(57)【要約】ｐＨ緩衝作用基が強固に結合する担体物質ならびにアノード側およびカソード側を含む、電気泳動分離物質、特に等電点電気泳動用の物質。少なくとも第一のｐＨ緩衝作用基の部分は、（ａ）ｓｐ２−混成炭素原子に結合する窒素原子においてｐＨ依存荷電を有し、（ｂ）ｐＫａ＞９．５の基を含む。１つの実施態様では、（ａ）の基は、可能なプロトン化型の構造−（ＮＨ）ｎＣ（＝ＮＨ）（ＮＨ２）（Ｉ）［式中、ｎは０また１である］を有し、自由原子結合手（ｆｒｅｅ ｖａｌｅｎｃｅ）が有機性リンカーを介し担体物質に結合する。モノマーの混合物の重合化により得られ、固定化ｐＨ勾配を確立し得る固定化緩衝作用基を含む、ＩＥＦ分離物質。この場合、（１）少なくとも１つのモノマーは、構造ＣＨ２＝ＣＨＲ’’ＣＯＮＲ１２Ｒ１３（Ｖ）［式中、（ｉ）Ｒ’’は水素またはメチルを示し、（ｉｉ）１またはそれより多いＲ１２およびＲ１３が−（（ＣＨ２）ｎ’−Ｏ）ｎ’’−Ｈ｛式中、ｎ’は２−３であり、ｎ’’１−５である｝である一方、任意の残りのＲ１２およびＲ１３基は水素であり、ｎが３であるとき、（ＣＨ２）ｎ中の中間炭素における水素は、ヒドロキシで置換され得、（２）固定化ｐＨ勾配は、ｐＨ＞１０に至っている。【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数のｐＨ緩衝作用基が強固に結合する担体物質ならびにアノード側およびカソード側を含む、電気泳動分離物質であって、
少なくとも、当該複数基のうちの第一の部分が、
（ａ）ｓｐ２−混成炭素原子に結合する窒素原子においてｐＨ依存荷電を有し、
（ｂ）ｐＫａ＞９．５の基を含む、
基であることを特徴とする当該物質。
【請求項２】
第一の部分の当該基が、可能なプロトン化型の構造
−（ＮＨ）ｎＣ（＝ＮＨ）（ＮＨ２）（Ｉ）
［式中、ｎは０また１である］
を有する基を含み、自由原子結合手が有機性リンカーを介し担体物質に結合する、
ことを特徴とする、請求項１の物質。
【請求項３】
ｎが１であること、およびリンカーが、好ましくは、式（Ｉ）の基の自由原子結合手に直接結合するｓｐ３−混成炭素原子を提供することを特徴とする、請求項２の物質。
【請求項４】
当該担体物質が、キャピラリーの内壁であるか、ゲル、恐らく架橋しており、例えば、フラットベッド型またはフィルドチャンネルもしくはキャピラリー型のゲルであることを特徴とする、請求項１−３の何れかに記載の物質。
【請求項５】
当該複数基のうちの第二の部分が、第一の部分中の基のｐＫａとは異なるｐＫａ値を有するｐＨ緩衝作用基を含むこと、ならびに第一および第二の部分の両方においてｐＨ緩衝作用基を配置し、アノード側からカソード側向きに増加するｐＨ勾配を決定することを特徴とする、請求項１−４の何れかに記載の物質。
【請求項６】
担体物質が、例えば、構造
ＣＨ２＝ＣＲ’−ＣＯ−Ｘ−Ｒ１０（ＩＩＩ）
［式中、（ａ）Ｒ’は水素またはメチルであり、
（ｂ）Ｘはエステル酸素（−Ｏ−）またはアミド窒素（−ＮＲ１１−）であるか、または何もなく、
（ｃ）多くともＲ１０およびＲ１１の１つは、水素および直鎖状、分枝状または環状Ｃ１−１０アルキル基から選択され、それらは何れも、１またはそれより多い位置でエーテル酸素（−Ｏ−）、アミノ窒素（−ＮＲ１−）またはチオエーテル硫黄（−Ｓ−）、特にエーテル酸素が恐らく介在する炭素鎖を有し、および／または水素は、−ＯＲ１、−ＮＲ２Ｒ３、または−ＳＲ４、特に−ＯＲ１｛式中、Ｒ１−Ｒ４は、独立して、水素、または直鎖状、分枝状もしくは環状アルキル基を表し得る｝から選択される基で恐らく置換され、
但し、アルキル基が２を超える炭素を有するとき、当該アルキル基の炭素原子数に対するヘテロ原子（特に酸素）数の割合は０．２５−０．８０の間にある］
を有する１またはそれより多いモノマーを含む重合混合物の重合により得られる、ビニル重合体であることを特徴とする、請求項１−５の何れかに記載の物質。
【請求項７】
Ｘ−Ｒ１０が−ＮＲ１０Ｒ１１−［式中、１またはそれより多いＲ１０およびＲ１１が−（（ＣＨ２）ｎ’−Ｏ）ｎ’’−Ｈ｛式中、ｎ’は整数２−３であり、ｎ’’は整数１−５である｝である一方、残りのＲ１０およびＲ１１基は、もしあるならば、水素であり、
但し、ｎ’が３であるとき、（ＣＨ２）ｎ中のエーテル酸素（−Ｏ−）に結合していない炭素原子に結合する水素は、ヒドロキシで置換される］
であることを特徴とする、請求項６の物質。
【請求項８】
好ましくは、ゲル型であり、モノマーの混合物の重合により得られ、そして、ｐＫａの異なる複数のｐＨ緩衝作用基により決定づけられる固定化ｐＨ勾配を含む、等電点電気泳動分離物質であって、
（ａ）少なくとも１つの当該モノマーが構造
ＣＨ２＝ＣＨＲ’’ＣＯＮＲ１２Ｒ１３　（ＩＶ）
［式中、
（ｉ）Ｒ’’は水素またはメチルを表し、
（ｉｉ）１またはそれより多いＲ１２およびＲ１３が−（（ＣＨ２）ｎ’−Ｏ）ｎ’’−Ｈ｛式中、ｎ’は２−３であり、ｎ’’は１−５である｝である一方、残りのＲ１２およびＲ１３基は、もしあるならば、水素であり、
但し、ｎ’が３であるとき、（ＣＨ２）ｎ中のエーテル酸素（−Ｏ−）に結合していない炭素原子に結合する水素は、恐らく水素で置換される］
