(57)【要約】本発明は、予防、診断及び／又は治療のために用いることができるヘモフィルス・インフルエンゼのポリぺプチドに関する。
2004509647.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記より選ばれたポリヌクレオチドを含む単離されたポリヌクレオチド。
（ａ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２及び２４より選ばれた配列又はその断片又は類似体を含む第２ポリぺプチドに対して少なくとも７０％が同一であるポリぺプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２及び２４より選ばれた配列又はその断片又は類似体を含む第２ポリぺプチドに対して少なくとも９５％が同一であるポリぺプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２及び２４より選ばれた配列又はその断片又は類似体を含むポリぺプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２及び２４より選ばれた配列又はその断片又は類似体をもつポリぺプチドに結合特異性を有する抗体を産生することができるポリぺプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｅ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２及び２４より選ばれた配列又はその断片又は類似体をもつポリぺプチドの一部をもったエピトープをコードするポリヌクレオチド； 又は
（ｆ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）又は（ｅ）におけるポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド。
【請求項２】
下記より選ばれたポリヌクレオチドを含む単離されたポリヌクレオチド。
（ａ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２及び２４より選ばれた配列を含む第２ポリぺプチドに対して少なくとも７０％が同一であるポリぺプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２及び２４より選ばれた配列を含む第２ポリぺプチドに対して少なくとも９５％が同一であるポリぺプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２及び２４より選ばれた配列を含むポリぺプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２及び２４より選ばれた配列をもつポリぺプチドに結合特異性を有する抗体を産生することができるポリぺプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｅ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２及び２４より選ばれた配列をもつポリぺプチドの一部をもったエピトープをコードするポリヌクレオチド； 又は
（ｆ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）又は（ｅ）におけるポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド。
【請求項３】
前記ポリヌクレオチドがＤＮＡである、請求項１記載のポリヌクレオチド。
【請求項４】
前記ポリヌクレオチドがＤＮＡである、請求項２記載のポリヌクレオチド。
【請求項５】
前記ポリヌクレオチドがＲＮＡである、請求項１記載のポリヌクレオチド。
【請求項６】
前記ポリヌクレオチドがＲＮＡである、請求項２記載のポリヌクレオチド。
【請求項７】
ストリンジェントな条件下で
（ａ）ポリぺプチドをコードするＤＮＡ配列、又は
（ｂ）ポリぺプチドをコードするＤＮＡ配列の補体；
のいずれかに対してハイブリダイズし、前記ポリぺプチドが配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４又はその断片又は類似体を含む、請求項１記載のポリヌクレオチド。
【請求項８】
ストリンジェントな条件下で
（ａ）ポリぺプチドをコードするＤＮＡ配列、又は
（ｂ）ポリぺプチドをコードするＤＮＡ配列の補体；
のいずれかに対してハイブリダイズし、前記ポリぺプチドが配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４を含む、請求項１記載のポリヌクレオチド。
【請求項９】
ストリンジェントな条件下で
（ａ）ポリぺプチドをコードするＤＮＡ配列、又は
（ｂ）ポリぺプチドをコードするＤＮＡ配列の補体；
のいずれかに対してハイブリダイズし、前記ポリぺプチドが配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４又はその断片又は類似体を含むポリぺプチドから少なくとも１０の隣接アミノ酸残基を含む、請求項１記載のポリヌクレオチド。
【請求項１０】
ストリンジェントな条件下で
（ａ）ポリぺプチドをコードするＤＮＡ配列、又は
（ｂ）ポリぺプチドをコードするＤＮＡ配列の補体；
のいずれかに対してハイブリダイズし、前記ポリぺプチドが配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４を含むポリぺプチドから少なくとも１０の隣接アミノ酸残基を含む、請求項１記載のポリヌクレオチド。
【請求項１１】
前記ＤＮＡが発現制御領域に作用可能に結合する、請求項１記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項１２】
前記ＤＮＡが発現制御領域に作用可能に結合する、請求項２記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項１３】
請求項１１記載のベクターでトランスフェクトしたホスト細胞。
【請求項１４】
請求項１２記載のベクターでトランスフェクトしたホスト細胞。
【請求項１５】
ポリぺプチドを生産する方法であって、前記ポリぺプチドの発現に適した条件下で請求項１３記載のホスト細胞を培養する段階を含む、前記方法。
【請求項１６】
ポリぺプチドを生産する方法であって、前記ポリぺプチドの発現に適した条件下で請求項１４記載のホスト細胞を培養する段階を含む、前記方法。
【請求項１７】
下記より選ばれた１種を含む単離されたポリぺプチド。
（ａ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２及び２４より選ばれたアミノ酸配列又はその断片又は類似体をもつ第２ポリぺプチドに対して少なくとも７０％が同一であるポリぺプチド；
（ｂ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２及び２４より選ばれた配列又はその断片又は類似体をもつ第２ポリぺプチドに対して少なくとも９５％が同一であるポリぺプチド；
（ｃ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２及び２４より選ばれた配列又はその断片又は類似体を含むポリぺプチド；
（ｄ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２及び２４より選ばれた配列又はその断片又は類似体をもつポリぺプチドに結合特異性を有する抗体を産生することができるポリぺプチド；
（ｅ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２及び２４より選ばれた配列又はその断片又は類似体をもつポリぺプチドの一部をもったエピトープ；
（ｆ）Ｎ末端Ｍｅｔ残基が欠失している（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）又は（ｅ）のポリぺプチド； 又は
（ｇ）分泌アミノ酸配列が欠失している（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）又は（ｅ）のポリぺプチド。
【請求項１８】
下記より選ばれた１種を含む単離されたポリぺプチド。
（ａ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２及び２４より選ばれたアミノ酸配列をもつ第２ポリぺプチドに対して少なくとも７０％が同一であるポリぺプチド；
（ｂ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２及び２４より選ばれたアミノ酸配列をもつ第２ポリぺプチドに対して少なくとも９５％が同一であるポリぺプチド；
（ｃ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２及び２４より選ばれた配列を含むポリぺプチド；
（ｄ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２及び２４より選ばれた配列をもつポリぺプチドに結合特異性を有する抗体を産生することができるポリぺプチド；
（ｅ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２及び２４より選ばれた配列をもつポリぺプチドの一部をもったエピトープ；
（ｆ）Ｎ末端Ｍｅｔ残基が欠失している（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）又は（ｅ）のポリぺプチド； 又は
（ｇ）分泌アミノ酸配列が欠失している（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）又は（ｅ）のポリぺプチド。
【請求項１９】
配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２及び２４より選ばれた配列又はその断片又は類似体をもつポリぺプチドを２つ以上含み、該ポリぺプチドがキメラポリぺプチドを形成するように結合するキメラポリぺプチド。
【請求項２０】
配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２及び２４より選ばれた配列をもつポリぺプチドを２つ以上含み、該ポリぺプチドがキメラポリぺプチドを形成するように結合するキメラポリぺプチド。
【請求項２１】
請求項１７〜２０のいずれか１項に記載のポリぺプチドと薬学的に許容しうる担体、希釈剤又は補助剤を含む医薬組成物。
【請求項２２】
中耳炎、副鼻腔炎、気管支炎、肺炎及び髄膜炎並びに菌血症の予防又は治療方法であって、請求項２１記載の組成物の治療又は予防量を個体に投与する段階を含む、前記方法。
【請求項２３】
ヘモフィルス・インフルエンゼ感染症に感受性のある個体においてヘモフィルス・インフルエンゼ細菌感染症を予防又は治療する方法であって、請求項２１記載の組成物の治療又は予防量を前記個体に投与する段階を含む、前記方法。
【請求項２４】
ヘモフィルス・インフルエンゼが型別不能ヘモフィルス・インフルエンゼである、請求項２３記載の方法。
【請求項２５】
ヘモフィルス・インフルエンゼが型別可能ヘモフィルス・インフルエンゼである、請求項２３記載の方法。
【請求項２６】
中耳炎、副鼻腔炎、気管支炎、肺炎及び髄膜炎並びに菌血症の診断方法であって、請求項２１記載の組成物の治療又は予防量を個体に投与する段階を含む、前記方法。
【請求項２７】
