(57)【要約】新規ポリペプチドをコードする核酸配列が本明細書中で開示される。これらの核酸配列によってコードされるポリペプチド、このポリペプチドに免疫特異的に結合する抗体、ならびに前述のポリペプチド、ポリヌクレオチド、または抗体の誘導体、改変体、変異体またはフラグメントがまた、開示される。本発明は、これらの新規ヒト核酸およびタンパク質のいずれか１つに関連する障害の、治療剤、診断方法ならびに、診断、処置および予防のための研究方法を、さらに開示する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離されたポリペプチドであって、以下：
（ａ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２および／または３４からなる群より選択されるアミノ酸配列の成熟形態；
（ｂ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２および／または３４からなる群より選択されるアミノ酸配列の成熟形態の改変体であって、ここで、該改変体中の１以上のアミノ酸残基が、該成熟形態のアミノ酸配列と異なり、ただし、該改変体は、該成熟形態のアミノ酸配列と、そのアミノ酸残基のうちの１５％以下が異なる、改変体；
（ｃ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２および／または３４からなる群より選択されるアミノ酸配列；ならびに
（ｄ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２および／または３４からなる群より選択されるアミノ酸配列の改変体であって、ここで、該改変体中の１以上のアミノ酸残基が、該成熟形態のアミノ酸配列と異なり、ただし、該改変体は、該アミノ酸配列と、そのアミノ酸残基のうちの１５％以下が異なる、改変体；
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチド。
【請求項２】
請求項１に記載のポリペプチドであって、該ポリペプチドが、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２および／または３４からなる群より選択されるアミノ酸配列の天然に存在する対立遺伝子改変体のアミノ酸配列を含む、ポリペプチド。
【請求項３】
請求項２に記載のポリペプチドであって、ここで、前記対立遺伝子改変体が、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１および／または３３からなる群から選択される核酸配列と単一ヌクレオチドで異なる核酸配列の翻訳であるアミノ酸配列を含む、ポリペプチド。
【請求項４】
前記改変体のアミノ酸配列が、保存的アミノ酸置換含む、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項５】
単離された核酸分子であって、以下：
（ａ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２および／または３４からなる群から選択されるアミノ酸配列の成熟形態；
（ｂ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２および／または３４からなる群より選択されるアミノ酸配列の成熟形態の改変体であって、ここで、該改変体中の１以上のアミノ酸残基が、該成熟形態のアミノ酸配列と異なり、ただし、該改変体は、該成熟形態のアミノ酸配列と、そのアミノ酸残基のうちの１５％以下が異なる、改変体；
（ｃ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２および／または３４からなる群より選択されるアミノ酸配列；
（ｄ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２および／または３４からなる群より選択されるアミノ酸配列の改変体であって、ここで、該改変体中の１以上のアミノ酸残基が、該成熟形態のアミノ酸配列と異なり、ただし、該改変体は、該アミノ酸配列と、そのアミノ酸残基のうちの１５％以下が異なる、改変体；
（ｅ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２および／または３４からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドまたは該ポリペプチドの改変体の、少なくとも一部をコードする核酸フラグメントであって、ここで、該改変体中の１以上のアミノ酸残基が、該成熟形態のアミノ酸配列と異なり、ただし、該改変体は、該アミノ酸配列と、そのアミノ酸残基のうちの１５％以下が異なる、核酸フラグメント；ならびに
（ｆ）  （ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）または（ｅ）の相補体を含む、核酸分子、
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸配列を含む、単離された核酸分子。
【請求項６】
請求項５に記載の核酸分子であって、ここで、該核酸分子が天然に存在する対立遺伝子核酸改変体のヌクレオチド配列を含む、核酸分子。
【請求項７】
請求項５に記載の核酸分子であって、ここで、該核酸分子が、天然に存在するポリペプチド改変体のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする、核酸分子。
【請求項８】
請求項５に記載の核酸分子であって、ここで、該核酸分子が、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１および／または３３からなる群から選択される核酸配列と単一ヌクレオチドで異なる、核酸分子。
【請求項９】
請求項５に記載の核酸分子であって、ここで、該核酸分子が以下：
（ａ）配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１および／または３３からなる群より選択されるヌクレオチド配列；
（ｂ）配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１および／または３３からなる群より選択されるヌクレオチド配列と１つ以上のヌクレオチドで異なる、ヌクレオチド配列であって、ただし、そのヌクレオチドの２０％以下が、該ヌクレオチド配列と異なる、ヌクレオチド配列；
（ｃ）（ａ）の核酸フラグメント；ならびに
（ｄ）（ｂ）の核酸フラグメント；
からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む、核酸分子。
【請求項１０】
請求項５に記載の核酸分子であって、ここで、該核酸分子が、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１および／または３３からなる群より選択されるヌクレオチド配列または該ヌクレオチド配列の相補鎖にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、核酸分子。
【請求項１１】
請求項５に記載の核酸分子であって、該核酸分子は、以下：
（ａ）第１ヌクレオチド配列であって、前記アミノ酸配列をコードするコード配列と１以上のヌクレオチド配列で異なるコード配列を含み、ただし、該第１ヌクレオチド配列中のコード配列におけるヌクレオチドの２０％以下が、該コード配列と異なる、第１ヌクレオチド配列；
（ｂ）該第１ポリヌクレオチドの相補体である、単離された第２ポリヌクレオチド；ならびに
（ｃ）（ａ）または（ｂ）の核酸フラグメント；
からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む、核酸分子。
【請求項１２】
請求項１１に記載の核酸分子を含む、ベクター。
【請求項１３】
前記核酸分子に作動可能に連結されたプロモーターをさらに含む、請求項１２に記載のベクター。
【請求項１４】
請求項１２に記載のベクターを含む、細胞。
【請求項１５】
請求項１に記載のポリペプチドに免疫特異的に結合する、抗体。
【請求項１６】
前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項１５に記載の抗体。
【請求項１７】
前記抗体がヒト化抗体である、請求項１５に記載の抗体。
【請求項１８】
サンプル中の請求項１に記載のポリペプチドの存在または量を決定するための方法であって、該方法は、以下：
（ａ）該サンプルを提供する工程；
（ｂ）該サンプルを、該ポリペプチドに免疫特異的に結合する抗体と接触させる工程；および
（ｃ）該ポリペプチドに結合した抗体の存在または量を決定して、それによって該サンプル中のポリペプチドの存在または量を決定する工程、
を包含する、方法。
【請求項１９】
サンプル中の請求項５に記載の核酸分子の存在または量を決定するための方法であって、該方法は、以下：
（ａ）該サンプルを提供する工程；
（ｂ）該サンプルを、該核酸分子に結合するプローブと接触させる工程；および
（ｃ）該核酸分子に結合した該プローブの存在または量を決定して、それによって該サンプル中の該核酸分子の存在または量を決定する工程、
を包含する、方法。
【請求項２０】
請求項１に記載のポリペプチドに結合する因子を同定する方法であって、該方法は、以下：
（ａ）該ポリペプチドを該因子と接触させる工程；および
（ｂ）該因子が該ポリペプチドに結合するか否かを決定する工程；
を包含する、方法。
【請求項２１】
請求項１に記載のポリペプチドの発現または活性を調節する因子を同定するための方法であって、該方法は、以下：
（ａ）該ポリペプチドを発現する細胞を提供する工程；
（ｂ）該因子と該細胞とを接触させる工程；および
（ｃ）該因子が、該ポリペプチドの発現または活性を調節するか否かを決定する工程、
を包含し、それによって、該ペプチドの発現または活性における変化が、外因子の該ポリペプチドの発現または活性の調節を示す、方法。
【請求項２２】
請求項１に記載のポリペプチドの活性を調節するための方法であって、該方法は、請求項１に記載のポリペプチドを発現する細胞サンプルを、該ポリペプチドの活性を調節するのに十分な量で、該ポリペプチドに結合する化合物とを接触させる工程を包含する、方法。
【請求項２３】
ＮＯＶＸ関連障害を処置または予防する方法であって、該方法は、そのような処置または予防が所望される被験体に、該被験体における該ＮＯＶＸ関連障害を処置または予防するに十分な量で、請求項１に記載のポリペプチドを投与する工程を包含する、方法。
【請求項２４】
前記被験体がヒトである、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
ＮＯＶＸ関連障害を処置または予防する方法であって、該方法は、そのような処置または予防が所望される被験体に、該被験体における該ＮＯＶＸ関連障害を処置または予防するに十分な量で、請求項５に記載の核酸を投与する工程を包含する、方法。
【請求項２６】
前記被験体がヒトである、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
ＮＯＶＸ関連障害を処置または予防する方法であって、該方法は、そのような処置または予防が所望される被験体に、該被験体における該ＮＯＶＸ関連障害を処置または予防するに十分な量で、請求項１５に記載の抗体を投与する工程を包含する、方法。
【請求項２８】
前記被験体がヒトである、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
請求項１に記載のポリペプチドおよび薬学的に受容可能なキャリアを含有する、薬学的組成物。
【請求項３０】
請求項５に記載の核酸分子および薬学的に受容可能なキャリアを含有する、薬学的組成物。
【請求項３１】
請求項１５に記載の抗体および薬学的に受容可能なキャリアを含有する、薬学的組成物。
【請求項３２】
請求項２９に記載の薬学的組成物を１つ以上の容器に含む、キット。
【請求項３３】
請求項３０に記載の薬学的組成物を１つ以上の容器に含む、キット。
【請求項３４】
請求項３１に記載の薬学的組成物を１つ以上の容器に含む、キット。
【請求項３５】
ヒト疾患に関連する症候群を処置するための医薬品の製造における治療剤の使用であって、該疾患は、ＮＯＶＸ関連障害から選択され、ここで、該治療剤は、ＮＯＶＸポリペプチド、ＮＯＶＸ核酸、およびＮＯＶＸ抗体からなる群より選択される、使用。
【請求項３６】
ＮＯＶＸ関連障害の活性もしくは潜伏のモジュレータまたはＮＯＶＸ関連障害の素因についてスクリーニングする方法であって、該方法は、以下：
（ａ）ＮＯＶＸ関連疾患について増大した危険にされされている試験動物に対して、試験化合物を投与する工程であって、ここで、該試験動物は、請求項１に記載のポリペプチドを組換え可能に発現する、工程；
（ｂ）工程（ａ）の化合物を投与する工程の後に、該試験動物における該ポリペプチドの活性を測定する、工程；
（ｃ）該ポリペプチドが投与されていないコントロール動物における該ポリペプチドの活性と、該試験動物における該タンパク質の活性を比較する工程であって、ここで、該コントロール動物と比較した場合の該第１の試験動物における該ポリペプチドの活性における変化が、該試験化合物がＮＯＶＸ関連疾患の潜伏のモジュレータまたはＮＯＶＸ関連疾患の素因を示す、工程
を包含する、方法。
【請求項３７】
請求項３６に記載の方法であって、ここで、前記試験動物が組換え試験動物であり、該組換え試験動物は試験タンパク質導入遺伝子を発現するか、野生型試験動物と比較して増大したレベルでプロモーターの制御下において該導入遺伝子を発現し、そして、ここで該プロモーターが該導入遺伝子のネイティブ遺伝子プロモーターではない、方法。
【請求項３８】
第１の哺乳動物被験体における請求項１に記載のポリペプチドの変化したレベルと関連する疾患の存在または該疾患に対する素因を決定するための方法であって、該方法は、以下：
（ａ）該第１の哺乳動物被験体由来のサンプル中の該ポリペプチドの発現レベルを測定する工程；および
（ｂ）工程（ａ）のサンプル中の該ポリペプチドの量を、該疾患を有さないことが既知であるか、または該疾患にかかりにくいことが既知の、第２の哺乳動物被験体由来のコントロールサンプル中に存在する該ポリペプチドの量と、比較する工程、
を包含し、ここで、該コントロールサンプルと比較した場合の該第１の被験体における該ポリペプチドの発現レベルにおける変化が、疾患の存在または該疾患に対する素因を示す、方法。
【請求項３９】
第１の哺乳動物被験体における請求項５に記載の核酸分子の変化したレベルと関連する疾患の存在または該疾患に対する素因を決定するための方法であって、該方法は、以下：
（ａ）該第１の哺乳動物被験体由来のサンプル中の該核酸の量を測定する工程；および
（ｂ）工程（ａ）のサンプル中の該核酸の量を、該疾患を有さないことが既知であるかまたは該疾患にかかりにくいことが既知の、第２の哺乳動物被験体由来のコントロールサンプル中に存在する該核酸の量と比較する工程、
を包含し、ここで、該コントロールサンプルと比較した場合の、該第１の被験体における該核酸のレベルにおける変化が、該疾患の存在または該疾患に対する素因を示す、方法。
【請求項４０】
哺乳動物において病理学的状態を処置する方法であって、該方法は、該病理状態を緩和するに十分な量でポリペプチドを該哺乳動物に投与する工程を包含し、ここで、該ポリペプチドが、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２および／または３４のうちの少なくとも１つのアミノ酸配列を含むポリペプチドまたはそれらの生物学的に活性なフラグメントと、少なくとも９５％同一なアミノ酸配列を有するポリペプチドである、方法。
【請求項４１】
哺乳動物において病理学的状態を処置する方法であって、該方法は、該病理学的状態を緩和するに十分な量で請求項１５に記載の抗体を該哺乳動物に投与する工程を包含する、方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、ポリヌクレオチドおよびこのようなポリヌクレオチドにコードされたポリペプチド、ならびにポリペプチドおよびポリヌクレオチドを産生するためのベクター、宿主細胞、抗体、および組換え方法、ならびにこれらを使用する方法に関する。
【０００２】
（発明の背景）
本発明は、一部、タンパク質をコードする核酸に基づき、このタンパク質は、以下のタンパク質ファミリーの新しいメンバーである：カルパイン様、エプシン（Ｅｐｓｉｎ）様、低密度リポタンパク質Ｂ様、プリンレセプター様、ＣＧ８８４１様、シナプトタグミン様、セリンプロテアーゼＴＬＳＰ様、グリプカン２前駆体様、マイトジェン活性化プロテインキナーゼキナーゼ様、ジンクフィンガータンパク質２７６Ｃ２Ｈ２型タンパク質およびサイモシンβ１０様。より詳細には、本発明は、新規のポリペプチドをコードする核酸、ならびにこれらの核酸およびポリペプチドを産生するためのベクター、宿主細胞、抗体、および組換え方法に関する。
【０００３】
カルパインは、カルシウムによって調節される細胞内システインプロテアーゼである。これらは、多くの細胞内プロセス、例えば、アポトーシス、タンパク質プロセシング、細胞分化、代謝などに関与することが知られている。このように、病態生理学におけるこれらの役割は、組織の再構築および再生（眼、脳、脊髄、腎臓などにおける種々の損傷モデルに関し）、受胎能、腫瘍形成、およびミオパシーに及ぶが、これらに限定されない。ＩＩ型糖尿病に対する感受性において同定された遺伝子のひとつは、カルパイン（カルパイン−１０）である（Ｈｏｒｉｋａｗａら、Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ  ２６（２）：１６３−７５、２０００）。この遺伝子の中の多型性は、インシュリン抵抗性と相関する。治療標的化カルパインは、白内障、脊髄損傷、アルツハイマー病、筋ジストロフィー、音響外傷、糖尿病、癌、学習障害および記憶障害ならびに不妊症のような疾患領域と関連する。種々のカルパインのノックアウトモデルおよびトランスジェニックモデルもまた、多くの細胞プロセスおよび疾患プロセスにおけるこのファミリーのプロテアーゼの潜在的な役割を示す。
【０００４】
エプシンは、Ｅｐｓ１５のようなＥＮＴＨドメインタンパク質に結合するタンパク質のファミリーである。これらは、クラスリン媒介性エンドサイトーシスならびに細胞内タンパク質選別（ｓｏｒｔｉｎｇ）に関与する。このファミリーのいくつかのメンバーは、有糸分裂の間にリン酸化を受ける。さらに、エプシンは、神経伝達物質含有小胞の分泌を補うための、シナプスでのエンドサイトーシスに関与する。エプシン１と転写因子（前骨髄球白血病ジンクフィンガータンパク質）との相互作用が、最近実証され、これは、エンドサイトーシスの機構が核の機能とクロストークし得る可能性を高めた。エプシン機能の混乱は、引き続く副作用を伴う膜レセプターならびにトランスフェリンのような分泌タンパク質のエンドサイトーシスの欠損を導く。エプシンの欠損は、異常な細胞−細胞シグナル伝達、発生の欠陥、異常な神経伝達物質シグナル伝達などを強力に導き得る。
【０００５】
低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）粒子は、循環における主要なコレステロールのキャリアであり、その生理学的な機能は、コレステロールを細胞に運搬することである。アテローム発生の過程において、これらの粒子は、修飾され、そして動脈壁に蓄積する。低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）に結合した血清コレステロールの増加は、家族性高コレステロール血症の特徴である。冠状動脈疾患を有する個体は、冠状心疾患を有さない個体より有意に高い平均リポタンパク質濃度を有し、このことは、リポタンパク質の測定が、家族性高コレステロール血症を有する個体において冠状心疾患の危険性を予測する助けとなり得る。
【０００６】
多くの細胞は、プリンレセプターと名付けられた、細胞外分子に対する原形質膜レセプターを発現し、これは原形質膜孔と共役しているようである。プリンレセプターは、原始的であり、広範囲にわたりそして多くの異なるシステムを提供する。プリンレセプターには、いくつかのサブクラスがある；アデノシンに対するレセプター（Ｐ１−プリンレセプター）およびＡＴＰに対するレセプター（Ｐ２−プリンレセプター）。他の主要な伝達物質（例えば、アセチルコリン、ＧＡＢＡ、グルタミン酸および５−ＨＴ）に関してと同様、２つの主要なファミリーのレセプターは、ＡＴＰによって活性化され、一方（Ｐ２Ｘ−プリンレセプターファミリー）は、リガンド型イオンチャネルを通して速い応答を媒介するが、他方（Ｐ２Ｙ−プリンレセプターファミリー）はＧ−タンパク質を介してより遅い応答を媒介する。
【０００７】
シナプトタグミン（Ｓｙｔ）は、脳特異的Ｃａ２＋／リン脂質結合型タンパク質である（Ｌｉら、Ｎａｔｕｒｅ  ３７５（６５３２）：５９４−９、１９９５）。海馬のシナプスにおいて、Ｓｙｔ  Ｉは、速いＣａ（２＋）依存性シナプス小胞エキソサイトーシスに重要であるが、Ｃａ（２＋）非依存性エキソサイトーシスには重要ではない。従って、脊椎動物および無脊椎動物において、Ｃａ（２＋）が誘発する速い神経伝達物質の放出の最終工程においてＣａ２＋センサーとして働くことによってか、またはさらなるＣａ２＋センサーと共同して働くことによってかのいずれかでＳｙｔは、Ｃａ（２＋）依存性シナプス膜融合に関与し得る。Ｓｙｔ  ＩがＣａ２＋をを結合するが（参考文献１０、１１）、そのリン脂質結合は、エキソサイトーシスのために要求される濃度より低いカルシウム濃度（ＥＣ５０＝３〜６μＭ）において誘発される。さらに、Ｓｙｔは、高い親和性でクラスリン−ＡＰ２を結合し、このことは、これらが調節されたエキソサイトーシスにおいて特定の機能に限定されるのではなく、エンドサイトーシスにおいて一般的な役割を果たし得ることを示す。ここで本発明者らは、４つのＳｙｔ（これらの中の３つ（Ｓｙｔ  ＶＩ、ＶＩＩ、およびＶＩＩＩ）は、非神経組織において広範に発現される）を記載することによって、この明白な矛盾を解決する。全ての試験されるＳｙｔは、２つのＣ２ドメイン（これは、クリスタリン−ＡＰ２（Ｋｄ＝０．１〜１．０ｎＭ）ならびに神経性および非神経性シンタキシンと相互作用する）からなる細胞質領域を有する、共通のドメイン構造を共有する。Ｓｙｔ  Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＶおよびＶＩＩ（しかし、ＩＶも、ＶＩもＶＩＩＩも含まない）の第１のＣ２ドメインは、同様のＣａ２＋濃度依存性（ＥＣ５０＝３〜６μＭ）でリン脂質を結合する。同一のＣ２ドメインはまた、Ｃａ２＋の関数としてシンタキシンと結合するが、Ｓｙｔ  Ｉ、ＩＩおよびＶのＣａ（２＋）濃度依存性（＞２００μＭ）は、Ｓｙｔ  ＩＩＩおよびＶＩＩの濃度依存性（＜１０μＭ）とは異なる。
【０００８】
その触媒活性においてセリンを利用するタンパク質分解酵素は、遍在し、ウイルス、細菌および真核生物において見出される。これらは、広範なペプチダーゼ活性を（エキソペプチダーゼ活性、エンドペプチダーゼ活性、オリゴペプチダーゼ活性、およびオメガペプチダーゼ活性を含む）を含む。２０を越えるセリンプロテアーゼのファミリー（Ｓ１〜Ｓ２７で示される）が、同定されており、これらは、構造的な類似性および他の機能的な証拠に基づいて６つの族（ｃｌａｎ）（ＳＡ、ＳＢ、ＳＣ、ＳＥ、ＳＦおよびＳＧ）にグループ分けされる。４つの族（ＳＡ、ＳＢ、ＳＣおよびＳＥ）について構造が知られている：これらは全く無関係のようであり、少なくとも４つの、ことによるともっと多くのセリンペプチダーゼの進化的な起源を示唆する。その進化的起源の違いにもかかわらず、いくつかのペプチダーゼの反応機構には類似性が存在する。キモトリプシン族、サブチリシン族およびカルボキシペプチダーゼＣ族は、セリン、アスパラギン酸およびヒスチジンが共通する触媒的三つ組を持つ：セリンは、求核部位として作用し、アスパラギン酸は、求電子部位として作用し、そしてヒスチジンは、塩基として作用する。タンパク質の折り畳みの相違にもかかわらず、触媒残基の幾何学的な配置は、ファミリーの間で類似である。触媒残基の直線的な配列は、普通、族の関係を反映する。例えば、キモトリプシン族（ＳＡ）における触媒的三つ組は、ＨＤＳの順であるが、サブチリシン族（ＳＢ）においてはＤＨＳ、およびカルボキシペプチダーゼ族（ＳＣ）においては、ＳＤＨの順である。
【０００９】
グリピカンは、硫酸ヘパランプロテオグリカンのファミリーであり、グリコシルホスファチジルイノシトール修飾を介して原形質膜につながれている。これまでに同定された６つのグリピカン遺伝子は、マウスにおいて別個の発生的パターンおよび組織発現パターンを示す。グリピカンはまた、潜在的にタンパク分解によって膜から分泌され得、そしてこの可溶性タンパク質は、潜在的にインタクトなタンパク質のドミナントネガティブなインヒビターとして作用する。このファミリーのタンパク質は、神経の発達、ガイダンスおよび再生に関与する。従って、このファミリーのタンパク質は、シナプス可塑性における役割を有し得る。Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａにおけるグリピカン遺伝子の１つは、ウイングレス（ｗｉｎｇｌｅｓｓ）およびデカペンタプレジック（ｄｅｃａｐｅｎｔａｐｌｅｇｉｃ）シグナル伝達経路に関与する。マウスでのグリピカン−３の欠損は、先天性の異常増殖症候群（ｃｏｎｇｅｎｉｔａｌ  ｏｖｅｒｇｒｏｗｔｈ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）を導く。ヒトにおいては、グリピカン−３遺伝子に関与する欠失および転座は、Ｘ−連鎖劣性巨人症症候群に関連する。さらに、このタンパク質の発現は、悪性中皮腫のインビトロモデルでは抑止される。従って、この新規タンパク質は、組織の形態発生およびパターン形成、細胞分裂および細胞シグナル伝達において役割を果たし得る。
【００１０】
マイトジェン活性化プロテインキナーゼキナーゼ（ＭＡＰＫＫ）は、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）をリン酸化および活性化する、二重特異的（ｄｕａｌ−ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ）プロテインキナーゼである。ＭＡＰＫＫ、ＭＡＰＫＫ１およびＭＡＰＫＫ２（ＭＥＫ１およびＭＥＫ２としても知られている）の２つのアイソフォームをコードするｃＤＮＡは、哺乳動物細胞においてクローン化された（Ｍｏｒｉｇｕｃｈｉら、Ｅｕｒ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ２３４（１）：３２−８、１９９５）。マイトジェン活性化プロテインキナーゼキナーゼ１（ＭＡＰＫＫ１）およびＭＡＰＫＫ２は、細胞増殖および細胞分化に影響するシグナル伝達経路において癌原遺伝子産物Ｒａｆの下流で機能する。これらのアイソフォームは、２つの重要な方法によって差示的に調節されることが示されてきた：ＭＡＰＫＫ１（しかしＭＡＰＫＫ２は違う）は、サイクリン依存性キナーゼｐ３４ｃｄｃ２によってリン酸化され、そして不活性化され；そしてｐ２１ＲａｓはＲａｆ／ＭＡＰＫＫ１との（しかしＲａｆ／ＭＡＰＫＫ２はではない）３成分の複合体を形成した（Ｍａｎｓｏｕｒら、Ｃｅｌｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｄｉｆｆｅｒ  ７（２）：２４３−５０、１９９６）。マウスの組織の研究において、ＭＡＰＫＫ１は、脳の中で高度に富化されるが、ＭＡＰＫＫ２は、比較的一様に存在することが示された。両方のアイソフォームは、細胞質に存在し、ともに神経増殖因子（ＮＧＦ）および上皮増殖因子（ＥＧＦ）に応答して活性化されることが示された（Ｍｏｒｉｇｕｃｈｉら、Ｅｕｒ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ２３４（１）：３２−８、１９９５）。
【００１１】
驚くべき数のｃＤＮＡクローンが、ジンクフィンガーコンセンサスドメインに一致する１つ以上の配列を含むタンパク質をコードし、このことはジンクフィンガータンパク質は、真核生物におけるＤＮＡ結合タンパク質のおそらく最も大きいクラスの代表であること、そしてジンクフィンガータンパク質に制御される遺伝子の発現は、発生ならびに他のプロセスの基本的な局面であり得ることを示している。ジンクフィンガーモジュールの構造的に異なるクラスターは、脊椎動物において数百の、おそらくは数千の異なるメンバーを有する、非常に広範な核酸結合タンパク質のスーパーファミリーを規定する。Ｃ２Ｈ２型ジンクフィンガータンパク質（ＺＦＰ）は、ジンクフィンガーモジュールの最も複雑なメンバーの１つである（Ｐｉｅｌｅｒら、Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  Ｒｅｐ  ２０（１）：１−８、１９９４およびＢｅｒｇら、Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｃｈｅｍ  １９：４０５−２１、１９９０）。
【００１２】
β−サイモシンは、元々仔ウシの胸腺から単離された、構造的に関連する、高度に保存された酸性ポリペプチドのファミリーを含む。多くのペプチドがこのファミリーに属す。このファミリーは、サイモシンβ４（これは胸腺のホルモンとして最初に単離され、そしてターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼを誘導した小ポリペプチドである）、ウシおよびブタにおけるサイモシンβ９（およびβ８）、ヒトおよびラットにおけるサイモシンβ１０、マス（ｔｒｏｕｔ）におけるサイモシンβ１１およびβ１２ならびにヒトＮｂサイモシンβが挙げられる。これらは、胸腺および脾臓において大量に見出されたが、多くの組織にも広く分布する。これらは、アクチンモノマーに結合することが示され、従ってアクチンの重合を阻害する。
【００１３】
サイモシンβ１０は、保存された小さい酸性タンパク質であり、アクチンの重合の阻害に関与する。サイモシンβ１０の発現は、インビトロおよびインビボの両方で、甲状腺細胞の成長を刺激する細胞外シグナルによって調節されることが、研究により実証され、このことは、濾胞細胞（ｆｏｌｌｉｃｕｌａｒ  ｃｅｌｌ）の増殖によって特徴付けられる甲状腺の疾患におけるこのタンパク質の役割を示唆する（１０３６６４１６）。他の研究は、サイモシンβ１０が、ラットの甲状腺形質転換細胞株ならびにヒト甲状腺癌組織および癌細胞株において過剰発現されることを実証した。この証拠は、サイモシンβ１０の検出が、いくつかのヒト新生物形成の診断のための潜在的なツールとして考慮され得ることを示唆する（１０４８７８３７）。
【００１４】
（発明の要旨）
本発明は、一部新規のポリペプチドをコードする核酸配列の発見に基づく。この新規の核酸およびポリペプチドを、本明細書において、ＮＯＶＸ、またはＮＯＶ１、ＮＯＶ２、ＮＯＶ３、ＮＯＶ４、ＮＯＶ５、ＮＯＶ６、ＮＯＶ７、ＮＯＶ８、ＮＯＶ９、ＮＯＶ１０およびＮＯＶ１１の核酸およびポリペプチドという。これらの核酸およびポリペプチド、ならびにその誘導体、ホモログ、アナログ、およびフラグメントを、本明細書において以降は、総称して「ＮＯＶＸ」核酸配列または「ＮＯＶＸ」ポリペプチド配列と称する。
【００１５】
１つの局面において、本発明は、ＮＯＶＸポリペプチドをコードする単離されたＮＯＶＸ核酸分子を提供し、これは、配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、および３３に開示される核酸に対して同一性を有する核酸配列を含む。いくつかの実施形態において、このＮＯＶＸ核酸分子は、ＮＯＶＸ核酸配列のタンパク質コード配列を含む核酸分子に相補的な核酸配列に、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする。本発明はまた、ＮＯＶＸポリペプチド、あるいはそのフラグメント、ホモログ、アナログまたは誘導体をコードする、単離された核酸を含む。例えば、この核酸は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２および３４のアミノ酸配列を含むポリペプチドに対して少なくとも８０％同一であるポリペプチドをコードし得る。この核酸は、例えば、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、および３３のいずれかの核酸配列を含む、ゲノムＤＮＡフラグメントまたはｃＤＮＡ分子であり得る。
【００１６】
オリゴヌクレオチド（例えば、ＮＯＶＸ核酸（例えば、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、および３３）の少なくとも６個連続するヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドまたはそのオリゴヌクレオチドの相補体）もまた、本発明に含まれる。実質的に精製されたＮＯＶＸポリペプチド（配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２および３４）もまた、本発明に含まれる。特定の実施形態において、このＮＯＶＸポリペプチドは、ヒトＮＯＶＸポリペプチドのアミノ酸配列に実質的に同一であるアミノ酸配列を含む。
【００１７】
本発明はまた、ＮＯＶＸポリペプチド、あるいはそれらのフラグメント、ホモログ、アナログまたは誘導体に免疫選択的に結合する抗体を特徴とする。
【００１８】
別の局面において、本発明は、治療有効量または予防有効量の治療剤および薬学的に受容可能なキャリアを含む、薬学的組成物を包含する。この治療剤は、例えば、ＮＯＶＸ核酸、ＮＯＶＸポリペプチド、またはＮＯＶＸポリペプチドに特異的な抗体であり得る。さらなる局面において、本発明は、１以上の容器中に、この薬学的組成物の治療有効量または予防有効量を含む。
【００１９】
さらなる局面において、本発明は、ポリペプチドを産生する方法を包含し、この方法は、ＮＯＶＸ核酸を含む細胞を、このＤＮＡによってコードされるＮＯＶＸポリペプチドの発現を可能にする条件下で培養することによる。所望の場合、次いで、このＮＯＶＸポリペプチドを回収し得る。
【００２０】
別の局面において、本発明は、サンプル中のＮＯＶＸポリペプチドの存在を検出する方法を包含する。この方法において、サンプルを、このポリペプチドに選択的に結合する化合物と、このポリペプチドとこの化合物との間での複合体の形成を可能にする条件下で接触させる。この複合体は、存在するならば、検出され、それによって、このサンプル中のＮＯＶＸポリペプチドを同定する。
【００２１】
本発明はまた、ＮＯＶＸの発現に基づいて特定の細胞型または組織型を同定するための方法を包含する。
【００２２】
サンプル中のＮＯＶＸ核酸分子の存在を検出する方法もまた本発明に包含され、この方法は、このサンプルに、ＮＯＶＸ核酸プローブまたはプライマーを接触させ、そしてこの核酸プローブまたはプライマーが、このサンプル中のＮＯＶＸ核酸分子に結合したか否かを検出することによる。
【００２３】
さらなる局面において、本発明は、ＮＯＶＸポリペプチドの活性を調節するための方法を提供し、この方法は、このＮＯＶＸポリペプチドを含む細胞サンプルに、このＮＯＶＸポリペプチドに結合する化合物を、このポリペプチドの活性を調節するに十分な量の接触させることによる。この化合物は、例えば、本明細書中にさらに記載されるような、低分子（例えば、核酸、ペプチド、ポリペプチド、ペプチド模倣物、炭水化物、脂質または他の有機（炭素含有）分子または無機分子）であり得る。
【００２４】
以下を含む障害または症候群を処置または予防するための医薬の製造における治療薬の使用はまた、本発明の範囲内に包含される：例えば、フォン・ヒッペル−リンダウ症候群（ＶＨＬ）症候群、肝硬変、移植障害、膵炎、肥満、糖尿病、自己免疫疾患、腎動脈狭窄症、間隙性腎炎、糸球体腎炎、多発性嚢胞腎疾患、全身性エリスマトーデス、尿細管性アジドーシス、ＩｇＡ腎症、高カルシウム血症、レッシュ−ナイハン症候群、発育欠陥（ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  ｄｅｆｅｃｔ）、白内障、脊髄損傷（ｓｐｉｎａｌ  ｃｏｒｄ  ｉｎｊｕｒｙ）、アルツハイマー病、筋ジストロフィー、音響外傷（ａｃｏｕｓｔｉｃ  ｔｒａｕｍａ）、癌、学習障害および記憶障害、不妊症、心筋症、アテローム硬化症、高血圧症、先天性心欠損、大動脈狭窄症、房室管欠陥、動脈管、肺動脈弁狭窄症、大動脈弁下部狭窄症、心室中隔欠損症、弁疾患（ｖａｌｖｅ  ｄｉｓｅａｓｅ）、結節硬化症、強皮症、心宮内膜症、血友病、凝固能亢進、特発性血小板減少性紫斑病、免疫欠損、対宿主性移植片病、痴呆、発作、パーキンソン病、ハンティングトン病、脳性小児麻痺、てんかん、多発性硬化症、毛細血管拡張性運動失調、白質萎縮症、行動障害（ｂｅｈａｖｉｏｒａｌ  ｄｉｓｏｒｄｅｒ）、嗜癖、不安、疼痛、神経変性、家族性高コレステロール血症、高リポ蛋白血症ＩＩ表現型、腱黄色性、角膜弓（ｃｏｒｎｅａｌ  ａｒｃｕｓ）、冠状動脈疾患、平面黄色腫（ｐｌａｎａｒ  ｘａｎｔｈｏｍａｓ）、水掻き指（ｗｅｂｂｅｄ  ｄｉｇｉｔｓ）、高コレステロール血症、受胎能、黄色腫症、Ｃ型肝炎感染、ＬＤＬレセプターの調節、合成、輸送、再利用または代謝回転、皮質下梗塞および白質脳症を有する大脳動脈症、骨端形成異常、多発性１（ｍｕｌｔｉｐｌｅ  １）、魚鱗癬、非層状（ｎｏｎｌａｍｅｌｌａｒ）および非紅皮症（ｎｏｎｅｒｙｔｈｒｏｄｅｒｍｉｃ）、先天性の、白血病、Ｔ細胞急性リンパ芽球腫、偽性軟骨形成不全症、ＳＣＩＤ、常染色体劣性、Ｔ−ネガティブ／Ｂ−ポジティブ型、Ｃ３欠損症、真性糖尿病、インシュリン抵抗性、黒色表皮肥厚症を伴う、グルタル酸性尿症（ｇｌｕｔａｒｉｃａｃｉｄｕｒｉａ）、Ｉ型、甲状腺機能低下不全症、先天性、妖精症、脂肪肉腫、ムコリピドーシスＩＶ、ミュラー管開存症、Ｉ型、Ｒａｂｓｏｎ−Ｍｅｎｄｅｎｈａｌｌ症候群、甲状腺癌腫、非髄質、好酸性細胞を伴う、赤血球増加症、家族性、マラリア、大脳の、被感受性（ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ  ｔｏ）、不完全（ｄｅｆｅｃｔｉｖｅ）トロンボキサンＡ２レセプターに起因する出血障害、小脳性運動失調、ケーマン型（Ｃａｙｍａｎ  ｔｙｐｅ）、痙攣、家族性の発熱（ｆａｍｉｌｉａｌ  ｆｅｂｒｉｌｅ）、２、循環性造血（Ｃｙｃｌｉｃ  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｓｉｓ）、フコシルトランスフェラーゼ−６欠損症、ＧＡＭＴ欠損症、肝硬変、乾癬、光線性角化症、結節硬化症、挫瘡、毛髪の成長（ｈａｉｒ  ｇｒｏｗｔｈ）、アロペシア（ａｌｌｏｐｅｃｉａ）、色素沈着障害、内分泌障害、外傷、免疫学的疾患、呼吸性疾患、胃腸の疾患、生殖に関する健康、神経学的疾患、骨髄移植、代謝疾患および内分泌疾患、アレルギーおよび炎症、腎臓学的障害（ｎｅｐｈｒｏｌｏｇｉｃａｌ  ｄｉｓｏｒｄｅｒ���、造血障害、泌尿器系障害、アトピー；骨粗しょう症−偽性神経膠腫症候群；Ｓｍｉｔｈ−Ｌｅｍｌｉ−Ｏｐｉｔｚ症候群Ｉ型；Ｓｍｉｔｈ−Ｌｅｍｌｉ−Ｏｐｉｔｚ症候群、ＩＩ型；色素性乾皮症、Ｅ群（ｇｒｏｕｐ  Ｅ）、亜型２；ぜん息、アトピー性の、被感受性；真性糖尿病、インシュリン依存性、４；ＩＤＤＭに感受性である；血管性水腫、遺伝性；パラガングリオーマ、家族性非クロム親和性、２；神経保護；ランバート−イートン筋無力症症候群、消化器系障害、プロテアーゼ／プロテアーゼインヒビター欠陥障害の全てもしくはいくつか、真性糖尿病非インシュリン依存性、アシルＣｏＡデヒドロゲナーゼ、長鎖の欠損、短指症、Ａ１型、カルバモイルリン酸シンテターゼＩ欠損症、心筋症拡張型ＩＩ、白内障Ｃｏｐｐｏｃｋ様、白内障結晶性刺型（Ｃａｔａｒａｃｔ  ｃｒｙｓｔａｌｌｉｎｅ  ａｃｕｌｅｉｆｏｒｍ）、白内障多型先天性（Ｃａｔａｒａｃｔ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ  ｃｏｎｇｅｎｉｔａｌ）、白内障不定小帯粉状（Ｃａｔａｒａｃｔ  ｖａｒｉａｂｌｅ  ｚｏｎｕｌａｒ  ｐｕｌｖｅｒｌｅｎｔ）、白内障斑点状進行性若年型（Ｃａｔａｒａｃｔｓ  ｐｕｎｃｔａｔｅ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ  ｊｕｖｅｎｉｌｅ−ｏｎｓｅ）、舞踏病アテトーシス家族性発作性、脳顔面頭蓋の−難聴−手（ｈａｎｄ）症候群、魚鱗癬葉状、２型、ミオパシー、デスミン−関連型心臓骨格（ｄｅｓｍｉｎ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｃａｒｄｉｏｓｋｅｌｅｔａｌ）、ＴＢに対する抵抗性／感受性、横紋筋肉腫肺胞、ワールデンブルヒ症候群Ｉ型およびＩＩＩ型、アルポート症候群常染色体劣性、ブヨルンスタッド症候群、血尿、家族性良性、高シュウ酸尿症原発性、１型、合指症１型、高プログルカゴン血症、Ｂｅｔｈｌｅｍミオパシー、短指症Ｅ型、短指症精神遅滞症候群、フィンランド（Ｆｉｎｎｉｓｈ）致死性新生児代謝症候群、２に対し感受性、Ｓｉｍｐｓｏｎ−Ｇｏｌａｂｉ−Ｂｅｈｍｅｌ症候群、１型および２型、ベックウィズ−ヴィーデマン症候群、病原体感染、心臓疾患、前立腺癌、新脈管形成および創傷治癒、アポトーシスの調節、神経精神医学障害、加齢性障害、脾臓、胸腺、肺および腹膜マクロファージが関与する病理学的障害ならびに／または他の病理状態ならびに障害など。
【００２５】
治療剤は、例えば、ＮＯＶＸ核酸、ＮＯＶＸポリペプチド、またはＮＯＶＸ特異的抗体、あるいはそれらの生物学的に活性な誘導体またはフラグメントであり得る。
【００２６】
例えば、本発明の組成物は、上に開示される疾患および障害ならびに／またはこのような他の病理状態および障害に罹患する患者の処置のために効力を有する。このポリペプチドは、本発明に特異的な抗体を産生するための免疫原として、およびワクチンとして使用され得る。これらはまた、潜在的なアゴニスト化合物およびアンタゴニスト化合物についてスクリーニングするために使用され得る。例えば、ＮＯＶＸをコードするｃＤＮＡは、遺伝子治療において有用であり得、そしてＮＯＶＸは、それを必要とする被験体に投与された場合に有用であり得る。非限定的な例として、本発明の組成物は、上に開示される疾患および障害ならびに／またはこのような他の病理状態および障害に罹患する患者の処置のために効力を有する。
【００２７】
本発明はさらに、例えば、上で開示した疾患および障害ならびに／またはこのような他の病理状態および障害を含む、障害または症候群のモジュレーター（調節因子）についてスクリーニングするための方法を包含する。この方法は、試験化合物をＮＯＶＸポリペプチドと接触させる工程、およびこの試験化合物が上記ＮＯＶＸポリペプチドに結合するか否かを決定する工程を包含する。ＮＯＶＸポペプチドペプチドに対するこの試験化合物の結合によって、この試験化合物が、活性のモジュレーター、あるいは上述の障害または症候群の潜伏または素因のモジュレーターであることが示される。
【００２８】
前述の障害または症候群についての危険性の増大した試験動物に対し、試験化合物を投与することによって、活性のモジュレーター、あるいは、例えば上で開示した疾患および障害ならびに／もしくはこのような他の病理状態および障害などを含む、障害または症候群の潜伏または素因のモジュレーターについてスクリーニングするための方法もまた、本発明の範囲内である。試験動物は、ＮＯＶＸ核酸によってコードされる組換えポリペプチドを発現する。次いで、ＮＯＶＸポリペプチドの発現または活性を、この試験動物において測定し、同様に、コントロール動物（これは、ＮＯＶＸポリペプチドを組換え的に発現し、かつ上記の障害についての危険性も上記の症候群についての危険性も増大していない）におけるこのタンパク質の発現または活性を測定する。次いで、試験動物およびコントロール動物の両方におけるＮＯＶＸポリペプチドの発現を比較する。コントロール動物と比較した、試験動物におけるＮＯＶＸポリペプチドの活性の変化は、この試験化合物が、上記の障害または症候群の潜伏のモジュレーターであることを示す。
【００２９】
なお別の局面では、本発明は、被験体（例えば、ヒト被験体）におけるＮＯＶＸポリペプチド、ＮＯＶＸ核酸またはその両方のレベルの変化に関連した疾患の存在または素因を決定する方法を含む。この方法は、この被験体由来の試験サンプル中におけるＮＯＶＸポリペプチドの量を測定する工程、およびコントロールサンプル中において存在するＮＯＶＸポリペプチドの量に対して、この試験サンプル中におけるこのポリペプチドの量を比較する工程、を包含する。コントロールサンプルと比較した場合の試験サンプルにおけるＮＯＶＸポリペプチドレベルの変化は、この被験体における疾患の存在または素因を示す。好ましくは、この素因としては、例えば、上で開示された疾患および障害ならびに／または他のこのような病理状態および障害が挙げられる。また、本発明の新規なポリペプチドの発現レベルは、種々の癌についてスクリーニングするための方法および癌の病期を決定するための方法において使用され得る。
【００３０】
さらなる局面では、本発明は、病理学的状態を緩和または予防するに十分な量で、被験体（例えば、ヒト被験体）にＮＯＶＸポリペプチド、ＮＯＶＸ核酸、またはＮＯＶＸ特異的抗体を投与することにより、哺乳動物における障害に関連した病理学的状態を処置または予防する方法を包含する。好ましい実施形態では、この障害としては、例えば、上で開示された疾患および障害ならびに／または他のこのような病理状態および障害が挙げられる。
【００３１】
なお別の局面において、本発明は、当該分野において一般的に使用される多数の技術のうちのいずれか１つによって、本発明の細胞性レセプターおよび下流エフェクターを同定する方法において使用され得る。これらの技術としては、ツーハイブリッド系、アフィニティ精製、抗体または他の特異的な相互作用分子を用いる共沈が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３２】
ＮＯＶＸ核酸およびポリペプチドは、治療方法または診断方法において使用するための新規のＮＯＶＸ物質に免疫特異的に結合する抗体の産生においてさらに有用である。これらのＮＯＶＸ抗体は、以下の節「抗−ＮＯＶＸ抗体」において記載されるように、疎水性チャートからの予測値を使用して、当該分野で公知の方法に従って産生され得る。開示されるＮＯＶＸタンパク質は、複数の疎水性領域を有し、これらの各々が、免疫原として使用され得る。これらのＮＯＶＸタンパク質は、種々のヒト障害の機能的分析のためのアッセイ系において使用され得、この分析は、疾患の症状および種々の障害に対する新規の薬物標的の開発を理解するのを助ける。
【００３３】
本明細書中で同定されたＮＯＶＸ核酸およびタンパク質は、以下に示されるような種々の症状および障害（これらの限定されない）に関連した潜在的な治療適用において有用であり得る。本発明のための潜在的な治療適用としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：タンパク質療法、低分子薬物標的、抗体標的（治療抗体、薬物標的／細胞障害性抗体）、診断マーカーおよび／または予後マーカー、遺伝子療法（遺伝子送達／遺伝子切除）、研究ツール、本明細書中に定義される全ての組織および細胞型（これらに限定されない）を含む全ての組織および細胞型のインビボおよびインビトロでの組織再生。
【００３４】
他に規定されない限り、本明細書中において使用される全ての専門用語および科学技術用語は、本発明が属する分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書中に記載された方法および物質と類似または等価な方法および物質が、本発明の実施または試験において使用され得るが、適切な方法および物質を以下に記載する。本明細書中で引用された全ての刊行物、特許出願、特許および他の参考文献が、それらの全体において、参考として援用される。矛盾する場合には、定義を含む本明細書が支配する。さらに、物質、方法および例は、例示にすぎず、限定されることは意図されない。
【００３５】
本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明および特許請求の範囲から明らかである。
【００３６】
（発明の詳細な説明）
本発明は、新規なヌクレオチドおよびそれによってコードされるポリペプチドを提供する。新規な核酸配列およびそれらがコードするポリペプチドが本発明に含まれる。それらの配列は、集合的に、本明細書中で「ＮＯＶＸ核酸」または「ＮＯＶＸポリヌクレオチド」と呼ばれ、そして対応する対応するコードされるポリペプチドは、「ＮＯＶＸポリペプチド」または「ＮＯＶＸタンパク質」と呼ばれる。他に示されない場合、「ＮＯＶＸ」は、本明細書中に開示された新規な配列のいずれかをいうことを意味する。表Ａは、ＮＯＶＸ核酸およびそれらがコードするポリペプチドの要約を提供する。
【００３７】
【数１】
2004532613.tif 000002
2004532613.tif 000003
ＮＯＶＸ核酸およびそれらがコードするポリペプチドは、種々の適用および状況において有用である。本発明に従う種々のＮＯＶＸ核酸およびＮＯＶＸポリペプチドは、以前に記載されたタンパク質に対するドメインおよび配列の関連性の存在に従って、タンパク質ファミリーの新規なメンバーとして有用である。さらに、ＮＯＶＸ核酸およびＮＯＶＸポリペプチドはまた、ＮＯＶＸポリペプチドが属するファミリーのメンバーであるタンパク質を同定するために使用され得る。
【００３８】
ＮＯＶ１は、カルパイン様ファミリーのタンパク質に対して相同である。従って、本発明に従うＮＯＶ１核酸、ＮＯＶ１ポリペプチド、ＮＯＶ１抗体およびＮＯＶ１に関連する化合物は、例えば、以下に関連する治療適用および診断適用において有用である：フォン・ヒッペル−リンダウ（ＶＨＬ）症候群、肥満症、糖尿病、自己免疫疾患、全身性エリテマトーデス、レッシュ−ナイハン症候群、発育欠陥症（ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  ｄｅｆｅｃｔ）、アルツハイマー病、筋ジストロフィー、音響外傷、癌、学習欠陥症および記憶欠陥症、不妊症、ならびに／または他の症状／障害。
【００３９】
ＮＯＶ２は、エプシン（ｅｓｐｉｎ）様ファミリーのタンパク質に対して相同である。従って、本発明に従うＮＯＶ２核酸、ＮＯＶ２ポリペプチド、ＮＯＶ２抗体およびＮＯＶ２に関連する化合物は、例えば、以下に関連する治療適用および診断適用において有用である：心筋症、アテローム性動脈硬化症、高血圧症、先天性心臓欠陥、肥満症、不妊症、癌、自己免疫疾患、アレルギー、発育欠陥症、痴呆、フォン・ヒッペル−リンダウ（ＶＨＬ）症候群、アルツハイマー病、脳卒中、パーキンソン病、ハンティングトン病、脳性麻痺、てんかん、レッシュ−ナイハン症候群、多発性硬化症、白質萎縮症、神経変性、および／または他の病状／障害。
【００４０】
ＮＯＶ３は、低密度リポタンパク質Ｂ様タンパク質のファミリーに対して相同である。従って、本発明に従うＮＯＶ３核酸、ＮＯＶ３ポリペプチド、ＮＯＶ３抗体およびＮＯＶ３に関連する化合物は、例えば、以下に関連する治療適用および診断適用において有用である：家族性高コレステロール血症、冠状動脈疾患、糖尿病、アテローム性動脈硬化症、Ｃ型肝炎、甲状腺癌、フォン・ヒッペル−リンダウ（ＶＨＬ）症候群、肝硬変症、移植、乾癬、光線性角化症、結節硬化症、挫瘡、発毛、脱毛症（ａｌｌｏｐｅｃｉａ）、色素沈着障害、内分泌障害、および／または他の病状／障害。
【００４１】
ＮＯＶ４は、プリンレセプター様ファミリーのタンパク質に対して相同である。従って、本発明に従うＮＯＶ４核酸、ＮＯＶ４ポリペプチド、ＮＯＶ４抗体およびＮＯＶ４に関連する化合物は、種々の疾患、病状および障害に関連する治療適用および診断適用において有用である。
【００４２】
ＮＯＶ５は、ＣＧ８８４１様タンパク質のファミリーに対して相同である。従って、本発明に従うＮＯＶ５核酸、ＮＯＶ５ポリペプチド、ＮＯＶ５抗体およびＮＯＶ５に関連する化合物は、例えば、以下に関連する治療適用および診断適用において有用である：癌、外傷、免疫学的疾患、呼吸性疾患、胃腸疾患、生殖の健康状態、神経性疾患および神経変性疾患、骨髄移植、代謝活性疾患および内分泌疾患、アレルギーおよび炎症、腎臓学的障害、泌尿器系障害、ならびに／または他の病状／障害。
【００４３】
ＮＯＶ６は、シナプトタグミン様（Ｓｙｎａｐｔｏｔａｇｍｉｎ−ｌｉｋｅ）ファミリーのタンパク質に対して相同である。従って、本発明に従うＮＯＶ６核酸、ＮＯＶ６ポリペプチド、ＮＯＶ６抗体およびＮＯＶ６に関連する化合物は、例えば、以下に関連する治療適用および診断適用において有用である：アトピー、フォン・ヒッペル−リンダウ（ＶＨＬ）症候群、アルツハイマー病、脳卒中、結節硬化症、高カルシウム血症、パーキンソン病、ハンティングトン病、脳性麻痺、レッシュ−ナイハン症候群、多発性硬化症、毛細血管拡張性運動失調、白質萎縮症、行動障害、嗜癖、不安、疼痛、神経防御（ｎｅｕｒｏｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ）；代謝性障害、ランバート−イートン筋無力性症候群、および／または他の症状／障害。
【００４４】
ＮＯＶ７は、セリンプロテアーゼＴＬＳＰ様ファミリーのタンパク質のメンバーに対して相同である。従って、本発明のＮＯＶ７核酸、ＮＯＶ７ポリペプチド、ＮＯＶ７抗体およびＮＯＶ７に関連する化合物は、例えば、以下に関連する治療適用および診断適用において有用である：癌、神経性障害、消化器系障害、全てまたはいくつかのプロテアーゼ／プロテアーゼインヒビターの欠損障害、ならびに／または他の病状／障害。
【００４５】
ＮＯＶ８は、グリピカン−２（ｇｌｙｐｉｃａｎ−２）前駆体様ファミリーのタンパク質に対して相同である。従って、本発明に従うＮＯＶ８核酸、ＮＯＶ８ポリペプチド、ＮＯＶ８抗体およびＮＯＶ８に関連する化合物は、例えば、以下に関連する治療適用および診断適用において有用である：糖尿病、インスリン非依存性糖尿病（ｄｉａｂｅｔｅｓ  ｍｅｌｌｉｔｕｓ  ｎｏｎ−ｉｎｓｕｌｉｎ  ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ）、自己免疫疾患、全身性エリテマトーデス、フォン・ヒッペル−リンダウ（ＶＨＬ）症候群、アルツハイマー病、脳卒中、パーキンソン病、ハンティングトン病、脳性麻痺、てんかん、多発性硬化症、毛細血管拡張性運動失調、白質萎縮症、神経変性、癌、心筋症、種々の白内障障害、Ｉ型およびＩＩＩ型のワールデンブルヒ症候群、ブヨルンスタッド症候群、１型および２型のシンプソン−ゴラビ−ベーメル（Ｓｉｍｐｓｏｎ−Ｇｏｌａｂｉ−Ｂｅｈｍｅｌ）症候群、ベックウィズ−ヴィーデマン症候群、ならびに／または他の病状／障害。
【００４６】
ＮＯＶ９は、マイトジェン活性化タンパク質キナーゼキナーゼ２様ファミリーのタンパク質に対して相同である。従って、本発明に従うＮＯＶ９核酸、ＮＯＶ９ポリペプチド、ＮＯＶ９抗体およびＮＯＶ９に関連する化合物は、例えば、以下に関連する治療適用および診断適用において有用である：アテローム性動脈硬化症、代謝性疾患、病原体感染、神経性疾患および／または他の病状／障害。
【００４７】
ＮＯＶ１０は、ジンクフィンガータンパク質２７６  Ｃ２Ｈ２型ファミリーのタンパク質に対して相同である。従って、本発明に従うＮＯＶ１０核酸、ＮＯＶ１０ポリペプチド、ＮＯＶ１０抗体およびＮＯＶ１０に関連する化合物は、例えば、以下に関連する治療適用および診断適用において有用である：癌、外傷、免疫学的疾患、呼吸系疾患、心臓疾患、胃腸疾患、生殖の健康状態、神経性疾患および神経変性疾患、骨髄移植、代謝性疾患および内分泌疾患、アレルギーおよび炎症、神経性障害、造血障害、泌尿器系障害、ならびに／または他の病状／障害。
【００４８】
ＮＯＶ１１は、サイモシンβ−１０様ファミリーのタンパク質に対して相同である。従って、本発明に従うＮＯＶ１１核酸、ＮＯＶ１１ポリペプチド、ＮＯＶ１１抗体およびＮＯＶ１１に関連する化合物は、例えば、以下に関連する治療適用および診断適用において有用である：前立腺癌、免疫学的障害および自己免疫障害（すなわち、甲状腺機能亢進症）、新脈管形成および創傷治癒、アポトーシスの調節、神経変性障害および神経精神病学障害、加齢性障害、脾臓、胸腺、肺および腹膜のマクロファージに関連する病理学的障害、ならびに／または他の病状／障害。
【００４９】
ＮＯＶＸ核酸およびＮＯＶＸポリペプチドはまた、ＮＯＶＸの活性または機能を阻害または増強する分子についてスクリーニングするために使用され得る。詳細には、本発明に従う核酸およびポリペプチドは、例えば、神経発生、細胞分化、細胞増殖、造血、創傷治癒および脈管形成を調節または阻害する低分子の同定のための標的として使用され得る。
【００５０】
本発明に従うＮＯＶＸ核酸およびＮＯＶＸポリペプチドについてのさらなる有用性は、本明細書中に開示される。
【００５１】
（ＮＯＶ１）
新規カルパイン様タンパク質をコードする１９４７ヌクレオチドの開示されたＮＯＶ１核酸（３３５２２７４とも呼ばれる）を、表１Ａに示す。ヌクレオチド１〜３のＡＴＧ開始コドンから始まり、ヌクレオチド１９４５〜１９４７のＴＡＧコドンで終結する、オープンリーディングフレームが同定された。開始コドンおよび終止コドンを、表１Ａにおいて太字で示す
【００５２】
【表１Ａ】
2004532613.tif 000004
ＮＯＶ１核酸配列は、第１９染色体にマッピングし、Ｇａｌｌｕｓ  ｇａｌｌｕｓカルシウムプロテアーゼｍＲＮＡ（ｇｂ：ＧＥＮＢＡＮＫ−ＩＤ：ＧＧＣＰＲＯＴ｜ａｃｃ：Ｘ０１４１５）に同一な、６３１塩基中の４３０塩基（６８％）を有する（Ｅ＝１．４ｅ−９０）。類似性情報は、全てのＧｅｎＢａｎｋデータベースおよびＧｅｎｅＳｅｑ特許データベースを含む公のヌクレオチドデータベースを使用して、評価された。染色体情報を、ＯＭＩＭおよびＣｕｒａｔｏｏｌ製の電子化ノーザンツールを使用して評価して、ＳｅｑＣａｌｌｉｎｇアセンブリ、ゲノムクローン、および／または本発明に含まれるＥＳＴ配列の染色体マッピングを誘導した。
【００５３】
本明細書中における全てのＢＬＡＳＴアライメントにおいて、「Ｅ値（Ｅ−ｖａｌｕｅ）」または「期待値（Ｅｘｐｅｃｔ）」とは、その整列された配列が、検索したデータベース内で、単なる偶然によって、ＢＬＡＳＴの問い合わせ配列に対してその類似性を達成し得た確率（可能性）の数的な指標である。例えば、ＮＯＶ１  ＢＬＡＳＴ分析から検索された対象（「Ｓｂｊｃｔ」）（例えば、Ｇａｌｌｕｓ  ｇａｌｌｕｓカルシウムプロテアーゼｍＲＮＡ）が、偶然のみで、問い合わせ（Ｑｕｅｒｙ）（クエリ）ＮＯＶ１配列にマッチした確率（可能性）は、１．４ｅ−９０である。期待値（Ｅｘｐｅｃｔ  ｖａｌｕｅ）（Ｅ）は、特定のサイズのデータベースを検索する場合に、全く偶然に見出すことを「期待」し得る、ヒット数を示すパラメーターである。これは、２つの配列の間のマッチに割り当てられるスコア（Ｓｃｏｒｅ）（Ｓ）に伴い、指数関数的に減少する。本質的に、このＥ値は、配列の間のマッチに存在するランダムなバックグラウンドノイズを示す。
【００５４】
期待値（Ｅｘｐｅｃｔ  ｖａｌｕｅ）は、結果を報告するための有意な閾値を作成するための都合のよい手段として使用される。ＢＬＡＳＴを行うために使用されるデフォルト値は、代表的には、０．０００１に設定される。ＢＬＡＳＴ２．０において、この期待値をまた、Ｐ値（確率）の代わりに用いて、マッチの有意性を報告する。例えば、１ヒットに割り当てられる１であるＥ値は、現在のサイズのデータベースにおいて、類似のスコアを有する１つのマッチを単なる偶然によって見出すことを期待し得ることを意味すると解釈され得る。ゼロであるＥ値は、類似のスコアを有するいかなるマッチも単なる偶然では見出すことが期待されないことを意味する。例えば、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ／ＢＬＡＳＴｉｎｆｏ／を参照のこと。場合によっては、文字列Ｘおよび文字列Ｎが、ＢＬＡＳＴ検索から生じる。これは、人為的なヒットを妨げるように実施される、低い複雑性の配列の問い合わせ（クエリ）の自動的フィルタリングの結果である。このフィルターは、ヌクレオチド配列において文字「Ｎ」（例えば、「ＮＮＮＮＮＮＮＮ」）またはタンパク質配列において文字「Ｘ」（例えば、「ＸＸＸ」）によって、見出される任意の低い複雑性の配列を置換する。低い複雑性の領域は、有意な位置ごとのアラインメントではなく、組成の偏りを反映する、高いスコアを生じ得る。ＷｏｏｔｔｏｎおよびＦｅｄｅｒｈｅｎ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ  ２６６：５５４〜５７１、１９９６。
【００５５】
配列番号１によってコードされる開示されたＮＯＶ１ポリペプチド（配列番号２）は、６４８アミノ酸残基を有し、１文字アミノ酸コードを用いて表１Ｂにおいて表わされる。ＳｉｇｎａｌＰ、Ｐｓｏｒｔおよび／またはＨｙｄｒｏｐａｔｈｙの結果は、ＮＯＶ１が、シグナルペプチドを含まず、そして０．７４８０の確実性でおそらく細胞質中に局在するであろうことが予測される。
【００５６】
【表１Ｂ】
2004532613.tif 000005
ＮＯＶ１アミノ酸配列は、Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ  ７２０アミノ酸残基タンパク質（ｐｔｎｒ：ＴＲＥＭＢＬＮＥＷ−ＡＣＣ：ＣＡＣ１００６６）と同一な、４５６アミノ酸残基中の４０５アミノ酸残基（８８％）、およびこのタンパク質と類似した、４５６アミノ酸残基中の４２９アミノ酸残基（９４％）を有する（Ｅ＝４．１ｅ−３１１）。
【００５７】
