(57)【要約】本願発明は、食虫植物の組織または消化液から単離される、エンドキチナーゼ活性によって特徴づけられる少なくとも１つのタンパク質を含む酵素組成物を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
食虫植物の組織または消化液から単離される、エンドキチナーゼ活性によって特徴づけられる少なくとも１つのタンパク質を含む酵素組成物。
【請求項２】
前記少なくとも１つのタンパク質は１０未満のｐＩによって特徴づけられる請求項１の酵素組成物。
【請求項３】
前記少なくとも１つのタンパク質は抗ＣｈｉＡＩＩポリクローナル抗体との反応性を有しない請求項１の酵素組成物。
【請求項４】
前記少なくとも１つのタンパク質は、還元性条件にさらされた後、エンドキチナーゼ活性を示さない請求項１の酵素組成物。
【請求項５】
前記少なくとも１つのタンパク質は、１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって測定されたとき、約３２．７ｋＤａの見かけ分子量によって特徴づけられる請求項１の酵素組成物。
【請求項６】
前記少なくとも１つのタンパク質は、１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって測定されたとき、約３６ｋＤａの見かけ分子量によって特徴づけられる請求項１の酵素組成物。
【請求項７】
有効成分としての請求項１の酵素組成物および薬学的に受容可能なキャリアまたは希釈剤を含む薬学的組成物。
【請求項８】
前記少なくとも１つのタンパク質は抗菌類活性によって特徴づけられる請求項１の酵素組成物。
【請求項９】
前記抗菌類活性は殺菌類活性である請求項８の酵素組成物。
【請求項１０】
前記抗菌類活性は抗カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）活性である請求項８の酵素組成物。
【請求項１１】
キチン含有病原体を滅菌消毒するための組成物であって、有効成分としての請求項１の酵素組成物およびキャリアまたは希釈剤を含む組成物。
【請求項１２】
有効成分としての請求項１の酵素組成物および農学的に受容可能なキャリアを含む農学的組成物。
【請求項１３】
前記少なくとも１つのタンパク質は、ギャップ生成が８に等しく、ギャップ伸長ペナルティーが２に等しいＳｍｉｔｈ／Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムを用いてウィスコンシン（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）配列分析パッケージのＢｅｓｔＦｉｔソフトウエアを使用して決定されたとき、配列番号５に対して少なくとも７０％の同一性、または配列番号６に対して少なくとも７５％の同一性、または配列番号７に対して少なくとも８１％の同一性、または配列番号８に対して少なくとも７７％の同一性を有する請求項１の酵素組成物。
【請求項１４】
前記少なくとも１つのタンパク質は、配列番号５、配列番号６、配列番号７または配列番号８に示されるか、あるいはそれらの活性な部分である請求項１３の酵素組成物。
【請求項１５】
前記組織はトラップ組織および／または葉組織である請求項１の酵素組成物。
【請求項１６】
前記消化液はトラップ消化液である請求項１の酵素組成物。
【請求項１７】
前記食虫植物は、ウツボカズラ（Ｎｅｐｅｎｔｈｅｓ  ｓｓｐ．）、モウセンゴケ（Ｄｒｏｓｅｒａ  ｓｐ．）、ハエトリソウ（Ｄｉｏｎｅａ  ｓｐ．）およびヘイシソウ（Ｓａｒｒａｃｅｎｉａ  ｓｐ．）からなる群から選択される請求項１の酵素組成物。
【請求項１８】
食虫植物の組織または消化液のタンパク質抽出物で、エンドキチナーゼ活性を示す少なくとも１つのタンパク質を含むタンパク質抽出物を含む酵素組成物。
【請求項１９】
前記少なくとも１つのタンパク質は１０未満のｐＩによって特徴づけられる請求項１８の酵素組成物。
【請求項２０】
前記少なくとも１つのタンパク質は抗ＣｈｉＡＩＩポリクローナル抗体との反応性を有しない請求項１８の酵素組成物。
【請求項２１】
前記少なくとも１つのタンパク質は、還元性条件にさらされた後、エンドキチナーゼ活性を示さない請求項１８の酵素組成物。
【請求項２２】
前記少なくとも１つのタンパク質は、１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって測定されたとき、約３２．７ｋＤａの見かけ分子量によって特徴づけられる請求項１８の酵素組成物。
【請求項２３】
前記少なくとも１つのタンパク質は、１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって測定されたとき、約３６ｋＤａの見かけ分子量によって特徴づけられる請求項１８の酵素組成物。
【請求項２４】
有効成分としての請求項１８の酵素組成物および薬学的に受容可能なキャリアまたは希釈剤を含む薬学的組成物。
【請求項２５】
前記少なくとも１つのタンパク質は抗菌類活性によって特徴づけられる請求項１８の酵素組成物。
【請求項２６】
前記抗菌類活性は殺菌類活性である請求項２５の酵素組成物。
【請求項２７】
前記抗菌類活性は抗カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）活性である請求項２５の酵素組成物。
【請求項２８】
キチン含有病原体を滅菌消毒するための組成物であって、有効成分としての請求項１８の酵素組成物およびキャリアまたは希釈剤を含む組成物。
【請求項２９】
有効成分としての請求項１８の酵素組成物および農学的に受容可能なキャリアを含む農学的組成物。
【請求項３０】
前記少なくとも１つのタンパク質は、ギャップ生成が８に等しく、ギャップ伸長ペナルティーが２に等しいＳｍｉｔｈ／Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムを用いてウィスコンシン（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）配列分析パッケージのＢｅｓｔＦｉｔソフトウエアを使用して決定されたとき、配列番号５に対して少なくとも７０％の同一性、または配列番号６に対して少なくとも７５％の同一性、または配列番号７に対して少なくとも８１％の同一性、または配列番号８に対して少なくとも７７％の同一性を有する請求項１８の酵素組成物。
【請求項３１】
前記少なくとも１つのタンパク質は、配列番号５、配列番号６、配列番号７または配列番号８に示されるか、あるいはそれらの活性な部分である請求項３０の酵素組成物。
【請求項３２】
前記組織はトラップ組織および／または葉組織である請求項１８の酵素組成物。
【請求項３３】
前記消化液はトラップ消化液である請求項１８の酵素組成物。
【請求項３４】
前記食虫植物は、ウツボカズラ（Ｎｅｐｅｎｔｈｅｓ  ｓｓｐ．）、モウセンゴケ（Ｄｒｏｓｅｒａ  ｓｐ．）、ハエトリソウ（Ｄｉｏｎｅａ  ｓｐ．）およびヘイシソウ（Ｓａｒｒａｃｅｎｉａ  ｓｐ．）からなる群から選択される請求項１８の酵素組成物。
【請求項３５】
エンドキチナーゼ活性を有するポリペプチドであって、ギャップ生成が８に等しく、ギャップ伸長ペナルティーが２に等しいＳｍｉｔｈ／Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムを用いてウィスコンシン（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）配列分析パッケージのＢｅｓｔＦｉｔソフトウエアを使用して決定されたとき、配列番号５に対して少なくとも７０％の同一性、または配列番号６に対して少なくとも７５％の同一性、または配列番号７に対して少なくとも８１％の同一性、または配列番号８に対して少なくとも７７％の同一性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む単離された核酸。
【請求項３６】
前記ポリヌクレオチド配列は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４および配列番号４８またはそれらの活性な部分からなる群から選択される請求項３５の単離された核酸。
【請求項３７】
前記ポリペプチドは、配列番号５、配列番号６、配列番号７および配列番号８またはそれらの活性な部分からなる群から選択される請求項３５の単離された核酸。
【請求項３８】
前記ポリヌクレオチド配列は、ゲノムポリヌクレオチド配列、相補的なポリヌクレオチド配列および複合ポリヌクレオチド配列からなる群から選択される請求項３５の単離された核酸。
【請求項３９】
請求項３５の単離された核酸を含む核酸構築物。
【請求項４０】
請求項３９の核酸構築物を含む宿主細胞。
【請求項４１】
配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４および配列番号４８からなる群から選択されるポリヌクレオチド配列を含む単離された核酸。
【請求項４２】
前記ポリヌクレオチド配列は、ゲノムポリヌクレオチド配列、相補的なポリヌクレオチド配列および複合ポリヌクレオチド配列からなる群から選択される請求項４１の単離された核酸。
【請求項４３】
請求項４１の単離された核酸を含む核酸構築物。
【請求項４４】
請求項４３の核酸構築物を含む宿主細胞。
【請求項４５】
エンドキチナーゼ活性を有するポリペプチドであって、少なくとも３０アミノ酸のシグナルペプチドを含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む単離された核酸。
【請求項４６】
前記シグナルペプチドはタンパク質分泌のためである請求項４５の単離された核酸。
【請求項４７】
前記ポリヌクレオチド配列は配列番号１または配列番号４８に示されるか、あるいはそれらの活性な部分である請求項４５の単離された核酸。
【請求項４８】
前記ポリペプチドは配列番号５に示されるか、またはその活性な部分である請求項４５の単離された核酸。
【請求項４９】
前記ポリヌクレオチド配列は、ゲノムポリヌクレオチド配列、相補的なポリヌクレオチド配列および複合ポリヌクレオチド配列からなる群から選択される請求項４５の単離された核酸。
【請求項５０】
前記シグナルペプチドは配列番号４７に示される請求項４５の単離された核酸。
【請求項５１】
前記ポリヌクレオチド配列は、ゲノムポリヌクレオチド配列、相補的なポリヌクレオチド配列および複合ポリヌクレオチド配列からなる群から選択される請求項４５の単離された核酸。
【請求項５２】
請求項４５の単離された核酸を含む核酸構築物。
【請求項５３】
請求項５２の核酸構築物を含む宿主細胞。
【請求項５４】
ギャップ荷重が５０に等しく、長さ荷重が３に等しく、平均マッチが１０に等しく、平均ミスマッチが−９に等しいＳｍｉｔｈ／Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムを用いてウィスコンシン（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）配列分析パッケージのＢｅｓｔＦｉｔソフトウエアを使用して決定されたとき、配列番号１との少なくとも６７％の同一性、または配列番号２との少なくとも７５％の同一性を含む単離された核酸。
【請求項５５】
請求項５４の単離された核酸を含む核酸構築物。
【請求項５６】
請求項５５の核酸構築物を含む宿主細胞。
【請求項５７】
前記ポリヌクレオチド配列は、ゲノムポリヌクレオチド配列、相補的なポリヌクレオチド配列および複合ポリヌクレオチド配列からなる群から選択される請求項５４の単離された核酸。
【請求項５８】
配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４または配列番号４８に示される単離された核酸と特異的にハイブリダイゼーションし得る少なくとも１７塩基のオリゴヌクレオチド。
【請求項５９】
核酸増幅反応においてその一部の特異的な増幅が行われるように、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４または配列番号４８と反対方向に特異的にハイブリダイゼーションし得る少なくとも１７塩基からそれぞれがなる１対のオリゴヌクレオチド。
【請求項６０】
エンドキチナーゼ活性を有する単離されたポリペプチドであって、ギャップ生成が８に等しく、ギャップ伸長ペナルティーが２に等しいＳｍｉｔｈ／Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムを用いてウィスコンシン（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）配列分析パッケージのＢｅｓｔＦｉｔソフトウエアを使用して決定されたとき、配列番号５に対して少なくとも７０％の同一性、または配列番号６に対して少なくとも７５％の同一性、または配列番号７に対して少なくとも８１％の同一性、または配列番号８に対して少なくとも７７％の同一性を有する単離されたポリペプチド。
【請求項６１】
有効成分としての請求項６０の単離されたポリペプチドおよび薬学的に受容可能なキャリアまたは希釈剤を含む薬学的組成物。
【請求項６２】
前記薬学的に受容可能なキャリアまたは希釈剤は局所投与または経口投与のために配合される請求項６１の薬学的組成物。
【請求項６３】
キチン含有病原体を滅菌消毒するための組成物であって、有効成分としての請求項６０の酵素組成物およびキャリアまたは希釈剤を含む組成物。
【請求項６４】
有効成分としての請求項６０の酵素組成物および農学的に受容可能なキャリアを含む農学的組成物。
【請求項６５】
配列番号５、配列番号６、配列番号７および配列番号８またはそれらの活性な部分からなる群から選択される単離されたポリペプチド。
【請求項６６】
有効成分としての請求項６５の単離されたポリペプチドおよび薬学的に受容可能なキャリアまたは希釈剤を含む薬学的組成物。
【請求項６７】
キチン含有病原体を滅菌消毒するための組成物であって、有効成分としての請求項６５の酵素組成物およびキャリアまたは希釈剤を含む組成物。
【請求項６８】
有効成分としての請求項６５の酵素組成物および農学的に受容可能なキャリアを含む農学的組成物。
【請求項６９】
キチン含有病原体に関連する病気または状態を有する個体を処置する方法であって、食虫植物のトラップ消化液またはトラップ組織に由来するタンパク質抽出物であって、エンドキチナーゼ活性を示す少なくとも１つのタンパク質を含むタンパク質抽出物を有効成分として含む薬学的組成物の治療効果的な量を個体に投与することを含む方法。
【請求項７０】
前記少なくとも１つのタンパク質は１０未満のｐＩによって特徴づけられる請求項６９の方法。
【請求項７１】
前記少なくとも１つのタンパク質は抗ＣｈｉＡＩＩポリクローナル抗体との反応性を有しない請求項６９の方法。
【請求項７２】
前記少なくとも１つのタンパク質は、還元性条件にさらされた後、エンドキチナーゼ活性を示さない請求項６９の方法。
【請求項７３】
前記少なくとも１つのタンパク質は、１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって測定されたとき、約３２．７ｋＤａの見かけ分子量によって特徴づけられる請求項６９の方法。
【請求項７４】
前記少なくとも１つのタンパク質は、１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって測定されたとき、約３６ｋＤａの見かけ分子量によって特徴づけられる請求項６９の方法。
【請求項７５】
前記薬学的組成物は薬学的に受容可能なキャリアまたは希釈剤をさらに含む請求項６９の方法。
【請求項７６】
前記少なくとも１つのタンパク質は、ギャップ生成が８に等しく、ギャップ伸長ペナルティーが２に等しいＳｍｉｔｈ／Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムを用いてウィスコンシン（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）配列分析パッケージのＢｅｓｔＦｉｔソフトウエアを使用して決定されたとき、配列番号５に対して少なくとも７０％の同一性、または配列番号６に対して少なくとも７５％の同一性、または配列番号７に対して少なくとも８１％の同一性、または配列番号８に対して少なくとも７７％の同一性を有する請求項６９の方法。
【請求項７７】
前記少なくとも１つのタンパク質は、配列番号５、配列番号６、配列番号７または配列番号８に示されるか、あるいはそれらの活性な部分である請求項７６の方法。
【請求項７８】
前記組織はトラップ組織および／または葉組織である請求項６９の方法。
【請求項７９】
前記消化液はトラップ消化液である請求項６９の方法。
【請求項８０】
前記食虫植物は、ウツボカズラ（Ｎｅｐｅｎｔｈｅｓ  ｓｓｐ．）、モウセンゴケ（Ｄｒｏｓｅｒａ  ｓｐ．）、ハエトリソウ（Ｄｉｏｎｅａ  ｓｐ．）およびヘイシソウ（Ｓａｒｒａｃｅｎｉａ  ｓｐ．）からなる群から選択される請求項６９の方法。
【請求項８１】
キチン含有病原体に関連する病気または状態を処置するために有用な薬学的組成物を作製する方法であって、
（ａ）エンドキチナーゼ活性を示すタンパク質画分を食虫植物のトラップ消化液またはトラップ組織から抽出すること、および
（ｂ）前記タンパク質画分を薬学的に受容可能なキャリアまたは希釈剤と混合し、それにより、キチン含有病原体に関連する病気または状態を処置するために有用な薬学的組成物を作製すること
を含む方法。
【請求項８２】
前記食虫植物は、ウツボカズラ（Ｎｅｐｅｎｔｈｅｓ  ｓｓｐ．）、モウセンゴケ（Ｄｒｏｓｅｒａ  ｓｐ．）、ハエトリソウ（Ｄｉｏｎｅａ  ｓｐ．）およびヘイシソウ（Ｓａｒｒａｃｅｎｉａ  ｓｐ．）からなる群から選択される請求項８１の方法。
【請求項８３】
（ａ）に先立って、前記食虫植物のトラップ消化液またはトラップ組織をキチンにさらすことをさらに含む請求項８１の方法。
【請求項８４】
キチン含有病原体に対する植物の感受性を低下させる方法であって、エンドキチナーゼ活性を有する外因性ポリペプチドであって、ギャップ生成が８に等しく、ギャップ伸長ペナルティーが２に等しいＳｍｉｔｈ／Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムを用いてウィスコンシン（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）配列分析パッケージのＢｅｓｔＦｉｔソフトウエアを使用して決定されたとき、配列番号５に対して少なくとも７０％の同一性、または配列番号６に対して少なくとも７５％の同一性、または配列番号７に対して少なくとも８１％の同一性、または配列番号８に対して少なくとも７７％の同一性を有する外因性ポリペプチドを植物内において発現させることを含む方法。
【請求項８５】
前記外因性ポリペプチドは配列番号５、配列番号６、配列番号７および配列番号８またはそれらの活性な部分からなる群から選択される請求項８４の方法。
【請求項８６】
キチン含有病原体に対する植物の感受性を低下させる方法であって、食虫植物の消化液または組織に由来するタンパク質抽出物であって、エンドキチナーゼ活性を示す少なくとも１つのタンパク質を含むタンパク質抽出物を有効成分として含む組成物に植物をさらすことを含む方法。
【請求項８７】
前記少なくとも１つのタンパク質は１０未満のｐＩによって特徴づけられる請求項８６の方法。
【請求項８８】
前記少なくとも１つのタンパク質は抗ＣｈｉＡＩＩポリクローナル抗体との反応性を有しない請求項８６の方法。
【請求項８９】
前記少なくとも１つのタンパク質は、還元性条件にさらされた後、エンドキチナーゼ活性を示さない請求項８６の方法。
【請求項９０】
前記少なくとも１つのタンパク質は、１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって測定されたとき、約３２．７ｋＤａの見かけ分子量によって特徴づけられる請求項８６の方法。
【請求項９１】
前記少なくとも１つのタンパク質は、１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって測定されたとき、約３６ｋＤａの見かけ分子量によって特徴づけられる請求項８６の方法。
【請求項９２】
前記組成物はキャリアまたは希釈剤をさらに含む請求項８６の方法。
【請求項９３】
前記少なくとも１つのタンパク質は、ギャップ生成が８に等しく、ギャップ伸長ペナルティーが２に等しいＳｍｉｔｈ／Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムを用いてウィスコンシン（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）配列分析パッケージのＢｅｓｔＦｉｔソフトウエアを使用して決定されたとき、配列番号５に対して少なくとも７０％の同一性、または配列番号６に対して少なくとも７５％の同一性、または配列番号７に対して少なくとも８１％の同一性、または配列番号８に対して少なくとも７７％の同一性を有する請求項８６の方法。
【請求項９４】
前記少なくとも１つのタンパク質は、配列番号５、配列番号６、配列番号７または配列番号８に示されるか、あるいはそれらの活性な部分である請求項９３の方法。
【請求項９５】
前記組織はトラップ組織および／または葉組織である請求項８６の方法。
【請求項９６】
前記消化液はトラップ消化液である請求項８６の方法。
【請求項９７】
前記食虫植物は、ウツボカズラ（Ｎｅｐｅｎｔｈｅｓ  ｓｓｐ．）、モウセンゴケ（Ｄｒｏｓｅｒａ  ｓｐ．）、ハエトリソウ（Ｄｉｏｎｅａ  ｓｐ．）およびヘイシソウ（Ｓａｒｒａｃｅｎｉａ  ｓｐ．）からなる群から選択される請求項８６の方法。
【請求項９８】
大きいエンドキチナーゼ活性を示すポリペプチドを単離する方法であって、
（ａ）食虫植物のトラップ組織またはトラップ消化液からタンパク質抽出物を調製すること、および
（ｂ）キチナーゼ活性画分を前記タンパク質抽出物から単離し、それにより、大きいエンドキチナーゼ活性を示すポリペプチドを単離すること
を含む方法。
【請求項９９】
（ａ）に先立って、前記トラップ組織または前記トラップ消化液をキチンにさらすことをさらに含む請求項９８の方法。
【請求項１００】
前記食虫植物は、ウツボカズラ（Ｎｅｐｅｎｔｈｅｓ  ｓｓｐ．）、モウセンゴケ（Ｄｒｏｓｅｒａ  ｓｐ．）、ハエトリソウ（Ｄｉｏｎｅａ  ｓｐ．）およびヘイシソウ（Ｓａｒｒａｃｅｎｉａ  ｓｐ．）からなる群から選択される請求項９８の方法。
【請求項１０１】
低温損傷に対する植物の感受性を低下させる方法であって、エンドキチナーゼ活性を有する外因性ポリペプチドであって、ギャップ生成が８に等しく、ギャップ伸長ペナルティーが２に等しいＳｍｉｔｈ／Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムを用いてウィスコンシン（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）配列分析パッケージのＢｅｓｔＦｉｔソフトウエアを使用して決定されたとき、配列番号５に対して少なくとも７０％の同一性、または配列番号６に対して少なくとも７５％の同一性、または配列番号７に対して少なくとも８１％の同一性、または配列番号８に対して少なくとも７７％の同一性を有する外因性ポリペプチドを多数の植物内において発現させることを含む方法。
【請求項１０２】
前記外因性ポリペプチドは配列番号５、配列番号６、配列番号７および配列番号８またはそれらの活性な部分からなる群から選択される請求項１０１の方法。
【請求項１０３】
低温損傷に対する植物の感受性を低下させる方法であって、食虫植物の消化液または組織に由来するタンパク質抽出物であって、エンドキチナーゼ活性を示す少なくとも１つのタンパク質を含むタンパク質抽出物を有効成分として含む組成物に多数の植物をさらすことを含む方法。
【請求項１０４】
前記少なくとも１つのタンパク質は１０未満のｐＩによって特徴づけられる請求項１０３の方法。
【請求項１０５】
前記少なくとも１つのタンパク質は抗ＣｈｉＡＩＩポリクローナル抗体との反応性を有しない請求項１０３の方法。
【請求項１０６】
前記少なくとも１つのタンパク質は、還元性条件にさらされた後、エンドキチナーゼ活性を示さない請求項１０３の方法。
【請求項１０７】
前記少なくとも１つのタンパク質は、１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって測定されたとき、約３２．７ｋＤａの見かけ分子量によって特徴づけられる請求項１０３の方法。
【請求項１０８】
前記少なくとも１つのタンパク質は、１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって測定されたとき、約３６ｋＤａの見かけ分子量によって特徴づけられる請求項１０３の方法。
【請求項１０９】
前記組成物はキャリアまたは希釈剤をさらに含む請求項１０３の方法。
【請求項１１０】
前記少なくとも１つのタンパク質は、ギャップ生成が８に等しく、ギャップ伸長ペナルティーが２に等しいＳｍｉｔｈ／Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムを用いてウィスコンシン（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）配列分析パッケージのＢｅｓｔＦｉｔソフトウエアを使用して決定されたとき、配列番号５に対して少なくとも７０％の同一性、または配列番号６に対して少なくとも７５％の同一性、または配列番号７に対して少なくとも８１％の同一性、または配列番号８に対して少なくとも７７％の同一性を有する請求項１０３の方法。
【請求項１１１】
前記少なくとも１つのタンパク質は、配列番号５、配列番号６、配列番号７または配列番号８に示されるか、あるいはそれらの活性な部分である請求項１１０の方法。
【請求項１１２】
前記組織はトラップ組織および／または葉組織である請求項１０３の方法。
【請求項１１３】
前記消化液はトラップ消化液である請求項１０３の方法。
【請求項１１４】
前記食虫植物は、ウツボカズラ（Ｎｅｐｅｎｔｈｅｓ  ｓｓｐ．）、モウセンゴケ（Ｄｒｏｓｅｒａ  ｓｐ．）、ハエトリソウ（Ｄｉｏｎｅａ  ｓｐ．）およびヘイシソウ（Ｓａｒｒａｃｅｎｉａ  ｓｐ．）からなる群から選択される請求項１０３の方法。
【請求項１１５】
エンドキチナーゼ活性を有するポリペプチドであって、ギャップ生成が８に等しく、ギャップ伸長ペナルティーが２に等しいＳｍｉｔｈ／Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムを用いてウィスコンシン（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）配列分析パッケージのＢｅｓｔＦｉｔソフトウエアを使用して決定されたとき、配列番号５に対して少なくとも７０％の同一性、または配列番号６に対して少なくとも７５％の同一性、または配列番号７に対して少なくとも８１％の同一性、または配列番号８に対して少なくとも７７％の同一性を有するポリペプチドをコードする外因性ポリヌクレオチド配列を含む植物または植物組織または植物種子。
【請求項１１６】
前記ポリヌクレオチド配列は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４および配列番号４８またはそれらの活性な部分からなる群から選択される請求項１１５の植物または植物組織または植物種子。
【請求項１１７】
前記ポリペプチドは、配列番号５、配列番号６、配列番号７および配列番号８またはそれらの活性な部分からなる群から選択される請求項１１５の植物または植物組織または植物種子。
【請求項１１８】
前記ポリヌクレオチド配列は、ゲノムポリヌクレオチド配列、相補的なポリヌクレオチド配列および複合ポリヌクレオチド配列からなる群から選択される請求項１１５の植物または植物組織または植物種子。
【請求項１１９】
エンドキチナーゼ活性を有するポリペプチドであって、少なくとも１０個で、多くても１５個のプロリンアミノ酸を有するプロリンリッチ領域を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む単離された核酸。
【請求項１２０】
前記プロリンリッチ領域は６個の推定されるグリコシル化部位を含む請求項１１９の単離された核酸。
【請求項１２１】
前記ポリヌクレオチド配列は配列番号１または配列番号４８に示されるか、あるいはそれらの活性な部分である請求項１１９の単離された核酸。
【請求項１２２】
前記ポリヌクレオチド配列は配列番号５に示されるか、あるいはそれらの活性な部分である請求項１１９の単離された核酸。
【請求項１２３】
前記ポリヌクレオチド配列は、ゲノムポリヌクレオチド配列、相補的なポリヌクレオチド配列および複合ポリヌクレオチド配列からなる群から選択される請求項１１９の単離された核酸。
【請求項１２４】
前記プロリンリッチ領域は配列番号４９に示される請求項１１９の単離された核酸。
【請求項１２５】
請求項１１９の単離された核酸を含む核酸構築物。
【請求項１２６】
請求項１２５の核酸構築物を含む宿主細胞。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野および背景
本発明は、食虫植物に由来するキチナーゼ、そのようなキチナーゼをコードするポリヌクレオチド配列、ならびにキチン含有病原体に対する植物の感受性を低下させるために、そして植物を寒冷状態および霜状態に対して抵抗性にするために、そしてカンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）などのキチン含有病原体に関連する病気または状態に罹っている個体を処置するために、そのようなキチナーゼを単離および使用する方法である。
【０００２】
植物病原体は作物生産全体に影響を及ぼし、そして多くの場合には作物の完全な破壊を生じさせることがある。様々な細胞プロセスにより、植物は病原体の感染に抵抗し、関連する病気症状の発生を防ぐことができる。これらの応答には、中でも、病原体関連タンパク質（ＰＲタンパク質）として知られている１群のタンパク質ファミリーのデノボ合成が含まれる。しかし、植物病原体からの保護のために天然の植物産物を使用することには、多くの場合、植物防御機構に関与する産物の合成を増大させるために既存の代謝経路を強化することが必然的に伴う。そのような代謝的変化は、正常な発達、同化物の産生、収量的能力および品質的能力を発現する能力などに対して有害な影響を及ぼすことがある。従って、異種供給源由来のより強力なＰＲタンパク質の遺伝子組換え発現によって植物防御システムを改変することは非常に重要である（例えば、欧州特許出願０３９２２２５を参照のこと）。
【０００３】
最も良く特徴づけられているＰＲタンパク質の１つが、卵菌類を除くほとんどの糸状菌の主要な細胞壁成分であるキチン（Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン（ＮＡＧ）の１，４結合ポリマー）の加水分解を触媒するキチナーゼ（Ｅ．Ｃ．３．２．２．１４）である。キチンはまた、節足動物および線虫および軟体動物の重要な構成成分である。菌類では、キチナーゼは、キチンを成長中の菌糸体の先端において加水分解し、胞子形成を阻害し、そして吸器の細胞壁を加水分解する（ＣａｒｒおよびＫｌｅｓｓｉｎｇ、１９８９）。この加水分解活性は、菌類の成長を遅らせ、そして植物組織内への病原体の侵入を遅延または防止することにおいて直接的な役割を果たしている。キチナーゼはまた、植物防御応答を誘発する際のシグナル分子として後に作用する分解産物を菌類の細胞壁から放出させることにおいて、間接的ではあるが、重要な役割を果たしている（ＧｒａｈａｍおよびＳｔｉｃｋｌｅｎ、１９９４）。
【０００４】
