(57)【要約】本発明は、少なくとも１のバインダー分子を同定する方法であって、（ａ）所望のポリペプチドまたはタンパク質中の２種のアミノ酸型（ＡＡ１とＡＡ２）を選択し、ここでＡＡ２は、該ポリペプチドまたはタンパク質のアミノ酸配列中のＡＡ１に直接的に続いて少なくとも一度存在し、アミノ酸対ＡＡ１−ＡＡ２を定義する；（ｂ）所望のポリペプチドまたはタンパク質中の該２種のアミノ酸型（ＡＡ１とＡＡ２）を標識し、ここですべてのＡＡ１残基を１３Ｃで、およびすべてのＡＡ２残基を１５Ｎで標識する；（ｃ）ステップ（ｂ）からの標識されたポリペプチドまたはタンパク質の第１のＨＮＣＯ−型ＮＭＲスペクトルを作成し、ここで該標識したアミノ酸対ＡＡ１−ＡＡ２からのシグナルを同定する；（ｄ）該標識したポリペプチドまたはタンパク質を、可能性のあるバインダー分子またはバインダー分子の混合物と、可能性のあるバインダー分子（複数もある）と標識したポリペプチドまたはタンパク質の結合を可能とする条件および十分な時間で、接触させる；（ｅ）ステップ（ｄ）の、第２のＨＮＣＯ型ＮＭＲスペクトル、または１Ｈ−１５Ｎ相関型ＮＭＲスペクトルを作成し、ステップ（ｃ）で同定されるシグナルを監視する；（ｆ）第１および第２のＮＭＲスペクトルを比較し、ここで２種のスペクトル間のステップ（ｃ）で同定したシグナルの化学シフト変化が、可能性のあるバインダー分子および標識したポリペプチドまたはタンパク質間の相互作用を指示する；ステップを含む方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１個のバインダー分子を同定するための方法であって、
（ａ）所望のポリペプチドまたはタンパク質中の２種のアミノ酸型（ＡＡ１とＡＡ２）を選択し、アミノ酸対ＡＡ１−ＡＡ２を定義し、ここでＡＡ２は、該ポリペプチドまたはタンパク質のアミノ酸配列中でＡＡ１に直接的に続いて少なくとも一度存在する；
（ｂ）該所望のポリペプチドまたはタンパク質中の該２種のアミノ酸型（ＡＡ１とＡＡ２）を標識し、ここですべてのＡＡ１残基を１３Ｃで、およびすべてのＡＡ２残基を１５Ｎで標識する；
（ｃ）ステップ（ｂ）からの標識されたポリペプチドまたはタンパク質の第１のＨＮＣＯ−型ＮＭＲスペクトルを作成し、ここで該標識したアミノ酸対ＡＡ１−ＡＡ２からのシグナルを同定する；
（ｄ）該標識したポリペプチドまたはタンパク質を、可能性のあるバインダー分子またはバインダー分子の混合物と、該可能性のあるバインダー分子（複数もある）と該標識したポリペプチドまたはタンパク質の結合を可能とする条件および十分な時間で、接触させる；
（ｅ）ステップ（ｄ）からの混合物の、第２のＨＮＣＯ型ＮＭＲスペクトル、または１Ｈ−１５Ｎ相関型ＮＭＲスペクトルを作成し、ステップ（ｃ）で同定されるシグナルを監視する；
（ｆ）該第１および第２のＮＭＲスペクトルを比較し、ここで２種のスペクトル間のステップ（ｃ）で同定されたシグナルの化学シフト変化が、該可能性のあるバインダー分子と該標識したポリペプチドまたはタンパク質間の相互作用を指示する；
ステップを含む方法。
【請求項２】
該標識されたアミノ酸対ＡＡ１−ＡＡ２が、１０オングストロームの球半径内、好ましくは５０オングストロームの球半径内、最も好ましくはポリペプチドまたはタンパク質全体内で独特である、請求項１の方法。
【請求項３】
該標識されたアミノ酸対ＡＡ１−ＡＡ２が、ポリペプチドまたはタンパク質の結合ポケット内にある、請求項１または２の方法。
【請求項４】
該標識されたアミノ酸対ＡＡ１−ＡＡ２が、ポリペプチドまたはタンパク質内で活性部位付近にある、請求項１または２の方法。
【請求項５】
該方法の結果を、任意の他の好適な結合または活性部位の結果と比較する、請求項１または２の方法。
【請求項６】
該ポリペプチドまたはタンパク質が１０−１５０ｋＤのサイズを有する、請求項１ないし５のいずれかの方法。
【請求項７】
該可能性のあるバインダー分子が、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体、核酸分子、炭水化物、または１または２以上の前記分子型の複合体である、請求項１ないし６のいずれかの方法。
【請求項８】
該可能性のあるバインダー分子が、比較的小分子、好ましくは５０−１０００Ｄのサイズ範囲にある、請求項１ないし７のいずれかの方法。
【請求項９】
該方法が、化合物ライブラリーをスクリーニングするために使用される請求項１ないし８のいずれかの方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
技術分野
本発明は、種々の化合物の、ポリペプチドまたはタンパク質ヘの結合をアッセイするための、核磁気共鳴（ＮＭＲ）に基づく方法に関する。より具体的には、該方法は、ポリペプチドまたはタンパク質の表面上の指定された結合エピトープへの結合のスクリーニングを可能とする。
【０００２】
技術的背景
現代の生物学および医学では、小および大生物分子の構造、並びに種々の分子および化合物の間の相互作用を調査することを可能とする、物理的方法の要請があった。この目的のために、幾つかの強力な技術、例えば、ｘ線結晶学、質量分析法、および核磁気共鳴（ＮＭＲ）が適用された。
【０００３】
