(57)【要約】固相サンプル採集媒体を含むか、またはこれに連結された乳房ポンプ装置を利用して、患者から乳房分泌流体またはその成分の生体サンプルを採取する非侵襲性の方法を提供する。乳房ポンプ装置は患者からの乳房分泌流体表出を刺激し、患者の癌を含む乳房疾患を評価するための診断用サンプルの採取を可能にする。こ装置を使用する方法では、必要に応じて患者にオキシトシン類似薬を投与することによって肺胞管の筋上皮収縮を刺激して乳流体の表出を促す。乳流体表出時またはその後に、生体サンプルが、乳房流体の全部、全細胞または細胞成分、その他の特定の液体または固形部分、さらに浄化蛋白質またはバルク・蛋白質、糖蛋白質、ペプチド、ヌクレオチドまたはその他の乳流体成分の所望形態で採集される。サンプル採集方法に従って得た乳流体またはその成分の生体サンプル中の乳房疾患マーカの存在または量を測定する方法およびキットが同様に提供される。本発明は、更に、乳房ポンプおよび乳房ポンプ・アダプタ装置を提供する。乳房ポンプまたはアダプタに一体化されるか、またはそれらと流体により連結される固相サンプル採集媒体が含まれる。これらの装置では、ポンプまたはアダプタを乳房に当てながら、乳流体を固相サンプル採集媒体と接触させることによって、圧搾された乳流体サンプルを採集する。乳流体サンプルの実験室操作および処理のための他の方法、装置付属品および材料、関連の診断方法が更に提供される。これらのうち、特に、本発明の乳房流体採集ポンプ内での使用のために流体保持容器が採用され、これは種々の乳房流体採集、サンプル操作、サンプル処理方法に有用である。
2004524060.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者の乳房器官から生体サンプルを採集するためのサンプル採集装置であって、
患者の乳房の少なくとも乳頭部を受けかつ乳房と吸引シールを形成する寸法および形態の無孔材料で構成された乳房係合部材、
表出した乳房分泌流体サンプルを受けるために前記乳房係合部材と流体により連結される固相サンプル採集媒体、および
前記乳房係合部材へ負圧を発生して乳房分泌流体の表出を促進するために前記乳房係合部材と気体により連結される真空ポンプ手段を含み、
前記サンプル採集装置が前記乳房係合部材および真空ポンプ手段を組合わせて構造的に一体化された、片手で操縦かつ操作できるコンパクトな乳房分泌流体採集装置の形態の手持型乳房ポンプである、サンプル採集装置。
【請求項２】
前記固相サンプル採集媒体は、顕微鏡用スライドカラス、毛細管、採取管、カラム、マイクロカラム、ウェル、プレート、膜、フィルタ、樹脂、無機マトリックス、ビーズ、粒状クロマトグラフィー媒体、プラスチック微粒子、ラテックス粒子、被覆管、被覆テンプレート、被覆ビーズ、被覆マトリックス、またはこれらの組合せから成る群から選択されている、請求項１に記載のサンプル採集装置。
【請求項３】
前記手持型乳房ポンプは、相互に結合または固定自在に一体構造にされ、かつ効率的操作、洗浄、修理および／または保管のために所望により個別構成要素を除去または分離するために一部または全部が分解できる複数の構成要素により形成されたモジュール型乳房ポンプ装置から成る、請求項１に記載のサンプル採集装置。
【請求項４】
前記モジュール型乳房ポンプ装置は、ヒト被験者の乳房の少なくとも乳頭部または乳輪部を受けかつ乳頭部または乳輪部に吸引シールを形成するサイズおよび形態の剛性または半剛性の無孔材料で構成された分離した乳房係合部材を含み、前記乳房係合部材は洗浄または殺菌のためにまたは患者ごとに異なる乳房の解剖学的差異に対応させて異なる係合部材と交換可能にするために、相互に連結された一つまたは二つ以上の構成要素から取外し可能である、請求項３に記載のサンプル採集装置。
【請求項５】
前記固相サンプル採集媒体は、前記乳房係合部材と流体により連結するように着脱自在に取付けられた支持部材によって支持されている、請求項１に記載のサンプル採集装置。
【請求項６】
前記支持部材は、前記乳房係合部材に流体により連結するように着脱自在に取付けるために前記乳房係合部材に挿入できる着脱自在のカセットである、請求項５に記載のサンプル採集装置。
【請求項７】
前記支持部材は吸収または吸着性材料の１枚または２枚以上のパッドまたはシートを支持している、請求項５に記載のサンプル採集装置。
【請求項８】
前記固相サンプル採集媒体はニトロセルロース膜を含む、請求項１に記載のサンプル採集装置。
【請求項９】
前記ニトロセルロース膜は、その膜上に表出した乳房分泌流体からの全細胞を効果的に保持するように選択された孔径を有する、請求項８に記載のサンプル採集装置。
【請求項１０】
前記パッドまたはシートは、通気を促進しかつ機械的動揺に対する構造的可撓性を付与するために、膜またはフィルタの平坦面を切断する穿孔またはスリットを有する膜またはフィルタである、請求項７に記載のサンプル採集装置。
【請求項１１】
前記支持部材は、真空圧の通過のために前記支持部材の本体を貫通する一つまたは二つ以上のエア・チャンネル、および／または乳房係合部材と手持型乳房ポンプのサンプル採集ハウジング部材との間の乳房流体サンプルの通過のためのチャンネルとして作用するチャンネルを有する、請求項５に記載のサンプル採集装置。
【請求項１２】
前記支持部材または前記手持型ポンプのサンプル採集ハウジング部材に一体化されるか、または流体により連結される流体保持凹部、ウェルまたはリザーバを更に含む、請求項１に記載のサンプル採集装置。
【請求項１３】
前記流体保持凹部、ウェルまたはリザーバは、乳房分泌流体および／またはその成分を受けるために前記サンプル採集ハウジング内に一体的に形成された区画室または包囲体を含む、請求項１２に記載のサンプル採集装置。
【請求項１４】
前記流体保持凹部、ウェルまたはリザーバは前記サンプル採集ハウジングの取外し自在の流体リザーバ部材を含む、請求項１２に記載のサンプル採集装置。
【請求項１５】
前記取外し自在の流体リザーバ部材は、前記サンプル採集ハウジングの外側ケーシング部材に一部または全部が囲まれて前記外側ケーシング部材に着脱自在に連結された剛性のサンプル採集管またはバイアルである、請求項１４に記載のサンプル採集装置。
【請求項１６】
前記取外し自在の流体リザーバ部材は、前記サンプル採集ハウジングの外側ケーシング部材と着脱自在且つ密封可能に連結されて前記サンプル採集ハウジングと気密結合を形成する剛性のサンプル採集管またはバイアルである、請求項１４に記載のサンプル採集装置。
【請求項１７】
前記取外し自在の流体リザーバ部材は、前記サンプル採集ハウジングの外側ケーシング部材に密封可能に連結されて前記サンプル採集ハウジングと気密結合を形成する細胞学的バイアルである、請求項１４に記載のサンプル採集装置。
【請求項１８】
前記取外し自在の流体リザーバ部材および前記サンプル採集ハウジングの外側ケーシング部材は結合されて組み立てられたサンプル採集ハウジングを形成し、前記流体リザーバ部材は前記外側ケーシング部材内に着脱自在に嵌め込まれて、前記外側ケーシング部材の内壁と前記流体リザーバ部材の外壁、または上端または下端との間に実質的に気密接触を形成している、請求項１７に記載のサンプル採集装置。
【請求項１９】
前記取外し自在の流体リザーバ部材は、前記バイアルが前記外側ケーシング部材内に嵌め込まれときに、前記外側ケーシング部材の内壁と係合して円周方向の気密シールを形成する、円周方向の突起，フィンまたはＯ−リングを有する、請求項１８に記載のサンプル採集装置。
【請求項２０】
前記取外し自在の流体リザーバ部材は、サンプル採取を促進するために、前記乳房係合部材と気体および液体により連結される、請求項１４に記載のサンプル採集装置。
【請求項２１】
前記真空ポンプ手段からの真空圧が前記サンプル採集ハウジングの取外し自在の流体リザーバ部材を介して前記乳房係合部材へ通過する、請求項１４に記載のサンプル採集装置。
【請求項２２】
前記取外し自在の流体リザーバ部材は、そのリザーバ部材の内孔と前記真空ポンプ手段との間に気体による連結を形成する一つまたは二つ以上の通気ポートを含む、請求項２１に記載のサンプル採集装置。
【請求項２３】
前記取外し自在の流体リザーバ部材は、乳房へ真空圧を伝達する導管、および表出した流体を直接的に採集する流体サンプル物質の容器として機能し、または一次固相サンプル採集媒体から洗浄または移送された一次採取サンプル物質を受ける二次採取媒体として機能する、請求項１４に記載のサンプル採集装置。
【請求項２４】
前記取外し自在の流体リザーバ部材は、流体及び気体の伝達により直接的に前記乳房係合部材と連通し、または前記乳房係合部材と選択的に結合される支持部材内のエア・チャンネルを介して前記乳房係合部材と間接的に連通する、請求項１４に記載のサンプル採集装置。
【請求項２５】
前記乳房係合部材と流体により連結される一次固相サンプル採集媒体は、採集後に前記乳房係合部材および前記取外し自在の流体リザーバ部材を取外しまたは分解することなく前記取外し自在の流体リザーバ部材へ直接的または間接的に洗浄または移送される、一つまたは二つ以上の乳房流体成分の一次サンプルを採集するように配置されている、請求項１４に記載のサンプル採集装置。
【請求項２６】
前記一次固相サンプル採集媒体は、細胞および他の細胞学的物質を膜の表面に保持するためのニトロセルロース膜である、請求項２５に記載のサンプル採集装置。
【請求項２７】
前記一次サンプル採集媒体は、支持部材により前記乳房係合部材と流体により連結するように支持され、かつ前記支持部材は、サンプル移送チャンネルを介して前記一次サンプル採集媒体から前記取外し自在の流体リザーバ部材へ一次サンプルを移送するための一つまたは二つ以上のサンプル移送チャンネルを含む、請求項２５に記載のサンプル採集装置。
【請求項２８】
前記サンプル移送チャンネルは、前記支持部材から前記流体リザーバ部材の内孔に向かってまたはその内孔へ延びた管状基底カラムまたは他の流体連結ポートへ延びている、請求項２７に記載のサンプル採集装置。
【請求項２９】
前記取外し自在の流体リザーバ部材は、一つまたは二つ以上の通気ポートを有する細胞学用バイアルであり、前記通気ポートは前記バイアルの外壁と内孔とを連通させて、前記バイアルの内孔、前記真空ポンプ手段、および前記乳房係合部材の間に気体による連結を形成する、請求項１４に記載のサンプル採集装置。
【請求項３０】
前記取外し自在の流体リザーバ部材は、サンプルの汚染や溢出を防止するために、サンプル採集完了後にその流体リザーバ部材を閉鎖する閉鎖手段を更に含み、それにより前記取外し自在の流体リザーバ部材は乳房ポンプ装置の構成要素としてサンプルを採集し、かつ前記乳房ポンプ装置から前記流体リザーバ部材の取外し後にそのサンプルの保管、輸送かつ／または処理する多目的機能を有する、請求項１４に記載のサンプル採集装置。
【請求項３１】
前記閉鎖手段は前記取外し自在の流体リザーバ部材の上端と密封可能に係合するキャップを含む、請求項３０に記載のサンプル採集装置。
【請求項３２】
前記取外し自在の流体リザーバ部材は、前記乳房ポンプ装置と係合するときに、その流体リザーバ部材の内孔と前記真空ポンプ手段との間に気体による連結を形成する一つまたは二つ以上の通気ポートを含むように改良され、かつ前記閉鎖手段は、サンプル採集後に前記通気ポートを密封可能に閉鎖するための二次閉鎖手段を更に含む、請求項３０に記載のサンプル採集装置。
【請求項３３】
前記二次閉鎖手段は、通気ポートを囲む前記流体リザーバ部材の外壁に接着するサイズで構成された接着シールまたはステッカーを含む、請求項３２に記載のサンプル採集装置。
【請求項３４】
前記二次閉鎖手段が取外し自在のリザーバの通気ポートを密封するための第二閉鎖機構として機能しかつサンプル標識のための記入面を提供する標識テンプレートとして機能する閉鎖・標識兼用装置を含む、請求項３２に記載のサンプル採集装置。
【請求項３５】
前記二次閉鎖手段がサンプル採取後に、通気ポートを密封するために直接貼付できる組合せ閉鎖・標識兼用タブまたはステッカーを含み、通気ポート上への貼付により前記取外し自在の流体リザーバの外壁との並設または接着接触によりシールを形成する第一蓋形成面と、安定したインクまたはグラファイト印刷を施すのに適したブランクのテンプレート材による、前記蓋形成面と反対側の第二標識面とを有する、請求項３２に記載のサンプル採集装置。
【請求項３６】
前記第一蓋形成面が、水溶液との接触による剥離に抵抗する接着剤コーティングを有する、請求項３５に記載のサンプル採集装置。
【請求項３７】
前記二次閉鎖手段が、第一開放形態で取外し自在の流体リザーバ部材に予め取付けられ、かつサンプル採取後に手動で第二閉鎖形態へ変位させまたは操作することによって通気ポートに対するシールまたは蓋を形成する閉鎖・標識兼用タブまたはステッカーを含む、請求項３２に記載のサンプル採集装置。
【請求項３８】
前記二次閉鎖手段は、開放形態に折り曲げられて、前記通気ポート近くで前記流体リザーバ部材に取付けられた内層と、前記内層に折り重ねられた外層とを形成し、前記外層が第一蓋形成面および第二標識面を提供する接着タブまたは接着細片を含み、前記内層上から前記外層を展開してリザーバをラップすることによって、前記蓋形成面が前記通気ポートを覆って耐流体閉鎖を形成し、前記標識面はサンプル・データの記録のために外方に対面している、請求項３７に記載のサンプル採集装置。
【請求項３９】
前記標識面と前記内層との接着係合によって、前記外層が前記内層に対して折重ね位置に選択的に固定される、請求項３８に記載のサンプル採集装置。
【請求項４０】
前記第一蓋形成面は、裏面に接着剤が塗布された外層の端セグメントを折り曲げることによって開放形態で保護された接着剤塗布面を有し、それにより前記蓋形成面が閉鎖前に接着剤を遮断する保護面を提供し、それにより前記端セグメントを持ち上げて外方へ引っ張ることによって前記端セグメントが展開して、前記蓋形成面上の接着剤コーティングが保護面から分離し、かつ前記通気ポートを閉鎖するために前記外層を前記内層から剥離する、請求項３９に記載のサンプル採集装置。
【請求項４１】
前記乳房係合部材は、前記乳房係合部材と、前記サンプル採集ハウジングの対応する連結面とを着脱自在に連結するための着脱自在の連結手段を含む、請求項１４に記載のサンプル採集装置。
【請求項４２】
前記サンプル採集ハウジングは外側ケーシング部材および取外し自在の流体リザーバ部材を含み、かつ前記乳房係合部材は前記流体リザーバ部材に直接連結できる構成である、請求項４１に記載のサンプル採集装置。
【請求項４３】
前記乳房係合部材は、前記流体リザーバ部材の開放端の螺条と係合する対応する係合螺条を有し、前記流体リザーバの前記螺条は、前記流体リザーバ部材の開放端と密封可能に係合するキャップを相互交換可能に受けるように構成されている請求項４２に記載のサンプル採集装置。
【請求項４４】
前記流体リザーバ部材は改良型細胞学用バイアルである、請求項４３に記載のサンプル採集装置。
【請求項４５】
前記固相サンプル採集媒体は、使用時にポンプの係合部材の基部に対して、制御自在に接近させたり遠ざけたりできるように、前記サンプル採集ハウジングに対して調節自在に取付けられている、請求項１に記載のサンプル採集装置。
【請求項４６】
携帯用乳房ポンプを乳頭に係合させる時に、前記固相サンプル採集媒体を調節自在に移動させて乳頭に接近させたり遠ざけたりする往復動機構を更に含む、請求項１に記載のサンプル採集装置。
【請求項４７】
前記真空ポンプ手段を前記サンプル採集ハウジングと構造的且つ機能的に一体化したコンパクトな真空ポンプハウジングを更に含む、請求項１に記載のサンプル採集装置。
【請求項４８】
前記真空ポンプハウジングおよび前記サンプル採集ハウジングの外側ケーシング部材は前記サンプル採集装置の単一の一体的構成要素として鋳造または成形されている、請求項４７に記載のサンプル採集装置。
【請求項４９】
前記サンプル採集装置の真空ポンプハウジングに連結された真空ポンプ作動機構を更に含む、請求項１に記載のサンプル採集装置。
【請求項５０】
前記真空ポンプ作動機構は、前記真空ポンプハウジングに枢動自在に連結された作動レバーである、請求項４９に記載のサンプル採集装置。
【請求項５１】
前記真空ポンプハウジングは一体的なハンドルを含み、前記ハンドルはその基部に枢動自在に連結された作動レバーと対峙している、請求項４９に記載のサンプル採集装置。
【請求項５２】
前記真空ポンプ手段は可撓性ダイヤフラム部材、および前記サンプル採集ハウジングに連結または一体化された一次真空チェンバから前記可撓性ダイヤフラム部材を引き離すポンプ作動手段を含む、請求項１に記載のサンプル採集装置。
【請求項５３】
真空ポンプハウジングを更に含み、前記一次真空チェンバが前記可撓性ダイヤフラム部材の近くで前記真空ポンプハウジング内に一体形成され、かつ前記サンプル採集ハウジングへ開放する連通ポートにまで延びている、請求項５２に記載のサンプル採集装置。
【請求項５４】
前記真空ポンプハウジングの取外し自在の流体リザーバ部材を更に含み、前記流体リザーバ部材はその内孔と前記連通ポート間に気体による結合を形成して前記流体リザーバ部材の内孔と前記一次真空チェンバとを気体により連結する一つまたは二つ以上の通気ポートを含む構成である、請求項５３に記載のサンプル採集装置。
【請求項５５】
乳房流体またはその成分の生体サンプル中の乳房疾患マーカを検出または定量化するために診断検定に使用するための生体サンプルを操作または処理する方法であって、
前記生体サンプルにアクセスするための一次開口を形成する上端、およびリザーバ外壁を有し、外壁とバイアルの内孔間を連通する一つまたは二つ以上の通気ポートを形成する前記外壁を有する流体保持リザーバ内に前記生体サンプルを提供または採取する工程を含む、生体サンプルを操作または処理する方法。
【請求項５６】
前記流体保持リザーバが前記生体サンプルを前記流体保持リザーバに導入した後にサンプル汚染および溢出を防止するために前記流体保持リザーバを閉鎖するための閉鎖手段を更に含む、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
前記閉鎖手段が前記流体保持リザーバの上端と密封係合するキャップである、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
前記閉鎖手段は、前記生体サンプルを前記流体保持リザーバに導入した後に前記通気ポートを密閉する二次閉鎖手段を更に含む、請求項５６に記載の方法。
【請求項５９】
前記二次閉鎖手段は、通気ポート開口を囲む前記流体保持リザーバの外壁に接着するように寸法設定且つ構成された接着シールまたはステッカーである、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
前記二次閉鎖手段が、前記流体保持リザーバの通気ポートを密封する二次閉鎖機構として機能すると共に、サンプル標識のための記入面を提供する標識テンプレートとして機能する閉鎖・標識兼用装置である、請求項５８に記載の方法。
【請求項６１】
前記二次閉鎖手段が、サンプル採集後、前記通気ポートを密封するため直接貼付できる閉鎖・標識兼用タブまたはステッカーを含み、通気ポート上に適用されて前記流体保持リザーバの外壁と並設または接着接触によるシールを形成する第一蓋形成面と、安定したインクまたはグラファイト印刷を施すのに適したブランクのテンプレート材により形成された、前記蓋形成面とは反対側の第二標識面とを有する、請求項５８に記載の方法。
【請求項６２】
前記第一蓋形成面が、水溶液との接触による剥離に抵抗する接着剤コーティングを有する、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
前記二次閉鎖手段が、第一開放形態で前記流体保持リザーバに予め取付けられ、かつサンプル採集後に手作業で第二閉鎖形態に変位させまたは操縦して前記通気ポートに対するシールまたは閉鎖を形成する閉鎖・標識兼用タブまたはステッカーを含む、請求項５８に記載の方法。
【請求項６４】
前記二次閉鎖手段は、開放形状に折り曲げられて、前記通気ポート近くで前記流体保持リザーバに取付けられた内層と、前記内層に折り重ねられた外層とを形成し、前記外層が第一蓋形成面および第二標識面を提供する接着タブまたは接着細片を含み、前記内層上から前記外層を展開して前記流体保持リザーバをラップすることによって、前記蓋形成面が前記通気ポートを覆って耐流体閉鎖を形成し、かつ前記標識面はサンプル・データの記録のために外方に対面している、請求項５８に記載の方法。
【請求項６５】
前記標識面と前記内層との接着係合によって、前記外層が前記内層に対して折重ね位置に選択的に固定される、請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
前記第一蓋形成面は、裏面に接着剤が塗布された外層の端セグメントを折り曲げることによって開放形態で保護される接着剤塗布面を有し、それにより前記蓋形成面が閉鎖前に接着剤を遮断する保護面を提供し、それにより前記端セグメントを持ち上げて外方へ引っ張ることによって前記端セグメントが展開して、前記蓋形成面上の接着剤コーティングが保護面から分離し、かつ前記通気ポートを閉鎖するために前記外層を前記内層から剥離する、請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】
前記流体保持リザーバは改良型細胞学用バイアルである、請求項５５に記載の方法。
【請求項６８】
前記液体保持リザーバは乳房流体採集装置のサンプル採集ハウジングの取外し自在の流体リザーバ部材を含む、請求項５５に記載の方法。
【請求項６９】
前記流体保持リザーバは、前記乳房流体採集装置のサンプル採集ハウジングの外側ケーシング部材に着脱自在に連結された剛性のサンプル採集管またはバイアルである、請求項６８に記載の方法。
【請求項７０】
前記流体保持リザーバは、前記サンプル採集ハウジングの外側ケーシング部材と着脱自在且密封可能に結合して前記外側ケーシング部材と気密結合を形成するように構成されている、請求項６９に記載の方法。
【請求項７１】
前記流体保持リザーバは、前記外側ケーシング部材と気密結合を形成するために、前記外側ケーシング部材と密封可能に連結できる細胞学用バイアルある、請求項７０に記載の方法。
【請求項７２】
前記液体保持リザーバは、前記外側ケーシング部材の内壁と前記流体リザーバ部材の外壁または上端または下端との間に実質的気密接触を形成するために、前記外側ケーシング部材内に実質的着脱自在に嵌め込むことができる、請求項７１に記載の方法。
【請求項７３】
前記流体保持リザーバの外壁は、円周方向の突起、フィンまたはＯ−リングを有する、請求項５５に記載の方法。
【請求項７４】
前記流体保持リザーバは、乳房流体採集装置のサンプル採集ハウジングの取外し自在の流体リザーバ部材を含み、かつ前記円周方向の突起、フィンまたはＯ−リングが前記乳房流体採集装置のサンプル採集ハウジングのケーシング部材の内壁と係合して円周方向の気密シールを形成するように構成されている、請求項７３に記載の方法。
【請求項７５】
前記乳房流体サンプルまたはその成分が全細胞または細胞断片を含む、請求項５５に記載の方法。
【請求項７６】
前記生体サンプルを移送するかまたは処理して前記乳房疾患マーカを検出または定量化するために、前記流体保持リザーバ内の前記生体サンプルにアクセスする工程を更に含む、請求項５５に記載の方法。
【請求項７７】
前記生体サンプルを処理して前記乳房疾患マーカを検出または定量化するために第二リザーバまたは他のサンプル容器またはテンプレートへ前記生体サンプルを移送する工程を更に含む、請求項７６に記載の方法。
【請求項７８】
前記生体サンプルを処理して前記乳房疾患マーカを検出または定量化することは、細胞学的マーカを検出するために前記生体サンプルからの細胞または細胞断片を細胞学的染料で染色する工程を含む、請求項７７に記載の方法。
【請求項７９】
前記生体サンプルからの染色された細胞または細胞断片の顕微鏡検査によって、前記乳房疾患マーカを検出または定量化するために前記生体サンプルを処理する工程を更に含む、請求項７６に記載の方法。
【請求項８０】
前記生体サンプルは、一次乳房流体サンプルの全乳房流体、全細胞、細胞断片、細胞膜、浄化蛋白質、バルク蛋白質、糖蛋白質、ペプチドおよびポリヌクレオチド成分から成る群から選択された一つまたは二つ以上の成分を含む、請求項５５に記載の方法。
【請求項８１】
前記乳房疾患マーカは乳癌マーカである、請求項５５に記載の方法。
【請求項８２】
前記乳房疾患マーカを、蛋白質、ペプチド、糖ペプチド、脂質、ＤＮＡポリヌクレオチドおよびＲＮＡポリヌクレオチドから成る群から選択する、請求項５５に記載の方法。
【請求項８３】
前記乳房疾患マーカを、Ｋｉ６７成長因子、Ｃｙｃｌｉｎ  Ｄ１、増殖細胞核抗原、トランスフォーミング成長因子組織プラスミノゲン活性化因子、インスリン成長因子レセプタ、コラゲナーゼ  タイプＩＶ，ラミニン・レセプタ、インテグリンス、ｐ５３、ｒｂ、ｎｍ２３、ｒａｓ、ｃ−ｍｙｃ、熱ショック・蛋白質、プロラクチン、ニュウロン−特異エノラーゼ、ＩＲ−１４、ＫＡ  １、ＫＡ  １４、α−ラクトアルブミンおよびアクチンから成る群から選択する、請求項５５に記載の方法。
【請求項８４】
前記乳房疾患マーカをＣＥＡ、ＨＭＦＧ、ＭＣＡ、バソプレッシンおよびカテプシンから成る群から選択する、請求項５５に記載の方法。
【請求項８５】
ＥＬＩＳＡ免疫検定、免疫沈降検定または固相免疫検定によって前記乳房疾患マーカを検出または定量化する工程を更に含む、請求項５５に記載の方法。
【請求項８６】
前記生体サンプルは乳房流体またはその成分のオキシトシン誘導サンプルを含む、請求項５５に記載の方法。
【請求項８７】
前記生体サンプルは、乳房流体の前記オキシトシン誘導サンプルからの全細胞または細胞断片を含む、請求項８６に記載の方法。
【請求項８８】
乳房流体の生体サンプルを採集、操作および処理するための乳房流体採集リザーバであって、
乳房流体サンプルを採集し且つこれにアクセスするための一次開口を形成する上端と、その下端で閉鎖したリザーバ内孔を形成する円筒状外壁とを有する剛性管またはバイアルを含み、前記外壁が前記外壁と前記バイアルの内孔間を連通する一つまたは二つ以上の通気ポートを形成している、乳房流体採集リザーバ。
【請求項８９】
前記乳房流体採集リザーバは、乳房流体採集装置のサンプル採集ハウジングの取外し自在の流体リザーバ部材を含む、請求項８８に記載の乳房流体採集リザーバ。
【請求項９０】
前記乳房流体採集リザーバは、乳房流体採集装置のサンプル採集ハウジングの外側ケーシング部材と着脱自在に連結された剛性サンプル採集管またはバイアルを含む、請求項８９に記載の乳房流体採集リザーバ。
【請求項９１】
前記乳房流体採集リザーバは、気密結合を形成するために、前記サンプル採集ハウジングの外側ケーシング部材と着脱自在且つ密封自在に連結できる構成である、請求項９０に記載の乳房流体採集リザーバ。
【請求項９２】
前記乳房流体採集リザーバは、気密結合を形成するために、前記外側ケーシング部材と密封可能に連結できる細胞学用バイアルである、請求項９１に記載の乳房流体採集リザーバ。
【請求項９３】
前記乳房流体採集リザーバは、前記外側ケーシング部材の内壁と前記流体リザーバ部材の外壁または上端または下端との間に実質的気密接触を形成するために、前記外側ケーシング部材内に実質的着脱自在に嵌め込むことができる構成である、請求項８９に記載の乳房流体採集リザーバ。
【請求項９４】
前記乳房流体採集リザーバの外壁は、円周方向の突起、フィンまたはＯ−リングを有する、請求項８９に記載の乳房流体採集リザーバ。
【請求項９５】
乳房流体サンプルは、サンプル汚染および溢出を防止するために、前記乳房流体採集リザーバに導入された後前記乳房流体採集リザーバを閉鎖する閉鎖手段を更に含む、請求項８８に記載の乳房流体採集リザーバ。
【請求項９６】
前記閉鎖手段は前記乳房流体採集リザーバの上端と密封可能に係合して前記一次開口を密閉するキャップを含む、請求項９５に記載の乳房流体採集リザーバ。
【請求項９７】
前記閉鎖手段は一つまたは二つ以上の前記通気ポートの蓋を構成する二次閉鎖手段を含む、請求項９５に記載の乳房流体採集リザーバ。
【請求項９８】
前記閉鎖手段は、前記通気ポートでまたはそれを囲む前記流体リザーバ部材の外壁に係合または接着する寸法および構成のプラグ、キャップまたは接着カバーから選択された二次閉鎖装置を含む、請求項９７に記載の乳房流体採集リザーバ。
【請求項９９】
前記二次閉鎖手段は、前記乳房流体採集リザーバの通気ポートを密封する二次閉鎖機構として機能すると共に、サンプル標識のための記入面を提供する標識テンプレートとして機能する閉鎖・標識兼用装置である、請求項９５に記載の乳房流体採集リザーバ。
【請求項１００】
前記二次閉鎖手段は、サンプル採集後、前記通気ポートを密封するために直接貼付できる閉鎖・標識兼用タブまたはステッカーを含む、請求項９９に記載の乳房流体採集リザーバ。
【請求項１０１】
前記閉鎖・標識兼用タブまたはステッカーは、前記通気ポート上に適用されて、前記乳房流体採集リザーバの外壁と並設または接着接触によってシールを形成する第一蓋形成面と、安定したインクまたはグラファイト印刷を施すのに適したブランクのテンプレート材により形成された、前記蓋形成面と反対側の第二標識面とを有する、請求項１００に記載の乳房流体採集リザーバ。
【請求項１０２】
前記二次閉鎖手段が、第一開放形態で前記流体リザーバ部材に予め取付けられ、かつサンプル採集後に手作業で第二閉鎖形態に変位させまたは操縦して前記通気ポートに対するシールまたは蓋を形成してサンプル標識のための露出した記入面を提供する、請求項９９に記載の乳房流体採集リザーバ。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の技術分野
本発明は乳房分泌流体（または乳房流体と言う（ｍａｍｍａｒｙ ｆｌｕｉｄ））から生体サンプルを採取しかつ検定する方法、装置およびキットに関する。具体的には、本発明は、感染症、前癌状態、癌罹患性および癌を含む乳房疾患を評価、診断および管理するために女性被験者の乳腺から流体および細胞学的サンプルを採取かつ検定する方法、装置およびキットに関する。
【０００２】
関連出願
本願は２０００年１１月１３日付けＱｕａｙの米国仮特許出願第６０／２４８，１３４号および２０００年１１月１３日付けＱｕａｙの米国仮特許出願第６０／２４８，１３６号の優先権を主張する。上記優先権出願のそれぞれの開示内容は参考として本願明細書に組み入れられる。
【０００３】
発明の背景
乳癌は女性に見られる癌の最も一般的な形態であり、癌による死亡の原因としては２番目に位置する。乳癌の診断と治療が近時飛躍的に進歩しているにもかかわらず、この疾病の罹患率は１９４０年以来、毎年約１％の割合で上昇しつつある。今日、北米に住む女性が生涯に乳癌を発生する確率は１／８である。
【０００４】
乳房撮影が普及するようになって、乳癌が発見され易くなっている。にもかかわらず、乳癌による死亡率は女性１０万人につき約２７件であり、依然として高い。発見された時点で既に進行した段階にあり、治療法の選択も生存率も厳しく制限される場合が多い。そこで、小さい（直径２ｃｍ以下）初期段階の乳房癌腫を発見する、より感度の高い確実な方法が必要とされる。このような方法なら、子宮頚癌を早期に発見して治療するのに採用されて成功を収めたパパニコラウスミアによって示唆されるように、乳癌生存率を著しく改善するに違いない。
【０００５】
早期発見の問題に加えて、乳房疾病が悪性か良性かの弁別、乳癌の病期分類、乳癌のタイプ分け（エストロゲン依存か、非エストロゲン依存か）の重大な問題が残されている。乳癌の検出、病期分類、タイプ分類のより有効な方法を開発するため、最近は有望な一連のいわゆる癌“マーカ”に注目が集まっている。癌マーカは典型的には癌性細胞によって（例えば、細胞表面または分泌蛋白質として）特有の形で発現されるか、または癌性細胞によって正常な細胞よりも多くまたは少なく発現される蛋白質である。癌マーカとして、このほかに、特定形態の癌と関連して遺伝子発現のパターンまたはレベルにおける有害な遺伝的変化をマークする特異なＤＮＡまたはＲＮＡが挙げられる。
【０００６】
今日までに多種多様な乳癌マーカが確認されており、その多くが予後および／または治療に関する変量を決定する上で重要な価値を有することが判明している。予後変量とは、例えば、再発または生残の可能性や時期というような疾病の成り行きを予告するのに役立つ変量である。治療に関連する変量は所与の治療計画の成功または不成功の可能性を予告する。明らかに両方の機能を果たす乳癌マーカがある。例えば、エストロゲン・レセプタ・レベルは治療とは無関係に、乳癌患者の再発および生残を予告し、内分泌治療に対する反応をも予告する。Ｐｅｒｔｓｃｈｕｋ ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ ６６：１６６３−１６７０， １９９０； Ｐａｒｌ ａｎｄ Ｐｏｓｅｙ， Ｈｕｍ． Ｐａｔｈｏｌ． １９：９６０−９６６， １９８８； Ｋｉｎｓｅｌ ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ４９：１０５２−１０５６， １９８９； Ａｎｄｅｒｓｏｎ ａｎｄ Ｐｏｕｌｓｏｎ Ｃａｎｃｅｒ ６５：１９０１−１９０８， １９８９．
スクリーニングと診断、病期分類とタイプ分類，モニタリングおよび／または治療を目的とする特定の乳癌マーカの有用性は、問題のマーカの性質と活性に応じて異なる。乳癌マーカの概説については下記論文を参照されたい。Ｐｏｒｔｅｒ−Ｊｏｒｄａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｈｅｍａｔｏｌ． Ｏｎｃｏｌ． Ｃｌｉｎ． Ｎｏｒｔｈ Ａｍｅｒ． ８：７３−１００， １９９４； ａｎｄ Ｇｒｅｉｎｅｒ， Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｔｅｃｈ．， Ｍａｙ， １９９３， ｐｐ．２８−４４．  これらの論文に反映されているように、乳癌マーカの開発に当たっては、第一に、腫瘍形成、腫瘍成長および癌侵襲のオーバーラップ領域に焦点が当てられた。腫瘍形成と腫瘍成長は（例えば、Ｋｉ６７、サイクリンＤ１および増殖細胞核抗原（ＰＣＮＡ）のような）種々の細胞増殖マーカを使用して検定することができ、これらのマーカのうちの幾つかは重要な癌遺伝子でもあり得る。腫瘍成長は種々の成長因子やホルモン・マーカ（例えば、エストロゲン、表皮成長因子（ＥＧＦ）、ｅｒｂＢ−２、トランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ））を使用して評価することができ、これらは癌細胞中で発現の変化を示したり、活性の変化を示す可能性がある。同様に、自己分泌または外分泌成長因子およびホルモンのレセプタ（例えば、インスリン成長因子（ＩＧＦ）レセプタ、およびＥＧＦレセプタ）も腫瘍成長と関連して発現または活性の変化を示す可能性がある。最後に、腫瘍成長は新しい血管の生成と成長およびこれに付随する血管新生因子の発現を伴う血管形成によって支えられ、血管新生因子は腫瘍形成および腫瘍成長のマーカとして利用することができる。
