(57)【要約】本発明は、RNAを抽出するために特に有用な、RNA抽出試薬、方法、およびキットを提供する。本発明の試薬、方法、およびキットは、RNA、たとえば細胞質RNAを、困難な材料から、植物、特にフェノール類、タンニン、多糖（デンプンなどの）および樹脂を含むものなどの困難な植物組織から抽出するために、特に有用である。従来の試薬および方法と比較して、本発明によって比較的に高収量が得られる。また、本発明に従って得られたRNA標品は、高品質であり、優れたA260/280結果によって、およびゲル電気泳動によって示される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の成分の1つまたはそれ以上を含むRNAの抽出のための試薬：
少なくとも一つの非イオン性界面活性剤；
少なくとも一つのイオン性界面活性剤；
少なくとも一つのキレート剤；および、
少なくとも一つの還元剤。
【請求項２】
抗菌薬（たとえば、アジ化ナトリウム、0.5%）をさらに含む、請求項1記載の試薬。
【請求項３】
非イオン性界面活性剤がtert-オクチルフェノキシポリ（オキシエチレン）エタノールを含む、請求項1記載の試薬。
【請求項４】
イオン性界面活性剤がSDSを含む、請求項1記載の試薬。
【請求項５】
キレート剤がEDTAまたはEGTAを含む、請求項1記載の試薬。
【請求項６】
還元剤が2−メルカプトエタノールまたはジチオトレイトールを含む、請求項1記載の試薬。
【請求項７】
請求項1記載の試薬であって：
tert-オクチルフェノキシポリ（オキシエチレン）エタノール；
SDS；
EDTA；および、
2−メルカプトエタノールまたはジチオトレイトール、
を含む試薬。
【請求項８】
請求項1記載の試薬であって：
体積の0.1〜4%の濃度の、少なくとも一つの非イオン性界面活性剤；
重量の0〜1%の濃度の、少なくとも一つのイオン性界面活性剤；
0.02〜0.25Mの濃度の、少なくとも一つのキレート剤；および、
体積の1〜40%の濃度の、少なくとも一つの還元剤、
を含む試薬。
【請求項９】
請求項8記載の試薬であって：
約1%のアイジパール；
約100mMのEDTA；
約0.2%のSDS；
約40%の2−メルカプトエタノール；および、
約0.5%のアジ化ナトリウム、
を含む試薬。
【請求項１０】
請求項8記載の試薬であって：
約1%のアイジパール；
約100mMのEDTA；
約0.02%のSDS；
約20%の2−メルカプトエタノール；および、
約0.5%のアジ化ナトリウム、
を含む試薬。
【請求項１１】
植物材料からRNAを単離するための方法であって、以下の1つまたはそれ以上の段階を含む方法：
請求項1記載の抽出試薬と材料を混合して、抽出物を形成することと；
抽出物から細胞片を分離して、不純物が除去された画分を形成することと；
不純物が除去された画分を有機的に抽出して、水相および有機相を形成することと；
水相からRNAを沈殿させること。
【請求項１２】
請求項11記載の方法であって、植物材料が植物組織、真菌の菌糸、または種子を含み、該組織または種子を微粉砕して粉末またはペーストを形成することをさらに含む方法。
【請求項１３】
細胞片が遠心によって除去される、請求項11記載の方法。
【請求項１４】
有機的抽出がクロロホルム抽出を含む、請求項11記載の方法。
【請求項１５】
沈殿することがアルコール沈殿を含む、請求項11記載の方法。
【請求項１６】
植物材料からRNAを単離するための方法であって、以下の1つまたはそれ以上の段階を含む方法：
請求項1記載の抽出試薬と材料を混合して、抽出物を形成することと；
抽出物から細胞片を分離して、不純物が除去された画分を形成することと；
固体マトリックスにRNAを結合すること。
【請求項１７】
結合が優先してmRNAを結合する、請求項16記載の方法。
【請求項１８】
固体マトリックスからRNAを溶出させることをさらに含む、請求項16記載の方法。
【請求項１９】
植物材料からRNAを単離するための方法であって：
植物組織、真菌の菌糸または種子を含む植物材料を透過試薬にさらして、植物材料の細胞または細胞片から細胞質RNAを抽出させることと；
細胞質RNAを細胞または細胞片から分離することと、
を含む方法。
【請求項２０】
分離がろ過または布ごしを含む、請求項18記載の方法。
【請求項２１】
分離がRNAを沈殿させて沈降物を回収することを含む、請求項18記載の方法。
【請求項２２】
以下の成分の1つまたはそれ以上を含むRNAを抽出するためのキット：
請求項1記載の1つまたはそれ以上のRNA抽出試薬；
1つまたはそれ以上のRNaseフリーの洗浄試薬；