近年、ＮＭＲ分光学は、リード鋳型（ｌｅａｄ ｔｅｍｐｌａｔｅ）を同定するための、ＮＭＲに基づくスクリーニング方法の出現によって、薬物発見プロセスにおける重要な手段となった。幾つかの技術が導入され（Ｓｈｕｋｅｒ， １９９６； Ｃｈｅｎ， １９９８；Ｍａｙｅｒ， １９９９； Ｃｈｅｎ， ２０００； Ｊａｈｎｋｅ， ２０００）、恐らく最も周知のものは、１９９６年にＦｅｓｉｋおよび協力者によって記載された「ＮＭＲによるＳＡＲ」方法である。（ＷＯ９７／１８４７１， Ｓｈｕｋｅｒ， １９９６ ａｎｄ ＥＰ−Ｂ１−０８６６９６７）。ＮＭＲによるＳＡＲ技術は、標的タンパク質に結合する化合物を同定するための２次元１Ｈ−１５Ｎ相関スペクトルにおける化学シフトの変化を同定することによる。第１リガンドが同定されたとき、第２リガンドを、第１リガンドの飽和濃度の存在下で探す（「第２部位」バインダーのスクリーンニング）。タンパク質の３次元構造が既知であり、そして該タンパク質バックボーン共鳴の配列特異的ＮＭＲ値割り当てが取得されたならば、該２種のリガンドを構造的データに基づいて連結し得る。１次の近似化のために、連結される化合物の結合親和性は、個々の化合物の結合親和性の産物であり、出発化合物がミリモルないしマイクロモルの親和性しか有しないとしても、高親和性「ナノモルバインダー」という結果となる。
【０００４】
ＮＭＲによるＳＡＲ法のための必須なことは、配列特異的共鳴の値割り当てが、標的タンパク質のバックボーンＮＭＲ共鳴（１５Ｎ、１３Ｃα、１３Ｃ’、１ＨＮ）について取得されていることである。これは、数ヶ月の実験作業および比較的小タンパク質についてさえデータ分析を要する恐るべき仕事である。
【０００５】
大タンパク質の構造調査のために、Ｙａｂｕｋｉ ｅｔ ａｌ．， １９９８は、ペプチド配列中の２つの部位特異的標識化に関係する方法であって、それぞれ１３Ｃおよび１５Ｎを有するアミノ酸に従う方法を開示している。これは、取りこみを妨害する問題を回避するため、いわゆる細胞フリー系で実施される。これによって、１ＪＣＮ−カップリングのために、十分なスペクトル中のたった１シグナルを調査することが可能である。この記事は、ヒトｃ−Ｈａ−Ｒａｓタンパク質の構造調査のための細胞フリー合成の方法の開発、並びにタンパク質−タンパク質相互作用に主に焦点がある。
【０００６】
よって、標的タンパク質中の特異的部位、例えば、活性部位ヘの小バインダー分子をスクリーニングするための既知技術は、それらは時間がかかり、そして多くの実験的作業並びに得られたデータの複雑な解釈に関係する点で、いくつかの不利がある。こうして、特異的標的ヘのバインダー分子の同定を、より容易かつより効率的なやり方で可能とし、それによって実験的作業を制限する方法の必要性がある。
【０００７】
本発明の目的は、先行技術の、欠点を減少させ、そして可能性を拡張することである。
【０００８】
発明の要約
この目的は、本発明にしたがって、少なくとも１個のバインダー分子を同定するための方法であって、
（ａ）所望のポリペプチドまたはタンパク質中の２種のアミノ酸型（ＡＡ１とＡＡ２）を選択し、アミノ酸対ＡＡ１−ＡＡ２を定義し、ここでＡＡ２は、該ポリペプチドまたはタンパク質のアミノ酸配列中でＡＡ１に直接的に続いて少なくとも一度存在する；
（ｂ）所望のポリペプチドまたはタンパク質中の該２種のアミノ酸型（ＡＡ１とＡＡ２）を標識し、ここですべてのＡＡ１残基を１３Ｃで、およびすべてのＡＡ２残基を１５Ｎで標識する；
（ｃ）ステップ（ｂ）からの標識されたポリペプチドまたはタンパク質の第１のＨＮＣＯ−型ＮＭＲスペクトルを作成し、ここで該標識したアミノ酸対ＡＡ１−ＡＡ２からのシグナルを同定する；
（ｄ）該標識したポリペプチドまたはタンパク質を、可能性のあるバインダー分子またはバインダー分子の混合物と、可能性のあるバインダー分子（複数もある）と標識したポリペプチドまたはタンパク質の結合を可能とする条件および十分な時間で、接触させる；
（ｅ）ステップ（ｄ）からの混合物の、第２のＨＮＣＯ型ＮＭＲスペクトル、または１Ｈ−１５Ｎ相関型ＮＭＲスペクトルを作成し、ステップ（ｃ）で同定されるシグナルを監視する；
（ｆ）第１および第２のＮＭＲスペクトルを比較し、ここで２種のスペクトル間のステップ（ｃ）で同定したシグナルの化学シフト変化が、可能性のあるバインダー分子および標識したポリペプチドまたはタンパク質間の相互作用を指示する；
ステップを含む方法によって解決される。
【０００９】
これによって、薬物分子スクリーニングの分野で、大タンパク質の構造調査からの努力を使用することによって、発明者は、標的分子ヘのバインダー分子の容易な同定を可能とする方法を、予測できないことには提供する。
【００１０】
本発明のなおさらなる側面は、該標識したアミノ酸対ＡＡ１−ＡＡ２が、１０オングストロームの球半径内、好ましくは５０オングストロームの球半径内、そして最も好ましくはポリペプチドまたはタンパク質全体の内で独特である方法である。
【００１１】
本発明のある実施態様は、該標識したアミノ酸対ＡＡ１−ＡＡ２が該ポリペプチドまたはタンパク質の結合ポケット内である方法である。これは、単一結合部位ヘの結合のスクリーニングを可能とする。該要件は、独特なアミノ酸対が該結合ポケット中に存在することである。
【００１２】
本発明のさらなる実施態様は、該標識したアミノ酸対ＡＡ１−ＡＡ２が、該ポリペプチドまたはタンパク質内の活性部位の付近、好ましくは１５オングストロームより近くにある方法である。これは、該ポリペプチドまたはタンパク質の活性部位の付近の特異性のスクリーニングを可能とする。もし該標的タンパク質が活性部位の付近に１または２以上の独特なアミノ酸対を有し、それによって該独特なアミノ酸対が、同じタンパク質ファミリーの他のメンバーと異なるならば、これを選択性のスクリーニングに使用でき、すなわち同じファミリーの異なるタンパク質を比較することができる。異なる化合物は、異なる化学シフトを与え得、なぜなら特異性スクリーニングを可能とする活性部位からの最長距離が、変化するからである。
