(57)【要約】外因性ＤＮＡの導入なしで遺伝子治療の効果と同様の効果を達成するために、細胞の機能を変更するための、外因性タンパク質を用いた細胞膜の持続的な調節のための方法および組成物が提供される。免疫系を改変するための、ＤＮＡ配列、これらの配列を具体化するタンパク質およびポリペプチドが、開示される。この調節としては、ダウンレギュレーション、アップレギュレーションおよびアポトーシスが挙げられる。本発明は、表面を改変する方法を提供し、この方法は、以下：（１）装飾された表面を形成するために表面に結合する結合対の１つのメンバーと表面を接触させる工程；および引き続き（２）表面またはその機能を改変し得る薬剤に作動可能に連結された結合対の第２のメンバーを含む組成物と、装飾された表面を接触させる工程、を包含する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１、２、３、４、５、６、または７の配列を有する核酸によってコードされる、タンパク質。
【請求項２】
配列番号１、２、３、４、５、６、または７の配列を有する、核酸。
【請求項３】
表１のＤＮＡインサートによってコードされる、キメラタンパク質。
【請求項４】
配列番号１、２、３、４、５、６、または７の配列を有する核酸によってコードされるタンパク質を含む、細胞。
【請求項５】
配列番号１、２、３、４、５、６、または７の配列を有する核酸を含む、産生細胞。
【請求項６】
請求項５に記載の産生細胞によって産生された、産物。
【請求項７】
配列番号１、２、３、４、５、６、または７の配列を有する核酸によってコードされるタンパク質を含む、標的細胞。
【請求項８】
配列番号１、２、３、４、５、６、または７の配列を有する核酸によってコードされるタンパク質を含む、装飾された表面。
【請求項９】
配列番号１、２、３、４、５、６、または７の配列を有する核酸によってコードされるタンパク質を含むワクチン。
【請求項１０】
表面に薬剤を結合させる方法であって、該方法は、以下：
（ａ）該表面をビオチンと接触させて、装飾された表面を形成する、工程；
（ｂ）（ｉ）薬剤および（ｉｉ）アビジンまたはストレプトアビジンを含むキメラタンパク質を産生する工程；ならびに
（ｃ）該キメラタンパク質を該装飾された表面と接触させて、結合対で装飾された表面を形成する工程であって、ただし、該表面は人体の一部を構成しない、工程、
を包含する、方法。
【請求項１１】
前記表面が細胞表面である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記細胞表面が標的細胞表面である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記標的細胞表面が腫瘍細胞表面である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
標的細胞中でアポトーシスを誘導する方法であって、該方法は、請求項１０に記載の結合対で装飾された表面と標的細胞を接触させる工程を包含し、ただし、該細胞は人体の一部を構成しない、方法。
【請求項１５】
前記標的細胞がリンパ球である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
請求項１５に記載の方法であって、前記表面が、リンパ球の表面、脾臓細胞の表面、骨髄細胞の表面、内皮細胞の表面、心臓細胞の表面、膵臓小島細胞の表面、または膵臓β細胞の表面である、方法。
【請求項１７】
前記薬剤が、標的細胞中でアポトーシスを誘導する組成物を含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１８】
前記キメラタンパク質が、表１のＤＮＡインサートによってコードされる、請求項１０に記載の方法。
【請求項１９】
前記薬剤が、サイトカイン、同時刺激分子、死のリガンド、リンホタクチン、ケモカイン、または細胞増殖因子の機能的ドメインを含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項２０】
前記薬剤が、ＦａｓＬ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＴＧＦ−β、ＩＬ−２、Ｂ７、またはＣＤ４０Ｌの機能的ドメインを含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項２１】
前記薬剤が、サイトカイン、接着分子、またはケモカインの機能的ドメインを含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項２２】
前記薬剤が、インビトロで約１０日以上続く期間、前記表面に結合したままである、請求項１０に記載の方法。
【請求項２３】
前記薬剤が、インビボで約５日以上続く期間、前記表面に結合したままである、請求項１０に記載の方法。
【請求項２４】
請求項１０に記載の方法であって、該方法は、遊離ビオチンを除去するために前記装飾された表面を洗浄する工程をさらに包含し、該洗浄する工程の前に、該表面が、たった約３０分続く期間だけ、ビオチンと接触される、方法。
【請求項２５】
前記表面が、室温でビオチンと接触される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
請求項１０に記載の方法であって、該方法は、前記結合対で装飾された表面を洗浄する工程をさらに包含し、該洗浄する工程の前に、前記キメラタンパク質が、たった約４５分続く期間だけ、該装飾された表面と接触される、方法。
【請求項２７】
前記キメラタンパク質が、たった約２０分続く期間だけ、前記装飾された表面と接触される、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記キメラタンパク質が、約１０℃を超えない温度で、前記装飾された表面と接触される、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
アロ反応性の応答を減少させることが所望である脊椎動物中のドナー細胞に対するアロ反応性の応答を減少させる際の使用のための、結合対で装飾されたドナー細胞を調製する方法であって、該方法は、以下：
（ａ）該ドナー細胞をビオチンと接触させて、装飾されたドナー細胞を形成する、工程；ならびに
（ｂ）（ｉ）標的細胞中でアポトーシスを誘導する組成物および（ｉｉ）アビジンまたはストレプトアビジンを含むキメラタンパク質と、該装飾されたドナー細胞を接触させて、結合対で装飾されたドナー細胞を形成する、工程、
を包含する、方法。
【請求項３０】
前記標的細胞がリンパ球である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
腫瘍細胞に対する免疫応答を増加させることが所望である脊椎動物中の腫瘍細胞に対する免疫応答を増加させる際の使用のための、結合対で装飾されたドナー細胞を調製する方法であって、該方法は、以下：
（ａ）該腫瘍細胞をビオチンと接触させて、装飾された腫瘍細胞を形成する、工程；ならびに
（ｂ）（ｉ）同時刺激分子または炎症誘発性サイトカインの機能的ドメインおよび（ｉｉ）アビジンまたはストレプトアビジンを含むキメラタンパク質と、該装飾された腫瘍細胞を接触させて、結合対で装飾された腫瘍細胞を形成する、工程、
を包含する、方法。
【請求項３２】
結合対で装飾された腫瘍細胞を前記脊椎動物のリンパ球と接触させる工程をさらに包含する、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
（ｉ）ＦａｓＬの機能的ドメインおよび（ｉｉ）アビジンまたはストレプトアビジンを含む、活性化リンパ球中でアポトーシスを誘導するための組成物。
【請求項３４】
対宿主性移植片病を減少させることが所望である脊椎動物宿主中の対宿主性移植片病を減少させる際の使用のための、結合対で装飾されたドナー細胞を調製する方法であって、該方法は、以下：
（ａ）該ドナー細胞をビオチンと接触させて、装飾されたドナー細胞を形成する、工程；ならびに
（ｂ）（ｉ）活性化リンパ球中でアポトーシスを誘導する組成物および（ｉｉ）アビジンまたはストレプトアビジンを含むキメラタンパク質と、該装飾されたドナー細胞を接触させて、結合対で装飾されたドナー細胞を形成する、工程、
を包含する、方法。
【請求項３５】
感染に対する免疫応答を増加させることが所望である脊椎動物中で該感染に対する免疫応答を増加させるための組成物であって、該組成物は、（ｉ）同時刺激分子または炎症誘発性サイトカインの機能的ドメインおよび（ｉｉ）アビジンまたはストレプトアビジンを含む治療的に有効な量のキメラタンパク質を含む、組成物。
【請求項３６】
