(57)【要約】分子量が５０ｋＤ〜５００ｋＤのヘモグロビン（Ｈｂ）−デキストラン（Ｄｘ）複合体は、許容される赤血球沈降速度（ＥＳＲ）及び排出率（ＥＸＣ）値をもたらす血液代用品を提供する。本発明のＤｘＨｂ複合体は、血液の代用品として種々の目的のために有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヘモグロビンと多糖とが共有結合により結合した、平均分子量約５０ｋＤ〜約５００ｋＤを有する複合体を含む酸素運搬化合物。
【請求項２】
請求項１記載の化合物であって、該化合物により、ウイントローブ法を用いて測定した赤血球沈降速度（ＥＳＲ）が２０ｍｍ／時間未満となり、腎排泄率（ＥＸＣ）が１％未満となる、上記化合物。
【請求項３】
多糖がデキストランである、請求項１記載の化合物。
【請求項４】
複合体が平均分子量約８９ｋＤ〜約１１６ｋＤを有する、請求項３記載の化合物。
【請求項５】
請求項２記載の化合物であって、該化合物により、ウイントローブ法を用いて測定したＥＳＲが１ｍｍ／時間未満となり、腎ＥＸＣが０．２％未満となる、上記化合物。
【請求項６】
酸素運搬化合物の製造方法であって、該化合物はヘモグロビンと多糖とが共有結合により結合した複合体を含むものであり、以下のステップ：
１）多糖と臭素化合物とを反応させて該多糖に臭素基を与え、それにより活性多糖を得るステップ；
２）上記活性多糖を第１フィルターを用いてろ過するステップ；
３）上記活性多糖とヘモグロビンとを反応させて、結合したデキストラン−ヘモグロビン分子を得るステップ；及び
４）上記デキストラン−ヘモグロビン分子を第２フィルターを用いてろ過するステップ；
を含むものである、上記方法。
【請求項７】
多糖がデキストランである、請求項６記載の方法。
【請求項８】
デキストランが平均分子量２０ｋＤを有する、請求項７記載の方法。
【請求項９】
第１フィルターが分子量５００ｋＤを超えるものを保持する孔サイズを有する、請求項６記載の方法。
【請求項１０】
第１フィルターが分子量３００ｋＤを超えるものを保持する孔サイズを有する、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
ヘモグロビンがストローマフリーヘモグロビンである、請求項６記載の方法。
【請求項１２】
第２フィルターが分子量５００ｋＤを超えるものを保持する孔サイズを有する、請求項６記載の方法。
【請求項１３】
ステップ４の後、デキストラン−ヘモグロビン分子を第３フィルターによりろ過するステップをさらに含む、請求項６記載の方法。
【請求項１４】
第３フィルターが分子量８０ｋＤを超えるものをろ過する孔サイズを有する、請求項１３記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明は、血液代用品、及びそれらの製造方法に関する。さらに具体的には、本発明は、哺乳動物用の血液代用品として使用するための改良多糖−ヘモグロビン複合体、及びかかる複合体の製造方法に関する。
【０００２】
発明の背景
最近、安全な血液代用品の研究が著しく加速している。血液の需要が供与者から入手できる供給を超えることが多い。さらに、世界の多くの地域で、全血供給が有害なこともある。従って、血液代用品を開発する必要がある。
【０００３】
血液の最も重要な機能の１つは、酸素を肺から運搬して組織の呼吸を支援することである。ヘモグロビン（Ｈｂ）は、臨床用血液代用品の開発において魅力的な酸素運搬体であり、呼吸色素としての、広範な溶解度、酸素の吸収と放出、及びとりわけ大量の酸素運搬能力の特性を備えている。しかし、血液代用品としての遊離Ｈｂ自体の基本的な欠点の１つは、それが比較的小さい６４．５ｋＤの分子サイズを有し、その結果、腎排泄率（ＥＸＣ）が高くなるため循環から急速にクリアランスされることである。従って、Ｈｂの腎排泄を防止しかつ血漿半減期を延長するために、担体ポリマーとの共有結合による複合体化が利用されている。そのような複合体はヘモグロビンに基づく酸素運搬体（ＨＢＯＣ）と呼ばれる。かかるポリマーの例としては、デキストラン及びデキストランのバイオポリマー誘導体、イヌリン、ヒドロキシエチルデンプン、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドンが挙げられる（Ｓ．Ｐ． Ｔｓａｉ及びＪ．Ｔ．−Ｆ． Ｗｏｎｇ， 「デキストラン−ヘモグロビン（Ｄｅｘｔｒａｎ−Ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ）」：Ｗｉｎｓｌｏｗ， Ｒ．Ｎ．， Ｖａｎｄｅｇｒｉｆｆ， Ｋ．Ｄ．，及びＩｎｔａｇｌｉｅｔｔａ， Ｍ．［編］， １９９７ 「血液代用品の進歩：産業上の機会と医学的挑戦（Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｂｌｏｏｄ Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｓ： Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｏｐｐｏｒｔｕｎｉｔｉｅｓ ａｎｄ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ）」， Ｂｉｒｋｈａｕｓｅｒ， Ｂｏｓｔｏｎに収載；これらの参考文献の内容は本明細書に参照により組み入れられる）。
【０００４】
酸素送達の効率は、全血流量と容積、酸素含量、赤血球又はヘモグロビン質量、酸素親和性及び酸素消費速度によって決定される。酸素含量、送達及び利用の間の関係は、フィック（Ｆｉｃｋ）の式によって最もよく例示される。従って、単位容積当たり最大酸素量を運搬しかつ送達することができて、しかも優れた流動特性を維持する血液代用品があれば理想的であることは明らかである。
【０００５】
デキストラン−ヘモグロビン（ＤｘＨｂ）は、血液代用品として提唱されている複合体の１つである。デキストランは、水溶性、広範囲の利用可能な分子サイズ、及び有意な毒性又は組織向性を有しない特性を組合せて有するため、生分解性ポリマーのなかでも優れた薬物担体である。デキストラン（Ｄｘ）とヘモグロビン（Ｈｂ）との共有結合複合体は、Ｈｂの有効サイズを増大させ、それによって、その腎系による排泄率（ＥＸＣ）が低減する。複合体溶液の粘度を安定化する方法が報じられていて、イヌ及びマカクにおいてＤｘＨｂとの交換輸血が実施された（Ｔａｍら、１９７６；Ｔａｍら、１９７８；Ｗｏｎｇ、１９８８）。しかし、これまでにこの複合体の流動特性は研究されていない。ＤｘＨｂ複合体の例は米国特許第４，０６４，１１８号及び第４，６５０，７８６号に記載され、それらの内容は本明細書に参照により組み入れられる。米国特許第４，０６４，１１８号は、ヘモグロビン（Ｈｂ）と分子量約５ｋＤ〜２０００ｋＤを有するデキストラン（Ｄｘ）とを化学的に結合することにより製造した血液代用品又は血液増量剤として有用な組成物を教示する。このＤｘＨｂ複合体の分子量は７０〜２０００ｋＤの範囲にある。しかし米国特許第４，０６４，１１８号による製品は、ヘモグロビンと比較すると、ヘモグロビンの本質的な酸素運搬及び放出能力を保持するが、幾分より大きい酸素親和性を示す傾向があることが見出されている。
