(57)【要約】置換ジアリールウレア、それを含む医薬組成物およびＦａｓ媒介アポトーシスを刺激するためのその使用。単一立体異性体または立体異性体混合物としての化合物、医薬的に許容しうる塩およびそれを含む医薬組成物は、自己免疫疾患、感染症および悪性腫瘍の治療方法において有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
式：
【化１】
2004528311.tif 000013
［式中、Ｘ１およびＸ２は独立して、−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒおよび−ＯＳＯ２Ｒ１から選ばれる；
Ｙ１およびＹ２は独立して、−ＣＮ、−ＮＯ２、−ＣＯＲ１、−ＣＯＮＲ１Ｒ２、−ＳＯ２Ｒ１および−ＳＯ２Ｒ１Ｒ２から選ばれる；および
各Ｒ１は独立して、置換されてもよいアルキル、置換されてもよいアリールおよび置換されてもよいアラルキルから選ばれる；
各Ｒ２は独立して、Ｈ、置換されてもよいアルキル、置換されてもよいアリールおよび置換されてもよいアラルキルから選ばれる］
で示される化合物およびその医薬的に許容しうる塩。
【請求項２】
Ｘ１およびＸ２が、同一である請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
Ｙ１およびＹ２が、同一である請求項１に記載の化合物。
【請求項４】
Ｘ１およびＸ２が独立して、−Ｆおよび−Ｃｌから選ばれる請求項１に記載の化合物。
【請求項５】
Ｙ１およびＹ２が独立して、−ＣＮ、−ＮＯ２および−ＣＯＲ１から選ばれる請求項１に記載の化合物。
【請求項６】
１,３−ビス(４−クロロ−３−ニトロフェニル)ウレアである請求項１に記載の化合物。
【請求項７】
請求項１に記載の化合物および医薬的に許容しうる賦形剤を含む医薬組成物。
【請求項８】
請求項２に記載の化合物および医薬的に許容しうる賦形剤を含む医薬組成物。
【請求項９】
請求項３に記載の化合物および医薬的に許容しうる賦形剤を含む医薬組成物。
【請求項１０】
請求項４に記載の化合物および医薬的に許容しうる賦形剤を含む医薬組成物。
【請求項１１】
請求項５に記載の化合物および医薬的に許容しうる賦形剤を含む医薬組成物。
【請求項１２】
請求項６に記載の化合物および医薬的に許容しうる賦形剤を含む医薬組成物。
【請求項１３】
治療有効量の請求項１に記載の化合物を哺乳動物に投与することを含む、Ｆａｓ媒介アポトーシスの刺激剤の投与によって治療可能な哺乳動物における疾患の治療方法。
【請求項１４】
疾患が、自己免疫疾患、感染症および悪性腫瘍から選ばれる請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
慣例の形態の該疾患の療法で哺乳動物を治療することをさらに含む請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
慣例の形態の療法が、免疫抑制剤、抗炎症剤、抗ウイルス剤、抗菌剤、抗真菌剤および抗がん性化学療法剤から選ばれる薬物を含む請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
細胞をＦａｓ媒介アポトーシスを刺激するのに十分な量の請求項１に記載の化合物を接触させることを含む、Ｆａｓ受容体を有する細胞におけるＦａｓ媒介アポトーシスを刺激する方法。
【請求項１８】
Ｆａｓ受容体を刺激することおよびＦａｓ媒介アポトーシスを刺激することから選ばれる少なくとも１つの機能を有する化合物を同定する方法であって、請求項１に記載の化合物をＦａｓ結合またはＦａｓ媒介アポトーシスのアッセイに付して第１の結果を記録し、試験化合物を該アッセイに付して第２の結果を記録し、次いで、第１と第２の結果を比較することによって、第１の結果と同様あるいはより良い結果を生み出している試験化合物を、所望の機能を有する化合物として同定することを含む方法。
【請求項１９】
アッセイにおいて請求項１に記載の化合物の機能を模倣する標的化合物を同定する方法であって、請求項１に記載の化合物をアッセイに付して第１の結果を記録し、試験化合物を該アッセイに付して第２の結果を記録し、次いで、第１と第２の結果を比較することによって、第１の結果と同様あるいはより良い結果を生み出している試験化合物を、請求項１に記載の化合物の機能を模倣する標的化合物として同定することを含む方法。
【請求項２０】
バイオアッセイを確認、最適化および標準化する方法であって、請求項１に記載の化合物をバイオアッセイに付し、次いでバイオアッセイにおける化合物の活性によってバイオアッセイを確認、最適化および標準化することを含む方法。
【請求項２１】
Ｆａｓ媒介アポトーシスの刺激剤の投与による、治療可能な疾患の治療のための医薬の製造のための式：
【化２】
2004528311.tif 000014
［式中、Ｘ１およびＸ２は独立して、−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒおよび−ＯＳＯ２Ｒ１から選ばれる；
Ｙ１およびＹ２は独立して、−ＣＮ、−ＮＯ２、−ＣＯＲ１、−ＣＯＮＲ１Ｒ２、−ＳＯ２Ｒ１および−ＳＯ２Ｒ１Ｒ２から選ばれる；および
各Ｒ１は独立して、置換されてもよいアルキル、置換されてもよいアリールおよび置換されてもよいアラルキルから選ばれる；
各Ｒ２は独立して、Ｈ、置換されてもよいアルキル、置換されてもよいアリールおよび置換されてもよいアラルキルから選ばれる］
で示される化合物およびその医薬的に許容しうる塩の使用。
【請求項２２】
疾患が、自己免疫疾患、感染症および悪性腫瘍から選ばれる請求項２１に記載の使用。
【請求項２３】
式：
【化３】
2004528311.tif 000015
［式中、Ｘ１およびＸ２は独立して、−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒおよび−ＯＳＯ２Ｒ１から選ばれる；
Ｙ１およびＹ２は独立して、−ＣＮ、−ＮＯ２、−ＣＯＲ１、−ＣＯＮＲ１Ｒ２、−ＳＯ２Ｒ１および−ＳＯ２Ｒ１Ｒ２から選ばれる；および
各Ｒ１は独立して、置換されてもよいアルキル、置換されてもよいアリールおよび置換されてもよいアラルキルから選ばれる；
各Ｒ２は独立して、Ｈ、置換されてもよいアルキル、置換されてもよいアリールおよび置換されてもよいアラルキルから選ばれる］
で示される化合物およびその医薬的に許容しうる塩の製造方法であって、
（ａ）式：
【化４】
2004528311.tif 000016
［式中、Ｘ１およびＹ１は前記と同意義］
で示される化合物を式：
【化５】
2004528311.tif 000017
［式中、Ｘ２およびＹ２は前記と同意義］
で示される化合物と反応させること
；または
（ｂ）式：
【化６】
2004528311.tif 000018
［式中、Ｘは、−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒおよび−ＯＳＯ２Ｒ１から選ばれる；
Ｙは、−ＣＮ、−ＮＯ２、−ＣＯＲ１、−ＣＯＮＲ１Ｒ２、−ＳＯ２Ｒ１および−ＳＯ２Ｒ１Ｒ２から選ばれる；および
各Ｒ１は独立して、置換されてもよいアルキル、置換されてもよいアリールおよび置換されてもよいアラルキルから選ばれる；