自己免疫または敗血症性ショックを処置または未然に防ぐことが所望である脊椎動物中の自己免疫または敗血症性ショックを処置または未然に防ぐための組成物であって、該組成物は、（ｉ）死のリガンドまたは抗炎症性サイトカインの機能的ドメインおよび（ｉｉ）アビジンまたはストレプトアビジンを含む治療的に有効な量のキメラタンパク質を含む、組成物。
【請求項３７】
障害性の造血能力を有する脊椎動物をレスキューする際の使用のための、結合対で装飾された骨髄細胞を調製する方法であって、該方法は、以下：
（ａ）ドナー骨髄細胞をビオチンと接触させて、装飾されたドナー骨髄細胞を形成する、工程；ならびに
（ｂ）（ｉ）活性化リンパ球中でアポトーシスを誘導する組成物および（ｉｉ）アビジンまたはストレプトアビジンを含むキメラタンパク質と、該装飾されたドナー骨髄細胞を接触させて、結合対で装飾された骨髄細胞を形成する、工程、を包含する、方法。
【請求項３８】
前記脊椎動物が、前記結合対で装飾された骨髄細胞の該脊椎動物への投与後、少なくとも約１００日生存する、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
脊椎動物レシピエントによるドナーの細胞成分、細胞、組織、または器官の拒絶を防止する際の使用のための、結合対で装飾された細胞成分、細胞、組織、または器官を調製する方法であって、該方法は、以下：
（ａ）ドナーの細胞成分、細胞、組織、または器官をビオチンと接触させて、装飾されたドナーの細胞成分、細胞、組織、または器官を形成する、工程；ならびに
（ｂ）（ｉ）活性化リンパ球中でアポトーシスを誘導する組成物および（ｉｉ）アビジンまたはストレプトアビジンを含むキメラタンパク質と、該装飾された細胞成分、細胞、組織、または器官を接触させて、結合対で装飾された細胞成分、細胞、組織、または器官を形成する、工程、
を包含する、方法。
【請求項４０】
脊椎動物中の免疫応答をダウンレギュレートする際の使用のための、結合対で装飾された細胞を調製する方法であって、該方法は、以下：
（ａ）細胞をビオチンと接触させて、装飾された細胞を形成する、工程；ならびに
（ｂ）（ｉ）ＴＧＦ−βまたはＩＬ−１０の機能的ドメインおよび（ｉｉ）アビジンまたはストレプトアビジンを含むキメラタンパク質と、該装飾された細胞を接触させて、結合対で装飾された細胞を形成する、工程、
を包含する、方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、細胞の機能を変更するために細胞膜の持続的な調節に関する。本発明の組成物および方法は、外因性ＤＮＡの導入なしで、遺伝子治療の効果に類似した効果を達成する。細胞機能の有用な変更は、アポトーシスの導入である。
【０００２】
（発明の背景）
細胞が推定可能な様式で挙動することを誘導することおよび被験体に有益である様式で細胞の挙動を変更することは、長い間、実験的な生物学および医学の目的であった。例えば、正常細胞が正常な機能を保持する間、所望でない細胞が、アポトーシスを起こすようにこれらの挙動を変更するように誘導され得る場合、所望でない細胞の増殖によって引き起こされた疾患を有する患者は、疾患からの解放を得る。同様に、組織拒絶細胞が、除去され得るかまたはこれらの挙動を変更され得る場合、被験体に対して外来の組織を有する移植は、好首尾であり得る。
【０００３】
遺伝子治療は、病理学的プロセスまたは生理学的プロセスを直すかまたは改変するために、選択された疾患について提案されている。一般に称される遺伝子治療において、特定のＤＮＡが、組織および器官に導入され、ここで、このＤＮＡは、状態を直すかまたは軽減する種々のタンパク質を生成する。これは、潜在的に危険な発現ベクターおよび不確かな送達効率（これは、しばしば低い）に依存して、予測可能でない治療である。さらに、遺伝子治療は、所望の治療期間後の所望な細胞もしくは組織における維持された発現、または所望でない組織または細胞における遺伝子改変の導入のような、危険な副作用を有すると考えられる。このような有害な影響に起因して、ヒトの臨床試験において発見されるように、遺伝子治療が実行される前に、多くの注意が勧告される。
【０００４】
ＤＮＡベースの遺伝子治療は、選択されたタンパク質の発現が処置を提供し得る遺伝疾患および他の病理学的状態の処置について遺伝子治療が提供する多大な可能性に起因して、過去数１０年の間、熱心な研究の対象となっている。例えば、遺伝子治療は、感染または腫瘍を扱うための免疫応答の能力を強化するか、または自己免疫もしくは外来移植片の拒絶の予防のための免疫応答をダウンレギュレートするかのいずれかのために、免疫調節のために使用され得る。過去２０年における多大な努力にも関わらず、疾患の処置に対する遺伝子治療の安全かつ効果的な適用は、非常に限定されている。遺伝子治療の明らかな欠点の中で、宿主のＤＮＡ相補体における永続的な変化；不確かな組織特異性；意図される治療の期間を超えるコードされるタンパク質の発現；ならびに高い費用、を引き起こす可能性が存在する。従って、これは、細胞および組織が外来ＤＮＡの導入なしで短い期間で目的のタンパク質を発現するように改変され得る場合、非常に有益である。
【０００５】
遺伝子治療は、一般に、細胞に核酸を送達する問題に集中しているが、細胞表面分子の重要な役割に関する多数の基本的な知識が、免疫応答（これらは、容易に到達可能であり、そして十分に理解された機能を有する）の細胞におけるシグナル伝達の研究を介して得られている。免疫応答は、外来抗原の存在に反応する、いくつかの異なる細胞型の相互作用を介して調節される。順応性の免疫応答は、病原微生物で満ちた環境における脊椎動物の生存に重要である。先天的な遺伝子欠損、化学療法剤への曝露またはヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）のようなウイルスによる感染に起因して、十分に機能的な免疫応答を欠く個体は、健康な免疫応答を有する個体が容易に抵抗する感染に感受性である。しかし、免疫系は、生物体に有益である様式で必ずしも機能するとは限らない。その調節不全は、自己免疫および腫瘍を導く。免疫系はまた、外来移植片（例えば、移植レシピエント以外の個体から採取された細胞）の移植に対する障壁として機能する。移植は、他の末期疾患における失敗した細胞、組織、または器官の交換を可能にし、一方、骨髄移植は、造血障害、悪性腫瘍、自己免疫障害、および他の疾患を処置し得る。移植が成功するには、順応性の免疫を抑制するか、またはこれらの外来抗原をネイティブとして受容するようにレシピエントの免疫系を「教育する」かのいずれかが必要である。
【０００６】
外来抗原に対する免疫応答は、自己主要組織適合複合体（ＭＨＣ）分子によって提示されるペプチドのような抗原を認識するクローン発現したＴ細胞レセプター（ＴＣＲ）を使用するネイティブなＴ細胞によって開始される。この認識反応は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）によって提供される同時刺激シグナルが伴う場合、十分なＴ細胞活性化を生じると考えられている。生産的なＴ細胞応答は、現在、３つの別のシグナルを必要とすると理解されている。シグナル１は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）上の主要組織適合複合体（ＭＨＣ）抗原／ペプチドとのＴ細胞レセプター相互作用によって生成される。シグナル２は、Ｔ細胞およびＡＰＣ上の同時刺激分子（例えば、Ｂ７／ＣＤ２８およびＣＤ４０／ＣＤ４０Ｌ）の関与によって媒介される。シグナル３は、シグナル１およびシグナル２の両方を受け取るＴ細胞およびＡＰＣによって合成されるサイトカインを介して伝達される。これらの３つのシグナルの伝達は、Ｔ細胞およびＡＰＣの、生産的な免疫応答の生成のためのエフェクターへの増殖および分化を駆動する。Ｔ細胞応答の間にこれらのシグナルのいずれかが欠如することは、Ｔ細胞アネルギーおよび免疫非応答性を生じる。例えば、腫瘍は、これらのシグナルの１つの伝達を阻害することによって、免疫系を回避する。
【０００７】
活性化の際に、Ｔ細胞は、系からの抗原のクリアランスを担う免疫学的機構を回避するエフェクター細胞に増殖および分化する。次いで、活性化Ｔ細胞のほとんどがアポトーシス媒介性「活性化誘導細胞死」（ＡＩＣＤ）を起こし、そしてエフェクター活性が鎮静する死の期間が続く。アポトーシスは、細胞がアポトーシスを起こすように運命付けるカスパーゼと呼ばれる酵素の活性化に集中する一連の細胞外シグナルおよび細胞内シグナルを含む、複雑なプロセスである。
【０００８】
外来細胞（例えば、骨髄および幹細胞）、組織（例えば、膵臓小島）、および器官（例えば、腎臓、心臓、肝臓）の移植は、選択された末期的な疾患を有する患者についての重要なかつ効率的な治療法となっている。しかし、遺伝的に異なる患者の間の外来移植片の移植（同じ種のメンバーの間の同種移植片または異なる種のメンバー間の異種移植片）は、レシピエントによる移植の免疫学的認識および拒絶を制御する能力によって制限される。
