(57)【要約】本発明は、連鎖球菌感染症の診断およびこれに対するワクチン接種の分野と、連鎖球菌のビルレンス標識の検出とに関する。本発明は、連鎖球菌のビルレンスを調節する方法であって、前記連鎖球菌のゲノムフラグメントであって、核酸またはそのフラグメントに対してストレプトコッカス・スイスにおけるハイブリッド形成によって同定可能なフラグメントの機能部分を少なくとも含む前記ゲノムフラグメントを修飾することを含む方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
連鎖球菌（Streptococcus）のビルレンスを調節する方法であって、前記連鎖球菌のゲノムフラグメントであって、図６において示すような核酸またはそのフラグメントに対してストレプトコッカス・スイス（Streptococcus suis)におけるハイブリッド形成によって同定可能な機能部分を少なくとも含むゲノムフラグメントを修飾することと、前記ゲノムフラグメントを修飾したクローンを得ることとを含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
前記ゲノムフラグメントは、鉄制限条件によって環境的に調節可能な、Ｓ．スイスにおける遺伝子発現の機能部分を少なくとも含むことを特徴とする請求項２記載の方法。
【請求項３】
前記ゲノムフラグメントは、野生型のＳ．スイスに感染したブタで発現される遺伝子の機能部分を少なくとも含むことを特徴とする請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
前記遺伝子は、フィブロネクチン／フィブリノーゲン結合タンパク質をコード化することを特徴とする請求項３記載の方法。
【請求項５】
ストレプトコッカス・スイスのビルレンスを調節することを特徴とする請求項１〜４のいずれか１つに記載の方法。
【請求項６】
前記連鎖球菌によって前記遺伝子の少なくとも前記機能部分の発現を機能的に削除することを含む請求項１〜５のいずれか１つに記載の方法。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１つに記載の方法によって得られた連鎖球菌のクローン。
【請求項８】
連鎖球菌のビルレンスを検定する方法であって、前記連鎖球菌のゲノムフラグメントであって、図６において示すような核酸またはそのフラグメントに対してストレプトコッカス・スイスにおけるハイブリッド形成によって同定可能なフラグメントの機能部分を少なくとも含む前記ゲノムフラグメントを検定することを含むことを特徴とする方法。
【請求項９】
連鎖球菌から誘導可能であるとともに、図６に示すような核酸またはそのフラグメントに対して、ストレプトコッカス・スイスにおけるハイブリッド形成によって同定可能であることを特徴とする単離された核酸および／または組換え核酸。
【請求項１０】
請求項９記載の核酸を含むことを特徴とするベクター。
【請求項１１】
請求項９記載の核酸または請求項１０記載のベクターを含むことを特徴とする宿主細胞。
【請求項１２】
連鎖球菌を含むことを特徴とする請求項１１記載の宿主細胞。
【請求項１３】
請求項７記載のクローン、請求項９記載の核酸、請求項１０記載のベクター、または請求項１１もしくは１２記載の宿主細胞を含むことを特徴とするワクチン。
【請求項１４】
請求項９記載の核酸によってコード化されることを特徴とするタンパク質またはそのフラグメント。
【請求項１５】
請求項１４記載のタンパク質またはそのフラグメントに対する抗体。
【請求項１６】
請求項１４記載のタンパク質またはそのフラグメントを含むことを特徴とする抗原。
【請求項１７】
請求項１５記載の抗体を含むことを特徴とする診断テスト。
【請求項１８】
請求項１４記載の抗原を含むことを特徴とするワクチンまたは診断テスト。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、連鎖球菌感染症の診断および連鎖球菌感染症に対するワクチン接種の分野、ならびに連鎖球菌のビルレンスマーカの検出に関する。
【０００２】
家畜およびヒトに感染症を引起す多種多様に存在する連鎖球菌(Streptococcus)種は、ランスフィールド(Lancefield)の群に大抵分類される。ランスフィールドに従った分類は、特に細菌のカプセル中に存在する血清決定基または抗原に基づいてなされ、近似の決定基を分類可能にし、大抵の異なる群からの細菌は互いに交差反応性を示す一方で、その他の連鎖球菌は、群決定基に全く配属され得ない。群内では、血清型に従ってさらに分化可能であり、これらの血清型は、連鎖球菌の抗原性の変動をさらに大きくさせ、この事実は連鎖球菌感染症の診断およびこれに対するワクチン接種における一連の問題を生じさせる。
【０００３】
ランスフィールドＡ群連鎖球菌（ＧＡＳ、ストレプトコッカス・ピオゲネス）は、子供によく発生し、鼻咽喉感染症とその合併症を引起す。動物の中で、特にウシはＧＡＳに敏感であり、これによって大抵乳腺炎が発見される。
【０００４】
ランスフィールドＢ群連鎖球菌（ＧＢＳ）は、ウシに最も多く見られ、乳腺炎を引起すけれども、ヒト幼児も敏感であり、大抵致命的な結果を生じさせる。Ｂ群連鎖球菌（ＧＢＳ）は、米国および西ヨーロッパで産まれたヒト新生児の間で細菌性敗血症および脳膜炎の主要な原因を構成し、発展途上国においても重大な新生児の病原体として現れている。
【０００５】
ランスフィールドＣ群感染症、たとえばＳ．エクイ(S.equi)、Ｓ．ズーエピデミクス(S.zooepidemicus)、およびＳ．ディスガラクティエ(S.dysgalactiae)などは、主としてウマ、ウシおよびブタに見られるが、ヒトに対して種の壁を横断することもある。
【０００６】
ランスフィールドＤ群感染症Ｓ．ボビス（S.bovis）は、すべての哺乳類およびいくつかの鳥類で発見され、時には心内膜炎または敗血症を引起す。
【０００７】
ランスフィールドＥ群、Ｇ群、Ｌ群、Ｐ群、Ｕ群およびＶ群（Ｓ．ポルシナス(S.porcinus)，Ｓ．カニス(S.canis)，Ｓ．ディスガラクティエ(S.dysgalactiae)）は、さまざまな宿主に見られ、新生児感染症、鼻咽喉感染症または乳腺炎を引起す。
【０００８】
ランスフィールドＲ群、Ｓ群およびＴ群（ならびに分類されていない型）内で発見されるＳ．スイス(S.suis)は、若いブタの脳膜炎、敗血症、関節炎および突然死の重要な原因である。因みに、Ｓ．スイスは、ヒトの脳膜炎を引起すこともある。
【０００９】
分類されていない連鎖球菌種、たとえばヒトに保菌を引起すＳ．ミュータンス(S.mutans)、ウシに乳腺炎を引起すＳ．ウベリス(S.uberis)、およびヒトに主要な感染症を引起こす肺炎球菌(S.pneumonia)、ならびにエンテロコッカス・フェカリス(Enterococcus faecilalis)およびＥ．フェシウム(E.faecium)は、連鎖球菌の群をさらに大きくさせる。肺炎球菌(Streptococcus pnoeumoniae/pneumococcus)は、肺炎、菌血症および脳膜炎などの侵入性疾患を引起すヒト病原体である。
【００１０】
連鎖球菌によって引起される疾患の病原が少し知られている。ムラミダーゼ放出タンパク質（ＭＲＰ）、細胞外因子（ＥＦ）、ならびに線毛、血球凝集素および溶血素などの細胞膜関連タンパク質などの様々な細胞構成要素がビルレンス因子として示唆された。しかしながら、疾患の病原におけるこれらのタンパク質構成要素の正確な役割は、不明なままである。しかしながら、様々な連鎖球菌およびその他のグラム陽性細菌の多糖カプセルが病原における重要な役割を果たしていることが広く知られ、かつ一般に受け入れられている。このカプセルは、これらの微生物を食作用に抵抗可能にするので、重要なビルレンス因子または標識と考えられている。
【００１１】
特に、ストレプトコッカス・スイス(Streptococcus suis)は、若いブタの脳膜炎、敗血症、関節炎および突然死の重要な原因である。これは、ヒトの脳膜炎を引起すこともある。この疾患を制御するための試みは、疾患の病原に関する十分な知識の欠如と、有効なワクチンおよび鋭敏な診断方法の欠如とによって、未だ阻害されている。現在のところ、Ｓ．スイスの３５の血清型が述べられている。Ｓ．スイスのビルレンスは、血清型の中で異なり得る。世界中で、Ｓ．スイスの血清型２型は、最も高頻度に単離された血清型である。Ｓ．スイス血清型２型内では、病原性、弱病原性、および非病原性の菌株が発見され得る。病原性の菌株はブタの病気の重い臨床的症状を引起し、多数の細菌は実験感染後の中枢神経系（ＣＮＳ)および関節から再単離されることができる。弱病原性の菌株は、疾患の緩やかな臨床的症状しか引起さず、細菌は稀にしか実験感染後のＣＮＳおよび関節から再単離され得ない。非病原性の菌株は、実験感染後の若いブタにおいて完全に無毒である。１３６−ｋＤａのムラミダーゼ関連タンパク質（ＭＲＰ）と、１１０−ｋＤａの細胞外因子（ＥＦ）とは、ヨーロッパおよび米国で単離されたＳ．スイス血清型２型株に重要なビルレンス標識として一般に考えられている。しかしながら、病原性、弱病原性、および非病原性の菌株間のビルレンスの相違を、ＭＲＰおよびＥＦの発現パターンの相違によって排他的に説明することができない。加えて、ストレプトコッカス・スイス血清型２型のカプセルは、重要なビルレンス因子である。しかしながら、病原性、弱病原性および非病原性の菌株はともに、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏでの成長後にカプセルに完全に被包されるようであったので、これらのカプセルに完全に被包された菌株のカプセル被包のレベルがビルレンスの相違に関連するという見込みはない。
【００１２】
本発明は、連鎖球菌のビルレンスを調節する方法であって、前記連鎖球菌のゲノムフラグメントであって、図６に示すような核酸またはそのフラグメントに対してストレプトコッカス・スイスにおけるハイブリッド形成によって同定可能なフラグメントの機能部分を少なくとも含む前記ゲノムフラグメントを修飾することと、前記ゲノムフラグメントを修飾したクローンを得ることとを含む方法を提供する。好適な一実施形態において、前記ゲノムフラグメントは、鉄制限条件によって環境的に調節可能な、Ｓ．スイスにおける遺伝子発現の機能部分を少なくとも含む。別の好適な実施形態において、前記ゲノムフラグメントは、野生型のＳ．スイスに感染したブタ（ｉｎ  ｖｉｖｏ）で発現される遺伝子の機能部分を少なくとも含む。最も好適な実施形態において、鉄制限条件下の選択は、ｉｎ  ｖｉｖｏでの選択と組合せられる。前記遺伝子がフィブロネクチン／フィブリノーゲン結合タンパク質をコード化することは、特に好適である。ここに提供される方法は、ストレプトコッカス・スイスのビルレンスを調節するのに特に有用であり、前記連鎖球菌による前記遺伝子の少なくとも前記機能部分の発現を機能的に削除することを含む。機能的に削除すること、とは、前記遺伝子の遺伝子産生物（ｍＲＮＡおよび／またはタンパク質）の発現の阻害または抑制に関与する当該技術分野において知られたいずれの技術（たとえば、各遺伝子のオープンリーディングフレームにおけるフレームシフトの削除、挿入、突然変異または発生を可能にする技術）をも意味する。したがって、本発明は、本発明に従った方法によって得られた、または得られ得る連鎖球菌のクローンを提供する。ビルレンスの相違で決定された病原性、弱病原性および非病原性の菌株またはクローン間の相違の見識を得るために、本発明は、鉄制限条件および子ブタの実験感染によりストレプトコッカス・スイスの環境的に調節された遺伝子の同定を提供する。Ｓ．スイスの１８個の独特な鉄制限誘導（ｉｒｉ）された遺伝子と、２２個の独特なｉｎ  ｖｉｖｏ選択（ｉｖｓ）された遺伝子とが発見された。ｉｖｓ遺伝子は、ｉｎ  ｖｉｖｏで排他的に発現しなかった。４つのｉｒｉ遺伝子は、子ブタにおいて選択された４つのｉｖｓ遺伝子と一致した。