ヘモフィルス・インフルエンゼ感染症に感受性のある個体においてヘモフィルス・インフルエンゼ細菌感染症を診断する方法であって、請求項２１記載の組成物の治療又は予防量を前記個体に投与する段階を含む、前記方法。
【請求項２８】
ヘモフィルス・インフルエンゼが型別不能ヘモフィルス・インフルエンゼである、請求項２７記載の方法。
【請求項２９】
ヘモフィルス・インフルエンゼが型別可能ヘモフィルス・インフルエンゼである、請求項２７記載の方法。
【請求項３０】
ヘモフィルス感染症を予防又は治療するための請求項２１記載の医薬組成物の使用であって、該組成物の予防又は治療量を個体に投与する段階を含む、前記使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明は、ヒトのような個体においてヘモフィルス・インフルエンゼ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）感染症を予防、診断及び／又は治療するのに用いることができるヘモフィルス・インフルエンゼのポリぺプチド及び対応ＤＮＡ断片に関する。
【０００２】
発明の背景
ヘモフィルス・インフルエンゼは、ヒト病原体としてのみ天然に見出されているグラム陰性桿菌である。ヘモフィルス・インフルエンゼ（Ｈ． ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）の分離物は、封入形態と非封入形態に更に分けることができる。封入菌株は、“ａ”〜“ｆ”型を示している６種の構造上と抗原性で異なる莢膜多糖の１種である。非封入菌株は、認識されたヘモフィルス・インフルエンゼ莢膜多糖に対する抗血清と凝集することができないことによって定義され、非型別不能を意味する。
【０００３】
型別不能ヘモフィルス・インフルエンゼ（Ｎｏｎｔｙｐｅａｂｌｅ Ｈ． ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）株は、一般に、鼻咽腔や後口腔咽頭を含む上気道にコロニー形成する。多くの健康な個体の調査から小児と成人両方でコロニー形成率４０％〜８０％が示されている（Ｓｐｉｎｏｌａ Ｓ．Ｍ．， Ｐｅａｃｏｃｋ Ｊ．， Ｄｅｎｎｙ Ｆ．Ｗ．， Ｓｍｉｔｈ Ｄ．Ｌ． ＆ Ｃａｎｎｏｎ Ｊ．Ｇ． （１９８６） Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｃｏｌｏｎｉｓａｔｉｏｎ ｂｙ ｎｏｎｔｙｐｅａｂｌｅ Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ ｉｎ ｃｈｉｌｄｒｅｎ： ａ ｌｏｎｇｉｔｕｄｉｎａｌ ｓｔｕｄｙ． Ｊ． Ｉｎｆｅｃｔ． Ｄｉｓ． １５４：１００−１０９； Ｔｒｏｔｔｉｅｒ Ｓ．， Ｓｔｅｎｂｅｒｇ Ｋ． ＆ Ｓｖａｎｂｏｒｇ−Ｅｄｅｎ Ｃ． （１９８９） Ｔｕｒｎ ｏｖｅｒ ｏｆ ｎｏｎｔｙｐｅａｂｌｅ Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ ｉｎ ｔｈｅ ｎａｓｏｐｈａｒｙｎｇｅｓ ｏｆ ｈｅａｌｔｈｙ ｃｈｉｌｄｒｅｎ． Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ２７：２１７５−２１７９）。具体的な菌株とのコロニー形成によって、たいていの個体において数週間か数ヶ月間この期間全体に無症候のままであることにより持続してしまう。型別不能ヘモフィルス・インフルエンゼに基づく疾患の発生機序は、気道内での近接拡散を必要とする。隣接領域への拡散は、通常は非特異的又は特異的ホスト防御における異常の結果である。そのようにして、ヘモフィルス・インフルエンゼは耳炎、副鼻腔炎、気管支炎又は肺炎を含む小児や成人における種々の呼吸器系感染症を引き起こす。これらの感染症は、気管支炎又は耳炎をもつ患者において慢性又は再発することがある。実際に、乳児や小児では型別不能ヘモフィルス・インフルエンゼは、急性中耳炎がしばしば起こり、一般的には再発中耳炎に関係があるとされている（Ｈａｒａｂｕｃｈ Ｙ．， Ｆａｄｄｅｎ Ｈ．， Ｙａｍａｎａｋａ Ｎ．， ｄｕｆｆｙ Ｌ．， Ｗｏｌｆ Ｊ．， Ｋｒｙｓｔｏｆｉｋ Ｄ． ＆ Ｔｎａｗａｎｄａ／Ｗｉｌｌｉａｍｓｖｉｌｌｅ Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ． （１９９４） Ｎａｓｏｐｈａｒｙｎｇｅａｌ ｃｏｌｏｎｉｓａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｎｏｎｔｙｐｅａｂｌｅ Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ ａｎｄ ｒｅｃｕｒｒｅｎｔ ｏｔｉｔｉｓ ｍｅｄｉａ． Ｊ． Ｉｎｆｅｃｔ． Ｄｉｓ． １７０：８６２−８６６）。
【０００４】
乳児では、型別不能ヘモフィルス・インフルエンゼは１歳までは中耳炎の最初のエピソードの２７〜３７％に関与している（Ｓｍｉｔｈ−Ｖａｕｇｈａｎ Ｈ．Ｃ．， Ｓｒｉｐｒａｋａｓｈ Ｋ．Ｓ．， Ｍａｔｈｅｗｓ Ｊ．Ｄ． ＆ Ｋｅｍｐ Ｄ．Ｊ． （１９９７） Ｎｏｎｅｎｃａｐｓｕｌａｔｅｄ Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ ｉｎ ａｂｏｒｉｇｉｎａｌ ｉｎｆａｎｔｓ ｗｉｔｈ ｏｔｉｔｉｓ ｍｅｄｉａ： ｐｒｏｌｏｎｇｅｄ ｃａｒｒｉａｇｅ ｏｆ Ｐ２ ｐｏｒｉｎ ｖａｒｉａｎｔｓ ａｎｄ ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｆｏｒ ｈｏｒｉｚｏｎｔａｌ Ｐ２ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ． Ｉｎｆｅｃｔ． Ｉｍｍｕｎ． ６５：１４６８−１４７４； Ｔｅｅｌｅ Ｄ．Ｗ．， Ｋｌｅｉｎ Ｊ．Ｏ．， Ｒｏｓｎｅｒ Ｂ． ＆ Ｇｒｅａｔｅｒ Ｂｏｓｔｏｎ Ｏｔｉｔｉｓ Ｍｅｄｉａ ｓｔｕｄｙ Ｇｒｏｕｐ． （１９８９） Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｏｔｉｔｉｓ ｍｅｄｉａ ｄｕｒｉｎｇ ｔｈｅ ｆｉｒｓｔ ｓｅｖｅｎ ｙｅａｒｓ ｏｆ ｌｉｆｅ ｉｎ ｃｈｉｌｄｒｅｎ ｉｎ Ｇｒｅａｔｅｒ Ｂｏｓｔｏｎ： ａ ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ， ｃｏｈｏｒｔ ｓｔｕｄｙ． Ｊ． Ｉｎｆｅｃｔ． Ｄｉｓ． １６０：８３−９４）。髄膜炎は、型別不能ヘモフィルス・インフルエンゼによってしばしば引き起こされ、すべての症例の１〜３％ とみなされている。しかし、型別不能ヘモフィルス・インフルエンゼは、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）や嚢胞性線維症のような生来の粘膜免疫系に働く基礎にある疾患をもつホストにおいて特に優勢である（Ｍｕｒｐｈｙ Ｔ．Ｆ． ＆ Ｓｅｔｈｉ Ｓ． （１９９２） Ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｉｎ ｃｈｒｏｎｉｃ ｏｂｓｔｒｕｃｔｉｖｅ ｐｕｌｍｏｎａｒｙ ｄｉｓｅａｓｅ． Ａｍ． Ｒｅｖ． Ｒｅｓｐｉｒ． Ｄｉｓ． １４６：１０６７−１０８３； Ｓｔ． Ｇｅｍｅ Ｊ．Ｗ． ＩＩＩ． （１９９３） Ｎｏｎｔｙｐｅａｂｌｅ Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ ｄｉｓｅａｓｅ： ｅｐｉｄｅｍｉｌｏｇｙ， ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ ａｎｄ ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ ｆｏｒ ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ． Ｉｎｆｅｃｔ． Ａｇｅｎｔｓ Ｄｉｓ． ２：１−１６）。型別不能ヘモフィルス・インフルエンゼ株は、痰が粘液膿性になるときの悪化の間に主に見られる。慢性気管支炎の急性感染性の悪化は、慢性肺疾患をもつ患者の疾病率と死亡率に重要な役割を果たしている。
【０００５】
院外感染性肺炎の病因は、この十年間で変化してきたと思われる。ストレプトコッカス・ニゥモニエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）は依然として主な病原体であるが、他の微生物を含む症例の割合が増加してきた。ヘモフィルス・インフルエンゼは、肺炎の第２の最も一般的な原因であると現在しばしば報告されている。ヘモフィルス・インフルエンゼ肺炎症例の１０％ は、菌血症になる。発展途上国では、型別不能ヘモフィルス・インフルエンゼによる肺炎が小児における疾病率と死亡率の重要な原因であることは明らかである。
【０００６】
数種のヘモフィルス・インフルエンゼｂ型多糖結合ワクチンが開発されたが、これらのワクチンは他のヘモフィルス・インフルエンゼ株による疾患に対しては無効である（Ｓｃｈｅｉｆｅｌｅ Ｄ．Ｗ．， Ｊａｄａｖｊｉ Ｔ．Ｐ．， Ｌａｗ Ｂ．Ｊ．， Ｇｏｌｄ Ｒ．， Ｍａｃｄｏｎａｌｄ Ｎ．Ｅ．， Ｌｅｂｅｌ Ｍ．Ｈ．， Ｍｉｌｌｓ Ｅ．Ｌ．， Ｄｅｒｙ Ｐ．， Ｈａｌｐｅｒｉｎ Ｓ．Ａ．， Ｍｏｒｒｉｓ Ｒ．Ｆ．， Ｍａｒｃｈｅｓｓａｕｌｔ Ｖ． ＆ Ｄｕｃｌｏｓ Ｐ．Ｊ． （１９９６） Ｒｅｃｅｎｔ ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ ｐｅｄｉａｔｒｉｃ Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ ｔｙｐｅ ｂ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｃａｎａｄａ． Ｃａｎ． Ｍｅｄ． Ａｓｓｏｃ． Ｊ． １５４：１０４１−１０４７； Ｓｃｈｕｌｔｅ Ｅ．Ｅ．， Ｂｉｒｋｈｅａｄ Ｇ．Ｓ．， Ｋｏｎｄｒａｃｋｉ Ｓ．Ｆ． ＆ Ｍｏｒｓｅ Ｄ．Ｌ． （１９９４） Ｐａｔｔｅｒｎｓ ｏｆ Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ ｔｙｐｅ ｂ ｉｎｖａｓｉｖｅ ｄｉｓｅａｓｅ ｉｎ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ｓｔａｔｅ， １９８７−９９１： ｔｈｅ ｒｏｌｅ ｏｆ ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ ｆｏｒ ｄａｙ−ｃａｒｅ ａｔｔｅｎｄａｎｃｅ． Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ ９４：１０１４−１０１６）。保存交差防御抗原の同定は、ヘモフィルス・インフルエンゼ感染や疾患に対する広域ワクチンの開発に重要である。Ｐ１、Ｐ２、Ｐ４、Ｐ６、ＰＣＰ、ＯＭＰ２６又はＤ−１５のような外膜タンパク質が同定され、現在は潜在的ワクチン抗原としても追究されている（Ｆｏｘｗｅｌｌ Ａ．Ｒ．， Ｋｙｄ Ｊ．Ｍ． ＆ Ｃｒｉｐｐｓ Ａ．Ｗ． （１９９８） Ｎｏｎｔｙｐｅａｂｌｅ Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ： Ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ ａｎｄ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． Ｒｅｖ． ６２：２９４−３０８）。プロテインＤ−１５は、科学文献に多重血清型や型別不能菌株に対して防御を与えることができると記載されている唯一の保存免疫原である。