【０００９】
骨髄（ＢＭ）移植は、造血障害および自己免疫障害ならびに特定の癌についての並外れて有望な処置と見なされている。骨髄移植に対する１つの障害は、宿主のＴ細胞およびＮＫ細胞によって媒介される移植された組織の拒絶の可能性である。対宿主性移植片病（ＧｖＨＤ）は、骨髄移植の別の可能性のある有害な結果である。移植組織中のドナーＴ細胞は、宿主の重要な器官に対する免疫応答を高め得、しばしば、宿主の死を導く。従って、対宿主移植片反応およびＧｖＨＤは、骨髄移植の臨床的使用を制限し、これらは、そうでなければ種々の疾患を処置するため、そして外来の移植片拒絶を防止するために広範に使用され得る。
【００１０】
免疫抑制を引き起こす薬理学的因子は、現在、同種移植片拒絶の制御のための主要なレジメンである。このような薬物は、拒絶エピソードの重篤度を減少させる際に効果的であるが、これらは、非特異的であり、そして持続的な移植片特異的耐性の状態を作製できない。従って、レシピエントのこれらの免疫抑制剤に対する連続的な曝露は、日和見感染および悪性腫瘍の有意に増加した危険に関連している。ＢＭ拒絶を防止するためのより選択的かつより持続的な方法を開発する必要性が残っている。
【００１１】
さらに、これらの非特異的免疫抑制剤は、宿主において重篤かつ所望でない副作用を誘導し得る。これらの有害な影響は、しばしば、身体が身体自体の特定の部分を「外来」として同定しそしてＩ型糖尿病、関節炎、狼瘡、および多発性硬化症において観察されるような自己免疫を生じる順応性の免疫攻撃を始める疾患を有する患者の利益を上回る。「外来」自己抗原に耐性である免疫系を「教育」し得ることが、非常に望ましい。
【００１２】
免疫系に腫瘍細胞を生物体から除くことを「教育」し得ることはまた、非常に望ましい。Ｔ細胞媒介細胞性免疫は、腫瘍に対する最も重要な後天性の応答である。一連の実験的研究によって、腫瘍がいくつかの異なる機構によってＴ細胞媒介免疫を回避する証拠が提供されている。これらの機構としては、以下が挙げられる：ｉ）腫瘍細胞上のＭＨＣ／腫瘍抗原２分子（ｂｉｍｏｌｅｃｕｌａｒ）複合体の不十分な提示またはこのシグナル伝達における欠損に起因する、シグナル１の欠如；ｉｉ）腫瘍細胞上の同時刺激分子の非存在に起因する、シグナル２の非存在；ｉｉｉ）Ｔ細胞におけるアネルギーの誘導；およびｉｖ）アポトーシスを介するエフェクターＴ細胞の物理的除去。これらの機構の全ては、大きな腫瘍負荷を有する患者において有効であり得るが、同時刺激の欠如は、最も重要な役割を果たすと考えられている。
【００１３】
従って、治療目的のための細胞への核酸の導入なしで、細胞機能を調節するためのより迅速な、選択的かつ持続的な方法を開発する必要性が残っている。生物体への外因性核酸の導入に付帯する多数の危険を伴わずに、遺伝子治療の目的を達成する手段を開発する必要性もまた残っている。多数の細胞機能は、細胞表面でのシグナルの伝達を介して制御されるので、一般的に薬剤を表面に付着させる適用可能な方法が、有用である。このような方法の使用の中には、以下が存在し得る：核酸の細胞への導入なしでの細胞機能の調節；代替的かつ潜在的に好ましい手段による遺伝子治療の目的の達成；および自己免疫を処置することまたは対宿主移植片病を未然に防ぐことに関して応答を減少させるための、あるいは腫瘍または感染を処置することに関して応答を増加させるための生物体の免疫応答の操作。
【００１４】
（発明の要旨）
本発明は、表面を改変する方法を提供し、この方法は、以下：（１）装飾された表面を形成するために表面に結合する結合対の１つのメンバーと表面を接触させる工程；および引き続き（２）表面またはその機能を改変し得る薬剤に作動可能に連結された結合対の第２のメンバーを含む組成物と、装飾された表面を接触させる工程、を包含する。結合対は、アビジン／ビオチン、ストレプトアビジン／ビオチンまたは抗原／抗体であり得る。「アビジン」は、アビジン、およびビオチンに対して強い結合を保持するアビジンの任意のフラグメントまたは誘導体を意味する。「ストレプトアビジン」は、ストレプトアビジン、およびビオチンに対する強い結合を保持するストレプトアビジンの任意のフラグメントまたは誘導体を意味する。逆に、「ビオチン」は、アビジンおよびストレプトアビジンに対する強い結合を保持するビオチンの任意のフラグメントまたは誘導体を意味する。
【００１５】
表面が細胞表面である場合、薬剤は、アポトーシスを誘導する任意の化合物；免疫系をダウンレギュレートする任意の薬剤；免疫系をアップレギュレートする任意の薬剤；細胞追跡のための任意の接着分子；任意の増殖因子；またはリシンもしくは植物毒素のような毒素に結合された抗体であり得る。表面が細胞表面である場合、工程１の接触は、「装飾された細胞」を生成する。
【００１６】
薬剤がアポトーシスを誘導するように選択される場合、薬剤は、ＦａｓＬ、ｍＦａｓＬ、ＴＲＡＩＬ、ＴＮＦ−ａ、ＴＷＥＡＫなどのような死誘導分子であり得る。薬剤が、免疫系をダウンレギュレートするように選択される場合、薬剤は、ＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＴＧＦ−βなどのような抗炎症性サイトカインであり得る。薬剤が、免疫系をアップレギュレートするように選択される場合、薬剤は、Ｂ７、ＣＤ４０Ｌなどのような同時刺激分子またはＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、リンホタクチン（ｌｙｍｐｈｏｔａｃｔｉｎ）およびケモカインのような炎症誘発性のサイトカインであり得る。
【００１７】
好ましい実施形態において、結合対の第１のメンバーはビオチンであり、結合対の第２のメンバーは、ストレプトアビジンおよび死誘導分子を含むキメラタンパク質であり、そして表面は、標的細胞、組織、器官または腫瘍を含む。
【００１８】
より好ましい実施形態において、結合対の第１のメンバーは、Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチンであり、結合対の第２のメンバーは、ＳＡ−ｍＦａｓＬであり、そして表面は、Ｆａｓレセプターを提示する細胞を含む。結合対の第２のメンバーを構築する際に、ストレプトアビジンは、組換え遺伝子技術を介してＦａｓＬの細胞外部分に融合され、そしてキメラタンパク質ＳＡ−ｍＦａｓＬが生成される。
【００１９】
この構築物は、免疫系を調節する方法において使用され、ここで、処置される被験体は、まずビオチンが投与されて、装飾された細胞を形成し、その後ＳＡ−ｍＦａｓＬの投与が続いて、キメラの装飾された細胞を形成する。組織、器官または腫瘍中の、ビオチン化されそしてＦａｓを発現する細胞のみが、アポトーシスを起こす。一般に、これらの細胞は、免疫媒介傷害を起こす細胞を含む。
【００２０】
本発明の別の局面において、免疫系のダウンレギュレーションから恩恵を受ける被験体は、まずビオチンが投与されて、装飾された細胞を形成し、次いで、アビジンまたはストレプトアビジンを含む構築物およびダウンレギュレーション分子が投与される。免疫系のダウンレギュレーションから恩恵を受ける被験体としては、自己免疫、対宿主移植片病、アレルギー、敗血性ショックおよび脈管系の病気に罹患する被験体が挙げられる。組織または器官の移植片を受ける被験体はまた、免疫系のダウンレギュレーションから恩恵を受ける。
【００２１】
本発明の別の局面において、免疫系のアップレギュレーションから恩恵を受ける被験体は、まずビオチンが投与されて装飾された細胞を形成し、次いで、アビジンまたはストレプトアビジンを含む構築物およびアップレギュレーション分子が投与される。免疫系のアップレギュレーションから恩恵を受ける被験体としては、新生物形成または感染性疾患に罹患する患者が挙げられる。
【００２２】
本発明の別の局面において、全身的効果は、局所的に処置され得る標的の単離または局所的に処置され得る標的の選択によるエキソビボでの細胞のビオチン化によって回避され、その後、引き続く第２の接触を用いる患者への装飾された細胞の再導入が続く。
【００２３】
本発明の別の局面において、結合対のメンバーは、お互いに共有結合を形成する。好ましい局面において、結合対の第１のメンバーはシステイン残基を含み、そして結合対の第２のメンバーはシステイン残基を含む。２つのメンバーは、結合対の第１のメンバーと結合対の第２のメンバーとの間のジスルフィド結合の形成を嫌う条件下にまず一緒に配置される。引き続く工程において、２つのメンバーは、結合対の第１のメンバーと結合対の第２のメンバーとの間のジスルフィド結合の形成を好む条件下に配置される。
【００２４】
