(57)【要約】本発明によれば、生体組織との接触に適した材料の表面特性を修飾し、その血液適合性を高め、使用時の血栓形成性を低下させるための新規な方法が提供される。このような手法は：材料の表面上に反応基を創製する目的で、前記材料の表面をプラズマ処理条件に暴露すること；前記材料の表面上に創製された反応基と共有結合を形成することが可能な反応性分子種を生成するために、活性化因子を用いて分子を活性化することを含む。本発明は、さらに、このような手法により製造される材料や、本手法により修飾された材料を有してなる血管補綴等の装置をも包含する。【選択図】図９
2004524096.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体組織との接触に適した材料の表面特性を修飾するための方法であって：
材料の表面上に反応基を創製する目的で、前記材料の表面をプラズマ処理条件に暴露すること；
前記材料の表面上に創製された反応基と強力な結合を形成することが可能な反応性分子種を生成するために、活性化因子を用いて分子を活性化すること；および
強力な結合を形成するために、前記反応性分子種を、前記材料の表面上に創製された反応基と接触させること、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
前記強力な結合が共有結合である請求項１の方法。
【請求項３】
得られる材料の表面が、生体組織に対して適合性を有する請求項１または２の方法。
【請求項４】
前記組織が血液組織である、請求項３の方法。
【請求項５】
請求項１の方法であって、
前記プラズマがアンモニア高周波（RF）プラズマで、前記反応基がアミン基であり；
前記分子が、コリン、ヘパリン、およびその血液適合性が当業者間で周知である他の分子から成る群より選択され、前記活性化因子が塩化ホスホリル（POCl3）であり、前記反応性分子種が前記分子のオキシホスホロジクロリネーションによる誘導体であり；さらに、
前記強力な結合が、ホスホアミド型の共有結合である
方法。
【請求項６】
前記プラズマ処理条件が、約5 watt〜約500 wattのRF出力を、約50 mtorr〜約5 torrの圧力下、約10秒間〜約30分間にわたり適用することから成る、請求項５の方法。
【請求項７】
前記プラズマ処理条件が、約20 wattのRF出力を、約300 mtorrの圧力下、約250秒間にわたり適用することから成る、請求項６の方法。
【請求項８】
前記プラズマ処理条件が、約15wattのRF出力を、約250ミリtorrの圧力下、約100秒間にわたり適用することから成る、請求項６の方法。
【請求項９】
前記第３工程が、前記第１工程の約２時間以内に行なわれる、請求項７または８の方法。
【請求項１０】
前記生体組織との接触に適した材料が、動物の体内に移植可能な材料である請求項１ないし９のいずれかの方法。
【請求項１１】
前記動物の体内に移植可能な材料が
微孔性の延伸ポリテトラフルオロエチレン（ePTFE）、ポリテトラフルオロエチレン（PTFE）、ポリ塩化ビニル（PVC）、ポリエチレン、ポリエステル(ポリエチレン・テレフタレート、PETなど）、ポリプロピレン、ポリウレタン、ポリカーボネート、シリコーン、PVDF、およびポリマーコートされた例えば金属およびセラミックなどの材料、
から成る群より選択される、請求項１０の方法。
【請求項１２】
前記動物の体内に移植可能な材料がePTFEである、請求項１１の方法。
【請求項１３】
前記ePTFEが、血管補綴の内表面を構成するものである、請求項１２の方法。
【請求項１４】
前記血管補綴が約1〜30 mmの内径を有している、請求項１３の方法。
【請求項１５】
請求項１ないし１４のいずれかの方法により製造される動物の体内に移植可能な材料。
【請求項１６】
請求項１３または１４の方法により製造された血管補綴。
【請求項１７】
請求項１５の材料を含むことを特徴とする装置。
【請求項１８】
前記装置が動物の組織と接触して使用されるためのものである、請求項１７の装置。
【請求項１９】
前記組織が血液組織である、請求項１８の装置。
【請求項２０】
前記装置が：
移植片、補綴、人工臓器、ステント、心臓弁、体外血液循環の間に血液と接触する装置、透析治療の間に血液と接触する装置、または血液と接触する表面をもつ任意の他の材料、
から成る群より選択される、請求項１８または１９の装置。
【請求項２１】
血栓症を予防するための、請求項１７ないし２０のいずれかの装置の使用。
【請求項２２】
生体組織との接触に適した材料であって、好中球の付着、血小板の付着および活性化に対して抵抗性を有しながら、線維芽細胞および内皮細胞の発育を増進する表面を有することを特徴とする材料。
【請求項２３】
プラズマ処理され、PRCが移植されたePTFEである、請求項２２の材料。
【請求項２４】
請求項２２または２３の材料を含むことを特徴とする装置。
【請求項２５】
前記装置が：
移植片、補綴、人工臓器、ステント、心臓弁、体外血液循環の間に血液と接触する装置、透析治療の間に血液と接触する装置、または血液と接触する表面をもつ任意の他の材料、
から成る群より選択される、請求項２４の装置。
【請求項２６】
血栓症を予防するための、請求項２４または２５の装置の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願発明は、生体組織との接触に適した材料の表面特性を修飾するための新規な方法に関するものであり、表面上に反応基を創製する目的で、材料の表面をプラズマ処理条件に暴露することと、前記表面上に創製された反応基と強い結合を形成することの可能な反応性分子種を産生するために分子を活性化することと、強い結合を形成するために該反応性分子種を該材料の表面上に創製された反応基と接触させることを含むことを特徴とする。本願発明はさらに、この方法により産生される材料、ならびにこのような方法により修飾された材料を含んで成る血管補綴などの装置をも包含する。
【背景技術】
【０００２】
西側諸国および日本においては、毎年約350000の合成血管補綴が動脈バイパスとして移植されている。ダクロン（DacronTM）（ポリエチレンテレフタレート）または微孔性のテフロン（登録商標）（TeflonTM）（延伸性のポリテトラフルオロエチレン、またはePTFE））から製されるそれらは、高い流速条件下にある大口径の血管においてはうまく機能するが、小口径のバイパス（すなわち、冠動脈）として、あるいは低い流速条件および高抵抗部位における中口径のバイパス（すなわち、下肢動脈）として使用される場合には低い開存率を有する。（開存率は、動脈を置換する際に血流を通らせたままにする生体材料の能力に関する）。中口径のバイパスとして移植され、合併症の後に回収された398のePTFE血管補綴についての研究では、それらの65 %が血栓症のため外植されなければならなかったことが明らかになっている（文献1）。
【０００３】
内皮細胞の裏打ちは、血管および心腔の内側を被覆する天然の血液適合性の表面であり、最適な血液適合性表面とされている。これまでに、血管補綴の管腔表面への内皮細胞の接着および伸展を促進する目的で提案された主要な技術としては：（1）内皮細胞の伸展；（2）内皮細胞分裂分裂促進剤を用いた移植片の前処理；（3）構造上の有孔性を増大すること；および（4）タンパク質マトリックスによる表面のコーティング、がある。いくつかの試みがなされてきたものの、血液に暴露される補綴の内表面の内皮細胞による完全な被覆は、ヒトではまだ観察されていない。それゆえ、今日の心臓血管研究において、動脈補綴の開存率を増大することは、明らかに優先順位の高い課題である。
【０００４】
