(57)【要約】本発明は、インターフェロン（ＩＦＮ）を介した免疫応答を減少するための製薬学的調製物の製造のための肺炎ウイルスＮＳ１タンパク質及び／もしくはＮＳ２タンパク質または肺炎ウイルスＮＳ１タンパク質及び／もしくはＮＳ２タンパク質をコードする核酸の使用に関する。本発明はまた、インターフェロン（ＩＦＮ）を介した免疫応答に対する増加もしくは減少した抵抗性を有するかまたは抵抗性をもたない組換え肺炎ウイルス、特にＲＳウイルス（ＲＳＶ）にも関する。本発明はさらに、インターフェロン（ＩＦＮ）を介した免疫応答に対する増加した抵抗性を有する組換えウイルス、及び製薬学的適用における、例えばワクチンとしての該ウイルスの使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＩＦＮを介した免疫応答を減少するための製薬学的調製物の製造のためのＲＳＶ ＮＳ１及び／もしくはＮＳ２タンパク質またはＮＳ１をコードする核酸配列及び／もしくはＮＳ２をコードする核酸配列の使用。
【請求項２】
免疫応答が抗ウイルス応答である請求項１に記載の使用。
【請求項３】
免疫応答を抑制する請求項１もしくは２に記載の使用。
【請求項４】
核酸配列がＤＮＡもしくはＲＮＡである請求項１−３のいずれかに記載の使用。
【請求項５】
ＲＳＶ ＮＳ１及びＮＳ２タンパク質を一緒に使用するか、もしくはＮＳ１をコードする核酸配列とＮＳ２をコードする核酸配列とを一緒に使用する請求項１−４に記載の使用。
【請求項６】
ＲＳＶ ＮＳ１タンパク質及びＮＳ２タンパク質が異なるＲＳＶウイルスから得られるか、もしくはＲＳＶ ＮＳ１をコードする核酸配列及びＲＳＶ ＮＳ２をコードする核酸配列が異なるＲＳＶウイルスから得られる請求項５に記載の使用。
【請求項７】
核酸配列が、プラスミドまたはベクターまたはウイルス由来のベクターまたは組換えＤＮＡもしくはＲＮＡウイルスに含有される請求項４に記載の使用。
【請求項８】
該ベクターが、免疫目的のために、遺伝子治療においてもしくは細胞減少（細胞破壊；抗癌）療法において使用されるウイルス遺伝子発現ベクターである請求項７に記載の使用。
【請求項９】
ウイルスもしくはウイルス由来のベクターが、アデノウイルス（ＡｄＶ）、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、ヘルペスウイルスもしくはポックスウイルスのようなＤＮＡウイルスから得られる請求項７に記載の使用。
【請求項１０】
ウイルスもしくはウイルス由来のベクターが、（＋）鎖ウイルスから、好ましくは、アルファ−、フラビ−及びピコルナウイルス科という科のウイルスから得られる請求項７に記載の使用。
【請求項１１】
ウイルスもしくはウイルス由来のベクターが、分節型もしくは非分節型（−）鎖ＲＮＡウイルスから得られる請求項７に記載の使用。
【請求項１２】
ＲＮＡウイルスが、パラミクソウイルス科、フィロウイルス科、ボルナウイルス科もしくはラブドウイルス科という科から、特に狂犬病ウイルスから得られる請求項７に記載の使用。
【請求項１３】
ＲＮＡウイルスがヒトもしくは動物ＲＳＶから得られる請求項１２に記載の使用。
【請求項１４】
ＮＳ１をコードする核酸配列及び／もしくはＮＳ２をコードする核酸配列が該ヒトもしくは動物ＲＳＶと異種起源である請求項１３に記載の使用。
【請求項１５】
製薬学的調製物がワクチンをさらに含む請求項１〜１４に記載の使用。
【請求項１６】
ＲＳＶ ＮＳ１及び／もしくはＮＳ２タンパク質を改変する請求項１〜１５に記載の使用。
【請求項１７】
改変がアミノ酸置換、欠失もしくは挿入の群から選択される請求項１６に記載の使用。
【請求項１８】
改変が、ＮＳ１及び／もしくはＮＳ２タンパク質のＩＦＮ拮抗活性の増加をもたらす請求項１６もしくは１７に記載の使用。
【請求項１９】
改変が、ＮＳ１及び／もしくはＮＳ２タンパク質のＩＦＮ拮抗活性の減少をもたらす請求項１６もしくは１７に記載の使用。
【請求項２０】
ワクチンの製造のためのＮＳ１及び／もしくはＮＳ２をコードする改変された核酸配列を有する組換えＲＳＶの使用であって、ここで、該改変は、宿主のＩＦＮを介した免疫応答を逃れるウイルスの能力を下げるかもしくはなくする、該組換えＲＳＶの使用。
【請求項２１】
ＮＳ１及び／もしくはＮＳ２をコードする改変された核酸配列が該ＲＳＶと同一源であるかもしくは異種起源である請求項２０に記載の使用。
【請求項２２】
組換えＲＳＶがヒトもしくはウシＲＳＶから得られる請求項２０もしくは２１に記載の使用。
【請求項２３】
ＮＳ１及び／もしくはＮＳ２をコードする核酸配列がマウスの肺炎ウイルス（ＰＶＭ）から得られる請求項２０〜２２に記載の使用。
【請求項２４】
ＩＦＮがＩ型インターフェロン（ＩＦＮアルファもしくはＩＦＮベータ）である請求項１〜２３に記載の使用。
【請求項２５】
ＮＳ１及び／もしくはＮＳ２をコードする核酸配列が、所望の宿主に感染することができるＲＳＶから得られるＮＳ１及び／もしくはＮＳ２をコードする核酸配列で置換される、ＲＳＶの宿主範囲を改変する方法。
【請求項２６】
ウイルスのＮＳ１及び／もしくはＮＳ２をコードする核酸配列が、所望の宿主に感染することができるウイルスから得られるＮＳ１及び／もしくはＮＳ２をコードする核酸配列で置換される、改変された宿主範囲を有する組換えＲＳＶ。
【請求項２７】
ＲＳＶ ＮＳ１及び／もしくはＮＳ２タンパク質を発現するように遺伝子的に改変された組換えウイルスであって、ここで、ＲＳＶ ＮＳ１及び／もしくはＮＳ２タンパク質の発現は、ＩＦＮを介した免疫応答を逃れる能力を該ウイルスに与えるかもしくは増強する、該組換えウイルス。
【請求項２８】
該ウイルスが狂犬病ウイルスから得られる請求項２７に記載のウイルス。
【請求項２９】
ワクチンとしての使用のための請求項２６〜２８に記載のウイルス。
【請求項３０】
ＲＳＶ ＮＳ１及び／もしくはＮＳ２タンパク質またはＮＳ１をコードする核酸配列及び／もしくはＮＳ２をコードする核酸配列がＢＲＳＶ、ＨＲＳＶもしくはＰＶＭから得られる請求項１に記載の使用。
【請求項３１】
ＢＲＳＶ、ＨＲＳＶもしくはＰＶＭのＲＳＶ ＮＳ１及び／もしくはＮＳ２タンパク質が図１８に記載の配列を有するか、またはＢＲＳＶ、ＨＲＳＶもしくはＰＶＭのＮＳ１をコードする核酸配列及び／もしくはＮＳ２をコードする核酸配列が図１８に記載の配列をコードする請求項３０に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の背景
発明の技術分野
本発明は、インターフェロン（ＩＦＮ）によりもたらされる免疫応答を減少するための製薬学的調製物の製造のための肺炎ウイルスＮＳ１タンパク質及び／もしくはＮＳ２タンパク質または肺炎ウイルスＮＳ１タンパク質及び／もしくはＮＳ２タンパク質をコードする核酸の使用に関する。本発明はさらに、宿主のインターフェロン（ＩＦＮ）が介在する免疫応答に対する増加もしくは減少した抵抗性を有するかまたは抵抗性を欠く組換え肺炎ウイルス、特にＲＳウイルス（ＲＳＶ）、インターフェロン（ＩＦＮ）が介在する免疫応答に対する増加した抵抗性を有する組換えウイルス、及び製薬学的調製物における、例えばワクチンとしてのこれらのウイルスの使用に関する。
【０００２】
先行技術の記述
ウシ呼吸器性シンシチアルウイルス（ＢＲＳＶ）は、仔ウシにおける気道の疾患の最も重要な病原体であり、そして重大な経済上の損失をもたらす（４０；４５）。仔ウシにおける免疫応答及び病理は、依然として世界的に乳児及び幼児における重い細気管支炎及び肺炎の主な原因であるヒトＲＳウイルス（ＨＲＳＶ）により引き起こされる症状によく似る（９）。ＨＲＳＶ及びＢＲＳＶ並びに関連ウイルス、マウスの肺炎ウイルス（ＰＶＭ）の分子クローニングは、ＢＲＳＶ及びＨＲＳＶ間の近縁関係を裏付けただけでなく、それらがパラミクソウイルス科の他のメンバーに対して本質的な違いを共有することも明らかにし、パラミクソウイルス科内の肺炎ウイルス科という亜科の設立につながった（３６；３７）。この亜科内において、ＲＳＶウイルス及びＰＶＭは肺炎ウイルス属を形成し、一方、トリ肺炎ウイルス（ＡＰＶ）は、現在まで、メタニューモウイルス属の唯一のメンバーである。
【０００３】
モノネガウイルス目の全てのメンバーでのように、ＲＳＶ及びＰＶＭの約１５ｋｂのゲノムＲＮＡはリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体に含有され、次に起こる遺伝子の転写の鋳型として働く（２５；４９）。１１種のタンパク質が、３’−ＮＳ１−ＮＳ２−Ｎ−Ｐ−Ｍ−ＳＨ−Ｇ−Ｆ−Ｍ２−Ｌ−５’の順に配置される１０個の転写単位により発現される（５；９；３０；３１）。コードされるタンパク質は、５種のＲＮＰ関連タンパク質を含んでなる：核タンパク質（Ｎ）、リンタンパク質（Ｐ）、ＲＮＡポリメラーゼのラージ触媒サブユニット（Ｌ）、及びＭ２遺伝子の２個の重複するオープンリーディングフレームの第一のものによりコードされる転写伸長因子（Ｍ２−１）（８；１７；２７；３８）。Ｍ２転写単位の第二のオープンリーディングフレーム（Ｍ２−２）は、おそらくＲＮＡ合成の調節に関与する（４；２８）記述されているような（１）非必須タンパク質をコードする。３種のウイルスタンパク質は、ウイルスエンベロープと関連する：融合タンパク質Ｆ、推定上の付着タンパク質Ｇ、及び低分子量（ｓｍａｌｌ）疎水性タンパク質ＳＨ。
【０００４】
ゲノムの３’末端位置における２個の非構造タンパク質遺伝子の存在は、肺炎ウイルス族のメンバーをモノネガウイルス目の全ての他のメンバーから区別する。ＮＳ遺伝子は、３’末端に近いそれらの位置のために過剰に転写される。コードされるタンパク質は、感染細胞において検出された（１０；１６）。ＢＲＳＶ ＮＳ遺伝子は、１３６及び１２４アミノ酸を有するポリペプチドをコードする。亜群Ａ及びＢからのＨＲＳＶのＮＳタンパク質との比較により、ＮＳ１タンパク質では６９％及び６８％の、そしてＮＳ２タンパク質では８４％及び８３％のアミノ酸相同性が示された（５；３４）。ＰＶＭ ＮＳ１及びＮＳ２タンパク質は、ＲＳＶ ＮＳ遺伝子に著しい相同性を示さないが（約２０％の同一性）、それにもかかわらず同様の機能を有する。しかしながら、得られる配列は、ウイルスの生活環におけるＮＳタンパク質の機能に関して明白な指摘を与えなかった。ＨＲＳＶ ＮＳ１タンパク質はＭタンパク質と関連し、一方、ＮＳ２タンパク質はＲＳＶ構造タンパク質との検出可能な関連を示さず、ＮＳ１及びＮＳ２の異なる機能を示唆することが報告されている（１６；４７）。最近、人工ＨＲＳＶミニゲノムをＮＳ１の非存在下及び存在下で増やす実験によりウイルスＲＮＡの転写に対するＮＳ１の抑制機能が示唆されている。さらに、同じ研究において、ＮＳ２にも抑制作用が認められたが、ＮＳ２のこの作用ははるかに強さが低かった（３）。
【０００５】
ｃＤＮＡから感染性（−）鎖ＲＮＡウイルスを調製（「回収」）する最近確立された方法（１１）により、組換えヒト（８；２９）及びウシ（５）ＲＳＶの作製並びにウイルスに関連する個々のタンパク質機能の検討が可能になっている。生存可能なＮＳ２遺伝子欠失突然変異体の成功した調製は、ＮＳ２が細胞培養におけるウイルス複製にとって必須ではないことを裏付けた（５；４３）。感染細胞において生産されるｍＲＮＡ及び全長ＲＮＡのパターン及び相対量は、可視的に改変されなかった。しかしながら、欠失突然変異体は弱毒化され、出発ウイルスと比較して遅い増殖速度を示し、そして低い感染性ウイルス力価を与えた。従って、ＮＳ２は非必須であるが、それは、これまで未知の機構によりウイルス増殖を実質的に支えることができる補助因子に相当する。しかしながら、現在まで、ＮＳタンパク質の機能は未知のままである。
【０００６】
発明の要約
本発明は、ＲＳＶ及びＲＳＶ関連ウイルス、特に肺炎ウイルス属のもの（ＲＳＶ及びＰＶＭ）（これらの全てを下記において「ＲＳＶ」と称する）のＮＳ１及び／もしくはＮＳ２タンパク質が、ＩＦＮを介した免疫応答に対する拮抗作用を有するという発見に基づく。
【０００７】
本発明は、ＩＦＮにより、好ましくはＩＦＮアルファ及び／もしくはベータによりもたらされる免疫応答を減少するための製薬学的調製物の製造のためのＲＳＶ ＮＳ１及び／もしくはＮＳ２タンパク質またはＲＳＶ ＮＳ１をコードする核酸配列もしくはＲＳＶ ＮＳ２をコードする核酸配列の使用に関する。
【０００８】
本発明の別の態様は、ＲＳＶ ＮＳ１及び／もしくはＮＳ２タンパク質またはＲＳＶ ＮＳ１タンパク質をコードする核酸もしくはＮＳ２タンパク質をコードする核酸の投与を含んでなる動物におけるＩＦＮを介した免疫応答を減少する方法に関する。特に、本発明は、ＩＦＮを介した抗ウイルス応答を抑制することによるＩＦＮを介した免疫応答の改変のためのＲＳＶ ＮＳ１及び／もしくはＮＳ２タンパク質またはこれらのタンパク質をコードする核酸の使用に関する。
【０００９】
本発明の好ましい態様として、ＩＦＮを介した免疫応答を減少するための製薬学的調製物の製造のためにＲＳＶ ＮＳ１タンパク質をＮＳ２タンパク質と組み合わせて使用するか、もしくは製薬学的調製物の製造のためにＲＳＶ ＮＳ１タンパク質をコードする核酸配列とＲＳＶ ＮＳ２タンパク質をコードする核酸配列とを組み合わせて使用する。本発明による「組み合わせて」は、同時もしくは連続投与のいずれかに関する。
【００１０】
本発明の別の態様として、ＲＳＶ ＮＳ１及び／もしくはＮＳ２タンパク質は、非関連ウイルスをＩＦＮを介した免疫応答から防御するために使用する。好ましくは、ＲＳＶ ＮＳ１及び／もしくはＮＳ２タンパク質はＢＲＳＶ ＮＳタンパク質である。ＮＳ１及びＮＳ２タンパク質は、協同して非関連ウイルスを防御する。本発明による「非関連ウイルス」は、 ＲＳＶ ＮＳ１及び／もしくはＮＳ２タンパク質を発現しないウイルスをさす。好ましい態様として、ウイルスは狂犬病ウイルスである。好ましくは、ＲＳＶ ＮＳ１及び／もしくはＮＳ２タンパク質は、ウイルス核酸から発現される。
【００１１】
別の態様として、ＲＳＶ ＮＳ１及び／もしくはＮＳ２タンパク質またはＲＳＶ ＮＳ１をコードする核酸配列及び／もしくはＮＳ２をコードする核酸配列を含有しそしてＩＦＮを介した免疫応答を減少する本発明の製薬学的調製物はさらにワクチンを含んでなる。好ましくは、製薬学的調製物と一緒のワクチンの投与は、それを投与する体からのワクチンの減少した除去をもたらす。
【００１２】
本発明はまた、ＩＦＮを介した免疫応答を調節するための製薬学的調製物の製造のための改変されたＲＳＶ ＮＳ１及び／もしくはＮＳ２タンパク質の適用にも関する。好ましい態様として、改変は、ＮＳ１及び／もしくはＮＳ２タンパク質の高められたＩＦＮ調節活性をもたらす。
【００１３】
本発明は、ワクチンの製造のためのＮＳ１及び／もしくはＮＳ２をコードする改変された核酸配列を保有する組換えＲＳＶの使用に関し、ここで、改変は、ＩＦＮを介した免疫応答を逃れるウイルスの能力を下げるかもしくはなくする。好ましい態様として、ＮＳ１及び／もしくはＮＳ２をコードする改変された核酸配列は、該組換えＲＳＶと同一源であるかもしくは異種起源である。組換えＲＳＶがヒト、ウシＲＳＶから、もしくはＰＶＭから得られる適用が特に好ましい。
【００１４】
