(57)【要約】ＥＧＦＲシグナル伝達に関係するロンボイド関連タンパク質（ＲＲＰ）を提供する。ＲＲＰポリペプチドをコードする導入遺伝子又はＲＲＰポリペプチドの発現に影響する遺伝子を含む遺伝子組み換え非ヒト動物、ＲＲＰタンパク質とそれらの経路構成要素との相互作用を調節する方法、ＲＲＰポリペプチドとＲＲＰ結合標的、例えばＲＲＰ特異的抗体及び高処理スクリーニングで同定された小分子との相互作用を調節する薬剤をスクリーニングする方法を提供する。ＲＲＰタンパク質を過剰発現する腫瘍細胞の成長を特異的に阻害するために本発明の方法を用いて同定された調節剤が使用される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＲＲＰタンパク質を過剰発現する腫瘍細胞の成長を特異的に阻害する方法であって、前記腫瘍細胞と腫瘍細胞成長の阻害を引き起こす量の外因性ＲＲＰ結合剤とを接触させることを含む方法。
【請求項２】
前記腫瘍細胞が、脳、乳、卵巣、肺、前立腺、肝臓、リンパ節及び大腸からなる群から選択される組織由来である請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＲＲＰ結合剤が、抗体又は前記抗体の断片である請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記抗体が、ヒト化されている請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記抗体が、ヒト定常領域の残基及びロンボイド特異的マウス可変領域の残基を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
前記抗体が、検出可能な標識と結合している請求項３に記載の方法。
【請求項７】
前記抗体が、細胞毒性標識と結合している請求項３に記載の方法。
【請求項８】
ＲＲＰポリペプチドとＲＲＰ結合標的の相互作用を調節する薬剤のスクリーニング方法であって：
ａ）組み換えＲＲＰポリペプチドを発現させること、
ｂ）組み換えＲＲＰポリペプチドをＲＲＰ結合標的及び候補ＲＲＰ調節剤と共にインキュベートすること、
ｃ）前記候補ＲＲＰ調節剤がＲＲＰポリペプチドとＲＲＰ結合標的との結合を調節したかどうかを決定することを含む方法。
【請求項９】
前記結合標的が、ＴＧＦα、ＥＧＦ、及びアンフィレグリン（ａｍｐｈｉｒｅｇｕｌｉｎ）からなる群から選択される請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記結合標的が、ＴＧＦαである請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記候補ＲＲＰ調節剤が、抗体である請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
前記候補ＲＲＰ調節剤が、小有機分子である請求項８に記載の方法。
【請求項１３】
異常なＥＧＦＲ経路シグナル伝達を有する腫瘍細胞を診断する方法であって、前記腫瘍細胞のＲＲＰ発現レベルを測定し、腫瘍細胞と同じ組織又は器官の非腫瘍細胞に比較して増加した腫瘍細胞のＲＲＰ発現レベルによって、腫瘍細胞における欠陥のあるＥＧＦＲ経路シグナル伝達が示される方法。
【請求項１４】
配列番号：４として示されるアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチド。
【請求項１５】
ＲＲＰ２ポリヌクレオチドを含む組み換え発現系であって、前記発現系が適合する宿主細胞中に存在する場合に、配列番号：４のアミノ酸配列を含む組み換えＲＲＰ２ポリペプチドを生成する能力がある発現系。
【請求項１６】
請求項１５の発現系を含む宿主細胞。
【請求項１７】
ＲＲＰ２タンパク質を生成する方法であって、前記ＲＲＰ２タンパク質の発現に適した条件下での請求項１６の宿主細胞の培養、及び前記タンパク質の回収を含む方法。
【請求項１８】
ＲＲＰ２タンパク質を産生する細胞を作製する方法であって、宿主細胞が適した培養条件下でＲＲＰ２タンパク質を産生するように請求項１５の発現系を用いて宿主細胞を形質転換又はトランスフェクションすることを含む方法。
【請求項１９】
請求項１８の方法によって産生されるタンパク質を発現する組み換え宿主細胞。
【請求項２０】
配列番号：１４のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単離されたポリヌクレオチド。
【請求項２１】
配列番号：６に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、又はその逆相補鎖をコードする精製核酸分子。
【請求項２２】
２５℃の６Ｘ ＳＳＣ／０％ホルムアルデヒドハイブリダイゼーションバッファー、３５℃の４Ｘ ＳＳＣ洗浄バッファーを含むハイブリダイゼーション条件下で配列番号：５の核酸配列をハイブリダイズする能力のある請求項２１の核酸分子。
【請求項２３】
前記核酸配列が細胞外ドメイン、細胞内ドメイン、及びＲＲＰモチーフ（ＰＦＡＭ０１６９４）からなる群から選択された少なくとも１つのＲＲＰ３機能性ドメインをコードする、請求項２１の核酸分子。
【請求項２４】
ＤＮＡ又はＲＮＡ分子を含む組み換え発現系であって、前記発現系が適合する宿主細胞に存在する場合に、配列番号：６のアミノ酸配列を含むＲＲＰ３ポリペプチドを産生する能力のある発現系。
【請求項２５】
請求項２４の発現系を含む宿主細胞。
【請求項２６】
ＲＲＰ３タンパク質を生成する方法であって、前記ＲＲＰ３タンパク質の発現に適した条件下での請求項２５の宿主細胞の培養、及び前記タンパク質の回収を含む方法。
【請求項２７】
ＲＲＰ３タンパク質を産生する細胞を作製する方法であって、宿主細胞が適した培養条件下でＲＲＰ３タンパク質を産生するように請求項２４の発現系を用いて宿主細胞を形質転換又はトランスフェクションすることを含む方法。
【請求項２８】
請求項２７の方法により生成されるタンパク質を発現する組み換え宿主細胞。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（関連出願の提示）
本出願は、２０００年７月１９日出願の米国仮特許出願第６０／２１９，２８９号、２００１年３月２１日出願の同第６０／２７７，４８７号、２００１年３月２１日出願の同第６０／２７７，４７１号、及び２００１年７月１２日に出願の「ヒトＲＲＰ配列及び使用方法」と題された出願番号第／号の優先権を主張し、その内容の全てをここに取り込む。
【０００２】
（発明の背景）
シグナル伝達経路は、成長因子、そのレセプター、成長因子の上流の制御因子、及び下流の細胞内キナーゼネットワークから成り立つ。これらの経路は、増殖を含む多くの細胞性のプロセスを制御し、腫瘍形成において重要な役割を果たすようである。
上皮成長因子レセプター（ＥＧＦＲ）及びその経路の構成要素は、最も広く調査されているシグナル伝達経路の１つである。この経路のシグナル伝達は、多様な生物反応を誘発し、その現れとしては、有糸分裂誘発又はアポトーシス、増強された細胞運動性、タンパク質分泌、及び分化又は脱分化を含む。上方制御されたＥＧＦＲシグナル伝達は、器官の形態形成、維持、修復に関連づけされ、多様な腫瘍の浸潤及び転移と関連する。従って、ＥＧＦＲ及びその経路のシグナル伝達構成要素は、創傷の修復及び癌における治療介入のための標的である。
【０００３】
シグナル伝達経路、例えばＥＧＦＲ経路は進化的に、線虫、キイロショウジョウバエ、及び脊椎動物のように遠い種の間で保存されている（Ｄｕｆｆｙ ＪＢ， 及びＰｅｒｒｉｍｏｎ Ｎ， Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． （１９９６） ８：２３１−２３８）。実際に、Ｓｐｉｔｚ（Ｒｕｔｌｅｄｇｅ Ｂ， 等， Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ． （１９９２） ６：１５０３−１５１７）及びＧｕｒｋｅｎ（Ｎｅｕｍａｎ−Ｓｉｌｂｅｒｂｅｒｇ ＦＳ， 及びＳｃｈｕｐｂａｃｈ Ｔ， Ｃｅｌｌ （１９９３） ７５：１６５−１７４）として知られるショウジョウバエのＥＧＦＲ（ＤＥＲ）のリガンドは、共にＴＧＦα（トランスフォーミング成長因子α）、脊椎動物ＥＧＦＲのリガンドと類似している（Ｍａｓｓａｑｕｅ Ｊ， Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ． （１９９０） ２６５：２１３９３−２１３９６）。膜貫通タンパク質をコードするロンボイド遺伝子は、この経路のもう一つの上流構成要素である（Ｂｉｅｒ Ｅ．， 等， Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ． （１９９０） ４：１９０−２０３）。ショウジョウバエでは、ロンボイドタンパク質はＳｐｉｔｚを膜結合から分泌形態に形質転換して、ＤＥＲシグナル伝達経路を誘因及び上方制御する（Ｗａｓｓｅｒｍａｎ ＪＤ 等， Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖｅｌ （２０００） １４：１６５１−１６６３）。ロンボイドに関連するＤＮＡ配列は線虫（Ｗａｓｓｅｒｍａｎ ＪＤ， 及びＦｒｅｅｍａｎ Ｍ， Ｔｒｅｎｄｓ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ （１９９７） ７：４３１−４３６）と哺乳動物（Ｐａｓｃａｌｌ ＪＣ， 及びＢｒｏｗｎ ＫＤ， ＦＥＢＳ ｌｅｔｔｅｒｓ （１９９８） ４２９：３３７−３４０； 中でもヒト：ＧＩ＃３２８７１９１及びＧＩ＃７０２０５３４、ラット：ＧＩ＃３２９７９３６）で同定され、ロンボイド機能は進化的に保存されていることが示唆されている。シグナル伝達経路活性の調節は腫瘍成長に関わり、多くの癌の進行の理解、結果的には癌の治療にとって発達が不可欠である。
【０００４】