【０００７】
腫瘍形成、増殖および成長マーカの他にも、癌細胞ポピュレーションの侵襲性および／または転移潜在性のインジケータとして利用できる多数のマーカが確認されている。これらのマーカは一般に癌細胞とこれを取巻く微環境との相互作用の変化を反映する。例えば、癌細胞が侵襲性であるか、または転移性であれば、細胞粘着または運動因子の発現や活性に変化が現れ、これらの因子の例としては、癌マーカであるカテプシンＤ、プラスミノゲン活性化因子、コラゲナーゼ、およびその他の因子が挙げられる。さらに、幾つかの腫瘍 “抑制” と推定される遺伝子（例えば、ｎｍ２３、ｐ５３、ｒｂのような）の発現の増減は予後経過の芳しくないことを予測させる潜在的転移の増大または成長の緩和に関連する。
【０００８】
これら種々の分類に含まれるその他の代表的な乳房疾患マーカとして、プロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）；エストロゲンによって調節されるｐＳ２のような蛋白質；インターロイキン（例えば、ＩＬ−１０）；ビメンチン；上皮抗原；前立腺特異抗原（ＰＳＡ）；ｂｃｌ−２；ＣＡ１５−３；（多形型上皮ムチンの異常形態）；ＣＡ１９−９；ムチンコアカルボハイドレイト（例えば、Ｔｎ抗原およびＴｎ−類似抗原）；α−ラクトアルブミン；脂質関連シアル酸（ＬＡＳＡ）；ガラクトース−Ｎ−アセチルガラクトースアミン（Ｇａｌ−ＧａｌＮＡＣ）；ＧＣＤＦＰ−１５；Ｌｅ（ｙ）−関連カルボハイドレイト抗原；ＣＡ１２５；ウロキナーゼ−タイプのプラスミノゲン活性化因子（ｕＰＡ）およびｕＰＡ関連抗原および複合因子（例えば、ＬＭＷ−ｕＰＡ、ｕＰＡ  Ｎ末端断片（ＡＴＦ），ｕＰＡレセプタ（ｕＰＡＲ）およびＰＡｌ−１やＰＡｌ−２のような抑制因子との複合因子；β−グルクロニダーゼ；ＣＤ３１；ＣＤ４４スプライス変異体；血液型抗原（例えば、ＡＢＨ，ルイス、およびＭＮ）；および遺伝的な損傷または変化発現レベルのＣＣＮＤ１、ＥＭＳ１、ＢＲＣＡ１およびＢＲＣＡ２遺伝子が挙げられる。
【０００９】
要約すれば、多々ある癌マーカのうち、増殖マーカ、癌遺伝子、成長因子および成長因子レセプタ、血管新生因子、プロテアーゼ、接着因子および腫瘍抑制遺伝子は患者における癌の危険、存在、現状または将来の動向に関する重要な情報を提供することができる。これらの癌マーカの一つまたは二つ以上の存在、または発現または活性のレベルを測定することは、例えば、悪性の異常を良性の異常から弁別することによって、不確かな臨床的異常を有する患者に対して差異ある診断を下すのに役立つ。また、明らかに悪性腫瘍を有する患者の場合には、癌マーカは将来の再発の危険性を予告し、または選択された治療コースに対する特定患者の反応可能性を予告するのに有用である。極めて特異的な癌マーカまたはその組合せを分析することによってさらに具体的な情報を得ることができ、この情報に基づいて、特定医薬または治療法に対する患者の反応性を予告することができる。
【００１０】
癌マーカを検出および測定する方法は免疫検定、特に、モノクローナル抗体技術を利用する検定の開発によって、最近革命的な進歩を遂げた。これまで、多くの癌マーカは従来の生化学的検定方法を利用して検出または測定する意外に方法はなく、従来の方法では大きい試験サンプルが必要であり、従って、大抵の臨床用には不適当である。これに反して、現代の免疫検定技術は、特に、目標とするマーカ蛋白質を具体的に認識するモノクローナル抗体を利用する場合、極めて小さいサンプルで癌マーカを検出および測定することができる。従って、今日では、従来の生検法を介して得られた乳房組織サンプルを免疫組織化学的に染色することによって、任意の癌マーカの存否、レベル、または活性について検定するのが主流となっている。免疫組織化学的染色は極めて敏感な手法であるから、従来の生検サンプルと比較して、侵襲性のサンプル採取方法を必要としない比較的小さい針生検サンプルで、癌マーカの検出および測定に利用して成果を挙げている。このほかにも種々の免疫検定法が開発されており、非細胞サンプル、例えば、患者からの血清および他の生物学的流体で癌マーカの検出および測定を可能にすることが知られている。このような種々のサンプル供給源を利用することにより、従来の生検サンプルを使用する方法と比較して、罹患率と検定コストが著しく軽減され、癌マーカ検定を早期のスクリーニングに利用でき、侵襲性の生検方法を必要としない低リスクのモニタリング・プログラムが可能になる。
【００１１】
乳癌評価に従来生検サンプルまたは針生検サンプルを使用することは多くの場合好ましくない。何故なら、この検定の主目的は触知可能な、または乳房撮影検出可能な腫瘍段階まで進行する前に癌を検出することにある。この段階より前に生検を行うことは禁止されるのが普通であり、生検サンプルを使用して早期スクリーニングや低危険・モニタリングを行うことは許容できない。従って、例えば血清採取による生検よりも侵襲性の少ない手段、乳癌マーカ検定を可能にするサンプルを得ることが当分野におけるニーズである。
【００１２】
主な理由として、血清では目標のマーカを検出できないか、または血清ではマーカのレベルまたは活性の明確な変化をモニターできないため、乳癌マーカ検定に血清サンプルを利用しようという試みは目立った成果を挙げていない。しかも、血清中に乳癌マーカが存在するとすれば、恐らく微少転移の時であり、転移前の疾病検出には、血清検定の有用性は低い。これに反して、乳腺そのものに含まれる流体は、具体的にはすべての乳癌の８０％−９０％が乳腺の腺管内上皮の内部に発生することから判断して、血清よりもはるかに高く、且つ生物学的に関連性の濃いレベルの乳癌マーカを含有することが期待される。乳腺の管内の流体は肺胞管系周囲細胞から分泌される、またはこれらの細胞に作用する流体に匹敵するホルモン、成長因子およびその他の潜在的マーカの混合濃縮成分を含有すると期待される。同様に、乳房流体、即ち、乳房分泌流体は、その液状部分では検出できない細胞内または細胞表面のマーカを評価するために細胞学的または免疫学的検定に利用できる細胞および固体状細胞断片または生成物を含有すると期待される。
【００１３】
乳房流体サンプルを利用する非侵襲性乳癌マーカ検定を開発する従来の試みには、自然発生的に乳頭から乳房流体を放出する患者から得た乳房流体の研究が含まれている。これらの研究の一例がＩｎａｊｉ ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ ６０：３００８−３０１３， １９８７であり、乳癌マーカである癌胎児性抗原（ＣＥＡ）のレベルが従来の酵素結合免疫検定（ＥＬＩＳＡ）およびサンドイッチ・タイプの免疫検定法を利用して測定された。これらの方法は成功裡に、且つ再現可能に、自然発生的に放出される乳房流体中のＣＥＡレベルが、触知不能な乳癌の敏感なインジケータを提供することを実証した。これに続く同じくＩｎａｊｉ ｅｔ ａｌ．による研究 Ｊｐｎ． Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｏｎｃｏｌ． １９：３７３−３７９， １９８９において、ＣＥＡ検出に、さらに敏感なドライケミストリー、ドット−免疫結合検定を採用して上記の成果がさらに広げられた。この論文（１９８９）は、触知可能な乳房腫瘍を有する被験者の４３％において、かつ触知不能な乳房腫瘍を有する被験者の７３％においてＣＥＡレベルが上昇したことを報告している。放出された乳房流体中のＣＥＡレベルは腫瘍内ＣＥＡレベルと高い相関関係にあり、乳癌細胞によるＣＥＡ発現レベルが乳房流体中のＣＥＡ含有量に密接に反映されることを示唆した。これらの結果に基づき、上記研究者等は、自然発生的に放出される乳房流体中のＣＥＡを免疫検定することが、触知不能な乳癌のスクリーニングに有用であると結論した。
【００１４】
乳房流体の評価が自然発生的な乳頭放出を経験する女性の触知不能な乳癌をスクリーニングするのに有用な方法であることは実証されたが、このような放出を経験する女性は稀であり、Ｉｎａｊｉ ｅｔ ａｌ．の方法を、早期乳癌スクリーニングの志願者である大多数の女性に応用することはできない。また、引用した第一Ｉｎａｊｉ論文は、自然発生的な乳頭放出を経験した患者の一部は１０μｌ以下の乳房流体を分泌するに過ぎず、この研究が採用するＥＬＩＳＡおよびサンドイッチ免疫検定にとっては低すぎるレベルである。他の癌マーカの検定に使用される他の抗体はＩｎａｊｉとその協力者が使用する抗ＣＥＡ抗体よりも感度が低く、自然発生的に放出される乳房流体の小さいサンプルのドライケミカル免疫検定に使用するには不適当または感度不足である可能性がある。
【００１５】
上記の問題点に鑑み、癌を含む乳房疾病の評価、診断、および対処または管理、特に、初期の触知不能な乳房腫瘍のスクリーニングに利用される生体サンプルを得るための、より広い目的に利用できる非侵襲性の方法および材料に対する切実な需要が存在する。これに関連して、特に、選択された乳癌マーカ、または乳癌マーカのパネルを検出または測定することにより、乳房疾患を評価、診断、かつ管理して、極めて具体的な癌の予後徴候および／または処置に関する情報を提供し、前癌状態、癌に罹る可能性、乳房感染症およびその他の乳房疾病を診断しかつ管理するために、そのようにして容易に得られる生体サンプルを利用する方法及び材料に対して需要が存在する。
【００１６】
発明の概要
従って、本発明の課題は、乳房の疾病、特に癌を評価し、診断し、かつ管理するための検定に使用できる生体サンプルを採取する非侵襲性の方法およびキットを提供することにある。
【００１７】
本発明の他の課題は、広範囲の患者に広く適用でき、早期の触知不能な乳房腫瘍のスクリーニングに有用な検定方法およびキットを含む検定方法及びキットにおいて上記課題を達成することにある。
【００１８】
本発明のさらに他の課題は、乳癌マーカのような任意の乳房疾患マーカ、または乳癌マーカのパネルを検出かつ／または測定することによって乳房疾病、特に乳癌を評価し、診断し、かつ管理して、極めて具体的な予後および／または処置に関する情報を臨床医に提供するために上記生体サンプルを利用する方法およびキットを提供することにある。
【００１９】
本発明は、詳しくは後述するように、女性患者の乳房から生体サンプルを得るための非侵襲性の方法および装置を提供することによって上記およびその他の課題を達成する。固相サンプル採集媒体と流体により連結される（即ち、直接的または間接的連結によって）本発明による新規な特殊乳房ポンプ装置を使用することにより、医師は迅速且つ非侵襲的に、付加的介入を必要とすることなく、乳分泌の有無に関係なく女性患者から乳房流体サンプルを採集することができる。本発明の乳房流体採集方法では、乳房ポンプ装置、即ち、乳房ポンプ装置を使用して、乳房流体表出を刺激または増長する有効量のオキシトシンまたはオキシトシン類似物を投与してもよい。オキシトシンまたはオキシトシン類似物（例えば、カルベトシンのような長時間に亙って作用するオキシトシン類似物）を目標である乳房の肺胞管組織に到達し（例えば、鼻腔から）、かつこれを刺激する方法および量で投与することにより、オキシトシンが肺胞管組織の筋上皮収縮を刺激して乳房流体表出を誘発または促進する。他の方法として、オキシトシンは筋肉内または静脈内注射により、鼻腔内投与の場合と同様の筋上皮収縮反応を達成できる。オキシトシン投与の量、タイミングおよび／または形態は、月経サイクルの段階、バスコントロールまたはホルモン補充療法を利用しているかどうか、初経年齢、民族性、および個別患者の乳房流体表出に影響する他の要因等のファクタによって、個々の患者毎に調節されてよい。
【００２０】
本発明の乳房流体採集装置は単独で、またはオキシトシン刺激との併用でサンプル採集のために乳房流体圧搾または表出を誘発するのに効果的である。本発明の装置は乳頭を覆うように乳房に取り付けられ、かつ典型的には、表出した乳房流体を直接的に受ける特殊乳房ポンプである。乳房ポンプの使用を伴う好ましい方法において、負圧を乳房上に発生させて乳房流体の表出を誘発し、必要に応じて、予めまたは同時的にオキシトシンを投与することにより表出を促進する。さらに他の方法において、乳房ポンプの助けを借りずに乳房流体を圧搾して採集することができ、この場合に、オキシトシンの投与量を増やすか、乳房流体が乳頭から完全に表出するまで投与後時間を長くする必要がある。
【００２１】
乳房流体表出時または表出後に、表出した乳房流体から生体サンプルを採集するが、このサンプルは全乳房流体、全細胞、細胞断片、細胞膜、選択された液体、細胞、または乳房流体の他の固形部分、および蛋白質、糖蛋白質、ペプチド、ヌクレオチド（ＤＮＡおよびＲＮＡポリヌクレオチドを含む）および乳房流体の他の生化学的および分子成分で構成される。
【００２２】
サンプル採集は、普通のサンプル貯蔵容器や検定容器のような適当なリザーバ内に圧搾された乳房流体を単に受けることにより達成される。本発明の好ましい実施形態では、乳房流体表出と同時または表出に続いて、乳房流体を固相サンプル採集媒体に露出させる。この観点で、適宜固相媒体として、顕微鏡観察用スライドガラス、毛細管、被覆管、マイクロタイター・ウェルまたはプレート、膜、フィルタ、アフィニティカラム、ドットブロット・マトリックス、ビーズ、微小球、樹脂、および選択的に吸着、結合、濾過、分配または分離する（ｐａｒｔｉｔｉｏｎ）他の同様媒体、または所望検定に適宜組み合わせるための乳房流体の所望プロセス成分が含まれる。時には、サンプル採集のための複数の固相媒体、例えば、フィルタと膜、膜と粒状媒体等を組み合わせることによって、乳房流体の所要成分を別々に分配かつ吸着することが望ましい。
【００２３】
サンプル採集に関連して、サンプルを安定させるか、または所望検定での処理のためにサンプルを調製するために、緩衝剤、希釈剤、抽出、クロマトグラ媒体、架橋剤、変性剤等の他の薬剤にサンプルを暴露させてよい。
【００２４】
このように、本発明は患者から生体サンプルを採取しかつ／または乳房流体から生体サンプル中の乳房疾患マーカ量を測定する方法および装置を提供し、この方法および装置は新規の乳房ポンプまたは乳房ポンプ・アダプタを採用する。本発明による乳房ポンプは従来の乳房ポンプと同様に機能するが、ポンプと流体により連結される（ｆｌｕｉｄｌｙ ｃｏｎｎｅｃｔｅｄ）固相サンプル採集媒体を有する。固相サンプル採集媒体は乳房ポンプ内に一体化するか、またはポンプに液体を介して連結させることにより、典型的にはポンプを乳房に当てたまま、圧搾された乳房流体のサンプルを該採集媒体と接触させるようにする。さらに詳しくは、この新規乳房ポンプを採用する本発明の方法は、予めオキシトシンまたはカルベトシンを投与するか、または投与せずに乳房流体表出を刺激するために乳房ポンプを適用する工程を含み、その際に固相サンプル採集媒体は乳房ポンプの乳房係合部または乳房係合部材と液体により連結される。
【００２５】
上記の方法によれば、典型的にはポンプが乳房に当てられたままの状態で、ポンプの作動によって、圧搾される乳房流体サンプルが固相サンプル採集媒体と接触する。上記方法の他の実施形態として、新規の手持型もしくは携帯用の乳房ポンプ装置を利用する方法が提供される。この場合、乳房流体サンプルを採集する医師、技師または患者自身が一方の手で手持型ポンプを操作して乳房流体表出を刺激して乳房流体サンプルを採集しながら、もう一方の手で別の作業を行うことができる。手持型ポンプはコンパクトであるから、片手で操作して乳房係合要素を乳房に係合させ、真空ポンプを手動操作して乳房に真空圧を作用させることにより、乳頭またはその近傍から適当量の乳房流体を表出させ、同時に少なくとも表出した乳房流体の一次サンプルを固相サンプル採集媒体上にまたはその内部に採集し、その際に乳房から装置を取外したりまたは操作に両手を使う補足的な手作業工程または必要はない。
【００２６】
本発明の他の採集方法では、汎用または手持型乳房ポンプを使用して圧搾した乳房流体を、表出と同時にまたはその後に、希釈、濾過、洗浄、固定剤または他の処理剤と混合するか、さもなければ表出した流体中にもともと存在する細胞、蛋白質および／またはその他の特定成分を部分的または全面的に除去した採集流体サンプルを採取するために処理または改変して、実験室分析に必要な処理済み流体サンプルが提供される。他の実施形態では、乳房流体の粒状成分、例えば、細胞、細胞成分および／または細胞断片を、例えば、細胞学的検査のため、処理および／または変性後に採集する。この観点から、場合によっては、一次サンプル採集および／処理は、乳房係合部材と液体により連結する一つまたは二つ以上の固相採取媒体との接触と同時進行する。使用する媒体の種類によっては、補足的な処理工程や患者の乳房からの乳房係合部材取外しを必要とせずに、手持型ポンプの操作だけで直接一次サンプル処理を行うことができる。
【００２７】
本発明の他の方法では、一次サンプル処理に、乳房流体表出に続く補足的工程を伴う。実施例によっては、乳房流体が表出た後、乳房係合部材を乳房から取外し、乳房流体を、典型的には膜またはフィルタから成る第１固相サンプル採集媒体へ移す。サンプル採取のこの初期または一次工程で、選択された乳房流体成分（例えば、蛋白質、カロボハイドレイト，細胞、細胞断片）を洗浄するか、または第１固相サンプル採集媒体（例えば、ニトロセルロース膜）から例えば流体収容リザーバのような第２固相媒体へ、選択された乳房流体成分（例えば、蛋白質、カロボハイドレイト、細胞、細胞断片）を手作業で移すステップが続く。典型的には、これに関連して、予備サンプル処理が行われ、続いて貯蔵するか、またはさらにサンプル処理および分析のために実験室へ出荷するために、採集サンプルが最終的にパッケージされる。一例として、全細胞またはその他の細胞物質は、乳房係合部材もしくはサンプル採集ハウジングに取付けられた固定式または取外し自在の支持部材を介して係合部材と液体により連結されるニトロセルロース膜またはフィルタ上へ圧搾された乳房流体から分離される。次いで、細胞は流体（例えば、細胞学的液体）で洗浄されるか、または第２固相サンプル採集媒体、例えば乳房係合部材またはサンプル採集ハウジングに連結または一体化された取外し自在の流体リザーバへ移送される。
【００２８】
上記方法に関連して、本発明の実施例の詳細な説明で述べるように、種々のサンプル採集装置および付属品が使用される。典型例として、本発明の乳房流体採集装置は、患者の乳房の少なくとも乳頭部を受け、これとの間に吸引シールを形成するように寸法および形態の無孔材料で構成された乳房係合部材を含む。表出した乳房流体サンプルを受けるために一つまたはそれ以上の固相のサンプル採集媒体が乳房係合部材と流体により連結するように設けられる。乳房係合部材から負圧を発生して乳房流体表出を促進するために真空ポンプ手段が乳房係合部材と気体により連結するようにを設けられる。
【００２９】
本発明の採集装置の特定実施形態では、サンプル採集ハウジングが乳房係合部材と液体により連結される。固相サンプル採集媒体は、場合によって、乳房係合部材を乳房に当てて真空ポンプ機構によって負圧を発生させる時、乳頭近傍で、ハウジング内に取外し自在に支持される。固相サンプル採集媒体は、一つまたは二つ以上の顕微鏡観察用スライドカラス、毛細管、採集管、カラム、マイクロカラム、ウェル、プレート、膜、フィルタ、樹脂、無機マトリックス、ビーズ、粒状クロマトグラフ媒体、プラスチック微粒子、ラテックス粒子、被覆管、被覆テンプレート、被覆ビーズ、または被覆マトリックスであってよい。
【００３０】
乳房流体採集装置の選択的特徴は前記サンプル採集ハウジングを前記乳房係合部材と着脱自在に連結する着脱自在な連結手段を含む。他の実施形態として、固相サンプル採集媒体は、前記乳房係合部材と流体により連結されるサンプル採集ハウジング内に一体的または着脱自在に取付けた支持部材によって支持されてよい。本発明に使用するために、使い捨てまたは再使用可能なディスク、カートリッジ、カセットを含む種々の支持部材が付属品として設けられる。さらに他の実施形態として、乳房係合部材に対して固相サンプル採集媒体を往復移動自在に位置調節するための往復動機構が設けられる。往復動機構は乳房係合部材に対して往復動自在に設けた支持部材またはキャリヤを含み、この支持部材またはキャリヤが固相サンプル採集媒体を支持する。さらに他の実施形態では、本発明装置の選択的特徴は、乳房流体サンプル採取のために本発明の概念を採用しかつ従来乳房ポンプに組み合わせて使用できる乳房ポンプ・アダプタを含む。
【００３１】
本発明の他の実施形態では、サンプル採集装置は、乳房係合部材および真空ポンプ機構を組合わせた、片手で操縦かつ操作できる構造的に一体化されたコンパクトな乳房流体採集装置にした手持型もしくは携帯用の乳房ポンプである。実施例によっては、携帯用乳房ポンプは、複数の部品で形成されたモジュール装置であり、複数の部品が一体構造に相互に結合または固定され、かつ操作、洗浄、修理および／または保管を促進するために、一部または全部を残余の構成部品から分解できるものである。モジュール型乳房ポンプは、洗浄のために、または患者ごとに異なる乳房の解剖学的差異に対応させるために異なる係合部材と相互交換できるように、一つまたは二つ以上の構成部品から取外すことができる分離した乳房係合部材を含んでよい。
【００３２】
携帯用乳房ポンプの詳細な実施形態として、固相のサンプル採集媒体は、乳房係合部材と流体により連結するように着脱自在に取付けられる支持部材によって支持できる。支持部材は、乳房係合部材と流体により連結される着脱自在に取付けられる着脱自在のカセットであってよい。支持部材は上記サンプル採集媒体のいずれかを収容することができ、かつ乳房係合部材と携帯用乳房ポンプのサンプル採集ハウジング部材との間を真空圧および／または乳房流体サンプル物質が通過するための、支持部材の本体を貫通する一つまたは二つ以上のエア・チャンネルを含んでよい。
【００３３】
他の実施形態において、手持型ポンプ装置が支持部材またはサンプル採集ハウジング部材と一体化または流体により連結して流体を保持する流体保持凹部、ウェルまたはリザーバをも含む。流体保持凹部、ウェルまたはリザーバを、乳房流体および／またはその組成分を受けるためサンプル採集ハウジング内に一体的に形成された区画室または包囲体として構成することができる。これに代わる実施形態として、流体保持凹部、ウェルまたはリザーバは、サンプル採集ハウジングの取外し自在の流体リザーバ部材を含み、典型的には、前記ハウジングの外側ケーシング部材に着脱自在に連結された剛性のサンプル採集管またはバイアルとして提供される。取外し自在の流体リザーバ部材は前記ハウジングの外側ケーシング部材に選択により密封可能に連結されて、それと気密結合を形成する。特定実施形態において、バイアルが外側ケーシング部材へ入れ子式に嵌め込まれる際に、外側ケーシング部材の壁またはその他の面と係合して気密シールを形成する円周方向突起、フィン、またはＯ−リングを有する。
【００３４】
さらに他の実施形態において、取外し自在の流体リザーバ部材はサンプル採集を促進するために気体および流体により乳房係合部材に連結される。例えば、真空ポンプ手段からの真空圧が前記ハウジングの取外し自在の流体リザーバ部材を介して乳房係合部材に送られる。取外し自在のリザーバ部材は、該流体リザーバ部材の内孔と真空ポンプ手段との間に気体による結合を形成する一つまたは二つ以上の通気ポートを含むように改良されている。該流体リザーバ部材は、この関係で、乳房へ真空圧を伝達する導管として、かつ圧搾または表出した流体を直接採集する流体サンプル物質の受容器として、または一次固相サンプル採集媒体から受容器へ洗浄または移送された一次採集サンプル物質を受けるための二次採集媒体として機能してよい。例えば、乳房係合部材および取外し自在の流体リザーバ部材を取外したり分解したりせずに、その後に該リザーバ部材へ直接または間接的に洗流または移送される一つまたは二つ以上の乳房流体成分の一次サンプルを採集するように、乳房係合部材に流体により連結される一次固相サンプル採集媒体を配置することができる。
【００３５】
流体採集リザーバは乳房流体または乳房流体成分サンプルの採集、および採集された乳房流体または乳房流体成分サンプルの保管、輸送および／または処理と言う二重目的に寄与することができる。この目的に関連して、取外し自在のリザーバ部材は、サンプル採集完了後にサンプルの汚染や溢出を防止するために該リザーバを閉鎖する閉鎖手段を更に含む。閉鎖手段は、取外し自在の流体リザーバ部材の上端と密封可能に係合するように構成されたキャップを含む。該流体リザーバ部材は、該リザーバの内孔と真空ポンプ手段との間に真空圧を伝達するための一つまたは二つ以上の通気ポートを含むように改良され、閉鎖手段はサンプル採集後に通気ポートを密閉するための二次閉鎖手段を含む。例えば、二次閉鎖手段は、通気ポートを囲繞する流体リザーバ部材の外壁に接着するように寸法設定され且つ構成された接着シールまたはステッカーを含んでよい。典型的には、二次閉鎖手段は取外し自在の流体リザーバの通気ポートを密封する二次閉鎖機構きして、かつサンプル標識のための記入面を提供する標識テンプレートとしても機能する閉鎖・標識兼用装置を含む。閉鎖・標識兼用タブまたはステッカーは、通気ポート上に適用されて取外し自在の流体リザーバの外壁に並設または接着接触することによりシールを形成する第一蓋形成面、および安定したインクまたはグラファイト印刷を施すのに適したブランクのテンプレート材により形成される、第一蓋形成面とは反対側の第二標識面を含む。更に詳細には、二次閉鎖手段は、第一開放形態で取外し自在のリザーバ部材に予め取付けられ、かつサンプル採集後に手作業で第二閉鎖形態に変位させるかまたは操作することによって通気ポートに対するシールまたは蓋を形成することができる閉鎖と標識に兼用できるタブまたはステッカーを含む。
【００３６】
本発明に関係する特徴として、新規の乳房流体採集リザーバ、例えば改良型細胞学用バイアルは、本発明の乳房流体採集装置に使用するために提供され、このリザーバはサンプル採集ハウジングの取外し自在の流体リザーバ部材に関して上述した構成要件を備える。この新規採集リザーバは本発明の乳房流体採集方法に有用であると共に、乳房流体採集に続く実験室でのサンプル処理および診断検定方法にも有用である。
【００３７】
本発明に関係する特徴として、女性患者の乳房器官から採取した生体サンプル中の乳房疾患マーカ、好適には乳癌マーカの存在または量を決定する方法が提供される。これらの方法は、女性患者の乳房流体表出を刺激するのに効果的な量で患者にオキシトシンまたはオキシトシン類似物の鼻腔内、筋肉内または静脈内投与を伴ってもよい。投与後、オキシトシンが目標とする肺胞管組織に達し、これを刺激するのに充分な時間が経過したところで、乳頭から直接乳房流体を採集するか、または乳房にポンプを作用させ、圧搾された乳房流体から生体サンプルを上術のようにして採集する。サンプルを採集した後、このサンプルで生物検定を実施してサンプル中の乳房疾患マーカの存在および／または量を測定、決定する。これに関する適宜生物検定として、例えば細菌性およびウィルス性病原体を含む特定の病原体によって発現される特定の抗原およびその他のマーカを検出するのに好適な免疫学的またはその他のプローブを利用する生物検定等、乳房疾患の既知マーカを検出する検定が含まれる。より好ましい生物検定は、良性乳房腫瘍、前癌乳房疾病および／または乳房の癌性肺胞管細胞によって発現される特定の抗原およびその他のマーカを検出する免疫学的またはその他適宜プローブを使用する検定等のごとく良性乳房腫瘍、および／または乳癌の個別マーカまたはマーカ・パネルを検出する。かかる検定は、例えば複数の乳癌マーカと結合または反応する免疫学的プローブまたは分子プローブのパネルを含めることによって、生体サンプル中の複数の乳房疾患マーカの存在または量を検出できることが好ましい。
【００３８】
本発明の他の特徴において、乳房流体の生体サンプル中の乳房疾患マーカを検出または定量化する診断検定に利用される、乳房流体生体サンプルの新規の操作または処理方法が提供される。典型的には、この方法は、サンプルにアクセスするための一次開口を形成する上端とリザーバ外壁とを有し、リザーバ外壁とバイアルの内孔間を連通させる一つまたは二つ以上の通気ポートを形成する流体保持リザーバ内に乳房流体またはその成分の生体サンプルを得るまたは採取することを含む。特定形態において、この流体収容リザーバ部材は、サンプルをリザーバに導入した後、リザーバを閉鎖してサンプルの汚染および溢出を防止する閉鎖手段を含む。
【００３９】
閉鎖手段として取外し自在のリザーバ部材の上端と密封可能に係合する構成のキャップを含んでよい。他の実施形態では、閉鎖手段は、生体サンプルをリザーバに導入した後に、通気ポートを密閉する二次閉鎖手段を含む。二次閉鎖手段の例として、通気ポートを囲むリザーバ部材の外壁に接着するように寸法設定且つ構成された接着シールまたはステッカーが含まれる。選択的に、二次閉鎖手段は、取外し自在のリザーバの通気ポートを密封する二次閉鎖機構として機能すると共に、サンプル標識のための記入面を提供する標識テンプレートとしても機能する閉鎖・標識兼用装置を含む。閉鎖・標識兼用装置は、サンプル採集後に、通気ポートを密封するため直接貼付できる閉鎖・標識兼用タブまたはステッカーであり、通気ポート上に貼付されて、取外し自在のリザーバの外壁と並置するかまたは接着接触させることによりシールを形成する第一蓋形成面と、安定したインクまたはグラファイト印刷を施すのに適したブランクのテンプレート材から形成され、前記蓋形成面とは反対側の第二標識面とを有する。
【００４０】
本発明の他の形態において、第一蓋形成面に、水溶液との接触による剥離に抵抗する接着剤コーティングを施すことができる。二次閉鎖手段は、第一開放形態で取外し自在のリザーバ部材に予め取付けられ、サンプル採集後に手作業で第二閉鎖形態に変位させるかまたは操縦することによって通気ポートに対するシールまたは蓋を形成することができる閉鎖および標識に兼用できるタブまたはステッカーを含む。二次閉鎖手段は、開放形態に折り曲げられて、通気ポート近くでリザーバに取付けられた内層と前記内層に折り重ねられた外層とを形成し、前記外層が第一蓋形成面と第二標識面とを提供する接着タブまたは接着片を選択的に含み、前記外層が内層から展開されてリザーバをラップすることによって、前記蓋形成面が通気ポートを被覆して耐流体閉鎖を形成し、かつ前記標識面はサンプル・データを記録できるように外方に対面する。前記外層は、標識面を内層に接着により係合させることにより、内層に対して折り重ね位置に固定することも可能である。
【００４１】
関連する実施形態では、第一蓋形成面は接着剤コーティングを有していてよく、接着剤コーティングは、接着剤塗布裏面を有する外層の端セグメントを折り曲げることによって開放形態において保護されて蓋形成面が閉鎖前には接着剤を遮断する保護面を提供し、それにより外層の端セグメントを持ち上げて外方へ引っ張ることによって、外層の端セグメントを展開して、蓋形成面の接着剤コーティングを保護面から分離し、かつ外層を内層から剥離して通気ポートを閉鎖することができる。
【００４２】
本発明の特定形態において、上記方法は、改造された細胞学用バイアルである流体保持リザーバを利用する。他の形態において、流体保持リザーバは乳房流体採集装置のサンプル採集ハウジングの取外し自在の流体リザーバ部材を含む。流体保持リザーバは、サンプル採集装置のサンプル採集ハウジングの外側ケーシング部材に着脱自在に連結された剛性の散布採集管またはバイアルであってよい。流体保持リザーバは、選択により、ハウジングの外側ケーシング部材に着脱自在に且つ密封可能に連結できるように構成されて、ハウジングと気密結合を形成する。或る実施例では、流体保持リザーバは、ハウジングの外側ケーシング部材と気密結合を形成するように、該外側ケーシング部材に密封可能に連結できる細胞学用ハウジングである。流体保持リザーバ部材を該外側ケーシング部材内に着脱自在に入れ子式に嵌め込むことによって、外側ケーシング部材の内壁とリザーバ部材の外壁、または上端または下端との間に実質的に気密接触状態を形成することもできる。或る実施形態では、流体保持リザーバの外壁が、円周方向の突起、フィンまたはＯ−リングを担持する。流体保持リザーバは、乳房流体採集装置のサンプル採集ハウジングの取外し自在の流体リザーバ部材を含み、かつ円周方向の突起、フィンまたはＯ−リングはその装置のサンプル採集ハウジングのケーシング部材の内壁と係合して該内壁に対して円周方向の気密シールを形成するように構成されてよい。
【００４３】
本発明のサンプル操作および処理方法例において、乳房流体またはその成分は全細胞または細胞断片を含む。本発明による操作および処理方法は、サンプルを移送または処理して乳房疾患マーカを検出または定量化するために、リザーバ内のサンプルにアクセスする工程を更に含む。例示形態において、サンプルは、乳房疾患マーカを検出または定量化するために、サンプルを処理するための第二リザーバまたは他のサンプル容器またはテンプレートに移送されてよい。サンプル処理工程は、細胞学的マーカを検出するために細胞学的染料によりサンプルからの細胞または細胞断片を染色することによって乳房疾患マーカを検出または定量化することを含む。他の処理工程は、染色されたサンプルの細胞または細胞断片を顕微鏡検査することにより乳房疾患マーカを検出または定量化することを含む。或る実施形態では、生体サンプルは、全乳房流体、全細胞、細胞断片、細胞膜、浄化蛋白質、バルク蛋白質、糖蛋白質、一次乳房流体サンプルのペプチドおよびポリヌクレオチド成分から成る群から選択される一つまたは二つ以上の成分を含む。乳房疾患マーカは、しばしば、乳癌マーカを含む。種々の観点から、乳房疾患マーカは、蛋白質、ペプチド、糖蛋白質、脂質、ＤＮＡポリヌクレオチドおよびＲＮＡポリヌクレオチドから成る群から選択される。１例として、乳房疾患マーカはＫｉ６７成長因子、Ｃｙｃｌｉｎ  Ｄ１、増殖細胞核抗原、トランスフォーミング成長因子組織プラスミノゲン活性化因子、インスリン成長因子レセプタ、コラゲナーゼ  タイプＩＶ，ラミニン・レセプタ、インテグリンス、ｐ５３、ｒｂ、ｎｍ２３、ｒａｓ、ｃ−ｍｙｃ、熱ショック・蛋白質、プロラクチン、ニュウロン−特異エノラーゼ、ＩＲ−１４、ＫＡ  １、ＫＡ  １４、α−ラクトアルブミン、アクチン、ＣＥＡ、ＨＭＦＧ、ＭＣＡ、バソプレシンおよびカテプシンを含む。
【００４４】
