(57)【要約】本発明はｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによって、ビールに対し有害な細菌を特異的かつ迅速に検出するための方法に関する。本発明は、前記方法とともに使用するのに適したオリゴヌクレオチド、および本発明の検出方法の実施を可能にするキットにも関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記のヌクレオチド配列（いずれも５’→３’方向）のいずれか１つを有するオリゴヌクレオチドからなる群から選択されるオリゴヌクレオチド。
【化１】
2004529662.tif 000079
【化２】
2004529662.tif 000080
【化３】
2004529662.tif 000081
【化４】
2004529662.tif 000082
【化５】
2004529662.tif 000083
【化６】
2004529662.tif 000084
【化７】
2004529662.tif 000085
【化８】
2004529662.tif 000086
【化９】
2004529662.tif 000087
【化１０】
2004529662.tif 000088
【化１１】
2004529662.tif 000089
【化１２】
2004529662.tif 000090
【化１３】
2004529662.tif 000091
【化１４】
2004529662.tif 000092
【化１５】
2004529662.tif 000093
【請求項２】
試料中の、ビールに対し有害な細菌を検出する方法であって、
−  試料中に含まれる細菌を培養する工程と、
−  試料中に含まれる細菌を固定する工程と、
−  ハイブリダイゼーションを達成するために固定された細胞を請求項１に記載の少なくとも１つのオリゴヌクレオチドとともにインキュベートする工程と、
−  ハイブリダイズしなかったオリゴヌクレオチドを除去または洗い流す工程と、
−  ハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドを用いて、ビールに対し有害な細菌を検出、および任意選択で定量および可視化する工程とを含む方法。
【請求項３】
ビールに対し有害な細菌は、Lactobacillus 属およびPediococcus 属、特にPediococcus damnosus, Lactobacillus coryniformis, Lactobacillus perolens, Lactobacillus buchneri, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus fructivorans, Lactobacillus lindneri, Lactobacillus casei, Lactobacillus brevisの各種に属する乳酸菌、または、Pectinatus属およびMegasphaera 属、特にPectinatus frisingensis, Pectinatus cerevisiiphilus, Megasphaera cerevisiae の各種に属するグラム陰性細菌であることを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項４】
試料はビール試料、酵母試料またはすすぎ水試料であることを特徴とする請求項２または３に記載の方法。
【請求項５】
試料は食品試料であることを特徴とする請求項２または３に記載の方法。
【請求項６】
試料中のビールに対し有害な細菌を検出するための、請求項１に記載のオリゴヌクレオチドの用途。
【請求項７】
ビールに対し有害な細菌は、Lactobacillus 属およびPediococcus 属、特にPediococcus damnosus, Lactobacillus coryniformis, Lactobacillus perolens, Lactobacillus buchneri, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus fructivorans, Lactobacillus lindneri, Lactobacillus casei, Lactobacillus brevisの各種に属する乳酸菌、または、Pectinatus属およびMegasphaera 属、特にPectinatus frisingensis, Pectinatus cerevisiiphilus, Megasphaera cerevisiaenの各種に属するグラム陰性細菌であることを特徴とする請求項６に記載の用途。
【請求項８】
請求項１に記載の少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを含む、請求項２〜５のいずれかに記載の方法を遂行するためのキット。
【請求項９】
ハイブリダイゼーション溶液中に少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを含む、請求項８に記載のキット。
【請求項１０】
洗浄溶液、任意選択で１つまたはそれ以上の固定溶液、また任意選択で、細胞破壊溶液または酵素溶液をさらに含む、請求項８または９に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションにより、ビールに対し有害な細菌を特異的かつ迅速に検出する方法に関する。本発明は、前記方法とともに用いるのに適したオリゴヌクレオチドプローブ、ならびに本発明の検出方法の実行を可能にするキットにも関する。
【背景技術】
【０００２】
ＥＵにおける年間のビール生産量は、およそ３１３億リットルにのぼり、うち１１２億リットルがドイツで生産されている。ドイツには約１２７０のビール工場があり、毎年の売上高は約１８０億（18 Milliarden ）ドイツマルクであることから、ビール醸造プロセスは、この国における最も重要な工業的に用いられる生物工学的プロセスの一つとなっている（「欧州醸造業資料１９９９年（Daten aus der Brauwirtschaft Europa 1999）」、ドイツビール醸造組合（Deutscher Brauer Bund ）、２００１年、ボン、http://www.brauer-bund.de ）。
【０００３】
ビール製品に対する高度な品質基準を満たすためには、原料の選択や醸造工程自体だけでなく、微生物学的品質管理も非常に重要である。
ビールは高度な選択性とある程度の殺菌性の効力を有するため、ビール工場内には非常に狭いスペクトルの微生物しか入り込んでこなかった。ビール環境中で生き延びるためには、微生物は低ｐＨ、嫌気的雰囲気、ホップの苦味、アルコールならびに含量および種類が非常に少ない栄養素と成長物質に耐えなければならない（ヴェー．バック（W. Back ）、Farbatlas unt Handbuch der Getraenkebiologie、１９９４年、ドイツ連邦共和国ニュルンベルク（Nuernberg ）所在のハンス・カール出版（Verlag Hans Carl））。したがって、ビールに対し有害な微生物の大部分は、ラクトバチルス（Lactobacillus ）属およびペディオコッカス（Pediococcus ）属の乳酸菌、ならびにペクチナトス（Pectinatus）属およびメガスフェラ（Megasphaera ）属のメンバーである。
【０００４】
「乳酸菌」という用語は、すべてのグラム陽性、胞子非形成カタラーゼ陰性桿菌および球菌を含意している。現在までに９つの異なる属（Lactobacillus, Latococcus, Leuconostoc, Carnobacterium, Bifidobacterium, Enterococcus, Pediococcus, Weissella およびStreptococcus ）が、乳酸菌という用語に包含されている。系統発生学的にいえば、乳酸菌のすべてのメンバーは、ＤＮＡ中のＧＣ含量の低いグラム陽性細菌のクラスに属するものとして分類されている（ブロック（Brock ）、Microbiologie 、２００１年、ドイツ連邦共和国ベルリン‐ハイデルベルク（Heidelberg-Berlin ）所在のスペクトルム・アカデミシャー出版（Spektrum Akademischer Verlag GmbH ））。
