(57)【要約】転移性結腸直腸癌の診断及び治療に使用することができる方法及び組成物が、明らかにされている。更に、転移性結腸直腸癌のモジュレーターを同定するために使用することができる方法も本願明細書に説明されている。【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者からの細胞中の転移性結腸直腸癌-関連転写産物を検出する方法であり、患者からの生物学的試料を、配列表1-26に示された配列と少なくとも80％同一の配列に選択的にハイブリダイズするポリヌクレオチドと接触することを含む、方法。
【請求項２】
生物学的試料が単離された核酸を含む、請求項1記載の方法。
【請求項３】
ポリヌクレオチドが標識されている、請求項1記載の方法。
【請求項４】
ポリヌクレオチドが、固形物表面に固定されている、請求項1記載の方法。
【請求項５】
表1-26に示されたポリヌクレオチド配列からなる単離された核酸分子。
【請求項６】
請求項5記載の核酸を含む、発現ベクター。
【請求項７】
請求項6記載の発現ベクターを含む、宿主細胞。
【請求項８】
表1-26に示されたポリヌクレオチド配列を有する核酸分子によりコードされている、単離されたポリペプチド。
【請求項９】
請求項8記載のポリペプチドに特異的に結合する抗体。
【請求項１０】
抗体断片である、請求項10記載の抗体。
【請求項１１】
ヒト化された抗体である、請求項10記載の抗体。
【請求項１２】
患者からの生物学的試料中の転移性結腸直腸癌細胞を検出する方法であり、生物学的試料を、請求項9記載の抗体と接触することを含む、方法。
【請求項１３】
抗体が標識されている、請求項12記載の方法。
【請求項１４】
患者において転移性結腸直腸癌に特異的な抗体を検出する方法であり、患者からの生物学的試料を、表1-26からの配列を含む核酸によりコードされたポリペプチドと接触することを含む、方法。
【請求項１５】
転移性結腸直腸癌-関連ポリペプチドを変調する化合物を同定する方法であり：
(i)化合物を、転移性結腸直腸癌-関連ポリペプチドと接触する工程であり、ここでこのポリペプチドは、表1-26に示された配列と少なくとも80％同一の配列に選択的にハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされている、工程；及び
(ii)この化合物の該ポリペプチドに対する機能的作用を決定する工程を含む、方法。
【請求項１６】
機能的作用が、該ポリペプチドへのリガンド結合の測定により決定される、請求項15記載の方法。
【請求項１７】
患者の結腸直腸癌を治療するために、転移性結腸直腸癌-関連細胞の増殖を阻害する方法であり、表1-26に示された配列によりコードされたポリペプチドを変調する化合物の治療的有効量を対象へ投与する工程を含む、方法。
【請求項１８】
薬物スクリーニングアッセイであり：
(i)被験化合物を、結腸直腸癌を有する哺乳類又はそれから単離された細胞へ投与する工程；
(ii)処理した細胞又は哺乳類における表1-26に示された配列と少なくとも80％同一の配列に選択的にハイブリダイズするポリヌクレオチドの遺伝子発現のレベルを、対照細胞又は哺乳類における該ポリヌクレオチドの遺伝子発現レベルと比較する工程であり、ここでこのポリヌクレオチドの発現レベルを変調する被験化合物は、結腸直腸癌の治療の候補である、方法。
【請求項１９】
結腸直腸癌を有する哺乳類を治療するための医薬組成物であり、請求項18記載のアッセイにより同定された化合物及び生理的に許容できる賦形剤を含有する、医薬組成物。
【請求項２０】
患者からの細胞中の転移性結腸直腸癌-関連ポリペプチドを検出する方法であり、患者からの生物学的試料を、表1-26に示されたポリヌクレオチド配列を有する核酸分子によりコードされたポリペプチドに選択的に結合する抗体と接触する工程を含む、方法。
【請求項２１】
抗体が標識されている、請求項21記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、2001年2月27日に出願された米国特許出願第60/272,206号、2001年4月2日に出願された米国特許出願第60/281,149号、及び2001年4月17日に出願された米国特許出願第60/284,555号に関連しており、これらは全てその全体が本願明細書に参照として組入れられている。
【０００２】
発明の技術分野
本発明は、転移性結腸直腸癌に関連した核酸及びタンパク質発現プロファイルの同定、並びにそれらの核酸、産物及び抗体；並びに、転移性結腸直腸癌の診断及び治療におけるそのような発現プロファイル及び組成物の使用に関連している。本発明は更に、転移性結腸直腸癌を阻害する物質及び／又は標的を同定しかつ使用する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
結腸及び／又は直腸の癌(「結腸直腸癌」と称する)は、白人集団において、特に米国において重要である。結腸及び直腸の癌は、最も一般的には50歳以降の男女双方において生じる。これらは、侵襲性癌への正常結腸上皮の病理的悪性転換の結果として発症する。結腸直腸癌に関わりのある、多くの最近特徴付けられた遺伝的変化があり、これは、癌抑制遺伝子及び癌原遺伝子のふたつの遺伝子のクラスの突然変異を含み、最近の研究は、DNA修復遺伝子の突然変異も、腫瘍形成に関与し得ることを示唆している。例えば、癌抑制遺伝子である、大腸腺腫性ポリポーシス(APC)遺伝子の両対立遺伝子の突然変異の失活は、結腸直腸癌の初期の事象のひとつであるように見え、かつ開始事象でさえあるかもしれない。結腸直腸癌に関与した他の遺伝子は、MCC遺伝子、p53遺伝子、DCC(結腸直腸癌腫で欠失した)遺伝子及び他の染色体18q遺伝子、並びにTGF-βシグナル伝達経路の遺伝子を含む。検証のためには、「Molecular Biology of Colorectal Cancer」、238-299頁、Curr. Probl. Cancer、1997年9/10月号参照；同じく、Willams、Colorectal Cancer(1996)；Kinsella及びSchofield、Colorectal Cancer: A Scientific Perspective (1993)；Colorectal Cancer: Molecular Mechanisms、Premalignant State and its Prevention (Schmiegel及びScholmerich編集、2000年)；Colorectal Cancer: New Aspects of Molecular Biology and Their Clinical Applications (Hanskiら編集、2000年)；McArdleら、Colorectal Cancer (2000)；Wanebo、Colorectal Cancer (1993)；Levin、The American Cancer Society: Colorectal Cancer (1999)；Treatment of Hepatic Metastases of Colorectal Cancer (Nordlinger及びJaeck編集、1993年)；Management of Colorectal Cancer (Dunitzら編集、1998年)；Cancer: Principles and Practice of Oncology (Devitaら編集、2001年)；Surgical Oncology: Contemporary Principles and Practice (Kirbyら編集、2001年)；Offit、Clinical Cancer Genetics: Risk Counseling and Management (1997)；Radioiimmunotherapy of Cancer (Abrams及びFritzberg編集、2000年)；Fleming、AJCC Cancer Sタグing Handbook (1998)；Textbook of Radiation Oncology (Leibel及びPhillips編集、2000年)；及び、Clinical Oncology (Abeloffら編集、2000年)を参照のこと。
【０００４】
診断のための結腸直腸癌の造影には、問題が多く、限定的である。加えて、この腫瘍の管腔への転移、及び腫瘍細胞の限局的リンパ節への転移は、重要な予後因子である(例えば、PET in Oncology: Basics and Clinical Application (Ruhlmannら編集、1999年)参照)。例えば、5年生存率は、リンパ節転移を伴わない患者の80％から、リンパ節転移を伴う患者では45〜50％へ低下する。最近の報告は、結腸直腸癌のほぼ大半に存在するが正常組織には存在しないことが予め示されている、癌胎児抗原のmRNAの存在を基にした逆転写酵素-PCR法を用い、リンパ節からの微小転移を検出することができることを示している。Liefersら、New England J. of Med.、339(4):223 (1998)。加えて、結腸直腸癌は、肝臓に転移することが多い。しかし、これらの癌により示された遺伝子発現に関する情報が欠けていることは、本疾患を効果的に診断しかつ治療する能力を限定している。
【０００５】
従って、転移性結腸直腸癌の診断及び予後判定の方法並びに結腸直腸癌の効果的治療法が、望まれている。それに従い本願明細書には、転移性結腸直腸癌の診断及び予後判定に使用することができる方法が提供されている。更に、結腸直腸癌を変調、例えば治療する能力について、候補の治療的物質をスクリーニングするために使用することができる方法が提供される。加えて、転移性結腸直腸疾患及び他の転移性癌の治療的介入のための分子標的及び組成物が本願明細書に提供されている。
【発明の開示】
【０００６】
発明の概要
従って本発明は、転移性結腸直腸癌細胞においてアップレギュレーション及びダウンレギュレーションされる遺伝子のヌクレオチド配列を提供する。このような遺伝子及びこれらがコードしているタンパク質は、診断及び予後判定の目的に有用であり、かつ更に転移性結腸直腸癌を変調する治療的化合物、例えば抗体のスクリーニングのための標的としても有用である。本発明の核酸又はそれらがコードしたタンパク質を検出する方法は、多くの目的のために使用することができる。例は、結腸癌の早期検出、結腸癌治療後の経過観察及び再発の早期検出、結腸癌の療法に対する反応の経過観察、結腸癌の予後判定、結腸癌の療法の指示、術後の化学療法又は放射線療法についての患者の選択、療法の選択、腫瘍の予後、治療、又は治療に対する反応の決定、及び前癌性結腸腺腫の早期検出を含む。他の本発明の局面は、以下の本発明の説明により、当業者には明らかになるであろう。
【０００７】
ひとつの局面において、本発明は、患者からの細胞中の転移性結腸直腸癌-関連した転写産物の検出法を提供し、この方法は、患者からの生物学的試料を、表1-26に示した配列と少なくとも80％同一の配列と選択的にハイブリダイズするポリヌクレオチドと接触することを含む。
【０００８】
ひとつの態様において、このポリヌクレオチドは、表1-26に示された配列と少なくとも95％同一の配列に選択的にハイブリダイズする。別の態様において、このポリヌクレオチドは、表1-26に示された配列を含む。
ひとつの態様において、生物学的試料は、組織試料である。別の態様において、生物学的試料は、単離された核酸、例えばmRNAを含む。
ひとつの態様において、このポリヌクレオチドは、例えば蛍光標識により標識されている。
ひとつの態様において、このポリヌクレオチド、固形物表面に固定されている。
【０００９】
ひとつの態様において、患者は、転移性結腸直腸癌を治療するために治療措置を受けている。別の態様においては、患者は、転移性結腸直腸癌を有する疑いがある。
ひとつの態様において、患者はヒトである。
ひとつの態様において、この方法は更に、生物学的試料を該ポリヌクレオチドと接触する工程の前に、核酸を増幅する工程を含む。
【００１０】
別の局面において、本発明は、患者からの細胞において、転移性結腸直腸癌-関連した転写産物によりコードされたポリペプチドを検出する方法を提供し、この方法は、患者からの生物学的試料を、表1-26に示された配列と少なくとも80％同じ配列によりコードされたポリペプチドと特異的に結合する抗体と接触することを含む。
【００１１】
別の局面において、本発明は、転移性結腸直腸癌の治療的処置の効能を経過観察する方法を提供し、この方法は：(i)治療的処理を受けている患者から生物学的試料を提供する工程；及び、(ii)生物学的試料を、表1-26に示した配列と少なくとも80％同一の配列と選択的にハイブリダイズするポリヌクレオチドと接触することにより、生物学的試料中の転移性結腸直腸癌-関連転写産物のレベルを決定し、これにより療法の効能を経過観察する工程を含む。
ひとつの態様において、この方法は更に、(iii)転移性結腸直腸癌-関連転写産物のレベルを、治療的処置の前又は初期の患者からの生物学的試料中の転移性結腸直腸癌-関連転写産物のレベルと比較する工程を含む。
【００１２】
別の局面において、本発明は、転移性結腸直腸癌の治療的処置の効能の経過観察の方法を提供し、この方法は：(i)治療的処置を受けている患者から生物学的試料を提供する工程；及び、(ii)生物学的試料を、表1-26に示した配列と少なくとも80％同一の配列と選択的にハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされたポリペプチドと接触することにより、生物学的試料中の転移性結腸直腸癌-関連抗体のレベルを決定し、ここで該ポリペプチドは、転移性結腸直腸癌-関連抗体と特異的に結合し、これにより、該療法の効能を経過観察する工程を含む。
ひとつの態様において、この方法は更に、(iii)転移性結腸直腸癌-関連抗体のレベルを、治療的処置の前又は初期の患者からの生物学的試料中の転移性結腸直腸癌-関連抗体のレベルと比較する工程を含む。
【００１３】
別の局面において、本発明は、転移性結腸直腸癌の治療的処置の効能の経過観察の方法を提供し、この方法は：(i)治療的処置を受けている患者から生物学的試料を提供する工程；及び、(ii)生物学的試料を、抗体と接触することにより、生物学的試料中の転移性結腸直腸癌-関連ポリペプチドのレベルを決定し、ここでこの抗体は、表1-26に示した配列と少なくとも80％同一の配列と選択的にハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされたポリペプチドと特異的に結合し、これにより、該療法の効能を経過観察する工程を含む。
ひとつの態様において、この方法は更に、(iii)転移性結腸直腸癌-関連ポリペプチドのレベルを、治療的処置の前又は初期の患者からの生物学的試料中の転移性結腸直腸癌-関連ポリペプチドのレベルと比較する工程を含む。
【００１４】
ひとつの局面において、本発明は、表1-26に示したポリヌクレオチド配列からなる単離された核酸分子を提供する。
ひとつの態様において、発現ベクター又は細胞は、単離された核酸を含む。
ひとつの局面において、本発明は、表1-26に示したポリヌクレオチド配列を有する核酸分子によりコードされた単離されたポリペプチドを提供する。
【００１５】
別の局面において、本発明は、表1-26に示したポリヌクレオチド配列を有する核酸分子によりコードされた単離されたポリペプチドに特異的に結合する抗体を提供する。
ひとつの態様において、この抗体は、エフェクター成分、例えば蛍光標識、放射性同位元素又は細胞傷害性化学物質と複合される。
ひとつの態様において、この抗体は、抗体断片である。別の態様において、この抗体はヒト化されている。
【００１６】
ひとつの局面において、本発明は、患者からの生物学的試料中の転移性結腸直腸癌細胞を検出する方法を提供し、この方法は、生物学的試料を、本願明細書に説明されたような抗体と接触することを含む。
別の局面において、本発明は、患者の転移性結腸直腸癌に特異的な抗体を検出する方法を提供し、この方法は、患者からの生物学的試料を、表1-26の配列を含む核酸によりコードされたポリペプチドと接触すること含む。
【００１７】
別の局面において、本発明は、転移性結腸直腸癌-関連ポリペプチドを変調する化合物を同定する方法を提供し、この方法は：(i)化合物を転移性結腸直腸癌-関連ポリペプチドと接触し、このポリペプチドが、表1-26に示した配列と少なくとも80％同一の配列に選択的にハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされている工程；及び、(ii)化合物のポリペプチドに対する機能的作用を決定する工程を含む。
【００１８】
ひとつの態様において、機能的作用は、物理的作用、酵素的作用、又は化学的作用である。
ひとつの態様において、このポリペプチドは、真核宿主細胞又は細胞膜において発現される。別の態様において、このポリペプチドは、組換え体である。
ひとつの態様において、機能的作用は、該ポリペプチドに結合するリガンドの測定により決定される。
【００１９】
別の局面において、本発明は、患者における結腸直腸癌の治療のために、転移性結腸直腸癌-関連細胞の増殖を阻害する方法を提供し、この方法は、本願明細書に説明されたように同定された化合物を治療有効量対象に投与する工程を含む。
ひとつの態様において、この化合物は抗体である。
【００２０】
別の局面において、本発明は、薬物スクリーニングアッセイを提供し、これは：(i)被験化合物を、結腸直腸癌を有する哺乳類又はそれらから単離された細胞に投与する工程；(ii)処理した細胞又は哺乳類における表1-26に示した配列と少なくとも80％同一の配列に選択的にハイブリダイズするポリヌクレオチドの遺伝子発現レベルを、対照細胞又は哺乳類の該ポリヌクレオチドの遺伝子発現のレベルと比較する工程であり、ここで該ポリヌクレオチドの発現レベルを変調する被験化合物は、結腸直腸癌の治療のための候補である工程を含む。
【００２１】
ひとつの態様において、対照は、被験化合物で処理されていない、結腸直腸癌を有する哺乳類又はそれらからの細胞である。別の態様において、対照は、正常な細胞又は哺乳類である。
【００２２】
別の局面において、本発明は、本願明細書に説明されたアッセイにより同定された化合物を投与することを含む、結腸直腸癌を有する哺乳類を治療する方法を提供する。
別の局面において、本発明は、結腸直腸癌を有する哺乳類を治療するための医薬組成物を提供し、この組成物は、本願明細書に説明されたアッセイにより同定された化合物及び医薬として許容できる賦形剤を含有している。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
発明の詳細な説明
前述の目的に従い、本発明は、転移性結腸直腸癌を含む、結腸及び／又は直腸の癌(例えば、結腸直腸癌)の診断及び治療のための新規方法、更には結腸直腸癌を変調する組成物をスクリーニングする方法を提供する。本願明細書において「転移性結腸直腸癌」は、Dukes病期C又はDに分類されるような、結腸及び／もしくは直腸の腫瘍又は癌を意味する(例えば、Cohenら、Cancer of the Colon、「Cancer: Principles and Practice of Oncology」の1144-1197頁(Devitaら編集、第5版、1997年)参照；同じく、「ハリソン内科学」、1289-129頁(Wilsonら編集、第12版、1991年)を参照のこと)。「転移性結腸直腸癌の治療、経過観察、検出又は変調」は、転移性結腸直腸疾患を有する患者(Dukes病期C又はD)における転移性結腸直腸疾患の治療、経過観察、検出又は変調を含む。Dukes病期Aにおいて、腫瘍は、腸壁に浸潤しているが、貫通はしていない。Dukes病期Bにおいて、腫瘍は、腸壁を貫通しているが、まだリンパ関与はない。Dukes病期Cにおいて、癌は、限局的にリンパ節に関与している。Dukes病期Dにおいて、例えば肝臓、肺などの遠位部への転移がある。
【００２４】
表1-26は、転移している結腸直腸癌試料中で増大した又は減少した発現を示す遺伝子のヌクレオチド配列に関するUniGeneクラスター同定番号を提供する。表1-26は更に、UniGeneクラスターの一部であるヌクレオチド配列を提供する例証的寄託番号も提供している。表1-26において、提供された比は、わかっているDukes病期Bの生存者からの原発性腫瘍試料、対、転移性結腸直腸癌の患者からの肝転移試料について表わしている。これらの試料において、比は1よりも大きい、好ましくは1.5又はそれ以上、より好ましくは2.0又はそれ以上であるので、同定された遺伝子は、転移性試料において過小発現されている。表1-26において、提供された比は、わかっている転移性結腸直腸癌の患者からの肝転移試料、対、わかっているDukes病期B生存者からの原発性腫瘍試料についてを表わしている。これらの試料において、比は1よりも大きい、好ましくは1.5又はそれ以上、より好ましくは2.0又はそれ以上であるので、同定された遺伝子は、転移性試料において過剰発現されている。表1-26において、提供された比は、わかっているDukes病期Bの生存者からの原発性腫瘍試料、対、転移性結腸直腸癌の患者からの肝転移試料についてを表わしている。これらの試料において、比は1よりも小さい、好ましくは0.5又はそれ未満、より好ましくは0.25又はそれ未満であるので、同定された遺伝子は、転移性試料において過剰発現されている。生存者とは、5年間又はそれ以上疾患を有さない対象である。
【００２５】
表1-26において、提供された比は、わかっている転移性疾患の患者からの肝転移試料、対、正常な結腸組織からの組織試料を表わしている。これらの試料において、比は1よりも大きい、好ましくは1.5又はそれ以上、より好ましくは2.0又はそれ以上であるので、同定された遺伝子は、転移性試料において過剰発現されている。表1-26において、比は、わかっている転移性疾患の患者からの肝転移試料、対、正常な結腸組織からの組織試料を表わしている。これらの試料において、比は1よりも小さい、好ましくは0.5又はそれ未満、より好ましくは0.25又はそれ未満であるので、同定された遺伝子は、転移性試料において過小発現されている。
【００２６】
当業者は、表1-26に同定された配列は転移性結腸直腸癌試料において増大した又は減少した発現を示すにもかかわらず、本発明の配列、及びそれらでコードされたタンパク質は、Dukes病期A又はBの結腸直腸癌の患者における癌の診断、治療又は予防に使用することができることを認めるであろう。表1-26の遺伝子発現の変化は、対象が、転移性疾患に進行することのより大きい可能性又はより小さい可能性そ示すであろう。これらの配列は更に、前癌性結腸腺腫のような、前癌性又は良性の状態を診断、治療又は予防するために使用することもできる。表1-26の遺伝子についての遺伝子発現の変化は、対象が、癌又は転移性疾患に進行する可能性が大きいことを示すことも示さないこともある。従って、本願明細書は主に転移する結腸直腸癌に焦点を当てているが、以下に説明された方法は、非転移性結腸直腸癌(例えば、Dukes病期A及びB)並びに前癌性もしくは良性の状態(例えば、前癌性腺腫)にも適用することができる。
【００２７】
定義
用語「転移性結腸直腸癌タンパク質」又は「転移性結腸直腸癌ポリヌクレオチド」又は「転移性結腸直腸癌-関連転写産物」は、核酸及びポリペプチド多型の変種、アレル、突然変異体、及び種間ホモログを意味し、これは：(1)表1-26のUniGeneクラスターの又はこれに関連したヌクレオチド配列に対し、好ましくは少なくとも約25、50、100、200、500、1000個又はそれよりも多いヌクレオチドの領域について、約60％よりも大きいヌクレオチド配列同一性、65％、70％、75％、80％、85％、90％、好ましくは91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％又は99％もしくはそれよりも大きいヌクレオチド配列同一性を有するヌクレオチド配列を有し；(2)表1-26のUniGeneクラスターの又はこれに関連したヌクレオチド配列によりコードされたアミノ酸配列、又は保存的に修飾されたそれらの変種を含む免疫原に対して生じた抗体、例えばポリクローナル抗体に結合し；(3) 表1-26の核酸配列、もしくはそれらの相補体、及びそれらの保存的に修飾された変種に、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で特異的にハイブリダイズし；もしくは、(4)表1-26のUniGeneクラスターの又はこれに関連したヌクレオチド配列によりコードされたアミノ酸配列に対し、好ましくは少なくとも約25、50、100、200、500、1000個又はそれよりも多いアミノ酸領域について、約60％より大きいアミノ酸配列同一性、65％、70％、75％、80％、85％、90％、好ましくは91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％又は99％もしくはそれ以上のアミノ配列同一性を有する、アミノ酸配列を有する。ポリヌクレオチド又はポリペプチド配列は、典型的には、霊長類、例えばヒト；齧歯類、例えばラット、マウス、ハムスター；ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ又は他の哺乳類を含むが、これらに限定されるものではない哺乳類に由来している。「転移性結腸直腸癌ポリペプチド」及び「転移性結腸直腸癌ポリヌクレオチド」は、天然又は組換えの両方を含む。
【００２８】
「完全長」転移性結腸直腸癌タンパク質又は核酸は、1種又は複数の天然の野生型転移性結腸直腸癌ポリヌクレオチド又はポリペプチド配列に通常含まれるエレメントの全てを含む、転移性結腸直腸癌ポリペプチドもしくはポリヌクレオチド配列、又はそれらの変種を意味する。「完全長」は、翻訳後プロセシング又は選択的スプライシングを含むスプライシングの様々な段階の前、又は後であることができる。
【００２９】
本願明細書において使用される「生物学的試料」は、例えば転移性結腸直腸癌タンパク質、ポリヌクレオチド又は転写産物の、核酸又はポリペプチドを含有する生物学的組織又は液体の試料である。このような試料は、例えばヒトのような霊長類、又は例えばマウス及びラットのような齧歯類から単離された組織を含むが、これらに限定されるものではない。生物学的試料は、生検及び剖検試料のような組織の切片、組織学的目的で採取した凍結切片、血液、血漿、血清、喀痰、糞便、涙液、粘液、毛髪、皮膚なども含むことができる。生物学的試料は更に、患者組織に由来した外植片並びに初代及び／又は形質転換された細胞培養物も含む。生物学的試料は、典型的には真核生物から得られ、最も好ましくは哺乳類、例えば、チンパンジー又はヒトのような霊長類；ウシ；イヌ；ネコ；例えば、モルモット、ラット、マウスのような齧歯類；ウサギ；もしくは他の哺乳類；又は鳥類；爬虫類；魚類から得られる。
【００３０】
「生物学的試料の提供」は、本発明において説明された方法において使用するために生物学的試料を得ることを意味する。最も頻繁には、これは、動物由来細胞の試料の採取により行われるが、予め単離された(例えば、別のヒトから、別の時点で、及び／又は別の目的で単離された)細胞を用いることにより、もしくはin vivoにおいて本発明の方法を行うことにより、実現することもできる。処置又は転帰となる病歴を有する保管された組織は、特に有用であろう。
【００３１】
2種又はそれよりも多い核酸又はポリペプチド配列に関する用語「同一」又は％「同一性」は、BLAST又はBLAST 2.0配列比較アルゴリズムを以下に説明したデフォルトのパラメータで用いて測定したものと、又は手作業の並置及び肉眼による検査により、同じであるか、又は同一であるアミノ酸残基もしくはヌクレオチドを特定の割合を有する(すなわち、比較ウインドウ又は指定された領域について最大に対応するように比較されかつ並置された場合に、特定の領域について、約60％同一性、好ましくは70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、又はそれよりも高い同一性)ような、2種又はそれよりも多い配列又は部分配列を意味する(例えば、NCBIウェブサイト：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/などを参照のこと)。従ってこのような配列は、「実質的に同じ」と称される。この定義は、被験配列の相補性(compliment)を意味し、もしくはこれに適用することができる。この定義は、天然のものに加え、欠失及び／又は付加を有する配列、更には置換を有する配列、例えば多型又はアレル変種、及び人工の変種も含む。以下に説明するように、好ましいアルゴリズムは、ギャップなどに対処することができる。好ましくは、同一性は、長さが少なくとも約25個のアミノ酸又はヌクレオチドである領域について存在し、より好ましくは、長さが50〜100個のアミノ酸又はヌクレオチドの領域について存在する。
【００３２】
配列比較に関して、典型的には、ひとつの配列が、参照配列として作用し、これろ被験配列が比較される。配列比較アルゴリズムが使用される場合、被験配列及び参照配列が、コンピュータへ入力され、必要ならば、部分配列座標がデザインされ、かつ配列アルゴリズムプログラムパラメータが指定される。好ましくは、デフォルトのプログラムパラメータを使用することができ、もしくは代替パラメータを指定することができる。その後この配列比較アルゴリズムが、プログラムパラメータを基に、参照配列に対する被験配列の配列同一性％をクラスター化する。
【００３３】
本願明細書において使用される「比較ウインドウ」は、ふたつの配列が最適に並置された後に、配列が同じ数の連続位置を有する参照配列と比較され得るような、典型的には20〜600個、通常約50〜約200個、より一般的には約100〜約150個からなる群より選択される連続位置の数の中のひとつのセグメントを参照することを含む。配列の並置法は当該技術分野において周知である。比較のための配列の最適な並置は、例えばSmith及びWatermanのAdv. Appl. Math.、2:482 (1981)のローカルホモロジーアルゴリズムにより、Needlenaan及びWunschのJ. Mol. Biol.、48:443 (1970)のホモロジーアラインメントアルゴリズムにより、Pearson及びLipmanのProc. Natl. Acad. Sci. USA、85:2444 (1988)の類似性検索法により、これらのアルゴリズムのコンピュータ援用の履行により(GAP、BESTFIT、FASTA、及びTFASTA、Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI)、又は手作業による並置及び肉眼による検証により、行うことができる(例えば、Current Protocols in Molecular Biology (Ausubelら編集、1995年、補遺)参照)。
【００３４】
配列同一性及び配列類似性を％で決定するアルゴリズムの好ましい例は、BLAST及びBLAST 2.0アルゴリズムを含み、これらはAltschulら、Nuc. Acids Res.、25:3389-3402 (1977)及びAltschulら、J. Mol. Biol.、215:403-410 (1990)に説明されている。BLAST及びBLAST 2.0は、本発明の核酸及びタンパク質の配列同一性％を決定するために、本願明細書に説明されたパラメータと共に使用される。BLAST解析を行うためのソフトウェアは、National Center for Biotechnology Information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)から公表されている。このアルゴリズムは、クエリー配列中の長さWの短いワードを同定することにより、高スコアセグメント(HSP)を最初に同定することに関連しており、これはデータベース中の同じ長さのワードと並置した場合に、いくつかの正値(positive-valued)閾値スコアTにマッチするか又はこれを満足する。Tは、隣接ワードスコア閾値と称される(Altschulら、前掲)。これらの最初の隣接ワードのヒットは、それらを含むより長いHSPを見つける検索を開始するための種として作用する。ワードヒットは、累積アラインメントスコアが増大し得る限りは、各配列に沿って両方向へと伸びる。累積スコアは、例えばヌクレオチド配列について、パラメータM(マッチする残基対に関する報償(reward)スコア；常に＞0)及びN(ミスマッチする残基に関するペナルティスコア；常に＜0)を用いて計算される。アミノ酸配列について、スコア行列を使用し、累積スコアが計算される。各方向へのワードヒットの伸長は、下記の場合に停止される：累積アラインメントスコアが、その最大到達値から量X離れた場合；1個又は複数の負-スコア化残基アラインメントの蓄積のために、累積スコアがゼロ又はそれ以下になった場合；又は、いずれかの配列の末端に達した場合を含む。BLASTアルゴリズムパラメータであるW、T及びXは、アラインメントの感度及びスピードを決定する。BLASTNプログラム(ヌクレオチド配列について)を、デフォルトとしてワード長(W)11、期待値(E)10、M=5、N=-4 及び両鎖の比較を使用する。アミノ酸配列について、BLASTPプログラムは、デフォルトとして、ワード長3、期待値(E)10、及びBLOSUM62スコア行列(Henikoff及びHenikoff、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、89:10915 (1989)参照)、50のアラインメント(B)、期待値(E)10、M=5、N=-4、及び両鎖の比較を使用する。
【００３５】
BLASTアルゴリズムは、ふたつの配列間の類似性の統計学的解析を行うことができる(例えば、Karlin及びAltschul、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、90:5873-5787 (1993)参照のこと)。BLASTアルゴリズムにより提供された類似性のひとつの測定は、最小和確立(smallest sum probability)(P(N))であり、これはふたつのヌクレオチド又はアミノ酸配列の間のマッチが偶然生じる確立の指標を提供する。例えば、被験核酸と参照核酸との比較において最小和確立が、約0.2未満、より好ましくは約0.01未満、最も好ましくは約0.001未満である場合に、核酸は、参照配列に類似していると見なされる。対数値は、大きい負の数であり、例えば、5、10、20、30、40、40、70、90、110、150、170などである。
