(57)【要約】本発明は、ファージディスプレイライブラリーから単離された５つのヒトＨＣＥ２特異的モノクローナル抗体の同定および特徴付け、ならびに哺乳類、好ましくはヒトにおけるＨＣＶの診断、治療、および予防におけるそれらの使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）Ｅ２抗原に対する免疫学的結合親和性を示すヒトモノクローナル抗体であって、配列番号１〜配列番号５で示されるアミノ酸配列から選択されるγ鎖ＣＤＲ３領域アミノ酸配列を有するモノクローナル抗体。
【請求項２】
Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）Ｅ２抗原に対する免疫学的結合親和性を示すヒトモノクローナル抗体であって、配列番号１〜配列番号５で示されるγ鎖可変領域アミノ酸配列のうちの１つを有するモノクローナル抗体。
【請求項３】
Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）Ｅ２抗原に対する免疫学的結合親和性を示すヒトモノクローナル抗体であって、該抗体をコードするＤＮＡ構築物が、ＡＴＣＣ受託番号：ＰＴＡ−２７４７、ＰＴＡ−２７４８、ＰＴＡ−２７４９、ＰＴＡ−２７４５、ＰＴＡ−２７４６からなる群から選択されるＡＴＣＣアクセッション番号を有するモノクローナル抗体。
【請求項４】
配列番号１〜配列番号３および配列番号５のアミノ酸配列から選択されるγ鎖ＣＤＲ３領域を有し、かつＨＣＶ遺伝子型１ａおよび１ｂ由来のＥ２抗原との免疫反応性を有する請求項１記載のモノクローナル抗体。
【請求項５】
配列番号２のアミノ酸配列から選択されるγ鎖ＣＤＲ３領域を有し、かつＨＣＶ遺伝子型１ａ、１ｂ、２ａ、３ａ、４ａ、５ａ、および６ａ由来のＥ２抗原との免疫反応性を有する請求項１記載のモノクローナル抗体。
【請求項６】
請求項１〜３記載の抗体の重鎖免疫グロブリンアミノ酸配列および軽鎖免疫グロブリンアミノ酸配列をコードする核酸分子。
【請求項７】
請求項６記載の核酸分子を含むＤＮＡ構築物。
【請求項８】
ＡＴＣＣ特許寄託指定番号：ＰＴＡ−２７５０を有するファージディスプレイライブラリー。
【請求項９】
請求項８記載のファージディスプレイライブラリーから単離されるヒトモノクローナル抗体。
【請求項１０】
ＨＣＶポリペプチドとの免疫反応性を有する請求項９記載の抗体。
【請求項１１】
ＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチドとの免疫反応性を有する請求項１０記載の抗体。
【請求項１２】
請求項１、２、３、１０、または１１記載の抗体の抗原結合断片。
【請求項１３】
請求項１、２、３、１０、または１１記載の少なくとも１つの抗体、および適切な賦形剤、希釈剤、または担体を含む医薬組成物。
【請求項１４】
請求項１２記載の抗原結合断片、および適当な賦形剤、希釈剤、または担体を含む医薬組成物。
【請求項１５】
生物学的試料中のＣ型肝炎ウイルスの検出方法であって、
ａ）抗体とＣ型肝炎ウイルス抗原との間の免疫複合体を形成するのに適した条件下で、請求項１、２、３、１０、または１１記載の少なくとも１つの抗体と試料を接触させること、および
ｂ）前記免疫複合体の存在を検出すること
を含む方法。
【請求項１６】
生物学的試料中のＣ型肝炎ウイルスの検出方法であって、
ａ）抗原結合断片とＣ型肝炎ウイルス抗原との間の免疫複合体を形成するのに適した条件下で、請求項１２記載の少なくとも１つの抗原結合断片と試料を接触させること、および
ｂ）前記免疫複合体の存在を検出すること
を含む方法。
【請求項１７】
前記生物学的試料は、肝細胞、骨髄、血清、血漿、唾液、リンパ球、またはその他の単核細胞からなる群から選択される請求項１５記載の方法。
【請求項１８】
前記生物学的試料は、肝細胞、骨髄、血清、血漿、唾液、リンパ球、またはその他の単核細胞からなる群から選択される請求項１６記載の方法。
【請求項１９】
ＨＣＶに感染した哺乳類への受動免疫療法の提供方法であって、治療的に有効量の、請求項１、２、３、１０、または１１記載の少なくとも１つのヒトモノクローナル抗体を前記哺乳類に投与することを含む方法。
【請求項２０】
ＨＣＶに感染した哺乳類への受動免疫療法の提供方法であって、治療的に有効量の、請求項１２記載の少なくとも１つの抗原結合断片を前記哺乳類に投与することを含む方法。
【請求項２１】
Ｃ型肝炎の予防方法であって、ＨＣＶによる攻撃から哺乳類を防御するのに有効な量の、請求項１、２、３、１０または１１記載の少なくとも１つのモノクローナル抗体を前記哺乳類に投与することを含む方法。
【請求項２２】
Ｃ型肝炎の予防方法であって、ＨＣＶによる攻撃から哺乳類を防御するのに有効な量の、請求項１２記載の少なくとも１つの抗原結合断片を前記哺乳類に投与することを含む方法。
【請求項２３】
請求項１、２、３、１０、または１１記載の抗体に対する抗イディオタイプ抗体。
【請求項２４】
請求項１２記載の抗原結合断片に対する抗イディオタイプ抗体。
【請求項２５】
請求項１、２、３、１０、または１１記載のモノクローナル抗体を含むＨＣＶの検出のためのキット。
【請求項２６】
請求項１２記載の抗原結合断片を含むＨＣＶの検出のためのキット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
［技術分野］
本発明は、肝炎ウイルス学の分野に属する。特に本発明は、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）のエンベロープ２（Ｅ２）タンパク質に特異的なモノクローナル抗体、ならびにＣ型肝炎の診断、治療、および予防におけるこれらの抗体の使用に関する。
【０００２】
［発明の背景］
元来は非Ａ、非Ｂ型肝炎と呼ばれたＣ型肝炎は、Ａ型肝炎およびＢ型肝炎とは血清学的に別個の疾患であると１９７５年に初めて説明された（Ｆｅｉｎｓｔｏｎｅ， Ｓ．Ｍ． ｅｔ ａｌ．（１９７５） Ｎ． Ｅｎｇｌ． Ｊ． Ｍｅｄ．， ２９２：７６７−７７０）。Ｃ型肝炎は依然として輸血による肝炎の主要な種類であって、かつ主要な地域感染型肝炎の一つであるが、ＨＣＶゲノムのクローニングおよびシーケンシングによるＣ型肝炎の原因物質としてのＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）の同定がなされるまで、当該疾患の理解に関してほとんど進歩がなかった（Ｃｈｏｏ， Ａ．Ｌ． ｅｔ ａｌ． （１９８９） Ｓｃｉｅｎｃｅ ， ２８８：３５９−３６２）。この研究により得られた配列情報から、ＨＣＶは、小型エンベロープ正鎖ＲＮＡウイルスであると特徴付けられた。
【０００３】
ＨＣＶは、世界中に広がった急性および慢性肝炎の両方の主要原因である（Ｗｅｉｎｅｒ， Ａ．Ｊ． ｅｔ ａｌ． （１９９０） Ｌａｎｃｅｔ， ３３５：１−３）。ＨＣＶに急性感染した個体の約８０％が慢性感染になり、これらの個体の２０％以上がそのうちに肝硬変を発症する（Ａｌｔｅｒ， Ｈ．Ｊ． Ｓｅｅｆｆ， Ｌ．Ｂ．： Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ， Ｉｎ： Ｚｕｃｋｅｒｍａｎ， Ａ．Ｊ． Ｔｈｏｍａｓ， Ｈ．Ｃ． （ｅｄｓ）： Ｖｉｒａｌ Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ： Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｂａｓｉｓ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ， Ｅｄｉｎｂｕｒｇｈ Ｃｈｕｒｃｈｉｌｌ Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎｅ， １９９３）。感染個体の大多数において、ＨＣＶは慢性疾患を引き起こして、肝機能の損失をもたらし、かつ肝臓移植をしなければ、最終的には死に至る。移植を受けた患者はそれでもなお、体内を循環しているＨＣＶから、新たな肝臓が再感染する危険に曝されている。さらに、ＨＣＶ感染と肝細胞癌の発症との間に強い関連が見出されている（Ｂｕｋｈ ｅｔ ａｌ． （１９９３） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ，９０：１８４８−１８５１）。ＨＣＶ感染は、その他の疾患、例えばいくつかの自己免疫疾患とも関連すると考えられる（Ｍａｎｎｓ， Ｍ．Ｐ．（１９９３） Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌ．， ３５：１０８−１１５； Ｌｉｏｎｅｌ， Ｆ． （１９９４） Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ， １０７： １５５０−１５５５）。したがって、有意の罹患率および死亡率が、世界中でＨＣＶ感染により引き起こされている。現在、ＨＣＶ感染を予防かつ／または治療するための免疫予防法または免疫療法はなく、さらに、現在の薬剤療法は部分的に有効であるに過ぎない。したがって有効な免疫予防法または免疫療法の開発は、最優先されるべきものである。
