(57)【要約】本発明は、対象におけるＩｇＡ抗ＯｍｐＣ抗体の存在又は欠如を決定することにより、対象におけるクローン病を診断する方法を提供する。ここで、ＩｇＡ抗ＯｍｐＣ抗体の存在は、対象がクローン病を有していることを示す。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象におけるＩｇＡ抗ＯｍｐＣ抗体の存在又は欠如を決定することを含む、対象におけるクローン病を診断する方法であって、該ＩｇＡ抗ＯｍｐＣ抗体の存在が、該対象がクローン病を有していることを示す、方法。
【請求項２】
（ａ）炎症性腸疾患を有すると推測される対象から試料を得る工程；
（ｂ）ＯｍｐＣ抗原又はその反応性断片とＯｍｐＣ抗原に対するＩｇＡ抗体との複合体の形成に適した条件の下で、試料をＯｍｐＣ抗原又はその反応性断片と接触させる工程；
（ｃ）該複合体を抗ＩｇＡ抗体と接触させる工程；及び
（ｄ）ＩｇＡ抗ＯｍｐＣ抗体の存在又は欠如を検出する工程を含む、対象におけるクローン病を診断する方法であって、該ＩｇＡ抗ＯｍｐＣ抗体の存在が、該対象がクローン病を有していることを示す、方法。
【請求項３】
ＯｍｐＣ抗原が、実質的に配列番号：１のアミノ酸配列を含む、請求項２の方法。
【請求項４】
ＩｇＡ抗ＯｍｐＣ抗体が、酵素結合免疫吸着アッセイ法により検出される、請求項２の方法。
【請求項５】
対象におけるＩｇＡ抗サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）抗体（ＡＳＣＡ）の存在又は欠如を決定することをさらに含む、請求項２の方法であって、該対象におけるＩｇＡ抗ＯｍｐＣ抗体の存在又はＩｇＡ ＡＳＣＡの存在が、該対象がクローン病を有していることをそれぞれ独立に示す、方法。
【請求項６】
ＩｇＡ ＡＳＣＡの存在が、精製された酵母細胞壁ホスフォペプチドマンナン（ＰＰＭ）との反応性により決定される、請求項５の方法。
【請求項７】
酵母細胞壁ＰＰＭが、ＡＴＣＣ＃３８９２６株から調製される、請求項６の方法。
【請求項８】
対象におけるＩｇＡ抗Ｉ−２ポリペプチド抗体の存在又は欠如を決定することをさらに含む、請求項２の方法であって、対象におけるＩｇＡ抗ＯｍｐＣ抗体の存在又はＩｇＡ抗Ｉ−２ポリペプチド抗体の存在が、該対象がクローン病を有していることをそれぞれ独立に示す、方法。
【請求項９】
ＩｇＡ抗Ｉ−２ポリペプチド抗体の存在が、実質的に配列番号：３のアミノ酸配列を有するＩ−２ポリペプチドとのＩｇＡ反応性によって決定される、請求項８の方法。
【請求項１０】
（ａ）対象におけるＩｇＡ抗ＯｍｐＣ抗体の存在又は欠如を決定する工程；
（ｂ）対象におけるＩｇＡ ＡＳＣＡの存在又は欠如を決定する工程；及び
（ｃ）対象におけるＩｇＡ抗Ｉ−２ポリペプチド抗体の存在又は欠如を決定する工程を含む、対象におけるクローン病を診断する方法であって、ＩｇＡ抗ＯｍｐＣ抗体の存在、ＩｇＡ ＡＳＣＡの存在、又はＩｇＡ抗Ｉ−２ポリペプチド抗体の存在が、該対象がクローン病を有していることをそれぞれ独立に示す、方法。
【請求項１１】
対象における核周囲抗好中球抗体（ｐＡＮＣＡ）の存在又は欠如を決定することをさらに含む、請求項１０の方法。
【請求項１２】
クローン病を有する患者に、有効な用量なＯｍｐＣ抗原又はその寛容原性断片を投与することを含む、クローン病を有する患者において寛容を誘導する方法。
【請求項１３】
ＯｍｐＣ抗原が、実質的に配列番号：１のアミノ酸配列を含む、請求項１２の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本願は、米国公衆衛生総局（Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ）より授与されたＵＳＰＨＳグラントＤＫ４６７６３の下で政府の支援を受けてなされた。政府は、本発明における一定の権利を有する。
【０００２】
発明の背景
発明の領域
本発明は、一般的に、免疫学及び炎症性腸疾患の領域に関し、より具体的には細菌抗原、外膜タンパク質Ｃ（ＯｍｐＣ）を使用したクローン病の診断及び治療に関する。
【０００３】
背景情報
炎症性腸疾患（ＩＢＤ）とは、病因が不明の２つの胃腸障害：クローン病（ＣＤ）及び潰瘍性大腸炎（ＵＣ）を記載するために使用される総称である。世界中で発生しており、２００万人もの人々が罹患していると報告されているＩＢＤの経過及び予後は、極めて多様である。ＩＢＤは、主に青年期に発症し、下痢、腹痛、及び発熱を３つの最も一般的な症状とする。下痢は軽度のものから重度のものまで様々であり、そして貧血及び体重減少がＩＢＤのさらなる一般的兆候である。ＩＢＤを有する全患者の１０〜１５パーセントが、１０年の間に手術を必要とするであろう。さらに、ＩＢＤを有する患者においては、胃腸癌発症のリスクが増大している。ＩＢＤは人生最盛期の人々を襲う消耗性疾患である場合が多く、不安及びうつを含む心理学的問題の発症率が増大しているという報告は、おそらく、驚くべき症状ではない。
【０００４】
残念ながら、炎症性腸疾患のため利用可能な療法はほとんど存在せず、疾患の病因に関する知識の不足によって、診断及び治療の両方が妨げられている。しかしながら、明らかであるのは、遺伝学的要因、外因性誘発因子、及び内因性ミクロフローラの組み合わせが、炎症性腸疾患において見られる、免疫により媒介された腸粘膜傷害に寄与しうるという点である。クローン病においては、細菌が疾患の開始及び進行に関与していることが示されており：クローン病における腸の炎症においては、高頻度の抗生物質に対する応答性、及び細菌糞便流に対する感受性が顕著である。一般的な腸管内コロニー形成体及び新規な病原体が、直接的な検出、又は疾患と関連した抗微生物免疫応答により、クローン病に関与していることが示されている。さらに、多くの遺伝学的に感受性の慢性大腸炎の動物モデルでは、管腔の微生物が、その疾患にとって必要なコファクターであり；無菌環境に収容された動物は大腸炎を発症しない。しかしながら、クローン病における腸内微生物の役割の直接的及び間接的な証拠は多く存在するにもかかわらず、この疾患で見られる免疫制御異常に寄与する病原性生物及び抗原は同定されていない。
【０００５】
クローン病のための現在の診断アッセイ法は、その疾患を有する患者を全て検出することはできない。従って、クローン病と関連した新規微生物抗原の同定は、現在の診断アッセイ法の感度を増加させることができる試薬を提供するであろう。さらに、そのような微生物抗原は、疾患関連Ｔ細胞エピトープを保持しているかもしれず、疾患関連免疫応答の最初の又は貢献的な誘導因子として、クローン病を治療するための効果的な寛容原性抗原となりうる。
【０００６】
従って、クローン病の現在の診断アッセイ法の感度を改良するために使用されうる、この疾患と関連した微生物抗原の同定が必要とされている。本発明は、この需要を満たし、関連した利点をも提供する。
【０００７】
発明の概要
本発明は、ＩｇＡ抗外膜タンパク質Ｃ（ＯｍｐＣ）抗体の存在又は欠如を決定することにより、対象におけるクローン病を診断する方法を提供する。ここで、ＩｇＡ抗ＯｍｐＣ抗体の存在は、対象がクローン病を有していることを示す。本発明の方法は、例えば、対象から試料を得ること；ＯｍｐＣ抗原又はその反応性断片とＯｍｐＣ抗原に対するＩｇＡ抗体との複合体の形成に適した条件の下で、試料をＯｍｐＣ抗原又はその反応性断片と接触させること；及びＩｇＡ抗ＯｍｐＣ抗体の存在又は欠如を検出することにより実施されうる。ここで、対象におけるＩｇＡ抗ＯｍｐＣ抗体の存在は、対象がクローン病を有していることを示す。一つの態様において、本発明は、実質的に配列番号：１のアミノ酸配列を有するＯｍｐＣ抗原を使用して実施される。もう一つの態様において、ＩｇＡ抗ＯｍｐＣ抗体は、酵素結合免疫吸着アッセイ法により検出される。
【０００８】
本発明は、対象におけるＩｇＡ抗ＯｍｐＣ抗体の存在又は欠如、及び対象におけるＩｇＡ抗サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）抗体（ＡＳＣＡ）の存在又は欠如を決定することにより、クローン病を診断する方法をさらに提供する。ここで、対象におけるＩｇＡ抗ＯｍｐＣ抗体の存在又はＩｇＡ ＡＳＣＡの存在は、対象がクローン病を有していることをそれぞれ独立に示す。ＩｇＡ ＡＳＣＡの存在は、例えば、例えばＡＴＣＣ＃３８９２６株から調製されうる、精製された酵母細胞壁ホスフォペプチドマンナン（ｐｈｏｓｐｈｏｐｅｐｔｉｄｏｍａｎｎａｎ）（ＰＰＭ）との反応性により決定されうる。
【０００９】
本発明は、さらに、対象におけるＩｇＡ抗ＯｍｐＣ抗体の存在又は欠如、及び対象におけるＩｇＡ抗Ｉ−２ポリペプチド抗体の存在又は欠如を決定することにより、クローン病を診断する方法を提供する。ここで、対象におけるＩｇＡ抗ＯｍｐＣ抗体の存在又はＩｇＡ抗Ｉ−２ポリペプチド抗体の存在は、対象がクローン病を有していることをそれぞれ独立に示す。一つの態様において、ＩｇＡ抗Ｉ−２ポリペプチド抗体の存在は、実質的に配列番号：３のアミノ酸配列を有するＩ−２ポリペプチドに対するＩｇＡ反応性によって決定される。
【００１０】
対象におけるＩｇＡ抗ＯｍｐＣ抗体の存在又は欠如を決定すること；対象におけるＩｇＡ ＡＳＣＡの存在又は欠如を決定すること；及び対象におけるＩｇＡ抗Ｉ−２ポリペプチド抗体の存在又は欠如を決定することにより、対象におけるクローン病を診断する方法が、本発明により、さらに提供される。ここで、ＩｇＡ抗ＯｍｐＣ抗体の存在、ＩｇＡ ＡＳＣＡの存在、又はＩｇＡ抗Ｉ−２ポリペプチド抗体の存在は、対象がクローン病を有していることをそれぞれ独立に示す。一つの態様において、この方法は、対象における核周囲抗好中球抗体（ｐＡＮＣＡ）の存在又は欠如を決定する工程をさらに含む。