【００３６】
ふたつの核酸配列又はポリペプチドが実質的に同じである指標は、以下に説明したように、第一の核酸によりコードされたポリペプチドは、第二の核酸によりコードされたポリペプチドに対して生じた抗体と免疫学的に交差反応性であることである。従って、例えばふたつのペプチドが保存的置換によってのみ異なる場合などは、ポリペプチドは、典型的には第二のポリペプチドと実質的に同じである。ふたつの核酸配列が実質的に同じであることの別の指標は、以下に説明したように、ふたつの分子又はそれらの相補体が互いに、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることである。ふたつの核酸配列が実質的に同じであることの更に別の指標は、同じプライマーを使用し、それらの配列を増幅することができることである。
【００３７】
「宿主細胞」は、発現ベクターを含み、かつこの発現ベクターの複製又は発現を支援する天然の細胞又は形質転換された細胞である。宿主細胞は、培養された細胞、外植片、in vivoの細胞などであることができる。宿主細胞は、E. coliのような原核細胞、又は酵母、昆虫、両生類又は哺乳類細胞、例えばCHO、HeLaなどのような真核細胞であることができる(例えば、American Type Culture Collectionカタログ又はウェブサイトwww.atcc.orgを参照のこと)。
【００３８】
用語「単離された」、「精製された」又は「生物学的に純粋な」とは、その未変性の状態で認められるような通常それに付随する成分を実質的に又は本質的に含まないような物質を意味する。純度及び等質性は、典型的には、ポリアクリルアミドゲル電気泳動又は高速液体クロマトグラフィーのような、分析化学技術を用いて決定される。調製物中に存在する顕著な種であるタンパク質又は核酸は、実質的に精製される。特に、単離された核酸は、天然には該遺伝子にフランキングしかつ該遺伝子によりコードされたタンパク質以外のタンパク質をコードしている一部のオープンリーディングフレームから分離される。一部の態様において、用語「精製された」は、核酸又はタンパク質が電気泳動ゲルにおいて本質的に1本のバンドを生じることを意味する。好ましくは、これは、核酸又はタンパク質が、少なくとも85％純粋である、より好ましくは少なくとも95％純粋である、及び最も好ましくは少なくとも99％純粋であることを意味する。別の態様における「精製する」又は「精製」は、少なくとも1種の夾雑物を精製されるべき組成物から除去することを意味する。この意味において、精製は、精製された化合物が均質であること、例えば100％純粋であることは必要としない。
【００３９】
用語「ポリペプチド」、「ペプチド」及び「タンパク質」は、本願明細書において互換的に使用され、アミノ酸残基のポリマーを意味する。これらの用語は、1個又は複数のアミノ酸残基が対応する天然のアミノ酸の人工的化学擬態であるようなアミノ酸ポリマーに加え、天然のアミノ酸ポリマー、修飾された残基を含むもの、及び非天然のアミノ酸ポリマーに適用される。
【００４０】
用語「アミノ酸」は、天然及び合成のアミノ酸に加え、天然のアミノ酸と同様に機能するアミノ酸アナログ及びアミノ酸擬態を意味する。天然のアミノ酸は、遺伝暗号によりコードされたものに加え、例えば、ヒドロキシプロリン、γ-カルボキシグルタミン酸、及び0-ホスホセリンのような、後に修飾されたそれらのアミノ酸である。アミノ酸アナログは、天然のアミノ酸と同じ基本的化学構造を有する化合物、例えば、水素、カルボキシル基、アミノ基及びR基に結合したα炭素、例えば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウムを意味する。このようなアナログは、修飾されたR基(例えば、ノルロイシン)又は修飾されたペプチド骨格を有してもよいが、天然のアミノ酸と同じ基本的化学構造を維持している。アミノ酸擬態は、アミノ酸の一般的化学構造と異なる構造を有するが、天然のアミノ酸と同様に機能する化学的化合物を意味する。
【００４１】
アミノ酸は、本願明細書において、通常知られている3文字表記又はIUIPAC-IUBの生化学命名委員会が推奨している1文字表記のいずれかにより示すことができる。同様にヌクレオチドは、それらの通常受け入れられている1文字コードで示すことができる。
【００４２】
「保存的に修飾された変種」は、アミノ酸配列及び核酸配列の両方に適用される。特定の核酸配列に関して、保存的に修飾された変種は、同じ又は本質的に同じアミノ酸配列をコードしているような核酸、又は核酸が、例えば天然の隣接配列のように本質的に同じ又は関連したアミノ酸配列をコードしていないような核酸を意味する。遺伝暗号の縮重のために、多数の機能的に同じ核酸が、ほとんどのタンパク質をコードしている。例えばコドンGCA、GCC、GCG及びGCUは、全てアミノ酸アラニンをコードしている。従って、アラニンがコドンにより特定化される各位置において、そのコドンは、コードされたポリペプチドを変更することなく、説明された対応する別のコドンに変更することができる。このような核酸変動は、「サイレント変動」であり、これは保存的に修飾された変動の一種である。本願明細書においてポリペプチドをコードしている各核酸配列は、核酸のサイレント変動も説明する。当業者は、ある状況において、核酸の各コドン(通常メチオニンの唯一のコドンであるAUG、及び通常トリプトファンの唯一のコドンであるTGGを除く)は修飾され、機能的に同じ分子を得ることができることを、認めるであろう。従って、ポリペプチドをコードしている核酸のサイレント変動は、発現産物に関して説明された配列に暗示されているが、実際のプローブ配列に関してはそうではないことが多い。
【００４３】
アミノ酸配列のように、当業者は、コードされた配列において1個のアミノ酸又は小さい割合のアミノ酸を変更し、付加し又は欠失するような、核酸、ペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質配列への個々の置換、欠失又は付加は、変更が、アミノ酸の化学的に類似したアミノ酸との置換の結果であるような、「保存的に修飾された変種」であることを認めるであろう。機能的に類似したアミノ酸を提供する保存的置換の表は、当該技術分野において周知である。このような保存的に修飾された変種は、加えて、本発明の多型変種、中間ホモログ、及びアレルであり、これらを排除しない。
【００４４】
下記の8群は各々、典型的に互いに保存的に置換するアミノ酸を含んでいる：1)アラニン(A)、グリシン(G)；2)アスパラギン酸(D)、グルタミン酸(E)；3)アスパラギン(N)、グルタミン(Q)； 4)アルギニン(R)、リシン(K)；5)イソロイシン(I)、ロイシン(L)、メチオニン(M)、バリン(V)；6)フェニルアラニン(F)、チロシン(Y)、トリプトファン(W)；7)セリン(S)、トレオニン(T)；及び、8)システイン(C)、メチオニン(M)(例えば、Creighton, Proteins (1984)を参照)。
【００４５】
ポリペプチド構造のような巨大分子構造は、組織化の様々なレベルに関して説明することができる。この組織化の一般的考察に関しては、例えばAlbertsらの「Molecular Biology of the Cell」(第3版、1994年)並びにCantor及びSchimmelの「Biophysical Chemistry Part I: The Conformation of Biological Macromolecules」(1980年)を参照のこと。「一次構造」は、特定のペプチドのアミノ酸配列を意味する。「二次構造」は、ポリペプチド内の局所的に並べられた三次元構造を意味する。これらの構造は、一般にドメインとして知られている。ドメインは、ポリペプチドの小型のユニットを形成することが多いポリペプチドの一部であり、かつ典型的には25〜約500個のアミノ酸の長さである。典型的ドメインは、ひと続きのβ-シート及びα-ヘリックスのようなより少ない組織化区域で構成される。「三次構造」は、ポリペプチドモノマーの完全な三次元構造を意味する。「四次構造」は、通常独立した三次ユニットの非共有的会合により形成された三次元構造を意味する。用語異方性は、エネルギー用語としても知られている。
【００４６】
本願明細書において使用される「核酸」又は「オリゴヌクレオチド」又は「ポリヌクレオチド」又は文法上の同等物は、互いに共有的に連結された少なくとも2個のヌクレオチドを意味する。オリゴヌクレオチドは、典型的には長さが約5、6、7、8、9、10、12、15、25、30、40、50又はそれよりも多いヌクレオチドであり、最大長さは約100ヌクレオチドである。核酸及びポリヌクレオチドは、例えば200、300、500、1000、2000、3000、5000、7000、10,000などのより長い長さを含む、いずれかの長さのポリマーである。本発明の核酸は、一般にホスホジエステル結合を含むが、場合によっては代替の骨格を有することがアル核酸アナログが含まれ、これは例えばホスホロアミダイト、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、又はO-メチルホスホロアミダイト連結(Eckstein、Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach、Oxford University Press社を参照のこと)；並びに、ペプチド核酸骨格及び連結を含む。その他のアナログ核酸は、正の(positive)骨格；非-イオン性骨格、及び非-リボース骨格を持つものを含み、これらは米国特許第5,235,033号及び第5,034,506号、並びにASCシンポジウムシリーズSeries 580、第6章及び第7章、Carbohydrate Modifications in Antisense Research、Sanghui及びCook編集を含む。1個又は複数の単素環式糖を含む核酸も、核酸の定義に含まれる。リボース-リン酸骨格の修飾は、様々な理由で成され、例えば、生理的環境におけるこのような分子の又はバイオチップ上のプローブとしての分子の安定性及び半減期を増大するために行われる。天然の核酸及びアナログの混合物は作成することができ；あるいは、異なる核酸アナログの混合物、並びに天然の核酸及びアナログの混合物を作成することができる。
【００４７】
特に好ましいのは、ペプチド核酸アナログを含むペプチド核酸(PNA)である。これらの骨格は、天然の核酸の高度に帯電したホスホジエステル骨格とは対照的に、中性の条件下で実質的に非-イオン性である。これは、ふたつの利点をもたらす。第一に、PNA骨格は、改善されたハイブリダイゼーション速度論を示す。PNAは、ミスマッチのために完全にマッチした塩基対に対し、融点(Tm)のより大きい変化を有する。DNA及びRNAは、典型的には、内部ミスマッチのために、Tmの2〜4℃の低下を示す。非-イオン性PNA骨格では、この低下は、7〜9℃に近い。同様に、それらの非-イオン性の特徴のために、これらの骨格に結合した塩基のハイブリダイゼーションは、塩濃度とは比較的切り離せないものである。加えてPNAは、細胞酵素によって分解されず、その結果より安定することができる。
【００４８】
核酸は、特定するように、一本鎖又は二本鎖であり、もしくは、二本鎖又は一本鎖化された両配列の一部を含む。当業者に理解されるように、一本鎖の既述は、相補鎖の配列も定義し；従って、本願明細書に説明された配列は、配列の相補体も提供する。核酸は、ゲノム及びcDNAの両方のDNA、RNA又はハイブリッドであることができ、ここで核酸は、デオキシリボ-及びリボ-ヌクレオチドの組合せ、並びにウラシル、アデニン、チミン、シトシン、グアニン、イノシン、キサンチン、ヒポキサンチン、イソシトシン、イソグアニンなどを含む塩基の組合せを含むことができる。「転写産物」は、典型的には、天然のRNA、例えばプレ-mRNA、hnRNA、又はmRNAを意味する。本願明細書に使用されるように用語「ヌクレオシド」は、ヌクレオチド並びにヌクレオシド及びヌクレオチドのアナログを含み、かつアミノ修飾したヌクレオシドのような修飾されたヌクレオシドを含む。加えて「ヌクレオシド」は、非天然のアナログ構造を含む。従って、例えば各々塩基を含むペプチド核酸の個々のユニットは、本願明細書においてヌクレオシドと称される。
【００４９】
「標識」又は「検出可能な部分」は、分光光学的手段、光化学的手段、生化学的手段、化学的手段又は他の物理的手段により検出可能な組成物である。例えば有用な標識は、32P、蛍光色素、高電子密度試薬、酵素(例えば、ELISAにおいて通常使用されるものなど)、ビオチン、ジゴキシゲニンもしくはハプテン及びタンパク質、又は例えばペプチドへの放射標識の組込みによるような、検出可能に作成された他の実体、もしくはペプチドに特異的に反応する抗体の検出のために使用される他の実体を含む。
【００５０】
「エフェクター」又は「エフェクター部分」又は「エフェクター成分」は、抗体へ、リンカーもしくは化学結合により共有的に、又はイオン結合、ファンデルワールス結合、静電結合もしくは水素結合により非共有的のいずれかで、結合された(又は連結、又は複合された)分子である。「エフェクター」は、様々な分子を含み、これは例えば、放射性化合物、蛍光化合物、酵素又は基質、エピトープタグのようなタグ、毒素を含む検出部分；活性化可能な部分、化学療法剤；リパーゼ；抗生物質；又は、例えばβ線のような「硬線(hard)」を放出する放射性同位元素を含む。
【００５１】
「標識された核酸プローブ又はオリゴヌクレオチド」は、標識へ、リンカーもしくは化学結合により共有的に、又はイオン結合、ファンデルワールス結合、静電結合もしくは水素結合により非共有的に結合されるものであり、その結果、このプローブの存在は、プローブに結合した標識の存在を検出することにより検出することができる。あるいは、高親和性相互作用を用いる方法は、結合パートナー対の一方が、他方、例えばビオチン、ストレプトアビジンなどへ結合する場合に同じ結果を達成することができる。
【００５２】
本願明細書において使用される「核酸プローブ又はオリゴヌクレオチド」は、1種又は複数種の化学結合を介し、通常相補的塩基対形成を介し、通常水素結合形成を介し、相補的配列の標的核酸に結合することが可能な核酸として定義される。本願明細書において使用されるプローブは、天然の塩基(すなわち、A、G、C、又はT)又は修飾された塩基(7-デアザグアノシン、イノシンなど)を含むことができる。加えて、プローブ中の塩基は、ハイブリダイゼーションを機能的に妨害しない限りは、ホスホジエステル結合以外の連結により結合することができる。従って例えばプローブは、構成塩基が、ホスホジエステル連結よりもむしろペプチド結合により結合されているペプチド核酸であることができる。当業者には、プローブは、ハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーに応じて、プローブ配列と完全な相補性を欠いている標的配列に結合し得ることは理解されるであろう。これらのプローブは、好ましくは同位元素、発色団、発光体、色素原により直接標識されるか、もしくはそれにストレプトアビジン複合体が後に結合するビオチンなどにより間接的に標識される。プローブの存在又は非存在をアッセイすることにより、選択配列又は部分配列の存在又は非存在を検出することができる。診断又は予後判定は、ゲノムレベル、又はRNAもしくはタンパク質発現レベルを基にしている。
【００５３】
例えば、細胞、又は核酸、タンパク質、もしくはベクターに関して使用される用語「組換え体」は、細胞、核酸、タンパク質又はベクターが、異種核酸又はタンパク質の導入もしくは未変性の核酸又はタンパク質の変更により修飾されること、もしくは細胞がそのように修飾された細胞に由来していることを意味する。従って例えば組換え細胞は、その細胞の未変性(非-組換え)型においては認められない遺伝子を発現するか、もしくはさもなければ異常に発現するか、過小発現される、又は全く発現しない未変性の遺伝子を発現する。本願明細書において用語「組換え核酸」は、概して、天然には通常認められない形の、例えばポリメラーゼ及びエンドヌクレアーゼを使用する核酸の操作により、in vitroにおいて当初形成された核酸を意味する。この方法において、異なる配列の機能的連結が実現される。従って線状の形の単離された核酸、又は通常は結合されないDNA分子のライゲーションによりin vitroにおいて形成された発現ベクターは、両方とも本発明の目的のための組換え体とみなされる。一旦組換え核酸が作成されかつ宿主細胞又は生物に再導入されるならば、非-組換え的に、すなわちin vitro操作よりもむしろ宿主細胞のin vivo細胞機構を用いて、複製するが；しかし、一旦組換え的に作成されたが、引き続き非-組換え的に複製されるこのような核酸も、依然本発明の目的のための組換え体と見なされることは理解される。同様に「組換えタンパク質」は、組換え技術を用い、すなわち前述のような組換え核酸の発現により、作成されたタンパク質である。
【００５４】
用語「異種」は、核酸の一部に関して使用される場合、その核酸が、自然状態では互いに同じ関係では通常認められないような2種又はそれよりも多い部分配列を含むことを意味する。例えば核酸は、典型的には組換え的に作出され、例えば、新規機能性核酸を作成するために配置された無関係の遺伝子から、2種又はそれより多い配列を有し、例としてひとつの給源からプロモーターを及び別の給源からコード領域を有する。同様に、異種タンパク質は、自然において互いに同じ関係では認められない2種又はそれよりも多い部分配列を意味することが多い(例えば、融合タンパク質)。
【００５５】
「プロモーター」は、核酸の転写を指示する核酸制御配列のアレイと定義される。本願明細書において使用されるように、プロモーターは、転写開始部位の近傍の必要な核酸配列、例えばポリメラーゼII型プロモーターの場合、TATAエレメントを含む。プロモーターは同じく、任意に遠位エンハンサー又はリプレッサーエレメントを含み、これらは、転写開始部位からの塩基対が数千にも達するように位置することができる。「構成的」プロモーターは、ほとんどの環境条件及び発生条件下で活性があるプロモーターである。「誘導性」プロモーターは、環境的又は発生的制御下で活性があるプロモーターである。用語「機能的に連結した」は、核酸発現制御配列(例えばプロモーター、又は転写因子結合部位のアレイ)と第二の核酸配列の間の機能性連結を意味し、ここでこの発現制御配列は、第二の配列に相当する核酸の転写を指示する。
【００５６】
「発現ベクター」は、宿主細胞において特定の核酸の転写を可能にする、一連の特定化された核酸エレメントを伴う、組換え的又は合成的に作成された核酸構築体である。発現ベクターは、プラスミド、ウイルス、又は核酸断片の一部であることができる。典型的には、発現ベクターは、プロモーターに機能的に連結されている転写されるべき核酸を含む。
【００５７】
語句「選択的(又は特異的)にハイブリダイズする」とは、配列が複雑な混合物(例えば、総細胞又はライブラリーDNAもしくはRNA)中に存在する場合に、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、分子が特定のヌクレオチド配列へのみ結合、二重鎖化又はハイブリダイズすることを意味する。
【００５８】
語句「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」とは、その条件下でプローブが、典型的には核酸の複雑な混合物中でその標的部分配列にハイブリダイズするが、本質的には他の配列にはハイブリダイズしないような条件を意味する。ストリンジェントな条件は、配列依存型であり、かつ異なる環境においては異なるであろう。より長い配列は、より高温で特異的にハイブリダイズする。核酸ハイブリダイゼーションに関する広範な指針は、Tijssenの「Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridiziation with Nucleic Probes」の「ハイブリダイゼーションの原理及び核酸アッセイ戦略の概観」(1993年)に見られる。一般に、ストリンジェントな条件は、所定のイオン強度pHにおいて、特定の配列についてサーマル融点(Tm)よりも約5〜10℃低いように選択される。Tmは、標的に相補的なプローブの50％が平衡状態で標的配列にハイブリダイズする温度(所定のイオン強度、pH、及び核酸濃度下)である(標的配列は、Tmで過剰に存在するので、プローブの50％は平衡状態で占拠されている)。ストリンジェント条件は、塩濃度が約1.0M未満のナトリウムイオンである条件であり、典型的にはpH7.0〜8.3で約0.01〜1.0Mナトリウムイオン濃度(又は他の塩)であり、その温度は、短いプローブ(例えば、10〜50ヌクレオチド)については低くとも約30℃であり、長いプローブ(例えば、50ヌクレオチドより大きい)については低くとも約60℃である。ストリンジェントな条件は、ホルムアミドのような脱安定化剤の添加により実現することもできる。選択的又は特異的ハイブリダイゼーションについて、正のシグナルは、バックグラウンドの少なくとも2倍であり、好ましくはバックグラウンドの10倍のハイブリダイゼーションである。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の例は、下記であることが多い：50％ホルムアミド、5x SSC、及び1％SDS、42℃でのインキュベーション、又は5x SSC、1％SDS、65℃でのインキュベーション、並びに0.2x SSC、及び0.1％SDS、65℃での洗浄。PCRについては、温度約36℃が、低ストリンジェンシーでの増幅のための典型であるが、アニーリング温度は、プライマー長に応じて、約32〜48℃を変動することができる。高ストリンジェンシーでのPCR増幅について、温度約62℃が典型であるが、高ストリンジェンシーでのアニーリング温度は、プライマー長及び特異性に応じて、約5O℃〜約65℃の範囲であることができる。高及び低ストリンジェンシー増幅に関する典型的サイクル条件は、変性相90℃〜95℃で30秒〜2分間、アニーリング相の30秒〜2分間の維持、及び伸長相の約72℃での1〜2分間を含む。高及び低ストリンジェンシー増幅反応に関するプロトコール及び指針は、例えばInnisらの「PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications」(1990年)に提供されている。
【００５９】
ストリンジェントな条件下では互いにハイブリダイズしない核酸は、これらがコードしているポリペプチドが実質的に同じである場合は、依然実質的に同じである。これは、例えば核酸コピーが遺伝暗号により許容される最大のコドン縮重を用いて作成される場合に生じる。このような場合、核酸は、典型的には中程度のストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする。「中程度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」の例は、40％ホルムアミド、1M NaCl、1％SDSの緩衝液中、37℃でのハイブリダイゼーション、及び1x SSC、45℃での洗浄を含む。正のハイブリダイゼーションは、バックグラウンドの少なくとも2倍である。当業者は、代わりのハイブリダイゼーション及び洗浄条件を利用し、同様のストリンジェンシーの条件を提供することができることが容易にわかるであろう。ハイブリダイゼーションパラメータを決定するための追加のガイドラインは、多くの参考文献において提供されており、例えば「Current Protocols in Molecular Biology」(Ausubelら編集)がある。
【００６０】
転移性結腸直腸癌タンパク質の活性を変調する化合物を試験するアッセイの状況における語句「機能的作用」は、転移性結腸直腸癌タンパク質又は核酸の間接的又は直接的影響下にあるパラメータ、例えば、転移性結腸直腸癌を退縮する能力などの酵素的、機能的、生理的又は化学的作用の決定を含む。これは、リガンド結合活性；軟寒天上での細胞増殖；足場依存性；増殖の接触阻害及び密度限界；細胞増殖；細胞の形質転換；増殖因子又は血清依存性；腫瘍特異マーカーレベル；マトリゲルへの侵襲；in vivoにおける腫瘍成長及び転移；転移を受けている細胞におけるmRNA及びタンパク質の発現、並びに転移性結腸直腸癌細胞の他の特徴を含む。「機能的作用」は、in vitro、in vivo、及びex vivoの活性を含む。
【００６１】
「機能的作用の決定」は、転移性結腸直腸癌タンパク質配列の間接的又は直接的影響下にあるパラメータ、例えば機能的、酵素的、生理的及び化学的作用を増加又は減少する化合物のアッセイを意味する。このような機能的作用は、当業者に公知のいずれかの手段により測定することができ：例えばタンパク質の分光光度学的特性(例えば、蛍光、吸光度、屈折率)、流体力学的特性(例えば、形状)、クロマトグラフィー的特性、又は溶解度特性の変化、転移性結腸直腸癌タンパク質の誘導マーカーもしくは転写活性化の測定；例えば抗体又は他のリガンドへの結合のような、結合活性又は結合アッセイの測定；並びに、細胞増殖の測定などである。化合物の転移性結腸直腸癌への機能的作用を決定することは、in vitroアッセイのような、当業者に公知の転移性結腸直腸癌アッセイを用いて行うこともでき、これは例えば軟寒天上での細胞増殖；足場依存性；増殖の接触阻害及び密度限界；細胞増殖；細胞の形質転換；増殖因子又は血清依存性；腫瘍特異マーカーレベル；マトリゲルへの侵襲；in vivoにおける腫瘍成長及び転移；転移を受けている細胞におけるmRNA及びタンパク質の発現、並びに転移性結腸直腸癌細胞の他の特徴である。これらの機能的作用は、当業者に公知の多くの手段により、評価することができ、例えば、形態学的特徴の変化の定量的又は定性的測定のための鏡検、転移性結腸直腸癌-関連配列に関するRNA又はタンパク質レベルの変化の測定、RNA安定性の測定、例えば、化学発光、蛍光、比色反応、抗体結合、誘導マーカー、及びリガンド結合アッセイによる、下流又はレポーター遺伝子の発現の同定(CAT、ルシフェラーゼ、β-gal、GFPなど)がある。
【００６２】
転移性結腸直腸癌ポリヌクレオチド及びポリペプチド配列の「インヒビター」、「アクチベーター」及び「モジュレーター」は、本発明の転移性結腸直腸癌ポリヌクレオチド及びポリペプチド配列のin vitro及びin vivoアッセイを用いて同定された分子又は化合物を活性化、阻害又は変調することを意味するように使用される。インヒビターは、例えば、本発明の転移性結腸直腸癌タンパク質に、結合し、部分的に又は全体的に活性をブロックし、活性化を減少し、防止し、遅延し、失活し、脱感作し、又は活性もしくは発現をダウンレギュレーションする化合物、例えばアンタゴニストである。アンチセンス核酸は、タンパク質の発現及び引き続きの機能を阻害するように見えることがある。「アクチベーター」は、転移性結腸直腸癌タンパク質活性を増大、開放、活性化、促進、活性化の増強、増感、作動、又はアップレギュレーションする化合物である。インヒビター、アクチベーター、又はモジュレーターは、天然の及び合成のリガンド、アンタゴニスト、アゴニスト、抗体、小化学分子などに加え、例えば変更された活性の型のような、転移性結腸直腸癌タンパク質の遺伝的に修飾された型も含む。インヒビター及びアクチベーターのためのこのようなアッセイは、前述のような、例えば、転移性結腸直腸癌タンパク質のin vitro、細胞内、又は細胞膜における発現、推定モジュレーター化合物の適用、並びにその後の活性に対する機能的作用の決定を含む。転移性結腸直腸癌のアクチベーター及びインヒビターは、転移性結腸直腸癌細胞を被験化合物とインキュベーションし、かつ1種又は複数の転移性結腸直腸癌タンパク質、例えば1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、40、50又はそれよりも多い転移性結腸直腸癌タンパク質、例えば表2-26に示された配列によりコードされた結腸直腸癌タンパク質の発現の増加又は減少を決定することにより、同定することもできる。
【００６３】
可能性のあるアクチベーター、インヒビター、又はモジュレーターで処理される転移性結腸直腸癌タンパク質を含有する試料又はアッセイは、阻害の程度を試験するために、インヒビター、アクチベーター、又はモジュレーターを伴わない対照試料と比較される。対照試料(インヒビターで処理されない)は、100％の相対タンパク質活性値に割当てられる。ポリペプチドの阻害は、その活性値が対照に対して約80％、好ましくは50％、より好ましくは25〜0％である場合に、実現される。転移性結腸直腸癌ポリペプチドの活性化は、対照(アクチベーターで処理されない)に対する活性値が、110％、より好ましくは150％、更に好ましくは200〜500％(すなわち、対照に対して2〜5倍高い)、より好ましくは1000〜3000％高い場合に、実現される。
【００６４】
語句「細胞増殖の変化」は、例えば細胞増殖巣の形成、足場非依存性、半固形又は軟寒天増殖、増殖の接触阻害及び密度限度の変化、増殖因子又は血清の必要要件の喪失、細胞形態の変化、不死化の獲得又は喪失、腫瘍特異マーカーの獲得又は喪失、適当な動物宿主に注入した場合の腫瘍の形成能又は抑制能、及び／又は細胞の不死化のような、in vitro又はin vivoにおける細胞成長及び増殖の特性の変化を意味する。例えば、Freshneyの「Culture of Animal Cells a Manual of Basic Technique」、231-241頁(第3版、1994年)を参照のこと。
【００６５】
「腫瘍細胞」は、腫瘍内の前癌性、癌性、及び正常な細胞を意味する。
「癌細胞」、「悪性転換された」細胞又は組織培養物中の「悪性転換」は、新たな遺伝物質の取込みに必ずしも関与していない自然発生的又は誘導された表現型の変化を意味する。悪性転換は、トランスフォーミングウイルスの感染及び新規ゲノムDNAの組込み、又は外来性DNAの取込みから生じるが、これは自然発生的に又は発癌物質への曝露後に生じることもあり、これにより内因性遺伝子が突然変異される。悪性転換は、細胞の不死化、異常な増殖制御、非形態学的変化、及び／又は悪性度のような、表現型の変化にも関する(Freshney、「Culture of Animal Cells a Manual of Basic Technique」(第3版、1994年)参照)。
【００６６】
「抗体」は、抗原に特異的に結合しかつ認識する、免疫グロブリン遺伝子又はそれらの断片のフレームワーク領域を含むポリペプチドを意味する。認められた免疫グロブリン遺伝子は、κ、λ、α、γ、δ、ε、及びμ定常領域に加え、無数の免疫グロブリン可変領域遺伝子を含む。軽鎖は、κ又はλのいずれかに分類される。重鎖は、γ、μ、α、δ又はεに分類され、これらは次に各々、免疫グロブリンクラスであるIgG、IgM、IgA、IgD、及びIgEを定義する。典型的には、抗体の抗原-結合領域又はその機能性同等物は、結合の特異性及び親和性において最も重要であろう。Paulの「Fundamental Immunology」を参照のこと。
【００６７】
例証的免疫グロブリン(抗体)構造単位は、四量体を含む。各四量体は、ポリペプチド鎖のふたつの同一対で構成され、各対は、1個の「軽」鎖(約25kD)及び1個の「重」鎖(約50〜70kD)を有する。各鎖のN-末端は、抗原認識に主に寄与する約100〜110個又はそれよりも多いアミノ酸の可変領域を定義する。用語可変軽鎖(VL)及び可変重鎖(VH)は、各々、これらの軽鎖及び重鎖を意味する。
【００６８】
抗体は、例えば完全な免疫グロブリンとして、又は様々なペプチダーゼでの消化による多くの良く特徴付けられた断面として存在する。従って、例えばペプシンは、ヒンジ領域のジスルフィド連結下側で抗体を消化し、F(ab')2を形成し、これはそれ自身ジスルフィド結合によりVH-CH1に結合した軽鎖であるFab二量体である。このF(ab')2は、穏やかな条件下で還元され、ヒンジ領域のジスルフィド連結を破壊し、これによりF(ab')2二量体をFab'単量体へと転換する。このFab'単量体は、本質的にヒンジ領域の一部を伴うFabである(Fundamental Immunology (Paul編集、第3版、1993年)参照)。様々な抗体断片が、完全な抗体の消化に関して定義されるが、当業者は、このような断片は、de novoに化学的又は組換えDNA法の使用のいずれかにより合成され得ることを理解するであろう。従って、本願明細書において使用される用語抗体は、抗体全体の修飾により作成される抗体断片か、又は組換えDNA法を使用しde novoに合成される抗体断片(例えば単鎖Fv)又はファージディスプレイライブラリーを用いて同定された抗体断片のいずれかも含む(例えば、McCaffertyら、Nature、348:552-554 (1990)参照)。
【００６９】
抗体、例えば組換え、モノクローナル又はポリクローナル抗体の調製については、多くの当該技術分野において公知の技術を使用することができる(例えば、Kohler及びMilstein、Nature、256:495-497 (1975)；Kozborら、Immunology Today、4:72 (1983)；Coleら、77-96頁、Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy (1985)；Coligan、Current Protocols in Immunology、(1991)；Harlow及びLane、Antibodies, A Laboratory Manual、(1988)；及び、Goding、Monoclonal Antibodies: Principles and Practice、(第2版、1986)を参照のこと)。単鎖抗体の作成の技術(米国特許第4,946,778号)は、本発明のポリペプチドに対する抗体作成に適合させることができる。更にトランスジェニックマウス、又は他の哺乳類のようなその他の生物を用い、ヒト化された抗体を発現することができる。あるいは、ファージディスプレイ技術を用い、選択された抗原へ特異的に結合する抗体及びヘテロマーFab断片を同定することができる(例えば、McCaffertyら、Nature、348:552-554 (1990)；Marksら、Biotechnology、10:779-783 (1992)参照のこと)。