【０００５】
これらの属のいくつかは、食品工業にとって非常に重要である。このようにLactobacillus 、Lactococcus およびStreptococcus 属のメンバーは、チーズ、ヨーグルト、バターミルク、サワークリーム、「ザワークラウト」、肉およびソーセージ製品、ならびに他の食品の発酵のために用いられている。
【０００６】
しかしながら、乳酸菌は常に良い意味で食品および飲料工業に関与しているわけではない。実際に、様々な属のいくつかのメンバーは食品を腐敗させるのに重要な役割を果たしている。
【０００７】
例えば、微生物の増殖によって起こるビールの腐敗の９０％超は、Lactobacillus 属およびPediococcus 属の一部の種の関与によるものである。これらの生物によってもたらされる製品の腐敗には味やにおいの変化が伴い、通常ビールは非常に濁った状態になる。
【０００８】
非常に異質性な（heterogenen ）Lactobacillus 属のメンバーは、グラム陽性、胞子非形成性、ホモまたはヘテロ発酵型、カタラーゼ陰性ならびに通常は非運動性の桿菌として記述されている。この属には、現在約５０の異なる種が含まれており、ビールに対し有害であると実証されているのはその中の非常に少数である。
【０００９】
Pediococciは、主に四分子として生じる、グラム陽性、胞子非形成性、ホモ発酵型、カタラーゼ陰性球菌という特徴をもつ。この属においても、ビール中で増殖してビールを腐敗させることができるのはほんの数種である（ブロック（Brock ）、Microbiologie 、２００１年、ドイツ連邦共和国ベルリン‐ハイデルベルク（Heidelberg-Berlin ）所在のスペクトルム・アカデミシャー出版（Spektrum Akademischer Verlag GmbH ）；ハー．シュレーゲル（H. Schlegel ）、Allgemeine Mikrobiologie、１９９２年、ドイツ連邦共和国シュツットガルト（Stuttgart ）所在のゲオルグ・ティーメ出版（Georg Thieme Verlag ））。
【００１０】
乳酸菌群のなかでも以下の種が潜在的にビールに対し有害であると記載されている。Lactobacillus brevis, Lactobacillus buchneri, Lactobacillus lindneri, Lactobacillus coryniformis, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus pseudoplantarum, Lactobacillus casei, Lactobacillus paracasei, Lactobacillus fructivorans, Lactobacillus perolens, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus frigidus, Pediococcus damnosus,Pediococcus inopinatus (W. Back, Farbatlas und Handbuch der Getra enkebiologie,1994, Verlag Hans Carl, N ・nberg)。実務上特に重要なのは、Lactobacillus brevis,Lactobacillus lindneriおよびPediococcus damnosusである。
【００１１】
上記グラム陽性乳酸菌に加えて、PectinatusおよびMegasphaera 属のグラム陰性細菌もまたビールを腐敗させることが知られている。Pectinatus属の桿状細胞は、偏性嫌気性、運動性のわずかに湾曲した細菌である。偏性嫌気性微生物のなかではMegasphaera 属の球形またはわずかに楕円の球状細胞も挙げられる（ヴェー．バック（W. Back ）、Farbatlas unt Handbuch der Getraenkebiologie、１９９４年、ドイツ連邦共和国ニュルンベルク（Nuernberg ）所在のハンス・カール出版（Verlag Hans Carl））。上記グラム陽性ビール汚染菌は、いわゆる一次汚染物質としてビール中に存在するが、Megasphaera およびPectinatusによる汚染の多くは、瓶詰め業者の瓶詰め所で直接起こり、このことが該細菌が二次汚染物質と呼ばれる所以である。
【００１２】
現在までにビールに対し有害であると記載されてきたグラム陰性細菌としては、Pectinatus frisingensis, Pectinatus cerevisiiphilus, Megasphaera cerevisiae が挙げられる（ヴェー．バック（W. Back ）、Farbatlas unt Handbuch der Getraenkebiologie、１９９４年、ドイツ連邦共和国ニュルンベルク（Nuernberg ）所在のハンス・カール出版（Verlag Hans Carl））。
【００１３】
ビールに対し有害な微生物の異質性により、ビール工場における微生物学的品質管理にとって最も大きな難題がもたらされる。さらに、１０万リットルものバッチサイズと比較して、分析に用いる試料の体積は非常に小さい（一般に２５０〜５００ｍＬ）。（バック、ヴェー．およびペシュル、ペー．（Back, W. und Poeschl, P.）、Bypass-Membranfiltration [BM-System]-Ver-besserung des Spurennachweises nach der Filtration 、Brauwelt第１３８巻、２３１２‐２３１５ページ）。
【００１４】
これまでビールに対し有害な細菌の標準的な検出方法は、培養であった。ＮＢＢ、ＶＬＢ‐Ｓ７Ｓ、ＵＢＡ、およびＭＲＳなどの数種の選択培地が市販されている。使用されるどの選択培地も有害なビール細菌の増殖を促進しながら、同時に関連微生物叢（mikrobiellen Begleitflora ）の増殖またはビール工場特異的な酵母の増殖を阻害剤によって阻止するように設計されている。すべての培養方法は、ビール汚染物質の有無についての定性的記載しかできないという点で共通している。定量試験は行われていない。伝統的な培養方法は非常に時間がかかり、培養に１２日間を要する。そのため、品質管理が完了し、生産バッチの出荷が許可されるまでビールを保存する必要があり、間接コストの上昇をまねく。
【００１５】
培養工程で陽性の結果が出た場合には、引き続き検出されたビール汚染物質の特性解析を行うことが有用であろう。このような広範な判定はこれまでには行われてこなかった。というのも、この目的のための使い勝手のよい方法がなかったためである。ビールに対し有害な細菌を正確に同定するために、さらなる生理学的試験（グラム染色、糖利用能）を実施する必要があるかもしれない。そのような試験には時間がかかる一方で、そのような分析を正確に実施するには分析を遂行するスタッフの側にも高度な技能が要求される。しかしながら、より正確な分析を無くすことは、そのような分析に固有の利点を無くすことも意味する。混入物を正確に知ることにより、可能性のある混入源についての推論を導くことができ、その結果ビール混入物を効果的に抑制することにより、さらなる混入物に対抗できる見込みが与えられる。これに関しては、ビール混入物が常に同一であるかどうか、あるいは異なる細菌が製品の腐敗に関与しているかどうかを知ることも有用である。
【００１６】
ビールに対し有害な細菌の検出における伝統的な培養方法から生じる難点は、必然的に核酸による代替検出方法を連想させる。