多くの実例により、プラズマ処理を介した表面の修飾が、ポリマー材料における特定の血液適合性および一般的な生体適合性を改善する技術として最も見込みのあるものの一つであることが示されている（文献2, 3）。プラズマ処理の利点の一つは、他の、共有結合なしにコーティングが補綴の内側に沈着されるか（文献4, 5）、結合がイオン性であるか（文献6）、または生体材料に生物活性物質が取り込まれている（文献7）アプローチとは異なり、それが修飾因子と、処理されるべき表面との間の共有結合の形成を可能にする点にある。また、プラズマ処理により、材料表面に対する修飾因子の共有結合形成に続き、その生体適合性のために選ばれた分子が、直接またはスペーサー分子を介して、修飾因子に共有結合できる。臨床的には、プラズマ処理等の表面処理により安定性が向上することで、結果として、四肢救助率の改善と、小口径の冠動脈バイパス手術における将来的な使用の可能性とをもたらした。そして、このことは、患者にとっては、再手術の発生率を最小限にし、このような外科的関与に対する社会的な健康管理コストを低下させることができる。
【０００５】
生体材料のプラズマ処理は、所望の血液適合性および／または生体適合性を有する分子の共有結合をもたらす唯一の方法ではない。しかしながら、関係する先行技術において記述されている方法は、しばしばいくつかの段階を包含している（文献8〜14）。今日までのところ、生体材料表面の性能を改善するべく行なわれた実験のほとんどは、平らな材料被検物、とくにポリマーシートに基づくものであった。残念ながら、表面を活性化するためのプラズマの使用を包含する実験は、非平面の幾何学をもつ市販の補綴について、直接行なわれることはほとんどなかった。ワシントン大学において行なわれた実験（文献2, 15〜20）は、主として、テトラフルオロエチレン（TFE）ガス雰囲気中で、市販のダクロン（DacronTM）人工補綴をプラズマ処理して、補綴の内表面をより生体適合性の高い性質を有するCF3基でコートするものであり、新規な市販の高周波グロー放電（Radio Frequency Glow Discharge）（RFGD）処理−血管移植片の先駆けであった（文献17）。しかし、生体材料表面のための多くの表面処理システムが存在するにもかかわらず、管状装置の内表面をコーティングではなく、処理する結果はほとんど得られていなかった（文献21〜23）。
【０００６】
過去30年間にわたり、補綴がin situにおいて移植される際に、その生体適合性を増進すること、またはポリマーと組織との相互作用を調節することを目指して、生物医学的装置の表面を処理またはコートする上でのプラズマの効果が検討されてきた（文献16, 24〜30）。様々な基質を薄いポリマー層でコートするために、プラズマ重合可能なガスが用いられてきた一方で（文献15, 17〜19, 24, 31, 32）、物質表面を処理するために重合不能なガスが適用されてきた（文献33〜38）。
【０００７】
生体材料の表面をコートまたは処理する方法として多くのアプローチがなされてきたが、RFGD処理によるアミノ基の導入は、二つの理由から特に興味深い。第一に、アミノ基は生体材料表面での細胞の伸展を促進することが知られている（文献39, 41）。第二に、アミノ基は他の化学官能基と容易に反応し、特定の分子が、血流によるこれらの分子の浸出を防止するのに充分な強度の相互作用を介して付着することを可能にする（文献42）。たとえば、アミノ基は、周知の多糖類血液凝固阻止薬であるヘパリンをイオン結合により固定化することができる（文献22）。
【文献】
【０００８】
2004524096.tif 000003
【０００９】
2004524096.tif 000004
【００１０】
2004524096.tif 000005
【００１１】
2004524096.tif 000006
【００１２】
2004524096.tif 000007
【００１３】
2004524096.tif 000008
【００１４】
2004524096.tif 000009
【００１５】
2004524096.tif 000010
【００１６】
2004524096.tif 000011
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
この20年間に、心臓血管補綴装置の分野では、改良されたヒト血液適合性をもつ表面を開発するべく多くの努力がなされてきたが、許容される長期間の血液適合性の人工材料はまだ達成されていない。血液と人工材料との間の相互作用の複雑さは、この点において界面についての主要な問題を成している。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
表面処理は、その生物学的環境との界面反応を亢進するための、生体材料の表面特性の修飾を可能にする。低圧プラズマ表面処理は、それらが材料の大部分の特性を変えることなく表面の修飾を可能にすることから、新規な生体適合性材料のデザインおよび開発において特に有利である（文献43）。本願発明においては、それらは異なる組織／生体材料の界面特性を修飾するために特に有用ではあるが、それらの究極の有用性は、血管補綴の血液適合性を大きく改良できる点にあってもよい。
【００１９】
したがって、本願発明によれば、生体組織と接触して配置されるべき材料の表面特性を修飾するための新規な方法が提供される。この方法は：
材料の表面上に反応基を創製する目的で、前記材料の表面をプラズマ処理条件に暴露すること；
前記材料の表面上に創製された反応基と強力な結合を形成することが可能な反応性分子種を生成するために、活性化因子を用いて分子を活性化すること；および
強力な結合を形成するために、前記反応性分子種を、前記材料の表面上に創製された反応基と接触させること、
を含む。
【００２０】
好ましくは、該強力な結合は共有結合である。好ましい態様においては、活性化用に選ばれた分子は、ヒトの組織を含む生体組織と適合性がある。
【００２１】
具体的な態様においては、本願発明の新規な方法はさらに以下の特徴を含む：
前記プラズマがアンモニア高周波（RF）プラズマで、前記反応基がアミン基であり；
前記分子が、コリン、ヘパリン、およびその血液適合性が当業者間で周知である他の分子から成る群より選択され、前記活性化因子が塩化ホスホリル（POCl3）であり、前記反応性分子種が前記分子のオキシホスホロジクロリネーションによる誘導体であり；さらに、
前記強力な結合が、ホスホアミド型の共有結合である。
【００２２】
上記の具体的な態様についての好ましい態様において、RF出力は、約5 watt〜約500 wattであり、約50 mtorr〜約5 torrの圧力下で、約10秒間〜約30分間にわたり適用する。当業者には、処理された表面に対し、過剰量のエネルギーが照射されるような時間と出力の組合せを避けるための注意を払う必要があることが分かるだろう。このような条件は、微視的に脆弱な表面をもたらす。好ましくは、RF出力は約20wattであり、約300 mtorrの圧力下で約250秒間にわたり適用する。さらにもう一つの態様においては、RF出力は約15 wattであり、約250 mtorrの圧力下で約100秒間にわたり適用される。
【００２３】
理想的には、第三の段階は第一の段階の約２時間以内に行なわれる。
【００２４】
本願発明の新規な方法は、以下の群より選択される移植可能な材料について特に適している：延伸ポリテトラフルオロエチレン（ePTFE）、ポリテトラフルオロエチレン（PTFE）、ポリエチレン、ポリエステル、ポリプロピレン、およびポリウレタン。好ましい態様においては、移植可能な材料はePTFEであり、処理された表面は血管補綴の内表面である。さらに好ましい態様においては、血管補綴は約１〜30 mmの内径を有する。
【００２５】