ショウジョウバエ等のモデル生物のゲノムをスクリーニング及び操作する能力は、重要な進化的保存を通じて、より複雑な脊椎動物の生物体に直接関連する生化学的プロセスを分析するための強力な手段となる。高レベルな遺伝子及び経路の保存、細胞性プロセスの強力な類似性、及びショウジョウバエと哺乳動物の間の遺伝子の機能的保存により、ハエにおける特定の経路に関わる新規な遺伝子及びそれらの機能の同定は、哺乳動物における相関関係のある経路の理解及びそれらを調節する方法に直接的に貢献する（Ｍｅｃｈｌｅｒ ＢＭ 等， １９８５ ＥＭＢＯ Ｊ ４：１５５１−１５５７； Ｇａｔｅｆｆ Ｅ． １９８２ Ａｄｖ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ３７： ３３−７４； Ｗａｔｓｏｎ ＫＬ， 等， １９９４ Ｊ Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ． １８： １９−３３； Ｍｉｋｌｏｓ ＧＬ， 及びＲｕｂｉｎ ＧＭ． １９９６ Ｃｅｌｌ ８６：５２１−５２９； Ｗａｓｓａｒｍａｎ ＤＡ， 等， １９９５ Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｇｅｎ Ｄｅｖ ５：４４−５０； Ｂｏｏｔｈ ＤＲ． １９９９ Ｃａｎｃｅｒ Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ Ｒｅｖ． １８：２６１−２８４）。例えば、対象とする遺伝子が過剰発現して可視的な表現型となったショウジョウバエで遺伝子スクリーニングを実施することができ；他の遺伝子の突然変異を有するハエと交雑を行って；子孫に本来の過剰発現表現型の増強又は減退があることが同定され、突然変異遺伝子が対象とする遺伝子と同じ又は重複する経路に関する「修飾因子」であることが示唆される（Ｒｏｒｔｈ Ｐ．， 等， Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ （１９９８） １２５： １０４９−１０５７； ＷＯ００１５８４３）。対象とする遺伝子が、例えば癌抑制遺伝子又は発癌遺伝子等の疾患経路に関連しているヒト遺伝子のオルソログである場合、修飾遺伝子は、新規治療のための興味ある候補標的でありうると決定することができる。
【０００５】
（発明の概要）
本発明は、ロンボイドに分類されるタンパク質のメンバー（以下これをロンボイド関連タンパク質（ＲＲＰ）、より具体的にはＲＲＰ１、ＲＲＰ２及びＲＲＰ３と称する）であり、ＥＧＦＲシグナル伝達経路に関係する新規な化合物標的を提供する。本発明は、ＲＲＰタンパク質をコードする核酸配列並びにその断片及び誘導体を含む単離された核酸分子を提供する。ＲＲＰ核酸分子を含むベクター及び宿主細胞もまた説明される。
本発明はＲＲＰポリペプチドをコードする導入遺伝子又はＲＲＰポリペプチドの発現に影響する遺伝子を含む遺伝子組み換え非ヒト哺乳動物を提供する。このような遺伝子組み換え非ヒト哺乳動物は、（例えば、更なる遺伝子、アンチセンス核酸等の導入によって）特にＲＲＰポリペプチド導入の影響、及びＲＲＰポリペプチドの発現の制御を研究する為のｉｎ ｖｉｖｏ試験システムとして役立つ。
【０００６】
さらに、本発明は、ＲＲＰタンパク質とそれらの経路の構成要素との相互作用を調節する方法を提供する。本発明はまた、ＲＲＰ遺伝子産物を過剰発現する腫瘍細胞の成長を特異的に阻害する方法を提供する。本発明は、ＲＲＰ結合標的とＲＲＰポリペプチドの相互作用を調節する薬剤のスクリーニング方法を提供する。
本方法を用いて同定された調節薬剤は、ＲＲＰタンパク質を過剰発現する腫瘍細胞の成長を特異的に阻害するために使用することができる。好ましい調節薬剤は、高処理スクリーニング系で同定されたＲＲＰ特異的抗体及び小分子を含む。
【０００７】
（本発明の詳細な説明）
サイクリン依存性キナーゼ阻害因子、ｐ２１（Ｂｏｕｒｎｅ ＨＲ， 等， Ｎａｔｕｒｅ （１９９０） ３４８（６２９７）：１２５−１３２； Ｍａｒｓｈａｌｌ ＣＪ， Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ （１９９１） ７（３）：９１−９５）と相互作用する遺伝子を同定するために、ショウジョウバエで過剰発現スクリーニングを実施した。ショウジョウバエのロンボイドをｐ２１経路の修飾因子と同定した。従って、ショウジョウバエロンボイドの脊椎動物オルソログ、好ましくはヒトオルソログは、以下、ロンボイド関連タンパク質（ＲＲＰ）、より具体的にはＲＲＰ１、ＲＲＰ２、及びＲＲＰ３と称され、例えば癌のような欠陥のあるｐ２１シグナル伝達経路と関連する病理を治療するための好ましい薬剤標的である。
【０００８】
ロンボイド関連タンパク質（ＲＲＰ）は、５以上の膜貫通ドメインと推定上の膜貫通領域に強力に保存された３つのヒスチジン残基を含む不可欠な膜タンパク質のファミリーである。ＲＲＰのロンボイドドメインは、ＰＦＡＭプログラム（ＰＦＡＭ０１６９４； Ｂａｔｅｍａｎ Ａ．， 等， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ， １９９９， ２７：２６０−２； ｈｔｔｐ：／／ｐｆａｍ．ｗｕｓｔｌ．ｅｄｕ）を用いて同定することができる。ＲＲＰ ＤＮＡ（ＲＲＰ１：配列番号：１、ＲＲＰ２：配列番号：３、及びＲＲＰ３：配列番号：５）及びタンパク質（ＲＲＰ１：配列番号：２及びＲＲＰ２：配列番号：４）に関連する配列が、公的なデータベースで入手可能である（ＲＲＰ１について：ｃＤＮＡ：ＧＩ＃３２８７１９０；タンパク質 ＧＩ＃３２８７１９１；ＲＲＰ２について：ｃＤＮＡ：Ｕｎｉｇｅｎｅ Ｈｓ１９６９７３５、ＧＩ＃ｓ：１２７６２６８９、１２０９６４１５、６６５７０８０、７９４７７５６、３１１７０１０、９３３９８７０、７１５２４９６、１１３１７５１２、１１３１７５１３、及び１１３１７５１１；タンパク質：ＧＩ＃ｓ：８９２３４０９、１２７１９５２２、及び１１４２１８１７；ＲＲＰ３について：ｃＤＮＡ：ＧＩ＃１０１９９６７３及びＧＩ＃２００３９９２）。ＲＲＰ ＤＮＡ配列は膜貫通タンパク質をコードする。ＲＲＰ１タンパク質（配列番号：２）の細胞外又は細胞内ドメインは、およそアミノ酸残基１−１９５、２１７−２６５、２８１−２８３、３０５−３０７、３２９−３７２、３９３−４０３、及び４２４−４３８にある。ＲＲＰ２タンパク質（配列番号：４）の細胞外又は細胞内ドメインは、およそアミノ酸残基１−７０、９２−１３２、１５４−１５８、１８０−１８２、２０４−２０７、２２９−２４７、２６９−２７７、及び２９９−３０３にある。ＲＲＰ３タンパク質（配列番号：６）の細胞外又は細胞内ドメインは、およそアミノ酸残基、１−１１７、１３９−１８３、２０５−２０７、２２９−２３１、２５３−２９６、３１８−３２５、及び３４７−３６２にある。ＲＲＰについてのＰＦＡＭデータベース（Ｂａｔｅｍａｎ Ａ等 上掲）での検索結果は、それらのロンボイドドメインをＲＲＰ１についてはおよそアミノ酸残基２３９−３９６、ＲＲＰ２については１１４−２６９、ＲＲＰ３については１６３−３２０に位置づける。
【０００９】
本発明の方法は、ＲＲＰ遺伝子産物を過剰発現する哺乳動物の悪性又は良性腫瘍の治療に役立つ。ＳＡＧＥ（連続的遺伝子発現解析）の結果は、脳、乳、及び大腸の癌でヒトＲＲＰ１遺伝子の過剰発現を；膵臓及び中皮（腹腔及び胸膜腔の内張）の癌でヒトＲＲＰ２遺伝子の過剰発現を；さらに脳及び前立腺の癌でヒトＲＲＰ３の過剰発現を示す。
完全な又は部分的なＲＲＰ１（配列番号：１）、ＲＲＰ２（配列番号：３）、及びＲＲＰ３（配列番号；５）ｃＤＮＡ配列をプローブとして用いる腫瘍サンプル由来ｍＲＮＡのノーザンブロット分析は、特定の腫瘍がＲＲＰを過剰発現するかどうかを決定することができる（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｅｄｓ． Ａｓｕｂｅｌ， 等， Ｗｉｌｅｙ ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ， ＮＹ）。あるいは、ＴａｑＭａｎ（登録商標）が腫瘍サンプルでのＲＲＰ過剰発現分析に使用される（ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）。
【００１０】
（本発明の核酸）
本発明の第一の態様は、配列番号：５として示されるようなヒトＲＲＰ３をコードする核酸である。本発明のＤＮＡ及びＲＮＡ配列は１本鎖又は２本鎖であってよい。従って、ここで使用される用語「単離された核酸配列」は、特に示さない限り、記載される配列の逆相補鎖、ＲＮＡ等価物、ＤＮＡ又はＲＮＡの１本鎖又は２本鎖配列、及びＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドを含む。
【００１１】
本発明の第一の態様の一部には、核酸の断片、例えば本発明のある全長配列の結合ドメインをコードする断片等を含む。ＲＲＰ３核酸配列の断片は、様々な目的に使用することができる。実施例のように、干渉ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）断片、特に二本鎖の（ｄｓ）ＲＮＡｉは、機能喪失表現型を生じさせるために利用することができ；また、中でも遺伝子機能の決定に利用できる。線虫、ショウジョウバエ、植物、及びヒトにおける遺伝子サイレンシングのためのＲＮＡｉの利用に関係する方法は当分野で既知である（Ｆｉｒｅ Ａ， 等， Ｎａｔｕｒｅ ３９１：８０６−８１１（１９９８）； Ｆｉｒｅ， Ａ． Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ． １５， ３５８−３６３ （１９９９）； Ｓｈａｒｐ， Ｐ． Ａ． ＲＮＡ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ ２００１． Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ． １５， ４８５−４９０（２００１）； Ｈａｍｍｏｎｄ， Ｓ． Ｍ．， 等， Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖ． Ｇｅｎｅｔ． ２， １１０−１１１９（２００１）； Ｔｕｓｃｈｌ， Ｔ． Ｃｈｅｍ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２， ２３９−２４５（２００１）； Ｈａｍｉｌｔｏｎ， Ａ． 等， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８６， ９５０−９５２ （１９９９）； Ｈａｍｍｏｎｄ， Ｓ． Ｍ．， 等， Ｎａｔｕｒｅ ４０４， ２９３−２９６ （２０００）； Ｚａｍｏｒｅ， Ｐ． Ｄ．， 等， Ｃｅｌｌ １０１， ２５−３３ （２０００）； Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ， Ｅ．， 等， Ｎａｔｕｒｅ ４０９， ３６３−３６６ （２００１）； Ｅｌｂａｓｈｉｒ， Ｓ． Ｍ．， 等， Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ． １５， １８８−２００ （２００１）； ＷＯ０１２９０５８； ＷＯ９９３２６１９； Ｅｌｂａｓｈｉｒ ＳＭ， 等， ２００１ ｎａｔｕｒｅ ４１１：４９４−４９８）。