それ故、ヒトのような個体においてヘモフィルス・インフルエンゼ感染症を予防、診断及び／又は治療するのに用いることができるヘモフィルス・インフルエンゼポリぺプチドが依然として強く求められている。
【０００７】
発明の要約
態様によれば、本発明は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２及び２４より選ばれた配列又はその断片又は類似体を含む第２ポリぺプチドに対して少なくとも７０％ が同一であるポリぺプチドをコードする分離したポリヌクレオチドを提供する。
態様によれば、本発明は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２及び２４より選ばれたアミノ酸配列又はその断片又は類似体を含むポリぺプチドに関する。
他の態様においては、本発明のポリヌクレオチドによってコードされたポリぺプチド、医薬組成物、発現制御領域に作用可能に結合した本発明のポリヌクレオチドを含むベクター、前記ベクターでトランスフェクトしたホスト細胞及び前記ホスト細胞を発現に適した条件下で培養する段階を含むポリぺプチドの生産方法が提供される。
【０００８】
発明の詳細な説明
本発明は、ヘモフィルス・インフルエンゼ感染症を予防、治療、及び／又は診断するために用いることができるヘモフィルス・インフルエンゼポリぺプチドをコードする精製分離したポリヌクレオチドを提供する。本発明は、１２の別個の好ましいポリヌクレオチドを提供し、各々が配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、及び２３の１つによって別個に定義されている。更に、本発明は、１２の別個のポリぺプチドを提供し、各々が配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、又は２４の１つによって別個に定義されている。本発明には本出願において本明細書に記載されているようにそのようなポリぺプチドの突然変異体、変異体、相同体又は誘導体のような類似体をコードするポリヌクレオチドが含まれることを当業者は理解している。本発明は、本発明のＤＮＡ分子に対応するＲＮＡ分子も包含している。ＤＮＡ分子とＲＮＡ分子のほかに、本発明は対応ポリぺプチドとそのようなポリぺプチドに特異的に結合する単一特異抗体を包含している。
【０００９】
態様によれば、本発明は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２及び２４より選ばれた配列又はその断片又は類似体を含む第２ポリぺプチドに対して少なくとも７０％ が同一であるポリぺプチドをコードする分離したポリヌクレオチドを提供する。
態様によれば、本発明は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２及び２４より選ばれた配列又はその断片又は類似体を含む第２ポリぺプチドに対して少なくとも８０％ が同一であるポリぺプチドをコードする分離したポリヌクレオチドを提供する。
態様によれば、本発明は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２及び２４より選ばれた配列又はその断片又は類似体を含む第２ポリぺプチドに対して少なくとも８５％ が同一であるポリぺプチドをコードする分離したポリヌクレオチドを提供する。
態様によれば、本発明は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２及び２４より選ばれた配列又はその断片又は類似体を含む第２ポリぺプチドに対して少なくとも９０％ が同一であるポリぺプチドをコードする分離したポリヌクレオチドを提供する。
【００１０】
態様によれば、本発明は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２及び２４より選ばれた配列又はその断片又は類似体を含む第２ポリぺプチドに対して少なくとも９５％ が同一であるポリぺプチドをコードする分離したポリヌクレオチドを提供する。
態様によれば、本発明は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２及び２４より選ばれた配列又はその断片又は類似体を含むポリぺプチドをコードする分離したポリヌクレオチドを提供する。
態様によれば、本発明は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２及び２４より選ばれた配列又はその断片又は類似体をもつポリぺプチドの一部をもったエピトープをコードするポリヌクレオチドに関する。
態様によれば、本発明は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２及び２４より選ばれた配列をもつポリぺプチドの一部をもったエピトープをコードするポリヌクレオチドに関する。
態様によれば、本発明は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２及び２４より選ばれた配列又はその断片又は類似体をもつポリぺプチドの一部をもったエピトープに関する。
【００１１】
態様によれば、本発明は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２及び２４より選ばれた配列をもつポリぺプチドの一部をもったエピトープに関する。
態様によれば、本発明は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２及び２４より選ばれた配列を含む第２ポリぺプチドに対して少なくとも７０％ が同一であるポリぺプチドをコードする分離したポリヌクレオチドを提供する。
態様によれば、本発明は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２及び２４より選ばれた配列を含む第２ポリぺプチドに対して少なくとも８０％ が同一であるポリぺプチドをコードする分離したポリヌクレオチドを提供する。
態様によれば、本発明は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２及び２４より選ばれた配列を含む第２ポリぺプチドに対して少なくとも８５％ が同一であるポリぺプチドをコードする分離したポリヌクレオチドを提供する。
【００１２】
態様によれば、本発明は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２及び２４より選ばれた配列を含む第２ポリぺプチドに対して少なくとも９０％ が同一であるポリぺプチドをコードする分離したポリヌクレオチドを提供する。
態様によれば、本発明は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２及び２４より選ばれた配列を含む第２ポリぺプチドに対して少なくとも９５％ が同一であるポリぺプチドをコードする分離したポリヌクレオチドを提供する。
態様によれば、本発明は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２及び２４より選ばれた配列を含むポリぺプチドをコードする分離したポリヌクレオチドを提供する。
態様によれば、本発明は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２及び２４より選ばれた配列をもつポリぺプチドの一部をもったエピトープをコードするポリヌクレオチドに関する。
【００１３】
他の実施態様においては、本発明は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２及び２４より選ばれた配列又はその断片又は類似体をもつポリぺプチドに結合特異性を有する抗体を産生することができるポリぺプチドをコードするポリヌクレオチドに関する。
他の実施態様においては、本発明は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２及び２４より選ばれた配列をもつポリぺプチドに結合特異性を有する抗体を産生することができるポリぺプチドをコードするポリヌクレオチドに関する。
相同％ は、アミノ酸型の同一％ と類似％ 又は保存％ の合計として定義される。
アミノ酸配列を比較するためにＣＬＵＳＴＡＬプログラムのようなプログラムを使用し得る。このプログラムによって、アミノ酸配列が比較され、適するように両配列のスペースを挿入することにより最適アラインメントが見出される。最適アラインメントのアミノ酸同一又は類似（アミノ酸型の同一と保存）を計算することが可能である。ＢＬＡＳＴｘのようなプログラムは、類似の配列の最長の伸長物を配列させ、価値を一致まで対応させる。このようにいくつかの類似領域が見られる比較を得ることが可能であり、各々が異なるスコアをもっている。両方のタイプの同定分析が本発明に企図されている。
【００１４】
他の実施態様においては、本発明のポリぺプチドは抗原性である。
他の実施態様においては、本発明のポリぺプチドは免疫原性である。
他の実施態様においては、本発明のポリぺプチドは個体において免疫応答を誘発し得る。
他の実施態様においては、本発明は、上で定義した本発明のポリぺプチドに結合特異性を有する抗体を産生することができるポリぺプチドに関する。
他の実施態様においては、本発明は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２及び２４より選ばれた配列をもつポリぺプチド又はその断片又は類似体に結合特異性を有する抗体を産生することができるポリぺプチドに関する。
他の実施態様においては、本発明は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２及び２４より選ばれた配列をもつポリぺプチドに結合特異性を有する抗体を産生することができるポリぺプチドに関する。
“結合特異性を有する”抗体は、選択されたポリぺプチドを認識結合するが試料、例えば、生体試料中の他の分子をほとんど認識結合しない抗体である。特異結合は、選択されたポリぺプチドが抗原として使われるＥＬＩＳＡ分析を用いて測定し得る。
【００１５】
本発明によれば、生物学的実験における“防御”は生存曲線、生存率又は生存期間の著しい増加によって定義される。生存曲線を比較するログランク試験、また、生存率や死亡するまでの日数を比較するフィッシャー確定試験を用いる統計分析がＰ値を計算するとともに２つのグループ間の差が統計的に有意であるかを求めるために用いることができる。０．０５のＰ値は有意とみなされない。
本発明の他の態様においては、本発明のポリぺプチドの抗原性／免疫原性断片、又はその類似体が提供される。
本発明の断片は、１種以上のそのエピトープ領域を含まなければならず、抗原性／免疫原性の性質を保持するその領域にも十分似ていなければならない。従って、本発明の断片の場合、記載されたポリぺプチド又はその類似体の具体的な部分に１００％ 同一であってもよいので、同定度はおそらく無関係である。本発明は、更に、本発明のポリぺプチド配列から少なくとも１０の隣接アミノ酸残基をもつ断片を提供する。実施態様においては、少なくとも１５の隣接アミノ酸残基をもつ断片を提供する。実施態様においては、少なくとも２０の隣接アミノ酸残基をもつ断片を提供する。
【００１６】
前と同様に、重要な課題は断片が抗原性／免疫原性の性質を保持することである。
本発明のポリぺプチドの断片、類似体又は誘導体が本発明に関連して、即ち、抗原性／免疫原性材料として使われることは当業者によって理解される。従って、例えば、１つ以上の付加、欠失、置換等を含むポリぺプチドは本発明によって包含される。
