(57)【要約】ＣｏｌＥ１複製システムを有する発現ベクターにおいて、ＣｏｌＥ１の複製開始点のＲＮＡＩ及びＲＮＡＩＩの未装着ｔＲＮＡとの相同性を、ＲＮＡＩ遺伝子のコード領域の変異及びＲＮＡＩＩ遺伝子の対応する変異によって改変する。該変異はＲＮＡＩ及びＲＮＡＩＩのループ１及び／又はループ２及び／又はループ３における１個又は複数の塩基置換を生じる。組換え蛋白質を産生するこのベクターを使用する方法において、プラスミドコピー数は安定に保持される。プラスミド産生方法において、高いプラスミドコピー数を得ることができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣｏｌＥ１の複製システムを有する発現ベクターであって、ＣｏｌＥ１の複製開始点のＲＮＡＩ及びＲＮＡＩＩの未装着ｔＲＮＡ との相同性がＲＮＡＩ遺伝子のコード領域の１個又は複数の変異及びＲＮＡＩＩ遺伝子の１個又は複数の対応する変異によって改変され、前記変異がＲＮＡＩ及びＲＮＡＩＩのループ１及び／又はループ２及び／又はループ３における１個又は複数の塩基置換を生じることを特徴とする前記発現ベクター。
【請求項２】
ｐＭＢ１、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ １８／１９、ｐＴＺ１９Ｒ、ｐＴＺ１９Ｕ、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＫＳ（＋／−）及びｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ（＋／−）から選択されるベクターから誘導される請求項１に記載の発現ベクター。
【請求項３】
前記変異が未装着ｔＲＮＡとのＲＮＡＩ／ＲＮＡＩＩ相同性の減少又は喪失を生じる、請求項１に記載の発現ベクター。
【請求項４】
前記変異がＲＮＡＩ及びＲＮＡＩＩのループ２で生じる、請求項３に記載の発現ベクター。
【請求項５】
ＲＮＡＩ及びＲＮＡＩＩのループ２が本質的にその完全な配列の変異によって改変される、請求項４に記載の発現ベクター。
【請求項６】
ループ２の７個の塩基中６個がそれぞれの相補的塩基によって置換される、請求項５に記載の発現ベクター。
【請求項７】
ＲＮＡＩのループ２が野生型配列に代えて配列ＴＧＴＡＧＡＴを含み、ＲＮＡＩＩのループ２が野生型配列に代えて配列ＡＴＣＴＡＣＡを含む、請求項６に記載の発現ベクター。
【請求項８】
ＲＮＡＩのループ２が野生型配列ＵＵＧＧＵＡＧに代えて配列ＣＴＧＡＡＣＴを含み、ＲＮＡＩＩのループ２が野生型配列ＣＵＡＣＣＡＡに代えて配列ＡＧＴＴＣＡＧを含む、請求項６に記載の発現ベクター。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか１項に記載のベクターで形質転換された細菌宿主細胞。
【請求項１０】
大腸菌細胞である請求項９に記載の宿主細胞。
【請求項１１】
大腸菌の菌株ＨＭＳ １７４の細胞である請求項１０に記載の宿主細胞。
【請求項１２】
大腸菌において所定の組換え蛋白質を産生するための請求項７に記載の発現ベクターの使用。
【請求項１３】
大腸菌においてプラスミドＤＮＡを産生するための請求項８に記載の発現ベクターの使用。
【請求項１４】
所定の蛋白質を産生する方法であって、発現制御配列と操作的に結合された蛋白質をコードするＤＮＡを含む請求項１〜７のいずれか１項に記載のベクターが、ＣｏｌＥ１の複製システムと適合性のある細菌宿主細胞において転換され、宿主細胞を適した条件下で増殖し、所定の蛋白質を回収及び精製する前記方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、組換え蛋白質及びプラスミドＤＮＡ産生のために改善された、複製システムのＣｏｌＥ１開始点を有する発現ベクターに関する。
所定の組換え蛋白質の産生又はプラスミドＤＮＡの産生のための遺伝子改変微生物（ＧＭＯ）による発酵プロセスの使用は、工業的に普及してきている。
発酵プロセスを最適化する場合、主要な目的はできる限り多くの生成物を、良い品質で、費用対効果の大きい方法で得ることである。これを達成するために、容積及び時間当たりに生成される生成物の単位として定義される容積生産性を最適化する必要がある。最適化プロセスに対して大きな影響を有する因子は容積当たりのバイオマス、すなわち生成物を産生することのできる細胞の数、及び各細胞が産性できる蛋白質の量である。ある種の制限において、細胞当たりの産生能力は、組換え蛋白質をコードする遺伝子を有する細胞におけるプラスミドの数であるプラスミドコピー数（ＰＣＮ）に比例する。さらに、組換え蛋白質のための転写システムの強度は重要である。いくつかのプロモーターは弱く、代謝ポテンシャルを十分に活用しないが、多くのプロモーターは過度に強く、組換え蛋白質の過剰発現を引き起こす。代謝資源は組換え蛋白質の発現と宿主蛋白質の発現との間で共有されなければならず、過剰に強い発現システムは代謝資源の枯渇をすぐに引き起こし、結果的に細胞死を引き起こす。
近年、遺伝子治療の分野においてプラスミドＤＮＡの使用が全く新しい産業の中心となってきている。従って、十分な量の高品質プラスミドＤＮＡが要求される。プラスミド産生プロセスにおいて、組換え蛋白質は産生されず、代わりに細胞工場はプラスミドＤＮＡ産生のために利用されている。非常に高いプラスミド複製速度がこの目的を達成するために必要であり、その結果宿主細胞は組換え蛋白質産生と異なる課題を成し遂げなければならない。
【０００２】
細菌発酵プロセスについて、高いプラスミドコピー数がこのシステムを用いて得ることができるために、主にＣｏｌＥ１プラスミドが提案されている。
ＣｏｌＥ１プラスミドは既に広範に記載されており（Ｃｈａｎ ｅｔ ａｌ．， １９８５）、ＣｏｌＥ１の複製開始点の複製メカニズムはよく研究されている（Ｃｅｓａｒｅｎｉ ｅｔ ａｌ．， １９９１）。ＣｏｌＥ１プラスミドからの複製は、複製開始点の５５５ｂｐ上流のプレプライマーＲＮＡＩＩの転写で、宿主のＲＮＡポリメラーゼによって開始する（Ｔｏｍｉｚａｗａ， １９８５）。ＲＮＡＩＩは、伸長の際特異的構造を保持し、約５５０ヌクレオチドの重合の後鋳型ＤＮＡとのハイブリッドを形成し始める。プレプライマー転写は不均一に終結し、ハイブリッド形成の後、ＲＮＡＩＩプレプライマーはＲＮアーゼＨによって切断され、遊離した３’ＯＨ末端と活性プライマーを形成し、ＤＮＡポリメラーゼＩに近づきやすくなる（Ｔｏｍｉｚａｗａ， １９９０； Ｌｉｎ−Ｃｈａｏ ａｎｄ Ｃｏｈｅｎ， １９９１； Ｍｅｒｌｉｎ ａｎｄ Ｐｏｌｉｓｋｙ， １９９５）。
