(57)【要約】本発明は、低酸素であるか、または活性化されたＨＩＦ経路を有する細胞または組織において選択的に複製する新規な組み換えウイルスを含む組成物に関する。本発明の新規な組成物は、低酸素反応性要素、またはこのような要素の複数を有するように遺伝子操作された組み換えウイルスを含む。これらの要素は、プロモーターに作動可能に連結されており、このプロモーターは、ウイルスの複製を調節もしくは調整する遺伝子か、または治療分子をコードする遺伝子に作動可能に連結されている。本発明はまた、低酸素誘導性経路においてタンパク質または遺伝子と相互作用する因子のスクリーニングに有用な構築物を含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ウイルスの複製を調節する遺伝子の発現を制御する、低酸素反応性および／またはＨＩＦ反応性要素を含む組み換えウイルスであって、該ウイルスは、低酸素の組織および細胞、または活性なＨＩＦ経路を含む細胞および組織を細胞溶解する、組み換えウイルス。
【請求項２】
前記ウイルスがアデノウイルス、ヘルペスウイルス、ヘルペス様ウイルス、レトロウイルス、およびピコルナウイルスである、請求項１に記載の組み換えウイルス。
【請求項３】
抗脈管形成性活性をコードする遺伝子をさらに含む、請求項１に記載の組み換えウイルス。
【請求項４】
前記低酸素反応性要素が、双方向性発現を誘導し得る、請求項１に記載の組み換えウイルス。
【請求項５】
低酸素依存性の様式で、腫瘍細胞を細胞溶解する、組み換えウイルス。
【請求項６】
抗脈管形成性遺伝子をさらに含む、請求項５に記載の組み換えウイルス。
【請求項７】
前記抗脈管形成性遺伝子が、アンギオスタチン、トロンボスポンジン−１、トロンボスポンジン−２、エンドスタチン、ＰＦ４、ＢＡＩ１、ＩＬ４、ＡＤＡＭＴＳ、ＰＥＤＦ、またはそれらのフラグメントをコードする、請求項２に記載の組み換えウイルス。
【請求項８】
前記ウイルスの複製を調節する前記遺伝子がＥＩＡ遺伝子である、請求項２に記載の組み換えウイルス。
【請求項９】
前記低酸素反応性要素が、正常酸素未満で、少なくとも１つの遺伝子の発現を誘導する、請求項１に記載の組み換えウイルス。
【請求項１０】
レセプター遺伝子に作動可能に連結された少なくとも１つの低酸素反応性要素を含む、ベクター。
【請求項１１】
前記少なくとも１低酸素反応性要素が、双方向性に２つの遺伝子の発現を駆動する、請求項１０に記載のベクター。
【請求項１２】
前記レポーター遺伝子が、比色アッセイによって検出され得る、請求項１０に記載のベクター。
【請求項１３】
前記ベクターが、哺乳動物または非哺乳動物の細胞株に安定に、または一過性にトランスフェクトされている、請求項１０に記載のベクター。
【請求項１４】
前記ベクターが、哺乳動物または非哺乳動物の腫瘍細胞株に安定に、または一過性にトランスフェクトされている、請求項１０に記載のベクター。
【請求項１５】
前記レポーター遺伝子が、アルカリホスファターゼ、ベータガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、または緑色蛍光タンパク質である、請求項１０に記載のベクター。
【請求項１６】
レポーター遺伝子に作動可能に連結された少なくとも１つの低酸素反応性エレメントまたはＨＩＦ反応性エレメントからなるベクターを含む、哺乳動物腫瘍細胞株。
【請求項１７】
前記レポーター遺伝子が比色アッセイによって検出可能である、請求項１６に記載の哺乳動物腫瘍細胞株。
【請求項１８】
前記ベクターが、安定に形質転換されている、請求項１６に記載の哺乳動物腫瘍細胞。
【請求項１９】
レポーター遺伝子がアルカリホスファターゼをコードする、哺乳動物腫瘍細胞株。
【請求項２０】
脳腫瘍細胞株から誘導される、哺乳動物腫瘍細胞株。
【請求項２１】
低酸素誘導性経路の活性を調節する化合物を検出する方法であって、以下の工程：
（ａ）低酸素条件下で、試験化合物と、低酸素反応性要素に作動可能に連結したレポーター遺伝子を安定に発現する細胞株とを接触させて、反応混合物を得る工程；
（ｂ）選択された時間、該反応物をインキュベートする工程；および
（ｃ）レポーター遺伝子発現のレベルについて該反応物をアッセイスする工程；
を包含し、
ここで該レポーター遺伝子の発現を減少する試験化合物が、低酸素誘導性経路のインヒビターである、方法。
【請求項２２】
前記レポーター遺伝子の発現が、比色アッセイによって検出可能である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記低酸素条件が、約５％未満の酸素分圧である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
前記低酸素条件が、約５％〜約１０％の酸素分圧である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２５】
前記低酸素条件が、約１％未満の酸素分圧である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２６】
前記レポーター遺伝子が、アルカリホスファターゼをコードする、請求項２１に記載の方法。
【請求項２７】
前記化合物が、前記レポーター遺伝子の発現の５０％より多く阻害する、請求項２１に記載の方法によって検出された化合物。
【請求項２８】
前記低酸素誘導性経路を阻害するためのＩＣ５０が、約１００μＭ未満である、請求項２１に記載の方法によって検出された化合物。
【請求項２９】
前記低酸素誘導性経路を阻害するためのＩＣ５０が、約１０μＭ未満である、請求項２１に記載の化合物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（関連出願についての相互参照）
米国Ｐｒｏｖｉｓｉｏｎａｌ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ　６０／２３５（２８３の出願日）に対する本出願請求項優先権
２０００年９月２６日、それはこれと共に矛盾していない範囲に完全に本願明細書において組み込まれる。
【０００２】
（政府資金提供の承認）
認可ｎｏ．　ＮＳ４１４０３の下の国立衛生研究所からの資金提供については、一部の最少で、本発明はなされた。
【０００３】
（技術分野）
本発明は、一般に選択的に部分的な酸素圧が通常より少ない細胞を目標とするウイルスがその特定の組織タイプで発見した、または、動作中のＨＩＦ（低酸素症−Ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ　Ｆａｃｔｏｒ）経路を有する新しい再結合物に関する。本発明は、更に選択的に複製して、細胞において細胞融解であるウイルスおよび低酸素症であるかまたは動作中のＨＩＦ経路を有する組織に関する。細胞を処理する方法または本発明の新規な組成によって低酸素症である組織は、また、提供される。本発明は、更に低酸素症ｉｎｄｕｃｉｂｌｅな経路を調整する合成物を識別するための分析を隠すことに関する。
【０００４】
（発明の背景）
ガンは、先進工業国の主要な死因のうちの１つである。米国において、ガンは全ての死亡の第２の主要な原因であって、毎年何十万もの死亡を説明する。ガンは、多くのレベル上の破壊的な疾患である。例えば、神経膠腫は脳腫瘍患者のメイン死因である。神経膠芽腫患者に１２ヵ月未満の中間の生存時間がある、そして、この予後はガンを治療する方法の印象的な成果にもかかわらず、１９５９（１０ヵ月）および１９３２（９ヵ月に対する６）年以降多くを変えなかった。
ガンは、手術、放射線療法、化学療法および免疫治療を含む様々な方法によって治療されることができる。治療のこれらの方法が一般に改善されたにもかかわらず、生存はガン犠牲者（そこのガンと戦うことの改良された治療的な技術のはっきりした必要である事実残り）の中で評価される。
【０００５】
ガンを治療する甦る方法は、ｖｉｒｏｔｈｅｒａｐｙと称する。Ｖｉｒｏｔｈｅｒａｐｙは、最初に科学者のそれらがウィルス性伝染病または予防接種を経験したあと、一部のガン患者の腫瘍が退行したということを発見されるときに関心を得た（Ｓｉｎｋｏｖｉｃｓ、Ｊ．及びＨｏｒｖａｒｔｈの再調査は、知る　―　Ｊ．　［　１９９３の］　Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ　３６：１９３−２１４およびＡｌｅｍａｎｙほか［２０００］ナット。生物工学１８：７２３−７２７）．残念なことに、研究者がｖｉｒｏｔｈｅｒａｐｙと関連する毒性課題を発見するときに、この方法の最初の見込みは減弱した、そして、さらに、治療は効き目を制限した。
【０００６】
現代の分子生物学の出現は、科学者にｖｉｒｏｔｈｅｒａｐｙの実現可能性を再評価させた。特に、ウイルス調停された遺伝子治療は、現在ｖｉｒｏｔｈｅｒａｐｙに対する更新された関心の中心焦点である。ウイルス調停された遺伝子治療システムの設計の基礎をなしている分子の戦略は腫瘍細胞成長を阻害する遺伝子を届けることになっている（ｅ。ｇ．、制御細胞周期‖またはアポトーシス）、細胞（自殺遺伝子）を殺す、さもなければ、免疫反応（免疫治療）を誘発する。
【０００７】
２つの一般の方法は、利用できる。１つの方法は、複製が不足しているウィルス・ベクトルの活用法に集まった。ｖｉｒｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃな薬品としての複製不十分なベクトルの活用法は、２つの重大な課題に遭遇した：（１）低く、通常の組織対特に目標腫瘍に劣った遺伝子送出および（２）不能に結果としてなって、活発な形質導入効率の。
【０００８】
ｖｉｒｏｔｈｅｒａｐｙへの他のアプローチは、複製−有能なウイルスの使用を必要とする。細胞融解サイクルを有する複製−有能なウイルスの使用は、同じく遺伝子転送を強化していて、腫瘍細胞を特に目標としている腫瘍細胞（腫瘍消散）を直接殺すための現実的な戦略として出てきた。様々な修正されたｎｅｕｒｏａｔｔｅｎｕａｔｅｄされた単純疱疹ウイルス、中で削除については、ｎｅｕｒｏｖｉｒｕｌｅｎｃｅ（Ｙ１３４．　５）およびリボヌクレオチド還元酵素（ＵＬ３９）のための遺伝子は、ｖｉｔｒｏの人間の腫瘍細胞のための、そして、生体内人間の脳腫瘍のマウス・モデルのｏｎｃｏｌｙｔｉｃな薬品として機能する。（ＨＳＶｓ）確認する。ｅに、ｇ．（パーカーほか２０００のＰＮＡＳ　９７）：２２０８−２２１３；米国特許５，７２８，３７９）。
【０００９】
位相１つの臨床試験において、悪性神経膠腫２１人の患者が脳炎またはＣＮＳ変化のいかなる合図のないもＨＳＶ　Ｇ２０７の頭蓋内注射を受信したこと（マーカートほか２０００のＧｅｎｅ　Ｔｈｅｒ．１０：　８６７−８７４）．異なる戦略は、ｏｎｃｏｌｙｔｉｃ、リードする削除を有する複製有能なアデノウイルス（ｄｌｌ５２０／ＯＮＹＸ−０１５）、５５ｋＤａ　ＢＩＢタンパク質の廃止された製造を利用する（ビショーフほか１９９６冊のサイエンス２７４：３７３−３７６）（確認する。ｅに、本願明細書に引用したものとするｇ．（米国特許６，０８０，５７８および５，６７７，１７８）。）、Ｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｙデータは、このウイルスの複製が不十分なｐ５３腫瘍抑制器遺伝子を有する腫瘍細胞に制限されることを示唆した。しかし、より最近の所見は、状況がそうすることができるｐ５３遺伝子のための野生型でもある細胞がこのウイルスの複製を支持すると確認した（ロートマンその他１９９８のＪ．ウイルス学７２：９４７０−９４７８　；Ｇｏｏｄｒｕｎ及びＯｒｎｅｌｌｅｓ　１９９８のＪ．　Ｖｉｒｏｌ．７２：９４７９−９４９０）．このウイルスが、卵巣のガンのための位相１つの臨床試験および、再発して耐火性頭部及び首ガンのための２つの３つの臨床試験と同位相で同様に、肝臓に転移した胃腸ガンにおいて現在使われている。結果は、これまで、ｄｌｌ５２０が安全で訴状が主に軽微な等級１−２つのインフルエンザのような徴候である患者によって、よく我慢することを複製−有能なアデノウイルスのその注入に明らかにした。（キム［　２０００の］　Ｏｎｃｏｇｅｎｅ　１９：６６６０−６６６９。）、人間のこれらの２つのウィルス・システムの低い毒性は、複製−有能なウイルスが患者を腫瘍で扱う方法を約束していることを示唆する。近年、複製が特定の腫瘍タイプに制限されるｏｎｃｏｌｙｔｉｃなウイルスの計画は、現実になった。ｖｉｔｒｏの、そして、ネズミ前立腺の陽性癌細胞が生体内にモデルを癌のようにむしばむことを前立腺に特有の抗原（ＰＳＡ）のための選択的な細胞毒性に明らかにしたアデノウイルス（ＣＮ７０６）は、つくられた（ロドリゲスほか１９９７のＣａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．　５７：２５５９−２５６３）．（確認する。ｅに、本願明細書に引用したものとするｇ．（米国特許５，８７１，７２６および６，１９７，２９３）。）