今日までに単離された植物キチナーゼはほとんどが、コアのキチン構造の小さいポリマーを放出するエンドキチナーゼである。これらの酵素の分子量範囲は２５ｋＤａ〜４０ｋＤａの間である。これらの酵素は、通常、酸性の至適値（ｐＨ３〜６．５）を有する単量体として活性であり、また補因子を要求しないようであり、そして広い温度範囲で安定である。様々なキチナーゼが多くの植物種から単離されているが、それらは、そのマルチドメイン構造に従って５つのクラス（Ｉ〜Ｖ）に分類されている（Ｃｏｌｌｉｎｇｅ他、１９９３；Ｈａｍｅｌ他、１９９７）。
【０００５】
クラスＩキチナーゼは、（塩基性のｐＩ値を有する）塩基性タンパク質から主に構成されており、ほとんどが液胞に標的化され、そして単子葉植物および双子葉植物の両方において見出される。これらの酵素は大きい比活性を示し、根および苗条および花における植物のキチン分解活性の大部分を担っている（Ｌｅｇｒａｎｄ他、１９８７）。クラスＩキチナーゼは５つの構造的ドメインから構成される：（ｉ）タンパク質を小胞体内腔内に輸送するＮ末端のシグナルペプチド（２０個〜２７個のアミノ酸残基）；（ｉｉ）システインリッチドメイン（約４０個のアミノ酸からなるＣＲＤ）、このドメインはキチン結合に関与し、８個のシステイン残基を非常に保存された位置に含有する；（ｉｉｉ）サイズが一定しないプロリン（ほとんどがヒドロキシプロリン）リッチのヒンジ領域（ＨＲ）；（ｉｖ）触媒作用ドメイン（ＣＤ＞２２０アミノ酸）、このドメインは、クラスＩＩキチナーゼおよびクラスＩＶキチナーゼの触媒作用ドメインに対して大きい相同性を示し、細菌キチナーゼのＣＤに対して低い相同性を示す、タンパク質の中央ドメインを構成する；そして（ｖ）カルボキシ末端の伸長部（ＣＴＥ）、この部分はタンパク質を液胞内に標的化し、クラスＩキチナーゼのほとんどに存在する（ＧｒａｈａｍおよびＳｔｉｃｋｌｅｎ、１９９４；Ｈａｍｅｌ他、１９８７）。液胞に区画化されたキチナーゼの迅速な多量の放出が、病原体の侵入に対する過敏的応答から生じる細胞溶解のときに生じる。基本的にはクラスＩキチナーゼではあるが、ＣＴＥを有していないクラスＩキチナーゼもまたいくつか特徴づけられている。これらのキチナーゼは細胞外空間に分泌されている（Ｌｅｇｒａｎｄ他、１９８７；Ｓｗｅｇｌｅ他、１９９２；Ｖａｄ他、１９９１）。
【０００６】
クラスＩＩキチナーゼは酸性（酸性のｐＩを有する）であり、シグナルペプチドおよび触媒作用ドメインを含むだけである。触媒作用ドメインは、クラスＩキチナーゼおよびクラスＩＶキチナーゼの触媒作用領域に対して大きいアミノ酸配列相同性を示す。酸性キチナーゼの比活性はクラスＩキチナーゼの比活性よりも低い。クラスＩＩキチナーゼの主要な機能は、菌類病原体の細胞壁を部分的に分解することによって防御応答のエリシターを生じさせることであると推定されている（ＧｒａｈａｍおよびＳｔｉｃｋｌｅｎ、１９９４）。
【０００７】
クラスＩＩＩキチナーゼには、キチナーゼ／リゾチーム活性を有する塩基性または酸性の細胞外タンパク質が含まれる。それらの触媒作用ドメインは、クラスＩおよびクラスＩＩの触媒作用ドメインとは異なるが、酵母および糸状菌に由来するキチナーゼとの著しい同一性を有している。
【０００８】
クラスＩＶキチナーゼはクラスＩキチナーゼとの構造的なドメイン類似性を有するが、アミノ酸配列の同一性は大きくない。クラスＩＶ酵素はすべて、ＣＴＥを有しておらず、従ってアポプラストに標的化される。さらに、クラスＩタンパク質とのアミノ酸配列アラインメントにより、１個がキチン結合ドメインに存在し、３個が触媒作用ドメイン内に存在する４つの異なる欠失が示された。この群には、マメ由来のＰＲ４キチナーゼ、カノーラ由来のＣｈＢ４などが含まれる（Ｈａｍｅｌ他、１９９７）。
【０００９】
クラスＶキチナーゼは、細菌起源（セラチア・マルセセンス（Ｓｅｒｒａｃｉａ  ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）、バチルス・サークランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）およびストレプトミセス・プリカツス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｐｌｉｃａｔｕｓ））のエキソキチナーゼに対してある程度の相同性を有する。
【００１０】
構造が上記に記載されたカテゴリーとは異なる植物キチナーゼもまたいくつか特徴づけられている。いくつかの酸性キチナーゼはクラスＩの構造的組成を有するようである（Ｖａｎ  Ｄａｍｍｅ他、１９９３）。別の珍しい酵素がイラクサ（Ｕｒｔｉｃａ  ｄｉｏｉｃａ）由来のアグルチニン型キチナーゼ（ＵＤＡ）であり、これは、Ｎ末端の２つのキチン結合ドメインと、クラスＩキチナーゼに対するアミノ酸配列相同性を有する触媒作用ドメインとを含む。この酵素は、キチンポリマーを切断する代わりに、侵入している菌類菌糸の先端においてキチン鎖を架橋する能力を示し、それにより病原体の発達を阻害する（ＬｅｒｎｅｒおよびＲａｉｋｈｅｌ、１９９２）。エンドキチナーゼおよび昆虫α−アミラーゼの両方の阻害活性を有するホモ二量体のホロ酵素がジュズダマ（Ｃｒｏｉｘ  ｌａｃｈｒｙｍｏｓａ）の種子から単離された（Ａｒｙ他、１９８９）。従って、キチナーゼ活性を有する変わったタンパク質が様々な植物機構において進化している。しかし、植物キチナーゼに関するデータが多いにもかかわらず、今日までのところ、食虫植物からはキチナーゼが１つも単離されていない。
【００１１】
重要作物の病原体に対する植物防御機構は、広い作用スペクトルの抗菌類活性を有するタンパク質をコードする外来遺伝子を導入することにより改変することができる。単子葉植物における遺伝子組換え植物を作製するための様々な方法が広く報告されている。形質転換および植物再生の成功が、アスパラガス（Ａｓｐａｒａｇｕｓ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ；Ｂｙｔｅｂｉｅｒ他（１９８７））、オオムギ（Ｈｏｒｄｅｕｍ  ｖｕｌｇａｒｅ；ＷａｎおよびＬｅｍａｕｘ（１９９４））、トウモロコシ（Ｚｅａ  ｍａｙｓ；Ｒｈｏｄｅｓ他、（１９８８）；Ｇｏｒｄｏｎ−Ｋａｍｍ他（１９９０）；Ｆｒｏｍｍ他（１９９０）；Ｋｏｚｉｅｌ他（１９９３））、オートムギ（Ａｖｅｎａ  ｓａｔｉｖａ；Ｓｏｍｅｒｓ他（１９９２））、カモガヤ（Ｄａｃｔｙｌｉｓ  ｇｌｏｍｅｒａｔａ；Ｈｏｒｎ他（１９８８））、イネ（Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ（インディカ品種およびジャポニカ品種を含む）；Ｔｏｒｎｙａｍａ他（１９８８）；Ｚｈａｎｇ他（１９８８）、ＬｕｏおよびＷｕ（１９８８）；ＺｈａｎｇおよびＷｕ（１９８８）；Ｃｈｒｉｓｔｏｕ他（１９９１））、ライムギ（Ｓｅｃａｌｅ  ｃｅｒｅａｌｅ；Ｄｅ  ｌａ  Ｐｅｎａ他（１９８７））、モロコシ（Ｓｏｒｇｈｕｍ  ｂｉｃｏｌｏｒ；Ｃａｓｓａｓ他（１９９３））、サトウキビ（Ｓａｃｃｈａｒｕｍ  ｓｐｐ．；ＢｏｗｅｒおよびＢｉｒｃｈ（１９９２））、ヒロハノウシノケグサ（Ｆｅｓｔｕｃａ  ａｒｕｎｄｉｎａｃｅａ；Ｗａｎｇ他（１９９２））、ヌカボ（Ａｇｒｏｓｔｉｓ  ｐａｌｕｓｔｒｉｓ；Ｚｈｏｎｇ他（１９９３））、コムギ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ  ａｅｓｔｉｖｕｍ；Ｖａｓｉｌ他（１９９２）；Ｔｒｏｙ  Ｗｅｅｋｓ他（１９９３）；Ｂｅｃｋｅｒ他（１９９４））において達成されている。
【００１２】
細胞壁分解酵素（特にキチナーゼ）をコードする植物遺伝子が、菌類病原体に対する植物の抵抗性を高めるために使用されている（例えば、米国特許第６２９１６４７号および同第６２８０７２２号（それぞれ、Ｍｅｌｃｈｅｒｓ他およびＭｏａｒ）を参照のこと）が、単一遺伝子では十分なレベルの抵抗性が得られていない（Ｂｒｏｇｌｉｅ他、１９９１；ＰｕｎｊａおよびＲａｈａｒｊｏ、１９９６；Ｚｈｕ他、１９９４；Ｊａｃｈ他、１９９５）。さらに、トリコデルマ・ハルジアヌム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｈａｒｚｉａｎｕｍ）に由来する菌類キチナーゼが、タバコ、ジャガイモにおいて（Ｌｏｒｉｔｏ他、１９９８）、そしてリンゴにおいて（Ｂｏｌａｒ他、２０００）、病原体に対して効果的であると報告されているが、多数の病原体に対する持続した感受性が、抗菌類遺伝子を取り込む作物では依然として共通する費用のかかる問題である。最近、遺伝子組換えによる菌類耐性作物において使用されるアルファルファ由来の作用スペクトルが広い抗菌類剤がＬｉａｎｇ他（米国特許第６３２９５０４号）によって開示された。しかしながら、抗菌類活性の生化学的特徴づけは示されていなかった。
【００１３】
植物病原体耐性タンパク質の比活性は、病気を保護するための遺伝子およびその産物の選択において重要な検討事項である。従って、大きい比活性を有する新規な植物病原体耐性タンパク質を有することは好都合である。
【００１４】
先行技術には、植物および動物の病気を処置および防止することにおいてキチナーゼによるキチンの酵素的消化の様々な適用が記載されている。例えば、Ｊａｙｎｅｓ他は、遺伝子組換え動物において病気抵抗性を付与するために、植物以外の抗菌性タンパク質（中でも、キチナーゼ）の使用を開示した（米国特許第６３０３５６８号）。Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｅｎｓｉｓ由来の新規なキチナーゼもまたＭｏａｒによって報告された（米国特許第６２８０７２２号）。しかし、食虫植物に由来するキチナーゼについては何ら言及されていない。さらに、ヒト病原体に対する植物キチナーゼの適用はこれまで報告されていない。
【００１５】
植物に対して有害であることに加えて、キチン含有生物（菌類、原生動物および蠕虫など）もまた、ヒトおよび動物における様々な感染性疾患の原因病原体である。
【００１６】
限られた数の現在利用可能な抗菌類薬（抗真菌薬）は、一般に効力があまり強くない。様々な菌類（真菌）感染症が、免疫不適格者において、現在では、最も高頻度には後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）患者においてたびたび直面している。皮膚の真菌感染症のほとんどは局所用調製物で処置される。内臓の感染症およびあま皮の感染症は長期間の全身的な治療を必要とする。
【００１７】
最も頻発する真菌感染症がカンジダ・アルビカンスによって引き起こされている。この生物は口腔粘膜および膣粘膜の一般的な片利共生生物であるが、局所的な微生物エコロジーが乱れたときには、損傷を受けた皮膚、重病な患者、特定の免疫不全を有する患者、そして広い作用スペクトルの抗生物質を服用している患者において病原体になり得る。カンジダ感染の極端な結果は、肺炎、心内膜炎、敗血症、そして死でさえあり得る。その唯一の効果的な処置はアンフォテリシンＢの静脈内投与である。この薬物の投与は、低血圧および虚脱状態を伴う重篤な有害作用を生じさせることがある。そのような理由から、最初の試験的な用量が、許容性を決定するために注入される。フルシトシンは、真菌細胞に入り、ＤＮＡ合成およびＲＮＡ合成を妨害することによって代謝を阻害する合成されたフッ素化ピリミジンである。この化合物は通常、全身的な真菌感染症を処置するためにアンフォテリシンＢとの組合せで投与される。単独で投与されたとき、フルシトシンに対する耐性が急速に発生する。
【００１８】
ヒトにおいて重篤な感染性疾患を引き起こし得る真菌の他の種には、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、クリプトコッカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、コクシジオイデス（Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ）属、パラコクシジオイデス（Ｐａｒａｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ）属、ブラストミセス（Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｓ）属、スポロトリクス（Ｓｐｏｒｏｔｈｒｉｘ）属およびヒストプラスマ・カプスラツム（Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｍ）がある。
【００１９】
従って、病原体に対する保護をもたらすために十分な量で遺伝子組換え生物において発現し得る新規な病原体防御化合物、特に、植物およびヒトの病原性菌類（真菌）に対して効果的である化合物を同定および特徴づけることが引き続き求められている。
【００２０】
発明の開示
本発明の１つの局面により、食虫植物の組織または消化液から単離される、エンドキチナーゼ活性によって特徴づけられる少なくとも１つのタンパク質を含む酵素組成物が提供される。
【００２１】
本発明の別の局面により、食虫植物の組織または消化液のタンパク質抽出物であって、エンドキチナーゼ活性を示す少なくとも１つのタンパク質を含むタンパク質抽出物を含む酵素組成物が提供される。
【００２２】
下記に記載される本発明の好ましい実施形態におけるさらなる特徴により、少なくとも１つのタンパク質は１０未満のｐＩによって特徴づけられる。
【００２３】
記載される好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴により、少なくとも１つのタンパク質は抗ＣｈｉＡＩＩポリクローナル抗体との反応性を有しない。
【００２４】
記載される好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴により、少なくとも１つのタンパク質は、還元性条件にさらされた後、エンドキチナーゼ活性を示さない。
【００２５】
記載される好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴により、少なくとも１つのタンパク質は、１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって測定されたとき、約３２．７ｋＤａの見かけ分子量によって特徴づけられる。
【００２６】
記載される好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴により、少なくとも１つのタンパク質は、１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって測定されたとき、約３６ｋＤａの見かけ分子量によって特徴づけられる。
【００２７】
記載される好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴により、有効成分としての上記酵素組成物および薬学的に受容可能なキャリアまたは希釈剤を含む薬学的組成物が提供される。
【００２８】
記載される好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴により、少なくとも１つのタンパク質は抗菌類活性によって特徴づけられる。
【００２９】
記載される好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴により、抗菌類活性は殺菌類活性である。
【００３０】
記載される好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴により、抗菌類活性は抗カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）活性である。
【００３１】
記載される好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴により、キチン含有病原体を滅菌消毒するための組成物であって、有効成分としての上記酵素組成物およびキャリアまたは希釈剤を含む組成物が提供される。
【００３２】
記載される好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴により、有効成分としての上記酵素組成物および農学的に受容可能なキャリアを含む農学的組成物が提供される。
【００３３】
記載される好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴により、少なくとも１つのタンパク質は、ギャップ生成が８に等しく、ギャップ伸長ペナルティーが２に等しいＳｍｉｔｈ／Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムを用いてウィスコンシン（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）配列分析パッケージのＢｅｓｔＦｉｔソフトウエアを使用して決定されたとき、配列番号５に対して少なくとも７０％の同一性、または配列番号６に対して少なくとも７５％の同一性、または配列番号７に対して少なくとも８１％の同一性、または配列番号８に対して少なくとも７７％の同一性を有する。
【００３４】
記載される好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴により、少なくとも１つのタンパク質は、配列番号５、配列番号６、配列番号７または配列番号８に示される通りであるか、あるいはその活性な部分である。
【００３５】
記載される好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴により、組織はトラップ組織および／または葉組織である。
【００３６】
記載される好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴により、消化液はトラップ消化液である。
【００３７】
記載される好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴により、食虫植物は、ウツボカズラ（Ｎｅｐｅｎｔｈｅｓ  ｓｓｐ．）、モウセンゴケ（Ｄｒｏｓｅｒａ  ｓｐ．）、ハエトリソウ（Ｄｉｏｎｅａ  ｓｐ．）およびヘイシソウ（Ｓａｒｒａｃｅｎｉａ  ｓｐ．）からなる群から選択される。
【００３８】
本発明のさらに別の局面により、エンドキチナーゼ活性を有するポリペプチドであって、ギャップ生成が８に等しく、ギャップ伸長ペナルティーが２に等しいＳｍｉｔｈ／Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムを用いてウィスコンシン（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）配列分析パッケージのＢｅｓｔＦｉｔソフトウエアを使用して決定されたとき、配列番号５に対して少なくとも７０％の同一性、または配列番号６に対して少なくとも７５％の同一性、または配列番号７に対して少なくとも８１％の同一性、または配列番号８に対して少なくとも７７％の同一性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む単離された核酸が提供される。
【００３９】
記載される好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴により、ポリヌクレオチド配列は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４および配列番号４８またはそれらの活性な部分からなる群から選択される。
【００４０】
記載される好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴により、ポリペプチドは、配列番号５、配列番号６、配列番号７および配列番号８またはそれらの活性な部分からなる群から選択される。
【００４１】
記載される好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴により、ポリヌクレオチド配列は、ゲノムポリヌクレオチド配列、相補的なポリヌクレオチド配列および複合ポリヌクレオチド配列からなる群から選択される。
【００４２】
記載される好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴により、上記の単離された核酸を含む核酸構築物が提供される。
【００４３】
記載される好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴により、上記の核酸構築物を含む宿主細胞が提供される。
【００４４】
本発明のさらに別の局面により、エンドキチナーゼ活性を有するポリペプチドであって、少なくとも３０アミノ酸のシグナルペプチドを含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む単離された核酸が提供される。
【００４５】
記載される好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴により、シグナルペプチドはタンパク質分泌のためである。
【００４６】
記載される好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴により、ポリヌクレオチド配列は配列番号１または配列番号４８に示されるか、あるいはそれらの活性な部分である。
【００４７】
記載される好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴により、ポリペプチドは配列番号５に示されるか、またはその活性な部分である。
【００４８】
記載される好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴により、シグナルペプチドは配列番号４７に示される。
【００４９】
本発明のさらなる局面により、ギャップ荷重が５０に等しく、長さ荷重が３に等しく、平均マッチが１０に等しく、平均ミスマッチが−９に等しいＳｍｉｔｈ／Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムを用いてウィスコンシン（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）配列分析パッケージのＢｅｓｔＦｉｔソフトウエアを使用して決定されたとき、配列番号１との少なくとも６７％の同一性、または配列番号２との少なくとも７５％の同一性を含む単離された核酸が提供される。
【００５０】
記載される好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴により、ポリヌクレオチド配列は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４および配列番号４８あるいはそれらの活性な部分からなる群から選択される。
【００５１】
記載される好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴により、ポリヌクレオチド配列は、ゲノムポリヌクレオチド配列、相補的なポリヌクレオチド配列、および複合ポリヌクレオチド配列からなる群から選択される。
【００５２】
本発明のなおさらなる局面により、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４または配列番号４８に示される単離された核酸と特異的にハイブリダイゼーションし得る少なくとも１７塩基のオリゴヌクレオチドが提供される。
【００５３】
本発明のさらにさらなる局面により、核酸増幅反応においてその一部の特異的な増幅が行われるように、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４または配列番号４８と反対方向に特異的にハイブリダイゼーションし得る少なくとも１７塩基からそれぞれがなる１対のオリゴヌクレオチドが提供される。
【００５４】
本発明のさらなる局面により、エンドキチナーゼ活性を有するポリペプチドであって、ギャップ生成が８に等しく、ギャップ伸長ペナルティーが２に等しいＳｍｉｔｈ／Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムを用いてウィスコンシン（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）配列分析パッケージのＢｅｓｔＦｉｔソフトウエアを使用して決定されたとき、配列番号５に対して少なくとも７０％の同一性、または配列番号６に対して少なくとも７５％の同一性、または配列番号７に対して少なくとも８１％の同一性、または配列番号８に対して少なくとも７７％の同一性を有する単離されたポリペプチドが提供される。
【００５５】
本発明のなおさらなる局面により、配列番号５、配列番号６、配列番号７および配列番号８またはそれらの活性な部分からなる群から選択される単離されたポリペプチドが提供される。
【００５６】
本発明のさらにさらなる局面により、キチン含有病原体に関連する病気または状態を有する個体を処置する方法が提供される。この場合、この方法は、食虫植物のトラップ消化液またはトラップ組織に由来するタンパク質抽出物であって、エンドキチナーゼ活性を示す少なくとも１つのタンパク質を含むタンパク質抽出物を有効成分として含む薬学的組成物の治療効果的な量を個体に投与することを含む。
【００５７】
本発明のさらにさらなる局面により、キチン含有病原体に関連する病気または状態を処置するために有用な薬学的組成物を作製する方法が提供される。この場合、この方法は、（ａ）エンドキチナーゼ活性を示すタンパク質画分を食虫植物のトラップ消化液またはトラップ組織から抽出すること、および（ｂ）タンパク質画分を薬学的に受容可能なキャリアまたは希釈剤と混合し、それにより、キチン含有病原体に関連する病気または状態を処置するために有用な薬学的組成物を作製することを含む。
【００５８】
本発明のさらにさらなる局面により、キチン含有病原体に対する植物の感受性を低下させる方法が提供される。この場合、この方法は、エンドキチナーゼ活性を有する外因性ポリペプチドであって、ギャップ生成が８に等しく、ギャップ伸長ペナルティーが２に等しいＳｍｉｔｈ／Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムを用いてウィスコンシン（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）配列分析パッケージのＢｅｓｔＦｉｔソフトウエアを使用して決定されたとき、配列番号５に対して少なくとも７０％の同一性、または配列番号６に対して少なくとも７５％の同一性、または配列番号７に対して少なくとも８１％の同一性、または配列番号８に対して少なくとも７７％の同一性を有する外因性ポリペプチドを植物内において発現させることを含む。
【００５９】
本発明のさらにさらなる局面により、大きいエンドキチナーゼ活性を示すポリペプチドを単離する方法が提供される。この場合、この方法は、（ａ）食虫植物のトラップ組織またはトラップ消化液からタンパク質抽出物を調製すること、および（ｂ）キチナーゼ活性画分をタンパク質抽出物から単離し、それにより、大きいエンドキチナーゼ活性を示すポリペプチドを単離することを含む。
【００６０】
さらにさらなる特徴により、この方法は、（ａ）に先立って、トラップ組織またはトラップ消化液をキチンにさらすことをさらに含む。
【００６１】
本発明のさらにさらなる局面により、低温損傷に対する植物の感受性を低下させる方法が提供される。この場合、この方法は、食虫植物の消化液または組織に由来するタンパク質抽出物であって、エンドキチナーゼ活性を示す少なくとも１つのタンパク質を含むタンパク質抽出物を有効成分として含む組成物に多数の植物をさらすことを含む。
【００６２】
本発明のさらにさらなる局面により、エンドキチナーゼ活性を有するポリペプチドであって、ギャップ生成が８に等しく、ギャップ伸長ペナルティーが２に等しいＳｍｉｔｈ／Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムを用いてウィスコンシン（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）配列分析パッケージのＢｅｓｔＦｉｔソフトウエアを使用して決定されたとき、配列番号５に対して少なくとも７０％の同一性、または配列番号６に対して少なくとも７５％の同一性、または配列番号７に対して少なくとも８１％の同一性、または配列番号８に対して少なくとも７７％の同一性を有するポリペプチドをコードする外因性ポリヌクレオチド配列を含む植物または植物組織または植物種子が提供される。
【００６３】
本発明のさらにさらなる局面により、エンドキチナーゼ活性を有するポリペプチドであって、少なくとも１０個で、多くても１５個のプロリンアミノ酸を有するプロリンリッチ領域を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む単離された核酸が提供される。
【００６４】
記載される好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴により、プロリンリッチ領域は６個の推定されるグリコシル化部位を含む。
【００６５】
記載される好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴により、ポリヌクレオチド配列は配列番号１または配列番号４８に示されるか、あるいはそれらの活性な部分である。
【００６６】
本発明は、食虫植物に由来する新規なキチナーゼ、そのようなキチナーゼをコードするポリヌクレオチド配列、ならびにキチン含有病原体に対する植物の感受性を低下させるために、そして寒冷状態および霜状態に対して植物を抵抗性にするために、そしてカンジダ・アルビカンスなどのキチン含有病原体に関連する病気または状態に罹っている個体を処置するために、そのようなキチナーゼを単離および使用する方法を提供することによって、現在知られている形態の欠点を解決することに成功している。
【００６７】
図面の簡単な説明
本発明は、本明細書中には、例としてだけであるが、添付された図面を参照して記載される。次に図面を詳細に特に参照することにより、示される特定の事項は、例としてであり、かつ本発明の好ましい実施形態の例示的な議論のためだけであり、そして本発明の原理および概念的局面の最も有用で、かつ容易に理解される記載であると考えられるものを提供するために示されることに重点が置かれている。これに関連して、本発明の基本的な理解のために必要とされるよりも詳しく本発明の構造的詳細を示すことはなされていない。しかし、図面とともに理解される説明により、本発明のいくつかの形態がいかにして実際に具体化され得るかが当業者には明らかになる。
図１は、ウツボカズラのトラップ消化液における新規なキチナーゼ活性の存在を明らかにするキチナーゼ活性ゲルである。葉の開いたトラップ組織抽出物および閉じたトラップ組織抽出物（１５０μｌ）、そして消化液（７５μｌ）サンプルを１５％未変性ＰＡＧＥで分離した。電気泳動後、ゲルを、０．０１％（ｗ／ｖ）グリコールキチンを含有する別のゲルと重ねて、３７℃で一晩インキュベーションし、そして０．０１％カルコフルオルホワイトＭ２Ｒで５分間染色した。キチナーゼ活性（溶解活性の暗い染色バンド）がＵＶ照射により可視化された。消化液には、それ以外の植物組織のバンドとは異なって移動するキチナーゼ活性の新規なバンドが存在することに留意すること。
