(57)【要約】【課題】サンプル中の検体検出に使用される試験ストリップとその使用方法を提供する。【解決手段】サンプル中の検体検出に使用される試験ストリップとその使用方法が提供される。この試験ストリップは、正電荷を持つ基質の表面に水溶性のテトラゾリウム塩を少なくとも含むことを特徴とする。多くの実施の形態として、水溶性のテトラゾリウム塩は検体酸化信号生成システムの構成要素として存在する。このシステムはさらに１以上の次のような成分を含む。すなわち、検体デヒドロゲナーゼ、検体オキシダーゼのような検体酸化酵素、電子伝達剤および酵素補助要因である。また、この試験ストリップが組み込まれたシステムおよびキットが提供される。これらの試験ストリップ、システムおよびキットは、サンプル、例えば血液、血液片のような生理学的サンプル中の種々の検体の検出に使用される。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
正電荷を持つ基質と、前記正電荷を持つ基質の少なくとも１つの面に存在する少なくとも１つの水溶性テトラゾリウム塩とを備えた組成物。
【請求項２】
前記正電荷を持つ基質が吸収性の基質であることを特徴とする請求項１記載の組成物。
【請求項３】
前記正電荷を持つ基質が非吸収性の基質であることを特徴とする請求項１記載の組成物。
【請求項４】
前記水溶性テトラゾリウム塩が検体酸化信号生成システムの構成要素であることを特徴とする請求項１記載の組成物。
【請求項５】
前記検体酸化信号生成システムが検体オキシダーゼを含むことを特徴とする請求項４記載の組成物。
【請求項６】
前記検体酸化信号生成システムが検体デヒドロゲナーゼを含むことを特徴とする請求項４記載の組成物。
【請求項７】
前記検体酸化信号生成システムがさらに電子伝達剤を含むことを特徴とする請求項４記載の組成物。
【請求項８】
前記検体酸化信号生成システムがさらに酵素補助要因を含むことを特徴とする請求項４記載の組成物。
【請求項９】
前記検体酸化信号生成システムが試薬組成物として存在することを特徴とする請求項４記載の組成物。
【請求項１０】
正電荷を持つ基質と、前記正電荷を持つ基質上に存在する検体酸化信号生成システムとを備え、前記検体酸化信号生成システムが水溶性のテトラゾリウム塩を含むことを特徴とする試薬試験ストリップ。
【請求項１１】
前記正電荷を持つ基質が吸収性であることを特徴とする請求項１０記載の試験ストリップ。
【請求項１２】
前記正電荷を持つ基質が非吸収性であることを特徴とする請求項１０記載の試験ストリップ。
【請求項１３】
前記水溶性テトラゾリウム塩が無水物を受容して水溶性ホルマザン生成物を生成することを特徴とする請求項１０記載の試験ストリップ。
【請求項１４】
前記検体酸化信号生成システムが検体オキシダーゼを含むことを特徴とする請求項１０記載の試験ストリップ。
【請求項１５】
前記検体酸化信号生成システムがさらに電子伝達剤を含むことを特徴とする請求項１４記載の試験ストリップ。
【請求項１６】
前記検体酸化信号生成システムがさらに酵素補助要因を含むことを特徴とする請求項１４記載の試験ストリップ。
【請求項１７】
前記検体酸化信号生成システムがグルコース酸化信号生成システムであることを特徴とする請求項１０記載の試験ストリップ。
【請求項１８】
（ａ）（ｉ）正電荷を持つ基質と、（ｉｉ）前記基質上に存在し、水素化物を受容して水溶性ホルマザンを生成できる水溶性テトラゾリウム塩を含む検体酸化信号生成システムと、（ｂ）自動化装置とを備えた検体検出または測定システム。
【請求項１９】
サンプル中の検体の存在を検出する、または濃度を測定する方法であって、（ａ）（ｉ）正電荷を持つ基質と、（ｉｉ）前記基質上に存在し、水溶性ホルマザン生成物を生成できる水溶性テトラゾリウム塩を含み、これにより前記ホルマザン生成物を含む洗浄不能スポットを前記基質上に生成できる検体酸化信号生成システムとを備えた試薬試験ストリップに前記生理学的サンプルを塗る工程と、
（ｂ）前記洗浄不能スポットを検出する工程と、
（ｃ）前記検出された洗浄不能スポットを前記生理学的サンプル中の前記検体の存在または濃度に関連付ける工程とを備えた方法。
【請求項２０】
前記信号生成システムがさらに検体オキシダーゼを含むことを特徴とする請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
前記信号生成システムがさらに少なくとも１つの電子伝達剤を含むことを特徴とする請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
前記サンプルが全血またはその抽出物であることを特徴とする請求項１９記載の方法。