複製−有能なウイルスを利用しているこの種の方法が約束している、それらが制限されるＷｈｉｌｅその：多数の（１つの）ウイルスは、腫瘍の遺伝子の異質性のために異なる腫瘍タイプおよびできる限り個々の腫瘍のためにつくられなければならないそして、それらは潜在的に厳密な抗ウイルスの治療が治療の完成の後、ウイルスを除去することを必要とすると、それらが組織の幅広い範囲に由来する腫瘍を選択的に目標とするために定めない（２）。（３）特許が出した米国の多数が低酸素症−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅなｆａｃｔｏｒ−１に注意して、ウイルスは遺伝子送出、組織特定の構造物および関連した主題を調停した。ＳｅｍｅｎｚａおよびＳｅｍｅｎｚａに対するいくつかの特許その他は、低酸素症−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅなｆａｃｔｏｒ１に関する。米国ｐａｔｅｎｔ６、２２２，０１８、Ｓｅｍｅｎｚａは、ＨＩＦ−１つの締め具サイトを含む遺伝子の遺伝子表現を起動させることができることとして描写されるａｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌｌｙｐｕｒｉｆｉｅｄｈｙｐｏｘｉａ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅな要因（ＨＩＦ−１）を開示する。Ｓｅｍｅｎｚａに対する米国特許６，１２４，１３１は、同じことをコード化しているヌクレオチドと同様にかなり精製された安定人間の低酸素症−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅな要因−ｌａを開示する。Ｓｅｍｅｎｚａに対する米国特許５，８８２，９１４は、浄化と同様に低酸素症ｉｎｄｕｃｉｂｌｅなｆａｃｔｏｒ−１をコード化している核酸および表されたタンパク質の特徴描写を開示する。ＳｅｍｅｎｚａおよびＳｅｍｅｎｚａに対する特許その他は精製されたＨＩＦ−１に関連する。そして、核酸がＨＩＦ−１、ＨＩＦ−１を結合する抗体、ＨＩＦ−１の変異体およびこれらの生物学的分子の全てを使用する方法をコード化する。特許は、選択的に中で複製する再結合物ウイルスおよびｃｙｔｏｌｙｓｅ低酸素症組織を記載しなくて、反ａｎｇｉｏｇｅｎｉｃな要因を分配する能力を有しない。ウェブスターに対する米国特許６，２１８，１７９その他は、組織に特有の低酸素症が構造物を調整したことを開示する。ウェブスターほかは、虚血性損傷を低酸素症状況にさらされる細胞に下げる方法を記載する。ウェブスターに記載されている虚血性損傷を減らすための構造物その他は、低酸素症応答する要素、治療的な遺伝子および組織に特有のプロモータを含んでいる空想的な遺伝子から成る。
その表現が虚血性損傷を細胞に下げることに効果的であるために、治療的な遺伝子は選ばれる。治療的な遺伝子の実施例は、一酸化窒素シンターゼ、Ｂｃｌ−２、過酸化物ｄｉｓｍｕｔａｓｅおよびカタラーゼのためのｔｈｏｓである。ウェブスターに対する米国特許５，８３４，３０６その他は、空想的な遺伝子から成る方法および組成物を開示する。空想的な遺伝子は組織に特有のプロモータおよび低酸素症応答するエンハンサ要素を含む。そして、その両方は使用可能な状態で選択された遺伝子にリンクされる。それらを使用する再結合物アデノ関連するビリオンおよび方法はＰｏｄｓａｋｏｆｆその他に一連の特許に記載されている。そして、Ｐｏｄｓａｋｏｆｆに対する米国特許６，２１１，１６３その他はＤＮＡを再結合物を使用している血流に届けることのための方法がウイルス・ベクトルをａｄｅｎｏａｓｓｏｃｉａｔｅｄしたことを開示する。本発明は、再結合物アデノ関連するビリオンが能率的にさまざまな筋細胞タイプに届けられて、治療的なタンパク質の継続された生産を提供するという発見に基づく。Ｐｏｄｓａｋｏｆｆに対する米国特許５，８５８，３５１その他は、ＤＮＡ分子を筋細胞および組織に届けるためのアデノ関連するウイルス・ビリオンの使用を開示する。Ｐｏｄｓａｋｏｆｆに対する米国特許５，８４６，５２８その他は、ＤＮＡ分子を筋細胞に届けるための再結合物アデノ関連するウイルス・ビリオンおよび貧血症の治療の組織を開示する。Ｐｏｄｓａｋｏｆｆほか特許は、低酸素症ｏｎｃｙｌｙｓｅが織り上げる再結合物ウイルスを記載しなくて、ａｎｔｉａｎｇｉｏｇｅｎｉｃな要因を提供しない。低酸素症−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅなｆａｃｔｏｒ−１経路に関連した米国特許は、多くの戦略を記載する。セテに対する米国特許６，１８４，０３５その他は、低酸素症状況を用いて分離して、起動させて、骨格の筋肉茎または原種細胞から微分を制御する方法を開示する。
【００１０】
セテに対する特許その他は、低酸素症状況の下で培養される成体骨格の筋繊維が通常の酸素濃度の下で発達する筋繊維と比較して、多くの原種細胞を引き起こすという発見に関する。Ａｌｉｔａｌｏに対する米国特許６，１３０，０７１その他は、精製されて単離された脈管内皮成長因子−Ｃシステイン削除異型を開示する。Ａｅｂｉｓｃｈｅｒに対する米国特許５，９５２，２２６その他は、連続的に欧州特許庁をリリースする植設された装置を使用している患者に、装置および欧州特許庁の配送のための方法を開示する。Ａｅｂｉｓｃｈｅｒほか特許に記載されている本発明は、低酸素症状況の下で欧州特許庁の明らかな高水準に設計される細胞を有する主題に、欧州特許庁を提供することに関する。アンダーソンに対する米国特許５，６８１，７０６その他は、酸素欠乏症にさらされる哺乳類の細胞のＤＮＡ分子のａｎｏｘｉｃな誘導を遂行する遺伝子の監査機関要素を開示する。ラトクリフに対する米国特許５，９４２，４３４その他は、プロドラッグ起動システムまたはサイトカインのための遺伝子のような符号化シーケンスに、使用可能な状態で連結される低酸素症応答部材から成る核酸構造物を開示する。
これらの特許から見られるように、低酸素症−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅな経路が用途のために中で利用されて、少し明確なコンテキスト出願人が認識のあるのと、同程度はるかに、しかし‖選択的に中で複製する再結合物ウイルス、そして、ｃｙｔｏｌｙｓｅ低酸素症組織、または、組織を有する、そして、ＨＩＦ経路を起動させて、そして、助手ｔｈｒｅａｐｙを更に分配する、それらがこれと共に矛盾していない程度まで、特許が本願明細書においてはっきりと組み込まれる米国に続くことは参照する従来技術に記載されなくてある：６，２２２，０１８；６，２１８，１７９；６，２１１，１６３；６，　１８４，０３５；６，１３０，０７１；６，１２４，１３１；５，９５２，２２６；５，９４２，４３４；５，８８２，９１４；５，８５８，３５１；５，８４６，５２８；５，８３４，３０６および５，６８１，７０６。
【００１１】
このように、治療的な遺伝子交付方法および多種多様な腫瘍を選択的に目標とするｏｎｃｏｌｙｔｉｃな過程を結合するｖｉｒｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃなシステムの必要が、ある。様々な特定の課題は、本発明の発見の間、遭遇された。ウイルスによる細胞の伝染は、複雑な生化学方法である。細胞が再結合物アデノウイルスによって感染することができたことをその腫瘍に明らかにすることは、まず必要だった。トランスフェクションする腫瘍細胞系の構造物の次の、低酸素症によって誘発された表明は、示されなければならなかった。ＨＩＦ−動作中の表現も、表現レベル側面対適切な０の集中を有しなければならなかった。
【００１２】
二方向に遺伝子製品を表した低酸素症ｉｎｄｕｃｉｂｌｅな構造物は、設計されなければならなくて、アジュバント療法の交付を含む本発明の実施例用に試験されなければならなかった。設計およびテストのこれらの初期の後、構造物を含んだ再結合物ウイルスは、Ｅｌ　ＡおよびＥ１Ｂ遺伝子製品の表現度のためのトランスフェクションする腫瘍細胞系において調べられた。これらの表現研究は、一時的なリポータ遺伝子分析法に示す低酸素症に依存する規則がウィルス・ゲノムのコンテキストにおいて維持されることを証明した。本発明における次のステップは、再結合物ウイルスが低酸素症に依存する方法の腫瘍細胞をｃｙｔｏｌｙｚｅｄしたことを証明することを含んだ。最後に、発明者は再結合物ウイルスがモデル・システムの脳腫瘍に届けられることを示した。最後に、これらの研究は、本発明の再結合物ウイルスにつながった。
【００１３】
（発明の要旨）
本発明は、低酸素症である細胞または組織において選択的に複製する新しい再結合物ウイルスから成る組成物に提供するかまたは有する起動させるＨＩＦ経路。本発明の新規な組成は低酸素症に反応する要素を有するために遺伝子工学による再結合物ウイルスまたは多数のこの種の要素から成る。そして、使用可能な状態で使用可能な状態で遺伝子にリンクされるプロモータまたは調整するかまたはウイルスの複製を調整するかまたは治療的な分子をコード化する遺伝子にリンクされる。
【００１４】
また、タンパク質と相互に作用する薬品のふるい分けまたは低酸素症−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅな経路の遺伝子に役立つ構造物は、本発明に含まれる。本発明の第１実施例は、低酸素症細胞または組織の選択性を繰り返すかまたは動作中のＨＩＦ経路を有する再結合物細胞融解ウイルスから成る組成物に関する。この実施例の新規な構成は低酸素症に反応する要素を有するために遺伝子工学による再結合物ウイルスまたは多数のこの種の要素から成る。そして、使用可能な状態で使用可能な状態で遺伝子にリンクされるプロモータまたはウイルスが細胞融解サイクルを有するウイルスの複製を調整するかまたは調整する遺伝子にリンクされる。この実施例の再結合物ウイルスが選択的に複製する小説、そして、細胞崩壊低酸素症細胞、または、動作中のＨＩＦ経路を織り上げるかまたは有する。特定のアデノウイルス血清型５で、細胞融解サイクルを有するウイルスの実施例は、細胞融解アデノウイルスを含むが、これに限定されるものではない；細胞融解ピコルナウイルス。ｅに、ｇ．（ポリオウイルス）；そして、細胞融解ヘルペスウイルスおよびヘルペスのようなウイルス。ｅに、ｇ．（単純疱疹ウイルス）。
【００１５】
本発明の第２の実施例は、選択的に遺伝子または遺伝子を低酸素症であるかまたは動作中のＨＩＦ経路を有する細胞に届ける低酸素症ＨＩＦ−従属する反復可能なウイルスから成る組成物に関する。
この実施例の再結合物ウイルスから成る組成物はｈｙｐｏｘｉａｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅな要素または多数のこの種の要素を有するために遺伝子工学による。そして、使用可能な状態で使用可能な状態でウイルスの複製を調整するかまたは調整する少なくとも一つの遺伝子にリンクされるプロモータにリンクされる。
腫瘍を含んで、この実施例の新しい再結合物ウイルスは低酸素症組織または細胞を目標とする。ここで、それらは選択的に遺伝子を繰り返して、届ける。
この実施例によれば、追加的な遺伝子（ｓ）は、反血管形成活動を提供するかまたはリポータ遺伝子として役立つかまたは一方低酸素症組織または細胞を調整する本発明の新しい再結合物ウイルスに含まれる。
【００１６】
あってもよい好適な遺伝子の実施例は、本発明の新規な組成がａｎｇｉｏｓｔａｔｉｎのような血管形成抑制遺伝子であることをそばに分配した。
【００１７】
本発明の第３の実施例は、遺伝子または遺伝子を低酸素症であるかまたは動作中のＨＩＦ経路を有する細胞に届ける低酸素症に依存する反復可能なｏｎｃｏｌｙｔｉｃなウイルスから成る組成物に関する。この実施例の再結合物細胞融解ウイルスから成る組成物は低酸素症に反応する要素または多数のこの種の要素を有するために遺伝子工学による。そして、使用可能な状態で使用可能な状態でウイルスが細胞融解サイクルを有するウイルスの複製を調整するかまたは調整する遺伝子（ｓ）にリンクされるプロモータにリンクされる。
【００１８】
この実施例の新しい再結合物ウイルスは、それらが選択的に複製する腫瘍を含む低酸素症組織または細胞を目標とする交付遺伝子、そして、原因細胞崩壊。この実施例によれば、追加的な遺伝子（ｓ）は、反血管形成活動を提供するかまたはリポータ遺伝子として役立つかまたは一方低酸素症組織を調整するこの実施例の新しい再結合物細胞融解ウイルスに含まれることができる。ａｎｇｉｏｓｔａｔｉｎ．のようなこの実施例血管形成抑制遺伝子の組成によって分配されることができる好適な遺伝子の実施例。
【００１９】
