(57)【要約】本発明は脂肪細胞に分化する能力を有する新規なヒト前脂肪細胞系に関する。特に、本発明は、白色脂肪組織に由来する脂肪細胞系、ならびに肥満、糖尿病および心血管疾患に対する薬物、食品成分および栄養補助剤の開発におけるその使用に関する。
2004504024.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
成熟して白色脂肪細胞となり、正常な白色脂肪細胞の細胞特性を本質的に示す能力を有するヒト前脂肪細胞系。
【請求項２】
前記前脂肪細胞系から分化した脂肪細胞が、リポタンパク質リパーゼ、脂肪酸合成酵素、脂肪細胞脂肪酸結合タンパク質、レプチン、アディプシン、アディポネクチン、ペルオキシゾーム増殖剤応答性受容体γおよびβ（ＰＰＡＲγ、β）ならびにホルモン感受性リパーゼについて、正常な脂肪細胞と本質的に同一の代謝パターンを示す請求項１に記載のヒト前脂肪細胞系。
【請求項３】
ＣＮＣＭ　Ｉ−２５２０またはＣＮＣＭ　Ｉ−２６６３であるヒト前脂肪細胞系。
【請求項４】
（ａ）ヒト脂肪組織から細胞を分離するステップ、
（ｂ）（ａ）で得た細胞を脱分化し、増殖して前脂肪細胞クローンを得るステップ、
（ｃ）ステップ（ｂ）で単離した前脂肪細胞クローンを不死化するステップ、
（ｄ）不死化細胞を選択するステップ、および
（ｅ）白色脂肪細胞に分化する能力を有する細胞を選択するステップ
を含む前記請求項のいずれかに記載の前脂肪細胞の調製方法。
【請求項５】
不死化ステップが、ＳＶ４０Ｔ抗原を担持する組換えベクターを用いて実行された請求項４に記載の方法。
【請求項６】
不死化ステップが、ＨＰＶウィルスのＥ７遺伝子を担持する組換えベクターを用いて実行された請求項４に記載の方法。
【請求項７】
不死化ステップが、テロメラーゼ法によって実行された請求項４に記載の方法。
【請求項８】
不死化ステップが、ＨＰＶウィルスのＥ７遺伝子を担持する組換えベクターとテロメラーゼ逆転写酵素遺伝子を担持するウィルスを組み合わせて実行された請求項４に記載の方法。
【請求項９】
ヒト白色脂肪細胞による脂質の取り込みおよび放出の調節を制御する物質を同定するための請求項１から請求項３までのいずれかに記載の細胞系の使用。
【請求項１０】
前脂肪細胞の成熟脂肪細胞への分化を制御する物質を同定するための請求項１から請求項３までのいずれかに記載の細胞系の使用。
【請求項１１】
肥満、心血管疾患および糖尿病に対する標的の発現を制御することができる化合物をスクリーニングするための請求項１から請求項３までのいずれかに記載の細胞系の使用。
【請求項１２】
ヒト白色脂肪細胞からの任意の代謝産物またはホルモンの分泌を調節することができる化合物をスクリーニングするための請求項１から請求項３までのいずれかに記載の細胞系の使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、脂肪細胞に分化する能力を有するヒト前脂肪細胞系に関する。特に、本発明は、白色脂肪組織に由来する前脂肪細胞系、ならびに肥満、糖尿病および心臓血管疾患に対する薬剤、食品成分および栄養補助剤の開発におけるその使用に関する。
【０００２】
肥満は米国国立衛生研究所によって公衆衛生上の危険要因であると宣言されている。肥満は余剰脂肪組織の存在として定義できるが、北米人口の約３０〜５０％、また、世界的に見ても人口の相当な割合が肥満に冒されている。肥満の影響、例えば、インシュリン非依存型糖尿病、冠状動脈疾病、高血圧症は、直接的に４５８億ドルのコストをもたらし、また例えば、休業などによってさらに２３０億ドルの間接コストをもたらしていると見積もられている。
【０００３】
脂肪および炭水化物の過剰摂取は、肥満と高脂血症を引き起こし、最終的には高血圧症や動脈硬化症の発症にもつながると考えられている。したがって、脂肪および炭水化物の吸収を抑制し、蓄積した脂肪を減少させることが望ましいという点は強く認識されてきた。幼児はカロリーの過剰摂取環境に置かれると、脂肪細胞が増加して潜在的肥満と呼ぶべき状態になる。この理由から、特に幼児の脂肪細胞数増加の抑制は、子供において、したがって、成人においても肥満および肥満の併発症と呼ぶべき心臓血管疾患の予防に直接つながることが報告されている。