【請求項２３】
前記検出工程および関連付け工程が自動化された装置によって実施されることを特徴とする請求項１９記載の方法。
【請求項２４】
生理学的サンプル中の検体の濃度測定に使用されるキットであって、（ａ）（ｉ）正電荷を持つ基質と、（ｉｉ）前記基質上に存在し、水溶性ホルマザン生成物を生成できる水溶性テトラゾリウム塩を含む検体酸化信号生成システムとを含む試薬試験ストリップと、
（ｂ）（ｉ）生理学的サンプルを取得する手段、（ｉｉ）検体標準の少なくとも１つを備えたキット。
【請求項２５】
前記生理学的サンプルを取得するための前記手段がランスであることを特徴とする請求項２４記載のキット。
【請求項２６】
前記検体標準が、既知の試薬を標準濃度含むことを特徴とする請求項２４記載のキット。
【請求項２７】
前記キットが、生理学的サンプルを取得するための手段と、検体標準とを備えたことを特徴とする請求項２４記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
序
技術分野
この発明の分野は検体の測定に関するものである。
【０００２】
従来技術
生理学的液体、例えば血液または血液抽出物中の検体の検出は、今日の社会においてはますます重要となっている。検体検出測定法は、臨床検査室試験、家庭試験等の様々な用途に使用され、これらの試験結果は様々な病状の診断と処理に卓越した役割を果たしている。関心が持たれている検体には、アルコール、ホルムアルデヒド、グルコース、グルタミン酸、グリセロール、β−ヒドロキシブチレート、Ｌ−乳酸塩、ロイシン、リンゴ酸、ピルビン酸、ステロイド等が含まれる。このような検体検出の重要度の増大に応じて、様々な検体検出プロトコルや検体検出装置が、臨床用にも家庭用にも開発されてきた。これまでに開発されたプロトコルや装置の多くは、血液のような生理学的サンプル中に存在する当該検体を認識するために信号生成システムを用いている。
様々な検体を検出するために、これまでに上記のような種々の信号生成システムが開発されているが、このようなシステムのさらなる開発が引き続き求められている。
【０００３】
関連文献
関連する特許は、欧州公開公報第０９０８４５３号、国際特許第９４／０１５７８号、国際特許第９４／０１５４４号を含む。
【０００４】
発明の概要
サンプル中の検体検出に使用される試験ストリップとその使用方法が提供される。この試験ストリップは、正電荷を持つ基質の表面に水溶性のテトラゾリウム塩を少なくとも含むことを特徴とする。多くの実施の形態として、水溶性のテトラゾリウム塩は検体酸化信号生成システムの構成要素として存在する。このシステムはさらに１以上の次のような成分を含む。すなわち、検体デヒドロゲナーゼ、検体オキシダーゼのような検体酸化酵素、電子伝達剤および酵素補助要因である。また、この試験ストリップが組み込まれたシステムおよびキットが提供される。これらの試験ストリップ、システムおよびキットは、サンプル、例えば血液、血液片またはＩＳＦ（細胞間液）のような生理学的サンプル中の種々の検体の検出に使用される。
【０００５】
発明を実施するための最良の形態
サンプル中の検体測定に使用される試験ストリップとその使用方法が提供される。この試験ストリップは、正電荷を持つ基質の表面に水溶性のテトラゾリウム塩を少なくとも含むことを特徴とする。多くの実施の形態として、水溶性のテトラゾリウム塩は検体酸化信号生成システムの構成要素として存在する。このシステムはさらに１以上の次のような成分を含む。すなわち、検体デヒドロゲナーゼ、検体オキシダーゼのような検体酸化酵素、電子伝達剤および酵素補助要因である。また、この試験ストリップが組み込まれたシステムおよびキットが提供される。これらの試験ストリップ、システムおよびキットは、サンプル、例えば血液、血液片またはＩＳＦ（細胞間液）のような生理学的サンプル中の種々の検体の検出に使用される。
【０００６】
本発明について詳細に述べる前に理解されるべきことは、下記の特定の実施の形態を種々に変更することができ、それらの変更は依然として特許請求の範囲に含まれるので、この発明は下記の特定の実施の形態によって限定されないことである。また、用いられている用語は実施の形態を説明するためのものであり、限定するためのものではないことが理解されるべきである。むしろ、本発明の範囲は特許請求の範囲により確定されるであろう。
【０００７】
本明細書と特許請求の範囲において、特に明示しない限り、単数に言及した場合は複数の場合を含むものとする。特に定義しない限り、本明細書で使われている全ての技術用語および科学用語は、本発明の属する分野の技術者に通常理解されるのと同様の意味を持つ。