各Ｒ２は独立して、Ｈ、置換されてもよいアルキル、置換されてもよいアリールおよび置換されてもよいアラルキルから選ばれる］
で示される化合物を水の存在下で反応させる；または
（ｃ）式(Ｉ)の化合物を対応する塩基付加または酸付加塩に変換すること；または
（ｄ）式(Ｉ)の化合物の塩を遊離化合物に変換すること；または
（ｅ）式(Ｉ)の化合物の塩を医薬的に許容しうる塩に変換すること；または
（ｆ）式(Ｉ)の化合物の立体異性体の混合物を個々の立体異性体に分割すること；
を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の背景】
【０００１】
（技術分野）
本発明は、置換ジアリールウレア、それを含む医薬組成物およびＦａｓ媒介アポトーシスを刺激するためのその使用に関する。
（従来技術の記載）
ＡＰＯ−１またはＣＤ９５としても知られるＦａｓ受容体は、種々の細胞タイプにおけるアポトーシス性のプログラム細胞死の重要なイニシエーターであると考えられている。Ｆａｓリガンド（ＦａｓＬ）またはアゴニスト抗体によるＦａｓ受容体の活性化は、Ｆａｓ受容体の凝集および細胞内死亡誘発シグナル複合体（ＤＩＳＣ）の補充を導く。たとえば、Kischkel ら, EMBO J. 14:5579-5588 (1995)を参照。カスパーゼなどの他の分子の補充、および他の細胞においてｂｃｌ−２などの補充もまた起こる。Ｆａｓシグナリング複合体の主要機能が、カスパーゼ８プロテアーゼを活性化させることであることが示唆されている。たとえば、Siegel ら, J. Allergy Clin. Immunol. 103:729 (1999)を参照。ＣＤ４＋Ｔ細胞は、それら自身のＦａｓ受容体を刺激することによって自殺を委託する能力において独特である。Ｔ細胞もまた、Ｂ細胞、マクロファージおよび他の細胞タイプにおいて、ＦａｓＬを介してアポトーシスの引き金を引くことができる。これらの相互作用は、免疫系をネガティブに調節するが、肝炎および他の臓器特異的自己免疫疾患における標的組織のＦａｓ媒介損傷においてなどの免疫病理の一因となることもできる。Ｆａｓは、ヒトの免疫応答において重要な役割を演じ、その臨床的重要性の詳細が、活発に研究さえている。改変されたＦａｓ受容体または改変されたＦａｓＬは、自己免疫リンパ増殖症候群、自己免疫甲状腺疾患、過好酸性症、ウイルス性肝炎、大腸がん、乳がん、前立腺がん、神経芽腫、神経膠腫および他のがんならびに疾患状態などの自己免疫、感染および悪性腫瘍の一因となると考えられる。たとえば、Houghton, J. Curr. Opin. Oncol. 11:475 (1999)およびSiegel ら, J. Allergy Clin. Immunol. 103:729 (1999)を参照。
【０００２】
文献に引用されている数多くのジアリールウレアがあるが、ハロゲンで置換されたジアリールウレアの数は限定されている。特定のジアリールウレアが、ｐ３８キナーゼインヒビター(WO 99/32463, WO 99/00357)、ｒａｆキナーゼインヒビター(WO 99/32436)および５−ＨＴ受容体アンタゴニスト(WO 98/50346)として有用であると報告されている。
本明細書中および本出願におけるその他の箇所に引用した文献は、全体を参考文献として援用される。
【発明の概要】
【０００３】
本発明の第１の態様は、式：
【化１】
2004528311.tif 000002
［式中、Ｘ１およびＸ２は独立して、−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒおよび−ＯＳＯ２Ｒ１から選ばれる；
Ｙ１およびＹ２は独立して、−ＣＮ、−ＮＯ２、−ＣＯＲ１、−ＣＯＮＲ１Ｒ２、−ＳＯ２Ｒ１および−ＳＯ２Ｒ１Ｒ２から選ばれる；および
各Ｒ１は独立して、置換されてもよいアルキル、置換されてもよいアリールおよび置換されてもよいアラルキルから選ばれる；
各Ｒ２は独立して、Ｈ、置換されてもよいアルキル、置換されてもよいアリールおよび置換されてもよいアラルキルから選ばれる］
で示される化合物およびその医薬的に許容しうる塩である。
【０００４】
本発明の第２の態様は、本発明の第１の態様の化合物および医薬的に許容しうる賦形剤を含む医薬組成物である。
本発明の第３の態様は、Ｆａｓ媒介アポトーシスの刺激剤を投与することによる、すなわち、治療有効量の本発明の第１の態様の化合物または本発明の第２の態様の組成物を哺乳動物に投与することによる、治療可能な哺乳動物における疾患の治療方法である。本発明の第１の態様の化合物は、Ｆａｓ媒介アポトーシスを刺激し、Ｆａｓ受容体を含む細胞を細胞死に至らしめ、免疫系および免疫応答、細胞増殖および悪性腫瘍の調節に有用である。このような治療に適した疾患は、自己免疫リンパ増殖症候群、自己免疫甲状腺疾患、過好酸性症、ウイルス性肝炎、大腸がん、乳がん、前立腺がん、神経芽腫、神経膠腫および他のがんならびに疾患などの自己免疫疾患、感染症および悪性腫瘍である。またこの態様は、Ｆａｓ媒介アポトーシスの刺激剤の投与による、治療可能な哺乳動物における疾患の治療のための医薬の製造における本発明の第１の態様の化合物の使用を含む。
【０００５】
本発明の第４の態様は、細胞をＦａｓ媒介アポトーシスを刺激するのに十分な量の本発明の第１の態様の化合物に接触させることによる、Ｆａｓ受容体を有する細胞におけるＦａｓ媒介アポトーシスの刺激方法を提供する。インビボでは、細胞を本発明化合物に接触させるステップは、細胞を有する動物に有効量の化合物を投与することによって達成される。インビトロでは、細胞を本発明化合物に接触させるステップは、細胞または細胞を浸している溶液に有効量の化合物を投与することによって達成される。
本発明の第５の態様は、本発明の第１の態様の化合物の製造方法である。
【発明の詳細な記載】
【０００６】
（ａ）定義および一般的パラメーター
「アルキル」は、直鎖、分枝鎖または環式であってよいＣ１−Ｃ１０の一価のヒドロカルビルを意味し、たとえば、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、ヘキシル、シクロペンチル、シクロプロピルメチル、シクロヘキシルおよびシクロへキシルメチルが挙げられる。Ｃ１−Ｃ６アルキルが好ましい。
「置換アルキル」は、３個までのハロゲン原子および／または−ＣＮ、−ＮＯ２、−ＯＲ、−ＳＲ、−ＣＯＲ、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ、−ＮＲ２、−ＳＯ２ＯＲ、−ＯＳＯ２Ｒ、−ＳＯ２ＮＲ２、−ＮＲＳＯ２Ｒ、−ＣＯＮＲ２または−ＮＲＣＯＲ（ここで、各Ｒは独立して、水素、Ｒ'−置換されてもよいアルキル、Ｒ'−置換されてもよいアリール、ヘテロアリール、Ｒ'−置換されてもよいアラルキルまたはヘテロアラルキルであり、各Ｒ'は独立して、ハロ、−ＣＮ、−ＮＯ２、−ＯＨ、Ｃ１−３アルキル、Ｃ１−３アルコキシ、−ＳＨまたは−ＮＨ２である）から選ばれる置換基で置換されたアルキルである。好ましい置換アルキルは、３個までのハロゲン原子および／または−ＣＮ、−ＮＯ２、−ＯＨ、Ｃ１−３アルコキシ、−ＳＨおよび−ＮＨ２から選ばれる置換基の１つで置換されたアルキルであり、置換基が−ＣＦ３であるのが特に好ましい。
【０００７】
