしては、Lequesne指数、Western Ontario McMaster Arthritisスケール(WOMAC)、日常生活動作(ADL)などが挙げられる。機能に関するいくつかの行動に基づく試験を、迅速かつ容易に診察室で行うことができるが、身体障害及び損傷に関する直接的質問よりも切迫した身体障害を予測するのにより感受性が高い。そのような尺度としては、握力、一定時間の歩行、及び連続して椅子から立ち上がることなどが挙げられる。これらの試験は患者の現在の機能レベルに関する価値ある情報を臨床医に提供することができ、また機能の低下を評価するのに長期間にわたって役立つ。
【０３９４】
骨関節炎は年長者において最も一般的な関節疾患である。早期疾患を検出することができる疾患マーカー、及び疾患の進行を遅延させるか、又は停止させる薬剤が決定的に必要とされている。現在の管理は全身及び局所治療を用いた安全かつ十分な疼痛の軽減を含むべきであり、また、機能減退を制限する医学的及びリハビリテーション的介入を含むべきである。
【０３９５】
疫学的研究はOAに罹りやすい危険因子に関する理解を促進してきたが、この疾患を引き起こす最初の事象はまだ理解されていない。
【０３９６】
軟骨は、その細胞外マトリックスにより与えられる粘弾性及び圧縮性特性を有する独特な組織であり、主にII型コラーゲン及びプロテオグリカンから構成される。正常な条件下で、このマトリックスは、軟骨の体積を維持するように、低レベルの分解酵素と合成酵素の活性が平衡化している力学的なリモデリングプロセスを受ける。しかしながら、OA軟骨においては、マトリックス分解酵素が過剰発現され、この平衡を正味の分解の方にシフトさせ、結果としてマトリックスからのコラーゲン及びプロテオグリカンの喪失をもたらす。おそらくこの喪失に応答して、軟骨細胞が最初に増殖し、増強された量のプロテオグリカン及びコラーゲン分子を合成する。しかしながら、疾患が進行するにつれて、進行性の軟骨分解が修復する試みをしのぐ。線維化、腐食及び割れが最初に軟骨の表面層に現れ、時間経過と共により深い層にまで進行し、最終的には大きな臨床的に観察可能な腐食をもたらす。従って、簡単に言うと、OAは、修復における無駄な試みを行う、軟骨マトリックス分解の進行性のプロセスであると考えることができる。
【０３９７】
重要な問題は、OAが本当に疾患であるのか、又は加齢の自然の結果であるのかということである。加齢した軟骨とOA軟骨とのいくつかの差異が記載されてきたが、前者であることを示唆している。例えば、正常な加齢した軟骨及びOA軟骨の双方において変性したII型コラーゲンが認められるが、それはOAにおいてはより顕著である。さらに、OA軟骨と正常な加齢した軟骨は水含量及び硫酸コンドロイチンと硫酸ケラチンの組成比において異なる。OA軟骨における硫酸コンドロイチンエピトープ(エピトープ846)の発現は、胎児及び新生児の軟骨においてのみ存在するが、OAが異なる病理学的プロセスであるというさらなる証拠を提供する。最終的であるが重要な区別は、分解酵素活性がOAにおいては増加しているが、正常な加齢した軟骨においては増加していないことである。
【０３９８】
軟骨の分解を担う主な酵素はマトリックスメタロプロテイナーゼ(MMP)である。これらの酵素は滑液細胞及び軟骨細胞の両方により分泌され、3つの一般的なカテゴリーに分類される：a) コラゲナーゼ；b) ストロメリジン；及びc) ゼラチナーゼである。正常な条件下で、MMPの合成及び活性化はいくつかのレベルで厳密に調節されている。これらは活性化されるために酵素的切断を必要とする不活性なプロ酵素として分泌される。活性化されると、MMPは血漿由来MMPインヒビター、α-2-マクログロブリンに対して感受性になり、滑液細胞及び軟骨細胞により分泌されるMMPの組織インヒビター(TIMP)にも感受性になる。OAにおいては、MMPの合成が大きく増加し、利用可能なインヒビターは圧倒され、正味の分解をもたらす。興味深いことに、ストロメリジンはそれ自身のプロ酵素、並びにプロコラゲナーゼ及びプロストロメリジンのための活性化因子として働き、かくして軟骨におけるプロMMP活性化の積極的フィードバックを作り得る。
【０３９９】
候補の一つはインターロイキン-1(IL-1)である。IL-1は強力なプロ炎症性サイトカインであり、in vitroにおいて軟骨細胞及び滑液細胞がMMPを合成するように誘導することができる。さらに、IL-1はII型コラーゲン及びプロテオグリカンの合成を抑制し、トランスフォーミング増殖因子-βにより刺激される軟骨細胞の増殖を阻害する。IL-1のRNA及びタンパク質の存在がOA関節において確認されている。かくして、IL-1は、OAにおいて、軟骨分解を活発に促進するだけでなく、修復における試みを抑制し得る。これらの作用に加えて、IL-1は、さらに軟骨の減退に寄与する一酸化窒素の産生、軟骨細胞のアポトーシス、及びプロスタグランジンの合成を誘導する。正常な条件下で、内因性IL-1受容体アンタゴニストはIL-1活性を調節する。相対的に過剰のIL-1及び／又はIL-1受容体アンタゴニストの欠損は、おそらくOAに特徴的である軟骨破壊をもたらす。損傷された軟骨に由来する他のサイトカイン又は粒子状物質もこの炎症性の分解プロセスに寄与するようである。
【０４００】
軟骨及び滑膜においては局所的に増殖因子が産生され、コラーゲン及びプロテオグリカンのde novo合成を刺激することにより、局所での軟骨のリモデリングに寄与するようである。トランスフォーミング増殖因子β(TGFβ)は最もよく特性評価されており、最も強力な軟骨細胞の増殖因子である。TGFβはde novoでのマトリックス合成を刺激するだけではなく、IL-1受容体発現をダウンレギュレートし、IL-1受容体アンタゴニストの放出及びTIMP発現を増加させることにより、軟骨の分解を相殺する。OA軟骨にはインスリン様増殖因子(IGF-1)及び塩基性線維芽細胞増殖因子(b-FGF)も存在し、修復の試みに寄与するようであるが、記載されたように、分解は究極的にはOA軟骨における修復を上回る。
【０４０１】
疾患を改変する戦略の一つは、OAにおいて発生する軟骨の進行的分解を抑制することである。これを達成するために、MMPインヒビターとMMP酵素との比率を前者の方にシフトさせなければならない。組換え遺伝子治療、又は外因性TIMPの投与によってTIMPの関節レベルを増強することにより、これを達成することができた。OA様疾患を有する動物に外因性TIMPを投与する試験は不確定な結果を示したが、それはおそらく軟骨マトリックス中へのこの比較的高分子量のタンパク質の浸透が無効であることに起因するものである。より迅速に進行した代替的手法はMMPの経口阻害剤を開発することである。実際、MMPのいくつかの合成小分子量阻害剤は関節炎の動物モデルにおいて有効であることが証明されており、ヒトにおいて第III相臨床試験に入っている。抗生物質テトラサイクリン、並びにその半合成誘導体ドキシサイクリン及びミノサイクリンは適度なMMP阻害特性を有し、OA及びRAの両方の治療におけるこれらの薬剤の精査を促してきた。最後に、可溶性IL-1受容体又は受容体アンタゴニストの投与を介するIL-1の阻害は、MMP合成を抑制するための別の合理的戦略であり、RAにおける予備試験も前途有望である。
【０４０２】
損傷された軟骨の増強はOAの治療及び／又は予防のための別の合理的戦略である。軟骨細胞の増殖及び／又はマトリックス合成を刺激するためのIGF及びbFGFなどの外因性増殖因子の投与はOAの動物モデルにおいて有益な効果を有し、TGF-βはMMP合成を抑制するさらなる利点を有する。同じ効果は1種以上のこれらの増殖因子部位を過剰発現するように遺伝子操作された健康な自己由来の軟骨細胞を移植することによって理論的には達成することができる。しかしながら、OAにおける軟骨喪失の領域は非常に広範囲であり、古い軟骨細胞は若い軟骨細胞よりも代謝的に活性が低いため、自己由来又は異種由来の移植がOAの管理にとって実用的であるかどうかは明確ではない。
【０４０３】
まとめると、MMP及びプロ炎症性サイトカイン(例えば、IL-1)はOAにおける軟骨破壊の重要なメディエーターであるようである。MMP及びサイトカインの増殖因子及びインヒビターの合成及び分泌はこれらの分解力を相殺するのには明らかに不十分である。進行的軟骨分解及びOAが生じる。MMP活性の低下及びマトリックス合成の刺激に焦点を当てた新しい治療法が開発中である。
【０４０４】
NMR分光測定
上記で考察したように、本発明の多くの態様はNMRスペクトルを使用する方法、又はNMRスペクトルから得られた、もしくはそれから誘導されたデータに関する。
【０４０５】
生物医学的NMR分光測定において試験される主な核はプロトン又は1H核である。これは全ての天然の核のうちで最も感度が高い。その化学シフト範囲は有機分子については約10 ppmである。さらに、自然に豊富な1.1％の13C核を用いるか、又は同位体濃縮を用いる13C NMR分光測定は代謝物の同定に有用である。13Cの化学シフト範囲は約200 ppmである。他の核も特殊な用途がある。これらのものとしては、薬物代謝の試験には15N(天然の量、もしくは濃縮された状態)、19F、及びin vitroもしくはin vivoでの内因性リン酸生化学に関する試験には31Pが挙げられる。
【０４０６】
NMRスペクトルを取得するためには、「パルスプログラム」を定義することが必要である。簡単に言うと、これは無線周波(RF)パルスを印加した後、自由誘導減衰(FID)-アナログ-デジタル変換器(ADC)中でデジタル化される時間依存的に振動し、減衰する電圧を獲得することである。平衡状態では、核スピンはいくつかの量子状態で存在し、RFパルスはこの平衡状態を乱す。FIDはスピンが平衡状態に向かって戻る結果である。最適な応答を得るためにはパルス長(通常、数マイクロ秒)を選択する必要がある。
【０４０７】
このパラメーター、及び他の実験パラメーターを、分光技師の部分の知識及び経験に基づいて選択する。例えば、T.D.W. Claridge, High-Resolution NMR Techniques in Organic Chemistry: A Practical Guide to Modern NMR for Chemists. Oxford University Press, 2000を参照されたい。これらは、頻繁に用いられる観察、試験下にある核の公知の特性に基づく(すなわち、予想される化学シフト範囲はスペクトル幅を決定し、所望のピーク解像度はデータポイント数を決定し、休止時間は走査間の再循環時間を決定する、など)。加えられる走査数は分析物の濃度、試験下にある核の固有の感度及びその存在量(天然の量又は同位体濃縮により富化された量)により決定される。
【０４０８】
データの獲得後、いくつかの可能な操作を行うことができる。シグナル-ノイズ比を改良するか、又はピークライン幅を減少させるために、数学的関数によりFIDを増大させることができる。専門的操作員がそのようなパラメーターを選択する。次いで、ゼロの数によりFIDを満たした後、フーリエ変換にかけることが多い。時間依存的データから周波数依存的データへのこの変換の後、全ピークが直立に出現するようにスペクトルを位相化する必要がある-これをスクリーン上での可視的観察により2つのパラメーターを用いて行う(現在では、合理的な成功により自動ルーチンが利用可能である)。この時点でスペクトルベースラインが曲線化することがある。これを矯正するために、ピークが出現しないスペクトル中のポイントを定義し、これらをベースラインであるとする。通常、多項式関数をこれらのポイントに適合させるが、他の方法も利用可能であり、この関数をスペクトルから引き算して平坦なベースラインを提供する。これを自動的な様式で行うこともできる。他の操作も可能である。解像度を改良するため、又はFIDがノイズ中で減衰する前に走査のデータ獲得を停止する場合に起こるいわゆる切り捨て人為現象 (truncation artifacts) を除去するために、「線形予測」によりFIDを前方又は後方に拡張することができる。これらの判断は全て2-及び3-次元NMR分光法にも適用可能である。
【０４０９】
NMRスペクトルは、等間隔のx値(周波数)の関数としてのy値(シグナル強度に関する)を有する一連のデジタルデータポイントからなる。これらのデータポイント値は、スペクトル全体に渡って走る。スペクトル中の個々のピークを、分光技師により同定するか、又はソフトウェアにより自動的に同定し、各ピーク下の面積を積分(ピークに渡る全ポイントのy値の和)又は曲線適合により決定する。ピークは、単一の共鳴点であってもよいし、特定の化学環境(例えば、安息香酸中のカルボキシル基に対してオルト位にある2個のプロトン)における単一のタイプの核に対応する複数の共鳴点であってもよい。また、2次元NMRスペクトル中での3次元ピーク体積の積分も可能である。NMRスペクトル中のピーク強度は、そのピークを生じる核数に比例する(各々連続して蓄積した自由誘導減衰(FID)を平衡において取り始める条件下で実験を行う場合)。また、同一サンプル中の異なる分析物に由来するピークの相対強度はその分析物の濃度に比例する(平衡が各走査の開始時点で優勢である場合)。
【０４１０】
かくして、本明細書で用いる用語「NMRスペクトル強度」は、NMRピーク面積に関連するいくつかの測定値に関し、それは絶対値でも相対値であってもよい。NMRスペクトル強度は、例えば、複数のNMRスペクトル強度の組合せ、例えば、複数のNMRスペクトル強度の一次結合であってもよい。
【０４１１】
NMRスペクトル強度の文脈において、用語「NMR」は任意の型のNMR分光法を指す。
【０４１２】
NMR分光測定技術を、周波数の軸数に従って分類することができるが、これらのものとしては1D、2D及び3D-NMRが挙げられる。1Dスペクトルとしては、例えば、単一パルス；飽和又は非励起によって排除された水のピーク；CPMG(すなわち、スピン-スピン緩和に基づいて編集される)などのスピンエコー；拡散により編集された、特定のスペクトル領域の選択的励起が挙げられる。2Dスペクトルとしては、例えば、J解像(JRES)；NOESY、COSY、TOCSY及びその変法などの1H-1H相関法；HETCORなどの直接検出法を含む異種核相関法、並びに1H-13C HMQC、HSQC、HMBCなどの逆検出法が挙げられる。3Dスペクトルとしては、全てHMQC-TOCSY、NOESY-TOCSYなどの2D法の組合せである多くの変法が挙げられる。これらのNMR分光測定技術の全てをマジック角スピニング(MAS)と組合せて、異方性組成物を特徴とする組織などの等方性液体以外のサンプルを試験することもできる。
【０４１３】
好ましい核としては1H及び13Cが挙げられる。本発明における使用にとって好ましい技術としては、CPMGなどの水のピークを排除したスピンエコー、拡散を編集したJRES、COSY、TOCSY、HMQC、HSQC及びHMBCが挙げられる。
【０４１４】
利用可能性(非常に高い磁場機械は普及していない)、費用(600 MHzの器具は約500,000ポンドかかるが、シールド付きの800 MHzの器具は3,500,000ポンド）、及び購入する付属装備の性質に依存して、実用可能な最も高い磁場強度でNMR分析(特に、生物流体)を行う。維持／操作にかかる費用は大きく変わらず、機械の資本費及び人件費と比較して小さい。
【０４１５】
典型的には、1H観測周波数は約200〜約900 MHz、より典型的には約400〜約900 MHz、さらに典型的には約500〜約750 MHzである。500及び600 MHzの1H観測周波数が特に好ましい。以下の1H観測周波数を有する器具が市販されている／されていた：200、250、270(中止)、300、360(中止)、400、500、600、700、750、800、及び900 MHz。
【０４１６】
より良いシグナル-ノイズ比及び共鳴のより大きいスペクトル分散を取得するには、より高い周波数を用いる。これにより、ピークを生じる分子を同定するより良い機会が得られる。より良い分散に加えて、詳細なスペクトルピークは検査による分析が不可能である「第2オーダー」から、それが可能である「第1オーダー」に向かって動き得るので、その利益は直線的ではない。多重線内のピーク位置及び強度は共に、この進行が起こるにつれて非直線的な様式で変化する。費用に問題がある場合にはより低い観測周波数を用いてもよいが、これはバイオマーカーの分類及び同定に関して有効性の低下をもたらすようである。
【０４１７】
NMR分光測定：サンプルの調製
NMRスペクトルを、120 K〜420 Kの温度範囲に渡って、及び特殊化された装置を用いればこの範囲外でも、固体、液体、液体結晶又は気体状態で測定することができる。典型的には、生物流体のNMR分析を、約274 K〜約328 Kのサンプル温度にて液体状態で行うが、より典型的には約283 K〜約321 Kで行う。
【０４１８】
生物流体がいかなる分解も受けないことを確実にするか、又はデータ獲得の間の化学反応もしくは酵素反応の作用を遅延させるために、より低い温度を用いることができる。特定の種の検出を改良するために、より高い温度を用いることができる。例えば、血漿又は血清については、リポタンパク質はその温度が上昇するにつれて一連の位相変化を受ける；特に、低密度リポタンパク質(LDL)のピーク強度はむしろ温度依存的であり、リポタンパク質がより「液体」になるにつれて、線は鋭くなり、より広い、より検出困難な成分は可視的になる。
【０４１９】
典型的には、生物流体サンプルを溶媒で希釈した後、NMR分析を行う。これは溶液の粘度を低下させるため、溶液のpHを制御するため、並びに試薬及び参照物質を添加させるため、などの様々な理由から行う。
【０４２０】
典型的な希釈溶媒の例は、D2O中の0.9重量％の塩化ナトリウム溶液である。D2OはH2O濃度を全体的に低下させ、代謝物のNMRシグナルの最適な検出に必要な、溶媒水NMR共鳴の抑制における技術的要求を容易にする。D2Oの重水素核はまた、連続的走査の正確な共整合を可能にする磁場を探すためのNMRシグナルをも提供する。
【０４２１】
生物流体の入手可能な量に依存して、典型的には希釈比は体積比で約1:50〜約5:1であるが、より典型的には約1:20〜約1:1である。典型的な希釈比の例は、従来の5 mm NMRチューブ及び流体圧入NMR分光測定にとって典型的な、体積比で3:7(例えば、150μLのサンプル、350μLの溶媒)である。
【０４２２】
NMR分析のための典型的なサンプル体積は約50μL(例えば、マイクロプローブについて)〜約2 mLである。典型的なサンプル体積の例は約500μLである。
【０４２３】
NMRピーク位置(化学シフト)を、通常、サンプルに対して直接添加する公知の標準化合物のそれと比較して測定する。尿などの生物流体については、これは一般的には部分的に重水素化された形態のTSP、すなわち、3-トリメチルシリル-[2,2,3,3-2H4]-プロピオン酸ナトリウム塩である。高レベルのタンパク質を含む生物流体については、この物質はタンパク質に結合し、広くなったNMR線を示すため、好適ではない。血液の血漿などの場合には、付加ギ酸陰イオン(例えば、塩として)を用いることができる。
【０４２４】
NMR分光測定：NMRスペクトルの操作
典型的には、NMRスペクトルを獲得し、続いてデジタル化された形態でこれを扱う。(デジタル)スペクトルのスペクトル予備処理の従来方法は公知であり、適用可能である場合、シグナル平均化、フーリエ変換(及び他の変換法)、位相補正、ベースライン補正、平滑化などが挙げられる(例えば、Lindonら、1980を参照)。
【０４２５】
現在の分光測定法により、高いか、又は非常に高い解像度のスペクトルの収集が可能になることが多い。デジタル形態では、単純なスペクトル(例えば、シグナル対分光パラメーター)でさえ、数万ではないにしても、数千ものデータポイントを有し得る。両方の実用的なコンピュータ法にとって、より少ないデータポイントを取得するために、またpH変動、区分化などの物理的作用を補正するためのある程度のシグナル平均化を行うために、データを減少させるか、又は圧縮することが望ましいことが多い。得られたデータを「スペクトルデータ」と呼ぶことができる。
【０４２６】
例えば、典型的な1H NMRスペクトルは、約δ 0〜δ 10の範囲である化学シフト(δ)に対するシグナル強度として記録される。約δ 10-4〜10-3ppmの典型的な化学シフト解像度では、デジタル形態のスペクトルは約10,000〜100,000個のデータポイントを含む。上記で考察したように、例えば、約10〜100個、約10〜1000個のデータポイントの因子により、このデータを圧縮することが望ましい場合が多い。
【０４２７】
例えば、ある手法では、化学シフト軸、δを特定の長さの「バケット」又は「ビン」に「区分化」する。δ 0〜δ 10の範囲に及ぶ1-D1H NMRスペクトルについては、バケット長を用いて、通常、中間点、例えば、δ 9.98、δ 9.94、δ 9.90などにより報告される、例えば、δ 10.0〜9.96、δ 9.96〜9.92、δ 9.92〜9.88などの0.04のΔδにより250バケットが得られる。所与のバケット内のシグナル強度を平均化又は積分し、得られた値を報告することができる。この方法で、例えば、100,000個の元のデータポイントを有するスペクトルを、例えば、250個のデータポイントを有する等価なスペクトルにまで圧縮することができる。
【０４２８】
同様の手法を2-Dスペクトル、3-Dスペクトルなどに適用することができる。2-Dスペクトルについては、「バケット」手法を「パッチ」に拡張することができる。3-Dスペクトルについては、「バケット」手法を「体積」に拡張することができる。例えば、両方の軸上でδ 0〜δ 10の範囲に及ぶ2-D1H NMRスペクトルは、Δδ0.1 x Δδ0.1のパッチを用いると、10,000パッチを生じる。この方法で、おそらく108個の元のデータポイントを有するスペクトルを、104個のデータポイントの等価なスペクトルにまで圧縮することができる。
【０４２９】
本明細書において、等価なスペクトルを、「スペクトルのデータセット」、「スペクトルデータを含むデータセット」と称することがある。
【０４３０】
そのようなNMRスペクトルの処理のためのソフトウェア、例えば、AMIX(Analysis of MIXture, V 2.5, Bruker Analytik, Rheinstetten, Germany)が市販されている。
【０４３１】
特定のスペクトル領域は、現実の診断情報を担持していないか、又は矛盾する生化学的情報を担持していることが多く、詳細な分析を行う前にこれらの「余分な」領域を除去するのが有用であることが多い。最も単純な手法では、データポイントを削除する。別の単純な手法では、余分な領域中のデータをゼロ値で置換する。
【０４３２】
例えば、他の分子と比較して水に関するダイナミックレンジ問題により、水の共鳴(δ 4.7周辺)を抑制する。しかしながら、水の抑制 (water suppression) における小さな変動が残っており、これらの変動は分析を望ましくなく複雑化し得る。同様に、水の抑制における変動は交差飽和により、尿素シグナル(δ 6.0周辺)にも影響し得る。従って、特定のスペクトル領域、例えば、約δ 4.5〜6.0(例えば、δ 4.52〜6.00)を削除するのが有用であることが多い。
【０４３３】
一般的には、NMRデータを、データ行列として取り扱う。典型的には、行列中の各列は個々のサンプル(「データベクトル」と呼ぶことが多い)に対応し、カラム中の入力は、例えば、特定のδ又はΔδ(「記述子」と呼ぶことが多い)での特定のデータポイントのスペクトル強度である。
【０４３４】
例えば、欠測値のアドレス指定、翻訳、基準化、重み付けにより、データを予備処理するのが有用であることが多い。
【０４３５】
主成分分析(PCA)及び部分最小二乗分析(PLS)などの多変量投影法は、いわゆる基準化高感度法である。試験したデータの型に関する従来の知識及び経験を用いることにより、多変量モデリングの前にデータの質を、基準化及び／又は重み付けにより増強することができる。十分な基準化及び／又は重み付けはデータ内の隠された重要で興味深い変動を表すことができ、従って、それに続く多変量モデリングをより効率的にする。基準化及び重み付けを用いて、試験系の知識及び経験に基づいて、データを正確な距離に置き、従って、データ中に既に固有に存在するパターンを表すことができる。
【０４３６】
全く可能である場合、欠測値、例えば、カラム値中のギャップを回避するべきである。しかしながら、必要に応じて、そのような欠測値を、例えば、カラムの平均値(「平均充填」)；ランダム値(「ランダム充填」)；又は主成分分析に基づく値(「主成分充填」)と置換するか、又は「充填」することができる。これらの異なる手法の各々はその後のPR分析に対して異なる効果を有するであろう。
【０４３７】
記述子候補軸の「翻訳 (translation)」は有用であり得る。そのような翻訳の例としては、正規化及び平均中心化が挙げられる。
【０４３８】
「正規化」を用いて、サンプル間の変動を除去することができる。多くの正規化手法が可能であり、それらを分析中のいくつかのポイントのいずれかで適用することができることが多い。通常、余分なスペクトル領域を除去した後、正規化を適用する。ある手法では、1/A(Aはそのスペクトルに関する全記述子の絶対値の和である)の因子により、各スペクトルを正規化(基準化)する。この方法では、各データベクトルは同じ長さ、具体的には1を有する。例えば、特定のスペクトルにおける各バケットの強度の絶対値の和が1067である場合、この特定のスペクトルに関する各バケットの強度を1/1067により基準化する。
【０４３９】
「平均中心化」を用いて、解釈を単純化することができる。通常、各記述子について、全サンプルに関するその記述子の平均値を差し引く。この方法では、記述子の平均は起点と一致し、全記述子をゼロで「中心化」する。例えば、全スペクトルについて、δ 10.0〜9.96での平均強度が1.2ユニットである場合、全スペクトルについてのδ 10.0〜9.96での強度を1.2ユニットで換算する。
【０４４０】
「ユニット分散基準化」において、データを等しい分散に基準化することができる。通常、各記述子の値を、1/StDev(StDevは全サンプルのその記述子に関する標準偏差である)により基準化する。例えば、全スペクトルについて、δ 10.0〜9.96での標準偏差が2.5ユニットである場合、全スペクトルに関するδ 10.0〜9.96での強度を、1/2.5又は0.4により基準化する。ユニット分散基準化を用いて、「ノイズ」データの影響を減少させることができる。例えば、生物流体中のいくつかの代謝物は、いかなる病理生理学的プロセスにも関連しない、強い程度の生理学的変動(例えば、日周性の変動、食事に関連する変動)を示す。ユニット分散基準化を用いない場合、これらのノイズを含む代謝物はそれに続く分析を支配し得る。
【０４４１】
「パレート基準化」は、ある意味では、平均中心化とユニット分散基準化との中間である。実際には、スペクトル中のより弱いピークは、平均中心化された事例についてよりも高い程度にまでこのモデルに影響し得る。また、一般的には、負荷はユニット分散に基づくモデルについてよりも解釈可能である。パレート基準化においては、各記述子の値を1/sqrt(StDev)(StDevは全サンプルについてのその記述子の標準偏差である)により基準化する。この方法では、各記述子はその最初の標準偏差に数値的に等しい分散を有する。パレート基準化を、例えば、生データ又は平均中心化されたデータについて行うことができる。
【０４４２】
「対数基準化」を用いて、データが明確な歪みを有する場合、及び／又はデータが大きい範囲、例えば、数桁に及ぶ場合、解釈を補助することができる。通常、各記述子について、値をその値の対数により置換する。例えば、δ 10.0〜9.96での強度を、全スペクトルについて、δ 10.0〜9.96での強度の対数に置換する。
【０４４３】
「等範囲基準化」においては、各記述子を、全サンプルについてその記述子の範囲で除算する。この方法では、全記述子は同じ範囲、すなわち1を有する。例えば、全スペクトルについて、δ 10.0〜9.96で、最も大きい値が87ユニットであり、最も小さい値が1である場合、その範囲は86ユニットであり、全スペクトルについて、δ 10.0〜9.96での強度を86ユニットで除算する。しかしながら、この方法は外れ点の存在に対して高感度である。
【０４４４】
「自動基準化」においては、各データベクトルを平均中心化し、ユニット分散を基準化する。この技術は、各記述子を等しく重み付けし、NMR記述子の場合、大きいピーク及び小さいピークを等しい力点で処理するので、非常に有用である。これは非常に低レベルであるが、検出可能なレベルで存在する代謝物にとっては重要であり得る。
【０４４５】
データを基準化するいくつかの管理方法も公知である。これらのうちのいくつかは、分類間を識別するためのパラメーター(例えば、記述子)の能力の尺度を提供し、これを用いて分離を引き伸ばすことにより分類法を改良することができる。
【０４４６】
例えば、「分散重み付け」においては、単一のパラメーター(例えば、記述子)の分散重みを分類間分散と分類内分散の和の比として算出する。大きい値は、この変数が分類間を識別していることを意味する。例えば、サンプルが2つの分類に分類されることが知られている場合(例えば、トレーニングセット)、各記述子の平均及び分散を試験することができる。記述子が非常に異なる平均値及び小さい分散を有する場合、それは分類の分離において良好である。
【０４４７】
「特徴重み付け」は、各記述子の平均及び標準偏差を算出する場合だけでなく、フィッシャーの重みなどの他の公知の重み付け因子を用いる場合にも、より一般的な分散重み付けの記述方法である。
【０４４８】
多変量統計解析
上記で考察したように、パターン認識方法などの多変量統計解析方法は、NMRスペクトルなどの複雑なデータを分析するための最も便利で効率的な方法であることが多い。
【０４４９】