２つのｉｖｓ遺伝子は、推定のビルレンス因子に関する遺伝子と類似していた。これらのｉｖｓ遺伝子のうち１つは、ビルレンスＳ．スイス血清型２型株のｅｐｆ遺伝子と一致し、その他はストレプトコッカス・ゴルドニー(Streptococcus gordonii)のフィブロネクチン結合タンパク質をコード化する遺伝子との相同性を示した。さらなる研究例として、本発明は、ストレプトコッカス・スイスおよびここに同定されるＳ．スイス遺伝子のフィブロネクチンおよびフィブリノーゲン結合タンパク質（ＦＢＰＳ）の特性の研究を提供する。流体相中か、または表面に固定化されるかいずれかでのフィブロネクチンの結合能力は、Ｓ．スイスの特性であるとともに、宿主細胞への付着および侵入に用いるＳ．スイスの機構の１つである。したがって、ＦＢＰＳは、重要なビルレンス因子である。このタンパク質をコード化する遺伝子は、ここに提供されるようにブタのｉｎ  ｖｉｖｏ選択システムを用いて同定され、再び��ｎ  ｖｉｖｏでの該タンパク質の重要な役割を示した。この発見は、Ｓ．スイスのここでまた提供された同質遺伝子ＦＢＰＳ突然変異体がブタにおいて弱毒化されるという観察によって裏付けられた。驚いたことに、ＦＢＰＳは、フィブロネクチンのみならずフィブリノーゲンにも結合したけれども、最も広く述べられているフィブロネクチン結合タンパク質の構造的特徴を示さなかったことは、なぜこれがより早期に発見されなかったかを説明している。今日まで述べられた多くのフィブロネクチン結合タンパク質は、非常に類似する構造組織を有する予測寸法６０〜１００ｋＤａの大きい細胞表面タンパク質である。これらのタンパク質は、Ｎ末端信号配列のみならず細胞壁信号配列（ＬＰＸＴＧＥ）を含有する。ｆｎ結合部位は、３０〜４２アミノ酸長のモチーフからなる。特に、ここにおいて、Ｓ．スイスの第１フィブロネクチン結合タンパク質およびフィブリノーゲン結合タンパク質を提供する。ＦＢＰＳをコード化する遺伝子をクローン化かつ配列し、ＦＢＰＳを精製した。ヒトｆｎおよびｆｇｎに対するＦＢＰＳの結合を示した。ＦＢＰＳは子ブタにおけるＳ．スイス感染に特異的な器官のコロニー形成に関係するが、子ブタの扁桃腺におけるＳ．スイスのコロニー形成に関係しないことが示された。
【００１３】
多くの連鎖球菌およびブドウ球菌は、いくつかの異なるフィブロネクチン結合タンパク質および／またはフィブリノーゲン結合タンパク質を有し、これらのほとんどは、約１３０ｋＤａと非常に大きい。今日まで、Ｓ．ピオゲネスは、大きいＦｎＢＰと、より小さい（５４ｋＤａ）ＦｎＢＰとを有する唯一の有機体である。１つよりも多いＦｎＢＰの存在は、なぜいくつかの有機体において、ＦｎＢＰのうち１つのみにおいて防御的な同質遺伝子突然変異体がｆｎおよび／またはｆｇｎになお結合可能であり、さらにフィブロネクチン結合に関連してｉｎ  ｖｉｖｏで弱毒化され得るかを説明する。
【００１４】
Ｓ．スイスの病原におけるＦＢＰＳの役割は、子ブタの実験感染モデルにおいて研究された。突然変異体クローンのＬＤ50値を決定できず、通常用いられる数の細菌を用いて致死量を定めることができないことを発見したので、子ブタにおいて競合感染アッセイで野生型Ｓ．スイスに対して同質遺伝子のＦＢＰＳクローンのビルレンスを比較することとした。この種の共通コロニー形成実験は、子ブタのアクチノバシラスプリュロニューモニエ(Actinobacillus pleuropneumoniae)の突然変異体のビルレンスを決定するために首尾よく用いられた。このデータは、突然変異体クローンが野生型と同じ効率で扁桃腺をコロニー形成する能力を有することを明らかに示した。これは、ＦＢＰＳが扁桃腺のコロニー形成に関係しないことを強く示した。前記競合アッセイにおいて関節およびＣＮＳが突然変異体細菌よりも野生型によってより効率的にコロニー形成されたので、このデータはまた、ＦＢＰＳが、特異的な器官のコロニー形成において役割を果たすことを示した。加えて、突然変異細菌の数と比較してより多い数の野生型細菌が、特異的な器官から再単離され、これは突然変異クローンがｉｎ  ｖｉｖｏで弱毒化されることを示す。この実験に用いられたブタの数は少ないけれども、これらのデータは、ＦＢＰＳ突然変異体が野生型菌株よりもビルレンスが小さいことを示す。ＦＢＰＳがＳ．スイス感染を克服したブタの回復期血清と反応したことを明示することができた。したがって、ＦＢＰＳはブタにおいて免疫原性を有し、この発見は、Ｓ．スイスのＦＢＰＳがｉｎ  ｖｉｖｏ状態下で発現されることを明確に示す。ｆｂｐｓ遺伝子がＳ．スイスのすべての知られている血清型（２型を除く）、および血清型２型の３つのすべての表現型中に存在することを示した。これは、ｆｂｐｓ遺伝子がほとんどの血清型中に存在することを示唆する。しかしながら、すべての血清型および表現型中のＦＢＰＳの発現を研究しなかった。したがって、血清型３２型および３４型を除くすべての菌株がｆｂｐｓ遺伝子を保有するけれども、すべての菌株がＦＢＰＳを発現しない可能性がある。ＦＢＰＳがブタにおいて免疫原性を有し、ｆｂｐｓ遺伝子が２型を除くすべての一般的なＳ．スイス血清型中に存在するという事実に基づいて、ＦＢＰＳは、本質的にすべての血清型に対して交差防御的なワクチンとして非常に魅力的な候補である。魅力的な選択肢は、前記ワクチンに突然変異菌株１０）ＦＢＰＳを用いることであり、この突然変異体は、ここに同定される１つまたは２つ以上のビルレンス因子を削除することによってさらに弱毒化可能であり、別の実施形態において、このワクチンは、適切なアジュバントを伴う精製されたＦＢＰＳタンパク質またはその抗原部分に基づく。要するに、ここで同定されたビルレンス因子の同定方法をさらに有効にするために、子ブタのＳ．スイス血清型２型の病原におけるフィブロネクチン結合タンパク質／フィブリノーゲン結合タンパク質（ＦＢＰＳ）の役割をさらに研究した。Ｓ．スイス血清型２型からのＦＢＰＳをコード化する完全遺伝子を、大腸菌中でクローン化するとともに、配列した。様々な血清型における遺伝子の発生を、ハイブリッド形成研究によって分析した。ＦＢＰＳタンパク質を大腸菌中で発現し、精製するとともに、ヒトのフィブロネクチンおよびフィブリノーゲンとの結合を明示した。子ブタにおける抗体の誘導を感染症において研究した。ＦＢＰＳを産生不可能な同質遺伝子突然変異体を構築するとともに、野生型および突然変異体の菌株のビルレンスを若いブタの競合感染モデルで比較した。器官培養は、ＦＢＰＳが扁桃腺のコロニー形成に必要とされない一方で、ＦＢＰＳがＳ．スイス感染症に関係する特異的な器官のクローン化において役割を果たすことを示した。したがって、ＦＢＰＳ突然変異体を、ワクチンに非常に有用な弱毒化された突然変異体と考えた。代替的に、ブタにおけるＦＢＰＳに特異的な抗体またはＴ細胞の応答がＦＢＰＳまたはその抗原部分のワクチン摂取後に現れるような、主としてＦＢＰＳタンパク質または少なくともその抗原部分からなるワクチンを用いる。
【００１５】
２つの追加的なｉｖｓ遺伝子は、その他の細菌種においてｉｎ  ｖｉｖｏ発現技術（ＩＶＥＴ）選択を用いることによって予備同定された環境的に調節された遺伝子との相同性を示した。これらのうち１つは、重要な座が多数のビルレンスタンパク質の調節に関係する、黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)のａｇｒＡ遺伝子との類似性を示した。
【００１６】
これによって、本発明はまた、連鎖球菌のビルレンスの検定方法を提供し、この方法は前記連鎖球菌のゲノムフラグメントを検定することを含み、前記ゲノムフラグメントは、ここに提供される核酸またはそのフラグメントに対してストレプトコッカス・スイスにおいてハイブリッド形成によって同定可能なフラグメントの少なくとも機能部分を含む。
【００１７】
本発明はまた、本発明に従った核酸を含むベクターと、本発明に従った核酸またはベクターを含む宿主細胞とを提供する。このような宿主細胞は好ましくは、大腸菌のような容易に修飾可能な有機体を含み、しかしながら、本発明に従ったベクターまたは核酸を含む組換え連鎖球菌のようなその他の宿主細胞もここに提供される。
【００１８】
さらに、本発明は、本発明に従った核酸もしくはベクターまたは宿主細胞を含むワクチンと、連鎖球菌感染症の予防および／または処置におけるこのようなワクチンの使用とを提供する。
【００１９】
また、本発明に従った核酸によってコード化されたタンパク質またはそのフラグメント、たとえば、ここで開示された核酸もしくはそのフラグメントによってコード化されたタンパク質、または機能的、すなわち抗原性を有するそのフラグメントを提供する。本発明はまた、本発明に従ったタンパク質またはそのフラグメントに対する抗体と、このような抗体と反応する、たとえばタンパク質またはフラグメントを含む抗原とを提供する。このようなタンパク質またはそのフラグメントは、組換え手段でしか得られないわけではなく、アミノ酸配列に従ったペプチド合成も同様に可能である。ここに提供されるこのような抗原および抗体は、本発明に従った抗体を含む診断テストにおいて、または本発明に従った抗原を含むワクチンまたは診断テストの範囲内で用いることができる。このようなワクチンおよび診断テストは、連鎖球菌感染症の診断およびこれに対するワクチンの分野において、ならびに連鎖球菌のビルレンス標識の検出に用いることができる。
【００２０】
ストレプトコッカス・スイスは、若いブタにおける脳膜炎、敗血症、関節炎および突然死の重要な原因である（Clifton-Hadley, 1983; Vecht et al., 1985）。これはヒトにおいて脳膜炎を引起すこともある（Arends & Zanen, 1988）。この疾患を制御する試みは、この疾患の病原に関する十分な知識の欠如、ならびに有効なワクチンおよび鋭敏な診断方法の欠如によってなお阻害される。これらの欠点に対処するために、病原過程に関係する遺伝子を同定する必要がある。しかしながら、現在のところ、限定された数のＳ．スイス遺伝子しか知られておらず（Smith et al., 1992、Smith et al., 1993、Serhir et al., 1997、Segers et al., 1998、Smith et al., 1999、ならびに受託番号ＡＦ１０６９２７、Ｚ９５９２０およびＡ５７２２２）、これらのうち２、３種しかビルレンスに関係しないと推定される（Smith et al., 1992; Smith et al., 1993; Jacobs et al., 1994; Gottschalk et al., 1995; Segers et al., 1998; Smith et al., 1999）。以前、推定ビルレンス因子は標準の研究所媒体において細菌の成長後に同定されてきた。しかしながら、多くの重要なビルレンス因子が環境的に調節され、感染過程の特定の段階で誘導されることが知られている（Mahan et al., 1993）。近年、いくつかの方法が、宿主で特異的に発現した遺伝子の同定を可能にすることを報告した。たとえば、タグを付した突然変異生成法(signature-tagged mutagenesis)（ＳＴＭ）およびｉｎ  ｖｉｖｏ発現技術(in vivo expression technology)（ＩＶＥＴ; Mahan et al., 1993; Camili & Mekalanous, 1995; Hensel et al., 1995; Mahan et al., 1995; Mei at el., 1997; Young & Miller, 1997; Chiang & Mekalanos, 1998; Coulter et al., 1998; Lowe et al., 1998; Polissi et al., 1998; Camacho et al., 1999; Darwin et al., 1999; Edelstein et al., 1999; Fuller et al., 1999; Zhao et al., 1999)である。加えて、重要なビルレンスタンパク質はｉｎ  ｖｉｖｏ条件に酷似する条件下で特異的に発現した遺伝子の選択によって、たとえば鉄制限条件における成長によって同定されることもできる（Litwin & Calderwood, 1993; Martinez et al., 1990）。