さらに、本発明は、ＲＳＶのＮＳ１及び／もしくはＮＳ２をコードする核酸配列が、所望の宿主に感染することができる異なるＲＳＶからのＮＳ１及び／もしくはＮＳ２をコードする核酸配列で置換される改変された宿主範囲を有するＲＳＶ、並びに改変された宿主細胞親和性を有するそのようなＲＳＶの作製方法を含んでなる。
【００１５】
発明の詳細な記述
ＲＳＶタンパク質の機能をさらに詳細に調べるために、ＮＳ１遺伝子もしくはＮＳ１とＮＳ２遺伝子を欠くＢＲＳＶ欠失突然変異体を作製し、そして異なる細胞系におけるそれらの性質について調べた。
【００１６】
宿主細胞因子に対するＮＳ欠失突然変異体の増加した感受性に関する最初の表示は、ｗｔ ＢＲＳＶ感染に完全に感受性でありそして試験する全ての他の細胞系より高いｗｔ ＢＲＳＶ力価を与えるＭＤＢＫ細胞の感染後に認められた。ＮＳ遺伝子の一方もしくは両方を欠くウイルスは、しかしながら、ＭＤＢＫ細胞において増殖が最も悪く、一方、ＶｅｒｏもしくはＢＳＲのような他の細胞系では、ＮＳ遺伝子の欠如は、感染力価の１０倍の減少のみをもたらした。共培養実験により、ＢＲＳＶに感染したＭＤＢＫ細胞により生産される重要な宿主細胞因子としてＩ型インターフェロンが同定された。明らかに、感染したＭＤＢＫ培養物では自己分泌及びパラ分泌細胞刺激により抗ウイルス状態が誘導される。ｗｔ ＢＲＳＶはこの応答に拮抗することができるが、ＮＳ欠失突然変異体のいずれもこの能力を共有しない。一方、Ｖｅｒｏ細胞はＩ型インターフェロン遺伝子を欠き（１５；４６）、従って、ウイルス感染は、抗ウイルス状態の誘導をもたらさず、そしてＮＳ欠失突然変異体の増殖を可能にする。Ｖｅｒｏ細胞は、インターフェロン生産をすることができないが、ＩＦＮアルファ受容体（ＩＦＮＡＲ）複合体を介したＪＡＫ／ＳＴＡＴによりもたらされるシグナリングによって外来インターフェロンによる刺激に反応することができる。感染したＭＤＢＫ細胞により分泌されるウシインターフェロンは、Ｖｅｒｏ「応答（ｒｅｓｐｏｎｄｅｒ）」細胞における抗ウイルス応答を誘導し、ＮＳ欠失突然変異体の増殖を抑制したが、ｗｔ ＢＲＳＶの増殖は抑制しなかった。ＭＤＢＫ上清によりもたらされる抗ウイルス作用は、ＩＦＮＡＲへのＩＦＮ結合を阻止する抗体とＶｅｒｏ細胞とのインキュベーションにより妨げられた。従って、抗ウイルス応答の誘導におけるＭＤＢＫ細胞上清の唯一の有効成分は、ＩＦＮアルファ及び／もしくはＩＦＮベータであった。
【００１７】
ＭＤＢＫ細胞上清で処理したＶｅｒｏ細胞におけるＮＳ欠失突然変異体に対する抑制作用は弱く、最大７倍の二重欠失突然変異体の減少で、従って、ＭＤＢＫ細胞におけるＮＳ欠失突然変異体の激しい抑制に匹敵しなかった。これは、いくつかの要因に起因すると考えることができる。おそらく、ウシ起源の異種起源のＩＦＮでの霊長類由来のＶｅｒｏ細胞の刺激は、ＭＤＢＫの刺激と比較して効率が低い。ヒトにおける状況と同様に、異なる生物学的活性を示す異なる型のウシＩＦＮアルファ（２〜８型）及びＩＦＮベータ（１〜３型）が同定された（７）。さらに、Ｖｅｒｏ細胞の抗ウイルス機構は、ＭＤＢＫのものより効率が低いようである。他の細胞より多量のＩ型インターフェロンを分泌することが知られている活性化しそして感染したマクロファージの上清は、Ｖｅｒｏ「応答」細胞におけるＮＳ欠失突然変異体の高められた５０倍までの減少をもたらした。組換えヒトＩＦＮアルファＡ／ＤもしくはＩＦＮベータでＶｅｒｏ細胞を刺激することにより、ＮＳ欠失突然変異体の複製を用量に依存して抑制することができ、ここで、５００ユニットは複製活性をほとんど完全に抑制した。
【００１８】
従って、本発明により、ＲＳＶタンパク質は、ＩＦＮを介した宿主細胞応答のアンタゴニストと同定された。
【００１９】
さらに、ＢＲＳＶから得られるＮＳ遺伝子の発現のためのベクターとして別の（−）鎖ＲＮＡウイルス、狂犬病ウイルスを用いて、２種のＮＳタンパク質ＮＳ１及びＮＳ２の活性は、非関連ウイルスのＩＦＮ抵抗性を増加できることが示された。他の発見は、ＮＳ１及びＮＳ２タンパク質を異なるＲＳＶから得ることができることであった。
【００２０】
要約すると、ＲＳＶ ＮＳタンパク質は、細胞のインターフェロン由来の抗ウイルス機構に対するウイルスの防御をもたらす（ＩＦＮ拮抗作用）点において、重要な生物学的機能がそれらに起因すると考えることができた。さらに、意外にも、両方のＮＳタンパク質を組み合わせて用いることにより該ＩＦＮ拮抗作用が増すことが見出された。これは、インターフェロンに対する拮抗作用における２種のウイルスタンパク質の協同作用の最初の例である。
【００２１】
生来の宿主の細胞内の先天性免疫応答に対抗するためのウイルスタンパク質の適応は、ウイルスの宿主範囲を決定する重要な因子であると考えられ、そしてウイルスが種の障壁を越えることを妨げることができる（１３；２３；２６）。例えば、シミアンウイルス５（ＳＶ５）のＶタンパク質は、霊長類細胞におけるインターフェロン応答遺伝子の活性化を阻止することができるが、マウス細胞ではできない（１４）。これは、マウス及びさらにＳＣＩＤマウスの増殖性ＳＶ５感染を防ぐ関連機構であることができる（１３）。最近、ＢＲＳＶのヒト同等物であるＨＲＳＶが、ヒト細胞においてＩＦＮにより誘導される抗ウイルス活性に抵抗性であることが報告されており（２）、そして我々の結果から、我々は、ＨＲＳＶ ＮＳタンパク質が、ヒト細胞におけるＩＦＮ応答に拮抗するようにそして異なる起源の細胞におけるより優れて最適化されると推論する。
【００２２】
実際、ＲＳＶ感染に対する宿主感受性へのＮＳタンパク質の寄与は、これらの近縁ウイルスが強く限定される宿主範囲を有する理由を説明することができる。ＢＲＳＶ及びＨＲＳＶは、ヒト、ウシ及びマウス細胞に浸入することができ；宿主特異的防御機構に拮抗するＮＳタンパク質の異なる能力は、ウイルスが排除されるかどうかを決定することができる。これはまた、さらに初期の結果によっても裏付けられる。初期マウス胚（ＭＥ）細胞におけるＨＲＳＶの増殖は明らかに制限されたが、培地への抗マウスＩＦＮ血清の添加後にウイルス収量は増え、そして感染は完全な単層に広がった（２６）。さらに、霊長類細胞への浸入を容易にするためにＧ及びＦ表面タンパク質をＨＲＳＶのもので置換した組換えＢＲＳＶは、ＢＲＳＶよりチンパンジーにおける複製能力がほんのわずかにあった。しかしながら、感染は非常に限定されたままであり、そして相同なＨＲＳＶでの実験感染に対する防御を誘導するために十分ではなかった（６）。我々の結果から、我々は、霊長類の防御機構に拮抗することにおけるＢＲＳＶ ＮＳタンパク質の低い効果は、宿主範囲の主要な決定要素であると推論する。
【００２３】
従って、我々の結果は、有効な弱毒化ＲＳＶ生ワクチンの設計にとって重要な意味を有する。ＮＳ１もしくはＮＳ２または両方の遺伝子の欠失は、いかなるインターフェロン応答も逃れることができない過剰弱毒化ウイルスをもたらす。さらに、異なるＲＳＶ、例えばＢＲＳＶ及びＨＲＳＶ間のＮＳタンパク質の相互交換によりそして特にＢＲＳＶ及びＨＲＳＶワクチンを作製するためにウシ及びヒト先天性防御機構を逃れる中間の能力を有するワクチンを設計することができる。さらに、ＩＦＮ拮抗活性を部分的にのみなくする突然変異をＮＳタンパク質に導入することができる。
【００２４】
さらに、本発明によるＲＳＶ ＮＳ１及び／もしくはＮＳ２タンパク質またはＮＳ１をコードする及び／もしくはＮＳ２をコードする核酸配列はまた、ＩＦＮを介した免疫応答を減少するための製薬学的調製物の製造のためにも有用である。好ましい態様として、製薬学的調製物の製造のためにＲＳＶ ＮＳ１をＮＳ２タンパク質と組み合わせて使用する。製薬学的調製物は、動物もしくはヒトにおけるＩＦＮを介した免疫応答を改変するために有効な量のＮＳ１及び／もしくはＮＳ２、並びに製薬学的に許容しうる担体もしくは希釈剤を含んでなる。製薬学的調製物は、通常の技術を用いて製造することができる。従って、本発明による製薬学的調製物は、適切なバッファーを用いてｐＨ値を約６．０のｐＨに調整する滅菌した等張溶液に所望の量のＲＳＶ ＮＳ１及び／もしくはＮＳ２タンパク質またはＮＳ１をコードする核酸配列及び／もしくはＮＳ２をコードする核酸配列を混合することにより製造することができる。
【００２５】
本発明による製薬学的調製物は、通常の成分、例えば、食塩水、ｐＨ調節因子、バッファー、防腐剤などのような製薬学的に許容しうる担体もしくは希釈剤を含むことができる。そのような成分は、それらを選択することができる当業者に既知である。
【００２６】
本発明による「ＩＦＮ」という用語は、好ましくはＩ型インターフェロン、すなわち、インターフェロンα及びβをさす。
【００２７】
本明細書における「ＩＦＮを介した免疫応答」という用語は、例えば、ＭＨＣ糖タンパク質の増加した発現、ウイルス感染細胞の破壊のような抗ウイルス機構の活性化、もしくはウイルス複製の抑制のようなウイルス感染に対する応答として、インターフェロン、特にインターフェロンα及びβの活性により誘導される免疫及び／もしくは抗ウイルス作用をさす。
【００２８】
「ＩＦＮを介した免疫応答の減少」は、例えば、ＭＨＣ糖タンパク質の増加した発現、ウイルス感染細胞の破壊のような抗ウイルス機構の活性化、もしくはウイルス複製の抑制のようなウイルス感染に対する応答として、インターフェロン、特にインターフェロンα及びβの活性により誘導される免疫及び／もしくは抗ウイルス作用を減少することを意味する。
【００２９】
本発明による「ＩＦＮ拮抗活性」は、例えば、ＭＨＣ糖タンパク質の増加した発現、ウイルス感染細胞の破壊のような抗ウイルス機構の活性化、もしくはウイルス複製の抑制のようなウイルス感染に対する応答として、インターフェロン、特にインターフェロンα及びβの活性により誘導される免疫及び／もしくは抗ウイルス作用を減少するかもしくはなくすることを意味する。
【００３０】
本発明による「改変される（ｍｏｄｉｆｉｅｄ）」もしくは「改変される（ａｌｔｅｒｅｄ）」という用語は、基準として使用する野生型に関する。
【００３１】
「核酸配列」は、本明細書において用いる場合、ヌクレオチド塩基の任意の連続配列を意味し、そしてリボ核酸もしくはデオキシリボ核酸からなることができる。好ましくは、核酸配列はｃＤＮＡである。
【００３２】
「ＲＳＶと同一源もしくは異種起源であるＮＳ１及び／もしくはＮＳ２をコードする核酸配列」は、ＮＳ１及び／もしくはＮＳ２をコードする核酸配列が、同じもしくは異なるＲＳＶ種から、または肺炎ウイルス属の他のウイルス、例えばＰＶＭから得られることを意味する。
【００３３】
ＲＳＶ ＮＳ１もしくはＲＳＶ ＮＳ２のタンパク質配列内の改変には、単一もしくは複数のアミノ酸置換、欠失及び挿入が包含される。好ましくは、改変は、ＩＦＮを介した免疫応答を減少することもしくはＩＦＮに拮抗することにおけるタンパク質の生物学的活性に影響がない。本発明によるアミノ酸挿入変異体には、単一もしくは複数アミノ酸のアミノ及び／もしくはカルボキシ末端融合並びに内部配列挿入が包含される。アミノ酸挿入変異体は、１個以上のアミノ酸がタンパク質内の特定の位置に導入されるものであり；しかしながら、無作為な挿入もまた、得られる生成物の適切なスクリーニングと組み合わせて可能である。欠失変異体は、配列からの１個以上のアミノ酸の欠失を特徴とする。置換アミノ酸変異体は、少なくとも１個の残基が配列から取り除かれそして同じ位置で別の残基により置換されるものである。好ましくは、改変されていないＮＳ１もしくはＮＳ２タンパク質の配列は、野生型に対する少なくとも４０％、好ましくは少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも８０％もしくは少なくとも９０％、特に９５％の相同性を有する。
【００３４】
好ましい改変は、種間で保存されていない位置に存在する。好ましくは、このタイプの改変は、同様の大きさ及び極性を有する別のものでのあるアミノ酸の置換を含んでなる。製造する可能な置換のタイプに関して、異なる生物体における相同タンパク質間のアミノ酸置換の頻度の分析を最初に用いることができる。これらの分析に基づいて、保存的置換を以下に挙げるグループ内の置換と定義する。
１．低分子量脂肪族、非極性もしくは弱く極性：Ａｌａ，Ｓｅｒ，Ｔｈｒ（Ｐｒｏ，Ｇｌｙ）
２．負に荷電及びそのアミド：Ａｓｎ，Ａｓｐ，Ｇｌｕ，Ｇｌｎ
３．正に荷電：Ｈｉｓ，Ａｒｇ，Ｌｙｓ
４．高分子量脂肪族、非極性：Ｍｅｔ，Ｌｅｕ，Ｉｌｅ，Ｖａｌ（Ｃｙｓ）
５．高分子量芳香族：Ｐｈｅ，Ｔｙｒ，Ｔｒｐ
３種のアミノ酸は、タンパク質構造におけるそれらの特異的役割のために括弧に入れて記す。Ｇｌｙは側鎖のない唯一のアミノ酸であり、従って、ペプチド鎖に柔軟性を与える。Ｐｒｏは、鎖の柔軟性を強く制限する独特な構造を有する。Ｃｙｓは、ジスルフィド結合に関与することができる。
【００３５】
さらに、上記に詳述するような改変をＲＳＶ ＮＳ１もしくはＲＳＶ ＮＳ２のタンパク質配列に導入し、ＩＦＮを介した免疫応答を減少するもしくはＩＦＮに拮抗するタンパク質の生物学的活性の増強もしくは減少をもたらすことができる。
【００３６】
以下の実施例は、本発明の異なる態様を例示する目的のために示し、そして本発明を決して限定するものではない。
【００３７】
実施例
実施例１：ＮＳ遺伝子を欠くＢＲＳＶ欠失突然変異体の構築及びレスキュー
組換えＢＲＳＶ（ｒＢＲＳＶ）をＢＲＳＶ株Ａ５１９０８（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）（３３）、変異体Ａｔｕｅ５１９０８（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ０９２９４２））から得、そしてすでに記述されているように（５）ＭＤＢＫ細胞において培養した。ＢＲＳＶ株Ａｔｕｅ５１９０８（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ０９２９４２）の全長ｃＤＮＡのクローニング及びＢＲＳＶ全長アンチゲノムＲＮＡもしくはＮＳ２遺伝子なしのアンチゲノムＲＮＡ（ｐＢＲＳＶ ΔＮＳ２）のＴ７ ＲＮＡポリメラーゼによりもたらされる転写を可能にするプラスミドの構築は他で記述されている（５）。
【００３８】
ＮＳ１遺伝子（ｐＢＲＳＶ ΔＮＳ１）もしくはＮＳ１とＮＳ２の両方の遺伝子（ｐＢＲＳＶ ΔＮＳ１／２）を欠く構築物もまたｐＢＲＳＶに基づいて作製した。ＮＳ１遺伝子は、ＮｏｔＩ及びＡｓｅＩで切断し、クレノウポリメラーゼで埋め、そして続いて再連結することによりｐＢＲＳＶから取り除いた。このようにしてｐＢＲＳＶ ΔＮＳ１を得た。二重欠失突然変異体ｐＢＲＳＶ ΔＮＳ１／２を作製するために、Ｎ遺伝子の一部を含んでなる０．６ｋｂのＰＣＲフラグメントを増幅した。この目的のために、Ｎ開始コドンの上流にＮｏｔＩ制限部位（下線を施す）を含有するプライマーＮＮｏｔ（＋）（５‘−ＴＡＧＧＣＧＧＣＣＧＣＡＡＡＡＡＴＧＧＣＴＣＴＴＡＧＣ−ＡＡＧＧＴＧ−３’）並びに唯一のＳｔｕＩ制限部位（ｒＢＲＳＶ位置１６７１）の下流のｒＢＲＳＶのｎｔ １７３５−１７１５に対応するリバースプライマーＮｓｔｕ（−）（５’−ＴＣＣＴＴＴＧＴＡＴＣＧＴＴＴＣＡＴＴＴＣ−３’）を用いた。ＮｏｔＩ（ｒＢＲＳＶ位置７２）及びＳｔｕＩ（ｒＢＲＳＶ位置１６７１）での消化によるｐＢＲＳＶからのＮＳ１及びＮＳ２遺伝子並びにＮ遺伝子の一部の欠失後に　ＳｔｕＩ制限ＰＣＲフラグメントを用いて欠失配列を置換した（図１）。