【００７０】
「キメラ抗体」は、例えば、(a)定常領域、又はその一部が、変更、置換又は交換され、その結果この抗原結合部位(可変領域)が、異なる又は代替のクラスの定常領域、エフェクター機能及び／又は種、又はキメラ抗体に新たな特性を付与する全体が異なる分子、例えば酵素、毒素、ホルモン、増殖因子、薬物などに連結されているか；又は、(b)可変領域、又はその一部が、異なる又は代替の抗原特異性を有する可変領域と変更、置換又は交換されているような、抗体分子である。
【００７１】
転移性結腸直腸癌-関連配列の同定
ひとつの局面において、遺伝子の発現レベルは、発現プロファイルを提供するために、診断情報が望まれる様々な患者試料において決定される。特定の試料の発現プロファイルは、本質的にその試料の状態の「フィンガープリント」であり；ふたつの状態は、同様に発現されたいずれか特定の遺伝子を有する一方で、多くの遺伝子の評価は、細胞の状態を特徴とする遺伝子発現プロファイルの同時作成を可能にする。すなわち、正常組織は、癌性又は転移性癌性組織から識別され、もしくは転移性癌性組織は、生存している癌患者の組織と比較することができる。わかっている様々な転移性結腸直腸癌状態において組織の発現プロファイルを比較することにより、これらの状態の各々においてどの遺伝子が重要であるか(遺伝子のアップ-及びダウン-レギュレーションの両方を含む)に関する情報が得られる。
【００７２】
転移性結腸直腸癌、対、非-転移性結腸直腸癌組織において示差的に発現された配列の同定は、多くの方法でのこの情報の使用を可能にする。例えば、特定の治療措置は、特定の患者において、化学治療薬は、転移性結腸直腸癌をダウンレギュレーションし、その結果、腫瘍成長又は再発をダウンレギュレーションするように作用するかどうかを、評価される。同様に、診断及び治療の転帰は、患者試料を公知の発現プロファイルと比較することにより、行う又は確認することができる。転移性組織は、組織における転移性結腸直腸癌の病期を決定するために、分析することもできる。更に、これらの遺伝子発現プロファイル(又は個々の遺伝子)は、特定の発現プロファイルを模倣又は変更するような薬物候補の肉眼によるスクリーニングを可能にし；例えば、スクリーニングは、転移性結腸直腸癌発現プロファイルを抑制する薬物について行うことができる。これは、重要な転移性結腸直腸癌遺伝子のセットを含むバイオチップの作成により行うことができ、その後これはこれらのスクリーニングにおいて使用される。PCR法は、選択されたプライマー対を適用することができ、かつ分析は、RNA又はゲノム配列についてであることができる。これらの方法は更に、タンパク質ベースに行うこともでき；すなわち、転移性結腸直腸癌タンパク質のタンパク質発現レベルは、診断目的又は候補物質のスクリーニングのために評価することができる。加えて、転移性結腸直腸癌核酸配列は、治療薬又はタンパク質もしくはDNAワクチンとして投与される、アンチセンス核酸、又は転移性結腸直腸癌タンパク質(それらの抗体及び他のモジュレーターを含む)の投与を含む、遺伝子治療目的で投与することができる。
【００７３】
従って、本発明は、本願明細書においては「転移性結腸直腸癌配列」と称される、転移性結腸直腸癌において示差的に発現される核酸及びタンパク質配列を提供する。以下に概説するように、転移性結腸直腸癌配列は、転移性結腸直腸癌においてアップレギュレーションされるもの(すなわち、より高いレベルで発現されるもの)に加え、ダウンレギュレーションされるもの(すなわち、より低いレベルで発現されるもの)を含む。好ましい態様において、転移性結腸直腸癌配列は、ヒトに由来するが；しかし、当業者には理解されるように、他の生物由来の転移性結腸直腸癌配列が、疾患及び薬物評価の動物モデルにおいて有用であり；従って、他の転移性結腸直腸癌配列が、齧歯類(ラット、マウス、ハムスター、モルモットなど)、霊長類、家畜(ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウシ、ウマなど)及びペット(イヌ、ネコなど)を含む哺乳類を含む脊椎動物から提供される。他の生物由来の転移性結腸直腸癌配列は、下記に概説した技術を用いて得ることができる。
【００７４】
転移性結腸直腸癌配列は、核酸配列及びアミノ酸配列の両方を含み得る。当業者に理解されかつより詳細に以下に概説するように、転移性結腸直腸癌核酸配列は、天然の核酸を検出する診断適用に加え、スクリーニング適用を含む、様々な適用において有用であり；例えば、核酸プローブを含むバイオチップ、又は転移性結腸直腸癌配列に対する選択されたプローブを伴うPCRマイクロタイタープレートを、作成することができる。
【００７５】
転移性結腸直腸癌配列は、本願明細書に概説した転移性結腸直腸癌配列に対する実質的核酸及び／又はアミノ酸の配列相同性により最初に同定することができる。このような相同性は、核酸又はアミノ酸配列全体を基にすることができ、かつ一般に相同性プログラム又はハイブリダイゼーション条件のいずれかを用い、以下に概略されるように決定される。
【００７６】
転移性結腸直腸癌-関連配列の同定に関して、転移性結腸直腸癌スクリーニングは、典型的には、例えば、正常組織及び癌性組織、又は転移性疾患を有する患者からの腫瘍組織試料、対、非転移性組織、又はDukes病期A又はBの癌であると診断されたが生存している患者からの腫瘍組織試料、対、転移性組織のような異なる組織において同定された遺伝子を比較することを含む。他の適当な組織比較は、転移性結腸直腸癌試料の、肺、乳房、他の消化器癌、前立腺、卵巣などの他の癌からの転移性癌試料との比較を含む。例えばDukes病期Bの生存者の組織及び転移を受けている組織からの試料は、核酸プローブを含むバイオチップに塗布される。これらの試料は、適用可能であれば、最初にマイクロダイセクションされ、かつmRNA調製のために当該技術分野において公知のように処理される。適当なバイオチップは、例えばAffymetrix社から市販されている。本願明細書に説明されたような遺伝子発現プロファイルが作成され、かつデータ解析される。
【００７７】
ひとつの態様において、正常状態と疾患状態の間で発現の変化を示している遺伝子は、好ましくは正常な結腸であるが、肺、心臓、脳、肝臓、乳房、腎臓、筋肉、前立腺、小腸、大腸、脾臓、骨及び胎盤を含むが、これらに限定されるものではない他の正常な組織で発現されている遺伝子と比較される。好ましい態様において、他の組織で有意な量発現される転移性結腸直腸癌スクリーニング時に同定されたこれらの遺伝子は、本プロファイルから除かれるが、一部の態様においては、これは必要ではない。すなわち、薬物についてスクリーニングする場合、通常副作用の可能性を最小化するために、標的は疾患特異的であることが好まれる。
【００７８】
好ましい態様において、転移性結腸直腸癌配列は、転移性結腸直腸癌においてアップレギュレーションされたものであり；すなわち、これらの遺伝子の発現は、非-転移性癌組織又は正常な結腸組織と比べ、転移性組織においてより高い(例えば、表1-26参照)。本願明細書において使用される「アップ-レギュレーション」は、比が1よりも大きい数として示される場合、この比は、1よりも大きい、好ましくは1.5又はそれよりも大きく、より好ましくは2.0又はそれよりも大きいことを意味する。本願明細書において全てのUniGeneクラスター同定番号及び寄託番号は、表現上本願明細書に参照として組入れられている。 GenBankは、当該技術分野において公知であり、例えばBenson, DAら、Nucleic Acids Research、26:1-7 (1998)及びhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/を参照のこと。配列は、例えば、European Molecular Biology Laboratory (EMBL)及び日本DNAデータバンク(DDBJ)などの、他のデータベースにおいて入手することもできる。
【００７９】
別の好ましい態様において、転移性結腸直腸癌配列は、転移性結腸直腸癌においてダウンレギュレーションされ；すなわち、これらの遺伝子の発現は、非-転移性癌組織又は正常な結腸組織と比べ、転移性組織においてより低い(例えば、表1-26参照)。本願明細書において使用される「ダウン-レギュレーション」は、比が1よりも大きい数として示される場合、この比は、1よりも大きい、好ましくは1.5又はそれよりも大きく、より好ましくは2.0又はそれよりも大きく、もしくは比が1よりも小さい数として示される場合、この比は、1未満である、好ましくは0.5未満、より好ましくは0.25未満であることを意味する。
【００８０】
インフォマティクス
転移性結腸直腸癌において過剰又は過小発現された遺伝子を同定する能力は、更に診断、治療、創薬、遺伝薬理学、タンパク質構造、バイオセンサー開発の分野、及び他の関連分野において使用することができる、高度の分解能で、高感度のデータセットを提供する。例えば、発現プロファイルは、転移性結腸直腸癌の患者の診断又は予後の評価に使用することができる。又は別の例として、細胞下(subcellar)毒性情報を作成し、薬物構造及び活性相関をより良く指示することができる(Anderson、Pharmaceutical Proteomics: Targets, Mechanism, and Function、IBC Proteomics会議に論文提出、コロナド、CA(1998年6月11-12日)参照)。細胞下毒性情報は、化学曝露に対する可能性のある毒性作用及び恐らく忍容性のある曝露閾値を推定するための、生物学的センサー装置においても使用することができる(米国特許第5,811,231号参照)。同様の利点は、他の生体分子及び生体活性物質(例えば、核酸、糖質、脂質、薬物など)に関連したデータセットから増大している。
【００８１】
従って、別の態様において、本発明は、アッセイデータの少なくとも1セットを含むデータベースを提供する。このデータベースに含まれるデータは、例えば、単独の又はライブラリー様式のいずれかのアレイ解析を用い獲得される。このデータベースは、実質的にデータが維持されかつ伝達されるいずれかの形であることができるが、好ましくは電子データベースである。本発明の電子データベースは、例えば、パーソナルコンピュータのようなデータベースの保存及びアクセスが可能であるいずれかの電子装置において維持することができるが、ワールドワイドウェブ(WWW)のような、広域ネットワーク上で配布されることが好ましい。
【００８２】
ペプチド配列データを含むデータベースへの本項目の集中は、例証を明確にするためのみである。同様のデータベースを、本発明のアッセイを使用して得られたアッセイデータについて集成することができることは、当業者には明らかであろう。
【００８３】
転移性結腸直腸癌を罹患した生物学的試料から、様々な分子及び巨大分子種の比較的及び／又は絶対的な豊富さを同定および／または定量するためすなわち、本願明細書に説明された転移性結腸直腸癌-関連配列を同定するための組成物及び方法は、豊富な情報を提供し、これは病態、疾病素因、薬物試験、治療的経過観察、遺伝子疾患が原因となる連関、免疫及び生理的状態の相関の同定などと関連することができる。本発明のアッセイから作成されたデータは、手作業による検証及び解析に適しており、好ましい態様において、高速コンピュータを使用する事前(prior)データ処理が使用される。
【００８４】
生体分子情報を指標化しかつ検索する方法のアレイは、当該技術分野において公知である。例えば、米国特許第6,023,659号及び第5,966,712号は、1種又は複数のタンパク質機能の階層に従い配列を便覧作成及び検索することを可能にする方法で、生体分子配列情報を保存しているリレーショナルデータベースシステムを開示している。米国特許第5,953,727号は、部分長配列の収集から完全長配列を得るために、1種又は複数の配列決定プロジェクトとの関連に従い便覧作成及び検索される部分長DNA配列の収集を可能にするフォーマットの情報を含む配列記録を有するリレーショナルデータベースを開示している。米国特許第5,706,498号は、キー配列と標的配列の間の類似性の程度を基にした遺伝子データベース中の配列データ項に類似した遺伝子配列の検索を行う、遺伝子データベース検索システムを開示している。米国特許第5,538,897号は、closeness-of-fit測定を用い推定された質量スペクトルを実験から得た質量スペクトルと比較することにより、コンピュータデータベースにおいて、アミノ酸配列を同定するための、ペプチドの質量分析フラグメンテーションパターンを用いる方法を開示している。米国特許第5,926,818号は、投影された串刺し演算(consolidation)及び1種よりも多い串刺し演算経路又は次元に従う実際のデータを必然的に伴う、オンライン解析処理(OLAP)として説明された多次元データ解析の関数を含む、多次元データベースを開示している。米国特許第5,295,261号は、各データベース記録フィールドが、ナビゲーションデータとインフォメーションデータのふたつのクラスに分割された、ハイブリッドデータベース構造を開示しており、ここでナビゲーションフィールドは、樹状構造として又は2種以上のこのような樹状構造の合体として見ることができる階層的位相的地図を保存している。
【００８５】
更に、Mountら、Bioinformatics、(2001年)；Biological Sequence Anatysis: Probabilistic Models of Proteins and Nucleic Acids (Durbinら編集、1999年)；Bioinformatics: A Practical Guide to the Analysis of Genes and Proteins (Baxevanis及びOeulletteら、1998))；Rashidi及びBuehler、Bioinformatics: Basic Applications in Biological Science and Medicine (1999年)；Introduction to Computational Molecular Biology (Setubalら編集、1997年)；Bioinfomatics: Methods and Protocols (Misener及びKrawetz編集、2000年)；Bioinformatics: Sequence, Structure, and Databanks: A Practical Approach (Higgins及びTaylor編集、2000年)；Brown、Bioinfomatics: A Biologist's Guide to Biocomputing and the Internet (2001年)； Han及びKamber、Data Mining: Concepts and Techniques (2000年)；並びに、Waternian、Introduction to Computational Biology: Maps, Sequences, and Genomes (1995年)も参照のこと。
【００８６】
本発明は、例えば、それから各配列特異性記録が得られる標的含有試料の給源を特定化するデータを伴うような、クロス集計されたコンピュータで検索可能な形のアッセイデータ記録を保存するためのコンピュータ及びソフトウェアを含む、コンピュータデータベースを提供する。
【００８７】
例証的態様において、標的-含有試料の給源の少なくとも1種は、病理的疾患を伴わないことがわかっている対照組織試料に由来する。変型において、給源の少なくとも1種は、例えば新生物形成性病巣のような病原性であることが分かっている組織標本、又は転移性結腸直腸癌について分析されるべき他の組織標本である。別の変型において、アッセイ記録は、試料中の各標的種に関する下記のパラメータの1種又は複数をクロス集計する：(1)独自の同定コード、これは、例えば、標的分子構造及び／又は特徴的分離座標(例えば、電気泳動座標)を含むことができる；(2)試料給源；及び、(3)試料中に存在する標的種の絶対量及び／又は相対量。
【００８８】
本発明は更に、磁気ディスク、光学ディスク、磁気-光学ディスク、DRAM、SRAM、SGRAM、SDRAM、RDRAM、DDRRAM、磁気バブルメモリー装置、並びにCPUレジスター及びオン-CPUデータ記憶アレイを含む他のデータ記憶装置を含むことができる、コンピュータデータ記憶装置内の標的データの収集の保存及び検索を提供する。典型的には、標的データ記録は、磁気化できる媒体上の磁気ドメインアレイ内にビットパターンとして、又はDRAM装置内のセルアレイ(例えば、トランジスタ及びトランジスタ上に存在し得る電荷保存領域で構成された各セル)のような、荷電状態もしくはトランジスタゲート状態のアレイとして保存される。ひとつの態様において、本発明は、標的給源との少なくとも10個の標的データ記録クロス集計についての独自の識別子を備える、タンパク質発現フィンガープリント記録をコードしているビットパターンを含むような、このような記憶装置、及びこれらにより構築されたコンピュータシステムを提供する。
【００８９】
標的がペプチド又は核酸である場合、本発明は、好ましくは、コンピュータ記憶装置又はデータベースに保存された又はそこから検索されたペプチド又は核酸の配列アッセイ記録と、少なくとも1種の他の配列の間のコンピュータによる比較を行うことを含む、関連したペプチド又は核酸配列を同定する方法を提供する。この比較は、配列解析又は比較アルゴリズム又はそれらのコンピュータプログラムの態様(例えば、FASTA、TFASTA、GAP、BESTFIT)を含むことができ、及び／又はこの比較は、標本のポリペプチド又は核酸試料から決定された配列プール中のペプチド又は核酸配列の相対量であることができる。
【００９０】
本発明は更に好ましくは、コンピュータ化した配列の解析、比較又は相対定量法において検索及び処理に適したファイルフォーマットで本発明のアッセイから得たデータをコードしているビットパターンを含む、IBM互換性(DOS、Windows、Windows95/98/2000、Windows NT、OS/2)又は他のフォーマット(例えば、Linux、SunOS、Solaris、AIX、SCO Unix、VMS、MV、Macintoshなど)のフロッピーディスケット又はハード(固定式、Winchester)ディスクドライブのような、磁気ディスクを提供する。
【００９１】
本発明は更に、イーサーネットケーブル(coax又は10BaseT)、電話線、ISDN線、無線ネットワーク、光ケーブル、又は他の適当なシグナル転送媒体のような、データリンクを介して接続された複数のコンピュータ装置を含む、ネットワークを提供し、これにより少なくともひとつのネットワーク装置(例えば、コンピュータ、ディスクアレイなど)は、本発明のアッセイから獲得されたデータをコードしているビットパターンを構成している、磁気ドメイン(例えば、磁気ディスク)及び／又は電荷ドメイン(例えば、DRAMセルのアレイ)のパターンを備える。
【００９２】
本発明は更に、モデム、ISDNターミナルアダプター、DSL、ケーブルモデム、ATMスイッチなどのような、電気通信装置上の電気シグナルの作成を含む、アッセイデータを転送する方法も提供し、ここでシグナルは、本発明の方法で得られた複数のアッセイ結果を含むアッセイ又はデータベースからのデータをコードしている、(固有の(native)又は暗号化したフォーマットの)ビットパターンを含む。
【００９３】
好ましい態様において、本発明は、クエリー標的を、本発明の方法により得られたアッセイ結果のような、データ構造のアレイを含むデータベースと比較し、かつ標的データに対する同一性の程度及びギャップ重みを基にしたデータベース標的を等級化するコンピュータシステムを提供する。中央処理装置は、アレイ結果の並置及び／又は比較に関するコンピュータプログラムをロード及び実行するために初期化されることが好ましい。クエリー標的に関するデータは、I/O装置を介して中央処理装置に入力される。コンピュータプログラムの実行は、中央処理装置における、アッセイデータの、アッセイ結果のバイナリー表記を含むデータファイルからの検索を生じる。
【００９４】
標的データ又は記録及びコンピュータプログラムは、二次メモリーに転送することができ、これは典型的にはランダムアクセスメモリー(例えば、DRAM、SRAM、SGRAM又はSDRAM)である。標的は、選択されたアッセイ特徴(例えば、選択された親和性部分に対する結合)とクエリー標的の同じ特徴の間の一致の程度に従い等級化され、かつ結果はI/O装置を介して出力される。例えば、中央処理装置は、従来型のコンピュータ(例えば、Intel Pentium、PowerPC、Alpha、PA-8000、SPARC、MIPS 4400、MIPS 10000、VAXなど)であることができ；プログラムは、市販又は公開されたドメイン分子生物学ソフトウェアパッケージ(例えば、UWGCG Sequence Analysis Software、Darwin)であることができ；データファイルは、光学又は磁気ディスク、データサーバー、メモリー装置(例えば、DRAM、SRAM、SGRAM、SDRAM、EPROM、バブルメモリー、フラッシュメモリーなど)であることができ；I/O装置は、ビデオディスプレイ及びキーボードを備える端末、モデム、ISDNターミナルアダプター、イーサーネットポート、パンチカード読取装置、磁気ストリップ読取装置、又は他の適当なI/O装置であることができる。
【００９５】
本発明は更に、前述のように、下記を備えるコンピュータシステムの使用を提供することが好ましい：(1)コンピュータ；(2)本発明の方法で得られたペプチド配列特異性記録の収集をコードしている保存されたビットパターン、これはコンピュータ内に保存されている；(3)クエリー標的のような比較標的；及び、(4)典型的にはコンピュータ処理した類似性の値を基にした結果比較の等級序列化を伴う、並置及び比較のためのプログラム。
【００９６】
転移性結腸直腸癌-関連タンパク質の特徴
本発明の転移性結腸直腸癌タンパク質は、分泌タンパク質、膜貫通タンパク質又は細胞内タンパク質として分類することができる。ひとつの態様において、転移性結腸直腸癌タンパク質は、細胞内タンパク質である。細胞内タンパク質は、細胞質及び／又は核及び／又は細胞小器官に認められる。細胞小器官に独占的に存在する1種又は複数の膜貫通ドメインを含むタンパク質も、細胞内タンパク質と考えられる。細胞内タンパク質は、細胞の機能及び複製の全ての局面に関係し(例えばシグナル伝達経路を含む)；そのようなタンパク質の異常な発現は、細胞プロセシングの未調節又は非調節をもたらすことが多い(例えば、Molecular Biology of the Cell (Alberts編集、第3版、1994年)。例えば、多くの細胞内タンパク質が、プロテインキナーゼ活性、タンパク質リン酸化酵素活性、プロテアーゼ活性、ヌクレオチドシクラーゼ活性、ポリメラーゼ活性などの酵素活性を有する。細胞内タンパク質は、タンパク質の複合体の組織化に関連したドッキングタンパク質、又は様々な細胞下局在への標的タンパク質としても利用され、かつ細胞小器官の構造の完全性を維持することも関連している。
【００９７】
理解が増しつつあるタンパク質の特徴決定に関する概念は、その限定された機能が寄与している1種又は複数のモチーフのタンパク質に存在している。タンパク質の酵素ドメインに認められた高度に保存された配列に加え、タンパク質-タンパク質相互作用に関連したタンパク質において、高度に保存された配列が同定された。例えば、Src-ホモロジー-2(SH2)ドメインは、配列独自の方法でチロシンリン酸化標的に結合する。SH2ドメインとは区別されるPTBドメインも、チロシンリン酸化した標的に結合する。SH3ドメインは、プロリン-リッチ標的に結合する。加えて、2、3例を挙げると、PHドメイン、テトラトリコペプチド反復単位及びWDドメインが、タンパク質-タンパク質相互作用を媒介することが示されている。これらの一部も、リン脂質又は他のセカンドメッセンジャーへの結合に関連している。当業者に理解されるように、これらのモチーフは、一次配列を基に同定され；従って、タンパク質配列の分析は、その分子の酵素的可能性及び／又はそれによりタンパク質を会合することができる分子の両方への洞察を提供することができる。ひとつの有用なデータベースはPfam(タンパク質ファミリー)であり、これは多くの共通タンパク質ドメインを対象としている複数の配列アラインメント及び隠れマルコフモデルの巨大な収集である。バージョンは、ワシントン大学(セントルイス)、Sanger Center(英国)及びKarolinska Institute(スウェーデン)からインターネットにより入手することができる(例えば、Batemanら、Nuc. Acids Res.、28:263-266 (2000)；Sonnhammerら、Proteins、28:405-420 (1997)；Batemanら、Nuc Acids Res.、27:260-262 (1999)；及びSonnhammerら、Nuc. Acids Res.、26:320-322 (1998)参照)。
【００９８】
別の態様において、転移性結腸直腸癌配列は、膜貫通タンパク質である。膜貫通タンパク質は、細胞のリン脂質二重層に広がる分子である。これらは、細胞内ドメイン、細胞外ドメイン、又は両方を有することができる。このようなタンパク質の細胞内ドメインは、細胞内タンパク質について既に説明されているものを含む、多くの機能を有することができる。例えば、細胞内ドメインは、酵素活性を含み、及び／又は追加のタンパク質の結合部位として利用することができる。頻繁に膜貫通タンパク質の細胞内ドメインは両方の役割を利用する。例えばある受容体チロシンキナーゼは、プロテインキナーゼ活性及びSH2ドメインの両方を有する。加えて、受容体分子それ自身上のチロシンの自己リン酸化は、追加のSH2ドメイン含有タンパク質の結合部位を生じる。
【００９９】
膜貫通タンパク質は、1個から数個の膜貫通ドメインを含むことができる。例えば、受容体チロシンキナーゼ、ある種のサイトカイン受容体、受容体グアニリルシクラーゼ及び受容体セリン／トレオニンプロテインキナーゼは、1個の膜貫通ドメインを含む。しかし、チャネル、ポンプ、及びアデニリルシクラーゼを含む様々な他のタンパク質は、多くの膜貫通ドメインを含む。Gタンパク質共役型受容体(GPCR)のような多くの重要な細胞表面受容体は、7個の膜に広がる領域を含むので、これらは「7回膜貫通ドメイン」タンパク質として分類される。特徴的膜貫通ドメインは、およそ20個の連続する疎水性アミノ酸を含み、これに帯電したアミノ酸が続く。従って、特定のタンパク質のアミノ酸配列の解析に際して、タンパク質内の膜貫通ドメインの局在及び数を推定することができる(例えば、PSORTウェブサイトhttp://psort.nibb.ac.jp/参照のこと)。
【０１００】
膜貫通タンパク質の細胞外ドメインは、多様である；しかし、保存されたモチーフが、様々な細胞外ドメイン間に反復して認められる。保存された構造及び／又は機能は、異なる細胞外モチーフに起因している。多くの細胞外ドメインは、他の分子への結合に関連している。ひとつの局面において、細胞外ドメインは、受容体上に認められる。受容体ドメインに結合する因子は、循環血中リガンドを含み、これはアデノシンなどのペプチド、タンパク質又は小分子であることができる。例えば、EGF、FGF及びPDGFのような増殖因子は、様々な細胞反応を開始するためにそれらのコグネイト受容体に結合する循環血中増殖因子である。他の因子は、サイトカイン、分裂促進因子、ホルモン、神経栄養因子などを含む。細胞外ドメインは、細胞-会合した分子にも結合する。これに関して、これらは、細胞-細胞相互作用を媒介する。細胞-会合したリガンドは、例えばグリコシルホスファチジルイノシトール(GPI)アンカーを介して、細胞に縛られるか、もしくはそれら自身膜貫通タンパク質であることができる。細胞外ドメインは更に、細胞外マトリックスにも会合し、かつ細胞構造の維持に寄与する。
【０１０１】
膜貫通する転移性結腸直腸癌タンパク質は、本願明細書に説明されたように、細胞外免疫療法の標的に容易にアクセス可能であるので、これらは本発明において特に好ましい。加えて以下に概説したように、膜貫通タンパク質は、画像形成のモダリティにおいても有用であることができる。抗体は、in situ又は組織学的分析においてこのような容易にアクセス可能なタンパク質を標識するために使用することができる。あるいは、抗体は、細胞内タンパク質を標識することもでき、ここでは、症例解析的(case analytical)試料は、典型的には細胞内タンパク質へのアクセスを提供するために、透過性である。
【０１０２】
当業者には、膜貫通タンパク質は、例えば組換え法により、膜貫通配列を除去することにより、可溶性とすることができることも理解されるであろう。更に、可溶性とされた膜貫通タンパク質は、適当なシグナル配列の添加による組換え手段により、分泌型とすることもできる。
【０１０３】
別の態様において、転移性結腸直腸癌タンパク質は、分泌型タンパク質であり；その分泌は、構成的又は調節されるかのいずれかである。これらのタンパク質は、分子を分泌経路に標的化するシグナルペプチド又はシグナル配列を有する。分泌されたタンパク質は、多くの生理的事象に関連し；それらの循環する性質により、様々な他の細胞型へのシグナル伝達に利用されることが多い。分泌されたタンパク質は、オートクリン様式(因子を分泌した細胞に作用する)、パラクリン様式(因子を分泌した細胞の近傍にある細胞に作用する)又はエンドクリン様式(離れた細胞に作用する)で機能する。従って分泌された分子には、多くの生理学的局面を変調又は変更することにおける用途が認められる。分泌タンパク質である転移性結腸直腸癌タンパク質は、例えば血液、血漿、血清又は糞便試験に関する診断マーカーとして良好な標的であるので、これらは、本発明において特に好ましい。
【０１０４】
転移性結腸直腸癌核酸の使用
前述のように、転移性結腸直腸癌配列は、本願明細書に概説した転移性結腸直腸癌配列への実質的核酸及び／又はアミノ酸配列の相同性又は連鎖について最初に同定される。このような相同性は、全般的核酸又はアミノ酸配列を基にすることができ、かつ一般に相同性プログラム又はハイブリダイゼーション条件のいずれかを用い、いかに概説したように決定される。典型的には、mRNAに連結した配列は、同じ分子において認められる。
【０１０５】
本発明の転移性結腸直腸癌核酸配列、例えば表1-26の配列は、比較的大きい遺伝子の断片であることができ、すなわちこれらは核酸セグメントである。この状況での「遺伝子」は、コード領域、非-コード領域、並びにコード領域及び非-コード領域の混合物を含む。従って、当業者に理解されるように、本願明細書に提供された配列を用い、転移性結腸直腸癌遺伝子のいずれかの方向に延長された配列を、より長い配列又は完全長配列のいずれかのクローニングのために当該技術分野において周知の技術を用い得ることができる；Ausubelら、前掲を参照のこと。インフォマティクスにより多くを行うことができ、かつ多くの配列を、単独遺伝子に対応する複数の配列を含む、例えばUniGeneのようなシステムにクラスター化することができる(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/unigene/を参照)。
【０１０６】
一旦転移性結腸直腸癌核酸が同定されたならば、これをクローニングし、かつ必要に応じ、その構成的部分を組換え、全体の転移性結腸直腸癌核酸コード領域又は総mRNA配列を作成することができる。例えばプラスミドもしくは他のベクター内に含まれたか、又は線状核酸セグメントとしてそれらから切出されるように、一旦その天然の給源から単離されたならば、組換え転移性結腸直腸癌核酸は、更に他の転移性結腸直腸癌核酸、例えば延長されたコード領域を同定及び単離するためのプローブとして使用することができる。これは、修飾した又は変種の転移性結腸直腸癌核酸及びタンパク質を作成するための、「前駆体」核酸として使用することもできる。
【０１０７】
本発明の転移性結腸直腸癌核酸は、いくつかの方法で使用される。第一の態様において、転移性結腸直腸癌核酸への核酸プローブが作成され、かつ下記に概説したようなスクリーニング及び診断法において、又は例えば遺伝子治療、ワクチン及び／もしくはアンチセンス適用などのような投与において使用されるバイオチップに結合される。あるいは、転移性結腸直腸癌タンパク質のコード領域を含む転移性結腸直腸癌核酸は、転移性結腸直腸癌タンパク質の発現のために、更にスクリーニング目的又は患者への投与のために、発現ベクターに入れることができる。
【０１０８】
好ましい態様において、転移性結腸直腸癌核酸に対する核酸プローブ(図に示した核酸配列及び／又はそれらの相補体の両方)が作成される。バイオチップに結合した核酸プローブは、転移性結腸直腸癌核酸、すなわち標的配列(例えばサンドイッチアッセイにおける、試料の標的配列又は他のプローブ配列のいずれか)に対し実質的に相補的であるようにデザインされ、その結果標的配列と本発明のプローブのハイブリダイゼーションが生じる。下記に概説したように、この相補体は完全である必要はない；そこには、標的配列と本発明の一本鎖核酸の間のハイブリダイゼーションを妨害するであろういくつかの塩基対のミスマッチが存在してもよい。しかし、変異の数が大きすぎて、最低のストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件下であってもハイブリダイゼーションが生じないならば、この配列は、相補的標的配列ではない。従って、本願明細書において「実質的に相補的」とは、これらのプローブが、適当な反応条件、特に以下に概説するような高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズするのに十分な程に、標的配列に相補的であることを意味する。