【００１１】
本発明は、クローン病を有する患者に、有効な用量のＯｍｐＣ抗原又はその寛容原性断片を投与することにより、クローン病を有する患者において寛容を誘導する方法をさらに提供する。寛容を誘導する方法において有用なＯｍｐＣ抗原は、例えば、実質的に配列番号：１のアミノ酸配列を有しうる。
【００１２】
発明の詳細な説明
本発明は、外膜タンパク質Ｃ（ＯｍｐＣ）に対するＩｇＡ抗体がクローン病と関連しているという衝撃的な発見に関する。図４に示されるように、クローン病を有していない（「正常な」）個体で、０．２４０５を越えるＩｇＡ ＯｍｐＣ反応性を有していたのはただ１人であったが、多くの正常体が有意なＩｇＧ ＯｍｐＣ反応性を有していた。正常体とは対照的に、多くのクローン病を有する患者からの血清中に、有意なＩｇＡ ＯｍｐＣ反応性が存在した（図１参照）。さらに、この反応性は、クローン病患者からの血清において見られたＩｇＡ Ｉ−２反応性及びＩｇＡ ＡＳＣＡ反応性（図１及び２）と、大部分が区別されるようであった。これらの結果は、表１に要約されており、表１は、ＩｇＡ ＡＳＣＡ反応性、ｐＡＮＣＡ反応性、及びＩ−２ポリペプチド反応性と組み合わされたＩｇＡ ＯｍｐＣ反応性が、クローン病を有する患者の８６％を検出することができる、極めて高感度の診断システムであることを示している。さらに、表２に示されるように、ＩｇＡ ＯｍｐＣ反応性は、単独で、クローン病を有する患者の５５％を検出した。これらの結果は、ＩｇＡ ＯｍｐＣ反応性が、疾患を有すると診断されるクローン病患者の数を増加させ、それにより、より早期の、より適切な治療を容易にするのに有益であり得ることを示している。
【００１３】
【表１】
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【表２】
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【００１４】
上記に基づき、本発明は、対象におけるＩｇＡ抗ＯｍｐＣ抗体の存在又は欠如を決定することにより、対象におけるクローン病を診断する方法を提供する。ここで、ＩｇＡ抗ＯｍｐＣ抗体の存在は、対象がクローン病を有していることを示す。本発明の方法は、例えば、対象から試料を得ること；ＯｍｐＣ抗原又はその反応性断片とＯｍｐＣ抗原に対するＩｇＡ抗体との複合体の形成に適した条件の下で、試料をＯｍｐＣ抗原又はその反応性断片と接触させること；複合体を抗ＩｇＡ抗体と接触させること；及びＩｇＡ抗ＯｍｐＣ抗体の存在又は欠如を検出することにより実施されうる。ここで、対象におけるＩｇＡ抗ＯｍｐＣ抗体の存在は、対象がクローン病を有していることを示す。一つの態様において、本発明は、実質的に配列番号：１のアミノ酸配列を有するＯｍｐＣ抗原を使用して実施される。もう一つの態様において、ＩｇＡ抗ＯｍｐＣ抗体は、酵素結合免疫吸着アッセイ法により検出される。
【００１５】
本発明の方法において有用な外膜タンパク質Ｃ（「ＯｍｐＣ」）は、「ポリン」である。ポリンとは、大腸菌のようなグラム陰性腸内細菌を含む細菌の外膜に見い出される膜貫通型タンパク質のクラスである。大腸菌細胞の外膜中のポリンは、二糖、リン酸、及び類似の分子の通過のためのチャンネルを提供する。ポリンは、中心に孔を有するバレル形構造を形成するよう配置された同一サブユニットの三量体でありうる（Ｌｏｄｉｓｈら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，チャプター１４（１９９５））。
【００１６】
ＯｍｐＣは、大腸菌のような細菌の外膜に見い出される主要ポリン・タンパク質のうちの一つである。ＯｍｐＣは、外膜タンパク質Ｆ（「ＯｍｐＦ」）と構造及び機能が類似している。いずれも、外膜中で三量体として会合して、親水性低分子の疎水性関門を介した受動拡散を可能にする水性チャンネルを形成している。しかしながら、ＯｍｐＣの孔は１．１ｎｍという直径を有しているが、ＯｍｐＦの孔は１．２ｎｍという直径を有している。この違いのため、ＯｍｐＣの孔を介した拡散の速度は、ＯｍｐＦの孔を介したものよりも遅い。
【００１７】
ポリンの発現は、浸透圧、温度、増殖期、及び毒素濃度を含む環境的条件によって影響され得る。例えば、栄養素及び毒性分子の両方の濃度が比較的高い腸管内では、より小さい孔径を有するＯｍｐＣが、優勢なポリンである（Ｐｒａｔｔら，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏ．，２０：９１１−９１７（１９９６））。
【００１８】
本明細書において使用されるように、「ＯｍｐＣ抗原」又は「ＯｍｐＣ」という用語は、ＯｍｐＣとの直線的又は三次元的な相同性を有しているタンパク質を意味する。ＯｍｐＣ抗原は、大腸菌のようなグラム陰性菌に由来することができ、図５に示されている大腸菌ＯｍｐＣ（配列番号：１）の種ホモログでありうる。自然状態では、ＯｍｐＣ抗原とは、低分子の通過を可能にする、細菌の外膜中で三量体構造を形成するタンパク質、又はそのようなタンパク質の前駆物質である。
【００１９】
本明細書において使用されるように、ＯｍｐＣ抗原又はＯｍｐＣという用語は、図５に示されている大腸菌ＯｍｐＣ（配列番号：１）との少なくとも５０％のアミノ酸同一性を有しているタンパク質を意味する。ＯｍｐＣ抗原は、例えば少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、又は９５％の配列番号：１とのアミノ酸同一性（デフォルト・パラメーターを用いたＢＬＯＳＵＭ ６２マトリックスを使用して、ＣＬＵＳＴＡＬＷにより決定される）を有しうる。本発明の方法において使用するため、ＯｍｐＣ抗原は、例えば、実施例ＩＶに記載されているように、スフェロプラスト溶解によって、ＯｍｐＡ及びＯｍｐＦが欠損している細胞から部分精製されてもよいし、又はＯｍｐＣに加えてＯｍｐＡ及びＯｍｐＦを含有していてもよい多様なその他の大腸菌株から同様に調製されてもよい。ＯｍｐＣ抗原は、当分野において周知の方法により、ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）登録番号Ｋ００５４１として入手可能なもののようなコーディング核酸配列を発現させることにより、組換え調製されてもよい（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９９）参照）。
【００２０】
本発明の方法は、対象におけるＩｇＡ抗ＯｍｐＣ抗体の存在又は欠如の決定に関する。本明細書において使用されるように、「ＩｇＡ抗ＯｍｐＣ抗体の存在」とは、同一条件下で分析された対照（標準）血清のＩｇＡ抗ＯｍｐＣ反応性の平均よりも標準偏差の２倍を超える分だけ大きいＯｍｐＣ抗原に対するＩｇＡ反応性を意味する。
【００２１】
本発明の方法は、胃腸管の任意の部分を侵しうる慢性炎症疾患であるクローン病（限局性腸炎）の診断及び治療に関する。一般的には、小腸の遠位部分（回腸）及び盲腸が影響を受ける。この疾患は、小腸、大腸、又は肛門直腸の領域に限局している場合もある。クローン病は、ときには十二指腸及び胃を侵し、比較的低頻度で、食道及び口腔も侵す。
【００２２】
クローン病の臨床的発現が多様であるのは、一部には、疾患の解剖学的局在部位が様々であるためである。クローン病の最も高頻度の症状は、腹痛、下痢、及び回帰熱である。クローン病は、一般的には、例えば、腸閉塞、又は罹患腸ループ間の異常な通路であるフィステルと関連している。クローン病には、眼、関節、及び皮膚の炎症；肝疾患；腎臓結石又はアミロイドーシスのような合併症も含まれる。さらに、ＣＤは、腸管癌のリスクの増加と関連している。
【００２３】
クローン病の病理に特徴的な特質は、いくつか存在する。経壁炎症として知られているＣＤと関連した炎症は、腸壁の全ての層を侵す。例えば、典型的には、肥厚及び浮腫も腸壁全体に出現し、長期的な疾患においては繊維症も存在する。「スキップ病変」として知られる炎症組織のセグメントが、見かけ上正常な腸管によって隔離されている不連続な炎症も、ＣＤに特徴的である。さらに、介在組織の線状潰瘍化、浮腫、及び炎症が、ＣＤに特有の腸管粘膜の「敷石」状所見をもたらす。
【００２４】
クローン病のホールマークは、一般的には粘膜下に見出される、肉芽種として知られる、離散性の炎症細胞塊の存在である。典型的な離散性肉芽種を示すクローン病例もあるし、びまん性肉芽腫性反応又は非特異的経壁炎症を示すものもある。結果として、肉芽種の欠如も疾患と矛盾しないが、離散性肉芽種の存在はＣＤの指標となる。従って、経壁炎症又は不連続炎症の方が、肉芽種の存在よりもむしろ好ましいクローン病の診断指標である（Ｒｕｂｉｎ ａｎｄ Ｆａｒｂｅｒ，Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ（第２版）Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ：Ｊ．Ｂ．Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｃｏｍｐａｎｙ（１９９４））。
【００２５】