【０００４】
Ｃ型肝炎ウイルスは、Ｎ末端ヌクレオキャプシドタンパク質（「コア」と呼ばれる）および２つのエンベロープ糖タンパク質「Ｅ１」および「Ｅ２」からなる３つの推定構造タンパク質を含む（Ｈｏｕｇｈｔｏｎ ｅｔ ａｌ． （１９９１） Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ， １４： ３８１−３８８参照）。
【０００５】
ＨＣＶ  Ｅ１およびＥ２タンパク質は、免疫予防学および免疫療法の開発に大いに関係がある。実際、これらの分子を基礎にした組換えワクチンは、霊長類試験においてＨＣＶによる実験的攻撃に対して防御的であることが示されている。特に、Ｃｈｏｏ等（（１９９４）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ９１： １２９４−９８）は、免疫原としてＨＣＶ−１の組換えＥ１およびＥ２タンパク質を用いて、同種株のＨＣＶによる攻撃に対するチンパンジーの予防接種の成功を報告した。しかしながらＣｈｏｏ等は、異種株のＨＣＶによる攻撃に対する防御は実証していない。多数のＨＣＶ単離物の配列分析に基づいたＨＣＶゲノムの異常分散性の発見（Ｂｕｋｈ ｅｔ ａｌ．； Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， （１９９３） ９０： ８２３４−８２３８， Ｂｕｋｈ ｅｔ ａｌ．（１９９４） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ９１： ８２３９−８２４３）は、多数種の株のＨＣＶによる攻撃に対して防御できなければ、ワクチンとして適切ではないことを示唆する。この結論は、Ｆａｒｃｉ等（Ｆａｒｃｉ， Ｐ． ｅｔ ａｌ． （１９９２） Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２５８： １３５−１４０）およびＰｒｉｎｃｅ等（Ｐｒｉｎｃｅ， Ａ．Ｍ． ｅｔ ａｌ． （１９９２） Ｊ． Ｉｎｆｅｃｔ． Ｄｉｓ．， １６５： ４３８−４４３）の両者の研究により支持されており、各々が、ある一つの株のＨＣＶによる感染は、再感染によるＣ型肝炎の程度を緩和するが、それは密接に関連した株による再感染に対して防御しないという証拠を提示した。
【０００６】
ＨＣＶに対して生産された抗体はそのウイルスの感染性を中和し得る（Ｓｈｉｍｉｚｕ ｅｔ ａｌ． （１９９４） Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６８：１４９４−１５００； Ｆａｒｃｉ ｅｔ ａｌ． （１９９４） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ９１： ７７９２−９６）ため、感染の危険に曝されているか、または感染性作用物質に最近曝露されたことのある個体に、高反応性中和抗ＨＣＶ抗体調製物を投与することにより、免疫化個体に受動免疫を提供し得る。
【０００７】
したがって、ＨＣＶ感染の危険性が高いか、またはＨＣＶに最近曝露されたことのある個体を防御するために用いることができる、ＨＣＶに対する抗体が必要である。好ましくは、中和抗体は種々の株のＨＣＶに対して広範に交差反応性を有する。
【０００８】
［発明の概要］
本発明は、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）Ｅ２ポリペプチド抗原に対して免疫学的結合親和性を示し、かつ種々の株のＨＣＶに対して交差反応性を有するヒトモノクローナル抗体に関する。
【０００９】
本発明は、これらの抗体のγ１鎖のＦＲおよびＣＤＲのアミノ酸配列に、ならびにこれらのアミノ酸配列をコードする核酸分子にも関する。
【００１０】
本発明はさらに、本明細書中に記載される特異的抗体が得られるコンビナトリアルライブラリーに関するが、それは、そのライブラリーはＨＣＶタンパク質に対する付加的モノクローナル抗体のリポジトリ（ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙ）を提供するためである。
【００１１】
したがって本発明は、このライブラリーから単離され得るモノクローナル抗体にも関するが、この場合、このような抗体は、ＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチドに対する抗体、ならびにその他のＨＣＶポリペプチドに対する抗体を含み得る。
【００１２】
さらに本発明は、哺乳類、好ましくはヒトにおける肝炎の予防、治療、および検出のための予防薬、治療薬および診断薬の開発における本発明のモノクローナル抗体の使用に関する。
【００１３】
さらに本発明は、治療薬、予防薬、または診断薬として用いるための、本発明の抗体を含むキットに関する。
【００１４】
本発明のこれらのおよびその他の目的は、本発明の以下の説明を考察した後に、さらに十分に理解されよう。
【００１５】
［発明の詳細な説明］
本発明は、ＨＣＶ  Ｅ２に対する免疫学的結合親和性を示す５つのヒトモノクローナル抗体であって、無症候性慢性ＨＣＶ感染患者（患者Ｈ）から単離された骨髄リンパ球および形質細胞ＲＮＡから調製されたファージディスプレイライブラリーからのＦａｂ断片として単離される抗体に関する。特に本発明の抗体は、可溶性形態のＨＣＶ  Ｅ２糖タンパク質を利用してＨＣＶ  Ｅ２抗原に特異的なＦａｂ分子を選択するパニング法を用いて選択された。
【００１６】
Ｆａｂ断片をＦｃドメインと組み合わせることにより単離Ｆａｂ断片からの無傷な免疫グロブリンを製造する方法は、当業者に既知である。「抗体」という用語は、無傷な免疫グロブリン分子および免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分を指すために本明細書中で用いられる。例示的抗体分子は、無傷な免疫グロブリン分子、実質的に無傷な免疫グロブリン分子、および例えば抗原結合断片、すなわちＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、Ｆ（ｖ）およびｓＦｖを含む免疫グロブリン分子の一部分、ならびに親抗体分子の免疫学的結合特性を示すそのキメラ抗体分子である。
【００１７】
「免疫学的結合親和性」および「免疫反応性」という用語は、本明細書中で互換的に用いられる場合、免疫グロブリン分子と、免疫グロブリンとの特異性を有する抗原との間に生じる非共有結合相互作用を指す。免疫学的結合相互作用の親和性は、相互作用の解離定数（Ｋｄ）に換算して表すことができ、この場合、Ｋｄが小さいほど親和性は大きいことを表す。表２は、ＨＣＶ−Ｅ２に対して誘導される５つのモノクローナル抗体のうち、２つのモノクローナル抗体が特に高い親和性を有する（ＨＣＶ＃４およびＨＣＶ＃７）ことを示す。選択された抗体の免疫学的結合特性は、当該技術分野で周知の方法を用いて定量することができる。このような方法の一つは、抗原結合部位／抗原複合体の会合速度および解離速度の測定を伴うが、この場合、その速度は複合体パートナーの濃度、相互作用の親和性、ならびに両方の速度に等しく影響を及ぼす幾何学的パラメーターによっている（Ｄａｖｉｅｓ ｅｔ ａｌ． （１９９０） Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， ５９： ４３９−７３参照）。
【００１８】
本発明の５つのクローンのγ１鎖の可変領域のアミノ酸配列（ＨＣＶ＃１、ＨＣＶ＃４、ＨＣＶ＃７、ＨＣＶ＃１２およびＨＣＶ＃１３）は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、および配列番号５として図１に示されている。配列番号１〜５は各々、４つのＦＲが隣接する３つの連続ＣＤＲを含む連続アミノ酸配列からなるが、この場合、アミノ酸配列はＦＲ１のＮ末端で開始して、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３を通して連続して、ＦＲ４のＣ末端で終わる。