ＣｏｌＥ１領域は２つのプロモーターを含む。ＲＮＡＩは１０８ヌクレオチドのアンチセンスＲＮＡ分子であり、逆鎖の第２プロモーターから転写され、ＲＮＡＩＩの５’末端と相補的である。ＲＮＡＩは複製開始点から４４５ｂｐ上流から転写され、ほぼそれに向かってＲＮＡＩＩの転写が始まる（Ｍｅｒｌｉｎ ａｎｄ Ｐｏｌｉｓｋｙ， １９９５； Ｔｏｍｉｚａｗａ， １９９０）。
【０００３】
ＣｏｌＥ１プラスミドにおけるプラスミドコピー数の調節について、速度論は平衡特性よりも重要である。例えば、ＲＮＡＩＩにおける変異を有する一部の変異株は、ＲＮＡＩと相補的である領域に影響を及ぼさないが、ＲＮＡＩによって減らされる抑制を結果として生じる。これはおそらく中間体ＲＮＡ構造の半減期に影響し、ＲＮＡＩ感受性のための時間を減少するためであり、従って増加したプラスミドコピー数を結果として生じる。この知見は中間体ＲＮＡＩＩ構造及びＲＮＡＩＩ折り畳み経路の速度論の重要性を示唆する（Ｇｕｌｔｙａｅｖ ｅｔ ａｌ， １９９５）。
【０００４】
アミノ酸の欠乏は特定のアミノ酸を装着しない（ｎｏｔ ｃｈａｒｇｅｄ）多量のｔＲＮＡを生じることが観測された（以下、これらのｔＲＮＡを“未装着（ｕｎｃｈａｒｇｅｄ）ｔＲＮＡ”と呼ぶ。）。上述のように、この現象は、代謝源が枯渇した場合、組換え蛋白質の発現の誘導後の状況と比較され得る。
Ｗｒｏｂｅｌ及びＷｅｇｒｚｙｎ（１９９８）は５つの異なるアミノ酸の欠乏を選択的に誘導するストラテジーをテストした。特定の欠乏したアミノ酸に対応するｔＲＮＡのアンチコドンループの相同性とＲＮＡＩ及びＲＮＡＩＩの特定のループとの間に正の相関があることが見出された。大部分の装着（ｃｈａｒｇｅｄ）ｔＲＮＡは翻訳メカニズムによって捕獲されるが、代わりに未装着ｔＲＮＡはその他の分子、ＲＮＡＩ及びＲＮＡＩＩと相互作用する機会があるものと仮定された。おそらくｔＲＮＡとＲＮＡＩ又はＲＮＡＩＩとの間の相互作用は、ＲＮＡＩとＲＮＡＩＩの相互作用と干渉し、結果としてより高いＲＮＡＩＩ−ＤＮＡハイブリダイゼーション頻度を生じるであろう（どんな思い切った方法でも、ＲＮＡＩＩと相互作用するｔＲＮＡはＲＮＡＩＩ構造を変えないものと思われる。）。後者はより高い複製頻度、従ってより高いＰＣＮを意味するであろう。
【０００５】
Ｚａｖａｃｈｅｖ及びＩｖａｎｏｖ（１９８８）は２１のｔＲＮＡのすべてとＲＮＡＩ／ＲＮＡＩＩとの間の相同性を比較した。これらのうち、１１はＲＮＡＩ又はＲＮＡＩＩのいずれかと４０％よりも高い相同性をしめした。彼等はこれらを３つのカテゴリーに分けた：
ａ）ＲＮＡＩと相同的であるｔＲＮＡ：Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｐｈｅ及びＴｈｒ、
ｂ）ＲＮＡＩＩと相同的であるｔＲＮＡ：ｆ−Ｍｅｔ、Ｔｒｙ及びＧｌｙ、及び
ｃ）ＲＮＡＩ及びＲＮＡＩＩの両方と相同的であるｔＲＮＡ：Ｍｅｔ及びＶａｌ。
すべてのｔＲＮＡは７ヌクレオチドのアンチコドンループを有する（Ｈｊａｌｔ ａｎｄ Ｗａｇｎｅｒ， １９９２）。ＲＮＡＩと相同的であるｔＲＮＡの場合、最も高い相同性がループ２の領域において見られたが、ほとんどはＲＮＡＩの５’末端においてより小さい相同性を示した。
欠乏及び細胞ストレスは、ＣｏｌＥ１プラスミドの複製開始点と相互作用する未装着ｔＲＮＡの増加したプールを誘導する。この相互作用は、複製開始点のＲＮＡＩ及びＲＮＡＩＩに存在する３つのＲＮＡループ構造と相同的であるｔＲＮＡの配列によって生じ、システムのＰＣＮ制御メカニズムとの干渉を誘導する。このように、ＰＣＮは急速に増加し、発酵プロセスの崩壊を生じる。
【０００６】
これらの問題を克服するために、国際公開第８９／０７１４１号では、発現を増大する目的でＲＮＡＩＩ遺伝子及び／又はｒｏｐ遺伝子に変異を含むＣｏｌＥ１複製システムを有する発現ベクターが提案される。これはプラスミドコピー数を実質的に増大することなしに達成された。
細菌発酵プロセスは、システムが長期間にわたって保持され得る場合にのみ効果的であり、増大したプラスミドコピー数は、発現システムの崩壊を生じる主な因子の一つであるため、発酵の際の延長された細菌生存度有する改善された発現システムを提供することが本発明の目的である。
特に、本発明の目的は、発現システムの誘導後、プアラスミドコピー数が、代謝負担を致死量未満に保つために、制御されない増幅に関して制限される発現システムを提供することである。
本発明のさらなる目的はプラスミド複製速度を増大し、その結果プラスミド産生プロセスにおけるプラスミドＤＮＡの収量を増大することである。
本発明の根底にある問題を解決するために、ＣｏｌＥ１型複製のメカニズムが利用された。特に、遺伝的アプローチは、ＣｏｌＥ１の複製開始点の未装着ｔＲＮＡに対する相同性の程度を変えるために、好ましくは減少又は完全に取り除くために行われた。別のアプローチにおいて、ランダムライブラリーは変化した複製作用、例えば高いプラスミドコピー数を有するプラスミドを選択するために生成された。
【０００７】
本発明はＣｏｌＥ１の複製システムを有する発現ベクターであって、ＣｏｌＥ１の複製開始点のＲＮＡＩ及びＲＮＡＩＩの未装着ｔＲＮＡとの相同性がＲＮＡＩ遺伝子のコード領域の１個又は複数の変異及びＲＮＡＩＩ遺伝子の１個又は複数の対応する変異によって改変され、前記変異がＲＮＡＩ及びＲＮＡＩＩのループ１及び／又はループ２及び／又はループ３における１個又は複数の塩基置換を生じることを特徴とする前記発現ベクターに関する。
用語“変異”はＲＮＡＩ及びＲＮＡＩＩの未装着ｔＲＮＡとの相同性を増加する変異及び減少させる変異の両方を包含する。
複製を損なわないように、できる限りＲＮＡＩ及びＲＮＡＩＩの２次構造及び融解温度を保持するために、変異は相補的な塩基置換、すなわちＡ→Ｔ、Ｔ→Ａ、Ｃ→Ｇ、Ｇ→Ｃ変異が好ましい。また、その他の変異も存在してもよいが、複製のメカニズムを損なわないことが条件である。
ＲＮＡＩＩ遺伝子に変異を含み、従ってその位置によりＲＮＡＩ遺伝子のプロモーターに変異を含む国際公開第８９／０７１４１号に記載のＣｏｌＥ１ベクターに対して、本発明のベクターは、未装着ｔＲＮＡと相同的であるコード領域、より詳細にはＲＮＡＩ及びＲＮＡＩＩ遺伝子の両方のループ領域に変異を含む。このように、本発明は、相同性の程度を故意に操作し、最終的にプラスミド複製の速度を調整するために新規なストラテジーを提供する。