1つまたはそれ以上の組織濾過器；および、
チューブを保持する1つまたはそれ以上のRNaseフリーの試料。
【請求項２３】
RNAの有機抽出のための成分をさらに含む、請求項22記載のキット。
【請求項２４】
RNAを結合するためのRNaseフリーのマトリックスをさらに含む、請求項22記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、RNAを含む細胞および組織から、並びに好ましくは、植物および植物材料に由来する細胞および／または組織からRNAを単離するための試薬、方法、およびキットである。
【背景技術】
【０００２】
関連技術
RNA単離のために使用できる市販の試薬およびキットは、困難な検体、特にポリフェノール（たとえば、針葉樹針状葉）またはデンプン（たとえば、ジャガイモ塊茎または種子）に富んだ検体のものには順応しない。これらの試薬およびキットからのRNA収量は低く、またはRNAの質は不十分であり、低いA260/280比もしくはゲル電気泳動によって示される。
【０００３】
松葉およびトウヒ針状葉からRNAを単離するために、いくつかの方法が文献に記載されており、良質のRNAを与えることが報告されている。たとえば、Schneiderbauer, A.ら、Isolation of Functional RNA from Plants Rich in Phenolic Compound Analytical Biochemistry 197： 91-95 (1991)； Graham, Glenn C.、A method of extraction of total RNA from Pinus radiata and other conifers、Plant Molecular Biology Reporter、11： 32−37 (1993)； Chang, Shujun、Puryear, JeffおよびCairney, John、A simple and efficient method for isolating RNA from pine trees、Plant Molecular Biology Reporter 11： 113-116 (1993)；並びにBahloul, MounaおよびBurkard, Gerard、An improved method for the isolation of total RNA from spruce tissues、Plant Molecular Biology Reporter 11 ： 212−215 (1993)）を参照されたい。
【０００４】
しかし、これらの既知の方法の全ては、極めて面倒である。たとえば、Schneiderbauerは、70℃においてアセトンでマツまたはトウヒ検体を抽出して、ポリフェノールを除去する。次いで、ペレットを0.1%（v/v）のトライトン（Triton）X-100、15mM DTT（ジチオトレイトール）およびフェノールの存在下でホモジナイズする。ホモジナイゼーションプロセスでは、RNA、DNAおよびタンパク質を放出する。タンパク質は、有機抽出相に相分離されることによって除去される。次いで、DNAを塩化セシウムクッション上で遠心することによって除去する。
【０００５】
もう一つの方法（Graham）は、グアニジウムイソチオシアネートを使用して組織を破壊し、次いで、RNAをトリフルオロ酢酸セシウムクッション上で遠心することによって回収する。その他の方法は、カチオン性（Changら）またはアニオン性（Bahloulら）の界面活性剤を使用して核酸を放出した後、多数のアルコール沈殿またはフェノール抽出のいずれか、および塩化リチウム沈殿により単離したRNAからDNAを除去する。
【０００６】
本発明の試薬および方法は、RNA抽出プロセスを単純化し、RNA含有材料、特に通常の植物検体、並びにポリフェノールおよびデンプンに富んだものから、高品質のRNAを得る。
【発明の開示】
【０００７】
発明の概要
本発明は、RNAを抽出するために特に有用な、RNA抽出試薬、方法、およびキットを提供する。本発明の試薬、方法、およびキットは、RNA、たとえば細胞質RNAを、困難な材料から、植物から、特にフェノール、タンニン、多糖（デンプンなどの）、および樹脂を含むものなどの困難な植物組織から抽出するために、特に有用である。従来の試薬および方法と比較した場合、本発明に従って比較的に高収量が得られる。また、本発明に従って得られたRNA標品は、優れたA260/280結果によって、およびゲル電気泳動によって示されて高品質である。
【０００８】
発明の詳細な記載