【００１２】
ある種の「アンチセンス」断片、即ち、配列番号：５のコーディング及び／又は非翻訳領域（例えば５’ＵＴＲ）の部分の逆相補鎖は、ＲＲＰ３タンパク質の機能の阻害に有用である。断片は、対応する配列番号：５と特異的にハイブリッド形成するのに十分な長さである。断片は、配列番号５の少なくとも１２，好ましくは少なくとも２４、より好ましくは少なくとも３６、さらに好ましくは少なくとも９６の連続したヌクレオチドからなるか、又はそれらを含む。その断片が他の核酸配列に隣接する場合、組み合わせた核酸配列の全長は、１５ｋｂ未満、好ましくは１０ｋｂ未満又は５ｋｂ未満、さらに好ましくは２ｋｂ未満、場合によっては５００塩基未満である。
配列番号：５の更なる好ましい断片は、およそヌクレオチド２４８−５９８、６６５−７９６、８６２−８７０、９３４−９４３、１００６−１１３８、１２０１−１２２５、及び１２８９−１３３６にある細胞外又は細胞内ドメインをコードする。好ましい断片はまた、結合ドメイン又はＲＲＰモチーフ（例えば、ＰＦＡＭ０１６９４）を含んでいてもよい。これらのドメインは、タンパク質の機能及び／又は結合のパートナーを確認するのに有用でありうる。例えば、タンパク質の細胞外又は細胞内ドメインをコードする核酸は、タンパク質に関連する結合パートナーを捜すために使用されうる。
【００１３】
対象とする核酸配列は、専ら配列番号：５又はその断片から構成されるものであってよい。あるいは、対象とする核酸配列及びその断片は、標識、ペプチド、細胞膜通過を促進させるような薬剤、ハイブリダイゼーションを誘起する切断薬又は挿入剤のような他の構成要素に連結されてもよい。対象核酸配列及びその断片は、他の核酸配列に連結されてもよく（即ち、それらは長い配列の一部を含んでもよく）、合成／非天然配列であり、及び／又は単離され、及び／又は精製され、すなわち、少なくとも天然の状態では付随している幾つかの物質を伴っていない。好ましくは単離された核酸は、所定の分画に存在する全核酸に対して少なくとも約０．５重量％、さらに好ましくは少なくとも約５重量％を構成し、好ましくは、天然の染色体で結合しているもの以外のヌクレオチドと結合している非天然配列又は天然配列を含んで意味される組み換え体である。
【００１４】
ＲＲＰ３の誘導核酸配列は、配列番号：５の核酸配列とハイブリダイズする配列を含む。様々なハイブリダイゼーション条件が当業者によく知られている（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， 上掲）。特に、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件が用いられうる：５ｘＳＳＰＥ（０．１８ＭのＮａＣｌ、０．０１ＭのＮａＰＯ４、ｐＨ７．７、０．００１ＭのＥＤＴＡ）バッファーに３０％のホルムアルデヒドを含む温度４２℃バッファー、さらに４２℃の０．２ｘＳＳＰＥで洗浄して残った結合；好ましくは、５ｘＳＳＰＥバッファーに５０％のホルムアルデヒドを含む温度４２℃のバッファーでハイブリダイズし、４２℃、０．２ｘＳＳＰＥバッファーで洗浄して残った結合。
【００１５】
対象核酸は、翻訳可能な転写物、ハイブリダイゼーションプローブ、ＰＣＲプライマー、診断用核酸等としての使用；ＲＲＰ３遺伝子及び遺伝子転写物の存在を検出するための、並びに更なるＲＲＰ３相同体及び構造類似体をコードする核酸の検出又は増幅のための使用を含む広範で様々な用途が見出される。診断では、ＲＲＰ３ハイブリダイゼーションプローブの、臨床用及び研究用のサンプルにおける野生型及び突然変異ＲＲＰ３対立遺伝子を同定する為の使用が見出される。突然変異対立遺伝子は、高処理臨床診断の為の対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）プローブを作製するのに使用される。治療において、治療用ＲＲＰ３核酸は、活性ＲＲＰ３の細胞性発現あるいは細胞内濃度又は有効性を調節するのに使用される。
【００１６】
ここで用いられる、対象配列又は対象配列の特定部位に対する「パーセント（％）核酸同一性」とは、配列を整列させ、最大の配列同一性の割合を達成するために必要ならば、全てのサーチ変数のセットを初期値にしたプログラムＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２．０ａ１９（Ａｌｔｓｃｈｕｌ等， Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ． （１９９７）２１５：４０３−４１０；ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｗｕｓｔｌ．ｅｄｕ．／ｂｌａｓｔ／ＲＥＡＤＭＥ．ｈｔｍｌ；ここでは、一般に「ＢＬＡＳＴ」と称する）によって産み出されるギャップを導入した後に、対象配列（又はその特定の部分）中においてヌクレオチドと同一である候補誘導体核酸配列におけるヌクレオチドのパーセンテージとして定義される。誘導体ＲＲＰ３核酸配列は、通常、配列番号：５、又はそのドメインをコードしている領域と、少なくとも７０％の配列同一性、好ましくは少なくとも８０％の配列同一性、より好ましくは少なくとも８５％の配列同一性、さらに好ましくは少なくとも９０％の配列同一性、最も好ましくは９５％の配列同一性を有する。
【００１７】
好ましい実施態様では、誘導体核酸は、配列番号：６のＲＲＰ３アミノ酸配列、あるいはその断片又は誘導体を含むポリペプチドをコードする。誘導体ＲＲＰ３核酸配列、又はその断片は、配列番号：５と１００％の配列同一性を有しうるが、塩基又は糖の部分、あるいはリン酸骨格に一以上の修飾を有するという意味でその誘導体であり得る。修飾の例は、当分野でよく知られている（Ｂａｉｌｅｙ， Ｕｌｌｍａｎｎ’ｓ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ （１９９８）， 第６版， Ｗｉｌｅｙ 及び Ｓｏｎｓ）。このような誘導体は、修飾された安定性又は他の所望の特徴を得るために使用されうる。
好ましいＲＲＰ３タンパク質断片及び誘導体のより特定の実施態様として、特定のＲＲＰタンパク質に関して以下に記載する。
【００１８】
（本発明のタンパク質）
第２の態様では、本発明により配列番号：４又は６のアミノ酸配列、あるいはその断片又は誘導体を含む、あるいはそれらからなるＲＲＰタンパク質が得られる。これらのタンパク質を含む組成物は、本質的にＲＲＰタンパク質、断片、又は誘導体からなっていてもよく、更なる成分（例えば、製薬的に許容される担体又は賦形剤、培養媒体等）を含んでいてもよい。
【００１９】
ＲＲＰタンパク質誘導体は典型的に、配列番号４又は６、あるいはその断片とある程度の配列同一性又は配列類似性をを有する。ここで用いられる、対象配列又は対象配列の特定部分との「パーセント（％）アミノ酸配列同一性」とは、配列を整列させ、最大の配列同一性の割合を達成するために必要ならば、誘導体の核酸配列について上述したのと同一の変数を用い、ＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ等， 上掲）により産み出されるギャップを導入した後に、対象配列（又はその特定の部分）中におけるアミノ酸と同一である候補誘導体アミノ酸におけるアミノ酸のパーセンテージとして定義される。％アミノ酸配列同一性の値は、パーセント同一性が報告される配列の長さで、一致する同一なアミノ酸の数を割ることにより決定される。「パーセント（％）アミノ酸配列類似性」は、％アミノ酸同一性の場合と同様な計算を行うことにより決定されるが、コンピューター解析の結果得られる同一アミノ酸に加えて、保存的なアミノ酸置換を含むものである。保存的アミノ酸置換とは、タンパク質の折り畳み又は活性がそれほど重大な影響を受けないように、一のアミノ酸を類似の性質を有する他のアミノ酸と置換えることである。互いに置換可能な芳香族アミノ酸は、フェニルアラニン、トリプトファン、及びチロシンであり；互換的な疎水性アミノ酸は、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、及びバリンであり；互換的な極性アミノ酸は、グルタミン及びアスパラギンであり；互換的な塩基性アミノ酸は、アルギニン、リジン及びヒスチジンであり；互換的な酸性アミノ酸は、アスパラギン酸及びグルタミン酸であり；互換的な小分子のアミノ酸は、アラニン、セリン、システイン、スレオニン、及びグリシンである。
【００２０】
好ましい実施態様の一つには、ＲＲＰタンパク質誘導体は、配列番号：４又は６の、少なくとも２５のアミノ酸、好ましくは少なくとも５０のアミノ酸、さらに好ましくは少なくとも１００のアミノ酸の連続して伸展する部分と、ある場合にはその全長と、少なくとも８０％の配列同一性又は類似性、好ましくは少なくとも８５％、さらに好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは９５％の配列同一性又は類似性を有する。好ましい実施態様では、ＲＲＰドメイン（ＰＦＡＭ０１６９４）と同一性を有する。
ＲＲＰタンパク質の断片又は誘導体は、好ましくは「機能的に活性」であり、これは、ＲＲＰタンパク質誘導体又は断片が、配列番号４又は６のアミノ酸配列を含む全長の野生型ＲＲＰタンパク質に付随する一又は複数の機能的な活性を示すことを意味する。好ましくは、機能的に活性なＲＲＰ断片又は誘導体は、ＲＲＰタンパク質に関し一以上の生物学的活性を示すものである。一例として、断片又は誘導体は、ＲＲＰタンパク質に対して抗体を作製することに関して後述する中で議論されているように、免疫化、ＲＲＰ活性の調節などについて、イムノアッセイにて使用可能な抗原性を有してもよい。また、ここでの目的のために、機能的に活性な断片は、ＲＲＰの一以上の構造的特徴があるそれらの断片、例えば細胞外又は細胞内ドメインを含む。ＲＲＰタンパク質、誘導体、断片の機能的な活性は、当該技術の当業者に公知の種々の方法によりアッセイされ得る（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ （１９９８） Ｃｏｌｉｇａｎ等， 編集， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．， Ｓｏｍｅｒｓｅｔ， Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ）。