【００１９】
「ＦＲ」という用語は、「超可変領域」と呼ばれる重鎖および軽鎖のＶ領域内の３つの高度分岐ストレッチと隣接する保存配列である「フレームワーク領域」を意味する。抗体分子においては、Ｎ末端抗原結合表面は結合抗原の三次元表面と相補的であり、重鎖の３つの超可変領域を含む。軽鎖の３つの超可変領域は、三次元空間で互いに関して形成される。重鎖および軽鎖の各々の３つの超可変領域は、「相補性決定領域」すなわち「ＣＤＲ」と呼ばれる。
【００２０】
本明細書中で用いる場合、「ＦＲ組」という用語は、重鎖または軽鎖Ｖ領域のＣＤＲ組のＣＤＲを組み立てる４つのフランキングアミノ酸配列を意味する。いくつかのＦＲ（フレームワーク領域）残基は、結合抗原と接触し得る。しかしながら、ＦＲは主として抗原結合部位に、特にＣＤＲに直接隣接するＦＲ残基中にＶ領域をフォールディングするのに関与する。
【００２１】
「ＣＤＲ組」という用語は、重鎖または軽鎖Ｖ領域の３つの超可変領域を意味する。重鎖または軽鎖のＮ末端から進行して、これらの相補性決定領域はそれぞれ「ＣＤＲ１」、「ＣＤＲ２」、および「ＣＤＲ３」として示される。ＣＤＲは抗原−抗体結合に関与し、ＣＤＲ３は特に、抗原−抗体結合に特異的な特有の領域を含む。したがって、抗原結合部位は、重鎖および軽鎖Ｖ領域の各々からのＣＤＲ組からなる６つのＣＤＲを含み得る。
【００２２】
現在、系統発生学的分析に基づいて同定された多数の別個のサブタイプを有するＨＣＶの６つの既知の別個の遺伝子型が存在する（Ｈｏｕｇｈｔｏｎ， Ｍ． （１９９６） Ｆｉｅｌｄｓ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ， ３ｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｆｉｅｌｄｓ ｅｔ ａｌ．， ｅｄｓ．， Ｌｉｐｐｅｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ， Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ， ＰＡ； Ｓｉｍｍｏｎｄｓ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｇｅｎ． Ｖｉｒｏｌ．， （１９９３） ７４：２３９１−９９）。γ１鎖アミノ酸配列が図１に示されている５つの抗体分子のうち、ＨＣＶ  Ｅ２エンベロープ糖タンパク質に特異的な４つの新規のヒトモノクローナル抗体分子は「交差遺伝子型反応性」を有する、すなわち少なくとも２つの遺伝子型由来のＨＣＶ単離物のＥ２抗原決定基と特異的に結合する抗体分子である。
【００２３】
したがって本発明は、配列番号１〜配列番号５で示されたγ１鎖アミノ酸配列のＣＤＲおよびＦＲ組をコードする核酸分子にも関する。各々のプラスミドがｐＣｏｍｂ３Ｈベクター中にγ１重鎖（Ｆｄ部分）およびκ軽鎖遺伝子を含有する５つのヒトモノクローナル抗体をコードするＤＮＡ構築物が、２０００年１１月３０日にＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）に寄託され、ＡＴＣＣ特許寄託指定番号：ＰＴＡ−２７４７、ＰＴＡ−２７４８、ＰＴＡ−２７４９、ＰＴＡ−２７４５、ＰＴＡ−２７４６を有する。
【００２４】
本発明は、遺伝暗号の縮重に起因するこれらの核酸配列の変異にも関する。Ｆａｂ分子の重鎖および軽鎖部分に関するコード配列は、単離または合成することができ、発現のための任意の適切なベクターまたはレプリコン中にクローニングすることができる。適当なベクターの例としては、細菌、哺乳類、酵母、およびウイルス発現系が挙げられる。
【００２５】
本発明のＦａｂ分子は、確証済のアミノ酸配列に基づいて、タンパク質合成の従来の方法を用いて生産することもできる。
【００２６】
本発明はさらに、これらのヒトモノクローナル抗体を得ることができる、本明細書中に記載されたファージディスプレイライブラリーに関する。このライブラリーは、２０００年１１月３０日にＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）に寄託され、ＡＴＣＣ特許寄託指定番号ＰＴＡ−２７５０を有する。本発明はさらに、寄託されたファージディスプレイライブラリーからヒトモノクローナル抗体を作製する方法に関する。当業者は、ファージディスプレイライブラリーからモノクローナル抗体を単離する方法についての知識を有する。好ましい実施形態では、本方法は、（１）パニングのような免疫親和性技法を用いて予備選定抗原と免疫反応するファージ粒子を選択すること、（２）選択ファージ粒子で細菌を感染させること、（３）回収されたクローンからファージミドＤＮＡを調製および分析すること、および（４）さらなる分析のために当該クローンから可溶性Ｆａｂ断片を発現させて、精製することを含む。もちろん、スクリーニングに用いられる予め選択される抗原は、ＨＣＶ  Ｅ２タンパク質もしくはペプチド断片、または例えばＥ１およびコア構造タンパク質もしくは非構造タンパク質である、Ｅ２以外のＨＣＶの任意のその他のタンパク質（またはそのペプチド断片）であり得ることを当業者は容易に理解するであろう。上記の方法を用いることにより、ＨＣＶに対する、またはある個体のＲＮＡからライブラリーを調製したその個体中に存在する可能性がある任意のその他の病原体に対する付加的ヒトモノクローナル抗体が、本発明のライブラリーから単離され得る。
【００２７】
本発明は、γ１鎖配列が配列番号１〜５で示される５つのモノクローナル抗体、または寄託されたファージディスプレイライブラリーから得られるＨＣＶに対するモノクローナル抗体を、診断薬として使用することにも関する。当該抗体は、生物学的試料中のＨＣＶの存在に関して試験するためのインビトロ診断薬として用いることもできる。特に、本発明の新規の特異的結合分子は、ＨＣＶを保有し、かつ／またはＨＣＶに感染した個体をスクリーニングおよび同定するための高感度な方法、ならびにＨＣＶ混入血液または血液製品をスクリーニングするための高感度な方法において用いられ得る。本発明の結合分子は、治療個体における抗ＨＣＶ療法の進行をモニタリングするためのアッセイ、およびＨＣＶ剤の調査および研究に用いられるＨＣＶ培養の成長速度をモニタリングするためのアッセイにおいても用いられ得る。
【００２８】
一実施形態では、個体から得られる生物学的液体または生物学的組織のような試料は、試料中に存在し得るＨＣＶ抗原と抗体との免疫学的複合体の形成が可能な条件下で、診断的に有効量の本発明の１つまたは複数のヒトモノクローナル抗体と接触させられる。次に試料中にＨＣＶが存在することを示す免疫学的複合体の形成が、イムノアッセイにより検出される。このようなアッセイとしては、ラジオイムノアッセイ、ウエスタンブロットアッセイ、免疫蛍光アッセイ、酵素イムノアッセイ、化学発光アッセイ、免疫組織化学的アッセイ等が挙げられるが、これらに限定されない。この場合、抗体に直接的または間接的に接合される検出可能な化合物または組成物に関連して、本明細書中で用いられる「標識」とは、診断目的で用いられ得る。標識はそれ自体検出可能であり（例えば放射性同位元素標識または蛍光標識）、または酵素を標識した場合に、検出可能である基質化合物または組成物の化学的変化を触媒し得る。
【００２９】
免疫療法および免疫予防法はウイルス中和抗体を基礎にしているので、本発明の抗体は、好ましくは中和抗体、さらに好ましくは異なる遺伝子型に属するＨＣＶ単離物由来のＥ２抗原と免疫反応性を有する中和抗体である。中和活性を有する所定の抗体の能力を評価するために用いることができるインビトロアッセイが当該技術分野でいくつか既知である。例えば本発明に係るモノクローナル抗体によるＣＤ８１とＥ２の結合の阻害は（表３参照）、インビトロでの潜在的な中和活性の指標となる。さらに、実施例６に記載されたような結合の中和（ＮＯＢ）アッセイは、ＨＣＶ中和抗体を評価するために、かつヒト細胞とのＨＣＶの結合の阻害を評価するために用いられ得る。図２は、ＨＣＶ＃４モノクローナル抗体および実験的ＮＯＢ陽性対照のすべてが、細胞とＨＣＶの結合を阻害するというＮＯＢアッセイの結果を示す。
【００３０】
したがって本発明は、予防目的または治療目的のための薬学的組成物として本発明の抗体を使用することにも関する。従って、このような組成物は免疫予防または免疫療法薬として用いられる。