本明細書に用いられる本発明のポリぺプチドの“断片”、“類似体”又は“誘導体”には、アミノ酸残基の１つ以上が保存アミノ酸残基で置換され（好ましくは保存され）かつ天然であっても天然でなくてもよいポリぺプチドが含まれる。実施態様においては、本発明のポリぺプチドの誘導体や類似体は、図面に示された配列又はその断片と約７０％ が同一である。即ち、残基の７０％ が同じである。他の実施態様においては、ポリぺプチドは同一が８０％より多い。他の実施態様においては、ポリぺプチドは同一が９０％ より多い。他の実施態様においては、ポリぺプチドは同一が９５％ より多い。他の実施態様においては、ポリぺプチドは同一が９９％ より多い。他の実施態様においては、本発明のポリぺプチドの類似体は置換、修飾又は欠失が約２０のアミノ酸残基より少なく、好ましくは１０未満である。
【００１７】
実施態様においては、本発明のポリぺプチドの誘導体又は類似体は、図面に示された配列又はその断片と約７０％ が相同である。他の実施態様においては、ポリぺプチドの誘導体又は類似体は相同が８０％ より多い。他の実施態様においては、ポリぺプチドの誘導体又は類似体は相同が９０％ より多い。他の実施態様においては、ポリぺプチドの誘導体又は類似体は相同が９５％ より多い。他の実施態様においては、ポリぺプチドの誘導体又は類似体は相同が９９％ より多い。他の実施態様においては、本発明のポリぺプチドの誘導体又は類似体はアミノ酸残基の置換、修飾又は欠失が約２０より少なく、更に好ましくは１０未満である。
他の態様によれば、本発明は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２及び２４より選ばれたアミノ酸配列又はその断片又は類似体をもつ第２ポリぺプチドに対して少なくとも７０％が同一であるポリぺプチドを提供する。
他の態様によれば、本発明は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２及び２４より選ばれたアミノ酸配列又はその断片又は類似体をもつ第２ポリぺプチドに対して少なくとも８０％が同一であるポリぺプチドを提供する。
【００１８】
他の態様によれば、本発明は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２及び２４より選ばれたアミノ酸配列又はその断片又は類似体をもつ第２ポリぺプチドに対して少なくとも８５％が同一であるポリぺプチドを提供する。
他の態様によれば、本発明は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２及び２４より選ばれたアミノ酸配列又はその断片又は類似体をもつ第２ポリぺプチドに対して少なくとも９０％が同一であるポリぺプチドを提供する。
他の態様によれば、本発明は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２及び２４より選ばれたアミノ酸配列又はその断片又は類似体をもつ第２ポリぺプチドに対して少なくとも９５％が同一であるポリぺプチドを提供する。
他の態様によれば、本発明は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２及び２４より選ばれた配列又はその断片又は類似体を含むポリぺプチドを提供する。
他の態様によれば、本発明は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２及び２４より選ばれた配列又はその断片又は類似体を特徴とするポリぺプチドを提供する。
【００１９】
他の態様によれば、本発明は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２及び２４より選ばれたアミノ酸配列をもつ第２ポリぺプチドに対して少なくとも７０％が同一であるポリぺプチドを提供する。
他の態様によれば、本発明は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２及び２４より選ばれたアミノ酸配列をもつ第２ポリぺプチドに対して少なくとも８０％が同一であるポリぺプチドを提供する。
他の態様によれば、本発明は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２及び２４より選ばれたアミノ酸配列をもつ第２ポリぺプチドに対して少なくとも８５％が同一であるポリぺプチドを提供する。
他の態様によれば、本発明は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２及び２４より選ばれたアミノ酸配列をもつ第２ポリぺプチドに対して少なくとも９０％が同一であるポリぺプチドを提供する。
他の態様によれば、本発明は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２及び２４より選ばれたアミノ酸配列をもつ第２ポリぺプチドに対して少なくとも９５％が同一であるポリぺプチドを提供する。
【００２０】
他の態様によれば、本発明は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２及び２４より選ばれたアミノ酸配列を含むポリぺプチドを提供する。
他の態様によれば、本発明は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２及び２４より選ばれたアミノ酸配列を特徴とするポリぺプチドを提供する。
これらの置換は、ポリぺプチドの二次構造と親水性に対して影響が最少のものである。好ましい置換は、保存された当該技術において既知のものである。即ち、置換残基が疎水性、サイズ、電荷又は官能基のような物理的又は化学的性質を共有するものである。Ｄａｙｈｏｆｆ， Ｍ．， Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ５， １９７８； Ａｒｇｏｓ， Ｐ．， ＥＭＢＯ Ｊ． ８， ７７９−７８５， １９８９に記載された置換が含まれる。例えば、下記群の１つに属する天然の或いは天然でないアミノ酸は保存的変化である。
ａｌａ、ｐｒｏ、ｇｌｙ、ｇｌｎ、ａｓｎ、ｓｅｒ、ｔｈｒ、ｖａｌ；
ｃｙｓ、ｓｅｒ、ｔｙｒ、ｔｈｒ；
ｖａｌ、ｉｌｅ、ｌｅｕ、ｍｅｔ、ａｌａ、ｐｈｅ；
ｌｙｓ、ａｒｇ、ｏｒｎ、ｈｉｓ；及び
ｐｈｅ、ｔｙｒ、ｔｒｐ、ｈｉｓ。
好ましい置換には、対応するＬ−アミノ酸をＤ−エナンチオマーに置換することが含まれている。
【００２１】
好ましくは、本発明のポリぺプチドの断片、類似体又は誘導体は少なくとも１つの抗原領域、即ち、少なくとも１つのエピトープを含む。
代替的方法においては、類似体は精製を容易にする部分を取り込んでいる、例えば、所望のポリぺプチドを効果的にタグ標識することによる融合ポリぺプチドであり得る。“タグ”を除去することは必要なことであり、融合ポリぺプチド自体が用いるのに十分な抗原性を保持している例であってもよい。
従って、類似体、誘導体又は断片について重要なことは、少なくともタンパク質又はポリぺプチドが由来している程度の抗原性／免疫原性をもっていることである。
ポリぺプチドの生物学的性質又は薬理学的性質を変える他の化合物、即ち、半減期を増大させるポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、精製を容易にするリーダー配列又は分泌アミノ酸配列、プレプロ配列又はプロ配列又は（多）糖を融合したポリぺプチドも包含される。
更に、アミノ酸領域が多型であることがわかった状態においては、異なるヘモフィルス・インフルエンゼ株の異なるエピトープを効果的にミミックするように１つ以上の具体的なアミノ酸を変えることが望ましい。
【００２２】
更に、本発明のポリぺプチドは、安定性、支持体又は他の分子に結合する高疎水性を得るために末端−ＮＨ２アシル化（例えば、アセチル化又はチオグリコール酸アミノ化、例えば、アンモニア又はメチルアミンを用いた末端カルボキシアミノ化）により修飾し得る。
ポリぺプチド断片又は類似体のヘテロ又はホモポリぺプチド多量体も企図される。これらの重合体は、例えば、アビジン／ビオチン、グルタルアルデヒド又はジメチルスーパーイミデートのような架橋剤で架橋したポリぺプチド１種以上を含む。そのような重合体としては、組換えＤＮＡ技術によって生成したマルチシストロンｍＲＮＡから生産された縦列又は逆方向隣接配列を２つ以上有するポリぺプチドが含まれる。
他の実施態様においては、本発明は、本出願の図面に定義されたポリぺプチド又はその断片又は類似体又は誘導体を１種以上含むキメラポリぺプチドに関する。
他の実施態様においては、本発明は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２及び２４より選ばれた配列又はその断片又は類似体をもつポリぺプチドを２つ以上含むキメラポリぺプチドに関し、該ポリぺプチドはキメラポリぺプチドを形成するように結合されている。
【００２３】
他の実施態様においては、本発明は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２及び２４より選ばれた配列をもつポリぺプチドを２つ以上含むキメラポリぺプチドに関し、該ポリぺプチドはキメラポリぺプチドを形成するように結合されている。
抗原重合体（即ち、合成多量体）の形成を達成するために、ビスハロアセチル基、ニトロアリールハライド等を有するポリぺプチドを用いることができ、その試薬はチオ基に特異的である。それ故、異なるぺプチドの２つのメルカプト基間の結合は単結合であってもよく、炭素原子が少なくとも２個、典型的には少なくとも４個で１６個以下、通常は約１４個以下の結合基から構成されていてもよい。
具体的な実施態様においては、本発明のポリぺプチド断片又は類似体は、出発メチオニン（Ｍｅｔ）残基を含んでいない。好ましくは、ポリぺプチドはリーダー配列又は分泌配列（シグナル配列）を取り込まない。本発明のポリぺプチドのシグナル部分は、確立された分子生物学的手法に従って求めることができる。一般に、問題のポリぺプチドは、ヘモフィルス培養物から分離し、次に配列決定して成熟タンパク質の開始残基、それ故成熟ポリぺプチドの配列を求めることができる。
次の表Ａは、図面に記載された本発明のポリぺプチドのシグナル配列を記載したものである。
【００２４】
【表１】
2004509647.tif 000003
【００２５】
本発明の他の態様によれば、（ｉ）本発明のポリぺプチドを担体、希釈剤又は補助剤と共に含む物質の組成物；（ｉｉ）本発明のポリぺプチドと担体、希釈剤又は補助剤とを含む医薬組成物；（ｉｉｉ）本発明のポリぺプチドと担体、希釈剤又は補助剤とを含むワクチン；（ｉｖ）個体において免疫応答、例えば、ヘモフィルスに対する防御免疫応答を誘発する本発明のポリぺプチドの免疫原性的に有効な量を該個体に投与することによりヘモフィルスに対して免疫応答を誘発する方法； 特に（ｖ）本発明のポリぺプチドの予防又は治療量を必要としている個体に投与することによりヘモフィルス感染症（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ）を予防及び／又は治療する方法が提供される。
免疫化する前に、本発明のポリぺプチドは、テタヌストキシン、ジフテリアトキシン、Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原、灰白髄炎ウイルスＶＰ１抗原又は他のウイルス毒素又は細菌毒素又は抗原のような担体タンパク質又は強い免疫応答の発生を刺激する適切なタンパク質にカップリング又はコンジュゲートし得る。このカップリング又はコンジュゲーションは化学的に又は遺伝的に行うことができる。ぺプチド−担体結合の詳しい説明は、Ｖａｎ Ｒｅｇｅｎｍｏｒｔｅｌ， Ｍ．Ｈ．Ｖ．， Ｂｒｉａｎｄ Ｊ．Ｐ．， Ｍｕｌｌｅｒ Ｓ．， Ｐｌａｕｅ Ｓ．，《Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｓ ａｎｔｉｇｅｎｓ》Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌ．１９ （ｅｄ．） Ｂｕｒｄｏｕ， Ｒ．Ｈ． ＆ Ｖａｎ Ｋｎｉｐｐｅｎｂｅｒｇ Ｐ．Ｈ． （１９８８）， Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋで得られる。