図２aおよび２ｂは、新規なトラップ消化液キチナーゼとＳ．ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓキチナーゼとの間には抗原的類似性がないことを明らかにするウエスタンブロットである。ウツボカズラに由来する組織抽出物（葉＝Ｌ、トラップ組織＝Ｃ）およびトラップ消化液（Ｓ）、そしてＳ．ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ抽出物を含有する大腸菌抽出物（Ｓｅｒ）を１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離して、ＰＶＤＦメンブランにブロットし、そしてＳ．ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓのＣｈｉＡＩＩキチナーゼを認識するウサギポリクローナル抗体でプローブした。免疫反応性のバンドが、アルカリホスファターゼ結合のヤギ抗ウサギ抗体を結合させることによって可視化された。図２ａ−サンプルには、５０μｌの葉抽出物（Ｌ）およびトラップ組織抽出物（Ｃ）、４０μｌのトラップ消化液（Ｓ）、そして＋Ｓ．ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓのＣｈｉＡＩＩキチナーゼを過剰発現する大腸菌細胞の抽出物の１００ｎｇ（Ｓｅｒ）が含まれる。図２ｂ−サンプルには、５０μｌの葉抽出物（Ｌ）、Ｓ．ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓキチナーゼを過剰発現する大腸菌細胞の１００ｎｇ（Ｓｅｒ）、および８７５μｌの濃縮されたトラップ消化液（Ｓ）が含まれる。矢印は免疫反応性の葉抽出物バンドおよび大腸菌バンドを示しているが、トラップ消化液の２２倍濃縮でさえ、Ｓ．ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓに対する抗体との抗原性交差反応性は明らかにされなかった。
図３は、ウツボカズラのトラップ消化液における新規なキチナーゼ活性のＳＤＳ変性に対する抵抗性を明らかにする半変性キチナーゼ活性ゲルである。葉抽出物（Ｌ）およびトラップ組織抽出物（Ｃ）の一部（１５０μｌ）、トラップ消化液（Ｓ）（７５μｌ）、そしてＳ．ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓのＣｈｉＡＩＩキチナーゼを過剰発現する大腸菌細胞の抽出物の０．６μｇ（Ｓｅｒ）を、煮沸または２−メルカプトエタノールを用いることなく１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離した。電気泳動後、ゲルを４０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．８）／１％カゼイン／２ｍＭ  ＥＤＴＡにおいてインキュベーションすることによって再生し、その後、０．０１％（ｗ／ｖ）グリコールキチンを含有する別のゲルと重ねて、３７℃で一晩インキュベーションし、そして０．０１％カルコフルオルホワイトＭ２Ｒで５分間染色した。キチナーゼ活性（溶解活性の暗い染色バンド）がＵＶ照射により可視化された。トラップ消化液のキチナーゼ活性の新規なバンド（Ｓ）は一貫してより遅く移動することに留意すること。
図４aおよび４ｂは、ＳＤＳおよび２−メルカプトエタノールの変性に対するウツボカズラの新規なトラップ消化液キチナーゼ活性の感受性を明らかにする変性キチナーゼ活性ゲルである。葉抽出物（葉）の一部（１５０μｌ）、トラップ消化液（消化液）（７５μｌ）、そしてＳ．ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓのＣｈｉＡＩＩキチナーゼを過剰発現する大腸菌細胞の抽出物の０．６μｇ（Ｓｅｒ）を、煮沸を行うことなく（図４ａ）、または５分間の煮沸とともに（図４ｂ）、ＳＤＳおよび２−メルカプトエタノールにおいて調製して、１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離した。電気泳動後、ゲルを４０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．８）／１％カゼイン／２ｍＭ  ＥＤＴＡにおいてインキュベーションすることによって再生し、その後、０．０１％（ｗ／ｖ）グリコールキチンを含有する別のゲルと重ねて、３７℃で一晩インキュベーションし、そして０．０１％カルコフルオルホワイトＭ２Ｒで５分間染色した。キチナーゼ活性（溶解活性の暗い染色バンド）がＵＶ照射により可視化された。煮沸を伴う変性後または煮沸を伴わない変性後には、トラップ消化液キチナーゼ活性の新規なバンド（Ｓ）が存在しないが、それ以外のキチナーゼのバンドが存在することに留意すること。
図５は、大きい比活性のウツボカズラトラップ消化液キチナーゼを明らかにするクーマシーブルー染色されたＳＤＳ−ＰＡＧＥである。濃縮されたトラップ消化液（Ｓ）のサンプル（６００μｌ）、５８ｋＤａのＳ．ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓのＣｈｉＡＩＩキチナーゼを過剰発現する大腸菌のタンパク質抽出物の４μｇ（Ｓｅｒ）、およびサイズマーカー（ＳＭ）を１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離して、クーマシーブルー染色により可視化した。トラップ消化液におけるタンパク質レベルは検出できないことに留意すること。
図６は、ウツボカズラトラップ消化液酵素のＦＰＬＣによる精製および濃縮を例示する。トラップ消化液をセファデックスＧ−２５でのゲルろ過によって脱塩し、そしてｐＨ１０にして、ＭｏｎｏＱアニオン交換カラムに負荷し、そして結合したキチナーゼを、ＮａＣｌの濃度を増大させながら溶出した。キチナーゼ活性を方法に記載されるようにキチナーゼ活性ゲルにおいて測定し、そしてタンパク質濃度を２８０ｎｍにおける吸光度に従って評価した。垂直の矢印は、キチナーゼ活性を発現する画分を示す。
図７は、閉じたウツボカズラのトラップ消化液のＦＰＬＣ画分におけるキチナーゼ活性の精製を明らかにするＳＤＳ−ＰＡＧＥ分離である。トラップ消化液をアニオン交換カラムに負荷し、結合したタンパク質を図６に記載されるようにＮａＣｌのグラジエント（０〜６００ｍＭ）により溶出した。その後、各画分（レーン５〜２０）を活性ゲルにおいてキチナーゼ活性について試験した。キチナーゼ活性は＋によって示される。画分のタンパク質含有量はＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび銀染色によって分析された。「プール」レーンは、キチナーゼ活性を示すプールおよび濃縮（８倍）されたＦＰＬＣ精製画分の５０μｌが含まれた（画分９〜１７）。ＳＭ＝サイズマーカー。
図８は、ウツボカズラトラップ消化液キチナーゼの多数の形態がキチンの注入によって誘導されることを明らかにするキチナーゼ活性ゲルである。約１ｍｇのコロイド状キチン（ｐＨ５．０）を閉じたトラップ内に注入した。非誘導（注入前）の消化液を含有するサンプル（レーン３、３０μｌ）、誘導後２０時間のトラップ消化液サンプル（レーン４、３０μｌ）および誘導後５日目のトラップ消化液サンプル（レーン５、３０μｌ）、濃縮（８倍）されたＦＰＬＣ精製の非誘導消化液キチナーゼのサンプル（レーン２、１５μｌ）、そしてセラチアＣｈｉＡＩＩを過剰発現する大腸菌細胞の抽出物の０．６μｇのサンプル（レーン１）を未変性１５％ＰＡＧＥゲルで分離した。電気泳動後、ゲルを、０．０１％（ｗ／ｖ）グリコールキチンを含有するさらなるゲルと重ねて、キチナーゼ活性についてアッセイした。誘導性のキチナーゼ活性のさらなるバンドの存在に留意すること（レーン４および５）。
図９は、キチンにより誘導されたタンパク質のバンドを明らかにする、ウツボカズラのトラップ消化液のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分離および銀染色である。約１ｍｇのコロイド状キチン（ｐＨ５．０）を閉じたトラップ内に注入した。非誘導のトラップ消化液の１００μｌ（レーン１）、そして誘導後４日目のトラップ消化液の１００μｌ（レーン２）、誘導後８日目のトラップ消化液の１００μｌ（レーン３）、誘導後１４日目のトラップ消化液の１００μｌ（レーン４）、または５０μｌの非誘導のプールおよび８倍濃縮されたＦＰＬＣ清浄化消化液（レーン５）を含む各サンプルを１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで分離した。タンパク質バンドの移動を銀染色によって可視化した。少なくとも４つのさらなるキチン誘導のタンパク質バンドが出現していることに留意すること（レーン２、３および４）。
図１０aから１０ｃは、植物病原体およびヒト病原体に対するキチン誘導のウツボカズラのトラップ消化液キチナーゼの殺菌類活性を例示する成長阻害アッセイ平板である。図１０ａでは、ヒト病原体のカンジダ・アルビカンスの阻害に対する最少阻害濃度（ＭＩＣ）値が、方法の節に記載されるように培養液において決定された。酵母致死性（最少殺菌類濃度、ＭＦＣ）のさらなる評価が、１００ｍｌのトラップ消化液にさらされた細胞をトラップ消化液非含有固体培地（サブロー）に再置床して、２８℃で４８時間のインキュベーションを行った後のコロニー数を計数することによって行われた。１：８希釈（右側の平板）のトラップ消化液と比較して、１：４希釈（左側の平板）にさらされた場合、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓコロニーがほぼ完全に存在しないことに留意すること。図１０ｂには、植物病原体のセプトリア・トリチシ（Ｓｅｐｔｏｒｉａ  ｔｒｉｔｉｃｉ）に対するキチン誘導のウツボカズラのトラップ消化液キチナーゼの殺菌類活性が例示される。セプトリア・トリチシ分生子の液体培養物（２．５×１０４分生子／ｍｌ、１００μｌ）を、ウツボカズラのキチン誘導されたトラップ消化液の増大する希釈度（１〜１／３２）の１００μｌとともに１９℃で６日間インキュベーションした（非希釈サンプルにおける総タンパク質濃度＝３．１ｍｇ／ｍｌ）。最少阻害希釈度は、ＯＤ５５０により分光光度法で測定された場合、１：２であった。サンプル（５０μｌ）をトラップ消化液非含有麦芽寒天平板に置床し、同じ条件でさらに６日間インキュベーションした。希釈度が各サンプルの側に示される（１、１／２、１／１６、１／３２）。コントロール培養物をトラップ消化液の非存在下でインキュベーションした（Ｈ２Ｏ）。Ｓ．ｔｒｉｔｉｃｉ分生子が非希釈のトラップ消化液に対する暴露に耐えたことに留意すること（１）。図１０ｃには、リゾクトニア・ソラニ（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ  ｓｏｌａｎｉ）およびアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｉｕｍ  ｓｐｐ．）の菌糸発達に対するキチン誘導のウツボカズラのトラップ消化液キチナーゼの殺菌類活性が例示される。５倍濃縮されたトラップ消化液のサンプル（２０μｌ）を、リゾクトニアまたはアスペルギルスのいずれかの対数期培養物を含有する平板に加えた。阻害領域がトラップ消化液キチナーゼの添加部位の近くに形成されたことに留意すること（矢印）。
図１１は、ウツボカズラのトラップ消化液の塩基性キチナーゼ１遺伝子Ｎｋｃｈｉｔ１ｂの完全なヌクレオチド配列（配列番号１）である。イントロンが緑色で印され、最初のメチオニンコドンおよび停止コドンが赤色で印される。
図１２aおよび１２ｂは、ウツボカズラのトラップ消化液の塩基性キチナーゼ２遺伝子Ｎｋｃｈｉｔ２ｂの核酸配列および推定されるアミノ酸配列が例示される。図１２ａは、ウツボカズラキチナーゼ２のｃＤＮＡの推定されるアミノ酸配列の比較である。ｃＤＮＡは、トラップ分泌組織から単離されたｍＲＮＡに対するＲＴ−ＰＣＲ法によって合成された。キチナーゼ２の数個のＰＣＲクローンが、キチナーゼ２遺伝子に特異的なプライマーを使用することによって単離された。２タイプのｃＤＮＡ配列（Ｎｋｃｈｉｔ２ｂ−ＩＩ（配列番号３）およびＮｋｃｈｉｔ２ｂ−ＩＩＩ（配列番号４））が同定された。６個のアミノ酸ミスマッチのうち、緑色で印されるミスマッチは、ゲノムクローンによってコードされる、逆ＰＣＲによって単離された元のＮｋｃｈｉｔ２ｂと同一である。図１２ｂは、ウツボカズラのトラップ消化液の塩基性キチナーゼ２遺伝子Ｎｋｃｈｉｔ２ｂの完全なヌクレオチド配列（配列番号２）である。イントロンが緑色で印され、最初のメチオニンコドンおよび停止コドンが赤色で印される。
図１３は、データベース内の塩基性キチナーゼの構造に従って推定されるＮｋＣＨＩＴ１ｂ（ｃｈ１）（配列番号５）およびＮｋＣＨＩＴ２ｂ（ｃｈ２）（配列番号６）のアミノ酸配列アラインメント（ＰＲＥＴＴＹＢＯＸ）および機能的ドメインである。機能的ドメインが色で示される：シグナルペプチド−緑色、システインリッチドメイン−オレンジ色、超可変プロリンリッチ領域−明るい青色、触媒作用ドメイン−赤色、そしてＣ末端伸長部−紫色。
図１４は、ＮｋＣＨＩＴ１ｂ（配列番号５）に対して非常に近い相同性を明らかにする、知られている単子葉植物キチナーゼおよび双子葉植物キチナーゼのアミノ酸配列の多配列アラインメントである。知られているキチナーゼがそのＮＣＢＩアクセション番号によって示される：ｓ４０４１４−イネ（Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ）１；ｓ３９９７９−イネ２；ｘ５６０６３−イネ３；ｏｒｉｚａ−イネ４（３８３０２４）；ｔ０３６１４−イネ５；ｊｃ２０７１−ライムギ（Ｓｅｃａｌｅ  ｃｅｒｅａｌｅ）１；ｓｅｃａｌｅ−ライムギ２（７４１３１７）；ｓ３８６７０−コムギ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ  ａｅｓｔｉｖｕｍ）；ａｆ０００９６６−ハガハグサ（Ｐｏａ  ｐｒａｔｅｎｓｉｓ）；ｌ３７２８９−イネ６；ｚ７８２０２−アボカド（Ｐｅｒｓｅａ  Ａｍｅｒｉｃａｎａ）；ｐ５１６１３−ブドウ（Ｖｉｔｉｓ  ｖｉｎｉｆｅｒａ）；ｃｈ１−ＮｋＣＨＩＴ１ｂ。ＮｋＣＨＩＴ１ｂにおける推測されるグリコシル化部位が紫色のドットにより示される。共通する機能的に重要な個々のアミノ酸が色で示される：システイン（黄色）−ジスルフィド架橋に関与；トレオニンおよびグルタミン（赤色）−活性部位幾何構造の維持；グルタミン酸およびアスパラギン酸（緑色）−触媒作用において重要；チロシン（青色）−触媒作用裂溝における基質結合のために重要。
図１５は、ＮｋＣＨＩＴ２ｂ（配列番号６）に対して非常に近い相同性を明らかにする、知られている単子葉植物キチナーゼおよび双子葉植物キチナーゼのアミノ酸配列の多配列アラインメントである。知られているキチナーゼがそのＮＣＢＩアクセション番号によって示される：ｙ１０３７３−タルウマゴヤシ（Ｍｅｄｉｃａｇｏ  ｔｒｕｎｃａｔｕｌａ）；ｔ０９６８７−アルファルファ（Ｍｅｄｉｃａｇｏ  ｓａｔｉｖａ）；ｐ２１２２６−エンドウ（Ｐｉｓｕｍ  ｓａｔｉｖｕｍ）；ａｊ０１２８２１−ヒヨコマメ（Ｃｉｃｅｒ  ａｒｉｅｔｉｎｕｍ）；ｐ０６２１５−インゲンマメ（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ  ｖｕｌｇａｒｉｓ）１；ｐ３６３６１−インゲンマメ２；ｓ５７４８２−アズキ（Ｖｉｇｎａ  ｕｎｇｕｉｃｕｌａｔａ）；マメ−シカクマメ（Ｐｓｏｐｈｏｃａｒｐｕｓ  ｔｅｔｒａｇｏｎｏｌｏｂｕｓ）（ＢＡＢ１３３６９）；ｘ５６０６３−イネ（Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ）１；ｏｒｙｚａ−イネ２（３８３０２４）；ｔ０３６１４−イネ３；ｃｈ２−ＮｋＣＨＩＴ２ｂ；ｐ５１６１３−ブドウ（Ｖｉｔｉｓ  ｖｉｎｉｆｅｒａ）；ｚ７８２０２−アボカド（Ｐｅｒｓｅａ  ａｍｅｒｉｃａｎａ）。ＮｋＣＨＩＴ２ｂに対して非常に相同的な他のすべてのキチナーゼと比較したとき、ＮｋＣＨＩＴ２ｂにおいて特徴的なバリンおよびグルタミン酸の２つのアミノ酸が、それぞれ、茶色矢印および黒色矢印により示される。ＮｋＣＨＩＴ２ｂにおける推測されるグリコシル化部位が紫色のドットにより示される。共通する機能的に重要な個々のアミノ酸が色で示される：システイン（黄色）−ジスルフィド架橋に関与；トレオニンおよびグルタミン（赤色）−活性部位幾何構造の維持；グルタミン酸およびアスパラギン酸（緑色）−触媒作用において重要；チロシン（青色）−触媒作用裂溝における基質結合のために重要。
図１６aおよび１６ｂは、ＮｋＣＨＩＴ２ｂにおける保存されたアミノ酸を例示する。図１６ａは、ＮｋＣＨＩＴ２ｂと、ＮｋＣＨＩＴ２ｂに対して非常に相同的な遺伝子バンク由来の単子葉植物キチナーゼおよび双子葉植物キチナーゼのアミノ酸配列との多配列アラインメントの一部である。オオムギ（Ｈｏｒｄｅｕｍ  ｖｕｌｇａｒｅ  Ｌ．、ｐ２３９５１）エンドキチナーゼのアミノ酸配列の一部が三次元構造の比較および予測のために含められる。キチナーゼ機能に関係するアミノ酸が矢印により印される。図１６ｂは、分子の右側および左側から見たときのＮｋＣＨＩＴ２ｂの三次元構造モデルを示す（ＳＷＩＳＳ−ＭＯＤＥＬタンパク質モデル化、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｘｐａｓｙ．ｃｈ／ｓｗｉｓｓｍｏｄ／ＳＷＩＳＳ−ＭＯＤＥＬ）。キチナーゼ機能に関係する個々のアミノ酸が強調されている。Ｇｌｕ１３４、Ｇｌｕ１５６、Ａｓｎ１９１およびＰｈｅ１９０のアミノ酸が触媒作用裂溝内に存在することに留意すること。
図１７は、ウツボカズラのトラップ消化液の新規な塩基性キチナーゼＮｋＣＨＩＴ１ｂのアミノ酸配列における可能なＯ−グリコシル化部位の予測を示す。予測は、翻訳後修飾を予測するＥｘＰａＳｙ分子サーバー（ＮｅｔＯＧｌｙｃ予測、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＮｅｔＯＧｌｙｃ）を用いて行われた。ＮｋＣＨＩＴ１ｂでは、可能なグリコシル化部位が、プロリンリッチのヒンジ領域に集中して、９個存在することに留意すること。
図１８は、ウツボカズラのトラップ消化液の新規な塩基性キチナーゼＮｋＣＨＩＴ２ｂのアミノ酸配列における可能なＯ−グリコシル化部位の予測を示す。予測は、翻訳後修飾を予測するＥｘＰａＳｙ分子サーバー（ＮｅｔＯＧｌｙｃ予測、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＮｅｔＯＧｌｙｃ）を用いて行われた。ＮｋＣＨＩＴ２ｂでは、可能なグリコシル化部位が１個だけ存在することに留意すること。
図１９は、新規なキチナーゼの示差的な発現を例示する、非誘導のウツボカズラのトラップ組織に由来するｍＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ分析の結果を示す。閉じたトラップから熱ホウ酸塩／プロテイナーゼＫ法によって単離されたｍＲＮＡを、オリゴｄＴプライマーとともにｃＤＮＡを合成するために使用した。連続したＰＣＲ増幅では、示された特異的なプライマーが使用された。逆転写酵素を有しないコントロール反応（−ＲＴ）が、それぞれの遺伝子特異的ＰＣＲ反応について加えられた。ゲノムＤＮＡをテンプレートとして用いる反応もまた陽性コントロールのために含められた。ＰＣＲ産物をアクリルアミドゲル電気泳動によって分離して、ＥｔＢｒで染色し、ＵＶ照射のもとで可視化した。サンプルには、特異的なＮｋｃｈｉｔ１ｂプライマー（レーン１＝＋ＲＴ、レーン２＝−ＲＴコントロール）およびテンプレートとしてのゲノムのＮｋｃｈｉｔ１ｂＤＮＡ（レーン３）を使用するＲＴ−ＰＣＲ産物；特異的なＮｋｃｈｉｔ２ｂプライマー（レーン４＝＋ＲＴ、レーン５＝−ＲＴコントロール）およびテンプレートとしてのゲノムのＮｋｃｈｉｔ２ｂＤＮＡ（レーン６）を使用するＲＴ−ＰＣＲ産物、５’および３’のコントロールプライマー（それぞれ、レーン７およびレーン８）を使用するＲＴ−ＰＣＲ産物；特異的な酸性キチナーゼプライマー（レーン９＝＋ＲＴ、レーン１０＝−ＲＴコントロール）およびテンプレートとしてのゲノムの酸性キチナーゼＤＮＡ（レーン１１）を使用するＲＴ−ＰＣＲ産物；塩基性キチナーゼの縮重プライマーＢｓ２（レーン１２＝＋ＲＴ、レーン１３＝−ＲＴコントロール）およびテンプレートとしてのゲノムの塩基性キチナーゼＤＮＡ（レーン１４）を使用するＲＴ−ＰＣＲ産物；塩基性キチナーゼの縮重プライマーＢｓ１（レーン１５＝＋ＲＴ、レーン１６＝−ＲＴコントロール）およびテンプレートとしてのゲノムのＢｓ１  ＤＮＡ（レーン１７）を使用するＲＴ−ＰＣＲ産物が含まれた。Ｎｋｃｈｉｔ１ｂは、Ｎｋｃｈｉｔ１ｂプライマー（レーン１）および酸性キチナーゼプライマー（レーン９）に関して非常にかすかな特異的なバンドを生じさせるだけであり、一方、強い特異的なバンドがＮｋｃｈｉｔ２ｂプライマー（レーン４）に関して生じることに留意すること。また、より高分子量の生成物が、ゲノムＤＮＡをテンプレートとして使用したときに生じたことにも留意すること（例えば、レーン３およびレーン６）。高分子量および低分子量のマーカー（ＳＭ）もまた含まれた。
図２０は、新規なキチナーゼの特異的な誘導を例示する、キチン誘導のウツボカズラのトラップ組織に由来するｍＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ分析の結果を示す。ｍＲＮＡは、キチン注入による誘導の４日後にトラップ組織から単離された。ｍＲＮＡの単離、ｃＤＮＡ合成、ＲＴ−ＰＣＲ、生成物の分離および可視化、ならびに特異的プライマーの同定は、図１９に記載される通りである。誘導後のトラップに由来するｍＲＮＡにおけるＮｋｃｈｉｔ１ｂ転写物の増大が著しいこと（レーン１）、そしてグループ２縮重プライマーを使用したとき、さらなるキチナーゼ産物が誘導後のトラップ組織に現れること（レーン２）に留意すること。
図２１は、プラスミドｐＰＣＶ７０２−ｃｈｉｔ１＼ｃｈｉｔ２−ＨＡの物理地図である。このプラスミドは、ＨＡペプチドの標識配列に翻訳的に融合し、かつタンデム配置の構成的なＣａＭＶ３５Ｓプロモーターによって駆動されるＮｋｃｈｉｔ１ｂ−Ｉ遺伝子またはＮｋｃｈｉｔ２ｂ−ＩＩ遺伝子を有するアグロバクテリウムシャトルベクターである。ｎｐｔＩＩ選択マーカーの存在に留意すること。プラスミドサイズは１２．３３ｋｂである。
図２２は、遺伝子組換えタバコ植物におけるＮｋｃｈｉｔ１ｂ−ｇＩ−ＨＡ融合タンパク質の発現および正しいプロセシングを明らかにするウエスタンブロットを例示する。実験の節に記載されるようにｐＰＣＶ７０２−ｃｈｉｔ１−ＨＡを用いたタバコ葉ディスクのアグロバクテリウム媒介形質転換によって作製された６個の遺伝子組換え植物に由来する葉組織（０．５ｇ）の抽出物（レーン１〜６）、野生型植物の抽出物（陰性コントロール、レーンＮＮ）、およびセラチアキチナーゼ−ＨＡを発現する遺伝子組換え植物の抽出物（陽性コントロール、レーン７）を方法に記載されるように調製して、１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで分離した。タンパク質をＰＶＤＦメンブランにブロットして、融合タンパク質を、ポリクローナルラット抗ＨＡ抗体とのプロービングおよびアルカリホスファターゼ結合のアフィニティー精製されたヤギ抗ラットＩｇＧを用いた可視化（黒色バンド）によって検出した。新規なウツボカズラキチナーゼとの融合タンパク質の様々なレベルの発現を表す３６ｋＤａバンドの存在（矢印、レーン３、４および５）、そして５９ｋＤａのセラチアキチナーゼ−ＨＡ融合タンパク質の明確な同定（レーン７）に留意すること。
図２３は、遺伝子組換えタバコ植物におけるＮｋｃｈｉｔ２ｂ−ｇＩＩ−ＨＡ融合タンパク質の発現および正しいプロセシングを明らかにするウエスタンブロットを例示する。実験の節に記載されるようにｐＰＣＶ７０２−ｃｈｉｔ２−ＨＡを用いたタバコ葉ディスクのアグロバクテリウム媒介形質転換によって作製された５個の遺伝子組換え植物に由来する葉組織（０．５ｇ）の抽出物（レーン１〜５）、野生型植物の抽出物（陰性コントロール、レーンＮＮ）、およびセラチアキチナーゼ−ＨＡを発現する遺伝子組換え植物の抽出物（陽性コントロール、レーン６）を、上記の図２２に詳しく記載されるように調製し、分離した。タンパク質のブロッティングおよび検出を図２２に詳しく記載されるように行った。新規なウツボカズラキチナーゼとの融合タンパク質の様々な発現レベルを表す３２．７ｋＤａバンドの存在（矢印、レーン２およびレーン４）、そして５９ｋＤａのセラチアキチナーゼ−ＨＡ融合タンパク質の明確な同定（レーン６）に留意すること。
図２４は、食虫植物（ハエトリソウ、ヘイシソウおよびモウセンゴケ）のトラップにおける新規なキチナーゼ活性の多数の形態を例示する未変性キチナーゼ活性ゲルである。トラップ組織の抽出物を、１グラムの新鮮重量あたり１．４ｍｌまたは１．６ｍｌまたは１．９ｍｌの抽出緩衝液（０．１２５Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）および２０％グリセロール）におけるホモジネート化によって、ハエトリソウおよびセラセニアおよびモウセンゴケの食虫植物からそれぞれ調製した。トラップ組織抽出物（６０−レーン１、１００μｌ−レーン２、および１４０μｇ−レーン３）、そしてセラチアのＣｈｉＡＩＩを過剰発現する大腸菌の抽出物の０．６μｇ（レーン４）を未変性１５％ＰＡＧＥで分離して、０．０１％（ｗ／ｖ）グリコールキチンを含有するキチナーゼ活性ゲルと重ねて、３７℃で一晩インキュベーションし、そして０．０１％カルコフルオルホワイトＭ２Ｒで５分間染色した。キチナーゼ活性がＵＶ照射（３２０ｎｍ）により可視化された（溶解活性の暗い染色バンド）。３つの食虫植物のすべてに由来するトラップ組織抽出物における著しいキチナーゼ活性の多数の形態の存在に留意すること（すべてのゲルにおいて、レーン１、２および３）。
図２５は、モウセンゴケのキチナーゼ遺伝子（配列番号７）およびハエトリソウのキチナーゼ遺伝子（配列番号８）の推定されるアミノ酸配列と、相同的な植物キチナーゼの遺伝子バンク配列の推定されるアミノ酸配列との多配列アラインメントである。ウツボカズラの２つの推定されるキチナーゼアミノ酸配列（ｃｈ１およびｃｈ２、これらはそれぞれＮｋｃｈｉｔ１ｂおよびＮｋｃｈｉｔ２ｂを表す）が含まれる。知られているキチナーゼの配列のＮＣＢＩアクセション番号は下記の通りである：Ａｌｌｉｕｍ−ニンニク（Ａｌｌｉｕｍ  ｓａｔｉｖｕｍ）（Ｍ９４１０５）；Ｐｏｔａｔｏ−ジャガイモ（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ）（Ｘ６７６９３）；Ｍｅｄｉｃａｇｏ−タルウマゴヤシ（Ｍｅｄｉｃａｇｏ  ｔｒｕｃａｔｕｌａ）（Ｙ１０３７３）；Ｐｉｓｕｍ−エンドウ（Ｐｉｓｕｍ  ｓａｔｉｖｕｍ）（Ｌ３７８７６）。広範囲の領域の相同性に留意すること。
図２６aおよび２６ｂは、セラチア・マルセセンスのキチナーゼおよびウツボカズラのトラップ消化液キチナーゼのタンパク質定量評価を例示する。示されたタンパク質はゲル電気泳動によって分けられ、銀染色によって可視化された。図２６ａは、示された容量の市販セラチア・マルセセンス（５８ｋＤａ）および示された量のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、６６ｋＤａ）を示す。図２６ｂは、示された容量のウツボカズラのトラップ消化液キチナーゼおよび示された量のカルボニックアンヒドラーゼ（２９ｋＤａ）を示す。ＳＭ−分子量マーカーを示す。
図２７aおよび２７ｂは、セラチア・マルセセンスのキチナーゼおよびウツボカズラのトラップ消化液キチナーゼを用いて行われたキチナーゼ活性アッセイの結果を示す。キチナーゼ活性は、１００ｎｇの市販セラチア・マルセセンスのキチナーゼ（図２７ａ）および２０ｎｇ〜３０ｎｇのトラップ消化液キチナーゼ（図２７ｂ）について測定された。四量体ｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−Ｎ−Ｎ’−Ｎ”−トリアセチルキトトリオースが基質として使用され、ｐ−ニトロフェニルの放出が測定された。
【００６８】
好適な実施形態の説明
本発明は、食虫植物に由来するキチナーゼ、キチナーゼ含有組成物、そのようなキチナーゼをコードするポリヌクレオチド配列、ならびにキチン含有病原体（土壌菌類および線虫など）に対する植物の感受性を低下させるために、そして植物を寒冷状態および霜状態に対して抵抗性にするために、そしてカンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）などキチン含有病原体に関連する病気または状態に罹っている個体を処置するために、そのようなキチナーゼおよびキチナーゼ組成物を単離および使用する方法である。
【００６９】
本発明の原理および操作は、図面および付随する説明を参照してより良く理解することができる。
【００７０】
本発明の少なくとも１つの実施形態を詳細に説明する前に、本発明は、その適用において、下記の説明に示されるか、または本明細書中下記の実施例の節において記載される図面に例示される構成要素の構造および配置の細部に限定されないことを理解しなければならない。本発明は、他の実施形態が可能であり、または様々な方法で実施することができ、または様々な方法で実施される。また、本明細書中で用いられている表現法および用語法は説明のためであり、従って限定として見なされるべきではないことを理解しなければならない。
【００７１】
植物は、多くの場合、土壌菌類および線虫を含む様々な病原体によって引き起こされる病気に罹りやすい。これらの病気は、発芽前および発芽後の実生立ち枯れ病、根腐れ病、菌核病、病斑、維管束萎凋病および様々な他の形態の症状を含む多数の成長欠陥を生じさせることがあり、これらは作物全体の破壊を生じさせることが多い。
【００７２】
様々な方法が、現在、病気に関連する菌類および線虫の蔓延を防止するために利用することができる。これらの方法は、多くの場合、菌類の細胞壁、および昆虫、線虫、線虫卵または線虫嚢子の外側を覆う物質の主要な構成成分であるキチンの分解および破壊に基づいている。
【００７３】
従って、長く実施されている方法は、殺菌類剤または殺線虫剤で土壌または植物を化学的に処置することである。別の方法は、キチナーゼとも呼ばれているキチン分解酵素の産生によって病原体の成長を阻害または妨害するある種の変異型細菌株または天然に存在する細菌株を適用することである。
【００７４】
前者の方法は環境およびヒトの健康に対する化学的殺虫剤の有害な作用によって制限され、一方、後者の方法はいくつかの要因によって制限される。
【００７５】
後者の方法の制限の１つは、適正な量のキチナーゼが産生されるような方法で導入細菌におけるキチナーゼの産生を調節することができないことである。別の制限が、キチナーゼ産生細菌の多くは、植物病原体が相互作用するための一般的な部位である宿主生物の根圏（すなわち、根）に定着し、持続する能力が限られていることから生じている。細菌の根キチナーゼ産生もまた、他の炭素源が存在することによって、例えば、根により放出される代謝産物の存在によって制限される。上記の制限のいくつかは、変異型細菌株を使用することによって乗り越えることができるが、そのような菌株は復帰変異して、低下したレベルのキチナーゼ産生を示す形態になることが多い。
【００７６】
上記の制限が克服されるようにキチナーゼを発現させるために植物を遺伝子操作する方法が数多く報告されているが、導入された遺伝子はほとんどどれも、病原体抵抗性の十分なレベルを付与するために十分に大きいキチナーゼ活性を示していない。
【００７７】
本明細書中下記および下記の実施例の節に記載されるように、本発明は、食虫植物に由来する新規で高活性なキチナーゼを提供する。
【００７８】
食虫植物は、捕捉された昆虫の外骨格を分解することができ、そしてそのタンパク質含有物を分解することができる超活性なタンパク質分解酵素を含有する塩基液（これはまた本明細書中では「消化液」として示される）を分泌することが以前に示されている［Ｏｗｅｎ  ＴＰおよびＬｅｎｎｏｎ  ＫＡ（１９９９）、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊ．ｏｆ  Ｂｏｔ．８６：１３８２〜１３９０］が、食虫植物の組織または塩基消化液がキチナーゼを含むことは以前には示されていない。本明細書中下記においてさらに詳述されるように、本発明者らは、いくつかの食虫植物のキチナーゼポリペプチドおよびキチナーゼをコードするポリヌクレオチドを同定および単離することができた。