例えば、そのような分析法を用いて、例えば、試験下にある特定の状態に関する、診断スペクトルウィンドウ及び／又は診断種を同定することができる。
【０４５０】
また、そのような分析法を用いて、予測モデルを形成した後、そのモデルを用いて試験データを分類することができる。例えば、ある便利で特に効率的な分類方法は、第1に既知の分類のサンプル(例えば、特定の症状を有するか、又は有しないことが知られた被験者からのサンプル)から得たデータ(「モデリングデータ」)を用いてモデル(「予測数学モデル」を形成するため、及び第2にその症状を有するか、又は有しないものとして未知のサンプル(例えば、「試験データ」)を分類するために、多変量統計解析モデリングを用いる。
【０４５１】
パターン認識法の例としては、限定されるものではないが、主成分分析(PCA)及び部分的最小二乗法判別式解析(PLS-DA)が挙げられる。
【０４５２】
PCAは多変量データ内の「クラスター」を総覧するのに用いる双線形分解法である。このデータをK次元空間(Kは変数の数に等しい)で表し、分類メンバーシップの任意の知識(すなわち、「未管理」)とは独立な、データ内の最大変動を記述するいくつかの主成分(又は潜在変数)に減少させる。主成分を、クラスター化、傾向、又は外れ値を強調する「スコア」(t)のセット、及びtに対する入力変数の影響を強調する「負荷」(p)のセットとして表す。例えば、Kowalskiら、1986を参照されたい。
【０４５３】
PCA分解を以下の式：
X = TP' + E
(式中、TはXにおける観測値間の系統的変動を説明するスコアのセットであり、Pは変数変動間を説明する負荷のセットであり、スコア空間中のクラスター、傾向、及び外れ値に対する説明を提供する)
により記述することができる。このモデルにより説明されない変動の非系統的部分は残差Eを形成する。
【０４５４】
PLS-DAは、サンプルの既知の分類間の最大分離を記述する潜在変数を得る管理された多変量法である。PLS-DAは、先に説明したPCA法の回帰拡張であるPLSに基づく。PCAが試験サンプル間の最大変動を説明するのに働く場合、PLS-DAはデータ(X)中のサンプルの既知の分類間の最大分離を説明するのに十分である。これを、分類分離情報を担持する「ダミーベクトル又は行列」(Y)に対するPLS回帰により行う。それにより、この情報がデータ中に存在する場合、算出されたPLS成分をX中の分類を分離する変動を記述するのにより焦点を当てることができる。解釈の観点から、PLSの全特徴を用いることができるが、これは変動をスコア(t,u)、負荷(p,c)、PLS重み(w)及び回帰係数(b)に関して解釈することができることを意味する。回帰を既知の分類分離に対して実行するという事実は、PLS-DAが管理方法であり、実際のモデリングの前に分類メンバーシップを知る必要があることを意味する。モデルを算出し、有効であると認めれば、それを「新しい未知のサンプル」に関する分類メンバーシップの予測に用いることができる。分類メンバーシップの判断を、決定に関する統計的有意差限界を用いて、予測分類メンバーシップ(Ypred)、予測スコア(tpred)及び予測残差(DmodXpred)に基づいて行う。例えば、Sjostromら、1986；Stahleら、1987を参照されたい。
【０４５５】
PLSにおいては、X中の対象間の変動を、Xスコア、Tにより記述し、Yブロックで回帰したアゲンスト中の変動をYスコア、Uで記述する。PLS-DAにおいて、Yブロックは各観測値の分類メンバーシップを記述する「ダミーベクトル又は行列」である。基本的には、PLSが行うことは、TとUとの間の共分散を最大化することである。各成分については、Y中の変動の説明に対する各X変数の影響を含む、PLS重みベクトル、wを算出する。同時に、この重みベクトルは、各算出された成分に関するスコアTとUとの間の共分散を最大化するX中の変動を含む、行列、Wを形成する。PLS-DAについては、これは重み、WがYにおいて記述された分類分離と相関するX中の変動を含むことを意味する。重みのYブロック行列をCと呼ぶ。X負荷の行列、Pも算出する。これらの負荷はXの適切な分解を実行するのに用いる解釈とは別である。
【０４５６】
従って、X及びYのPLS分解を下記式：
X = TP' + E
Y = TC' + F
のように記述する。
【０４５７】
次いで、PLS回帰係数、Bを下記式：
B = W(P'W)-1C'
により与える。
【０４５８】
次いで、Yの推定値、Yhatを、下記式：
Yhat= XW(P'W)-1C' = XB
に従って算出する。
【０４５９】
本明細書に例示されるパターン認識アルゴリズムは共に(PCA、PLS-DA)、入力変数間の直線関係の抽出に頼るものである。そのような直線関係が不十分である場合、神経網に基づくパターン認識技術が多くの相関した入力変数に基づいて個体を分類する能力を改善する場合がある(例えば、Ala-Korpelaら、1995；Hiltunenら、1995を参照)。にもかかわらず、本明細書で適用される方法は、試験する個体の分類を可能にするのに十分に強力であり、それらは入力データセットの態様が行おうとする分類を可能にする際に特に重要であることに関していくらかの情報を獲得することを可能にする神経網法を超えるさらなる利益を提供する。
【０４６０】
代表的ではない、スペクトル中の偽性又は不規則なデータ(「外れ値」)を同定し、除去するのが好ましい。不規則なデータ(「外れ値」)の一般的な理由としては、位相補正の不足、ベースライン補正の不足、化学シフト参照の不足、水抑制の不足などのスペクトルに関する人為現象、並びに細菌の夾雑、生物流体のpHの変化、毒素もしくは疾患により誘導される生化学的応答、及び他の症状、例えば、代謝的結果を有する病理学的症状、例えば、糖尿病などの生物学的作用が挙げられる。
【０４６１】
外れ値を、用いる分析方法に応じて異なる方法で同定する。例えば、主成分分析(PCA)を用いる場合、複数群の残りから遠くにある少数のサンプルを外れ値として眼により同定することができる。PCAの同定のより客観的な手段は、一変量統計において用いられる公知のスチューデントのT検定の多変量バージョンであるホテリングのT検定を用いることである。任意の所与のサンプルについて、T2値を算出し、これをサンプルの選択した画分(例えば、95％)が通常存在する標準値と比較する。次いで、実質的にこの限界の外側にあるT2値を有するサンプルを外れ値として標識することができる。
【０４６２】
また、SIMCA又はPNNなどのより洗練された管理方法を用いる場合、同様の方法を用いる。信頼レベル(例えば、95％)を選択し、この限界を超える信頼値に対応する多変量空間の領域を決定する。この領域をいくつかの異なる方法(例えば、PCAスコアプロット上で決定的なT2楕円をプロットすることにより)で図式的に表示することができる。高い信頼領域の外側にある任意のサンプルを潜在的外れ値として標識する。
【０４６３】
Xにおけるモデルに対する距離(DModX)として表した残りの方向において、外れ値の検出のための信頼限界も算出する。
【０４６４】
簡単に述べると、DModXは主成分に対する(又は2種以上の主成分により作られた平面もしくは超平面に対する)対象の垂直距離である。SIMCAソフトウェアにおいては、DModXを、式：
DModX = v*sqrt(e2/K-A)
(式中、eは単一の観測値についての残差であり；
Kはデータセット中の元の変数の数であり；
Aはモデル中の主成分数であり；
vは観測値数(N)及び主成分数(A)に基づく補正因子であり、かつ1よりわずかに大きい)
として算出する。
【０４６５】
この方向における外れ値はスコア方向において生じるものほど厳しくはないが、それらをモデリングに含めるかどうかについて決定を下す前に、常に注意深く試験しなければならない。一般的には、全ての外れ値を、例えば、寄与する負荷及びモデルに対する距離(DModX)を試験し、並びに特徴を逸脱させるために元のNMRスペクトルを視覚的に検査した後、それらをモデルから除去することにより、完全に精査する。自動化アルゴリズムによる外れ値の検出はスコアの特徴及び上記のモデルに対する残差距離(DModX)を用いる可能性である。
【０４６６】
PLS法を用いる場合、Y中でのモデルに対する距離(DModY)も同じ方法で算出することができる。
【０４６７】
データのフィルタリング
パターン認識法を「フィルターされていない」データに対して適用することができるが、まずデータを除去された無関係の変動に対してフィルターするのが望ましいことが多い。
【０４６８】
ある方法では、興味のない潜在変数を「フィルタリング」により除去することができる。
【０４６９】
フィルタリング法の例としては、予め定義された分類と低い相関を有する変数を排除するためのサンプル分類に基づく指標に対する記述子変数の回帰が挙げられる。関連する方法としては、標的回転(例えば、Kvalheimら、1989を参照)及びPCTフィルタリング(例えば、Sun、1997を参照)が挙げられる。これらの方法では、除去された変動はサンプル分類と完全に非相関的(すなわち、直交)である必要はない。
【０４７０】
別の方法では、いくつかの変動又は目的の分類指標に対して直交する潜在変数を「直交フィルタリング」により除去する。ここでは、目的の変動を分離する分類に相関していない(すなわち、直交する)データ中の変動を除去することができる。一般的には、そのような方法は、非直交フィルタリング法よりも有効である。
【０４７１】
種々の直交フィルタリング法が記載されている(例えば、Woldら、1998a；Fearn、2000；Anderson、1999；Westerhuisら、2001；Wiseら、2001を参照)。
【０４７２】
好ましい直交フィルタリング法の1つを、直交シグナル補正(OSC)と呼ぶのが都合がよく、ここでは目的の変動に直交する潜在変数を除去する。例えば、Woldら、1998aを参照されたい。
【０４７３】
サンプル分類間の変動を記述するために、分類同一性を応答ベクトル、Yとして用いる。次いで、OSC法はYベクトルと相関しないサンプル間の変動を記述する最長のベクトルに位置させ、それをデータ行列から除去する。相関しない直交変動ではなく、サンプル集団内の目的の特徴に相関する変動に焦点を当てたパターン認識を可能にするために、得られたデータセットをフィルタリングした。
【０４７４】
OSCは、補正された応答に対して直交する成分、潜在変数を除去することにより、スペクトル中の望ましくない系統的変動の問題を解決するスペクトルフィルタリングのための方法である。PLSにおいては、XとYの間の共分散を最大化するために、重み、wを算出する。OSCにおいては、対照的に、XとYの間の共分散を最小化するために、重み、wを算出するが、これはYとの直交にできるだけ近い成分を算出することと同じである。次いで、望ましくない系統的変動を含む、これらの成分、Yとの直交を、スペクトルデータ、Xから減算して、目的の変動を記述するフィルタリングされた予測因子行列を作成する。簡単に述べると、OSCを、スコアのセット、T**、及び応答に直交する変動、Yを含む、対応する負荷のセット、P**中でのスペクトル行列、Xの双線形分解として記述することができる。説明されない部分又は残差、Eは、あまり望ましくない変動を含む、フィルタリングされたX行列、XOSCに等しい。この分解を、以下の式：
X = T**P**' + E
XOSC= E
により記述する。
【０４７５】
OSC手順は、データ中の変動、Xを記述する第1の潜在変数又は主成分の算出から始まる。この計算をNIPALSアルゴリズムに従って行う。
【０４７６】
X = tp' + E
次いで、X中のサンプル変動間の合計である第1のスコアベクトル、tを応答(Y)に対して直交化し、直交化されたスコアベクトル、t*：
t*= (I-Y(Y'Y)-1Y')t
を得る。
【０４７７】
直交化の後、PLS重み、wを、Xw = t*にする目的で算出する。これを行うことにより、重み、wを、XとYの間の共分散を最小化するために設定する。重み、wは、下記式：
w = x - t*
により与えられる。
【０４７８】
直交スコアt**の評価を、下記式：
t**= Xw
から算出する。
【０４７９】
次いで、評価又はアップデートされたスコアベクトルt**を、再びYと直交化させ、t**が収束するまで繰り返す。これにより、t**が応答Yに直交する最長のベクトルに向かって収束することが確実になり、X中での変動を良好に記述させるであろう。次いで、データ、Xを、（Yと直交するスコア、t**）×（対応する負荷ベクトルp**）＋（説明されない部分、残差E）：
X = t**p**' + E
として記述することができる。
【０４８０】
残差Eは、応答Yに直交する第1成分の減算後にフィルタリングされたX、XOSCに等しい。
【０４８１】
E = X - t**p**'
XOSC= E
2つ以上の成分を除去する必要がある場合、開始データ行列、Xとして、残差Eを用いて同じ手順を繰り返す。
【０４８２】
モデル計算中に存在しない新しい外部データを、モデリングデータのフィルタリングに従って処理する必要がある。これを、新しいデータ、Xnewについて、スコアベクトル、tnewを算出するためのフィルタリングに由来する算出された重み、wを用いて行う。
【０４８３】
tnew= XnewW
新しい外部データ、Xnewから、補正、p**に由来する負荷ベクトルをtnew倍したものを減算することにより、残差、Enewは、新しい外部データについて得られるOSCフィルタリングされた行列となる。
【０４８４】
Enew= Xnew- tnewP**'
PCAが試験下の分類間の分離を示唆する場合、直交シグナル補正(OSC)を用いて分離を最適化し、かくしてそれに続く多変量パターン認識分析の性能を改善し、モデルの予測力を増強することができる。本明細書に記載される実施例においては、PCA及びPLS-DA分析の双方がOSCの予備的適用により改善された。
【０４８５】
典型的なOSCプロセスの例は、以下の工程を含む。
【０４８６】
(a)1H NMRデータを、AMIXを用いて区分化し、正規化し、必要に応じて基準化及び／又は平均中心化する。スペクトルデータの直交フィルタリングに関するデフォルトは、平均中心化されたデータのみを用いることであり、これは各変数の平均(スペクトルのバケット)をデータ行列中の各単一の変数から減算することを意味する。
【０４８７】
(b) 分類分離変動を記述する応答ベクトル(y)を、各サンプルに対して分類メンバーシップを評価することにより作成する。
【０４８８】
(c) 応答ベクトル(y)に直交する1つの潜在変数をOSCアルゴリズムに従って除去する。
【０４８９】
(d) 必要に応じて、除去された直交変動を調べ、スコア(T)及び負荷(P)に関して解釈することができる。
【０４９０】
(e) 次に、分類分離と相関しないあまり変動を含まないフィルタリングされたデータ行列を、任意的な基準化及び／又は平均中心化の後にさらなる多変量モデリングに用いる。
【０４９１】
任意の特定のモデルは、それを公式化するのに用いるデータも同然である。従って、全てのモデリングデータ及び試験データを、同じ(又は類似した)条件下で、同じ(又は類似した)実験パラメーターを用いて取得するのが好ましい。そのような条件及びパラメーターとしては、例えば、サンプルのタイプ(例えば、血漿、血清)、サンプルの収集及び取り扱いのプロトコル、サンプルの希釈率、NMR分析(例えば、型、磁場強度／周波数、温度)、並びにデータの加工(例えば、参照付け、ベースライン補正、正規化)が挙げられる。好適な場合、例えば、上記のパラメーターのいずれか(例えば、磁場強度／周波数)、又は他のパラメーター、例えば、性別、年齢、民族、既往歴、生活習慣(例えば、喫煙者、非喫煙者)、ホルモン状態(例えば、閉経前、閉経後)に従って、事例の特定のサブグループについて公式化するのが望ましい。
【０４９２】
一般的には、モデルの品質はモデリングデータの量が増加するにつれて改善する。それにもかかわらず、以下の実施例に示されるように、比較的小さいセットのモデリングデータ(例えば、約50〜100人の被験者)でさえ、信頼できる分類(例えば、診断)を達成するのに十分である。
【０４９３】
典型的な未管理モデリングプロセスは以下のステップ：
(a) 必要に応じてモデリングデータを基準化及び／又は平均中心化するステップ；
(b) データを分類するステップ(例えば、対照又は陽性、例えば、疾患を有する)；
(c) モデルに適合させるステップ(例えば、PCA、PLS-DAを用いる)；
(d) 必要に応じて、外れ値を同定し、除去するステップ；
(e) モデルに再適合させるステップ；
(f) 必要に応じて、(c)、(d)及び(e)を繰り返すステップ、
を含む。
【０４９４】
必要に応じて(及び好ましくは)、データのフィルタリングをステップ(d)であってステップ(e)の前に実行する。必要に応じて(及び好ましくは)、直交フィルタリング(例えば、OSC)をステップ(d)であってステップ(e)の前に実行する。
【０４９５】
OSCフィルタリングされたデータを用いる、典型的なPLS-DAモデリングプロセスの例としては、以下のステップ：
(a) OSCフィルタリングされたデータを必要に応じて基準化及び／又は平均中心化するステップ、
(b) 分類分離変動を記述する応答ベクトル(y)を、全サンプルに対して分類メンバーシップを評価することにより作成するステップ、
(c) OSCフィルタリングされたデータと応答ベクトル(y)の間でPLS回帰モデルを算出する。算出された潜在変数又はPLS成分を、既知の分類間の最大分離を記述することに集中させるステップ、
(d) このモデルを、スコア(T)、負荷(P)、PLS重み(W)、PLS係数(B)及び残差(E)を調べることにより解釈するステップ。同時に、それらは分類間の分離を記述するための手段として機能し、並びに観測された分離に対する説明を提供するであろうステップ、
を含む。
【０４９６】
モデルを算出すれば、モデルを算出するのに用いなかった既知の分類のサンプルに関するデータを用いてそれを実証することができる。この方法では、分類を正確に予測するモデルの能力を試験することができる。これを、例えば、上記の方法において、以下のさらなる工程：
(e) (例えば、PLS)モデル算出において用いなかった、既知の分類が属する外部サンプルのセットを、モデルの予測能力の実証に用いる。予測結果を、例えば、予測された応答(ypred)、予測されたスコア(Tpred)、及びモデルに対する予測された距離(DmodXpred)として記述した予測された残差に関して精査する、
を用いて達成することができる。
【０４９７】
次いで、このモデルを用いて、未知の分類の試験データを分類することができる。分類の前に、試験データをデータのモデリングと同様の様式で数学的に予備処理する。
【０４９８】
パターン認識(PR)分析からの出力の解釈は生物学的分類の分離を担うバイオマーカーに関する有用な情報を提供する。勿論、このPR出力は用いるデータ分析法に応じていくらか異なる。上記のように、PRのための方法及び結果の解釈は当業界で公知である。2種のPR技術(PCA及びPLS-DA)のための解釈方法は本明細書に簡単に考察されている。
【０４９９】
PCAの結果の解釈
データ行列(X)を、N観測値(サンプル、ラット、患者、など)およびK変数(1H-NMR共鳴に関してバイオマーカー情報を担持するスペクトルバケット)により構築する。
【０５００】
PCAにおいては、N*K行列(X)を、データ中の系統的変動を記述するいくつかの潜在変数又は主成分(PC)に分解する。PCAは双線形分解法であるため、各PCを2つのベクトル、スコア(t)及び負荷(p)に分割することができる。このスコアを、各PCに対する各観測値の投影として、負荷を、方向に関して表現されたPCに対する各変数(スペクトルバケット)の寄与として記述することができる。
【０５０１】
スコアプロットにおいて認められた方向(例えば、PC1対PC2)に沿った観測値(サンプル)の任意のクラスター化を、どの変数(スペクトルバケット)がスコア中のこの特定の方向について高い負荷を有するかを同定することにより説明することができる。高い負荷を、スコアプロット中のサンプルの位置に一致する傾向を示す系統的様式中の観測値間で変化する変数(スペクトルバケット)として規定する。高い負荷を有する各スペクトルベケット、又はその組合せを、その1H NMR化学シフト位置により規定する；これはその診断スペクトルウィンドウである。次いで、これらの化学シフト値により、技術を有するNMR分光技師が元のNMRスペクトルを試験し、関連するバケット中でピークを生じる分子を同定することが可能となる；これらはバイオマーカーである。典型的には、これを、標準的な1及び2次元NMR法の組合せを用いて行う。
【０５０２】
スコアプロットにおいて、サンプルの2つの分類の分離が特定の方向で認められた場合、スコアプロットと同じ方向にあるこれらの負荷を調べることにより、どの負荷が分類同定にとって重要であるかがわかる。負荷プロットはバケット化学シフトに従って標識されるポイントを示す。これは、バケットの中心に対応する1H NMR分光測定の化学シフトである。このバケットは診断スペクトルウィンドウを規定する。これらのバケット識別子のリストが与えられれば、技術を有するNMR分光技師はいくつかの可能性のあるNMR共鳴を2つの分類間で変化させるバケット幅内で、1H NMRスペクトル及び識別子を再試験する。重要な共鳴を、正確な化学シフト、強度、及びピーク多重性に関して特性評価する。2-D NMR分光測定などの他のNMR実験及び／又は、例えばHPLC-NMR-MSを用いる特定の分子の分離を用いて、同じ分子に由来する他の共鳴を同定し、究極的には、全てのNMRデータ及び好適な場合、他のデータに基づいて、該分子(バイオマーカー)の同定を行う。
【０５０３】
本明細書に記載の分類状況においては、PCAを用いる関連バイオマーカーを見つけるための1つの手順は以下の通りである。
【０５０４】
(a) 2つの既知の分類(健康又は疾患)のいずれかに属するN観測値を含むデータ行列(X)のPCA。観測値の記述は1H NMR共鳴に関するバイオマーカー情報を含むK変数(スペクトルバケット)にある。
【０５０５】
(b) X中の2つの既知の分類間の分離のための方向を見つけるためのスコア(t)の解釈。
【０５０６】
(c) 負荷(p)の解釈は、どの変数(スペクトルバケット)がスコア(t)中に記述された分離のための方向に最大の影響を与えるかを示す。これは関連する診断スペクトルウィンドウを規定する。
【０５０７】
(d) 特定のバイオマーカーに対するスペクトルバケット又はその組合せの帰属。これを、例えば、1H NMRスペクトルにおける共鳴の解釈により、及び帰属ライブラリーと同じ型の以前に帰属されたスペクトルを用いることにより、行う。
【０５０８】
PLS-DAの結果の解釈
PCA法の回帰的拡張であるPLS-DAにおいては、解釈に関するオプションはPCAの事例と比較してより広範囲である。PLS-DAは、データ行列(X)と分類メンバーシップ情報(例えば、サンプルに、健康な分類に対して1の値を、疾患を有する分類に対しては2の値を割当てることができる)を含有する「ダミー行列」(Y)との間で回帰を実行する。算出されたPLS成分はXとYとの間の最大共分散を記述し、この場合、YはX中の既知の分類間の最大分離と同じである。PLS-DAにおいては、スコア(t)及び負荷(p)の解釈はPCAの場合と同じである。各成分についてのPLS重み(w)の解釈は、Y中の変動と相関するX中の変数の説明を提供する。これにより、分類間の分離に関するバイオマーカー情報が得られるであろう。
【０５０９】
PLS-DAは回帰法であるので、回帰係数(b)の特徴を、バイオマーカーの発見及び解釈に用いることもできる。PLS-DA中の回帰係数(b)は、X中の変動の記述及びYとの相関の双方の点で最も重要であるX中の変数(スペクトルバケット)の合計を提供する。これは、相関しているY行列は各サンプルの分類同一性に関する情報のみを含むので、高い回帰係数を有する変数(スペクトルバケット)がX中の既知の分類を分離するのに重要であることを意味する。
【０５１０】
また、上記で考察されたように、スコアプロットを試験して重要な負荷、診断スペクトルウィンドウ、関連するNMR共鳴、及び究極的には関連するバイオマーカーを同定する。
【０５１１】
本明細書に記載される分類状況においては、PLS-DAを用いて関連バイオマーカーを見つけるための1つの手順は、以下のものである。
【０５１２】
(a) X中の観測値の分類メンバーシップに関する情報を含む、「ダミー行列」(Y)に対するN*Kデータ行列(X)間のPLSモデルを算出することにより、X中の2つの分類(例えば、健康な分類及び疾患を有する分類)間の最大分離を記述するいくつかの潜在変数(PLS成分)が得られる。
【０５１３】
(b) X中の2つの既知の分類間の分離の方向を見つけるためのスコア(t)の解釈。
【０５１４】
(c) どの変数(スペクトルバケット)がスコア(t)中に記述された分離の方向に対して最も大きい影響を与えるかを示す負荷(p)の解釈；これらは診断スペクトルウィンドウである。
【０５１５】
PLS-DAにおいては、変量重要プロット(VIP)はスコアプロット中のサンプルの分類の分離を引き起こすことにおいて負荷の有意性を評価する別の方法である。典型的には、このVIPはPLS重みの二乗関数であり、従って、正の数値のみが存在する；さらに、所与のモデルについては、1セットのVIP値のみが存在する。1より大きいVIP値を有する変数をモデルに関して最も影響力があると考える。VIPは分類変数に対するPLS回帰に基づく分類分離に関する減少する順番の重要性における各負荷を示す。
【０５１６】
(w*c)プロットはPLS-DA分析から得られる別の診断プロットである。それは、記述子が分類分離を主に担うことを示す。(w*c)パラメーターはモデル中の総変数相関、すなわち、記述子(例えば、バケット中のNMR強度)間、NMR記述子と分類変数との間、及びそれが存在する場合、分類変数間(本発明の2つの分類の場合では、分類1と分類2に対する規定によりサンプルを割当てる場合、相関はない)の相関を記述する試みである。かくして、スコアプロット(例えば、t1対t2)における状況について、分類1のサンプルが右上四分円中にクラスター化され、分類2のサンプルが左下四分円中にクラスター化される場合、(w*c)プロットはこれらの四分円中にもある記述子を示すであろう。右上四分円中の記述子は分類2と比較して分類1において増加するが、左上四分円については逆である。
【０５１７】
(d) PLS重み(w)の解釈は、X中のどの変数(スペクトルバケット)がY(分類分離)との相関にとって重要であるかを示す；これらも診断スペクトルウィンドウである。
【０５１８】
(e) PLS回帰係数(b)の解釈は、どの変数(スペクトルバケット)の総計がスコア中に記述された分離の方向に対して最も大きい影響を有するかを示す；これらも診断スペクトルウィンドウである。
【０５１９】
1H NMRについての典型的な回帰係数においては、各バーはスペクトル領域(例えば、0.04 ppm)を表し、サンプルの1つの分類の1H NMRプロフィールがサンプルの2つ目の分類の1H NMRプロフィールとどのように異なるかを示す。x軸上の正の値は、1つの分類において、他の分類と比較して高い濃度の代謝物(NMR化学シフト帰属表を用いる)が存在することを示唆し、x軸上の負の値は、1つの分類において、他の分類と比較して低い濃度を示唆する。
【０５２０】
(f) 特定のバイオマーカーへのスペクトルバケット又はその組合せの帰属。これを、例えば、1H NMRスペクトル中の共鳴の解釈により、及び帰属ライブラリーと同じ型の以前に帰属されたスペクトルを用いることにより行う。
【０５２１】
時限的サンプリング
本明細書に記載される分析法を、単一のサンプル、又は時限的な一連のサンプルに適用することができる。これらのサンプルを、比較的近い時間(例えば、毎日)又は少ない頻度(例えば、毎月もしくは毎年)で取得することができる。
【０５２２】
時限的な一連のサンプルを、各サンプルが単一のサンプルである場合と同じ分類方法を適用して、1つ以上の目的、例えば、連続的診断を行うために用いることができる。これにより、患者に関する単一のサンプルの取得、又は被験者における一時的変化(例えば、診断、治療しようとする根本的な症状における変化など)をモニターすることと比較して、診断におけるより高い信頼性が得られる。
【０５２３】
あるいは、時限的な一連のサンプルを、入力データセットの情報密度を増加させることにより、分析方法の力を増加させてより弱いパターンを同定するための単一のデータセットとして集約的に処理することができる。
【０５２４】
さらに別の代替として、時限的な一連のサンプルを集約的に処理して、一時的変化(例えば、各ビンにおいて)が変数の余分のリスト(例えば、複合データセットとして)として含まれる単一のデータセットを得ることができる。(例えば、内因性)診断種の量における一時的変化は、パターンを正確に分類するための分析方法の能力を大きく改善し得る(特に、パターンが弱い場合)。
【０５２５】
バッチモデリング
本明細書に記載される方法、その適用(例えば、診断、予防)を、バッチモデリングを用いることによりさらに改良することができる。
【０５２６】
統計的バッチ処理を、2つのレベルの多変量モデリングに分けることができる。低い方のレベル、又は観測レベルは、通常、時間に対する部分最小二乗法(PLS)(又はプロセスの成熟度を記述する任意の他の指標)に基づくが、PCAからなる高い方のレベル又はバッチレベルは低い方のレベルのPLSモデルに由来するスコアに基づく。分離パッチの最終特性を有する低い方のレベルのスコアに基づく行列を相関させるために、PLSを高い方のレベルにおいて用いることもできる。これは、最終生成物の特性を品質の記述として用いる産業用途において一般的である。
【０５２７】