【００１３】
本発明のなおさらなる実施態様は、該方法の結果を他の好適な結合または活性アッセイ、例えば、蛍光に基づくアッセイ、レポーター遺伝子アッセイ、置換アッセイまたはＥＬＩＳＡの結果と比較する方法である。これはこの特異的に標識された部位への結合の急速な確認を可能とし、または任意の他の好適な方法によってより徹底的な調査の候補の選択を可能とする。
【００１４】
よって、本発明のさらなる側面にしたがって、該方法を化合物ライブラリーのスクリーニングのために使用する。
【００１５】
図面の簡単な説明
図１；ＰＴＰ１Ｂの部位特異的標識。すべてのアルギニンおよびアスパルテート残基を、それぞれ１３Ｃおよび１５Ｎで富化した。該配列中に唯一の独特なＡｒｇ−Ａｓｐ対（ボックス付）がある。
【００１６】
図２；１５Ｎ−Ａｓｐ、１３Ｃ−Ａｒｇ標識したＰＴＰ１Ｂの２Ｄ  ＮＭＲスペクトル。Ａ）遊離タンパク質の２Ｄ  ＴＲＯＳＹ、Ｂ）遊離タンパク質の２ＤＤＮＣＯ、Ｃ−Ｆ）Ｃ）遊離タンパク質の２Ｄ  ＴＲＯＳＹスペクトル、Ｄ）タンパク質＋化合物カクテル、Ｅ）タンパク質＋ＰＮＵ１７９９８３を省略している化合物カクテルおよびＦ）タンパク質＋ＰＮＵ１７９９８３。
【００１７】
図３；５つの選択的に標識したアミノ酸残基対を示すＰＴＰ１ｂのリボン描写。「Ｙループ対」Ａｒｇ４７−Ａｓｐ４８（Ｉ）およびＡｒｇ４３−Ａｓｎ４４（ＩＩ）を示し、並びにＡｒｇ１５６−Ｇｌｎ１５７（ＩＩＩ）、Ａｒｇ１６９−Ｇｌｕ１７０（ＩＶ）およびＡｒｇ１９９−Ｇｌｕ２００（Ｖ）および活性部位システイン（ＶＩ）。
【００１８】
図４；すべての化合物を、比色アッセイで試験した。１μＭ  ＰＴＰ１Ｂ、  ２ｍＭ  パラ−ニトロフェニルフォスフェート（基質）および１ｍＭ  化合物を、２０ｍＭ  ｐＨ７．５のトリス−ＨＣｌバッファー中で調製し、そして室温で５分間インキュベートした。反応を、ＮａＯＨを添加して、ｐＨを上昇させて、停止させた。阻害の量を、得られた産物（パラ−ニトロフェノール）の測定された吸光度から計算した。
【００１９】
図５；２．２オングストローム解像度の予備的ｘ線結晶学電子密度地図から決定されるような、ＰＴＰ１Ｂへ結合するＰＮＵ１７９９８３の立体図。ＰＮＵ１７９９８３は明かに、活性残基と相互作用するだけでなく、また水素結合を介しＹループ（強調）との接近した接触を有する。ＰＮＵ１７９９８３とＹループの間の最も接近した距離は、近似的に２．８オングストロームである。結晶は、０．１Ｍ  ｐＨ６．５  カコジレートバッファー、０．２Ｍ  Ｍｇアセテート、１６−２０％  ＰＥＧ８０００中の２ｍＭ  阻害剤の存在下で成長した。該結晶は空間群Ｐ２２２に属し、セルディメンジョンは、ａ＝５３．２オングストローム、ｂ＝８４．３オングストローム、ｃ＝８８．７オングストローム、アルファ＝ベータ＝ガンマ＝９０であった。データは、Ｒｓｙｍ＝６．７％を有する２．２オングストロームに及ぶ。データは加工し、モデルはＲ＝２５％にリファインした。
【００２０】
図６は、本発明の１実施態様の概略図である（単一結合部位付近への結合についてスクリーニング）。適用Ｉ：単一結合部位への結合についてのスクリーニング。
【００２１】
図７は、本発明のさらなる実施態様の概略図である（活性部位付近の特異性についてのスクリーニング）。適用ＩＩ：活性部位付近の特異性についてのスクリーニング。
【００２２】
図８；２００μＭの、１３Ｃ’−Ｖａｌ、１５Ｎ−Ａｌａで選択的に標識したＭ−ＦＡＢＰサンプルで、ＮＭＲスペクトルを記録した。該スペクトルを、標準的技術を使用して、６００ＭＨｚ  Ｖａｒｉａｎ Ｕｎｉｔｙ ＩＮＯＶＡ ＮＭＲスペクトロメーターで、２０℃で記録した。該サンプルを、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＤＴＴおよび０．０２％  ＮａＮ３を含む２０ｍＭ  リン酸ナトリウムバッファー（１０％  Ｄ２Ｏ／９０％Ｈ２Ｏ）ｐＨ７．４中で調製した。ＮｍｒＰｉｐｅ（Ｄｅｌａｇｌｉｏ ｅｔ ａｌ．， １９９５）をデータ加工のために使用した。（ａ）２Ｄ  １Ｈ−１５Ｎｆａｓｔ−ＨＳＱＣ（Ｍｏｒｉ ｅｔ ａｌ．， １９９５）、（ｂ）２Ｄ  ＨＮＣＯおよび（ｃ）１Ｄ  ＨＮＣＯ。パネルｂおよびｃのＨＮＣＯスペクトルは、アラニン３３（パネルａのローマ数字ＩＩ）に対応する共鳴を同定する。実験時間はそれぞれ、１時間、４時間および２０分であった。
【００２３】
図９；図８ａのアラニン３３クロスピークに対応する領域を示す、６００ＭＨｚで記録された１Ｈ−１５Ｎ  ｆＨＳＱＣスペクトルのプロット。実験条件は、図８で記載のものと同一であった。ただしスペクトルｂ−ｄに使用されるサンプルは、追加的に１％  ｄ−ＤＭＳＯを含んだ。（ａ−ｄ）遊離Ｍ−ＦＡＢＰの参照スペクトル。（ｂ）Ｍ−ＦＡＢＰおよび化合物カクテルの１：１混合物。（ｃ）Ｍ−ＦＡＢＰと、オレイン酸を欠く化合物カクテルの１：１混合物。（ｄ）Ｍ−ＦＡＢＰとオレイン酸の１：１混合物。
【００２４】
発明の詳細な記載
「化合物ライブラリー」は、例えば、巨大分子に結合するアッセイのために使用できる化学的化合物のセットを意味する。該化合物ライブラリーは、約２−１００，０００化合物、好ましくは１００−１０００化合物を含み得る。ライブラリーの化合物は任意の大きさ、好ましくは５０−１０００Ｄであることができる。化合物は任意の有機分子または天然産物であることができる。