【００３９】
組換えｗｔウイルスｒＢＲＳＶの配列と比較して、ＮＳ１、ＮＳ２及びＮＳ１／ＮＳ２欠失突然変異体は、それぞれ、４９６、５０９及び１０６０ヌクレオチドを欠く。全ての構築物において、３’末端遺伝子の転写は、本来のリーダー／ＮＳ１転写開始シグナルにより誘導される（図１）。
【００４０】
生存可能な組換えウイルスｒＢＲＳＶ、ｒＢＲＳＶ ΔＮＳ１、ｒＢＲＳＶ ΔＮＳ２及びｒＢＲＳＶ ΔＮＳ１／２は、それぞれのウイルスｃＤＮＡ（１０μｇ）を有するＴ７プロモーター制御プラスミドのトランスフェクション（ＣａＰＯ４プロトコル；哺乳動物トランスフェクションキット（Ｍａｍｍａｌｉａｎ　Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ）、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）後にＴ７ ＲＮＡポリメラーゼを発現するＢＳＲ Ｔ７／５細胞（５）においてそれぞれのｃＤＮＡ構築物から得ることができた。ファージＴ７ ＲＮＡポリメラーゼを安定に発現する約１０６のＢＳＲ Ｔ７／５細胞にＢＲＳＶタンパク質Ｎ及びＰ（ｐＴＩＴＢ−Ｎ及びｐＴＩＴＢ−Ｐ、プラスミド当たり４μｇ）並びにＬ及びＭ２（ｐＴＩＴＢ−Ｌ及びｐＴＩＴＢ−Ｍ２、プラスミド当たり２μｇ）をコードするプラスミドを各ウイルスｃＤＮＡと共トランスフェクションした（５）。４時間後に、トランスフェクション培地を取り除き、そして５％ ＦＣＳを含有するＢＨＫ−２１培地（Ｇｉｂｃｏ）を加えた。細胞破壊効果を認めることができるまで、ＢＲＳＶ ｃＤＮＡでトランスフェクションした細胞を５日ごとに１：３の比率で希釈した
ＮＳ１／２二重突然変異体を含む全ての場合において、ＢＲＳＶ Ｎ、　Ｐ、Ｌ及びＭ２タンパク質をコードする支持プラスミド（ｓｕｐｐｏｒｔ　ｐｌａｓｍｉｄ）の共トランスフェクションは、シンシチウムの形成をもたらした。トランスフェクションした細胞を１：３の比率で希釈し、そして明白な細胞破壊効果の発生後にウイルスを採取した。
【００４１】
ウイルスストック溶液の調製のために、８０％融合したＭＤＢＫ及びＶｅｒｏ細胞に血清なしのダルベッコ最小必須培地（ＤＭＥＭ）において０．１の感染多重度（ＭＯＩ）で感染させた。１時間の吸着後に接種材料を取り除き、そして明白な細胞変性効果（ＣＰＥ）が認められるまで５％ ＣＯ２大気中２．５％ ＦＣＳを補足したＤＭＥＭにおいて３７℃で細胞をインキュベーションした。ウイルスを凍結及びそれに続く融解により遊離させた。Ｖｅｒｏ細胞上のウイルス力価は、マイクロタイタープレートにおける希釈シリーズ及びその後の感染フォーカスの計数により決定した。この目的のために、Ｆ融合タンパク質に対する抗体（Ｊ．Ａ．Ｍｅｌｅｒｏ，Ｍａｄｒｉｄから好意により入手した）を用いる間接染色によりフォーカスを染色した。ＮＳ欠失突然変異体のウイルスストック溶液の調製は、０．１のＭＯＩで感染させたＶｅｒｏ細胞上で実施した。０．１のＭＯＩでのＶｅｒｏ細胞の感染後に明白なＣＰＥが認められるまでｒＢＲＳＶの場合には３日、そしてＮＳ欠失突然変異体の場合には５日かかった
実施例２：ＮＳ欠失突然変異体の増殖
ウイルスの増殖特性は、ウイルスをレスキューするために使用したＢＨＫ細胞由来の細胞系ＢＳＲ Ｔ７／５において最初に分析した。親の全長ウイルスと異なり、全ての３種の突然変異体は弱毒化され、ウイルス複製への両方のＮＳタンパク質の寄与を示唆した。興味深いことに、単一及び二重欠失突然変異体間で感染細胞におけるウイルスの分布及び最終力価に関して明白な違いを認めることができなかった。全ての突然変異体は、０．１のＭＯＩでのＢＳＲ Ｔ７／５細胞の感染及びその後の６日のインキュベーション期間の後に２ｘ１０５ｐｆｕの感染力価に達した。しかしながら、親ウイルスは、１ｘ１０６ｐｆｕまでに達した（図３Ａ）。わずかに高い力価を有する同様の結果が、Ｈｅｐ２もしくはＶｅｒｏ細胞の感染により得られ、後者はＨＲＳＶの培養のための好ましい細胞系である。
【００４２】
次に、ｗｔ ＢＲＳＶの増殖を最適に支持する（５）ウシ起源の細胞系、ＭＤＢＫを用いた。実際、感染の６日後に２ｘ１０６ｐｆｕのわずかに高いＢＲＳＶ力価を得ることができた（図３Ｂ）。しかしながら、意外にも、この細胞系における欠失突然変異体の増殖は強く影響を受けた。単一欠失突然変異体ΔＮＳ１及びΔＮＳ２は、６日後にＢＳＲ細胞におけるものより１００倍低い３ｘ１０３ｐｆｕのみの力価に達した。二重欠失突然変異体ΔＮＳ１／２は、感染の最初の６日以内に検出可能に増殖することができなかった。細胞を希釈しそしてさらに８日間インキュベーションしてから２ｘ１０２のウイルス力価を得ることができた。ＭＤＢＫ細胞はｗｔ ＢＲＳＶの最適な宿主細胞であるが、それらは明らかに全てのＮＳ欠失突然変異体に許容ではなく、一方、ｗｔ ＢＲＳＶの次善の宿主細胞であるＢＳＲ及びＶｅｒｏ細胞は、ＮＳ欠失突然変異体の増殖の比較的優れた支持を示す。
実施例３：ＮＳ遺伝子を欠くＢＲＳＶ欠失突然変異体のＲＮＡでのノーザンハイブリダイゼーション
ノーザンハイブリダイゼーションのために、ｒＢＲＳＶもしくはＮＳ欠失突然変異体を感染させた細胞からＲＮＡを単離した。
【００４３】
Ｖｅｒｏ細胞に組換えウイルスｒＢＲＳＶ、ｒＢＲＳＶ ΔＮＳ１、ｒＢＲＳＶ ΔＮＳ２及びｒＢＲＳＶ ΔＮＳ１／２を０．１のＭＯＩで感染させ、そして強いＣＰＥが認められた後（ｒＢＲＳＶでは３日後、ＮＳ欠失突然変異体では５日後）に全ＲＮＡを単離した。ＲＮＡを変性ゲル電気泳動により分離し、ナイロン膜（Ｄｕｒａｌｏｎ−ＵＶ，　Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）上に移し、そしてＵＶ照射によって膜に結合させた。約５００ｎｔの長さのＮＳ１、ＮＳ２及びＮ遺伝子特異的ＤＮＡプローブをニックトランスレーション（ニックトランスレーションキット，Ａｍｅｒｓｈａｍ）により（ａ−３２Ｐ）ｄＣＴＰ（３，０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ，　Ａｍｅｒｓｈａｍ）で標識した。ハイブリダイゼーションしたフィルターは、増感紙を用いてＫｏｄａｋ　Ｂｉｏｍａｘ　ＭＳフィルムに感光させるか、もしくはホスホルイメージング（ｐｈｏｓｐｈｏｒ　ｉｍａｇｉｎｇ）（Ｓｔｏｒｍ，　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｄｙｎａｍｉｃｓ）によって評価した。
【００４４】
同様の転写産物パターンが全てのウイルスについて認められ、ここで、ウイルスは、ＮＳ１及びＮＳ２に特異的なＲＮＡの有無においてのみ異なった（図２）。ＢＲＳＶ及びＨＲＳＶ ＮＳ２欠失突然変異体ですでに認められているように（５；４３）、使用する組換え体にかかわらず全ての感染細胞において同様の量のＮ ｍＲＮＡ及びゲノムＲＮＡが存在した。従って、ＮＳタンパク質は、ＲＮＡ複製もしくは転写における異なった工程に影響を及ぼす代わりにむしろ一般にＲＮＡ合成に対する影響を有する。
実施例４：ＭＤＢＫ細胞及びウシマクロファージにより生産される可溶性因子は、ＮＳ欠失突然変異体の増殖に影響を及ぼす。
【００４５】
ＭＤＢＫ細胞におけるＮＳ欠失突然変異体の増殖の明白な選択的抑制を招く細胞因子を同定するために、ＭＤＢＫ細胞により生産される可溶性分子が、ＮＳ欠失突然変異体の増殖を制限することができるかどうかを最初に調べた。この目的のために、ウイルスを通さないが可溶性因子には透過性の膜により２つの細胞培養物の分離を可能にする装置においてＭＤＢＫ細胞及びＶｅｒｏ細胞を共培養した（図４Ａ）。上の方の皿のＭＤＢＫ細胞はエフェクター細胞として使用し、一方、下の方の皿のＶｅｒｏ細胞は応答細胞の役割を果たした。
【００４６】
懸濁したＶｅｒｏ応答細胞に擬似感染させるか、またはＦＣＳなしのＤＭＥＭにおいてｒＢＲＳＶ ΔＮＳ１、ｒＢＲＳＶ ΔＮＳ２もしくはｒＢＲＳＶ ΔＮＳ１／２を０．１のＭＯＩで１時間感染させた。洗浄した後、２．５％ ＦＣＳを含有するＤＭＥＭにおいて各々５ｘ１０５の細胞を６ウェル皿に接種した。ＭＤＢＫエフェクター細胞もしくは１０μｇ／ｍｌのＬＰＳ（Ｓｉｇｍａ）で一晩刺激したウシマクロファージに１のＭＯＩでｒＢＲＳＶを懸濁して１時間感染させた。洗浄した後、２００ｎｍ Ａｎｏｐｏｒｅ膜を備えた２５ｍｍ細胞培養インサート（Ｎｕｎｃ）に１ｘ１０６の細胞を接種し、そして感染したＶｅｒｏ「応答」細胞を含有する皿の中に置いた。３日間共培養した後、膜インサートを取り除き、そしてＶｅｒｏ細胞のウイルス力価を実施例１において記述するように決定した。
【００４７】
少なくとも５回の独立した共培養実験を実施した。陰性コントロールとして使用する感染していないＭＤＢＫエフェクター細胞もしくはＢＳＲ細胞は、Ｖｅｒｏ応答細胞におけるｗｔ ＢＲＳＶもしくはＮＳ欠失突然変異体の増殖に対して抑制作用を示さなかった。ＢＲＳＶに感染したＭＤＢＫ細胞（ＭＯＩ＝１）との共培養は、ＮＳ欠失突然変異体の弱いが再現性のある抑制をもたらし、一方、ｗｔ ＢＲＳＶの増殖は影響を受けなかった（図４Ｂ）。最も顕著な影響は、ＮＳ１／２二重欠失突然変異体で認められた。この場合、力価は、感染していないＭＤＢＫ細胞と比較した場合に感染したＭＤＢＫの存在下で約７倍減少した。この場合に単一欠失突然変異体ｒＢＲＳＶ ΔＮＳ１及びｒＢＲＳＶ ΔＮＳ２の力価は、それぞれ、２倍及び４倍減少した。
【００４８】
感染していないＭＤＢＫ細胞の上清は、Ｖｅｒｏ応答細胞における欠失突然変異体の増殖に影響を及ぼすことができなかったので、有効なＭＤＢＫ因子は、ウイルス感染により誘導されると推定された。ｗｔ ＢＲＳＶでの感染だけでなく、ｒＢＲＳＶ ΔＮＳ１／２を含む複数のＢＲＳＶ欠失突然変異体並びにＳＨ及びＧ遺伝子を欠失する突然変異体（ｒＢＲＳＶ ΔＳＨ／Ｇ；未公開）でもまた、有効因子の分泌をもたらした。さらに、異なるＲＮＡウイルス、狂犬病ウイルスでの感染もまた、ＭＤＢＫ細胞における有効因子の誘導をもたらすことを示すことができた。これらの結果は、サイトカイン、特にインターフェロンによりもたらされるＶｅｒｏ応答細胞における抗ウイルス状態の誘導を強く示唆した。
【００４９】
関与するサイトカインをさらに詳細に調べるために、ウシマクロファージをエフェクター細胞として使用した。ウシマクロファージは、１，５００ｒｐｍでのフィコール勾配遠心分離（Ｌｙｍｐｈｏｆｌｏｔ，　Ｂｉｏｔｅｓｔ，　Ｄｒｅｉｅｉｃｈ）及び細胞培養フラスコの底への単核細胞画分の吸着を用いてウシ及び仔ウシの血液から単離した。一晩インキュベーション後にＦＣＳなしのＲＰＭＩ（Ｇｉｂｃｏ）で３回洗浄することにより非接着細胞を取り除いた。残っている接着細胞（９０−９５％ ＣＤ１４陽性）を、１０％ ＦＣＳを含有するＲＰＭＩにおいて３７℃及び５％ ＣＯ２でインキュベーションした。単離したウシマクロファージをＬＰＳで一晩刺激し、そして上記のようにＶｅｒｏ細胞と共培養した。
【００５０】
刺激し、ウイルス感染したもしくは刺激していないマクロファージとのインキュベーション後に、全長ｒＢＲＳＶの得られる量は変わらないままであった。しかしながら、ＮＳ欠失突然変異体では、刺激せずそして感染していないマクロファージコントロールと異なり、３０〜５０倍の減少が認められた（図４Ｂ）。後のウイルス感染なしのＬＰＳでのみのマクロファージの刺激もまた、ｒＢＲＳＶ ΔＮＳ１／２における約１０倍の減少をもたらすために十分であった。刺激したマクロファージはＩ型インターフェロンの生産体であることが知られているので、これらの実験は、ＢＲＳＶ ＮＳ欠失突然変異体の増殖を抑制することにおけるＩＦＮアルファ及び／もしくはベータの関与を示す。
実施例５：ＮＳ遺伝子の欠失は、ＢＲＳＶをＩ型インターフェロン感受性にする。
【００５１】
共培養実験において応答細胞として使用するＶｅｒｏ細胞は（実施例４参照）、インターフェロンＩ型受容体アルファサブユニット（ＩＦＮＡＲ２）（４４）を発現することをＦＡＣＳ分析によって示すことができた。感染したＭＤＢＫ細胞もしくはマクロファージにより生産されるＩＦＮアルファ及び／もしくはベータが、ＮＳ欠失突然変異体に対する抑制作用をもたらすかどうかを調べるために、Ｖｅｒｏ応答細胞にｒＢＲＳＶ ΔＮＳ１／２、ｒＢＲＳＶ ΔＮＳ２もしくはｒＢＲＳＶ ΔＮＳ１／２を感染させ、そしてその後にＩＦＮＡＲ２をブロックするモノクローナル抗体（ＰＢＬ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）で処理した。応答細胞の処理は、細胞を５μｇ／ｍｌの中和マウス抗ヒトインターフェロンアルファ／ベータ受容体鎖２（ＣＤ１１８）抗体（ＰＢＬ　Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）またはＴＮＦＲＩもしくはＭＨＣクラスＩ分子を認識する５μｇ／ｍｌのコントロール抗体と１時間インキュベーションすることにより感染後すぐに実施した。細胞を６ウェル皿に希釈した後、細胞を１μｇ／ｍｌのそれぞれの抗体において保ち、そして感染したＭＤＢＫエフェクター細胞の存在下で３日間インキュベーションした。
【００５２】
ＮＳ欠失突然変異体の抑制は、コントロール抗体を含有するかもしくは抗体なしの細胞培養物において認められたが、ＩＦＮＡＲ２抗体で処理した細胞では抑制作用はほとんど完全になくなった（図５）。この結果によって、Ｖｅｒｏ応答細胞における抗ウイルス状態の誘導は、ＭＤＢＫ細胞もしくはマクロファージにより生産されるＩ型インターフェロンにのみ起因すると考えることができる。
【００５３】
次に、ＩＦＮで刺激した細胞におけるｗｔ ＢＲＳＶ及びＢＲＳＶ突然変異体の性質を直接分析するために組換えヒトＩ型インターフェロンを用いた。ＢＲＳＶ及びＮＳ欠失突然変異体の複製に対するＩ型インターフェロンの影響を調べるために、ＶｅｒｏもしくはＭＤＢＫ細胞に異なるウイルスを上記のように０．１のＭＯＩで感染させ、そして２．５％ ＦＣＳを含有するＤＭＥＭにおいて６ウェル皿に接種した。接種した後に組換えユニバーサルＩ型インターフェロン（ヒトインターフェロンアルファＡ／Ｄ）もしくはヒトインターフェロンベータ（ＰＢＬ　Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を１５，０００Ｕ／ｍｌの濃度まで直接加えた。３日のインキュベーション期間の後に希釈シリーズ及びＦ融合タンパク質に対する抗体での感染細胞の間接染色によりウイルス力価を決定した。
【００５４】
全ての３種のＮＳ欠失突然変異体は、ＩＦＮで誘導される細胞応答に対する非常に同様のそして用量に依存する感受性を示し、ここで、１，５００Ｕは、感染力価における約１０，０００倍の減少をもたらした（図６）。一方、ｗｔ ＢＲＳＶは、ＩＦＮ処理に対して比較的抵抗性であった。しかしながら、防御は完全ではなく、１，５００ＵのＩＦＮアルファもしくはＩＦＮベータは、約１３倍の減少をもたらした。
【００５５】