本願発明はさらに、新規な方法により生成される材料、ならびに以下の任意のものを含めて、これらの材料を含んで成る装置を含む：移植片、補綴、人工臓器、ステント、心臓弁、体外血液循環の間に血液と接触する装置、透析治療の間に血液と接触する装置、または血液と接触する表面をもつ任意の他の材料。
【００２６】
加えて、本願発明は、任意の該装置の、特にヒトを含めた動物における血栓症を予防するための使用を包含するものである。
【００２７】
RF出力、アンモニア圧、および処理時間を制御することにより、原子置換率が調節されてよく、Ｘ線光電子分光法（XPS）によりプローブされるように、表面原子の15 %までが窒素で置換されてよい。表面上には、処理の後、アミンおよびイミン基といった異なる化学種が存在する。空気中での80日間まで貯蔵すると、表面の脱フッ素化と、表面窒素濃度の緩やかな減少が見られる。アンモニアRFプラズマ処理は、大気に暴露されることにより大幅な表面再構成が生じるため、これを予防するための注意が払われねばならないが、ePTFE人工補綴の内表面を均一に処理する方法として有効に適用できる（文献44, 45）。
【００２８】
血管補綴のアンモニアRFプラズマ処理された内表面は、その分子構造が、該補綴をより血液適合性に、また使用中に非血栓形成性にすることが可能な分子と反応させられてもよい。この分子は、好ましくは活性化されたホスホリルコリン（PRC）か、または同様の性質をもつ任意の他の分子であり、リン酸塩部分の二つのヒドロキシル基が塩素で置換されて、該分子のジクロロ誘導体を形成する。このジクロロ誘導体は、血管補綴の内表面のアンモニアRFプラズマ処理の結果として生じるアミノ基と容易に反応し、該分子の有効な固着を可能にする。
【００２９】
生体組織との接触に適した材料を製造するための新しい方法を提供することは、本願発明の一つの目的である。この材料は、好中球の接着および血栓症に対し抵抗性がありながら、線維芽細胞および内皮細胞の発育を増大する表面を有することを特徴とする。この出願の発明の方法は、たとえば、血管補綴などの装置の内表面を処理するために用いられてよく、それによりその血液適合性を増強し、かつ使用中の血栓形成性を低下させるようにする。したがって本願発明のさらなる目的は、本願発明の新規な方法を用いて処理された装置を提供することである。
【００３０】
本願発明の他の目的、利益、および特徴は、添付の図面を参照にして、以下の単なる実施例であってその好ましい態様を制限するものではない説明を読めば、さらに明らかになるであろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３１】
本明細書において発明者らは、「未処理の」および「処理された」という用語について、以下の定義を示す。「未処理の」は、本願発明者らがそれに対して何ら表面修飾処理を適用しなかった市販の血管補綴を意味する。「処理された」は、本願発明者らがそれに対して、この後に記述される表面修飾方法を適用した市販の血管補綴を意味する。
【００３２】
本文において用いられる「動物」という用語は、ヒト、霊長類、家畜（ウマ、ウシ、ブタ、ヤギ、ヒツジ、ネコ、イヌ、モルモット、マウス、その他などの）、および他の哺乳類を意味することが意図される。一般に、この用語は、高度に発達した血管系を有する生きた生物を指すべく用いられる。
【実施例】
【００３３】
Ｉ．  アンモニア高周波（RF）プラズマを用いた血管補綴物の内表面の前処理
実験法
（実験法は図１を参照して記述される。）
・材料
平均25ミクロン長の線維をもつ微孔性のePTFE血管補綴６（内径6および10 mm）を使用した。方法については一つの補綴に関して記述する。
【００３４】
まず、微孔性ePTFE人工補綴（長さ３〜10cm）を、高純度のメタノールで10分間洗浄し、真空乾燥した。この処置は、「購入時に」補綴の表面上に存在する可能性のある汚染物質を除去するために行なわれた。この洗浄操作に続き、補綴の一端に、二つの小穴を互いに向き合うようにあけ、双方の穴を通してポリプロピレンのモノフィラメント（5-0-Ethicon）３を挿入し、補綴の上に結び目をゆるく結んだ。モノフィラメントの他端は、電動機36の水平軸上に位置し、試料補綴がRFGD処理システムのパイレックス（登録商標）（PyrexTM）管２の内側を垂直に移動できるよう設置された滑車５に巻きつけた。重力により血管補綴がパイレックス（登録商標）管内を下方に移動した。3 cmより長い血管補綴については、前述の結び目と、モノフィラメントを介した滑車に取り付けることに加えて、まずモノフィラメントが管を下るように通し、次いで滑車まで上るようにして、ポリプロピレンモノフィラメント３を血管補綴の底部に取り付け、かつモノフィラメントを滑車にとりつけるようにすることが好ましい。以上の仕組みにより、補綴がパイレックス（登録商標）管を下っている間モータで引くことが可能となり、補綴が管を下降する際の、管内壁と補綴の摩擦が問題とならなくなる。このシステムを閉じるに先立ち、RFGD処理後に補綴をアルゴン雰囲気下で回収、保存し、補綴の表面上の活性部位と空気の接触を最小限にするために、容器とその蓋をベルジャー１の中に設置した。
・プラズマ装置
図１に示されたように、使用されたRFGD処理システムは、一般に数字10によって表される。このシステムは基本的には、補綴の内側のみにRFGDを発生させるために、補綴６の外径よりもやや大きい内径４を有するパイレックス（登録商標）ガラス管（長さ400 mm、内径10 mmの補綴用には内径12.5 mmであり、内径６mmの補綴用には内径８mm）２からなる。実際、補綴６とパイレックス（登録商標）管４との間隔は、プラズマ形成に必要な電子誘発性の段階的イオン化を可能にするのに充分な長さではない（文献11）。したがって、様々な直径の補綴の処理には、適切な直径のパイレックス（登録商標）管の選択が必要である。
【００３５】
上記のように、選択の基準は、処理を通じて補綴の外表面に対してプラズマが発光しないことである。補綴の外径と、パイレックス（登録商標）ガラス管２の内壁の間隔を、全周で約1 mmとすると適切であることが証明されている。パイレックス（登録商標）ガラス管２は、その上端の5 cm下に位置するガス注入のための入口８を有する。静電結合された３つの銅の電極12a、12b、および12cが、互いに（処理するべき補綴の長さに応じて）３〜５cmの間隔をあけて、管２の中央に取り付けられている。チャンバー内の真空は、機械式ポンプ16（モデル1402、ウェルチ・サイエンティフィック・カンパニー（Welch Scientific Company））に接続された、60リットル／秒のポンピング速度をもつターボモレキュラーポンプ14（モデルTCP015、バルザース・プファイファ（Balzers Pfeiffer））により作られた。この装置により、4×10-5 torrに近い圧力を得ることが可能となる。処理中は、機械電気式バルブ20（タイプ248A-00200SV、MKSインスツルメンツ（Instruments））およびキャパシタンス圧力計22（バラトン（Baraton）タイプ 626A01TAE、MKSインスツルメンツ）に接続された、キャパシタンス圧力計／機械電気式バルブコントローラー18（タイプ250-1A、MKSインスツルメンツ）により、チャンバー内の圧力が一定に保たれる。最後に、ガス状の分子は、出力メーター26を介して出力を自動マッチング・ネットワーク（スマーチュナー（Smartuner SG-230、SGC））28へ伝え、それが次にRF出力を三つの銅の電極12ａ〜ｃから成るアンテナへ結びつける、RFジェネレーター24（八重洲HFトランシーバーFT-840、八重洲）により製された高周波フィールドを通して励起される。アンテナの両端に位置する電極12ａおよび12ｃは、アース（示されず）へ接続される一方、RF出力は中央の電極12ｂを通して伝達される。処理は、13.56MHzにおいて、10から100 wattのRF出力範囲で行うことが可能である。