【００２６】
他の態様によれば、１種以上の本発明のヘモフィルスポリぺプチドを薬学的に許容しうる担体、希釈剤又は補助剤との混合物で含む医薬組成物が提供される。適切な補助剤としては、（１）水中油型エマルジョン製剤、例えば、ＭＦ５９（登録商標）、ＳＡＦ（登録商標）、Ｒｉｂｉ（登録商標）；（２）フロインド完全アジュバント又は不完全アジュバント；（３）塩、即ち、ＡｌＫ（ＳＯ４）２、ＡｌＮａ（ＳＯ４）２、ＡｌＮＨ４（ＳＯ４）２、Ａｌ（ＯＨ）３、ＡｌＰＯ４、シリカ、カオリン；（４）サポニン誘導体、例えば、Ｓｔｉｍｕｌｏｎ（登録商標）又はそれから生成された粒子、例えば、ＩＳＣＯＭ（免疫刺激複合体）；（５）サイトカイン、例えば、インターロイキン、インターフェロン、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）；（６）他の物質、例えば、炭素ポリヌクレオチド、即ち、ポリＩＣやポリＡＵ、無毒化コレラ毒素（ＣＴＢ）又は粘膜免疫を誘発する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）熱不安定毒素が含まれる。補助剤の詳しい説明は、Ｍ．Ｚ．Ｉ Ｋｈａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， ｖｏｌ． １１， Ｎｏ．１ （１９９４） ｐｐ２−１１からの総説、Ｇｕｐｔａ ｅｔ ａｌ．， Ｖａｃｃｉｎｅ， Ｖｏｌ． １３， Ｎｏ． １４， ｐｐ１２６３−１２７６ （１９９５）からの他の総説、国際出願第９９／２４５７８号で得られる。好ましい補助剤としては、ＱｕｉｌＡ（登録商標）、ＱＳ２１（登録商標）、Ａ１ｈｙｄｒｏｇｅｌ（登録商標）又はＡｄｊｕｐｈｏｓ（登録商標）が含まれる。
【００２７】
本発明の医薬組成物は、注射、急速注入、鼻咽頭吸収、皮膚吸収による非経口投与、又はバッカル又は経口投与することができる。
本発明の医薬組成物は、Ｐ．Ｒ． Ｍｕｒｒａｙ （Ｅｄ， ｉｎ ｃｈｉｅｆ）， Ｅ．Ｊ． Ｂａｒｏｎ， Ｍ．Ａ． Ｐｆａｌｌｅｒ， Ｆ．Ｃ． Ｔｅｎｏｖｅｒ ＆ Ｒ．Ｈ． Ｙｏｌｋｅｎ． Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ， ＡＳＭ Ｐｒｅｓｓ， Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ， Ｄ．Ｃ． ７ｔｈ ｅｄ．， １９９９， ｐ１４８１−１４８２に記載されているヘモフィルス感染症及び／又はヘモフィルス感染症によって仲介される疾患又は症状の治療又は予防に用いられ、この文献の記載は本願明細書に含まれるものとする。実施態様においては、本発明の医薬組成物は、中耳炎（急性又は再発）、副鼻腔炎、気管支炎、肺塩、髄膜炎又は菌血症の治療又は予防に用いられる。実施態様においては、本発明の医薬組成物は、ヘモフィルス感染症及び／又はヘモフィルス感染症によって仲介される疾患又は症状の治療又は予防に用いられる。他の実施態様においては、ヘモフィルス感染症はヘモフィルス・インフルエンゼである。他の実施態様においては、ヘモフィルス感染症は型別不能ヘモフィルス・インフルエンゼである。他の実施態様においては、ヘモフィルス感染症は型別可能ヘモフィルス・インフルエンゼ（Ｔｙｐｅａｂｌｅ Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）である。
【００２８】
本出願において用いられる“個体”という用語は哺乳動物が含まれる。他の実施態様においては、哺乳動物はヒトである。
具体的な実施態様においては、医薬組成物は、乳児、高齢者又はイムノコンプロマイズド個体のようなヘモフィルス・インフルエンゼ感染症の恐れがある個体に投与される。
医薬組成物は、免疫処置の間に約１〜６週間の間隔で１〜３回好ましくは約０．００１〜１００μｇ／ｋｇ（抗原／体重）、更に好ましくは０．０１〜１０μｇ／ｋｇ、最も好ましくは０．１〜１μｇ／ｋｇの単位剤形にある。
医薬組成物は、免疫処置の間に約１〜６週間の間隔で１〜３回好ましくは約０．１〜１０μｇ／ｋｇ、更に好ましくは１μｇ〜１ ｍｇ、最も好ましくは１０〜１００μｇの単位剤形にある。
実施態様においては、ポリヌクレオチドは、本発明のポリぺプチドをコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含むことができる配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１及び２３に示されたものである。
他の実施態様においては、ポリヌクレオチドは、本発明のポリぺプチドをコードする配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３に示されたものである。
【００２９】
縮重コドンで修飾することができる図面に示されたポリヌクレオチド配列が本発明のポリぺプチドをなおコードすることは理解される。従って、本発明は、配列間で５０％ が同一である上記ポリヌクレオチド（又はその補体配列）を提供する。実施態様においては、配列間で少なくとも７０％ が同一である。実施態様においては、配列間で少なくとも７５％ が同一である。実施態様においては、配列間で少なくとも８０％ が同一である。実施態様においては、配列間で少なくとも８５％ が同一である。実施態様においては、配列間で少なくとも９０％ が同一である。他の実施態様においては、ポリヌクレオチドはストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能である。即ち、少なくとも９５％ が同一である。他の実施態様においては、同一が９７％ より多い。
ハイブリダイゼーションに適したストリンジェントな条件は当業者によって容易に求めることができる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， （１９８９） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ２ｎｄ ｅｄ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎ．Ｙ．； Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， （１９９９） Ｅｄ． Ａｕｓｕｂｅｌ Ｆ．Ｍ． ｅｔ ａｌ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．， Ｎ．Ｙ．）。
【００３０】
他の実施態様においては、本発明は、ストリンジェントな条件下で
（ａ）ポリぺプチドをコードするＤＮＡ配列、又は
（ｂ）ポリぺプチドをコードするＤＮＡ配列の補体；
のいずれかに対してハイブリダイズし、前記ポリぺプチドが配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、又はその断片又は類似体を含むポリヌクレオチドを提供する。
他の実施態様においては、本発明は、ストリンジェントな条件下で
（ａ）ポリぺプチドをコードするＤＮＡ配列、又は
（ｂ）ポリぺプチドをコードするＤＮＡ配列の補体；
のいずれかに対してハイブリダイズし、前記ポリぺプチドが配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、又はその断片又は類似体を含むポリヌクレオチドを提供する。
他の実施態様においては、本発明は、ストリンジェントな条件下で
（ａ）ポリぺプチドをコードするＤＮＡ配列、又は
（ｂ）ポリぺプチドをコードするＤＮＡ配列の補体；
のいずれかに対してハイブリダイズし、前記ポリぺプチドが配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４を含むポリヌクレオチドを提供する。
【００３１】
他の実施態様においては、本発明は、ストリンジェントな条件下で
（ａ）ポリぺプチドをコードするＤＮＡ配列、又は
（ｂ）ポリぺプチドをコードするＤＮＡ配列の補体；
のいずれかに対してハイブリダイズし、前記ポリぺプチドが配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４を含むポリぺプチドから少なくとも１０の隣接アミノ酸残基を含むポリヌクレオチドを提供する。
当業者によって容易に理解されるように、ポリヌクレオチドはＤＮＡとＲＮＡ双方を含む。
本発明は、また、本出願に記載されたポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドを含む。
他の態様においては、本発明のポリぺプチド、その断片又は類似体をコードするポリヌクレオチドは、ＤＮＡ免疫法で用いることができる。即ち、注入時に複製可能であり発現可能であるベクターに取り込むことができ、よってインビボで抗原ポリぺプチドが産生される。例えば、真核細胞において機能するＣＭＶプロモーターの制御下でプラスミドベクターに取り込むことができる。好ましくは、ベクターは筋肉内注射される。
【００３２】
他の態様によれば、ホスト細胞においてポリぺプチドをコードするポリヌクレオチドを発現させ、その発現したポリぺプチド産物を回収することによる組換え技術によって本発明のポリぺプチドを生産する製造工程又は方法が提供される。また、ポリぺプチドは、確立された合成化学法、即ち、全ポリぺプチドを生産するためにライゲートするオリゴぺプチドの液相又は固相合成に従って生産し得る（ブロックライゲーション）。
ポリヌクレオチドとポリぺプチドの獲得と評価の一般法は、次の文献： Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， （１９８９） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ２ｎｄ ｅｄ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎ．Ｙ．； Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， （１９９９） Ｅｄ． Ａｕｓｕｂｅｌ Ｆ．Ｍ． ｅｔ ａｌ．， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｌｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．， Ｎ．Ｙ．； ＰＣＲ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ｔｏ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， （１９９７） Ｅｄ． Ｗｈｉｔｅ Ｂ．Ａ．， Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ， Ｔｏｔｏｗａ， Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ， ４９０ ｐ．； Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ， Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅｓ， （１９９３） Ｓｃｏｐｅｓ Ｒ．Ｋ．， Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ， Ｎ．Ｙ．， ３ｒｄ Ｅｄ．， ３８０ ｐ．； Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， （１９９９） Ｅｄ． Ｃｏｌｉｇａｎ Ｊ．Ｅ． ｅｔ ａｌ．， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ Ｉｎｃ．， Ｎ．Ｙ．に記載され、これらの文献の記載は本願明細書に含まれるものとする。