【００３１】
予防的に供給される場合、本発明の医薬組成物（１つまたは複数）は、任意の１つまたは複数のＨＣＶ株に任意に曝露する前に、またはウイルスの感染に起因する任意の症状が表れる前に提供される。本発明の医薬組成物（単数または複数）を予防的投与することは、哺乳類におけるこれらのウイルスの任意のその後の感染を防止するか、または弱めるのに役立つ。治療的に使用するためには、本発明の医薬組成物（単数または複数）は、感染した時（または感染した直後）に、あるいは感染の任意の症状、またはこれらのウイルスにより引き起こされる任意の疾患もしくは有害作用が表れた時に提供される。医薬組成物（単数または複数）の治療的投与は、感染または疾患を弱めるのに役立つ。したがって、本発明の医薬組成物（単数または複数）は、Ｃ型肝炎ウイルスへ曝露されると予想されるときに前もって、または感染した後に提供することができる。
【００３２】
あるいは、組換え抗体をコードする遺伝子は、哺乳類細胞中へ遺伝子を移入するために開発された多数のウイルスベースの系を用いて、発現または同時発現するために適当な哺乳類宿主細胞中に導入され得る。例えばレトロウイルスは、遺伝子送達系のための便利な手段を提供する。一本鎖ＶＨまたはＶＬドメインポリペプチドをコードする選択ヌクレオチド配列は、当該技術分野で既知の技法を用いて、ベクター中に挿入され、かつレトロウイルス粒子中にパッケージングされ得る（Ｍａｒａｓｃｏ ｅｔ ａｌ． （１９９９） Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈ． ２３１： ２２３−２３８）。次に組換えウイルスが単離され、被験体に送達され得る。多数の適切なレトロウイルス系が記載されている（米国特許第５，２１９，７４０号；Ｍｉｌｌｅｒ （１９９０） Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ， １：５−１４； Ｓｃａｒｐａ ｅｔ ａｌ （１９９１） Ｖｉｒｏｌｏｇｙ， １８０： ８４９−５２； Ｂｕｒｎｓ ｅｔ ａｌ． （１９９３） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ９０：８０３３−７；およびＢｏｒｉｓ−Ｌａｗｒｉｅ ａｎｄ Ｔｅｍｉｎ （１９９３） Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｇｅｎｅｔ． Ｄｅｖｅｌｏｐ．， ３： １０２−９）。さらに、アデノウイルス、ヘルペスまたはワクシニアウイルス由来の発現ベクター、あるいは種々の細菌プラスミド由来の発現ベクターは、標的器官、標的組織、または標的細胞集団へヌクレオチド配列を送達するために用いられ得る。当業者に周知の方法を、１つまたは複数の組換え抗体をコードする配列を適当な転写調節要素および翻訳調節要素とともに含む発現ベクターを構築するために用いることができる。これらの方法としては、インビトロ組換えＤＮＡ技法、合成技法、ならびにインビボ遺伝子組換えが挙げられる。このような技法は、Ｊ． Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， １９８９， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ， Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ， ＮＹ、およびＦ．Ｍ． Ａｕｓｕｂｅｌ， ｅｔ ａｌ．， １９８９， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ＮＹに記載されている。
【００３３】
活性成分として、１つまたは複数の抗体、抗体断片、ｓＦｖ分子、またはそれらの組合せを含む医薬組成物の調製は、当業者に一般的に知られている。通常、このような組成物は注射することができる形態（例えば液体溶液または懸濁液、あるいは注射前に溶液または溶液中の懸濁液とするのに適した固体形態）として調製される。当該組成物は一般に、例えば水、食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノール等の１つまたは複数の「薬学的に許容可能な賦形剤またはビヒクル」、およびそれらの組合せも含む。さらに、例えば湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝物質等の少量の補助物質がこのようなビヒクル中に存在していてもよい。
【００３４】
個々の患者にとって治療的に有効なモノクローナル抗体の量は、副作用を最小限に抑えながら、治療または予防効果が得られるように、個体に投与される抗体の量を滴定することにより確定することができる。送達される組成物の量は、治療される被験体、被験体自体の免疫応答を高める被験体の免疫系の能力、および保護したい程度に依存する。必要とされる正確な量は、特に、治療される個体の年齢および一般的状態、治療される症状の重篤度、および選択された特定の抗ＨＣＶ薬およびその投与方式などによって変わる。当業者は、適切な有効量を容易に確定することができる。したがって、組成物の「治療上の有効量」は、ＨＣＶ疾患症状の治療または予防をもたらすのに十分である量であればよい。有効量は、組成物を投与した後に、ＨＣＶの量を測定することにより確定され得る。ＨＣＶのレベルは、当該技術分野で既知の、例えばＲＴ−ＰＣＲなどのインビトロアッセイにより測定され得る。治療を受けている個体に関する抗体の血漿濃度は、通常０．１μｇ／ｍｌ〜１００μｇ／ｍｌである。概して、哺乳類の体重１ｋｇ当たり約５ｍｇ〜約２０ｍｇの範囲である投与量の抗体をレシピエントに提供するのが望ましいが、それより低い用量または高い用量を投与してもよい。さらに接種物は、通常約１μｇ〜約５０ｍｇ／接種（用量）、好ましくは約１０μｇ〜約１０ｍｇ／用量、最も好ましくは約１００μｇ〜約５ｍｇ／用量の濃度のペプチドを含む。
【００３５】
本発明のモノクローナル抗体は、例えば静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、経皮等（これらに限定されない）を含むいくつかの経路のうちの１つにより投与され得る。さらに薬学的組成物は、単回または多数回投与スケジュールでの免疫予防薬として、あるいは多数回投与または連続投与スケジュールでの免疫治療法として投与され得る。多数回投与スケジュールとは、主な治療コースが１回以上の別個の投与、好ましくは１〜１０回の投与で、その後は、必要に応じて一定の間隔でさらに投与され、それにより組成物の作用を保持または強化し得るスケジュールである。したがって、投薬レジメンは、少なくとも一部は、治療される被験体の特定の必要性に基づいても決定され、そして投与医の判断によっている。
【００３６】
したがって本発明は、ＨＣＶ感染の受動免疫療法における本発明の中和モノクローナル抗体の使用にも関する。無傷な免疫グロブリン分子を含む抗体、実質的に無傷な免疫グロブリン分子および免疫グロブリン分子の一部分ならびにそのキメラ抗体分子のほかに、抗体分子の免疫学的結合特性を示し得る抗原結合部位を含む、当該技術分野で既知であるいくつかの治療的に有用な分子が存在する。このような分子の１つが、無傷抗原結合部位を含むヘテロダイマーからなるＦａｂ分子である。酵素ペプシンは、ＩｇＧを、いくつかの断片（例えば２つの抗原結合部位を含む「Ｆ（ａｂ）２」断片）に切断し得る。「Ｆｖ」断片は、ＩｇＭ免疫グロブリン分子の、そして時としてはＩｇＧまたはＩｇＡ免疫グロブリン分子の選択的タンパク質分解切断により生産され得る。しかしながら、Ｆｖ断片は、より一般的には、当該技術分野で既知の組換え技法を用いて得ることができる。Ｆｖ断片としては、例えば自然抗体分子の抗原認識および結合能力の多くを有する抗原結合部位を含む非共有結合ＶＨ：：ＶＬヘテロダイマー（Ｉｎｂａｒ ｅｔ ａｌ． （１９７２） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ６９：２６５９−６２； Ｈｏｃｈｍａｎ ｅｔ ａｌ． （１９７６） Ｂｉｏｃｈｅｍ．， １５：２７０６−１０；およびＥｈｒｌｉｃｈ ｅｔ ａｌ．， （１９８０） Ｂｉｏｃｈｅｍ．， １９：４０９１−６参照）が挙げられる。受動免疫療法に用いられる場合、患者は、治療的に有効量の１つまたは複数の中和ヒトモノクローナル抗体を投与される。本発明の受動免疫療法は、ＨＣＶに感染した個体、またはＨＣＶ感染の危険に直面している個体に実施され得る。