【００７９】
大きいキチナーゼ活性を示す単離された酵素はそれ自体、植物および哺乳動物の両方のキチン含有病原体の強力な阻害剤として、そして推定される生物不凍性物質として、そして実の可能な甘味剤として、様々な商業的用途において使用することができる。
【００８０】
従って、本発明の１つの局面により、例えば、ウツボカズラ（Ｎｅｐｅｎｔｈｅｓ  ｓｓｐ．）などの食虫植物の組織または分泌物から調製され、かつエンドキチナーゼ活性を示すタンパク質抽出物を含む酵素組成物が提供される。
【００８１】
本明細書中で使用される用語「食虫植物」は、主として昆虫を、しかし他の小動物もまた、引き寄せ、捕捉し、消化するために適合した植物をいう。食虫植物の例には、ウツボカズラ（Ｎｅｐｅｎｔｈｅｓ  ｓｓｐ．）、モウセンゴケ（Ｄｒｏｓｅｒａ  ｓｐ．）、ハエトリソウ（Ｄｉｏｎｅａ  ｓｐ．）およびヘイシソウ（Ｓａｒｒａｃｅｎｉａ  ｓｐ．）が含まれるが、これらに限定されない。
【００８２】
本明細書中で使用される用語「エンドキチナーゼ活性」は、キチン分子における内部のβ−１，４−グリコシド結合を切断して、少なくとも３個のＧｌｕＮＡｃユニットからなるオリゴマーを遊離させる加水分解酵素の能力をいう。
【００８３】
本明細書中で使用される用語「タンパク質抽出物」は、タンパク質を含む調製物をいう。これには、固体の植物抽出物、液体の植物抽出物、親水性の植物抽出物、親油性の植物抽出物、個々の植物成分およびそれらの混合物が含まれ得る。本発明のタンパク質抽出物は、そのような抽出物がエンドキチナーゼ活性を示す限り、精製されたタンパク質抽出物、または部分精製されたタンパク質抽出物、または粗タンパク質抽出物であってもよい。
【００８４】
本発明の１つの好ましい実施形態により、酵素組成物は、好ましくは、ウツボカズラ（Ｎｅｐｅｎｔｈｅｓ  ｓｓｐ．）のトラップ組織または葉組織またはトラップ分泌物（例えば、トラップ消化液）に由来し、本明細書中ではタンパク質抽出物の「活性な画分」としても示されるエンドキチナーゼ活性を示す少なくとも１つのタンパク質を含む。
【００８５】
下記の実施例の節では、本発明の酵素組成物のタンパク質を特徴づける生化学的性質および免疫学的性質および機能的性質の包括的な分析が提供される。
【００８６】
下記の節には、本発明の酵素組成物のエンドキチナーゼ活性なタンパク質の生化学的性質および免疫学的性質が記載される。
【００８７】
分子量−本発明のエンドキチナーゼタンパク質は、還元性の変性条件下でのゲル電気泳動によって測定されたとき、見かけの分子量が、約２４ｋＤａ〜２７ｋＤａ、約３０ｋＤａ〜３１ｋＤａ、約３１ｋＤａ〜３３ｋＤａ、約３２ｋＤａ〜３６ｋＤａ、約３４ｋＤａ〜３８ｋＤａである単量体として活性であり得る。本発明のポリペプチドはまた、相同的サブユニットまたは異種サブユニットからなる二量体または三量体などの多サブユニットタンパク質として組み立てられ得る。そのため、本発明のタンパク質は、非還元性の条件下でのゲル電気泳動によって測定されたとき、約４８ｋＤａ〜５４ｋＤａ、約６０ｋＤａ〜６２ｋＤａ、約６２ｋＤａ〜６６ｋＤａ、約６４ｋＤａ〜７２ｋＤａ、約６８ｋＤａ〜７６ｋＤａ、約７６ｋＤａ〜約１００ｋＤａの見かけの分子量によって特徴づけられる。
【００８８】
エンドキチナーゼ活性−本発明のタンパク質は、アッセイ特異的な基質（実施例の節の実施例３を参照のこと）を使用し、そしてニトロフェノールの放出を４１０ｎｍでの分光光度法による分析によってモニターして測定されるエンドキチナーゼ活性によって特徴づけられる。
【００８９】
Ｋｍ−本発明のタンパク質は、セラチア・マルセセンスのキチナーゼと比較した場合、大きいＫｍ値を有するとみなすことができる。しかし、これらのポリペプチドは、ミカエリス−メンテンモデルには明らかに従っていないことが推定される。これは、反応速度対基質濃度のＳ字形プロットが観測され、これにより、本発明のポリペプチドがアロステリック酵素であることが示唆されるからである。このことは、キチンによる誘導がポリペプチドの酵素活性を著しく増大させるという観測結果によって、そしてまた本発明の酵素が２つ以上のサブユニットを有し得るという観測結果によっても立証される（実施例の節の実施例２０を参照のこと）。
【００９０】
ｐＩ−本発明のエンドキチナーゼのｐＩ値は、ｐＨ１０を有する炭酸塩緩衝液の存在下でＦＰＬＣアニオン交換カラムに対する結合によって測定されたとき、１０未満であり、好ましくは７〜９の間である。そのうえ、キチナーゼ活性が、２００ｍＭのＮａＣｌで溶出される画分において既に検出され得るという観測結果は、ｐＩ値が比較的大きいことを示唆している（実施例の節の実施例６を参照のこと）。
【００９１】
抗体反応性−トラップ組織および葉に由来するキチナーゼタンパク質とは異なり、本発明のトラップ消化液のキチナーゼタンパク質は、セラチア・マルセセンスのキチナーゼ（ＣｈｉＡＩＩ）に対するポリクローナル抗体との反応性を有しない。このことは、本発明のタンパク質が、セラチア・マルセセンスのキチナーゼと同じ抗原性エピトープを有していないことを示している（実施例の節の実施例２を参照のこと）。
【００９２】
酵素安定性−一般に、本発明の酵素組成物のエンドキチナーゼタンパク質は、ｐＨ６．７において５０℃で３０分間インキュベーションした後、酵素活性を保持しているか、またはｐＨ５において３７℃で１６時間インキュベーションした後において活性である。
【００９３】
本発明の酵素組成物は強い抗菌類活性をさらに示す（実施例の節の実施例９〜１１を参照のこと）。
【００９４】
本明細書中で使用される用語「抗菌類活性」は、菌類のさらなる増殖を防止する静菌類活性、および／または既に存在する菌類の殺傷を促進する殺菌類活性をいう。下記の実施例の節に示される結果から明かであるように、本発明の酵素組成物は、先行技術のキチナーゼ酵素と比較した場合、効率的かつ強化された殺菌類活性を示す（実施例の節の実施例９〜１１を参照のこと）。
【００９５】
セラチアのキチナーゼとは対照的に、本発明の酵素組成物の抗菌類活性は殺菌類的であり、それ自体を農業目的および治療目的の両方のために使用することができる。
【００９６】
キチナーゼは、キチンを含有する菌類の細胞壁を加水分解することによって植物の防御応答において主要な役割を果たすことが知られている。この加水分解活性により、菌類の成長が遅くなり、そして植物組織内への病原体の侵入が遅らされるか、または回避される。本発明の酵素組成物は極めて大きい抗菌類活性を示すので（実施例の節の実施例９〜１１を参照のこと）、そのような組成物は、ヒトおよび動物の両方（例えば、イヌ、ネコ、ヒツジ、ブタ、ウマ、ウシ、ヒトなど）においてキチン含有病原体により引き起こされる感染症を処置するために、そして植物および植物由来組織を消毒するために使用することができる。
【００９７】
本発明の酵素組成物は、現在利用可能な抗菌類薬（抗真菌薬）の効力が悪いことを考えれば、考えられる治療ツールとして特に好都合である。例えば、カンジダ・アルビカンス感染症の唯一の効果的な処置はアンフォテリシンＢの静脈内投与であるが、これは、低血圧および虚脱状態を伴う重篤な有害作用を生じさせることが多い。
【００９８】
ヒトまたは動物において菌類（真菌）／細菌感染症を処置するために使用されるとき、本発明の酵素組成物は、局所投与または経口投与のために好ましくは設計された薬学的組成物における有効成分として好ましくは含まれる。
【００９９】
用語「処置（する）」は、細菌感染症に関連する症状を軽減または縮小させることをいう。好ましくは、処置は、感染に関連する症状を治し、例えば、実質的に除き、かつ／または感染組織における細菌量を実質的に低下させる。
【０１００】
本明細書中で使用される「薬学的組成物」は、本明細書中上記に記載される１つもしくは複数の有効成分、またはその生理学的に受容可能な塩もしくはプロドラッグと、生理学的に好適なキャリアおよび賦形剤などの他の化学的成分との組成物をいう。薬学的組成物の目的は、生物への化合物の投与を容易にすることである。
【０１０１】
以降、用語「薬学的に受容可能なキャリア」および用語「生理学的に受容可能なキャリア」は、処置されている個体に対して著しい刺激を生じさせず、かつ有効成分の生物学的な活性および性質を妨げないキャリアまたは希釈剤を示すために交換可能に使用される。
【０１０２】
本明細書中の用語「賦形剤」は、有効成分の投与をさらに容易にするために薬学的組成物に加えられる不活性な物質をいう。賦形剤の非限定的な例には、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、様々な糖および様々なタイプのデンプン、セルロース誘導体、ゼラチン、植物油、ならびにポリエチレングリコールが含まれる。
【０１０３】
本発明の薬学的組成物の配合および投与に関する様々な技術を「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ、最新版）（これは参考として本明細書中に組み込まれる）に見出すことができる。
【０１０４】
好適な投与経路には、例えば、経口送達、直腸送達、経粘膜送達、腸管送達または非経口送達（筋肉内注射、皮下注射および髄膜内注射、ならびにクモ膜下注射、直接的な心室（脳室）内注射、静脈内注射、腹腔内注射、鼻腔内注射または眼内注射を含む）を挙げることができる。
【０１０５】
あるいは、薬学的組成物は、例えば、多くの場合にはデポ剤または徐放性配合物（下記に記載される配合物など）で感染領域内に組成物を直接注射することによって、全身的な様式ではなく、局所的な様式で投与することができる。
【０１０６】
本発明の薬学的組成物は、この分野で十分に知られている方法によって、例えば、混合、溶解、造粒、糖衣剤作製、研和、乳化、カプセル化、包括化または凍結乾燥の従来のプロセスによって製造することができる。
【０１０７】
本発明に従って使用される薬学的組成物は、従って、薬学的に使用され得る組成物への有効成分の加工を容易にする、賦形剤および補助剤を含む１つ以上の生理学的に受容可能なキャリアを使用して、従来の様式で配合することができる。適正な配合は、選ばれた投与経路に依存する。
【０１０８】
注射の場合、本発明の有効成分は、水溶液において、好ましくは生理学的に適合し得る緩衝液（ハンクス溶液、リンゲル溶液または生理学的食塩水緩衝液など）において配合することができる。経粘膜投与の場合、透過しなければならないバリアに対して適切な浸透剤が配合において使用される。そのような浸透剤はこの分野では一般に知られている。
【０１０９】
経口投与の場合、薬学的組成物は、活性な化合物を、この分野で十分に知られている薬学的に受容可能なキャリアと組み合わせることによって配合することができる。そのようなキャリアにより、本発明の方法によって使用される薬学的組成物を、患者によって経口摂取される錠剤、ピル、糖衣錠、カプセル、液剤、ゲル、シロップ、スラリー剤、懸濁物などとして配合することが可能になる。経口使用される薬理学的組成物を、固体の賦形剤を使用し、得られた混合物を場合により粉砕し、そして錠剤または糖衣錠コアを得るために所望する場合には好適な補助剤を添加した後、顆粒の混合物を加工して作製することができる。好適な賦形剤は、具体的には、ラクトース、スクロース、マンニトールまたはソルビトールを含む糖などの充填剤；セルロース組成物、例えば、トウモロコシデンプン、コムギデンプン、コメデンプン、ジャガイモデンプン、ゼラチン、トラガカントゴム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ナトリウムカルボメチルセルロースなど；および／またはポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）などの生理学的に受容可能なポリマーである。所望する場合には、架橋されたポリビニルピロリドン、寒天、またはアルギン酸もしくはその塩（アルギン酸ナトリウムなど）などの崩壊剤を加えることができる。
【０１１０】
糖衣錠コアには、好適なコーティングが施される。この目的のために、高濃度の糖溶液を使用することができ、この場合、糖溶液は、場合により、アラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カルボポールゲル、ポリエチレングリコール、二酸化チタン、ラッカー溶液および好適な有機溶媒または溶媒混合物を含有し得る。色素または顔料が、有効成分の量を明らかにするために、または有効成分の量の種々の組合せを特徴づけるために、錠剤または糖衣錠コーティングに添加され得る。
【０１１１】
経口使用され得る薬学的組成物には、ゼラチンから作製されたプッシュ・フィット型カプセル、ならびにゼラチンおよび可塑剤（グリセロールまたはソルビトールなど）から作製された軟いシールされたカプセルが含まれる。プッシュ・フィット型カプセルは、充填剤（ラクトースなど）、結合剤（デンプンなど）、滑剤（タルクまたはステアリン酸マグネシウムなど）および場合により安定化剤と混合された有効成分を含有し得る。軟カプセルでは、有効成分を好適な液体（脂肪油、流動パラフィンまたは液状のポリエチレングリコールなど）に溶解または懸濁させることができる。さらに、安定化剤を加えることができる。経口投与される配合物はすべて、選ばれた投与経路に好適な投薬形態でなければならない。
【０１１２】
口内投与の場合、組成物は、従来の様式で配合された錠剤またはトローチの形態を取ることができる。
【０１１３】
吸入による投与の場合、本発明に従って使用される薬剤は、好適な噴射剤（例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタンまたは二酸化炭素）の使用により加圧パックまたはネブライザーからのエアロゾルスプレー提示物の形態で都合よく送達される。加圧されたエアロゾルの場合、投薬量単位は、計量された量を送達するためのバルブを備えることによって決定することができる。吸入器または吹き入れ器において使用される、例えば、ゼラチン製のカプセルおよびカートリッジで、有効成分と好適な粉末基剤（ラクトースまたはデンプンなど）との粉末混合物を含有するカプセルおよびカートリッジを配合することができる。
【０１１４】
眼用配合物、眼軟膏、粉末剤、溶液剤などもまた本発明の範囲内であると考えられる。
【０１１５】
本明細書中に記載される組成物は、例えば、ボーラス注射または連続注入による非経口投与のために配合することができる。注射用配合物は、例えば、アンプルまたは多用量容器における単位投薬形態で、場合により、添加された保存剤とともに提供され得る。組成物は、油性ビヒクルまたは水性ビヒクルにおける懸濁物または溶液剤またはエマルションにすることができ、そして懸濁剤、安定化剤および／または分散剤などの配合剤を含有することができる。
【０１１６】
非経口投与される薬学的組成物には、水溶性形態の有効成分の水溶液が含まれる。さらに、有効成分の懸濁物を適切な油性の注射懸濁物として調製することができる。好適な親油性の溶媒またはビヒクルには、脂肪油（ゴマ油など）、または合成脂肪酸エステル（オレイン酸エチルなど）、トリグリセリドまたはリポソームが含まれる。水性の注射用懸濁物は、懸濁物の粘度を増大させる物質、例えば、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、ソルビトールまたはデキストランなどを含有することができる。場合により、懸濁物はまた、高濃度溶液の組成物を可能にするために有効成分の溶解性を増大させる好適な安定化剤または配合物を含有することができる。
【０１１７】
あるいは、有効成分は、使用前に好適なビヒクル（例えば、滅菌されたパイロジェン非含有水）を用いて構成される粉末形態にすることができる。
【０１１８】
本発明の組成物はまた、例えば、カカオバターまたは他のグリセリドなどの従来の坐薬基剤を使用して、坐薬または停留浣腸剤などの直腸用組成物で配合することができる。
【０１１９】
前記に記載された配合物に加えて、本発明の組成物はまた、局所投与のために、デポ剤組成物などに配合することができる。そのような長期間作用する配合物は、（例えば、皮下または筋肉内への）埋め込みによって、または筋肉内注射によって投与することができる。従って、例えば、組成物は、（例えば、受容可能なオイルにおけるエマルションとして）好適なポリマー材料もしくは疎水性材料、またはイオン交換樹脂、または溶解性が良くない誘導体（溶解性が良くない塩など）とともに配合することができる。局所投与される配合物には、ローション、懸濁物、軟膏ゲル、クリーム、滴剤、液剤、スプレー剤、エマルションおよび粉末剤が含まれるが、これらに限定されない。
【０１２０】
本明細書中に記載される薬学的組成物はまた、ゲル相キャリアまたは賦形剤の好適な固体を含むことができる。そのようなキャリアまたは賦形剤の例には、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、様々な糖、デンプン、セルロース誘導体、ゼラチンおよびポリマー（ポリエチレングリコールなど）が含まれるが、これらに限定されない。
【０１２１】
本発明に関連して使用される好適な薬学的組成物には、意図された目的を達成するために効果的な量で有効成分が含有される組成物が含まれる。より詳細には、治療効果的な量は、病気の症状を防止もしくは軽減もしくは改善するために、または処置されている対象の生存を延ばすために効果的な有効成分の量を意味する。
【０１２２】
治療効果的な量の決定は、特に本明細書中に示される詳細な実施例を考慮に入れて十分に当業者の能力の範囲内である（実施例の節の実施例９〜１１および２０を参照のこと）。
【０１２３】
治療効果的な量または用量は、細胞培養アッセイおよび無細胞アッセイから最初に推定することができる（実施例の節の実施例９〜１１および２０を参照のこと）。
【０１２４】
本発明の酵素組成物は大きい抗菌類活性を示すので（下記の実施例の節の実施例９〜１１を参照のこと）、その低い濃度を、菌類の様々な病気を処置し、それにより細胞毒性を避けることにおいて使用することができる。
【０１２５】
それにもかかわらず、本明細書中に記載される薬学的組成物の毒性および治療効力は、実験動物における標準的な薬学的手法によって、例えば、問題とする成分に対するＩＣ５０およびＬＤ５０（試験された動物の５０％において死を生じさせる致死量）を測定することによって決定することができる。アッセイから得られたデータは、ヒトにおいて使用される投薬量の範囲を組み立てる際に使用することができる。投薬量は、用いられる投薬物形態および使用される投与経路に依存して変化し得る。正確な配合、投与経路および投薬量は、患者の状態を考慮して個々の医師によって選ぶことができる（例えば、Ｆｉｎｇｌ他、１９７５、Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、第１章、１頁を参照のこと）。
【０１２６】
投薬量および投薬間隔は、最小有効濃度（ＭＥＣ）と呼ばれる、必要とされる効果を維持するために十分な、有効成分の血漿中レベルを提供するために個々に調節することができる。ＭＥＣはそれぞれの組成物について異なるが、インビトロでのデータから、例えば、５０％〜９０％の阻害を達成するために必要な濃度から推定することができる（実施例の節の実施例１を参照のこと）。ＭＥＣを達成するために必要な投薬量は、個々の特性および投与経路に依存する。ＨＰＬＣアッセイまたはバイオアッセイを、血漿中濃度を測定するために使用することができる。
【０１２７】
投薬間隔もまた、ＭＥＣ値を使用して決定することができる。組成物は、１０％〜９０％の時間について、好ましくは３０％〜９０％について、最も好ましくは５０％〜９０％についてＭＥＣを越える血漿中レベルを維持する方法を使用して投与すべきである。
【０１２８】
局所投与または選択的取り込みの場合、薬物の効果的な局所濃度は血漿中濃度に関連しなくてもよいことが認められている。そのような場合、この分野で知られている他の手法を用いて、効果的な局所濃度を測定することができる。
【０１２９】
処置される感染の重篤度および応答性に依存して、投薬はまた、徐放性組成物の単回投与にすることができ、この場合、処置期間は、数日から数週間まで、または治療が達成されるまで、または感染状態の軽減が達成されるまで続く。
【０１３０】
投与される組成物の量は、当然のことではあるが、処置されている対象、感染の重篤度、投与様式、処方医の判断などに依存する。
【０１３１】
本発明の組成物は、使用および投薬および対抗適用症に関する説明書を好ましくは含むＦＤＡ承認キットの一部としての１つ以上の単位投薬形態物としてディスペンサーデバイスにおいてパッケージすることができる。キットは、例えば、ピルもしくは錠剤を含有するために好適であるブリスターパックなどの金属箔またはプラスチック箔、または吸入器として使用される好適なディスペンサーデバイスを含むことができる。キットはまた、医薬品の製造または使用または販売を規制する政府当局により定められた形式で容器に関連する通知によって規定され得る。この場合、そのような通知は、組成物の形態またはヒトもしくは動物への投与の当局の承認を反映する。そのような通達は、例えば、処方薬物または承認された製品添付文書に関する米国食品医薬品局により承認されたラベル書きであり得る。本発明とともに使用される好適な有効成分を含む組成物もまた、示された病気または状態を処置するために調製され、適切な容器に入れられ、そして表示することができる。
【０１３２】
上記に記載された薬学的組成物は、菌類（真菌）感染症（例えば、皮膚真菌症、皮下真菌症、肺真菌症、カンジダ症）、原生動物感染症［例えば、トキソプラズマ症、マラリア（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ種）、リーシュマニア症（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ種）、シャガス病、睡眠病（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ種）］、および蠕虫感染症（例えば、住吸血虫症、旋毛虫症、フィラリア症、オチョセルシア症（Ｏｃｈｏｃｅｒｃｉａｓｉｓ）、菌類（真菌）感染症）（これらに限定されない）を含む様々なキチン含有病原体感染症を処置するために使用することができる。
【０１３３】
本発明の酵素組成物にはまた、菌類、線虫、昆虫および病気媒介体を含むキチン含有病原体の殺虫剤または忌避剤または殺傷剤として重要な用途が見出され得る。例えば、菌類病原体には、フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）属、フハイカビ（Ｐｙｔｈｉｕｍ）属、エキビョウキン（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ）属、バーティシリウム（Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ）属、リゾクトニア（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ）属、マクロホミナ（Ｍａｃｒｏｐｈｏｍｉｎａ）属、ティーラビオプシス（Ｔｈｉｅｌａｖｉｏｐｓｉｓ）属、キツネノワン（Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ）属などを含む広範囲の属に由来する菌類種が含まれる。菌類により引き起こされる植物の病気には、発芽前および発芽後の実生立ち枯れ病、胚軸の腐敗、根腐れ病、菌核病、維管束萎凋病、および様々な他の形態の症状発生が含まれる。線虫病原体には、キタネコブセンチュウ（Ｍｅｌｏｉｄｏｇｙｎｅ）属、シストセンチュウ（Ｈｅｔｅｒｏｄｅｒａ）属、クキセンチュウ（Ｄｉｔｙｌｅｎｃｈｕｓ）属、ネグサレセンチュウ（Ｐｒａｔｙｌｅｎｃｈｕｓ）属に由来する線虫種が含まれるが、これらに限定されない。線虫により引き起こされる植物病には、根のこぶ、根腐れ、病斑、「スタビー（ｓｔｕｂｂｙ）」根、萎縮病、ならびに病原性菌類による増大した感染に関連する様々な他の腐れ病および萎凋病が含まれるが、これらに限定されない。一部の線虫（例えば、トリコドルス（Ｔｒｉｃｈｏｄｏｒｕｓ）属、ロナイドルス（Ｌｏｎａｉｄｏｒｕｓ）属、キシフェネマ（Ｘｉｐｈｅｎｅｍａ）属）は、プルヌス（Ｐｒｕｎｕｓ）属、ブドウ、タバコおよびトマトを含む多数の植物におけるウイルス病のベクターとして作用し得る。これらの組成物はまた、本明細書中下記に詳しく記載されるように、低温損傷から植物を保護する生物学的な不凍性物質として、そして果実の考えられる甘味剤として使用され得ることが理解される。
【０１３４】
従って、本発明の酵素組成物はまた、好ましくは農学的に受容可能なキャリアもまた含む農業用組成物に含めることができる。
【０１３５】
農学的に受容可能なキャリアは固体または液体の物質であり得るが、好ましくは液体であり、より好ましくは水である。要求されないが、本発明の農業用組成物はまた、肥料、不活性な配合助剤（すなわち、界面活性剤、乳化剤、消泡剤、色素、増量剤など）などの他の添加物を含有することができる。農業用組成物の調製方法および適用方法を記載する様々な総説を得ることができる。例えば、ＣｏｕｃｈおよびＩｇｎｏｆｆｏ（１９８１）、Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  Ｐｅｓｔｓ  ａｎｄ  Ｐｌａｎｔ  Ｄｉｓｅａｓｅ、１９７０〜１９８０、Ｂｕｒｇｅｓ（編）、３４章、６２１頁〜６３４頁；ＣｏｒｋｅおよびＲｉｓｈｂｅｔｈ、同上、３９章、７１７頁〜７３２頁；Ｂｒｏｃｋｗｅｌｌ（１９８０）、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｅｖａｌｕａｔｉｎｇ  Ｎｉｔｒｏｇｅｎ  Ｆｉｘａｔｉｏｎ、Ｂｅｒｇｅｒｓｅｎ（編）、４１７頁〜４８８頁；Ｂｕｒｔｏｎ（１９８２）、Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｎｉｔｒｏｇｅｎ  Ｆｉｘａｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｆｏｒ  Ｔｒｏｐｉｃａｌ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ、ＧｒａｈａｍおよびＨａｒｒｉｓ（編）、１０５頁〜１１４頁；Ｒｏｕｇｈｌｅｙ（１９８２）、同上、１１５頁〜１２７頁；Ｔｈｅ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓｅｓ、第ＩＩ巻、上掲、そして上記に引用される参考文献を参照のこと。昆虫抑制において使用されるバキュロウイルスを含む湿潤可能な粉末組成物が、欧州特許ＥＰ６９７１７０（これは参考として本明細書中に組み込まれる）に記載される。
【０１３６】
本発明の農業用組成物を適用する好ましい方法は、米国特許第５０３９５２３号（これは全体が本明細書中に組み込まれる）に開示されるように、葉への塗布、種子コーティングおよび土壌適用である。
【０１３７】
本発明のキチナーゼ含有食虫植物組成物の重要性および商業的利用可能性により、本発明者らは、そのようなエンドキチナーゼをコードするポリヌクレオチドを食虫植物から同定および単離することに至った。
【０１３８】
従って、本発明の別の局面により、食虫植物の組織から単離され、かつ自身（単量体）で、または多量体タンパク質の一部として、そのいずれでもエンドキチナーゼ活性を示すポリペプチドをコードするゲノムの相補的または複合的なポリヌクレオチド配列が提供される。
【０１３９】
本明細書中で使用される用語「相補的なポリヌクレオチド配列」は、逆転写酵素または任意の他のＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを使用してメッセンジャーＲＮＡの逆転写から最初に生じる配列をいう。そのような配列は、続いて、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを使用してインビボまたはインビトロで増幅することができる。
【０１４０】
本明細書中で使用される用語「ゲノムのポリヌクレオチド配列」は、染色体に由来し、従って染色体の連続した一部分を反映する配列をいう。
【０１４１】
本明細書中で使用される用語「複合的なポリヌクレオチド配列」は、少なくとも部分的には相補的であり、そして少なくとも部分的にはゲノム性である配列をいう。複合的な配列は、本発明のポリペプチドをコードするために必要とされるいくつかのエキソン配列、ならびにエキソン配列間に介在するいくつかのイントロン配列を含むことができる。イントロン配列は任意の起源であり得るが、典型的には、保存されたスプライシングシグナル配列を含む。そのようなイントロン配列は、シス作用する発現調節エレメントをさらに含むことができる。
【０１４２】
本発明のこの局面の１つの好ましい実施形態により、本発明の単離されたポリヌクレオチドは、配列番号５に対して、少なくとも７０％の同一性、少なくとも７５％の同一性、少なくとも８０％の同一性、少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％またはそれ以上の同一性、例えば、９５％〜１００％の同一性を有するポリペプチドをコードする。
【０１４３】
そのような同一性および／または配列相同性は、Ｓｍｉｔｈ／Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムおよび下記のパラメーターを用いるウィスコンシン（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）配列分析パッケージのＢｅｓｔＦｉｔソフトウエアなどのコンピューター専用ソフトウエアを使用して決定することができる：ギャップ生成ペナルティーは８に等しく、ギャップ伸長ペナルティーは２に等しい。
【０１４４】
本発明のこの局面の別の好ましい実施形態により、本発明の単離されたポリヌクレオチドは、配列番号６に対して、少なくとも７５％の同一性、少なくとも８０％の同一性、少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％またはそれ以上の同一性、例えば、９５％〜１００％の同一性を有するポリペプチドをコードする。
【０１４５】
本発明のこの局面の別の好ましい実施形態により、本発明の単離されたポリヌクレオチドは、配列番号７に対して、少なくとも８１％の同一性、少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％またはそれ以上の同一性、例えば、９５％〜１００％の同一性を有するポリペプチドをコードする。
【０１４６】
本発明のこの局面の別の好ましい実施形態により、本発明の単離されたポリヌクレオチドは、配列番号８に対して、少なくとも７７％の同一性、少なくとも８０％の同一性、少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％またはそれ以上の同一性、例えば、９５％〜１００％の同一性を有するポリペプチドをコードする。
【０１４７】
本発明のこの局面のさらに別の好ましい実施形態により、コードされるポリペプチドは、少なくとも３０個のアミノ酸、少なくとも３２個のアミノ酸、少なくとも３４個のアミノ酸、少なくとも３６個のアミノ酸、例えば、３８個のアミノ酸からなるシグナルペプチドを有する。そのようなシグナルペプチドは配列番号４７に示され、おそらくはタンパク質分泌のために使用される（実施例の節の実施例１４を参照のこと）。
【０１４８】
本発明のこの局面のさらなる別の好ましい実施形態により、コードされるポリペプチドは、少なくとも１０個のアミノ酸で、多くても１５個のプロリンアミノ酸を特徴とするプロリンリッチ領域を有する（配列番号４９を参照のこと）。これらのプロリンは、推定されるグリコシル化部位として役立ち、そしてタンパク質の分泌およびタンパク質相互作用のために重要であると考えられる［Ｌｉｕ他、Ｊ  Ｂｉｏｍｅｄ  Ｓｃｉ、１９９４（３月）、１（２）：６５〜８２］。