【０１０９】
核酸プローブは、一般に一本鎖であるが、部分的に一本鎖及び部分的に二本鎖であることができる。このプローブの鎖状性(strandness)は、標的配列の構造、組成、及び特性から決定づけられる。一般に、核酸プローブは、約8〜約100個の塩基長範囲であり、約10〜約80個の塩基が好ましく、かつ約30〜約50個の塩基が特に好ましい。すなわち、一般にORF又は全遺伝子の相補体は使用されない。一部の態様において、最大数百の長さの核酸を使用することができる。
【０１１０】
好ましい態様において、1配列当り1種よりも多いプローブが使用され、重複プローブ又は標的の異なるセクションのプローブが使用される。すなわち、2、3又は4種又はそれより多いプローブが、好ましくは3種が、特定の標的について重複性(redundancy)を構成するために使用される。これらのプローブは、重複することができ(すなわちいくつかの共通配列を有する)、又は分離する。場合によっては、PCRプライマーを用いて、より高感度のシグナルを増幅することができる。
【０１１１】
当業者に理解されるように、核酸は、多種多様な方法で、固形支持体に結合又は固定することができる。本願明細書において「固定した」及び文法的同等物は、核酸プローブと固形支持体の間の会合又は結合が、下記に概説した結合、洗浄、分析及び除去の条件下で、十分安定していることを意味する。この結合は、典型的には共有的又は非共有的であることができる。本願明細書において「非共有的結合」及び文法的同等物は、典型的には、1種又は複数の静電的、親水性及び疎水性の相互作用を意味する。非共有結合に含まれるのは、分子、例えばストレプトアビジンの支持体への共有的結合、及びビオチン化されたプローブのストレプトアビジンへの非共有的結合である。本願明細書において「共有結合」及び文法的同等物は、2種の部分、固形支持体及びプローブが、σ結合、π結合及び配位結合を含む、少なくとも1種の結合で結合されていることを意味する。共有結合は、プローブと固形支持体の間に直接形成することができるか、もしくは固形支持体又はプローブ又は両分子のいずれかへの架橋によるか又は特異的反応基の包含により形成することができる。固定には、共有及び非-共有相互作用の組合せも関与している。
【０１１２】
一般に、これらのプローブは、当業者に理解されるように、多種多様な方法でバイオチップに結合することができる。本願明細書に記されたように、核酸は、最初に合成され、引き続きバイオチップに結合されるか、もしくは直接バイチップ上に合成することができるかのいずれかである。
【０１１３】
このバイオチップは適当な固形基体を含む。本願明細書において「基体」又は「固形支持体」又は他の文法的同等物は、核酸プローブの結合又は会合に適した離れた個別の位置を含むように修飾することができ、かつ少なくともひとつの検出法に適合された材料を意味する。当業者に理解されるように、可能性のある基体の数は非常に多く、かつガラス及び改質又は機能性ガラス、プラスチック(アクリル系、ポリスチレン及びスチレンと他の材料のコポリマー、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリブチレン、ポリウレタン、Teflonなどを含む)、多糖、ナイロン又はニトロセルロース、樹脂、シリカ又はシリコン及び改質シリコンを含むシリカベースの材料、炭素、金属、無機ガラス、プラスチックなどを含むが、これらに限定されるものではない。一般にこれらの基体は、光学検出ができかつ明らかに蛍光体ではない。好ましい基体は、1999年3月15日に同時係属出願された、米国特許出願第09/270,214号の「Reusable Low Fluorescent Plastic Biochip」に開示されており、これは全体が本願明細書に参照として組入れられているいる。
【０１１４】
一般に基体は平面であるが、しかし他の形状の基体も有用であることは、当業者には理解されるであろう。例えば、プローブは、試料容量を最小にするために、フロスルー試料分析用のチューブの内面に配置することができる。同様に、基体は、特定のプラスチックから製造された独立気泡を含む軟質フォームのように、柔軟であることができる。
【０１１５】
好ましい態様において、バイオチップ表面及びプローブは、その後のこれらふたつの結合のために、化学官能基により誘導することができる。従って例えばバイオチップは、アミノ基、カルボキシ基、オキソ基及びチオール基を含むが、これらに限定されるものではない化学官能基により誘導され、アミノ基が特に好ましい。これらの官能基を用い、プローブを、プローブ上の官能基を用い結合させることができる。例えば、アミノ基を含む核酸は、例えば、当該技術分野において公知のようにリンカーを用い、アミノ基を含む表面に結合することができ；例えば、ホモ-又はヘテロ-二官能性リンカーが周知である(1994年版のPierce Chemical社カタログ参照、架橋剤に関する技術セクション、155-200頁)。加えて場合によっては、アルキル基(置換された及びヘテロアルキル基を含む)のような追加のリンカーを使用してもよい。
【０１１６】
この態様において、オリゴヌクレオチドは、当該技術分野において公知の方法のように合成され、その後固形支持体の表面に結合される。当業者に理解されるように、5'又は3'末端のいずれかを固形支持体に結合することができ、もしくは結合は内部ヌクレオシドを介することができる。
別の態様において、固形支持体への固定は、非常に強力にしかし非-共有的であることができる。例えば、ビオチン化されたオリゴヌクレオチドを作成し、これをストレプトアビジンで共有的に被覆した表面に結合させ、結合を生じることができる。
【０１１７】
あるいは、これらのオリゴヌクレオチドは、当該技術分野において公知であるように、表面で合成することができる。例えば、光重合化合物及び技術を利用する光活性化技術が使用される。好ましい態様において、核酸は、周知のフォトリソグラフ技術を用い、in situで合成することができ；これらは全て説明のために本願明細書に参照として組入れられている、国際公開公報第95/25116号；国際公開公報第95/35505号；米国特許第5,700,637号及び第5,445,934号；及び、その中に引用された参考文献に開示されており；結合のこれらの方法は、Affimetrix GeneChip(商標)技術を基礎としている。
【０１１８】
しばしば増幅-ベースのアッセイが、転移性結腸直腸癌-関連配列の発現レベルを測定するために行われる。これらのアッセイは、典型的には、逆転写と組合せて行われる。このようなアッセイにおいて、転移性結腸直腸癌-関連核酸配列は、増幅反応(例えば、ポリメラーゼ連鎖反応又はPCR)の鋳型として作用する。定量的増幅において、増幅産物の量は、当初の試料中の鋳型の量に比例するであろう。適当な対照との比較は、転移性結腸直腸癌-関連RNAの量の測定をもたらす。定量的増幅法は、当業者に周知である。定量的PCRの詳細なプロトコールは、例えば、Innisらの論文、PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications (1990)に提供されている。
【０１１９】
一部の態様において、TaqManベースのアッセイが、発現の測定に使用される。TaqManベースのアッセイは、5'蛍光色素及び3'消光剤を含む蛍光原オリゴヌクレオチドプローブを使用する。このプローブは、PCR産物にハイブリダイズするが、それ自身は3'末端のブロック剤のために延長されない。PCR産物が後続のサイクルにおいて増幅される場合、例えば、AmpliTaqのようなポリメラーゼの5'ヌクレアーゼ活性は、TaqManプローブの切断をもたらす。この切断は、5'蛍光色素と3'消光剤を分離し、これにより増幅の関数としての蛍光の増加を生じる(例えば、Perkin-Elmer社により提供された文献を参照のこと、例えば、www2.perkin-elmer.com)。
【０１２０】
その他の適当な増幅法は、リガーゼ鎖反応(LCR)(Wu及びWallace、Genomics、4:560 (1989)、Landegrenら、Science、241:1077 (1988)、及びBarringerら、Gene、89:117 (1990))、転写増幅(Kwohら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、86:1173 (1989))、自続式配列複製(Guatelliら、Proc. Nat. Acad. Sci. USA、87:1874 (1990))、dot PCR、及びリンカーアダプターPCRなどを含むが、これらに限定されるものではない。
【０１２１】
核酸からの転移性結腸直腸癌タンパク質の発現
好ましい態様において、例えば転移性結腸直腸癌タンパク質をコードしている転移性結腸直腸癌核酸は、下記に説明したような、スクリーニングアッセイにおいて次に使用することができる転移性結腸直腸癌タンパク質を発現するための様々な発現ベクターの作成に使用することができる。発現ベクター及び組換えDNA技術は、当業者に周知であり(例えば、Ausubel、前掲、及びGene Expression Systems (Fernandez及びHoeffler編集、1999年)参照)、かつタンパク質発現に使用される。これらの発現ベクターは、自己複製染色体外ベクター又は宿主ゲノムに組込まれるベクターのいずれかである。一般に、これらの発現ベクターは、転移性結腸直腸癌タンパク質をコードしている核酸に機能的に連結された転写及び翻訳調節核酸を含む。用語「制御配列」は、特定の宿主生物における機能的に連結されたコード配列の発現に使用されるDNA配列を意味する。原核生物に適した制御配列は、例えば、プロモーター、任意にオペレーター配列、及びリボソーム結合部位を含む。真核細胞は、プロモーター、ポリアデニル化シグナル、及びエンハンサーを利用することが分かっている。
【０１２２】
核酸は、他の核酸配列と機能的関係で配置されている場合に「機能的に連結され」ている。例えば、プレ配列又は分泌リーダーのDNAは、これが、ポリペプチドの分泌に関与するプレタンパク質として発現される場合には、ポリペプチドのDNAに機能的に連結されており；プロモーター又はエンハンサーは、配列の転写に影響を及ぼす場合には、コード配列に機能的に連結され；もしくは、リボソーム結合部位は、翻訳を促進するように配置された場合に、コード配列に機能的に連結されている。一般に、「機能的に連結された」とは、連結されているDNA配列が、隣接しており、かつ分泌リーダーである場合は、隣接しかつリーディング相内にあることを意味している。しかしエンハンサーは、隣接していない。連結は、典型的には、都合の良い制限部位でのライゲーションにより達成される。このような部位が存在しない場合は、合成オリゴヌクレオチドアダプター又はリンカーは、通常の実践に従い使用される。転写及び翻訳調節核酸は、一般に転移性結腸直腸癌タンパク質を発現するために使用される宿主細胞に適しているであろう。様々な宿主細胞のための多くの種類の適当な発現ベクター、及び適当な調節配列が、当該技術分野において公知である。
【０１２３】
一般に、転写及び翻訳調節配列は、プロモーター配列、リボソーム結合部位、転写開始及び終結配列、翻訳開始及び終結配列、並びにエンハンサー又はアクチベーター配列を含むが、これらに限定されるものではない。好ましい態様において、調節配列は、プロモーター並びに転写開始及び終結配列を含む。
プロモーター配列は、構成的又は誘導的のいずれかのプロモーターをコードしている。これらのプロモーターは、天然のプロモーター又はハイブリッドプロモーターのいずれかであることができる。1種より多いプロモーターのエレメントと一緒のハイブリッドプロモーターも、当該技術分野において公知であり、かつ本発明において有用である。
【０１２４】
加えて、発現ベクターは、追加のエレメントを含むことができる。例えば、発現ベクターは、ふたつの複製システムを有し、従ってふたつの生物において維持されることが可能であり、例えば、発現のための哺乳類又は昆虫細胞、並びにクローニング及び増幅のための原核宿主などである。更に発現ベクターの組込みのために、この発現ベクターは、宿主細胞ゲノムと相同な少なくとも1個の配列を含み、かつ好ましくはこの発現構築体にフランキングしている2個の相同配列を含む。組込みベクターは、ベクターに封入するための適当な相同配列を選択することにより、宿主細胞の特異的遺伝子座に方向付けることができる。組込みベクターの構築は、当該技術分野において周知である(例えば、Fernandez及びHoeffler、前掲)。
【０１２５】
加えて、好ましい態様において、発現ベクターは、形質転換された宿主細胞の選択を可能にする選択マーカー遺伝子を含む。選択遺伝子は、当該技術分野において周知であり、かつ使用した宿主細胞により変動するであろう。
【０１２６】
本発明の転移性結腸直腸癌タンパク質は、転移性結腸直腸癌タンパク質をコードしている核酸を含む発現ベクターにより形質転換された宿主細胞の、転移性結腸直腸癌タンパク質の発現を誘導又は引き起すのに適した条件下での培養により産生される。転移性結腸直腸癌タンパク質発現に適した条件は、発現ベクター及び宿主細胞の選択によって変動し、かつ当業者はこれを、慣習的実験又は最適化を通じて容易に確認するであろう。例えば、発現ベクターにおける構成的プロモーターの使用は、宿主細胞の成長及び増殖の最適化を必要とする一方で、誘導プロモーターの使用は、誘導に適した増殖条件を必要とするであろう。加えて一部の態様において、収穫の時期は重要である。例えば、昆虫細胞発現において使用したバキュロウイルスシステムは、溶解性ウイルスであり、従って収穫時期の選択は、生成物の収量にとって重要であり得る。
【０１２７】
適当な宿主細胞は、酵母、細菌、古細菌、真菌、及び昆虫、並びに哺乳類細胞を含む動物細胞である。特に興味深いのは、Saccharomyces cerevisiae及び他の酵母、E. coli、Bacillus subtilis、Sf9細胞、C129細胞、293細胞、Neurospora、BHK、CHO、COS、HeLa細胞、HUVEC(ヒト臍帯静脈内皮細胞)、TEP1細胞(マクロファージ細胞株)及び様々な他のヒト細胞及び細胞株である。
【０１２８】
好ましい態様において、転移性結腸直腸癌タンパク質は、哺乳類細胞において発現される。哺乳類発現システムも当該技術分野において公知であり、かつレトロウイルス及びアデノウイルスシステムを含む。特に哺乳類プロモーターとしての使用は、哺乳類ウイルス遺伝子からのプロモーターであり、その理由はこのウイルス遺伝子は高度に発現されることが多く、かつ広範な宿主範囲を有するからである。例として、SV40初期プロモーター、マウス乳癌ウイルスLTRプロモーター、アデノウイルス主要後期プロモーター、単純ヘルペスウイルスプロモーター、及びCMVプロモーターがある(例えば、Fernandez及びHoeffler、前掲参照)。典型的には、哺乳類細胞により認識された転写終結配列及びポリアデニル化配列が、翻訳停止コドンの3'側に位置しかつ従ってプロモーターエレメントと共にコード配列にフランキングした調節領域である。転写ターミネーター及びポリアデニル化シグナルの例は、SV40由来のものを含む。
【０１２９】
外来核酸の哺乳類宿主に加え他の宿主への導入法は、当該技術分野において周知であり、かつ使用した宿主細胞により変動するであろう。技術は、デキストラン-媒介したトランスフェクション、リン酸カルシウム沈降法、ポリブレン(polybrene)媒介したトランスフェクション、プロトプラスト融合、電気穿孔、ウイルス感染、リポソーム内へのポリヌクレオチド(複数)のカプセル封入、及びDNAの核への直接的微量注入を含む。
【０１３０】
好ましい態様において、転移性結腸直腸癌タンパク質は、細菌システムにおいて発現される。バクテリオファージ由来のプロモーターも用いることができ、かつこれは当該技術分野において公知である。加えて、合成プロモーター及びハイブリッドプロモーターも有用である；例えば、tacプロモーターは、trp及びlacプロモーター配列のハイブリッドである。更に、細菌プロモーターは、細菌RNAポリメラーゼに結合しかつ転写を開始する能力を有する非-細菌起源の天然のプロモーターを含むことができる。機能性プロモーター配列に加えて、効率的リボソーム結合部位が望ましい。この発現ベクターは同じく、細菌における転移性結腸直腸癌タンパク質の分泌を提供するシグナルペプチド配列も含む。このタンパク質は、増殖培地に分泌される(グラム陽性菌)か、又は細胞の内膜と外膜の間に位置した細胞周辺腔へと分泌されるかの(グラム陰性菌)いずれかである。細菌発現ベクターは更に、形質転換された細菌株の選択を可能にする選択マーカー遺伝子も含むことができる。適当な選択遺伝子は、アンピシリン、クロラムフェニコール、エリスロマイシン、カナマイシン、ネオマイシン及びテトラサイクリンなどの薬物に対して細菌を耐性とする遺伝子を含む。選択マーカーは更に、ヒスチジン、トリプトファン及びロイシンの生合成経路におけるもののような生合成遺伝子も含む。これらの成分は、発現ベクターに集成される。細菌の発現ベクターは、当該技術分野において周知であり、かつとりわけBacillus subtilis、E. coli、Streptococcus cremoris、及びStreptococcus lividansのベクターを含む(例えば、Fernandez及びHoeffler、前掲)。これらの細菌発現ベクターは、塩化カルシウム処理、電気穿孔などのような当該技術分野において周知の技術を用い、細菌宿主細胞へ形質転換される。
【０１３１】
ひとつの態様において、転移性結腸直腸癌タンパク質は、昆虫細胞において産生される。昆虫細胞の形質転換のための発現ベクターは、特にバキュロウイルス-ベースの発現ベクターであり、当該技術分野において周知である。
好ましい態様において、転移性結腸直腸癌タンパク質は、酵母細胞において産生される。酵母発現システムは、当該技術分野において周知であり、かつSaccharomyces cerevisiae、Candida albicans及びC. maltosa、Hansenula polymorpha、Kluyveromyces fragilis及びK. lactis、Pichia guillerimondii及びP. pastoris、Schizosaccharomyces pombe、及びYarrowia lipolyticaの発現ベクターを含む。
【０１３２】
転移性結腸直腸癌タンパク質は、当該技術分野において周知の技術を用い、融合タンパク質としても作成することができる。従って例えば、モノクローナル抗体の作成のために、望ましいエピトープが小さいならば、転移性結腸直腸癌タンパク質は、担体タンパク質に融合し免疫原を形成することができる。あるいは、転移性結腸直腸癌タンパク質は、アフィニティー精製を目的として、又は他の理由で発現を増大するために、融合タンパク質として作成することができる。例えば、転移性結腸直腸癌タンパク質が転移性結腸直腸癌ペプチドである場合、このペプチドをコードしている核酸は、発現を目的として他の核酸に連結することができる。
【０１３３】
好ましい態様において、転移性結腸直腸癌タンパク質は、発現後に精製又は単離される。転移性結腸直腸癌タンパク質は、様々な適当な方法で単離又は精製することができる。標準の精製法は、電気泳動的、分子的、免疫学的及びクロマトグラフィー的技術を含み、これはイオン交換、疎水性、アフィニティー及び逆相HPLCクロマトグラフィー、及び等電点電気泳動を含む。例えば、転移性結腸直腸癌タンパク質は、標準の抗-転移性結腸直腸癌タンパク質抗体カラムを用いて精製することができる。タンパク質濃縮と組合せた、限外濾過及びダイアフィルトレーション技術も有用である。適当な精製技術の一般的指針については、Scopesの「Protein Purification」(1982)を参照のこと。必要な精製の程度は、転移性結腸直腸癌タンパク質の用途に応じて変動するであろう。場合によっては、精製は不要である。
【０１３４】
必要に応じ、一旦発現されかつ精製された転移性結腸直腸癌タンパク質及び核酸は、多くの適用において有用である。これらは、免疫選択試薬として、ワクチン試薬として、スクリーニング剤などとして有用であることができる。
【０１３５】
転移性結腸直腸癌タンパク質の変種
ひとつの態様において、転移性結腸直腸癌タンパク質は、野生型配列と比べて、誘導体又は変種の転移性結腸直腸癌タンパク質である。すなわちより詳細に以下に概説するように、誘導体転移性結腸直腸癌ペプチドは、少なくとも1種のアミノ酸の置換、欠失又は挿入を含むことが多く、アミノ酸置換が特に好ましいであろう。アミノ酸の置換、挿入又は欠失は、転移性結腸直腸癌ペプチド内の特定の残基において生じ得る。
【０１３６】
アミノ酸配列変種も、本発明の転移性結腸直腸癌タンパク質のひとつの態様に含まれる。これらの変種は、典型的には、下記の3クラスのひとつ又は複数に収まる：置換変種、挿入変種又は欠失変種。これらの変種は通常、前述のように変種をコードしているDNAを作成し、その後組換え細胞培養においてDNAを発現するために、カセット又はPCR突然変異誘発又は他の技術を使用する、転移性結腸直腸癌タンパク質をコードしているDNAのヌクレオチドの位置指定突然変異誘発により調製される。しかし、最大約100〜150残基を有する変種転移性結腸直腸癌タンパク質断片は、in vitro合成により調製することができる。アミノ酸配列変種は、変動の予め決定された性質により特徴決定され、それらを設定する特徴は、転移性結腸直腸癌タンパク質アミノ酸配列の天然のアレル又は中間種の変動からかけ離れている。これらの変種は、典型的には、天然のアナログと同じ定性的生物学的活性を示すが、以下により完全に概説するような修飾された特徴を有する変種を選択することもできる。
【０１３７】
アミノ酸配列変動を導入するための部位又は領域は予め決定されることが多いが、突然変異それ自身は予め決定される必要はない。例えば、所定の部位での突然変異の性能を最適化するために、ランダム突然変異誘発を、標的コドン又は領域において行い、かつ発現された転移性結腸直腸癌変種が、望ましい活性の最適な組合せについてスクリーニングされる。例えば、M13プライマー突然変異誘発及びPCR突然変異誘発のような、公知の配列を有するDNA内の予め決定された位置での置換突然変異の作出に関する技術が存在する。突然変異体のスクリーニングは、転移性結腸直腸癌タンパク質の活性アッセイを用いて行われる。
【０１３８】
アミノ酸置換は、典型的には1個の残基であり；挿入は通常、約1〜20個のアミノ酸の桁であるが、場合によってはかなり大きい挿入も忍容できる。欠失は、約1〜約20個の残基の範囲であるが、場合によってははるかに大きい欠失であってもよい。
【０１３９】
置換、欠失、挿入又はそれらの組合せは、最終誘導体に到達するために使用することができる。一般に、これらの変化は、その分子の変更を最小化するために、2、3個のアミノ酸について行われる。比較的大きい変化は、特定の環境において忍容される。転移性結腸直腸癌タンパク質の特徴の小さい変更が望ましい場合、置換は一般に、定義の項目で提供されたアミノ酸置換チャートに従い行われる。
【０１４０】
変種は、典型的には、天然のアナログと同じ性質の生物学的活性を示し、かつ同じ免疫応答を誘起するが、変種は、必要ならば、転移性結腸直腸癌タンパク質の特徴を修飾するように選択することもできる。あるいは、変種は、転移性結腸直腸癌タンパク質の生物学的活性が変更されるように設計又は認識することができる。例えば、グリコシル化部位を、変更又は除去することができる。
【０１４１】
転移性結腸直腸癌ポリペプチドの共有的修飾は、本発明の範囲内に含まれる。共有的修飾のひとつの型は、転移性結腸直腸癌ポリペプチドの選択された側鎖又はN-もしくはC-末端残基と反応することが可能である有機誘導化剤と転移性結腸直腸癌ポリペプチドの標的化されたアミノ酸残基との反応を含む。二価性試薬による誘導は、例えば、より詳細に以下に説明している、抗-転移性結腸直腸癌ポリペプチド抗体の精製のための方法又はスクリーニングアッセイにおいて使用するための、転移性結腸直腸癌ポリペプチドの水に不溶性の支持体マトリックス又は表面への架橋において有用である。通常使用される架橋剤は、例えば、1,1-ビス(ジアゾアセチル)-2-フェニルエタン、グルタルアルデヒド、N-ヒドロキシスクシンイミドエステル、例えば、4-アジドサリチル酸とのエステル、3,3'-ジチオビス(スクシンイミジルプロピオン酸エステル)のようなジスクシニミジルエステルを含むホモ二官能イミドエステル、ビス-N-マレイミド-1,8-オクタンのような二官能マレイミド、及びメチル-3-((p-アジドフェニル)ジチオ)プロピオイミダートのような試薬を含む。
【０１４２】
他の修飾は、各々、対応するグルタミル及びアスパルチル残基への、グルタミニル及びアスパラギニル残基の脱アミド化、プロリン及びリシンの水酸化、セリル、トレオニル又はチロシル残基のヒドロキシル基のリン酸化、リシン、アルギニン及びヒスチジン側鎖のγ-アミノ基のメチル化(Creighton、Proteins: Structure and Molecular Properties、79-86頁(1983年))、N-末端アミンのアセチル化、並びにC-末端カルボキシル基のアミド化を含む。
【０１４３】
本発明に包含される転移性結腸直腸癌ポリペプチドの共有的修飾の別の種類は、このポリペプチドの変更された未変性のグリコシル化パターンである。本願明細書において「未変性のグリコシル化パターンの変更」は、転移性結腸直腸癌ポリペプチドの未変性配列の1個又は複数の糖残基の付加又は欠失を意味することが意図されている。グリコシル化パターンは、多くの方法で変更することができる。例えば、転移性結腸直腸癌-関連配列を発現するための様々な細胞型の使用は、様々なグリコシル化パターンを生じることができる。
【０１４４】
グリコシル化部位の転移性結腸直腸癌ポリペプチドへの付加は、それらのアミノ酸配列の変更によっても実現することができる。この変更は、例えば、転移性結腸直腸癌ポリペプチドの未変性の配列への、1個又は複数のセリン又はトレオニン残基の付加、又は置換により行うことができる(O-連結したグリコシル化部位)。この転移性結腸直腸癌アミノ酸配列は、DNAレベルでの変化を通じて、特に所望のアミノ酸へ翻訳するコドンが作成されるための転移性結腸直腸癌ポリペプチドをコードしているDNAの予め選択された塩基での突然変異により、任意に変更することができる。
【０１４５】
転移性結腸直腸癌ポリペプチド上の糖部分の数を増大する別の手段は、グリコシドのポリペプチドへの化学的又は酵素的結合による。このような方法は、当該技術分野において説明されており、例えば、国際公開公報第87/05330号、及びAplin及びWriston, CRC Crit. Rev. Biochem.、259-306頁(1981)に説明されている。
転移性結腸直腸癌ポリペプチド上に存在する糖部分の除去は、化学的もしくは酵素的に、又は標的としてグリコシル化を利用するアミノ酸残基をコードしているコドンの突然変異性の置換により、実現することができる。化学的脱グリコシル化技術は、当該技術分野において公知であり、かつ例えばHakimuddinらの論文(Arch. Biochem. Biophys.、259:52 (1987))及びEdgeらの論文(Anal. Biochem.、118:131 (1981))に説明されている。ポリペプチド上の糖部分の酵素的切断は、Thotakuraらの論文(Meth. Enzymol.、138:350 (1987))に説明されたような、様々なエンド-及びエキソ-グリコシダーゼの使用により実現することができる。
【０１４６】
別の種類の転移性結腸直腸癌の共有的修飾は、転移性結腸直腸癌ポリペプチドの、様々な非タンパク質性ポリマー、例えばポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、又はポリオキシアルキレンへの連結を含み、その方法は、米国特許第4,640,835号；第4,496,689号；第4,301,144号；第4,670,417号；第4,791,192号又は第4,179,337号に開示されている。
【０１４７】
本発明の転移性結腸直腸癌ポリペプチドは、別の異種ポリペプチド又はアミノ酸配列に融合した転移性結腸直腸癌ポリペプチドを含むキメラ分子を形成する方法で修飾することもできる。ある態様において、このようなキメラ分子は、転移性結腸直腸癌ポリペプチドの、抗-タグ抗体が選択的に結合し得るエピトープを提供するタグポリペプチドとの融合体を含む。このエピトープタグは一般に、転移性結腸直腸癌ポリペプチドのアミノ-又はカルボキシル-末端に配置される。このような転移性結腸直腸癌ポリペプチドのエピトープ-タグ化された形の存在は、このタグポリペプチドに対する抗体を用いて検出することができる。更に、エピトープタグの供給は、抗-タグ抗体又はこのエピトープタグに結合する他の種類のアフィニティマトリックスを使用するアフィニティ精製により、転移性結腸直腸癌ポリペプチドを容易に精製することができるようにする。代わりの態様において、キメラ分子は、転移性結腸直腸癌ポリペプチドの、免疫グロブリン又は免疫グロブリンの特定領域との融合体を含むことができる。二価型のキメラ分子については、このような融合体は、IgG分子のFc領域である。
【０１４８】
様々なタグポリペプチド及びそれらの各抗体は周知であり、かつ例として、ポリ-ヒスチジン(poly-his)又はポリ-ヒスチジン-グリシン(poly-his-gly)タグ；HIS6及び金属キレートタグ、flu HAタグポリペプチド及びその抗体12CA5(Fieldら、Mol. Cell. Biol.、8:2159-2165 (1988))；c-mycタグ及びそれに対する8F9、3C7、6E10、G4、B7及び9E10抗体(Evanら、Molecular and Cellular Biology、5:3610-3616 (1985))；並びに、単純ヘルペスウイルス糖タンパク質D(gD)タグ及びその抗体(Paborskyら、Protein Engineering、3(6):547-553 (1990))がある。他のタグポリペプチドは、Flag-ペプチド(Hoppら、BioTechnology、6:1204-1210 (1988))；KT3エピトープペプチド(Martinら、Science、255:192-194 (1992))；チューブリンエピトープペプチド(Skinnerら、J. Biol. Chem.、266:15163-15166 (1991))；並びに、T7遺伝子10タンパク質ペプチドタグ(Lutz-Freyermuthら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、87:6393-6397 (1990))がある。
【０１４９】
更に他の転移性結腸直腸癌ファミリーの転移性結腸直腸癌タンパク質、及び他の生物に由来する転移性結腸直腸癌タンパク質も含まれ、これらは以下に概説したように、クローニングされかつ発現される。従って、プローブ又は縮重ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)プライマー配列を用い、霊長類又は他の生物から、他の関連した転移性結腸直腸癌タンパク質を見つけることができる。当業者に明らかであるように、特に有用なプローブ及び／又はPCRプライマー配列は、転移性結腸直腸癌核酸配列の独自の領域を含む。当該技術分野において一般に公知であるように、好ましいPCRプライマーは、長さが約15〜約35個のヌクレオチドであり、約20〜約30個が好ましく、かつ必要ならばイノシンを含むことができる。PCR反応条件は、当該技術分野において周知である(例えば、Innis、PCR Protocols、前掲)。
【０１５０】
転移性結腸直腸癌タンパク質に対する抗体
好ましい態様において、例えば免疫療法又は免疫診断のために、転移性結腸直腸癌タンパク質を使用し抗体を作成する場合、転移性結腸直腸癌タンパク質は、完全長タンパク質と、少なくとも1個のエピトープ又は決定基を共有しなければならない。本願明細書において「エピトープ」又は「決定基」は、典型的には、抗体又はMHCの状況ではT-細胞受容体を作成及び／又は結合するタンパク質の部分を意味する。従ってほとんどの場合、比較的小さい転移性結腸直腸癌タンパク質に対して作成された抗体は、完全長タンパク質に、特に線状エピトープに結合することができるであろう。好ましい態様において、エピトープは独特であり；すなわち、独自のエピトープに対して作成された抗体は、ほとんど又は全く交差反応性を示さない。
【０１５１】
ポリクローナル抗体を調製する方法は、周知である(例えば、Coligan、前掲；及び、Harlow及びLane、前掲)。ポリクローナル抗体は、哺乳類において、例えば、免疫化物質及び望ましいならばアジュバントの1回又は複数回の注射により作成することができる。典型的には、この免疫化物質及び／又はアジュバントは、哺乳類において、反復皮下又は腹腔内注射により注射することができるであろう。免疫化物質は、表1-26の核酸によりコードされたタンパク質又はそれらの断片又はそれらの融合タンパク質を含む。免疫化物質を、免疫感作された哺乳類において免疫原性であることがわかっているタンパク質に複合することは有用であり得る。免疫原性タンパク質は、例えば、キーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシチログロブリン、及びダイズトリプシンインヒビターを含む。アジュバントは、例えば、フロイントの完全アジュバント及びMPL-TDMアジュバント(モノホスホリルリピドA、合成トレハロースジコリノミコレート)を含む。免疫感作プロトコールは、当業者は選択することができる。
【０１５２】