【００２１】
本作業の目的は、子ブタの実験感染により、およびｉｎ  ｖｉｔｒｏでの鉄制限条件の使用により環境的に調節された遺伝子の選択によってＳ．スイスのビルレンス遺伝子を同定することである。この目的のために、Ｓ．スイスの染色体ＤＮＡフラグメントを、プロモーターレスエリスロマイシン耐性遺伝子の前にプラスミド中でクローン化した。その後、このライブラリは細菌の選択に用いられ、ここにおいてエリスロマイシン耐性を鉄制限条件下で誘導した。加えて、このライブラリによる子ブタの感染およびエリスロマイシンによる子ブタの処置後、エリスロマイシン耐性細菌を選択した。これらの実験用にマウスの代わりにブタを用いたのは、我々が、Ｓ．スイスのビルレンスがこれら２つの動物種で異なることを近年示したからである（Vecht et al., 1997）。この方法を用いて、１８個の独特な鉄制限誘導された（ｉｒｉ）遺伝子と、２２個の独特なｉｎ  ｖｉｖｏで選択された（ｉｖｓ）遺伝子とを同定し、これらのうちいくつかはビルレンスに関係することが推定される（Smith et al., 1993; Smith et al., 1996）。
【００２２】
（方法）
細菌株および成長条件。本研究に用いられた細菌株およびプラスミドを表１に記載する。Ｓ．スイス菌株を、トッド・ヒューイット(Todd-Hewitt)培地（オキソイド(Oxoid)社製）中で成長させ、６％（ｖ／ｖ）のウマ血液を含有するコロンビア寒天（オキソイド社製）で培養した。鉄制限条件を誘導した遺伝子の選択のために、トッド・ヒューイット培地、５％（ｗ／ｖ）酵母エキスおよび７５μＭデフェロキサミンメシレート（シグマ(Sigma)社製）を含有する寒天プレートでＳ．スイス細胞を培養した。対照プレートには、３８μＭのＦｅＳＯ4．７Ｈ2Ｏ（シグマ社製）が追加された。必要に応じて、抗生物質を、１ｍＬ-1あたり１００μｇのスペクチノマイシンおよび１ｍＬ-1あたり１μｇのエリスロマイシンという濃度で加えた。大腸菌株をルリア(Luria)培地（Miller, 1972）中で成長させ、１．５％（ｗ／ｖ）の寒天を含有するルリア培地で培養した。必要に応じて、１ｍＬ-1あたり５０μｇのアンピシリンまたは１ｍＬ-1あたり５０μｇスペクチノマイシンを加えた。
【００２３】
ｐＩＶＳ−Ｅの構築。本研究に用いられたＩＶＳ選択ベクターは、スペクチノマイシン耐性遺伝子およびプロモーターレスエリスロマイシン耐性遺伝子、ならびにプラスミドｐＷＶＯ１の複製起点を含む（Van der Vossen et al., 1987）。このｐＩＶＳ−Ｅを構築するために、スペクチノマイシン耐性遺伝子をｐＫＵＮ１９−ｓｐｃから増幅した（Konings et al., 1987; Smith et al., 1995）。ＰＣＲ反応において、各５末端でＮｓｉＩおよびＳａＩ制限部位を含有するプライマー５’−ＴＧＣＡＴＧＣＡＴＧＧＡＴＣＣＡＴＣＧＡＴＴＴＴＣＧＴＴＣＧ−３’と５’−ＣＧＡＧＣＴＣＧＧＴＡＣＣＴＧＡＴＴＡＣＣＡＡＴＴＡＧＡＡＴ−３’とを用いた。得られたＰＣＲ産生物をＮｓｉＩおよびＳａＩで消化し、ＳａＩ（部分的に）およびＮｓＩで消化されたｐＧＫＶ２１０（Van der Vossen et al., 1987）に結合させた。この結果生じるプラスミドを、ｐＧＫＶ２１０−ｓｐｃとした。ｐＥ１９４（Horinouchi & Weisblum, 1982）を、プロモーターレスエリスロマイシン耐性遺伝子の増幅用テンプレートとして用いた。このために、プライマー５’−ＧＧＧＴＣＧＡＣＣＣＴＡＴＡＡＣＣＡＡＡＴＴＡＡＡＧＡＧＧＧ−３’および５’−ＣＣＣＡＡＧＣＴＴＧＧＧＣＡＧＴＴＴＡＴＧＣＡＴＣＣＣＴＴＡＡＣ−３’を、ＰＣＲ反応において用いた。これらのプライマーは、各５末端においてＳａｌＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ制限部位を含有した。増幅されたフラグメントをＳａｌＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、このフラグメントをＳａｌＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化されたｐＧＫＶ２１０−ｓｐｃに結合した。この結果生じるプラスミドを、ｐＩＶＳ−Ｅとした。ｐＩＶＳ−ＰＥを構築するために、ｍｒｐ遺伝子のプロモーター領域を、プロモーターレスエリスロマイシン耐性遺伝子についての５’にｐＩＶＳ−Ｅに対して挿入した。ｍｒｐ遺伝子のプロモーター領域を、プライマー５’−ＣＣＣＡＡＧＣＴＴＧＧＧＡＡＴＴＣＡＴＡＡＴＧＴＴＴＴＴＴＴＧＡＧＧ−３’および５’−ＧＣＧＴＣＧＡＣＡＴＣＴＡＣＧＣＡＴＡＡＡＡＡＡＴＣＣＣＣＣ−３’を用いて、ｐＭＲＰ１１（Smith et al., 1992）からＰＣＲによって増幅した。これらのプライマーは、各５末端においてＥｃｏＲＩおよびＳａＩ部位を含有した。増幅されたＤＮＡをＥｃｏＲＩおよびＳａＩで消化し、その結果生じたフラグメントをＥｃｏＲＩおよびＳａｌＩで消化されたｐＩＶＳ−Ｅに結合した。
【００２４】
ｐＩＶＳ−ＥにおけるゲノムＳ．スイスライブラリの構築。Ｓ．スイス血清型２菌株１０ＤＮＡのＡｌｕＩ部分的消化物を、０．８％（ｗ／ｖ）のアガロースゲルで断片化（５００〜１０００ｂｐ）した。精製されたフラグメントを、ＳｍａＩおよび子ウシ腸のホスファターゼで消化されたｐＩＶＳ−Ｅに結合させ、これらの連結反応混合物を大腸菌ＸＬ２−ｂｌｕｅ細胞に形質転換させた。スペクチノマイシン耐性コロニーを選択した。ＰＣＲによる形質転換細胞の分析は、８０％を超える細胞が挿入断片を含有していることを示した。約２０００〜３０００個の独立した大腸菌形質転換細胞の１５個のプールから、プラスミドＤＮＡを単離した。その後、このプラスミドＤＮＡをＳ．スイス菌株１０の電気形質転換に用いた（Smith et al., 1995）。この結果、約３０，０００の独立したＳ．スイス形質転換細胞が生じた。これらの形質転換細胞を−８０℃でプールし、かつ保存した。
【００２５】
ＤＮＡ技術。通常のＤＮＡ操作およびＰＣＲ反応を、Sambrook et al.(1989)によって記載されたように実行した。ＤＮＡ配列を、３７３ＡＤＮＡシーケンシングシステム（アプライドバイオシステムズ(Applied Biosystems)社製）において決定した。サンプルをＡＢＩ／ＰＲＩＳＭダイターミネーターサイクルシークエンシングレディーリアクションキット(dye terminator cycle sequencing ready reaction kit)（アプライドバイオシステムズ社製）を用いて調製した。特注のシークエンシングプライマーをライフテクノロジー(Life Technology)社から購入した。シークエンシングデータをマクモリーテトラ(McMollyTetra)ソフトウェアパッケージを用いて整理し、かつ分析した。演繹されたアミノ酸配列に類似するタンパク質配列の検索にＢＬＡＳＴプログラムを用いた。
【００２６】
ＰＣＲ反応混合物（５０μＬ）は、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．３、１．５ｍＭのＭｇＣｌ2、５０ｍＭのＫＣｌ、各０．２ｍＭの４つのデオキシヌクレオチドリン酸、各１μＭのプライマー、および１ＵのAmpliTaq Gold ＤＮＡポリミラーゼ（パーキンエルマー・アプライドバイオシステムズ(Perkin Elmer Applied Biosystems)社製）を含有する。ＤＮＡ増幅をパーキンエルマー９６００サーマルサイクラーにおいて実行し、プログラムは、９５℃で１０分間のインキュベーションと、９５℃で１分間、５６℃で２分間および７２℃で２分間の３０サイクルのインキュベーションとから構成された。
【００２７】
処理された子ブタにおけるエリスロマイシンレベルの評価。１週齢の特定病原菌無菌（ＳＰＦ）ブタをエリスロマイシンステアレート（アボット(Abbott)社製、体重１ｋｇ-1あたり２０または４０ｍｇ）で経口処置、またはエリスロマイシン（エリストロシン２００、サノフィ・サンテ(Sanofi Sante)社製、体重１ｋｇ-1あたり２０または４０ｍｇ）で筋肉注射処置した。エリスロマイシンレベルを決定するために抗体の投与から３時間、６時間または２４時間後に血液サンプルを収集した。
【００２８】
実験感染。ノトバイオートグレートヨークシャとダッチランドレースとを交配した子ブタを帝王切開によってメスブタから得た。この手術は消毒したフレキシブルフィルムアイソレータにおいて行われた。これらのブタを、それぞれ４匹のブタからなるグループに割り当て、消毒したステンレス鋼のインキュベータにおいて収容した。収容条件および給餌管理は前述のとおりである（Vecht et al., 1989; Vecht et al., 1992）。１年齢の子ブタに、前述のようなＳ．スイス菌株１０（ｐＩＶＳ−Ｅ）、１０（ｐＩＶＳ−ＰＥ）または１０（ｐＩＶＳ−ＲＥ）を静脈注射で接種した（Vecht et al., 1989; Vecht et al., 1992, 表３）。感染から２時間後、これらのブタに、エリスロマイシンを第一に筋肉注射して、その後、１日に２回、すなわち１回は筋肉注射で（１体重ｋｇ-1あたりエリスロシン４０ｍｇ）、１回は経口で（１体重ｋｇ-1あたりエリスロマイシンステアレート４０ｍｇ）、エリスロマイシンを収受させた。子ブタを疾患、たとえば発熱、神経性症状および跛行の臨床的症状について１日２回監視した。血液サンプルを各ブタから１週間に３回採集した。白血球濃度を伝導カウンタを用いて決定した（コントラヴェスＡ．Ｇ．(Contraves A.G.)社製、スイス）。Ｓ．スイスの感染症を監視するために、および汚染物質の有無を検査するために、鼻咽頭および糞のスワブを毎日採集した。これらのスワブを６％（ｖ／ｖ）のウマ血液を含有するコロンビア寒天に直接培養した。子ブタを殺した後、これらを総病原性変化について実験した。組織標本を、中枢神経系、漿膜、関節、肺および扁桃腺から採集した。これらの組織をウルトラ・タラックス(Ultra-Turrax)ティシュマイザー（オムニインターナショナル(Omni International)社製）を用いてトッド・ヒューイット培地中で均質化し、１５％（ｖ／ｖ）のグリセロール中で−８０℃で凍結した。
【００２９】
（結果）
プロモーター選択システム。
【００３０】
プラスミドｐＩＶＳ−Ｅは、プロモーターレスエリスロマイシン耐性遺伝子の前で多数の独特な制限部位中にＳ．スイスＤＮＡフラグメントを導入可能に構築される。このプラスミドは、ｐＷＶＯ１の複製起点を保持し、大腸菌でもＳ．スイス（Smith et al., 1995）でも機能する。ｐＩＶＳ−Ｅを含有するＳ．スイス菌株１０細胞は、寒天プレートにおける１ｍＬ-1あたり１μｇのエリスロマイシンに敏感であった。ｐＩＶＳ−ＰＥにおいて、ｉｎ  ｖｉｖｏでもｉｎ  ｖｉｔｒｏでも相当発現するＳ．スイス（Smith et al., 1992）のｍｒｐ遺伝子のプロモーターは、エリスロマイシン耐性遺伝子の発現を促進する。ｐＩＶＳ−ＰＥを含有するＳ．スイス菌株１０細胞は、寒天プレートにおいて高濃度のエリスロマイシン（＞１ｍＬ-1あたり２５６μｇのエリスロマイシン）に耐性を有した。ｐＩＶＳ−Ｅ（ｐＩＶＳ−ＲＥ）におけるＳ．スイスＤＮＡライブラリを構築して、３０，０００個の個別のＳ．スイスクローンまたは突然変異体を得た。２４個のランダムに選択された形質転換細胞の分析によって決定されるように、８０％を超えるこれらのクローンまたは突然変異体が挿入断片を含有した（結果は示していない）。さらに、２％のクローンが寒天プレートにおいて１ｍＬ-1あたり１μｇのエリスロマイシンに耐性を有し、このことはｉｎ  ｖｉｔｒｏで機能するいくつかのプロモーター配列の存在を示した。