ウシ細胞におけるｗｔ ＢＲＳＶの防御は、Ｖｅｒｏ霊長類細胞系におけるより顕著である可能性を評価するために、平行実験においてＭＤＢＫ及びＶｅｒｏ細胞に１のＭＯＩで感染させ、そして同じ量のＩＦＮを加えた。未処理のＭＤＢＫ及びＶｅｒｏ細胞において、ＢＲＳＶは、それぞれ、１．７ｘ１０７及び４ｘ１０６ｐｆｕ／ｍｌの同じ力価まで増殖した（図７）。ＩＦＮ処理で、Ｖｅｒｏ細胞における力価はＭＤＢＫ細胞におけるより速く減少した。１０，０００ＵのＩＦＮの添加後に、ＭＤＢＫ細胞はすでにかなりの細胞損傷を示したが、Ｖｅｒｏ細胞における感染力価は、ＭＤＢＫ細胞におけるものより５５５倍低かった。ＮＳ欠失突然変異体の強い抑制は、ＭＤＢＫ細胞の抗ウイルス応答がＶｅｒｏ細胞のものと少なくとも同じ強さを有することを示した。従って、ＭＤＢＫ細胞におけるｗｔ ＢＲＳＶの高い防御は、ＢＲＳＶがウシ細胞の抗ウイルス応答に霊長類細胞のものより効率よく対処することを示唆する。
実施例６：ＢＲＳＶ ＮＳ１及びＮＳ２は一緒になって、ＩＦＮを介した抗ウイルス応答に対する狂犬病ウイルスの抵抗性を高める。
【００５６】
ＢＲＳＶの各ＮＳ遺伝子の欠失は、ＩＦＮを介した細胞応答に対するほぼ同程度の感受性もたらした。これは、抗ウイルス機構に対抗するために両方のＮＳタンパク質が必要とされることを示唆する。ＮＳ１及びＮＳ２の絶対的協同機能を確かめるため、そして非関連ウイルスの防御に２種のＮＳタンパク質を使用できるかをどうか明らかにするために、ＮＳ１（ＳＡＤ　ＶＢ−ＮＳ１）もしくはＮＳ２（ＳＡＤ　ＶＢ−ＮＳ２）のいずれかを発現する組換え狂犬病ウイルスを開発した。追加のＮＳ１もしくはＮＳ２遺伝子を含有する組換えＲＶ（図１）は、Ｇ遺伝子の３’非コーディング配列内に追加の転写終止及び再開配列を含んでなる全長ＲＶ ｃＤＮＡ（ＳＡＤ Ｌ１６）（ＳＡＤ ＶＢ）（３２）に基づいて構築した。追加の遺伝子は、他の遺伝子ですでに成功している方法である（１２；３９）、弱毒化狂犬病ウイルスＳＡＤ Ｌ１６のＧ及びＬ遺伝子の間に導入した（図１Ｂ）。最初に、Ｃ末端タンパク質標識を有するＢＲＳＶ ＮＳ１もしくはＮＳ２タンパク質のバージョンを含むｃＤＮＡを構築した。ＮＳ１終止コドンの直前にインフルエンザ赤血球凝集素（ＨＡ）タンパク質の内部領域に対応する追加の２７ヌクレオチドをリバースプライマーＮＳ１ＨＡｒ−ＥｃｏＲＩ（５’−ＧＣＡＡＴＡＧＡＡＴＴＣＣＴＡＡＧＣＧＴＡＡＴＣＴＧＧＴＡＣＡＴＣＡＴＡＡＧＧＡＴＡＡＴＴＣＡＧＡＣＣＡＡＧＡＡＧＡＧＴ−３’）（ＥｃｏＲＩ制限部位を含有する；下線を施す）を用いてＰＣＲにより導入した。ＮＳ２の場合には、合成ＦＬＡＧペプチドに対応する２４ヌクレオチドをリバースプライマーＮＳ２ＦＬｒ−ＥｃｏＲＩ（５’−ＧＣＡＡＴＡＧＡＡＴＴＣＣＴＡＴＴＴＡＴＣＧＴＣＡＴＣＡＴＣＴＴＴＡＴＡＡＴ−ＣＴＧＧＡＴＴＴＡＡＡＴＣＡＴＡＣＴＴＡＴＡ−３’）（ＥｃｏＲＩに下線を施す）を用いて導入した。全長ＢＲＳＶ ｃＤＮＡ（５）のｎｔ１〜ｎｔ９５７を含有するプラスミド（ｐＢＳＢＲＳＶＮＳ１ＮＳ２）の対応する配列を置換するためにこれらのＰＣＲフラグメントを用いた。ＮＳ１−ＨＡ遺伝子をＮｏｔＩ及びＥｃｏＲＩで切り出した。クレノウポリメラーゼでの充填反応後に、４７５ｎｔフラグメントを追加の転写開始シグナルのすぐ下流のｐＳＡＤ ＶＢの唯一のＳｍａＩ部位に導入した。これによりｐＳＡＤ ＶＢ−ＮＳ１ＨＡを得た。４７０ｎｔのＮＳ２−ＦＬフラグメントは、ＡｓｅＩ及びＥｃｏＲＩで切り出しそしてクレノウポリメラーゼで充填した後に同様にクローン化し、ｐＳＡＤ ＶＢ−ＮＳ２ＦＬを得た。
【００５７】
ＮＳ１もしくはＮＳ２遺伝子のいずれかを有する組換えＲＶは、それぞれのウイルスｃＤＮＡ（１０μｇ）を有するＴ７プロモーター制御プラスミドのトランスフェクション（ＣａＰＯ４プロトコル；哺乳動物トランスフェクションキット、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）後に以前に記述されているようにして得た（１９）。ファージＴ７ ＲＮＡポリメラーゼを安定に発現する約１０６のＢＳＲ Ｔ７／５細胞にＲＶタンパク質Ｎ（ｐＴＩＴＢ−Ｎ、５　μｇ）、Ｐ及びＬ（ｐＴＩＴＢ−Ｐ及びｐＴＩＴＢ−Ｌ、プラスミド当たり２．５μｇ）をコードするプラスミドをそれぞれのウイルスｃＤＮＡと共トランスフェクションした（５）。４時間後に、トランスフェクション培地を取り除き、そして１０％ ＦＣＳを含有するＢＨＫ−２１培地（Ｇｉｂｃｏ）で置換した。トランスフェクションの６日後に細胞培養上清を採取し、そして新しいＢＳＲ細胞に加えた。感染性ＲＶの検出は、ＲＶ核タンパク質Ｎを認識するＦＩＴＣコンジュゲート（Ｃｅｎｔｏｃｏｒ）を用いる免疫染色により実施した。
【００５８】
トランスフェクションしたプラスミドからＮ、Ｐ及びＬ ＲＶタンパク質を発現するＢＳＲ Ｔ７／５細胞においてｃＤＮＡから組換え体を得ることができた。ＮＳタンパク質の発現は、明らかに、ＢＳＲ細胞における組換え体の複製、増殖特性及び感染力価に対して不都合な影響がなかった（示さない）。
【００５９】
発現されるＢＲＳＶタンパク質の活性を調べるために、Ｖｅｒｏ細胞に親ＲＶ（ＳＡＤ ＶＢ）もしくは組換え体の各々を個々に感染させるか、または２種の組換え体ＳＡＤ ＶＢ−ＮＳ１及びＳＡＤ ＶＢ−ＮＳ２を共感染させた。組換え体ＲＶ ＳＡＤ ＶＢ、ＳＡＤ ＶＢ−ＮＳ１及びＳＡＤ ＶＢ−ＮＳ２での感染は、それぞれ、５のＭＯＩを用いて懸濁して以前に記述されているように実施した（１８）。ＳＡＤ ＶＢ−ＮＳ１及びＳＡＤ ＶＢ−ＮＳ２での共感染には、各組換え体に２．５のＭＯＩを用いた。組換えユニバーサルＩ型インターフェロンＡ／Ｄを細胞の希釈後に直接５００Ｕ／ｍｌの濃度まで加えた。感染の２日後に希釈シリーズ及びＲＶタンパク質Ｎに対して向けられるＦＩＴＣコンジュゲート（Ｃｅｎｔｏｃｏｒ）での免疫染色によりウイルス力価を決定した。さらに、感染の２日後にＲＶタンパク質の発現を少なくとも４回の独立した実験において調べた。
【００６０】
単一感染の親ＲＶ ＳＡＤ ＶＢ及びＮＳ１もしくはＮＳ２タンパク質を発現するウイルスの増殖は同程度に影響を受けた（図８Ａ）。５０ＩＵのＩＦＮアルファを添加すると力価は約１ｌｏｇ減少し、そして次に増加する量のＩＦＮに従ってさらに非常にゆっくりと減少した。これは、Ｖｅｒｏ細胞の弱いＩＦＮ応答もしくはＶｅｒｏ細胞におけるＩＦＮを介した応答に対するＲＶの高い固有の抵抗性を示す。しかしながら、ＮＳ１及びＮＳ２を発現するウイルスで共トランスフェクションした細胞では、ウイルス複製の防御を示すことができた。ウイルス力価は、単一感染におけるより有意に高いままであり、そして用量に依存して単にゆっくりと減少した。
【００６１】
ＢＲＳＶのＮＳタンパク質は、ウシ細胞の抗ウイルス応答をＶｅｒｏ細胞のものより効率よく阻止できるという上記の結果を再評価するために、実験をＭＤＢＫ細胞において同時に実施した（図８Ｂ）。基準ＲＶ ＳＡＤ ＶＢ及びＮＳを発現する組換え体は、未処理のＭＤＢＫ細胞においてＶｅｒｏ細胞におけるよりわずかに低い力価まで複製した。Ｖｅｒｏ細胞と異なり、ＩＦＮ処理は、ｗｔ ＲＶ及びＮＳを発現するウイルスの単一感染の感染力価をかなり減少した。感染力価の３ｌｏｇ段階の即座の減少は、非常に効率のよいＩＦＮを介した細胞応答を示した。しかしながら、この応答にもかかわらず、ＳＡＤ ＶＢ−ＮＳ１及びＳＡＤ ＶＢ−ＮＳ２で共トランスフェクションした細胞では、ウイルス複製は、加える１５０ＩＵのＩＦＮの量まで完全に防御された。これらの結果は、ＲＶタンパク質合成の分析により確かめることができた。未処理の細胞では、全ての組換え体は同様の量のＲＶタンパク質を生産し、一方、ＩＦＮで処理した細胞では、共感染のみが１５０−２００ＩＵより多くの添加までかなりのタンパク質合成を行うことができた（示さない）。
【００６２】
上記の結果は、両方のＢＲＳＶ ＮＳタンパク質が、ＩＦＮを介した抗ウイルス応答への抵抗性をＢＲＳＶだけでなく別の非関連ウイルスにも与えることができることを示す。さらに、これらの結果は、両方のＮＳタンパク質が、ＩＦＮ拮抗作用を出すために必要且つ十分であることを裏付ける。
実施例７：ヒトＲＳＶ（ＨＲＳＶ）の臨床単離株のインターフェロン抵抗性
ＨＲＳＶもまたインターフェロンに対する防御機構を有することを示すために、入院患者の離床単離株で実験を実施した。単離株は、ＢｏｃｈｕｍのＲｕｈｒ　ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙのＷｅｒｃｈａｕ教授によって調整されるマルチセンター研究から得られた。４種の単離株は、「細気管支炎」と診断されたためにＧｅｒｍａｎ病院において処置される患者から得られ（＃６１；＃８６；＃１０９及び＃１１０；１群）、そして３種の単離株は、「閉塞性気管支炎」と診断された患者から得られた（＃１０４；＃１１２及び＃１６２；２群）。
【００６３】
細胞系へのこれらの臨床単離株の適応を防ぐためにそれらを２回の継代の間Ｈｅｐ２細胞上で増やし、そして後の実験に用いた。これらの単離株の増殖曲線をＨｅｐ２細胞で決定した。１群の単離株＃６１；＃８６；及び＃１０９並びに２群の単離株＃１１２は、Ｈｅｐ２細胞において迅速に増殖し、そして３日後に３ｘ１０６〜４ｘ１０７ｐｆｕ／ｍｌの間の同様に高い感染力価に達したが、１群の単離株＃１１０並びに２群の＃１０４及び＃１６２は明らかに増殖が減少し、そして３日後に３ｘ１０４ｐｆｕ／ｍｌのみの力価に達しただけであった（図９）。増殖におけるこれらの違いはまた、一次気道上皮細胞においても認められ：＃６１；＃８６；＃１０９及び＃１１２はシンシチウムの形成を明らかに誘導したが、同じ感染期間の後に単離株＃１１０、＃１０４及び＃１６２では単一細胞感染のみを検出することができた（示さない）。
【００６４】
個々の単離株のインターフェロン抵抗性を決定するために、Ｈｅｐ２細胞に異なる単離株を１時間感染させ（ＭＯＩ＝０．１）、そして次に組換えＩ型インターフェロンＡ／Ｄを１５０〜５，０００Ｕ／ｍｌの濃度で加えた。７２時間のインキュベーション期間の後、個々の臨床単離株のウイルス力価を終点滴定によって決定した。これに関して、全ての臨床ＨＲＳＶ単離株は、それらの増殖速度にかかわらず、組換えＩ型ＩＦＮの抗ウイルス作用から防御されることが認められた。５，０００Ｕ／ｍｌの非常に高いＩＦＮ濃度でのみ、異なる臨床ＨＲＳＶ単離株の複製能力は１０倍のみ減少した（図１０）。これらのデータは、全ての臨床ＨＲＳＶ単離株が高濃度の組換えＩ型ＩＦＮの抗ウイルス作用に対抗でき、そしてこれがＨＲＳＶ実験室株Ｌｏｎｇと少なくとも同程度であることを示す（図７参照）。
【００６５】
単離株のＮＳ１及びＮＳ２遺伝子をＲＴ−ＰＣＲにより増幅し、そしてそれらの配列を決定した。両方の遺伝子は非常に保存されていることが立証され、ＩＦＮアッセイの結果を裏付けた。ＮＳ１及びＮＳ２タンパク質の両方で、ＨＲＳＶ Ｌｏｎｇ株に比較してそして単離株間でアミノ酸配列におけるほんのわずかな違いのみが存在した。ＨＲＳＶ ＬｏｎｇのＮＳ２タンパク質並びに臨床単離株＃１０４、１１２、６１及び１１０のＮＳ１タンパク質は同一である。単離株＃１６２、８６及び１０９の各々は、ＨＲＳＶ Ｌｏｎｇ配列に対して１個のアミノ酸置換を含有した（＃８６：Ｎ（７６）Ｓ、＃１６２：Ｖ（８２）Ｍ、＃１０９：Ｅ（９１）Ｇ）。全ての臨床単離株のＮＳ２タンパク質はそれらのアミノ酸配列において同一であり、そしてＨＲＳＶ Ｌｏｎｇと２置換により異なる、ＤＮ（７，８）ＧＴ及びＴ（２１）Ｉ。従って、ＨＲＳＶ ＬｏｎｇのＮＳタンパク質及び遺伝子を、それぞれ、さらなる実験に使用した。
実施例８：ヒトＲＳＶ（ＨＲＳＶ）のＮＳ１及びＮＳ２は一緒になって、ＩＦＮを介した抗ウイルス応答に対する狂犬病ウイルスの抵抗性を高める。
【００６６】
ＨＲＳＶの両方のＮＳタンパク質がＩＦＮ Ｉ型拮抗作用を有すること及びこの機能を別の非関連ウイルスに導入できることを示すために、ＨＲＳＶ（Ｌｏｎｇ株）のＮＳ１（ＳＡＤ ＶＢ−ｈＮＳ１）もしくはＮＳ２（ＳＡＤ ＶＢ−ｈＮＳ２）のいずれかを発現する組換え狂犬病ウイルスを開発した。追加のＮＳ１もしくはＮＳ２遺伝子を有する組換えＲＶ（図１１）は、Ｇ遺伝子の３’非コーディング配列中に追加の転写終止及び再開配列を含有する全長ＲＶ ｃＤＮＡ（ＳＡＤ Ｌ１６）（ＳＡＤ ＶＢ）（３２）に基づいて構築した。追加の遺伝子は、ＢＲＳＶのＮＳ遺伝子についてすでに記述しているように弱毒化狂犬病ウイルスＳＡＤ Ｌ１６のＧ及びＬ遺伝子の間に導入した（図１Ｂ）。２種のＨＲＳＶ遺伝子のｃＤＮＡはＲＴ−ＰＣＲによって得た。この目的のために、ＨＲＳＶ（Ｌｏｎｇ）に感染したＶｅｒｏ細胞から全ＲＮＡを単離した。ＮＳ１遺伝子には、以下のプライマー：ｈＮＳ１−ＮｃｏＩ５’（５’−ＡＴＴ　ＧＡＣ　ＣＡＴ　ＧＧＧ　ＣＡＧ　ＣＡＡ　ＴＴＣ　ＡＴＴ−３’；第一鎖合成及びＰＣＲ）及びｈＮＳ１−ＥｃｏＲＩ５’（５’−ＡＴＴ　ＧＡＧ　ＡＡＴ　ＴＣＴ　ＴＡＴ　ＧＧＡ　ＴＴＡ　ＡＧＡ　ＴＣＡ　ＡＡ−３’）、ＮＳ２遺伝子には、プライマーｈＮＳ２−ＮｃｏＩ５’（５’−ＡＴＴ　ＧＡＣ　ＣＡＴ　ＧＧＡ　ＣＡＣ　ＡＡＣ　ＣＣＡ　ＣＡ−３’）及びｈＮＳ２−ＥｃｏＲＩ３’（５’−ＡＴＴ　ＧＡＧ　ＡＡＴ　ＴＣＴ　ＴＡＴ　ＧＧＡ　ＴＴＧ　ＡＧＡ　ＴＣＡ　ＴＡ−３’）を用いた。ＮｏｔＩ及びＥｃｏＲＩ制限酵素での消化後に、これらのＰＣＲフラグメントを同じように切断したＴＩＴプラスミドにクローン化した（ｐＴＩＴ−ｈＮＳ１、ｐＴＩＴ−ｈＮＳ２）。次に、ＮＳ１遺伝子をｐＴＩＴ−ｈＮＳ１からプライマーｈＮＳ１−Ｎｏｔ５’（５’−ＴＡＴ　ＧＡＡ　ＧＣＧ　ＧＣＣ　ＧＣＣ　ＣＣＣ　ＴＣＴ　ＣＴＴ　ＣＴＴ　ＴＣＴ　ＡＣＡ　ＧＡＡ　ＡＡＴ　ＧＧＧ　ＣＡＧ　ＣＡＡ　ＴＴＣ　ＡＴＴ　ＧＡＧ−３’）及びｈＮＳ１−ＥｃｏＲＩ３’でのＰＣＲを用いて増幅し、そしてＮｏｔＩ及びＥｃｏＲＩ制限酵素で消化した。クレノウポリメラーゼでの充填反応後に、フラグメントを追加の転写開始シグナルのすぐ下流のｐＳＡＤ ＶＢの唯一のＳｍａＩ部位に導入した。これによりｐＳＡＤ ＶＢ−ｈＮＳ１を得た。ＮＳ２遺伝子は、ｐＴＩＴ−ｈＮＳ２からプライマーｈＮＳ２−ＡｓｅＩ５’（５’−ＡＴＡ　ＣＴＴ　ＡＴＴ　ＡＡＴ　ＴＧＧ　ＧＧＣ　ＡＡＡ　ＴＡＡ　ＡＴＣ　ＡＧＴ　ＴＣＣ　ＣＣＡ　ＡＣＣ　ＡＧＣ　ＣＡＴ　ＧＧＡ　ＣＡＣ　ＡＡＣ　ＣＣＡ　ＣＡＡ　ＴＧ−３’）及びｈＮＳ２−Ａｃｃ６５１３’（５’−ＡＴＡ　ＡＡＴ　ＧＧＴ　ＡＣＣ　ＡＡＡ　ＡＧＡ　ＴＡＡ　ＣＡＣ　ＴＧＴ　ＧＴＧ　ＡＡＴ　ＴＡＡ　ＡＴＴ　ＴＴＧ　ＡＡＡ　ＡＧＴ　ＧＣＴ　ＴＡＴ　ＧＧＡ　ＴＴＧ　ＡＧＡ　ＴＣＡ　ＴＡＣ　ＴＴＧ−３’）を用いて増幅し、ＡｓｅＩ及びＥｃｏＲＩで消化し、そしてクレノウポリメラーゼで充填した後にｈＮＳ１遺伝子と同様にクローン化した。これによりｐＳＡＤ ＶＢ−ｈＮＳ２を得た（図１１）。
【００６７】