【００３７】
したがって本発明は、本発明の抗体、およびファージディスプレイライブラリー由来の付加的抗体からなる群の少なくとも１つの抗体、ならびに薬学的に許容可能な担体を含む医薬組成物に関するが、このような担体としては、生理学的に許容可能な緩衝剤、例えば生理食塩水またはリン酸塩緩衝生理食塩水が挙げられる。
【００３８】
本発明はさらに、本発明のモノクローナル抗体に対する抗イディオタイプ抗体に関する。一実施形態では、抗イディオタイプ抗体は、当業者に既知の方法により、本発明のモノクローナル抗体で宿主動物を免疫化することにより調製することができる。Ｆｃ領域に対する免疫学的応答を排除するために、宿主動物と同一種により生産された抗体を用いてもよく、または投与抗体のＦｃ領域を除去してもよい。医薬組成物の調製においては、本発明のモノクローナル抗体を用いるよりもむしろ、産生された抗イディオタイプ抗体が用いられ得る。
【００３９】
本発明の抗体および／またはファージディスプレイライブラリーから得られた抗体は、キットの形態で、単独で、または医薬組成物の形態で供給され得る。
【００４０】
本発明の実施においては、別記しない限り、当該技術分野の技術内のウイルス学、微生物学、分子生物学および組換えＤＮＡ技法の従来の方法を用いる。このような技法は、文献中で十分に説明されている（例えばＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，（２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ， １９８９）； ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ， ｖｏｌ． Ｉ ＆ ＩＩ（Ｄ． Ｇｌｏｖｅｒ， ｅｄ．）； Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ， （Ｎ． Ｇａｉｔ， ｅｄ．， １９８４）； Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ， （Ｂ． Ｈａｍｅｓ ＆ Ｓ． Ｈｉｇｇｉｎｓ， ｅｄｓ．， １９８５）； Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ， （Ｂ． Ｈａｍｅｓ ＆ Ｓ． Ｈｉｇｇｉｎｓ， ｅｄｓ．， １９８４）； Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ， （Ｒ． Ｆｒｅｓｈｎｅｙ， ｅｄ． １９８６）； Ｐｅｒｂａｌ， Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， （１９８４）； Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ， ２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ， ｖｏｌ． Ｉ ＆ ＩＩ（Ｂ．Ｎ． Ｆｉｅｌｄｓ ａｎｄ Ｄ．Ｍ． Ｋｎｉｐｅ， ｅｄｓ．）参照）。
【００４１】
ここで実施例により本発明を説明するが、実施例は例示のためであって、本発明の範囲を限定するものではない。
【００４２】
実施例
本明細書中の実施例は、本発明を実施する種々の態様を例示するものであり、いかなるようにも本発明の範囲を限定するよう意図されない。実施例には、例えばベクターの構築、このようなベクター中へのｃＤＮＡの挿入、あるいはその結果生じるベクターを適当な宿主中へ導入することなど、用いられた従来の方法に関する詳細な説明は含まれない。このような方法は当業者に周知であり、多数の出版物中に、例えばＳａｍｂｒｏｏｋ， Ｆｒｉｔｓｃｈ， ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， ＵＳＡ， （１９８９）に記載されている。
【００４３】
実施例１
ドナー
ＨＣＶに慢性感染している無症候性患者である患者Ｈから、骨髄を吸引した。骨髄リンパ球および形質細胞をフィコール比重遠心法で分離し、１０％ジメチルスルホキシド、１０％ウシ胎児血清、およびＲＰＭＩ１６４０培地（Ｂｉｏ Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ； Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ， ＭＤ）中の生育可能単一細胞懸濁液として液体窒素中で保存した。
【００４４】
実施例２
γ１／κ抗体ファージライブラリーの構築
全ＲＮＡを〜１０８の骨髄リンパ球および形質細胞（ＲＮＡ単離キット；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）から抽出し、オリゴ（ｄＴ）プライマー（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ， Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ， ＭＤ）を用いてｍＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写した。ｒＴｔｈＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ； Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ， ＭＤ）を用いてＰＣＲにより、ｃＤＮＡを増幅した。「９４℃で１５秒、５２℃で５０秒、および６８℃で９０秒」のサイクルを３０サイクル実施した。ヒトκ鎖遺伝子に特異的なプライマーを用いて、患者κ鎖遺伝子を増幅した。遺伝子の５’末端を認識する９つのファミリー特異的ヒトＶＨプライマーを用いて、ヒトγ１鎖遺伝子のＦｄセグメント（可変および一次定常ドメイン）を増幅した（Ｂａｒｂａｓ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８８：７９７８−８２， １９９１； Ｐｅｒｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８８：２４３２−６， １９９１）。
【００４５】
Ｗｉｌｌｉａｍｓｏｎ等（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ９０： ４１４１−５， １９９３； ｅｒｒａｔｕｍ Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ９１：１１９３， １９９３）による記載に従って、ｐＣｏｍｂ３Ｈファージディスプレイベクター中に増幅κ鎖をクローニングした。ＰＣＲ産物の３’末端でｒＴｔｈＤＮＡポリメラーゼにより付加された付加的アデノシンヌクレオチドにより、ｐＧＥＭ−Ｔクローニングベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ； Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩ）中に増幅γ１鎖をクローニングした。Ｇｌａｍａｎｎ等（Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．， ７２： ５８５−９２，１９９８）の記載に従って、γ１−ｐＧＥＭ−Ｔクローンはエシェリヒア・コリＸＬ−１Ｂｌｕｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ； Ｌａ Ｊｏｌｌａ， ＣＡ）中に形質転換され、固相増幅により２リットルの容積に拡張させた。γ１−ｐＧＥＭ−ＴライブラリーをＸｈｏＩおよびＳｐｅＩ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ； Ｎｕｔｌｅｙ， ＮＪ）で消化し、ＸｈｏＩおよびＳｐｅＩで消化されたκ鎖ｐＣｏｍｂ３Ｈライブラリーに連結した。連結産物はエシェリヒア・コリＸＬ−１Ｂｌｕｅ中に形質転換された。固相増幅により、形質転換体を２リットルの容積に拡張させた。１．９×１０７クローンの最終ライブラリーを、使用するまで、１２．５％グリセロール−ＬＢブロス中に−８０℃で保存した。
【００４６】