【００２１】
ＲＲＰ誘導体は、当該技術分野において公知の種々の方法により生産され得る。結果としてそれらを生産する操作は、遺伝子又はタンパク質レベルで行うことができる。例えば、クローン化されたＲＲＰ遺伝子配列は、適切な部位で制限酵素により切断され（Ｗｅｌｌｓ等， Ｐｈｉｌｏｓ． Ｔｒａｎｓ． Ｒ． Ｓｏｃ． Ｌｏｎｄｏｎ ＳｅｒＡ （１９８６） ３１７：４１５）、続いて必要な場合には更なる酵素的修飾を受け、単離され、 ｉｎ ｖｉｔｒｏ において連結され、所望の誘導体を生産するために発現させうる。あるいは、ＲＲＰ遺伝子は、翻訳、開始、及び／又は終結配列を作製及び／又は破壊し、又はコード領域に変異を創出し、及び／又は新たな制限酵素部位を作製し又は元々存在しているものを破壊し、ｉｎ ｖｉｖｏ における更なる修飾を促進するために ｉｎ ｖｉｔｒｏ 又は ｉｎ ｖｉｖｏにおいて変異させることが可能である。化学的突然変異、ｉｎ ｖｉｔｒｏ 部位特異的突然変異法（Ｃａｒｔｅｒ等， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． （１９８６） １３：４３３１）、ＴＡＢ（登録商標）リンカー（Ｐｈａｒｍａｃｉａ ａｎｄ Ｕｐｊｏｈｎ， Ｋａｌａｍａｚｏｏ， ＭＩ から入手可能）の使用など、種々の変異導入技術が、当該技術分野において公知である。
【００２２】
タンパク質レベルにおいて、操作には、例えば、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、保護／阻害基による誘導体化、タンパク質分解的切断、抗体分子又は他の細胞性リガンドとの連結等のような翻訳後修飾が含まれる。多くの化学的突然変異のいずれも、既知の技術により実施することができる（例えば、臭化シアン、トリプシン、キモトリプシン、パパイン、Ｖ８プロテアーゼ、ＮａＢＨ４による特異的化学的切断、アセチル化、ホルミル化、酸化、還元、ツニカマイシン存在下における代謝的生合成など）。また、誘導体タンパク質は、例えば、非古典的アミノ酸又は化学的アミノ酸類似体をＲＲＰタンパク質配列中に置換又は付加として導入するために、ペプチド合成装置を利用することにより化学的に合成され得る。
【００２３】
キメラ又は融合タンパク質は、アミノ−又はカルボキシ−末端にペプチド結合を介して異なるタンパク質のアミノ酸配列と連結されるＲＲＰタンパク質又はその断片（好ましくは、一以上のＲＲＰタンパク質の構造又は機能ドメインを含む）を含むように作製することができる。キメラタンパク質は、あらゆる既知の方法により生産され、該方法には次のものが含まれる：タンパク質をコードする核酸の組み換え体発現（異なるタンパク質のコーディング配列にインフレームを連結させたＲＲＰコーディング配列を含む）；所望のアミノ酸配列をコードする適切な核酸配列を適当なコーディングフレームで互いに対して連結し、キメラ産物を発現させること；及び例えばペプチド合成装置の使用による、タンパク質合成技術。
また、対象とするＲＲＰポリペプチドは、Ｎ及び／又はＣ末端切断を含む微細欠失突然変異を包含する。このような欠失突然変異はＲＲＰ競合又は優性阻害活性を容易にスクリーニングする。
【００２４】
（ＲＲＰの発現及び生成）
ＲＲＰポリペプチドは、通常それらを合成する細胞から単離され、培養した細胞から組み換え技術により生成され、あるいは非細胞システムで合成（例えばＪｅｒｍｕｔｕｓ Ｌ， 等， Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． （１９９８） ９：５３４−４８）されうる。広範で種々の分子及び生化学的方法が、生化学合成、分子発現及び対象組成物の精製に利用可能である（Ｓａｍｂｒｏｏｋ等， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ （１９８９）， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ （上掲））。合成又は組み換え生産ポリペプチドは、それらをコードするポリヌクレオチドから生成される。これらは、対象ポリペプチド配列（「ＧＣＧ」ソフトウェア、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ， Ｉｎｃ， Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ）から作製される縮重オリゴヌクレオチドプライマー及びプローブを用いて単離した天然コーディングポリヌクレオチド、又はコンピュータアルゴリズムによる対象ポリペプチドの逆翻訳により作製した選択発現系を最適化したポリヌクレオチド（例えば、Ｈｏｌｌｅｒ等， Ｇｅｎｅ （１９９３） １３６： ３２３−３２８； Ｍａｒｔｉｎ等， Ｇｅｎｅ （１９９５） １５４：１５０−１６６）であり得る。一実施態様では、異種プロモーターの制御下でＲＲＰを発現する組み換え細胞は、後述のように、ＲＲＰ機能を調節する薬剤のスクリーニングの為のアッセイに使用される。
【００２５】
（ＲＲＰ調節剤）
本発明は、このような調節剤を同定及び生成する方法、並びに診断、治療及び製薬開発におけるそれらの使用を提供する。化学結合剤は、以下にさらに説明されるｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞ベース及び動物ベース結合アッセイ等の化学ライブラリのスクリーニング、又は当業者に既知の他の方法により同定されうる。内因性ＲＲＰ特異的結合剤及び他の天然細胞内結合剤は、１−、２−及び３−ハイブリッドスクリーニングを用いて同定することができる。ＲＲＰ結合特異性はＴＧＦαプロセシング（例えばＲＲＰ発現細胞の負のエフェクターとして機能する候補ＲＲＰ特異的結合薬剤の能力）により、結合平衡定数（通常は少なくとも約１０７Ｍ−１、好ましくは少なくとも約１０８Ｍ−１、より好ましくは少なくとも約１０９Ｍ−１）により、免疫原性（例えば、マウス、ラット、ヤギ又はウサギ等の異種宿主におけるＲＲＰ特異的抗体を誘発する能力）等によりアッセイされうる。
【００２６】
また、本発明は、ＲＲＰ発現を阻害又は促進することにより作用する、あるいはＲＲＰ結合活性に直接的又は間接的に影響するＲＲＰ調節剤を提供する。ＲＲＰ調節剤は、ＲＲＰ突然変異タンパク質（例えば、ドミナントネガティブ突然変異）、ＲＲＰ特異的抗体、及びＲＲＰに特異的に結合する化学薬品を含む。好ましいＲＲＰ調節剤はＲＲＰポリペプチドに特異的に結合し、ＲＲＰ機能を阻害する。ＲＲＰ特異的結合剤は、ＲＲＰポリペプチドとの分子相互作用のあらゆる都合の良いｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎ ｖｉｖｏアッセイによって評価されうる。好ましくは、ＲＲＰポリペプチドはヒト由来のもの（例えば、配列番号：２、４、又は６）であるが、そのホモログ又はオルソログ（例えば、配列番号２、４、又は６と少なくとも８０％、好ましくは８５％、より好ましくは９０％、最も好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有する）であってもよい。結合剤は、内因性、つまりＴＧＦα、ＥＧＦ、アンフィレグリン、ヘレグリン、ＲＲＰ制御タンパク質、又はＲＲＰ活性又はその局在を直接的に調節する他の経路制御因子等のＲＲＰシグナル伝達に通常関わるものでありうる。あるいは、結合剤は、外因性、例えば、ＲＲＰ特異的抗体、Ｔ細胞抗原レセプター（例えば、Ｈａｒｌｏｗ及びＬａｎｅ （１９８８） Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ参照）又は化学結合剤、例えば本発明のアッセイにより同定される化学薬品であり得る。
【００２７】
特異的結合剤、例えば以下にさらに説明されるような抗体及びＲＲＰ特異的小分子は、様々な診断及び治療の用途、特に疾患又は疾患予後がＥＧＦＲ経路等のＲＲＰに関与する経路と関係がある場合に有用である。従って、本発明はまた、ＲＲＰ活性を調節する工程を含む細胞におけるＥＧＦＲ経路を調節する方法を提供する。
【００２８】
（ＲＲＰ特異的抗体）
ＲＲＰタンパク質に特異的に結合する抗体を作製することができる。抗体は、治療及び診断への有用性があり、ＲＲＰ遺伝子及びタンパク質の機能確認に利用される。例えば、抗体の利用は、生物学的試料中のＲＲＰタンパク質の検出及びＲＲＰ活性の抑制、例えば、発癌性疾患の進行の阻害を含む。また、抗体は、様々な細胞性応答の原因となるＲＲＰ経路の一部の分析並びにＲＲＰの一般的なプロセシング及び成熟に用いることができる。
ＲＲＰポリペプチドに特異的に結合する抗体は、既知の方法を用いて作製することができる。好ましくは、抗体は哺乳動物のＲＲＰタンパク質、より好ましくはヒトＲＲＰタンパク質に特異的である。抗体は、ポリクローナル、モノクローナル（ｍＡｂｓ）、ヒト化またはキメラ抗体、一本鎖抗体、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）．ｓｕｂ．２断片、ＦＡｂ発現ライブラリにより作製された断片、抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体、及び上記の何れかのエピトープ結合断片であってもよい。抗体は、ＲＲＰの粗細胞抽出物又は実質的に精製した断片に対して作製されうる。ＲＲＰ断片が使用される場合、好ましくはＲＲＰの細胞内又は細胞外ドメインの少なくとも１０、より好ましくは少なくとも２０の連続したアミノ酸を含む。
【００２９】
