(57)【要約】本発明は、哺乳動物における膵臓に基づく脂肪吸収不良障害の診断に有用な方法およびキットに関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
膵臓に基づく脂肪吸収不良障害の疑いのある第１の哺乳動物において該障害を診断する方法であって：
ａ）該哺乳動物から血液のベースライン試料を得；
ｂ）膵臓リパーゼ加水分解がなくても哺乳動物の小腸から吸収できる第１の脂肪酸含有基質および膵臓リパーゼ加水分解がないとき哺乳動物の小腸から吸収できない第２の脂肪酸含有基質を含んでなる消化可能な組成物を該哺乳動物に投与し；
ｃ）該消化可能な組成物の投与後に、該哺乳動物から少なくとも１つの事後血液試料を得；
ｄ）該ベースライン試料および該少なくとも１つの事後試料を脂肪酸についてアッセイし；
ｅ）工程ｄ）から、該哺乳動物における該第１および第２の脂肪酸基質の各々の脂肪酸吸収速度を決定し、それにより、第１の吸収プロファイルを得；
ｆ）第１の吸収プロファイルと、膵臓に基づく脂肪吸収不良障害について陽性または陰性である対照哺乳動物において工程ａ）、ｂ）およびｃ）を行った後に得られた脂肪酸吸収の第２のプロファイルとを比較し、それにより、第１の脂肪酸吸収プロファイルと膵臓に基づく脂肪吸収不良障害を有する陽性対照動物の第２の脂肪酸吸収プロファイルとの間の類似性が、該第１の哺乳動物における膵臓に基づく脂肪吸収不良障害の存在を示し、第１の脂肪酸吸収プロファイルが膵臓に基づく脂肪吸収不良障害を有さない陰性対照動物の第２の脂肪酸吸収プロファイルに類似する場合、該第１の哺乳動物において膵臓に基づく脂肪吸収不良障害がないことを示す
工程を含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
第１および第２の基質のどちらも放射能標識されていない請求項１記載の方法。
【請求項３】
第１および第２の基質のどちらも検出可能に標識されている請求項１記載の方法。
【請求項４】
哺乳動物がヒトである請求項１記載の方法。
【請求項５】
陽性対照哺乳動物が、膵臓リパーゼの欠如の結果である膵臓に基づく脂肪吸収不良障害を有する請求項１記載の方法。
【請求項６】
脂肪吸収不良障害が、嚢胞性繊維症、遺伝性膵炎、α１抗−トリプシン欠如、シュワッハマン症候群、ヨハンソン・ブリザード症候群、鉄芽球性貧血、膵機能不全、リパーゼ欠如、子供のコリパーゼ欠如、部分的および完全な膵臓外科的切除、膵臓癌、慢性および自己免疫膵炎、高脂血症、および上皮小体亢進症からなる群から選択される障害である請求項１記載の方法。
【請求項７】
第１の脂肪酸基質が１以上の飽和長鎖脂肪酸を含む飽和長鎖遊離脂肪酸トリグリセリドである請求項１記載の方法。
【請求項８】
飽和長鎖遊離脂肪酸がペンタデカン酸（ＰＡ）であり、トリグリセリドがトリヘプタデカノイン（ＴＨＡ）である請求項７記載の方法。
【請求項９】
基質の消化および／または吸収に由来する遊離脂肪酸がＰＡおよびヘプタデカン酸（ＨＡ）である請求項７記載の方法。
【請求項１０】
アッセイが、定量的ガス−液体クロマトグラフィー法を用いて、哺乳動物から得られる１以上の血清試料における基質の消化および／または吸収に由来する遊離脂肪酸のレベルを評価することを含む、請求項１記載の方法。
【請求項１１】
吸収速度を用いて１以上の脂肪吸収係数（ＣＦＡ）を算出する、請求項１記載の方法。
【請求項１２】
１以上のＣＦＡを用いて哺乳動物における脂肪吸収不良障害を診断する、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
哺乳動物において膵臓に基づく脂肪吸収不良障害を診断するためのキットであって、
ａ）説明材料
ｂ）膵臓リパーゼ加水分解がなくても哺乳動物の小腸から吸収できる第１の基質および膵臓リパーゼ加水分解がないとき哺乳動物の小腸から吸収できない第２の基質を含んでなる消化可能な組成物；および
ｃ）哺乳動物から血液試料を得るためのチューブまたはバイアル
を含むキット。
【請求項１４】
膵臓に基づく脂肪吸収不良障害が医薬によって誘導される、請求項１記載の方法。
【請求項１５】
障害がオルリスタットの第２の哺乳動物への投与により誘導される、請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
さらに、哺乳動物の糞便を第１および第２の脂肪酸のレベルについて評価することを含んでいてもよい、請求項１記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本出願は、２００１年６月５日に出願された米国仮出願番号第６０／２９５，９１６号（その全開示は出典明示により本明細書の一部とされる）に対して優先権を主張する。
【０００２】
発明の分野
本発明は、脂肪吸収不良障害の診断および評価のための改善された方法に関する。
【０００３】
発明の背景
嚢胞性繊維症（ＣＦ）は、白色人種において最も一般的な寿命を縮める常染色体劣性病であり、米国だけで推定２５，０００人の患者および数百万人の保因者がいる。
過去２９年にわたり、ＣＦ生存者の中間年齢は、１９６９年の１４歳から１９９７年の３１歳に劇的に増加した。したがって、ＣＦは現在、小児および成人の両方の疾患である。ＣＦを有する人々の成長および栄養状態は、肺疾患の重篤度、膵機能不全の重篤度ならびに栄養摂取量および吸収量と関係がある。
【０００４】
全国データ（ＣＦＦ患者登録（CFF Patient Registry））を考慮すると、栄養に関連した成長不足は、依然として許容できない高い割合にある。１９９７年には、ＣＦ患者の１９％が身長について第５百分位数以下であり、２４％が体重について第５百分位数以下であった。体重について第１０百分位数が、ＣＦのような栄養学的に危険性の高い疾患の患者に対するより適当な選抜基準であるとみなすと、ＣＦ患者の３３％が１９９７年において望ましいレベル以下であった。肺疾患の最終段階を除外すると、該成長不足および不十分な栄養状態（身長に対して少ない体重）のほとんどが膵機能不全に関連している。
【０００５】
ＣＦ患者ならびに非ＣＦ関連吸収不良を患った他の患者における膵機能不全の改善された治療は、腸壁を介する栄養素の吸収不良について有効な臨床ケア試験を必要とする。新規な膵臓酵素産物または既存の生産物の修飾は、吸収不良に関する研究に適した性質の試験における評価を必要とする。以前には認識されなかった繊維性結腸疾患の診断の出現を考えると、ＣＦケアコミュニティーならびにＣＦおよび膵機能不全患者にとって、吸収不良の重篤度の正確な文書化がいっそう重要である（Smyth R.Lら, 1995; Lancet, 346(8985):1247-51; Lloyd-Still, J.D.ら, 1998; J. Pediatr Gastroenterol Nutr., 26(5):489-95）。
ＣＦを有する子供における膵機能不全と栄養不良との間の重要な関連は、過去４０年にわたって確立された（Pencharz, P.B.ら, 1993; Annu. Rev. Nutr. 13:111-36）。これらの研究者らは、膵臓酵素が脂肪吸収を改善し、患者において正の窒素バランスを導くことを明らかにした。脂肪便および吸収不良は、ＣＦを有する幼児および小児の２０％以上において提示されている症状である。ＣＦを有する個体の８５％以上が膵機能不全を有し、その食事中に外来的に投与される膵臓酵素を必要とする（FitzSimmons, S.C., 1993; J. Pediatr., 122:1-9）。腸における脂肪吸収不良の程度を評価することは、ＣＦおよび膵機能不全を有する子供および成人において酵素療法および栄養介入の両方を指導する助けとなる。
【０００６】
異常な脂肪吸収に関連する種々の他の病理学的状態が存在する。これらは、限定するものではないが、遺伝性膵炎、α１抗−トリプシン欠如、シュワッハマン症候群、ヨハンソン・ブリザード症候群、鉄芽球性貧血、膵機能不全、リパーゼ欠如、子供のコリパーゼ欠如、部分的および完全な膵臓外科的切除、膵臓癌、慢性および自己免疫膵炎、高脂血症、および上皮小体亢進症を包含する。これらの障害の各々において異常な膵臓に基づく脂肪吸収不良を評価するための改善された方法は、診断および疾患管理計画の発展を容易にするであろう。
【０００７】
７２時間糞便および食餌採集（72-hour stool and diet collection）法が、患者における脂肪吸収不良の程度を測定するための標準的な試験と考えられている（Van De Kamer, J.H.ら, 1949; J. Biol Chem. 177:345-55; Jeejeebhoy, K.N.ら, 1970; Clin. Biochem., 3:157-63）。７２時間糞便採集および食餌性摂取法から得られる脂肪吸収係数（ＣＦＡ）は、脂肪吸収不良を評価するための非特異的であるが、臨床的、診断的な試験として幅広く許容されている。該試験の精度は、少なくとも３日、所定の中程度から高い脂肪食餌の消費および文書化と共に全糞便を採集することに依存する。その化学的精度にもかかわらず、該試験は、食餌摂取量の不十分な文書化、不完全な糞便採集および糞便の脂肪排出における日々の変化による誤差の傾向がある（Holmes, G.K.T., 1988; BMJ, 296:1552）。糞便採集、保管および分析に伴う技術的および美的な困難性は、患者、家族および研究所所員にとって該試験を非常に魅力のないものにしている。定量的な糞便の脂肪分析を行っている地方の研究所はほとんどなく、その結果、糞便を地域の研究所に輸送するための付加的な時間および費用が必要となる。試料採集と報告される結果との間のこの遅延期間が、該試験における無関心をさらに煽る。したがって、７２時間糞便および食餌採集法によって提供される臨床的に重要なデータにもかかわらず、該試験は、ほとんどの臨床ケアおよび研究設定において十分に活用されていないか、または避けられている。有能な研究所の利用の可能性をもってしても、この潜在的に重要な臨床試験は、患者およびケア提供者の両方によってほとんど許容されておらず、また、十分に活用されておらず（Holmes, G.K.T., 1988; BMJ, 296:1552）、かくして、ＣＦに関連する栄養不良および成長不足に寄与している。