・プラズマ処理
まず、システムの全バルブを閉じる。ベルジャー１内に補綴を導入した後、バルブ30を開け、機械式ポンプ16を、約10-3 torrの真空に達するまで作動させる。この圧力がこのシステム内で達成されると同時に、バルブ30を閉じ、バルブ32を開け、数秒後にターボ分子ポンプ14を作動する。約１分後、バルブ34を開け、5 x 10-5 torrより高い真空度に達するまでベルジャー内を連続的に脱気する。次いで、バルブ34を閉じることにより、チャンバーをターボポンプ14から分離し、機械電気式バルブ20を経て高純度のアンモニアをベルジャー１内に導入し、圧力が0.1torrより高い場合には、ベルジャー１は機械式ポンプ16のみによりバルブ30を経てポンプで脱気される。機械電気式バルブコントローラー18は、チャンバーに入ってくるガスの量を自動的に調節し、キャパシタンス計22で検出された圧力は、１分以内にキャパシタンス計／機械電気式バルブコントローラー上に選択された値まで落ち着く。典型的には、この構成により、10-3〜1 torrの圧力範囲でのプラズマの発生を可能にする。
【００３６】
上記で確立されたパラメーターを用いて、高周波ジェネレーター24を作動させることにより、プラズマが発光する。放電と出力のマッチングを最適化するために、マッチング・ネットワーク28が、出力メーター26上の値が1と1.15の間の定在波比（SWR）シグナルを達成するまで充分な時間がかけられる。次いで、静電的な処理によりRFGD処理が行なわれる：まず入口８の直下に補綴６を配置し、かつプラズマパラメーターを調節して、パイレックス（登録商標）ガラス管２におけるこの位置から、照射された領域の中央（三つの電極12ａ、12ｂ、および12ｃの間）へ、電動機36をにより移動し、あらかじめ定めた時間プラズマ内に維持する。10 cmより長い補綴は、電動機36により補綴が照射領域を横切るようにゆっくりと移動させることにより処理でき、結果として同様の移植効率が得られる（文献45）。
【００３７】
処理の最後に、高周波ジェネレーター24を止め、コントローラー18を介して機械電気式バルブ20を閉じることにより、ガスの流れを止める。機械式ポンプ16は、ベルジャー１中の残存アンモニアガスを除去するために、約50 mtorrの圧力が達成されるまで運転する。次いで、バルブ38を注意深く開くことにより、２分間にわたりアルゴンでフラッシュする。これは、プラズマ処理により励起された分子種を基底状態に戻すために行う。バルブ30を閉じることにより、機械式ポンプ16をベルジャーから分離した後、ベルジャーを大気圧に戻すために、チャンバー内部へのアルゴンフローを継続する。次いで補綴６をパイレックス（登録商標）管２の底まで降ろし、ベルジャー１を速やかに開け、補綴６をポリプロピレンマイクロフィラメント３から切り離し、蓋をした容器内に入れる。次いで、これを窒素ガスでパージされたグローブボックス内に置き、XPS用に少量の試料を採取し、アンモニア処理の成功を判断する。補綴は、さらに、以下に記述される固着操作のために調製される。
II．  分子の固着
赤血球の非血栓形成性表面の模倣は、非血栓形成性の生体材料の開発の出発点として支持されてきた。ホスホリルコリン（PRC）は、赤血球の外表面の主要な成分であることから、それを含んでいる材料は非血栓形成性であると期待できる（文献46〜50）。さらに、ポリマー表面に付着したPRC基が血液適合性を改善することが知られている（文献51〜57）。
【００３８】
血管補綴の内表面の血液適合性および非血栓形成性を増大するべく、プラズマで（上述のように）前処理された補綴を、ホスホリルコリン（PRC）等の分子の活性体と反応させた。究極の目標はこのような補綴をヒトの体内に移植することであるため、分子は補綴の内壁に強固に付着されねばならない。したがって、補綴の内表面に分子を固定化するためには、イオン結合の形成や吸着に依存するよりも、むしろ、分子とプラズマ処理によって作製されたアミン基との間に強力な結合（好ましくは、共有結合）を形成することが必要である。加えて、この種の化学的処理は、簡単で費用がかからないことが望ましい。
【００３９】
該分子の一般的な構造は以下に示される：
【００４０】
【化１】
2004524096.tif 000012
【００４１】
PRCと、プラズマ処理された補綴の表面に存在するアミノ基との間の直接的な反応により、イオン結合および／または表面吸収を生じるが、そのどちらも、前述のとおり、目的の用途において充分な強度や安定性を有さない。そのため、反応性の類似体を合成することによりこれらの分子の反応性を増強し、それらが、アンモニアプラズマ前処理された補綴の表面のアミノ基と、ホスホアミド系の共有結合を形成できるようにすることが必要である。このような方法により、分子は補綴の内表面に対し効率的に固着されると予想される。
【００４２】
所望の共有結合反応を達成するためには、まず、標的分子RPO(CH)2の二塩素化誘導体RPO(Cl)2を合成しなければならない。前処理された補綴の内表面のアミノ基との反応に適した分子の二塩素化誘導体の合成は、PRCを用いて、以下に図式的に示されたように、少なくとも二つの方法より成就できる。第１の経路では、カルシウム塩として市販されているPRCを、酸性の樹脂（文献58）と反応してカルシウムを除去する。次に、生成物を三塩化または五塩化リン（または、ホスゲン、塩化オキサリル、塩化チオニルなどの、任意のハロゲン化剤）と反応させ、二塩素化誘導体を得る。別の合成は第２の経路に示されている。ここでは、PRCの二塩素化誘導体は、塩化ホスホリルとコリンから、一段階で直接的に合成される。
【００４３】
【化２】
2004524096.tif 000013
【００４４】
好ましい態様においては、好ましい経路は、必要とする工程数がより少ないという利点を有する上記の第２の経路である。この実験プロトコールは、再現性および毒性、ならびに工業用の規模での可能性といった因子を考慮している。
実験法
PRCの二塩素化誘導体は、閉じたガラスフラスコ内で、水の存在を除外しかつ反応の結果生じるHClを移動させるために乾燥窒素流下に、ガラスビーズ（直径3mm）存在下、０℃（氷浴）でコリンを含むクロロホルム溶液に、塩化ホスホリル（POCl3）のクロロホルム溶液を加えることにより合成される。混合物を０℃で１時間、さらに室温において12時間撹拌し、コリン結晶の溶解と油性相の形成が確認されるまで反応を進行させる。反応を通じてすべての塩化ホルホリルが確実に消費されるように、やや過剰のコリンを使用する。PRCの二塩素化誘導体の合成の後、直ちに、上記のガラスフラスコ内において3 cmの補綴を室温で浸漬し、さらに２時間撹拌を続ける。より長い血管補綴（＞3 cm）を用いる場合には、底に出口をもつ市販の１リットルガラスリアクターを用いた簡単なシステムを設計した。この場合には、12時間の機械的撹拌に続き、残留するPOCl3をすべて除去するために、下層のクロロホルム層をフラスコ底部の出口より除去し、新鮮なクロロホルムで置換した。次に、PTFEダイアフラム型ポンプにより、リアクター底部からPTFEチューブ部分を通じ、補綴を保持する垂直のガラス管を通じて活性化されたPRC溶液を循環する。最後に、PTFEチューブ部分により、該溶液をガラスリアクターに戻し、再循環を可能とする。
【００４５】