【０００６】
米国特許第４，６５０，７８６号は、より低い酸素親和性を有する修飾デキストラン−ヘモグロビン複合体を記載する。このＤｘＨｂ複合体の分子量は７０〜２０００ｋＤの範囲にある。
【０００７】
ＤｘＨｂ複合体又は修飾ＤｘＨｂ複合体に関連する問題の１つは、複合体溶液の粘度が貯蔵時に増大し、それによってこの溶液が投与不適になることである。上記の問題に対する解決手段が米国特許第４，９００，８１６号に記載されており、その内容は本明細書に参照により組み入れられる。上記特許には、デキストラン部分の活性部位をブロッキングして、ヘモグロビン複合体の酸素運搬特性に影響を与えることなく、貯蔵時の粘度を安定化しうることが示されている。米国特許第４，９００，８１６号は、ヘモグロビン残基、酸素親和性を低減するリガンド、多糖（例えば、デキストラン）、共有結合した化学架橋基及びブロッキングされた活性基を含む、約７０〜約２０００ｋＤの分子量を有する化合物を教示する。
【０００８】
上記のように、血液代用品の重要な特性の１つは、該血液代用品を生理学的に許容可能とする流動特性であって、その粘度は血流を妨げるほど高くてはいけない。赤血球の凝集は、特に低剪断速度における血液粘度増加の重要な要因の１つであるが、赤血球凝集の実際の機構は未だに完全には解明されていない。赤血球の凝集は様々な要因によって起こりうる。一般的に、免疫グロブリン濃度が増大すると、粘度とＲＢＣ凝集は両方とも増大する。しかし、両者間の正確な関係は実に複雑なようである。従って、ＤｘＨｂの可能な物理化学的特性を決定することが、その血液代用品としての開発において重要である。
【０００９】
本発明においては、以下に記載するように、ＤｘＨｂの様々な調製物を合成し、そしてこれらの溶液の流動特性を、それらの粘度と、赤血球沈降速度（ＥＳＲ）試験に基づいて評価したそれらの凝集傾向とを測定する（Ｄｉｎｔｅｎｆａｓｓ １９８５、その内容は本明細書に参照により組み入れられる）ことによって試験した。血漿中の一定の「臨界濃度」を超える巨大分子（ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅ）の存在は、赤血球（ＲＢＣ）凝集を、そしてまた血液粘性、特に低剪断速度における血液粘性を誘導する可能性がある。
【００１０】
低剪断領域、特に静脈循環における血流は、血液粘度が高く、スラッジ形成により毛細管流を妨げる赤血球凝集の増大によって、大きく低下する（Ｄｉｎｔｅｎｆａｓｓ １９８１）。赤血球（ＲＢＣ）凝集は、隣接する赤血球表面間の巨大分子による架橋の結果である。非カプセル化ヘモグロビンに基づく血液代用品を循環中に注入すると、これらの巨大分子も赤血球と相互作用してＲＢＣ凝集を誘導する可能性があり、ＥＳＲはかかる凝集の影響をうける血液流動パラメーターの最も重要なものの１つである。従って、ヘモグロビンに基づく血液代用品のＥＳＲ増大作用を試験することは、それらの設計及び開発の過程で基本的に重要である。
【００１１】
分子サイズが巨大分子架橋機構によりＥＳＲ増大の重要な決定要因の１つであることは知られている。２０ｋＤのデキストランはＲＢＣ凝集を誘導しないし、従ってＥＳＲ上昇はないが、４０ｋＤより大きいデキストランは全てＥＳＲを増大しうる（Ｃｈｉｅｎ及びＪａｎ、１９７３；その内容は本明細書に参照により組み入れられる）。従来の研究は、２２０ｋＤより大きい巨大分子の重合ヘモグロビンは、ＲＢＣ凝集を誘導して、それがまた低剪断速度の血液粘度を増大しかつ循環中のＲＢＣ分布に影響を与えうることを示した（Ｔｓａｉ及びＷｏｎｇ、１９９６；その内容は本明細書に参照により組み入れられる）。
【００１２】
本発明は、低レベルのＥＸＣ及びＥＳＲをもたらす分子量範囲のＤｘＨｂ複合体を提供し、それ故に、有効な血液代用品又は血漿増量剤を提供する。
【００１３】
発明の概要
本発明は、一実施形態においては、ヘモグロビンと多糖とが共有結合により結合した、平均分子量約５０ｋＤ〜約５００ｋＤを有する複合体を含む酸素運搬化合物を提供する。
【００１４】
他の実施形態においては、本発明は、酸素運搬化合物の製造方法であって、該化合物がヘモグロビンと多糖とが共有結合により結合した複合体を含むものであり、以下のステップ：
１）多糖と臭素化合物とを反応させて該多糖にブロモ基を与え、それにより活性多糖を得るステップ；
２）上記活性多糖を第１フィルターを用いてろ過するステップ；
３）上記活性多糖とヘモグロビンとを反応させて、結合したデキストラン−ヘモグロビン分子を得るステップ；及び
４）上記デキストラン−ヘモグロビン分子を第２フィルターを用いてろ過するステップ；
を含む、上記方法を提供する。
【００１５】
本発明の好ましい実施形態のこれら及び他の特徴は、添付した図面を参照して説明する以下の詳細な説明においてさらに明らかになるであろう。
【００１６】
好ましい実施形態の説明
本明細書に使用される用語「ヘモグロビン」は、任意の哺乳動物の赤血球に由来するヘモグロビンを含むと理解されたい。本発明は、主にヒトヘモグロビンに関するが、他の動物に由来するヘモグロビンにも等しく適用可能であって、例えばウシ及びブタヘモグロビンを含む。
【００１７】
好ましい実施形態においては、本発明は、担体多糖−ヘモグロビン複合体、そしてさらに好ましくは、血液代用品又はＨＢＯＣとして使用するための改良デキストラン−ヘモグロビン（ＤｘＨｂ）複合体を提供する。以下にさらに考察するように、本発明の好ましい実施形態において、ＤｘＨｂ複合体は約５０ｋＤ〜約５００ｋＤ、さらに好ましくは約８９ｋＤ〜１１６ｋＤの分子量（ＭＷ）を有するものである。Ｈｂのサイズは一般的に一定であるという事実により、この分子サイズの範囲は主にＨｂとＤｘ分子との間の複合体形成の量に基づく。この範囲の複合体サイズは、かかる分子のＥＸＣ率が高くならないようにするのに十分にＨｂより大きいサイズの分子を与える一方、またかかる分子のＥＳＲが高くならないようにするのに十分に小さいサイズの分子も与えることを見出した。さらに以下に記載するように、用語「高い」は、ＥＸＣ率については１％であり、かつＥＳＲに対しては２０ｍｍ／時間である。本発明はまたかかる複合体の製造方法も提供する。本明細書に記載した実施例は、例示目的のために提供するものであって、当業者であれば明らかであるように、本発明の範囲を限定するものではない。
【００１８】
１．ストローマフリーヒトヘモグロビン（ＳＦＨ）の調製