ＰＣＲ、すなわちポリメラーゼ連鎖反応において、供試試料を富化してから（大抵はＮＢＢ培地中）、特異的プライマーを用いて特定の細菌ゲノムの特徴的セグメントの増幅を行う。プライマーが標的部位を見つけると、何百万もの遺伝情報断片のアンプリコンが生成される。続く分析において、ＤＮＡ断片を分離するために例えばアガロースゲルを用いて、定性試験を行ってもよい。これにより、最も簡単な場合では、分析した試料中に使用したプライマーに対する標的部位が存在するかどうかの情報が得られる。標的部位は、生菌、死菌または裸のＤＮＡに由来しうるため、他の結論は出ない。ビール試料の分析に対しては非常に厄介な、判別はここでは不可能である。ビールおよび麦芽汁を主成分とした様々な選択培地は、生物学的酸性化に用いられる多数の死んだ乳酸菌を含んでいる。このような死菌、またはそれらの裸のＤＮＡが存在してもＰＣＲ反応は陽性となるので、偽陽性の結果を回避することはほぼ無理である。一方、ビール中に存在する様々な物質がＤＮＡ増幅酵素、Ｔａｑポリメラーゼの阻害を引き起こすかもしれない。これは、偽陰性結果によくある原因である。ＰＣＲ技術の発展型として、存在する細菌の量と得られた増幅ＤＮＡの量の間の相関性を求めようとする、定量的ＰＣＲがある。ＰＣＲの利点は特異性が高く、適用が容易であり、短時間で実施できることにある。重大な欠点としては、混入が起こりやすく偽陽性の結果が出てしまうこと、ならびに、上述のように生細胞および死細胞または裸のＤＮＡそれぞれの間の判別ができないことが挙げられる。
【００１７】
前記方法に包含される欠点を受けずにＰＣＲなどの分子生物学的方法の特異性を実現するための唯一の方法として、蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（FISH; アマン、エル．アイ．、ヴェー．ルートヴィヒおよびカー．‐ハー．シュライファー（Amann, R.I., W. Ludwig and K.-H. Schleifer）、Phylogenetic identification and in situ detection of individual microbial cells without cultivation 、Microbiol. Rev. 第５９巻、１４３‐１６９ページ、１９９５年）が挙げられる。この方法を用いて、細菌の種、属または群を可視化し、非常に詳細に同定することができる。
【００１８】
ＦＩＳＨ技法は、細菌細胞内には、進化の過程においてその極めて重要な機能ゆえにごく僅かな程度しか変異しなかった特定の分子が存在するという事実に基づいたものである。それら特定の分子とは、１６Ｓおよび２３Ｓリボソームリボ核酸（ｒＲＮＡ）である。いずれもタンパク質生合成部位であるリボソームの構成要素であり、その遍在分布、その大きさ、およびその構造的かつ機能的不変性から、特異的マーカーとして機能することができる（ヴェーゼ、ツェー．エル．（Woese, C.R. ）、Bacterial evolution, Microbiol. Rev.  第５１巻、２２１‐２７１ページ、１９８７年）。比較配列分析を用いて、これらのデータだけから系統発生学的関係を得ることができる。そのためには配列データのアライメントを行う必要がある。これらの巨大分子の２次および３次構造の知見に基づいたアライメントにおいて、リボソーム核酸の相同的な位置が相関づけられる。
【００１９】
上記データに基づいて、系統発生学的演算を行うことができる。最先端のコンピュータ技術を用いることにより、大規模な演算さえも迅速かつ効率的に行うことができるとともに、１６ＳｒＲＮＡと２３ＳＲＮＡの配列アライメントを含む大きなデータベースを作成することもできる。このデータ資料への迅速なアクセスにより、新しく得られた配列を短時間のうちに系統発生学的に分析することができる。これらのｒＲＮＡデータベースは、種特異的または属特異的遺伝子プローブを構築するために用いることができる。このようにして、すべての入手可能なｒＲＮＡ配列が比較され、細菌の種、属または群を特異的に検出するプローブが特定の配列領域に対して設計される。
【００２０】
ＦＩＳＨ（蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション）において、リボゾーム標的配列上の特定の領域に相補的な上記遺伝子プローブが細胞内に導入される。通常は、遺伝子プローブは小さく、１６〜２０塩基長の一本鎖デオキシリボ核酸断片であり、細菌の種または細菌の属に特有な標的領域に対するプローブである。蛍光標識した遺伝子プローブが細菌細胞中でその標的配列をみつけると、該プローブは該標的配列に結合し、細胞は蛍光顕微鏡において蛍光によって検出できるようになる。
【００２１】
一般に、細菌は評価の際に高エネルギー光の照射によって可視化される、すなわち目に見えるようになるため、ＦＩＳＨ分析は顕微鏡スライド上で行われる。しかしながら、古典的なＦＩＳＨ分析の欠点の１つがまさにここで生じる。その性質上、比較的少量しか顕微鏡スライド上では分析できないので、この方法の感度は信頼性のある分析には不満足かつ不十分な可能性がある。したがって、本発明は古典的なＦＩＳＨ分析の利点と培養による利点を併せ持っている。特異的ＦＩＳＨによる細菌検出の実施前に、比較的短い培養工程によって、十分な量の検出すべき細菌が存在するようにしている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２２】
本発明の目的は、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションにより、ビールに対し有害な細菌を特異的かつ迅速に検出する方法、前記方法とともに用いるのに適したオリゴヌクレオチドプローブ、ならびに本発明の検出方法の実行を可能にするキットを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００２３】
ビールに対し有害な細菌の特異的迅速検出のための本発明の方法の実施には、以下の工程が含まれる。
−  被験試料中に存在する細菌を培養する工程、
−  試料中に存在する細菌を固定する工程、
−  ハイブリダイゼーションを達成するために固定された細菌を核酸プローブ分子とともにインキュベートする工程、
−  ハイブリダイズしなかった核酸プローブ分子を除去または洗い流す工程、および
−  核酸プローブ分子とハイブリダイズした細菌を検出する工程。
【００２４】
本発明の範囲において、「培養する」とは、試料中に含まれる細菌を適当な培養培地中で増殖させることを意味する。この目的に適した方法は当業者周知である。
本発明の範囲において、細菌の「固定」とは、細菌の細胞外被を核酸プローブ透過性にする処理のことをいう。通常は固定のためにエタノールが用いられる。細胞壁がこれらの技法を用いても核酸プローブ透過性にならない場合、当業者は同一の結果を与える十分なさらなる技法を認識しているであろう。そのような技法としては、例えば、メタノール、アルコールの混合物、低濃度のパラホルムアルデヒド溶液もしくは希釈ホルムアルデヒド溶液、酵素的処理、または同様のものが挙げられる。本発明の方法の特に好ましい実施形態において、続いて細菌を完全に分解するために酵素的工程を行ってもよい。この工程に用いることのできる酵素は、たとえば、リゾチーム、プロテイナーゼＫおよびムタノライシン（Mutanolysin ）である。当業者であれば、十分なさらなる技法を知っており、どの細菌が含まれているかによって細胞の分解にどの薬剤が適切であるかを容易に見いだすであろう。
【００２５】
本発明の範囲において、固定された細菌を、蛍光標識した核酸プローブを用いる「ハイブリダイゼーション」のためにインキュベートする。オリゴヌクレオチドとそれに連結されたマーカーとで構成されるこれらの核酸プローブは、細胞内の核酸プローブに対応する標的配列に結合するために細胞外被を通過することができる。この結合は、相補的な核酸領域間での水素結合の形成として理解される。
【００２６】