【００２５】
「所望のポリペプチドまたはタンパク質」は、可能性のある結合エピトープを有するアミノ酸配列またはアミノ酸配列の複合体を意味する。
【００２６】
「可能性のある結合分子」は、所望のポリペプチドまたはタンパク質に結合し得る、そして化合物ライブラリーのメンバーであり得る、化学的化合物を意味する。可能性のあるバインダー分子は、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体、核酸分子、炭水化物、または述べた分子型の１または２以上の一部または複合体、または任意の他の所望の化学的化合物を意味する。好ましくは、可能性のあるバインダー分子は比較的小分子、例えば、５０−１０００Ｄのサイズ範囲の分子である。
【００２７】
「ＡＡ１」および「ＡＡ２」は、約２０の天然に存在するアミノ酸型のいずれかであることができる。さらに、ＡＡ１および／またはＡＡ２はまた、１ＪＣＮ−カップリングを検出することが可能である限り、アミノ酸の任意の修飾された変異体であり得る。ＡＡ１とＡＡ２は、同じまたは異なる型であり得る。
【００２８】
アミノ酸配列中のＡＡ１に、すくなくとも一度「直接的に続いて」存在するＡＡ２は、この場合のＡＡ１が配列位置ｎ−１を有し、そしてＡＡ２が配列位置ｎを有することを意味する。
【００２９】
「ＡＡ１−ＡＡ２対」は、配列中で互いに直接的に続くアミノ酸の対である。ここでＡＡ１は、アミノ酸配列中でｎ−１の数およびＡＡ２はｎの数を有する。
【００３０】
「結合ポケット」は、可能性のあるバインダー分子の結合を可能とすることが予測される、所望のポリペプチドまたはタンパク質上のエピトープを意味する。
「球半径」は、この文脈ではアミノ酸の規定された対（ＡＡ１−ＡＡ２）からの任意の方向の空間中の規定された距離を意味する。
【００３１】
本発明の中核は、広くは使用されていなかった配列特異的標識化方法のリバイバルである［Ｋａｉｎｏｓｈｏ， １９８２， Ｋａｔｏ， １９９１， Ｙａｂｕｋｉ， １９９１］。すべてのアミノ酸ＡＡ１は、１３Ｃで標識され、そしてすべてのアミノ酸ＡＡ２は１５Ｎで標識される。もし、１つのＡＡ１−ＡＡ２対のみが、該アミノ酸配列中に存在するならば、１Ｄカルボニル１３Ｃスペクトル中の１のシグナルのみが１ＪＣＮカップリングによる分裂を示す。あきらかに１のピークのみが、１Ｄ（または２Ｄまたは３Ｄ）ＨＮＣＯ型相関スペクトル中に出現する（図１）。
【００３２】
標識化戦略は、間接的な意味で、専ら配列特異的である。すなわち、標識されたアミノ酸残基の独特な対の存在は、配列特異性を付与する。この技術を使用して、配列特異的な値割り当ての必要性なく、選択されたエピトープに結合することについて選択的にスクリーニングすることが可能である。ＨＮＣＯスペクトルはこうして、スクリーニング実験として直接的に（１Ｄまたは２Ｄバージョン）、または２Ｄ１Ｈ−１５Ｎ相関スペクトルで監視すべきシグナルがなにかを同定するため、間接的に使用できる。可能性のあるリガンドを添加するときの化学シフトの摂動を、選択的に標識したサンプルの使用に起因する減少したスペクトル複雑性のために、大タンパク質についてさえ容易に検出する。
【００３３】
部位特異性は標識化技術に固有であり、そして重要なことは、スクリーニングされるべき結合部位中の独特な配列モチーフを見出すことである。３００アミノ酸残基のタンパク質を想定し、全２０アミノ酸残基の等しい、かつ無作為分布を仮定するならば、所定のアミノ酸残基対が配列中に一度のみ存在する確率は、近似的に０．５である。望まれる部位は、独特な対を発見する確率がかなり高い、すなわち８５−９５％である、少なくとも３−４つの好適な対を含む。
【００３４】
配列特異的標識されたタンパク質を取得する最も信頼できるやりかたは、Ｙａｂｕｋｉ ｅｔ ａｌ．［Ｙａｂｕｋｉ， １９９８］によって記載のとおり細胞フリー合成を使用してタンパク質を過剰発現させることである。代替的に、該タンパク質は、選択的アミノ酸富化の特定の型に好適な遺伝子損傷を有する細菌筋株を使用して、標識したアミノ酸を含むリッチ培地で過剰発現させ得る［Ｍｕｃｈｍｏｒｅ， １９８９］。好ましい場合ではしかし、すべてのアミノ酸およびヌクレオチドを含むリッチ培地中で、原栄養性細菌菌株を使用して、よい結果が報告された［ｋａｉｎｏｓｈｏ， １９８２］［Ｍｕｃｈｍｏｒｅ， １９８９］。
【００３５】
本発明の１実施態様にしたがって、該方法は、単一結合部位に結合することについてのスクリーニングのために使用できる（図６）。これは、もし所望の標的タンパク質またはペプチドが、可能性のある結合部位内で、少なくとも１の独特なアミノ酸対（基本構造中互いに隣接する２アミノ酸）を有するならば、実施できる。次いで、この独特なアミノ酸対を、本発明の方法にしたがって標識し、そして結合部位と可能性のあるバインダー分子の間の相互作用を調査することができる。
【００３６】
本発明のさらなる実施態様にしたがって、該方法を近接の活性部位における特異性についてスクリーニングするために使用できる（図７）。これは、所望の標的タンパク質またはポリペプチドが、活性部位に近接して（好ましくは１５オングストロームより近い、そしてより好ましくは５−１５オングストローム以内）中の少なくとも１の独特なアミノ酸対を有するならば、達成できる。さらに、標的タンパク質が他のタンパク質と比較して少なくとも１の独特なアミノ酸を有するという点で、同じタンパク質ファミリー内の他のタンパク質と異なるならば、これを使用して、標的タンパク質ヘの可能性のあるバインダー分子の選択性についてスクリーニングすることができる。これは、ファミリーの他のタンパク質と異なる、独特なアミノ酸が、三次構造の点では活性部位に近いが、１次構造の点では必ずしも近くないかもしれないことを意味する。しかし、独特なアミノ酸は、好ましくは活性部位内にあるべきではない。