本発明の第４の実施例は、状態を治療する方法または低酸素症によって特徴づけられる疾患に関する。この実施例の好適な態様は、個人を腫瘍細胞特定の渙散（腫瘍消散）を表示して、更に、腫瘍微環境に対する反ａｎｇｉｏｇｅｎｉｃな要因の形で、アジュバント療法を加える再結合物複製−有能なアデノウイルスの管理から成るガンで扱う方法に関する。これは、低酸素症状況（ＨＹＰＲＡ−Ａｄ）の下で、反ａｎｇｉｏｇｅｎｉｃな要因を表すｈｙｐｏｘｉａ／ＨＩＦに依存する反復可能なアデノウイルス（ＨＹＰＲ　Ａｄ（ｓ））から成るウィルス構造物の管理によって達成される。この方法では、本発明の新規な組成は、ウィルス細胞崩壊の効果および反ａｎｇｉｏｇｅｎｉｃな要因の表明のために低酸素症腫瘍組織を破壊する際の相乗効果を有する。
【００２０】
本発明の本実施例の別の態様は、本発明の再結合物ウイルスを有する治療が続く組織の低酸素症／ＨＩＦ経路の起動を誘導することに関する。特定の、望まれていない組織において、ｉ．ｅ．（脂肪または傷跡）は、特に望まれていない組織のＨＩＦ経路を誘導する薬品で処理されることができる。薬品を有する治療の後、望まれていない組織は、本発明の再結合物ウイルスによって滅失に影響されやすい。
【００２１】
第５の実施例において、本発明は組成物および低酸素症およびＨＩＦ経路を調整する合成物を識別することに役立つ方法に関する。使用可能な状態で連結されるｈｙｐｏｘｉａ／ＨＩＦ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅなプロモータから成るベクトルを含んでいる安定してまたは一時的にトランスフェクションする細胞、リポータ遺伝子は、試験合成物によって接触して、リポータ遺伝子の表現度のために検定される。好ましい実施例において、ＨＩＦ薬発見分析は多数の試験合成物に適している高いスループット分析（ｉ．　ｅ．）である。そして、合成物のライブラリをｂｙｕｓｉｎｇする。合成物のライブラリは、市販であるかまたは当業者によって周知の手順を使用して総合されることができる。本発明の発見分析がそうすることができる薬も、生物学的組織、ｉ．ｅ．、設備、菌類の抜粋を試験するために使われる細菌、そして、動物の。第６の実施例において、本発明は薬発見分析に関する。リポータ遺伝子に使用可能な状態で結合されるｈｙｐｏｘｉａ−ｏｒ　ＨＩＦ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅなプロモータから成るベクトルは、ベクトルを含んでいる腫瘍を起こすために用いる。ベクトルを含んでいる腫瘍は、特に滅失のための低酸素症組織を目標とするかまたは生体内に低酸素症誘導経路を崩壊させる化学であるか生物学的薬品の有効性を評価するために用いる。若干の本発明の態様において、再結合物ウイルスは、非細胞融解である。本発明も、低酸素症（例えば光（紫外線（可視光））、放射線（Ｘ線）、ｐＨ、音（電波）、レドックス状況、代謝状況、ホルモンの反応およびｔｅｌｅｏｍｅｒｅショートニング）以外の刺激に応答する遺伝子の要素の使用を考察する。
【００２２】
（発明の詳細な説明）
本発明は、低酸素症の制御の下のウィルス複製および／または応答する要素／プロモータが選択的に造るＨＩＦのためのタンパク質本質的事項を有するために遺伝子工学によるウイルスが目標とする発明者の発見およびｃｙｔｏｌｙｓｅ低酸素症組織に基づいた。発明者は、新しい再結合物ウイルスが低酸素症組織または細胞に選択的に診断であるか治療的な目的のための遺伝子を届けるために更に設計されることができるということを更に発見した。本発明は、低酸素症細胞において選択的に複製する再結合物ウルスから成る組成物を提供する。
【００２３】
本発明の新規な組成は、使用可能な状態で遺伝子にリンクされるプロモータまたはウイルスの複製を調整するかまたは調整する遺伝子に使用可能な状態で結合される低酸素症に反応する元素を有するために遺伝子工学による再結合物ウイルスから成る。組成物は、細胞融解サイクルを有することができるかまたは有することができない再結合物ウイルスから成る。細胞融解サイクルを有するウイルスは、好まれる。
【００２４】
本発明の新しい再結合物ウイルスは、選択的に低酸素症である、または、ＨＩＦ経路が起動したいかなる低酸素症組織もまたは細胞を目標とする。
低酸素症であるかまたは低酸素症の領域を有する腫瘍は、本発明の組成の好適な目標である。
【００２５】
本発明の好ましい実施例は、腫瘍細胞特定の渙散（腫瘍消散）を表示して、更に、腫瘍微環境に対する反ａｎｇｉｏｇｅｎｉｃな要因の形で、アジュバント療法を加える再結合物ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎｃｏｍｐｅｔｅｎｔなアデノウイルスに関する。これは、低酸素症状況（ＨＹＰＲＡ−Ａｄ）の下で、反ａｎｇｉｏｇｅｎｉｃな要因を表す低酸素症に依存する反復可能なアデノウイルス（ＨＹＰＲ−Ａｄ（ｓ））から成るウィルス構造物の管理によって達成される。他の本発明の好ましい実施例は、ガン患者を低酸素症であるか、動作中のＨＩＦ経路を有するかまたは本発明の組成を管理することによって低酸素症／ＨＩＦ活動の領域を有する腫瘍で扱う方法に関する。
【００２６】
本発明の方法は患者の治療を考慮に入れる。そして、腫瘍が低酸素症であるかまたは低酸素症の領域を有する限り、多種多様な腫瘍については、人間および動物を含む。この実施例の特定の方法は、すでにｃｈｅｍｏ−ｏｒ　ｒａｄｉｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃな技術で扱われて、この種の治療に抵抗するようになった腫瘍を有するガン患者の方向を目指す。この種のｃｈｅｍｏ−ａｎｄ　ｒａｄｉｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃな技術は非低酸素症腫瘍組織を殺すかまたは破壊することは公知である。そして、それによって低酸素症腫瘍組織の生存を考慮に入れる。このように、本発明の方法は受けた患者を治療することに適している前の、または、現在ｃｈｅｍｏ−ａｎｄ　ｒａｄｉｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃな治療を受信している。
【００２７】
ここで使用しているように、酸素または酸素の通常のレベルに対するｔｅｒｍ”ｎｏｒｍｏｘｉａ”ｏｒ”ｎｏｒｍｏｘｉｃ”ｒｅｆｅｒｓは、細胞または組織において張力をかける。ここで使用しているように、通常分かることに、酸素の下部のレベルまたは細胞または組織の酸素分圧に対するｔｅｒｍ”ｈｙｐｏｘｉａ”ｏｒ”ｈｙｐｏｘｉｃ”ｒｅｆｅｒｓは、匹敵した。０２集中がこれらの特定の細胞または組織の酸素の通常のレベルより低いときに、細胞または組織は低酸素症である。
ここで使用しているように、酸素分圧がある通常のおよび腫瘍組織間の酸素濃度の生理的違いに対するｔｅｒｍ”ｔｕｍｏｒ　ｈｙｐｏｘｉａ”ｏｒ”ｈｙｐｏｘｉｃ腫瘍ｃｅｌｌｓ”ｒｅｆｅｒｓは、通常の組織と比較して、腫瘍組織において減少した。
細胞または組織に本願明細書において動作中のＨＩＦ”ｒｅｆｅｒｓを有するｔｅｒｍ”ｃｅｌｌｓまたは組織を使用する、ＨＩＦ転写要因経路は、いずれであるどちらか構成的に作動中の、または。そこにおいて、それは外生の刺激または治療によって起動した。多くの薬品は、従来技術においてＨＩＦ経路を起動させて、鉄のキレート化剤、コバルト、ｐｒｏｔｅｏｓｏｍｅ抑制剤およびｇａｌｄａｎａｍｙｃｉｎを含むが、これに限定されるものではないために通常の技術のそれらにとって公知である。
ここで使用しているように、能力に対するｔｅｒｍ”ｏｎｃｏｌｙｔｉｃ”ｏｒ”ｏｎｃｏｌｙｓｉｓ”ｒｅｆｅｒｓは、ガンまたは腫瘍細胞を溶解させるかまたは破壊する。
能力に本願明細書においてｔｅｒｍ”ｃｙｔｏｌｙｔｉｃ”ｏｒ”ｃｙｔｏｌｙｓｉｓ”ｏｒ”ｃｙｔｏｌｙｓｅ”ｒｅｆｅｒｓを使用されるように、細胞または細胞を溶解させるかまたは破壊する。
血管形成を阻害する能力に本願明細書においてｔｅｒｍ”ａｎｔｉ−ａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ”ｏｒ”ａｎｔｉ　ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ”ｒｅｆｅｒｓを使用したように。
血管形成の抑制剤は、血管形成を調整するために直接間接的に作用する遺伝子またはタンパク質であってもよい。血管形成の抑制剤はａｎｇｉｏｓｔａｔｉｎを含むが、これに限定されるものではない。そして、反ａｎｇｉｏｇｅｎｉｃなペプチド、ａｎｔｉａｎｇｉｏｇｅｎｉｃなアンチセンスのＤＮＡおよび他の反ａｎｇｉｏｇｅｎｉｃな要因が当業者にとって公知である。
【００２８】
能力に本願明細書においてｔｅｒｍ”ａｎｔｉ−ｔｕｍｏｒ”ｏｒ”ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ”ｒｅｆｅｒｓを使用されるように、腫瘍またはガン成長の容積を破壊するかまたは減らす。
（薬発見分析）
一実施例において、本発明はタンパク質および／または遺伝子表現の低酸素症−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ経路調停された誘導を調整する合成物を識別する方法に関する。この方法では、リポータ遺伝子に使用可能な状態で結合される低酸素症−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅなプロモータから成るベクトルによって、安定してまたは一時的にトランスフェクションする細胞系は遺伝子の表現度を調整する合成物を検出するために用いる、または、いかなるタンパク質も低酸素症および／またはＨＩＦによって変調した。この方法の一態様において、リポータ遺伝子に使用可能な状態で結合されるｈｙｐｏｘｉａｉｎｄｕｃｉｂｌｅなプロモータから成る細胞系は、リポータ遺伝子の表明を禁止する合成物を検出するために用いることができる。リポータ遺伝子の表現度が直ちに検出されることができることは、好まれる。ｅに、単純な比色分析によって、ｇ．。酵素であるかｆｌｕｏｒｏｍｅｔｒｉｃな分析のような他の技術によって検出されることができる他の遺伝子が、リポータ遺伝子として使われることができる。
【００２９】
本発明の薬発見分析法で陽性反応を示す合成物は、リポータ遺伝子の表現度を調整するものである。例えば、細胞は指定された条件の試験合成物によって暖められて、細胞と比較してその合成物の欠如を除いて同一の状況の下で孵化すた。試験合成物を有するリポータ遺伝子表現およびｎｏ−ｃｏｍｐｏｕｎｄ分析からのリポータ遺伝子表現の間の比較によって、１が試験合成物は陽性かどうか決定することができる。ｎｏｃｏｍｐｏｕｎｄ（または他の適切な制御）と比較して、リポータ遺伝子の表現レベルを変えるそれらの試験合成物は、ｔｅｓｔｅｄ”ｐｏｓｉｔｉｖｅを有する。」、本発明の薬発見分析法で陽性反応を示すＭａｔｅｒｉａｌｓは、様々な臨床重要な状況、ｉ．　ｅ．、ガン、虚血、などを伴う低酸素症／ＨＩＦ経路を調整することに役立つ。この実施例の特定の態様において、それが試験合成物によって接触する前に、細胞系は溶解するかまたは更に処理される。いずれにせよ、試験合成物が細胞を有する選択された期間またはそれの部分のために暖められたあと、反応混合はリポータ遺伝子表現のレベルのために検定される。この実施例の特に役立つ態様において、リポータ遺伝子が読みやすく検出可能であるタンパク質を表すこと。ｅに、ｇ．、単純なｃｏｌｏｒｍｅｔｒｉｃな分析によってまたは単クローン性抗体検出のような他の手段によって検出される反応を引き起こす酵素。
本発明に役立つリポータ遺伝子の実施例は、発光酵素、ｐ−ガラクトシダーゼ・アルカリホスファターゼ、緑の蛍光タンパク質、その他を含むが、これに限定されるものではない。具体例、低酸素症から成るベクトルおよび／またはＨＩＦにおいてアルカリホスファターゼのための遺伝子に使用可能な状態で結合されるｉｎｄｕｃｉｂｌｅなプロモータは、細胞系に安定してまたは一時的にトランスフェクションする。ベクトルから成る細胞系は、低酸素症−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅな要因経路を起動させて、試験合成物によって接触する状況に従属する。
一般に、試験合成物がアルカリホスファターゼ活動の表明を減らすかまたは増やすときに、それはｈｙｐｏｘｉａ−ａｎｄ／ｏｒ　ＨＩＦ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅな経路モジュレータと確認される。アルカリホスファターゼ活動の表明を調整する合成物がｔｅｓｔｅｄ”ｐｏｓｉｔｉｖｅ”ａｎｄが更に調べられる効果がある試験。