【００３１】
鉄制限条件下で誘導されたプロモーターの選択。
第一に、鉄制限条件下で寒天プレートにおいて特異的に誘導された遺伝子配列を選択した。この目的のために、約９６，０００ｃ.ｆ.ｕ.を、デフェロキサミンメシレートおよびエリスロマイシンを含有する寒天プレートにおいて鉄制限条件下で培養した。これらのプレートにおいて成長した１５００個のコロニーを、エリスロマイシン、デフェロキサミンメシレートおよびＦｅＳＯ4を含有するプレートに接種した。２４個のクローンは、ＦｅＳＯ4中で減少成長を示した。２４個の選択されたｉｒｉクローンの挿入断片を、エリスロマイシンおよびスペクチノマイシン耐性遺伝子の５’末端に相補的なプライマーを用いてＰＣＲによって増幅し、これらのフラグメントのヌクレオチド配列を決定した。配列データは、これらの２４個のクローンが１８個の独特な配列を含有することを示した。これらの１８個の配列を、ジェンバンク(GenBank）/ＥＭＢＬおよびスイスプロット(SWISSPROT)データベース中の配列と比較することによって既知の遺伝子との類似性について分析した。１つの配列ｉｒｉ３１は、ｃｐｓ２Ａと同一であり、予備同定されたＳ．スイス遺伝子は、カプセル発現の調節に関係することが推定された（Smith et al., 1999）。１４個のｉｒｉ配列は、既知の非Ｓ．スイスの遺伝子の配列と類似した。これらの配列のうち３つ（ｉｒｉ２、ｉｒｉ１、６および２２、ならびにｉｒｉ３４）は、ＩＶＥＴをコレラ菌(V.cholerae)（Camilli & Mekalanos, 1995）、黄色ブドウ球菌(S.aureus)（Lowe et al., 1998）および緑膿菌(P.aeruginosa)（Wang et al., 1996）にそれぞれ用いることによって予め選択された環境的に調節された遺伝子の配列に類似した。ｉｒｉ１、６および２２に含有される１つは、黄色ブドウ球菌のａｇｒＡ遺伝子に類似し、重要な座は多数のビルレンスタンパク質の調節に関係した。３つのｉｒｉ配列は、データベース中のいずれの配列にも重要な類似性を有しなかった（表２）。
【００３２】
子ブタ中のプロモーター配列の選択に関する条件。
ｉｎ  ｖｉｖｏ発現プロモーター配列の有効な選択に必要な抗生物質処置法を決定するために、子ブタに１日１回異なる濃度のエリスロマイシンを処置した。エリスロマイシンを、経口または筋肉注射のいずれかで投与した。血清中のエリスロマイシンレベルを、１週間に渡って処置から３時間、６時間または２４時間後に決定した。高いエリスロマイシンレベルが、両処置から３時間および６時間後に検出された（結果は示していない）。しかしながら、処置から２４時間後、前記レベルは劇的に減少した。これらのデータに基づいて、有効なプロモーター選択のために、エリスロマイシン（１ｋｇ-1あたり４０ｍｇ）を１日２回、すなわち１回は筋肉注射で（午前９時）、１回は経口（午後４時）で動物に処置することが必要であった。
【００３３】
この仮説をテストするために、ブタにＳ．スイス菌株１０（ｐＩＶＳ−ＰＥ）または菌株１０（ｐＩＶＳ−Ｅ）のいずれかを接種した。ｐＩＶＳ−ＰＥにおいて、ｉｎ  ｖｉｖｏでもｉｎ  ｖｉｔｒｏでも相当発現するＳ．スイス（Smith et al., 1992）のｍｒｐ遺伝子のプロモーターは、エリスロマイシン耐性遺伝子の発現を促進する。対照プラスミドｐＩＶＳ−Ｅは、エリスロマイシン耐性遺伝子の前にプロモーターを含有しない。菌株を静脈注射または鼻腔内注射で接種した。菌株１０（ｐＩＶＳ−ＰＥ）に感染したすべてのブタは特異的なＳ．スイスの症状を示し（表３）、１匹を除いてすべてのブタが実験の過程で死亡した。さらに、多数の細菌は、中枢神経系、漿膜および関節から単離された。対照的に、菌株１０（ｐＩＶＳ−Ｅ）を接種したブタは、いずれも疾患の特異的な臨床的症状を示さず、すべてのブタが実験終期まで感染症を克服した。さらに、細菌は、中枢神経系、漿膜またはこれらの動物の関節から単離されなかった。これらのデータは、ｉｎ  ｖｉｖｏ発現配列を、用いられた抗生物質処置法によってブタから選択することができることを明示した。
【００３４】
子ブタにおいてｉｎ  ｖｉｖｏで発現された遺伝子配列の選択。
子ブタに、異なる投与量（５×１０5〜５×１０8ｃ.ｆ.ｕ.）のＳ．スイスライブラリを静脈注射で接種するとともに（表３）、前述のようにエリスロマイシンを処置した。疾患の臨床的症状は、感染から８日後にすべての動物において生じた（表３）。多数の細菌を、個別の子ブタの組織（中枢神経系、関節、漿膜、肺、肝臓、脾臓、心臓および腎臓）から回収した。回収された細菌の分析は、限定数の異なるクローンが病気のブタから単離された各細菌サンプルに存在することを示した。たとえば、１匹のブタの関節からの３０個のランダムに選択されたクローンはすべて、ＰＣＲおよびＤＮＡ配列分析によって評価されるものと同一のＤＮＡ挿入断片を保有した（結果は示していない）。さらに、８０％の６２の分析したサンプル部位において、４個のランダムに選択されたクローンは、すべて同一であった。しかしながら、単一の動物の異なる組織から、異なるクローンまたは突然変異体を単離することができた。他方、同一のクローンを、異なる動物の異なる組織および対応する組織から単離することができた。これらの発見は、限定数のクローンがｉｎ  ｖｉｖｏで選択されるとともに、感染した組織において相当豊富になることを示した。この観察された選択は、組織特異的ではなかった。最後に、１ｍＬ-1あたり１μｇエリスロマイシンを含有した寒天プレートにおいて成長し損なった選択されたクローンは存在しなかった。
【００３５】
２４５個のクローンをＰＣＲおよび部分的配列分析によって分析した。これらのうち、２２個の独特なｉｖｓクローンを発見した。この２２個の配列を、ジェンバンク／ＥＭＢＬおよびスイススポットデータベースと比較することによって、既知の遺伝子の配列との類似性について分析した（表４）。２つの遺伝子の配列は、推定ビルレンス因子をコード化する遺伝子との類似性を示し、ｉｖｓ２１、２６および３０は、ビルレンスに関係することが推定される予備同定されたＳ．スイス遺伝子であるｅｐｆ遺伝子と一致し（Smith et al., 1993; Smith et al., 1996）、ｉｖｓ３１は、Ｓ．ゴルドニーのフィブロネクチン結合タンパク質と類似した。さらに、２つのｉｖｓ遺伝子の配列（ｉｖｓ２５、ならびにｉｖｓ６、７、１３および１４）は、その他の細菌種においてＩＶＥＴ選択を用いて予備同定された２つの環境的に調節されたｉｖｉ遺伝子と相同であった（Camilli & Mekalanos, 1995; Lowe et al., 1998）。４つのｉｖｓ配列（ｉｖｓ２５、ｉｖｓ２３および２４、ｉｖｓ２、４および２８、ならびにｉｖｓ６、７、１３および１４）はまた、ライブラリが鉄制限条件を用いて選択されたときに発見された。これらの配列の残りは、既知の非Ｓ．スイス遺伝子の配列との類似性を示し、可動要素との類似性を示す２つの遺伝子と、知られていない機能の遺伝子との類似性を示す５つの遺伝子とを含有する。
【００３６】
鉄制限条件の使用と子ブタの実験感染とによる、Ｓ．スイス血清型２型の環境的に調節された遺伝子の同定を述べる。１８個の独特なｉｒｉ遺伝子と、２２個の独特なｉｖｓ遺伝子とを発見した。ｉｎ  ｖｉｖｏで排他的に発現するｉｖｓ遺伝子は存在しなかった。４つのｉｒｉ遺伝子は、ｉｎ  ｖｉｖｏで選択された４つのクローンと一致した。これらの選択された遺伝子配列は、潜在的なビルレンス因子をコード化し、ブタにおけるＳ．スイス感染症の病原に関する知識を拡張させ、有効なワクチンの開発または新しい診断方法の開発のいずれかによって疾患の制御に価値を有する。特定の条件下において発現した、すなわち鉄制限の期間中または実験感染の期間中に発現した環境的に調節されたＳ．スイス遺伝子を同定するためのプロモータートラップを用いた。このシステムは、Ｓ．タイフィムリウム(S.typhimurium)（Mahan et al., 1995）に関して記載された抗生物質に基づくＩＶＥＴシステムと２つの点で異なる。１つは、ベクターの構造安定性を生じさせるｌａｃＺ遺伝子を含有するために、ｌａｃＺリポーター遺伝子融合がベクター構築において省略される点である。もう１つの相違点は、染色体統合システムよりむしろプラスミドシステムを用いた点である。Ｓ．スイス（Smith et al., 1995）の低い形質転換効率が染色体統合システムを用いる完全遺伝子ライブラリの調節を妨げ得るので、プラスミドシステムを用いた。得られたデータからは、多数の誘導可能な、環境的に調節された配列が選択されたことが明白である。興味深いことに、４つのｉｒｉ遺伝子は４つのｉｖｓ遺伝子と一致した。ほとんどの細菌が成長に鉄を必要とするとともに、宿主内で利用可能な限定量の遊離鉄が存在するので（Payne, 1993）、いくつかのｉｖｓ遺伝子の発現が鉄によって調節されることが予期され得る。ｉｎ  ｖｉｖｏ選択システムによって、組織特異的なコロニー形成を観察しなかった。１匹の子ブタから単離されたクローンはまた、他の子ブタの対応する組織および異なる組織から単離された。これは、ブタにおけるＳ．スイス感染症の分子病原に関係する機構に起因するのであろう。さらに、ＩＶＥＴシステムによって行われた観察が、限定数のクローンしか選択され得ないという点で著しく異なった。加えて、ｉｎ  ｖｉｖｏで排他的に発現する遺伝子配列を選択したことを明示することができなかった。このことは、２２個の同定されたｉｖｓ遺伝子の中でｉｎ  ｖｉｖｏで排他的に発現するプロモーター配列の不存在、および／または遺伝子量効果に起因してこのような配列を同定するためのこのプラスミド基礎システムの不能によって、説明され得るであろう。
【００３７】
多数の関心のある遺伝子を選択した。２つのｉｖｓ遺伝子は、推定ビルレンス因子をコード化する遺伝子との類似性を示した。ｉｖｓ２１、２６および３０は、Ｓ．スイス血清型１型および２型（Stockhofe-Zurwieden et al., 1996; Vecht et al., 1991; Vecht et al., 1992）のビルレンス菌株中で発見されるＳ．スイス（Smith et al., 1993）のｅｐｆ遺伝子と一致することが示された。ｉｖｓ３１は、Ｓ．ゴルドニー（受託番号Ｘ６５１６４）および連鎖球菌Ａ群（Courtney et al., 1994）のフィブロネクチン／フィブリノーゲン結合タンパク質との類似性を示した。連鎖球菌において、フィブロネクチン／フィブリノーゲン結合タンパク質は、宿主細胞との接着に重要な役割を果たし、重要なビルレンス因子として考えられている。これらの２つのｉｖｓ遺伝子の選択は、システムの選択性を明示し、ブタにおけるＳ．スイス感染症の病原での他のｉｖｓ遺伝子の関連性を暗示している可能性がある。システムの能力は、２つのｉｖｓ遺伝子、ｉｖｓ２５ならびにｉｖｓ６、７、１３および１４が、その他の細菌種においてＩＶＥＴ選択システムを用いて予備同定された環境的に調節された遺伝子との類似性を示すという観察によってさらに明示された。
【００３８】
ｉｖｓ２５は、Ｓ．ミュータンス(S.mutants)（受託番号Ｐ７２４８５）のＳａｐＲ遺伝子およびラクトバチルス・サケ(Lactobacillus sake)Ｌｂ７０６（Axelsson & Holck, 1995）、ならびに黄色ブドウ球菌（Projan & Novick, 1997）のａｇｒＡ遺伝子との著しい類似性を示し、これらの両方は、細菌２成分情報伝達系の応答調節タンパク質をコード化し、これによって環境的な情報に対する応答を仲介する（Projan & Novick, 1997）。マウス中の黄色ブドウ球菌に関するＩＶＥＴ選択系の使用は、ａｇｒＡ遺伝子に先行する領域を選択し、ｉｎ  ｖｉｖｏ条件下におけるａｇｒＡの発現の誘導を示唆している（Lowe et al., 1998）。さらに、黄色ブドウ球菌において、ａｇｒ座は、細胞密度に応答して多数のビルレンス因子の発現を変化させる重要な役割を果たすことが示された（Projan & Novick, 1997）。将来の実験において、Ｓ．スイスにおけるビルレンス因子の発現におけるｉｖｓ２５の推定される役割がさらに分析されるであろう。