【００３７】
本発明のなおさらなる実施態様にしたがって、本発明の方法を、任意の他の好適な結合または活性アッセイ、例えば、蛍光に基づくアッセイ、レポーター遺伝子アッセイ、置換アッセイまたはＥＬＩＳＡと組み合わせて使用し、その方法の結果を確認し、または興味の持たれる化合物をスクリーニングし得、次いで他の方法によってより徹底的に調査する。本発明の方法をこの側面で有利に使用し、それは、信頼できる結果を急速にもたらす方法を提供する。これは、調査されるタンパク質についてＸ線データがないがコンピューターモデリングデータのみあるときに有用である。
【００３８】
可能性のあるバインダー分子および標識された所望のタンパク質またはポリペプチドが相互作用し、かつＮＭＲによって相互作用を監視することを可能とするのに好適な条件は、タンパク質ＮＭＲについて標準的な条件である［Ｃａｖａｎａｇｈ］（バッファー性溶液、ｐＨ安定維持、反応温度５−５０℃）。好ましくは標的タンパク質濃度は、２５μＭ−１ｍＭの範囲であり、そして可能性のあるバインダー分子濃度は２５μＭ−１ｍＭの範囲であり得る。
【００３９】
関連すると考えられる化学シフトを変化させるために、該変化は天然の線幅と等しい、またはそれより大きくあるべきであり、または該シグナルは、検出限界を超えて交換により広げられるべきである。
さらに、本発明の方法を競合結合分析実験のために使用し得る。
【００４０】
まとめると、この新規技術は、部位特異的な態様で、タンパク質標的をスクリーニングし、そしてバインダーを同定する新規アプローチを提示する。これは、特定の部位（複数含む）についての結合優先性で、（小さい化合物ライブラリーをスクリーニングすることによって）スキャフォールドの同定を可能とし、これはタンパク質ファミリー内のある種の標的に対する特異性を付与し得、そしてまた他の好適な結合または活性アッセイ、例えば、蛍光に基づくアッセイ、レポーター遺伝子アッセイ、置換アッセイまたはＥＬＩＳＡを使用して検出されるヒットから、結合様式を確認し得る。
【００４１】
また、該新規技術は、伝統的ＳＡＲ−ＢＹ−ＮＭＲよりずっと大きいサイズのタンパク質のＮＭＲ調査を可能とする可能性を有し、なぜなら本質的に値割り当てのないタンパク質共鳴を企図しなければならないからである。近似的に３０ｋＤまでのサイズのタンパク質のみ、調査可能であることが便宜である。本発明の方法によって、５０ｋＤのサイズ、そして最も恐らくは１００ｋＤまでのサイズのタンパク質を監視できる。サンプル調製を、以前記載のプロトコールにしたがって調製できる［Ｍｕｃｈｍｏｒｅ １９８９， Ｙａｂｕｋｉ １９９８］。
【００４２】
本発明の分野に関連のあるＮＭＲ分光学または実験的アプローチの更なる詳細のために、ＷＯ９７／１８４７１およびＣａｖａｎａｇｈ， １９９６を引用によりここに含める。
以下に、本発明を以下の実施例によって説明し、これは本発明を例示のみし、そして本発明をいかなる意味でも限定しない。
【００４３】
実施例
実施例１：タンパク質チロシンフォスファターゼ−１Ｂ（ＰＴＰ１Ｂ）（配列番号１）のＹ−ループへの結合についてのスクリーニング
ＰＴＰ１Ｂ（３５ｋＤ、単一ドメインタンパク質）は、ホスホチロシンを脱リン酸化するタンパク質である。活性部位結合切断は、活性システイン残基周辺に中心がある。ＰＴＰ１ＢのいわゆるＹ−ループは、幾つかのリガンドの結合のために重要であるものと考えられた。Ｙ−ループは、配列中で独特である配列モチーフ、すなわちＡｒｇ４７−Ａｓｐ４８を含む（図１）。ＰＴＰ１Ｂの選択的な標識されたサンプルを調製し、この部位への結合を監視した。
【００４４】
部位特異的標識化ＰＴＰ１Ｂ（残基１−２９８）を、形質転換Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞から調製した。細菌を、Ｍｕｃｈｍｏｒｅ ｅｔ ａｌ．［Ｍｕｃｈｍｏｒｅ， １９８９］によって記載のプロトコルにしたがって、すべての２０アミノ酸および５ヌクレオチドを含むリッチ培地中で成長させた。アスパルテートおよびアルギニンを、それぞれ１５Ｎ−富化および１３Ｃ−富化して供した。該サンプルを調製するためのこのプロトコル（すなわち、原栄養性細菌菌株の使用）は、選択的に１５Ｎ−Ａｓｐ富化タンパク質の生産のためには最適ではないことが、注意されるべきである。アミノトランスフェラーゼ活性は、他のアミノ酸残基中の１５Ｎのミス取りこみを引き起こし得る。Ａｓｐの場合について、Ａｓｎ、ＧｌｕおよびＧｌｎ残基の取りこみがみられ得る［Ｍｕｃｈｍｏｒｅ， １９８９］。にもかかわらず、１５Ｎ標識のミス取りこみのリスクは、本発明を決して限定しない。もし、特定の型の選択的アミノ酸富化に好適な遺伝子損傷を有する細菌菌株を使用するならば、選択的に標識したタンパク質を、１５Ｎ（または１３Ｃ）標識のミス取りこみなく生産し得る［Ｍｕｃｈｍｏｒｅ， １９８９］。代替的に、該サンプルを、細胞フリー合成を使用して調製し得る［ｙａｂｕｋｉ， １９８９］。また、好ましい場合には、原栄養性細菌菌株を使用するとき、良好な結果が報告されたことが、注目されるべきである［Ｋａｉｎｏｓｈｏ， １９８２］［Ｍｕｃｈｍｏｒｅ，１９８９］。
【００４５】