「アリール」は、６〜２０個の環炭素原子を含み、単環（フェニル）または縮合多環、好ましくは縮合二環（たとえば、ナフチル）、あるいは連結多環、好ましくは連結二環（たとえば、ビフェニル）である基を意味する。アリール基は、好ましくはＣ６−Ｃ１６、さらに好ましくはＣ６−Ｃ１４である。アリールがフェニルであるのが特に好ましい。
「置換アリール」は、ハロ、−ＣＮ、−ＮＯ２、−ＯＲ、ハロ−置換されてもよいＣ１−３アルキル、ハロ−置換されてもよいＣ１−３アルコキシ、−ＳＲ、−ＣＯＲ、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ、−ＮＲ２、−ＳＯ２ＯＲ、−ＯＳＯ２Ｒ、−ＳＯ２ＮＲ２、−ＮＲＳＯ２Ｒ、−ＣＯＮＲ２または−ＮＲＣＯＲ（ここで、各Ｒは独立して、水素またはＲ'−置換されてもよいアルキルであり、各Ｒ'は独立して、ハロ、−ＣＮ、−ＮＯ２、−ＯＨ、Ｃ１−３アルキル、Ｃ１−３アルコキシ、−ＳＨまたは−ＮＨ２である）から選ばれる３個までの置換基で置換されたアリールである。好ましい置換アリールは、３個までのハロ、−ＣＮ、−ＮＯ２、−ＯＨ、ハロ−置換されてもよいＣ１−３アルキル、ハロ−置換されてもよいＣ１−３アルコキシ、−ＳＨおよび−ＮＨ２から選ばれる３個までの置換基で置換されたアルキルであり、置換アリールが置換フェニルであるのが特に好ましい。
【０００８】
「アラルキル」は、アリールで置換されたアルキルを意味する。好ましいアラルキルはベンジルおよびフェネチルである。
「置換アラルキル」は、アリールもしくはアルキル、または両方が、上記置換アリールおよび置換アルキルで述べた仕方と同様ににして置換されたアラルキルである。
「ハロゲン」または「ハロ」は、Ｆ、ＣｌまたはＢｒを意味する。
「ヘテロアリール」は、６〜２０個の原子を含み、そのうちの１〜３個の環原子が、Ｏ、Ｓ、ＮまたはＮＲ（ここで、ＲはＨまたはＣ１−３アルキルである）で置換される単環式または縮合二環式芳香族ヒドロカルビルを意味する。好ましいヘテロアリールは、５または６個の環原子を含む単環式基であり、フリル、チエニル、ピロリル、オキサゾリル、イミダゾリル、ピリジニル、ピリダジニル、ピリミジニルなどである。
【０００９】
「医薬的に許容しうる塩」は、「化合物」と題するセクションにおいて記載する。
「治療有効量」は、疾患を処置するために哺乳動物へ投与する場合、その疾患に対するそのような治療を達成するのに十分である量を意味する。
哺乳類において疾患を「治療すること」または疾患の「治療」には、以下のものが含まれる：
（１）その疾患になりやすいが、まだその疾患を経験していないかまたはその疾患の症状が表れていない哺乳動物において、その疾患の発生を予防すること；
（２）その疾患を阻害すること、すなわち、その疾患の進行を制止すること；
（３）その疾患の症状を軽減すること、すなわち、その疾患の影響を減少させること；および
（４）その疾患の後退をもたらすこと。
【００１０】
（ｂ）化合物
第１の態様において、本発明は、式：
【化２】
2004528311.tif 000003
［式中、Ｘ１およびＸ２は独立して、−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒおよび−ＯＳＯ２Ｒ１から選ばれる；
Ｙ１およびＹ２は独立して、−ＣＮ、−ＮＯ２、−ＣＯＲ１、−ＣＯＮＲ１Ｒ２、−ＳＯ２Ｒ１および−ＳＯ２Ｒ１Ｒ２から選ばれる；および
各Ｒ１は独立して、置換されてもよいアルキル、置換されてもよいアリールおよび置換されてもよいアラルキルから選ばれる；
各Ｒ２は独立して、Ｈ、置換されてもよいアルキル、置換されてもよいアリールおよび置換されてもよいアラルキルから選ばれる］
で示される化合物およびその医薬的に許容しうる塩である。
【００１１】
好ましい種類の化合物の例は、１つまたはそれ以上の以下の条件が当てはまる場合である：
（１）Ｘ１およびＸ２が独立して、−Ｆまたは−Ｃｌ；
（２）Ｙ１およびＹ２が独立して、−ＣＮ、−ＮＯ２または−ＣＯＲ１；
（３）Ｘ１およびＸ２が同じ；または
（４）Ｙ１およびＹ２が同じ。
【００１２】
より好ましい種類の化合物の例は、１つまたはそれ以上の以下の条件が当てはまる場合である：
（１）Ｘ１およびＸ２の両方が−Ｆまたは両方が−Ｃｌ；または
（２）Ｙ１およびＹ２の両方が−ＮＯ２または両方が−ＣＮ。
特に好ましい化合物は、Ｘ１およびＸ２が−Ｃｌであり、Ｙ１およびＹ２が−ＮＯ２である化合物、すなわち、１,３−ビス(４−クロロ−３−ニトロフェニル)ウレアである。
これらの化合物の合成および説明は、実施例において概説する。
【００１３】
特定の本発明化合物は、１つまたはそれ以上のキラル中心を含んでいてもよい。そのような場合、すべての立体異性体もまた本発明の範囲に含まれる。本発明の化合物には、個々に単離された立体異性体ならびにそのような立体異性体の混合物が含まれる。
本発明化合物の医薬的に許容しうる塩、カチオンおよびアニオンもまた本発明に含まれ、本明細書に記載する方法および医薬組成物において有用である。
【００１４】
医薬的に許容しうる塩には、存在する酸性プロトンが無機または有機の塩基と反応することができるときに形成しうる塩が含まれる。典型的には、親化合物を、過剰のアルカリ試薬、たとえば適当なカチオンを含む、水酸化物、カーボネートまたはアルコキシドなどで処理する。Ｎａ＋、Ｋ＋、Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋およびＮＨ４＋などのカチオンが、医薬的に許容しうる塩に存在するカチオンの例である。Ｎａ＋塩は特に有用である。したがって、許容しうる無機塩基には、水酸化アルミニウム、水酸化カルシウム、水酸化カリウム、炭酸ナトリウムおよび水酸化ナトリウムが含まれる。塩は、第１級、第２級および第３級アミン、天然に存在する置換アミンなどの置換アミンおよびイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ジエチルアミン、トリエチルアミン、トリプロピルアミン、エタノールアミン、２−ジメチルアミノエタノール、トロメタミン、リシン、アルギニン、ヒスチジン、カフェイン、プロカイン、ヒドラバミン、コリン、ベタイン、エチレンジアミン、グルコサミン、Ｎ−アルキルグルカミン、テオブロミン、プリン、ピペラジン、ピペリジン、Ｎ−エチルピペリジンなどの環式アミンの塩などの有機塩基を用いて調製することもできる。
【００１５】
本発明化合物が、塩基性基を含んでいるならば、酸付加塩を調製することができる。その化合物の酸付加塩は、適当な溶媒中、親化合物と、過剰量の酸、たとえば、塩酸、臭化水素酸、硫酸（硫酸塩および重硫酸塩を生じる）、硝酸、リン酸など、有機酸、たとえば酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、ピルビン酸、シュウ酸、リンゴ酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、桂皮酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、サリチル酸、ｐ−トルエンスルホン酸、ヘキサン酸、ヘプタン酸、シクロペンタンプロピオン酸、乳酸、ｏ−（４−ヒドロキシベンゾイル）安息香酸、１,２−エタンジスルホン酸、２−ヒドロキシエタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ−クロロベンゼンスルホン酸、２−ナフタレンスルホン酸、ショウノウスルホン酸、４−メチル−ビシクロ［２.２.２］オクタン−２−エン−１−カルボン酸、グルコヘプタン酸、グルコン酸、４,４’−メチレンビス（３−ヒドロキシ−２−ナフトエ）酸、３−フェニルプロピオン酸、トリメチル酢酸、ｔ−ブチル酢酸、ラウリル硫酸、グルクロン酸、グルタミン酸、３−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸、ステアリン酸、ムコン酸などから、標準的な方法で調製する。
