(57)【要約】哺乳類を対象に一酸化窒素（ＮＯ）吸入に関連するＨＰＶ低下を緩和する方法、部分的に予防する方法、または完全に予防する方法を開示する。この方法は、治療的有効量のＮＯを吸入により投与する段階、および有効量の抗活性酸素（抗ＲＯＳ）薬剤（例えばＮ−アセチルシステインまたはロイコトリエンブロッカー）を同時に投与する段階を含む。哺乳類におけるＮＯ吸入に対する肺血管拡張反応性の喪失を緩和する方法、部分的に予防する方法、または完全に予防する方法も開示する。この方法は、治療的有効量のＮＯを吸入により投与する段階、ならびに有効量の抗ＲＯＳ薬剤、および治療的有効量のロイコトリエンブロッカーを同時に投与する段階を含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
治療的有効量の一酸化窒素を吸入により哺乳類に投与する段階と、有効量の抗ＲＯＳ薬剤を同時に投与する段階とを含む、哺乳類における、一酸化窒素吸入に関連した低酸素性肺血管収縮の低下を緩和する方法、部分的に予防する方法、または完全に予防する方法。
【請求項２】
抗ＲＯＳ薬剤が、Ｎ−アセチルシステイン、アロプリノール、アスコルビン酸（ビタミンＣ）、ビリルビン、コーヒー酸、カタラーゼ、ＰＥＧ−カタラーゼ、カテキン、セルロプラスム（ｃｅｒｕｌｏｐｌａｓｍ）、銅サリチル酸ジイソプロピル、デフェロキサミンメシレート、ジメチル尿素、エブセレン、ＥＵＫ−８、ＦｅＴＭＴＰｙＰ、ＦＥＴＰＰＳ、グルココルチコイド、グルタチオン、ＭｎＴＢＡＰ、ＭｎＴＭＰｙＰ、セレノメチオニン、スーパーオキシドジスムターゼ、ＰＥＧ−スーパーオキシドジスムターゼ、タクシフォリン（Ｔａｘｉｆｏｌｉｎ）、およびビタミンＥからなる群より選択される、請求項１記載の方法。
【請求項３】
抗ＲＯＳ薬剤がＮ−アセチルシステインである、請求項２記載の方法。
【請求項４】
有効量のロイコトリエンブロッカーを同時に投与する段階をさらに含む、請求項１記載の方法。
【請求項５】
治療的有効量の一酸化窒素を吸入により哺乳類に投与する段階と、有効量のロイコトリエンブロッカーを同時に投与する段階とを含む、哺乳類における一酸化窒素吸入に関連した低酸素性肺血管収縮の低下を緩和する方法、部分的に予防する方法、または完全に予防する方法。
【請求項６】
ロイコトリエンブロッカーが、モンテルカスト、ザフィルカスト、ザイリュートン、プランクラスト（ｐｒａｎｋｕｌａｓｔ）、ＭＫ−５７１、ＭＫ−５９１、ＭＫ−８８６、ＢＡＹｘ１００５、シナルカスト（ｃｉｎａｌｕｋａｓｔ）、ポビルカストエダミン（ｐｏｂｉｌｕｋａｓｔ ｅｄａｍｉｎｅ）、ＭＫ−６７９、およびＺＤ２１３８からなる群より選択される、請求項５記載の方法。
【請求項７】
ロイコトリエンブロッカーが、モンテルカスト、ザフィルカスト、およびザイリュートンからなる群より選択される、請求項６記載の方法。
【請求項８】
治療的有効量の一酸化窒素を吸入により哺乳類に投与する段階と、有効量の抗ＲＯＳ薬剤を同時に投与する段階とを含む、哺乳類における一酸化窒素の吸入に対して肺血管の拡張反応性が喪失するのを緩和する方法、部分的に予防する方法、または完全に予防する方法。
【請求項９】
抗ＲＯＳ薬剤が、Ｎ−アセチルシステイン、アロプリノール、アスコルビン酸（ビタミンＣ）、ビリルビン、コーヒー酸、カタラーゼ、ＰＥＧ−カタラーゼ、カテキン、セルロプラスム、銅サリチル酸ジイソプロピル、デフェロキサミンメシレート、ジメチル尿素、エブセレン、ＥＵＫ−８、ＦｅＴＭＴＰｙＰ、ＦＥＴＰＰＳ、グルココルチコイド、グルタチオン、ＭｎＴＢＡＰ、ＭｎＴＭＰｙＰ、セレノメチオニン、スーパーオキシドジスムターゼ、ＰＥＧ−スーパーオキシドジスムターゼ、タクシフォリン、およびビタミンＥからなる群より選択される、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
抗ＲＯＳ薬剤がＮ−アセチルシステインである、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
有効量のロイコトリエンブロッカーを同時に投与する段階をさらに含む、請求項８記載の方法。
【請求項１２】
治療的有効量の一酸化窒素を吸入により哺乳類に投与する段階と、有効量のロイコトリエンブロッカーを同時に投与する段階とを含む、哺乳類における一酸化窒素の吸入に対して肺血管の拡張反応性が喪失するのを緩和する方法、部分的に予防する方法、または完全に予防する方法。
【請求項１３】
ロイコトリエンブロッカーが、モンテルカスト、ザフィルカスト、ザイリュートン、プランクラスト、ＭＫ−５７１、ＭＫ−５９１、ＭＫ−８８６、ＢＡＹｘ１００５、シナルカスト、ポビルカストエダミン、ＭＫ−６７９、およびＺＤ２１３８からなる群より選択される、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
ロイコトリエンブロッカーが、モンテルカスト、ザフィルカスト、およびザイリュートンからなる群より選択される、請求項１３記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
技術分野
本発明は、肺生理学および心臓病学に関する。
【０００２】
背景
一酸化窒素（ＮＯ）は、身体の多くの細胞により産生される反応性の高いフリーラジカル化合物である。ＮＯは細胞質グアニル酸シクラーゼのヘム部分に結合し、グアニル酸シクラーゼを活性化し、また環状グアノシン３’，５’−一リン酸（ｃＧＭＰ）の細胞内濃度を上昇させることにより、血管拡張を誘導することで血管平滑筋を弛緩させる。
【０００３】
吸入されたＮＯガスは、ヒトおよび動物の肺血管の選択的な血管拡張物質として作用する。したがってＮＯの吸入は、肺の高換気領域における血管拡張の促進に用いられている。急性呼吸促迫症候群（ＡＲＤＳ）では、肺組織に換気障害があると動脈血の酸素化が低下する。一酸化窒素の吸入は、ＡＲＤＳ患者における酸素化を改善することがある。これは、肺の高換気部分において血管を拡張し、血流を高換気領域に向かって再分布させる、すなわちほとんどＮＯの届かない低換気領域から血流を離すことで起こる。しかしＡＲＤＳ患者の３０〜４０％では、ＮＯを吸入させても動脈の酸素化を改善することはできない（Ｂｉｇａｔｅｌｌｏら、１９９４、Ａｎｅｓｔｈｅｓｉｏｌｏｇｙ ８０：７６１〜７７０；Ｄｅｌｌｉｎｇｅｒら、１９９８、Ｃｒｉｔ． Ｃａｒｅ Ｍｅｄ． ２６：１５〜２３）。どのＡＲＤＳ患者がＮＯ吸入に反応しないか、またはどの患者が一過的にのみ反応するかということを予測することは困難である。しかし、敗血症を併発している最大６０％のＡＲＤＳ患者が、吸入されたＮＯに反応しないことが報告されている（Ｋｒａｆｆｔら、１９９６、Ｃｈｅｓｔ １０９：４８６〜４９３）。
【０００４】
正常肺の脈管は、肺胞低酸素に反応して収縮する。ＡＲＤＳなどの肺損傷のある患者では、低酸素性肺血管収縮（ＨＰＶ）は、血流を低換気（低酸素状態）の肺または肺領域から離して、高換気（正常酸素状態）の肺領域へ再分布させることで、体動脈の酸素化のレベルを上げる。敗血症およびエンドトキシン血症はＨＰＶを低下させ（Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎら、１９８５、Ｊ． Ａｐｐｌ． Ｐｈｙｓｉｏｌ． ５８：１４６３〜１４６８）、動脈の酸素濃度を大きく低下させる。このような全身の酸素化レベルの低下は生命を脅かす恐れがある。一酸化窒素の吸入は、高換気肺領域で血流を上昇させることで、敗血症における動脈血の酸素化を改善すると考えられる。しかし実際にはＮＯの吸入がＨＰＶを低下させるために、敗血症におけるＮＯ吸入は無効な場合が多く、またときには有害な場合がある。これについては例えばガーラック（Ｇｅｒｌａｃｈ）ら、１９９６、「急性肺損傷における一酸化窒素吸入のレベル低下（Ｌｏｗ ｌｅｖｅｌｓ ｏｆ ｉｎｈａｌｅｄ ｎｉｔｒｉｃ ｏｘｉｄｅ ｉｎ ａｃｕｔｅ ｌｕｎｇ ｉｎｊｕｒｙ）」、ｐ２７１〜２８３、「一酸化窒素と肺（Ｎｉｔｒｉｃ Ｏｘｉｄｅ ａｎｄ ｔｈｅ Ｌｕｎｇ）」、（ＺａｐｏｌおよびＢｌｏｃｈ編）、Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ Ｉｎｃ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを参照されたい。
【０００５】
内因性のＮＯは、酸素の存在下でＬ−アルギニンをＬ−シトルリンへ変換する一酸化窒素合成酵素によって産生される（Ｋｎｏｗｌｅｓら、１９９４、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２９８：２４９〜２５８）。３種類の異なる形状の一酸化窒素合成酵素（ＮＯＳ）の特徴が明らかにされている。神経細胞ＮＯＳ （ＮＯＳ１）および内皮ＮＯＳ （ＮＯＳ３）は構成的な酵素である。大量のＮＯを産生可能なＮＯＳ２として知られる誘導性ＮＯＳは、エンドトキシン（リポ多糖またはＬＰＳとも呼ばれる）、およびサイトカインにより誘導される（Ｋｎｏｗｌｅｓら、前掲）。さまざまな適用に対するＮＯ吸入療法が有用であることが明らかにされているにもかかわらず、ＮＯ吸入に対する肺血管拡張の反応性の低下と、ＮＯに関連したＨＰＶの喪失は、急性呼吸器疾患の未だ大きな問題である。
【０００６】
概要
発明者らは、肺のＮＯ濃度の上昇が、敗血症におけるＨＰＶの低下に必要であること、またこのようなＨＰＶの低下を、活性酸素スカベンジャーまたはロイコトリエンブロッカーで改善できることを明らかにした。したがって発明者らは、ＮＯ吸入の血管拡張作用を維持して、肺損傷患者におけるＮＯ吸入によるＨＰＶ低下作用を改善しながら、動脈血の酸素化を改善する方法を開発した。発明者らは、ＨＰＶの低下が単にＮＯによる血管拡張ではないことを確認している。発明者らはまた肺のＮＯ、加えて他のリポ多糖誘導性薬剤濃度の上昇が、エンドトキシンで刺激したマウスにおけるＮＯ吸入に対する肺血管拡張の反応性を低下させるのに必要なことも明らかにした。したがって発明者らは、ＮＯ吸入に対する肺血管拡張の反応性を維持する方法を開発した。
【０００７】
一つの局面では、本発明は、哺乳類を対象にＮＯ吸入に関連するＨＰＶ低下を緩和する方法、部分的に予防する方法、または、完全に予防する方法を特徴とする。一つの態様では、この方法は、治療的有効量のＮＯを吸入により哺乳類に投与する段階、および有効量の抗活性酸素（抗ＲＯＳ）薬剤を同時に投与する段階を含む。抗ＲＯＳ薬剤は例えば、Ｎ−アセチルシステイン、アロプリノール、アスコルビン酸（ビタミンＣ）、ビリルビン、コーヒー酸、カタラーゼ、ＰＥＧ−カタラーゼ、セルロプラスム（ｃｅｒｕｌｏｐｌａｓｍ）、銅サリチル酸ジイソプロピル、デフェロキサミンメシレート、ジメチル尿素、エブセレン（２−フェニル−１，２−ベンズイソセレナゾル−３（２Ｈ）−オン；Ｐｚ５１）、ＥＵＫ−８、ＦｅＴＭＴＰｙＰ （５，１０，１５，２０−テトラキス（Ｎ−メチル−４’−ピリジル）ポルフィナト鉄（ＩＩＩ）塩化物）、ＦＥＴＰＰＳ （５，１０，１５，２０−テトラキス（４−スルホナトフェニル）ポルフィリナト鉄（ＩＩＩ）塩化物）、グルココルチコイド、グルタチオン、ＭｎＴＢＡＰ （Ｍｎ（ＩＩＩ）テトラキス（４−安息香酸）ポルフィリン塩化物）、ＭｎＴＭＰｙＰ （Ｍｎ（ＩＩＩ）テトラキス（１−メチル−４−ピリジル）五塩化ポルフィリン）、セレノメチオニン、スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）、ポリエチレングリコール結合ＳＯＤ （ＰＥＧ−ＳＯＤ）、タクシフォリン（Ｔａｘｉｆｏｌｉｎ）（ジヒドロケルセチン；３，３’，４’，５，７−ペンタヒドロキシフラボン）、およびビタミンＥである。Ｎ−アセチルシステインは好ましい抗ＲＯＳ薬剤である。別の態様では、この方法は、治療的有効量を吸入により投与する段階、および有効量のロイコトリエンブロッカーを同時に投与する段階を含む。別の態様では、２種もしくはそれ以上の抗ＲＯＳ薬剤、または１種の抗ＲＯＳ薬剤と１種のロイコトリエンブロッカーとが、ＮＯ吸入とともに同時に投与される。
【０００８】
別の局面では、本発明は、哺乳類を対象にＮＯ吸入に対する肺血管拡張の反応性の喪失を緩和する方法、部分的に予防する方法、または完全に予防する方法を特徴とする。一つの態様では、この方法は、治療的有効量のＮＯの吸入により哺乳類に投与する段階、および有効量の抗ＲＯＳ薬剤を同時に投与する段階を含む。別の態様では、この方法は、治療的有効量のＮＯを吸入により投与する段階、および有効量のロイコトリエンブロッカーを同時に投与する段階を含む。別の態様では、２種またはそれ以上の抗ＲＯＳ薬剤、または１種の抗ＲＯＳ薬剤と１種のロイコトリエンブロッカーとが、ＮＯ吸入とともに同時に投与される。