ここで核酸プローブは、染色体ＤＮＡまたはエピソームＤＮＡだけでなく、検出すべき微生物のｍＲＮＡまたはｒＲＮＡに相補的なものであってよい。同定しようとする微生物内に２以上のコピー数で存在する領域に相補的な核酸プローブを選択すると有益である。検出すべき配列は、好ましくは１細胞あたり５００〜１００，０００コピー、特に好ましくは１，０００〜５０，０００コピー存在している。そのためｒＲＮＡを標的部位として用いるのが好ましい。これは、各活性細胞中にはタンパク質生合成の部位としてのリボソームが何千コピー数も存在しているためである。
【００２７】
本発明の意味における核酸プローブは、通常は１２〜１，０００ヌクレオチド、好ましくは１２〜５００、より好ましくは１２〜２００、特に好ましくは１７〜５０および１５〜４０、および最も好ましくは１７〜２５ヌクレオチドからなるＤＮＡまたはＲＮＡプローブであってよい。核酸プローブの選択は、相補的配列が検出すべき微生物内に存在するかどうかの基準にしたがって行う。確定配列を選択することにより、細菌種、細菌属または全細菌群を検出することができる。１５ヌクレオチドからなるプローブにおいては、１００％の配列が相補的でなければならない。１５より多くのヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドにおいては、１つまたはそれ以上、特に１、２、または３つの不一致が許される。
【００２８】
本発明の方法に関連して、本発明の核酸プローブ分子は、以下に列挙する長さと配列を有している（すべての核酸プローブ分子は５’から３’への方向で記されている）。
本発明の核酸プローブ分子は、Lactobacillus 属およびPediococcus 属、特にPediococcus damnosus, Lactobacillus coryniformis, Lactobacillus perolens, Lactobacillus buchneri, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus fructivorans, Lactobacillus lindneri, Lactobacillus casei, Lactobacillus brevisの各種に属するビールに対し有害な乳酸菌の検出のみならず、Pectinatus属およびMegasphaera 属、特にPectinatus frisingensis, Pectinatus cerevisiiphilus, Megasphaera cerevisiae の各種に属するビールに対し有害なグラム陰性細菌の検出にも有用であり、本発明の検出方法において相応に用いられる。
【００２９】
【化１】
2004529662.tif 000002
配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．）：１〜３は、Lactobacillus perolensの検出に特に有用である。配列番号：１〜３は、本発明の好ましい実施形態である。
【００３０】
【化２】
2004529662.tif 000003
配列番号：４は、Lactobacillus buchneriの検出に特に有用である。配列番号：４は、本発明の好ましい実施形態である。
【００３１】
【化３】
2004529662.tif 000004
配列番号：５は、Lactobacillus plantarum の検出に特に有用である。配列番号：５は、本発明の好ましい実施形態である。
【００３２】
【化４】
2004529662.tif 000005
配列番号：６は、Lactobacillus fructivoransの検出に特に有用である。配列番号：６は、本発明の好ましい実施形態である。
【００３３】
【化５】
2004529662.tif 000006
配列番号：７は、Lactobacillus casei の検出に特に有用である。配列番号：７は、本発明の好ましい実施形態である。
【００３４】
【化６】
2004529662.tif 000007
配列番号：８は、Lactobacillus coryniformisの検出に特に有用である。配列番号：８は、本発明の好ましい実施形態である。
【００３５】
【化７】
2004529662.tif 000008
配列番号：９および１０は、本発明の好ましい実施形態である。これらの配列は、Lactobacillus brevisの検出に特に有用である。
【００３６】
【化８】
2004529662.tif 000009
配列番号：１１は、Lactobacillus lindneriの検出に特に有用である。配列番号：１１は、本発明の好ましい実施形態である。
【００３７】
【化９】
2004529662.tif 000010
配列番号：１２は、Pediococcus damnosusの検出に特に有用である。配列番号：１２は、本発明の好ましい実施形態である。
【００３８】
【化１０】
2004529662.tif 000011
配列番号：１３は、Lactobacillus lindneriの検出に特に有用である。
【００３９】
【化１１】
2004529662.tif 000012
配列番号：１４は、Pediococcus 属およびLactobacillus 属の検出に有用である。
【００４０】
【化１２】
2004529662.tif 000013
配列番号：１５は、Pediococcus 属に属する細菌、特にP. acidilactici, P. pentosaceus, P. damnosusおよびP. parvulus の検出に特に有用である。
【００４１】
【化１３】
2004529662.tif 000014
配列番号：１６は、L. caseiの検出に特に有用である。
【００４２】
【化１４】
2004529662.tif 000015
配列番号：１７は、L. coryniformis の検出に特に有用である。
【００４３】
【化１５】
2004529662.tif 000016
配列番号：１８は、L. fructivorans の検出に特に有用である。
【００４４】
【化１６】
2004529662.tif 000017
配列番号：１９および２０は、P. damnosus の検出に有用である。
【００４５】
【化１７】
2004529662.tif 000018
配列番号：２１は、L. brevis の検出に有用である。
【００４６】
【化１８】
2004529662.tif 000019
配列番号：２２および２３は、L. plantarumの検出に有用である。
【００４７】
【化１９】
2004529662.tif 000020
配列番号：２４および２５は、Pedicoccus属およびLactobacillus 属の検出に有用である。
【００４８】
【化２０】
2004529662.tif 000021
配列番号：２６は、L. lindneri の検出に有用である。
【００４９】
【化２１】
2004529662.tif 000022
配列番号：２７は、L. brevis の検出に有用である。
【００５０】
【化２２】
2004529662.tif 000023
【００５１】
【化２３】
2004529662.tif 000024
【００５２】
【化２４】
2004529662.tif 000025
【００５３】
【化２５】
2004529662.tif 000026
配列番号：２８〜６７は、P. damnosus の検出に特に有用である。
【００５４】
【化２６】
2004529662.tif 000027
【００５５】
【化２７】
2004529662.tif 000028
【００５６】
【化２８】
2004529662.tif 000029
【００５７】
【化２９】
2004529662.tif 000030
【００５８】
【化３０】
2004529662.tif 000031
配列番号：６８〜１０７は、L. brevis の検出に有用である。
【００５９】
【化３１】
2004529662.tif 000032
【００６０】
【化３２】