【００３９】
クローンｉｖｓ６、７、１３および１４は、コレラ菌（Camilli & Mekalanos, 1995）中でＩＶＥＴ選択によって予備同定された遺伝子ｉｖｉＶＩとの類似性を示した。ｉｖｉＶＩの機能は知られていない。しかしながら、これらの遺伝子は、輸送体のＡＴＰ結合カセットファミリーの一員との類似性を示した。ｉｖｓ６、７、１３および１４の配列された部分は、この輸送体ファミリーにおいて保存されるＮ末端ＡＴＰ結合ウォーカーＡボックスモチーフを含有した。
【００４０】
４つのｉｖｓ遺伝子は、４つのｉｒｉ遺伝子と一致した。ｉｒｉ２４と一致する第１の遺伝子、ｉｖｓ２３および２４は、Ｓ．アガラクティエ(S.agalactiae)のｃｐｓＹ（Koskiniemi et al., 1998）と、様々な有機体のｏｘｙＲ（Demple, 1999）との類似性を示した。Ｓ．アガラクティエのｃｐｓＹは、カプセル発現の調節に関係し、ｃｐｓＹ遺伝子の発現の環境的誘導はKoskiniemi et al.(1998)によって示唆された。Ｓ．スイスにおいて、ｉｖｓ２３および２４、ならびにｉｒｉ２４は、カプセルの座に連結されない（Smith et al., 1999）。ｏｘｙＲ遺伝子は、大腸菌（Demple, 1999）中の酸化的ストレス応答の中心の調節遺伝子であり、約１０個の遺伝子がＯｘｙＲタンパク質の制御に従う。ｉｒｉ１０および２０と一致する第２の遺伝子、ｉｖｓ２、４および２８は、大腸菌（受託番号Ｐ７６２６２）のｙｏａＥ遺伝子、推定ＡＢＣ輸送タンパク質との類似性を示した。第３および第４の遺伝子、ｉｖｓ２５と、ｉｖｓ６、７、１３および１４とは、ｉｒｉ１、６および２２と、ｉｒｉ２とにそれぞれ一致した。これらの遺伝子はまた、その他の細菌種におけるＩＶＥＴを用いて選択されたｉｖｉ遺伝子との類似性を示した。Niven et al.(1999)によって近年示されたデータに基づくと、Ｓ．スイスのｉｒｉ遺伝子の選択は予期されない。これらの著者は、Ｓ．スイスが成長のために鉄を要求しないことを述べている。しかしながら、彼らの研究においては、これらの著者は、エチレンジアミンジオヒドロキシフェニル酢酸（ＥＤＤＡ）を用いることによって鉄から削減された培地を用いた。したがって、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで用いられた異なる条件は、異なる結果を得たことを説明している。
【００４１】
２つのＳ．スイスｉｖｓ遺伝子、ｉｖｓ１およびｉｖｓ８は、トランスポゾン配列との類似性を示した。さらに、１つのＳ．スイスｉｖｓ遺伝子、ｉｖｓ２、４および２８は、残りの選択された遺伝子の組成よりも相当高いＧＣ％を有した。ブタにおけるＳ．スイス感染症の病原におけるこれらのｉｖｓ遺伝子の関連性は、さらに研究する必要がある。しかしながら、特筆すべきは、Ｓ．タイフィムリウムにおいて、十分なビルレンスのために必要ないくつかのｉｖｉクローンが、可動要素と関連して発見されことである。これらの異常な塩基組成およびコドン使用頻度は、これらが水平移動によって他の細菌種から入手されたことを示唆するに至らせた（Conner et al., 1998）。
【００４２】
重要なことに、我々のスクリーンは、知られていない機能のタンパク質をコード化する配列との類似性を示す５つのｉｖｓ遺伝子を同定した。これらの遺伝子は標準的なハウスキーピング遺伝子または代謝遺伝子ではない。したがって、これらの遺伝子それぞれにおける突然変異体を有するＳ．スイスの菌株は今日構築されており、細菌のビルレンスへのこれらの突然変異体の効果を検査した。
【００４３】
４つのｉｖｓ／ｉｒｉ遺伝子の他、相当な数のその他のｉｒｉ遺伝子が、鉄制限条件下でライブラリを培養することによって、この研究において選択された。興味深いことに、１つの選択されたｉｒｉ遺伝子、ｉｒｉ３１は、Ｓ．スイスのｃｐｓ２Ａ遺伝子と同一である。この遺伝子は、Ｓ．スイス血清型２型（Smith et al., 1999）のカプセルの座の一部として予め単離されるとともに、カプセル多糖の生合成の調節に関係していた（Kolkman et al., 1997; Smith et al., 1999）。さらに、Ｓ．スイスのカプセルが、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの成長と比較するとｉｎ  ｖｉｖｏでの成長後により大きな寸法で発現するので（Quessy et al., 1994）、ｃｐｓ２Ａの調節された発現が予期され得る。他方のｉｒｉ遺伝子、ｉｒｉ７は、Ｓ．ミュータンスのｒｐｇＧ遺伝子との類似性を示した。この遺伝子はラムノース−グルコース多糖の生合成に必要とされることが示された（Yamashita et al., 1999）。ラムノースはＳ．スイス血清型２型（Elliott & Tai, 1978）における多糖カプセルの一部であるので、カプセル生合成におけるｉｒｉ７遺伝子の役割を示すことができる。ｉｒｉ３４は、Ｐ．アエルギノーサ(P.aeruginosa)中でＩＶＥＴ選択を用いて予備同定され、かつトレオニン・デヒドラターゼ活性をコード化すると推測されるｎｐ１６遺伝子との類似性を示した（Wang et al., 1996）。４つのｉｒｉ遺伝子がｉｎ  ｖｉｖｏでの方法によって選択され得るという観察とともに、これらのデータは、ｉｒｉ遺伝子がＳ．スイスに重要なビルレンス因子をコード化することを示す。
【００４４】
（さらなる実施例）
Ｓ．スイス血清型２型の病原に対するフィブロネクチン結合タンパク質の寄与。
【００４５】
ストレプトコッカス・スイスは、ブタに深刻な感染症を引起す。細菌感染症は、脳膜炎、敗血症、および関節炎を含み、動物はこの感染症をたいてい克服しない（６，２８）。時折、Ｓ．スイスはヒトに敗血症および脳膜炎を引起させる（３）。Ｓ．スイス感染症の病原は、おおよそ理解されていない。メスブタは、扁桃腺においてＳ．スイスの無症状保持者であり、これらの子ブタに対して細菌を送る。これらの子ブタは細菌に対抗することはできず、その後Ｓ．スイス感染症の特異的な症状を発症する。今日まで、Ｓ．スイスの３５のカプセル血清型が述べられてきたが（２６）、血清型２型株は病気の子ブタから最も多く単離された。Ｓ．スイス血清型２型株のカプセルなしの突然変異体に感染した子ブタはいずれの臨床的症状をも発症しないので、カプセルは、重要なビルレンス因子である（２２）。細菌タンパク質は、病原での役割も果たすことを示唆された（２，２６）。ムリミダーゼ放出タンパク質（ＭＲＰ）、細胞外因子（ＥＦ）およびsuilysinの発現は、Ｓ．スイス血清型２型の病原菌株に強く関連することが示された（１，２９，３０）。ＭＲＰおよびＦＥを欠いた同質遺伝子の突然変異体、ならびにsuilysinを欠いた同質遺伝子の突然変異体が若いブタに関してなお病原性を有したので、これらのタンパク質は、ビルレンスに全く必要とされない（２，２３）。近年、新たなビルレンス因子を、補足的な方法を用いて同定した（２１）。病原におけるこのビルレンス因子の機能はさらに研究されなければならない。
【００４６】
多くの重要なビルレンス因子は環境的に調節されるとともに、感染過程の特定の段階で誘導される（１５）。Ｓ．スイスにおけるこれらの遺伝子を同定するために、子ブタの実験Ｓ．スイス感染症の間「ＯＮ」であるプロモーターおよびこれらの下流配列をクローン形成した（２０）。２２個のｉｎ  ｖｉｖｏで選択された（ｉｖｓ）遺伝子が発見された。２つのｉｖｓ遺伝子は、既知のビルレンス因子に関してコード化するデータベース中の遺伝子との相同性が発見されたので、ビルレンスに直接関連した。これらのｉｖｓ遺伝子のうち一方（ｉｖｓ２１）は、ビルレントＳ．スイス血清型２型株のｅｐｆ遺伝子と一致した（３０）。他方（ｉｖｓ３１）は、ストレプトコッカス・ゴルドニー（ジェンバンク受託番号Ｘ６５１６４）およびストレプトコッカス・ピオゲネスＦＢＰ５４のフィブロネクチン／フィブリノーゲン結合タンパク質をコード化する遺伝子との相同性を示した（８）。様々な細菌種の相当な数のフィブロネクチン結合タンパク質が重要なビルレンス因子であることが示された（１２）。Ｓ．ピオゲネスにおいて、ＦＢＰ５４がヒト宿主において発現されること、およびヒト口腔上皮細胞に対する粘着性を優先的に仲介することが示された（７）。ＦＢＰ５４タンパク質は、マウスにおいてＳ．ピオゲネス対抗に対する防御的免疫を誘導することが近年示された（１３）。
【００４７】
本研究においては、Ｓ．スイスのフィブロネクチン／フィブリノーゲン結合タンパク質（ＦＢＰＳ）を述べる。ｆｂｐｓの配列は、決定された。結合研究は、精製されたＦＢＰＳがフィブロネクチンおよびフィブリノーゲンと結合したことを示した。Ｓ．スイス血清型２型の病原に対するＦＢＰＳの寄与を発見した。
【００４８】
（材料および方法）
細菌株および成長条件。本研究に用いられる細菌株およびプラスミドは、表５に記載される。Ｓ．スイス菌株を、トッド・ヒューイット培地（コードＣＭ１８９、オキソイド社製）において成長させ、６％（ｖ／ｖ）のウマ血液を含有するコロンビア血液基礎寒天プレート（コードＣＭ３３１、オキソイド社製、ロンドン、英国）において培養した。大腸菌株を、ルリア培地において成長させ（１７）、１．５％（ｗｔ／ｖ）の寒天を含有するルリア培地において培養した。必要に応じて、抗生物質を、５０：ｇ／ｍＬの大腸菌用スペクチノマイシン（シグマ社製、セントルイス、ミズーリ州）および１００：ｇ／ｍＬのＳ．スイス用スペクチノマイシン、１００：ｇ／ｍＬの大腸菌用アンピシリン（ベーリンガーマンハイム社製、独国）、ならびに２５：ｇ／ｍＬの大腸菌用カナマイシン（ベーリンガー社製）の濃度で加えた。
【００４９】
ＤＮＡ技術および配列分析。通常のＤＮＡ操作を、Sambrook et al.（１９）によって述べられたように実行した。ＤＮＡ配列を３７３Ａ ＤＮＡ配列システム（アプライドバイオシステムズ社、ウォリントン、英国）において決定した。サンプルをＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍダイターミネーターサイクルシークエンシングレディリアクションキット（アプライドバイオシステムズ社）を用いて精製した。シークエンシングデータを集めて、Ｌａｓｅｒｇｅｎｅプログラム（ＤＮＡＳＴＡＲ）を用いて解析した。ＢＬＡＳＴソフトウェアパッケージを、ジェンバンク／ＥＭＢＬデータベース中の演繹されたアミノ酸配列と相同なタンパク質配列を検索するために用いた。
【００５０】
サザンブロッティングおよびハイブリッド形成。染色体ＤＮＡをSambrook et al.（１９）によって述べられたように単離した。ＤＮＡフラグメントを、０．８％のアガロースゲルにおいて分離するとともに、Sambrook et al.（１９）によって述べられたようにジーンスクリーンプラス(GeneScreen Plus)ハイブリッド形成転移膜（ＮＥＮ（登録商標）ライフサイエンスプロダクツ社製、ボストン、米国）に転移した。ｆｂｐおよびｓｐｃ遺伝子のＤＮＡプローブを、ランダムプライマーＤＮＡ標識キット（ベーリンガー社製）を用いて［ａ−32Ｐ］ｄＣＴＰ（３，０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ、アメルシャムライフサイエンス社、バッキンガムシャー、英国）で標識付けした。点染上のＤＮＡを、６５℃で少なくとも３０分間、前もってハイブリッド形成した後、０．５Ｍのリン酸ナトリウム［ｐＨ７．２］、１ｍＭのＥＤＴＡおよび７％のドデシル硫酸ナトリウムを含有する緩衝液中で適当なＤＮＡプローブによって６５℃で１６時間ハイブリッド形成した。ハイブリッド形成後、これらの膜を、６５℃で３０分間４０ｍＭのリン酸ナトリウム［ｐＨ７．２］、１ｍＭのＥＤＴＡおよび５％のドデシル硫酸ナトリウムを含有する緩衝液で２回洗浄するとともに、６５℃で３０分間４０ｍＭのリン酸ナトリウム［ｐＨ７．２］、１ｍＭのＥＤＴＡおよび１％のドデシル硫酸ナトリウムを含有する緩衝液で２回洗浄した。信号を、ホスフォイメージャー(phosphor-imager)（Ｓｔｏｒｍ、モレキュラーダイナミックス社製、サニーベール、カリフォルニア州）において検出した。