【００３３】
組換え生産については、ホスト細胞を本発明のポリぺプチドをコードするベクターでトランスフェクトし、次にプロモーターの活性化、形質転換体の選択又は遺伝子の増幅に適切なように修飾した栄養培地で培養する。適切なベクターは、選ばれたホストにおいて生存可能で複製可能なものであり、染色体配列、非染色体配列又は合成ＤＮＡ配列、例えば、細菌プラスミド、ファージＤＮＡ、バキュロウイルス、酵母プラスミド、プラスミドとファージＤＮＡの組合わせに由来するベクターが含まれる。ポリぺプチド配列は、プロモーターと、リボソーム結合部位（コンセンサス領域又はシャイン・ダルガーノ配列）と、任意によりオペレーター（制御要素）とを含む発現制御領域に作用可能に結合するように制限酵素を用いてベクターの適切な部位に取り込むことができる。確立された分子生物学原理に従って或るホストとベクターに適している発現制御領域の個々の成分が選択され得る（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， （１９８９） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ， ２ｎｄ ｅｄ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎ．Ｙ．； Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， （１９９９） Ｅｄ． Ａｕｓｕｂｅｌ Ｆ．Ｍ． ｅｔ ａｌ．， Ｊｏｈｎ Ｗｉｋｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．， Ｎ．Ｙ．　これらの文献の記載は本願明細書に含まれるものとする）。
【００３４】
適切なプロモーターとしては、ＬＴＲ又はＳＶ４０プロモーター、Ｅ．ｃｏｌｉ ｌａｃ、ｔａｃ又はｔｒｐプロモーター又はファージλＰＬプロモーターが挙げられるがこれらに限定されない。ベクターは、複製起点と選択マーカー、即ち、アンピシリン耐性遺伝子を組込むことが好ましい。適切な細菌ベクターとしては、ｐＥＴ、ｐＱＥ７０、ｐＱＥ６０、ｐＱＥ−９、ｐＤ１０ ｐｈａｇｅｓｃｒｉｐｔ、ｐｓｉＸ１７４、ｐｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ、ｐｂｓｋｓ、ｐＮＨ８Ａ、ｐＮＨ１６ａ、ｐＮＨ１８Ａ、ｐＮＨ４６Ａ、ｐｔｒｃ９９ａ、ｐＫＫ２２３−３、ｐＫＫ２３３−３、ｐＤＲ５４０、ｐＲＩＴ５又は真核ベクター、ｐＢｌｕｅＢａｃＩＩＩ、ｐＷＬＮＥＯ、ｐＳＶ２ＣＡＴ、ｐＯＧ４４、ｐＸＴ１、ｐＳＧ、ｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧ又はｐＳＶＬが含まれる。ホスト細胞は、細菌細胞、即ち、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、バシラス・サチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）； 真菌細胞、即ち、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・ニダリンス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌｉｎｓ）； 酵母、即ち、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）又は真核細胞、即ち、ＣＨＯ、ＣＯＳが含まれる。
【００３５】
ポリぺプチドの培養内発現時に、細胞を、典型的には、遠心分離により収集し、次に物理的手段又は化学的手段（発現したポリぺプチドが培地に分泌していない場合）により破壊し、得られた粗抽出物を保持して問題のポリぺプチドを分離する。ポリぺプチドの培養液又は溶解物からの精製は、ポリぺプチドの性質によっては確立された手法により、即ち、硫酸アンモニウム又はエタノール沈殿、酸抽出、アニオン又はカチオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互反応クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー又はレシチンクロマトグラフィーを用いて達成することができる。最終精製は、ＨＰＬＣを用いて達成することができる。
ポリぺプチドは、リーダー配列又は分泌配列を含めて又は含めずに発現することができる。前者の例においては、リーダーは転写後処理を用いて除去することができ（米国特許第４ ４３１ ７３９号、同第４ ４２５ ４３７号、同第４ ３３８ ３９７号参照、これらの明細書の記載は本願明細書に含まれるものとする）、発現したポリぺプチドの精製に続いて化学的に除去することもできる。
【００３６】
他の態様においては、本発明のヘモフィルスポリぺプチドは、ヘモフィルス・インフルエンゼ、特にヘモフィルス・インフルエンゼ感染症の診断試験に用いることができる。いくつかの診断法、例えば、生体試料においてヘモフィルス菌を検出する段階が可能であり、下記手順：
ａ． 個体から生体試料を得る段階と；
ｂ． 本発明のヘモフィルスポリぺプチドと反応性の抗体又はその断片を該生体試料とインキュベートして混合物を形成する段階と；
ｃ． ヘモフィルスの存在を示す該混合物において特異的に結合した抗体又は結合した断片を検出する段階と
を行うことができる。
また、前記抗体を含有する又は含有する疑いのある生体試料においてヘモフィルス・インフルエンゼ抗原に特異的な抗体を検出する方法は、次のように
ａ． 個体から生体試料を得る段階と；
ｂ． 本発明のヘモフィルス・インフルエンゼポリぺプチド又はその断片と該生物試料とをインキュベートして混合物を形成する段階と；
ｃ． ヘモフィルス・インフルエンゼに特異的な抗体の存在を示す該混合物において特異的に結合した抗原又は結合した断片を検出する段階と
を行うことができる。
【００３７】
当業者は、この診断試験が実質的にはポリぺプチドに特異的な抗体が細菌内に存在しているかを求めるために、酵素結合免疫吸着分析（ＥＬＩＳＡ）、放射線免疫分析又はラテックス凝集分析を含むいくつかの形態を取ることができることを認識する。
他の態様によれば、本発明は、中耳炎、副鼻腔炎、気管支炎、肺炎及び髄膜炎並びに菌血症を予防又は治療する方法であって、本発明の組成物の治療又は予防量を個体に投与する段階を含む、前記方法に関する。他の実施態様においては、ヘモフィルス・インフルエンゼは型別不能ヘモフィルス・インフルエンゼである。他の実施態様においては、ヘモフィルス・インフルエンゼは型別可能ヘモフィルス・インフルエンゼである。
他の態様によれば、本発明は、中耳炎、副鼻腔炎、気管支炎、肺炎及び髄膜炎並びに菌血症を診断する方法であって、本発明の組成物の治療又は予防量を個体に投与する段階を含む、前記方法に関する。
【００３８】
他の態様によれば、本発明は、ヘモフィルス・インフルエンゼ感染症に感受性のある個体においてヘモフィルス・インフルエンゼ細菌感染症を予防又は治療する方法であって、本発明の組成物の治療又は予防量を前記個体に投与する段階を含む、前記方法に関する。他の実施態様においては、ヘモフィルス・インフルエンゼは型別不能ヘモフィルス・インフルエンゼである。他の実施態様においては、ヘモフィルス・インフルエンゼは型別可能ヘモフィルス・インフルエンゼである。
他の態様においては、本発明は、中耳炎、副鼻腔炎、気管支炎、肺炎及び髄膜炎並びに菌血症を診断する方法であって、本組成物の治療又は予防量を個体に投与する段階を含む、前記方法に関する。
他の態様によれば、本発明は、ヘモフィルス・インフルエンゼ感染症に感受性のある個体においてヘモフィルス・インフルエンゼ細菌感染症を診断する方法であって、本発明の組成物の治療又は予防量を前記個体に投与する段階を含む、前記方法に関する。他の実施態様においては、ヘモフィルス・インフルエンゼは型別不能ヘモフィルス・インフルエンゼである。他の実施態様においては、ヘモフィルス・インフルエンゼは型別可能ヘモフィルス・インフルエンゼである。
【００３９】
他の態様によれば、本発明は、ヘモフィルス感染症を予防又は治療するための医薬組成物の使用であって、該組成物の予防又は治療量を個体に投与する段階を含む、前記使用に関する。
他の態様によれば、本発明のヘモフィルスポリぺプチドは、ヘモフィルス感染症の診断を検出するための本発明のポリぺプチドを含むキットに用いることができる。
本発明のポリぺプチドをコードするＤＮＡ配列は、ヘモフィルス・インフルエンゼを含んでいる疑いのある生体試料においてその細菌の存在を検出するのに用いられるＤＮＡプローブを設計するために用いることができる。本発明の検出法は、
ａ． 個体から生体試料を得る段階と；
ｂ． 本発明のポリぺプチド又はその断片をコードするＤＮＡ配列を有する１種以上のＤＮＡプローブを生体試料とインキュベートして混合物を形成する段階と；
ｃ． ヘモフィルス・インフルエンゼ菌の存在を示す該混合物において特異的に結合するＤＮＡプローブを検出する段階と
を含む。
【００４０】
本発明のＤＮＡプローブは、ヘモフィルス・インフルエンゼ感染症を診断する方法として、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応を用いて、試料において循環ヘモフィルス・インフルエンゼ（即ち、ヘモフィルス・インフルエンゼ核酸）を検出するために用いることができる。プローブは、慣用的な手法を用いて合成することができ、固相に固定化することができ、検出可能標識で標識することもできる。本出願に好ましいＤＮＡプローブは、本発明のヘモフィルス・インフルエンゼポリぺプチドの少なくとも約６隣接ヌクレオチドに相補的な配列をもつオリゴマーである。
個体においてヘモフィルス・インフルエンゼを検出する他の診断法は、
ａ． 本発明のポリぺプチド又はその断片と反応性の抗体を検出可能標識で標識する段階と；
ｂ． 標識抗体又は標識断片を該個体に投与する段階と；
ｃ． ヘモフィルス・インフルエンゼの存在を示す該個体において特異的に結合した標識抗体又は標識断片を検出する段階と
を含む。
【００４１】
本発明の他の態様は、ヘモフィルス・インフルエンゼ感染症の診断、特に治療に特異的な抗体を生産する免疫原としての本発明のヘモフィルスポリぺプチドの使用である。適切な抗体は、適切なスクリーニング法を用いて、例えば、試験モデルにおいてヘモフィルス・インフルエンゼ感染症に対して受動的に防御する具体的な抗体の能力を測定することにより求めることができる。動物モデルの一例は実施例に記載されたマウスモデルである。抗体は、全抗体でもその抗原結合断片であってもよく、免疫グロブリン類に属していてもよい。抗体又は断片は、動物由来、特に哺乳動物由来、特にマウス、ラット又はヒト由来であってもよい。自然抗体又はその断片、又は所望される場合には、組換え抗体又は抗体断片であってもよい。組換え抗体又は抗体断片という用語は、分子生物学手法を用いて生産された抗体又は抗体断片を意味する。抗体又は抗体断片は、ポリクローナル又は好ましくはモノクローナルであってもよい。ヘモフィルス・インフルエンゼポリぺプチドと関連がある多くのエピトープに特異的であってもよいが１つに特異的であることが好ましい。