2004529662.tif 000033
【００６１】
【化３３】
2004529662.tif 000034
【００６２】
【化３４】
2004529662.tif 000035
【００６３】
【化３５】
2004529662.tif 000036
配列番号：１０８〜１４６は、L. lindneri の検出に有用である。
【００６４】
【化３６】
2004529662.tif 000037
【００６５】
【化３７】
2004529662.tif 000038
【００６６】
【化３８】
2004529662.tif 000039
【００６７】
【化３９】
2004529662.tif 000040
【００６８】
【化４０】
2004529662.tif 000041
配列番号：１４７〜１８７は、L. buchneri の検出に有用である。
【００６９】
【化４１】
2004529662.tif 000042
【００７０】
【化４２】
2004529662.tif 000043
【００７１】
【化４３】
2004529662.tif 000044
【００７２】
【化４４】
2004529662.tif 000045
【００７３】
【化４５】
2004529662.tif 000046
配列番号：１８８〜２２６は、L. caseiの検出に有用である。
【００７４】
【化４６】
2004529662.tif 000047
【００７５】
【化４７】
2004529662.tif 000048
【００７６】
【化４８】
2004529662.tif 000049
【００７７】
【化４９】
2004529662.tif 000050
【００７８】
【化５０】
2004529662.tif 000051
配列番号：２２７〜２６５は、L. coryniformis の検出に有用である。
【００７９】
【化５１】
2004529662.tif 000052
【００８０】
【化５２】
2004529662.tif 000053
【００８１】
【化５３】
2004529662.tif 000054
【００８２】
【化５４】
2004529662.tif 000055
【００８３】
【化５５】
2004529662.tif 000056
配列番号：２６６〜３０４は、L. fructivorans の検出に有用である。
【００８４】
【化５６】
2004529662.tif 000057
【００８５】
【化５７】
2004529662.tif 000058
【００８６】
【化５８】
2004529662.tif 000059
【００８７】
【化５９】
2004529662.tif 000060
【００８８】
【化６０】
2004529662.tif 000061
配列番号：３０５〜３４３は、Lactobacillus perolensの検出に有用である。
【００８９】
【化６１】
2004529662.tif 000062
【００９０】
【化６２】
2004529662.tif 000063
配列番号：３４４〜３５６は、Lactobacillus plantarum の検出に有用である。
【００９１】
【化６３】
2004529662.tif 000064
配列番号：３５７および３５８は、Megasphaera cerevisiaeの検出に特に有用である。
配列番号：３５８は、本発明の好ましい実施形態である。
【００９２】
【化６４】
2004529662.tif 000065
配列番号：３５９および３６０は、Pectinatus cerevisiiphilusの検出に特に有用である。
【００９３】
【化６５】
2004529662.tif 000066
【００９４】
【化６６】
2004529662.tif 000067
【００９５】
【化６７】
2004529662.tif 000068
【００９６】
【化６８】
2004529662.tif 000069
【００９７】
【化６９】
2004529662.tif 000070
配列番号：３６１〜４００は、Pectinatus属に属する細菌の検出に特に有用である。
【００９８】
【化７０】
2004529662.tif 000071
【００９９】
【化７１】
2004529662.tif 000072
【０１００】
【化７２】
2004529662.tif 000073
【０１０１】
【化７３】
2004529662.tif 000074
【０１０２】
【化７４】
2004529662.tif 000075
配列番号：４０１〜４３９は、Megasphaera cerevisiaeの検出に特に有用である。
【０１０３】
【化７５】
2004529662.tif 000076
配列番号：４４０は、Pectinatus属の検出に特に有用である。
【０１０４】
【化７６】
2004529662.tif 000077
配列番号：４４１および４４２は、Pectinatus cerevisiiphilusの検出に特に有用である。
【０１０５】
配列中、Ｋは「Ｇ＋Ｔ」、Ｍは「Ａ＋Ｃ」、Ｒは「Ａ＋Ｇ」、Ｗは「Ａ＋Ｔ」、Ｙは「Ｃ＋Ｔ」を表す。
【発明を実施するための最良の形態】
【０１０６】
本発明の対象は、配列番号：１〜配列番号：４４２の前記オリゴヌクレオチド配列の変形配列も含む。これらには特に以下のａ）〜ｃ）が含まれる。
ａ）核酸分子であって、（ｉ）前記オリゴヌクレオチド配列（配列番号：１〜配列番号：４４２）のうちの１つと、少なくとも８０％、８４％、８７％および好ましくは少なくとも９０％、９２％、および特に好ましくは少なくとも９４％、９６％、９８％の塩基が同一である核酸分子（オリゴヌクレオチドの全配列ではなく、上記のオリゴヌクレオチド（配列番号：１〜４４２）の１つの配列領域に相当する核酸分子の配列領域とみなすべきであり、上記のオリゴヌクレオチドと比較して１または複数塩基だけ長い配列を有する可能性もある）、または（ｉｉ）１つまたはいくつかの欠失および／または付加がある点で上記オリゴヌクレオチド配列とは異なる核酸分子であり、かつ、Lactobacillus 属およびPediococcus 属、特にPediococcus damnosus, Lactobacillus coryniformis, Lactobacillus perolens, Lactobacillus buchneri, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus fructivorans, Lactobacillus lindneri, Lactobacillus casei, Lactobacillus brevisの各種に属するビールに対し有害な乳酸菌、またはPectinatus  属およびMegasphaera 属、特にPectinatus frisingensis, Pectinatus cerevisiiphilus, Megasphaera cerevisiae の各種に属するビールに対し有害なグラム陰性細菌、の核酸配列との特異的ハイブリダイゼーションを可能にする核酸分子。ここでいう「特異的ハイブリダイゼーション」とは、本明細書中に記載もしくはｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション技法において当業者周知のハイブリダイゼーション条件下において、標的生物のリボソームＲＮＡのみが前記オリゴヌクレオチドに結合し、非標的生物のｒＲＮＡは結合しないことを意味する。
ｂ）厳密な（ストリンジェントな）条件下において、ａ）に列挙したオリゴヌクレオチドのうちの１つに相補的、または配列番号：１〜配列番号：４４２で識別されるプローブの１つに相補的な配列にハイブリダイズする核酸分子。
ｃ）配列番号：１〜４４２のオリゴヌクレオチド配列を含む、あるいはａ）またはｂ）のオリゴヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、前記配列またはａ）もしくはｂ）によるそれらの変形配列に加えて、少なくとも１つのさらに別のヌクレオチドを含み、かつ標的生物の核酸配列との特異的ハイブリダイゼーションが可能である核酸分子。