本発明のある特定の化合物は分子内塩または両性イオンを形成する。
【００１６】
（ｃ）医薬組成物
本発明の第２の態様は、本発明の第１の態様の化合物および医薬的に許容しうる賦形剤を含む医薬組成物である。
本発明の医薬組成物は、有効成分として、好ましい本発明の第１の態様の化合物を含むのが好ましい。しかし、本発明化合物のいずれかを含む医薬組成物を意図するものである。本発明の医薬組成物は、医薬的に許容しうる賦形剤も含む。
【００１７】
本発明組成物は、静脈内、筋肉内、動脈内、骨髄内、髄膜下、脳室内、経粘膜または経皮、皮下、腹腔内、鼻腔内、腸内、舌下、直腸内あるいは座剤などの他の体腔からなどの数多くの経路によって局所的投与することができ、または経口で投与することができるが、これらに限定されるものではない。投与は、急性であってもよく、経口投与時放出カプセルなどの制御放出、遅延放出もしくは持続性放出システムまたは他のデリバリー手段、投薬量の相対的一定レベルが維持されるようなデポ投与、留置カテーテル、経皮薬物デリバリーパッチもしくは皮下インプラントを介する慢性投与などによるものでもよい。US 3,710,795を参照。
【００１８】
製剤は、水性、油性、エマルジョンであってよく、あるいは投与様式に適した溶媒を含むこともでき、必要に応じて、リポソーム製剤、粘膜を通して薬物を投与するように設計された製剤または経皮製剤であってもよい。これらのそれぞれおよび本出願において述べた他の投与方法に適した製剤は、たとえば、Gennaro編, 「Remington: The Science and Practice of Pharmacy」, 20th ed., 2000, Lippincott, Williams & Wilkins, Philadelphia PAに見出すことができる。
【００１９】
意図する投与様式に応じて、医薬組成物は、たとえば、錠剤、座剤、丸剤、カプセル剤、散剤、液剤、懸濁液剤、クリーム剤、軟膏、ローションなどの固形、半固形または液体投与剤形の形態をとることができ、正確な用量の一回投与に適した単位投与剤形であるのが好ましい。有効量の有効成分に加えて、組成物は、医薬的に使用しうる調製品への有効化合物の加工を促進する適当な医薬的に許容しうる賦形剤および助剤を含むことができる。本明細書で用いる用語「医薬的に許容しうる賦形剤」は、有効成分の生物活性の有効性を妨げず、投与される宿主に対する毒性がない賦形剤または賦形剤の混合物を意味する。
【００２０】
さらに、医薬組成物は、他の医薬的作用剤、アジュバント、希釈剤、緩衝剤などを含むことができる。したがって、化合物は、経口、非経口、経皮、経直腸、鼻腔内、バッカル、局所投与することができ、あるいは慣例の非毒性医薬的に許容しうる担体、アジュバントおよびビヒクルを含む投与製剤としてインプラントリザーバーを介して投与してもよい。本明細書で用いる用語「非経口」は、皮下、静脈内および筋肉内注射を含むことを意図している。
【００２１】
固形組成物については、慣例の非毒性固形担体として、たとえば、医薬品グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、タルク、セルロース、グルコース、スクロース、炭酸マグネシウムなどが挙げられる。液体の薬理学的に投与可能な組成物は、たとえば、本明細書に記載した有効成分および任意の医薬的アジュバントを水、生理的食塩水、水性デキストロース、グリセロールなどの賦形剤に溶解、分散して、溶液または懸濁液を形成することなどによって調製することができる。要すれば、投与されるべき医薬組成物は、酢酸ナトリウム、モノラウリル酸ソルビタン、酢酸ナトリウムトリエタノールアミン、オレイン酸トリエタノールアミンなどの湿潤または乳化剤、ｐＨ緩衝剤などの少量の非毒性助剤物質も含んでもよい。
【００２２】
経口投与には、組成物は、一般に錠剤またはカプセル剤の形態をとるが、あるいは水性または非水性溶液、懸濁液またはシロップであってもよい。錠剤およびカプセル剤が、好ましい経口投与剤形である。経口用の錠剤およびカプセル剤は、一般に、ラクトースおよびコーンスターチなどの１種またはそれ以上の通例用いられる担体を含む。ステアリン酸マグネシウムなどの滑沢剤も一般的に加えられる。液状の懸濁液を用いる場合、有効成分を乳化剤および懸濁化剤と合わせることができる。要すれば、香味剤、着色剤および／または甘味料も加えることができる。経口製剤に配合するための他の任意の成分として、保存剤、懸濁化剤、増粘剤などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００２３】
非経口投与を用いる場合は、一般に、注射を特徴とする。注射用製剤は、溶液剤または懸濁液剤のいずれか、注射を行う前に液体に可溶化または懸濁するのに適した固形形態、またはエマルジョンなどの慣例の形体で製造することができる。好ましくは、適当な担体、分散または湿潤剤および懸濁化剤を用いる当業界で公知の技術にしたがって、滅菌注射用懸濁液として製剤する。滅菌注射用製剤は、滅菌注射用溶液剤または非毒性の非経口的に許容しうる希釈剤または溶媒中の懸濁液であってもよい。使用することができる該許容しうるビヒクルおよび溶媒は、水、リンゲル液、および等張塩化ナトリウム溶液である。さらに、滅菌不揮発性油、脂肪エステルまたはポリオールが、従来、溶媒または懸濁媒体として用いられる。
【００２４】
また本発明化合物は、慣例の経皮ドラッグデリバリーシステム、すなわち、通常、皮膚に貼られるドラッグデリバリーデバイスとして働く積層構造内に作用剤を含有する経皮“パッチ”を用いて、皮膚を通してデリバリーされる。このような構造では、医薬組成物は、通常、上部基材層の下にある１つの層または「リザーバー」内に含まれる。積層デバイスは、単一のリザーバーを含んでもよく、あるいは複数のリザーバーを含んでもよい。１つの具体例において、リザーバーは、ドラッグデリバリー中に皮膚にシステムを貼りつけるように働く医薬的に許容しうるコンタクト接着物質ポリマーマトリックスからなる。適当な皮膚コンタクト接着物質の例として、ポリエチレン、ポリシロキサン、ポリイソブチレン、ポリアクリレート、ポリウレタンなどが挙げられるが、これらに限定されるものではない。あるいは、薬物含有リザーバーおよび皮膚コンタクト接着剤は、接着剤がリザーバーの下にある、分離した別の層として存在してもよく、この場合、リザーバーは、上述のポリマーマトリックスであるか、または液体もしくはヒドロゲルリザーバーであるか、またはその他の形態であるかのいずれかであってよい。
【００２５】