低い方のレベルのバッチモデリングにおいて、試験プロセスの経時的な変化(成熟度)をPLSスコア及び負荷に関してモニター及び解釈することができる。PLSはサンプリング時間(成熟度)に対する回帰を行うので、算出された成分は時間による変化に焦点を当てるであろう。算出されたPLS成分は互いに直交するという事実は、独立の時間(成熟度)プロフィールを検出し、また、どの測定変数がこれらのプロフィールを引き起こすかを解釈することが可能であることを意味する。いくつかの任意の有意差レベル、通常95％及び／又は99％について任意の時間で任意のスペクトルの逸脱している振舞いを検出するのに信頼限界を用いることができる。
【０５２８】
モデルとの距離(DModX)として表される残差は、低い方のレベルでも、範囲外のパッチ又は特定の時点での特定のバッチについて逸脱する振舞いを検出するための別の重要なツールである。高い方のレベル又はバッチレベルは分離したパッチ間の差異を丁度探すための可能性を提供する。これを、各単一のバッチを記述する新しい変数として各バッチに関する全時点を含む低い方のレベルのスコアを用いた後、この新しいデータ行列に対してPCAを実行することにより行う。スコアの特徴、負荷及びDModXを、高い方のレベルの負荷を元の負荷におけるより詳細な説明に関して低い方のレベルに対して追跡することができること以外は通常のPCA分析と同じ方法で用いる。
【０５２９】
「新しい」バッチに関する予測をバッチモデルの両レベルに対して行うことができる。低い方のレベルでは、スコア及びDmodXを用いる時間による変化のモニタリングは任意の時点でのバッチについて正常から逸脱する振舞いを検出するための強力なツールである。高い方のレベルでは、単一のバッチの振舞いの予測をスコア及びDmodXに関して行うことができる。
【０５３０】
バッチプロセスの規定、及びまたバッチモデリングの要求は、全てのバッチが等しい継続時間を有し、これをサンプル収集に従って同期させるプロセスである。例えば、投与された生体外物質の作用をモニターするために、同一の固定された時点で動物群からサンプルを取得する。
【０５３１】
そのような試験のためのバッチモデリングを用いる利点は、低い方のレベルのスコア中で時間により変化する既知の代謝プロセスの検出、又は新しい代謝プロセスの探索、及びまた寄与する低い方のレベルの負荷に由来する異なるプロセスに関与する実際の代謝物の同定の可能性である。また、低い方のレベルの分析は、単一の観測値(例えば、特定の時点での個々の動物)間を識別することを可能にする。
【０５３２】
低い方のレベルのモデリングのための適用としては、例えば、特定の時点での投与の代謝作用に関する非投与対照と投与動物との識別；正規性のためのモデルの作成及び新しいサンプルの分類ツール、例えば、正常又は異常としてのこのモデルの使用が挙げられる。これを、正規性を記述するモデルを用いる新しいサンプルの分類のPLS予測を用いて達成することができる。次いで、予測されたスコア及び残差(DmodX)の組合せに基づいて決定を行う。
【０５３３】
自動化された専門システムを、低い方のバッチモデリングにおいて早期の故障検出に用いることができ、これを用いて分析手順をさらに増強し、効率を改善することができる。
【０５３４】
高い方のレベルは存在するモデルを用いて新しい動物の予測を行う可能性を提供する。次いで、異常な動物を、予測されたスコア及び残差(DmodX)を共に判断することにより検出することができる。高い方のレベルのモデルは低い方のレベルのスコアに基づいているので、異常であると予測された動物の解釈を元の低い方のレベルのスコア及び負荷並びにNMRスペクトルを作る元の生変数に対して追跡することができる。新しい動物の状態の予測のために高い方と低い方のレベルを組み合わると、分類は4つのパラメーターに基づき得る：高い方のレベルのスコア及び残差(DmodX)及び低い方のレベルのスコア及び残差(DModX)。これはバッチモデリングが動物が正常であるか異常であるかを決定し、もし後者である場合、何故、いつ、それらが正常から逸脱するのかを決定するための有効なツールであることを示している。
【０５３５】
例えば、Woldら、1998a及びErikssonら、1999を参照されたい。
【０５３６】
メタボノミクスの積分
上記で考察したように、本発明の方法の多くを複合データ又は複合データセットに適用することもできる。本明細書で用いる用語「複合データセット」は、スペクトルデータ(例えば、NMRスペクトルデータ、例えばNMRスペクトル)並びに少なくとも1つの他のデータもしくはデータベクトルを含むスペクトル(又はデータベクトル)に関する。他のデータベクトルの例としては、例えば、異なるNMR技術を用いて同じサンプルについて取得された；同じサンプル型(例えば、血液、尿、組織、組織抽出物)の別のサンプルについて取得されるが、異なる時点で被験者から取得された；同じ被験者について異なるサンプル型(例えば、血液、尿、組織、組織抽出物)の別のサンプルについて取得された1つ以上の他のNMRスペクトルデータ、例えば、NMRスペクトル；他の型のスペクトル、例えば、質量スペクトル、画像の数値的表示などが挙げられる。
【０５３７】
他のデータの例としては、例えば、1つ以上の臨床パラメーターが挙げられる。複合法における使用に好適な臨床パラメーターとしては、限定されるものではないが、以下のもの：
(a) 病院の臨床研究室で日常的に測定される確立された臨床パラメーター：年齢；性別；ボディーマス指数；身長；体重；家族歴；既往歴；喫煙；アルコール摂取；血圧；総血液細胞計数(FBC)；赤血球；白血球；単球；リンパ球；好中球；好酸球；好塩基球；血小板；ヘマトクリット；ヘモグロビン；平均血球体積及び関連血液希釈指示薬；フィブリノーゲン；機能的凝固パラメーター(トロンボプラスチン及び部分トロンボプラスチン)；電解質(ナトリウム、カリウム、カルシウム、リン酸)；尿素；クレアチニン；総タンパク質；アルブミン；グロブリン；ビリルビン；肝機能のタンパク質マーカー(アラニンアミノトランスフェラーゼ、アルカリホスファターゼ、γグルタミルトランスフェラーゼ)；グルコース；Hba1c(糖尿病をモニターするのに用いられるグルコース-ヘモグロビンコンジュゲートの尺度)；リポタンパク質プロフィール；総コレステロール；LDL；HDL；トリグリセリド；血液型群、
(b)研究室においては日常的に測定されるが、通常、病院においては測定されない確立された研究用パラメーター：ホルモン状態；テストステロン；エストロゲン；プロゲステロン；黄体刺激ホルモン；インヒビン；トランスフォーミング増殖因子-β1；トランスフォーミング増殖因子-β2；ケモカイン；MCP-1；エオタキシン；プラスミノーゲン活性化因子インヒビター-1；シスタチンC、
(c) 1又は少数の特殊研究室において測定される早期段階の研究用パラメーター：sRIIに対する抗体；血液型群A抗原に対する抗体；血液型群B抗原に対する抗体；α-galに対する免疫グロブリン(IgD)；ペンタ-galに対する免疫グロブリン(IgD)、
が挙げられる。
【０５３８】
診断スペクトルウィンドウ
上記で考察したように、本発明の方法の多くは、1つ以上の所定の診断スペクトルウィンドウでのNMRスペクトル強度を所定の状態と関連させることを含む。
【０５３９】
例えば、パターン認識法を用いる、所与の状態のための1つ以上の好適な診断スペクトルウィンドウを同定するための方法の例を本明細書に記載する。
【０５４０】
本明細書で用いる用語「診断スペクトルウィンドウ」は、指標値δrを包含する化学シフト値の狭い範囲 (Δδ) (すなわち、δrは範囲Δδ内に収まる)に関する。各指標値、及びその関連スペクトルウィンドウは、NMRスペクトル強度が1種以上の化学種の存在を示す化学シフトの範囲(Δδ)を規定する。
【０５４１】
2D NMR法については、診断スペクトルウィンドウは指標値[δr1、δr2]を包含する化学シフトパッチ(Δδ1、Δδ2)を指す。3D NMR法については、診断スペクトルウィンドウは指標値[δr1、δr2、δr3]を包含する化学シフト体積(Δδ1、Δδ2、Δδ3)を指す。
【０５４２】
一実施形態においては、スペクトルウィンドウをその指標値に関して中心化する(例えば、δr＝1.30;｜Δδ｜＝δ 0.04、及びΔδ 1.28-1.32)。
【０５４３】
この範囲の幅、｜Δδ｜を、主に磁場強度／周波数、温度、サンプル粘度などの分光測定パラメーターにより決定する。この範囲の幅は典型的なスピン結合多重線パターンを包含するように選択されることが多い。位置がサンプルのpHと共に変化するピークについては、範囲の幅を、位置の期待される範囲を包含するように広げることができる。
【０５４４】
典型的には、この範囲の幅、｜Δδ｜は約δ0.001〜約δ0.2である。
【０５４５】
一実施形態においては、この幅は約δ0.005〜約δ0.1である。
【０５４６】
一実施形態においては、この幅は約δ0.005〜約δ0.08である。
【０５４７】
一実施形態においては、この幅は約δ0.01〜約δ0.08である。
【０５４８】
一実施形態においては、この幅は約δ0.02〜約δ0.08である。
【０５４９】
一実施形態においては、この幅は約δ0.005〜約δ0.06である。
【０５５０】
一実施形態においては、この幅は約δ0.01〜約δ0.06である。
【０５５１】
一実施形態においては、この幅は約δ0.02〜約δ0.06である。
【０５５２】
一実施形態においては、この幅は約δ0.04である。
【０５５３】
一実施形態においては、この幅は「バケット」又は「ビン」の幅に等しい。一実施形態においては、この幅は「バケット」又は「ビン」の幅の整数倍に等しい。
【０５５４】
診断スペクトルウィンドウを試験下の条件に関して決定するが、そのようなウィンドウに関する正確な指標値は、例えば、元のスペクトル中のデジタル解像度、用いるバケットの幅、スペクトルデータ獲得の温度などの用いる実験パラメーターに応じて変化し得る。サンプル(例えば、生物流体、組織、など)の正確な組成は区画化、金属の錯体形成、タンパク質小分子結合などによりピーク位置に影響し得る。観測周波数は、異なる程度のピーク重複及びスペクトルの第1／第2の性質が原因で影響を与える。
【０５５５】
一実施形態においては、前記の1つ以上の所定の診断スペクトルウィンドウは、単数の所定の診断スペクトルウィンドウである。
【０５５６】
一実施形態においては、前記の1つ以上の所定の診断スペクトルウィンドウは、複数の所定の診断スペクトルウィンドウである。実際には、これが好ましい。
【０５５７】
所定の診断スペクトルウィンドウ数の論理的な限界はデータ密度(例えば、変数、例えばバケットの数)の関数であるが、典型的には所定の診断スペクトルウィンドウ数は1〜約30である。実際の数はこれらの一般的な限界内の任意の部分範囲であってよい。下限の例としては、1、2、3、4、5、6、8、10、及び15が挙げられる。上限の例としては、3、4、5、6、8、10、15、20、25、及び30が挙げられる。
【０５５８】
一実施形態においては、この数は1〜約20である。
【０５５９】
一実施形態においては、この数は1〜約15である。
【０５６０】
一実施形態においては、この数は1〜約10である。
【０５６１】
一実施形態においては、この数は1〜約8である。
【０５６２】
一実施形態においては、この数は1〜約6である。
【０５６３】
一実施形態においては、この数は1〜約5である。
【０５６４】
一実施形態においては、この数は1〜約4である。
【０５６５】
一実施形態においては、この数は1〜約3である。
【０５６６】
一実施形態においては、この数は1又は2である。
【０５６７】
一実施形態においては、前記の1つ以上の所定の診断スペクトルウィンドウは複数の診断スペクトルウィンドウであり；かつ、1つ以上の所定の診断スペクトルウィンドウにおける前記のNMRスペクトル強度は複数のNMRスペクトル強度の組合せであり、その各々は前記複数の所定の診断スペクトルウィンドウの1つに関するNMRスペクトル強度である。
【０５６８】
一実施形態においては、前記組合せは一次結合である。
【０５６９】
一実施形態においては、少なくとも1つの前記1つ以上の所定の診断スペクトルウィンドウは、診断種のNMR共鳴(例えば、診断種の1H NMR共鳴)の化学シフト値を包含する。
【０５７０】
一実施形態においては、複数の前記1つ以上の所定の診断スペクトルウィンドウの各々は、診断種のNMR共鳴(例えば、診断種の1H NMR共鳴)の化学シフト値を包含する。
【０５７１】
一実施形態においては、前記1つ以上の所定の診断スペクトルウィンドウの各々は、診断種のNMR共鳴(例えば、診断種の1H NMR共鳴)の化学シフト値を包含する。
【０５７２】
診断スペクトルウィンドウ-高血圧
指標値、及び関連する診断スペクトルウィンドウは、主に表2-1-HYP、表2-2-HYP、及び／又は表2-3-HYPに記載の種を反映すると考えられる。
【０５７３】
一実施形態においては、前記所定の診断スペクトルウィンドウを、表2-1-HYP、表2-2-HYP、及び／又は表2-3-HYPに列挙するバケット領域に対応する、1つ以上の指標値、δrにより規定する。
【０５７４】
一実施形態においては、前記所定の診断スペクトルウィンドウを、表2-1-HYP、表2-2-HYP、及び／又は表2-3-HYPに列挙するバケット領域に対応する、1つ以上の指標値、δr、並びに範囲値の幅、｜Δδ｜約0.04により規定する。
【０５７５】
一実施形態においては、前記所定の診断スペクトルウィンドウを、表2-1-HYP、表2-2-HYP、及び／又は表2-3-HYPに列挙するバケット領域に対応する、1つ以上の指標値、δrにより規定し、これを「NMR実験パラメーター」の節に説明される条件を用いて決定する。
【０５７６】
診断スペクトルウィンドウ-アテローム性動脈硬化症／CHD
指標値、及び関連する診断スペクトルウィンドウは、主に表3-4-CHDに記載の種を反映すると考えられる。
【０５７７】
一実施形態においては、前記所定の診断スペクトルウィンドウを、表3-4-CHDに列挙するバケット領域に対応する、1つ以上の指標値、δrにより規定する。
【０５７８】
一実施形態においては、前記所定の診断スペクトルウィンドウを、表3-4-CHDに列挙するバケット領域に対応する、1つ以上の指標値、δr、及び範囲値の幅、｜Δδ｜約0.04により規定する。
【０５７９】
一実施形態においては、前記所定の診断スペクトルウィンドウを、表3-4-CHDに列挙するバケット領域に対応する、1つ以上の指標値、δrにより規定し、これを「NMR実験パラメーター」の節に説明される条件を用いて決定する。
【０５８０】
診断スペクトルウィンドウ-骨粗鬆症
指標値、及び関連する診断スペクトルウィンドウは、主に表4-1-OP及び／又は表4-2-OPに記載の種を反映すると考えられる。
【０５８１】
一実施形態においては、前記所定の診断スペクトルウィンドウを、表4-1-OP及び／又は表4-2-OPに列挙するバケット領域に対応する、1つ以上の指標値、δrにより規定する。
【０５８２】
一実施形態においては、前記所定の診断スペクトルウィンドウを、表4-1-OP及び／又は表4-2-OPに列挙するバケット領域に対応する、1つ以上の指標値、δr、並びに範囲値の幅、｜Δδ｜約0.04により規定する。
【０５８３】
一実施形態においては、前記所定の診断スペクトルウィンドウを、表4-1-OP及び／又は表4-2-OPに列挙するバケット領域に対応する、1つ以上の指標値、δrにより規定し、これを「NMR実験パラメーター」の節に説明される条件を用いて決定する。
【０５８４】
診断スペクトルウィンドウ-骨関節炎
指標値、及び関連する診断スペクトルウィンドウは、主に表5-1-OA及び／又は表5-2-OAに記載の種を反映すると考えられる。
【０５８５】
一実施形態においては、前記所定の診断スペクトルウィンドウを、表5-1-OA及び／又は表5-2-OAに列挙するバケット領域に対応する、1つ以上の指標値、δrにより規定する。
【０５８６】
一実施形態においては、前記所定の診断スペクトルウィンドウを、表5-1-OA及び／又は表5-2-OAに列挙するバケット領域に対応する、1つ以上の指標値、δr、並びに範囲値の幅、約0.04の｜Δδ｜により規定する。
【０５８７】
一実施形態においては、前記所定の診断スペクトルウィンドウを、表5-1-OA及び／又は表5-2-OAに列挙するバケット領域に対応する、1つ以上の指標値、δrにより規定し、これを「NMR実験パラメーター」の節に説明される条件を用いて決定する。
【０５８８】
診断種及びバイオマーカー
指標値、及び関連する診断スペクトルウィンドウは、NMRスペクトル強度が1種以上の化学種の存在を示し、その1種以上が例えば、試験下の条件(例えば、兆候)のための診断種(例えば、バイオマーカー)である化学シフトの範囲を規定する。
【０５８９】
一実施形態においては、前記1種以上の診断種は内因性診断種である。
【０５９０】
一実施形態においては、前記1種以上の診断種は所定の診断スペクトルウィンドウにおけるNMRスペクトル強度に関連する。
【０５９１】
一実施形態においては、前記1種以上の診断種は複数の診断種(すなわち、診断種の組合せ)である。
【０５９２】
一実施形態においては、前記1種以上の診断種は単一診断種である。
【０５９３】
本明細書で用いる用語「内因性種」は、試験下の被験者を起源とする、例えば、被験者のサンプル中に存在する化学種に関する。
【０５９４】
指標値、及びその関連する診断スペクトルウィンドウを同定すれば(例えば、本明細書に記載されるモデリング法の適用により)、その特定のウィンドウにおいてNMRスペクトル強度を生じる1つ以上の推定バイオマーカーを同定することができることが多い。
【０５９５】
特定のスペクトルウィンドウにおける(例えば、積分された)NMRスペクトル強度(例えば、バケット)は、そのウィンドウにおける全てのNMRピークに関するスペクトル強度の総和である。通常、鋭いNMRピークを与える小分子については、生のNMRデータを試験し、どのピークが、適用されるパターン認識法により有意であるとして選択されるその特定のスペクトルウィンドウの原因となるかを決定する。次いで、関連するピークを帰属する。
【０５９６】
そのような帰属を、例えば、公開されたデータを参照することにより；真正物質のスペクトルとの比較により；サンプルへの真正参照標準の標準的添加により；例えば、HPLC-NMRを用いて、NMR及び質量分析を用いて個々の成分を同定することにより、それを分離することにより、行うことができる。通常、帰属のさらなる確認を、例えば、2次元(2D)NMR法を含む他のNMR法の適用から求める。
【０５９７】
別の手法においては、候補化学種の濃度を、別の特定の方法(例えば、ELISA、クロマトグラフィー、RIAなど)により測定し、関連する診断スペクトルウィンドウにおいて観測されるスペクトル強度、及び留意される任意の相関と比較する。これは、診断スペクトルウィンドウ中のどれぐらいの変化が候補化学種によりもたらされるのかを示すであろう。これはまた、考えられる化学種が、実際には、試験下の条件と高く相関しないことを示す場合もある。
【０５９８】
診断種の同定方法
かくして、本明細書に記載の方法はまた、特定の状態を示唆する(例えば、徴候を示す)種(バイオマーカー又は診断種と呼ばれることが多い)の同定を容易にする。例えば、特定の代謝物(例えば、血液、尿などの中の)は、特定の状態の徴候を示し得る。
【０５９９】
本発明の一態様は、本明細書に記載されるように、そのような診断種(例えば、バイオマーカー)を同定する方法に関する。
【０６００】
本発明の一態様は、所定の状態について診断種または複数診断種の組み合わせを同定する方法であって、
（ａ）多変量統計分析法を実験データに適用するステップであって、
前記実験データが複数の実験サンプルのそれぞれについて測定される実験パラメータを含む少なくとも１つのデータを含み、
前記実験サンプルが複数の分類からなる分類群を規定し、
前記複数の分類のうちの少なくとも１つが、前記所定の状態に関連する分類、例えば、前記所定の状態の存在に関連する分類であり、
前記複数の分類のうちの少なくとも１つが、前記所定の状態に関連しない分類、例えば、前記所定の状態の非存在に関連する分類であり、
前記各実験サンプルが前記分類群から選択される既知分類のものである前記ステップ；
ならびに
（ｂ）１つ以上の臨界実験パラメータを同定するステップであって、
前記各臨界実験パラメータが、前記分類群の分類に対し統計的に有意に異なっており、例えば前記分類群の分類間で区別を行う上で統計的に有意である前記ステップ；および
（ｃ）前記１つ以上の臨界実験パラメータの１つ以上のそれぞれを前記診断種と照合するステップ；
あるいは
（ｂ）複数の臨界実験パラメータの組み合わせを同定するステップであって、
前記複数の臨界実験パラメータ組み合わせが、前記分類群の分類について統計的に有意に異なっており、例えば前記分類群の分類間で区別を行う上で統計的に有意である前記ステップ；および
（ｃ）前記複数の臨界実験パラメータの１つ以上のそれぞれを複数の診断種の前記組み合わせと照合するステップ
を含む前記方法に関する。
【０６０１】
一実施形態においては、前記臨界実験パラメータのうちの１つ以上がスペクトルパラメータであり；
前記確認および照合ステップが、
（ｂ）１つ以上の臨界実験スペクトルパラメータを同定し；および
（ｃ）前記１つ以上の臨界実験スペクトルパラメータの１つ以上のそれぞれとスペクトル的特徴、例えばスペクトルピークと照合し、
および前記スペクトルピークの１つ以上を前記診断種と照合するステップであり；
あるいは
（ｂ）複数の臨界実験スペクトルパラメータの組み合わせを同定し；および
（ｃ）前記複数の臨界実験スペクトルパラメータのうちの複数個のそれぞれをスペクトル的特徴、例えばスペクトルピークと照合し、
および前記スペクトルピークの１つ以上を複数の診断種の前記組み合わせと照合するステップである。
【０６０２】
一実施形態においては、前記多変量統計解析方法は、パターン認識法を用いる多変量統計解析方法である。
【０６０３】
一実施形態においては、前記多変量統計解析方法は、PCAであるか、又はPCAを用いる。
【０６０４】
一実施形態においては、前記多変量統計解析方法は、PLSであるか、又はPLSを用いる。
【０６０５】
一実施形態においては、前記多変量統計解析方法は、PLS-DAであるか、又はPLS-DAを用いる。
【０６０６】
一実施形態においては、前記多変量統計解析方法は、データフィルタリングのステップを含む。
【０６０７】
一実施形態においては、前記多変量統計解析方法は、直交データフィルタリングのステップを含む。
【０６０８】
一実施形態においては、前記多変量統計解析方法は、OSCのステップを含む。
【０６０９】
一実施形態においては、前記実験パラメーターは、スペクトルデータを含む。
【０６１０】
一実施形態においては、前記実験パラメーターは、スペクトルデータ及び非スペクトルデータの両方(「複合実験データ」と呼ばれる)を含む。
【０６１１】
一実施形態においては、前記実験パラメーターは、NMRスペクトルデータを含む。
【０６１２】
一実施形態においては、前記実験パラメーターは、NMRスペクトルデータ及び非NMRスペクトルデータの両方を含む。
【０６１３】
一実施形態においては、前記NMRスペクトルデータは、1H NMRスペクトルデータ及び／又は13C NMRスペクトルデータを含む。
【０６１４】
一実施形態においては、前記NMRスペクトルデータは、1H NMRスペクトルデータを含む。
【０６１５】
一実施形態においては、前記非スペクトルデータは、非スペクトル臨床データである。
【０６１６】
一実施形態においては、前記非NMRスペクトルデータは、非スペクトル臨床データである。
【０６１７】
一実施形態においては、前記決定的実験パラメーターは、スペクトルパラメーターである。
【０６１８】
一実施形態においては、前記分類群は、前記所定の状態(例えば、存在、非存在、程度など)と関連する分類を含む。
【０６１９】
一実施形態においては、前記分類群は、正確に2つの分類を含む。
【０６２０】
一実施形態においては、前記分類群は、正確に2つの分類：前記所定の状態の存在；及び前記所定の状態の非存在を含む。
【０６２１】
一実施形態においては、前記所定の状態と関連する前記分類は、前記所定の状態の存在と関連する分類である。
【０６２２】
一実施形態においては、前記所定の状態と関連する前記分類は、前記所定の状態の非存在と関連する分類である。
【０６２３】
一実施形態においては、前記方法がさらに、
（ｄ）前記診断種が何であるかを同定するというさらなるステップを含む。
【０６２４】
本発明の一態様は、そのような方法により同定される新規な診断種(例えば、バイオマーカー)に関する。
【０６２５】
本発明の一態様は、分類方法(例えば、診断)において用いるためのそのような方法により同定される1つ以上の診断種(例えば、バイオマーカー)に関する。
【０６２６】
本発明の一態様は、そのような方法により同定される1つ以上の診断種(例えば、バイオマーカー)を用いるか、又はそれに依存する分類方法(例えば、診断)に関する。
【０６２７】
本発明の一態様は、分類方法(例えば、診断)においてそのような方法により同定される1つ以上の診断種(例えば、バイオマーカー)の使用に関する。
【０６２８】
本発明の一態様は、そのような方法により同定される1つ以上の診断種(例えば、バイオマーカー)に依存する、分類方法(例えば、診断)における使用のためのアッセイに関する。
【０６２９】
本発明の一態様は、そのような方法により同定される1つ以上の診断種(例えば、バイオマーカー)に依存する、分類方法(例えば、診断)におけるアッセイの使用に関する。
【０６３０】
診断種-高血圧
一実施形態においては、少なくとも1種の前記1種以上の診断種は、表2-1-HYP、表2-2-HYP、及び／又は表2-3-HYPに記載の種である。
【０６３１】
一実施形態においては、複数の前記1種以上の所定の診断種のそれぞれは、表2-1-HYP、表2-2-HYP、及び／又は表2-3-HYPに記載の種である。
【０６３２】
一実施形態においては、前記1種以上の所定の診断種のそれぞれは、表2-1-HYP、表2-2-HYP、及び／又は表2-3-HYPに記載の種である。
【０６３３】
診断種-アテローム性動脈硬化症／CHD
一実施形態においては、少なくとも1種の前記1種以上の診断種は、表3-4-CHDに記載の種である。
【０６３４】
一実施形態においては、複数の前記1種以上の所定の診断種のそれぞれは、表3-4-CHDに記載の種である。
【０６３５】
一実施形態においては、前記1種以上の所定の診断種のそれぞれは、表3-4-CHDに記載の種である。
【０６３６】
診断種-骨粗鬆症
一実施形態においては、少なくとも1種の前記1種以上の診断種は、表4-1-OP及び／又は表4-2-OPに記載の種である。
【０６３７】
一実施形態においては、複数の前記1種以上の所定の診断種のそれぞれは、表4-1-OP及び／又は表4-2-OPに記載の種である。
【０６３８】
一実施形態においては、前記1種以上の所定の診断種のそれぞれは、表4-1-OP及び／又は表4-2-OPに記載の種である。
【０６３９】
診断種-骨関節炎
一実施形態においては、少なくとも1種の前記1種以上の診断種は、表5-1-OA及び／又は表5-2-OAに記載の種である。
【０６４０】
一実施形態においては、複数の前記1種以上の所定の診断種のそれぞれは、表5-1-OA及び／又は表5-2-OAに記載の種である。
【０６４１】
一実施形態においては、前記1種以上の所定の診断種のそれぞれは、表5-1-OA及び／又は表5-2-OAに記載の種である。
【０６４２】
量又は相対量
上記で考察されたように、本発明の方法の多くは、1種以上の診断種の量、又は相対量に基づく分類を含む。
【０６４３】
一実施形態においては、前記分類を、単一診断種の量、又は相対量に基づいて行う。
【０６４４】
一実施形態においては、前記分類を、複数診断種の量、又は相対量に基づいて行う。
【０６４５】
一実施形態においては、前記分類を、複数診断種のそれぞれの量、又は相対量に基づいて行う。
【０６４６】
一実施形態においては、前記分類を、複数の診断種の総量、又は相対総量に基づいて行う。
【０６４７】
一実施形態においては前記1種以上の診断種が複数の診断種であり、1種以上の診断種の前記量、又は相対量が、複数の量、又は相対量の組合せであり、その各量が前記複数の診断種の1つの量、又は相対量である。
【０６４８】
一実施形態においては、前記組合せは一次結合である。
【０６４９】
本明細書で用いる用語「量」は、用語の表現にかかわらない量に関する。
【０６５０】
「(例えば、診断)種の量、又は相対量」の意味で本明細書で用いる用語「量」は、用語の表現にかかわらない量に関する。
【０６５１】
絶対量を、例えば、質量(例えば、μg)、モル(例えば、μmol)、体積(すなわち、μL)、濃度(モル濃度、μg/mL、μg/mL、μg/g、wt％、vol％など)などの用語で表すことができる。
【０６５２】
相対量を、例えば、別の化学種に関する絶対量の比として(例えば、比として、倍数として、％として)表すことができる。例えば、この量を、例えば、内因性であるか又は添加される、別の化学種などの内部標準と比較した相対量として表すことができる。
【０６５３】
この量を、量を示す別の量(おそらく前駆体量)に関して、間接的に示すことができる。例えば、他の量は、それ自身がその量を示すものである分光学的又は分光測定的な量(例えば、シグナル、強度、吸光度、透過率、消光係数、伝導率、など；必要に応じて加工される、例えば、積分される)であってもよい。
【０６５４】
この量を、量を示す異なる化学種(例えば、代謝前駆体、代謝生成物など)に関して、直接的又は間接的に示すことができる。
【０６５５】
診断シフト
上記で考察されたように、本発明の方法の多くは、例えば、1つ以上の所定の診断スペクトルウィンドウにおけるNMRスペクトル強度；診断種の量、又は相対量などの変調に基づく分類を含む。この意味において、「変調」は、例えば、増加又は減少であってもよい、変化に関する。一実施形態においては、前記「変調」は「増加又は減少」である。
【０６５６】
一実施形態においては、変調(例えば、増加、減少)は好適な対照と比較して少なくとも10％である。一実施形態においては、変調(例えば、増加、減少)は、好適な対照と比較して少なくとも20％である。一実施形態においては、変調は少なくとも50％の減少(すなわち、0.5の因子)である。一実施形態においては、変調は少なくとも100％の増加(すなわち、2の因子)である。