活性化されたPRCの移植が生じた場合には、固着した分子のホスホアミド部位上に残存するすべての塩素分（以下の全反応の工程２を参照）、ならびにすべての反応物および溶媒の痕跡を除去するために、補綴を水中で何度も洗浄する。次いで補綴は、移植の度合いを判定するためにXPSおよび静電SIMSにより分析されるが、その前に、真空下で一晩乾燥する。
【００４６】
【化３】
2004524096.tif 000014
【００４７】
本願発明の方法は、血液組織などの、生物学的組織に高度に適合性を有する他の分子を結合するものとして拡張されてよい。実際に、予備的報告（文献63）には、本明細書において記述されたアンモニアプラズマ処理によりあらかじめ処理された市販のePTFE人工補綴の内表面を、本明細書に記載されたものとは異なる移植方法を用いて、別の高度に生体適合性分子であるポリエチレングリコール（PEG）を均一にコートできることが示されている。
アンモニアRFGDプラズマ処理された表面およびPRC移植表面の確認
・Ｘ線光電子分光分析（XPS）
修飾された表面を確認するために、Ｘ線光電子分光分析（XPS）を用いた。XPSスペクトルは、PHI 5600-ciスペクトロメーター（フィジカル・エレクトロニクス(Physical Electronics)）を用いて記録した。単色アルミニウムＸ線源（1486.6 eV）を用いて、補綴表面のサーベイおよび高分解能スペクトルを記録した。いずれの分析においても、試料のＸ線による修飾を最小限にするために、光源は100 Wに保持し、検出は表面に対して45°で行なわれた。XPS分析チャンバー内の圧力は、約5 x 10 -9 torrに保持した。
・アンモニアRFGDプラズマ処理されたePTFE表面
RFGDアンモニアプラズマ処理の後、RFGD処理の30分以内に、窒素陽圧下、チャンバー内において試料を縦に開き、その内表面をXPSにより分析した。酸素の表面原子濃度は、常に５％より低いものとした。
【００４８】
縦に処理された試料の長さに沿って表面修飾のデータを収集するため、XPS分析領域は補綴の長さに沿って移動した。RFGDシステムが、結果として内表面のみの処理を生じることを確認するために、300 mtorrのアンモニア圧下、20 Wで250秒間処理された補綴試料の外表面のXPS分析を行った。データ（示さず）より、パイレックス（登録商標）TM管の内径が補綴の外径よりも少しだけ（1 mm）大きい場合には、外表面がグロー放電により修飾されないことが確認された。使用された圧力および電力の条件下では、イオン化プロセスが組換えプロセスを補填するのに不充分であったため（文献60）、デバイ長さが補綴の外表面と管の内表面との間に安定なプラズマ形成を可能にしなかったのである。
【００４９】
すべての結果は、表面上の窒素の原子濃度のパーセントと、N/C、F/C、およびO/C表面濃度比を考慮して議論される。実験および装置の不確定性により、５％を越える原子濃度の値は±１％（絶対値）またはそれ以上の信頼性を有する。プラズマを発生させるためにアンモニアガスが使用されたことから、窒素の濃度はRFGD処理の度合いに関する確かな指標となることが明らかである。さらに、N/C比はePTFE表面上への窒素原子挿入の程度をプローブする一方、F/C比は脱フッ素化のレベルをモニターすると同時に、他の原子および／または、鎖内または鎖間での多重結合の形成により置換されたフッ素原子の量を示す。
・血管補綴の表面上に移植された窒素含有種の性質と処理パラメーターとの関係
RFGD処理されたePTFE試料の表面上に移植された窒素含有種の性質との関係を理解するために、ガス圧、RF出力、および処理時間などの可変のパラメーターの影響を調べる異なる試験が行なわれた。長さが３cmある補綴を、変数のうちの二つを一定に保ち、三つ目を可変の条件として処理した。図２に見られるように、300 mtorrのアンモニア圧下、20 Wで250秒間のRFプラズマ処理により、0.3までの平均N/C比とともに、15 %までの表面原子窒素濃度の達成が可能であった。このことは、公開されているデータが１と３％の間の窒素濃度（文献26, 42, 61）、または0.06と0.18の間のN/C比（文献28〜43, 59）とされている、従来報告されているePTFE表面上に窒素を導入する処理方法に対し、有意な改善が実現したことを表している。この結果は、選択したリアクターの円筒状の形状が、処理の効率を最大限にしたことに起因すると説明されると考えられる（文献59）。
【００５０】
三つの表面特性のパラメーター（F/C、N/C、および%N）は、任意の補綴になされた表面修飾がかなり均一であることを示している：たとえば、内径6 mmの補綴の７cmのセグメント上の窒素原子濃度（250秒間、300ミリtorr、15W）は（13±1)%。その後の血液適合性分子の移植や血管補綴の性能の改良のために必要とされる均一性の度合いは、血液適合性試験によってのみ適正に決定できる。しかしながら、アンモニアプラズマ処理に次ぐ表面修飾について観察された相対的な均一性から、後に続く移植のために良好な出発点が提供されているといえる。
【００５１】
図３は、圧力を一定（300 mtorr）に保ちながら、出力（20、40、および50W）と処理時間（10、120、および275秒間）を変えて行なわれた処理の、表面組成に対する影響を示す。40 WのRF出力で窒素濃度が最も高い値に達すると見られる。275秒間にわたって行なわれた実験で測定されたN/C比は、120秒間にわたる処理に続いて測定されたものよりも有意に高かった。一方、F/C比は、これら二つの処理時間に関して、試験したすべてのRF出力において同等であった。したがってこのデータより、より高い窒素表面濃度が得られるにも関わらず、処理時間を長くしてもフッ素置換の増大が促進されなかったことを示唆している。この結果から、異なる処理時間により、表面上に異なる化学種が形成されることを示すと考えられる。
【００５２】
図４に見られるように、アンモニア圧を100から600 mtorrまで増加（RF出力を20Wに保ち、処理時間は10秒間とした）しても、窒素濃度はわずかに増加するにすぎない：低圧から高圧まで、含有量は各々５から７％の範囲であり、N/C比は0.14から0.16の範囲となった。しかしながら、表面の脱フッ素化は圧力に依存することが明らかである：F/C比は100 mtorrでの1.45から600 mtorrでの1.1に減少した。したがって、同程度の窒素挿入にもかかわらず、表面上に形成される化学種はチャンバー内の圧力に依存することが明らかである。
【００５３】
ほぼ一定した窒素の表面濃度を達成するために必要な時間を測定するために、さらなる実験が行なわれた。表面上で測定された窒素のパーセントおよびN/C比（図５）から明らかなように、窒素濃度は処理時間160秒の後一定に達した。表面の脱フッ素化は、より複雑な動きを見せつつも同様なパターンに従うように見える。
【００５４】
以上の結果から、サーベイスペクトルにより与えられた表面特性のパラメーターからわかるように、圧力、処理時間、およびRF出力のすべてが化学的組成に影響することが示された。特に、これらの結果は、上記の三つの処理パラメーターの関数として、異なる窒素種が存在する可能性を高める。
【００５５】
アンモニアRFGDプラズマ処理により、いくつかの窒素含有種が形成される可能性があることから、本願の発明者らは、NH2種として存在する窒素のパーセントを定量するために表面被覆を行なった。モデル表面についての表面被覆の結果（示されず）から、図６に示されるように、クロロベンズアルデヒドがアミン成分と特異的に反応することが証明された。したがって、d'Agostinoら（文献62）が報告しているように、被覆表面の塩素XPSシグナルから表面のアミン濃度を決定することが可能である。表面被覆術を用いることにより、プラズマ処理を通じて表面上に移植されたすべての窒素種（表１において、NH2として存在するN0の％）の45%までがアミン成分であることが示された。さらに、また、表１０に示されたデータから、プラズマ処理持続時間を変えることにより表面のアミン濃度を調節できることが示されている。たとえば、表面でのNH2の表面濃度は、50秒間の処理時間では3.6 %であり、表面が250秒間にわたって処理された場合には6.0 %となる。しかしながら、ポリテトラルフオロエチレン鎖の破断や二重結合の形成の発生を最小限にするために、プラズマ環境への長すぎる暴露は避けるべきである（文献64）。