別法として、本発明医薬組成物を直腸投与用の座剤の形態で投与してもよい。これらは、作用剤を室温では固体であるが、直腸温度では液体であり、したがって、直腸で融けて薬物を放出する適当な非刺激性賦形剤と混合することによって調製することができる。
本発明医薬組成物は、鼻腔エアロゾルまたは吸入によって投与することもできる。このような組成物は、医薬品製造業界で周知の技術を用いて調製され、ベンジルアルコールまたは他の適当な保存剤、バイオアベイラビリティを増強するための吸収促進剤、フルオロカーボンまたは窒素などの噴霧剤および／または慣例の可溶化もしくは分散剤を用いて生理的食塩水中の溶液剤として製造することができる。
【００２６】
局所ドラッグデリバリー用の好ましい製剤は、軟膏およびクリーム剤である。軟膏は、通常、ワセリンまたは他の石油誘導体を基剤とする半固形製剤である。選択された活性剤を含有するクリーム剤は、水中油型または油中水型のいずれかの当業界で公知の粘稠な液体または半固形エマルジョンである。クリーム基剤は、水洗可能であり、油相、乳化剤および水相を含む。油相は「内部」相と呼ばれることもあり、一般に、ワセリンおよびセチルもしくはステアリルアルコールなどの脂肪アルコールを含む；水相は、通常、必須ではないが、体積において油相より多く、一般に保湿剤を含む。クリーム製剤中の乳化剤は、一般に、非イオン性、アニオン性、カチオン性または両性界面活性剤である。用いられる特定の軟膏またはクリーム基剤は、当業者に公知であるが、最適のドラッグデリバリーを提供するものである。他の担体またはビヒクルに関して、軟膏基剤は、不活性で、安定な、非刺激性、非感作性でなければならない。
【００２７】
バッカル投与用製剤として、錠剤、ロゼンジ、ゲルなどが挙げられる。あるいは、バッカル投与は、当業者に公知の経粘膜デリバリーシステムを用いて行うこともできる。
【００２８】
本発明医薬組成物は、非経口投与用の溶液剤または凍結乾燥散剤として製剤化することができる。散剤は使用前に適当な希釈剤または他の医薬的に許容される担体を加えることによって再組成することができる。液状製剤は一般に、緩衝化された等張性水溶液である。適当な希釈剤の例は、正常等張性塩類溶液、水中の５％デキストロースまたは緩衝化酢酸ナトリウムまたは酢酸アンモニウム溶液である。このような製剤は非経口投与用に特に適当であるが、経口投与用に用いることもできる。賦形剤、例えばポリビニルピロリジノン、ゼラチン、ヒドロキシセルロース、アカシア、ポリエチレングリコール、マンニトール、塩化ナトリウムまたはクエン酸ナトリウムを加えるのが望ましいこともある。別法では、これらの化合物を、経口投与用にカプセル化、錠剤化、あるいはエマルジョンまたはシロップ中で調製することができる。医薬的に許容しうる固形または液状担体を加えて、組成物を強めるか、あるいは安定化するか、あるいは組成物の調製を容易にすることができる。液状担体には、シロップ、ラッカセイ油、オリーブ油、グリセリン、塩類溶液、アルコールおよび水が含まれる。固形担体には、デンプン、ラクトース、硫酸カルシウム、ジヒドレート、白土、ステアリン酸マグネシウムまたはステアリン酸、タルク、ペクチン、アカシア、寒天またはゼラチンが含まれる。担体にはまた、持続放出物質、例えばモノステアリン酸グリセリルまたはジステアリン酸グリセリルを単独で、あるいはワックスとともに含ませてもよい。固形担体の量は変化するが、好ましくは約２０ｍｇ〜約１ｇ／用量単位の範囲であろう。医薬調製物は、錠剤用には、必要な場合に、粉砕、混合、顆粒化、および圧縮を含み；硬ゼラチンカプセル剤用には粉砕、混合、および充填を含む製薬業における慣用技術にしたがって作成する。液状担体を用いる場合、調製物はシロップ、エリキシル、エマルジョン、または水性または非水性懸濁剤の剤型であろう。このような液状製剤を直接経口投与するか、あるいは軟ゼラチンカプセルに充填することができる。
【００２９】
医薬製剤は、さらに、本発明化合物に加えて、１つまたはそれ以上の薬理学的活性剤を含んでもよい。これらの追加の活性剤は、通常、自己免疫、感染症および悪性腫瘍を予防するか、または本発明化合物によるこのような障害の治療を強化するのに有用である。
適当な医薬組成物の特定の例をいくつか、後記の実施例に記載する。
典型的には、本発明の医薬組成物を、自己免疫リンパ増殖症候群、自己免疫甲状腺疾患、過好酸性症、ウイルス性肝炎、大腸がん、乳がん、前立腺がん、神経芽腫、神経膠腫または他のがんもしくは他の疾患などの自己免疫疾患、感染症、悪性腫瘍の治療における医薬組成物の用途を示すラベルもしくは指示書またはその両方を有する容器内にパッケージングする。
【００３０】
（ｃ）本発明方法および本発明化合物の使用
本発明化合物は、後記実施例において説明するように、Ｆａｓ媒介アポトーシスを刺激するのに有用である。Ｆａｓ媒介アポトーシスの刺激は、たとえば、自己免疫、感染または悪性腫瘍を有する患者の治療および管理に有用である。本発明化合物の使用のさらに詳しい例として、自己免疫リンパ増殖症候群、自己免疫甲状腺疾患、過好酸性症、ウイルス性肝炎、大腸がん、乳がん、前立腺がん、神経芽腫、神経膠腫および他のがんおよび他の疾患の治療が挙げられる。
【００３１】
したがって、本発明の第３の態様は、治療有効量の本発明化合物またはその医薬組成物を哺乳動物に投与することによる、哺乳動物、好ましくはヒトにおける自己免疫疾患の治療方法である。要すれば、該方法は、さらに、慣例の免疫抑制剤の投与などの慣例の治療形態で自己免疫疾患について哺乳動物を治療することを含む。別法として、抗炎症剤または慢性関節リウマチなどのこのような自己免疫疾患の症状に対する他の慣例の治療と併用して本発明化合物を哺乳動物に投与してもよい。個々の薬物それぞれの量はそれ自体、最適下限であるが、哺乳動物に投与される薬物の組合せの総量は、治療有効量でなければならない。
【００３２】
本発明の第３の態様は、治療有効量の本発明化合物またはその医薬組成物を哺乳動物に投与することによる、哺乳動物、好ましくはヒトにおける感染の治療方法である。要すれば、該方法は、さらに、慣例の形態の感染に対する療法で哺乳動物を治療することを含む。たとえば、該哺乳動物に、抗ウイルス剤、抗菌剤または抗真菌剤を投与することもできる。個々の薬物それぞれの量はそれ自体、最適下限であるが、哺乳動物に投与される薬物の組合せの総量は、治療有効量でなければならない。
【００３３】
本発明の第３の態様は、治療有効量の本発明化合物またはその医薬組成物を哺乳動物に投与することによる、哺乳動物、好ましくはヒトにおける悪性腫瘍の治療方法である。この場合も、他の本発明治療方法と同様に、さらに、抗がん性化学療法剤を哺乳動物に投与することなどの慣例の形態の悪性腫瘍に対する療法で哺乳動物を治療することを含む。個々の薬物それぞれの量はそれ自体、最適下限であるが、哺乳動物に投与される薬物の組合せの総量は、治療有効量でなければならない。
【００３４】
したがって、本発明化合物またはその医薬組成物は、治療有効量の選ばれた化合物を、好ましくは医薬的担体に分散して投与することによって、そのような治療を必要とする哺乳動物におけるＦａｓ媒介アポトーシスを刺激するのに用いることができる。本発明化合物の治療有効量は、０.０１〜１０００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは０.０１〜１００ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは１〜３０ｍｇ／ｋｇの範囲であるが、適当な用量は、当業者であれば、投与経路、患者の年齢および状態に応じて容易に決定できる。急性または慢性疾患に対して、これらの用量単位を１日当たり１〜１０回投与することができる。本発明化合物を本発明にしたがって投与する場合、許容できない毒性作用は予期されない。