【００５１】
ｆｂｐｓノックアウト突然変異体の構築。突然変異株１０）ＦＢＰＳを構築するために、Ｓ．スイス血清型２型の病原菌株１０（２７，２９）を、プラスミドｐＦＢＰＳ７−４７で電気形質転換した（２４）。このプラスミドにおいて、ｆｂｐ遺伝子をスペクチノマイシン耐性遺伝子の挿入によって不活性にした。ｐＥＢＰＳ７−４７を産生するために（図１）、ｐＦＢＰＳ７−４６の３８２ｂｐＳａｌＩ−ＳａｌＩフラグメントを、ベクターのＳａｌＩ部位を平滑にした後、スペクチノマイシン耐性遺伝子を含有するｐＩＣ−Ｓｐｃの１．２ｋｂＥｃｏＲＶ−ＳｍａＩフラグメントによって置換した。ｐＦＢＰＳ７−４７による菌株１０の電気形質転換の後、スペクチノマイシン耐性コロニーを１００：ｇ／ｍＬのスペクチノマイシンを含有するコロンビア寒天プレートにおいて選択した。サザンブロッティングおよびハイブリッド形成実験を、２回交差統合(double crossover integration events)に関する選択のために用いた（データは示していない）。
【００５２】
ＦＢＰＳ発現構築。ＦＢＰＳ発現プラスミドを構築するために、ＱＩＡエクスプレスキット（キアゲン(Qiagen)社製、ヒルデン、独国）を用いた。プライマーは、ｆｂｐｓ遺伝子の２５０位〜２７２位、および１９１１位〜１８９２位に対応した。これらのプライマーの配列は、５’（ＧＣＧＧＡＴＣＣＧＡＴＧＡＣＧＡＴＧＡＣＡＡＡＴＣＴＴＴＴＧＡＣＧＧＡＴＴＴＴＴＴＴＴＡＣ）３’、および５’（ＣＣＣＡＡＧＣＴＴＧＧＧＣＡＴＧＡＡＣＴＡＧＡＴＴＴＴＣＡＴＧＧ）３’である。これらのプライマーは、ｐＦＢＰＳ７−４７からｆｂｐｓ遺伝子を増幅するためにＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩのための制限部位をそれぞれ含有した。増幅されたＰＣＲ産生物をＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩによって消化し、１．８ｋｂのｆｂｐｓ遺伝子を、ＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩによって消化されたｐＱＥ−３０にクローン形成し、ｐＱＥ−３０−ＦＢＰＳを産生した。ｐＱＥ−３０−ＦＢＰＳを、Ｍ１５［ｐＲＥＰ４］に形質転換した。
【００５３】
ＦＢＰＳの精製。Ｍ１５［ｐＲＥＰ４］［ｐＱＥ−３０−ＦＢＰＳ］を、ＱＩＡエクスプレッショニスト（登録商標）（キアゲン社製)を用いてＦＢＰＳを発現かつ精製するために用いた。要するに、Ｍ１５［ｐＲＥＰ４］［ｐＱＥ−３０−ＦＢＰＳ］細胞を飛躍的に成長させ、１ｍＭのＩＰＴＧを加え、これらの細胞を３７℃でもう４時間成長可能にした。その後、細胞を収集し、かつ溶解した。透明な上清をＮｉ2+−ＮＴＡアガロースカラムに取込んだ。６×ＨＩＳタグを含有するＦＢＰＳをＮｉ2+−カラムに結合させた。カラムを洗浄し、タンパク質を溶出した。異なる緩衝液を、未変性の精製に、および変性の精製に用いた。変性条件下で精製されたＦＢＰＳを、プロテアーゼインヒビター（２５：ｇ／ｍＬのペファブロック(pefabloc)、０．７：ｇ／ｍＬのペプスタチン、１：ｇ／ｍＬのアプロチニン、および０．５：ｇ／ｍＬのロイペプチン）を含有する、５００ｍＭのＮａＣｌ、２０％のグリセロールおよび２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ［ｐＨ７．４］中の直線的な６Ｍ〜１Ｍの尿素濃度勾配を用いることによって、Ｎｉ2+−ＮＴＡカラムにおいて復元した。すべての手順は、製造者の提案に従って行われた。６×ＨＩＳタグを、ＲＴで１６時間、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ［ｐＨ７．４］、５０ｍＭのＮａＣｌ、２ｍＭのＣａＣｌ2および０．５Ｕの軽鎖エンテロキナーゼ（ニューイングランドバイオラブス(New England Biolabs)社製、べバリー、マサチューセッツ州）中で、精製したＦＢＰＳをインキュベーションすることによって、タンパク質から除去した。
【００５４】
ＦＢＰＳによるウサギの免疫。精製され、かつ復元されたＦＢＰＳを、２匹のウサギに免疫性を与えるために用いた。尿素を除去するために、タンパク質を４℃で一晩中、リン酸緩衝溶液（１３６ｍＭのＮａＣｌ、２．６８ｍＭのＫＣｌ、８．１ｍＭのＮａ2ＨＰＯ4、および２．７９ｍＭのＫＨ2ＰＯ4［ｐＨ７．２］）に対して透析した。免疫７日前、ＦＢＰＳに対する自然力価を決定するために、血液をウサギから採集した。１日目に、陰性の抗ＦＢＰＳ力価を有するこれらのウサギに、油中水エマルション（Ｓｐｅｃｏｌ、ＩＤ−レリスタッド(ID-lelystad)）中の１００：ｇ／ｍＬのＦＢＰＳ０．５ｍＬを２回、筋肉注射で免疫した。２８日目に、ウサギに同量のタンパク質および同経路の免疫法を用いて２回免疫した。２回目の免疫から４週間後、ウサギを犠牲にし、血液を採集した。血液を凝固させ、血清を採集し、ＦＢＰＳの免疫検出に用いた。
【００５５】
ＦＢＰＳの免疫検出。タンパク質を、標準的な手順（１９）により、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）によって分離した。ゲル中のタンパク質を、製造者の提案に従ってＳＹＰＲＯオレンジ（モレキュラープローブ(Molecular Probes)社製、サニーベール、カリフォルニア州）染色を用いて視覚化した。信号をホスフォイメージャー（Ｓｔｏｒｍ、モレキュラーダイナミックス社製）において検出した。ゲル中に存在するタンパク質の量を算定するために、既知のウシ血清アルブミン濃度範囲を標準として用いた。分子力学プログラムをその算定に用いた。
【００５６】
タンパク質を標準的な手順（１９）によってニトロセルロース膜に転移した。これらの膜を、ブロット(Blotto)、すなわち４％のスキムミルクおよび０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を含有するトリス緩衝溶液（ＴＢＳ）（５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ［ｐＨ７．５］、１５０ｍＭのＮａＣｌ）中で１時間室温（ＲＴ）でブロックした。組換え精製ＦＢＰＳを検出するために、膜を、１時間ＲＴで、ブロット−ＴＢＳ（１：１）の１：１０，０００の希釈液中で、６×ＨＩＳタグ（クロンテック(Clontech)社製、パロアルト、カリフォルニア州）に対するモノクローナル抗体とインキュベーションし、次いで１時間ＲＴでブロット−ＴＢＳ（１：１）の１：１，０００の希釈液中でアルカリホスタファーゼ複合抗マウス抗体とインキュベーションした。精製ＦＢＰＳの反応性を、Ｓ．スイス感染症を克服したブタの回復期血清を用いてテストした。ニトロセルロース膜を、１時間ＲＴでブロット−ＴＢＳ（１：１）の１：２００の希釈液中でポリクローナルブタ血清とインキュベーションし、次いで１時間ＲＴでブロット−ＴＢＳ（１：１）の１：２，０００中でアルカリホスタファーゼ複合抗ブタ抗体とインキュベーションした。基質として、ニトロブルーテトラゾリウム（メルク(Merck)社製、ダルムシュタット、独国）−リン酸ブロモクロロインドリル（シグマ社製）を用いた。すべての洗浄ステップをブロット−ＴＢＳ（１：１）中で行った。
【００５７】
フィブロネクチン結合およびフィブリノーゲン結合。結合研究を間接ウエスタンブロッティングによって行った。タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離するとともに、前述のようにニトロセルロース膜に転移した。膜をＭＰＢＳ、すなわち４％のスキムミルクおよび０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳ中でブロックした。その後、膜を、１時間ＲＴで５％のウシ胎仔血清、２％のＮａＣｌおよび０．０５％のＴｗｅｅｎ８０を含有するＰＢＳ中で５：ｇ／ｍＬのヒトフィブロネクチン（ｆｎ）（シグマ社製）またはヒトフィブリノーゲン（ｆｇｎ）（シグマ社製）とインキュベーションした。結合されたフィブロネクチンおよびフィブリノーゲンを検出するために、膜を、１時間ＲＴで５％のウシ胎仔血清、２％のＮａＣｌおよび０．０５％のＴｗｅｅｎ８０を含有するＰＢＳの１：１，０００希釈液中でホースラディッシュペルオキシダーゼ複合抗フィブロネクチン（ＤＡＫＯ）または抗フィブリノーゲン（ＤＡＫＯ）抗体とインキュベーションした。この信号を製造者の提案に従って、ＥＣＬ+（アメルシャムファーマシアバイオテック(Amersham Pharmacia Biotech)社製、Ｎ．Ｊ．）を用いて視覚化した。信号をホスフォイメージャー（Ｓｔｏｒｍ、モレキュラーダイナミックス社製）において検出した。すべての洗浄ステップをＭＰＢＳ−ＰＢＳ（１：１）中で行った。
【００５８】
実験感染。無菌の子ブタ、グレートヨークシャーおよびダッチランドレースの雑種を帝王切開によってメスブタから得た。この手術は、消毒したフレキシブルフィルムアイソレーターにおいて行った。子ブタを４匹の群に割り当て、消毒したステンレス鋼インキュベーター中で収容した。収容条件および給餌管理は前述のとおりであった（２７，２９）。６日齢の子ブタに、Ｓ．スイスによる感染症がこれらの子ブタにかかり易くするために、約１０７ｃｆｕの気管支敗血症菌(Bordetella bronchiseptica)９２９３２を鼻内で接種した。２日後、１０６ｃｆｕのＳ．スイス菌株１０と１０６ｃｆｕのＳ．スイス菌株１０）ＦＢＰＳとを鼻内に接種した。野生型菌株および突然変異体菌株の間のビルレンスの相違を決定するために、ＬＤ５０値を決定しなければならない。このために、多数の子ブタが必要とされる。倫理的理由のために、これは許されない。この問題を回避するために、共通コロニー形成研究を行うことにした。Ｓ．スイスおよび気管支敗血症菌の存在を監視するために、および汚染物質の不存在を検査するために、鼻咽頭および糞から採取されたスワブを１週間に３回培養した。これらのスワブを、６％のウマ血液を含有するコロンビア寒天に直接培養し、またはトッドヒューイット培地において４８時間成長させた後、６％のウマ血液を含有するコロンビア寒天に培養した。ブタを、発熱、神経性症状および跛行などの臨床的症状について１日２回監視した。各ブタからの血液サンプルを１週間に３回採集した。白血球を細胞カウンタで計数した。子ブタは、関節炎または脳膜炎などのＳ．スイス感染症の特異的な症状が観察されたとき、またはブタが致命的な病気になったときに殺された。その他のブタは、Ｓ．スイスによる接種から２週間後に殺され、臨床的症状に基づいて殺されたブタと同じ方法で検査された。すべてのブタを病理変化について検査した。心臓、肺、肝臓、腎臓、脾臓および扁桃腺、ならびにＳ．スイス感染症に特異的に関係する器官（中枢神経系（ＣＮＳ）、漿膜および関節）からの組織標本を外科用メスでスライスした。各器官または部位からの組織スライスを、１５％のグリセロールを含有する、前記組織スライスの寸法に応じて２〜２５ｍＬのトッドヒューイット中で再浮遊させた。この浮遊物を５分間３，０００ｒｐｍで分離した。上清を採集し、連続希釈液を、６％のウマ血液を含有するコロンビア寒天において培養するとともに、野生型および突然変異体細菌の存在数を定量化するために６％のウマ血液および１００：ｇ／ｍＬのスペクチノマイシンを含有するコロンビア寒天プレートにおいて培養した。突然変異菌株１０）ＦＢＰＳ細胞の数を、選択的プレートにおいて適当な連続希釈液におけるＣＦＵ数を計数することによって決定した。野生型菌株１０細胞の数を、コロンビア寒天血液プレートにおいて適当な連続希釈液のＣＦＵ数であって、前記選択的プレートにおいて計数されたＣＦＵ数を控除した数を計数することによって決定した。野生型および突然変異細菌が組織中に発見される場合、野生型菌株と突然変異菌株との割合は、両コロンビア寒天プレートに、および１００：ｇ／ｍＬのスペクチノマイシンを含有するコロンビア寒天プレートに約１００の個別のコロニーをトゥースピックすることによって再度決定した。すべての動物実験は、動物実験におけるオランダ法に従って動物科学健康研究所の倫理委員会によって承認された。