選択的に標識したサンプルの２次元１Ｈ−１３Ｃ相関スペクトルは、Ａｒｇ残基のみが１３Ｃ−富化されたことを確認した。しかし、対応する１Ｈ−１５Ｎ実験は、１５ＮがＡｓｐ残基中に専ら取りこまれたわけではないことを指摘した。図２Ａは、１５Ｎ−Ａｓｐ、１３Ｃ−Ａｒｇサンプルの２Ｄ１Ｈ−１５Ｎ  ＴＲＯＳＹ［Ｗｅｉｇｅｌｔ， １９９８］スペクトルを示す。もしＡｓｐ残基を１５Ｎ標識するならば、全部で１８ピークがこの１Ｈ−１５Ｎ相関スペクトル中に期待されるであろう（アミノ酸配列中の１８Ａｓｐ残基）。該スペクトルが近似的に６５ピークを含むかわりに、これはまたＡｓｎ、ＧｌｕおよびＧｌｎ部位での１５Ｎのとりこみと矛盾しない（該アミノ酸配列中全部で６９）。該アミノ酸配列を詳細に調査して、ここに、１の独特な対であるＡｒｇ４７−Ａｒｇ４８のかわりに、４つの追加的なものであるＡｒｇ４３−Ａｓｎ４４、Ａｒｇ１５６−Ｇｌｎ１５７、Ａｒｇ１６９−Ｇｌｕ１７０およびＡｒｇ１９９−Ｇｌｕ２００があることを理解することができる。これらの第１であるＡｒｇ４３−Ａｓｎ４４は、Ｙループの始めに位置する。他の３つは、出発部位から遠くのタンパク質表面上に位置する（図３）。
【００４６】
図２Ｂは、選択的に標識された対から、シグナルを選択する２Ｄ  ＨＮＣＯ［Ｃａｖａｎａｇｈ， １９９６］スペクトルを示す。予測されるように、５つの独特な配列対に対応する５つのピークが、スペクトル中に見える（丸付）。Ｃ−末端Ａｓｐ残基に起源する追加的なピーク（矢マーク）がまた見える。先行するＧｌｕ残基の天然存在量の１３Ｃ（１％）は、該Ｃ−末端Ａｓｐ残基の非常に強いＨＮ−共鳴のため、ＨＮＣＯシグナルをもたらすのに十分である。
【００４７】
Ｙループへの結合を検出するため、１または２の指定されたシグナルが、Ｙループと相互作用する化合物を添加すると、大きな化学シフト変化を経験する一方、他の３つのシグナルは本質的に影響を受けないままであることが予測される。
【００４８】
この仮説を試験するために、発明者は、５種の化合物のカクテルの存在下２Ｄ  ＴＲＯＳＹスペクトルを記録した。該化合物の１つであるＮ２００は、ＮＭＲ−ｌｉｎｅ ｂｒｏａｄｅｎｉｎｇアッセイによって決定されるように、該タンパク質に結合することが既知であった（等モル量のＰＴＰ１Ｂの存在下、５０μＭの濃度で５Ｈｚｌｉｎｅ ｂｒｏａｄｅｎｉｎｇより大）。３種の化合物のＮ３５、Ｎ１３６およびＮ２１２は、ＮＭＲによって決定されたように非バインダーであった。第５の化合物のＰＮＵ１７９９８３は、Ｙループと相互作用すると信じられるＰＴＰ１Ｂのマイクロモル阻害剤であった。図２Ｃは、遊離１５Ｎ−Ａｓｐ、１３Ｃ−ＡｒｇＰＴＰ１ＢのＴＲＯＳＹスペクトルからの選択された領域を示す。図２Ｅは、ＰＮＵ１７９９８３を除くカクテルからのすべての化合物の存在下でのスペクトルを示す。図２Ｆは、ＰＮＵ１７９９８３のみが存在するときのスペクトルを示す。すべてのスペクトルにおいて、ＨＮＣＯ選択性シグナルに対応するシグナルに丸を付する。
【００４９】
化合物カクテルの存在下で実質的なスペクトル変化を発生することが、明かである（図２Ｄ）。特に、指定されたピークの２つ（アスタリスクでマーク）は一緒に消失し、一方、他の３つのシグナルは小さいシフトを経験するのみである。これは、カクテル中の少なくとも１の化合物がＹループと強く相互作用することを指摘する。ＰＮＵ１７９９８３をカクテルから省略したときに（図２Ｅ）、いずれの指定されたシグナルについてもシフトが観察されない。図２Ｆは、ＰＮＵ１７９９８３が大きなシフトの原因となることを示し、なぜならこのスペクトルは、完全なカクテルの存在下で記録されるパターン（図２Ｄ）と同じパターンを示すからである。
【００５０】
本発明は選択された部位へのバインダーの同定を可能とするという発見を、さらに実体化するために、すべての化合物を、比色アッセイで試験した（図４）。ＮＭＲ ｌｉｎｅ−ｂｒｏａｄｅｎｉｎｇアッセイにしたがってＰＴＰ１Ｂに結合するＮ２００は、該酵素の部分的阻害を示し、このことは活性部位への結合を指摘した。Ｎ３５およびＮ１３６はまた部分的阻害を示し、このことは、これらが偽陰性であるか、またはＮＭＲ ｌｉｎｅ−ｂｒｏａｄｅｎｉｎｇアッセイでの結合を示すには相互作用が弱すぎることを指摘した。ＰＮＵ１７９９８３は該酵素の完全な阻害を示した。
【００５１】
さらに、ｘ線結晶学的調査を実施し、ＰＮＵ１７９９８３の結合様式を評価した。２．２オングストローム解像度の予備的ｘ線結晶学的データ（Ｄｅｒｅｋ Ｏｇｇ， 未公開結果）は、ＰＮＵ１７９９８３がＰＴＰ１Ｂに結合し、活性部位内のみならずＹループと相互作用することを示した（図５）。該阻害剤は、Ｙループに非常に近接し、そして水素結合を介してループと相互作用する。該阻害剤とＹループの間の最短距離は、近似的に２．８オングストロームである。
【００５２】
実施例２：ヒト筋肉脂肪酸結合タンパク質（Ｍ−ＦＡＢＰ）（配列番号２）の部位選択的スクリーニング