本発明は、合成物および本発明の薬発見分析法で陽性反応を示す合成物から成る組成物にも関する。ウイルスがそうすることができるいずれでも本発明で使用した一般においてウイルス。適当なウイルスの選択は、扱われるホストのような様々な要因に依存する。例えば、人間の治療は、ホモ・サピエンスを感染させることができて、複製することができるウイルスを必要とする。他の哺乳類のような人間外の主題を扱うために用いることができるウイルスは、また、本発明の範囲内で含まれる。好適なウイルスは、細胞を溶解させるために細胞融解サイクル、ｉ．　ｅ．、能力を有する。好適な細胞融解ウイルスは、アデノウイルス系統のそれらである。Ａｎｉｍａｌ　Ｖｉｒｕｓｅｓ及びＡｎｔｉｓｅｒａのＣａｔａｌｏｇｕｅ、クラミジア属及びアメリカのＴｙｐｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）からのＲｉｃｋｅｔｔｓｉａｓ　６’ｅｄｉｔｉｏｎ、１９９０にて説明したように、アデノウイルス系統からのウイルスの実施例は、Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓタイプ１−４１を含むが、これに限定されるものではない。本発明ために、適切な他のウイルスは、乳頭腫ウイルス、レトロウイルス、ピコルナウイルス、ｅを含むが、これに限定されるものではない。ｇ．（ポリオウイルス）；ヘルペスウイルス、そして、ヘルペスのようなウイルス。ｅに、ｇ．（単純疱疹ウイルス）；そして、アメリカのＴｙｐｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　ＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎからＡｎｉｍａｌ　Ｖｉｒｕｓｅｓ及びＡｎｔｉｓｅｒａのＣａｔａｌｏｇｕｅ、クラミジア属及びＲｉｃｋｅｔｔｓｉａｓ　６ｔ’ｅｄｉｔｉｏｎ、１９９０に記載されている他。
【００３０】
再結合物ウイルス
一般に、本発明の再結合物ウイルスは、ｓｅｌｅｃｔｉｖｅｌｙｕｎｄｅｒｈｙｐｏｘｉｃな状況を繰り返すために遺伝子工学による。本発明の再結合物ウイルスは、酸素分圧、ｉ．　ｅ．、低酸素症応答する要素を含む遺伝子または低酸素症−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅなエンハンサのモティーフ（ＨＲＥ）に応答する遺伝子を識別することによって造られることができる。標準の遺伝子工学方法を使用して、いかなる適切なプロモータもＨＲＥに連結されることができる。そして、それはそれからウイルス複製を調整するかまたは調整する特定のウイルスの遺伝子（ｓ）にリンクされる。様々な遺伝子および／またはそれらの製品は、ウィルス複製を調整するかまたは調整する当業者にとって公知である。例えば、Ｅｌ　Ａ遺伝子製品は、アデノウイルス複製の開始のための初期のウィルス・タンパク質本質的事項をコード化することは公知である。このように、アデノウイルス（またはいかなる構造上であるか機能的な相同物も）のこのＥｌ　Ａ遺伝子は低酸素症応答する要素／プロモータの管理下にされるために設計されることができる。そして、このように低酸素症状況の下で選択的に複製する有機体をつくる。
低酸素症状況は、生理的反応のカスケードを始めて、糖分解、赤血球生成および血管形成に関係している遺伝子の誘導に至ることは公知である。複雑なＨＩＦ−１タンパク質、２つの基本的なｈｅｌｉｘｌｏｏｐ−螺旋タンパク質ＨＩＦ−１から成るｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒである、そして、ＨＩＦ−１（３は、目標遺伝子の範囲内であるシス舞台の低酸素症−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅなエンハンサのモティーフ（ＨＲＥ）に結合することによって低酸素症への転写反応を調停する。
ＨＩＦ−１に加えて、低酸素症−１本のｉｎｄｕｃｉｂｌｅな経路の他の部材は、ＨＩＦ−２およびＨＩＦ−３を含む。エリトロポイエチン（欧州特許庁）遺伝子の３’−側面を接している領域およびＶＥＧＦ遺伝子の５’−側面を接している領域の中であるＨＲＥは、長さの５０ｂｐ未満である。これらのＨＲＥのものは、機能的に低酸素症誘導にとって重要であるシーケンスをｃｉｓａｃｔｉｎｇしている非常に節約されたＨＩＦ−１つの結合するサイトおよびその他ｇｅｎｅ−ｕｎｉｑｕｅを含む。欧州特許庁は、低酸素症に応答して腎臓および肝臓において生産されるグリコプロテイン・ホルモンであって、赤血球原種および前駆体電池に表されるそのレセプタに結合することによって赤血球生成を刺激する。それぞれ、欧州特許庁およびそのレセプタはまた、星状細胞および神経単位によって中枢神経系において表される。ここで、それらがｐａｒａｃｒｉｎｅ方法で作用して、神経単位を低酸素症によって誘発された損害から保護するように機能すると現在思われている。
【００３１】
ＶＥＧＦは様々な細胞タイプの低酸素症によって誘発されて、また、多数の腫瘍細胞タイプによって表される。そして、神経膠腫を含む。ＶＥＧＦは、血管形成の主要な監査機関であって、脈管内皮細胞に特有であるｍｉｔｏｇｅｎｉｃな活動を有する。この情報、欧州特許庁およびＶＥＧＦに基づいてＨＲＥのものは、設計のために選択されて、低酸素症に反応するプロモータで困難である。遺伝子制御複製Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓｅｓは、分割で静止した電池を感染させるＤＮＡウイルスである。細胞周期への感染した静かなセルの再入はウィルスＤＮＡ複製のために必要である、そして、最終的に、ウィルス後継者製品。ＥｌＡ遺伝子製品の表現度はこれらのウィルス機能にとって重要である、そして、Ｅ　１つのＡ遺伝子領域を欠いているアデノウイルスは複製が不足している。アデノウイルスＥ　１つのＡ遺伝子は、構成的に活発なプロモータ領域から表される第１の転写装置である。Ｅ　１つのＡ遺伝子の製品は、細胞でウィルス転写（Ｅ　１つのＢ遺伝子複写の誘導を含むこと）の変調および静かなセルのＤＮＡ合成の誘導を含む広範囲にわたる生物学的活動を呈する。しかし、Ｅ１Ａによる細胞成長制御の規制緩和は、依存しているｐ５３および独立機構によるアポトーシスを誘導して、最終的にウィルス後継者製造のじゃまをする。
野生型アデノウイルス伝染の間のアポトーシスの防止は、アデノウイルスＥ　１つのＢ遺伝子製品の表現度によって調停される。Ｅ１Ｂ遺伝子は２つのタンパク質、２１Ｋおよび５５Ｋをコード化する。そして、それはそれぞれにＥｌＡによって誘発されたアポトーシスを阻害するように機能する。２１Ｋのタンパク質が相応するＥ１Ｂ、アポトーシス調節装置およびブロックＥ１ＡのＢｃｌ−２つの一系統に対するシーケンスおよび機能は、多くの他のａｐｏｐｔｏｔｉｃな刺激と同様にアポトーシスを誘導した。２１Ｋの機能が広範囲な核でウィルスＤＮＡ分解（度表現型）および強化された細胞病理学的な効果（ｃｙｔ表現型）の体裁に導くＥ１Ｂを欠いているアデノウイルスを有する細胞の伝染。Ｅ１Ｂは、５５Ｋ、アデノウイルスＥ４−ｏｒｆ６遺伝子製品と連動して、ウィルス製造の間、２つの機能を有する：大部分の細胞ｍＲＮＡの輸送を禁止すると共に、ウィルス遅いｍＲＮＡの輸送を容易にするために直接相互に作用して、ウィルス製造のｐ５３およびそれ以後を機能させないために。本発明の再結合物ウイルスは外生のエージェント（例えばチミジン・キナーゼ）を有するウィルス普及の終了を考慮に入れる遺伝子を含むために更に設計されることができる。そして、それによってそれらがガンシクロビルに影響されやすくなる。加えて、表される遺伝子の数が４に増やされるために、内部ｒｉｂｏｓｏｍａｌな入力サイト（ＩＲＥＳ）が転写装置につき２つの遺伝子を表すために用いる場合、再結合物ウイルスは更に設計されることができる。
【００３２】
この実施例によれば、複数の遺伝子は、低酸素症に応答してまたはＨＩＦ−１本の経路を起動させる状況の下で表されることができる。
【００３３】
腫瘍および低酸素症
固い腫瘍（含むこと）、腫瘍は生理的にそれらが引き出される通常の組織および組織を囲むこととは別である（ブラウンおよびＧｉａｃｃｉａ（１９９８）ガン物。５８：１４０８−１４２６）．腫瘍で、通常の組織およびガン腫瘍間の組織脈管構造の基礎をなす違いは、貧しい酸化または低酸素症のユニークな生理的特徴につながる。腫瘍血管は、腫瘍によって通常の脈管構造を含んでいる組織およびａｎｇｉｏｇｅｎｉｃな要因の発散（２）上の腫瘍細胞の侵入している処理の結果として、非常に異常である（１）。堅実な腫瘍の血流は、通常の組織に示すそれよりしばしば鈍くてより漏れて、腫瘍血管の異常な、ａｎｆｒａｃｔｕｏｕｓな性質による。腫瘍血管新生のこれらの異常な特徴が腫瘍組織の低酸素症生理的状態に至ると思われている。証拠の大きい量は、低酸素症腫瘍がｒａｄｉｏ−ａｎｄ化学療法薬治療により抵抗することを示唆した（確認する。ｅに、ｇ．（英国のグレイほか１９５３）Ｊ．　Ｒａｄｉｏｌ．２６：　６３８−６４８　；タイシャーほか１９９０のＣａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．　５０：３３３９−３３４４；グラウてアーバガード１９８８のＲａｄｉｏｔｈｅｒ．　Ｏｎｃｏｌ．１３：３０１−３０９）．腫瘍の低酸素症の領域は、多くの固体の腫瘍モデル・システムで起こるために明らかにされて、知る。ｅに、ｇ．（Ｇｕｌｌｉｎｏ）Ｐ．　Ｍ．、その他、Ａｄｖ。ｅｘｐ．ｍｅｄ．生物学７５：５２１−５３６　（１９７５）；ハセガワ、Ｔ．、ｅｔａｌ．、Ｉｎｔ．　Ｊ．　Ｒａｄｉａｔ．Ｏｎｃｏｌ．生物学Ｐｈｙｓ．　１３：５６９−５７４　（１９８７）；ジャイナ教徒、Ｒ．、ほか、ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．４８：２６４１−２６５８　（１９８８）　；Ｓｉｅｍａｎｎ、Ｄ．、ｅｔａｌ．、ブラザーＪ．　Ｃａｎｃｅｒ　５８：２９６−３００　（１９８８）；歌、Ｃ．、ほか、Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．　４７：４４２−４４６　（１９８７）；Ｖａｕｐｅｌ、Ｐ．、ｅｔａｌ．、ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．　４７：３４９６３５０３　（１９８７）；Ｖａｕｐｅｌ．、Ｐ．、ほか、Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．　４１：２００８−２０１３　（１９８１）．腫瘍は、また、低酸素症の中でそれぞれに動作中のＨＩＦ経路を有することができる。ヴァン・ヒッペル・リンダウ症候群に伴う腫瘍がｈａｅｍｏｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａから成って、はっきりした細胞腎臓および癌膵臓のおよび内耳腫瘍は、実施例である。様々な方法は、利用できて、低酸素症組織を検出すること用の技術の技術のうちの１つにとって公知である。チャップマン、Ｊ．　Ｄ．、ＤｅｔｅｃｔｉｏｎおよびＳｏｌｉｄ　ＴｕｍｏｒｓのＨｙｐｏｘｉｃ　ＣｅｌｌｓのＭｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ参照」（Ｃａｎｃｅｒ）第５４巻、Ｎｏ．１１、ｐｐ．　２４４１−２４４９（１９８４）。チャップマン、Ｊ．　Ｄ．、ＩｎｖａｓｉｖｅでＮｏｎ−Ｉｎｖａｓｉｖｅ　ＰｒｏｃｅｄｕｒｅｓによるＴｕｍｏｒ　Ｈｙｐｏｘｉａの測定：Ｒｅｃｅｎｔ　Ｃｌｉｎｉｃａｌ　ＳｔｕｄｉｅｓのＲｅｖｉｅｗ」（Ｒａｄｉｏｔｈｅｒ．）Ｏｎｃｏｌ．、２０、ｐｐ．　１３−１９（１９９１）；「イメージング腫瘍ｈｙｐｏｘｉａ”Ｙａｎｇ　ＤＪ、ウォレスＳ、Ｃｈｅｒｉｆ　Ａ、Ｌｉ　Ｃ、Ｇｒｅｔｚｅｒ　ＭＢ、キムＥＥ、ＰｏｄｏｌｏｆｆＤＡ．　Ｒａｄｉｏｌｏｇｙ　１９４のためのＰＥＴ薬品としてのＦ−１８−ラベルをつけられたｆｌｕｏｒｏｅｒｙｔｈｒｏｎｉｔｒｏｉｍｉｄａｚｏｌｅの発現：７９５−８００，１９９５．米国ＰａｔｅｎｔＮｏｓ．５，４０１，４９０および５，８４３，４０４は、低酸素症または低酸素症組織を検出する方法を開示して、本願明細書に引用したものとする。
これらの技術のいずれかまたは当業者にとって公知の他は、低酸素症組織を識別するために用いることができる。腫瘍腫瘍の血管形成Ａｎ必須の部品は、血管形成（容器より先に存在することからの新規な血液供給の設立）である。腫瘍は新血管形成を始めるためにａｎｇｉｏｓｔａｓｉｓの上の生理的対照を崩壊させることを必要とする。そして、それらが直径約０．４ｍｍに達するときに、方法が腫瘍によって低酸素症−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅなａｎｇｉｏｇｅｎｉｃな要因の発散によって誘発される。血管形成は、星状細胞腫および他のガンの悪性進行の間の段階を追っての方法である。神経膠腫の発現において、新しい血管は、ａｎａｐｌａｓｔｉｃな星状細胞腫の密度の増加が続く軽度の星状細胞腫において現れる。ａｎａｐｌａｓｔｉｃな星状細胞腫から神経膠芽腫への移行の間、広範囲な微小血管増殖は発生する。そして、異常な容器に至る。低酸素症は星状細胞腫進行の積分要素である、そして、壊死はその最後の位相において発達する。脈管質および微小血管性細胞増殖はそれらのより悪質でない相対物から悪性星状細胞腫を診断するために用いる形態的な特徴である、そして、これらの特徴は予後と相関する。神経膠腫を含んで、人間の腫瘍の脈管構成要素を目標とすることは、特に効果的ガン治療を提供する。−その理由は、次のことにある。ｉ）約１００の腫瘍細胞が各々の内皮細胞を殺すことに影響を受けると推定する；ｉｉ）それらが腫瘍細胞の遺伝子の不安定性を共有しなかった時から、内皮細胞が治療に抵抗するようになることは、ありそうもない；そして、腫瘍脈管構造を妨げているｉｉｉ）戦略が、反血管形成薬品のＡバラエティが使われることができるモデルが再結合物ウイルスの効果を強化する動物における成功によって使われた本発明。