すべてのパニング実験および固相酵素免疫検定法（ＥＬＩＳＡ）において、ＣＨＯ細胞中で発現された組換え可溶性切断型（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）Ｅ２タンパク質（Ｌｅｓｎｉｅｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｍｅｄ． Ｖｉｒｏｌ．， ４５： ４１５−２２， １９９５）を５０ｍＭの炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．６）中に１μｇ／ｍｌに希釈し、４℃で一晩、ＥＩＡ／ＲＩＡ  Ａ／２プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｃｏｓｔａｒ； Ａｃｔｏｎ， ＭＡ）に吸着させた。ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）特異的抗体（Ｐｉｅｒｃｅ； Ｒｏｃｋｆｏｒｄ， ＩＬ）を用いて、Ｆａｂを検出した。これを、上記のような５０ｍＭ炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．６）中で１：１０００に希釈して、マイクロタイターウェルに被覆した。
【００４７】
Ｂａｒｂａｓ等（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８８：７９７８−８２， １９９１）およびＷｉｌｌｉａｍｓｏｎ等（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ９０： ４１４１−５， １９９３； ｅｒｒａｔｕｍ Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ９１：１１９３， １９９３）による以前の記載に従って、コンビナトリアルライブラリースクリーニングを実施した。アンピシリン１００μｇ／ｍｌおよび１％（ｖ／ｖ）グルコース（Ｓｉｇｍａ； Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ）を補充したＬｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）ブロス（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ， Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ， ＭＤ）中に、ライブラリーストックからの約１０９個の細菌を接種し、増幅し、次に５０の感染多重度でヘルパーファージＶＣＳ  Ｍ１３（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ； Ｌａ Ｊｏｌｌａ， ＣＡ）で感染させて、ファージ粒子の表面に提示されるライブラリーを作製した。ファージをＨＣＶ  Ｅ２被覆ＥＬＩＳＡウェル上でパニングした。すべてにおいて、３回のパニングを実施した。選定ライブラリーの増幅後、ファージミドＤＮＡを抽出し、制限酵素消化によりベクターを修飾して、ファージのバクテリオファージコートタンパク質ＩＩＩコード領域を除去した（Ｂｅｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ． Ｈｕｍ． Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ， ４：７４−９， １９９３）。ファージミドＤＮＡは再連結され、エシェリヒア・コリＸＬ−１Ｂｌｕｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）中に形質転換され、可溶性Ｆａｂを生産した。コロニーを、マイクロタイタープレートの各ウェル中のＬＢブロス中に接種して、３０℃で一晩インキュベートした。Ｇｌａｍａｎｎ等（Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．， ７２： ５８５−９２， １９９８）に従って、Ｆａｂ産生を誘導し、Ｅ２との反応性に関して、ならびにＦａｂの存在に関して、ＥＬＩＳＡにより細菌上清を試験した。
【００４８】
実施例３
ＦＡＢ産生およびＦＡＢ特異性の分析
Ｇｌａｍａｎｎ等（Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．， ７２： ５８５−９２， １９９８）の記載に従って、細菌培養およびＦａｂ断片精製を実施した。色素結合アッセイ（ＢｉｏＲａｄ； Ｈｅｒｃｕｌｅｓ， ＣＡ）およびＡ２８０ｎｍ（１．０ｍｇ／ｍｌと等価の１．４光学濃度単位の吸光係数を用いて）の両方により、タンパク質濃度を求めた。Ｆａｂ純度は、コロイドクーマシーブルー染色（Ｓｉｇｍａ）を用いてポリアクリルアミドゲル電気泳動により求めた。精製Ｆａｂを、製造業者のプロトコール（Ｐｉｅｒｃｅ）に従って、重炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．０）で希釈し、４℃でビオチン化した。ビオチン化した後、Ｆａｂをリン酸塩緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に対して４℃で一晩透析し、必要な場合には、濃縮器Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ−３０（Ａｍｉｃｏｎ／Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ； Ｂｅｄｆｏｒｄ， ＭＡ）で濃縮した。
【００４９】
タンパク質抗原でＥＬＩＳＡマイクロタイタープレートを被覆することにより、ＥＬＩＳＡ分析を実施した。具体的には、１μｇ／ｍｌのタンパク質抗原ＨＣＶ  Ｅ２および１０μｇ／ｍｌの非特異的タンパク質（例えば、チログロブリン、リゾチーム、グリセルアルデヒド−３−ホスフェート、ニワトリアルブミン、およびシトクロムＣ（Ｓｉｇｍａ））を用いて、マイクロタイタープレートを被覆した。抗原で被覆したウェルを、３％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）−ＰＢＳを用いて室温で１時間遮断し、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０（０．０５％（ｖ／ｖ））で２回洗浄し、５０μｌの粗製Ｆａｂをウェルに添加した。３７℃で１時間のインキュベーション後、プレートをＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０で４回洗浄した。結合Ｆａｂを、ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｆａｂ特異的）アルカリ性ホスファターゼ標識二次抗体（Ｓｉｇｍａ）の１：５０００希釈液で検出した。ジエタノールアミン緩衝液（Ｐｉｅｒｃｅ）中の１ｍｇ／ｍｌのｐ−ニトロフェニルホスフェート（Ｓｉｇｍａ）を用いて、アッセイ色を発色させた。６５０ｎｍの波長を参照して、４０５ｎｍでの光学濃度を確定した。
【００５０】
実施例４
ＨＣＶ特異的ＦＡＢクローンの核酸シーケンシング、分析、およびＢＳＴ  Ｎ１フィンガープリンティング
以下のシーケンシングプライマー：重鎖５’−ＡＴＴＧＣＣＴＡＣＧＧＣＡＧＣＣＧＣＴＧＧ−３’（ＨＣ１；配列番号６）および５’−ＧＧＡＡＧＴＡＧＴＣＣＴＴＧＡＣＣＡＧＧＣ−３’（ＨＣ４；配列番号７）；κ鎖５’−ＡＣＡＧＣＴＡＴＣＧＣＧＡＴＴＧＣＡＧＴＧ−３’（ＬＣ１；配列番号８）および５’−ＣＡＣＣＴＧＡＴＣＣＴＣＡＧＡＴＧＧＣＧＧ−３’（ＬＣ４；配列番号９）とともに、Ａｍｐｌｉ−ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ； Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ， ＭＤ）を用いることにより、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  Ｄｙｅターミネーターサイクルシーケンシングレディー反応キットで、核酸シーケンシングを実施した（Ｇｌａｍａｎｎ ｅｔ ａｌ． Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．， ７２： ５８５−９２， １９９８）。その結果生じた配列を、ＳｅｑｕｅｎｃｈｅｒおよびＭａｃ  Ｖｅｃｔｏｒ（Ｏｘｆｏｒｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｒｏｕｐ）ソフトウェアパッケージで分析した。全利用可能ヒト可変セグメントＩｇ生殖系配列をまとめたものであるＶ−ＢＡＳＥプログラムで、配列類似性を検索した（Ｃｏｏｋ ｅｔ ａｌ． Ｉｍｍｎｏｌ． Ｔｏｄａｙ， １６： ２３７：４２， １９９５）。すべての既知のヒト免疫グロブリン遺伝子の配列類似性を検索した結果を、表１に要約する。Ｂｓｔ  Ｎ１（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ； Ｂｅｖｅｒｌｙ， ＭＡ）フィンガープリンティングするために、プラスミドＤＮＡ１μｇを１Ｕの酵素で、６０℃で一晩、消化した。制限消化物を、３％アガロースゲル上で分析した。ヒトγ１重鎖を高頻度に切断する制限酵素Ｂｓｔ  Ｎ１を用いて、Ｆａｂクローンの種々の重鎖配列に関してスクリーニングした（Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， ２２２： ５８１−９７， １９９１）。配列分析によりＢｓｔ  Ｎ１消化物の結果を確かめたが、５つの特有のγ１重鎖のみを、ＨＣＶ＃１、ＨＣＶ＃４、ＨＣＶ＃７、ＨＣＶ＃１２およびＨＣＶ＃１３と同定した（図１）。