本発明の別の局面において、結合対の第１のメンバーは、細胞表面、ウイルス、ガラス粒子の表面、多糖粒子の表面またはプラスチック粒子の表面と接触されて、装飾された表面を形成する。次いで、装飾された表面は、結合対の第２のメンバーと接触され、第２の装飾された表面を形成する。第２の装飾された表面を含む細胞、ウイルスまたは粒子は、治療、診断、細胞分類または細胞同定のために、インビトロまたはインビボのいずれかで、生物体の細胞または細胞成分と接触される。
【００２５】
ストレプトアビジンと融合したＦａｓＬの細胞外部分を含む組換え核酸（ＳＡ−ｍＦａｓＬ）が、提供される。次いで、以前にインビボでビオチン化された細胞表面に接着された遺伝子産物が提供される。Ｆａｓ発現細胞の持続的除去のための遺伝子産物の使用のための方法が、教示される。
【００２６】
本発明の方法は、標的化細胞への任意のタンパク質の持続的結合を引き起こすため、細胞遺伝物質の改変なしでＤＮＡ遺伝子治療の結果を模倣するために改変され得る。標的細胞へのタンパク質の持続的結合は、タンパク質レベルでの遺伝子治療として考えられ得る。
【００２７】
（発明の詳細な説明）
一般的に使用されるような遺伝子治療（すなわち、ゲノムへの外来ＤＮＡの導入および組込み）に関連する著しい問題に起因して、遺伝子治療の結果、すなわちＤＮＡ導入の制限を伴なわない細胞機能の長期永続する改変を達成するための方法が、探索されていた。遺伝子治療の利点が細胞への核酸の送達よりも外因性タンパク質の送達によって獲得され得るか否かに関する問題が生じた。治療分子の一過性提示または長期持続する提示を達成するための細胞膜の改変を安全に可能にする方法が、臨床における広範囲の適用を有し得る。本願に開示されるように、出願人は、迅速な細胞表面発現の追加された利点を有する方法を発見し、そして本明細書中に開示する。
【００２８】
アビジンまたはストレプトアビジンとビオチンとの熱力学的に望ましい会合に起因して、形成される複合体は、核酸の導入を必要とする遺伝子治療によって誘発される効果の期間と競合し得るかまたはこの期間をしのぐ期間、細胞の特徴を変更させ得る。本発明は、表面に薬剤を付着させる方法を教示する。このような薬剤は、任意の一連の免疫調節分子（例えば、死のリガンド、同時刺激分子およびサイトカイン）（例示のためであって、限定ではない）であり得る。このような薬剤を表面（特に、細胞表面）に付着させることが有用である。なぜなら、このような薬剤は、同種異系移植拒絶および異種移植拒絶、対宿主性移植片病を回避するために自己反応性細胞、アロ反応性（ａｌｌｏｒｅａｃｔｉｖｅ）細胞および炎症性細胞を物理的または機能的に排除するために、そして自己免疫、敗血症性ショック、炎症、アレルギー、感染、新形成、および脈管疾患を処置するために、使用され得るからである。さらに、本方法は、治療目的のための選択された造血細胞のホーミングに関して、インビボ輸送のための細胞の表面上に規定された機能を有するタンパク質を提示するために使用され得る。
【００２９】
（定義）
本願の目的のために、以下の用語は、これらの定義を有する：
「薬剤」とは、重要な生物学的応答を誘発する組成物、あるいは疾患の診断、予防もしくは処置、または細胞、細胞成分またはウイルスの分類もしくは同定において有用である組成物を意味する。
【００３０】
「結合対」とは、互いに容易に結合する２つの組成物；互いに親和性を有する２つの組成物；またはそれらの会合が、熱力学的および動力学的に好ましいものである２つの組成物を意味する。
【００３１】
「細胞表面」とは、当該分野における通常の意味を有し、細胞膜のリン脂質二重層およびこの二重層と直接または間接的に会合する分子を含む。
【００３２】
「装飾した表面（装飾された表面）」とは、結合対のメンバーが結合する表面を意味する。
【００３３】
「発現」とは、当該分野における通常の意味に加えて、細胞上または細胞内での機能的タンパク質の配置を意味する。
【００３４】
「プラスチック」とは、固体表面に形成され得るポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレンまたは任意の他のポリマーを意味する。
【００３５】
「タンパク質」とは、ネイティブ、非ネイティブ、合成または共有結合によって改変された、タンパク質またはポリペプチドを意味する。
【００３６】
「表面」とは、細胞表面、ウイルスの表面、粒子の表面（例えば、ガラス粒子の表面、多糖粒子の表面、プラスチック粒子の表面）、リン脂質二重層の表面、または固体マトリックスの表面を意味する。
【００３７】
「標的細胞」とは、アポトーシスに対して標的化される細胞、すなわち、アポトーシスを誘導することが望まれる細胞を意味する。
【００３８】
免疫応答の調節の重要な適用は、外来移植片拒絶を回避するため、自己免疫およびＧＶＨＤを処置または回避するための、同種異系抗原、異種抗原、および自己抗原に対する寛容の導入である。Ｔ細胞は、適応免疫（これは、生成する応答のために３つの異なるシグナル（シグナル１、２および３）を必要とする）の最も重要な細胞である。シグナル１は、ＡＰＣ上でのＭＨＣ／ペプチド複合体とのＴ細胞レセプターの相互作用によって生成される。シグナル２は、同時刺激分子（例えば、Ｔ細胞およびＡＰＣ上でのＢ７／ＣＤ２８およびＣＤ４０／ＣＤ４０Ｌ）の関与によって媒介される。シグナル３は、シグナル１およびシグナル２の両方によって受けられるＴ細胞およびＡＰＣによって作られるサイトカインを介して変換される。抗原に対するＴ細胞応答の間のこれらのシグナルのいずれかの欠如は、寛容が誘導される最も効果的な機構の１つとしてはたらき得る。活性化の際、Ｔ細胞は、１２００倍までのクローンの拡大を可能にする抗原駆動の増殖状態を引き起こす。次いで、死までの期間が、その間に９５％より多くの活性化Ｔ細胞がアポトーシス（プログラムされた細胞死）を引き起こし、一方、残りの細胞が系の中の抗原量が減退するにつれ記憶細胞に分化するという期間を確保する。
【００３９】
アポトーシスまたは「プログラムされた細胞死」は、多細胞生物の発生およびホメオスタシスの両方に中心的な役割を果たす。アポトーシスは、いくつかの「死のレセプター」とそれらのリガンド（これは、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）レセプター／リガンドスーパーファミリーに属する）との間の複数の相互作用からなる最終的なエフェクター機構に収束する複数の独立したシグナル伝達経路によって誘導され得る。最も特徴付けられた死のレセプターは、ＣＤ９５（「Ｆａｓ」）、ＴＮＦＲ１（ｐ５５）、死のレセプター３（ＤＲ３またはＡｐｏ３／ＴＲＡＭＯ）、ＤＲ４およびＤＲ５（ａｐｏ２−ＴＲＡＩＬ−Ｒ２）である。最終的なエフェクター機構は、カスパーゼ群のタンパク質によって媒介される。
【００４０】
同時係属中の国際出願ＰＣＴ．ＵＳ０１／０２２５６（その教示は、参考として援用される）において、Ｆａｓ／ＦａｓＬ誘導されたアポトーシスが、免疫学的に特典が与えられた部位（例えば、免疫抗原からの中枢神経系、精巣および眼）を保護する際に中心的な役割を果たすことを開示する。例えば、これらの部位へ移植されたの同種異系組織および異種組織は、拒絶に対して耐性である。非常に重要なことは、主要な役割のアポトーシスが、活性化誘導性の細胞死（ＡＩＣＤ）を介して免疫系のホメオスタシスの維持に役割を果たすことである。ＡＩＣＤは、Ｆａｓ／ＦａｓＬ相互作用によって伝達されるアポトーシスシグナルによって主に媒介される。Ｆａｓは、４５ｋＤａのであり、システインに富む細胞外ドメインからなるＩ型の細胞表面タンパク質であり、細胞死を伝達する。Ｆａｓは、ＦａｓＬ（約４０ｋＤａのＩＩ型膜タンパク質）との相互作用によってエフェクター機能を媒介する。Ｔ細胞は、体の主な細胞型であり、活性化の際にＦａｓＬを発現する。この分子の発現は、アポトーシスを受け易い活性化Ｔ細胞を作製する（これは、Ｆａｓが同じ細胞上でＦａｓＬと係合するような、オートクライン様式で誘導される）。活性化Ｔ細胞上のＦａｓはまた、別の活性化細胞上のＦａｓＬとパラクライン様式で相互作用し得る。Ｆａｓ／ＦａｓＬ系によって媒介されるアポトーシスＴ細胞死のこれら２つの経路は、抗原刺激されるＴ細胞クローンのサイズを調節するためのホメオスタシス機構としてはたらく。この系の調節解除は、免疫学的障害を引き起こす。
【００４１】
Ｆａｓ／ＦａｓＬ媒介アポトーシスの分子機構は、非常に詳細に研究されている。Ｆａｓとの３つのＦａｓＬ分子の結合によって、ｃ末端の死のドメイン（ｄｄｓ）を介してＦａｓレセプターの３量体化が誘導され、これは次いで、アダプタータンパク質ＦＡＤＤ（死のドメインを有するＦａｓ結合タンパク質）およびカスパーゼ−８をリクルートする。この３分子複合体（Ｆａｓ／ＦＡＤＤ／カスパーゼ−８）のオリゴマー化によって、次に、タンパク質分解を介して他の下流のカスパーゼ（カスパーゼ−３を含む）を活性化することによってアポトーシスプロセスを開始する、タンパク質酵素カスパーゼ−８の活性カスパーゼ−８へのタンパク質分解性切断が引き起こされる。
【００４２】