ＮＯＶ１は、少なくとも以下の組織中で発現される：胎盤、全生体、腎臓、肝臓、膵臓、小腸。この情報は、本発明に含まれる配列の組織供給源を決定することによって誘導された。
【００５８】
開示されるＮＯＶ１ポリペプチドは、表１Ｃに列挙されるＢＬＡＳＴＰデータに示されるアミノ酸配列に対する相同性を有する。
【００５９】
【表１Ｃ】
2004532613.tif 000006
これらの配列と他の配列との間の相同性は、表１Ｄに示されるＣｌｕｓｔａｌＷ分析で図示される。ＮＯＶ１タンパク質のＣｌｕｓｔａｌＷアライメント、および本明細書中の全ての他のＣｌｕｓｔａｌＷ分析において、黒地に白抜きで示されるアミノ酸残基は、保存配列の領域（すなわち、構造的特性または機能的特性を保存するために必要とされ得る領域）を示し、強調していないアミノ酸残基は、それほど保存されておらず、そして潜在的に、タンパク質の構造または機能を変化することなく、非常に広範な程度に変更され得る。
【００６０】
【表１Ｄ】
2004532613.tif 000007
2004532613.tif 000008
ＮＯＶ１ならびに他の全てのＮＯＶＸタンパク質における同定可能なドメインの存在は、ソフトウェアアルゴリズム（例えば、ＰＲＯＳＩＴＥ、ＤＯＭＡＩＮ、Ｂｌｏｃｋｓ、Ｐｆａｍ、ＰｒｏＤｏｍａｉｎ、およびＰｒｉｎｔｓ）を用いる検索によって、次いで、Ｉｎｔｅｒｐｒｏウエブサイト（ｈｔｔｐ：ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｉｎｔｅｒｐｒｏ）を用いてドメインマッチ（または数）を組み合わせることによってＩｎｔｅｒｐｒｏ番号を決定することによって、決定した。表１Ｅおよび表１Ｆに開示されるようにＮＯＶ１についてのＤＯＭＡＩＮ結果を、Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｐｏｓｉｔｉｏｎ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ＢＬＡＳＴ分析を用いて、Ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ  Ｄｏｍａｉｎ  Ｄａｔａｂａｓｅ（ＣＤＤ）から収集した。このＢＬＡＳＴ分析ソフトウェアは、ＳｍａｒｔおよびＰｆａｍコレクションに見出されるドメインをサンプリングする。表１Ｅ、表１Ｆおよびその後の全てのＤＯＭＡＩＮ配列アライメントについて、完全に保存された単一の残基を、黒色影付きまたは記号（｜）によって示し、そして「強い」半保存残基は、灰色影付きまたは記号（＋）によって示す。この保存アミノ酸残基の「強い」グループは、以下のアミノ酸のグループのいずれか１つであり得る：ＳＴＡ、ＮＥＱＫ、ＮＨＱＫ、ＮＤＥＱ、ＱＨＲＫ、ＭＩＬＶ、ＭＩＬＦ、ＨＹ、ＦＹＷ。
【００６１】
表１Ｅおよび表１Ｆは、ＮＯＶ１に対するＤＯＭＡＩＮ分析結果からのドメイン表示を列挙する。これは、ＮＯＶ１配列が、これらのドメインを含むことが公知の他のタンパク質の特性と類似する特性を有することを示す。
【００６２】
【表１Ｅ】
2004532613.tif 000009
【００６３】
【表１Ｆ】
2004532613.tif 000010
システインプロテアーゼ活性は、システインおよびヒスチジンの活性な二分子に依存しており、これらの残基の順序および間隔は、２０程度の既知のファミリーにおいて変化する。Ｃ１、Ｃ２およびＣ１０のファミリーは、おおまかにはパパイン様と呼ばれ、全システインプロテアーゼのほぼ半分が、ウイルス中で排他的に見出される。カルパインは、カルシウムによって調節される多数の重要な細胞機能に関与する細胞内プロテアーゼである。このタンパク質は、２つのポリペプチド鎖（重鎖および軽鎖）の複合体であり、哺乳動物で以下の３つの既知の形態を有する：μカルパイン、μ−ＣＡＮＰまたはカルパインＩとして公知の、高カルシウム感受性（すなわち、マイクロモル濃度範囲）形態；ｍカルパイン、ｍ−ＣＡＮＰまたはカルパインＩＩとして公知の、ミリモル濃度範囲のカルシウムに感受性の形態；および、ｐ９４として公知の第三の形態（これは、骨格筋のみにおいて見出される）。これら３つの形態の全ては、同一の軽鎖を有するが異なる重鎖を有する。この重鎖は、４つのドメインを含む：ドメイン２は、触媒領域を含み；ドメイン４は、カルシウムに結合し、活性を調節する。ドメイン２は、パパインに対して低レベルの配列類似性を示すが；触媒性のＨｉｓは、生化学的意味によっては位置されてないか、カルパインおよびパパインが関連しているようである。ドメイン４は、４つのＥＦハンドカルシウム結合領域を有し、かつソルシン（ｓｏｒｃｉｎ）およびカルパイン軽鎖のＣａ２＋結合領域と類似している。カルパインは、Ｐ２残基のような、Ｔｙｒを有するロイシンまたはバリンに対して選択的な切断を示す。
【００６４】
カルパインは、カルシウム様活性を伴うチオールプロテアーゼ活性と組み合わさるという点において、酵素のシステインプロテアーゼファミリーの間で特有である。この酵素は、多数の病態生理学的状態に関連する（Ｄｏｎｋｏｒ，Ｃｕｒｒ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  ７（１２）：１１７１〜１１８８、２０００）。カスパーゼおよびカルパインファミリーのプロテアーゼは、それらの活性化がカルシウム流入および酸化ストレスによって誘発される場合、神経変性プロセスに関連している（ＣｈａｎおよびＭａｔｔｓｏｎ，Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  Ｒｅｓ  ５８（１）：１６７−９０，１９９９）。ミトコンドリアカルパインは、そのＮ末端にてＢａｘを切断し、Ｂａｘ／ｐ１８フラグメントを作製することによって、アポトーシスとの関わりにおいて役割を果たし、次いで、シトクロムｃの放出を媒介し、アポトーシスの遂行を開始する（ＧａｏおよびＤｏｕ，Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ８０（１）：５３〜７２，２００１）。ｎＣＬ−４カルパインプロテアーゼの欠失は、新生物性形質転換に関連している（Ｌｉｕら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７５（４０）：３１０９３−８，２０００）。カルパインプロテアーゼは、外傷後の軸索およびミエリン鞘の破壊に関連するが、これは、カルパインプロテアーゼがこの軸索−ミエリン鞘単位で構造タンパク質を分解し、脊髄における外傷性損傷の後の損傷部位に隣接するミエリン鞘を有する軸索の破壊の原因となり得るためである（Ｓｈｉｅｌｄｓら、Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  Ｒｅｓ  ６１（２）：１４６−５０，２０００）。精子のカルパインは、ヒト精子の受精能力を調節する生化学的プロセスの新規成分であることが示されている（ＲｏｊａｓおよびＭｏｒｅｔｔｉ−Ｒｏｊａｓ，Ｉｎｔ  Ｊ  Ａｎｄｒｏｌ  ２３（３）：１６３−８，２０００）。この知見は、カルパイン活性の調節が、カルパインによって影響される正常な調節機構を崩壊させることによって筋ジストロフィーに寄与することを示す（ＴｉｄｂａｌｌおよびＳｐｅｎｃｅｒ，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ３２（１）：１〜５，２０００）。
【００６５】
ＮＯＶ１について上記で定義された情報は、このカルパーゼ様タンパク質がカルパインファミリーのメンバーとして機能し得ることを示唆する。従って、本発明のＮＯＶ１核酸およびＮＯＶ１タンパク質は、以下に記載される種々の疾患および障害、ばらびに／または他の病状に関連する潜在的な治療適用において有用である。例えば、本発明のＮＯＶ１組成物は、以下に罹患した患者の処置に効果を有する：フォン・ヒッペル−リンダウ（ＶＨＬ）症候群、肝硬変症、移植障害、膵臓炎、肥満症、糖尿病、自己免疫疾患、腎動脈狭窄症、間質性腎炎、糸球体腎炎、多発性嚢胞腎疾患、全身性エリテマトーデス、尿細管性アシドーシス、ＩｇＡ腎症、高カルシウム血症、レッシュ−ナイハン症候群、発育欠陥症、白内障、脊髄損傷、アルツハイマー病、筋ジストロフィー、音響外傷、癌、学習欠陥症および記憶欠陥症、ならびに不妊症。カルパイン様タンパク質をコードするＮＯＶ１核酸、および本発明のカルパイン様タンパク質、またはそれらのフラグメントは、診断適用においてさらに有用であり得、ここで、この核酸またはタンパク質の存在または量が評価される。
【００６６】
（ＮＯＶ２）
新規エプシン（Ｅｐｓｉｎ）様タンパク質をコードする１７９６ヌクレオチドの開示されたＮＯＶ２核酸（２１４２１１７４とも呼ばれる）を、表２Ａに示す。ヌクレオチド４０〜４２のＡＴＧ開始コドンから始まり、ヌクレオチド１７７１〜１７７３のＴＡＡコドンで終結する、オープンリーディングフレームが同定された。開始コドンの上流および終止コドンの下流の推定非翻訳領域を、表２Ａに下線で示す。開始コドンおよび終止コドンを、太字で示す
【００６７】
【表２Ａ】
2004532613.tif 000011
開示されるＮＯＶ２核酸配列は、第１９染色体に局在化され、Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ＥＨドメイン結合有糸分裂リン酸タンパク質（ＥＰＳＩＮ）ｍＲＮＡ（ｇｂ：ＧＥＮＢＡＮＫ−ＩＤ：ＡＦ０７３７２７｜ａｃｃ：ＡＦ０７３７２７）に同一な、１５６３塩基中の１３３８塩基（８５％）を有する（Ｅ＝１．４ｅ−２３７）。
【００６８】
配列番号３によってコードされるＮＯＶ２ポリペプチド（配列番号４）は、５７７アミノ酸残基を有し、１文字アミノ酸コードを使用して表２Ｂに表す。ＳｉｇｎａｌＰ、Ｐｓｏｒｔおよび／またはＨｙｄｒｏｐａｔｈｙの結果は、ＮＯＶ２が、シグナルペプチドを含まず、そして０．４６００の確実性でおそらくミトコンドリアマトリクス中に局在し、かつ０．４５００の確実性でおそらく細胞質に局在するであろうことを予測する。
【００６９】
【表２Ｂ】
2004532613.tif 000012
ＮＯＶ２アミノ酸配列は、Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ５７６アミノ酸残基タンパク質（ｐｔｎｒ：ＴＲＥＭＢＬＮＥＷ−ＡＣＣ：ＢＡＢ１４０４１）と同一な、５７７アミノ酸残基中５６９アミノ酸残基（９８％）、およびこのタンパク質と類似した、５７７アミノ酸残基中５６９アミノ酸残基（９８％）を有する（ＣＤＮＡ  ＦＬＪ  １２３９２  ＦＩＳ、クローンＭＡＭＭＡ  １００２６９９）、Ｒａｔｔｕｓ  ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ  ｅｈドメイン結合タンパク質ｅｐｓｉｎ  ｍＲＮＡ（ＧＥＮＢＡＮＫ−ＩＤ：ＣＡＢ６１４１２）と高い類似性を有する（Ｅ＝３．０ｅ−３１３）。
【００７０】
開示されるＮＯＶ２は、少なくとも以下の組織中で発現される：網膜芽細胞腫、平滑筋腫、乳腺、海綿質細胞、卵巣、骨髄、脾臓、胎盤、心臓。この情報は、本発明に含まれる配列の組織供給源を決定することによって誘導された。さらに、この配列は、密接に関連したＨｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ＥＨドメイン結合有糸分裂リン酸タンパク質（Ｅｐｓｉｎ）ｍＲＮＡ（ＧＥＮＢＡＮＫ−ＩＤ：ｇｂ：ＧＥＮＢＡＮＫ−ＩＤ：ＡＦ０７３７２７│ａｃｃ：ＡＦ０７３７２７）の発現パターンによって、脳組織中で発現されることが予測される。
【００７１】
ＮＯＶ２はまた、表２Ｃに列挙されるＢＬＡＳＴＰデータに示されるアミノ酸配列に対する相同性を有する。
【００７２】
【表２Ｃ】
2004532613.tif 000013
これらの配列の相同性は、表２Ｄに示されるＣｌｕｓｔａｌＷ分析で図示される。
【００７３】
【表２Ｄ】
2004532613.tif 000014
2004532613.tif 000015
2004532613.tif 000016
表２Ｅおよび表２Ｆは、ＮＯＶ２に対するＤＯＭＡＩＮ分析結果からのドメイン表示を列挙する。これは、ＮＯＶ２配列が、これらのドメインを含むことが公知の他のタンパク質の特性と類似する特性を有することを示す。
【００７４】
【表２Ｅ】
2004532613.tif 000017
【００７５】
【表２Ｆ】
2004532613.tif 000018
ＮＯＶ２のアミノ酸配列はまた、表２Ｇに示される他のタンパク質と高い相同生を有する。
【００７６】
【表２Ｇ】
2004532613.tif 000019
エプシン（Ｅｐｓｉｎ）（Ｅｐｓ１５相互作用物質）は、そのクラスリン、クラスリンアダプターＡｐ−２、およびＥｐｓ１５との直接の相互作用を介する、クラスリン媒介性エンドサイトーシスに関わる細胞質タンパク質である。エプシンのＮＨ（２）末端部分は、未知の機能の、ＥＮＴＨドメイン（エプシンＮＨ（２）末端相同ドメイン）として公知の、系統発生論的に保存されたモジュールを含む。研究結果は、エプシン１がエンドサイトース機構を核機能の調節に連結するシグナル伝達経路において機能し得ることを示唆する（Ｈｙｍａｎら、Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １４９（３）：５３７−４６、２０００）。
【００７７】
エンドサイトーシスの間、クラスリンおよびクラスリンアダプタータンパク質ＡＰ−２は、種々のアクセサリー因子によって補助され、細胞膜で、陥入した芽を生成させる。これらの因子の１つが、ＡＰ−２のαアダプチンサブユニットに結合するＥｐｓ１５、クラスリン被覆結合性タンパク質である。エプシンは、被覆ピット陥入および小胞分裂に要求される、クラスリン被覆の分子再配置に、Ｅｐｓ１５と共に、関係し得ることが提唱された（Ｃｈｅｎら、Ｎａｔｕｒｅ  ３９４（６６９５）：７９３−７、１９９８）。
【００７８】
ラットエプシンおよびラットＥｐｓ１５の両方は、有糸分裂性リンタンパク質で、これらの有糸分裂性リン酸化は、αアダプチンの付属ドメインへの結合を阻害することが示された。エプシンおよびＥｐｓ１５の両方は、他のシナプス小胞エンドサイトーシス機構の細胞質成分の様に、神経末端で、構成性リン酸化および脱分極依存性脱リン酸化を受ける。さらに、脳抽出物におけるＡＰ−２の結合は、脱リン酸化によって強化される。エプシンは、Ｅｐｓ１５と共に、陥入反応／分裂反応の間の動的再配置において、クラスリン被覆を補助することが提唱されている。これらの有糸分裂性リン酸化は、有糸分裂において、クラスリン被覆ピットの陥入を、ブロックする機構の１つであり得、これらのシナプスでの刺激依存性脱リン酸化は、分泌性刺激後のエンドサイトーシスの代償的な破裂に寄与する（Ｃｈｅｎら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  １９９９年２月５日；２７４（６）：３２５７−６０）。
【００７９】
上記で規定されたＮＯＶ２に対する情報は、ＮＯＶ２タンパク質が新規のエプシン様タンパク質のファミリーのメンバーとして機能し得ることを示唆する。従って、本発明のＮＯＶ２核酸およびＮＯＶ２タンパク質は、以下に記載される種々の疾患および障害ならびに／または他の病理に関与する潜在的な治療適用に有用である。例えば、本発明のＮＯＶ２組成物は、心筋症、アテローム性動脈硬化症、高血圧、先天性心機能異常、大動脈狭窄症、心房中隔欠損症、房室管欠損、動脈管、肺動脈弁狭窄症、大動脈弁下部狭窄症、心室中隔欠損症、弁疾患、結節硬化症、硬皮症、肥満、移植障害、子宮内膜症、不妊症，癌、血友病、熱凝固、特発性血小板減少性紫斑病、自己免疫疾患、アレルギー、免疫欠損、対宿主性移植片病、発育欠損、痴呆、フォン・ヒッペル−リンダウ（ＶＨＬ）症候群、アルツハイマー病、発作、高カルシウム血症、パーキンソン病、ハンティングトン病、脳性小児麻痺、てんかん、レッシュ−ナイハン症候群、多発性硬化症、毛細血管拡張性運動失調、白質萎縮症、行動障害、嗜癖、不安、疼痛、神経退行を患っている患者の処置に対して効力を有する。本発明のエプシン様タンパク質をコードするＮＯＶ２核酸、およびエプシン様タンパク質またはそのフラグメントは、さらに診断的適用に有用である。ここで、核酸またはタンパク質の存在または量は、評価される。
【００８０】
（ＮＯＶ３）
新規の低密度リポタンパク質Ｂ（Ｌｏｗ  Ｄｅｎｓｉｔｙ  Ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ｂ）（ＬＤＬＢ）様タンパク質をコードする２９７３ヌクレオチドの開示されたＮＯＶ３核酸（ＡＣ０２５２６３＿ｄａｌとも呼ばれる）を、表３Ａに示す。ヌクオレチド１〜３のＡＴＧ開示コドンから始まり、ヌクオレチド２９７１〜２９７３のＴＡＡコドンで終結する、オープンリーディングフレームが同定された。開始コドンおよび開示コドンを、表３Ａに太字で示す。
【００８１】
【表３Ａ】
2004532613.tif 000020
2004532613.tif 000021
開示されたＮＯＶ３核酸配列は、染色体１９ｐ１３．１〜１３．３にマップし、これは、Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ  ｌｄｌＢｐ（ＬＤＬＢ）ｍＲＮＡ（ｇｂ：ＧＥＮＢＡＮＫ−ＩＤ：ＡＦ１０９３７７｜ａｃｃ：ＡＦ１０９３７７）と、２９５７塩基中２３６０塩基（７９％）同一である（Ｅ＝０．０）。
【００８２】
配列番号５によってコードされる開示されたＮＯＶ３タンパク質（配列番号６）は、９９０アミノ酸残基を有し、１文字アミノ酸コードを使用して表３Ｂに表される。Ｓｉｇｎａｌ  Ｐ、Ｐｓｏｒｔおよび／またはＨｙｄｒｏｐａｔｈｙの結果は、ＮＯＶ３が、シグナルペプチドを含まず、そして０．７６００の確実性で核に、および０．４８２４の確実性でミトコンドリアマトリクス空隙に局在するであろうことを予測する。
【００８３】
【表３Ｂ】
2004532613.tif 000022
ＮＯＶ３アミノ酸配列は、Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ由来の９８０アミノ酸残基のタンパク質（ｐｔｎｒ：ＳＰＴＲＥＭＢＬ−ＡＣＣ：Ｑ９Ｚ１６０）に、９９０アミノ酸残基中８０７アミノ酸残基（８１％）同一であり、９９０アミノ酸残基中８７７アミノ酸残基（８８％）が類似する（Ｅ＝０．０）。全体の配列相同性は、６２．３９６％アミノ酸相同性および５４．５７６％アミノ酸同一性である。
【００８４】
ＮＯＶ３は、文献供給源に基づく、少なくとも以下の組織中で発現される：卵巣、肝臓、表皮、線維芽細胞、血液白血球。
【００８５】
ＮＯＶ３は、表３Ｃに列挙されたＢＬＡＳＴＰデータに示されるアミノ酸配列に対する相同性を有する。
【００８６】
【表３Ｃ】
2004532613.tif 000023
2004532613.tif 000024
これらの配列の相同性は、表３Ｄに示されるＣｌｕｓｔａｌＷ分析に図示される。
【００８７】
【表３Ｄ】
2004532613.tif 000025
2004532613.tif 000026
2004532613.tif 000027
ＮＯＶ３のアミノ酸配列は、表３Ｅに示されるように、他のタンパク質と高い相同性を有する。
【００８８】
【表３Ｅ】
2004532613.tif 000028
低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）粒子は、血液循環における主要なコレステロールキャリアで、こららの生理学的機能は、コレステロールを細胞へ運ぶことである。アテローム発生の工程において、これらの粒子は、改変され、そして、動脈壁に蓄積する。低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）に結合する血清コレステロールの上昇は、家族性高コレステロール血症の一つの特徴である。
【００８９】
ホモ接合体由来の培養された線維芽細胞の研究によって、ＢｒｏｗｎおよびＧｏｌｄｓｔｅｉｎ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７０：２８０４−２８０８，１９７３；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７１：７８８−７９２，１９７４）は、冠動脈炎および／または家族性高コレステロール血症を患っている患者における基本的な欠損は、ＬＤＬに対する細胞膜レセプターに関係することを示した。通常、ＬＤＬは、細胞膜に結合され、細胞に取り込まれ、リソソームに達し、そこでタンパク質が分解され、そしてコレステロールは、ミクロソームの酵素３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル補酵素Ａ（ＨＭＧ  ＣｏＡ）レダクターゼの抑制（コレステロール合成における速度制限工程）に対して有効になる。疾患状態において、ＬＤＬレセプターの、細胞内取り込み変異体は、ＬＤＬに結合するが、細胞内へのＬＤＬの輸送を促進することはできない（Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎら、Ｃｅｌｌ  １２：６２９−６４１、１９７７）。上記で議論された疾患状態に加えて、ＬＤＬは、ウイルスの感染に関与する。研究結果は、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）（慢性肝炎の主要なウイルス的原因）および他のウイルスが、ＬＤＬレセプターの媒介を通して細胞に侵入することを示す。この研究は、これらウイルスのエンドサイトーシスは、ＬＤＬレセプターの活性と相関することを示す（Ａｇｎｅｌｌｏら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９６：１２７６６−７１、１９９９）。
【００９０】
上記で規定された、ＮＯＶ３に対する情報は、このＮＯＶ３タンパク質が、低密度リポタンパク質Ｂファミリーのメンバーとして機能し得ることを示唆する。従って、本発明のＮＯＶ３核酸およびＮＯＶ３タンパク質は、潜在的な適用および診断的適用に有用である。例えば、ＮＯＶ３タンパク質をコードするｃＤＮＡは、遺伝子療法において有用であり得、そしてＮＯＶ３タンパク質は、それを必要とする被験体に投与する場合、有用であり得る。非限定的な例示として、本発明の組成物は、家族性高コレステロール血症、リポ蛋白過剰血症ＩＩ表現型、腱黄色性、角膜環、冠状動脈疾患、扁平黄色腫、みずかき指、高コレステロール血症、受胎能、冠状動脈疾患、糖尿病、アテローム性動脈硬化症、黄色腫症、Ｃ型肝炎感染、ＬＤＬレセプターの調節、合成、輸送、再利用、または代謝回転、大脳皮質下梗塞および白質脳症を有する脳動脈症、骨端形成異常症（多発性１型）、魚鱗癬、非層板のおよび非紅色水腫の、先天性白血病、Ｔ細胞急性リンパ芽球状の偽性軟骨形成不全症、ＳＣＩＤ、常染色体の劣性、Ｔネガティブ／Ｂポジティブ型、Ｃ３欠損症、真性糖尿病、インシュリン耐性の黒色表皮肥厚症を有するグルタル酸尿症（Ｉ型）、甲状腺機能低下不全症、先天性妖精症、脂肪肉腫、ムコリピドーシス  ＩＶ、ミュラー管開存症（Ｉ型）、ラブソン−メンデンハール症候群、甲状腺癌、無髄の、細胞好酸性傾向を有する、赤血球増加症、家族性マラリア、トロンボキサンＡ２レセプター欠損による出血障害への大脳の感受性、小脳性運動失調（カイマン型）、痙攣、家族性熱性周期性造血（２）、フコシルトランスフェラーゼ−６欠損、ＧＡＭＴ欠損、フォン・ヒッペル−リンダウ（ＶＨＬ）症候群、肝硬変、移植、乾癬、光線性角化症、結節硬化症、挫瘡、髪の増殖、脱毛症（ａｌｌｏｐｅｃｉａ）、色素沈着障害および内分泌障害、を患っている患者の処置に対して効力を有する。低密度リポタンパク質Ｂ様タンパク質をコードするＮＯＶ３核酸、および本発明の低密度リポタンパク質Ｂ様タンパク質またはそのフラグメントは、さらに、診断的適用に有用であり得る。ここで、核酸またはタンパク質の存在または量は、評価される。
【００９１】
（ＮＯＶ４）
新規のプリンレセプター（Ｐｕｒｉｎｏｃｅｐｔｏｒ）様タンパク質をコードする１８５１ヌクレオチドの開示されたＮＯＶ４核酸（ＣｕｒａＧｅｎアクセッション番号Ａｃｏ２６７５６＿ｄａｌと示される）を、表４Ａに示す。ヌクオレチド３４７〜３４９のＡＴＧ開示コドンから始まり、ヌクオレチド１３５８〜１３６０のＴＧＡコドンで終結する、オープンリーディングフレームが同定された。開始コドンの上流および終止コドンの下流の推定非翻訳領域を、表４Ａに下線で示す。開始コドンおよび終止コドンを、太字で示す。
【００９２】
【表４Ａ】
2004532613.tif 000029
ＮＯＶ４核酸配列は、Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ  Ｐ２ＹプリンレセプターｍＲＮＡ（ｇｂ：ＧＥＮＢＡＮＫ−ＩＤ：ＭＭＵ２２８２９｜ａｃｃ：Ｕ２２８２９）と、７１７塩基中４１９塩基（５８％）同一である（Ｅ＝９．８ｅ−１９）。
【００９３】
配列番号７によってコードされるＮＯＶ４ポリペプチド（配列番号８）は、３３７アミノ酸残基で、１文字アミノ酸コードを使用して表４Ｂに表される。Ｓｉｇｎａｌ  Ｐ、Ｐｓｏｒｔおよび／またはＨｙｄｒｏｐａｔｈｙの結果は、ＮＯＶ４が、シグナルペプチドを含まず、そして０．６０００の確実性で形質膜に局在するであろうことを予測する。
【００９４】
【表４Ｂ】
2004532613.tif 000030
ＮＯＶ４アミノ酸配列は、Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ由来の３７３アミノ酸残基のＰ２Ｙ１プリンレセプタータンパク質（ＡＴＰレセプター）（ｐｔｎｒ：ＳＷＩＳＳＰＲＯＴ−ＡＣＣ：Ｐ４９６５０）に、３０６アミノ酸残基中１１２アミノ酸残基（３６％）同一であり、３０６アミノ酸残基中１７９アミノ酸残基（５８％）がポジティブである（Ｅ＝９．４ｅ−５６）。
【００９５】
ＮＯＶ４は、それらが増幅された最初のプールされた２０のｃＤＮＡに対応する少なくとも以下の組織中で発現される：副腎、骨髄、脳−扁桃、脳−小脳、脳−海馬、脳−黒質、脳−視床、脳−全体、胎児の脳、胎児の腎臓、胎児の肝臓、胎児の肺、心臓、腎臓、リンパ腫−ラージ細胞、乳腺、膵臓、下垂体、胎盤、前立腺、唾液腺、骨格筋、小腸、脊髄、脾臓、胃、精巣、甲状腺、気管および子宮。
【００９６】
ＧＰＣＲ４について見られる可能な小ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）を表４Ｃに列挙する。深度は、ＳＮＰの領域をカバーするクローンの数を表す。推定対立遺伝子頻度（ＰＡＦ）は、ＳＮＰを含むこれらのクローンの割合である。示される場合、ダッシュは、塩基が存在しないことを意味する。記号「＞」は「に変えられる」を意味する。
【００９７】
【表４Ｃ】
2004532613.tif 000031
ＮＯＶ４はまた、表４Ｄに列挙されたＢＬＡＳＴＰデータに示されるアミノ酸配列に対する相同性を有する。
【００９８】
【表４Ｄ】
2004532613.tif 000032
これらの配列の相同性は、表４Ｅに示されるＣｌｕｓｔａｌＷ分析に図示される。
【００９９】
【表４Ｅ】
2004532613.tif 000033
2004532613.tif 000034
表４Ｆは、ＮＯＶ４に対するＤＯＭＡＩＮ分析結果からのドメインの説明を列挙する。これは、ＮＯＶ４配列が、これらのドメインを含むことが既知の他のタンパク質の特性と類似する特性を有することを示す。
【０１００】
【表４Ｆ】
2004532613.tif 000035
ＮＯＶ４のアミノ酸配列は、表４Ｇに示されるように、他のタンパク質と高い相同性を有する。
【０１０１】
【表４Ｇ】
2004532613.tif 000036
上記で規定された、ＮＯＶ４に対する情報は、このＮＯＶ４タンパク質は、プリンレセプタータンパク質ファミリーのメンバーとして機能し得ることを示唆する。従って、本発明のＮＯＶ４核酸およびＮＯＶ４タンパク質は、種々の疾患および障害に関与する潜在的な治療的適用に有用である。プリンレセプター様タンパク質をコードするＮＯＶ４核酸、および本発明のプリンレセプター様タンパク質またはそのフラグメントは、さらに、診断的適用に有用であり得る。ここで、核酸またはタンパク質の存在または量は、評価される。
【０１０２】
（ＮＯＶ５）
ＮＯＶ５は、以下に開示される２つの新規ＣＧ８８４１様タンパク質を含む。この開示されるタンパク質は、ＮＯＶ５ａおよびＮＯＶ５ｂと名づけられる。
【０１０３】
（ＮＯＶ５ａ）
新規のＣＧ８８４１様タンパク質をコードする３１４６ヌクレオチドの開示されたＮＯＶ５ａ核酸（ｓｇｇｃ＿ｄｒａｆｔ＿ｄｊ８９５ｃ５＿２００００８１１＿ｄａｌとも呼ばれる）を、表５Ａに示す。ヌクオレチド１〜３のＡＴＧ開示コドンから始まり、ヌクオレチド２２９３〜２２９５のＴＧＡコドンで終結する、オープンリーディングフレームが同定された。開始コドンの上流および終止コドンの下流の推定非翻訳領域を、表５Ａに下線で示す。開始コドンおよび終止コドンを、太字で示す。
【０１０４】
【表５Ａ】
2004532613.tif 000037
2004532613.tif 000038
ＮＯＶ５ａ核酸は、第１７染色体上に同定された。この核酸は、Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｃｅ  ＤＫＦＺｐ４３４Ｉ１１２０  ｍＲＮＡ（ｇｂ：ＧＥＮＢＡＮＫ−ＩＤ：ＨＳＭ８０２２９５｜ａｃｃ：ＡＬ１３７５５６）と、５７１塩基中５６７塩基（９９％）同一である（Ｅ＝１．１ｅ−２１６）。
【０１０５】
配列番号９によってコードされる開示されたＮＯＶ５ａポリペプチド（配列番号１０）は、７６４アミノ酸残基で、１文字アミノ酸コードを使用して表５Ｂに表される。Ｓｉｇｎａｌ  Ｐ、Ｐｓｏｒｔおよび／またはＨｙｄｒｏｐａｔｈｙの結果は、ＮＯＶ５ａが、シグナルペプチドを含み、そして０．７３００の確実性で形質膜に、および０．６０７５の確実性でマイクロボディ（ペルオキシソーム）に局在するであろうことを予測する。ＮＯＶ５ａペプチドについて最も可能性が高い切断部位は、アミノ酸４９と５０との間の、ＦＡＬ−ＶＰである。
【０１０６】
【表５Ｂ】
2004532613.tif 000039
ＮＯＶ５ａアミノ酸配列は、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ由来の８３７アミノ酸残基のＣＧ８８４１タンパク質（ｐｔｎｒ：ＳＰＴＲＥＭＢＬ−ＡＣＣ：Ｑ９Ｖ６９５）に、６３８アミノ酸残基中３９７アミノ酸残基（６２％）同一であり、６３８アミノ酸残基中４７８アミノ酸残基（７４％）が類似する（Ｅ＝５．９ｅ−２７０）。
【０１０７】
ＮＯＶ５ａは、少なくとも以下の組織中で発現される：副腎／腎上体、扁桃，骨髄，脳、結腸、真皮、十二指腸、海馬、視床下部、腎臓、喉頭、肝臓、肺、リンパ節、リンパ組織、乳腺／胸、卵巣、膵臓、耳下腺唾液腺、下垂体、網膜、小腸、脊髄、胃、黒質、精巣、視床、扁桃、臍静脈、子宮、器官全体。この情報は、本発明に含まれる配列の組織供給源を決定することによって、導かれる。さらに、このＮＯＶ５Ａは、密接に関連するＨｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ＤＫＦＺｐ４３４Ｉ１１２０  ｍＲＮＡ（ｇｂ：ＧＥＮＢＡＮＫ−ＩＤ：ＨＳＭ８０２２９５｜ａｃｃ：ＡＬ１３７５５６）の発現パターンから、精巣組織中で発現されると予想される。
【０１０８】
（ＮＯＶ５ｂ）
新規のＣＧ８８４１様タンパク質をコードする３３１４ヌクレオチドの開示されたＮＯＶ５ｂ核酸（ＣＧ５４４４３−０２とも呼ばれる）を、表５Ｃに示す。ヌクオレチド９７〜９９のＡＴＧ開示コドンから始まり、ヌクオレチド２４６１〜２４６３のＴＧＡコドンで終結する、オープンリーディングフレームが同定された。開始コドンの上流および終止コドンの下流の推定非翻訳領域を、表５Ｃに下線で示す。開始コドンおよび終止コドンを、太字で示す。
【０１０９】
【表５Ｃ】
2004532613.tif 000040
ＮＯＶ５ｂ核酸は、第１７染色体上に同定された。この核酸は、Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｃｅ  ＤＫＦＺｐ４３４Ｉ１１２０  ｍＲＮＡ（ｇｂ：ＧＥＮＢＡＮＫ−ＩＤ：ＨＳＭ８０２２９５｜ａｃｃ：ＡＬ１３７５５６．１）と、１１６２塩基中１１５５塩基（９９％）同一である（Ｅ＝１．２ｅ−２５５）。
【０１１０】
配列番号１１によってコードされる開示されたＮＯＶ５ｂポリペプチド（配列番号１２）は、７８８アミノ酸残基で、１文字アミノ酸コードを使用して表５Ｄに表される。Ｓｉｇｎａｌ  Ｐ、Ｐｓｏｒｔおよび／またはＨｙｄｒｏｐａｔｈｙの結果は、ＮＯＶ５ｂが、シグナルペプチドを含み、そして０．７３００の確実性で形質膜に、および０．６００６の確実性でマイクロボディ（ペルオキシソーム）に局在するであろうことを予測する。ＮＯＶ５ｂペプチドについて最も可能性が高い切断部位は、アミノ酸４９と５０との間の、ＦＡＬ−ＶＰである。
【０１１１】
【表５Ｄ】
2004532613.tif 000041
ＮＯＶ５ｂアミノ酸配列は、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ由来の８３７アミノ酸残基のＣＧ８８４１タンパク質（ｐｔｎｒ：ＳＰＴＲＥＭＢＬ−ＡＣＣ：Ｑ９Ｖ６９５）に、６６２アミノ酸残基中４０９アミノ酸残基（６１％）同一であり、６６２アミノ酸残基中４９１アミノ酸残基（７４％）が類似する（Ｅ＝１．４ｅ−２７７）。
【０１１２】
ＮＯＶ５ｂは、少なくとも以下の組織中で発現される：副腎／腎上体、骨髄，脳、軟骨、結腸、真皮、十二指腸、胆嚢、腎臓、喉頭、肝臓、肺、リンパ節、リンパ組織、乳腺／胸、卵巣、膵臓、耳下腺唾液腺、下垂体、前立腺、網膜、小腸、脊髄、脾臓、胃、精巣、扁桃、膀胱、子宮、静脈、外陰部。さらに、この遺伝子は、以下の疾患状態において、発現された：前立腺腺癌、卵巣癌、結腸癌、子宮癌、膵臓腺癌、乳癌。この情報は、本発明に含まれる配列の組織供給源を決定することによって、導かれる。
【０１１３】
ＮＯＶ５ａおよびＮＯＶ５ｂは、表５Ｅにおいて、そのアミノ酸アライメントで示されるように、非常に密接に相同である。
【０１１４】
【表５Ｅ】
2004532613.tif 000042
2004532613.tif 000043
2004532613.tif 000044
任意の上記ＮＯＶ５タンパク質に対する相同性は、それらが上記に示されるように、互いに相同である限り、他のＮＯＶ５タンパク質によって共有される。任意のＮＯＶ５の表示は、他に言及しない限り、一般に、ＮＯＶ５タンパク質の両方をいうと想定される。
【０１１５】
ＮＯＶ５ａはまた、表５Ｆに列挙されたＢＬＡＳＴＰデータに示されるアミノ酸配列に対する相同性を有する。
【０１１６】
【表５Ｆ】
2004532613.tif 000045
これらの配列の相同性は、表５Ｇに示されるＣｌｕｓｔａｌＷ分析に図示される。
【０１１７】
【表５Ｇ】
2004532613.tif 000046
2004532613.tif 000047
ＮＯＶ５のアミノ酸配列は、表５Ｈに示されるように、他のタンパク質に高い相同性を有する。
【０１１８】
【表５Ｈ】
2004532613.tif 000048
ＮＯＶ５における上記に定義された情報は、このＮＯＶ５が、ＣＧ８８４１様タンパク質ファミリーのメンバーとして機能し得ることを示唆する。従って、本発明のＮＯＶ５核酸およびＮＯＶ５タンパク質は、以下に示されるような種々の疾患および障害および／または他の病理学に関連する、潜在的治療適用において有用であり得る。例えば、本発明のＮＯＶ５組成物は、癌、外傷、免疫疾患、呼吸疾患、胃腸疾患、生殖に関する健康（ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ  ｈｅａｌｔｈ）、神経疾患および神経変性疾患、骨髄移植、代謝疾患および内分泌疾患、アレルギーおよび炎症、腎臓障害、造血障害または泌尿系障害に罹患している患者の処置に対する効力を有する。本発明のＣＧ８８４１様タンパク質をコードするＮＯＶ５核酸、およびＣＧ８８４１様タンパク質あるいはそれらのフラグメントは、診断適用においてさらに有用であり得、ここで、その核酸またはタンパク質の存在または量が、評価される。
【０１１９】
（ＮＯＶ６）
ＮＯＶ６は、下記に開示される２つの新規なシナプトタグミン様タンパク質を含む。開示されるタンパク質は、ＮＯＶ６ａおよびＮＯＶ６ｂと名付けられた。
【０１２０】
（ＮＯＶ６ａ）
新規なシナプトタグミン様タンパク質をコードする１１１６ヌクレオチドの開示されたＮＯＶ６ａ核酸（ＳＣ１３４９１２６４２＿ｄａ１とも呼ばれる）を表６Ａに示す。ヌクレオチド１〜３のＡＴＧ開始コドンから始まり、ヌクレオチド１１１４〜１１１６のＴＧＡコドンで終結する、オープンリーディングフレームが同定された。開始コドンおよび終止コドンを、表６Ａに太字で示す。
【０１２１】
【表６Ａ】
2004532613.tif 000049
2004532613.tif 000050
ＮＯＶ６ａ核酸は、染色体１１ｑ１２．２上で同定され、そしてＭｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓシナプトタグミンＶＩＩ  ｍＲＮＡ（ｇｂ：ＧＥＮＢＡＮＫ−ＩＤ：ＡＢ０２６８０４｜ａｃｃ：ＡＢ０２６８０４）に対して、７６８塩基のうち７０９塩基（９２％）同一である塩基を有する（Ｅ＝１．３ｅ−２０８）。
【０１２２】
開示されるＮＯＶ６ａポリペプチド（配列番号１４）（配列番号１３によりコードされる）は、３７１のアミノ酸残基であり、そして表６Ｂにおいて一文字コードを用いて表される。Ｓｉｇｎａｌ  Ｐ、Ｐｓｏｒｔおよび／またはＨｙｄｒｏｐａｔｈｙの結果は、ＮＯＶ６ａが、シグナルペプチドを含み、そして０．８２００の確実度で細胞質に局在するようであることを予想する。ＮＯＶ６ａペプチドの最も可能性のある切断部位は、アミノ酸３５と３６との間（ＶＬＡ−ＳＲ）である。
【０１２３】
【表６Ｂ】
2004532613.tif 000051
ＮＯＶ６ａアミノ酸配列は、Ｒａｔｔｕｓ  ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ  ４０３アミノ酸残基シナプトタグミンＶＩＩタンパク質（ｐｔｎｒ：ＳＰＴＲＥＭＢＬ−ＡＣＣ：Ｑ６２７４７）に対して、２５５アミノ酸残基のうち２４８アミノ酸残基（９７％）同一であり、および２５５アミノ酸残基のうち２５１アミノ酸残基（９８％）類似する、アミノ酸残基を有する（Ｅ＝１．３ｅ−１９０）。
【０１２４】
ＮＯＶ６ａは、少なくとも以下の組織において発現される：副腎／腎上体、骨、脳、大脳髄質／大脳白質、心臓、海馬、肝臓、乳腺／乳房、下垂体、胎盤、唾液腺、視床。この情報は、ＳｅｑＣａｌｌｉｎｇ情報源、Ｐｕｂｌｉｃ（公的）ＥＳＴ情報源、文献情報源、および／またはＲＡＣＥ情報源を含むがこれに限定されない、本発明に含まれる配列の組織情報源を決定することによって導かれた。
【０１２５】
（ＮＯＶ６ｂ）
新規なシナプトタグミン様タンパク質をコードする１２１２ヌクレオチドの開示されたＮＯＶ６ｂ核酸（ＣＧ５６１０６−０１とも呼ばれる）を表６Ｃに示す。ヌクレオチド１〜３のＡＴＧ開始コドンから始まり、ヌクレオチド１２１０〜１２１２のＴＧＡコドンで終結する、オープンリーディングフレームが同定された。開始コドンおよび終止コドンは表６Ｃにおいて、太字である。
【０１２６】
【表６Ｃ】
2004532613.tif 000052
2004532613.tif 000053
ＮＯＶ６ｂ核酸は、染色体１１ｑ１２−１３．１上で同定され、そしてＨｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  シナプトタグミンＶＩＩ  ｍＲＮＡ（ｇｂ：ＧＥＮＢＡＮＫ−ＩＤ：ＡＦ０３８５３５｜ａｃｃ：ＡＦ０３８５３５．１）に対して、１２１２塩基のうち１２０１塩基（９９％）同一である塩基を有する（Ｅ＝５．６ｅ−２６３）。
【０１２７】
開示されるＮＯＶ６ｂポリペプチド（配列番号１６）（配列番号１５によりコードされる）は、４０３のアミノ酸残基であり、そして表６Ｄにおいて一文字コードを用いて表される。Ｓｉｇｎａｌ  Ｐ、Ｐｓｏｒｔおよび／またはＨｙｄｒｏｐａｔｈｙの結果は、ＮＯＶ６ｂが、シグナルペプチドを含み、そして小胞体（膜）に０．８２００の確実度で、および原形質膜に０．５１４０の確実度で局在するようであることを予想する。ＮＯＶ６ｂペプチドについての最も可能性の高い切断部位は、アミノ酸４６とアミノ酸４７との間（ＫＬＧ−ＫＲ）である。
【０１２８】
【表６Ｄ】
2004532613.tif 000054
ＮＯＶ６ｂアミノ酸配列は、Ｒａｔｔｕｓ  ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ  ４０３アミノ酸残基シナプトタグミンＶＩＩタンパク質（ｐｔｎｒ：ＳＰＴＲＥＭＢＬ−ＡＣＣ：Ｑ６２７４７）に対して、４０３アミノ酸残基のうち３９８アミノ酸残基（９８％）同一であり、および４０３アミノ酸残基のうち４０１アミノ酸残基（９９％）類似する、アミノ酸残基を有する（Ｅ＝７．１ｅ−２１７）。
【０１２９】
ＮＯＶ６ｂは、少なくとも以下の組織において発現される：副腎／腎上体、骨、脳、大脳髄質／大脳白質、心臓、海馬、肝臓、乳腺／乳房、下垂体、胎盤、唾液腺、視床。この情報は、ＳｅｑＣａｌｌｉｎｇ情報源、Ｐｕｂｌｉｃ（公的）ＥＳＴ情報源、文献情報源、および／またはＲＡＣＥ情報源を含むがこれに限定されない、本発明に含まれる配列の組織情報源を決定することによって導かれた。
【０１３０】
ＮＯＶ６ａおよびＮＯＶ６ｂは、表６Ｅのアミノ酸アライメントに示されたように、非常に近密な相同性である。
【０１３１】
【表６Ｅ】
2004532613.tif 000055
上記ＮＯＶ６タンパク質のいずれかに対する相同性は、上記に示されるように互いに相同性である範囲で、他のＮＯＶ６により共有される。ＮＯＶ６に対するいずれの参考文献も、特に断らない限り、一般に両方のＮＯＶ６を指すと想定される。
【０１３２】
ＮＯＶ６ａはまた、表６Ｆに挙げられるＢＬＡＳＴＰデータに示されるアミノ酸配列に対して相同性を有する。
【０１３３】
【表６Ｆ】
2004532613.tif 000056
2004532613.tif 000057
これらの配列の相同性を、表６Ｇに示すＣｌｕｓｔａｌＷ分析において図示する。
【０１３４】
【表６Ｇ】
2004532613.tif 000058
2004532613.tif 000059
表６Ｈ−６Ｋは、ＮＯＶ６ａに対するＤＯＭＡＩＮ解析結果からのドメインの詳細を列挙する。これらは、ＮＯＶ６ａ配列が、このドメインを含むことが、公知の他のタンパク質のドメインと類似した特性を有することを示す。
【０１３５】
【表６Ｈ】
2004532613.tif 000060
【０１３６】
【表６Ｉ】
2004532613.tif 000061
2004532613.tif 000062
【０１３７】
【表６Ｊ】
2004532613.tif 000063
【０１３８】
【表６Ｋ】
2004532613.tif 000064
シナプトタグミンは、シナプスのエキソサイトーシスおよび神経伝達物質放出において役割を果たす脳特異的カルシウム依存性リン脂質結合タンパク質のファミリーである。Ｂｅｓｔの卵黄様黄斑変性と関連するヒト染色体１１ｑ１３の間隔の転写マップを構築する一方で、Ｃｏｏｐｅｒらは、ラットシナプトタグミンＶＩＩのヒトホモログをコードするｃＤＮＡを単離した（Ｃｏｏｐｅｒら、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ４９：４１９〜４２９、１９９８）。予測される４０３アミノ酸のヒトタンパク質およびラットタンパク質は、９８％同一である。ノーザンブロット分析は、シナプトタグミンＶＩＩが、脳の異なる領域からの組織を含む、種々のヒト成人および胎児の組織において、４．４ｋｂおよび７．５ｋｂのｍＲＮＡとして発現されることを明らかとした。
【０１３９】
ニューロンは、シナプス小胞のカルシウム依存性のエキソサイトーシスによって、神経伝達物質を放出する。Ｂｒｏｓｅらは、シナプトタグミン（高い保存性のシナプス小胞タンパク質）が、陰性に荷電したリン脂質と共に複合体における生理学的濃度でカルシウムと結合することを報告した（Ｂｒｏｓｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５６：１０２１〜１０２５、１９９２）。この結合は、カルシウムについて特異的であり、そしてシナプトタグミンの細胞質ドメインを含む。カルシウム結合は、シナプトタグミンのインタクトなオリゴマー構造に依存し；これは、単一部位でのタンパク質分解の切断によって破壊される。Ｂｒｏｓｅら（１９９２）は、シナプトタグミンが、エキソサイトーシスにおいて協同的なカルシウムレセプターとして作用することを示唆するような結果を解釈した。シナプトタグミンは、プロテインキナーゼＣの調節領域に相同性である、配列の２つのコピーを含む。Ｐｅｒｉｎらは、ヒトシナプトタグミンおよびショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）シナプトタグミンをコードする全長ｃＤＮＡを特徴づけた（Ｐｅｒｉｎら、Ｎａｔｕｒｅ  ３４５：２６０〜２６３、１９９１）。ラットシナプトタグミン、ヒトシナプトタグミンおよびショウジョウバエシナプトタグミンの細胞質ドメインのリン脂質結合特性の類似性ならびにプロテインキナーゼＣに相同性である配列の選択的保存は、これらが、リン脂質結合に含まれ得ることを示唆する。
【０１４０】
ＮＯＶ６についての上記で規定された情報は、ＮＯＶ６が、シナプトタグミンファミリーのメンバーとして機能し得ることを示唆する。それ故、本発明のＮＯＶ６核酸およびＮＯＶ６タンパク質は、以下に記載される種々の疾患および障害ならびに／または他の病状に関する潜在的な治療適用において有用である。例えば、本発明のＮＯＶ６組成物は、アトピー；骨粗鬆症仮性神経膠腫症候群；スミス−レムリ−オピッツ症候群、Ｉ型；スミス−レムリ−オピッツ症候群、ＩＩ型；色素性乾皮症、Ｅ群、サブタイプ２；感受性のアトピーの喘息；糖尿病インスリン依存４；ＩＤＤＭに対する感受性；血管性水腫、遺伝性の；傍神経節腫、家族性の非クロム親和性、２；フォン・ヒッペル−リンダウ（ＶＨＬ）症候群；アルツハイマー病、発作、結節硬化症、高カルシウム血症、パーキンソン病、ハンティングトン病、脳性麻痺、癲癇、レッシュ−ナイハン症候群、多発性硬化症、毛細管拡張性運動失調、白質萎縮症、行動障害、嗜癖、不安、痛み、神経保護；代謝障害およびランバート−イートン無筋力症症候群に悩まされる患者の処置について有効性を有する。シナプトタグミン様タンパク質をコードするＮＯＶ６核酸および、本発明のシナプトタグミン様タンパク質、またはそれらのフラグメントはさらに、診断的適用においても有用であり得、ここで核酸またはタンパク質の存在または量が、評価される。
【０１４１】
（ＮＯＶ７）
新規セリンプロテアーゼＴＬＳＰ様レセプタータンパク質をコードする開示されるＮＯＶ７核酸の１１６４ヌクレオチド（ｗｕｇｃ＿ｄｒａｆｔ＿ｈ＿ｎｈ０７８１ｍ２１＿２００００８０９＿ｄａｌともいわれる）が、表７Ａに示される。オープンリーディングフレームは、ヌクレオチド１１３〜１１５のＡＴＧ開始コドンで始まり、そしてヌクレオチド８５４〜８５６のＴＡＧ終止コドンで終止することで同定された。推定の非翻訳領域は、開始コドンの上流および表７Ａにおける終止コドンから下流で見出され、そして開始コドンおよび終止コドンは、太字である。
【０１４２】
【表７Ａ】
2004532613.tif 000065
第１９染色体に位置する、開示されたＮＯＶ７核酸配列は、Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓトリプシン様セリンプロテアーゼ（ＴＬＳＰ）ｍＲＮＡ（ｇｂ：ＧＥＮＢＡＮＫ−ＩＤ：ＡＦ１６４６２３｜ａｃｃ：ＡＦ１６４６２３）に６０７塩基のうち５３１塩基（８７％）が同一性を有する（Ｅ＝１．３ｅ−１６５）。
【０１４３】
配列番号１７によってコードされる開示されたＮＯＶ７ポリペプチド（配列番号１８）は、２４７アミノ酸残基であり、そして表７Ｂにおける１文字アミノ酸コードを用いて表される。ｓｉｇｎａｌ  Ｐ、Ｐｓｏｒｔおよび／または疎水性親水性指標の結果は、ＮＯＶ７が、シグナルペプチドを含み、そして０．６９２１の確実性でミトコンドリアの内膜にそして０．６５００の確実性で原形質膜に位置される傾向があることを予測する。ＮＯＶ７ペプチドについて、最も可能性のある切断部位は、アミノ酸５０と５１との間のＶＧＧ−ＥＴである。
【０１４４】
【表７Ｂ】
2004532613.tif 000066
ＮＯＶ７アミノ酸配列は、Ｈｏｍｏ  Ｓａｐｉｅｎｓ  ２８２アミノ酸残セリンプロテアーゼ（ＴＬＳＰ）タンパク質（ｐｔｎｒ：ＳＰＴＲＥＭＢＬ−ＡＣＣ：Ｏ７５８３７）に、１４９アミノ酸残基のうち１４６アミノ酸残基（９７％）が同一であり、そして１４９アミノ酸残基のうち１４７アミノ酸残基（９８％）が類似である（Ｅ＝５．２ｅ−１３１）。
【０１４５】
ＮＯＶ７は、Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ（ＧｅｎＢａｎｋ  ＩＤ：ＡＢ０１２９１７）由来のセリンプロテアーゼ（ＴＬＳＰ）のスプライスされたアイソフォームである。位置４０６と位置４０７との間の１０５ヌクレオチドが欠落している。このエキソンの欠失は、タンパク質配列中の位置９８と位置９９との間の３５アミノ酸残基の欠失を生じる。
【０１４６】
ＮＯＶ７は、少なくとも以下の組織において発現される：結腸、心臓、肺、卵巣、耳下腺唾液腺、前立腺、唾液腺、胃（正常な）、胃（印環細胞をともなう不十分に分化された腺癌）精巣および子宮。密接に関連するＨｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  トリプシン様セリンプロテアーゼ（ＴＬＳＰ）遺伝子ホモログ（ＧＥＮＢＡＮＫ−ＩＤ：ｇｂ：ＧＥＮＢＡＮＫ−ＩＤ：ＡＦ１６４６２３｜ａｃｃ：ＡＦ１６４６２３）：脳、胸腺、脾臓、肝臓および乳がん細胞株ＢＴ−４７４における発現パターンのために、この配列は、以下の組織／細胞株において発現されるとさらに予測される。
【０１４７】
ＮＯＶ７はまた、表７Ｃに列挙されるＢＬＡＳＴＰデータに示されるアミノ酸配列に相同性を有する。
【０１４８】
【表７Ｃ】
2004532613.tif 000067
これらの配列の相同性は、表７Ｄに示されるＣｌｕｓｔａｌＷ分析に画像として示される。
【０１４９】
【表７Ｄ】
2004532613.tif 000068
2004532613.tif 000069
表７Ｅおよび表７Ｆは、ＮＯＶ７に対するドメイン分析結果からのドメインの記載を列挙する。これは、ＮＯＶ７配列が、このドメインを含むことが公知である他のタンパク質の特性と類似の特性を有する。
【０１５０】
【表７Ｅ】
2004532613.tif 000070
【０１５１】
【表７Ｆ】
2004532613.tif 000071
ＮＯＶ７のアミノ酸配列は、表７Ｇに示されるような他のタンパク質と高い相同性を有する。
【０１５２】
【表７Ｇ】
2004532613.tif 000072
トリプシン様酵素は、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属およびＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ属の放線菌、および真菌類のＦｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍにおいて見出されるが、トリプシンファミリーは、ほぼ全体的に動物に限定される。この酵素は、固有に分泌され、これを分泌経路へ標的化させるシグナルペプチドを用いて合成される。動物の酵素は、直接分泌されるか、調節された分泌のためのビヒクルにパッケージングされるか、または白血球顆粒中に保持されるかのいずれかである。
【０１５３】
プロテアーゼは、組織のリモデリングおよび細胞の移動を含む、様々な生物学的プロセスにおいて中枢の役割を果たす。セリンプロテアーゼの保存領域に対応するマウスニューロプシンｃＤＮＡ配列由来のプライマーを用いるヒト海馬ｃＤＮＡのＰＣＲによって、新規のセリンプロテアーゼ（ＫＬＫ１１）が、同定され、これは、ＴＬＳＰと命名された。推定される２６０アミノ酸タンパク質は、シグナルペプチド、セリンプロテアーゼ活性に必須の３つの重要なアミノ酸、Ｐ１位置の塩基性アミノ酸に対するトリプシン型の基質の特性を示唆する位置におけるａｓｐ残基、オキシアニオンホールを形成し得る保存されたアミノ酸、および潜在的なＮ−グリコシル化部位を含む。ＫＬＫ１１は、マウスニューロプシンと４８％のアミノ酸配列同一性、ヒトトリプシン１およびヒトカリクレインの両方と４３％の同一性、およびマウス神経増殖因子γサブユニットと３８％の同一性を共有する。組み換えＫＬＫ１１のウェスタンブロット分析は、このタンパク質が、分泌され、そして翻訳後に処理されることを示唆した。
【０１５４】
タンパク質分解酵素は、伝統的な医薬において容易に用いられており、そして研究は、酵素治療は、放射線治療および化学治療によって引き起こされる有害な効果を減少し得ることを示している。腫瘍のいくつかの型において、生存が、延長され得る証拠もまたある。全身系の酵素治療の有益な効果は、その抗炎症潜在性に基づくと考えられる（ＬｅｉｐｎｅｒおよびＳａｌｌｅｒ、Ｄｒｕｇｓ  ５９（４）：７６９−８０、２０００）。
【０１５５】
ＮＯＶ７についての上記で定義された情報は、このＮＯＶ７タンパク質が、セリンプロテアーゼＴＬＳＰファミリーのメンバーとして機能し得ることを示唆する。それ故、本発明のＮＯＶ７核酸およびＮＯＶ７タンパク質は、以下に記載される種々の疾患および障害ならびに／または他の病状に関する潜在的な治療適用において有用である。例えば、本発明のＮＯＶ７組成物は、癌、神経学的障害、消化系障害および全てまたはいくつかのプロテアーゼ／プロテアーゼインヒビター欠乏障害に悩まされる患者の処置について有効性を有する。セリンプロテアーゼＴＬＳＰ様タンパク質をコードするＮＯＶ７核酸、および本発明のセリンプロテアーゼＴＬＳＰ様タンパク質またはこれらのフラグメントは、さらに診断的適用において有用であり得、ここで、核酸またはタンパク質の存在または量が、評価される。
【０１５６】
（ＮＯＶ８）
ＮＯＶ８は、以下に開示される４つの新規グリピカン−２（Ｇｌｙｐｉｃａｎ−２）前駆体様タンパク質を含む。開示されるタンパク質は、ＮＯＶ８ａ、ＮＯＶ８ｂ、ＮＯＶ８ｃおよびＮＯＶ８ｄと命名されている。
【０１５７】
（ＮＯＶ８ａ）
新規グリピカン−２前駆体様タンパク質をコードする１７８５ヌクレオチドの開示されるＮＯＶ８ａ核酸（１３４９１３４４１＿ＥＸＴともいわれる）が、表８Ａに示される。オープンリーディングフレームが、同定され、ヌクレオチド１〜３のＡＴＧ開始コドンで始まり、そしてヌクレオチド１７３８〜１７４０のＴＡＡコドンで終止した。終止コドンから下流の推定の非翻訳領域が、表８Ａで下線を付され、そして開始コドンおよび終止コドンは、太字である。
【０１５８】
【表８Ａ】
2004532613.tif 000073
2004532613.tif 000074
第７染色体に位置される、開示されるＮＯＶ８ａ核酸配列は、Ｒａｔｔｕｓ  ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ  セレブトグリカンｍＲＮＡ（ｇｂ：ＧＥＮＢＡＮＫ−ＩＤ：ＲＡＴＣＲＢＧＬＶＣ｜ａｃｃ：Ｌ２０４６８）に１７８５塩基のうち１４６９塩基（８２％）の同一性を有する（Ｅ＝３．３ｅ−２６１）。
【０１５９】
配列番号１９によってコードされる開示されるＮＯＶ８ａポリペプチド（配列番号２０）は、５７９のアミノ酸残基であり、そして表８Ｂに１文字アミノ酸コードを用いて表される。ｓｉｇｎａｌ  Ｐ、Ｐｓｏｒｔおよび／または疎水性親水性指標の結果は、ＮＯＶ８ａが、シグナルペプチドを含み、そして０．４４６７の確実性で細胞外に位置される傾向があることを予測する。ＮＯＶ８ａペプチドについて、最も可能性のある切断部位は、アミノ酸２３と２４との間のＧＰＧ−ＳＥである。
【０１６０】
【表８Ｂ】
2004532613.tif 000075
ＮＯＶ８ａアミノ酸配列は、Ｒａｔｔｕｓ  ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ  ５７９アミノ酸残基ｇｌｙｐｉｃａｎ−２前駆体（セレブログリカン）タンパク質（ｐｔｎｒ：ＳＷＩＳＳＰＲＯＴ−ＡＣＣ：Ｐ５１６５３）に、５７９アミノ酸残基のうち４７７アミノ酸残基（８２％）が同一であり、そして５７９アミノ酸残基のうち５１３アミノ酸残基（８８％）が類似である（Ｅ＝１．１ｅ−２６０）。
【０１６１】
ＮＯＶ８ａは、少なくとも以下の組織において発現される：腎臓、膵臓、脳、小児前駆Ｂ細胞急性リンパ芽球白血病。この情報は、本発明に含まれる配列の組織供給源を決定することによって得られた。ＳｅｑＣａｌｌｉｎｇ供給源：腎臓、膵臓、脳；ＰｕｂｌｉｃＥＳＴ供給源：小児前駆Ｂ細胞急性リンパ芽球白血病。さらに、発現パターンが、Ｒａｔｔｕｓ  ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓセレブログリカンｍＲＮＡホモログ（ＧＥＮＢＡＮＫ−ＩＤ：ｇｂ：ＧＥＮＢＡＮＫ−ＩＤ：ＲＡＴＣＲＢＧＬＶＣ｜ａｃｃ：Ｌ２０４６８）と密接に関連しているため、ＮＯＶ８ａは、脳組織において、発現されると予測される。
【０１６２】
（ＮＯＶ８ｂ）
新規Ｇｌｙｐｉｃａｎ−２前駆体様タンパク質をコードする１９７６ヌクレオチドの開示されるＮＯＶ８ｂ核酸（ＣＧ５０９７０＿０２ともいわれる）が、表８Ｃに示される。オープンリーディングフレームが同定され、ヌクレオチド５４〜５６のＡＴＧ開始コドンで始まり、そしてヌクレオチド１４４９〜１４５１のＴＡＡコドンで終止した。開始コドンから上流および終止コドンから下流の推定の非翻訳領域が、表８Ｃで下線を付され、そして開始コドンおよび終止コドンは、太字である。
【０１６３】
【表８Ｃ】
2004532613.tif 000076
染色体２ｑ３５−ｑ３７に位置される、開示されるＮＯＶ８ｂ核酸配列は、Ｒａｔｔｕｓ  ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓセレブログリカンｍＲＮＡ（ｇｂ：ＧＥＮＢＡＮＫ−ＩＤ：ＲＡＴＣＲＢＧＬＶＣ｜ａｃｃ：Ｌ２０４６８．１）に１２７１塩基のうち１０４７塩基（８２％）の同一性を有する（Ｅ＝１．４ｅ−２４７）。
【０１６４】
配列番号２１によってコードされる開示されるＮＯＶ８ｂポリペプチド（配列番号２２）は、４６５のアミノ酸残基であり、そして表８Ｄに１文字アミノ酸コードを用いて表される。ｓｉｇｎａｌ  Ｐ、Ｐｓｏｒｔおよび／または疎水性親水性指標の結果は、ＮＯＶ８ｂが、シグナルペプチドを含み、そして０．４４６７の確実性で細胞外に位置される傾向があることを予測する。ＮＯＶ８ｂペプチドについて、最も可能性のある切断部位は、アミノ酸２３と２４との間のＧＰＧ−ＳＥである。
【０１６５】
【表８Ｄ】
2004532613.tif 000077
ＮＯＶ８ｂアミノ酸配列は、Ｒａｔｔｕｓ  ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ  ５７９アミノ酸残基ｇｌｙｐｉｃａｎ−２前駆体（セレブログリカン）タンパク質（ｐｔｎｒ：ＳＷＩＳＳＰＲＯＴ−ＡＣＣ：Ｐ５１６５３）に、３８０アミノ酸残基のうち３２２アミノ酸残基（８４％）が同一であり、そして３８０アミノ酸残基のうち３４８アミノ酸残基（９１％）が類似である（Ｅ＝１．５ｅ−２１０）。
【０１６６】
ＮＯＶ８ｂは、少なくとも以下の組織において発現される：大動脈、脳、軟骨、頸部、肝臓、肺、卵管（Ｏｖｉｄｕｃｔ）／卵管（Ｕｔｅｒｉｎｅ  Ｔｕｂｅ）、管／ファローピウス管、耳下唾液腺、胎盤、前立腺、網膜、骨格筋、胃、側頭葉、精巣、静脈。この情報は、ＳｅｑＣａｌｌｉｎｇ供給源、Ｐｕｂｌｉｃ  ＥＳＴ供給源、文献供給源、および／またはＲＡＣＥ供給源を含むがこれらに限定されない本発明に含まれる配列の組織供給源を決定することによって誘導された。
【０１６７】
（ＮＯＶ８ｃ）
新規なグリピカン−２前駆体様タンパク質をコードする、１６１３ヌクレオチドの開示されるＮＯＶ８ｃ核酸（ＣＧ５０９７０−０３とも呼ばれる）が、表８Ｅに示される。ヌクレオチド１〜３のＡＴＧ開始コドンで始まり、ヌクレオチド１３４８〜１３５０のＴＧＡコドンで終わる、オープンリーディングフレームが、同定された。終止コドンの下流の推定非翻訳領域は、表８Ｅにおいて下線を付されており、そして、開始コドンおよび終止コドンは、太字である。
【０１６８】
【表８Ｅ】
2004532613.tif 000078
2004532613.tif 000079
開示されるＮＯＶ８ｃ核酸配列は、第２染色体に位置付けされた。このＮＯＶ８ｃ核酸は、Ｒａｔｔｕｓ  ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ  ｃｅｒｅｂｒｏｇｌｙｃａｎ  ｍＲＮＡ（ｇｂ：ＧＥＮＢＡＮＫ−ＩＤ：ＲＡＴＣＲＢＧＬＶＣ｜ａｃｃ：Ｌ２０４６８．１）と同一な９９４塩基を１１７２塩基中に（８４％）有する（Ｅ＝１．３ｅ−２３７）。
【０１６９】
配列番号２３によってコードされる、開示されるＮＯＶ８ｃポリペプチド（配列番号２４）は、４４９アミノ酸残基であり、表８Ｆに１文字アミノ酸コードを用いて示される。Ｓｉｇｎａｌ  Ｐ、Ｐｓｏｒｔおよび／またはＨｙｄｒｏｐａｔｈｙの結果によって、ＮＯＶ８ｃが、シグナルペプチドを有し、確実性０．３７００でおそらく細胞外に局在化されることが、予測される。ＮＯＶ８ｃペプチドに関する最も可能性の高い切断部位は、アミノ酸２３と２４との間（ＧＰＧ−ＳＥ）である。
【０１７０】
【表８Ｆ】
2004532613.tif 000080