【００５１】
すべての既知のヒト免疫グロブリン遺伝子の配列類似性を検索することにより、特定の生殖系起源の５つのモノクローナル抗体を評価した。２つのγ１重鎖配列（ＨＣＶ＃１およびＨＣＶ＃１３）はヒトＶＨ４ファミリーの生殖細胞系セグメントと最も高い相同性を示したが、一方、他の３つのγ１重鎖配列（ＨＣＶ＃４、ＨＣＶ＃７、およびＨＣＶ＃１２）は、ヒトＶＨ１ファミリーの生殖系セグメントと最も高い相同性を示した（表１）。κ−軽鎖配列は、ヒトＶκファミリーの生殖系セグメントと様々な相同性を示した。
【００５２】
【表１】
2004524829.tif 000002
【００５３】
実施例５
ＨＣＶモノクローナル抗体の親和性の決定
競合阻害ＥＬＩＳＡにより、モノクローナル抗体の親和性（平衡解離定数Ｋｄ）を決定した（Ｐｅｒｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８８： ２４３２−６， １９９１； Ｒａｔｈ ｅｔ ａｌ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈ．， １０６： ２４５−９， １９８８）。簡単に述べると、Ｆａｂのｌｏｇ１０希釈液をＥ２被覆ウェル上で滴定し、Ｆａｂ濃度を１０分の１に低減することにより、Ｆａｂの結合が実質的に減少した希釈液を、競合ＥＬＩＳＡに用いた。次にこの濃度のＦａｂを３７℃で２時間インキュベートすると、Ｅ２被覆ウェル中で、溶液中のＥ２の濃度のｌｏｇ１０が減少した。プレートをＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ−２０で４回洗浄し、抗ヒトＩｇＧ（Ｆａｂ特異的）アルカリ性ホスファターゼ標識二次抗体（Ｓｉｇｍａ）の１：５０００希釈液を用いて、結合Ｆａｂを検出した。Ａ４０５ｎｍ値の減少％をプロットし、５０％阻害（Ｉ５０）値を推定した。Ｉ５０値でのＥ２の濃度は、抗原に対する抗体の親和性（Ｋｄ）を表す。
【００５４】
５つのＨＣＶクローンすべてに関して親和性を測定したが、ＨＣＶ＃１２は決定できなかった（表２）。配座エピトープを認識するＨＣＶ  Ｅ２特異的モノクローナル抗体は、可溶性Ｅ２タンパク質に対する親和性（１．６〜４０．５ｎＭ）を示した。４つのクローンに関するＫｄ値を決定したが、ＨＣＶ＃１２のＫｄ値はおそらくはアッセイに関する感受性の下限値（＜１０７Ｍ）未満であるために、決定不可能であったと考えられる。ＨＣＶ＃４およびＨＣＶ＃７モノクローナル抗体は、それぞれ１．６および３．５ｎＭの高平衡解離定数（Ｋｄ）を有した。
【００５５】
【表２】
2004524829.tif 000003
【００５６】
実施例６
ＨＣＶモノクローナル抗体によるＣＤ８１との組換えＥ２タンパク質の結合の中和
可溶性Ｅ２タンパク質と推定細胞受容体ＣＤ８１との間の結合の阻害を測定した。ＣＤ８１−Ｅ２相互作用の遮断を分析するために、Ｆｏｒｎｓ等（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ， ２７４： ７５−８５， ２０００）により記載されたアッセイを実施した。負の対照として用いられる無関係なＦａｂＨＥＶ＃３１（Ｓｃｈｏｆｉｅｌｄ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．， ７４： ５５４８−５５， ２０００）、および正の対照としてのＨ７９血清（一次ＨＣＶ感染の開始後２年目の患者Ｈからの血漿）を用いて、ＣＤ８１−Ｅ２相互作用を遮断する能力に関して、Ｆａｂを力価測定した。ＥＬＩＳＡフォーマットでの組換え可溶性Ｅ２と組換えＣＤ８１−チオレドキシン融合タンパク質の結合を遮断する能力に関して、モノクローナル抗体を力価測定した。モノクローナル抗体ＨＣＶ＃４およびＨＣＶ＃７はともに、ＣＤ８１−Ｅ２結合を効率的に阻害した（それぞれ２．４および１．９μｇ／ｍｌ）（要約に関しては表３参照）。
【００５７】
【表３】
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【００５８】
実施例７
ＨＣＶ−モノクローナル抗体相互作用の遮断および阻害
感受性ヒトＴ細胞系ＨＰＢＭａ１０−２にＨＣＶウイルス粒子が付着するのを、Ｓｈｉｍｉｚｕ等（Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．， ６８： １４９４−１５００， １９９４）により確立された方法により、本発明のＨＣＶモノクローナル抗体のうちの２つによって阻害した。簡単に述べると、抗体および患者Ｈからのウイルス接種物（１０３．５５０％チンパンジー感染用量／ｍｌでのＨ７７）を一緒に、４℃で一晩インキュベートした。次に、この抗体−ウイルス混合物を、３×１０５個の細胞の懸濁液１ｍｌに添加し、３７℃で２時間インキュベートした。ＰＢＳで２回洗浄後、ＲＮＡ抽出を実施した後、ＲＴ−ＰＣＲ処理を施して、細胞関連ＨＣＶゲノムを検出した（Ｓｈｉｍｉｚｕ ｅｔ ａｌ． （１９９４） Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．， ６８： １４９４−１５００）。
【００５９】
ＨＣＶ  Ｅ２特異的モノクローナル抗体、抗ＨＶＲ１（超可変領域１）ウサギ過免疫（８６Ｉ、８７Ｉ）または前免疫血清（８７Ｐ）、およびウイルス（１０３．５５０％チンパンジー感染用量／ｍｌでのＨ７７）を一緒に、４℃で一晩インキュベートした。次にこの抗体−ウイルス混合物を、３×１０５個のＨＰＢＭａ１０−２細胞（感受性ヒトＴ細胞系、Ｓｈｉｍｉｚｕ ｅｔ ａｌ． Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．，１９９４）の懸濁液１ｍｌに添加した。モノクローナル抗体が、連続ヒトＴ細胞系へのウイルス付着を阻害する能力を、ＲＴ−ＰＣＲにより決定した。ＲＴ−ＰＣＲデータの例を、図２に示す。５つのＭＡｂすべてに関する予備データの要約を、図２の表に示す。
【００６０】
実施例８
ＨＣＶ遺伝子型間の抗Ｅ２の交差反応性
これらのモノクローナル抗体により認識されるエピトープがＨＣＶ遺伝子型間においてどの程度広範に保存されているかを決定するために、免疫蛍光アッセイを実施した。特に、遺伝子型１ａ、１ｂ、２ａ、３ａ、４ａ、５ａ、および６ａ由来の完全な細胞内形態のＥ２を発現するプラスミドを構築した。それぞれのプラスミドを用いてトランスフェクトさせたＨｕｈ−７細胞の免疫蛍光染色により、種々の遺伝子型のＨＣＶ  Ｅ２と５つのモノクローナル抗体との反応性を決定した。Ｅ２構築物はすべて、Ｅ１のＣ末端由来の２０個のアミノ酸、およびＥ２およびｐ７の両方の完全なアミノ酸配列を含んでいた。遺伝子型１ａ構築物ｐＥ２−１ａは、Ｆｏｒｎｓ等（Ｖａｃｃｉｎｅ， １７： １９９２−２００２， １９９９）によりすでに記載されている。遺伝子型１ｂ（ｐＥ２−１ｂ）および遺伝子型２ａ（ｐＥ２−２ａ）構築物は、完全長コンセンサス感染性ｃＤＮＡクローンｐＪ４Ｌ６ＳＦ（遺伝子型１ｂ；Ｙａｎａｇｉ ｅｔ ａｌ． Ｖｉｒｏｌｏｇｙ， ２４４： １６１−７２， １９９８）およびｐＪ６ＣＦ（遺伝子型２ａ；Ｙａｎａｇｉ ｅｔ ａｌ． Ｖｉｒｏｌｏｇｙ， ２６２： ２５０−６３， １９９９）から調製した。遺伝子型３ａ、４ａ、５ａ、および６ａ構築物は、感染性血清攻撃プール（ｃｈａｌｌｅｎｇｅ ｐｏｏｌｓ）（Ｂｕｋｈ ｅｔ ａｌ． Ｊ． ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓ， １７８： １１９３−１１９７， １９９８； Ｂｕｋｈ ｅｔ ａｌ． Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ， ４４： １３２−１４２， ２００１）から調製した。