【００３４】
これらの抑制剤の一つの、ａｎｇｉｏｓｔａｔｉｎな（確認する。ｅに、ｇ．（米国特許６，０２４，６８８番）、それは完全に本願明細書に引用したものとしてオライリーであるその他である‖（Ａｎｇｉｏｓｔａｔｉｎ）：ＣｉｒｃｕｌａｔｉｎｇしているＥｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ　Ｃｅｌｌ　Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ　Ｔｈａｔ　Ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｓ　ＡｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓおよびＴｕｍｏｒ　Ｇｒｏｗｔｈ」、ＱｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅなＢｉｏｌｏｇｙ上のＣｏｌｄ春ハーバーＳｙｍｐｏｓｉａ、第ＬＩＸ巻、ｐｐ．　４７１−４８２（１９９４））、神経膠腫、胸部、前立腺および肺癌腫を含む様々なネズミおよび人間のｘｅｎｏｔｒａｎｓｐｌａｎｔｅｄされた腫瘍に対して効果的に使用した。さらに、ａｎｇｉｏｓｔａｔｉｎは内皮細胞に対する結合された細胞障害性効果によって、電離放射線の抗腫瘍効果を強化する。局所アジュバント療法としての用途のためのａｎｇｉｏｓｔａｔｉｎの有力な抗腫瘍特性は、本発明の低酸素症に依存するｏｎｃｏｌｙｔｉｃなアデノウイルスによって届けられることができる。
他の血管形成阻害している分子は、タンパク質のｔｈｒｏｍｂｏｓｐｏｎｄｉｎ（ＴＳＰ）一系統の部材を含む。（確認する。ｅに、ｇ．、デＦｒａｉｐｏｎｔほか、２００１、Ｔｒｅｎｄｓ．‖モル。ｍｅｄ．７　（９）：４０１−４６７。）、この系統（ＴＳＰ　１およびＴＳＰ２）のＳｅｖｅｒａｌ部材は、ａｎｔｉａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ活動を有することは公知である。
【００３５】
ＴＳＰｓの反対の血管形成活動は、それらのｐｒｏｃｏｌｌａｇｅｎおよびタイプ１つの繰り返し（ＴＳＲ）領域に局所化される、系統の他の部材が有しない特徴。このように、本発明の再結合物ウイルスは、低酸素症応答する要素の制御中で、ＴＳＰ遺伝子またはそれの部分を有するために設計されることができる。反ａｎｇｉｏｇｅｎｉｃな活動がタンパク質の少ない分に局所化されるので、反ａｎｇｉｏｇｅｎｉｃな活動をコード化している核酸が本発明で使われることができる。本発明で使われることができるＴＳＲ領域を含んでいる要因を阻害している他の血管形成は、ＧＤ−Ａ１Ｆである（確認する。ｅに、ｇ．（特許協力条約／ＵＳ９５／完全に本願明細書に引用したものとする０２６３４））。ＢＡＩ１（ＢＡＩ２およびＢＡＩ３）、そして、ＡＤＡＭＴＳ−１，４および８を含むがこれに限らずタンパク質のＡＤＡＭＴＳ一系統の部材‖（確認する。ｅに、本願明細書に引用したものとするｇ．（米国特許６，０４６，０３１））。反ａｎｇｉｏｇｅｎｉｃな遺伝子の数は増大している、そして、これらのいずれかが本発明で使われることができた。本発明で使われることができる他の遺伝子は、ｅｎｄｏｓｔａｔｉｎを含むが、これに限定されるものではない（確認する。ｅに、ｇ．、米国特許６，１７４，８６１、そして、５，８５４，２０５）、小板ｆａｃｔｏｒ−４（ＰＦ４）（確認する。ｅに、ｇ．（米国特許５，４８２，９２３））、ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−４（ＩＬ−４）（確認する。ｅに、ｇ．、米国特許５，３８２，４２７、そして、４，９５８，００７）、そして、顔料上皮−派生要因（ＰＥＤＦ）（見る、ｅ。ｇ．，　米国特許６，２８８，０２４および５，８４０，６８６）。ａｂｏｖｅ−ｒｅｆｅｒｅｎｃｅｄされた米国特許は、これと共に矛盾していない範囲に本願明細書においてそれらの全部に取り入れられる。脳血管形成抑制剤（１，２，３）をコード化している遺伝子、ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１２、ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓの組織抑制剤、プロラクチン（１０ｋＤ断片）、ｂＦＧＦ可溶なレセプタ、変えている成長因子ベータ、インターフェロン・アルファ、胎盤ｐｒｏｌｉｆｅｒｉｎ関連したタンパク質、脈管内皮成長因子レセプタの支配的な負の断片またはそれの断片が、また、本発明で使われることができる。
【００３６】
抗腫瘍代理人
抗腫瘍活動を呈するかまたはウイルスの抗腫瘍活動を強化するかまたは腫瘍に対して免疫反応を調整する様々な遺伝子は、本発明の新しいウィルス構造物に組み込まれることができる。これらの抗腫瘍薬品は、様々な機構によって作動する。
例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ亜種ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓは、ｏｎｃｏｔｏｘｉｎという名のタンパク質を有する。そして、それは抗腫瘍活動を有する‖（米国特許ｎｏ．５，９７７，０５８は、これによって参照によって結合した）。これのようなタンパク質のための遺伝子は、それらの抗腫瘍活動を強化するために本発明の新しい再結合物ウイルスに遺伝子工学によってもよい。抗腫瘍薬品の他の実施例は、ある抑制遺伝子が当業者に知っているさまざまな腫瘍を含むが、これに限定されるものではない。
【００３７】
他の代理人
他の薬品は治療的な目的のための本発明の再結合物ウイルスによって届けられることができて、細胞増殖、細胞周期、細胞成長、細胞運動性、アポトーシス、免疫反応、転移のモジュレータを含むが、これに限定されるものではなくなることができる。そして、そのことは従来技術において通常の技術のそれらにとって公知である。他の障害ＨｙｐｏｘｉｃなまたはＨＩＦ規制緩和は、関節炎、糖尿病性網膜症、虚血性心臓病、ストローク、腫瘍および妊娠障害（ｐｒｅｃｌａｍｐｓｉａおよび子宮内の成長遅滞）を含むがこれに限らず多くの哺乳類の疾患を伴う。
【００３８】
本発明は、この種の状況の治療的な遺伝子（ｓ）を届けるために利用されることができる。さらに、様々な治療的な薬品を試験することは上述した状況を治療することは、リポータ・システムを含んでいるトランスジェニック動物を生成するために用いることがありえる。管理および投薬量のルート腹膜内に、ｅｔｏｐｉｃａｌｌｙに、本発明の組成がエアゾールおよびｉｎｔｒａｃｅｒｅｂｒａｌｙ．で静注で皮下に様々なルートによって管理されることができる小説管理のルートは、当業者にとって公知である。
【００３９】
本発明の新しい再結合物ウイルスは単一の服用においてまたは多数の服用において管理されることができる、そして、治療を必要としている個人の複数の腫瘍は並行して治療されることができる。本発明の好ましい実施例を示すと共に、詳細な説明および具体例が説明だけとして与えられると理解されなければならない。これは、次のことの故である。本発明の範囲内のさまざまな改変と変更態様は詳細な説明および具体例から当業者にとって明らかになる。
【００４０】
実施例
実施例１：アデノウイルスＴｈｉｓ実施例による腫瘍細胞系の伝染は、細胞系がアデノウイルスによって能率的に感染することを脳腫瘍に明らかにする。脳腫瘍の遺伝子治療治療のためのアデノウイルスの利用は、ウィルス・エントリに依る。アデノウイルスを有する人間の細胞の伝染は、少なくとも２つのウィルス・タンパク質およびそれらのそれぞれの細胞レセプタの特定の相互作用を含むｍｕｌｔｉｓｔｅｐプロセスである。
【００４１】
脳腫瘍は組織学的に、そして、遺伝的に異種である、そして、したがって、これらの腫瘍の小さいサブセットだけがアデノウイルスによって感染することができることはあり得る。アデノウイルスによって感染する８つの人間の神経膠腫細胞系（Ｄ２４７ＭＧ、Ｕ２５１ＭＧ、ＬＮ−２２９、ＬＮ−４６４、Ｕ８７ＭＧ、Ｌｎ　Ｚ３０８、Ｔ９８Ｇ、Ｕ１３８ＭＧ）の収容力が構成的に活性外生のＬａｃＺリポータ遺伝子を含む複製が不足しているアデノウイルスを使用して調べられて、これを試験するために（ＡｄＬａｃＺな、ＵＮＣ−ウイルス・ベクトル核機能（チャペルヒル）ＮＣ）。それぞれ、感染してない神経膠腫細胞およびＡｄＬａｃＺ感染した２９３のヒト胚腎臓細胞が負および正の対照として使われた。
各々の細胞系の同等の数を、伝染より前の２４ｈ位に入った。細胞は、０．１−５００から変動している伝染（ＭＯＩ）の多様性のＡｄＬａｃＺに感染するかまたは偽って感染した。２４ｈは伝染に郵送する、細胞は組織化学的に染色されたｐ−、Ｘ−ｇａｌな基板を使用しているガラクトシダーゼ（Ｐ−ｇａｌな）活動および各々のＭＯＩの感染した（青い）細胞の数は視覚的に定量化された。そして、結果は図１にまとめられる。残りの３本の細胞線（ＬＮ−Ｚ３０８、Ｔ９８Ｇ、Ｕ１３８ＭＧ）が５００のＭＯＩでさえより能率的に感染しない（＜　３０％）と共に、８つの細胞系のうちの５つは１００から５００まで変動しているＭＯＩで、７５−１００％伝染力を成し遂げた。５のＭＯＩで１および９５％を超える伝染のＭＯＩで、５０％の伝染を達成しているＡｄＬａｃＺウイルスを有する非常に高い効率で感染する２９３の細胞。
【００４２】
これらの結果は、脳腫瘍細胞系の大きいサブセット（約６０％以上）が高周波でアデノウイルスによって感染することができると確認する。
アデノウイルス伝染に対する人間のガン細胞系の差動の感染性は他の細胞タイプのそれと類似している。そして、人間の膀胱および大腸ガン細胞系を含む。
【００４３】
実施例２：
腫瘍細胞系Ｔｈｉｓ実施例のアデノウイルス伝染上の効果ｏｆｈｙｐｏｘｉａは、脳腫瘍細胞系のアデノウイルス伝染が低酸素症に影響を受けないことを示す。
ＨＹＰＲアデノウイルスの治療的な有効性は、能率的に低酸素症腫瘍細胞を感染させるその能力に依る。２および生物学上多様な神経膠腫細胞系（Ｄ２４７ＭＧおよびＬＮ−２２９）のｎｏｒｍｏｘｉｃで低酸素症条件のアデノウイルス伝染のレベルは、遺伝的に比較された。上記した様に、細胞はｎｏｒｍｏｘｉｃである（２０．８％の０２）か低酸素症（１％の０２）条件の７２ｈ暖められて、それからいくつかのＭＯＩのもので複製が不足しているＡｄＬａｃＺウイルスに感染した。細胞はアガール活動のための２４ｈのポスト伝染で、組織化学的に染色された、そして、感染した（青い）細胞のパーセンテージは視覚的に定量化された（表１）。感染した細胞のパーセンテージがＭＯＩのものをｓｕｂｓａｔｕｒａｔｉｎｇすることでＤ２４７ＭＧ（９％の減少）およびＬＮ２２９（２８％の減少）細胞の低酸素症状況の下で、僅かに減少することを分かった。これはＭＯＩをＬＮ−２２９のための２５０に増やすことによって克服された。そして、ｎｏｒｍｏｘｉａおよび低酸素症の下で感染した１００％の細胞を産した。これらの実験は、細胞培養の低酸素症条件のアデノウイルス伝染がｎｏｒｍｏｘｉｃな状況の下でそれと同様のレベルで発生することを証明する。このように、各々の感染した細胞が１０３−１０４まで新規なウィルス分子を生産すると推定された時から、この効率はウイルス増殖および普及ができるようにする。
【００４４】
【表１】
2004509635.tif 000002
実施例３：
低酸素症状況Ｔｈｉｓ実施例の下のアデノウイルスの複製および後継者製造は、複製ａｎｄｐｒｏｇｅｎｙｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎがｅｆｆｉｃｉｅｎｔｕｎｄｅｒ低酸素症状況であることをＡｄＬａｃＺに明らかにする。低酸素症電池が高効率アデノウイルス複製を可能にしないという可能性および後継者製造は、ＡｄＬａｃＺを使用している２９３の細胞において試験された。２９３の細胞はヒト胚腎臓細胞系であるどの補足、のトランス、ウィルスものは複製が不足しているＡｄＬａｃＺにおいて失敗して機能して、ウィルス製造を許す。
【００４５】
ウイルスは、ｎｏｒｍｏｘｉｃ（２０．８％の０２）で低酸素症（１％の０２）状況の下で発達するＡｄＬａｃＺ感染した２９３の細胞から収穫されて、それから異なるいくつかのＭＯＩのものでｎｏｎｎｏｘｉａの下でＤ２４７ＭＧおよびＬＮ−２２９の神経膠腫細胞系を感染させるために用いた。細胞は、２４本のｈ柱で組織化学的に伝染にしみをつけられた（感染した（青い）細胞の３ガロンの活動およびパーセンテージが、視覚的に定量化されて、ウィルス滴定濃度の評価として使われた。結果は、表２にまとめられる。
【００４６】