【０１４９】
別の好ましい実施形態により、本発明のこの局面によるポリヌクレオチドは、配列番号１、配列番号２、配列番号３または配列番号４に示される通りであるか、あるいはそれらの活性な部分である。本明細書中で使用される用語「活性な部分」は、キチナーゼの一部分で、キチナーゼ活性を保持する部分（すなわち、触媒作用ドメイン）、および／または基質認識を保持する部分（すなわち、システインリッチドメイン）をいう。
【０１５０】
あるいは、またはさらに、本発明のこの局面によるポリヌクレオチドは、配列番号１、配列番号２、配列番号３または配列番号４とハイブリダイゼーションし得る。
【０１５１】
長い核酸（例えば、２００ｂｐを越える長さ）に対するハイブリダイゼーションは、ストリンジェントなハイブリダイゼーションまたは適度なハイブリダイゼーションのもとで好ましくは達成される。この場合、ストリンジェントなハイブリダイゼーションは、１０％のデキストラン硫酸、１ＭのＮａＣｌ、１％のＳＤＳおよび５×１０６ｃｐｍの３２ｐ標識プローブを含有するハイブリダイゼーション溶液によって６５℃で達成され、０．２×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳの最終的な洗浄液、そして６５℃での最終的な洗浄が伴い、これに対して適度なハイブリダイゼーションは、１０％のデキストラン硫酸、１ＭのＮａＣｌ、１％のＳＤＳおよび５×１０６ｃｐｍの３２ｐ標識プローブを含有するハイブリダイゼーション溶液によって６５℃で達成され、１×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳの最終的な洗浄液、そして５０℃での最終的な洗浄が伴う。
【０１５２】
従って、本発明のこの局面は、エンドキチナーゼ活性を示すポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。本発明の単離されたポリヌクレオチドは様々な単細胞発現システムまたは多細胞発現システムにおいて使用することができ、そしてそれらから回収される組換えポリペプチドを、本発明の酵素組成物に関して本明細書中上記に記載されるような薬学的用途および農業用途において使用することができる。
【０１５３】
単細胞システムにおいて発現させる場合、本発明のポリペプチドは適切な発現ベクター（すなわち、構築物）にクローン化される。
【０１５４】
用いられる宿主／ベクター系に依存して、構成的プロモーターおよび誘導性プロモーター、転写エンハンサーエレメント、転写ターミネーターなどを含む多数の好適な転写エレメントおよび翻訳エレメントはどれも発現ベクターにおいて使用することができる［例えば、Ｂｉｔｔｅｒ他（１９８７）、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５３：５１６〜５４４を参照のこと］。
【０１５５】
従って、挿入されたコード配列の転写および翻訳のための必要なエレメントを含有すること以外に、本発明のこの局面の発現構築物はまた、発現したポリペプチドの安定性、産生、精製、収量または毒性を高めるために操作された配列を含むことができる。例えば、本発明のポリペプチドと異種のタンパク質とを含む融合タンパク質または切断可能な融合タンパク質の発現を操作することができる。そのような融合タンパク質は、アフィニティークロマトグラフィーによって、例えば、異種のタンパク質に対して特異的なカラムにおける固定化によって容易に単離されるように設計することができる。切断部位が目的とするタンパク質（すなわち、キチナーゼ）と異種のタンパク質との間で操作されている場合、キチナーゼタンパク質を、切断部位を分断する適切な酵素または薬剤による処理によってクロマトグラフィーカラムから遊離させることができる［例えば、Ｂｏｏｔｈ他（１９８８）、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．１９：６５〜７０；Ｇａｒｄｅｌｌａ他（１９９０）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：１５８５４〜１５８５９を参照のこと］。
【０１５６】
様々な細胞を、キチナーゼをコードする配列を発現させるために、宿主発現システムとして使用することができる。これらには、微生物、例えば、キチナーゼをコードする配列を含む組換えバクテリオファージＤＮＡ発現ベクターまたはプラスミドＤＮＡ発現ベクターまたはコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換される細菌など；キチナーゼをコードする配列を含む組換え酵母発現ベクターで形質転換される酵母；（本明細書中下記においてさらに記載される）アルカリキチナーゼをコードする配列を含有する植物細胞で、組換えウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス、ＣａＭＶ；タバコモザイクウイルス、ＴＭＶ）で感染させられるか、または組換えプラスミド発現ベクター（Ｔｉプラスミドなど）で形質転換される植物細胞が含まれるが、これらに限定されない。哺乳動物発現システムもまた、キチナーゼを発現させるために使用することができる。細菌システムが、本発明に従って、組換えキチナーゼを製造するために好ましくは使用され、それにより、低コストで大きい生産容量が可能になる。
【０１５７】
細菌システムにおいて、多数の発現ベクターを、発現されるキチナーゼのために意図された使用に依存して都合良く選択することができる。例えば、多量のキチナーゼが所望されるとき、高レベルのタンパク質産物の発現を、おそらくは、タンパク質産物が容易に精製される細菌のペリプラスム内または培養培地内に発現産物を向かわせる疎水性のシグナル配列を有する融合体として行わせるベクターが所望され得る。キチナーゼの回収を助けるために特異的な切断部位を伴って操作されたある種の融合タンパク質もまた望ましいと考えられる。そのような操作に適合し得るそのようなベクターには、大腸菌発現ベクターのｐＥＴシリーズ［Ｓｔｕｄｉｅｒ他（１９９０）、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８５：６０〜８９］が含まれるが、これに限定されない。
【０１５８】
植物からクローン化されたキチナーゼのコドン使用が大腸菌における発現のために適当でないとき、宿主細胞は、大腸菌では希であるが、植物によって頻繁に使用されるｔＲＮＡ種をコードするベクターで同時形質転換することができる。例えば、大腸菌において希なｔＲＮＡ種であるｔＲＮＡＡｒｇＡＧＡ／ＡＧＧをコードする遺伝子ｄｎａＹの同時トランスフェクションは、大腸菌における異種遺伝子の高レベルの発現を生じさせることができる［Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ他、Ｇｅｎｅ、８５：１０９（１９８９）；Ｋａｎｅ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．６：４９４（１９９５）］。ｄｎａＹ遺伝子はまた、例えば、ｐＵＢＳベクターの場合（米国特許第６２７００９８８号）などの発現構築物に組み入れることができる。
【０１５９】
酵母では、米国特許第５９３２４４７号に開示されるように、構成的または誘導性のプロモーターを含有する多数のベクターを使用することができる。あるいは、酵母染色体への外来ＤＮＡ配列の組み込みを促進するベクターを使用することができる。
【０１６０】
昆虫宿主細胞システムおよび哺乳動物宿主細胞システムなどの他の発現システムもまた本発明によって使用することができ、これらはこの分野では十分に知られている。
【０１６１】
形質転換された細胞は、多量の組換えキチナーゼの発現を可能にする条件のもとで培養される。そのような条件には、タンパク質の産生を可能にする培地、バイオリアクター、温度、ｐＨおよび酸素条件が含まれるが、これらに限定されない。培地は、本発明の組換えキチナーゼタンパク質を産生させるために細胞が培養される任意の培地を示す。そのような培地は、典型的には、資化性の炭素源および窒素源およびリン酸源、そして適切な塩、ミネラル、金属、およびビタミンなどの他の栄養分を有する水溶液を含む。本発明の細胞は、従来の発酵バイオリアクター、振とうフラスコ、試験管、マイクロタイターディッシュおよびペトリ皿において培養することができる。培養は、組換え細胞に対して適切な温度およびｐＨおよび酸素含有量で行うことができる。そのような培養条件は当業者の技術の範囲内である。
【０１６２】
製造のために使用されるベクターおよび宿主の系に依存して、本発明の得られるタンパク質は、組換え細胞内に留まり得るか、または発酵培地に分泌され得るか、または２つの細胞膜の間の空間に、例えば、大腸菌における細胞周辺腔などに分泌され得るか、または細胞膜もしくはウイルス膜の外側表面に保持され得る。
【０１６３】
組換えタンパク質の回収は適切な培養時間の後に行われる。用語「組換えタンパク質の回収」は、組換えタンパク質を含有する全発酵培地を集めることを示し、分離または精製のさらなる工程を意味する必要はない。上記にもかかわらず、本発明のタンパク質は、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ろ過、電気泳動、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、コンカナバリンＡクロマトグラフィー、クロマトフォーカシングおよび示差的可溶化（これらには限定されない）などの様々な標準的なタンパク質精製技術を使用して精製することができる。
【０１６４】
本発明の組換えエンドキチナーゼタンパク質は、好ましくは、上記に記載される薬学的組成物および農業用組成物において使用されるために、「実質的に純粋」な形態で回収される。本明細書で使用される用語「実質的に純粋」は、本明細書中上記に記載される種々の用途におけるタンパク質の効果的な使用を可能にする純度をいう。
【０１６５】
下記の実施例の節の実施例１９に示されるように、数多くの食虫植物の種は、本発明のエンドキチナーゼに類似するエンドキチナーゼをコードする発現可能なポリヌクレオチドを含む。
【０１６６】
従って、本発明によって提供されるポリヌクレオチドおよびポリペプチドの配列情報はまた、エンドキチナーゼをコードする、食虫植物のさらなるポリヌクレオチド配列の同定および単離のために使用することができる。そのような同定および単離は、ＰＣＲ増幅、ライブラリースクリーニングなどを含むこの分野で十分に知られている分子的方法および生化学的方法を使用して行うことができる（さらなる詳細については実施例の節を参照のこと）。
【０１６７】
さらに、配列情報は、本発明のポリペプチドに固有的な生化学的特徴と一緒に、他の食虫植物から粗キチナーゼ活性画分または精製キチナーゼ活性画分を単離するために使用することができる。
【０１６８】
従って、本発明のさらなる局面により、大きいエンドキチナーゼ活性を示すポリペプチドを食虫植物から単離する方法が提供される。
【０１６９】
その場合、この方法は、食虫植物の組織（すなわち、トラップ組織もしくは葉組織）またはトラップ分泌物（例えば、嚢状葉植物のトラップ消化液）からタンパク質抽出物を調製することによって行われる。
【０１７０】
タンパク質を抽出した後、キチナーゼ活性画分が単離され、そして活性画分に由来し、かつ大きいキチナーゼ活性を示す個々のポリペプチドが、本明細書中下記においてさらに詳述されるキチナーゼ活性アッセイを使用して同定される。
【０１７１】
最後に、増強されたキチナーゼ活性を有するポリペプチドは、生化学的な特徴づけ（例えば、ｐＨ感受性および温度感受性、分子量、還元性条件／非還元性条件における活性、ｐＩ、エンドキチナーゼ／エキソキチナーゼ活性など、実施例の節を参照のこと）、そして殺生物活性（例えば、抗菌類活性）に対する機能的アッセイを行うことができる。
【０１７２】
本明細書中上記に記載された方法は、好ましくは、ポリペプチドの単離を容易にするように植物全体にキチナーゼ活性を最初に誘導することによって行われることが理解される。これは、植物ホルモン（例えば、エチレン）などの様々な内部因子および外部因子、熱ショック、化学物質、病原体、酸素欠乏、光、ストレスなどによって行うことができる。この方法論による好ましい誘導プロトコルはキチン誘導である（実施例の節の実施例７を参照のこと）。
【０１７３】
植物タンパク質抽出物の調製は、この分野で知られている任意の標準的なタンパク質抽出方法によって行うことができる。タンパク質抽出方法の選択は、活性なポリペプチドの組織分布およびその細胞局在化に依存し得る。タンパク質が植物細胞のアポプラスムまたは細胞間空間に分泌されない場合、目的とするタンパク質を放出させ、捕捉するために、植物細胞壁を溶解するための機構を用いなければならない。植物タンパク質の抽出方法に関する総説がＣｕｎｎｉｎｇｈａｍ  ＣおよびＰｏｒｔｅｒ  ＡＪＲ（１９９８）、「Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｆｒｏｍ  ｐｌａｎｔｓ」（Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ、Ｔｏｔｏｗａ、ＮＪ）によって提供される。
【０１７４】
分泌されたタンパク質またはアポプラストタンパク質は、分泌された消化液を単に集めることによって抽出することができる。しかし、周囲の細胞を破壊することがないようにし、それにより、分泌されたタンパク質がタンパク質分解環境または変性環境にさらされることがないように対策を取らなければならない。
【０１７５】
好ましくは、分泌されたタンパク質またはアポプラストタンパク質の抽出物は、５ｍＭのＥＤＴＡ、１０ｍＭのアスコルビン酸、１０ｍＭのメルカプトエタノール、１ｍＭのフッ化フェニルメチルスルホニル、２ｍＭのカプロン酸および２ｍＭのベンズアミジンを用いた、葉またはトラップ組織などの目的とする組織の真空浸潤によって調製される。真空浸潤は、ＭａｕｃｈおよびＳｔａｅｈｅｌｉｎ［Ｔｈｅ  ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ、１：４４７〜４５７（１９８９）］に記載される方法に従って行われる。処理された組織は、組織が曲がることを避けるように漏斗に垂直に詰められ、そして遠心分離管に入れられる。組織が漏斗に詰められたまま、材料は遠心分離され、細胞外浸潤物が、組織の細胞を破壊することなく除かれ、そして抽出物として遠心分離管に捕捉される。
【０１７６】
回収された抽出物は、その後、キチナーゼ活性についてアッセイされる。一般に、キチナーゼ活性は、コロイド状キチンからのグルコサミンの酵素的放出（エキソキチナーゼ）およびキチンオリゴマーからのグルコサミンの酵素的放出（エンドキチナーゼ）として測定することができる。
【０１７７】
キチナーゼ活性はゲル内活性アッセイによって測定することができる（実施例の節の実施例１を参照のこと）。サンプル（すなわち、タンパク質抽出物画分）が、Ｂｌａｃｋｓｈｅａｒ（１９８４）によって以前に記載されたように、未変性ポリアクリルアミドミニゲルにおける電気泳動に付される。電気泳動後、ゲルは、ＴｒｕｄｅｌおよびＡｓｓｅｌｉｎ［（１９８９）、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１７８：３６２〜３６６］の手順に従って、基質としてのグリコールキチンを含有するポリアクリルアミドゲルと重ねられ、そして効果的な条件のもとでインキュベーションされる。キチナーゼ活性のバンドが、紫外光のもとで見たとき、カルコフルオルによる染色がないことによって検出される。
【０１７８】
あるいは、キチナーゼ活性は、アナログのｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−Ｎ，Ｎ’，Ｎ”−トリアセチルキトビオース（Ｓｉｇｍａ、ＩＬ）を使用して測定することができる。このアッセイは、ナノ純粋の水に溶解された基質と、タンパク質抽出物画分とを用いて、ＣａＣｌ２を含むＫＨ２ＰＯ４緩衝液（ｐＨ６．７）を含有するＥＬＩＳＡプレートにおいて行われる。反応は５０℃で３０分後に停止させられ、そして吸光度が、ＥＬＩＳＡプレートリーダーを使用して４０５ｎｍで測定される。ブランクが、酵素単独または基質単独による何らかの吸収を除くために使用される。サンプルによって放出されたｐ−ニトロフェノールが、標準曲線を使用して計算される。酵素活性のユニット数が、アッセイ条件のもとで１分あたり放出されたｐ−ニトロフェノールのモル数として決定される。
【０１７９】
キチナーゼ活性画分が同定されると、目的とするポリペプチドは任意の好適な精製手順に従って濃縮および精製することができる（実施例の節の実施例６を参照のこと）。そのような手順には、米国特許第６２８４８７５号（これは全体が本明細書中に組み込まれる）に開示されるように、タンパク質沈殿、エキスパンド床クロマトグラフィー、限外ろ過、アニオン交換クロマトグラフィー、カチオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ＨＰＬＣ、ＦＰＬＣ、およびアフィニティークロマトグラフィー（キチンカラムにおけるクロマトグラフィーなど）が含まれ得るが、これらに限定されない。いくつかのタンパク質精製技術の一般的な考察が、Ｊｅｒｖｉｓ他、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１１：１６１〜１９８（１９８９）によって提供される（その開示は参考として本明細書中に組み込まれる）。
【０１８０】
上記に記載される方法論を使用して、本発明者らは、食虫植物の３つのさらなる属（ハエトリソウ（Ｄｉｏｎｅａ  ｓｐ．）、モウセンゴケ（Ｄｒｏｓｅｒａ  ｓｐ．）およびヘイシソウ（Ｓａｒｒａｃｅｎｉａ  ｓｐ．））からのエンドキチナーゼファミリーの酵素のさらなるメンバーを明らかにした。
【０１８１】
タンパク質製造のためのテンプレートとして役立つこと以外に、キチナーゼをコードする本発明のポリヌクレオチドはまた、様々な用途において使用することができる。
【０１８２】
従って、本発明のさらに別の局面により、キチン含有病原体に対する植物の感受性を低下させる方法が提供される。
【０１８３】
この方法は、本発明の高活性なキチナーゼポリペプチドを植物内で異所的に発現させることによって達成される。
【０１８４】
植物におけるポリペプチド発現は、植物を本発明のポリヌクレオチド配列で形質転換することによって達成される。
【０１８５】
植物の形質転換を行うために、エンドキチナーゼをコードするポリヌクレオチドが、好ましくは、植物細胞もしくは植物組織への外因性ポリヌクレオチドの導入を促進し、かつこれらの酵素を植物において発現させるために役立つ核酸構築物（１つまたは複数）に含められる。
【０１８６】
本発明による核酸構築物は、一過性の様式で、または好ましくは安定的な様式で、そのいずれでも、キチナーゼをコードする本発明のポリヌクレオチドを植物全体または規定された植物組織または規定された植物細胞において発現させるために用いられる。
【０１８７】
従って、本発明の好ましい実施形態により、核酸構築物は、キチナーゼをコードする本発明のポリヌクレオチドの発現を調節するためのプロモーターをさらに含む。
【０１８８】
組織特異的または発達特異的または構成的または誘導性のいずれかであり得る数多くの機能的な植物発現プロモーターおよびエンハンサーを本発明の構築物によって用いることができ、いくつかの例が下記に示される。
【０１８９】
本明細書中および下記の請求項の節において使用される用語「植物プロモーター」または用語「プロモーター」は、（ＤＮＡを含有するオルガネラを含む）植物細胞における遺伝子発現を行わせることができるプロモーターを含む。そのようなプロモーターは、植物起源、細菌起源、ウイルス起源、菌類起源または動物起源に由来し得る。そのようなプロモーターは、構成的、すなわち、多数の植物組織において高レベルの遺伝子発現を行わせることができ、または組織特異的、すなわち、特定の植物組織において遺伝子発現を行わせることができ、または誘導性、すなわち、刺激のもとで遺伝子発現を行わせることができ、またはキメラ、すなわち、少なくとも２つの異なるプロモーターの部分から形成され得る。
【０１９０】
従って、用いられる植物プロモーターは、構成的プロモーター、組織特異的プロモーター、誘導性プロモーター、またはキメラなプロモーターであり得る。
【０１９１】
構成的な植物プロモーターの例には、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター、ＣａＭＶ１９Ｓプロモーター、ＦＭＶ３４Ｓプロモーター、サトウキビ桿状バドナウイルスプロモーター、ＣｓＶＭＶプロモーター、アラビドプシスのＡＣＴ２／ＡＣＴ８アクチンプロモーター、アラビドプシスのユビキチンＵＢＱ１プロモーター、オオムギの葉チオニンＢＴＨ６プロモーター、およびイネのアクチンプロモーターが含まれるが、これらに限定されない。
【０１９２】
組織特異的なプロモーターの例には、マメのファゼオリン貯蔵タンパク質プロモーター、ＤＬＥＣプロモーター、ＰＨＳβプロモーター、ゼイン貯蔵タンパク質プロモーター、ダイズ由来のコングルチンγプロモーター、ＡＴ２Ｓ１遺伝子プロモーター、アラビドプシス由来のＡＣＴ１１アクチンプロモーター、セイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ）由来のｎａｐＡプロモーター、およびジャガイモのパタチン遺伝子プロモーターが含まれるが、これらに限定されない。
【０１９３】
誘導性プロモーターは、例えば、光、温度、化学物質、日照り、高塩度、浸透圧ショック、酸化性条件を含むストレス条件などの特異的な刺激によって、または病原性の場合に誘導されるプロモーターであり、これには、エンドウのｒｂｃＳ遺伝子に由来する光誘導性プロモーター、アルファルファのｒｂｃＳ遺伝子に由来するプロモーター、日照りにおいて活性なプロモーター（ＤＲＥ、ＭＹＣおよびＭＹＢ）、高塩度および浸透圧ストレスにおいて活性なプロモーター（ＩＮＴ、ＩＮＰＳ、ｐｒｘＥａ、Ｈａ、ｈｓｐ１７．７Ｇ４およびＲＤ２１）、ならびに病原性ストレスにおいて活性なプロモーター（ｈｓｒ２０３Ｊおよびｓｔｒ２４６Ｃ）が含まれるが、これらに限定されない。
【０１９４】
本発明による構築物は、好ましくは、例えば、抗生物質耐性遺伝子などの適切かつ特徴的な選択マーカーをさらに含む。本発明によるより好ましい実施形態において、構築物は複製起点をさらに含む。
【０１９５】
本発明による構築物は、大腸菌（構築物は適切な選択マーカーおよび複製起点を含む）においてともに増殖することができ、かつ植物の細胞における増殖または植物のゲノム内への組み込みのために適合し得るシャトルベクターであり得る。
【０１９６】
核酸構築物を単子葉植物および双子葉植物の両方に導入する様々な方法が存在する（Ｐｏｔｒｙｋｕｓ，Ｉ．、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｌａｎｔ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，Ｐｌａｎｔ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（１９９１）４２：２０５〜２２５；Ｓｈｉｍａｍｏｔｏ他、Ｎａｔｕｒｅ（１９８９）、３３８：２７４〜２７６）。そのような方法は、植物のゲノム内への核酸構築物もしくはその一部分の安定的な組み込みに、または核酸構築物の一過性の発現（そのような場合、これらの配列は植物の子孫によって受け継がれない）に頼っている。
【０１９７】
本発明の核酸構築物内に含まれる配列などの外因性配列の植物ゲノム内への安定的なゲノム組み込みを行う２つの基本的な方法が存在する：
（ｉ）アグロバクテリウムによって媒介される遺伝子移入：Ｋｌｅｅ他（１９８７）、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．３８：４６７〜４８６；ＫｌｅｅおよびＲｏｇｅｒｓ、Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｓｏｍａｔｉｃ  Ｃｅｌｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ｏｆ  Ｐｌａｎｔｓ、第６巻、植物核遺伝子の分子生物学、Ｓｃｈｅｌｌ，Ｊ．およびＶａｓｉｌ，Ｌ．Ｋ．編、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．（１９８９）、２頁〜２５頁；Ｇａｔｅｎｂｙ、Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｋｕｎｇ，Ｓ．およびＡｒｎｔｚｅｎ，Ｃ．Ｊ．編、Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、Ｂｏｓｔｏｎ、Ｍａｓｓ．（１９８９）、９３頁〜１１２頁。
（ｉｉ）直接的なＤＮＡ取り込み：Ｐａｓｚｋｏｗｓｋｉ他、Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｓｏｍａｔｉｃ  Ｃｅｌｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ｏｆ  Ｐｌａｎｔｓ、第６巻、植物核遺伝子の分子生物学、Ｓｃｈｅｌｌ，Ｊ．およびＶａｓｉｌ，Ｌ．Ｋ．編、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．（１９８９）、５２頁〜６８頁；これには下記が含まれる：プロトプラスト内へのＤＮＡの直接的な取り込みのための方法、Ｔｏｒｉｙａｍａ，Ｋ．他（１９８８）、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、６：１０７２〜１０７４）。植物細胞の一時的な電気ショックにより誘導されるＤＮＡ取り込み：Ｚｈａｎｇ他、Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐ．（１９８８）、７：３７９〜３８４。Ｆｒｏｍｍ他、Ｎａｔｕｒｅ（１９８６）、３１９：７９１〜７９３。粒子衝撃法による植物細胞内または植物組織内へのＤＮＡ注入、Ｋｌｅｉｎ他、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９８８）、６：５５９〜５６３；ＭｃＣａｂｅ他、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９８８）、６：９２３〜９２６；Ｓａｎｆｏｒｄ、Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｔ．（１９９０）、７９：２０６〜２０９；マイクロピペットシステムの使用による植物細胞内または植物組織内へのＤＮＡ注入：Ｎｅｕｈａｕｓ他、Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．（１９８７）、７５：３０〜３６；ＮｅｕｈａｕｓおよびＳｐａｎｇｅｎｂｅｒｇ、Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｔ．（１９９０）、７９：２１３〜２１７；発芽中の花粉とのＤＮＡの直接的なインキュベーションによる植物細胞内または植物組織内へのＤＮＡ注入、ＤｅＷｅｔ他、Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｏｖｕｌｅ  Ｔｉｓｓｕｅ、Ｃｈａｐｍａｎ，Ｇ．Ｐ．およびＭａｎｔｅｌｌ，Ｓ．Ｈ．およびＤａｎｉｅｌｓ，Ｗ．編、Ｌｏｎｇｍａｎ、Ｌｏｎｄｏｎ、（１９８５）、１９７頁〜２０９頁；Ｏｈｔａ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８６）、８３：７１５〜７１９。
【０１９８】
アグロバクテリウムの系では、植物のゲノムＤＮＡに組み込まれる規定されたＤＮＡセグメントを含有するプラスミドベクターの使用が含まれる。植物組織への接種方法は、植物種およびアグロバクテリウム送達システムに依存して変化する。広く使用されている方法は、完全な植物分化を開始させるための良好な供給源を提供する任意の組織外植片を用いて行うことができるリーフディスク法である。Ｈｏｒｓｃｈ他（Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｍａｎｕａｌ  Ａ５、Ｋｌｕｗｅｒ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、Ｄｏｒｄｒｅｃｈｔ（１９８８）、１頁〜９頁、補足的方法）は、アグロバクテリウム送達システムを真空浸潤と組み合わせて用いている。アグロバクテリウムの系は、遺伝子組換え双子葉植物を作製することにおいて特に実用的である。
【０１９９】
植物細胞内への直接的なＤＮＡ移入法は様々である。エレクトロポレーションでは、プロトプラストが強い電場に一時的にさらされる。マイクロインジェクションでは、ＤＮＡが、非常に小さいマイクロピペットを使用して細胞内に機械的に直接注入される。ミクロ粒子衝撃法では、ＤＮＡが、硫酸マグネシウム結晶またはタングステン粒子または金粒子などの微小弾丸に吸着され、そして微小弾丸が細胞内または植物組織内に物理的に加速されて入れられる。
【０２００】
形質転換後、植物の繁殖が行われる。植物繁殖の最も一般的な方法は種子による。しかし、種子繁殖による再生には、ヘテロ接合性のために、作物には均一性がないという欠陥がある。これは、種子が、メンデル則によって支配される遺伝子変化に従って植物により作製されるからである。基本的に、それぞれの種子は遺伝子的に異なり、そしてそれぞれがそれ自身の特異的な形質とともに成長する。従って、形質転換された植物は、再生された植物が親の遺伝子組換え植物と同一の形質および特徴を有するように作製されることが好ましい。従って、形質転換された植物は、形質転換された植物の迅速かつ安定した再生産をもたらすマイクロプロパゲーションによって再生されることが好ましい。
【０２０１】
本発明の核酸構築物に含まれる単離された核酸を一過性に発現させるために利用され得る一過性発現法には、上記に記載されるように、しかし一過性発現に好都合な条件のもとではマイクロインジェクションおよび衝撃法、そして核酸構築物を含むパッケージ型組換えウイルスベクターまたは非パッケージ型組換えウイルスベクターを植物組織または植物細胞に感染させ、その結果、植物組織または植物細胞において確立された増殖性の組換えウイルスが非ウイルス核酸配列を発現させるようにするために利用されるウイルス媒介による発現が含まれるが、これらに限定されない。
【０２０２】
植物宿主の形質転換のために有用であることが示されているウイルスには、ＣａＭＶ、ＴＭＶおよびＢＶが含まれる。植物ウイルスを使用する植物の形質転換が、米国特許第４８５５２３７号（ＢＧＶ）に、そして欧州特許ＥＰ−Ａ６７５５３（ＴＭＶ）、特開昭６３−１４６９３（ＴＭＶ）、欧州特許ＥＰＡ１９４８０９（ＢＶ）、同ＥＰＡ２７８６６７（ＢＶ）、およびＧｌｕｚｍａｎ，Ｙ．他、Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ｖｉｒａｌ  Ｖｅｃｔｏｒｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１７２頁〜１８９頁（１９８８）に記載される。植物を含む多くの宿主において外来ＤＮＡを発現させる際に使用される偽ウイルス粒子が、国際特許出願公開ＷＯ８７／０６２６１に記載される。
【０２０３】
非ウイルス性の外因性核酸配列の植物における導入および発現を行うための植物ＲＮＡウイルスの構築が、上記の参考文献によって、そして同様に、Ｄａｗｓｏｎ，Ｗ．Ｏ．他、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（１９８９）、１７２：２８５〜２９２；Ｔａｋａｍａｔｓｕ他、ＥＭＢＯ  Ｊ．（１９８７）、６：３０７〜３１１；Ｆｒｅｎｃｈ他、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８６）、２３１：１２９４〜１２９７；Ｔａｋａｍａｔｓｕ他、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ（１９９０）、２６９：７３〜７６によって明らかにされている。