上記方法において、種々の有用な技術のいずれか、例えば、ＥＬＩＳＡ免疫検定、免疫沈降検定、または固相免疫検定を利用して乳房疾患マーカを検出することができる。
【００４５】
本発明のさらに他の特徴において、女性患者の乳房から得た生体サンプル中の、乳房疾病、特に乳癌マーカの存在および／または量を検出するための臨床的に有用なキットが提供される。このキットは汎用性のあるまたは手持型乳房ポンプの形態の乳房流体採集装置を含む。他の形態によるキットは、一つまたは二つ以上の乳房ポンプ・アタッチメント（例えば、取外し自在の乳房係合部材、または異なる患者に使用できる複数のかかるアタッチメント）、付属品（例えば、取替え自在の流体保持リザーバ）、固相媒体、および／または採集媒体を保持するための使い捨てまたは再利用可能な支持部材、カートリッジまたはカセットを含む。上記およびその他のキット部品は単独で、または組合わせて、基本的乳房ポンプ装置と共に、またはポンプ装置抜きで提供することができる。さらに他の形態によるキットは、乳房流体採取方法に使用するために、生体に適したキャリヤのオキシトシンまたはオキシトシン類似物の医薬調製剤を含む。さらに他のキットは、分離または共通の容器に収容された一つまたはそれ以上の固定剤、プローブ、標識等を含む一つまたはそれ以上の調製用および／診断用試薬を含む。本発明の幾つかの実施形態では、生体サンプル中の一つまたは二つ以上の乳房疾患マーカの存在または量を検出するための構成成分および／または装置を含み、しばしば、一つまたはそれ以上の乳癌マーカと結合または反応する一つまたはそれ以上の免疫学的または分子プローブを含む。上記キット構成要素は集合的パッケージユニットに概ね組み立てられ、本発明のサンプル採集、操作および／または処理方法の詳細を文書などで示すユーザー使用指示書を含んでよい。
【００４６】
特定実施形態の説明
上述の如く本発明は、乳房流体から生体サンプルを採取し、操作または管理しかつ処理する方法および装置１０、１０’を提供する。好適には該方法は、非侵襲的であることから、非外科的であると共に針もしくは他の侵襲的装置による乳房への侵入を伴わない。非侵襲的なサンプル採取方法を実施するために、本発明は、真空ポンプ機構に連結されると共に固相サンプル採集媒体に流体により連結される乳房係合部もしくは部材を特徴とする特殊な乳房ポンプ装置を提供する。本明細書中に開示される乳房流体採集装置および方法は一定の特徴において１９９９年１１月５日に出願された米国特許出願第０９／４３５，１３１号、１９９８年２月２０日に出願された米国特許出願第０９／０２７，３６２号、および、１９９８年８月２５日に発行された米国特許第５，７９８，２６６号に開示された乳房流体採集装置および方法に関係し、その各々が参考として本明細書中に援用される。本発明の装置および方法は、単独でもしくはオキシトシン刺激と組み合わされて、サンプル採取のために乳房流体の圧搾または表出（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）を誘導するのに効果的である。
【００４７】
本発明の乳房流体採集装置は代表例として特殊な乳房ポンプ１０、１０’として提供され、該ポンプは、人間もしくは動物の乳房に装着されて乳頭を覆い得ると共に、表出された乳房流体を典型的には固相サンプル採集媒体内にかつ一定の場合には着脱式サンプル採集リザーバ内に受ける。乳房流体表出の間にまたはその後に表出乳房流体からは生体サンプルが採取され、該サンプルは、乳房流体全体、乳房流体の全細胞、細胞断片、細胞壁、選択された液体、細胞分画もしくは他の固体分画、ならびに、乳房流体の蛋白質、糖蛋白質、ペプチド、（ＤＮＡおよびＲＮＡのポリヌクレオチド等の）ヌクレオチドおよび他の同様な生化学的および分子的な構成要素から成り得る。
【００４８】
本発明の乳房ポンプ装置１０、１０’は部分的に、乳房の乳頭領域に負圧を掛けることで乳房流体表出を誘導するために機能する。該乳房ポンプにより誘導される流体表出は選択的に、該乳房ポンプ装置により誘導される乳房流体の表出を刺激もしくは増大するに効果的な量のペプチドホルモン・オキシトシンまたはその機能的類似物の協調的投与により促進され得る。上記オキシトシンもしくは（たとえばカルベトシン（ｃａｒｂｅｔｏｃｉｎ）等の持効性オキシトシン類似物等の）オキシトシン類似物は、乳房の目標の腺胞管組織（ａｌｖｅｏｌａｒ−ｄｕｃｔａｌ ｔｉｓｓｕｅ）に到達してそれを刺激することでオキシトシンが腺胞管組織の筋上皮収縮を刺激して乳房流体表出を誘導もしくは促進するに十分な方法（たとえば鼻腔内的）および量にて投与される。
【００４９】
上記乳房流体表出工程の間もしくはその後に、表出乳房流体から生体サンプルが採取される。本発明の方法において所定範囲の適切な生体サンプルが企図され且つ用いられるが、該サンプルは、乳房流体全体、乳房流体の選択された液体もしくは固体分画、乳房流体の全細胞もしくは細胞成分、蛋白質、糖蛋白質、ペプチド、ヌクレオチド（ＤＮＡおよびＲＮＡポリヌクレオチド等を含む）および他の同様の生化学的および分子的な成分を含む。サンプル採取は単に、通常のサンプル保存容器もしくは検定用容器等の適宜リザーバ内に表出乳房流体を受けることで達成され得る。
【００５０】
本発明の好適実施形態において表出乳房流体は、乳房流体表出と同時にまたはそれに引き続き、乳房ポンプ１０、１０’に流体により連結される固相サンプル採集媒体に接触させる。この観点で適宜固相媒体には、顕微鏡用ガラススライド、毛細管、被覆管、マイクロ滴定用のウェルもしくはプレート、膜、フィルタ、アフィニティカラム、ドットブロット・マトリクス、ビーズ、樹脂、および所望の検定法へ適宜に取入れられる乳房流体の所望成分を選択的に吸着、結合、濾過、分配（ｐａｒｔｉｔｉｏｎ）または別様に処理する他の同様の媒体が含まれる。
【００５１】
本発明において、当分野で公知の広範囲なサンプル採取処置および材料が有用である。当業者であれば理解かつ容易に実施される如く、選択される方法および材料は種々の検定法により変化する。たとえば特定の検定法に求められる乳房疾患マーカが可溶性蛋白質ならば、該蛋白質に対して高い特異性を有する試薬、好適にはポリクローン性もしくは単一クローン性の抗体に対して目標蛋白質を接触させることで固相マトリクスもしくはテンプレート上に該蛋白質を固定化することが多くの場合に望ましい。これにより、特定結合パートナ（ｐａｒｔｎｅｒ）に目標蛋白質が結合されるという配位子−蛋白質複合体、抗体−抗原複合体もしくは他の複合体等の複合体が得られる（すなわち、上記複合体は特定結合を決定するために対照物（ｃｏｎｔｒｏｌ）として従来的に用いられる非特定結合パートナの付加時に解離せず、且つ好適には結合パートナはｋＤ１０−９以上の親和力により結合する）。上記目標蛋白質に結合する結合パートナは、目標蛋白質との複合体形成の前もしくは後に上記固相媒体に対して固定化される。たとえば固相テンプレートもしくはマトリクスに対する共有結合的結合による上記結合パートナの固定化は、当分野で公知の種々の従来法により達成され得る。
【００５２】
この様にして目標蛋白質／結合パートナ複合体は不溶性マトリクスに直接的に吸着もしくは別様に結合される。他の形態として上記複合体を不溶性マトリクスに結合するために、たとえばアンチ−アイソ型抗体等の種々の二次的結合パートナが付加され得る。後者の工程は、たとえば一次結合パートナ（すなわち上記目標蛋白質に特異的に結合する結合物質）が一次的抗体、配位子等であるか等の、該一次結合パートナの性質に依存する。
【００５３】
本発明において、固相に対する標識の結合が目標抗原に対する反応性の存在もしくは不在の関数である如く当該免疫学的検定法のフォーマットが固相すなわち固定化試薬（ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ ｒｅａｇｅｎｔ）と標識試薬（ｌａｂｅｌｅｄ ｒｅａｇｅｎｔ）との組み合わせを採用するという免疫学的検定法が特に有用である。一般的に斯かる固相試薬は、関与する検定プロトコルに従い固相マトリクスに対して共有結合的もしくは非共有結合的に結合もしくは付着しまたは別様に固定化された形態である抗抗体（たとえば抗−ＩｇＧ）または他の免疫結合剤（ｉｍｍｕｎｏｂｉｎｄｅｒ）または他の結合物質を含む。
【００５４】
固相免疫学的検定法において有用な標識試薬として、関与する検定プロトコルに従い検出可能化学成分と化学的に結合される抗抗体（抗−ＩｇＧ）もしくは他の免疫結合剤もしくは他の結合物質などが挙げられる。有用な標識は当業界において習用的であると共に、螢光剤、化学的発光剤、放射性同位体および酵素が挙げられる。酵素標識は特に有用であると共に、一般的にはアルカリ性ホスファターゼ、ペルオキシターゼおよびβ−ガラクトシダーゼから選択される。酵素標識は、対応する発色基質を添加すると共に結果的な色もしくは蛍光応答を検出することにより容易に検出できる。
【００５５】
このプロトコルの変形例は目標抗原の配位子改変形態を用いるものであり、固相に対する固定化は配位子に対する固定化（たとえば結合もしくは吸着）結合パートナを担持する固相を用いて達成される。たとえばビオチンもしくはハプテン（たとえばフルオレセイン）が上記配位子として用いられ得ると共に、夫々、アビジンもしくは抗−ハプテン抗体の固相形態と接触することで固定化され得る。固相結合パートナの添加は、配位子−抗原に対するサンプルの接触に先立ちもしくはその後など、検定法における任意の適宜時点で行われ得る。
【００５６】
上記方法において使用されるに好適な固相マトリクスとして、黄色ブドウ球菌もしくはプロテインＡまたはＧアガロース［たとえば、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ ＡＢ， Ｕｐｐｓａｌａ、スウェーデン）］ビーズが挙げられる。プロテインＡおよびプロテインＧは、特定の菌株から分離された細胞壁蛋白質であり、かつ一定のクラスの免疫グロブリンに対する結合部位を有する。プロテインＡは、ＩｇＧの殆どのサブクラス、ならびに、ＩｇＭ、ＩｇＡおよびＩｇＤに結合する（可変度合いで）。プロテインＧはＩｇＧの殆ど全てのサブクラスに結合するが、免疫グロブリンの他のクラスには結合しない。
【００５７】
他の形態の固相サンプル採集および／または検定方法は特定の抗マーカ一次抗体を利用するが、該抗体は、たとえば臭化シアン活性化セファロース粒子に対して該抗体の自由アミノ基により該抗体が共有結合することで固相マトリクスに共有結合的に付着する。対応するマーカ抗原を当該不溶化抗体の表面に吸着して溶液から取出すために、不溶化抗体が使用され得る。更に別の形態においてマーカ蛋白質は、二次的結合パートナにより引き続き検出され得る架橋試薬（たとえばビオチンもしくはジゴキシゲニン）により処理され得る。ビオチンの場合に二次的結合パートナはアビジンもしくはストレプトアビジンであり、ジゴキシゲニンに対して二次試薬は抗−ジゴキシゲニン抗体である。アビジンおよびストレプトアビジンは、たとえばアガロース・ビーズ等の固相媒体に対して直接的に結合され得る。初期ビオチン化は上記マーカに対して特異的でないことから、サンプルは多くの場合にたとえばＳＤＳ ＰＡＧＥ上で電気泳動され、ニトロセルロースなどに移送され、且つ蛋白質因子に対して特異的な抗体によりウェスタンブロット（Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｅｄ）される。
【００５８】
蛋白質マーカを検出する好適な検定方法は、公知の酸素結合免疫吸着（ＥＬＩＳＡ）検定法である。この方法によれば、たとえばマイクロ滴定用のプレート、ウェル、管、ビーズ、試験細片、プラスチック微粒子、ラテックス粒子等の所望固相サンプル採集媒体の表面上へ直接的に種々の被覆試薬が吸着もしくは別様に結合され、被覆テンプレートもしくはマトリクスが形成され得る。これらの被覆試薬は典型的には種特異的なアンチ−アイソ型抗体（たとえば抗マウス−ＩｇＧ）であるが、アビジンもしくはストレプトアビジン等の抗マーカ一次抗体もしくは親和性試薬も含み得る。目標蛋白質（たとえば可溶性蛋白質マーカ）は特定の一次的抗体と接触させ、または代替的に（たとえばビオチンに対して）架橋されもしくは別様に修飾されて複合体を形成し、結果的な複合体は被覆テンプレートもしくはマトリクスに吸着されると共に従来検定方法に従って処理される。
【００５９】
更に、ラテックスもしくは粒子凝集方法について言及する。粒子は、目標抗原、配位子、抗体もしくは他の結合パートナに被覆もしくは共有結合される。粒子は次に試験サンプルと共に温置され、たとえば粒子間におけるＩＣＡ抗体結合の形成による粒子の結果的な凝集が検出される。検出は、視覚観察（たとえば、スライド凝集フォーマット）により達成されるか分光光度計もしくは比濁計により濁度変化を測定することで定量化され得る。粒子凝集の阻止に基づくこの一般的方法の周知変形例もまた採用され得る。これに加え、パネル内の一種類以上の抗原が複数付着する水溶性ポリマ骨格等の複数の抗原を含む凝集試薬が調製され得る。
【００６０】
本発明においてサンプルを採取して分析する他の方法として、ウェスタン免疫ブロットおよびドットブロット法が挙げられる。これらの方法を適用するために固相サンプル採集媒体は好適には、ニトロセルロース、ポリビニリデン・ジフルオライド（ＰＶＤＦ）もしくはナイロンの膜等の、膜もしくはフィルタである。乳房流体サンプル中の蛋白質は処理され（たとえばＳＤＳ ＰＡＧＥ上に分配される等）または膜へ直接的に移送され、かつ非特定相互作用は、たとえばウシ血清アルブミン／卵白アルブミンもしくは脱脂粉乳等と共に膜を温置することにより阻止され得る。上記蛋白質マーカに対して特異性を有する一次抗体は、上記膜と接触させ、かつ過剰抗体はたとえば緩衝洗浄剤で洗浄する。次に、標識されたアイソ型特異的抗体は上記膜と接触させ、且つ目標蛋白質−一次抗体−二次抗体の３元複合体はたとえば比色的に検出する。
【００６１】
目標蛋白質因子が糖質成分を含む場合、該因子もまたレクチン−糖質相互作用によりたとえば樹脂等の固相テンプレートもしくはマトリクスに吸着され得る。この目的のために、糖質結合特異性において異なる種々のレクチンが利用可能である。たとえばレクチンＣｏｎ Ａはマンノース含有糖質構造に結合すると共に、α−グルコースおよびα−Ｎ−アセチルグルコサミンに対して低い親和性を有する。レクチンＧＮＡは末端マンノース残基に結合する。レクチンＭＡＡはα（２−３）結合シアル酸に結合する。当分野において、広範囲な特異性を集合的に提供する他の種々のレクチンが既知である。
【００６２】
本発明における使用に特に好適な固相サンプル採集媒体は、表出乳房流体のサンプルに直接的に接触させることで吸着、吸収、結合、分配を行い、または、選択された検定法におけるサンプル処理もしくは管理を別様に促進し得るフィルタ、パッドもしくは膜である。この目的のために、最も一般的に用いられる移送膜（ｔｒａｎｓｆｅｒ ｍｅｍｂｒａｎｅ）であるニトロセルロース等の数種の移送膜が既知である。幾つかの販売元は今や、ニトロセルロースの性能を変えることなくその耐久性および可撓性を改善する合成支持材が含浸されたニトロセルロースを提供している。Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ（登録商標）の商品名でＭｉｌｌｉｐｏｒｅ（マサチューセッツ州、ベッドフォード）により販売されているポリビニリデン・ジフルオライド（ＰＶＤＦ）である一つの好適な移送膜はニトロセルロースよりも僅かに低い蛋白質結合能力を有するが、機械的に更に強力であり且つ多くの有機溶媒と適合する。これは、抗体プローブに対する引き続く使用を阻害することなく、移送された蛋白質に関するＣｏｏｍａｓｓｉｅ Ｂｌｕｅによる直接的な蛋白質着色、およびアミノ酸の組成および配列の直接的な分析を可能にする。
【００６３】
本発明において膜は蛋白質ブロットに対してだけでなく核酸の固定化に対しても有用である。故に、表出した乳房流体からＤＮＡおよびＲＮＡを固定化するには、ニトロセルロース、強化ニトロセルロース、ジアゾ化膜（紙材もしくはナイロン）、ナイロン、荷電ナイロン、または、ＰＶＤＦおよびＤＥＡＥ−陰イオン交換膜が有用である。この観点で、最も一般的に用いられる膜は強化ニトロセルロースおよびナイロンである。ニトロセルロースはバックグラウンドが低いだけでなく結合能力がナイロンよりも低いことから、主として検出能ではなくバックグラウンドが主要問題であるときに選択される。これと対照的にナイロンは、低コピー数の配列、（オリゴマまでの）短い目標配列もしくは再プローブに対して理想的である。異なる細孔サイズを備えた膜も利用可能である。ＤＮＡブロットに関し、大寸の断片に対しては通常０．４５μｍの細孔サイズが選択されるが、＜５００塩基の断片に対しては０．２２μｍである。ＲＮＡブロットに対しては、０．１もしくは０．２２μｍの細孔サイズの膜が最も効率的である。膜は、シート、ロール、事前切断したサークル等の異なるサイズ仕様で利用可能である。
【００６４】
最近、体液もしくは全細胞からＤＮＡを検出する等によりＤＮＡ精製なしでナイロン上でＤＮＡを検出すると共にサンプルを処理する方法が開発された（ＲｅｅｄおよびＭａｔｔｈａｅｉ， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １８：３０９３， １９９０；およびＨａｍｍｅｒｍｕｅｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ ３１：４７， １９９１；その各々は参考として本明細書に援用される）。これらの方法は、細胞巨大分子などを加水分解するために細胞の酵素分散とＲＮＡ分解酵素およびプロナーゼ処理を回避し、かつ典型的には細胞を分散かつ可溶化してＤＮＡでなくＲＮＡおよび蛋白質を含む巨大分子を加水分解するためにアルカリおよび他の試薬の能力に基礎を置く。従って、正に荷電されて改変されたナイロン・膜は、核酸を不可逆的に結合するが、ハイブリッド形成に対しては適正を維持する。
【００６５】
周知高速ブロット方法によれば、核酸抽出および処理工程は最小化され得る。特に固相としてナイロンを用いる高速ブロット方法は、細胞を解離し、ＤＮＡを変性し且つＤＮＡを固定化するためにＮａＯＨの能力を利用する。ニトロセルロースは低い結合能力を有するので、中性溶液からの核酸および蛋白質の同時固定化が問題となり得る。加熱乾燥を必要とせずに、蛋白質固定化を阻止し、ＤＮＡを変性し且つニトロセルロースに対して核酸を不可逆的に結合するために、濃縮ＮａＩが使用され得る。この方法はＲＮＡに対しても使用され得る。
【００６６】
蛋白質、核酸および他のマーカを固相マトリクスに直接的に移送し、かつ該マトリクスを直接的に検定法に取入れることは可能であるが、特に感度が問題となる場合にはたとえばクロマトグラフィ、抽出、特異的もしくは非特異的な吸着等による目標マーカの濃縮が望ましいことがある。故にサンプルは採取されると最初に、たとえばセファロース結合抗体のマイクロカラムから成るカートリッジ内において固相クロマトグラフ媒体と乳房流体を接触させることにより、処理される。この手法を用いると、８５〜９５％の見かけ回収率により５００倍までの免疫学的検定感度が達成され得る。このおよび他の周知クロマトグラフ処置は、通常方法では測定できないほど希薄な物質の定量化に強力な手法を提供する。
【００６７】
クロマトグラフ的方法および関連方法を用いたサンプル採集および処理のためには、粒状固相サンプル採集媒体が好適である。生体サンプルの成分を選択的に吸着、吸収、結合もしくは分配する種々の粒子媒体が既知であり、該媒体は乳房流体サンプルの採集および処理に容易に適合する。これらの粒子は、たとえば親和性試薬等の分野で既知の種々の被覆試薬と結合されて被覆媒体を提供し、または非改変形態で使用され得る。
【００６８】
本発明において使用される代表的なサンプル採集媒体として、ビーズ、プラスチック微粒子、ラテックスミクロスフェア、孔性制御ガラス等のガラス材料、細粒アガロース系材料、架橋デキストランポリマ、無機もしくは有機イオン交換材料、珪藻土および他のケイ酸塩材料が挙げられる。適切な材料として、更に、たとえばジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）セルロースもしくはジエチルアミノ（ＤＥＡ）セルロース等のセルロース材料が挙げられる。また、寒天、アガロースおよび架橋デキストランポリマ等の天然重合糖質、および、合成的に改変、架橋または置換されたそれらの誘導体も有用である。
【００６９】
ビニルポリマ（たとえばポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、ポリ酢酸ビニルおよびその部分的加水分解誘導体、ポリアクリレート、ポリアクリルアミド、ポリメタクリレート）、上記各ビニル単量体自体および他の単量体との共重合体および三元重合体、重縮合体（たとえばポリエステルおよびポリアミド）およびポリウレタンもしくはポリエポキシドの如き付加重合体等の、適切な孔性構造で調製され得る合成ポリマもまた有用である。
【００７０】
更に付加的な粒子媒体は、アルカリ土類金属およびマグネシウムの硫酸塩もしくは炭酸塩等の無機材料から適切な孔性形態で調製される。その例としては、硫酸バリウム、硫酸カルシウム、炭酸カルシウム、炭酸マグネシウム、ならびに、特に粘土、アルミナ、タルク、カオリン、ゼオライト等のアルカリおよびアルカリ土類金属および／またはアルミニウムおよび／またはマグネシウムおよびアルミニウムの、ケイ酸塩またはケイ素酸化物もしくは水和物が挙げられる。
【００７１】
また、有用な固相サンプル採集媒体には、たとえば乳房ポンプもしくは乳房ポンプ・アダプタに流体により連結され得るカートリッジ内に粒状固相媒体を囲繞するために本発明の乳房ポンプおよび乳房ポンプ・アダプタ装置と共に使用できる孔性隔壁材料が含まれる。斯かる孔性隔壁材料は、乳房疾患マーカの検定法で用いられるマーカおよび他の分析対象物および試薬に対して不活性かつ非反応性であると共に、液体および／または事前に選択されたサイズの粒子の通過に対して孔性である。適切な材料として、ナイロン織物、ポリエチレンおよび他のプラスチック膜、膜、フィルタ、グラスウール、スポンジ、発泡スチロール、セラミクスおよび他の孔性材料等の種々孔性材料が挙げられる。
【００７２】
サンプル採集に関して表出乳房流体のサンプルは、緩衝剤、希釈剤、抽出もしくはクロマトグラフ媒体、架橋剤、遮断剤、変性剤等の他の試剤に露出されて、所望検定の処理に対してサンプルを安定化もしくは別途調製される。たとえば上記サンプルは希釈される（たとえば希釈液内に湿潤もしくは懸濁された固相媒体を含むウェルもしくは凹所内にサンプルを採取することによって）ことで、引き続く免疫学的検定に影響する非特異的結合作用を最小化し得る。免疫学的検定に対するサンプル採取の事例において、マーカ抗原に対する抗体の親和性は重要検討事項であり、サンプル採取および温置の間に多少なりとも希釈剤を使用すれば、考察されつつある特定の抗原−抗体系が最適化され得る。
【００７３】
希釈のために一般的に用いられる緩衝剤として、リン酸塩、ホウ酸塩またはＴｒｉｓで緩衝された塩水が挙げられる。通常、緩衝剤の選択は重要でない。しかし、緩衝剤、ｐＨ、イオン強度および二価陽イオンの効果を慎重に検証すれば、感度を最大化すると共に当該検定法における障害の可能的原因を解明するために、新たなサンプル採取／検定システムの使用が促進される。免疫学的検定は通常は中性にて実施されるが、その様にすることが常に最適ではない。
【００７４】
たとえばガラスおよびプラスチック管もしくはピペットに対する抗原およびハプテン（特に疎水性ハプテン）の非特異的結合もしくは吸着は、特定の免疫学的検定において測定された活性に顕著に影響する。一定の蛋白質およびポリペプチドによれば、プラスチック管が用いられるならば免疫学的検定における非特異的結合は低減される。媒体に蛋白質を添加することでも非特異的吸着が最小化され、高度に希釈された抗原および抗体の変性が回避される。故にヨウ化された抗原を包含する検定法は一般的に、蛋白質含有緩衝剤において実施される。一般的には、１〜５ｍｇ／ｍｌの最終濃度にてウシ血清アルブミン、ゼラチン、リゾチームおよび卵白アルブミンが用いられる。一定の系においては、サンプル自体内に存在する希釈化された全ての血清もしくは蛋白質は充分満足できるものである。しかし添加蛋白質は多くの場合に有用であるが、たとえば酵素を汚染してマーカ蛋白質を劣化させる等の潜在的悪影響に対する評価を行わなければ、斯かる添加蛋白質は無差別に使用されるべきでない。
【００７５】
緩衝剤および蛋白質とは別に、改良されたサンプル採取および検定方法に対する他の可能的添加剤としては酵素抑制物質およびキレート化剤が挙げられる。３日間より長く続く検定法においては微生物成長の回避のために０．１〜２％のアジ化ナトリウム等の静菌剤がサンプル採取および／または検定媒体に取入れられてよい。
【００７６】
本発明の基本的な用途は乳房流体から生体サンプルを得る新規で非侵襲的な方法に在るが、本明細書においてはこれらのサンプルにおける重要な乳房疾患マーカを検出且つ／又は測定する有用な検定法を提供する付加的方法が開示される。この観点で、本発明は、生体サンプルにおける特に乳癌マーカ等の乳房疾患マーカの存在および／または発現レベルを決定するために既知の手順および試薬を取入れる広範囲な検定方法を提供する。本発明に取入れられる如くこれらの方法は、患者の乳房流体表出を促進するに有効な量のオキシトシン投与を選択的に取入れ、哺乳類の患者に乳房ポンプ１０、１０’を装着することを含む。サンプルが採取された後、好適にはサンプル内における乳癌マーカまたは乳癌マーカのパネル等の選択された乳房疾患マーカの存在および／または量を決定するためにサンプルに対する生物学的検定が行われる。
【００７７】
本明細書中で用いられる乳房疾患マーカ（ｂｒｅａｓｔ ｄｉｓｅａｓｅ ｍａｒｋｅｒ）の用語は、任意の細胞、細胞分画、蛋白質、ペプチド、糖蛋白質、脂質、糖脂質、蛋白脂質または他の分子的もしくは生体物質であり、疾患乳房細胞により固有に発現し（たとえば細胞表面もしくは分泌蛋白質として）、または疾患乳房細胞によりもしくは乳房疾患と関連して統計的に相当に測定可能に増大もしくは減少されたレベルにて発現し（たとえば乳房疾患に関連する感染因子により発現された蛋白質）、または正常な乳房細胞と比較して疾患乳房細胞により統計的に相当に測定可能に増大もしくは減少されたレベルにて発現し、または乳房疾患に関連した非疾患乳房細胞により発現する（たとえば疾患乳房細胞もしくはそれにより生成された物質の存在に応じて）物質を指す。乳房疾患マーカは、また、乳房疾患に相当に関連する有害な遺伝子変化、または遺伝子発現のパターンもしくはレベルの変化をマークする特定のＤＮＡもしくはＲＮＡ配列を含み得る。好適な乳房疾患マーカとして、乳房感染、良性腫瘍形成、悪性腫瘍形成、癌前兆状態、前癌状態および癌の危険性の高い状態に関するマーカが挙げられる。
【００７８】
本明細書中で用いられる乳癌マーカ（ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ ｍａｒｋｅｒ）という用語は、乳房疾患マーカの小セット、すなわちいずれかの蛋白質、ペプチド、糖蛋白質、脂質、糖脂質、蛋白脂質または他の分子的もしくは生体物質であって、癌細胞により固有に発現し（たとえば細胞表面もしくは分泌蛋白質として）、または正常な細胞と比較して癌細胞により統計的に相当に測定可能に増大もしくは減少されたレベルにて発現し、または癌に関連した非癌細胞により発現する（癌細胞もしくはそれにより生成された物質の存在に応じて）物質を示すものである。乳癌マーカはまた、癌に相当に関連する有害な遺伝子変化、または、遺伝子発現のパターンもしくはレベルの変化をマークする特定のＤＮＡもしくはＲＮＡ配列を含み得る。これに加えて乳癌マーカは、癌細胞によりまたはそれに関連して固有に発現する核内封入体もしくは細胞質構造もしくは着色属性等の、乳房流体内に存在する全細胞の細胞学的特徴を含み得る。
【００７９】
本発明の方法において有用な乳癌マーカの小セットは、Ｐｏｒｔｅｒ−Ｊｏｒｄａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｈｅｍａｔｏｌ． Ｏｎｃｏｌ． Ｃｌｉｎ． Ｎｏｒｔｈ Ａｍｅｒ． ８：７３−１００， １９９４；および、Ｇｒｅｉｎｅｒ， Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｔｅｃｈ、１９９３年５月、ｐｐ． ２８−４４による代表的な評価論文に記述されており、その各々は参考として全体が本明細書中に援用される。他の適宜マーカが同様に周知であり、かつ文献から概ね既知もしくは利用可能な情報および方法を用いて本発明の方法へ容易に取入れられ得る。本発明において使用される好適な乳癌マーカとして、人間の女性患者において前兆および／または処置関連変数を決定する上で重要な価値を有することが示されて良好に特徴付けられたマーカが挙げられる。先に述べた如く、前兆変数とは再発もしくは生存の可能性もしくは時期等の疾患の結果を予測するに資する変数である。処置関連変数は、所定治療プログラムの成功および失敗の可能性を予測する。これらのマーカの一つ以上の発現もしくは活性の存在もしくはレベルを決定することは、悪性および良性の異常を有する患者の分別診断に役立ち、かつ選択された治療オプションによる将来的な再発の危険性または可能性を予測する上で有用とされ得る。
【００８０】
但し、本発明は、人間患者に対する臨床使用について乳房疾患マーカが直ちに許容できる感度および特異性の厳しい要件を満す乳房疾患マーカのみに関するものでないことを銘記する。逆に、本発明において企図された多数の乳房疾患マーカはこれらの厳しい判定基準に届かないが、乳癌を検出、分別診断もしくは管理する上で実質的に有益である有用な情報を提供する。斯かる非臨床的に容認されるマーカは本発明の方法において、基本的な研究ツールとして且つ臨床用途における補助的なツールとして即時使用に有用である。これらの即時使用の他にも斯かるマーカの多くは、特にマーカの組み合わせを分析する検定方法において直接的に臨床使用されるほどに本発明の方法により改良かつ洗練されることで、個々のマーカのみにより得られるデータよりも大きな予測的価値を有する補足データを生成することが期待される。
【００８１】
本発明の好適な検定方法は特に腫瘍発生、腫瘍成長、血管新生および癌浸潤に関連する乳癌マーカに焦点を当てており、該方法はこの関係で、患者における癌の危険性、存在、状態もしくは将来的挙動に関する重要情報を提供する。先に述べた如く腫瘍発生および腫瘍成長は、種々の細胞増殖マーカ（たとえばＫｉ６７、サイクリンＤ１およびＰＣＮＡ）を用いて評価され得る。腫瘍成長はまた、種々の成長因子およびホルモンマーカ（たとえばエストロゲン、ＥＧＦ、ｅｒｂＢ−２およびＴＧＦ−α、オートクラインもしくは外分泌成長因子の受容体、およびホルモン（たとえばＩＧＦおよびＥＧＦ受容体）、または血管新生因子）を用いても評価され得る。腫瘍発生、増殖および成長マーカに加え、複数のマーカは、たとえば細胞接着もしくは運動性因子の発現もしくは活性の変化を表すことで癌細胞における癌浸潤もしくは転移可能性に関する情報を提供する。この観点で、代表的なマーカは、カテプシンＤ、プラスミノゲン活性化因子およびコラゲナーゼである。これに加え、ｎｍ２３、ｐ５３およびｒｂ等の幾つかの推定される腫瘍“抑制”遺伝子の発現レベルは、癌細胞の転移可能性もしくは成長調節に関する重要データを提供する。これらのクラスの各々における多数且つ種々の適宜乳癌マーカは区別されており、且つこれらの多くは乳癌に関する前兆および／または処置関連変数を決定する上での重要な価値を有することを示している。
【００８２】
本発明の検定法を夫々実行する前にもしくは実施と同時に、サンプルの起源および／または品質を検証するために事前評価を実施するのが好適である。斯かる事前評価の主眼は、表出乳房流体から採取されたサンプルが実際に乳房起源であり、乳頭を囲繞する皮膚からの汗等の他の可能汚染物により汚染されていないことを検証することにある。これらのサンプル検証目的から、種々の検定法が利用可能であるが、それらは哺乳動物乳房流体に存在することが知られた乳房流体マーカであって、好適には乳房流体に対して高度に特異的なマーカ（すなわち、乳房流体内には典型的に常に存在すると共に、潜在的に汚染された他の身体の流体および組織の全てもしくは殆どには不在であるマーカ）が利用可能である。但し、本発明の方法において乳房流体マーカの特異性の許容レベルは、他の身体流体に存在し得るとしても乳房流体に存在すると簡単に知られるマーカにより提供される。斯かるマーカのひとつは酵素リゾチームであり、これは人間の血清、尿、唾液、涙、鼻分泌物、腟分泌物、精液および乳房流体の通常成分である。リゾチーム（ムラミダーゼ）は、細胞分解に帰着する種々の微生物のムコ多糖細胞壁におけるベータ１，４−グリコシド結合を加水分解する酵素である。リゾチームの定量化測定は周知寒天平板拡散方法により容易に達成されるものであり、該方法は、Ｋａｌｌｅｓｔａｄ， Ｓａｎｏｆｉ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ（ミネソタ州、チャスタ［Ｃｈａｓｔａ］）から入手可能なＱｕａｎｔｉｐｌａｔｅ（登録商標）リゾチーム試験キットと共に提供される説明に詳細に記述されるが、その全ての開示内容は参考として本明細書中に援用される。
【００８３】
サンプル検証に対してリゾチームよりも更に特異的である他の乳房流体マーカは、本発明の方法において好適であると共に、刊行された概ね既知の情報に基づき本発明に容易に取入れられ得る。これらのマーカの中で最も好適なのは、乳房流体において特異的に発現もしくは濃縮された蛋白質および他の生体物質である。この観点で、種々の一連の適切なマーカは、親和力が精製された単一クローン性抗体を含む特異的な抗体を改良することにより特徴付けられかつ既に使用されている。而してこれらの抗体は、乳房流体サンプルの起源および品質を検証するために選択された乳房流体マーカの有無を決定し且つ／又は定量化する免疫学的プローブとして採用され得る。本発明での使用に特に関連する乳房流体マーカとして、正常なおよび癌の乳房上皮細胞により特徴的に発現する特異的シトケラチンが挙げられるが、これに対しては抗体プローブの特異的パネルが既に開発されている（たとえばＮａｇｌｅ， Ｊ．， Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ． Ｃｖｔｏｃｈｅｍ． ３４：８６９−８８１，１９８６年を参照されたい。その全ての開示内容は参考として本明細書中に援用される）。同様に乳房流体マーカとして有用なのは、人間の乳脂肪グロブリン（ＨＭＦＧ）蛋白質の糖蛋白質成分に対応する人間の乳房上皮抗原（ＨＭＥ−Ａｇｓ）であるが、これに対しても特異的抗体（たとえば抗ＨＭＦＧ１、Ｕｎｉｐａｔｈ、英国）が入手可能である。（Ｒｏｓｎｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｖｅｓｔ． １３：５７３−５８２、１９９５年；Ｃｅｒｉａｎｉ ｅｔ ａｌ． Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７４：５８２−５８６、１９８２年；Ｃｅｒｉａｎｉ ｅｔ ａｌ．， Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． Ｔｒｅａｔ． １５：１６１−１７４、１９９０年を参照されたい。その各々は参考として全体が本明細書中に援用される。）