を有し、そして
（ｂ）固定化ｐＨ勾配は、ｐＨ＞１０に至っている、
ことを特徴とする当該物質。
【請求項９】
複数の異なる基の少なくとも一部が、ｓｐ２−混成炭素原子に結合する窒素原子におけるｐＨ依存荷電およびｐＫａ＞９．５を有することを特徴とする、請求項８の分離物質。
【請求項１０】
特に、等電点電気泳動中、ステップ、
（ａ）分離物質に、互いに分離する物質を含むサンプルを提供すること、
（ｂ）当該物質に対し十分な時間、ｐＨ勾配に電気的ポテンシャルを適用すること、
を含む分離物質中、電気泳動を行う方法であって、
請求項１−９の何れかの分離物質を使用することを特徴とする方法。
【請求項１１】
荷電または荷電可能基（Ａ）、重合化可能非飽和（Ｂ）、およびＡをＢに結合させる架橋構造（Ｃ）を含む、重合化可能モノマーの使用であって、ここで、
Ａは、ｓｐ２−混成炭素原子、特に−（ＮＨ）ｎＣ（＝ＮＨ）（ＮＨ２）（式Ｉ） ［式中、ｎは０または１である］に結合する窒素原子においてｐＨ依存荷電を有し、
Ｂは、重合化可能炭素−炭素または炭素−炭素三重結合であり、そして
Ｃは、ヒドロキシまたは低級アルコキシ基、エーテル酸素、チオエーテル硫黄、第二または第三級アミノ基、アミド基などで置換され得る直鎖状、分枝状または環状炭化水素鎖から選択される構造を含み、
電気泳動、特に等電点電気泳動による分離に使用するための分離物質の合成のための、当該使用。
【請求項１２】
モノマーがｐＫａ＞９．５、例えば、ｐＫａ＞１０．０である、請求項１１の使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（技術分野）
本発明は、分離物質に関係し、それは、等電点（ｐＩ）、特に電気泳動（等電点電気泳動、ＩＥＦ）による相違に基づき両性化合物を分離する際に使用し得る。
【０００２】
電気泳動は、適用される電場により生ずる、液体中、主として水性中の大量輸送の手段により荷電または荷電可能溶質を互いから分離する分離方法を包含している。対流により生ずる障害を最小限とするため、当該液体は、多孔性担体物質（ゲル電気泳動）内、または物質輸送の方向と交差する多孔性膜によりセグメント化されるキャピラリー（キャピラリー電気泳動、ＣＥ）中もしくはチャンネル中に含まれる。本発明において、担体物質なる用語は、キャピラリー、チャンネルおよび多孔性膜の壁もまた包含し、溶質が通過することを意味する。
【０００３】
分離された物質は、典型的には生物有機化学的なものであり、主として、ポリペプチド構造体および／または炭水化物構造体を有する化合物を包含する。タンパク質は特に重要である。
【０００４】
（背景技術）
特定種の電気泳動では、担体物質は、目的の分離に有益となる条件を提供する基で官能化される。１つの重要な種類の基は、ｐＨ緩衝作用基である。電気泳動ゲルのアノード端およびカソード端の間で異なるｐＫａのｐＨ緩衝作用基を固定化することにより、等電点電気泳動に使用する固定化ｐＨ勾配（Ａｍｉｎｋｅｍｉ， ＵＳ４，１３０，４７０）をセットアップすることが７０年代後半に可能となった。良好なｐＨ勾配を得るためには、望ましいｐＨ区間に至る増加／減少ｐＫａ値を有する異なるｐＨ緩衝作用基の範囲を有することが重要であった。２つの隣接する緩衝性基のｐＫａ間の相違は、典型的に１−２ｐＨ単位である。ｐＨ１０を超えて至るｐＨ区間の場合、原理的に、第四級アンモニウム基のヒドロキシド型である基のみ、すなわち、基自体によってｐＫａ値および緩衝性能を欠き、ｐＨ独立荷電を有する基のみ利用可能である。ｐＨ＞１０．５の場合、認められる酸／塩基対は、Ｈ２Ｏ／ＯＨ−である。第三級アンモニウム基よりも高いｐＫａ値を有する、緩衝性基を改善するためアクセスする必要がある。
【０００５】
ｐＨ１０を超えて至っているｐＨ勾配は、ハイクオリティーの結果に必要な十分な時間、電気泳動（ｆｏｃｕｓｉｎｇ）し得るための十分な安定性および質を有さない。そのため、ｐＨ＞１０での加水分解のリスクを低くするため、担体物質と、第三級アンモニウム基のｐＫａよりも高いｐＫａを有する緩衝作用基との組み合わせを改善する必要がある。
【０００６】
固定化ｐＨ勾配は、Ｃｈｉａｒｉ ｅｔ ａｌ（Ｊ． Ｃｈｒｏｍａｔｏｇ． ５５９ （１９９１） １１９−１３１）、Ｃｈｉａｒｉ ｅｔ ａｌ（Ｊ． Ｃｈｒｏｍａｔｏｇ． ５４８ （１９９１） ３８１−３９２）、Ｃｈｉａｒｉ ｅｔ ａｌ（Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ １（１９８９） ９９−１０２ ａｎｄ １０３−１０７）により述べられている。ｐＨ極値の等電点電気泳動の有する問題が述べられている（Ｍｏｓｈｅｒ ｅｔ ａｌ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ７ （１９８６） ５９−６６）。
【０００７】
多くの科学記事では、種々のセリンプロテアーゼの分離のためのアフィニティークロマトグラフィー中のリガンドとして可能なプロトン化型の構造
−Ａｒ−Ｃ（＝ＮＨ）（ＮＨ２）