【０１０７】
核酸分子と、配列番号：１〜４４２のプローブとの配列の同一性は、通常のアルゴリズムによって決定することができる。この点に関して、例えば、http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST （このサイト上には例えば「標準的なヌクレオチド間ＢＬＡＳＴ（Standard nucleotide-nucleotide BLAST [blastn] ）へのリンクがある」からアクセスできる配列同一性の判定のためのプログラムが適している。
【０１０８】
本発明において、「ハイブリダイゼーション」は、「相補的」と同一の意味を有することもできる。本発明は、本発明の配列番号：１〜４４２の変形配列を含む新規オリゴヌクレオチドのうちの１つの（理論的）アンチセンス鎖にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドも含んでいる。
【０１０９】
本発明の核酸プローブ分子は、新規の検出方法における様々なハイブリダイゼーション溶液とともに用いることができる。この目的のために、様々な有機溶媒を０〜８０％の濃度で用いることができる。厳密なハイブリダイゼーション条件に従えば、核酸プローブ分子をしっかりと標的配列とハイブリダイズさせることができる。本発明の意味における緩和条件とは、例えば後述するハイブリダイゼーションバッファ中のホルムアミドが０％であることをいう。本発明の意味における厳密な条件は、例えばハイブリダイゼーションバッファ中のホルムアミドが２０〜８０％であることをいう。
【０１１０】
さらに、厳密なハイブリダイゼーション条件は言うまでもなく、文献および引例の標準的作業（例えば、サムブルック（Sambrook）らのマニュアル（１９８９）、コールドスプリングハーバー出版（Cold Spring Harbor Laboratory Press ）、米国ニューヨーク州コールドスプリングハーバー所在）を参照してもよい。一般に、「特異的にハイブリダイズする」とは、特異的な核酸配列がＤＮＡまたはＲＮＡの複合混合物（例えば全ＤＮＡまたはＲＮＡ）中に存在する場合に、ある分子が該特異的核酸配列に選択的にハイブリダイズすることを意味する。「厳密（な）条件」という用語は、該条件下において、プローブがその標的配列に選択的にハイブリダイズし、他の配列には明らかにより少ない程度でしか、あるいは全くハイブリダイズしない条件のことをいう。厳密条件は、ある程度は配列依存性であり、状況に応じて変わる。配列が長くなると、より高い温度において特異的にハイブリダイズする。一般に、厳密条件は、所定のイオン強度および所定のｐＨにおける特異的配列の熱融点（Ｔｍ）よりも、約５℃低くなるような温度に選択される。Ｔｍとは、（所定のイオン強度、ｐＨおよび核酸濃度条件で）標的配列に相補的なプローブ分子の５０％が該標的配列にハイブリダイズして平衡状態にある温度のことをいう。（標的配列は常に過剰であることから、平衡時にはプローブの５０％が関与している。）典型的には、短いプローブ（すなわち、例えば１０〜５０ヌクレオチド）に対する厳密条件は、ｐＨ７．０〜８．３における塩濃度が少なくとも０．０１〜１．０Ｍのナトリウムイオン（またはその他の塩）であり、温度が少なくとも約３０℃となるような条件である。さらに、厳密条件は上述したように、ホルムアミドなどの不安定化剤を添加することによって達成してもよい。
【０１１１】
本発明の方法の範囲内において、典型的なハイブリダイゼーション溶液は、０〜８０％のホルムアミド、好ましくは２０〜６０％のホルムアミド、特に好ましくは３５％のホルムアミドを含み、０．１モル／Ｌ〜１．５モル／Ｌ、好ましくは、０．５モル／Ｌ〜１．０モル／Ｌ、より好ましくは０．７モル／Ｌ〜０．９モル／Ｌ、最も好ましくは０．９モル／Ｌの塩濃度を有し、塩としては塩化ナトリウムが好ましい。さらに、ハイブリダイゼーション溶液は通常は、例えばラウリル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を０．００１％〜０．２％、好ましくは０．００５〜０．０５％、より好ましくは０．０１〜０．０３％、最も好ましくは０．０１％の濃度で含むなど、界面活性剤を含んでいる。ハイブリダイゼーション溶液は、様々な化合物、例えばトリス‐ＨＣｌ、クエン酸ナトリウム、ＰＩＰＥＳまたはＨＥＰＥＳバッファによって緩衝化されていてもよく、これらの化合物は通常は０．０１〜０．１モル／Ｌ、好ましくは０．０１〜０．０８モル／Ｌの濃度、ｐＨ範囲は６．０〜９．０、好ましくは７．０〜８．０において用いられる。本発明のハイブリダイゼーション溶液の好ましい実施形態は、０．０２モル／Ｌのトリス‐ＨＣｌ、ｐＨ８．０を含んでいる。
【０１１２】
当然のことであるが、当業者は、ハイブリダイゼーション反応に要求される厳密度が達成されるように、ハイブリダイゼーションバッファの成分の所与の濃度を選択することができる。特に好ましい実施形態は、厳密なハイブリダイゼーション条件〜特に厳密なハイブリダイゼーション条件を反映している。これらの厳密条件を用いて、当業者は、所与の核酸分子によって標的生物の核酸配列の特異的検出が可能か、そして本発明の内容において確実に使用可能かどうかを判定することができる。
【０１１３】
プローブの濃度は、標識のタイプや予想される標的構造物の数に応じて大幅に変えることができる。迅速かつ効率的なハイブリダイゼーションを可能にするために、核酸プローブ分子の数は、標的構造物の数より何桁も過剰とすべきである。一方で、蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）を用いる場合には、蛍光標識したハイブリダイゼーションプローブの濃度が高すぎると、バックグラウンドの蛍光が増大することも考慮しなければならない。したがって、プローブの濃度は、０．５ｎｇ／μＬ〜５００ｎｇ／μＬの範囲、好ましくは１．０ｎｇ／μＬ〜１００ｎｇ／μＬ、特に好ましくは１．０〜５０ｎｇ／μＬの範囲とすべきである。
【０１１４】
本発明の方法の内容において、使用される各核酸分子の好ましい濃度は、ハイブリダイゼーション溶液１μＬにつき１〜１０ｎｇである。使用されるハイブリダイゼーション溶液の体積は、８μＬ〜１００ｍＬとし、本発明の方法の特に好ましい実施形態は４０μＬである。
【０１１５】
ハイブリダイゼーションの持続時間は通常は１０分から１２時間であり、ハイブリダイゼーションは約１．５時間続けることが好ましい。ハイブリダイゼーション温度は好ましくは４４℃〜４８℃、特に好ましくは４６℃であり、これにより、核酸プローブ、特に核酸プローブの長さおよび被験細胞内の標的配列に対して該核酸プローブがどの程度の相補性をもつかに基づいて、ハイブリダイゼーション温度ならびにハイブリダイゼーション溶液中の塩および界面活性剤の濃度のパラメータを最適化することができる。当業者であれば適切な演算に精通している。
【０１１６】
ハイブリダイゼーションの終了後、ハイブリダイズしていない過剰の核酸プローブ分子を除去または洗浄により取り除かねばならないが、この工程は通常は従来の洗浄溶液によって行われる。必要に応じて、この洗浄溶液は、ＳＤＳなどの界面活性剤を０．００１〜０．１％、好ましくは０．０１％の濃度で、またトリス‐ＨＣｌを０．００１〜０．１モル／Ｌ、好ましくは０．０１〜０．０５モル／Ｌ、より好ましくは０．０２モル／Ｌの濃度で含んでいてもよく、トリス‐ＨＣｌのｐＨ値は、６．０〜９．０の範囲にあり、好ましくは７．０〜８．０、より好ましくは８．０である。界面活性剤が含まれていてもよいが、必須ではない。洗浄溶液もまた通常は、要求される厳密度に応じて、０．００３モル／Ｌ〜０．９モル／Ｌ、好ましくは０．０１モル／Ｌ〜０．９モル／Ｌの濃度のＮａＣｌを含んでいる。ＮａＣｌ濃度は特に好ましくは約０．０７モル／Ｌである。さらに、洗浄溶液は０．０１モル／Ｌまでの濃度のＥＤＴＡを含んでいてもよく、その濃度は好ましくは０．００５モル／Ｌである。洗浄溶液は、適当量の当業者によって周知の一般的に用いられる防腐剤をさらに含んでいてもよい。