赤血球を溶解してヘモグロビンを遊離させることによって、本発明の方法に使用するための純粋なヘモグロビン溶液を作製した。次いで、これらの調製物を、腎障害を回避するために溶液中のストローマを除去する処理をする。高純度のヘモグロビン溶液は、本発明の好ましい実施形態に従い、Ｗｉｎｓｌｏｗ及びＣｈａｐｍａｎが記載した標準ろ過技術（Ｍｅｔｈ． Ｅｎｚｙｍｏｌ．， １９９４，２３１：３−１６、その内容は本明細書に参照により組み入れられる）によって調製した。
【００１９】
２．アルキル化法によるデキストランの活性化
以上説明したように、多糖類とヘモグロビンとの共有結合による複合体化はその有効サイズを増大し、それによってその腎排泄を防止する。本発明の多糖類は生体適合性が確立されていてかつヘモグロビンと結合させることができるものとする。本発明において、好ましい多糖はデキストランである。
【００２０】
本発明のデキストランは、１０ｋＤ（デキストランＴ１０と呼ぶ）〜２０ｋＤ（デキストランＴ２０と呼ぶ）の平均分子量を有しうる。市販のデキストランはその平均分子量により分類され、デキストラン分子のサイズには本来変動があることに注意しなければならない。１０ｋＤデキストランを使用すると、ＤｘＨｂの腎及び非腎排泄がより高くなると予想される。従って、本発明の好ましい実施形態においては、最も好ましいデキストランの出発サイズは２０ｋＤである。
【００２１】
デキストランを修飾してヘモグロビンと反応できるようにするには、デキストランを、好ましくはアルキル化反応によって「活性化」する必要がある。具体的には、デキストランをアルカリ性ｐＨにて臭化シアン（ＣＮＢｒ）と、次いでジアミノエタンと反応させた。得られるアミノエチルアミノ−デキストランを透析した。この透析ステップを利用してジアミノエタンなどの小さい反応系分子又は反応した残余の物質を洗浄除去する。
【００２２】
この後、アミノエチルアミノ−デキストランをブロモ−アセチルブロミドを用いて中性ｐＨにてアシル化し、次いで水に対して透析し、そして凍結乾燥した。このデキストラン活性化法は、Ｓ．Ｃ． Ｔａｍ， Ｊ． Ｂｌｕｍｅｎｓｔｅｉｎ及びＪ．Ｔ．Ｆ． Ｗｏｎｇ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， １９７６， ７３：２１２８−２１３１にさらに詳細に記載されており、その内容は本明細書に参照により組み入れられる。
【００２３】
２つの試験、すなわちニンヒドリン試験及び硝酸銀試験を用いて透析の完了をモニターした。具体的には、これらの試験を、透析ステップから得たろ過物に対して実施し、Ｓ． Ｍｏｏｒｅ及びＷ．Ｈ． Ｓｔｅｉｎ（Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， １９４８，１７６：３６７−３８８；その内容は本明細書に参照により組み入れられる）により記載されたニンヒドリン試験によって、アミノ基の存在を検出した。硝酸銀試験を実施して、以下に記載するように、ブロモ基の存在を検出した。これらの両方の試験は以下にさらに説明する。
【００２４】
３．デキストラン−ヘモグロビン複合体の調製
ヘモグロビンとデキストランとを結合する最終ステップは、ストローマフリーヘモグロビンを、Ｎ−ブロモ−アセチルアミノ−エチルアミノ−デキストラン（ＤｘＢｒ）と呼ばれる活性デキストラン（ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｄｅｘｔｒａｎ）に加えることによって、実施した。この結合反応は活性デキストラン（ＤｘＢｒ）のＢｒ基の除去とヘモグロビンのスルフヒドリル（ＳＨ）基のＨ原子の除去とを含むものであり、Ｄｘ−とＨｂＳ−とを結合させてＤｘＨｂを得る。ブロモ−アミノエチルアミノ−デキストラン（ＤｘＢｒ）とＨｂとの間の結合は、共有結合の位置であるβ−９３システインの遊離−ＳＨを介するものである。結合反応の過程で、−ＢｒはＤｘＢｒから分離されて、遊離Ｂｒイオンになり、これはその後、透析除去される。硝酸銀試験（さらに以下に記載）を利用してＢｒイオンの存在を試験することができる。
【００２５】
デキストランとヘモグロビンとの複合体化は、Ｓ．Ｃ． Ｔａｍ， Ｊ． Ｂｌｕｍｅｎｓｔｅｉｎ及びＪ．Ｔ．Ｆ． Ｗｏｎｇ（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， １９７６， ７３：２１２８−２１３１、その内容は本明細書に参照により組み入れられる）の記載に従って実施することができる。本発明の好ましい実施形態によれば、複合体化反応は、ＤｘＢｒとストローマフリーヘモグロビンを、０．３３％ ＤｘＢｒ及び１％ストローマフリーヘモグロビン溶液を含む水溶液中で混合して実施する。かかるＨｂとＤｘＢｒの濃度は、重量比で３：１又はモル質量比で１：１のＤｘＨｂ結合を保証する。しかし、当業者であれば、これらの比を達成するためのその他の反応物初期濃度を理解することができる。
【００２６】
ブロモ−デキストラン（ＤｘＢｒ）とより高い濃度のヘモグロビンとの結合（すなわち、複合体化）の実験により、架橋度がより高くなり、それに従い得られる複合体はより高い分子量となった。従って、比較的小さいＤｘＨｂ分子をより高い比率で得るためには、結合反応をより低い（すなわち、１％より低い）濃度のＨｂを用いて行うことが好ましい。しかし、ＤｘＢｒと１％濃度より高い又はより低いいずれのヘモグロビンとの結合を実施することも可能であることは理解されたい。
【００２７】
結合反応は、炭酸水素ナトリウムバッファーを用いてｐＨ９．５の溶液中で実施した。混合溶液を最初に０．２２μｍフィルターを用いて滅菌し、結合反応を、Ｈ． Ｘｕｅ及びＪ．Ｔ．Ｆ． Ｗｏｎｇ（Ｍｅｔｈ． Ｅｎｚｙｍｏｌ， １９９４， ２３１：３０８−３２２、その内容は本明細書に参照により組み入れられる）が記載した方法に従って４℃にて一夜進行させる。結合反応は、約１０〜１６時間、最も好ましくは１６時間進行させる。結合時間が長いほど、架橋度がより高くなることにより、平均分子量がより高いＤｘＨｂが得られる。
【００２８】
次いでβ−メルカプトプロピオン酸を加えて、ＤｘＢｒ上の任意の残留ブロモ基と反応させ、それによって結合反応を停止させた。さらに、この添加によって架橋反応も停止させ、それによって溶液粘度のさらなる上昇を防止した（Ｓ．Ｐ． Ｔｓａｉ及びＪ．Ｔ．Ｆ． Ｗｏｎｇ：Ｗｉｎｓｌｏｗ， Ｒ．Ｗ．， Ｖａｎｄｅｇｒｉｆｆ， Ｋ．Ｄ．，及びＩｎｔａｇｌｉｅｔｔａ， Ｍ．［編］， １９９７ 「血液代用品の進歩（Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｂｌｏｏｄ Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｓ）」， Ｂｉｒｋｈａｕｓｅｒ， Ｂｏｓｔｏｎに収載；これらの参考文献の内容は本明細書に参照により組み入れられる）。次いでこの溶液を、リン酸緩衝化生理食塩水に対して透析し、残留反応物及び反応副生物を取り除いた。