ＮＯＶ８ｃアミノ酸配列は、Ｒａｔｔｕｓ  ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓの５７９アミノ酸残基のグリピカン−２前駆体（ｃｅｒｅｂｒｏｇｌｙｃａｎ）タンパク質（ｐｔｎｒ：ＳＷＩＳＳＰＲＯＴ−ＡＣＣ：Ｐ５１６５３）と、同一な３３４アミノ酸残基を３９１アミノ酸残基のうちに有し（８５％）、類似する３５９アミノ酸残基を３９１アミノ酸残基のうちに有する（９１％）（Ｅ＝１．４ｅ−１８３）。
【０１７１】
ＮＯＶ８ｃは、少なくとも以下の組織において発現される：大動脈、脳、軟骨、頚部、肝臓、肺、卵管／卵管／ファローピウス管、耳下腺、唾液腺、胎盤、前立腺、網膜、骨格筋、胃、側頭葉、精巣、静脈。発現情報は、ＮＯＶ８ｃ配列の誘導体に含まれる配列の組織供給源に由来した。
【０１７２】
（ＮＯＶ８ｄ）
新規なグリピカン−２前駆体様タンパク質をコードする、７２５ヌクレオチドの開示されるＮＯＶ８ｄ核酸（ＣＧ５０９７０−０４とも呼ばれる）が、表８Ｇに示される。ヌクレオチド１６０〜１６２のＡＴＧ開始コドンで始まり、ヌクレオチド６８８〜６９０のＴＡＡコドンで終わる、オープンリーディングフレームが、同定された。開始コドンの上流の推定非翻訳領域および終止コドンの下流の推定非翻訳領域は、表８Ｇにおいて下線を付されており、そして、開始コドンおよび終止コドンは、太字である。
【０１７３】
【表８Ｇ】
2004532613.tif 000081
開示されるＮＯＶ８ｄ核酸配列は、第２染色体に位置付けされた。このＮＯＶ８ｄ核酸は、Ｒａｔｔｕｓ  ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ  ｃｅｒｅｂｒｏｇｌｙｃａｎ  ｍＲＮＡ（ｇｂ：ＧＥＮＢＡＮＫ−ＩＤ：ＲＡＴＣＲＢＧＬＶＣ｜ａｃｃ：Ｌ２０４６８．１）と同一な４４８塩基を５４５塩基中に（８２％）有する（Ｅ＝４．２ｅ−１０１）。
【０１７４】
配列番号２５によってコードされる、開示されるＮＯＶ８ｄポリペプチド（配列番号２６）は、１７６アミノ酸残基であり、表８Ｈに１文字アミノ酸コードを用いて示される。Ｓｉｇｎａｌ  Ｐ、Ｐｓｏｒｔおよび／またはＨｙｄｒｏｐａｔｈｙの結果によって、ＮＯＶ８ｄが、シグナルペプチドを有し、確実性０．４４６７でおそらく細胞外に局在化されることが、予測される。ＮＯＶ８ｄペプチドに関する最も可能性の高い切断部位は、アミノ酸２３と２４との間（ＧＰＧ−ＳＥ）である。
【０１７５】
【表８Ｈ】
2004532613.tif 000082
このＮＯＶ８ｄアミノ酸配列は、Ｒａｔｔｕｓ  ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓの５７９アミノ酸残基のグリピカン−２前駆体（ｃｅｒｅｂｒｏｇｌｙｃａｎ）タンパク質（ｐｔｎｒ：ＳＷＩＳＳＰＲＯＴ−ＡＣＣ：Ｐ５１６５３）と、同一な１０３アミノ酸残基を１１９アミノ酸残基のうちに有し（８６％）、類似する１１４アミノ酸残基を１１９アミノ酸残基のうちに有する（９５％）（Ｅ＝２．６ｅ−７３）。
【０１７６】
ＮＯＶ８ｄは、少なくとも以下の組織において発現される：大動脈、脳、軟骨、頚部、肝臓、肺、卵管／卵管／ファローピウス管、耳下腺、唾液腺、胎盤、前立腺、網膜、骨格筋、胃、側頭葉、精巣および静脈。発現情報は、ＮＯＶ８ｄ配列の誘導体に含まれる配列の組織供給源由来であった。
【０１７７】
ＧＰＣＲ８ｄに見出される可能なＳＮＰは、表８Ｉに列挙される。
【０１７８】
【表８Ｉ】
2004532613.tif 000083
このＮＯＶ８ａ〜ＮＯＶ８ｄタンパク質は、表８Ｊのアライメントに示されるように非常に近く相同である。
【０１７９】
【表８Ｊ】
2004532613.tif 000084
2004532613.tif 000085
上記のＮＯＶ８タンパク質のいずれかに対する相同性は、他のＮＯＶ８タンパク質によって、それらが上記のように互いに相同である範囲で、共有される。ＮＯＶ８への言及はいずれも、他のように示されない限り、一般に、ＮＯＶ８タンパク質の両方を指すことを想定する。
【０１８０】
この開示されるＮＯＶ８ポリペプチドは、表８Ｋに列挙されるＢＬＡＳＴＰデータに示されるアミノ酸配列に対する相同性を有する。
【０１８１】
【表８Ｋ】
2004532613.tif 000086
これらの配列と他の配列との間の相同性は、表８Ｌに示されるＣｌｕｓｔａｌＷ分析において図表的に示される。
【０１８２】
【表８Ｌ】
2004532613.tif 000087
2004532613.tif 000088
表８Ｍは、ＮＯＶ８ａに対するＤＯＭＡＩＮ分析結果からのドメインの説明を列挙する。これは、これらのドメインを含有することが公知である他のタンパク質の性質と類似の性質をＮＯＶ８ａ配列が有することを示す。
【０１８３】
【表８Ｍ】
2004532613.tif 000089
2004532613.tif 000090
グリピカンは、硫酸ヘパリンプロテオグリカンのファミリーであり、グリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）結合によって細胞膜に固着される。構造的に、これらのタンパク質は、３つの別々のドメイン：シグナル配列と、ジスルフィド結合におそらく関連する１２個の保存されたシステインを含み、かつ硫酸ヘパリングリコサミノグリカン側鎖の結合部位も含む約５００残基の細胞外ドメインとＧＰＩアンカーが形成された後で、翻訳後に除去されるＣ末端疎水性領域と、からなる。
【０１８４】
上に定義したＮＯＶ８に関する情報は、ＮＯＶ８がグリピカン−２前駆体ファミリーのメンバーとして機能し得ることを示唆する。従って、本発明のＮＯＶ８核酸およびＮＯＶ８タンパク質は、以下に記載される種々の疾患および障害ならびに／または他の病理に関連する潜在的な治療適用において有用である。例えば、本発明のＮＯＶ８組成物は、以下に罹患している患者の処置に効力を有する；糖尿病、インスリン非依存性糖尿病、自己免疫疾患、腎動脈狭窄症、間質性腎炎、糸球体腎炎、多発性嚢胞腎疾患、全身性エリテマトーデス、尿細管性アシドーシス、ＩｇＡ腎症、高カルシウム血症、レッシュナイハン症候群、血友病、凝固能亢進、特発性血小板減少性紫斑病、免疫欠損、対宿主性移植片病、フォン・ヒッペル―リンダウ（ＶＨＬ）症候群、アルツハイマー病、発作、結節硬化症、パーキンソン病、ハンティングトン病、脳性麻痺、てんかん、多発性硬化症、毛細管拡張性運動失調、白質萎縮症、行動障害、嗜癖、不安、疼痛、神経変性、癌、発育異常、長鎖欠損アシル−ＣｏＡ  デヒドロゲナーゼ、短指症、Ａ１型、カルバモイルリン酸シンセターゼＩ欠損、拡張型心筋症ＩＩ型、Ｃｏｐｐｏｃｋ様白内障、棘状結晶状白内障（Ｃａｔａｒａｃｔ  ｃｒｙｓｔａｌｌｉｎｅ  ａｃｕｌｅｉｆｏｒｍ）、先天性多形白内障（Ｃａｔａｒａｃｔ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｏｃ  ｃｏｎｇｅｎｉｔａｌ）、可変性小帯層間白内障（Ｃａｔａｒａｃｔ  ｖａｒｉａｂｌｅ  ｚｏｎｕｌａｒ  ｐｕｌｖｅｒｕｌｅｎｔ）、若年性進行性点状白内障（Ｃａｔａｒａｃｔｓ  ｐｕｎｃｔａｔｅ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ  ｊｕｖｅｎｉｌｅ−ｏｎｓｅ）、家族性発作性舞踏病アテトーシス、脳顔面頭蓋難聴−手症候群、２型葉状魚鱗癬、デスミン関連心筋骨格筋（ｃａｒｄｉｏｓｋｅｌｅｔａ）筋障害、ＴＢに対する抵抗／感受性、肺胞横紋筋肉腫、Ｉ型およびＩＩＩ型ワールデンブルヒ症候群、常染色体劣性アルポート症候群、ブヨルンスタッド症候群、良性家族性血尿（Ｈｅｍａｔｕｒｉａ，ｆａｍｉｒｉａｌ  ｂｅｎｉｇｎ）、原発性高シュウ酸尿症、１型、１型合指症、高グルカゴン血症、筋ジストロフィー、Ｅ型短指症、短指症精神遅滞症候群、Ｆｉｎｎｉｓｈ致死性新生児代謝症候群、２に対する感受性、Ｓｉｍｐｓｏｎ−Ｇｏｌａｂｉ−Ｂｅｈｍｅｌ症候群、１型および２型ベックウィズ‐ヴィーデマン症候群。本発明のグリピカン−２前駆体様タンパク質をコードするＮＯＶ８核酸、およびグリピカン−２前駆体様タンパク質、もしくはそれらのフラグメントは、診断適用においてさらに有用であり得、その適用において、その核酸またはタンパク質の存在または量が、評価される。
【０１８５】
（ＮＯＶ９）
新規なマイトジェン活性化プロテインキナーゼキナーゼ２様タンパク質をコードする、９８５ヌクレオチドの開示されるＮＯＶ９核酸（ＡＣ０１１００５＿ｄａ２／１３９９４３５７８とも呼ばれる）が、表９Ａに示される。ヌクレオチド５４〜５６のＡＴＧ開始コドンで始まり、ヌクレオチド９７５〜９７７のＴＧＡコドンで終わる、オープンリーディングフレームが、同定された。開始コドンおよび終止コドンは、太字である。
【０１８６】
【表９Ａ】
2004532613.tif 000091
開示されるＮＯＶ９核酸配列は、（ｇｂ：ＧＥＮＢＡＮＫ−ＩＤ：ＨＵＭＭＥＫ２ＮＦ｜ａｃｃ：Ｌ１１２８５）由来のＨｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ＥＲＫアクチベーターキナーゼ（ＭＥＫ２）ｍＲＮＡと同一な７５４塩基を７５９塩基中に（９９％）有する（Ｅ＝１．３ｅ−２１１）。このＮＯＶ９核酸配列は、様々なアミノ酸変化を生じる多数のＳＮＰを含む。
【０１８７】
配列番号２７によってコードされる、開示されるＮＯＶ９ポリペプチド（配列番号２８）は、３０７アミノ酸残基であり、表９Ｂに１文字アミノ酸コードを用いて示される。Ｓｉｇｎａｌ  Ｐ、Ｐｓｏｒｔおよび／またはＨｙｄｒｏｐａｔｈｙの結果によって、ＮＯＶ９が、シグナルペプチドを有さず、確実性０．５５００でおそらく細胞質に局在化されることが、予測される。
【０１８８】
【表９Ｂ】
2004532613.tif 000092
ＮＯＶ９アミノ酸配列は、Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓの４００アミノ酸残基のマイトージェン活性化プロテインキナーゼキナーゼ２（ＥＣ  ２．７．１．−）（ＭＡＰキナーゼキナーゼ２）（ＭＡＰＫＫ２）（ＥＲＫアクチベーターキナーゼ２（ｐｔｎｒ：ＳＷＩＳＳＰＲＯＴ−ＡＣＣ：Ｐ３６５０７）と、同一な２３６アミノ酸残基を２３６アミノ酸残基のうちに有し（１００％）、類似する２３６アミノ酸残基を２３６アミノ酸残基のうちに有する（１００％）（Ｅ＝８．２ｅ−１６１）。
【０１８９】
ＮＯＶ９は、少なくとも以下の組織において発現される：副腎（ａｄｒｅｎａｌ  ｇｌａｎｄ）／腎上体（ｓｕｐｒａｒｅｎａｌ  ｇｌａｎｄ）、扁桃、骨、骨髄、脳、結腸、冠状動脈、真皮、表皮、包皮、心臓、視床下部、腎臓、肝臓、肺、リンパ節、リンパ組織、乳腺／乳房、筋肉、神経、卵巣、膵臓、末梢血管、下垂体、胎盤、前立腺、網膜、小腸、脾臓、胃、精巣、胸腺、舌、扁桃、腫瘍、臍静脈、子宮、生物全体。この情報は、本発明に含まれる配列の組織供給源を決定することにより誘導された。さらに、ＮＯＶ９は、密接に関連するＨｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ＥＲＫアクチベーターキナーゼ（ＭＥＫ２）ｍＲＮＡホモログ（ＧＥＮＢＡＮＫ−ＩＤ：ｇｂ：ＧＥＮＢＡＮＫ−ＩＤ：ＨＵＭＭＥＫ２ＮＦ｜ａｃｃ：Ｌ１１２８５）の発現パターンが原因で、以下の組織に発現されることが予測される：リンパ組織、神経組織、胃腸組織、末梢血、および心臓血管組織。
【０１９０】
ＮＯＶ９はまた、表９Ｃに列挙されるＢＬＡＳＴＰデータにおいて示されるアミノ酸配列との相同性を有する。
【０１９１】
【表９Ｃ】
2004532613.tif 000093
2004532613.tif 000094
これらの配列の相同性は、表９Ｄに示されるＣｌｕｓｔａｌＷ分析において図表的に示される。
【０１９２】
【表９Ｄ】
2004532613.tif 000095
2004532613.tif 000096
表９Ｅおよび９Ｆは、ＮＯＶ９に対するＤＯＭＡＩＮ分析結果からのドメインの説明を列挙する。これは、これらのドメインを含有することが公知である他のタンパク質の性質と類似の性質をＮＯＶ９配列が有することを示す。
【０１９３】
【表９Ｅ】
2004532613.tif 000097
【０１９４】
【表９Ｆ】
2004532613.tif 000098
ＮＯＶ９のアミノ酸配列は、表９Ｇに示されるような他のタンパク質に対して高い相同性を有する。
【０１９５】
【表９Ｇ】
2004532613.tif 000099
ＮＯＶ９に関するタンパク質類似性情報、発現パターン、マップ位置は、ＮＯＶ９がマイトジェン活性化プロテインキナーゼキナーゼ２タンパク質ファミリーに特徴的な重要な構造および／または生物学的機能を有し得ることを示唆する。従って、本発明のＮＯＶ９核酸およびＮＯＶ９タンパク質は、以下に記載される種々の疾患および障害および／または他の病理に関連する潜在的な治療適用において有用である。例えば、本発明のＮＯＶ９組成物は、アテローム硬化症、代謝病、病原体感染および神経性疾患に罹患している患者の処置に効力を有する。本発明のマイトジェン活性化プロテインキナーゼキナーゼ２様タンパク質をコードするＮＯＶ９核酸、およびマイトージェン活性化タンパク質キナーゼキナーゼ２様タンパク質、もしくはそのフラグメントは、診断適用においてさらに有用であり得、その適用において、その核酸またはタンパク質の存在または量が、評価される。
【０１９６】
（ＮＯＶ１０）
ジンクフィンガータンパク質２７６  Ｃ２Ｈ２型様タンパク質をコードする、１５０６ヌクレオチドの開示されるＮＯＶ１０核酸（ｓｇｇｃ＿ｄｒａｆｔ＿ｃ３３３ｅ１＿２００００８０４＿ｄａ２とも呼ばれる）が、表１０Ａに示される。ヌクレオチド３８５〜３８７のＡＴＧ開始コドンで始まり、ヌクレオチド１５０４〜１５０６のＴＧＡコドンで終わる、オープンリーディングフレームが、同定された。開始コドンの上流の推定非翻訳領域は、表１０Ａにおいて下線を付されており、そして、開始コドンおよび終止コドンは、太字である。
【０１９７】
【表１０Ａ】
2004532613.tif 000100
第１６染色体において位置決めされた開示されるＮＯＶ１０核酸配列は、Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ファンコーニ貧血Ａ群遺伝子、エキソン３９、４０、４１、４２および４３のｍＲＮＡ（ｇｂ：ＧＥＮＢＡＮＫ−ＩＤ：ＨＳＺ８３０９５｜ａｃｃ：Ｚ８３０９５）と同一な２７１塩基を２７１塩基中に（１００％）有する（Ｅ＝９．４ｅ−７７）。
【０１９８】
配列番号２９によってコードされる、開示されるＮＯＶ１０ポリペプチド（配列番号３０）は、３７３アミノ酸残基であり、表１０Ｂに１文字アミノ酸コードを用いて示される。Ｓｉｇｎａｌ  Ｐ、Ｐｓｏｒｔおよび／またはＨｙｄｒｏｐａｔｈｙの結果によって、ＮＯＶ１０が、シグナルペプチドを有し、確実性０．５５１７でおそらく糸粒体基質空間に局在化されることが、予測される。
【０１９９】
【表１０Ｂ】
2004532613.tif 000101
ＮＯＶ１０アミノ酸配列は、Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓの３７２アミノ酸残基のジンクフィンガータンパク質２７６  Ｃ２Ｈ２型（ｐｔｎｒ：ＴＲＥＭＢＬＮＥＷ−ＡＣＣ：ＡＡＧ０１６３４）と、同一な３１０アミノ酸残基を３７３アミノ酸残基のうちに有し（８３％）、類似する３２５アミノ酸残基を３７３アミノ酸残基のうちに有する（８７％）（Ｅ＝６．３ｅ−１６９）。
【０２００】
ＮＯＶ１０は、少なくとも以下の組織において発現される：骨髄、脳、頸、結腸、冠状動脈、心臓、視床下部、腎臓、リンパ節、肺、卵巣、末梢血、前立腺、精巣、甲状腺、扁桃、子宮および生物体全体。
【０２０１】
開示されるＮＯＶ１０ポリペプチドは、表１０Ｃに列挙されるＢＬＡＳＴＰデータにおいて示されるアミノ酸配列との相同性を有する。
【０２０２】
【表１０Ｃ】
2004532613.tif 000102
これらの配列と他の配列との間の相同性は、表１０Ｄに示されるＣｌｕｓｔａｌＷ分析において図表的に示される。
【０２０３】
【表１０Ｄ】
2004532613.tif 000103
2004532613.tif 000104
表１０Ｅは、ＮＯＶ１０に対するＤＯＭＡＩＮ分析結果からのドメインの説明を列挙する。これは、これらのドメインを含有することが公知である他のタンパク質の性質と類似の性質をＮＯＶ１０配列が有することを示す。
【０２０４】
【表１０Ｅ】
2004532613.tif 000105
ＮＯＶ１０のタンパク質類似性情報、発現パターン、マップ位置は、ＮＯＶ１０が、ジンクフィンガータンパク質２７６  Ｃ２Ｈ２型タンパク質ファミリーに特徴的な重要な構造および／または生物学的機能を有し得ることを示唆する。従って、本発明のＮＯＶ１０核酸およびＮＯＶ１０タンパク質は、以下に記載される種々の疾患および障害および／または他の病理に関連する潜在的な治療適用において有用である。例えば、本発明のＮＯＶ１０組成物は、癌、外傷、免疫学的疾患、呼吸疾患、心臓疾患、胃腸疾患、リプロダクティブヘルス（ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ  ｈｅａｌｔｈ）、神経性疾患および神経変性疾患、骨髄移植、代謝病および内分泌疾患、アレルギーおよび炎症、腎臓病学的障害、造血障害および泌尿系障害に罹患している患者の処置に効力を有する。本発明のジンクフィンガータンパク質２７６  Ｃ２Ｈ２型様タンパク質をコードするＮＯＶ１０核酸、およびジンクフィンガータンパク質２７６  Ｃ２Ｈ２型様タンパク質、もしくはそのフラグメントは、診断適用においてさらに有用であり得、その適用において、その核酸またはタンパク質の存在または量が、評価される。
【０２０５】
（ＮＯＶ１１）
ＮＯＶ１１は、以下に開示される、２つの新規サイモシン（Ｔｈｙｍｏｓｉｎ）β−１０−様タンパク質を含む。この開示されるタンパク質は、ＮＯＶ１１ａおよびＮＯＶ１１ｂと名付けられた。
【０２０６】
（ＮＯＶ１１ａ）
開示される１２９ヌクレオチドのＮＯＶ１１ａ核酸（またＧＭＡＣ０７９４００＿Ａと呼ばれる）は、新規サイモシンβ−１０様タンパク質をコードしており、表１１Ａに示される。オープンリーディングフレームは、ヌクレオチド２８〜３０でのＡＴＧ開始コドンで始まり、ヌクレオチド１５７〜１５９でのＴＡＡコドンで終止することが同定された。表１１Ａにおいて、開始コドンから上流および終止コドンから下流の推定の非翻訳領域に、下線を付し、そして開始コドンおよび終止コドンを太字で示す。
【０２０７】
【表１１Ａ】
2004532613.tif 000106
開示されるＮＯＶ１１ａ核酸配列は、Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓのサイモシンβ−１０  ｍＲＮＡ（ＧＥＮＢＡＮＫ−ＩＤ：Ｓ５４００５）に対し、１９０塩基の内１７２塩基（９０％）の同一性を有する（Ｅ＝３．１ｅ−２８）。
【０２０８】
配列番号３１にコードされる、開示されるＮＯＶ１１ａポリペプチド（配列番号３２）は、４３アミノ酸残基であり、そして表１１Ｂにおいて、１文字アミノ酸コードを用いて示される。Ｓｉｇｎａｌ  Ｐ、Ｐｓｏｒｔおよび／または疎水性親水性指標（Ｈｙｄｒｏｐａｔｈｙ）の結果は、ＮＯＶ１１ａがシグナルペプチドを含まず、そして０．５４２６の確実度で核に局在する可能性があると予測する。
【０２０９】
【表１１Ｂ】
2004532613.tif 000107
ＮＯＶ１１ａのアミノ酸配列は、Ｒａｔｔｕｓ  ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓの４４アミノ酸残基のサイモシンβ−１０タンパク質（Ａ２７２６６）に対し、４４アミノ酸残基の内３７アミノ酸残基（８４％）の同一性、および４４アミノ酸残基の内４０アミノ酸残基（９０％）の類似性を有する（Ｅ＝２．４ｅ−１２）。このグローバルな配列相同性は、８８．３７２％のアミノ酸相同性および８６．０４７％のアミノ酸同一性である。
【０２１０】
ＮＯＶ１１ａは、Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓのサイモシンβ−１０ホモログ（ＧＥＮＢＡＮＫ−ＩＤ：Ｓ５４００５）と密接な関係のある発現パターンのため、転移性黒色種（Ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ  Ｍｅｌａｎｏｍａ）組織で発現されると予測される。
【０２１１】
（ＮＯＶ１１ｂ）
開示される１７３ヌクレオチドのＮＯＶ１１ｂ核酸（またＣＧ１０９７５４−０１と呼ばれる）は、新規サイモシンβ−１０−様タンパク質をコードしており、表１１Ｃに示される。オープンリーディングフレームは、ヌクレオチド２７〜２９でのＡＴＧ開始コドンで始まり、ヌクレオチド１５６〜１５８でのＴＡＡコドンで終止することが同定された。表１１Ｃにおいて、開始コドンから上流および終止コドンから下流の推定の非翻訳領域に、下線を付し、そして開始コドンおよび終止コドンを太字で示す。
【０２１２】
【表１１Ｃ】
2004532613.tif 000108
開示されるＮＯＶ１１ｂ核酸配列は、第２染色体に局在し、Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓサイモシンβ−１０  ｍＲＮＡ（ｇｂ：ＧＥＮＢＡＮＫ−ＩＤ：ＨＵＭＴＨＭＢＸ｜ａｃｃ：Ｍ９２３８１．１）に対し、１６８塩基の内１５５塩基（９２％）の同一性を有する（Ｅ＝４．１ｅ−２５）。
【０２１３】
配列番号３３にコードされる、開示されるＮＯＶ１１ｂポリペプチド（配列番号３４）は、４３アミノ酸残基であり、そして表１１Ｄにおいて、１文字表記アミノ酸コードを使用して示される。Ｓｉｇｎａｌ  Ｐ、Ｐｓｏｒｔおよび／または疎水性親水性指標の結果は、ＮＯＶ１１ｂがシグナルペプチドを含まず、そして０．５４２６の確実度で核に局在する可能性があると予測する。ＰＳＯＲＴは、ＮＯＶ１１ｂポリペプチドが、核に局在し得ることを示すが、このＮＯＶ１１ｂタンパク質は、サイモシンファミリーに類似し、そのファミリーのいくつかのメンバーは細胞外に放出される。従って、この新規サイモシンβ  １０−様タンパク質は、細胞外空間に局在する可能性があると予測する。
【０２１４】
【表１１Ｄ】
2004532613.tif 000109
このＮＯＶ１１ｂのアミノ酸配列は、Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓの４３アミノ酸残基のサイモシンβ−１０タンパク質（ｐｔｎｒ：ＳＷＩＳＳＮＥＷ−ＡＣＣ：Ｐ１３４７２）に対し、４３アミノ酸残基の内３６アミノ酸残基（８３％）の同一性、および４３アミノ酸残基の内３９アミノ酸残基（９０％）の類似性を有する（Ｅ＝１．７ｅ−１２）。ＮＯＶ１１ｂタンパク質は、４３アミノ酸長く、公開されているタンパク質Ｐ１３４７２と同じ長さである。ＮＯＶ１１ｂタンパク質は、８アミノ酸位置で異なる。ＮＯＶ１１ｂは、公開されているＧｅｎＢａｎｋの寄託物（ｓｕｂｍｉｓｓｉｏｎ）が欠いているメチオニンで始まる。これに加え、６個の単一アミノ酸変化（Ｍ６Ｖ、Ｅ８Ｇ、Ｄ１４Ｎ、Ｋ１５Ｒ、Ｉ３４Ｔ、Ｅ３５Ｇ）、および単一アミノ酸欠失（Ｅ３７−）が存在する。このような短いペプチドにおけるこのいくつかの変化は、ＮＯＶ１１ｂタンパク質が公開されているタンパク質とは異なる遺伝子由来であることを示す。
【０２１５】
ＮＯＶ１１ｂは、Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓのサイモシンβ−１０ホモログ（ＧＥＮＢＡＮＫ−ＩＤ：ｇｂ：ＧＥＮＢＡＮＫ−ＩＤ：ＨＵＭＴＨＭＡＸ｜ａｃｃ：Ｍ９２３８１．１）と密接な関係のある発現パターンのため、脳組織および神経芽細胞腫組織で発現されると予測される。
【０２１６】
表１１Ｅでのアミノ酸アラインメントにおいて示されるように、ＮＯＶ１１ａおよびＮＯＶ１１ｂは、非常に厳密に相同である。
【０２１７】
【表１１Ｅ】
2004532613.tif 000110
上記に示されるように、それらが互いに相同である限り、任意の上記ＮＯＶ１１タンパク質に対する相同性は、他のＮＯＶ１１タンパク質によって共有される。ＮＯＶ１１への言及はいずれも、特に断りのない限り、一般に、それらのＮＯＶ１１タンパク質の両方に言及されると仮定される。
【０２１８】
ＮＯＶ１１ａはまた、表１１Ｆに列挙されるＢＬＡＳＴＰデータで示されるアミノ酸配列に対して相同性を有する。
【０２１９】
【表１１Ｆ】
2004532613.tif 000111
これらの配列の相同性は、表１１Ｇに示されるＣｌｕｓｔａｌＷ解析で写実的に示される。
【０２２０】
【表１１Ｇ】
2004532613.tif 000112
表１１Ｈに示されるように、ＮＯＶ１１のアミノ酸配列は、他のタンパク質に対して高い相同性を有する。
【０２２１】
【表１１Ｈ】
2004532613.tif 000113
ＮＯＶ１１タンパク質およびＮＯＶ１１核酸に関するタンパク質類似性情報、発現パターン、および地図位置は、ＮＯＶ１１が、重要な構造および／またはサイモシンβ  １０ファミリーの生理学的機能特性を有し得ることを示唆する。従って、本発明のＮＯＶ１１核酸およびＮＯＶ１１タンパク質は、以下に記載される種々の疾患および障害、ならびに／または他の病理学に関連した、潜在的な治療適用に有用である。例えば、本発明のＮＯＶ１１組成物は、前立腺癌、免疫学的障害および自己免疫障害（すなわち、甲状腺機能亢進症）、新脈管形成および創傷治癒、アポトーシスの調節、神経変性障害および神経心理学的障害、加齢関連障害、脾臓、胸腺、肺、および腹腔マクロファージに関する病理学的障害、ならびに／または他の病理学および障害を罹患する患者の処置に対する効力を有する。サイモシンβ  １０−様タンパク質をコードするＮＯＶ１１核酸、および本発明のサイモシンβ  １０−様タンパク質、またはそれらのフラグメントはさらに、診断適用に有用であり得る。ここで、核酸またはタンパク質の存在または量が、評価されるべきである。
【０２２２】
（ＮＯＶＸ核酸およびポリペプチド）
本発明の１つの局面は、ＮＯＶＸポリペプチドまたはそれらの生物学的活性部分をコードする核酸分子を単離するために、適切である。ＮＯＶＸ核酸分子の増幅および／または変異のためのＰＣＲプライマーとしての使用のために十分な、ＮＯＶＸをコードしている核酸（例えば、ＮＯＶＸ  ｍＲＮＡ）およびフラグメントを同定するためのハイブリダイゼーションプローブとしての使用のために十分な核酸フラグメントもまた、本発明に含まれる。本明細書中で使用される場合、用語「核酸分子」は、ＤＮＡ分子（例えば、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）、ＲＮＡ分子（例えば、ｍＲＮＡ）、ヌクレオチドアナログを使用して作成されるＤＮＡまたはＲＮＡのアナログ、ならびにそれらの誘導体、フラグメントおよびホモログを含むことが意図される。核酸分子は、一本鎖または二本鎖であり得るが、好ましくは、二本鎖ＤＮＡで構成される。
【０２２３】
ＮＯＶＸ核酸は、成熟ＮＯＶＸポリペプチドをコードし得る。本明細書中で使用される場合、本発明において開示されるポリペプチドまたはタンパク質の「成熟」形態は、天然に存在するポリペプチドの産物または前駆体形態またはプロプロテイン（ｐｒｏｐｒｏｔｅｉｎ）である。天然に存在するポリペプチド、前駆体またはプロプロテインとしては、非限定的な例として、対応する遺伝子によりコードされる全長遺伝子産物が挙げられる。あるいは、これは、本明細書中に記載されるＯＲＦによりコードされるポリペプチド、前駆体またはプロプロテインとして規定され得る。産物「成熟」形態は、また非限定的な例として、１つ以上の天然に存在するプロセシング工程（これらが、この遺伝子産物が生じる細胞または宿主細胞内で起こり得る場合）の結果として生じる。ポリペプチドまたはタンパク質の「成熟」形態を導くこのようなプロセシング工程の例としては、ＯＲＦの開始コドンによりコードされるＮ末端メチオニン残基の切断、あるいはシグナルペプチドまたはリーダー配列のタンパク質分解切断が挙げられる。従って、残基１〜Ｎ（残基１がＮ末端メチオニンである）を有する前駆体ポリペプチドまたはタンパク質から生じる成熟形態は、Ｎ末端メチオニンの除去後に残っている残基２〜Ｎを有する。あるいは、残基１〜Ｎ（ここで、Ｎ末端シグナル配列（残基１〜残基Ｍ）が切断される）を有する前駆体ポリペプチドまたはタンパク質から生じる成熟形態は、残りの残基Ｍ＋１〜残基Ｎの残基を有する。さらに、本明細書中で使用される場合、ポリペプチドまたはタンパク質の「成熟」形態は、タンパク質分解事象ではなく、翻訳後修飾の工程から生じ得る。このようなさらなるプロセスとしては、非限定的な例として、グリコシル化、ミリストイル化またはリン酸化が挙げられる。一般に、成熟ポリペプチドまたはタンパク質は、これらのプロセスの１つのみまたはこれらの任意の組み合わせの操作から生じ得る。
【０２２４】
用語「プローブ」とは、本明細書中で使用される場合、種々の長さの核酸配列をいい、好ましくは、特定の用途に依存して、少なくとも約１０ヌクレオチド（ｎｔ）、１００ｎｔ、または例えば、約６，０００ｎｔほどの大きさの間である。プローブは、同一、類似または相補的な核酸配列の検出において使用される。より長い長さのプローブは、通常、天然供給源または組換え供給源から入手され、非常に特異的であり、そしてより短い長さのオリゴマープローブよりもはるかに遅くハイブリダイズする。プローブは、一本鎖または二本鎖であり得、そしてＰＣＲ技術、膜ベースのハイブリダイゼーション技術、またはＥＬＩＳＡ様の技術において特異性を有するように設計され得る。
【０２２５】
用語「単離された」核酸分子は、本明細書中で使用される場合、この核酸の天然供給源中に存在する他の核酸分子から分離された核酸分子である。好ましくは、「単離された」核酸は、この核酸が由来する生物のゲノムＤＮＡ中でこの核酸に天然に隣接する配列（すなわち、この核酸の５’末端および３’末端に位置する配列）を含まない。例えば、種々の実施形態において、単離されたＮＯＶＸ核酸分子は、この核酸が由来する細胞／組織（例えば、脳、心臓、肝臓、脾臓など）のゲノムＤＮＡ中でこの核酸分子に天然で隣接する、約５ｋｂ、４ｋｂ、３ｋｂ、２ｋｂ、１ｋｂ、０．５ｋｂ、または０．１ｋｂ未満のヌクレオチド配列を含み得る。さらに、「単離された」核酸分子（例えば、ｃＤＮＡ分子）は、組換え技術により産生される場合、その他の細胞物質または培養培地を実質的に含み得ないか、もしくは化学的に合成される場合、化学物質前駆体または他の化学物質を実質的に含み得ない。
【０２２６】
本発明の核酸分子（例えば、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１または３３のヌクレオチド配列を有する核酸分子、またはこの上記のヌクレオチド配列の相補体）は、標準的な分子生物学的技術および本明細書で提供される配列情報を用いて単離され得る。ハイブリダイゼーションプローブとして、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１および３３の核酸配列の全部または一部を使用して、ＮＯＶＸ分子は、標準的なハイブリダイゼーション技術およびクローニング技術（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（編）、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ  第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ、１９８９；およびＡｕｓｕｂｅｌら（編）、ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ＮＹ、１９９３に記載されるような）を用いて単離され得る。
【０２２７】
本発明の核酸は、標準的なＰＣＲ増幅技術に従って、テンプレートとしてｃＤＮＡ、ｍＲＮＡあるいはゲノムＤＮＡ、および適切なオリゴヌクレオチドプライマーを用いて増幅され得る。このように増幅された核酸は、適切なベクター中にクローニングされ得、そしてＤＮＡ配列分析により特徴付けられ得る。さらに、ＮＯＶＸヌクレオチド配列に対応するオリゴヌクレオチドは、標準的な合成技術（例えば、自動化ＤＮＡ合成機を用いる）により調製され得る。
【０２２８】
本明細書中で使用される場合、用語「オリゴヌクレオチド」は、一連の連結されたヌクレオチド残基をいい、このオリゴヌクレオチドは、ＰＣＲ反応で用いられるに十分な数のヌクレオチド塩基を有する。短いオリゴヌクレオチド配列は、ゲノム配列またはｃＤＮＡ配列に基づき得るか、あるいはそれから設計され得、そして特定の細胞または組織において、同一、類似または相補的なＤＮＡもしくはＲＮＡを増幅し、確認し、またはその存在を示すために用いられる。オリゴヌクレオチドは、約１０ｎｔ長、５０ｎｔ長、または１００ｎｔ長、好ましくは約１５ｎｔ〜３０ｎｔ長を有する核酸配列の一部を含む。本発明の１つの実施形態において、１００ｎｔ長未満の核酸分子を含むオリゴヌクレオチドは、さらに、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１および３３の少なくとも６個連続するヌクレオチド、またはその相補体を含む。オリゴヌクレオチドは、化学的に合成され得、そしてまたプローブとして用いられ得る。
【０２２９】
別の実施形態において、本発明の単離された核酸分子は、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１および３３に示されるヌクレオチド配列またはこのヌクレオチド配列の一部（例えば、プローブまたはプライマーとして使用され得るフラグメント、あるいはＮＯＶＸポリペプチドの生物学的に活性な部分をコードするフラグメント）の相補体である核酸分子を含む。配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１または３３に示されるヌクレオチド配列に相補的である核酸分子は、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１または３３に示されるヌクレオチド配列に十分相補的である核酸分子であり、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１または３３に示されるヌクレオチド配列に対してミスマッチがほとんどないかまたは全くなく水素結合し得、それによって安定な二重鎖を形成する核酸分子である。
【０２３０】
本明細書中で使用される場合、用語「相補的」は、核酸分子のヌクレオチド単位間のＷａｔｓｏｎ−ＣｒｉｃｋまたはＨｏｏｇｓｔｅｅｎ塩基対形成をいい、そして用語「結合」は、２つのポリペプチドまたは化合物あるいは関連ポリペプチドまたは化合物あるいはその組合せの間の物理的または化学的相互作用を意味する。結合は、イオン性相互作用、非イオン性相互作用、ファンデルワールス性相互作用、疎水性相互作用などを含む。物理的相互作用は、直接的または間接的のいずれかであり得る。間接的相互作用は、別のポリペプチドまたは化合物を介し得るか、またはその効果に起因し得る。直接的結合は、別のポリペプチドもしくは化合物を介してか、またはその効果に起因して生じないが、その他の実質的な化学的中間体がない相互作用をいう。
【０２３１】
本明細書中に提供されるフラグメントは、少なくとも６個の（連続する）核酸配列または少なくとも４個の（連続する）アミノ酸配列（それぞれ、核酸の場合には、特異的なハイブリダイゼーションを可能にするに十分な長さ、またはアミノ酸の場合には、エピトープの特異的な認識を可能にするに十分な長さ）として規定され、そして全長配列未満のせいぜいいくらかの部分である。フラグメントは、選択された核酸配列またはアミノ酸配列の任意の連続する部分に由来し得る。誘導体は、直接的にかまたは改変もしくは部分的置換によってかのいずれかでネイティブな化合物から形成される核酸配列またはアミノ酸配列である。アナログは、ネイティブな化合物に類似する（ただし、同一ではない）構造を有するが、特定の成分または側鎖に関してそれとは異なる、核酸配列またはアミノ酸配列である。アナログは、合成物であり得るか、または進化的に異なる起源に由来し得、そして野生型と比較して、類似の代謝活性または反対の代謝活性を有し得る。ホモログは、異なる種由来の特定の遺伝子の核酸配列またはアミノ酸配列である。
【０２３２】
誘導体およびアナログは、以下に記載されるように、誘導体またはアナログが、修飾された核酸またはアミノ酸を含む場合、全長、または全長以外のものであり得る。本発明の核酸またはタンパク質の誘導体またはアナログとしては、種々の実施形態において、同一の大きさの核酸配列もしくはアミノ酸配列にわたって、または整列した配列（この整列は、当該分野で公知であるコンピューター相同性プログラムによって実施される）と比較した場合、本発明の核酸もしくはタンパク質に少なくとも約７０％、８０％、または９５％の同一性（好ましい同一性は、８０〜９５％）で実質的に相同である領域、あるいはそのコードする核酸がストリンジェントな条件、中程度にストリンジェントな条件、または低いストリンジェントな条件下で上記のタンパク質をコードする配列の相補体にハイブリダイズし得る領域を含む分子が挙げられるが、これらに限定されない。例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら、ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ＮＹ、１９９３、および以下を参照のこと。
【０２３３】
「相同な核酸配列」もしくは「相同なアミノ酸配列」、またはその改変体とは、上記で考察したように、ヌクレオチドレベルまたはアミノ酸レベルにおける相同性によって特徴付けられる配列をいう。相同なヌクレオチド配列は、ＮＯＶＸポリペプチドのアイソフォームをコードする配列をコードする。アイソフォームは、例えば、ＲＮＡの選択的スプライシングの結果として、同一の生物の異なる組織において発現され得る。あるいは、アイソフォームは、異なる遺伝子によってコードされ得る。本発明において、相同なヌクレオチド配列は、ヒト以外の種（脊椎動物が挙げられるが、これに限定されず、従って、例えば、カエル、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ウマおよび他の生物が挙げられ得る）のＮＯＶＸポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。相同なヌクレオチド配列としてはまた、天然に存在する対立遺伝子改変体および本明細書に記載されるヌクレオチド配列の変異体が挙げられるが、これらに限定されない。しかし、相同的ヌクレオチド配列は、ヒトＮＯＶＸタンパク質をコードする正確なヌクレオチド配列を含まない。相同核酸配列は、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１および３３の保存的アミノ酸置換（以下を参照のこと）、ならびにＮＯＶＸ生物学的活性を保有するポリペプチドをコードする核酸配列を含む。ＮＯＶＸタンパク質の種々の生物学的活性は、以下に記載されている。
【０２３４】
ＮＯＶＸポリペプチドは、ＮＯＶＸ核酸のオープンリーディングフレーム（「ＯＲＦ」）によりコードされる。ＯＲＦは、ポリペプチドに潜在的に翻訳され得るヌクレオチド配列に対応する。ＯＲＦを含む核酸のストレッチは、終止コドンによって途切れない。全タンパク質についてのコード配列を表すＯＲＦは、ＡＴＧ「開始（ｓｔａｒｔ）」コドンで始まり、そして３つの「終止（ｓｔｏｐ）」コドン（すなわち、ＴＡＡ、ＴＡＧまたはＴＧＡ）のうちの１つで終止する。本発明の目的で、ＯＲＦは、開始コドン、終止コドンまたはその両方を有するかまたは有さない、コード配列の任意の部分であり得る。ｂｏｎａ  ｆｉｄｅ細胞タンパク質をコードするための良好な候補としてみなされるＯＲＦについて、最小サイズの要求（例えば、５０アミノ酸以上のタンパク質をコードするＤＮＡのストレッチ）が、しばしば設定される。
【０２３５】
ヒトＮＯＶＸ遺伝子のクローニングから決定されたヌクレオチド配列は、他の細胞型（例えば、他の組織由来）におけるＮＯＶＸホモログ、ならびに他の脊椎動物由来のＮＯＶＸホモログを同定および／またはクローニングする際に使用するために設計されるプローブおよびプライマーの作製を可能にする。このプローブ／プライマーは、代表的には、実質的に精製されたオリゴヌクレオチドを含む。このオリゴヌクレオチドは、代表的には、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１および３３の少なくとも約１２個、約２５個、約５０個、約１００個、約１５０個、約２００個、約２５０個、約３００個、約３５０個もしくは約４００個の連続するセンス鎖ヌクレオチド配列；あるいは配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１および３３のアンチセンス鎖ヌクレオチド配列；または配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１および３３の天然に存在する変異体のアンチセンス鎖ヌクレオチド配列に、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列の領域を含む。
【０２３６】
ヒトＮＯＶＸヌクレオチド配列に基づくプローブは、同じかまたは相同なタンパク質をコードする転写物またはゲノム配列を検出するために使用され得る。種々の実施形態において、このプローブはさらに、プローブに付着した標識基を含み、例えば、この標識基は、放射性同位体、蛍光化合物、酵素または酵素補因子であり得る。このようなプローブは、ＮＯＶＸタンパク質を誤って発現する細胞または組織を同定するための診断試験キットの一部として、例えば、被験体由来の細胞のサンプル中のＮＯＶＸをコードする核酸のレベルを測定すること（例えば、ＮＯＶＸ  ｍＲＮＡレベルを検出すること、またはゲノムＮＯＶＸ遺伝子が変異もしくは欠失しているか否かを決定すること）によって使用され得る。
【０２３７】
「ＮＯＶＸポリペプチドの生物学的に活性な部分を有するポリペプチド」とは、本発明のポリペプチドの活性に類似するが必ずしも同一である必要はない活性を示すポリペプチドをいい、用量依存性の有無に関わらず、特定の生物学的アッセイにおいて測定されるような成熟形態を含む。「ＮＯＶＸの生物学的に活性な部分」をコードする核酸フラグメントは、ＮＯＶＸの生物学的活性（ＮＯＶＸタンパク質の生物学的活性は、以下に記載される）を有するポリペプチドをコードする、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１および３３の一部を単離し、ＮＯＶＸタンパク質のコードされた部分を発現させ（例えば、インビトロでの組換え発現によって）、そしてＮＯＶＸのコードされた部分の活性を評価することによって調製され得る。
【０２３８】
（ＮＯＶＸの核酸およびポリペプチドの改変体）
本発明はさらに、遺伝コードの縮重に起因して、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１および３３に示されるヌクレオチド配列とは異なる核酸分子を包含し、従って、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１および３３に示されるヌクレオチド配列によってコードされるタンパク質と同じＮＯＶＸタンパク質をコードする。別の実施形態において、本発明の単離された核酸分子は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２および３４に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を有する。
【０２３９】
配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１および３３に示されるヒトＮＯＶＸヌクレオチド配列に加えて、このＮＯＶＸポリペプチドのアミノ酸配列における変化を導くＤＮＡ配列多型が、集団（例えば、ヒト集団）内に存在し得ることは、当業者によって理解される。ＮＯＶＸ遺伝子中のこのような遺伝的多型は、天然の対立遺伝子のバリエーションに起因して、集団内の個体間に存在し得る。本明細書中で使用される場合、用語「遺伝子」および「組換え遺伝子」とは、ＮＯＶＸタンパク質、好ましくは脊椎動物のＮＯＶＸタンパク質をコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含む核酸分子をいう。このような天然の対立遺伝子のバリエーションは、代表的には、ＮＯＶＸ遺伝子のヌクレオチド配列において１〜５％の変動を生じ得る。天然の対立遺伝子バリエーションの結果であり、そしてこのＮＯＶＸポリペプチドの機能的活性を変化させない、ＮＯＶＸポリペプチド内の任意および全てのこのようなヌクレオチドのバリエーションならびに得られるアミノ酸多型は、本発明の範囲内であると意図される。
【０２４０】
さらに、他の種由来のＮＯＶＸタンパク質をコードし、従って、ヒトの配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１および３３とは異なるヌクレオチド配列を有する核酸分子は、本発明の範囲内にあることが意図される。本発明のＮＯＶＸのｃＤＮＡの天然の対立遺伝子改変体およびホモログに対応する核酸分子は、本明細書中に開示されるヒトＮＯＶＸ核酸に対するその相同性に基づいて、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、標準的なハイブリダイゼーション技術に従うハイブリダイゼーションプローブとして、ヒトｃＤＮＡまたはその一部を用いて単離され得る。
【０２４１】
従って、別の実施形態において、本発明の単離された核酸分子は、少なくとも６ヌクレオチド長であり、そしてストリンジェント条件下で配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１および３３のヌクレオチド配列を含む核酸分子にハイブリダイズする。別の実施形態において、この核酸は、少なくとも１０、２５、５０、１００、２５０、５００、７５０、１０００、１５００、または２０００以上のヌクレオチド長である。なお別の実施形態において、本発明の単離された核酸分子は、コード領域にハイブリダイズする。本明細書中で使用される場合、用語「ストリンジェント条件下でハイブリダイズする」は、ハイブリダイゼーションおよび洗浄に関して、互いに少なくとも６０％相同なヌクレオチド配列が、代表的には互いにハイブリダイズしたままである条件を記載することを意図される。
【０２４２】
ホモログ（すなわち、ヒト以外の種由来のＮＯＶＸタンパク質をコードする核酸）または他の関連配列（例えば、パラログ（ｐａｒａｌｏｇｓ））は、特定のヒト配列の全てまたは一部をプローブとし、核酸ハイブリダイゼーションおよびクローニングに関して当該分野で周知の方法を使用して、低い、中程度の、または高いストリンジェンシーのハイブリダイゼーションによって入手され得る。
【０２４３】
本明細書中で使用される場合、句「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」は、その条件下で、プローブ、プライマーまたはオリゴヌクレオチドが、その標的配列にハイブリダイズするが、その他の配列にはハイブリダイズしない条件をいう。ストリンジェントな条件は、配列依存性であり、そして異なる状況で異なる。より長い配列は、より短い配列より、より高い温度で特異的にハイブリダイズする。一般に、ストリンジェントな条件は、規定されたイオン強度およびｐＨで、特定の配列についての熱融解点（Ｔｍ）より約５℃低いように選択される。このＴｍは、標的配列に相補的なプローブの５０％が、平衡状態で標的配列にハイブリダイズする温度（規定されたイオン強度、ｐＨおよび核酸濃度下）である。標的配列は一般に過剰で存在するので、Ｔｍでは、５０％のプローブが平衡状態で占有されている。代表的には、ストリンジェントな条件は、ｐＨ７．０〜８．３で、塩濃度が約１．０Ｍナトリウムイオンより少なく、代表的には約０．０１〜１．０Ｍナトリウムイオン（または、他の塩）、そして温度が、短いプローブ、プライマーまたはオリゴヌクレオチド（例えば、１０ｎｔ〜５０ｎｔ）について少なくとも約３０℃、そしてより長いプローブ、プライマーおよびオリゴヌクレオチドについて少なくとも約６０℃であるような条件である。ストリンジェントな条件はまた、不安定化剤（例えば、ホルムアミド）の添加で達成され得る。
【０２４４】
ストリンジェント条件は、当業者に公知であり、そしてＡｕｓｕｂｅｌら（編）、ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎ．Ｙ．（１９８９），６．３．１−６．３．６に見出され得る。好ましくは、この条件は、互いに少なくとも約６５％、約７０％、約７５％、約８５％、約９０％、約９５％、約９８％または約９９％相同な配列が、代表的には互いにハイブリダイズしたままであるような条件である。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の非限定的な例は、６×ＳＳＣ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．０２％  ＰＶＰ、０．０２％  Ｆｉｃｏｌｌ、０．０２％  ＢＳＡ、および５００ｍｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡを含む高塩緩衝液中での６５℃でのハイブリダイゼーションであり、続いて、０．２×ＳＳＣ、０．０１％  ＢＳＡ中での５０℃での１回以上の洗浄を行う。ストリンジェント条件下で、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１および３３の配列にハイブリダイズする、本発明の単離された核酸分子は、天然に存在する核酸分子に対応する。本明細書中で使用される場合、「天然に存在する」核酸分子とは、天然に存在する（例えば、天然のタンパク質をコードする）ヌクレオチド配列を有する、ＲＮＡ分子またはＤＮＡ分子をいう。
【０２４５】
第２の実施形態において、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１および３３のヌクレオチド配列、あるいはそれらのフラグメント、アナログまたは誘導体を含む核酸分子に、中程度のストリンジェンシー条件下でハイブリダイズする核酸配列が提供される。中程度のストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件の非限定的な例は、６×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、０．５％  ＳＤＳおよび１００ｍｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡ中での５５℃でのハイブリダイゼーション、続いて１×ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳ中での３７℃での１回以上の洗浄である。用いられ得る中程度のストリンジェンシーの他の条件は、当該分野で周知である。例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら（編）、１９９３、ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，ＮＹおよびＫｒｉｅｇｌｅｒ、１９９０；ＧＥＮＥ  ＴＲＡＮＳＦＥＲ  ＡＮＤ  ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ，Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹを参照のこと。
【０２４６】
第３の実施形態において、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１および３３のヌクレオチド配列、あるいはそれらのフラグメント、アナログまたは誘導体を含む核酸分子に、低ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズし得る核酸が提供される。低ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件の非限定的な例は、３５％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．０２％  ＰＶＰ、０．０２％  Ｆｉｃｏｌｌ、０．２％  ＢＳＡ、１００ｍｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡ、１０％（重量／容量）デキストラン硫酸中での４０℃でのハイブリダイゼーション、続いて２×ＳＳＣ、２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、５ｍＭ  ＥＤＴＡおよび０．１％  ＳＤＳ中での５０℃での１回以上の洗浄である。用いられ得る低ストリンジェンシーの他の条件は、当該分野で周知である（例えば、種交差ハイブリダイゼーションのために用いられるように）。例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら（編）、１９９３、ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，ＮＹ、ならびにＫｒｉｅｇｌｅｒ、１９９０、ＧＥＮＥ  ＴＲＡＮＳＦＥＲ  ＡＮＤ  ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ，Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ；ＳｈｉｌｏおよびＷｅｉｎｂｅｒｇ、１９８１、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ７８：６７８９−６７９２を参照のこと。
【０２４７】
（保存的変異）
集団中に存在し得る、ＮＯＶＸ配列の天然に存在する対立遺伝子改変体に加えて、当業者は、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１および３３のヌクレオチド配列への変異によって変化が導入され得、それによって、このＮＯＶＸタンパク質の機能的能力を変更することなく、コードされるＮＯＶＸタンパク質のアミノ酸配列に変化がもたらされることをさらに理解する。例えば、「非必須」アミノ酸残基にてアミノ酸置換をもたらすヌクレオチド置換は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２および３４の配列において行われ得る。「非必須」アミノ酸残基は、その生物学的活性を変更することなく、このＮＯＶＸタンパク質の野生型配列から変更され得る残基であり、一方、「必須」アミノ酸残基は、このような生物学的活性に必要とされる。例えば、本発明のＮＯＶＸタンパク質の間で保存されているアミノ酸残基は、特に変更を受け入れ難いと予測される。保存的置換がなされ得るアミノ酸は、当該分野で周知である。
【０２４８】
本発明の別の局面は、活性に必須ではないアミノ酸残基における変化を含む、ＮＯＶＸタンパク質をコードする核酸分子に関する。このようなＮＯＶＸタンパク質は、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１および３３からのアミノ酸配列とは異なるが、生物学的活性をなお保持する。１つの実施形態において、単離された核酸分子は、タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含み、ここで、このタンパク質は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２および３４のアミノ酸配列に少なくとも約４５％相同であるアミノ酸配列を含む。好ましくは、この核酸分子によってコードされるタンパク質は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２および３４に対して少なくとも約６０％相同であり；より好ましくは、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２および３４に対して少なくとも約７０％相同であり；なおより好ましくは、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、および３４に対してして少なくとも約８０％相同であり；なおより好ましくは、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２および３４に対して少なくとも約９０％相同であり；そして最も好ましくは、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２および３４に対して少なくとも約９５％相同である。
【０２４９】
配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２および３４のタンパク質に相同なＮＯＶＸタンパク質をコードする単離された核酸分子は、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１および３３のヌクレオチド配列に１つ以上のヌクレオチドの置換、付加または欠失を導入することにより作製され得、その結果、１つ以上のアミノ酸の置換，付加または欠失が、コードされるタンパク質に導入される。
【０２５０】
変異は、標準技術（例えば、部位特異的変異誘発およびＰＣＲ媒介変異誘発）によって配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１および３３に導入され得る。好ましくは、保存的アミノ酸置換が、１つ以上の推定非必須アミノ酸残基にて作製される。「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置換される、アミノ酸置換である。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当該分野で定義されている。これらのファミリーとしては、以下が挙げられる：塩基性側鎖を有するアミノ酸（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アルパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β分枝側鎖を有するアミノ酸（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）および芳香族側鎖を有するアミノ酸（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）。従って、ＮＯＶＸタンパク質中の推定の非必須アミノ酸残基は、同じ側鎖のファミリー由来の別のアミノ酸残基で置換される。あるいは、別の実施形態において、変異は、ＮＯＶＸコード配列の全てまたは一部に沿って（例えば、飽和変異誘発（ｓａｔｕｒａｔｉｏｎ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）によって）ランダムに導入され得、そして得られる変異体を、ＮＯＶＸの生物学的活性についてスクリーニングして、活性を維持する変異体を同定し得る。配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１および３３の変異誘発に続いて、コードされるタンパク質は、当該分野で公知の任意の組換え技術によって発現され得、そしてこのタンパク質の活性が決定され得る。
【０２５１】
アミノ酸ファミリーの関連性はまた、側鎖の相互作用に基づいて決定され得る。置換されたアミノ酸は、完全に保存された「強い」残基または完全に保存された「弱い」残基であり得る。保存されたアミノ酸残基の「強い」群は、以下の群のいずれか１つであり得る：ＳＴＡ、ＮＥＱＫ、ＮＨＱＫ、ＮＤＥＱ、ＱＨＲＫ、ＭＩＬＶ、ＭＩＬＦ、ＨＹ、ＦＹＷ（ここで、一文字アミノ酸コードは、互いに置換され得るこれらのアミノ酸残基によりグループ化される）。同様に、保存された残基の「弱い」群は、以下のいずれか１つで有り得る：ＣＳＡ、ＡＴＶ、ＳＡＧ、ＳＴＮＫ、ＳＴＰＡ、ＳＧＮＤ、ＳＮＤＥＱＫ、ＮＤＥＱＨＫ、ＮＥＱＨＲＫ、ＶＬＩＭ、ＨＦＹ（ここで、各群内の文字は、一文字アミノ酸コードを表す）。
【０２５２】
１つの実施形態において、変異ＮＯＶＸタンパク質は、以下についてアッセイされ得る：（ｉ）他のＮＯＶＸタンパク質、他の細胞表面タンパク質、または生物学的に活性なそれらの部分と、タンパク質：タンパク質相互作用を形成する能力、（ｉｉ）変異ＮＯＶＸタンパク質と、ＮＯＶＸのリガンドとの間の複合体形成；あるいは、（ｉｉｉ）変異ＮＯＶＸタンパク質が細胞内標的タンパク質またはその生物学的に活性な部分に結合する能力；（例えば、アビジンタンパク質）。
【０２５３】
なお別の実施形態において、変異体ＮＯＶＸタンパク質は、特定の生物学的機能を調節する能力（例えば、インスリン放出の調節）についてアッセイされ得る。
【０２５４】
（アンチセンス核酸）
本発明の別の局面は、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１および３３のヌクレオチド配列を含む核酸分子、あるいはそのフラグメント、アナログまたは誘導体にハイブリダイズし得るかまたは相補的である、単離されたアンチセンス核酸分子に関する。「アンチセンス」核酸は、タンパク質をコードする「センス」核酸に相補的である（例えば、二本鎖ｃＤＮＡ分子のコード鎖に相補的であるかまたはｍＲＮＡ配列に相補的である）ヌクレオチド配列を含む。特定の局面では、ＮＯＶＸコード鎖の全体の少なくとも約１０、約２５、約５０、約１００、約２５０もしくは約５００ヌクレオチド、またはその一部のみに相補的な配列を含む、アンチセンス核酸分子が提供される。配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２および３４のＮＯＶＸタンパク質のフラグメント、ホモログ、誘導体およびアナログをコードする核酸分子、または配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１および３３のＮＯＶＸ核酸配列に相補的なアンチセンス核酸がさらに提供される。