【０００８】
組成物
上記のように、本発明はサンプル中の種々の検体を検出するために使用される組成物を提供する。組成物は正電荷を持つ基質と、基質の表面に存在し、典型的には検体酸化信号生成システムの構成要素として存在する水溶性のテトラゾリウム塩を含む。本組成物は試薬試験ストリップ中で見られるように典型的には乾燥組成物として存在する。本発明は特に、全血または、グルコース、アルコール、グリケート化たんぱく質などの血液抽出片の中の特定の検体の分析のためのストリップを提供する。最も広い意味では、試薬試験ストリップは、正電荷を持つ基質と、その基質の表面に存在する水溶性テトラゾリウム塩を含む検体酸化信号生成システムとを含む。以下、本組成物の上述した要素をより詳細に説明する。
【０００９】
正電荷を持つ基質
本組成物の特徴は、正電荷を持つ基質の存在である。正電荷を持つ基質とは、１以上、通常は多くの正電荷を、正電荷を持つ基または部位の少なくとも１つの面に示す基質を意味する。この基質は１つの物質または２以上の異なる物質から生成されてもよい。これらの異なる物質は、所望の正電荷を有する面を提供するために混合されても、積層されても、または他の方法で配置されてもよい。
【００１０】
さらに、正電荷を持つ基質は吸収性でも非吸収性でもよい。吸収性とは、例えば、クロマトグラフィーによる分離の際に起こるように１以上の成分を吸収できる物質中で起こりうるように１以上の成分を優先的に維持することを示す物質を意味する。吸収性の物質には、例えば、限定されないが、未処理の形態の紙、ニトロセルロース等があり、これらは、これらを通過する液体に含まれる成分をクロマトグラフィーにより分離する。
【００１１】
また、正電荷を持つ基質は非吸収性でもよい。非吸収性の正電荷を持つ基質は、以下に示す信号生成システムの種々の構成要素を支え、また正電荷を持つ不活性の多孔性マトリックスを含む。これらのマトリックスは、一般に、血液などの生理学的サンプルを塗る場所と、生成された発色性生成物を信号生成システムの着色によって検出する場所とを提供するように設計されている。したがって、多孔性マトリックスはその中を水性の液体が流れることができるようにし、信号生成システムにおいて化学反応が起こるための十分な空間を提供する。正電荷を持つ多くの多孔性マトリックスが、種々の検体検出分析において使用するために開発されてきた。これらのマトリックスは原料、穴の大きさ、寸法等に関して異なってよく、代表的なマトリックスは、米国特許第５５，９３２，４３１号、同第５，８７４，０９９号、同第５，８７１，７６７号、同第５，８６９，０７７号、同第５，８６６，３２２号、同第５，８３４，００１号、同第５，８００，８２９号、同第５，８００，８２８号、同第５，７９８，１１３号、同第５，６７０，３８１号、同第５，６６３，０５４号、同第５，４５９，０８０号、同第５，４５９，０７８号、同第５，４４１，８９４号、同第５，２１２，０６１号に開示されるものを含み、これらの開示は参照されることによって本明細書の一部をなす。試験ストリップの寸法と多孔性は大きく異なってもよく、マトリックスは、例えばサンプルを塗る領域またはその付近には大きな穴を有し、検出領域には小さな穴を有するというような場所による多孔度の変化を有しても有しなくてもよい。正電荷を持つ薄膜は、ポリアミド等の正電荷を持つポリマーを使用して調製されてもよい。また、このような薄膜は、例えばカチオン性界面活性剤またはポリマーを用いて表面をコーティングするなど、種々の技術によって調製されてもよい。コーティングは、ディップコーディング、化学処理、フォトグラフト、プラズマ重合等によって行われてもよい。さらに別の実施の形態として、薄膜は正電荷を有する１以上の物質を薄膜形成ポリマーに混合することによって生成されてもよい。正電荷を有するポリマーの例として、ポリアミド、ポリ（ビニルピリジン）、ポリ（ビニルイミダゾール）、ポリ（アリルアミン）、ポリ（塩化ビニルベンジルジメチルアンモニウム）、ポリリシンおよびキトーサンがある。カチオン性界面活性剤には、第１、第２、第４アミノ基を含むものがある。これらの物質は、以下に詳細を示す信号生成システムの種々の構成要素との共有結合または非共有結合を提供する機能を有しても有しなくてもよい。
【００１２】