【０００９】
特に明記した部分を除いて、本明細書で用いられるすべての科学技術用語は、本発明が属する技術分野の当業者により一般に理解される用語と同じ意味をもつ。矛盾が生じた場合は、定義を含め、本出願を優先する。本明細書で言及されたすべての出版物、特許、および他の文書は参照として組み入れられる。
【００１０】
本発明を実施または検討するにあたって、本明細書に記載されたものと類似または等価の方法および材料が使用される場合があるが、好ましい方法および材料を以下に説明する。材料、方法、および実施例は、説明を目的とするだけであって制限する意図はない。本発明の他の特徴および利点は、詳細な説明および特許請求の範囲から明らかになると思われる。
【００１１】
詳細な説明
ＮＯ吸入
吸入によるＮＯの安全で有効な投与方法は当技術分野で周知である。これについては例えばザポル（Ｚａｐｏｌ）、米国特許第５，５７０，６８３号；ザポルら、米国特許第５，９０４，９３８号；フロステル（Ｆｒｏｓｔｅｌｌ）ら、１９９１、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ ８３：２０３８〜２０４７を参照されたい。吸入用ＮＯは市販されている（ＩＮＯｍａｘ（商標）、ＩＮＯ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、Ｉｎｃ．、Ｃｌｉｎｔｏｎ、ＮＪ）。本発明では、ＮＯの吸入は好ましくは確立された方法に準じる。
【００１２】
吸入により投与するＮＯの適切な初期用量は２０ ｐｐｍである。これについては例えばＩＮＯｍａｘ（商標）の添付文書（ｗｗｗ．ｉｎｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ．ｃｏｍ）を参照されたい。しかし用量は、患者の年齢および条件、治療対象の疾患または障害、および施行する医師が関連すると考える他の因子に応じて、例えば０．１ ｐｐｍ〜１００ ｐｐｍの範囲で変動する場合がある。好ましくは最低有効量を吸入させる。最低有効量を経験的に得るためには、投与を２０ ｐｐｍで開始した後に、血管拡張作用が失われるまで徐々に低下させてゆくとよい。２０ ｐｐｍが不十分な吸入用量と考えられる場合は、ＮＯ用量を、血管拡張の有効性が認められるまで徐々に上昇させてゆくとよい。このような用量調節は当業者により日常的に行われている。本発明の利点は多くの場合、ＮＯを単独で投与するのに必要な用量より低いＮＯ用量で所望の治療転帰の達成が可能なことである。また、それ以外の場合、例えば敗血症による肺損傷がある場合に吸入ＮＯ反応を可能とすることができるほか、急性肺損傷の進行にかかわらず反応の維持が可能である。
【００１３】
抗ＲＯＳ薬剤
活性酸素（ＲＯＳ）は、スーパーオキシドラジカル（Ｏ２・）、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）、およびヒドロキシルラジカル（ＯＨ・）を含む。本明細書で使用される「抗ＲＯＳ薬剤」は、（１）活性酸素の産生を阻害する化合物、または（２）産生された活性酸素と速やかに反応することでこれを除去する化合物を意味する。本発明に有用な数多くの抗ＲＯＳ薬剤が知られている。抗ＲＯＳ薬剤の例には以下のような薬剤がある：Ｎ−アセチルシステイン（Ｍｕｃｏｓｉｌ（商標））、アロプリノール、アスコルビン酸（ビタミンＣ）、ビリルビン、コーヒー酸、カタラーゼ、ＰＥＧ−カタラーゼ、カテキン、セルロプラスム（ｃｅｒｕｌｏｐｌａｓｍ）、銅サリチル酸ジイソプロピル、デフェロキサミンメシレート、ジメチル尿素、エブセレン、ＥＵＫ−８、ＦｅＴＭＴＰｙＰ、ＦＥＴＰＰＳ、グルココルチコイド、グルタチオン、ＭｎＴＢＡＰ、ＭｎＴＭＰｙＰ、セレノメチオニン、スーパーオキシドジスムターゼ、ＰＥＧ−スーパーオキシドジスムターゼ、タクシフォリン（Ｔａｘｉｆｏｌｉｎ）、およびビタミンＥ。本発明のいくつかの態様では、２種またはそれ以上の抗ＲＯＳ薬剤が組み合わせて使用される。好ましい抗ＲＯＳ薬剤はＮ−アセチルシステイン（ＭＵＣＯＳＩＬ（商標）、Ｄｅｙ、Ｎａｐａ、ＣＡ）であり、これは例えば従来のネブライザーを使用するエアロゾルとしての吸入に適した無菌性溶液（１０％または２０％）として市販されている。
【００１４】
数種の抗ＲＯＳ薬剤は、ＮＯとスーパーオキシドとの反応で産生される、毒性のある活性窒素である過酸化亜硝酸も除去する。活性窒素を除去することで、ＮＯ吸入に関連したＨＰＶ低下、およびＮＯ吸入に対する肺血管拡張反応性の喪失を緩和したり、部分的に予防したり、または完全に予防したりすることができる。
【００１５】
抗ＲＯＳ薬剤の投与量および投与経路は、使用される特定の薬剤によって変わる。さまざまな抗ＲＯＳ薬剤の安全で有効な投与量および投与経路は当技術分野で周知である。これについては例えば「医師用添付文書集（Ｐｈｙｓｉｃｉａｎ’ｓ Ｄｅｓｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ；ＰＤＲ（登録商標））」、臨床薬理学２０００（Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ２０００）、Ｇｏｌｄ Ｓｔａｎｄａｒｄ Ｍｕｌｔｉｍｅｄｉａ（ｈｔｔｐ：／／ｃｐ．ｇｓｍ．ｃｏｍ／ｆｒｏｍｃｐｏ．ａｓｐ）、または業者の添付文書を参照されたい。
【００１６】
好ましい抗ＲＯＳ薬剤は、ＭＵＣＯＭＹＳＴ（商標）、ＭＵＣＯＳＩＬ−１０（商標）、およびＭＵＣＯＳＩＬ−２０（商標）として市販されているＮ−アセチルシステインである。Ｎ−アセチルシステインの適切な投与経路には、経口投与、直腸内投与、エアロゾルのネブライザーによる投与、および静脈内投与がある。超音波または従来のネブライザーを使用してＮ−アセチルシステインを投与することができる（Ｎ−アセチルシステインは、特定の材料、例えば鉄、銅、およびゴムと反応するので、Ｎ−アセチルシステインに接触するネブライザー装置のあらゆる部分はプラスチックまたはガラスで作製すべきである）。Ｎ−アセチルシステイン（ＭＵＣＯＳＩＬ（商標））の例示的な投与方法には、以下の方法などがあるがこれらに限定されない：
【００１７】
２０時間の静脈内投与：
１５０ ｍｇ／ｋｇ （２００ ｍｌのＤ５Ｗに希釈）の１５分間以上の静脈内投与に続いて、５０ ｍｇ／ｋｇ （５００ ｍｌのＤ５Ｗに希釈）の４時間以上の静脈内投与、さらに１００ ｍｇ／ｋｇ （１０００ ｍｌのＤ５Ｗに希釈）の１６時間以上の静脈内投与。
【００１８】
４８時間の静脈内投与：
１４０ ｍｇ／ｋｇ （Ｄ５Ｗに１：５で希釈）の１時間以上の静脈内投与に続いて、最初の１２回は７０ ｍｇ／ｍｌ （Ｄ５Ｗに１：５に希釈）のローディング投与を４時間かけて行い、その後に総用量９８０ ｍｇ／ｋｇを４時間毎に行う。４８時間の投与の各用量は１時間以上かけて静脈内投与する。
【００１９】
フェイスマスク、マウスピース、または気管切開による噴霧：
成人および青年：５〜１０ ｍｌの２０％溶液、または１０〜２０ ｍｌの１０％溶液を６〜８ 時間毎。
小児：３〜５ ｍｌの２０％溶液、または６〜１０ ｍｌの１０％溶液を６〜８時間毎。
幼児：１〜２ ｍｌの２０％溶液、または２〜４ ｍｌの１０％溶液を６〜８時間毎。
【００２０】
テントおよびｃｒｏｕｐｅｔｔｅを使用した噴霧：
成人および小児：濃厚なミストをもたらす十分量の１０％または２０％溶液（最大３００ ｍｌが必要とされる場合がある）。
【００２１】
小児に対する経口投与または経腸投与：
５〜３０ ｍｌの１０％溶液の１日３〜６回投与（例えば１０ ｍｌの１日４回投与）。
【００２２】
好ましくは、抗ＲＯＳ薬剤の投与は、ＮＯ吸入の開始と同時に始める。抗ＲＯＳ薬剤投与の期間は、使用される薬剤、およびＮＯ吸入の期間によって変わる。
【００２３】
ロイコトリエンブロッカー
ロイコトリエンは、白血球内に天然に存在する生物学的に活性のある化合物の一つのクラスである。ロイコトリエンは、ヒスタミンによるものと似たアレルギー反応および炎症反応を生じる。アラキドン酸は、５−リポキシゲナーゼ（５ＬＯ）および５ＬＯ−活性化タンパク質（ＦＬＡＰ）の作用によりロイコトリエンＡ４に変換される。ロイコトリエンＡ４は、速やかにロイコトリエンＢ４（ＬＴＢ４）、およびロイコトリエンＣ４ （ＬＴＣ４）に変換される。ＬＴＣ４は次にロイコトリエンＤ４ （ＬＴＤ４）およびＥ４ （ＬＴＥ４）に変換される。ＬＴＣ４、ＬＴＤ４、およびＬＴＥ４は、システイルロイコトリエンとも呼ばれ、ＣｙｓＬＴ１受容体およびＣｙｓＬＴ２受容体と相互作用する。本明細書で使用される「ロイコトリエンブロッカー」は、以下の化合物を意味する：（１）ロイコトリエン生合成経路の一段階を阻害する化合物；または（２）ロイコトリエン受容体の活性化を抑制する化合物。ロイコトリエンブロッカーの例には以下の化合物がある：モンテルカスト（ｍｏｎｔｅｌｕｋａｓｔ）（ＳＩＮＧＵＬＡＩＲ（登録商標）；Ｍｅｒｃｋ；選択的な経口活性ロイコトリエン受容体拮抗剤）、ザフィルカスト（ｚａｆｉｒｌｕｋａｓｔ）（ＡＣＣＯＬＡＴＥ（登録商標）；ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ；選択的なペプチドロイコトリエン受容体拮抗剤）、ザイリュートン（ｚｉｌｅｕｔｏｎ）（ＺＹＦＬＯ（登録商標）；Ａｂｂｏｔｔ；５ＬＯの経口活性阻害剤）、プランクラスト（ｐｒａｎｋｕｌａｓｔ）、ＭＫ−５７１、ＭＫ−５９１、ＭＫ−８８６、ＢＡＹｘ１００５、シナルカスト（Ｃｉｎａｌｕｋａｓｔ）、ポビルカストエダミン（Ｐｏｂｉｌｕｋａｓｔ ｅｄａｍｉｎｅ）、ＭＫ−６７９、およびＺＤ２１３８。本発明のいくつかの態様では、２種またはそれ以上のロイコトリエンブロッカーを組み合わせて使用する。好ましいロイコトリエンブロッカーは、選択的で経口活性のあるロイコトリエン受容体拮抗剤モンテルカスト（ＳＩＮＧＵＬＡＩＲ（登録商標））；ロイコトリエンＤ４（ＬＴＤ４）およびロイコトリエンＥ４（ＬＴＤ４）の選択的で競合性のある受容体拮抗薬ザフィルカスト（ＡＣＣＯＬＡＴＥ（登録商標））；および５ＬＯの経口活性阻害剤ザイリュートン（ＺＹＦＬＯ（登録商標））である。
【００２４】
ロイコトリエンブロッカーの投与量および投与経路は、使用される特定の薬剤によって変わる。さまざまなロイコトリエンブロッカーの安全で有効な投与用量および投与経路は当技術分野で周知である。これについては例えば、「医師用添付文書集（Ｐｈｙｓｉｃｉａｎ’ｓ Ｄｅｓｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ）（ＰＤＲ（登録商標））」、または業者の添付文書を参照されたい。例えば、ヒト成人におけるザフィルカスト（ＡＣＣＯＬＡＴＥ（登録商標））の好ましい用量は、２０ ｍｇ、１日２回の錠剤による経口投与である。別の例では、ヒト成人におけるモンテルカスト（ＳＩＮＧＵＬＡＩＲ（登録商標））の好ましい用量は、１０ ｍｇ、１日１回の錠剤による経口投与である。
【００２５】
好ましくは、ロイコトリエンブロッカーの投与は、ＮＯ吸入の開始と同時に始める。ロイコトリエンブロッカーの投与期間は、使用される薬剤、およびＮＯ吸入の期間によって変わる。
【００２６】
肺損傷
本発明は一般に、ＮＯ吸入中に有利に使用することができるが、急性呼吸促迫症候群（ＡＲＤＳ）を含む急性肺損傷患者における酸素化の改善に特に有用である。急性肺損傷の例には以下のようなものがある：びまん性の肺感染（例えばウイルス、細菌、真菌）；誤飲（例えば胃内容物、溺水時の水、新生児では胎便）；毒物または刺激物（例えば塩素ガス、ＮＯ２煙、オゾン、高濃度の酸素）の吸入；麻薬の過剰使用による肺水腫（例えばヘロイン、メサドン、モルヒネ、デキストロプロポキシフェン）；麻薬以外の薬物による作用（例えばニトロフラントイン）；宿主抗原に対する免疫応答（例えばグッドパスチャー症候群、全身性エリテマトーデス）；肺以外で開始された過程（例えばグラム陰性菌敗血症、出血性膵炎、羊水塞栓症、脂肪塞栓症）に対する全身反応と関連する、血圧低下による胸部以外の外傷による作用（「肺ショック」）；ならびに肺挫傷、肺移植、心肺バイパス手術による肺損傷、および肺切除術後の肺水腫を含む外傷後肺損傷。
【００２７】
ＨＰＶの低下
本発明の方法は、ＮＯ吸入に関連したＨＰＶ低下の緩和、部分的な予防、または完全な予防に有用である。既存のＨＰＶ低下の徴候には、患者が青くなることで明らかになることがある低血液酸素化（低酸素血症）、オキシメトリー飽和レベルの低下、精神状態の変化、神経の機能障害、呼吸困難、頻拍、および血圧低下などがある。既存のＨＰＶ低下の症状には息切れや胸痛などがある。ＨＰＶの障害または低下の診断は当技術分野の範囲に含まれる。