【０１１７】
一般に、洗浄工程においてバッファ溶液が用いられるが、このバッファ溶液は基本的にハイブリダイゼーションバッファと非常に類似したものとすることができ（塩化ナトリウム溶液により緩衝化）、洗浄工程の方が、通常はより低い塩濃度またはより高い温度のバッファ中で行われるという点だけが異なる。
【０１１８】
ハイブリダイゼーション条件の理論的概算のために以下の等式を用いることができる。Ｔｄ＝８１．５＋１６．６ｌｇ［Ｎａ＋］＋０．４×（％ＧＣ）−８２０／ｎ−０．５×（％ＦＡ）
Ｔｄ：解離温度（℃）
［Ｎａ＋］：ナトリウムイオンのモル濃度
％ＧＣ：全塩基数に対するグアニンおよびシトシンの割合
ｎ：ハイブリッドの長さ
％ＦＡ：ホルムアミド含量
この等式を用いて、例えば、洗浄バッファ中のホルムアミドの割合（ホルムアミドは毒性があるため、できるだけ低く抑えるべきである）を、相応の低い塩化ナトリウム含量に置換することができる。しかしながら、当業者であれば、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションおよび方法に関する広範な文献に基づいて、これらの成分を変えることができることや、その変え方を理解するであろう。ハイブリダイゼーションバッファに関する上記の記載は、ハイブリダイゼーション条件の厳密度にも適用される。
【０１１９】
結合しなかった核酸プローブ分子の「洗浄による除去」は、４４℃〜５２℃の範囲の温度、好ましくは４４℃〜５０℃、特に好ましくは４６℃において、１０〜４０分間、好ましくは１５分間の持続時間で通常行われる。
【０１２０】
本発明の方法の代替形態において、本発明の核酸プローブ分子は、所与の標的生物を特異的に検出するためのいわゆる迅速ＦＩＳＨ法において用いられる。迅速ＦＩＳＨ法は当業者によって周知であり、例えば、ドイツ連邦共和国特許出願第ＤＥ１９９  ３６  ８７５．９号および国際出願国際公開第９９／１８２３４号の中に記載されている。ここで上記文献中に記載されている検出方法を遂行するための開示を説明的に引用する。
【０１２１】
例えば核酸プローブ分子がマーカーに共有結合されていて該核酸プローブ分子が検出可能であれば、特異的にハイブリダイズした核酸プローブ分子を該当する細胞内で検出することができる。使用される当業者周知の検出可能なマーカーとしては、ＣＹ２（米国ハイツ（Heights ）アーリントン（Arlington ）所在のアマシャムライフサイエンシズ社（Amersham Life Sciences, Inc.）より市販）、ＣＹ３（同じくアマシャムライフサイエンシズより市販）、ＣＹ５（同じくアマシャムライフサイエンシズより市販）、ＦＩＴＣ（米国ユージーン所在のモレキュラープローブス社（Molecular Probes Inc. ））、ＦＬＵＯＳ（ドイツ連邦共和国マンハイム所在のロシュダイアグノスティクス社（Roche Diagnostics GmbH））、ＴＲＩＴＣ（米国ユージーン所在のモレキュラープローブス社（Molecular Probes Inc. ）より市販）、またはＦＬＵＯＳ‐ＰＲＩＭＥなどの蛍光基が挙げられる。化学マーカー、放射性マーカーまたは酵素マーカー、例えばホースラディッシュペルオキシダーゼ、酸ホスファターゼ、アルカリホスファターゼおよびペルオキシダーゼなども用いることができる。上記酵素のそれぞれに対する一連の色原体が知られているが、これらの色原体は天然の基質の代わりに反応させることができ、着色生成物または蛍光生成物を形成する。そのような色原体の例を下記の表に挙げる。
【０１２２】
【表１】
2004529662.tif 000078
最終的に、核酸プローブ分子は、該分子の５’または３’末端に、ハイブリダイゼーションに適したさらに別の核酸配列が存在するように形成することもできる。この核酸配列もまた約１５〜１，０００の、好ましくは１５〜５０のヌクレオチドを含んでいる。その結果この第２の核酸領域は、上述の薬剤のいずれかによって検出可能な核酸プローブ分子によって認識可能である。
【０１２３】
別の可能性として、検出可能な核酸プローブ分子をハプテンに連結することが考えられる。その結果この核酸プローブ分子を、ハプテンを認識する抗体と接触させることができ
る。このようなハプテンの例がジゴキシゲニンである。上述以外のさらなる例が、当業者によって周知であろう。
【０１２４】
最終の分析は、使用したプローブの標識の種類によるが、光学顕微鏡、エピ蛍光顕微鏡、化学照度計、蛍光光度計などを用いて行うことができる。
ビールに対し有害な細菌の特異的かつ迅速な検出のための本願に記載の方法の重要な利点は、上述のように従来の検出方法と比較した場合のそのスピードにある。検出に７日間〜１２日間を要する従来の培養方法とは対照的に、本発明の方法を用いると４８時間以内に結果を得ることができる。
【０１２５】
別の利点としては、ビールに対し有害なすべての関連乳酸菌を同時に検出できること、ならびに、同時にグラム陰性のビール混入菌を検出できる見込みがあることである。
別の利点は、Lactobacillus 属の様々な種を判別可能であることである。これは、様々な標識核酸プローブ分子を用いて容易かつ確実に行うことができる。
【０１２６】
他の利点は、本方法の特異性である。使用した核酸プローブ分子を用いると、Lactobacillus 属を特異的に、またLactobacillus coryniformis, Lactobacillus perolens, Lactobacillus buchneri, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus fructivorans, Lactobacillus lindneri, Lactobacillus casei, Lactobacillus brevisの各種、さらに加えてPediococcus damnosus種を高度に特異的に検出し可視化することができる。同様に、Pectinatus属を特異的に、Pectinatus frisingensis 種およびPectinatus cerevisiiphilus種ならびにMegasphaera cerevisiae種を高度に特異的に検出し可視化することができる。細菌を可視化することにより、目視による管理を同時に行うことができる。したがって偽陽性結果は排除される。
【０１２７】
全体として、列挙した細菌を同時に検出できるという可能性は、最新の技術水準を超える重要な利点を示す。適切なプローブ混合物、特に好ましいプローブとして記載した上記プローブを用いることにより、例えば、すべての列挙した細菌を同時に検出することが可能になる。これは大きな利点である。というのも実際に関連があり、ビールに対し有害なすべての細菌を１工程で調べることができるからである。
【０１２８】
従来技術を超えるさらなる利点は、時間の節約である。最新の技術水準におけるハイブリダイゼーションには普通４時間かかるが、本発明の方法はわずか１．５時間しか要しない。
【０１２９】
本発明の方法のさらなる利点は、取り扱いやすさにあり、大量の試料について上記細菌の有無を調べることができる。
本発明の方法は様々な方法で応用することができる。
【０１３０】
透明なビールのみならず、酵母の存在により濁ったビールを分析することもでき、さらには、例えば酵母試料（純粋な培養酵母；「一次成長」酵母、すなわち回収酵母；または醸造用酵母および酵母沈殿物）およびすすぎ水を分析することもできる。
【０１３１】
本発明の方法に対する他の応用分野は、検出される細菌が、食品の腐敗をもたらす食品汚染菌として作用する、あらゆる食品の微生物分析である。
さらに、本発明に従えば、本発明の方法を実施するためのキットが提供される。これらのキットに含まれるハイブリダイゼーション装置は、例えば、ドイツ連邦共和国特許出願第１００  ６１  ６５５．０号に記載されている。ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション装置に関するこの文献に含まれる開示を説明的に引用する。