通常、近位より遠位の方が重度である、大腸の連続的炎症を特徴とする潰瘍性大腸炎とは対照的に、クローン病は、直腸が高頻度に回避される斑点状疾患である。さらに、通常、粘膜層に限定されており、好中球を含む急性炎症性浸潤物及び陰窩膿瘍を特徴とする潰瘍性大腸炎において見られる表層炎症と、クローン病の炎症は区別される。そうではなく、クローン病は、腸壁の厚み全体を侵し、常にではないが、肉芽種が存在する場合が多い。さらに、回腸末端の関与、丸石様外観、離散性潰瘍、又はフィステルが、クローン病を示唆する。クローン病を潰瘍性大腸炎と区別するために役立つ特徴を、表３に要約する（Ｒｕｂｉｎ ａｎｄ Ｆａｒｂｅｒ（前記）１９９４）。
【００２６】
【表３】
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【００２７】
本明細書において使用されるように、「対象」という用語は、ヒト、非ヒト霊長類、ウサギ、ラット、又はマウス、特にヒトを含む、炎症性腸疾患を有しうる任意の動物を意味する。対象は、クローン病又は潰瘍性大腸炎の一つ以上の症状を有していてもよいし、又は無症候性であってもよい。
【００２８】
本発明の方法において有用な試料は、例えば全血、血漿、唾液、又はその他の体液もしくは組織、好ましくは血清のような、抗体を有している任意の生物学的液体から得られうる。
【００２９】
本明細書において使用されるように、「断片」という用語は、天然に存在するアミノ酸、天然には存在しないアミノ酸、又は化学的に修飾されたアミノ酸を含有している、ペプチド、ポリペプチド、又は化合物を意味する。ＯｍｐＣ抗原の反応性断片又は寛容原性断片は、本明細書において定義されたような、クローン病患者の血清中のＩｇＡ抗体との優先的な反応性、又は寛容原性を保持しているのであれば、アミノ酸配列を有するペプチドの構造を模倣する非アミノ酸化学構造であるペプチド・ミメティック（ｐｅｐｔｉｄｅ ｍｉｍｅｔｉｃ）であってもよい。そのようなミメティックは、一般的には、その対応ペプチドにおいて見出されるのと同一の空間的配置で、サイズ、電荷、又は疎水性のような類似の物理的特徴を示すことを特徴とする。ペプチド・ミメティックの具体例は、１個以上のアミノ酸間のアミド結合が、例えば炭素−炭素結合、又は当分野において周知のその他の結合に置換されている化合物である（例えば、Ｓａｗｙｅｒ，Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｂａｓｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ， ＡＣＳ， Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ（１９９５）参照）。
【００３０】
本明細書において使用されるように、「アミノ酸」という用語は、特記しない限りＬ−アミノ酸及びＤアミノ酸を含む、２０個の天然に存在するアミノ酸のうちの一つをさす。アミノ酸という用語は、クローン病血清との反応性又は寛容原性活性を保持するよう、ペプチド内で置換されうるのであれば、アミノ酸アナログを含む化学的に修飾されたアミノ酸、ノルロイシンのような通常はタンパク質へと取り込まれない天然に存在するアミノ酸、及びアミノ酸に特徴的であることが当分野において既知の特性を有する化学合成された化合物のような化合物もさす。アミノ酸及びアミノ酸アナログの例は、Ｇｒｏｓｓ ａｎｄ Ｍｅｉｅｎｈｏｆｅｒ，Ｔｈｅ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８３）に挙げられている。アミノ酸は、アミノ酸と実質的に同一の空間的配置又は官能基を示すが、アミノ酸に特徴的なα−アミノ基及びα−カルボキシル基を必ずしも有していない構造であるアミノ酸ミメティックであってもよい。
【００３１】
本発明において有用なＯｍｐＣ抗原の反応性断片又は寛容原性断片は、当分野において周知の方法を使用して作製又は合成されうる。そのような方法には、ペプチド作製のための組換えＤＮＡ法及び化学合成法が含まれる。適当な宿主細胞におけるペプチドをコードする核酸配列の発現によりペプチドを作製する組換え法は、当分野において周知であり、例えばＡｕｓｕｂｅｌら（前記）１９９９に記載されている。
【００３２】
本発明において有用なＯｍｐＣ抗原の反応性断片又は寛容原性断片は、化学合成、例えばＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５：２１４９（１９６４）の固相ペプチド合成法によっても作製されうる。当分野において周知の標準的な溶液法も、発明において有用な反応性断片又は寛容原性断片を合成するために使用されうる（例えば、Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ， Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ， Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ， Ｂｅｒｌｉｎ （１９８４）及びＢｏｄａｎｓｚｋｙ， Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ， Ｂｅｒｌｉｎ（１９９３）参照）。新たに合成されたペプチドは、例えば高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって精製され、例えば質量分析又はアミノ酸配列分析を使用して特徴決定されうる。
【００３３】
生物学的機能を破壊することなく、限定された修飾をＯｍｐＣ抗原に施しうることが理解される。同様に、反応性又は寛容原性活性を破壊することなく、限定された修飾が、ＯｍｐＣ抗原の反応性断片又はこの抗原の寛容原性断片に施されうる。クローン病を有する患者の血清中のＩｇＡ抗体との優先的な反応性を破壊しない、本明細書において開示された抗原の修飾、又は寛容原性活性を破壊しない、本明細書において開示された抗原の修飾は、ＯｍｐＣ抗原の定義に含まれる。同様に、クローン病を有する患者の血清中のＩｇＡ抗体と共に複合体を形成する能力を破壊しない、本明細書において開示された抗原の反応性断片の修飾が、反応性断片の定義に含まれる。さらに、免疫学的応答を減少させる能力を破壊しない、ＯｍｐＣ抗原の寛容原性断片の修飾が、ＯｍｐＣ抗原の寛容原性断片の定義に含まれる。修飾は、例えば、アミノ酸残基の付加、欠失、もしくは置換；アミノ酸の構造もしくは機能を模倣する化合物の置換；又はアミノ基もしくはアセチル基のような化学的部分の付加でありうる。修飾されたＯｍｐＣ抗原又は修飾されたＯｍｐＣ抗原の断片の活性は、例えば、本明細書において開示された反応性又は寛容原性活性に関するアッセイ法のうちの一つを使用してアッセイされうる。
【００３４】
特に有用な修飾は、増加した安定性を付与する。１個以上のＤ−アミノ酸の取り込みは、ＯｍｐＣ抗原又はその断片の安定性の増加において有用な修飾である。同様に、リジンの欠失又は置換は、分解からの保護により安定性を増加させうる。例えば、そのような置換は、反応性又は寛容原性活性を有意に減損させないのであれば、ＯｍｐＣ抗原又はその寛容原性断片の安定性を増加させ、従って生物学的利用率を増加させるものでありうる。
【００３５】
本発明は、対象におけるＩｇＡ抗ＯｍｐＣ抗体の存在又は欠如、及び対象におけるＩｇＡ抗サッカロマイセス・セレビシエ抗体（ＡＳＣＡ）の存在又は欠如を決定することにより、クローン病を診断する方法をさらに提供する。ここで、対象におけるＩｇＡ抗ＯｍｐＣ抗体の存在又はＩｇＡ ＡＳＣＡの存在は、対象がクローン病を有していることをそれぞれ独立に示す。ＩｇＡ ＡＳＣＡの存在は、例えば、例えばＡＴＣＣ＃３８９２６株から調製されうる、精製された酵母細胞壁ホスフォペプチドマンナン（ＰＰＭ）との反応性により決定されうる。ＩｇＡ ＡＳＣＡの存在を決定するための方法は、本明細書の実施例ＩＩＩに例示されている。本明細書において使用されるように、「ＩｇＡ ＡＳＣＡの存在」とは、参照（既知の陽性）クローン病血清によって与えられた反応性の２０％を超えているＳ．セレビシエに対するＩｇＡ反応性を意味する。
【００３６】
抗サッカロマイセス・セレビシエ抗体（ＡＳＣＡ）は、クローン病を有する患者において特徴的に上昇しているが、ＣＤにおける特異的抗体応答を支持するＳ．セレビシエ抗原の性質は不明である（Ｓｅｎｄｉｄら，Ｃｌｉｎ．Ｄｉａｇ．Ｌａｂ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，３：２１９−２２６（１９９６））。これらの抗体は、一般的な食品又は飲料の中に存在する酵母に対する応答、又は胃腸管でコロニー形成する酵母に対する応答を表わしているのかもしれない。過ヨウ素酸酸化を用いた研究により、ＣＤ患者の血清中のＡＳＣＡによって認識されるエピトープは、多糖を含有していることが示された。オリゴマンノシド・エピトープは、種々の酵母の株及び属、糸状菌、ウィルス、細菌、並びにヒトを含む様々な生物の糖タンパク質に共通して存在している。従って、ＣＤにおけるマンノースにより誘導される抗体応答は、病原性酵母生物に対する応答を表わすかもしれないし、又は例えばヒト糖タンパク質自己抗原上に存在する交差反応性のオリゴマンノシド・エピトープに対する応答を表わすのかもしれない。抗原の性質に関わらず、血清ＡＳＣＡのレベルの上昇は、クローン病のディファレンシャル・マーカーであり、ＵＣ患者においては低レベルのＡＳＣＡしか報告されていない（Ｓｅｎｄｉｄら（前記）１９９６）。