本発明の他の態様は、ヘモフィルス感染症を予防又は治療するための本発明の医薬組成物の使用であって、該組成物の予防又は治療量を個体に投与する段階を含む、前記使用である。
特に定義されない限り、本明細書に用いられるすべての技術科学用語は、本発明が属している当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に挙げたすべての出版物、特許出願、特許、他の参考文献の記載は全体で本願明細書に含まれるものとする。矛盾する場合には、定義を含む本明細書が支配する。更に、材料、方法、実施例は単に例示であり、限定するものではない。
【００４２】
【実施例】
型別不能ヘモフィルス・インフルエンゼ（ＮＴＨＩ）ポリぺプチドの分離とこれらのポリぺプチドをコードする遺伝子の同定
表面曝露ＮＴＨＩポリぺプチドの分離
細菌株
型別不能ヘモフィルス・インフルエンゼ臨床分離物１２０８５と１００９５はＤ．Ｍ． Ｇｒａｎｏｆｆ（セントルイス、ミズリー州）から、Ｂ−２０、Ａ１８、Ａ１０８、Ｃ−９８、Ｃ−２６、Ｂ−３１をＣｅｎｔｒｅ ｄｅ Ｒｅｃｈｅｒｃｈｅ ｅｎ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｌｏｇｉｅ ｄｕ Ｃｅｎｔｒｅ Ｈｏｓｐｉｔａｌｉｅｒ ｄｅ ｌ’Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｅ Ｌａｖａｌから供与された。型別不能ヘモフィルス・インフルエンゼ１２０８５は、パキスタンの下気道感染症をもつ子供の血液から分離した。
大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＤＨ５α（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ、バーリントン、オンタリオ）を組換えＤＮＡ用のホスト株として用いた。大腸菌 ＸＬ１−Ｂｌｕｅ ＭＲＦ’（ストラタジーン、ラ・ホーヤ、カリフォルニア州）をλＺＡＰ Ｅｘｐｒｅｓｓファージベクターによる感染用のホスト株として用いた。大腸菌 ＸＬＯＬＲ（ストラタジーン）をインビボ励起繊維状λＺＡＰ Ｅｘｐｒｅｓｓによる感染用のホスト株として用いた。
【００４３】
抗血清
完全又は不完全フロインドアジュバント（シーダーレーンラボラトリーズ社、ホーンバイ、カナダ）の存在下外膜タンパク質で３週おきに皮下免疫した後にマウス抗血清を産生した。３回目の免疫処置の２１日後に血清を集めた。
熱死滅型別不能ヘモフィルス・インフルエンゼ１２０８５についてＥＬＩＳＡとウェスタンブロッティングによる反応性に基づいて４種のヒト抗血清を選択した。
【００４４】
ヘモフィルス・インフルエンゼライブラリーの構築とスクリーニング
型別不能ヘモフィルス・インフルエンゼ１２０８５ＤＮＡをゲノム抽出キット（ＱＩＡｇｅｎ）を用いて抽出した。ＤＮＡをＴｓｐ５０９Ｉで消化し、ＥｃｏＲＩ消化λ−ＺＡＰ Ｅｘｐｒｅｓｓファージアーム（ストラタジーン）にライゲートした。そのライゲーションを製造業者の推奨（ストラタジーン）に従ってギガパック抽出物に試験管内パッケージングした。組換えファージを大腸菌 ＸＬ１−Ｂｌｕｅ ＭＲＦ’に２．５×１０４ ＰＦＵ／１５０ ｍｍ（直径）プレートの密度で塗布した。８時間インキュベートした後、プレートをニトロセルロースディスクで重層し、得られたリフトをヒトとマウスの血清でイムノブロッティング処理した。正のクローンを集め、プラーク精製した。問題のヘモフィルス遺伝子をコードする組換えｐＢＫ−ＣＭＶプラスミドをＥｘＡｓｓｉｓｔ繊維状ヘルパーファージとλ耐性株大腸菌 ＸＬＯＬＲを用いて精製バクテリオファージからインビボ切除により回収した。
【００４５】
抗原の同定
これらの組換え大腸菌の溶解物のＳＤＳ−ＰＡＧＡとイムノブロット分析から各クローンがヒト又はマウス抗血清と反応する１種以上のポリぺプチドを発現したことがわかった。
【００４６】
ＤＮＡシークエンシングと配列分析
ゲノムクローンをタクダイデオキシターメネーターサイクルシークエンシングキット（Ｔａｑ ＤｙｅＤｅｏｘｙ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ）（アプライドバイオシステム、フォスターシティ、カリフォルニア州）で配列決定した。いくつかの内部プライマーをクローン化挿入断片の中へ配列決定するために設計した。配列アセンブリをシークエンサーソフトウェア（ジーンコードコーポレーション、アンアーバ、ミシガン州）を用いて行い、配列分析をマックベクターソフトウェア（オックスフォードモレキュラー社、キャンベル、カリフォルニア州）で行った。
【００４７】
実施例１
本実施例は、型別不能ヘモフィルス・インフルエンゼ遺伝子の発現ベクターへのクローニングを示すものである。
型別不能ヘモフィルス・インフルエンゼ遺伝子ＢＶＨ−ＮＴＨＩ１〜ＢＶＨ−ＮＴＨＩ１２（配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３）のコード領域を、制限部位ＮｃｏＩ（ＣＣＡＴＧＧ）、ＮｄｅＩ（ＣＡＴＡＴＧ）、ＳａｌＩ（ＧＴＣＧＡＣ）又はＸｈｏＩ（ＣＴＣＧＡＧ）を付加するために塩基拡張部分を有する下記のオリゴヌクレオチドプライマーを用いることにより型別不能ヘモフィルス・インフルエンゼ株１２０８５のゲノムＤＮＡからＰＣＲ（ＤＮＡサーマルサイクラージーンアンプＰＣＲシステム２４００パーキンエルマー、サンホゼ、カリフォルニア州）によって増幅した。ＰＣＲ産物をキアゲン製キアクイックゲル抽出キットを用いることにより製造業者の説明書に従って（チャッツワース、カリフォルニア州）アガロスゲルから精製し、適切なエンドヌクレアーゼ（ファルマシアカナダ社、Ｂａｉｅ ｄ’Ｕｒｆｅ、カナダ）で消化した。ｐＥＴベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ、マディソン、ウィスコンシン州）を同様に消化し、キアゲン製キアクイックゲル抽出キット（チャッツワース、カリフォルニア州）を用いてアガロースゲルから精製した。消化したＰＣＲ産物を酵素制限ｐＥＴ発現ベクターにライゲートした。ライゲートした産物を大腸菌株ＤＨ５α［φ８０ｄｌａｃΔＭ１５△（ｌａｃＺＹＡ−ａｒｇＦ）Ｕ１６９ ｅｎｄＡ１ ｒｅｃＡ１ ｈｓｄＲ１７（ｒＫ−ｍＫ＋）ｄｅｏＲ ｔｈｉ−１ ｓｕｐＥ４４ λ−ｇｙｒＡ９６ ｒｅｌＡ１］（ギブコＢＲＳ、ゲイザースバーグ、メリーランド）にシマニスの方法（Ｈａｎａｈａｎ Ｄ． （１９８５） ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ． Ｄ．Ｍ． Ｇｌｏｖｅｒ， ｅｄ．， ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ， Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｄ．Ｃ． ｖｏｌ． １ ｐｐ． １０９−１３５）に従って形質転換した。組換え遺伝子含有プラスミド（ｒｐＥＴ）をキアゲンキット（チャッツワース、カリフォルニア州）を用いて精製し、ＤＮＡ挿入断片を配列決定した（タクダイデオキシターメネーターサイクルシークエンシングキット、ＡＢＩ、フォスターシティ、カリフォルニア州）。
【００４８】
表１．　ＤＮＡクローニング用オリゴヌクレオチドプライマー表
【表２】
2004509647.tif 000004
【００４９】
【表３】
2004509647.tif 000005
【００５０】
＊ ヌクレオチドの位置はクローニングの結果、即ち、ＰＣＲ産物の長さと図１での位置を示す。
【００５１】
実施例２
本実施例は、他の型別不能ヘモフィルス・インフルエンゼ株由来のＢＶＨ−ＮＴＨＩ１遺伝子のＰＣＲ増幅とシークエンシング及びその遺伝子の分子保存レベルの評価を記載するものである。
それらの株由来型別不能ヘモフィルス・インフルエンゼ遺伝子ＢＶＨ−ＮＴＨＩ１のそれぞれのコード領域を、次のオリゴ：
ＨＡＭＪ３４２（５’ −ＣＡＡＧＧＣＧＴＴＴＴＣＡＴＡＴＧＣＣＴＧＴＣＡＴＴＣＧＧＣＡＧＧ−３’）；
ＨＡＭＪ３４３（５’ −ＣＴＡＡＴＴＧＡＣＣＴＣＧＡＧＴＴＴＴＧＣＴＧＣＴＴＴＴＡＡＴＴＣＴＴＧＡＴＡＡＴＡＴＴＧ−３’）
を用いてゲノムＤＮＡからＰＣＲ（ＤＮＡサーマルサイクラージーンアンプＰＣＲシステム２４００パーキンエルマー、サンホセ、カリフォルニア州）によって増幅した。ＰＣＲ産物を、キアゲン製のキアクイックゲル抽出キットを用いて製造業者の説明書（チャッツワース、カリフォルニア州）に従ってアガロースゲルから精製し、ＤＮＡ挿入断片を配列決定した（タクダイデオキシターミネーターサイクルシークエンシングキット、ＡＢＩ、フォスターシティ、カリフォルニア州）。これらの８菌株すべてについて作成したＰＣＲ断片の長さは同一であった。これらの菌株（１２０８５、１００９５、Ａ１８、Ａ１０８）由来のヌクレオチドと予想アミノ酸配列のペアワイズ比較から、図２５に示されるように９９％ 同一であることがわかった。
【００５２】
実施例３
本実施例は、組換え型別不能ヘモフィルス・インフルエンゼＢＶＨ−ＮＴＨＩ１ポリぺプチドの作製と精製を示す図である。
配列番号１に対応するＢＶＨ−ＮＴＨＩ１遺伝子を有する組換えｐＥＴ２１−ｂ＋プラスミドを用いて大腸菌株Ｔｕｎｅｒ（ＤＥ３）［Ｆ−ｏｍｐＴ， ｈｓｄＳ（ｒｂ，ｍｂ）， ｇａｌ， ｄｃｎ， ｌａｃＹＩ（ＤＥ３）］（ノバジェン、マディソン、ウィスコンシン）をエレクトロトランスフォームした（ジーンパルサーＩＩ装置、バイオラドラボス、ミシソーガ、カナダ）。この大腸菌株の中で、遺伝子がイソプロピル−β−ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）による誘発性のｌａｃプロモーターの制御下にあるＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ（λＤＥ３プロファージに存在する）によって組換えポリぺプチドのＴ７プロモーター制御発現が特異的に認識される。形質転換体Ｔｕｎｅｒ（ＤＥ３）／ｒｐＥＴ２１を１００μｇ／ｍｌのカルベニシリン（シグマ・アルドリッヒカナダ社、オークビル、カナダ）を含有するＬＢブイヨン（ペプトン１０ ｇ／ｌ、酵母エキス５ ｇ／ｌ、ＮａＣｌ １０ ｇ／ｌ）中２５０ ｒｐｍで撹拌しながら３７℃でＡ６００値が０．５になるまで増殖した。型別不能ヘモフィルス・インフルエンゼＢＶＨ−ＮＴＨＩ１−Ｈｉｓ・タグ組換えポリぺプチドの生産を誘発させるために、細胞をＩＰＴＧの存在下に１ ｍＭの最終濃度で３０℃において３時間インキュベートした。５００ ｍｌの培養物からの誘発細胞を遠心分離により沈降させ、−７０℃で凍結した。
【００５３】
ＩＰＴＧ誘導Ｔｕｎｅｒ（ＤＥ３）／ｒｐＥＴ２１の可溶性細胞質画分からの組換えポリぺプチドの精製をＨｉｓ・タグ配列（６個の隣接的ヒスチジン残基）の性質に基づくアフィニティークロマトグラフィーによって行い、Ｈｉｓ・結合金属キレート化樹脂に固定化した２価のカチオン（Ｎｉ２＋）に結合した。概要としては、５００ ｍｌのＩＰＴＧ誘導培養物から得られた沈降細胞を１ ｍＭのフェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ；シグマ）を含有する溶解バッファー（２０ ｍＭトリス、５００ ｍＭ ＮａＣｌ、５ ｍＭイミダゾール、ｐＨ ７．９）に再懸濁し、音波処理し、１６，０００Ｘｇで３０分間遠心分離してデブリを除去した。上清をＮｉ−ＮＴＡアガロースカラム（キアゲン、ミシソーガ、オンタリオ、カナダ）上に析出させた。型別不能ヘモフィルス・インフルエンゼＢＶＨ−ＮＴＨＩ１−Ｈｉｓ・タグ組換えポリぺプチドを２５０ ｍＭイミダゾール−５００ ｍＭ ＮａＣｌ−２０ ｍＭトリスｐＨ ７．９で溶離した。試料からの塩とイミダゾールの除去は、４℃でＰＢＳに対して透析することにより行った。大腸菌の可溶性画分から得られた組換えポリぺプチド量をＭｉｃｒｏＢＣＡ（ピアス、ロックフォード、イリノイ州）によって測った。