【００２８】
ＨＰＶの障害または低下の発生にリスクのある患者には、敗血症の患者、および肺炎症が疑われる患者が含まれる。肺の炎症は、肺炎または急性呼吸促迫症候群などの状態から生じる場合がある。
【００２９】
ＮＯ吸入に対する反応性の低下
本発明の方法は、ＮＯ吸入に対する肺血管拡張反応性の喪失の緩和、部分的な予防、または完全な予防に有用である。ＮＯに対する肺血管拡張反応性が失われるということは、ＮＯが酸素化を上昇できないこと、または肺動脈圧（ＰＡＰ）を低下できないことを意味する。ＰＡＰを低下できないことを示す徴候には、心拍出量の減少、ならびに右心不全、ショック症状、水腫、および浮腫などがある。
【００３０】
ＮＯ吸入に対する肺血管拡張反応性を失うリスクのある患者には、敗血症の患者、および肺炎症が疑われる患者が含まれる。肺の炎症は、肺炎または急性呼吸促迫症候群などの状態から生じる場合がある。
【００３１】
実験に関する情報
実施例１：抗ＲＯＳ薬剤とＮＯに対する肺血管反応性の低下
実験的な証拠は、活性酸素および活性窒素のスカベンジャーが、エンドトキシンで刺激したマウスでみられる、ＮＯ吸入に対する肺血管反応性の低下を予防することを示すことで得られた。このような実験はＮＯＳ２欠損マウスを対象に行われ、ＮＯ以外のエンドトキシン誘導性因子とともに長期ＮＯ吸入を行ったところ、続くＮＯ吸入に反応して肺の脈管の拡張能力が低下した。ＮＯ吸入に対する反応性は、Ｕ４６６１９で事前に萎縮させたマウスの単離潅流肺を対象に評価を行った。野生型マウスをエンドトキシンで刺激してから１６時間後に肺を単離したところ、ＮＯ吸入に対する反応性が低下していた（図２Ａ）。エンドトキシンを投与したＮＯＳ２欠損マウスでは、ＮＯ吸入に対する反応性の低下は認められなかった（図２Ｂ）。野生型マウスを２０ ｐｐｍのＮＯに曝露させた１６時間後に肺を単離したところ、ＮＯ吸入に対する反応性の低下は認められなかった。エンドトキシンを投与して、２０ ｐｐｍのＮＯに１６時間曝露させたＮＯＳ２欠損マウスでは、ＮＯ吸入に対する反応性の低下が認められた（図３）。エンドトキシンではなく生理食塩水を投与して、２０ ｐｐｍのＮＯに１６時間曝露させたＮＯＳ２欠損対照マウスでは、ＮＯ吸入に対する反応性の低下は認められなかった。エンドトキシンを投与した野生型マウスでは、Ｎ−アセチルシステイン（図５）、ジメチル尿素、ＥＵＫ８、およびカタラーゼを含む、活性酸素および活性窒素のスカベンジャーは、ＮＯ吸入に対する反応性低下を予防した。Ｎ−アセチルシステインは、エンドトキシンで刺激した野生型マウスでＮＯ吸入を延長しても、ＮＯ吸入に対する肺血管反応性の低下を予防した（図６）。
【００３２】
図５に示す実験結果から、ＮＯ吸入に対する反応性が、エンドトキシンで刺激したＮ−アセチルシステインを投与した野生型マウスで維持されることがわかる。図６に示す実験結果から、Ｎ−アセチルシステインによる防御効果の元となる機構を、肺におけるエンドトキシン誘導性のＮＯＳ２発現の抑制に単純に関連づけられないことがわかった。
【００３３】
方法および材料
以上の調査は、マサチューセッツ総合病院の「実験動物の取り扱いに関する小委員会（Ｓｕｂｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｆｏｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ）」により承認された。表１に列挙して概説したように、計７８匹の成体の雄マウス（２０〜３５ ｇ）を対象とした。ＮＯＳ２欠損マウス（ＭａｃＭｉｃｋｉｎｇら、１９９５、Ｃｅｌｌ ８１：６４１〜６５０）は、ネイサン（Ｃａｒｌ Ｎａｔｈａｎ）博士から供与された。同じバックグラウンドをもつマウス（親系列がＳＶ１２９およびＣ５７ Ｂｌａｃｋ／６のＦ１世代）を野生型マウスとして使用した（Ｈｉｃｋｅｙら、１９９７、ＦＡＳＥＢ Ｊ． １１：９５５〜９６４）。
【００３４】
単離、潅流、換気したマウス肺モデル
マウスの腹腔にペントバルビタールナトリウム（２００ ｍｇ／ｋｇ 体重）を注射して殺し、３７℃の水ジャケット付きのチャンバー（Ｉｓｏｌａｔｅｄ Ｐｅｒｆｕｓｅｄ Ｌｕｎｇ Ｓｉｚｅ １ Ｔｙｐｅ ８３９；Ｈｕｇｏ−Ｓａｃｈｓ Ｅｌｅｋｔｒｏｎｉｋ、Ｍａｒｃｈ−Ｈｕｇｓｔｅｔｔｃｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）内に置いた。気管を単離して挿管し、従量式換気装置（モデル６８７；Ｈａｒｖａｒｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ、Ｓｏｕｔｈ Ｎａｔｉｃｋ、ＭＡ）を、呼吸回数が８５回／分の換気速度、および終末呼気圧を２ ｃｍ Ｈ２Ｏに設定して、肺を２１％ Ｏ２、６％ ＣＯ２、および７３％ Ｎ２で換気した。１回換気量を調節することで、最大吸気圧を各実験で１０ ｃｍ Ｈ２Ｏとした。肺を正中胸骨切開で露出し、結紮糸を大動脈肺動脈流出路の周囲に配した。１０ ＩＵのヘパリンを右心室に注入後、肺動脈にステンレス製のカニューレ（内径 １ ｍｍ）を右心室経由で挿入した。肺静脈流出液は、僧帽弁をはさんで左心室の頂部を通して左心房に至るように配置したステンレス製カニューレ（内径 １ ｍｍ）から排出させた。左心房圧は２ ｍｍＨｇに維持した。肺を、非再循環システムを用いて３７℃で一定流量（５０ ｍｌ ｋｇ 体重−１ 分−１；Ｉｓｍａｔｅｃ Ｒｅｇｌｏ−Ａｎａｌｏｇｕｅ ｒｏｌｌｅｒ ｐｕｍｐ；Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｕｍｓｔｅｃｈｎｉｋ ＧｍｂＨ、Ｗｅｒｔｈｅｉｍ−Ｍｏｎｄｆｅｌｄ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で潅流した。潅流液には、１．２６ ｍＭ ＣａＣｌ２、５．３３ ｍＭ ＫＣｌ、０．４４ ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、０．５０ ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．４１ ｍＭ ＭｇＳＯ４、１３８．０ ｍＭ ＮａＣｌ、４．０ ｍＭ ＮａＨＣＯ３、０．３ ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、および５．６ ｍＭ グルコースを含むハンクス液（Ｈａｎｋｓ’ Ｂａｌａｎｃｅｄ Ｓａｌｔ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）（ＧｉｂｃｏＢＲＬ、Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）を使用した。ウシ血清アルブミン、およびデキストラン（５％）（いずれもＳｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．、Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ、ＭＯから入手）を潅流液に添加して、単離、潅流、換気したラット肺における肺水腫を予防した。これはホルツマン（Ｈｏｌｚｍａｎｎ）ら、１９９６、Ａｍ． Ｊ． Ｐｈｙｓｉｏｌ． ２７１：Ｌ９８１〜Ｌ９８６に実質的に記載された手順に準じた。インドメタシン（３０ ｍＭ）（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．）、およびＬ−ＮＡＭＥ （１ ｍＭ）（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．）を潅流液に添加して、内因性プロスタグランジン合成およびＮＯ合成をそれぞれ抑制した。また炭酸水素ナトリウムを添加して、潅流液のｐＨを７．３４〜７．４３に調節した。
【００３５】
肺に止血または無気肺の徴候がなく、外見が均一に白い場合、また当初の１０分間のベースライン潅流期間の後半５分間に潅流圧が１０ ｍｍＨｇ未満で安定している場合は、両肺を本研究の対象とした。以上２つの基準を用いて、各群の約１５％の肺調製物を試験前に廃棄した。
【００３６】
肺動脈圧（ＰＡＰ）および左心房圧は、生理食塩水を満たした膜圧トランスデューサー（Ａｒｇｏｎ、Ａｔｈｅｎｓ、ＴＸ）を、それぞれ流入用カニューレおよび流出用カニューレの側方ポートに接続して測定した。気道内圧（Ｐａｗ）は、Ｙピースの直下にある吸気枝管に接続した差圧トランスデューサー（モデルＭＰ−４５−３２−８７１；Ｖａｌｉｄｙｎｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｃｏｒｐ．、Ｎｏｒｔｈｒｉｄｇｅ、ＣＡ）で測定した。圧力トランスデューサーを医用増幅器（Ｈｅｗｌｅｔｔ Ｐａｃｋａｒｄ ７７５４Ｂ、Ａｎｄｏｖｅｒ、ＭＡ）に接続し、データ収集システム（ＤＩ−２２０；Ｄａｔａｑ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ａｋｒｏｎ、ＯＨ）を備えたアナログ−デジタルインターフェイスを用いてパーソナルコンピュータ上で１５０ Ｈｚにおけるデータを記録した。このシステムは各実験を行う前に較正を行った。
【００３７】
ＮＯの吸入に関しては、ＮＯガス（８００ ｐｐｍまたは８０ ｐｐｍのＮＯが窒素（Ａｉｒｃｏ、Ｍｕｒｒａｙ Ｈｉｌｌ、ＮＪ）に含まれるもの）を、酸素、二酸化炭素、および窒素と混合して（Ｏｘｙｇｅｎ Ｂｌｅｎｄｅｒ；Ｂｉｒｄ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｐａｌｍ Ｓｐｒｉｎｇｓ、ＣＡ）、最終濃度をＯ２（２１％）、ＣＯ２（６％）、および所望のＮＯ濃度とした。ＮＯおよびＮＯの高次の酸化状態（ＮＯｘ；ＣＬＤ ７００ ＡＬ；Ｅｃｏ Ｐｈｙｓｉｃｓ、Ｄｕｍｔｅｎ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、酸素（Ｈｕｄｓｏｎ Ｖｅｎｔｒｏｎｉｃｓ Ｄｄｉｖｉｓｉｏｎ、Ｔｅｍｅｃｕｌａ、ＣＡ）、および二酸化炭素（Ｄａｔｅｘ ＣＯ２ ｍｏｎｉｔｏｒ；Ｐｕｒｉｔａｎ−Ｂｅｎｎｅｔｔ Ｃｏｒｐｒａｔｉｏｎ、Ｌｏｓ Ａｎｇｅｌｅｓ、ＣＡ）の濃度は連続的にモニタリングした。
【００３８】
リポ多糖刺激後におけるＮＯ吸入に対する肺血管の反応性
野生型マウスおよびＮＯＳ２欠損マウスの腹腔に、生理食塩水に溶解した５０ ｍｇ／ｋｇ（体重）の大腸菌０１１１：Ｂ４リポ多糖（ＬＰＳ；Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｄｅｔｒｏｉｔ、ＭＩ）を注射し、１６時間後に単離肺の潅流を行った。この時点を選択した理由は、ラットを対象とした過去の実験で用いられていたからである（Ｈｏｉｚｍａｎｎら、１９９６、Ａｍ． Ｊ． Ｐｈｙｓｉｏｌ． ２７１：Ｌ９８１〜Ｌ９８６）。対照には、未処置の野生型マウスおよびＮＯＳ２欠損マウスを使用した。
【００３９】
最初の１０分間のベースライン潅流期間後に、肺血管の収縮を、トロンボキサンＡ２類似体Ｕ−４６６１９ （Ｃａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ、ＭＩ）の持続注入により誘導した。注入速度は、５ ｍｍＨｇまたは６ ｍｍＨｇでＰＡＰが安定に上昇するように調節した。次に肺を０．４ ｐｐｍ、４ ｐｐｍ、および４０ ｐｐｍのＮＯで連続的に換気（各５分）することで、吸入ＮＯに対する用量反応曲線を作成した。ＮＯ換気の各期間の後に、ＰＡＰは、ＮＯによる上昇前のベースラインに戻った。ＰＡＰが、ＮＯ吸入の終了から５分後の時点でＮＯ処置前の値の±１０％の範囲にない場合には、Ｕ−４６６１９の注入を再調整した。吸入ＮＯに対する血管拡張反応（ΔＰＡＰ）は、Ｕ−４６６１９で誘導されるＰＡＰの上昇率（％）（ＮＯ処置前のＰＡＰ−初期ベースラインにおけるＰＡＰ）としての、吸入されたＮＯにより生じるＰＡＰの変化（ＮＯ吸入から５分後のＰＡＰ−ＮＯ処置前のＰＡＰ）として測定した。
【００４０】
ＮＯ曝露が吸入ＮＯに対する肺血管反応性に及ぼす影響
４群のマウスを対象に、２０ ｐｐｍのＮＯを１６時間かけて呼吸させた。野生型マウスの１群とＮＯＳ２欠損マウスの１群の腹腔内に５０ ｍｇ／ｋｇのリポ多糖を、ＮＯ曝露の直前に注射した。他の野生型マウス群およびＮＯＳ２欠損マウス群にはリポ多糖を注射せずにＮＯに曝露させた。ＮＯに曝露させてから１６時間後に肺を単離し、上述の手順で潅流を行った。肺血管の収縮は、Ｕ４６６１９を注射することで誘導し、０．４ ｐｐｍ、４ ｐｐｍ、および４０ ｐｐｍのＮＯに対する血管拡張作用を測定した。