本発明において提供される乳房疾患検定法を実施するために、乳房流体からの採集生体サンプルは、選択された乳房疾患マーカもしくは乳癌マーカに特異的に結合しまたは検出可能な方法で該マーカと相互作用するプローブであって、サンプル内の乳房疾患マーカもしくは乳癌マーカの有無もしくは量を表すプローブに、概ね露出される。この目的から、選択されるプローブは、乳房疾患マーカの特性に概ね依存、すなわち該マーカが蛋白質ポリヌクレオチドであるか他の物質であるかに依存する。本発明の好適実施形態において上記乳房疾患マーカは蛋白質、ペプチドもしくは糖蛋白質であるが、その全ては特異的な免疫学的プローブを用いて乳房疾患検定法において効果的に目標とされる。これらの免疫学的プローブは、該プローブを検出する信号を提供する共有結合標識により標識化され得るか、または、たとえば該免疫学的プローブに結合して検出可能信号を提供するために標識化された二次抗体により直接的に標識化され得る。
【００８４】
人間以外（たとえばネズミ、ウサギ、豚、馬等の）の抗血清もしくは単一クローン性抗体を生成する概ねの方法は周知であり、かつたとえば、選択された乳房疾患マーカ蛋白質、マーカ蛋白質配列の一部を含むべく合成されたペプチド、マーカ蛋白質配列の一部を含む分解生成物、または、異種蛋白質もしくはペプチドに結合されたマーカ蛋白質の全てもしくは一部を含む融合蛋白質により、動物に免疫を与えることで達成され得る。種々の実施形態において単一クローン性抗体を生成する細胞は、免疫化動物から採取され、不死化されて選別されるか、または、選択された乳癌マーカ蛋白質もしくはペプチドに結合する抗体の生成に対して先ず選別されてから不死化される。人間以外の抗体の抗原結合領域（すなわちＦ（ａｂ’）２もしくは高度可変領域）は、組換えＤＮＡ技術により人間の抗体の骨格に移し換えて実質的に人間の分子を生成するのが望ましい。斯かる“人間化”分子を生成する方法は概ね周知であり、かつたとえば米国特許第４，８１６，３９７号に記述されている（その全開示内容は参考として本明細書中に援用される）。選択的に、人間の単一クローン性抗体またはその一部は、Ｈｕｓｅ ｅｔ ａｌ．（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４６：１２７５−１２８１、１９８９年（その全開示内容は参考として本明細書中に援用される））により概ね示された方法に従い、選択された乳房疾患マーカに特異的に結合する抗体をコード化するＤＮＡ分子に対する人間Ｂ−細胞ｃＤＮＡライブラリを先ず選別することで識別され得る。上記ＤＮＡ分子は次に、所望の特異性の抗体（もしくは結合領域）をコード化した配列を得るために、クローン化かつ増幅される。
【００８５】
本発明においては、また、各免疫グロブリン分子上に独立した抗原結合部位を有する二官能抗体（例えば、各々の全体が参考として本明細書中に援用される、Ｔｈｒｏｍｂ． Ｒｅｓ． Ｓｕｐｐｌ． Ｘ：８３、１９９０年およびＴｈｅ Ｓｅｃｏｎｄ Ａｎｎｕａｌ ＩＢＣ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ ｏｎ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、Ａ． Ｇｅｏｒｇｅ ｅｄ．、１９９１年１２月１６−１８日に開示された如き）、および異なる特異性を有する個々の抗体のパネルが企図されている。本発明において特に用いられる二官能抗体および抗体パネルとして、個々のマーカのみにより得られるデータよりも大きな予測的価値の補足的データを生成するために、一つまたはそれ以上の選択された乳房疾患マーカに結合する抗体および抗体のパネルが含まれる。
【００８６】
本発明において、選択された乳房疾患マーカの存在または活性を検出、撮像且つ／又は定量化するために標識化されたプローブとして単一クローン性抗体が特に有用である。この観点から、選択された乳房疾患マーカに対して特異的に結合し、かつ染料、蛍光タグもしくは放射性同位体等の一種類以上の周知標識を取入れた単一クローン性抗体が提供される。斯かる標識を取入れることにより上記抗体は、乳房流体を含むまたは乳房流体から誘導された生体サンプルにおける一種類以上の選択された乳房疾患マーカの発現、局在化および／または活性を決定する通常検定法において採用され得る。乳房疾患の危険または乳房疾患があると判断された患者から採取された試験サンプル中の選択された乳房疾患マーカの発現、局在化および／または活性を決定するこれらの検定法の結果は、乳房疾患に対して陰性である正常患者から得られた生体サンプル中の同一マーカを検出し且つ／又は定量化した対照考察からの結果と比較される。この様にして、本発明の検定法を改良して直接的臨床試験に適合させるために、常用方法に従い基礎データおよび切り捨て値を決定する。
【００８７】
本発明の生体サンプルにおける乳房疾患マーカの検出および／または定量化は、種々の方法を用いて達成され得る。この点に関する好適な方法として、周知のＥＬＩＳＡ免疫学的検定法、免疫沈降検定法、および、他の方法の中でも特にウェスタンブロット、ドットブロットおよび親和力精製免疫学的検定法等の種々の固相免疫学的検定法が挙げられる。乳房疾患マーカの発現および／または活性を検出し且つ／又は定量化する非抗体プローブを用いる同等の方法は、本明細書中に開示されるかまたは当業界において他の箇所で開示されかつ既知である。本発明において使用に適した非抗体プローブとして、たとえば、発癌遺伝子のＤＮＡ移送物および大きな乳房疾患危険に関連する他のＤＮＡ配列に対し、または、乳房疾患マーカ蛋白質をコード化するｍＲＮＡ移送物に対して中程度のもしくは高い緊縮性でハイブリッド形成を行う標識ヌクレオチドプローブが挙げられる。好適には上記ヌクレオチドプローブは、高緊縮性条件下で目標配列とハイブリッド形成を行う。本明細書中で用いられた“中程度の緊縮性（ｍｏｄｅｒａｔｅ ｓｔｒｉｎｇｅｎｃｙ）”および“高い緊縮性（ｈｉｇｈ ｓｔｒｉｎｇｅｎｃｙ）”とは、文献中で良好に確立されたハイブリッド形成条件の有限範囲を指している。（たとえば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， ＮＹ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ， １９８９；Ｈａｍｅｓ ａｎｄ Ｈｉｇｇｉｎｓ， ｅｄｓ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ， ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ， Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ ＤＣ， １９８５；Ｂｅｒｇｅｒ ａｎｄ Ｋｉｍｍｅｌ， ｅｄｓ， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｖｍｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌ． ５２， Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ＮＹ， １９８７；および、Ｂｏｔｈｗｅｌｌ， Ｙａｎｃｏｐｏｕｌｏｓ ａｎｄ Ａｌｔ， ｅｄｓ， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ Ｇｅｎｅｓ， Ｊｏｎｅｓ ａｎｄ Ｂａｒｔｌｅｔｔ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ， Ｂｏｓｔｏｎ， ＭＡ １９９０を参照されたく、その各々は参考として全体が本明細書中に援用される）。中程度もしくは高い緊縮性でのハイブリッド形成条件は、たとえば、ハイブリッド形成の温度を調節し、ハイブリッド形成混合物におけるホルムアミド等の螺旋不安定化剤の割合を調節し、且つ、洗浄液の温度および塩濃度を調節することにより達成される。選択的に緊縮性は、塩濃度および／または温度を変化させることでハイブリッド形成後の洗浄の間に調節され得る。ハイブリッド形成における緊縮性は、ハイブリッド形成溶液中のホルムアミドの割合を減少することにより、または、洗浄液の温度を低下させることで減少され得る。典型的な高い緊縮性の条件は、たとえば高温洗浄、（たとえばＴｍよりも２〜２５℃低い）および低い塩濃度（たとえば０．１Ｘ ＳＳＣ等の）と組み合わせて高温ハイブリッド形成（たとえば４−６Ｘ ＳＳＣを含む水溶液中では６５〜６８℃、または、５０％ホルムアミド中では４２℃）を必要とする。これと対照的に中程度の緊縮性の条件はたとえば５０℃〜５５℃の温度でのハイブリッド形成と、５０℃〜５５℃における０．１ｘ ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳでの洗浄とを含み、これは他の種からポリヌクレオチド分子コード化Ｉ−ｍｆを識別し又はＩ−ｍｆのイソ型を分離するに十分なものである。更に対照的に、低い緊縮性の条件は、たとえば、低いハイブリッド形成温度（たとえば２０〜５０％ホルムアミド中の３５〜４２℃）および高い塩濃度（たとえば２−６Ｘ ＳＳＣ）中での中温（たとえば４０〜６０℃）を必要とする。
【００８８】
本発明の幾つかの好適実施形態において、表出乳房流体から採取された細胞サンプル中の選択された乳房疾患マーカの発現のレベルを識別かつ定量化する周知のノーザン、サザンおよびドットブロット検定法においてｃＤＮＡおよびオリゴヌクレオチド・プローブが採用される。
【００８９】
本発明において使用される他の適切なプローブとして、乳房疾患マーカの標識配位子、結合パートナおよび補因子（たとえばカテプシンＤ等の、成長因子受容体配位子、または、乳癌関連プロテアーゼの物質）が挙げられる。
【００９０】
前述の方法に従って乳房疾患マーカの発現のレベルを測定すると、哺乳動物、特に人間における癌の発生、成長および浸潤性等の広範囲な乳房疾患に対する重要な前兆および処置関連情報が提供される。たとえばオリゴヌクレオチドプローブを利用する検定法は、乳癌に関連する遺伝性の遺伝子障害を評価するため、且つ患者における前癌、早期癌および潜在的転移病巣を区別するために、早期のスクリーニングを補助する。
【００９１】
上述のサンプル採集および検定方法に加えて本発明は、本発明のサンプル採集および検定方法を実施する装置、構成要素、付属品、試薬および他の関連材料を備えたキットおよび多重容器ユニットを提供する。これらのキットは、たとえば生体サンプル中の好適には乳癌マーカである乳房疾患マーカの存在および／または量を決定するために乳房流体サンプルを採集、管理且つ／又は処理する上で臨床的に有用である。上記キットは、乳房係合部材と、真空ポンプと、本明細書中に記述される汎用もしくは携帯用乳房ポンプに取入れられるサンプル採集手段とを有する乳房流体採集装置を含む。本明細書中に記述された如く付加的なキットは、一個以上の乳房ポンプアタッチメント（たとえば着脱可能な乳房係合部材、または異なる患者に使用する複数の斯かるアタッチメント）、付属品（たとえば交換可能な流体保持リザーバ）、固相媒体、および／または、使い捨てもしくは再使用可能な支持部材、採集媒体を保持するカートリッジもしくはカセットを含む。これらのおよび他のキット構成要素は、該キットに基本的乳房ポンプ装置を含めるかもしくは含めずに単独でもしくは任意の組合せで提供され得る。更に付加的なキットは、本発明の他の乳房流体採集方法で使用するための生体的に適合するキャリアとしてのオキシトシンもしくはオキシトシン類似物の製剤を含む。好適には上記オキシトシン調製物（ｏｘｙｔｏｃｉｎ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ）は鼻腔内噴射散布器により提供され、かつ１ｍｌあたり約４０ＵＳＰ単位の液体キャリアを含有し、このキャリアは簡素で安価な緩衝塩水溶液である。好適な散布器は、患者の鼻孔内にオキシトシンの液体噴射を誘導するノズルを備えた種々の加圧エーロゾルもしくは手動ポンプリザーバ形態のいずれかであってよい。更に別のキットは、別体もしくは共通の容器内における一個以上の固定剤、プローブ、標識等の本明細書中で開示されたものから選択される一種類以上の調製試薬および／または診断試薬を含む。本発明の一定の実施形態においてキットは、生体サンプル内における一種類以上の乳房疾患マーカの存在もしくは量を検出する構成および／または装置を含み、多くの場合、一種類以上の乳癌マーカと結合もしくは反応する一種類以上の免疫学的もしくは分子的プローブを含む。上記のキット構成要素は集合的パッケージユニット内に概ね組立てられるが、該ユニットは本発明のサンプル採集、管理且つ／又は処理方法を詳述する書面またはユーザ利用のための指示書を含んでよい。
【００９２】
本発明の検定方法を実施するキットは、表出乳房流体から生体サンプルを採集、保存、管理且つ／又は処理する適宜容器もしくは他の装置を含む。表出乳房流体から採集され得る広範囲の適宜生体サンプルに対応する所定範囲の適宜採集装置が企図される。たとえば、乳房流体全体を採集するために単純な無菌容器もしくはリザーバが提供される。代替的に、乳房流体の選択された液体もしくは固体分画を受容もしくは分離するために、または乳房流体からの細胞もしくは細胞成分を受容もしくは分離するために、または、乳房流体からの精製もしくは膨張（ｂｕｌｋ）蛋白質、糖蛋白質、ペプチド、ヌクレオチド（ＤＮＡおよびＲＮＡポリヌクレオチドを含む）または他の同様の生化学的および分子的構成要素を受容または分離するために、顕微鏡用ガラススライド、膜、フィルタ、ビーズおよび同様の媒体等の種々の固相装置が提供される。多様な斯かるサンプル採集装置は本明細書中に開示され、または周知であり、または文献中に記述されており、それらは本発明の特定実施形態に容易に使用できる構成である。これらの採集装置は、乳房ポンプの構成要素（表出乳房流体が圧送されるときに該乳房流体を直接的に受けまたはそれに接触するために、ポンプ内に載置された着脱式ニトロセルロースフィルタであって選択的に永久的もしくは着脱自在の支持部材が連結されたフィルタ等）として提供され得るか、または別個に提供され得る（たとえば、検定目的で生体サンプルを採取するために乳房流体もしくは乳房流体成分が露出される非一体的な膜、フィルタ、アフィニティカラムもしくはブロット材料として）。更に詳細な特徴として上記採集装置は、本明細書中において以下に記述される如く着脱式の流体保持リザーバを含む。
【００９３】
本発明の一定の実施形態においてキットは、生体サンプル中の乳房疾患マーカの存在および／または量を検出する試薬および／または装置、たとえば乳癌マーカと結合もしくは反応する免疫学的もしくは分子的なプローブを含む。これらの可能試薬の内、免疫学的および非免疫学的なプローブは生体サンプル中の乳癌マーカの存在もしくは量を検出する。上記キットは、また、適宜緩衝剤、プロテアーゼ阻害剤等の保存剤、プローブを標識する直接的もしくは挟持型（ｓａｎｄｗｉｃｈ−ｔｙｐｅ）の標識、および／または上記標識からの信号を検出するための顕色試薬を含み得る。一特徴として本発明のキットは、サンプル中の乳癌マーカを検出且つ／又は測定するに有用な単一クローン性抗体を含む。斯かる抗体は、事前標識され、または上記キットに選択的に含まれる二次抗体に結合することによって検出され得る。上記抗体試薬は、別体容器で提供され得るか、一連の容器内に組み合わせて提供され得る。本発明の更に別の特徴としてキットは、乳癌マーカ蛋白質をコード化するポリヌクレオチド分子を検出する配列特異的オリゴヌクレオチド・プライマを含む。斯かるプライマは、別体容器で提供され得るか、または、一連の容器における一つ以上のプライマ対の組み合わせで提供され得る。本発明において、当業界における一般的知見および本明細書中の記述に基づき、本発明の検定法を実施する特定説明を含むキット等の他の広範囲に選択されたキットが提供される。
【００９４】
本発明において、患者から生体サンプルを採取し且つ／又は乳房流体からの生体サンプル中の乳房疾患マーカの量を決定する方法であって本明細書中において以下に記述される如く新規な乳房ポンプ１０もしくは乳房ポンプ・アダプタ１２を採用した方法が提供される。該方法は、乳房流体表出を誘導するために乳房ポンプを装着する工程を含み、固相サンプル採集媒体が上記乳房ポンプに流体により連結される。上記固相サンプル採集媒体は上記乳房ポンプ内に一体化されまたは上記ポンプに流体により連結されることから、上記ポンプは乳房に装着されている表出された乳房流体サンプルは上記採集媒体に接触する。
【００９５】
本発明のこれらの特徴を実施するために、乳房ポンプ１０（図１）および乳房ポンプ・アダプタ１２（図１２）の各々に、本明細書中で上述された固相媒体のいずれかから選択された固相サンプル採集媒体が流体により連結される。上記乳房ポンプは、たとえばＬａｒｓｓｏｎに対する米国特許第４，９２９，２２９号および米国特許第５，００７，８９９号、Ｓｉｌｖｅｒに対する米国特許第５，６０１，５３１号、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓに対する米国特許第３，７８６，８０１号、またはＡｉｄａ ｅｔ ａｌに対する米国特許第５，２９５，９５７号に記述された全体的設計による種々の従来乳房ポンプ設計に従って概ね構成され得る。
【００９６】
他の従来乳房ポンプと同様に、本発明の乳房ポンプ１０は無孔性材料で構成された乳房係合部１４を含む。上記係合部は、乳房１７の少なくとも乳頭部１６を受けて乳頭部に対する吸引シールを形成するサイズおよび形態にされる。好適には上記乳房係合部は、乳房の少なくとも乳輪部分、更に好適には（たとえば図１に示された如く）乳房の末端の１／４〜１／２または大部分を受けると共に、それに対する吸引シールを形成するサイズおよび形態にされる。たとえば異なるサイズの人間の乳房を受けるために、乳房係合部材の異なるサイズおよび形態が選択され得る。代替的に、獣医用の装置が提供され、その場合に乳房係合部材は人間以外の哺乳動物の乳房を受けるサイズおよび形態にされる。
【００９７】
上述された如く乳房１７との吸引シールを形成するために、ポンプ１０の乳房係合部１４は種々の形状および寸法で構成され得る。一実施形態において上記係合部は吸引シール内において乳房の乳頭１６もしくは乳輪部分に係合する形状および寸法の単純な円筒、管もしくは漏斗として形成される。好適には、上記係合部の末端縁部１８は丸形にもしくは拡開されることから、上記吸引シールを形成するために乳房に負圧が掛けられたときに上記縁部は乳房１７の皮膚に対して違和感なく衝当する。好適実施形態において上記係合部は、図１に示された如く乳房の末端の１／４〜１／２または大部分に快適に係合してそれと共に吸引シールを形成するために、概ね漏斗形状とされる。
【００９８】
乳房ポンプ１０の乳房係合部１４は、体液に対して不活性な任意の適宜無孔性材料であって、上記係合部の内壁２０に対して負圧が掛けられたときに該係合部の崩壊変形を防止するに十分な剛性を有する材料で構成され得る。好適には、上記係合部および上記乳房ポンプの他の部分は、滅菌目的で圧熱滅菌され得る。故に上記係合部は、ポリプロピレン、ポリウレタン、ポリビニルプラスチック、ポリメタクリル酸メチル等の剛性材料で構成され得る。選択的に上記係合部は、乳房１７の乳頭１６および／または乳輪領域をマッサージすることで乳房流体表出を促進するために、崩壊変形を防止する半剛性材料であって上記係合部の少なくとも基部２２の手動圧縮を可能にする半剛性材料で構成され得る。この観点で、適宜材料として、たとえばシリコン・プラスチック（Ｓｉｌａｓｔｉｃ）および同様の材料等のゴムもしくは合成弾性材が挙げられる。好適には、上記乳房ポンプを使用する医師もしくは技術者が該ポンプの装着時に乳房１７を観察してその位置および状態を決定できるように、上記係合部を形成する上記材料は透明である。
【００９９】
乳房ポンプ１０の乳房係合部１４は、剛性材料（好適には透明プラスチックである）で作成されたサンプル採集ハウジング３０と流体を介して連通する。上述の如く上記固相サンプル採集媒体は、たとえば該固相媒体を上記乳房係合部もしくはサンプル採集ハウジングに対してまたはその内部に繋止することにより、上記乳房係合部に流体により連結されて支持される。典型的に上記固相サンプル採集媒体は、広範囲の選択的な繋止もしくは位置決め手段のいずれかを使用して、上記サンプル採集ハウジングの内部区画室すなわち内孔５８内に、または上記乳房係合部の対応する内側空間に流体により連結されるように固定される。好適に上記固相媒体は、たとえば閉鎖結合可能な保持器もしくは交換可能なカセット（以下を参照）により、上記乳房係合部と流体により連通するように着脱自在に支持される。
【０１００】
本発明の一つの特徴において、サンプル採集ハウジング３０もしくは乳房係合部１４は、たとえば膜３９またはフィルタ４０のパッドもしくはシート（図２乃至図５）等の吸収もしくは吸着材料によるサンプル採集パッドもしくはシート３８を支持する。（同一もしくは異なる材料の）複数のパッドもしくはシートが組み合わせて使用され得る。図５に示された如く、たとえば膜３９（たとえばニトロセルロース等の）はフィルタ４０（たとえば紙材フィルタ等の）上に支持され得る。この様にして第一シートは、第２シートに対する支持部材、湿潤部材、浸出部材または分配部材の役割を果たし得るか、またはそれに対し、化学試薬、プローブ、遮断剤、緩衝剤、変性剤等を導入もしくは除去し得る。一つの特徴において上記複数のシート材料は乳房流体の各成分を分離し（たとえば乳房流体の異なる成分を保持するために異なる材料を使用することにより）、それにより異なるサンプルの同時的な採取を可能にする。
【０１０１】
本発明の他の特徴において、ハウジング３０または乳房係合部１４は、たとえばビーズ、樹脂、ミクロスフェア、粒状クロマトグラフ媒体（たとえばアガロースまたはケイ酸塩媒体）等の粒状固相サンプル採集媒体４１を支持する（たとえば図９参照）。本発明の更に他の特徴において上記ハウジングもしくは乳房係合部は、たとえばガラス、プラスチックもしくは他の適切な材料で形成された一本以上の毛細管４２（図６）、被覆管４３（図１０）、プレート、ウェル、スライド等のサンプル採集用の非粒状固体テンプレートを支持する。
【０１０２】
図１および図２に示された如く乳房ポンプ１０の好適設計は、係合部１４とサンプル採集ハウジング３０との間の着脱式連結機構を含む。好適な連結機構は、上記係合部およびハウジングの夫々の係合連結端部４８、５０に配設された対応する螺条４４、４６を含む。代替的に図９に示された如く、上記係合部およびハウジングの係合連結端部４８、５０を着脱自在に連結するために単純な圧力嵌め継手が配備され得る。更に他の実施形態において連結端部４８、５０は、２つの連結端部を枢動可能に連結するヒンジ５２およびラッチ５４により着脱自在に連結される（図１０）。
【０１０３】
サンプル採集ハウジング３０または乳房係合部１４は、各図に例示される如く幾通りかで、且つ当業者に明らかである種々の等価的な設計および形態により、上記固相サンプル採集媒体を支持し得る。本発明の好適実施形態において上記固相媒体は、たとえば係合部１４と上記サンプル採集ハウジングとの間に固定的に介設された支持体等のように、該固相媒体を上記乳房係合部と流体により連結して支持し得る支持部材５６上にもしくはその内部に保持される。
【０１０４】
このように、図１および図２に示された一つの代表的設計において支持部材５６は、上記ハウジングの内孔５８に埋める着脱可能なディスクであって上記係合部およびハウジングの連結端部４８、５０間に介設されたディスクである。種々の乳房ポンプ設計と組み合わせて使用するために上記支持部材の直径５９（図３）は、約１／４〜３．０インチ（１インチ＝約２．５４ｃｍ）、好適には１／２〜２．０インチ、更に好適には約３／４〜１インチである。好適な形態において、上記ディスク形状支持部材は、上記ハウジングの連結端部４８における円周溝６０内に着座する。上記係合部の連結端部４６における対応する円周溝６２は、上記ハウジングの連結端部における上記円周溝に対峙して、その両者間に上記ディスク形状支持部材を挟持する。
【０１０５】
この実施形態において、ハウジング３０と乳房ポンプ３０の係合部１４とを連結するに先立ち、それらの間に上記支持部材を着座させる（たとえば、上記ハウジングおよび係合部の対向円周溝６０、６２内に支持部材を嵌装する）。連結力により（たとえば上記係合部とハウジングとを相互に対して螺着、枢動もしくは押圧する等による）、上記支持部材は上記係合部とハウジングとの間における所定位置に堅固に挟持される。
【０１０６】
この目的を促進するために、本実施形態における支持部材５６の厚み（すなわち断面高さ）６３はハウジング３０の円周溝６０の側壁６４の高さに等しくまたは僅かに大きいことから、上記係合部とハウジングが連結されたときに上記支持部材は摩擦嵌めにより保持されかつ部分的に圧縮され得る。故に上記支持部材の厚みは約２ｍｍ〜５ｃｍ、好適には約３ｍｍ〜２ｃｍ、更に好適には約４ｍｍ〜１ｃｍである。この設計に整合して上記支持部材は硬質プラスチック材料（たとえば硬質ポリビニルもしくはポリウレタン等）で作成され得るが、好適には、たとえば従来配管および車両ガスケットで用いられる如き柔軟プラスチック、ゴムもしくは耐水繊維もしくは複合材料から作成される。
【０１０７】
ディスク形状の支持部材５６は、膜もしくはフィルタ等の吸収または吸着材料のシート３８の支持に良好に適している。図２および図７に示された如く上記シートは好適には上記支持部材の上側保持リング６６および下側保持リング６８間に挟持されることから、係合部１４およびハウジング３０を介して真空が付与されたとき（以下を参照）ならびに乳頭１６が上記シートに衝当したときに、上記フィルタを通過し得る負圧に対して上記シートは所定位置に保持される。上記上側および下側保持リングは図２に示された如く使い捨て詰替え部材内に一体的に接合され得るか、またはこれらの２個の保持リングは分離可能にされることにより交換シートを取出しかつ挿入する再使用可能カセットを提供し得る。後者の設計例は図７に示されており、この場合に上側および下側保持リングはヒンジ７１により、または連動螺着もしくは戻り止め嵌合機構等の他の結合手段により解除可能に相互結合される。この実施形態において上記上下のリングは、開放もしくは結合解除されることで上記シートの挿入および除去を可能にすると共に、たとえば、対向するリング上の受容部７４内に戻り止め嵌合（ｄｅｔｅｎｔ ｆｉｔ）を形成するように一方のリング上の弾性係止部７２により並置的に閉鎖される。この目的を促進するために上記上下のリングの各対向面７５は襞つき（ｒｕｇｏｓｅ）または別様に改変された表面、たとえば上記シートに係合して該シートを上記２個のリング間に確実に挟持する単一の隆起７６もしくは複数の隆起を有することで上記シートの保持を促進し得る。
【０１０８】
図４および図５に示された他の設計において上側保持リング７２は無く、シート３８は、単に支持部材５６上に着座するか、または、他の形態の保持手段により上記支持部材の上面７６に対して着脱自在に保持される。たとえば上記シートは、上記支持部材の上面を囲繞する凹所７８であって上記シートを受ける形状および寸法とされた凹所７８に嵌装され得る。上記シートは、たとえば該シートの縁部が上記凹所の側壁７９に摩擦により係合するように適宜サイズにされることにより、上記凹所内に確実に嵌装される。選択的に、上記凹所の側壁と上記支持部材の上面との間に保持溝が配設されることで、上記シートの縁部を受けると共に、使用の間は該シートを上記凹所内に戻り止め嵌合（ｄｅｔｅｎｔｉｏｎ ｆｉｔ）により保持し得る。更に別の設計において上記シートは単に上記支持部材の上面上に着座すると共に、たとえば該シートと支持部材上面との間に一時的結合を形成する湿潤もしくは接着により（好適には不活性な接着剤による）上記上面に取外し可能に固定される。上記設計の各々において上記シートは、サンプル採集用のハウジング内にもしくはハウジング上に容易に着座可能であり、かつその後に処理のために、たとえば手でまたはピンセットもしくは他の従来管理ツールで、取り外され得る。
【０１０９】
本発明の各好適実施形態において、支持部材５６は、図５に示された如く流体保持ウェルを形成する凹所７８を含む。故に該凹所には、緩衝剤、プローブ、架橋剤、遮断剤、変性剤などを含む溶液等の所望溶液が充填されて、サンプルの採集、管理および／または処理が促進される。
【０１１０】
支持部材５６の設計が、該支持部材がサンプル採集ハウジング３０の内孔５８または乳房係合部材１４の対応内部区画室を埋める場合、または上記支持部材がウェルを形成する凹所７８を含む場合には、支持部材５６内に空気チャネル８０を配設して、作動時に真空負圧が上記ハウジングから上記空気チャネルを通り上記ポンプの係合部１４まで通過するのを可能にし、且つ使用後に上記係合部およびハウジングの通気を可能にして、乳房１７からの上記係合部の係合解除を可能にすることが一般的に望ましい。好適には図２、図３、図５、図６および図９に示された如く、一本以上の斯かる空気チャネルが上記支持部材の周縁部の近傍に配置される。選択的に図４に示された如く、一本以上の空気チャネルが中央に配置され得る。上記空気チャネルは、図２、図３、図５、図６および図９に示された如く該空気チャネルが固相サンプル採集媒体と連絡しないように位置決めされるか、または図４に示された如く気体と連絡して気体を介して連結するように位置決めされてよい（固相媒体が孔性であると共に該空気チャネルを通して加わる真空圧に耐えるに十分な強度を有することを条件とする）。
【０１１１】
また、用いられる固相サンプル採集媒体のタイプにより変化するハウジング３０、乳房係合部材１４および／または支持部材５６の他の設計および形態が提供される。たとえば粒状固相サンプル採集媒体４１（ビーズ、樹脂もしくはミクロスフェア等）が用いられる場合に該媒体はカートリッジ８２内に囲繞され得る。該カートリッジは、上記支持部材に対して着脱自在に取付けられもしくは該支持部材内に一体化され、または上記ハウジング３０もしくは乳房係合部に対して着脱自在に取付けられる。図９に示された如く本発明の好適実施形態は着脱可能係合機構を提供するが、これによれば、たとえばカートリッジの第一端部がポンプ１０の係合部１４と流体により連結する如くカートリッジを支持部材に係合することにより、固相媒体を収納するカートリッジもしくは他の容器は上記ハウジングもしくは乳房係合部材に対して着脱自在に係合され得る。一実施形態においてカートリッジの第一端部は、上記支持部材を通る取付チャネル８６であって上記ポンプの上記係合部と該カートリッジの第一端部との間に流体による連結を提供する取付チャネル８６に取外し可能に挿入される。好適には上記チャネルは摩擦嵌めによりカートリッジの第一端部を受ける寸法とされる（たとえば該チャネルの直径は約０．５ｍｍ〜２ｃｍ、好適には約１ｍｍ〜１ｃｍ、更に好適には約３〜５ｍｍである）ことから、使用時に上記カートリッジの第一端部が上記支持部材の上面７６と面一となりまたは該上面の僅かに上方に延在して所定位置に留まるまで、上記カートリッジは上記チャネル内に単純に押し入れられ得る。この目的のために、上記支持部材の少なくともチャネル部は、適度な摩擦嵌めによりカートリッジを受容かつ解放するように（すなわち容易に手で取り外される）、好ましくは中圧縮力の弾性材料により形成され。選択的に、上記カートリッジは、カートリッジの第一端部と支持部材チャネルとの間の相補的な螺着もしくは相互係止による戻り止め嵌合により（たとえば従来キーと溝の設計等）、上記ハウジングに対して係合され得る。更に別の設計において上記カートリッジは、永続的に上記支持部材に対して係合されまたは上記ハウジングに対して直接的に係合され得る。
【０１１２】
カートリッジ８２の設計および構造は、粒子のサイズ、粒子の機能（たとえば、クロマトグラフ吸着、親和性結合等）を含む粒状固相媒体の特性に依存し、且つ、他の要因の中でも特に粒子が乾燥して用いられるか溶液に含められるかに依存して変化する。上記カートリッジの設計および構造は更に、サンプルの検出に求められ得る乳房疾患マーカ（たとえば細胞、蛋白質、脂質または核酸）のタイプに依存する。
【０１１３】
図９に示された好適実施形態において、上記カートリッジは円筒状でありかつビーズもしくはミクロスフェアを含む。ポンプ１０の係合部１４に対して流体による連結を維持しながら上記円筒体内にビーズもしくはミクロスフェアを囲繞するために、円筒体の第一端部８４は孔性隔壁材料（たとえばフィルタもしくは膜等）による半透性カバー９０により覆われ、該カバーは、カートリッジからのビーズもしくはミクロスフェアの脱落を防止し乍ら、乳房流体（乳房流体の細胞等の選択された成分を含むもしくは除く）が該カバーを通過してビーズもしくはミクロスフェアに接触するのを可能にする。このようにして上記カバーは、乳房流体の各成分をカートリッジ内へ分配（分離？）し、かつ該カバー上に異なる成分を別個に保持し得ることにより、異なるサンプルの同時採集を可能にする。上記半透性カバーは、たとえば除去可能もしくは永続的な接着剤により接合することにより、または該カバーをカートリッジの第一端部８４に固定する着脱可能または一体的なカバー保持リング９２を配備する等の種々の手段により、上記カートリッジに固着され得る。上記カートリッジの第２端部は第２端部カバー９６を特徴とし、第２端部カバー９６はカートリッジに一体化もしくは着脱可能にされ得ると共に、気体および流体に対して不透過性もしくは上記第一端部カバーについて記述したように半透過性とされ得る。
【０１１４】
本発明の他の特徴において、ハウジング３０は、サンプル採集用の非粒状固体テンプレートを支持する。このタイプの固相採集媒体として、たとえば、一本以上の毛細管４２（図６）、被覆管４３（図１０）、プレート、ウェル、スライドが挙げられる。乳房流体（またはその所望成分）のサンプルを受容、吸着もしくは結合するこれらのテンプレートは好適には、サンプル採集に適切であると当業界で知られているガラス、プラスチックまたは同様の材料（たとえば不活性プラスチック）で形成される。