【００５４】
実施例４
本実施例は、ＢＶＨ−ＮＴＨＩ１で免疫化後、型別不能ヘモフィルス・インフルエンゼ感染症に対する免疫原性と防御能の分析を示すものである。
５匹の雌のＢＡＬＢ／ｃマウス（チャールスリバー、オンタリオ、カナダ）を大腸菌熱不安定毒素アジュバント（ＬＴ； １μｇ； セダーレーンラボラトリーズ社、ホーンバイ、カナダ）の存在下に２５μｇのアフィニティ精製ＢＶＨ−ＮＴＨＩ１−Ｈｉｓ・タグ組換えポリぺプチドで、対照としてＰＢＳ中アジュバントのみで２週間おきに３回鼻内に免疫した。血液試料をそれぞれの免疫の前日と３回目（４２日目）の注射の１４日後に眼窩副鼻腔から集めた。抗体力価を型別不能ヘモフィルス・インフルエンゼ株１２０８５の熱死滅外膜小胞についてＥＬＩＳＡにより求めた。二次抗体は、アルカリンホスファターゼに結合したヤギ抗マウスＩｇＧ＋ＩｇＭ（Ｈ＋Ｌ）（Ｆｃ特異的）（ジャクソンイムノリサーチラボス、ミシソーガ、オンタリオ）を用いた。抗血清の反応性力価を相互の希釈度として定義し、吸光度が免疫前血清試料で得たものより２倍増加した。ＢＶＨ−ＮＴＨＩ１によって誘発した免疫応答が機能的に重要であるかを調べるために、約２×１０５ ＣＦＵの型別不能ヘモフィルス・インフルエンゼ株１２０８５で肺臓内に攻撃したマウスにおいて１４日後にインビボ防御能を評価した。型別不能ヘモフィルス・インフルエンゼ攻撃接種物の試料をチョコレート寒天プレート上に塗布して攻撃量を確かめた。型別不能ヘモフィルス・インフルエンゼのインビボ増殖を制限する点で予防接種の有効性を測定するために、注射の５時間後にペントバルビタールナトリウム（ＥｕＴｈａｎｙｌ（登録商標））の腹腔内注射によってマウスを犠牲にした。気管支肺胞洗浄について細菌数定量用連続希釈のプレーティングにより細菌クリアランスを評価した。アジュバントのみを注射したマウスを負の対照として用いた。
免疫原性実験の結果（表２）から、免疫動物の血清の特異抗体のレベルが対照血清に相対して約１０００倍まで上昇したことがわかった。平均力価をＯＭＰで測定し、熱死滅試料は１つの希釈だけ異なり、ＢＶＨ−ＮＴＨＩ１ポリぺプチドが実際に表面曝露抗原であることが確認された。
【００５５】
表２．　血清ａにおけるＮＴＨＩ特異的抗体に対する全身免疫の影響
2004509647.tif 000006
ａ） 免疫処置の４２日目に免疫マウスと対照マウスから血清試料を集めた。
【００５６】
防御実験の結果（表３）から、菌株１２０８５が対照動物の肺に容易に増殖して攻撃後５時間までに生存できる型別不能ヘモフィルス・インフルエンゼ細胞数が２００％だけ増加したことがわかった。対照的に、ＢＶＨ−ＮＴＨＩ１免疫マウスによる菌株１２０８５の実質的な肺クリアランスが明らかであったが、免疫動物の肺における細菌沈着物の最初の数の３５％ だけが攻撃後５時間までに回収された。
【００５７】
表３．　型別不能ヘモフィルス・インフルエンゼ１２０８５ａの肺クリアランスに対する全身免疫の影響
2004509647.tif 000007
ａ） 各数値は各時間での５匹の動物の平均である。
ｂ） ＊＊Ｐ ＜ ０．００９８は非対合性ｔ検定とウエルシュ補正に従って算出し、対照と比較した。
【００５８】
実施例５
本実施例は、ヒト血清と防御マウスからの抗血清による型別不能ヘモフィルス・インフルエンゼ株１２０８５由来の組換えポリぺプチドの認識を示すものである。
標準ウェスタンブロット法を用いて精製組換えポリぺプチドがヒト血清によって認識されるかを調べた。更に、外膜タンパク質標品で免疫したマウスからの抗血清を精製組換えポリぺプチドに対して試験した。これらの標品で免疫したマウスは、型別不能ヘモフィルス・インフルエンゼ株１２０８５で攻撃した後に高肺クリアランスを示した。抗原の調製については、精製組換えポリぺプチドをＳＤＳと２−メルカプトエタノールを含有する試料バッファーで１００℃で５分間処理した。ポリぺプチドをＬａｅｍｍｌｉ， Ｕ．Ｋ． （１９７０） Ｃｌｅａｖａｇｅ ｏｆ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｄｕｒｉｎｇ ｔｈｅ ａｓｓｅｍｂｌｙ ｏｆ ｔｈｅ ｈｅａｄ ｏｆ ｔｈｅ ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ Ｔ４． Ｎａｔｕｒｅ， ２２７：６８０−６８５の方法に従ってＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後、ポリぺプチドをゲルからニトロセルロース紙へ方法（Ｔｏｗｂｉｎ， Ｈ．， Ｓｔａｅｈｅｌｉｎ， Ｔ． ＆ Ｇｏｒｄｏｎ， Ｊ． （１９７９） Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｉｃ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｆｒｏｍ ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ ｇｅｌｓ ｔｏ ｎｉｔｒｏｃｅｌｌｕｌｏｓｅ ｓｈｅｅｔｓ： ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ ａｎｄ ｓｏｍｅ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ． Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ７６： ４３５０−４３５４）で電気泳動で移し、ヒト又はマウス抗血清でプローブした。抗体と反応性の抗原の検出を結合抗マウス又は抗ヒト免疫グロブリンと色基質を用いた間接酵素イムノアッセイで行った。表４の結果から、ほとんどのポリぺプチドがヒト免疫系によってすでに見られたことがわかる。ワクチン候補としてこれらのポリぺプチドは、ヒトにおいて強力な免疫応答を誘発させる可能性がある。更に、ほとんどのポリぺプチドが防御マウスからの血清によって認識された。血清反応性は、感染症のマウスモデルにおいて高肺クリアランスに相関している。
【００５９】
表４．　正常ヒト血清と防御マウス由来の抗血清と型別不能ヘモフィルス・インフルエンゼ１２０８５組換えポリぺプチドとの反応性
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ａ） ＋の数は反応の強さを示し、《−》記号は反応しないことを示している。
ｂ） マウスをそれぞれの組換えポリぺプチドで免疫し、肺クリアランスを実施例４のように測定した。
ｃ） ｎｄは実施せず。
【図面の簡単な説明】
【図１】
型別不能ヘモフィルス・インフルエンゼ株１２０８５由来のＢＶＨ−ＮＴＨＩ１遺伝子のＤＮＡ配列： 配列番号１を示す図である。
【図２】
型別不能ヘモフィルス・インフルエンゼ１２０８５株由来の全長ＢＶＨ−ＮＴＨＩ１の推定アミノ酸配列： 配列番号２を示す図である。
【図３】
型別不能ヘモフィルス・インフルエンゼ株１２０８５由来の全長ＢＶＨ−ＮＴＨＩ２遺伝子のＤＮＡ配列： 配列番号３を示す図である。
【図４】
型別不能ヘモフィルス・インフルエンゼ株１２０８５由来の全長ＢＶＨ−ＮＴＨＩ２の推定アミノ酸配列： 配列番号４を示す図である。
【図５】
型別不能ヘモフィルス・インフルエンゼ株１２０８５由来のＢＶＨ−ＮＴＨＩ３遺伝子のＤＮＡ配列： 配列番号５を示す図である。
【図６】
型別不能ヘモフィルス・インフルエンゼ株１２０８５由来の全長ＢＶＨ−ＮＴＨＩ３の推定アミノ酸配列： 配列番号６を示す図である。
【図７】
型別不能ヘモフィルス・インフルエンゼ株１２０８５由来のＢＶＨ−ＮＴＨＩ４遺伝子のＤＮＡ配列： 配列番号７を示す図である。
【図８】
型別不能ヘモフィルス・インフルエンゼ株１２０８５由来の全長ＢＶＨ−ＮＴＨＩ４の推定アミノ酸配列： 配列番号８を示す図である。
【図９】
型別不能ヘモフィルス・インフルエンゼ株１２０８５由来のＢＶＨ−ＮＴＨＩ５遺伝子のＤＮＡ配列： 配列番号９を示す図である。
【図１０】
型別不能ヘモフィルス・インフルエンゼ株１２０８５由来の全長ＢＶＨ−ＮＴＨＩ５の推定アミノ酸配列： 配列番号１０を示す図である。
【図１１】
型別不能ヘモフィルス・インフルエンゼ株１２０８５由来のＢＶＨ−ＮＴＨＩ６遺伝子のＤＮＡ配列： 配列番号１１を示す図である。
【図１２】
型別不能ヘモフィルス・インフルエンゼ株１２０８５由来の全長ＢＶＨ−ＮＴＨＩ６の推定アミノ酸配列： 配列番号１２を示す図である。
【図１３】
型別不能ヘモフィルス・インフルエンゼ株１２０８５由来のＢＶＨ−ＮＴＨＩ７遺伝子のＤＮＡ配列： 配列番号１３を示す図である。
【図１４】
型別不能ヘモフィルス・インフルエンゼ株１２０８５由来の全長ＢＶＨ−ＮＴＨＩ７の推定アミノ酸配列： 配列番号１４を示す図である。
【図１５】
型別不能ヘモフィルス・インフルエンゼ株１２０８５由来のＢＶＨ−ＮＴＨＩ８遺伝子のＤＮＡ配列： 配列番号１５を示す図である。
【図１６】
型別不能ヘモフィルス・インフルエンゼ株１２０８５由来の全長ＢＶＨ−ＮＴＨＩ８の推定アミノ酸配列： 配列番号１６を示す図である。
【図１７】
型別不能ヘモフィルス・インフルエンゼ株１２０８５由来のＢＶＨ−ＮＴＨＩ９遺伝子のＤＮＡ配列： 配列番号１７を示す図である。
【図１８】
型別不能ヘモフィルス・インフルエンゼ株１２０８５由来の全長ＢＶＨ−ＮＴＨＩ９の推定アミノ酸配列： 配列番号１８を示す図である。
【図１９】
型別不能ヘモフィルス・インフルエンゼ株１２０８５由来のＢＶＨ−ＮＴＨＩ１０遺伝子のＤＮＡ配列： 配列番号１９を示す図である。
【図２０】
型別不能ヘモフィルス・インフルエンゼ株１２０８５由来の全長ＢＶＨ−ＮＴＨＩ１０の推定アミノ酸配列： 配列番号６を示す図である。
【図２１】
型別不能ヘモフィルス・インフルエンゼ株１２０８５由来のＢＶＨ−ＮＴＨＩ１１遺伝子のＤＮＡ配列： 配列番号２１を示す図である。
【図２２】
型別不能ヘモフィルス・インフルエンゼ株１２０８５由来の全長ＢＶＨ−ＮＴＨＩ１１の推定アミノ酸配列： 配列番号２２を示す図である。
【図２３】
型別不能ヘモフィルス・インフルエンゼ株１２０８５由来のＢＶＨ−ＮＴＨＩ１２遺伝子のＤＮＡ配列： 配列番号２３を示す図である。
【図２４】
型別不能ヘモフィルス・インフルエンゼ株１２０８５由来の全長ＢＶＨ−ＮＴＨＩ１２の推定アミノ酸配列： 配列番号２４を示す図である。
【図２５】
マックベクター配列分析ソフトウエア（バージョン６．５）からのプログラムクラスタルＷを用いることにより１２０８５、１００９５、Ａ１８、Ａ１０８ヘモフィルス・インフルエンゼ由来のＢＶＨ−ＮＴＨＩ１オープンリーディングフレームの予想アミノ酸配列の比較を示す図である。アラインメントの下にコンセンサスラインがあり、（＊）の記号は同一アミノ酸残基であり、（．）は保存アミノ酸残基である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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2004509647.tif 000093
【国際調査報告】
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2004509647.tif 000095
2004509647.tif 000096
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