【００４１】
周囲圧力下におけるＮＯ曝露中は、マウスを４０−１アクリル製チャンバー内で飼育した。ＮＯおよびＮＯｘの濃度は、ソーダ石灰２２を使用して、新鮮なＮＯガス（窒素中に１０，０００ ｐｐｍのＮＯを含む；Ａｉｒｃｏ、Ｍｕｒｒｙ Ｈｉｌｌ、ＮＪ）、空気、および酸素を早い流速で、文献に記載された手順にしたがって慎重に制御した（Ｓｔｅｕｄｅｌら、１９９８、１０１：２４６８〜２４７７）。
【００４２】
他の２つのＮＯＳ２欠損マウス群には、リポ多糖（５０ ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内投与した後に、それぞれ０．２ ｐｐｍおよび２ ｐｐｍのＮＯに曝露させた。１６時間後に、０．４ ｐｐｍ、４ ｐｐｍ、および４０ ｐｐｍの吸入ＮＯにより生じる肺血管拡張の程度を測定する、単離肺を対象とした潅流実験を行った。
【００４３】
肺の湿重量と乾燥重量の比
各実験の終了時に、肺門部を除く両方の肺を摘出して重量を測定した（湿重量）。次に、文献に記載された手順（Ｈｏｉｚｍａｎｎら、前掲）にしたがって肺をマイクロ波加熱炉内で６０分間かけて乾燥させ、再び重量を測定した（乾燥重量）。肺の湿重量と乾燥重量の比を、湿重量を乾燥重量で割ることで算出した。
【００４４】
統計解析
すべてのデータは平均±標準誤差（ＳＥ）で表す。群間の比較は二元配置分散分析で行った。分散分析で有意差が検出されたら、計画された比較検討に対する事後的な最小有意差検定を用いた（Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａ ｆｏｒ Ｗｉｎｄｏｗｓ；ＳｔａｔＳｏｆｔ、Ｉｎｃ．、Ｔｕｌｓａ、ＯＫ）。統計学的有意差は、Ｐ値＜０．０５で推定した。
【００４５】
結果
Ｕ４６６１９を注入すると一定の潅流フローにおいてＰＡＰの安定な上昇がみられた。これは、実験終了時点でＵ４６６１９注入終了後に可逆的であった。５ ｍｍＨｇまたは６ ｍｍＨｇ のＰＡＰの上昇に必要なＵ４６６１９の用量は、リポ多糖を事前に投与した野生型マウスとＮＯＳ２欠損マウス間で、また非投与の野生型マウスとＮＯＳ２欠損マウス間で差は認められなかった。
【００４６】
リポ多糖を腹腔内に注入したマウスでは、野生型マウスとＮＯＳ２欠損マウスの両方において同程度の起毛、下痢、および嗜眠が認められた。リポ多糖注入から１６時間後における死亡率は約１５％であり、二系統のマウス間に差は認められなかった。
【００４７】
ＮＯ吸入に対する肺血管反応
ＮＯの吸入は、すべての群で用量依存的にＰＡＰを低下させた。図１は、未処置の野生型マウスから単離した潅流肺の肺動脈圧（ＰＡＰ；潅流圧に等しい）、および左心房圧（ＬＡＰ）を測定した代表的な実験で得られた動脈圧曲線である。安定なトロンボキサンＡ２類似体Ｕ４６６１９を注入すると、ＰＡＰは５ ｐｐｍまたは６ ｐｐｍ上昇した。ＮＯガスの濃度を変えて（０．４ ｐｐｍ、４．０ ｐｐｍ、および４０ ｐｐｍ）、肺を各５分間換気した。ＮＯによる換気の終了後に、ＰＡＰはＮＯ処置前のレベルまで戻った。この結果から、低濃度のＮＯガスで換気を行うことで、マウスの単離潅流肺では、肺動脈圧を測定すること、安定な肺血管収縮を誘導すること、また肺血管収縮を緩和することが可能であることがわかる。
【００４８】
リポ多糖刺激を受けた野生型マウスの単離潅流肺では、ＰＡＰは、それぞれ０．４ ｐｐｍおよび４ ｐｐｍの吸入ＮＯに反応して、未処置マウスと比べて７９％および４５％未満低下した（Ｐ＜０．００１；図２Ａ）。４０ ｐｐｍのＮＯに対する肺血管拡張反応は群間で差がなかった。未処置のＮＯＳ２欠損マウスにおける吸入ＮＯに対する反応は、未処置の野生型マウスにおける反応と差はなかった。これとは対照的に、リポ多糖で刺激したＮＯＳ２欠損マウスから回収した肺では、リポ多糖を投与した野生型マウスの肺と比べて、吸入ＮＯに対する大きな血管拡張が認められた（各ＮＯ用量においてＰ＜０．００１；図２Ｂ）。また、リポ多糖を投与したＮＯＳ２欠損マウスにおけるＮＯ誘導性の血管拡張は、未処置のＮＯＳ２欠損マウスまたは野生型マウスと比べて促進された（各ＮＯ用量それぞれにおいてＰ＜０．０５；図２Ｂ）。
【００４９】
図２Ａのデータから、エンドトキシン刺激が、野生型マウスのもつ、０．４ ｐｐｍおよび４０ ｐｐｍのＮＯの換気に反応した肺血管拡張能力を低下させることがわかる（＊Ｐ＜０．００１）。図２Ｂに記載されたデータからは、エンドトキシン刺激が、吸入ＮＯに対する肺血管拡張反応を低下させなかったことがわかる。むしろエンドトキシンは、ＮＯＳ２欠損マウスの肺の脈管が有する、０．４ ｐｐｍ、４ ｐｐｍ、および４０ ｐｐｍのＮＯの換気に反応した拡張能力を増強した（†Ｐ＜０．０５）。吸入ＮＯに対するこのような肺血管拡張反応は、エンドトキシンで刺激したＮＯＳ２欠損マウスの方が、エンドトキシンで刺激した野生型マウスより大きかった（‡Ｐ＜０．００１）。
【００５０】
ＮＯ吸入曝露後におけるＮＯに対する肺血管反応
分子状のＮＯが、ＮＯ吸入に対する反応性低下の発現に果す役割を調べるために、発明者らは、リポ多糖を投与したＮＯＳ２欠損マウスおよび野生型マウス、ならびに未処置のＮＯＳ２欠損マウスおよび野生型マウスを対象に、２０ ｐｐｍのＮＯを添加した空気を１６時間にわたって呼吸させた。過去のＮＯ吸入曝露は、未処置の野生型マウスもしくはＮＯＳ２欠損マウスから回収した潅流肺、またはリポ多糖を事前に投与した野生型マウスを対象に、後に吸入させたＮＯに対する反応性を変えなかった。これとは対照的に、ＮＯ吸入に対する肺血管拡張反応は、空気中のＮＯに１６時間曝露させたリポ多糖を事前に投与したＮＯＳ２欠損マウスでは、ＮＯに曝露させなかったリポ多糖を事前に投与したＮＯＳ２欠損マウスと比べて低下した。２０ ｐｐｍのＮＯ（空気中）に１６時間曝露させたＮＯＳ２欠損マウスから単離した潅流肺では、ＮＯ吸入に対する後の血管拡張反応性は、リポ多糖の事前投与後に、０．４ ｐｐｍのＮＯ （ΔＰＡＰ−２４±４％ 対 −４２±４％；Ｐ＜０．０５）、および４ ｐｐｍのＮＯ （ΔＰＡＰ−３９±５％ 対 −５８±４％；Ｐ＜０．０１）では低下したが、４０ ｐｐｍのＮＯでは低下は認められなかった（ΔＰＡＰ−５５±３％ 対 −６２±５％；Ｐ＝有意ではない；図３）（未処置対照に対して）。過去にＮＯ吸入曝露を受けなかったマウスと同様に、ＮＯで誘導した血管拡張は、リポ多糖を事前に投与した野生型マウスでは、２０ ｐｐｍのＮＯを１６時間呼吸させてから肺の潅流実験を行った未処置の野生型マウスと比べて低下した（図３）。
【００５１】
長期のＮＯ曝露後に、エンドトキシンで刺激したＮＯＳ２欠損マウスでは、短期のＮＯ吸入に対する反応性が、リポ多糖の投与を受けなかったＮＯＳ２欠損マウスと比べて低かった（＊Ｐ＜０．０５）。同様に長期のＮＯ曝露後に、リポ多糖を事前に投与した野生型マウスにおける短期ＮＯ吸入に対する反応性は、リポ多糖の投与を受けなかった野生型マウスと比べて低かった（＊Ｐ＜０．０５）。以上の結果は、２０ ｐｐｍのＮＯの長期呼吸が、未処置の野生型マウスまたはＮＯＳ２欠損マウスにおける後のＮＯ換気に対する肺血管拡張反応を低下させないことを示している。これとは対照的に、２０ ｐｐｍ ＮＯを長期にわたって呼吸させると、後のＮＯ換気に対する肺血管拡張反応が、エンドトキシンで刺激したＮＯＳ２欠損マウスで大きく低下した（図２Ｂのデータと比較されたい）。
【００５２】
低濃度のＮＯの１６時間に及ぶ吸入が、肺潅流中の短期ＮＯ吸入に対する血管反応性を損なう可能性があるか否かを判定するために、リポ多糖を投与したＮＯＳ２欠損マウスを、０．２ ｐｐｍおよび２ ｐｐｍのＮＯ吸入に曝露させた。リポ多糖の投与後に０．２ ｐｐｍのＮＯを１６時間にわたって呼吸させると、ＮＯＳ２欠損マウスにおける短期吸入ＮＯに対する後の低反応性は認められなかった。しかし、２ ｐｐｍのＮＯを１６時間かけて呼吸させると、０．４ ｐｐｍのＮＯ吸入に対する血管拡張反応は、対照マウスでみられる反応と比べて低下した（Ｐ＜０．０５；図４）。
【００５３】
肺の湿重量と乾燥重量の比
潅流後に肺の湿重量と乾燥重量の比が変化しないことから、肺水腫でないことを確認した。リポ多糖を事前に投与した野生型マウス（湿重量−乾燥重量：４．３±０．２）とＮＯＳ２欠損マウス（４．８±０．１）との間に差は認められず、未処置の野生型マウス（４．６±０．１）と未処置のＮＯＳ２欠損マウス（４．６±０．１）との間でも差は認められなかった。ＮＯ吸入に１６時間曝露させても、肺の湿重量と乾燥重量の比は、非曝露マウスと比べて、リポ多糖を事前に投与した野生型マウス（４．９±０．１）と、ＮＯＳ２欠損マウス（５．１±０．２）との間で変わらず、未処置の野生型マウス（４．５±０．３）と未処置のＮＯＳ２欠損マウス（４．８±０．１）との間でも変わらなかった。肺の湿重量と乾燥重量の比は、吸入ＮＯに対する血管拡張反応と相関しなかった。
【００５４】
Ｎ−アセチルシステインの作用
発明者らは、Ｎ−アセチルシステイン（ＮＡＣ）による活性酸素の除去が、エンドトキシンで刺激したマウスにおけるＮＯ吸入に対する肺の血管拡張反応の低下を予防するか否かを調べた。野生型マウスにエンドトキシン（大腸菌０１１：Ｂ４−ＬＰＳ、５０ ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内投与した直後、また３．５時間後に生理食塩水またはＮＡＣ （１５０ ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内投与した（ｎ＝５）。ＮＡＣを投与した、エンドトキシンで刺激した別のマウスには、２０ ｐｐｍのＮＯを１６時間呼吸させた。
【００５５】
エンドトキシンで刺激して１６時間後にマウスの肺を単離し、潅流し、換気を行った。生理食塩水のみを投与して、室内の空気を呼吸させたマウスから単離した肺を対照として使用した（ｎ＝１０）。肺血管収縮をＵ４６６１９で誘導し、０．４ ｐｐｍ、４．０ ｐｐｍ、および４０ ｐｐｍのＮＯの吸入による拡張反応を測定した。０．４ ｐｐｍ、４．０ ｐｐｍ および４０ ｐｐｍのＮＯに反応した血管拡張は、エンドトキシン刺激マウスでは、それぞれ対照マウスで得られた値と比べて３２±１３％、４３±１０％、および５３±８％であった（対照に対してｐ＜０．００１）（図６）。これとは対照的に、ＮＡＣを投与したエンドトキシン刺激マウスにおける、ＮＯ吸入に対する血管拡張反応は、対照マウスの反応と変わらなかった（それぞれ７５±１４％、１０３±１５％、および９１±７％、（ＬＰＳに対してｐ＜０．００１）（図６）。ＮＯ吸入に対する反応性も、２０ ｐｐｍ ＮＯに曝露させた、エンドトキシンで刺激されたＮＡＣ投与マウスでは維持されていた。これはＮＡＣが、エンドトキシン誘導性の肺ＮＯ濃度の上昇を防いだことにより、短期ＮＯ吸入に対する反応性を維持しなかったことを意味していた。以上の結果から、活性酸素のスカベンジャーとしてのＮＡＣが、ＮＯ吸入に対する反応性のエンドトキシン誘導性の低下の予防に有効であることが明らかとなった。
【００５６】
実施例２：ＨＰＶと活性酸素のスカベンジャー
活性酸素のスカベンジャーが、エンドトキシン刺激マウスでＨＰＶの低下を予防することを示す実験的な証拠が得られた。エンドトキシン誘導性のＨＰＶ低下においてＮＯＳ２が果す役割を調べるために、発明者らは、野生型マウスとＮＯＳ２を先天的に欠くマウスを対象に、左主気管支閉鎖（ＬＭＢＯ）後に、肺血流の再分布能力の比較を行った。この実験を実施するにあたって発明者らは、マウスのＬＭＢＯモデルを開発した。このモデルを用いることで発明者らは、エンドトキシンが完全なマウスのＨＰＶに及ぼす影響を評価することができた。
【００５７】
図７に示した結果から、左肺血流と全肺血流の比（ＱＬＰＡ／ＱＰＡ比）の負の変化によって示されるように、肺血流を低酸素状態の左肺から離すような再分布をＬＭＢＯが生じたことがわかる。エンドトキシン刺激は、野生型マウスにおいてＬＭＢＯ後に肺血流分布を著しく低下させた（＊Ｐ＜０．０５、エンドトキシン 対 対照）が、ＮＯＳ２欠損マウスではこれは認められなかった（Ｐ＜０．０１、野生型マウスに対して）。Ｌ−ＮＩＬを最初に投与しておくと、ＬＭＢＯ誘導性の肺血流再分布の低下が妨げられた（＃Ｐ＜０．０１、Ｌ−ＮＩＬ非投与のエンドトキシン刺激マウスに対して）。４０ ｐｐｍのＮＯを長期吸入させた後に、エンドトキシンを事前に投与したＮＯＳ２欠損マウスでは、エンドトキシンで刺激された野生型マウスと同様のＨＰＶ喪失が認められた（§Ｐ＜０．０５ ＮＯ 対 ＮＯなし）。４０ ｐｐｍのＮＯを２２時間呼吸させた生理食塩水で刺激したＮＯＳ２欠損マウスおよび野生型マウスでは、ＮＯ吸入終了してから１時間後に測定したところ、ＬＭＢＯ後に肺血流を再分布する能力は保持されていた。以上の結果から、エンドトキシン誘導性のＮＯＳ２発現による、またはＮＯ吸入による肺のＮＯ濃度の上昇が、エンドトキシン刺激後におけるＨＰＶの低下に必要であることがわかる。しかし、肺を高濃度のＮＯに長期曝露するだけでは、ＨＰＶを低下させるのに十分ではない（ＮＯ吸入を終了してから１時間後に測定）。