【０００８】
脂肪吸収不良を評価するためのいくつかの別の試験が開発されたが、全て、有意な制限を有するものであり、７２時間糞便および食餌採集法に対する正確なまたは実用的な別法としての幅広い受諾を得ることができなかった。これらの試験のうちのいくつかを下記に論じる。
スポット・スダン（Spot Sudan）ＩＩＩ染色試験は、スダン色素で染色されたランダムな糞便試料の顕微鏡試験を含む定量試験である（Drummey, G.D.ら, 1961; N. Engl. J. Med., 264:85-7）。客観的な基準を用いた場合でも、その結果は、ＣＦ患者に共通の軽〜中程度の脂肪便においてほとんど再現性がない。該試験の精度は、均質化したプールした糞便試料を用いたときに増加する。しかしながら、患者および家族からみると、このことは、該試験を７２時間糞便採集法と変わらないものにする。
【０００９】
酸ステアトクリット（Acid Steatocrit）試験は、少量（約５グラム）の糞便試料を用い、それをスピンして酸性化脂肪を固形糞便から分離する（Tran, M.ら, 1994; J. Pediatr. Gastroenterol Nutr., 19:299-303; Phuapradit P.ら, 1981; Arch. Dis. Child., 56:725-7）。７２時間糞便および食餌採集法との相関は、均質化してプールした糞便を用いた時にだけ起こる。したがって、プールした糞便採集の必要性は、患者および家族に付加利益を与えず、７２時間採集法とあまり相関しない。
１４Ｃおよび１３Ｃトリオレイン・ブレス試験（Newcomer, A.D.ら, 1979; Gastroenterology, 76:6-13; Watkins, J.B.ら, 1982; Gastroenterology, 82:911-7）などのブレス（Breath）試験は、安定または放射性同位体で標識した少量の食餌脂肪を用いる非侵襲性試験である。脂肪吸収不良は、標識したＣＯ２によって予測され、吸収された食餌脂肪のインジケーターである。該データは、既知の膵機能不全の場合において、膵臓酵素療法に対する応答を定性的にモニターするのに使用されうる（Amarri, S.ら, 1997; Arch. Dis. Child., 76:349-51; Goff, J.S., 1982; Gastroenterology, 83:44-46）。７２時間糞便および食餌採集法と比較すると、ブレス試験は８０％までの感受性を有したが、特異性はたった４５％であった（Pedersen, N.T.ら, 1991; Scand. J. Clin. Lab. Invest. 51:699-703）。ブレス試験の使用において、対象の肺の状態が正常または正常に近いという仮定条件もあり、ＣＦ患者においては、常にそのような状態にあるというわけではない。また、１４Ｃは放射性化合物であり、それゆえ、子供における使用に適さない。安定同位体１３Ｃは、子供における使用に安全であるが、基質および分析に必要な装置（質量分析計）のコストが非常に高い。
【００１０】
キロミクロン経路を介する腸吸収の前にリパーゼによって加水分解される長鎖脂肪、パルミチン酸レチニルは、食餌脂肪に対する食後のキロミクロン応答をモニターするためのマーカーとして首尾よく使用されてきた。しかしながら、レチニルエステルを特異的に加水分解する内在性消化管刷子縁リパーゼ酵素が存在するので、ヒトにおける膵機能不全による脂肪吸収不良を評価するためのパルミチン酸レチニルの特異性は制限される（Rigtrup, K.M.ら, 1994; Am. J. Clin. Nutr., 60:111-116）。さらに、レチノールの腸内処理を含む特異的な欠点がＣＦおよび他の膵臓−脂肪に基づく吸収不良障害において生じる可能性があり、それがさらに、膵機能不全によって引き起こされる食餌脂肪吸収不良をモニターするための該アッセイの使用を制限する（Ahmed, F.ら, 1990; Arch. Dis. Child., 65(6):589-593）。
アポリポ蛋白質Ａ−ＩＶ（Ａ−４）は、ヒトにおいて食餌性脂肪に応答して腸細胞においてキロミクロンを用いて排他的に合成される４６ｋＤリポ蛋白質である（Green, P.H.R.ら, 1982; Gastroenterology, 83:1223-30）。該化合物の合成および分泌の比率は、食餌性長鎖トリグリセリドの消費と用量依存パターンにおいて相関する（Rodriguez, M-D.ら, 1997; Am. J. Physiol., 272:R1170-177）。Ａ−４は迅速に異化するので、該化合物の血清レベルはＡ−４の合成速度に依存し、したがって、Ａ−４は吸収された食餌性脂肪のマーカーとして使用されうる（Rader, D.J.ら, 1993; J. Clin. Invest., 92:1009-17）。しかしながら、Ａ−４の検出のために使用されるイムノアッセイは、あまり標準化されておらず、そのため、幅広い臨床的な有用性を制限する。
【００１１】
ペンタデカン酸（ＩＰＰＡ）試験は、膵臓リパーゼ活性を評価するために使用される成人における非侵襲性定性試験である。該アッセイは、グリセロール骨格の３位に結合した長鎖脂肪酸としてヨードフェニルペンタデカン酸１２３Ｉ−ＩＰＰＡを含有する放射性標識したトリグリセリドの経口投与を含む。ＩＰＰＡが吸収される前に、膵臓リパーゼによる該トリグリセリドの加水分解が必要である。吸収後、β−酸化によってＩＰＰＡが代謝され、最終代謝産物１２３Ｉ−ｐ−ヨード安息香酸が尿中に排出される。１２３Ｉ−ｐ−ヨード安息香酸に関する尿のシンチグラフィー分析は、膵臓リパーゼの活性について定性データを提供する。しかしながら、放射能を伴うため、子供に対する該試験の幅広い応用が制限される。
【００１２】
糞便のボンベ熱量測定法および近赤外線分光法を包含する脂肪およびエネルギー含量について糞便を分析する他の試験が開発されてきた（Benini, L.ら, 1989; Gut., 30:1344-7; Emmanuel, B., 1974; Biochem. Biophys. Acta., 337:404-13）。全ての場合において、７２時間糞便および食餌採集法との相関は、プールして均質化した糞便試料を用いた場合にだけ起こる。したがって、これらの試験は、患者および家族に対し、上記の試験以上に付加利益を与えない。
先行技術のアッセイの全ては、ＣＦ研究または膵臓脂肪に基づく吸収不良障害を有する患者の臨床ケアにおいて幅広く許容されることができなかった。かくして、ＣＦおよび他の膵機能不全に関連する病状を有する患者の診断および栄養的ケアのための方法の改善に対する当該分野における要望が、依然としてある。
【００１３】
発明の簡単な概要
本発明によると、哺乳動物、好ましくはヒトにおいて、膵臓に基づく脂肪吸収不良障害を診断するための診断法およびキットが提供される。該方法は、哺乳動物から基準血液試料を得、次いで、第１および第２脂肪酸含有基質（ここに、第１基質は膵臓リパーゼ加水分解がなくても小腸において吸収可能であり、第２脂肪酸は小腸からの吸収のために膵臓リパーゼ加水分解を必要とする）を含んでなる消化可能な組成物を投与することを含む。次いで、事後血液試料を得て、第１および第２脂肪酸含有基質の吸収速度を得、それにより、第１吸収プロファイルを作成する。次いで、該プロファイルを、比較対照哺乳動物（ここに、該対照哺乳動物は、膵臓−脂肪に基づく吸収不良障害に対して陽性または陰性である）由来の第２吸収プロファイルと比較する。第１吸収プロファイルが、膵臓に基づく脂肪吸収不良障害を有する陽性対照動物から得られた第２吸収プロファイルと類似する場合、第１哺乳動物において、膵臓に基づく脂肪吸収不良障害が示される。第１吸収プロファイルが、膵臓に基づく脂肪吸収不良障害を有さない陰性対照動物から得られた第２吸収プロファイルに類似する場合、膵臓に基づく脂肪吸収不良障害は第１哺乳動物に存在しない。
【００１４】
本発明の方法を用いて診断されうる例示的な膵臓に基づく脂肪吸収不良障害は、限定するものではないが、嚢胞性繊維症、遺伝性膵炎、α１抗−トリプシン欠如、シュワッハマン症候群、ヨハンソン・ブリザード症候群、鉄芽球性貧血、膵機能不全、リパーゼ欠如、子供のコリパーゼ欠如、部分的および完全な膵臓外科的切除、膵臓癌、慢性および自己免疫膵炎、高脂血症、および上皮小体亢進症を包含する。
本発明の別の具体例において、第２哺乳動物において、膵臓に基づく脂肪吸収不良障害は医薬によって誘導される。かかる障害の医薬的誘導のための例示的試薬は、オルリスタット（Orlistat）である。
上記の概要ならびに下記の本発明の詳細な記載は、添付の図面と共に読むと、より良く理解されるであろう。
【００１５】
発明の詳細な記載
本発明は、哺乳動物における膵臓に基づく脂肪吸収不良およびその障害の正確な信頼性のある特異的な測定のための方法およびキットに関する。本発明の方法は、ＣＦを有する人々において膵機能不全に起因する脂肪吸収不良を測定するための標準的な方法として現在使用されている７２時間糞便および食餌採集法に対する、より許容される別法を提供するが、限定するものではないが、遺伝性膵炎、α１抗−トリプシン欠如、シュワッハマン症候群、ヨハンソン・ブリザード症候群、鉄芽球性貧血、膵機能不全、リパーゼ欠如、子供のコリパーゼ欠如、部分的および完全な膵臓外科的切除、膵臓癌、慢性および自己免疫膵炎、高脂血症、および上皮小体亢進症を包含する他の膵臓に基づく脂肪吸収不良病態の診断に幅広く応用可能である。
本発明の方法は、食餌脂肪吸収のマーカーとして用いられる消化可能な組成物中の２つの天然飽和長鎖脂肪酸を基質として用いる血液試験を含む。消化可能な組成物の経口投与後、膵臓リパーゼによる基質の加水分解に由来する脂肪酸の血清応答パターンにおける相違を用いて、膵臓に基づく脂肪吸収不良およびその障害を診断する。数学的または統計学的モデリング技術を用いて、脂肪吸収係数を求めることができ、それを用いて、哺乳動物における膵臓に基づく脂肪吸収不良障害を診断することができる。
【００１６】
定義
本明細書で使用される場合、下記の用語の各々は、このセクションにおけるその用語に付随した意味を有する。本明細書で使用される場合、冠詞「ａ」および「ａｎ」は、その冠詞の文法上の目的物の１または１以上（すなわち、少なくとも１個）を示す。例として、「ａｎ ｅｌｅｍｅｎｔ」は１つの要素または１以上の要素を意味する。