ウイルスが低酸素症２９３の細胞において生じるときに、感染した（青い）細胞のパーセンテージがほぼ２０％減ったことを分かった。これらの結果は、ウィルス製造が低酸素症２９３の細胞において僅かに減少するだけのことを示唆する。
【００４７】
【表２】
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要約すると、実施例１−３に記載されている実験は神経膠腫細胞系の大きいサブセットが高効率でアデノウイルスに感染することができることを証明した、そして、そのアデノウイルス伝染、複製および後継者製造は低酸素症状況によって劇的に変えられない。
【００４８】
実施例４：
低酸素症応答するプロモータ実施例４の構造は、ｈｙｐｏｘｉａ−ａｎｄ／ｏｒ　ＨＩＦ−従属する反復可能なアデノウイルス（ＨＹＰＲ−Ａｄのもの）の生成のために使用される低酸素症に反応するプロモータの設計およびテストを記載する。再結合物アデノウイルスの連続がｈｙｐｏｘｉａ／ＨＩＦに依存する規則を必要とするＨＹＰＲ（調整される低酸素症および／またはＨＩＦ）の構造
反最小の低酸素症−反応最小のＥｌ
ＡＮＧＩＯＧＥＮＩＣプロモータ要素プロモータ遺伝子
遺伝子
【００４９】
【表３】
2004509635.tif 000004
市販の哺乳類の表現ベクトル（ｐＢＩ、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、パロアルト、ＣＡ、図２）が、使われた双方向性低酸素症／ＨＩＦ−敏感なプロモータの世代およびテストのための基礎。ｐＢＩプラスミドは、２つのｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓな遺伝子の条件つきの双方向性表明を可能にするｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎに反応する要素を含む。低酸素症に反応する要素は、いくつかの遺伝子において識別されて、古典的エンハンサ要素として機能するように見えた。したがって、これらの要素は、２つの遺伝子の表現度を二方向にｃｏｒｅｇｕｌａｔｅするために機能にこれらの構造物のために選ばれた。
【００５０】
ＨＹＰＲウイルスの構造における第１のステップは、低酸素症／ＨＩＦｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅプロモータのより抜きであった。低酸素症状況は、生理的反応のカスケードを始めて、糖分解、ｅｒｙｔｈｒｏｐｉｅｓｉｓおよび血管形成に関係している遺伝子の誘導に至ることは公知である。複雑なＨＩＦ−１タンパク質、それは２つの基本的な螺旋−ループ螺旋タンパク質ＨＩＦ−１から成るｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒであるそして、ＨＩＦ−１ｓｓ、結合しによる目標遺伝子の範囲内であるシス舞台のｈｙｐｏｘｉａ／ＨＩＦ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅなエンハンサのモティーフ（ＨＲＥ）に対する低酸素症に対する転写ｒｅｐｏｎｓｅｓｄを調停する。低酸素症−動作中のｔｒａｎｓｅｒｉｐｔｉｏｎ要因の一系統の一部として、ＨＩＦ２およびＨＩＦ３が、また、識別されて、機能的にＨＩＦ　１つのａ．と類似しているとわかった。ｃｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ（欧州特許庁）遺伝子の３’−側面を接している領域およびＶＥＧＦ遺伝子の５’−側面を接している領域の中であるＨＲＥは、長さの５０ｂｐ未満である。これらのＨＲＥのものは、サイトを結合している非常に節約されたＨＩＦ−１およびｈｙｐｏｘｉｃ／ＨＩＦ　ｉｎｄｕｃｔｉｉｏｎのために機能的にｃｓｓｃｎｔｉａｌである他の遺伝子−ユニークなシス代理のｓｃｑｕｅｎｃｅｓを含む。欧州特許庁は、低酸素症に応答して腎臓および肝臓において生産されるグリコプロテイン・ホルモンであって、ｃｒｔｙｈｒｏｉｄ原種およびｐｅｒｃｕｒｓｏｒ細胞に表されるそのレセプタに結合することによってｃｒｙｔｈｒｏｐｏｉｃｓｉｓを刺激する。
【００５１】
それぞれ、欧州特許庁およびそのレセプタはまた、星状細胞および神経単位によって中枢神経系において表される。ここで、それらがｐａｒａｃｒｉｎｅ方法で作用して、神経単位を低酸素症によって誘発された損害から保護するように機能することは現在行儀よくされる。ＶＥＧＦは様々な細胞タイプの低酸素症によって誘発されて、また、多数の腫瘍細胞タイプによって表される。そして、神経膠腫を含む。ＶＥＧＦは、血管形成の主要な監査機関であって、脈管内皮細胞に特有であるｍｉｔｏｇｅｎｉｃな活動を有する。これに基づいて、シーケンスが公知である（Ｓｅｍｅｎｚａほか１９９８（Ｃｈｅｓｔ　１１４：４０Ｓ−４５Ｓ））情報（欧州特許庁およびＶＥＧＦ　ＨＲＥのもの）は、設計のために選択されて、ｈｙｐｏｘｉａ／ＨＩＦに反応するプロモータで困難である。
欧州特許庁ＨＲＥシーケンス（配列番号）：
１、ＧＣＣＣＴＡＣＧＴＧ　ＣＴＧＴＣＴＣＡＣＡ　ＣＡＧＣＣＴＧＴＣＴ　ＧＡＣおよびＶＥＧＦシーケンス（配列番号）：
２、ＣＣＡＣＡＧＴＧＣＡ　ＴＡＣＧＴＧＧＧＧＣＴ　ＣＣＡＡＣＡＧＧＴＣ　ＣＴＣＴＴ、容易にする追加的なシーケンスと一緒のｐＢＩベクトルへのそれらのクローニングは、標準のオリゴヌクレオチド合成手順によって総合された。
これらのＨＲＥは、それから実施例５のベクトルを造るために用いた。
【００５２】
実施例５：
低酸素症−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅな表現の生成はかなりのサイズを一定方向に向ける、そして、現在利用できるアデノウイルス・ベクトルの限られたユニークなクローニング場所は構造ｏｆｔｈｅ　ＨＹＰＲおよびＨＹＰＲＡウイルスのために必要なステップをｓｕｂｃｌｏｎｉｎｇしているそれらの有用性ｉｎｔｈｅ倍数を制限する。したがって、Ｅ１および反ａｎｇｉｏｇｅｎｉｃなａｎｇｉｏｓｔａｔｉｎ遺伝子のｈｙｐｏｘｉａ／ＨＩＦに依存するプロモータおよび次のｓｕｂｃｌｏｎｉｎｇの構造およびテストは、修正されたｐＢＩおよびｐＢＩ−ＧＬ哺乳類の表現ベクトル（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、パロアルト、ＣＡ、図２）をｓｕｓｉｎｇして実行された。修正されたｐＢＩプラスミドの範囲内の結果として生じる遺伝子カセットが、再結合物ＨＹＰＲおよびＨＹＰＲＡアデノウイルスの構造において、その後使われる。ｐＢＩベクトルは、ｔｅｔに反応する要素の７枚の写しを含む敏感なプロモータが２つの最小のＣＭＶによって側面に位置したｂｉｄｉｒｅｃｔｉｉｏｎａｌなテトラサイクリン（ｔｅｔ）から、関心の２つの遺伝子を表すために用いることができる。ｐＢＩ−ＧＬベクトル、ｃｏｎｔａｎｓにＬｕｃｉｅｆｅｒａｓｅおよび同じことの規制の下のＬａｃＺ／ｓｓ−Ｇａｌリポータ遺伝子。ｔｅｔに反応する要素が低酸素症／ＨＩＦｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ要素（ＨＲＥ）と取り替えられたように、ｐＢＩおよびｐＢＩ−ＧＬ哺乳類の表現ベクトルは修正された。認識が据え付けるＸｈｏ　１は、ｐＢＩおよびｐＢＩ−ＧＬプラスミド５に導入された」、そして、３」サイト誘導されたｍｕｔａｇｅｎｃｅｓｉｓ（ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ　Ｓｉｔｅは、Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓキット、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、ラ・ホーヤ、ＣＡをＤｉｒｅｃｔｅｄした）によるｔｅｔに反応する要素の。ｔｅｔ−反応要素は、それからＸｈｏ１を有する消化によって取り外された。
【００５３】
中でＨＲＥにわたるＯｌｉｇｏｎｕｃｌｃｏｔｉｄｅｓ　５」、ＶＥＧＦ遺伝子および欧州特許庁遺伝子の３’ｆｌａｎｋｉｎｇ領域のｆｌａｎｋｉｎ部位は、総合され（実施例４を見る）て、ｃｏｎｃａｔｅｍｅｒｉｚｅｄされて、それから修正されたｐＢＩおよびｐＢＩ−ＧＬ　ＴＥＴベクトルのＸｈｏ１サイトに、ｔｈａｎｄｅｍ（尾部方位に対するｈｃａｄ）においてクローンをつくられた。
両方ともＶＥＧＦまたは欧州特許庁ＨＲＥの６つの縦に並んだｃｏｐｉｃｓに、１を含むｐＢＩ−ＨＲＥてｐＢＩ−ＧＬ　ＨＲＥを示される構造物５」、そして、３」、方位は発生した。
【００５４】
実施例６：
双方向性ｈｙｐｏｘｉａｌＨＩＦ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅなリポータ遺伝子表現のテスト。ｅｐＢＩ−ＧＬ　ＨＲＥ構造物が、低酸素症および／またはＨＩＦ．に二方向に発光酵素を表すそれらの能力およびｓｓ−ｇａｌなリポータ遺伝子ｉｎｒｅｓｐｏｎｓｅがないか調べられた加算、コピー番号の影響および基礎活動および低酸素症上のｏｒｉｃｎｔａｔｉｏｎにおいてリポータ遺伝子の特定の誘導は、また、調べられた。最後に、ＥＰＯＨＲＥのもの対ＶＥＧＦ基礎活動および誘導能力は、神経膠腫細胞系の最適規則を与える応答部材を決定するために比較された。まず最初に、ｎｏｒｍｏｘｉｃな対低酸素症条件のＬＮ−２２９の神経膠腫細胞系の２４のｐＢＩＧＬ−ＨＲＥ構造物のリポータ遺伝子活動は、調べられた。構造物は、ＧｅｎｅＰｏｒｔｅｒトランスフェクション試薬（遺伝子Ｔｈｅｒａｐｙ　Ｓｙｓｔｅｍｓ、サンディエゴ、ＣＡ）を使用しているＬＮ−２２９の細胞に、一時的にトランスフェクションした。細胞は、一晩トランスフェクション手順から回復することができて、それから４８ｈのｎｏｒｍｏｘｉｃである（２０．８％のＯ２）か低酸素症（１％のＯ２）条件の下で暖められた。
原物のｐＢＩおよびｐＢＩ−ＧＬプラスミドが、これらの実験のための負の対照として使われた。Ｌｕｃｎｓｒａｓｃに、完全に破壊する、そして、ｓｓ−ｇａｌな酵素の活動はｃｏｍｍｅｒｉｃａｌな分析（Ｔｒｏｐｉｘ二重軽いｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔなリポータ遺伝子分析システム、印加Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、フォスター市、ＣＡ）を使用して測定された。酵素の活動は、それからａｍｏｄｉｆｉｅｄされたブラッドフォード・タンパク質分析（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、ヘラクレス、ＣＡ）を使用している細胞抜粋の全タンパク質に正常化された。ＬＮ−２２９細胞において得られたｄａｓｔａ基づく２４の構造物の８（ｐＢＩ−ＧＬ　ＶＥＧＦ−５Ｌ、６Ｌ、３Ｒ、４Ｒ、５Ｒ、そして、６ＲおよびｐＢＩ−ＧＬ　ＥＰＯ−３Ｌ、そして、６Ｌ）更なる分析のための選択した。
これらの８つの構造物は、低酸素症に応答してｎｏｒｍｏｘｉｃな条件のリポータ遺伝子活動およびリポータ遺伝子活動の最高の双方向性帰納法の最も低いレベルを表示した。活動データがＬＮ−２２９細胞において得た双方向性リポータ遺伝子を確認して、延長するために、これらの８つの構造物は、また、ｎｏｒｍｏｘｉａおよび低酸素症（１％の％Ｏ２）（図３）の下で２つの他の神経膠腫細胞系（Ｕ２５１　ＭＧ（Ｕ１３８ＭＧ））において試験された。
これらの結果は、ＶＥＧＦおよび欧州特許庁ＨＲＥがプラスミドの低酸素症状況の下で双方向性遺伝子表現を誘導することを証明した。重要なことに、高い誘導は、縦に並んだコピーが両方ともに向かっていた時を呈された５」、または、３」、リポータ遺伝子の双方向性誘導が縦に並んだｃｏｐｉｃｓ．のｏｒｉｅｎｔｔｉｏｎに、依らなかったことを示唆して、方向（構造物名のＲ対Ｌ）最後に、ｎｏｒｍｏｘｉｃな条件のこれらのｃｏｎｓｔｒｕｃｔｓｄの背景表明は、最小でｓｅｅｎｗｉｔｈｔｈｅ　ｐＢＩ−ＧＬベクトルよりかなり大きくなかった。
【００５５】
実施例７：
ｇｅｎｅｒａｓｔｅ再結合物アデノウイルスに対する低酸素症および／またはＨＩＦに反応するウイルスＴｗｏ共通して使う方法は、いずれの相応する組換えも哺乳類の細胞に関係させるかまたはアデノウイルス・ゲノムのＤＮＡ断片のくくることを導く。最近、新しいシステムは、ｐＡｄＥａｓｙ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、ラ・ホーヤ、ＣＡ）としてに関連した（彼（Ｔ．　Ｃ．　ｅｔ　ａＬ）［　１９９８の］会報全米科学アカデミー９５：２５０９−１４）、組換え手順のためのａ７１０ｗｅｄは、バクテリアにおいて実行される。ｐＡｄＥａｓｙシステムにおいて、ｐｏｌｙｌｉｎｋｅｒはアデノウイルス・シーケンスが側面に並んでいる往復のプラスミドに、重要な遺伝子は、最初にクローンをつくられる。これらの側面を接しているａｄｅｎｏｖｉｒｌａｎシーケンスは、Ｅ１てＥ３ウィルス地方を除いて、アデノウイルス・ゲノムの全てを含むａｄｅｎｏｉｒａｌなプラスミドを有する相応する組換えを可能にする。組換え製品は、それから再結合物アデノウイルスを生成するために２９３のｐａｃｋａｉｇｉｎｇしている細胞系（ＡＴＣＣ、ロックビル、ＭＤ）にトランスフェクションする。