を含む基が述べられている。Ａｒはアリール部分である。Ｃｈａｎｇ ｅｔ ａｌ （Ｊ． Ｃｈｅｍ． Ｔｅｃｈ， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ５９ （１９９４） １３３−１３９）； Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ （Ｊ． Ｃｈｒｏｍａｔｏｇ． Ａ ７０４ （１９９５） ３０７−３１４）；Ｋｈａｍｌｉｃｈｉ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｃｈｒｏｍａｔｏｇ． ５１０ （１９９０） １２３−１３２；およびＢｕｒｔｏｎ ｅｔ ａｌ （ＵＳ５，７８９，５７８）参照。同じ基はまた、１９９９年１１月２２日に出願のＳＥ特許出願９９０４１９７−２（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ ＡＢ）に記載されている。この後者の場合、当該基は、イオン交換吸着によるタンパク質の分離のための混合型イオン交換リガンドとして使用される。
【０００８】
構造：
ＣＨ２＝ＣＨ（ＣＨ３）ＣＯＮＨＣ（＝ＮＨ）（ＮＨ２）または
ＣＨ２＝ＣＨ（ＣＨ３）ＣＯＮＨ（ＣＨ２）３ＮＨＣ（＝ＮＨ）（ＮＨ２）
のアクリルアミドモノマーは、この種のモノマーが塩基性官能基を提供する、インプリント化マクロポーラスポリマーの合成に使用する。これらのポリマーは、カラムクロマトグラフィー実験での酸性分子の結合について試験した。Ｓｐｉｖａｋ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｏｒｇ． Ｃｈｅｍ． ６４ （１９９４） ４６２７−４６３４参照。
【０００９】
ＵＳ５，０５５，５１７（Ｓｈｏｒｒ ｅｔ ａｌ）、ＵＳ５，２１９，９２３（Ｓｈｏｒｒ ｅｔ ａｌ）、ＵＳ５，４３８，０９２（Ｋｏｚｕｌｉｃ）、ＵＳ５，０６６，３７６（Ｏｓｔｅｒｈｏｕｄｔ ｅｔ ａｌ）、ＷＯ９３１１１７４（Ｒｉｇｈｅｔｔｉ ｅｔ ａｌ）、ＷＯ９７１６４６２（Ｒｉｇｈｅｔｔｉ）、およびＷＯ９８１０２７６（Ｋｏｚｕｌｉｃ）参照。それらの文献はすべて引用により組み込まれ、それらは、Ｎ−アルキル置換アミドおよび／またはアクリル酸および／またはメタクリル酸のアルキルエステルに基づく電気泳動のための担体物質について記載したものである。アルキル基は、ヒドロキシおよびエーテル基をも含み、レディーメイドゲルに十分な親水性を供与する。特にＷＯ９３１１１７４（Ｒｉｇｈｅｔｔｉ ｅｔ ａｌ）およびＷＯ９７１６４６２（Ｒｉｇｈｅｔｔｉ）は、アルカリ環境下で処理しその後、ｐＨ＝１０までの可溶性で固定化ｐＨ勾配を有する等電点電気泳動中で使用する担体物質を提供する。Ｓｉｍｏ−Ａｌｆｏｎｓｏ ｅｔ ａｌ．， Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ １７（１９９６） ７２３−７３１ ａｎｄ １７ （１９９６） ７３２−７３７およびＧｅｌｆｉ ｅｔ ａｌ．， Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ １７ （１９９６） １７ （１９９６） ７３８−７４３もまた参照。１９９５年に市販された電気泳動の新規型のポリマーのレビューが、Ｃｈｉａｒｉ ｅｔ ａｌ（Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ １６ （１９９５） １８１５−１８２９）により発行された。
【００１０】
本発明の目的
最初の目的は、ハイクオリティーの結果を提供をするために十分な時間、アルカリｐＨ＞１０．０での等電点電気泳動に使用し得る改善した分離物質を、例えば、これらのｐＨ値で使用するｐＨ勾配を有意に不安定とすることなく、提供することである。
【００１１】
第二の目的は、１０．０を超える、例えば、１０．５以上または１１．０以上のｐＫａを有する緩衝作用基で官能化し、このｐＨ範囲で改善された安定性および最適な親水性を有する担体物質を含む、ｐＨ勾配分離物質を含む、分離物質を提供することである。
【００１２】
この目的は、上記のような多孔性膜を有する多孔性ゲル、キャピラリーまたはチャンネルの型の、主に分離物質に関する。目的の使用は、第三の目的のために提供した種類の方法である。
【００１３】
第三の目的は、ｐＨ＞９、例えばｐＨ＞１０またはｐＨ＞１１での分離を含む改善した電気泳動分離方法、および担体物質に固定化するｐＨ緩衝作用基の存在を提供することである。主として、当該方法は、ｐＩ＞９．５、例えばｐＩ＞１０またはｐＩ＞１０．５を有する化合物の固定化ｐＨ勾配を有する等電点電気泳動（ＩＥＦ）を含む。
【００１４】
第四の目的は、ｐＫａ＞１０．０、例えば、ｐＫａ＞１０．５またはｐＫａ＞１１．０を有する新規緩衝作用基およびモノマー、および上記のような分離物質の製造のためのｐＨ＞１０での加水分解に対する改善した安定性を提供することである。
【００１５】
（発明の開示）
発明者は、これらの目的が
（１）（ａ）ｓｐ２−混成炭素原子に結合する窒素原子におけるｐＨ依存荷電、および（ｂ）ｐＫａ＞９．５、例えば、ｐＫａ＞１０．０またはｐＫａ＞１０．５またはｐＫａ＞１１．０