【００１７】
本明細書で使用される場合、「膵臓に基づく脂肪吸収不良障害」なる語は、１以上の食餌脂肪の吸収不良が徴候である哺乳動物における障害、疾患または状態を意味し、ここに、該障害、疾患または状態は、哺乳動物における膵臓リパーゼの機能および／または量の欠如および／またはコリパーゼ欠如に起因する。脂肪吸収不良はまた、異常な胆汁酸塩合成、排出、脱抱合、再吸収、トリグリセリド再合成障害、キロミクロン形成および／または排出、または腸リンパ管の閉塞にも起因しうる（Schmitz, J., Malabsorption, in Pediatric Gastrointestinal Disease: Pathophysiology, Diagnosis and Management, Walker, W.A.ら編  B.C. Decker Inc. Philadelphia, PA, 1991, pgs. 79-89）。
本発明の方法にしたがって評価されうる障害は、限定するものではないが、嚢胞性繊維症、遺伝性膵炎、α１抗−トリプシン欠如、シュワッハマン症候群、ヨハンソン・ブリザード症候群、鉄芽球性貧血、膵機能不全、リパーゼ欠如、子供のコリパーゼ欠如、部分的および完全な膵臓外科的切除、膵臓癌、慢性および自己免疫膵炎、高脂血症、および上皮小体亢進症を包含する。
【００１８】
本明細書で使用される場合、「消化可能な組成物」なる語は、通常の消化過程の間に哺乳動物によって消化される組成物を意味する。
本明細書で使用される場合、「消化可能な組成物」に関連して使用される場合、「消化」なる語は、各々、哺乳動物の胃および小腸における消化可能な組成物の酸加水分解、次いで、リパーゼ加水分解および／または蛋白質溶解を意味する。
【００１９】
記載
本発明は、膵臓に基づく脂肪吸収不良障害を患った疑いのある哺乳動物においてかかる障害を診断する方法を包含する。該方法は、膵臓リパーゼ加水分解がなくても哺乳動物の小腸から吸収できる第１基質および膵臓リパーゼ加水分解がないとき哺乳動物の小腸から吸収できない第２基質を含んでなる消化可能な組成物を哺乳動物に経口投与することを特徴とする。該方法は、また、消化可能な組成物の哺乳動物における消化ならびに第１および第２基質の哺乳動物の小腸における吸収に十分な時間を与えることを特徴とする。血液のベースライン試料は、消化可能な組成物を経口投与する前に哺乳動物から得られ、１以上の事後血液試料は、消化可能な組成物の投与後、１またはそれ以上の回数、哺乳動物から得られる。
【００２０】
該方法は、次いで、基質の膵臓リパーゼ加水分解および小腸吸収に由来するベースライン試料および１以上の事後試料中の脂肪酸レベルをアッセイすることを含む。該方法は、上記脂肪酸レベルから、哺乳動物における各上記脂肪酸の小腸からの吸収速度を決定することを含む。該吸収速度パターンは、診断を要求される膵臓に基づく脂肪吸収不良障害を患っているか、診断を要求される膵臓に基づく脂肪吸収不良障害を患っていないか、または診断を要求される膵臓に基づく脂肪吸収不良が医薬によって誘導されたかのいずれかの別の点では同一の第２哺乳動物における脂肪酸の吸収速度パターンと比較される。別の点では同一の第２哺乳動物は、陽性または陰性対照のいずれかとして働き、それにより、膵臓に基づく脂肪吸収不良障害が第１哺乳動物において診断される。
【００２１】
本発明の方法において、哺乳動物は、いずれの哺乳動物であってもよく、好ましくはヒトである。膵臓に基づく脂肪吸収不良障害は、本明細書に記載のいずれの膵臓に基づく脂肪吸収不良障害であってもよく、好ましくはＣＦである。
好ましい具体例において、膵臓に基づく脂肪吸収不良障害は、膵臓リパーゼの欠如の結果である。該欠如は、哺乳動物における膵臓リパーゼの量および／または機能に関係している可能性がある。しかしながら、以前に記載されたように、異常型の膵臓に基づく脂肪吸収不良は、種々の病理学的状態に起因する可能性がある。
消化可能な組成物は、基質の経口投与のための当業者に既知のいずれかの方法または方針によって、例えば、ピル、カプセル、錠剤または哺乳動物によって消費されるべき固形もしくは液状食の形態の消化可能な組成物を投与することによって、経口投与される。本発明の消化可能な組成物は、エリキシルの形態で投与されてもよい。また、それは、例えば、フローズンアイスクリームと混合して患者にとってより口に合うものにしてもよい。別の投与手段は、経口ＮＧチューブまたは胃チューブの胃への直接的な挿入を含む。
【００２２】
好ましい具体例において、消化可能な組成物は、食事、例えば、固形または液状朝食の形態で、哺乳動物に経口投与される。
消化可能な組成物は、各々、膵臓リパーゼによる加水分解がなくても哺乳動物の小腸から吸収できる脂肪および膵臓リパーゼによる加水分解がないとき哺乳動物の小腸から吸収できない脂肪である第１および第２基質を含む。第１基質は、例えば、限定するものではないが、飽和長鎖遊離脂肪酸、すなわち、１６個以上の炭素原子を有するものであることができる。好ましくは、第１基質は、ペンタデカン酸（ＰＡ）である。
第２基質は、例えば、限定するものではないが、１以上の飽和長鎖脂肪酸または奇数個の炭素を有する（但し、炭素数は１５を超える）長鎖脂肪酸を含んでなるトリグリセリドであることができる。加水分解のために膵臓リパーゼを必要とする飽和または不飽和長鎖脂肪酸より構成されるいずれのトリグリセリドも、第２基質の潜在的な候補でありうる。好ましくは、第２基質はトリヘプタデカノイン（ＴＨＡ）である。
【００２３】
ＰＡは、１５−炭素飽和脂肪酸（Ｃ１５：０）である。ＴＨＡは、グリセロール骨格と、各々が１７炭素長（Ｃ１７：０）の３つのヘプタデカン（ＨＡ）飽和脂肪酸よりなるトリグリセリドである。ＰＡのような遊離脂肪酸は、膵臓リパーゼによる加水分解を必要とせずに、哺乳動物の小腸から吸収される。しかしながら、ＴＨＡのようなトリグリセリドは、膵臓リパーゼによる加水分解を必要とし、その後、ＨＡが脂肪酸として遊離され、小腸から吸収されることができる。ＰＡおよびＨＡのどちらも、奇数個の炭素原子を有する天然飽和長鎖脂肪酸である。どちらも、細菌、原生動物および反芻動物によって合成される（Emmanuel, B., 1974; Biochem. Biophys. Acta., 337:404-13）。ヒトは、奇数個の炭素原子を有する脂肪酸を合成することができない。ヒトにおけるＰＡおよびＨＡの主な食餌供給源は乳製品であり、ヒトによるＰＡおよびＨＡに関する平均の一日の食餌摂取量は、各々、約１５０〜約２２０ｍｇ／日の範囲である（Smith, L.M., 1961; J. Dairy Sci., 44:607-22; Barrefors, P.ら, 1995; J. Dairy Sci., 78:2691-9; Wolk, A.ら, Am. 1998; J. Clin. Nutr., 68:291-5; Smedman, A.E.M.ら, 1999; Am. J. Clin. Nutr., 69:22-9）。かくして、本発明の方法を用いて評価されるべき患者は、試験の前に、乳製品の摂取を制限すべきである。
【００２４】
両脂肪酸（ＰＡおよびＨＡ）のトリグリセリドエステルは、それらが遊離脂肪酸として小腸から吸収できるように、膵臓リパーゼによる加水分解によって遊離されなければならない。どちらも長鎖脂肪なので、血液中への吸収はキロミクロンリンパ経路を介し、次いで血液に吸収される。得られる遊離脂肪酸の代謝は、プロピオニルＣｏＡへの連続的ベータ酸化を介し、それはさらに、肝臓および心筋におけるβ−酸化のための部位にてスクシニルＣｏＡに代謝される（Champe, P.C.ら, 1994, Biochemistry, J.B. Lippincott Company, Philadelphia, PA.; Schmitz B.ら, 1984; J. Lipid Res., 25:1102-8; Knapp, F.F.ら, 1993; J. Nucl. Med., 34:946-52）。ＰＡは、脂肪組織および構造脂質中へ取り込まれることができ、したがって、乳製品脂肪摂取量のマーカーとして使用されうる（Wolk, A.,ら, 1998; J. Clin. Nutr., 68:291-5; Smedman, A.E.M.ら, 1999; Am. J. Clin. Nutr., 69:22-9）。これらの脂肪酸の血清濃度は非常に低く、ヒトにおける内因性合成は存在しないので、ＰＡおよびＨＡはマーカー脂肪として有用な理想的な候補である（Wolk, A.ら, 1998; Am. J. Clin. Nutr., 68:291-5）。
【００２５】
第１基質は、消化可能な組成物中に、約１０〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重の量で存在し、好ましくは、約２５〜６０ｍｇ／ｋｇ体重の量で存在する。別法では、約２〜９ｇの単一投与単位が消費されうる。最も好ましくは、２．５ｇの単一用量が与えられる。
第２基質は、消化可能な組成物中に、約２０〜約２００ｍｇ／ｋｇ体重の量で存在し、好ましくは、約６０〜約１２０ｍｇ／ｋｇ体重で存在する。別法では、約４〜９ｇの単一投与単位が消費されうる。最も好ましくは、５ｇの単一用量が与えられる。
別の具体例において、２つの基質が等モル用量、例えば、５ｇのＰＡおよび５．５ｇのＴＨＡで投与される。
【００２６】
所望により、第１および第２の両基質は、検出可能に標識されていてもよい。適当な検出可能な標識は、限定するものではないが、物理的または化学的手段による直接または間接的なその検出または測定が試験試料中のアッセイされるべき物質の存在を示すいずれの物質をも包含する。有用な検出可能な標識の代表例は、限定するものではないが、光吸収度、蛍光、反射率、光散乱、燐光、またはルミネセンス特性に基づく直接または間接的に検出可能な分子またはイオン；その放射性によって検出可能な分子またはイオン；その核磁気共鳴または常磁性によって検出可能な分子またはイオンを包含する。光吸収度または蛍光に基づいて間接的に検出可能な分子の群のなかでも、例えば、適当な基質に変化を引き起こす、例えば、非光吸収性から光吸収性分子へ、または非蛍光性から蛍光性分子への変換を引き起こす種々の酵素が包含される。放射性検出可能標識を本願発明の方法に用いてもよいが、それらは、特に子供が膵臓に基づく脂肪吸収不良障害について評価されている場合、あまり好ましくない。