【０６５７】
複数の所定の診断スペクトルウィンドウの各々、及び複数の診断種の各々は、同じであっても異なっていてもよい独立した変調を有してもよい。例えば、2つの所定の診断スペクトルウィンドウが存在する場合、NMRスペクトル強度は一方のウィンドウにおいて増加し、他方のウィンドウにおいて減少してもよい。このように、異なる診断スペクトルウィンドウにおけるNMRスペクトル強度の変調の組合せは診断的であり得る。同様に、2つの診断種が存在する場合、一方の量は増加し、他方の量は減少してもよい。また、異なる診断種の量、又は相対量の変調の組合せも診断的である。例えば、異なる種が異なる変調を有する事例を例示する以下の実施例中のデータを参照されたい。
【０６５８】
本明細書で用いる用語「診断シフト」は、好適な対照と比較した変調(例えば、増加、減少)に関する。
【０６５９】
診断シフトは、例えば、1つ以上の所定の診断スペクトルウィンドウにおけるNMRスペクトル強度；又は診断種の量、もしくは相対量に関するものであってもよい。
【０６６０】
対照サンプル、対照被験者、対照データ
通常、好適な対照を、研究下の生物(例えば、被験者、患者) (試験被験者、研究被験者など)、及び研究の性質(例えば、サンプルの型、スペクトルの型など)に基づいて選択する。通常、対照を、「正常性」の状態を代表するように選択する。本明細書に記載されるように、試験データ、試験サンプル、試験被験者などにおける正常からの逸脱を、分類、診断などにおいて用いる。
【０６６１】
例えば、ほとんどの事例では、対照被験者は試験被験者と同一の種であり、等価で正常な(例えば、健康な)生物の代表となるように選択される。対照集団は対照被験者の集団である。好適な場合、対照被験者は試験被験者と共通の特徴(例えば、性別、民族、年齢群など)を有してもよい。好適な場合、対照被験者は試験被験者のものと異なる特徴(例えば、年齢群など)を有してもよい。例えば、対照被験者として、試験被験者と同じ性別及び民族の健常な20歳を選択するのが望ましい。
【０６６２】
ほとんどの事例では、対照サンプルを対照被験者から取得する。通常、対照サンプルは同一のサンプル型(例えば、血清)のものであり、研究下のサンプル(例えば、試験サンプル、研究サンプル)と同じ又は類似した条件下で回収し、取り扱う(例えば、処理、加工、保存する)。
【０６６３】
ほとんどの事例では、対照データ(例えば、対照値)を、対照被験者から取得される対照サンプルから取得する。通常、対照データ(例えば、対照データセット、対照スペクトルデータ、対照スペクトルなど)は同一の型(例えば、1-D1H NMRなど)のものであり、試験データと同じか、又は類似した条件(例えば、パラメーター)下で回収し、取り扱う(例えば、記録、加工する)。
【０６６４】
器具
本発明の方法、又はその一部を、例えば、好適にプログラムされたコンピュータシステムを用いて、電気的に都合よく行うことができる。
【０６６５】
本発明の一態様は、本明細書に記載される、本発明の方法を実行するために機能し得る形で配置された、コンピュータもしくは連結されたコンピュータなどのコンピュータシステム又は装置に関する。
【０６６６】
本発明の一態様は、好適なコンピュータシステム上で、本明細書に記載されるような本発明の方法を実行するのに好適なコンピュータコードに関する。
【０６６７】
本発明の一態様は、コンピュータ上で実行されたときに本明細書に記載されるような本発明による方法を実施するように適合されているコンピュータプログラム手段を含むコンピュータプログラムに関する。
【０６６８】
本発明の一態様は、コンピュータ読取可能媒体に格納された、上記のようなコンピュータプログラムに関する。
【０６６９】
本発明の一態様は、好適なコンピュータ上で、本明細書に記載されるような本発明の方法を実行するのに好適なコンピュータコードを記憶するデータ記憶媒体に関する。
【０６７０】
一実施形態においては、上記のコンピュータコード又はコンピュータプログラムは、本明細書に記載されるような予測数学モデルを表すコンピュータコード及び／もしくはコンピュータ読取可能データを含むか、又はそれを伴っている。
【０６７１】
一実施形態においては、上記のコンピュータコード又はコンピュータプログラムは、本明細書に記載されるような予測数学モデルを算出するデータを表すコンピュータコード及び／もしくはコンピュータ読取可能データを含むか、又はそれを伴っている。
【０６７２】
本発明の一態様は、本明細書に記載されるような予測数学モデルを表すコンピュータコード及び／又はコンピュータ読取可能データに関する。
【０６７３】
本発明の一態様は、本明細書に記載されるような予測数学モデルを表すコンピュータコード及び／又はコンピュータ読取可能データを記憶するデータ記憶媒体に関する。
【０６７４】
本発明の一態様は、本明細書に記載されるような予測数学モデルを表すコンピュータコード及び／もしくはコンピュータ読取可能データを用いてプログラムされた、もしくはロードされたコンピュータまたは連結されたコンピュータなどのコンピュータシステム又は装置に関する。
【０６７５】
コンピュータを、例えば、内部的に(例えば、同じ回路板上、同じユニットの一部である異なる回路板上で)、ケーブル(例えば、ネットワーク構築、イーサーネット、インターネット)により、ワイヤレス技術(例えば、ラジオ、マイクロ波、衛星リンク、セル電話)を用いて、又はそれらの組合せにより、連結することができる。
【０６７６】
データ記憶媒体及びコンピュータ読取可能媒体の例としては、チップ媒体(例えば、ROM、RAM、フラッシュメモリー(例えば、Memory Stick(商標)、Compact Flash(商標)、Smartmedia(商標))、磁気ディスク媒体(例えば、フロッピーディスク、ハードドライブ)、光ディスク媒体(例えば、コンパクトディスク(CD)、デジタル多用途ディスク(DVD)、磁気-光(MO)ディスク)、及び磁気テープ媒体が挙げられる。
【０６７７】
ここで分析される1H-NMRスペクトルは従来の(及び従って大きく高価な)600 MHz NMR分光測定装置を用いて生成されたが、進行中の技術的進歩は、同様の解像力の分光測定装置がデスクトップユニット(分析しようとするサンプルが血漿又は血清サンプルのように小さい場合)としてまもなく利用可能となることを示唆している。そのようなユニットは自動化されたパターン認識を実行するためのパーソナルコンピュータと一緒に、大病院だけでなく初期医療環境においてもまもなく利用可能となるであろう。
【０６７８】
本発明の一態様は、
(a) サンプルについてのNMRスペクトル強度データを取得するための装置(例えば、NMR分光測定装置、例えば、Bruker INCA 500 MHz)を含む第1の構成要素；並びに、
(b) 本明細書に記載されるような本発明の方法を実行するために機能し得る形で構成されたコンピュータもしくは連結されたコンピュータなどのコンピュータシステム又は装置を有し、前記第1の構成要素に機能し得る形で連結された第2の構成要素、
を含むシステム(例えば、「統合分析装置」、「診断装置」)に関する。
【０６７９】
一実施形態においては、第1及び第2の構成要素を、例えば、単一のコンソール、ユニット、システムなどを形成するように、近くに配置する。一実施形態においては、第1の構成要素と第2の構成要素とは (例えば、別の部屋、別の建物中で)隔離されている。
【０６８０】
そのようなシステムの使用のための単純なプロセスを以下に説明する。
【０６８１】
第1のステップにおいて、サンプル(例えば、血液、尿など)を、例えば、適当な資格を有する医療技師、看護婦などにより、被験者から取得し、このサンプルを必要に応じて加工する。例えば、血液サンプルを採取し、続いて加工して約3時間以内に血清サンプルを得ることができる。
【０６８２】
第2のステップにおいて、このサンプルを適当に加工(例えば、本明細書に記載されるように、希釈により)し、例えば、適当な資格を有するNMR技師により、サンプルについてNMRスペクトルを取得する。典型的には、これには約15分を要する。
【０６８３】
第3のステップにおいて、NMRスペクトルを、本明細書に記載されるような本発明の方法を用いて分析及び／又は分類する。これを、例えば、本明細書に記載の方法を実行するために機能し得る形で配置された、コンピュータもしくは連結されたコンピュータなどのコンピュータシステム又は装置を用いて、実行する。一実施形態においては、このステップを、前のステップから離れた位置で行う。例えば、病院又は診療所に位置するNMR分光測定装置を、例えば、イーサーネット、インターネット、又はワイヤレス接続により、分析／分類を実行する遠隔にあるコンピュータに連結することができる。好適な場合、次いで結果を好適な届け先、例えば、主治医に送達する。典型的には、これには約15分を要する。
【０６８４】
用途
本明細書に記載の方法を、化学、生化学、及び生物学的データの分析において用いることができる。
【０６８５】
本明細書に記載の方法は、疾患の診断及び予後のため、疾患の最適な治療の提供において医師を援助するため、並びに生体外化合物の利益と副作用を理解することによって薬剤開発のプロセスを援助するための強力な手段を提供する。
【０６８６】
さらに、本明細書に記載の方法を、死亡(mortem)後試験、法医学、及び哺乳動物細胞又は生物流体以外の複雑な化学混合物の分析などの非医学的設定において適用することができる。
【０６８７】
本明細書に記載の方法のこれらの用途及び他の用途の例としては、限定されるものではないが、以下のものが挙げられる。
【０６８８】
医学的診断用途
(a) 異常／問題の早期検出。例えば、この技術を用いて、病院の救急部に到着して即座に脳水腫に罹患した被験者を同定することができる。現在では、患者が頭部外傷を有する場合、脳水腫が問題となるかどうかを言うのは困難である：結果として、脳水腫の臨床症状が明らかになるまで介入することが不可能であり、そのときには患者を救うには遅すぎる場合がある。
【０６８９】
同様の例では、救急部に到着する患者を、内出血及び器官破裂についてスクリーニングして、早期の外科的介入を容易にすることができる。
【０６９０】
第3の例では、本明細書に記載の方法を用いて、臨床症状(例えば、骨折；潰瘍の発達)が始まる前に、臨床的に無症候性の疾患(例えば、低い骨密度(例えば、骨粗鬆症)；ヘリコバクター・ピロリ(Helicobacter Pylori)による感染)を同定することができる。
【０６９１】
(b) 診断(疾患の同定)、特に、安価、迅速、及び非侵襲的な診断。例えば、本明細書に記載の方法を用いて、ドレッドミル運動負荷試験、心エコー図、心電図、及び侵襲的血管造影術を冠動脈心疾患の同定のための総合的方法と置き換えることができる。冠動脈心疾患に関する現在の試験は遅く、高価で、侵襲的であるので(罹病率及び死亡率に関連する)、本明細書に記載の方法は大きな利点を提供する。
【０６９２】
(c) 差時的診断、例えば、疾患の分類、疾患の重篤度など、例えば、1、2、もしくは3つ全ての冠動脈に冠動脈疾患を有する患者を識別する能力(例えば、以下を参照)；異なる解剖部位、例えば、左冠動脈対回旋動脈中、又は冠動脈と反対の頸動脈中で疾患を識別する能力。
【０６９３】
(d) 集団標的化。症状(例えば、冠動脈心疾患、骨粗鬆症)は、罹病率又は死亡率に有意に関連し得る急性の事象(例えば、心臓発作、骨折)まで長年の間、臨床的に無症候性であり得る。薬剤はこの急性事象を予防するのを助けるために存在し得るが(例えば、心臓病についてはスタチン、骨粗鬆症についてはビスホスホナート)、これらは集団レベルでは効率的に標的化できないことが多い。集団スクリーニングに有用である試験に関する要求は、それらが安く、非侵襲的でなければならないことである。本明細書に記載の方法は集団スクリーニングに理想的に好適である。単一の血液サンプルを用いた複数の疾患についてのスクリーニング(例えば、骨粗鬆症、心臓病、及び癌)はさらに、スクリーニングの費用／利益比を改良する。
【０６９４】
(e) 代謝性疾患(例えば、先天性代謝異常)の分類、フィンガープリント、及び診断。
【０６９５】
(f) 感染性疾患の同定、分類、その進行の測定、及びその治療のモニタリング。
【０６９６】
(g) 過剰な用量で使用された薬剤の特性評価及び同定。例えば、患者は過剰投与後に無意識となる場合があり、及び／又は過剰な用量で摂取された薬剤の性質が未知である場合がある。本明細書に記載の方法を用いて、過剰投与の生物学的結果を特性評価し、作用を逆転させる迅速な介入を容易にする候補薬剤を迅速に同定することができる。かくして、オピオイドの過剰投与はナロキソンにより迅速に無効化することができた。
【０６９７】
(h) 毒物、及び中毒の代謝的又は生物学的結果の特性評価及び同定。中毒の多くの犠牲者(例えば、子供)は、自分が摂取した物質の性質に気づかない。さらに、被験者が無意識であるか、又は意思疎通することができない場合もある。本明細書に記載の方法を用いて、中毒の生物学的結果を特性評価し、候補毒物を迅速に同定することができる。これにより、典型的には毒性物質への曝露(例えば、摂取)後、できるだけ迅速に行う必要がある、好適な解毒剤の投与が容易になる。
【０６９８】
医学的予後用途
(a) 予後(将来の結果の予測)、例えば、回顧的予後を行うための「古い」サンプルの分析。例えば、サンプルを用いて狭心症の患者間の心筋梗塞の危険性を評価し、心臓発作に進行する最も大きい危険性を有する者に、より積極的な治療戦略を適用することができる。
【０６９９】
(b) 特定の徴候に罹患する危険性を有する人々を同定するための危険性評価。本明細書に記載の方法を集団スクリーニング(診断のため)に用いることができるが、この場合、特定の疾患を発生する危険性についてスクリーニングすることができる。そのような手法は、有効な予防法が知られているが、それを有効なものとするためには疾患の発達の前に適用する必要がある場合に有用である。例えば、ビスホスホナートは骨粗鬆症における骨の損失の防止に有効であるが、低い骨密度を病理学的に増加させることはない。従って、理想的には、これらの薬剤を骨の損失が発生する前に適用する。これは、将来の疾患の予測(予後)を容易にする技術によってのみ行うことができる。本明細書に記載の方法を用いて、疾患の開始前に予防を始めることができるように、将来、骨密度を失う高い危険性を有する人々を同定することができる。
【０７００】
(c) 広範囲の疾患罹患性についての出生前スクリーニング。本明細書に記載の方法を用いて、出生前スクリーニングのために予定日前の胎児(例えば、絨毛膜絨毛サンプリング又は羊水穿刺中)から採取した血液又は組織を分析することができる。
【０７０１】
治療的介入への援助
(a)治療的モニタリング、例えば、治療の進行をモニタリングすること。例えば、連続的診断試験を作成することにより、被験者が治療計画の開始後、正常に戻るかどうか、及びその程度を測定することができるであろう。
【０７０２】
(b)患者の服薬遵守、例えば、治療による患者の服薬遵守をモニタリングすること。患者の服薬遵守は、特に有意な副作用を有する治療については非常に乏しいことが多い。患者は治療計画に従うことを要求することが多いが、これはいつもというわけではない。本明細書に記載の方法により、薬剤濃度を直接測定すること、及びまた薬剤の生物学的結果を試験することの双方により、患者の服薬遵守をモニタリングすることが可能となる。かくして、本明細書に記載の方法は、患者は精査の直前に薬剤を摂取するが、前の週又は月に関しては従うのに失敗しているので、服薬遵守をモニタリングする(薬剤の血漿濃度を測定することなど)既存の方法よりも有意な利益を提供する。治療の生物学的結果をモニタリングすることにより、長期の服薬遵守を評価することが可能である。
【０７０３】
(c) 毒物学、例えば、患者ごとに基づく、罹患した任意の副作用の高度なモニタリング。これにより、特異体質毒性の精査が容易になる。大部分の患者には認められない、治療に由来する現実の臨床的に有意な副作用に罹患する患者もいる。本明細書に記載の方法の適用により、治療を適宜中止するか、又は改変することができるように、これらの稀な特異体質毒性を迅速に同定することが容易になる。そのような手法により、治療を各患者の個々の代謝に合わせることが可能となる。
【０７０４】
(d) 本明細書に記載の方法を、薬理遺伝学に類似した「薬理メタボノミクス」に用いることができる。例えば、被験者を、「応答」の証拠としてメタボノミックプロフィールを用いて「応答群」と「非応答群」に分割した後、メタボノミックプロフィールの特徴を用いて特定の治療過程に応答する可能性がある将来の患者を標的化することができる。例えば、スタチンを与えられた患者を、冠動脈心疾患に関連するリポタンパク質の希薄な組成物中における有益な変化について、本明細書に記載の方法を用いてモニタリングすることができる。これに基づいて、患者を「スタチン応答性」又は「スタチン非応答性」に分類することができる。第2段階において、本明細書に記載の方法を未処理のメタボノミックフィンガープリントに再適用して、スタチンへの将来の応答を予測するパターン要素を同定することができる。かくして、臨床医は結果を評価するのに数週間又は数ヶ月も待つ必要がなく、他の患者をスタチンで治療するべきかどうかを知ることができる。
【０７０５】
薬剤開発のためのツール
(a) 薬物療法及び効力の臨床評価。治療的モニタリングについては、本明細書に記載の方法を新規治療法の効力についての臨床試験における1つのエンドポイントとして用いることができる。連続的診断フィンガープリントが正常に向かう程度を、候補治療法の効力の尺度の1つとして用いることができる。
【０７０６】
(b) 薬剤及びモデル化合物の毒性的副作用の検出(例えば、薬剤開発プロセス及び臨床試験における)。例えば、第1相試験中に新規治療の毒性作用の主要な部位(例えば、肝臓、腎臓など)を同定し、並びに後期段階の臨床試験中に特異体質毒性を同定することができる。
【０７０７】
(c) 疾患のトランスジェニック動物モデルの品質制御における改良；疾患のトランスジェニックモデルの設計の援助。種々の疾患のトランスジェニックモデルは新規治療法の前臨床開発にとって有用であった。このトランスジェニックモデルはヒト疾患の表現型マーカーの多くを概括し得るが、同様の生物学的機構が得られる表現型の原因となるかどうかは不明確であることが多い。
【０７０８】
(d) 疾患の他の動物モデル。例えば、マウスへのウシII型コラーゲンの注入を慢性関節リウマチのモデルとして用いることが多く、これは関節の腫れ及び自己抗体をもたらすが、この表現型をもたらす機構はヒト疾患とほとんど共通していない。結果として、動物モデルにおいて有効である治療はヒトにおいては無効である場合がある。本明細書に記載の方法を用いて、疾患の動物モデルを得るために用いられる遺伝子操作又は他の介入の代謝的及び表現型的結果を試験し、それらをヒトにおける疾患に特徴的な代謝的及び表現型的変化と比較することにより、様々なヒト疾患の動物モデルを実証することができる。
【０７０９】
(e) 疾患及び／又は組織もしくは器官の損傷の新規な生化学的マーカーの探索。例えば、δ3.22周辺のNMRビンを、冠動脈心疾患と特に関連していると同定し(以下の実施例を参照)、関連する種を、治療的に介入する冠動脈心疾患の新規な代謝的マーカーとして同定した。
【０７１０】
商業的用途及び他の非医学的用途
(a) 疾患の将来の危険性を評価する保険会社にとっての商業的必要性に応えるための、保険数理評価のための商業的分類。例としては、健康保険及び一般生命保険の支給が挙げられる。この用途は、その目的が正確な保険数理情報を提供することであること以外は、集団スクリーニングにおける予後評価及び危険性評価と類似している。
【０７１１】
(b) 臨床試験における登録のための特定の症状に罹患しているか、又はその危険性を有する個体を選択する能力についての商業的必要性に応えるための、臨床試験の登録。例えば、現在では、心臓病を予防することを意図した薬剤の効力を評価するための臨床試験を実施するためには、少なくとも4,000人の被験者を登録し、彼らを4年間追跡する必要がある。心臓病に罹患した個体を選択することが可能であった場合、400人の被験者を用いて2年間追跡することにより、費用を25倍以上軽減することができると評価される。
【０７１２】
(c) 違法薬物、及び薬物乱用の代謝的もしくは生物学的結果の特性評価及び同定。所望の治療剤による患者の服薬遵守のモニタリングに関する本明細書に記載の方法を用いて、違法な薬物又はその代謝物が精査の時点で系中に存在しない場合でさえ、該薬物乱用の代謝的結果を試験し、該薬物の使用を確認することができる。これにより、禁止された物質を慢性的に使用するが、同定されるのを回避するためにその使用を一時的に中止するということができなくなる。違法薬物(ヘロイン、コカイン、アンフェタミンなど)の常習的使用者の同定に警察が使用するために、又はスポーツにおける禁止物質の使用をモニタリングするために(例えば、運動選手間での筋肉増強剤の使用を検出するため)、この用途を適用することができる。
【０７１３】
(d) 病理学及び死亡後試験への適用。例えば、本明細書に記載の方法を用いて、死亡後試験を受ける被験者において死亡の直接の原因を同定することができる。
【０７１４】
(e) 法医学への適用。例えば、本明細書に記載の方法を用いて、被験者(精査の時点で死んでいても生きていてもよい)に対する様々な作用の代謝的結果を同定することができる。例えば、本明細書に記載の方法を、窒息死、中毒、性的刺激、又は恐怖の代謝的結果を同定するのに適用することができる。
【０７１５】
(f) 哺乳動物細胞又は生物流体以外のサンプルの分析。例えば、本明細書に記載の方法を、品質について専門家により分類された1パネルのワインに適用することができる。良好な品質に関連するパターンを認識することにより、ブレンドの製造中にワイン製造業者によって、並びに与えられたワインの品質の迅速で独立の評価を容易にするためにワイン購入者によって、本明細書に記載の方法を用いることができる。
【０７１６】
(g) 本明細書に記載の方法を用いて、(既知もしくは新規の)遺伝子型及び／又は表現型を同定し、並びに生物の表現型又は遺伝子型を決定することができる。これは好適な治療の選択を援助し、又は薬剤開発プロセスにおけるその妥当性の評価を容易にする。例えば、疾患状態、感染状態、又は治療を受けている個体の一団におけるメタボノミックデータの作成により、疾患、症状、又は治療に対する応答に関する対立遺伝子ベースが存在することを示唆する、2つ以上のサブ群に分けることができる個体群の応答プロフィールが示唆される。例えば、特定の表現型は特定の薬剤を用いた治療に対して感受性が高くないが、別の表現型は治療に対する感受性が高い場合がある。逆に、ある表現型はある薬剤を代謝できず、従ってそれを排泄できないために毒性を示すことがあるが、この薬剤は別の表現型ではこの作用を示さないために安全である場合がある。例えば、メタボノミック方法を用いて、生物のアセチル化能の状態を測定することができる：薬剤代謝物の「速い」及び「遅い」アセチル化に対応する2つの表現型が存在する。表現型決定を、尿のみに基づいて(すなわち、生体外物質を投与せずに)、又はアセチル化に関する潜在能力を有する生体外物質(例えば、ガラクトサミン)を投与した後の尿に基づいて達成することができる。また、同様の方法を用いて、他の酵素多型、例えば、シトクロムP450多型などの他の差異を決定することもできる。
【０７１７】
以下に示すように、本明細書に記載の方法を成功裏に用いて、双生児を、同一性双生児であるか、又は非同一性双生児であるかを識別することができる。
【０７１８】
また、本明細書に記載の方法を、例えば、1個以上の遺伝子が除去されるか、もしくは非機能的にされた「ノックアウト動物」において；1個以上の遺伝子が同じか、もしくは異なる種から組み込まれた「ノックイン」動物において；又はアルツハイマー病のモデルなどの、マウス脳においてβアミロイドタンパク質の過剰発現をもたらすモデルにおけると同様に、遺伝子のコピー数を増加させた動物において、遺伝子改変の生化学的結果に関する研究に用いることもできる。遺伝子を、細菌、植物及び動物種間で移動させることができる。
【０７１９】
包括的な「バイオノミック」系におけるゲノミック、プロテオミック、及びメタボノミックなデータセットにより、混乱したin vivo機能の全体論的評価が可能となる。
【０７２０】
本明細書に記載の方法を、他の方法、例えば、種々のゲノミック、ファーマコゲノミック、及びプロテオミック方法に対する代替物又は付加物として用いることができる。
【実施例】
【０７２１】
以下は単に本発明を例示するために提供される実施例であり、本明細書に記載の本発明の範囲を限定することを意図したものではない。
【０７２２】
実施例1
同型対非同型双生児
上記で考察したように、本発明者らは、正確な数学的モデルを得た後、続いて試験サンプルもしくは被験者の分類、及び／又は診断に用いることができる、試験集団からデータ(例えば、NMRスペクトル)を分析する新規な方法(多変量統計解析及びパターン認識(PR)技術、及び必要に応じてデータフィルタリング技術を用いる)を開発した。
【０７２３】
これらの技術を、同型及び非同型の双生児を同定する状況において、血清の分析に適用した。メタボノミック分析は同型双生児と非同型双生児とを識別することができる。同型及び非同型双生児に関する新規な診断バイオマーカーを同定し、関連する分類のための方法を開発した。
【０７２４】
本実施例は、同型一卵性(MZ)双生児と非同型二卵性(DZ)双生児との間の代謝における生涯の差異がどのように1H NMRに基づくメタボノミクス、特に、本明細書に記載の方法により関連付けられるかを説明するものである。2つの型の双生児にはほとんど違いがないが、本明細書に記載の方法は、子宮で、この場合、50年以上前に起こった変化を検出することができる。
【０７２５】
同型(MZ)双生児と非同型(DZ)双生児の比較を包括的に用いて、様々な表現型、生理学的(血圧など)及び分子的(種々のサイトカインの血漿濃度など)表現型の双方における変化に対する遺伝的差異の寄与可能性を評価した。これらの研究は、その正確性について、MZ双生児及びDZ双生児の対が、彼らが共有する遺伝物質の比率においてのみ異なるという仮定に基づくものである。この仮定はいくつかの議論の課題であったが、成人したMZ双生児とDZ双生児との間の他の系統的差異に関する直接的証拠はほとんどない。
【０７２６】
そこで、1H-NMRに基づくメタボノミック分析を、様々な表現型の遺伝的分析に以前に用いたMZ及びDZ双生児対の一団に適用した。204人の被験者についての臨床データを以下の表1-1-TWにまとめる。各パラメーターについては、1つの標準偏差(SD)と共に平均値を与え、ここでnは被験者数である。一般的には、測定したパラメーターに基づけば、MZ及びDZ双生児間には差異はない。
【表２】
2004528559.tif 000003
【０７２７】
NMRスペクトルの取得
血液を各患者から採取し、室温にて2時間、プラスチックチューブ中で凝固させ、遠心分離により血清を回収した。血清のアリコートをアッセイするまで-80℃にて保存した。
【０７２８】
NMR分析の前に、サンプル(150μl)を溶媒溶液(10％ D2O v/v、0.9％ NaCl w/v)(350μl)で希釈した。次いで、希釈したサンプルを5 mmの高品質NMRチューブ(Goss Scientific Instruments Ltd)中に入れた。
【０７２９】
血清サンプルの従来の1-D1H NMRスペクトルを、「NMR実験パラメーター」の節に説明する条件を用いてBruker DRX-600分光測定装置上で測定した。
【０７３０】
NMR実験パラメーター
(a) 一般：
サンプルは分光測定装置中では非スピン性である。
【０７３１】
温度：300 K
運転周波数：600.22 MHz
スペクトル幅：8389.3 Hz
データポイント数(TD)：32 K
走査数：64
ダミー走査数：4(獲得の開始前に1度のみ)
獲得時間：1.95 s
(b) パルスシーケンス
noesypr1d(マニュアルに列挙されるような、Bruker standard noesypresat sequence)：RD-90°-t1-90°-tm-90°-FID
弛緩遅延(RD)：1.5 s
固定間隔(t1)：4μs
混合時間(tm)：150 ms
90°パルス長：10.9μs
合計再循環期間：3.6 s
RD及びtm中の水共鳴での2回目の照射
(c) 位相サイクリング
RFパルスと受信装置の位相を連続走査上でサイクルさせて、PH1が最初の90°パルスを指し、PH2が2回目のパルスを指し、PH3が3回目のパルスを指し、PH31が受信装置の位相を指す、以下のスキームに従って人為的影響を除去した。以下のスキームにおいて：
0は0°位相増分を示す
1は90°位相増分を示す
2は180°位相増分を示す
3は270°位相増分を示す
PH1＝0 2
PH2＝0 0 0 0 0 0 0 0 2 2 2 2 2 2 2 2
PH3＝0 0 2 2 1 1 3 3
PH31＝0 2 2 0 1 3 3 1 2 0 0 2 3 1 1 3
(d) FIDの加工：
これをXWINNMR(バージョン2.1、Bruker GmbH、Germany)を用いて行った。
【０７３２】
FIDの最後に自動ゼロ化x2。
【０７３３】
+0.3 Hzの線拡大に等しい負の指数によりFIDを掛けることによる線拡大。
【０７３４】
フーリエ変換。
【０７３５】
(e) NMRスペクトルの加工：
これをXWINNMR(バージョン2.1、Bruker GmbH、Germany)を用いて行った。
【０７３６】
スペクトルのピーク位相を、ゼロ及び1桁目のパラメーターPHC0、PHC1を用いて手動で調整した。
【０７３７】