【００２９】
従って、上記複合体化を行うためのアルキル化法は以下のようにまとめることができる（Ｂｌｕｍｅｎｓｔｅｉｎら「デキストラン−ヘモグロビンの実験的輸血（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ ｏｆ Ｄｅｘｔｒａｎ−Ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ）」（１９７８）に示され；その内容は本明細書に参照により組み入れられる）：
2004509168.tif 000002
【００３０】
４．ＤｘＨｂ分画、並びにＥＳＲ、ＥＸＣ及びＭＷの間の相関
過度に大きいＤｘＨｂ分子によるＥＳＲ増大の発見後に、分画ステップを導入する。分子サイズとＥＳＲ及びＥＸＣとの間の相関を決定するために、ＤｘＨｂを好ましくは少なくとも２つの出発平均サイズ、すなわち１０ｋＤ（ＤｘＴ１０）及び２０ｋＤ（ＤｘＴ２０）のデキストラン分子から合成する。得られた複合体、すなわちＤｘＴ１０Ｈｂ及びＤｘＴ２０Ｈｂを、Ｗａｔｅｒｓ ６５０Ｅ新型（Ａｄｖａｎｃｅｄ）タンパク質精製システムを用いて分画する。さらに具体的には、分画を、ＨｉｌｏａｄＴＭ ２６／６０ ＳｕｐｅｒｄｅｘＴＭ２００分取（ｐｒｅｐ ｇｒａｄｅ）ゲルろ過カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）上で実施する。１０ｍＭリン酸緩衝化生理食塩水、ｐＨ７．４の溶液を溶出バッファーとして用い、溶出流速を０．５ｍｌ／分とする。使用するサンプルは８ｍｌの８％ ＤｘＨｂである。画分をＩＳＣＯ Ｒｅｔｒｉｅｖｅｒ ＩＩを用いて採集する（画分は８分間採集する、すなわち１画分当たり４ｍｌ）。画分を、以下に記載するＥＳＲ及びＥＸＣについて試験する。しかし、カラム画分ステップから得られるサンプル量はＥＳＲとＥＸＣの両試験を行うには不十分であるので、両試験を実施するのに十分な（各サイズの）サンプルを得る目的で、数回実施して得た画分をプールし、そしてＣｅｎｔｒｉｐｒｅｐ３０（Ａｍｉｃｏｎ）を用いて濃縮する。各画分の平均ＭＷも測定する。上記分画ステップをＤｘＨｂについて記載したが、当業者であれば、かかる分画ステップはＤｘＢｒ前駆体分子についても実施しうることは理解できる。この場合、ＤｘＢｒ画分を上記の方法を用いてＨｂと複合体化させて所望のサイズ範囲のＤｘＨｂ画分を得る。本発明の好ましい実施形態によって実施される測定の詳細を以下に記載する。
【００３１】
４．１．ＥＳＲ測定
赤血球沈降速度（ＥＳＲ）は赤血球の凝集を定量する方法である。かかる凝集は一般的に巨大分子の存在によって起こる。この測定のために、好ましくは、６．０％試験溶液を等量の新しく採取したクエン酸添加ラット全血と混合することによって、サンプルを調製する。赤血球を長時間放置すると赤血球の懸濁安定性と変形能が変化する可能性があるので、ＥＳＲ測定は新鮮な血液の採血後３〜４時間以内に実施しなければならない。この知見はラットから採血した血液を用いた時に得たものである。ＥＳＲ測定は、製造業者Ｃｌａｙ Ａｄａｍｓ（Ｄｉｖｉｓｉｏｎ ｏｆ Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｓｏｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ， Ｐａｒｉｓｉｐｐａｎｙ， Ｎ．Ｊ．， ０７０５４ ＵＳＡ）により与えられた指示書に従って実施した。溶液を、汎用ＥＳＲラック（Ｃｈａｓｅ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）上の再使用可能なＣｌａｙ Ａｄａｍｓウイントローブ血液沈降管（１１５ｍｍ長、３．０ｍｍ孔径）に入れて、６０分間、室温（約２０〜２２℃）にて垂直に保った。本明細書では、この方法を共通して「ウイントローブ法（Ｗｉｎｔｒｏｂｅ’ｓ ｍｅｔｈｏｄ）」と呼ぶが、この方法は「医薬研究室技術のてほどき（Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）」， Ｂａｋｅｒ ＆ Ｓｉｌｖｅｒｓｔｅｉｎ （編）， 第５版， ｐｐ．６０５−６０６， Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈｓに記載されていて、その内容は本明細書に参照により組み入れられる。
【００３２】
沈降管には１ｍｍ間隔の目盛を付けた。複数の調製物では、沈降物と上清との間に明確な境界がなく、むしろＥＳＲ管上部に段階的な色の変化が起こるのを観察した。かかる調製物については、ＥＳＲはある範囲の形式（例えば、１〜１８ｍｍ／時間、表２）で記録した。許容しうるＥＳＲは２０ｍｍ／時間とした。
【００３３】
当業者であれば、ＥＳＲを測定するための他の方法を理解できるということに留意されたい。例えば、上記のウイントローブ法の代わりに、「医薬研究室技術のてほどき（Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）」， Ｂａｋｅｒ ＆ Ｓｉｌｖｅｒｓｔｅｉｎ （編）， 第５版， ｐｐ．６０６−６０７， Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈｓ（その内容は本明細書に参照により組み入れられる）に記載のウェスターグレン（Ｗｅｓｔｅｒｇｒｅｎ）法を利用することも可能である。これらの方法は、異なるＥＳＲ値をもたらすことになるが、本明細書に記載した例と同じ結論を引き出すであろう。
【００３４】
４．２．ＥＸＣ測定
排泄率（ＥＸＣ）実験を実施して、本発明のＤｘＨｂ複合体の腎排泄の程度を測定した。ＥＸＣを測定するために、麻酔した平均体重約３００〜３５０ｇの雄性Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットの頚静脈中にＤｘＨｂ複合体の試験溶液を注入した。排泄率は、ラットの尿サンプル中のヘモグロビン濃度を、Ｄ．Ｌ． Ｄｒａｂｋｉｎ及びＪ．Ｈ． Ａｕｓｔｉｎ（Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， １９３５， １１２：５１−６５、その内容は本明細書に参照により組み入れられる）が記載した方法により測定して評価した。ＥＸＣ値は好ましくは０であるが、許容しうる値は１％未満としてもよい。このレベルを超えると、ラットの尿は赤色を呈するのがみとめられる。
【００３５】
４．３．分子量測定