あるいは抗体は、モノクローナル抗体であることができる。モノクローナル抗体は、Kohler及びMilstein、Nature、256:495 (1975)に説明されたような、ハイブリドーマ法を用いて調製される。ハイブリドーマ法において、マウス、ハムスター又は他の適当な宿主動物は、典型的には、免疫化物質により免疫感作され、免疫化物質に特異的に結合するであろう抗体を産生する又は産生することが可能であるようなリンパ球を惹起する。あるいは、リンパ球は、in vitroにおいて免疫感作することができる。この免疫化物質は、典型的には、表1-26の核酸でコードされたポリペプチド、又はそれらの断片、又はそれらの融合タンパク質を含むであろう。一般に、ヒト起源の細胞が望ましい場合、末梢血リンパ球(「PBL」)が使用され、もしくは非ヒト哺乳類給源が望ましい場合は、脾細胞又はリンパ節細胞が使用される。その後リンパ球は、ポリエチレングリコールのような適当な融合剤を用い、不死化された細胞株と融合され、ハイブリドーマ細胞を形成する(Goding、Monoclonal Antibodies: Principles and Practice、59-103頁(1986年))。不死化された細胞株は、通常形質転換された哺乳類細胞であり、特に齧歯類、ウシ及び霊長類起源のミエローマ細胞である。通常、ラット又はマウスのミエローマ細胞株が使用される。これらのハイブリドーマ細胞は、好ましくは融合していない不死化された細胞の増殖又は生存を阻害する1種又は複数の物質を含有する適当な培養培地において培養することができる。例えば、親細胞が、酵素ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(HGPRT又はHPRT)を欠損しているならば、そのハイブリドーマに対する培養培地は典型的には、ヒポキサンチン、アミノプテリン、及びチミジンを含有し(「HAT培地」)、これらの物質は、HGPRT-欠損細胞の増殖を阻害する。
【０１５３】
ある態様において、抗体は、二重特異性抗体である。二重特異性抗体は、典型的には、少なくとも2種の異なる抗原に対する結合特異性を有する、又は同じ抗原上のふたつのエピトープに対する結合特異性を有するか、モノクローナル性の、好ましくはヒト又はヒト化された抗体である。ひとつの態様において、結合特異性のひとつは、表1-26の核酸又はそれらの断片によりコードされたタンパク質に関し、他方は、いずれか他の抗原、及び好ましくは細胞-表面タンパク質又は受容体もしくは受容体サブユニット、好ましくは腫瘍特異性のものに関する。あるいは、四量体型技術は、多価試薬を作成することができる。
【０１５４】
好ましい態様において、転移性結腸直腸癌タンパク質に対する抗体は、以下に説明するように、転移性結腸直腸癌タンパク質の生物学的機能を低下又は排除することが可能である。すなわち、抗-転移性結腸直腸癌タンパク質抗体(ポリクローナル性又は好ましくはモノクローナル性のいずれか)を転移性結腸直腸癌組織(又は転移性結腸直腸癌を含む細胞)へ添加することは、転移性結腸直腸癌を軽減又は消失する。一般に、活性、成長、サイズなどの少なくとも25％の減少が好ましく、少なくとも約50％が特に好ましく、及び約95〜100％の減少が特に好ましい。
【０１５５】
好ましい態様において、転移性結腸直腸癌タンパク質に対する抗体は、ヒト化された抗体である(例えば、Xenerex Biosciences社、Mederex社、Abgenix社、Protein Design Labs社)。非-ヒト(例えばマウス)抗体のヒト化された型は、非ヒト免疫グロブリン由来の最小配列を含む免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖、又はそれらの断片(例えばFv、Fab、Fab'、F(ab')2、又は抗体の他の抗原-結合部分配列)のキメラ分子である。ヒト化抗体は、レシピエントの相補性決定領域(CDR)からの残基が、望ましい特異性、親和性及び能力を有するマウス、ラット又はウサギのような非ヒト種のCDRからの残基(ドナー抗体)で置き換わっているような、ヒト免疫グロブリン(レシピエント抗体)を含む。一部の例においては、ヒト免疫グロブリンのFvフレームワーク残基は、対応する非-ヒト残基と交換することができる。ヒト化された抗体は更に、レシピエント抗体においても移入されたCDR又はフレームワーク配列においても認められない残基を含むこともできる。一般に、ヒト化された抗体は、少なくとも1種、及び典型的には2種の可変ドメインの実質的に全てを含み、ここで全て又は実質的に全てのCDR領域は、非ヒト免疫グロブリンのそれに相当し、かつ全て又は実質的に全てのフレームワーク(FR)領域は、ヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のものである。最適にヒト化された抗体は、典型的にはヒト免疫グロブリンの、免疫グロブリン定常領域(Fc)の少なくとも一部を含むであろう(Jonesら、Nature、321:522-525 (1986)；Riechmannら、Nature、332:323-329 (1988)；及び、Presta、Curr. Op. Struct Biol.、2:593-596 (1992))。ヒト化は、齧歯類CDR又はCDR配列のヒト抗体の対応する配列との置換により、本質的にWinterとその同僚の方法に従い行うことができる(Jonesら、Nature、321:522-525 (1986)；Riechmannら、Nature、332:323-327 (1988)；Verhoeyenら、Science、239:1534-1536 (1988))。従って、このようなヒト化された抗体は、キメラ抗体(米国特許第4,816,567号)であり、ここでは完全なヒト可変ドメインよりも実質的に少ないものが、非ヒト種由来の対応する配列で置換されている。
【０１５６】
ヒト-様抗体も、ファージディスプレイライブラリーを含む、当該技術分野において公知の様々な技術を用い作成することができる(Hoogenboom及びWinter、J. Mol. Biol.、227:381 (1991)；Marksら、J Mol. Biol.、222:581 (1991))。Coleら及びBoernerらの技術も、ヒトモノクローナル抗体の調製に利用可能である(Coleら、Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy、77頁(1985)及びBoenrerら、J. Immunol、147(1):86-95 (1991))。同様に、ヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン遺伝子座の、例えば、内因性免疫グロブリン遺伝子が部分的又は完全に失活されているマウスのような、トランスジェニック動物へ導入することにより作成することができる。チャレンジ時に、ヒト抗体産生が認められ、これは、遺伝子再構成、集成及び抗体レパトアを含む、事実上全ての点に関してヒトにおいて認められるものと密に類似している。この方法は、例えば、米国特許第5,545,807号；第5,545,806号；第5,569,825号；第5,625,126号；第5,633,425号；第5,661,016号、並びに下記の科学文献：Marksら、Bio/Technology、10:779-783 (1992)；Lonbergら、Nature、368:856-859 (1994)；Morrison、 Nature、368:812-13 (1994)；Fishwildら、Nature、Biotechnology、14:845-51 (1996)；Neuberger、Nature Biotechnology、14:826 (1996)；Lonberg及びHuszar、Intern. Rev. Immunol.、13:65-93 (1995)に説明されている。
【０１５７】
免疫療法は、転移性結腸直腸癌タンパク質に対して生じた抗体による、転移性結腸直腸癌の治療を意味する。本願明細書において使用されるように、免疫療法は、受動又は能動であることができる。本願明細書に定義された、受動免疫療法は、レシピエント(患者)への抗体の受動的輸送である。能動免疫は、レシピエント(患者)における抗体及び／又はT-細胞反応の誘導である。免疫応答の誘導は、それに対し抗体が生じるような抗原のレシピエントへの提供の結果である。この抗原は、それに対する抗体が生じることが望ましいポリペプチドのレシピエントへの注射、又は抗原を発現することが可能な核酸とレシピエント及び抗原の発現のための条件下での接触により提供され、免疫応答につながる。
【０１５８】
好ましい態様において、それに対して抗体が生じる転移性結腸直腸癌タンパク質は、先に説明したように分泌タンパク質である。理論的裏付けはないが、治療に使用される抗体は、分泌タンパク質に結合し、これがその受容体に結合することを妨害し、これにより、分泌される転移性結腸直腸癌タンパク質を失活させる。
【０１５９】
別の好ましい態様において、それに対して抗体が生じる転移性結腸直腸癌タンパク質は、膜貫通タンパク質である。理論的裏付けはないが、この治療に使用される抗体は、典型的には転移性結腸直腸癌タンパク質の細胞外ドメインに結合し、これが、循環血中リガンド又は細胞-会合分子のような他のタンパク質と結合することを妨害する。この抗体は、膜貫通転移性結腸直腸癌タンパク質のダウン-レギュレーションを引き起す。この抗体は、転移性結腸直腸癌タンパク質の細胞外ドメインへのタンパク質結合の競合的、非-競合的又は未競合的インヒビターであることができる。この抗体は、転移性結腸直腸癌タンパク質のアンタゴニストであることができ、もしくは膜貫通転移性結腸直腸癌タンパク質の活性化を妨害することができる。一部の態様において、抗体が他の分子の転移性結腸直腸癌タンパク質への結合を妨害する場合、この抗体は、細胞の増殖を妨害する。この抗体は、細胞を、TNF-α、TNF-β、IL-1、IFN-γ及びIL-2を含むが、これらに限定されるものではないような細胞傷害性物質、又は5FU、ビンブラスチン、アクチノマイシンD、シスプラチン、メトトレキセートなどの化学療法剤に対して標的化又は増感するために使用することもできる。場合によっては、この抗体は、膜貫通タンパク質と複合体化された場合に、血清補体を活性化し、これにより細胞傷害性又は抗原依存性細胞傷害作用(ADCC)を媒介する亜型に属する。従って、転移性結腸直腸癌は、患者への、膜貫通転移性結腸直腸癌タンパク質に対する抗体の投与により治療される。抗体-標識は、共毒素(co-toxin)を活性化し、毒素搭載(payload)を局在化し、さもなければ局所的に細胞を除去する手段を提供する。
【０１６０】
別の好ましい態様において、抗体は、エフェクター部分に複合される。エフェクター部分は、放射性標識又は蛍光標識のような標識部分を含むいくつかの分子であることができ、もしくは治療的部分であることができる。ひとつの局面において、治療的部分は、転移性結腸直腸癌タンパク質の活性を変調する小分子である。別の局面において、治療的部分は、転移性結腸直腸癌タンパク質に会合した又はこれと非常に近傍にある分子の活性を変調する。治療的部分は、転移性結腸直腸癌に関連したプロテアーゼ又はコラゲナーゼ活性のような、酵素活性を阻害してもよい。
【０１６１】
好ましい態様において、治療的部分は、細胞傷害性物質であることもできる。この方法において、細胞傷害性物質の転移性結腸直腸癌組織又は細胞への標的化は、罹患細胞数の減少を生じ、これにより転移性結腸直腸癌に関連した症状が軽減される。細胞傷害性物質は多数でありかつ変動し、及び細胞傷害性薬物又は毒素又はこのような毒素の活性断片を含むが、これらに限定されるものではない。適当な毒素及びそれらに対応する断片は、ジフテリアA鎖、外毒素A鎖、リシンA鎖、アルビンA鎖、クルシン、クロチン、フェノマイシン、エノマイシンなどである。細胞傷害性物質は更に、転移性結腸直腸癌タンパク質に対して生じた抗体への放射性同位元素の複合、又は抗体に共有結合されたキレート剤への放射性核種の結合により作成される放射性化学物質も含む。膜貫通転移性結腸直腸癌タンパク質への治療的部分の標的化は、転移性結腸直腸癌の患部における治療的部分の局所的濃度の増加を利用するのみではなく、治療的部分に関連し得る有害な副作用の低減も利用する。
【０１６２】
別の好ましい態様において、それに対し抗体が生じる転移性結腸直腸癌タンパク質は、細胞内タンパク質である。この場合、抗体は、細胞への侵入を促進するタンパク質又は他の実体に複合することができる。ひとつの場合において、抗体は、エンドサイトーシスにより細胞へ侵入する。別の態様において、抗体をコードしている核酸が、個体又は細胞へ投与される。更に、転移性結腸直腸癌タンパク質が、細胞内、すなわち核内に標的化され得る場合、それに対する抗体は、標的の局在化に関するシグナル、すなわち核局在化シグナルを含む。
【０１６３】
本発明の転移性結腸直腸癌抗体は、転移性結腸直腸癌タンパク質に特異的に結合する。本願明細書において「特異的結合」は、抗体がタンパク質へ、少なくとも約0.1mMのKdで、より一般的には少なくとも約1μM、好ましくは少なくとも約0.1μM又はそれ以上、及び最も好ましくは0.01μM又はそれ以上で結合することを意味する。結合の選択性も重要である。
【０１６４】
診断及び治療適用での転移性結腸直腸癌配列の検出
ひとつの局面において、遺伝子のRNA発現レベルが、転移性結腸直腸癌表現型の様々な細胞状態について決定される。正常組織(すなわち、転移性結腸直腸癌ではない)及び転移性結腸直腸癌組織(場合によっては、以下に概略したように予後に関連している転移性結腸直腸癌の重症度を変動するため)における遺伝子の発現レベルは、発現プロファイルを提供することにより評価される。特定の細胞状態又は発症の時点での発現プロファイルは、本質的にその状態の「フィンガープリント」である。ふたつの状態が、同様に発現された特定の遺伝子を有する一方で、多くの遺伝子の評価は、同時に細胞の状態を反映している遺伝子発現プロファイルの作成を可能にする。様々な状態での細胞における発現プロファイルを比較することにより、これらの状態の各々においてどの遺伝子が重要であるか(遺伝子のアップ-及びダウン-レギュレーションの両方を含む)に関する情報が得られる。その後、診断が行われるか又は、その組織試料が、正常なもしくは癌性組織の遺伝子発現プロファイルを有するかどうかを決定するために確認される。これは関連した状態の分子診断を提供するであろう。
【０１６５】
本願明細書において使用される「示差的発現」又は文法上の同等物は、細胞及び組織内及び間における、一時的及び／又は細胞性の遺伝子発現パターンにおける定性的又は定量的差異を意味する。従って、示差的に発現された遺伝子は、例えば、正常組織、対、転移性結腸直腸癌組織において、活性化又は失活を含む、変更されたその発現を定性的に有することができる。遺伝子は、特定の状態でオン又はオフ(turned on or turned off)されることができ、従って別の状態と関連して、2種以上の状態の比較が可能である。定性的に調節された遺伝子は、標準技術で検出可能な状態又は細胞型内の発現パターンを示すであろう。いくつかの遺伝子は、一方の状態又は細胞型においては発現されるが、両方では発現されないであろう。あるいは発現の差異は、定量的であることができ、例えば、発現は、増加又は減少され；すなわち、遺伝子発現は、アップレギュレーションされ、増加した量の転写産物を生じるか、もしくはダウンレギュレーションされ、減少した量の転写産物を生じるかのいずれかである。発現が異なる程度は、以下に概説するような標準の特徴決定技術、例えばAffymetrix GeneChip(商標)発現アレイ(Lockhart、Nature Biotechnology、14:1675-1680 (1996)、これは明らかに本願明細書に参照として組入れられている。）の使用により定量するために十分な大きさのみが必要である。他の技術は、定量的逆転写PCR、ノーザン分析及びRNaseプロテクションを含むが、これらに限定されるものではない。先に概説したように、好ましくは発現の変化(すなわち、アップレギュレーション又はダウンレギュレーション)は、典型的には少なくとも約50％、より好ましくは少なくとも約100％、更に好ましくは少なくとも約150％、更により好ましくは少なくとも約200％であり、300〜少なくとも1000％が特に好ましい。
【０１６６】
評価は、遺伝子転写産物、又はタンパク質レベルであることができる。遺伝子発現の量は、遺伝子転写産物のDNA又はRNA同等物への核酸プローブ、及び遺伝子発現レベルの定量を用いてモニタリングすることができ、あるいは最終遺伝子産物それ自身(タンパク質)を、例えば、転移性結腸直腸癌タンパク質に対する抗体及び標準のイムノアッセイ(ELISAなど)又は質量分析アッセイ、2Dゲル電気泳動アッセイなどを含む他の技術により、モニタリングすることができる。転移性結腸直腸癌遺伝子に対応するタンパク質、すなわち、転移性結腸直腸癌表現型において重要であることが同定されたものは、転移性結腸直腸癌診断試験において評価することができる。
好ましい態様において、遺伝子発現のモニタリングは、多くの遺伝子において同時に行われる。
【０１６７】
転移性結腸直腸癌核酸プローブは、特定の細胞における転移性結腸直腸癌配列の検出及び定量のために、本願明細書に概説したようなバイオチップに結合してもよい。これらのアッセイは更に、下記例において説明される。PCR技術は、より大きい感度を提供するために使用することができる。複数のタンパク質発現のモニタリングも、行うことができる。同様にこれらのアッセイは、個体を基にも行うことができる。
【０１６８】
好ましい態様において、転移性結腸直腸癌タンパク質をコードしている核酸が検出される。転移性結腸直腸癌タンパク質をコードしているDNA又はRNAは検出することができるが、特に興味深いのは、転移性結腸直腸癌タンパク質をコードしているmRNAが検出される方法である。mRNAを検出するためのプローブは、mRNAと相補的でありかつハイブリダイズするようなヌクレオチド／デオキシヌクレオチドプローブであることができ、かつオリゴヌクレオチド、cDNA又はRNAを含むが、これらに限定されるものではない。プローブは、本願明細書において定義されたような、検出可能な標識も含むこととする。ひとつの方法において、mRNAは、ナイロン膜のような固形支持体上への試験される核酸の固定、及びこのプローブの試料とのハイブリダイゼーションの後に、検出される。非特異的に結合したプローブを除去するために洗浄した後、標識が検出される。別の方法において、mRNAの検出は、in situにおいて行われる。この方法において、透過性とされた細胞又は組織試料は、検出できるように標識された核酸プローブと、このプローブが標的mRNAとハイブリダイズするのに十分な時間、接触させられる。非特異的に結合したプローブを除去するために洗浄した後、標識が検出される。例えば、転移性結腸直腸癌タンパク質をコードしているmRNAに相補的であるジゴキシゲニン標識したリボプローブ(RNAプローブ)は、ジゴキシゲニンの、抗-ジゴキシゲニン二次抗体との結合、並びにニトロブルーテトラゾリウム及び5-ブロモ-4-クロロ-3-インドイルリン酸による発色により検出される。
【０１６９】
好ましい態様において、本願明細書に説明されたようなタンパク質の3種のクラス(分泌型、膜貫通型又は細胞内型タンパク質)の様々なタンパク質が、診断アッセイにおいて使用される。転移性結腸直腸癌配列を含む転移性結腸直腸癌タンパク質、抗体、核酸、修飾されたタンパク質及び細胞は、診断アッセイにおいて使用される。これは、個々の遺伝子又は対応するポリペプチドレベルについて行うことができる。好ましい態様において、発現プロファイルは、好ましくは高処理量スクリーニング技術と組合せて使用され、遺伝子及び／又は対応するポリペプチドの発現プロファイルのモニタリングを可能にする。
【０１７０】
本願明細書において説明されかつ定義されたように、細胞内型、膜貫通型又は分泌型タンパク質を含む転移性結腸直腸癌タンパク質は、転移性結腸直腸癌のマーカーとしての用途が認められる。転移性結腸直腸癌と推定される組織におけるこれらのタンパク質の検出は、転移性結腸直腸癌の検出又は診断を可能にする。ひとつの態様において、抗体が、転移性結腸直腸癌タンパク質の検出に使用される。好ましい方法は、ゲル(典型的には、変性及び縮小(reducing)タンパク質ゲルであるが、等電点ゲルなどのような、他の種類のゲルであることもできる)上での電気泳動により、試料からタンパク質を分離する。タンパク質の分離後、転移性結腸直腸癌タンパク質は、例えば、転移性結腸直腸癌タンパク質に対して生じた抗体によるイムノブロッティングにより検出される。イムノブロッティング法は、当業者に周知である。
【０１７１】
別の好ましい方法において、転移性結腸直腸癌タンパク質に対する抗体は、例えば、組織学(例えば、Methods in Cell Bology: Antibodies in Cell Biology、第37巻(Asai編集、1993年))において、in situ画像形成技術における用途が分かっている。この方法において、細胞は、転移性結腸直腸癌タンパク質(複数)に対する多くの抗体のひとつと接触される。非特異的に結合した抗体を除去するために洗浄した後、1個又は複数の抗体の存在が検出される。ひとつの態様において、この抗体は、例えば、多色蛍光又は共焦点画像形成のような、検出可能な標識を含む二次抗体と共にインベーションすることにより検出される。別の方法において、転移性結腸直腸癌タンパク質(複数)に対する一次抗体は、検出可能な標識、例えば、基質に作用することができる酵素マーカーを含む。別の好ましい態様において、複数の一次抗体の各々は、識別できかつ検出可能な標識を含む。この方法は、複数の転移性結腸直腸癌タンパク質に関する同時スクリーニングにおける特定の用途を見いだす。多くの他の組織学的画像形成技術も、本発明により提供される。
【０１７２】
好ましい態様において、標識は、異なる波長の放出を検出及び識別の能力を有する蛍光光度計により検出される。加えて、蛍光標示式細胞分取器(FACS)を、この方法において使用することができる。
別の好ましい態様において、抗体は、血液、血清、血漿、糞便及び他の試料中の転移性結腸直腸癌の診断における用途を見つける。従ってこのような試料は、転移性結腸直腸癌タンパク質の存在について探索又は試験される試料として有用である。抗体は、ELISA、イムノブロッティング(ウェスタンブロット)、免疫沈降、BIACORE技術などを含む、先に説明したイムノアッセイ技術により、転移性結腸直腸癌タンパク質を検出するために使用することができる。逆に抗体の存在は、内在性転移性結腸直腸癌タンパク質又はワクチンに対する免疫応答を示すことができる。
【０１７３】
好ましい態様において、標識された転移性結腸直腸癌核酸プローブの組織アレイへのin situハイブリダイゼーションが行われる。例えば、転移性結腸直腸癌組織及び／又は正常組織を含む組織試料のアレイが作成される。その後in situハイブリダイゼーション(例えば、Ausubel、前掲参照)が行われる。個体と標準の間のフィンガープリントを比較する場合に、当業者は、その所見を基に診断、予後又は推定を行うことができる。更に、診断を示す遺伝子は、予後を示すものとは異なり、及び細胞の状態の分子プロファイリングは、反応性又は難治性の状態の識別につながり、もしくは転帰を推定することができることが理解される。
【０１７４】
好ましい態様において、転移性結腸直腸癌配列を含む転移性結腸直腸癌タンパク質、抗体、核酸、修飾されたタンパク質及び細胞は、予後判定アッセイにおいて使用することができる。前記のように、長期予後判定に関して、転移性結腸直腸癌と相関する遺伝子発現プロファイルを作成することができる。再度これも、タンパク質又は遺伝子レベルのいずれかについて行うことができ、この遺伝子の使用が好ましい。前記のように、転移性結腸直腸癌プローブは、組織又は患者における転移性結腸直腸癌配列の検出及び定量のために、バイオチップに結合することができる。これらのアッセイは、診断に関して先に概説したように進行される。PCR法は、より感度の良い正確な定量を提供することができる。
【０１７５】
治療的化合物のアッセイ
好ましい態様において、本願明細書に説明された3種のタンパク質の一員が、薬物スクリーニングアッセイにおいて使用される。転移性結腸直腸癌配列を含む転移性結腸直腸癌タンパク質、抗体、核酸、修飾されたタンパク質及び細胞は、薬物スクリーニングアッセイにおいて、又は「遺伝子発現プロファイル」もしくはポリペプチドの発現プロファイルに対する薬物候補の作用の評価により使用される。好ましい態様において、発現プロファイルが使用され、好ましくは候補物質による処理後、発現プロファイルについて遺伝子をモニタリングすることができる高処理量スクリーニング技術と組合せて、使用される(例えば、Zlokarnikら、Science、279:84-8 (1998)；Heid、Genome Res、6:986-94 (1996))。
【０１７６】
好ましい態様において、未変性の又は修飾された転移性結腸直腸癌タンパク質を含む転移性結腸直腸癌タンパク質、抗体、核酸、修飾されたタンパク質及び細胞が、スクリーニングアッセイにおいて使用される。すなわち、本発明は、転移性結腸直腸癌表現型又は同定された転移性結腸直腸癌タンパク質の生理的機能を変調する組成物についてスクリーニングするための新規方法を提供する。前記のように、これは個々の遺伝子レベルについて又は薬物候補の「遺伝子発現プロファイル」に対する作用の評価により行うことができる。好ましい態様において、発現プロファイルが使用され、好ましくは候補物質による処理後、発現プロファイルについて遺伝子をモニタリングすることができる高処理量スクリーニング技術と組合せて使用され、これについては前掲のZlokarnikらの論文を参照のこと。
【０１７７】
ここで示差的に発現された遺伝子が同定され、様々なアッセイが適用される。好ましい態様において、アッセイは、個々の遺伝子又はタンパク質レベルについて試行することができる。すなわち、転移性結腸直腸癌において変更されたレギュレーションを伴う特定の遺伝子を同定し、被験化合物を、遺伝子発現を変調する能力又は転移性結腸直腸癌タンパク質への結合についてスクリーニングすることができる。従って「変調」は、遺伝子発現の増加又は減少を含む。変調の好ましい量は、正常組織、対、転移性結腸直腸癌罹患した組織における遺伝子発現の当初の変化によって決まり、この変化は、少なくとも10％、好ましくは50％、より好ましくは100〜300％、及び一部の態様においては300〜1000％又はそれよりも多いであろう。従って、遺伝子が正常組織と比べ転移性結腸直腸癌組織において4倍の増加を示す場合は、約4-倍の減少が望ましいことが多く；同様に、正常組織と比べ転移性結腸直腸癌組織における10倍の減少は、被験化合物により誘導される発現の10-倍の増加の目標値を提供することが多い。
【０１７８】
遺伝子発現の量は、核酸プローブ及び遺伝子発現レベルの定量を用いてモニタリングするか、あるいは、遺伝子産物それ自身を、例えば転移性結腸直腸癌タンパク質に対する抗体の使用及び標準のイムノアッセイにより、モニタリングすることができる。プロテオミクス及び分離技術も、発現の定量が可能である。
【０１７９】
好ましい態様において、多くの実体の遺伝子又はタンパク質発現のモニタリングすなわち、発現プロファイルは、同時にモニタリングされる。このようなプロファイルは、典型的には複数の本願明細書において説明されたこのような実体に関連するであろう。
【０１８０】
この態様において、特定の細胞における転移性結腸直腸癌配列の検出及び定量のために、本願明細書に概説したように、転移性結腸直腸癌核酸プローブは、バイオチップに結合することができる。あるいは、PCRを使用することができる。従って、望ましいウェル中の分配されたプライマーを伴う一連のもの、例えばマイクロタイタープレートを使用することができる。次にPCR反応を、各ウェルについて行いかつ分析することができる。
【０１８１】
発現のモニタリングは、1種又は複数の転移性結腸直腸癌-関連配列、例えば、表1-26に示したポリヌクレオチド配列の発現を修飾する化合物を同定するために行うことができる。一般に好ましい態様において、被験化合物は、分析前に細胞に添加される。更に、転移性結腸直腸癌を変調するか、転移性結腸直腸癌タンパク質を変調するか、転移性結腸直腸癌タンパク質に結合するか、もしくは転移性結腸直腸癌タンパク質と抗体、基体又は他の結合パートナーとの結合を妨害するような物質を同定するためのスクリーニングも提供される。
【０１８２】
本願明細書において使用される用語「被験化合物」又は「薬物候補」又は「モジュレーター」又は文法上の同等物は、転移性結腸直腸癌表現型、又は例えば、核酸もしくはタンパク質配列のような転移性結腸直腸癌配列の発現を直接的又は間接的に変更する能力について試験される、いずれかの分子、例えば、タンパク質、オリゴペプチド、小有機分子、多糖、ポリヌクレオチド等を説明する。好ましい態様において、モジュレーターは、本願明細書に提供された核酸又はタンパク質の発現プロファイルを変更する。ひとつの態様において、モジュレーターは、例えば正常な組織のフィンガープリントへと、転移性結腸直腸癌の表現型を抑制する。別の態様において、モジュレーターは、転移性結腸直腸癌の表現型を誘導する。一般に、複数のアッセイ混合物が、異なる物質濃度で平行して試行され、様々な濃度に対する示差的反応が得られる。典型的には、これらの濃度のひとつは陰性対照、すなわちゼロ濃度又は検出レベル以下として利用する。
【０１８３】
ひとつの局面において、モジュレーターは、転移性結腸直腸癌タンパク質の作用を中和するであろう。「中和」は、細胞に対するタンパク質の活性及び結果としての作用が阻害又はブロックされることを意味する。
ある態様において、可能性のあるモジュレーターのコンビナトリアルライブラリーが、転移性結腸直腸癌ポリペプチドに結合する能力又は活性を変調する能力についてスクリーニングされるであろう。慣習的に、有用な特性を有する新規化学実体は、例えば阻害活性のような、いくつかの望ましい特性又は活性を伴う、化学化合物(「リード化合物」と称される)の同定、このリード化合物の変種の作成、並びにこれらの変種化合物の特性及び活性の評価によりもたらされる。高処理量スクリーニング(HTS)法が、このような分析に使用されることが多い。
【０１８４】
ひとつの好ましい態様において、高処理量スクリーニング法は、大量の可能性のある治療的化合物(候補化合物)を含むライブラリーを提供することに関する。その後このような「コンビナトリアルケミカルライブラリー」は、1種又は複数のアッセイにおいてスクリーニングされ、望ましい特徴的活性を展示するそのようなライブラリーメンバー(特定の化学種又はサブクラス)を同定する。従ってこれらの同定された化合物は、従来型の「リード化合物」として利用するか、もしくはこれらを可能性のある治療又は実際の治療として使用することができる。
【０１８５】
コンビナトリアルケミカルライブラリーは、試薬のような多くのケミカル「ビルディングブロック」を組合せることによる化学合成又は生物学的合成のいずれかにより作成された、多様な化学化合物の収集である。例えば、ポリペプチド(例えば突然変異タンパク質)ライブラリーのような、線形(linear)コンビナトリアルケミカルライブラリーは、所定の化合物長(すなわち、ポリペプチド化合物中のアミノ酸の数)について全ての可能性のある方法で、アミノ酸と称されるケミカルビルディングブロックのセットを組合せることにより作成される。数百万の化学化合物を、ケミカルビルディングブロックのこのようなコンビナトリアル混合により合成することができる(Gallopら、J. Med. Chem.、37(9):1233-1251 (1994))。
【０１８６】
コンビナトリアルケミカルライブラリーの調製及びスクリーニングは、当業者に周知である。このようなコンビナトリアルケミカルライブラリーは、ペプチドライブラリー(例えば、米国特許第5,010,175号、Furka、Pept. Prot. Res.、37:487-493 (1991)、Houghtonら、Nature、354:84-88 (1991)参照)、ペプトイド(PCT公開国際公開公報第91/19735号)、コードされたペプチド(PCT公開国際公開公報第93/20242号)、ランダム生体-オリゴマー(PCT公開国際公開公報第92/00091号)、ベンゾジアゼピン(米国特許第5,288,514号)、ヒダントイン、ベンゾジアゼピン及びジペプチドのようなダイバーソマー(diversomer) (Hobbsら、Proc. Nat. Acad. Sci. USA、90:6909-6913 (1993))、ビニル性ポリペプチド(Hagiharaら、J. Amer. Chem. Soc.、114:6568 (1992))、β-D-グルコース足場を伴う非ペプチド擬態(Hirschmannら、J. Amer. Chem. Soc.、114:9217-9218 (1992))、小化合物ライブラリーのアナログ性有機合成(Chenら、J. Amer. Chem. Soc.、116:2661 (1994))、オリゴカルバメート(Choら、Science、261:1303 (1993))、及び／又はペプチジルホスホネート(Campbellら、J. Org. Chem.、59:658 (1994))を含むが、これらに限定されるものではない。一般的には、Gordonらの論文(J. Med. Chem.、37:1385 (1994))、核酸ライブラリー(例えば、Strategene社参照)、ペプチド核酸ライブラリー(例えば、米国特許第5,539,083号参照)、抗体ライブラリー(例えば、Vaughnら、Nature Biotechnology、14(3):309-314 (1996)、及びPCT/US96/10287号参照)、糖質ライブラリー(例えば、Liangら、Science、274:1520-1522 (1996)、及び米国特許第5,593,853号参照)、並びに小有機分子ライブラリー(例えば、ベンゾジアゼピン、Baum、C&EN、1月18日、33頁(1993年)；イソプレノイド、米国特許第5,569,588号；チアゾリジノン及びメタチアザノン、米国特許第5,549,974号；ピロリジン、米国特許第5,525,735号及び第5,519,134号；モルホリノ化合物、米国特許第5,506,337号；ベンゾジアゼピン、米国特許第5,288,514号；など参照)を参照のこと。
【０１８７】
コンビナトリアルライブラリー調製のための装置は、市販されている(例えば、357MPS、390MPS、Advanced Chem Tech社(ルイスビル、KY)、Symphony、Rainin社(ウォバーン、MA)、433A、Applied Biosystems社(フォスターシティ、CA)、9050 Plus、Millipore社(ベッドフォード、MA)など参照)。