本発明の意味において、用語“ループ”は、望ましくはＲＮＡＩ又はＲＮＡＩＩの不対ループ構造を包含するが、この用語は単なるループ領域に厳密に制限するだけでなく、幹領域（ｓｔｅｍ ｒｅｇｉｏｎ）の隣接ヌクレオチド、好ましくは２個以下のヌクレオチドを含んでもよい。
変異は、ループ１、ループ２又はループ３のいずれかにおける単一の塩基置換又はループ１及び／又はループ２及び／又はループ３における単一の又は任意の数の塩基置換（すべての塩基の置換を含む。）であってもよい。
好ましくは、変異は、未装着ｔＲＮＡと最も高い相同性を有する領域であるループ２においてである。
ＲＮＡＩ及びＲＮＡＩＩ遺伝子のループにおける所望の変異は通常の変異及びクローニング方法に従って得られてもよい。
【０００８】
一の実施態様において、それらは以下のようにして得ることができる。鋳型としてＲＮＡＩ又はＲＮＡＩＩ遺伝子又はそのフラグメントのいずれかから開始し、プライマーとしてその一方又は両方が所望の変異を有する２個のオリゴデオキシリボヌクレオチドを使用するＰＣＲ反応が行われる。好ましくは、ＰＣＲ反応は２工程ＰＣＲである。第１工程において、２個の重複フラグメントが増幅され、その１つは該フラグメントを連結するために設計される制限部位と、プライマー結合部位との間のプライマー配列に所望の変異を含む。次に、増幅されたフラグメントは関連する制限酵素で消化され、結合されて、次のＰＣＲ増幅工程において鋳型として使用される。この工程において、新たに導入された制限部位を含まない第１工程と同じプライマーが使用され、該プライマーは個々のプラスミドにおける最も隣接した特有の制限部位の上流及び下流と結合するために選択される。
ＲＮＡＩ及びＲＮＡＩＩ遺伝子の相補性のために、ベクターの調製において、両方の遺伝子又はその断片はＰＣＲ増幅のための鋳型として同様に適している。与えられた相補性により、それらの遺伝子のいずれかの１個又は複数のループにおける任意の変異は、その他の相補的遺伝子における対応する変異を生じ、上述の好ましい方法において、変異を含むプライマーはポリメラーゼによって伸長に役立つだけでなく、ＤＮＡポリメラーゼのための鋳型としても役立ち、その結果変異を含む相補鎖を生じる。ＲＮＡＩ又はＲＮＡＩＩ遺伝子のいずれが鋳型として使用されるかに依存して、ＲＮＡＩＩ又はＲＮＡＩは相補的変異を自動的に有することになる。
好ましくは、ＲＮＡＩ及びＲＮＡＩＩ遺伝子の全体を含むプラスミドは鋳型として使用される。あるいは、ＲＮＡＩ又はＲＮＡＩＩ遺伝子の全体をコードするＤＮＡ分子は使用されてもよい。ＲＮＡＩ及びＲＮＡＩＩ遺伝子はＴｏｍｉｚａｗａ ｅｔ ａｌ， １９７７に記載されている。
ＲＮＡＩ又はＲＮＡＩＩ遺伝子フラグメントが鋳型として使用される場合、該フラグメントは、要求されるすべての成分、すなわち変異する配列、プライマー結合部位、必要によっては、さらに１個又は複数の制限部位を含むのに十分な大きさを有する必要がある。好ましくは、該フラグメントは１個又は複数のループ（各ループは約７個のヌクレオチドからなる。）及びプライマー結合部位（約１８個のヌクレオチド）を含み、すなわち適したフラグメントの最小の大きさは約２５〜３０個のヌクレオチドである。
【０００９】
本発明の好ましい実施態様において、変異は、部位及び数の点で、できる限り多くの未装着ｔＲＮＡ種との相同性の程度を実質的に変化させる目的で選択される。
このように、本発明の実施態様において、ＲＮＡＩ及びＲＮＡＩＩの改変は、ループ２、すなわち最も高い相同性を有するループの改変から開始することによって行われ、前記改変はできる限り多くの位置の置換を意味する。一例として、実施例１の実験で示されるように、ループ２はその７個のヌクレオチド中６個を置換することによって改変され、１個の塩基（プラスミドＣｏｌＥ１の６９３位、Ｇｅｎｂａｎｋ ＧＩ ９５０７２５３）を変化させないままにし、その結果新しい制限部位、好ましくはＮｃｏ１部位の一部として利用できる。塩基はそれぞれ相補的塩基によって置換される。
必要に応じて、このアプローチによって、すべての未装着ｔＲＮＡとの相同性は完全に消滅し得る。従って、このアプローチは、それらのアミノ酸配列とは無関係の所定の多種多様の組換え蛋白質の産生のための最大の柔軟性を、特に発現の際の細胞生存度を維持するプラスミド複製の制御によって提供する。この場合、プラスミドの増幅はＣｏｌＥ１特異的複製メカニズムのみに影響を受け、宿主細胞の代謝変動には影響を受けない。また、この場合、プラスミドコピー数は発酵プロセスの間中、本質的に一定に保たれる。
あるいは、ＲＮＡＩ及びＲＮＡＩＩと、未装着ｔＲＮＡとの間の相同性を完全に無くすために、この相同性は改変、すなわち所望される程度まで増大又は減らされてもよい。いくつかの応用について、例えば発現機構の可能性が減少したプラスミドコピー数、従って最適以下の量のプラスミド（“遺伝子量”）によって十分に活用されないため、生成物の収量が不十分である場合、わずかに増加するプラスミドコピー数によって発現速度を増加することが望ましいかもしれない。これは、いくつかの未装着ｔＲＮＡ、特に珍しいｔＲＮＡとの配列相同性を選択的に保持することによって達成できる。特異的な未装着ｔＲＮＡのための配列相同性は文献（Ｚａｖａｃｈｅｖ ａｎｄ Ｉｖａｎｏｖ， １９８８）から知られている。また、このストラテジーは、生成物が封入体の形態で又は可溶性の形態で存在するように蛋白質合成の速度に影響を与えるのに有用である。一例として、ある程度のプラスミド増幅は封入体の形成を導くかもしれないが、わずかな減少は可溶性生成物の形成に都合がよいかもしれない。
【００１０】
いくつかの応用のために、ＲＮＡＩ及びＲＮＡＩＩの未装着ｔＲＮＡとの配列相同性を増大することによってプラスミドコピー数を劇的に増大することが、特にプラスミドＤＮＡ産生にとって有利である。また、配列相同性を増大するために要求される変異は文献（Ｚａｖａｃｈｅｖ ａｎｄ Ｉｖａｎｏｗ， １９８８）から知られ、配列相同性の減少の目的で記載される原理と同じ原理に従って行うことができる。
個々の応用及び／又は生成物のために、該方法は変異の範囲を実験的にテストすることによって最適化できる。適した実験は以下のようにして行ってもよい。テストされるべき変異を有するプラスミド又は一連のプラスミド候補は適切な細菌宿主細胞に形質移入され、適した条件下で小スケール、例えば浸透フラスコで増殖され、発酵プロセスは所定のパラメータ、特に増殖、生成物収量及び品質、プラスミドコピー数に関してモニターされる。
【００１１】