【００３７】
ＩｇＡ ＡＳＣＡは、ＡＳＣＡが特異的に結合する任意の抗原又は抗原混合物である、ＡＳＣＡに特異的な抗原を使用して検出されうる。ＡＳＣＡ抗体は、最初は、Ｓ．セレビシエとの結合能によって特徴付けられたが、当業者は、ＡＳＣＡに特異的な抗原が、ＡＳＣＡとの特異的な結合能を有するのであれば、Ｓ．セレビシエから得られてもよいし、又はその他の多様な起源から得られてもよいことを理解するであろう。従って、本発明の方法において使用するために企図されるＡＳＣＡに特異的な抗原の起源の例には、サッカロマイセス属及びカンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属のような酵母の不活化された細胞全体、酵母細胞壁ホスフォペプチドマンナン（ＰＰＭ）、オリゴマンノシド、ネオグリコリピッド（ｎｅｏｇｌｙｃｏｌｉｐｉｄｓ）、抗ＡＳＣＡイディオタイプ抗体等が含まれる。前記のように、サッカロマイセスを含む種々の酵母の種及び株が、本明細書に提供された方法において、ＡＳＣＡに特異的な抗原として使用されうる。例えば、Ｓ．セレビシエ株Ｓｕ１、Ｓｕ２、ＣＢＳ１３１５、又はＢＭ１５６、又はカンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）株ＶＷ３２が、本発明の方法において、ＡＳＣＡに特異的な抗原として使用されうる。
【００３８】
酵母細胞壁マンナン、又はホスフォペプチドマンナン（ＰＰＭ）の調製も、ＡＳＣＡに特異的な抗原として本明細書において企図される。これらの水溶性の表面抗原は、実施例ＩＩＩに記載されたようなオートクレーブ処理を含む適切な抽出技術によって調製されてもよいし、又は商業的に得られてもよい（Ｌｉｎｄｂｅｒｇら，Ｇｕｔ ３３：９０９−９１３（１９９２）参照）。酵母細胞壁ＰＰＭの酸安定画分も、本発明の方法において有用であるかもしれない（Ｓｅｎｄｉｄら（前記）１９９６）。クローン病の臨床サブタイプの診断において使用するためのＰＰＭの例は、Ｓ．セレビシエ株ＡＴＣＣ＃３８９２６に由来するものである。
【００３９】
ＡＳＣＡに特異的なオリゴマンノシドのような精製されたオリゴ糖抗原も、本発明の方法において使用するために企図される。本発明における使用のため、精製されたオリゴマンノシド抗原は、好ましくは、Ｆａｉｌｌｅら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１１：４３８−４４６（１９９２）に記載されたようにして、ネオグリコリピッドへと変換される。当業者は、そのようなオリゴマンノシド抗原のＡＳＣＡとの反応性が、マンノシル鎖長（Ｆｒｏｓｈら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２：１１９４−１１９８（１９８５））；アノマー構造（Ｆｕｋａｚａｗａら，Ｅ．Ｋｕｒｓｔａｋ編，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｆｕｎｇａｌ Ｄｉｓｅａｓｅ，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，３７−６２頁（１９８９）；Ｎｉｓｈｉｋａｗａ ｅｔ ａｌ，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，３４：８２５−８４０（１９９０）；Ｐｏｕｌａｉｎら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，２３：４６−５２（１９９３）；Ｓｈｉｂａｔａら，Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．，２４３：３３８−３４８（１９８５）；及びＴｒｉｎｅｌら，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．，６０：３８４５−３８５１（１９９２））；又は結合の位置（Ｋｉｋｕｃｈｉら，Ｐｌａｎｔａ，１９０：５２５−５３５（１９９３））を変動させることにより最適化されうることを理解する。
【００４０】
ＡＳＣＡに特異的なオリゴマンノシド抗原は、マンノテトラオースＭａｎ（１→３）Ｍａｎ（１→２）Ｍａｎ（１→２）Ｍａｎを含み、Ｆａｉｌｌｅら（前記）１９９２に記載されたようにしてＰＭＭより精製されうる。本発明の方法において使用するためのネオグリコリピッドの例は、各ＰＰＭからオリゴマンノシドを放出させ、次に放出されたオリゴマンノシドを４−ヘキサデシルアニリン等とカップリングさせることにより構築されうるものである。
【００４１】
本発明は、対象におけるＩｇＡ抗ＯｍｐＣ抗体の存在又は欠如、及び対象におけるＩｇＡ抗Ｉ−２ポリペプチド抗体の存在又は欠如を決定することにより、クローン病を診断する方法をさらに提供する。ここで、対象におけるＩｇＡ抗ＯｍｐＣ抗体の存在又はＩｇＡ抗Ｉ−２ポリペプチド抗体の存在は、対象がクローン病を有していることをそれぞれ独立に示す。一つの態様において、ＩｇＡ抗Ｉ−２ポリペプチド抗体の存在は、実質的に配列番号：３のアミノ酸配列を有するＩ−２ポリペプチドに対するＩｇＡ反応性によって決定される。
【００４２】
本発明の方法は、対象におけるＩｇＡ抗Ｉ−２ポリペプチド抗体の存在又は欠如の決定に関する。本明細書において使用されるように、「ＩｇＡ抗Ｉ−２ポリペプチド抗体の存在」又は「ＩｇＡ抗Ｉ−２ポリペプチド抗体」とは、同一条件下で分析された対照（標準）血清のＩｇＡ抗Ｉ−２反応性の平均よりも標準偏差の２倍を超える分だけ大きいＩ−２ポリペプチドに対するＩｇＡ反応性を意味する。
【００４３】
本明細書において使用されるように、「Ｉ−２ポリペプチド」という用語は、図６に示された微生物Ｉ−２ポリペプチド（配列番号：３）と実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドを意味する。微生物Ｉ−２ポリペプチド（配列番号：３）は、細菌転写制御因子とのある程度の類似性を有する１００アミノ酸のポリペプチドであり、最大の類似性はアミノ末端の３０アミノ酸に存在する。Ｉ−２コーディング核酸（配列番号：２）は、巨視的には疾患のない粘膜と比較して、侵されたクローン病組織にディファレンシャルに存在する。Ｉ−２ポリペプチド又はその反応性断片は、例えば実施例ＩＶに記載された組換え法を使用して調製されうる。
【００４４】
配列番号：３と実質的に同一のアミノ酸配列を有するＩ−２ポリペプチドは、天然に存在するＩ−２ポリペプチド（配列番号：３）であってもよいし、この配列との実質的なアミノ酸配列類似性を有する関連ポリペプチドであってもよい。そのような関連ポリペプチドには、図６に示されたアミノ酸配列のイソタイプ異型又はホモログが含まれる。本明細書において使用されるように、Ｉ−２ポリペプチドという用語は、一般的に、５０％超の同一性、好ましくは約６０％超の同一性、より好ましくは約７０％超の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドを記載し、配列番号：３との約８０％、９０％、９５％、９７％、又は９９％を超えるアミノ酸配列同一性（デフォルト・パラメーターを用いたＢＬＯＳＵＭ ６２マトリックスを使用して、ＣＬＵＳＴＡＬＷにより決定される）を有するポリペプチドでありうる。
【００４５】
対象におけるＩｇＡ抗ＯｍｐＣ抗体の存在又は欠如を決定すること；対象におけるＩｇＡ ＡＳＣＡの存在又は欠如を決定すること；及び対象におけるＩｇＡ抗Ｉ−２ポリペプチド抗体の存在又は欠如を決定することにより、対象におけるクローン病を診断する方法が、本発明によりさらに提供される。ここで、ＩｇＡ抗ＯｍｐＣ抗体の存在、ＩｇＡ ＡＳＣＡの存在、又はＩｇＡ抗Ｉ−２ポリペプチド抗体の存在は、対象がクローン病を有していることをそれぞれ独立に示す。
【００４６】
以前の研究によって、クローン病を有する患者の極一部にＡＮＣＡ反応性があることが示されたが、これらの抗体は潰瘍性大腸炎を有する患者においてはより高頻度に上昇している。報告されているＣＤにおける有病率は、０〜４３％であり、大部分の研究が、ＣＤ患者の１０〜３０％がＡＮＣＡを発現していると報告している（例えば、Ｓａｘｏｎら，Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．８６：２０２−−２１０（１９９０）；Ｃａｍｂｒｉｄｇｅら，Ｇｕｔ ３３：６６８−６７４（１９９２）；Ｐｏｏｌら，Ｇｕｔ ３４４６−５０（１９９３）；及びＢｒｏｋｒｏｅｌｏｆｓら，Ｄｉａ．Ｄｉｓ．Ｓｃｉ．３９：５４５−５４９（１９９４）参照）。
【００４７】
本発明の方法において、場合によっては、対象におけるｐＡＮＣＡの存在又は欠如が、例えば固定化好中球との反応性により決定されてもよい。本明細書において使用されるように、「核周囲抗好中球細胞質抗体」という用語は、「ｐＡＮＣＡ」と同義であり、好中球と特異的に反応して、核周囲が強調された、核周囲から核の染色又は細胞質の染色を与える抗体をさす。対象におけるｐＡＮＣＡの存在を決定するための方法は、本明細書の実施例Ｖに例示されている。
【００４８】
本発明は、クローン病を有する患者に、有効な用量のＯｍｐＣ抗原又はその寛容原性断片を投与することにより、クローン病を有する患者において寛容を誘導する方法をさらに提供する。寛容を誘導する方法において有用なＯｍｐＣ抗原には、例えば配列番号：１の配列が含まれうる。