【０１１５】
これらの種々のテンプレートに適応するために、ハウジング３０、乳房係合部１４および／または支持部材５６の更に他の設計および構造が提供される。たとえば毛細管４２が用いられる場合、該毛細管は上記支持部材に取付けられもしくはその内部に一体化され、または他の種々の同等手段によりハウジング３０に対して繋止され得る。図６に示された如く本発明の好適実施形態は一本以上の毛細管４２の第一端部を着脱自在に受ける一個以上の取付チャネル８６を有する支持部材を利用して、上記毛細管の端部がポンプ１０の係合部１４と流体により連結するように構成する。故に上記チャネルは、標準的な毛細管の直径に等しいもしくは僅かに小さい、すなわち約０．５ｍｍ〜３ｍｍ、好適には約１〜２ｍｍ、更に好適には約１．５ｍｍの好適直径を有する。上記支持部材の構造および上記管の取付けは、上述の支持部材構造およびカートリッジの取付けと同様である。単一の管が用いられる場合、それは好適には上記ハウジングに対して中央に載置される。複数の管が使用される場合、それらはたとえば図６に示された如く複数のサンプルを同時に採集するために配列され得る。
【０１１６】
本発明において提供されるサンプル採集用の他の形態の固体テンプレートは、毛細管４２について上述した同様方法でハウジング３０に対して好適に取付けられる被覆管４３である（図１０）。この管は、両端部が開放するか、またはカートリッジ８２に対して上述した如く一端もしくは両端部に半透過性カバーならびに不透過性の第２端部カバーを有し得る。
【０１１７】
上記被覆管は、乳房流体サンプルを吸着、結合、分配もしくは別様に処理し得る内孔被覆１００を有する。たとえば上記被覆は選択された乳房疾患マーカに特異的に結合する抗体、配位子もしくは他の結合パートナを有する親和性被覆とされ得るものであり、その場合に該被覆は上記管の内孔壁に共有結合的にもしくは別様に結合する。有用である多様な被覆が本明細書中に開示されるか、さもなければ業界周知である。これらの被覆は、支持部材５６内の凹所７８により形成されるウェルを含め、ウェル、プレート、スライドの如きテンプレート等の本発明で用いられる他の固相媒体を被覆するために使用され得る。
【０１１８】
乳頭１６の表面には乳房流体の小さな液滴のみが典型的に表出することから、乳頭上の表出流体を上記固相サンプル採集媒体に直接的に接触させることが概ね好適である。このためには、各図に示される如くポンプの乳房係合部１４の基部２２の近傍にサンプル採集媒体を位置決めすることが必要である。故に支持部材５６が設置される場合に該部材は、乳房に対する上記係合部を介して負圧を掛ける間に該支持部材の上面７６が乳頭に直接的に接触するように位置決めされる。この観点から概略的な位置決めのみが必要とされる。これは、乳頭が真空により上記支持部材に方へ吸引されることにより支持部材上面に当接し易いからである。
【０１１９】
但し、乳房ポンプの設計および乳房の解剖学的構造は相当に変化することから、ポンプ１０の係合部１４の基部２２に対して固相媒体が接近もしくは離間されるように該固相媒体をハウジング３０に対して調節可能に取付けるのが好適である。故に、本発明の好適実施形態においては、上記乳房ポンプが乳頭に係合するときに固相採集媒体を乳頭に更に接近もしくは離間させて調節可能に移動する往復機構が設けられる。流体表出処置の開始時に、流体表出を促進するために乳房に対して負圧を加えながら上記採集媒体を乳頭から後退させる。流体表出は透明な係合部もしくはハウジングを介して視覚により観察され、かつそのとき採集媒体は表出流体に接触するために乳頭の近傍へ前進する。
【０１２０】
図１１に示された如く上記往復機構に対する好適設計は、上述された如く固相採集媒体を支持する支持部材５６を採用する。上記支持部材はハウジング３０の回転部材１０９に対して好適には往復キャリア１１０上に往復するように取付けられる。上記ハウジングおよび／またはポンプ１０の係合部１４に対して上記支持部材を取付けるために、上述したように、該支持部材は、上記キャリアの第一端部１１２に対して該支持部材をたとえば摩擦嵌め、移動止め嵌合または螺着係合することで、上記キャリアに着脱自在に取付けられ得る。たとえば上記支持部材は、上記キャリアの第一端部で円周溝１１４内に摩擦嵌めにより取付けられ得る。この設計に関して上記キャリアは、好適には、負圧が該キャリアおよび支持部材を通して上記係合部へと効率的に伝達され得るように、開口円筒体の形態である。
【０１２１】
ポンプ１０の係合部１４に対してキャリア１１０および／または支持部材５６の位置を往復可能に調節するために、ハウジング３０の回転部材１０９は上記係合部の基部２２に対してシール可能、回転可能および着脱自在に連結される。この連結は種々の設計により達成され得るが、その一つは、上記係合部と上記ハウジングの回転部材との夫々の連結端部４８、５０で対向円周溝１１８、１２０に第一のＯ−リング１１６を着座させることである。これらの溝は、上記ハウジングおよび上記ポンプの係合部を介して真空圧が掛けられたときに上記Ｏ−リングを実質的に圧縮せずに気密シールで上記Ｏ−リングを受けるサイズおよび形状にされる。上記Ｏ−リングはまた、たとえばシリコングリースにより潤滑される。これらの特徴によって上記ポンプの係合部に対する上記ハウジングの回転部材の自由回転が可能になり、この回転によって上記往復機構はサンプル採集媒体を前進させて（たとえば上記キャリアおよび／または支持部材を前進させる）乳頭１６上の表出乳房流体に接触させる。
【０１２２】
本発明の上述の実施形態に対する往復機構を完成するために、ハウジング３０の回転部材１０９は、また、該ハウジングの固定側部材１２４に対してシール可能かつ回転可能に相互に連結される。この相互連結は、好適には、上記ハウジングの回転部材の後側連結端部１３２と上記ハウジングの固定側部材１２４の第一連結端部１３４との夫々における対向円周溝１２８、１３０内に第２のＯ−リング１２６を着座させることで達成される。これらの溝はまた上記Ｏ−リングを実質的に圧縮せずに気密シールで該Ｏ−リングを受けるサイズおよび形状とされ、且つ、該Ｏ−リングは上記固定側部材に対する上記回転部材の自由回転を促進するために潤滑される。
【０１２３】
係合部１４に対してキャリア１１０および／または支持部材５６を前後に往復動するために、ハウジング３０の回転部材１０９は、上記キャリアもしくは支持部材から横切る方向に延在する係合突起（ｒｉｄｉｎｇ ｐｅｇ）１４２を受ける寸法の内孔的螺旋配向溝１４０を有する。これに加えて、上記ハウジングの回転部材は、上記キャリアもしくは支持部材から横切る方向に延在する角度を付けた固定用隆起部１４６を受ける寸法の長手方向に配向された内孔的溝１４４を有する。この設計によればハウジング３０の回転部材１０９が回転すると、該回転部材の上記長手溝に係合する上記固定用隆起部により該回転部材に対して角度を付けた固定された上記キャリアもしくは支持部材が駆動回転する。故に上記ハウジングの回転部材およびキャリアが回転するときに（上記ハウジングの上記係合部および固定側部材の位置は摩擦もしくは手動もしくは構造的な抵抗により角度を付けて固定される）、上記係合突起は上記螺旋溝に沿い移動し、上記溝の方向に沿い該突起を並進させることにより、上記支持部材もしくはキャリアは上記係合部に対して前後に往復する。
【０１２４】
ハウジング３０の回転部材１０９に固相媒体および／または支持部材５６を挿入しもしくは取り外すために、上述された如く上記回転部材と上記係合部の基部２２との間は着脱可能に相互に連結される。上記回転部材および係合部を結合解除する上で必要なことの全ては、これらの部材が反対方向に引張られ、それによりＯ−リング１１６が上記係合部および回転部材の夫々の連結端部４８、５０における対峙する円周溝１１８、１２０の一方から着座解除されることである。サンプル採集媒体および／または支持部材を装填または回収した後に上記回転部材および係合部を再連結するために、それらは単に一緒に押し戻される。上記Ｏ−リングの再着座を促進するために、対峙する上記各円周溝の一方を他方より深くして上記回転部材および係合部が分離したときに深い方の溝がＯ−リングを保持するようにし、かつ回転部材および係合部を再連結するときには浅い方の溝が更に容易にＯ−リングを受け入れるようにするのが望ましい。
【０１２５】
本発明において、図１４および図１５に示された如く、ポンプ１０の係合部１４に対してサンプル採集媒体を往復動させる単純な摺動機構を用いる他の形態の往復機構が提供される。該摺動機構の一実施形態は、上記ハウジングの外側内孔１５４と気体により連結されない内側内孔１５２を形成するマニフォルド１５０を特徴とする。この設計によれば、当該手動スライド・レバー１５６のヘッド部分１５８がポンプオペレータにより手動で管理され得るように上記ハウジングの外側まで延在する手動スライド・レバー１５６が設けられる。一方、上記内側内孔内において上記キャリアが自由に往復動するのを可能にするサイズおよび形状の上記スライド・レバーは、支持部材５６もしくはキャリア１１０に連結される。
【０１２６】
作動時にスライド・レバー１５６は後方位置へ移動して、図１４に示された如く上記固相サンプル採集媒体（たとえば吸収材料製のパッドもしくはシート３８）が乳頭１６との接触から外れるようにする。外側内孔１５４を介して乳頭の周囲の乳房領域に負圧が掛けられ、乳頭の先端が上記内側内孔と整列する。乳房流体表出は透明な上記係合部およびハウジングを介して視覚観察され、この時点で上記レバーはヘッド部分１５８により手動で管理されて前方移動する。上記レバーの移動により上記支持部材および／またはキャリアは、乳頭の先端における表出流体に対してサンプル採集媒体が接触するまで前方移動する。上記係合部およびハウジングはたとえばヒンジ５２およびラッチ５４または他の適宜連結手段により着脱自在に連結されることにより、固相媒体および／または支持部材の挿入および取り外しが容易になる。
【０１２７】
上記乳房ポンプの設計の各々において乳房ポンプ１０の係合部１４は、乳頭１６の周囲の乳房１７の領域に持続的負圧を生成し得る真空ポンプ１６０に気体を介して連結される（図１参照）。手動ポンプ（図１）、機械的駆動ポンプおよび電気的駆動ポンプ等の、上記乳房ポンプと組み合わせて使用される多様な周知真空ポンプの任意のものが使用され得る。作動時に上記ポンプは、約５０〜２００ｍｍＨｇの負圧を生成する。典型的に上記ポンプは、上記係合部に対して高真空ホース１６２を介して連結される。一般的に上記ホースは、上記係合部に気体により連結されるハウジング３０に連結される（たとえば図１、図８および図１１を参照）。
【０１２８】
上記ポンプにより乳房１７に加わる圧力は、周知圧力調整機構により（たとえば、ライン内の圧力調整弁の直径を調整するダイヤフラムもしくは他の機構を配備することにより）変更できる。これに加えて乳房ポンプ１０はたとえば圧力解放弁１６４等の通気機構を含み、これは使用の前後において上記システムを閉鎖かつ通気するためにユーザが選択的に管理することにより、乳房に作用する真空圧が選択的に付加および解除される。この点に関して上記システムは、一般的に、十分な乳房流体表出がオペレータにより観察されたなら直ちに通気される。これによって、上記往復機構が上記ポンプの種々の部材間のシール可能および回転可能に連結される場合に、シール（たとえばＯ−リング１１６、１２６等）上の圧力が解放され（図１１および図１３に示された如く）、それにより支持部材５６および／またはキャリア１１０を往復動させるために種々の部材の夫々の回転が促進される。
【０１２９】
本発明の更に他の特徴において、従来乳房ポンプに対して固相サンプル採集媒体を連結する乳房ポンプ・アダプタ１２が提供される（図１２および図１３を参照）。図１２に示された如く上記アダプタは、従来乳房ポンプの乳房係合部１４内に着脱自在に挿入されるサイズおよび形態の取替式乳房係合部１７０を特徴とする。好適実施形態において上記取替式乳房係合部は漏斗形状とされると共に、既存の乳房ポンプの漏斗形状の乳房係合部内に嵌め込まれる（ｎｅｓｔ）。完全に嵌め込まれたときに上記取替式乳房係合部の末端縁部１７２は少なくとも、既存の乳房ポンプの乳房係合部の末端縁部１８までは延在する。
【０１３０】
取替式乳房係合部１７０は既存の乳房ポンプ１０の乳房係合部１４に対し、たとえば既存ポンプの乳房係合部に対して上記取替式係合部を摩擦嵌め、移動止め嵌合、または螺合する等の種々の手段により、着脱自在に連結され得る。好適にはアダプタ１２は既存ポンプの円筒状連結部１７６へ延びたステム部１７４を有し、該ステム部は既存ポンプの対応部と協働して着脱可能な連結機構を提供する。故に一好適実施形態において上記ステム部は、上記連結部の内壁１８２に衝当するＯ−リング１８０であって既存ポンプの乳房係合部に対して上記取替式係合部を相互に結合する摩擦嵌めを形成するＯ−リング１８０を受ける寸法にされた円周溝１７８を特徴とする。
【０１３１】
アダプタ１２は、取替式係合部材１７０に流体により連結される固相サンプル採集媒体を支持する。好適には上記固相媒体は、上述の如く、支持部材５６により上記取替式係合部に連結される。乳房流体表出時もしくはその後に乳頭と固相媒体との間の接触を可能にする位置において、たとえば上記支持部材を上記取替式係合部のステム１７４に摩擦嵌め、移動止め嵌合または螺合することにより、上記支持部材は上記アダプタに一体的または着脱自在に取付けられる。たとえば上記支持部材は摩擦嵌めにより、上記ステムの基部で円周溝１８４内に取付けられ得る（図１２）。
【０１３２】
乳房ポンプ・アダプタ１２の好適実施形態において、上述の概念に従い取替式係合部１７２に対して固相サンプル採集媒体を移動するために往復機構が設けられる。図１３に示された如く往復機構を有する上記アダプタに対する好適設計は回転ダイアル部材１９０内にシール可能かつ回転可能に嵌め込まれた取替式乳房係合部１７０を特徴とし、かつ回転ダイアル部材１９０は既存乳房ポンプの乳房係合部１４内に着脱可能に挿入されるサイズおよび形態にされる。上記取替式乳房係合部および回転ダイアル部材は好適には漏斗形状とされることで集合的に、従来乳房ポンプの漏斗形状の乳房係合部内に嵌め込まれる。完全に嵌め込まれたときに、上記取替式乳房係合部の末端縁部１７２および上記回転ダイアル部材の自由縁部１９２は少なくとも、既存乳房ポンプの乳房係合部の末端縁部１８まで延在する。
【０１３３】
回転ダイアル部材１７２はハウジング３０の回転部材１０９に対して好適には一体的な挿入物として連結されることにより、上記ダイアル部材を手動で回転すると上記ハウジングの回転部材が回転する。一方、上記ハウジングの回転部材は該ハウジングの繋止部材１９４に回転可能に連結され、該繋止部材は、たとえば既存ポンプの円筒状連結部分１７６内等のように既存ポンプ内にハウジング全体を繋止する。図１３に示された如く上記ハウジングの上記繋止部材は、好適には、該ハウジングの回転部材を部分的に囲繞するスリーブであって該回転部材に対してシール可能、回転可能に連結されたスリーブの形態である。一方、上記繋止部材は既存ポンプの円筒状連結部分内に回転しないように繋止される。
【０１３４】
一好適実施形態において、上記ハウジングの回転部材および繋止部材１９４の夫々の前部連結端部２０２、２０４で対峙する円周溝１９８、２００内に第一のＯ−リング１９６を着座させることにより、上記ハウジングの回転部材１０９は該ハウジングの繋止部材１９４に対してシール可能かつ回転可能に連結される。これらの溝は、上記Ｏ−リングを実質的に圧縮せずに上記回転部材および繋止部材の間に該Ｏ−リングを気密シールで受けるサイズおよび形態にされる。該Ｏ−リングは、また、上記繋止部材に対する上記回転部材の自由回転を促進するために潤滑される。上記ハウジングの回転部材および繋止部材の夫々の後側連結端部２１２、２１４で対峙する円周溝２０８、２１０内に潤滑されかつ無圧縮状態で第２のＯ−リング２０６が着座することにより、上記繋止部材に対する上記回転部材の回転が促進される。
【０１３５】
上記ハウジングの回転部材１０９の回転を整合しかつ促進するために、回転ダイアル部材１９０（上記ハウジングの回転部材を駆動する）はアダプタ１２の取替式係合部１７０に対してシール可能かつ回転可能に連結される。好適には上記取替式係合部は、上記回転ダイアル部材のステム状基部２１８内に嵌まるステム２１６を有する。これらの構造間の自由回転は、たとえば、上記取替式係合部および回転ダイアル部材の夫々のステムおよび基部において対峙する円周溝２２２、２２４内に潤滑され且つ無圧縮状態で着座する第３のＯ−リング２２０を設けることにより達成される。この回転は、また、上記取替式係合部と患者の乳房１７との間における摩擦接触（圧力および／または吸引による）により促進され、該摩擦接触によれば上記取替式係合部は角度を付けて固定され、かつ上記回転ダイアル部材に対する該取替式係合部の共回転が防止される。
【０１３６】
一方、上記ハウジングの繋止部材１９４は既存ポンプ内に繋止機構により繋止されるが、該繋止機構はポンプ内でたとえば円筒状連結部分１７６の内壁１８２に対して上記繋止機構を角度を付けて固定する。たとえば圧縮可能な前後繋止スリーブ２３０、２３２は、上記繋止部材を囲繞する繋止スリーブ保持用の前後円周溝２３４、２３６内に取付けられ得る。上記各繋止スリーブは潤滑されないで、ゴムまたは柔軟プラスチック等の半圧縮性材料で形成される。この構成は上記繋止部材と上記連結部分の内壁との間に摩擦繋止を形成することにより、上記ハウジングの回転部材１０９が回転する間に上記繋止部材は傾斜移動しないようにする。既存の乳房ポンプ１０に対してアダプタ１２を組み立てるために該ポンプの連結部に上記ハウジングの繋止部材を挿入するときに上記連結部の内壁に対する強力な摩擦にもかかわらず、上記各繋止スリーブを各溝内に夫々確実に保持するために、上記保持溝の基部に対応する位置で上記繋止スリーブおよび保持溝は好適には鋭角に傾斜する（すなわちそれらは矩形もしくは三角形の断面を有する）。
【０１３７】
取替式係合部材１７０は乳房１７に対して摩擦により繋止され、かつハウジング３０の繋止部材１９４は既存ポンプ１０の連結部１７６の内壁１８２に対して摩擦により繋止されることから、オペレータが回転ダイアル部材１９０を手動で操作して乳房に対する圧力を維持しながら該ダイアル部材を穏やかに回転するときに、上記ハウジングの回転部材１０９は上記取替式係合部および上記繋止部材の両者に対して自由に回転する。
【０１３８】
本発明のこの実施形態において上記ハウジングの回転部材と繋止部材との間の相対回転により上記往復機構は駆動され（たとえばキャリア１１０および／または媒体を支持する支持部材５６を前進させることにより）、サンプル採集媒体を取替式係合部材１７０に向けて前進させ、乳頭１６上の表出乳房流体に接触させる。先に説明した実施形態と同様に、ハウジング３０は好適には上述の如く固相採集媒体を支持する支持部材５６を収納する。上記支持部材は、好適には往復キャリア１１０上で、ハウジング３０の繋止部材１９４に対して往復可能に取付けられる。上述の如く、上記支持部材は、たとえば該支持部材を上記キャリアの第一端部１１２に摩擦嵌め、移動止め嵌合または螺合することにより上記キャリアに着脱自在に取付けられ得る。図１３に示された実施形態において、上記支持部材は、該支持部材とキャリアとの間の協働螺条１４０により該キャリアに着脱自在に係合される。これに加えて、上記支持部材は上記取替式係合部のステム２１６内に受けることのできるサイズおよび形態にされ得る。これは、乳頭が上記ハウジング内の採集媒体に接触するために上記ステムを完全に通過しないようにするために上記取替式係合部およびそのステムの内径（すなわち内孔の直径）が元の係合部１４およびその基部２２の夫々の寸法よりも小さいことによる。この設計に関連して、負圧が回転部材１０９およびキャリアを介して（且つ／又は上記支持部材の空気チャネル８０を介して）上記取替式係合部へ効果的に伝達されるように、上記キャリアは好適には開放円筒状の形態であり、且つ上記ハウジングの回転部材１０９は真空ポート２４２を有する。
【０１３９】
アダプタ１２の取替式係合部材１７０に対してキャリア１１０および／または支持部材５６の位置を往復調節するために、上記ハウジングの繋止部材１９４は、上記キャリアまたは支持部材から横切る方向に延在する係合突起１４２を受ける寸法の内孔的螺旋配向溝１４０を有する。これに加えて、上記ハウジングの回転部材は、上記キャリアまたは支持部材から横切る方向に延在する角度付き固定用隆起部１４６を受ける寸法にされて長手方向に配向された内孔的溝１４４を有する。最後に、上記ハウジングの回転部材の壁部から上記螺旋配向溝内への上記係合突起のアクセスを可能にし、且つ該溝に沿った上記ピンの往復通過を可能にするために、上記回転部材は長手方向に配向された第２内孔的溝２４４を有する。
【０１４０】
この設計によれば、回転ダイアル部材１９０の回転は、ハウジング３０の回転部材１０９、および該回転部材の長手溝１４４に係合された固定用隆起部１４６により該回転部材に対して角度を付けて固定されたキャリア１１０（もしくは支持部材）の両者の回転を駆動する。故に上記回転部材およびキャリアが回転するとき（取替式係合部材１７０および繋止部材１９４の位置は摩擦もしくは手動もしくは構造的な抵抗により傾斜固定される）、上記係合突起は上記螺旋溝１４０に沿い移動し、上記溝の方向へ該突起を移動させることにより、上記支持部材もしくはキャリアは上記取替式係合部に対して前後に往復動する。
【０１４１】
上記固相媒体および／または支持部材５６をアダプタ１２に挿入しかつ取り外すために、当業者であれば容易に明らかな他のアクセス設計によって、着脱可能連結が既存ポンプ１０とアダプタ・ユニット全体との間、ハウジングの回転部材１９０と繋止部材１９４との間、または上記回転ダイアル部材と取替式係合部１７０との間で結合解除され得る。
【０１４２】
図１６乃至図２６に示された本発明の更に詳細な特徴において、上述の如き乳房流体サンプル採集用の汎用乳房ポンプ１０の選択された特徴は、サンプル採集の更に優れた適合度および容易さのために構成された携帯用乳房ポンプ装置１０’に取入れられる。上記携帯用サンプル採集ポンプは、片手で操縦かつ操作できる構造的に一体化されたコンパクトな乳房流体採集装置に乳房係合部材１４および真空ポンプ機構１６０を取入れるために独自に設計かつ構成される。上述の汎用乳房ポンプ１０と同様に携帯用ポンプ１０’は乳房係合部１４と気体を介して連結される真空ポンプ機構１６０を取入れることにより上記ポンプ機構からの吸引圧力を乳房係合部１４へ送って、患者の乳頭１６の領域に負圧を加える。固相サンプル採集媒体（たとえば膜、フィルタ、粒子媒体、および／もしくはプラスチック、またはガラス管、ウェル、バイアルもしくはスライド等）が同様に上記乳房係合部材に流体により連結されて、上記係合部材を経て固相採集媒体に接触させる直接的もしくは間接的な表出した乳房流体の送出が提供される。
【０１４３】
本発明のこれらの特徴によれば、新規な乳房流体サンプル採集方法が提供され、該方法において乳房流体標本を採集する医師、技術者もしくは患者は携帯用乳房ポンプ１０’を把持して操作することにより乳房流体の表出を刺激してその標本を採取する一方で、患者を監視しかつ患者情報を記録する等の付加的作業に対して片手を自由にさせる。この関係で、上記コンパクトなポンプ設計によれば、上記装置は片手で持ち上げて操作でき、患者の乳房に対して乳房係合要素を着座させた後に真空ポンプ１６０の手動操作により乳房に対して真空圧を加えて乳房流体の表出を刺激し得る。このような操作によって、サンプル採集に対して乳頭１６またはその近傍に適当量の乳房流体が表出する。これらの単純な操作工程に関して、上記携帯用装置は、また、多くの場合には乳房から上記装置を取り外すために、または両手で操作するために付加的手動工程もしくは必要性を伴うことなく、上記係合部材に流体により連結される固相サンプル採集媒体上または該媒体内に表出乳房流体の同時的採集を可能にする。
【０１４４】
携帯用乳房ポンプ装置１０’は、上述の如く乳房流体表出を促進するオキシトシン刺激に続いて乳房流体を採集するために採用され得る。選択的に、上記装置は対象体の実質的割合において、機械的乳房刺激に選択的に組み合わせた真空圧のみにより乳房流体表出を達成するためにオキシトシン準備刺激なしで使用され得る。
【０１４５】
本発明の携帯用乳房ポンプ１０’を使用する際に、表出した乳房流体は、代表例として、サンプルが採取される前に乳房１７から乳房係合部材１４を取り外す介在的手動工程もしくはその必要性を伴うことなく、表出時に固相サンプル採集媒体へ直接的に移動する。このようなサンプル採集は迅速かつ単純であると共に、当該装置の衛生的使用を促進することにより患者感染およびサンプル汚染の危険が最小化される。故に上記携帯用乳房ポンプの一定の方法において乳房流体は、該携帯用ポンプ内に一体化された、たとえば膜、フィルタ、リザーバもしくはバイアル等の固相採集媒体へ直接的に移送される。上記サンプルは、構成蛋白質、粒子および／または細胞を含む全体的な非希釈乳房流体として採集され得る。選択的に、処理済流体サンプルを得且つ／又は固相構成サンプルを得るために、表出した乳房流体の選択された成分は上記流体から同時にもしくは引き続いて除去される（たとえば乳房流体を濾過、分離または純化することにより）。たとえば、上記流体から分離した固体成分（たとえば細胞もしくは他の粒子）を採取する種々の採集方法が提供される。他の形態の方法は表出した乳房流体から、可溶性の、懸濁されたまたは固相で捕捉された蛋白質、脂質、糖質、ポリヌクレオチドまたは他の分子的／生化学的成分を採取する。他の形態において上記携帯用ポンプ装置は、膜、フィルタもしくはクロマトグラフ基板等の固相採集媒体（たとえばレプチン−、抗体−、酵素−または配位子−で被覆されたバイアル、ビーズなど）へ所望の蛋白質、脂質、糖質もしくはポリヌクレオチドのサンプル材料を分配もしくは分離するために機能する。これに関連して、本発明に係るサンプル採集および処理時には既知採集／クロマトグラフ方法から種々の選択的もしくは付加的な工程が採用され得る。このようにして、膜吸着、濾過、アフィニティ・クロマトグラフィ、化学処理、遠心分離等の種々の既知方法により乳房流体の液体成分から、流体の表出と同時にもしくはそれに引き続いて、蛋白質、脂質、糖質、ポリヌクレオチド、細胞および非細胞粒子が分配されもしくは相互から分離されることにより所定範囲の構成成分もしくは処理サンプルが採取され得る。
【０１４６】
本発明の一定の採集方法において、携帯用ポンプ１０’を用いて表出した乳房流体は、同時にもしくは引き続いて希釈、濾過、洗浄、定着剤または他の処理剤と混合され、又は他の方法で処理もしくは改変されることにより、表出した流体中に本来的に存在する細胞、蛋白質および／または他の選択された成分が部分的にもしくは完全に無い採集流体サンプルが採取され、実験室分析用の処理済流体サンプルが提供される。他の実施形態において、たとえば細胞、細胞成分および／または細胞破片等の乳房流体の粒子成分が、処理および／または改変の後に、たとえば細胞学的検査のために採集される。携帯用乳房ポンプ１０’の使用と組み合わされた予備サンプル処理を含むこれらのおよび他の形態の採集方法は、乳房流体の表出と同時にもしくはその直後に選択的に実施される。多くの場合にサンプル採集は、乳房係合部材１４に流体により連結される一個以上の固相採集媒体に上記流体が接触することと符合する。用いられる媒体のタイプに依存し、付加的処理もしくは対象体の乳房から乳房係合部材１４を取り外すことを必要とせずに、予備サンプル処理は上記ポンプの単純操作によって直接的に達成され得る。たとえば表出した乳房流体は、たとえばフィルタもしくは膜等の複数の媒体を介して液体保持リザーバもしくは容器内へと順次に送られ、それにより他の処理もしくは分析のために一定成分を分離する。選択的に表出した流体は、媒体に対する、または、該媒体に混合もしくは結合された被覆もしくは二次的処理剤に対する、化学的もしくは物理的な反応（たとえば、吸着、共有結合もしくは親和結合、酵素反応など）により、固相媒体への移送と同時に部分的に処理され得る。
【０１４７】
本発明の更に別の方法において予備サンプル処理は、乳房流体表出に続く付加的工程を含む。一定の実施形態において、乳房係合部材１４は、乳房流体が表出しかつ典型的には膜もしくはフィルタである第一固相サンプル採集媒体へ該流体が移送された後に、乳房から取り外される。サンプル採集のこの初期もしくは一次工程に続いて、洗浄、または第一固相採集媒体（たとえば蛋白質、糖質、細胞もしくは細胞破片等）から選択された乳房流体成分（たとえばニトロセルロース膜３９等）を、たとえばガラススライドもしくは流体収納リザーバ等の第２固相媒体への移送が行なわれる。典型例として、これ関連して予備サンプル処理は、保存のため、又はサンプルの更なる処理および分析のために、実験室へ搬送するための採集サンプルの最終梱包に先行する。
【０１４８】
本発明の更に詳細な実施形態において細胞学的検査に有用な細胞もしくは他の細胞物質は、第一固相採集媒体上へのまたは該媒体内への乳房流体表出と同時にもしくはそれに引き続いて分離もしくは分配される。一例において全細胞は表出した流体から、上記係合部材もしくはサンプル採集ハウジング３０に取付けられまたは携帯用乳房ポンプ１０’に一体化された固定的なもしくは着脱可能な支持部材５６により乳房係合部材１４に対して典型的には流体により連結されて固定されたニトロセルロース膜３９またはフィルタ４０上へ分配される。細胞は引き続いて流体中（たとえば細胞学的流体等）で第２固相サンプル採集媒体（たとえばスライド、ウェル、管もしくはバイアル等）へ移送するかもしくは洗浄され、かつ第２固相サンプル採集媒体は、また、上述の如く上記乳房係合部材もしくはサンプル採集ハウジングに連結もしくは一体化され得る。
【０１４９】
本発明の先の実施形態に係るサンプル採集を促進するために、携帯用乳房ポンプ１０’は容易な使用および貯蔵の便宜のために典型的にはコンパクトな携帯用ユニットとして提供される。図１６に示された如く上記携帯用ポンプの或る実施形態は、相互に連結または固定自在に固定構造で相互連結される複数の構成要素から形成されたモジュール式装置から成る。乳房係合部材１４、真空ポンプ１６０および固相サンプル採集構成要素を含むこれらの構成要素は、効率的な操作、洗浄、保守および／または保管のために望まれる個々の構成要素もしくはその部品を取り外しもしくは結合解除するために部分的にもしくは完全に分解され得る。
【０１５０】
本発明の汎用乳房ポンプ１０について上述したように、携帯用ポンプ１０’の乳房係合部１４は剛性もしくは半剛性の無孔性材料で構成されると共に、少なくとも対象体の乳房１７の乳頭１６を受けてそれと共に吸引シールを形成するサイズおよび形態にされる（たとえば図１６参照）。上記乳房係合部は、乳房の解剖学的構造における変化に適応するために種々の形状および寸法で構成され得る。同様に上述の如く上記係合部の末端縁部１８は、乳房に対して負圧が加わるときに末端縁部１８が皮膚に対して快適に衝当して効果的な吸引シールを形成するようにに丸形とされもしくは拡開される。オペレータが乳房を視認し、当該装置の位置を決定し且つ乳頭１６からの流体の表出を観察し得るように、典型的には、上記係合部材は透明な剛性プラスチック材料で構成される。好適には、上記ポンプの係合部および他の再使用可能な構成要素は滅菌目的で圧熱滅菌される。
【０１５１】
図１６乃至図１８に示された本発明の更に詳細な実施形態において、携帯用乳房ポンプ１０’は複数の一体的な構成要素から成るモジュール式装置であり、これらの構成要素は、該ポンプが組立てられるときに相互に固定的に結合されるが相互から容易に取り外されまたは結合解除され得る。上記装置のモジュール式形態は、上記ポンプを異なる様々な患者に適合させると共に当該装置の保管、洗浄および／または保守を促進するために、部品が交換可能である。故に一実施形態において、上記ポンプの乳房係合部１４は、当該装置の一個以上の相互連結構成要素から着脱可能な、分離した漏斗形状構成要素として形成される（たとえば図１８参照）。このようにして上記係合部材は洗浄および滅菌のために上記装置の残部から取り外すことができ、また患者間の乳房の解剖学的構造の相違に適応するために種々の係合部材と交換可能である。典型的に、上記乳房係合部材は、サンプル採集ハウジング３０の表面もしくは部材に対して着脱自在に連結される。
【０１５２】
図１８に示された如く本発明の携帯用乳房ポンプ１０’は、典型的には乳房係合部材１４に対して固着されまたは着脱自在に連結された支持部材５６を用いて、該係合部材に流体により連結される固相サンプル採集媒体を一体化している。選択された実施形態において、上記支持部材は、たとえばニトロセルロース膜３９等の、吸収もしくは吸着材料の一個以上のパッドもしくはシートを囲繞もしくは支持する。同一のまたは異なる材料の複数のパッドもしくはシートが組み合わせて使用できる（たとえば、湿潤部材、吸上部材または分配部材等）。選択的に、上記支持部材は、たとえばビーズ、樹脂、ミクロスフェア、粒状クロマトグラフ媒体（たとえばアガロースもしくはケイ酸塩媒体）等の粒状固相サンプル採集媒体を取入れもしくは支持し得る。本発明の更に他の付加的特徴において、上記支持部材は、ガラス、プラスチックまたは他の適宜材料で形成されたたとえば一個以上の毛細管、被覆管、プレート、ウェル、スライド等のサンプル採集用の非粒状固体テンプレートに係合しまたはそれを支持する。或る実施形態において、上記支持部材は、化学試薬、プローブ、遮断剤、緩衝剤、変性剤から選択されたサンプル処理剤を受けもしくは導入する区画室、ウェルもしくはリザーバを取入れ得る。
【０１５３】
携帯用乳房ポンプ１０’と組み合わせて用いられる支持部材５６は、典型的には、多くの場合に乳房係合部材１４の内壁２０に対して着座するために該係合部材内に挿入され得る着脱可能カセットとして提供される（たとえば図１６および図１８参照）。好適な形態において、上記支持部材は上記係合部材の内壁に対して摩擦嵌めもしくは圧縮嵌合により着座するが、この嵌合は、図１６に示された如く上記支持部材と係合部材の内壁との間における相補的な円周隆起部および円周溝により促進され得る。
【０１５４】