広範囲の配列改変を得るのに特に有用である他の実施態様は、ループ１及び／又はループ２及び／又はループ３の１個又は複数の位置をランダムに変異することであり、その結果発現システムの所望の性質で選択される発現ベクターの構築で使用されてもよいライブラリーを作成する。一例として、プラスミド候補は組換え蛋白質産生に最も関連したある選択パラメータ、例えば増殖速度、生産力及び生存度によって選択されてもよく、該方法は上述の標準的な実験装置で行われる。
さらに、このアプローチでは、ＰＣＮ操作に基づく組換え蛋白質発現速度の効率的な調整が可能となる。所定の遺伝子はライブラリーを含んでいるベクターに存在することを条件として、選択されるプラスミドは、常に所定の遺伝子の発現に最適である。
正常な発酵の際、本発明に従って、誘導後のプラスミドコピー数（ＰＣＮ）のほぼ１０倍の増加が観測され、ｔＲＮＡとＲＮＡＩＩとの間の相同性は減少又は消滅する。これは、制限されないＲＮＡＩ分子の多量のプールが自由にＲＮＡＩＩと相互作用できる効果を有する。このように、複製のメカニズムは、組換え蛋白質の発現のために代謝的な過負荷によって引き起こされた未装着ｔＲＮＡの高いプールとは無関係である。プラスミド複製のメカニズムが組換え蛋白質発現と関係した代謝的ストレスと無関係であることは、組換え蛋白質のより高い収量を生じる。
すべてのｔＲＮＡとの相同性において変化を生じる本発明の塩基置換はＲＮＡＩ及びＲＡＮＩＩの両方に存在するため、未装着ｔＲＮＡの組成（組換え産物に依存する）はこのアプローチとは関係しない。改変ＣｏｌＥ１複製システムに加えて、本発明の発現ベクターは蛋白質発現のために要求される成分、すなわちプロモーター、翻訳開始領域、選択マーカー（例えば抗生物質耐性マーカー）、所定の蛋白質をコードするＤＮＡの挿入のための制限部位等を含む、所定の蛋白質をコードするｃＤＮＡ配列と機能的に（ｏｐｅｒａｔｉｖｅｌｙ）結合した発現制御配列を含む。
好ましくは、本発明の発現ベクターは以下のベクターの１つから誘導される：ｐＭＢ１ （Ｂｏｌｉｖａｒ ｅｔ ａｌ．， １９７７）；
ｐＢＲ３２２ （Ｃｏｖａｒｒｕｂｉａｓ ｅｔ ａｌ．， １９８１；ＭＢＩ Ｆｅｒｍｅｎｔａｓから入手可能、カタログ番号＃ＳＤ００４１； ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ配列受入番号Ｊ０１７４９， Ｋ００００５， Ｌ０８６５４， Ｍ１０２８２， Ｍ１０２８３， Ｍ１０２８６， Ｍ１０３５６， Ｍ１０７８４， Ｍ１０７８５， Ｍ１０７８６， Ｍ３３６９４， Ｖ０１１１９）；
ｐＵＣ１８ （Ｙａｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎ ｅｔ ａｌ．， １９８５； ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ配列受入番号Ｌ０９１３７；ＭＢＩ Ｆｅｒｍｅｎｔａｓから入手可能、カタログ番号＃ＳＤ００６１）；
ｐＵＣ１９ （ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ配列受入番号Ｌ０９１３６． ＭＢＩ Ｆｅｒｍｅｎｔａｓから入手可能、＃ＳＤ００５１）；
ｐＴＺ１９Ｒ （ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ配列受入番号Ｙ１４８３５；ＭＢＩ Ｆｅｒｍｅｎｔａｓから入手可能、カタログ番号＃ＳＤ０１４１）；
ｐＴＺ１９Ｕ （ＭＢＩ Ｆｅｒｍｅｎｔａｓから入手可能、カタログ番号＃ＳＤ０１６１； ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ配列受入番号Ｙ１４８３５）；
ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＫＳ（−）（Ａｌｔｉｎｇ−Ｍｅｅｓ ｅｔ ａｌ．， １９８９； ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ配列受入番号Ｘ５２３２９）；
ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ＫＳ（＋） （Ａｌｔｉｎｇ−Ｍｅｅｓ ｅｔ ａｌ．， １９８９； ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ配列受入番号Ｘ５２３２７）；
ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ＳＫ（−）（Ａｌｔｉｎｇ−Ｍｅｅｓ ｅｔ ａｌ．， １９８９；ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ配列受入番号Ｘ５２３３０．
ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ＳＫ（＋）（Ａｌｔｉｎｇ−Ｍｅｅｓ ｅｔ ａｌ．， １９８９； ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ配列受入番号Ｘ５２３２８）。
所定の蛋白質に関して、大腸菌におけるプラスミドの発現が機能的蛋白質を与える限り、配列に関して制限はない。
【００１２】
本発明の実験において、ヒトのＣｕ−ＺｎスーパーオキシドジスムターゼをコードするｃＤＮＡを使用した。このｃＤＮＡを有するベクターから、１５３アミノ酸からなり、細胞質内に放出される、溶解性の高い、３２ｋＤａの二量体蛋白質を産生することができる（Ｃｓｅｒｊａｎ−Ｐｕｓｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．， １９９９）。
ＣｏｌＥ１型プラスミドと適合性のある任意の細菌宿主細胞、好ましくは大腸菌の菌株、特に菌株ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）（Ｓｔｕｄｉｅｒ ａｎｄ Ｍｏｆｆａｔ， １９８６）、又はサルモネラ菌の菌株を使用してもよい。
【００１３】
さらに別の実施態様において、本発明は改変ＣｏｌＥ１複製を有する発現ベクターによって形質転換された宿主細胞に関する。
宿主菌株の形質転換のために、任意の従来の方法、例えばエレクトロポレーション又は塩化カルシウム又はカルシウム沈殿を使用してもよい。
【００１４】