ＨＲＳＶのＮＳ１もしくはＮＳ２遺伝子のいずれかを含有する組換えＲＶは、それぞれのウイルスｃＤＮＡ（１０μｇ）を用いるＴ７プロモーター制御プラスミドのトランスフェクション（ＣａＰＯ４プロトコル；哺乳動物トランスフェクションキット、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）後に以前に記述されているようにして得た（１９）。ファージＴ７ ＲＮＡポリメラーゼを安定に発現する約１０６のＢＳＲ Ｔ７／５細胞にＲＶタンパク質Ｎ（ｐＴＩＴＢ−Ｎ、５　μｇ）、Ｐ及びＬ（ｐＴＩＴＢ−Ｐ及びｐＴＩＴＢ−Ｌ、各プラスミド当たり２．５μｇ）をコードするプラスミドをそれぞれのウイルスｃＤＮＡと共トランスフェクションした（５）。４時間後に、トランスフェクション培地を取り除き、そして１０％ ＦＣＳを含有するＢＨＫ−２１培地（Ｇｉｂｃｏ）で置換した。トランスフェクションの６日後に細胞培養上清を採取し、そして新しいＢＳＲ細胞に加えた。感染性ＲＶの検出は、ＲＶ核タンパク質Ｎを認識するＦＩＴＣコンジュゲート（Ｃｅｎｔｏｃｏｒ）を用いる免疫染色により実施した。ＨＲＳＶ ＮＳタンパク質の発現は、明らかに、ＢＳＲ細胞における組換えＲＶの複製、増殖特性及び感染力価に関して不都合な影響がなかった（示さない）。
【００６８】
発現されるＨＲＳＶタンパク質の活性を調べるために、ＭＤＢＫ細胞に親ＲＶ（ＳＡＤ ＶＢ）もしくは個々の組換え体の各々を感染させるか、または２種の組換え体ＳＡＤ ＶＢ−ｈＮＳ１及びＳＡＤ ＶＢ−ｈＮＳ２を共感染させた。組換え体ＲＶ ＳＡＤ ＶＢ、ＳＡＤ ＶＢ−ｈＮＳ１及びＳＡＤ ＶＢ−ｈＮＳ２での感染は、それぞれ、５のＭＯＩを用いて懸濁してすでに記述されているように実施した（１８）。ＳＡＤ ＶＢ−ｈＮＳ１及びＳＡＤ ＶＢ−ｈＮＳ２での共感染には、各組換え体に２．５のＭＯＩを用いた。組換えユニバーサルＩ型インターフェロンＡ／Ｄを細胞の希釈後に直接５０−５００Ｕ／ｍｌの濃度で加えた。感染の２日後に希釈シリーズ及びＮ ＲＶタンパク質に対して向けられるＦＩＴＣコンジュゲート（Ｃｅｎｔｏｃｏｒ）での免疫染色によりウイルス力価を決定した。ＩＦＮ処理は、ｗｔ ＲＶ及びｈＮＳを発現するウイルスの単一感染の感染力価を明らかに減少した。５０Ｕ ＩＵのみのＩＦＮアルファの添加は、３次数の大きさの感染力価の減少をもたらした。しかしながら、ＳＡＤ ＶＢ−ｈＮＳ１及びＳＡＤ ＶＢ−ｈＮＳ２を共感染させた細胞では、ウイルス複製は、加える１５０ＩＵ ＩＦＮの量まで明らかに防御された（図１１）。
【００６９】
これらの結果は、２種のＨＲＳＶ ＮＳタンパク質もまた、ＩＦＮに対する細胞応答に拮抗することができ、そして非関連ウイルスをＩＦＮを介した抗ウイルス応答に対して抵抗性にすることができることを示す。さらに、これらの結果は、両方のＮＳタンパク質が、ＩＦＮ拮抗活性を出すために必要且つ十分であることを裏付ける
実施例９：マウス肺炎ウイルス（マウスの肺炎ウイルス；ＰＶＭ）のＮＳ１及びＮＳ２タンパク質は一緒になって、ＩＦＮを介した抗ウイルス応答に対する狂犬病ウイルスの抵抗性を高める。
【００７０】
ＰＶＭの２種のＮＳタンパク質もまた ＩＦＮ Ｉ型抵抗性をもたらすこと及びこの機能を狂犬病ウイルスに導入できることを示すために、ＰＶＭのＮＳ１（ＳＡＤ　ＶＢ−ｍＮＳ１）もしくはＮＳ２（ＳＡＤ　ＶＢ−ｍＮＳ２）のいずれかを発現する組換え狂犬病ウイルスを開発した。２種のＰＶＭ遺伝子のｃＤＮＡは、Ａｎｄｒｅｗ　Ｅａｓｔｏｎ；Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｗａｒｗｉｃｋ，Ｕ．Ｋ．によって親切にも提供された。（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｄ１０３３１；図１８）。追加のＮＳ１もしくはＮＳ２遺伝子を有する組換えＲＶ（図１１）もまた、ＳＡＤ ＶＢに基づいて構築した（３２；実施例６及び８を参照）。追加の遺伝子は、ＢＲＳＶのＮＳ遺伝子についてすでに上に記述したようにＲＶ ＳＡＤ Ｌ１６のＧ及びＬ遺伝子の間に導入した（図１Ｂ）。２種のＮＳタンパク質の遺伝子はＰＣＲによって増幅し、ＮＳ１遺伝子には翻訳終止コドンの直前にインフルエンザ赤血球凝集素（ＨＡ）タンパク質の内部領域（ＨＡ標識）をコードする２７個の追加のヌクレオチドを導入した。ＮＳ２遺伝子の終止コドンのすぐ上流には、合成ＦＬＡＧペプチド（ＦＬＡＧ標識）をコードする２４ヌクレオチドを導入した。ＰＶＭのＮＳ１遺伝子には、以下のプライマー：ｍＮＳ１−ＮｏｔＩＥｃｏＲＶ５’（５’−ＡＡＴ　ＧＡＴ　ＡＴＣ　ＧＣＧ　ＧＣＣ　ＧＣＣ　ＣＣＣ　ＴＣＴ　ＣＴＴ　ＣＴＴ　ＴＣＴ　ＡＣＡ　ＧＡＡ　ＡＴＧ　ＧＧＣ　ＴＧＴ　ＡＡＴ　ＧＴＧ　ＡＴＧ　ＡＴＧ−３’）及びｍＮＳ１ｈａ−ＥｃｏＲＩ／Ｖ３’（５’−ＡＡＴ　ＧＡＴ　ＡＴＣ　ＧＡＡ　ＴＴＣ　ＴＴＡ　ＡＧＣ　ＧＴＡ　ＡＴＣ　ＧＧ　ＴＡＣ　ＡＴＣ　ＡＴＡ　ＡＧＧ　ＡＴＡ　ＡＣＣ　ＡＣＴ　ＧＡＴ　ＣＡＧ　ＣＴＣ　ＴＡＣ−３’）、ＰＶＭのＮＳ２遺伝子には、プライマーｍＮＳ２−ＡｓｅＩＥｃｏＲＶ５’（５’−ＡＡＴ　ＧＡＴ　ＡＴＣ　ＡＴＴ　ＡＡＴ　ＴＧＧ　ＧＧＣ　ＡＡＡ　ＴＡＡ　ＡＴＣ　ＡＧＴ　ＴＣＣ　ＣＣＡ　ＡＣＣ　ＡＧＣ　ＣＡＴ　ＧＴＣ　ＣＡＣ　ＡＧＣ　ＴＡＴ　ＧＡＡ　ＣＡＡ　Ｇ−３’）及びｍＮＳ２ｆｌ−ＥｃｏＲＩ／Ｖ３’（５’−ＡＡＴ　ＧＡＴ　ＡＴＣ　ＧＡＡ　ＴＴＣ　ＴＣＡ　ＴＴＴ　ＡＴＣ　ＧＴＣ　ＡＴＣ　ＡＴＣ　ＴＴＴ　ＡＴＡ　ＧＴＣ　ＡＴＣ　ＡＴＣ　ＡＴＣ　ＣＴＣ　ＡＴＣ−３’）を用いた。制限酵素ＥｃｏＲＶでの消化後に、これらのＰＣＲフラグメントを次に追加の転写開始シグナルのすぐ下流のｐＳＡＤ ＶＢの唯一のＳｍａＩ部位に導入した。これによりｐＳＡＤ ＶＢ−ｍＮＳ１及びｐＳＡＤ ＶＢ−ｍＮＳ２を得た（図１１）。
【００７１】
ＰＶＭのＮＳ１もしくはＮＳ２遺伝子のいずれかを含有する組換えＲＶは、実施例６及び８においてすでに記述しているようにトランスフェクションしたプラスミドからＲＶタンパク質Ｎ、Ｐ及びＬを発現するＢＳＲ Ｔ７／５細胞において得た。ＮＳタンパク質の発現は、明らかに、ＢＳＲ細胞における組換え体の複製、増殖特性及び感染力価に関して不都合な影響がなかった（示さない）。
【００７２】
発現されるＰＶＭタンパク質の活性を評価するために、ＭＤＢＫ細胞に親ＲＶ（ＳＡＤ ＶＢ）もしくは個々の組換え体の各々を感染させるか、または２種の組換え体ＳＡＤ ＶＢ−ｍＮＳ１及びＳＡＤ ＶＢ−ｍＮＳ２を共感染させた。組換え体ＲＶ ＳＡＤ ＶＢ、ＳＡＤ ＶＢ−ｍＮＳ１及びＳＡＤ ＶＢ−ｍＮＳ２での感染は、それぞれ、５のＭＯＩを用いて懸濁してすでに記述されているように実施した（１８）。ＳＡＤ ＶＢ−ｍＮＳ１及びＳＡＤ ＶＢ−ｍＮＳ２での共感染には、各組換え体に２．５のＭＯＩを用いた。組換えユニバーサルＩ型インターフェロンＡ／Ｄを細胞の希釈後に直接５０−５００Ｕ／ｍｌの濃度で加えた。感染の２日後に希釈シリーズ及びＮ ＲＶタンパク質に対して向けられるＦＩＴＣコンジュゲート（Ｃｅｎｔｏｃｏｒ）を用いる免疫染色によりウイルス力価を決定した。ＩＦＮ処理は、ｗｔ ＲＶ及びｈＮＳを発現するウイルスの単一感染の感染力価を明らかに減少した。しかしながら、ＳＡＤ ＶＢ−ｍＮＳ１及びＳＡＤ ＶＢ−ｍＮＳ２を共感染させた細胞では、ウイルス複製は、加える１００ＩＵ ＩＦＮの量まで明らかに防御された（図１３）。
【００７３】
これらの結果は、２種のＰＶＭ ＮＳタンパク質もまた、ＩＦＮに対する細胞応答に拮抗することができ、そして非関連ウイルスをＩＦＮを介した抗ウイルス応答に対して抵抗性にすることができることを示す。ＨＲＳＶのＮＳタンパク質に対するＰＶＭ ＮＳタンパク質の相同性は１７％（ＮＳ１について）及び２０％（ＮＳ２について）のみであるので、ＩＦＮ拮抗機能は予測できなかった。ＢＲＳＶ及びＨＲＳＶのＮＳタンパク質ですでに認められているように、ＰＶＭの場合においてもまた、両方のＮＳタンパク質は、ＩＦＮ拮抗活性を出すために必要且つ十分である。
実施例１０：異種起源のＮＳ遺伝子を保有する組換えＢＲＳＶの製造
ＢＲＳＶ自体の遺伝子を他の肺炎ウイルスからのＮＳ遺伝子で置換することにより組換えキメラＢＲＳＶをさらに構築した。
【００７４】
ＢＲＳＶ ＮＳ１遺伝子の代わりにＨＲＳＶもしくはＰＶＭのＮＳ１遺伝子を含有する組換えＢＲＳＶの製造のために全長ＢＲＳＶ ｃＤＮＡ（５）のｎｔ１〜９５７を含有しそしてさらにｎｔ３１１でＮＳ１遺伝子中にＥｃｏＲＩ制限部位を有するプラスミドを用いた（ｐｂＮＳ１ＥｃｏＲＩｂＮＳ２）。このようにしてＮＳ２遺伝子の完全なコーディング領域をＮｏｔＩ及びＥｃｏＲＩ制限酵素での消化により取り除くことができる。ＨＲＳＶ及びＰＶＭ ＮＳ１遺伝子は、ＨＲＳＶ ＮＳ１にはプライマーｈＮＳ１−ＮｏｔＩ５’及びｈＮＳ１−ＥｃｏＲＩ３’、そしてＰＶＭ ＮＳ１にはｍＮＳ１−ＮｏｔＩＥｃｏＲＶ５’及びｍＮＳ１ｈａ−ＥｃｏＲＩ３’を用いてＰＣＲによって増幅し、そしてＮｏｔＩ及びＥｃｏＲＩ制限酵素での消化後にプラスミドに導入し、ｐｈＮＳ１ｂＮＳ２及びｐｍＮＳ１ｂＮＳ２を得た。その後、両方のプラスミドをＮｏｔＩ及びＡｃｃＩで消化し、そしてｈＮＳ１ｂＮＳ２では１０９４ｎｔの長さ、そしてｍＮＳ１ｂＮＳ２では１０４３ｎｔの長さの生成フラグメントをそれぞれ全長ＢＲＳＶ ｃＤＮＡに挿入した。これによりｒＢＲＳＶ ｈＮＳ１ｂＮＳ２及びｒＢＲＳＶ ｍＮＳ１ｂＮＳ２を得た（図１４）。
【００７５】
異種起源のＮＳ２遺伝子を保有するＢＲＳＶ（ｒＢＲＳＶ ｂＮＳ１ｈＮＳ２及びｒＢＲＳＶ ｂＮＳ１ｍＮＳ２）の製造のために、ｐＮＳ１ＮＳ２（５）を最初に制限酵素Ａｃｃ６５Ｉで、次に部分的に制限酵素ＡｓｅＩで切断し、ｂＮＳ２遺伝子を含んでなる４４６ｎｔのフラグメントを切り出した。次にこの部位に、ｈＮＳ２もしくはｍＮＳ２遺伝子を含有するフラグメントをそれぞれ導入した。これらのフラグメントは、　ＨＲＳＶ ＮＳ２遺伝子にはプライマーｈＮＳ２−ＡｓｅＩ５’及びｈＮＳ２−Ａｃｃ６５Ｉ３’、もしくはＰＶＭ ＮＳ２遺伝子にはｍＮＳ２−ＡｓｅＩＥｃｏＲＶ５’及びｍＮＳ２−Ａｃｃ６５Ｉ３’（５’−ＡＴＡ　ＡＡＴ　ＧＧＴ　ＡＣＣ　ＡＡＡ　ＡＧＡ　ＴＡＡ　ＣＡＣ　ＴＧＴ　ＧＴＧ　ＡＡＴ　ＴＡＡ　ＡＴＴ　ＴＴＧ　ＡＡＡ　ＡＧＴ　ＧＣＴ　ＣＡＴ　ＴＴＡ　ＴＣＧ　ＴＣＡ　ＴＣＡ　ＴＣＴ　ＴＴＡ　ＴＡＧ−３’）を用いてＰＣＲにより作製した。続いて、フラグメントを制限酵素ＡｓｅＩ及びＡｃｃ６５Ｉで消化し、そしてｐＮＳ１ＮＳ２に導入し、ｐｂＮＳ１ｈＮＳ２及びｐｂＮＳ１ｍＮＳ２を得た。次にこれらのプラスミドを制限酵素ＮｏｔＩ及びＡｃｃ６５Ｉで消化し、そして生成フラグメント（ｂＮＳ１ｈＮＳ２では９４９ｎｔ、そしてｂＮＳ１ｍＮＳ２では１０６９ｎｔ）を全長ＢＲＳＶ ｃＤＮＡに挿入し、ｒＢＲＳＶ ｂＮＳ１ｈＮＳ２及びｒＢＲＳＶ ｂＮＳ１ｍＮＳ２を得た（図１４）。
【００７６】
ＨＲＳＶ及びＰＶＭの両方のＮＳ遺伝子をそれぞれ含有する組換えＢＲＳＶの製造のために、プラスミドｐｈＮＳ１ｂＮＳ２及びｐｍＮＳ１ｂＮＳ２を最初に制限酵素Ａｃｃ６５Ｉで、次に部分的に制限酵素ＡｓｅＩで切断した。その後、ＨＲＳＶ ＮＳ２遺伝子及びＰＶＭ ＮＳ２遺伝子の上記のフラグメントをそれぞれのプラスミドに導入し、ｐｈＮＳ１ｈＮＳ２及びｐｍＮＳ１ｍＮＳ２を得た。これらのプラスミドもまた制限酵素ＮｏｔＩ及びＡｃｃ６５Ｉで消化し、そしてｈＮＳ１ｈＮＳ２では１０９４ｎｔ、そしてｍＮＳ１ｍＮＳ２では１１６３ｎｔの生成フラグメントをＢＲＳＶの全長ｃＤＮＡに挿入した。これによりｒＢＲＳＶ ｈＮＳ１ｈＮＳ２及びｒＢＲＳＶ ｍＮＳ１ｍＮＳ２を得た（図１４）。
【００７７】
生存可能な組換えウイルスｒＢＲＳＶ ｈＮＳ１ｂＮＳ２、ｒＢＲＳＶｂＮＳ１ｈＮＳ２及びｒＢＲＳＶ ｈＮＳ１ｈＮＳ２並びにｒＢＲＳＶ ｍＮＳ１ｂＮＳ２、ｒＢＲＳＶ ｂＮＳ１ｍＮＳ２及びｒＢＲＳＶ ｍＮＳ１ｍＮＳ２は、それぞれのウイルスｃＤＮＡ（１０μｇ）を用いるＴ７プロモーター制御プラスミドのトランスフェクション（ＣａＰＯ４プロトコル；哺乳動物トランスフェクションキット、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）後にＢＳＲ Ｔ７／５細胞（５）においてそれぞれのｃＤＮＡ構築物から得ることができた。ファージＴ７のＲＮＡポリメラーゼを安定に発現する約１０６のＢＳＲ Ｔ７／５細胞にＢＲＳＶタンパク質Ｎ及びＰ（ｐＴＩＴＢ−Ｎ及びｐＴＩＴＢ−Ｐ、各プラスミド当たり４μｇ）並びにＬ及びＭ２（ｐＴＩＴＢ−Ｌ及びｐＴＩＴＢ−Ｍ２、各プラスミド当たり２μｇ）をコードするプラスミドを各ウイルスｃＤＮＡと共トランスフェクションした（５）。４時間後に、トランスフェクション培地を取り除き、そして５％ ＦＣＳを含有するＢＨＫ−２１培地（Ｇｉｂｃｏ）を加えた。細胞破壊効果を認めることができるまで、ＢＲＳＶ ｃＤＮＡでトランスフェクションした細胞を５日ごとに１：３の比率で希釈した。
【００７８】
全ての場合において、ＢＲＳＶのＮ、Ｐ、Ｌ及びＭ２タンパク質をコードする支持プラスミドの共トランスフェクションはシンシチウムの形成をもたらした。１：３の比率での細胞の希釈及び明白な細胞破壊効果の発生後にウイルスを採取した。
【００７９】
ウイルスストック溶液の調製のために、８０％融合したＶｅｒｏ細胞に血清なしのダルベッコ最小必須培地（ＤＭＥＭ）において０．１の感染多重度（ＭＯＩ）で感染させた。１時間の吸着後に接種材料を取り除き、そして約４日後に明白な細胞変性効果（ＣＰＥ）が認められるまで細胞を５％ ＣＯ２大気中で２．５％ ＦＣＳを補足したＤＭＥＭにおいて３７℃でインキュベーションした。ウイルスを凍結及びそれに続く融解により遊離させた。Ｖｅｒｏ細胞上のウイルス力価は、マイクロタイタープレートにおける希釈シリーズ及びその後の感染フォーカスの計数により決定した。この目的のために、Ｆ融合タンパク質に対する抗体を用いる間接染色によりフォーカスを染色した（ＳＥＲＯＴＥＫ，Ｕ．Ｋ．）。実施例１１：ＢＲＳＶキメラの増殖：ＩＦＮ抵抗性は細胞タイプに依存する。
【００８０】
ウイルスの増殖特性を最初にＶｅｒｏ細胞において分析した。ＢＲＳＶ ｈＮＳ１ｈＮＳ２及びＢＲＳＶ ｈＮＳ１ｂＮＳ２はＢＲＳＶ ｗｔと同様に作用したが、ＢＲＳＶ ｍＮＳ１ｍＮＳ２及びＢＲＳＶ ｍＮＳ１ｂＮＳ２は親の全長ウイルスと比較した場合にわずかに弱毒化された。これは、ウイルス複製におけるＢＲＳＶ ＮＳタンパク質の機能（１つもしくは複数）がＨＲＳＶ ＮＳタンパク質によって最大限に果たされることを示す。親ｗｔ ＢＲＳＶ及び２種のＨＲＳＶ／ＢＲＳＶキメラは両方とも、０．１のＭＯＩでのＶｅｒｏ細胞の感染及びその後の３日のインキュベーション期間の後に約５ｘ１０５ｐｆｕの感染力価に達した（図１５）。一方、ＰＶＭ／ＢＲＳＶキメラは、３日後に約４ｘ１０５ｐｆｕのみに達し、ＰＶＭ　ＮＳ遺伝子がウイルス複製におけるＢＲＳＶ（及びＨＲＳＶ）遺伝子の機能を果たすのに最適ではないことを示した。
【００８１】
次に、ｗｔ ＢＲＳＶの増殖を支持することにおいて最適であり、そしてＶｅｒｏ細胞と異なり機能性ＩＦＮ Ｉ型系を有する（５）ウシ起源の細胞系、ＭＤＢＫを用いた。この場合、ＢＲＳＶｈＮＳ１ｈＮＳ２の増殖はｗｔ ＢＲＳＶと比較して減少した。１ｘ１０６ｐｆｕまで増殖するＢＲＳＶと異なり、３日後に４ｘ１０４ｐｆｕのみの力価が得られた（図１６）。ｗｔ ＢＲＳＶの最適宿主細胞、ウシＭＤＢＫ細胞において、ＢＲＳＶ ｈＮＳ１ｈＮＳ２の増殖は明らかに弱毒化され、一方、ＩＦＮ陰性のＶｅｒｏ細胞では弱毒化を認めることはできない。
【００８２】