様々なＲＲＰポリペプチド及びペプチド断片に対するポリクローナル抗体が調製されうる。特定の実施態様では、対象ポリペプチドは、タンパク質に結合してそれを運び、それ自体免疫応答を促進する免疫源及び／又はＲＲＰ特異的抗原を提供する。例えば、対象ポリペプチドは、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）担体に共有的に結合し、抱合体はフロイント完全アジュバントに乳化し、免疫応答を促進する。適した免疫システム、例えば実験用ウサギ又はマウスを従来のプロトコールに従って免疫化し、出血させて抗体を回収した。ＲＲＰ特異的抗体の存在は、免疫化した対応するＲＲＰポリペプチドを用いた適切なアッセイ、例えば固相酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）によってアッセイする。他のアッセイ、例えば放射免疫アッセイ又は蛍光アッセイも使用されうる。
【００３０】
モノクローナル抗体（ｍＡｂｓ）は、同種であり、クローン化によって誘導され、単一の抗原決定基と結合する。モノクローナル抗体（ｍＡｂｓ）が作製される場合、好ましくはそれらは少なくとも１０８Ｍ−１、好ましくは１０９Ｍ−１〜１０１０Ｍ−１、或いはより強い親和性を有する。ｍＡｂｓについての標準的な方法が当分野に既知である（Ｈａｒｌｏｗ 及び Ｌａｎｅ， Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ＣＳＨ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ （１９８８）； Ｇｏｄｉｎｇ （１９８６） Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ 及び Ｐｒａｃｔｉｃｅ （第２版） Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ； 及び米国特許番号第４，３８１，２９２号、同第４，４５１，５７０号及び同第４，６１８，５７７号）。概略すると、適した動物を選択し、所望の免疫化手順を次の通りにおこなう。適切な時間の後、該動物の脾臓を摘出して個々の脾臓細胞を、典型的には不死化したミエローマ細胞に適切な選択条件で融合させる。次いで細胞をクローン化によって分離し、全クローンの上清を抗原の所望の領域に特異的な抗体の生成についてＥＬＩＳＡにより試験する。
【００３１】
異なる動物種の異なる部位を含むＲＲＰポリペプチドに特異的なキメラ抗体を作ることができる。例えば、ヒト免疫グロブリン定常領域をマウスｍＡｂの様々な領域に結合させ、抗体の生物学的活性はヒト抗体由来であり、結合特性はマウス断片由来である。キメラ抗体は、それぞれの種の適切な領域をコードする遺伝子を継ぎ合わせることにより作製される（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ等， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． （１９８４） ８１：６８５１−６８５５； Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ等， Ｎａｔｕｒｅ （１９８４） ３２１：６０４−６０８； Ｔａｋｅｄａ等， Ｎａｔｕｒｅ （１９８５） ３１：４５２−４５４）。キメラ抗体の形態であるヒト化抗体は、組み換えＤＮＡ技術（Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ＬＭ， 等， １９８８ Ｎａｔｕｒｅ ３２３： ３２３−３２７）によってヒトフレームワーク領域及び定常領域をバックグラウンドにマウス抗体の相補性決定領域（ＣＤＲｓ）（Ｃａｒｌｏｓ， Ｔ． Ｍ．， Ｊ． Ｍ． Ｈａｒｌａｎ． １９９４． Ｂｌｏｏｄ ８４：２０６８−２１０１）をグラフトすることにより作製することができる。ヒト化抗体は、〜１０％のマウス配列とから９０％のヒト配列を含み、さらに免疫原性を減少又は排除し、抗体特異性を維持する（Ｃｏ ＭＳ， 及びＱｕｅｅｎ Ｃ． １９９１ Ｎａｔｕｒｅ ３５１：５０１−５０１； Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ＳＬ．１９９２ Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｉｍｍｕｎ． １０：２３９−２６５）。ヒト化抗体及びその作製方法は、当分野に既知である（米国特許第５，５３０， １０１号； 同第５，５８５， ０８９号； 同第５，６９３，７６２号及び同第６，１８０，３７０号）。
【００３２】
ＲＲＰ特異的一本鎖抗体は、組み換え体、アミノ酸架橋を介してＦｖ領域の軽鎖及び重鎖の断片に結合させることにより形成された一本鎖ポリペプチドであり、当分野で既知の方法で作製することができる（米国特許第４，９４６，７７８号； Ｂｉｒｄ， Ｓｃｉｅｎｃｅ （１９８８）２４２：４２３−４２６； Ｈｕｓｔｏｎ等， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ （１９８８） ８５：５８７９−５８８３； 及びＷａｒｄ等， Ｎａｔｕｒｅ（１９８９） ３３４：５４４−５４６）。
抗体作製の他の適切な技術は、ファージ又は同様のベクターでの抗体ライブラリの選択、或いは抗原ポリペプチドに対するリンパ球のｉｎ ｖｉｔｒｏ曝露に関する（Ｈｕｓｅ等， Ｓｃｉｅｎｃｅ （１９８９） ２４６：１２７５−１２８１）。
【００３３】
本発明の抗体は、修飾をして又はしないで使用することができる。たびたびポリペプチド及び抗体は、検出可能なシグナルを与える又は標的タンパク質を発現する細胞に毒性のある物質に、共有的又は非共有的に結合することにより標識されうる（Ｍａｎａｒｄ Ｓ， 等， Ｉｎｔ Ｊ． Ｂｉｏｌ Ｍａｒｋｅｒｓ （１９８９） ４：１３１−１３４）。広範で種々の標識及びコンジュゲーション技術が知られ、科学及び特許文献の両方で広く報告されている。適した標識には、放射性核種、酵素、基質、補因子、阻害剤、蛍光成分、蛍光発光ランタニド金属、化学発光成分、生体発光成分、磁性粒子等が含まれる（米国特許第３，８１７，８３７号； 第３，８５０，７５２号； 第３，９３９，３５０号； 第３，９９６，３４５号； 第４，２７７，４３７号； 第４，２７５，１４９号； 及び第４，３６６，２４１号）。また、組み換え免疫グロブリンも生成されうる（米国特許第４，８１６，５６７号）。
【００３４】
（抗体の治療的使用）
患者の抗腫瘍治療に使用される場合、患者の腫瘍量をなくす又は減少させる治療的有効量で対象とする発明の抗体を患者に投与する。それらは通常、非経口で、可能な場合には標的細胞部位に、或いは静脈内に投与される。投与量及び投与方式は、癌の性質（原発性又は転移性）、その密度、標的部位、（使用される場合には）特定の免疫毒素等の特性、例えばその治療係数、及び患者病歴に依存しうる。投与される抗体の量は、典型的に患者の体重の約０．１−１０ｍｇ／ｋｇの範囲でありうる。治療用抗体を使用する治療方式は当分野に既知である（米国特許第５，８５９，２０６号）。
【００３５】
当分野で知られているように、治療に適した抗体のサブクラスの選択は、腫瘍抗原の性質に依存しうる。例えば、抗原が腫瘍標的に非常に特異的であり、正常細胞に滅多に生じない場合にはＩｇＭが好ましい。しかしながら、腫瘍関連抗原が非常に低いレベルであっても正常細胞にも発現される場合には、ＩｇＧサブクラスが好ましい。少なくとも２つのＩｇＧ分子の近接した結合は、補体、細胞性抗原に対する防御を形成する抗体と結合する血清タンパク質の活性化に必要である。従って、より少ない量の抗原を発現し、より少ないＩｇＧ分子と結合する正常組織は、補体が関連するダメージをあまり被りえない。さらに、ＩｇＧはＩｇＭよりも小さいので、腫瘍組織により敏速に局在しうる。
【００３６】
免疫応答は、抗腫瘍治療の供給又は有効性の助けとなる。補体の活性化は、炎症反応及びマクロファージ活性化を引き起こすという証拠がある（Ｕａｎａｎｕｅ 及びＢｅｎｅｃｅｒｒａｆ， Ｔｅｘｔｂｏｏｋ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， 第２版， Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ， ｐ． ２１８ （１９８４））。活性化したマクロファージは正常細胞よりも優先的に腫瘍細胞を破壊する（Ｆｉｄｌｅｒ 及び Ｐｏｓｔｅ， Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｓｅｍｉｎ． Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ． ５， １６１ （１９８２））。また、炎症を伴う増大した血管拡張は、腫瘍に局在する化学療法剤又は放射標識した抗体等の抗ガン剤の能力を増大させうる。標準的な化学療法又は放射線療法の重大な損害は、健常細胞を傷つけることであるが、本発明により説明される抗原抗体結合は通常、腫瘍細胞集団の不均一性により生じる多くの問題を回避しうる。さらに、異なる個体の同じエピトープの可変部を認識する精製した抗原（Ｈａｋｏｍｏｒｉ， Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． （１９８４） ２： １０３）又は関連抗イディオタイプ抗体（Ｎｅｐｏｍ 等， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ， （１９８５） ８１：２８６４； Ｋｏｐｒｏｗｓｋｉ等， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． （１９８４） ８１：２１６）は、ヒト癌患者の活性免疫応答を誘発するのに使用することができる。このような応答は、ヒト補体を活性化し、抗体依存性の細胞性細胞毒性を調節する能力のある抗体の形成を含み、このようなメカニズムによって腫瘍の破壊が引き起こされる。
【００３７】
ＲＲＰ機能の非抗体調節因子