【００２７】
本発明の方法は、また、消化可能な組成物の哺乳動物における摂取、および基質の哺乳動物の小腸からの吸収に十分な期間を与えることを含む。該期間は、約０〜約２４時間の範囲にあってもよく、好ましくは、約０〜約８時間である。
本発明の方法は、また、消化可能な組成物を経口投与する前に、哺乳動物から基準血液試料を得ること、および消化可能な組成物の投与後に、１以上の事後血液試料を該哺乳動物から１回以上得ることを含む。哺乳動物から得られる事後血液試料は、消化可能な組成物の投与後、約５分〜約２４時間の期間に得てもよく、好ましくは、消化可能な組成物の投与後、約１０分〜約８時間に得られる。消化可能な組成物の投与後に採取されるべき最小数の試料は１である。しかしながら、４−５個の試料を採取することが好ましく、好ましくは、消化可能な組成物の摂取後１時間毎に採取する。
【００２８】
本発明の方法は、また、ベースライン試料、および第１基質の小腸からの吸収ならびに第２基質の膵臓リパーゼによる加水分解および小腸からの吸収に起因する１以上の事後試料中の脂肪酸のレベルをアッセイすることを含む。これらの試料中の脂肪酸レベルは、血液または血清試料中の脂肪酸量を定量的に評価するための当業者に既知のいずれかの方法を用いて評価できる。かかる方法は、限定するものではないが、質量分光法を包含する。
好ましい具体例において、試料中の脂肪酸レベルは、定量的ガス−液体クロマトグラフィー法を用いて評価される。かかる技術は当該分野で既知であり、例えば、ＰＡおよびＨＡを包含する多量または少量脂肪酸の全ての検出を伴うガス−液体クロマトグラフィー（ＧＬＣ）を用いてルーメン乳の脂肪酸含量の定量分析を記載するSmith, L.M., 1961; J. Dairy Sci., 44: 607-22に記載される。蓄牛のルーメンに存在する原生動物および細菌は、奇数炭素鎖長鎖飽和脂肪酸、例えば、ＰＡおよびＨＡを生産する（Emmanuel, B., 1974; Biochem. Biophys Acta, 337:404-13）。ＰＡおよびＨＡは、ヒトにおいて血清脂質の１％未満を構成することが報告されている（Smedman, A.E.M.ら, 1999; Am. J. Clin. Nutr., 69:22-9）。これらの低濃度にもかかわらず、両脂肪酸は、ＧＬＣを用いて血清中で首尾よく定量され、該レベルは乳製品の食餌摂取量と相関することが見出された。Wolk, A.ら（1998; Am. J. Clin. Nutr., 68: 291-5）は、ＧＬＣを用いて、ヒトにおけるＰＡおよびＨＡのヒト脂肪組織含量を定量した。ＰＡおよびＨＡの脂肪組織含量はまた、乳製品の食餌摂取量に相関した。計量した食物の記録を用いて、ＰＡおよびＨＡの平均の一日摂取量をＧＬＣ法に基づいて、乳製品を消費した成人において各々、２２０および１５０ｍｇと見積もった。かくして、ＰＡおよびＨＡは一般に、いずれかの種類の乳製品を消費する人々における食餌脂肪の一部として摂取される。
【００２９】
好ましいＧＬＣアッセイ法の例を下記する。
本発明の方法は、また、上記のように試料において評価された脂肪酸レベルから、哺乳動物における小腸からの第１および第２基質由来の各脂肪酸の吸収速度を決定することを含む。該吸収速度は、小腸からリンパ系または血流中への脂質または薬理学的化合物の吸収速度を算出するための当業者に既知のいずれかの方法を用いて、数学的または統計学的に決定できる。かかる計算の例を本明細書中、実施例において記載する。
【００３０】
好ましい具体例において、１以上の脂肪吸収係数（ＣＦＡ）を、消化可能な組成物の第１および第２基質の吸収および／または加水分解に起因する各脂肪酸の吸収速度に基づいて算出する。ＣＦＡの計算は、本明細書中、実施例において記載される。簡単に言うと、血清試料に関し、消化可能な組成物の投与後の所定の時点での哺乳動物の血清中に吸収された脂肪酸の量は、該所定の時点にて同じ脂肪酸の血清レベルをアッセイすることによって測定された脂肪酸の量から基準血清試料中に存在する同じ脂肪酸の量を減じることによって算出される。吸収された脂肪酸の量は、消化可能な組成物中における哺乳動物に投与された脂肪酸のパーセンテージとして表され、該パーセンテージ値をＣＦＡと称する。
【００３１】
本発明の方法は、また、上記のように得られた吸収速度パターンを、他の点では同一の第２哺乳動物を上記の方法に付した後、該第２哺乳動物から得られた同じ脂肪酸についての吸収速度パターンと比較することを含む。吸収速度パターンの比較は、当業者に既知のいずれかの数学的または統計学的方法を用いて達成できる。この目的に有用な典型的な数学的および統計学的方法を本明細書に提供する。
上記のように、他の点では同一の第２哺乳動物は、膵臓に基づく脂肪吸収不良障害の診断において陽性または陰性対照として働くことのできるいずれかの哺乳動物である。
一の好ましい態様において、他の点では同一の第２哺乳動物は、第１哺乳動物において診断が求められる膵臓に基づく脂肪吸収不良障害を患った哺乳動物である。該態様において、第２哺乳動物は、陽性対照として働き、第１哺乳動物において上記のようにして得られた吸収速度パターンが、第２哺乳動物について上記のようにして得られた吸収速度パターンとの比較において数学的または統計学的に類似することが見いだされた場合、該第１哺乳動物において診断が要求される膵臓に基づく脂肪吸収不良障害は存在する。該数学的または統計学的分析において、当業者に既知のいずれの数学的または統計学的方法も使用できる。
【００３２】
別の好ましい態様において、他の点では同一の第２哺乳動物は、診断が要求される膵臓に基づく脂肪吸収不良障害が医薬によって誘導された哺乳動物である。例えば、限定するものではないが、膵臓リパーゼ阻害化合物を用いて、膵機能不全の一時的状態を誘導することができる。
膵臓リパーゼを阻害するための好ましい医薬化合物は、オルリスタット（Orlistat）である（XenicalR（登録商標）, Roche Pharmaceuticals, Nutley, NJ）。オルリスタットを用いて膵臓に基づく脂肪吸収不良障害を医薬によって誘導する方法は、本明細書中、実施例に記載される。該態様において、第２哺乳動物は陽性対照として働く。第１哺乳動物において上記のようにして得られた吸収速度パターンが、第２哺乳動物について上記のようにして得られた吸収速度パターンとの比較において数学的または統計学的に類似することが見出された場合、該第１哺乳動物において診断が要求される膵臓に基づく脂肪吸収不良障害は存在する。該数学的または統計学的分析において、当業者に既知のいずれの数学的または統計学的方法も用いることができる。
【００３３】
また別の好ましい態様において、他の点では同一の第２哺乳動物は、第１哺乳動物において診断が要求される膵臓に基づく脂肪吸収不良障害を患っていない哺乳動物である。該態様において、第２哺乳動物は、陰性対照として働く。第１哺乳動物において上記のようにして得られた吸収速度パターンが、第２哺乳動物について上記のようにして得られた吸収速度パターンとの比較において数学的または統計学的に類似することが見出された場合、該第１哺乳動物において診断が要求される膵臓に基づく脂肪吸収不良障害は存在しない。上記のように、該数学的または統計学的分析において、当業者に既知のいずれの数学的または統計学的方法も用いることができる。
【００３４】
好ましくは、本明細書に記載のように算出された１以上のＣＦＡを、上記で論じた吸収速度パターンを比較することによる膵臓に基づく脂肪吸収不良障害の診断に用いる。
本発明は、また、哺乳動物において膵臓に基づく脂肪吸収不良障害を診断するためのキットを包含する。該キットは、哺乳動物における膵臓に基づく脂肪吸収不良障害の診断における本発明の方法の使用を伝えるために有用な説明材料を含む。本明細書で使用される場合、「説明材料」なる語は、出版物、録音物、ダイアグラム、またはその指定された用途のための本発明の方法の有用性を伝達するために使用できるいずれの他の表現媒体も包含する。本発明のキットの説明材料は、例えば、組成物を含有する容器に添付されていてもよく、または組成物を含有する容器と一緒に輸送されてもよい。別法では、該説明材料は、説明材料および組成物がレシピエントによって連帯して使用される意向で、容器と別に輸送されてもよい。
【００３５】
該キットは、また、膵臓リパーゼ加水分解がなくても哺乳動物の小腸から吸収できる第１基質および膵臓リパーゼ加水分解がないとき哺乳動物の小腸から吸収できない第２基質を含んでなる消化可能な組成物を含む。該消化可能な組成物は、本明細書に記載の消化可能な組成物のいずれであってもよい。
該キットは、さらに、該哺乳動物から血液試料を得るためのチューブまたはバイアルなどを含む。
【００３６】
本発明の実施を容易にするための方法およびプロトコール
本発明によると、食餌摂取量は、計量した食物の記録を用いて評価される（St. Jeor, S.T.ら, 1983; J. Am. Diet Asso., 83:155-62）。該記録は、食餌摂取量の測定として用いられる。膵臓酵素、ビタミン、ミネラルおよび他の種類の栄養サプリメント消費についての情報は、食物摂取量記録において記録される。ミネソタ大学、栄養コーディネーティングセンター、公衆衛生学部（the University of Minessota Nutrition Coordinating Center, School of Public Health）（Minneapolis, MN）によって開発された「栄養学的データシステム（Nutritional Data System）（ＮＤＳ）」ソフトウェアを用いて、食物摂取量および食餌記録を分析する。ＮＤＳは、食物および調理法の完全な記述のためのメニュー方式プロンプトを有する。この項目のレベルは、カロリー、蛋白質、炭水化物、脂肪および微量栄養素の食餌摂取量および比率のための研究に適した性質の計算に必要とされる（Daniels, L.A., 1984; Appl. Nutr., 38A:110-18; Feskanich, D.ら, 1989; Comput. Methods Programs Biomed., 30:47-57）。該データベースは、１６，０００以上の食物品目を含有し、市場の変化を反映するように引き続きアップデートされている。不明データパーセントは、カロリー、蛋白質および脂肪についてゼロである。ほとんどの他の主要な栄養素は、同様に低い比率の不明データを有する。該プログラムの注文に応じて作成されるバージョンは、現在、ナショナル・ヘルスおよびニュートリション・エグザミネーション・サーベイ（the National Health and Nutrition Examination Survey）（NHANES  III）によって使用されている。ＮＨＡＮＥＳ ＩＩＩは、３０，０００人を超えるアメリカ人について食餌データを有し、栄養学的参照データの次世代である（Briefel, R.R.ら, 1995; Am. J. Clin. Nutr., 62(上掲):1072S-80S）。さらに、該コンピューター分析プログラムにおいて利用可能な項目は、しばしばＣＦを有する子供に推奨される高カロリー高脂肪食物のより望ましい記述を提供する。いずれの同様に正確な食餌データ分析ソフトウェアプログラムも用いることができる。