【０１３２】
記載されたハイブリダイゼーション装置（ＶＩＴ反応器と呼ばれる）に加えて、キットの最も重要な要素は、上述のような検出すべき微生物に対する特異的核酸プローブ分子を含有するそれぞれのハイブリダイゼーション溶液（いわゆるＶＩＴ溶液）である。キットは対応するハイブリダイゼーションバッファ（溶液Ｃ）および対応する洗浄溶液の濃縮物（溶液Ｄ）をも常に含んでいる。キットは、必要に応じて固定溶液（溶液Ａおよび溶液Ｂ）、さらには細胞破壊溶液（ブレーカ＿２）ならびに、必要であれば包埋溶液（フィニッシャ）を含んでいてもよい。フィニッシャは市販されており、その活性には蛍光顕微鏡下での蛍光プローブの迅速な褪色を防ぐことも含まれる。任意選択で、正の対照および負の対照を平行して実施するための溶液を含んでいてもよい。
【０１３３】
以下の実施例は、本発明を限定することなく説明することを意図している。
【実施例】
【０１３４】
（試料中の、ビールに対し有害な細菌の特異的かつ迅速な検出）
試料を２２〜４０時間適切に培養する（例えば、ＮＢＢ培地中、４８時間、２８℃）。
培養物のアリコートを遠心分離し（５分間、８０００ｒｐｍ、室温）、上清を捨て、ペレットを適当な体積の固定溶液（溶液Ａ、５０％エタノール）中に溶解する。
【０１３５】
その後、固定された細胞の適当なアリコート（４０μＬが好ましい）をスライド上に塗布して乾燥させる（４６℃、３０分または完全に乾燥するまで）。
次に、別の固定溶液（溶液Ｂ、無水エタノール、４０μＬが好ましい）を加えることにより、乾燥させた細胞の水分を完全に取り除く。スライドをもう一度乾燥させる（室温、３分または完全に乾燥するまで）。細胞を完全に分解するために、適当な体積の細胞破壊溶液（ブレーカ＿２、４０μＬが好ましい）をスライド上に塗布し、スライドをインキュベートする（１０分、室温）。
【０１３６】
スライドを蒸留水で満たした試験管、好ましくはＶＩＴ反応器に浸漬することにより、細胞分解または破壊液を洗浄し、次いでスライドを立てて乾燥させる。
その後、検出すべき各微生物に対する上記特異的核酸プローブ分子を含むハイブリダイゼーション溶液（ＶＩＴ溶液）を、固定し脱水した細胞上に塗布する。好ましい体積は４０μＬである。
【０１３７】
次にスライドをハイブリダイゼーションバッファ（溶液Ｃ、オリゴヌクレオチドを含まないハイブリダイゼーション溶液に相当）で加湿したチャンバ、好ましくはＶＩＴ反応器内でインキュベートする（４６℃、９０分間）。
【０１３８】
その後、スライドをチャンバから取り出し、チャンバを洗浄溶液（溶液Ｄ、蒸留水中に１：１０希釈）で満たし、その中でスライドをインキュベートする（４６℃、１５分）。
次にチャンバを蒸留水で満たし、スライドをその中に短時間浸漬した後、立てた状態で風乾する（４６℃、３０分または完全に乾燥するまで）。
【０１３９】
次にこのスライドを適切な媒体（フィニッシャ）内に包埋する。
最後に、蛍光顕微鏡を用いて試料を分析する。
【国際公開パンフレット】
2004529662.tif 000094
2004529662.tif 000095
2004529662.tif 000096
2004529662.tif 000097
2004529662.tif 000098
2004529662.tif 000099
2004529662.tif 000100
2004529662.tif 000101
2004529662.tif 000102
2004529662.tif 000103
2004529662.tif 000104
2004529662.tif 000105
2004529662.tif 000106
2004529662.tif 000107
2004529662.tif 000108
2004529662.tif 000109
2004529662.tif 000110
2004529662.tif 000111
2004529662.tif 000112
2004529662.tif 000113
2004529662.tif 000114
2004529662.tif 000115
2004529662.tif 000116
2004529662.tif 000117
2004529662.tif 000118
2004529662.tif 000119
2004529662.tif 000120
2004529662.tif 000121
2004529662.tif 000122
2004529662.tif 000123
2004529662.tif 000124
2004529662.tif 000125
2004529662.tif 000126
2004529662.tif 000127
2004529662.tif 000128
2004529662.tif 000129
2004529662.tif 000130
2004529662.tif 000131
2004529662.tif 000132
2004529662.tif 000133
2004529662.tif 000134
2004529662.tif 000135
2004529662.tif 000136
2004529662.tif 000137
2004529662.tif 000138
2004529662.tif 000139
2004529662.tif 000140
2004529662.tif 000141
2004529662.tif 000142
2004529662.tif 000143
2004529662.tif 000144
2004529662.tif 000145
2004529662.tif 000146
2004529662.tif 000147
2004529662.tif 000148
2004529662.tif 000149
2004529662.tif 000150
2004529662.tif 000151
2004529662.tif 000152
2004529662.tif 000153
2004529662.tif 000154
2004529662.tif 000155
2004529662.tif 000156
2004529662.tif 000157
2004529662.tif 000158
2004529662.tif 000159
2004529662.tif 000160
2004529662.tif 000161
2004529662.tif 000162
2004529662.tif 000163
2004529662.tif 000164
2004529662.tif 000165
2004529662.tif 000166
2004529662.tif 000167
2004529662.tif 000168
2004529662.tif 000169
2004529662.tif 000170
2004529662.tif 000171
2004529662.tif 000172
2004529662.tif 000173
2004529662.tif 000174
2004529662.tif 000175
2004529662.tif 000176
2004529662.tif 000177
2004529662.tif 000178
2004529662.tif 000179
2004529662.tif 000180
2004529662.tif 000181
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004529662.tif 000182
【国際調査報告】
2004529662.tif 000183
2004529662.tif 000184
2004529662.tif 000185
2004529662.tif 000186
2004529662.tif 000187
2004529662.tif 000188
2004529662.tif 000189
2004529662.tif 000190