【００５９】
ヌクレオチド配列受託番号。ｆｂｐｓのヌクレオチド配列データはジェンバンクに提出されており、配列は受託番号ＡＦ４３８１５８に記載される。
【００６０】
（結果）
Ｓ．スイスのｆｂｐｓ遺伝子のクローン形成。ｉｎ  ｖｉｖｏ選択された遺伝子（ｉｖｓ３１）（２０）のうち１つは、ＦｌｐＡおよびＦＢＰ５４、それぞれストレプトコッカス・ゴルドニー（ジェンバンク受託番号Ｘ６５１６４）およびストレプトコッカス・ピオゲネス（８）のフィブロネクチン結合タンパク質（ＦｎＢＰ）についてコード化する遺伝子の５’部分との同一性を示した。Ｓ．スイスの全ｆｂｐｓ遺伝子をクローン形成するために、その後、側面にｆｂｐｓ配列を含有するＳ．スイス血清型２型の染色体ＤＮＡフラグメントを同定するために、ｉｖｓ３１をプローブとして用いた。５ｋｂのＥｃｏＲＩフラグメントを同定し、ｐＧＥＭ７Ｚｆ（＋）中でクローン形成し、ｐＦＢＰＳ７−４６を産生した（図１）。配列分析は、このフラグメントがＳ．スイス血清型２型の全ｆｂｐｓ遺伝子を含有することを明らかにした。５５３個のアミノ酸のポリペプチドに関してコード化する１６５９ｂｐのオーブンリーディングフレームを発見した。推定ＡＴＧ開始コドンはグラム陽性細菌のリボソーム結合部位と類似する配列に先行される。さらに上流では、２つの推定プロモーター配列を同定することができた。ｆｂｐｓのこれらのプロモーター配列の上流では、直列反復が、ｆｂｐｓの５’に位置する遺伝子の転写終結区としての機能を果たすことを発見した。ｆｂｐｓの下流では、遺伝子がアルファアセト乳酸デカルボキシラーゼとの相同性を示したことを発見した。この遺伝子はｆｂｐｓの反対方向に転写される。演繹されたアミノ酸配列を、その他の細菌から予備同定したいくつかのＦｎＢＰのアミノ酸配列と並べた。予期されるとおり、ＦＢＰＳは、Ｓ．ゴルドニー（７６％）のＦｌｐＡとの極めて相同しており、また、肺炎球菌（７３％）、Ｓ．ピオゲネス（６９％）、ラクトコッカス・ラクチス(Lactococcus lactis)（５９％）および枯草菌(Bacillus subtilis)（４１％）のようなその他の有機体のＦｎＢＰとの相同性を示した。ＦＢＰ５４の配列と比較すると、ＦＢＰＳは、７６個の追加アミノ酸を有するより長いＮ末端を有する。このより長いＮ末端はまた、Ｓ．ゴルドニー、肺炎球菌および枯草菌のようなその他の有機体中で見られた。ＦＢＰ５４において、一次フィブロネクチン／フィブリノーゲン結合ドメインをＮ末端部分、最初の８９個のアミノ酸に局在化させた（８）。この領域に渡って、ＦＢＰＳのＦＢＰ５４との相同性は非常に高く（８０％）、これは、ＦＢＰＳがフィブロネクチンおよびフィブリノーゲンの両方と結合可能であることを示唆している。
【００６１】
フィブロネクチンおよびフィブリノーゲンに対するＦＢＰＳの結合。フィブロネクチン（ｆｎ）およびフィブリノーゲン（ｆｇｎ）に対するＳ．スイスのＦＢＰＳの結合を確認するために、ＦＢＰＳを自然条件下で精製した。この精製のために、Ｎ末端と融合した６×ＨＩＳタグによってＦＢＰＳを発現するタンパク質発現構築物を用いた。４００：ｇのＦＢＰＳを、ＩＰＴＧによる誘導後に５０ｍＬの指数的成長相大腸菌細胞から精製した。このＦＰＢＳの純度を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロッティグによって決定した（図２）。誘導された大腸菌溶解物は広範囲のタンパク質を含有し、このうち６４ｋＤａタンパク質ＦＢＰＳは非常に明瞭に存在した（パネルＡ，レーン１）。精製後、６×ＨＩＳタグによって高度に精製されたＦＢＰＳが得られた（パネルＡ，レーン２）。サンプルを６×ＨＩＳタグに対するモノクローナル抗体とインキュベーションすると、ＦＢＰＳは検出された唯一のタンパク質であった（パネルＢ）。
【００６２】
ＦＢＰＳがｆｎおよびｆｇｎと結合するか否かを決定するために、精製ＦＢＰＳを含有するウエスタンブロットを、可溶性ヒトｆｎおよびヒトｆｇｎとインキュベーションした（図３，パネルＡおよびＢ）。ｆｎおよびｆｇｎのＦＢＰＳに対する特異的結合は、明らかに検出された。ｆｎおよびｆｇｎのＢＳＡ（陰性対照タンパク質）に対する結合は、観察されなかった。ＦＢＰＳの免疫グロブリン結合に起因して起こり得るバックグラウンド信号を排除するために、同じ実験を、フィブロネクチンまたはフィブリノーゲンの追加なしに行った。結合は発見されず（図３，パネルＣおよびＤ）、これは結合がフィブロネクチンおよびフィブリノーゲンに特異的であることを示した。ｆｎおよびｆｇｎのＦＢＰＳに対する結合が６×ＨＩＳタグによって仲介されるか否かを制御するために、前記タグをエンテロキナーゼ処理によって除去した。図３のパネルＥおよびＦは、６×ＨＩＳタグなしのＦＢＰＳが、ｆｎおよびｆｇｎに対してなお有効に結合したことを明らかに示す。したがって、ＦＢＰＳがｆｎおよびｆｇｎに対して特異的に結合可能であることを結論付けた。
【００６３】
ＦＢＰＳの免疫原性。ＦＢＰ５４が致死量のＳ．ピオゲネス（１３）に対するマウスの防御免疫応答を誘導したことを示したので、次いで精製ＦＢＰＳがＳ．スイス感染症を克服したブタの回復期血清によって認識されたか否かを決定した。図２パネルＣに示されるように、ＦＢＰＳはこの抗血清と明らかに反応した。同じ実験をＳＰＦブタの非免疫血清によって行ったとき、その寸法のＦＢＰＳの集団は、検出されなかった（データは示していない）。これらの発見は、ＦＢＰＳがｉｎ  ｖｉｖｏで発現されること、およびこのタンパク質が若いブタにおいて免疫原性を確かに有することを示す。
【００６４】
３５のＳ．スイス血清型中のｆｂｐｓ遺伝子の分布。交差防御的ワクチンの候補に関心があったので、次いで様々なＳ．スイス血清型中のｆｂｐｓ遺伝子の存在を分析した。ｆｂｐｓ遺伝子のプロモーターおよび５’部分を含有するクローンをラジオラベルし、３５の異なるＳ．スイス血清型の参照菌株の染色体ＤＮＡをこのプローブとハイブリッド形成した。Ｓ．スイス血清型２型の３つの異なる表現型である、病原性、非病原性および弱病原性菌株を、この研究にも含めた。ｆｂｐｓ遺伝子は、血清型３２型および３４型を除いたすべてのＳ．スイス血清型および表現型に存在した（図４）。
【００６５】
病原におけるＦＢＰＳの役割。Ｓ．スイスの病原におけるＦＢＰＳの役割をテストするために、ＦＢＰＳの同質遺伝子ノックアウト突然変異体を、菌株１０、菌株１０）ＦＢＰＳにおいて構築した。ｆｂｐｓの上流では、転写終結区としての役割を果たし得る直列反復が発見され、ｆｂｐｓの下流では、αアセトラクタートデカルボキシラーゼとの相同性を示す反対方向に転写される遺伝子が発見されたので、ｆｂｐｓの上流および下流における遺伝子の極性効果は予期されない。突然変異株１０）ＦＢＰＳがＦＢＰＳを産生しなかったことを証明するために、菌株１０および菌株１０）ＦＢＰＳのプロトプラストに、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロッティングを受けさせた。ＦＢＰＳは、精製ＦＢＰＳに対するポリクローナル抗血清を用いて検出された。菌株１０）ＦＢＰＳはＦＢＰＳを発現しない一方、菌株１０は発現することを示した（データは示されていない）。その後、この突然変異体菌株のビルレンスを子ブタにおける実験感染においてテストした。突然変異株１０）ＦＢＰＳを、この突然変異体菌株の関連する弱毒化を決定するために野生型菌株との競合対抗実験に用いた。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ条件を用いて、トッドヒューイット培地における野生型菌株および突然変異体菌株の成長率は本質的に同一であることが発見された（データは示されていない）。野生型菌株および突然変異体菌株を０．６５の実際の率（１ｍＬ-1あたり１．６３ｅ６ｃｆｕの野生型細菌および１ｍＬ-1あたり３．０９ｅ６ｃｆｕの突然変異体細菌）でインキュベーションした。実験中、特異的なＳ．スイスの症状（脳膜炎、関節症および致命的な病気）を発症した子ブタは殺された。これらの症状の発症しなかった子ブタは、実験の終期に殺された。すべての子ブタから、様々な器官中の野生型菌株および突然変異体菌株の割合を決定した。図５パネルＡにおいて示されるように、類似数の野生型および突然変異体細菌が扁桃腺から再単離された。その割合は、入力の割合（０．３３〜０．８５の多様な割合、平均０．６１）と類似した。これは、扁桃腺における野生型菌株および突然変異体菌株のコロニー形成の効率が本質的に同一であったことを明らかに示す。ＦＢＰＳは、子ブタの扁桃腺のコロニー形成に厳密に必要とされないようである。４匹の子ブタのうち３匹がＳ．スイス感染症に特異的な臨床的症状を発症した。２匹の子ブタ（４６６４および４６６６）は関節炎の臨床的症状を示し、１匹の子ブタ（４６６８）は明らかな中枢神経徴候を示した。４匹目の子ブタはどの臨床的症状も発症しなかった。これらの観察は、解剖部位におけるＳ．スイス感染症の特異的な器官の病理形態学上の異常と一致した。図５パネルＢにおいて示されるように、排他的に野生型細菌を子ブタ４６６４の関節および子ブタ４６６８のＣＮＳから再単離した。これらの特異的な器官から再単離された野生型細菌のＣＦＵ数が非常に高い一方で、突然変異体細菌は全く発見されなかった。ブタ４６６６の関節から、少数の野生型細菌および突然変異体細菌の両方を、入力の率と本質的に同一の０．８４の率（１．０ｅ２ＣＦＵの野生型細菌および５．２ｅ２ＣＦＵの突然変異細菌）で再単離した（図５パネルＢ）。サザンブロッティング実験は���プローブとしてｆｂｐｓおよびｓｐｃ遺伝子を用いて、ブタ４６６６の関節から単離された突然変異体細菌が入力の突然変異体細菌と正確に同一であることを確認した。総合すれば、これらのデータは、ＦＢＰＳ突然変異体が、特異的なＳ．スイスの器官（少なくとも関節）に達してコロニー形成することができる一方で、この突然変異体は、野生型よりも極めて悪い効率で器官から回復することを示す。
【００６６】
【表１】
2004528826.tif 000002
【００６７】
【表２】
2004528826.tif 000003
【００６８】
【表３】
2004528826.tif 000004
【００６９】
【表４】
2004528826.tif 000005
【００７０】
【表５】
2004528826.tif 000006
【００７１】
【表６】
2004528826.tif 000007
【００７２】
2004528826.tif 000008
2004528826.tif 000009
2004528826.tif 000010
2004528826.tif 000011
2004528826.tif 000012
2004528826.tif 000013
2004528826.tif 000014
2004528826.tif 000015
2004528826.tif 000016
2004528826.tif 000017
2004528826.tif 000018
【図面の簡単な説明】
【００７３】