【０００４】
この歴然とした健康問題と闘うには、予防と治療双方のアプローチが必要である。予防目的のためには、人の肥満への傾向性や感受性を予見し、測定できるようにすることが有用であろう。治療目的のためには、脂肪細胞の発達または分化を妨害する手段が非常に有益となるであろう。こうした望ましい目的はいずれもこれまでのところ達成されていないが、これは主として脂肪組織の発達の調節および制御（例えば脂肪細胞前駆体の増殖および分化）に関してほとんど知られていないためである。
【０００５】
このような増殖および分化を制御する手段または物質をそれぞれ識別することは正常な脂肪組織の発達を理解するためにも、また、肥満のような脂肪組織発達の異常な状態を制御するためのアプローチを考えるためにも非常に重要である。
【０００６】
ある物質が脂肪組織発達の生理学的調節に関係するかどうかを決定するためには、脂肪細胞またはその前駆体がこの因子に応答的であるか、また、最終的にはこの因子がｉｎ　ｖｉｖｏで脂肪組織の発達を効率的かつ特異的に調節することができるかを調べればよいであろう。しかし、これまでは適切な研究ができていない。この事実は、主として、生体組織から得た正常な脂肪細胞の特性を示し、かつ、実験を行なうためにｉｎ　ｖｉｔｒｏで長期間、培養できるヒト脂肪組織に由来する適当な組織または細胞がなかったためである。
【０００７】
脂肪細胞すなわちアディポサイトは、脂肪組織の主要な部分を占める細胞集団であり、トリグリセリドの主要な貯蔵場所となっており、内分泌腺系細胞であるとみなされている。脂肪組織はトリグリセリドの形で身体のためのエネルギーを蓄える貯蔵庫となり、また、カロリーの摂取が同化作用の必要量以下に落ちた場合、この組織は遊離脂肪酸を放出することができる。食餌の摂取量増加に応じて身体はエネルギー・バランスを維持するため、通常自動的に活動によってエネルギー消費を増加させる。エネルギーは熱として放出することもできる。食餌の摂取を同化作用の活動とバランスさせる共通のエネルギー調節経路があり、これは大体は視床下部によって調整されている。現在では、脂肪細胞はこのプロセスにおいて積極的な役割を果たし、トリグリセリド新陳代謝をフィード・バックし、その調節を果たす分子もおそらく生産していることが明らかになっている。さらに、脂肪細胞は、末梢器官や中枢器官における重要な機能を調整するホルモンを分泌できる。最も良い例はレプチンであり、これは脂肪細胞によって分泌され、視床下部に存在する受容体を介してエネルギー代謝と満腹感を調節する。したがって、このような分子を発見して調べることは大変興味深いであろう。
【０００８】
基本的に２つのタイプの脂肪組織、褐色脂肪組織および白色脂肪組織が存在し、これらは体内で全く異なる役割を果たしている。白色脂肪は余剰カロリー摂取分を貯蔵するように設計されており、褐色脂肪はユニークなシステムを用いて余剰カロリーを吸い上げ、それを使用して体温を生成する。しかし、白色脂肪細胞は熱発生の制御に関わる非結合性タンパク質を発現することが示された。白色脂肪組織だけが成人に存続するので、白色脂肪によって引き起こされた熱発生はエネルギー消費を増加させるかもしれない。
【０００９】
したがって、本発明の目的は、体内における白色脂肪組織の役割をさらに調べる手段の提供にある。
【００１０】
本発明の別の目的は白色脂肪組織に対する新規な薬剤または食物成分の影響の調査を可能にする手段を提供することである。
【００１１】
上記の目的は、成熟白色脂肪細胞に分化する能力を有する一方、基本的に正常な白色脂肪細胞と同様な細胞特性を示す、白色脂肪細胞に由来する新規な前脂肪細胞系の提供により解決された。
【００１２】
細胞系は、分子細胞生物学の発達、特に細胞内の活動、細胞外分子の作用および細胞−細胞相互作用の解明に重要な役割を果たしてきた。細胞系は、通常、種々の細胞の集まりである組織を外植し、細胞を分離し、対象とする細胞クローンを単離し、数世代にわたって全細胞数を増加させ、集団の血統が均一化するように、細胞クローンを培養することによって段階的に確立される。しかし、これらの細胞でも、ｉｎ　ｖｉｔｒｏの培養では老化開始前の限られた世代数しか継代できない。
【００１３】