多くの実施の形態として、マトリックスは薄膜試験パッドとして構成され、中空の支持材に固定される。支持材はプラスチック（ポリスチレン、ナイロンまたはポリエステル）、金属シートまたは本分野で既知の他の適切な物質でもよい。多くの実施の形態に関連のある試験ストリップの構成は、米国特許第５，９７２，２９４号、同第５，９６８，８３６号、同第５，９６８，７６０号、同第５，９０２，７３１号、同第５，８４６，４８６号、同第５，８４３，６９２号、同第５，８４３，６９１号、同第５，７８９，２５５号、同第５，７８０，３０４号、同第５，７５３，４５２号、同第５，７５３，４２９号、同第５，７３６，１０３号、同第５，７１９，０３４号、同第５，７１４，１２３号、同第３８３，５５０号、同第３８１，５９１号、同第５，６２０，８６３号、同第５，６０５，８３７号、同第５，５６３，０４２号、同第５，５２６，１２０号、同第５，５１５，１７０号、同第３６７，１０９号、同第５，４５３，３６０号、同第５，４２６，０３２号、同第５，４１８，１４２号、同第５，３０６，６２３号、同第５，３０４，４６８号、同第５，１７９，００５号、同第５，０５９，３９４号、同第５，０４９，４８７号、同第４，９３５，３４６号、同第４，９００，６６６号、同第４，７３４，３６０号に開示され、これらの開示は参照されることによって本明細書の一部をなす。
【００１３】
信号生成システム
上記のように、本組成物の特徴は少なくとも１つの水溶性テトラゾリウム塩を含むことであり、この水溶性テトラゾリウム塩の成分は、典型的には検体酸化信号生成システムの１以上の構成要素と結合した状態で存在する。特に、本組成物の特徴は、水素化物を受容し水溶性で色を持つホルマザン生成物を生成することができる水溶性テトラゾリウム塩の存在である。関連のある水溶性テトラゾリウム塩には、例えば欧州特許第０９０８４５３号に開示されるものがあり、この開示は参照されることによって本明細書の一部をなす。関連のある水溶性テトラゾリウム塩の一種に、欧州特許第０９０８４５３号の第２項、第３５行乃至第４８行、式２に開示されるものがある。また、関連のある水溶性テトラゾリウム塩の他の種類には、欧州特許第０９０８４５３号の第３項、第１０行乃至第２５行、式１に開示されるものがある。
【００１４】
特に関連のある特定の水溶性テトラゾリウム化合物または塩には、限定されないが、２，２’−ジベンゾチアゾリル−５，５’−ビス［４−ジ（２−スルホエチル）カルバモイルフェニル］−３，３’−（３，３’−ジメトキシ−４，４’−ビフェニレン）ジテトラゾリウム二ナトリウム塩（ＷＳＴ−５）、２−ベンゾチアゾリル−３−（４−カルボニル−２−メトキシフェニル）−５−［４−（２−スルフォエチルカルバモイル）フェニル］−２Ｈ−テトラゾリウム（ＷＳＴ−４）等がある。多くの実施の形態としてはＷＳＴ−５が好ましい。これはＷＳＴ−５が水性の媒体に速やかに溶解し、生物学的サンプルと強い適合性があるからである。さらに、生成されるホルマザン化合物は、紫−青の領域でスペクトルの強い吸収を示し、これによりヘモグロビンによるバックグラウンドシグナルを修正する必要が減少する。
【００１５】
上記のように、水溶性テトラゾリウム塩は、典型的には検体酸化信号生成システムの構成要素として存在する。信号生成システムとは、結合すると協働して作用し、与えられたサンプル中の特定の検体の存在としばしばその量を示す検出可能な信号を生成することができる２以上の化合物または分子の集まりを意味する。信号生成システムという用語は、広く、信号生成システムの全試薬成分の混合物と、１以上の試薬成分がキット中に存在するなど残りの試薬成分から分離されたシステムとの両方を包含するものとして使用される。
【００１６】
上記のように、本組成物および試験ストリップにおける信号生成システムは、検体酸化信号生成システムである。検体酸化剤とは一般に、対象となる検体から水素化物を取り除き、検体の酸化体を生成できる酵素である。関連のある検体酸化酵素には、検体オキシダーゼ、検体デヒドロゲナーゼがある。関連のある検体オキシダーゼには、限定されないが、グルコースオキシダーゼ（検体がグルコースのとき）、コレステロールオキシダーゼ（検体がコレステロールのとき）、アルコールオキシダーゼ（検体がアルコールのとき）、ビリルビンオキシダーゼ（検体がビリルビンのとき）、コリンオキシダーゼ（検体がコリンのとき）、ホリムアルデヒドオキシダーゼ（検体がホルムアルデヒドのとき）、グルタメートオキシダーゼ（検体がＬ−グルタミン酸のとき）、グリセロールオキシダーゼ（検体がグリセロールのとき）、ガラクトースオキシダーゼ（検体がガラクトースのとき）、Ｌ−アスコルベートオキシダーゼ（検体がアスコルビン酸のとき）、乳酸オキシダーゼ（検体が乳酸のとき）、ロイシンオキシダーゼ（検体がロイシンのとき）、リンゴ酸オキシダーゼ（検体がリンゴ酸のとき）、ピルビン酸オキシダーゼ（検体がピルビン酸のとき）、尿酸オキシダーゼ（検体が尿酸のとき）等がある。
【００１７】