ベースラインをコマンド「basl」を用いて手動で補正した。これにより様々な程度の多項式のベースラインの差引きが可能となる。最も単純なのは、DCオフセットを除去するために定数を差し引くことであるが、これは本発明の事例では効率的である。他の事例では、調整可能なスロープの直線を差し引くか、又は二次方程式関数により規定されるベースラインを差し引く必要がある場合がある。その可能性は、事実上、四次方程式までの関数に関するソフトウェア内に存在する。
【０７３８】
適切に位相化し、ベースラインを補正すれば、完全なスペクトルはシグナルの主なセットの両側(すなわち、範囲δ0〜10の外側)上で平坦な特徴のないベースラインを示し、目的のピークは明確な同位相の吸収プロフィールを示した。
【０７３９】
スペクトル中の1H NMR化学シフトを乳酸のメチル基の化学シフト(δ 1.33で取得した二重線の真中)と比較して規定した。
【０７４０】
(f) 記述子へのNMRスペクトルの換算
領域δ 10〜δ0.2中の1H NMRスペクトルを、AMIX(Analysis of MIXtures software、バージョン2.5、Bruker、Germany)を用いて245個の領域又は等しい長さ(δ 0.04)の「バケット」に区分化した。各区分におけるスペクトルの積分を算出した。水共鳴の抑制における変動の効果、及びまた溶媒交換プロトンを介する部分的交叉溶媒飽和により引き起こされる尿素シグナルにおける変動の効果を除去するために、領域δ 6.0〜4.5を整数0に設定した。以下のAMIXプロフィールを用いた：
2004528559.tif 000004
積分データを、Excel(Microsoft, USA)を用いて総スペクトル面積に対して正規化した。強度を全ての含まれる領域に渡って積分し、次いで各領域を総積分で割り、定数(すなわち、100、最終積分強度が総強度の百分率として表されるように)を掛けた。
【０７４１】
次いで、正規化されたデータをSIMCA-P(バージョン8.0 Umetrics, Sweden)ソフトウェアパッケージにエクスポートし、各記述子を平均中心化した。従って、全てのその後の分析は正規化された平均中心化されたデータ上で実施されたものである。
【０７４２】
データの分析
NMRスペクトルの視覚的比較はDZ双生児対からの個体と比較してMZ双生児対からの個体間で明らかな差異を示さなかった。
【０７４３】
主成分分析(PCA)パターン認識技術の適用はいくらかの分離を示した；しかしながら、DZ双生児とMZ双生児の間で重複が多すぎた。DZ双生児のいくらかのクラスター化が図1-1A-TWに示されるプロットの左手側で明らかであったが、これは有意な体系的差異がMZ及びDZ双生児対を構成する個体間に存在することを示唆している。どのスペクトルの要素が2つの型の双生児を識別するのに最も大きく寄与するかを示す、対応する負荷プロットを図1-1B-TWに示す；最も影響力のある負荷は1.34、1.30、1.26、1.22、0.90及び0.86 ppmである。
【０７４４】
双生児から得たスペクトルにOSCを適用した後、PCAを適用し、グループ間の差異の程度を強調したが、分離に寄与するスペクトル領域は変化しなかった。MZ及びDZ双生児間の改善された分離は図1-1C-TWに示されるスコア散布図中で明らかであり、MZ双生児サンプルは該プロットの右上で、DZ双生児サンプルは該プロットの左下で優位を占めている。今、最適な分離はPC1及びPC2で観察される。対応する負荷プロットを図1-1D-TWに示す；最も影響力のある負荷は3.22、1.38、1.34、1.30、1.26、1.22、1.18、0.90、0.86及び0.82 ppmである。
【０７４５】
OSCの適用後、同じデータを用いて実施した部分最小二乗判別式解析(PLS-DA)を実施した。PC2及びPC1の得られたスコアを図1-2E-TWに示す。対応する負荷プロットを図1-2F-TWに示す。
【０７４６】
MZ及びDZ双生児から得たOSCフィルタリングされたNMRデータから算出されたPLS-DAモデルに関する変量重要性プロット(VIP)の区分を図1-2A-TWに示す。
【０７４７】
MZ及びDZ双生児から得たOSCフィルタリングされたNMRデータから算出されたPLS-DAモデルに関する回帰係数を図1-2B-TWにグラフとして示す。
【０７４８】
MZ双生児とDZ双生児の間の分離を引き起こすのに最も影響力のある11個の負荷(変数)を以下の表1-2-TWにまとめる。帰属は、負荷と、NMRデータの公開されたテーブルとを比較することにより行った。
【表３．１】
2004528559.tif 000005
【表３．２】
2004528559.tif 000006
検証
MZ双生児とDZ双生児を分離するモデルを検証するために、予測分析を行った。サンプル(6組のMZ及び6組のDZ)を取り出して検証セットを構成した；残りのサンプルについてモデルを算出し、続いてこれを用いて検証セット中のサンプルの分類メンバーシップを予測した。このモデルを、OSCフィルタリングされたデータを用いる部分最小二乗判別式解析(PLS-DA)を用いて算出した。得られたｙ−予測された散布図を、サンプルが分類1(MZ)又は分類0(DZ)として割当てられ、カットオフが0.5である図1-3-TWに示す。PLS-DAモデルは83％の事例において接合子性を正確に予測し、さらに、2成分モデルについては、99％の信頼限界を用いて、83％以上の有意性で分類を予測することができる。
【０７４９】
明らかに、後期成人期に存続するDZ対と比較して、MZ双生児対を構成する個体間に様々な系統的な代謝的差異が存在していた。結果として、MZ対とDZ対は彼らが共有する遺伝物質の比率においてのみ異なるという仮定は妥当ではない。
【０７５０】
2群間の代謝的差異は生物学的なものであり、統計的に有意である。リポタンパク質代謝及びケトン体経路の双方は中間代謝網において中心的な位置を占める。結果として、他の表現型(血圧、炎症細胞集団、及びサイトカインレベルなど)の多くが影響を受け得ると推定される。
【０７５１】
多くの表現型がそれ自体MZ及びDZ双生児間で異なるわけではないという観察は、同型及び非同型双生児が、彼らが共有するゲノムの比率以上に異なるという関係を排除するものではないことに注目することが重要である。これらの観察に基づけば、遺伝性の双生児に基づく研究が、ある場合には非常に有意に、様々な表現型の制御に対する遺伝的変動の寄与を過剰評価することはもっともらしい。双生児研究は任意の特徴の遺伝性について上方評価を提供し得るに過ぎず、双生児から誘導される遺伝性評価に基づいて関連する多型性に関する研究を開始する前に注意を払うべきである。
【０７５２】
実施例2
高血圧
上記で考察したように、本発明者らは正確な数学的モデルを得た後、続いて試験サンプルもしくは被験者の分類、及び／又は診断に用いることができる、試験集団からデータ(例えば、NMRスペクトル)を分析する新規な方法(多変量統計解析及びパターン認識(PR)技術、及び必要に応じてデータフィルタリング技術を用いる)を開発した。
【０７５３】
これらの技術を高血圧の状況において血清の分析に適用した。メタボノミック分析は高血圧を有する個体と高血圧を有しない個体とを識別することができる。高血圧の新規な診断バイオマーカーを同定し、関連する診断のための方法を開発した。
【０７５４】
NMRスペクトルの取得
本明細書に記載の冠動脈心疾患(CHD) NCA/TVD試験の一部として回収した血清サンプル上で分析を行った。
【０７５５】
データを、以下のように最高血圧(SBP)に従って分類した：
低SBP(130 mmHg以下；28サンプル)-三角(黒塗り三角形)、
中SBP(131〜149 mmHg；19サンプル)-丸(●)、
高SBP(150 mmHg以上；17サンプル)-四角(■)。
【０７５６】
血液を各患者から採取し、室温にて2時間、プラスチックチューブ中で凝固させ、遠心分離により血清を回収した。血清のアリコートをアッセイするまで-80℃にて保存した。
【０７５７】
NMR分析の前に、サンプル(150μl)を溶媒溶液(10％ D2O v/v、0.9％ NaCl w/v)(350μl)で希釈した。次いで、希釈したサンプルを5 mmの高品質NMRチューブ(Goss Scientific Instruments Ltd)中に入れた。
【０７５８】
血清サンプルの従来の1-D1H NMRスペクトルを、「NMR実験パラメーター」の節に説明した条件を用いてBruker DRX-600分光測定装置上で測定した。
【０７５９】
データの分析
主成分分析(PCA)モデルを、低、中、及び高SBPを有する患者から得た血清の1D1H NMRスペクトルから算出した。対応するスコア及び負荷プロットを、それぞれ図2-1A-HYP及び図2-1B-HYPに示す。異なるSBPサンプル間の分離を引き起こすのを担うNMRスペクトルのこれらの領域も図2-1B-HYPに示す。このサンプル間には実質的な重複が存在する。
【０７６０】
主成分分析(PCA)モデルを、低、中、及び高SBPを有する患者から得た血清の1D1H NMRスペクトルから算出したが、この事例では、PCAの前に、分類と相関しない変動を除去するのに役立ち、従って、その後のデータ分析を改善する直交シグナル補正(OSC)の適用によりデータをフィルタリングした。対応するスコア及び負荷プロットを、それぞれ図2-1C-HYP及び図2-1D-HYPに示す。異なるSBP間の改善された分離は図2-1C-HYPにおいて明らかであり、特に、低SBPサンプルはPCAプロットの右側で優位を占めている。
【０７６１】
異なるSBPサンプル間の分離を引き起こすのを担うNMRスペクトルのこれらの領域も図2-1D-HYPに示す。低SBPサンプルの分離に影響する領域はδ 1.30とδ 1.26周辺にある(脂質、特にVLDL及びLDLの(CH2)n鎖)。中SBPサンプル及び高SBPサンプルの分離に影響する領域はδ 0.86(脂質、CH3)、δ 1.22(脂質、特にHDLの(CH2)n)、及びδ 3.22(コリンの-N(CH3)3+)周辺にある。
【０７６２】
パターン認識ソフトウェアパッケージ(SIMCA)はデータを2次元でのみ表示し、この実施例においては3つのサンプル分類が存在するという事実に起因して、このモデルについて算出された時間で2つの分類をプロットする必要がある。スコアプロット及び各対(「低」及び「中」；「中」及び「高」；「低」及び「高」)に関する対応する負荷を図2-1E-HYPに示す。
【０７６３】
(未管理PCAではない)改善された分離はPLS-DAを用いれば可能である。また、PLS-DAモデルについて算出された時間で2つの分類をプロットする必要がある。スコアプロット及び各対(低及び中；中及び高；低及び高)に関する対応する負荷を図2-1F-HYPに示す。
【０７６４】
図2-1F-HYPは低SBPと中SBPの間の分離を図示し(図2-1F(1)-HYP)、また低SBPと高SBPの間の分離を図示する(図2-1F(5)-HYP)。しかしながら、中SBPと高SBPサンプルの間には重複が存在する(図2-1F(3)-HYP)。これらの結果は、低SBPサンプルのNMRプロフィールが中及び高SBPサンプルのNMRプロフィールとは異なることを示唆している。さらに、中及び高SBPサンプルのNMRプロフィールには大きい程度の類似性が存在するに違いなく、これは図2-1F(3)-HYPで観察される重複を説明するものである。低SBPサンプルの除去と共に、領域δ 1.30は影響力が低くなることに留意されたい(図2-1F(4)-HYP)。
【０７６５】
図2-2-HYPは、図2-1F-HYPに記載のPLS-DAモデルから誘導される変量重要性プロット(VIP)及び回帰係数プロットの区分を示す。
【０７６６】
回帰係数プロットにおいて、各バーは0.04 ppmをカバーするスペクトル領域を表し、1分類のSBPサンプルの1H NMRプロフィールが、第2の分類のSBPサンプルの1H NMRプロフィールとどのように異なるかを示す。x軸上の正の値は、比較的高い濃度の代謝物が存在することを示唆し(NMR化学シフト帰属テーブルを用いて帰属する)、x軸上の負の値は比較的低い濃度を示唆する。
【０７６７】
3つのモデルの各々に関する10個の最も重要な化学シフトウィンドウを以下の表にまとめる。負荷と、NMRデータの公開された表とを比較することにより、帰属を行った。
【表４】
2004528559.tif 000007
【表５】
2004528559.tif 000008
【表６】
2004528559.tif 000009
【０７６８】
検証
種々のモデルについて検証を行った。各事例において、いくつかの1分類のサンプル(たとえば、低、中、高SBP)を構築し、考慮下で対の残りのサンプルについてモデルとの距離を算出した(例えば、低及び中；中及び高；低及び高)。
【０７６９】
モデルとの距離のプロットは残りのサンプルの分類メンバーシップを予測するモデルの能力を示す。距離がさらに遠くなると(DModX)、サンプルはモデルに対してより非類似的になり、従って、このサンプルは非メンバーであると分類される。距離が近くなると、サンプルはモデルに対してより類似的になり、従って、このサンプルはメンバーであると分類される。DCrit線はモデルと近いと考えられるサンプルとモデルから遠いと考えられるサンプルとの間の閾値である。
【０７７０】
図2-2A-HYP
14個の低SBPサンプルを用いて算出されたモデル。
残りの低及び中SBPサンプルを用いて試験。
1.41のDCrit。
予測率：84％。
【０７７１】
全体として、図2-2A-HYPにおいては、低SBPサンプルはモデルに対して近い位置にあるが(DCrit線より下)、中SBPサンプルはモデルから遠い位置にある(DCrit線より上)。
【０７７２】
図2-2B-HYP
9個の中SBPサンプルを用いて算出されたモデル。
残りの低及び中SBPサンプルを用いて試験。
1.50のDCrit。
予測率：84％。
【０７７３】
全体として、図2-2B-HYPにおいては、中SBPサンプルはモデルに対して近い位置にあるが(DCrit線より下)、低SBPサンプルはモデルから遠い位置にある(DCrit線より上)。
【０７７４】
図2-3A-HYP
9個の中SBPサンプルを用いて算出されたモデル。
残りの中及び高SBPサンプルを用いて試験。
1.50のDCrit。
予測率：59％。
【０７７５】
図2-3A-HYPに示されるモデルとの距離のプロットは、全体として、ほとんどのサンプルがモデルと近い位置にあり(DCrit線より下)、従って、中SBPサンプルとして分類されることを示唆している。しかしながらこれは事実に反する。なぜなら、いくつかのサンプルが、実際には高SBPであることが知られているからである。図2-3A-HYPは、中及び高SBPサンプルのNMRスペクトルが非常に類似しており、従って中SBPであるか高SBPであるか予測できないという事実の結果である。これは、中SBPサンプル対高SBPサンプルについてのスコア散布図において観察される分離が少ないという事実と相関している(図2-1E(3)-HYP)。
【０７７６】
図2-3B-HYP
9個の高SBPサンプルを用いて算出されたモデル。
残りの中及び高SBPサンプルを用いて試験。
1.50のDCrit。
予測率：37％。
【０７７７】
図2-3B-HYPに示されるモデルとの距離のプロットは、全体として、ほとんどのサンプルがモデルと近い位置にあり(DCrit線より下)、従って、高SBPサンプルとして分類されることを示唆している。しかしながらこれは事実に反する。なぜならいくつかのサンプルが、実際には中SBPであることが知られているからである。図2-3B-HYPは、中及び高SBPサンプルのNMRスペクトルが非常に類似しており、従って中SBPであるか高SBPであるか予測できないという事実の結果である。これは、中SBPサンプル対高SBPサンプルについてのスコア散布図において観察される分離が少ないという事実と相関している(図2-1E(3)-HYP)。
【０７７８】
図2-4A-HYP
15個の低SBPサンプルを用いて算出されたモデル。
残りの低及び高SBPサンプルを用いて試験。
1.41のDCrit。
予測率：80％。
【０７７９】
全体として、図2-4A-HYPにおいては、低SBPサンプルはモデルに対して近い位置にあるが(DCrit線より下)、高SBPサンプルはモデルから遠い位置にある(DCrit線より上)。
【０７８０】
図2-4B-HYP
9個の高SBPサンプルを用いて算出されたモデル。
残りの低及び高SBPサンプルを用いて試験。
1.50のDCrit。
予測率：83％。
【０７８１】
全体として、図2-4B-HYPにおいては、高SBPサンプルはモデルに対して近い位置にあるが(DCrit線より下)、低SBPサンプルはモデルから遠い位置にある(DCrit線より上)。
【０７８２】
実施例3
冠動脈心疾患(CHD)の診断
上記で考察したように、本発明者らは正確な数学的モデルを得た後、続いて試験サンプルもしくは被験者の分類、及び／又は診断に用いることができる、試験集団からデータ(例えば、NMRスペクトル)を分析する新規な方法(多変量統計解析及びパターン認識(PR)技術、及び必要に応じてデータフィルタリング技術を用いる)を開発した。
【０７８３】
アテローム性動脈硬化症／CHDの状況において、本発明者らは、最も標準的血管造影技術によるアテローム性動脈硬化症／CHDの存在についての、また、様々な従来の危険因子についての、包括的に特性評価された個体から得た血清又は血漿の分析にこれらの技術を適用した。メタボノミック分析はアテローム性動脈硬化症／CHDを有する個体と有しない個体とを識別し；及び／又はアテローム性動脈硬化症／CHDの程度を識別することができる。アテローム性動脈硬化症／CHDのための新規な診断バイオマーカーを同定し、関連する診断のための方法を開発した。
【０７８４】
NMRスペクトルの取得
3つ全ての冠動脈(左前室間動脈、回旋冠動脈及び右冠動脈)の有意な冠動脈疾患(腔内直径の50％を超える減少として定義される)を有する患者をTVD(三枝疾患)群とした。狭心症の症状は少なくとも1ヶ月間安定しており、先の3ヶ月において心筋梗塞に罹患した患者はいなかった。
【０７８５】
胸部疼痛を有し、陽性の運動心電図(J点後、80 msでの少なくとも1 mmの水平又は下方に傾斜するSTセグメント抑制の存在が陽性であると考えられる、Bruceプロトコル(例えば、Bruce、1974; Bermanら、1978；Guyton、1991を参照)を用いる)であるが、正常な冠状血管造影図(2人の独立した観察者により判断される)を有する患者をNCA(正常な冠動脈)群とした。高血圧、糖尿病及び弁性心臓病又は左心室肥大を有するNCA患者を排除した。
【０７８６】
TVD又はNCA群のいずれかについて上記の基準を満たすPapworth Hospital (Cambridgeshire, UK)に存在する連続した患者をこの試験に勧誘した。重篤なCHDを有する36人の患者(TVD患者)及び血管造影的に正常な冠動脈を有する30人の患者(NCA患者)を登録した。これらの患者群に関する臨床データを以下の表3-2-CHDに示す。各パラメーターについては、1個の標準偏差と共に平均値を与える。
【表７．１】
2004528559.tif 000010
【表７．２】
2004528559.tif 000011
血液を各患者から採取し、室温にて2時間、プラスチックチューブ中で凝固させ、遠心分離により血清を回収した。血清のアリコートをアッセイするまで-80℃にて保存した。
【０７８７】
NMR分析の前に、サンプル(150μl)を溶媒溶液(10％ D2O v/v、0.9％ NaCl w/v)(350μl)で希釈した。次いで、希釈したサンプルを5 mmの高品質NMRチューブ(Goss Scientific Instruments Ltd)中に入れた。
【０７８８】
血清サンプルの従来の1-D1H NMRスペクトルを、「NMR実験パラメーター」の節に説明する条件を用いてBruker DRX-600分光測定装置上で測定した。
【０７８９】
スペクトルの視覚的分析
重篤なCHDを有する患者(TVD患者)及び血管造影的に正常な冠動脈を有する患者(NCA患者)から得たヒト血清の600 MHz1H NMRスペクトルを視覚的に比較した(例えば、図3-1-CHD)。2つの群を比較した場合、系統的な差異はほとんど検出できなかった。
【０７９０】
スペクトル中に認められる化学成分を、以前に公開されたデータ(例えば、Nicholsonら、1995；Luiら、1997；Ala-Korpela、1995を参照)に基づいて帰属した。図3-1-CHDに帰属された特徴を以下の表3-3-CHDにまとめる。
【表８．１】
2004528559.tif 000012
【表８．２】
2004528559.tif 000013
データの分析
NMRスペクトルに基づいてTVD患者とNCA患者を識別することが可能であるかどうかを決定するために、主成分分析(PCA)を行った。
【０７９１】
PC2及びPC3のスコアプロット(図3-2A-CHD)は、2つのサンプル分類間に多くの重複が存在するが、いくらかのクラスター化が明らかであることを示している。NCAサンプルとTVDサンプルの間には重複が存在するが、いくらかの分離が明らかであり、NCAサンプルは右上四分円で優位を占め、TVDサンプルは左下四分円で優位を占めている。最適な分離がPC2及びPC3において認められ、従ってt2対t3を図3-2A-CHDに示す。
【０７９２】
対応するPCA負荷散布図(図3-2B-CHD)は、NMRスペクトルのどの領域がNCAサンプルとTVDサンプルの間の分離を引き起こすのを担うかを示す；最も影響力のある負荷は、領域δ 1.30；δ 1.22；δ 3.22；δ 0.86；及びδ 1.26であることが示される。
【０７９３】
OSCの適用後、TVD群とNCA群はPC1及びPC2のスコアプロット中でよく分離された(図3-2A-CHDと比較した図3-2C-CHD)。ここで、NCAサンプル(丸印)は左下四分円において優位を占め、TVDサンプル(四角)は右上四分円において優位を占めている。最適な分離はPC1及びPC2中で観察され、従って、t1対t2を図3-2C-CHDに示す。
【０７９４】
対応する負荷プロット(図3-2D-CHD)は、NMRスペクトルのどの領域がNCAサンプルとTVDサンプルの間の分離を引き起こすのを担うかを示す。重要なことに、フィルタリングされていないデータセット(図3-2B-CHD)におけるクラスター化に寄与したスペクトルの同じ領域もOSCの適用後に認められるクラスター化に寄与していた(図3-2D-CHD)：δ 1.30；δ 1.34；δ 3.22；δ 0.86；及びδ 1.26。
【０７９５】
OSCの適用後、同じデータを用いて部分最小二乗判別式解析(PLS-DA)を行ったところ、優れた分離が得られた。PC2及びPC1の得られたスコアプロット(図3-2E-CHDを参照)；ここで、NCAサンプル(丸印)は右手側を占め、TVDサンプル(四角)は左手側を占める。対応する負荷プロット(図3-2F-CHD)は、NMRスペクトルのどの領域がNCAサンプルとTVDサンプルの間の分離を引き起こすのを担うかを示す。また、同じ領域が出現する：δ 1.30；δ 1.22；δ1.26；δ 1.34；δ 3.22；δ 0.86など。
【０７９６】
OSCフィルタリングされたデータから算出されるPLS-DAモデルについての変量重要性プロット(VIP)の区分を図3-3A-CHDに示す。
【０７９７】
OSCフィルタリングされたデータについての回帰係数を図3-3B-CHDにグラフとして示す。回帰係数については、正の値はTVDサンプル中に存在する比較的高濃度の代謝物を示し(例えば、NMR化学シフト帰属テーブルを用いて帰属する)、負の値は対照サンプルに関して、比較的低濃度を示す。
【０７９８】
PLS-DAモデルについての回帰係数(フィルタリングされていないデータ又はOSCフィルタリングされたデータを用いて取得されたかどうか)はまた、同じスペクトル領域が分類：脂質、主にVLDL及びLDL、並びにコリンの判別に最も強く寄与することを示していた。
【０７９９】
NCAサンプルとTVDサンプルの間の分離を引き起こすのに最も影響力のある負荷(変数)を以下の表3-4-CHDにまとめ、重要度の高い順に列挙する。負荷と、NMRデータの公開されたテーブルとを比較することにより、帰属を行った。
【表９】
2004528559.tif 000014
【０８００】
領域δ 3.22は、リポタンパク質の既知のリン脂質含量に基づいて、リポタンパク質、主にHDLに由来するコリン部分、主にホスファチジルコリンを含有する分子中の-N(CH3)3+基であると帰属される。
【０８０１】
δ 1.30、1.22、1.26及び1.34の領域は全て、リン脂質、コレステロールエステル、及びトリアシルグリセロールとして全てのリポタンパク質中に存在する脂肪アシル基の(CH2)n鎖から生じる。全ての3クラスの化合物の割合はリポタンパク質の種類に渡って変化する。領域δ 1.34-1.22には、通常はLDL及びVLDLとして帰属される2つの広い1H NMRピークが存在するが、しかしながら、両方のピークはそのピーク線幅のためにこれらの領域の全てに影響するであろう。
【０８０２】
リポタンパク質は総ヒト血液タンパク質の約10％を占める。リポタンパク質はタンパク質成分(例えば、アポリポタンパク質)及び脂質成分(例えば、コレステロール、コレステロールエステル、リン脂質、及びトリグリセリド)を含む水に可溶性の複合体である。リポタンパク質は、水性の環境中で親水性ドメインを表面に出す比較的より親水性の殻(主にアポリポタンパク質、リン脂質、及び非エステル化コレステロール)により囲まれた疎水性核(主にコレステロールエステル及びトリグリセリド)を含むと都合よく考えられることが多い。リポタンパク質はおそらく、トリアシルグリセロール、コレステロール(及びコレステロールエステル)、及びその他の脂質(例えば、リン脂質)などの脂質のための輸送タンパク質として働く。
【０８０３】
リポタンパク質のいくつかのクラス(例えば、α、β、広いβ、プレβ)を、その電気泳動の振舞いに従って、ヒト血液中で識別することができる。しかしながら、リポタンパク質は以下のようなその浮上定数(密度)により説明されるように高塩媒体中での超遠心分離法による振舞いによってより都合よく特性評価されている：カイロミクロン、1.006 g/mL未満；超低密度(VLDL)、1.006〜1.019 g/mL；低密度(LDL)、1.019〜1.063 g/mL；高密度(HDL)、1.063〜1.21 g/mL；超高密度(VHDL)、＞1.21 g/mL。リポタンパク質はほぼ球形の形状であることが多く、その直径は約0.1ミクロン(カイロミクロンに関して)〜約5ナノメートル(VHDLに関して)の範囲である。リポタンパク質の分子量は200 kd〜10,000 kdであり、4〜95％の脂質(密度が高くなるにつれて脂質含量は低くなる)である。カイロミクロン及びVLDLはトリグリセリドに富むが(それぞれ、総脂質含量の約90％及び約60％)、LDLはコレステロールに富み(総脂質含量の約60％)、HDLはリン脂質に富む(総脂質含量の約50％)。
【０８０４】
コリン(HO-CH2CH2-N(CH3)3+)は、ホスホリルコリン、グリセロホスホコリン及びホスファチジルコリン(例えば、リン脂質)などの多くの生物学的に重要な種に含まれる。リン脂質は脂質膜、及びまたリポタンパク質の成分である。血漿中で主要なコリン含有種はホスファチジルコリンである。
【０８０５】
検証
PCAにより「クラスター」の存在を確立した後、データをPLS-DAにより分析してモデルの予測力を試験した。
【０８０６】
交叉検証のために、試験下の約80％のサンプル(無作為に選択)を含むトレーニングセットを構築し、これを用いて残りの20％のサンプルの分類を予測した。約80％のサンプルを無作為に選択してPLS-DAモデルを構築し、次いでこれを用いて残りの20％のサンプルの分類メンバーシップを予測した。2つの分類と0.01を超える分類メンバーシップ確率値(99％信頼区間)との間の0.5分割線を用いて、分類メンバーシップを予測した。
【０８０７】
次いで、OSCフィルタリングされたデータのために算出されたPLS-DAモデルを用いて、トレーニングセット中に含まれなかったサンプルの分類メンバーシップを予測した(図3-4-CHD)。約80％のNCAサンプル(丸印)及びTVDサンプル(四角)を用いて、PLS-DAモデルを算出し、これを用いて残りの20％のサンプル(検証セット)(三角、マークしたようにNCA又はTCA)中のTVDの存在を予測した。ｙ−予測した散布図はサンプルに分類1(この場合、TVDに対応)又は分類0(この場合、NCAに対応)のいずれかを割当てる；0.5はカットオフである。PLS-DAモデルは、分類メンバーシップに関する99％の信頼区間に基づいて92％の感度及び93％の特異性でTVDの存在及び非存在を予測した。
【０８０８】
これは、血漿サンプルの1H NMRに基づくメタボノミック分析は、それ自身、侵襲性は最小限であり、サンプルにとって非破壊的であり、侵襲的な血管造影術と比較した場合、臨床的に有用な診断性能を達成することができることを証明するものである。
【０８０９】
本実施例は、主成分分析(PCA)を用いて、正常な冠動脈を有する被験者から、3つ全ての主要な動脈の狭窄症を有するCHD患者を完全に分離することができることを証明するものである。
【０８１０】
さらに、管理されたPLS-DAアルゴリズムを用いて、24人のNCA個体及び30人のTVD個体のみからなるトレーニングセットを用いて未知のサンプルの動脈状態を予測することができる。90％を超える感度及び特異性を達成するのに必要とされるトレーニングセットのサイズが小さいという点がこの技術の力を際立たせる。この技術の臨床への適用を介して得られた実質的により大きなトレーニングセットにより、この技術の診断感度及び特異性はさらに改良されるであろう。
【０８１１】