活性化Ｔ細胞のアポトーシスによって、同種異系移植および異種移植（骨髄移植ならびに他の器官の移植および細胞移植を含む）に対する寛容が引き起こされる。活性化Ｔ細胞のパージングはまた、アレルギーおよび他の免疫誘導疾患の徴候を緩和する。後者に含まれるのは、多発性硬化症、エリテマトーデス、サルコイドーシスおよび慢性関節リウマチのような自己免疫障害である。多くの障害（いくつかの腫瘍を含む）は、障害の持続を導くリンパ球機能に依存する。多くの造血障害は、外来幹細胞に対する寛容を誘導するように免疫応答が調節され得る場合、骨髄幹細胞移植を用いて処置され得る。これらの障害のうち、白血病、リンパ腫、再生不良性貧血、鎌状血球およびクーリー貧血などがある。これらの障害の全ては、活性化免疫細胞（Ｔ細胞を含む）のアポトーシスによって永久的にまたは一時的に制御され得る。
【００４３】
タンパク質の迅速な細胞表面の提示を用いる免疫調節のための戦略が提供され、この戦略は、結合対の１つのメンバーを用いた免疫調節タンパク質の機能的部分をコードするキメラｃＤＮＡの構築を含む。表１は、このような構築物の要約である。構築物の選択は、例えば、以下のような因子に基づき得る：適応免疫を刺激する外来抗原の性質；要求される緩和が、一時的または永久的であるか否か；死へのコミットメントが所望されるかまたはアポトーシスのさらなるダウンレギュレートが好まれるか否か。以下に列挙される構築物は、本発明の代表のみであり、限定ではないことが、理解される。例えば、これらの構築物は、コアストレプトアビジン（ＣＳＡ）を用いて作製された。ストレプトアビジンのフラグメントおよび誘導体ならびにストレプトアビジン分子全体は、等価な構築物を作製するために用意に使用されるようなものであり得る。従って、本明細書において、ＳＡは、一般的に、ストレプトアビジン全体、フラグメントのストレプトアビジンまたは誘導体化されたストレプトアビジンを意味するために使用される。当業者は、過度の実験なしに、本発明の教示に従って、公知の免疫調節分子に連結された結合対の第１のメンバーおよび結合対の第２のメンバーを含む構築物を容易に作製し得る。
【００４４】
【表１】
2004524806.tif 000002
ＤＮＡ構築物によってコードされるキメラ組成物の産生のための好ましい産生細胞は、市販されるＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ系である。しかし、キメラ組成物を産生する当業者は、多くの発現系およびベクターが、本発明のキメラ組成物の産生に適切であることを認識する。これらの他の系に含まれるのは、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、酵母、および哺乳動物細胞の培養物である。
【００４５】
同時係属中の国際出願ＰＣＴ／ＵＳ００／３４５５４（その教示は、参考として本明細書中によって援用される）に開示される発明は、リンパ球および腫瘍細胞のアポトーシスに関する。本発明は、結合対のカップリングを介して細胞表面上で目的の治療剤と共に免疫調節分子を発現させる改善された方法を開示する。アビジン／ビオチンまたはストレプトアビジン／ビオチンは、本発明において有用な結合対の例である。改変されたＦａｓＬタンパク質は、そのような組成物の例として詳細に記載される。骨髄細胞、内皮細胞、脾細胞、膵臓小島のような組織、および心臓のような器官は、細胞表面の変更を受け易い細胞の例である。本方法が、抗原に対する免疫応答をダウンレギュレートまたはアップレギュレートするために使用され得ることが、ここで見出された。従ってこの方法は、外来移植片拒絶の予防のため、自己免疫の予防もしくは処置のため、ならびに腫瘍および感染に対する免疫応答のアップレギュレートのために、使用され得る。さらに、免疫調節機能を有するタンパク質以外のタンパク質が、全身性副作を引き起こすことなく細胞に結合され得ることもまた、提供される。
【００４６】
本発明をここで、特別の例を用いて記載する。本明細書中に記載される実験手順は、細胞、組織または器官への薬剤の永続性の結合「発現」のための組成物および方法の代表である。詳細に開示される１つの実施形態は、キメラ組成物のＳＡ−ｍＦａｓＬであり、これは、コアストレプトアビジンタンパク質をコードするＤＮＡとＦａｓＬをコードするＤＮＡの融合物との融合および適切な産生細胞中でのキメラ組成物（配列番号１）を発現させることによって産生される。
【００４７】
標的細胞は、エキソビボまたはインビボで最初にビオチン化され、次いで、ＳＡ−ｍＦａｓＬは、アポトーシスを引き起こす（例えば、ドナー特異的の長期の生存および／または寛容の誘導を引き起こす）ために投与される。詳細に記載される別の例は、本発明の方法に従って処理された免疫細胞を伴なう膵臓小島細胞の移植、引続く膵臓インスリン産生の永続である。別の例は、異所性心臓移植の長期生存である。他の例もまた、提供される。以下の実施例の教示に従って、当業者は、他の細胞の膜機能を変更するためにこれらを容易に適用し得る。
【００４８】
あるいは、このようなキメラ組成物をコードするＤＮＡが、エキソビボまたはインビボで適用され得、永久的な変更（例えば、活性化Ｔ細胞のアポトーシス）を導く。
【００４９】
以下の実施例は、本発明が実施に適用される場合に本発明を例示するために開示され、添付の特許請求の範囲の範囲を制限しない。
【００５０】
（実施例１．キメラタンパク質の産生のためのコアストレプトアビジンのクローニング）
本発明は、細胞への核酸の導入を伴なわない、外因性タンパク質を発現させるための細胞表面の改変のための技術を開示し、この技術は、ｉ）コアストレプトアビジンおよび所望のタンパク質の機能的ドメインからなるキメラ分子の生成、ｉｉ）ビオチンを用いた細胞膜の改変、およびｉｉｉ）キメラ分子を用いたビオチン化細胞の装飾を含む（図１）。これを達成するために、ストレプトアビジンをコードするゲノムＤＮＡを、ＰＣＲにおいて特異的プライマーを用いてＳ．ａｖｉｄｉｎｉｉからクローン化した。５’プライマーおよび３’プライマーを、設計して、三次元のフレキシビリティ、適切な折り畳みおよび機能を可能にする選択された制限酵素部位およびアミノ酸のための配列を組込んだ。この遺伝子を、ＴＡクローニングベクターにクローン化し、配列決定し、そして高収量の昆虫発現系（ＤＥＳｔｍ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）における発現のためにｐＭＴ／Ｂｉｐ／Ｖ５−ＨｉｓＡベクターにサブクローン化した。
【００５１】
（実施例２．産生細胞における発現のためのキメラ遺伝子の構築）
総ＲＮＡを、ヒト細胞株または末梢血細胞から調製し、このＲＮＡの２ｎｇを、逆転写酵素に対するプライマーとしてオリゴ（ｄＴ）１８を用いて第１鎖のＤＮＡに逆転写した。次いで、このｃＤＮＡ調節物の１／１０を、８つの別々のＰＣＲ増幅において、ヒトＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＴＧＦ−β、ＦａｓＬ、ＴＮＦ−α、Ｂ７．１およびＣＤ４０Ｌについての３セットのセンスプライマーおよびアンチセンスプライマーを用いて増幅した。５’プライマーおよび３’プライマーを、クローニングのための制限酵素部位および産物の適切な折り畳みを促進するためのいくつかのアミノ酸残基を含むように設計した。これらのプライマーは、目的のこれらの全遺伝子について予想サイズのＤＮＡバンドを増幅した。次いで、これらのＰＣＲ産物を、ＴＡクローニングベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）にクローン化し、そしてこの材料から調製したライブラリーを、ＰＣＲ増幅において同じオリゴヌクレオチドプライマーを用いてスクリーニングした。陽性のクローンを、適切な制限酵素を用いて消化し、表１に示す各遺伝子についての予想サイズのフラグメント（図２）を放出させた。示した全クローンを配列決定し、予想された特徴を有することを見出した。次いで、これらのクローンを、Ｎ末端タンパク質またはＣ末端タンパク質のいずれかとしてｐＭＴ／Ｂｉｐ／Ｖ５−ＨｉｓＡベクター中でＣＳＡに融合させ、正確な三次元構造および機能を促進させた（表１の配列番号を参照のこと）。
【００５２】
キメラタンパク質を、高収量の昆虫発現系（ＤＥＳｔｍ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）における発現のためにｐＭＴ／Ｂｉｐ／Ｖ５−ＨｉｓＡベクターに、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ＢｉＰ分泌シグナルとインフレームでサブクローン化した。組換えベクターを、リン酸カルシウムを用いてＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ  Ｓ２細胞に一過性にトランスフェクトした。次いで、細胞を硫酸銅を用いてパルスし、キメラタンパク質の発現を駆動する誘導性メタロチオネインプロモーターを活性化させた。培養培地を、活性化後の種々の時間に収集し、硫酸銅を除去するために透析し、そしてＥＬＩＳＡおよびウエスタンブロットを用いてキメラタンパク質について分析した。