【０１８８】
多くの周知のロボットシステムも、液相化学のために開発されている。これらのシステムは、武田化学工業社(大阪、日本)により開発された自動合成装置、並びに化学者により行われる手動による合成操作を模倣する、ロボットアームを利用する多くのロボットシステム(Zymate II、Zymark社(ホプキントン、MA)；Orca、Hewlett-Packard社(パロアルト、CA))のような、自動化されたワークステーションを備えている。適当に改良した前記装置は、本発明での使用に適している。加えて多くのコンビナトリアルライブラリーが、それら自身市販されている(例えば、ComGenex社(プリンストン、NJ)、Asinex社(モスクワ、ロシア)、Tripos社(セントルイス、MO)、ChemStar社(モスクワ、ロシア)、3D Pharmaceuticals社(エクソン、PA)、Martek Biosciences社(コロンビア、MD)など参照)。
【０１８９】
モジュレーターを同定するためのアッセイは、高処理量スクリーニングに順応させやすい。従って好ましいアッセイは、転移性結腸直腸癌遺伝子転写、ポリペプチド発現、及びポリペプチド活性の変調を検出する。
【０１９０】
特定の核酸又はタンパク質産物の存在、非存在、定量又は他の特性を評価するための高処理量アッセイは、当業者に周知である。同じく結合アッセイ及びレポーター遺伝子アッセイも、同様に周知である。従って、例えば、米国特許第5,559,410号は、タンパク質の高処理量スクリーニング法を開示し、米国特許第5,585,639号は、核酸結合(すなわち、アレイ内)の高処理量スクリーニング法を開示する一方で、米国特許第5,576,220号及び第5,541,061号は、リガンド／抗体結合スクリーニングの高処理量法を開示している。
【０１９１】
加えて、高処理量スクリーニングシステムが市販されている(例えば、Zymark社(ホプキントン、MA)；Air Technical Industries社(メントール、OH)；Beckman Instruments社(フラートン、CA)；Precision Systems社(ナチック、MA)など参照)。これらのシステムは、典型的には自動化された手順であり、試料及び試薬のピペッティング、液体分注、時間を区切ったインキュベーション、及びアッセイに適した検出装置(複数)内のマイクロプレートの最終判読を含む。これらの構成可能なシステムは、高処理量及び迅速な開始、更には高度の柔軟性及びカスタマイズを提供する。このようなシステムの製造業者は、様々な高処理量システムに関する詳細なプロトコールを提供している。従って、例えばZymark社は、遺伝子転写、リガンド結合などの変調を検出するための、スクリーニングシステムを説明している技術会報を提供する。
【０１９２】
ひとつの態様において、モジュレーターは、タンパク質であり、天然のタンパク質又は天然のタンパク質の断片であることが多い。従って、例えば、タンパク質を含有する細胞抽出物、又はタンパク質性細胞抽出物のランダムもしくは指定された消化産物も使用することができる。この方法において、タンパク質ライブラリーを、本発明の方法のスクリーニングにより作成することができる。この態様において特に好ましいのは、細菌、真菌、ウイルス、及び哺乳類のタンパク質のライブラリーであり、後者が好ましく、かつヒトタンパク質が特に好ましい。特に有用な被験化合物は、標的が属するタンパク質のクラス、例えば酵素の基質又はリガンド及び受容体に対し示されるであろう。
【０１９３】
好ましい態様において、モジュレーターは、約5〜約30個のアミノ酸のペプチドであるが、ここで約5〜約20個のアミノ酸が好ましく、かつ約7〜約15個が特に好ましい。これらのペプチドは、先に概説したように天然のタンパク質の消化産物、ランダムペプチド、又は「バイアスがかかった(biased)」ランダムペプチドである。本願明細書において「ランダム化された」又は文法上の同等物は、核酸又はペプチドが、各々、本質的にヌクレオチド及びアミノ酸のランダム配列からなることを意味する。これらのランダムペプチド(又は以下に考察される核酸)は、化学的に合成されることが多いので、これらは、いずれかのヌクレオチド又はアミノ酸にいずれかの位置で取込むことができる。この合成法は、配列の長さを超える可能性のある組合せの全て又はほとんどの形成が可能であるように、ランダム化されたタンパク質又は核酸を作成するためにデザインすることができ、従ってランダム化された候補生体活性タンパク質性物質のライブラリーを形成することができる。
【０１９４】
ひとつの態様において、このライブラリーは、完全にランダム化されており、いずれかの位置での配列の優先又は一定のものはない。好ましい態様において、このライブラリーはバイアスがかかっている。すなわち、この配列内のいくつかの位置が、一定に保たれるか、又は限定数の可能性から選択される。好ましい態様において、ヌクレオチド又はアミノ酸残基は、核酸結合ドメインの形成、架橋のためのシステイン、SH-3ドメインのためのプロリン、リン酸化部位のためのセリン、トレオニン、チロシン又はヒスチジンの形成などに対して、例えば、疎水性アミノ酸、親水性残基、立体的にバイアスのかかった(小又は大のいずれかの)残基のような定義されたクラス内で無作為化されている。
【０１９５】
転移性結腸直腸癌のモジュレーターは、先に定義したように、核酸であることもできる。
先に全般的にタンパク質について説明したように、核酸変調物質は、天然の核酸、ランダム核酸、又は「バイアスがかかった」ランダム核酸であることができる。原核又は真核ゲノムの消化産物を、タンパク質について先に概説したように使用することができる。
好ましい態様において、候補化合物は、有機化学物質の部分であり、多種多様なそれを、文献から入手することができる。
【０１９６】
候補物質を添加しかつ細胞をある程度の期間インキュベーションした後、標的配列を含む試料を分析する。必要ならば、標的配列は、公知の技術を用いて調製される。例えば、試料は、公知の溶解緩衝液、電気穿孔などを用い、細胞を溶解するように処理し、精製及び／又はPCRのような増幅で適宜処理される。例えば、ヌクレオチドに共有結合した標識によるin vitro 転写が行われる。一般に、核酸は、ビオチン-FITC又はPEにより、又はcy3もしくはcy5により標識される。
【０１９７】
好ましい態様において、標的配列は、例えば、蛍光的、化学発光的、化学的、又は放射性シグナルにより標識され、プローブに対する標的配列に特異的な結合を検出する手段を提供する。この標識は更に、アルカリホスファターゼ又はホースラディッシュペルオキシダーゼのような酵素であることもでき、これらは適当な基質と共に提供された場合、検出することができる生成物を生じる。あるいは、標識は、酵素と結合するが、酵素により触媒も変更もされない酵素インヒビターのような、標識された化合物又は小分子であることができる。この標識は、エピトープタグ又はストレプトアビジンに特異的に結合するビオチンのような、部分又は化合物であることもできる。ビオチンの例について、ストレプトアビジンは、前述のように標識され、これにより、結合した標的配列について検出可能なシグナルを提供する。未結合の標識されたストレプトアビジンは、典型的には、分析の前に取り除かれる。
【０１９８】
核酸アッセイは、直接ハイブリダイゼーションアッセイであるか、又は複数のプローブの使用を含む「サンドイッチアッセイ」を含むことができ、これらは一般に米国特許第5,681,702号、第5,597,909号、第5,545,730号、第5,594,117号、第5,591,584号、第5,571,670号、第5,580,731号、第5,571,670号、第5,591,584号、第5,624,802号、第5,635,352号、第5,594,118号、第5,359,100号、第5,124,246号及び第5,681,697号に開示されており、これらは全て本願明細書に参照として組入れられている。この態様において、一般に、標的核酸は、先に概説したように調製され、かつ次にハイブリダイゼーション複合体の形成を可能にするような条件下で、複数の核酸プローブを含むバイオチップに添加される。
【０１９９】
様々なハイブリダイゼーション条件を、本発明において使用することができ、これは、先に概説したような、高、中及び低ストリンジェンシー条件を含む。これらのアッセイは、一般に標的の存在下でのみ、標識プローブハイブリダイゼーション複合体の形成を可能にするようなストリンジェンシー条件下で行われる。ストリンジェンシーは、温度、ホルムアミド濃度、塩濃度、カオトロピック塩濃度、pH、有機溶媒濃度などを含むが、これらに限定されるものではない、熱力学的に変動可能な工程パラメータの変更により制御することができる。
これらのパラメータは、非特異的結合を制御するためにも使用することができ、これは米国特許第5,681,697号に開示されている。従って非特異的結合を低下するために、高ストリンジェンシー条件である工程を行うことが望ましいことがある。
【０２００】
本願明細書に概説した反応は、様々な方法で実現することができる。この反応の成分は、以下に概説した好ましい態様において、同時、又は異なる順番で逐次添加することができる。加えて、この反応は、様々な他の試薬を含有することができる。これらは、塩、緩衝液、中性タンパク質、例えばアルブミンなど、界面活性剤などを含み、これらは、最適なハイブリダイゼーション及び検出を促進し、並びに／又は非特異的又はバックグラウンド相互作用を低下するために使用される。さもなければアッセイ効率を改善する試薬、例えばプロテアーゼインヒビター、ヌクレアーゼインヒビター、抗菌剤なども、試料調製法及び標的の純度に応じて、適宜使用することができる。
このアッセイデータは、個々の遺伝子の発現レベル、及びそれらの状態間で発現レベルの変化を決定するために分析され、遺伝子発現プロファイルを作成する。
【０２０１】
スクリーニングは、転移性結腸直腸癌表現型のモジュレーターを同定するために行われる。ひとつの態様において、スクリーニングは、特定の発現プロファイルを誘導又は抑制することができるモジュレーターを同定する、従って好ましくは関連した表現型を作成するために行われる。別の態様において、例えば、特定の状態において重要な示差的に発現されている遺伝子が同定される診断適用に関して、スクリーニングは、個々の遺伝子の発現を変更するモジュレーターを同定するために行うことができる。別の態様において、スクリーニングは、示差的に発現された遺伝子の発現産物の生物学的機能を変更するモジュレーターを同定するために行われる。再度、特定の状態の遺伝子の重要性を同定するために、遺伝子産物の生物学的活性に結合及び／又は変調する物質を同定し、又は遺伝子多型を評価するスクリーニングが行われる。
【０２０２】
遺伝子は、候補物質に反応して誘導されるものについてスクリーニングすることができる。正常な発現パターンにつながる転移性結腸直腸癌発現パターンを抑制する能力、又は正常な組織由来の遺伝子の発現を模倣するように単独の転移性結腸直腸癌遺伝子発現プロファイルを変調するその能力を基にモジュレーターを同定した後、前述のスクリーニングを行い、該物質に反応して特異的に変調されている遺伝子を同定することができる。正常な組織と物質で処理した転移性結腸直腸癌組織の間の発現プロファイルの比較は、正常な組織又は転移性結腸直腸癌組織において発現されないが、物質処理した組織において発現される遺伝子を明らかにする。これらの物質-特異的配列は、転移性結腸直腸癌遺伝子又はタンパク質について本願明細書に説明された方法により同定しかつ使用することができる。特にこれらがコードしている配列及びタンパク質は、物質処理した細胞の作成又は同定における用途が見つかる。加えて、抗体は、この物質が誘導したタンパク質に対して生じ、かつ治療した転移性結腸直腸癌組織試料に対する新規療法を標的化するために使用することができる。
【０２０３】
従ってひとつの態様において、被験化合物は、転移性結腸直腸癌発現プロファイルに関連している転移性結腸直腸癌細胞の集団に投与される。本願明細書において「投与」又は「接触」は、取込み及び細胞内作用によるか、もしくは細胞表面での作用のいずれかにより、候補物質が細胞に作用することができるような方法で、候補物質が、細胞に添加されることを意味する。一部の態様において、タンパク質性候補物質(すなわち、ペプチド)をコードしている核酸は、アデノウイルス又はレトロウイルス構築体のようなウイルス構築体に組込み、並びに細胞に添加することができ、その結果そのペプチド物質の発現が実現され、これは例えば、PCT US97/01019号に開示されている。調節可能な遺伝子治療システムも使用され得る。
【０２０４】
一旦被験化合物が細胞へ投与されたならば、この細胞は、望ましいならば洗浄され、かつ好ましくは生理的条件下で一定期間インキュベーションすることができる。その後、以下に概説したように、これらの細胞は、収集され、かつ新規遺伝子発現プロファイルが作成される。
【０２０５】
従って、例えば転移性結腸直腸癌組織は、転移性結腸直腸癌表現型を変調、例えば、誘導又は抑制する物質についてスクリーニングすることができる。発現プロファイルの少なくとも1種の、好ましくは多くの遺伝子の変化は、その物質が、転移性結腸直腸癌活性に対する作用を有することを示している。転移性結腸直腸癌表現型に関するこのようなサイン(signature)を同定することにより、その表現型を変更する新規薬物のスクリーニングを考案することができる。この方法により、薬物標的を知る必要はなく、かつ当初の発現スクリーニングプラットフォームにおいて表わされる必要もなく、更に標的タンパク質の転写産物レベルが変化する必要もない。
【０２０６】
転移性結腸直腸癌ポリペプチド活性、又は転移性結腸直腸癌もしくは転移性結腸直腸癌表現型の測定は、様々なアッセイを用いて行うことができる。例えば、転移性ポリペプチドの機能に対する被験化合物の作用は、先に説明したパラメータを試験することにより測定することができる。活性に影響を及ぼす適当な生理的変化は、被験化合物の本発明のポリペプチドに対する影響を評価するために使用することができる。無傷の細胞又は動物を用いて機能的結果が決定される場合、腫瘍に関連した転移性結腸直腸癌の症例における、腫瘍成長、腫瘍転移、新血管形成、ホルモン放出、公知の及び特徴未決定の両遺伝子マーカーの転写変化(例えば、ノーザンブロット)、細胞増殖又はpH変化のような細胞代謝の変化、並びにcGMPのような細胞内セカンドメッセンジャーの変化などの、様々な作用を測定することもできる。本発明のアッセイにおいて、哺乳類の、例えば、マウス、好ましくはヒトの転移性結腸直腸癌ポリペプチドが、典型的には使用される。
【０２０７】
活性を変調する化合物を同定するアッセイは、in vitroにおいて行うことができる。例えば、結腸直腸癌ポリペプチドは、最初に可能性のあるモジュレーターと接触され、かつ適当な時間、例えば、0.5〜48時間インキュベーションされる。ひとつの態様において、転移性結腸直腸癌ポリペプチドレベルは、タンパク質又はmRNAのレベルの測定により、in vitroにおいて決定される。タンパク質のレベルは、転移性結腸直腸癌ポリペプチド又はそれらの断片に選択的に結合する抗体による、ウェスタンブロット、ELISAなどのような、イムノアッセイを用いて決定される。mRNAの測定に関し、例えばPCR、LCRを使用する増幅、又は例えばノーザンハイブリダイゼーション、RNAse保護、ドットブロットのようなハイブリダイゼーションアッセイが好ましい。本願明細書に説明されたように、タンパク質又はmRNAのレベルは、直接的又は間接的に標識された検出物質、例えば蛍光又は放射性標識された核酸、放射性又は酵素的に標識された抗体などを用いて検出される。
【０２０８】
あるいは、レポーター遺伝子システムは、ルシフェラーゼ、グリーン蛍光タンパク質、CAT、又はβ-galのような、レポーター遺伝子に機能的に連結された転移性結腸直腸癌タンパク質プロモーターを用いて企図することができる。このレポーター構築体は、典型的には細胞へトランスフェクションされる。可能性のあるモジュレーターによる処理後、レポーター遺伝子の転写、翻訳の量又は活性が、当業者に公知の標準技法に従い測定される。
【０２０９】
好ましい態様において、先に概説したように、スクリーニングは、個々の遺伝子及び遺伝子産物(タンパク質)について行うことができる。すなわち、特定の示差的に発現された遺伝子が特定の状態において重要であると同定されたならば、その遺伝子又は遺伝子産物それ自身の発現のモジュレーターのスクリーニングを行うことができる。示差的に発現された遺伝子の遺伝子産物は、本願明細書において時には「転移性結腸直腸癌タンパク質」と称されることがある。この転移性結腸直腸癌タンパク質は、断片であるか、あるいは本願明細書に示された断片に対する完全長タンパク質であることができる。
【０２１０】
ひとつの態様において、特異的遺伝子の発現のモジュレーターのスクリーニングが行われる。典型的には、わずかにひとつの又は2、3種の遺伝子の発現が評価される。別の態様において、スクリーニングは、最初に示差的に発現されたタンパク質に結合する化合物を見つけるようにデザインされる。次にこれらの化合物は、示差的に発現された活性を変調する能力について評価される。更に、一旦最初の候補化合物が同定されたならば、構造活性相関のより良い評価のために変種を更にスクリーニングすることができる。
【０２１１】
好ましい態様において、結合アッセイが行われる。一般に、精製又は単離された遺伝子産物が使用され；すなわち、1種又は複数の示差的に発現された核酸の遺伝子産物が作成される。例えば、抗体は、タンパク質遺伝子産物に対して作成され、かつ標準のイムノアッセイが、存在するタンパク質の量を決定するために試行される。あるいは、転移性結腸直腸癌タンパク質を含有する細胞を、これらのアッセイにおいて使用することができる。
【０２１２】
従って、好ましい態様において、これらの方法は、転移性結腸直腸癌タンパク質及び候補化合物を一緒にし、かつ化合物の転移性結腸直腸癌タンパク質への結合を決定することを含む。好ましい態様は、ヒト転移性結腸直腸癌タンパク質を利用するが、例えばヒト疾患の動物モデルの開発のために、他の哺乳類タンパク質も使用することができる。一部の態様において、本願明細書に概略されるように、変種又は誘導体の転移性結腸直腸癌タンパク質を使用してもよい。
【０２１３】
一般に、本願明細書の方法の好ましい態様において、転移性結腸直腸癌タンパク質又は候補物質は、分離された試料受け取り領域(例えば、マイクロタイタープレート、アレイなど)を有する不溶性支持体に非-拡散性に結合される。この不溶性支持体は、それにこの組成物が結合することができるようないずれかの組成で製造することができ、可溶性材料から容易に分離することができ、さもなければスクリーニングの全体的方法と適合性がある。このような支持体の表面は、固形又は多孔質であり、かついずれか好都合な形状であることができる。適当な不溶性支持体の例は、マイクロタイタープレート、アレイ、膜及びビーズを含む。これらは、典型的にはガラス、プラスチック(例えば、ポリスチレン)、多糖、ナイロン又はニトロセルロース、テフロン(商標)などで製造される。マイクロタイタープレート及びアレイは、少量の試薬及び試料を用い、非常に多くのアッセイを同時に行うことができるので、特に都合が良い。この組成物の結合の具体的方法は、本発明の試薬及び全体的方法と適合性があり、この組成物の活性を維持しかつ非拡散性である限りは重要ではない。結合の好ましい方法は、抗体(タンパク質が支持体に結合した場合に、リガンド結合部位又は活性化配列のいずれも立体的にブロックしない)の使用、「粘着性」又はイオン性支持体への直接結合、化学架橋、その表面上でのタンパク質又は物質の合成などを含む。タンパク質又は物質の結合後、過剰な未結合の材料は、洗浄により除去される。その後試料を受け取る領域は、ウシ血清アルブミン(BSA)、カゼイン又は他の無害なタンパク質又は他の部分と一緒のインキュベーションを通じて、ブロックされ得る。
【０２１４】
好ましい態様において、転移性結腸直腸癌タンパク質は、支持体に結合され、かつ被験化合物がこのアッセイに添加される。あるいは、この候補物質が、支持体に結合され、かつ転移性結腸直腸癌タンパク質が添加される。新規結合物質は、特異的抗体、ケミカルライブラリーのスクリーニングにより同定された非天然の結合物質、ペプチドアナログなどを含む。特に関心があるのは、ヒト細胞に対し毒性が低い物質のスクリーニングアッセイである。多種多様なアッセイを、この目的に使用することができ、これは標識されたin vitroタンパク質-タンパク質結合アッセイ、電気泳動移動度シフトアッセイ、タンパク質結合のイムノアッセイ、機能アッセイ(リン酸化アッセイ、など)などを含む。
【０２１５】
被験変調化合物の転移性結腸直腸癌タンパク質への結合の決定は、多くの方法で行うことができる。好ましい態様において、この化合物は標識され、かつ例えば、転移性結腸直腸癌タンパク質の全て又は一部の固形支持体への結合、標識された候補物質(例えば、蛍光標識物)の添加、過剰な試薬の洗浄除去、並びに標識物が固相支持体に存在するかどうかの決定により、結合が直接決定される。様々なブロック及び洗浄工程を、適宜利用することができる。
【０２１６】
一部の態様において、ひとつの成分のみが標識され、例えば、タンパク質(又はタンパク質性候補化合物)が標識され得る。あるいは、1種よりも多い成分が、異なる標識物、例えばタンパク質のための125I及び化合物のための発蛍光団などにより標識される。近接試薬、例えば消光剤又はエネルギー転移試薬も、有用である。
【０２１７】
ひとつの態様において、被験化合物の結合は、競合的結合アッセイにより決定される。競合相手は、標的分子(すなわち、転移性結腸直腸癌タンパク質)に結合することが分かっている結合部分、例えば、抗体、ペプチド、結合パートナー、リガンドなどである。ある状況下において、化合物とその結合部分の間に競合的結合が存在することがあり、この結合部分はその化合物と置き換わる。ある態様において、被験化合物は標識されている。化合物、又は競合相手のいずれか、もしくは両方が、最初にタンパク質に、存在する場合に結合するのに十分な時間かけて、添加される。インキュベーションは、最適活性を促進する温度で行うことができ、典型的には4〜40℃である。インキュベーション期間は、典型的には、例えば迅速な高処理量スクリーニングを促進するために、最適化される。典型的には、0.1〜1時間で十分であろう。過剰な試薬は、一般に除去又は洗浄除去される。その後第二の成分が添加され、かつ結合を示すために、標識された成分の存在又は非存在が追跡される。
【０２１８】
好ましい態様において、競合相手は、最初に添加され、引き続き被験化合物が添加される。競合相手の置換えは、被験化合物が転移性結腸直腸癌タンパク質に結合したことの、従って転移性結腸直腸癌タンパク質の活性をに結合することが可能であるか、又はこれを変調する可能性があることの指標である。この態様において、いずれかの成分が標識され得る。従って、例えば、競合相手が標識される場合、洗浄液中の標識物の存在は、該物質による置換えを示す。あるいは、被験化合物が標識される場合、支持体上の標識の存在は、置換えを示す。
【０２１９】
代わりの態様において、被験化合物が最初に添加され、インキュベーション及び洗浄され、その後競合相手が添加される。競合相手による結合が存在しないことは、この被験化合物は、転移性結腸直腸癌タンパク質に高親和性で結合されることを示すことができる。従って、被験化合物が標識される場合、競合相手の結合の欠落と組合せられた、支持体上の標識の存在は、この被験化合物が、転移性結腸直腸癌タンパク質と結合可能であることを示すことができる。
【０２２０】
好ましい態様において、これらの方法は、転移性結腸直腸癌タンパク質の活性を変調することが可能である同じ物質を同定するための示差的スクリーニングを含む。これらの態様において、この方法は、第一の試料中の転移性結腸直腸癌タンパク質及び競合相手を一緒にすることを含む。第二の試料は、被験化合物、転移性結腸直腸癌タンパク質、及び競合相手を含む。この競合相手の結合が、両試料について決定され、かつこれらふたつの試料間の結合の変化又は差異は、転移性結腸直腸癌タンパク質に結合可能な物質及びその活性を変調する可能性のある物質の存在を示している。すなわち、競合相手の結合が第二の試料と第一の試料とで異なるならば、この物質は、転移性結腸直腸癌タンパク質に結合することが可能である。
【０２２１】
あるいは、示差的スクリーニングを使用し、未変性の転移性結腸直腸癌タンパク質に結合するが、修飾された転移性結腸直腸癌タンパク質には結合することができない薬物候補が同定される。転移性結腸直腸癌タンパク質の構造は、モデル化することができ、かつその部位と相互作用する物質を合成するための理論的ドラッグデザインにおいて使用される。転移性結腸直腸癌タンパク質の活性に影響する薬物候補も、タンパク質の活性を増強又は減少するいずれかの能力についての薬物のスクリーニングにより同定される。
【０２２２】
陽性対照及び陰性対照を、これらのアッセイにおいて使用することができる。好ましい対照及び被験試料は、統計学的に有意な結果を得るために、少なくとも3つ組で行うことができる。全ての試料のインキュベーションには、物質のタンパク質への結合に十分な時間をかける。インキュベーション後、特異的に結合していない物質を含まないように、試料を洗浄し、かつ一般には標識された物質の、結合量を決定する。例えば、放射標識が使用される場合、これらの試料は、シンチレーションカウンターで測定し、結合した化合物の量を決定することができる。
【０２２３】
様々な他の試薬を、スクリーニングアッセイに含むことができる。これらは、最適なタンパク質-タンパク質結合を促進し及び／又は非-特異的もしくはバックグラウンド相互作用を減少するために使用することができるような、塩、中性タンパク質、例えばアルブミン、界面活性剤などの試薬を含む。プロテアーゼインヒビター、ヌクレアーゼインヒビター、抗菌剤などの、さもなければアッセイ効率を改善する試薬も、使用することができる。これらの成分の混合物は、必要な結合を提供する順番で添加することができる。
【０２２４】
好ましい態様において、本発明は、転移性結腸直腸癌タンパク質の活性を変調することが可能な化合物をスクリーニングする方法を提供する。この方法は、先に定義したように、被験化合物の、転移性結腸直腸癌タンパク質を含有する細胞への添加を含む。好ましい細胞型は、ほぼ全ての細胞を含む。これらの細胞は、転移性結腸直腸癌タンパク質をコードしている組換え核酸を含む。好ましい態様において、候補物質のライブラリーは、複数の細胞において試験される。
【０２２５】
ひとつの局面において、アッセイは、例えばホルモン、抗体、ペプチド、抗原、サイトカイン、増殖因子、活動電位、化学療法剤を含む薬理学的物質、放射線、発癌性物質、又は他の細胞(すなわち、細胞-細胞接触)などの生理的シグナルの、存在もしくは非存在について、又はこれらへの曝露前にもしくは曝露に引き続き評価される。別の例において、これらの決定は、細胞周期プロセスの異なる段階で決定される。
【０２２６】
この方法において、転移性結腸直腸癌物質を変調する化合物が、同定される。薬理学的活性を伴う化合物は、転移性結腸直腸癌タンパク質の活性を増強又は妨害することができる。一旦同定されると、同様の構造が評価され、その化合物の重要な構造的特徴が同定される。
【０２２７】
ひとつの態様において、転移性結腸直腸癌細胞の分裂を阻害する方法が提供される。この方法は、転移性結腸直腸癌インヒビターを投与することを含む。別の態様において、転移性結腸直腸癌を阻害する方法が提供される。この方法は、転移性結腸直腸癌インヒビターを投与することを含む。更なる態様において、転移性結腸直腸癌の細胞又は個体を治療する方法が提供される。この方法は、転移性結腸直腸癌インヒビターを投与することを含む。
以下に説明したような、様々な細胞成長、増殖、及び転移アッセイが、当業者には公知である。
【０２２８】
軟質寒天増殖又は懸濁液中コロニー形成
正常な細胞は、接着及び増殖のために、固形基体を必要とする。細胞が形質転換された場合、これらはこの表現型を失い、基体から離れて成長する。例えば、形質転換された細胞は、攪拌した懸濁培養液中又は半固形もしくは軟寒天のような懸濁した半固形培地で成長することができる。形質転換された細胞は、癌抑制遺伝子によりトランスフェクションされた場合、正常な表現型を再生し、かつ接着及び増殖するために固形基体を必要とする。軟寒天増殖及び懸濁アッセイにおけるコロニー形成を用い、宿主細胞において発現された場合に、異常な細胞増殖及び形質転換を阻害するような転移性結腸直腸癌配列のモジュレーターを同定することができる。治療的化合物は、攪拌した懸濁培養液中又は半固形もしくは軟質のような懸濁した半固形培地中で増殖する宿主細胞の能力を低下又は排除するであろう。
【０２２９】
軟寒天増殖又は懸濁アッセイにおけるコロニー形成の技術は、Freshneyの、Culture of Animal Cells a Manual of Basic Technique (第3版、1994年)に説明されており、これは本願明細書に参照として組入れられている。同じく、前掲のGarkavtsevらの論文(1996)の方法の項も参照し、これは本願明細書に参照として組入れられている。
【０２３０】
増殖の接触阻害及び密度限界
正常細胞は、典型的にはペトリ皿において、それらが他の細胞に接触するまで、平坦及び組織化されたパターンで増殖する。この細胞が互いに接触する場合、これらは接触阻害され、かつ増殖停止される。しかし細胞が形質転換されている場合、これらの細胞は接触阻害されず、かつ組織化されていない増殖巣において高密度まで増殖し続ける。従って、形質転換された細胞は、正常な細胞よりもより高い飽和密度まで増殖する。これは、正常な周辺細胞の通常のパターン内の増殖巣における細胞又は円形細胞の方向のない単層の形成により、形態学的に検出することができる。あるいは、飽和密度での(3H)-チミジンによる標識指標を用い、増殖の密度限界を測定することができる。前掲のFreshneyの論文(1994)を参照のこと。形質転換された細胞は、癌抑制遺伝子でトランスフェクションされた場合に、正常な表現型を再生し、かつ接触阻害されるようになり、かつより低い密度まで増殖するであろう。
【０２３１】
このアッセイにおいて、飽和密度での(3H)-チミジンによる標識指標は、増殖の密度限界を測定する好ましい方法である。形質転換された宿主細胞は、転移性結腸直腸癌-関連配列によりトランスフェクションされ、かつ非制限的培地条件において、飽和密度で、24時間増殖される。(3H)-チミジンにより標識された細胞の割合は、オートラジオグラフィーにより決定される。前掲のFreshneyの論文(1994)を参照のこと。
【０２３２】
増殖因子又は血清依存性
形質転換された細胞は、それらの正常な対抗物よりもより低い血清依存性を有する(例えば、Temin、J. Natl. Cancer Insti.、37:167-175 (1966)；Eagleら、J. Exp. Med.、131:836-879 (1970)参照)；前掲のFreshneyの論文)。これは、一部、形質転換された宿主細胞による様々な増殖因子の放出に起因している。形質転換された宿主細胞の増殖因子又は血清依存性は、対照のそれと比較することができる。
【０２３３】
腫瘍特異マーカーレベル
腫瘍細胞は、それらの正常な対抗物よりも増大した量のある種の因子(以後「腫瘍特異マーカー」と称す)を放出する。例えば、プラスミノーゲン活性化因子(PA)は、ヒト神経膠腫から、正常な脳細胞よりも高いレベルで放出される(例えば、Gullino、Angiogenesis, tumor vascularization, and potential interference with tumor growth、Biological Responses in Cancer、178-184頁(Mihich(編集)、1985年)参照)。同様に腫瘍脈管形成因子(TAP)は、それらの正常な対抗物よりも高いレベルで腫瘍細胞において放出される。例えば、Folkman、Angiogenesis and Cancer、Sem Cancer Biol. (1992)参照のこと。
【０２３４】
これらの因子の放出を測定する様々な技術が、前掲のFreshneyの論文(1994)に説明されている。同じく、Unklessら、J. Biol. Chem.、249:4295-4305 (1974)；Strickland及びBeers、J. Biol. Chem.、251:5694-5702 (1976)；Whaurら、Br. J. Cancer、42:305-312 (1980)；Gullino、Angiogenesis, tumor vascularization, and potential interference with tumor growth、Biological Responses in Cancer、178-184頁 (Mihich(編集) 1985)；Freshney、Anticancer Res.、5:111-130(1985)。
【０２３５】
マトリゲルへの侵襲
マトリゲル又はいくつかの他の細胞外マトリックス構成体への侵襲の程度は、転移性結腸直腸癌-関連配列を変調する化合物を同定するためのアッセイとして使用することができる。腫瘍細胞は、悪性度と、マトリゲル又はいくつかの他の細胞外マトリックス構成体への細胞の侵襲性の間に、良好な相関関係を示している。このアッセイにおいて、腫瘍形成性の細胞は、典型的には、宿主細胞として使用される。これらの宿主細胞における癌抑制遺伝子の発現は、宿主細胞の侵襲性を低下するであろう。
【０２３６】
前掲のFreshneyの論文(1994)に説明された技術を使用することができる。簡単に述べると、宿主細胞の侵襲のレベルは、マトリゲル又はいくつかの他の細胞外マトリックス構成体で被覆されたフィルターを用いて測定することができる。このゲルへの、又はフィルターの遠位側を通った浸透は、侵襲性として等級化することができ、かつ移動した細胞の数及び距離により組織学的に等級化するか、もしくは125Iによる細胞の予備標識及びフィルターの遠位側又は皿の底部での放射能の計測により等級化することができる。例えば、前掲のFreshneyの論文(1984)を参照のこと。