本発明は、ＲＲＰ機能の非抗体調節因子、及び例えば遺伝子発現、転写、又は細胞機能によりＲＲＰを調節することのできるリード化合物等の好ましい化学薬品を同定する効果的な方法を提供する。ｉｎ ｖｉｔｒｏリガンド結合アッセイ、免疫アッセイ等を含む転写調節因子又は結合薬剤の広範で種々のアッセイを使用することができる（Ｈａｒｌｏｗ及びＬａｎｅ， Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ， 上掲； Ｋｎｏｐｆｅｌ等， Ｊ． Ｍｅｄ． ｃｈｅｍ． （１９９５） ３８：１４１７）。該方法は、リード化合物の化学ライブラリの費用効果の高い自動高処理スクリーニングに従う。同定した試薬は、動物及びヒトの治験の製薬産業で使用することができる。結合薬剤のアッセイは、天然ＲＲＰ結合標的とＲＲＰの相互作用を調節する化合物のスクリーニングを含む。このようなアッセイで使用されるＲＲＰポリペプチドは、検出又は固着用ペプチドタグ等の他のポリペプチドと融合させてもよい。特定の実施態様では、結合標的は、ＴＧＦα、又はその部分であり、それは通常アッセイで測定可能であって好ましくは無傷のＴＧＦαに匹敵する対象ＲＲＰポリペプチドへの結合親和性及び結合活性を提供する。候補結合薬剤は多くの化学クラスを包含する。それらは典型的には有機化合物、好ましくは小さく（例えば、好ましくは分子量１００００未満、より好ましくは５０００未満、さらに好ましくは１０００未満、最も好ましくは５００未満を有する）、合成又は天然化合物のライブラリーを含む広範で種々の供給源から得られる。塩類、緩衝液、中性タンパク質、例えばアルブミン、界面活性剤、プロテアーゼ阻害剤、ヌクレアーゼ阻害剤、抗菌剤等のような様々な他の試薬も混合物に含まれうる。できた混合物を、候補薬物が存在しなければＲＲＰポリペプチドが特異的に細胞性結合標的、部分又は基準の結合親和性を有する類似体に結合する条件下でインキュベートした。必要な結合が可能となるように混合物の成分を追加することがき、結合が円滑になされる温度でインキュベーションを実施することができる。インキュベーション時間は、同様に最適な結合をするが高速高処理スクリーニングを円滑に行うための最小限で選択される。
【００３８】
インキュベーションの後、ＲＲＰポリペプチドと一以上の結合標的の間のあらゆる薬剤結合を、生成物の性質及び他のアッセイ要素、例えば吸光度、電子密度、放射線放出、非放射線エネルギー移動等に依存する様々な方法の任意のもの、あるいは抗体コンジュゲート等を用いた間接的な検出により検出する。薬剤の存在下での結合親和性に比較した、薬剤の非存在下での標的に対するＲＲＰの結合親和性の相違は、薬剤がＲＲＰ結合標的へのＲＲＰの結合親和性を調節する、つまり「薬剤偏性」の結合があることを示す。ここで使用される相違とは、統計的に有意であり、少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは７５％、最も好ましくは９０％の相違であることが好ましい。
【００３９】
化合物の製剤化
ここで説明される本発明のアッセイで同定された化合物は、典型的に製薬組成物、例えば、組み合わせ治療の目的の他の活性成分、及び／又は適した担体又は賦形剤を含む組成物等に処方される。本出願の化合物の処方又は投与の技術は、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ， 」Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．， Ｅａｓｔｏｎ， ＰＡ， 最新版に見ることができる。
【００４０】
遺伝子改変動物
調節薬剤の二次的確証の好ましい方法は、動物及び／又は動物モデル、例えばＥＧＦＲに関連した症状のモデルの使用である。従って、本発明は、遺伝子改変してＲＲＰ発現を変えた非ヒト動物を提供する。好ましくは、変化したＲＲＰ発現は、検出可能な表現型、例えば、正常なＲＲＰ発現をするコントロール非ヒト動物に比較して減少又は増加したレベルの細胞増殖、血管形成、又はアポトーシスとなる。遺伝子改変動物は、さらに改変されたＥＧＦＲ発現を有していてもよい。好ましい遺伝子改変動物は、霊長類、齧歯類（好ましくはマウス）、ウシ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、ブタ、イヌ及びネコ等の動物である。好ましい非哺乳動物種には、ゼブラフィッシュ、線虫、及びショウジョウバエを含む。好ましい遺伝子改変動物は、その細胞の一部に染色体外成分として存在する異種核酸配列を有する遺伝子組み換え動物、つまりモザイク動物（例えば、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ， １９９４， Ｃｕｒｒ． ｂｉｏｌ． ４：７６１−７６３． 参照）又はその生殖系列のＤＮＡに安定して（つまり、その細胞のほとんど又は全ての遺伝子配列に）組み込まれたものである。異種核酸は、このような遺伝子組み換え動物の生殖系列に例えば宿主細胞の胚又は胚幹細胞等の遺伝子操作により導入される。
【００４１】
遺伝子組み換え動物を作る方法は、当分野でよく知られている（遺伝子組み換えマウスについては、Ｂｒｉｎｓｔｅｒ等， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８３：４４３８−４４４２ （１９８５）， Ｌｅｄｅｒ等による米国特許第４，７３６，８６６号及び同第４，８７０，００９号、Ｗａｇｎｅｒ等による米国特許第４，８７３，１９１号、Ｇｅｒｍｅｎ等による米国特許第６，１２７，５９８号、及びＭａｎｉｐｕｒａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎ． Ｙ．， （１９８６）参照；微粒子銃については、Ｓａｎｄｆｏｒｄ等による米国特許第４，９４５，０５０号参照；遺伝子組み換えショウジョウバエについては、Ｒｕｂｉｎ及びＳｐｒａｄｌｉｎｇ， Ｓｃｉｅｎｃｅ （１９８２） ２１８：３４８−５３ 及び米国特許第４，６７０，３８８号参照；遺伝子組み換え昆虫については、Ｂｅｒｇｈａｍｍｅｒ Ａ．Ｊ． 等， Ａ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｍａｒｋｅｒ Ｆｏｒ Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｉｎｓｅｃｔｓ （１９９９） Ｎａｔｕｒｅ ４０２：３７０−３７１参照；遺伝子組み換えゼブラフィッシュについては、Ｌｉｎ Ｓ．， Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｚｅｂｒａｆｉｓｈ， Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ． （２０００） ； １３６：３７５−３８３０参照；魚類、両生類の卵及び鳥類の微量注入方法については、Ｈｏｕｄｅｂｉｎｅ 及びＣｈｏｕｒｒｏｕｔ， Ｅｘｐｅｒｉｅｎｔｉａ （１９９１） ４７： ８９７−９０５参照；遺伝子組み換えラットについては、Ｈａｍｍｅｒ等， Ｃｅｌｌ （１９９０） ６３：１０９９−１１１２参照；並びに電気穿孔法、リン酸カルシウム／ＤＮＡ沈殿法及び直接注入等の方法を用いたＤＮＡの胚幹（ＥＳ）細胞への導入によるＥＳ細胞の培養と遺伝子組み換え動物のその後の方法については、例えばＴｅｒａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａｓ ａｎｄ Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ， Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ， Ｅ． Ｊ． Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ， 編， ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ （１９８７）参照）。非ヒト遺伝子組み換え動物のクローンを利用可能な方法（Ｗｉｌｍｉｔ， Ｉ．等 （１９９７）Ｎａｔｕｒｅ ３８５：８１０−８１３；及びＰＣＴ国際公報番号ＷＯ９７／７６６８及びＷＯ９７／０７６６９）に従って作製することができる。
【００４２】
一実施態様では、遺伝子組み換え動物は、ＲＲＰ機能の低下を生じる、好ましくはＲＲＰ発現が検出されない或いは僅かである、内因性ＲＲＰ遺伝子の配列においてヘテロ接合性又はホモ接合性の改変を有する「ノックアウト」マウスである。ノックアウト動物は通常、ノックアウトされる遺伝子の少なくとも一部を有する導入遺伝子を含むベクターを用いた相同性組み換えにより作製される。典型的に欠失、付加又は置換を導入遺伝子に導入して機能的に破壊している。導入遺伝子はヒト遺伝子（例えば、ヒト遺伝子クローン）でありうるが、より好ましくは導入遺伝子宿主種から誘導されるヒト遺伝子のオルソログである。例えば、マウスＲＲＰ遺伝子は、マウスゲノムの内因性ＲＲＰ遺伝子を改変するのに適した相同性組み換えベクターを構築するのに使用される。相同性組み換えのための詳細な方法論が利用できる（Ｃａｐｅｃｃｈｉ， Ｓｃｉｅｎｃｅ （１９８９） ２４４：１２８８−１２９２； Ｊｏｎｅｒ等， Ｎａｔｕｒｅ （１９８９） ３３８：１５３−１５６）。非齧歯類遺伝子組み換え動物及び他の動物の作製手段もまた、入手可能である（Ｈｏｕｄｅｂｉｎｅ 及びＣｈｏｕｒｒｏｕｔ，上掲； Ｐｕｒｓｅｌ等， Ｓｃｉｅｎｃｅ （１９８９） １２８１−１２８８； Ｓｉｍｍｓ等， Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ （１９８８） ６：１７９−１８３）。
【００４３】
他の実施態様では、遺伝子組み換え動物は、例えば、ＲＲＰの更なる複製の導入、又はＲＲＰ遺伝子の内因性複製の改変された発現を提供する調節配列を有効に挿入すること等によってＲＲＰ遺伝子の改変された発現（例えば、増大（異所を含む）又は減少した発現）を生じるゲノムにおける改変を有する「ノックアウト」動物である。このような調節配列は誘導性、組織特異的、及び構成性のプロモータ及びエンハンサーエレメントを含む。ノックインはホモ接合性又はヘテロ接合性であり得る。
また、導入遺伝子非ヒト動物は、導入遺伝子の調節された発現を可能にする選択されたシステムを含むものが作られる。このようなシステムの一態様は、バクテリオファージＰ１のｃｒｅ／ｌｏｘＰリコンビナーゼシステム（Ｌａｋｓｏ等， ＰＮＡＳ （１９９２） ８９：６２３２−６２３６；米国特許第４，９５９，３１７号）である。ｃｒｅ／ｌｏｘＰリコンビナーゼシステムが導入遺伝子の発現を制御するために使用される場合、Ｃｒｅリコンビナーゼ及び選択されたタンパク質の両方をコードする導入遺伝子を含む動物を必要とする。このような動物は、例えば一方が選択タンパク質をコードする導入遺伝子を含み、他方がリコンビナーゼをコードする導入遺伝子を含む２つの遺伝子組み換え動物を交配すること等によって、「二重」遺伝子組み換え動物の構築を通して得ることができる。リコンビナーゼシステムの他の例は、酵母のＦＬＰリコンビナーゼシステムである（Ｏ’Ｇｏｒｍａｎ等 （１９９１） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５１：１３５１−１３５５； 米国特許第５，６５４，１８２号）。