【００５３】
（実施例３．細胞のビオチン化、組換えタンパク質の発現、およびインビボ発現の時間動力学）
このタンパク質に基づくアプローチの治療的使用は、生理学的条件下の細胞、組織または器官の好首尾のビオチン化ならびにＣＳＡおよび治療能力を有する分子からなる細胞キメラタンパク質のこれらの細胞への結合を必要とする（図１）。
【００５４】
ビオチン化のための最適条件を、最初に決定した。単一細胞懸濁物を、ラットの脾臓または骨髄から調製した。１００万個の細胞を、室温で３０分間、生理食塩水中、種々の濃度（１．５〜１５０μＭの範囲）のＥＺ−Ｌｉｎｋビオチン（Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチン、Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、Ｉ１の商標名）中でインキュベートした。遊離のビオチンを除去するために徹底的に洗浄した後、細胞を、培養するか、またはビオチン化のレベルを評価するためにフルオレセイン（ＡＰＣ）標識ストレプトアビジンで染色するために使用した。１００％の細胞が、５μＭ  ビオチン濃度においてビオチンについて陽性であった（データは示さず）。
【００５５】
能動的に分裂する細胞上でビオチンがどれぐらいの期間存続するか、およびビオチンの至適用量（１５μＭ）を決定するために、ビオチン化脾細胞をＴ細胞分裂促進因子であるコンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）の存在下で培養して、Ｔ細胞増殖を刺激した。ＣｏｎＡ刺激した細胞および未刺激の細胞を、培養後、異なる時点で回収し、そしてＡＰＣストレプトアビジンで染色し、そしてフローサイトメトリーで分析した。ストレプトアビジンなしの脾細胞およびビオチンのみの脾細胞をバックグランド染色として用いた。５０％を超える細胞が、試験した最長時点である２０日間、表面上でビオチンを維持した。能動的に分裂している細胞の大きい（有意な）割合（＞３５％）がまた、この時点でビオチンを発現した。次に、これを試験して、ビオチン化が脾臓の増殖を妨害するか否かを決定した。９６タイタープレートにおいて異なる日数の間、２．５μｇ／ｍｌのＣｏｎＡで脾臓を活性化した。培養物をトリチウム化したチミジンでパルスし、収集し、そして増殖の指標としてＤＮＡ関連放射線活性について分析した。ビオチン化された脾臓は、操作されていない脾臓と比較して類似の反応速度論およびレベルを有するＣｏｎＡ活性に応答して増殖した。このことは、１．５〜１５μＭの間の範囲の濃度でのビオチン化は、細胞の増殖機能に有意な影響を有さない（データ示さず）ことを示唆する。
【００５６】
培養物中のビオチン化血管内皮細胞を試験して、細胞表面に対するビオチンの時間反応速度論を決定した。このセットの実験についての理論的根拠は、心臓血管のような組織において代謝回転が最小である分化した細胞の表面上にビオチンがどれくらいの期間存続するかを試験することである。ラットの動脈内皮細胞の単層培養を、室温で３０分間、６ウェルプレートにおいて１５μＭ濃度のビオチンで処理した。細胞を大々的に洗浄し、そして培養物の１ウェルをビオチン化後、異なる時点でトリプシンで消化した。単一細胞懸濁液を調製し、そしてＡＰＣ−ストレプトアビジンを用いてフローサイトメトリーで分析した。内皮細胞の大きい（有意な）割合（＞１５％）が、培養物中で、試験した最長期間である２０日間ビオチンを発現した。
【００５７】
脾細胞を免疫調節機能を有する組み換えタンパク質の１つ（コアストレプトアビジンと融合したＦａｓＬの細胞外部分（ＳＡ−ｍＦａｓＬ））の発現について試験した。脾細胞を上記のようにビオチン化し、２０分間１００ｎｇのＳＡ−ｍＦａｓＬとともにインキュベートし、そして規定の期間にわたって３７℃インキュベーター内で維持し、ここで細胞を抗ＦａｓＬ抗体で染色した。ほとんど全ての細胞が５日目にＳＡ−ｍＦａｓＬを発現し、そして多数の（有意な）細胞（＞２５％）が、分析した最終時点である１０日目にＳＡ−ｍＦａｓＬを発現した（図４）。
【００５８】
ＳＡ−ｍＦａｓＬのような免疫調節分子を使用するための提案されたタンパク質ベースの遺伝子治療の目的の１つは、外部環境におけるＢＭ細胞の移植を容易にすることである。従って、ＢＭ細胞を、ＦａｓＬのビオチン化およびタンパク質レベルの発現について試験した。Ｂｍ細胞を標準的なプロトコールを用いて、ラットの大腿骨および頸骨から収集した。単一細胞懸濁物を調製し、次いで上記条件下でビオチン化した。ビオチンを除くために徹底的に洗浄した後、ＢＭ細胞を氷上で２０分間ＳＡ−ｍＦａｓＬ（５０ｎｇ／細胞１００万個）を用いて処理した。次いで細胞を徹底的に洗浄して遊離のＳＡ−ｍＦａｓＬを除き、そしてフローサイトメトリー中で、ＦａｓＬに対する抗体（ＰＥ−ＭＦＬ４）を用いて染色した。図５に示すように、１００％のＢＭ細胞がＳＡ−ｍＦａｓＬを発現した。
【００５９】
（実施例４．インビボにおける発現の時間反応速度論）
インビボで長期間にわたって細胞膜に組み込みんで存続する親油性色素（ＣＦＳＥ）で脾細胞を標識し、ビオチンまたはＳＡ−ｍＦａｓＬを発現するように改変し、そして同系の動物に静脈内注射した。脾細胞を注射後異なる時点で回収し、そしてフローサイトメトリーでの分析のためにＡＰＣ−ストレプトアビジンまたは抗ＦａｓＬ抗体で染色した。図３に示すように、インビボ注射後、試験した最長時点である１０日間、４０％のＣＦＳＥ陽性細胞の表面上にビオチンは検出された。同様に、ＳＡ−ｍＦａｓＬを発現するように改変されたＣＳＦＥ陽性細胞は、注射の５日後、この分子の発現について陽性（２６％）であった。まとめて考慮すると、これらのデータは、このアプローチがインビボにおける長期のタンパク質の発現について目的の機能を果たすことを可能にすることを明確に実証する。
【００６０】
（実施例５．免疫調節分子を発現する標的細胞を用いる、インビトロにおけるアロ反応性免疫応答のブロック）
のアプローチを用いて目的の免疫調節性タンパク質を発現するように改変された細胞を用いて、アロ反応性応答を防ぐことが可能か否かを試験するため、アロ同種異型の脾細胞を、ＳＡ−ｍＦａｓＬを発現するように改変し、そしてインビトロ増殖アッセイにおける標的として用いた。要するに、Ｆ３４４ラット由来の脾細胞をビオチン化し、培養上清またはＳＡ−ｍＦａｓＬで処理した。非機能的構築物でトランスフェクトした細胞由来の上清をコントロールとして使用し、そして本出願全体にわたって、Ｓ２上清と呼ぶ。次いでこれらの細胞を照射し、そして標準的な５日混合リンパ球培養物におけるアロ反応性応答に対する刺激因子として用いた。ＰＶＧ．ＩＵラットのリンパ節から収集したリンパ球をレスポンダーとして用いた。ＳＡ−ｍＦａｓＬを発現する標的は、ＳＡ−ｍＦａｓＬなしの培養物に比べて、リンパ球の増殖反応を完全にブロックした。これらのデータは、ビオチン化脾細胞が、抗原提示細胞として働くこと、および脾細胞の表面上で発現されたＳＡ−ｍＦａｓＬが、インビトロでアロ反応性の免疫応答をブロックすることを実証する。さらに、これらのデータは、ビオチン化が細胞の抗原提示機能を妨害しないことを実証する。なぜならビオチンで装飾されＳ２コントロール上清で処理された細胞はリンパ球を刺激する能力を妨害しないからである。従って、これらのデータは、細胞の表面上のタンパク質の発現が細胞の機能も発現された分子の機能も妨害しないことを実証する。これは、免疫調節の手段としてタンパク質ベースの発現を確証するのにおいて重要な工程である。
【００６１】
（実施例６．ＳＡ−ｍＦａｓＬタンパク質の毒性）
一般に、Ｆａｓを発現するほとんどの細胞（例えば、活性化リンパ球、または高速分裂する細胞、例えば肝細胞、または所望されない細胞、例えば、腫瘍細胞）が活性化される。しかし、ＳＡ−ｍＦａｓＬが毒性であるか否かを確認する必要がある。Ｆａｓに対する抗体は、静脈内注射または複腔内注射された場合、選択されたマウス株において劇症肝障害を誘導することが示されている。これは、肝細胞に対するＦａｓの発現に起因すると考えられる。本発明のキメラタンパク質が同様に毒性であるか否かを確認するために、２×１０７のビオチン−ＳＡ−ｍＦａｓＬ保有脾細胞、または８×１０７のビオチン−ＳＡ−ｍＦａｓＬ保有骨髄細胞を、ラットに複腔内注射または静脈内注射した。この動物を１０日間入念にモニターし、次いで全体的な病理的分析および解剖的分析のために屠殺した。表２に示されるように、細胞−ビオチン−ＳＡ−ｍＦａｓＬを注射した動物には、顕著な病理は認められなかった。
【００６２】
【表２】