【０２３７】
In vivoにおける腫瘍成長
転移性結腸直腸癌-関連配列の細胞成長に対する作用は、トランスジェニック又は免疫抑制したマウスにおいて試験することができる。転移性結腸直腸癌遺伝子が破壊されたか、もしくは転移性結腸直腸癌遺伝子が挿入された、ノックアウトトランスジェニックマウスを、作出することができる。ノックアウトトランスジェニックマウスは、相同組換えによる、マウスゲノムの内因性転移性結腸直腸癌遺伝子部位への、マーカー遺伝子又は他の異種遺伝子の挿入により作出することができる。このようなマウスは、内因性転移性結腸直腸癌遺伝子の、転移性結腸直腸癌遺伝子の変異された変種との置換によって、又は例えば発癌物質への曝露による、内因性転移性結腸直腸癌遺伝子の突然変異によっても作出することができる。
【０２３８】
DNA構築体は、胚性幹細胞の核へ導入される。新たに遺伝子操作された遺伝的病変を含む細胞は、宿主マウス胚へと注入され、これはレシピエント雌に再移植される。これらの胚の一部は、一部突然変異体細胞株に由来した生殖細胞を有するキメラマウスへと発達する。従って、キメラマウスの繁殖により、導入された遺伝的病変を含むマウスの新規系統を得ることが可能である(例えば、 Capecchiら、Science、244:1288 (1989)参照)。キメラ的に標的化されたマウスは、Hoganらの、「Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual」Cold Spring Harbor Laboratory社(1988)、及び「Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach」、Robertson編集、IRL. Press社、ワシントンD.C.(1987)に従い誘導することができる。
【０２３９】
あるいは、様々な免疫抑制された又は免疫欠損した宿主動物を使用することができる。例えば、遺伝子欠損「ヌード」マウス(例えば、Giovanellaら、J. Natl. Cancer Inst.、52:921 (1974)参照)、SCIDマウス、胸腺摘出マウス、又は放射線照射したマウス(例えば、Bradleyら、Br. J. Cancer、38:263 (1978)；Selbyら、Br. J. Cancer、41:52 (1980)参照)を、宿主として使用することができる。同系宿主に注入された移植可能な腫瘍細胞(典型的には約106個細胞)は、高割合のケースにおいて侵襲性腫瘍を形成するが、同様の起源の正常細胞は生じないであろう。侵襲性腫瘍を発達した宿主において、転移性結腸直腸癌-関連配列を発現している細胞が、皮下に注射される。適当な時間の後、好ましくは4〜8週間の後、腫瘍成長が測定され(例えば、容積によるか又はふたつの最大寸法により)及び対照と比較される。統計学的に有意な(例えば、スチューデントT検定使用)退縮を有する腫瘍は、阻害された成長を有すると称される。加えて、本発明の遺伝子を発現しているヒト腫瘍細胞を、免疫不全状態の動物へ注入することができる。これらの腫瘍又は、異種移植片の成長は、本発明の遺伝子を発現していない同様のヒト腫瘍細胞の成長と比較される。これらの動物は、抗体又は小分子のような、転移性結腸直腸癌を変調する治療的化合物に関する、結合アッセイ及び効能試験にも使用することができる。
【０２４０】
転移性結腸直腸癌のポリヌクレオチドモジュレーター
アンチセンスポリヌクレオチド
ある態様において、転移性結腸直腸癌-関連タンパク質の活性は、アンチセンスポリヌクレオチド、すなわち、例えば転移性結腸直腸癌タンパク質mRNAのような、コーディングmRNA核酸配列に相補的な核酸又は優先して特異的にハイブリダイズすることができるような核酸、もしくはそれらの部分配列の使用により、ダウンレギュレーションされるか、もしくは全体的に阻害される。アンチセンスポリヌクレオチドのmRNAへの結合は、このmRNAの翻訳及び／又は安定化を低下する。
【０２４１】
本発明の状況において、アンチセンスポリヌクレオチドは、天然のヌクレオチド、又は天然のサブユニットから形成された合成種もしくはそれらの近接したホモログを含むことができる。アンチセンスポリヌクレオチドは、糖鎖部分又は糖間の連結を変更することもできる。これらの中の例は、当該技術分野における用途が公知であるホスホロチオエート及び他のイオウ含有種である。アナログは、転移性結腸直腸癌タンパク質mRNAと効率的にハイブリダイズするように機能する限りは、本発明に包含される。例えば、Isis Pharmaceuticals社、カールスパッド、CA；Sequitor社、ナチック、MAを参照のこと。
【０２４２】
このようなアンチセンスポリヌクレオチドは、組換え手段を用い、容易に合成することができるか、もしくはin vitroにおいて合成することができる。このような合成のための装置は、Applied Biosystems社を含む、いくつかの供給業者から販売されている。ホスホロチオエート及びアルキル化された誘導体のような他のオリゴヌクレオチドの調製も、当業者に周知である。
【０２４３】
本願明細書において使用されるアンチセンス分子は、アンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドを含む。センスオリゴヌクレオチドは、例えば、アンチセンス鎖への結合により転写をブロックするために使用することができる。アンチセンス及びセンスオリゴヌクレオチドは、転移性結腸直腸癌分子について標的mRNA(センス)又はDNA(アンチセンス)配列に結合することが可能な一本鎖核酸配列(RNA又はDNAのいずれか)を含む。アンチセンス分子は、表1-26の転移性結腸直腸癌配列について、もしくはそれらのリガンド又はアクチベーターについてが好ましい。本発明のアンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドは、一般に少なくとも約14個のヌクレオチド、好ましくは約14〜30個のヌクレオチドである断片を含む。所定のタンパク質をコードしているcDNA配列を基に、アンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドを誘導する能力は、例えばStein及びCohenの論文(Cancer Res.、48:2659 (1988))及びvan der Krolらの論文(BioTechniques、6:958 (1988))に説明されている。
【０２４４】
リボザイム
アンチセンスポリヌクレオチドに加え、リボザイムを転移性結腸直腸癌-関連ヌクレオチド配列の標的化及び転写の阻害に使用することができる。リボザイムは、他のRNA分子を触媒的に切断するRNA分子である。様々な種類のリボザイムが説明されており、これはグループIリボザイム、ハンマーヘッド型リボザイム、ヘアピン型リボザイム、RNaseP、及び斧ヘッド型リボザイムを含む(例えば、異なるリボザイムの特性の一般的検証については、Castanottoら、Adv. in Pharmacology、25:289-317 (1994)参照)。
【０２４５】
ヘアピン型リボザイムの一般的特徴は、例えば、Hampelら、Nucl. Acids Res.、18:299-304 (1990)；欧州特許公開第0360 257号；米国特許第5,254,678号に開示されている。調製法は、当業者に周知である(例えば、国際公開公報第94/26877号；Ojwangら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、90:6340-6344 (1993)；Yamadaら、Human Gene Therapy、1:39-45 (1994)；Leavittら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、92:699-703 (1995)；Leavittら、Human Gene Therapy、5:1151-120 (1994)；及び、Yamadaら、Virology、205:121-126 (1994)を参照のこと)。
【０２４６】
転移性結腸直腸癌のポリヌクレオチドモジュレーターは、国際公開公報第91/04753号に開示されているような、リガンド結合分子との複合体の形成による、標的ヌクレオチド配列を含む細胞への導入であることができる。適当なリガンド結合分子は、細胞表面受容体、増殖因子、他のサイトカイン類、又は細胞表面受容体に結合する他のリガンドを含むが、これらに限定されるものではない。好ましくは、リガンド結合分子の複合は、リガンド結合分子の、その対応する分子もしくは受容体へ結合する能力、又はセンスもしくはアンチセンスオリゴヌクレオチド又はその複合された変種の細胞への侵入をブロックする能力を実質的に妨害しない。あるいは、転移性結腸直腸癌のポリヌクレオチドモジュレーターは、例えば国際公開公報第90/10448号に開示されたような、ポリヌクレオチド-脂質複合体の形成により、標的核酸配列を含む細胞へ導入することができる。アンチセンス分子又はノックアウト及びノックインモデルの使用は、前述のスクリーニングアッセイに加え治療法において使用することができることが理解される。
【０２４７】
従って、ひとつの態様において、細胞又は生物において転移性結腸直腸癌を変調する方法が提供される。ひとつの態様において、これらの方法は、内因性転移性結腸直腸癌タンパク質の生物学的活性を低下又は排除する抗-転移性結腸直腸癌抗体を、細胞へ投与することを含む。あるいは、これらの方法は、転移性結腸直腸癌タンパク質をコードしている組換え核酸を、細胞又は生物へ投与することを含む。これは、多くの方法のいずれかで実現することができる。好ましい態様において、例えば、転移性結腸直腸癌配列が転移性結腸直腸癌においてダウンレギュレーションされる場合、このような状態は、細胞における転移性結腸直腸癌遺伝子産物の量の増加により逆行されるであろう。これは例えば、公知の遺伝子治療技術を用いる、内因性転移性結腸直腸癌遺伝子の過剰発現、又は転移性結腸直腸癌配列をコードしている遺伝子の投与により、実現することができる。好ましい態様において、遺伝子治療技術は、例えばPCT/US93/03868号に開示されたような、増強された相同組換え(EHR)を用いる、外因性遺伝子の組込みを含み、これはその全体が本願明細書に参照として組入れられている。あるいは、例えば転移性結腸直腸癌配列が転移性結腸直腸癌においてアップレギュレーションされる場合、内因性転移性結腸直腸癌遺伝子の活性は、例えば転移性結腸直腸癌アンチセンス核酸の投与により、低下される。
【０２４８】
ひとつの態様において、本発明の転移性結腸直腸癌タンパク質を使用し、転移性結腸直腸癌タンパク質に対するポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体を作出することができる。同様に、転移性結腸直腸癌タンパク質は、標準技術を用い、アフィニティークロマトグラフィーカラムに結合することができる。その後これらのカラムを用い、製造、診断又は治療目的に有用な転移性結腸直腸癌抗体を精製することができる。好ましい態様において、抗体は、転移性結腸直腸癌タンパク質に独自のエピトープに対して作出され；すなわち、これらの抗体は、他のタンパク質に対する交差反応性をほとんど又は全く示さない。これらの転移性結腸直腸癌抗体は、標準のアフィニティークロマトグラフィーカラムに結合することができ、かつ転移性結腸直腸癌タンパク質を精製するために使用される。これらの抗体は、転移性結腸直腸癌タンパク質に特異的に結合するので、先に概説したように、これらはブロッキングポリペプチドとしても使用することができる。
【０２４９】
変種転移性結腸直腸癌-関連した配列の同定法
理論に縛られるものではないが、様々な転移性結腸直腸癌配列の発現は、転移性結腸直腸癌と相関されている。従って、突然変異体又は変種の転移性結腸直腸癌遺伝子を基にした障害は、決定することができる。ひとつの態様において、本発明は、例えば、細胞内の少なくとも1種の内因性転移性結腸直腸癌遺伝子の配列の全て又は一部を決定する、変種の転移性結腸直腸癌遺伝子を含む細胞を同定する方法を提供する。これは、多くの配列決定法を用いて実現することができる。好ましい態様において、本発明は、例えば、個体の少なくとも1種の転移性結腸直腸癌遺伝子の配列の全て又は一部を決定する、個体の転移性結腸直腸癌遺伝子型を同定する方法を提供する。これは、一般に個体の少なくともひとつの組織において行われ、かつ多くの組織又は同じ組織の異なる試料の評価を含むことができる。この方法は、配列決定された転移性結腸直腸癌遺伝子の配列の、公知の転移性結腸直腸癌遺伝子、すなわち野生型遺伝子の配列との比較を含むことができる。
【０２５０】
その後転移性結腸直腸癌遺伝子の全ての又は一部の配列を、公知の転移性結腸直腸癌遺伝子の配列と比較し、何らかの差異が存在するかどうかを決定することができる。これは、Bestfitなどのような多くの公知のホモロジープログラムを用いて行うことができる。好ましい態様において、本願明細書に概略するように、患者の転移性結腸直腸癌遺伝子と公知の転移性結腸直腸癌遺伝子の間の配列の差異の存在は、病態又は病態の性向に相関している。
【０２５１】
好ましい態様において、転移性結腸直腸癌遺伝子は、ゲノム内の転移性結腸直腸癌遺伝子のコピー数を決定するためのプローブとして使用される。
別の好ましい態様において、転移性結腸直腸癌遺伝子は、転移性結腸直腸癌遺伝子の染色体局在を決定するためのプローブとして使用される。染色体局在のような情報は、特に転座などのような染色体異常が転移性結腸直腸癌遺伝子座において同定された場合の、診断又は予後判定を提供する上での用途を見いだす。
【０２５２】
医薬組成物及びワクチン組成物の投与
ひとつの態様において、転移性結腸直腸癌タンパク質又はそれらのモジュレーターの治療的有効量が、患者に投与される。本願明細書において「治療的有効量」は、そのためにそれが投与される作用を生じる用量を意味する。正確な用量は、治療の目的に応じて決まり、かつ公知の技術を用い当業者により確認されるであろう(例えば、Anselら、Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery；Lieberman、Pharmaceutical Dosage Forms (第1-3巻、1992)、Dekker社、ISBN0824770846、082476918X、0824712692、0824716981；Lloyd、The Art, Science and Technology of Pharmaceutical Compounding、(1999)；及び、Pickar、Dosage Calculations、(1999)など)。当該技術分野において公知であるように、転移性結腸直腸癌の退化の調節、全身対局所の送達、及び新規プロテアーゼ合成速度、更には年齢、体重、全身の健康状態、性別、食事、投与時間、薬物相互作用及び状態の重症度が必要であり、かつこれは当業者により慣習的実験により確認されるであろう。
【０２５３】
本発明の目的のための「患者」は、ヒト及び他の動物、特に哺乳類の両方を含む。従って、この方法は、臨床治療及び獣医学的適用の両方に適用可能である。好ましい態様において、患者は、哺乳類、好ましくは霊長類であり、最も好ましい態様において、患者はヒトである。
本発明の転移性結腸直腸癌タンパク質及びそれらのモジュレーターの投与は、前述のような、様々な方法で行うことができ、経口、皮下、静脈内、鼻腔内、経皮的、腹腔内、筋肉内、肺内、膣内、直腸内、又は眼内を含むが、これらに限定されるものではない。例えば、創傷及び炎症の治療のように、場合によっては、転移性結腸直腸癌タンパク質及びモジュレーターは、液剤又はスプレー剤として直接塗布することができる。
【０２５４】
本発明の医薬組成物は、患者へ投与するのに適した剤形中に、転移性結腸直腸癌タンパク質を含有している。好ましい態様において、この医薬組成物は、水溶液の剤形であり、例えば医薬として許容できる塩として示され、これは酸及び塩基の両付加塩を含むことを意味する。「医薬として許容できる酸付加塩」は、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸などのような無機酸、及び酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、ピルビン酸、シュウ酸、マレイン酸、マロン酸、コハク酸、フマル酸、酒石酸、コハク酸、安息香酸、桂皮酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、p-トルエンスルホン酸、サリチル酸などのような有機酸により形成された、遊離塩基の生物学的有効性を保持する塩及び生物学的でない又はさもなければ望ましくない塩を意味する。「医薬として許容できる塩基付加塩」は、ナトリウム、カリウム、リチウム、アンモニウム、カルシウム、マグネシウム、鉄、亜鉛、銅、マンガン、アルミニウム塩などのような無機塩基から誘導されたものを含む。特に好ましいのは、アンモニウム、カリウム、ナトリウム、カルシウム及びマグネシウム塩である。医薬として許容できる有機の無毒の塩基に由来した塩は、第一級、第二級、及び第三級アミン、天然に置換されたアミンを含む置換されたアミン、環状アミン及び塩基性イオン交換樹脂、例えばイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ジエチルアミン、トリエチルアミン、トリプロピルアミン、及びエタノールアミンを含む。
【０２５５】
医薬組成物は、更に下記の中の1種又は複数を含む：血清アルブミンのような担体タンパク質；緩衝剤；微晶質セルロース、乳糖、コーンスターチ及び他のデンプンのような充填剤；結合剤；甘味剤及び他の矯味矯臭剤；着色剤；及びポリエチレングリコール。
【０２５６】
医薬組成物は、投与法に応じて、様々な単位剤形で投与することができる。例えば、経口投与に適した単位剤形は、散剤、錠剤、丸剤、カプセル剤及びトローチ剤を含むが、これらに限定されるものではない。転移性結腸直腸癌タンパク質モジュレーター(例えば、抗体、アンチセンス構築体、リボザイム、小有機分子など)は、経口投与される場合、消化から保護されなければならないことが認められる。同じく、体の他の部位(例えば、循環系、リンパ系又は腫瘍部位)に送達後、本発明の転移性結腸直腸癌モジュレーターは、排泄、加水分解、タンパク質分解性消化もしくは修飾、又は肝臓による解毒から保護される必要があることも認められる。全てのこれらの場合において、保護は、典型的には、酸及び酵素による加水分解に対して抵抗性とするための分子(複数)と組成物との複合化によるか、又はリポソームもしくは保護障壁などの適当な抵抗性担体中への分子(複数)の封入によるか、又はモジュレーターの分子サイズ、質量及び／又は電荷の修飾のいずれかにより実行される。消化、分解及び排泄から物質を保護する手段は、当該技術分野において周知である。
【０２５７】
投与するための組成物は、医薬として許容できる担体、好ましくは水性担体に溶解された、転移性結腸直腸癌タンパク質モジュレーターを通常含有するであろう。様々な水性担体、例えば緩衝した生理食塩水などを使用することができる。これらの溶液は無菌であり、かつ一般に望ましくない物質は含まない。これらの組成物は、通常の周知の滅菌技術により滅菌することができる。この組成物は、pH調節剤及び緩衝剤、毒性調節剤など、例えば酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、乳酸ナトリウムなどのような、ほぼ生理的な条件が必要とするような、医薬として許容できる賦形剤を含有することができる。これらの処方中の活性物質の濃度は、広範囲に変動することができ、かつ選択された投与の具体的様式及び患者の必要性に従い、主に液体の容量、粘度、体重などを基に選択されるであろう(例えば、レミントンの薬科学(15版、1980年)及びGoodman & Gillman、The Pharmacologial Basis of Therapeutics (Hardmanら編集、1996年)参照)。
【０２５８】
従って、静脈内投与のための典型的医薬組成物は、約0.1〜10mg／患者／日であろう。用量0.1から最大約100mg／患者／日も使用することができ、特にこの薬物が、血流ではなく隔離された部位へ投与される場合、例えば体腔又は臓器管腔に投与される場合に使用することができる。実質的により高い用量が、局所投与において可能である。非経口投与可能な組成物調製の実際の方法は、例えば前掲の「レミントン薬科学」及びGoodman and Gillman「The Pharmacologial Basis of Therapeutics」において、当業者には公知であるかもしくは自明である。
【０２５９】
転移性結腸直腸癌タンパク質のモジュレーターを含有する組成物は、治療的又は予防的処置のために投与することができる。治療的適用において、組成物は、疾患(例えば、癌)に罹患した患者へ、疾患及びその合併症が治癒又は少なくとも部分的に停止するのに十分な量で投与される。これを達成するのに適切な量は、「治療有効量」と定義される。この用途のための有効量は、疾患の重症度及び患者の健康の全身状態によって左右される。この組成物の単回又は反復投与は、必要とされる用量及び頻度並びに患者の忍容性によって決まる。いずれの事象においても、この組成物は、本発明の物質を患者を効果的に治療するのに十分な量提供することとする。哺乳類において癌の発生を予防又は遅延することが可能なモジュレーターの量は、「予防的有効量」と称される。予防的処置に必要な具体的用量は、哺乳類の医学的状態及び病歴、予防される具体的癌、更には他の要因、例えば年齢、体重、性別、投与経路、効能などによって決まるであろう。このような予防的処置は、例えば、癌の既往のある哺乳類において癌の再発を防止するために、又は癌発症の重大な可能性があると疑われる哺乳類において使用することができる。
【０２６０】
本転移性結腸直腸癌タンパク質を変調する化合物は、単独で、又は追加の転移性結腸直腸癌を変調する化合物もしくは他の治療的物質、例えば他の抗癌剤又は治療と併用して投与することができることは理解されるであろう。
【０２６１】
多くの態様において、1種又は複数の核酸、例えば、表1-26に示した核酸配列を含むポリヌクレオチド、例えば、アンチセンスポリヌクレオチド又はリボザイムは、in vitro又はin vivoにおいて細胞に導入されるであろう。本発明は、in vitro(細胞-非含有)、ex vivo又はin vivo(細胞又は生物-ベース)の組換え発現システムを用いる、転移性結腸直腸癌-関連ポリペプチド及び核酸の発現に有用な方法、試薬、ベクター、及び細胞を提供する。
【０２６２】
核酸をタンパク質又は核酸の発現のために宿主細胞へ導入するために使用される具体的手法は、適用に特異的である。外来ヌクレオチド配列を宿主へ導入する多くの手法を使用することができる。これらは、リン酸カルシウムトランスフェクション、スフェロプラスト、電気穿孔、リポソーム、微量注入、プラズマベクター、ウイルスベクター、並びにクローニングされたゲノムDNA、cDNA、合成DNA又は他の外来遺伝的物質を宿主細胞へ導入するための他の周知の方法のいずれかの使用を含む(例えば、Berger及びKimmel、Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology、第152巻(Berger)、Ausubelら編集、最新プロトコール(1999年まで補遺)、及びSambrookら、Molecular Cloning - A Laboratory Manual (第2版、第1-3巻、1989年)参照のこと)。
【０２６３】
好ましい態様において、転移性結腸直腸癌タンパク質及びモジュレーターは、治療的物質として投与され、かつ先に概説したように処方することができる。同様に、転移性結腸直腸癌遺伝子(転移性結腸直腸癌コード領域の完全長配列、部分配列、又は調節配列のいずれも含む)は、遺伝子治療の適用において投与することができる。これらの転移性結腸直腸癌遺伝子は、当業者に理解されるように、遺伝子治療として(すなわち、ゲノムへの組込み)又はアンチセンス組成物としてのいずれかでのアンチセンス適用を含むことができる。
【０２６４】
転移性結腸直腸癌ポリペプチド及びポリヌクレオチドは、HTL、CTL及び抗体反応を刺激するために、ワクチン組成物としても投与することができる。このようなワクチン組成物は、例えば、リピド化されたペプチド(例えば、Vitielloら、J. Clin. Invest.、95:341 (1995)参照)、ポリ(DL-ラクチド-コ-グリコシド)("PLG")ミクロスフェア中にカプセル封入されたペプチド組成物(例えば、Eldridgeら、Molec. Immunol.、28:287-294 (1991)；Alonsoら、Vaccine、12:299-306 (1994)；Jonesら、Vaccine、13:675-681 (1995)参照)、免疫賦活複合体(ISCOMS)に含まれたペプチド組成物(例えば、Takahashiら、Nature、344:873-875 (1990)；Huら、Clin Exp Immunol.、113:235-243 (1998)参照)、多重抗原ペプチドシステム(MAP)(例えば、Tam、Proc. Natl. Acad. Sci. USA.、85:5409-5413 (1988)；Tam、J. Immunol. Methods、196:17-32 (1996)参照)、多価ペプチドとして処方されたペプチド；「射出(ballistic)送達システム」において使用するためのペプチド、典型的には結晶化されたペプチド、ウイルス送達ベクター(Perkusら、「Concepts in vaccine development」(Kaufmann編集、379頁、1996年)；Chakrabartiら、Nature、320:535 (1986)；Huら、Nature、320:537 (1986)；Kienyら、AIDS Bio/Technology、4:790 (1986)；Topら、J. Infect. Dis.、124:148 (1971)；Chandaら、Virology、175:535 (1990)参照)、ウイルス又は合成起源の粒子(例えば、Koflerら、J. Immunol. Methods.、192:25 (1996)；Eldridgeら、Sem. Hematol.、30:16 (1993)；Faloら、Nature Med.、7:649 (1995)参照)、アジュバント(Warrenら、Annu. Rev. Immunol.、4:369 (1986)；Guptaら、Vaccine、11:293 (1993)参照)、リポソーム(Reddyら、J. Immunol.、148:1585 (1992)；Rock、Immunol. Today、17:131 (1996)参照)、又は裸のもしくは粒子吸着したcDNA(Ulmerら、Science、259:1745 (1993)；Robinsonら、Vaccine、11:957 (1993)；Shiverら、「Concepts in vaccine development」(Kaufmann編集、423頁、1996年)；Cease及びBerzofsky、Annu. Rev. Immunol.、12:923 (1994)、及びEldridgeら、Sem. Hematol.、30:16 (1993)参照)を含有することができる。Avant Immunotherapeutics社(ニードハム、MA)の製品のような、受容体媒介型ターゲティングとしても公知である毒素-標的化した送達技術も、使用することができる。
【０２６５】
ワクチン組成物は、アジュバントを含有することが多い。多くのアジュバントは、抗原を迅速な異化作用から保護するようにデザインされた物質、例えば水酸化アルミニウム又は鉱油、並びに免疫応答賦活剤、例えばリピドA、Bortadella pertussis又はMycobacterium tuberculosis由来のタンパク質を含む。ある種のアジュバントは、市販されており、例えばフロイントの不完全アジュバント及び完全アジュバント(Difco Laboratories社、デトロイト、MI)；メルクアジュバント65(Merck社、ラーウェイ、NJ)；AS-2(SmithKline Beecham社、フィラデルフィア、PA)；水酸化アルミニウムゲル(ミョウバン)又はリン酸アルミニウムのようなアルミニウム塩；カルシウム、鉄又は亜鉛の塩；アシル化したチロシンの不溶性懸濁液；アシル化した糖質；カチオン性又はアニオン性に誘導された多糖；ポリホスファゼン；生分解性ミクロスフェア；モノホルホリルリピドA及びキルAがある。GM-CSF、インターロイキン-2、-7、-12のようなサイトカイン及び他の同様の増殖因子も、アジュバントとして使用することができる。
【０２６６】
ワクチンは、核酸組成物として投与することができ、ここでは1種又は複数のポリペプチド又はそれらの断片をコードしているDNA又はRNAが、患者へ投与される。この方法は、例えば、Wolffら、Science、247:1465 (1990)に加え、米国特許第5,580,859号；第5,589,466号；第5,804,566号；第5,739,118号；第5,736,524号；第5,679,647号；国際公開公報第98/04720号；並びに、以下により詳細に説明されている。DNA-ベースの送達技術の例は、「裸のDNA」で促進された(ブピバカイン、ポリマー、ペプチド-媒介型)送達、カチオン性脂質複合体、及び粒子-媒介型(「遺伝子銃」)又は圧力-媒介型送達(例えば、米国特許第5,922,687号参照)を含む。
【０２６７】
治療的又は予防的免疫感作を目的として、本発明のペプチドは、ウイルス又は細菌ベクターにより発現することができる。発現ベクターの例は、ワクシニア又は家禽ポックスのような、弱毒化したウイルス宿主を含む。この方法は、例えば、転移性結腸直腸癌ポリペプチド又はポリペプチド断片をコードしているヌクレオチド配列を発現するためのベクターとしての、ワクシニアウイルスの使用に関連している。宿主への導入時に、この組換えワクシニアウイルスは、免疫原性ペプチドを発現し、かつこれにより免疫応答を誘起する。免疫感作プロトコールにおいて有用なワクシニアベクター及び方法は、例えば、米国特許第4,722,848号に開示されている。別のベクターはBCG(Bacille Calmette Guerin)である。BCGベクターは、Stoverら、Narure、351:456-460 (1991)に説明されている。治療的投与又は免疫感作に有用な多種多様な他のベクターは、例えば、アデノ及びアデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、Salmonella typhiベクター、解毒した炭疽毒素ベクターなどがあり、以下の説明から当業者には明らかであろう(例えば、Shataら、Mol Med Today、6:66-71 (2000)；Shedlockら、J. Leukoc Biol、68:793-806 (2000)；Hippら、In Vivo、14:571-85 (2000)参照)。
【０２６８】
DNAワクチンとしての遺伝子の使用法は、よく知られており、かつ転移性結腸直腸癌遺伝子又は転移性結腸直腸癌遺伝子の一部を、転移性結腸直腸癌患者における発現のために、調節プロモーター又は組織-特異的プロモーターの制御下に配置することを含む。DNAワクチンに使用した転移性結腸直腸癌遺伝子は、完全長転移性結腸直腸癌タンパク質をコードすることができるが、より好ましくは転移性結腸直腸癌タンパク質由来のペプチドを含む転移性結腸直腸癌タンパク質の一部をコードしている。ひとつの態様において、患者は、転移性結腸直腸癌遺伝子に由来した複数のヌクレオチド配列を含有するDNAワクチンにより免疫感作される。例えば、転移性結腸直腸癌タンパク質の小断片をコードしている転移性結腸直腸癌-関連遺伝子又は配列は、発現ベクターに導入され、かつクラスI MHCの状況においてそれらの免疫原性について及び細胞傷害性T細胞反応を生じる能力について試験される。この手法は、細胞内エピトープを含む、抗原を提示している細胞に対する細胞傷害性T細胞反応を生じることを提供する。
【０２６９】
好ましい態様において、DNAワクチンは、DNAワクチンと共にアジュバント分子をコードしている遺伝子を含む。このようなアジュバント分子は、DNAワクチンによりコードされた転移性結腸直腸癌ポリペプチドに対する免疫原性反応を増強するサイトカインを含んでいる。追加の又は代替のアジュバントも利用可能である。
【０２７０】
別の好ましい態様において、転移性結腸直腸癌遺伝子は、転移性結腸直腸癌の動物モデルの作成における用途を見いだしている。同定された転移性結腸直腸癌遺伝子が、転移性組織において抑制又は縮小された場合は、例えばアンチセンスRNAが転移性結腸直腸癌遺伝子に対するような遺伝子治療技術も、この遺伝子の発現を縮小又は抑制するであろう。転移性結腸直腸癌の動物モデルは、転移性結腸直腸癌-関連した配列のモジュレーター又は転移性結腸直腸癌のモジュレーターのスクリーニングにおける用途を見いだしている。同様に、例えば適当な遺伝子標的化ベクターによる相同組換えの結果としての、遺伝子ノックアウト技術を含むトランスジェニック動物技術は、転移性結腸直腸癌タンパク質の発現の欠損又は増大を生じるであろう。望ましい場合は、転移性結腸直腸癌タンパク質の組織特異的発現又はノックアウトが必要となる。
【０２７１】
転移性結腸直腸癌タンパク質は、転移性結腸直腸癌において過剰発現されることも可能である。従って、転移性結腸直腸癌タンパク質を過剰発現するトランスジェニック動物を、作出することができる。望ましい発現レベルに応じて、様々な強度のプロモーターを、導入遺伝子を発現するために使用することができる。更に、組込まれた導入遺伝子のコピー数を決定し、その導入遺伝子の発現レベルの決定について比較することができる。このような方法で作出された動物は、転移性結腸直腸癌の動物モデルとしての用途を見いだしており、及び追加的に転移性結腸直腸癌を治療するためのモジュレーターのスクリーニングにおいて有用である。
【０２７２】
診断及び／又は予後判定適用における使用のためのキット