【０２５５】
１つの実施形態において、アンチセンス核酸分子は、ＮＯＶＸタンパク質をコードするヌクレオチド配列のコード鎖の「コード領域」に対してアンチセンスである。用語「コード領域」とは、アミノ酸残基に翻訳されるコドンを含む、ヌクレオチド配列の領域をいう。別の実施形態において、このアンチセンス核酸分子は、ＮＯＶＸタンパク質をコードするヌクレオチド配列のコード鎖の「非コード領域」に対してアンチセンスである。用語「非コード領域」とは、コード領域に隣接する、アミノ酸に翻訳されない、５’配列および３’配列をいう（すなわち、５’非翻訳領域および３’非翻訳領域ともいわれる）。
【０２５６】
本明細書中に開示されるＮＯＶＸタンパク質をコードするコード鎖配列を考慮すれば、本発明のアンチセンス核酸は、ＷａｔｓｏｎおよびＣｒｉｃｋまたはＨｏｏｇｓｔｅｅｎの塩基対形成の規則に従って設計され得る。アンチセンス核酸分子は、ＮＯＶＸ  ｍＲＮＡのコード領域全体に相補的であり得るが、より好ましくは、ＮＯＶＸ  ｍＲＮＡのコード領域または非コード領域の一部にのみアンチセンスであるオリゴヌクレオチドである。例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＮＯＶＸ  ｍＲＮＡの翻訳開始部位を取り囲む領域に相補的であり得る。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、例えば、約５、約１０、約１５、約２０、約２５、約３０、約３５、約４０、約４５または約５０ヌクレオチドの長さであり得る。本発明のアンチセンス核酸は、当該分野で公知の手順を用いて、化学的合成または酵素連結反応を用いて構築され得る。例えば、アンチセンス核酸（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド）は、天然に存在するヌクレオチド、またはこの分子の生物学的安定性を増大させるように、もしくはアンチセンス核酸とセンス核酸との間で形成される二重鎖の物理的安定性を増大させるように設計された種々に改変されたヌクレオチドを用いて化学的に合成され得る（例えば、ホスホロチオエート誘導体およびアクリジン置換ヌクレオチドが用いられ得る）。
【０２５７】
アンチセンス核酸を作製するために用いられ得る改変されたヌクレオチドの例としては、以下が挙げられる：５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４−アセチルシトシン、５−（カルボキシヒドロキシメチル）ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、β−Ｄ−ガラクトシルキュェオシン（ｇａｌａｃｔｏｓｙｌｑｕｅｏｓｉｎｅ）、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−アデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、β−Ｄ−マンノシルキュェオシン（ｍａｎｎｏｓｙｌｑｕｅｏｓｉｎｅ）、５’−メトキシカルボキシメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、ワイブトキソシン（ｗｙｂｕｔｏｘｏｓｉｎｅ）、シュードウラシル、キュェオシン（ｑｕｅｏｓｉｎｅ）、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、５−メチル−２−チオウラシル、３−（３−アミノ−３−Ｎ−２−カルボキシプロピル）ウラシル、（ａｃｐ３）ｗ、および２，６−ジアミノプリン。あるいは、このアンチセンス核酸は、核酸がアンチセンス方向でサブクローニングされた発現ベクターを用いて生物学的に生成され得る（すなわち、挿入された核酸から転写されたＲＮＡは、以下の小節にさらに記載される、目的の標的核酸に対してアンチセンス方向である）。
【０２５８】
本発明のアンチセンス核酸分子は、代表的には被験体に投与されるか、またはインサイチュで生成され、その結果、これらは、ＮＯＶＸタンパク質をコードする細胞性ｍＲＮＡおよび／またはゲノムＤＮＡとハイブリダイズするか、またはこれらに結合し、それによってこのタンパク質の発現を阻害する（例えば、転写および／または翻訳を阻害することによって）。ハイブリダイゼーションは、安定な二重鎖を形成する従来のヌクレオチド相補性によってか、または、例えばＤＮＡ二重鎖に結合するアンチセンス核酸分子の場合には、二重らせんの主溝における特異的相互作用を介してであり得る。本発明のアンチセンス核酸分子の投与経路の例としては、組織部位での直接的注射が挙げられる。あるいは、アンチセンス核酸分子は、選択された細胞を標的化するように改変され得、次いで全身に投与される。例えば、全身投与のために、アンチセンス分子は、選択された細胞表面上に発現されたレセプターまたは抗原にそれらが特異的に結合するように改変され得る（例えば、そのアンチセンス核酸分子を細胞表面レセプターまたは抗原に結合するペプチドまたは抗体に連結することによって）。このアンチセンス核酸分子はまた、本明細書中に記載されるベクターを用いて細胞に送達され得る。十分な核酸分子を達成するために、アンチセンス核酸分子が強力なｐｏｌ  ＩＩプロモーターまたはｐｏｌ  ＩＩＩプロモーターの制御下に置かれているベクター構築物が、好ましい。
【０２５９】
なお別の実施形態において、本発明のアンチセンス核酸分子は、α−アノマー核酸分子である。α−アノマー核酸分子は、相補的ＲＮＡと特異的な二本鎖ハイブリッドを形成し、ここで、通常のβ−ユニットとは対照的に、鎖は、互いに平行に延びる。例えば、Ｇａｕｌｔｉｅｒら、１９８７、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１５：６６２５−６６４１を参照のこと。このアンチセンス核酸分子はまた、２’−ｏ−メチルリボヌクレオチド（例えば、Ｉｎｏｕｅら、１９８７，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１５：６１３１−６１４８を参照のこと）またはキメラＲＮＡ−ＤＮＡアナログ（例えば、Ｉｎｏｕｅら、１９８７，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．２１５：３２７−３３０を参照のこと）を含み得る。
【０２６０】
（リボザイムおよびＰＮＡ部分）
核酸の改変としては、非限定的な例として、改変塩基、および糖リン酸骨格が改変または誘導体化された核酸が挙げられる。これらの改変は、少なくとも一部が、改変された核酸の化学的安定性を増強するために実施され、その結果、これらは、例えば、被験体での治療的適用におけるアンチセンス結合核酸として使用され得る。
【０２６１】
１つの実施形態において、本発明のアンチセンス核酸はリボザイムである。リボザイムは、一本鎖核酸（例えば、ｍＲＮＡ）を切断し得るリボヌクレアーゼ活性を有する触媒性ＲＮＡ分子であり、これらは、その一本鎖核酸に対する相補性領域を有する。従って、リボザイム（例えば、ＨａｓｅｌｈｏｆｆおよびＧｅｒｌａｃｈ  １９８８．Ｎａｔｕｒｅ  ３３４：５８５−５９１に記載されるハンマーヘッド型リボザイム）を使用して、ＮＯＶＸ  ｍＲＮＡ転写物を触媒的に切断し、それによってＮＯＶＸ  ｍＲＮＡの翻訳を阻害し得る。ＮＯＶＸをコードする核酸に特異性を有するリボザイムは、本明細書中に開示されるＮＯＶＸ  ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（すなわち、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１および３３）に基づいて設計され得る。例えば、活性部位のヌクレオチド配列が、ＮＯＶＸをコードするｍＲＮＡ内で切断されるヌクレオチド配列に相補的である、Ｔｅｔｒａｈｙｍｅｎａ  Ｌ−１９  ＩＶＳ  ＲＮＡの誘導体が構築され得る。例えば、Ｃｅｃｈらに対する米国特許第４，９８７，０７１号およびＣｅｃｈらに対する米国特許第５，１１６，７４２号を参照のこと。ＮＯＶＸ  ｍＲＮＡをまた使用して、ＲＮＡ分子のプールから、特異的リボヌクレアーゼ活性を有する触媒性ＲＮＡを選択し得る。例えば、Ｂａｒｔｅｌら、（１９９３）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６１：１４１１−１４１８を参照のこと。
【０２６２】
あるいは、ＮＯＶＸ遺伝子発現は、ＮＯＶＸ核酸の調節領域（例えば、ＮＯＶＸのプロモーターおよび／またはエンハンサー）に相補的なヌクレオチド配列を標的化し、標的細胞中でＮＯＶＸ遺伝子の転写を妨害する三重らせん構造を形成することによって阻害され得る。例えば、Ｈｅｌｅｎｅ，１９９１．Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓ．６：５６９−８４；Ｈｅｌｅｎｅら．１９９２．Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．６６０：２７−３６；Ｍａｈｅｒ，１９９２．Ｂｉｏａｓｓａｙｓ  １４：８０７−１５を参照のこと。
【０２６３】
種々の実施形態において、ＮＯＶＸ核酸は、塩基部分、糖部分またはリン酸骨格で改変され、例えば、その分子の安定性、ハイブリダイゼーションまたは可溶性を改善し得る。例えば、核酸のデオキシリボースリン酸骨格を改変して、ペプチド核酸を生成し得る。例えば、Ｈｙｒｕｐら、１９９６．Ｂｉｏｏｒｇ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  ４：５−２３を参照のこと。本明細書中で使用される場合、用語「ペプチド核酸」または「ＰＮＡ」とは、デオキシリボースリン酸骨格が偽ペプチド骨格によって置換され、そして４つの天然の核酸塩基のみが保持されている核酸模倣物（例えば、ＤＮＡ模倣物）をいう。ＰＮＡの中性の骨格は、低いイオン強度の条件下でＤＮＡおよびＲＮＡに対する特異的ハイブリダイゼーションを可能にすることが示されている。ＰＮＡオリゴマーの合成は、Ｈｙｒｕｐら、１９９６、前出；Ｐｅｒｒｙ−Ｏ’Ｋｅｅｆｅら、１９９６、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３：１４６７０−１４６７５において記載されるような標準的固相ペプチド合成プロトコルを用いて行われ得る。
【０２６４】
ＮＯＶＸのＰＮＡは、治療的適用および診断的適用において使用され得る。例えば、ＰＮＡは、例えば転写もしくは翻訳の停止を誘導すること、または複製を阻害することによる、遺伝子発現の配列特異的調節のためのアンチセンスまたは抗遺伝子剤として使用され得る。ＮＯＶＸのＰＮＡはまた、遺伝子における一塩基対変異の分析（例えばＰＮＡ指向性ＰＣＲクランピング）において；他の酵素（例えば、Ｓ１ヌクレアーゼ）と組み合わせて使用される場合の人工制限酵素として（Ｈｙｒｕｐら、１９９６、前出を参照のこと）；またはＤＮＡ配列およびハイブリダイゼーションのプローブもしくはプライマーとして（Ｈｙｒｕｐら、１９９６、前出；Ｐｅｒｒｙ−Ｏ’Ｋｅｅｆｅら、１９９６．前出を参照のこと）、使用され得る。
【０２６５】
別の実施形態において、ＮＯＶＸのＰＮＡは、例えば、それらの安定性または細胞性取り込みを増強するために、ＰＮＡに脂溶性基または他のヘルパー基を結合することによって、ＰＮＡ−ＤＮＡキメラの形成によって、またはリポソームもしくは当該分野において公知の薬物送達の他の技術の使用によって、改変され得る。例えば、ＰＮＡおよびＤＮＡの有利な特性を組合せ得る、ＮＯＶＸのＰＮＡ−ＤＮＡキメラが生成され得る。ＰＮＡ部分が高い結合親和性および特異性を提供する一方で、そのようなキメラは、ＤＮＡ認識酵素（例えば、ＲＮａｓｅ  ＨおよびＤＮＡポリメラーゼ）がＤＮＡ部分と相互作用するのを可能にする。ＰＮＡ−ＤＮＡキメラは、塩基のスタッキング、核酸塩基間の結合数および方向を考慮して選択される、適切な長さのリンカーを使用して連結され得る（Ｈｙｒｕｐら、１９９６、前出を参照のこと）。ＰＮＡ−ＤＮＡキメラの合成は、Ｈｙｒｕｐら、１９９６、前出およびＦｉｎｎら、１９９６、Ｎｕｃｌ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ２４：３３５７−３３６３において記載されるように行われ得る。例えば、ＤＮＡ鎖は、標準的なホスホルアミダイトカップリング化学を用いて固体支持体上で合成され得、そして改変されたヌクレオシドアナログ（例えば、５’−（４−メトキシトリチル）アミノ−５’−デオキシ−チミジンホスホルアミダイト）が、ＰＮＡとＤＮＡの５’末端との間で使用され得る（例えば、Ｍａｇら、１９８９、Ｎｕｃｌ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ  １７：５９７３−５９８８を参照のこと）。次いで、ＰＮＡモノマーが段階様式でカップリングされ、５’ＰＮＡセグメントおよび３’ＤＮＡセグメントを有するキメラ分子を生成する（例えば、Ｆｉｎｎら、１９９６、前出を参照のこと）。あるいは、５’ＤＮＡセグメントおよび３’ＰＮＡセグメントを用いて、キメラ分子が合成され得る。例えば、Ｐｅｔｅｒｓｅｎら、１９７５、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．５：１１１９−１１１２４を参照のこと。
【０２６６】
他の実施形態において、オリゴヌクレオチドは、以下のような他の付属の基を含み得る：例えば、ペプチド（例えば、インビボで宿主細胞レセプターを標的化するため）、または細胞膜を横切る輸送を容易にする因子（例えば、Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら、１９８９、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８６：６５５３−６５５６；Ｌｅｍａｉｔｒｅら、１９８７、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８４：６４８−６５２；ＰＣＴ公開番号ＷＯ８８／０９８１０を参照のこと）、または血液脳関門（例えば、ＰＣＴ公開番号ＷＯ８９／１０１３４を参照のこと）。さらに、オリゴヌクレオチドは、ハイブリダイゼーション誘発切断剤（例えば、Ｋｒｏｌら、１９８８、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ６：９５８−９７６を参照のこと）、またはインターカレント剤（例えば、Ｚｏｎ、１９８８、Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．５：５３９−５４９を参照のこと）を用いて改変され得る。この目的のために、オリゴヌクレオチドは、別の分子（例えば、ペプチド、ハイブリダイゼーション誘発架橋剤、輸送剤、ハイブリダイゼーション誘発切断剤など）に結合体化され得る。
【０２６７】
（ＮＯＶＸポリペプチド）
本発明のポリペプチドは、その配列が配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２および３４に提供されるＮＯＶＸポリペプチドのアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。本発明はまた、なおそのＮＯＶＸ活性および生理学的機能を維持するタンパク質、またはその機能的フラグメントをコードするが、その任意の残基が配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２および３４に示される対応する残基から変化し得る、変異体または改変体タンパク質を含む。
【０２６８】
一般に、ＮＯＶＸ様機能を保持するＮＯＶＸ改変体は、配列中の特定位置の残基が他のアミノ酸により置換され、そしてさらに、親タンパク質の２つの残基間にさらなる残基を挿入する可能性、および親配列から１つ以上の残基を欠失する可能性を含む。任意のアミノ酸置換、挿入または欠失が、本発明に包含される。好適な状況では、この置換は、上記で規定されるような保存的置換である。
【０２６９】
本発明の１つの局面は、単離されたＮＯＶＸタンパク質、およびその生物学的に活性な部分、またはその誘導体、フラグメント、アナログもしくはホモログに関する。抗ＮＯＶＸ抗体を惹起するための免疫原としての使用に適するポリペプチドフラグメントもまた提供される。１つの実施形態において、ネイティブなＮＯＶＸタンパク質は、標準的なタンパク質精製技術を用いて、適切な精製スキームによって、細胞または組織供給源から単離され得る。別の実施形態では、ＮＯＶＸタンパク質は、組換えＤＮＡ技法により生産される。組換え発現の代替えとして、ＮＯＶＸタンパク質またはポリペプチドは、標準的なペプチド合成技法を用いて化学的に合成され得る。
【０２７０】
「単離された」または「精製された」タンパク質またはその生物学的に活性な部分は、ＮＯＶＸタンパク質の由来する細胞または組織供給源由来の細胞性物質または他の夾雑タンパク質を実質的に含まないか、あるいは化学合成される場合に化学前駆体または他の化学物質を実質的に含まない。用語「細胞性物質を実質的に含まない」は、ＮＯＶＸタンパク質の調製物を含み、この調製物において、ＮＯＶＸタンパク質が単離または組換え産生される細胞の細胞性成分から、ＮＯＶＸタンパク質は分離されている。１つの実施形態において、用語「細胞性物質を実質的に含まない」は、非ＮＯＶＸタンパク質（本明細書中において「夾雑タンパク質」とも呼ばれる）を約３０％未満（乾燥重量にて）、より好ましくは非ＮＯＶＸタンパク質を約２０％未満、なおより好ましくは非ＮＯＶＸタンパク質を約１０％未満、そして最も好ましくは非ＮＯＶＸタンパク質を約５％未満有する、ＮＯＶＸタンパク質の調製物を含む。ＮＯＶＸタンパク質またはその生物学的に活性な部分が組換え産生される場合、好ましくは、調製物はまた培養培地を実質的に含まない。すなわち、培養培地は、そのＮＯＶＸタンパク質調製物の容量の約２０％未満、より好ましくは約１０％未満、そして最も好ましくは約５％未満を示す。
【０２７１】
用語「化学前駆体または他の化学物質を実質的に含まない」は、タンパク質が、そのタンパク質の合成に関与する化学前駆体または他の化学物質から分離されているＮＯＶＸタンパク質の調製物を含む。１つの実施形態において、用語「化学前駆体または他の化学物質を実質的に含まない」は、化学前駆体または非ＮＯＶＸの化学物質を約３０％未満（乾燥重量にて）、より好ましくは化学前駆体または非ＮＯＶＸ化学物質を約２０％未満、なおより好ましくは化学前駆体または非ＮＯＶＸ化学物質を約１０％未満、そして最も好ましくは化学前駆体または非ＮＯＶＸ化学物質を約５％未満有する、ＮＯＶＸタンパク質の調製物を含む。
【０２７２】
ＮＯＶＸタンパク質の生物学的に活性な部分は、全長ＮＯＶＸタンパク質より少ないアミノ酸を含み、そしてＮＯＶＸタンパク質の少なくとも１つの活性を示す、ＮＯＶＸタンパク質のアミノ酸配列（例えば、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２および３４に示されるアミノ酸配列）に十分に相同なアミノ酸配列、またはＮＯＶＸタンパク質のアミノ酸配列に由来するアミノ酸配列を含むペプチドを含む。代表的には、生物学的に活性な部分は、ＮＯＶＸタンパク質の少なくとも１つの活性を有するドメインまたはモチーフを含む。ＮＯＶＸタンパク質の生物学的に活性な部分は、例えば、長さが１０、２５、５０、１００またはそれより多いアミノ酸であるポリペプチドであり得る。
【０２７３】
さらに、タンパク質の他の領域が欠失している他の生物学的に活性な部分は、組換え技術によって調製され得、そしてネイティブなＮＯＶＸタンパク質の機能的活性のうちの１つ以上について評価され得る。
【０２７４】
１つの実施形態において、ＮＯＶＸタンパク質は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２および３４に示されるアミノ酸配列を有する。他の実施形態において、ＮＯＶＸタンパク質は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２および３４に実質的に相同であり、そして以下に詳細に議論されるように、天然の対立遺伝子改変体または変異誘発に起因してアミノ酸配列が異なるが、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２および３４のタンパク質の機能的活性を保持する。従って、別の実施形態において、ＮＯＶＸタンパク質は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２および３４のアミノ酸配列に少なくとも約４５％相同なアミノ酸配列を含み、そして、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２および３４のＮＯＶＸタンパク質の機能的活性を保持するタンパク質である。
【０２７５】
（２つ以上の配列間の相同性の決定）
２つのアミノ酸配列または２つの核酸の相同性の百分率を決定するために、配列は、至適な比較の目的のために整列される（例えば、ギャップは、配列間の最適な整列について比較される配列のいずれかに導入され得る）。次いで、対応するアミノ酸位置またはヌクレオチド位置でのアミノ酸残基またはヌクレオチドが比較される。第１の配列中の位置が、第２の配列中の対応する位置と同じアミノ酸残基またはヌクレオチドで占められる場合、分子はその位置で相同である（すなわち、本明細書中で使用される場合、アミノ酸または核酸の「相同性」は、アミノ酸または核酸の「同一性」と等価である）。
【０２７６】
核酸配列の相同性は、２つの配列間の同一性の程度として決定され得る。相同性は、当該分野において公知のコンピュータープログラム（例えば、ＧＣＧプログラムパッケージにおいて提供されるＧＡＰソフトウェア）を用いて決定され得る。ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ  １９７０．Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ４８：４４３〜４５３を参照のこと。核酸配列比較のための以下の設定（ＧＡＰ作製ペナルティー、５．０、およびＧＡＰ伸長ペナルティー、０．３）を用いてＧＣＧ  ＧＡＰソフトウェアを使用すると、上記で言及される類似の核酸配列のコード領域は、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、および３３に示されるＤＮＡ配列のＣＤＳ（コード）部分と、好ましくは少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の同一性の程度を示す。
【０２７７】
用語「配列同一性」は、２つのポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列が、特定の比較領域にわたって、残基毎を基準として同一である程度をいう。用語「配列同一性のパーセンテージ」は、以下により算出される：この比較領域にわたって最適に整列された２つの配列を比較すること、両方の配列において同一の核酸塩基（例えば、核酸の場合にはＡ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、Ｕ、またはＩ）が存在する位置の数を決定し、一致した位置の数を導くこと、この一致した位置の数を、比較領域の内の位置の総数（すなわち、ウインドウサイズ）で除算すること、およびその結果を１００で乗算して、配列同一性のパーセンテージを導くこと。用語「実質的な同一性」は、本明細書中で使用される場合、ポリヌクレオチド配列の特徴を示し、ここでこのポリヌクレオチドは、比較領域にわたり参照配列と比較して、少なくとも８０％の配列同一性、好ましくは少なくとも８５％の配列同一性、そして頻繁には９０〜９５％の配列同一性、より通常には少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を含む。
【０２７８】
（キメラタンパク質および融合タンパク質）
本発明はまた、ＮＯＶＸキメラタンパク質または融合タンパク質を提供する。本明細書中で使用される場合、ＮＯＶＸ「キメラタンパク質」またはＮＯＶＸ「融合タンパク質」は、非ＮＯＶＸポリペプチドに作動可能に連結された、ＮＯＶＸポリペプチドを含む。「ＮＯＶＸポリペプチド」は、ＮＯＶＸタンパク質（配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２および３４）に対応するアミノ酸配列を有するポリペプチドをいうが、「非ＮＯＶＸポリペプチド」は、ＮＯＶＸタンパク質に対して実質的に相同ではないタンパク質（例えば、ＮＯＶＸタンパク質とは異なり、かつ同一でかまたは異なる生物体に由来するタンパク質）に対応するアミノ酸配列を有するポリペプチドをいう。ＮＯＶＸ融合タンパク質において、このＮＯＶＸポリペプチドは、ＮＯＶＸタンパク質のすべてまたは一部分に対応し得る。１つの実施形態では、ＮＯＶＸ融合タンパク質は、ＮＯＶＸタンパク質の少なくとも１つの生物学的に活性な部分を含む。別の実施形態では、ＮＯＶＸ融合タンパク質は、ＮＯＶＸタンパク質の少なくとも２つの生物学的に活性な部分を含む。さらに、別の実施形態において、ＮＯＶＸ融合タンパク質は、ＮＯＶＸタンパク質の少なくとも３つの生物学的に活性な部分を含む。融合タンパク質において、用語「作動可能に連結された」は、ＮＯＶＸポリペプチドおよび非ＮＯＶＸポリペプチドが、インフレームで互いに融合されていることを示すことが意図される。非ＮＯＶＸポリペプチドは、ＮＯＶＸポリペプチドのＮ末端またはＣ末端に融合され得る。
【０２７９】
１つの実施形態においては、この融合タンパク質は、ＧＳＴ−ＮＯＶＸ融合タンパク質であり、ここではＮＯＶＸ配列が、ＧＳＴ（すなわち、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ）配列のＣ末端に融合される。このような融合タンパク質は、組換えＮＯＶＸの精製を容易にし得る。
【０２８０】
別の実施形態において、融合タンパク質は、そのＮ末端において非相同的なシグナル配列を含むＮＯＶＸタンパク質である。特定の宿主細胞（例えば、哺乳動物細胞）において、ＮＯＶＸの発現および／または分泌は、非相同的なシグナル配列の使用を介して上昇され得る。
【０２８１】
なお別の実施形態においては、この融合タンパク質は、ＮＯＶＸ−免疫グロブリン融合タンパク質であり、ここではＮＯＶＸ配列が、免疫グロブリンタンパク質ファミリーのメンバーに由来する配列に融合される。本発明のこのＮＯＶＸ−免疫グロブリン融合タンパク質は、薬学的組成物中に取り込まれ、そして被験体に投与されて、細胞の表面上でＮＯＶＸリガントとＮＯＶＸタンパク質との間の相互作用を阻害し、それによってインビボのＮＯＶＸ媒介信号伝達を抑制し得る。このＮＯＶＸ−免疫グロブリン融合タンパク質を用い、ＮＯＶＸ同族リガンドの生体利用性に影響を与え得る。ＮＯＶＸリガンド／ＮＯＶＸ相互作用の阻害は、増殖障害および分化障害の両方の処置、および細胞生存を調節（例えば、促進または阻害）することに、治療的に有用であり得る。さらに、本発明のこのＮＯＶＸ−免疫グロブリン融合タンパク質は、被験体中で抗ＮＯＶＸ抗体を産生するための免疫原として用いられ得、ＮＯＶＸリガンドを精製し、そしてＮＯＶＸリガンドとのＮＯＶＸの相互作用を阻害する分子を同定するスクリーニングアッセイで用いられ得る。
【０２８２】
本発明のＮＯＶＸキメラまたは融合タンパク質は、標準的な組換えＤＮＡ技法により産生され得る。例えば、異なるポリペプチド配列をコードするＤＮＡフラグメントを、従来の技法に従って、例えば、連結のための平滑末端または粘着（ｓｔａｇｇｅｒ）末端、適切な末端を提供するための制限酵素消化、必要に応じて粘着（ｃｏｈｅｓｉｖｅ）末端のフィルイン、所望しない連結を避けるためのアルカリホスファターゼ処理、および酵素的連結を採用することにより、インフレームで一緒に連結する。別の実施形態では、融合遺伝子を、自動化ＤＮＡ合成機を含む従来技法により合成し得る。あるいは、遺伝子フラグメントのＰＣＲ増幅を、キメラ遺伝子配列を生成するために次いでアニールおよび再増幅され得る、２つの連続遺伝子フラグメント間の相補的オーバハングを生じるアンカープライマーを用いて実施し得る（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら（編）ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、１９９２を参照のこと）。さらに、融合成分（例えば、ＧＳＴポリペプチド）をすでにコードした多くの発現ベクターが市販されている。ＮＯＶＸをコードする核酸は、この融合成分がＮＯＶＸタンパク質にインフレーム連結されるように、このような発現ベクター中にクローン化され得る。
【０２８３】
（ＮＯＶＸアゴニストおよびアンタゴニスト）
本発明はまた、ＮＯＶＸアゴニスト（模倣物）として、またはＮＯＶＸアンタゴニストとして機能するＮＯＶＸタンパク質の改変体に関する。ＮＯＶＸタンパク質の改変体、例えば、ＮＯＶＸタンパク質の離散した点変異または短縮型が、変異誘発により生成され得る。ＮＯＶＸタンパク質のアゴニストは、天然に存在する形態のＮＯＶＸタンパク質と実質的に同じ生物学的活性、またはその生物学的活性のサブセットを保持し得る。ＮＯＶＸタンパク質のアンタゴニストは、天然に存在する形態のＮＯＶＸタンパク質の１つ以上の活性を、例えば、ＮＯＶＸタンパク質を含む細胞シグナル伝達カスケードの下流または上流メンバーに競合的に結合することにより阻害し得る。従って、特異的生物学的効果が、限られた機能の改変体を用いた処理により惹起され得る。１つの実施形態では、このタンパク質の天然に存在する形態の生物学活性のサブセットを有する改変体を用いた被験体の処置は、ＮＯＶＸタンパク質の天然に存在する形態を用いた処置に対して被験体におけるより少ない副作用を有する。
【０２８４】
ＮＯＶＸアゴニスト（模倣物）として、またはＮＯＶＸアンタゴニストのいずれかとして機能するＮＯＶＸタンパク質の改変体は、ＮＯＶＸタンパク質アゴニストまたはアンタゴニスト活性のためのＮＯＶＸタンパク質の変異体、例えば短縮型変異体のコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングすることにより同定され得る。１つの実施形態では、ＮＯＶＸ改変体の多彩なライブラリーは、核酸レベルのコンビナトリアル変異誘発により生成され、そして多彩な遺伝子ライブラリーによりコードされる。ＮＯＶＸ改変体の多彩なライブラリーは、例えば、合成オリゴヌクレオチドの混合物を、潜在的なＮＯＶＸ配列の縮重セットが、個々のポリペプチドとして、あるいは、その中にＮＯＶＸ配列のセットを含む（例えば、ファージディスプレイのための）より大きな融合タンパク質のセットとして発現可能であるように、遺伝子配列に酵素的に連結することにより産生され得る。縮重オリゴヌクレオチド配列から潜在的なＮＯＶＸ改変体のライブラリーを産生するために用いられ得る種々の方法がある。縮重遺伝子配列の化学的合成は、自動化ＤＮＡ合成機中で実施され得、次いでこの合成遺伝子は、適切な発現ベクター中に連結される。遺伝子の縮重セットの使用は、１つの混合物において、潜在的なＮＯＶＸ配列の所望のセットをコードする配列のすべての供給を可能にする。縮重オリゴヌクレオチドを合成する方法は当該分野で公知である（例えば、Ｎａｒａｎｇ（１９８３）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  ３９：３；Ｉｔａｋｕｒａら（１９８４）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ  ５３：３２３；Ｉｔａｋｕｒａら（１９８４）Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９８：１０５６；Ｉｋｅら（１９８３）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１１：４７７を参照のこと）。
【０２８５】
（ポリペプチドライブラリー）
さらに、ＮＯＶＸタンパク質コード配列のフラグメントのライブラリーを用いて、ＮＯＶＸタンパク質の改変体のスクリーニングおよび引き続く選択のためのＮＯＶＸフラグメントの多彩な集団を生成し得る。１つの実施形態では、コード配列フラグメントのライブラリーは、ＮＯＶＸコード配列の二本鎖ＰＣＲフラグメントを、１分子あたり約１つのみのニックが生じる条件下、ヌクレアーゼで処理すること、二本鎖ＤＮＡを変性させること、異なるニック産物からのセンス／アンチセンス対を含み得る二本鎖ＤＮＡを形成するためにこのＤＮＡを再生すること、Ｓ１ヌクレアーゼを用いた処理により再形成された二本鎖から一本鎖部分を除去すること、および得られるフラグメントライブラリーを発現ベクター中に連結することにより生成し得る。この方法により、ＮＯＶＸタンパク質の種々のサイズのＮ末端および内部フラグメントをコードする発現ライブラリーが派生し得る。
【０２８６】
点変異または短縮により作製されたコンビナトリアルライブラリーの遺伝子産物をスクリーニングするため、選択された性質を有する遺伝子産物のｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするためのいくつかの技法が当該分野で公知である。このような技法を、ＮＯＶＸタンパク質のコンビナトリアル変異誘発により生成された遺伝子ライブラリーの迅速スクリーニングに適用可能である。大きな遺伝子ライブラリーをスクリーニングするための、高スループット分析に適した最も広く用いられる技法は、代表的には、遺伝子ライブラリーを複製可能な発現ベクター中にクローニングすること、得られるベクターのライブラリーで適切な細胞を形質転換すること、およびこのコンビナトリアル遺伝子を、所望の活性の検出が、その産物が検出された遺伝子をコードするベクターの単離を容易にする条件下で発現することを含む。ライブラリー中の機能的変異体の頻度を増大する新規技法であるリクルーシブエンセブル変異誘発（ＲＥＭ）を、スクリーニングアッセイと組み合わせて用い、ＮＯＶＸ改変体を同定し得る（ＡｒｋｉｎおよびＹｏｕｒｖａｎ、１９９２．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：７８１１−７８１５；Ｄｅｌｇｒａｖｅら、１９９３．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ６：３２７−３３１）。
【０２８７】
（抗ＮＯＶＸ抗体）
ＮＯＶＸタンパク質に対する抗体、またはＮＯＶＸタンパク質のフラグメントもまた、本発明に含まれる。本明細書中で使用される場合、用語「抗体」は、免疫グロブリン分子、および免疫グロブリン（Ｉｇ）分子の免疫学的に活性な部分（すなわち、抗原に特異的に結合する（免疫反応する）抗原結合部位を含む分子）をいう。このような抗体としては、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、単鎖抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’  フラグメントおよびＦ（ａｂ’）２フラグメント、ならびにＦａｂ発現ライブラリーが挙げられるが、これらに限定されない。一般的に、ヒト由来の抗体分子は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥおよびＩｇＤの任意のクラスに関連し、これらは分子内に存在する重鎖の性質によってお互いに異なる。特定のクラスは同様にサブクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２など）を有する。さらに、ヒトにおいては、軽鎖はκ鎖またはλ鎖であり得る。本明細書中で抗体に対する参照は、ヒト抗体種のすべてのこのようなクラス、サブクラスおよび型に対する参照を含む。
【０２８８】
本発明の単離されたＮＯＶＸ関連タンパク質は、抗原、またはその一部もしくはフラグメントとして役立つことが意図され得、そしてさらに、免疫原として使用され、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の調製のための標準的な技術を用いて、抗原に免疫特異的に結合する抗体を生成し得る。全長タンパク質が使用され得るか、あるいは本発明は、免疫原として使用するための抗原の抗原性ペプチドフラグメントを提供する。抗原性ペプチドフラグメントは、全長タンパク質のアミノ酸配列の少なくとも６アミノ酸残基を含み、そしてそれらのエピトープを含み、その結果このペプチドに対して惹起された抗体は、全長タンパク質またはこのエピトープを含む任意のフラグメントと特定の免疫複合体を形成する。好ましくは、抗原性ペプチドは、少なくとも１０アミノ酸残基、または少なくとも１５アミノ酸残基、または少なくとも２０アミノ酸残基、または少なくとも３０アミノ酸残基を含む。この抗原性ペプチドにより含まれる好ましいエピトープは、そのペプチド表面上に位置するタンパク質の領域であり；通常、これらは親水性領域である。
【０２８９】
本発明の特定の実施形態では、抗原性ペプチドにより包含される少なくとも１つのエピトープは、ＮＯＶＸタンパク質の表面上に位置するＮＯＶＸ関連タンパク質の領域、例えば、親水性領域である。ヒトＮＯＶＸ関連タンパク質配列の疎水性分析は、ＮＯＶＸ関連タンパク質のどの領域が特に親水性であるか、そしてそれ故、抗体産生を標的にするために有用な表面残基をコードするようであるかを示す。抗体産生を標的にする手段として、親水性および疎水性の領域を示すヒドロパシープロットを、例えば、フーリエ変換とともにまたはなしの、Ｋｙｔｅ  ＤｏｏｌｉｔｔｌｅまたはＨｏｐｐ  Ｗｏｏｄｓ法を含む、当該分野で周知の任意の方法により生成し得る。例えば、それらの全体が本明細書に参考として援用される、ＨｏｐｐおよびＷｏｏｄｓ、１９８１、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７８：３８２４−３８２８；ＫｙｔｅおよびＤｏｏｌｉｔｔｌｅ  １９８２、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５７：１０５−１４２を参照のこと。抗原性タンパク質またはその誘導体、フラグメント、アナログもしくはホモログ内の１つ以上のドメインに対して特異的な抗体はまた、本明細書中で提供される。
【０２９０】
本発明のタンパク質、またはその誘導体、フラグメント、アナログ、ホモログもしくはオルソログは、これらのタンパク質成分に免疫特異的に結合する抗体の産生における免疫原として利用され得る。
【０２９１】
当該分野において公知の種々の手順が、本発明のタンパク質、またはその誘導体、フラグメント、アナログ、ホモログもしくはオルソログに対して指向されるポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体の産生のために使用され得る（例えば、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｈａｒｌｏｗ  Ｅ，およびＬａｎｅ  １９９８，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ（本明細書中に参考として援用される）を参照のこと）。これらの抗体のうちのいくつかは、以下で考察される。
【０２９２】
（ポリクローナル抗体）
ポリクローナル抗体の産生のために、種々の適切な宿主動物（例えば、ウサギ、ヤギ、マウスまたは他の動物）は、ネイティブなタンパク質、その合成改変体、または前記の誘導体を用いる１以上の注射によって免疫され得る。適切な免疫原性調製物は、例えば、天然に存在する免疫原性タンパク質、免疫原性タンパク質を提示する化学的に合成されたポリペプチド、または組換え的に発現される免疫原性タンパク質を含み得る。さらに、このタンパク質は、免役されている哺乳動物において免疫原性であることが知られている第２のタンパク質に結合体化され得る。このような免疫原性タンパク質の例としては、キーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシサイログロブリン、および大豆トリプシンインヒビターが挙げられるが、これらに限定されない。この調製物はさらに、アジュバントを含み得る。種々のアジュバントが免疫学的応答を増加させるために使用され、このようなアジュバントとしては、Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ（完全および不完全）、ミネラルゲル（例えば、水酸化アルミニウム）、界面活性物質（例えば、リゾレシチン、プルロニック（ｐｌｕｒｏｎｉｃ）ポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油乳濁液、ジニトロフェノールなど）、ヒトにおいて使用可能なアジュバント（例えば、Ｂａｃｉｌｌｅ  Ｃａｌｍｅｔｔｅ−ＧｕｅｒｉｎおよびＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐａｒｖｕｍ）または類似の免疫刺激剤が挙げられるが、これらに限定されない。使用され得るアジュバントのさらなる例としては、ＭＰＬ−ＴＤＭアジュバント（モノホスホリルリピドＡ、合成トレハロースジコリノミコレート）が挙げられる。
【０２９３】
免疫原性タンパク質に対して指向されるポリクローナル抗体分子は、哺乳動物から（例えば、血液から）単離され得、そして周知の技術（例えば、プロテインＡまたはプロテインＧを用いるアフィニティクロマトグラフィー（これは、主に免疫血清のＩｇＧ画分を提供する））によってさらに精製され得る。続いて、または代替的に、求められている免疫グロブリンの標的である特定の抗原またはその抗原のエピトープがカラムに固定され、免疫アフィニティクロマトグラフィーによって免疫特異的抗体を精製し得る。免疫グロブリンの精製は、例えば、Ｄ．Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎ（Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｓｔ（Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｓｔ，Ｉｎｃ．，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ  ＰＡより発行）、第１４巻、第８号（２０００年４月１７日）、２５〜２８頁）によって考察される。
【０２９４】
（モノクローナル抗体）
本明細書で用いられる用語「モノクローナル抗体」（ＭＡｂ）または「モノクローナル抗体組成物」は、独特の軽鎖遺伝子産物および独特の重鎖遺伝子産物からなる唯一の分子種の抗体分子を含む抗体分子の集団をいう。特に、モノクローナル抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）は、すべての分子の集団に同一である。従って、ＭＡｂは、抗原への独特の結合親和性によって特徴付けられる抗原の特定のエピトープと免疫反応可能な抗原結合部位を含む。
【０２９５】
モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ方法（例えば、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５（１９７５）に記載されるような方法）を使用して調製され得る。ハイブリドーマ方法において、マウス、ハムスター、または他の適切な宿主細胞は、免疫因子で代表的に免疫され、免疫因子に特異的に結合する抗体を産生するか、または産生し得るリンパ球を誘発する。あるいは、リンパ球は、インビトロで免疫され得る。
【０２９６】
免疫因子としては、代表的に、タンパク質抗原、そのフラグメントまたはその融合タンパク質が挙げられる。一般的には、以下のいずれかである：ヒト起源の細胞が望まれる場合は、末梢血リンパ球が使用され、または非ヒト哺乳動物供給源が望まれる場合は、脾臓細胞またはリンパ節細胞が使用される。次いで、適切な融合因子（例えば、ポリエチレングリコール）を使用して、リンパ球を不死化細胞株に融合し、ハイブリドーマ細胞を形成する（Ｇｏｄｉｎｇ，ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ  ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ：ＰＲＩＮＣＩＰＬＥＳ  ＡＮＤ  ＰＲＡＣＴＩＣＥ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９８６）第５９−１０３頁）。不死化細胞株は、哺乳動物細胞、特にげっ歯類、ウシおよびヒト起源の骨髄腫細胞に通常形質転換される。通常ラットまたはマウスの骨髄腫細胞株が使用されるハイブリドーマ細胞は、１以上の物質（融合されていない不死化細胞の増殖も生存も阻害する）を適切に含む適切な培養培地中で培養され得る。例えば、親の細胞が酵素、ヒポキサンチングアニンンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴまたはＨＰＲＴ）を欠く場合、ハイブリドーマからの培養培地は、代表的にヒポキサンチン、アミノプテリン、およびチミジンを含み（「ＨＡＴ培地」）、それらの物質はＨＧＰＲＴ欠失細胞の増殖を阻害する。
【０２９７】
好ましい不死化細胞株は、効率的に融合する細胞株であり、それらは選択された抗体産生細胞の安定な高レベルの抗体の発現を支持し、そしてＨＡＴ培地のような培地に敏感である。より好ましい不死化細胞株はマウス骨髄腫細胞株であり、それらを、例えば、Ｓａｌｋ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｃｅｌｌ  Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  Ｃｅｎｔｅｒ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣａｌｉｆｏｒｎｉａおよびＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖｉｒｇｉｎｉａから得ることが可能である。ヒト骨髄腫およびマウス−ヒト骨髄腫細胞株はまた、ヒトモノクローナル抗体の産生について記載される（Ｋｏｚｂｏｒ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３３：３００１（１９８４）；Ｂｒｏｄｅｕｒら、ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ  ＡＮＴＩＢＯＤＹ  ＰＲＯＤＵＣＴＩＯＮ  ＴＥＣＨＮＩＱＵＥＳ  ＡＮＤ  ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮ，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，（１９８７）第５１−６３頁）。
【０２９８】
次いで、ハイブリドーマ細胞が培養される培養培地は、抗原に対するモノクローナル抗体の存在についてアッセイされ得る。好ましくは、ハイブリドーマ細胞によって産生されるモノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈降によって決定されるか、またはインビトロ結合アッセイ（例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）または酵素結合イムノソルベント検定法（ＥＬＩＳＡ））によって決定される。このような技術およびアッセイは、当該分野で公知である。モノクローナル抗体の結合親和性は、例えば、ＭｕｎｓｏｎおよびＰｏｌｌａｒｄ，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１０７：２２０（１９８０）のスキャッチャード分析によって決定され得る。好ましくは、標的抗原に対する高い程度の特異性および高結合親和性を有する抗体が、単離される。
【０２９９】
所望のハイブリドーマ細胞が同定された後、希釈手順を限定することによって、クローンをサブクローニングし得、そして標準方法によって増殖し得る。例えば、この目的のために適切な培養培地としては、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  ＭｅｄｉｕｍおよびＲＰＭＩ−１６４０培地が挙げられる。あるいは、ハイブリドーマ細胞は、哺乳動物内の腹水としてインビボで増殖され得る。
【０３００】
サブクローンによって分泌されたモノクローナル抗体は、従来の免疫グロブリン精製手順（例えば、タンパク質Ａセファロース、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、またはアフィニティークロマトグラフィー）によって、培養培地または腹水から、単離または精製され得る。
【０３０１】
モノクローナル抗体はまた、組換えＤＮＡ方法（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号に記載される方法）によって作製され得る。本発明のモノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、従来の手順を使用して（例えば、マウス抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合し得るオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって）容易に単離され得、そして配列決定され得る。本発明のハイブリドーマ細胞は、このようなＤＮＡの好ましい供給源として役立つ。一旦単離されると、ＤＮＡは、発現ベクターに配置され得、次いでそれらは、宿主細胞（例えば、さもなければ免疫グロブリンタンパク質を産生しないサルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、または骨髄腫細胞）にトランスフェクトされ、組換え宿主細胞内でのモノクローナル抗体の合成を得る。ＤＮＡはまた、例えば、相同なマウス配列の代わりにヒト重鎖および軽鎖定常ドメインをコードする配列の置換（米国特許第４，８１６，５６７号；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ  ３６８，８１２−１３（１９９４））によってか、または非免疫グロブリンポリペプチドについてのコード配列のすべてまたは一部の配列をコードする免疫グロブリンへの共有結合的な連結によって改変され得る。このような非免疫グロブリンポリペプチドは、本発明の抗体の定常領域に置換され得るか、または本発明の抗体の１つの抗原結合部位の可変領域に置換され得、キメラ二価の抗体を作製する。
【０３０２】
（ヒト化抗体）
本発明のタンパク質抗原に対する抗体は、さらにヒト化抗体またはヒト抗体を含み得る。これらの抗体は、投与された免疫グロブリンに対するヒトの免疫応答を引き起こさないヒトへの投与に適する。抗体のヒト化形態は、キメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖またはそれらのフラグメント（例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２または他の抗体の抗原結合配列）であり、それらは主にヒト免疫グロブリンの配列から構成され、そして非ヒト免疫グロブリンに由来する最小の配列を含む。ヒト化は、ヒト抗体の対応する配列についてのげっ歯類ＣＤＲまたはＣＤＲ配列の置換によって、Ｗｉｎｔｅｒおよび共同研究者の方法（Ｊｏｎｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ，３１：５２２−５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ，３３２：３２３−３２７（１９８８）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９：１５３４−１５３６（１９８８））の後に達成され得る。（米国特許第５，２２５，５３９号もまた参照のこと。）いくつかの場合において、ヒト免疫グロブリンのＦｖ骨格（ｆｒａｍｅｗｏｒｋ）残基は、対応する非ヒト残基によって置換される。ヒト化抗体はまた、患者の抗体においても、移入されたＣＤＲまたは骨格配列においても見出されない残基を含み得る。一般に、ヒト化抗体は、すべての少なくとも１つ、および代表的には２つの可変領域を実質的に含む。これらの領域内で、すべてのまたは実質的にすべてのＣＤＲ領域は非ヒト免疫グロブリンの領域に対応し、そしてすべてまたは実質的にすべての骨格領域はヒト免疫グロブリンコンセンサス配列の領域に対応する。ヒト化抗体はまた、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）、代表的には、ヒト免疫グロブリンの少なくとも一部を必要に応じて含む（Ｊｏｎｅｓら、１９８６；Ｒｉｅｃｈａｍａｎｎら、１９８８；およびＰｒｅｓｔａ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．，２：５９３−５９６（１９９２））。
【０３０３】
（ヒト抗体）
ＣＤＲを含む軽鎖および重鎖の両方の全体配列がヒト遺伝子から本質的に生じる抗体分子に、ヒト抗体は十分に関連する。このような抗体を、「ヒト抗体」、または「十分なヒト抗体」と本明細書中で呼ぶ。ヒトモノクローナル抗体は、トリオーマ（ｔｒｉｏｍａ）技術によって調製され得る；ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｚｂｏｒら、１９８３  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｔｏｄａｙ  ４：７２を参照のこと）およびヒトモノクローナル抗体を産生するためのＥＢＶハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅら、１９８５：ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ  ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ  ＡＮＤ  ＣＡＮＣＥＲ  ＴＨＥＲＡＰＹ，Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，第７７−９６頁）。ヒトモノクローナル抗体は、本発明の実行において使用され得、そしてヒトハイブリドーマの使用によってか（Ｃｏｔｅら、１９８３．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  ＵＳＡ  ８０：２０２６−２０３０を参照のこと）、またはインビトロでのＥｐｓｔｅｉｎ  Ｂａｒｒ  Ｖｉｒｕｓを用いたヒトＢ細胞による形質転換によって（Ｃｏｌｅら、１９８５：ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ  ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ  ＡＮＤ  ＣＡＮＣＥＲ  ＴＨＥＲＡＰＹ，Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，第７７−９６頁を参照のこと）産生され得る。
【０３０４】
さらに、ヒト抗体はまた、さらなる技術（ファージディスプレイライブラリー（ＨｏｏｇｅｎｂｏｏｍおよびＷｉｎｔｅｒ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２７：３８１（１９９１）；Ｍａｒｋｓら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１（１９９１））を含む）を使用して産生され得る。同様に、ヒト免疫グロブリン位置をトランスジェニック動物（例えば、内因性免疫グロブリン遺伝子が、部分的または完全に不活化されているマウス）に導入することによって、ヒト抗体は作製され得る。チャレンジの際にヒト抗体産生が観察され、このことはすべての点（遺伝子再配列、アセンブリー、および抗体レパートリーを含む）でヒトにおいて観察されたものに密接に類似する。このアプローチは、例えば、以下に記載される：米国特許第５，５４５，８０７号；同第５，５４５，８０６号；同第５，５６９，８２５号；同第５，６２５，１２６号；同第５，６３３，４２５号；同第５，６１１，０１６号、およびＭａｒｋｓら（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０、７７９−７８３（１９９２））；Ｌｏｎｂｅｒｇら（Ｎａｔｕｒｅ  ３６８  ８５６−８５９（１９９４））；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ（Ｎａｔｕｒｅ  ３６８、８１２−１３（１９９４））；Ｆｉｓｈｗｉｌｄら（Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４、８４５−５１（１９９６））；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ（Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４、８２６（１９９６））；ならびにＬｏｎｂｅｒｇおよびＨｕｓｚａｒ（Ｉｎｔｅｒｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３  ６５−９３（１９９５））。
【０３０５】
ヒト抗体は、抗原によるチャレンジに応答して動物の内因性抗体よりもヒト抗体を十分に産生するように改変されたトランスジェニック非ヒト動物を使用して、さらに産生され得る。（ＰＣＴ刊行物ＷＯ９４／０２６０２を参照のこと。）非ヒト宿主における重免疫グロブリン鎖および軽免疫グロブリン鎖をコードする内因性遺伝子は、耐えられなくなっており、そしてヒト重鎖および軽鎖免疫グロブリンをコードする活性な位置は、宿主のゲノムに挿入される。例えば、要求性ヒトＤＮＡセグメントを含む酵母人工染色体を使用して、ヒト遺伝子は組み込まれる。次いで、すべての所望の改変を提供する動物を、完全な改変の相補体よりもより少ない改変の相補体を含む中間トランスジェニック動物を雑種することによって子孫として得る。このような非ヒト動物の好ましい実施形態は、マウスであり、ＰＣＴ刊行物ＷＯ９６／３３７３５およびＷＯ９６／３４０９６に開示されるようにＸｅｎｏｍｏｕｓＴＭと呼ばれる。この動物は、ヒト免疫グロブリンを十分に分泌するＢ細胞を産生する。目的の免疫原を有する免疫後の動物から（例えば、ポリクローナル抗体の調製）、あるいは動物由来の不死化されたＢ細胞（例えば、モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ）から、抗体を直接得ることが可能である。さらに、ヒト可変領域を有する免疫グロブリンをコードする遺伝子は、抗体を直接得るために回復され、そして発現され得るか、または抗体のアナログ（例えば、１本鎖Ｆｖ分子）を得るために、さらに改変され得る。
【０３０６】
内因性免疫グロブリン重鎖の発現を欠く非ヒト宿主（マウスとして例証される）を作製するための方法の例は、米国特許第５，９３９，５９８号に記載される。それを、以下の工程を包含する方法によって得ることが可能である：位置の再配列を防ぎ、そして再配列された免疫グロブリン重鎖位置の転写物の形成、および選択マーカーをコードする遺伝子を含む標的ベクターによって影響される欠失を防ぐために、胚幹細胞における少なくとも１つの内因性重鎖位置由来のＪセグメント遺伝子を欠失する工程；およびトランスジェニックマウス（その体細胞および生殖細胞は、選択マーカーをコードする遺伝子を含む）を、胚幹細胞から作製する工程。
【０３０７】
目的の抗体（例えば、ヒト抗体）を産生する方法は、米国特許第５，９１６，７７１号に開示される。それは以下の工程を包含する：重鎖をコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターを、培養中の１つの哺乳動物宿主細胞に導入する工程、軽鎖をコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターを、別の哺乳動物宿主細胞に導入する工程、およびハイブリッド細胞を形成するために２つの細胞融合する工程。ハイブリッド細胞は、重鎖および軽鎖を含む抗体を発現する。
【０３０８】
この手順のさらなる改善において、免疫原上の臨床的に関連するエピトープを同定する方法、および関連するエピトープに高い親和性で免疫特異的に結合する抗体を選択する相関する方法は、ＰＣＴ刊行物ＷＯ９９／５３０４９に開示される。
【０３０９】
（Ｆａｂフラグメントおよび１本鎖抗体）