検体デヒドロゲナーゼには、限定されないが、アルコールに対してアルコールデヒドロゲナーゼ、ホルムアルデヒドに対してホルムアルデヒドデヒドロゲナーゼ、グルコースに対してグルコースデヒドロゲナーゼ、グルコース−６−リン酸塩に対してグルコース−６−リン酸塩デヒドロゲナーゼ、グルタミン酸に対してグルタミン酸デヒドロゲナーゼ、グリセロールに対してグリセロールデヒドロゲナーゼ、ベータヒドロキシブチル塩に対してベータヒドロキシブチル塩デヒドロゲナーゼ、ステロイドに対してヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ、Ｌ−乳酸塩に対してＬ−乳酸塩デヒドロゲナーゼ、ロイシンに対してロイシンデヒドロゲンザーゼ、リンゴ酸に対してリンゴ酸デヒドロゲナーゼ、ピルビン酸に対してピルビン酸デヒドロゲナーゼがある。
【００１８】
多くの実施の形態として、本信号生成システムはまた、対象となる検体が酸化剤によって酸化され、それに伴って酸化剤が酵素補助要因を還元するといった方法で酸化剤と相互作用できる酵素補助要因を含む。関連のある酵素補助要因には、すなわち、限定されないが、ベータニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ベータ−ＮＡＤ）、ベータ−リン酸ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ベータ−ＮＡＤＰ）、チオニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、リン酸チオニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、ニコチンアミド１，Ｎ６−エテノアデニンジヌクレオチド、リン酸ニコチンアミド１，Ｎ６−エテノアデニンジヌクレオチドおよびピロロキノリンキノン（ＰＱＱ）がある。本信号生成システムに含まれてもよい特に関連のある酵素補助要因には、ＮＡＤＨまたはＮＡＤ（Ｐ）Ｈがある。
【００１９】
検体酸化酵素に加えて、本信号生成システムは典型的には電子伝達剤を含む。電子伝達剤とは、水素化物イオンの形態をした電子を還元された酵素補助要因から水溶性テトラゾリウム生成物に伝達できる化合物または分子を意味する。関連のある電子伝達剤は高分子量および低分子量の電子伝達剤を含む。本明細書において、低分子量とは約２０００ドルトンを超えない範囲であり、通常は約１０００ドルトン、多くの実施の形態では約５００ドルトンである。高分子量とは、少なくとも約５０００ドルトンの分子量を意味し、多くの実施の形態では１０，０００ドルトンまたは２０，０００ドルトンまたはそれより大きい。高分子量の電子伝達剤の分子量は、大抵約１００，０００ドルトンを超えないであろう。多くの実施の形態として、高分子量の電子伝達剤はタンパク性化合物であるのに対し、低分子量の電子伝達剤は非タンパク性化合物である。タンパク性とは、ポリペプチドまたはその擬似ポリマー体を意味する。
【００２０】
種々の低分子量非タンパク性の電子伝達剤に関心が持たれている。これらの試剤には、リボフラビン（ＲＢＦ）、アロキサジン（ＡＬＬ）およびルミクロム（ＬＣ）のようなフラビン、フェナジン、フェナジンメトサルフェート（ＰＭＳ）、フェナジンエトサルフェート、メトキシフェナジンメトサルフェートおよびサフラニンのようなフェナジン、メチル−１，４−ナフトール（メナジオン）、ＰＴおよびそのラジカルカチオンＰＴ＋、チオニン（ＴＨ）、アズールＡ（ＡＡ）、アズールＢ（ＡＢ）、アズールＣ（ＡＣ）、メチレンブルー（ＭＢ）、メチレングリーン（ＭＧ）およびトルイジンブルーＯ（ＴＯＬ）のようなフェノチアジン、フェノキサジン（ＰＯＡ）、ベーシックブルー３（ＢＢ３）、ブリリアントクレシルブルーＡＬＤ（ＢＣＢＡ）、ベンゾ−α−フェナゾキソニウムクロライド（Ｍｅｄｏｌａ’ｓ ｂｌｕｅ）のようなフェノキサジン、２，６−ジクロロフェノールインドフェノール（ＤＣＩＰ）のようなインドフェノール、バインドシェドラーズグリーン（Ｂｉｎｄｓｃｈｅｄｌｅｒ’ｓ ｇｒｅｅｎ）、フェニレンブルーのようなインダミン等が含まれる。多くの実施の形態で特に関心が持たれるのは、例えばＰＭＳ、フェナジンエトサルフェート、メトキシフェナジンメトサルフェートおよびサフラニンのようなフェナジン化合物である。多くの実施の形態では、ＰＭＳが低分子量非タンパク性の電子伝達剤として用いられる。
【００２１】
多くの実施の形態では、高分子量でタンパク性の電子伝達剤は、例えばＮＡＤ（Ｐ）Ｈのような還元された補助因子を酸化し、それに付随して信号生成システムのテトラゾリウム塩を還元できる酵素である。多くの実施の形態として、この電子伝達酵素は、リポデヒドロゲナーゼ、フェレドキシン−ＮＡＤＰレダクターゼ、リポアミドデヒドロゲナーゼ、ＮＡＤＰＨデヒドロゲナーゼ等のジアホラーゼである。種々のジアホラーゼが利用可能であり用いられてもよい。本信号生成システム中に存在してもよい代表的な市販のジアホラーゼには、バチルスジアホラーゼ、クロストリジウムジアホラーゼ、ビブリオジアホラーゼ、ポルシンジアホラーゼ等がある。