【００３７】
糞便の脂肪分析
７２時間糞便採集は、食餌摂取量の測定と一致する。糞便は、メイヨー医学研究所（the Mayo Medical Laboratories）（Rochester, MN）にてＪｅｅｊｅｅｂｈｏｙの方法を用いて脂肪吸収係数の計算のための重量測定法によって全脂肪含量について分析される（Jeejeebhoy, K.N.ら, 1970; Clin. Biochem, 3:157-63; Silverman, A.ら, 1983; Pediatric Clinical Gastroenterology, 901-2）。実施例１において、健康な成人患者に、家庭用採集キット（試料カン、採集容器、手袋、スクレーパー）および詳細な説明書を与える。試料は家庭で冷凍保存し、次いで、分析のためにメイヨー研究所に輸送される。実施例２において、ＣＦ患者は、入院の間に７２時間糞便採集を行った。ＣＦを有する子供を持つほとんどの家族は、脂肪分析のための糞便採集を以前に経験していた。脂肪吸収係数は下記のように計算される。
％脂肪吸収係数（ＣＦＡ）＝［｛脂肪摂取量（ｇ）−糞便脂肪（ｇ）｝／脂肪摂取量（ｇ）］ｘ１００
【００３８】
人体測定評価
人体測定は、Ｓｃａｌｅｔｒｏｎｉｘ（White Plains, NY）デジタル体重計において測定される体重（０．１ｋｇまで）；スタジオメーター（Crymych UK）において測定される身長（０．１ｃｍまで）；Ｈｏｌｔａｉｎ（Crymych, UK）カリパスで測定される皮下脂肪貯蔵のための三頭筋、二頭筋、肩甲下、および腸骨上部での皮膚厚；および非ストレッチ性プラスチックテープを用いて測定される中央上腕での円周よりなる。測定は、Ｌｏｈｍａｎらにおいて記載の方法に従う（Lohman, T.G.ら, 1988; Anthropometric Standardization Reference Manual, Champaign, IL:  Human Kinetcs Books）。全測定は、３連で行い、記録し、その平均を分析で使用する。
【００３９】
血清試料のＧＬＣ分析
全吸収後血清および該血清の単離キロミクロン画分の両方を脂肪酸組成について分析する。キロミクロンは、ｄ＝１．００６ｇ／ｍｌにて３０分間、２６，０００ｇでの遠心分離によって血漿から単離する（Hatch, F.T.ら, 1968; Adv. Lipid Res., 6:1-68）。全脂質をＢｌｉｇｈおよびＤｙｅｒの方法にしたがって各試料から抽出する（Bligh, E.G.ら, 1959; Can. J. Biochem., 37:911-917）。ＢＦ３−メタノールを用いる脂質抽出物のメチル基転移後、フレームイオン化検出器、自動７６７３サンプラーおよびＳＰ−２５６０の０．２０ミクロンフィルムよりなる１００ｍｍ ｘ ０．２５ｍｍ ＩＤカラムを備え付けたＨｗｅｌｅｔｔ Ｐａｃｋａｒｄ ＧＬＣ（Supelco, Bellefonte, PA）を用いるガス−液体クロマトグラフィー（ＧＬＣ）分析を用いて、脂肪酸組成を決定する（Morrison, W.ら、1964; J. Lipid Res. 5: 600-608）。温度は、４℃／分の速度で１４０℃から２４０℃に変化するようにプログラムされる。抽出時に、ヘプタデカン酸メチルエステルを内部標準として加える。
【００４０】
モデリング
ペンタデカン酸（ＰＡ）およびヘプタデカン脂肪酸を含有するトリグリセリド（ＴＨＡ）の３回投与について、ベースライン試料およびその後８時間まで３０分毎または１時間毎に採取した血清試料の分析を用いて、時間依存性測定および標準化測定（下記参照）用量応答曲線を作成する。各濃度は、各対象について、および全対象の完全なセットとして独立して分析して、測定した脂肪酸ＰＡおよびヘプタデカン酸（ＨＡ）の各々について吸収、分布および排出の速度およびＴＨＡの加水分解のための膵臓酵素活性を決定する。脂肪吸収係数および膵臓酵素活性指数を決定するための最も単純なモデルを正常対象のセットから得、次いで、膵臓酵素阻害剤（オルリスタット（Orlistat））を用いる治療前および治療中の対象に応用する。最後に、該モデルを、種々のレベルの酵素治療を受けているＣＦを有する対象に応用して、それらの脂肪吸収係数および酵素活性指数を決定する。
【００４１】
脂肪酸ＰＡおよびＨＡの血清レベルを決定するのに関与する生物学的因子は：１）胃腸管の通過時間；２）ＴＨＡからＨＡを遊離するための膵臓酵素活性；３）胃腸管内での胆汁酸との相互作用；４）胃粘膜インターフェースでのキロミクロン画分中への吸収；５）キロミクロン画分の血漿を包含するその体コンパートメント中への分布；および６）体からの排出である。
【００４２】
正常対象の第１セットにおけるＰＡの測定を用いて、ＨＡのための吸収モデルにおいてのみ関与する工程２（膵臓酵素活性）を除く上記の吸収および排出工程の相互作用を決定する。ＰＡの全血漿濃度およびキロミクロン画分濃度の測定値および標準化測定値を独立した試験変数として比較する。消化可能な組成物の投与量から受け取られたＰＡ（およびＨＡ）のみが吸収係数（ＣＦＡＭＢＴ）について分析されるように、ＰＡ（およびＨＡ）のベースライン測定値を事後測定値から減ずる。これらのデータセットの各々について用量に関係する時間依存性作用を比較し、最も単純な時間依存性作用を示す独立試験変数を分析に用いる。また、該試験変数のいずれの用量依存も、時間の関数としてデータをプロットし、測定および標準化測定データセットの各々について平均および標準偏差を計算することによって行われるこの最初の分析から決定される。
【００４３】
測定された血漿濃度は、分母として、試験対象のＢＭＩから算出される試験対象の血漿コンパートメント容量で除された初回投与量を用いて標準化される。キロミクロン画分は、分母としてキロミクロンコンパートメント容量で除された受け取られた投与量を用いて標準化される。キロミクロン容量は、試験対象についてＢＭＩから決定された全血漿容量を乗じたキロミクロンとして抽出された血漿容量の画分から、上記のようにＢＭＩから概算された血漿コンパートメントを用いて、計算される。標準化に用いられるＨＡの投与量は、ＴＨＡの投与量において送達されるＨＡの重量として決定される。
【００４４】
最も単純な可能性のある状況において、ＨＡおよびＰＡの両方の測定レベルが用量独立性であり、全血漿またはキロミクロン画分中のいずれかにおいて、初期の延長された安定した状態に達する。その場合、標準化ＰＡおよびＨＡを、従来の標準的な７２時間糞便および食餌採集法を用いて測定されたＣＦＡと、同じ患者について比較でき、適当な変換因子（ＢＭＩに依存性であってもよい）を該データから決定することができる。標準化ＨＡの標準化ＰＡに対する比率は、吸収相の間の膵臓酵素活性プロファイルを反映する指数として定義付けられる。該データは、患者の年齢またはＢＭＩに対する該指数のいずれの依存についても分析される。オルリスタットでの治療前および治療後の比較は、約７０％の該指数における減少を反映すると予想される。
【００４５】
十分に延長した安定な状態でない場合、該データの分析により複雑性が加えられる。上記のように、ＰＡに関するデータは膵臓酵素活性を必要としないので、まず、ＰＡに関するデータを分析する。ＰＡおよびＨＡの吸収、分布および排出工程は基本的に同じであり、これらの脂肪酸の類似性により、事実上、同じ速度定数および分布画分を有すると仮定する。ＰＡは膵臓酵素活性を考慮しないので、それ自体、より単純な系である。膵臓酵素活性指数は、膵臓酵素活性に関する工程を該モデルに重ね合わせてＨＡに関するデータを分析し、ＰＡの分析から決定された吸収、分布および排出に関するすでに決定された定数を用いることによって決定される。
【００４６】
１つのコンパートメント（血漿コンパートメントまたはキロミクロンコンパートメントのいずれか）中への全身性分布ならびに吸収および排出に関する速度制限性一次速度式を有する２相モデルを用いて、時間の関数として標準化された独立変数のモデルを作成する。キロミクロンと血漿コンパートメントとの間の交換速度論に基づく付加的な複雑性、および必要ならば、付加的な管外コンパートメントの導入、または吸収もしくは排出のより複雑な速度論の導入を比較して、該データを説明する最も良好なモデルを見出す。根元的な原理は、該モデルにおいて導入される自由度が測定値のそれに近いか、またはそれよりも少ないことである。キロミクロンおよび血漿画分の両方を測定するならば、該データはより複雑なモデルを支持することができる。いったん、吸収、分布および排出の速度を記述するための適当なモデルおよび定数をＰＡのデータから決定したならば、ＰＡの測定のための最適な時間を見積もり、それに続くデータ収集において用いる。
【００４７】