本発明に従って、技術は、本発明の抗原性タンパク質に特異的な１本鎖抗体の産生に適用され得る（例えば、米国特許第４，９４６，７７８号を参照のこと）。さらに、方法は、Ｆａｂ発現ライブラリーの構築に適用され得（例えば、Ｈｕｓｅら、１９８９  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４６：１２７５−１２８１を参照のこと）、タンパク質またはその誘導体、フラグメント、アナログまたはホモログについての所望の特異性を有するモノクローナルＦａｂフラグメントの迅速かつ効果的な同定を可能にする。タンパク質抗原に対するイディオタイプを含む抗体フラグメント（（ｉ）抗体分子のペプシン消化によって産生されるＦ（ａｂ’）２フラグメント；（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２フラグメントのジスルフィド架橋を還元することによって産生されたＦａｂフラグメント（ｉｉｉ）ペプシンおよび還元剤を用いた抗体分子の処理によって産生されたＦａｂフラグメント、および（ｉｖ）Ｆｖフラグメントを含むが、これらに限定ない）は、当該分野で公知の技術によって産生され得る。
【０３１０】
（二重特異的抗体）
二重特異的抗体は、モノクローナル抗体（好ましくはヒトモノクローナル抗体またはヒト化されたモノクローナル抗体）であって、これは少なくとも２つの異なる抗原に対して結合特異性を有する。この場合において、結合特異性の１つは、本発明の抗原性タンパク質に対してである。第２の結合標的は、任意の他の抗原であり、そして有利には細胞表面タンパク質あるいはレセプターまたはレセプターサブユニットである。
【０３１１】
二重特異的抗体を作製する方法は、当該分野で公知である。伝統的に、二重特異的抗体の組換え生成は、２つの免疫グロブリンの重鎖／軽鎖の対の同時発現に基づき、ここでこの２つの重鎖は異なる特異性を有する（ＭｉｌｓｔｅｉｎおよびＣｕｅｌｌｏ、Ｎａｔｕｒｅ，３０５：５３７−５３９（１９８３））。免疫グロブリンの重鎖および軽鎖のランダムな組み合わせのために、これらのハイブリドーマ（クアドローマ）は、１０の異なる抗体分子の潜在的混合物を作製し、このうち１つのみが正確な二重特異的構造を有する。この正確な分子の精製は、通常アフィニティークロマトグラフィー工程によって達成される。同様の手順は、１９９３年５月１３日開示のＷＯ９３／０８８２９、およびＴｒａｕｎｅｃｋｅｒら、１９９１  ＥＭＢＯ  Ｊ．、１０：３６５５−３６５９において開示される。
【０３１２】
所望の結合特異性（抗体−抗原結合部位）を有する抗体可変ドメインは、免疫グロブリン定常領域配列に融合され得る。この融合は、好ましくは免疫グロブリン重鎖定常ドメインを有し、ヒンジ、ＣＨ２、およびＣＨ３領域の少なくとも部分を含む。この融合物中の少なくとも１つに存在する軽鎖結合のために必要な部位を含む第１の重鎖定常領域（ＣＨ１）を有することが好ましい。この免疫グロブリン重鎖融合体、および所望の場合、この免疫グロブリン軽鎖をコードするＤＮＡは、別々の発現ベクターに挿入され、そして適切な宿主生物体に同時トランスフェクトされる。二重特異的抗体の作製のさらなる詳細は、例えば、Ｓｕｒｅｓｈら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１２１：２１０（１９８６）を参照のこと。
【０３１３】
ＷＯ９６／２７０１１に記載される別のアプローチに従って、抗体分子の対の間の界面は、組換え細胞培養物から回収されるヘテロダイマーのパーセンテージを最大化するために操作され得る。好ましい界面は、抗体定常領域のＣＨ３領域の少なくとも一部を含む。この方法において、第１の抗体分子の界面からの１つ以上の小さなアミノ酸側鎖は、より大きな側鎖（例えば、チロシンまたはトリプトファン）で置換される。大きな側鎖についての同一または同様のサイズの代償的な「空洞」は、大きなアミノ酸側鎖を小さなアミノ酸側鎖（例えば、アラニンまたはスレオニン）で置換することによって、第２の抗体分子の界面上に生成される。このことは、ホモダイマーのような他の不必要な最終生成物よりも、ヘテロダイマーの収量を増加するための機構を提供する。
【０３１４】
二重特異的抗体は、全長抗体または抗体フラグメント（例えば、Ｆ（ａｂ’）２二重特異的抗体）として調製され得る。抗体フラグメントから二重特異的抗体を作製するための技術は、文献において記載される。例えば、二重特異的抗体は、化学結合を使用して調製され得る。Ｂｒｅｎｎａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９：８１（１９８５）は、インタクトな抗体がタンパク分解的に切断されてＦ（ａｂ’）２フラグメントを作製する手順を記載する。これらのフラグメントは、ビシナルジチオールを安定化し、そして分子間ジスルフィド形成を阻止するために、ジチオール錯化剤ナトリウム亜ヒ酸塩の存在下で還元される。次いで、この作製されたＦａｂ’フラグメントは、チオニトロベンゾエート（ＴＮＢ）誘導体に変換される。次いで、Ｆａｂ’−ＴＮＢ誘導体の１つは、メルカプトエチルアミンでの還元によってＦａｂ’−チオールに再変換され、そしてこれは等モル量の他のＦａｂ’−ＴＮＢ誘導体と混合されて二重特異的抗体を形成する。生成された二重特異的抗体は、酵素の選択的固定化のための薬剤として使用され得る。
【０３１５】
さらに、Ｆａｂ’フラグメントは、Ｅ．ｃｏｌｉから直接回収され得、そして化学的にカップリングされて二重特異的抗体を形成する。Ｓｈａｌａｂｙら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７５：２１７−２２５（１９９２）は、完全にヒト化された二重特異的抗体Ｆ（ａｂ’）２分子の生成を記載する。各Ｆａｂ’フラグメントは、Ｅ．ｃｏｌｉから別々に分泌され、そしてインビトロの化学的カップリングに供され、二重特異的抗体を形成する。従って、形成されたこの二重特異的抗体は、ＥｒｂＢ２レセプターを過剰発現する細胞および正常なヒトＴ細胞に結合し得、そしてヒト胸部腫瘍標的に対するヒト細胞傷害性リンパ球の溶解性活性を誘因し得る。
【０３１６】
組換え細胞培養物から直接二重特異的抗体フラグメントを作製し、そして単離するための種々の技術が記載されてきた。例えば、二重特異的抗体は、ロイシンジッパーを使用して産生される。Ｋｏｓｔｅｌｎｙら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８（５）：１５４７−１５５３（１９９２）。ＦｏｓおよびＪｕｎタンパク質由来のロイシンジッパーペプチドは、遺伝子融合によって２つの異なる抗体のＦａｂ’部分に結合される。この抗体ホモダイマーは、ヒンジ領域で還元されてモノマーを形成し、次いで再酸化されて抗体ヘテロダイマーを形成する。この方法はまた、抗体ホモダイマーの産生のために使用され得る。Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：６４４４−６４４８（１９９３）に記載されるこの「ディアボディー（ｄｉａｂｏｄｙ）」技術は、二重特異的抗体フラグメントを作製するための代替的な機構を提供した。このフラグメントは、短すぎて同じ鎖上の２つのドメインの間を対にできないリンカーによって軽鎖可変領域（ＶＬ）に接続された重鎖可変領域（ＶＨ）を含む。従って、１つのフラグメントのＶＨおよびＶＬドメインは、別のフラグメントの相補的なＶＬおよびＶＨドメインと対になるように強制され、これによって２つの抗原結合部位が形成する。単鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）ダイマーの使用によって二重特異的抗体フラグメントを作製するための別のストラテジーもまた、報告されてきた。Ｇｒｕｂｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：５３６８（１９９４）を参照のこと。
【０３１７】
２つ以上の結合価を有する抗体が意図される。例えば、三重特異的抗体が調製され得る。Ｔｕｔｔら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：６０（１９９１）。
【０３１８】
例示的な二重特異的抗体は、２つの異なるエピトープに結合し得、このうち少なくとも１つは、本発明のタンパク質抗原に起源を有する。あるいは、免疫グロブリン分子の抗抗原性アームは、Ｔ細胞レセプター分子のような白血球（例えば、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ２８、またはＢ７）、あるいはＩｇＧに対するＦｃレセプター（ＦｃγＲ）（例えば、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）およびＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６））上の標的化分子に結合するアームに、特定の抗原を発現する細胞に対する細胞の防御機構に焦点を合わせるように結合され得る。二重特異的抗体はまた、特定の抗原を発現する細胞に対する細胞傷害性因子に指向するために使用され得る。これらの抗体は抗原結合アーム、および細胞傷害性因子または放射性核種キレーター（例えば、ＥＯＴＵＢＥ、ＤＰＴＡ、ＤＯＴＡ、またはＴＥＴＡ）に結合するアームを保有する。目的の別の二重特異的抗体は、本明細書中に記載のタンパク質抗原に結合し、そしてさらに組織因子（ＴＦ）に結合する。
【０３１９】
（ヘテロ結合体抗体）
ヘテロ結合体抗体はまた、本発明の範囲内である。ヘテロ結合体抗体は、２つの共有結合した抗体からなる。このような抗体は、例えば、免疫系細胞を不必要な細胞に標的化するために（米国特許第４，６７６，９８０号）、およびＨＩＶ感染の処置のために（ＷＯ９１／００３６０；ＷＯ９２／２００３７３；ＥＰ０３０８９）提案されてきた。この抗体（架橋剤を含む抗体を含む）は、インビトロで、合成タンパク質化学において公知の方法を使用して調製され得ることが意図される。例えば、免疫毒素は、ジスルフィド交換反応の使用またはチオエーテル結合の形成によって構築され得る。この目的のための適切な試薬の例としては、イミノチオレートおよびメチル−４−メルカプトブチルイミデート、ならびに例えば米国特許第４，６７６，９８０号において開示される試薬が挙げられる。
【０３２０】
（エフェクター機能操作）
本発明の抗体を、エフェクター機能について、例えば癌の処置における抗体の効力を増大するように改変することが望ましくあり得る。例えば、システイン残基は、Ｆｃ領域に導入され得、これによってこの領域における鎖間ジスルフィド結合の形成を可能にする。このようにして、作製されるこのホモダイマー抗体は、改良されたインターナリゼーションの能力および／または増加した補体媒介細胞死滅、ならびに抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）を有し得る。Ｃａｒｏｎら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１７６：１１９１−１１９５（１９９２）およびＳｈｏｐｅｓ、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：２９１８−２９２２（１９９２）を参照のこと。増大した抗腫瘍活性を有するホモダイマー抗体はまた、Ｗｏｌｆｆら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、５３：２５６０−２５６５（１９９３）に記載されるヘテロ二官能性架橋剤を使用して調製され得る。あるいは、抗体は、二重のＦｃ領域を有するように操作され得、そしてこれによって増大した補体溶解およびＡＤＣＣの能力を有し得る。Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎら、Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ，３：２１９−２３０（１９８９）を参照のこと。
【０３２１】
（免疫結合体）
本発明はまた、細胞傷害性因子（例えば、化学療法剤、毒素（例えば、細菌、真菌、植物、または動物起源の酵素学的に活性な毒素、あるいはそれらのフラグメント）、または放射性同位体（すなわち、放射性結合体））に結合した抗体を含む免疫結合体に関する。
【０３２２】
このような免疫結合体の作製において有用な化学療法剤は、上記に記載される。使用され得る酵素学的に活性な毒素およびそれらのフラグメントとしては、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合活性フラグメント、外毒素Ａ鎖（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ由来）、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシン（ｍｏｄｅｃｃｉｎ）Ａ鎖、α−サルシン、Ａｌｅｕｒｉｔｅｓ  ｆｏｒｄｉｉタンパク質、ジアンチン（ｄｉａｎｔｈｉｎ）タンパク質、Ｐｈｙｔｏｌａｃａ  ａｍｅｒｉｃａｎａタンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、およびＰＡＰ−Ｓ）、ｍｏｍｏｒｄｉｃａ  ｃｈａｒａｎｔｉａインヒビター、クルシン（ｃｕｒｃｉｎ）、クロチン（ｃｒｏｔｉｎ）、ｓａｐａｏｎａｒｉａ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓインヒビター、ゲロニン（ｇｅｌｏｎｉｎ）、ミトゲリン（ｍｉｔｏｇｅｌｌｉｎ）、レストリクトシン（ｒｅｓｔｒｉｃｔｏｃｉｎ）、フェノマイシン（ｐｈｅｎｏｍｙｃｉｎ）、エノマイシン（ｅｎｏｍｙｃｉｎ）、およびトリコテセン（ｔｒｉｃｏｔｈｅｃｅｎ）が挙げられる。種々の放射性核種は、放射性結合した抗体の作製のために利用可能である。その例としては、２１２Ｂｉ、１３１Ｉ、１３１Ｉｎ、９０Ｙ、および１８６Ｒｅが挙げられる。
【０３２３】
抗体および細胞傷害性因子の結合体は、種々の二官能性タンパク質カップリング剤（例えば、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオール）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、イミノチオラン（ｉｍｉｎｏｔｈｉｏｌａｎｅ）（ＩＴ）、イミドエステルの二官能性誘導体（例えば、ジメチルアジピミデート  ＨＣＬ）、活性エステル（例えば、ジスクシンイミジルスベレート）、アルデヒド（例えば、グルタルアルデヒド（ｇｌｕｔａｒｅｌｄｅｈｙｄｅ））、ビスアジド化合物（例えば、ビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミン）、ビス−ジアゾニウム誘導体（例えば、ビス−（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）−エチレンジアミン）、ジイソシアネート（例えば、トルエン（ｔｏｌｙｅｎｅ）２，６−ジイソシアネート）、およびビス−活性フッ素化合物（例えば、１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン））を使用して作製される。例えば、リシン免疫毒素は、Ｖｉｔｅｔｔａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３８：１０９８（１９８７）に記載されるように調製され得る。炭素−１４−標識１−イソチオシアナトベンジル−３−メチルジエチレントリアミン五酢酸（ＭＸ−ＤＴＰＡ）は、放射性ヌクレオチドの抗体への結合のための例示的なキレート剤である。ＷＯ９４／１１０２６を参照のこと。
【０３２４】
別の実施形態において、腫瘍の前標的化における利用のために、この抗体は、「レセプター」（例えば、ストレプトアビジン）に結合され得、ここで抗体−レセプター結合体は患者に投与され、続いて除去剤を使用して結合していない結合体が循環から除去され、次いで今度は細胞傷害性因子に結合する「リガンド」（例えば、アビジン）が投与される。
【０３２５】
１つの実施形態において、所望の特異性を保有する抗体のスクリーニングのための方法としては、当該分野内で公知の酵素結合イムノソルベント検定法（ＥＬＩＳＡ）および他の免疫学的に媒介された技術が挙げられるがこれらに限定されない。特定の実施形態において、ＮＯＶＸタンパク質の特定のドメインに対して特異的である抗体の選択は、このようなドメインを所有しているＮＯＶＸタンパク質のフラグメントに結合するハイブリドーマの生成により容易にされる。従って、ＮＯＶＸタンパク質、またはそれらの誘導体、フラグメント、アナログもしくはホモログ内の所望のドメインについて特異的である抗体がまた、本明細書において提供される。
【０３２６】
抗ＮＯＶＸ抗体は、ＮＯＶＸタンパク質の局在化および／または定量化に関する当該分野で公知の方法において用いられ得る（例えば、適切な生理学的サンプル中のＮＯＶＸタンパク質のレベルを測定する使用のために、診断的方法における使用のために、タンパク質の画像化における使用のために、など）。所定の実施形態において、ＮＯＶＸタンパク質、またはそれらの誘導体、フラグメント、アナログもしくはホモログについての抗体（抗体由来の結合ドメインを含む）は、薬理学的に活性な化合物（本明細書中、以降において「治療剤」）として利用される。
【０３２７】
抗ＮＯＶＸ抗体（例えば、モノクローナル抗体）は、標準的技術（例えばアフィニティークロマトグラフィまたは免疫沈降）によって、ＮＯＶＸポリペプチドを単離するために用いられ得る。抗ＮＯＶＸ抗体は、細胞からの天然のＮＯＶＸポリペプチド、そして宿主細胞において発現される組換え的に産生されたＮＯＶＸポリペプチドの精製を容易にし得る。さらに、抗ＮＯＶＸ抗体が、（例えば、細胞の溶解産物または細胞上清における）ＮＯＶＸタンパク質を検出するために用いられて、ＮＯＶＸタンパク質の発現の量およびパターンを評価し得る。抗ＮＯＶＸ抗体は、例えば、所定の治療レジメンの有効性を決定するために、臨床試験の手順の一部として、組織におけるタンパク質レベルをモニターするために診断的に用いられ得る。検出は、抗体を検出可能物質にカップリングする（すなわち、物理的に連結する）ことにより容易にされ得る。検出可能物質の例としては、種々の酵素、補欠分子族、蛍光物質、発光物質、生物発光物質および放射性物質が挙げられる。適切な酵素の例としては、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼまたはアセチルコリンエステラーゼが挙げられる；適切な補欠分子族複合体の例としては、ストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチンが挙げられる；適切な蛍光物質の例としては、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミン（ｄｉｃｈｌｏｒｏｔｒｉａｚｉｎｙｌａｍｉｎｅ）フルオレセイン、ダンシルクロリドまたはフィコエリトリンが挙げられる；発光物質の例としては、ルミノールが挙げられる；生物発光物質の例としては、ルシフェラーゼ、ルシフェリンおよびエクオリンが挙げられる；そして、適切な放射性物質の例としては１２５Ｉ、１３１Ｉ、３５Ｓまたは３Ｈが挙げられる。
【０３２８】
（ＮＯＶＸ組換え発現ベクターおよび宿主細胞）
本発明の別の局面は、ＮＯＶＸタンパク質、またはその誘導体、フラグメント、アナログもしくはホモログをコードする核酸を含む、ベクター、好ましくは、発現ベクターに関する。本明細書において使用する場合、用語「ベクター」は、連結された別の核酸を輸送し得る核酸分子をいう。１つの型のベクターは、「プラスミド」である。これはさらなるＤＮＡセグメントが連結され得る環状の二本鎖ＤＮＡループをいう。別の型のベクターは、ウイルス性ベクターであり、ここでは、さらなるＤＮＡセグメントが、ウイルスゲノムに連結され得る。特定のベクターは、ベクターが導入される宿主細胞中で自律複製し得る（例えば、細菌性の複製起点を有する細菌ベクター、およびエピソーム性哺乳動物ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソーム性哺乳動物ベクター）は、宿主細胞への導入の際、宿主細胞のゲノムに組み込まれ、そして、これにより宿主ゲノムとともに複製される。さらに、特定のベクターは、それらが作動可能に連結される遺伝子の発現を指示し得る。このようなベクターは、本明細書において「発現ベクター」と呼ばれる。一般に、組換えＤＮＡ技術において有用な発現ベクターは、しばしばプラスミドの形態である。本明細書において、「プラスミド」および「ベクター」は、プラスミドが最も一般的に用いられる形態のベクターであるので、交換可能に使用され得る。しかし、本発明は、等価の機能を果たす、ウイルス性ベクター（例えば、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルス、およびアデノ随伴ウイルス）のような、このような他の形態の発現ベクターを含むことを意図する。
【０３２９】
本発明の組換え発現ベクターは、宿主細胞における核酸の発現に適切な形態の本発明の核酸を含む。これは、組換え発現ベクターが、発現されるべき核酸配列に作動可能に連結されている、発現に用いられる宿主細胞に基づいて選択された１つ以上の調節配列を含むことを意味する。組換え発現ベクターにおいて、「作動可能に連結する」とは、目的のヌクレオチド配列が、（例えば、インビトロの転写／翻訳系において、またはベクターが宿主細胞に導入される場合は、宿主細胞において）ヌクレオチド配列の発現を可能にする様式で調節配列に連結されることを意味することを意図する。
【０３３０】
用語「調節配列」は、プロモーター、エンハンサーおよび他の発現制御エレメント（例えば、ポリアデニル化シグナル）を含むことを意図する。このような調節配列は、例えば、Ｇｏｅｄｄｅｌ；ＧＥＮＥ  ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ：ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ  １８５、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．（１９９０）に記載されている。調節配列は、多くの型の宿主細胞においてヌクレオチド配列の構成的発現を指示する配列、および特定の宿主細胞のみにおいてヌクレオチド配列の発現を指示する配列（例えば、組織特異的調節配列）を含む。発現ベクターの設計が、形質転換される宿主細胞の選択、所望のタンパク質の発現のレベルなどのような因子に依存し得ることが当業者に理解される。本発明の発現ベクターは、宿主細胞に導入され得、それにより、本明細書に記載される核酸によってコードされるタンパク質またはペプチド（融合タンパク質またはペプチドを含む）（例えば、ＮＯＶＸタンパク質、ＮＯＶＸタンパク質の変異形態、融合タンパク質など）を産生し得る。
【０３３１】
本発明の組換え発現ベクターは、原核生物細胞または真核生物細胞における、ＮＯＶＸタンパク質発現のために設計され得る。例えば、ＮＯＶＸタンパク質は、細菌細胞（例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、昆虫細胞（バキュロウイルス発現ベクターを用いる）、酵母細胞または哺乳動物細胞において発現され得る。適切な宿主細胞は、Ｇｏｅｄｄｅｌ；ＧＥＮＥ  ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ：ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ  １８５、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．（１９９０）にさらに考察されている。あるいは、組換え型発現ベクターは、例えば、Ｔ７プロモーター調節配列およびＴ７ポリメラーゼを用いて、インビトロで転写および翻訳され得る。
【０３３２】
原核生物におけるタンパク質の発現は、最も頻繁には、融合タンパク質または非融合タンパク質のいずれかの発現を指示する、構成的プロモーターまたは誘導性プロモーターを含むベクターを用いてＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉにおいて実施される。融合ベクターは、そこにコードされるタンパク質に、通常、組換えタンパク質のアミノ末端に、多数のアミノ酸を付加する。このような融合ベクターは、代表的には、以下の３つの目的のために役立つ：（ｉ）組換えタンパク質の発現を増加させるため；（ｉｉ）組換えタンパク質の溶解性を増加させるため；および（ｉｉｉ）アフィニティー精製においてリガンドとして作用することによって組換えタンパク質の精製の際に補助するため。しばしば、融合発現ベクターにおいて、タンパク質分解の切断部位が、融合部分と組換えタンパク質との結合部に導入されて、融合タンパク質の精製の後に融合部分から組換えタンパク質を分離することを可能とする。このような酵素、およびその同族（ｃｏｇｎａｔｅ）の認識配列は、第Ｘａ因子、トロンビン、およびエンテロキナーゼが挙げられる。代表的な融合発現ベクターとしては、それぞれ、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトースＥ結合タンパク質、またはプロテインＡを標的の組換えタンパク質に融合する、ｐＧＥＸ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｉｎｃ．；ＳｍｉｔｈおよびＪｏｈｎｓｏｎ（１９８８）Ｇｅｎｅ  ６７：３１−４０）、ｐＭＡＬ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，Ｍａｓｓ．）およびｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎ．Ｊ．）が挙げられる。
【０３３３】
適切な誘導性非融合Ｅ．ｃｏｌｉ発現ベクターの例には、ｐＴｒｃ（Ａｍｒａｎｎら（１９８８）Ｇｅｎｅ  ６９：３０１−３１５）およびｐＥＴ  １１ｄ（Ｓｔｕｄｉｅｒら、ＧＥＮＥ  ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ：ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ  １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．（１９９０）６０−８９）が挙げられる。
【０３３４】
Ｅ．ｃｏｌｉにおける組換えタンパク質発現を最大化するための１つのストラテジーは、組換えタンパク質をタンパク質分解的に切断する能力を欠損した宿主細菌中でタンパク質を発現させることである。例えば、Ｇｏｔｔｅｓｍａｎ，ＧＥＮＥ  ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ：ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ  １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．（１９９０）１１９−１２８を参照のこと。別のストラテジーは、各アミノ酸についての個々のコドンが、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて優先的に利用されるコドンであるように、発現ベクターに挿入される核酸の核酸配列を変更することである（例えば、Ｗａｄａら（１９９２）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２０：２１１１−２１１８を参照のこと）。本発明の核酸配列のこのような変更は、標準的なＤＮＡ合成技術によって実行され得る。
【０３３５】
別の実施形態において、ＮＯＶＸ発現ベクターは、酵母発現ベクターである。酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｉｖｉｓａｅにおける発現のためのベクターの例には、ｐＹｅｐＳｅｃ１（Ｂａｌｄａｒｉら、（１９８７）ＥＭＢＯ  Ｊ．６：２２９−２３４）、ｐＭＦａ（ＫｕｒｊａｎおよびＨｅｒｓｋｏｗｉｔｚ、（１９８２）Ｃｅｌｌ  ３０：９３３−９４３）、ｐＪＲＹ８８（Ｓｃｈｕｌｔｚら、（１９８７）Ｇｅｎｅ  ５４：１１３−１２３）、ｐＹＥＳ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）、およびｐｉｃＺ（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）が挙げられる。
【０３３６】
あるいは、ＮＯＶＸは、バキュロウイルス発現ベクターを使用して、昆虫細胞中で発現され得る。培養昆虫細胞（例えば、ＳＦ９細胞）中でのタンパク質の発現のために利用可能なバキュロウイルスベクターには、ｐＡｃシリーズ（Ｓｍｉｔｈら（１９８３）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３：２１５６−２１６５）およびｐＶＬシリーズ（ＬｕｃｋｌｏｗおよびＳｕｍｍｅｒｓ（１９８９）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １７０：３１−３９）が挙げられる。
【０３３７】
なお別の実施形態において、本発明の核酸は、哺乳動物発現ベクターを使用して、哺乳動物細胞中で発現される。哺乳動物発現ベクターの例には、ｐＣＤＭ８（Ｓｅｅｄ（１９８７）Ｎａｔｕｒｅ  ３２９：８４０）およびｐＭＴ２ＰＣ（Ｋａｕｆｍａｎら（１９８７）ＥＭＢＯ  Ｊ．６：１８７−１９５）が挙げられる。哺乳動物細胞中で使用される場合、発現ベクターの制御機能は、しばしば、ウイルスの調節エレメントによって提供される。例えば、一般に使用されるプロモーターは、ポリオーマ、アデノウイルス２、サイトメガロウイルス、およびシミアンウイルス４０に由来する。原核生物細胞および真核生物細胞の両方のために適切な他の発現系については、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ．第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８９の第１６章および第１７章を参照のこと。
【０３３８】
別の実施形態において、組換え哺乳動物発現ベクターは、特定の細胞型中で優先的に核酸の発現を指示し得る（例えば、組織特異的調節エレメントを使用して核酸を発現する）。組織特異的調節エレメントは、当該分野で公知である。適切な組織特異的なプロモーターの非限定的な例には、アルブミンプロモーター（肝臓特異的；Ｐｉｎｋｅｒｔら（１９８７）Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１：２６８−２７７）、リンパ特異的プロモーター（ＣａｌａｍｅおよびＥａｔｏｎ（１９８８）Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４３：２３５−２７５）、Ｔ細胞レセプターの特定のプロモーターにおいて（ＷｉｎｏｔｏおよびＢａｌｔｉｍｏｒｅ（１９８９）ＥＭＢＯ  Ｊ．８：７２９−７３３）および免疫グロブリンの特定のプロモーターにおいて（Ｂａｎｅｒｊｉら（１９８３）Ｃｅｌｌ  ３３：７２９−７４０；ＱｕｅｅｎおよびＢａｌｔｉｍｏｒｅ（１９８３）Ｃｅｌｌ  ３３：７４１−７４８）、ニューロン特異的プロモーター（例えば、神経フィラメントプロモーター；ＢｙｒｎｅおよびＲｕｄｄｌｅ（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：５４７３−５４７７）、膵臓特異的プロモーター（Ｅｄｌｕｎｄら（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３０：９１２−９１６）、ならびに乳腺特異的プロモーター（例えば、乳清プロモーター；米国特許第４，８７３，３１６号および欧州出願公開第２６４，１６６号）が挙げられる。発達的に調節されるプロモーターもまた含まれる（例えば、マウスｈｏｘプロモーター（ＫｅｓｓｅｌおよびＧｒｕｓｓ（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：３７４−３７９）およびα−フェトプロテインプロモーター（ＣａｍｐｅｓおよびＴｉｌｇｈｍａｎ（１９８９）Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．３：５３７−５４６））。
【０３３９】
本発明はさらに、アンチセンス方向で発現ベクターにクローニングされた本発明のＤＮＡ分子を含む組換え発現ベクターを提供する。すなわち、そのＤＮＡ分子は、ＮＯＶＸ  ｍＲＮＡに対してアンチセンスであるＲＮＡ分子の発現（ＤＮＡ分子の転写によって）を可能にする様式で調節配列に作動可能に連結される。種々の細胞型においてアンチセンスＲＮＡ分子の持続的な発現を指示する、アンチセンス方向でクローニングされた核酸に作動可能に連結された調節配列（例えば、ウイルスプロモーターおよび／もしくはエンハンサー）が選択され得るか、または、アンチセンスＲＮＡの構成的発現、組織特異的発現、または細胞型特異的発現を指示する調節配列が、選択され得る。アンチセンス発現ベクターは、組換えプラスミド、ファージミド、または弱毒化されたウイルスの形態であり得、ここではアンチセンス核酸は、高効率調節領域の制御下で産生され、その活性は、ベクターが導入される細胞型によって決定され得る。アンチセンス遺伝子を使用する遺伝子発現の調節の考察については、例えば、Ｗｅｉｎｔｒａｕｂら、「Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ＲＮＡ  ａｓ  ａ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｔｏｏｌ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ａｎａｌｙｓｉｓ」、Ｒｅｖｉｅｗｓ−Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、第１巻（１）１９８６を参照のこと。
【０３４０】
本発明の別の局面は、本発明の組換え発現べクターが導入された宿主細胞に関する。用語「宿主細胞」および「組換え宿主細胞」は、本明細書中で、交換可能に使用される。このような用語は、特定の被験細胞をいうのみでなく、そのような細胞の子孫または潜在的な子孫をもいうことが理解される。変異または環境の影響のいずれかに起因して、特定の改変は次の世代において生じ得るので、このような子孫は、実際には、親の細胞と同一でないかもしれないが、なお、本明細書中で使用される場合のこの用語の範囲内に含まれる。
【０３４１】
宿主細胞は、任意の原核生物細胞または真核生物細胞であり得る。例えば、ＮＯＶＸタンパク質は、細菌細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）、昆虫細胞、酵母または哺乳動物細胞（例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）またはＣＯＳ細胞）において発現され得る。他の適切な宿主細胞は、当業者に公知である。
【０３４２】
ベクターＤＮＡは、従来の形質転換またはトランスフェクション技術を介して原核生物細胞または真核生物細胞に導入され得る。本明細書中で使用される場合、用語「形質転換」および「トランスフェクション」とは、外来性の核酸（例えば、ＤＮＡ）を宿主細胞に導入するために当該分野で容認されている種々の技術をいうことを意図し、これらには、リン酸カルシウムまたは塩化カルシウム共沈、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、リポフェクション、またはエレクトロポレーションが含まれる。宿主細胞を形質転換またはトランスフェクションするための適切な方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ．第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８９）および他の実験室マニュアルに見出され得る。
【０３４３】
安定な哺乳動物細胞のトランスフェクションのために、使用される発現ベクターおよびトランスフェクション技術に依存して、細胞のほんの一部のみが外来ＤＮＡをそのゲノムに組み込み得ることが知られている。これらの要素を同定および選択するために、選択マーカー（例えば、抗生物質に対する耐性）をコードする遺伝子が、一般的には目的の遺伝子とともに宿主細胞に導入される。種々の選択マーカーには、薬物（例えば、Ｇ４１８、ハイグロマイシン、およびメトトレキサート）に対する耐性を付与するものが含まれる。選択マーカーをコードする核酸は、ＮＯＶＸをコードするベクターと同じベクター上で宿主細胞に導入され得るか、あるいは別々のベクター上で導入され得る。導入された核酸で安定にトランスフェクトされた細胞は、薬物選択によって同定され得る（例えば、選択マーカー遺伝子を取り込んだ細胞は生存するが、他の細胞は死滅する）。
【０３４４】
本発明の宿主細胞（例えば、培養中の原核生物宿主細胞および真核生物宿主細胞）は、ＮＯＶＸタンパク質を産生（すなわち、発現）するために使用され得る。従って、本発明はさらに、本発明の宿主細胞を使用して、ＮＯＶＸタンパク質を産生するための方法を提供する。１つの実施形態において、この方法は、ＮＯＶＸタンパク質が産生されるような適切な培地中で、本発明の宿主細胞（ここに、ＮＯＶＸタンパク質をコードする組換え発現ベクターが導入されている）を培養する工程を包含する。別の実施形態において、この方法はさらに、培地または宿主細胞からＮＯＶＸタンパク質を単離する工程を包含する。
【０３４５】
（トランスジェニックＮＯＶＸ動物）
本発明の宿主細胞はまた、非ヒトトランスジェニック動物を作製するために使用され得る。例えば、１つの実施形態において、本発明の宿主細胞は、ＮＯＶＸタンパク質コード配列が導入された、受精卵母細胞または胚性幹細胞である。次いで、このような宿主細胞は、外因性のＮＯＶＸ配列がゲノムに導入された非ヒトトランスジェニック動物、または内因性のＮＯＶＸ配列が変更された相同組換え動物を作製するために使用され得る。このような動物は、ＮＯＶＸタンパク質の機能および／または活性を研究するため、ならびにＮＯＶＸタンパク質活性のモジュレーターを同定および／または評価するために有用である。本明細書中で使用される場合、「トランスジェニック動物」とは、非ヒト動物であり、好ましくは哺乳動物であり、より好ましくは、ラットまたはマウスのような齧歯類であり、ここで、その動物の１つ以上の細胞が、導入遺伝子を含む。トランスジェニック動物の他の例としては、非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ウシ、ヤギ、ニワトリ、両生類などが挙げられる。導入遺伝子は、細胞（この細胞からトランスジェニック動物を発生させた）のゲノムに組み込まれかつ成熟動物のゲノムに残存し、それによって、トランスジェニック動物の１つ以上の細胞型または組織においてコードされた遺伝子産物の発現を指示する、外因性のＤＮＡである。本明細書中で使用される場合、「相同（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ）組換え動物」とは、非ヒト動物であり、好ましくは哺乳動物であり、より好ましくはマウスであり、ここで内因性のＮＯＶＸ遺伝子は、内因性の遺伝子と、その動物の発生の前にその動物の細胞（例えば、その動物の胚細胞）に導入された外因性のＤＮＡ分子との間の相同組換えによって変更されている。
【０３４６】
本発明のトランスジェニック動物は、ＮＯＶＸをコードする核酸を、例えば、マイクロインジェクション、レトロウイルス感染によって、受精卵母細胞の雄性前核に導入すること、およびその卵母細胞を偽妊娠雌性養育動物（ｆｏｓｔｅｒ  ａｎｉｍａｌ）中で発達させることを可能にすることによって作製され得る。配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１および３３のヒトのＮＯＶＸ  ｃＤＮＡ配列は、非ヒト動物のゲノムに導入遺伝子として導入され得る。あるいは、ヒトのＮＯＶＸ遺伝子の非ヒトホモログ（例えば、マウスのＮＯＶＸ遺伝子）は、ヒトのＮＯＶＸ  ｃＤＮＡ（上記にさらに記載された）に対するハイブリダイゼーションに基づいて単離され得、そして導入遺伝子として使用され得る。イントロン配列およびポリアデニル化シグナルもまた導入遺伝子中に含まれ得、その導入遺伝子の発現の効率を増大させ得る。組織特異的調節配列（単数または複数）は、特定の細胞に対して、ＮＯＶＸタンパク質の発現を指示するように、ＮＯＶＸ導入遺伝子に作動可能に連結され得る。胚の操作およびマイクロインジェクションを介するトランスジェニック動物（特に、マウスのような動物）を作製するための方法は、当該分野で慣習的になっており、そして例えば、米国特許第４，７３６，８６６号；同第４，８７０，００９号；および同第４，８７３，１９１号；ならびにＨｏｇａｎ  １９８６、ＭＡＮＩＰＵＬＡＴＩＮＧ  ＴＨＥ  ＭＯＵＳＥ  ＥＭＢＲＹＯ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．に記載されている。同様の方法が、他のトランスジェニック動物の作製のために使用される。トランスジェニック創始（ｆｏｕｎｄｅｒ）動物は、そのゲノムにおけるＮＯＶＸ導入遺伝子の存在および／またはその動物の組織もしくは細胞中のＮＯＶＸ  ｍＲＮＡの発現に基づいて同定され得る。次いで、トランスジェニック創始動物は、導入遺伝子を有するさらなる動物を育種するために使用され得る。さらに、ＮＯＶＸタンパク質をコードする導入遺伝子を有するトランスジェニック動物は、さらに、他の導入遺伝子を有する他のトランスジェニック動物に交雑され得る。
【０３４７】
相同組換え動物を作製するために、ＮＯＶＸ遺伝子の少なくとも一部を含むベクターを調製する。ここで、この遺伝子は、欠失、付加、または置換が導入され、それによってそのＮＯＶＸ遺伝子が変更されている（例えば、機能的に破壊されている）。ＮＯＶＸ遺伝子は、ヒト遺伝子（例えば、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１および３３のｃＤＮＡ）であり得るが、より好ましくは、ヒトのＮＯＶＸ遺伝子の非ヒトホモログである。例えば、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１および３３のヒトのＮＯＶＸ遺伝子のマウスホモログは、マウスゲノムにおける内因性のＮＯＶＸ遺伝子を変更するのに適切な相同組換えベクターを構築するために使用され得る。１つの実施形態において、そのベクターは、相同組換えに際して、その内因性のＮＯＶＸ遺伝子が、機能的に破壊されるように設計される（すなわち、機能的タンパク質をもはやコードしない；「ノックアウト」ベクターともいわれる）。
【０３４８】
あるいは、このベクターは、相同組換えに際して、内因性ＮＯＶＸ遺伝子が変異されるか、あるいはさもなければ、変更されるが、なお機能性タンパク質をコードするように、設計され得る（例えば、上流の調節領域が変更され、それによって内因性ＮＯＶＸタンパク質の発現を変更し得る）。相同組換えベクターにおいて、ＮＯＶＸ遺伝子の変更された部分は、ＮＯＶＸ遺伝子のさらなる核酸によって、その５’末端および３’末端で隣接されることにより、相同組換えが、ベクターによって保有される外因性ＮＯＶＸ遺伝子と胚性幹細胞中の内因性ＮＯＶＸ遺伝子との間で起こることを可能にする。さらなる隣接するＮＯＶＸ核酸は、内因性遺伝子との首尾よい相同組換えのために十分な長さである。典型的に、数キロベースの隣接ＤＮＡ（５’末端および３’末端の両方における）が、ベクターに含まれる。例えば、相同組換えベクターの説明について、Ｔｈｏｍａｓら（１９８７）Ｃｅｌｌ  ５１：５０３を参照のこと。次いで、このベクターは、（例えば、エレクトロポレーションによって）胚性幹細胞株に導入され、そして導入されたＮＯＶＸ遺伝子が内因性ＮＯＶＸ遺伝子と相同組換えした細胞が、選択される。例えば、Ｌｉら（１９９２）Ｃｅｌｌ  ６９：９１５を参照のこと。
【０３４９】
次いで、選択された細胞が、動物（例えば、マウス）の胚盤胞へ注入され、凝集キメラを形成する。例えば、Ｂｒａｄｌｅｙ（１９８７）のＴＥＲＡＴＯＣＡＲＣＩＮＯＭＡＳ  ＡＮＤ  ＥＭＢＲＹＯＮＩＣ  ＳＴＥＭ  ＣＥＬＬＳ：Ａ  ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ  ＡＰＰＲＯＡＣＨ、Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ編、ＩＲＬ、Ｏｘｆｏｒｄ、１１３頁〜１５２頁を参照のこと。次いで、キメラ胚が、適切な偽妊娠雌性養育動物に移植され得、そしてその胚は分娩に到る。その生殖細胞中に相同組換えされたＤＮＡを保有する子孫が、動物を育種するために使用され得、ここでこの動物の全ての細胞は、導入遺伝子の生殖系列伝達によって、相同組換えされたＤＮＡを含む。相同組換えベクターおよび相同組換え動物を構築するための方法が、さらに以下に記載される；Ｂｒａｄｌｅｙ（１９９１）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２：８２３−８２９；ＰＣＴ国際公開番号：ＷＯ９０／１１３５４；ＷＯ９１／０１１４０；ＷＯ９２／０９６８；およびＷＯ９３／０４１６９。
【０３５０】
別の実施形態において、導入遺伝子の調節された発現を可能にする選択された系を含む非ヒトトランスジェニック動物が産生され得る。このような系の１つの例は、バクテリオファージＰ１のｃｒｅ／ｌｏｘＰリコンビナーゼ系である。ｃｒｅ／ｌｏｘＰリコンビナーゼ系の説明については、例えば、Ｌａｋｓｏら（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：６２３２−６２３６を参照のこと。リコンビナーゼ系の別の例は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＦＬＰリコンビナーゼ系である。Ｏ’Ｇｏｒｍａｎら（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５１：１３５１−１３５５を参照のこと。ｃｒｅ／ｌｏｘＰリコンビナーゼ系が導入遺伝子の発現を調節するために使用される場合、Ｃｒｅリコンビナーゼおよび選択されたタンパク質の両方をコードする導入遺伝子を含む動物が必要となる。このような動物は、例えば、２つのトランスジェニック動物（一方は選択されたタンパク質をコードした導入遺伝子を含み、他方はリコンビナーゼをコードした導入遺伝子を含む）を交配することによる「二重の」トランスジェニック動物の構築によって提供され得る。
【０３５１】
本明細書中に記載される非ヒトトランスジェニック動物のクローンがまた、Ｗｉｌｍｕｔら（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ  ３８５：８１０−８１３に記載される方法に従って、産生され得る。簡単には、トランスジェニック動物からの細胞（例えば、体細胞）が単離され得、そして増殖サイクル（ｇｒｏｗｔｈ  ｃｙｃｌｅ）から出て、Ｇ０期に入るように誘導され得る。次いで、静止性細胞が、例えば、電気パルスの使用により、その静止性細胞が単離されたのと同種の動物から除核された卵母細胞へ融合され得る。次いで、この再構築された卵母細胞は培養され、これにより、これは桑実胚または未分化胚芽細胞に発達し、次いで、偽妊娠雌性養育動物に移される。この雌性養育動物から産まれた子孫は、その細胞（例えば、その体細胞）が単離された動物のクローンである。
【０３５２】
（薬学的組成物）
本発明のＮＯＶＸ核酸分子、ＮＯＶＸタンパク質、および抗ＮＯＶＸ抗体（これはまた、本明細書中で、「活性化合物」とも呼ばれる）、ならびにそれらの誘導体、フラグメント、アナログ、およびホモログが、投与に適した薬学的組成物に組み込まれ得る。このような組成物は、典型的に、核酸分子、タンパク質または抗体、および薬学的に受容可能なキャリアを含む。本明細書中で使用される場合、「薬学的に受容可能なキャリア」は、薬学的な投与に適合性の任意のおよび全ての溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤（ｄｅｌａｙｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）などを含むことが意図される。適切なキャリアは、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（当該分野の標準的参考文献であって、本明細書中に参考として援用される）の最新版に記載される。このようなキャリアまたは希釈剤の好ましい例としては、水、生理食塩水、フィンガー（ｆｉｎｇｅｒ）溶液、デキストロース溶液、および５％ヒト血清アルブミンが挙げられるが、これらに限定されない。リポソームおよび非水性ビヒクル（例えば、不揮発性油）もまた、使用され得る。薬学的に活性な物質に対するこのような媒体および薬剤の使用は、当該分野で周知である。任意の従来の媒体または薬剤が活性化合物と不適合である場合を除いて、組成物におけるその使用が意図される。補助的な活性化合物もまた、組成物へ組み込まれ得る。
【０３５３】
本発明の薬学的組成物は、その意図される投与経路と適合性であるように処方される。投与経路の例には、非経口（例えば、静脈内、皮内、皮下）投与、経口（例えば、吸入）投与、経皮（すなわち、局所的）投与、経粘膜（ｔｒａｎｓｍｕｃｏｓａｌ）投与、および直腸投与が挙げられる。非経口適用、皮内適用または皮下適用のために使用される溶液または懸濁液は、以下の成分を含み得る：注射用水、生理食塩水溶液、不揮発性油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の合成溶媒のような、滅菌希釈剤；ベンジルアルコールまたはメチルパラベンのような、抗菌剤；アスコルビン酸または重亜硫酸ナトリウムのような、抗酸化剤；エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）のような、キレート剤；酢酸塩、クエン酸塩またはリン酸塩のような緩衝剤、および塩化ナトリウムまたはデキストロースのような、張度の調整のための薬剤。ｐＨは、塩酸または水酸化ナトリウムのような酸または塩基で調整され得る。非経口調製物は、ガラスまたはプラスチック製のアンプル、使い捨てシリンジ、または多用量のバイアル中に入れられ得る。
【０３５４】
注入用途に適した薬学的組成物は、滅菌水溶液（水溶性の場合）または分散物、および滅菌注入可能溶液または分散物の即座の調製のための滅菌粉末を含む。静脈内投与において、適切なキャリアには、生理食塩水、静菌水、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ  ＥＬＴＭ（ＢＡＳＦ、Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ、Ｎ．Ｊ．）またはリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）が挙げられる。全ての場合において、組成物は、無菌でなければならず、そして容易な注入性（ｓｙｒｉｎｇｅａｂｉｌｉｔｙ）が存在する程度に流動性であるべきである。これは、製造および保存の条件下で安定でなければならず、そして、細菌および真菌のような微生物の汚染行為に対して保護されなければならない。このキャリアは、例えば、以下を含む溶媒または分散媒であり得る：水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）ならびにそれらの適切な混合物。適切な流動性が、例えば、レシチンのようなコーティングの使用によって、分散物の場合には、要求される粒子サイズを維持することによって、および界面活性剤を使用することによって維持され得る。微生物の作用の防止は、種々の抗菌剤および抗真菌剤（例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなど）によって達成され得る。多くの場合、組成物中に等張剤（例えば、糖、ポリアルコール（例えば、マンニトール（ｍａｎｉｔｏｌ）、ソルビトール）、塩化ナトリウム）を含むことが好ましい。注入可能組成物の吸収期間の延長は、組成物に吸収を遅延させる薬剤（例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチン）を含ませることによってもたらされ得る。
【０３５５】
滅菌注射可能溶液は、必要量の活性化合物（例えば、ＮＯＶＸタンパク質または抗ＮＯＶＸ抗体）を、適切な溶媒中で、必要な場合、上記で列挙される成分の１つまたは組み合わせと共に組み込み、続いて濾過滅菌することによって調製され得る。一般的に、分散物は、活性化合物を、基本（ｂａｓｉｃ）の分散媒と上記で列挙される成分から必要とされる他の成分とを含む滅菌ビヒクル中へ組み込むことによって調製される。滅菌注射可能液剤の調製のための滅菌粉末の場合において、調製方法は、真空乾燥および凍結乾燥であり、これにより、予め滅菌濾過されたその溶液から活性成分および任意のさらなる所望の成分の粉末を得る。
【０３５６】
経口組成物は、一般的に、不活性希釈剤または食用キャリアを含む。これらは、ゼラチンカプセルに封入され得るか、または錠剤へと圧縮され得る。経口治療投与の目的のために、この活性化合物は、賦形剤とともに組み込まれ得、そして錠剤、トローチ剤、またはカプセル剤の形態で使用され得る。経口組成物はまた、うがい薬としての使用のために流体キャリアを使用して調製され得、ここで、この流体キャリア中のこの化合物は、経口的に適用され、そして音を立てられ（ｓｗｉｓｈ）、そして吐き出されるか、または飲み込まれる。薬学的に適合性の結合剤、および／またはアジュバント物質が、この組成物の一部として含まれ得る。錠剤、丸剤、カプセル剤、トローチ剤などが、任意の以下の成分または同様の性質を有する化合物を含み得る：結合剤（例えば、微結晶セルロース、ガムトラガントまたはゼラチン）；賦形剤（例えば、デンプンまたはラクトース）、崩壊剤（例えば、アルギン酸、プリモゲル（Ｐｒｉｍｏｇｅｌ）、またはコーンスターチ）；滑沢剤（例えば、ステアリン酸マグネシウムまたはステロテス（Ｓｔｅｒｏｔｅｓ））；潤滑剤（ｇｌｉｄａｎｔ）（例えば、コロイド状二酸化ケイ素）；甘味剤（例えば、スクロースまたはサッカリン）；あるいは香味剤（例えば、ペパーミント、サリチル酸メチル、またはオレンジフレーバー）。
【０３５７】
吸入による投与について、この化合物は、適切な噴霧剤（例えば、二酸化炭素のような気体）を含む加圧容器またはディスペンサー、あるいは噴霧器から、エアロゾル噴霧の形態で送達される。
【０３５８】
全身的投与はまた、経粘膜手段または経皮手段により得る。経粘膜投与または経皮投与について、浸透される障壁に適切な浸透剤が、処方物において使用される。このような浸透剤は、一般的に、当該分野で公知であり、そして、例えば、経粘膜投与については、界面活性剤、胆汁酸塩、およびフシジン酸誘導体が挙げられる。経粘膜投与は、鼻噴霧または坐剤の使用によって達成され得る。経皮投与については、活性化合物は、当該分野で一般的に公知である軟膏剤（ｏｉｎｔｍｅｎｔ）、軟膏（ｓａｌｖｅ）、ゲル、またはクリーム剤へ処方される。
【０３５９】
この化合物はまた、直腸送達のための坐剤（例えば、ココアバターおよび他のグリセリドのような従来の坐剤基剤と共に）または貯留（ｒｅｎｔｅｎｔｉｏｎ）浣腸の形態で調製され得る。
【０３６０】
１つの実施形態において、活性化合物は、身体からの急速な排出に対してこの化合物を保護するキャリアを用いて調製され（例えば、制御放出処方物）、これには、移植片およびマイクロカプセル化された送達系が挙げられる。酢酸エチレンビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸のような、生分解性、生体適合性ポリマーが使用され得る。このような処方物の調製のための方法は、当業者には明らかである。これらの物質はまた、Ａｌｚａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｎｏｖａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．から商業的に入手され得る。リポソーム懸濁物（ウイルス抗原に対するモノクローナル抗体を感染させた細胞へ標的化されるリポソームを含む）もまた、薬学的に受容可能なキャリアとして使用され得る。これらは、例えば米国特許第４，５２２，８１１号に記載されるような、当業者に公知の方法に従って調製され得る。
【０３６１】
投与の容易さおよび投薬量の均一性のために、投薬単位形態で、経口組成物または非経口組成物を処方することが、特に有益である。本明細書で使用される投薬単位形態は、処置される被験体に対する単位投薬量として適切な物理的に個々の単位をいい；各単位は、必要とされる薬学的キャリアと共に所望の治療的効果を生じるように計算された、所定量の活性化合物を含む。本発明の投薬単位形態についての詳細は、活性化合物の固有の特徴、および達成される特定の治療効果、ならびに個体の処置のためのこのような活性化合物を調合する分野に固有の制限によって決定されるか、あるいはこれらに直接依存する。
【０３６２】
本発明の核酸分子は、ベクターに挿入され得、そして遺伝子治療ベクターとして使用され得る。遺伝子治療ベクターは、被験体へ、例えば静脈内注射、局所投与（米国特許第５，３２８，４７０号を参照のこと）によって、または定位注射（例えば、Ｃｈｅｎら（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：３０５４−３０５７を参照のこと）によって送達され得る。遺伝子治療ベクターの薬学的調製物は、受容可能な希釈剤中の遺伝子治療ベクターを含み得るか、または遺伝子送達ビヒクルが組み込まれる除放性マトリックスを含み得る。あるいは、完全な遺伝子送達ベクターが組換え細胞からインタクトで産生され得（例えば、レトロウイルスベクター）、薬学的調製物は、遺伝子送達系を産生する１以上の細胞を含み得る。
【０３６３】
薬学的組成物は、投与のための使用説明書と共に、容器、包装、またはディスペンサーに含まれ得る。
【０３６４】
（スクリーニングおよび検出の方法）
本発明の単離された核酸分子は、以下にさらに説明されるように、ＮＯＶＸタンパク質を（例えば、遺伝子治療適用における宿主細胞中の組換え発現ベクターを介して）発現するため、ＮＯＶＸ  ｍＲＮＡ（例えば、生物学的サンプルにおいて）またはＮＯＶＸ遺伝子における遺伝子損傷を検出するため、ならびにＮＯＶＸ活性を調節するために使用され得る。さらに、ＮＯＶＸタンパク質は、ＮＯＶＸタンパク質の活性または発現を調節する薬物または化合物をスクリーニングするために、ならびにＮＯＶＸタンパク質の不十分もしくは過剰な産生によって、あるいはＮＯＶＸ野生型タンパク質と比較して減少した活性もしくは異常な活性を有するＮＯＶＸタンパク質形態の産生によって特徴付けられる障害を処置するために使用され得る（例えば、糖尿病（インスリン放出を調節）；肥満（脂質に結合し輸送する）；肥満に関連した代謝障害、代謝症候群Ｘ、ならびに拒食症、および、慢性疾患および種々の癌に関連した消耗性障害、および感染性疾患（抗菌活性を有する）、および種々の異脂肪血症）。さらに、本発明の抗ＮＯＶＸ抗体が、ＮＯＶＸタンパク質を検出および単離するため、ならびにＮＯＶＸ活性を調節するために使用され得る。さらなる局面において、本発明を、正の様式および負の様式の両方で、食欲、栄養吸収、および代謝物の廃棄に影響する方法で用い得る。
【０３６５】
本発明は、さらに、本明細書中に記載のスクリーニングアッセイによって同定される新規の薬剤、および上記で本明細書中で記載されるような処置のためのそれらの使用に関する。
【０３６６】
（スクリーニングアッセイ）
本発明は、調節因子、すなわち、ＮＯＶＸタンパク質に結合するか、あるいは例えば、ＮＯＶＸタンパク質の発現またはＮＯＶＸタンパク質の活性に対して刺激効果または阻害効果を有する、候補または試験化合物または因子（例えば、ペプチド、ペプチド模倣物、低分子または他の薬物）を同定するための方法（本明細書中において「スクリーニングアッセイ」とも称される）を提供する。本発明はまた、本明細書中に記載のスクリーニングアッセイにおいて同定された化合物を含む。
【０３６７】
１つの実施形態において、本発明は、ＮＯＶＸタンパク質またはポリペプチド、あるいはその生物学的に活性な部分の膜結合形態に結合するか、またはその膜結合形態の活性を調節する、候補化合物もしくは試験化合物をスクリーニングするためのアッセイを提供する。本発明の試験化合物は、当該分野において公知のコンビナトリアルライブラリー法における多数のアプローチのいずれかを使用して得られ得、これには、以下が挙げられる：生物学的ライブラリー；空間的にアドレス可能な並行固相もしくは溶液相ライブラリー；逆重畳を要する合成ライブラリー法；「１ビーズ１化合物」ライブラリー法；およびアフィニティークロマトグラフィー選択を使用する合成ライブラリー法。生物学的ライブラリーアプローチはペプチドライブラリーに限定されるが、他の４つのアプローチは、ペプチド、非ペプチドオリゴマーもしくは化合物の低分子ライブラリーに適用可能である。例えば、Ｌａｍ（１９９７）Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ  １２：１４５を参照のこと。
【０３６８】
本明細書中で使用される場合、「低分子」とは、約５ｋＤ未満の分子量、最も好ましくは約４ｋＤ未満の分子量を有する組成物をいうように意味される。低分子は、例えば、核酸、ペプチド、ポリペプチド、ペプチド模倣体、炭水化物、脂質または他の有機分子もしくは無機分子であり得る。化学的および／または生物学的混合物（例えば、真菌、細菌または藻類抽出物）のライブラリーは、当該分野で公知であり、そして本発明のアッセイのいずれかを用いてスクリーニングされ得る。
【０３６９】