【００５６】
【表１】
2004524096.tif 000015
【００５７】
当業者は、表面のアミン基が、本発明の精神からはずれることなく、本文に示されたものと異なる方法によって表面上に創製されてよいことを認識するであろう。たとえば、いくつかの限定的でない例を挙げるならば、アミン基は、アンモニアプラズマの使用によるばかりでなく、N2H4（ヒドラジン）のプラズマ（文献65, 66）、脂肪族アミン（文献67）、アリルアミンなどのコーティング形成ガス（文献68〜71）を用いても表面上に創製できる。たとえば米国特許第6,159,531号（文献72）は、表面アミン基の前駆体としての利用の観点から、これらのガスの相対的な利点について簡単に議論している。また、本文において用いられた連続的な、容量結合RFプラズマ以外にも、表面を活性化する様々な方法が適用できる。これらは、本発明の精神からはずれることなく、パルスプラズマ（文献68, 70, 73）、誘導結合RFプラズマ（文献74〜76）、コロナ放電（文献77, 75）、マイクロ波プラズマ（文献79, 80）、およびUV照射（文献81, 82）を含むが、それに制限されない。一つの実例として、ポリマーの部分的な表面酸化のための同処理の使用を教示している、米国特許第5,922,161号（文献83）を読むことができる。
【００５８】
さらに、当業者であれば、本発明の精神からはずれることなく、アミン以外の表面反応性基が、ホスホリルコリンのオキシホスホロジクロロ誘導体や同様に活性化された他の分子と好適に反応できることを理解できるだろう。ヒドロキシルやチオール基（文献84〜87）が、このような表面の置換基の限定的でない二つの実例として挙げられる。反対に、本文において提示されたものに加えて、当業者に周知のように、ホスホリルコリンの活性化された形状を得るためには、異なる経路を追求してもよい。これらの付加的な活性化方法は、少なくとも一つの反応性のP−ハロゲン結合の形成を介して、ホスホリルコリンを直接的に活性化するべく、PCl3、PCl2、PBr5、PBr3、PI3、SOCl2、SOBr2、COCl2、COBr2、(COCl)2、(COBr)2といった試薬を使用することを含むが、それらに制限されない（文献87, 88）。
アンモニアプラズマ処理された補綴の大気中での貯蔵
・空気中での貯蔵時間の関数としての表面原子濃度
処理された補綴の表面における窒素の表面原子密度は、徐々に減少する傾向があり（14 %の初期値が、空気中での80日間の貯蔵後12 %へ、または0.3から0.2へのN/Cの減少）、また酸素の取り込みも観察される（O/Cは0.05から、20日後に0.3へ増加する）（文献43）。したがって、分子の移植はプラズマ処理後まもなく、好ましくは２時間以内に行われることが好ましい（文献45）。
・PRC移植されたePTFE表面
原子表面もまたXPS分光法により測定された。まず、サーベイスペクトルは、PRCの分子構造（塩素は、PRCのN(CH3)3+成分の対イオンとして存在する）から予期されたように、ほぼ同じ濃度のリンおよび塩素原子の取り込みがあることを示した。したがって、PRCの移植の程度は、XPSにより検出されたリンのパーセントから推定された。さらに、図７は、Ｎ 1sの高分解能XPSスペクトルが、402 eVのトリメチルアンモニウムのピーク（アンモニアプラズマ処理された補綴上には存在しないピーク）と補綴上に移植されたリンのパーセントとの間に良好な相関関係があることを明確に表している。事実、PRC移植の程度（%Pにより特徴づけられる）とトリメチルアンモニウムのピーク+N(CH3)3との間には、直線的な関係がある（図７）。トリメチルアンモニウム成分からの三つのメチル基の各々についてのC 1sピーク+N(CH3)3（示されず）も同様の傾向をたどり、PRCの表面上への好適な移植を示した。
【００５９】
PTFEフィルム上へのPRC移植はまた、静的SIMS（静的二次イオン質量分析法）によっても確証された。この方法では、表面に強力な一次粒子が当てられた時に放出される原子状または分子状の粒子の質量スペクトルを記録することにより、表面に吸収された分子を同定する。表面から放出された二次粒子は、最初の表面分子のフラグメンテーションの結果生じるものであり、イオン化された状態（正および負の状態）下でのみ検出される。ピークはダルトン（分子量−gmol-1）で示される。したがって、このようなスペクトルの分析から、表面に移植された分子の初期構造を決定することができる。
【００６０】
PRC移植されたPTFEフィルムのスペクトル（示されず）は、以下のフラグメントを示し、PRC移植を確証した。
【００６１】
【化４】
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【００６２】
III．  内表面修飾された血管補綴の滅菌
この表面修飾法が有用であるためには、滅菌により移植された分子が除去されないことが必要である。きわめて広く用いられる滅菌法は、高圧蒸気滅菌法である。少なくとも二つの可能な高圧蒸気滅菌法が考えられる：
1)  蒸気圧下での滅菌：120 ℃、15 PSI、20分間；および
2)  乾熱滅菌：短時間、高温（180 ℃、１時間）または、より低い温度でより長い持続時間（150 ℃、２時間）。
【００６３】
科学論文によれば、PRC誘導体は第１の滅菌処置にかけられた場合に安定である。さらにePTFE補綴は、より頻繁にこの方式で滅菌されている。この方法は病院により承認され用いられている。
【００６４】
試料のPRC移植フィルムおよび補綴を滅菌袋内に置き、密封した。滅菌マーカーである粘着テープの一片を、袋の上に置いた；この指標は滅菌が成功した場合に黒ずむ。滅菌処置に続き、試料補綴を、そのリン原子の組成および分布が変えられているかどうかを測定するために、XPSにより分析した。結果を以下の表１１にまとめた。
【００６５】
【表２】
2004524096.tif 000017
【００６６】
他ではそれが存在しないことから、表面上のPRC量であると考えられるリンの含有量（%）のわずかな減少が見られたものの、PRC移植は蒸気圧下の滅菌にかけられた場合に安定であることが明らかになり、また表面上の移植の分布も均一なままであった。表面濃度は６ヵ月後も安定であり、分布も均一なままであった（同じことが、別の補綴において、１および２ヵ月の時点について観察された）。したがって、病院により最も実行されている滅菌処置は、PRC処理された血管補綴上に移植された分子の質や分布を不利に修飾しないことが示された。
IV．  内表面を修飾された血管補綴のインビトロの検査
A.  アンモニアRFGDプラズマ処理された補綴の非毒性
アンモニアプラズマ処理された補綴の非毒性を確認するべく、本発明者らは、生体材料により細胞増殖が阻害されるかどうかを、DNAに特異的な着色剤（ヘキスト(Hoechst)）を用いることによって測定する拡散試験を行った。「抽出希釈法」としても知られる溶出試験もまた適用された；それは、生体材料の抽出物を探すことにより、細胞増殖の阻害があるかどうかを測定する方法である。
a)  拡散試験