を有するものの中で固定化したｐＨ緩衝作用基を適当に選ぶこと、および／または
（２）特定のアクリルモノマーに基づく、担体物質を利用すること
により、少なくとも部分的に適合し得ることを認識する。１ａを充足するｐＨ緩衝作用基は、本発明では、Ｍ基と称する。典型的になＭ基は、式Ｉ：
−（ＮＨ）ｎＣ（＝ＮＨ）（ＮＨ２）（Ｉ）
である。式（Ｉ）の個々の基は、陽子供与（荷電）型または非陽子供与（非荷電）型であり得る。当該基の担体物質への固定は、リンカーを介し得る。ｎは０または１の整数である。水素は、以下の考察のように置換し得る。
【００１６】
最初の態様、ｐＫａ＞９．５を有するＭ基を有する分離物質
この態様は、担体物質およびリンカーを介し担体物質に強固に結合する複数のｐＨ緩衝作用基を含む電気泳動分離物質に関する。この態様の主な特徴は、複数基のうちの少なくとも一部がＭ基であり、ｐＫａ＞９．５、例えば、ｐＫａ＞１０．０またはｐＫａ＞１０．５またはｐＫａ＞１１．０であることである。適当なｐＫａ値の典型的な上限は、水のｐＫａに相当する。好ましい基は、式（Ｉ）を有するものの中から選択される。
【００１７】
以下で言及するｐＫａ値は、関連する特定Ｍ基および担体物質の基礎骨格（ｂａｓｅ ｓｋｅｌｅｔｏｎ）に結合するリンカーの少なくとも典型的部分を有する低分子量化合物／モノマーの場合、水溶液中で測定する。ｐＫａ値は、イオン強度ゼロに外挿される。Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｐｈｙｓｉｃｓ， ５６ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ （１９７５−１９７６） ｐａｇｅ Ｄ−１３３， ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ， １８９０１ Ｃｒａｎｗｏｏｄ Ｐａｒｋｗａｙ， Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ， Ｏｈｉｏ， Ｕ．Ｓ．Ａ．参照。
【００１８】
１、２、３またはそれより多い種類のＭ基が存在し得る。少なくとも１種の異なるＭ基は上記のようなｐＫａを有する。
【００１９】
式Ｉの化合物はまた、−（ＮＨ）ｎＣ（＝ＮＨ）（ＮＨ２）（Ｉ）中の少なくとも１つの水素が、個々の（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ）水素によって同じであったり、異なったりし得る直鎖、分枝または環状の炭化水素基（Ｒ）、例えば、アルキル基で置換され得ることを含む。典型的に炭化水素基は、１０炭素原子までを含む。炭化水素基中、炭素鎖は、エーテル酸素（−Ｏ−）、アミノ窒素（−ＮＲ１−）またはチオエーテル硫黄（−Ｓ−）、特にエーテル酸素により、１またはそれより多い位置で介在され得る。炭化水素基およびアルキル基という表現には、１またはそれより多い位置の水素が−ＯＲ１、−ＮＲ２Ｒ３、または−ＳＲ４、特に−ＯＲ１から選択される基で置換され得ることが含まれる。個々のＲ１−Ｒ３は、独立して、水素、または低級直鎖状、分枝状または環状アルキル基、典型的には水素および／またはＣ１−３アルキルを示し得る。Ｒ４は、Ｒ１−Ｒ３と同じ方法で選択されるが、アルキルが好ましい点が異なる。アルキル基のような、２−３を超える炭素を有する炭化水素基の場合、炭素原子数に対するヘテロ原子数（特に酸素）の割合は、０．２５−０．８０の区間である。「ヘテロ原子」という用語は、酸素、窒素および硫黄、特に酸素を意味する。好ましい変種では、アルキル基中の１つの同一ｓｐ３−混成炭素原子が、多くとも１つの一重結合のヘテロ原子を保有する。水素はまた、ペア−ワイズ法において、式（Ｉ）中のＣ＝ＮＨ基と共役する二重結合を供与する可能性がある二価Ｃ２−３炭化水素基で置換され得る。
【００２０】
リンカーは、担体物質に対する式Ｉの基の共有結合を供与する。典型的に、リンカーは、式（Ｉ）により表される基中の自由原子結合手（ｆｒｅｅ ｖａｌｅｎｃｅ）に直接結合するｓｐ３−混成炭素原子または芳香性炭素原子を有する。アリール基は、分離される物質を含む水性液体中の種々の生物有機化学溶質との不要な相互作用を容易に生じ得るため、好ましいのはｓｐ３−混成炭素原子の場合である。
【００２１】
リンカーは、担体物質の基礎骨格から式Ｉの基に延びており、そのためまた、その基礎骨格から突出する担体物質の一部を含み得る。リンカーは、好ましくは非荷電である。そのため、好ましい変種では、当該リンカーは、−ＯＲ５、または−ＳＲ６、特に−ＯＲ７で置換される可能性のある、直鎖状、分枝状または環状二価炭化水素基から選択される構造を含み得る。当該リンカーはまた、エーテル基（−Ｏ−）、チオエーテル基（−Ｓ−）、アミド基（−ＣＯＮＲ８−）、エステル基（−ＣＯ−Ｏ−）および／または加水分解および／または酸化性切断に対し同様またはより高い安定性の他の非荷電基を含み得る。Ｒ５−Ｒ８は、水素およびＲと同じ基から選択される。アルキルは、Ｒ６が好ましい。安定性の理由のため、１つの同一ｓｐ３−混成炭素原子からへテロ原子に対する多くとも１つの一重結合がしばしば存在する。好ましくは、リンカーは、エーテル酸素（−Ｏ−）により１またはそれより多い位置で介在される可能性があり、および／または１またはそれより多い位置でヒドロキシ基で置換される可能性がある、アルキレン鎖である。リンカーは、典型的には１０原子以下のような２０原子以下の長さを有する。