ＴＨＡの場合、触媒の単純なモデルを用いて、膵臓酵素活性の速度論を記述し、ここに、ＰＥは膵臓酵素を示し、ｋ１およびｋ２は、各々、酵素−基質結合の正反応および逆反応のための速度定数であり、ｋ３は、結合した酵素−基質複合体の最終産物への変換およびさらなる活性のための酵素の遊離のための速度定数である。ＴＨＡの３つの投与量を用いて、過剰な基質または速度制限工程のいずれがモデルを単純化するための仮定条件として応用できるかを決定する。さらに、膵臓酵素阻害剤オルリスタットの投薬の間の試験を用いて、酵素活性の範囲にわたってデータを分析するのに必要な複雑性を決定する。これら２つのデータセットの分析を用いて、ＨＡの測定のための最適時間を決定する。吸収されたＨＡの画分の吸収されたＰＡの画分に対する比較を用いて、膵臓酵素活性指数とする。オルリスタットの存在下での推定活性は、正常（抑制されていない）活性の約７０％であると予想される。必要ならば調整を行い、該モデルを、種々の投与量の膵臓酵素を投与しているＣＦ対象の無作為化セットに応用して、該方法を用いて酵素活性および脂肪吸収係数を評価できるかどうかを決定する。
【００４８】
結果の統計学的分析および数学的モデリング
ＭＢＴから得られた脂肪吸収係数（ＣＦＡ）（ＣＦＡＭＢＴ）は７２時間糞便および食餌採集法から得られたＣＦＡ（ＣＦＡ７２）と共に、これらの実験における主要な結果である。ヒストグラムおよびボックスプロットのようなプロットならびに平均、メディアン、範囲、平均の標準偏差および標準誤差のような要約した記載を調べる。
ＣＦＡＭＢＴとＣＦＡ７２を比較するために、各々に付随するばらつきを、２つの測定値のどちらがより小さいばらつきを有するかを評価するために、変動係数（ＣＶ）を用いて調べる。変動係数（ＣＶ）は、平均のパーセンテージとして表される標準偏差である。
【００４９】
該分析における第２工程は、ＣＦＡＭＢＴとＣＦＡ７２との間の関連を試験することである。全対象に関するデータをスカッタープロットを用いてプロットし、ＰｅａｒｓｏｎまたはＳｐｅａｒｍａｎ相関係数を得る。ＣＦＡＭＢＴがＣＦＡ７２における変動の少なくとも８０％（Ｒ２）を説明できると予想される。
実施例３において、どのようにＣＦＡＭＢＴが膵臓酵素投与量の変化に応答するかを調べるために、指定された膵臓酵素の通常の投与量におけるＣＦおよび膵機能不全を有する対象を無作為化して、通常の酵素投与量の０％または５０％のいずれかを与える。各群は、膵臓酵素の２つの明確な減少させた投与量にて別々に分析し、ＣＦＡＭＢＴの分布が正常な場合、対応のあるｔ−検定を用いて、ＣＦＡＭＢＴの変化を調べる。分布が正常でない場合、Ｗｉｌｃｏｘｏｎ順位和検定のような非パラメーター試験を用いて該データを分析する。
【００５０】
本発明は、ここに、下記の実施例を引用して記載される。これらの実施例は、説明の目的にのみ提供され、本発明はいかなる方法においても、これらの実施例に限定されるものとして解釈されるべきではなく、むしろ、本明細書に提供される教示の結果として、明らかになるいずれかおよび全てのバリエーションを包含するものと解釈されるべきである。
【実施例】
【００５１】
実施例１：
健康な成人を含む膵臓に基づく脂肪吸収不良研究
以前に記載されたように、ある特定の長鎖脂肪酸は、吸収の前に膵臓リパーゼによる加水分解を必要とする。これらの脂肪酸の吸収速度は、加水分解を必要としないものと異なると仮定される。この仮説を調べるために、吸収に膵臓リパーゼを必要としないＰＡおよび吸収前にヘプタデカン酸（ＨＡ）に加水分解されるＴＨＡを、試験朝食として健康な個体に与えた。
【００５２】
対象
１８〜５０才の健康な対照対象を選択した。除外基準は：栄養吸収に影響を及ぼすことが知られているいずれかの慢性疾患、体量指数（ＢＭＩ）＜２１または＞３０ｋｇ／ｍ２（一般に許容される健康な成人の範囲）、脂質低下薬を用いる治療、真性糖尿病（ＮＩＤＤＭおよびＩＤＤＭ）、改変されたエネルギー代謝に関連する障害（例えば、甲状腺低下症）および全３回の投薬実験に参加することに無関心なことを包含した。該成人年齢範囲は、いくつかの理由のために選択された：（ａ）成人対象は、おそらく、該研究の全３回の成分に変わりなく専念する；（ｂ）成人は、試験朝食の味および寛容ならびに全吸収不良試験手順に対する信頼性のあるフィードバックを提供する必要性を理解するであろう；および（ｃ）成人対象は、０７００〜１５００時の複数回の瀉血事象に全て協力するための実験日を計画することができる。
【００５３】
プロトコール
研究センターに到着時に、対象はその体重および身長を測定され、経験のある瀉血医が一連の血液サンプリングのために、ヘパリンロックを伴う留置静脈内カテーテルを挿入した。最初に２ｍｌの血液を滅菌シリンジ中へ採血した後、実験血液試料（２ｍｌ）を採血し、直ちに４ｍｌ血清セパレーターチューブ中に保管した。その後、最初の２ｍｌの血液をカテーテル中へ注入して戻し、次いで、２ｍｌのヘパリンフラッシュを行った。ベースライン血液試料を得た後、対象は約８〜１２オンスの液体試験朝食を飲用した。該食事は、１〜３投与量のＰＡおよびＴＨＡを無作為分布で含有した。対象は、試験朝食を５分以内に消費することを要した。その後、一連の血液試料を、３０分〜２４時間にわたって規則的な間隔をおいて得た。最初の８時間の間、対象は非カロリー性のカフェイン不含飲料を摂取することを許可された。既知の脂肪含量の研究プロトコール昼食が提供され、実際の食物摂取量が記録された。血液サンプリングスケジュールにおける３０〜６０分間隔の厳守を維持するために、移動は制限された。血液サンプリングの完了後、カテーテルを除去し、軽食を与えられ、対象は全食事を消費するように奨励された。該実験において用いられたＰＡおよびＴＨＡの脂質投与量（ｍｇ／ｋｇ）は、嚢胞性繊維症における必須脂肪酸欠如を補正するために用いられる同様の脂肪および膵臓疾患における脂肪吸収不良を定性的に評価するために１３Ｃ放射性同位体を用いた以前の研究（Rosenlund, M.L.ら, 1977;Pediatrics, 59:428-32; Wutzke, K.D.ら, 1999; J. Pediatr. Gastroenterol. Nutr., 29:148-54）よりも１０倍高い投与量に基づいた。
【００５４】
結果
健康な対照対象における経時的ＰＡおよびＨＡ吸収のモデルを図１に示す。４人の健康な対照対象は、３０ｍｇ／ｋｇ ＰＡおよび６０または９０ｍｇ／ｋｇ ＴＨＡをベースラインにおいて与えられた。ベースラインにおいて消化可能な組成物中における該脂肪の投与後、ベースラインにおける無視してもよいレベルから予測どおりＰＡ血清レベルが経時的に直線的に増加し、６時間にて約４ｍｇ／ｄＬのピークに達し、その後、投与後８時間までに約１ｍｇ／ｄＬに低下した。対照的に、ＨＡの血清レベルは、投与後最短２時間後まで上昇せず、膵臓酵素の加水分解作用のために十分な時間を与えて、ＨＡをそのトリグリセリド（ＴＨＡ）前駆体から分離させた。加水分解後、ＨＡの血清レベルは経時的に直線的に増加し、６時間で約３ｍｇ／ｄＬのピークに達し、その後、投与後８時間までに約１ｍｇ／ｄＬに低下した。ＰＡおよびＨＡの血清レベルは、投与後８時間までにベースラインに戻らなかった。しかしながら、それらは、投与後２４時間までにベースラインレベルに十分に戻ると予想された。
【００５５】
４人の健康な対照対象は、１２時間の断食後、消化可能な組成物（液体朝食シェイク）中における３０ｍｇ／ｋｇ ＰＡおよび３０ｍｇ／ｋｇ ＴＨＡの投与量を投与された。該シェイクの消費前にベースラインで採血し、次いで、その後３０分毎に６時間まで採血した。図２は、これら４人の対象による脂肪吸収の合わせた結果を示す。約３０分遅延後、ＰＡは、測定時間間隔にわたって、ほとんど直線的に上昇した。ＨＡの場合、３−４時間の遅延期間があり、次いで、血清濃度のほとんど直線的な増加があった。予備的なデータは、明らかに、ＰＡおよびＨＡについて異なるパターンの吸収速度式を示し、ここに、ＰＡはほんの少しの遅延後に経時的に絶え間なく増加し、ＨＡは、４時間までの実質的な遅延後にだけ増加した。
【００５６】
これらの最初の結果から：１）ＴＨＡのより高い投与量は、潜在的に、脂肪吸収パターンについてより最適な情報を生ずるであろう；２）２種類の脂肪の吸収速度式に関する価値のある情報を失うことなく、採血回数を減らすことができ、採血間隔を延長することができる；および３）脂肪のピーク血清レベルでの時間および血清レベルがベースラインまたはベースライン近くに戻るのに必要な時間を得るために、血液は、より長期にわたってサンプリングされるべきであるということが決定された。
【００５７】
１２時間の絶食後、４人の健康な対照対象は、３０ｍｇ／ｋｇ ＰＡおよび６０ｍｇ／ｋｇ ＴＨＡを与えられ、１週間以上後（洗浄期間を与えるため）、同じ４人の対照対象に、液体朝食シェイクからなる消化可能な組成物中における３０ｍｇ／ｋｇ ＰＡおよび９０ｍｇ／ｋｇ ＴＨＡを与えた。血液は、ベースラインにてサンプリングし、次いで、２〜８時間、１時間間隔でサンプリングし、次いで、２４時間目に再びサンプリングした。対象は、既知量の脂肪（８０ｍｇ）を有する調理された昼食を与えられた。
個々の結果は、３０ｍｇ／ｋｇ ＰＡおよび６０ｍｇ／ｋｇ ＴＨＡを投与している４人の健康な対照対象について、ＰＡについて図３Ａに示される。ベースラインでの非常に低い血清レベルから、ＰＡの増加は２時間までに現れ、６時間でピークレベルに達し、その後、低下した。
【００５８】
ＰＡおよびＴＨＡの投与に対する血清応答における個体間および個体内のばらつきの程度を調べるために、付加実験が行われた。１８〜５０歳の６人の健康なボランティアに、試験−再試験プロトコールにおいて、ＰＡ（２．５ｇ）およびＴＨＡ（３対象において５．０ｇおよび３対象において８．０ｇ）の投与量を与えた。図３Ｂは、６個体（女性４人および男性２人）の各々について３回の試験の平均を示す。結果は、ＰＡに対する血清応答において個体間のばらつきがあったことを示した（図３Ｂ）。応答の相違にもかかわらず、個体間の応答パターンは類似し、ＰＡは最初の２時間にわたって増加し、６時間にわたって上昇を維持した。
図３Ｃは、全６個体について３回の試験の結果の全てを示す。別々の機会に測定した個体内のばらつきは、個体間よりも少なかった。例えば、個体内標準偏差はＰＡについて０．４〜１．３ｍｇ／ｄＬの範囲であった。対照的に、個体間標準偏差は、ＰＡについて０．６〜１．３ｍｇ／ｄＬの範囲であった。
【００５９】