【図１】Ｓ．スイス血清型２型のｆｂｐｓ遺伝子をクローン化するために用いられる手順と、Ｓ．スイス血清型２型の挿入ノックアウト突然変異体の構築との概略図である。Ａ５ｋｂのＥｃｏＲＩフラグメントを、ｐＧＥＭ７Ｚｆ（＋）中でクローン化して、ｐＦＢＰＳ７−４６を産生し、ｆｂｐｓの挿入ノックアウトを得るようにベクターを平滑化した後、ｐＦＢＰＳ７−４６の３８２ｂｐＳａｌＩ−ＳａｌＩフラグメントを、１．２ｋｂのスペクチノマイシン耐性遺伝子によって置換した。ｉｖｓ−３１：ｉｎ  ｖｉｖｏで選択された遺伝子３１。
【図２】自然条件下で精製されたＦＢＰＳの純度および免疫原性。４：Ｌの大腸菌Ｍ１５［ｐＱＥ−３０−ｐＲＥＰ４−ＦＦＢＰＳ］溶解物（レーン１）および１６５ｎｇの精製されたＦＢＰＳ（レーン２）の、ＳＹＰＲＯオレンジ非特異的タンパク質染色によるＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析（パネルＡ）、ならびに６ｘＨＩＳタグに対するモノクローナル抗体によるウエスタンブロット分析（パネルＢ）。４：Ｌの大腸菌Ｍ１５［ｐＱＥ−３０−ｐＲＥＰ４−ＦＢＰＳ］溶解物および０．５：ｇの精製されたＦＢＰＳに存在するＦＰＢＳの免疫原性を検査するために、Ｓ．スイス菌株１０に対する回復期血清を用いた（パネルＣ，レーン１および２）。矢印：６４ｋＤａのＦＰＢＳ、Ｍｗ：分子量標識。
【図３】精製されたＦＢＰＳとの結合研究。パネルＡおよびＢを、ｆｎ（Ａ）またはｆｇｎ（Ｂ）の５：ｇ／ｍＬで精査した。レーン１は５００ｎｇの精製されたＦＢＰＳを含有し、レーン２は５００ｎｇのＢＳＡを含有する。パネルＣならびにＤのレーン３および４は、５００ｎｇの精製されたＦＢＰＳを含有する。レーン３を２０：ｇ／ｍＬのｆｎ（Ｃ）またはｆｇｎ（Ｄ）で精査し、レーン４をｆｎまたはｆｇｎのない複合体とインキュベーションするのみであった。パネルＥおよびＦを、２０：ｇ／ｍＬのｆｎ（Ｅ）またはｆｇｎ（Ｆ）で精査した。レーン５は、エンタロキナーゼで消化された１．８：ｇの精製されたＦＢＰＳを含有し、レーン６は、５００ｎｇの精製されたＦＢＰＳを含有する。黒矢印は、６４ｋＤａのＦＢＰＳを示し、白抜き矢印は、６×ＨＩＳなしの約５５ｋＤａのＦＢＰＳを示す。
【図４】様々なＳ．スイス血清型中のｆｂｐｓの分布。１ｇの染色体ＤＮＡをニトロセルロース膜上にスポットし、32Ｐ標識ｆｂｐｓプローブでハイブリッド形成した。血清型を示すようにスポットした。Ｓ１０：Ｓ．スイス血清型２型、ＭＲＰ+ＥＦ+、Ｔ１５：Ｓ．スイス血清型２型、ＭＲＰ-ＥＦ-、Ｓ１７：Ｓ．スイス血清型２型、ＭＲＰ+ＥＦ+。
【図５】感染したブタの様々な器官における野生型および突然変異体細菌のコロニー形成の効率。パネルＡは、扁桃腺の野生型菌株１０および突然変異体菌株１０）ＦＢＰＳのコロニー形成を表す。υ：扁桃腺ブタｎｏ．４６６４、ν：扁桃腺ブタｎｏ．４６６５、σ：扁桃腺ブタｎｏ．４６６６、λ：扁桃腺ブタｎｏ．４６６８。パネルＢは、特異的な器官のコロニー形成を表す。白抜きおよび黒υ：関節からの膿ブタｎｏ．４６６４、σ：関節からの膿ブタｎｏ．４６６６、λ：ＣＮＳブタｎｏ．４６６８。各点は、１匹のブタからの１つの特異的な器官から単離された野生型または突然変異体細菌の数を表す。
【図６Ａ】ここに同定されるｉｒｉ１，６，２２のヌクレオチド配列。
【図６Ｂ】ここに同定されるｉｒｉ１０，２０のヌクレオチド配列。
【図６Ｃ】ここに同定されるｉｒｉ１１のヌクレオチド配列。
【図６Ｄ】ここに同定されるｉｒｉ１３，１５，２７のヌクレオチド配列。
【図６Ｅ】ここに同定されるｉｒｉ１４のヌクレオチド配列。
【図６Ｆ】ここに同定されるｉｒｉ１６のヌクレオチド配列。
【図６Ｇ】ここに同定されるｉｒｉ１８のヌクレオチド配列。
【図６Ｈ】ここに同定されるｉｒｉ２のヌクレオチド配列。
【図６Ｉ】ここに同定されるｉｒｉ２３のヌクレオチド配列。
【図６Ｊ】ここに同定されるｉｒｉ２４のヌクレオチド配列。
【図６Ｋ】ここに同定されるｉｒｉ２９のヌクレオチド配列。
【図６Ｌ】ここに同定されるｉｒｉ３のヌクレオチド配列。
【図６Ｍ】ここに同定されるｉｒｉ３２のヌクレオチド配列。
【図６Ｎ】ここに同定されるｉｒｉ３４のヌクレオチド配列。
【図６Ｏ】ここに同定されるｉｒｉ４のヌクレオチド配列。
【図６Ｐ】ここに同定されるｉｒｉ７のヌクレオチド配列。
【図６Ｑ】ここに同定されるｉｒｉ８，２６のヌクレオチド配列。
【図６Ｒ】ここに同定されるｉｖｓ１のヌクレオチド配列。
【図６Ｓ】ここに同定されるｉｖｓ１１のヌクレオチド配列。
【図６Ｔ】ここに同定されるｉｖｓ１５のヌクレオチド配列。
【図６Ｕ】ここに同定されるｉｖｓ１６のヌクレオチド配列。
【図６Ｖ】ここに同定されるｉｖｓ１８のヌクレオチド配列。
【図６Ｗ】ここに同定されるｉｖｓ１９のヌクレオチド配列。
【図６Ｘ】ここに同定されるｉｖｓ２，４，２８のヌクレオチド配列。
【図６Ｙ】ここに同定されるｉｖｓ２０のヌクレオチド配列。
【図６Ｚ】ここに同定されるｉｖｓ２３，２４のヌクレオチド配列。
【図６Ａ１】ここに同定されるｉｖｓ２５のヌクレオチド配列。
【図６Ｂ１】ここに同定されるｉｖｓ２９のヌクレオチド配列。
【図６Ｃ１】ここに同定されるｉｖｓ３のヌクレオチド配列。
【図６Ｄ１】ここに同定されるｉｖｓ３１のヌクレオチド配列。
【図６Ｅ１】ここに同定されるｉｖｓ３２，３５のヌクレオチド配列。
【図６Ｆ１】ここに同定されるｉｖｓ３３のヌクレオチド配列。
【図６Ｇ１】ここに同定されるｉｖｓ３４のヌクレオチド配列。
【図６Ｈ１】ここに同定されるｉｖｓ３６のヌクレオチド配列。
【図６Ｉ１】ここに同定されるｉｖｓ５，１０，１２，２２のヌクレオチド配列。
【図６Ｊ１】ここに同定されるｉｖｓ６，７，１３，１４のヌクレオチド配列。
【図６Ｋ１】ここに同定されるｉｖｓ８のヌクレオチド配列。
【図６Ｌ１】ここに同定されるｉｖｓ９，１７のヌクレオチド配列。
【図１】
2004528826.tif 000019
【図５】
2004528826.tif 000020
【国際公開パンフレット】
2004528826.tif 000021
2004528826.tif 000022
2004528826.tif 000023
2004528826.tif 000024
2004528826.tif 000025
2004528826.tif 000026
2004528826.tif 000027
2004528826.tif 000028
2004528826.tif 000029
2004528826.tif 000030
2004528826.tif 000031
2004528826.tif 000032
2004528826.tif 000033
2004528826.tif 000034
2004528826.tif 000035
2004528826.tif 000036
2004528826.tif 000037
2004528826.tif 000038
2004528826.tif 000039
2004528826.tif 000040
2004528826.tif 000041
2004528826.tif 000042
2004528826.tif 000043
2004528826.tif 000044
2004528826.tif 000045
2004528826.tif 000046
2004528826.tif 000047
2004528826.tif 000048
2004528826.tif 000049
2004528826.tif 000050
2004528826.tif 000051
2004528826.tif 000052
2004528826.tif 000053
2004528826.tif 000054
2004528826.tif 000055
2004528826.tif 000056
2004528826.tif 000057
2004528826.tif 000058
2004528826.tif 000059
2004528826.tif 000060
2004528826.tif 000061
2004528826.tif 000062
2004528826.tif 000063
2004528826.tif 000064
2004528826.tif 000065
2004528826.tif 000066
2004528826.tif 000067
2004528826.tif 000068
2004528826.tif 000069
2004528826.tif 000070
2004528826.tif 000071
2004528826.tif 000072
2004528826.tif 000073
2004528826.tif 000074
2004528826.tif 000075
2004528826.tif 000076
2004528826.tif 000077
2004528826.tif 000078
2004528826.tif 000079
2004528826.tif 000080
2004528826.tif 000081
2004528826.tif 000082
2004528826.tif 000083
2004528826.tif 000084
2004528826.tif 000085
2004528826.tif 000086
2004528826.tif 000087
2004528826.tif 000088
2004528826.tif 000089
2004528826.tif 000090
2004528826.tif 000091
2004528826.tif 000092
2004528826.tif 000093
2004528826.tif 000094
2004528826.tif 000095
2004528826.tif 000096
2004528826.tif 000097
2004528826.tif 000098
2004528826.tif 000099
2004528826.tif 000100
2004528826.tif 000101
2004528826.tif 000102
2004528826.tif 000103
2004528826.tif 000104
2004528826.tif 000105
2004528826.tif 000106
2004528826.tif 000107
2004528826.tif 000108
2004528826.tif 000109
2004528826.tif 000110
2004528826.tif 000111
2004528826.tif 000112
2004528826.tif 000113
2004528826.tif 000114
2004528826.tif 000115
2004528826.tif 000116
2004528826.tif 000117
2004528826.tif 000118
2004528826.tif 000119
2004528826.tif 000120
2004528826.tif 000121
2004528826.tif 000122
2004528826.tif 000123
2004528826.tif 000124
2004528826.tif 000125
2004528826.tif 000126
2004528826.tif 000127
2004528826.tif 000128
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004528826.tif 000129
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004528826.tif 000130
【国際調査報告】
2004528826.tif 000131
2004528826.tif 000132
2004528826.tif 000133
2004528826.tif 000134
2004528826.tif 000135
2004528826.tif 000136