部位選択的スクリーニング方法の原理を、ヒト筋肉脂肪酸結合タンパク質Ｍ−ＦＡＢＰについて実証する。リガンドであるオレイン酸との複合体のＭ−ＦＡＢＰの１．４オングストロームＸ線結晶構造は、入手可能である（ＰＤＢ  ＩＤコード：１ＨＭＳ）［Ｙｏｕｎｇ， １９９４］。該構造は、１０個の逆平行β鎖１および２に結合する２つのαヘリックスからなる。該β鎖は、２つのほとんど直交のβシートを形成する。脂肪酸結合部位は、該２つのβシートの間のキャビティに位置する。該キャビティはまた、ヘリックス１および２からの残基によって線形である。該脂肪酸のカルボキシル基は、タンパク質への水素結合（直接的または溶媒介在）を形成する。該脂肪酸の脂肪族尾部は、高度に疎水性のｕ−形状コンホメーションを採用する。アラニン３３は、該オレイン酸の炭素Ｃ１２、Ｃ１３、およびＣ１４と接触している［Ｙｏｕｎｇ， １９９４］。バリン３２およびアラニン３３は、該アミノ酸配列中に独特なアミノ酸残基を含み、したがって選択的標識化に好適である。アラニン３３のＮＭＲ共鳴が、オレイン酸が結合すると影響を受けることがありそうである。１３Ｃ’−Ｖａｌ、１５Ｎ−Ａｌａで選択的に標識された、Ｍ−ＦＡＢＰのサンプルを、Ｍ−ＦＡＢＰの１４３アミノ酸タンパク質構築物をコードする遺伝子を含むプラスミドを有する原栄養性Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ細胞から生産した。該構築物は精製目的のために含まれるＣ末端Ｈｉｓ−タグを含んだ。細胞を、Ｍｕｃｈｍｏｒｅ ｅｔ ａｌのプロトコルに従って、すべてのアミノ酸およびヌクレオチドを含む成長培地を使用して、ファーメンターで成長させた。バリンに、１３Ｃ−標識したカルボキシル炭素を供給し、アラニンは、１５Ｎ−標識した（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｉｓｏｔｏｐｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）。Ｍｕｃｈｍｏｒｅ ｅｔ ａｌ．は、望まれる特定の型のアミノ酸標識化に好適な遺伝子欠失を有する栄養要求性細菌菌株の使用を主張する。細胞フリー合成から、なおよりよい成績が期待される［Ｙａｂｕｋｉ， １９９８］。しかし、よい結果がまた、原栄養性細菌菌株を使用したとき、報告された［ｋａｉｎｏｓｈｏ， １９８２； Ｋａｔｏ， １９９１； Ｍｕｃｈｍｏｒｅ， １９８９； Ｓｅｎｎ， １９８７］。タンパク質を、Ｃｏｎｓｔａｎｔｉｎｅ ｅｔ ａｌ．によって記載のように、Ｎｉ２＋荷電５ｍｌＨｉＴｒａｐキレート化カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ ｐｈａｒｍａｃｉａ ｂｉｏｔｅｃｈ）、次いでＬｉｐｉｄｅｘ−１０００カラム（Ｓｉｇｍａ）を使用してアフィニティクロマトグラフィによって精製した。
【００５３】
該タンパク質質量を、エレクトロスプレースペクトロメトリを使用して決定した。バリンおよびアラニン残基中の１３Ｃおよび１５Ｎの取りこみの程度を、少なくとも９５％となるまで評価した。
【００５４】
図８は、選択的に標識されたＭ−ＦＡＢＰのＮＭＲスペクトルを示す。１Ｈ−１５Ｎ相関実験で見えるシグナルは（図８ａ）、Ｍ−ＦＡＢＰのアラニン共鳴に好ましくは対応する［Ｃｏｎｓｔａｎｔｉｎｅ， １９９８］。２Ｄ  ＨＮＣＯ実験は、１３Ｃ−１５Ｎ−１Ｈ部分についてのみクロスピークをもたらす。選択的に標識されたＭ−ＦＡＢＰタンパク質、すなわち（１３Ｃ’）Ｖａｌ３２−（１５Ｎ）Ａｌａ３３中に唯一のそのような存在がある。図８ｂのＨＮＣＯスペクトルは、公開された共鳴値割り当てと一致して、アラニン３３に対応する共鳴を容易に同定する唯一のクロスピークを含む。図８ｃに示されるスペクトルは、検出のための１Ｄ  ＨＮＣＯ実験の使用の実施可能性を実証する。
【００５５】
５種の試験化合物−オレイン酸およびＭ−ＦＡＢＰと混合したときＮＭＲ ｌｉｎｅ ｂｒｏａｄｅｎｉｎｇを示さないわれわれのＮＭＲスクリーニングライブラリーからの４種の化合物−を、化合物カクテルに混合した。図９は、種々の混合物中の選択的に標識されたＭ−ＦＡＢＰ上に記録されたスペクトルのスペクトル拡張を示す。
【００５６】
予測されるように、アラニン３３に属するＨＳＱＣクロスピークは、試験カクテルを添加すると、化学シフト変化を経験する（図９ｂ）。同じ化学シフト変化を、Ｍ−ＦＡＢＰをオレイン酸単独と混合するときに観察する（図９ｄ）。試験カクテルからオレイン酸を省略しても、スペクトルは変化しない（図９ｃ）。明かに、部位選択的標識化方法は、特異的結合特性を有する化合物を同定するための有益な手段であることを約束する。可能性のある適用は：ｘ線、ＮＭＲまたはモデリング調査のいずれかを経由して同定される選択された部位への、バインダーのスクリーニング：他の方法（すなわちＨＴＳ）によって同定されるリガンドの、望まれる部位への結合を確認するためのアッセイ；タンパク質ファミリー内で、１の標的タンパク質に対する結合特異性を付与し得る部位に結合するリガンドのスクリーニングを含む。選択的に標識されたサンプルの使用に起因する、減少したスペクトル複雑性のために、該方法は、慣行方法よりもより大きいタンパク質に適用可能であるものである。
【００５７】
【表１】
2004523732.tif 000002
【図面の簡単な説明】
【図１】図１；ＰＴＰ１Ｂの部位特異的標識。すべてのアルギニンおよびアスパルテート残基を、それぞれ１３Ｃおよび１５Ｎで富化した。該配列中に唯一の独特なＡｒｇ−Ａｓｐ対（ボックス付）がある。
【図２】図２；１５Ｎ−Ａｓｐ、１３Ｃ−Ａｒｇ標識したＰＴＰ１Ｂの２Ｄ  ＮＭＲスペクトル。Ａ）遊離タンパク質の２Ｄ  ＴＲＯＳＹ、Ｂ）遊離タンパク質の２ＤＤＮＣＯ、Ｃ−Ｆ）Ｃ）遊離タンパク質の２Ｄ  ＴＲＯＳＹスペクトル、Ｄ）タンパク質＋化合物カクテル、Ｅ）タンパク質＋ＰＮＵ１７９９８３を省略している化合物カクテルおよびＦ）タンパク質＋ＰＮＵ１７９９８３。