分子ライブラリーの合成のための方法の例は、当該分野において、例えば以下に見出され得る：ＤｅＷｉｔｔら（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９０：６９０９；Ｅｒｂら（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９１：１１４２２；Ｚｕｃｋｅｒｍａｎｎら（１９９４）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３７：２６７８；Ｃｈｏら（１９９３）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６１：１３０３；Ｃａｒｒｅｌｌら（１９９４）Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３３：２０５９；Ｃａｒｅｌｌら（１９９４）Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３３：２０６１；およびＧａｌｌｏｐら（１９９４）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３７：１２３３。
【０３７０】
化合物のライブラリーは、溶液中で（例えば、Ｈｏｕｇｈｔｅｎ（１９９２）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １３：４１２〜４２１）、あるいはビーズ上（Ｌａｍ（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ  ３５４：８２〜８４）、チップ上（Ｆｏｄｏｒ（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ  ３６４：５５５〜５５６）、細菌（Ｌａｄｎｅｒ  米国特許第５，２２３，４０９号）、胞子（Ｌａｄｎｅｒ  米国特許第５，２３３，４０９号）、プラスミド（Ｃｕｌｌら（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：１８６５〜１８６９）またはファージ上（ＳｃｏｔｔおよびＳｍｉｔｈ（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：３８６〜３９０；Ｄｅｖｌｉｎ（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：４０４〜４０６；Ｃｗｉｒｌａら（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８７：６３７８〜６３８２；Ｆｅｌｉｃｉ（１９９１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：３０１〜３１０；Ｌａｄｎｅｒ、米国特許第５，２３３，４０９号）において提示され得る。
【０３７１】
１つの実施形態において、アッセイは細胞ベースのアッセイであり、ここで、膜結合形態のＮＯＶＸタンパク質、またはその生物学的に活性な部分を細胞表面上に発現する細胞が、試験化合物と接触され、そしてこの試験化合物が、ＮＯＶＸタンパク質に結合する能力が、決定される。例えば、細胞は、哺乳動物起源または酵母細胞であり得る。この試験化合物がＮＯＶＸタンパク質に結合する能力の決定は、例えば、その試験化合物を放射性同位体または酵素標識とカップリングさせて、その結果、この試験化合物のＮＯＶＸタンパク質またはその生物学的に活性な部分に対する結合が、複合体におけるその標識化合物を検出することによって決定され得ることによって達成され得る。例えば、試験化合物は、１２５Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃ、または３Ｈで直接的または間接的のいずれかで標識され得、そしてその放射性同位体が、放射線放射の直接の計数により、またはシンチレーション計数により、検出され得る。あるいは、試験化合物は、例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、またはルシフェラーゼで酵素的に標識され得、そしてこの酵素的標識が、適切な基質の生成物への転換を決定することにより、検出され得る。１つの実施形態において、このアッセイは、膜結合形態のＮＯＶＸタンパク質、またはその生物学的に活性な部分をその細胞表面上に発現する細胞を、ＮＯＶＸと結合する既知の化合物と接触させて、アッセイ混合物を形成する工程、このアッセイ混合物に試験化合物を接触させる工程、ならびにこの試験化合物がＮＯＶＸタンパク質と相互作用する能力を決定する工程を包含し、ここで、この試験化合物がＮＯＶＸタンパク質と相互作用する能力を決定する工程は、この試験化合物が、この既知の化合物と比較して、ＮＯＶＸタンパク質またはその生物学的に活性な部分と優先的に結合する能力を決定する工程を包含する。
【０３７２】
別の実施形態において、アッセイは、細胞ベースのアッセイであり、これは、膜結合形態のＮＯＶＸタンパク質またはその生物学的に活性な部分を細胞表面上で発現する細胞を、試験化合物と接触させる工程、ならびにこの試験化合物が、ＮＯＶＸタンパク質またはその生物学的に活性な部分の活性を調節（例えば、刺激または阻害）する能力を決定する工程を包含する。この試験化合物が、ＮＯＶＸまたはその生物学的に活性な部分の活性を調節する能力の決定は、例えば、ＮＯＶＸタンパク質が、ＮＯＶＸ標的分子に結合またはこれら標的分子と相互作用する能力を決定することによって、達成され得る。本明細書中において使用する場合には、「標的分子」とは、ＮＯＶＸタンパク質が天然に結合または相互作用する分子であり、例えば、ＮＯＶＸ相互作用タンパク質を発現する細胞表面上の分子、第二の細胞表面上の分子、細胞外環境中の分子、細胞膜の内面と会合する分子、または細胞質分子である。ＮＯＶＸ標的分子は、非ＮＯＶＸ分子あるいは本発明のＮＯＶＸタンパク質またはポリペプチドであり得る。１つの実施形態において、ＮＯＶＸ標的分子は、シグナル伝達経路の構成要素であり、これは、細胞膜を通る細胞内への細胞外シグナル（例えば、化合物が膜結合ＮＯＶＸ分子に結合することにより発生するシグナル）の伝達を促進する。その標的は、例えば、触媒活性を有する第二の細胞内タンパク質、または下流シグナル伝達分子のＮＯＶＸとの会合を容易にするタンパク質であり得る。
【０３７３】
ＮＯＶＸタンパク質がＮＯＶＸ標的分子に結合するかまたはその標的分子と相互作用する能力の決定は、直接的結合を決定するための上記方法の１つにより、達成され得る。１つの実施形態において、ＮＯＶＸタンパク質がＮＯＶＸ標的分子に結合するかまたはその標的分子と相互作用する能力の決定は、その標的分子の活性を決定することにより、達成され得る。例えば、この標的分子の活性は、その標的の細胞性セカンドメッセンジャー（すなわち、細胞内Ｃａ２＋、ジアシルグリセロール、ＩＰ３など）の誘導を検出すること、適切な基質への標的の触媒活性／酵素活性を検出すること、レポーター遺伝子（検出可能なマーカー（例えば、ルシフェラーゼ）をコードする核酸に作動可能に連結されたＮＯＶＸ応答性調節エレメントを含む）の誘導を検出すること、または細胞応答（例えば、細胞生存度、細胞分化、または細胞増殖）を検出することにより、決定され得る。
【０３７４】
なお別の実施形態において、本発明のアッセイは、無細胞（ｃｅｌｌ−ｆｒｅｅ）アッセイであり、ＮＯＶＸタンパク質またはその生物学的に活性な部分を試験化合物に接触させる工程、ならびにその試験化合物がＮＯＶＸタンパク質またはその生物学的に活性な部分と結合する能力を決定する工程を包含する。この試験化合物の、ＮＯＶＸタンパク質への結合は、上記のように、直接的または間接的にのいずれかで決定され得る。１つのこのような実施形態において、このアッセイは、ＮＯＶＸタンパク質またはその生物学的に活性な部分を、ＮＯＶＸに結合する既知の化合物に接触させて、アッセイ混合物を形成する工程、このアッセイ混合物を試験化合物に接触させる工程、ならびにその試験化合物がＮＯＶＸタンパク質と相互作用する能力を決定する工程を包含し、ここで、この試験化合物がＮＯＶＸタンパク質と相互作用する能力を決定する工程は、この試験化合物が、既知の化合物と比較して、ＮＯＶＸ、またはその生物学的に活性な部分と優先的に結合する能力を決定する工程を包含する。
【０３７５】
なお別の実施形態において、アッセイは、無細胞アッセイであり、ＮＯＶＸタンパク質またはその生物学的に活性な部分を試験化合物と接触させる工程、ならびにその試験化合物がＮＯＶＸタンパク質またはその生物学的に活性な部分の活性を調節（例えば、刺激または阻害）する能力を決定する工程を包含する。この試験化合物がＮＯＶＸの活性を調節する能力の決定は、例えば、ＮＯＶＸタンパク質が、ＮＯＶＸ標的分子に結合する能力を、直接的結合の決定のための上記方法の１つによって決定することにより、達成され得る。代替の実施形態において、この試験化合物がＮＯＶＸタンパク質の活性を調節する能力の決定は、ＮＯＶＸタンパク質が、ＮＯＶＸ標的分子をさらに調節する能力を決定することにより、達成され得る。例えば、この標的分子の適切な基質に対する触媒活性／酵素活性は、上記のように決定され得る。
【０３７６】
さらに別の実施形態において、無細胞アッセイは、ＮＯＶＸタンパク質またはその生物学的に活性な部分を、ＮＯＶＸタンパク質を結合する既知の化合物に接触させてアッセイ混合物を形成する工程、このアッセイ混合物を試験化合物と接触させる工程、ならびにこの試験化合物がＮＯＶＸタンパク質と相互作用する能力を決定する工程を包含し、ここで、この試験化合物がＮＯＶＸタンパク質と相互作用する能力の決定は、ＮＯＶＸタンパク質が、ＮＯＶＸ標的分子と優先的に結合するか、またはその標的分子の活性を優先的に調節する能力を決定する工程を包含する。
【０３７７】
本発明の無細胞アッセイは、ＮＯＶＸタンパク質の、可溶性の形態または膜結合形態の両方の使用に受け入れられる。膜結合形態のＮＯＶＸタンパク質を含む無細胞アッセイの場合には、膜結合形態のＮＯＶＸタンパク質が溶液中に維持されるように、可溶化剤を利用することが所望され得る。このような可溶化剤の例には、非イオン性界面活性剤、（例えば、ｎ−オクチルグルコシド、ｎ−ドデシルグルコシド、ｎ−ドデシルマルトシド、オクタノイル−Ｎ−メチルグルカミド、デカノイル−Ｎ−メチルグルカミド、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１１４、Ｔｈｅｓｉｔ（登録商標）、イソトリデシポリ（エチレングリコールエーテル）ｎ（Ｉｓｏｔｒｉｄｅｃｙｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ  ｅｔｈｅｒ）ｎ、Ｎ−ドデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホネート、３−（３−コラミドプロピル）ジメチルアンミニオール−１−プロパンスルホネート（３−（３−ｃｈｏｌａｍｉｄｏｐｒｏｐｙｌ）ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｉｎｉｏｌ−１−ｐｒｏｐａｎｅ  ｓｕｌｆｏｎａｔｅ）（ＣＨＡＰＳ）、または３−（３−コラミドプロピル）ジメチルアンミニオール−２−ヒドロキシ−１−プロパンスルホネート（３−（３−ｃｈｏｌａｍｉｄｏｐｒｏｐｙｌ）ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｉｎｉｏｌ−２−ｈｙｄｒｏｘｙ−１−ｐｒｏｐａｎｅ  ｓｕｌｆｏｎａｔｅ）（ＣＨＡＰＳＯ））が挙げられる。
【０３７８】
本発明の上記アッセイ方法の１つより多い実施形態において、ＮＯＶＸタンパク質またはその標的分子のいずれかを固定して、そのタンパク質の一方または両方の非複合形態からの複合形態の分離を促進し、そしてそのアッセイの自動化に適合させることが、所望され得る。試験化合物の、ＮＯＶＸタンパク質への結合、または候補化合物の存在下および非存在下での、ＮＯＶＸタンパク質の標的分子との相互作用は、これらの反応物を収容するために適切な任意の容器内で、達成され得る。このような容器の例としては、マイクロタイタープレート、試験管、および微小遠心管が挙げられる。１実施形態において、そのタンパク質の一方または両方がマトリックスに結合することを可能にするドメインを付加する融合タンパク質が、提供され得る。例えば、ＧＳＴ−ＮＯＶＸ融合タンパク質またはＧＳＴ標的融合タンパク質は、グルタチオンセファロースビーズ（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）またはグルタチオン誘導体化マイクロタイタープレート上に吸着され得、次いでこれらは、試験化合物と合わせられるか、あるいは試験化合物および未吸着標的タンパク質またはＮＯＶＸタンパク質のいずれかと合わせられ、そしてこの混合物が、複合体形成を誘導する条件下（例えば、塩およびｐＨに関して生理学的条件）でインキュベートされる。インキュベーション後、ビーズまたはマイクロタイタープレートウェルを洗浄して、結合していないあらゆる成分を除去し、ビーズの場合にはマトリックスを固定し、例えば上記のように、複合体を直接的または間接的のいずれかで決定する。あるいは、複合体がマトリックスから解離され得、そしてＮＯＶＸタンパク質の結合レベルまたは活性レベルを、標準的な技術を使用して決定し得る。
【０３７９】
タンパク質をマトリックスに固定するための他の技術もまた、本発明のスクリーニングアッセイにおいて使用され得る。例えば、ＮＯＶＸタンパク質、またはその標的分子のいずれかが、ビオチンとストレプトアビジンとの結合を利用して、固定され得る。ビオチン化ＮＯＶＸタンパク質、または標的分子は、当該分野において周知の技術を使用して、ビオチン−ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド）から調製され得（例えば、ビオチン化キット、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、Ｉｌｌ．）、そしてストレプトアビジンでコーティングした９６ウェルのプレート（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ）のウェルに固定され得る。あるいは、ＮＯＶＸタンパク質、または標的分子と反応性であるがＮＯＶＸタンパク質のその標的分子への結合を妨害しない抗体が、そのプレートのウェルに誘導体化され得、そして結合していない標的またはＮＯＶＸタンパク質が、抗体の結合によってウェル内に捕捉され得る。このような複合体を検出するための方法には、ＧＳＴ固定複合体に関しての上記で述べた方法に加えて、ＮＯＶＸタンパク質または標的分子と反応性の抗体を使用する、複合体の免疫検出、ならびにＮＯＶＸタンパク質、または標的分子に関する酵素活性の検出に依存する酵素結合アッセイが挙げられる。
【０３８０】
別の実施形態において、ＮＯＶＸタンパク質発現のモジュレーターは、細胞を候補化合物と接触させ、そして細胞中のＮＯＶＸ  ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現を決定する方法において同定される。候補化合物の存在下でのＮＯＶＸ  ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現レベルは、候補化合物の非存在下でのＮＯＶＸ  ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現レベルと比較される。次いで、候補化合物は、この比較に基づいて、ＮＯＶＸ  ｍＲＮＡまたはタンパク質発現のモジュレーターとして同定され得る。例えば、ＮＯＶＸ  ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現が、候補化合物の非存在下よりも、その存在下における方が大きい（すなわち、統計的に有意に大きい）場合、この候補化合物は、ＮＯＶＸ  ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現の刺激物質として同定される。あるいは、ＮＯＶＸ  ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現が、候補化合物の非存在下よりもその存在下の方が少ない（統計的に有意に少ない）場合、この候補化合物は、ＮＯＶＸ  ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現のインヒビターとして同定される。細胞中のＮＯＶＸ  ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現レベルは、ＮＯＶＸ  ｍＲＮＡまたはタンパク質を検出するために本明細書中に記載の方法によって決定され得る。
【０３８１】
本発明のなお別の局面において、ＮＯＶＸタンパク質は、ツーハイブリッドアッセイまたはスリーハイブリッドアッセイにおいて「ベイト（ｂａｉｔ）タンパク質」として使用され得（例えば、米国特許第５，２８３，３１７号；Ｚｅｒｖｏｓら（１９９３）Ｃｅｌｌ  ７２：２２３−２３２；Ｍａｄｕｒａら、１９９３  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：１２０４６−１２０５４；Ｂａｒｔｅｌら、１９９３  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １４：９２０−９２４；Ｉｗａｂｕｃｈｉら、１９９３  Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ８：１６９３−１６９６；およびＢｒｅｎｔ  ＷＯ９４／１０３００を参照のこと）、ＮＯＶＸ（「ＮＯＶＸ結合タンパク質」または「ＮＯＶＸ−ｂｐ」）に結合するか、またはこれと相互作用し、そしてＮＯＶＸ活性を調節する他のタンパク質を同定し得る。このようなＮＯＶＸ結合タンパク質はまた、例えば、ＮＯＶＸ経路の上流または下流エレメントとしてＮＯＶＸタンパク質によるシグナル伝達に関与する可能性がある。
【０３８２】
ツーハイブリッドシステムは、分離可能なＤＮＡ結合ドメインおよび活性化ドメインからなる、大部分の転写因子のモジュール的性質に基づく。簡潔には、このアッセイは、２つの異なるＤＮＡ構築物を利用する。一方の構築物においては、ＮＯＶＸをコードする遺伝子が既知の転写因子（例えば、ＧＡＬ−４）のＤＮＡ結合ドメインをコードする遺伝子に融合される。他方の構築物においては、ＤＮＡ配列のライブラリー由来の、未同定タンパク質（「プレイ（ｐｒｅｙ）」または「サンプル」）をコードするＤＮＡ配列が、既知の転写因子の活性化ドメインをコードする遺伝子に融合される。「ベイト」および「プレイ」タンパク質がインビボで相互作用して、ＮＯＶＸ依存性複合体を形成し得る場合、この転写因子のＤＮＡ結合ドメインおよび活性化ドメインは、非常に近くにある。近位にあることにより、転写因子に応答性の転写調節部位に作動可能に連結されたレポーター遺伝子（例えば、ＬａｃＺ）の転写が可能となる。レポーター遺伝子の発現が検出され得、そして機能的転写因子を含む細胞コロニーが、単離され得、そしてＮＯＶＸと相互作用するタンパク質をコードするクローニングされた遺伝子を得るために使用され得る。
【０３８３】
本発明はさらに、上記のスクリーニングアッセイにより同定される新規な薬剤（因子）および本明細書中に記載されるような処置のためのこの薬剤（因子）の使用に関する。
【０３８４】
（検出アッセイ）
本明細書中で同定されるｃＤＮＡ配列の一部またはフラグメント（および対応する完全な遺伝子配列）は、ポリヌクレオチド試薬として多くの方法で使用され得る。例えば、これらの配列を使用して、（ｉ）染色体上にそれぞれの遺伝子をマッピングし得；従って遺伝病と関連する遺伝子領域を位置決定し得る；（ｉｉ）微量の生物学的サンプルから個体を同定し得る（組織型決定）；および（ｉｉｉ）生物学的サンプルの法医学的識別を助け得るが、これに限定されない。これらの適用のいくつかは、以下の節において記載される。
【０３８５】
（染色体マッピング）
一旦、遺伝子の配列（または配列の一部分）が単離されると、この配列を用いて染色体上に遺伝子の位置をマッピングし得る。このプロセスは、染色体マッピングとよばれる。従って、ＮＯＶＸ配列の一部またはフラグメント、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、および３３、またはそのフラグメントもしくは誘導体を用いて、それぞれ、ＮＯＶＸ遺伝子の位置を染色体上にマッピングし得る。ＮＯＶＸ配列を染色体にマッピングすることは、これらの配列と、疾患と関連する遺伝子とを相関付ける際の重要な第１工程である。
【０３８６】
簡潔には、ＮＯＶＸ遺伝子は、ＮＯＶＸ配列からＰＣＲプライマー（好ましくは、１５〜２５ｂｐの長さ）を調製することにより染色体にマッピングされ得る。ＮＯＶＸ配列のコンピューター分析を用いて、ゲノムＤＮＡにおける１つを超えるエキソンにまたがらないプライマーを迅速に選択し得、従って、増幅プロセスを複雑にし得る。次いで、これらのプライマーは、個々のヒト染色体を含む体細胞ハイブリッドのＰＣＲスクリーニングのために使用され得る。ＮＯＶＸ配列に対応するヒト遺伝子を含むハイブリッドのみが増幅されたフラグメントを生じる。
【０３８７】
体細胞ハイブリッドは、異なる哺乳動物由来の体細胞（例えば、ヒトおよびマウス細胞）を融合することにより調製される。ヒトおよびマウスの細胞のハイブリッドが増殖および分裂するにつれ、それらは、無作為な順序で徐々にヒト染色体を失うが、マウス染色体を維持する。マウス細胞は増殖できないが（マウス細胞は、特定の酵素を欠いているため）、ヒト細胞は増殖できる培地を使用することにより、必要な酵素をコードする遺伝子を含む１つのヒト染色体が維持される。種々の培地を使用することによって、ハイブリッド細胞株のパネルが確立され得る。パネルにおける各細胞株は、単一のヒト染色体または少数のヒト染色体いずれかおよびマウス染色体の完全なセットを含み、これにより、個々の遺伝子を特定のヒト染色体に容易にマッピングすることが可能になる。例えば、Ｄ’Ｅｕｓｔａｃｈｉｏら（１９８３）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２０：９１９−９２４を参照のこと。ヒト染色体のフラグメントのみを含む体細胞ハイブリッドはまた、転座および欠失を伴うヒト染色体を使用することにより生成され得る。
【０３８８】
体細胞ハイブリッドのＰＣＲマッピングは、特定の染色体に特定の配列を割り当てるための迅速な手順である。１つのサーマルサイクラーを用いて一日に３つ以上の配列が割り当てられ得る。ＮＯＶＸ配列を使用して、オリゴヌクレオチドプライマーを設計すると、下位位置決定（ｓｕｂｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ）は、特定の染色体由来のフラグメントのパネルを用いて達成され得る。
【０３８９】
中期染色体スプレッドに対するＤＮＡ配列の蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）をさらに使用して、一工程で正確な染色体位置を提供し得る。染色体スプレッドは、コルセミド（紡錘体を破壊する）のような化学物質により分裂が中期においてブロックされた細胞を使用して行われ得る。この染色体は、トリプシンで短時間処理され得、次いで、ギムザ染色され得る。薄いバンドおよび濃いバンドのパターンが各染色体で発生し、その結果、この染色体は、個々に同定され得る。ＦＩＳＨ技術は、５００または６００塩基ほどの短さのＤＮＡ配列と共に使用され得る。しかし、１，０００塩基より大きなクローンは、簡単な検出に十分なシグナル強度で、独特の染色体位置に結合する可能性がより高い。好ましくは、１，０００塩基、そしてより好ましくは、２，０００塩基が妥当な時間量で良好な結果を得るために十分である。この技術の総説については、Ｖｅｒｍａら、ＨＵＭＡＮ  ＣＨＲＯＭＯＳＯＭＥＳ：Ａ  ＭＡＮＵＡＬ  ＯＦ  ＢＡＳＩＣ  ＴＥＣＨＮＩＱＵＥＳ（Ｐｅｒｇａｍｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  １９８８）を参照のこと。
【０３９０】
染色体マッピングの試薬は、単一の染色体またはその染色体上の単一部位を印付けするために個々に使用され得るか、または試薬のパネルは複数部位および／または複数染色体を印付けするために使用され得る。遺伝子の非コード領域に対応する試薬は、実際に、マッピング目的のために好ましい。コード配列は、遺伝子ファミリー内に保存されており、従って、染色体マッピングの間に交叉ハイブリダイゼーションの機会が増大する可能性が高い。
【０３９１】
一旦、配列が正確な染色体位置にマッピングされると、その染色体上の配列の物理的位置は、遺伝子マップデータと相関付けられ得る。このようなデータは、例えば、ＭｃＫｕｓｉｃｋ，ＭＥＮＤＥＬＩＡＮ  ＩＮＨＥＲＩＴＡＮＣＥ  ＩＮ  ＭＡＮ（Ｊｏｈｎｓ  Ｈｏｐｋｉｎｓ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｗｅｌｃｈ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｌｉｂｒａｒｙを通じてオンラインで入手可能）において見いだされる。次いで、同じ染色体領域にマッピングされる遺伝子と疾患との間の関係は、例えば、Ｅｇｅｌａｎｄら（１９８７）Ｎａｔｕｒｅ，３２５：７８３−７８７に記載される連鎖分析（物理的に隣接する遺伝子の同時遺伝）を介して同定され得る。
【０３９２】
さらに、ＮＯＶＸ遺伝子と関連する疾患に罹患した個体と、この疾患に罹患していない個体との間のＤＮＡ配列における差異が決定され得る。罹患した個体のいくらかまたは全てにおいて変異が認められるが、非罹患個体のいずれにおいても認められない場合、この変異は特定の疾患の候補薬剤（因子）である可能性が高い。罹患個体と非罹患個体の比較は、一般に、染色体における構造的変化（例えば、染色体スプレッドから可視であるか、またはそのＤＮＡ配列に基づいたＰＣＲを用いて検出可能な欠失または転座）を最初に探すことを包含する。最終的に、いくらかの個体に由来する遺伝子の完全な配列決定を行って、変異の存在を確認し、かつ多型に由来する変異を区別し得る。
【０３９３】
（組織型決定（ｔｉｓｓｕｅ  ｔｙｐｉｎｇ））
本発明のＮＯＶＸ配列はまた、わずかな生物学的サンプルから個体を識別するために使用され得る。この技術において、個体のゲノムＤＮＡは、１つ以上の制限酵素で消化され、そして同定のために独特のバンドを生成するためにサザンブロット上でプローブされる。本発明の配列は、ＲＦＬＰ（米国特許第５，２７２，０５７号に記載の「制限フラグメント長多型」）のためのさらなるＤＮＡマーカーとして有用である。
【０３９４】
さらに、本発明の配列を用いて、個体のゲノムの選択された部分について実際の塩基ごとにＤＮＡ配列を決定する代替的技術を提供し得る。従って、本明細書中に記載のＮＯＶＸ配列を用いて、配列の５’末端および３’末端から２つのＰＣＲプライマーを調製し得る。次いで、これらのプライマーを使用して、個体のＤＮＡを増幅し得、引き続いて、配列決定し得る。
【０３９５】
この様式で調製された個体由来の対応するＤＮＡ配列のパネルは、各個体が、対立遺伝子差異に起因するこのようなＤＮＡ配列の独特のセットを有するので、独特の個体識別を提供し得る。本発明の配列は、個体由来および組織由来の配列のこのような識別を得るために使用され得る。本発明のＮＯＶＸ配列は、ヒトゲノムの部分を独特に表す。対立遺伝子バリエーションは、これらの配列のコード領域においてある程度生じ、そして非コード領域においてより大きな程度に生じる。個々のヒト間での対立遺伝子バリエーションは、各５００塩基につき約１回の頻度で生じると見積もられる。対立遺伝子バリエーションの多さは、制限フラグメント長多型（ＲＦＬＰ）を含む一塩基多型（ＳＮＰ）に起因する。
【０３９６】
本明細書中に記載の配列の各々は、ある程度、標準物質（これに対して個体からのＤＮＡが識別の目的で比較され得る）として使用され得る。より多くの多型が非コード領域で生じるので、個体を区別するために、それほど多くの配列が必要であるわけではない。非コード配列は、おそらく１０〜１，０００プライマーのパネルを用いてポジティブな個体識別を不自由なく提供し得る。これらのプライマーは、各々が１００塩基の増幅された非コード配列を生じる。推定コード配列（例えば、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、および３３における配列）が使用される場合、ポジティブな個体識別に関するプライマーのより適切な数は、５００〜２，０００である。
【０３９７】
（予測医療）
本発明はまた、診断アッセイ、予後アッセイ、薬理ゲノム（ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｏｍｉｃｓ）およびモニタリング臨床試験が、予後（予測）の目的に使用され、これによって個体を予防的に処置する、予測医療の分野に関する。従って、本発明の１つの局面は、生物学的サンプル（例えば、血液、血清、細胞、組織）の場合においては、ＮＯＶＸタンパク質および／または核酸の発現、ならびにＮＯＶＸの活性を決定するための診断アッセイに関し、これによって、異常なＮＯＶＸの発現または活性に関連して、個体が疾患または障害に罹患するかどうか、あるいは障害を発症するリスクがあるかどうかを決定する。この障害としては、代謝障害、糖尿病、肥満症、感染症、食欲不振、癌関連悪液質、癌、神経変性障害、アルツハイマー病、パーキンソン病、免疫障害、および造血障害、ならびに種々の異常脂肪性浮腫（ｄｙｓｌｉｐｉｄｅｍｉａｓ）、肥満に関連する代謝障害、Ｘ代謝症候群（ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ  Ｘ）、ならびに慢性疾患および種々の癌と関連する消耗疾患。本発明はまた、個体が、ＮＯＶＸのタンパク質、核酸の発現または活性と関連した障害を発症するリスクがあるかどうかを決定するための予後的（または予測的）アッセイを提供する。例えば、ＮＯＶＸの遺伝子における変異が、生物学的サンプルにおいてアッセイされ得る。このようなアッセイは、予後的または予測的な目的に使用され、これによってＮＯＶＸのタンパク質、核酸の発現または生物学的活性によって特徴付けられるかまたは関連した障害の発病の前に、個体を予防的に処置し得る。
【０３９８】
本発明の別の局面は、個体におけるＮＯＶＸのタンパク質、核酸の発現または活性を決定するための方法を提供し、これによって、その個体についての適切な治療的または予防的試薬（本明細書において「薬物ゲノム」とよばれる）を選択する。薬物ゲノムは、個体の遺伝型（例えば、特定の因子に対して応答する個体の能力を決定するために試験された個体の遺伝型）に基づいて、個体の治療的または予防的処置のための因子（例えば、薬物）の選択を可能にする。
【０３９９】
本発明のなお別の局面は、臨床試験におけるＮＯＶＸの発現または活性に対する因子（例えば、薬物、化合物）の影響をモニタリングすることに関する。
【０４００】
これらおよび他の因子は、以下の節でさらに詳細に記載される。
【０４０１】
（診断アッセイ）
生物学的サンプルにおけるＮＯＶＸの存在または非存在を検出するための例示的な方法は、試験被験体から生物学的サンプルを得る工程、およびその生物学的サンプルをＮＯＶＸのタンパク質またはＮＯＶＸタンパク質をコードする核酸（例えば、ｍＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ）を検出し得る化合物もしくは薬剤（因子）とを接触させ、その結果、ＮＯＶＸの存在が、その生物学的サンプルにおいて検出される工程を包含する。ＮＯＶＸ  ｍＲＮＡもしくはゲノムＤＮＡを検出するための因子は、ＮＯＶＸ  ｍＲＮＡもしくはゲノムＤＮＡにハイブリダイズし得る、標識された核酸プローブである。この核酸プローブは、例えば、全長のＮＯＶＸの核酸（例えば、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、および３３の核酸またはそれらの一部）（例えば、少なくとも、１５、３０、５０、１００、２５０もしくは５００ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドであり、ストリンジェントな条件下でＮＯＶＸ  ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡと特異的にハイブリダイズするに十分である核酸）であり得る。本発明の診断アッセイにおける使用のための他の適切なプローブは、本明細書において記載されている。
【０４０２】
ＮＯＶＸタンパク質を検出するための薬剤（因子）は、ＮＯＶＸタンパク質に結合し得る抗体であり、好ましくは、検出可能な標識を有する抗体である。抗体は、ポリクローナル抗体であり得るか、またはより好ましくはモノクローナル抗体であり得る。インタクトな抗体またはそのフラグメント（例えば、ＦａｂまたはＦ（ａｂ’）２）が使用され得る。用語「標識（された）」とは、プローブまたは抗体に関して、検出可能な物質をそのプローブもしくは抗体にカップリングさせる（すなわち、物理的に連結する）ことによってそのプローブまたは抗体を直接標識すること、ならびに、直接標識された別の試薬との反応性によってそのプローブもしくは抗体の間接的な標識をすることを包含することが意図される。間接的な標識の例としては、蛍光標識された二次抗体を用いた一次抗体の検出、および蛍光標識されたストレプトアビジンを用いて検出され得るようにＤＮＡプローブのビオチンを用いた末端標識が挙げられる。用語「生物学的サンプル」とは、被験体から単離された、組織、細胞および生物学的流体ならびに被験体に存在する組織、細胞および流体を含むことが意図される。すなわち、本発明の検出方法を用いて、ＮＯＶＸ  ｍＲＮＡ、タンパク質またはゲノムＤＮＡを、生物学的サンプル中で、インビトロおよびインビボで検出し得る。例えば、ＮＯＶＸ  ｍＲＮＡの検出のためのインビトロ技術としては、ノーザンハイブリダイゼーションおよびインサイチュハイブリダイゼーションが挙げられる。ＮＯＶＸタンパク質の検出のためのインビトロ技術としては、酵素連結免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ウェスタンブロット、免疫沈降および免疫蛍光が挙げられる。ＮＯＶＸのゲノムＤＮＡを検出するためのインビトロ技術としては、サザンハイブリダイゼーションが挙げられる。さらに、ＮＯＶＸタンパク質の検出のためのインビボ技術としては、標識された抗ＮＯＶＸ抗体を被験体に導入することが挙げられる。例えば、その抗体は、放射性マーカーを用いて標識され得る。被験体における放射性マーカーの存在および位置は、標準的な画像化技術によって検出され得る。
【０４０３】
１つの実施形態において、この生物学的サンプルは、その試験被験体由来のタンパク質分子を含む。あるいは、その生物学的サンプルは、その試験被験体由来のｍＲＮＡ分子またはその試験被験体由来のゲノムＤＮＡ分子を含み得る。好ましい生物学的サンプルは、被験体から従来の手段によって単離された末梢血白血球サンプルである。
【０４０４】
別の実施形態において、本発明の方法はさらに、コントロール被験体からコントロール生物学的サンプルを得る工程、そのコントロールサンプルを、ＮＯＶＸのタンパク質、ｍＲＮＡもしくはゲノムＤＮＡを検出し得る化合物もしくは薬剤（因子）と接触させ、その結果、ＮＯＶＸのタンパク質、ｍＲＮＡもしくはゲノムＤＮＡの存在がその生物学的サンプルにおいて検出される工程、およびそのコントロールサンプルにおけるＮＯＶＸのタンパク質、ｍＲＮＡもしくはゲノムＤＮＡの存在と、その試験サンプルにおけるＮＯＶＸのタンパク質、ｍＲＮＡもしくはゲノムＤＮＡの存在とを比較する工程を包含する。
【０４０５】
本発明はまた、生物学的サンプルにおけるＮＯＶＸの存在を検出するためのキットを包含する。例えば、このキットは、以下を備え得る：生物学的サンプルにおいてＮＯＶＸのタンパク質またはｍＲＮＡを検出し得る、標識された化合物もしくは薬剤（因子）；そのサンプルにおいてＮＯＶＸの量を決定するための手段；およびそのサンプルにおけるＮＯＶＸの量と標準とを比較するための手段。この化合物または薬剤は、適切な容器内に包装され得る。このキットは、さらに、ＮＯＶＸのタンパク質または核酸を検出するためにキットを用いるための指示書を備え得る。
【０４０６】
（予後アッセイ）
本明細書において記載された診断方法をさらに利用して、ＮＯＶＸの異常発現または異常活性に関連した疾患もしくは障害を有するか、またはその発症の危険性を有する被験体を同定し得る。例えば、本明細書に記載されるアッセイ（例えば、上述の診断アッセイまたは下記のアッセイ）を利用して、ＮＯＶＸのタンパク質、核酸の発現または活性に関連する障害を有するかまたはその発症の危険性を有する被験体を同定し得る。あるいは、この予後アッセイを利用して、疾患または障害を有するかまたはその発症の危険性を有する被験体を同定し得る。従って、本発明は、ＮＯＶＸの異常発現または異常活性に関連する疾患もしくは障害を同定するための方法を提供する。ここで、試験サンプルは、被験体から得られ、そしてＮＯＶＸのタンパク質または核酸（例えば、ｍＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ）が検出され、ここで、ＮＯＶＸのタンパク質または核酸の存在は、ＮＯＶＸの異常発現または異常活性に関連する疾患または障害を有するかまたはその発症の危険性を有する被験体についての診断指標である。本明細書において使用される場合「試験サンプル」とは、目的の被験体から得られた生物学的サンプルをいう。例えば、試験サンプルは、生物学的流体（例えば、血清）、細胞サンプル、または組織であり得る。
【０４０７】
さらに、本明細書に記載される予後アッセイを使用して、被験体に薬剤（因子）（例えば、アゴニスト、アンタゴニスト、ペプチド模倣物、タンパク質、ペプチド、核酸、低分子、または他の薬物候補）を投与してＮＯＶＸの異常発現または異常活性に関連する疾患または障害を処置し得るか否かを、決定し得る。例えば、このような方法を使用して、被験体が障害のための因子で有効に処置され得るか否かを決定し得る。従って、本発明は、ＮＯＶＸの異常発現または異常活性に関連する障害のための因子を用いて、被験体が有効に処置され得るか否かを決定するための方法を提供する。ここで、試験サンプルが得られ、そしてＮＯＶＸのタンパク質または核酸が検出される（例えば、ここで、ＮＯＶＸのタンパク質または核酸の存在は、この因子が投与されてＮＯＶＸの異常発現または異常活性に関連する障害が処置され得る被験体についての、診断指標である）。
【０４０８】
本発明の方法はまた、ＮＯＶＸ遺伝子における遺伝的損傷を検出し、それによって、その損傷遺伝子を有する被験体が異常な細胞増殖および／または分化によって特徴付けられる障害についての危険性を有するか否かを決定するためにも使用され得る。種々の実施形態において、この方法は、その被験体由来の細胞のサンプルにおいて、ＮＯＶＸタンパク質をコードする遺伝子の完全性に影響を与える少なくとも１つの変更によって特徴付けられる遺伝的損傷の存在または非存在、あるいはＮＯＶＸ遺伝子の誤発現を検出する工程を包含する。例えば、そのような遺伝的損傷は、以下の少なくとも１つの存在を確認することによって検出され得る：（ｉ）ＮＯＶＸ遺伝子からの１つ以上のヌクレオチドの欠失；（ｉｉ）ＮＯＶＸ遺伝子への１つ以上のヌクレオチドの付加；（ｉｉｉ）ＮＯＶＸ遺伝子の１つ以上のヌクレオチドの置換、（ｉｖ）ＮＯＶＸ遺伝子の染色体再配置；（ｖ）ＮＯＶＸ遺伝子のメッセンジャーＲＮＡ転写物のレベルにおける変更、（ｖｉ）ＮＯＶＸ遺伝子の異常改変（例えば、ゲノムＤＮＡのメチル化パターンの異常改変）、（ｖｉｉ）ＮＯＶＸ遺伝子のメッセンジャーＲＮＡ転写物の非野生型スプライシングパターンの存在、（ｖｉｉｉ）ＮＯＶＸタンパク質の非野生型レベル、（ｉｘ）ＮＯＶＸ遺伝子の対立遺伝子の欠失、ならびに（ｘ）ＮＯＶＸタンパク質の不適切な翻訳後修飾。本明細書において記載されるように、当該分野において、ＮＯＶＸ遺伝子における損傷を検出するために使用され得る、多数の公知のアッセイ技術が存在する。好ましい生物学的サンプルは、従来手段によって被験体から単離された末梢血白血球サンプルである。しかし、有核細胞を含む任意の生物学的サンプルが使用され得、これには、例えば、頬粘膜細胞が挙げられる。
【０４０９】
特定の実施形態において、損傷の検出は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（例えば、米国特許第４，６８３，１９５号および同第４，６８３，２０２号を参照のこと）（例えば、アンカーＰＣＲまたはＲＡＣＥ  ＰＣＲ）、あるいは、連結連鎖反応（ＬＣＲ）（例えば、Ｌａｎｄｅｇｒａｎら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４１：１０７７−１０８０；およびＮａｋａｚａｗａら（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｉｃ．ＵＳＡ  ９１：３６０−３６４を参照のこと）におけるプローブ／プライマーの使用を包含する。後者は、ＮＯＶＸ遺伝子における点変異を検出するために特に有用であり得る（Ａｂｒａｖａｙａら，１９９５  Ｎｕｃｌ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２３：６７５−６８２を参照のこと）。この方法は、患者から細胞のサンプルを収集する工程、核酸（例えば、ゲノム、ｍＲＮＡまたはその両方）をそのサンプルの細胞から単離する工程、ＮＯＶＸの遺伝子に特異的にハイブリダイズする１つ以上のプライマーとその核酸サンプルとを、ＮＯＶＸ遺伝子（存在する場合）のハイブリダイゼーションおよび増幅が生じるような条件下で接触させる工程、ならびに増幅産物の存在もしくは非存在を検出する工程、またはその増幅産物のサイズを検出する工程およびその長さをコントロールサンプルと比較する工程を包含し得る。ＰＣＲおよび／またはＬＣＲは、本明細書中に記載される変異を検出するために使用される技術のいずれかとともに予備的増幅工程として使用されることが望ましくあり得ることが予想される。
【０４１０】
代替的な増幅方法としては、以下が挙げられる：当業者に周知な技術を用いた、その増幅された分子の検出の前の、自己維持配列複製（Ｇｕａｔｅｌｌｉら、１９９０、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：１８７４−１８７８を参照のこと）、転写増幅系（Ｋｗｏｈら、１９８９、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：１１７３−１１７７を参照のこと）、Ｑβレプリカーゼ（Ｌｉｚａｒｄｉら、１９８８、ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６：１１９７を参照のこと）、または他の任意の核酸増幅方法。これらの検出スキームは、核酸分子が非常に極少数で存在する場合に、そのような核酸分子の検出のために特に有用である。
【０４１１】
代替の実施形態において、サンプル細胞からのＮＯＶＸ遺伝子における変異は、制限酵素切断パターンにおける変更によって同定され得る。例えば、サンプルおよびコントロールのＤＮＡが単離され、増幅され（必要に応じて）、１つ以上の制限エンドヌクレアーゼを用いて消化され、そしてフラグメント長の大きさがゲル電気泳動によって決定され、そして比較される。サンプルＤＮＡとコントロールＤＮＡとの間のフラグメント長の大きさにおける差異は、そのサンプルＤＮＡにおける変異を示す。さらに、配列特異的なリボザイムの使用（例えば、米国特許第５，４９３，５３１号を参照のこと）を使用して、リボザイム切断部位の発生または喪失による特異的な変異の存在についてスコア付けし得る。
【０４１２】
他の実施形態において、ＮＯＶＸにおける遺伝子変異は、サンプル核酸およびコントロール核酸（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）を、数百または数千のオリゴヌクレオチドプローブを含む高密度アレイに対してハイブリダイズさせることによって同定され得る（例えば、Ｃｒｏｎｉｎら（１９９６）Ｈｕｍａｎ  Ｍｕｔａｔｉｏｎ  ７：２４４−２５５；Ｋｏｚａｌら（１９９６）Ｎａｔ．Ｍｅｄ．２：７５３−７５９を参照のこと）。例えば、ＮＯＶＸにおける遺伝子変異は、Ｃｒｏｎｉｎら（前出）に記載されるように光生成ＤＮＡプローブを含む二次元アレイにおいて同定され得る。手短には、プローブの第一ハイブリダイゼーションアレイを用いて、サンプルおよびコントロールにおける長いストレッチのＤＮＡにわたって走査し、連続的に重複するプローブの線形アレイを作成することによって、その配列間の塩基変化を同定し得る。この工程は、点変異の同定を可能にする。この工程に第二のハイブリダイゼーションアレイが続き、これは、検出される全ての改変体または変異体に相補的な、より小さな特化されたプローブアレイを用いることによる特定の変異の特徴付けを可能にする。各変異アレイは、一方が野生型遺伝子に対して相補的であり、そして他方が変異遺伝子に対して相補である並行プローブセットから構成される。
【０４１３】
なお別の実施形態において、当該分野で公知の種々の配列決定反応のいずれかを使用して、ＮＯＶＸ遺伝子を直接配列決定し得、そしてサンプルＮＯＶＸ配列と対応する野生型（コントロール）配列とを比較することによって、変異を検出し得る。配列決定反応の例としては、ＭａｘｉｍおよびＧｉｌｂｅｒｔ（１９７７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｉｃ．ＵＳＡ  ７４：５６０またはＳａｎｇｅｒ（１９７７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｉｃ．ＵＳＡ  ７４：５４６３によって開発された技術に基づくものが挙げられる。診断アッセイを実施する場合、種々の自動化配列決定手順のいずれかを利用し得ることもまた企図される（例えば、Ｎａｅｖｅら（１９９５）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １９：４４８を参照のこと）。これらには、質量分析法による配列決定法（例えば、ＰＣＴ国際公開番号ＷＯ  ９４／１６１０１；Ｃｏｈｅｎら（１９９６）Ａｄｖ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  ３６：１２７−１６２；およびＧｒｉｆｆｉｎら（１９９３）Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３８：１４７−１５９を参照のこと）が含まれる。
【０４１４】
ＮＯＶＸ遺伝子における変異を検出するための他の方法としては、切断剤からの保護を使用して、ＲＮＡ／ＲＮＡもしくはＲＮＡ／ＤＮＡのヘテロ二重鎖におけるミスマッチ塩基を検出する方法が挙げられる（例えば、Ｍｙｅｒｓら（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３０：１２４２を参照のこと）。一般に、「ミスマッチ切断」の当該分野の技術は、野生型のＮＯＶＸ配列を含む（標識された）ＲＮＡまたはＤＮＡを、組織サンプルから得られた潜在的な変異体ＲＮＡまたはＤＮＡとハイブリダイズさせることによって形成されるヘテロ二重鎖を提供する工程によって始まる。この二本鎖の二重鎖を、二重鎖の一本鎖領域（例えば、そのコントロールとサンプルの鎖との間の塩基対ミスマッチに起因して存在するもの）を切断する因子を用いて処理する。例えば、ＲＮＡ／ＤＮＡ二重鎖を、ＲＮａｓｅを用いて処理し得、そしてＤＮＡ／ＤＮＡハイブリッドを、そのミスマッチ領域を酵素的に消化するために、Ｓ１ヌクレアーゼを用いて処理し得る。他の実施形態において、ＤＮＡ／ＤＮＡまたはＲＮＡ／ＤＮＡのいずれかの二重鎖を、ミスマッチ領域を消化するために、ヒドロキシルアミンまたは四酸化オスミウム、およびピペリジンを用いて処理し得る。そのミスマッチ領域の消化後、次いで、得られた物質を変性ポリアクリルアミドゲル上で、大きさにより分離して、変異の部位を決定する。例えば、Ｃｏｔｔｏｎら（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：４３９７；Ｓａｌｅｅｂａら（１９９２）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．２１７：２８６−２９５を参照のこと。１つの実施形態において、コントロールのＤＮＡまたはＲＮＡは、検出のために標識され得る。
【０４１５】
なお別の実施形態において、ミスマッチ切断反応は、二本鎖ＤＮＡにおけるミスマッチ塩基対を認識する１つ以上のタンパク質（いわゆる「ＤＮＡミスマッチ修復」酵素）を、細胞のサンプルから得られたＮＯＶＸ  ｃＤＮＡにおける点変異を検出およびマッピングするために規定された系において使用する。例えば、Ｅ．ｃｏｌｉのｍｕｔＹ酵素は、Ｇ／ＡミスマッチでＡを切断し、そしてＨｅＬａ細胞からのチミジンＤＮＡグリコシラーゼは、Ｇ／ＴミスマッチでＴを切断する（例えば、Ｈｓｕら（１９９４）Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ  １５：１６５７〜１６６２を参照のこと）。例示的な実施形態に従って、ＮＯＶＸ配列（例えば、野生型ＮＯＶＸ配列）に基づくプローブは、試験細胞由来のｃＤＮＡまたは他のＤＮＡ産物にハイブリダイズされる。二重鎖は、ＤＮＡミスマッチ修復酵素を用いて処理され、そしてその切断産物（もしあれば）は、電気泳動プロトコルなどから検出され得る。例えば、米国特許第５，４５９，０３９号を参照のこと。
【０４１６】
他の実施形態において、電気泳動の移動度における変化は、ＮＯＶＸ遺伝子における変異を同定するために使用される。例えば、一本鎖コンホメーション多型（ＳＳＣＰ）は、変異体と野生型核酸との間の電気泳動の移動度における差異を検出するために使用され得る（例えば、Ｏｒｉｔａら（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ：８６：２７６６、またＣｏｔｔｏｎ（１９９３）Ｍｕｔａｔ．Ｒｅｓ．２８５：１２５〜１４４；Ｈａｙａｓｈｉ（１９９２）Ｇｅｎｅｔ．Ａｎａｌ．Ｔｅｃｈ．Ａｐｐｌ．９：７３〜７９を参照のこと）。サンプルおよびコントロールＮＯＶＸ核酸の一本鎖ＤＮＡフラグメントは、変性され、そして再生される。一本鎖核酸の二次構造は、配列に従って変化し、電気泳動の移動度において得られる変化は、１つの塩基変化の検出さえも可能にする。ＤＮＡフラグメントは、標識され得るか、または標識されたプローブを用いて検出され得る。アッセイの感度は、ＤＮＡよりもむしろ、二次構造が配列中の変化に対してより感受的であるＲＮＡを使用することによって増強され得る。１つの実施形態において、本発明の方法は、ヘテロ二重鎖分析を利用して、電気泳動の移動度における変化に基づいて二本鎖のヘテロ二重鎖分子を分離する。例えば、Ｋｅｅｎら（１９９１）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ．７：５を参照のこと。
【０４１７】
なお別の実施形態において、一定勾配の変性剤を含有するポリアクリルアミドゲルにおける変異体または野生型フラグメントの移動は、変性勾配ゲル電気泳動（ＤＧＧＥ）を使用してアッセイされる。例えば、Ｍｙｅｒｓら（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ  ３１３：４９５を参照のこと。ＤＧＧＥが分析の方法として使用される場合、ＤＮＡは、例えば、ＰＣＲにより約４０ｂｐの高融点ＧＣリッチＤＮＡのＧＣクランプを付加することによって、完全には変性されないことを確実するように改変される。さらなる実施形態において、温度勾配は、コントロールＤＮＡおよびサンプルＤＮＡの移動度における差異を同定するために、変性剤勾配の代わりに使用される。例えば、ＲｏｓｅｎｂａｕｍおよびＲｅｉｓｓｎｅｒ（１９８７）Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．２６５：１２７５３を参照のこと。
【０４１８】
点変異を検出するための他の技術の例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：選択的オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション、選択的増幅、または選択的プライマー伸長。例えば、オリゴヌクレオチドプライマーは、既知の変異が中心的に配置されるように調製され得、次いで、完全なマッチが見出される場合にのみハイブリダイゼーションを許容する条件下で標的ＤＮＡにハイブリダイズされる。例えば、Ｓａｉｋｉら（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ  ３２４：１６３；Ｓａｉｋｉら（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：６２３０を参照のこと。このような対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドは、このオリゴヌクレオチドがハイブリダイズ膜に付着され、そして標識された標的ＤＮＡとハイブリダイズされる場合に、ＰＣＲ増幅された標的ＤＮＡまたは多くの異なる変異にハイブリダイズされる。
【０４１９】
あるいは、選択的ＰＣＲ増幅に依存する対立遺伝子特異的増幅技術は、本発明と合わせて使用され得る。特異的増幅についてのプライマーとして使用されるオリゴヌクレオチドは、分子の中心において（その結果、増幅は、差次的ハイブリダイゼーションに依存する）（例えば、Ｇｉｂｂｓら（１９８９）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１７：２４３７〜２４４８を参照のこと）か、あるいは適切な条件下でミスマッチが妨げられ得るかまたはポリメラーゼ伸長を減少し得る、１つのプライマーの３’の最末端で、目的の変異を保有し得る（例えば、Ｐｒｏｓｓｎｅｒ（１９９３）Ｔｉｂｔｅｃｈ  １１：２３８を参照のこと）。さらに、切断に基づく検出を行うために、変異領域に新規な制限部位を導入することは、望ましくあり得る。例えば、Ｇａｓｐａｒｉｎｉら（１９９２）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｂｅｓ  ６：１を参照のこと。特定の実施形態において、増幅はまた、増幅用Ｔａｑリガーゼを使用して実施され得ることが予測される。例えば、Ｂａｒａｎｙ（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：１８９を参照のこと。このような場合において、連結は、５’配列の３’末端に完全なマッチが存在する場合にのみ生じ、増幅の存在または非存在を探索することによって、特定の部位における既知の変異の存在を検出することを可能にする。
【０４２０】
本明細書中に記載される方法は、例えば、本明細書中に記載れる少なくとも１つのプローブ核酸または抗体試薬を含む、予めパッケージングされた診断キットを利用することによって実施され得、これは、例えば、ＮＯＶＸ遺伝子を含む疾患または疾病の症状または家族病歴を示す患者を診断するための臨床的設定において好都合に使用され得る。
【０４２１】
さらに、ＮＯＶＸが発現される任意の細胞型または組織（好ましくは、末梢血白血球）は、本明細書中に記載される予後アッセイにおいて利用され得る。しかし、有核細胞を含む任意の生物学的サンプル（例えば、頬粘膜細胞を含む）が、使用され得る。
【０４２２】
（薬理ゲノム学（Ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｏｍｉｃｓ））
ＮＯＶＸ活性（例えば、ＮＯＶＸ遺伝子発現）に対する刺激性または阻害性の影響を有する因子、すなわちモジュレーターは、本明細書中に記載されるスクリーニングアッセイによって同定されるように、障害（この障害は、代謝障害、糖尿病、肥満症、感染症、食欲不振、癌関連悪液質、癌、神経変性疾患、アルツハイマー病、パーキンソン病、免疫障害、および造血障害、および種々の異常脂肪性浮腫（ｄｙｓｌｉｐｉｄｅｍｉａｓ）、肥満に関連する代謝障害、Ｘ代謝症候群（ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ  Ｘ）、ならびに慢性疾患および種々の癌と関連する消耗疾患を含む）を（予防的または治療的に）処置するために個体に投与され得る。このような処置と合わせて、個体の薬理ゲノム学（すなわち、個体の遺伝子型と外来化合物または薬物に対するその個体の応答との間の関係についての研究）が、考慮され得る。治療剤の代謝における差異は、薬理学的に活性な薬物の用量と血中濃度との間の関係を変更することによって、重篤な毒性または治療の失敗を導き得る。従って、個体の薬理ゲノム学は、個体の遺伝子型の考慮に基づく予防的または治療的処置のために有効な因子（例えば、薬物）の選択を可能にする。このような薬理ゲノム学は、さらに、適切な投薬量および治療剤レジメンを決定するために使用され得る。従って、ＮＯＶＸタンパク質の活性、ＮＯＶＸ核酸の発現、あるいは個体におけるＮＯＶＸ遺伝子の変異含量が決定されて、それによって個体の治療的または予防的処置のために適切な因子を選択し得る。
【０４２３】
薬理ゲノム学は、罹患した人おける変更された薬物の性質および異常な作用に起因して、薬物に応答する臨床的に有意な遺伝性変更を扱う。例えば、Ｅｉｃｈｅｌｂａｕｍ、１９９６．Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ，２３：９８３〜９８５；Ｌｉｎｄｅｒ、１９９７、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．，４３：２５４〜２６６を参照のこと。一般に、２つの型の薬理ゲノム学状態が、区別され得る。薬物が身体に作用する方法を変更する１つの因子として伝達される遺伝的状態（変更された薬物作用）、または身体が薬物に作用する方法を変更する１つの因子として伝達される遺伝的状態（変更された薬物代謝）。これらの薬理ゲノム学状態は、稀な欠損としてか、または多型としてのいずれかで生じ得る。例えば、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ６ＰＤ）欠損は、一般的な遺伝性酵素病であり、この主な臨床的合併症は、酸化剤薬物（抗マラリア剤、スルホンアミド、鎮痛薬、ニトロフラン）の摂取およびソラマメの摂食後の溶血である。
【０４２４】
例示的な実施形態として、薬物代謝酵素の活性は、薬物作用の強度および持続期間の両方の主要な決定因子である。薬物代謝酵素（例えば、Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ２（ＮＡＴ２）およびシトクロムＰ４５０酵素ＣＹＰ２Ｄ６およびＣＹＰ２Ｃ１９）の遺伝的多型の発見は、幾人かの患者が予期される薬物効果を得ないか、または標準的かつ安全な用量の薬物を摂取した後に過大な薬物応答および深刻な毒性を示すことに関しての説明を提供した。これらの多型は、集団において２つの表現型（高い代謝能を持つ人（ｅｘｔｅｎｓｉｖｅ  ｍｅｔａｂｏｌｉｚｅｒ）（ＥＭ）および低い代謝能を持つ人（ｐｏｏｒ  ｍｅｔａｂｏｌｉｚｅｒ）（ＰＭ））で表現される。ＰＭの有病率は、異なる集団の間で異なる。例えば、ＣＹＰ２Ｄ６をコードする遺伝子は高度に多型であり、そしていくらかの変異がＰＭにおいて同定されており、この全ては機能的ＣＹＰ２Ｄ６の非存在に至る。ＣＹＰ２Ｄ６およびＣＹＰ２Ｃ１９の低い代謝能を持つ人は、彼らが標準的な用量を受ける場合に、かなり頻繁に過大な薬物応答および副作用を経験する。代謝産物が活性な治療的部分である場合、そのＣＹＰ２Ｄ６形成代謝産物によって媒介されるコデインの鎮痛効果について実証されるように、ＰＭは治療的応答を示さない。他の極端なものは、標準的な用量に応答しない、いわゆる超急速な代謝能を持つ人である。最近、超急速な代謝の基準となる分子は、ＣＹＰ２Ｄ６遺伝子増幅に起因していることが同定されている。
【０４２５】
従って、ＮＯＶＸタンパク質の活性、ＮＯＶＸ核酸の発現、あるいは個体におけるＮＯＶＸ遺伝子の変異内容を決定して、それによって、その個体の治療的または予防的処置のために適切な因子を選択し得る。さらに、薬理ゲノム学の研究を使用して、個体の薬物応答性の表現型の同定に対して薬物代謝酵素をコードする多型対立遺伝子の遺伝子型を適用し得る。この知見は、用量または薬物選択に適用される場合、有害な反応または治療の失敗を回避し得、従って、被験体をＮＯＶＸの調節因子（例えば、本明細書中に記載される例示的なスクリーニングアッセイの１つによって同定される調節因子）を用いて処置する場合に治療的または予防的効率を増強し得る。
【０４２６】
（臨床試験中の効果のモニタリング）
ＮＯＶＸの発現または活性（例えば、異常な細胞増殖および／または分化を調節する能力）に対する因子（例えば、薬物、化合物）の影響をモニタリングすることは、基本的な薬物スクリーニングだけでなく臨床試験にも適用され得る。例えば、本明細書中に記載されるようなスクリーニングアッセイによって、ＮＯＶＸの遺伝子発現、タンパク質レベルを増加するため、またはＮＯＶＸ活性をアップレギュレートすることが決定される因子の効力は、減少したＮＯＶＸの遺伝子発現、タンパク質レベル、またはダウンレギュレートしたＮＯＶＸの活性を示す被験体の臨床試験においてモニターされ得る。あるいは、スクリーニングアッセイによって、ＮＯＶＸの遺伝子発現、タンパク質レベルを減少、またはＮＯＶＸの活性をダウンレギュレートすることが決定される因子の効力は、増加したＮＯＶＸの遺伝子発現、タンパク質レベル、またはアップレギュレートしたＮＯＶＸの活性を示す被験体の臨床試験においてモニターされ得る。このような臨床試験において、ＮＯＶＸの発現または活性、および好ましくは、例えば、細胞増殖または免疫障害に関与する他の遺伝子が、「リードアウト（読み出し）（ｒｅａｄ  ｏｕｔ）」、すなわち、特定の細胞の免疫応答性のマーカーとして使用され得る。