本発明のRNA単離試薬は、以下の成分のうちの1つまたはそれ以上、好ましくは2つまたはそれ以上を含むが、限定されない：
1つまたはそれ以上の非イオン性界面活性剤；
1つまたはそれ以上のイオン性界面活性剤；
1つまたはそれ以上のキレート剤；
1つまたはそれ以上の還元剤；
1つまたはそれ以上の抗菌薬（たとえば、アジ化ナトリウム、約0.5%）。
【０００９】
主要な界面活性剤は、入手可能または使用している非イオン性界面活性剤のいずれか：たとえば、アイジパール（Igepal）（NP-40の代替）、トライトン類（トライトンX-100）、ツィーン（Tween）20、およびその他同種のものなどであってもよく、DNAが共に単離されずにRNAを抽出するというその機能について選択される。好ましくは、非イオン性界面活性剤は、体積の約0.1〜4%の濃度で、より好ましくは、約0.53%または約1〜2%の濃度で存在する。適切な非イオン性界面活性剤は、体積の1%の濃度のアイジパール（tert-オクチルフェノキシポリ（オキシエチレン）エタノール）である。
【００１０】
ヘルパー界面活性剤または二次界面活性剤は、入手可能などのようなカチオン性またはアニオン性界面活性剤（たとえばSDS、CTAB）であってもよく、特に高還元剤濃度、たとえば約40%の濃度の2メルカプトエタノールにおいて、RNA収量を改善する。好ましくは、イオン性界面活性剤の濃度は、約0.01%〜0.5%、より好ましくは約0.01%〜1%の濃度である。適切なイオン性界面活性剤は、植物材料およびその他の成分、特に還元剤の濃度に依存して、約0.02%または約0.2%までの濃度のSDSである。
【００１１】
界面活性剤は、細胞膜を膜透過性にするような量に選択され、その結果、薬剤は細胞の細胞質ドメインに入ることができ、RNAは細胞の細胞質ドメインを出ることができる。好ましくは、界面活性剤および還元剤（類）の量は、細胞内に分解性の成分を保持するように選択され、その結果、有害な酵素等が細胞片とともに除去される。
【００１２】
製剤中の2−メルカプトエタノールまたは同様の還元剤の濃度が大きくなるにつれ、含まれている可能性のある二次（イオン性）界面活性剤の濃度は高くなる。2−メルカプトエタノール濃度が増加するとRNA収量が減少するが、RNAがよく保護され、すなわち、より高品質で抽出される。この高品質RNAは、特に、最も高いレベルのポリフェノールを含む植物（たとえば、ヒマラヤスギまたはビャクシン）で著しい。表1-13を参照されたい。
【００１３】
また、キレート剤は、浸透圧性分解を回避するために、生理学的な塩条件で細胞膜および／または細胞核を維持するために必要な「塩」を提供してもよい。キレート剤は、普通に使用されるものから選択してもよい。たとえば、EDTA、EGTA、クエン酸塩（クエン酸ナトリウムなど）、クエン酸、サリチル酸、サリチル酸の塩、フタル酸、2,4-ペンタンジン（pentanedine）、ヒスチジン、二塩化水素化ヒスチジノール、8-ヒドロキシキノリン、8-ヒドロキシキノリン、クエン酸塩、およびo-ヒドロキシキノリンは、当業者に既知のキレート剤の代表である。または、試薬の1つの成分には、NaCl、KCI等を、塩強度を提供するために使用してもよく、種々の薬剤（たとえば、ベタイン）を、キレート剤として使用してもよい。
【００１４】
好ましくは、キレート剤は、約0.02〜0.25Mの濃度で存在する。より好ましくは、キレート剤は、0.05-0.2Mの濃度で存在する。適切なキレート剤は、約0.1Mの濃度のEDTAである
【００１５】
還元剤は、2−メルカプトエタノールから、または2−メルカプトエタノール（たとえば、DTTまたはその他のメルカプタン）に取って代わると考えられる任意の数から選ばれてもよい。好ましくは、還元剤は、体積の約1%〜40%の濃度で存在する。より好ましくは、還元剤は、約10%〜40%の濃度で存在する。20%または40%の濃度の2−メルカプトエタノールは、選択した組織において好収量および高品質のRNAを産生することが見出された。一部の適用については、約4%の2−メルカプトエタノールが適切である。
【００１６】
抗菌薬、たとえばアジ化ナトリウムは、好ましくは試薬の貯蔵寿命を延長するために含まれる。したがって、抗菌薬は、新たに調製した成分が使用直前に混合される場合は必要でない。また、得られたRNAの質を過度に分解することなく貯蔵寿命を延長するいずれの抗菌薬も、従って本発明における使用に適している。抗菌薬の量は、薬剤および貯蔵条件に依存し、抽出プロセスを妨げず、かつ所望の貯蔵寿命を提供するように選択されるべきである。
【００１７】