臍帯に由来するヒトの内皮細胞を、24ウェルプレートで（1×104細胞／穴）、使用前に各々の穴をゼラチンにより前処理するよう注意して培養した。細胞は、10 %FBS、ヘパリン（90 g/ml）、L-グルタミン（2 mM）、ペニシリンG（100 I.U./ml）、硫酸ストレプトマイシン（100μg/ml）、アンホテリシンB（250 ng/ml）、およびECGF（20μg/ml）を含む199培地（Medium199）において増殖させるようにした。処理および未処理の補綴からの、直径７mmの円形の補綴試料を採取し、24ウェルに置いた。培養物を湿った大気中で、5 % CO2を用いて３日間インキュベートした。次に、培養物を洗浄、溶解し、ヘキスト（Hoechst）#33358で処理した後、最後に蛍光研究用にデザインされた別のプレートに移した。読み取りは、バイオテック（Bio-Tek）600蛍光光度計を用いて行い、DNAの量は検量線から計算した。同時に、細胞は補綴試料なしに穴内で培養された（対照）。
b)  溶出試験
一つは前処理された補綴から、他方は未処理の補綴から採取し、これら二つの試料を、M199中で７日間インキュベートした。終了24時間前に、内皮細胞を24穴プレートで培養した。７日目に、細胞を補綴と共に使用されたM199培地において培養された。（ここでは、拡散試験において行なわれたこととは対照的に、培地のみが用いられたことを特筆する必要がある；試料補綴装置は、インキュベーション期間の後に除去される。）内皮細胞を、拡散試験用のものと同様の条件下で３日間インキュベートし、同様の方法（蛍光光度法）で分析した。
【００６７】
表３は、未処理（未使用）の補綴、アンモニアプラズマ処理された補綴、および対照試料についての、拡散および溶出試験の結果を示している。（すべての実験はシリーズＡおよびＢの二回行なわれた。）これらの結果は、細胞増殖のレベルにおいては何ら有意な変化がないことを示している。したがって、アンモニアプラズマ処理されたePTFE血管補綴は、未処理のePTFE血管補綴以上の毒性がないことが結論づけられる。
【００６８】
【表３】
2004524096.tif 000018
【００６９】
・PRC移植された血管補綴の細胞毒性
上述のとおり、プラズマ処理後であって、分子固定化前の補綴について行なわれた毒性試験は、プラズマ処理された補綴が非毒性であるか、または少なくとも未使用の補綴以上に毒性ではないことを示した。論理的に考えて次の工程は、本発明のプロセスにより完全に処理された補綴もまた、細胞、特に天然に血管の内表面を裏打ちしている内皮細胞、に対して非毒性であるかを決定することであった。内皮細胞は目下、ある種の製品の毒性を確認するとともに、滅菌効率を確認する上で使用されている。細胞毒性試験では、補綴は内皮細胞とは直接接触せず、インキュベーション期間は37℃において３日間である。細胞増殖は、特定のマーカーを使用して、DNA鎖の蛍光により測定される。
【００７０】
細胞培養について、最良の統計学的平均値を得るために、試験を数回繰り返した。細胞に対するPRC移植の影響について、より良い判断を得るべく、未処理の補綴についても同様の試験が行われ、また、「対照」の細胞培養物も用られた。
【００７１】
図８のヒストグラムは、処理された補綴が、細胞増殖に対し、未処理の補綴以上に影響しないこと、および、いずれの補綴も細胞増殖に対して有意に影響しないことを明確に示している。したがって、本発明のプロセスにより処理された補綴は非細胞毒性であり、実質的に、内皮細胞の増殖にやや有利であると言える。内皮細胞が補綴の内表面を裏打ちしなければならないことを考えれば、これらの結果は有望である。
B)  血小板接着
・血小板の付着および凝集
血小板は凝固カスケードに関与しているため、血小板の補綴装置上への付着および凝集は、血液適合性に直接的な影響を及ぼす。事実、補綴の内表面への血小板の付着は、内皮細胞（天然の血管の裏打ち）の付着を妨げることがあり、蓄積が重大すぎる場合には、結果として血栓症を生じる恐れがある。
【００７２】
In vitro試験は、以下の方式により数回行なわれた。ヒトの血液を遠心分離した後、血小板に富む血漿を抽出し、37℃で１時間、補綴上に置いた。次いでSEMによる分析に先立ち、補綴を異なる溶液で処理した。
【００７３】
図９は、処理および未処理の補綴装置のSEM写真を表す。二つの写真を比較することにより、未処理の補綴が、本発明のプロセスを用いて処理された補綴よりも、有意により多くの血小板を蓄積および活性化していることが示される。したがって、処理された補綴は血小板の蓄積をはるかに効果的に予防するようである。
・血小板の定量化
ヒトの血液を遠心分離した後、血小板に富む血漿（血球計数器によるカウント5 x 104血小板／μl）を抽出し、51Crで放射線標識して、37℃で２時間補綴上に置いた。次いで、分析に先立ち補綴を無菌のPBSにより３回洗浄し、270〜370 keVに調整したガンマシンチレーションカウンターにより血小板取り込み量を判定した。この試験は、６人の提供者からのヒトの血液を用いて３回行なわれた（図１０）。
【００７４】
いずれの場合においても、未処理および処理された補綴について、付着した血小板には何らの有意差も見られなかった。
C)  好中球
好中球は、外来性物質に対する個体の炎症反応に特有である。
【００７５】
ヒト血液を遠心分離した後、白血球に富む懸濁液を抽出し、111Inで放射線標識して、37℃で２時間補綴上に置いた。次いで補綴を分析し、接着した好中球を、260〜480 keVに調整されたガンマシンチレーションカウンターにより判定した。この試験は、６人の異なる提供者からの血液を用いて３回行なわれた（図１１）。
【００７６】
各個体について、未処理の補綴上よりも、処理された補綴上の方が好中球の付着が少なかった。したがって、補綴上のPRC移植により炎症性反応が低減されたことが示された。
D)  凝固時間
生体材料への血小板の付着は、しばしば血液適合性の指標として用いられるが、より臨床的に関連があるのは、付着した血小板が凝血塊形成を促進することができるかどうかである。事実、凝固事象が凝固カスケードを触媒するためには、フィブリノーゲンなどの他の血液要素の存在が必要となる。より長い凝固時間は、血液と接触している補綴において、より良い血栓形成抵抗性の指標とされる。
【００７７】
正常なヒトの血液をクエン酸塩抗凝固管内に収集し、1 mlの試料を補綴の表面上に置いた。凝固時間は視覚的に測定した：血液が試料補綴を傾ける動きに反応した動きを示さなくなった時点で、凝固したとみなした。この試験は、未処理および処理された（PRC移植された）補綴について、６人のヒトの提供者からの血液を用いて３回行なわれた（図１２）。
【００７８】
図１２に見られるように、PRC移植された補綴については、凝固時間は有意に長かった。したがって、未処理の補綴に比べた場合、処理された補綴は血栓形成性がより少ないことが示された。
E)  トロンボエラストグラフィー
材料の血栓形成能についてのもう一つの重要な指標として、材料の表面上に生じる全血凝血塊の弾性特性の進化がある。血液と接触している任意の材料について、血栓形成性の指標は、凝固時間と凝血塊の弾性を考慮に入れる。良好な血液適合性をもつ表面では、トロンボエラストグラフィーにより測定される血栓形成指数が低くなければならない。この技術は、ピストンとキュベット内表面との間に１mmのクリアランス（すきま）を有しているキュベット内に置かれた鋼製のピストンを使用する。血液をキュベットの内側に置く。凝固が進むにつれ、生じる凝血塊の弾性が変化し、この変化が、ピストンを吊しているトーションワイヤにより検出される。これは電気信号に変換され、さらにチャートレコーダーに送られる。結果として得られたトレースは、トロンボエラストグラム（TEG）と呼ばれ、形成された凝血塊の弾性を記録する。この試験は、未処理および処理された補綴について、６人のヒトの提供者からの血液を用いて行なわれた（図１３）。