【００２２】
上述の信号生成システムは、一般に本組成物中に試薬組成物として存在する。多くの実施の形態として、この試薬組成物は乾燥組成物である。最小では本試薬組成物は水溶性のテトラゾリウム塩を含むものである。しかしながら、多くの実施の形態として、試薬組成物はさらに酵素補助要因、検体酸化酵素および電子伝達剤を含む。これらの成分は上述のものである。
【００２３】
試薬試験ストリップ
本発明の多くの実施の形態で特に関連があるのは、上述した組成物を含み、サンプル中の検体の存在および濃度を測定するために使用される試験ストリップである。特に、本発明は全血中の特定の検体、例えばベータヒドロキシブチレート、グルコース等の検出のための乾燥ストリップを提供する。最も広い意味では、試薬試験ストリップは、正電荷を有する中空の支持材とその上の乾燥試薬組成物を含む。乾燥試薬組成物は、対象となる検体が存在するときに検出可能となる信号を生成するために必要なすべての試薬組成物から作られる。本発明の多くの実施の形態として、試験ストリップ上の乾燥試薬組成物は、検体酸化酵素、酵素補助要因、電子伝達剤および水溶性テトラゾリウム塩を含む。これらの各構成要素は詳細に上述したものである。
【００２４】
多くの実施の形態として、本試験ストリップは中空の支持材に固定される薄膜試験パッドを含む。この支持材は、ポリスチレン、ナイロン、ポリエステルなどのプラスチックシート、金属シート、または当分野で知られるいかなる適当な物質であってもよい。試験パッド上にコーティングされたり、内部に包含させられたりして、試薬組成物が試験パッドに結合する。また、このストリップは入り組んだ構成に設計されてもよく、例えば試験パッドが、支持材と、サンプル処理中に用いられる１以上の試薬が存在しうる表層との間に存在してもよい。さらに、流れの道筋または経路が当業者に知られるように試験ストリップ上に存在してもよい。多くの実施の形態として関心が持たれる試験ストリップの構成は、米国特許第５，９０２，７３１号に開示されており、この開示は参照されることによって本明細書の一部をなす。
【００２５】
本試験ストリップはいかなる便利なプロトコルを用いて作られてもよい。ある便利なプロトコルは、ストリップの少なくとも試験パッド部を、最終的な試薬試験ストリップにおける試験パッドに結合するであろう試薬組成物の全ての構成成分を含む水性組成物に接触させることである。好都合なことに、試験パッドをこの水性組成物に浸し十分な時間維持した後に乾燥させることにより、試薬組成物が結合された試薬試験ストリップの試験パッドが生成される。上記のように、水性組成物は試薬試験ストリップの試験パッドと結合するであろう試薬組成物の種々の構成要素を含むであろう。ここで、種々の構成要素は試験パッド上に生成される試薬組成物を所望の量供給するのに十分な量存在する。したがって、電子伝達剤が非タンパク性であるとき、この水性組成物中に存在する非タンパク性電子伝達剤の濃度は、通常、約１０μＭ乃至５０，０００μＭ、多くは約５０μＭ乃至１０，０００μＭ、さらには約１００μＭ乃至５，０００μＭである。これに対し、電子伝達剤がタンパク性であるときは、水性組成物中の電子伝達剤の濃度は通常は約１０Ｕ／ｍｌ乃至１０，０００Ｕ／ｍｌ、多くは約５０Ｕ／ｍｌ乃至５，０００Ｕ／ｍｌ、さらには約１００Ｕ／ｍｌ乃至３，０００Ｕ／ｍｌである。水性組成物中に存在するテトラゾリウム塩の濃度は約３ｍＭ乃至３６ｍＭであり、通常は約６ｍＭ乃至２４ｍＭである。酵素補助因子が存在するときは、その濃度は約１．５ｍＭ乃至２８ｍＭ、通常は約３．５ｍＭ乃至１４ｍＭである。同様に、検体酸化酵素が存在するとき、この検体酸化酵素の濃度は約１００Ｕ乃至２０００Ｕ、通常は約２００Ｕ乃至１０００Ｕである。本試薬試験ストリップを生成する代表的な方法のより詳細な記載については下記の実験項を参照されたい。
【００２６】
検体の検出方法
上記の信号生成システム、試薬組成物および試験ストリップは、サンプル中の検体の存在およびしばしばその量を検出する方法に使用される。種々の検体が本方法により検出できる。代表的な検体には、上述した例えばアルコール、ホルムアルデヒド、グルコース、グルタミン酸、グリセロール、ベータ−ヒドロキシブチレート、Ｌ−ラクテート、ロイシン、リンゴ酸、ピルビン酸、ステロイド等が含まれる。原理上は、本方法を種々の生物学的サンプル、例えば尿、涙、唾液等の中の検体の存在およびその濃度を測定するために用いてもよいが、特に血液または血液抽出サンプルなどの血液片、また特に全血、ＩＳＦ（細胞間液）中の検体の濃度を測定するために用いるのに適している。