【００２２】
好ましいリンカーの実例は、式ＩＩ：
−ＣＯ−ＮＲ９−［（ＣＨ２）ｍＯ］ｋ（ＣＨ２）ｍ’−（ＩＩ）
［式中、Ｒ９は、水素およびＲと同じ基から選択され、ｍおよびｍ’は、２、３および４のような２−１０の区間で選択される整数であり、ｋは７未満のような０またはそれよりも大きい整数である］
である。左の自由原子結合手は、典型的に、担体物質の基礎骨格に結合し、右の自由原子結合手は、式Ｉの基に結合するか、またはその逆である。この種の特定の興味のひかれるリンカーは、担体物質の基礎骨格に対する式Ｉの基の結合のため、３−８原子の鎖を提供する。−ＮＲ９−基は、−Ｏ−と置換し得る。
【００２３】
担体物質および式Ｉの基で官能化された担体物質の製造
担体物質は、天然または合成のポリマーに基づき得る。
実例の合成ポリマーは、典型的には架橋し、非置換および／またはＮ−アルキル置換アクリルアミドまたはメタクリルアミド、Ｎ−ビニル置換飽和カルボキサミド（そのホルムアミドを含む）、アクリル酸またはメタクリル酸のアルキルエステル、ビニルアリールおよび種々のビニル基のような重合化可能非飽和基を含む他のモノマーに基づく。重合混合物中の２つまたはそれより多い重合化可能非飽和基を示す相当モノマーを含むことにより、得られたポリマーは架橋する。２−３より多い炭素原子を有する２またはそれよりも多いメチル基および／またはアルキル基を含むモノマーの場合、メチル／アルキル基は、好ましくは、明白な親水性を示す。これは、メチル／アルキル基が、炭素原子に対するヘテロ原子（上記のような、特に酸素）の割合が０．２５−０．８０の区間である限り、１つまたはそれより多いヒドロキシ、エーテル、チオエーテル基などで官能化される場合に、生ずる。
【００２４】
重合混合物が式ＩＩＩのモノマーおよび／またはそれに相当するビス−トリス−などの型：
ＣＨ２＝ＣＲ’−ＣＯ−Ｘ−Ｒ１０（ＩＩＩ）
［式中、
Ｘは−Ｏ−（エステル酸素）または−ＮＲ１１−（Ｎはアミド窒素である）であり得、または何もないかもしれない］
を含むならば、利点となり得る。Ｒ’は、水素またはメチルである。Ｒ１０およびＲ１１は、水素およびＲとして定義したアルキル基から選択される。Ｘがエステル酸素（−Ｏ−）ならば、Ｒ１０は、好ましくは、１またはそれより多い、ヒドロキシまたはＲで定義したようなエーテル酸素を含む。Ｘが−ＮＲ１１−ならば、Ｒ１０およびＲ１１の一方またはその両方は、好ましくは、１またはそれより多いヒドロキシまたはＲで定義したようなエーテル酸素を含み、残りのＲ１０およびＲ１１があるとすると、好ましくは水素である。１、２またはそれより多い重合化可能非飽和物（ｐｏｌｙｍｅｒｉｓａｂｌｅ ｕｎｓａｔｕｒａｔｉｏｎｓ）を含む他の重合化可能モノマーは、重合混合物、例えば、ビス−、トリス−などの型を含む他のアクリルおよび／またはメタクリルモノマー中に含まれ得る。
【００２５】
式ＩＩＩおよび／またはそれに相当するビス−トリス−などの型のモノマーが重合混合物中に存在するならば、その総量は、典型的には、重合化可能モノマーの総量の５ｍｏｌ−％を超える。
【００２６】
式ＩＩＩおよびそのビス−、トリス−型のモノマー、ならびにその利点および製造は、例えば、ＵＳ５，０５５，５１７（Ｓｈｏｒｒ ｅｔ ａｌ）、ＵＳ５，２１９，９２３（Ｓｈｏｒｒ ｅｔ ａｌ）、ＵＳ５，４３８，０９２（Ｋｏｚｕｌｉｃ）、ＵＳ５，０６６，３７６（Ｏｓｔｅｒｈｏｕｄｔ ｅｔ ａｌ）、ＷＯ９３１１１７４（Ｒｉｇｈｅｔｔｉ ｅｔ ａｌ）、ＷＯ９７１６４６２（Ｒｉｇｈｅｔｔｉ）、およびＷＯ９８１０２７６（Ｋｏｕｚｕｌｉｃ）（それらは引用により本明細書にすべて加える）に大々的に記載されている。１９９５年に利用可能であった最適なゲルのレビューとして、Ｃｈｉａｒｉ ｅｔ ａｌ（Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ １６ （１９９５） １８１５−１８２９）参照。
【００２７】
モノマーは、（プレポリマー）のような重合性となり得、複数の非飽和構造体を有し得る。典型的なプレポリマーは、デキストラン、アガロースおよび他のポリサッカライドのようなポリヒドロキシポリマーから選択される。ＵＳ４，０９４，８３２； ＵＳ４，０９４，８３３； ＥＰ８７９９５； ＷＯ９７３１０２６、ＷＯ９７２６０７１参照（それらは引用によりすべて本明細書に加える）。
【００２８】
担体物質として使用し得る他の種類の合成ポリマーは、モノマーが、アミノ、ヒドロキシ、カルボキシなどの基から選択される２またはそれより多い基を示す化合物から選択される縮合ポリマーに基づく。この種類は、ポリアミド、ポリアミン、ポリエーテルなどを含む。基礎骨格は、炭素鎖および重合の間に形成されるアミン、アミド、エーテル基により形成される。
【００２９】