【０４２７】
例えば、ＮＯＶＸを含む遺伝子（これは、ＮＯＶＸ活性（例えば、本明細書中に記載されるようなスクリーニングアッセイにおいて同定される）を調節する因子（例えば、化合物、薬物または低分子）を用いる処置によって、細胞内で調節される）が同定され得るが、これらに限定されない。従って、細胞性増殖障害に対する因子の効果を研究するために、例えば、臨床試験において、細胞が単離され得、そしてＲＮＡが調製され得、そしてＮＯＶＸおよびこの障害に関与する他の遺伝子の発現のレベルについて分析され得る。遺伝子発現のレベル（すなわち、遺伝子発現パターン）は、本明細書中に記載されるように、ノーザンブロット分析もしくはＲＴ−ＰＣＲによるか、あるいは産生されるタンパク質の量を測定することによるか、本明細書中に記載されるような方法の１つによるか、あるいはＮＯＶＸまたは他の遺伝子の活性のレベルを測定することによって、定量され得る。この様式で、この遺伝子発現パターンは、この因子に対する細胞の生理学的応答の指標であるマーカーとして作用し得る。従って、この応答状態は、この因子を用いる個体の処置の前、および処置の間の種々の時点で、決定され得る。
【０４２８】
１つの実施形態において、本発明は、因子（例えば、アゴニスト、アンタゴニスト、タンパク質、ペプチド、ペプチド模倣物、核酸、低分子、または本明細書中に記載されるスクリーニングアッセイによって同定される他の薬物候補物）を用いる、被験体の処置の効力をモニタリングするための方法を提供し、これは、以下の工程を包含する：（ｉ）因子の投与の前に、被験体から投与前サンプルを得る工程；（ｉｉ）この投与前サンプルにおける、ＮＯＶＸのタンパク質、ｍＲＮＡ、またはゲノムＤＮＡの発現のレベルを検出する工程；（ｉｉｉ）この被験体から１つ以上の投与後サンプルを得る工程；（ｉｖ）この投与後サンプルにおいて、ＮＯＶＸのタンパク質、ｍＲＮＡ、またはゲノムＤＮＡの発現または活性のレベルを検出する工程；（ｖ）この投与前サンプルにおけるＮＯＶＸのタンパク質、ｍＲＮＡ、またはゲノムＤＮＡの発現または活性のレベルを、この投与後サンプルにおけるＮＯＶＸのタンパク質、ｍＲＮＡ、またはゲノムＤＮＡの発現または活性のレベルと比較する工程；ならびに（ｖｉ）然るべく、この被験体に対する因子の投与を変更する工程。例えば、この因子の増加した投与は、検出されるよりも高いレベルにＮＯＶＸの発現または活性を増加するため（すなわち、この因子の効力を増加するため）に所望され得る。あるいは、この因子の減少した投与は、検出されるよりも低いレベルにＮＯＶＸの発現または活性を減少するため（すなわち、この因子の効力を減少するため）に所望され得る。
【０４２９】
（処置方法）
本発明は、異常なＮＯＶＸの発現または活性に関連する障害の危険性がある（またはこの障害に感受性である）か、またはこの障害を有する被験体を処置する予防的方法および治療的方法の両方を提供する。この障害としては、心筋症、アテローム性動脈硬化症、高血圧症、先天性心欠損症、大動脈狭窄症、心房中隔欠損症（ＡＳＤ）、房室（Ａ−Ｖ）管欠損症、動脈管、肺動脈弁狭窄症、大動脈弁下部狭窄症、心室中隔欠損症（ＶＳＤ）、弁疾患、結節硬化症、強皮症、肥満症、移植、副腎脳白質ジストロフィー、先天性副腎過形成、前立腺癌、新形成；腺癌、リンパ腫、子宮癌、不妊（ｆｅｒｔｉｌｉｔｙ）、血友病、凝固能亢進、特発性血小板減少性紫斑病、免疫欠損症、対宿主性移植片病、ＡＩＤＳ、気管支ぜんそく、クローン病；多発性硬化症、オールブライト遺伝性骨形成異常症の処置、ならびに他の疾患、障害および状態などが挙げられる。
【０４３０】
これらの処置方法は、以下により詳細に考察される。
【０４３１】
（疾患および障害）
（その疾患または障害に罹患していない被験体と比較して）増加したレベルまたは生物学的活性によって特徴付けられる疾患および障害は、活性を拮抗する（すなわち、低減または阻害する）治療剤を用いて処置され得る。活性を拮抗する治療剤は、治療的または予防的な様式で、投与され得る。利用され得る治療剤としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：（ｉ）上記ペプチド、またはそのアナログ、誘導体、フラグメントもしくはホモログ；（ｉｉ）上記ペプチドに対する抗体；（ｉｉｉ）上記ペプチドをコードする核酸；（ｉｖ）相同組換えによって上記ペプチドの内因性機能を「ノックアウトする」ために利用される、アンチセンス核酸および「機能不全性」である（すなわち、上記ペプチドに対するコード配列のコード配列内の異種挿入に起因する）核酸の投与（例えば、Ｃａｐｅｃｃｈｉ、１９８９、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４：１２８８〜１２９２を参照のこと）；または（ｖ）上記ペプチドとその結合パートナーとの間の相互作用を変化させる、調節因子（すなわち、インヒビター、アゴニストおよびアンタゴニスト（本発明のさらなるペプチド模倣物または本発明のペプチドに対して特異的な抗体を含む））。
【０４３２】
（その疾患または障害に罹患していない被験体と比較して）減少したレベルまたは生物学的活性によって特徴付けられる疾患および障害は、活性を増加させる（すなわち、活性に対するアゴニストである）治療剤を用いて処置され得る。活性をアップレギュレートする治療剤は、治療的または予防的な様式で、投与され得る。利用され得る治療剤としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：上記ペプチド、またはそのアナログ、誘導体、フラグメントもしくはホモログ；あるいはバイオアベイラビリティーを増加させるアゴニスト。
【０４３３】
増加したレベルまたは減少したレベルは、ペプチドおよび／またはＲＮＡを定量することによって、容易に検出され得る。この定量は、患者の組織サンプルを（例えば、生検組織から）入手し、そしてそのサンプルを、発現したペプチド（または上記ペプチドのｍＲＮＡ）のＲＮＡレベルまたはペプチドレベル、構造および／または活性をインビトロでアッセイすることによる。当該分野において周知の方法としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：イムノアッセイ（例えば、ウェスタンブロット分析、免疫沈降と、それに続く、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）ポリアクリルアミドゲル電気泳動、免疫細胞化学などによる）および／またはｍＲＮＡの発現を検出するためのハイブリダイゼーションアッセイ（例えば、ノーザンアッセイ、ドットブロット、インサイチュハイブリダイゼーションなど）。
【０４３４】
（予防方法）
１つの局面において、本発明は、被験体において異常なＮＯＶＸの発現または活性と関連する疾患または状態を、ＮＯＶＸの発現または少なくとも１つのＮＯＶＸ活性を調節する因子をこの被験体に投与することによって予防するための方法を提供する。異常なＮＯＶＸの発現または活性によって引き起こされるかまたはこれらに起因する疾患についての危険性がある被験体は、例えば、本明細書中に記載の診断アッセイまたは予後アッセイのいずれか、またはそれらの組み合わせによって、同定され得る。予防因子の投与は、疾患または障害が予防されるか、あるいはその進行を遅延させるように、ＮＯＶＸ異常に特徴的な症状が現れる前に行い得る。このＮＯＶＸ異常の型に依存して、例えば、ＮＯＶＸアゴニスト因子またはＮＯＶＸアンタゴニスト因子が、被験体を処置するために使用され得る。適切な因子は、本明細書中に記載のスクリーニングアッセイに基づいて決定され得る。本発明の予防方法は、以下の小節において、さらに議論される。
【０４３５】
（治療方法）
本発明の別の局面は、治療目的のためにＮＯＶＸの発現または活性を調節する方法に関する。本発明の調節方法は、細胞を、その細胞に関するＮＯＶＸタンパク質活性のうちの１つ以上の活性を調節する因子と接触させる工程を包含する。ＮＯＶＸタンパク質活性を調節する因子は、核酸またはタンパク質、ＮＯＶＸタンパク質の天然に存在する同族リガンド、ペプチド、ＮＯＶＸペプチド模倣物、または他の低分子のような、本明細書中に記載されるような因子であり得る。１つの実施形態において、この因子は、１つ以上のＮＯＶＸタンパク質活性を刺激する。このような刺激因子の例としては、活性なＮＯＶＸタンパク質、および細胞に導入されたＮＯＶＸをコードする核酸分子が挙げられる。別の実施形態において、この因子は、１つ以上のＮＯＶＸタンパク質活性を阻害する。このような阻害因子の例としては、アンチセンスＮＯＶＸ核酸分子、および抗ＮＯＶＸ抗体が挙げられる。これらの調節方法は、インビトロで（例えば、その因子とともに細胞を培養することによって）、あるいはインビボで（例えば、被験体にその因子を投与することによって）実施され得る。このように、本発明は、ＮＯＶＸのタンパク質または核酸分子の異常な発現または異常な活性によって特徴付けられる、疾患または障害に罹患した個体を処置する方法を提供する。１つの実施形態において、この方法は、ＮＯＶＸの発現または活性を調節する（例えば、アップレギュレートまたはダウンレギュレートする）因子（例えば、本明細書中に記載のスクリーニングアッセイによって同定される因子）あるいはそのような因子の組み合わせを投与する工程を包含する。別の実施形態において、この方法は、低下したかまたは異常なＮＯＶＸの発現または活性を補完するための治療として、ＮＯＶＸのタンパク質または核酸分子を投与する工程を包含する。
【０４３６】
ＮＯＶＸ活性の刺激は、ＮＯＶＸが異常にダウンレギュレートされている状況、および／またはＮＯＶＸ活性の増加が有益な効果を有する可能性がある状況において、望ましい。このような状況の１つの例は、被験体が、異常な細胞増殖および／または細胞分化によって特徴付けられる障害（例えば、癌または免疫関連障害）を有する場合である。このような状況の別の例は、被験体が妊娠性疾患（例えば、子癇前症（ｐｒｅｃｌａｍｐｓｉａ））を有する場合である。
【０４３７】
（治療剤の生物学的効果の決定）
本発明の種々の実施形態において、適切なインビトロアッセイまたはインビボアッセイを行って、特定の治療剤の効果およびその投与が罹患組織の処置を示すか否かを決定する。
【０４３８】
種々の特定の実施形態において、インビトロアッセイが患者の障害に関与する代表的な細胞型で行われ、所定の治療剤がこの細胞型に対して所望の効果を発揮するか否かを決定し得る。治療において使用する化合物は、ヒト被験体において試験する前に、適切な動物モデル系において試験され得る。これらの動物モデル系としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ラット、マウス、ニワトリ、ウシ、サル、ウサギなど。同様に、インビボ試験については、当該分野で公知の任意の動物モデル系が、ヒト被験体に対する投与の前に使用され得る。
【０４３９】
（本発明の組成物の予防的用途および治療的用途）
本発明のＮＯＶＸ核酸およびタンパク質は、以下を含むが、これらに限定されない種々の障害に関連する潜在的な予防的適用および治療的適用に有用である：代謝障害、糖尿病、肥満症、感染症、食欲不振、癌関連癌、神経変性障害、アルツハイマー病、パーキンソン病、免疫障害、造血障害、および種々の異脂肪性浮腫、肥満に関連する代謝障害、Ｘ代謝症候群、ならびに慢性疾患および種々の癌と関連する消耗疾患。
【０４４０】
例えば、本発明のＮＯＶＸタンパク質をコードするｃＤＮＡは、遺伝子治療に有用であり得、そしてこのタンパク質は、遺伝子治療を必要とする被験体に投与される場合、有用であり得る。非制限的例示として、本発明の組成物は、以下に罹患した患者の処置についての効力を有する：代謝障害、糖尿病、肥満症、感染症、食欲不振、癌関連悪液質、癌、神経変性障害、アルツハイマー病、パーキンソン病、免疫障害、造血障害、および種々の異脂肪性浮腫。
【０４４１】
本発明のＮＯＶＸタンパク質をコードする新規な核酸、およびＮＯＶＸタンパク質の両方、またはそれらのフラグメントは、診断適用にも有用であり得、ここでは、この核酸またはタンパク質の存在または量が評価される。さらなる用途は、抗菌分子としての用途であり得る（すなわち、いくつかのペプチドは、抗菌特性を有することが見出されている）。これらの材料は、治療的または診断的な方法における使用のための、本発明の新規物質に免疫特異的に結合する抗体の産生においてさらに有用である。
【０４４２】
本発明を以下の実施例においてさらに記載する。この実施例は、特許請求の範囲に記載した本発明の範囲を限定しない。
【０４４３】
（実施例）
（実施例１．ＮＯＶＸ核酸の同定）
ポリペプチドまたはホモログに関するＣｕｒａＧｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎの配列ファイルを使用するＴｂｌａｓｔＮを、ＧｅｎＢａｎｋによって利用可能になったＧｅｎｏｍｉｃ  Ｄａｉｌｙ  Ｆｉｌｅｓまたは個々の配列決定センターからダウンロードしたファイルに対して実行した。エキソンを相同性によって推定し、そしてイントロン／エキソンの境界を標準的な遺伝子規則を使用して決定した。エキソンを複数のＢＬＡＳＴ（例えば、ｔＢｌａｓｔＮ、ＢｌａｓｔＸ、およびＢｌａｓｔＮ）検索、およびいくつかの場合には、ＧｅｎｅＳｃａｎおよびＧｒａｉｌを使用する類似性の決定手段によって、さらに選択し、そして精緻化した。利用可能な場合、公的なデータベースおよび独自データベースの両方からの発現配列をもまた加え、この遺伝子配列をさらに定義しそして完全なものとした。次いで、そのＤＮＡ配列を、明白な不一致について手作業で補正し、それによって全長タンパク質をコードする配列を得た。
【０４４４】
本発明で同定した新規なＮＯＶＸ標的配列を、この配列を確認するためにエキソン連結プロセス（ｅｘｏｎ  ｌｉｎｋｉｎｇ  ｐｒｏｃｅｓｓ）に供した。ＰＣＲプライマーを、順方向プライマーについては利用可能な最も上流の配列で、そして逆方向プライマーについては利用可能な最も下流の配列で開始するように設計した。ＰＣＲプライマーの配列を、種々のクローンを得るために使用した。それぞれの場合について、適切な配列（すなわち、特有であるかまたは高度に選択的であるかのいずれかである）に遭遇するまで、または逆方向プライマーの場合には終止コドンに達するまで、コード配列に向ってそれぞれの末端から内向きにウォーキングさせることによって、配列を試験した。このようなプライマーを、標的配列の全長のｃＤＮＡ、ＤＮＡの一部（１つ以上のエキソン）もしくはタンパク質配列についてのインシリコ（ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ）予測に基づいて、または他の種由来の密接に関連するヒト配列に対する推定エキソンの翻訳物の相同性によって、設計した。次いで、これらのプライマーを、以下のヒトｃＤＮＡのプールに基づくＰＣＲ増幅において使用した：副腎、骨髄、脳−扁桃、脳−小脳、脳−海馬、脳−黒質、脳−視床、脳−全体、胎児の脳、胎児の腎臓、胎児の肝臓、胎児の肺、心臓、腎臓、リンパ腫−ラージ、乳腺、膵臓、脳下垂体、胎盤、前立腺、唾液腺、骨格筋、小腸、脊髄、脾臓、胃、精巣、甲状腺、気管、子宮。通常は、得られたアンプリコンをゲル精製し、クローン化し、そして高い重複性について配列決定した。エキソン連結によって誘導されたＰＣＲ産物を、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎからのｐＣＲ２．１ベクター中にクローン化した。得られた細菌クローンは、ｐＣＲ２．１ベクター中にクローン化した完全なオープンリーディングフレームを包含するインサートを有する。全てのクローンから得られた配列を、それ自体とともに、ＣｕｒａＧｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎのデータベース中の他のフラグメントとともに、そして公的なＥＳＴとともにまとめた。集合の別の成分との同一性の程度が５０ｂｐにわたって少なくとも９５％である場合に、そのフラグメントおよびＥＳＴを集合の成分として含ませた。さらに、少数の配列を手作業によって評価し、そして適切である場合には修正を施した。これらの手順によって本明細書中に報告する配列を提供する。
【０４４５】
物理的なクローン：エキソンを相同性によって推定し、そしてイントロン／エキソンの境界を標準的な遺伝子規則を使用して決定した。エキソンを、複数のＢＬＡＳＴ（例えば、ｔＢｌａｓｔＮ、ＢｌａｓｔＸ、およびＢｌａｓｔＮ）検索、およびいくつかの場合には、ＧｅｎｅＳｃａｎおよびＧｒａｉｌを使用する類似性の決定手段によって、さらに選択し、そして精緻化した。利用可能な場合、公的なデータベースおよび独自データベースの両方からの発現配列をもまた加え、この遺伝子配列をさらに定義しそして完全なものとした。次いで、そのＤＮＡ配列を、明白な不一致について手作業で補正し、それによって全長タンパク質をコードする配列を得た。
【０４４６】
（実施例２：ＮＯＶＸ核酸配列における一ヌクレオチド多型の同定）
改変体配列もまた、本出願に含まれる。改変体配列は、一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）を含み得る。ＳＮＰは、いくつかの例においては、ＳＮＰを含有するヌクレオチド配列がｃＤＮＡとして生じることを示す、「ｃＳＮＰ」と呼ばれる。ＳＮＰは、いくつかの方法で生じ得る。例えば、ＳＮＰは、多形の部位での別のヌクレオチドへの１つのヌクレオチドの置換に起因し得る。このような置換は、転移または転換のいずれかであり得る。ＳＮＰはまた、参照対立遺伝子と比較した、ヌクレオチドの欠失またはヌクレオチドの挿入によっても生じ得る。この場合には、多型の部位は、１つの対立遺伝子が、別の対立遺伝子中の特定のヌクレオチドに関してギャップを保有している部位である。遺伝子中に存在しているＳＮＰは、ＳＮＰの位置で遺伝子によってコードされるアミノ酸の変化を生じ得る。しかし、ＳＮＰを含むコドンが遺伝子コードの縮重の結果として同じアミノ酸をコードする場合には、遺伝子内ＳＮＰはまた、サイレントであり得る。遺伝子の領域の外側に存在している、または遺伝子内のイントロンに存在しているＳＮＰは、タンパク質のアミノ酸配列には全く変化を生じないが、発現パターンの調節の変更を生じ得る。例としては、一過性発現、生理学的応答の調節、細胞型による発現調節、発現の強度および転写されたメッセージの安定性における変更が挙げられる。
【０４４７】
エキソン連結プロセスによって作製されたＳｅｑＣａｌｌｉｎｇアセンブリを、以下の基準を使用して選択および伸長した。初期配列または伸長配列の全てまたは一部と９８％の同一性を有する領域を有するゲノムクローンを、問い合わせヒトゲノムデータベースに対して関連する配列を使用するＢＬＡＳＴＮ検索によって同定した。得られたゲノムクローンを、さらなる分析について選択した。なぜなら、この同一性は、これらのクローンがこれらのＳｅｑＣａｌｌｉｎｇアセンブリに対するゲノム遺伝子座を含むことを示しているからである。これらの配列を、推定コード領域ならびに既知のＤＮＡ配列およびタンパク質配列との類似性について分析した。これらの分析のために使用されるプログラムとしては、Ｇｒａｉｌ、Ｇｅｎｓｃａｎ、ＢＬＡＳＴ、ＨＭＭＥＲ、ＦＡＳＴＡ、Ｈｙｂｒｉｄおよび他の関連するプログラムが挙げられる。
【０４４８】
いくつかのさらなるゲノム領域もまた、同定され得る。なぜなら、選択されたＳｅｑＣａｌｌｉｎｇアセンブリがこれらの領域をマッピングするからである。このようなＳｅｑＣａｌｌｉｎｇ配列は、相同性またはエキソン予測によって規定される領域とオーバーラップし得る。これらはまた、フラグメントの位置が、本来の推定配列に含まれていた類似性またはエキソン予測によって同定されたゲノム領域の近傍にあるので、含まれ得る。そのように同定された配列を、手動で構築し、次いで、ＣｕｒａＧｅｎ  ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎのヒトＳｅｑＣａｌｌｉｎｇデータベースから得られる１つ以上のさらなる配列を使用して伸長し得る。含めることに適したＳｅｑＣａｌｌｉｎｇフラグメントを、ＣｕｒａＴｏｏｌｓＴＭプログラムＳｅｑＥｘｔｅｎｄによってか、または分析されたゲノムクローンの適切な領域にマッピングするＳｅｑＣａｌｌｉｎｇフラグメントを同定することによって、同定した。
【０４４９】
次いで、上記手順によって規定される領域を手動で組み込み、そして、例えば、本来のフラグメントの誤った塩基または推定エキソン接合部、ＥＳＴの位置および配列類似性の領域との間の差異から生じ得る明らかな不一致を補正して、本明細書中に開示される最終配列を誘導した。必要な場合、ＳｅｑＣａｌｌｉｎｇアセンブリおよびゲノムクローンを同定および分析するためのプロセスを繰り返して、全長配列を誘導した。
【０４５０】
（実施例３．種々の細胞および組織中でのクローンの定量的発現分析）
種々のクローンの定量的な発現を、種々の正常細胞および病理誘導性の細胞、細胞株および組織由来のＲＮＡサンプルを含有するマイクロタイタープレートを使用し、リアルタイム定量的ＰＣＲ（ＲＴＱ  ＰＣＲ）を使用して評価した。ＲＴＱ  ＰＣＲを、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ（登録商標）７７００  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍによって実施した。サンプルの種々のコレクションをプレート上に組立て、そしてこれらをパネル１（正常な組織および癌細胞株を含む）、パネル２（正常な供給源および癌の供給源に由来する、組織由来のサンプルを含む）、パネル３（癌細胞株を含む）、パネル４（正常な組織由来の細胞および細胞株ならびに炎症状態に関係している細胞を含む）、パネル５Ｄ／５Ｉ（代謝疾患に対する重要性を有するヒト組織および細胞株を含む）、ＡＩ＿包括＿パネル（ＡＩ＿ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ＿ｐａｎｅｌ）（正常な組織および自己炎症疾患由来のサンプルを含む）、パネルＣＮＳＤ．０１（正常な脳および疾患性の脳由来のサンプルを含む）、およびＣＮＳ＿神経変性＿パネル（ＣＮＳ＿ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ＿ｐａｎｅｌ）（正常な脳およびアルツハイマー病の脳由来のサンプルを含む）と呼ぶ。
【０４５１】
全てのサンプルに由来するＲＮＡの完全性を、指針としての２８Ｓおよび１８ＳリボソームＲＮＡの染色強度比（２：１〜２．５：１の２８ｓ：１８ｓ）、および分解産物の指標である低分子量のＲＮＡが存在しないことを使用して、アガロースゲル電気泳動の視覚的な評価によって質を制御した。サンプルを、単一のエキソンの範囲全体を増幅するように設計したプローブおよびプライマーのセットを使用して、逆転写酵素の非存在下でＲＴＱ  ＰＣＲ反応を実行することにより、ゲノムＤＮＡの混入に対して制御した。
【０４５２】
最初に、ＲＮＡサンプルを、構成的に発現される遺伝子（例えば、β−アクチンおよびＧＡＰＤＨ）のような、参照核酸に対して正規化した。正規化したＲＮＡ（５μｌ）をｃＤＮＡに転換し、そしてＯｎｅ  Ｓｔｅｐ  ＲＴ−ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ（ＰＥ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ；カタログ番号４３０９１６９）および遺伝子特異的プライマーを製造業者の説明書に従って使用する、ＲＴＱ−ＰＣＲによって分析した。プローブおよびプライマーを、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  ＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓのＰｒｉｍｅｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅパッケージ（Ａｐｐｌｅ  ＣｏｍｐｕｔｅｒのＭａｃｉｎｔｏｓｈ  Ｐｏｗｅｒ  ＰＣ用バージョンＩ）または同様のアルゴリズムに従って、入力として標的配列を使用して、それぞれのアッセイについて設計した。デフォルト設定を反応条件について使用し、そして以下のパラメーターを、プライマーの選択の前に設定した：プライマー濃度＝２５０ｎＭ、プライマーの融解温度（Ｔｍ）範囲＝５８〜６０℃、プライマーの最適Ｔｍ＝５９℃、最大のプライマー差分＝２℃、プローブは５’にＧを有さない、プローブのＴｍはプライマーのＴｍよりも１０℃高くなければならない、アンプリコンの大きさは７５ｂｐから１００ｂｐである。選択したプローブおよびプライマー（下記を参照のこと）を、Ｓｙｎｔｈｅｇｅｎ（Ｈｏｕｓｔｏｎ，ＴＸ，ＵＳＡ）によって合成した。プローブを、カップリングしていない色素を除去するためにＨＰＬＣによって二重精製し、そしてプローブのそれぞれ５’および３’末端へのレポーター色素およびクエンチャー色素のカップリングを確認するために質量分析法によって評価した。それらの最終濃度は：順方向および逆方向プライマーについてはそれぞれ９００ｎＭ、そしてプローブは２００ｎＭであった。
【０４５３】
ＰＣＲ条件：各組織および各細胞株由来の正規化したＲＮＡを、９６ウェルのＰＣＲプレート（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）の各ウェルにスポットした。ＰＣＲ溶液は、２つのプローブ（標的クローンに特異的なプローブおよび標的プローブと多重化する別の遺伝子特異的プローブ）を含み、これを１×ＴａｑＭａｎＴＭＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（ＰＥ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ７７００）を使用して、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、ｄＮＴＰ（ｄＡ、Ｇ、Ｃ、Ｕを１：１：１：２の比率で）、０．２５Ｕ／ｍｌ  ＡｍｐｌｉＴａｑ  ＧｏｌｄＴＭ（ＰＥ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、および０．４Ｕ／μｌ  ＲＮａｓｅインヒビター、および０．２５Ｕ／μｌ  逆転写酵素で設定した。逆転写を、４８℃で３０分間行い、続いて以下のような増幅／ＰＣＲサイクルを行った。：９５℃で１０分間、次いで、９５℃で１５秒間、６０℃で１分間の４０サイクル。結果を、ＣＴ値（所定のサンプルが蛍光の閾値を越えるサイクル）として対数目盛を使用して記録し、ここで、所定のサンプルと最も低いＣＴ値を有するサンプルとの間でのＲＮＡ濃度の差分は、２のΔＣＴ乗として表される。次いで、相対的な発現の割合を、このＲＮＡ差分の逆数をとり、そして１００を乗算することによって得る。
【０４５４】
（パネル１、１．１、１．２および１．３Ｄ）
パネル１、１．１、１．２および１．３Ｄのプレートは、２つのコントロールウェル（ゲノムＤＮＡコントロールおよび化学コントロール）および種々のサンプル由来のｃＤＮＡを含有する９４個のウェルを含む。これらのパネルのサンプルは、２つのクラスに分類される：培養細胞株由来のサンプルおよび初代正常細胞由来のサンプル。この細胞株は、以下の型の癌に由来する：肺癌、乳癌、黒色種、結腸癌、前立腺癌、ＣＮＳ癌、扁平上皮癌、卵巣癌、肝臓癌、腎臓癌、胃癌および膵臓癌。これらのパネルにおいて使用される細胞株は、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）（培養細胞株の寄託機関）によって広く利用可能であり、ＡＴＣＣによって推奨される条件を使用して培養した。これらのパネルにおいて見出された正常組織は、一人の成人個体または胎児の全ての主要な器官系由来のサンプルから構成される。これらのサンプルは、以下の器官由来である：成人の骨格筋、胎児の骨格筋、成人の心臓、胎児の心臓、成人の腎臓、胎児の腎臓、成人の肝臓、胎児の肝臓、成人の肺、胎児の肺、脳の種々の領域、脾臓、骨髄、リンパ節、膵臓、唾液腺、下垂体、副腎、脊髄、胸腺、胃、小腸、結腸、膀胱、気管、胸部、卵巣、子宮、胎盤、前立腺、精巣および脂肪。
【０４５５】
パネル１、１．１、１．２および１．３Ｄの結果においては、以下の略号を使用する：
ｃａ．＝癌腫
＊＝転移によって確立された
ｍｅｔ＝転移
ｓ  ｃｅｌｌ  ｖａｒ＝小細胞改変株
ｎｏｎ−ｓ＝ｎｏｎ−ｓｍ＝非小
ｓｑｕａｍ＝扁平上皮細胞
ｐｌ．ｅｆｆ＝ｐｌ  ｅｆｆｕｓｉｏｎ＝胸水
ｇｌｉｏ＝神経膠腫
ａｓｔｒｏ＝星状細胞腫、および
ｎｅｕｒｏ＝神経芽細胞腫。
【０４５６】
（一般＿スクリーニング＿パネル＿ｖ１．４（Ｇｅｎｅｒａｌ＿ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ＿ｐａｎｅｌ＿ｖ１．４））
パネル１．４のプレートは、２つのコントロールウェル（ゲノムＤＮＡコントロールおよび化学コントロール）および種々のサンプル由来のｃＤＮＡを含有する９４個のウェルを含む。パネル１．４のサンプルは、２つのクラスに分類される：培養細胞株由来のサンプルおよび初代正常細胞由来のサンプル。この細胞株は、以下の型の癌に由来する：肺癌、乳癌、黒色種、結腸癌、前立腺癌、ＣＮＳ癌、扁平上皮癌、卵巣癌、肝臓癌、腎臓癌、胃癌および膵臓癌。パネル１．４において使用される細胞株は、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）（培養細胞株の寄託機関）によって広く利用可能であり、ＡＴＣＣによって推奨される条件を使用して培養した。パネル１．４において見出された正常組織は、２〜５人の異なる成人個体または胎児の全ての主要な器官系由来のサンプルのプールから構成される。これらのサンプルは、以下の器官由来である：成人の骨格筋、胎児の骨格筋、成人の心臓、胎児の心臓、成人の腎臓、胎児の腎臓、成人の肝臓、胎児の肝臓、成人の肺、胎児の肺、脳の種々の領域、脾臓、骨髄、リンパ節、膵臓、唾液腺、下垂体、副腎、脊髄、胸腺、胃、小腸、結腸、膀胱、気管、胸部、卵巣、子宮、胎盤、前立腺、精巣および脂肪。
略語は、パネル１、１．１、１．２および１．３Ｄについて記載される通りである。
【０４５７】
（パネル２Ｄおよび２．２）
パネル２Ｄおよび２．２のプレートは、一般的には、２つのコントロールのウェルと９４個の試験サンプルを含む。これらの試験サンプルは、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  ＩｎｓｔｉｔｕｔｅのＣｏｏｐｅｒａｔｉｖｅ  Ｈｕｍａｎ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｎｅｔｗｏｒｋ（ＣＨＴＮ）またはＮａｔｉｏｎａｌ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｉｔｉａｔｉｖｅ（ＮＤＲＩ）との閉鎖会社に勤めている、外科医によって入手されたヒト組織から単離したＲＮＡまたはｃＤＮＡを含む。組織は、ヒトの悪性腫瘍に由来し、そして示される場合、多くの悪性組織は、腫瘍にすぐ隣接している非癌性組織から得られる「ぴったり沿った境界（ｍａｔｃｈｅｄ  ｍａｒｇｉｎ）」を有する。これらを、正常な隣接組織と呼び、そして以下の結果には「ＮＡＴ」と記載する。腫瘍組織および「ぴったり沿った境界」を、２人の別々の病理学者によって評価する（外科の病理学者、およびＮＤＲＩまたはＣＨＴＮの病理学者によって再度）。この分析は、腫瘍の分化の段階の全体的な組織病理学的評価を提供する。さらに、ほとんどのサンプルは、もともとの外科の病理報告を含み、この報告は、患者の臨床段階に関する情報を提供する。これらのぴったり沿った境界を、外科手術領域の周辺（すなわち、すぐ隣接している）組織（表ＲＲにおいては正常な隣接組織を「ＮＡＴ」と明示する）から採取する。さらに、ＲＮＡサンプルおよびｃＤＮＡサンプルを、高齢者または突然死の被害者（事故など）について行った検死による種々のヒト組織から得た。これらの組織は、疾患を有さないことを確認され、そしてこれを、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）、Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、およびＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのような種々の商業的な供給源から購入した。
【０４５８】
（パネル３Ｄ）
パネル３Ｄのプレートは、９４個のｃＤＮＡサンプルおよび２個のコントロールサンプルを含む。詳細には、これらのサンプルのうちの９２個は、培養されたヒトの癌細胞株に由来し、２個の独立したサンプルはヒトの初代小脳組織であり、そして２つはコントロールである。ヒトの細胞株は、一般的には、ＡＴＣＣ（アメリカンタイプカルチャーコレクション）、ＮＣＩ、またはＧｅｒｍａｎ腫瘍細胞バンクから入手し、そして以下の組織グループに分ける：舌の扁平上皮細胞癌、乳癌、前立腺癌、黒色腫、類表皮癌腫、肉腫、膀胱癌、膵臓癌、腎臓癌、白血病／リンパ腫、卵巣／子宮／子宮頚癌、胃癌、結腸癌、肺癌、およびＣＮＳ癌細胞株。さらに、小脳の２つの異なるサンプルが存在する。これらの細胞の全てを、標準的な推奨される条件下で培養し、そして標準的な手順を使用してＲＮＡを抽出した。パネル３Ｄおよび１．３Ｄの細胞株は、科学技術文献において使用される最も一般的な細胞株である。
【０４５９】
（パネル４Ｄ、４Ｒおよび４．１Ｄ）
パネル４は、９６ウェルプレート（２個のコントロールのウェル、９４個の試験サンプル）上にサンプルを含む。これは、炎症状態に関連している種々のヒトの細胞株または組織から単離したＲＮＡ（パネル４Ｒ）またはｃＤＮＡ（パネル４Ｄ／４．１Ｄ）を含む。結腸および肺（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）ならびに胸腺および腎臓（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）のようなコントロールの正常組織に由来する全ＲＮＡを使用した。肝硬変患者由来の肝臓組織および狼瘡患者由来の腎臓に由来する全ＲＮＡを、ＢｉｏＣｈａｉｎ（Ｂｉｏｃｈａｉｎ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｉｎｃ．，Ｈａｙｗａｒｄ，ＣＡ）から入手した。クローン病および潰瘍性大腸炎を有すると診断された患者からのＲＮＡの調製のための腸組織を、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｔｅｒｃｈａｎｇｅ（ＮＤＲＩ）（Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ）から入手した。
【０４６０】
星状細胞、肺繊維芽細胞、皮膚繊維芽細胞、冠状動脈平滑筋細胞、小気道上皮細胞、気管支上皮細胞、微小血管皮膚内皮細胞、微小血管肺内皮細胞、ヒトの肺大動脈の血管内皮細胞、ヒトの臍帯静脈の血管内皮細胞を、全て、Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ（Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ）から購入し、そしてＣｌｏｎｅｔｉｃｓによってこれらの細胞型に供給される培地中で増殖させた。これらの初代細胞型を、示すように、種々のサイトカインまたはサイトカインの組合せを用いて６時間および／または１２〜１４時間の間、活性化した。以下のサイトカインを使用した：約１〜５ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１β、約５〜１０ｎｇ／ｍｌのＴＮＦα、約２０〜５０ｎｇ／ｍｌのＩＦＮγ、約５〜１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−４、約５〜１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−９、約５〜１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１３。内皮細胞を、時折、０．１％の血清を有するＣｌｏｎｅｔｉｃｓによる基底培地中での培養によって種々の時間飢餓させた。
【０４６１】
単核細胞を、Ｆｉｃｏｌｌを使用して、ＣｕｒａＧｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎの従業員の血液から調製した。ＬＡＫ細胞を、ＤＭＥＭ、５％のＦＣＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、１００μＭの非必須アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ／Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ）、５．５×１０−５Ｍのメルカプトエタノール（Ｇｉｂｃｏ）、および１０ｍＭのＨｅｐｅｓ（Ｇｉｂｃｏ）、およびインターロイキン２（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ  ２）中での４〜６日間の培養によってこれらの細胞から調製した。次いで、細胞を、１０〜２０ｎｇ／ｍｌのＰＭＡ、および１〜２μｇ／ｍｌのイオノマイシン、５〜１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１２、２０〜５０ｎｇ／ｍｌのＩＦＮγ、および５〜１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１８のいずれかで、６時間活性化した。いくつかの場合には、単核細胞を、約５μｇ／ｍｌのＰＨＡ（フィトヘマグルチニン）またはＰＷＭ（アメリカヤマゴボウ有糸分裂促進物質）を含有する、ＤＭＥＭ  ５％のＦＣＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、１００μＭの非必須アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ）、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ）、５．５×１０−５Ｍのメルカプトエタノール（Ｇｉｂｃｏ）、および１０ｍＭのＨｅｐｅｓ（Ｇｉｂｃｏ）中で、４〜５日間培養した。ＲＮＡの調製のために、サンプルを２４、４８、および７２時間で採取した。ＭＬＲ（混合リンパ球反応）サンプルを、２人のドナーから採血し、Ｆｉｃｏｌｌを使用して単核細胞を単離し、そして単離した単核細胞を、ＤＭＥＭ  ５％のＦＣＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、１００μＭの非必須アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ）、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ）、メルカプトエタノール（５．５×１０−５Ｍ）（Ｇｉｂｃｏ）、および１０ｍＭのＨｅｐｅｓ（Ｇｉｂｃｏ）中において約２×１０６個の細胞／ｍｌの最終濃度で１：１にて混合することによって得た。このＭＬＲを培養し、そしてＲＮＡの調製のために１〜７日までの範囲の種々の時点でサンプルを採取した。
【０４６２】
単球を、製造業者の説明書に従って、ＣＤ１４  Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｅａｄｓ、＋ｖｅＶＳ選択カラムおよびＶａｒｉｏ  Ｍａｇｎｅｔを使用して単核細胞から単離した。単球を、ＤＭＥＭ  ５％のウシの胎児の血清（ＦＣＳ）（Ｈｙｃｌｏｎｅ、Ｌｏｇａｎ，ＵＴ）、１００μＭの非必須アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ）、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ）、５．５×１０−５Ｍのメルカプトエタノール（Ｇｉｂｃｏ）、および１０ｍＭのＨｅｐｅｓ（Ｇｉｂｃｏ）、５０ｎｇ／ｍｌのＧＭＣＳＦ、および５ｎｇ／ｍｌのＩＬ−４中での５〜７日間の培養によって樹状細胞に分化させた。マクロファージを、ＤＭＥＭ  ５％のＦＣＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、１００μＭの非必須アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ）、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ）、５．５×１０−５Ｍのメルカプトエタノール（Ｇｉｂｃｏ）、１０ｍＭのＨｅｐｅｓ（Ｇｉｂｃｏ）、および１０％のＡＢヒト血清、または約５０ｎｇ／ｍｌのＭＣＳＦ中で５〜７日間の単球の培養によって調製した。単球、マクロファージ、および樹状細胞を、１００ｎｇ／ｍｌのリポポリサッカライド（ＬＰＳ）で６時間および１２〜１４時間刺激した。樹状細胞をまた、１０μｇ／ｍｌの抗ＣＤ４０モノクローナル抗体（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）で６時間および１２〜１４時間刺激した。
【０４６３】
ＣＤ４リンパ球、ＣＤ８リンパ球、およびＮＫ細胞をまた、製造業者の説明書に従って、ＣＤ４、ＣＤ８、およびＣＤ５６のＭｉｌｔｅｎｙｉビーズ、ポジティブＶＳ選択カラム、およびＶａｒｉｏ  Ｍａｇｎｅｔを使用して単核細胞から単離した。ＣＤ４５ＲＡリンパ球およびＣＤ４５ＲＯ  ＣＤ４リンパ球を、ＣＤ８、ＣＤ５６、ＣＤ１４、およびＣＤ１９のＭｉｌｔｅｎｙｉビーズおよびポジティブ選択を使用してＣＤ８細胞、ＣＤ５６細胞、ＣＤ１４細胞、およびＣＤ１９細胞の単核細胞を除去することによって単離した。次いで、ＣＤ４５ＲＯビーズを使用してＣＤ４５ＲＯ  ＣＤ４リンパ球を単離し、残りの細胞はＣＤ４５ＲＡ  ＣＤ４リンパ球であった。ＣＤ４５ＲＡ  ＣＤ４、ＣＤ４５ＲＯ  ＣＤ４、およびＣＤ８のリンパ球を、ＤＭＥＭ  ５％のＦＣＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、１００μＭの非必須アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ）、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ）、５．５×１０−５Ｍのメルカプトエタノール（Ｇｉｂｃｏ）、および１０ｍＭのＨｅｐｅｓ（Ｇｉｂｃｏ）中に入れ、そしてＰＢＳ中の０．５μｇ／ｍｌの抗ＣＤ２８（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）および３μｇ／ｍｌの抗ＣＤ３（ＯＫＴ３、ＡＴＣＣ）で一晩コーティングしたＦａｌｃｏｎ  ６ウェル組織培養プレート上に１０６細胞／ｍｌでプレートした。６時間および２４時間後、細胞をＲＮＡの調製のために回収した。慢性的に活性化されたＣＤ８リンパ球を調製するために、本発明者らは、抗ＣＤ２８および抗ＣＤ３でコーティングしたプレート上で４日間、単離したＣＤ８リンパ球を活性化し、次いで細胞を回収して、それらをＤＭＥＭ  ５％のＦＣＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、１００μＭの非必須アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ）、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ）、５．５×１０−５Ｍのメルカプトエタノール（Ｇｉｂｃｏ）、および１０ｍＭのＨｅｐｅｓ（Ｇｉｂｃｏ）、ならびにＩＬ−２中で拡大させた。次いで再び、拡大させたＣＤ８細胞を、プレートに結合させた抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８で４日間活性化し、そして先のように拡大させた。ＲＮＡを２回目の活性化の６時間後および２４時間後、ならびに２回目の培養物の拡大の４日後に単離した。単離したＮＫ細胞を、ＤＭＥＭ  ５％のＦＣＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、１００μＭの非必須アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ）、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ）、５．５×１０−５Ｍのメルカプトエタノール（Ｇｉｂｃｏ）、および１０ｍＭのＨｅｐｅｓ（Ｇｉｂｃｏ）、ならびにＩＬ−２中で、ＲＮＡを調製する前に４〜６日間培養した。
【０４６４】
Ｂ細胞を得るために、扁桃をＮＤＲＩから得た。扁桃を、滅菌した解剖用の鋏で切断し、次いで篩を通過させた。次いで、扁桃体の細胞をスピンダウンさせ、そしてＤＭＥＭ  ５％のＦＣＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、１００μＭの非必須アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ）、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ）、５．５×１０−５Ｍのメルカプトエタノール（Ｇｉｂｃｏ）、および１０ｍＭのＨｅｐｅｓ（Ｇｉｂｃｏ）中に１０６個の細胞／ｍｌで再懸濁した。細胞を活性化するために、本発明者らは、５μｇ／ｍｌでＰＷＭ、または約１０μｇ／ｍｌで抗ＣＤ４０（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）および５〜１０ｎｇ／ｍｌでＩＬ−４を使用した。細胞を、ＲＮＡの調製のために、２４、４８、および７２時間で回収した。
【０４６５】
初代ならびに２次Ｔｈ１／Ｔｈ２細胞およびＴｒ１細胞を調製するために、６ウェルのＦａｌｃｏｎプレートを、１０μｇ／ｍｌの抗ＣＤ２８（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）および２μｇ／ｍｌのＯＫＴ３（ＡＴＣＣ）で一晩コーティングし、次いでＰＢＳで２回洗浄した。臍帯血ＣＤ４リンパ球（Ｐｏｉｅｔｉｃ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｇｅｒｍａｎ  Ｔｏｗｎ，ＭＤ）を、ＤＭＥＭ  ５％のＦＣＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、１００μＭの非必須アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ）、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ）、５．５×１０−５Ｍのメルカプトエタノール（Ｇｉｂｃｏ）、１０ｍＭのＨｅｐｅｓ（Ｇｉｂｃｏ）、およびＩＬ−２（４ｎｇ／ｍｌ）中で１０５〜１０６個の細胞／ｍｌで培養した。ＩＬ−１２（５ｎｇ／ｍｌ）および抗ＩＬ−４（１μｇ／ｍｌ）を、Ｔｈ１に指向させるために使用し、一方で、ＩＬ−４（５ｎｇ／ｍｌ）および抗ＩＦＮγ（１μｇ／ｍｌ）をＴｈ２に指向させるために使用し、そして５ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１０をＴｒ１に指向させるために使用した。４〜５日後、活性化させたＴｈ１リンパ球、Ｔｈ２リンパ球、およびＴｒ１リンパ球をＤＭＥＭ中で１回洗浄し、そしてＤＭＥＭ  ５％のＦＣＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、１００μＭの非必須アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ）、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ）、５．５×１０−５Ｍのメルカプトエタノール（Ｇｉｂｃｏ）、１０ｍＭのＨｅｐｅｓ（Ｇｉｂｃｏ）、およびＩＬ−２（１ｎｇ／ｍｌ）中で４〜７日間拡大させた。この後、活性化させたＴｈ１リンパ球、Ｔｈ２リンパ球、およびＴｒ１リンパ球を、上記のように、抗ＣＤ２８／ＯＫＴ３およびサイトカインを用いて、しかしアポトーシスを防ぐために抗ＣＤ９５Ｌ（１μｇ／ｍｌ）を添加して、５日間再刺激した。４〜５日後、Ｔｈ１リンパ球、Ｔｈ２リンパ球、およびＴｒ１リンパ球を洗浄し、次いで再びＩＬ−２を用いて４〜７日間拡大させた。活性化させたＴｈ１リンパ球およびＴｈ２リンパ球を最大３回のサイクルまで、この方法で維持した。ＲＮＡを、プレートに結合させた抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８  ｍＡｂでの２回目および３回目の活性化の６時間および２４時間後、ならびにインターロイキン２中での２回目および３回目の拡大培養の４日目に、初代および２次Ｔｈ１、Ｔｈ２およびＴｒ１から調製した。
【０４６６】
以下の白血球細胞株をＡＴＣＣから入手した：Ｒａｍｏｓ、ＥＯＬ−１、ＫＵ−８１２。ＥＯＬ細胞を、５×１０５個の細胞／ｍｌの０．１ｍＭのｄｂｃＡＭＰ中での８日間の培養、３日毎の培地の交換、および５×１０５個の細胞／ｍｌの細胞濃度への調整によってさらに分化させた。これらの細胞の培養のために、本発明者らは、５％のＦＣＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、１００μＭの非必須アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ）、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ）、５．５×１０−５Ｍのメルカプトエタノール（Ｇｉｂｃｏ）、１０ｍＭのＨｅｐｅｓ（Ｇｉｂｃｏ）を添加した、（ＡＴＣＣによって推奨されるように）ＤＭＥＭまたはＲＰＭＩを使用した。ＲＮＡを、休止細胞または１０ｎｇ／ｍｌのＰＭＡおよび１μｇ／ｍｌのイオノマイシンで６時間および１４時間活性化した細胞のいずれかから調製した。ケラチノサイト株ＣＣＤ１０６および気道上皮腫瘍株ＮＣＩ−Ｈ２９２をまたＡＴＣＣから入手した。両方を、ＤＭＥＭ  ５％のＦＣＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、１００μＭの非必須アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ）、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ）、５．５×１０−５Ｍのメルカプトエタノール（Ｇｉｂｃｏ）、および１０ｍＭのＨｅｐｅｓ（Ｇｉｂｃｏ）中で培養した。ＣＣＤ１１０６細胞を、約５ｎｇ／ｍｌのＴＮＦαおよび１ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１βで６時間および１４時間活性化し、一方、ＮＣＩ−Ｈ２９２細胞を、以下のサイトカインを用いて６時間および１４時間活性化した：５ｎｇ／ｍｌのＩＬ−４、５ｎｇ／ｍｌのＩＬ−９、５ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１３、および２５ｎｇ／ｍｌのＩＦＮγ。
【０４６７】
これらの細胞株および血液細胞について、約１０７個の細胞／ｍｌをＴｒｉｚｏｌ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）を使用して溶解させることによってＲＮＡを調製した。簡潔には、１／１０容量のブロモクロロプロパン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）をＲＮＡサンプルに添加し、ボルテックスし、そして室温で１０分後、チューブをＳｏｒｖａｌｌ  ＳＳ３４ローターで１４，０００ｒｐｍで回転させた。水相を採取し、そして１５ｍｌのＦａｌｃｏｎ  Ｔｕｂｅに入れた。等量のイソプロパノールを添加し、そして−２０℃で一晩静置した。沈殿させたＲＮＡをＳｏｒｖａｌｌ  ＳＳ３４ローター中で９，０００ｒｐｍで１５分間スピンダウンさせ、そして７０％のエタノール中で洗浄した。このペレットを３００μｌのＲＮＡｓｅを含まない水中に再度溶解させ、そして３５μｌの緩衝液（Ｐｒｏｍｅｇａ）、５μｌのＤＴＴ、７μｌのＲＮＡｓｉｎ、および８μｌのＤＮＡｓｅを添加した。チューブを、混入しているゲノムＤＮＡを除去するために３７℃で３０分間インキュベートし、フェノールクロロホルムで１回抽出し、そして１／１０容量の３Ｍの酢酸ナトリウムおよび２倍容量の１００％エタノールで再度沈殿させた。ＲＮＡをスピンダウンさせ、そしてＲＮＡｓｅを含まない水中に入れた。ＲＮＡを−８０℃で保存した。
【０４６８】
（ＡＩ＿包括的パネル＿ｖ１．０）
ＡＩ＿包括的パネル＿ｖ１．０のプレートは、２個のコントロールのウェルおよび８９個の試験サンプルを含む。これらの試験サンプルは、Ｂａｃｋｕｓ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｏｍｉｃｓ（Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ，ＭＤ）から入手した外科的な死後のヒト組織から単離されたｃＤＮＡを含む。総ＲＮＡを、ＣｕｒａＧｅｎの施設にあるＢａｃｋｕｓ病院からの組織サンプルから抽出した。他の組織由来の総ＲＮＡを、Ｃｌｉｎｏｍｉｃｓから入手した。
【０４６９】
滑液、滑膜、骨および軟骨を含む関節組織を、Ｂａｃｋｕｓ病院で全ての膝または股関節部の置換手術を経験した患者から入手した。組織サンプルは、単離されたＲＮＡが最適な量で分解されないことを確実にするように、液体窒素中で瞬時に冷凍された。変形性関節症および慢性関節リウマチの結合組織のさらなるサンプルを、Ｃｌｉｎｏｍｉｃｓから入手した。正常なコントロール組織がＣｌｉｎｏｍｉｃｓによって供給され、そしてこれらは、外傷犠牲者の死体解剖の間に得られた。
【０４７０】
乾癬組織の外科検体および隣接する適合組織が、Ｃｌｉｎｏｍｉｃｓによって総ＲＮＡとして提供された。二人の男性患者および二人の女性患者を、２５歳と４７歳の間で選択した。その患者の誰もが、サンプルが単離された時点で処方薬を摂取していなかった。
【０４７１】
潰瘍性大腸炎およびクローン病に罹患した患者由来の疾患性の結腸の外科検体および隣接する適合組織を、Ｃｌｉｎｏｍｉｃｓから入手した。４１歳〜６９歳の三人の女性クローン病患者および３人の男性クローン病患者由来の腸組織を、使用した。二人の患者は処方薬を摂取していなかったが、他の患者は、デキサメタゾン、フェノバルビタール、またはタイレノールを摂取していた。潰瘍性大腸炎組織は、三人の男性患者および四人の女性患者由来であった。その患者のうちの四人は、レブバイド（ｌｅｂｖｉｄ）を摂取しており、二人は、フェノバルビタールを摂取していた。
【０４７２】
外傷犠牲者からの死後の肺組織由来の総ＲＮＡを、Ｃｌｉｎｏｍｉｃｓから購入した。４０歳〜７０歳の範囲の肺気腫患者は、全てが喫煙者であり、この年齢範囲は、タバコ関連肺気腫の患者に焦点を当て、α−１抗トリプシン欠乏の患者を避けるように選択した。喘息患者は、３６歳〜７５歳の範囲であり、ＣＯＰＤも有し得る患者であることを避けるために喫煙者を除いた。ＣＯＰＤ患者は、３５歳〜８０歳の範囲であり、喫煙者と非喫煙者の両方を含んだ。ほとんどの患者がコルチコステロイド、および気管支拡張薬を摂取していた。
【０４７３】
ＡＩ＿包括的パネル＿ｖ１．０（ＡＩ＿ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  ｐａｎｅｌ＿ｖ１．０）パネル中の組織を同定するために使用した標識には、以下の略号を使用した：
Ｓｙｎ＝滑液
Ｎｏｒｍａｌ＝見かけ上の疾患なし
Ｒｅｐ２２／Ｒｅｐ２０＝個々の患者
ＲＡ＝慢性関節リウマチ
Ｂａｃｋｕｓ＝Ｂａｃｋｕｓ病院由来
ＯＡ＝変形性関節症
（ＳＳ）（ＢＡ）（ＭＦ）＝個々の患者
Ａｄｊ＝隣接組織
Ｍａｔｃｈ  ｃｏｎｔｒｏｌ＝隣接組織
−Ｍ＝男性
−Ｆ＝女性
ＣＯＰＤ＝慢性閉塞性肺疾患。
【０４７４】
（パネル５Ｄおよび５Ｉ）
パネル５Ｄおよび５Ｉのプレートは、２個のコントロールウェルおよびヒト組織から単離された種々のｃＤＮＡおよび代謝性疾患に重点をおいて細胞株を含む。代謝組織は、妊娠糖尿病研究に登録された患者から得られた。細胞は、ヒト間葉幹細胞由来の脂肪細胞の分化における異なる段階の間に得られた。ヒト膵臓島がまた、得られた。
【０４７５】
妊娠糖尿病研究において、被験体は若く（１８歳〜４０歳）、慣用的な（選択的な）帝王切開を引き起こす妊娠糖尿病に罹患しているかまたは罹患していない、その他の点では健常な女性である。胎児の分娩後、外科的切開が修復され／閉じられ、産科医は、各外科レベルの閉鎖の間にさらされた代謝性組織の少量のサンプル（＜１ｃｃ）を取り出した。この生検物質を、取り出しの時から５分以内に滅菌生理食塩水中でリンスし、ブロットし、そして高速で凍結させた。次いで、この組織を液体窒素中で瞬間冷凍し、そしてネジ蓋付きチューブ中に個別に保管し、そしてＣｕｒａＧｅｎへの輸送か、入手されるためにドライアイス上で保持した。目的の代謝性組織としては、子宮壁（平滑筋）、内臓脂肪、骨格筋（腹直筋）および皮下脂肪が挙げられる。記載した患者は、以下のようである：
患者２：ラテンアメリカ系糖尿病患者、体重超過、インスリンなし
患者７〜９：非糖尿病の白人、肥満（ＢＭＩ＞３０）
患者１０：ラテンアメリカ系糖尿病患者、体重超過、インスリン投与
患者１１：非糖尿病のアフリカ系アメリカ人、体重超過
患者１２：ラテンアメリカ系糖尿病患者、インスリン投与。
【０４７６】
脂肪細胞分化は、Ｏｓｉｒｕｓ（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ／ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒの部門）から入手されたドナー前駆体細胞において、２つの複製のみ有するドナー３Ｕを除いて三連で誘導された。Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓの科学者は、ＣｕｒａＧｅｎのために、Ｍａｒｋ  Ｆ．Ｐｉｔｔｅｎｇｅｒら、Ｍｕｌｔｉｌｉｎｅａｇｅ  Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｏｆ  Ａｄｕｌｔ  Ｈｕｍａｎ  Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９９９年４月２日：１４３−１４７において見出される公開されたプロトコルに基づいてヒト間葉幹細胞（ＨｕＭＳＣ）を単離し、増殖および分化した。Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓは、ｍＲＮＡ単離およびｄｓ  ｃＤＮＡ生成に適切なトリゾール溶解物または凍結ペレットを提供した。各ドナーの一般的な記載は以下のようである：
ドナー２および３Ｕ：間葉幹細胞、未分化の脂肪
ドナー２および３ＡＭ：脂肪、分化中の脂肪
ドナー２および３ＡＤ：脂肪、分化した脂肪。
【０４７７】
ヒトの細胞株は、一般的には、ＡＴＣＣ（アメリカンタイプカルチャーコレクション）、ＮＣＩ、またはＧｅｒｍａｎ腫瘍細胞バンクから入手し、そして以下の組織グループに分けた：曲尿細管、子宮平滑筋、小腸、肝臓ＨｅｐＧ２癌細胞、心臓初代基質細胞、および副腎皮質アデノーマ細胞。これらの細胞は全て標準の推奨条件下において培養され、そしてＲＮＡは、標準の手順を用いて抽出された。全てのサンプルは、一本鎖ｃＤＮＡを生成するためにＣｕｒａＧｅｎで処理された。
【０４７８】
パネル５Ｉは、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｍｉａｍｉ  Ｓｃｈｏｏｌ  ｏｆ  ＭｅｄｉｃｉｎｅにおけるＤｉａｂｅｔｅｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅから入手した５８歳の女性患者由来の膵臓島を追加して、前に記載した全てのサンプルを含む。島組織は、外部の供給源で総ＲＮＡに処理され、そしてパネル５Ｉに加えるためにＣｕｒａＧｅｎに運ばれた。
【０４７９】
５Ｄパネルおよび５Ｉパネル中の組織を同定するために使用した標識には、以下の略号を使用した：
ＧＯ  Ａｄｉｐｏｓｅ＝より大きい網脂肪
ＳＫ＝骨格筋
ＵＴ＝子宮
ＰＬ＝胎盤
ＡＤ＝分化された脂質
ＡＭ＝分化中の脂質
Ｕ＝未分化の幹細胞
（パネルＣＮＳＤ．０１）
パネルＣＮＳＤ．０１のプレートは、２個のコントロールのウェルおよび９４個の試験サンプルを含む。これらの試験サンプルは、Ｈａｒｖａｒｄ  Ｂｒａｉｎ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｃｅｎｔｅｒから入手した死後のヒトの脳組織から単離されたｃＤＮＡを含む。脳を、死後４時間から２４時間の間にドナーの頭蓋冠から切り出し、神経解剖学者によって断片化し、そして液体窒素蒸気中で−８０℃で凍結させた。全ての脳を断片化し、そして明確な関連する神経病理学の診断を確認するために神経病理学者によって試験した。
【０４８０】