さらに別の実施態様において、本発明は、所定の組換え蛋白質を産生する方法であって、大腸菌宿主細胞はＲＮＡＩ及びＲＮＡＩＩ遺伝子の１個又は複数のループに変異を有するＣｏｌＥ１複製システムを有する発現ベクターで形質転換され、適切な条件下で増殖し、所定の蛋白質が回収される前記方法に関する。本発明は、組換え蛋白質の発現から生じる宿主代謝との干渉を補償するためのツールを提供することによって組換え蛋白質産生プロセス発生を加速する。本発明の方法は流加（ｆｅｄ ｂａｔｃｈ）発酵プロセス、すなわち栄養分の添加がバイオマスの増加と共役するプロセスにおいて特に有利である。長期間にわたって実施でき、その結果古典的なバッチプロセスよりも高いバイオマス産生及びプロセス全体の効率性を生じる流加プロセスの利点を十分に利用するために、安定で、調節可能な発現システムが要求される。この必要性は、本発明の発現ベクターの使用によって有利に満たされる。
さらに、ＣｏｌＥ１ ＲＮＡ Ｉ及びＲＮＡ Ｉの１個又は複数のループの配列の変化はプラスミド複製速度を劇的に増大するのに役立つことができ、本発明のベクターはプラスミドの産生のために、例えば遺伝子治療における使用に、非常に有用である。本発明の利点は、いわゆるＲＮＡ Ｉ／ＲＮＡ ＩＩ“キッシングコンプレックス（ｋｉｓｓｉｎｇ ｃｏｍｐｌｅｘ）”の安定性を減少させ、その結果プラスミド複製速度を増大する可能性にある。
【００１５】
実施例１
プラスミドとしてｐＥＴ１１ａ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社のｐＵＣ１９の誘導体）を実験で使用した。このプラスミドはアンピシリン耐性のためのベータラクタマーゼ遺伝子を含む。このプラスミドの組換え蛋白質発現は効率的なＴ７ ＲＮＡポリメラーゼによって調節される。ｌａｃオペレーターはＴ７プロモーターと翻訳開始配列との間に位置している。これはインデューサーＩＰＴＧがないときに抑制を生じる。ｐＥＴ１１ａ−ＳＯＤプラスミドは、組換え蛋白質ヒトＣｕ−Ｚｎスーパーオキシドジスムターゼ（ｈＳＯＤ）（細胞に対して非毒性であり、細胞質に放出される、溶解性の高い１５３アミノ酸の３２ｋＤａ二量体蛋白質）をコードするｃＤＮＡ遺伝子を含む（Ｃｓｅｒｊａｎ−Ｐｕｓｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．， １９９９）。
ＳＯＤのプラスミド伝播及び発現のために大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）を細菌の菌株として使用した（Ｓｔｕｄｉｅｒ ａｎｄ Ｍｏｆｆａｔ， １９８６）。この菌株は染色体ＤＮＡに組み込まれたＴ７ポリメラーゼを有する。Ｔ７ポリメラーゼは組換え蛋白質の発現に必要不可欠である。形質転換体をアンププレート（ａｍｐ ｐｌａｔｅｓ）（１００ｐｇ／ｍｌのアンピシリンを含む抗生物質培地ＬＢ）で選択した（Ｍａｎｉａｔｉｓ， ｅｔ ａｌ．， １９８２）。
これらの実験において形質転換方法としてＢｉｏ−Ｒａｄ Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒを用いるエレクトロポレーションを使用した。プライマーを真空乾燥粉末の形態でＭｅｔａｂｉｏｎ（Ｍａｒｔｉｎｓｒｉｅｄ， Ｇｅｒｍａｎｙ）から得て、水に溶解し、１００ｐｍｏｌ／μｌの濃度の原液を得た。ＰＣＲは、Ｔｈｅｒｍｏｂｌｏｃｋ（Ｔ−ｇｒａｄｉｅｎｔ， Ｂｉｏｍｅｔｒａ， Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて、加熱できるカバー（ｃｏｖｅｒ）Ｄｙｎａｚｙｍｅ ＥＸＴポリメラーゼ１ｕ／μｌ（Ｆｉｎｎｚｙｍｅｓ）、１０×Ｍｇを含まない緩衝剤及び１０ｍＭのＭｇＣｌ（補充）１ｍＭのｄＮＴＰ、ＤＭＳＯ及び蒸留水で行った。
プライマーとしてｐＥＴ１１ａ−１１４ｂａｃｋ（配列番号１）、ｐＥＺ１１ａ６５６ｆｏｒ（配列番号２）、ＲＮＡＩ−Ｎｃｏｂａｃｋ（配列番号３）及びＲＮＡＩ−Ｎｃｏ ｆｏｒ（配列番号４）を使用した。制限エンドヌクレアーゼ、λマーカー、Ｔ４−リガーゼ、子ウシ腸ホスファターゼをＭＢＩ−Ｆｅｒｍｅｎｔａｓから得て、彼等のアドバイスに従って使用した。
発酵槽として、それに連結されたＭＢＲ ＩＭＣＳ−２０００コントローラーを有するＭＢＲ Ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ ＡＧ（Ｗｅｔｚｉｋｏｎ， Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）の２０リットル発酵槽を使用した。発酵槽の許容容積は約１２リットルであった。
使用した飼料培地：流加状態の間システムにポンピングされる飼料培地の量は容器を連続的に秤量することによって測定した。飼料ポンプを調節して、μ＝０．１の一定の増殖速度を与えた。消泡剤の添加は伝導度センサーによって誘発した。外部との非接触は発酵槽の汚染のリスクがないことを意味する。使用したバッチ培地は半合成培地であり、バッチの開始時の増殖を促進するために少量のトリプトン及び酵母エキスを含む。成分を約４リットル（４０００ｇ）の合計容積に一緒に混合した。しかし、沈殿を回避するために、同じ番号の化学物質（以下の表１の＃を参照のこと。）を最初に個別に蒸留水に溶解した。グルコース溶液を蒸留水で３００ｇに増量し、個別にオートクレーブで処理した。続いて、グルコース溶液以外のすべてを与えられた順番で一緒に混合し、蒸留水で３７００ｇに増量した。
【００１６】
【表１】
表１：
バッチ培地（４０００ｇ）の組成。値は、特に明記されない限り、グラムで与えられる。
2004510437.tif 000002
【００１７】
【表２】
表２：
流加状態用飼料培地（６０００ｇ）の組成。値は、特に明記されない限り、グラムで与えられる。
2004510437.tif 000003
【００１８】
コッホテストを行い、プラスミドを含む細菌細胞の画分を決定し、プラスミド含有細胞がインデューサーＩＰＴＧを含むプレートで増殖するか否かを決定し、後者はプラスミド含有細胞が誘導後“正常な”量でＳＯＤを産生するか否かを示す。
細菌乾燥質量（ＢＤＭ）は乾燥物質の合計量を与える。
各実施例について、ガラスビーカーを一晩１０５℃で乾燥し、乾燥機中で冷却し、次いで分析スケールで秤量した。
ＰＣＮはゲノムＤＮＡ及びプラスミドＤＮＡの大きさ（塩基対の数）を相関させることから計算できる。
プラスミドＤＮＡ調製のために、サンプル調製物由来の細胞ペレットを１５０μｌの溶液Ｉ（５０ｍＭのグルコース、１０ｍＭのＥＤＴＡ、２５ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０）に懸濁し、２００μｌのＳＤＳ（０．５％のＳＤＳ溶液（ＩＣＮ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ））を添加し、５０μｌのリゾチーム（Ｓｉｇｍａ）を添加し、調製物を混合し、１０分間３７℃でインキュベートし、溶液をボルテックスで撹拌することによって均質化した。サンプルを冷蔵庫に入れて、分光蛍光光度計（Ｈｉｔａｃｈｉ Ｆ−２０００）での蛍光測定まで貯蔵した。