基本的に連続的に培養できる細胞は不死化細胞として知られている。これを培養することによって多くの細胞を含む均一な細胞集団が得られるので、不死化細胞は、非不死化細胞に優る多くの利点を有する。通常、不死化細胞系は、組換えウィルスまたはレトロウィルスによって調製されるが、こうした方法で不死化された細胞は細胞機能の点で何らかのバランスを欠いている。このため、不死化細胞系は、非常に多くの場合、前記の種類の細胞で通常見られる酵素または構造ポリペプチドを生産しないなど異なる同化作用のパターンを示し、それらが由来する細胞と実質的に異なっている。さらにそのために分化能力も強く影響を受ける。したがって、多くの種類の細胞は単離して連続的に培養することが困難なままであった。
【００１４】
本発明は、分化成熟して白色脂肪細胞となる能力を有する新規な不死化細胞系を提供する。この白色脂肪細胞は生体組織から得た白色脂肪細胞と基本的に同一の形態学的パターン（例えば、ポリペプチド発現や細胞の外観によって示されるもの）を示すものである。
【００１５】
本発明の前脂肪細胞系はインシュリン、トリヨードチロニン、デキサメタゾンおよびペルオキシソーム増殖剤応答性受容体（ＰＰＡＲ：ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ　ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ　ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ）のアクティベータなど、当業者には知られた化合物によって成熟白色脂肪細胞に分化することができる。このようにして得られた白色脂肪細胞は、次いで、トリグリセリド合成に関与する酵素（例えば、リポタンパク質リパーゼ、脂肪酸合成酵素、脂肪細胞脂肪酸結合タンパク質、レプチン、アディプシン（ａｄｉｐｓｉｎ）、アディポネクチン（ａｄｉｐｏｎｅｃｔｉｎ）、ペルオキシソーム増殖剤応答性受容体γ（ＰＰＡＲγ）、ホルモン感受性リパーゼなど）など、正常な白色脂肪細胞と同じ代謝マーカーを基本的に示す。白色脂肪細胞は、少なくとも１２世代、好ましくは少なくとも２０世代、より好ましくは少なくとも３０世代、最も好ましくは少なくとも５０世代を培養において維持することができる。
【００１６】
好ましい実施形態によれば、細胞系はブダペスト条約に従い２０００年７月１３日にパストゥール研究所に寄託された細胞系（寄託番号：ＣＮＣＭ　Ｉ−２５２０）または２００１年４月２７日に寄託された細胞系（寄託番号：ＣＮＣＭ　Ｉ−２６６３）のいずれかである。
【００１７】
本発明の細胞株を調製する方法は次のステップ（ａ）〜（ｅ）を含む。
【００１８】
ステップ（ａ）では、人間のドナーの適当な脂肪組織からｉｎ　ｖｉｔｒｏに白色脂肪細胞を分離する。ドナーから得た１次組織は、最初に、存在する他の細胞から脂肪細胞を分離するように、例えば、コラゲナーゼを含む溶液で組織試料を処理し、引き続いてろ過、さらに遠心分離することによって脂肪細胞を他の細胞から分離するなどの処理を行う。
【００１９】
次のステップ（ｂ）では、ステップ（ａ）の中で得られた脂肪細胞を脱分化する。これは、例えばげっ歯動物脂肪細胞について前に記載されたいわゆる「天井培養法」（ｃｅｉｌｉｎｇ　ｃｕｌｔｕｒｅ　ｍｅｔｈｏｄ）を使用して行うことができる（Ｓｕｇｉｈａｒａ　Ｈ．，Ｙｏｎｅｍｉｔｓｕ　Ｎ．，Ｍｉｙａｂａｒａ　Ｓ．，Ｙｕｎ　Ｋ．１９８６．単房性脂肪細胞の１次培養：インビトロでの成長の特徴と分化特性の変化（Ｐｒｉｍａｒｙ　ｃｕｌｔｕｒｅ　ｏｆ　ｕｎｉｌｏｃｕｌａｒ　ｆａｔ　ｃｅｌｌｓ：ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ　ｏｆ　ｇｒｏｗｔｈ　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ａｎｄ　ｃｈａｎｇｅｓ　ｉｎ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ　ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ．）、Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ，３１：４２〜４９）。この方法では、上部まで培地で満たした培養フラスコに脂肪細胞を移し、これを上下逆さまにする。この条件下では、脂肪細胞は６日後には脂質小滴を失った繊維芽細胞状の細胞に自然に脱分化した。次いで、このようにして生じた脱分化脂肪細胞を前記と同じ培養条件下に増殖させると、活発に成長する前脂肪細胞が得られる。