【０２０４】
ウイルスがＤＮＡウイルスであるとき、構築をそのウイルス自身に対して行うことができる。あるいは、ウイルスは、外来ＤＮＡを有する所望するウイルスベクターの構築を容易にするために、細菌プラスミドに最初にクローン化することができる。その後、ウイルスはプラスミドから切り出される。ウイルスがＤＮＡウイルスである場合、細菌の複製起点をウイルスＤＮＡに取り付けることができ、これにより、ウイルスＤＮＡは、その後、細菌によって複製される。このＤＮＡが転写および翻訳されることにより、ウイルスＤＮＡをキャプシド化するコートタンパク質が産生される。ウイルスがＲＮＡウイルスである場合、ウイルスは、一般にはｃＤＮＡとしてクローン化され、プラスミドに挿入される。このプラスミドは、その後、構築のすべてを行うために使用される。その後、ＲＮＡウイルスが、ウイルスＲＮＡをキャプシド化するためのコートタンパク質を産生させるためにプラスミドのウイルス配列を転写し、そしてウイルス遺伝子を翻訳することによって産生される。
【０２０５】
本発明の構築物に含まれる核酸配列などの非ウイルス性の外因性核酸配列の植物における導入および発現を行うための植物ＲＮＡウイルスの構築が、上記の参考文献によって、そして同様に米国特許第５３１６９３１号に明らかにされている。
【０２０６】
１つの実施形態において、植物ウイルス核酸が提供されるが、これは、本来のコートタンパク質をコードする配列がウイルス核酸から欠失されているが、植物宿主における発現を可能にし、組換え植物ウイルス核酸をパッケージングし、そして組換え植物ウイルス核酸による宿主の全身感染を確実にする、非天然型の植物ウイルスコートタンパク質をコードする配列および非天然型プロモーター（好ましくは、非天然型コートタンパク質をコードする配列のサブゲノムプロモーター）が挿入されている。あるいは、コートタンパク質の遺伝子を、タンパク質が産生されるように非天然型の核酸配列をその中に挿入することによって不活性化することができる。組換え植物ウイルス核酸は、１つまたは複数のさらなる非天然型のサブゲノムプロモーターを含有することができる。それぞれの非天然型サブゲノムプロモーターは、隣接する遺伝子または核酸配列を植物宿主において転写または発現させることができるが、相互の組換えおよび本来のサブゲノムプロモーターとの組換えができない。２つ以上の核酸配列が含まれる場合、非天然型（外来）核酸配列を、本来の植物ウイルスサブゲノムプロモーターに隣接して、または本来の植物ウイルスサブゲノムプロモーターおよび非天然型の植物ウイルスサブゲノムプロモーターに隣接して挿入することができる。非天然型の核酸配列がサブゲノムプロモーターの制御下で宿主植物において転写されるか、または発現して、所望する産物をもたらす。
【０２０７】
第２の実施形態では、本来のコートタンパク質をコードする配列が、非天然型コートタンパク質をコードする配列の代わりに、非天然型コートタンパク質サブゲノムプロモーターの１つに隣接して設置されていることを除いて第１の実施形態の場合のように、組換え植物ウイルス核酸が提供される。
【０２０８】
第３の実施形態では、本来のコートタンパク質遺伝子がそのサブゲノムプロモーターに隣接し、１つ以上の非天然型サブゲノムプロモーターがウイルス核酸内に挿入されている組換え植物ウイルス核酸が提供される。挿入された非天然型サブゲノムプロモーターは、隣接する遺伝子を植物宿主において転写または発現させることができるが、相互の組換えおよび本来のサブゲノムプロモーターとの組換えができない。非天然型の核酸配列を非天然型のサブゲノム植物ウイルスプロモーターに隣接して挿入することができ、その結果、これらの配列がサブゲノムプロモーターの制御下で植物宿主において転写されるか、または発現して、所望する産物が産生されるようになる。
【０２０９】
第４の実施形態では、本来のコートタンパク質をコードする配列が、非天然型のコートタンパク質をコードする配列によって置換されていることを除いて第３の実施形態の場合のように、組換え植物ウイルス核酸が提供される。
【０２１０】
ウイルスベクターは、組換え植物ウイルス核酸によりコードされるコートタンパク質によってキャプシド化されて、組換え植物ウイルスをもたらす。組換え植物ウイルス核酸または組換え植物ウイルスは、適切な宿主植物に感染させるために使用される。組換え植物ウイルス核酸は、宿主における複製、宿主における全身的な伝搬、および所望するタンパク質を産生させるための宿主における外来遺伝子（単離された核酸）の転写または発現が可能である。
【０２１１】
本発明のポリヌクレオチドと他のポリヌクレオチドとの同時形質転換が、欧州特許ＥＰ４４０３０４Ａ１（これは全体が本明細書中に組み込まれる）に開示されるように、キチナーゼとグルコナーゼとの組合せなどの相乗効果を達成するために望ましいことが理解される。
【０２１２】
任意の植物種を本発明の核酸構築物で形質転換することができ、そのような植物には、農業、園芸学、林学、ガーデニング、屋内ガーデニング、または植物を伴う任意の他の活動形態（食品もしくは飼料としての直接的な使用のため、または任意の種類の産業におけるさらなる加工のためのいずれでも）において、物質の抽出、装飾目的、繁殖、交配、または任意の他の使用のために一般的に使用される、裸子植物ならびに被子植物、双子葉植物ならびに単子葉植物の様々な種が含まれる。
【０２１３】
一般に、形質転換後、植物の細胞または外植片は、本発明の構築されたベクターによってコードされる１つまたは複数のマーカーの存在について選択され、その後、形質転換物は完全な植物に再生／繁殖させられる。植物繁殖の最も一般的な方法は種子による。しかし、種子繁殖による再生には、ヘテロ接合性のために、作物には均一性がないという欠陥がある。これは、種子が、メンデル則によって支配される遺伝子変化に従って植物により作製されるからである。基本的に、それぞれの種子は遺伝子的に異なり、そしてそれぞれがそれ自身の特異的な形質とともに成長する。従って、遺伝子組換え植物は、再生された植物が親の遺伝子組換え植物と同一の形質および特徴（例えば、融合タンパク質の再生産）を有するように作製されることが好ましい。従って、遺伝子組換え植物は、遺伝子組換え植物の迅速かつ安定した再生産をもたらすマイクロプロパゲーションによって再生されることが好ましい。
【０２１４】
マイクロプロパゲーションは、選択された親植物または栽培種から切り出された組織の単一片から新しい世代の植物を成長させる方法である。この方法により、融合タンパク質を発現する好ましい組織を有する植物の大量再生産が可能になる。作製される新しい世代の植物は、元の植物と遺伝子的に同一であり、そして元の植物の特徴のすべてを有する。マイクロプロパゲーションは、短期間で高品質の植物体の大量生産を可能にし、そして元の遺伝子組換え植物または形質転換植物の特徴を維持して、選択された栽培種の迅速な繁殖を提供する。
【０２１５】
マイクロプロパゲーションは、培養培地または増殖培地を段階間で替えることを必要とする多段階法である。従って、マイクロプロパゲーション法には、４つの基本的な段階が含まれる：第１段階、最初の組織培養；第２段階、組織培養物を増やすこと；第３段階、分化および植物形成；第４段階、温室栽培および強固化。第１段階、すなわち、最初の組織培養のとき、組織培養が確立され、そして組織培養物に混入がないことが確認される。第２段階のとき、最初の組織培養物が、生産目標を満たすために十分な数の組織サンプルが作製されるまで増やされる。第３段階のとき、第２段階で増殖させられた組織サンプルが分割され、個々の小植物に成長させられる。第４段階のとき、遺伝子組換え小植物は、天然の環境で成長することができように、光に対する植物の耐性を徐々に大きくする強固化用の温室に移される。
【０２１６】
植物の形質転換および繁殖を行った後、適切な植物の選択を、外因性のエンドキチナーゼの発現レベルをモニターすることによって、または対応するｍＲＮＡの転写レベルをモニターすることによって行うことができる。
【０２１７】
外因性エンドキチナーゼの発現レベルは、組換えポリペプチドを特異的に認識する抗体（例えば、配列番号４７のシグナルペプチドのＮ末端端部に対する抗体など）を使用して行うことができる免疫検出アッセイ（すなわち、ＥＬＩＳＡおよびウエスタンブロット分析、免疫組織化学など）を使用して測定することができる。様々な抗体作製方法が「Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」、Ａｂｂａｓ，Ｋ．他（１９９４）、第２版、ＷＢ  Ｓａｕｎｄｅｒｓ  Ｃｏｍｐ（編）に開示される（これは全体が本明細書中に組み込まれる）。あるいは、組換えポリペプチドは、クーマシーブルー染色または銀染色（これらに限定されない）などの種々の染色技術を使用してＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によってモニターすることができる。
【０２１８】
本発明のポリペプチドのｍＲＮＡレベルはまた、形質転換率および／または形質転換レベルを示し得る。ｍＲＮＡレベルは、当業者に知られている様々な方法によって、例えば、特異的なオリゴヌクレオチドプローブに対するハイブリダイゼーション（例えば、ノーザン分析）またはＰＣＲなどによって測定することができる。
【０２１９】
そのようなポリヌクレオチドは、本明細書中上記に記載されるポリヌクレオチド配列と特異的にハイブリダイゼーションし得る、少なくとも１７個の塩基、少なくとも１８個の塩基、少なくとも１９個の塩基、少なくとも２０個の塩基、少なくとも２２個の塩基、少なくとも２５個の塩基、少なくとも３０個の塩基、または少なくとも４０個の塩基からなる。
【０２２０】
本発明のポリヌクレオチド配列を特異的に検出するために、様々な処置が、使用されるハイブリダイゼーション条件のもとで、他の関連する遺伝子とハイブリダイゼーションしない特異的なオリゴヌクレオチドプローブを設計するために取られる。実施例１４には、特異的なオリゴヌクレオチドを設計するために有用であると考えられる保存された配列が例示される。
【０２２１】
短い核酸（２００ｂｐ未満の長さ、例えば、１７ｂｐ〜４０ｂｐの長さ）のハイブリダイゼーションは、所望するストリンジェンシーに依存して、下記のハイブリダイゼーションプロトコルによって行うことができる；（ｉ）６×ＳＳＣおよび１％ＳＤＳまたは３Ｍ  ＴＭＡＣＩ、０．０１Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ７．６）、０．５％ＳＤＳ、１００μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡおよび０．１％脱脂粉乳のハイブリダイゼーション液、Ｔｍよりも１℃〜１．５℃低いハイブリダイゼーション温度、３Ｍ  ＴＭＡＣＩ、０．０１Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ７．６）、０．５％ＳＤＳからなる、Ｔｍよりも１℃〜１．５℃低い温度の最終洗浄液；（ｉｉ）６×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳまたは３Ｍ  ＴＭＡＣＩ、０．０１Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ７．６）、０．５％ＳＤＳ、１００μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡおよび０．１％脱脂粉乳のハイブリダイゼーション液、Ｔｍよりも２℃〜２．５℃低いハイブリダイゼーション温度、３Ｍ  ＴＭＡＣＩ、０．０１Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ７．６）、０．５％ＳＤＳからなる、Ｔｍよりも１℃〜１．５℃低い温度の最終洗浄液、６×ＳＳＣの最終洗浄液、そして２２℃での最終洗浄；（ｉｉｉ）６×ＳＳＣおよび１％ＳＤＳまたは３Ｍ  ＴＭＡＣＩ、０．０１Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ７．６）、０．５％ＳＤＳ、１００μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡおよび０．１％脱脂粉乳のハイブリダイゼーション液、３７℃のハイブリダイゼーション温度、６×ＳＳＣの最終洗浄液、そして２２℃での最終洗浄。
【０２２２】
本発明のオリゴヌクレオチドは、サブトラクティブハイブリダイゼーション、ディファレンシャルプラークハイブリダイゼーション、アフィニティークロマトグラフィー、エレクトロスプレー質量分析法、ノーザン分析、ＲＴ−ＰＣＲなどを含む、ヌクレオチドハイブリダイゼーションに基づく任意の技術において使用することができる。ＰＣＲに基づく方法の場合、１対のオリゴヌクレオチドが、ポリメラーゼ連鎖反応などの核酸増幅反応においてその一部分の指数関数的な増幅が行われるように反対向きで使用される。本発明のこの局面による１対のオリゴヌクレオチドは、好ましくは、適合し得る融解温度（Ｔｍ）を有するように、例えば、差が７℃未満であり、好ましくは５℃未満であり、より好ましくは４℃未満であり、最も好ましくは３℃未満であり、理想的には３℃〜０℃の間である融解温度を有するように選択される。
【０２２３】
本発明のこの局面による新規なキチナーゼを、単独で、または（本明細書中上記に記載される）本発明の組換えキチナーゼと相乗的に機能するタンパク質をコードする他の遺伝子との組合せで、そのいずれでも産生または過剰産生する植物および植物の一部は、病原体抵抗性（特に菌類抵抗性）を評価するために使用することができる。続いて、抵抗性がより大きい系統が、強化された病原体抵抗性（特に菌類抵抗性）を有する商業品種を得るための育種プログラムにおいて使用することができる。病原体または菌類の攻撃に対して低下した感受性を有する植物を野外または温室において使用することができ、続いて、動物飼育のために、ヒトによる直接的な消費のために、長期間の貯蔵のために使用することができ、そして食品産業または他の産業での加工などにおいて使用することができる。本発明に従って作製される植物またはその一部分の利点は、材料コストの低下、労働コストの低下、および環境汚染の低下をもたらす、殺菌類処理の必要性が低下していること、または製造物（例えば、実、種子など）の保存寿命が長くなっていることである。さらに、収穫後の損失を、収穫された植物または植物組織によって発現されるキチナーゼの存在により減少させることができる。
【０２２４】
本発明の方法論はまた、植物を低温損傷から保護する際にも使用することができる。キチナーゼはまた、キチンを可溶性の糖ユニット（例えば、Ｎ−アセチルグルコサミン単量体またはその小さいオリゴマー）に分解することが知られている［Ｒｏｂｅｒｔｓ他（１９８８）、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１３４、１６９〜１７６］。小さい可溶性の化合物（特に糖）は、寒冷損傷または凍結損傷からの保護に関連するか、またはそのような保護をもたらし得ることが知られている［Ｆｉｎｋｌｅ，Ｂ．Ｊ．他（１９８５）、Ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  Ｏｒｇａｎｓ（第５章）、７５頁〜１１３頁、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．、Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ、Ｆｌａ．；Ｓａｋａｉ他（１９６８）、Ｃｒｙｏｂｉｏｌ．５（３）：１６０〜１７４］。従って、低温損傷からの保護が、植物の多糖類を分解し（例えば、ヘミセルロースおよびペクチンなどの細胞壁の多糖成分におけるβ−１，４−グリコシド結合を切断し）、可溶性の糖（単量体または小さいオリゴマー）の増大したレベルをもたらし、これにより、凍結損傷または寒冷損傷からの高められた保護を次にもたらし得る本発明のキチナーゼによって媒介され得ると考えられる。
【０２２５】
従って、本発明のさらに別の局面により、低温損傷に対する植物の感受性を低下させる方法が提供される。
【０２２６】
この方法は、本明細書中上記に記載されるように植物を本発明のポリヌクレオチドで形質転換すること、および寒冷温度（０℃〜１０℃）または凍結温度（０℃以下）にさらされる野外条件のもとで形質転換植物を成長させること、および低下した寒冷損傷または凍結損傷を示すか、あるいはそうでない場合には、寒冷損傷または凍結損傷に対する抵抗性または増大した抵抗性を示す植物（またはその実）を選択することを含む（米国特許第６２３５６８３号、同第５７７６４４８号、同第５６３３４５０号および同第５５５４５２４号を参照のこと。これらはそれぞれ、その全体が参考として本明細書中に組み込まれる）。
【０２２７】
この方法は、低温損傷（すなわち、凍結または寒冷）から保護される植物を作製するために使用することができる。
【０２２８】
高まったレベルの可溶性の糖が本発明の形質転換された植物に含有されることを考えれば、本発明の方法はまた、より高い糖含有量を有する実をもたらす植物を作出するために使用することができる。そのような場合、キチナーゼをコードする外因性ポリヌクレオチドが、好ましくは、増大した糖含有量が所望される植物部分（例えば、実）において発現させられる。
【０２２９】
本発明の方法はさらに、糖含有量を低下させること、または高められた低下する糖含有量に関連する他の性質（改善された貯蔵性、保存性および貯蔵安定性を含む）を植物に付与するために使用することができる。
【０２３０】
本発明はまたさらなる関連する適用を有し得る。本発明のキチナーゼは、医療目的のために注入または埋め込まれたキチン型構造体を分解するための道具として使用することができる。例えば、薬物をキチン型カプセル（「キトソーム」）に配合することができる。十分に規定された量の本発明のキチナーゼをカプセル内に同時に存在させることにより、薬物の制御された放出を確実にすることができる。薬物がキチンマトリックスに取り込まれているとき、遅いが、徐放性の薬物放出を特に考えることができる。そのようなシステムにおけるキチナーゼ酵素の使用はキチン型カプセルの最終的な破壊をもたらすが、免疫学的応答を誘発させない。そのようなシステムにおいて使用される薬物は、小さい化合物から、酵素治療および遺伝子治療のためのタンパク質およびＤＮＡフラグメントまで変化させることができる。
【０２３１】
別の関連する適用は、構造的成分としてキチンを含有するインプラントを早く分解させるための、本発明のキチナーゼ（好ましくは組換え形態）の使用である。これは、機能をほんの一時的に満たさなければならないが、組換えキチナーゼの投与によって都合良く「溶解」され得るインプラントの場合には有用であると考えられる。
【０２３２】
本発明のさらなる目的および利点および新規な特徴は、限定であることを意図しない下記の実施例を検討したとき、当業者に明らかになる。さらに、本明細書中上記に示され、そして下記の請求項の節に記載される本発明の様々な実施形態および局面のそれぞれは、実験的裏づけが下記の実施例に見出される。
【０２３３】
実施例
次に、下記の実施例が参照されるが、下記の実施例は、上記の説明とともに、本発明を非限定的な様式で例示する。
【０２３４】
一般に、本明細書中で使用される命名法および本発明において用いられる実験室手順には、分子的技術、生化学的技術、微生物学的技術および組換えＤＮＡ技術が含まれる。そのような技術は文献に詳細に説明されている。例えば、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」、Ｓａｍｂｒｏｏｋ他（１９８９）；「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」、第Ｉ巻〜第ＩＩＩ巻、Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｒ．Ｍ．編（１９９４）；Ａｕｓｕｂｅｌ他、「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ、Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ、Ｍａｒｙｌａｎｄ（１９８９）；Ｐｅｒｂａｌ、「Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ」、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８８）；Ｗａｔｓｏｎ他、「Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ」、Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｂｏｏｋｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ｂｉｒｒｅｎ他（編）、「Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  Ｓｅｒｉｅｓ」、第１巻〜第４巻、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９８）；米国特許第４６６６８２８号、同第４６８３２０２号、同第４８０１５３１号、同第５１９２６５９号および同第５２７２０５７号に示されるような方法論；「Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ」、第Ｉ巻〜第ＩＩＩ巻、Ｃｅｌｌｉｓ，Ｊ．Ｅ．編（１９９４）；「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」、第Ｉ巻〜第ＩＩＩ巻、Ｃｏｌｉｇａｎ  Ｊ．Ｅ．編（１９９４）；Ｓｔｉｔｅｓ他（編）、「Ｂａｓｉｃ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」（第８版）、Ａｐｐｌｅｔｏｎ＆Ｌａｎｇｅ、Ｎｏｒｗａｌｋ、ＣＴ（１９９４）；ＭｉｓｈｅｌｌおよびＳｈｉｉｇｉ（編）、「Ｓｅｌｅｃｔｅｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８０）を参照のこと。様々な利用可能な免疫アッセイが特許および科学文献に広範囲に記載されている：例えば、米国特許第３７９１９３２号、同第３８３９１５３号、同第３８５０７５２号、同第３８５０５７８号、同第３８５３９８７号、同第３８６７５１７号、同第３８７９２６２号、同第３９０１６５４号、同第３９３５０７４号、同第３９８４５３３号、同第３９９６３４５号、同第４０３４０７４号、同第４０９８８７６号、同第４８７９２１９号、同第５０１１７７１号および同第５２８１５２１号；「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」、Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．編（１９８４）；「Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ」、Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．およびＨｉｇｇｉｎｓ  Ｓ．Ｊ．編（１９８５）；「Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ」、Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．およびＨｉｇｇｉｎｓ  Ｓ．Ｊ．編（１９８４）；「Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ」、Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｒ．Ｉ．編（１９８６）；「Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ」、ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ（１９８６）；「Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ」、Ｐｅｒｂａｌ，Ｂ．（１９８４）、および「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ」、第１巻〜第３１７巻、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；「ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  Ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ（１９９０）；Ｍａｒｓｈａｋ他、「Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｃｏｕｒｓｅ  Ｍａｎｕａｌ」、ＣＳＨＬ  Ｐｒｅｓｓ（１９９６）。これらはすべて、全体が本明細書中に示されているかのように参考として組み込まれる。他の一般的な参考文献がこの文書中に示されている。参考文献中の手順は、この分野では十分に知られていると考えられ、そして読者の便宜のために提供される。参考文献に含まれる情報はすべて、参考として本明細書中に組み込まれる。
【０２３５】
一般的な材料および方法
植物材料：嚢状葉植物（ネペンテス・カシアナ（Ｎｅｐｅｎｔｈｅｓ  ｋａｓｓｉａｎａ））を、肥料を与えることなく温室（２５℃）で生育させ、植物には２回蒸留水が与えられた。トラップ消化液を、無菌性を保つために、滅菌シリンジによって閉じたトラップから取り出し、小分けにして−７０℃で保存した。トラップ組織および葉組織が使用される場合、トラップ組織および葉組織は下記のように調製された：葉組織またはトラップ組織を、１ｇの新鮮重量あたり２ｍｌまたは５ｍｌの抽出緩衝液（０．１２５Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）および２０％グリセロール）においてそれぞれホモジネートした。ホモジネート物をエッペンドルフミニ遠心分離器において１４，０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清（葉組織またはトラップ組織の抽出物）をＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析およびキチナーゼ活性ゲル分析のために使用した。
【０２３６】
キチナーゼ活性ゲル：キチナーゼ活性は、葉またはトラップ組織または無菌トラップ消化液から調製された抽出物を未変性１２％アクリルアミドゲルで分離し、泳動後、基質としてキチン−グリコール（０．０１％ｗ／ｖ）を含有するさらなるアクリルアミドゲルと重ね、３７℃で８時間インキュベーションすることによって調べられた。キチナーゼ活性は、０．０１％（ｗ／ｖ）カルコフルオルホワイトＭ２Ｒで５分間染色した後、ゲル上の暗いスポットとしてＵＶ光（２６０ｎｍ）のもとで可視化された。
【０２３７】
ウエスタン分析。ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、１２％または１５％の分離ゲルおよび５％の濃縮ゲルを用いて行われた。タンパク質をＰＶＤＦメンブラン（Ｇｅｌｍａｎ）に転写し、そしてキチナーゼを、セラチア・マルセセンスのキチナーゼ（ＣｈｉＡＩＩ）に対するウサギポリクローナル抗体（Ｊｏｎｅｓ他、１９８６）または（植物における一過性発現の場合には）ラット抗ＨＡ抗体［ラットモノクローナル抗体（クローン３Ｆ１０）、Ｒｏｃｈ、カタログ番号１８６７４２３］のいずれかを使用して検出し、アルカリホスファターゼとコンジュゲート化されているアフィニティー精製されたヤギ抗ウサギＩｇＧまたは抗ラットＩｇＧ（アッフィニピュア・ヤギ抗ラット、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈカタログ番号１１２−０５５−００３）によってそれぞれ可視化した。
【０２３８】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの再生：メルカプトエタノールの存在下または非存在下での通常のＳＤＳ−ＰＡＧＥの後、ゲルを、４０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．８）、１％カゼイン、２ｍＭ  ＥＤＴＡにおいて２０分間インキュベーションすることによって再生した。その後、ゲルを、０．０１％（ｗ／ｖ）グリコールキチンを含有する７．５％アクリルアミドのキチナーゼ活性ゲルと重ね、そしてキチナーゼ活性を上記に記載されるようにモニターした。
【０２３９】
エキソキチナーゼ活性およびキトビオシダーゼ活性：消化液ならびにトラップ組織抽出物および葉組織抽出物を、基質としてｐ−ニトロフェニル  Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミニド（二量体、Ｓｉｇｍａ）またはｐ−ニトロフェニル−Ｄ−Ｎ，Ｎ−ジアセチルキトビオース（三量体、Ｓｉｇｍａ）を使用してエキソキチナーゼ活性およびキチン１，４−キトビオシダーゼ活性についてそれぞれ試験した。キチナーゼ活性は、ｐＨ６．５における上記基質の加水分解から生じるニトロフェノールの吸光度を測定することによって４１０ｎｍにおいて分光光度法により検出された。
【０２４０】
ＦＰＬＣ分析：トラップ消化液をセファデックスＧ−２５でのゲルろ過により脱塩し、ｐＨ１０にした。その後、トラップ消化液をＭｏｎｏＱアニオン交換カラムに負荷し、結合したキチナーゼを、ＮａＣｌの濃度を増大させながらカラムから溶出した。各画分（１ｍｌ）におけるタンパク質濃度を２８０ｎｍにおける吸光度に従って評価した。
【０２４１】
キチン注入によるキチナーゼ活性の誘導：コロイド状キチン（１ｍｇ／１００μｌ）（ｐＨ５．０）を、閉じたトラップに滅菌シリンジで注入した。消化液の一部を、注入後、様々な間隔で、閉じたトラップから集めた。
【０２４２】
ゲノムＤＮＡの単離：葉組織（１ｇ）を、１容量のＤＮＡ抽出緩衝液（０．３５Ｍソルビトール；０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５；５ｍＭ  ＥＤＴＡおよび０．０２Ｍ重亜硫酸Ｎａ）、１容量の核酸溶解緩衝液（０．２Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５；５０ｍＭ  ＥＤＴＡ；２Ｍ  ＮａＣｌおよび２％ＣＴＡＢ）および０．４容量の５％サルコシルからなる緩衝液Ａの５ｍｌにおいてホモジネートした。ホモジネート物を６５℃で２０分間インキュベーションし、その後、１容量のクロロホルム：イソアミルアルコール（２４：１）で２回抽出した。３容量の６Ｎ  ＮａＩを水相に加え、そしてゲノムＤＮＡを、ハイピュアプラスミド単離キット（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）のハイピュアフィルターチューブを使用することによって清浄化および単離した。
【０２４３】
総ＲＮＡの単離：総ＲＮＡを、特別な熱ホウ酸塩／プロテイナーゼＫ法（Ｓｃｈｕｌｚｅ他、１９９９）によって嚢状葉（トラップ）の下側部分から単離した。
【０２４４】
ｍＲＮＡの単離：ポリアデニル化ｍＲＮＡを、磁気ＤｙｎａＢｅａｄｓ（Ｄｙｎａｌ、ノルウェー）にコンジュゲート化されているオリゴｄＴを使用することによって総ＲＮＡから単離した。その後、総ｃＤＮＡを、ＭＭ−ＬＶ逆転写酵素（ＲＴ）およびプライマーとしてのオリゴ（ｄＴ）１２〜１８を使用することによって合成した。