【００４９】
本明細書において使用されるように、「有効な用量」という用語は、クローン病を有する患者における寛容の誘導に有用な、ＯｍｐＣ抗原又はその寛容原性断片の量を意味する。経口寛容誘導の場合、例えば、比較的少ない経口用量が複数回投与されてもよいし、又は大用量が１回投与されてもよい。そのような用量は、例えば、動物モデルにおける寛容の誘導から外挿されうる（例えば、Ｔｒｅｎｔｈａｍら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６１：１７２７−１７３０（１９９３）参照）。
【００５０】
様々な分子が寛容を誘導、促進、又は増強することが当分野において既知であり、ＯｍｐＣ抗原又はその寛容原性断片は、所望により、寛容化（ｔｏｌｅｒｏｇｉｚｉｎｇ）分子と組み合わせられうる。例えば、米国特許第５，２６８，４５４号及びその中の引用物（各々、参照として本明細書に組み込まれる）を参照のこと。本明細書において使用されるように、「寛容化分子」という用語は、ＯｍｐＣ抗原又はその断片と組み合わせられた場合に、寛容原性活性を誘導、促進、又は増強する、分子、化合物、又はポリマーを意味する。寛容化分子は、場合により、ＯｍｐＣ抗原と複合させられてもよく、例えばポリエチレングリコールであり得る。そのような分子は、当分野において周知である（例えば、米国特許第５，２６８，４５４号（前記）参照）。
【００５１】
寛容を誘導するために有効な用量のＯｍｐＣ抗原又はその断片は、当分野において周知の方法により投与されうる。経口寛容は、自己免疫疾患を治療する方法として、当分野においてよく認識されている（例えば、Ｗｅｉｎｅｒ，Ｈｏｓｐｉｔａｌ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，５３−５８頁（１９９５年９月１５日）参照）。例えば、経口投与された自己抗原は、いくつかの実験的自己免疫モデルを、疾患特異的かつ抗原特異的に抑制する。その疾患には、実験的な自己免疫性の脳脊髄炎、ブドウ膜炎、及び筋無力症、コラーゲン及びアジュバントにより誘導された関節炎、並びにＮＯＤマウスにおける糖尿病が含まれる（例えば、Ｗｅｉｎｅｒら，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２：８０９−８３７（１９９４）参照）。さらに、経口寛容の臨床試験は、多発性硬化症、慢性関節リウマチ、及びブドウ膜炎の治療において陽性の結果を与えた。投与様式には、非経口投与及び皮下注射が含まれる（Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ３６（補遺）：Ｓ１１５−Ｓ１１７（１９９４））。
【００５２】
ＯｍｐＣ抗原に関して使用されるように、「寛容原性断片」という用語は、単独で、又はもう一つの分子と組み合わされて免疫学的応答を減少させる能力により定義されるような寛容原性活性を有している抗原のペプチド部分又はポリペプチド部分を意味する。従って、ＯｍｐＣ抗原の寛容原性断片は、配列番号：１の一部と実質的に同一のアミノ酸配列を有し、単独で、又はもう一つの分子と組み合わされて免疫学的応答を減少させる能力により定義されるような寛容原性活性を有しているペプチド又はポリペプチドである。ＯｍｐＣ抗原の寛容原性断片は、約３〜約９０個のアミノ酸を有しうる。ＯｍｐＣ抗原の寛容原性断片は、例えば、少なくとも５個、８個、１０個、１２個、１５個、１８個、２０個、又は２５個のアミノ酸を有しうる。例えば、ＯｍｐＣ抗原の寛容原性断片は、５〜５０個のアミノ酸、８〜５０個のアミノ酸、又は１０〜５０個のアミノ酸を有しうる。より好ましくは、寛容原性断片は、８〜２０個のアミノ酸、又は１０〜２０個のアミノ酸を有する。最も好ましくは、寛容原性断片は、１２〜２０個のアミノ酸、又は１５〜２０個のアミノ酸を有する。
【００５３】
ＯｍｐＣ抗原の寛容原性断片は、Ｔ細胞増殖アッセイ法又はサイトカイン分泌アッセイ法のようなインビトロ・アッセイ法、及び炎症性腸疾患のマウス・モデルにおける寛容の誘導のようなインビボ・アッセイ法を含む多様なアッセイ法のうちの一つを使用して、同定されうる。例えば、Ｔ細胞増殖アッセイ法は、寛容原性活性を予測するものとして、当分野においてよく認識されている（例えば、Ｍｉｙａｈａｒａら，Ｉｍｍｕｎｏｌ．８６：１１０−１１５（１９９５）又はＬｕｎｄｉｎ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７８：１８７−１９６（１９９３）参照）。Ｔ細胞増殖アッセイ法は、様々な濃度のアッセイされる断片と共に、マイクロタイター・ウェルにおいて、放射線を照射された正常脾細胞のような抗原提示細胞と共にＴ細胞を３日間培養すること；３Ｈ−チミジンを添加すること；及びＤＮＡへの３Ｈ−チミジンの取り込みを測定することにより実施されうる。そのようなアッセイ法において、ＯｍｐＣ抗原の断片は、例えば２０μｇ／ｍｌ及び４０μｇ／ｍｌの濃度で、活性に関して試験されうる。
【００５４】
ＯｍｐＣ抗原の寛容原性断片は、当分野において既知のＴ細胞サイトカイン分泌アッセイ法を使用しても同定されうる。例えば、Ｃｚｅｒｉｎｓｋｙら，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．１１９：５−２２（１９９１）に記載されたようにして、様々な濃度の着目している断片と共に、マイクロタイター・ウェルにおいて、放射線を照射された抗原提示細胞と共にＴ細胞を培養し、３日後、ＩＬ−２、ＩＬ−４、又はＩＦＮ−γに関して培養上清をアッセイすることができる。
【００５５】
Ｔ細胞増殖アッセイ法又はサイトカイン分泌アッセイ法において使用するための初代Ｔ細胞は、例えば、固有層又は末梢血より単離されうる。さらに、寛容原性活性のインビトロ・アッセイ法において使用するためのＴ細胞の便利な起源は、クローン病患者のようなＩＢＤ患者、ＩＢＤのマウス・モデル、又は本発明のＯｍｐＣ抗原で免疫感作された健康動物から樹立されたＴ細胞株でありうる。ＯｍｐＣ抗原の寛容原性断片の同定において使用するためのＴ細胞の好ましい起源は、クローン病患者である。
【００５６】
Ｔ細胞株は、例えば、低濃度（約１０μｇ／ｍｌ）の増殖を支持するＩＬ−２の存在下で、約１μｇ／ｍｌの組換えＯｍｐＣ抗原又はＯｍｐＣ融合タンパク質と共にＴリンパ球を培養することにより、ＣＤ又はＵＣを有する患者から樹立されうる。Ｔ細胞株は、Ｎａｎｄａら，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７６：２９７−３０２（１９９２）に記載されたようにして、抗原提示細胞と共にＴリンパ球を培養し、ＩＬ−２及びＯｍｐＣ抗原、又はＩＬ−２単独を４〜５日周期で細胞に与えることにより樹立されうる。ＯｍｐＣ抗原の存在に依存して確実に増殖する細胞株へと発達する細胞株は、寛容原性断片の同定において特に有用である。小腸粘膜からのＴ細胞株の樹立は、例えば、Ｌｕｎｄｉｎら（前記）１９９３に記載されている。ＯｍｐＣ抗原の存在に依存し、ＯｍｐＣ抗原の寛容原性断片の同定において有用なＴ細胞株は、同様に調製されうる。
【００５７】
前記のような増殖応答もしくはサイトカイン分泌応答の減少のようなＴ細胞応答の減少、又は抗原に対する抗体力価の減少であり得る免疫学的応答の減少によって示されるような、寛容をインビボで誘導する能力によっても、寛容原性断片は同定されうる。新生マウス又は成体マウスを、ＯｍｐＣ抗原の断片により寛容化し、免疫感作による抗原接種の後、Ｔ細胞応答又は抗ＯｍｐＣ抗体力価をアッセイ法することができる。例えば、新生マウスを、生後４８時間以内に、不完全フロイント・アジュバントで乳化されたＯｍｐＣ抗原の断片約１００μｇの腹腔内投与により寛容化し、次に約８週齢の時点でＩ−２ポリペプチドで免疫感作することができる（例えば、Ｍｉｙａｈａｒａ（前記）１９９５参照）。成体マウスは、ＯｍｐＣ抗原の断片約０．３３ｍｇを３日間毎日静脈内投与（全用量１ｍｇ）することにより寛容化し、１週間後にＯｍｐＣ抗原で免疫感作することができる。寛容原性活性を示す、増殖又はサイトカイニン分泌の減少のようなＴ細胞応答の減少を、免疫感作の１０日後に採取されたＴ細胞を使用して測定することができる。さらに、やはり寛容原性活性を示す、抗ＯｍｐＣ抗体力価の減少を、免疫感作の４〜８週間後に採取された血液を使用してアッセイすることができる。Ｔ細胞応答又は抗ＯｍｐＣ抗原抗体力価をアッセイするための方法は、既に記載されており、当分野において周知である。
【００５８】
ＯｍｐＣ抗原の寛容原性断片は、炎症性腸疾患のマウス・モデルを使用しても同定されうる。ＩＢＤ様疾患を有する新生マウス又は成体マウスを、前記のようなＯｍｐＣ抗原の断片で寛容化し、Ｔ細胞応答又は抗ＯｍｐＣ抗体力価をアッセイすることができる。Ｔ細胞応答の減少又は抗原に対する抗体力価の減少は、免疫学的応答の減少を示し、従ってＯｍｐＣ抗原の寛容原性断片を同定するために役立つ。さらに、ＯｍｐＣ抗原の寛容原性断片は、ＩＢＤのマウス・モデルにおける大腸炎の頻度、発症時期、又は重度を減少させる能力によって同定されうる。
【００５９】