δ 1.30周辺のピークは主に脂質のCH2共鳴から得られることが知られているが、この領域におけるNMR記述子の値はLDL-コレステロールのレベルと弱く相関しているに過ぎない(r2= 0.20)。これは、これらのウィンドウ中にLDL-コレステロールのレベルと相関しないかなりのNMRシグナル強度情報が存在することを意味する。これは、乳酸及びスレオニンなどのいくつかの小分子代謝物の存在並びにまた生物流体中に存在する他のリポタンパク質(主にVLDL)からの寄与に起因する。LDL及びVLDLのCH2ピークの線幅は著しいので、2つのピークがかなり重複して、両方とも程度の差こそあれこの領域中の全てのウィンドウに影響してしまう。残りの変動は、個体間のLDL粒子の脂質組成における微妙な化学的相違、例えば、脂肪酸側鎖の不飽和度及びリポタンパク質-タンパク質分子の相互作用から生じるようである。そのような観察はリポタンパク質粒子組成物のCHDの発達への寄与を理解するためのNMR及び他の分析技術の両方を用いる進行中の研究に寄与するであろう。しかしながら、非常に高い感度及び特異性をもって個体を正確に分類することができるようにするために、CHDに関連するスペクトルの特徴の原因となる複雑な分子的差異を完全に理解する必要性は全くないという高いデータ密度の代謝分析の重要な面を強調しなければならない。しかしながら、スペクトルの差異の分子的基礎に関するさらなる分析は関連する機構的プロセスへの洞察を与えるであろう。
【０８１２】
実施例4
冠動脈心疾患(CHD)の重篤度の決定
上記で考察したように、本発明者らは正確な数学的モデルを得た後、続いて試験サンプルもしくは被験者の分類、及び／又は診断に用いることができる、試験集団からデータ(例えば、NMRスペクトル)を分析する新規な方法(多変量統計解析及びパターン認識(PR)技術、及び必要に応じてデータフィルタリング技術を用いる)を開発した。
【０８１３】
アテローム性動脈硬化症／CHDの状況において、本発明者らは、最も標準的血管造影技術によるアテローム性動脈硬化症／CHDの存在についての、また、様々な従来の危険因子についての、包括的に特性評価された個体から得た血清又は血漿の分析にこれらの技術を適用した。メタボノミック分析はアテローム性動脈硬化症／CHDを有する個体と有しない個体とを識別し；及び／又はアテローム性動脈硬化症／CHDの程度を識別することができる。アテローム性動脈硬化症／CHDのための新規な診断バイオマーカーを同定し、関連する診断のための方法を開発した。
【０８１４】
NMRスペクトルの取得-CHDの重篤度
1H NMRに基づくメタボノミック分析が存在するCHDの重篤度を識別できるかどうかを決定するために、1、2又は3つの主要な冠動脈の狭窄症を有する個体からサンプルを回収した。これは疾患の重篤度の粗い指示因子であるが、狭窄した血管数は全身のアテローム性動脈硬化プラーク負荷と相関している(少なくとも弱く)と推定される。
【０８１５】
76人の患者(1血管狭窄：「1」型血管疾患を有する28人；2血管狭窄：「2」型血管疾患を有する20人；3血管狭窄：「3」型血管疾患を有する28人)から得た血漿を用いて、1H NMRスペクトル分析を用いてCHDの重篤度を分類した。サンプルの回収方法；NMR分光測定；データ処理；及びパターン認識法は、特に特定しない限り、全て上記と同様であった。
【０８１６】
1、2又は3つ全ての冠動脈の50％を超える狭窄を有する患者(2人の独立した観察者により評価)を集めた点および女性を除外した点以外は、上記と同じ基準に従って患者を集めた。これらの患者群について測定された(従来通りに)臨床データを以下の表3-5-CHDに示す。各パラメーターについては、1個の標準偏差と共に平均値を与える。
【表１０．１】
2004528559.tif 000015
【表１０．２】
2004528559.tif 000016
これらの患者に由来する血液サンプルをDiatube Hチューブに採取し、血小板の少ない血漿を以前に記載のように調製した。血漿のアリコートをアッセイするまで-80℃にて保存した。
【０８１７】
サンプルを取得し、NCA/TVDの節に記載したのと同じ方法及びパラメーターを用いて1-D1H NMRスペクトルを収集した。
【０８１８】
データの分析
1、2、又は3つの狭窄した血管(すなわち、それぞれ「1」型、「2」型、及び「3」型血管疾患)を有する患者から得た血清サンプルについて、1-D1H NMRスペクトルを用いて主成分分析(PCA)モデルを算出した。
【０８１９】
このPCAモデルに関するスコア散布図を図3-5A-CHDに示す。3つの分類のサンプル間には多くの重複が存在するが、特に、プロットの左下を占める「1」型血管疾患サンプルについてはいくらかの分離が明らかである。最適な分離はPC2及びPC1において観察され、従ってt2対t1を図にプロットする。
【０８２０】
対応する負荷プロットを図3-5B-CHDに示すが、これはNMRスペクトルのどの領域が3つの異なる程度の重篤度のCHD間の分離を引き起こすのを担うかを示すものである。重複の程度に起因して、負荷プロットを解釈するのは困難であるが、しかしながら、最も影響力のある負荷は領域：3.22；1.38；1.34；1.30；1.26；1.22；0.90；0.86；及び0.82 ppmである。
【０８２１】
(未管理PCAではなく)PLS-DAを用いれば、改善された分離が可能である。パターン認識ソフトウェアパッケージ(SIMCA)は2次元でのみデータを表示し、及び本実施例では3つのサンプル分類が存在するという事実に起因して、例えば、PLS-DAモデルについて算出された時間で2つの分類をプロットする必要がある。スコアプロット及び各対に関する対応する負荷(「1」及び「2」；「1」及び「3」；「2」及び「3」)を図3-5C-CHDに示す。分類間には依然として多くの重複が存在するが、いくらかの分離が明らかである。
【０８２２】
同じデータを用いて別のPCAモデルを算出した。しかしながら、PCAの前に、分類と相関しない変動を除去するのに役立ち、従ってその後の多変量分析を改良するOSCの適用によりNMRデータをフィルタリングした。
【０８２３】
得られるPCAモデルに関するスコア散布図を図3-6A-CHDに示す。異なる重篤度のCHDの分類間の改善された分離が明らかであり、「1」型血管疾患は左下四分円中で優位を占めている。
【０８２４】
対応する負荷散布図を図3-6B-CHDに示すが、これはNMRスペクトルのどの領域がCHDの重篤度を識別するのを担うかを示すものである。重要なことに、それは図3-5B-CHDに記載されたTVDからNCAを識別することについてと同じ領域である：すなわち、3.22；1.38；1.34；1.30；1.26；1.22；0.90；0.86；及び0.82 ppm。
【０８２５】
また、(未管理PCAではなく)PLS-DAを用いれば改良された分離が可能である。スコアプロット及び各対(「1」及び「2」；「1」及び「3」；「2」及び「3」)に関する対応する負荷を図3-6C-CHDに示す。最も大きい分離は「1」型と「2」型間(図3-6C-(1)-CHD)、及び「1」型と「3」型間(図3-6C-(5)-CHD)で観察される。
【０８２６】
これは「1」型血管疾患に関する代謝プロフィール(NMRスペクトル)が、互いにより類似している「2」型と「3」型に関するプロフィールと比較して異なることを示唆している。
【０８２７】
図3-6C-(1)-CHD〜(6)-CHDに記載される3つのPLS-DAモデルの各々についての変量重要性プロット(VIP)の対及び回帰係数を図3-7-(1)-CHD〜(6)-CHDに示す。
【０８２８】
負荷プロット中の回帰係数は、脂質共鳴により支配される約δ1.30及びδ1.26でのスペクトルウィンドウは、重篤な分類間の分離のほとんどに寄与し、δ3.22(コリン)でのウィンドウはTVD及びNCA患者の比較においては相対的に重要性が低いことを示唆していた。
【０８２９】
検証
OSC-PLS-DAモデルについてのｙ−予測された散布図を図3-8A-CHD、図3-8B-CHD、及び図3-8C-CHDに示すが、これらは1H NMRに基づくメタボノミクスが未知のサンプルの分類メンバーシップ(CHDの重篤度；1、2又は3つの血管が罹患)を予測する能力を証明するものである。各プロットについては、総数の約80％のサンプルを用いてPLSモデルを算出し、次いでこれを用いて残りの20％のサンプルにおける重篤度を予測した。ｙ−予測あれた散布図はサンプルに分類1又は分類0のいずれかを割当てる；及びカットオフは0.5である。
【０８３０】
「1」型及び「2」型血管疾患PLS-DAモデル(図3-8A-CHD)は、88％の事例において重篤度を正確に予測した。さらに、2成分モデルについては、99％の信頼限界を用いて90％以上の有意レベルで重篤度を予測した。
【０８３１】
「2」型及び「3」型血管疾患PLS-DAモデル(図3-8B-CHD)は、88％の事例において重篤度を正確に予測した。さらに、2成分モデルについては、99％の信頼限界を用いて85％以上の有意レベルで重篤度を予測した。
【０８３２】
「1」型及び「3」型血管疾患PLS-DAモデル(図3-8C-CHD)は、75％の事例において重篤度を正確に予測した。さらに、2成分モデルについては、99％の信頼限界を用いて92％以上の有意レベルで重篤度を予測した。
【０８３３】
このメタボノミック分析は異なる重篤度のCHDを有する個体を識別することができる。狭窄が50％を超える主要な冠状血管数の粗いパラメーターを用いてさえ、本実施例はPCA及びPLS-DAが両方とも重篤度に基づいてCHD患者を分類することができることを証明している。分類の完全な分離を達成できないのは、個体を判別するメタボノミック分析における力の欠如と同様、冠状血管造影のみに基づいて重篤度を表すことが不十分であることを反映しているようである。
【０８３４】
実施例5(比較例)
確立された臨床危険因子の使用
本実施例においては、多変量データ分析を用いて、確立された臨床パラメーターに基づくCHDの重篤度を分類した。
【０８３５】
これにより、従来の危険因子に基づくアルゴリズムを用いた診断技術としてメタボノミック分析の性能を直接比較することが可能となる。
【０８３６】
1、2又は3つの血管が狭窄した患者について測定された確立された臨床パラメーターを用いてPCAモデルを算出した。PC1及びPC2に関するスコア散布図を図3-9A-CHDに示す。このPCAモデルは、サンプル間に多くの重複が存在し、分離は明らかでないことを示している；これと、図3-5A-CHD及び図3-6A-CHDとを比較されたい。PCAスコアプロットには分離の証拠が存在しないが、これは臨床パラメーターが「1」、「2」、又は「3」血管疾患の間を識別しないことを示唆している。
【０８３７】
対応する負荷プロットを図3-9B-CHDに示すが、これは、どの確立された臨床パラメーターが3つの異なる程度の重篤度のCHD間の分離を引き起こすのを担うかを示すものである。重複の程度に起因して、この負荷プロットを解釈することは困難である。
【０８３８】
(未管理PCAではなく)PLS-DAを用いれば改善された分離が可能である。パターン認識パッケージ(SIMCA)は2次元でのみデータを表示し、本実施例においては3つのサンプル分類が存在するという事実に起因して、例えば、PLS-DAモデルについて算出された時間で2つの分類をプロットする必要がある。スコアプロット及び各対に関する対応する負荷を図3-9C-CHDに示す。図面から認められるように、確立された臨床パラメーターに基づく分離はNMRデータに基づくものほど明らかではない。
【０８３９】
図3-9C-(1)-CHD〜(6)-CHDに記載の3つのPLS-DAモデルの各々に関する変量重要性プロット(VIP)の対及び回帰係数プロットを図3-10-(1)-CHD〜(6)-CHDに示す。
【０８４０】
測定した危険因子(年齢、血圧、LDL及びHDLコレステロール、総コレステロール、総トリグリセリド、フィブリノーゲン、PAI-1、白血球数、クレアチニン又は喫煙の履歴など)はいずれも、3群間で有意な差異はなかった(各事例においてANOVAによりp＞0.05)。
【０８４１】
これは、上記の1H-NMRに基づくメタボノミック法が既に同定された従来の危険因子のいずれかよりも、単一の血液サンプルに基づいてCHDの重篤度を実質的により良く識別することができることを証明している。
【０８４２】
これらの被験者において測定した他の従来の危険因子(年齢、血圧、リポタンパク質レベル又は凝固パラメーターなど)はクロスセクショナル分析においてさえ、重篤度分類間で差異はなく、従ってCHDの重篤度に基づいて集団内の個体を識別することは完全にはできなかった。これは、メタボノミクスが従来の危険因子分析に対して改良される程度を証明するものである。
【０８４３】
実施例6
骨粗鬆症
上記で考察したように、本発明者らは正確な数学的モデルを得た後、続いて試験サンプルもしくは被験者の分類、及び／又は診断に用いることができる、試験集団からデータ(例えば、NMRスペクトル)を分析する新規な方法(多変量統計解析及びパターン認識(PR)技術、及び必要に応じてデータフィルタリング技術を用いる)を開発した。
【０８４４】
骨粗鬆症の状況において、血清の分析にこれらの技術を適用した。メタボノミック分析は骨粗鬆症を有する個体と有しない個体とを識別することができる。骨粗鬆症のための新規な診断バイオマーカーを同定し、関連する診断のための方法を開発した。
【０８４５】
簡単に述べると、メタボノミック法を骨粗鬆症の研究において被験者についての血清サンプルに適用した。遊離プロリンなどのバイオマーカーを、骨粗鬆症にとって診断的であるとして同定した。続いて、プロリンレベルを用いて、特に、遊離プロリンレベルを考慮にいれた予測数学モデルを用いることにより、患者を分類(例えば、診断)した。
【０８４６】
NMRスペクトルの収集
試験下にある被験者から回収した血清サンプルに対して分析を行った。骨疾患の正式な診断の前に、対照被験者(n=40)及び骨粗鬆症を有する患者(n=29)から血清を取得した。
【０８４７】
データを「対照」(黒塗り三角形)又は「骨粗鬆症」(丸印、●)として分類した。
【０８４８】
骨粗鬆症を、Zスコアとして表される腰椎(LS)の骨密度(BMD)に従って診断した。骨密度が年齢及び性別を一致させた平均値から標準偏差(SD)の１．５倍低いカットオフ値以下(すなわち、-1.5以下のZスコア)であるか、又は脊椎骨折が存在するという、骨粗鬆症の世界保健機関(WHO)の定義(例えば、世界保健機関、1994)を用いて、被験者における骨粗鬆症を診断した。対照被験者はこのカットオフ値を超えるZスコアを有し、骨折の履歴を有さなかった。
【０８４９】
各患者から血液を採取し、室温にて2時間、プラスチックチューブ中で凝固させ、遠心分離により血清を回収した。血清のアリコートをアッセイするまで-80℃にて保存した。
【０８５０】
NMR分析の前に、サンプル(150μl)を溶媒溶液(10％ D2O v/v、0.9％ NaCl w/v)(350μl)で希釈した。次いで、希釈したサンプルを5 mmの高品質NMRチューブ(Goss Scientific Instruments Ltd)中に入れた。
【０８５１】
血清サンプルの従来の1-D1H NMRスペクトルを、「NMR実験パラメーター」の節に説明する条件を用いてBruker DRX-600分光測定装置上で測定した。
【０８５２】
データの分析
主成分分析(PCA)モデルを、対照被験者(黒塗り三角形)及び骨粗鬆症を有する患者(●)から得た血清サンプルの1D1H NMRスペクトルから算出した。対応するスコア及び負荷プロットを、それぞれ図4-1A-OP及び図4-1B-OPに示す。異なるサンプル間の分離を引き起こすのを担うNMRスペクトルのこれらの領域も図4-1B-OPに示す。対照群と骨粗鬆症群の間の分離がPC2において明らかであり、対照サンプルは四分円の下2つを占め、骨粗鬆症サンプルは四分円の上2つを占めている。
【０８５３】
主成分分析(PCA)モデルを、対照被験者(黒塗り三角形)及び骨粗鬆症を有する患者(●)から得た血清サンプルの1D1H NMRスペクトルから算出したが、この事例では、PCAの前に、分類と相関しない変動を除去するのに役立ち、従ってその後のデータ分析を改善する、直交シグナル補正(OSC)の適用によりデータをフィルタリングした。対応するスコア及び負荷プロットを、それぞれ図4-1C-OP及び図4-1D-OPに示す。
【０８５４】
対照サンプルと骨粗鬆症サンプルの間の改良された分離が明らかであり、対照はプロットの左手側を占め、骨粗鬆症は右手側を占めている。また、OSCの適用がPC2においてよりもむしろPC1において観察される最大の変動をもたらすことにも留意されたい。
【０８５５】
(未管理PCAではなく)PLS-DAを用いれば、改良された分離が可能である。スコアプロット及び対応する負荷プロットを、それぞれ図4-1E-OP及び図4-1F-OPに示す。改良された分離が明らかであり、対照はプロットの右手側を占め、骨粗鬆症は左手側を占めている。
【０８５６】
図4-2A-OPは変量重要性プロット(VIP)及び図4-1E-OPに記載のPLS-DAモデルから誘導された回帰係数プロットの断面図を示す。
【０８５７】
図4-2B-OPは、図4-1E-OPに記載のPLS-DAモデルから誘導された回帰係数プロットの断面図を示す。この回帰係数プロットにおいて、各バーは0.04 ppmをカバーするスペクトル領域を表し、1つの対照サンプルの1H NMRプロフィールが骨粗鬆症サンプルの1H NMRプロフィールとどのように異なるかを示すものである。x軸上の正の値は、比較的高い濃度の代謝物が存在することを示し(NMR化学シフト帰属テーブルを用いて帰属する)、x軸上の負の値は比較的低濃度の代謝物を示す。
【０８５８】
PLS-DAモデルについての10個の最も重要な化学シフトウィンドウを以下の表にまとめる。負荷とNMRデータの公開された表とを比較することにより、帰属を行った。
【表１１】
2004528559.tif 000017
【０８５９】
まとめると、対照サンプルに関して、骨粗鬆症サンプルは脂質、プロリン、コリン及び3-ヒドロキシ酪酸のレベルが減少し、乳酸、アラニン、クレアチン、クレアチニン、グルコース、及び芳香族アミノ酸のレベルが増加したようである。これらの種に関連するバケットに関するさらなるデータを以下の表に記載する。また、負荷とNMRデータの公開された表とを比較することにより、帰属を行った。
【表１２．１】
2004528559.tif 000018
【表１２．２】
2004528559.tif 000019
δ3.42及びδ3.46でのプロリン共鳴、δ3.66でのコリン共鳴、δ1.34での乳酸共鳴並びにδ4.14でのβ-ヒドロキシ酪酸についての強度変化は、全て他のピークと重複しており、これを元の1H NMRスペクトルを参照することにより確認した。
【０８６０】
検証
ｙ−予測散布図を用いて検証を行った。図4-3-OPはｙ−予測散布図を示し、従って、未知のサンプルの分類メンバーシップ(対照又は骨粗鬆症)を予測する1H NMRに基づくメタボノミクスの能力を示す。約85％の対照及び骨粗鬆症サンプルを用いて、PLS-DAモデルを構築し、これを用いて残りの15％のサンプル(検証セット)中での疾患の存在を予測した。ｙ−予測散布図はサンプルに分類1(この場合、対照に対応する)又は分類0(この場合、骨粗鬆症に対応する)を割当てる；0.5はカットオフである。PLS-DAモデルは100％の事例において骨粗鬆症の存在又は非存在を予測し、さらに、4成分モデルについては、99％の信頼限界を用いて88％以上の有意レベルで分類を予測することができる。
【０８６１】
診断種／バイオマーカーとしてのプロリン
この分析後、3.38、2.06、2.02、3.34でのバケットを、対照サンプルと比較して、骨粗鬆症患者の血漿においてより低い強度を有するものとして同定した。
【０８６２】
統計分析に用いられる元のNMRスペクトルから誘導されたデータ換算され、区分化されたファイルではなく、元のNMRスペクトルの再試験により、これらの特定領域でのNMRピークの視覚的検査が可能となる。これらの領域におけるピーク多重性の同定は、訓練されたNMR分光測定技師にこのピークの原因となる分子として遊離プロリンを示唆させる。これらのピークは互いにスピン結合しており、従って、同じ分子の一部であるという事実は、2次元COSYスペクトル中に認められる交叉ピークの解釈から来ている。次いで、従来の1次元NMRスペクトル中に認められるNMRピークを、比較可能なpH値で水に溶解した真のプロリンのものと視覚的に比較する。例えば、Ellenbergerら、1975；Lindonら、1999を参照されたい。
【０８６３】
領域3.38及び3.34は共に、水素原子のδ-CH2対のプロトンの1つに帰属可能なδ3.34での多重線の一部を含むようである。2.06の領域はβ-CH2基に由来するプロトンの1つとして同定可能なδ2.05での共鳴を示す。同様に、2.02の領域はプロリンのγ-CH2プロトンの一方又は両方として同定されるδ1.99での共鳴を含む(2つのγプロトン間の化学シフト差が小さい)。これらのピークの各々のピーク多重性は比較可能な条件下で測定されたプロリンの真性サンプルと一致する。
【０８６４】
プロリンがバイオマーカーである場合、骨粗鬆症と共にレベルの変化をも示す、プロリンに関する4つの他のプロトン共鳴が存在する。これらはそれぞれδ2.34、約δ2.0、及びδ3.45での他のβ-、γ-、及びδ-CH2プロトンであり、δ4.14でのα-CHプロトンである。実際、このスペクトルの試験は他のβ-CH2及びδ-CH2プロトンについてのシグナルの強度も診断と相関していることを示している。化学シフトが第1のγ-CH2プロトンと近く、既に上記のものを含んでいたかもしれないため、他のγ-CH2プロトンを区別することは不可能である。また、スペクトル重複のため、α-CHプロトンの化学シフトを観察することも不可能である。
【０８６５】
最後に、真性プロリンのサンプルを血漿サンプルに加え、プロリンに帰属される全ての内因性シグナルと添加されたプロリンのシグナルとの完全な一致に留意することにより、プロリンが診断的NMRピークを担う物質であるという確認を得る。
【０８６６】
プロリンを含む全てのアミノ酸についての1H NMR化学シフトはイオン化可能な官能基の存在のため、溶液のpHに依存する。プロリンの場合、これらはカルボキシル基(-COOH)及び二級アミン基(-NH-)である。従って、同じpHで血漿のNMRスペクトルとプロリンの真性サンプルとを比較することが重要である。これを上記のように行った。
【０８６７】
さらに、生物サンプル中でアミノ酸と重炭酸イオン(HCO3-)とを反応させて、カルバメート付加物を形成させる、すなわち、アミノ酸のアミノ基と重炭酸イオンとの間で形成させることが可能である。得られる付加物は親アミノ酸のものとは異なるNMR化学シフトを有する。この問題は特にプロリンについて認められなかった。しかしながら、変化した化学シフトのこの問題は、真性プロリンを好適な血漿サンプルに加え、添加したプロリンのプロトンピークの全てと内因性バイオマーカーのピークのものとの正確な一致に留意することにより克服することができる。
【０８６８】
実施例7
骨関節炎
上記で考察したように、本発明者らは正確な数学的モデルを得た後、続いて試験サンプルもしくは被験者の分類、及び／又は診断に用いることができる、試験集団からデータ(例えば、NMRスペクトル)を分析する新規な方法(多変量統計解析及びパターン認識(PR)技術、及び必要に応じてデータフィルタリング技術を用いる)を開発した。
【０８６９】
骨関節炎の状況において、血清の分析にこれらの技術を適用した。メタボノミック分析は骨関節炎を有する個体と有しない個体とを識別することができる。骨関節炎のための新規な診断バイオマーカーを同定し、関連する診断のための方法を開発した。
【０８７０】
NMRスペクトルの取得
試験下にある被験者から回収した血清サンプルに対して分析を行った。骨疾患の正式な診断の前に、対照被験者(n=40)及び骨粗鬆症を有する患者(n=29)から血清を取得した。
【０８７１】
データを、膝及び手首関節のX線検査に基づいて、「対照」(黒塗り三角形)又は「骨関節炎」(丸印、●)として分類した。これらの関節のいずれかにおける軟骨中での任意の骨成長の存在を、骨関節炎を有するものとして定義した。骨粗鬆症とは顕著に対照的に、骨関節炎の臨床診断には骨密度を用いない。なぜなら、骨関節炎を有する患者は任意の程度の平均骨密度(病理学的に低い骨密度を含む)を有してもよいが、骨関節炎を有する平均的患者においては対照被験者よりもわずかに高い骨密度を有するからである。
【０８７２】
各患者から血液を採取し、室温にて2時間、プラスチックチューブ中で凝固させ、遠心分離により血清を回収した。血清のアリコートをアッセイするまで-80℃にて保存した。
【０８７３】
NMR分析の前に、サンプル(150μl)を溶媒溶液(10％ D2O v/v、0.9％ NaCl w/v)(350μl)で希釈した。次いで、希釈したサンプルを5 mmの高品質NMRチューブ(Goss Scientific Instruments Ltd)中に入れた。
【０８７４】
血清サンプルの従来の1-D1H NMRスペクトルを、「NMR実験パラメーター」の節に説明する条件を用いてBruker DRX-600分光測定装置上で測定した。
【０８７５】
データの分析
主成分分析(PCA)モデルを、対照被験者(黒塗り三角形)及び骨関節炎を有する患者(●)から得た血清サンプルの1D1H NMRスペクトルから算出した。対応するスコア及び負荷プロットを、それぞれ図5-1A-OA及び図5-1B-OAに示す。異なるサンプル間の分離を引き起こすのを担うNMRスペクトルのこれらの領域も図5-1B-OAに示す。分離はほとんど、又は全く認められなかった。
【０８７６】
主成分分析(PCA)モデルを、対照被験者(黒塗り三角形)及び骨関節炎を有する患者(●)から得た血清サンプルの1D1H NMRスペクトルから算出したが、この事例では、PCAの前に、分類と相関しない変動を除去するのに役立ち、従ってその後のデータ分析を改善する、直交シグナル補正(OSC)の適用によりデータをフィルタリングした。対応するスコア及び負荷プロットを、それぞれ図5-1C-OA及び図5-1D-OAに示す。PC2対PC3をプロットしたところ、対照サンプルと骨関節炎サンプルの間の改良された分離が明らかであり、対照はプロットの右上を占め、骨関節炎はプロットの左下を占めている。
【０８７７】
PLS-DA(未管理PCAよりもむしろ)を用いれば、改良された分離が可能である。対応するスコアプロット及び負荷プロットを、それぞれ図5-1E-OA及び図5-1F-OAに示す。改良された分離が明らかであり、対照はプロットの右手側を占め、骨関節炎サンプルは左手側を占めている。
【０８７８】
図5-2A-OAは変量重要性プロット(VIP)及び図5-1E-OAに記載のPLS-DAモデルから誘導された回帰係数プロットの断面図を示す。
【０８７９】
図5-2B-OAは、図5-1E-OAに記載のPLS-DAモデルから誘導された回帰係数プロットの断面図を示す。この回帰係数プロットにおいて、各バーは0.04 ppmをカバーするスペクトル領域を表し、1つの対照サンプルの1H NMRプロフィールが骨関節炎サンプルの1H NMRプロフィールとどのように異なるかを示すものである。x軸上の正の値は、比較的高い濃度の代謝物が存在することを示し(NMR化学シフト帰属テーブルを用いて帰属する)、x軸上の負の値は比較的低濃度の代謝物を示す。
【０８８０】
同定された代謝物に由来するNMRピークを含むPLS-DAモデルについての7個の最も重要な化学シフトウィンドウを以下の表にまとめる。負荷とNMRデータの公開された表とを比較することにより、帰属を行った。
【表１３】
2004528559.tif 000020
【０８８１】
まとめると、対照サンプルに関して、骨関節炎サンプルはプロリン、コリン及び3-ヒドロキシ酪酸のレベルが減少し、脂質、クレアチン及びクレアチニンのレベルが増加したようである。これらの種に関連するバケットに関するさらなるデータを以下の表に記載する。また、負荷とNMRデータの公開された表とを比較することにより、帰属を行った。
【表１４】
2004528559.tif 000021
【０８８２】
プロリン共鳴、δ3.66でのコリン共鳴、δ1.34での乳酸共鳴及びδ4.14でのβ-ヒドロキシ酪酸共鳴についての強度変化は全て他のピークと重複しており、これを元の1H NMRスペクトルを参照することにより確認した。
【０８８３】
検証
ｙ−予測散布図を用いて検証を行った。図5-3-OAはｙ−予測散布図を示し、従って、未知のサンプルの分類メンバーシップ(対照又は骨関節炎)を予測する1H NMRに基づくメタボノミクスの能力を示す。約85％の対照及び骨関節炎サンプルを用いて、PLS-DAモデルを構築し、これを用いて残りの15％のサンプル(検証セット)中での疾患の存在を予測した。ｙ−予測散布図はサンプルに分類1(この場合、対照に対応する)又は分類0(この場合、骨関節炎に対応する)を割当てる；0.5はカットオフである。PLS-DAモデルは90％の事例において骨関節炎の存在又は非存在を予測し、さらに、2成分モデルについては、99％の信頼限界を用いて70％以上の有意レベルで分類を予測することができる。
【０８８４】
前述のことは本発明の原理、好ましい実施形態、及び操作様式を説明したものである。しかしながら、本発明は、考察した特定の実施形態に限定されると解釈されるべきではない。その代わりに、上記の実施形態は限定的ではなく例示的であると見なされるべきであり、添付の特許請求の範囲により定義された本発明の範囲から逸脱することなく、当業者によりこれらの実施形態において変更を行うことができると理解されるべきである。
【０８８５】
参考文献
本発明及び本発明が属する技術水準をより十分に記載し開示するために、本明細書においては、多くの特許及び刊行物が引用される。これらの参考文献についての全引用をここに提供する。これらの引用文献は、具体的かつ個別に参照により組み込まれることが示されたのと同様に、それぞれが、参照によりその全体が本発明の開示に組み込まれる。
【０８８６】
Ala-Korpela, M., 1995, "H-1 NMR spectroscopy of human blood plasma," Progress in Nuclear Magnetic   Resonance Spectroscopy, Vol. 27, pp. 475 554.