プラスミドＤＮＡの量を決定するために、細胞ペレットのＤＮＡをＧＦＸキット（ＭＢＩ， Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）でサプライヤーの取扱説明書に従って、以下の変更で精製した。溶解工程後、既知の量（約２μｇ）のｐＵＣ １９を内部標準として添加した。５０μｌの水のＤＮＡの溶出に続いて、Ｈｉｎｄ ＩＩＩによるプラスミドの直線化を１時間３７℃で行った。制限消化ＤＮＡを有するサンプルをキャピラリー電気泳動用のサンプルバイアルに気泡を回避して移す。サンプルをオートサンプラーに入れた。キャピラリーを１５〜２０分間緩衝剤で洗い流して校正した。吸光度の決定はダイオードアレイによる２６０ｎｍ及び２８０ｎｍで行った。分析後、キャピラリーを緩衝剤で洗い流し、４℃で貯蔵した。染色体ＤＮＡの量を合計ＤＮＡ含量／ｍｇ ＢＤＭからプラスミドＤＮＡ／ｍｇ ＢＤＭの量を減算することによって計算した。添加した内部標準の量は既知であるため、ＰＣＮは、Ｂｒｅｕｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９８）に従って、以下の式によって計算できる。
【００１９】
【数１】
2004510437.tif 000004
【００２０】
ＳＯＤの量の決定について、捕獲抗体（Ｎｏｖｏｃａｓｔｒａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｌｔｄ．， ＵＫから入手できるＳＯＤモノクローナル抗体クローン３０Ｆ１１）を被覆緩衝剤（２００μｇ／ｍｌ）で１：１００に希釈した。１００μｌの希釈した抗体溶液をマイクロタイタープレートの各ウエルに移し、４℃で一晩、又は室温で少なくとも２時間インキュベートした。プレートを洗浄緩衝剤で３回洗浄し、プレートを静かに叩くことによって緩衝剤を取り除いた。サンプル及び標準物質をピペットロボットにより希釈プレートで徐々に１：２に希釈した。５０μｌの各希釈液を抗体被覆プレートに（ロボットで）移し、１時間室温でインキュベートした。
プレートを洗浄緩衝剤で洗浄した。複合抗体を希釈緩衝剤で１：５００に希釈した（Ｐｏｒｓｔｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．， １９８８）。
複製開始点の範囲内の変異を表３に示す（表には、変異位置を記載し、その数値はＧＩ＝“９５０７２５３”Ｇｅｎｂａｎｋに従った全ＣｏｌＥ１配列を参照する。）。
【００２１】
【表３】
表３
2004510437.tif 000005
【００２２】
大腸菌ＨＭＳ １７４（ＤＥ３）ｐＥＴ１１ａｃｈＳＯＤのプラスミドを用いる発酵プロセスを図に示す。組換え蛋白質（ＳＯＤ）の合計及び特定産生を、産生速度ｑｐと共に示す。また、合計細菌乾燥物質（ＢＤＭ）及びプラスミドコピー数（ＰＣＮ）を示す。標準プロセス（例えば、Ｃｓｅｒｊａｎ−Ｐｕｓｃｈｍａｎｎ， １９９９に記載される）に対し、ＰＣＮは、４５時間での誘導後であっても、むしろ一定に保持されることが観測された。
コッホテストの結果及びプラスミドコピー数を下記表に示す。
【００２３】
【表４】
表４
2004510437.tif 000006
【００２４】
実施例２
プラスミドとして実施例１に記載されるｐＥＴ１１ａ−ＳＯＤを実験で使用した。
プラスミド伝播及びＳＯＤの発現のために細菌の菌株として実施例１に記載される大腸菌ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）を使用した。細菌及びプラスミドＤＮＡのすべての操作を実施例１に記載される通りに行った。オリゴヌクレオチド及び酵素を実施例１に記載される同じ源から得た。
プライマーとしてｐｅｔ１１ａ−Ｓｃａ−Ｉ−ｆｏｒ（配列番号５）、ｐｅｔ１１ａ−ＡｌｗＮ−Ｉ（配列番号６）、ｐｅｔ１１ａ−Ｘｂａ−Ｉ−ｂａｃｋ（配列番号７）及びＲＮＡ−Ｉ−ｒａｎｄｏｍＸｂａ−Ｉ−ｂａｃｋ（配列番号８）を使用した。
異なるクローンのプールにおける最良の候補を選別するために、２つのアプローチを用いた。
１．高プラスミドコピー数を有する細胞の選択
高ＰＣＮを有する細胞はアンピシリンに対するより高い耐性を有するであろう。細菌のプールを０．１、１又は１０ｍｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ−寒天のペトリ皿に蒔いた。１０ｍｇ／ｍｌのＬＢ−Ａｍｐ−プレートの１０個のコロニーを採集し、その配列を解析した。結果は、ＲＮＡ Ｉ及びＲＮＡ ＩＩのループ２の配列に関して異なる７個のクローンを示した。
【００２５】
【表５】
表５
2004510437.tif 000007
【００２６】
第２の選別の基準はプラスミドの安定性である。プラスミドプールを含む細菌を振盪フラスコで、３７℃で、ＯＤ＝２になるまで、アンピシリンを含まない合成培地を用いて培養した。３継代後（約２０世代に相当する。）、依然としてプラスミドを含む細菌を選択するために、最終継代の細菌をＬＢ−Ａｍｐプレートに蒔き、単一のコロニーを配列分析のために採集した。
この選別の結果を表６に示す。
【００２７】
【表６】
表６
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【００２８】
この選別における発酵槽及び付属物は実施例１に記載されるものと同じものを使用した。飼料培地及び増殖速度は実施例１に記載されるものと同じである。
ＰＣＮを実施例１に記載の通り決定し、計算した。それらのＰＣＮに関するクローンの候補の振る舞いを流加培養で特徴付けた。有望な候補の結果を表７に示し、異なるクローンのＰＣＮを非誘導状態及び誘導状態について示す。
【００２９】
【表７】
表７
2004510437.tif 000009
【００３０】
クローンＣｏｌＥ１Ｍｕｔ９（及び同じ配列を有するＣｏｌＥ１Ｍｕｔ１）はプラスミド産生のための非常に有望な候補であるとわかった。７５０のプラスミドコピー数は、野生型ＣｏｌＥ１プラスミドと比較して、約１４倍の増加を示す。
また、クローンＣｏｌＥ１Ｍｕｔ２２のＰＣＮはより高かった（換算係数２．５）。