次に、ＩＦＮで刺激した細胞におけるｗｔ ＢＲＳＶ及びＢＲＳＶ ｈＮＳ１ｈＮＳ２の性質を分析するために組換えヒトＩ型インターフェロンを用いた。組換え体の複製に対するＩ型インターフェロンの影響を調べるために、ＶｅｒｏもしくはＭＤＢＫ細胞に異なるウイルスを上記のように０．１のＭＯＩで感染させ、そして２．５％ ＦＣＳを含有するＤＭＥＭにおいて６ウェル皿に接種した。組換えユニバーサルＩ型インターフェロン（ヒトインターフェロンアルファＡ／Ｄ、ＰＢＬ　Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を接種後に直接５００−１０，０００Ｕ／ｍｌの濃度で加えた。３日のインキュベーション期間の後に希釈シリーズ及びＦ融合タンパク質に対する抗体での感染細胞の間接染色によりウイルス力価を決定した。
【００８３】
ｗｔ ＢＲＳＶ及びＢＲＳＶ ｈＮＳ１ｈＮＳ２間でそれらのＩＦＮ抵抗性に関してＶｅｒｏ細胞上ではいかなる違いも認めることができなかった。両方のウイルスで、５０００Ｕ以上の添加の際にのみ感染力価のわずかな減少を認めることができた（図１７Ａ）。それに反してＭＤＢＫ細胞上では、ＢＲＳＶ ｈＮＳ１ｈＮＳ２は、ＩＦＮで誘導される細胞応答に対して強い用量に依存する感受性を示し、ここで、１５００Ｕ程度の少量では感染力価の３倍の減少が、そして１０，０００Ｕでは約３０倍の減少がもたらされた。一方、ｗｔ ＢＲＳＶは、ＩＦＮ処理に対する高い抵抗性を示した。１０，０００ＵのＩＦＮアルファでさえ、ｗｔ ＢＲＳＶの複製に影響を与えなかった（図１７Ｂ）。キメラＢＲＳＶ ｈＮＳ１ｈＮＳ２は、Ｖｅｒｏ細胞においてｗｔ ＢＲＳＶのものと同様のＩＦＮ抵抗性を示すが、ウシ起源の細胞ではＩＦＮで誘導される抗ウイルス応答を完全には防ぐことができない。これは、ＢＲＳＶ ＮＳタンパク質が、ウシ細胞の抗ウイルス応答を処理することにおいてＨＲＳＶ ＮＳタンパク質より成功することを示す。明らかに、ＮＳタンパク質のＩＦＮ拮抗作用は、異種起源の宿主細胞において次善である。異種起源のＮＳタンパク質を保有するキメラＲＳウイルスをインビボで弱毒化し、そして生ワクチンとして用いることができる。
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３．　　 Ａｔｒｅｙａ， Ｐ．Ｌ．， Ｍ．Ｅ． Ｐｅｅｐｌｅｓ ｕｎｄ Ｐ．Ｌ． Ｃｏｌｌｉｎｓ． １９９８． Ｔｈｅ ＮＳ１ ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｃｙｔｉａｌ ｖｉｒｕｓ ｉｓ ａ ｐｏｔｅｎｔ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｏｆ ｍｉｎｉｇｅｎｏｍｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ ＲＮＡ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ． Ｊ Ｖｉｒｏｌ． ７２：１４５２−１４６１．
４．　　 Ｂｅｎｎｉｎｇｈａｍ， Ａ．， ａｕｄ Ｐ．Ｌ． Ｃｏｌｌｉｎｓ． １９９９． Ｔｈｅ Ｍ２−２ ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｃｙｔｉａ１ ｖｉｒｕｓ ｉｓ ａ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｆａｃｔｏｒ ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｂａｌａｎｃｅ ｂｅｔｗｅｅｎ ＲＮＡ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９６：１ １２５９−１１２６４．
５．　　 Ｂｕｃｈｈｏｌｚ， Ｕ．Ｊ．， Ｓ． Ｆｉｎｋｅ ｕｎｄ Ｋ．Ｋ． Ｃｏｎｚｅｌｍａｎｎ． １９９９． Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｂｏｖｉｎｅ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｃｙｔｉａｌ ｖｉｒｕｓ （ＢＲＳＶ） ｆｒｏｍ ｃＤＮＡ： ＢＲＳＶ ＮＳ２ ｉｓ ｎｏｔ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｆｏｒ ｖｉｒｕｓ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｉｓｓｕｅ ｃｕｌｔｕｒｅ， ａｎｄ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ＲＳＶ ｌｅａｄｅｒ ｒｅｇｉｏｎ ａｃｔｓ ａｓ ａ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ＢＲＳＶ ｇｅｎｏｍｅ ｐｒｏｍｏｔｅｒ． Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７３：２５１−２５９．
６．　　 Ｂｕｃｈｈｏ１ｚ， Ｕ．Ｊ．， Ｈ． Ｇｒａｎｚｏｗ， Ｋ． Ｓｃｈｕｌｄｔ， Ｓ．Ｓ． Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ， Ｂ．Ｒ． Ｍｕｒｐｈｙ ｕｎｄ Ｐ．Ｌ． Ｃｏｌｌｉｎｓ． ２０００． Ｃｈｉｍｅｒｉｃ ｂｏｖｉｎｅ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｃｙｔｉａｌ ｖｉｒｕｓ ｗｉｔｈ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ ｇｅｎｅ ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎｓ ｆｒｏｍ ｈｕｍａｎ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｃｙｔｉａＩ ｖｉｒｕｓ （ＨＲＳＶ）： Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｎ ｈｏｓｔ ｒａｎｇｅ ａｎｄ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ａｓ ａ ｌｉｖｅ−ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ ＨＲＳＶ ｖａｃｃｉｎｅ． Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７４：１１８７−１１９９．
７．　　 Ｃｈａｐｌｉｎ， Ｐ．Ｊ．， Ｋ．Ｒ． Ｐａｒｓｏｎｓ ｕｎｄ Ｒ．Ａ． Ｃｏｌｌｉｎｓ． １９９６． Ｔｈｅ ｃｌｏｎｉｎｇ ｏｆ ｃａｔｔｌｅ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−Ａ ｓｕｂｔｙｐｅｓ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｇｕｔ ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ ｏｆ ｒｏｔａｖｉｒｕｓ−ｉｎｆｅｃｔｅｄ ｃａｌｖｅｓ． Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ ４４：１４３−１４５．
８．　　 Ｃｏｌｌｉｎｓ， Ｐ．Ｌ．， Ｍ．Ｇ． Ｈｉｌｌ， Ｅ． Ｃａｍａｒｇｏ， Ｈ． Ｇｒｏｓｆｅｌｄ， Ｒ．Ｍ． Ｃｈａｎｏｃｋ ｕｎｄ Ｂ．Ｒ． Ｍｕｒｐｈｙ． １９９５． Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｈｕｍａｎ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｃｙｔｉａｌ ｖｉｒｕｓ ｆｒｏｍ ｃｌｏｎｅｄ ｃＤＮＡ ｃｏｎｆｉｒｍｓ ａｎ ｅｓｓｅｎｔｉａ１ ｒｏｌｅ ｆｏｒ ｔｈｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ５’ ｐｒｏｘｉｍａ１ ｏｐｅｎ ｒｅａｄｉｎｇ ｆｒａｍｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｍ２ ｍＲＮＡ ｉｎ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｐｒｏｖｉｄｅｓ ａ ｃａｐａｂｉｌｉｔｙ ｆｏｒ ｖａｃｃｉｎｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ． Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ９２：ｌ１５６３−１１５６７．
９．　　 Ｃｏｌｌｉｎｓ， Ｐ．Ｌ．， Ｋ． ＭｃＩｎｔｏｓｈ ｕｎｄ Ｒ．Ｍ． Ｃｈａｎｏｃｋ． １９９６． Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｃｙｔｉａｌ ｖｉｒｕｓ， Ｓ． １３１３−１３５２− Ｉｎ Ｂ．Ｎ． Ｆｉｅｌｄｓ， Ｄ．Ｍ． Ｋｎｉｐｅ， Ｐ．Ｍ． Ｈｏｗｌｅｙ， Ｒ．Ｍ． Ｃｈａｎｏｃｋ， Ｊ．Ｌ． Ｅｌｎｉｋ， Ｔ．Ｐ． Ｏｎａｔｈ， Ｂ． Ｏｉｚｍａｎ， ａｎｄ Ｓ．Ｅ． Ｔｒａｕｓ （Ｈｒｓｇ．）， Ｆｉｅｌｄｓ ｖｉｒｏｌｏｇｙ． Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ． Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ， ＰＡ．
１０．　　Ｃｏｌｌｉｎｓ， Ｐ．Ｌ．， ｕｎｄ Ｇ． Ｗ． Ｗｅｒｔｚ． １９８５． Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ＩＢ ａｎｄ １Ｃ ｎｏｎｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ｍＲＮＡｓ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｃｙｔｉａｌ ｖｉｒｕｓ． Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １４３：４４２−４５１．
１１．　　Ｃｏｎｚｅｌｍａｎｎ， Ｋ．Ｋ． １９９８． Ｎｏｎｓｅｇｍｅｎｔｅｄ ｎｅｇａｔｉｖｅ−ｓｔｒａｎｄ ＲＮＡ ｖｉｒｕｓｅｓ： Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ ｍａｎｉｐｕ１ａｔｉｏｎ ｏｆ ｖｉｒａｌ ｇｅｎｏｍｅｓ． Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ． ３２：１２３−１６２．
１２．　　Ｃｏｎｚｅｌｍａｎｎ， Ｋ．Ｋ．， Ｊ．Ｈ． Ｃｏｘ， Ｌ．Ｇ． Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ ｕｎｄ Ｈ．Ｊ． Ｔｈｉｅｌ． １９９０． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｔｈｅ ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ ｒａｂｉｅｓ ｖｉｒｕｓ ＳＡＤ Ｂ１９． Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １７５：４８５−４９９．
１３．　　Ｄｉｄｃｏｃｋ， Ｌ．， Ｄ．Ｆ． Ｙｏｕｎｇ， Ｓ． Ｇｏｏｄｂｏｕｒｎ ｕｎｄ Ｒ．Ｅ． Ｒａｎｄａｌｌ． １９９９ａ． Ｓｅｎｄａｉ ｖｉｒｕｓ ａｎｄ ｓｉｍｉａｎ ｏｎ ａｎｔｉｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｆ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｃｙｔｉａｌ ｖｉｒｕｓ ｉｎ ｓｅｑｕｅｎｔｉａｌ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ． Ｊ． Ｖｉｒｏｌ ７３：５８５２−５８６４．
１８．　　Ｆｉｎｋｅ， Ｓ．， ｕｎｄ Ｋ．Ｋ． Ｃｏｎｚｅｌｍａｎｎ． １９９７． Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｆｒｏｍ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｒａｂｉｅｓ ｖｉｒｕｓ： ｒａｎｄｏｍ ｐａｃｋａｇｉｎｇ ｏｆ ｐｏｓｉｔｉｖｅ− ａｎｄ ｎｅｇａｔｉｖｅ−ｓｔｒａｎｄ ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ ｉｎｔｏ ｒａｂｉｅｓ ｖｉｒｉｏｎｓ． Ｊ．Ｖｉｒｏｌ． ７１ ：７２８１− ７２８８．
１９．　　Ｆｉｎｋｅ， Ｓ．， ｕｎｄ Ｋ．Ｋ． Ｃｏｎｚｅｌｍａｎｎ． １９９９． Ｖｉｒｕｓ ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ ｂｙ ｄｅｆｅｃｔｉｖｅ ＲＮＡｓ： ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｉｎｉ−ＲＮＡ ｖｅｃｔｏｒｓ ａｎｄ ｒｅｓｃｕｅ ｆｒｏｍ ｃＤＮＡ ｂｙ ａ ３’ ｃｏｐｙ−ｂａｃｋ ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ｒａｂｉｅｓ ｖｉｒｕｓ． Ｊ． Ｖｉｒｏｌ ７３：３８１８−３８２５．
２０．　　Ｇａ１ｅ， Ｍ．Ｊ．， Ｃ．Ｍ． Ｂｌａｋｅｌｙ， Ｂ． Ｋｗｉｅｃｉｓｚｅｗｓｋｉ， Ｓ．Ｌ． Ｔａｎ， Ｍ． Ｄｏｓｓｅｔｔ， Ｎ．Ｍ． Ｔａｎｇ， Ｍ．Ｊ． Ｋｏｒｔｈ， Ｓ．Ｊ． Ｐｏｌｙａｋ， Ｄ．Ｒ． Ｇｒｅｔｃｈ ｕｎｄ Ｍ．Ｇ． Ｋａｔｚｅ． １９９８． Ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ＰＫＲ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ ｂｙ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ ｖｉｒｕｓ ｎｏｎｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ５Ａ ｐｒｏｔｅｉｎ： ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｏｆ ｋｉｎａｓｅ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ． Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １８：５２０８−５２１８．