図３Ａの記載に対応する４人の健康な対照対象のＨＡに関する結果は、図４において３０ｍｇ／ｋｇ ＰＡおよび６０ｍｇ／ｋｇ ＴＨＡを投与している対照対象について示される。図５Ａは、これら４人の対照対象について、全体として、同じ結果を示す。ＨＡの場合、血清レベルの増加が遅延し、３時間目に始まり、６時間でピークになり、その後、ベースラインに向かって低下した。ＨＡレベルは、期間を通して、ＰＡレベルより低いままであった。８時間までに、ＰＡおよびＨＡレベルはベースラインに戻らなかったが、投与後２４時間で明らかに該レベルにほとんど戻った。
【００６０】
図５Ｂは、ＨＡについて６個体の各々について、３回の試験の平均間のばらつきを示す。ＰＡに関し、該結果は、ＨＡに対する血清応答における個体間にばらつきがあったことを示した。ＨＡに関する応答パターンは、１または２時間後に増加し始め、６時間まで増加し続け、その後、急激に減少した。該結果は、５．０または８．０ｇのＴＨＡを与えられた個体について同様であった。
【００６１】
図５Ｃは、全６個体について３回の試験の結果を示す。ＰＡに関し、別々の機会に測定した個体内のばらつきは、個体間のものより小さかった。例えば、個体内標準偏差は、ＨＡについて３〜６時間の間、０．２〜１．１ｍｇ／ｄＬの範囲であった。対照的に、個体間標準偏差は、ＨＡについて０．７〜２．９ｍｇ／ｄＬの範囲であった。
【００６２】
図３Ａ、図４および図５Ａの同じ４人の健康な対照対象について、３０ｍｇ／ｋｇ ＰＡおよび９０ｍｇ／ｋｇ ＴＨＡを与えられた後の個々の結果は、ＰＡについて図６に、ＨＡについて図７に示される。これら４人の対照対象について平均脂肪吸収は、図８に示される。ＴＨＡが６０ｍｇ／ｋｇで投与された場合、ＰＡの増加は２時間までに明らかに現れ、６時間でピークになり、８時間までベースラインに向かって低下した。ＨＡは、ずっとゆっくりと増加し、６時間でピークレベルに達し、その後、低下した。ＴＨＡレベルは、増加期間の間およびピークレベルにて、ＰＡレベルよりも低いままであった。
該試験は、以後、実施例において、「吸収不良血液試験（ＭＢＴ）」と称する。
【００６３】
実施例２：
ＭＢＴは、オルリスタット処理後の脂肪吸収を検出する。
ＭＢＴは、さらに、ＦＤＡに是認された膵臓リパーゼ阻害剤、オルリスタット（Orlistat）（ＸｅｎｉｃａｌＲ（登録商標），Roche Pharmaceuticals, Nutley, NJ）での処理後、健康な成人対象において評価された。オルリスタットは、膵臓リパーゼによる加水分解を必要とするＴＨＡの吸収を阻害するが、遊離脂肪酸であるＰＡの吸収を阻害しない。したがって、該薬剤は、患者において膵機能不全を模倣するために使用することができる。
【００６４】
対象
１８〜５０歳の１５人の健康な成人対象ボランティア（女性９人）を地方広告によって募集した。除外基準は：栄養吸収に影響を及ぼすことが知られているいずれかの慢性疾患、２１ｋｇ／ｍ２未満または３０ｋｇ／ｍ２より大きい体量指数（ＢＭＩ）（すなわち、一般に許容される健康な成人の範囲外）、脂質低下薬を用いる治療、真性糖尿病（ＮＩＤＤＭおよびＩＤＤＭ）および改変されたエネルギー代謝に関連する障害（例えば、甲状腺低下症）を包含した。オルリスタットは成人においてＦＤＡ是認されているので、該成人年齢範囲が選択された。さらに、成人は、リサーチ研究食、外来患者７２時間糞便採集および瀉血要件の４日間の協力のための実験日を計画することができる。
【００６５】
該実験は、３部分において行われた：（１）ベースラインでのＭＢＴの適用；（２）食事を用いるオルリスタット２４０ｍｇＴＩＤでの治療の５日間およびリサーチ特定食を提供中の７２時間糞便採集；および（３）オルリスタット治療中の６日目におけるＭＢＴの適用。該プロトコールのスケジュールを表１に示す。
【００６６】
【表１】
2004529363.tif 000002
【００６７】
プロトコール
該実験の目的は、医薬によって誘導された膵臓リパーゼに基づく脂肪吸収不良後、健康な成人においてＭＢＴを用いて脂肪吸収速度を表す測定値を得ることであった。該測定値を、ＭＢＴによる脂肪吸収係数（ＣＦＡＭＢＴ）と称する。第２の目的は、医薬によって誘導された膵臓リパーゼに基づく脂肪吸収不良後、健康な成人対象において、ＣＦＡＭＢＴを７２時間糞便および食餌採集法によって得られるＣＦＡと比較することであった。
【００６８】
対象は、研究の１日目に２１００時から１２時間絶食を行った。１日目の昼食時に開始し、対象は、非日常的な身体的活動を断ち、全ての乳製品およびアルコール摂取を避けた。女性対象は、プロゲステロンの循環性代謝およびＧＩ運動性影響を標準化するために、月経周期の最初の１４日間を試験日に予定した。２日目の朝に研究センターに到着すると、対象は、体重および身長を測定し、一連の血液サンプリングのために、経験のある瀉血医がヘパリンロックを伴う留置静脈内カテーテルを挿入した。２ｍｌの血液を最初に採血し、滅菌シリンジ中で保持し、その後、実験血液試料（２ｍｌ）を採血し、すぐに４ｍｌ血清分離チューブ中で保存した。次いで、シンリンジ中の血液を対象中に再注入し、次いで、２ｍｌヘパリンフラッシュを行った。ベースライン血液試料を得た後、対象は５分以内で標準試験朝食を飲用した。その後、一連の血液試料を得た。血液試料の数およびタイミングは、実施例１の実験によって決定され、８時間以下の期間にわたって、６または数個の試料があることを予測した。推定８時間の実験の間、対象は非カロリー性のカフェイン不含飲料の摂取を許可され、血液サンプリングスケジュールの厳守を維持するために移動が制限された。２日目に血液サンプリング完了後、カテーテルを除去し、軽食が与えられた。
【００６９】
オルリスタットを用いる治療
経口オルリスタット２４０ｍｇＴＩＤでの治療は、２日目のＭＢＴの完了後すぐの昼食時に開始した。それは、１日に３回食事前に投与され、６日目の第２ＭＢＴ朝食の適用まで続けられた。
【００７０】
リサーチ研究食
特定リサーチ研究食は、７２時間糞便採集法を用いるＣＦＡの決定に必要とされた。１日に約８０ｇの脂肪を提供する１日に３回の食事および軽食が各対象に提供された。該食事は、正確な食餌摂取量記録を得るために、食事前および後に計量した。対象は、食事の全ての残りを研究センターに返さなくてはならなかった。また、対象は、リサーチ研究食は別として、いずれか他の食物または飲料を消費してはならなかった。リサーチ研究食以外に、対象は非カロリー性カフェイン不含飲料、例えば、水またはダイエットソーダを飲用することだけ許可された。リサーチ研究食は、２日目の昼食で開始され、５日目の夕食まで続行した。５日目の朝食はＭＢＴ朝食飲料からなった。
【００７１】
７２時間糞便採集法
７２時間糞便採集法は、外来患者に基づき、対象がリサーチ研究食摂取中であり、オルリスタットで治療されている間に行った。糞便採集は、３日目の０７００時に開始し、６日目の０７００時に完了した。糞便採集のための詳細な口頭および記載した指示および支給物がリサーチチームによって対象に与えられた。
第２ＭＢＴの適用は、患者がオルリスタットを摂取している間、６日目の朝に行った。対象は、５日目の２０００時に開始している１２時間一晩絶食を完了した。対象は、外来患者研究センターに入り、２日目のプロトコールにしたがって、０８００時にＭＢＴを適用された。
【００７２】
結果
図９は、脂肪の高吸収者であることがわかった人を包含する全１５対象について、オルリスタット前後のＰＡおよびＨＡの平均応答を示す。予想どおり、ＰＡの血清応答は、オルリスタット投与前後の両方で１２人の健康な対象について類似していた（図９）。しかしながら、オルリスタット治療をしていないＨＡの血清応答は明らかに、オルリスタットの投与後より高かった。３〜６時間、オルリスタット治療中のＨＡの吸収規模は、これらの対象におけるオルリスタットを与えない吸収規模の約５０％〜７５％の範囲であった。これらの結果は、ＭＢＴが、健康な対象においてオルリスタットによって誘導された脂肪吸収不良を検出したことを示す。
【００７３】
図１０および１１は、高吸収者が包含されるオルリスタット投与前の、各々、ＰＡおよびＨＡの個々の応答を示す。高吸収者の規模の相違は明らかであった。ＰＡの平均吸収は、約６５％であり、ＨＡでは約４５％であった。しかしながら、高吸収者について、どちらの脂肪についても、９０−１００％により近かった。
【００７４】
実施例３：
ＣＦおよび膵機能不全を有する対象を含む膵臓に基づく脂肪吸収不良研究
嚢胞性繊維症（ＣＦ）投薬研究は、嚢胞性繊維症（ＣＦ）および膵機能不全を有する対象においてＰＡおよびＴＨＡの血清応答パターンを決定するために行われた。膵臓酵素の一時的な使用中止は、ＴＨＡの吸収不良をもたらすが、ＰＡの吸収不良をもたらさないと仮定された。
【００７５】
対象
現在、膵臓酵素で治療を受けている、８歳以上のＣＦおよび膵機能不全を有する対象を募集した。除外基準は：１秒の努力呼気肺活量（ＦＥＶ１）＜４０％、繊維性結腸疾患または重大な腸切除（＞１０ｃｍ）の病歴、精神遅滞、重大な精神学的欠損、発達障害および自閉症を包含した。対象は、健康な正常な状態にある。該年齢範囲は、吸収不良の程度に関する情報が改善された栄養的介入および膵臓酵素治療を導く活発な成長の間の子供を包含するので、選択された。また、８歳以上の子供は、ＭＢＴの許容可能性および寛容に関する同意およびフィードバックを提供するのに十分に成熟している。
【００７６】
結果
図１２〜１５に示される実験において、３人のＣＦを有する対象に、１２時間絶食後、液体朝食シェイクからなる消化可能な組成物中における３０ｍｇ／ｋｇ ＰＡおよび６０ｍｇ／ｋｇ ＴＨＡ（２対象）または３０ｍｇ／ｋｇ ＰＡおよび９０ｍｇ／ｋｇ ＴＨＡ（１対象）を与えた。該対象は、通常の投与量の膵臓酵素を投与している間に試験し、次いで、彼らが膵臓酵素を服用していない時に再び試験した（１週間以上後）。ベースラインにて血液をサンプリングし、次いで、１時間毎に２〜８時間採血し、次いで、２４時間目に再び採血した。対象は、既知の脂肪量（８０ｇ）を有する調理された昼食を与えられた。酵素を投与している該３人のＣＦを有する対象について脂肪吸収の個々の結果を、ＰＡについて図１２に、ＨＡについて図１３に示す。酵素を投与していない同じ３人のＣＦを有する対象の場合、脂肪吸収の結果は、ＰＡについて図１４に、ＨＡについて図１５に示される。
【００７７】
付加実験は、膵臓酵素処理を受けた、または受けていないいずれかの６人のＣＦを有する対象で行われた。膵臓酵素処理を受けた、または受けていない該６人の対象におけるＰＡおよびＨＡの血清レベルを各々、図１６および図１７に示す。膵臓酵素処理を受けた、および受けていない６人の対象におけるＰＡおよびＨＡについて平均血清レベルを図１８に示す。