【００２０】
このように得られた前脂肪細胞を次のステップ（ｃ）で不死化する。これは、組換えプラスミド、組換えウィルスまたはレトロウィルス（例えば、ＳＶ４０ウィルス（サル・ウィルス）のラージＴ抗原遺伝子またはＨＰＶウィルス（ヒト乳頭腫ウィルス）のＥ６またはＥ７の遺伝子を担持する組換えレトロウィルス・ベクター）などの組換えベクターに細胞を感染させることによって行なうことができる。別法では、組換えベクターはテロメラーゼ逆転写酵素（ＴＥＲＴ）遺伝子（好ましくは不死化しようとする細胞種に由来するもの）を有する。後の方法の要点は、老化に伴う効果として知られている染色体テロメアの短縮を基本的に防止することにある。テロメアの維持および細胞の不死化はＫｉｙｏｎｏら、Ｎａｔｕｒｅ，３９６（１９９８），８４〜８８において上皮細胞について報告されており、その内容は言及により本願に組み込まれる。
【００２１】
ＳＶ４０ウィルス（サル・ウィルス）あるいはＨＰＶウィルスのＥ６またはＥ７遺伝子およびＴＥＲＴ遺伝子による連続的感染もヒト前脂肪細胞の不死化の別法となる。
【００２２】
続くステップ（ｄ）では、確実に不死化した細胞を選択する。これは、例えば、ステップ（ｃ）で得た細胞を単に数世代継代培養することにより、または、ＳＶ４０ウィルス由来の遺伝子またはＨＰＶウィルス由来の遺伝子など、不死化のために使用したベクターの遺伝子の有無について細胞を試験することにより行なうことができる。これは、抗体によるそれぞれの遺伝子の発現の検知により行ってもよいし、あるいはＰＣＲ技術による分析を含んでもよい。テロメラーゼ逆転写酵素遺伝子の発現は、テロメラーゼ反復増幅プロトコル（ＴＲＡＰ）を適用することにより決定されるテロメラーゼ活性を測定することにより検知される。
【００２３】
続くステップ（ｅ）では、ベクターの導入によって確実に不死化していることが示された細胞について、その成熟白色脂肪細胞への分化能力を試験する。この目的のために、ステップ（ｄ）で得られた細胞系を、細胞内脂質の染色によって検知できるように一般的な分化剤によって処理する。脂質の染色は、一般に、特異的に脂質を染色するオイルレッドＯ法によって行われる。
【００２４】
本発明による細胞系は、白色脂肪細胞による、脂質の取り込みおよび放出の調節を制御する役割を調べたり、前脂肪細胞の成熟した脂肪細胞への分化を制御する物質の識別、または肥満、糖尿病および心臓血管疾患用について標的発現を制御する能力を有する化合物のスクリーニングなど、様々な目的に利用できる。特に、これらの細胞系は、レプチンなどのエネルギー代謝制御に関わる化合物の脂肪細胞による放出を調節し得る因子のスクリーニングに有用かもしれない。
【００２５】
以下の例は本発明を例証するが、本発明はここに述べる特定の実施形態に限定されるものではない。
【００２６】
実施例１　ヒト皮下脂肪組織からの脂肪細胞の採取
外科手術後、肥満の患者からの皮下脂肪組織の生検試料を、ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ：Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｅａｇｌｅ’ｓ　ｍｅｄｉｕｍ）および１０％のウシ胎仔血清（ＦＣＳ）（Ｇｉｂｃｏ　ＢＲＬ）、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン／ペニシリンおよび２ｍＭグルタミンを補ったハム（Ｈａｍ）Ｆ１２培地（ｖ／ｖ）（Ｇｉｂｃｏ　ＢＲＬ）の混合物を用いて室温で維持した。この培地を基本培地と呼ぶ。脂肪組織をミンチして小片とし、組織１グラムについて消化培地３ｍｌを用い３７℃で２０分間消化した。消化培地は２ｍｇ／ｍｌのコラゲナーゼ（Ｒｏｃｈｅ　Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ）および２０ｍｇ／ｍｌのウシ血清アルブミン（シグマ）を含みＤＭＥＭ培地に溶解したものである。