【図３】図３；５つの選択的に標識したアミノ酸残基対を示すＰＴＰ１ｂのリボン描写。「Ｙループ対」Ａｒｇ４７−Ａｓｐ４８（Ｉ）およびＡｒｇ４３−Ａｓｎ４４（ＩＩ）を示し、並びにＡｒｇ１５６−Ｇｌｎ１５７（ＩＩＩ）、Ａｒｇ１６９−Ｇｌｕ１７０（ＩＶ）およびＡｒｇ１９９−Ｇｌｕ２００（Ｖ）および活性部位システイン（ＶＩ）。
【図４】図４；すべての化合物を、比色アッセイで試験した。１μＭ  ＰＴＰ１Ｂ、  ２ｍＭ  パラ−ニトロフェニルフォスフェート（基質）および１ｍＭ  化合物を、２０ｍＭ  ｐＨ７．５のトリス−ＨＣｌバッファー中で調製し、そして室温で５分間インキュベートした。反応を、ＮａＯＨを添加して、ｐＨを上昇させて、停止させた。阻害の量を、得られた産物（パラ−ニトロフェノール）の測定された吸光度から計算した。
【図５】図５；２．２オングストローム解像度の予備的ｘ線結晶学電子密度地図から決定されるような、ＰＴＰ１Ｂへ結合するＰＮＵ１７９９８３の立体図。ＰＮＵ１７９９８３は明かに、活性残基と相互作用するだけでなく、また水素結合を介しＹループ（強調）との接近した接触を有する。ＰＮＵ１７９９８３とＹループの間の最も接近した距離は、近似的に２．８オングストロームである。結晶は、０．１Ｍ  ｐＨ６．５  カコジレートバッファー、０．２Ｍ  Ｍｇアセテート、１６−２０％  ＰＥＧ８０００中の２ｍＭ  阻害剤の存在下で成長した。該結晶は空間群Ｐ２２２に属し、セルディメンジョンは、ａ＝５３．２オングストローム、ｂ＝８４．３オングストローム、ｃ＝８８．７オングストローム、アルファ＝ベータ＝ガンマ＝９０であった。データは、Ｒｓｙｍ＝６．７％を有する２．２オングストロームに及ぶ。データは加工し、モデルはＲ＝２５％にリファインした。
【図６】図６は、本発明の１実施態様の概略図である（単一結合部位付近への結合についてスクリーニング）。適用Ｉ：単一結合部位への結合についてのスクリーニング。
【図７】図７は、本発明のさらなる実施態様の概略図である（活性部位付近の特異性についてのスクリーニング）。適用ＩＩ：活性部位付近の特異性についてのスクリーニング。
【図８】図８；２００μＭの、１３Ｃ’−Ｖａｌ、１５Ｎ−Ａｌａで選択的に標識したＭ−ＦＡＢＰサンプルで、ＮＭＲスペクトルを記録した。該スペクトルを、標準的技術を使用して、６００ＭＨｚ  Ｖａｒｉａｎ Ｕｎｉｔｙ ＩＮＯＶＡ ＮＭＲスペクトロメーターで、２０℃で記録した。該サンプルを、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＤＴＴおよび０．０２％  ＮａＮ３を含む２０ｍＭ  リン酸ナトリウムバッファー（１０％  Ｄ２Ｏ／９０％Ｈ２Ｏ）ｐＨ７．４中で調製した。ＮｍｒＰｉｐｅ（Ｄｅｌａｇｌｉｏ ｅｔ ａｌ．， １９９５）をデータ加工のために使用した。（ａ）２Ｄ  １Ｈ−１５Ｎｆａｓｔ−ＨＳＱＣ（Ｍｏｒｉ ｅｔ ａｌ．， １９９５）、（ｂ）２Ｄ  ＨＮＣＯおよび（ｃ）１Ｄ  ＨＮＣＯ。パネルｂおよびｃのＨＮＣＯスペクトルは、アラニン３３（パネルａのローマ数字ＩＩ）に対応する共鳴を同定する。実験時間はそれぞれ、１時間、４時間および２０分であった。
【図９】図９；図８ａのアラニン３３クロスピークに対応する領域を示す、６００ＭＨｚで記録された１Ｈ−１５Ｎ  ｆＨＳＱＣスペクトルのプロット。実験条件は、図８で記載のものと同一であった。ただしスペクトルｂ−ｄに使用されるサンプルは、追加的に１％  ｄ−ＤＭＳＯを含んだ。（ａ−ｄ）遊離Ｍ−ＦＡＢＰの参照スペクトル。（ｂ）Ｍ−ＦＡＢＰおよび化合物カクテルの１：１混合物。（ｃ）Ｍ−ＦＡＢＰと、オレイン酸を欠く化合物カクテルの１：１混合物。（ｄ）Ｍ−ＦＡＢＰとオレイン酸の１：１混合物。
【図４】
2004523732.tif 000003
【図６】
2004523732.tif 000004
【図７】
2004523732.tif 000005
【国際公開パンフレット】
2004523732.tif 000006
2004523732.tif 000007
2004523732.tif 000008
2004523732.tif 000009
2004523732.tif 000010
2004523732.tif 000011
2004523732.tif 000012
2004523732.tif 000013
2004523732.tif 000014
2004523732.tif 000015
2004523732.tif 000016
2004523732.tif 000017
2004523732.tif 000018
2004523732.tif 000019
2004523732.tif 000020
2004523732.tif 000021
2004523732.tif 000022
2004523732.tif 000023
2004523732.tif 000024
2004523732.tif 000025
2004523732.tif 000026
2004523732.tif 000027
2004523732.tif 000028
2004523732.tif 000029
2004523732.tif 000030
2004523732.tif 000031
2004523732.tif 000032
2004523732.tif 000033
2004523732.tif 000034
2004523732.tif 000035
2004523732.tif 000036
【国際調査報告】
2004523732.tif 000037
2004523732.tif 000038
2004523732.tif 000039