【００３５】
本発明の別の態様では、Ｆａｓ受容体を有する細胞をＦａｓ媒介アポトーシスを刺激するのに十分な量の本発明化合物に接触させることによって、Ｆａｓ媒介アポトーシスを刺激する。このような場合、接触は、インビボでは、細胞を有する動物に本発明化合物またはその医薬組成物を投与することによって達成される；インビトロでは、細胞が存在する容器または細胞を浸している溶液に本発明化合物またはその医薬組成物投与することによって達成される。
【００３６】
本発明化合物は、Ｆａｓ媒介アポトーシスを刺激することが実証されており、自己免疫、感染および悪性腫瘍の治療に用いることができる。同様に、Ｆａｓ媒介アポトーシスにおいて同じ効果を示す他の化合物は、自己免疫、感染および悪性腫瘍の治療に用いることができる。本出願に開示する化合物は、Ｆａｓ媒介アポトーシスを刺激するように作用する他の新規な作用剤を発見するためのモデルとして使用することができる。新規な治療薬を発見するためにこれらの化合物を利用しうるプロセスにおけるステップは、次のようにして達成することができる：化合物を用いて、Ｆａｓ媒介アポトーシスを刺激する、およびＦａｓ受容体における作用によってＦａｓ媒介アポトーシスを刺激する他の化合物の発見に必要なアッセイを確認、最適化および標準化することができる。これらの化合物は、アッセイにおいて：
１．Ｆａｓ受容体を活性化／刺激する；
２．Ｆａｓ受容体をブロックする；
３．Ｆａｓ媒介アポトーシスを刺激する；
４．細胞増殖のＦａｓ媒介調節に影響を及ぼす；
５．免疫応答のＦａｓ媒介調節に影響を及ぼす；および／または
６．感染のＦａｓ媒介調節に影響を及ぼす；
改良された活性を示す他の作用剤を発見するための判断基準として利用することができる。
【００３７】
アッセイにおいて、Ｆａｓ受容体を活性化／刺激する；Ｆａｓ受容体をブロックする；Ｆａｓ媒介アポトーシスを刺激する；または細胞増殖、免疫応答および／または感染のＦａｓ媒介調節に影響を及ぼす；改良された活性を示す作用剤を発見する方法は、複数の濃度の本発明化合物の存在下におけるＦａｓ媒介アポトーシスについてのアッセイの結果を得ること、複数の濃度の試験化合物の存在下におけるアッセイの結果を得ること、アッセイの結果を比較すること、および、試験化合物を、アッセイにおいて得られた結果が本発明化合物で得られた結果と比べて改良された、アッセイにおいて、Ｆａｓ受容体との相互作用を測定または検出する；Ｆａｓ媒介アポトーシスを刺激する；または細胞増殖、免疫応答および／または感染のＦａｓ媒介調節に影響を及ぼす；改良された活性を示す作用剤として同定すること、というステップを含む。
【００３８】
アルゴリズムを用いて、例示化合物および他の試験化合物などの化合物の構造または化学的特性を比較することができる。アルゴリズムを用いて、試験化合物のライブラリー内で構造または化学的特性を一致させることもできる。この方法で、例示化合物または試験化合物が、特定の構造、特性または興味の対象となる活性をもつことがわかっている場合、化合物を利用して、このような構造、特性または活性をもつ他の化合物または作用剤を発見することができる。たとえば、興味の対象となる活性は、バイオアッセイにおける望ましい活性である。このようなアルゴリズムは公知である：たとえば、米国特許5,567,317および米国特許5,587,293には、標的部分または受容体との候補化合物の反応性の決定方法が記載されている。標的受容体との式から予測される反応性は、特定の特性に関して系統的に異なる受容体の対象セットまたは化合物のパネルから得られる。この方法で試験される化合物は、対象受容体、適用された式に関して物理学的に評価することができ、実際の標的受容体との期待する反応性を予測することができる。米国特許5,587,293の方法は、受容体の物理的存在を必要としない。
【００３９】
構造または化学的特性を比較する、および／または試験化合物ライブラリー内で構造または化学的特性を一致させるこのようなアルゴリズムの使用は、バイオアッセイにおいて活性を示す作用剤を発見するのに有効である。このようなバイオアッセイとして、Ｆａｓ受容体との相互作用、Ｆａｓ受容体のブロック、Ｆａｓ媒介アポトーシス、Ｆａｓ媒介アポトーシスの活性化、Ｆａｓ媒介アポトーシスの刺激、および細胞増殖のＦａｓ媒介調節，免疫応答のＦａｓ媒介調節および感染のＦａｓ媒介調節における効果を検出および測定するためのバイオアッセイが挙げられる。
【００４０】
さらに、構造または化学的特性を比較する、および／または試験化合物ライブラリー内で構造または化学的特性を一致させるアルゴリズムと組み合わせる場合、これらの化合物を利用して、バイオアッセイにおいて、
１．Ｆａｓ受容体を活性化／刺激する；
２．Ｆａｓ受容体をブロックする；
３．Ｆａｓ媒介アポトーシスを刺激する；
４．細胞増殖のＦａｓ媒介調節に影響を及ぼす；
５．免疫応答のＦａｓ媒介調節に影響を及ぼす；および／または
６．感染のＦａｓ媒介調節に影響を及ぼす；
活性を示す化合物を発見することができる。
【００４１】
バイオアッセイにおいて、Ｆａｓ受容体を活性化／刺激する；Ｆａｓ受容体をブロックする；Ｆａｓ媒介アポトーシスを刺激する；または細胞増殖、免疫応答および／または感染のＦａｓ媒介調節に影響を及ぼす；活性を示す化合物を発見する方法は、試験化合物ライブラリー内での化学構造または化学的特性を本発明化合物の化学構造または化学的特性と比較するためにアルゴリズムを適用すること、およびバイオアッセイにおいて、Ｆａｓ受容体を活性化／刺激する；Ｆａｓ受容体をブロックする；Ｆａｓ媒介アポトーシスを刺激する；または細胞増殖、免疫応答および／または感染のＦａｓ媒介調節に影響を及ぼす；活性を示す作用剤として、本発明化合物と類似した化学構造または化学的特性をもつことがアルゴリズムによって決定された試験化合物を同定すること、を含む。
【００４２】
また、アルゴリズムを用いて、分子間相互作用をモデリングするために構造を比較する、および／または構造を一致させることができる。このようなアルゴリズムは公知である；たとえば、米国特許5,567,317および米国特許5,587,293の方法を用いて、分子間相互作用をモデリングするために構造を比較する、および／または構造を一致させることができる。
このようなアルゴリズムの使用は、Ｆａｓ受容体との相互作用、Ｆａｓ受容体のブロック、Ｆａｓ媒介アポトーシス、Ｆａｓ媒介アポトーシスの活性化、Ｆａｓ媒介アポトーシスの刺激、および細胞増殖のＦａｓ媒介調節，免疫応答のＦａｓ媒介調節および感染のＦａｓ媒介調節における効果を検出および測定するためのバイオアッセイなどのバイオアッセイにおいて活性を示す作用剤を発見するのに有効である。
【００４３】
さらに、分子間相互作用をモデリングするために、構造を比較する、および／または構造を一致させるアルゴリズムと組み合わせる場合、これらの化合物を利用して、バイオアッセイにおいて、