疾患の診断を患者の記録から入手する。パネルは、以下の診断のそれぞれに由来する２つの脳を含む：アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、進行性核上性麻痺、欝状態、および「正常なコントロール」。これらの脳のそれぞれにおいて、以下の領域を示す：帯状回、大脳側頭極、淡蒼球（ｇｌｏｂｕｓ  ｐａｌｌａｄｕｓ）、黒質、ブロードマン野  ４（主要な運動ストリップ（ｐｒｉｍａｒｙ  ｍｏｔｏｒ  ｓｔｒｉｐ））、ブロードマン野  ７（頭頂皮質）、ブロードマン野  ９（前前頭皮質）、およびブロードマン野  １７（後頭の皮質）。全ての脳の領域が全ての症例において示されるわけではない；例えば、ハンチントン病は、淡蒼球の神経変性によって一部特徴付けられ、従ってこの領域は、確認されたハンチントン病の症例からは得ることができない。同様に、パーキンソン病は、黒質の変性によって特徴付けられ、この領域を得ることをさらに困難にする。正常なコントロールの脳を神経病理学について試験し、そして神経変性に関係しているいかなる病理も含まないことを見出した。
【０４８１】
ＣＮＳパネル中の組織を同定するために使用した標識には、以下の略号を使用した：
ＰＳＰ＝進行性核上性麻痺
Ｓｕｂ  Ｎｉｇｒａ＝黒質
Ｇｌｏｂ  Ｐａｌｌａｄｕｓ＝淡蒼球
Ｔｅｍｐ  Ｐｏｌｅ＝大脳側頭極
Ｃｉｎｇ  Ｇｙｒ＝帯状回
ＢＡ  ４＝ブロードマン野  ４。
【０４８２】
（パネルＣＮＳ＿神経変性（Ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）＿Ｖ１．０）
パネルＣＮＳ＿神経変性＿Ｖ１．０のプレートは、２個のコントロールウェルおよび４７個の試験サンプルを含む。これらの試験サンプルは、Ｈａｒｖａｒｄ  Ｂｒａｉｎ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｃｅｎｔｅｒ（ＭｃＬｅａｎ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ）およびＨｕｍａｎ  Ｂｒａｉｎ  ａｎｄ  Ｓｐｉｎａｌ  Ｆｌｕｉｄ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｃｅｎｔｅｒ（ＶＡ  Ｇｒｅａｔｅｒ  Ｌｏｓ  Ａｎｇｅｌｅｓ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｓｙｓｔｅｍ）から入手した死後のヒトの脳組織から単離されたｃＤＮＡを含む。脳を、死後４時間から２４時間の間にドナーの頭蓋冠から切り出し、神経解剖学者によって断片化し、そして液体窒素蒸気中で−８０℃で凍結させた。全ての脳を断片化し、そして明確な関連する神経病理学の診断を確認するために神経病理学者によって試験した。
【０４８３】
疾患の診断を患者の記録から入手する。パネルは、アルツハイマー病（ＡＤ）患者に由来する６つの脳、および生前に痴呆の兆候を示さない「正常なコントロール」に由来する８つの脳を含む。８つの正常なコントロールの脳は、２つのカテゴリーに分けられる：痴呆もアルツハイマー様の病理症状もないコントロール（コントロール）および痴呆がないが重症のアルツハイマー様病理症状の証拠を示すコントロール（特に、老人斑負荷を０〜３のスケールでレベル３として評価した；０＝斑を示さない、３＝重症のＡＤの老人斑負荷）。これらの脳のそれぞれの範囲で、以下の領域を示す：海馬、側頭皮質（ブロードマン野２１）、頭頂皮質（ブロードマン野７）、および後頭皮質（ブロードマン野１７）。これらの領域は、ＡＤでの神経変性のすべてのレベルを含むように選ばれた。海馬は、ＡＤでの早期かつ重症の神経欠損の領域である；側頭皮質は、海馬の後に、ＡＤでの神経変性を示すことが知られている；頭頂皮質は、この疾患の後期段階で中程度の神経の死を示す；後頭皮質は、ＡＤにおいて免れ、したがってＡＤ患者内の「コントロール」領域として働く。脳のすべての領域がすべての症例において示されるわけではない。
【０４８４】
ＣＮＳ＿神経変性＿Ｖ１．０パネル中の組織を同定するために使用した標識には、以下の略号を使用する：
ＡＤ＝アルツハイマー病の脳；患者は、痴呆症であり、そして検死でＡＤ様の病理症状を示した
Ｃｏｎｔｒｏｌ＝コントロールの脳；患者は、痴呆症でなく、神経病理症状を示さない
Ｃｏｎｔｒｏｌ（Ｐａｔｈ）＝コントロールの脳；患者は、痴呆症ではないが、重症のＡＤ様の病理症状を示す
Ｓｕｐ  Ｔｅｍｐｏｒａｌ  Ｃｔｘ＝上側頭皮質
Ｉｎｆ  Ｔｅｍｐｏｒａｌ  Ｃｔｘ＝下側頭皮質。
【０４８５】
（ＮＯＶ１：カルパイン様）
ＮＯＶ１遺伝子（３３５２２７４とも呼ばれる）の発現を、表１２で記載されたプライマー−プローブセットＡｇ２００３を使用して評価した。ＲＴＱ−ＰＣＲ実行からの結果を、表１３および１４に示す。
【０４８６】
【表１２】
2004532613.tif 000114
【０４８７】
【表１３】
2004532613.tif 000115
2004532613.tif 000116
【０４８８】
【表１４】
2004532613.tif 000117
2004532613.tif 000118
（パネル１．３Ｄの概要）
ＮＯＶ１遺伝子の発現は、肝臓に特異的であるようであり、正常肝臓組織で最も高い発現であり（ＣＴ＝３２．１）、胎児肝臓細胞株および肝臓癌細胞株において同様に有意に発現した。ＮＯＶ１遺伝子の発現は、肝臓に関連しているようなので、ＮＯＶ１遺伝子を、肝臓由来の組織と他の組織とを区別するために潜在的に用い得た。さらに、ＮＯＶ１遺伝子の治療的調節は、肝硬変のような、肝臓に関する障害の処置に有益であり得る。
【０４８９】
（パネル４Ｄの概要）
このパネルにおいて、ＮＯＶ１の発現は、わずかなサンプルに制限され、肝硬変で、最も高い発現が検出された（ＣＴ＝３３．２）。この結果は、パネル１．３Ｄで観察された肝臓特異的発現と一致する。胸腺ならびにＴＮＦ−αおよびＩＬ−１βで処理した気管支上皮においても、低いレベルだが有意なレベルで遺伝子の発現が検出される。ＮＯＶ１遺伝子によりコードされるタンパク質は、カルシウム活性化中性プロテアーゼ（カルパイン）に対する相同性を有する。カルパインは、気管および肺で同定され、そして組織破壊に関与し得る。ＮＯＶ１遺伝子によりコードされるタンパク質を用いて設計された治療薬は、喘息、肺気腫、および肝硬変の処置に重要であり得る（Ｄｅａｒら、Ａ  ｎｅｗ  ｓｕｂｆａｍｉｌｙ  ｏｆ  ｖｅｒｔｅｂｒａｔｅ  ｃａｌｐａｉｎｓ  ｌａｃｋｉｎｇ  ａ  ｃａｌｍｏｄｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ  ｄｏｍａｉｎ：ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｃａｌｐａｉｎ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ．Ｇｅｎｏｍｉｃｓ．４５：１７５−８４，１９９７）。
【０４９０】
（ＮＯＶ２：エプシン様）
ＮＯＶ２遺伝子（２１４２１１７４とも呼ばれる）の発現を、表ＢＡで記載されたプライマー−プローブセットＡｇ３０８８を使用して評価した。ＲＴＱ−ＰＣＲ実行からの結果を、表１５、１６、１７，１８および１９に示す。
【０４９１】
【表１５】
2004532613.tif 000119
【０４９２】
【表１６】
2004532613.tif 000120
2004532613.tif 000121
【０４９３】
【表１７】
2004532613.tif 000122
2004532613.tif 000123
【０４９４】
【表１８】
2004532613.tif 000124
2004532613.tif 000125
2004532613.tif 000126
【０４９５】
【表１９】
2004532613.tif 000127
（パネル１．３Ｄの概要）
ＮＯＶ２遺伝子は、このパネル中のサンプルの多くにおいて広く発現され、脳腫瘍細胞株で、最も高い発現である（ＣＴ＝２６）。ＮＯＶ２遺伝子はまた、中枢神経系（扁桃体、小脳、海馬、黒質、視床、大脳皮質および脊髄を含む）由来のすべての正常組織において高度に発現される。ＮＯＶ２遺伝子によりコードされるタンパク質は、エプシンのホモログであり、これは、巨大分子のファゴサイトーシスに関与し、Ｈｕｎｔｉｎｇｔｏｎ相互作用タンパク質と相互作用する。ゆえに、この遺伝子は、Ｈｕｎｔｉｎｇｔｏｎタンパク質のエンドサイトーシスおよびハンチントン病の病因において重要な役割を果たし得る。この遺伝子またはそのタンパク質の産物の下方制御は、ハンチントン病の処置において治療的な利点があり得る。
【０４９６】
このＮＯＶ２遺伝子はまた、成人および胎児の両方の供給源由来の脂肪、膵臓、副腎、甲状腺、下垂体、骨格筋、ならびに心臓および肝臓を含む代謝機能を有する多くの組織において発現される。従って、この遺伝子産物は、肥満および糖尿病を含む、これらの組織のいずれかまたは全てにおける病因および／または疾患の処置において重要であり得る。
【０４９７】
ＮＯＶ２遺伝子は、正常な腎臓、乳房、卵巣および前立腺組織と比較した場合、腎癌、乳癌、脳腫瘍、卵巣癌、肺癌、結腸癌、腎臓癌、膵臓癌および前立腺癌細胞株で高度に発現され、従って、これらの癌において役割を果たし得る。この遺伝子はまた、１つの細胞株が他のメラノーマ細胞株と比較して高いレベルにおいてこの遺伝子を発現する場合、メラノーマの転移において役割を果たし得る。この発現プロフィールに基づいて、ＮＯＶ２遺伝子の発現は、これらの癌の異なる段階／型についてのマーカーとして使用され得る。さらに、この遺伝子は、多種の胎児組織および癌細胞株に発現される。
【０４９８】
（パネル２．２の概要）
ＮＯＶ２遺伝子の高度な発現が、肝臓腫瘍に隣接する肝臓組織において検出される（ＣＴ＝２７．３）。さらに、いくつかの肺癌、乳癌、肝臓癌および腎臓癌サンプルにおける発現のレベルは、マッチした正常組織と比較した場合、増加しているようである。逆のことは結腸、卵巣および胃組織に当てはまり、これらの発現は、マッチした癌組織より正常組織において若干高い。このように、これらのプロフィールに基づいて、ＮＯＶ２遺伝子の発現は、正常隣接組織からある癌を識別するためのマーカーとしての使用、または異なる段階／型の癌に対するマーカーとして使用され得る。
【０４９９】
（パネル４Ｄの概要）
ＮＯＶ２遺伝子は、結腸で最も高度に発現する（ＣＴ＝２２）。有意な発現はまた、種々の組織（繊維芽細胞、内皮細胞、上皮細胞、ケラチノサイト、白血球および平滑筋細胞）でも検出される。このＮＯＶ２遺伝子によってコードされるタンパク質は、ＥＨ−ドメイン結合様タンパク質、エプシンのホモログであり、このタンパク質は、エンドサイトーシスに関与すると考えられる。エピシンファミリーのメンバーは、創傷治癒において重要な役割を果たすことが示された。ＮＯＶ２遺伝子はいくつかの細胞型において発現されるので、この遺伝子によりコードされるタンパク質を用いて設計された治療剤は、一般的に生体治療分子の細胞取り込みの調節、および特に創傷治癒の促進に重要な役割を果たし得る。
【０５００】
（パネルＣＮＳ＿神経変性＿ｖ１．０の要約）
ＮＯＶ２遺伝子の最高の発現が、アルツハイマー病患者の海馬で検出される（ＣＴ＝２５．６）。しかし、このパネルでのすべてのサンプルにおいてもまた、広範な発現があり、この遺伝子の発現とアルツハイマー病の存在との間の特定の関係はこれらの結果から観察されない。しかし、これらの結果は、さらなる個体のセットの脳におけるＮＯＶ２遺伝子の発現を確認する。中枢神経系におけるこの遺伝子の潜在的な有用性の議論についてはパネル１．３Ｄを参照のこと（Ｒｏｓｅｎｔｈａｌら、Ｔｈｅ  ｅｐｓｉｎｓ  ｄｅｆｉｎｅ  ａ  ｆａｍｉｌｙ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｔｈａｔ  ｉｎｔｅｒａｃｔ  ｗｉｔｈ  ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃｌａｔｈｒｉｎ  ｃｏａｔ  ａｎｄ  ｃｏｎｔａｉｎ  ａ  ｎｅｗ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｍｏｄｕｌｅ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２７４：３３９５９−６５，１９９９；Ｍｉｓｈｒａら、Ｃｌａｔｈｒｉｎ−  ａｎｄ  ＡＰ−２−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｓｉｔｅｓ  ｉｎ  ＨＩＰ１  ｕｎｃｏｖｅｒ  ａ  ｇｅｎｅｒａｌ  ａｓｓｅｍｂｌｙ  ｒｏｌｅ  ｆｏｒ  ｅｎｄｏｃｙｔｉｃ  ａｃｃｅｓｓｏｒｙ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，２００１；Ｓｐｒａｄｌｉｎｇら、Ｅｐｓｉｎ  ３  ｉｓ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｍａｔｒｉｘ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｔｏ  ｗｏｕｎｄｅｄ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａ．Ｊ  Ｂｉｏ  Ｃｈｅｍ．２７６：２９２５７−６７，２００１）。
【０５０１】
（ＮＯＶ３：低密度リポプロテインＢ様）
ＮＯＶ３遺伝子（ＡＣ０２５２６３＿ｄａｌとも呼ばれる）の発現を、表２０および２１で記載されたプライマー−プローブのセットＡｇ２００２およびＡｇ２４５２を使用して評価した。ＲＴＱ−ＰＣＲ実行からの結果を、表２２、２３、２４および２５に示す。
【０５０２】
【表２０】
2004532613.tif 000128
【０５０３】
【表２１】
2004532613.tif 000129
【０５０４】
【表２２】
2004532613.tif 000130
2004532613.tif 000131
2004532613.tif 000132
【０５０５】
【表２３】
2004532613.tif 000133
2004532613.tif 000134
【０５０６】
【表２４】
2004532613.tif 000135
2004532613.tif 000136
2004532613.tif 000137
【０５０７】
【表２５】
2004532613.tif 000138
。
【０５０８】
（パネル１．３Ｄの概要）
Ａｇ２００２／Ａｇ２４５２  ２つの異なるプローブ／プライマーセットを用いた２つの実験は、非常によく一致した結果を生じ、両方の実行において最大の発現は、脳の領域で生じる。ＮＯＶ３遺伝子の発現は、１回の実行では大脳皮質（ＣＴ＝２６）において最大であり、そして他方では海馬（ＣＴ＝２７）において最大であり、顕著な発現が扁桃においても検出される。この発現パターンは、アルツハイマー病（ＡＤ）におけるＮＯＶ３遺伝子産物の機能的役割を示す。なぜなら、この遺伝子（低密度リポタンパク質ホモログ）は、ＡＤ病理学に対して重要な脳領域において発現される。アルツハイマー病の血清におけるアポリポタンパク質Ｂの発現の増大、およびＬＲＰがアルツハイマー病の病因に寄与するという証拠は、ＮＯＶ３遺伝子によってコードされるタンパク質についての病理学的役割を示唆する。それゆえ、ＡＣ０２４２６３ Ａ遺伝子産物は、アルツハイマー病の処置のための有望な抗体または低分子標的であり得る。
【０５０９】
高レベルの発現はまた、脳の癌、乳癌、肺癌、腎臓癌および黒色腫に由来する細胞株において検出される。さらに、正常卵巣における発現は、卵巣癌組織に由来する細胞株においてよりもさらに高いようである。従って、この遺伝子の発現は、これらの癌についてのマーカーまたは治療剤として、有用であり得る。
【０５１０】
ＮＯＶ３遺伝子は、代謝機能を有する組織において広範に発現され、そして胎児骨格筋（ＣＴ＝２７−３０）において、成体骨格筋（ＣＴ＝３０−３３）においてよりも高いレベルで顕著に発現される。発現のこの相違は、ＮＯＶ３タンパク質産物が、胎児における筋肉の増殖または発達に関与し得、それゆえ、成体における再生能力に作用し得ることを示唆する。従って、ＮＯＶ３遺伝子の治療調整は、筋肉関連疾患の処置において有用であり得、そしてこのタンパク質産物を用いた処置は、弱い筋肉またはジストロフィーの筋肉に対して筋肉量または機能を回復し得る。
【０５１１】
（パネル２Ｄの概要）
Ａｇ２４５２  ＮＯＶ３遺伝子の最大の発現は、結腸（ＣＴ＝２９．７）において生じる。高レベルの発現はまた、正常な隣接組織と比較した場合、乳癌、前立腺癌、卵巣癌および結腸癌において検出可能である。従って、ＮＯＶ３遺伝子の発現は、これらの癌の存在を検出するためのマーカーとして使用され得る。
（パネル４Ｄの概要）
Ａｇ２００２／Ａｇ２４５２  ２つの異なるプローブおよびプライマーセットを用いた２つの実験は、正常結腸（ＣＴ＝２６．２）およびＴＮＦ−αで処理した皮膚の線維芽細胞（ＣＴ＝２９．２）におけるＮＯＶ３遺伝子の最大の発現を示す。顕著な発現はまた、線維芽細胞、内皮細胞および上皮細胞、ケラチノサイト、白血球、平滑筋細胞および正常腎臓において見られる。ＮＯＶ３遺伝子は、正常結腸における発現と比較した場合、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）を有する患者由来の結腸においてずっと低いレベルで発現される。同様に、ループス腎臓における発現は、正常腎臓よりもずっと低い。従って、ＮＯＶ３遺伝子によってコードされるタンパク質は、正常組織／細胞機能に関与し得、そして少なくとも腎臓および結腸において、このタンパク質のダウンレギュレーションは、ループスまたはＩＢＤについての診断マーカーとして役立ち得る。
【０５１２】
（パネルＣＮＳ ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｖ１．０の概要）
Ａｇ２４５２  ＮＯＶ３遺伝子は、このパネルにおけるサンプルの大部分において発現され、最大の発現は、コントロール患者（ＣＴ＝２９．４）の側頭皮質において検出される。明らかな疾患関連は、低密度リポタンパク質に対するその相同性およびパネル１．３Ｄにおけるその発現プロフィールに基づけば、この神経変性パネルにおいて遺伝子発現について出現しないが、ＮＯＶ３遺伝子産物は、アルツハイマー病の処置についての有望な抗体または低分子標的のままである（Ｃａｒａｍｅｌｌｉら，Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ｂ  ｓｅｒｕｍ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ．Ａｃｔａ  Ｎｅｕｒｏｌ  Ｓｃａｎｄ．１００：６１−３，１９９９およびＵｌｅｒｙら，Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂｅｔａ−ａｍｙｌｏｉｄ  ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  ｂｙ  ｔｈｅ  ｌｏｗ  ｄｅｎｓｉｔｙ  ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  ｒｅｓｅｐｔｏｒ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ（ＬＲＰ）．Ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｔｈａｔ  ＬＲＰ  ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｅｓ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｏｆ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７５（１０）：７４１０−５，２０００）。
【０５１３】
（ＮＯＶ４：プリンレセプター様（Ｐｕｒｉｎｏｃｅｐｔｏｒ−ｌｉｋｅ））
ＮＯＶ４遺伝子（ＡＣ０２６７５６＿ｄａ１とも呼ばれる）の発現を、表２６および表２７に記載されるプライマー−プローブセットＡｇ１９０５およびＡｇ２５０４を用いて評価した。ＲＴＱ−ＰＣＲの実行からの結果を、表２８、表２９および表３０に示す。
【０５１４】
【表２６】
2004532613.tif 000139
【０５１５】
【表２７】
2004532613.tif 000140
【０５１６】
【表２８】
2004532613.tif 000141
2004532613.tif 000142
2004532613.tif 000143
【０５１７】
【表２９】
2004532613.tif 000144
2004532613.tif 000145
2004532613.tif 000146
【０５１８】
【表３０】
2004532613.tif 000147
2004532613.tif 000148
（パネル１．３Ｄの概要）
Ａｇ１９０５  同じプローブおよびプライマーセットを用いた２つの実験は、肺癌細胞株ＳＨＰ−７７（ＣＴ＝３０）および気管（ＣＴ＝３０−３１）における最大の発現と良く一致する結果を生じる。結腸および卵巣に由来する細胞株におけるＮＯＶ４遺伝子の顕著な発現もまた存在する。この遺伝子は、種々の型の肺、卵巣および結腸癌における役割を果たし得る。なぜなら、この遺伝子は、これらの癌に由来する細胞株において、正常組織と比較して、より高度に発現されるからである。さらに、正常な脳および膵臓における発現は、これらの組織に由来する癌細胞株よりも高いようである。従って、ＮＯＶ４遺伝子の発現は、結腸癌、卵巣癌、脳の癌、肺癌および膵臓癌についてのマーカーまたは治療剤として用いられ得る。さらに、ペプチド、キメラ分子または低分子薬物の使用を通したこの遺伝子の産物の治療調整は、これらの癌の治療において有用であり得る。
【０５１９】
中枢神経系に関与する組織（扁桃、海馬、視床、大脳皮質および脊髄を含む）におけるＮＯＶ４遺伝子の顕著な発現もまた存在する。
【０５２０】
ＧＤＮＦ感受性知覚ニューロンにおいて見出されたプリンレセプターは、侵害受容器機能を媒介する。ＮＯＶ４遺伝子産物はプリンレセプターのホモログであるので、このレセプターの作用をブロックする因子は、鎮痛剤として作用するかまたは慢性の疼痛の樹立を阻害するかのいずれかによって、疼痛を処置する際に有用性を有し得る。さらに、アデノシンは、脳の領域（例えば、海馬、皮質、脳幹神経節および視床）において顕著な神経調節の役割を果たすので、ＮＯＶ４プリンレセプターホモログは、脳のこれらの領域におけるアデノシンの作用に関与する位置に局在する。ＮＯＶ４遺伝子によってコードされるタンパク質は、Ｐ２Ｙ４プリンレセプターおよびＰ２Ｙ６プリンレセプターに最も相同であり、このことは、この機能が、これらのレセプターによって誘導されるＰＬＣ媒介Ｃａ２＋動員に類似し得ることを示唆する。Ｃａ２＋動員は、神経伝達物質の放出をもたらす分子プロセスの重要な構成要素である。アデノシンは、脳におけるグルタメートの放出を調整する。グルタメートは、主な興奮性アミノ酸神経伝達物質である。グルタメートは、多数の病理学的状態（卒中を含む）において興奮毒性ニューロン損傷およびニューロン死を発揮する。Ａ１アデノシンレセプターのアゴニストは、グルタメート放出のＧタンパク質共役阻害を介してこの損傷を低減する。Ａ２レセプターのアンタゴニストはまた、グルタメート誘導性興奮毒性を低減する。それゆえ、ＮＯＶ４遺伝子によってコードされるタンパク質を阻害または刺激する因子は、脳におけるグルタメート放出およびこれらの領域におけるその後のグルタメートの作用に影響を与えるようである。ＮＯＶ４遺伝子産物が、グルタメート放出に関してＡ１レセプターと同様に機能するならば、推定レセプターのアゴニストは、卒中の処置において有用性を有するようである。ＮＯＶ４遺伝子産物が、Ａ２レセプターと同様に機能するならば、推定レセプターのアンタゴニストは、卒中の処置において有用性を有するようである。さらに、Ａ２ａプリンレセプターのアンタゴニストは、抗鬱剤である。それゆえ、ＮＯＶ４遺伝子産物のアンタゴニストは、有用な抗鬱剤であり得る。Ａ２ａレセプターアンタゴニストはまた、マウスにおけるパーキンソン症候群様の症状に対向し、このことは、ＮＯＶ４遺伝子産物アンタゴニストもまた、パーキンソン病の処置において有用性を有し得ることを示唆する。
【０５２１】
Ａｇ２５０４  ＮＯＶ４遺伝子の発現は、パネル１．３Ｄの全てのサンプルにおいて低い／検出不可能（Ｃｔ値＞３５）である（データを示さず）。
【０５２２】
（パネル２．２の概要）
Ａｇ２５０４  ＮＯＶ４遺伝子の発現は、パネル２．２の全てのサンプルにおいて低い／検出不可能（Ｃｔ値＞３５）である（データを示さず）。
【０５２３】
（パネル２Ｄの概要）
Ａｇ１９０５  ＮＯＶ４遺伝子の最大発現は、結腸癌（ＣＴ＝３０．４）において検出される。さらに、この遺伝子の発現は、このパネルに存在する６つ全ての一致した組織対において正常な隣接組織と比較した場合、結腸癌において過剰発現されるようである。従って、ＡＣ０２５７５６ ｄａ１遺伝子の発現を用いて、結腸癌と正常組織との間を区別し得る。さらに、ＮＯＶ４遺伝子産物の機能または活性の治療調整は、結腸癌の処置において有効であり得る。ＮＯＶ４遺伝子はまた、腎臓において逆の関連を示し、この遺伝子の過剰発現は、対応する癌性組織と比較した場合、正常腎臓において存在する。従って、この遺伝子の発現をまた用いて、正常腎臓組織と癌性腎臓組織との間を区別し得、そしてこの遺伝子産物の治療調整は、腎臓癌の処置において有効であり得る。
【０５２４】
（パネル４Ｄの概要）
Ａｇｌ９０５  ＮＯＶ４遺伝子の発現は、胸腺（ＣＴ＝３１．９）に制限される。この遺伝子によってコードされる推定のＧＰＣＲは、Ｔ細胞の発達において重要であり得る。なぜなら、プリノレセプター（ｐｕｒｉｎｏｒｅｃｅｐｔｏｒ）は、胸腺細胞において実証されているからである。ＮＯＶ４遺伝子によってコードされるタンパク質を用いて設計された免疫調節性の治療薬物は、胸腺におけるＴ細胞産生を調節し得、そして組織拒絶を予防する際、自己免疫障害を処置する際、およびウイルス疾患（例えば、ＡＩＤＳ）を処置する際に重要であり得る。さらに、この転写産物またはこの転写産物によってコードされるタンパク質に対して設計された抗体は、特定の発生段階の胸腺細胞のサブセットを同定するための診断マーカーとして用いられ得る。
【０５２５】
Ａｇ２５０４  ＮＯＶ４遺伝子の発現は、パネル４Ｄの全てのサンプルにおいて低い／検出不可能である（Ｃｔ値＞３４．５）（データは示さず）。
【０５２６】
パネルＣＮＳ ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｖ１．０  概要  Ａｇ２５０４  ＮＯＶ４遺伝子の発現は、パネルＣＮＳ ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｖ１．０の全てのサンプルにおいて低い／検出不可能である（Ｃｔ値＞３５）（データは示さず）。
【０５２７】
【数２】
2004532613.tif 000149
（ＮＯＶ５：ＣＧ８８４１様）
ＮＯＶ５遺伝子（ＡＣ０２６７５６ ｄａ１とも呼ばれる）の発現を、表３１に記載されるプライマー−プローブセットＡｇ２０００を用いて評価した。ＲＴＱ−ＰＣＲの実行からの結果を、表３２、３３および３４に示す。
【０５２８】
【表３１】
2004532613.tif 000150
【０５２９】
【表３２】
2004532613.tif 000151
2004532613.tif 000152
【０５３０】
【表３３】
2004532613.tif 000153
2004532613.tif 000154
2004532613.tif 000155
【０５３１】
【表３４】
2004532613.tif 000156
2004532613.tif 000157
2004532613.tif 000158
（パネル１．３Ｄの概要）
ＮＯＶ５遺伝子（膜貫通多回貫通タンパク質（ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ  ｍｕｌｔｉ−ｐａｓｓ  ｐｒｏｔｅｉｎ）のホモログ）の最大の発現は大脳皮質（ＣＴ＝２６．８）において見られ、中程度の発現が、脳の全ての領域にまたがって検出可能である。この遺伝子は、脳の癌における大きなダウンレギュレーションを示すので、この遺伝子が存在しないことは、死後組織を調べて分類する際に脳組織が前癌性であったか否かを決定するための優れたマーカーである。
【０５３２】
ＮＯＶ５遺伝子の発現はまた、代謝関連性を有する組織（脂肪組織、膵臓、成体および胎児の心臓、成体および胎児の肝臓、成体および胎児の骨格筋、ならびに副腎、下垂体および甲状腺を含む）において広範にみられる。ＮＯＶ５遺伝子は、胎児の心臓および骨格筋（ＣＴ＝２８）において、成体の心臓および骨格筋（ＣＴ＝３１−３４）においてよりもずっと高いレベルで発現される。この示差的発現パターンは、ＮＯＶ５遺伝子発現を用いて、心臓および骨格筋についての２つの組織供給源の間を区別し得ることを示唆する。さらに、胎児の骨格筋におけるこの遺伝子の顕著により高いレベルの発現は、ＮＯＶ５遺伝子産物が、胎児における筋肉の増殖または発達に関与し得、そして成体における再生能力に潜在的に作用し得ることを示唆する。それゆえ、ＮＯＶ５遺伝子の治療調整は、筋肉関連疾患の処置および弱いかまたはジストロフィーの筋肉の処置において有用であり得る。
【０５３３】
ＮＯＶ５遺伝子はまた、卵巣癌、乳癌、肺癌、胃癌、前立腺癌および結腸癌に由来する細胞株において、正常組織と比較して有意なレベルで発現される。従って、この遺伝子の発現は、卵巣、乳房、肺、胃、前立腺および結腸についてのマーカーまたは治療剤として有用であり得る。さらに、ペプチド、キメラ分子または低分子薬物の使用を介した、この遺伝子の産物の治療調整は、これらの癌の処置において有用であり得る。
【０５３４】
（パネル２．２の概要）
ＮＯＶ５遺伝子の最大の発現は、パネル１．３Ｄにおいて見られるのと同様に、乳癌（ＣＴ＝２８）において見られる。さらに、対応する正常組織と比較した場合、ＮＯＶ５遺伝子の顕著な過剰発現が、乳癌サンプル、肺癌サンプルおよび卵巣癌サンプルのクラスターに存在する。従って、ＮＯＶ５遺伝子の発現を用いて、乳癌、卵巣癌および肺癌を正常組織から区別し得、そしてＮＯＶ５遺伝子の発現をこれらの癌の存在についてのマーカーとして用い得る。さらに、ＮＯＶ５遺伝子のタンパク質産物の治療調整は、乳癌、卵巣癌および肺癌の処置において有益であり得る。この遺伝子の発現はまた、一致した胃癌組織と比較した場合、いくつかの正常な胃サンプルとの逆の関連を示す。このことは、ＮＯＶ５遺伝子を用いて正常な胃組織と癌性の胃組織との間を区別し得ること、および遺伝子産物の治療調整は、胃癌の処置において有用であり得ることを示唆する。
【０５３５】
（パネル４Ｄの概要）
ＮＯＶ５遺伝子の最大の発現は、結腸（ＣＴ＝２６．２）において見出され、中程度の発現は、粘膜性類表皮細胞株Ｈ２９２および肺において検出可能である。これはまた、それらの活性化状態にかかわらず、ＨＵＶＥＣおよび肺の微小血管において中程度のレベルで発現される。ＮＯＶ５遺伝子によってコードされるタンパク質は、上皮増殖因子関連タンパク質（フィブロペリン（ｆｉｂｒｏｐｅｌｌｉｎ）様）に相同であり、そして肺粘膜性類表皮細胞、結腸または血管系のマーカーとして用いられ得る。この転写産物によってコードされる推定タンパク質はまた、これらの組織の正常なホメオスタシスにおいて重要な役割を果たし得る。ＮＯＶ５遺伝子産物を用いて設計された低分子または抗体治療剤は、喘息および気腫に関連した炎症の間に正常な機能をこれらの器官に維持または回復するために重要であり得る。
【０５３６】
（ＮＯＶ６：シナプトタグミン様）
ＮＯＶ６遺伝子（ＳＣ１３４９１２６４２ ｄａ１とも呼ばれる）の発現を、表３５に記載されるプライマー−プローブセットＡｇ２０５６を用いて評価した。ＲＴＱ−ＰＣＲの実行からの結果を、表３６、表３７、表３８、表３９および表４０に示す。
【０５３７】
【表３５】
2004532613.tif 000159
【０５３８】
【表３６】
2004532613.tif 000160
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【０５３９】
【表３７】
2004532613.tif 000162
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【０５４０】
【表３８】
2004532613.tif 000164
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【０５４１】
【表３９】
2004532613.tif 000167
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【０５４２】
【表４０】
2004532613.tif 000169
2004532613.tif 000170
（パネル１．３Ｄの概要）
ＮＯＶ６遺伝子は、シナプトタグミンのホモログであり、そして脳のすべての領域にわたって中程度〜高程度の発現を示し、大脳皮質において最高の発現である（ＣＴ＝２７．６）。シナプトタグミンは、シナプス小胞の放出に関与するシナプス前性タンパク質である。このことは、ＮＯＶ６を、神経伝達の減少が有益である癲癇のような疾患についての理想的な薬物標的にする。従って、この遺伝子またはそのタンパク質産物の選択的阻害は、痙攣障害の処置において有用であり得る。さらに、ＮＯＶ６遺伝子によってコードされるタンパク質の拮抗作用を通して神経伝達を選択的に阻害することは、不適切な神経連絡が確立されていると考えられる精神医学的疾患（例えば、精神分裂病および双極性障害）において、治療上の利益を示し得る。さらに、シナプトタグミンに対する抗体は、ランバート−イートン筋無力症症候群を引き起こし得る。従って、ＮＯＶ６遺伝子によってコードされるタンパク質のペプチドフラグメントは、これらの抗体の作用をブロックするため、およびランバート−イートン筋無力症症候群を処置するために役立ち得る。
【０５４３】
ＮＯＶ６遺伝子はまた、脂肪、成体および胎児の心臓、成体および胎児の肝臓、膵臓、ならびに副腎、下垂体および甲状腺を含む多くの代謝組織において、少ないが有意な発現を示す。この遺伝子産物は、成体の骨格筋（ＣＴ値＝３７）と比較した場合に、胎児の骨格筋（ＣＴ値＝３１）においてはるかにより高いレベルで発現されるようであり、そしてこの組織における胎児の表現型からの成体の分化に有用であり得る。
【０５４４】
ＮＯＶ６遺伝子は、正常な組織と比較して、肺癌、胃癌、結腸癌および卵巣癌に由来する細胞株のクラスターにおいて顕著に発現される。この遺伝子の発現はまた、脳組織および前立腺組織の癌に由来する細胞株と比較した場合に、いくつかの正常な脳および前立腺のサンプルとの関連を示す。従って、そのプロフィールに基づいて、この遺伝子の発現は、肺癌、胃癌、結腸癌および卵巣癌についてのマーカーまたは治療剤として有用であり得る。さらに、ペプチド、抗体、化学分子または低分子薬物の使用を通した、この遺伝子産物の治療的調整は、これらの癌の処置において有用であり得る。
【０５４５】
（パネル２．２の概要）
ＮＯＶ６遺伝子の発現は、胸部癌転移（ＣＴ＝２７．８）において最高であり、そして正常な隣接組織と比較した場合に、胸部癌に由来するサンプルにおいて高度に発現されるようである。この遺伝子の発現はまた、対応する腎臓癌組織、前立腺癌組織および肺癌組織と比較した場合に、いくつかの正常な腎臓、前立腺および肺のサンプルとの関連を示す。従って、そのプロフィールに基づいて、この遺伝子の発現の非存在／存在は、胸部癌、腎臓癌、前立腺癌および肺癌についてのマーカーとして有用であり得る。ペプチド、抗体、化学分子または低分子薬物の使用を通した、この遺伝子産物の治療的調整は、肺癌、腎臓癌、前立腺癌および胸部癌の治療において有用であり得る。
【０５４６】
（パネル４Ｄの概要）
同じプローブおよびプライマーのセットでの２つの実験からの結果は、ＮＯＶ６遺伝子が、肺に関連した組織において、中程度のレベルで選択的に発現されることを示している。この遺伝子の発現は、正常なヒト肺線維芽細胞において見出され、そしてこれらの細胞において、ＩＦＮｇ、ＩＬ４、ＩＬ１３およびＩＬ−９での処理後にアップレギュレートされ、ＩＦＮｇ処理細胞において最高の発現である（ＣＴ＝３０）。ＮＯＶ６遺伝子によってコードされるタンパク質はまた、ＴＮＦ−ａおよびＩＬ−１ｂで処理された末梢気道（ｓｍａｌｌ  ａｉｒｗａｙ）上皮においてアップレギュレートされ、そしてＩＬ−１３およびＩＦＮｇでの処理に際して、粘膜性類表皮細胞株Ｈ２９２においてダウンレギュレートされる。ＮＯＶ６遺伝子は、シナプトタグミンのホモログであり、この偏在的に発現されるアイソフォームであるシナプトタグミンＶＩＩは、リソソームのエキソサイトーシスを調節する。シナプトタグミンＶＩＩは近年、形質膜の修復を担うＣａ（２＋）調節性エキソサイトーシス画分として作用するリソソームと共に、線維芽細胞形質膜の修復に関連付けられた。従って、抗体または低分子薬物の使用を通した、この遺伝子または遺伝子産物の発現または機能の治療的調整は、ぜん息、気腫、ならびに、炎症性サイトカインの局所的産生に起因した細胞ストレスと関連付けられるウイルスおよび細菌の肺感染のような肺疾患を処置するために有益であり得る。
【０５４７】
（パネルＣＮＳ＿１の概要）
ＮＯＶ６遺伝子の最高の発現は、パーキンソン病を有する患者の脳において見られる（ＣＴ＝２９．６）。中枢神経系における潜在的有用性の考察については、パネル１．３Ｄを参照されたい。
【０５４８】
（パネルＣＮＳ＿ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ（神経変性）＿ｖ１．０の概要）
ＮＯＶ６遺伝子の発現は、このパネルのサンプル全体を通して偏在的であり、アルツハイマー病を有する患者の海馬において最高の発現である（ＣＴ＝２５．８）。このパネルにおいて、この遺伝子の発現とアルツハイマー病の存在との間での関連は検出されなかったが、これらの結果は、アルツハイマー病において変性する領域（皮質、海馬、扁桃および視床を含む）におけるこの遺伝子の発現を確証付ける。シナプトタグミンの発現は、アルツハイマー病の患者の脳において改変され、このことはおそらく、シナプス形成の障害および／または神経変性障害において観察されるニューロンの欠損に対して二次的に起こるシナプトソームの欠損を説明する。このことはまた、エキソサイトーシス機構の衰退によって引き起こされる、アルツハイマー病（ＡＤ）における神経伝達の障害を表し得るか、反映し得るか、または説明し得る。ＮＯＶ６遺伝子は、シナプトタグミンのホモログであるので、ＮＯＶ６遺伝子によってコードされるタンパク質の発現または機能を増強する薬剤は、アルツハイマー病の処置において有用であり得る。（Ｒｅｄｄｙら，Ｐｌａｓｍａ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｒｅｐａｉｒ  ｉｓ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｂｙ  Ｃａ（２＋）−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｅｘｏｃｙｔｏｓｉｓ  ｏｆ  ｌｙｓｏｓｏｍｅｓ．Ｃｅｌｌ  １０６：１５７−６９，２００１；Ｔａｋａｍｏｒｉら，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｔｏ  ｃａｌｃｉｕｍ  ｃｈａｎｎｅｌ  ａｎｄ  ｓｙｎａｐｔｏｔａｇｍｉｎ  ｉｎ  Ｌａｍｂｅｒｔ−Ｅａｔｏｎ  ｍｙａｓｔｈｅｎｉｃ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ．Ａｍ  Ｊ  Ｍｅｄ  Ｓｃｉ．３１９：２０４−８，２０００；Ｓｚｅら，Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｒｅｇｉｏｎａｌ  ｌｏｓｓ  ｏｆ  ｅｘｏｃｙｔｏｔｉｃ  ｐｒｅｓｙｎａｐｔｉｃ  ｖｅｓｉｃｌｅ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｂｒａｉｎｓ．Ｊ  Ｎｅｕｒｏｌ  Ｓｃｉ．１７５：８１−９０，２０００；Ｓｏｋｏｌｏｖら，Ｌｅｖｅｌｓ  ｏｆ  ｍＲＮＡｓ  ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ｓｙｎａｐｔｉｃ  ｖｅｓｉｃｌｅ  ａｎｄ  ｓｙｎａｐｔｉｃ  ｐｌａｓｍａ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｔｅｍｐｏｒａｌ  ｃｏｒｔｅｘ  ｏｆ  ｅｌｄｅｒｌｙ  ｓｃｈｉｚｏｐｈｒｅｎｉｃ  ｐａｔｉｅｎｔｓ．Ｂｉｏｌ  Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ．４８：１８４−９６，２０００；Ｍａｓｌｉａｈら，Ａｌｔｅｒｅｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｓｙｎａｐｔｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｃｃｕｒｓ  ｅａｒｌｙ  ｄｕｒｉｎｇ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ．Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ  ５６：１２７−９，２００１；Ｙｏｏら，Ｓｙｎａｐｔｏｓｏｍａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ，ｂｅｔａ−ｓｏｌｕｂｌｅ  Ｎ−ｅｔｈｙｌｍａｌｅｉｍｉｄｅ−ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｆａｃｔｏｒ  ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ（ｂｅｔａ−ＳＮＡＰ），ｇａｍｍａ−ＳＮＡＰ  ａｎｄ  ｓｙｎａｐｔｏｔａｇｍｉｎ  Ｉ  ｉｎ  ｂｒａｉｎ  ｏｆ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｄｏｗｎ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ  ａｎｄ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ．Ｄｅｍｅｎｔ  Ｇｅｒｉａｔｒ  Ｃｏｇｎ  Ｄｉｓｏｒｄ．１２：２１９−２５，２００１）。
【０５４９】
（ＮＯＶ８：グリピカン（Ｇｌｙｐｉｃａｎ）２前駆体様）
ＮＯＶ８ａ遺伝子（１３４９１３４４１＿ＥＸＴ）、ならびに改変体ＮＯＶ８ｂ（ＣＧ５０９７０−０２）およびＮＯＶ８ｃ（ＣＧ５０９７０−０３）の発現を、表４１および４２に記載されるプライマー−プローブセットＡｇ１３０９およびＡｇ２２５１を使用して評価した。ＲＴＱ−ＰＣＲ実行からの結果を、表４３、４４、４５および４６に示す。
【０５５０】
【表４１】
2004532613.tif 000171
【０５５１】
【表４２】
2004532613.tif 000172
【０５５２】
【表４３】
2004532613.tif 000173
2004532613.tif 000174
【０５５３】
【表４４】
2004532613.tif 000175
2004532613.tif 000176
【０５５４】
【表４５】
2004532613.tif 000177
2004532613.tif 000178
2004532613.tif 000179
【０５５５】
【表４６】
2004532613.tif 000180
（パネル１．３Ｄの概要）
（Ａｇ２２５１）  ＮＯＶ８遺伝子の最高レベルの発現は、ＣＮＳ癌細胞株ＳＫ−Ｎ−ＡＳにおいて見られる（ＣＴ＝２９．６）。この遺伝子はまた、正常組織と比較して、肺癌、前立腺癌および胸部癌由来の細胞株においてより高いレベルで発現され、そしてこれらの癌において役割を果たし得る。従って、ＮＯＶ８遺伝子の発現は、肺癌、前立腺癌および胸部癌についてのマーカーまたは治療剤として使用され得る。さらに、ペプチド、抗体、化学分子または低分子薬物の使用を通した、この遺伝子産物の活性の治療的調整は、これらの癌の処置において有用であり得る。
【０５５６】
ＮＯＶ８遺伝子はまた、成体組織（ＣＴ＝４０）における発現と比較した場合に、胎児の肝臓、肺、骨格筋および心臓（ＣＴ＝３２−３５）においてより高いレベルで発現される。これらの結果は、ＮＯＶ８遺伝子の発現が、これらの組織の成体表現型と胎児表現型との間を識別するために潜在的に使用され得ることを示唆する。さらに、胎児組織と成体組織とにおける発現の差異はまた、成体器官の形成へと導く分化プロセスにおけるこの遺伝子産物の関与を示し得る。従って、ＮＯＶ８遺伝子によってコードされるタンパク質は、成体におけるこれらの組織の再生において潜在的に役割を果たし得る。
【０５５７】
ＮＯＶ８遺伝子（グリピカンホモログ）は、脳の多くの領域にわたって、中程度〜低いレベルで発現される。これらの領域は、海馬、扁桃、視床および大脳皮質を含み、これらはすべて、アルツハイマー病の神経変性を受ける重要な領域である。さらに、グリピカンは老人斑および神経原線維変化において発現され、このこともまた、アルツハイマー病における役割を示す。従って、ＮＯＶ８遺伝子の発現プロフィールは、ＮＯＶ８遺伝子によってコードされるタンパク質に対する抗体が、ヒト脳における神経変性疾患を識別するために使用され得ることを示唆する。さらに、ＮＯＶ８遺伝子産物様物質は、アルツハイマー病の痴呆病理を生じさせると考えられる老人斑の成分であるので、この遺伝子を標的化する薬剤および老人斑におけるその役割を破壊する薬剤は、アルツハイマー病の原因および症状、ならびにこのグリピカンが関与する他の神経変性疾患を処置するにおいて有用性を有し得る。
【０５５８】
（パネル２Ｄの概要）
（Ａｇ２２５１）  ＮＯＶ８遺伝子の最高の発現は、胸部癌サンプル（ＣＴ＝３０．３）において見られる。この遺伝子の発現は、対応する正常組織と比較した場合に、結腸癌、肺癌、腎臓癌、胸部癌、膀胱癌および胃癌由来のサンプルとの関連を示すようである。従って、ＮＯＶ８遺伝子の発現は、これらの癌についてのマーカーとして使用され得る。さらに、ペプチド、抗体、化学分子または低分子薬物の使用を通した、この遺伝子産物の治療的活性は、結腸癌、肺癌、腎臓癌、胸部癌、膀胱癌および胃癌の処置において有用であり得る。
【０５５９】
（パネル４Ｄの概要）
（Ａｇ２２５１／Ａｇ１３０９）  ２つの異なるプローブおよびプライマーのセットを使用する２つの実験は、非常によく一致する結果を生じ、腎臓（ＣＴ＝２８−２９）において最高の発現が見られる。腎臓におけるこの高い発現レベルは、ＮＯＶ８遺伝子の発現が、腎臓組織についてのマーカーとして役立ち得ることを示唆する。ＮＯＶ８遺伝子はまた、活性化Ｒａｍｏｓ  Ｂ細胞株、活性化初代Ｂ細胞、Ｔｈ１  Ｔ細胞、活性化ＨＵＶＥＣおよびケラチノサイトにおいて、低レベルで発現される。ＮＯＶ８遺伝子は、ＨＳＰＧ（ヘパラン硫酸プロテオグリカン）のファミリーに属するグリピカン分子のホモログであるタンパク質をコードする。グリピカンは、広範な種々の増殖因子および生存因子の活性を調節し得る。従って、抗体薬物の使用を通した、この遺伝子または遺伝子産物の発現または機能の治療的調整は、自己免疫媒介性疾患（例えば、インスリン依存性糖尿病、慢性関節リウマチ、クローン病、アレルギー、遅延型過敏症、ぜん息および乾癬）の処置において、潜在的に、Ｔ細胞およびＢ細胞の活性化を防止し得る。
【０５６０】
（パネルＣＮＳ＿ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ（神経変性）＿ｖ１．０の概要）（Ａｇ２２５１）  このパネルにおけるＮＯＶ８遺伝子の最高の発現は、アルツハイマー病患者の大脳皮質（ＣＴ＝３２．７）において検出される。このパネルにおいて、この遺伝子の発現とアルツハイマー病の存在との間での関連は検出されなかったが、これらの結果は、アルツハイマー病において変性する領域におけるこの遺伝子の発現を確証付ける。中枢神経系におけるこの遺伝子の潜在的有用性の考察については、パネル１．３Ｄを参照されたい。（Ｖｅｒｂｅｅｋら，Ａｇｒｉｎ  ｉｓ  ａ  ｍａｊｏｒ  ｈｅｐａｒａｎ  ｓｕｌｆａｔｅ  ｐｒｏｔｅｏｇｌｙｃａｎ  ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｎｇ  ｉｎ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｂｒａｉｎ．Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ．１５５：２１１５−２５，１９９９）。
【０５６１】
（ＮＯＶ９：マイトジェン活性化プロテインキナーゼキナーゼ２様）
ＮＯＶ９遺伝子（ＡＣ０１１００５＿ｄａ２ともいう）の発現を、表４７に記載したプライマー−プローブセットＡｇ２０２２を使用して評価した。ＲＴＱ−ＰＣＲ実行からの結果を、表４８、４９および５０に示す。
【０５６２】
【表４７】
2004532613.tif 000181
【０５６３】
【表４８】
2004532613.tif 000182
2004532613.tif 000183
2004532613.tif 000184
【０５６４】
【表４９】
2004532613.tif 000185
2004532613.tif 000186
【０５６５】
【表５０】
2004532613.tif 000187
2004532613.tif 000188
2004532613.tif 000189
（パネル１．３Ｄの概要）
同じプローブおよびプライマーのセットを用いた２つの結果は、極めてよく一致し、成体の骨格筋（ＣＴｓ＝２７）においてＮＯＶ９遺伝子の最も高い発現を有する。ＮＯＶ９遺伝子はまた、代謝機能を有する他の組織においても中程度の発現を示し、その組織としては、脂肪、成体および胎児の心臓および肝臓、成体の骨格筋、膵臓、および副腎、甲状腺、ならびに下垂体が挙げられる。胎児の骨格筋（ＣＴｓ＝３０）における発現は、成体の組織（ＣＴｓ＝２７）に比べて非常により低く、このことは、骨格筋の分化におけるこの遺伝子の発現を意味し、従って、ＮＯＶ９遺伝子の発現が、この組織の成体表現形と胎児表現形との間を区別するために用いられ得ることを示唆する。ＭＡＰキナーゼキナーゼ（ＭＡＰＫＫ）によって媒介される経路が筋芽細胞の増殖に影響を与えること、ならびにインスリンおよび自律運動の両方が、骨格筋におけるこの経路を介してシグナル伝達を刺激することが示された。肥満および糖尿病の被験体におけるインスリン耐性は、一部、腫瘍壊死因子αに起因し得、その腫瘍壊死因子の効果は、インスリンによるＭＡＰＫＫの正常な活性化の妨害を介して媒介される。さらに、自律運動訓練は、肥満Ｚｕｃｋｅｒマウスにおいてインスリン誘導性ＭＡＰＫＫ活性を有意に改善する。このことは、このキナーゼの活性化因子が、糖尿病の処置において効果的な薬剤であり得ることを示す。さらに、ＭＡＰＫＫ経路の活性化は、アンドロゲン欠損の前脂肪細胞からの脂肪細胞の分化に関連する。従って、ＭＡＰＫＫアンタゴニストは、いくつかの場合において肥満の処置に適する薬物であり得る。
【０５６６】
ＮＯＶ９遺伝子は、正常な組織と比較して、黒色腫ならびに腎臓癌および肺癌由来の細胞株においてより高いレベルで発現され、そしてそれらの組織の癌において役割を果たし得る。従って、この遺伝子の発現は、肺癌および腎臓癌ならびに黒色腫についてのマーカーまたは治療剤として有用である。さらに、ペプチド、キメラ分子、または低分子薬物の使用を介する、遺伝子産物の活性の治療的調節は、これらの癌の治療に有用であり得る。
【０５６７】
ＮＯＶ９遺伝子（マイトジェン活性化プロテインキナーゼキナーゼのホモログ）は、脳にわたって、高い〜中程度のレベルで発現され、視床中において見られる中枢神経において最も高い発現（ＣＴ＝２８．４）を有する。マイトジェン活性化プロテンキナーゼキナーゼは、バルプロ酸（痙攣障害および双極性障害の処置に用いられる薬物）によって活性化される。バルプロ酸は、ＧＡＢＡ（脳内の主要な阻害神経伝達物質）の神経性の産生を増加させることによって作用すると考えられる。従って、このキナーゼの選択的な活性は、痙攣障害、双極性障害、またはＧＡＢＡ欠損によって引き起こされると考えられている任意の他の神経学的／精神医学的状態（精神分裂病）の処置において治療的利益を有し得る。
【０５６８】
（パネル２．２の概要）このパネル中でＮＯＶ９遺伝子の最も高い発現は、乳癌のサンプル（ＣＴ＝２９．０）において見られる。この遺伝子の発現は、対応する正常な組織と比較した場合、乳癌および腎臓癌由来のサンプルとの関連を示す。従って、ＮＯＶ９遺伝子の発現は、乳癌および腎臓癌のマーカーとして有用であり得る。さらに、この遺伝子産物の治療活性は、ペプチド、キメラ分子または低分子薬物の使用を介して、乳癌および腎臓癌の処置に有用であり得る。
【０５６９】
（パネル４Ｄの概要）
ＮＯＶ９遺伝子の発現は、このパネルを通して遍在する。ＮＯＶ９遺伝子の最も高い発現は、活性化されていない細胞と比較して、ＰＭＡ／イオノマイシンで活性化した際、好塩基性球細胞株（ＫＵ−８１２）（ＣＴ＝２６．２）において見出される。ＮＯＶ９遺伝子の高い活性はまた、活性化Ｂ細胞、Ｂ細胞株および皮膚線維芽細胞においても見出される。ＮＯＶ９遺伝子は、マイトジェン活性化プロテインキナーゼキナーゼ２（ＭＡＰＫＫ２）（増殖および分化に影響するシグナル伝達経路におけるＲａｆの下流で機能するセリントレオニンキナーゼ）と相同である。好塩基球でのこのキナーゼの高い活性は、肥満細胞／好塩基球細胞のシグナル伝達におけるこのキナーゼの役割を示唆する。活性化肥満細胞／好塩基球細胞は、多くのアトピー性疾患に関連しており、そのアトピー性疾患としては、喘息、アトピー性接触皮膚炎、アレルギー、および鼻炎が挙げられる。従って、低分子薬物の使用を介する、ＮＯＶ９遺伝子産物の発現または機能の治療的調節は、これらの疾患の処置に有益であり得る。さらに、活性化Ｂ細における、このキナーゼの高い発現は、ＮＯＶ９遺伝子産物に対して設計された低分子薬物の使用が、自己免疫疾患およびリンパ腫のようなＢ細胞過剰増殖障害を予防し得る
【０５７０】
【数３】
2004532613.tif 000190
。
【０５７１】
（ＮＯＶ１１：サイモシンβ  １０様）
ＮＯＶ１１ａ遺伝子（ＧＭＡＣ０７９４００＿Ａ）および改変体ＮＯＶ１１ｂ（ＣＧ１０９７５４−０１）の発現を、表５１に記載されるプライマー−プローブのセットＡｇ２４３１およびＡｇ３０８７を用いて評価した。ＲＴＱ−ＰＣＲ実行の結果を、表５２、表５３、表５４および表５５に示す。
【０５７２】
【表５１】
2004532613.tif 000191
【０５７３】
【表５２】
2004532613.tif 000192
2004532613.tif 000193
【０５７４】
【表５３】
2004532613.tif 000194
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2004532613.tif 000196
【０５７５】
【表５４】
2004532613.tif 000197
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2004532613.tif 000199
【０５７６】
【表５５】
2004532613.tif 000200
（パネル１．３の概要）
（Ａｇ２４３１）ＮＯＶ１１遺伝子（サイモシンβ  １０のホモログ）は、海馬において最も高く発現され（ＣＴ＝２４．２）、そしてＣＮＳにおいて広範に発現される。この遺伝子は、全ての神経変性疾患の顕著な特徴である神経膠症の処置において重要であることが明らかである。さらに、神経膠瘢痕の形成は、脊髄損傷および頭部外傷に応答する神経再生に対する１つの原理的な障害である。従って、この遺伝子および／またはそのタンパク質産物の選択的ダウンレギュレーションは、脊椎損傷もしくは頭部損傷、または任意の神経変性疾患（アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンティングトン病、脊髄小脳性運動失調など）の処置に有益であり得る。
【０５７７】
ＮＯＶ１１遺伝子はまた、多くの代謝組織において中程度〜低い発現を調節し、その代謝組織としては、脂肪、副腎、成体および胎児の心臓、成体および胎児の肝臓、成体および胎児の骨格筋、膵臓、下垂体、および甲状腺が挙げられる。この遺伝子は、成体の骨格筋（ＣＴ＝３１．７）よりも胎児の骨格筋（ＣＴ＝２８）においてより高いレベルで発現されることが、明らかであり、そして、潜在的に、この組織の成体の表現形と胎児の表現形との間を区別するために用いられ得る。さらに、胎児の骨格筋におけるより高い発現は、ＮＯＶ１１遺伝子が、胎児の筋肉の成長または発達における役割を果たし得、従って、成体における再生能力において作用をし得ることを示唆する。従って、ＮＯＶ１１遺伝子の治療的調節は、筋肉関連疾患の処置に有用であり得、そしてそのタンパク質産物での処置は、弱体化した筋肉または筋ジストロフィーに対して筋肉の量または機能を再生し得る。
【０５７８】
ＮＯＶ１１遺伝子は、乳癌、肝臓癌、および黒色腫由来の細胞株において、その対応する正常な組織における発現と比較した場合、有意なレベルで発現される。従って、この遺伝子の発現は、乳癌、肝臓癌、および黒色腫についてのマーカーまたは治療薬として有用であり得る。さらに、ＮＯＶ１１遺伝子によってコードされたタンパク質の活性の治療的調節は、ペプチド、抗体、キメラ分子または低分子薬物の使用を介して、これらの癌の治療に有用であり得る。
【０５７９】
（パネル２Ｄの概要）
（Ａｇ２４３１）ＮＯＶ１１遺伝子の最も高い発現は、胃癌サンプル（ＣＴ＝２３．５）において見られる。パネル２Ｄ中のこの遺伝子の発現は、卵巣癌、膀胱癌、肝臓癌、乳癌、腎臓癌、および結腸癌由来のサンプルの、対応する正常な組織と比較した場合の、関連を示す。筋肉に転移した肺癌はまた、その隣接する筋肉組織と比較した場合、この遺伝子の増加された発現を示す。従って、ＮＯＶ１１遺伝子の発現は、これらの癌についてのマーカーとして有用であり得る。さらに、ペプチド、抗体、キメラ分子または低分子薬物の使用を介する、この遺伝子の産物の活性の治療的調節は、これらの癌の処置に有益であり得る。
【０５８０】
（パネル４Ｄの概要）
（Ａｇ２４３１）ＮＯＶ１１遺伝子は、正常な細胞型および細部株の両方において、それらの活性化の状態に関らず、このパネルを通して遍在的に発現される。この遺伝子は、サイモシンβ−１０との相同性を有するタンパク質をコードする。いくつかの報告は、サイモシンβ（機能的に非常に類似するサイモシンβ４のように）が、生細胞においてアクチンフィラメントのラージサブセットの効果的な調節因子であることを示す。サイモシンβ−１０の減少した発現は、ＥＣ形成性の減少による老化表現型に寄与し得、従って、遊走性の刺激に対するそれらの応答を減少させる。従って、ＮＯＶ１１によってコードされたタンパク質を用いて設計された治療薬は、リンパ球、肺、皮膚線維芽細胞、内皮細胞の正常な機能の維持または回復における役割を果たし得、そして細胞の老化の予防に有益であり得る。
【０５８１】
（パネル  ＣＮＳ変性ｖ１．０の概要）
（Ａｇ２４３１）ＮＯＶ１１遺伝子の発現は、このパネル中の少数のサンプルに制限され、アルツハイマー病の患者の大脳皮質において最も高い発現（ＣＴ＝３３．５）を有する。この遺伝子の発現とアルツハイマー病の存在との間の関連性はこのパネル中で検出されないが、これらの結果は、さらなるセットの個体の脳におけるこの遺伝子の発現を確認する。中枢神経系におけるこの遺伝子の潜在的な有用性の議論に関してパネル１．３Ｄを参照のこと（Ｃａｒｐｉｎｔｅｒｏら、Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｔｈｙｍｏｓｉｎ  ｂｅｔａ１０  ｇｅｎｅ  ｉｎ  ｎｏｒｍａｌ  ａｎｄ  ｋａｉｎｉｃ  ａｃｉｄ−ｔｒｅａｔｅｄ  ｒａｔ  ｆｏｒｅｂｒａｉｎ．Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ  Ｍｏｌ  Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．７０：１４１−６，１９９９）。
【０５８２】
（他の実施形態）
特定の実施形態が本明細書中で詳細に開示されているが、これは例示の目的のみのための例として行われており、そして添付される特許請求の範囲の範囲に関して限定するようには意図されない。詳細には、種々の置換、変更、および改変が、特許請求の範囲によって定義される本発明の精神および範囲を逸脱することなく本発明に対して行われ得ることが、本発明者らによって企図される。核酸の出発物質、目的のクローン、ライブラリーの型の選択は、本明細書中に記載されている実施形態の知見を考慮すると、当業者にとって慣用的な事項であると考えられる。他の局面、利点、および改変は、以下の特許請求の範囲内にあると考えられる。
【国際公開パンフレット】
2004532613.tif 000201
2004532613.tif 000202
2004532613.tif 000203
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004532613.tif 000437
2004532613.tif 000438
【国際調査報告】
2004532613.tif 000439
2004532613.tif 000440
2004532613.tif 000441
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