【００７８】
酵素を投与しているＣＦを有する対象の場合、ＰＡ吸収の増加は、２時間までに現れ、約２〜６時間プラトーになり、次いで、８時間までベースライン近くに低下した。ＨＡの場合、２時間遅延後、血清レベルがゆっくりと増加し、約６時間でピークになり、その後、低下した。酵素を投与しているＣＦを有する対象におけるＰＡおよびＨＡの両方の血清レベルは、健康な対照対象において見られたよりも低かった。酵素を投与していないＣＦを有する対象の場合、ＰＡレベルは２時間まで増加し、約３〜６時間プラトーになり、その後、低下した。対照的に、酵素を投与していないＣＦを有する対象において、ＨＡの血清レベルにおける増加はなく、試験期間中、ずっと低いままであった。
【００７９】
付加実験において、血清ＰＡおよびＨＡレベルを、オルリスタット処理を受けた、および受けていない健康な対象、および膵臓酵素治療を受けた、および受けていないＣＦを有する対象において比較した。該データは、ＰＡおよびＨＡのレベルについて各々、図１９および２０に示す。
【００８０】
考察
ＰＡ吸収のパターンは、ＣＦを有する対象および健康な対象において、膵臓酵素投与があってもなくても、またはオルリスタット処理の前でも後でも同様であった。予想どおり、ＰＡ吸収は、膵臓リパーゼの欠如または医薬によって誘導された膵機能不全のいずれによっても影響を及ぼされなかった。
【００８１】
しかしながら、ＨＡ吸収のパターンは、通常の酵素治療中のＣＦを有する対象とオルリスタット処理前の健康な対象との間で幾分異なった。ＣＦ対象において、ＨＡの吸収は遅延し、健康な対照と比べて低かった。これらの結果は、ＭＢＴが、健康な対照と比べて酵素治療中であってもＣＦ対象における脂肪吸収の減少を検出できることを明らかにした。
【００８２】
実施例４：
ＣＦを有する対象においてＭＢＴを評価するために提案された入院患者研究
プロトコールは、目的１および２に別々に向けられる２部分において行う。目的１は、５日間の入院を含む（１日目〜５日目）。目的２は、目的１の完了後の最短７日後に予定される外来患者の訪問を含む。目的１および２の研究のスケジュールを表２に示す。
【００８３】
【表２】
2004529363.tif 000003
【００８４】
これらの研究の第１の目的は、規定の通常投与量の酵素治療を受けているＣＦおよび膵機能不全を有する患者において、ＣＦＡＭＢＴと７２時間糞便および食餌採集法から得られるＣＦＡを比較することである（ベースライン）。
【００８５】
対象は、１日目から５日目まで（４晩）、入院患者研究センターに入れられる。滞在の間、全ての食物および飲料摂取量が文書化され（食事の前重量および後重量を記録する）、膵臓酵素の通常投与量の間に７２時間糞便採集試験を行う。ＭＢＴは、５日目の食餌および糞便採集の終了時および６日目に行う。
【００８６】
人体測定学的評価（体重、身長、皮膚層測定）を行い、ＦＥＶ−１データも得る。１日目に開始し、対象に、体重を維持するように計画された約３５％の脂肪由来のカロリーを含む食餌を与える。食物の好みおよび通常の食物摂取量を決定するために患者および家族と会話後、栄養士が食餌を計画する。研究センタースタッフは、糞便採集に関する詳細な指示および装置を提供する。５日目の朝に、患者が通常投与量の膵臓酵素を服用している間に、ＭＢＴを適用する。ＭＢＴは実施例１に記載のように、４日目の２０００時に開始している１２時間一晩の絶食後に適用される。ＭＢＴの完了後、対象は家に放免される。
【００８７】
これらの研究の第２の目的は、ＣＦおよび膵機能不全を有するこれらの対象において２回の食事（夕食およびＭＢＴ朝食試験食）の間、膵臓酵素投与量をベースラインから通常投与量の０％または５０％へ無作為に減少するとき、どのようにＣＦＡＭＢＴが応答するかを調べることである。
【００８８】
目的２実験における対象は、１１日目に夕食で開始する膵臓酵素の２つの減少された投与量：規定の通常投与量の０％または５０％のうち１つを受けるために無作為化される。標準１２時間一晩絶食後、対象は、外来患者研究センターに入れられ、割り当てられた膵臓酵素投与量を用いてＭＢＴを適用される。ＭＢＴの完了後、対象は、規定の投与量の通常の膵臓酵素を再開するように指示された後、ＣＲＣから解放される。
【００８９】
本明細書に引用される各および全ての特許、特許出願および出版物の開示は、出典明示により全体として本明細書の一部とされる。
【００９０】
本発明は、特定の具体例を引用して開示されたが、本発明の他の具体例および変更が当業者によって、本発明の真の精神および範囲から逸脱することなく、工夫されることは明らかである。添付の特許請求の範囲は、かかる具体例および等価の変更の全てを包含すると解釈されることが意図される。
【図面の簡単な説明】
【００９１】
【図１】図１は、健康な対照における経時的なＰＡおよびＨＡ吸収のための理論的モデルを示すグラフである。ペンタデカン酸（ＰＡ）およびトリヘプタデカノイン（ＴＨＡ）の投与後、吸収に膵臓リパーゼを必要としないＰＡおよび膵臓リパーゼによるＴＨＡの加水分解後に吸収されるヘプタデカン酸（ＨＡ）の吸収パターンは、健康な個体において異なると予想される。
【図２】図２は、３０ｍｇ／ｋｇ ＰＡおよび３０ｍｇ／ｋｇ ＴＨＡを投与している４人の健康な対照対象における平均脂肪吸収を示すグラフである。
【図３Ａ】図３Ａは、３０ｍｇ／ｋｇ ＰＡおよび６０ｍｇ／ｋｇ ＴＨＡを投与している４人の健康な対照対象における２４時間にわたるＰＡレベルを示す。
【図３Ｂ】図３Ｂは、２．５ｇ用量のＰＡを投与している６人の健康な対象における８時間にわたる３回の試験の平均を示すグラフである。
【図３Ｃ】図３Ｃは、２．５ｇ用量のＰＡを投与している６人の健康な対象における３つの独立した試験から得られた結果の全てを示すグラフである。これらの結果の平均は図３Ｂに示される。
【図４】図４は、３０ｍｇ／ｋｇ ＰＡおよび６０ｍｇ／ｋｇ ＴＨＡを投与している４人の健康な対照対象におけるＨＡレベルを示すグラフである。
【図５Ａ】図５Ａは、３０ｍｇ／ｋｇ ＰＡおよび６０ｍｇ／ｋｇ ＴＨＡを投与している４人の健康な対照対象について平均脂肪吸収を示すグラフである。
【図５Ｂ】図５Ｂは、５．０ｇ用量のＴＨＡ（ＫＭ５、ＭＳ５およびＪＶ５）または８．０ｇ用量のＴＨＡ（ＤＷ８、ＧＰ８およびＲＧ８）のいずれかを投与している６人の健康な対象における３つの独立した試験の平均を示すグラフである。
【図５Ｃ】図５Ｃは、５．０ｇ用量のＴＨＡ（ＫＭ、ＭＳおよびＪＶ）または８．０ｇ用量のＴＨＡ（ＤＷ、ＧＰおよびＲＧ）のいずれかを投与している６人の健康な対象において３つの独立した試験から得られた結果の全てを示すグラフである。
【図６】図６は、３０ｍｇ／ｋｇ ＰＡおよび９０ｍｇ／ｋｇ ＴＨＡを投与している４人の健康な対照対象における２４時間にわたるＰＡレベルを示すグラフである。
【図７】図７は、３０ｍｇ／ｋｇ ＰＡおよび９０ｍｇ／ｋｇ ＴＨＡを投与している４人の健康な対照対象におけるＨＡレベルを示すグラフである。
【図８】図８は、３０ｍｇ／ｋｇ ＰＡおよび９０ｍｇ／ｋｇ ＴＨＡを投与している４人の健康な対照対象について平均脂肪吸収を示すグラフである。
【図９】図９は、１５対象由来のオルリスタット処理の前後の平均結果を示すグラフである。対象は、ＰＡ（２．５ｇ）およびＴＨＡ（８．０ｇ）の固定された用量を与えられた。
【図１０】図１０は、１５対象由来のオルリスタット処理前のＰＡ吸収の結果を示すグラフである。対象は、ＰＡ（２．５ｇ）およびＴＨＡ（８．０ｇ）の固定された用量を与えられた。
【図１１】図１１は、１５対象由来のオルリスタット処理前のＨＡ吸収の結果を示すグラフである。対象は、ＰＡ（２．５ｇ）およびＴＨＡ（８．０ｇ）の固定された用量を与えられた。
【図１２】図１２は、通常の膵臓酵素治療中の、３０ｍｇ／ｋｇ ＰＡおよび６０ｍｇ／ｋｇ ＴＨＡ（ｎ＝２）または９０ｍｇ／ｋｇ ＴＨＡ（ｎ＝１）のいずれかを投与している嚢胞性繊維症を有する３対象におけるＰＡレベルを示す。
【図１３】図１３は、通常の酵素治療中の、３０ｍｇ／ｋｇ ＰＡおよび６０ｍｇ／ｋｇ ＴＨＡ（ｎ＝２）または９０ｍｇ／ｋｇ ＴＨＡ（ｎ＝１）のいずれかを投与している嚢胞性繊維症を有する３対象におけるＨＡレベルを示すグラフである。
【図１４】図１４は、膵臓酵素を用いずに、３０ｍｇ／ｋｇ ＰＡおよび６０ｍｇ／ｋｇ ＴＨＡ（ｎ＝２）または９０ｍｇ／ｋｇ ＴＨＡ（ｎ＝１）のいずれかを投与している嚢胞性繊維症を有する３対象におけるＰＡレベルである。
【図１５】図１５は、膵臓酵素を用いずに、３０ｍｇ／ｋｇ ＰＡおよび６０ｍｇ／ｋｇ ＴＨＡ（ｎ＝２）または９０ｍｇ／ｋｇ ＴＨＡ（ｎ＝１）のいずれかを投与している嚢胞性繊維症を有する３対象におけるＨＡレベルを示すグラフである。
【図１６】図１６は、膵臓酵素処理を受けた（ＰＡ１）、および受けていない（ＰＡ２）ＣＦを有する６対象におけるＰＡ血清レベルを示すグラフである。ＣＦを有する対象は、ＰＡ（２．５ｇ）の固定された用量を与えられた。
【図１７】図１７は、膵臓酵素処理を受けた（ＨＡ１）、および受けていない（ＨＡ２）ＣＦを有する６対象におけるＨＡ血清レベルを示すグラフである。ＣＦを有する対象は、５ｇのＴＨＡ（対象ＧＭ、ＡＡおよびＭＬ）または８ｇのＴＨＡ（対象ＴＨ、ＳＣおよびＪＭ）のいずれかを与えられた。
【図１８】図１８は、膵臓酵素処理を受けた（１）、または受けていない（２）ＣＦを有する６対象について、図１６および１７由来の平均ＰＡおよびＨＡ血清レベルを示すグラフである。
【図１９】図１９は、膵臓酵素処理を受けた、および受けていないＣＦを有する６対象において、およびオルリスタット処理を受けた、または受けていない１２人の健康な対象において、平均ＰＡ血清レベルを示すグラフである。
【図２０】図２０は、膵臓酵素処理を受けた、および受けていないＣＦを有する６対象において、およびオルリスタット処理を受けた、または受けていない１２人の健康な対象において、平均ＨＡ血清レベルを示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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