ＤｘＨｂ複合体の分子量はゲルろ過クロマトグラフィーを用いて測定したが、この場合、この分子は分子量の低い順にカラムから溶出する。ＤｘＨｂ分子はゲルろ過カラム上で分画されるので、検出器はそれらの保持時間をモニターする。本発明のＤｘＨｂ複合体の分子量測定においては急速タンパク質液体クロマトグラフィ（ＦＰＬＣ）を使用したが、同様に高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）を使用してもよい。本発明を説明するために、分子量をＷａｔｅｒｓ ６５０Ｅ新型タンパク質精製システムを用いて決定した。このシステムでは次の２つのカラムを直列で使用した：１）ＴＳＫ−Ｇｅｌ ＧＭＰＷＸＬ（７．８×３００）；及び２）Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｓｕｐｅｒｏｓｅ ６ ＨＲ１０／３０。溶出バッファーは１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．０５％アジ化ナトリウム、ｐＨ８．０からなり、これを０．４ｍｌ／分の流速で使用した。好ましい実施形態においては、ＤｘＨｂのＭＷ測定に使用しうる検出器を用いて溶出液の組成を確かめる。例えば、Ｗｙａｔｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ＭｉｎｉＤａｗｎレーザー検出器又はＵＶ検出器をこの目的に使用することができる。好ましい実施形態においては、次の３つの検出器：Ｗａｔｅｒｓ ４４０ ＵＶ検出器Ａ２８０；Ｗｙａｔｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ＭｉｎｉＤａｗｎ検出器；及びＷａｔｅｒｓ ４１０示差屈折計、を直列にして使用した。下記の表１は、作製した様々なＤｘＨｂのピーク分子量値を示す。さらに、次の分子量データは上記のシステムを使用して得たものである：
2004509168.tif 000003
【００３６】
様々な画分の分子量測定は、当該の分子に対するＶｅ／Ｖｏ比を既知分子量のタンパク質標準のＶｅ／Ｖｏ（Ｖｅは溶出容積であり、Ｖｏは空隙容積である）と比較することによって実施した。所与のカラムの空隙容積は、ブルーデキストラン（Ｂｌｕｅ Ｄｅｘｔｒａｎ）などの大きい分子の溶出に必要な溶出容積に基づく。次いで、較正曲線は、既知分子量のタンパク質標準の対数とそれらのそれぞれのＶｅ／Ｖｏ値とをプロットすることによって作製することができる。
【００３７】
注意しなければならないのは、分子量の測定値は、使用した設備／方法に依存して変化しうることである。例えば、Ｓ．Ｐ． Ｔｓａｉ及びＪ．Ｆ．Ｔ． Ｗｏｎｇ（Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ｃｅｌｌｓ Ｂｌｏｏｄ Ｓｕｂｓｔ． Ｉｍｍｏｂ． Ｂｉｏｔｅｃｈ．， １９９６， ２４：５１３−５２３）は、ヘモグロビンの分子量測定における異常値を報じている。かかる報告によると、Ｈｂ分子は緻密な丸い分子構造及び形状をもつので、その理論値が６４．５ｋＤであるにも関わらず、ＦＰＬＣシステムによればＭＷ測定値がちょうど４６ｋＤであることが見出された。上に示したように、ＭｉｎｉＤａｗｎレーザー法を用いるＨｂの分子量測定値は６６±７ｋＤで、５８〜７３ｋＤの範囲にあり、この測定値は理論値と非常に近いことが見出された。さらに、デキストランは、直鎖構造であるので、ゲルろ過を用いるとその理論値より高い分子量の読みとり値が得られる。本発明のＤｘＨｂ複合体についてＭＷ限界値を決定するとき、この事実を考慮しなければならない。この理由で、さらに正確な結果を得るために、上記のレーザー検出器を使用した。例えば、かかるレーザー検出器を用いると、Ｈｂの分子量測定値はその理論値に近接することが見出された。
【００３８】
４．４．　ＤｘＨｂ複合体に対するＥＳＲ及びＥＸＣのサイズ依存性
ＥＳＲ、ＥＸＣ及び上記の溶出容積ピークで測定したＭＷを以下の表１に示し、また図１に示した。
【００３９】
【表１】
2004509168.tif 000004
2004509168.tif 000005
【００４０】
上述したように、ヘモグロビンの高速排泄の問題それ自身は、その比較的低い分子量の結果であると思われる。ヘモグロビンの分子量を増大させて適度に保持されるようにするため、ヘモグロビンをデキストランなどの多糖と結合させる。理想的には、かかるヘモグロビンをＤｘＨｂ複合体の形態で血液代用品として投与した場合には、ヘモグロビンの腎排泄は観察されなくなることである。しかし、約１％未満の排泄率は好ましく、約０．２％未満はさらに好ましい（Ｓ．Ｃ． Ｔａｍ及びＪ．Ｔ．Ｆ． Ｗｏｎｇ， 「ラットにおけるストローマフリーヘモグロビンによる腎機能障害（Ｉｍｐａｉｒｍｅｎｔ ｏｆ Ｒｅｎａｌ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｂｙ Ｓｔｒｏｍａ−Ｆｒｅｅ Ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ ｉｎ Ｒａｔｓ）」， Ｊ． Ｌａｂ． Ｃｌｉｎ． Ｍｅｄ， １９８８， １１１：１８９−１９３；その内容は本明細書に参照により組み入れられる）。
【００４１】
また上述したように、より高い分子量はＥＸＣを低下するが、かかる大きな分子はＥＳＲを増大させる。本発明の好ましい実施形態においては、ＥＳＲは約２０ｍｍ／時間未満でなければならないし、そしてさらに好ましくは約１ｍｍ／時間未満でなければならない。
【００４２】
本発明のＤｘＨｂ複合体をゲルろ過クロマトグラフィーを用いて分子量に基づいて分画し、その採集した画分をＥＳＲに対する影響について試験した結果、約５００ｋＤ未満のピーク分子量のＤｘＨｂ画分は、ＥＳＲを２０ｍｍ／時間までの許容限界を超えて増大させないことを見出した。他方、約５０ｋＤのピーク分子量を超えるＤｘＨｂ複合体により、０〜１％の許容範囲内のＥＸＣ値が得られた。本発明の好ましい実施形態によれば、この結果は、所望のＥＸＣ及びＥＳＲレベルが得られるＤｘＨｂ複合体の許容しうる分子量範囲を約５０ｋＤ〜約５００ｋＤと規定する。
【００４３】
５．好ましいＤｘＨｂ複合体を得るための最適分画方法の選択
以上のＤｘＨｂ複合体の所望の分子量範囲が決定されたので、最適分画法の探索に着手した。最適分画法を決定する上で考慮すべき１つの因子はＤｘＨｂ生成物の収率の最大化である。最終生成物の高い収率はＤｘＨｂの不必要な浪費を防ぐ。
【００４４】
最適分子サイズの最終ＤｘＨｂ生成物を得る目標を達成するために数種の方法を採用した。これらの方法としては、エタノール沈殿、出発デキストランの選択、及びろ過を含めた。Ｄｘ、ＤｘＢｒ及びＤｘＨｂの分画を活性化ステップの前後、並びに複合体化ステップの前後に行って、より優れた生産スキームをスクリーニングした。様々なＤｘＨｂ調製物に対して採用した方法、及び得られるＥＳＲ及びＥＸＣを次の表２にまとめる。
【００４５】
【表２】
2004509168.tif 000006
2004509168.tif 000007
2004509168.tif 000008