【００２７】
ＦＣＳ濃度２０％とするために、等体積のＦＣＳを添加して消化を停止した。消化された流体を異なる空孔率（２５０、１００μｍ）のフィルタで２度ろ過し、１０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。脂肪細胞画分を薄い白色浮遊層として得、これを取り出して３７℃の３０ｍｌリン酸塩バッファー中に入れた。他の汚染細胞の除かれた脂肪細胞画分を得るためにこの懸濁液を遠心分離した（１０００ｒｐｍ、１０分間）。
【００２８】
実施例２　１次脂肪細胞分化および増殖
２０％ＦＣＳ、１０ｍｇ／ｍｌストレプトマイシン／ペニシリンおよび２ｍＭグルタミンを補ったハムＦ１２培地（ｖ／ｖ）と混合したＤＭＥＭで２５ｃｍ２フラスコを完全に満たし、このフラスコ中で約１０６個の脂肪細胞をインキュベートした。脂肪細胞が上面内部の表面に付着し得るようにフラスコを上下逆さまにした。適当な環境（３７℃、湿度９０％）で８日間培養した後、細胞は付着して前脂肪細胞に自然に脱分化し増殖し始めた。次いで、フラスコを本来の向きに戻し培地を取り除いた。上記の基本培地５ｍｌをフラスコに加えた。２日後、これらの条件下で細胞を感染させた。
【００２９】
実施例３　細胞不死化
１．レトロウィルスの生産
ＳＶ４０ウィルス（サル・ウィルス）のラージＴ抗原遺伝子もしくはＨＰＶウィルス（ヒト乳頭腫ウィルス）のＥ６／Ｅ７遺伝子またはヒト・テロメラーゼ逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）を含む組換えレトロウィルス・ベクターを、選択マーカーとしてヒスチジノール遺伝子を含むｐＬＨＸＳＤレトロウィルス・ベクター（Ｓｔｏｃｋｓｃｈｌａｅｄｅｒら，Ｈｕｍ　Ｇｅｎｅ　Ｔｈｅｒ．２（１９９１），３３〜３９）のＢａｍＨＩサイトに標準的な組み換えＤＮＡ技術によって挿入することにより構築した。
【００３０】
両種指向性（ａｍｐｈｏｔｒｏｐｉｃ）パッケージング細胞系であるフェニックス（Ｐｈｏｅｎｉｘ）（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）への組換えレトロウィルス・ベクターのトランスフェクション後、「ピンポン」感染により高タイター・ウィルスを製造するため同種指向性（ｅｃｏｔｒｏｐｉｃ）パッケージング細胞系Ｐｓｉ２（ＡＴＣＣ）との共培養によって伝染性の組換えウィルス粒子を生成した（Ｌｙｎｃｈ　Ｃ，Ｍｉｌｌｅｒ　Ｄ．１９９１．パッケージング細胞の様々な宿主手段との共培養による高ヘルパーウイルスフリーレトロウイルスベクターの製造（Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｈｉｇｈ　ｈｅｌｐｅｒ　ｖｉｒｕｓ−ｆｒｅｅ　ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ　ｖｅｃｔｏｒｓ　ｂｙ　ｃｏｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｐａｃｋａｇｉｎｇ　ｃｅｌｌｓ　ｗｉｔｈ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｈｏｓｔ　ｒａｃｉｐｅｓ．）、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６５：３８８７〜３８９０）。
【００３１】
２．１次脂肪細胞の感染
前記のようにして製造した伝染性の組換えウィルス粒子を用いて、実施例２によって得た１次ヒト脱分化脂肪細胞を感染させた。細胞を２０μｇ／ｍｌ　ＤＥＡＥデキストランの存在下、組換えウィルスとともに３７℃（湿度９０％）で３時間インキュベートした。感染後に、培地を基本培地と交換した。
【００３２】
感染１０日後に、１次クローンを吸引によって拾い上げ、別々に展開した。
ＳＶ４０Ｔ抗原：
５’ＧＧＡＴＴＣＡＧＴＧＧＴＧＴＡＴＧＡＣＴ；
５’ＡＧＧＣＡＣＡＣＴＧＴＡＣＴＣＡＴＴＣＡ；