上記携帯用乳房ポンプの他の実施形態において、当該装置が使用され且つ乳房に対して吸引が加わるときに乳頭１６の直近にまたはそれに接触してニトロセルロース膜３９等の吸収もしくは吸着材料の一枚以上のシートを支持するために、ディスク形状支持部材５６が設けられる。図１６および図１８に示された如く上記シートは、好適には、対峙する面（円周保持溝２７０により例示）に対して固定的もしくは着脱自在に着座される上側保持リング６６により固定され、該シートの縁部はそれらの間に挟持される。これにより、上記係合部材を介して真空圧が掛けられたときに上記シートを通過し得る負圧に対して該シートは所定位置に保持されると共に、該シートに乳頭が衝当したときに該シートは所定位置に固定される。上記保持リングは、使い捨て詰替え部材から成り得る上記支持部材に一体的に結合され得るか、または該リングは分離可能とされ得ると共に上記支持部材はシート交換品を受ける再使用可能カセットから成り得る。他の設計において、上側保持リングは無く、かつ膜３９もしくはフィルタ４０が、単に支持部材５６上に着座するかまたは該支持部材に対して着脱自在に直接連結される（たとえば該シートと上側支持部材の表面との間に一時的結合を可能にするために湿潤もしくは接着するか、または上記シートの周縁部が摩擦嵌めもしくは戻り止め嵌合により上記支持部材の表面に係合するように上記シートを適切なサイズにすることによる）。典型的に、上記シートは、該フィルタもしくは膜を離脱させるために、手により、またはピンセットもしくは他の従来操作ツールを使用して、処理のために上記支持部材から容易に取り外しできる。
【０１５５】
典型的に、携帯用乳房ポンプ１０’と共に用いられる支持部材５６は、作動時に真空ポンプ１６０から付与された真空圧が該ポンプの係合部材１４に到達するのを可能にするために該支持部材の本体を通過する空気チャネル８０を含む（即ち、上記ポンプからサンプル採集ハウジング３０および空気チャネルを通り上記係合部材まで通過することにより）。同様に、上記空気チャネルは、使用後に乳房１７から係合解除するために、上記係合部材の通気を可能にする。他の実施形態において，図１８に示された如く、上記支持部材のディスク形状本体に対して中央に配置され得る２〜３本以上の複数の空気チャネルが形成される。上記空気チャネルは、上記乳房係合部材とサンプル採集ハウジング３０との間での細胞および細胞成分等の流体および／または流体懸濁粒子の通過または移送のためのチャネルとして二重目的に寄与し得る。
【０１５６】
本発明に関連する一つの特徴において、表出した乳房流体からの細胞物質は先ず、係合部材１４に対して固定関係で取付けられた一次固相サンプル採集媒体（たとえば膜３９もしくはフィルタ４０等）上に採集される（たとえば支持部材５６により）。二次的サンプル採集もしくは処理工程において、上記細胞物質は上記一次サンプル採集媒体から、選択的に上記支持部材および／またはサンプル採集ハウジングに連結された二次的固相サンプル採集媒体（たとえばプラスチックまたはガラス製のスライド、細片、管、ウェルもしくはバイアル等の）へ除去もしくは洗流され。上記細胞物質は上記二次的媒体上へまたは該二次的媒体内へ上記一次媒体から直接的に移送され得る。この移送は、たとえば、二次的媒体（たとえば上記支持部材もしくはハウジングに連結されもしくは挿入された凹所、ウェル、バイアルもしくは他の容器等）内へ直接的に上記一次的媒体から細胞物質を洗流することよる（たとえば生理学的溶液、定着剤などを使用する）。
【０１５７】
一つの代表的実施形態において、細胞物質は表出した乳房流体から、フィルタ、粒子媒体またはニトロセルロース膜３９から成る一次サンプル採集媒体上へ採集される。ニトロセルロース膜が用いられる場合、上記細胞物質は一次採集の後に該膜から洗流洗浄により洗浄される。たとえば、支持部材５６またはサンプル採集ハウジング３０に対して一体化されもしくは連結された典型的には流体保持ウェルまたはリザーバである二次的採集媒体内へ一次採集媒体から細胞を移送するために、細胞学的流体もしくは他の所望の洗浄液体が用いられる。
【０１５８】
本発明の更に詳細な実施形態において、一次サンプル採集のためにニトロセルロース膜３９が採用される。該膜は典型的には、上述の如く該フィルタを支持部材５６上もしくは該部材内に着座させもしくは取付けることにより携帯用ポンプ１０’に流体を介して連結される。ニトロセルロース膜は、乳房流体の蛋白質、ポリヌクレオチドまたは他の可溶性のもしくは懸濁された構成成分を採集するのに特に適している。好適な形態において、特に細胞および細胞構成要素である細胞学的標本を採集するために当該装置においてニトロセルロース膜が選択かつ採用される。図１６乃至図１８に示された如く、係合部材が乳房に対して着座したときに上記フィルタ（選択的に支持部材に支持される）は、乳房係合部材１４内において、該患者の乳頭に近い該係合部材の基部２２の近傍に位置する。図１６および図１７を比較すると、上記装置の手動操作により吸引圧力を作用させると乳頭１６は吸引されて上記膜に接近、または実際に該膜と物理的に接触し、それにより表出した流体が効率的に該膜へ移送される。
【０１５９】
ニトロセルロース膜３９の脆弱性および微孔性の故に、ポンプ１０’の作動時に真空負圧および乳頭１６との接触に対して該膜を保護する付加的対策の採用が必要なこともある。これ関連して、上記装置に使用するための独自設計の膜およびフィルタが提供され、この膜またはフィルタは、空気の通過を促進すると共に機械的摂動に対して構造的可撓性を与えるために、該膜もしくはフィルタの平坦表面を分断する穿孔もしくはスリットを特徴とする。一例において、真空加圧時に該膜もしくはフィルタへの空気の通過を可能にし、かつ該膜もしくはフィルタの構造的可撓性を増大するために、膜もしくはフィルタ（図２４）の中央ディスク部分２８２から半径方向に放射状スリット２８０が設けられている。透過性および可撓性に関して同様の改善をするために、選択的に、膜もしくはフィルタには一本以上の螺旋穿孔２８４（図２５）または横切る方向のスリット２８６（図２６）が切断もしくはスタンプ成形される。
【０１６０】
表出した流体から採集される目標構成要素が全細胞または細胞成分である場合、更なる処理および細胞学的検査のためにこれらの物質は典型的にはニトロセルロース膜３９である膜もしくはフィルタの表面上へ分配され得る。この目的のために、当該膜の外側の（すなわち乳頭に対面する）面上に細胞もしくは細胞破片を保持できる十分に小寸の孔サイズを有するニトロセルロース膜が採用される。たとえば、その表面上に全細胞を分配するために、約０．５μ〜５．０μ、好適には約１．０μ〜２．０μの孔サイズを有するニトロセルロース膜が有用である。
【０１６１】
上述の如く、一次および／または二次サンプル採集のために携帯用乳房ポンプ装置１０’の支持部材５６もしくはサンプル採集ハウジング３０のいずれかに対して、流体保持凹所、ウェルもしくはリザーバが流体を介して連結され得る。他の実施形態において、上記流体保持リザーバは、上述の如く一次採集の後に該リザーバ内へ洗浄される細胞学的標本等の乳房流体および／またはその構成要素サンプルを受けるために上記サンプル採集ハウジング内に一体的に形成された区画室もしくは囲繞体を備える。選択的に、上記流体ウェルもしくはリザーバは上記サンプル採集ハウジングの分離可能構成要素とされてよく、たとえば、当該流体リザーバ部材を部分的にまたは完全に囲繞しもしくは係合する相補的ハウジング部材に着脱可能に連結された上記ハウジングの可撓性ライナまたは剛性流体リザーバ部材の形態である。
【０１６２】
故に、図１６および図１８に示された如く本発明の或る形態は、細胞学的標本等の乳房流体成分の二次サンプル採集のためにハウジング３０の着脱可能流体リザーバ部材２８８を採用する。好適形態において、上記着脱可能リザーバ部材は、標準的な細胞用バイアルにより例示される堅固なサンプル採集管またはバイアル（すなわち標準的細胞用バイアルと概ね同一の形状および寸法を有する容器）の形態で提供される。上記管もしくはバイアルは、たとえば該バイアルを部分的にもしくは完全に囲繞する上記ハウジングの外側ケーシング部材２９０等の対応するハウジング部材に着脱自在に連結される。好適には上記管もしくはバイアルは、たとえば該バイアルを上記外側ケーシング部材内に部分的にもしくは完全に嵌まり該部材と気密結合をすることにより、上記外側ケーシング部材にシール可能に連結される。
【０１６３】
種々の特定形態において、上記管もしくはバイアルは、ケーシング部材２９０の内壁２９２と係合すると共にそれに対して概ね気密シールを形成する。たとえば上記ケーシング部材およびバイアルは、該ケーシング部材およびバイアルが組立ハウジングを形成するために連結されたときに、該ケーシング部材の内壁と該バイアルの外壁２９４または頂端部２９６または底端部２９８との間に実質的気密接触を提供する相補的なサイズおよび形状にされ得る。所定形態において、上記バイアルの外壁は円周隆起部またはフィン２９９を特徴とするが、該フィンは、上記バイアルが上記ケーシング部材に嵌め込まれたときに上記ケーシング部材の内壁に係合し、それにより該内壁に対して円周気密シールを形成する（たとえば図１６乃至図２０参照）。更に詳細な実施形態において、上記フィンもしくは隆起部は可撓Ｏ−リング３００により置換されるが、該Ｏ−リングは、上記バイアルの外側面上の円周Ｏ−リング溝３０２内に着座すると共に上記内側ケーシング壁と円周シールを形成する。
【０１６４】
ハウジング３０の外側ケーシング部材２９０と着脱可能流体リザーバ部材２８８との間における上記シール可能連結の目的は、ハウジング３０の上記流体リザーバ部材を含む経路内において真空ポンプ１６０から乳房係合部材１４へ真空圧を誘導することである。このようにして、上記着脱可能リザーバは上記係合部材に気体を介して、また流体を介して連結されることにより、二次サンプル採集を促進する。これらの目的を達成するために、上記着脱可能リザーバ部材は、該リザーバの内孔と上記真空ポンプとの間に気体による連結を形成する一個以上の空気ポート３１０を含むように改変される（該内孔は、選択的に支持部材５６を通る空気チャネル８０を介して、上記係合部材に連結される）。これにより上記リザーバ部材は、一次および／または二次サンプル採集時に所定位置に留まり、乳房に真空圧を伝達する管路として、かつ流体サンプル材料用容器として機能し得る（たとえば表出した流体を直接的に採集するか、または、一次サンプル採集媒体から洗浄もしくは移送された一次採集サンプル材料を受ける二次的採集媒体として）。
【０１６５】
後者の場合に、ハウジング３０の着脱可能リザーバ部材２８８は、流体および気体の両方の伝達のために上記装置の乳房係合部材１４と、直接的に、または該係合部材に選択的に連結された支持部材５６内の空気チャネル８０により間接的に、連通し得る。上述の如く、上記空気チャネルは、真空圧伝達のためのチャネル、および上記一次サンプル採集媒体から上記空気チャネルを通り上記着脱可能リザーバに至る流体の移送のためのチャネルとして二重目的に寄与する（上記支持部材に取付けられた、たとえばニトロセルロース膜等の、一次採集器から洗流されて上記空気チャネルを通り上記二次採集流体リザーバに至る、細胞および細胞成分を含む“洗浄”流体の移送により例示されように）。この目的および関連目的を促進するために、上記チャネルは、管状基礎コラム３１１へ侵入し、または上記支持部材から上記ハウジングのリザーバ部材の内孔３１４に向けてまたは該内孔内へ延びた他の流体連結ポートへ侵入していてよい。
【０１６６】
図１６乃至図２０に示された携帯用ポンプ装置１０’の実施形態において、リザーバ部材２８８は、外側ケーシング部材２９０に着脱自在、シール可能に連結されて組立てられたハウジング３０を形成する細胞用バイアルである。このシール可能連結を達成するために上記バイアルの外壁２９４は、上記ケーシング部材の内壁２９２と円周シールを形成するために円周Ｏ−リング溝３０２内に着座する円周フィン２９９もしくは可撓Ｏ−リング３００を特徴とする（たとえば図１６、図１９および図２０を参照）。上記バイアルは一個以上の空気ポート３１０を採用し、該ポートは上記バイアルの外壁と内孔３１４との間に連通して、該バイアルの内孔、真空ポンプ１６０および乳房係合部材１４の間を気体により連結する。好適には複数の空気ポートが設けられ、該空気ポートは、上記ケーシング部材の壁部と気体シールを形成する上記隆起部もしくはＯ−リングの下方に（すなわちバイアルの底端部２９８に向けて）位置する上記バイアル側に配置される。選択的に、上記空気ポートは、その位置が真空圧流の所望経路を維持し且つ上記リザーバ内に流体を保持するために適切であれば、バイアル上のたとえば下側壁すなわち底面壁３１８等の他の位置に配置され得る。この観点で、上記ハウジングの上記流体リザーバ部材の或る形態は空気ポートの位置の変化を左右することを注記する。たとえば図１６および図２０に示された如く、細胞用バイアル形状のリザーバが選択されたとき、管理（操作）および処理目的からバイアルのサンプル体積を小さくするために、上記底面壁はバイアルの底端部２９８に対して上昇させてよい。この設計および他の設計に適応するために、上記空気ポートは望ましくは、上記底面壁とシール・フランジ２９９もしくはＯ−リング３００との間でリザーバの外（側）壁２９４に位置決めされる。
【０１６７】
図１９および図２０を参照すると、着脱可能流体リザーバ部材２８８の他の改変例は、臨床的設定におけるサンプル採集、ならびに実験室設定におけるサンプル保存、搬送および／または処理のためにリザーバ部材の多目的用途を提供する。後者の目的を促進するために、上記着脱可能リザーバ部材は、サンプル採集が完了した後に上記リザーバを閉鎖してサンプル汚染および漏出を防止する閉鎖手段を備え得る。たとえば細胞用バイアル・リザーバを例に取ると、バイアルの頂端部２９６は該バイアルの主要開口に対するシール可能な主要閉鎖体を提供するように構成され得る。たとえば上記バイアル頂端部は、該バイアル頂端部にシール可能に係合するサイズおよび形態にされた（たとえば相補的螺条を形成）従来キャップを受ける相補的螺条３２０もしくは他の閉鎖手段を備え得る。この用途に関し、且つ二次開口（すなわち真空連結部として機能する一体的空気ポート３１０）を提供するために流体リザーバ部材の新規構成を更に検討すると、上記流体リザーバはサンプル採集の後で上記空気ポートをシール可能に閉鎖する二次閉鎖手段を有する。種々の空気ポート形態が企図され、それらは対応する種々の閉鎖機構を用いてシールされ得る。たとえば単一もしくは複数の空気ポートは、ポート開口内にシール可能に差込まれる形状および寸法の可撓ストッパ（たとえばゴム等）を用いてシールされ得る。選択的に、上記ポートは、ポート開口を囲繞する上記リザーバ部材の外壁２９４に接合する接着剤シールもしくはステッカーにより閉鎖され得る。
【０１６８】
後者の二次閉鎖設計に関して、本発明は、上記着脱可能リザーバの空気ポート３１０をシールする二次閉鎖機構として、かつサンプル・ラベル付けまたはサンプル標識（Ｓａｍｐｌｅ ｌａｂｅｌｉｎｇ）のための適宜記入面を提供するラベル・テンプレートとして機能する閉鎖／標識兼用装置３２４を提供する（たとえば図２１および図２２参照）。本発明のこの特徴は、たとえばサンプル採集後に上記空気ポートをシールするために直接的に貼付できる種々の接着閉鎖／標識タブの任意のもの提供することにより達成され得る。この単純なタイプの閉鎖／標識タブは、たとえば上記着脱可能リザーバの外壁２９４に接着剤を接触させる等により、シールを形成するために上記空気ポート上に貼付できる、表面の少なくとも一部上に接着剤被覆３２６を担持する第一の閉鎖形成表面３２５を有する別体の接着性ステッカーとして提供され得る。上記接着剤被覆は、好適には、採集サンプル内に存在する、たとえば緩衝剤および定着剤等の、水溶液および他の物質との接触により剥離に耐性を有するシールを形成する。上記接着剤被覆は、また好適には、被覆をカバーしかつ使用に先立ち該被覆から取り外されて該接着剤被覆を露出する保護タブまたは保護面３２７により使用前は防護されてる。
【０１６９】
閉鎖／標識装置３２４は蓋形成面３２５の逆側に第２ラベル面３２８を有し、蓋形成面３２５は、安定したインクもしくはグラファイト・インプリント（捺染−ｉｍｐｒｉｎｔ）を受けるに適したブランクのテンプレート材料で形成される。たとえば上記第２ラベル面は、ペン、鉛筆または他の筆記具を用いて表面上にサンプル・データをインプリントするに適したセルロースまたは他の繊維質材料で形成され得る。選択的に、上記第２ラベル面は、パーマネントインク（たとえばアルコール系マーカを用いる）によりインプリントされるデータを保持できる構成のプラスチックもしくは他の材料で形成され得る。上記接着性タブが空気ポート上に貼付されたときに上記第２ラベル面のブランク・テンプレート材は外向きにされ、かつその面の少なくとも一部は着脱可能リザーバ２８８の外壁の円滑部分を覆い、それにより医師もしくは技術者は上記ラベル面上に明確なデータ記録を記入できるようにする。
【０１７０】
更に詳細な形態において、閉鎖／標識装置３２４は、真空圧の伝達のために空気ポート３１０が開放される第一開放形態において携帯用乳房ポンプ１０’の作動時に着脱可能リザーバ２８８に固着されている（たとえば図２１を参照）。このように上記リザーバに対して予め取付けられた閉鎖／標識装置は、サンプル採集の後に、空気ポートに対するシールもしくは閉鎖を形成する第２閉鎖形態へ手動で再位置決めまたは操作される（たとえば図２１乃至図２３参照）。図１９乃至図２３に示された代表的実施形態において、上記閉鎖／標識装置は接着性細片を有し、該細片は第一開放形態（図２１）へ折畳まれて２層、すなわち、上記空気ポートの近傍で該空気ポートをカバーしないように上記リザーバに固着された内側層３３０と、上記開放形態において上記内側層上に折り返された外側層３３２とを形成する。この実施形態において、上記細片の上記外側層は、該細片の閉鎖を固定する接着剤被覆３２６を備えた第一の蓋形成面３２５、および上記蓋形成面の逆側でブランク・テンプレート材料により形成される第２ラベル面３２８を提供する。上記開放形態において、上記外側層は、たとえば上記２層を折畳み位置に一体的に保持する上記内側層上の第２接着剤被覆３３６により上記内側層に上記ラベル面を係合することにより、上記内側層に対する折り返し位置に選択により固定される。同様に選択的に、上記第一蓋形成面の接着剤被覆３２６は、接着剤被覆３２６を担持する外側層３２５の端部セグメント３３８を第一蓋形成面上へ折返すように折畳むことにより開放形態で保護されてよく、蓋形成面３２５は閉鎖に先立ち上記接着剤を防護する保護面３２７を提供する（図２１および図２２に示された）。この閉鎖／標識装置を上記第２閉鎖形態へ操作するために、上記端部セグメントを、そこで、揚動し外方に引張って内側層３３０から外側層３３２を剥離すると共に、該端部セグメントを展開して蓋形成面３２５上の接着剤被覆３２６を保護面３２７から分離する。次に、外側層３３２を上記内側層から展開する共に上記リザーバの回りに巻き、そのようにして上記蓋形成面が上記空気ポートをカバーして上記リザーバからのサンプル漏出および汚染を効果的に防止する水密または耐水性の閉鎖体を形成する。この観点で（このようにして）、閉鎖は、上記空気ポートを囲繞するリザーバの外壁２９４に接着剤被覆３２６を直接的に添着することにより、または上記空気ポートを覆うべく上記外側層をタイトに引張ると共に内側層上に接着剤面を堅固に押しつける？（ａｎｎｅａｌｉｎｇ ｂａｃｋ）ことにより達成される。いずれの場合においても、上記閉鎖／標識表示細片を上記閉鎖形態へと操作すると、ラベル表面３２８はサンプル・データの容易な記録のために外方に向けられる。更に他の詳細実施形態において、上記リザーバの外側に一個以上の円周案内隆起部３４０（図１９および図２０参照）を含めることにより機械的移動から上記閉鎖／標識表示細片を防護し且つ／又は漏出に対する上記閉鎖体の適合度を高めるために、上記閉鎖／標識表示細片はリザーバ２８８の装填および取外し時の移動に対して更に良好に固定され得る。
【０１７１】
本発明の関連形態において、本発明の乳房流体採集装置に使用するために、上記サンプル採集ハウジングの着脱可能リザーバ部材の特徴を取入れた新規な乳房流体採集リザーバが提供される。上述したように、新規な採集リザーバは、本発明の乳房流体採集方法において、且つ乳房流体サンプルの採集に引き続き実験室で実施される種々のサンプル管理、処理および診断検定方法に有用である。
【０１７２】
本発明の新規な乳房流体採集リザーバは、代表例として、サンプルにアクセスするための主要開口を形成する頂端部を有する、たとえば改良された細胞用バイアルの形態の、剛性管もしくはバイアルの形態で提供される。上記リザーバは更に、上述の如くたとえば底面壁により、底端部が閉鎖された管状リザーバの典型的には円筒状側壁である、外側リザーバ壁を備える。上記外側リザーバ壁は、バイアルの該外壁と内側内孔との間を連通する一個以上の空気ポートを形成する。更に詳細な実施形態において、上記流体保持リザーバは乳房流体採集装置のサンプル採集ハウジングの着脱式流体リザーバ部材から成る。典型的に、リザーバ部材は、上記採集装置のサンプル採集ハウジングの外側ケーシング部材に着脱自在に連結された剛性サンプル採集管もしくはバイアルである。
【０１７３】
本発明のこの形態において、上記リザーバは上記ハウジングの上記外側ケーシング部材に着脱可能でシール可能に連結できるように構成されて、該部材と気密結合を形成する。所定形態において、上記流体保持リザーバは上記気密結合を形成するために上記外側ケーシング部材とシール可能に連結できる細胞用バイアルである。たとえば上記流体保持リザーバは上記ケーシング部材内に着脱自在に嵌め込まれて、該ケーシング部材の内壁と該リザーバ部材の外壁もしくは頂端部もしくは底端部との間に実質的気密接触を形成する。この機能を達成するために、上記流体保持リザーバの外壁は円周隆起部、フィンもしくはＯ−リングを備え得るが、該Ｏ−リングは、上記ケーシング部材の内壁に係合して該内壁に対して円周方向の気密シールを形成し得るものである。
【０１７４】
更に詳細な形態において、本発明の上記装置および方法において用いられる上記流体収納リザーバ部材は、サンプルの汚染および漏出を防止するために、上記リザーバ内へと乳房流体のサンプルが導入された後に該リザーバを閉鎖する閉鎖装置を含む。前記閉鎖装置は、上記リザーバの頂端部にシール可能に係合し得る単純なキャップから成り得る。上記キャップもしくは同様の“基本蓋（ｐｒｉｍａｒｙ ｃｌｏｓｕｒｅ）”は、上記リザーバの頂部開口と連続的されもしくは別体とされ得る該リザーバの単一もしくは複数の空気ポートをカバーするために延在し得る。他の実施形態において、単一もしくは複数の空気ポートに特に適合する二次的閉鎖手段が設けられてよい。上記二次的閉鎖手段は、蓋を形成するために単一もしくは複数の空気ポート開口に、もしくは該開口を囲繞する上記リザーバ部材の外壁に係合するもしくは接着されるサイズおよび構成のプラグ、キャップもしくは接着性シールもしくはステッカーから成り得る。
【０１７５】
一定の実施形態において、上記二次的閉鎖手段は閉鎖／標識兼用装置から成るが、該装置は、上記リザーバの単一もしくは複数の空気ポートをシールする二次的閉鎖機構として、且つサンプル・ラベル付けのための記入表面を提供するラベル・テンプレートとして機能する。上記二次的閉鎖手段は、しばしば、サンプルが採集された後に上記空気ポートをシールするために上記リザーバの外壁に貼付する組合式閉鎖／標識タブもしくはステッカーから成る。上記タブもしくはステッカーは、上記リザーバの外壁に並置もしくは接着接触によりシールを形成するために上記空気ポート上に貼付される第一蓋形成面と、書き込み情報を記入するためのブランク・テンプレート材で形成される第一蓋形成面の逆側の第２ラベル面とを有する。上記第一蓋形成面は、典型的に、該蓋形成面の少なくとも一部に水に不溶性の接着剤被覆を有する。更に詳細な形態において、上に詳述した如く上記タブもしくはステッカーは、第一開放形態で上記着脱可能リザーバ部材に事前に取付けられると共に、サンプル採集の後に第２閉鎖形態へ手動で再位置決めもしくは操作されることにより単一もしくは複数の空気ポートに対してシールもしくは蓋を形成する。
【０１７６】
本発明の更に他の関連形態において、本発明の携帯用乳房ポンプ１０’に使用できる上記新規な流体保持リザーバを取入れて乳房流体サンプル採集、サンプル管理および／またはサンプル処理する幾つかの方法が提供される。これらの方法は、概ね、上述された如く改変された流体リザーバ内に表出した乳房流体を採集することを含む乳房流体サンプルの採集方法を含む。他の方法は、改変された流体保持リザーバを上記記述に従い携帯用乳房ポンプ内に装填し且つ取外すことを含む。関連方法は、乳房流体のサンプルもしくはその成分が上記リザーバ内に採集された後に該リザーバの主要および／または二次的閉鎖手段を固定する付加的工程を含む。
【０１７７】
これらの方法に関して、本発明は、乳房流体またはその成分の生体サンプルにおける乳房疾患マーカを検出もしくは定量化する診断検定法で使用するために該サンプルを管理もしくは処理する他の方法を提供する。この方法は、概ね、上述のごとく、特殊な流体保持リザーバに乳房流体もしくは乳房流体成分の生体サンプルを提供もしくは採取することを含む。上記サンプルは最初に、オキシトシン誘導により、またはオキシトシン誘導を伴うことなく本発明の乳房ポンプ１０、１０’の装着により、採集され得る。上記リザーバは、典型的には、乳房流体サンプルの採集および該サンプルに対する後時のアクセスのための主要開口を形成する頂端部と、当該バイアルの当該外壁と内側内孔との間を連通する一個以上の空気ポートを形成する外側リザーバ壁とを有するフラスコ、バイアルもしくは管として提供される。
【０１７８】
更に詳細な管理および処理方法において、上記リザーバは、サンプルが採集された後に該リザーバを閉鎖してサンプル汚染および漏出を防止するために、該リザーバの上記頂端部を固定するたとえばキャップ等の特殊な閉鎖手段と、該リザーバの一個以上の空気ポートをシール可能に閉鎖する二次的閉鎖手段とを取入れている。典型的に、上記流体保持リザーバは、上述の如く携帯用乳房流体採集ポンプ１０’と一体化される着脱可能リザーバ部材として構成される改良細胞用バイアルである。上記新規なリザーバを採用する更に詳細な管理／処理方法は、乳房疾患マーカの検出もしくは定量化のために、上記リザーバ内の上記サンプルにアクセスして乳房流体サンプルを移送もしくは処理する該工程を含む。他の方法は、上記乳房疾患マーカを検出もしくは定量化するためにサンプルを処理する一つ以上の工程を含む。
【０１７９】
他の詳細形態において、マーカ検出のためにサンプルを処理する上記工程は、上記リザーバからの上記サンプルの移送の前もしくは後において、たとえば細胞学的分析のために、上記サンプル内の細胞もしくは細胞断片を固定もしくは着色することを含む。更に他の方法は、上記リザーバ内におけるサンプルまたは移送した後のサンプルを、たとえば定着剤、標識試薬、緩衝剤等の処理試薬へ暴露して、選択された乳房疾患マーカとして検出または定量化を含む更なる処理のために、乳房流体全体、全細胞、細胞断片、細胞膜、浄化蛋白質、バルク蛋白質、糖蛋白質、ペプチドおよび／またはポリヌクレオチド成分を含むサンプル成分を調製することを含む。
【０１８０】
上述の如く、本発明の携帯用乳房ポンプ１０’の一定のモジュール設計は、部品の洗浄および交換のためにその装置の一個以上の相互連結構成要素に対して着脱可能に連結され得る漏斗形状構成要素として提供される別体の乳房係合部材１４を特徴とする。典型的に、上記乳房係合部材は、サンプル採集ハウジング３０に着脱自在に連結される。図１６乃至図１８に示された一実施形態において、上記ハウジングは、外側ケーシング部材２９０および着脱可能な流体リザーバ部材２８８により例示された複数の部材で構成される。図１８に示された如く、上記係合部材は上記流体リザーバ部材に直接的に連結され得る一方、上述された如く該流体リザーバ部材はシール可能連結（たとえばシール可能な圧縮嵌め等の）により上記ハウジングの上記外側ケーシング部材に係合される。この観点で、一つの他の形態の連結設計は、上記係合部材を螺条３４０に固定し、または螺条３２０に対応する他の連結手段、または上記着脱可能リザーバ（たとえば細胞用バイアル等）の頂端部２９６上に他の閉鎖手段を設けることである。このようにして、上記リザーバの頂端部にシール可能に係合する従来キャップを受け得る上記着脱可能リザーバの閉鎖手段は、その装置の他のモジュール構成要素に係合部材１４を連結する二重目的に寄与する。当然ながら、上記係合部材およびリザーバ部材の各係合する端部を着脱自在に連結する単純な圧力嵌めによる例示された連結と同様に、他の形態の連結手段が企図されている。サンプル採集ハウジング３０と上記係合部材との安定連結を促進するために、上記ハウジングは、更に、上記係合部材の拡開もしくは折返し末端縁部１８の下側に位置する内側円周溝３５４に（集合的に）係合する形状および寸法の外方折返し脚部３５２に終端する拡開延長部３５０を含むように構成されてよい（たとえば図１８参照）。
【０１８１】
上記の特徴に加えて、本発明の携帯用乳房ポンプ１０’は種々の固相サンプル採集媒体および支持部材５６の設計等の汎用乳房ポンプ１０に対して上述された選択的特徴の任意のものを含み得る。故に、上記携帯用ポンプに用いられる上記支持部材は流体保持ウェルも含んでよく、サンプルの採集、管理および／または処理を促進するために、該ウェルは、緩衝剤、または、プローブ、架橋剤、遮断剤、変性剤などを含む溶液等の所望溶液により選択的に充填されてよい。また、用いられる固相サンプル採集媒体のタイプにより異なる他の設計および形状のハウジング３０および／または支持部材５６が提供される。たとえば、粒状固相サンプル採集媒体４１（ビーズ、樹脂もしくはミクロスフェア等）が用いられる場合に該媒体は、上記に詳述の如く、上記支持部材に着脱自在に取付けられもしくは該支持部材内に一体化されるか、または、ハウジング３０に対して着脱自在に連結されるカートリッジ８２内に囲繞され得る。上記固相媒体を上記携帯用ポンプ装置のハウジング３０に対して調節可能に取付けることも企図されることから、上記採集媒体はポンプ１０の係合部材１４の基部２２に対して更に接近もしくは離間して移動され得る。この関係で、上記携帯用乳房ポンプが乳頭に係合されたときに該乳頭に対して上記固相採集媒体を更に接近もしくは離間させるべく調節可能に移動する往復機構を提供するために、上記記述に対応する種々の設計が企図される。
【０１８２】
本発明の更に詳細な形態において、携帯用乳房ポンプ１０’は、代表例として、コンパクト真空ポンプ・ハウジング４１０を採用するが、該ハウジングは真空ポンプ１６０をサンプル採集ハウジング３０に対し且つ係合部材１４に対して構造的且つ機能的に一体化する（たとえば図１６乃至図１８参照）。一方、上記真空ポンプ・ハウジングは、真空ポンプ起動機構に連結されるか該機構を含むべく改変される。上記起動機構は、選択された真空ポンプへの使用に適したスィッチ、ボタン、レバーもしくは他の起動装置の形態であってよい。上述の如く上記乳房ポンプ装置には、上記携帯用ポンプの真空ハウジングに採用するのに適したサイズおよび形態である任意の手動もしくは電気、ピストン、油圧もしくはダイヤフラムポンプ等の種々の真空ポンプが採用され得る。図１６乃至図１８に示された代表的実施形態において、上記真空ポンプは従来ダイヤフラムポンプであり且つ上記ポンプ起動機構は上記ポンプ・ハウジングまたは他の適切な連結点に枢着される単純なハンドレバー４２０である。
【０１８３】
本発明のこの形態を例示として、上記ポンプ・ハウジングは、上記レバーを把持して該ハンドルに向けて手動で閉じることにより上記ハンドレバーの押圧を促進するために、選択的に、対向ハンドル４２２に対して連結されるかもしくは該ハンドルを含んで延在する（図１６および図１７を比較されたい）。上記ハンドルは好適には、上記真空ポンプ・ハウジングの一体的延長部として成形もしくは鋳造される。図１６乃至図１８に例示された更に詳細な実施形態において、上記真空ポンプ・ハウジングおよびハンドルは、サンプル採集ハウジング３０の外側ケーシング部材２９０との一体的ユニットもしくはモジュール構成要素として一体的に成形もしくは鋳造される。上記ハンドルは、上記ポンプ起動レバーに結合もしくは一体化された枢動ヘッド４３２もしくはシャフトを枢動的に受ける枢動凹所４３０もしくは窪みを形成する（図１６および図１７に示された如く）。
【０１８４】
このようにしてポンプ起動レバー４２０は枢動連結４３０、４３２によりポンプ・ハウジング４１０もしくはハンドル４２２に枢着され、該枢動連結４３０、４３２は、たとえば上記レバーの枢動ヘッド４３２を上記ハンドルの枢動用凹所４３０内へスナップ係止することにより、容易な組立て様式で上記起動レバーおよびポンプ・ハウジングを結合する。上記起動レバーは、上記サンプル採集ハウジングに連結されまたは該ハウジングに一体化された主要真空チャンバ４４２から離間するために可撓ダイヤフラム部材４４０を引き下ろするために該レバーを押圧することにより、真空ポンプ１６０を容易に且つ効果的に起動する。図１６乃至図１８に示された実施形態において、上記主要真空チャンバは、上記可撓ダイヤフラム部材の近傍の上記真空ポンプ・ハウジング内のチャネルであって上記ハウジングの外側ケーシング部材２９０の内壁２９２へ開口する連通ポート４４４へ延在するチャネルとして一体的に形成される。上記真空経路の残部（すなわち、上記外側ケーシング部材を通り上記ハウジングの着脱可能流体リザーバ部材２８８の空気ポート３１０に至り、上記リザーバの内孔３１４に入り、選択的に支持部材５６の空気チャネル８０を通り、上記乳房係合部材に至る経路）は上述されている。
【０１８５】
このようにして可撓ダイヤフラム部材４４０に係合して該部材４４０を移動させるために、上記起動レバーは、たとえば上記ダイヤフラムからダイヤフラム係合ヘッド４５２にシール可能に連結された往復シャフト４５０もしくはピストンを含む、ダイヤフラム引込み機構に係合し、上記レバーの押圧移動を上記可撓ダイヤフラム部材の下方引込みへ集合的に変換する（たとえば図１６および図１７を比較）。ダイヤフラムポンプのこれらの構成要素は、相補的係合継手（矢印４６４）によりポンプ・ハウジング４１０の相補的縁部４６２もしくは他の連結面に係合するポンプ保護カバー４６０内に至便に収納される。この継手は、各図に示された如くたとえば上記ダイヤフラムの周縁部４６６を上記キャップとハウジングとの間に挟持することにより、選択的に、上記可撓性ダイヤフラム部材をシール可能に繋止するようにする。本発明において、当業者の技術レベル内にある選択的なポンプ装置、起動機構およびポンプ・ハウジングの設計が本明細書に開示された上記携帯用乳房ポンプ装置に使用できると企図されている。
【０１８６】
上述の如く、本発明の装置を用いた乳房流体の表出および採集は一定の場合に、乳房の腺胞管（ａｌｖｅｏｌａｒ ｇｌａｎｄ ｄｕｃｔ）における筋上皮収縮を刺激することで乳頭からの乳房流体の表出を促進するに有効な量でペプチドホルモン・オキシトシンもしくはその類似物を予めもしくは同時的に投与することで促進され得る。好適には上記オキシトシン調製物は鼻腔内に投与されると共に、乳頭からの乳房流体の表出を刺激する上で鼻腔内的に有効な量で投与される。選択的に、オキシトシンの筋内もしくは血管内注入は、鼻腔内への投与経路と同一の筋上皮収縮応答を引き起こし得る。オキシトシン投与の量、タイミングおよび／またはモードは、乳房流体表出に関して個人の傾向に影響すると知られた月経周期段階、受胎調節もしくはホルモン補充療法の使用、妊娠履歴、初潮の開始年齢、人種および他の要因等の要因に依存して個人毎に調節され得る。