【００４６】
表２中：
１）「ＤｘＴ１０」及び「ＤｘＴ２０」とは、デキストラン（Ｄｘ）分子の出発サイズ；すなわち、それぞれ１０又は２０ｋＤの平均分子量を意味する。
【００４７】
２）「活性化」とは、Ｄｘの上述したアルキル化による活性化を意味する。
【００４８】
３）「結合」とは、上記のＤｘＢｒとＨｂとの複合体化又は結合を意味する。
【００４９】
４）「＜１００ｋＤ」又は「＞５００ｋＤ」などは、ＤｘＢｒ又はＤｘＨｂのろ過ステップで使用したフィルターのカットオフ値を意味する。さらに、記号「＜」及び「＞」はそれぞれ、ろ過したろ過物及び保持物の値を意味する。例えば、「＜１００ｋＤ」はフィルターが１００ｋＤより低い分子量を有する分子だけを含むろ過物を与える、そのような分子のみをろ過するフィルターを示す。同様に、「＞５００ｋＤ」は該フィルターが５００ｋＤより大きい分子量をもつ分子を含む保持物を与える。
【００５０】
＊　ＮＤ＝未測定
＊＊　全てのＤｘサンプル（すなわち、Ｔ１０、Ｔ２０、Ｔ２０Ｐ）はＰｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ ＡＢから入手した。
【００５１】
＊＊＊　Ａ／Ｇ＝Ａ／Ｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏｒｐ．， Ｎｅｅｄｈａｍ， ＭＡ， ＵＳＡ
＊＊＊＊　エタノールｐｐｔ＝エタノール沈降（さらに以下に記載）。
【００５２】
結合反応後に適用したより大きなカットオフサイズのフィルター（例えば、５００ｋＤ）は、過度に大きいＤｘＨｂ複合体（好ましい生成物の上限である約５００ｋＤより大きいＤｘＨｂ複合体）を排除するために行った。複合体化後に適用した中間カットオフサイズのフィルター（例えば、５０ｋＤ、７０ｋＤ）は、好ましい生成物の下限（約５０ｋＤ）より小さい分子を除去するのに利用した。小さいカットオフサイズのフィルター（例えば、１０ｋＤ）の実機能は、複合体化反応後に行った透析方法の機能と同じで、残留反応物（例えば、メルカプトプロピオン酸など）を除去することであった。
【００５３】
エタノール沈降の機能は、過度に大きいデキストラン分子を、活性化ステップ前に排除することである。エタノールは段階的に添加した。例えば、＃５５〜５９（表２）の調製物では、エタノールを初期濃度０％から開始して徐々に最終濃度５５％まで加えた。その結果、若干の過度に大きいデキストラン分子を沈殿させ、ペレット化して除去し、再溶解して後の活性化に用いた。
【００５４】
最も好ましい複数のＤｘＨｂ調製物を表２のリストから選定した。これらの調製物は、表２における＃１３、１４、及び１６である。選定した調製物は所望のＥＳＲ及びＥＸＣ値並びに生成物収率に基づいて選択した。
【００５５】
これらの調製物のピーク分子量を上記のように測定して、図３に示した。図３に示されるように、好ましい調製物、すなわち＃１４の２バッチの調製物及び＃１６の２バッチの調製物のピークＭＷは１０２、９６、９３、８９ｋＤであることがわかった。さらに、図３には示していないが、調製物＃１３の平均ＭＷは１１６ｋＤであることがわかった。これらの数字は、本発明の最も好ましいＤｘＨｂ調製物の平均ＭＷに対する最も好ましい範囲を規定するものである。
【００５６】
従って、本発明によれば、ＤｘＨｂ複合体の好ましいサイズ範囲は約５０ｋＤ〜５００ｋＤであり、最も好ましい範囲は約８９ｋＤ〜約１１６ｋＤである。これらの調製物を合成する最適の方法は、出発サイズ２０ｋＤを有するデキストランの活性化、活性ＤｘＢｒの５００ｋＤ又は３００ｋＤフィルターを用いたろ過、ろ過生成物とストローマフリーヘモグロビンとの結合、得られるＤｘＨｂの５００ｋＤフィルターを用いたろ過による過度に大きい複合体の排除を含むものである。本発明のＤｘＨｂ複合体を製造する最も好ましい方法はまた、得られる複合体を８０ｋＤフィルターを通してろ過し、ＥＸＣ値を増大する可能性のあるいずれの過度に小さい複合体も排除する最終ステップも含む。
【００５７】
次の表３は、表２のデータと類似するＤｘＨｂ複合体調製物のデータを示す。しかし表３は、様々な複合体に関する追加のさらなる調製と分析の情報を含むものである。表３のデータはまた、様々なバッチの分子量分布も示す。
【００５８】
【表３】
2004509168.tif 000009
2004509168.tif 000010
2004509168.tif 000011
【００５９】
注記：
（１）：ＤｘＨｂの結合に示す％の値はＨｂ濃度に対応する。例えば、バッチ５．５については、ＤｘＨｂ結合は１％Ｈｂと０．３３％ＤｘＢｒを用いて実施した。
【００６０】
（２）：最終ＤｘＨｂ分画ステップの正規化した収率であり、生成したＤｘＨｂ成分の割合（％）を示す。
【００６１】
（３）：表３はＥＳＲ値を高い順に並べたデータであり、ＥＳＲ値が上に規定した許容しうる値である「カットオフ（ｃｕｔｏｆｆ）」を示している。
【００６２】
以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態を説明するものであって、決して本発明を限定することを意図するものでない。
【００６３】
実施例１：ストローマフリーヒトヘモグロビン（ＳＦＨ）の調製
本発明のＳＦＨを上記の方法に従って調製した。期限切れのヒト血液を香港赤十字輸血サービス（Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ Ｒｅｄ Ｃｒｏｓｓ Ｂｌｏｏｄ Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ Ｓｅｒｖｉｃｅ）から供給を受けた。Ａ、ＡＢ又はＯ型の全血１５ユニット（約４．５リットル）をプールし、４．５Ｌの１０ｍＭ ＰＢＳ（リン酸緩衝化生理食塩水−１０ｍＭリン酸ナトリウムバッファーと１５４ｍＭ ＮａＣｌとの混合物）ｐＨ７．４と１０リットルガラス瓶中で混合した。赤血球（ＲＢＣ）を７倍量の冷バッファーを用いて洗浄し、ＦｌｅｘＳｔｒａｎｄＴＭ（Ａ／Ｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏｒｐ．、Ｎｅｅｄｈａｍ、ＭＡ）上に取り付けた０．６５μｍ（ＣＦＰ−６−Ｄ−６Ａ）の中空線維フィルターを用いて約１０Ｌの一定量でダイアフィルトレーションを行った。次いでＲＢＣを低張性１０ｍＭリン酸バッファーによって同じｐＨにて、０．１μｍメンブランカートリッジ（ＣＦＰ−１−Ｅ−６Ａ、Ａ／Ｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏｒｐ）を用いて徐々に溶解した。ＲＢＣ血球の１倍量をバッファーを５倍量まで用いて完全に洗浄した。次いでろ液を５００ｋＤフィルター（ＵＦＰ−５００−Ｅ５Ａ、Ａ／Ｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏｒｐ．）を通してダイアフィルトレーションを行い、確実にストローマフリーとし、次いで１０ｋＤメンブランカートリッジ（ＵＦＰ−１０−Ｅ−９Ａ、Ａ／Ｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏｒｐ．）を通して循環することにより２０ｇ／ｄＬまで濃縮した。溶液を最終貯蔵バッファーである１０ｍＭ ＰＢＳ（ｐＨ７．４）を用いてダイアフィルトレーションを行った。最終ヘモグロビン溶液を、さらにプレフィルターと０．２２μｍフィルター（２９３ｍｍ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を直列に通して確実に無菌性とした。ストローマフリーヘモグロビン溶液をビン詰めして４℃にて貯蔵した。