2004524806.tif 000003
（実施例７．ＦａｓＬ発現ＢＭ細胞は、致死的に照射されたラットをレスキューする）
このアプローチの主な前提は、ＤＮＡベースの遺伝子治療に対する代替としてタンパク質ベースの発現を用いることである。免疫回避のためにＢＭ細胞を改変するこのアプローチによるＢＭ細胞拒絶の防止は、この条件を満たす。骨髄細胞をＰＶＧ．Ｒ８またはＡＣＩラットから回収して、ビオチンまたはＳＡ−ｍＦａｓＬを発現するように改変し、そして致死的に（９５０ｃＧｙ）照射したラットに対して０．７〜１×１０８細胞／動物で投与した。細胞を投与していない照射動物をコントロールとして用いた。細胞を投与していない動物全てが８〜９日以内に死んだ（ｎ＝６）が、ｂｉｏ（ビオチン）またはＳＡ−ｍＦａｓＬを発現するように操作したＢＭ細胞を投与された全ての動物（ｎ＝１２）は、１００％キメラであり（図６）、そして期限なく（＞１００日）生存した。これらのデータは、ＢＭ細胞が、その長期移植能力に影響することなく、治療目的の目的のタンパク質を発現するように、この新規なアプローチによって安全に操作されていることを明確に実証する。
【００６３】
（実施例８．ＳＡ−ｍＦａｓＬ発現ＢＭ細胞は、インビボでアロ反応性応答をブロックする）
ＳＡ−ｍＦａｓＬのような免疫刺激性分子を発現するＢＭ細胞を用いて、インビボにおいて標的細胞として異寛容性（アロ寛容性）（ａｌｌｏｔｏｌｅｒａｎｃｅ）を誘導した。ＰＶＧ．１ＵまたはＷＦラットに、ＦａｓＬを発現するそれぞれ、０．７−２×１０８のＰＶＧ．Ｒ８もしくはＡＣＩ  ＢＭ細胞、またはコントロールＳ２上清で処理したビオチン化細胞をｉ．ｖ．で投与した。腸間膜リンパ節を注射の６０日後に収集し、そして、標準的混合リンパ節アッセイにおけるＰＶＧ．Ｒ８またはＡＣＩ細胞に対するレスポンダーとして用いた。ドナー抗原に対する応答はまったく存在しなかった。このインビボ免疫非応答性は、第三部分（ｐａｒｔｙ）抗原に対する応答がインタクトであったのでドナー特異的であった。この効果はＳＡ−ｍＦａｓＬ特異的であった。なぜなら、コントロールＳ２上清で処理したＰＶＧ．Ｒ８細胞を投与された動物が、ナイーブな動物の応答に比べて、ドナーおよび第三部分抗原に対して正常な応答を生じたからである（図７）。これらのデータは、インビトロのブロック反応を確証し、そしてインビボにおけるこのアプローチの免疫調節性効果を直接証明する。
【００６４】
（実施例９．血管内皮上でＣＳＡタンパク質を発現するための心臓の改変）
本発明の方法は、器官上でタンパク質ベースの発現をもたらすように適用されてきた。目的のタンパク質をエキソビボで発現するための、宿主でなく、器官の改変は、選択された設定における所望の治療アプローチを示す。エキソビボ操作は、宿主が処置された場合に生じ得る合併症を回避する。この合併症は、所望されない副作用を含み得るがこれに限定されない。従って、３７℃でＡＣＩラットおよびＢ１０．ＢＲマウスにおいて、ビオチン、ストレプトアビジン、およびＳＡ−ｍＦａｓＬを発現する試験系として心臓を用いた。要するに、切り出した心臓の大動脈を、改変Ｋｒｅｂｓ−Ｈｅｎｓｅｌｅｉｔ溶液（ＫＨ）を用いて、９６ｍｍＨｇの圧力でＬａｎｇｅｎｄｏｒｆｆ逆向性灌流システム（ｒｅｔｒｏｇｒａｄｅ  ｐｅｒｆｕｓｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ）においてカニューレ挿入して、還流した。心臓収縮力を、左心室に挿入したラテックスバルーンでモニターした。ラット心臓についての灌流プロトコールは以下であった：心機能の安定化をさせるためにＫＨで２０分；５μｇ／ｍｌ  ＥＺ−Ｌｉｎｋ  Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−Ｂｉｏｔｉｎ（Ｐｉｅｒｃｅ）を含有するＫＨで２０分；ビオチン洗い出し（ウオッシュアウト）のためにＫＨで１０分；ストレプトアビジン−ＦＩＴＣ（Ｚｙｍｅｄ）またはＳＡ−ｍＦａｓＬのいずれかを０．５μｇ／ｍｌ含有するＫＨで２０分；ストレプトアビジン洗い出しのためにＫＨで１０分。コントロール心臓をＫＨ溶液のみで還流した。左心圧は、灌流の８０分の間に、３つの群（ｎ＝５／群）全てにおいて９８±７〜９１±６ｍｍＨｇ低下した。冠血流は、１０．４±０．６ｍｌ／分（ｎ＝１５）の基準値（ベースライン値）から有意に低下しなかった。これらのデータは、内皮のビオチン化およびＳＡ−ｍＦａｓＬでの装飾が、心機能に短期間の有害効果を有さないこと、およびＦａｓＬは冠動脈に直接毒性ではないことを示す。
【００６５】
次に、冠動脈のビオチン化された内皮の裏層が４℃でＳＡ−ｍＦａｓＬで「装飾」され得るか否かを決定した。この温度は、移植の前に体外心臓保存のための臨床設定において広く用いられる。マウス（Ｂ１０．ＢＲ）およびラット（ＡＣＩ）の心臓をマグネシウム心保護溶液（ＫＨ＋１６ｍＭ  ＭｇＳＯ４）で停止させ、そして上記のプロトコールに従って４℃で還流した（ビオチン、ＫＨ、ストレプトアビジン−ＦＩＴＣまたはＳＡ−ｍＦａｓＬ、ＫＨ）。血管内皮上のビオチンを、ストレプトアビジン−ＦＩＴＣによって検出し、ここでＳＡ−ｍＦａｓＬを、一次抗体およびＦＩＴＣ標識した適切な二次抗体として、ストレプトアビジン（Ｚｙｍｅｄ）およびＦａｓＬ（ＭＦＬ４）に対する抗体を用いて検出した。心臓を取り出し、そして改良ミクロトーム（Ｐｏｌｙｃｕｔ  Ｓ，Ｒｅｉｃｈｅｒｔ−Ｊｕｎｇ）のステージ上で−８０℃で凍結させた。連続的凍結切片（約２００ミクロン）を行い、そしてＦＩＴＣ−標識ストレプトアビジンまたは抗体の存在をＡｘｉｏｐａｎ顕微鏡（Ｃ．Ｚｅｉｓｓ）を用いて決定した。この顕微鏡のステージをミクトロームの冷却ブロックにあうように改変した。１０×の倍率で心臓切片の画像を得た。蛍光を心臓の脈管構造において検出した。これは、臨床手技において広範に用いられた保存培地中において、低体温条件下における脈管内皮へのビオチンおよびストレプトアビジンの結合の可能性を実証する。ＳＡ−ｍＦａｓＬとともに還流した移植内皮におけるＳＡ−ｍＦａｓＬの存在（ただし、コントロールＳ２上清との灌流ではない）を、ＦＩＴＣ−ＭＦＬ４ｍＡｂを用いて確証した。これらのデータは、ＳＡ−ｍＦａｓＬが、体外器官保存の条件においてビオチン化を介して冠動脈に導入され得ることを示す。上記の移植の操作は、標準的な保存溶液を用いて、４℃で１０〜６０分内に実施する。従って、このアプローチは、臨床において用いられる温度、期間、および条件の要件を満たす。
【００６６】
（実施例１０．同系宿主へ移入した場合、ビオチンまたはＳＡ−ｍＦａｓＬを発現するように改変された心臓は、期限なく生存した）
器官のこのタンパク質ベースの改変が機能に影響するか否かという疑問が生じる。ビオチンまたはＳＡ−ｍＦａｓＬを発現するように改変された心臓を、同系のレシピエントへ異所性に移植した。移植された心臓の毎日の腹部触診によって移植片の生存を評価した。表３に示すように、ＳＡ−ｍＦａｓＬで装飾された同系の心臓（ｎ＝４；＞５６日）またはＫＨ灌流コントロール同系心臓（ｎ＝４；＞７４日）を移植された移植レシピエントの生存の間に検出可能な差異は存在しなかった。
【００６７】
【表３】
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（実施例１１：キメラ装飾した小島細胞）
膵臓小島移植は、糖尿病の補正のために広く意図される。本発明の方法が、小島の異種移植の拒絶の防止に有効であり得るか否かを試験するため、ストレプトジン（２６０ｍｇ／ｋｇ）の複腔内注射によってＢＡＬＢ／ｃレシピエントにおいて、糖尿病を誘導した。少なくとも３連続日の間、血糖値が＞４５０ｍｇ／ｄｌを示す動物を、非主要組織適合抗原および主要組織適合抗原が異なるＣ５７ＢＬ／１０小島のレシピエントとして用いた。小島をＣ５７ＢＬ／１０マウスから収集し、そして標準的プロトコールに従ってＦｉｃｏｌｌ勾配で単離した。脾細胞をＣ５７ＢＬ／１０（ビオチン化し（１５μＭ）、ＦａｓＬまたはコントロール上清で装飾し、そして照射した（２０００ｒａｄ））から収集した。１００万の脾細胞を、糖尿病Ｂａｌｂ／ｃマウスの腎臓嚢の下で約４００の小島細胞とともに同時移植した。移植の後の３日後に開始して血糖値をモニタリングすることによって、小島の生存および機能を評価した。ＦａｓＬ装飾された脾細胞は、９日間をこえて、全ての異種遺伝子小島の生存を延長した。９日でコントロールマウスの血糖値は、ほぼ移植前のレベルまで上昇した。図８は、ＦａｓＬおよびストレプトアビジンを発現する膵臓細胞を示す。
【００６８】
この技術のさらなる実施例において、コラゲナーゼでの消化によってマウス膵臓小島を収集し、そしてＦｉｃｏｌｌ勾配を用いて精製した。小島を一晩培養し、次いでビオチン（５μＭ）で改変し、そしてＳＡ−ｍＦａｓＬ（約１００ｍｍｇ／ｍｌ）またはコントロールとしてＳ２上清で装飾した。共焦点顕微鏡による小島の検査によって、高レベルのビオチンおよびＳＡ−ｍＦａｓＬが示された。ＳＡ−ｍＦａｓＬで装飾した小島は、視覚検査およびトリパンブルー排除によって決定されるように、１０日以上にわたって培養中で生存していた。