有用な天然ポリマーの例示としては、セルロース、アガロース、デキストラン、ポリビニルアルコールなどがある。個々のこれらポリマーは、架橋され得、適当な剛性を供与し得る。
【００３０】
担体物質は、フラットベッドゲルとなり得る。担体物質はまた、キャピラリーの内壁であり得、例えば、キャピラリーの内壁のネイキッド型に結合するゲル型であり得る。上記の「技術分野」の項目もまた参照。
【００３１】
本発明の電気泳動分離物質は、カソード側／端およびその反対側にアノード側／端を有する。固定化Ｍ基は、これら２つの側の間の担体物質中のいたるところすべてに存在し得る。その濃度は、均等に分布し得るか、またはアノード側に比べてカソード側の濃度が高くなり得、例えば、増加する濃度勾配の型となり得る。
【００３２】
本発明の最初の態様の好ましい変種において、分離物質は、少なくともｐＨ１０−１３またはその一部の区間、１１−１３、１０−１２などのような区間を含む固定化ｐＨ勾配を含む。この変種の特徴は、Ｍ基がｐＨ１０−１３またはその一部の区間、１０−１１、１０−１２、１１−１３などの区間の決定をアシストすることである。１０−１３またはその一部の区間は、次に、ｐＨ２−３、３−４、４−５、５−６、６−７、７−８、８−９、９−１０、１０−１１または１１−１２の区間で始まり得、ｐＨ１１−１２、１２−１３、１３−１４またはそれより上の区間で終わり得る、より大きな区間の一部となり得る。典型的に、ｐＨ勾配は、少なくとも、１−２、好ましくは少なくとも２−３、ｐＨ単位をカバーする。Ｍ基は、ｐＫａ＞９．５、例えば、ｐＫａ＞１０．０またはｐＫａ＞１０．５またはｐＫａ＞１１．０を有し、例えば式Ｉのとおりとなり得る。
【００３３】
ｐＨ勾配の広さに依存して、分離物質中に存在し、ｐＫａ＞９．５、例えば、ｐＫａ＞１０．０またはｐＫａ＞１０．５またはｐＫａ＞１１．０を有する、Ｍ基のｐＫａ未満のｐＫａを有する更なる１またはそれより多いｐＨ緩衝作用基を含み得る。これら更なる基は、当分野に一般に知られる原理に従い選択される。固定化ｐＨ勾配に関し上記で考察した刊行物参照。
【００３４】
他の変種において、担体物質は、チャンネルの長軸に沿ってｐＨ勾配が増加／減少するように、チャンネルを交差して位置するｐＨ緩衝性多孔性膜によりセグメント化されるチャンネルである。チャンネルの一端は、アノード端であり、他方は、カソード端である。個々のセグメントとして、カソード端膜はしばしば、アノード端膜よりも高いｐＫａを有するｐＨ緩衝作用基を有する。
【００３５】
例えば式ＩのＭ基は、
（ａ）Ｍ基、特に式ＩのＭ基、またはその基に変換し得る基、および
（ｂ）担体物質が親電子基を含むか、またはその逆ならば、レディーメイド担体物質中の反応基、例えば、二機能性化合物中の求核性基と共有結合を形成し得る反応基
の両方を示す少なくとも二機能性化合物を反応させることにより、レディーメイド担体物質に導入し得る。Ｍ基は、ｐＫａ＞９．５、例えば、ｐＫａ＞１０．０またはｐＫａ＞１０．５またはｐＫａ＞１１．０を有する。
【００３６】
クロマトグラフィーのために担体物質を官能化するこの種の二機能性試薬は、ＳＥ特許出願９９０４１９７−２（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ ＡＢ）およびＵＳ５，７８９，５７８（Ｂｕｒｔｏｎ ｅｔ ａｌ）に記載されている。同様のアプローチが、電気泳動の担体物質の官能化に利用され得る。
【００３７】
Ｍ基、特に式ＩのＭ基を示す重合化可能モノマーを上記定義のような他のモノマーを含む重合混合物中に含め、次いで重合を開始することにより、しばしば、より簡単に、本発明による満足のいく分離物質を作成される。Ｍ基を示すモノマーは典型的に以下の部分を含む：
Ａ．Ｍ基、例えば式ＩのＭ基、およびｐＫａ＞９．５、例えば、ｐＫａ＞１０．０またはｐＫａ＞１０．５またはｐＫａ＞１１．０を有するＭ基
Ｂ．担体物質の製造に使用するモノマーについて上に記載したような重合化可能炭素−炭素または炭素−炭素のトリプル二重結合；および
Ｃ．ＡをＢに結合させる架橋構造およびリンカーと同じ方法で選択される構造を含む構造。上記参照。
【００３８】
この種のモノマーは、背景技術で概略したように合成し得る。Ｓｐｉｖａｋ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｏｒｇ． Ｃｈｅｍ． ６４ （１９９９） ４６２７−４６３４参照。また、実験部分参照。
【００３９】