【００５８】
発明者らは、ＬＭＢＯに反応した左肺血管抵抗の増分変化ΔｉＬＰＶ （ＨＰＶの尺度の一つ）を調べる実験を行った。ＨＰＶは、エンドトキシンで刺激した野生型マウスで低下した（図８）。ＨＰＶは、Ｎ−アセチルシステインを５００ ｍｇ／ｋｇ投与したエンドトキシン刺激マウスでは変わらなかったが、１５０ ｍｇ／ｋｇを投与した場合（エンドトキシンと同時に腹腔内投与）は変わった。ＨＰＶは、スーパーオキシド、過酸化水素、過酸化亜硝酸のすべてのスカベンジャーであるＥＵＫ−８を投与したエンドトキシン刺激マウスでは全く変わらなかった。
【００５９】
上記の実験から発明者らは、ＮＯＳ２の欠損が、エンドトキシン誘導性のＨＰＶ低下からマウスを予防することを発見した。発明者らはまた、活性酸素のスカベンジャーが、エンドトキシンで刺激した野生型マウスのＨＰＶの低下を予防することを理解した（図８）。
【００６０】
以上の結論を支持する６つの証拠
（１）野生型マウスでＬＭＢＯは肺血管耐性（ＰＶＲ）を左肺で強化するが、エンドトキシン刺激から２２時間後にはＬＭＢＯ誘導性の左肺血管収縮は低下した；（２）ＮＯに曝露させなかったエンドトキシン刺激ＮＯＳ２欠損マウスでは、ＬＭＢＯ誘導性の左肺血管収縮は低下しなかった（図７）；（３）４０ ｐｐｍのＮＯに２２時間曝露させたエンドトキシン刺激ＮＯＳ２欠損マウスでは、ＬＭＢＯ誘導性の左肺血管収縮が低下した（図７）；（４）長期のＮＯ吸入だけではマウスのＨＰＶは低下しなかった（図）；（５）Ｎ−アセチルシステインまたはＥＵＫ−８はエンドトキシン刺激野生型マウスのＨＰＶ低下を防いだ（図８）；および（６）ＨＰＶは、Ｎ−アセチルシステインを投与して２０ ｐｐｍのＮＯに２２時間曝露させたエンドトキシンで刺激した野生型マウスでは低下しなかった。
【００６１】
方法および材料
マサチューセッツ総合病院の「実験動物の取り扱いに関する小委員会（Ｓｕｂｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｆｏｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ）」の施設内承認を受けた後、発明者らは、ＳＶ１２９／Ｂ６Ｆ１野生型マウス（ＳＶ１２９マウスとＣ５７ＢＬ／６マウスのＦ１世代の仔）、およびＳＶ１２９野生型マウス（Ｔｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ、Ｍａｉｎｅ、ＵＳＡ）、ならびにＳＶ１２９とＣ５７ＢＬ／６の雑種のバックグラウンドをもつＮＯＳ２欠損マウス（ＭａｃＭｉｃｋｉｎｇら、１９９５、Ｃｅｌｌ ８１：６４１〜６５０）（Ｃ． Ｎａｔｈａｎ、Ｃｏｒｎｅｌｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹより供与）を対象に調査を行った。追加調査として、Ｃ５７ＢＬ／６のバックグラウンドに１０世代にわたって戻し交配したＮＯＳ２欠損マウス（１８）（Ｃ５７ＢＬ／６−Ｎｏｓ２ｔｍ１Ｌａｕ、Ｎ１０−戻し交配世代；Ｔｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、および野生型のＣ５７ＢＬ／６を調べた。
【００６２】
動物の月齢、体重、性別をマッチさせた実験群を使用した。２〜５月齢で１８〜３０ ｇの雌雄マウスを対象とした。
【００６３】
グループ１：対照
ＳＶ１２９／Ｂ６Ｆ１野生型マウス（ｎ＝５）、ＳＶ１２９野生型マウス（ｎ＝７）、およびＮＯＳ２欠損マウス（ｎ＝７）の腹腔内に０．２ ｍＬの生理食塩水を注射し、２２時間後に調べた。
【００６４】
グループ２：エンドトキシン投与
ＳＶ１２９／Ｂ６Ｆ１野生型マウス（ｎ＝５）、ＳＶ１２９ 野生型マウス（ｎ＝６）、およびＮＯＳ２欠損マウス（ｎ＝６）を、１０ ｍｇ／ｋｇの大腸菌０１１Ｂ４エンドトキシン（０．２ ｍＬの生理食塩水に溶解したもの）を腹腔内に注射した２２ 時間後に調べた。またＣ５７ＢＬ／６野生型マウス（ｎ＝７）、およびＣ５７ＢＬ／６−Ｎｏｓ２ｔｍ１Ｌａｕマウス（ｎ＝５）を、０．２ ｍＬの生理食塩水に溶解した１０ ｍｇ／ｋｇのエンドトキシンを腹腔内に注射して刺激した２２ 時間後に調べた。
【００６５】
グループ３：エンドトキシン投与＋Ｌ−ＮＩＬ
ＳＶ１２９／Ｂ６Ｆ１野生型マウス（ｎ＝５）の腹腔内に、０．２ ｍＬの生理食塩水に溶解した１０ ｍｇ／ｋｇの大腸菌０１１Ｂ４エンドトキシンを注射した。エンドトキシン刺激から３時間後に、Ｌ−ＮＩＬ （５ ｍｇ／ｋｇ）をマウスの腹腔内に投与した。調査は、エンドトキシン刺激から２２時間後に行った。事前（２２時間前）にエンドトキシンで刺激した（ｎ＝５）、または刺激しなかった（ｎ＝４）別のＳＶ１２９／Ｂ６Ｆ１マウスを対象に、ＬＭＢＯ中に投与したＬ−ＮＩＬ（５ ｍｇ／ｋｇ）の静脈内ボーラス投与に対する急性反応を調べた。発明者らは、腹腔内に投与するＬ−ＮＩＬの用量を５ ｍｇ／ｋｇとした。これは同等の用量が、げっ歯類の炎症モデルにおけるＮＯＳ２活性をインビボで有効に抑制することがわかっていたからである（Ｓｃｈｗａｒｔｚら、１９９７、Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． １００：４３９〜４４８）。
【００６６】
グループ４：４ ｐｐｍまたは４０ ｐｐｍのＮＯの長期曝露
生理食塩水を投与したＳＶ１２９野生型マウス（ｎ＝５）、およびＮＯＳ２欠損マウス（ｎ＝５）に、空気中４０ ｐｐｍのＮＯを２２時間呼吸させ、ＮＯ吸入終了から１時間後に調べた。ＳＶ１２９野生型マウス（ｎ＝５）、およびＮＯＳ２欠損マウス（ｎ＝５）を対象に、エンドトキシン（１０ ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内投与して刺激した後に、空気中４０ ｐｐｍのＮＯを２２時間呼吸させ、ＮＯ吸入終了から１時間後に調べた。別のＮＯＳ２欠損マウス（ｎ＝４）は、エンドトキシン（１０ ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内投与して刺激した後に空気中４ ｐｐｍのＮＯを２２時間呼吸させ、ＮＯ吸入終了から１時間後に調べた。
【００６７】
グループ５：ＰａＯ２およびＰｖＯ２の連続測定
ＰａＯ２の評価は、ＬＭＢＯの前後に、ＳＶ１２９／Ｂ６Ｆ１野生型マウス（ｎ＝３）、およびＮＯＳ２欠損マウス（ｎ＝３）を対象に、エンドトキシン（１０ ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内投与して刺激した２２時間後に連続的に行った。ＰｖＯ２の評価は、ＬＭＢＯ前またはＬＭＢＯ中に、ＳＶ１２９／Ｂ６Ｆ１野生型マウス（ｎ＝４）およびＮＯＳ２欠損マウス（ｎ＝４）を対象に、エンドトキシン（１０ ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内投与して刺激した２２時間後に連続的に行った。生理食塩水を投与したＳＶ１２９野生型マウスでは、ＰａＯ２ （ｎ＝４）およびＰｖＯ２ （ｎ＝４）をＬＭＢＯ前またはＬＭＢＯ中に対照条件下で、事前のエンドトキシン刺激を行わずに調べた。
【００６８】
グループ６：静脈内アンギオテンシンＩＩの用量上昇に対する肺血管反応
エンドトキシンを投与したＳＶ１２９／Ｂ６Ｆ１野生型マウス（ｎ＝５）、または生理食塩水を投与した同マウス（ｎ＝３）を刺激から２２時間後に調べた。
【００６９】
実験材料の調製
マウスは、ケタミンを腹腔内に注射して麻酔した（０．１ ｍｇ／ｇ 体重）。気管切開術および動脈カテーテル法は文献の手順にしたがって行った（Ｓｔｅｕｄｅｌら、１９９７、Ｃｉｒｃ． Ｒｅｓ、８１：３４〜４１）。２ Ｆｒｅｎｃｈのフォガーティ（Ｆｏｇａｒｔｙ）動脈塞栓形成用カテーテル（Ｂａｘｔｅｒ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｃｏｒｐ．、Ｉｒｖｉｎｅ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、ＵＳＡ）を接続した特注の気管内チューブ（２２Ｇ Ａｎｇｉｏｃａｔｈ；Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｓａｎｄｙ、Ｕｔａｈ、ＵＳＡ）を気管内に挿入した。フォガーティカテーテルのバルーンチップは当初は気管内に残した。従量式の換気を、１１０〜１２０回／分の呼吸速度、ＦｉＯ２＝１．０、最大吸気圧＝１３ ｃｍ Ｈ２Ｏ、および呼気終末陽圧＝２〜３ ｃｍ Ｈ２Ｏで開始した。右傍胸骨の開胸を行い、小血管用の超音波フロー プローブ（１ＲＢ；Ｔｒａｎｓｏｎｉｃ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｉｔｈａｃａ、ＮＹ）を右肺動脈の周囲に配置し、マイクロマニピュレーター（Ｘ−ｔｒａ Ｈａｎｄ；ＴｅｃｈｎｉＴｏｏｌ、Ｐｌｙｍｏｕｔｈ、ＰＡ）を用いて所定の位置に固定した。４−０絹縫合糸を、左主肺動脈周囲に巻いて一過的に血管を閉鎖させた。肺動脈用カテーテル（ＰＥ１０）を直接穿刺して主肺動脈内に挿入した。別の実験では、胸部下行動脈フロー プローブを文献の手順で配置した（Ｓｔｅｕｄｅｌら、前掲）。
【００７０】
一部の調査では、右中間葉に至る肺静脈に、ＰＥ１０チューブに接続してマイクロクリップで固定した３０Ｇの針で穴を開けて左心房圧（ＰＬＡ）の評価を行った。大動脈内の酸素分圧（ＰａＯ２）を測定する際には、可動性のポーラログラフ クラーク型ＰＯ２電極（ＬＩＣＯＸ Ａ３−Ｒｅｖｏｘｏｄｅ、１．５ Ｆｒ．；ＧＭＳ−Ｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ ｆｕｅｒ ｍｅｄｉｚｉｎｉｓｃｈｅ Ｓｏｎｄｅｎｔｅｃｈｎｉｋ、Ｋｉｅｌ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を頚動脈経由で大動脈弓に進めた。肺動脈中の酸素分圧（ＰｖＯ２）を測定する際には、右心室流出路に穴をあけ、酸素電極を肺動脈に進めた。電極は、各実験の前後に大気圧の空気中で、試験用プローブバレルを用いて較正した。麻酔は、腹腔内にケタミン（０．１ ｍｇ／ｇ 体重）、およびキシラジン（０．０１ ｍｇ／ｇ 体重）を、筋肉を弛緩させるための腹腔内パンクロニウム（０．００２ ｍｇ／ｇ 体重）とともに注射することで維持した。
【００７１】
血流および血圧の測定
平均体動脈圧（ＰＳＡ）、平均肺動脈圧（ＰＰＡ）、および一部の試験ではＰＬＡを、医用増幅器（Ｈｅｗｌｅｔｔ Ｐａｃｋａｒｄ ８８０５Ｃ、Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、ＣＡ；Ｓｉｅｍｅｎｓ Ｓｉｒｅｃｕｓｔ ９６０、Ｄａｎｖｅｒｓ、ＭＡ）を用いて連続的にモニタリングした。胸部下行動脈流（ＱＬＴＡＦ）、および右肺動脈流（ＱＲＰＡ）の平均は、フローメーター（Ｔ１０６；Ｔｒａｎｓｏｎｉｃ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）に接続した小血流用プローブで測定した。一部の実験では、左心室の拡張終期圧を１．４ Ｆｒ．のミラー（Ｍｉｌｌａｒ）カテーテルで測定した。このカテーテルは右頚動脈を介して左心室に進めた。測定したすべてのシグナルは、アナログ−デジタル変換器に転送し、コンピュータスクリーン上に表示させ、またパソコン上でデータ収集システム（ＤＩ ２２０；Ｄａｔａｑ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ａｋｒｏｎ、ＯＨ）を用いて６４０ Ｈｚで記録した。すべてのモニタリング装置は、各実験前に較正を行った。
【００７２】
左右の肺動脈流の差の測定