いくつかのよく容認されている炎症性腸疾患のマウス・モデルは、ＯｍｐＣ抗原の寛容原性断片の同定において有用でありうる。例えば、Ｇ−タンパク質Ｇｉ２のアルファ・サブユニットをコードする遺伝子がターゲティッド破壊されているマウスは、ヒト腸疾患の特質を示す周知のモデルである（Ｈｏｒｎｑｕｉｓｔら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５８：１０６８−１０７７（１９９７）；Ｒｕｄｏｌｐｈら，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．１０：１４３−１５０（１９９５））。Ｋｕｈｎら，Ｃｅｌｌ ７５：２６３−２７４（１９９３）に記載されているようなＩＬ−１０欠損マウス、及びＳａｄｌａｃｋら，Ｃｅｌｌ ７５：２５３−２６１（１９９３）に記載されているようなＩＬ−２欠損マウスも、大腸炎様疾患を有し、ＯｍｐＣ抗原の寛容原性断片の同定において有用である。さらに、Ｍｏｍｂａｅｒｔｓ ｅｔ ａｔ．，Ｃｅｌｌ ７５：２７５−２８２（１９９３）に記載されているような、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）α、ＴＣＲβ、ＴＣＲβ×δ、又はクラスＩＩ主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）の変異を有するマウスは、炎症性腸疾患を発症し、従ってＯｍｐＣ抗原の寛容原性断片の同定において有用である。同様に、断片は、Ｐｏｗｒｉｅら，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １：５５３−５６２（１９９４）に記載されているような、炎症性腸疾患のよく容認されているモデルである、ＣＤ４５ＲＢ ＣＤ４＋Ｔ細胞で再構成されたＳＣＩＤマウスにおいて、寛容原性活性に関してアッセイされうる。さらなるＩＢＤの動物モデルも、当分野において周知である（例えば、Ｐｏｄｏｌｓｋｙ，Ａｃｔａ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．Ｂｅｌｇ．６０：１６３−１６５（１９９７）；及びＢｒｅｇｅｎｈｏｌｔら，ＡＰＭＩＳ １０５：６５５−６６２（１９９７）参照）。従って、ＯｍｐＣ抗原の寛容原性断片は、本明細書において開示されたインビトロもしくはインビボのアッセイ法、又は当分野において周知の他のアッセイ法によって容易に同定されうる。
【００６０】
ＯｍｐＣ抗原の反応性断片又は寛容原性断片は、着目しているペプチド又はランダムなペプチドの大きな集合体又はライブラリーを、反応性又は寛容原性活性に関してスクリーニングすることにより同定されうる。例えば、ＯｍｐＣ抗原の配列全体をカバーするペプチドのパネルが、前記のような反応性又は寛容原性活性に関してスクリーニングされうる。そのようなパネルは、Ｇｅｙｓｅｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３５：１１８４（１９８７）に記載されているような、ミモトープ分解可能ピン技術（Ｍｉｍｏｔｏｐｅ ｃｌｅａｖａｂｌｅ ｐｉｎ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＤＥ）を使用した、３残基又は５残基ずつシフトしながら各々オーバーラップしているＯｍｐＣ抗原の配列（配列番号：１）をカバーする１５マー・ペプチドのパネルであり得る。次に、パネルは、前記のアッセイ法のうちの一つを使用して、反応性又は寛容原性活性に関してスクリーニングされる（例えば、Ｍｉｙａｈａｒａ（前記）１９９５参照）。スクリーニングされるペプチドのライブラリーは、アミノ酸配列が配列番号：１と関係しているが、配列番号：１と異なるアミノ酸を１個以上有しているペプチドの集団であってもよい。
【００６１】
スクリーニングされるさらなるペプチドには、例えば、ペプチド及びペプチド・ミメティック分子のタグ付加化学ライブラリーが含まれる。ペプチド・ライブラリーには、ファージ・ディスプレイ技術によって作製されたものも含まれる。ファージ・ディスプレイ技術には、ファージの表面上のペプチド分子の発現、並びにタンパク質リガンドが、それをコードする核酸に関連している、又は関連させられうる他の方法論が含まれる。ベクター及び発現されるペプチド集団の多様化法を含むファージ・ディスプレイ・ライブラリーの作製のための方法も、当分野において周知である（例えば、Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｓｃｏｔｔ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．２１７：２２８−２５７（１９９３）；Ｓｃｏｔｔ ａｎｄ Ｓｍｉｔｈ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：３８６−３９０（１９９０）；並びにＨｕｓｅのＷＯ９１／０７１４１及びＷＯ９１／０７１４９参照）。これら又はその他の周知の方法は、例えば、開示されたアッセイ法のうちの一つによって、反応性又は寛容原性活性に関してスクリーニングされうるファージ・ディスプレイ・ライブラリーを作製するために使用されうる。所望により、ペプチドの集団は、活性に関してエン・マッセ（ｅｎ ｍａｓｓｅ）でアッセイされうる。例えば、ＯｍｐＣ抗原の反応性断片を同定するために、ペプチドの集団を、ＩｇＡ抗ＯｍｐＣ抗原反応性を含有している患者の血清と複合体を形成する能力に関してアッセイし；活性を有する集団を分取し、集団から反応性断片を単離するためにそのアッセイを繰り返すことができる。
【００６２】
ＯｍｐＣ抗原の反応性断片又は寛容原性断片は、例えば、化学的又はタンパク質分解的な分解により作製されたポリペプチドの断片をスクリーニングすることによっても同定されうる。化学的又はタンパク質分解的な分解、及び得られたタンパク質断片の精製のための方法は、当分野において周知である（例えば、Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｃｙ，第１８２巻，「タンパク質精製のガイド（Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ）」，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ：Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．（１９９０）参照）。例えば、臭化シアンのような化学物質、又はトリプシン、キモトリプシン、Ｖ８プロテアーゼ、エンドプロテイナーゼＬｙｓ−Ｃ、エンドプロテイナーゼＡｒｇ−Ｃ、もしくはエンドプロテイナーゼＡｓｐ−Ｎのようなプロテアーゼが、本明細書において開示されたアッセイ法のうちの一つを使用して、反応性又は寛容原性活性に関してスクリーニングされうる便利なＯｍｐＣ抗原の断片を作製するために使用されうる。
【００６３】
以下の実施例は、本発明を制限するのではなく、例示するためのものである。
【００６４】
実施例Ｉ
ＯｍｐＣの精製
この実施例は、スフェロプラスト溶解を使用したＯｍｐＣの精製を記載する。
【００６５】
ＯｍｐＦ−／−／ＯｍｐＡ−／−変異大腸菌を、グリセロール・ストックから１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンが補足されたルリア・ベルターニ・ブロス（Ｌｕｒｉａ Ｂｅｒｔａｎｉ ｂｒｏｔｈ）（ＬＢ−Ｓｔｒｅｐ）へと接種し、対数増殖期までおよそ８時間３７℃で活発に培養した。この開始培養物を使用して、ＬＢ−Ｓｔｒｅｐ培地１リットルへと接種し、１Ｌ培養物を１５時間未満増殖させた。
【００６６】
遠心分離（ＪＳ−４．２、４Ｋ／１５分／４℃）により細胞を採取した。必要であれば、氷冷 （ｉｃｅ ｃｏｌｄ）２０ｍＭトリス−Ｃｌ（ｐＨ７．５）で２回細胞を洗浄した。次に、細胞を氷冷スフェロプラスト形成緩衝液（２０ｍＭトリス−Ｃｌ（ｐＨ７．５）、２０％グリセロール、０．１Ｍ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）、１ｍｇ／ｍｌリゾチーム）に再懸濁させ、その後、再懸濁した細胞を、反転により時々混合しながら、氷上で２０分〜２時間インキュベートした。
【００６７】
必要であれば、スフェロプラストを遠心分離（ＪＡ−１７、５．５Ｋ／１０分／４℃）し、より少量のスフェロプラスト形成緩衝液（ＳＦＢ）に再懸濁させた。場合により、溶解効率を改良するためにスフェロプラスト・ペレットを再懸濁の前に凍結させた。溶解の効率を有意に減少させる、スフェロプラストの破裂、及び染色体ＤＮＡの放出を回避するために、低張の緩衝液は避けた。
【００６８】
スフェロプラスト調製物を、氷冷１０ｍＭトリス−Ｃｌ（ｐＨ７．５）、１ｍｇ／ｍｌ ＤＮａｓｅ−Ｉで１４倍希釈し、激しくボルテックス処理した。試料を泡状化又は過熱することなく、調製物を、１秒のパルス「オンタイム（Ｏｎ ｔｉｍｅ）」によりセッティング４で５０％パワーで３０秒間４回氷上で超音波処理した。
【００６９】
細胞片を、遠心分離（ＪＡ−１７、５〜１０Ｋ／ｌ０分／４℃）によりペレット化し、第２の遠心分離（１０Ｋ／１０分／４℃）によって上清を取り出し、清浄化した。ペレットを収集することなく上清を取り出し、超遠心分離機チューブへと置いた。チューブに、頂部から１．５ミリメートルまで２０ｍＭトリス−Ｃｌ（ｐＨ７．５）を充填した。
【００７０】
膜調製物を、１００，０００ｇ（Ｂｅｃｋｍａｎ ＳＷ ６０スイング・バケット・ローターにて３５Ｋ／１時間／４℃）での超遠心分離によってペレット化した。１ｍｌの青色ピペット・チップを使用し、ペレットを分散させた後、直ちに１チューブ当たりおよそ１０分間、上下にピペッティングし、２０ｍＭトリス−Ｃｌ（ｐＨ７．５）へホモジナイズすることにより、ペレットを再懸濁させた。