【００５６】
本発明のコンテキストの範囲内でｐＡｄＥａｓｙシステムを決めるために、緑の蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を表す複製が不足しているアデノウイルスは発生した、そして、ＧＦＰ表現は感染したＬＮ−２２９の脳腫瘍細胞において検査された。
【００５７】
実施例８：
ｐＡｄＥａｓｙシステム実施例８を有する複製−有能な再結合物アデノウイルスＨＹＰＲ−Ａｄの生成は、外因性ｈｙｐｏｘｉａ／ＨＩＦに依存するプロモータ（最小のＣＭＶプロモータに連結するＨＲＥ）の下で、アデノウイルスＥ１Ａ遺伝子を有する再結合物ａｄｅｎｖｉｒｕｓの構造によって、低酸素症および／またはＨＩＦ起動の状態の下で、選択的に複製する条件つきの減らされたアデノウイルスの生成を記載する。
【００５８】
アデノウイルスは、分割で静止した電池を感染させるＤＮＡウイルスである。細胞周期への感染した静かなセルの再入はウィルスＤＮＡ複製のために必要である、そして、最終的に、ウィルス後継者製品。Ｅ１Ａ遺伝子製品の表現度はこれらのウィルス機能のためにｃｓｓｅｎｔｉａｌである、そして、Ｅ１Ａ遺伝子領域を欠いているアデノウイルスは複製が不足している。
ａｄｃｎｏ　：
＋　＋ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ　Ｅ１Ａ遺伝子は、構成的に活発なプロモータ領域から表される第１の転写装置である。
【００５９】
Ｅ　ｌＡ遺伝子の製品は、細胞でウィルスｔｒａｎｓｃｒｐｔｉｏｎ（Ｅ１Ｂ遺伝子転写の誘導を含むこと）の変調および静かなセルのＤＮＡ合成の誘導を含む広範囲にわたる生物学的活動を呈する。しかし、Ｅ１Ａによる細胞成長制御の規制緩和は、依存しているｐ５３および独立機構によるアポトーシスを誘導して、最終的にウィルス後継者製造のじゃまをする。野生型アデノウイルス伝染の間のアポトーシスの防止は、アデノウイルスＥ１Ｂ遺伝子製品の表現度によって調停される。Ｅ１Ｂ遺伝子は、２つのタンパク質、２１Ｋおよび５５Ｋをコード化する。そして、それはそれぞれにＥ１Ａによって誘発されたアポトーシスを阻害するように機能する。２１Ｋのタンパク質が相応するＥ１Ｂ、アポトーシス調節装置およびブロックＥ１ＡのＢｃｌ−２つの一系統に対するシーケンスおよび機能は、多くの他のａｐｏｐｔｏｔｉｃな刺激と同様にアポトーシスを誘導した。２１Ｋの機能が広範囲な核でウィルスＤＮＡ分解（度表現型）および強化された細胞病理学的な効果（ｃｙｔ表現型）の体裁に導くＥ１Ｂを欠いているアデノウイルスを有する細胞の伝染。Ｅ１Ｂは、５５Ｋ、アデノウイルスＥ４−ｏｒｆ６遺伝子製品と連動して、ウィルス製造の間、２つの機能を有する：大部分の細胞ｍＲＮＡの輸送を禁止すると共に、ウィルス遅いｍＲＮＡの輸送を容易にするために直接相互に作用して、ウィルス製造のｐ５３およびそれ以後を機能させないために。ＯＮＹＸ−０１５のような、５５Ｋ　Ｅ１Ｂを欠いているアデノウイルスは、機能する多くの人間の細胞のそれぞれにｐ５３．の機能的な現状の効果的なウィルス後継者製品ができある
しかし、これらの変異体ウイルスは、人間の細胞系のサブセットの徹底的に減少するウィルス産出高を呈する。この変異体表現型が５５Ｋ主にＥ１Ｂの遅いｍＲＮＡ輸送機能の欠如から生じる、そして、若干の細胞系が変異体ウイルスが利用することができるｂｃｏｍｐｅｎｓａｔｏｒ経路を有することができると現在思われている。ウィルス後継者製品（Ａｄ−ＣＭＶ　Ｅ１が発生することができるのと、同程度よくこの遺伝子を含むＨＹＰＲ−Ａｄのもの）の間のベースのｏｎｔｈｅ重要な役割ｏｆｔｈｅ　Ｅ１Ｂ遺伝子製品。これは、達成されることができるＥ１削除されたアデノウイルス媒体動物に導くＥ１Ａ遺伝子が調整されるｗｈｉｈｃのａｄｅｎｏｖｉｒａｌＥ１ゲノム領域（Ｅ１Ａ、Ｅ１ｂおよびＩＸ遺伝子）を含んでいるＤＮＡカセット外生の低酸素症−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅなプロモータ（図６）。アデノウイルス・タイプ５（Ｅ１Ａ遺伝子領域およびＥ１ＢおよびＩＸ転写装置をｅｎｃｏｍｐａｓｉｎｇすること）のうちの４１０５に対するヌクレオチド５０１からのゲノムＥ１領域は、ＤＮＡ　ｅｘｔｒａｔｅｄされたｆｅｒｏｍを使用しているＰｆｕターボＤＮＡ　ｐｏｌｙｍｃｒｅａｓｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）によって拡大されたｄ１３０９ウイルス（Ｅ　１つの遺伝子領域のための野生型であるが、それを研究所用途にとってより安全にしている領域が得られたＥ３遺伝子の置換を有するＥ．Ｈａｒｌｏｗ博士、マサチューセッツ総合病院、ボストン、ＭＡ）。結果として生じる拡大された３．６ＫｂのＤＮＡ製品は、最小のＣＭＶプロモータ（ｐＢＩ−ＶＥＧＦ−６Ｒに由来した）に連結する６つのＶＥＧＦ　ＨＲＥを含んでいるｈｙｐｏｘｉａ／ＨＩＦ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅなプロモータの下流にクローンをつくられた。ＨＲＥ−ＣＭＶ　Ｅ１カセットは、アデノウイルス・シャトル・ベクトル（ｐＳｈｕｔｔｌｅ）（ＦＩＧ．５）で、その後ｓｕｂｃｌｏｎｅｄされた。再結合物はカナマイシン抵抗のためにｓｃｌｅｃｔｅｄされた、そして、エンドヌクレアーゼが分析する多数の規制によって、組換えは確認された。
【００６０】
最後の相において、再結合物アデノウイルス・プラスミドは、逆にされた終端の繰り返しをさらすＰａｃ１によってｌｉｎｃａｒｉｚｅｄされて、それから２９３の包装細胞系にｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ試薬（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ博士））を使用することをトランスフェクションさせた。
結果として生じるウイルス（ＨＹＰＲ−Ａｄ１）は、標準のプロトコルを使用して収穫されて、下記のように特徴づけられた。我々も生成した比較の目的およびＥ　１つの領域が構成的に活性ＣＭＶプロモータ（Ａｄ−ＣＭＶ　Ｅｌ）によって調整されるアデノウイルスのための。
【００６１】
実施例９：
再結合物ウィルス遺伝子製品の表現度は低酸素症でｎｏｒｍｏｘｉｃな状況の下で細胞をトランスフェクションさせた彼、Ｅ１ＡおよびＥ１Ｂウィルス・タンパク質は２９３の細胞ゲノムのこれらの遺伝子の安定した統合の結果として、人間の２９３の細胞において構成的に表される。したがって、２９３の細胞は、これらのウィルス・タンパク質の表現度を確認するために用いることができない。再結合物アデノウイルス、Ｕ２５　１丁のＭＧおよびＬＮ−２２９細胞からこれらのタンパク質の表現度を確認することは、Ａｄ−ＣｔＥＩ　Ｅｌに感染した、そして、そして、ＨＹＰＲ−Ａｄ１．タンパク質表現は、単クローン反対のＡｄｅｎｏｖｉｒｕｓ　Ｔｙｐｅ　５つのＥ　１つのＡ、Ｅ　１つのＢ　５つのＳＫｄおよび２１のＫｄ抗体を使用している感染した細胞の中でにじんでいるウェスタンによって調べられた。感染してない細胞は、負の制御（図７Ａ−Ｂ）として役立った。Ｅ１Ａは、ＨＹＰＲ−Ａｄ１の低酸素症によって起動する。
Ｅ１Ａは、早めのＥ１Ｂ遺伝子規制を含んでいる他のウィルス・プロモータの表現度を起動させることは公知である。
【００６２】
これは、低酸素症の下でＥ１Ｂ遺伝子製品の増加する表現度を説明する。
遅いＥ１Ｂ遺伝子規則は、他の要因を含んで、２−３つの日ポスト伝染で、ｎｏｎｏＹ−ａの下でＥ　１つのＢ２　１つのＫの増加する表明を説明することができる。これらの実験は、再結合物アデノウイルスが構成的に急行（Ａｄ−ＣＭＶ　Ｅｌ）に有能で条件つきで（ＨＹＰＲ−Ａｄｌ）Ｅ１ＡでＥ１Ｂ遺伝子製品だったことを証明する。これは、一時的なｒｅｃｐｏｒｔｅｒ遺伝子分析法に示す低酸素症に依存する規則がアデノウイルス・ゲノムのコンテキストにおいて維持されることを証明する。
【００６３】
実施例１０：
ＨＹＰＲ−Ａｄ１の能力およびＬＮ−２２９の神経膠腫細胞の細胞崩壊を誘発するＡｄ−ＣＭＶ　Ｅ１が線をひく低酸素症従属する方法の腫瘍細胞の細胞崩壊は、２つのウイルス（図８Ａ−Ｄ）量の増加と共に、伝染で測定された。
１セットの細胞はｎｏｒｍｏｘｉｃな状況（２０．８％のＯ２）の下で暖められた、そして、細胞の他の一組は低酸素症状況（１％の０２）の下で暖められた。負の制御として、感染してないＬＮ２２９神経膠腫細胞が、使われた。細胞は、毎日細胞病理学的な効果（ＣＥＰ）の証拠がないか調べられた。伝染のためのウィルス集中をｓｕｂｓａｔｕｒａｔｉｎｇすることの使用で、我々は時間とともにＣＰＥの進行に続くことができた。これらの事前のデータは、６日のｎｏｒｍｏｘｉａ（図示せず）ｒｏ低酸素症（図８Ａ）の後、擬感染したＬＮ−２２９細胞が合流することを示す。暗い点が白い光輪によって囲んだｓとして、少数の細胞概要およびＣＡは現れる。いくつかのこれらの細胞は分けている、そして、いくつかは単分子層から分離する。そして、この細胞のための典型的挙動はそれが合流点にあることをかつて線をひく。明白なショーがＣＰＥの中で多くの細胞概要と署名して、単分子層から分離するＡｄ−ＣＭＶ　Ｅ１（図８Ｂ）に感染する細胞。ＨＹＰＲ　Ａｄｌに感染して、ｎｏｒｍｏｘｉａの下で維持される細胞の形態は、おそらく、概要細胞（図８Ｃ）のわずかな増加については、感染してない細胞のそれに対するｓｉｍｎｉｌａｒである。対照、ＨＹＰＲ−Ａｄｌに感染する大部分の細胞および維持された下の低酸素症において（図８Ｄ）　Ａｄ−ＣＭＶ−Ｅ１感染した細胞に、細胞崩壊ｓｉｍｎｉｌａｒを受けた。
【００６４】
これらの結果は、それが低酸素症状況の下でＣＰＥを誘発した時から、ＨＹＰＲ　Ａｄｌが条件つきでｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ−ｃｏｍｐｅｔｅｎｔなことを示唆する。
【００６５】
実施例１１：
実験がこの断面に記載した脳腫瘍に対する再結合物ウイルスの配送は、定位技術によって腫瘍細胞およびアデノウイルスのヌードマウスへの脳内注入を必要とする。９ｌのネズミｇｌｉｏｍａｔｕｍｏｒ細胞（５ｘ１０４細胞、５、ｗｌ　ｖ；ｓｅの前にｅ；。ｔｕ：ｕｐｌ　ｅｕ　ｉ　ｅ　ｂｒ　３ｆ　３ｚｚ　ｓｙ　ｇｅｎｅｃ　Ｆｓｅ　ｒ．　ｔｓ．後でリーヴェン日、ＬａｃＺ（１．８ｘｌＯｌＯ分子（２４の生産量））を表している複製が不足しているアデノウイルスは、共同腫瘍細胞注射に関しては同じｓｔｅｒｅｏｔａｃｔｉｃａｌな共同縦座標を使用している腫瘍に、不活性コロイド・カーボン分子（０．５ｌ）によって吹き込んだ。ネズミは、注射および脳が引き出して、シリアルによって切断することを分析したウイルスの後の犠牲にされた２４のｈであった。断面は検出するために処理された−ガロン、ｖｉｒａｌｌｙなコード化された酵素を表している表現および細胞は青い領域において見える。黒い穀物は、針トラックに沿って堆積するコロイド・カーボン分子である。
【００６６】
この断面は、針地域に沿った腫瘍細胞の６０−８０％が感染して、ＬａｃＺタンパク質を表すことを明らかにした。結果について図９を参照する。
【００６７】
実施例１２：
低酸素症−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅなプロモータの制御中で、アルカリホスファターゼ遺伝子から成る低酸素症−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅなアルカリ・リン酸塩表現Ａプラスミド構造物は、ＬＮ２２９神経膠腫細胞にトランスフェクションした。
クローンは、４８−ｗｅｌｌプレートの個々の井戸に入れられて、いずれのｎｏｒｍｏｘｉｅまたはｈｙｐｏｘｉｅ状況にもさらされた。低酸素症条件のアルカリホスファターゼの表現度が陽性でｎｏｒｍｏｘｉｃな状況の下で負の含有率を示したクローンは、保持されて、更に調べられた。ｎｏｒｍｏｘｉｃで低酸素症状況の下で陽性反応を示したクローンは、廃棄された。
【００６８】
実施例１３：
使用可能な状態でｈｙｐｏｘｉａ／ＨＩＦに反応するプロモータから成る表現可能なプラスミド構造物によって変わるＬＮ２２９神経膠腫細胞のクローンに由来する細胞のＥｑｕａｌ数が連結した低酸素症−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅな経路を調整する合成物の識別、アルカリホスファターゼのための遺伝子は、９６−ｗｅｌｌ　ｍｉｃｒｏｔｉｔｅｒプレートの井戸に加えられる。細胞は、それらが付着することができるために３７Ｃで一晩暖められる。すなわち、リポータ構造物を含んでいるｍｉｃｒｏｔｉｔｅｒプレートおよび細胞は、所望のＯ２集中に同時にｅｑｗｕｉｌｉｂｒａｔｅｄされる低酸素症またはｎｏｒｍｏｘｉｃな、または、ｈｙｐｏｘｉａ／ＨＩＦに反応するプロモータによってドライブされる遺伝子の書換えを誘導することは公知の合成物を有する処理する。分析バッファに希釈される試験合成物の適当な量は、それからよい各々に入れられる。