本発明により、先に示された診断、研究、及び治療的適用における使用のためのキットも提供される。診断及び研究の適用において、このようなキットは、以下のいずれか又は全てを備えることができる：アッセイ試薬、緩衝剤、転移性結腸直腸癌に特異的な核酸又は抗体、ハイブリダイゼーションプローブ及び／又はプライマー、アンチセンスポリヌクレオチド、リボザイム、ドミナントネガティブ転移性結腸直腸癌ポリペプチド又はポリヌクレオチド、転移性結腸直腸癌-関連配列の小分子インヒビターなど。治療用製品は、滅菌生理食塩水又は他の医薬として許容できる乳剤及び懸濁剤基剤を備えることができる。
【０２７３】
加えてこれらのキットは、本発明の方法の実践のための指示(すなわち、プロトコール)を含む使用説明書を備えることもできる。使用説明書は典型的には記載されているか又は印刷物であるが、このようなものには限定されない。最終使用者へのこのような使用説明の保存及びそれらの通達が可能である媒体は、本発明により企図されている。このような媒体は、電子記録媒体(例えば、磁気ディスク、テープ、カートリッジ、チップ)、光学媒体(例えば、CD ROM)などを含むが、これらに限定されるものではない。このような媒体は、このような使用説明書を提供するインターネットサイトのアドレスを含んでも良い。
【０２７４】
本発明は、転移性結腸直腸癌-関連配列のモジュレーターに関するスクリーニングのキットも提供する。このようなキットは、容易に入手できる材料及び試薬から調製することができる。例えば、このようなキットは、1種又は複数の下記の材料を備えることができる：転移性結腸直腸癌-関連ポリペプチド又はポリヌクレオチド、反応チューブ、及び転移性結腸直腸癌-関連活性を試験するための指示書。任意に、このキットは、生物学的に活性のある転移性結腸直腸癌タンパク質を備えることができる。多種多様なキット及び成分を、キットの意図された使用者及び使用者の具体的必要性に応じて、本発明に従い調製することができる。診断は、典型的には、複数の遺伝子又は産物の評価に関連している。これらの遺伝子は、既往歴又は転帰のデータにおいて確認することができる疾患における重要なパラメータとの相関を基に選択されるであろう。
【０２７５】
表1
【表１】
2004532622.tif 000002
【表２】
2004532622.tif 000003
【表３】
2004532622.tif 000004
【０２７６】
【表４】
2004532622.tif 000005
【表５】
2004532622.tif 000006
【表６】
2004532622.tif 000007
【０２７７】
表2
【表７】
2004532622.tif 000008
【表８】
2004532622.tif 000009
【表９】
2004532622.tif 000010
【０２７８】
【表１０】
2004532622.tif 000011
【表１１】
2004532622.tif 000012
【表１２】
2004532622.tif 000013
【０２７９】
【表１３】
2004532622.tif 000014
【表１４】
2004532622.tif 000015
【表１５】
2004532622.tif 000016
【０２８０】
【表１６】
2004532622.tif 000017
【表１７】
2004532622.tif 000018
【表１８】
2004532622.tif 000019
【０２８１】
【表１９】
2004532622.tif 000020
【表２０】
2004532622.tif 000021
【表２１】
2004532622.tif 000022
【０２８２】
表3
【表２２】
2004532622.tif 000023
【表２３】
2004532622.tif 000024
【表２４】
2004532622.tif 000025
【０２８３】
【表２５】
2004532622.tif 000026
【表２６】
2004532622.tif 000027
【表２７】
2004532622.tif 000028
【０２８４】
【表２８】
2004532622.tif 000029
【表２９】
2004532622.tif 000030
【表３０】
2004532622.tif 000031
【０２８５】
【表３１】
2004532622.tif 000032
【表３２】
2004532622.tif 000033
【表３３】
2004532622.tif 000034
【０２８６】
【表３４】
2004532622.tif 000035
【表３５】
2004532622.tif 000036
【表３６】
2004532622.tif 000037
【０２８７】
【表３７】
2004532622.tif 000038
【０２８８】
表4
【表３８】
2004532622.tif 000039
【表３９】
2004532622.tif 000040
【表４０】
2004532622.tif 000041
【０２８９】
【表４１】
2004532622.tif 000042
【表４２】
2004532622.tif 000043
【表４３】
2004532622.tif 000044
【０２９０】
【表４４】
2004532622.tif 000045
【表４５】
2004532622.tif 000046
【表４６】
2004532622.tif 000047
【０２９１】
【表４７】
2004532622.tif 000048
【表４８】
2004532622.tif 000049
【表４９】
2004532622.tif 000050
【０２９２】
表5
【表５０】
2004532622.tif 000051
【０２９３】
表6
【表５１】
2004532622.tif 000052
【０２９４】
表7
【表５２】
2004532622.tif 000053
【０２９５】
表8
【表５３】
2004532622.tif 000054
【０２９６】
表9
【表５４】
2004532622.tif 000055
【０２９７】
表10
【表５５】
2004532622.tif 000056
【０２９８】
表11
【表５６】
2004532622.tif 000057
【表５７】
2004532622.tif 000058
【０２９９】
表12
【表５８】
2004532622.tif 000059
【表５９】
2004532622.tif 000060
【０３００】
表13
【表６０】
2004532622.tif 000061
【０３０１】
表14
【表６１】
2004532622.tif 000062
【表６２】
2004532622.tif 000063
【表６３】
2004532622.tif 000064
【０３０２】
表15
【表６４】
2004532622.tif 000065
【０３０３】
表16
【表６５】
2004532622.tif 000066
【表６６】
2004532622.tif 000067
【０３０４】
表17
【表６７】
2004532622.tif 000068
【表６８】
2004532622.tif 000069
【表６９】
2004532622.tif 000070
【０３０５】
【表７０】
2004532622.tif 000071
【表７１】
2004532622.tif 000072
【表７２】
2004532622.tif 000073
【０３０６】
【表７３】
2004532622.tif 000074
【表７４】
2004532622.tif 000075
【表７５】
2004532622.tif 000076
【０３０７】
【表７６】
2004532622.tif 000077
【表７７】
2004532622.tif 000078
【表７８】
2004532622.tif 000079
【０３０８】
【表７９】
2004532622.tif 000080
【表８０】
2004532622.tif 000081
【表８１】
2004532622.tif 000082
【０３０９】
【表８２】
2004532622.tif 000083
【表８３】
2004532622.tif 000084
【表８４】
2004532622.tif 000085
【０３１０】
表18
【表８５】
2004532622.tif 000086
【表８６】
2004532622.tif 000087
【表８７】
2004532622.tif 000088
【０３１１】
表19
【表８８】
2004532622.tif 000089
【表８９】
2004532622.tif 000090
【表９０】
2004532622.tif 000091
【０３１２】
【表９１】
2004532622.tif 000092
【表９２】
2004532622.tif 000093
【表９３】
2004532622.tif 000094
【０３１３】
【表９４】
2004532622.tif 000095
【表９５】
2004532622.tif 000096
【表９６】
2004532622.tif 000097
【表９７】
2004532622.tif 000098
【０３１４】
表20
【表９８】
2004532622.tif 000099
【０３１５】
表1-20Aは、表1-20のunigeneIDを欠損しているpkeyの寄託番号を示す。各プローブセットについて、本発明者らは、オリゴヌクレオチドがデザインされた遺伝子クラスター番号を列記した。遺伝子クラスターは、GenbBank EST由来の配列及びmRNAを用いて、集計した。これらの配列は、Clustering and Alignment Tools(DoubleTwist、オークランド、CA)を用い、配列類似性を基にクラスター化した。各クラスターを含む配列のGenBank寄託番号は、「Accession」欄に列記している。
【０３１６】
【表９９】
2004532622.tif 000100
【表１００】
2004532622.tif 000101
【表１０１】
2004532622.tif 000102
【０３１７】
【表１０２】
2004532622.tif 000103
【表１０３】
2004532622.tif 000104
【表１０４】
2004532622.tif 000105
【０３１８】
【表１０５】
2004532622.tif 000106
【表１０６】
2004532622.tif 000107
【表１０７】
2004532622.tif 000108
【０３１９】
【表１０８】
2004532622.tif 000109
【表１０９】
2004532622.tif 000110
【表１１０】
2004532622.tif 000111
【０３２０】
【表１１１】
2004532622.tif 000112
【表１１２】
2004532622.tif 000113
【表１１３】
2004532622.tif 000114
【０３２１】
【表１１４】
2004532622.tif 000115
【表１１５】
2004532622.tif 000116
【表１１６】
2004532622.tif 000117
【０３２２】
【表１１７】
2004532622.tif 000118
【表１１８】
2004532622.tif 000119
【表１１９】
2004532622.tif 000120
【０３２３】
【表１２０】
2004532622.tif 000121
【表１２１】
2004532622.tif 000122
【表１２２】
2004532622.tif 000123
【表１２３】
2004532622.tif 000124
【０３２４】
表1-20Bは、表1-20のunigeneID及び寄託番号を欠損しているpkeyのゲノム配置を示す。各予想されるエキソンについて、本発明者らは、予想に使用したゲノム配列給源を列記した。各予想されたエキソンのヌクレオチド位置も列記した。
【０３２５】
【表１２４】
2004532622.tif 000125
【表１２５】
2004532622.tif 000126
【表１２６】
2004532622.tif 000127
【０３２６】
【表１２７】
2004532622.tif 000128
【表１２８】
2004532622.tif 000129
【表１２９】
2004532622.tif 000130
【０３２７】
【表１３０】
2004532622.tif 000131
【表１３１】
2004532622.tif 000132
【表１３２】
2004532622.tif 000133
【０３２８】
【表１３３】
2004532622.tif 000134
【表１３４】
2004532622.tif 000135
【表１３５】
2004532622.tif 000136
【０３２９】
【表１３６】
2004532622.tif 000137
【表１３７】
2004532622.tif 000138
【表１３８】
2004532622.tif 000139
【０３３０】
表21：正常な結腸組織と比較した結腸癌由来の肝転移においてアップレギュレーションされた310遺伝子
表21は、正常な結腸組織と比較した結腸癌由来の肝転移においてアップレギュレーションされた310種の遺伝子を示している。これらは、Affymetris/Eos Hu03 GeneChipアレイ上の59680プローブセットから選択し、その結果「平均」結腸癌由来の肝転移の「平均」正常結腸組織に対する比は、3.0以上であった。「平均」結腸癌由来の肝転移レベルを、50番目のパーセンタイルと設定した。「平均」正常結腸組織を、50番目のパーセンタイルと設定した。
【０３３１】
【表１３９】
2004532622.tif 000140
【表１４０】
2004532622.tif 000141
【表１４１】
2004532622.tif 000142
【０３３２】
【表１４２】
2004532622.tif 000143
【表１４３】
2004532622.tif 000144
【０３３３】
表21Aは、表21AのunigeneIDを欠損しているpkeyの寄託番号を示す。各プローブセットについて、本発明者らは、オリゴヌクレオチドがデザインされた遺伝子クラスター番号を列記した。遺伝子クラスターは、GenbBank EST由来の配列及びmRNAを用いて、集計した。これらの配列は、Clustering and Alignment Tools(DoubleTwist、オークランド、CA)を用い、配列類似性を基にクラスター化した。各クラスターを含む配列のGenBank寄託番号は、「Accession」欄に列記している。
【０３３４】
【表１４４】
2004532622.tif 000145
【０３３５】
表21B
【表１４５】
2004532622.tif 000146
【０３３６】
表22：正常な結腸組織と比較した結腸癌由来の肝転移においてダウンレギュレーションされた177遺伝子
表22は、正常な結腸組織と比較した結腸癌由来の肝転移においてダウンレギュレーションされた177種の遺伝子を示している。これらは、Affymetris/Eos Hu03 GeneChipアレイ上の59680プローブセットから選択し、その結果「平均」結腸癌由来の肝転移の「平均」正常結腸組織に対する比は、0.25以下であった。「平均」結腸癌由来の肝転移レベルを、50番目のパーセンタイルと設定した。「平均」正常結腸組織を、50番目のパーセンタイルと設定した。
【０３３７】
【表１４６】
2004532622.tif 000147
【表１４７】
2004532622.tif 000148
【表１４８】
2004532622.tif 000149
【０３３８】
表22Aは、表21AのunigeneIDを欠損しているpkeyの寄託番号を示す。各プローブセットについて、本発明者らは、オリゴヌクレオチドがデザインされた遺伝子クラスター番号を列記した。遺伝子クラスターは、GenbBank EST由来の配列及びmRNAを用いて、集計した。これらの配列は、Clustering and Alignment Tools(DoubleTwist、オークランド、CA)を用い、配列類似性を基にクラスター化した。各クラスターを含む配列のGenBank寄託番号は、「Accession」欄に列記している。
【０３３９】
【表１４９】
2004532622.tif 000150
【０３４０】
表22B
【表１５０】
2004532622.tif 000151
表23：Duke病期B生存として分類された結腸癌原発性腫瘍と比較した結腸癌由来の肝転移においてアップレギュレーションされた175遺伝子
表23は、陽性生存の転帰を伴うDuke病期B(Duke病期B生存)として分類された結腸癌原発性腫瘍と比較した結腸癌由来の肝転移においてアップレギュレーションされた175種の遺伝子を示している。これらは、Affymetris/Eos Hu03 GeneChipアレイ上の59680プローブセットから選択し、その結果「平均」結腸癌由来の肝転移の「平均」正常結腸組織に対する比は、3.0以上であった。「平均」結腸癌由来の肝転移レベルを、50番目のパーセンタイルと設定した。「平均」Duke病期B生存レベルを、50番目のパーセンタイルと設定した。
【０３４１】
【表１５１】
2004532622.tif 000152
【表１５２】
2004532622.tif 000153
【表１５３】
2004532622.tif 000154
【０３４２】
表23Aは、表1-20A、21A、22A及び23AについてのunigeneIDを欠損しているpkeyの寄託番号を示す。各プローブセットについて、本発明者らは、オリゴヌクレオチドがデザインされた遺伝子クラスター番号を列記した。遺伝子クラスターは、GenbBank EST由来の配列及びmRNAを用いて、集計した。これらの配列は、Clustering and Alignment Tools(DoubleTwist、オークランド、CA)を用い、配列類異性を基にクラスター化した。各クラスターの配列比較のためのGeneBank寄託番号は、「Accession」欄に列記している。
【０３４３】
【表１５４】
2004532622.tif 000155
表24：Duke病期B生存として分類された結腸癌原発性腫瘍と比較した結腸癌由来の肝転移においてダウンレギュレーションされた34遺伝子
表24は、陽性生存の転帰を伴うDuke病期B(Duke病期B生存)として分類された結腸癌原発性腫瘍と比較した結腸癌由来の肝転移においてダウンレギュレーションされた34種の遺伝子を示している。これらは、Affymetris/Eos Hu03 GeneChipアレイ上の59680プローブセットから選択し、その結果「平均」結腸癌由来の肝転移の「平均」正常結腸組織に対する比は、0.25以上であった。「平均」結腸癌由来の肝転移レベルを、50番目のパーセンタイルと設定した。「平均」Duke病期B生存レベルを、50番目のパーセンタイルと設定した。
【０３４４】
【表１５５】
2004532622.tif 000156
【０３４５】
表24B
【表１５６】
2004532622.tif 000157
【０３４６】
表25：表25は、表26の配列全てについて、配列番号、UnigeneID、UnigeneTitle、Pkey及びExAccnを示す。配列番号は、表26から表25における核酸及びタンパク質配列情報に関連している。
【０３４７】
【表１５７】
2004532622.tif 000158
【０３４８】
表25A
【表１５８】
2004532622.tif 000159
【表１５９】
2004532622.tif 000160
【０３４９】
表26
【表１６０】
2004532622.tif 000161
【表１６１】
2004532622.tif 000162
【表１６２】
2004532622.tif 000163
【０３５０】
【表１６３】
2004532622.tif 000164
【表１６４】
2004532622.tif 000165
【表１６５】
2004532622.tif 000166
【０３５１】
【表１６６】
2004532622.tif 000167
【表１６７】
2004532622.tif 000168
【表１６８】
2004532622.tif 000169
【０３５２】
【表１６９】
2004532622.tif 000170
【表１７０】
2004532622.tif 000171
【表１７１】
2004532622.tif 000172
【０３５３】
【表１７２】
2004532622.tif 000173
【表１７３】
2004532622.tif 000174
【表１７４】
2004532622.tif 000175
【０３５４】
【表１７５】
2004532622.tif 000176
先に説明した例は、いかなる意味においても、本発明の真の範囲を制限するものではなく、むしろ例証を目的として提示されていることが理解される。本願明細書に参照として引用した全ての刊行物、寄託番号の配列、及び特許明細書は、各々個別の刊行物又は特許出願が、具体的かつ個別に示されるように、参照として組込まれている。
【国際公開パンフレット】
2004532622.tif 000177
2004532622.tif 000178
2004532622.tif 000179
2004532622.tif 000180
2004532622.tif 000181
2004532622.tif 000182
2004532622.tif 000183
2004532622.tif 000184
2004532622.tif 000185
2004532622.tif 000186
2004532622.tif 000187
2004532622.tif 000188
2004532622.tif 000189
2004532622.tif 000190
2004532622.tif 000191
2004532622.tif 000192
2004532622.tif 000193
2004532622.tif 000194
2004532622.tif 000195
2004532622.tif 000196
2004532622.tif 000197
2004532622.tif 000198
2004532622.tif 000199
2004532622.tif 000200
2004532622.tif 000201
2004532622.tif 000202
2004532622.tif 000203
2004532622.tif 000204
2004532622.tif 000205
2004532622.tif 000206
2004532622.tif 000207
2004532622.tif 000208
2004532622.tif 000209
2004532622.tif 000210
2004532622.tif 000211
2004532622.tif 000212
2004532622.tif 000213
2004532622.tif 000214
2004532622.tif 000215
2004532622.tif 000216
2004532622.tif 000217
2004532622.tif 000218
2004532622.tif 000219
2004532622.tif 000220
2004532622.tif 000221
2004532622.tif 000222
2004532622.tif 000223
2004532622.tif 000224
2004532622.tif 000225
2004532622.tif 000226
2004532622.tif 000227
2004532622.tif 000228
2004532622.tif 000229
2004532622.tif 000230
2004532622.tif 000231
2004532622.tif 000232
2004532622.tif 000233
2004532622.tif 000234
2004532622.tif 000235
2004532622.tif 000236
2004532622.tif 000237
2004532622.tif 000238
2004532622.tif 000239
2004532622.tif 000240
2004532622.tif 000241
2004532622.tif 000242
2004532622.tif 000243
2004532622.tif 000244
2004532622.tif 000245
2004532622.tif 000246
2004532622.tif 000247
2004532622.tif 000248
2004532622.tif 000249
2004532622.tif 000250
2004532622.tif 000251
2004532622.tif 000252
2004532622.tif 000253
2004532622.tif 000254
2004532622.tif 000255
2004532622.tif 000256
2004532622.tif 000257
2004532622.tif 000258
2004532622.tif 000259
2004532622.tif 000260
2004532622.tif 000261
2004532622.tif 000262
2004532622.tif 000263
2004532622.tif 000264
2004532622.tif 000265
2004532622.tif 000266
2004532622.tif 000267
2004532622.tif 000268
2004532622.tif 000269
2004532622.tif 000270
2004532622.tif 000271
2004532622.tif 000272
2004532622.tif 000273
2004532622.tif 000274
2004532622.tif 000275
2004532622.tif 000276
2004532622.tif 000277
2004532622.tif 000278
2004532622.tif 000279
2004532622.tif 000280
2004532622.tif 000281
2004532622.tif 000282
2004532622.tif 000283
2004532622.tif 000284
2004532622.tif 000285
2004532622.tif 000286
2004532622.tif 000287
2004532622.tif 000288
2004532622.tif 000289
2004532622.tif 000290
2004532622.tif 000291
2004532622.tif 000292
2004532622.tif 000293
2004532622.tif 000294
2004532622.tif 000295
2004532622.tif 000296
2004532622.tif 000297
2004532622.tif 000298
2004532622.tif 000299
2004532622.tif 000300
2004532622.tif 000301
2004532622.tif 000302
2004532622.tif 000303
2004532622.tif 000304
2004532622.tif 000305
2004532622.tif 000306
2004532622.tif 000307
2004532622.tif 000308
2004532622.tif 000309
2004532622.tif 000310
2004532622.tif 000311
2004532622.tif 000312
2004532622.tif 000313
2004532622.tif 000314
2004532622.tif 000315
2004532622.tif 000316
2004532622.tif 000317
2004532622.tif 000318
2004532622.tif 000319
2004532622.tif 000320
2004532622.tif 000321
2004532622.tif 000322
2004532622.tif 000323
2004532622.tif 000324
2004532622.tif 000325
2004532622.tif 000326
2004532622.tif 000327
2004532622.tif 000328
2004532622.tif 000329
2004532622.tif 000330
2004532622.tif 000331
2004532622.tif 000332
2004532622.tif 000333
2004532622.tif 000334
2004532622.tif 000335
2004532622.tif 000336
2004532622.tif 000337
2004532622.tif 000338
2004532622.tif 000339
2004532622.tif 000340
2004532622.tif 000341
2004532622.tif 000342
2004532622.tif 000343
2004532622.tif 000344
2004532622.tif 000345
2004532622.tif 000346
2004532622.tif 000347
2004532622.tif 000348
2004532622.tif 000349
2004532622.tif 000350
2004532622.tif 000351
2004532622.tif 000352
2004532622.tif 000353
2004532622.tif 000354
2004532622.tif 000355
2004532622.tif 000356
2004532622.tif 000357
2004532622.tif 000358
2004532622.tif 000359
2004532622.tif 000360
2004532622.tif 000361
2004532622.tif 000362
2004532622.tif 000363
2004532622.tif 000364
2004532622.tif 000365
2004532622.tif 000366
2004532622.tif 000367
2004532622.tif 000368
2004532622.tif 000369
2004532622.tif 000370
2004532622.tif 000371
2004532622.tif 000372
2004532622.tif 000373
2004532622.tif 000374
2004532622.tif 000375
2004532622.tif 000376
2004532622.tif 000377
2004532622.tif 000378
2004532622.tif 000379
2004532622.tif 000380
2004532622.tif 000381
2004532622.tif 000382
2004532622.tif 000383
2004532622.tif 000384
2004532622.tif 000385
2004532622.tif 000386
2004532622.tif 000387
2004532622.tif 000388
2004532622.tif 000389
2004532622.tif 000390
2004532622.tif 000391
2004532622.tif 000392
2004532622.tif 000393
2004532622.tif 000394
2004532622.tif 000395
2004532622.tif 000396
2004532622.tif 000397
2004532622.tif 000398
2004532622.tif 000399
2004532622.tif 000400
2004532622.tif 000401
2004532622.tif 000402
2004532622.tif 000403
2004532622.tif 000404
2004532622.tif 000405
2004532622.tif 000406
2004532622.tif 000407
2004532622.tif 000408
2004532622.tif 000409
2004532622.tif 000410
2004532622.tif 000411
2004532622.tif 000412
2004532622.tif 000413
2004532622.tif 000414
2004532622.tif 000415
2004532622.tif 000416
2004532622.tif 000417
2004532622.tif 000418
2004532622.tif 000419
2004532622.tif 000420
2004532622.tif 000421
2004532622.tif 000422
2004532622.tif 000423
2004532622.tif 000424
2004532622.tif 000425
2004532622.tif 000426
2004532622.tif 000427
2004532622.tif 000428
2004532622.tif 000429
2004532622.tif 000430
2004532622.tif 000431
2004532622.tif 000432
2004532622.tif 000433
2004532622.tif 000434
2004532622.tif 000435
2004532622.tif 000436
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004532622.tif 000437
2004532622.tif 000438
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004532622.tif 000439