【００６９】
まとめて考慮すれば、これらのデータは、心臓のような細胞、組織、および複雑な器官（例えば、心臓）が、検出可能な毒性なしに、長期間にわたってストレプトアビジンとのキメラタンパク質を示すように、ビオチンで改変され得ることを明確に実証する。
【００７０】
（実施例１２．ＧＶＨＤの防止）
骨髄移植（ＢＭＴ）は、種々の遺伝的に遺伝した障害および後天的な血液学的障害を処置する能力を有し、自己免疫抗原および外来移植に対する寛容を誘導する。従って、ＢＭＴは遺伝子治療を実施する自然な方法として認められている。しかし、重大な問題は、宿主対移植片病（ＧＶＨＤ）であり、これはほとんどの場合致死的である。Ｔ細胞は、ＧＶＨＤを起こす最も重要な細胞であるとみなされている。ＧＶＨＤを起こすＢＭ接種における、特定のＴ細胞の除外を可能にする方法は、広範な臨床適用を有する。従来の遺伝子治療を用いて、Ｔ細胞へ「自殺」遺伝子を導入した。一旦ＧＶＨＤが生じれば、自殺機構が活性化してこれらの細胞を排除する。しかし、従来の遺伝子治療の障害は、臨床におけるこのアプローチの慣用的な使用に対する重要な問題である。この「自殺」アプローチを達成するために、より「非侵襲的」なアプローチが必要である。
【００７１】
本発明のこの方法は、「自殺」アプローチまたは免疫下方制御（ダウンレギュレーション）のために十分適切である。骨髄細胞（成熟Ｔ細胞を含む）におけるアポトーシス性分子（死亡リガンド）または下方制御分子（抗炎症性サイトカイン；ＣＳＡ−ＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＴＧＦ−β）の提示は、宿主抗原および活性化のこれらの細胞の認識の際、これらの細胞を物理的にまたは機能的に排除することが予期される。概念の証明として、ＳＡ−ｍＦａｓＬを提示するように改変された脾細胞におけるＴ細胞は、Ｔ細胞分裂促進因子（マイトジェン）で刺激された場合、増殖応答を生じないことが示された（図１０）。対照的に、改変されていない脾細胞は、活発な増殖応答を生成した。このことは、分裂促進因子に応答するＴ細胞が、Ｆａｓを発現し、そして同じ細胞上でのＦａｓＬとＦａｓとの相互作用の際に死んだ（自殺）ことを実証した。これは、骨髄細胞および成熟リンパ球を投与されたラットがＧＶＨＤを１７〜２０日内に発症したことをさらに実証した。ＦａｓＬを発現する同系脾細胞によるこれらの動物の処置によって、ＧＶＨＤの防止が得られた。これは、このアプローチが臨床において用いられている他の処置レジメンより優れているという強力なインビボデータである。
【００７２】
（実施例１３．免疫調節分子を用いる免疫下方制御）
細胞、組織、および器官上で外因性タンパク質を発現する本発明の方法は、これらの分子のいくつかが同時に発現される場合、治療目的のために免疫系を下方制御することにおいて特に有効である。従って、死亡リガンド（ＳＡ−ｍＦａｓＬ、−ＴＮＦα、−ＴＲＡＩＬ、など）および抗炎症性分子（ＣＳＡ−ＩＬ−４、−ＩＬ−１０、−ＴＧＦ−β、など）の組み合わせを、自己免疫疾患、外来移植片拒絶、および他の免疫に基づく障害を予防／処置するための治療アプローチとして、細胞、組織および器官の表面上で発現する。この方法は、免疫系の下方制御を示す。
【００７３】
（実施例１４．腫瘍に対するワクチン接種）
腫瘍は、Ｔ細胞応答を刺激するシグナルを下方制御することによって免疫系を逃れ得る。有効なＴ細胞応答は、以下の３つの異なるシグナルを必要とする：シグナル１、シグナル２およびシグナル３。シグナル１は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）上の主要組織適合複合体（ＭＨＣ）抗ペプチドとのＴ細胞レセプター相互作用によって生成される。シグナル２は、Ｔ細胞およびＡＰＣ上の同時刺激分子（例えば、Ｂ７／ＣＤ２８およびＣＤ４０／ＣＤ４０Ｌ）の結合によって媒介される。シグナル３は、シグナル１およびシグナル２の両方を受けたＴ細胞およびＰＡＣによって合成されたサイトカインによって誘導される。これらの３つのシグナルの誘導が、Ｔ細胞およびＡＰＣを駆動して、有意義な免疫応答の生成のためのエフェクターへと増殖および分化させる。腫瘍へのＴ細胞応答の間のこれらのシグナルのいずれかの欠失は、腫瘍が免疫系を回避する最も有効な機構の１つとして機能し得る。本発明は、外因性タンパク質の発現のために細胞表面を改変するための方法および組成物を提供する。このアプローチは、任意の細胞を、有効な免疫応答の生成のための専門的抗原提示細胞へ変換することが目的である。
【００７４】
ＣＳＡおよびＣＤ４０Ｌの細胞外部分（構造的可撓性のために操作された合成残基を有する）からなるキメラタンパク質（ＣＳＡ−ＣＤ４０Ｌ）を、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ（ショウジョウバエ）の産生細胞において産生した。次いでこの分子を脾細胞の表面上の発現のために用いた。フローサイトメトリーにおいてＣＤ４０Ｌに対する抗体によって示されるように、ほとんど全ての脾細胞が、ＣＳＡ−ＣＤ４０Ｌに関して陽性であった（図１１）。ＣＤ４０Ｌを発現する脾細胞は、ＡＰＣとして用いた場合、抗原特異的応答を誘導する通常の脾細胞よりもかなり有効であった。これは、治療目的のために細胞表面上で外因性タンパク質を発現する本発明者らのアプローチの実行可能性を明確に実証する。
【００７５】
この概念を、肺癌動物モデルで試験する。マウス起源の２つの肺癌株であるＬｅｗｉｓおよびＬｉｎｅ１ならびにＣ５８腫瘍細胞（ラットリンパ腫）は、腫瘍に対するワクチン接種の目的に用いられる。
【００７６】
Ｂ７．１（配列番号２）、ＣＤ４０Ｌ（配列番号６）、またはＩＬ２（配列番号４）の核酸に融合したＣＳＡの核酸を含む核酸から生成されたキメラタンパク質を、これらの腫瘍細胞の表面上での提示のために用い、そしてこの細胞を、腫瘍に対するマウスおよびラットのワクチン接種のために用いる。要するに、腫瘍細胞（２×１０７）は、上記のようにビオチン化される。ＰＢＳでの数回の洗浄後、ビオチン化細胞を上記のようなキメラタンパク質とともにインキュベートしこのキメラタンパク質をビオチン化細胞に結合させる。キメラ装飾した細胞を、５〜１０，０００ｃＧｙで照射し、そして腫瘍を保有する動物に注射してワクチンとして使用する。腫瘍の緩解をモニタリングする。上記の実施例に示した結果に基づいて、この方法は、免疫系の上方制御を示すことが予期される。
【００７７】
他の腫瘍システムおよびキメラタンパク質が同定され得、そして本発明の方法が、他の腫瘍ワクチンおよび感染に対するワクチンを提供するために適用され得ることが容易に理解され得る。
【００７８】
本発明は、種々の好ましい実施例において記載されている。当業者は、本明細書において開示される化合物および方法の改変、偏向物、または置換物が、本明細書の趣旨および範囲から逸脱することなくなされ得ることを容易に認識する。このような改変、偏向物、および置換物の全てが、本発明の特許請求の範囲内であるとみなされる。
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は、新規機能について内因性タンパク質の発現について細胞膜を改変するための方法の概略図である。
【図２】
図２は、示したクローンを含む発現ベクターの制限フラグメント分析を示す。
【図３】
図３は、インビボにおけるビオチン発現を示す。
【図４】
図４は、脾細胞の表面上でのＳＡ−ｍＦａｓＬのインビトロ発現を示す。
【図５】
図５は、骨髄細胞の表面上でのＳＡ−ｍＦａｓＬ発現を示す。
【図６】
図６は、致死的に照射された動物におけるドナーキメラ現象を示す。
【図７】
図７は、インビボでのアロ反応性応答におけるＳＡ−ｍＦａｓＬブロッキングで装飾した同種異系細胞のグラフでの要約を示す。
【図８】
図８は、コントロール小島（Ａ）と比較した、ＦａｓＬ（赤）およびストレプトアビジン（Ｂ）を発現する膵臓小島細胞を示す。
【図９】
図９は、ＣｏｎＡによって活性化された、ＳＡ−ｍＦａｓＬを発現するように改変されたＴ細胞を示す。
【図１０】
図１０は、脾細胞上でのＳＡ−ＣＤ４０Ｌの発現を示す。
【図１】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図９】
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【図１０】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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