Ala-Korpela, M., Hiltunen, Y. and Bell, J.D., 1995, "Quantification of biomedical NMR data using artificial neural network analysis: Lipoprotein lipid profiles from H-1 NMR data of human plasma," NMR Biomed., Vol. 8, pp. 235 244.
Andersen, C. A., 1999, "Direct orthogonalization," Chemometrics and Intelligent Laboratory Systems, Vol. 47, pp. 51-63.
Anker, L.S., and Jurs, P.C., 1992, "Prediction of C-13 nuclear magnetic resonance chemical shifts by artificial neural networks," Anal. Chem., Vol. 64, pp. 1157-1164.
Anthony, M.L. et al., 1994, "Pattern recognition classification of the site of nephrotoxicity based on metabolic data derived from proton nuclear magnetic resonance spectra of urine," Mol. Pharmacol., Vol. 46, pp. 199 211.
Anthony, M.L. et al., 1995, "Classification of toxin-induced changes in 1H NMR spectra of urine using an artificial neural network," J. Pharm. Biomed. Anal., Vol. 13, pp. 205-211.
Beckwith-Hall, B.M. et al., 1998, "Nuclear magnetic spectroscopic and principal components analysis investigations into biochemical effects of three model hepatotoxins," Chem. Res. Tox., Vol. 11, pp. 260-272.
Berman J.W., Guida M.P., Warren J., Amat J., and Brosnan C.F., 1996, “Localization of monocyte   chemoattractant peptide-1 expression in the central nervous system in experimental autoimmune encephalomyelitis and trauma in the rat”, Journal of Immunology, Vol. 156, pp 3017-3023.
Berman, J.L., Wynne, J., Cohn, P.F. (1978), "A multivariate approach for interpreting treadmill exercise tests in coronary artery disease," Circulation, Vol. 58, pp. 505-512.
Bishop, C., 1995, Neural Networks for Pattern Recognition, University Press, Oxford, England,  pp. 164-193.
Breslow, J.L., 1993, "Transgenic mouse models of lipoprotein metabolism and atherosclerosis," Proc. Natl. Acad. Sci. USA,  Vol. 90, pp. 8314-8318.
Bretthorst, G.L., 1990a, "Bayesian Analysis. 2. Signal-Detection and Model Selection," J. Magn. Reson., Vol. 88, pp. 552 570.
Bretthorst, G.L., 1990b, "Bayesian Analysis. 3. Applicants to NMR Signal-Detection, Model Selection, and Parameter-Estimation," J. Magn. Reson., Vol. 88, pp. 571 595.
Bretthorst, G.L., Hung, C.C., Davignon, D.A., et al., 1988, "Bayesian-Analysis of Time-Domain Magnetic Resonance Signals," J. Magn. Reson., Vol. 79, pp. 369 376.
Bro, R., 1997, "PARAFAC. Tutorial and applications," in Chemometrics and Intelligent Laboratory Systems, Vol. 38, pp. 149-171.
Broomhead, D.S., and Lowe, D., 1988, "Multi-variable functional interpolation and adaptive networks," Complex Systems, Vol. 2, pp. 321 355.
Brown, T.R. and Stoyanova, R., 1996, "NMR spectral quantitation by principal-component analysis .2. Determination of frequency and phase shifts," J. Magn. Reson., Series B, Vol. 112, pp. 32-43.
Bruce, R.A., 1974, "The value of the Balke protocol," Am. Heart J., Vol. 88, pp. 533-534.
Claridge, T.D.W., High-Resolution NMR Techniques in Organic Chemistry: A Practical Guide to Modern NMR for Chemists,Oxford University Press, 2000.
Collins, F.S. and McKusick, V.A., 2001, "Implications of the Human Genome Project for medical science," JAMA, Vol. 285, pp. 540 544.
Confort-Gouny, S., Vion-Dury, J., Nicoli, F., Dano, P., Gastaut, J.-L., and Cozzone, P.J., 1992, "Metabolic characterization of neurological diseases by proton localized nmr-spectroscopy of the human brain," Comptes Rendus de l'Academie des Sciences Serie III - Sciences de la Vie-Life Sciences, Vol. 315, pp. 287-293.
Cullen, P., Funke, H., Schulte, H. and Assmann, G., 1998, "Lipoproteins and cardiovascular risk - from genetics to CHD prevention," European Heart Journal, Vol. 19, pp. C5-C11, Suppl. C.
Despres, J., Lemieux, I., Dagenais, G., Cantin, B. and Lamarche, B., 2000, "HDL cholesterol as a marker of coronary heart disease risk: the Quebec cardiovascular study," Atherosclerosis, Vol. 153, pp. 263-272.
Dolecek, T.A., Milas, N.C., Van Horn, L.V., Farrand, M.E., Gorder, D.D., Duchene, A.G., Dyer, J.R., Stone, P.A. and Randall, B.L., 1986, "A long term nutrition intervention experience - lipid responses and dietary adherence patterns in the multiple risk factor intervention trial," J. Am. Diet Assoc., Vol. 86, pp. 752 758.
Dutt, M.J. and Lee, K.H., 2000, "Proteomic analysis," Curr. Opin. Biotechnol., Vol. 11, pp. 176-179.
Dvorak A.M., Schroeder J.T., MacGlashan D.W., Bryan K.P., Morgan E.S., Lichtenstein L.M. and MacDonald S.M., 1996, “Comparative ultrastructural morphology of human basophils stimulated to release histamine by anti-lge, recombinant IGE-dependent histamine-releasing factor, or monocyte chemotactic protein-1”, Journal of Allergy and Clinical Immunology, Vol. 98, pp 355-370.
Eriksson, L., Johansson, E., Kettaneh-Wold, H., and Wold, S., 1999, Introduction to Multi and Megavariate Analysis using Projection Methods (PCA & PLS), UMETRICS Inc. (Box 7960, SE90719 Umea, SWEDEN), pp. 267-296.
Fan, T.W.-M., 1996, "Metabolite profiling by one- and two-dimensional NMR analysis of complex mixtures,"  Prog. NMR Spectrosc., Vol. 28, pp. 161 219.
Farrant, R.D., et al., 1992, "An automatic data reduction and transfer method to aid pattern-recognition analysis and classification of NMR spectra," J. Pharm. Biomed. Anal., Vol. 10, pp. 141-144.
Fearn, T., 2000, "On orthogonal signal correction," Chemometrics and Intelligent Laboratory Systems, Vol. 50, pp. 47-52.
Frank, I.E., et al., 1984, "Prediction of product quality from spectral data using the partial least-squares method," J. Chem. Info. Comp., Vol. 24, p. 20 24.
Garrod, S., Humpher, E., Connor, S.C., Connelly, J.C., Spraul, M., Nicholson, J.K., and Holmes, E., 2001, "High-resolution H-1 NMR and magic angle spinning NMR spectroscopic investigation of the biochemical effects of 2-bromoethanamine in intact renal and hepatic tissue," Magn. Reson. Med., Vol. 45, pp. 781-790.
Gartland, K.P.R. et al., 1990a, "A pattern recognition approach to the comparison of 1H NMR and clinical chemical data for classification of nephrotoxicity," J. Pharm. Biomed. Anal., Vol. 8, pp. 963-968.
Gartland, K.P.R. et al., 1990b, "Pattern recognition analysis of high resolution 1H NMR spectra of urine.  A nonlinear mapping approach to the classification of toxicological data," NMR in Biomed., Vol. 3, pp. 166 172.
Gartland, K.P.R. et al., 1991, "The application of pattern recognition methods to the analysis and classification of toxicological data derived from proton NMR spectroscopy of urine,"  Mol. Pharmacol., Vol. 39, pp. 629-642.
Geisow, M.J., 1998, "Proteomics: One small step for a digital computer, one giant leap for humankind," Nature Biotechnology, Vol. 16, p. 206.
Ghirnikar R.S., Lee Y.L., He T.R., Eng L.F., 1996, “Chemokine expression in rat stab wound brain injury”, Journal of Neuroscience Research, Vol.  46, pp 727-733.
Gong J.-H.,Ratkay L.G., Waterfield J.D., and Clark-lewis I., 1997, “An antagonist of monocyte chemoattractant protein 1 (mcp-1) inhibits arthritis in the mrl-lpr mouse model”, Journal of Experimental Medicine, Vol. 186, pp 131-137.
Guyton, A.C., 1991, "Chapter 12: Electrocardiographic interpretation of cardiac muscle and coronary abnormalities," In: A Textbook of Medical Physiology, Eighth Edition (WB Saunders, London), pp. 124-137.
Gygi, S.P.; Rochon, Y.; Franza, B.R.; Aebersold, R, 1999, "Correlation between protein and mRNA abundance in yeast," Molecular and Cellular Biology, Vol. 19, pp. 1720-1730.
Hare, B.J., and Prestegard, J.H., 1994, "Application of neural networks to automated assignment of NMR spectra of proteins," J. Biomol. NMR, Vol. 4, pp. 35-46.
Hiltunen, Y., Heiniemi, E. and Ala-Korpela, M., 1995, "Lipoprotein lipid quantification by neural-network analysis of H-1 NMR data from human blood-plasma," J. Mag. Res. Ser. B, Vol. 106, pp. 191-194.
Holmes, E. et al., 1998a, "Development of a model for classification of toxin-induced lesions using 1H NMR spectroscopy of urine combined with pattern recognition," NMR in Biomed., Vol. 11, pp. 235-244.
Holmes, E. et al., 1998b, "The identification of novel biomarkers of renal toxicity using automatic data reduction techniques and PCA of proton NMR spectra of urine," Chemomet. & Intel. Lab Systems, Vol. 44, pp. 245 255.
Holmes, E., et al., 1992, "NMR spectroscopy and pattern recognition analysis of the biochemical processes associated with the  progression and recovery from nephrotoxic lesions in the rat induced by mercury(II)chloride and 2 bromo-ethanamine," Mol. Pharmacol., Vol. 42, pp. 922-930.
Holmes, E., et al., 1994, "Automatic data reduction and pattern recognition methods for analysis of 1H NMR spectra of human urine from normal and pathological states," Anal. Biochem., Vol. 220, pp. 284-296.
Howells, S.L., Maxwell, R.J., Howe, F.A., Peet, A.C., Stubbs, M., Rodrigues, L.M., Robinson, S.P., Baluch, S., and Griffiths, J.R., 1993, "Pattern-recognition of P-31 magnetic-resonance spectroscopy tumor spectra obtained in-vivo," NMR Biomed., Vol. 6, pp. 237-241.
Iida K, Kadota J., Kawakami K., Matsubara Y., Shirai R., and Kohno S., 1997, “Aanalysis of T cell subsets and beta chemokines in patients with pulmonary sarcoidosis”, Thorax, Vol. 52, pp 431-437.
Isles, C.G. and Paterson, J.R., 2000, "Identifying patients at risk for coronary heart disease: implications from trials of lipid-lowering drug therapy," Q. J. Med., Monthly Journal of the Association of Physicians, Vol. 93, pp. 567-574.
Joreskog, K.G., and Wold, H., 1982 Systems under Indirect Observation, North Holland, Amsterdam.
Kannel, W.B, Gordon, T. (eds.), February 1974, The Framingham Study.  An epidemiological investigation of cardiovascular disease, DHEW pub. no. (NIH) 74-599, Public Health Service, Washington, DC (U.S. Government Printing Office).
Kjelsberg, M.O., Cutler, J.A. and Dolecek, T.A., 1997, "Brief description of the Multiple Risk Factor Intervention Trial," Amer. J. Clinical Nutrition, Vol. 65 (supplement), pp. S191-S195.
Klenk, H.P., et al., 1997, "The complete genome sequence of the hyperthermophilic, sulphate-reducing archaeon Archaeoglobus fulgidus," Nature, Vol. 390, pp. 364-370.
Kopka, P. Dormann, T. Altmann, R.N. Trethewey and L. Willmitzer, 2000, "Metabolic profiling for plant functional genomics," Nature Biotechnology, Vol. 18, pp. 1157-1161.
Kowalski, B.R., Sharaf, M. and Illman D., Chemometrics (John Wiley & Sons, Chichester, 1986).
Kuesel, A.C., Stoyanova, R., Aiken, N.R., Li, C.-W., Szwergold, B.S., Shaller, C. and Brown, T.R., 1996, "Quantitation of resonances in biological P-31 NMR spectra via principal component analysis: Potential and limitations," NMR Biomed., Vol. 9, pp. 93 104.
Kuller, L.H., Ockene, J.K., Meilahn, E., Wentworth, D.N., Svendsen, K.H. and Neaton, J.D., 1991, "Cigarette-smoking and mortality," Preventative Medicine, Vol. 20, pp. 638-654.
Kvalheim, O. M., Karstang, T. V., 1989, "Interpretation of latent-variable regression models," Chemometrics and Intelligent Laboratory Systems, Vol. 7, pp. 39-51.
Lindon, J.C., et al., 1980, "Digitisation and Data Processing in Fourier Transform NMR," Progress in NMR Spectroscopy, Vol. 14, pp. 27-66.
Lindon, J.C., et al., 1999, "NMR spectroscopy of biofluids," in Annual Reports on NMR Spectroscopy (Webb, G.A., ed.), Academic Press (London), Vol. 38, pp. 1-88.
Lindon, J.C.; Holmes, E.; Nicholson, J.K., 2001, "Pattern recognition methods and applications in biomedical magnetic resonance," Progress in NMR Spectroscopy," Vol. 39, pp. 1 40.
Martin, G.J., 1998, "Recent advances in site-specific natural isotope fractionation studied by nuclear magnetic resonance," Isotopes in Environmental and Health Studies, Vol. 34, pp. 233 243.
Martin, M.L. and Martin, G.J., 1999, "Site-specific isotope effects and origin inference," Analysis, Vol. 27, p. 209 213.
Martin T.R., Galli S.J., Katona I.M.and Drazen J.M., 1989, “Role of mast-cells in anaphylaxis - evidence for the importance of mast-cells in the cardiopulmonary alterations and death induced by anti-IGE in mice”, Journal of Clinical Investigation, Vol. 83, pp 1375-1383.
Mazzucchelli L., Hauser C., Zgraggen K., Wagner H.E., Hess M.W., Laissue J.A. and Mueller C, 1996, “Differential in situ expression of the genes encoding the chemokines mcp-1 and rantes in human inflammatory bowel disease”, Journal of Pathology Vol. 178, 201-206.
McIlvain, H.E., McKinney, M.E., Thompson, A.V. and Todd, G.L., 1992, "Application of the MRFIT smoking cessation program to a healthy, mixed-sex sample," Am. J. Prev. Med., Vol. 8, pp. 165 170.
Moka, D., et al., 1998, "Biochemical classification of kidney carcinoma biopsy samples using magic angle spinning NMR spectroscopy," J.  Pharm. Biomed. Anal., Vol. 17, pp. 125-132.
Morvan, D., Jehenson, P., Duboc, D., and Syrota, A., 1990, "Discriminant factor-analysis of P-31 NMR spectroscopic data in myopathies," Magn. Reson. Med., Vol. 13, pp. 216 227.
Multiple Risk Factor Intervention Trial (MRFIT) Research Group, 1986, "Relationship between baseline risk factors and coronary heart disease and total mortality in the Multiple Risk Factor Intervention Trial, " Prev. Med., Vol. 15, pp. 254-273.
Nicholson, J.K. et al., 1989, "High resolution proton magnetic resonance spectroscopy of biological fluids," Prog. NMR Spectrosc., Vol. 21, pp. 449 501.
Nicholson, J.K. et al., 1995, "750 MHz 1H and 1H -13C NMR spectroscopy of human blood plasma," Analytical Chemistry, Vol. 67, pp. 793-811.
Nicholson, J.K., et al., 1999, "Metabonomics - understanding the metabolic responses of living systems to pathophysiological stimuli via multivariate statistical analysis of biological NMR spectroscopic data," Xenobiotica, Vol. 29, pp. 1181-1189.
Nillson, N.J., 1965, Learning Machines, McGraw-Hill, New York.
Ogata H., Takeya M., Yoshimura T., Takagi K. and  Takahashi K. 1997, “The role of monocyte chemoattractant protein-1 (mcp-1) in the pathogenesis of collagen-induced arthritis in rats”,  Journal of Pathology Vol. 182, pp106-114.
Parzen, E., 1962, "On estimation of a probability density function and mode," Ann. Mathemat. Stat., Vol. 33, p. 1065 1076.
Patterson, D., 1996, Artificial Neural Networks, Prentice Hall, Singapore.
Plump, A.S., Smith, J.D., Hayek, T., Aalto-Setala, K., Walsh, A., Verstuft, J.G., Rubin E.M. & Breslow, J.L., 1992, "Severe hypercholesterolemia and atherosclerosis in apolipoproteinE deficient mice created by homologous recombination in ES cells," Cell, Vol. 71, pp. 343-353.
Press, William H., Teukolsky, Saul A., Vetterling, William T., Flannery, Brian P., January 1993, Numerical Recipes in C : The Art of Scientific Computing, 2nd edition, Cambridge University Press.
Quinlan, J.R., 1986, "Induction of decision trees," Machine Learning, Vol. 1, pp. 81 106.
Ross, R., 1999, "Mechanisms of disease - Atherosclerosis - An inflammatory disease," The New England Journal of Medicine, Vol. 340, pp. 115-126.
Sach M., Bauermeister K., Burger J., Loetscher P., Elsner J., Schollmeyer P, and Dobos G., 1997, “Inverse mcp-1/il-8 ration in effluents of CAPD patients with peritonitis and in isolated cultured human peritoneal macrophages”, Nephrology, Dialysis and Transplantation, Vol. 12, pp 315-320.
Sjostrom, M., Wold, S., and Soderstrom, B., 1986, "PLS Discriminant Plots," Proceedings of PARC in Practice, Amsterdam, June 19-21, 1985, Elsevier Science Publishers B.V., North Holland.
Somorjai, R.L., Nikulin, A.E., Pizzi, N., Jackson, D., Scarth, G., Dolenko, B., Gordon, H., Russell, P., Lean, C.L., Delbridge, L., Mountford, C.E., and Smith, I.C.P., 1995, "Computerized consensus diagnosis - a classification strategy for the robust analysis of MR spectra .1. application to H-1 spectra of thyroid neoplasms," Magn. Reson. Med., Vol. 33, pp. 257 263.
Speckt, D.F., 1990, "Probabilistic Neural Networks," Neur. Networks, Vol. 3, pp. 109 118.
Spraul, M. et al., 1994, "Automatic reduction of NMR spectroscopic data for statistical and pattern recognition classification of samples," J. Pharm. Biomed. Anal., Vol. 12, pp. 1215-1225.
Stahle, L., and Wold, S., 1987, "Partial Least Squares Analysis with Cross-Validation for the Two-Class Problem: A Monte Carlo Study," Journal of Chemometrics, Vol. 1, pp. 185-196.
Stoyanova, R., Kuesel, A.C., and Brown, T.R., 1995, "Application of principal-component analysis for NMR spectral quantitation," J. Magn. Reson., Series A, Vol. 115, pp. 265 269.
Sugiyama Y., Kasahara T., Mukaida N., Matsushima K. and Kitamura S., 1995, “Chemokines in bronchoalveolar lavage fluid in summer-type hypersensitivity pneumonitis”, European Respiratory Journal, Vol. 8, pp 1084-1090.
Sun, J., 1997, "Statistical analysis of NIR data: data pretreatment," Journal of Chemometrics, Vol. 11, pp. 525 532.
Sze, D.Y., et al., 1994, "High-resolution proton NMR studies of lymphocyte extracts," Immunomethods, Vol. 4, pp. 113-126.
Tomlins, A.M. et al., 1998, "High resolution magic angle spinning 1H NMR analysis of intact prostatic hyperplastic and tumour tissues," Anal. Comm., Vol. 35, pp. 113-115.
Tranter, G.E., et al., 1999, "Metabonomic prediction of drug toxicity via probabilistic neural network analysis of NMR biofluid data," Abstr. 9th North American ISSX Meeting, Oct 24-28, 1999, p. 246.
Volejnikova S., Laskari M., Marks jr. S.C., and Graves D.T., 1997, “Monocyte recruitment and expression of monocyte chemoattractant protein- 1 are developmentally regulated in remodeling bone in the mouse”, American Journal of Pathology, Vol 150, pp 1711-1721.
Wasserman, P.D., 1989, Neural Computing: Theory and Practice, (Van Nostrand, ed.) Reinhold, New York, USA.
Weber, O.M., Duc, C.O., Meier, D., and Boesiger, P., 1998, "Heuristic optimization algorithms applied to the quantification of spectroscopic data," Magn. Reson. Med., Vol. 39, pp. 723-730.
Westerhuis, J. A., de Jong, S., Smilde, A. K., 2001, "Direct orthogonal signal correction," Chemometrics and Intelligent Laboratory Systems, Vol. 56, pp. 13-25.
Wise, B. M., Gallagher, N. B., 2001, http://www.eigenvector.com/MATLAB/OSC.html.
Wold, H., 1966, in Multivariate Analysis (P.R. Krishnaiah, Ed.) Academic Press, New York.
Wold, S., 1976, "Pattern recognition by means of disjoint principal components models," Pattern Recog., Vol. 8, pp. 127 139.
Wold, S., Antti, H., Lindgren, F., and Ohman, J., 1998a, "Orthogonal Signal Correction of Near-Infrared Spectra," Chemometrics and Intelligent Laboratory Systems, Vol. 44, pp. 175-185.
Wold, S., Kettaneh, N., Friden, H., and Holmberg, A., 1998b, "Modelling and Diagnostics of Batch Processes and Analogous Kinetic Experiments," Chemometrics and Intelligent Laboratory Systems, Vol. 44, pp. 331-340.
Yokode, M., Hammer, R.E., Ishibashi, S., Brown, M.S. & Goldstein, J.L., 1990, "Diet-induced hypercholesterolemia in mice: prevention by over-expression of LDL receptors," Science, Vol. 250, pp. 1273-1275.
Zeyneloglu H.B., Seli E., Senturk L.M.,Gutierrez L.S.,Olive D.L. and Arici A., 1998, “The effect of monocyte chemotactic protein 1 in intraperitoneal adhesion formation in a mouse model”,  American Journal of Obstetrics and Gynecology, Vol. 179, pp  438-443.
Zheng M.H., Fan Y, Smith A, Wysocki S., Papadimitriou J.M., Wood D.J., 1998, “Gene expression of monocyte chemoattractant protein-1 in giant cell tumors of bone osteoclastoma: possible involvement in cd68+ macrophage-like cell migration”, Journal of Cellular Biochemistry, Vol 70, pp 121-129.