特に、フェノールは、本RNA単離試薬に含まれない。フェノールは、（ポリ）フェノールオキシダーゼの基質として作用することが見出されており、これにより、抽出されたRNAの酸化反応に関与する。したがって、上で一覧を示したもの以外の成分が本発明の抽出試薬に含まれてもよいが、はっきりと分かる量のフェノールは許容されない。
【００１８】
試料に接触し得る全ての成分および表面は、好ましくはRNaseフリーである。
【００１９】
成分のサブセットは、別々にまたは組み合わせて予め調製することもでき、使用前の時点で、または作用製剤を得るために使用する時点で、残りの成分と組み合わせることもできる。
【００２０】
本発明に従ったRNAを単離するための一般的なプロトコールは、様々なRNA含有材料、たとえば、植物細胞または植物組織、たとえば植物の茎、葉、根、種子、および花から得られた細胞または組織に適している。植物組織は、最初に粗くまたは微細な粉末に粉砕される。植物材料が細胞培養液である場合、細胞は、たとえば抽出培地と約5分間揺らすことによって混合される。植物材料が組織材料である場合、粉末は、抽出培地と約20分間混合される。好ましくは、植物材料は、粉砕組織が完全に懸濁されるまで試薬と混合される。
【００２１】
より微細な材料では、粗い材料よりも少ない混合時間を必要とする。より短い混合では、より低い収量となる。延長された混合では、増加された収量を提供するが、より低い質のRNAである。混合時間は、植物材料、並びに要求されるRNAの量および質に依存して調整することができる。
【００２２】
次いで、抽出標品を遠心して、細胞片を除去する。また、濾過または布ごしの工程を使用することもできる。次いで、濃縮したNaCl（たとえば5MのNaCIの約0.25部分）を標品に添加する。CHCl3などの有機抽出用溶剤を上清に添加して、それとともに混合する。遠心により、水相と有機相を遠心分離によって分離する。水相をアルコール沈殿、たとえばエタノール沈殿にかけて、単離したRNAを得る。
【００２３】
後述する例において、好ましい製剤として2つの製剤を使用した。その他の製剤は、一般的にまたは特定の植物組織に適している。好ましい製剤は、40%の2−メルカプトエタノール製剤および20%の2−メルカプトエタノール製剤である。これらの好ましい製剤は、以下に一覧を示す：
2004523229.tif 000002
【００２４】
高レベルのポリフェノールを含む植物については、40%の2−メルカプトエタノール製剤が好ましく；より一般的な適用については、20%の2−メルカプトエタノール製剤が好ましい。
【００２５】
本発明のRNA抽出試薬は、好ましくは細胞質RNAを抽出する。核膜は、細胞内にDNAおよびその他の核成分を保持して保存される。細胞膜は、透過化されるが、完全性の程度を維持する分解酵素などの多くの細胞質成分を細胞内に保持する。
【００２６】
全ての特許、特許出願および本願明細書において引用される刊行物は、参照としてその全体が本明細書に組み入れられる。
【００２７】
実施例
実施例1
クロロホルム抽出によるRNA単離の小規模プロトコール
新鮮な組織、たとえば植物の葉または根は、液体窒素中で粉末に粉砕した。乾燥した種子は、室温で粉砕した。全ての粉砕した植物材料は、-70℃に貯蔵した。0.1gの粉砕した組織を0.5mlのRNA単離試薬（たとえば、20%の2−メルカプトエタノール製剤）に添加した。粉砕した組織が完全に再懸濁されるまで試料を混合し、次いで、室温で5分間静置させた。
【００２８】
試料を微量遠心機で2分間、12,000×gで遠心した。上清をRNaseフリーのチューブへ移した。0.1mlの5M NaClの一定分量を上清に添加して、試料を混合した。0.3mlのクロロホルムの一定分量を添加して混合した。試料を4℃において10分間、12,000×gで遠心し、相を分離した。水相をRNaseフリーのチューブへ移して、同体積のイソプロピルアルコールを添加した。試料を混合して10分間室温で静置させた。試料を4℃において10分間12,000×gで遠心した。上清をデカントで移して、ペレットを75%エタノールで洗浄して水に溶解した。少しでも濁りが観察される場合、試料を1分間、12,000×gで遠心して、上清を新しいチューブへ移した。
【００２９】
実施例2
RNAカートリッジ精製による小規模プロトコール
新鮮な組織、たとえば植物の葉または根は、液体窒素中で粉末に粉砕した。乾燥した種子は、室温で粉砕した。全ての粉砕した植物材料は、-70℃に貯蔵した。0.1gの粉砕した組織を0.5mlのRNA単離試薬（たとえば、20%の2−メルカプトエタノール製剤）に添加した。粉砕した組織が完全に再懸濁されるまで試料を混合し、次いで、室温で5分間静置させた。
【００３０】