【００４４】
遺伝子改変動物は、ＥＧＦＲ経路をさらに解明するための遺伝子研究に、欠陥のあるＥＧＦＲ経路に関連する疾患及び障害の動物モデルとして、並びに上記の同定スクリーニングで同定したもの等の候補治療薬のｉｎ ｖｉｖｏ試験の目的で使用することができる。候補治療薬を改変されたＲＲＰ機能を有する遺伝子改変動物に投与し、遺伝子の変化を適したコントロール動物、例えばプラセボ治療を受けた遺伝子改変動物、及び／又は候補治療薬を受けた改変していないＲＲＰ発現を有する動物等と比較する。
【００４５】
遺伝子治療
また、本発明のＲＲＰ配列は、遺伝子治療に利用できるであろう（Ｍｉｌｌｅｒ， Ｎａｔｕｒｅ ３５７：４５５−１６０， １９９２； Ｂａｄｉａｖａｓ ＥＶ及びＦａｌａｎｇａ Ｖ．， Ｊ． Ｄｅｒｍａｔｏｌ （２００１） Ａｐｒ； ２８（４）： １７５−９２； Ｍａｒｏｎ等 Ｓｕｒｇ Ｏｎｃｏｌ Ｃｌｉｎ Ｎ Ａｍ （２００１） Ａｐｒ； １０（２）： ４４９−６０； 及びＭｕｌｌｉｇａｎ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６０：９２６−９３１ （１９９３））。遺伝子治療の近年の進歩により、肯定的な結果が得られている。
好ましい実施態様の一つには、ＲＲＰコーディング配列を含む発現ベクター、例えばドミナントネガティブ型が細胞に挿入される。細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏで育成し、次いで患者に注入する。他の好ましい実施態様では、異種プロモーター又はエンハンサーを含むＤＮＡセグメントを本発明のＲＲＰをコードする内因性遺伝子を含む細胞に導入し、このような方法では、プロモーター／エンハンサーセグメントが内因性ＲＲＰ遺伝子の発現を促進する（例えば、プロモーターセグメントが内因性ＲＲＰ遺伝子に直接結合するような細胞に移動する）。
【００４６】
遺伝子治療には、腫瘍を標的としたＲＲＰｃＤＮＡを含むアデノウィルスの使用、加工した細胞の移植による全身性ＲＲＰ増加、ＲＲＰをコードするウィルスの注入、又は適切な組織への裸のＲＲＰ ＤＮＡの注入を包含する。
一以上のタンパク質複合体成分の改変形態を導入することによって、このような複合体の活性を調節するように標的細胞集団を修飾することができる。例えば、標的細胞内で複合体成分活性を減少又は阻害することによって、症状を引き起こす異常なシグナル伝達を低下、抑制、又は後退させうる。タンパク質複合体の他の成分と相互作用する能力は保持するが、シグナル伝達で機能することができない成分の欠失又はミスセンス突然変異は、異常で有害なシグナル伝達を抑制するのに使用されうる。
【００４７】
レトロウィルス、ワクシニアウィルス、アデノウィルス、アデノ随伴ウィルス、ヘルペスウィルス、幾つかのＲＮＡウィルス、又はウシパピローマウィルス等のウィルスから誘導される発現ベクターは、本発明のタンパク質の組み換えＲＲＰをコードするヌクレオチド配列（例えば、ｃＤＮＡ）の標的細胞集団（例えば、腫瘍細胞）への供給に使用することができる。コーディング配列を含む組み換えウィルスベクターを構築するために当業者によく知られる方法を使用することができる（Ｍａｎｉａｔｉｓ等， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｎ．Ｙ．， １９８９； Ａｕｓｕｂｅｌ等， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｎ．Ｙ．， １９８９）。あるいは、タンパク質配列をコードする組み換え核酸分子は、裸のＤＮＡとして又は再構築システムで、例えば標的細胞に供給するためのリポソーム又は他の脂質システムで使用することができる（例えば、Ｆｅｌｇｎｅｒ等， Ｎａｔｕｒｅ ３３７：３８７−８， １９８９）。ヒトの遺伝子治療での使用のためにプラスミドＤＮＡを細胞に直接導入するための幾つかの他の方法があり、タンパク質にプラスミドＤＮＡを複合させることによって細胞のレセプターに対してＤＮＡを標的化させることに関する（Ｍｉｌｌｅｒ， 上掲）。
【００４８】
その最も簡単な形態には、微量注入法により単に細胞の核に微量のＤＮＡを注入することによって、遺伝子導入を実施することができる（Ｃａｐｅｃｃｈｉ， Ｃｅｌｌ ２２：４７９−８８， １９８０）。組み換え遺伝子が細胞に導入されると、それらを転写及び翻訳の細胞の通常のメカニズムにより認識することができ、遺伝子産物が発現されうる。また、より多数の細胞にＤＮＡを導入するために他の方法も試みられている。これらの方法には：ＤＮＡをリン酸カルシウムで沈殿させて飲作用により細胞に取り込むトランスフェクション（Ｃｈｅｎ等， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． ７：２７４５−５２， １９８７）；細胞に大きな電圧衝撃を与えて膜に孔を形成する電気穿孔法（Ｃｈｕ等， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １５： １３１１−２６， １９８７）；ＤＮＡを標的細胞と融合する親油性の小胞で包むリポフェクション／リポソーム融合（Ｆｅｌｇｎｅｒ等， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ． ８４： ７４１３−７４１７， １９８７）；及び小弾丸に結合させたＤＮＡを用いる微粒子銃（Ｙａｎｇ等， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ８７：９５６８−９５７２， １９９０）を含む。ＤＮＡを細胞に導入する他の方法は、化学的に修飾したタンパク質へのＤＮＡの結合がある。
【００４９】
アデノウィルスタンパク質は、エンドソームの不安定化及びＤＮＡの細胞への取り込み促進の能力がある。ＤＮＡ複合体を含む溶液へのアデノウィルスの混合、又はタンパク質結合剤を用いたアデノウィルスに共有的に接着するポリリシンへのＤＮＡの結合は、組み換え遺伝子の取り込み及び発現を実質的に改善する（Ｃｕｒｉｅｌ等， Ａｍ． Ｊ． Ｒｅｓｐｉｒ． Ｃｅｌｌ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， ６：２４７−５２， １９９２）。
遺伝子導入、細胞への外来核酸分子の導入方法は、通常、遺伝子によりコードされる特定の産物の発現を可能にするために実施される。産物には、タンパク質ポリペプチド、アンチセンスＤＮＡ又はＲＮＡ、或いは酵素活性ＲＮＡを含みうる。遺伝子導入は、培養細胞で、或いは動物への直接投与により実施することができる。一般に遺伝子導入は、非特異的又はレセプター媒介相互作用による標的細胞との核酸接触、膜を通した又はエンドサイトーシスによる細胞への核酸の取り込み、並びに原形質膜又はエンドソームから原形質への核酸の放出の工程を含む。さらに発現は、細胞の核への核酸の移動及び転写に適した他の核因子の結合を必要としうる。遺伝子導入は、細胞のｅｘ ｖｉｖｏで実施して次いで患者に移植することができ、あるいは患者に核酸又は核酸タンパク質複合体を直接投与することにより実施することができる。
【００５０】
他の好ましい実施態様では、ＲＲＰポリペプチドをコードする核酸配列を有するベクターは、核酸配列を特定の組織のみで発現するように提供される。組織特異的遺伝子発現を得る方法は、１９９２年１１月３日に出願され１９９３年５月１３日に公開された国際公報番号ＷＯ９３／０９２３６に説明される。
上に説明される上記全てのベクターにおいて、本発明の更なる態様としては、ベクターに含まれる核酸配列が上述のように核酸の幾つか又は全ての配列の付加、欠失又は修飾を含むものがある。
他の好ましい実施態様では、動物においてｉｎ ｖｉｖｏで発現することができる核酸配列を供給することで動物で不足又は欠陥のある内因性遺伝子の機能を提供又は増強する遺伝子置換の方法が示される。
次の実験部分及び実施例は例示にのために提供され、限定するためのものではない。
【００５１】
（実施例、手順及び発現方法）
Ｉ．高処理Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ蛍光偏光アッセイ
蛍光標識ＲＲＰペプチド／ＴＧＦ−αポリペプチドを、９６穴マイクロタイタープレートの各ウェルに試験バッファー（１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１０ｍＭのＮａＣｌ、６ｍＭの塩化マグネシウム、ｐＨ７．６）に選択される試験化合物と共に加える。次いで蛍光偏光の量をフルオロライト（Ｆｌｕｏｒｏｌｉｔｅ）ＦＰＭ−２蛍光偏光マイクロタイターシステム（Ｄｙｎｅｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｉｎｃ）を用いることにより測定する。
【００５２】
ＩＩ．構造検出器−ＥＬＩＳＡ形式アッセイ
グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ／ＴＧＦ−αポリペプチド融合タンパク質とビオチニル化ＲＲＰの種々の組み合わせを、マイクロタイタープレート（ＰｉｅｒｃｅからのＳｕｐｅｒ−Ｂｌｏｃｋｉｎｇ 試薬により遮断されているＲｅａｃｔｉ−Ｂｉｎｄ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−Ｃｏａｔｅｄ， Ｗｈｉｔｅ Ｐｏｌｙｓｔｙｒｅｎｅ プレート（＃１５１１８Ｂ））の各ウェルのアッセイバッファー（０．０１ＭのＨＥＰＥＳ、０．１５ＭのＮａＣｌ、０．００２ＭのＭｇＣｌ２）中にに加える。次いで試験化合物を各ウェルに加え、室温で１時間インキュベートする。次に、抗ＧＳＴ、ウサギ及び抗ウサギ抗体を各ウェルに加え、氷上で１時間インキュベートする。次にプレートを水で洗浄し、希釈したスーパーシグナル基質を各ウェルに加え、次いで化学発光を測定する。
【００５３】
ＩＩＩ．高処理Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ結合アッセイ