固定化ｐＨ勾配を含む分離担体、例えばゲルを調製するとき、勾配の低いほう（酸性）の端に相当するｐＨを有する第一の重合溶液および勾配の高いほう（アルカリ性）の端に相当するｐＨを有する第二の重合溶液から開始し得る。一方または両方の溶液は、重合化可能モノマーを含み、増加ｐＫａのｐＨ緩衝作用基、ｐＫａ＞９．５、例えば、ｐＫａ＞１０．０またはｐＫａ＞１０．５またはｐＫａ＞１１．０を有するＭ基であり、特に式Ｉの通りであるＭ基のうち少なくとも１つを有するモノマーの範囲を含む。２つの溶液を混合し、適当な開始システムに適用する勾配により、固定化ｐＨ勾配を含む担体物質は、架橋勾配を含むゲルの類似の製造により得られ得る。典型的に、担体物質は、当分野に既知の２つの溶液（他の中への一方の溶液の量を増加させつつ）の適当な勾配混合物でカセットを満たし、重合することにより、適当なカセット中に流し込む。Ｒｅｉｎｅｒ Ｗｅｓｔｍｅｉｅｒ， ”Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ｉｎ Ｐｒａｃｔｉｃｅ： Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｔｈｅｏｒｙ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ”， ＶＣＨ Ｖｅｒｌａｇｓｇｅｓｃｈｅｌｌｓｃｈａｆｔ ＧｍｂＨ， Ｗｅｉｈｅｉｍ， Ｇｅｒｍａｎｙ （１９９３， Ｅｎｇｌｉｓｈ ｖｅｒｓｉｏｎ）、特に１９７−２２０頁のようなテキスト参照。
【００４０】
固定化ｐＨ勾配を含むキャピラリーは、
（ａ）増加／減少ｐＫａのモノマー、および必要ならば適当なイニシエーターを含む溶液を提供すること、
（ｂ）モノマーがグラフトされ得る壁を有するキャピラリーを提供すること、およびステップ（ａ）の溶液でキャピラリーを満たすこと、
（ｃ）キャピラリーの長軸に沿った電場を適用し、当該軸に沿ったｐＨ勾配を確立すること、および
（ｄ）当分野に既知のグラフティングを開始すること、
により製造され得る。最終的に、残りの溶液を取除き、当該キャピラリーを電気泳動および／または保存のためにコンディションした。
【００４１】
上記で概略したキャピラリーの原理は、一般的に適用可能性を有する。そのため、その原理はまた、ｐＫａ＜１１．０、例えば、ｐＫａ＜１０．０の緩衝作用基のみ、および／またはイオン交換により水酸化物型に変わるかまたは変わり得る第四級基（ｑｕａｔｅｒｎａｒｙ ｇｒｏｕｐ）を含む等電点電気泳動分離物質の製造に有用となる。
【００４２】
当分野に既知のように、本発明において適用される重合／グラフティングシステムは、イニシエーターを含み得るかまたは含み得ない種々の開始システムを使用し得る。熱および化学イニシエーター（ｔｈｅｒｍａｌ ａｎｄ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｉｎｉｔｉａｔｏｒ）はしばしば、重合の開始に使用される。熱イニシエーターがしばしば好ましい。それらは、５０−９０℃の範囲で最も効率がよい。既知の化学／熱イニシエーターは、アゾ化合物（例えば、２，２’−アゾビス−（２，４−ジメチルバレロニトリル））、アゾイソニトリル、ペルオキシド（例えば、ベンゾイルペルオキシド）、ペルサルフェートである。重要な種類の化学イニシエーターは、重合開始のためには、照射、例えばＵＶを必要とする。酸化還元システムではまた、例えばＦｅｎｔｏｎ’ｓ試薬を使用する（過酸化水素＋Ｆｅ２＋）。重合またはグラフティングの開始は、イニシエーターなしで生じ得、例えば、電子ビーム照射またはγ−照射により生じ得る。
【００４３】
第二の態様、所望のｐＫａのＭ基を有する分離物質
この態様は、固定化したｐＨを含む等電点電気泳動分離物質に関係する。この態様は、分離物質がｐＨ緩衝作用基を含み、その基は、例えば、式Ｉでは、勾配のｐＨ区間の少なくとも一部の区間を決定するＭ基であることを特徴とする。この態様の有利な変種では、勾配／区間は、ｐＫａ＞９．５、例えば、ｐＫａ＞１０．０またはｐＫａ＞１０．５またはｐＫａ＞１１．０を（１１．０を含んで）有する少なくとも１種のＭ基を有する本発明の最初の態様について考察したような、ｐＨ＞１０に至っている。他の点において、第二の態様は、本発明の最初の態様を概略する種々の実施態様を含む。
【００４４】
第三の態様、本発明の分離物質の使用
この態様は、上記の特徴を有する分離物質で電気泳動を行うための方法に関係する。この態様は、特に、上記のような少なくともｐＨ区間を含む、固定化ｐＨ勾配における等電点電気泳動に関係する。当該方法は、分離物質に、互いから分離する物質を含むサンプルを適用するステップ（ａ）、およびｐＩで互いから分離する物質について十分な時間、ｐＨ勾配に電気的ポテンシャルを適用するステップ（ｂ）を含む。その後、ｐＩが異なる個々の物質を同定し得、および／または更なる分離ステップに供し得、および／または化学誘導体（ｃｈｅｍｉｃａｌ ｄｅｒｉｖａｔｉｚａｔｉｏｎ）に供し得、および／または回収し得、および／または分析し得る。等電点電気泳動の後、しばしば、個々の分離された物質が更に分子量および／または分子サイズにより更に分離される、ゲル電気泳動を行う。等電点電気泳動およびゲル電気泳動は、典型的に、２つ互いに垂直に行う（二次元ゲル電気泳動）。
【００４５】
典型的な等電点電気泳動は、十分な分離を行うため、すなわち、ｐＩ０．０１またはそれより多いｐＩでは相違する両性化合物を分離するため、少なくとも４−５時間またはそれより多い時間、行う。そのため、電気泳動（ｆｏｃｕｓｉｎｇ）時間は、６−７時間またはそれより多い時間（一夜の電気泳動時間を含む）であり得る。
【００４６】
第四の態様、Ｍ基を有する重合化可能モノマーの使用
この態様は、上記のような分離ゲルの製造に関し上記定義のＭ基を示す重合化可能モノマーの使用に関係する。Ｍ基は、特に式Ｉの通りであり、および／または上記定義のようなｐＫａを有する。