ＱＲＰＡおよび左肺動脈流（ＱＬＰＡ）の総肺動脈流（ＱＰＡ）に対する寄与を評価するために、左肺動脈（ＱＬＰＡ）を一過的に（９０秒）閉鎖した。短期の左肺動脈閉鎖中におけるＱＲＰＡはＱＰＡ（心拍出量）とみなし、ＱＬＴＡＦとよく相関した（ｒ２＝０．８８；ｙ＝０．９５ｘ＋０．３８；ｎ＝９）。ＱＬＰＡは、左肺動脈閉鎖中のＱＲＰＡ （ＱＰＡ）と、開存性左肺動脈のＱＲＰＡとの差として算出した（ＱＬＰＡ＝ＱＰＡ−ＱＲＰＡ）。個々の流量の絶対値を記録し、左右肺に至る流量分布の比率（ＱＲＰＡ／ＱＰＡおよびＱＬＰＡ／ＱＰＡ）を算出した。
【００７３】
ＱＰＡは、左肺動脈（ＱＬＰＡ）の一過性の閉鎖中にＱＲＰＡを測定して評価した。これは胸部下行動脈の測定時に血流が上肢および頭部へ失われるからである。また別のフロー プローブを加えるとエラーを生じる恐れが大きくなる。というのは、マウスの大きさが小さく、マウスに対する外科的損傷およびストレスが大きくなるためである。
【００７４】
一側性の肺胞低酸素
局所的（左肺）肺胞低酸素を誘導するために、フォガーティ（Ｆｏｇａｒｔｙ）カテーテルを左主気管支に進め、直視下でバルーンチップを膨張させることで左主気管支を可逆的に閉鎖した（ＬＭＢＯ）。左肺の完全な萎縮が約１分以内に視認され、右肺の一過性の過膨張により確認された。ＰＰＡ、ＰＳＡ、およびＱＲＰＡはＬＭＢＯ中に連続的に測定した。一部の実験では、萎縮した左肺を、窒素中に５％ ＣＯ２ を含む気体で再膨張させ、最大気道内圧を３０ ｃｍ Ｈ２Ｏとした。ＱＬＰＡは、ＬＭＢＯの前と５分後に測定した。
【００７５】
アンギオテンシンＩＩの注入
無菌性の生理食塩水に溶解したアンギオテンシンＩＩを増量しながら（０．０５、０．５、および５．０ ｎｇ／ｇ 体重／分）、注入ポンプ（ポンプ１１；Ｈａｒｖａｒｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ Ｃｏ．、Ｓｏｕｔｈ Ｎａｔｉｃｋ、ＭＡ）を用いて中心静脈カテーテルを介して注入した。ＰＬＡ、ＰＰＡ、ＰＳＡ、およびＱＬＴＡＦを連続的に測定した。
【００７６】
追加的なＮＯの呼吸
マウスは特注のチャンバー内で飼育した（Ｓｔｅｕｄｅｌら、前掲）。このチャンバー内で、吸入酸素分圧（ＦｉＯ２）を０．２１として、４０ ｐｐｍのＮＯを吸気用混合ガスに添加して、２２時間自然に呼吸させた。曝露後にマウスをチャンバーから出し、麻酔誘導中は空気を呼吸させた。血行動態測定値は、チャンバーから出してから６０分後に得た。測定中のマウスは、ＮＯを追加することなく、ＦｉＯ２を１．０として機械的に換気させた。
【００７７】
肺血流測定値の検証
生理食塩水を投与した野生型マウス（ｎ＝５）については、発明者らは、蛍光標識微粒子の静脈内投与を用いて得られた肺血流分布の比率の同時測定値（Ｇｌｅｎｎｙら、１９９３、Ｊ． Ａｐｐｌ． Ｐｈｙｓｉｏｌ． ７４：２５８５〜２５９７）を、本明細書に記載された超音波フロー プローブで得られた値と比較した。ＬＭＢＯ前に、５０，０００個の着色微粒子（１５−μｍ ＮｕＦｌｏｗ Ｓｐｈｅｒｅｓ；Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｖｅ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｌｔｄ．、Ｗｅｓｔ Ｌｏｓ Ａｎｇｅｌｅｓ、ＣＡ）を、凝集を防ぐための０．０５％ Ｔｗｅｅｎ−８０界面活性剤を含む０．２ ｍＬの生理食塩水に懸濁し、ボルテックスミキサーで混合後すぐに頚静脈カニューレを介して３０秒以上かけて注入した。注入完了後、カテーテルを０．１ ｍＬの生理食塩水で洗浄した。ＬＭＢＯの５分後に、微粒子の注入を、異なる色の微粒子を用いて行った。マウスを殺し、肺を摘出して個別に秤量した。組織試料は、フローサイトメトリー分析で全ての微粒子カウントを調べた。左右の肺に至る肺血流の比率は、両方の肺における総球体数に対する、左右の肺に至る総球体数として算出した。
【００７８】
また、生理食塩水を投与した別の野生型マウス（ｎ＝６）を対象に、肺血流のＬＭＢＯ誘導性の再分布が左肺血管抵抗の上昇を反映していることを確認するために、発明者らは、下大静脈の一過性の閉鎖中にＱＬＰＡを直接測定し、左肺動脈圧と血流の関係の傾きと切片を算出した。
【００７９】
肺の湿重量と乾燥重量の比
ペントバルビタール（０．１ ｍｇ／ｇの腹腔内投与）で安楽死させた後に、肺門部を除く両肺を摘出し、水分を拭きとり、直ちに秤量した。その後、組織をマイクロ波加熱炉内で文献（２０）に記載された方法で６０分間かけて乾燥させ、再び秤量した。肺の湿重量と乾燥重量の比を算出した。
【００８０】
統計解析
肺血流の変化を、ベースラインの血流に対する減少率（％）で表す。群間の差は二元配置ＡＮＯＶＡで検出した。ＡＮＯＶＡで有意差が検出された場合は、事後的なフィッシャー検定を行った（Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａ ｆｏｒ Ｗｉｎｄｏｗｓ；ＳｔａｔＳｏｆｔ Ｉｎｃ．、Ｔｕｌｓａ、ＯＫ）。０．０５未満のＰ値は有意差を意味する。すべてのデータは平均±ＳＥＭで表す。
【００８１】
結果
一側性の肺胞低酸素が肺血流に及ぼす作用
インビボにおけるＨＰＶを評価するために、発明者らは、肺血流の測定値の差が、左肺の一側性肺胞低酸素の前と間に得られるマウスモデルを開発した（図９Ａ〜９Ｃ）。右主気管支を閉鎖すると、重度の低酸素となり、また血行動態が不安定化するので、発明者らは、左主気管支を閉鎖する（ＬＭＢＯ）こととした。これは一側性肺萎縮の安定なモデルとなる。肺血流の差は、右肺動脈の周囲に配置した超音波フロー プローブを用いて開胸中に測定し、また左右肺間における流量分布は、左肺動脈を一過的に閉鎖することで評価した（図９Ａ〜９Ｃ）。
【００８２】
図９Ａ〜９Ｃは、ＬＭＢＯ前（図９Ａ）、ＬＭＢＯ開始時（図９Ｂ）、およびＬＭＢＯ開始から５分後（図９Ｃ）に、一過的に左肺動脈（ＬＰＡ）を適宜閉鎖して測定した肺および全身の血行動態の代表的な動脈圧曲線である。左肺動脈流を一過的に閉鎖しても、全身性の血行動態作用は何ら生じなかった（図９Ａ）。肺全体の萎縮はＬＭＢＯの約１分後にみられた。生理食塩水を投与した野生型マウスを対象に、右肺動脈を介した平均流量（ＱＲＰＡ）、平均肺動脈圧（ＰＰＡ）、平均体動脈圧の平均（ＰＳＡ）、および平均気道内圧（ＰＡＬＶ）のベースラインとＬＭＢＯ後におけるオンライン記録を示す。左右の肺動脈間の血流分布を評価するために、左肺動脈を一過的に閉鎖した。この時点ではＱＲＰＡ＝ＱＰＡとなる（図９Ａおよび図９Ｃを参照）。ＱＰＡとＱＲＰＡとの差はＱＬＰＡに等しい。測定値は、ベースラインとＬＭＢＯ開始から５分後に得た。矢印は、閉鎖（９０秒間）、および左肺動脈の解放を意味する。以上の代表的な動脈圧曲線は、マウスの肺血流分布をインビボで測定できることを意味している。
【００８３】
図１０Ａ〜１０Ｃは、マウスの肺血流分布を測定する方法の検証に用いた実験的アプローチを示す。図１０Ａは、蛍光微粒子（直径１５ μｍ）の静脈内注入により、また超音波フロー プローブを用いたＱＲＰＡの同時測定により評価された左肺または右肺に至る肺血流率（％）に相関があることを示す。後者の方法では、左右の肺動脈間で異なる血流分布を、左肺動脈を一過的に閉鎖することで評価した。値は、ＬＭＢＯの前後における左右の肺に至る流量比として表す（生理食塩水を投与した野生型マウス；ｎ＝４）。２つの方法がよく一致することに注意されたい（ｒ２＝０．９６７）。図１０Ｂは、生理食塩水を投与した野生型マウス（ｎ＝６）を対象に、ＬＭＢＯの前（ベースライン）と、ＬＭＢＯ開始から５分後における左肺の流量と圧力の関係を調べた実験の結果を示す。ＬＭＢＯにより誘導される左肺血管抵抗の増分の上昇を意味する傾きに有意な上昇がみられることに注意されたい。以上の調査では、左肺動脈流（ＱＬＰＡ）は、超音波フロー プローブを用いて直接測定し、その傾きは、下大静脈を一過的に閉鎖して得たＱＰＡを差引くことで得た（Ｐ＜０．０５、傾きはベースラインに対して異なる）。図１０Ｃは、生理食塩水を投与した野生型マウス（ｎ＝３）を対象に、萎縮した左肺の再拡張中における左肺全体の肺血管抵抗（ＴＬＰＶＲ）の変化を示す。左肺は、最大吸気圧が３０ ｃｍ Ｈ２Ｏになるまで５％ ＣＯ２（窒素中）を連続注入して膨張させた。値は、個々の信頼区間を９５％とした、全データ点の線形回帰として表す。以上の結果から、ＬＭＢＯ後の肺血流の再分布は低酸素には関連づけられるが、左肺の萎縮には関連づけられないことがわかった。
【００８４】
ＬＭＢＯ前には、血行動態パラメータは、野生型マウスとＮＯＳ２欠損マウスとで変わらなかった。ＬＭＢＯ開始の５分後に、ＱＬＰＡ／ＱＰＡは、生理食塩水を投与した野生型マウスで４６±５％低下し、また生理食塩水を投与したＮＯＳ２欠損マウスで５０±７％低下した（図７）。左肺動脈周囲のフロー プローブを用いてＱＬＰＡを直接測定した追加実験では、発明者らは、ＬＭＢＯ誘導性の肺血流の再分布が、左肺血管抵抗の１０２±１８ ｍｍＨｇ・分・ｇ・ｍＬ−１から２１０±３８ ｍｍＨｇ・分・ｇ・ｍＬ−１への上昇を反映しているという結果を得た（図１０Ｂ）。ＬＭＢＯ誘導性の肺血流再分布は、萎縮した肺を直接観察しながら５％ ＣＯ２（窒素中）で正常肺容積まで再び膨張させても、左肺の血管抵抗（ＬＰＶＲ）が変化しなかったことから、左肺の萎縮に関連する機械的因子に関連づけることはできなかった（ｎ＝３、図１０Ｃ）。
【００８５】
エンドトキシン血症が一側性の肺胞低酸素で肺および全身の血行動態に及ぼす影響
１０ ｍｇ／ｋｇの大腸菌エンドトキシンを腹腔内に注入して刺激した後、マウスには起毛および下痢を伴う嗜眠がみられた。約５０％のマウスが、エンドトキシン刺激から１週間以内に死亡し、野生型マウスとＮＯＳ２欠損マウスとの間に死亡率の差は認められなかった（データは示していない）。ＬＭＢＯ前には、生理食塩水を投与したマウスとエンドトキシンを投与したマウス間で血行動態パラメータに差は認められなかった（図１２）が、ＱＰＡは、エンドトキシンを投与した野生型マウスの方が、ＮＯＳ２欠損マウスより高くなる傾向がみられた（２３０±３５ 対 １２０±３２ μＬ・分−１・ｇ−１ 体重）が、この差は有意差とはならなかった。すべての試験対象のエンドトキシンで刺激した野生型マウスおよびＮＯＳ２欠損マウスのＱＰＡを比較したところ、２つの遺伝子型間に有意差がないことが確認された（野生型マウス のＱＰＡ＝１８０±２０ μＬ／分／ｇ；ＮＯＳ２欠損マウスのＱＰＡ＝１４０±１５ μｌ／分／ｇ；それぞれｎ＝２１およびｎ＝１５）。ＱＰＡの差は、肺血流再分布に影響を及ぼすことがあるので、発明者らは、ＱＬＰＡ／ＱＰＡの変化がＱＰＡの変化に依存するか否かを検討した。線形回帰分析の結果、ＬＭＢＯ中はＱＰＡとＱＬＰＡ／ＱＰＡの間に相関がないことがわかった（全マウス、および全てのエンドトキシン投与マウスについてｒ２＝０．０３）（Ｐ＜０．００１；図７）。ＬＭＢＯ後にＱＬＰＡ／ＱＰＡは、生理食塩水を投与した野生型マウスで４６±５％低下し、またエンドトキシンを投与した野生型マウスで１８±５％低下した。これとは対照的に、ＬＭＢＯはＱＬＰＡ／ＱＰＡを、生理食塩水を投与したＮＯＳ２欠損マウスで５０±７％低下させ、エンドトキシンを投与したＮＯＳ２欠損マウスで５１±６％低下させた（図７）。エンドトキシンに対する反応性は、ＳＶ１２９、ＳＶ１２９Ｂ６Ｆ１、もしくはＣ５７ＢＬ／６野生型系列間で差は認められず、ＳＶ１２９／Ｂ６Ｆ１雑種バックグラウンドをもつＮＯＳ２欠損マウスと、１０世代にわたってＣ５７ＢＬ／６のバックグラウンドと戻し交配したＮＯＳ２欠損マウスとの間にも差は認められなかった（データは示していない）。
【００８６】
一側性の肺胞低酸素中にエンドトキシンを血症がＰａＯ２およびＰｖＯ２に及ぼす影響
野生型マウスおよびＮＯＳ２欠損マウスでエンドトキシン刺激後にみられるＬＭＢＯ誘導性の肺血流再分布にみられる差が、動脈酸素化におけるＬＭＢＯ誘導性の変化の差を反映したものであるか否かを判定するために、ＬＭＢＯ前およびＬＭＢＯ中ＰａＯ２を連続的に測定した。エンドトキシンを投与した別の野生型マウスおよびＮＯＳ２欠損マウスでは、ＬＭＢＯがＰｖＯ２に及ぼす影響も評価した。ＦｉＯ２ １．０で呼吸させ、生理食塩水を投与した野生型マウス（ｎ＝４）では、５分間のＬＭＢＯにより、ＰａＯ２は４３２±７ ｍｍＨｇから２２５±１３ ｍｍＨｇに低下した。ＰａＯ２は、エンドトキシンを投与した野生型マウスで３４２±２３ ｍｍＨｇであり、エンドトキシンを投与したＮＯＳ２欠損マウスでは３４７±３３ ｍｍＨｇであった。ＬＭＢＯの５分後に、ＰａＯ２は、エンドトキシンを投与した野生型マウスの方（１４５±９ ｍｍＨｇ）が、エンドトキシンを投与したＮＯＳ２欠損マウスと比べて大きく低下した（２３０±１８ ｍｍＨｇ；Ｐ＜０．０５；図１１）。
【００８７】