アッセイバッファー（１００ｍＭのＫＣｌ、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．６、１ｍＭのＭｇＣｌ２、１％のグリセロール、０．５％のＮＰ−４０、５０ｍＭのβメルカプトエタノール、１ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ、プロテアーゼ阻害剤の反応混液）中の３３Ｐ標識したペプチドを対象とする化合物と共にＮｅｕｔｒａｌｉｔｅアビジンで被覆したアッセイプレートのウェルのに添加し、２５℃で１時間インキュベートする。次に、ビオチニル化ＴＧＦαポリペプチドを各ウェルに添加し１時間インキュベートする。ＰＢＳで洗浄して反応を停止し、シンチレーションカウンターでカウントする。アッセイのコントロールは各プレートにあり、非ビオチニル化ＴＧＦαポリペプチドである。
【００５４】
ＩＶ．発現分析
次の実施例で使用される全ての細胞株はＮＣＩ（米国国立ガン研究所）の株であり、ＡＴＣＣ（アメリカンタイプカルチャーコレクション、マナッサス、バージニア州 ２０１１０−２２０９）から入手可能である。正常及び腫瘍細胞はＩｍｐａｔｈ社、ＵＣ Ｄａｖｉｓ社、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社、及びＡｍｂｉｏｎ社から入手した。
ＴａｑＭａｎ（登録商標）（ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社）を正常ヒト組織、対応大腸腫瘍及び正常サンプル、乳、卵巣、肺、前立腺、及び肝臓癌の保存腫瘍組織における正常組織と腫瘍細胞株を比較したヒトＲＲＰ１、ＲＲＰ２、及びＲＲＰ３の発現の分析に用いた。方法は全て製造業者の手順書に従って実施した。
【００５５】
正常ヒト組織サンプル。試験される全ての組織において全てのロンボイドの遍在する発現を観察し、最も高いレベルの発現は脳であった。また、ＲＲＰ３について脊髄でより高い発現が観察された。
対応腫瘍及び正常サンプル。正常対応に比べて大腸腫瘍で高い発現が、ＲＲＰ１については１８の腫瘍のうち８つで、ＲＲＰ２については１９の腫瘍のうち１つで、ＲＲＰ３については１８腫瘍のうち４つで見られた。さらに、ＲＲＰ１は乳、卵巣、肺、前立腺及び肝臓癌の保存腫瘍組織で正常に比較して高い発現を示した。ＲＲＰ２は、乳腫瘍の１つの保存物と卵巣組織の２つの保存物において対応正常組織に比較して過剰発現した。ＲＲＰ３発現は、肺腫瘍組織の１つの保存物において対応正常組織に比較して増加した。
腫瘍細胞株。リンパ腫、肺、乳、及び大腸癌細胞株をこれらの研究に使用した。ＲＲＰ１は、全ての腫瘍株で発現され、大腸癌において最も高い発現レベルであり；ＲＲＰは乳癌株においてのみ増大した発現を示し；ＲＲＰ３発現は乳及び大腸癌株において僅かに増加したが、肺癌株では著しく増加した。
【００５６】
Ｖ．細胞生物学及び機能の特徴付け
ＲＲＰの局在。ショウジョウバエでは、ロンボイドは細胞表面タンパク質である。しかしながら、ヒトＲＲＰの位置確認は現在までなされていない。さらに、ヒトにおいてロンボイドの各末端が細胞内にあるのか細胞外にあるのか分かっていない。これらの疑問に答えるために、ＲＲＰ１を製造業者の手順書に従ってｃ末端のｍｙｃ−ｈｉｓタグを含む部分でｐｃＤＮＡ発現ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にサブクローニングした。できた発現ベクターを、ヒト胎児腎臓ＨＥＫ−２９３細胞にリポフェクタミンプラス試薬（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて一過性にトランスフェクトした。次に抗ｍｙｃ抗体を用いた免疫蛍光染色を細胞上で実施し、ＲＲＰ１を定位した。これらの実験の結果は、ＲＲＰ１が細胞表面に発現されることを示した。さらに、透過させた（ＰＢＳ中に０．１％のトリトン）細胞と透過させていない細胞は同じ染色パターンを表し、タンパク質のｃ末端が外側に、Ｎ末端が内側にあることを示す。また、ＲＲＰ２及びＲＲＰ３をサブクローニングし、各タンパク質の位置確認のためにｃ末端を標識付けし、それぞれの場合でタンパク質末端の方向を判断した。
【００５７】
ＥＧＦＲシグナル経路におけるＲＲＰの関与。ショウジョウバエのロンボイドはＥＧＦＲ経路において必須であるが、ヒトＲＲＰの機能は現在まで判断されていない。ＥＧＦＲシグナル経路におけるヒトＲＲＰの役割を判断するために、ＲＲＰ１をＣａＰＯ４トランスフェクションキット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いて内因性ＥＧＦＲ活性を有するＨｅｌａ細胞に安定にトランスフェクトした。次に、保存した安定な細胞で次のアッセイを実施した。
チロシンリン酸化により測定されるＥＧＦＲ活性化
ＲＲＰ１を過剰発現するＨｅｌａ細胞と親Ｈｅｌａ細胞を、抗ホスホチロシン抗体（Ｕｐｓｔａｔｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を用いた抗ホスホチロシンに対する免疫ブロットによりＥＧＦＲチロシンリン酸化について試験した。ＲＲＰ１を過剰発現する細胞を親Ｈｅｌａコントロールに比較して２倍増加したＥＦＦＲチロシンリン酸化を示した。
【００５８】
ＲＲＰ１を過剰発現する細胞のＥＧＦＲ発現
ＲＲＰ１を過剰発現する細胞の直接細胞可溶化物に対する抗ＥＧＦＲ抗体を用いた免疫ブロットにより試験した場合に、ＥＧＦＲの発現は増加した。さらにまた、ＥＧＦＲの発現は、ＴａｑＭａｎ（登録商標）によりＲＲＰ１を過剰発現する腫瘍サンプルにおいて増加した。ＥＧＦＲ及びＲＲＰ１の一致した過剰発現についてのｉｎ−ｖｉｔｒｏ及びｉｎ−ｖｉｖｏ両方の結果の相関は、非常に顕著で、あらゆる腫瘍サンプル又は細胞株における２つのタンパク質の機能の関係を評価するための手段を提供するものである。
【００５９】
細胞増殖及び遊走
ＲＲＰ１を過剰発現するＨｅｌａ細胞は、Ｐｒｏｃｈｅｃｋ（Ｉｎｔｅｒｇｅｎ）及びアラマーブルー（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）化学発光アッセイにより測定され、Ｈｅｌａ親細胞に比較して２倍増加した細胞増殖を示す。さらに、Ｆｌｕｒｏｂｌｏｋ（ＢＤ Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ）分析は、Ｈｅｌａ親細胞に比較してＲＲＰ１を過剰発現する細胞の運動性のわずかな増加を示した。
まとめると、これらの結果は、進化を通じるロンボイドの強い機能的保存を示す。さらに腫瘍サンプル及び細胞株で増加したＲＲＰ１発現、同時に起こるＥＧＦＲの増加した発現、並びにＲＲＰ１を発現する細胞の増加した増殖及び運動性は、様々な癌におけるＲＲＰ１の関与を示唆している。従って、ＲＲＰ１発現レベルは、欠陥のあるＥＧＦＲ経路で腫瘍をスクリーニングして、本発明の方法により同定される化合物及び抗体を用いた治療を受け入れる腫瘍を同定するために使用することができる。上述の実施例はＥＧＦＲシグナル経路におけるそれらの関与を評価するためにＲＲＰ２及びＲＲＰ３でも実施される。
【００６０】
ＲＲＰ１結合標的。ショウジョウバエにおいて、ロンボイドはＳｐｉｔｚ（ヒトＴＧＦ−αのホモログ）を膜結合から分泌形態に形質転換させて、ＤＥＲ（ショウジョウバエＥＧＦＲ）経路を誘発及び上方制御する。このような機能はヒトロンボイドには見られない。ＨＥＫ２９３細胞をＲＲＰ１及びＴＭ−ＴＧＦ−α（膜貫通−結合性ＴＧＦ）を一過性に同時形質移入し、次いで抗ｍｙｃ抗体（ＲＲＰ１に対する）で免疫沈降し、抗ＴＧＦαで免疫ブロットした。ベクターのみ、ＲＲＰ１のみ、又はＴＭ−ＴＧＦ−αのみで形質移入した細胞をコントロールとして使用した。ＴＧＦ−αに相当する帯を抗ＴＧＦ−α抗体により認識したが、コントロールの列には帯は検出されなかった。このデータは、ＲＲＰ１がＴＧＦ−αと物理的に相互作用することを示す。結合パターンを決定するために同じ実験をＲＲＰ２及びＲＲＰ３でも実施される。
【００６１】
ヒトロンボイドに対する抗体。ペプチド抗体、配列番号：７はペプチド１と称され、ＲＲＰ１のＮ末端に対して作製された。この抗体は、例えばホルマリンで固定した細胞又はウェスタンブロットでのタンパク質等で変性ＲＲＰ１に対して強い親和性を示した。さらに、細胞の透過処理と同時に残った染色パターンは、抗ｍｙｃ抗体（ＲＲＰ１のｃ末端に対する）及びペプチド１で共に染色され、ペプチド１がＲＲＰ１を認識することが示唆された。さらに、細胞は、それらが透過処理されたときにのみ顕著に免疫染色され、ＲＲＰ１のＮ末端が細胞の中にあることを示唆した。この結果は、Ｃ末端の抗ｍｙｃ抗体を用いた前記の染色パターンに相関する。
【００６２】
腫瘍におけるＲＲＰ１タンパク質発現をペプチド１を用いた免疫組織化学（ＩＨＣ）により試験した。大腸腺癌組織部分の上皮細胞のポジティブ染色を免疫前血清におけるバックグラウンド染色に比較して観察し、抗体が大腸癌細胞の標的、ＲＲＰ１に特異的であることが示唆された。さらに、結腸直腸腺癌の増加した染色を、ペプチド１抗体を用いて対応する正常組織に比較して観察した。まとめると、これらの結果は、ペプチド１抗体が腫瘍サンプルにおけるＲＲＰ１の発現レベルを評価するための有力な手段であることを示唆する。また、抗体は腫瘍における発現レベルを評価するためにＲＲＰ２及びＲＲＰ３に対しても作製される。
【００６３】
当業者であれば、本発明が目的を達成し、上記の結果及び利点並びにそれらが本来持ち合わせるものが得られるようにうまく適合させることが容易に理解されるであろう。ここで記載される分子複合体及び方法、手順、処理、分子、特定の化合物は、好ましい実施態様の現在の代表的なものであり、例示であって、本発明の範囲を限定することを意図するものではない。当業者であれば、本発明の範囲及び精神から逸脱することなくここに記載される発明について多様な置換及び改変がなされうることが容易に理解されるであろう。
本明細書中に引用する全ての特許出願および出版物は、本発明が属する技術の水準の例である。全ての特許出願および出版物は、あたかもそれぞれ個々の文献が具体的に及び個々に参考文献として援用されることが示されるかのように、ここで参考文献として援用される。
【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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