【００６４】
実施例２：アルキル化法によるデキストランの活性化
本発明の好ましい実施形態に従って、アルキル化法によるデキストラン活性化には、小規模及びパイロット規模の活性化が含まれる。小規模デキストラン活性化は研究目的に十分なだけの限られた量のＤｘＨｂのみを生成するのに対して、パイロット規模デキストラン活性化法はさらに大量のＤｘＨｂを続いて行う複合体化のために産業的な規模で生成することができる。
【００６５】
ａ）　小規模活性化
アセトニトリル３ｍＬ中に溶解した臭化シアン（ＣＮＢｒ）（Ｒｉｅｄｅｌ−ｄｅ Ｈａｅｎ）０．３ｇを、２％デキストラン（平均ＭＷ２０ｋＤ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ）９５ｍＬに加え、活性化を５分間進行させた。活性化の間、１Ｍ ＮａＯＨを連続添加してｐＨを１０．８に維持する。その後、ｐＨを２Ｍ ＨＣｌを用いて２．０〜２．５に低下させた。次いで、ジアミノエタン（Ｓｉｇｍａ）２ｍＬを加えるとともに追加のＨＣｌを加えてｐＨが９．５を超えるのを防止した。４℃にて一夜攪拌した後、混合物を蒸留水に対して完全に透析した。透析の完全性は透析液をニンヒドリン法を用いて試験することによって好ましく確認した。こうしてアミノエチルアミノ−デキストランを得た。次いで固体Ｎａ２ＨＰＯ４を混合物に加えて濃度０．１Ｍ及びｐＨ７．０とし、ブロモアセチルブロミド（Ｆｌｕｋａ）３ｍＬを２時間かけて加え、激しく攪拌しかつ１Ｍ ＮａＯＨを加えてｐＨを７．０に維持した。次いで混合物を再び蒸留水に対して透析した。透析液を硝酸銀溶液を用いて試験することによって、透析の完全性を好ましく確認した。透析後、生成物Ｎ−ブロモアセチル−アミノエチルアミノ−デキストラン（ＤｘＢｒ）を凍結乾燥して、フリーザー内で貯蔵して使用に備えた。
【００６６】
ｂ）パイロット規模活性化
ＣＮＢｒ（Ｒｉｅｄｅｌ−ｄｅ Ｈａｅｎ）２８ｇをアセトニトリル５０ｍＬ中に溶解し、次いで３．５％デキストラン（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）４．０Ｌに加えた。５〜１０分間、６Ｍ ＮａＯＨ（約５０ｍＬ）を連続添加することにより、溶液のｐＨを１０．８に維持した。その後、６Ｎ ＨＣｌ約５０ｍＬを加えてｐＨを２．０付近に低下させた。次いで、ジアミノエタン（Ｓｉｇｍａ）２１０ｍＬを加えるとともに６Ｎ ＨＣｌ（約５００ｍＬ）を加えてｐＨを９．５未満に保った。４℃にて一夜攪拌した後、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｐｅｌｌｉｃｏｎカセットフィルターアクリルホルダー及び３層ＰＴＧＣ ０００５カセット（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて１分間当たり約８Ｌの流速で、混合物を蒸留水４０Ｌに対して完全にダイアフィルトレーションした。デキストラン溶液の循環は、イージーロード・ポンプヘッド（Ｅａｓｙ−ｌｏａｄ ｐｕｍｐ ｈｅａｄ）（Ｍｏｄｅｌ ７５４９−４０， ＭａｓｔｅｒＦｌｅｘ）を備えたＣｏｌｅ−Ｐａｒｍｅｒぜん動ポンプ（モデル７５４９−４０）を用いて維持した。循環容積は３〜４Ｌに保った。透析の完全性をモニターするために、次いでろ過物について以下に記載のニンヒドリン試験を行った。
【００６７】
その後、激しく攪拌しながら２時間かけて、ブロモ−アセチルブロミド（Ｆｌｕｋａ）を徐々に加え、その間、溶液は６Ｍ ＮａＯＨを加えることにより中性ｐＨに維持した。次いで、混合物を、Ｐｅｌｌｉｃｏｎカセットを用いて蒸留水（約５０Ｌ）に対して完全に透析した。以下に記載のように硝酸銀試験を用いて透析液を試験することによって、透析の完全性を確認した。活性化したブロモデキストランを凍結乾燥して−２０℃で貯蔵した。
【００６８】
ｃ）ニンヒドリン試験
最初に、ニンヒドリン溶液を、先にＭｏｏｒｅ， Ｓ．及びＳｔｅｉｎ， Ｗ．Ｈ．（Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， １９４８， １７６：３６７−３８８；本明細書に参照により組み入れられる）が記載したように調製した。簡単に説明すると、ｐＨ５．５の４．０Ｍ酢酸ナトリウム１．０Ｌとエチレングリコールモノメチルエーテル（Ｓｉｇｍａ）３．０Ｌを混合することにより、ニンヒドリン溶液を調製した。混合物に窒素を１時間通気した。次いで、ニンヒドリン（Ｓｉｇｍａ）８０ｇ及び２１％塩化第一チタン溶液（Ｓｉｇｍａ）７．５ｍＬを加えた。ニンヒドリン溶液は窒素雰囲気下に保った。
【００６９】
試験を実施するために、ニンヒドリン溶液１．０ｍＬをＤｘＢｒ溶液１．０ｍＬと混合し、該混合物を１００℃にて１５分間反応させた。５０％エタノール２．０ｍＬを加えることによって安定化しうる青い呈色は、陽性結果を示した。定量分析は５７０ｎｍにおける分光分析によって得た。エチルアミンを較正に使用した。アミノ基が不在であると無色の溶液が得られ、これは反応の完了を示す。
【００７０】
より簡単なニンヒドリン試験を実施して定性的な結果を得ることができ、その場合、ニンヒドリン（Ｓｉｇｍａ）１．０ｇを５０ｍＬ蒸留水に溶解する。このニンヒドリン溶液０．５ｍＬを等量のＤｘＢｒ溶液と混合する。もし残余アミノ基があれば、混合物が黄色を呈することになる。
【００７１】
ｄ）硝酸銀試験
試験は、硝酸銀（ＡｇＮＯ３）（Ｎａｌｃａｌａｉ Ｔｅｓｑｕｅ）溶液を用いて実施した。最初に、ブロモ基をアルカリ加水分解によって遊離させた。１Ｍ ＮａＯＨ ３滴をそれぞれのＤｘＢｒサンプル０．５ｍＬに加え、この溶液を３７℃にて３０分間インキュベートした。続いて濃硝酸３滴を加え、その後にさらに１％ ＡｇＮＯ３溶液３滴を加えた。もし臭化物が存在すれば臭化銀の白色沈殿を生じて、溶液は白濁することになる。上記の実際の実験においては、白色沈殿はなくＤｘＢｒ溶液中にブロモ基が不在であることを示した。
【００７２】
実施例３：デキストラン−ヘモグロビン複合体の調製