２１．　Ｇａｌｅ， Ｍ．Ｊ．Ｊ．， Ｍ．Ｊ． Ｋｏｒｔｈ， Ｎ．Ｍ． Ｔａｎｇ， Ｓ．Ｌ． Ｔａｎ， Ｄ．Ａ． Ｈｏｐｋｉｎｓ， Ｔ．Ｅ． Ｄｅｖｅｒ， Ｓ．Ｊ． Ｐｏｌｙａｋ， Ｄ．Ｒ． Ｇｒｅｔｃｈ ｕｎｄ Ｍ．Ｇ． Ｋａｔｚｅ． １９９７． Ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｔｈａｔ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ ｖｉｒｕｓ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｔｏ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ ｉｓ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｔｈｒｏｕｇｈ ｒｅｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ＰＫＲ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ ｂｙ ｔｈｅ ｎｏｎｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ５Ａ ｐｒｏｔｅｉｎ． Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２３０：２１７−２２７．
２２．　　Ｇａｒｃｉｎ， Ｄ．， Ｐ． Ｌａｔｏｒｒｅ ｕｎｄ Ｄ． Ｋｏｌａｋｏｆｓｋｙ． １９９９． Ｓｅｎｄａｉ ｖｉｒｕｓ Ｃ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｃｏｕｎｔｅｒａｃｔ ｔｈｅ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ａｎ ａｎｔｉｖｉｒａｌ ｓｔａｔｅ． Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７３：６５５９−６５６５．
２３．　　Ｇａｒｃｉａ−Ｓａｓｔｒｅ， Ａ．， Ｒ．Ｋ． Ｄｕｒｂｉｎ， Ｈ． Ｚｈｅｎｇ， Ｐ． Ｐａｌｅｓｅ， Ｒ． Ｇｅｒｔｎｅｒ， Ｄ．Ｅ． Ｌｅｖｙ ｕｎｄ Ｊ．Ｅ． Ｄｕｒｂｉｎ． １９９８． Ｔｈｅ ｒｏｌｅ ｏｆ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ ｉｎ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓ ｔｉｓｓｕｅ ｔｒｏｐｉｓｍ． Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７２；８５５０−８５５８．
２４．　　Ｇａｒｃｉａ−Ｓａｓｔｒｅ， Ａ．， Ａ． Ｅｇｏｒｏｖ， Ｄ． Ｍａｔａｓｓｏｖ， Ｓ． Ｂｒａｎｄｔ， Ｄ．Ｅ． Ｌｅｖｙ， Ｊ．Ｅ． Ｄｕｒｂｉｎ， Ｐ． Ｐａｌｅｓｅ ｕｎｄ Ｔ． Ｍｕｓｔｅｒ． １９９８． Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ａ ｖｉｒｕｓ ｌａｃｋｉｎｇ ｔｈｅ ＮＳ１ ｇｅｎｅ ｒｅｐｌｉｃａｔｅｓ ｉｎ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ ｓｙｓｔｅｍｓ． Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２５２：３２４−３３０．
２５．　　Ｇｒｏｓｆｅｌｄ， Ｈ．． Ｍ．Ｇ． Ｈｉｌｌ ｕｎｄ Ｐ．Ｌ． Ｃｏｌｌｉｎｓ． １９９５． ＲＮＡ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｂｙ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｃｙｔｉａｌ ｖｉｒｕｓ （ＲＳＶ） ｉｓ ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｂｙ ｔｈｅ Ｎ， Ｐ， ａｎｄ Ｌ ｐｒｏｔｅｉｎｓ； ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｌｓｏ ｏｃｃｕｒｓ ｕｎｄｅｒ ｔｈｅｓｅ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｂｕｔ ｒｅｑｕｉｒｅｓ ＲＳＶ ｓｕｐｅｒｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｆｏｒ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｆｕｌｌ−ｌｅｎｇｔｈ ｍＲＮＡ． Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６９：５６７７−５６８６．
２６．　　Ｈａｎａｄａ． Ｎ．， Ｔ． Ｍｏｒｉｓｈｉｍａ， Ｋ． Ｎｉｓｈｉｋａｗａ， Ｓ． Ｉｓｏｍｕｒａ ｕｎｄ Ｙ． Ｎａｇａｉ． １９８６． Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｓｅｌｆ−ｌｉｍｉｔｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｏｆ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｃｙｔｉａ１ ｖｉｒｕｓ ｉｎ ｍｏｕｓｅ ｅｍｂｒｙｏ ｃｅｌｌｓ． Ｊ Ｍｅｄ Ｖｉｒｏｌ ２０：３６３−３７０．
２７．　　Ｈａｒｄｙ． Ｒ． Ｗ ｕｎｄ Ｇ． Ｗ． Ｗｅｒｔｚ． １９９８． Ｔｈｅ ｐｒｏｄｕｃｔ ｏｆ ｔｈｅ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｃｙｔｉａｌ ｖｉｒｕｓ Ｍ２ ｇｅｎｅ ＯＲＦ１ ｅｎｈａｎｃｅｓ ｒｅａｄｔｈｒｏｕｇｈ ｏｆ ｉｎｔｅｒｇｅｎｉｃ ｊｕｎｃｔｉｏｎｓ ｄｕｒｉｎｇ ｖｉｒａｌ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ． Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７２：５２０−５２６．
２８．　　Ｊｉｎ． Ｈ．， Ｘ． Ｃｈｅｎｇ， Ｈ−Ｚ． Ｚｈｏｕ， Ｓ． Ｌｉ ｕｎｄ Ｒ． Ｓｅｉｄ． ２０００． Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｃｙｔｉａｌ ｖｉｒｕｓ ｔｈａｔ ｌａｃｋｓ ｏｐｅｎ ｒｅａｄｉｎｇ ｆｒａｍｅ ２ ｏｆ ｔｈｅ Ｍ２ ｇｅｎｅ （Ｍ２−２） ｈａｓ ａｌｔｅｒｅｄ ｇｒｏｗｔｈ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ ａｎｄ ｉｓ ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ ｉｎ ｒｏｄｅｎｔｓ． Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７４；７４−８２．
２９．　　Ｊｉｎ， Ｈ．， Ｄ． Ｃｌａｒｋｅ， Ｈ．Ｚ． Ｚｈｏｕ， Ｘ． Ｃｈｅｎｇ， Ｋ． Ｃｏｅｌｉｎｇｈ， Ｍ． Ｂｒｙａｎｔ ｕｎｄ Ｓ． Ｌｉ． １９９８． Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｈｕｍａｎ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｃｙｔｉａｌ ｖｉｒｕｓ （ＲＳＶ） ｆｒｏｍ ｃＤＮＡ ａｎ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｓｕｂｇｒｏｕｐ Ａ ａｎｄ Ｂ ｃｈｉｍｅｒｉｃ ＲＳＶ． Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２５１：２０６−２１４．
３０．　　Ｌｅｒｃｈ， Ｒ．Ａ．， Ｅ．Ｊ． Ｓｔｏｔｔ ｕｎｄ Ｇ．Ｗ． Ｗｅｒｔｚ． １９８９． Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｂｏｖｉｎｅ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｃｙｔｉａｌ ｖｉｒｕｓ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｎｄ ｍＲＮＡｓ ａｎｄ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｃＤＮＡ ｃｌｏｎｅｓ ｔｏ ｔｈｅ ｖｉｒａｌ ｍＲＮＡｓ． Ｊ Ｖｉｒｏｌ ６３：８３３−８４０．
３１．　　Ｍａｌｌｉｐｅｄｄｉ， Ｓ．Ｋ．， Ｓ．Ｋ． Ｓａｍａｌ ｕｎｄ Ｓ．Ｂ． Ｍｏｈａｎｔｙ． １９９０． Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄ ｉｎ ｂｏｖｉｎｅ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｃｙｔｉａ１ ｖｉｒｕｓ−ｉｎｆｅｃｔｅｄ ｃｅｌｌｓ． Ａｒｃｈ Ｖｉｒｏｌ １１５：２３−３６．
３２．　　Ｍｅｂａｔｓｉｏｎ， Ｔ．， Ｍ．Ｊ． Ｓｃｈｎｅｌｌ． Ｊ．Ｈ． Ｃｏｘ． Ｓ． Ｆｉｎｋｅ． ａｎｄ Ｋ．Ｋ． Ｃｏｎｚｅｌｍａｎｎ． １９９６． Ｈｉｇｈｌｙ ｓｔａｂｌｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ａ ｆｏｒｅｉｇｎ ｇｅｎｅ ｆｒｏｍ ｒａｂｉｅｓ ｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒｓ． Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ． ９３：７３１０−７３１４．
３３．　　Ｍｏｈａｎｔｙ， Ｓ．Ｂ．， Ａ．Ｌ． Ｉｎｇ１ｉｎｇ ｕｎｄ Ｍ．Ｇ． Ｌｉｌｌｉｅ． １９７５． Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｌｙ ｉｎｄｕｃｅｄ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｃｙｔｉａ１ ｖｉｒａｌ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｉｎ ｃａｌｖｅｓ− Ａｍ Ｊ Ｖｅｔ Ｒｅｓ ３６；４１７−４１９．
３４．　　Ｐａｓｔｅｙ， Ｍ．Ｋ．， ｕｎｄ Ｓ．Ｋ． Ｓａｍａｌ． １９９５． Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｎｏｎｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ＮＳ１ （１Ｃ） ａｎｄ ＮＳ２ （１Ｂ） ｐｒｏｔｅｉｎ ｇｅｎｅｓ ｏｆ ｂｏｖｉｎｅ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｃｙｔｉａｌ ｖｉｒｕｓ． Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７６：１９３−１９７．
３５．　　Ｐｌｏｅｇｈ， Ｈ．Ｌ． １９９８． Ｖｉｒａｌ ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｏｆ ｉｍｍｕｎｅ ｅｖａｓｉｏｎ． Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８０：２４８−２５３．
３６．　　Ｐｒｉｎｇｌｅ， Ｃ．Ｒ． １９９６． Ｖｉｒｕｓ ｔａｘｏｎｏｍｙ １９９６ ￣ ａ ｂｕｌｌｅｔｉｎ ｆｒｏｍ ｔｈｅ Ｘｔｈ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　 Ｃｏｎｇｒｅｓｓ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ｉｎ Ｊｅｒｕｓａｌｅｍ． Ａｒｃｈ ＶｉｒｏＩ１４１；２２５１−２２５６．
３７．　　Ｐｒｉｎｇｌｅ， Ｃ．Ｒ． １９９８． Ｔｈｅ ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ｓｙｓｔｅｍ ｏｆ ｖｉｒｕｓ ｔａｘｏｎｏｍｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｎ Ｖｉｒｕｓ Ｔａｘｏｎｏｍｙ （ＩＣＴＶ）， ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ｎｅｗ ｐｒｏｐｏｓａｌｓ ｒａｔｉｆｉｅｄ ｓｉｎｃｅ ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｓｉｘｔｈ ＩＣＴＶ Ｒｅｐｏｒｔ ｉｎ １９９５ ［ｎｅｗｓ］ ［ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｅｒｒａｔｕｍ ａｐｐｅａｒｓ ｉｎ ＡｒｃｈＶｉｒｏｌ １９９８；１４３（３）：６３０］． Ａｒｃｈ Ｖｉｒｏｌ １４３；２０３−２１０．
３８．　　Ｓａｍａｌ， Ｓ．Ｋ．， Ｍ．Ｋ． Ｐａｓｔｅｙ， Ｔ．Ｈ． ＭｃＰｈｉｌｌｉｐｓ ｕｎｄ Ｓ．Ｂ． Ｍｏｈａｎｔｙ． １９９３． Ｂｏｖｉｎｅ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｃｙｔｉａ１ ｖｉｒｕｓ ｎｕｃｌｅｏｃａｐｓｉｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｉｎ ｉｎｓｅｃｔ ｃｅｌｌｓ ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ ｉｎｔｅｒａｃｔｓ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｐｈｏｓｐｈｏｐｒｏｔｅｉｎ ａｎｄ ｔｈｅ Ｍ２ ｐｒｏｔｅｉｎ． Ｖｉｒｏ１ｏｇｙ １９３：４７０−４７３．
３９．　　Ｓｃｈｎｅｌｌ． Ｍ．Ｊ．， Ｔ． Ｍｅｂａｔｓｉｏｎ ｕｎｄ Ｋ．Ｋ． Ｃｏｎｚｅｌｍａｎｎ． １９９４． Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｒａｂｉｅｓ ｖｉｒｕｓｅｓ ｆｒｏｍ ｃｌｏｎｅｄ ｃＤＮＡ． ＥＭＢＯ Ｊ． １３：４１９５−４２０３．
４０．　　Ｓｔｏｔｔ， Ｅ．Ｊ．， Ｌ．Ｈ． Ｔｈｏｍａｓ， Ｇ． Ｔａｙｌｏｒ， Ａ．Ｐ． Ｃｏｌｌｉｎｓ， Ｊ． Ｊｅｂｂｅｔｔ ｕｎｄ Ｓ． Ｃｒｏｕｃｈ． １９８４． Ａ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｔｈｒｅｅ ｖａｃｃｉｎｅｓ ａｇａｉｎｓｔ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｃｙｔｉａｌ ｖｉｒｕｓ ｉｎ ｃａｌｖｅｓ． Ｊ Ｈｙｇ （Ｌｏｎｄ） ９３：２５１−２６１．