試料をコンサートホモジナイザー（Concert Homogenizer）へ注いで、微量遠心機で2分間、12,000×gで遠心し、RNA抽出物を透明にした。同体積のグアニジウムイソチオシアネートおよびエタノールを添加してコンサート（Concert）RNAカートリッジを通して加工して、洗浄し、製造業者によって提供されるプロトコールに従ってRNAを水で溶出した。
【００３１】
実施例3
RNAを植物から単離するための大規模プロトコール
新鮮な組織を液体窒素中で粉末に粉砕した。乾燥した種子は、室温で粉砕した。全ての粉砕した植物材料は、-70℃に貯蔵した。1gの粉砕した組織を5mlの本RNA単離試薬（たとえば、20%の2−メルカプトエタノール製剤）に添加した。粉砕した試料が完全に再懸濁されるまで試料を混合し、次いで、室温で5分間静置させた。試料を4℃において5分間、卓上遠心機にて2600×gで遠心した。上清をRNaseフリーのチューブへ移し、溶液を100μmナイロン篩に通した。1mlの5M NaClの一定分量を上清および3mlのクロロホルムに添加して混合した。試料を4℃において30分間、2600×gで遠心して相を分離した。水相をRNaseフリーのチューブへ移し、同体積のイソプロピルアルコールを添加した。試料を混合して室温で10分間静置させた。試料を4℃において30分間、2600×gで遠心した。上清をデカントで移して、ペレットを75%エタノールで洗浄して水に溶解した。少しでも濁りが観察される場合、溶液を1分間、12,000×gで遠心して、上清を新しいチューブへ移して-70℃で貯蔵した。
【００３２】
結果
本RNA単離試薬は、様々なRNA含有材料、特にポリフェノールおよびデンプンに富んだものを含む植物検体由来のものから、高品質RNAを単離する（表1〜13および図1を参照されたい）。ポリフェノールまたはデンプンに富んだ検体から、2つの主な市販のRNA単離試薬（RNイージー（RNeasy）およびトライゾール（TRIzol)）を使用して単離したRNAについては、A260/280比が低く、RNA品質が不十分であることを示す。ゲル解析は、本RNA単離試薬を使用して単離したRNAが、ポリフェノールに富んだ植物から単離されたか否かにかかわらず、無傷であることを示す（図1）。
【００３３】
表1〜12および図1に示した結果は、本発明の本RNA単離試薬が、ポリフェノールおよびデンプンに富んだものを含む様々な植物検体から高品質RNAを単離することを示す。ポリフェノールまたはデンプンに富んだ検体から、2つの主な市販のRNA単離試薬（RNイージーおよびトライゾール）を使用して単離したRNAについては、A260/280比が比較的低く、RNA品質が不十分であることを示す。ゲル解析では、本RNA単離試薬を使用して単離したRNAが、ポリフェノールに富んだか植物から単離された場合でさえも、無傷であることを示す（図1）。本RNA単離試薬を使用して単離されたRNAは、RT-PCRのためおよびcDNAライブラリの調製のためのテンプレートとしてうまく使用された。
【００３４】
表1に要約した結果は、ホワイトマツの水源苗条では、RNAを得るために還元剤であるDTTを必要とし、これが、ゲル解析によって決定されたように、分解されずに28SリボソームRNAバンドを維持することを示す。（ゲル電気泳動によって単離された、本発明に従って得られたRNAの例について図1を参照されたい）。表2に示すように、還元剤の濃度を4%の2−メルカプトエタノールに増加すると、最高品質および最も高いRNA収量が得られる。表3は、ヒマラヤスギおよびビャクシンなどのより問題のある針葉樹について、RNAの完全性を維持するためには、4%の濃度の2−メルカプトエタノールでは十分でなく、40%の2−メルカプトエタノールを必要とすることを示す。2種のマツについて2−メルカプトエタノール濃度を増加すると、RNA収量を減少する。種々の濃度の2−メルカプトエタノールを、ポリフェノールに富むトマトの葉で試験した場合、表5は、完全なRNAの単離が、好ましくは20%および40%の濃度の還元剤で達成されたことを示す。
【００３５】
正常レベルのポリフェノールまたはデンプンの植物では、40%の2−メルカプトエタノールがより低い、たとえば20%の2−メルカプトエタノールの量と比較した場合よりも低いRNA収量を与える。ポップコーン種子は、40%の2−メルカプトエタノールでは、ほんの僅かの量のRNAを得る。2−メルカプトエタノール濃度を20%に減少させ、並びにSDS濃度を0.02%に下げると、種子（高デンプン含有）、トマト、ホワイトマツ、およびプンゲントウヒ（高ポリフェノール含有）、並びにデンプンおよびポリフェノールの正常レベルを有する、シロイヌナズナ（Arabidopsis）、ダイズ、イネ、およびトウモロコシから高品質RNAを単離するために有用な製剤を生じることとなる。