【００７９】
処理および未処理の補綴についての血栓形成能の指数を比較したところ、PRC移植された補綴についてより低い血栓形成能が示された。値は、値が30 %高かった一人を除いて、17から45 %低い範囲となった。したがって、処理された補綴は最初の材料の非血栓形成能を改善した。
F)  線維芽細胞の培養
天然の血液適合性表面である内皮が補綴表面で発育することにより、補綴がさらに血液適合性となるだろう。線維芽細胞は、分化が可能な細胞であり、in vitroの血液適合性試験においてしばしば使用されている。線維芽細胞の吸着を試験することにより、材料が、細胞の吸着および伸展のための素地として作用する能力を測定することができる。細胞の吸着および伸展は、内皮の発育に必要な条件を代表している。
【００８０】
異なる材料上で細胞が生育する能力を観察するため、線維芽細胞を補綴に直接接触するように置いた。細胞は、37℃において７日間増殖させた。次いで線維芽細胞を、二つの着色剤を用いて、顕微鏡により観察した：ヘキスト試薬により核を染色し（細胞が数えられるようにした）、ローダミンにより細胞質のアクチンフィラメントを染めた（細胞の形を測定できるようにした）。
【００８１】
図１４に示されるように、本発明の手法により処理された補綴の表面における線維芽細胞の発育は、未処理の補綴に比較して多いに増大した：核の数はより多く、線維芽細胞の形状はより伸展していることから、細胞が表面に付着しつつその上で発育することが示された。
G)  内皮細胞の培養
内皮細胞は、天然に血管の内表面を裏打ちする細胞である；したがって、それらは理想的な血液適合性の表面を構成する。内皮細胞は線維芽細胞よりも壊れやすく、感受性が高いことが知られていることから、この試験はさらに厳しいものである。内皮細胞は、線維芽細胞用に用いられたものと同じプロトコールに従って培養された。インキュベーション期間は37℃で３日間とした。内皮細胞の発育は、未処理のものよりも、本発明の手法により処理された補綴の上で多いに増大された。図１４は、内皮細胞の核をヘキスト試薬により染色した後の、光学顕微鏡像を示す。SEM（図１４）で観察されるように、細胞核の数は、細胞の広がりと同様に、処理された補綴上で明らかに重要となっている。
IV．  内表面を修飾された血管補綴のin vivoでの試験
AMBIOPATMで処理された補綴のin vivoでの反応は、イヌモデルにおいてテストされた。移植期間は１ヵ月間であり、６匹のイヌが補綴を受けた：３匹が、未処理のゴアテックス（Gore-TexTM）ePTFE補綴を受け、他の３匹はANBIOPATM処理された補綴を受けた。
・外科手術
（以下の処置は、一匹のイヌに関して記述されているが、試験に参加した６匹全てのイヌ対して用いられたものである。）
24時間の絶食の後、体重が20と25 kgの間にある条件を安定させた雑種犬に、硫酸アトロピン（0.05 mg/kg）およびマレイン酸アセプロマジン（0/1 mg/kg）の静脈内投与による前麻酔を施した。イヌの腹部を剃毛し、ヒビテン（Hibitane）およびプロビオジン（Proviodine）により消毒した。次に、イヌを臥位の姿勢で手術台に置き、ペントサール（Penthothal）(10 mg/kg）の静脈内投与により麻酔を施し、次いで空気とイソフランの混合物を通気して麻酔を維持するようにした。腹部切開の後、腎臓下の大動脈を定位し、側副動脈を結紮する前に周辺構造物を除去した。クランピングに先たち、抗凝固剤としてヘパリン（0.5 mg/kg）を注射した。大動脈を、大動脈−大動脈の位置にある５cmのセグメントの上流および下流でクランプし、このセグメントを、直径６mmの同じ長さの血管補綴（未処理の市販の補綴、またはANBIOPATM処理された補綴）を用いて、サージレン（SurgileneTM）モノフィラメントを用いた終末終末吻合術により置換した。イヌを縫合し、沈痛薬として酒石酸ブトルファノール（0.2 mg/kg）を、手術後３日間にわたり、皮下注射した。手術後、イヌには１ヵ月後の補綴の外植までは、標準的な食餌を与えた。
・画像分析
外植された補綴のSEM観察結果より、未処理の市販の補綴と、ANBIOPATM処理された補綴との間に、明らかな差異が示された（図１５）。低倍率では、ANBIOPATM処理された補綴の表面は、滑らかな表面を有し均一なままであり、ほとんど沈着物がない（図１５a）。高倍率でのさらなる観察により、赤血球の複数の層から成るコーティングが確認される（図15 c）。ANBIOPATM処理された補綴上に活性化された血小板およびフィブリン凝塊がないことから、抗血栓形成性の性質が示唆される。一方、未処理の市販の補綴は、低倍率において、表面上に重大な沈着物を示しており（図１５b）、沈着物は主に活性化された血小板から成るネットワークと、フィブリン凝塊に捕えられた赤血球から成り（図１５d）、したがって血栓形成の証拠を示している。
【００８２】
本発明は、その好ましい態様の例として説明されてきたが、それは、添付の特許請求の範囲において定義されるように、本件の発明の精神および性質から外れることなく、変更されてもよいものである。
【産業上の利用可能性】
【００８３】
【図面の簡単な説明】
【００８４】
【図１】本願発明の方法において用いられた高周波グロー放電（Radio Frequency Glow Discharge）処理システムの概略説明図である。
【図２】未処理のePTFE血管補綴の内側表面のXPSスペクトル、およびアンモニアプラズマ処理されたePTFE血管補綴の内側表面のXPSスペクトルを示す。
【図３】300ミリtorrのアンモニアにおいて、出力（20、40、および50W）および処理時間（10、120、および275秒間）を変えることにより、表面組成物に対して行なわれた処理への影響を示す。
【図４】チャンバー内の圧力とePTFE補綴表面の修飾との関係を示す。
【図５】表面について測定された窒素濃度と、N/CおよびF/C比を、アンモニアプラズマ処理時間の関数として示す。
【図６】プラズマ処理されたPTFEフィルムの、クロロベンズアルデヒドを用いた誘導反応を示す。
【図７】表面上に移植されたリンの原子表面濃度（%P）と、402 eVのNピークの強度との関係を示す。
【図８】特異マーカーを用いてＤＮＡ鎖の蛍光により測定された、未処理および処理された補綴、ならびに「対照」の細胞培養物による細胞増殖を示す。
【図９】（a）本願発明の方法により処理された補綴、および（b）未処理の補綴内の血小板の集合の度合を示すSEM顕微鏡写真である。
【図１０】未処理の、および処理された補綴上の接着性の血小板の定量結果を示す。
【図１１】未処理の、および処理された補綴上の接着性の好中球の定量結果を示す。
【図１２】未処理の、および処理された補綴上の血液凝固時間に対する影響を示す。
【図１３】未処理の、および処理された補綴の血栓形成指数に対する影響を示す。
【図１４】本願発明の方法により処理された補綴（(a)および(c)）および未処理の補綴（(b)および(d)）内における線維芽細胞の増殖を表す顕微鏡用スライド標本を示す。
【図１５】イヌモデルへの移植一ヵ月後の、ANBIOPATM処理された補綴および市販の未処理の補綴の20 Xおよび2000 Xの倍率におけるＳＥＭ像：ａ）ANBIOPATM処理、20 X；ｂ）未処理、20 X；ｃ）ANBIOPATM処理、2000 X；ｄ）未処理、2000 XX。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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