ＰｖＯ２には、エンドトキシンを投与した野生型マウスと、エンドトキシンを投与したＮＯＳ２欠損マウスとの間で差は認められなかった（ＬＭＢＯ前：それぞれ３９±５ ｍｍＨｇおよび４４±８ ｍｍＨｇ；ＬＭＢＯ後：それぞれ３４±４ ｍｍＨｇおよび４３±７ ｍｍＨｇ；両群についてｎ＝３）。
【００８８】
ＮＯＳ２活性の長期薬理的阻害
ＮＯＳ２の長期の薬理的阻害がＨＰＶを維持するか否かを判定するために、野生型マウス（ｎ＝５）の腹腔内に１０ ｍｇ／ｋｇのエンドトキシンを注射し、その３時間後に、ＮＯＳ２活性の選択的阻害剤であるＬ−ＮＩＬ （５ ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内投与した。この用量のＬ−ＮＩＬは、野生型マウスで、エンドトキシン刺激から７時間後の時点で肺のｃＧＭＰ量の上昇を十分防いでいた（データは示していない）。肺血流の調査をエンドトキシン刺激の２２時間後に行った。Ｌ−ＮＩＬを投与した、エンドトキシンに曝露させたマウスでは、発明者らは、ＬＭＢＯ前の全身と肺の血行動態に、生理食塩水を投与した野生型マウス、またはエンドトキシンを投与した野生型マウスとの間に差がないことを確認した。ＱＬＰＡ／ＱＰＡの低下は、Ｌ−ＮＩＬを投与したエンドトキシンで刺激した野生型マウスの方が、エンドトキシンのみの投与を受けた野生型マウスと比較して大きかった（それぞれ５３±１０％ 対 １８±５％；Ｐ＜０．０１；図７）。
【００８９】
ＮＯＳ２のＬ−ＮＩＬによる短期薬理的阻害
ＮＯＳ２酵素活性の短期阻害が、ＬＭＢＯ中にＨＰＶを増強するか否かを判定するために、肺血流の調査を、生理食塩水を投与した野生型マウスとエンドトキシンを投与した野生型マウスを対象に、Ｌ−ＮＩＬ（５ ｍｇ／ｋｇ）をＬＭＢＯ後に腹腔内投与して行った。生理食塩水を投与した野生型マウス（ｎ＝５）では、短期Ｌ−ＮＩＬ投与は、ＬＭＢＯ中にＱＬＰＡ／ＱＰＡをさらに低下させることはなかった（Ｌ−ＮＩＬ 投与前＝４９±３％、Ｌ−ＮＩＬ投与後＝５６±３％）。他のすべての血行動態パラメータは、Ｌ−ＮＩＬ注射後に変化しなかった。エンドトキシンを投与してから２２時間後の野生型マウス（ｎ＝４）では、短期Ｌ−ＮＩＬの投与は、ＬＭＢＯ中にＱＬＰＡ／ＱＰＡをさらに低下させることはなかった（Ｌ−ＮＩＬ投与前＝２２±１１％の低下、Ｌ−ＮＩＬ投与後＝２４±１８％の低下）。
【００９０】
４ ｐｐｍまたは４０ ｐｐｍのＮＯの長期吸入
別のＮＯＳ２産物ではなく、肺のＮＯ量の増加が、エンドトキシン誘導性のＨＰＶの低下に寄与するか否かを知るために、生理食塩水を投与した野生型マウスおよびＮＯＳ２欠損マウス、ならびにエンドトキシンを投与した野生型マウスおよびＮＯＳ２欠損マウスを対象に、４０ ｐｐｍのＮＯ（空気中）を２２時間にわたって呼吸させた。血行動態の調査を１時間後に行い、吸入されたＮＯによる潜在的な血管拡張作用が散逸するのに十分な時間をおいた。４０ ｐｐｍのＮＯを２２時間呼吸させても、生理食塩水を投与したマウスのＨＰＶとＮＯＳ２欠損マウスのＨＰＶは低下しなかった。ＬＭＢＯ後におけるＱＬＰＡ／ＱＰＡの低下は、２２時間に及ぶ４０ ｐｐｍのＮＯの呼吸後において、生理食塩水を投与した野生型マウスでは５１±１０％であり、生理食塩水を投与したＮＯＳ２欠損マウスでは５０±１１％であった（図７）。心拍数にわずかな差がみられたことを除いて、ＬＭＢＯ前の血行動態に他の差は、４０ ｐｐｍのＮＯを２２時間かけて長期吸入曝露させた、エンドトキシンを投与したマウスと、生理食塩水を投与したマウスとの間に認められなかった（図１２）。長期にわたる４０ ｐｐｍ ＮＯの吸入後に、エンドトキシンを投与したＮＯＳ２欠損マウスにおけるＨＰＶの減弱は、追加的なＮＯを呼吸させなかったエンドトキシンを投与したＮＯＳ２欠損マウスと比べて顕著であった（ＱＬＰＡ／ＱＰＡの低下はそれぞれ２０±７％ 対 ５０±１％；Ｐ＜０．０５；図７）。これとは対照的に、長期ＮＯ吸入は、野生型マウスのエンドトキシン誘導性のＨＰＶ低下には影響しなかった（ＱＬＰＡ／ＱＰＡの低下：４０ ｐｐｍ ＮＯを２２時間呼吸させたエンドトキシンを投与させた野生型マウスで１９±１０％、これに対し、ＮＯ曝露のないエンドトキシンを投与した野生型マウスでは１８±５％；図７）。これとは対照的に、４ ｐｐｍのＮＯを２２ 時間呼吸させても、エンドトキシンを投与したＮＯＳ２欠損マウスでＨＰＶは低下しなかった（ＱＬＰＡ／ＱＰＡの低下：６２±２％；ｎ＝４）。
【００９１】
アンギオテンシンＩＩに対する肺血管反応性
エンドトキシンがＨＰＶに及ぼす影響を、肺血管収縮機能に及ぼすエンドトキシンの非特異的な作用に関連づけられるか否かを判定するために、発明者らは、生理食塩水を投与した野生型マウス、およびエンドトキシンで刺激後２２時間における野生型マウスを対象に、アンギオテンシンＩＩの静脈内用量の上昇に対する肺血管収縮反応を測定した。アンギオテンシンＩＩ （５．０ μｇ／ｋｇ／分）を投与すると、ＰＶＲは、生理食塩水を投与した野生型マウス（エンドトキシン非投与）ではベースラインにおける７４±２４ ｍｍＨｇ・分・ｇ・ｍＬ−１から１８４±２５ ｍｍＨｇ・分・ｇ・ｍＬ−１に上昇し（Ｐ＜０．０１）、またエンドトキシンで刺激した野生型マウスでは５５±１１ ｍｍＨｇ・分・ｇ・ｍＬ−１から１７４±４０ ｍｍＨｇ・分・ｇ・ｍＬ−１に上昇した（Ｐ＜０．００１）。任意のアンギオテンシンＩＩ注入用量レベルにおいて、エンドトキシンを投与したマウスと生理食塩水を投与したマウスとの間にＰＶＲの差は認められなかった。ベースラインにおけるＰＬＡは、生理食塩水を投与した野生型マウス（６±１ ｍｍＨｇ）と、エンドトキシンを投与した野生型マウス（５±１ ｍｍＨｇ）との間で差はなく、またＰＬＡは、いずれの群でもアンギオテンシンＩＩ注入に反応した変化は認められなかった。
【００９２】
肺の湿重量と乾燥重量の比
肺の湿重量／乾燥重量の比は、エンドトキシンで刺激した野生型マウス（湿重量／乾燥重量：５．０±０．５）とＮＯＳ２欠損マウス（４．６±０．２）間で差はなく、生理食塩水を投与した野生型マウス（４．６±０．１）と生理食塩水を投与したＮＯＳ２欠損マウス（４．５±０．１）間でも差はなかった。４ ｐｐｍまたは４０ ｐｐｍのＮＯを２２時間呼吸させても、肺の湿重量と乾燥重量の比に変化は認められなかった。
【００９３】
実験の概要および解釈
敗血症におけるＨＰＶ低下にＮＯおよびＮＯＳ２が果す役割を調べるために、発明者らは、ＬＭＢＯにより生じる一側性の肺胞低酸素に反応した肺血流再分布を評価するマウスのインビボモデルを開発した。エンドトキシンに曝露しなかったマウスでは、ＬＭＢＯは左肺のＰＶＲを２倍にすることで、左肺血流を右肺に５０％を迂回させ、ＰａＯ２を若干低下させた。開胸時に超音波フロー プローブで測定されたマウスの肺血流分布の変化は、蛍光微粒子の静脈内注入で得られた測定値と強く相関しており（図１０Ａ参照）、大型動物モデルを対象に研究を行っている研究者によって報告された値と同等であった（Ｄｏｍｉｎｏら、１９８４、Ａｎｅｓｔｈｅｓｉｏｌｏｇｙ ６０：５６２〜５６６；Ｓｐｒａｇｕｅら、１９９２、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８９：８７１１〜８７１５）。
【００９４】
エンドトキシンで刺激してから２２時間後の野生型マウスでは、発明者らは、肺の局所的な低酸素に応じて肺血流を再分布する能力が大きく低下しており、体動脈の酸素化の顕著な悪化に至ることを認めた。このようなマウスにおけるエンドトキシン誘導性の肺血流再分布の低下は、生菌（Ｆｉｓｃｈｅｒら、１９９７、Ａｍ． Ｊ． Ｒｅｓｐｉｒ． Ｇｒｉｔ． Ｃａｒｅ Ｍｅｄ． １５６：８３３〜８３９）またはエンドトキシン（Ｈｕｔｃｈｉｓｏｎら、１９８５、Ｊ． Ａｐｐｌ． Ｐｈｙｓｉｏｌ． ５８：１４６３〜１４６８）による静脈内刺激後の覚醒状態のヒツジで観察された結果と同等である。
【００９５】
エンドトキシン誘導性のＨＰＶ低下は、血管運動性の収縮装置の非特異的な機能不全に起因するのではないようであった。というのは、発明者らは、アンギオテンシンＩＩのもつ、肺の脈管系の収縮能力に、エンドトキシンで刺激したマウスと生理食塩水を投与したマウスとの間で差がないことを確認したからである。また、エンドトキシンがマウス肺の脈管系に及ぼす有害な作用は、エンドトキシンの投与から１４日後におけるＨＰＶの回復と可逆的であった（データは示していない）。
【００９６】
エンドトキシンで刺激してから２２時間後のＮＯＳ２欠損マウスでは、ＬＭＢＯ中にＨＰＶは低下せず、体動脈の酸素化は維持されていた。同様にＨＰＶは、エンドトキシン刺激の３時間後に、ＮＯＳ２酵素活性の特異的阻害剤であるＬ−ＮＩＬを投与した野生型マウスで維持されていた。以上の結果から、ＮＯＳ２酵素活性が、エンドトキシン誘導性のＨＰＶ低下の誘導に極めて重要なことがわかる。
【００９７】
ＬＭＢＯ直後のＬ−ＮＩＬの短期投与はＨＰＶを回復しなかったので、エンドトキシン刺激から２２時間後の野生型マウスにおけるＨＰＶの低下が、肺ＮＯ量が過剰であることと結びつく可能性は低い。以上の結果から、エンドトキシン誘導性の肺のＮＯＳ２発現が、ＨＰＶの低下に必要であるが、ＮＯＳ２活性の継続は、エンドトキシン刺激から２２時間後に測定されるＨＰＶの低下に必要でないことがわかる。
【００９８】
特定の条件では、ＮＯＳ２は、ＮＯのほかにスーパーオキシドを産生する（２８）。発明者らは、ＮＯＳ２により産生されるＮＯが、エンドトキシンで刺激したＮＯＳ２欠損マウスに肺のＮＯ量を吸入補充することでエンドトキシン誘導性のＨＰＶ低下に寄与するか否かを調べた。ＮＯＳ２欠損マウスをエンドトキシンで刺激し、さまざまな濃度のＮＯを含む曝露用チャンバー内で２２時間飼育した。ＬＭＢＯに反応した肺血流再分布は、チャンバーから出してから１時間後に測定した。この時点までには、肺のＮＯ量が上昇することはないと予測される。４０ ｐｐｍのＮＯを呼吸させたエンドトキシンで刺激したＮＯＳ２欠損マウスではＨＰＶは低下していた（図７を参照）。これとは対照的に、４ ｐｐｍのＮＯを２２ 時間呼吸させても、エンドトキシンを投与したＮＯＳ２欠損マウスでＨＰＶは低下しなかった。以上のデータは、著しく上昇した肺のＮＯ量（ＮＯＳ２により内因的に産生されたＮＯ、または吸入により供給されたＮＯ）が、ＨＰＶの低下に必要であることを示唆している。マウスを対象に発明者らが得た結果をヒトに外挿するのであれば、発明者らの研究の重要な臨床上の意味は、高濃度の吸入ＮＯの、肺に炎症を有する患者への投与が、ＨＰＶを減弱させて、動脈の酸素化の逆説的な低下に至らせる可能性があるということである。また以上の結果は、急性呼吸不全患者を治療する際に、吸入ＮＯの可能な限り低い有効濃度を使用している現在の医療状況を示唆している（Ｚａｐｏｌ、１９９３、Ｉｎｔｅｎｓｉｖｅ Ｃａｒｅ Ｍｅｄ． １９：４３３〜４３４）。
【００９９】
生理食塩水を投与した野生型マウスおよびＮＯＳ２欠損マウスでは、４０ ｐｐｍのＮＯを２２ 時間吸入させても、マウスを曝露チャンバーから出して１時間後に調べてもＨＰＶは低下しなかった（図７を参照）。この結果は、肺のＮＯ量の持続的な上昇のみでは、持続的なＨＰＶ低下を十分誘導できないことを示唆している。また、４０ ｐｐｍのＮＯを２２時間呼吸させても、エンドトキシンで刺激した野生型マウスのＨＰＶは、それ以上低下しなかった。したがって、吸入されたＮＯ、およびエンドトキシン誘導性の肺のＮＯの産生は、ＨＰＶ低下に付加的に作用しないと考えられる。発明者らの得た結果は、エンドトキシン刺激後におけるＨＰＶの持続的な低下には、肺のＮＯ量の上昇、および付加的なエンドトキシン誘導性の炎症性産物の増加の両方が必要であることを示唆している。
【０１００】
実施例３：ロイコトリエンブロッカーおよびＨＰＶの低下
ロイコトリエン合成の阻害物質、およびロイコトリエン受容体活性化の阻害物質が、エンドトキシンで刺激したマウスにおけるＨＰＶ低下を防ぐことを示す実験的証拠が得られている。発明者らは、５−リポキシゲナーゼ活性化タンパク質（ＦＬＡＰ）が存在する場合に、アラキドン酸からロイコトリエンＡ４への変換を触媒する５ＬＯを欠くエンドトキシンで刺激したマウスでＨＰＶが維持されることを確認している。発明者らは、野生型マウスでは、ＦＬＡＰ阻害物質ＭＫ８８６、またはＣｙｓＴ１受容体ブロッカーＭＫ５７１を投与したエンドトキシンで刺激したマウスではＨＰＶが維持されることを確認している。このような実験で発明者らは、片肺低酸素のインビボマウスモデルを用いた。
【０１０１】
野生型マウス（ＳＶ１２９Ｂ６／Ｆ１）、および５ＬＯ欠損マウスを麻酔し、開胸して調べた。左肺動脈流（ＱＬＰＡ）、ならびに肺動脈圧（ＰＰＡ）および体動脈圧（ＰＳＡ）を連続的に測定した。左肺循環における圧力と流量の関係は、下大静脈を一過的に閉鎖することで得た。