【００２７】
本方法において、サンプルと信号生成システムとが混合されて反応混合物が生成され、反応はサンプル中の検体の存在（およびしばしばその量）を示す信号を生成するために十分な時間進行される。生成されたシグナルが検出され、サンプル中の検体の存在（およびしばしばその量）に関連付けられる。これらの工程は上述した試薬試験ストリップ上で行われる。
【００２８】
本方法の特徴は、検出可能な信号がストリップの基質の表面に形成される洗浄不能なスポットから構成されることである。洗浄不能なスポットは、基質の表面にしっかりと結合される水溶性ホルマザン生成物から構成されるため、標準的な洗浄環境においては表面から容易に取り除かれることはない。標準的な洗浄環境とは、結合していない成分が表面から取り除かれなければならない検体検出分析における基質表面によって実現される状況を意味する。標準的な洗浄環境の例として、アレーベース核酸の雑種化分析において当業者が使用するものがある。これは、雑種化工程の後にアレー表面から雑種化されていない核酸を取り除くものである。このような状況は当業者によく知られている。このように、本方法の特徴は正電荷を有する基質の表面に洗浄不能なスポットを生成することである。この洗浄不能なスポットは水溶性ホルマザン生成物から構成されている。
【００２９】
本方法の実施において、最初の工程は一定量の生理学的サンプルを試験ストリップに塗ることである。この試験ストリップについては上記に述べた通りである。試験ストリップに塗られる血液などの生理学的サンプルの量は様々であってよいが、通常は約２μＬ乃至４０μＬ、多くは約５μＬ乃至２０μＬである。本試験ストリップの性質から、試験ストリップに塗られる血液サンプルのサイズは比較的小さくてよく、約２μＬ乃至４０μＬ、通常は約５μＬ乃至２０μＬである。生理学的サンプルが血液の場合、ヘマトクリット値が約２０％乃至６５％、さらには２５％乃至６０％であるときには、種々のヘマトクリット値を有する血液サンプルが本方法により測定されうる。
【００３０】
試験ストリップをサンプルに塗った後、サンプルを信号生成システムの構成要素と反応させ、検出可能生成物、すなわち洗浄不能なスポットを生成させる。この検出可能生成物は、サンプル中に存在する当該検体の最初の量に比例する量生成される。検出可能な生成物、すなわち信号生成システムによって生成された洗浄不能スポットの形態の信号の量が測定され、最初のサンプル中の検体の量に関連付けられる。ある実施の形態として、上記検出工程および関連付け工程を行う自動化された装置が使用される。上記反応工程、検出工程、関連付け工程およびそれらを実施する装置について、米国特許出願第４，７３４，３６０号、同第４，９００，６６６号、同第４，９３５，３４６号、同第５，０５９，３９４号、同第５，３０４，４６８号、同第５，３０６，６２３号、同第５，４１８，１４２号、同第５，４２６，０３２号、同第５，５１５，１７０号、同第５，５２６，１２０号、同第５，５６３，０４２号、同第５，６２０，８６３号、同第５，７５３，４２９号、同第５，５７３，４５２号、同第５，７８０，３０４号、同第５，７８９，２５５号、同第５，８４３，６９１号、同第５，８４６，４８６号、同第５，９０２，７３１号、同第５，９６８，８３６号、同第５，９７２，２９４号に開示されている。これらの開示は参照されることによって本明細書の一部をなす。関連付け工程において導かれた検体の濃度は、実測された信号に対する競争反応の一定の割合を装置の校正などにより考慮している。
【００３１】
キット
また、本発明により本方法を実施するのに使用されるキットが提供される。上記のように、本発明のキットは少なくとも信号生成システムを含んでいる。この信号生成システムの構成成分は組み合わせて１つの試薬組成物にしてもよいし、別々の容器等に分離させてもよい。ある実施の形態として、信号生成システムは上述のように試薬試験ストリップの形態でキット中に存在するであろう。本キットはさらに生物学的サンプルを取得する手段を備えてもよい。例えば、生理学的サンプルが血液の場合、本キットはさらに血液サンプルを得る手段、例えば指を穿刺するためのランス、ランス作動手段等を含んでもよい。さらに、本キットは標準溶液、例えば検体を標準濃度含む検体標準溶液を含んでもよい。ある実施の形態として、本キットはまた上述のようにサンプルを塗った後にストリップ上に生成される生成物の量を検出し、検出した生成物をサンプル中の検体の量に関連付けるための自動化された装置を含む。最後に、本キットは生理学的サンプル中の検体の濃度測定において本キットの構成要素を使用するための取扱説明書を備えている。これらの取扱説明書は包装、挿入されたラベル、キットに存在する容器等の１つ以上に存在してもよい。