１．Ｆａｓ受容体を活性化／刺激する；
２．Ｆａｓ受容体をブロックする；
３．Ｆａｓ媒介アポトーシスを刺激する；
４．細胞増殖のＦａｓ媒介調節に影響を及ぼす；
５．免疫応答のＦａｓ媒介調節に影響を及ぼす；および／または
６．感染のＦａｓ媒介調節に影響を及ぼす；
活性を示す化合物を発見することができる。
【００４４】
バイオアッセイにおいて、Ｆａｓ受容体を活性化／刺激する；Ｆａｓ受容体をブロックする；Ｆａｓ媒介アポトーシスを刺激する；または細胞増殖、免疫応答および／または感染のＦａｓ媒介調節に影響を及ぼす；活性を示す作用剤を発見する方法は、分子間相互作用をモデリングするために、試験化合物ライブラリー内での化学構造を本発明化合物の化学構造と比較する、および／または一致させるためにアルゴリズムを適用すること、およびＦａｓ受容体を活性化／刺激する；Ｆａｓ受容体をブロックする；Ｆａｓ媒介アポトーシスを刺激する；または細胞増殖、免疫応答および／または感染のＦａｓ媒介調節に影響を及ぼす；活性を示す作用剤として、本発明化合物と類似するか、または一致する化学構造もつことがアルゴリズムによって決定された試験化合物を同定すること、を含む。
さらに、本発明方法は、バイオアッセイを確認、最適化または標準化する過程を含む。この過程は、（ａ）本発明化合物をバイオアッセイに付すこと；および（ｂ）バイオアッセイにおける化合物の活性によって、バイオアッセイを確認、最適化または標準化することを含む。
【実施例】
【００４５】
以下の実施例によって、本発明を説明するが、これらは本発明の範囲を制限することを意図するものではない。
本発明化合物は、有機化学の慣例の方法によって製造され、置換ウレアの合成のための多くの方法が当業界で公知である。たとえば、Larock, 「Comprehensive Organic Transformations」, Wiley-VCH, New York NYを参照。幾つかの場合、保護基を導入し、後で除去してもよい。アミノ、ヒドロキシルおよびカルボキシル基のための適当な保護基は、Greene ら「Protective Groups in Organic Synthesis」, 2nd ed., 1991, John Wiley and Sons, New York NYに記載されている。本発明化合物は、後記実施例に示すように合成することができるが、あるいは当業者に公知の手段による例示の合成を変更することもできる。
【００４６】
対称および非対称ジアリールウレアの両方に好都合な代表的な合成を反応工程式１に示す。塩基性溶液中、イソシアネート（２）（塩基性溶液中、最初のアミン（１）とホスゲンとの反応によって都合よく合成される）と第２のアミン（３）との反応により、ウレア（４）を得る。この反応工程式において、各Ｘ１およびＸ２は同一あるいは異なってもよく、同様に各Ｙ１およびＹ２は同一あるいは異なってもよい。
反応工程式１
【化３】
2004528311.tif 000004
実施例１：1−(4−クロロ−3−シアノフェニル)−3−(4−クロロ−3−ニトロフェニル)ウレア
50 mLのベンゼンおよび5 mLのトリエチルアミン中の3−ニトロ−4−クロロアニリン(2 g)の溶液を、トルエン(6 g)および10 mLのベンゼン中のホスゲンの20w/w％溶液に5℃にて攪拌しながら滴下する。添加完了後、反応混合物を室温まで温め、3時間攪拌して、イソシアネートを形成し、次いで、イソシアネート溶液に10 mLのベンゼン中の2.1 gの3−シアノ−4−クロロアニリンを滴下する。反応混合物を65℃にて一夜攪拌する。溶液を室温まで冷却し、100 mLのジエチルエーテルを加えて生成物およびアミン塩を沈澱させる。フリットロートを用いてスラリーを濾過し、ジエチルエーテルで洗浄する。水を加えて固体を再スラリー化し、水、10％ 塩酸(2回)および蒸留水(3回)で洗浄する。生成物を風乾して、2.9 g(72％)の1−(4−クロロ−3−シアノフェニル)−3−(4−クロロ−3−ニトロフェニル)ウレアを得る。
反応工程式２に示すように、イソシアネート(5)(もちろん、上述したようにアミンから製造したもの)を水で処理して、ある程度のイソシアネートをアミンに戻すように加水分解し、残っているイソシアネートをアミンと縮合させて、適当な対象ウレア(6)を得ることによって、対称ウレアを都合よく製造することができる。
【００４７】
反応工程式２
【化４】
2004528311.tif 000005
【００４８】
実施例２：1,3−ビス(4−クロロ−3−ニトロフェニル)ウレア
50 mLのベンゼン、5 mLのピリジンおよび100 mgの4−ジメチルアミノピリジン中の3−ニトロ−4−クロロアニリン(2 g)の溶液を、トルエン(6 g)および10 mLのベンゼン中のホスゲンの20w/w％溶液に5℃にて攪拌しながら滴下する。添加完了後、反応混合物を室温まで温め、3時間攪拌を続ける。次いで、この溶液を、200 mLのジエチルエーテル、0.5 mLのピリジンおよび100 mgの水の混合物に攪拌しながら加え、一夜攪拌する。10 mLの水を追加し、攪拌を1時間続ける。得られる沈澱をフリットロートを用いて濾過し、ジエチルエーテルで洗浄する。水を加えて固体を再スラリー化し、水、10％ 塩酸(2回)および蒸留水(洗液が中性ｐＨになるまで)で洗浄する。生成物を風乾して、0.97 g(47％)の1,3−ビス(4−クロロ−3−ニトロフェニル)ウレアを得る。
【００４９】
下記の表は、本発明化合物の代表例である。
【化５】
2004528311.tif 000006
【表１】
2004528311.tif 000007
【表２】
2004528311.tif 000008
【表３】
2004528311.tif 000009
【００５０】
実施例３：Ｆａｓ媒介アポトーシス
Ｆａｓ媒介アポトーシスについてのアッセイは当業界で公知である。たとえば、Ruiz−Ruizら, Cell Death Diff. 6:271(1999)；およびMullerら, J. Exp. Therap. 188:2033(1998)を参照。
アポトーシスは、アポトーシス細胞死に特有のＤＮＡ断片化パターンの検出によって同定される。この実施例では、CellQuestソフトウエアを用いてFACScan（登録商標）フローサイトメーター(Becton Dickinson)で行うFACS（登録商標）分析によってアポトーシスを検出し、測定する。ＤＮＡ断片化の定量は、Nicolletti ら, J. Immunol. Methods 139:271−279(1991)に記載されているように、ヨウ化プロピジウム染色核のFACS（登録商標）分析によって行う。培養培地中の浮遊肝細胞を200ｘｇの遠心分離によって集める。１％トリプシンとともに1分間インキュベートすることにより付着肝細胞を採取する。細胞をリン酸緩衝生理的食塩水（PBS）で洗浄し、低張溶解緩衝液(0.1％クエン酸ナトリウム、0.1％トリトンXおよび50 ng/mLヨウ化プロピジウム)(Sigma)に懸濁し、4℃にて6時間インキュベートする。次いで、フローサイトメトリーによってＤＮＡ含量について細胞を分析する。
【００５１】