【０１０２】
左主気管支閉鎖（ＬＭＢＯ）後における左肺の血管抵抗（Ｐ／Ｑ関係の傾き、ＬＰＶＲ）の上昇率としてＨＰＶを評価した。ＬＭＢＯにより、ＬＰＶＲは５ＬＯ欠損マウスで９９±１３％、また野生型マウスで１００±１１％上昇した。データを図１３にまとめる。以上の結果から、システイニルロイコトリエンの合成または受容体活性化を阻害すると、エンドトキシン誘導性のＨＰＶ低下を予防できることがわかった。
【０１０３】
他の態様
本発明のいくつかの態様を記載した。しかしながら、本発明の精神および範囲から解離することなく、さまざまな修正がなされることは言うまでもない。例えば本発明は、本明細書に記載された抗ＲＯＳ薬剤以外の抗ＲＯＳ薬剤およびロイコトリエンブロッカーを用いて実施されることがある。したがって他の態様は、特許請求の範囲に含まれる。
【図面の簡単な説明】
【図１】未処置の野生型マウスの単離潅流肺の肺動脈圧（ＰＡＰ；潅流圧に等しい）、および左心房圧（ＬＡＰ）を測定した代表的な実験で得られた動脈圧曲線。安定なトロンボキサンＡ２類似体Ｕ４６６１９を潅流すると、ＰＡＰが５ ｍｍＨｇまたは６ ｍｍＨｇ上昇した。ＮＯガスの各用量（０．４ ｐｐｍ、４．０ ｐｐｍ、および４０ ｐｐｍ）を各５分間投与した。投与後にＰＡＰは以前のＮＯ濃度に戻った。
【図２Ａ】リポ多糖を前投与した野生型マウス（●）、および未処置の野生型マウス（○）におけるＮＯ吸入の用量反応曲線。ＮＯ吸入に対する反応は、リポ多糖を前投与した野生型マウスでは、未処置の野生型マウスに対して低かった（＊Ｐ＜０．００１）。データは平均±ＳＥで表す。ΔＰＡＰ＝肺動脈圧の変化をＵ４６６１９誘導性の上昇に対するパーセントで表した値。
【図２Ｂ】リポ多糖を前投与したＮＯＳ２欠損マウス（■）、および未処置のＮＯＳ２欠損マウス（□）におけるＮＯ吸入の用量反応曲線。ＮＯ吸入に対する反応は、リポ多糖を投与したＮＯＳ２欠損マウスの方が、未処置のＮＯＳ２欠損マウスに対して大きく（†Ｐ＜０．０５）、またリポ多糖を前投与した野生型マウスに対して大きかった（‡Ｐ＜０．００１）。データは平均±ＳＥで表す。ΔＰＡＰ＝肺動脈血の変化をＵ４６６１９誘導性の上昇に対するパーセントで表した値。
【図３】リポ多糖を前投与した野生型マウス（ｗｔ／ＬＰＳ）、および未処置の野生型マウス（ｗｔ／対照）に由来する単離潅流肺における、短期ＮＯ吸入による血管拡張、また外気中で事前に２０ ｐｐｍのＮＯに１６時間曝露させた、リポ多糖を前投与したＮＯＳ２欠損マウス（ｋｏ／ＬＰＳ）、および未処置のＮＯＳ２欠損マウス（ｋｏ／対照）に由来する単離潅流肺における、短期ＮＯ吸入による血管拡張に関するデータをまとめたグラフ。長期ＮＯ曝露後に、リポ多糖を前投与したＮＯＳ２欠損マウスは、短期ＮＯ吸入に対する反応性が、リポ多糖投与を受けなかったＮＯＳ２欠損マウスと比べて低かった（＊Ｐ＜０．０５）。同様に、長期ＮＯ曝露後に、リポ多糖を前投与した野生型マウスの短期ＮＯ吸入に対する反応性は、リポ多糖の投与を行わなかった野生型マウスと比べて低かった（＊Ｐ＜０．０５）。データは平均±ＳＥで表す。
【図４】リポ多糖刺激後における１６時間に及ぶ０ ｐｐｍ、０．２ ｐｐｍ、２．０ ｐｐｍ、および２０ ｐｐｍのＮＯの呼吸が、ＮＯＳ２欠損マウスから回収した単離潅流肺において、０．４ ｐｐｍ ＮＯガスの短期吸入に反応した、その後の血管拡張に及ぼす作用を調べた実験で得られたデータをまとめたヒストグラム。２ ｐｐｍおよび２０ ｐｐｍのＮＯガス曝露により、ＮＯに対する肺血管拡張反応は低下した。データは平均±ＳＥで表す。１６時間の０ ｐｐｍ ＮＯ曝露に対して、＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．００１。
【図５】リポ多糖で刺激したマウス（●）および対照マウス（○）におけるＮＯ吸入、またリポ多糖と同時に、および３．５時間後に再びＮ−アセチルシステイン（１５０ ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内投与した、リポ多糖で刺激したマウス（▲）における、ＮＯ吸入に対する肺血管拡張反応を調べた実験で得られたデータをまとめたグラフ。ＮＯ吸入に対する反応は、リポ多糖を投与したマウスでは、対照マウスと比較して弱かった（＊Ｐ＜０．００１）。Ｎ−アセチルシステイン（１５０ ｍｇ／ｋｇ）の２回の投与では、ＮＯ吸入に対する血管反応性の多糖誘導性の減弱は完全に予防された。血管拡張率（％）は、Ｕ４６６１９誘導性の上昇に対する割合（％）で表した肺動脈圧の変化である。データは平均±ＳＥで表す。
【図６】事前にＮ−アセチルシステインまたは生理食塩水を同時に腹腔内に注入した、リポ多糖（ＬＰＳ）で刺激したマウス、および室内空気、または室内空気＋２０ ｐｐｍ ＮＯガスを１６時間にわたって呼吸させたリポ多糖で刺激したマウスを対象に、ＮＯ吸入に対する肺血管拡張反応を調べた実験で得られたデータをまとめたグラフ。リポ多糖で刺激したマウスにおける、ＮＯに対する肺血管拡張反応に及ぼすＮ−アセチルシステイン（１５０ ｍｇ／ｋｇ）による防御効果は、長期ＮＯ吸入中は維持されていた（＊両群におけるＬＰＳ＋生理食塩水に対してＰ＜０．０５）。
【図７】生理食塩水（対照、白いバー；ｎ＝７）、エンドトキシン（エンドトキシン、黒いバー；ｎ＝６）、またはエンドトキシン＋Ｌ−ＮＩＬ （５ ｍｇ／ｋｇ）（エンドトキシン＋Ｌ−ＮＩＬ （選択的なＮＯＳ２インヒビター）、縞模様のバー；ｎ＝５）の腹腔内投与を、エンドトキシン刺激の３時間後に行った、野生型マウス（＋／＋）およびＮＯＳ２欠損マウス（−／−）における、左主気管支閉鎖（ＬＭＢＯ）の５分後における、左肺に至る血流の変化の比率（ＱＬＰＡ／ＱＰＡ）を調べた実験で得られたデータをまとめたヒストグラム（＊Ｐ＜０．０５、エンドトキシン刺激マウス 対 対照マウス；Ｐ＜０．０１、野生型マウス 対 ＮＯＳ２欠損マウス；＃Ｐ＜０．０１ エンドトキシン＋Ｌ−ＮＩＬ刺激マウス 対 エンドトキシン単独刺激マウス）。測定値は、空気または４０ ｐｐｍ ＮＯ（空気中）の２２時間にわたる呼吸を終了してから１時間後に得た（§Ｐ＜０．０５ ＮＯ 対 ＮＯなし）。エンドトキシン刺激により、ＬＭＢＯ後における肺血流の再分布が、野生型マウスでは顕著に低下したが、ＮＯＳ２欠損マウスでは同様の低下は認められなかった。４０ ｐｐｍのＮＯの長期吸入後に、ＮＯ吸入を終了してから１時間後に測定したところ、エンドトキシンを投与したＮＯＳ２欠損マウスとエンドトキシンを投与した野生型マウスとで、ＨＰＶの喪失は同程度であった。４０ ｐｐｍ ＮＯを２２時間呼吸させた、生理食塩水を投与したＮＯＳ２欠損マウスと野生型マウスでは、ＬＭＢＯ後における肺血流再分布能力が、ＮＯ吸入終了から１時間後の測定時点で維持されていた。
【図８】ＬＭＢＯに対する、左肺血管抵抗の増分変化ΔｉＬＰＶ（低酸素肺血管収縮（ＨＰＶ）の尺度の一つ）を測定した実験で得られた結果をまとめたヒストグラム。ＨＰＶは、エンドトキシンで刺激した野生型マウスでは低下していた（ＥＴＸ；＃Ｐ＜０．０５、生理食塩水で刺激したマウスに対して）。ＨＰＶは、５００ ｍｇ／ｋｇのＮ−アセチルシステイン（ＮＡＣ；エンドトキシンと同時）を腹腔内投与したマウスでは維持されていた（‡Ｐ＜０．０５、未処置のエンドトキシン刺激マウスに対して）が、１５０ ｍｇ／ｋｇのＮ−アセチルシステインを投与したマウスでは維持されていなかった（＊Ｐ＜０．０５、生理食塩水で刺激したマウスに対して）。ＨＰＶは、スーパーオキシド、過酸化水素、および過酸化亜硝酸のスカベンジャーであるＥＵＫ−８を投与した、エンドトキシンで刺激したマウスでは完全に維持されていた（‡Ｐ＜０．０５、未処置のエンドトキシン刺激マウスに対して）。
【図９Ａから９Ｃ】一過性の左肺動脈（ＬＰＡ）閉鎖を適宜行ったときの、ＬＭＢＯの前後における肺および全身の血行動態測定の代表的な動脈圧曲線。ＬＭＢＯで誘導される一側性の肺胞低酸素が、ＬＭＢＯ前およびＬＭＢＯ中（ｂおよびｃ）に、中心血行動態に及ぼす作用を示す。肺胞全体の虚脱は、ＬＭＢＯを開始してから約１分後にみられた。生理食塩水を投与した野生型マウスのベースライン時、およびＬＭＢＯ後における、右肺動脈（ＱＲＰＡ）経由の平均流量、平均肺動脈圧（ＰＰＡ）、平均体動脈圧（ＰＳＡ）、および平均気道内圧（ＰＡＬＶ）の連続記録を示す。左右の肺動脈間における血流分布を評価するために左肺動脈を一過的に閉鎖した（この時点でＱＲＰＡ＝ＱＰＡとなる（ａおよびｃを参照））。ＱＰＡからＱＲＰＡを引いた値はＱＬＰＡに等しい。測定値は、ベースライン時とＬＭＢＯ開始から５分後に得た。矢印は、左肺動脈の閉鎖（９０秒）および解放を意味する。
【図１０Ａ】蛍光微粒子（直径１５ μｍ）の静脈内注入により評価した、また超音波フロー プローブを用いたＱＲＰＡの同時測定により評価した、左右の肺に至る肺血流率（％）に相関があることを示すグラフ。値は、ＬＭＢＯの前後における、左右の肺に至る流量の比率として表す（生理食塩水を投与した野生型マウス；ｎ＝４）。２つの方法がよく一致することに注意されたい（ｒ２＝０．９６７）。
【図１０Ｂ】生理食塩水を投与した野生型マウス（ｎ＝６）を対象に、ＬＭＢＯの前（ベースライン）、およびＬＭＢＯの５分後における左肺の流量と圧力の関係を調べた実験結果を示すグラフ。左肺動脈流（ＱＬＰＡ）を超音波フロー プローブで測定し、その傾きを、下大静脈を一過的に閉鎖したときのＱＰＡを差引くことで得た（Ｐ＜０．０５、傾きはベースラインと異なる）。
【図１０Ｃ】生理食塩水を投与した野生型マウス（ｎ＝３）を対象に、萎縮した左肺の再拡張中における左肺全体の肺血管抵抗（ＴＬＰＶＲ）の変化を示すグラフ。値は、個々の信頼区間を９５％とした、全データ点の線形回帰として表す。
【図１１】ＬＭＢＯで誘導される局所的な低酸素が、エンドトキシンを投与した野生型マウス（太い線）、およびエンドトキシンを投与したＮＯＳ２欠損マウス（細い線）の体動脈の酸素分圧（ＰａＯ２）に及ぼす作用を示すグラフ。エンドトキシンは、試験の２２時間前に、１０ ｍｇ／ｋｇの大腸菌エンドトキシンを腹腔内に注射して投与した。ＰａＯ２の連続記録は、大動脈弓に配置したクラーク型酸素電極を用いて得た。データは、野生型マウス（ｎ＝５）およびＮＯＳ２欠損マウス（ｎ＝３）を対象に行った独立した実験の平均である。
【図１２】血行動態測定で得られたデータの表。血行動態測定は、血行動態実験の２２時間前に生理食塩水を投与（対照）、もしくはエンドトキシンを投与（エンドトキシン）した野生型マウス（ＮＯＳ２ ＋／＋）およびＮＯＳ２欠損マウス（ＮＯＳ２ −／−）、または、４０ ｐｐｍ（空気中）のＮＯの吸入を２２時間にわたって適宜行った（ＮＯ吸入終了の１時間後に測定）野生型マウスおよびＮＯＳ２欠損マウスを対象に、ＬＭＢＯの前（ベースライン）、および左肺低酸素（ＬＭＢＯ）の５分後に行った。ＨＲ＝心拍数（分−１）、ＰＳＡ＝平均体動脈圧（ｍｍＨｇ）、ＰＰＡ＝平均肺動脈圧（ｍｍＨｇ）、ＱＰＡ＝左肺動脈閉鎖中に右肺動脈を経由する流量（μｌ×分−１×ｇ−１ 体重）、ＱＲＰＡ＝右肺動脈を経由する流量（μｌ×分−１×ｇ−１ 体重）、ＱＬＰＡ＝左肺動脈を経由する流量（μｌ×分−１×ｇ−１ 体重）、ＱＬＰＡ／ＱＰＡ＝一過性の左肺動脈閉鎖中における、左肺動脈経由流量と右肺動脈経由流量の比。ＬＭＢＯ前のベースラインにおけるすべての値をＡＮＯＶＡにより群間で比較した。ＬＭＢＯが各パラメータに及ぼす影響は、事後的な比較を伴うＡＮＯＶＡにより各群を対象に分析した（ＡＰ＜０．０５、ＢＰ＜０．０１、ＣＰ＜０．００１、ベースラインに対して）。
【図１３】生理食塩水で刺激した野生型マウス（ｎ＝７）、生理食塩水で刺激した５−ＬＯ欠損マウス（ｎ＝７）、エンドトキシンで刺激した野生型マウス（ｎ＝８）、エンドトキシンで刺激した５−ＬＯ欠損マウス（ｎ＝９）、５−ＬＯ活性化タンパク質阻害剤ＭＫ８６６を投与したエンドトキシンで刺激した野生型マウス（ｎ＝８）、およびｃｙｓＬＴ１受容体拮抗剤ＭＫ５７１を投与したエンドトキシンで刺激した野生型マウス（ｎ＝７）を対象に、左肺の肺血管抵抗（左ＰＶＲ）におけるＬＭＢＯ誘導性の上昇を調べた実験で得られたデータをまとめたヒストグラム。＊生理食塩水で刺激した野生型マウスに対してＰ＜０．０１；＃エンドトキシンで刺激した野生型マウスに対してＰ＜０．０１。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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