【００４７】
第五の態様、ｐＨ＞１０での固定化および置換を含む等電点電気泳動物質
この態様は、固定化ｐＨ勾配を決定する固定化した緩衝性基を含む、等電点電気泳動分離物質、好ましくはゲル型の物質に関係する。この分離物質の特徴は、上記式ＩＩＩのモノマー（モノマー１）を含むモノマーの混合物を重合化することにより得られることであり、ｐＨ勾配がｐＨ値＞１０、例えば、ｐＨ値＞１０．５またはｐＨ値＞１１．０に至っていることである。好ましい変種では、モノマー１およびそのビス−、トリス−などの型は、５ｍｏｌ−％以上のような重要部分の、混合物の重合化可能モノマーを構成する。他の好ましい変種では、モノマー１は、式ＩＶ：
ＣＨ２＝ＣＨＲ’’ＣＯＮＲ１２Ｒ１３（ＩＶ）
［式中、
Ｒ’’は、水素またはメチルである］
に従う。Ｒ１２およびＲ１３は、上記Ｒ１０およびＲ１１と同じ意味であり、更に好ましくは、１つまたはそれより多いそれらは、−（（ＣＨ２）ｎ’−Ｏ）ｎ’’−Ｈ［式中、ｎ’は整数２−３であり、ｎ’’は整数１−５である］であり、その一方、Ｒ１２およびＲ１３の基が残っているならば、それは水素となる。ｎおよびｎ’の好ましい値は、それぞれ３および１である。エーテル酸素に結合していない炭素原子において、ある水素原子は、ヒドロキシ基で置換され得る。ｓｐ３−混成炭素原子に結合する水素は、ヒドロキシメチルで置換され得る。
【００４８】
第四の態様の分離物質の製造に使用する重合混合物はまた、本発明の第一の態様として上記考察したような式ＩＩＩまたはＩＶとは異なる他の構造を有する１つまたはそれより多い重合化可能モノマーを含み得る。典型的に他のモノマーは、他のアクリルアミドおよび他のメタクリルアミド（そのビス−、トリス−などの型を含む）である。
【００４９】
本発明の第四の態様の分離物質は、好ましくは、ｐＫａ＞１０．０、ｐＫａ＞１０．５またはｐＫａ＞１１．０の複数のｐＨ緩衝作用基を含み、その基は、ｐＨ＞１０、例えばｐＨ＞１１．０に至っている勾配の一部を決定するためのヒドロキシド型の第四級アンモニウム基を含み得るかまたは含み得ない。好ましくは、複数のｐＨ緩衝作用基の一部は、適当なｐＫａ値を有するＭ基である。
【００５０】
ｐＫａ＞１０．０、例えばｐＫａ＞１０．５またはｐＫａ＞１１．０であるｐＨ緩衝作用基は、重合混合物中にこの種の基を有する重合化可能モノマーを含むことにより導入され得る。
【００５１】
第四の態様による分離物質のｐＨ勾配は、第一の態様として上記と同じ種類となり得る。分離物質はまた、当分野に既知であり、本発明の第一の態様で記載したカソード側およびアノード側を有する。本発明の第四の態様の分離物質は、本発明の他の態様として上記考察の任意の型となり得る。
【００５２】
本発明の種々の態様では、最適の担体物質は、式ＩＩＩで定義のような、特に式ＩＶのとおりのアクリルアミドモノマーに基づくと考えられる。優先権主張出願時、予備実験により、担体物質の最良の結果は、
ＣＨ２＝ＣＨ２ＣＯＮＨ（ＣＨ２）３ＯＨ
に基づくものであることが示された。
【００５３】
本発明は、複数の非制限の特許の実施例により解説する。本発明は、添付の特許請求の範囲でより詳細に定義する。
【００５４】
実験部分
アクリルアミドアグマチンの合成
アグマチンサルフェートを、水中のバリウムヒドロキシドで脱塩し、バリウムサルフェートを水中で沈殿を形成させ、濾過した。アグマチン（５０ｍｍｏｌ）をメタノール中に溶解し、ジイソプロイルアミン（５５ｍｍｏｌ）を加え、その溶液を氷／水バスで０℃に冷却した。６０ｍｍｏｌアクリロイルクロリドを一定時間（３０分間）に渡り加え、その一方、その溶液は０℃に維持した。次いで、当該反応溶液を一夜かけて室温とした。当該溶媒を蒸発させ、その生成物を、水／メタノール勾配を有するＲＰＣ−１８カラムでフラッシュクロマトグラフィーで精製した。
アクリルアミドアグマチン合成
【化１】
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【００５５】
アクリルアミドアグマチンの重合
イニシエーターとしてＡＰＳ（アンモニウムペルサルフェート）／Ｔｅｍｅｄ）酸化還元システムを用い、アクリルアミドアグマチン（ＡＡＡ）をホモ重合化し、水中でアクリルアミド（ＡＡ）およびアクリルアミドプロパノール（ＡＡＰ）と共重合させた。
【表１】
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【００５６】
ＡＡＰにより作成されるコポリマーは、塩基性加水分解に対し、ＡＡを有するコポリマーよりも安定である。
【００５７】
アクリルアミドアグマチンの架橋
ゲルは、モノマーとしてアクリルアミドアグマチン（ＡＡＡ）およびアクリルアミドで、および架橋剤としてビスアクリルアミドで製造した。当該システムは、イニシエーターとしてＡＰＳ／Ｔｅｍｅｄを用い、水中で重合した。
【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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