【００６１】
８のチャンバを有する顕微鏡スライド中にある、ほぼ集密的Ｈｕｈ−７細胞を、リポフェクタミン２０００トランスフェクション試薬（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）を用いて、製造業者のプロトコールに従って、１チャンバ当り１μｇのＤＮＡでトランスフェクトした。３７℃で４８時間インキュベートした後、細胞を固定し、氷冷アセトンで透過性にした。モノクローナル抗体を５％ＢＳＡ−ＰＢＳ中で１：１０に希釈し、かつＨ７９を５％ＢＳＡ−ＰＢＳ中で１：１００に希釈した。スライドを簡単に風乾し、次に一次抗体を添加して、加湿チャンバ中において室温で４０分間インキュベートした。それぞれのスライドをＰＢＳ中で１５分間３回洗浄した後、１：１００で希釈した抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）ＦＩＴＣ（Ｐｉｅｒｃｅ）二次抗体を添加した。暗所において室温で３０分間インキュベートした後、スライドを再び洗浄した後、蛍光顕微鏡により調査した。表４は、交差遺伝子型反応性アッセイの結果を要約するが、ＨＣＶ＃１２以外のモノクローナル抗体はすべて、ＨＣＶ  Ｅ２遺伝子型１ａおよび１ｂとの交差反応性を示した。ＨＣＶ＃４は、６つすべての主要ＨＣＶ遺伝子型（１ａ〜６ａ）由来のＥ２との交差反応性を示した。ＨＣＶ＃１およびＨＣＶ＃１３は、遺伝子型４ａ由来のＥ２との交差反応性を示した。ＨＣＶ＃７も、遺伝子型３ａ、４ａ、および５ａ由来のＥ２と交差反応をした。Ｅ２の超可変領域（ＨＶＲ１）を有さない、表面発現されたＥ２６６１△ＨＶＲ１（遺伝子型１ａ）が正の対照として用いられ、すべてのモノクローナル抗体により認識された。したがって、本発明のモノクローナル抗体はすべて、Ｅ２タンパク質のＨＶＲ１中のエピトープに対して誘導される抗体ではない。
【００６２】
【表４】
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【００６３】
実施例９
間接的競合ＥＬＩＳＡによるエピトープマッピング
間接的競合アッセイは、Ｅ２タンパク質上の５つのＭＡｂにより認識されるエピトープの相対的トポロジーを決定するために実施されるものである（図３）。競合モノクローナル抗体をＥ２被覆ウェル上で力価測定し、適切な希釈率を決定して、Ａ４０５ｎｍで、かつプレートに被覆された抗原を飽和しない濃度で、約１．０のＯ．Ｄ．読取値を得た。競合アッセイのために、非標識モノクローナル抗体の３倍希釈液をＥ２被覆ウェル中において３７℃で１時間インキュベートし、次にＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ−２０で４回洗浄した。競合モノクローナル抗体（ビオチン化チンパンジーＦａｂまたはマウスＩｇＧ）の単一希釈液を、すべてのウェル中において３７℃で１時間インキュベートした。ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ−２０で４回洗浄後、競合体モノクローナル抗体の結合を、抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ鎖特異的）アルカリホスファターゼ接合抗体（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いて、またはストレプトアビジン−アルカリホスファターゼ（Ｐｉｅｒｃｅ）の添加により検出した。上記と同様に発色させた。可溶性Ｅ２との結合に関する互いの競合に基づいて、ＭＡｂを２つの群に分けた：（１）ＨＣＶ＃４およびＨＣＶ＃７；ならびに（２）ＨＣＶ＃１、ＨＣＶ＃１２、およびＨＣＶ＃１３。したがって、ＭＡｂは、Ｅ２糖タンパク質上のエピトープのうち少なくとも２つの異なるエピトープに対して誘導されると思われる。
【００６４】
実施例１０
チンパンジーにおけるインビボモニタリングによるＨＣＶのインビトロ中和の測定
５０％チンパンジー感染性用量（ＣＩＤ５０）の６４倍のＨＣＶ（Ｈ７７株）を、ＨＣＶに対するヒトモノクローナル抗体の混合物とともに、４℃で一晩インキュベートする。翌朝、混合物をナイーブチンパンジーに静脈内接種する。肝炎の生化学的証拠（例えばＡＬＴ、ＩＣＤ、ＧＧＴＰ）、感染のウイルス学的証拠（例えばウイルス血症のＲＴ−ＰＣＲ）およびＨＣＶに対する抗体の血清学的証拠に関して、チンパンジーを毎週追跡調査する。チンパンジーが１ヶ月間、ＨＣＶ感染の証拠を示さないままである場合には、モノクローナル抗体のオリジナルプールのサブセットを用いて実験を反復する。チンパンジーが感染するまで、モノクローナル抗体の異なるサブセットを用いて、この手順を反復する。必要な場合には、モノクローナル抗体が中和させているか否かを正確に確定するために、さらに別のチンパンジーに接種する。すべてのモノクローナル抗体が中和させていることを確認した場合は、チンパンジーの感受性に関する正の対照として、他のウイルスに対して向けられるモノクローナル抗体を用いて、当該手順を反復する。
【００６５】
実施例１１
チンパンジーにおけるＨＣＶに対する受動免疫予防法
１つまたは複数の中和ＨＣＶモノクローナル抗体を、ナイーブチンパンジーに静脈内注入する。次に、６４ＣＩＤ５０のＨＣＶを用いてチンパンジーをチャレンジする。肝炎の生化学的証拠（例えばＡＬＴ、ＩＣＤ、ＧＧＴＰ）、感染のウイルス学的証拠（例えばウイルス血症のＲＴ−ＰＣＲ）、およびＨＣＶに対する抗体の血清学的証拠に関して、６ヶ月間チンパンジーを毎週追跡調査する。チンパンジーがＨＣＶ感染をしないままである場合には、受動免疫予防法が成功したとみなした。
【００６６】
実施例１２
チンパンジーにおける慢性ＨＣＶ感染に対する受動免疫療法
１つまたは複数の中和ＨＣＶモノクローナル抗体を、ＨＣＶに慢性的に感染しているチンパンジーに静脈内注入する。肝炎の生化学的証拠（例えばＡＬＴ、ＩＣＤ、ＧＧＴＰ）、感染のウイルス学的証拠（例えばウイルス血症のＲＴ−ＰＣＲ）、およびＨＣＶに対する抗体の血清学的証拠に関して、チンパンジーにおけるＨＣＶ感染の経過を毎週調査する。複製レベルの変化が認められない場合、注入する抗体の用量を増大させる。臨床的応答（ＰＣＲにより測定した場合の、血中のウイルスゲノムの力価の減少）が検出された場合、モノクローナル抗体の用量を調整して、その下限有効力価を決定する。一定間隔で当該容量をチンパンジーに投与して、受動免疫療法により恒久的に感染が除去され得るか否かを決定する。
【図面の簡単な説明】
【図１】
ＨＣＶ＃１（配列番号１）、ＨＣＶ＃４（配列番号２）、ＨＣＶ＃７（配列番号３）、ＨＣＶ＃１２（配列番号４）、ＨＣＶ＃１３（配列番号５）で示される、５つのＥ２特異的モノクローナル抗体のγ１鎖のＦＲおよびＣＤＲのアミノ酸配列を示す。ここで、ＦＲはフレームワーク領域を意味し、ＣＤＲは相補性決定領域を意味する。
【図２】
ＨＣＶ感染に感受性を有するヒトＴ細胞系であるＨＰＢＭａ１０−２細胞に、患者Ｈ（Ｈ７７）由来のウイルス接種物が吸着するのを阻害したことを示す、結合の中和（ＮＯＢ）吸着阻害アッセイの結果を示す。ＨＣＶ＃４は細胞関連ウイルスの力価を減少したが、ＨＣＶ＃７に関するＰＣＲ力価の減少は認められなかった。したがって、ＨＣＶ＃４は、ＨＰＢＭａ１０−２細胞にＨＣＶが吸着するのを遮断した。ウサギ高度免疫血清８６Ｉおよび８７Ｉは、細胞へのＨＣＶ吸着の阻害に関する正の対照として用いられた。ウサギ前免疫血清８７Ｐは、負の対照として用いられた。
【図３】
Ｅ２タンパク質上での５つのモノクローナル抗体の間接的競合ＥＬＩＳＡによるエピトープマッピングの結果を示す。非標識ＨＣＶ＃４ＦａｂをＥ２被覆ＥＬＩＳＡウェルと反応させて、ビオチン化ＨＣＶ＃１（）、ＨＣＶ＃４（）、ＨＣＶ＃７（）、ＨＣＶ＃１２（）およびＨＣＶ＃１３（）の結合を、ストレプトアビジン−アルカリ性ホスファターゼ接合体を用いて検出した。非標識ＨＣＶ＃４は、Ｅ２被覆ウェルにビオチン化ＨＣＶ＃４およびＨＣＶ＃７が結合するのを阻害した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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