【００３６】
本RNA単離試薬を使用して単離されたRNAは、RT-PCRに、およびポリ（A+）選択後のcDNAライブラリの調製のために使用された（データ示さず）。
【００３７】
【表１】
2004523229.tif 000003
【００３８】
【表２】
2004523229.tif 000004
【００３９】
【表３】
2004523229.tif 000005
【００４０】
【表４】
2004523229.tif 000006
a 40% 2−メルカプトエタノール／100mM EDTA／1% アイジパール／0.2% SDS
b 20% 2−メルカプトエタノール／100mM EDTA／1% アイジパール／0.2% SDS
【００４１】
【表５】
2004523229.tif 000007
【００４２】
【表６】
2004523229.tif 000008
*ゲル解析によって少または全くRNAが存在しないOD'sを示す
【００４３】
【表７】
2004523229.tif 000009
【００４４】
【表８】
2004523229.tif 000010
【００４５】
【表９】
2004523229.tif 000011
【００４６】
【表１０】
2004523229.tif 000012
*20% 2−メルカプトエタノール、1% アイジパール、0.02 %SDS、100mM EDTA、0.5% アジ化ナトリウム製剤
**クロロホルム添加前の清澄RNA抽出物に塩を添加した
【００４７】
【表１１】
2004523229.tif 000013
*20% 2−メルカプトエタノール、1% アイジパール、0.02 %SDS、100mM EDTA、0.5% アジ化ナトリウム製剤
【００４８】
【表１２】
2004523229.tif 000014
*20% 2−メルカプトエタノール、1% アイジパール、0.02% SDS、100mM EDTA、0.5% アジ化ナトリウム製剤
【００４９】
【表１３】
2004523229.tif 000015
*20% 2−メルカプトエタノール、1% アイジパール、0.02% SDS、100mM EDTA、0.5% アジ化ナトリウム製剤
【図面の簡単な説明】
【００５０】
【図１】RNイージー形式を使用した、針葉樹およびホリーから単離したRNAのゲル解析を示す。
【図２】RNA単離試薬カートリッジ精製法を使用した、針葉樹およびホリーから単離したRNAのゲル解析を示す。
【図３】RNA単離試薬クロロホルム抽出形式を使用した、針葉樹およびホリーから単離したRNAのゲル解析を示す。
【図４】トライゾールを使用した、針葉樹およびホリーから単離したRNAのゲル解析を示す。
【００５１】
図1-4において、8つのアッセイバンドは、a-hとラベルされ、ここで、a-hは：(a) プンゲントウヒ針状葉（Blue spruce needles）；（b）低木性のマツ（Scrub pine）（水源苗条）；(c)ホワイトマツ（White pine）（水源苗条）；（d）ビャクシン（Juniper）；（e）ヒマラヤスギ（Cedar）；(f)ホリーの葉（Holly leaves）（水源の葉）；（g）ドクニンジン（Hemlock）；および（h）RNAラダーである。
【図１】
2004523229.tif 000016
【図２】
2004523229.tif 000017
【図３】
2004523229.tif 000018
【図４】
2004523229.tif 000019
【国際公開パンフレット】
2004523229.tif 000020
2004523229.tif 000021
2004523229.tif 000022
2004523229.tif 000023
2004523229.tif 000024
2004523229.tif 000025
2004523229.tif 000026
2004523229.tif 000027
2004523229.tif 000028
2004523229.tif 000029
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2004523229.tif 000031
2004523229.tif 000032
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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