以下の実施例は説明のために示されているものであって、限定のためのものではない。
【００３２】
実験
実施例１
Ｐａｌｌ社（Ｅａｓｔ Ｈｉｌｌｓ、ニューヨーク州）から入手したナイロン薄膜の０．８μｍを表１の試薬に浸し、飽和させた後、ガラスロッドを用いて丁寧に余分な試薬を絞り取った。得られた薄膜を乾燥室に取り付け５６℃で１０分間乾燥させた。Ｐｏｒｅｘ（厚さ０．６ｍｍ）を表２の硝酸溶液に浸した後、乾燥室に取り付け１００℃で１０時間乾燥させた。最後に、この薄膜をポリエステル材料（ＩＣＩ Ａｍｅｒｉｃａ（ウィルミントン、デラウエア州）から入手した０．４ｍｍのＭｅｌｅｎｅｘ（登録商標）ポリエステル）と硝酸を染み込ませたＰｏｒｅｘとの間に積層した。
【００３３】
実施例２
実施例１の手順を繰り返す。ただし、最初に浸す試薬は表３に示す試薬である。また、Ｐｏｒｅｘは必要ないため、２度目の浸し処理は行わない。
【表１】
グルコース試験パッドのための試薬
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【表２】
亜硝酸塩試薬
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【表３】
グルコース試験パッドのための試薬
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【００３４】
種々のグルコース標準溶液を、電荷を持たない薄膜と正電荷を有する薄膜の上で試験を行った。血液中のグルコース量が５０ｍｇ／ｄｌ乃至４５０ｍｇ／ｄｌの範囲では信号は直線的であった。図１は同一のディップを異なる薄膜にコーティングした場合を示す図である。一方は正電荷のナイロン薄膜であり、他方は電荷を持たないポリスルホン薄膜である。コーティングされた薄膜を４００ｍｇ／ｄｌのグルコースでテストした。
【００３５】
以下のプロトコルを用いて、４００ｍｇ／ｄＬグルコースを含む１０μＬの水性サンプルを、上述のストリップ上でテストした。このとき、ストリップの薄膜を、正電荷を持つナイロン薄膜と、（正電荷を持つ、または電荷を持たない）ポリスルホン薄膜とに変化させた。新たに準備した試験ストリップ上に１０μｌ水性サンプルを塗った。このストリップを反射率計に挿入し、データの取得を開始した。データを読み出すストリップの反射率を６１５ｎｍにおいて１／２秒間隔で４５秒間測定した。続いて、取得したデータを反射率計のメモリバッファから修正シリアルケーブルを介してパソコンにアップロードした。反応の特性をＫ／Ｓ対秒でプロットした（Ｋ／Ｓは反射率の割合を示し、これは米国特許第４，９３５，３４６号１４段に開示されており、この開示は参照されることによって本明細書の一部をなす）。
【００３６】
上記の結果および検討から、従来の試薬試験ストリップの構成を改善できることが明らかである。水溶性のテトラゾリウム塩を正電荷を持つ基質に組み合わせて使用することによって、本発明はテトラゾリウム塩が正電荷を持つ特性の利益を全て享受し、得られた水溶性ホルマザン生成物から洗浄不能な通知信号を生成できる。したがって、本発明は当技術分野への顕著な貢献を示している。
【００３７】
本明細書中で引用されたすべての刊行物および特許文献は全て、それらが具体的にかつ個別に参照されるために示されているのと同様に、参照されることによって本明細書の一部をなす。すべての刊行物は本出願の出願日前に開示されているから引用したのであって、本発明が先発明のためにこれらの刊行物より先行しているという資格を有していないことを自認するものではない。
【００３８】
本発明の明確な理解のために図示および実施例を用いて詳細に説明したが、本発明の教示するところにしたがって特許請求の範囲を逸脱しない範囲である程度の変更および改変を加えることができることは当業者にとって明らかである。
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は、本発明に基づいて、指示薬として水溶性テトラゾリウム塩を使用し、正電荷を持つ薄膜上および電荷を持たない薄膜上で動作する４００ｍｇ／ｄｌグルコース試験の結果を示す図である。
【図１】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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