【０２４５】
縮重した逆ＰＣＲプライマーおよび遺伝子特異的プライマー：グループ１塩基性キチナーゼおよびグループ２塩基性キチナーゼおよび酸性キチナーゼに対してそれぞれ特異的に設計された３組の縮重プライマー（＃１〜＃３）を、それぞれのキチナーゼ遺伝子の部分配列を最初にＰＣＲ増幅するために使用した（表Ｉ）。
【０２４６】
【表１】
2004526431.tif 000002
【０２４７】
プライマー＃４〜＃６は、グループ２に属する塩基性キチナーゼの遺伝子に対して使用される逆ＰＣＲ法のために使用された（表ＩＩ）。
【０２４８】
【表２】
2004526431.tif 000003
【０２４９】
プライマー＃７〜＃９は、トラップ分泌細胞に存在する転写された遺伝子を同定するための遺伝子特異的プライマーとして使用され、プライマー＃１０〜＃１１（遺伝子特異的）は、全長のｃＤＮＡを単離するために使用された（表ＩＩＩ）。
【０２５０】
【表３】
2004526431.tif 000004
【０２５１】
プライマー１２〜１３は、ＨＡコード配列を有するプラスミドへの単離遺伝子のクローニングを可能にする、直接ＰＣＲ法による遺伝子の単離のために使用される特別に設計されたプライマーであった（表ＩＶ）。
【０２５２】
【表４】
2004526431.tif 000005
【０２５３】
殺菌類活性：インビトロ感受性試験は、臨床研究室標準委員会（ＮＣＣＬＳ）によって勧告される培養液ミクロ希釈法ＮＣＣＬＳ  Ｍ２７−Ｐ（Ｅｓｐｉｎｅｌ−Ｉｎｇｒｏｆｆ＆Ｐｆａｌｌｅｒ、１９９５；ＡＳＭ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ）からの改変であった。ミクロ希釈技術には、試験サンプルの連続希釈物を含有する増殖培地において酵母を培養するために９６ウエルマイクロタイタープレートの使用が含まれた。増殖の速度論が、５３０ｎｍにおける吸光度を測定することによってモニターされた。Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ（単離体ＣＢＳ５６２、これはｔｈｅ  Ｃｅｎｔｒａｌ  Ｂｕｒｅａｕ  ｏｆ  Ｓｃｈｉｍｍｅｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（Ｄｅｌｆｔ、オランダ）から最初に分譲された）が酵母試験株として使用された。アンフォテリシンＢ（ＡＭＢ）（Ｓｑｕｉｂ）がコントロールの抗菌類薬（抗真菌薬）として使用された。Ｃａｎｄｉｄａ  ｓｐｐ．に対する最少阻害濃度（ＭＩＣ）は＜１〜１μｇ／ｍｌの範囲内である（Ｅｓｐｉｎｅｌ−Ｉｎｇｒｏｆｆ他、１９９７、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３５：１３９）。最終的な抗菌類試験条件は下記の通りであった：マイクロタイタープレート（Ｎｕｎｃ）の平底９６ウエルのそれぞれには、試験媒体（１％グルコースおよび０．１５％アスパラギンが補充された酵母窒素基礎培地）に溶解された０．１ｍｌの薬物（植物材料またはＡＭＢ）と、０．１ｍｌの酵母培養液（０．５〜２．５×１０３細胞／ウエル）とが含有された。最初の１０ウエルは、薬物の２倍（２×）連続希釈物と、等しい初期数の酵母細胞とを含有した。ウエル１１には、菌類コントロール（薬物なし）が含有され、ウエル１２は培地コントロール（薬物なし、菌類なし）であった。２８℃で４８時間のインキュベーションを行った後、５３０ｎｍにおける吸光度がマイクロタイターリーダーで測定された。最少阻害濃度（ＭＩＣ）値を、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓの増殖を完全に阻害した薬物の最少濃度として定義した。酵母の致死性（最少殺菌類濃度）のさらなる確認が、薬物処理が終わったとき１００μｌの細胞を薬物非含有固形培地（サブロー）に再置床し、２８℃で４８時間のインキュベーションの後のコロニー数を計数することによって行われた。
【０２５４】
キチナーゼ活性アッセイ（光学的吸光度）：アッセイは、ＴｒｏｎｓｍｏおよびＨａｒｍａｎ（１９９３）（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２０８：７４〜７９）の手法に従って行われた。試験サンプルをマイクロタイタープレートの平底ウエルに加えた。５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．７）に溶解された基質溶液の量を増大させながら加えた（０〜１５μｇ）。プレートを５０℃で３０分間インキュベーションした。反応を、基質の酵素的切断により形成されるｐ−ニトロフェノールの発色を高めるためにも役立つ５０μｌの０．４Ｍ  Ｎａ２ＣＯ３を各ウエルに加えることによって停止させた。４０５ｎｍにおける吸光度を、マイクロプレートリーダーを用いて測定した。
【０２５５】
銀染色：Ｂｌｕｍ  Ｈ他（１９８７）（Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ、８：９３〜９９）の方法に従って行った。
【０２５６】
質量分析法：Ｓｈｅｖｃｈｅｎｋｏ  Ａ他（１９９６）（Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．６８：８５０〜８５８）の方法に従って行われる。
【０２５７】
実施例１
ウツボカズラ（Ｎｅｐｅｎｔｈｅｓ）の種々の組織に由来する新規なキチナーゼ
食虫植物ネペンテス・カシアナ（Ｎｅｐｅｎｔｈｅｓ  ｋａｓｓｉａｎａ）は、獲物の誘因および捕捉の受動的な方法を使用する嚢状葉植物である（ＯｗｅｎおよびＬｅｎｎｏｎ、１９９９）。トラップは、向軸表面がらせん状になって融合して嚢状管の内壁を形成する変形した上面杯葉である。昆虫が嚢状葉の急峻な壁を滑って落ちたとき、昆虫は、分泌細胞が多い嚢状葉の下部の腺領域から分泌された様々なタンパク質分解酵素を含有することが報告されている液体（消化液）の底に捕捉される（ＯｗｅｎおよびＬｅｎｎｏｎ、１９９９）。ネペンテス・カシアナの種々の組織に存在するキチナーゼを特徴づけるために、無菌の嚢状葉液（消化液）および葉組織および嚢状葉（トラップ）組織に由来するキチナーゼの移動度を未変性ポリアクリルアミドゲルで調べた。電気泳動後、ゲルを、キチン−グリコール（０．０１％ｗ／ｖ）を基質として含有するさらなるキチナーゼ活性ゲルと重ねた。キチナーゼ活性を、３７℃で一晩インキュベーションした後、キチン分解活性が存在したゲル上の暗いスポットとして可視化した。濃縮された葉抽出物、開いたトラップまたは閉じたトラップに由来するトラップ組織抽出物（それぞれ１５０μｌ）、そしてトラップ消化液（７５μｌ）におけるキチナーゼ活性を示す典型的なキチナーゼ活性ゲルが図１に示される。驚くべきことに、キチナーゼ活性が３つのすべての組織の抽出物において明瞭に明らかにされる。さらに、消化液酵素は、その相対的移動度が、葉組織およびトラップ組織の両方に存在する酵素とは明らかに異なっている。
【０２５８】
実施例２
ウツボカズラの新規なトラップ消化液キチナーゼは知られているキチナーゼの抗原性エピトープを有しない
様々な組織から抽出されたウツボカズラのキチナーゼの抗原性特性の差異を解明するために、ウエスタンブロット分析を、セラチア・マルセセンスのキチナーゼ（ＣｈｉＡＩＩ）に対するポリクローナル抗体を用いて行い、プローブした。図２Ａには、トラップ組織（Ｃ）または葉組織（Ｌ）のいずれかの抽出物（５０μｌ）およびトラップ消化液（Ｓ）（４０μｌ）の濃縮物が負荷された１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルのウエスタンブロットが示される。抗セラチアＣｈｉＡＩＩ抗体は、（下側の矢印により示される）トラップ組織および葉組織の両方に由来するキチナーゼを認識したが、消化液キチナーゼを認識しなかった。図２Ｂのゲルにより、トラップ消化液キチナーゼと、葉（Ｌ）組織またはトラップ組織のキチナーゼとの間には抗原的同一性がないことが確認される。これにより、トラップ消化液サンプル（Ｓ）のタンパク質濃縮が２２倍に増大されたとき（これは８７５μｌの元のトラップ消化液容量を表す）でさえ、免疫認識がないことが明らかにされる。
【０２５９】
実施例３
ウツボカズラのキチナーゼはエンドキチナーゼである
エンドキチナーゼはキチンをポリマー内において加水分解的に分解する。逆に、エキソキチナーゼの消化は末端における分解に限定される。ウツボカズラのキチナーゼのエンドキチナーゼ活性対エキソキチナーゼ活性の評価を下記のように行った：消化液ならびにトラップ組織抽出液および葉組織抽出物を、基質のｐ−ニトロフェニル  Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミニド（二量体）またはｐ−ニトロフェニル−Ｄ−Ｎ，Ｎ−ジアセチルキトビオース（三量体）を使用してエキソキチナーゼ活性およびキチン１，４−キトビオシダーゼ活性についてそれぞれ試験した。キチナーゼ活性は、ｐＨ６．５における上記基質の加水分解から生じるニトロフェノールの吸光度を測定することによって４１０ｎｍにおいて分光光度法により検出された。ウツボカズラのキチナーゼはどれもエキソキチナーゼ活性またはキトビオシダーゼ活性を示さなかったが、セラチアのＣｈｉＡＩＩキチナーゼはキトビオシダーゼ活性を示した。消化液およびトラップおよび葉のウツボカズラキチナーゼはすべてグリコール−キチンを加水分解する（図１）。このことは、３つのキチナーゼはすべてがエンドキチナーゼであることを示している。
【０２６０】
実施例４
ウツボカズラの消化液およびトラップ組織および葉組織の新規なキチナーゼ活性は部分的変性に対して抵抗性である
トラップ消化液ならびにトラップ組織および葉組織の抽出物（煮沸なし）を２−メルカプトエタノールの非存在下で１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥに負荷した。電気泳動後、ゲルを、４０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．８）、１％カゼイン、２ｍＭ  ＥＤＴＡにおいてインキュベーションすることによって再生し、その後、０．０１％（ｗ／ｖ）グリコールキチンを含有するキチナーゼ活性ゲルと重ねた。図３により、電気泳動段階におけるＳＤＳの存在によって引き起こされる半変性は、ＳＤＳが分離後に洗い流されたとき、消化液（Ｓ）またはトラップ組織（Ｃ）または葉組織（Ｌ）のキチナーゼ活性を阻害しなかったことが示される。非変性の未変性ゲル（図１）において以前に示されたように、半変性ゲルにおける消化液キチナーゼの移動速度は、葉組織およびトラップ組織のキチナーゼの移動速度とは異なる。
【０２６１】
実施例５
ウツボカズラの新規なトラップ消化液キチナーゼ活性はＳＤＳおよび２−メルカプトエタノールによって変性されるが、葉の酵素活性は変性されない
ウツボカズラのキチナーゼをさらに区別するために、非煮沸および煮沸（５分）された消化液および葉抽出物のサンプルをＳＤＳおよび２−メルカプトエタノールの両方の存在下において１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離した。その後、ゲルを実施例４に記載されるように再生し、キチナーゼ活性ゲルを重ねた。図４Ａおよび図４Ｂは、ＳＤＳに加えて、還元剤２−メルカプトエタノールの添加は消化液キチナーゼを完全に不活性化しているが、葉のキチナーゼ活性には影響を及ぼしていないことを明瞭に明らかにしている。対照的に、セラチアのキチナーゼ活性は煮沸サンプルでのみ失われた。従って、消化液の新規なキチナーゼは葉のキチナーゼと明らかに異なる。さらに、トラップ消化液のキチナーゼ活性に対する無傷のＳ−Ｓ結合の重要性は、トラップ消化液キチナーゼが、鎖間ジスルフィド結合によって一緒になっている二量体であることを示している（これはまた、図１および図３に示されるゲル上におけるその相対的移動度によっても明らかにされる）。今日までのところ、同定された植物キチナーゼの非常に活性な形態は約２５〜４０ｋＤａの単量体である。従って、二量体キチナーゼが同定されたことは極めて希であり、予想外のことである。
【０２６２】
実施例６
ウツボカズラの新規なトラップ消化液キチナーゼは大きい比活性を有する
消化液キチナーゼはＳＤＳ−ＰＡＧＥのクーマシー染色によって検出することができない：キチナーゼ活性ゲル（図１）に負荷されたトラップ消化液サンプル（７５μｌ）におけるタンパク質の量はブラッドフォードアッセイの検出レベル未満であったので、６００μｌのトラップ消化液を濃縮し、そしてサイズマーカーおよび過剰発現させたセラチアＣｈｉＡＩＩ（５８ｋＤａのＭｒ）を含有する大腸菌タンパク質抽出物の２０μｌ（４μｇ）とともに１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで分離した。タンパク質バンドをクーマシーブリリアントブルーによる染色によって可視化した。活性ゲルよりも８倍多いトラップ消化液がクーマシー染色ゲルには加えられた（図１）が、タンパク質バンドを検出することができなかった（図５、レーンＳ）。従って、消化液のキチナーゼは非常に大きい比活性を有する。
【０２６３】
ウツボカズラの新規なトラップ消化液キチナーゼのＦＰＬＣによる濃縮／精製：図１および図５に示される結果により、トラップ消化液キチナーゼは非常に大きい比活性を有する。このトラップ消化液の酵素を精製および濃縮するために、ＦＰＬＣ分離を、ＭｏｎｏＱアニオン交換カラムを使用して行った。消化液（４ｍｌ）を、セファデックスＧ−２５でのゲルろ過によって最初に脱塩し、そしてｐＨ１０にした。その後、消化液をアニオン交換カラムに加え、結合したキチナーゼを、ＮａＣｌの濃度を増大させながらカラムを洗浄することによって溶出した。その後、それぞれの画分（１ｍｌ）を活性ゲルでキチナーゼ活性について試験した。図６には、ＦＰＬＣ分離の典型的な一例が示される。各画分におけるタンパク質濃度は２８０ｎｍにおける吸光度によって評価された。驚くべきことに、キチナーゼ活性が、ＯＤ２８０含有画分の大部分の溶出に先立って、（垂直な矢印により示される）画分７〜画分１４において検出された。このことは、消化液に由来する主要な溶出ＦＰＬＣタンパク質ピークはキチナーゼでないことを示唆する。キチナーゼ活性が、０．２ＭのＮａＣｌで溶出された画分において既に検出され得るという事実により、このタンパク質は比較的大きいＰＩ値を有することが示唆される。ＦＰＬＣ分析の分解能を改善するために、（別のＦＰＬＣ分離からの）溶出画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび銀染色（これはクーマシー染色よりもはるかに高感度である）によって分析した。図７は、キチナーゼ含有画分（レーン９〜１７）において検出された２つの主要なタンパク質バンドでさえも、キチナーゼ活性と相関しないことを明瞭に示している。キチナーゼ含有画分（レーン９〜１７）において検出される２つの主要なタンパク質バンドが画分のすべてにおいて同様に検出されるからである。このことにより、ウツボカズラの新規な消化液キチナーゼが非常に大きい比活性を有することがさらに確認される。
【０２６４】
実施例７
キチンはウツボカズラの新規なトラップ消化キチナーゼを誘導する
誘導されたキチナーゼ活性：図６および図７は、正常な植物生育条件のもとでは、産生され、閉じたトラップ液に分泌されるキチナーゼタンパク質の量が非常に低いことを明瞭に示している。このことが、キチナーゼ活性を示すタンパク質の分離を複雑にしている。従って、キチナーゼの量を増大させる試みが、閉じたトラップにキチンを注入することによって行われた。約１ｍｇのコロイド状キチン（ｐＨ５．０）を閉じたトラップに注入した。キチナーゼ活性を、注入前、そして注入の２０時間後および５日後にトラップ消化液において測定した。驚くべきことに、注入されたキチンにより、未変性ゲルにおいて非誘導型のキチナーゼとは異なって移動する少なくとも３つの新しいキチナーゼの出現が誘導された（図８、レーン４および５）。
【０２６５】
実施例８
キチンにより誘導されたウツボカズラの新規な消化液キチナーゼ活性に対応するタンパク質の同定
キチンの注入前ならびに注入後の種々の時間における消化液のサンプルを１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、銀染色により可視化した。キチンの注入は、少なくとも４つの新しいバンドの出現を誘導し、誘導を受けないバンドの２つを強めた（図９、レーン２、３および４）。これらは構成的および誘導性の両方の消化液キチナーゼを表している。本明細書中下記に報告される（非誘導条件ならびに誘導条件に由来する）いくつかのキチナーゼのｃＤＮＡヌクレオチド配列を単離することによって、そのアミノ酸配列およびそれらのそれぞれのＭＷを予測することができる。トラップ消化液の５つの特徴的なタンパク質のバンドをＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルから切り出し、質量分析法による配列決定のために処理した。
【０２６６】
実施例９
トラップ消化液の抗菌類作用
キチナーゼは、キチンを含有する菌類の細胞壁を加水分解することによって植物の防御応答において主要な役割を果たすことが知られている。この加水分解活性により、菌類の成長が遅くなり、そして病原体の植物組織内への侵入が遅らされるか、または回避される。ウツボカズラのトラップ消化液の抗菌類活性を３つの異なるインビトロバイオアッセイによって調べた。
【０２６７】
キチンにより誘導されるウツボカズラの新規なトラップ消化液キチナーゼはヒト病原体カンジダ・アルビカンスのインビトロ増殖を阻害する：重要なヒト病原体Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓに対するウツボカズラの新規なトラップ消化液キチナーゼの抗菌類作用を測定するために、通常のトラップおよびキチン誘導されたトラップに由来するネペンテス・カシアナの無菌のトラップ消化液を集め、濃縮した。比較のために、３つの他の食虫植物（ハエトリソウ、モウセンゴケおよびヘイシソウ）の葉抽出物をプロテアーゼ阻害剤の存在下で調製した。これらの異なる抽出物のサンプルの抗菌類的な致死／阻害活性を、方法の節に詳しく記載されるように、カンジダ・アルビカンス増殖アッセイを使用してインビトロで評価した。それぞれのサンプルの最少阻害濃度（ＭＩＣ）として表される結果が表Ｖに示される。
【０２６８】
【表５】
2004526431.tif 000006
【０２６９】
これらの結果は、通常のトラップ消化液は効果がないが、キチンにより誘導されたトラップ消化液は、カンジダ・アルビカンスの増殖を阻害することにおいて（サンプルの１／８希釈で）非常に効率的であったことを示している。注入されたキチンがアッセイサンプル中に存在するとき、ＭＩＣは増大した。このことは、キチナーゼが、実際に、抗菌類活性において非常に重要な役割を果たしていることを示している。そのうえ、キチンにより誘導された消化液に対する最少殺菌類濃度（ＭＦＣ）が測定されたとき、最少殺菌類濃度が、サンプルを１／４に希釈したときにおいてであることが見出された（図１０ａ）。このことは、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓの甚だしい分解がその濃度で生じていることを示す。さらに、市販のセラチア・マルセセンスのキチナーゼは阻害作用を全く有しておらず、一方、３つのさらなる食虫植物の葉抽出物はすべて、カンジダ・アルビカンスの増殖を阻害することにおいて非常に強力であった（表Ｖ、図２４もまた参照のこと）。
【０２７０】
実施例１０
キチンにより誘導されたウツボカズラの新規なトラップ消化液キチナーゼはセプトリア・トリチシ（Ｓｅｐｔｏｒｉａ  ｔｒｉｔｉｃｉ）の増殖を阻害する
植物病原体セプトリア・トリチシに対するキチン誘導された消化液の作用を、方法に詳しく記載されるように、キチンにより誘導されたウツボカズラのトラップ消化液の希釈度を増大させながら分生子を培養し、ＯＤ２８０を測定することによって測定した。キチンにより誘導された消化液は、１／２の希釈度において、セプトリア・トリチシの増殖を著しく阻害した（図１０ｂ）。上記のＣ．ａｌｂｉｃａｎｓアッセイの場合のように、トラップ消化液の濃度が高くなると（非希釈）、作用は殺菌類的であった（図１０ｂ）。
【０２７１】
実施例１１
ウツボカズラの新規なトラップ消化液キチナーゼはリゾクトニア・ソラニ（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ  ｓｏｌａｎｉ）およびアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｐｐ．）の菌糸の発達を阻害する
一般的な植物病原体のＲ．ｓｏｌａｎｉおよびアスペルギルスにおける菌糸の増殖に対するウツボカズラのトラップ消化液の抗菌類作用を、リゾクトニアまたはアスペルギルスのいずれかの対数期培養物を含有する平板に５倍濃縮されたトラップ消化液の２０μｌの液滴を加えることによって見積もった。図１０ｃ（矢印参照）は、トラップ消化液キチナーゼにより、リゾクトニア・ソラニおよびアスペルギルスの菌糸の発達が阻害されることを示している。従って、ウツボカズラの新規なトラップ消化キチナーゼは、試験された菌類の種のすべてにおいて著しい増殖阻害活性および殺菌類活性を示した。
【０２７２】
実施例１２
縮重プライマーを使用するＰＣＲによるウツボカズラキチナーゼの部分ゲノム配列の単離
ＧｅｎｅＢａｎｋ（ＮＣＢＩ）における本データにより、植物キチナーゼが、そのアミノ酸配列に基づいて、塩基性キチナーゼ（グループ１）、塩基性キチナーゼ（グループ２）および酸性キチナーゼ（グループ３）の３つのタイプに分類される。本発明の新規なキチナーゼに対する遺伝子を単離するために、１組の縮重プライマー（方法における表Ｉを参照のこと）をそれぞれのグループについて設計し、そして葉の総ＤＮＡをＰＣＲスクリーニングのためのテンプレートとして使用した。３つの部分キチナーゼ遺伝子が単離された。これらのＤＮＡフラグメントのうちの２つ（８９５ｂｐおよび１．１ｋｂ）がクローン化され、配列決定された。両者は、グループ２の塩基性キチナーゼの遺伝子に対する相同性を示した。一方、３番目のフラグメント（５３６ｂｐ）は酸性キチナーゼに対する相同性を示した。ウツボカズラの新規なトラップ消化液キチナーゼの本発明者らの生化学的特徴づけ（大きいキチナーゼ比活性および大きいＰＩ値）は、これがクラスＩ塩基性キチナーゼに属することを示唆するので、塩基性キチナーゼのグループに属するゲノム配列およびｃＤＮＡ配列を単離した。
【０２７３】
実施例１３
ウツボカズラの２つの新規な塩基性キチナーゼ遺伝子の単離および完全なヌクレオチド配列
単離された部分配列に基づいて、１組のプライマー（表ＩＩ）が、塩基性キチナーゼ遺伝子の２つのタイプの残りを逆ＰＣＲ法によってさらに単離するために、それぞれの遺伝子について合成された。ＰＣＲ反応を、完全な遺伝子が単離されるまで新しい組のインバースプライマー（表ＩＩ）を用いて繰り返し、そしてそれらの配列を確認した。
【０２７４】
【表６】
2004526431.tif 000007
【０２７５】
ウツボカズラキチナーゼＩ遺伝子の配列決定および増幅により、キチナーゼＩ遺伝子の多数のコピーが明らかにされる：図１１には、逆ＰＣＲ法によって単離され、Ｎｋｃｈｉｔ１ｂと名付けられた塩基性キチナーゼＩ遺伝子の完全な配列が示される（配列番号１）。推定される翻訳開始コドンから停止コドンまでの遺伝子の全長は１５７２ｂｐである。遺伝子バンク内の他のキチナーゼとの配列アラインメントおよびコンセンサスなスプライシング部位により、サイズが２４７ｂｐおよび２６９ｂｐである２つの推定されるイントロンの存在が示唆された。スプライシング部位は、キチンにより誘導されたトラップに由来するｍＲＮＡを逆転写のためのテンプレートとして使用して遺伝子の全長ｃＤＮＡ配列を増幅するために設計された５’および３’の遺伝子特異的プライマー（方法における表ＩＶを参照のこと）を使用するＲＴ−ＰＣＲ法によって後で確認された。
【０２７６】
キチナーゼＩをコードする別の遺伝子が、テンプレートとしてのゲノムＤＮＡおよび特異的に設計されたプライマー（表ＩＶ）を使用する直接ＰＣＲ法によって単離され、これはＮｋｃｈｉｔ１ｂ−ｇＩと名付けられた（配列番号４８）。これらの２つの異なるキチナーゼＩ遺伝子（Ｎｋｃｈｉｔ１ｂおよびＮｋｃｈｉｔ１ｂ−ｇＩ）は同一のエキソンを有するが、異なるイントロンを有する。Ｎｋｃｈｉｔ１ｂ−ｇＩが植物の形質転換のために使用された。
【０２７７】
ウツボカズラキチナーゼ２遺伝子の配列決定および増幅により、アミノ酸置換を有するキチナーゼ２遺伝子の多数のコピーが明らかにされる：図１２ｂには、逆ＰＣＲ法によって単離され、Ｎｋｃｈｉｔ２ｂと名付けられた塩基性キチナーゼ２遺伝子の完全な配列が示される（配列番号２）。推定される翻訳開始コドンから停止コドンまでの遺伝子の全長は１６７３ｂｐであり、そして遺伝子バンク内の他のキチナーゼとの配列アラインメントおよびコンセンサスなスプライシング部位により、２つの推定されるイントロン（２４８ｂｐおよび４６８ｂｐ）の存在が示唆されたが、これらは（Ｎｋｃｈｉｔ１ｂについて上記に詳しく記載されるのと同様に）それぞれのｃＤＮＡ配列に基づいて後に確認された。
【０２７８】
テンプレートとしてのゲノムＤＮＡおよび特異的に設計されたプライマー（表Ｖ）を使用する直接ＰＣＲ法により、４つのアミノ酸のコドンがＮｋｃｈｉｔ２ｂのエキソンとは異なるエキソンを有するキチナーゼ２をコードするさらなる遺伝子が明らかにされ、これはＮｋｃｈｉｔ２ｂ−ｇＩＩと名付けられた。どの遺伝子が発現しているかを明らかにするために、ポリアデニル化ｍＲＮＡを、トラップの分泌細胞から、材料および方法に記載されるように単離した。ＲＴ−ＰＣＲにより、キチナーゼ２タイプの酵素をコードする、Ｎｋｃｈｉｔ２ｂ−ｃＩＩおよびＮｋｃｈｉｔ２ｂ−ｃＩＩＩと名付けられた２つのｃＤＮＡタイプを単離することができた（表ＩＩＩ）。Ｎｋｃｈｉｔ２ｂ−ｃＩＩのｃＤＮＡはゲノム配列Ｎｋｃｈｉｔ２ｂ−ｇＩＩに対応し、一方、Ｎｋｃｈｉｔ２ｂ−ｃＩＩＩによってコードされるキチナーゼ２は６個のアミノ酸がＮｋｃｈｉｔ２ｂ−ｃＩＩのキチナーゼ２と異なる。さらに別のタイプのキチナーゼ２をコードする遺伝子がコスミドライブラリーから単離されたが、対応するｃＤＮＡが見出されなかったので、この２つの発現した遺伝子のみがさらなる研究のために使用された。図１２ａには、これらのキチナーゼ２ｃＤＮＡの２つの推定されるアミノ酸配列のアラインメントが示される。このようにして、驚くべきことに、ウツボカズラの新規なキチナーゼ遺伝子は多重遺伝子族に属することが明らかにされた。
【０２７９】
実施例１４
ネペンテス・カシアナの新規なキチナーゼにおけるアミノ酸配列の非相同性およびその機能的意味
ウツボカズラの２つのキチナーゼ遺伝子の推定されるアミノ酸配列は、（ｃＤＮＡ配列に基づいて）、ＮｋＣＨＩＴ１ｂ（配列番号５）およびＮｋＣＨＩＴ２ｂ（配列番号６）と名付けられた。ＮｋＣＨＩＴ１ｂのアミノ酸配列相同性に対するＢＬＡＳＴ検索は、イネ（Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ）（Ｌ３７２８９）キチナーゼに対して最高（６７％）の同一性および７６％の相同性（そしてＤＮＡレベルでは６７％の同一性）を示し、一方、ＮｋＣＨＩＴ２ｂは、ブドウ（Ｖｉｔｉｓ  ｖｉｎｉｆｅｒａ）の塩基性エンドキチナーゼ前駆体（Ｐ５１６１３）に対して７３％の同一性および７８％の相同性（そしてＤＮＡレベルでは７５％の同一性）を示した。図１３には、ＮｋＣＨＩＴ１ｂおよびＮｋＣＨＩＴ２ｂのアミノ酸配列アラインメント（装飾ボックス）が示される。それらは、ＧＣＧのＧＡＰプログラムによって決定されたとき、７５％の類似性および７０％の同一性を有する。
【０２８０】
クラスＩ塩基性キチナーゼは、通常、５個の構造的ドメインから構成される：１）Ｎ末端のシグナルペプチド、２）システインリッチドメイン、３）プロリンリッチのヒンジ領域、４）触媒作用ドメイン、および５）カルボキシ末端の伸長部。図１３に例示されるように、ウツボカズラの両方のキチナーゼは、長さおよびアミノ酸組成が異なるが、シグナルペプチドを有し、そしてシステインリッチドメインおよび触媒作用ドメインを有する。しかし、プロリンリッチのヒンジ領域はＮｋＣＨＩＴ１ｂに存在するだけである。ヒンジ領域の長さは、種々のキチナーゼの間で異なることが知られており、そしてＮｋＣＨＩＴ２ｂの場合のように全く存在しないことがある。カルボキシ末端の伸長部は、疎水性のアミノ酸が多く、液胞を標的化するためのシグナルであることが示唆されている（Ｇｒａｈａｍ、１９９４）。例えば、タバコのキチナーゼの場合、ＮＬＬＶＤＴＭのアミノ酸コンセンサス配列のＣ末端における欠失は、アポプラストへの修飾キチナーゼの分泌をもたらした（ＣｈｒｉｓｐｅｅｌｓおよびＲａｉｋｈｅｌ、１９９２）。ネペンテス・カシアナのこの２つの塩基性キチナーゼのＣ末端部分の比較により、長さが８アミノ酸の疎水性伸長部がＮｋＣＨＩＴ２ｂにだけ存在することが明らかにされた。
【０２８１】
図１４および図１５には、ウツボカズラの２つのキチナーゼのそれぞれと、新規なキチナーゼに対して最大のアミノ酸配列相同性を示すタンパク質データベース由来の単子葉植物キチナーゼ配列および双子葉植物キチナーゼ配列との多配列アラインメントが示される。機能的に重要であることが示唆される保存されたアミノ酸残基（Ｇｒａｈａｍ、１９９４；Ｈａｍｅｌ他、１９９７）が、異なる色によって示される。例えば、８個のシステイン（Ｃ）が、これらの配列のほとんどのキチン結合領域内において同一の位置（黄色の矢印）に存在しており、これらは、立体的に詰まった活性な立体配座へのドメインの正しい折り畳みを可能にするジスルフィド架橋の形成に関与している。活性部位の幾何構造において役割を果たしているトレオニン（Ｔ）およびグルタミン（Ｑ）（赤色の矢印）が、触媒作用のために重要であることが示されているグルタミン酸（Ｅ）およびアスパラギン酸（Ｎ）（緑色の矢印）（Ｇｒａｈａｍ、１９９４；Ｈａｍｅｌ他、１９９７）と同様に、ウツボカズラの両方の新規なキチナーゼにおいてもまたすべて存在する（図１４＆図１５）。しかし、保存されたチロシン（Ｙ）は、触媒作用裂溝において基質と結合することが考えられている（Ｈａｒｔ他、１９９５）が、ＮｋＣＨＩＴ２ｂではフェニルアラニン（Ｆ）（青色の矢印、図１５）に変化している。ＮｋＣＨＩＴ２ｂをＮｋＣＨＩＴ１ｂならびに他のキチナーゼから区別する２つの他の顕著な違いが、アラニンの代わりの、ＮｋＣＨＩＴ２ｂのバリン（茶色の矢印）およびグルタミン酸（黒色の矢印）である（図１５）。従って、ウツボカズラの新規なキチナーゼは、他の種のキチナーゼとのアミノ酸配列相同性を有する領域を有するが、それらは触媒作用裂溝の組成において明らかに特徴的である。
【０２８２】
実施例１５
ＮｋＣＨＩＴ２ｂの三次元モデル化により、触媒作用裂溝における特徴的な構造が確認される
上記の特徴的なアミノ酸配列の考えられる影響を調べるために、（トラップ消化液における構成的なキチナーゼであると考えられる）ＮｋＣＨＩＴ２ｂの三次元構造モデル化（ＳＷＩＳＳ−ＭＯＤＥＬタンパク質モデル化、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｘｐａｓｙ．ｃｈ／ｓｗｉｓｓｍｏｄ／ＳＷＩＳＳ−ＭＯＤＥＬ）を行った。図１６Ａおよび図１６Ｂには、この情報がまとめられている。予測はオオムギ（Ｈｏｒｄｅｕｍ  ｖｕｌｇａｒｅ  Ｌ）種子に由来するエンドキチナーゼの結晶構造に基づいている（Ｓｏｎｇ他、１９９３；ＰＤＢおよびＳｗｉｓｓｐｒｏｔのアクセション番号はそれぞれ１ＣＮＳおよびｐ２３９５１である）。図１６Ａには、オオムギキチナーゼの配列が含まれた、ＮｋＣＨＩＴ２ｂに対して最も近い相同性を示す遺伝子バンク由来の配列とともに、ＮｋＣＨＩＴ２ｂの多配列アラインメントの一部のセグメントが示される。上記の変化したアミノ酸残基に加えて、オオムギキチナーゼにおいて触媒活性に必須であることが示されているＮｋＣＨＩＴ２ｂの２つのグルタミン酸（＃１３４および＃１５６）には印が付けられ、そして同様に、オオムギにおいて基質結合溝に位置するアスパラギン＃１９１にも印が付けられた（Ａｎｄｅｒｓｅｎ他、１９９７）。これらのグルタミン酸（オオムギキチナーゼにおけるＧｌｕ６７およびＧｌｕ８９、これらはＮｋＣＨＩＴ２ｂにおけるＧｌｕ１３４およびＧｌｕ１５６に対応する）のいずれかの変異により、オオムギキチナーゼ活性の実質的な喪失がもたらされる。同様に、アスパラギン（ＮｋＣＨＩＴ２ｂにおけるＡｓｎ１９１に対応するオオムギにおけるＡｓｎ１２４）は重要な機能的役割を果たしていることが示された（Ａｎｄｅｒｓｅｎ他、１９９７）。