最初のスクリーンの間、よい各々は、異なる試験に＠ｖｅを有する制御井戸を除いて、合成物か不活性合成物を合成させなくさる。
【００６９】
選択された期間の後、反応はアルカリホスファターゼ活動のために検定される。
アルカリホスファターゼ活動は、視覚的にまたは分光測光法で検出されることができる。低酸素症に反応する遺伝子を誘導する状況の下で、減らすかまたはアルカリホスファターゼの表現度のレベルを増やす合成物は、ｈｙｐｏｘｉａ／ＨＩＦ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅな経路のモジュレータとして分類される。最初のふるい分け分析のｐｏｉｓｔｉｖｅを試験する合成物は、アルカリホスファターゼ活動（ＩＣ５０）の表明のレベルの５０％を阻害する合成物の濃度を決定するために試験合成物の濃度を変化させることを除いて、上記の通りに同じ分析を実行することによって調べられるｆｅｕｒｔｈｅｒである。これらのｉ．のＩＣ５０を有する合成物Ｓ２ｉ　ｖｅＳａ「ｖ　ｆｉ　ｉ．ＴＧ」ｒＷ。ｆＣ３ｒＷｕ　ＣｖＷＯ’ｕｕｕＳ　ＬｌｌＣＩＬ　ｌｉＣ．そうｉ．　ＪＶ　ｉｔｌｌ　ｉｖ．．　ｖｉ　ｉｖ。Ｓ　ｉｉｉｃ．　ｕ　Ｉｖｖ　．．　ｓ、ｉ、Ｗ。より好適な；そして、１０ｕｍ未満のＩＣ５０を有するものは、非常に好まれる。
【００７０】
実施例１４：
ｅｈｙｐｏｘｉａに反応する遺伝子の表現度を調整している合成物の活発な評価において。ＣＡ実験的な腫瘍は、アルカリホスファターゼのための遺伝子に使用可能な状態で結合される低酸素症に反応するプロモータから成る表現可能なプラスミド構造物によって変わるＬＮ２２９神経膠腫細胞のクローンに由来する細胞を配置することによってｉｍｍｕｎｏｃｏｍｐｏｍｉｓｅｄされたマウスにおいて発達する。腫瘍が特定のサイズに達するときに、低酸素症に反応する遺伝子の誘導を調整することを示した合成物はマウスに与えられる。不活性合成物または合成物以外は、負の制御として実験群の他のマウスに与えられる。１決定された時間、実験的な腫瘍はマウスおよび断面から取り除かれる。そして、これらの腫瘍はアルカリホスファターゼの表現度のために検定される。対照腫瘍はアルカリホスファターゼ表現のポケットを示す、しかし、腫瘍の大多数の細胞は現在アルカリホスファターゼ表現を示す。対照腫瘍に示してあるより、高い細胞のパーセンテージによって、低酸素症−ｒｅｓｄｐｏｎｓｉｖｅな遺伝子の表現度を調整する合成物で扱われる実験的な腫瘍のアルカリホスファターゼの式は、合成物が腫瘍細胞を着くことができることを確認して、低酸素症に反応する遺伝子複写を刺激するために生体内に動作中である。しかし、Ｗ−ｕｔに示すより、低い細胞のパーセンテージによるアルカリホスファターゼ表現」ｉ　ｉ’ｖｉｌ’ｌ−ｖＴ　−ｖｉ’ｌＷ．　ｉ　ｉｉｅ７．　ｉ　ｉｉｉｖ　ｖ．　−ｖ
３Ｗｉ１Ｃｉ　ｉ　−ｖｅ−．　ｉｉ。ｉＣ」。ＯＴＢｃ」。Ｗｉｉ’１　ｔ；低酸素症に反応する遺伝子転写を禁止するｕ’ｎｏｒ　ｃｅｉ　ｅｉ．　ｉｕ　ｉａ　ａＣｔｌＶ　ｌｉ２　ｖｌ　ｖｖ−。
【００７１】
実施例１５：
免疫不全マウスのｘｅｎｏｇｒａｆｔｅｄされた神経膠腫細胞の成長の減少。ＬＮ２２９細胞は、皮下にｎｕ／ｎｕマウスの左の横腹に植設された。。そのとき、平均腫瘍生産量‖［量＝（長さｘ　ｗｉｄｔｈ２）／２）マウスを７５のｍｍ３（矢）に渡す１０８ｐｆｕのアデノウイルス（ＨＹＰＲ−Ａｄ１またはｄ１３０９）またはＰＢＳ（車両）が５日毎日吹き込まれた３つのグループおよび０．６６のｘに分けた。Ｆｏｒｏｔｙ−九つ日注射実施要項後の、マウスは殺された（ＰＢＳ注射された腫瘍のかなりの容積による）、そして、腫瘍は収穫された。
車両マウスのうちの１匹は未知の原因のために注射実施要項の完成後の、すぐ死んだ、そして、ｄｌ３０９マウスのうちの１匹はｃｙｅ伝染に関連した過剰な体重減少のために、日５７に犠牲にされた。
【００７２】
我々は、違いをそれが吹き込まれなく（示されないデータ）て、ＰＢＳによって注入されたＬＮ２２９腫瘍の成長で発見しなかった。収穫時に、ＰＢＳ（正方形）が腫瘍に注射したより、ＨＹＰＲ−Ａｄ１注射された腫瘍（円）の平均容積は、５．３回、少なかった。ＰＢＳが腫瘍に注射したより、ｄｌ３０９注入された腫瘍（ダイヤモンド）Ａｌ−９は３４回小さかった。ＨＹＰＲ−Ａｄｌが腫瘍に注射したより、ｄ１３−９つの注射された腫瘍は６．４回小さかった。
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は、再結合物アデノウイルスを有する腫瘍細胞の伝染を示す。パネルの上に示されるさまざまな細胞系は、ＬａｃＺリポータを含んでいる再結合物アデノウイルスに感染して、染色されられた（３ガロンの活動。更なる説明および実験的な詳細について実施例１を参照する。
【図２】
図２は、使用するプラスミドの概略図が本発明から新しい再結合物ウイルスを造ることを示す。ＭＣＳは、多数のクローニング・サイトに関連する；ＴＥＴｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ応答する要素；ＨＲＥ−低酸素症および／またはＨＩＦ応答する要素；１−６は、ＨＲＥの縦に並んだコピーの数に関連する。
更なる説明および実験的な詳細について実施例４および５を参照する。
【図３Ａ】
図３Ａ−Ｄは、低酸素症がトランスフェクションする腫瘍細胞系の構造物の表明を誘導したことを示す。ＶＥＧＦまたはＥＰＯ−３，４，５，６は、構造物の縦に並んだ繰り返し、５’ｏｒｉｅｎｔａｔｉｏｎのためのＬおよび３’ｏｒｉｅｎｔａｔｉｏｎのためのＲの数に関連する。
図３Ａおよび３Ｃは、構造物の能力が低酸素症に応答して二方向に発光酵素を表すことを示す；
図３Ｂ、そして、二方向に表す構造物の３Ｄショー能力（低酸素症に応答する３−Ｇａｌ。更なる説明および実験的な詳細について実施例５を参照する。
【図３Ｂ】
図３Ａ−Ｄは、低酸素症がトランスフェクションする腫瘍細胞系の構造物の表明を誘導したことを示す。ＶＥＧＦまたはＥＰＯ−３，４，５，６は、構造物の縦に並んだ繰り返し、５’ｏｒｉｅｎｔａｔｉｏｎのためのＬおよび３’ｏｒｉｅｎｔａｔｉｏｎのためのＲの数に関連する。
図３Ａおよび３Ｃは、構造物の能力が低酸素症に応答して二方向に発光酵素を表すことを示す；
図３Ｂ、そして、二方向に表す構造物の３Ｄショー能力（低酸素症に応答する３−Ｇａｌ。更なる説明および実験的な詳細について実施例５を参照する。
【図３Ｃ】
図３Ａ−Ｄは、低酸素症がトランスフェクションする腫瘍細胞系の構造物の表明を誘導したことを示す。ＶＥＧＦまたはＥＰＯ−３，４，５，６は、構造物の縦に並んだ繰り返し、５’ｏｒｉｅｎｔａｔｉｏｎのためのＬおよび３’ｏｒｉｅｎｔａｔｉｏｎのためのＲの数に関連する。
図３Ａおよび３Ｃは、構造物の能力が低酸素症に応答して二方向に発光酵素を表すことを示す；
図３Ｂ、そして、二方向に表す構造物の３Ｄショー能力（低酸素症に応答する３−Ｇａｌ。更なる説明および実験的な詳細について実施例５を参照する。
【図３Ｄ】
図３Ａ−Ｄは、低酸素症がトランスフェクションする腫瘍細胞系の構造物の表明を誘導したことを示す。ＶＥＧＦまたはＥＰＯ−３，４，５，６は、構造物の縦に並んだ繰り返し、５’ｏｒｉｅｎｔａｔｉｏｎのためのＬおよび３’ｏｒｉｅｎｔａｔｉｏｎのためのＲの数に関連する。
図３Ａおよび３Ｃは、構造物の能力が低酸素症に応答して二方向に発光酵素を表すことを示す；
図３Ｂ、そして、二方向に表す構造物の３Ｄショー能力（低酸素症に応答する３−Ｇａｌ。更なる説明および実験的な詳細について実施例５を参照する。
【図４Ａ】
図４Ａ−Ｂは、低酸素症が可変の酸素分圧の下でトランスフェクションする腫瘍細胞系の構造物の表明を誘導したことを示す。ＶＥＧＦまたはＥＰＯ３，４，５，６は、構造物の縦に並んだ繰り返し、５’ｏｒｉｅｎｔａｔｉｏｎのためのＬおよび３’ｏｒｉｅｎｔａｔｉｏｎのためのＲの数に関連する。図４Ａは、構造物の能力が可変の酸素分圧に応答して二方向に発光酵素を表すことを示す。図４Ｂは、示す（可変の酸素分圧に応答する３−Ｇａｌ双方向性表現。更なる説明および実験的な詳細について実施例５を参照する。
【図４Ｂ】
図４Ａ−Ｂは、低酸素症が可変の酸素分圧の下でトランスフェクションする腫瘍細胞系の構造物の表明を誘導したことを示す。ＶＥＧＦまたはＥＰＯ３，４，５，６は、構造物の縦に並んだ繰り返し、５’ｏｒｉｅｎｔａｔｉｏｎのためのＬおよび３’ｏｒｉｅｎｔａｔｉｏｎのためのＲの数に関連する。図４Ａは、構造物の能力が可変の酸素分圧に応答して二方向に発光酵素を表すことを示す。図４Ｂは、示す（可変の酸素分圧に応答する３−Ｇａｌ双方向性表現。更なる説明および実験的な詳細について実施例５を参照する。
【図５】
図５は、再結合物ウイルスの構造の模式的な概略を示す。更なる説明および実験的な詳細について実施例６−８を参照する。
【図６】
図６は、ｐＡｄＥａｓｙアデノウイルス・ベクトルにＥｌ遺伝子カセットをｓｕｂｃｌｏｎｉｎｇする概略図を示す。
更なる説明および実験的な詳細について実施例６−８を参照する。
【図７】
図７Ａ−Ｂは、ウィルス中で遺伝子製品が西の汚点分析によって腫瘍細胞系（神経膠腫ＬＮ２２９）をトランスフェクションさせたことを再結合物の表明に明らかにする。感染してない細胞系は図７Ａ（Ｕｎｉｎｆ．）においてある、ｄｌ３０９はＥｌ領域のｗｉｌｄｔｙｐｅであって、Ｅ３領域の突然変異を有するアデノウイルスに感染する細胞系である。そして、ＣＭＶ−Ｅ１はＣＭＶ最小のプロモータおよびＥ１遺伝子を含んでいる構造物である。Ｕが感染してない細胞にゆだねる図７Ｂにおいて、Ｈは低酸素症状況に関連する、そして、Ｎはｎｏｒｍｏｘｉｃな状況に関連する。更なる説明および実験的な詳細について実施例９を参照する。
【図８】
図８Ａ−Ｄは、低酸素症従属する方法の腫瘍細胞の細胞崩壊を示す。図８Ａは低酸素症の下の感染してない細胞である。図に、８Ｂ、細胞を感染するＡｄ−ＣＭＶ　Ｅｌはｎｏｒｍｏｘｉａ状況である。図に、８Ｃはｎｏｒｍｏｘｉａ状況および図８Ｄの下のＨＹＰＲ−Ａｄｌである。そして、ＨＹＰＲ−Ａｄｌは低酸素症の下にある。更なる説明および実験的な詳細について実施例１０を参照する。
【図９】
図９は、脳腫瘍に再結合物ウイルスの配送を示す。しみをつけられるｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎｄｅｆｉｃｉｅｎｔなアデノウイルスを表しているＬａｃＺを感染する移植されたネズミ神経膠腫腫瘍細胞からの神経膠腫の断面（３ガロンの表現。更なる説明および実験的な詳細について実施例１１を参照する。
【図１０】
図１０Ａ−Ｂは、低酸素症を有する構造物によって安定してトランスフェクションする人間の神経膠腫細胞系に由来するクローン上のアルカリホスファターゼ酵素活動の検査法から、応答する要素が使用可能な状態で使用可能な状態でリポータ遺伝子アルカリホスファターゼにリンクされるプロモータとつながったことを結果に明らかにする。図１　ＯＡはｎｏｒｍｏｘｉｃな状況にさらされる細胞を示す、そして、図１０Ｂは低酸素症状況にさらされる細胞を示す。更なる説明および実験的な詳細について実施例１２を参照する。
【図１１Ａ】
図１１Ａは、ＨＹＰＲ−Ａｄｌで扱われる免疫不全マウスの神経膠腫細胞の平均腫瘍量を示しているグラフである。図１１Ｂは、サイズおよびさまざまな治療を有する腫瘍の重量を示す。示される結果は、ＨＹＰＲ−Ａｄｌが特に感染した低酸素症腫瘍細胞の細胞崩壊を引き起こすことによって腫瘍成長を減らすことを示唆する。更なる説明および実験的な詳細について実施例１５を参照する。
【図１１Ｂ】
図１１Ａは、ＨＹＰＲ−Ａｄｌで扱われる免疫不全マウスの神経膠腫細胞の平均腫瘍量を示しているグラフである。図１１Ｂは、サイズおよびさまざまな治療を有する腫瘍の重量を示す。示される結果は、ＨＹＰＲ−Ａｄｌが特に感染した低酸素症腫瘍細胞の細胞崩壊を引き起こすことによって腫瘍成長を減らすことを示唆する。更なる説明および実験的な詳細について実施例１５を参照する。
【図１２】
図１２Ａおよび図１２Ｂは低酸素症の表現を調整している合成物の活発な評価のを示す。更なる説明および実験的な詳細について実施例１４を参照する。
【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【国際公開パンフレット】
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2004509635.tif 000075
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004509635.tif 000076
【国際調査報告】
2004509635.tif 000077
2004509635.tif 000078
2004509635.tif 000079