クローンＣｏｌＥ１Ｍｕｔ５４の低いＰＣＮは、低い代謝負荷のために、組換え蛋白質産生に有利であろう。
【００３１】
参考文献
Ａｌｔｉｎｇ−Ｍｅｅｓ， Ｍ．Ａ．， ａｎｄ Ｓｈｏｒｔ， Ｊ．Ｍ． （１９８９） ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ： ｇｅｎｅ ｍａｐｐｉｎｇ ｖｅｃｔｏｒｓ， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， １７， ９４９４．
Ｂｒｅｕｅｒ， Ｓ． ｅｔ ａｌ （１９９８） Ｏｆｆ−ｌｉｎｅ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ ｏｆ ｐｌａｓｍｉｄ ｃｏｐｙ ｎｕｍｂｅｒ ｉｎ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｂｙ ｃａｐｉｌｌａｒｙ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ． Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ １９， ２４７４−２４７８．
Ｂｏｌｉｖａｒ， Ｆ．， Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ， Ｒ．Ｌ．， Ｇｒｅｅｎｅ， Ｐ．Ｊ．， Ｂｅｔｌａｃｈ， Ｍ．Ｃ．， Ｈｅｙｎｅｋｅｒ． Ｈ，Ｌ． ａｎｄ Ｂｏｙｅｒ， Ｈ．Ｗ． （１９７７） Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｅｗ ｃｌｏｎｉｎｇ ｖｅｈｉｃｌｅｓ． ＩＩ． Ａ ｍｕｌｔｉｐｕｒｐｏｓｅ ｃｌｏｎｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ， Ｇｅｎｅ ２， ９５−１１３．
Ｃｅｓａｒｅｎｉ Ｇ， Ｈｅｌｍｅｒ＿Ｃｉｔｔｅｒｉｃｈ Ｍ， Ｃａｓｔａｇｎｏｌｉ Ｌ． Ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ＣｏｌＥ１ ｐｌａｓｍｉｄ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｂｙ ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ＲＮＡ． Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ １９９１ Ｊｕｌ ７：７ ２３０−５．
Ｃｈａｎ ＰＴ， Ｏｈｍｏｒｉ Ｈ， Ｔｏｍｉｚａｗａ Ｊ， Ｌｅｂｏｗｉｔｚ Ｊ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ ｇｅｎｅ ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ＣｏｌＥ１ ＤＮＡ． Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ １９８５ Ｊｕｌ ２５ ２６０：１５ ８９２５−３５．
Ｃｓｅｒｊａｎ−Ｐｕｓｃｈｍａｎｎ， Ｍ．， Ｗ． Ｋｒａｍｅｒ， Ｅ． Ｄｕｒｒｓｃｈｍｉｄ， Ｇ． Ｓｔｒｉｅｄｎｅｒ ａｎｄ Ｋ． Ｂａｙｅｒ （１９９９）． Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｏｐｔｉｍｉｓａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ． Ａｐｐｌ． Ｍｉｃｒｏｂ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ． ５３， ４３−５０．
Ｃｏｖａｒｒｕｂｉａｓ， Ｌ．， Ｃｅｒｖａｎｔｅｓ， Ｌ．， Ｃｏｖａｒｒｕｂｉａｓ， Ａ．， Ｓｏｂｅｒｏｎ， Ｘ．， Ｖｉｃｈｉｄｏ， Ｉ．， Ｂｌａｎｃｏ， Ａ．， Ｋｕｐｅｒｓｚｔｏｃｈ−Ｐｏｒｔｎｏｙ， Ｙ．Ｍ． ａｎｄ Ｂｏｌｉｖａｒ， Ｆ． （１９８１） Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｅｗ ｃｌｏｎｉｎｇ ｖｅｈｉｃｌｅｓ． Ｖ． Ｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｏｄｉｎｇ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ｐＢＲ３２２ ａｎｄ ｓｅｖｅｒａｌ ｄｅｌｅｔｉｏｎ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ｐＢＲ３２７ ａｎｄ ｐＢＲ３２８， Ｇｅｎｅ １３， ２５−３５．
Ｇｕｌｔｙａｅｖ， Ａ． ｅｔ ａｌ （１９９５）． Ｔｈｅ ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ ｏｆ ａ ｍｅｔａｓｔａｂｌｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｉｎ ｐｌａｓｍｉｄ ｐｒｉｍｅｒ ＲＮＡ ｏｎ ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ＲＮＡ ｂｉｎｄｉｎｇ ｋｉｎｅｔｉｃｓ． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． Ｓｅｐ ２５；２３（１８）：３７１８−２５．
Ｈｊａｌｔ， Ｔ．， Ｇｅｒｈａｒｔ， Ｅ． ａｎｄ Ｗａｇｎｅｒ， Ｈ． （１９９２）． Ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｌｏｏｐ ｓｉｚｅ ｉｎ ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ａｎｄ ｔａｒｇｅｔ ＲＮＡｓ ｏｎ ｔｈｅ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ｏｆ ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ＲＮＡ ｃｏｎｔｒｏｌ． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２０， ２４， ６７２３−６７３２．