【０２８３】
図１６Ａには、同じ分子の左側および右側から見たときのＮｋＣＨＩＴ２ｂのモデルが示される。関連するアミノ酸残基の位置が分子上に印され、そしてそれらはその相対的な位置に従って分子の左側および右側に具体的に示されている。オオムギキチナーゼにおける触媒活性のために極めて重要であることが示されるＧｌｕ１３４およびＧｌｕ１５６ならびにＡｓｎ１９１が触媒作用裂溝に存在することを認めることができる。ＮｋＣＨＩＴ２ｂの疎水性アミノ酸Ｐｈｅ１９０が、オオムギでは重要な機能的役割を有する、触媒作用裂溝においてＡｓｎ１９１の隣に存在する非常に保存された極性チロシンにとって代わっていることを認めることは注目すべきことである。そのうえ、ともに荷電アミノ酸であるＧｌｕ２１１およびＬｙｓ２１２が、オオムギにおける対応する位置での疎水性アミノ酸（アラニン）および極性アミノ酸（トレオニン）にとって代わっている。触媒作用裂溝の近くにおける電荷のそのような変化により、ウツボカズラの新規なキチナーゼに特徴的な触媒活性の変化を説明することができる。
【０２８４】
実施例１６
ウツボカズラの新規なキチナーゼにおける翻訳後修飾：ＮｋＣＨＩＴ１ｂおよびＮｋＣＨＩＴ２ｂにおけるＯ−グリコシル化部位
ウツボカズラキチナーゼと他の植物キチナーゼとをさらに区別するために、ＮｋＣＨＩＴ１ｂおよびＮｋＣＨＩＴ２ｂにおける可能なＯ−グリコシル化部位を予測した。いくつかの植物キチナーゼは糖タンパク質であることが示されている（Ｍａｒｇｉｓ−Ｐｉｎｈｉｅｒｏ他、１９９１；Ｄｅ  Ｊｏｎｇ他、１９９２）が、大多数は糖タンパク質ではない（Ｇｒａｈａｍ、１９９４）。
【０２８５】
予測は、様々な翻訳後修飾を予測するＥｘＰａＳｙ分子サーバー（ＮｅｔＯＧｌｙｃ予測、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＮｅｔＯＧｌｙｃ）を用いて行われた。驚くべきことに、多数のグリコシル化部位が確認された。図１７および図１８には、ＮｋＣＨＩＴ１ｂが９個の可能なグリコシル化部位を有しているが、ＮｋＣＨＩＴ２ｂには１個の可能な部位が予測されるだけであったことが示される（図１４および図１５もまた参照のこと、紫色のドット）。９個の部位（ＮｋＣＨＩＴ１ｂ）はすべてがプロリンリッチのヒンジ領域に集中していた。従って、これらの予想外の翻訳後修飾は、ウツボカズラの新規なキチナーゼの特性および大きい比活性にとって重要であると考えられる。
【０２８６】
実施例１７
ウツボカズラのトラップ液分泌細胞におけるキチナーゼ遺伝子の発現
ウツボカズラのトラップ消化液のキチナーゼは非常に大きいキチナーゼ活性を示す。しかし、トラップ消化液ではタンパク質合成が行われていない。従って、分泌されたキチナーゼの合成を担うトラップ分泌領域（嚢状葉の底部部分）からウツボカズラの新規なキチナーゼのｍＲＮＡを同定および単離することは重要であった。
【０２８７】
Ｎｋｃｈｉｔ２ｂは非誘導のトラップにおいて優先的に発現する：総ＲＮＡを特別な熱ホウ酸塩／プロテイナーゼＫ法（Ｓｃｈｕｌｚｅ他、１９９９）によってトラップの底部部分から単離した。ｍＲＮＡを、磁気ＤｙｎａＢｅａｄｓ（Ｄｙｎａｌ、ノルウェー）にコンジュゲート化されているオリゴｄＴを使用することによって総ＲＮＡから単離し、その後、総ｃＤＮＡを、ＭＭ−ＬＶ逆転写酵素（ＲＴ）およびプライマーとしてのオリゴ（ｄＴ）１２〜１８を使用することによって合成した。これまでに単離された３つの異なる（２つの完全な塩基性および１つの部分的な酸性）ウツボカズラキチナーゼを区別するために、方法の節において記載されるように、それぞれの遺伝子について１組の遺伝子特異的プライマーを合成した（＃７〜＃９、表ＩＶ）。その後、これらのプライマーを使用して、３つの遺伝子のどれが変化した条件のもとでのトラップ分泌細胞において最も活性に転写されているかを明らかにした。
【０２８８】
図１９には、３組のプライマー（Ｎｋｃｈｉｔ１ｂ、Ｎｋｃｈｉｔ２ｂおよび酸性キチナーゼ）、ならびに塩基性キチナーゼの遺伝子を単離するために以前に使用された２組の塩基性キチナーゼ縮重プライマー（＃１〜＃２、表Ｉ）を使用したＲＴ−ＰＣＲの結果が示される。これまでに研究された３つのキチナーゼのうち、Ｎｋｃｈｉｔ２ｂは、トラップ分泌領域のｍＲＮＡに存在する主要なキチナーゼ転写物を構成することを明瞭に認めることができる。Ｎｋｃｈｉｔ１ｂまたは酸性キチナーゼのプライマーを用いた増幅は、非常にかすかなバンドをもたらすだけであった。このことは、トラップ組織におけるそれらの転写物レベルが非常に低いことを示唆する。同じｃＤＮＡ調製物を使用して縮重プライマーを用いたＰＣＲ増幅は明確なバンドをもたらさなかった。ゲノムＤＮＡがテンプレートとしてｃＤＮＡの代わりに使用されたとき、より長い転写産物が検出された（レーン３および６を、それぞれ、レーン１および４と比較すること）。これにより、両方の塩基性遺伝子において、イントロンのサイズと正確に一致するそれぞれのプライマー組の間の増幅された領域にイントロンが存在することが確認された。
【０２８９】
キチンにより誘導されたトラップにおけるウツボカズラの新規なトラップ消化液キチナーゼの選択的発現：上記実施例により、閉じたトラップ内へのキチンの注入は少なくとも３つの新しい消化液キチナーゼの出現を誘導することが明らかにされる。誘導トラップ対非誘導トラップのキチナーゼプロフィルをさらに特徴づけるために、誘導トラップおよび非誘導トラップに由来するｃＤＮＡを用いたＲＴ−ＰＣＲ分析の生成物を増幅のためのテンプレートとして使用した。図２０には、誘導トラップにおけるＮｋｃｈｉｔ１ｂ転写物の量が明かに増大しているが、Ｎｋｃｈｉｔ２ｂの量は著しく変化していないことが示される。さらに、１組の縮重プライマー（グループ２）を使用したとき、さらなるキチナーゼ産物が誘導トラップに現れた。この４３５ｂｐのバンドを単離し、クローン化して、配列決定した。これはＮｋｃｈｉｔ２ｂ−ｃＩＩＩと同一である。従って、Ｎｋｃｈｉｔ２ｂ−ｃＩＩＩの転写物もまたキチン誘導性である。
【０２９０】
実施例１８
遺伝子導入されたタバコ植物および懸濁培養物におけるＮｋｃｈｉｔ１ｂ−ｇＩおよびＮｋｃｈｉｔ２ｂ−ｇＩＩおよびＮｋｃｈｉｔ２ｂ−ｃＩＩＩによってコードされるウツボカズラの新規なキチナーゼの発現
非常に低いレベルのキチナーゼタンパク質がトラップ消化液に存在するだけであることが上記に示されている（実施例６を参照のこと）。このことが、酵素の精製および製造に対する相当の障害となっている。さらに、農業適用および臨床適用における殺生物性化合物の現在の使用には、開発中のＤＮＡ技術およびクローニング技術との適合性が必要である。従って、キチナーゼの遺伝子導入発現法および精製法は非常に注目されている。しかし、キメラなクローン化されたタンパク質の生物学的活性の正確な発現および保持は、多くの場合、広範囲の実験および遺伝子操作を必要とすることが広く知られている。この目的のために、目的とする新規なウツボカズラキチナーゼ遺伝子を、長さが９アミノ酸のＨＡペプチド標識に３’末端で翻訳的に融合した（Ｆｅｒｒａｎｄｏ他、２００１）。ＨＡペプチドにより、著しい量の各キチナーゼの精製、そして各酵素の速度論的性質のその後の測定が可能になる。
【０２９１】
Ｎｋｃｈｉｔ１ｂ−ｇＩおよびＮｋｃｈｉｔ２ｂ−ｇＩＩおよびＮｋｃｈｉｔ２ｂ−ｃＩＩＩを、特異的な高忠実性Ｔａｑポリメラーゼと、ＨＡコード配列を伴う植物発現カセットを有するプラスミドへの遺伝子のさらなるクローニングを可能にする特別に設計されたプライマー（表ＩＶ）とを使用する直接ＰＣＲ法によって合成した。その後、キチナーゼ−ＨＡカセットを、その後のアグロバクテリウム媒介タバコリーフディスク形質転換のためのｐＰＣＶ７０２バイナリーベクター［Ｋｏｎｃｚ他（１９８９）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８６：８４６７〜８４７１］にクローン化した。図２１には、ＨＡエピトープをコードする配列に３’末端で融合され、構成的なＣａＭＶ３５Ｓプロモーターによって駆動されるＮｋｃｈｉｔ１ｂ−ｇＩ遺伝子またはＮｋｃｈｉｔ２ｂ−ｇＩＩ遺伝子またはＮｋｃｈｉｔ２ｂ−ｃＩＩＩ遺伝子のいずれかを、ｎｐｔＩＩ選択マーカーに加えて有する最終的なｐＰＣＶ７０２ベクターが示される。操作されたアグロバクテリウムと一緒にリーフディスクを同時に培養した後、苗条の再生をカナマイシンおよびホルモンの存在下で誘導した。形質転換から得られたカナマイシン耐性植物を、抗ＨＡ抗体を使用するウエスタン分析によってそれぞれのキチナーゼ−ＨＡ融合タンパク質の発現についてスクリーニングした。図２２および図２３には、カナマイシン耐性植物植物の典型的なウエスタンブロット分析が示される。野生型タバコ（ＮＮ）、およびＨＡ標識融合のセラチアキチナーゼ（約５９，０００ダルトンのＭＷ）を発現する遺伝子導入タバコが、それぞれ、陰性コントロールおよび陽性コントロールとして使用された。Ｈａ標識に融合されたキチナーゼ１タンパク質およびキチナーゼ２タンパク質の予測されるサイズは、それぞれ、３６，０００ダルトンおよび３２，７００ダルトンである。スクリーニングされた６つの植物のうちの４つがキチナーゼ１酵素を発現した（図２２）。測定された分子量は予想通りであった。このことは、タバコ植物におけるウツボカズラキチナーゼの正確なプロセシングを示している。植物＃４は比較的多量のキチナーゼ１−ＨＡ産物を示した。このことは、この遺伝子導入植物が数コピーの導入されたキチナーゼ１トランスジーンを含有することを示している。従って、植物＃４は、キチナーゼ１タンパク質を続いて精製するための良好の候補体である。図２３は、スクリーニングされた５つの植物のうちの２つにおいてキチナーゼ２酵素が発現していることを明らかにしている。キチナーゼ２−ＨＡタンパク質の測定された分子量は３２，７００ダルトンであった。このことは、これらの遺伝子導入植物における正確なイントロンスプライシングを同様に示している。
【０２９２】
両方のウツボカズラキチナーゼは、タンパク質を小胞体内に標的化するリーダーペプチドを有する。しかし、キチナーゼ２のみが、タンパク質を液胞に標的化するカルボキシ末端伸長部（ＣＴＥ）を有する。従って、ＣＴＥを有しないキチナーゼ１は細胞外空間に分泌されることが予想される（Ｌｅｇｒａｎｄ他、１９８７；Ｓｗｅｇｌｅ他、１９９２；Ｖａｄ他、１９９１）。従って、遺伝子導入植物は、その物理的一体性および酵素的一体性の両方を保持する新規なウツボカズラキチナーゼを正確に発現した。
【０２９３】
実施例１９
さらなる食虫植物における新規なキチナーゼ活性
上記の実施例では、ネペンテス・カシアナ（ウツボカズラ科）が一群の高活性な新規キチナーゼを有することが示される。そのような大きいキチナーゼ活性は他の種ではこれまで明らかにされていないが、２つの異なる科に属する食虫植物の３つのさらなる属（ハエトリソウ（Ｄｉｏｎｅａ  ｓｐ．）、モウセンゴケ（Ｄｒｏｓｅｒａ  ｓｐ．）およびヘイシソウ（Ｓａｒｒａｃｅｎｉａ  ｓｐ．））（最初の２つはモウセンゴケ科に属し、３番目はサラセニア科に属する）をスクリーニングした。これらの３つの代表例を、キチナーゼ活性と同様に抗菌類性についてスクリーニングした。これらの３つの食虫植物は、昆虫餌食を捕捉するために個々の構造的機構を発達させている。すなわち、ウツボカズラおよびヘイシソウは、昆虫を消化するためにトラップ消化液を使用するが、それ以外の植物は、餌食を捕捉する粘着性の液滴または餌食の回りを折り畳む葉のいずれかを使用する。従って、抗菌類活性ならびにキチナーゼ活性の両方のアッセイを、トラップ消化液ではなく、トラップ組織抽出物を用いて行った。表Ｉａ（上記の実施例９を参照のこと）には、ヒト病原体のカンジダ・アルビカンスに対する組織抽出物の抗菌類活性の結果がまとめられている。ハエトリソウおよびモウセンゴケの両方の抽出物は、最も低い試験された希釈物（１／３２）でさえも、カンジダ・アルビカンスの増殖の非常に強力な阻害を明らかにする。ヘイシソウもまた、より高濃度ではあるが、カンジダ・アルビカンスの増殖を阻害することにおいて活性である。まとめると、これらの結果により、ヒト病原体のカンジダ・アルビカンスに対する食虫植物抽出物の新規な抗菌類作用が初めて明らかにされる。
【０２９４】
図２４には、３つの異なる食虫植物におけるキチナーゼ活性の結果がまとめられている。強いキチナーゼ活性のバンドが３つのすべての植物において検出された。移動距離に従って２つの異なるキチナーゼがドロセラ・スパチュラタ（Ｄｒｏｓｅｒａ  ｓｐａｔｈｕｌａｔａ）に存在した。これらの結果により、３つの異なるタイプの食虫植物は多数の形態の活性なキチナーゼを有することが示される。相対的な活性を他の植物に由来するキチナーゼと比較するために、モウセンゴケおよびハエトリソウに由来するキチナーゼ遺伝子を単離した。図２５には、２つの部分的なキチナーゼ遺伝子の推定されるアミノ酸配列（モウセンゴケに由来する１つの配列（配列番号７）およびハエトリソウに由来する別の配列（配列番号８））と、遺伝子バンクおいて非常に近い相同性を示す植物キチナーゼ）（ＢＬＡＳＴ検索）とのアラインメントが示される。モウセンゴケのキチナーゼはニンニク（Ａｌｌｉｕｍ  ｓａｔｉｖｕｍ）およびジャガイモ（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ）に対して最も近い相同性を示し（それぞれ、８１％および７６％の同一性）、そしてハエトリソウのキチナーゼはタルウマゴヤシ（Ｍｅｄｉｃａｇｏ  ｔｒｕｃａｔｕｌａ）およびエンドウ（Ｐｉｓｕｍ  ｓａｔｉｖｕｍ）に対して最も近い相同性を示す（それぞれ、７６％および７５％の同一性）。部分的なモウセンゴケキチナーゼは、キチナーゼ１（Ｎｋｃｈｉｔ１ｂ）およびキチナーゼ２（Ｎｋｃｈｉｔ２ｂ）に対して、それぞれ、７７％および７３％の同一性を有し、一方、ハエトリソウのキチナーゼは、キチナーゼ１（Ｎｋｃｈｉｔ１ｂ）およびキチナーゼ２（Ｎｋｃｈｉｔ２ｂ）に対して、それぞれ、７３％および６７％の同一性を示す。遺伝子の５’配列および３’配列を単離することにより、これらの異なる供給源に由来するキチナーゼの類似性のより正確な推定が得られる。
【０２９５】
実施例２０
トラップ消化液キチナーゼの速度論的性質
ウツボカズラのトラップ消化液に存在するキチナーゼ活性を生化学的にさらに特徴づけるために、消化液キチナーゼの速度論的性質をセラチア・マルセセンスの組換えキチナーゼの速度論的性質と比較した。
【０２９６】
無菌のトラップ消化液を閉じたトラップから集め、そしてスピードバック処理（ｓｐｅｅｄｖａｃｃｉｎｇ）によって４．８倍濃縮した。セラチア・マルセセンスのキチナーゼ（凍結乾燥粉末）をＳｉｇｍａ（Ｃ１６５０）から購入し、Ｈ２Ｏに溶解した。
【０２９７】
トラップ消化液に存在するキチナーゼタンパク質の量は非常に少ないため、タンパク質の正確な量を日常的な方法によって検出することができなかった（実施例６を参照のこと）。従って、活性アッセイのために使用された酵素量を見積もるために、ウツボカズラキチナーゼのタンパク質濃度の単離されたｃＤＮＡの推定サイズに対応する約３２〜３５ｋＤａのバンドの量をＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび銀染色によって測定した。同様に、市販のセラチア・マルセセンスのキチナーゼの量もまた測定した。
【０２９８】
図１には、銀染色後の１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにおけるウツボカズラキチナーゼおよびセラチアキチナーゼの近似的な定量が示される。ＢＳＡ（約６６ｋＤａ）およびカルボニックアンヒドラーゼ（約２９ｋＤａ）が、それぞれ、セラチアキチナーゼ（約５８ｋＤａ）およびウツボカズラキチナーゼ（約３２〜３５ｋＤａ）の量を補正するために使用された。活性アッセイのために使用されたキチナーゼ量は、セラチアについては（５μｌにおいて）約１００ｎｇであると見積もられた。ウツボカズラキチナーゼの場合、酵素を表し得るかすかなバンドが３２〜３５ｋＤａに存在するだけであり、従って、キチナーゼの量は最大で（３０μｌにおいて）２０ｎｇ〜３０ｎｇの範囲内であると見積もられた。
【０２９９】
両方の調製物における酵素の速度論的プロフィルを決定するために、キチナーゼ活性アッセイを、基質（四量体：ｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−Ｎ，Ｎ’，Ｎ”−トリアセチル−キトトリオース、Ｓｉｇｍａ、Ｎ８６３８）の濃度を増大させながら行い、ｐ−ニトロフェノールの放出を測定した。
【０３００】
図２には、ウツボカズラのキチナーゼがセラチア酵素よりも大きいＫｍを有するようであるが、その活性は基質濃度と依然として直線的に相関しており、一方、セラチアのキチナーゼは９μｇ／アッセイの基質濃度で既に最大活性に達したことが示される。さらに、繰り返されたアッセイのもとで、ウツボカズラの酵素は、正常なミカエリス・メンテン挙動とは異なるＶｏと［Ｓ］との関係を示した（データ示さず）。（双曲線ではなく）Ｓ字形の飽和曲線（これはアロステリック酵素に特徴的である）が認められた。このＳ字形の速度論的挙動は、一般に、多数のタンパク質サブユニット間の共同的な相互作用を反映するものである［Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ他（１９９３）、Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２２９〜２３３］。ＳＤＳに加えてβ−メルカプトエタノールの存在は消化液キチナーゼを不活性化させ、その一方で、葉のキチナーゼ活性には影響を及ぼさないことが以前に示されている（実施例５）。これらの結果により、トラップ消化液キチナーゼは分子間ジスルフィド結合によって結ばれた二量体であると考えられることが既に示唆されていた。ほとんどの植物キチナーゼは約２５〜３５ｋＤａの単量体として活性であるが、二量体キチナーゼがジュズダマの種子において同定されている（Ｌ．Ｓ．ＧｒａｈａｍおよびＭ．Ｂ．Ｓｔｉｃｋｌｅｎ（１９９４）によって総説される）。上記でその活性が調べられたトラップ消化液には２つ以上のキチナーゼが存在し得るので、ウツボカズラのキチナーゼの性質に関する明確な結論を得ることができない。従って、最終的な特徴づけは、遺伝子導入植物においてそれらを別々に発現させた後、精製された酵素を用いてのみ行われる。
【参考文献】
【０３０１】
2004526431.tif 000008
2004526431.tif 000009
【図面の簡単な説明】
【０３０２】
【図１】ウツボカズラのトラップ消化液における新規なキチナーゼ活性の存在を明らかにするキチナーゼ活性ゲルである。
【図２ａ】新規なトラップ消化液キチナーゼとＳ．ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓキチナーゼとの間には抗原的類似性がないことを明らかにするウエスタンブロットである。図２ａ−サンプルには、５０μｌの葉抽出物（Ｌ）およびトラップ組織抽出物（Ｃ）、４０μｌのトラップ消化液（Ｓ）、そして＋Ｓ．ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓのＣｈｉＡＩＩキチナーゼを過剰発現する大腸菌細胞の抽出物の１００ｎｇ（Ｓｅｒ）が含まれる。
【図２ｂ】新規なトラップ消化液キチナーゼとＳ．ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓキチナーゼとの間には抗原的類似性がないことを明らかにするウエスタンブロットである。図２ｂ−サンプルには、５０μｌの葉抽出物（Ｌ）、Ｓ．ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓキチナーゼを過剰発現する大腸菌細胞の１００ｎｇ（Ｓｅｒ）、および８７５μｌの濃縮されたトラップ消化液（Ｓ）が含まれる。
【図３】ウツボカズラのトラップ消化液における新規なキチナーゼ活性のＳＤＳ変性に対する抵抗性を明らかにする半変性キチナーゼ活性ゲルである。
【図４ａ】ＳＤＳおよび２−メルカプトエタノールの変性に対するウツボカズラの新規なトラップ消化液キチナーゼ活性の感受性を明らかにする変性キチナーゼ活性ゲルである。
【図４ｂ】ＳＤＳおよび２−メルカプトエタノールの変性に対するウツボカズラの新規なトラップ消化液キチナーゼ活性の感受性を明らかにする変性キチナーゼ活性ゲルである。
【図５】大きい比活性のウツボカズラトラップ消化液キチナーゼを明らかにするクーマシーブルー染色されたＳＤＳ−ＰＡＧＥである。
【図６】ウツボカズラトラップ消化液酵素のＦＰＬＣによる精製および濃縮を例示する。
【図７】閉じたウツボカズラのトラップ消化液のＦＰＬＣ画分におけるキチナーゼ活性の精製を明らかにするＳＤＳ−ＰＡＧＥ分離である。
【図８】ウツボカズラトラップ消化液キチナーゼの多数の形態がキチンの注入によって誘導されることを明らかにするキチナーゼ活性ゲルである。
【図９】キチンにより誘導されたタンパク質のバンドを明らかにする、ウツボカズラのトラップ消化液のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分離および銀染色である。
【図１０ａ】植物病原体およびヒト病原体に対するキチン誘導のウツボカズラのトラップ消化液キチナーゼの殺菌類活性を例示する成長阻害アッセイ平板である。
【図１０ｂ】植物病原体およびヒト病原体に対するキチン誘導のウツボカズラのトラップ消化液キチナーゼの殺菌類活性を例示する成長阻害アッセイ平板である。
【図１０ｃ】植物病原体およびヒト病原体に対するキチン誘導のウツボカズラのトラップ消化液キチナーゼの殺菌類活性を例示する成長阻害アッセイ平板である。
【図１１ａ】図１１は、ウツボカズラのトラップ消化液の塩基性キチナーゼ１遺伝子Ｎｋｃｈｉｔ１ｂの完全なヌクレオチド配列（配列番号１）である。
【図１１ｂ】図１１の続きである。
【図１２ａ】ウツボカズラのトラップ消化液の塩基性キチナーゼ２遺伝子Ｎｋｃｈｉｔ２ｂの核酸配列および推定されるアミノ酸配列が例示される。図１２ａは、ウツボカズラキチナーゼ２のｃＤＮＡの推定されるアミノ酸配列の比較である。
【図１２ｂ】ウツボカズラのトラップ消化液の塩基性キチナーゼ２遺伝子Ｎｋｃｈｉｔ２ｂの核酸配列および推定されるアミノ酸配列が例示される。図１２ｂは、ウツボカズラのトラップ消化液の塩基性キチナーゼ２遺伝子Ｎｋｃｈｉｔ２ｂの完全なヌクレオチド配列（配列番号２）である。
【図１２ｃ】図１２ｂの続きである。
【図１３】データベース内の塩基性キチナーゼの構造に従って推定されるＮｋＣＨＩＴ１ｂ（ｃｈ１）（配列番号５）およびＮｋＣＨＩＴ２ｂ（ｃｈ２）（配列番号６）のアミノ酸配列アラインメント（ＰＲＥＴＴＹＢＯＸ）および機能的ドメインである。
【図１４】ＮｋＣＨＩＴ１ｂ（配列番号５）に対して非常に近い相同性を明らかにする、知られている単子葉植物キチナーゼおよび双子葉植物キチナーゼのアミノ酸配列の多配列アラインメントである。
【図１５】ＮｋＣＨＩＴ２ｂ（配列番号６）に対して非常に近い相同性を明らかにする、知られている単子葉植物キチナーゼおよび双子葉植物キチナーゼのアミノ酸配列の多配列アラインメントである。
【図１６ａ】ＮｋＣＨＩＴ２ｂにおける保存されたアミノ酸を例示する。図１６ａは、ＮｋＣＨＩＴ２ｂと、ＮｋＣＨＩＴ２ｂに対して非常に相同的な遺伝子バンク由来の単子葉植物キチナーゼおよび双子葉植物キチナーゼのアミノ酸配列との多配列アラインメントの一部である。
【図１６ｂ】ＮｋＣＨＩＴ２ｂにおける保存されたアミノ酸を例示する。図１６ａは、ＮｋＣＨＩＴ２ｂと、ＮｋＣＨＩＴ２ｂに対して非常に相同的な遺伝子バンク由来の単子葉植物キチナーゼおよび双子葉植物キチナーゼのアミノ酸配列との多配列アラインメントの一部である。
【図１７】ウツボカズラのトラップ消化液の新規な塩基性キチナーゼＮｋＣＨＩＴ１ｂのアミノ酸配列における可能なＯ−グリコシル化部位の予測を示す。
【図１８】ウツボカズラのトラップ消化液の新規な塩基性キチナーゼＮｋＣＨＩＴ２ｂのアミノ酸配列における可能なＯ−グリコシル化部位の予測を示す。
【図１９】新規なキチナーゼの示差的な発現を例示する、非誘導のウツボカズラのトラップ組織に由来するｍＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ分析の結果を示す。
【図２０】新規なキチナーゼの特異的な誘導を例示する、キチン誘導のウツボカズラのトラップ組織に由来するｍＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ分析の結果を示す。
【図２１】プラスミドｐＰＣＶ７０２−ｃｈｉｔ１＼ｃｈｉｔ２−ＨＡの物理地図である。
【図２２】遺伝子組換えタバコ植物におけるＮｋｃｈｉｔ１ｂ−ｇＩ−ＨＡ融合タンパク質の発現および正しいプロセシングを明らかにするウエスタンブロットを例示する。
【図２３】遺伝子組換えタバコ植物におけるＮｋｃｈｉｔ２ｂ−ｇＩＩ−ＨＡ融合タンパク質の発現および正しいプロセシングを明らかにするウエスタンブロットを例示する。
【図２４】食虫植物（ハエトリソウ、ヘイシソウおよびモウセンゴケ）のトラップにおける新規なキチナーゼ活性の多数の形態を例示する未変性キチナーゼ活性ゲルである。
【図２５】モウセンゴケのキチナーゼ遺伝子（配列番号７）およびハエトリソウのキチナーゼ遺伝子（配列番号８）の推定されるアミノ酸配列と、相同的な植物キチナーゼの遺伝子バンク配列の推定されるアミノ酸配列との多配列アラインメントである。
【図２６ａ】セラチア・マルセセンスのキチナーゼおよびウツボカズラのトラップ消化液キチナーゼのタンパク質定量評価を例示する。図２６ａは、示された容量の市販セラチア・マルセセンス（５８ｋＤａ）および示された量のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、６６ｋＤａ）を示す。
【図２６ｂ】セラチア・マルセセンスのキチナーゼおよびウツボカズラのトラップ消化液キチナーゼのタンパク質定量評価を例示する。図２６ｂは、示された容量のウツボカズラのトラップ消化液キチナーゼおよび示された量のカルボニックアンヒドラーゼ（２９ｋＤａ）を示す。
【図２７ａ】セラチア・マルセセンスのキチナーゼおよびウツボカズラのトラップ消化液キチナーゼを用いて行われたキチナーゼ活性アッセイの結果を示す。
【図２７ｂ】セラチア・マルセセンスのキチナーゼおよびウツボカズラのトラップ消化液キチナーゼを用いて行われたキチナーゼ活性アッセイの結果を示す。
【配列表フリーテキスト】
【０３０３】
配列番号９は一本鎖ＤＮＡプライマーの配列である。
配列番号１０は一本鎖ＤＮＡプライマーの配列でである。
配列番号１１は一本鎖ＤＮＡプライマーの配列である。
配列番号１２は一本鎖ＤＮＡプライマーの配列である。
配列番号１３は一本鎖ＤＮＡプライマーの配列である。
配列番号１４は一本鎖ＤＮＡプライマーの配列である。
配列番号１５はキチナーゼ遺伝子産物の組換え部分配列である。
配列番号１６はキチナーゼ遺伝子産物の組換え部分配列である。
配列番号１７はキチナーゼ遺伝子産物の組換え部分配列である。
配列番号１８はキチナーゼ遺伝子産物の組換え部分配列である。
配列番号１９はキチナーゼ遺伝子産物の組換え部分配列である。
配列番号２０はキチナーゼ遺伝子産物の組換え部分配列である。
配列番号２１は一本鎖ＤＮＡプライマーの配列である。
配列番号２２は一本鎖ＤＮＡプライマーの配列である。
配列番号２３は一本鎖ＤＮＡプライマーの配列である。
配列番号２４は一本鎖ＤＮＡプライマーの配列である。
配列番号２５は一本鎖ＤＮＡプライマーの配列である。
配列番号２６は一本鎖ＤＮＡプライマーの配列である。
配列番号２７は一本鎖ＤＮＡプライマーの配列である。
配列番号２８は一本鎖ＤＮＡプライマーの配列である。
配列番号２９は一本鎖ＤＮＡプライマーの配列である。
配列番号３０は一本鎖ＤＮＡプライマーの配列である。
配列番号３１は一本鎖ＤＮＡプライマーの配列である。
配列番号３２は一本鎖ＤＮＡプライマーの配列である。
配列番号３３は一本鎖ＤＮＡプライマーの配列である。
配列番号３４は一本鎖ＤＮＡプライマーの配列である。
配列番号３５は一本鎖ＤＮＡプライマーの配列である。
配列番号３６は一本鎖ＤＮＡプライマーの配列である。
配列番号３７は一本鎖ＤＮＡプライマーの配列である。
配列番号３８は一本鎖ＤＮＡプライマーの配列である。
配列番号３９は一本鎖ＤＮＡプライマーの配列である。
配列番号４０は一本鎖ＤＮＡプライマーの配列である。
配列番号４１は一本鎖ＤＮＡプライマーの配列である。
配列番号４２は一本鎖ＤＮＡプライマーの配列である。
配列番号４３は一本鎖ＤＮＡプライマーの配列である。
配列番号４４は一本鎖ＤＮＡプライマーの配列である。
配列番号４５は一本鎖ＤＮＡプライマーの配列である。
配列番号４６は一本鎖ＤＮＡプライマーの配列である。
配列番号４７はＣｈ１の部分配列：シグナルペプチドである。
配列番号４９はＣｈ１の部分配列：プロリンリッチ領域である。
【図１】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図３】
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【図４ａ】
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【図４ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０ａ】
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【図１０ｂ】
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【図１０ｃ】
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【図１１ａ】
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【図１１ｂ】
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【図１２ａ】
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【図１２ｂ】
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【図１２ｃ】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６ａ】
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【図１６ｂ】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６ａ】
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【図２６ｂ】
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【図２７ａ】
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【図２７ｂ】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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