【００７１】
４ｍｌが充填された１５ｍｌスクリュー・キャップ・チューブで、材料を、３７℃で、回転させながら、１％ＳＤＳを含む２０ｍＭトリス−Ｃｌ（ｐＨ７．５）の中で１時間抽出した。調製物を、超遠心分離チューブへと移し、膜を１００，０００ｇ（Ｂｅｃｋｍａｎ ＳＷ ６０にて３５Ｋ／１時間／４℃）でペレット化した。ペレットを、前記と同様にして２０ｍＭトリス−Ｃｌ（ｐＨ７．５）へとホモジナイズすることにより再懸濁させた。場合により、４℃で一夜膜調製物を放置した。
【００７２】
ＯｍｐＣを、２０ｍＭトリス−Ｃｌ（ｐＨ７．５）、３％ ＳＤＳ、及び０．５Ｍ ＮａＣｌの中で３７℃で回転させながら１時間抽出した（３７℃未満に維持した場合、ＳＤＳは沈殿するであろう）。材料を超遠心分離チューブに移し、１００，ＯＯＯｇでの遠心分離（Ｂｅｃｋｍａｎ ＳＷ ６０にて３５Ｋ／１時間／３０℃）によって膜をペレット化した。さらなる冷却は、抽出されたタンパク質の溶液からの塩析を引き起こすと考えられたため、低温は避けた。
【００７３】
次いで、抽出されたＯｍｐＣを含有している上清を、１０，０００倍超の容量に対して透析し、高い塩含有量を排除した。ＳＤＳを、０．２％トリトンに対する界面活性剤交換によって除去した。トリトンは、５０ｍＭトリス−Ｃｌに対するさらなる透析によって除去した。
【００７４】
三量体の形態でポリンとして機能する精製されたＯｍｐＣは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により以下のように特徴決定された。室温での電気泳動によって、およそ１００ｋＤａ、およそ７０ｋＤａ、及びおよそ３０ｋＤａのラダーが生じた。６５〜７０℃での１０〜１５分間の加熱により、複合体は部分的に解離し、二量体及び単量体（およそ７０ｋＤａ及びおよそ３０ｋＤａのバンド）のみが生じた。５分間の煮沸によって、３８ｋＤａの単量体が生じた。
【００７５】
実施例ＩＩ
抗ＩｇＡ ＯｍｐＣ ＥＬＩＳＡアッセイ法
この実施例は、患者の血清中のＩｇＡ抗ＯｍｐＣ抗体の直接検出のためのＥＬＩＳＡアッセイ法を記載する。
【００７６】
ＯｍｐＣ直接ＥＬＩＳＡアッセイ法を、以下のように実施した。プレート（Ｉｍｍｕｌｏｎ ３，ＤＹＮＥＸ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃｈａｎｔｉｌｌｙ，ＶＡ）に、前記のようにして調製されたＯｍｐＣを０．２５μｇ／ｍｌで含むホウ酸緩衝生理的食塩水（ｐＨ８．５）を、１００μｌ／ウェル、４℃で、一夜かけてコーティングした。０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むリン酸緩衝生理的食塩水（ＰＢＳ）で３回洗浄した後、プレートを、０．５％ウシ血清アルブミンを含むＰＢＳ（ｐＨ７．４）（ＢＳＡ−ＰＢＳ）１５０μｌ／ウェルで、室温（ＲＴ）で３０分間ブロッキングした。次いで、ブロッキング溶液を廃棄し、１００倍希釈したクローン病患者、潰瘍性大腸炎患者、及び正常対照からの血清を１００μｌ／ウェル添加し、室温で２時間インキュベートした。前記と同様にしてプレートを洗浄した後、アルカリホスファターゼ結合指示抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ，Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ，ＰＡのヤギ抗ヒトＩｇＡ（α鎖特異的））を、ＢＳＡ−ＰＢＳで１０００倍希釈したものをプレートに添加し、プレートを室温で２時間インキュベートした。次に、プレートを、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むリン酸緩衝生理的食塩水で３回洗浄し、続いてトリス緩衝規定生理的食塩水（ｐＨ７．５）でさらに３回洗浄した。基質溶液（１．５ｍｇ／ｍｌ二ナトリウムＰ−ニトロフェノールリン酸（ｄｉｓｏｄｉｕｍ Ｐ−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｏｌ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）（Ａｍｒｅｓｃｏ；Ｓｏｌｏｎ，ＯＨ）、２．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．０１Ｍトリス（ｐＨ８．６））を１００μｌ／ウェル添加し、１時間発色させた後、プレートを４０５ｎｍで読み取った。
【００７７】
ＩｇＡ ＯｍｐＣ陽性反応性とは、被検試料と同時に分析された対照（標準）血清で得られた反応性の平均よりも標準偏差の２倍を超える分だけ大きい反応性と定義した。
【００７８】
実施例ＩＩＩ
ＩＲＡ ＡＳＣＡ ＥＬＩＳＡアッセイ法
この実施例は、患者の血清中のＩｇＡ抗サッカロマイセス・セレビシエ抗体の存在が、ＥＬＩＳＡマイクロプレート・アッセイ法を使用して決定されうることを例証する。
【００７９】
Ａ． 酵母細胞壁マンナンの調製
酵母細胞壁マンナンを、以下のように、そしてＦａｉｌｌｅらＥｕｒ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１１：４３８−４４６（１９９２）及びＫｏｃｏｕｒｅｋ ａｎｄ Ｂａｌｌｏｕら，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ １００：１１７５−１１８１（１９６９）に記載されたようにして調製した。酵母サッカロマイセス・ウバルム（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｕｖａｒｕｍ）の凍結乾燥ペレットを、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（＃３８９２６）より得た。酵母を、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）に従い調製された２Ｘ ＹＴ培地１０ｍｌで再生させた。Ｓ．ウバルムを、３０℃で２〜３日間増殖させた。終末Ｓ．ウバルム培養物を、２Ｘ ＹＴ寒天プレートに接種し、次に３０℃で２〜３日間増殖させた。単一コロニーを使用して５００ｍｌの２Ｘ ＹＴ培地に接種し、３０℃で２〜３日間増殖させた。蒸留水１リットル当たり２０ｇのグルコース、２ｇのバクト・イースト・エキストラクト、０．２５ｇのＭｇＳＯ４、及び２．０ｍｌの２８％Ｈ３ＰＯ４を添加することにより発酵培地（ｐＨ４．５）を調製した。５００ｍｌ培養物を使用して５０リットルの発酵培地に接種し、培養物を３７℃で３〜４日間発酵させた。
【００８０】
各１００グラムの細胞ペーストに５０ｍｌの０．０２Ｍクエン酸緩衝液（クエン酸ナトリウム１Ｌ当たり５．８８ｇ；ｐＨ７．０＋／−０．１）を添加することにより、Ｓ．ウバルム・マンナン抽出物を調製した。細胞／クエン酸混合物を１２５℃で９０分間オートクレーブ処理し、冷却させた。５０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した後、上清を取り出し保持した。次いで、細胞を７５ｍｌの０．０２Ｍクエン酸緩衝液で洗浄し、再度細胞／クエン酸混合物を１２５℃で９０分間オートクレーブ処理した。細胞／クエン酸混合物を５０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した後、上清を保持した。
【００８１】
銅／マンナン複合体を沈殿させるため、等量のフェーリング溶液（Ｆｅｈｌｉｎｇ’ｓ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を、撹拌しながら、合わせた上清に添加した。完全フェーリング溶液は、使用直前にフェーリング溶液Ａをフェーリング溶液Ｂと１：１の比率で混合することにより調製した。銅複合体を沈降させ、静かに容器を傾けて沈殿物から液体を分離した。次いで、銅／マンナン沈殿複合体を、酵母ペースト１００グラム当たり６〜８ｍｌの３Ｎ ＨＣｌに溶解させた。
【００８２】
得られた溶液を、激しく撹拌しながら、１００ｍｌの８：１メタノール：酢酸へと注入し、数時間かけて沈殿物を沈降させた。容器を傾けて上清を廃棄し、次いで上清が無色になるまで、およそ２〜３回、洗浄過程を繰り返した。沈殿物を焼結ガラス漏斗上に収集し、メタノールで洗浄し、一夜空気乾燥させた。場合によっては、５０００ｒｐｍで１０分間の遠心分離により沈殿物を収集した後、メタノールで洗浄し、一夜空気乾燥させた。乾燥マンナン粉末１グラム当たりおよそ５ｍｌの水を使用して、乾燥マンナン粉末を蒸留水に溶解させた。Ｓ．ウバルム細胞壁マンナンの最終濃度は、およそ３０μｇ／ｍｌであった。
【００８３】
Ｂ． Ｓ．ウバルム・マンナンＥＬＩＳＡプレートの調製
以下のようにして、Ｓ．ウバルム細胞マンナンＥＬＩＳＡプレートを、抗原で飽和化した。前記のようにして精製されたＳ．ウバルム・マンナンを、リン酸緩衝生理的食塩水／０．２％アジ化ナトリウム（ＰＢＳ−Ｎ３）で１００μｇ／ｍｌの濃度に希釈した。マルチ・チャネル・ピペッターを使用して、１００μｇ／ｍｌ Ｓ．ウバルム・マンナンを、１ウェル当たり１００μｌ、コスター９６穴ハイ・バインディング（ｈｉ−ｂｉｎｄｉｎｇ）プレート（カタログ番号３５９０；Ｃｏｓｔａｒ Ｃｏｒｐ．，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）のウェルに添加した。最低１２時間、４℃で抗原をプレートにコーティングした。プレートの各ロットを、使用前に、先のロットと比較した。プレートを最大１ヶ月間２〜８℃で保存した。