４１．　　Ｔａｎ， Ｓ．Ｌ．， ｕｎｄ Ｍ．Ｇ． Ｋａｔｚｅ． １９９８． Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ ｇｅｎｅｔｉｃ ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｆｏｒ ｃｏｍｐｌｅｘ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ ｔｈｅ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ａ ｖｉｒｕｓ ＮＳ１ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｎｄ ｔｈｅ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ ＰＫＲ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ． Ｊ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｒｅｓ １８：７５７−７６６．
４２．　　Ｔａｙｌｏｒ， Ｄ．Ｒ．， Ｓ．Ｔ． Ｓｈｉ， Ｐ．Ｒ． Ｒｏｍａｎｏ， Ｇ．Ｎ． Ｂａｒｂｅｒ ｕｎｄ Ｍ．Ｍ． Ｌａｉ． １９９９． Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ ＰＫＲ ｂｙ ＨＣＶ Ｅ２ ｐｒｏｔｅｉｎ ［ｓｅｅ ｃｏｍｍｅｎｔｓ］． Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８５：１０７−１１０．
４３．　　Ｔｅｎｇ， Ｍ．Ｎ．， ｕｎｄ Ｐ．Ｌ． Ｃｏｌｌｉｎｓ． １９９９． Ａｌｔｅｒｅｄ ｇｒｏｗｔｈ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｃｙｔｉａｌ ｖｉｒｕｓｅｓ ｗｈｉｃｈ ｄｏ ｎｏｔ ｐｒｏｄｕｃｅ ＮＳ２ ｐｒｏｔｅｉｎ． Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７３；４６６−４７３．
４４．　　Ｕｚｅ， Ｇ．， Ｇ． Ｌｕｔｆａｌｌａ ｕｎｄ Ｋ．Ｅ． Ｍｏｇｅｎｓｅｎ． １９９５． Ａｌｐｈａ ａｎｄ ｂｅｔａ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｆｒｉｅｎｄｓ ａｎｄ ｒｅｌａｔｉｏｎｓ． Ｊ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｒｅｓ １５：３−２６．
４５．　　ｖａｎ ｄｅｒ Ｐｏｅｌ， Ｗ．Ｈ．， Ａ． Ｂｒａｎｄ， Ｊ．Ａ． Ｋｒａｍｐｓ ｕｎｄ Ｊ．Ｔ． ｖａｎ Ｏｉｒｓｃｈｏｔ． １９９４． Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｃｙｔｉａｌ ｖｉｒｕｓ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｂｅｉｎｇｓ ａｎｄ ｉｎ ｃａｔｔｌｅ． Ｊ Ｉｎｆｅｃｔ ２９：２１５．２２８．
４６．　　Ｗａｔｈｅｌｅｔ， Ｍ．Ｇ．， Ｐ．Ｍ． Ｂｅｒｒ ｕｎｄ Ｇ．Ａ． Ｈｕｅｚ． １９９２． Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｂｙ ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ ａｎｄ ｖｉｒｕｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｃｅｌｌｓ ｌａｃｋｉｎｇ ｔｈｅ ｔｙｐｅ−Ｉ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ ｌｏｃｕｓ． Ｅｕｒ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ ２０６：９０１．９１０．
４７．　　Ｗｅｂｅｒ， Ｅ．， Ｂ． Ｈｕｍｂｅｒｔ， Ｈ．Ｊ． Ｓｔｒｅｃｋｅｒｔ ｕｎｄ Ｈ． Ｗｅｒｃｈａｕ． １９９５． Ｎｏｎｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ２ （ＮＳ２） ｏｆ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｃｙｔｉａｌ ｖｉｒｕｓ （ＲＳＶ） ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｂｙ ａｎ ａｎｔｉｐｅｐｔｉｄｅ ｓｅｒｕｍ． Ｒｅｓｐｉｒａｔｉｏｎ ６２：２７−３３．
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４９．　　Ｙｕ， Ｑ．， Ｒ．Ｗ． Ｈａｒｄｙ ｕｎｄ Ｇ．Ｗ． Ｗｅｒｔｚ． １９９５． Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｃＤＮＡ ｃｌｏｎｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｃｙｔｉａ１ （ＲＳ） ｖｉｒｕｓ Ｎ， Ｐ， ａｎｄ Ｌ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｓｕｐｐｏｒｔ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＲＳ ｖｉｒｕｓ ｇｅｎｏｍｉｃ ＲＮＡ ａｎａ１ｏｇｓ ａｎｄ ｄｅｆｉｎｅ ｍｉｎｉｍａｌ ｔｒａｎｓ−ａｃｔｉｎｇ ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ ｆｏｒ ＲＮＡ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ． Ｊ Ｖｉｒｏｌ ６９：２４１２−２４１９．
【図面の簡単な説明】
【図１】（Ａ）組換えＢＲＳＶのゲノムの概要図。転写産物（灰色の棒）及びタンパク質コーディング領域（白色の棒）の位置は、ウイルスゲノム（ｖＲＮＡ）（黒色の棒）に関して示す。拡大は、全長ウイルス及びＮＳ欠失突然変異体の構造を比較する。リーダーＲＮＡを水平に引いた線で示し；クローニングに使用したそれぞれのヌクレオチド及び制限部位の相対位置を示す。（Ｂ）狂犬病ウイルス（ＲＶ）Ｇ及びＬ遺伝子の間に遺伝子的に標識したＢＲＳＶ ＮＳ１もしくはＢＲＳＶ ＮＳ２ ＯＲＦを保有する組換えＲＶの構造。
【図２】組換えＢＲＳＶにおけるＮＳ１及びＮＳ２転写産物の欠如。示すウイルスによって感染させたＢＳＲ細胞からの全長ＲＮＡを感染の２〜４日後に単離し、そしてＮＳ１、ＮＳ２、ＮＳ１〜ＮＳ２及びＮ遺伝子を含んでなるプローブを用いてノーザンハイブリダイゼーションにより分析した。ＮＳ１、ＮＳ２及びＮ ｍＲＮＡを示す。
【図３】ＮＳ欠失突然変異体は、ＭＤＢＫ細胞においてＢＳＲ細胞におけるより弱毒化される。ほとんど融合したＢＳＲ Ｔ７−５（Ａ）及びＭＤＢＫ（Ｂ）単層にＢＲＳＶ（黒丸）、ＢＲＳＶ ΔＮＳ１（白四角）、ＢＲＳＶ ΔＮＳ２（黒三角）もしくはＢＲＳＶ ΔＮＳ１／２（白丸）を０．０１のＭＯＩで感染させた。感染性ウイルス力価を実施例の節において記述するように２日ごとに決定した。６日目から始まり、ＢＳＲ細胞における全ての突然変異体の複製及びＭＤＢＫ細胞におけるｗｔ ＢＲＳＶの複製は、大幅な細胞破壊をもたらした。値は２回の独立した実験から得られ、これらの各々を三重反復で実施した。棒は標準偏差を示す。
【図４】ウイルス感染したＭＤＢＫ細胞もしくは感染したマクロファージの上清は、共培養するＶｅｒｏ細胞におけるＢＲＳＶ ＮＳ欠失突然変異体の増殖を抑制する。共培養実験の原理を（Ａ）において図式的に示す。ＭＤＢＫ細胞もしくはＬＰＳで刺激したウシマクロファージにＢＲＳＶを１のＭＯＩで感染させ、Ｎｕｎｃ「Ａｎｏｐｏｒｅ膜」細胞培養インサートに接種し、そしてｗｔ ＢＲＳＶ、ＢＲＳＶ ΔＮＳ１、ＢＲＳＶ ΔＮＳ２もしくはＢＲＳＶ ΔＮＳ１／２によって感染させたＶｅｒｏ「応答」細胞と共に培養した。３日後に、インサートを取り除き、そしてＶｅｒｏ細胞の感染性ウイルス力価を決定した。（Ｂ）における結果は、感染していないＭＤＢＫもしくは感染していない、刺激していないマクロファージで得られるコントロールと比較した場合の標準偏差を含む抑制％としてそして（平均値の）減少倍数として示す。値は６回（ＭＤＢＫ）及び４回（マクロファージ）の共培養実験から得られる。
【図５】インターフェロンアルファー受容体（ＩＦＮＡ−Ｒ２）モノクローナル抗体（＃２）は、ＭＤＢＫもしくはマクロファージにより生産される抑制因子の作用を中和する。ｒＢＲＳＶ ΔＮＳ１、ｒＢＲＳＶ ΔＮＳ２、ｒＢＲＳＶ ΔＮＳ１／２もしくはｗｔ ｒＢＲＳＶを０．１のＭＯＩで感染させたＶｅｒｏ「応答」細胞を各々ＩＦＮＡＲ２（＃２）、ＭＨＣ Ｉ（＃３）、ＴＮＦ−Ｒ１（＃４）に対する５μｇ／ｍｌのモノクローナル抗体と、もしくは抗体の非存在下で（＃１）３時間インキュベーションした。感染したＭＤＢＫ細胞との共培養（図４における実験の原理を参照）を１μｇ／ｍｌのそれぞれの抗体の存在下で実施した。力価を６回（＃１及び＃２）もしくは２回の実験（＃３及び＃４）において決定した。棒は標準偏差を示す。
【図６】全てのＢＲＳＶ ＮＳ欠失突然変異体はＩ型ＩＦＮ感受性である。ＢＲＳＶ（黒丸）、ＢＲＳＶ ΔＮＳ１（白四角）、ＢＲＳＶ ΔＮＳ２（三角）もしくはＢＲＳＶ ΔＮＳ１／２（白丸）を０．１のＭＯＩで感染させたＶｅｒｏ細胞を示す量の組換えＩＦＮアルファＡ／Ｄ（Ａ）もしくはＩＦＮベータ（Ｂ）とインキュベーションした。感染性ウイルス力価を感染の４日後に決定した。
【図７】ＢＲＳＶのＩＦＮ抵抗性は、霊長類細胞におけるよりウシ細胞において顕著である。ＭＤＢＫ（詰まった柱）もしくはＶｅｒｏ細胞（開いた柱）にｒＢＲＳＶを１のＭＯＩで感染させ、そして示す量の組換えＩＦＮアルファＡ／Ｄで処理した。感染性ウイルス力価を感染の３日後に決定した。
【図８】ＮＳ１及びＮＳ２を発現する狂犬病ウイルス（ＲＶ）を感染させた細胞におけるＲＶの増加したＩＦＮ抵抗性。Ｖｅｒｏ（Ａ）もしくはＭＤＢＫ細胞（Ｂ）にＲＶ ＳＡＤ ＶＢ、ＳＡＤ ＶＢ−ＮＳ１もしくはＳＡＤ ＶＢ−ＮＳ２を感染させるか、またはＳＡＤ ＶＢ−ＮＳ１及びＳＡＤ ＶＢ−ＮＳ２を共感染させた。感染後すぐに培養物を示す量のＩＦＮアルファＡ／Ｄで処理した。感染性ウイルス力価を感染の２日後に決定した。結果は、少なくとも４回の独立した実験からの平均値を表し、そして誤差棒は標準偏差を示す。
【図９】各々１ｘ１０５のＨｅｐ２細胞の二重反復サンプルに０．５ｍｌのＤＭＥＭ ｗ／ｏ ＦＣＳにおいて異なるＨＲＳＶ単離株を１時間感染させ（ＭＯＩ＝０．１）、その後、各サンプルに０．５ｍｌ＋５％ ＦＣＳを与えた。その後、感染細胞を４ｃｍ２組織培養プレートに接種した。１、２、３及び４日後に各ウイルス単離株で現在値を取り出し（ａ　ｃｕｒｒｅｎｔ　ｖａｌｕｅ　ｗａｓ　ｒｅｍｏｖｅｄ）、ウイルスを凍結融解により遊離させ、そして感染期間により決まる異なる臨床単離株の力価を滴定により決定した。ＲＳＶ−Ｆに対する抗体での感染細胞の染色後に計数することによりｐｆｕ／ｍｌを決定した。
【図１０】各々１ｘ１０５のＨｅｐ２細胞の二重反復サンプルに０．５ｍｌのＤＭＥＭ ｗ／ｏ ＦＣＳにおいて異なるＨＲＳＶ単離株を１時間感染させ（ＭＯＩ＝０．１）、その後、４ｃｍ２組織培養プレートに接種した。０、１５０、５００、１０，０００Ｕ／ｍｌの組換えＩ型ＩＦＮ Ａ／Ｄを別の０．５ｍｌ ＤＭＥＭ＋５％ＦＣＳに懸濁し、そして３０分後に加えた。７２時間のインキュベーション期間の後、ウイルスを凍結融解により遊離させ、そして加えるＩＦＮの量により決まる異なる臨床単離株の力価を滴定により決定した。ＲＳＶ−Ｆに対する抗体での感染細胞の染色後に計数することによりｐｆｕ／ｍｌを決定した。
【図１１】狂犬病ウイルス（ＲＶ）Ｇ及びＬ遺伝子の間にＨＲＳＶ ＮＳ１もしくはＨＲＳＶ ＮＳ２または遺伝子的に標識したＢＲＳＶ ＮＳ１、ＢＲＳＶ ＮＳ２、ＰＶＭ ＮＳ１もしくはＰＶＭ ＮＳ２ ＯＲＦを保有する組換えＲＶの構造。
【図１２】ＮＳ１及びＮＳ２を発現する狂犬病ウイルス（ＲＶ）を感染させたＲＶの増加したＩＦＮ抵抗性。ＭＤＢＫ細胞にＲＶ ＳＡＤ ＶＢ、ＳＡＤ ＶＢ−ｈＮＳ１もしくはＳＡＤ ＶＢ−ｈＮＳ２を感染させるか、またはＳＡＤ ＶＢ−ｈＮＳ１とＳＡＤ ＶＢ−ｈＮＳ２もしくはＳＡＤ ＶＢ−ｂＮＳ１とＳＡＤ ＶＢ−ｂＮＳ２を共感染させた。感染後すぐに培養物を示す量のＩＦＮアルファＡ／Ｄで処理した。ウイルス力価を感染の２日後に決定した。結果は、少なくとも４回の独立した実験からの平均値を表し、そして誤差棒は標準偏差を示す。
【図１３】ＮＳ１及びＮＳ２を発現する狂犬病ウイルス（ＲＶ）を感染させたＲＶの増加したＩＦＮ抵抗性。ＭＤＢＫ細胞にＲＶ ＳＡＤ ＶＢ、ＳＡＤ ＶＢ−ｍＮＳ１もしくはＳＡＤ ＶＢ−ｍＮＳ２を感染させるか、またはＳＡＤ ＶＢ−ｍＮＳ１とＳＡＤ ＶＢ−ｍＮＳ２もしくはＳＡＤ ＶＢ−ｂＮＳ１とＳＡＤ ＶＢ−ｂＮＳ２を共感染させた。感染後すぐに培養物を示す量のＩＦＮアルファＡ／Ｄで処理した。ウイルス力価を感染の２日後に決定した。結果は、少なくとも４回の独立した実験からの平均値を表し、そして誤差棒は標準偏差を示す。
【図１４】異種起源のＮＳ遺伝子を保有するキメラＢＲＳＶの構造。
【図１５】ＰＶＭ／ＢＲＳＶキメラは、Ｖｅｒｏ細胞上でわずかに弱毒化される。Ｖｅｒｏ細胞にＢＲＳＶ ｗｔ（黒丸）、ＢＲＳＶ ｈＮＳ１ｂＮＳ２（濃灰色四角）、ＢＲＳＶ ｈＮＳ１ｈＮＳ２（薄灰色四角）、ＢＲＳＶ ｍＮＳ１ｂＮＳ２（濃灰色三角）及びＢＲＳＶ ｍＮＳ１ｍＮＳ２（薄灰色三角）を０．１のＭＯＩで感染させた。感染性ウイルス力価を４日連続して決定した。値は、少なくとも２回の独立した実験から得られた。
【図１６】ＢＲＳＶ ｈＮＳ１ｈＮＳ２の増殖は、ＭＤＢＫ細胞上で弱毒化される。ＭＤＢＫ細胞にＢＲＳＶ ｗｔ（黒丸）及びＢＲＳＶ ｈＮＳ１ｈＮＳ２（薄灰色四角）を０．１のＭＯＩで感染させた。感染性ウイルス力価を４日連続して決定した。値は、少なくとも２回の独立した実験から得られた平均値である。
【図１７】ＢＲＳＶ ｈＮＳ１ｈＮＳ２は、ＭＤＢＫ細胞上でＩＦＮ Ｉ型に対して感受性である。Ｖｅｒｏ（Ａ）及びＭＤＢＫ（Ｂ）細胞にＢＲＳＶ ｗｔ（黒丸）及びＢＲＳＶ ｈＮＳ１ｈＮＳ２（薄灰色四角）を０．１のＭＯＩで感染させ、そしてその後、示す量の組換えＩＦＮアルファＡ／Ｄとインキュベーションした。感染性ウイルス力価を感染の３日後に決定した。値は、少なくとも２回の独立した実験から得られた。
【図１８】ＨＲＳＶ（ｈＮＳ１、ｈＮＳ２）、ＢＲＳＶ（ｂＮＳ１、ｂＮＳ２）及びＰＶＭ（ｍＮＳ１、ｍＮＳ２）；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｕ３５０３０（ＨＲＳＶ Ｌｏｎｇ株）、ＡＦ０９２９４２（ＢＲＳＶ株 ＡＴｕｅ５１９０８）及びＤ１０３３１（ＰＶＭ）のＮＳ１（図１８Ａ）及びＮＳ２タンパク質（図１８Ｂ）のアミノ酸配列の比較。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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