【０１８７】
オキシトシンは、乳飲に応じて乳分泌婦人の血流内へ自然に放出される脳下垂体起源のペプチドホルモンであり、乳房の腺胞および管内の筋上皮細胞の収縮を刺激することで乳液噴出を引き起こす（Ｃｏｂｏ， Ｊ． Ｐｅｒｉｎａｔ． Ｍｅｄ． ２１：７７−８５， １９９３）。また、子宮収縮を刺激する作用により妊婦の陣痛を刺激する薬剤も広く使用されている（Ｓａｔｉｎ ｅｔ ａｌ．， Ａｍ． Ｊ． Ｏｂｓｔｅｔ． Ｇｙｎｅｃｏｌ． １６６： １２６０−１２６１， １９９２）。これらの理由により、有効な適用量、半減期および潜在的副作用の詳細な考察を含めてオキシトシンの薬理学は全般に研究されている。
【０１８８】
本発明に使用するために、生物学的に適切な液体キャリア内にオキシトシンを含むオキシトシン調製物は、鼻腔内、筋内もしくは静脈内投与として提供される。本明細書中で使用される“オキシトシン（ｏｘｙｔｏｃｉｎ）”は、天然もしくは合成のオキシトシン、および、生物学的に活性なその誘導体および類似物を指す。哺乳動物源から自然に生ずるオキシトシンはもちろん適切であるが、腺胞管の筋上皮収縮を刺激する同様の作用を有する他の既知の自然に生ずるオキシトシン状ペプチド類似物およびその合成同等物も同様である。好適には、本発明に使用されるオキシトシンは、良好に形成されたリング部分（Ｃｙｓ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−Ａｓｎ−Ｃｙｓ）および末端部（Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ）を有する環状ペプチドから成る単純なペプチドホルモンである。但し、当業界において、多数の誘導体および類似物が既知もしくは容易に入手可能であり、それはたとえば、当該ペプチドの一個以上の残基にアミノ酸の切捨て、欠失もしくは置換を有する誘導体もしくは類似物であって自然に生ずるオキシトシンと実質的に同一の作用を呈する（すなわち、腺胞管の筋上皮収縮を刺激する上で自然オキシトシンの作用と比較して少なくとも７５％、好適には８５％〜９５％以上の作用を有する）誘導体もしくは類似物である。本発明に使用される最も経済的なオキシトシン調製物として、合成オキシトシン（たとえば、Ｓａｎｄｏｚ（スイス、Ｂａｓｅｌ）および米国薬局方等の種々の供給業者から入手可能なＰｉｔｏｃｉｎ（登録商標）またはＳｙｎｔｏｃｉｎｏｎ（登録商標））が挙げられる。本発明の方法において持効性のオキシトシン類似物を使用すれば、他の利益が獲得され得る。ペプチド類似物カルベトシンにより例示される斯かる類似物の実用性および薬理動態は、２０００年１月１１日出願の米国特許出願第０９／４８１，０５８号に詳述される（参考として本明細書に援用される）。
【０１８９】
本発明の上記方法、装置およびキットに用いるために、好適なオキシトシン調製物は液体キャリアの１ｍｌ当たりで略４０ＵＳＰ単位を含有する。好適な液体キャリアは、乳酸加リンゲル液、または、生理学的に平衡化され、滅菌され、非毒性であり且つ非刺激性の他の溶液である。オキシトシンを鼻腔内に投与するために、強く握ったときに患者の鼻内に約０．５ｍｌのオキシトシン調製物を供給する標準的な鼻用スクイーズボトル（ｎａｓａｌ ｓｑｕｅｅｚｅ ｂｏｔｔｌｅ）が用いられる。上記オキシトシンは鼻粘膜により体循環内へ吸収され、そこでオキシトシンは乳房の腺胞の周囲の筋上皮細胞であって、特に乳管の壁部を構成する筋上皮細胞上に達して作用し、それらの平滑筋繊維を収縮させ、存在する一切の流体を大きな管もしくは腔所内へと押しやり、そこで該流体は自発的にもしくは乳房ポンプの更なる作用により乳頭からサンプル採集器上へ表出され得る。故に噴射調製物を鼻腔内に適用することは、実用的で効果的な投与方法である。人間の血流内においてオキシトシンの半減期は、オキシトシンが腎臓、肝臓および乳腺によりプラズマから迅速に除去されるが故に非常に短くて約１０〜１５分以下と見積もられ、薬理動態的かつ臨床的な定常状態までの時間は投与のモード（たとえば単一回投与（ｂｏｌｕｓ ｄｏｓａｇｅ）、反復投与もしくは定常注入）に依存して容易に決定される（たとえばＧｏｎｓｅｒ， Ａｒｃｈ． Ｇｖｎｅｃｏｌ． Ｏｂｓｔｅｔ． ２５６：６３−６６， １９９５；およびＯｒｈｕｅ， Ｏｂｓｔｅｔ． Ｇｙｎｅｃｏｌ． ８３：２２９−２３３， １９９４を参照されたく、その各々が全体的に参考として本明細書中に援用される）。故に、乳房ポンプの補助によりもしくは補助無しで乳房流体の表出を引き起こするためにオキシトシンの有効量（鼻腔内に有効、静脈内に有効もしくは筋内に有効）を投与するためにオキシトシン調製物の適切な濃度および適用量を決定するのは通常事項である。（たとえばＮｅｗｔｏｎ， Ａｎｎ． Ｎ．Ｙ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ６５２：４８１−４８３；Ｍｅｎａ， Ｎｅｕｒｏｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ ６１：７２２−７３０， １９９５；Ｇｏｎｓｅｒ， Ａｒｃｈ． Ｇｖｎｅｃｏｌ． Ｏｂｓｔｅｔ． ２５６：６３−６６ １９９５；Ｏｒｈｕｅ， Ｏｂｓｔｅｔ． Ｇｙｎｅｃｏｌ． ８３：２２９−２３３， １９９４；Ｓａｔｉｎ ｅｔ ａｌ．， Ａｍ． Ｊ． Ｏｂｓｔｅｔ． Ｇｙｎｅｃｏｌ． １６６：１２６０−１２６１， １９９２；およびＳａｔｉｎ ｅｔ ａｌ．， Ｏｂｓｔｅｔ． Ｇｙｎｅｃｏｌ． ８３：２３４−２３８， １９９４を参照されたい。その各々は参考として全体が本明細書中に援用される。）
全ての女性患者が鼻腔内オキシトシン刺激に応答するとは期待されないが、本発明の目的のためのオキシトシンの鼻腔内有効量は容易に決定され得る。本明細書中で使用される如くオキシトシンの鼻腔内有効量は、上記乳房ポンプの適用により乳頭に対して５０〜２００ｍｍＨｇの負圧を掛ける（オキシトシン噴射の最初の投与の後で４５分まで）ことにより乳分泌のない女性患者の少なくとも５０％において少なくとも３μｌの乳房流体の表出が鼻腔内刺激に十分なオキシトシンの量である。たとえば、各鼻孔内への４０ユニット／ｍｌのオキシトシン溶液の単一回噴射、または、低濃度のオキシトシン調製物の複数回噴射等のオキシトシンの低い事前適用量を患者に投与し、その後は特定の患者の感受性を決定するために待機することが必要なこともあり、また実際に好適である。２〜１５分、好適には２〜５分の投与期間の後に上記乳房ポンプを最初に適用しても反応がなければ、追加量のオキシトシン噴射を投与しかつポンプを再適用し得る。このようにして臨床医は患者毎に変化する感受性に対して適用量を調整することにより悪い潜在的副作用を最小化し得る。代替的に、鼻腔内投与が失敗しまたは投与の好適モードとしては逆の徴侯が見られた場合、患者に対する同一の適用量決定および投与原理に従いオキシトシンの筋内もしくは静脈内の有効適用量が使用され得る。
【０１９０】
上述の如くオキシトシン投与の量、タイミングおよび／またはモードは、乳房流体表出の誘導に対して個人を多少なりとも敏感にすることが知られた特定要因に基づいて調節され得る。これらの要因は業界既知であり、たとえば他の要因の中でも、月経周期段階、受胎調節またはホルモン補充療法の使用、妊娠履歴、初潮の開始年齢、人種が挙げられる。
【０１９１】
故に本発明の一形態において、患者から生体サンプルを採取し且つ／又は乳房流体からの生体サンプル中における乳房疾患マーカの量を決定する方法が提供されるが、該方法は患者の月経時期を決定する工程を含む。決定された月経時期に基づき、所定のオキシトシン適用量、オキシトシン供給のタイミングおよび／または頻度、および／またはオキシトシン投与のモードを有する薬剤投与プロトコルが選択される。
【０１９２】
該方法によればオキシトシン適用量、オキシトシン供給のタイミングおよび／または頻度、および／またはオキシトシン投与のモードの内の一以上の変数は、患者が５つの概ねの月経期の内のいずれの時期にあるかに依存して選択される。これらの各期は、１）増殖期（腺胞管腔（ａｌｖｅｏｌａｒ ｌｕｍｅｎａ）の密な形態により特徴付けられる）、２）卵胞期（腺胞管腔の形成された形態により特徴付けられる）、３）黄体期（腺胞細胞による一定の分泌を伴う腺胞管腔の開口形態により特徴付けられる）、４）分泌期（腺胞細胞による分泌を伴う腺胞管腔の開口形態により特徴付けられる）、および、５）月経期（腺胞細胞による分泌を伴う腺胞管腔の膨張形態により特徴付けられる）を含む。
【０１９３】
月経周期の増殖もしくは卵胞段階（夫々、略３〜７日および８〜１４日）に在る患者に対して本発明の方法を実施するのは一般的に望ましくない。但し、或る状況において、これらの個人に対し、オキシトシンの高適用量および／または反復的適用量を用いると共に、オキシトシン投与の特定モードを選択して乳房流体表出の応答を最適化するか、またはそれらを組み合わせること（たとえば静脈内投与に続く鼻腔内投与）により、サンプル採集が実施され得る。月経周期の黄体もしくは分泌段階（夫々、略々１５〜２０日および２１〜２７日）に在る患者に対しては、オキシトシンの中間的な適用量が選択されると共に反復的な投与は減少もしくは排除される。月経期に在る患者に対しては、オキシトシンの適用量および反復的投与は更に減少される一方、十分な乳房流体表出を得るために有効な投与プロトコルを続ける。
【０１９４】
本発明において、異なる月経時期に在る患者に対する有効投与プロトコルの決定は同様に容易に達成され得る。本明細書中で使用される如く、有効投与プロトコルによれば、オキシトシン噴射の最初の投与後４５分まで乳房ポンプにより乳頭に５０〜２００ｍｍＨｇの負圧を加えることにより同等の月経時期に乳分泌のない女性患者の少なくとも５０％において少なくとも３μｌの表出した乳房流体を採取する。本明細書中における教示に従い当業者に容易に決定され得る如く、オキシトシン適用量、オキシトシン供給のタイミングおよび／または頻度、および／またはオキシトシン投与のモードの種々の組み合わせが企図される。同様に、個々の月経時期が決定されると共に特定の投与プロトコルが選択された場合でも、患者に低い予備適用量を投与し、その後に特定患者の感受性を決定するために待機するのがしばしば好適である。故に、短い投与後期間後に上記乳房ポンプを最初に適用しても反応がなければ、追加適用量のオキシトシンが投与されてポンプが再適用され得る。このようにして臨床医は、第一段階の特定量のオキシトシンを適用した後、患者毎に変化する感受性に対し、適用量、追加投与間の期間および／または投与のモードを調整し得る。
【０１９５】
本発明の他の関連形態において、患者から生体サンプルを採取し且つ／又は乳房流体からの生体サンプル中の乳房疾患マーカの量を決定する方法が提供される。この方法は非月経時期の患者感度指数を決定する工程を含む。斯かる指数の例として、１）患者がホルモンを基礎とする受胎調節を使用しているか、２）患者がホルモン補充療法を使用しているか、３）患者の妊娠履歴；４）患者の初潮の開始年齢、および５）患者の人種が挙げられる。乳房流体表出を誘導する感受性に関連する他の指数も企図される。これらの要因は、患者診察、患者記録の評価、および臨床的または実験室的な分析（たとえば物理的スクリーニング、性ステロイド・ホルモン量）等の常用段階により決定され得る。
【０１９６】
決定された非月経時期の感度指数に基づき、上述の方法に従って所定のオキシトシン適用量、オキシトシン供給のタイミングおよび／または頻度、および／またはオキシトシン投与のモードを含む効果的薬剤投与プロトコルが選択される。更に他の方法において、先ず患者の月経時期と該患者に特有な少なくとも一つの非月経時期感度指数との両者を決定した後に、組み合わされたこれらの指数に基づき効果的なオキシトシン投与プロトコルを選択することにより、効果的な薬剤投与プロトコルが選択される。
【０１９７】
本発明における更に他の方法において、従来乳房造影処置と組み合わせて上述のサンプル採集方法を行うのが好適なこともある。このようにすれば、コスト、時間および患者の不快さが最小限にされ得る。更に乳房撮影の直後に上記サンプル採集を行うことにより、初期処理手順の間における乳房操作により乳房流体表出が促進されることが期待される。乳房流体表出を促進する付加的工程として、手動による乳房マッサージおよび乳房に対する加熱パックの適用が挙げられる。
【０１９８】
本発明の乳房ポンプ１０、１０’を用いる乳房流体採集のために、上記乳房ポンプは単独またはオキシトシン刺激と組み合わせて使用され、かつ乳房上に負圧を発生することにより乳房流体の表出を促進する。本発明の方法において、５０〜２００ｍｍＨｇの負圧が好適であると共に、この圧力は個々の患者の感受性、オキシトシン適用量および他の要因に依存して約１〜１５分に亙り好適には間欠的に維持される。表出乳房流体の体積は、乳房ポンプ適用の時間および圧力ならびに他の要因等の種々の要因に依存して変化する。本発明の最小感受性乳房マーカ検定法（ｌｅａｓｔ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｂｒｅａｓｔ ｍａｒｋｅｒ ａｓｓａｙ）に対して該検定法を行うに十分な材料を提供するために３００〜５００μｌの体積の表出乳房流体が好適であり、この体積は上記方法に従い治療される女性の相当の割合から採取され得る。３００〜５００μｌの乳房流体を表出するために、一定の女性は反復した刺激処理を必要とし、おそらくは複数回の患者訪問の間に採取された乳房流体サンプルの蓄積が必要とされる。但し、たとえば免疫学的固相検定法等の本発明の更に敏感な検定法に関し、特に乳房流体内へ自然に分泌される乳癌マーカであり、かつ従って、たとえば分泌されない乳房上皮細胞表面抗原もしくは細胞内抗原、と比較して非常に高濃度で存在すると予想される乳癌マーカの場合には、該検定法を実施するために３μｌ以下の非常に少ないサンプルで十分である。
【０１９９】
以下の実例は限定的では無く例示的なものとして提供される。
【０２００】
実施例１
新規の搾乳ポンプ／乳房分泌流体サンプル採集装置の適用による乳房分泌流体の誘導
本実施例において、携帯用搾乳ポンプ１０’を使って、全細胞と細胞片からなる乳房分泌流体成分（または乳房流体成分と言う）の一次サンプルを細胞学的検査のために採集する。医師、技師または患者は、乳房流体の圧搾（表出）を刺激し、そこから試料を採集するために、上述した通りの携帯用搾乳ポンプを掴み、操作することによって乳房流体試料を採集する。この操作は片手でできるので、医師または技師は、他方の空いている手で別の動作をする自由が残される。この関係で、コンパクトな携帯用ポンプ設計によって、装置を片手で持ち上げて操作し、乳房係合要素を胸に密着させ、真空ポンプの手操作によって胸に十分な真空圧を加えて、適宜量の乳房流体を乳首で、またはその付近で表出させ、かつ同時に少なくとも表出された乳房流体の一次サンプルを固相サンプル採集媒体（例えばニトロセルロースフィルタ）上または内に採集させることが可能となり、その際、装置を胸から外したり両手で操作したりする付加的手動工程も必要もない。
【０２０１】
本実施例において、携帯用搾乳ポンプ１０’を使って、他の処理のために保持されている細胞および他の細胞物質（例えば、乳房係合部材１４またはサンプル採集ハウジング３０と結合したニトロセルロース膜３９またはニトロセルロースフィルタ４０上に細胞を保持することによって）からなる、選択された乳房流体の一次サンプルを採集する。採集された細胞と他の物質からなる一次サンプルは、次に、更に貯蔵、処理かつ／または分析するために受容器または他の固相テンプレートへ移送される（例えば洗浄または手動移送によって）。より特殊なプロトコルでは、乳房係合部材１４、前記乳房係合部材に取り付けられた取外し可能な支持部材５６またはサンプル採集ハウジング３０と流体により連結するように固定されたニトロセルロース膜３９またはニトロセルロースフィルタ４０の上で全細胞を表出された乳房流体から分離する。
【０２０２】
細胞はその後、流体（例えば細胞学的流体）中で洗浄し、または第二固相サンプル採集媒体（例えばスライド、ウェル、管またはバイアル）へ移送する。この媒体は、上述した通りの乳房係合部材１４またはサンプル採集ハウジング３０に連結、またはそれと一体化されていてもよい。一プロトコルでは、乳房係合部材を胸から外し、細胞学的流体のジェットを、上に細胞が保持されたフィルタに対して発射する。これにより、細胞はフィルタから待機中の受容器、代表的には取外し可能流体保持容器へ流される。これに関連して、膜またはフィルタの平坦面を分断する穿孔またはスリットを付けた独特な設計の膜およびフィルタがこのプロトコルで使用するために設けられていて、空気の通過を促し、機械的不安原因に対して構造的柔軟性を与え、かつフィルタの第一側（胸に対面する側）から細胞を二次サンプル採集のために第二側（例えばフィルタが装置に取り付けられたときに、サンプル採集ハウジングに向かう、内部に対面する側）への洗浄を可能にする。例えば、半径方向スリット２８０、螺旋状穿孔２８４または横切る方向のスリットがフィルタに形成されていて、空気の通過を可能にし、かつ膜の第一面に分配された細胞を、貯蔵、輸送かつ／または採集された第二サンプルの細胞学的検査に向けた他の処理のために、サンプル採集ハウジング３０中に置かれた取外し可能流体保持容器２８８へ膜から流出させる。
【０２０３】
実施例２
乳房流体からの生体サンプルにおける細胞学的検査
本実施例では、従来の細胞学的技術を使って、実施例１において述べたようにして得られたサンプルから胸部疾患を識別しかつ分類する。例えば流体保持容器部材で、サンプルを採集するのに続いて、サンプルを更に処理してよい（例えば、改良型細胞学バイアルを使った遠心分離によって）。処理されたサンプルは次に、顕微鏡のクリーンガラス・スライドの中心域へ移送し、カバースリップをサンプル上で滑らせて、それをスライド面に沿って広げる。スライドを空気乾燥させ、次に、例えば無水アルコール、に固定し、かつメチレンブルー、ヘマトキシリン、エオシン、および他の適宜ステイン等の標準的細胞学ステインで染色する。
【０２０４】
次に、スライドを周知の方法を使って、細胞と細胞塊の典型的な成長の証拠について軽量顕微鏡により検査する。周知の方法には、Ｊａｃｑｕｅｌｉｎｅ Ｍｏｕｒｉｑｕａｎｄ論文「触診不可能な胸部病巣の診断：超音波制御による細針吸引：細胞学からの診断および予後判定（Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ｏｆ Ｎｏｎ−Ｐａｌｐａｂｌｅ Ｂｒｅａｓｔ Ｌｅｓｉｏｎｓ： Ｕｌｔｒａｓｏｎｏｇｒａｐｈｉｃａｌｌｙ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｆｉｎｅ−Ｎｅｅｄｌｅ Ａｓｐｉｒａｔｉｏｎ： Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ ａｎｄ Ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ Ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｃｙｔｏｌｏｇｙ）」Ｓ． Ｋａｒｇｅｒ出版、１９９３年７月刊、Ｔｉｌｄｅ Ｓ． Ｋｌｉｎｅ／Ｉｒｗｉｎ Ｋ． Ｋｌｉｎｅ論文「胸：臨床的吸引生検の手引き（Ｂｒｅａｓｔ： Ｇｕｉｄｅｓ ｔｏ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ａｓｐｉｒａｔｉｏｎ Ｂｉｏｐｓｙ）」医学書院出版、１９８８年５月刊、Ｓｈａｈｌａ Ｍａｓｏｏｄ論文「胸の細胞病理学（米国臨床病理学会・細胞病理学の理論と実践５）（Ｃｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｂｒｅａｓｔ （Ａｓｏｐ Ｔｈｅｏｒｙ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｃｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ ５））」米国臨床病理学会、１９９５年１１月刊、Ｐｈｉｌｉｐ Ｓ． Ｆｅｌｄｍａｎ論文「細針吸引細胞学とその臨床的適用：胸と肺（Ｆｉｎｅ Ｎｅｅｄｌｅ Ａｓｐｉｒａｔｉｏｎ Ｃｙｔｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｔｓ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ： Ｂｒｅａｓｔ ａｎｄ Ｌｕｎｇ）」米国臨床病理学会、１９８４年１１月刊の中で述べられたものが含まる。各々が全体的に参考として本明細書に組み入れられる。
【０２０５】
実施例３
新規搾乳ポンプ／乳房流体採集装置の使用に協調的な鼻腔内オキシトシン投与によるサンプル採集のための乳房流体表出刺激
前述の実施例１におけるサンプル採集プロトコル、ならびに本発明による他のサンプル採集方法は、本発明の新規搾乳ポンプ１０、１０’の使用のみにより実践できる。選択的に、これらのサンプル採集手順は、搾乳ポンプの操作によって誘導される乳房流体の表出を促進または増進するために、オキシトシンまたはオキシトシン類似物を使って実践してもよい。本発明内に組み入れた通り、これらの方法は、搾乳ポンプ１０、１０’の使用を含み、これは、任意に、患者の乳房流体表出を促進するのに効果的な量のオキシトシン投与に組み合わされる。サンプルを採集した後、サンプル中の選択された胸部疾患マーカ、好ましくは乳癌マーカまたは乳癌マーカパネルの存在および／または量を決定するためにサンプルについて生物検定を行う。
【０２０６】
オキシトシン鼻腔液は、特に、胸部の腺胞を包囲しかつ乳管の壁を作る筋上皮要素に作用し、その平滑な筋繊維を収縮させ、かつ存在する流体を大きい管または副鼻洞へ付勢し、そこで搾乳ポンプの更なる作用によって乳首から表出させる。鼻腔スプレーは、鼻粘膜によって即座に吸収されて、系統的循環へ侵入する。製剤スプレーの鼻腔内投与は実用的でありかつ効果的な投与法である。体内を循環するオキシトシンの半減期は約１０〜１５分と極端に短く、オキシトシンはその後、腎臓、肝臓および乳腺によってプラズマから急速に除去される。
【０２０７】
オキシトシンは子宮収縮を生じさせる既知効果を有するので、妊婦の場合は、検査の利益が早産を誘発する危険を上回るのでなければ、ここに挙げた方法によって治療しない方がよい。
【０２０８】
オキシトシン鼻腔液は、天然オキシトシン、合成オキシトシン、またはカルベトシン等の機能的類似物である濃縮を含有し、乳房流体表出を助長するために搾乳ポンプを乳首にあてがったときに患者の乳首からの乳房流体表出を刺激するために選択された量をスプレー投与する場合に鼻腔内効果がある。本実施例では、乳房流体分泌リンゲル溶液ｍｌ当たり約４０ＵＳＰ単位のオキシトシンを含有する好ましいオキシトシン製剤を、起立位置で保持された圧搾瓶から、着座位置の患者の鼻へ投与する。スプレーをひと吹きまたはふた吹き、鼻用の標準的圧搾瓶から各鼻孔中に投与することにより、瓶圧搾時にひと吹き当たり約０．５ｍｌのオキシトシン溶液が微細噴霧で分配される。搾乳ポンプの起動により、患者に投与されるオキシトシンの量が、乳を分泌しない女性患者の少なくとも５０％において少なくとも３μｌの乳房分泌流体表出を刺激するために鼻腔内有効量に対応するのを確実にすために、投与されるスプレーの回数および量、ならびに、溶液中のオキシトシンの濃度は、周知の薬物動態学的原理に従って調整することができる（例えば、Ｎｅｗｔｏｎ論文、ニューヨーク科学アカデミー年報Ａｎｎ． Ｎ．Ｙ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ６５２，４８１−４８３；Ｍｅｎａ論文、神経内分泌学Ｎｅｔｒｏｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｙ ６１： ７２２−７３０， １９９５；Ｇｏｎｓｅｒ論文、産婦人科学アーカイブＡｒｃｈ． Ｇｙｎｅｃｏｌ． Ｏｂｓｔｅｔ． ２５６： ６３−６６， １９９５；Ｏｒｈｕｅ論文、産婦人科学Ｏｂｓｔｅｔ． Ｇｙｎｅｃｏｌ． ８３：２２９−２３３， １９９４；Ｓａｔｉｎ他論文、米国産婦人科学会誌Ａｍ． Ｊ． Ｏｂｓｔｅｔ． Ｇｙｎｅｃｏ１． １６６：１２６０−１２６１， １９９２；および、Ｓａｔｉｎ他論文、産婦人科学Ｏｂｓｔｅｔ． Ｇｙｎｅｃｏ１． ８３：２３４−２３８， １９９４を参照、ここにその全体を参考として組み入れる）。例えば、患者に供給されるスプレーの回数、および／または、スプレーを供給するタイミングについて調整するのが望ましく、そのようにして臨床医は、適用量を個々の患者の変化する敏感度に合わせて加減することができ、かつそれによって潜在的副作用を最小限にできる。本実施例では、予備適用量としてオキシトシン溶液ｍｌ当たり４０単位の１回分スプレーを患者の各鼻孔中に投与し、臨床医は、投与後２〜３分間待つ。この時間が経過した後に、搾乳ポンプをあてがい、臨床医は、供給されたオキシトシンの量が搾乳ポンプ誘導による搾乳を促進または増進するのに十分であるか否かを決定する。この段階で追加表出が望まれる場合は、１回分または２回分のオキシトシン溶液のスプレーを各鼻孔中に追加投与し、かつ追加投与後５〜１０分後に該ポンプを再度あてがう。
【０２０９】
鼻腔内有効適用量のオキシトシンが投与されかつ臨床医がオキシトシンが目標腺胞管組織に到達しかつ刺激するのに適した時間が経過したと判断した後に、搾乳ポンプが適用される。５０〜２００ｍｍＨｇの負圧を乳首一帯に加え、かつ個々の患者の敏感度、オキシトシン適用量および他のファクターに応じて約１〜１５分間、間欠的または連続的にその状態に保つ。あるいは代わりに、鼻腔内投与と同様の応答効果を得るために、周知の手段（オキシトシン注射（合成）、ＵＳＰ；Ｗｙｅｔｈ−Ａｙｅｒｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を使ってオキシトシンを筋内径路または脈管内径路により投与することができる。
【０２１０】
実施例４
サンプルの量、出所および質の検証
上述した実施例１および３の方法のどちらかを使って、実質的人数の乳を分泌しない女性患者において少なくとも３μｌの体積の圧搾乳房流体を採集することができる。乳房流体圧搾または表出工程時またはその後に、上述したように表出された乳房流体から生体サンプルを採集する。例えば、ニトロセルロースフィルタは搾乳ポンプ内で表出した乳房流体のポンプへの通路と同一線上に設置されてよく、そのようにして表出された乳房流体がフィルタと接触する。表出した乳房流体の一次サンプルがフィルタと接触すると、細胞、蛋白および乳房流体の他の所望成分がフィルタに付着し、その後の分析のためにフィルタ結合またはフィルタ保持された生体サンプルを形成する。他の適宜生体サンプルは、全乳房流体のサンプル、全細胞の細胞学的サンプル、膜または他の細胞成分、蛋白、糖蛋白、ペプチド、ヌクレオチドおよび他の一次サンプル成分を含有するサンプルを含めて、周知の原理および方法に応じて適宜変更を加えた上記手順に従って採集することができる。
【０２１１】
サンプルの乳房流体が乳房起源でありかつ汚染物質による汚染の危険性がないことを確かめるために、正常な乳房流体の１つ以上の成分を検定する。本実施例では、乳房流体中に普通に存在する酵素、リゾチームを乳房流体サンプルにおいて検定し、これを助けに、サンプルが乳房起源であることを確認する。リゾチーム（ムラミダーゼ）は、種々の微生物のムコ多糖細胞壁においてベータ１，４グリコシド結合を水解する酵素であり、その活性は、日常的な安価な検定手段によって容易に検出しかつ定量化することができる。本実施例では、リゾチームをクワンチプレート・リゾチームテストキット（Ｋａｌｌｅｓｔａｄ， Ｃｈａｓｔａ， ＭＮ）を使って一次乳房流体サンプルにおいて測定する。検定手段は、血清、尿または涙の代わりに乳房流体サンプルを使用することを除いて、上記製造者によって提供され、同製造者の取扱説明書において詳述された試薬および手順を使用する。その検定結果の分析から、サンプルはリゾチームを含有し、それはヒトの血清、尿、唾液、涙、鼻分泌物、膣分泌物、精液および乳房流体の正常成分であることが確認される。
【０２１２】
検定手段として、特に患者の臨床データが集められているところでは、リゾチームアッセイの代わりに、または、リゾチームアッセイの結果を補足する意味で、より特殊なアッセイが使用される。サンプル検証用マーカとしてリゾチームよりも特殊な他の乳房流体マーカが、一般に知られた既知情報に基づいて、本発明に容易に組み入れることができる。ある例では、モノクローナル抗体と、Ｖｅｔｖｉｃｋａ他論文、Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． Ｉｎｔ’ｌ． ３０：９２１−９２８， １９９３（ここにその全体を参考として組み入れる）において開示された方法を使ってカテプシンＤの存在を検定する。別の例では、ヒト乳房流体脂肪グロブリン（ＨＭＦＧ）蛋白の糖蛋白成分に相当する１つ以上のヒト乳房上皮抗原（ＨＭＥ−Ａｇｓ）を一次乳房流体サンプルにおいて、または、胸部癌マーカ検定で使用される生体サンプルにおいて、Ｒｏｓｎｅｒ他論文、Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｖｅｓｔ． １３：５７３−５８２， １９９５；Ｃｅｒｉａｎｉ他論文、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７４：５８２−５８６， １９８２；Ｃｅｒｉａｎｉ他論文、Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． Ｔｒｅａｔ． １５：１６１−ｌ７４， １９９０（各々、ここにその全体を参考として組み入れる）において開示された通り、特殊な抗体プローブを使って検出する。多くのケースでは、サンプル検証検定を単一の手順において胸部癌マーカ検定、例えば実施例４では下に述べる通り、ＨＭＥ−Ａｇｓ検定の中に組み入れることができる（ここで、ＨＭＥ−Ａｇｓ所見は、サンプルの出所／質を指示するものであり、また、サンプルにおける特定の胸部癌マーカの存在および／または量を指示するものである）。別の例では、種々のサイトケラチンを標的とする無作為配列（すなわち多重マーカ）免疫学的検定を通してサンプル検証を達成し、ここでは、それを乳房組織サンプルにおいて特に表出されたサイトケラチンのパネルとして検出することができる（Ｊ． Ｎａｇｌｅ論文、Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ． Ｃｙｔｏｃｈｅｍ． ３４：８６９−８８１， １９８６、ここにその全体を参考として組み入れる）。これらサイトケラチンの１つ以上（例えばＫ５、Ｋ８、Ｋ１８およびＫ１９）を同時に、または個別に胸部癌検定の観点ら測定することができ、被検体サイトケラチンの表出のレベルから、胸部癌患者における癌の存在または状態に関する情報を得ることができる（例えばハーバード大学ニュース記事Ｆｏｃｕｓ、Ｈａｒｖａｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｎｅｗｓ Ｏｆｆｉｃｅ， Ｍａｒｃｈ ２１， １９９１， ｐ． ２−３；およびＬｅｅ論文、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８８： １９９１（ここにその全体を参考として組み入れる））。
【０２１３】
実施例５
乳房流体からの生体サンプルにおけるヒト乳房上皮抗原の免疫学的検定
ヒト乳房上皮抗原（ＨＭＥ−Ａｇｓ）は、ヒト乳房流体脂肪小球（ＨＭＦＧ）と胸部上皮細胞の糖蛋白成分であり、胸部腫瘍によって解放されるが、正常な胸部組織によって解放されない（Ｃｅｒｉａｎｉ他論文、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７４：５８２−５８６， １９７７（ここにその全体を参考として組み入れる））。本例では、１５０、７０、４５キロダルトンの分子量を有する幾つかのＨＭＥ−Ａｇｓを、Ｃｅｒｉａｎｉ他論文、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７９：５４２０−５４２５， １９８２（ここにその全体を参考として組み入れる）において述べられた通りに調製、使用される特殊な抗ＨＭＦＧまたは抗ヒト乳房上皮（α−ＨＭＥ）を使って検出しかつ測定する。
【０２１４】
検定を始めるために、概ね上述べたように、搾乳ポンプ１０、１０’に連結したニトロセルロースフィルタで採集された乳房流体からの生体サンプルを標準的方法に従って電気泳動によってリン酸緩衝食塩水中に溶離して、テストサンプルを準備する。あるいは代わりに、全乳房流体のサンプルまたは乳房流体から得られた他の種類の生体サンプルを適当な媒体または混合物に調合して検定用のテストサンプルを準備することができる。こうしてテストサンプルを準備したならば、これを次に、Ｃｅｒｉａｎｉ他論文、Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． Ｔｒｅａｔ． １５：１６１−１７４， １９９０（ここにその全体を参考として組み入れる）において述べられた方法、すなわちＨＭＥ−Ａｇｓ放射免疫学的検定（ＲＩＡ）に従って検定する。
【０２１５】
手短に言えば、ＲＩＡは、互いに干渉し合うファクターを分離することを目的とする生体サンプルの２つの予備処理を含む。すなわち、存在する脂肪分を分離する遠心分離工程と、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を使って潜在する免疫複合体を沈澱させる第二沈澱工程を含む。その次の工程は適正検定を含み、ここで、固体支持（マイクロタイタープレート）に結合したＨＭＦＧ抗原を化学量論量またはそれより少ない量のα−ＨＭＥ抗体プローブに供し、かつα−ＨＭＥの結合を、上述の通り予備処理された乳房流体からの生体サンプルによって競わせる。固相においてＨＭＦＧ抗原に結合したα−ＨＭＥの量は、最終工程において、放射性ヨウ素で処理され、親和性純化されたウサギの抗マウス免疫グロブリンによるα−ＨＭＥ抗体プローブの検出によって決定される。
【０２１６】