【図面の簡単な説明】
【０８８７】
【図１】双生児に関する図であり、  図1-1A-TWは、一卵性双生児（MZ）（黒塗り三角形）および二卵性双生児（DZ）（円、●）からの血清の1-D1H-NMRスペクトル由来のPCAモデル（主成分分析）におけるPC2およびPC1（t2とt1）についてのスコア散布図であり；  図1-1B-TWは、図1-1A-TWに示したPCAについての相当する負荷散布図（p2とp1）であり；  図1-1C-TWは、MZ双生児（黒塗り三角形）およびDZ双生児（円、●）からの血清の1-D1H-NMRスペクトル由来のPCAモデルにおけるPC2およびPC1（t2とt1）についてのスコア散布図であり（PCAに先だって、データをフィルタリングした（この場合、直交シグナル補正、OSCを使用））；  図1-1D-TWは、図1-1C-TWに示したPCAについての相当する負荷散布図（p2とp1）であり；  図1-1E-TWは、MZ双生児（黒塗り三角形）およびDZ双生児（円、●）からの血清の1-D1H-NMRスペクトル由来のPLS-DAモデルにおけるPC2およびPC1（t2とt1）についてのスコア散布図であり（PCAに先だって、データをフィルタリングした（この場合、直交シグナル補正、OSCを使用））；  図1-1F-TWは、図1-1E-TWに示したPLS-DAについての相当する負荷散布図（p2とp1）であり；  図1-2A-TWは、21種類の最重要変量の重要性計算値を示す、OSC-PLS-DAモデルについての変量重要性プロット（VIP）の部分を示す図であり；  図1-2B-TWは、OSC-PLS-DAモデル由来のMZおよびDZ血清サンプルについての1-D  1H NMR変量の回帰係数のプロットであり（各バーは、δ0.04を網羅するスペクトル領域を表す）；  図1-3-TWは、OSC後に同一データについて計算された部分最小二乗判別式解析（PLS-DA）モデルにおけるMZ双生児（黒塗り三角形）およびDZ双生児（円、●）サンプルならびに検証サンプル（菱形、◆）を示すｙ−予測散布図である。
【図２】高血圧に関する図であり、  図2-1A-HYPは、低SBP（黒塗り三角形）、中SBP（円、●）または高SBP（正方形、■）を有する患者からの血清サンプルから得られた1-D  1H NMRスペクトル由来の主成分分析（PCA）モデルに関するPC2およびPC1（t2とt1）についてのスコア散布図であり；  図2-1B-HYPは、図2-1A-HYPに示したPCAについての相当する負荷散布図（p2とp1）であり；  図2-1C-HYPは、低SBP（黒塗り三角形）、中SBP（円、●）または高SBP（正方形、■）を有する患者からの血清サンプルから得られた1-D  1H NMRスペクトル由来のPCAモデルに関するPC2およびPC1（t2とt1）についてのスコア散布図であり（この場合、直交シグナル補正、OSCを使用）；  図2-1D-HYPは、図2-1C-HYPに示したPCAについての相当する負荷散布図（p2とp1）であり；  図2-1E-HYPは、３対のプロット（血清サンプル分類の対における1-D  1H NMRデータから計算されたPCAモデルでのPC2およびPC1（t2とt1）ならびに相当する負荷プロット（p2とp1）についてのスコア散布図）を示す図であり（そのスコアプロットにおいて、低SBPを有する患者からの血清サンプルは三角形（黒塗り三角形）で、中SBPの場合は円（●）で、高SBPの場合は正方形（■）で示されている。）；  図2-1E(1)-HYPは、低および中SBPスコア散布図であり；  図2-1E(2)-HYPは、低および中SBP負荷散布図であり；  図2-1E(3)-HYPは、中および高SBPスコア散布図であり；  図2-1E(4)-HYPは、中および高SBP負荷散布図であり；  図2-1E(5)-HYPは、低および高SBPスコア散布図であり；  図2-1E(6)-HYPは、低および高SBP負荷散布図であり；  図2-1F-HYPは、３対のプロット（血清サンプル分類の対における1-D  1H NMRデータから計算されたOSC-PLS-DAモデルでのPC2およびPC1（t2とt1）ならびに相当する負荷プロット（p2とp1）についてのスコア散布図）を示す図であり（そのスコアプロットにおいて、低SBPを有する患者からの血清サンプルは三角形（黒塗り三角形）で、中SBPの場合は円（●）で、高SBPの場合は正方形（■）で示されている。）；  図2-1F(1)-HYPは、低および中SBPスコア散布図であり；  図2-1F(2)-HYPは、低および中SBP負荷散布図であり；  図2-1F(3)-HYPは、中および高SBPスコア散布図であり；  図2-1F(4)-HYPは、中および高SBP負荷散布図であり；  図2-1F(5)-HYPは、低および高SBPスコア散布図であり；  図2-1F(6)-HYPは、低および高SBP負荷散布図であり；  図2-2-HYPは、図2-1F-HYPに示した各OSC-PLS-DAモデルについて、変量重要性プロット（VIP）の部分と各個々のモデルについての回帰係数のプロットの両方を示す図であり；  図2-2-(1)-HYPは、低および中SBPサンプルでのVIPであり；  図2-2-(2)-HYPは、中SBPに対する低の回帰係数であり；  図2-2-(3)-HYPは、中および高SBPサンプルでのVIPであり；  図2-2-(4)-HYPは、高SBPに対する中の回帰係数であり；  図2-2-(5)-HYPは、低および高SBPサンプルでのVIPであり；  図2-2-(6)-HYPは、高SBPに対する低の回帰係数であり；  図2-3A-HYPは、14個の低SBPサンプルから構築され、低および中SBPサンプルで調べたモデルについての距離−モデル（DModXPS）のプロットであり（1.41でのDCrit。予測率：84％）；  図2-3B-HYPは、９個の中SBPサンプルから構築され、低および中SBPサンプルで調べたモデルについての距離−モデル（DModXPS）のプロットであり（1.50でのDCrit。予測率：84％）；  図2-4A-HYPは、９個の中SBPサンプルから構築され、中および高SBPサンプルで調べたモデルについての距離−���デル（DModXPS）のプロットであり（1.50でのDCrit。予測率：59％）；  図2-4B-HYPは、９個の高SBPサンプルから構築され、中および高SBPサンプルで調べたモデルについての距離−モデル（DModXPS）のプロットであり（1.50でのDCrit。予測率：37％）；  図2-5A-HYPは、15個の低SBPサンプルから構築され、低および高SBPサンプルで調べたモデルについての距離−モデル（DModXPS）のプロットであり（1.41でのDCrit。予測率：80％）；  図2-5B-HYPは、９個の高SBPサンプルから構築され、低および高SBPサンプルで調べたモデルについての距離−モデル（DModXPS）のプロットである（1.50でのDCrit。予測率：83％）。
【図３】アテローム性動脈硬化症／冠動脈心疾患に関する図であり、  図3-1-CHDは、（Ａ）正常な冠動脈を有する患者（NCA）；および（Ｂ）三枝疾患患者（TVD）から得られた血清についての600MHz  1-D1H NMRスペクトルであり（スペクトルは、300Kの温度で記録し、位相およびベースラインの歪みについて補正を行い、化学シフトは乳酸のもの（CH3；δ1.33）を基準とした）；  図3-2A-CHDは、NCA（円、●）患者およびTVD（正方形、■）患者からの血清サンプルから得られた1-D  1H NMRスペクトル由来の主成分分析（PCA）モデルにおけるPC3およびPC2（t3とt2）についてのスコア散布図であり；  図3-2B-CHDは、図3-2A-CHDで示したPCAについての相当する負荷散布図（p3とp2）であり；  図3-2C-CHDは、NCA（円、●）患者およびTVD（正方形、■）患者からの血清サンプルから得られた1-D  1H NMRスペクトル由来の主成分分析（PCA）モデルにおけるPC2およびPC1（t2とt1）についてのスコア散布図であり（PCAに先だって、データをフィルタリングした）（この場合、直交シグナル補正、OSCを使用）；  図3-2D-CHDは、図3-2C-CHDで示したPCAについての相当する負荷散布図（p2とp1）であり；  図3-2E-CHDは、NCA（円、●）患者およびTVD（正方形、■）患者からの血清サンプルから得られた1-D  1H NMRスペクトル由来のPLS-DAモデルにおけるPC2およびPC1（t2とt1）についてのスコア散布図であり（PCAに先だって、データをフィルタリングした）（この場合、直交シグナル補正、OSCを使用）；  図3-2F-CHDは、図3-2E-CHDで示したPLS-DAについての相当する負荷散布図（w*c2とw*c1）であり；  図3-3A-CHDは、13個の最重要変量の重要性計算値を示す、OSC-PLS-DAモデルについての変量重要性プロット（VIP）の部分を示す図であり；  図3-3B-CHDは、OSC-PLS-DA由来のTVD血清サンプルについての1-D  1H NMR変量の回帰係数のプロットであり（各バーは、δ0.04を網羅するスペクトル領域を表す）；  図3-4-CHDは、OSC-PLS-DAモデルについてのNCA（円、●）およびTVD（正方形、■）サンプルならびに検証サンプル（黒塗り三角形、マークを施したNCAもしくはTVA）を示すｙ−予測散布図であり；  図3-5A-CHDは、３種類の血清サンプル分類全てについての1-D  1H NMRデータから計算したPCAモデルに関するPC2およびPC1（t2とt1）についてのスコア散布図であり（「１」枝型疾患（黒塗り三角形）、「２」枝型疾患（円、●）および「３」枝型疾患（正方形、■））；  図3-5B-CHDは、図3-5A-CHDに示したPCAについての相当する負荷散布図（p2とp1）であり；  図3-5C-CHDは、３対のプロットを示す図であり（血清サンプル分類の対に関する1-D  1H NMRデータから計算されたPLS-DAモデルにおけるPC2およびPC1（t2とt1）と相当するw*c負荷プロット（wc2とwc1）についてのスコア散布図）（このスコアプロットにおいて、「１」型サンプルは三角形（黒塗り三角形）で示してあり、「２」型サンプルは円（●）で示してあり、「３」型サンプルは正方形（■）で示してある。）；  図3-5C-(1)-CHDは、「１」型および「２」型スコア散布図であり；  図3-5C-(2)-CHDは、「１」型および「２」型負荷w*c散布図であり；  図3-5C-(3)-CHDは、「２」型および「３」型スコア散布図であり；  図3-5C-(4)-CHDは、「２」型および「３」型負荷w*c散布図であり；  図3-5C-(5)-CHDは、「１」型および「３」型スコア散布図であり；  図3-5C-(6)-CHDは、「１」型および「３」型負荷w*c散布図であり；  図3-6A-CHDは、３���類の血清サンプル分類全て（「１」枝型疾患（黒塗り三角形）；「２」枝型疾患（円、●）；および「３」枝型疾患（正方形、■））についてのフィルタリング（この場合、直交シグナル補正、OSCを用いてフィルタリング）1-D  1H NMRデータを用いて計算されたPCAモデルに関して計算されたPC2およびPC1（t2とt1）についてのスコア散布図であり；  図3-6B-CHDは、図3-5A-CHDに示したPCAについての相当する負荷散布図（p2とp1）であり；  図3-6C-CHDは、３対のプロットを示す図であり（OSC後の血清サンプル分類の対についての1-D  1H NMRデータから計算されたPLS-DAモデルにおけるPC2およびPC1（t2とt1）と、相当するw*c負荷プロット（wc2とwc1）についてのスコア散布図）（このスコアプロットにおいて、「１」型サンプルは三角形（黒塗り三角形）で示してあり、「２」型サンプルは円（●）で示してあり、「３」型サンプルは正方形（■）で示してある。）；  図3-6C-(1)-CHDは、「１」型および「２」型スコア散布図であり；  図3-6C-(2)-CHDは、「１」型および「２」型負荷w*c散布図であり；  図3-6C-(3)-CHDは、「２」型および「３」型スコア散布図であり；  図3-6C-(4)-CHDは、「２」型および「３」型負荷w*c散布図であり；  図3-6C-(5)-CHDは、「１」型および「３」型スコア散布図であり；  図3-6C-(6)-CHDは、「１」型および「３」型負荷w*c散布図であり；  図3-7-CHDは、図3-6Cに示した３種類の各モデルに関して、変量重要性プロット（VIP）の部分と個々のOSC-PLS-DAモデルについての回帰係数のプロットの両方を示す図であり（各バーは、δ0.04を網羅するスペクトル領域を表す）；  図3-7-(1)-CHDは、「１」枝および「２」枝疾患サンプルについてのVIPであり；  図3-7-(2)-CHDは、「２」枝疾患に対する「１」の回帰係数であり；  図3-7-(3)-CHDは、「２」枝および「３」枝疾患サンプルについてのVIPであり；  図3-7-(4)-CHDは、「３」枝疾患に対する「２」の回帰係数であり；  図3-7-(5)-CHDは、「１」枝および「３」枝疾患サンプルについてのVIPであり；  図3-7-(6)-CHDは、「３」枝疾患に対する「１」の回帰係数であり；  図3-8-CHDは、OSC後に同一データについて計算されたPLS-DAモデルにおける「１」型（黒塗り三角形）、「２」型（円、●）、「３」型（正方形、■）および検証サンプル（菱形、◆）を示すｙ−予測散布図を示す図であり；  図3-8A-CHDは、「１」型および「２」型であり；  図3-8B-CHDは、「２」型および「３」型であり；  図3-8C-CHDは、「１」型および「３」型であり；  図3-9A-CHDは、「１」枝型（黒塗り三角形）、「２」枝型（円、●）、「３」枝型（正方形、■）疾患を有する被験者についての確立された臨床パラメータから計算したPCAモデルでのPC2およびPC1（t2とt1）についてのスコア散布図であり；  図3-9B-CHDは、図3-9A-CHDに示したPCAにおける相当する負荷散布図（p2とp1）であり；  図3-9C-CHDは、３対のプロットを示す図であり（確立された臨床パラメータを用いて計算されたPLS-DAモデルにおけるPC2およびPC1（t2とt1）と相当する負荷w*cプロット（w*c2とw*c1）についてのスコア散布図）（このスコアプロットでは、「１」型サンプルを三角形（黒塗り三角形）によって示しており、「２」型サンプルを円（●）によって示しており、「３」型サンプルを正方形（■）によって示している）；  図3-9C-(1)-CHDは、「１」型および「２」型スコア散布図であり；  図3-9C-(2)-CHDは、���１」型および「２」型負荷w*c散布図であり；  図3-9C-(3)-CHDは、「２」型および「３」型スコア散布図であり；  図3-9C-(4)-CHDは、「２」型および「３」型負荷w*c散布図であり；  図3-9C-(5)-CHDは、「１」型および「３」型スコア散布図であり；  図3-9C-(6)-CHDは、「１」型および「３」型負荷w*c散布図であり；  図3-10-CHDは、図3-9Cに示した３種類の各モデルについての、変量重要性プロット（VIP）の部分および個々のOSC-PLS-DAモデルについての回帰係数のプロットの両方を示す図であり（各バーは、δ0.04を網羅するスペクトル領域を表す）；  図3-10-(1)-CHDは、「１」枝および「２」枝疾患サンプルにおけるVIPであり；  図3-10-(2)-CHDは、「２」枝疾患に対する「１」の回帰係数であり；  図3-10-(3)-CHDは、「２」枝および「３」枝疾患サンプルにおけるVIPであり；  図3-10-(4)-CHDは、「３」枝疾患に対する「２」の回帰係数であり；  図3-10-(5)-CHDは、「１」枝および「３」枝疾患サンプルにおけるVIPであり；  図3-10-(6)-CHDは、「３」枝疾患に対する「１」の回帰係数である。
【図４】骨粗鬆症に関する図であり、  図4-1A-OPは、対照被験者（黒塗り三角形）および骨粗鬆症患者（円、●）からの血清サンプルからの1-D  1H NMRスペクトル由来の主成分分析（PCA）モデルでのPC2およびPC1（t2とt1）についてのスコア散布図であり；  図4-1B-OPは、図4-1A-OPに示したPCAについての相当する負荷散布図（p2とp1）であり；  図4-1C-OPは、対照被験者（黒塗り三角形）および骨粗鬆症患者（円、●）からの血清サンプルからの1-D  1H NMRスペクトル由来のPCAモデルでのPC2およびPC1（t2とt1）についてのスコア散布図であり（PCAに先だって、データをフィルタリングした（この場合、直交シグナル補正、OSCを使用））；  図4-1D-OPは、図4-1C-OPに示したPCAについての相当する負荷散布図（p2とp1）であり；  図4-1E-OPは、対照被験者（黒塗り三角形）および骨粗鬆症患者（円、●）からの血清サンプルからの1-D  1H NMRスペクトル由来のPLS-DAモデルでのPC2およびPC1（t2とt1）についてのスコア散布図であり（PLS-DAに先だって、データをフィルタリングした（この場合、直交シグナル補正、OSCを使用））；  図4-1F-OPは、図4-1E-OPに示したPCAについての相当する負荷散布図（p2とp1）であり；  図4-2A-OPは、図4-1E-OPに示したPLS-DAモデル由来の変量重要性プロット（VIP）の部分を示す図であり；  図4-2B-OPには、図4-1E-OPに示したPLS-DAモデル由来の回帰係数プロットの部分を示す図であり；  図4-3-OPは、対照（黒塗り三角形）および骨粗鬆症（円、●）サンプルの約85％を用いて計算したPLS-DAモデルについてのｙ−予測散布図である（それを用いて、サンプル（正方形、■）（バリデーション集合）の残り15％における疾患の存在を予測した）。
【図５】骨関節炎に関する図であり、  図5-1A-OAは、対照被験者（黒塗り三角形）および骨関節炎患者（円、●）からの血清サンプルからの1-D  1H NMRスペクトル由来の主成分分析（PCA）モデルでのPC2およびPC1（t2とt1）についてのスコア散布図であり；  図5-1B-OAは、図5-1A-OAに示したPCAについての相当する負荷散布図（p2とp1）であり；  図5-1C-OAは、対照被験者（黒塗り三角形）および骨関節炎患者（円、●）からの血清サンプルからの1-D  1H NMRスペクトル由来のPCAモデルでのPC2およびPC1（t3とt2）についてのスコア散布図であり（PCAに先だって、データをフィルタリングした（この場合、直交シグナル補正、OSCを使用））；  図5-1D-OAは、図5-1C-OAに示したPCAについての相当する負荷散布図（p3とp2）であり；  図5-1E-OAは、対照被験者（黒塗り三角形）および骨関節炎患者（円、●）からの血清サンプルからの1-D  1H NMRスペクトル由来のPLS-DAモデルでのPC2およびPC1（t2とt1）についてのスコア散布図であり（PLS-DAに先だって、データをフィルタリングした（この場合、直交シグナル補正、OSCを使用））；  図5-1F-OAは、図5-1E-OAに示したPCAについての相当する負荷散布図（p2とp1）であり；  図5-2A-OAは、図5-1E-OAに示したPLS-DAモデル由来の変量重要性プロット（VIP）の部分を示す図であり；  図5-2B-OAには、図5-1E-OAに示したPLS-DAモデル由来の回帰係数プロットの部分を示す図であり；  図5-3-OAは、対照（黒塗り三角形）および骨粗鬆症（円、●）サンプルの約85％を用いて計算したPLS-DAモデルについてのｙ−予測散布図である（それを用いて、サンプル（正方形、■）（バリデーション集合）の残り15％における疾患の存在を予測した）。
【図１−１Ａ−ＴＷ】
2004528559.tif 000022
【図１−１Ｂ−ＴＷ】
2004528559.tif 000023
【図１−１Ｃ−ＴＷ】
2004528559.tif 000024
【図１−１Ｄ−ＴＷ】
2004528559.tif 000025
【図１−１Ｅ−ＴＷ】
2004528559.tif 000026
【図１−１Ｆ−ＴＷ】
2004528559.tif 000027
【図１−２Ａ−ＴＷ】
2004528559.tif 000028
【図１−２Ｂ−ＴＷ】
2004528559.tif 000029
【図１−３−ＴＷ】
2004528559.tif 000030
【図２−１Ａ−ＨＹＰ】
2004528559.tif 000031
【図２−１Ｂ−ＨＹＰ】
2004528559.tif 000032
【図２−１Ｃ−ＨＹＰ】
2004528559.tif 000033
【図２−１Ｄ−ＨＹＰ】
2004528559.tif 000034
【図２−１Ｅ（１）−ＨＹＰ】
2004528559.tif 000035
【図２−１Ｅ（２）−ＨＹＰ】
2004528559.tif 000036
【図２−１Ｅ（３）−ＨＹＰ】
2004528559.tif 000037
【図２−１Ｅ（４）−ＨＹＰ】
2004528559.tif 000038
【図２−１Ｅ（５）−ＨＹＰ】
2004528559.tif 000039
【図２−１Ｅ（６）−ＨＹＰ】
2004528559.tif 000040
【図２−１Ｆ（１）−ＨＹＰ】
2004528559.tif 000041
【図２−１Ｆ（２）−ＨＹＰ】
2004528559.tif 000042
【図２−１Ｆ（３）−ＨＹＰ】
2004528559.tif 000043
【図２−１Ｆ（４）−ＨＹＰ】
2004528559.tif 000044
【図２−１Ｆ（５）−ＨＹＰ】
2004528559.tif 000045
【図２−１Ｆ（６）−ＨＹＰ】
2004528559.tif 000046
【図２−２−（１）−ＨＹＰ】
2004528559.tif 000047
【図２−２−（２）−ＨＹＰ】
2004528559.tif 000048
【図２−２−（３）−ＨＹＰ】
2004528559.tif 000049
【図２−２−（４）−ＨＹＰ】
2004528559.tif 000050
【図２−２−（５）−ＨＹＰ】
2004528559.tif 000051
【図２−２−（６）−ＨＹＰ】
2004528559.tif 000052
【図２−３Ａ−ＨＹＰ】
2004528559.tif 000053
【図２−３Ｂ−ＨＹＰ】
2004528559.tif 000054
【図２−４Ａ−ＨＹＰ】
2004528559.tif 000055
【図２−４Ｂ−ＨＹＰ】
2004528559.tif 000056
【図２−５Ａ−ＨＹＰ】
2004528559.tif 000057
【図２−５Ｂ−ＨＹＰ】
2004528559.tif 000058
【図３−１−ＣＨＤ】
2004528559.tif 000059
【図３−２Ａ−ＣＨＤ】
2004528559.tif 000060
【図３−２Ｂ−ＣＨＤ】
2004528559.tif 000061
【図３−２Ｃ−ＣＨＤ】
2004528559.tif 000062
【図３−２Ｄ−ＣＨＤ】
2004528559.tif 000063
【図３−２Ｅ−ＣＨＤ】
2004528559.tif 000064
【図３−２Ｆ−ＣＨＤ】
2004528559.tif 000065
【図３−３Ａ−ＣＨＤ】
2004528559.tif 000066
【図３−３Ｂ−ＣＨＤ】
2004528559.tif 000067
【図３−４−ＣＨＤ】
2004528559.tif 000068
【図３−５Ａ−ＣＨＤ】
2004528559.tif 000069
【図３−５Ｂ−ＣＨＤ】
2004528559.tif 000070
【図３−５Ｃ−（１）−ＣＨＤ】
2004528559.tif 000071
【図３−５Ｃ−（２）−ＣＨＤ】
2004528559.tif 000072
【図３−５Ｃ−（３）−ＣＨＤ】
2004528559.tif 000073
【図３−５Ｃ−（４）−ＣＨＤ】
2004528559.tif 000074
【図３−５Ｃ−（５）−ＣＨＤ】
2004528559.tif 000075
【図３−５Ｃ−（６）−ＣＨＤ】
2004528559.tif 000076
【図３−６Ａ−ＣＨＤ】
2004528559.tif 000077
【図３−６Ｂ−ＣＨＤ】
2004528559.tif 000078
【図３−６Ｃ−（１）−ＣＨＤ】
2004528559.tif 000079
【図３−６Ｃ−（２）−ＣＨＤ】
2004528559.tif 000080
【図３−６Ｃ−（３）−ＣＨＤ】
2004528559.tif 000081
【図３−６Ｃ−（４）−ＣＨＤ】
2004528559.tif 000082
【図３−６Ｃ−（５）−ＣＨＤ】
2004528559.tif 000083
【図３−６Ｃ−（６）−ＣＨＤ】
2004528559.tif 000084
【図３−７−（１）−ＣＨＤ】
2004528559.tif 000085
【図３−７−（２）−ＣＨＤ】
2004528559.tif 000086
【図３−７−（３）−ＣＨＤ】
2004528559.tif 000087
【図３−７−（４）−ＣＨＤ】
2004528559.tif 000088
【図３−７−（５）−ＣＨＤ】
2004528559.tif 000089
【図３−７−（６）−ＣＨＤ】
2004528559.tif 000090
【図３−８Ａ−ＣＨＤ】
2004528559.tif 000091
【図３−８Ｂ−ＣＨＤ】
2004528559.tif 000092
【図３−８Ｃ−ＣＨＤ】
2004528559.tif 000093
【図３−９Ａ−ＣＨＤ】
2004528559.tif 000094
【図３−９Ｂ−ＣＨＤ】
2004528559.tif 000095
【図３−９Ｃ−（１）−ＣＨＤ】
2004528559.tif 000096
【図３−９Ｃ−（２）−ＣＨＤ】
2004528559.tif 000097
【図３−９Ｃ−（３）−ＣＨＤ】
2004528559.tif 000098
【図３−９Ｃ−（４）−ＣＨＤ】
2004528559.tif 000099
【図３−９Ｃ−（５）−ＣＨＤ】
2004528559.tif 000100
【図３−９Ｃ−（６）−ＣＨＤ】
2004528559.tif 000101
【図３−１０−（１）−ＣＨＤ】
2004528559.tif 000102
【図３−１０−（２）−ＣＨＤ】
2004528559.tif 000103
【図３−１０−（３）−ＣＨＤ】
2004528559.tif 000104
【図３−１０−（４）−ＣＨＤ】
2004528559.tif 000105
【図３−１０−（５）−ＣＨＤ】
2004528559.tif 000106
【図３−１０−（６）−ＣＨＤ】
2004528559.tif 000107
【図４−１Ａ−ＯＰ】
2004528559.tif 000108
【図４−１Ｂ−ＯＰ】
2004528559.tif 000109
【図４−１Ｃ−ＯＰ】
2004528559.tif 000110
【図４−１Ｄ−ＯＰ】
2004528559.tif 000111
【図４−１Ｅ−ＯＰ】
2004528559.tif 000112
【図４−１Ｆ−ＯＰ】
2004528559.tif 000113
【図４−２Ａ−ＯＰ】
2004528559.tif 000114
【図４−２Ｂ−ＯＰ】
2004528559.tif 000115
【図４−３−ＯＰ】
2004528559.tif 000116
【図５−１Ａ−ＯＡ】
2004528559.tif 000117
【図５−１Ｂ−ＯＡ】
2004528559.tif 000118
【図５−１Ｃ−ＯＡ】
2004528559.tif 000119
【図５−１Ｄ−ＯＡ】
2004528559.tif 000120
【図５−１Ｅ−ＯＡ】
2004528559.tif 000121
【図５−１Ｆ−ＯＡ】
2004528559.tif 000122
【図５−２Ａ−ＯＡ】
2004528559.tif 000123
【図５−２Ｂ−ＯＡ】
2004528559.tif 000124
【図５−３−ＯＡ】
2004528559.tif 000125
【国際公開パンフレット】
2004528559.tif 000126
2004528559.tif 000127
2004528559.tif 000128
2004528559.tif 000129
2004528559.tif 000130
2004528559.tif 000131
2004528559.tif 000132
2004528559.tif 000133
2004528559.tif 000134
2004528559.tif 000135
2004528559.tif 000136
2004528559.tif 000137
2004528559.tif 000138
2004528559.tif 000139
2004528559.tif 000140
2004528559.tif 000141
2004528559.tif 000142
2004528559.tif 000143
2004528559.tif 000144
2004528559.tif 000145
2004528559.tif 000146
2004528559.tif 000147
2004528559.tif 000148
2004528559.tif 000149
2004528559.tif 000150
2004528559.tif 000151
2004528559.tif 000152
2004528559.tif 000153
2004528559.tif 000154
2004528559.tif 000155
2004528559.tif 000156
2004528559.tif 000157
2004528559.tif 000158
2004528559.tif 000159
2004528559.tif 000160
2004528559.tif 000161
2004528559.tif 000162
2004528559.tif 000163
2004528559.tif 000164
2004528559.tif 000165
2004528559.tif 000166
2004528559.tif 000167
2004528559.tif 000168
2004528559.tif 000169
2004528559.tif 000170
2004528559.tif 000171
2004528559.tif 000172
2004528559.tif 000173
2004528559.tif 000174
2004528559.tif 000175
2004528559.tif 000176
2004528559.tif 000177
2004528559.tif 000178
2004528559.tif 000179
2004528559.tif 000180
2004528559.tif 000181
2004528559.tif 000182
2004528559.tif 000183
2004528559.tif 000184
2004528559.tif 000185
2004528559.tif 000186
2004528559.tif 000187
2004528559.tif 000188
2004528559.tif 000189
2004528559.tif 000190
2004528559.tif 000191
2004528559.tif 000192
2004528559.tif 000193
2004528559.tif 000194
2004528559.tif 000195
2004528559.tif 000196
2004528559.tif 000197
2004528559.tif 000198
2004528559.tif 000199
2004528559.tif 000200
2004528559.tif 000201
2004528559.tif 000202
2004528559.tif 000203
2004528559.tif 000204
2004528559.tif 000205
2004528559.tif 000206
2004528559.tif 000207
2004528559.tif 000208
2004528559.tif 000209
2004528559.tif 000210
2004528559.tif 000211
2004528559.tif 000212
2004528559.tif 000213
2004528559.tif 000214
2004528559.tif 000215
2004528559.tif 000216
2004528559.tif 000217
2004528559.tif 000218
2004528559.tif 000219
2004528559.tif 000220
2004528559.tif 000221
2004528559.tif 000222
2004528559.tif 000223
2004528559.tif 000224
2004528559.tif 000225
2004528559.tif 000226
2004528559.tif 000227
2004528559.tif 000228
2004528559.tif 000229
2004528559.tif 000230
2004528559.tif 000231
2004528559.tif 000232
2004528559.tif 000233
2004528559.tif 000234
2004528559.tif 000235
2004528559.tif 000236
2004528559.tif 000237
2004528559.tif 000238
2004528559.tif 000239
2004528559.tif 000240
2004528559.tif 000241
2004528559.tif 000242
2004528559.tif 000243
2004528559.tif 000244
2004528559.tif 000245
2004528559.tif 000246
2004528559.tif 000247
2004528559.tif 000248
2004528559.tif 000249
2004528559.tif 000250
2004528559.tif 000251
2004528559.tif 000252
2004528559.tif 000253
2004528559.tif 000254
2004528559.tif 000255
2004528559.tif 000256
2004528559.tif 000257
2004528559.tif 000258
2004528559.tif 000259
2004528559.tif 000260
2004528559.tif 000261
2004528559.tif 000262
2004528559.tif 000263
2004528559.tif 000264
2004528559.tif 000265
2004528559.tif 000266
2004528559.tif 000267
2004528559.tif 000268
2004528559.tif 000269
2004528559.tif 000270
2004528559.tif 000271
2004528559.tif 000272
2004528559.tif 000273
2004528559.tif 000274
2004528559.tif 000275
2004528559.tif 000276
2004528559.tif 000277
2004528559.tif 000278
2004528559.tif 000279
2004528559.tif 000280
2004528559.tif 000281
2004528559.tif 000282
2004528559.tif 000283
2004528559.tif 000284
2004528559.tif 000285
2004528559.tif 000286
2004528559.tif 000287
2004528559.tif 000288
2004528559.tif 000289
2004528559.tif 000290
2004528559.tif 000291
2004528559.tif 000292
2004528559.tif 000293
2004528559.tif 000294
2004528559.tif 000295
2004528559.tif 000296
2004528559.tif 000297
2004528559.tif 000298
2004528559.tif 000299
2004528559.tif 000300
2004528559.tif 000301
2004528559.tif 000302
2004528559.tif 000303
2004528559.tif 000304
2004528559.tif 000305
2004528559.tif 000306
2004528559.tif 000307
2004528559.tif 000308
2004528559.tif 000309
2004528559.tif 000310
2004528559.tif 000311
2004528559.tif 000312
2004528559.tif 000313
2004528559.tif 000314
2004528559.tif 000315
2004528559.tif 000316
2004528559.tif 000317
2004528559.tif 000318
2004528559.tif 000319
2004528559.tif 000320
2004528559.tif 000321
2004528559.tif 000322
2004528559.tif 000323
2004528559.tif 000324
2004528559.tif 000325
2004528559.tif 000326
2004528559.tif 000327
2004528559.tif 000328
2004528559.tif 000329
2004528559.tif 000330
2004528559.tif 000331
2004528559.tif 000332
2004528559.tif 000333
2004528559.tif 000334
2004528559.tif 000335
2004528559.tif 000336
2004528559.tif 000337
2004528559.tif 000338
2004528559.tif 000339
2004528559.tif 000340
2004528559.tif 000341
2004528559.tif 000342
2004528559.tif 000343
2004528559.tif 000344
2004528559.tif 000345
2004528559.tif 000346
2004528559.tif 000347
2004528559.tif 000348
2004528559.tif 000349
2004528559.tif 000350
2004528559.tif 000351
2004528559.tif 000352
2004528559.tif 000353
2004528559.tif 000354
2004528559.tif 000355
2004528559.tif 000356
2004528559.tif 000357
2004528559.tif 000358
2004528559.tif 000359
2004528559.tif 000360
2004528559.tif 000361
2004528559.tif 000362
2004528559.tif 000363
2004528559.tif 000364
2004528559.tif 000365
2004528559.tif 000366
2004528559.tif 000367
2004528559.tif 000368
2004528559.tif 000369
2004528559.tif 000370
2004528559.tif 000371
2004528559.tif 000372
2004528559.tif 000373
2004528559.tif 000374
2004528559.tif 000375
2004528559.tif 000376
2004528559.tif 000377
2004528559.tif 000378
2004528559.tif 000379
2004528559.tif 000380
2004528559.tif 000381
2004528559.tif 000382
2004528559.tif 000383
2004528559.tif 000384
2004528559.tif 000385
2004528559.tif 000386
2004528559.tif 000387
2004528559.tif 000388
2004528559.tif 000389
2004528559.tif 000390
2004528559.tif 000391
2004528559.tif 000392
2004528559.tif 000393
2004528559.tif 000394
2004528559.tif 000395
2004528559.tif 000396
2004528559.tif 000397
2004528559.tif 000398
2004528559.tif 000399
2004528559.tif 000400
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004528559.tif 000401
【国際調査報告】
2004528559.tif 000402
2004528559.tif 000403
2004528559.tif 000404