Ｅ７：
５’ＧＧＡＧＡＴＡＣＡＣＣＴＡＣＡＴＴＧＣＡ；
５’ＧＡＴＧＧＧＧＣＡＣＡＣＡＡＴＴＣＣＴＡ
（すべてＭｉｃｒｏｓｙｎｔｈから購入した）
を用いて、様々なクローン中のＳＶ４０Ｔ抗原またはＥ７遺伝子の発現をＲＴ−ＰＣＲを使用して測定し、ヒトＳＶ４０Ｔ抗原（発癌遺伝子）に対するマウス単クローン抗体を利用した免疫染色によって測定した。テロメラーゼ活性をキムら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６６（１９９４），２０１１〜２０１５によるテロメラーゼ反復増幅プロトコル（ＴＲＡＰ）を適用して決定した。
【００３３】
実施例４　感染した細胞の分化
実施例３で得た７ＳＶ４０Ｔ抗原、Ｅ７、ＴＥＲＴまたはＥ７およびＴＥＲＴ陽性の細胞を、実施例１で定義した基本培地中でインキュベートして集密化させ、その段階で脂肪生成用混合物（カクテル）を培地に加えた。この混合物は、基本培地を含み、また８５０ｎＭインシュリン、１０μｇ／ｍｌトランスフェリン、１ｎＭトリヨードチロニン、５００μＭフェチュイン（ｆｅｔｕｉｎ）、３３μＭパントテン酸、１ｍＭヘペス（Ｈｅｐｅｓ）、１５ｍＭ　ＮａＨＣ０３および１μＭデキサメタゾン、およびｌμＭ　ＢＲＬ４９６５３、ＰＰＡＲγアゴニストを補ったものである。次いで、細胞のインキュべーションを続けた。１０日目には、集密化した細胞が細胞内脂質小滴（特異的染色で観察）を有する脂肪細胞的発現型を示し始めた。１０％ホルムアルデヒドで固定した細胞をイソプロピルアルコールに溶解した染料とともに２時間インキュベートし、オイルレッドＯで染色した。次いで、細胞を水で洗浄し顕微鏡で観察した。分化した脂肪細胞は、脂質小滴の蓄積に対応する細胞質中の赤い点で満たされた細胞として現われた。
【００３４】
実施例５　分化した不死化ヒト前脂肪細胞中での細胞脂肪の発現
細胞系ＣＮＣＭ　Ｉ−２５５０（前記実施例で得たものと同様）の集密化した不死化ヒト前脂肪細胞を、実施例４に記載した無血清化学培地で培養した。
【００３５】
集密化後１７日目に、細胞をハンク平衡塩溶液で洗浄し、ＲＮｅａｓｙ全ＲＮＡ精製システム（Ｑｉａｇｅｎ　ＡＧ（スイス））を使用してＲＮＡを抽出した。ＲＴ−ＰＣＲ用第１鎖ｃＤＮＡ合成キット（ＡＭＶ；Ｒｏｃｈｅ　Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ、スイス）を使用し、オリゴｄ（Ｔ）１５をプライマーとして用いて全ＲＮＡ２μｇの入力に対して逆転写を行った。興味のあるｃＤＮＡの増幅のために使用したプライマーは、Ｍｙｃｒｏｓｙｎｔｈ（ヴィンディッシュ（スイス））によって合成された。
【００３６】
順方向および逆方向のプライマーの配列は以下のとおりであった：
【００３７】
2004504024.tif 000003
【００３８】
ＰＣＲ反応は、ＤＮＡ熱サイクラー装置（Ｂｉｏｃｏｎｃｅｐｔ、ＡｌＩｓｃｈｗｉｌ、スイス）中、９８℃、１分、６０℃、２分および７２℃、２分の加熱を２サイクル、次いで、９４℃、１分の変性ステップ、６０℃、１分のアニーリングステップおよび７２℃、２分の伸張ステップを２８サイクル行った。
【００３９】
内部対照としてアクチンプライマーを反応に含ませた。ＰＣＲ産物（１０μｌ）は、２％アガロース・ゲル上で分離し、エチジウムブロミドで染色することにより可視化した。
【００４０】
結果は、調べた細胞系が、そのままの脂肪組織と本質的に同じようにそれぞれの脂肪細胞マーカーを発現することを明確に示している。
【図面の簡単な説明】
【図１】
前脂肪細胞を得た方法を概略的に示す図である。
【図２】
ＲＴ−ＰＣＲおよび免疫蛍光検査法によって分析した様々な不死化クローン中でのＳＶ４０ラージＴ抗原の発現を示す図である。
【図３】
様々な脂肪生成条件下での細胞分化を示す図である。
【図４】
細胞系中の脂肪細胞分化の様々なマーカーの発現パターンをヒト脂肪組織と比較して調べた実験結果を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
2004504024.tif 000035
2004504024.tif 000036
2004504024.tif 000037