検定に使用される溶液は次の通りである。ｉ）リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）：０．０５Ｍ ＫＨ２ＰＯ４ １７６ｍｌ、０．０５Ｍ Ｎａ２ＨＰＯ４ ６０８ｍｌ、およびＨ２Ｏ中に１０００ｍｌまで入れられたＮａＣｌ ８ｇ（ｐＨ７．４）。ｉｉ）ＲＩＡ緩衝液：０．３％トリトンＸ−１００中の０．１％ＢＳＡ（Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｒｏｄ． Ｉｎｔｅｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｒｐ．， Ｍｏｕｎｔ Ｐｒｏｓｐｅｃｔ， ＩＬ）＋ＰＢＳ中の０．０５％アジ化ナトリウム。ｉｉｉ）洗浄性緩衝液：０．３％トリトンＸ−１００＋ＰＢＳ中の０．０５％アジ化ナトリウム。ｉｖ）緩衝ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）：６．６％ＰＥＧ（分子量８０００）（シグマ）＋ＰＢＳ中の０．０５％アジ化ナトリウム。ここに使用される１２５Ｉ標識化された、親和性純化されたウサギの抗マウス免疫グロブリン（ＲαマウスＩｇ）（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ， Ｉｎｃ．， Ｄａｖｉｓ， ＣＡ）は、報告された通りクロラミンＴ手順によって放射性ヨウ素で処理され（Ｃｅｒｉａｎｉ他論文、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ１． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７９：５４２０−５４２５， １９８２）、ＲＩＡ緩衝液中で４×１０６ｃｐｍ／ｍｌに希釈されたものである。ウサギのポリクローナル抗ＨＭＦＧ抗体または抗ヒト乳房上皮抗体（α−ＨＭＥ）を述べた通り調製し、検定した（Ｉｄ）。
【０２１７】
検定結果を評価するための標準曲線を作成するために、正常なヒト乳房流体からのコントロールサンプル（ニトロセルロースを吸着し、溶離したテストサンプルと同じ方法でニトロセルロースフィルタに暴露しかつ溶離したもの、あるいは代わりに、正常な全乳房流体のサンプルまたは正常な乳房流体から得られた他の種類のサンプルとして準備され、適当な媒体または混合物に調合して、検定用の適当なコントロールサンプルに調製したもの）を７分間、１０℃下で１０，２４０ｒｐｍにて遠心分離する。サンプルの頂部に形成された白色の上部帯（存在する場合）を捨てる。洗浄緩衝液中の、凍結乾燥した老廃ＨＭＦＧ（Ｃｅｒｉａｎｉ他論文、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７４：５８２−５８６， １９７７）からｍｌ当たり蛋白１００μｇの新鮮な溶液を調製し、音波発生型細胞破壊装置Ｓｏｎｉｆｉｅｒ Ｃｅｌｌ Ｄｉｓｒｕｐｔｅｒ ｌ８５（Ｂｒａｎｓｏｎ， Ｄａｎｂｕｒｙ， ＣＴ）において２５ワットの２段式マイクロチップホーンを使って、１０秒間隔で合計４分間、４℃下で音波破砕する（１０秒間音波破砕、続いて１０秒間静止）。蛋白濃度が０ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、３３．３ｎｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ、３３３．３ｎｇ／ｍｌ、１０００ｎｇ／ｍｌのＨＭＦＧ溶液をスピンした女性血清で処理し、正常な女性血清における各ＨＭＦＧレベルの３つの１８０μｌアリコットを４００μｌポリエチレン製マイクロ遠心分離管（Ｗｅｓｔ Ｃｏａｓｔ Ｓｃｉ． Ｅｍｅｒｙｖｉ１１ｅ， ＣＡ）にピペット注入する。６．６％ＰＥＧ溶液１５０μｌを各マイクロ遠心分離管に添加し、管を室温下で回転シェーカにおいて夜通し培養する。
【０２１８】
テストサンプルを比較可能な方法で処理する。すなわち、溶離したニトロセルロース濾液（あるいは代わりに乳房流体サンプル、または他の検定用サンプル）３００〜３５０μｌを４００μｌマイクロ遠心分離管に入れて５〜７分間、１０℃下で１０，２４０ｒｐｍにて遠心分離する。遠心分離管は次に、血清によって形成された白色の帯（存在する場合）より下をかみそり刃で切断し、残っている血清１８０μｌを新しい遠心分離管に移す。次に、６．６％ＰＥＧ溶液１５０μｌを各遠心分離管に添加し、管を室温下で回転シェーカにおいて夜通し培養する。
【０２１９】
２日目
（１）α−ＨＭＥを洗浄緩衝液でその適当な濃度に希釈する。抗体溶液は、６ｎｇのＨＭＦＧ蛋白当量（ｐｒｏｔ．ｅｑ．）に対して化学量論量またはそれより少ない量のα−ＨＭＥを有する。ＨＭＦＧの６ｎｇを、Ｃｅｒｉａｎｉ、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅｓ， ｐ． ３９８−４０２、Ｋｅｎｎｅｔ他（編集者）、Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９８４（ここにその全体を参考として組み入れる）によって先に述べたメタノール変性ＢＳＡ手順によってマイクロタイタープレートに共有結合させる。
【０２２０】
（２）２日目にテストサンプルとコントロールサンプルを処理するために、遠心分離管を、Ｓｏｒｖａｌｌ ＲＣ５Ｃ遠心分離機を備えたＳＨＭＴロータにおいて７分間、１０℃下で１０，２４０ｒｐｍにて遠心分離する。三サンプルにおいて、上澄み液５５μｌをピペットで空のマイクロタイタープレートウェル（Ｄｙｎａｔｅｃｈ， Ａｌｅｘａｎｄｒｉａ， ＶＡ）に注入し、ペレット化した沈澱物を乱されないままにしておく。６．６％ＰＥＧ溶液２５μｌを各ウェルに添加する。洗浄性緩衝液で希釈したα−ＨＭＥの３０μｌも各ウェルに添加し、蒸発を避けるために無孔テープＳｃｏｔｃｈ（登録商標）をウェルに貼る。次に、マイクロタイタープレートを室温下で回転シェーカにおいて夜通し培養する。
【０２２１】
３日目
沈澱可能な懸濁物を移し替えるため、マイクロタイタープレートを３０分間、室温下で遠心分離する（速度３０００ｒｐｍ）。ＲＩＡ緩衝液５０μｌを、６ｎｇのＨＭＦＧを含むマイクロタイタープレートのウェルに添加し、５分後に吸い出す。
【０２２２】
ＰＥＧによって誘導され、すでにペレット化した沈澱分を除いて、上記（１）からのマイクロタイタープレートの中味全部を、ウェル当たり６ｎｇのＨＭＦＧを含む別セットのマイクロタイタープレートのウェルに慎重に移す（２日目、（１）を参照）。
【０２２３】
マイクロタイタープレートを室温下で回転撹拌しながら３時間培養する。Ｄｙｎａｔｅｃｈ製品Ｄｙｎａｄｒｏｐ ＳＲ−１自動ディスペンサを使ってプレートをＲＩＡ緩衝液で５回洗浄する。次に、放射性ヨウ素で処理され、親和性純化されたウサギの抗マウス免疫グロブリンの、ＲＩＡ緩衝液で希釈された後の５０μｌをウェルごとに添加する。プレートをテープで覆い、室温下で回転撹拌しながら２時間培養する。プレートをＲＩＡ緩衝液で５回洗浄する。ウェルを切断し、ガンマカウンタで計数する。
【０２２４】
これら検定の結果から、癌患者における癌の存在および／または状態に関する重要情報を、範囲および数値の点で、Ｃｅｒｉａｎｉ他論文、Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． Ｔｒｅａｔ． １５：１６１−１７４， １９９０によりＨＭＥ−Ａｇ胸部癌マーカについて行われた血清検定によって提供されたデータに匹敵し得る情報が得られる。患者サンプルおよびコントロールサンプルを選択し、Ｃｅｒｉａｎｉが同僚と共同で追従した手順に従って比較データを展開し、評価することにより、本発明の検定方法は、胸部癌患者における予後変数と治療関連変数の両方を求める直接的な臨床用途での使用に容易に適合する。検定用の試薬および検定条件は無論、周知の免疫学的な方法および原理を適用することにより、予想される多様な変数に応じて代替または調整することができる。
【０２２５】
実施例６
乳房流体からの生体サンプルにおける非浸透性糖蛋白の競合放射免疫学的検定
この競合放射免疫学的検定は、化学量論量またはそれより少ない量のモノクローナル抗体Ｍｃ５を、ＨＭＦＧに含有された非浸透性糖蛋白（ＮＰＧＰ）として知られた固相結合抗原に結合させる本発明の方法に従って得られた乳房流体からの生体サンプルに含有される胸部上皮抗原による置換をベースとする。ＨＭＦＧを固体支持に結合させ、培養期間中にＭｃ５抗体に暴露して、抗体を固相結合ＨＭＦＧ中のＮＰＧＰ抗原と結合させる。生体サンプルにおけるＮＰＧＰの存在および／またはレベルは、Ｍｃ５抗体プローブを結合させかつ標識化するために放射性標識ヤギ抗マウス抗体を使って検出かつ／または測定されるように、究極的には、サンプルが固相結合ＨＭＦＧ中のＮＰＧＰ抗原とのＭｃ５結合に向かって競うことができる能力により試験される。
【０２２６】
本実施例における緩衝液および他の溶液および試薬は、上記実施例４において述べたＨＭＥ−Ａｇｓポリクローナル抗体放射免疫学的検定に使用されるものと概ね同じである。検定用のテストサンプルを準備するために、ニトロセルロースフィルタで採集された乳房流体からの生体サンプルを標準的方法に従って電気泳動によってリン酸緩衝食塩水中に溶離する。あるいは代わりに、全乳房流体のサンプルまたは乳房流体から得られた他の種類の生体サンプルを適当な媒体または混合物に調合して、検定用のテストサンプルを準備することができる。こうしてテストサンプルを準備したならば、これを次に、Ｃｅｒｉａｎｉ他論文、Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． Ｔｒｅａｔ． １５：１６１−１７４， １９９０（ここにその全体を参考として組み入れる）において述べられた方法、すなわちＮＰＧＰ／Ｍｃ５放射免疫学的検定（ＲＩＡ）に従って下記の通り検定する。
【０２２７】
適当なコントロールサンプルを準備するために、プールされた正常な女性乳房流体（ニトロセルロースを吸着し、溶離したテストサンプルと同じ方法でニトロセルロースフィルタに暴露し、溶離したもの、あるいは代わりに、正常な全乳房流体のサンプルまたは正常な乳房流体から得られた他の種類のサンプルとして準備され、適当な媒体または混合物に調合して、検定用の適当なコントロールサンプルに調製したもの）の４００μｌをＲＩＡ緩衝液で２．４ｍｌに希釈し、１／６の濃度にする。
【０２２８】
凍結乾燥したＨＭＦＧの５００μｇ／ｍｌ溶液を０．３％トリトンＸ−１００、０．０５％アジ化ナトリウムを含有する１Ｘ ＰＢＳで調製し、音波発生型細胞破壊装置Ｓｏｎｉｆｉｅｒ Ｃｅｌｌ Ｄｉｓｒｕｐｔｅｒ ｌ８５（Ｂｒａｎｓｏｎ， Ｄａｎｂｕｒｙ， ＣＴ）において２５ワットの２段式マイクロチップホーンを使って４分間、４℃下で音波破砕する（１０秒間音波破砕、続いて１０秒間静止）。
【０２２９】
標準曲線を作成する溶液は、１／６の濃度にされた２．４ｍｌの正常女性血清を使って、ＨＭＦＧの量を増やしながら（上記実施例４において述べたように、ＨＭＦＧ ｍｌ当たり０μｇ、０．２５μｇ、２．５μｇ、５０μｇ）調製する。
【０２３０】
検定用の希釈テストサンプルを形成するために、各テストサンプルをＲＩＡ緩衝液で６倍に希釈し（ＲＩＡ緩衝液２００μｌに対して血清４０μｌ）、渦状にする。
【０２３１】
Ｍｃ５保存溶液を、これが、Ｃｅｒｉａｎｉ、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅｓ， ｐ． ３９８−４０２、Ｋｅｎｎｅｔ他（編集者）、Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９８４（ここにその全体を参考として組み入れる）によって先に述べられたように調製されたマイクロタイタープレートに共有結合したＨＭＦＧのウェル当たり１００ｎｇの蛋白に対して化学量論量またはそれより少ない量の抗体を含有するように調整する。
【０２３２】
ＲＩＡ緩衝液２００μｌをＨＭＦＧ １００ｎｇの各ウェルに添加し、その５分後に吸引する。
【０２３３】
標準曲線を作成するために、ＨＭＦＧ標準化溶液３０μｌ（上記３における通りの）を四サンプルにおいてＨＭＦＧマイクロタイターウェルのウェル当たり１００ｎｇの蛋白に添加する。
【０２３４】
検定用の希釈テストサンプル（あるいは代わりに乳房流体のサンプルまたは他の種類のサンプル）３０μｌを三サンプルにおいてＨＭＦＧマイクロタイターウェルのウェル当たり１００ｎｇに添加する。
【０２３５】
各ウェルにＭｃ５保存溶液２０μｌを添加する。
【０２３６】
マイクロタイタープレートを無孔テープＳｃｏｔｃｈ（登録商標）で覆い、室温下で回転撹拌機において夜通し培養する。
【０２３７】
翌日、ウェルを吸引し、ＲＩＡ緩衝液で５回洗浄する。
【０２３８】
各ウェルに、２００，０００ｃｐｍ／５０μｌ１２５Ｉ標識化したヤギの抗マウス抗体５０μｌを与える。ウェルを無孔テープで覆い、３時間、室温下で回転撹拌機の上に置く。
【０２３９】
ウェルを吸引し、ＲＩＡ緩衝液で５回洗浄する。
【０２４０】
各ウェルを切断し、放射能をガンマカウンタで計数する。
【０２４１】
これら検定の結果から、癌患者における癌の存在および／または状態に関する重要情報を、範囲および数値の点で、Ｃｅｒｉａｎｉ他論文、Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． Ｔｒｅａｔ． １５：１６１−１７４， １９９０によりＮＰＧＰ胸部癌マーカについて行われた血清検定によって提供されたデータに匹敵し得る情報を得る。患者サンプルおよびコントロールサンプルを選択し、Ｃｅｒｉａｎｉが同僚と共同で追従した周知の手順に従ってデータを展開しかつ評価することにより、本発明の検定方法は、胸部癌患者における予後変数と治療関連変数の両方を求める直接的な臨床用途における使用に容易に適合できる。当業者の理解する通り、検定用の試薬および検定条件は、周知の免疫学的な方法および原理に従って、予想される多様な変数に応じて代替または調整することができる。
【０２４２】
実施例７
乳房流体中の粘液性癌腫関連抗原に関する固相免疫学的検定
この実施例は、本発明の方法に従って得られた乳房流体からの生体サンプルにおいて粘液性癌腫関連抗原（ＭＣＡ）を検出するのに高感度の固相免疫学的検定を使用する。ＭＣＡ濃度は、Ｈｏｆｆｍａｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ（スイス・バーゼル）により提供された抗体ビード免疫学的検定キットを使って、かつ、同製造者により提供された、Ｅｓｋｅｌｉｎｅｎ他の論文、ＡＥｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ９：４３７−４４０， １９８９に詳述された試薬および手順を使って特定される。手短に言えば、全乳房流体の検定用テストサンプルおよび標準サンプルを先ずＭＣＡモノクローナル抗体ビードで培養し、次に、適宜洗浄した後、酵素（ホースラディシュ（西洋ワサビ）ペルオキシダーゼ）標識化した二次抗体を添加する。二次培養の間に、抗ＭＣＡ酵素結合体をビード上の抗体抗原複合体に付着させる。余剰結合分を洗浄によって除去し、最終的に、酵素基質を添加し、生成した色を記録する。
【０２４３】
本例において呈示する固相検定フォーマットは、ＭＣＡマーカのほかに他の癌マーカをより高い感度で検出かつ／または測定する他の広範な検定用途に適合させることができる。加えて、これら検定の結果を、各種マーカを検出および／または測定する補助検定のそれと共に評価して、癌患者における癌の存在および／または状態に関するより精確な情報を得る。これは、Ｅｓｋｅｌｉｎｅｎ他論文、Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ９：４３７−４４０， １９８９（Ｅｓｋｅｌｉｎｅｎ他論文、 Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ８：６６５−６６８， １９８８も参照；ここにその全体を参考として組み入れる）において述べられたＭＣＡ／ＣＡ １５−３組合せ検定によって例証された通りである。
【０２４４】
実施例８
バソプレシンを検出するためにポリクローナル交代プローブとモノクローナル抗体抗体プローブを使ったヒト乳房流体の細胞片からの蛋白のウエスタン分析
ヒト乳房流体からの細胞サンプルに焦点を合わせる多様な検定が、本発明によって提供される。一般に、これらの検定は、標準的な分離方法（例えば遠心分離、スクロース勾配など）に従って表出された全乳房流体から細胞、膜または他の細胞成分を上記方法によって隔離することに依拠する。表出された乳房流体からの全細胞を含有する生体サンプルは、胸部癌患者の癌を検出しかつ評価する細胞学的検査および細胞化学的検査にとって特に有用である。ヒト乳房流体からの純化細胞膜部分を含有する生体サンプルは、この観点で、例えば腺胞管細胞によって細胞内蛋白または膜結合蛋白として表出する胸部癌マーカ、従って、乳房流体の液体分中に分泌蛋白として容易に検出されない胸部癌マーカを検出かつ／または測定する上で特に有用である。
【０２４５】
本実施例は、Ｎｏｒｔｈ他論文、Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． Ｔｒｅａｔ． ３４：２２９−２３５， １９９５から採用した方法を使って、乳房流体からの生体サンプルにおいてペプチドホルモンバソプレシンを検出するための検定に焦点を合わせる。特に、この検定は、表出した乳房流体から得られた細胞をプールしたサンプルから隔離された粗蛋白のテストサンプルを使用する。細胞は、標準的方法に従って全乳房流体から分離され、かつ粗蛋白は、０．１Ｍ ＨＣｌの１００体積における音波破砕によって細胞から抽出される。その結果生じる蛋白懸濁質を、次に１５００ ｘ ｇにて１０分間、周囲温度下で遠心分離し、可溶蛋白を４０％ＴＣＡで沈澱させる。この蛋白を、１０，０００ ｘ ｇにて２分間の遠心分離によってペレット化する。次に、エーテルで洗浄（２回）することによってＴＣＡをペレットから除去する。蛋白を０．１Ｍ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ中に再懸濁させ（ｐＨ８．７）、１００℃下で５分間、メルカプトエタノールで還元し（また、場合によっては、ＮエチルマレインイミドでＳアルキル化し）、Ｌａｅｍｅｌｉ論文、Ｎａｔｕｒｅ ２２７：６８０−６８５， １９７０（ここにその全体を参考として組み入れる）の方法を使ってｐＨ９．３の１５％ゲルにおいてＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動にかける。分離した蛋白は、次に、２０ｍＭ Ｔｒｉｓグリシン（ｐＨ８．０）を使って電気泳動によってイモビロンＰＶＤＦ膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ， Ｂｅｄｆｏｒｄ， ＭＡ）へ移す。この膜を５％無脂肪乳溶液でブロックし、０．５％トリトンを含有するＰＢＳで洗浄し（１５分間１回、５分間２回）、ＶＰ−ＨＮＰに対してマウスのモノクローナル抗体の製剤を使って、ＶＰに対してウサギのポリクローナル抗体を使って、ＶＡＧに対してウサギのポリクローナル抗体を使って、または至るところにあるマウスまたはウサギのＩｇＧ（負の制御）を使って、周囲温度下で１時間培養する（抗体および抗体製剤の説明については、Ｎｏｒｔｈ他論文、Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． Ｔｒｅａｔ． ３４： ２２９−２３５， １９９５を参照）。ＰＢＳトリトンでの二次洗浄（１５分間１回、５分間２回）に続いて、膜を、ヤギ抗マウスＩｇＧホースラディシュ・ペルオキシダーゼ結合体またはヤギ抗ウサギＩｇＧホースラディシュ・ペルオキシダーゼ結合体でそれぞれ１時間処理し、次に、ＰＢＳトリトンで洗浄する（１５分間１回、５分間４回）。ＥＣＬウエスタンブロッティング検出システムを使ってＸ線フィルムを１０秒間から５分間までの時間露光することによって免疫反応性蛋白を視覚化する。予め染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥ標準蛋白を分子サイズマーカとして使用する。
【０２４６】
最近の研究は、バソプレシンが汎用的に胸部癌腫を表しかつ正常な胸部細胞に存在しないことを示唆している（Ｎｏｒｔｈ他、Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． Ｔｒｅａｔ． ３４：２２９−２３５， １９９５）。その研究結果は、他の結果ともども、バソプレシンとその関係物が、胸部腫瘍細胞から隔離された蛋白の免疫学的検定によって容易に検出できる重要な胸部癌マーカであることを示している。従って、ヒト乳房流体から隔離された細胞サンプルを使用する本実施例の結果も、癌患者における癌の存在および／または状態に関する重要情報をもたらすと期待される。
【０２４７】
実施例９
乳房流体からの生体サンプル中の癌胎児抗原のドット免疫ブロット検定による定量化
本発明のより高い感度の検定のうち、低レベルの胸部癌マーカの測定に、また表出した乳房流体が少量しか使えないときのマーカの検出に有用であるのが、ドット免疫ブロット法である。本実施例では、全乳房流体において癌胎児抗原（ＣＥＡ）を、Ｅｌｍｏｔｅｃｈ抗ＣＥＡモノクローナル抗体キット（持田製薬株式会社、日本・東京）を使ってドットブロット検定フォーマットで測定する。手短に言えば、抗ＣＥＡモノクローナル抗体を適当な濃度に希釈し、プラスチックフィルムに塗布する。標準ＣＥＡ溶液（０ｎｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ、２００ｎｇ／ｍｌ、５００ｎｇ／ｍｌ）か、全乳房流体検定サンプルかどちらかのアリコット（５μｌ）を固定化フィルム上で塗抹化する。Ｅｌｍｏｔｅｃキット製造者の指示に従って、純化した抗原製剤から検定標準を作成する。必要であれば、１０００ｎｇ／ｍｌ ＣＥＡ溶液も標準として使用する。室温下で乾燥させた後、フィルムを室温下で２０分間、ペルオキシダーゼ結合の抗ＣＥＡ抗体にさらす。フィルムは次に、０．５％ （ｖ／ｖ） Ｔｗｅｅｎ ２０を含有する１Ｍ塩水で十分に洗浄する。テトラメチルベンジジンを色原体として使って、酵素反応を視覚化する。現像液は、０．０５ｍＭテトラメチルベンジジンと、１０％メタノールを含有するＭｃＩｌｖａｉｎ緩衝液（０．１％Ｍリン酸塩−クエン酸塩緩衝液）（ｐＨ５．０）中の０．０１％過酸化水素からなる。乳房流体検定サンプル中のＣＥＡの濃度は、色の強さを対応する標準と比較することによって決定される。
【０２４８】
本実施例で開示された検定、およびＣＥＡのほかに他の腫瘍マーカに抗体を組み入れる関連の検定は、低レベルの胸部癌マーカの測定に、また、限られた量のサンプルのマーカの検出に有用である。これら検定の結果から、胸部癌患者の予後変数と治療関連変数の両方を求める上で重要な情報が得られる。当業者に理解されるように、検定用の試薬および検定条件は、周知の免疫学的な方法および原理に従って、予想される多様な変数に応じて代替または調整することができる。
【０２４９】
実施例１０
乳房流体からの生体サンプルにおけるプロカテプシンＤ活性およびカテプシンＤ活性の検出
カテプシンＤは、癌の転移に必要な癌プロセスを知るためのマーカとして徹底的に研究されたリソソームアスパラギンプロテイナーゼの１つである。本実施例では、プロカテプシンＤに対するポリクローナル抗体を使って、一般にＶｅｔｖｉｃｋａ他、Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． Ｉｎｔ’１． ３０：９２ｌ−９２８， １９９３（ここにその全体を参考として組み入れる）において開示された方法に従って、全乳房流体からの蛋白または乳房流体からの細胞溶解産物を免疫沈降させ、免疫化学的に検出する。あるいは代わりに、または補助検定として、カテプシンＤのプロテアーゼ活性を、同じくＶｅｔｖｉｃｋａ他において開示された方法に従って検出する。手短に言えば、プールした全乳房流体（好ましくは、入手可能ならば３ｍｌ）を緩衝液Ａ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ．ＨＣｌ、５ｍＭ ＣａＣｌ２、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、５００ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ７．２）の３ｍｌで希釈する。その結果生じる水相を再び同じ条件のもとで遠心分離する。可溶分（合計で約３ｍｌ）を、緩衝液Ａで平衡状態に保たれたＣｏｎｃａｎａｖａｌｉｎ Ａ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、スウェーデン・ウプサラ）１ ｍｌカラムに装填し、緩衝液Ａで洗浄した後、保留蛋白を０．７５Ｍメチルａ−Ｄ−ｍａｎｎｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅで希釈する。留分（２５０μｌ）は、Ｌｉｎ他論文、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６４：４４８２−４４８９， １９８９（ここにその全体を参考として組み入れる）において述べられた通りの１４Ｃヘモグロビンアッセイを使って、ウエスタンブロット法により、また、銀染色電気泳動により、カテプシンＤ活性について分析する。ヒト乳汁プロカテプシンＤの抑制は、メタノール中に溶解した１ｍＭペプスタチンＡ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｈｅｉｍ、ドイツ）２μｌを反応混合物に添加することによって達成される。
【０２５０】
この検定例は、しかし、癌関連変数を決定するために乳房流体からの生体サンプルを評価するために、免疫学的検定に加えて、または免疫学的検定を補足する形で既知の生化学的検定を取り入れる本発明の多数の可能な実施例の１つにすぎない。ここにヒト乳房流体からサンプルを得るために提供される基本的方法によれば、これらの検定は、非侵襲性スクリーニングプロトコルの枠内で被検者胸部癌マーカの活性を検出かつ／または測定する臨床用途の使用に容易に適合し得る。
【０２５１】
当業者は、上述した本発明の概念を採用する他の実施形態および他のバリエーションが可能であることを認知するであろう。詳記すれば、広範かつ多様な種類の有用な胸部癌マーカ（蛋白、ＤＮＡシーケンス、ＲＮＡシーケンスおよび他のマーカを含む）およびプローブ（免疫学的プローブ、ヌクレオチドプローブおよび生化学的プローブを含む）が、本発明の方法およびキットに適用かつ使用するために容易に利用できる。これらのマーカおよびプローブは、本開示において引用しかつ組み入れた文献に幅広く説明または参照され、または他の文献で公表され、または当分野で周知である。これらの既知および既存のマーカおよびプローブのうち、本発明に有用な例として、Ｈｅｒ ２（ｅｒｂＢ−２およびｎｅｕとして知られてもいる）が含まれる。Ｈｅｒ ２は、胸部癌細胞系における周期的増幅領域である染色体１７ｑにある遺伝子によってコード化されたＥＧＦレセプタファミリーの膜内外糖蛋白成長因子レセプタである。このマーカは、胸部癌の確率の高い前兆であり、かつＨｅｒ ２の遺伝的欠陥を検出、またはｍＲＮＡを検出および／または測定して、癌細胞の漸進的増殖にリンクしたＨｅｒ ２の過剰発現を決定するために、既知のヌクレオチドプローブを使って本発明の細胞サンプルにおいて検出される（例えば、Ｖｉｓｓｃｈｅｒ他の論文、Ｉｎ Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ ａｎｄ Ｇｒａｈａｍ （ｅｄｓ） Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ， ｖｏ１． ５， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， Ｍｏｓｂｙ Ｙｕｅａｒ Ｂｏｏｋ， １９９２， ｐ． １２３−１６１；Ｂａｒｂａｒｅｓｃｈｉ他の論文、Ａｍ． Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｐａｔｈｏｌ． ９８：４０８−４１８， １９９２；Ｓｌａｍｏｎ他の論文、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３５：１７７−１８２， １９８７を参照。（各々、ここにその全体を参考として組み入れる））。Ｈｅｒ ２の蛋白レベルも、入手可能な免疫学的プローブを使って容易に検出することができる（詳細については、Ｐｏｒｔｅｒ−Ｊｏｒｄａｎ他の論文、Ｈｅｍａｔｏｌ． Ｏｎｃｏｌ． Ｃｌｉｎ． Ｎｏｒｔｈ Ａｍｅｒ． ８：７３−１００， １９９４および同論文の８０頁で引用された記事（各々、ここにその全体を参考として組み入れる）を参照）。本発明に使用できる他のマーカにはＥＧＦおよびＥＧＦレセプタが含まれ、その特徴については、本発明に容易に使用できる免疫学的プローブ、非免疫学的プローブおよび検定方法が、Ｐｏｒｔｅｒ−Ｊｏｒｄａｎ他の論文、Ｈｅｍａｔｏｌ． Ｏｎｃｏｌ． Ｃｌｉｎ． Ｎｏｒｔｈ Ａｍｅｒ． ８：７３−１００， １９９４の８０−８１頁および同論文で引用された参考文献において詳細に述べられている（ここにその全体を参考として組み入れる）。本発明の方法およびキットに有用な胸部疾患マーカおよび胸部疾患プローブを提供する増殖マーカ、成長因子、成長因子レセプタ、プロテアーゼ、癒着因子、脈管形成因子、オンコジーンおよび腫瘍抑圧遺伝子の他の例は、Ｋｉ６７成長因子、サイクリンＤ１、増殖細胞核抗原、トランスホーミング増殖因子、組織プラスミノゲン賦活剤、インスリン成長因子レセプタ、コラーゲナーゼＩＶ型、ラミニンレセプタ、インテグリン、ｐ５３、ｒｂ、ｎｍ２３���ｒａｓ、ｃ−ｍｙｃ、ｃ−ｍｙｂ、熱ショック蛋白、プロラクチン、ニューロン特定エノラーゼ、ＩＲ−１４、ＫＡ １、ＫＡ ｌ４、α−ラクトアルブミン、アクチン、ＩＬ−１０、Ｓ−１００蛋白、ビメンチン、網膜上膜抗原、ｂｃｌ−２、ＣＡ１５−３、ＣＡ１９−９、Ｔｎ抗原、α−ラクトアルブミン、ＬＡＳＡ、Ｇａｌ−ＧａｌＩＮＡＣ、ＧＣＤＦＰ−１５、Ｌｅ（ｙ）関連炭水化物抗原、ＣＡ １２５、ｕＰＡ、ｕＰＡ関連抗原、ｕＰＡ関連複合体、ｕＰＡレセプタ、ＰＡ１−１およびＰＡ１−２、β−グルクロニダーゼ、ＣＤ３１、ＣＤ４４スプライス変種、血液型抗原（ＡＢＨ、ＬｅｗｉｓおよびＭＮを含む）、および遺伝的病変またはＣＣＮＤ１、ＥＭＳ１、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２各遺伝子の発現レベル変化、およびその他多数を含み、これらについては、免疫学的および非免疫学的な結合相手、プローブおよび検定方法が知られておりかつ本発明に容易に使用できる。
【０２５２】
以上、本発明の明確な理解を目的として例示により詳細に説明したが、当業者には、ある一定の変更および改変が本開示によって理解され、かつ特許請求項の範囲内で熟練なしに実施され得ることは明白であろう。
【図１】
本発明の概念を採用した搾乳ポンプの部分断面図である。
【図２】
図１に示された搾乳ポンプの一部の断面図である。
【図３】
搾乳ポンプに流体により連結される固相サンプル採集媒体を支持する支持部材の斜視図である。
【図４】
搾乳ポンプに流体により連結される固相サンプル採集媒体を支持する他の形態の支持部材の斜視図である。
【図５】
搾乳ポンプに流体により連結される固相サンプル採集媒体を支持する他の形態の支持部材の斜視図である。
【図６】
搾乳ポンプに流体により連結される固相サンプル採集媒体を支持する他の形態の支持部材の斜視図である。
【図７】
搾乳ポンプに流体により連結される固相サンプル採集媒体を支持する他の形態の支持部材の斜視図である。
【図８】
本発明の概念を採用した搾乳ポンプ装置の部分断面図である。
【図９】
粒状固相サンプル採集媒体を収納する支持部材およびカートリッジを示す搾乳ポンプの一部の部分断面図である。
【図１０】
支持部材および代表的な固相サンプル採取テンプレート（被覆管）を示す搾乳ポンプの一部の部分断面図である。
【図１１】
搾乳ポンプ内の固相サンプル採集媒体の位置を調節する往復機構を採用した搾乳ポンプの部分断面図である。
【図１２】
本発明の概念を採用した搾乳ポンプ・アダプタを示す断面図である。
【図１３】
搾乳ポンプ・アダプタ内の固相サンプル採集媒体の位置を調節する往復機構を採用した搾乳ポンプ・アダプタの断面図である。
【図１４】
搾乳ポンプ内の固相サンプル採集媒体の位置を調節する摺動式往復機構を採用した搾乳ポンプの部分断面図である。
【図１５】
搾乳ポンプ内の固相サンプル採集媒体の位置を調節する摺動式往復機構を採用した搾乳ポンプの部分断面図である。
【図１６】
本発明の携帯用搾乳ポンプを示す断面図である。
【図１７】
本発明の携帯用搾乳ポンプを示す断面図である。
【図１８】
一次および二次サンプル採取のための着脱式支持部材および着脱式流体リザーバを採用した本発明の携帯用搾乳ポンプを示す分解斜視図である。
【図１９】
本発明の携帯用搾乳ポンプに用いられる着脱式サンプル採取リザーバの他の形態の斜視図である。
【図２０】
本発明の携帯用搾乳ポンプに用いられる着脱式サンプル採取リザーバの他の形態の斜視図である。
【図２１】
図１９の着脱式流体リザーバを密封すると共にサンプル・データを記録するための外側標識表示面を提供する閉鎖／標識表示細片の作用を示す該リザーバの断面図である。
【図２２】
図１９の着脱式流体リザーバを密封すると共にサンプル・データを記録するための外側標識表示面を提供する閉鎖／標識表示細片の作用を示す該リザーバの断面図である。
【図２３】
図１９の着脱式流体リザーバを密封すると共にサンプル・データを記録するための外側標識表示面を提供する閉鎖／標識表示細片の作用を示す該リザーバの断面図である。
【図２４】
本発明の搾乳ポンプに使用される、透過性および可撓性を高める穿孔もしくはスリットを有する改良膜もしくはフィルタの平面図である。
【図２５】
本発明の搾乳ポンプに使用される、透過性および可撓性を高める穿孔もしくはスリットを有する改良膜もしくはフィルタの平面図である。
【図２６】
本発明の搾乳ポンプに使用される、透過性および可撓性を高める穿孔もしくはスリットを有する改良膜もしくはフィルタの平面図である。
【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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2004524060.tif 000128
【国際調査報告】
2004524060.tif 000129