アポトーシス（しかし、正常ではない）細胞膜上に曝露されるたホスファチジルセリン分子(PS)(PSは通常、細胞膜二分子層の内部リーフレットに限定される)に結合するアネキシンV−Fluos(Boehringer Mannheim)を用いて、早期アポトーシス変化を同定する。ヨウ化プロピジウムを用いて、アネキシンVポジティブ染色細胞クラスターから壊死細胞を識別する。細胞をトリプシン処理し、ＰＢＳで洗浄し、200ｘｇにて5分間遠心分離し、100 μLのHEPES緩衝液(10 mlのHEPES/NaOH, pH 7.4, 140 mM NaCl, 5 mM CaCl2)および20 μLのヨウ化プロピジウムに再懸濁する。細胞を10〜15分間インキュベートし、CellQuestソフトウエアを用いるフローサイトメーターで分析する。488nmの励起波長および５６０nmのカットオフフィルターを用いてヨウ化プロピジウムを分析する。
化合物（３）が、10μMにてＦａｓ媒介アポトーシスの刺激を示す。
【００５２】
実施例４：Ｆａｓ媒介アポトーシスの刺激
ヒト化抗体である抗ヒトＦａｓ抗体h−HFE7Aは、Sankyo Co., Ltd.から入手した。この抗体は、インビトロにおいて二次抗体と架橋した場合にアポトーシスを誘発する。
ヒト滑膜のサンプルは、全膝置換手術または滑膜切除術の時点において慢性関節リウマチの患者から入手した。滑膜組織を細かく刻んで小片にし、コラゲナーゼで消化し、加湿した5％CO2雰囲気中、37℃にて 10％ウシ胎児血清(F10F)を補足したハムのF12培地にて培養した。付着細胞を滑膜細胞とみなし、F10F中で培養した。
【００５３】
Cancer Res. 48:4827(1988)に記載のXTT法を用いて細胞の生存率を決定した。96ウエル平板を抗ヒトIgGでプレコートした。h−HFE7A(1000 ng/mL)および／または10μMの本発明化合物を加え、2時間インキュベートした。滑膜細胞を播き(10,000/ウエル)、16時間インキュベートした。バックグラウンドウエルには培地のみを入れた。XTT(2,3−ビス[2−メトキシ−4−ニトロ−スルホフェニル]−2H−テトラゾリウム−5−カルボキサニリド)（最終濃度200μg／ｍＬ）およびメチル硫酸フェナジン（最終濃度5μM）を各ウエルに加え、さらに4時間インキュベートする。450nmにおける吸光度を測定し、細胞生存率を次の式により決定した：
(テストサンプルのOD450−バックグラウンドのOD450)ｘ100
細胞生存率(％)＝／
(対照サンプルのOD450−バックグラウンドのOD450)
本発明化合物によるＦａｓ媒介アポトーシスの強化を刺激インデックス(ＳＩ)によって決定した：
(化合物のみの細胞生存率(％))ｘ(h−HFE7Aのみの細胞生存率(％))
SI＝／
(化合物およびh−HEF7Aの細胞生存率(％))ｘ100
SIが2.0以上の場合、ポジティブとみなした。化合物（３）が、このアッセイにおいて10μMにてポジティブであった。
【００５４】
実施例５：Ｆａｓ受容体の発現
Muller ら, J. Exp. Med. 188:2033−2045(1998)の方法によって、Ｆａｓ受容体の発現を測定した。CellQuestソフトウエアを用いるFACScan（登録商標）フローサイトメーター(Becton Dickinson)を用いて、Ｆａｓ受容体の発現の増加パーセントを決定した。精製ビオチン化抗体として、Ｆａｓ受容体に特異的な抗APO−１抗体(IgG3)を用いる。クォンタム・レッド・ストレプトアビジン(Sigma)を間接免疫蛍光法の二次試薬として用いる。ビオチン化抗APO−1を加えた50μLの培養培地中で肝腫瘍細胞をインキュベートする。30分間インキュベートした後、細胞を2回洗浄し、クォンタム・レッド・ストレプトアビジンとともに30分間インキュベートし、再度2回洗浄し、アッセイする。データ獲得後、無処置の細胞に前方／側方散乱分析によりゲートをセットし、１０４個の生存細胞を分析する。以下の式にしたがって、Ｆａｓ受容体の増加パーセントを、処置細胞において検出されたＦａｓ受容体％と対照細胞において検出されたＦａｓ受容体％の間の差として計算する：
Ｆａｓ受容体発現の増加(％)=(処置細胞におけるＦａｓ受容体％−処置細胞におけるクォンタム・レッド％)−(対照細胞におけるＦａｓ受容体％−対照細胞におけるクォンタム・レッド％)
本発明化合物は、Ｆａｓ受容体発現を増加することがわかった。
【００５５】
実施例６：経口医薬組成物調製−固形投与製剤
経口投与用医薬組成物を以下の成分：
2004528311.tif 000010
を調合することによって製造する。
混合物を錠剤に圧縮する。別法として、混合物を硬ゼラチンカプセルに充填する。
錠剤はフィルム形成剤(たとえば、ヒドロキシプロピルメチルセルロース)、色素(たとえば、二酸化チタン)および可塑剤(たとえば、フタル酸ジエチル)の懸濁液を塗布し、溶媒の蒸発によりフィルムを乾燥させることによってコーティングすることができる。フィルムコーティングは錠剤重量の２％〜６％、好ましくは約３％であってよい。
本実施例の方法によって製造された本発明化合物を含む錠剤は、経口投与に適しており、Ｆａｓ媒介アポトーシスの増加ならびに自己免疫疾患、感染症および悪性腫瘍の治療において有効である。
【００５６】
実施例７：経口医薬組成物調製−軟ゲル剤
経口投与に適した本発明化合物の医薬組成物を以下の成分：
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を調合することによって製造する。
化合物を必要であれば増粘剤を含む液体担体中に分散または溶解する。次いで、製剤を適当な技術によって軟ゼラチンカプセルに封入する。
本実施例の方法によって製造された本発明化合物を含む軟ゼラチンカプセル剤は、経口投与に適しており、Ｆａｓ媒介アポトーシスの増加ならびに自己免疫疾患、感染症および悪性腫瘍の治療において有効である。
【００５７】
実施例８：非経口投与用医薬組成物
非経口投与用医薬組成物は、典型的には、医薬活性成分およびリン酸緩衝食塩水または動物への導入に適したpHおよび塩含量の他の水溶液などの生理的食塩水を含む。非経口投与用医薬組成物は、以下のとおり、本発明化合物およびダルベッコのリン酸緩衝食塩水(D8662、Sigma Chemical Co. St. Louis、MO)を合わせることによって製造する：
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溶液を滅菌し、滅菌容器に入れ密封する。
本実施例の方法によって製造された本発明化合物を含む医薬組成物は、経口投与に適しており、Ｆａｓ媒介アポトーシスの増加ならびに自己免疫疾患、感染症および悪性腫瘍の治療において有効である。
【００５８】
本発明の範囲および意図から逸脱することのない、本発明の種々の改良および変法は、当業者には明白であろう。しかし、本発明は特に好ましい態様に関連して記載したものであって、特許請求する本発明がこのような特定の態様に制限されないことを理解すべきである。本発明を実施するために記載した方法の種々の改良が、特許請求の範囲内にあることは、当業者には明白のことである。
【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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