【００８４】
Ｃ．  患者の血清の分析
患者の血清を、抗ＩｇＧ反応性又は抗ＩｇＡ反応性について２連で分析を行った。非特異的抗体結合を阻害するため、前記のようにして抗原で飽和化されたマイクロタイター・プレートを、室温でリン酸緩衝生理的食塩水／０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０と共に４５分間インキュベートした。次に、ＩｇＡに関しては、８０倍に希釈した患者の血清を添加し、室温で１時間インキュベートした。ウェルをＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０で３回洗浄した。次いで、アルカリホスファターゼ結合ヤギ抗ヒトＩｇＡ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｗｅｓｔｇｒｏｖｅ，ＰＡ）の１０００倍希釈物を添加し、マイクロタイター・プレートを室温で１時間インキュベートした。ｐ−ニトロフェノールリン酸を含むジエタノールアミン基質緩衝液の溶液を添加し、１０分間発色を進行させた。自動ＥＭＡＸプレート・リーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）を使用して、４０５ｎｍでの吸光度を分析した。
【００８５】
確立されたクローン病の診断を有する患者からプールされた血清の標準結合を、結合に関する標準参照として使用し、１００ＥＬＩＳＡ単位として設定した。被検患者の血清での結果を、参照ＣＤ血清の標準結合に対する割合（％）として表した。ＡＳＣＡ陽性とは、参照ＣＤ活性の２０％を超えるＩｇＡ  ＡＳＣＡ反応性と定義した。
【００８６】
実施例ＩＶ
ＩｇＡ Ｉ−２ ＥＬＩＳＡ
この実施例は、Ｉ−２ポリペプチドがＥＬＩＳＡ分析を使用して決定されうることを例証する。
【００８７】
Ａ．  ＧＳＴ−Ｉ−２融合タンパク質
全長Ｉ−２コーディング核酸配列（配列番号：３）をＧＳＴ発現ベクターｐＧＥＸへとクローニングした。大腸菌における発現の後、タンパク質をＧＳＴカラムで精製した。精製されたタンパク質は、銀染色により予想分子量を有することが示され、ウェスタン・ブロッティングでは抗ＧＳＴ反応性を有していた。
【００８８】
Ｂ．  ＥＬＩＳＡ分析
Ｉ−２ポリペプチド（配列番号：３）と結合するヒトＩｇＡ抗体を、本質的には以下のような直接ＥＬＩＳＡアッセイ法により検出した。プレート（Ｉｍｍｕｌｏｎ ３；ＤＹＮＥＸ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；Ｃｈａｎｔｉｌｌｙ，ＶＡ）に、１００μｌ／ウェルのＧＳＴ−Ｉ−２融合ポリペプチド（５μｇ／ｍｌホウ酸緩衝生理的食塩水（ｐＨ８．５）中）を４℃で一晩コーティングした。０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むリン酸緩衝生理的食塩水（ＰＢＳ）で３回洗浄した後、プレートを、１ウェル当たり１５０μｌの０．５％ウシ血清アルブミンを含むＰＢＳ（ｐＨ７．４）（ＢＳＡ−ＰＢＳ）で、室温で３０分間ブロッキングした。次いで、ブロッキング溶液を、１ウェル当たり１００μｌの、１００倍希釈したクローン病又は正常対照の血清と交換した。次いで、プレートを室温で２時間インキュベートし、前記と同様にして洗浄した。アルカリホスファターゼ結合二次抗体［ヤギ抗ヒトＩｇＡ（α鎖特異的）、Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ，Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ］を、ＢＳＡ−ＰＢＳで１０００倍希釈したものをＩｇＡプレートに添加した。プレートを室温で２時間インキュベートした後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０／ＰＢＳで３回洗浄し、続いてトリス緩衝規定生理的食塩水（ｐＨ７．５）でさらに３回洗浄した。基質溶液（１．５ｍｇ／ｍｌ二ナトリウムＰ−ニトロフェノールリン酸（Ａｒｅｓｃｏ；Ｓｏｌｏｎ，ＯＨ）を含む２．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．０１Ｍトリス（ｐＨ８．６））を１ウェル当たり１００μｌ添加し、１時間発色させた。次いで、４０５ｎｍでプレートを分析した。
【００８９】
ＩｇＡ Ｉ−２陽性反応性とは、被検試料と同時に分析された対照（標準）血清で得られた反応性の平均よりも標準偏差の２倍を超える分だけ大きい反応性と定義した。
【００９０】
実施例Ｖ
ｐＡＮＣＡ状態を決定するためのＥＬＩＳＡ及び間接免疫蛍光
この実施例は、対象のｐＡＮＣＡ状態を決定するための方法を記載する。
【００９１】
Ａ． ＡＮＣＡの存在を固定化好中球ＥＬＩＳＡにより決定した
Ｓａｘｏｎら，Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．８６：２０２−２１０（１９９０）に記載されたようにして、ＡＮＣＡを検出するために、固定化好中球酵素結合免疫吸着アッセイ法を使用し、全ての試料を盲検的に分析した。マイクロタイター・プレートに、１ウェル当たり２．５×１０５個の好中球をコーティングし、細胞を固定化するため１００％メタノールで処理した。非特異的抗体結合をブロッキングするため、細胞を０．２５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むリン酸緩衝生理的食塩水と共にインキュベートした。次に、対照血清及び暗号化された血清を１００倍希釈したものをウシ血清／リン酸緩衝生理的食塩水ブロッキング緩衝液へと添加した。アルカリホスファターゼ結合ヤギＦ（ａｂ’）２抗ヒト免疫グロブリンＧ（γ鎖特異的）抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ）を、１０００倍希釈したものを、好中球結合抗体を標識するために添加した。ｐ−ニトロフェノールリン酸基質溶液を添加し、陽性対照ウェル内の４０５ｎｍにおける吸光度が、ブランク・ウェル内の吸光度よりも０．８〜１．０光学濃度単位だけ大きくなるまで、発色を進行させた。
【００９２】
Ｂ． ＡＮＣＡ染色パターンの決定のための間接免疫蛍光アッセイ法
ＥＬＩＳＡによりＡＮＣＡ陽性であった試料に対し、優勢な染色パターンが核周囲性（ｐＡＮＣＡ）であるのか又は細胞質性（ｃＡＮＣＡ）であるのかを決定するため、間接免疫蛍光染色を実施した。スライド１枚当たりおよそ１００，０００個の好中球を含有するガラス・スライドを、細胞遠心分離（ｃｙｔｏｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎ）（Ｓｈａｎｄｏｎ Ｃｙｔｏｓｐｉｎ，Ｃｈｅｓｈｉｒｅ，Ｅｎｇｌａｎｄ）により調製し、それらを１００％メタノールで固定化し、空気乾燥させ、−２０℃で保存した。固定化された好中球を、希釈（２０倍）したヒト血清と共にインキュベートし、Ｓａｘｏｎら（前記）１９９０に記載のようにして、フルオレセイン標識Ｆ（ａｂ’）２γ鎖特異的抗体を用いて反応を可視化した。エピフルオレセンス（ｅｐｉｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）を装備したオリンパスＢＨ−２顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ，Ｌａｋｅ Ｓｕｃｃｅｓｓ，ＮＹ）を使用してスライドを検査した。
【００９３】
ｐＡＮＣＡ陽性とは、被検試料と同時に分析された対照（標準）血清で得られた反応性の平均よりも標準偏差の２倍を超える分だけ大きいＥＬＩＳＡ反応性と組み合わされた核周囲染色パターンと定義した。
【００９４】
括弧内又はそれ以外の前掲の雑誌論文、参照、及び特許引用物は、全て、既に言及又は注記されたものも、参照として本明細書に組込まれる。
【００９５】
前記の実施例を参照しつつ本発明を説明したが、本発明の本旨から逸脱することなく、様々な修飾を施しうることを理解されたい。従って、本発明は、以下の特許請求の範囲によってのみ制限される。
【図面の簡単な説明】
【図１】クローン病を有する患者からの血清のＩｇＡ ＯｍｐＣ反応性及びＩｇＡ Ｉ−２反応性を示す図である。
【図２】クローン病を有する患者からの血清のＩｇＡ ＯｍｐＣ反応性及びＩｇＡ ＡＳＣＡ反応性を示す図である。
【図３】クローン病を有する患者からの血清のＩｇＡ ＯｍｐＣ反応性及びＩｇＧ ＯｍｐＣ反応性を示す図である。
【図４】正常個体からの血清のＩｇＡ ＯｍｐＣ反応性及びＩｇＧ ＯｍｐＣ反応性を示す図である。
【図５】大腸菌ＯｍｐＣアミノ酸配列（配列番号：１）を示す図である。
【図６】Ｉ−２ヌクレオチド配列（配列番号：２）及び推定アミノ酸配列（配列番号：３）を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004526122.tif 000067
2004526122.tif 000068
【国際調査報告】
2004526122.tif 000069