Ｌｉｎ−Ｃｈａｏ， Ｓ． ａｎｄ Ｃｏｈｅｎ， Ｓ． （１９９１）． Ｔｈｅ ｒａｔｅ ｏｆ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ａｎｄ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ＲＮＡＩ ｒｅｇｕｌａｔｅｓ ｔｈｅ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＣｏｌＥ１−ｔｙｐｅ ｐｌａｓｍｉｄｓ ｉｎ ｖｉｖｏ． Ｃｅｌｌ ６５， １２３３−１２４２．
Ｍａｎｉａｔｉｓ， Ｔ． （１９８２） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ ｈａｒｂｏｒ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ．
Ｍｅｒｌｉｎ， Ａ． ａｎｄ Ｐｏｌｉｓｋｙ， Ｂ． （１９９５） Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ｏｆ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｍｏｄｅｌｓ ｆｏｒ ｐｌａｓｍｉｄ ＣｏｌＥ１ ｃｏｐｙ ｎｕｍｂｅｒ ｃｏｎｔｒｏｌ． Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２４８， ２１１−２１９．
Ｐｏｒｔｓｔｍａｎｎ， Ｔ．， Ｗｉｅｔｓｃｈｋｅ Ｒ．， Ｓｃｈｍｅｃｈｔａ Ｈ．， Ｇｒｕｎｏｗ Ｒ．， Ｐｏｒｓｔｍａｎｎ Ｂ．， Ｂｌｅｉｂｅｒ Ｒ．， Ｐｅｒｇａｎｄｅ Ｍ．， Ｓｔａｃｈａｔ Ｓ． ａｎｄ Ｂａｅｈｒ Ｒ． （１９８８） Ｒａｐｉｄ ａｎｄ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｅｎｚｙｍｅ ｉｍｍｕｎｏ ａｓｓａｙ ｆｏｒ Ｃｕ／Ｚｎ ｓｐｕｅｒｏｘｉｄｅ ｄｉｓｍｕｔａｓｅ ｗｉｔｈ ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ ａｎｄ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ． Ｃｌｉｎａｉｃａ Ｃｈｉｍｉｃａ Ａｃｔａ １７１：１−１０．
Ｓｔｕｄｉｅｒ， ＦＷ． Ａｎｄ Ｍｏｆｆａｔ ＢＡ． （１９８６） Ｕｓｅ ｏｆ ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ Ｔ７ ＲＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｔｏ ｄｉｒｅｃｔ ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｈｉｇｈ ｌｅｖｅｌ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｃｌｏｎｅｄ ｇｅｎｅｓ． Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ １８９： １１３−１３０．
Ｔｏｍｉｚａｗａ， Ｊ． （１９８５）． Ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ＣｏｌＥ１ ｐｌａｓｍｉｄ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ： Ｉｎｉｔｉａｌ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｏｆ ＲＮＡＩ ａｎｄ ｔｈｅ ｐｒｉｍｅｒ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ ｉｓ ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ， Ｃｅｌｌ ４０， ５２７−５３５．
Ｔｏｍｉｚａｗａ， Ｊ． （１９９０）． Ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ＣｏｌＥ１ ｐｌａｓｍｉｄ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ， ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｏｆ ＲＮＡＩ ａｎｄ ＲＮＡＩＩ， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２１２， ６８３−６９４．
Ｗｒｏｂｅｌ， Ｂ． ａｎｄ Ｗｅｇｒｚｙｎ， Ｇ． （１９９８）． Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ＣｏｌＥ１−ｌｉｋｅ ｐｌａｓｍｉｄｓ ｉｎ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ−ｓｔａｒｖｅｄ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ． Ｐｌａｓｍｉｄ ３９， ４８−６２．
Ｙａｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎ， Ｃ．， Ｖｉｅｉｒａ， Ｊ． ａｎｄ Ｍｅｓｓｉｎｇ， Ｊ． （１９８５） Ｉｍｐｒｏｖｅｄ Ｍ１３ ｐｈａｇｅ ｃｌｏｎｉｎｇ ｖｅｃｔｏｒｓ ａｎｄ ｈｏｓｔ ｓｔｒａｉｎｓ： ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｍ１３ｍｐ１８ ａｎｄ ｐＵＣ１９ ｖｅｃｔｏｒｓ， Ｇｅｎｅ ３３， １０３−１１９．
Ｚａｖａｃｈｅｖ， Ｌ． ａｎｄ Ｉｖａｎｏｖ， Ｉ． （１９８８）． Ｗｈａｔ ｄｏｅｓ ｔｈｅ ｈｏｍｏｌｏｇｙ ｂｅｔｗｅｅｎ Ｅ． ｃｏｌｉ ｔＲＮＡｓ ａｎｄ ＲＮＡｓ ｃｏｎｔｒｏｌｌｉｎｇ ＣｏｌＥ１ ｐｌａｓｍｉｄ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｍｅａｎ？ Ｊ． ｔｈｅｏｒ． Ｂｉｏｌ． １３１， ２３５−２４１．
【図面の簡単な説明】
【図１】大腸菌ＨＭＳ １７４（ＤＥ３）ｐＥＴ１１ａｃｈＳＯＤのプラスミドを用いる発酵プロセスを示す。
【図１】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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