本発明によれば、複合体化反応は、好ましくはＤｘＢｒ １６．７ｇを１％ストローマフリーヘモグロビン溶液５Ｌ（０．３３％ ＤｘＢｒ）に溶解することにより実施した。炭酸水素ナトリウムバッファーを加えて最終濃度０．１Ｍとし、１Ｍ ＮａＯＨを用いてｐＨを９．５に調節した。最初に、溶液混合物を０．２２μｍフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を通過させることによって無菌化し、攪拌し、そして結合反応を４℃にて１６時間進行させた。１６ｍＭ β−メルカプトプロピオン酸（Ｓｉｇｍａ、ＮａＯＨによってｐＨ０．５に調節した）を加えて残留ブロモ基と反応させて結合反応を停止した。溶液を１０ｍＭリン酸緩衝化生理食塩水（ｐＨ７．４）に対して透析し、６０分後に、β−メルカプトプロピオン酸、ブロモ基などの残留反応物を取り除いた。小さい試験管規模では通常の透析バッグを使用したが、パイロット規模のダイアフィルトレーションでは１０ｋＤフィルターカートリッジ（ＵＦＰ−１０−Ｅ−９Ａ、Ａ／Ｇ Ｔｅｃｈｎｏｌ．）を用いた。
【００７３】
実施例４：分子量測定：ろ過カラムの較正
本発明のＤｘＨｂ調製物の分子量を測定するためのゲルろ過クロマトグラフィーを用いる好ましい方法は、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ技術報告（Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ Ｎｏ．ＧＦ−３、１９８７年１０月）に概説されている。ＳｕｐｅｒｄｅｘＴＭ ２００，２６／６００ゲルろ過カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を使用した。該カラムは、本発明のＤｘＨｂ複合体のＭＷを測定する前に標準タンパク質を用いて較正した。使用した標準タンパク質は次の通りであった：シトクロムｃ（ＭＷ １２．４ｋＤ）、炭酸脱水素酵素（ＭＷ ２９ｋＤ）、アルブミン（ＭＷ ６６ｋＤ）、アルコール脱水素酵素（ＭＷ １５０ｋＤ）、β−アミラーゼ（ＭＷ ２００ｋＤ）、フェリチン（ＭＷ ４４０ｋＤ）。較正曲線を図２に示したが、ここでは、それぞれのタンパク質標準について、分子量をＶｅ／Ｖｏに対してプロットした。各画分は様々なＭＷ値のＤｘＨｂを含有しうるので、各画分に対して平均分子量を決定した。
【００７４】
実施例５：モルモットの出血モデルの開発
方法
６匹の正常で健康なモルモットを出血条件の最適化に用いて、生存率に与える影響及び酸素の組織への送達の評価を研究するために有用な出血モデルを開発した。モルモットは、実験の少なくとも１週間前に収容した。食餌と水を自由に摂れるようにした。
【００７５】
モルモットは気道が狭くエーテルの使用を避けるべきことが知られているので、動物はペントバルビタールの腹腔内（ｉ．ｐ．）注射によって麻酔した。頚静脈と頚動脈にカニューレを挿入して対照又は試験溶液を輸血し、そして電子式増幅器及び１０ｍＶ記録計と接続した圧力変換器を用いて血圧を測定した。最初の１０分間に、動物から最大出血量（Ｍａｘｉｍｕｍ Ｂｌｅｄ Ｏｕｔ）の３０％、５０％、７０％、９０％、及び１００％の率で出血させ、次いで時折、より少ない約０．２〜０．５ｍｌの量で出血させて血圧を低く保った。出血した血液量は次の通り計算した：
全血液量（ＴＢＶ）＝体重（ｇ）×８％
最大出血量（ＭＢＯ）＝ＴＢＶ×６０％
１０分間出血量（１０ＢＯ）＝ＭＢＯ×各種パーセント
出血及び約２５ｍｍＨｂの低血圧にて９０分間維持した後、０．２ｍｌの血液を採取して血清乳酸キット（Ｓｉｇｍａ）を用いて乳酸を定量した。Ｓｉｇｍａの診断キットに示された方法に従って行った。簡単に説明すると、血液を等量のＴＣＡ溶液と混合し、数分間静置の後に遠心分離した。上清は、後の乳酸アッセイに使うため貯蔵した。血管を結び、創傷をアンピシリンを用いてすすぎ、そして縫合した。次いで、動物をモニターし、生存率及び体重データを記録した。７日間以上生存した動物を「生存動物」として分類した。
【００７６】
結果と結論
次の生存率及び９０分における血液乳酸レベルの結果を得た。
【００７７】
2004509168.tif 000012
【００７８】
図４及び５は、血液量不足ショック動物の長期生存率に及ぼす１０分間出血量の影響、及び生存率と９０分における乳酸レベルとの間の関係を示す。一般的に言えることは、出血が速いほど乳酸レベルは高く、このことは、動物の無酸素性呼吸、従って動物が血液量不足ショック状態にあったことを示唆する。さらに、乳酸レベルが高いほど長期生存率が低かった。生存動物は、実験後２ヶ月以上生存することができ、徐々に体重が増加することが観察された。逆に、動物が回復しなかった場合、体重損失が続いて最終的に最初の数日の内に死亡した。
【００７９】
実施例６：モルモットにおける、致命的な出血後のデキストラン−ヘモグロビン溶液による蘇生
方法
体重３５０〜５５０ｇの市販モルモットを一夜（１６時間）絶食し、次いでペントバルビタール（Ｓｉｇｍａ）を用いて腹腔内注射により麻酔した。後足つま先のつねりに対する応答によって麻酔レベルを評価し、十分な応答をさらなる用量のペントバルビタール注射によって連続的に維持した。頚動脈にカニューレを挿入して、出血用、及び電子式増幅器と１０ｍＶチャート記録計に接続した圧力変換器による動脈圧力測定用とした。頚静脈にカニューレを挿入して、液体注入用とした。
【００８０】
ＭＢＯの７０％に等しい容量を頚動脈を通して最初の１０分間に出血させると、その間に血圧は８５ｍｍＨｇから３０ｍｍＨｇへ変化した。次いで、次の８０分間は時折０．２〜０．５ｍｌを出血させて血圧を２５〜３０ｍｍＨｇに保った。９０分に、対照バッファー、ヘモグロビン（Ｈｂ）又は分画デキストラン−ヘモグロビン（ＤｘＨｂ）を含む腎透析液を、出血させた量で６０分間にわたって注入した。実験中に出血技術の不一致により低過ぎるか又は過度に高い乳酸レベルを生じる可能性があるので、９０分乳酸レベルが５０〜９０ｍｇ／ｄｌのものだけを含めた。
【００８１】
結果と結論
2004509168.tif 000013
【００８２】
使用したＤｘＨｂ複合体の説明：
2004509168.tif 000014
【００８３】
当業者であれば、本発明のＤｘＨｂ複合体が様々な目的にかつ様々な方法に利用できることを理解するであろう。主に、本発明の複合体は、血液代用品又は血液増量剤として使用することができる。例を挙げれば、ＤｘＨｂ複合体は出血性ショック（外傷部分において）を防止するため又は血液透析用の血液代用品として使用することができる。
【００８４】
本発明はある特定の実施形態を参照して説明されているが、本明細書に記載の特許請求の範囲に記載した本発明の精神と範囲を逸脱することなしに、その様々な修飾を行いうることが当業者には明らかであろう。
【００８５】
参照文献
以下に、本明細書中で示した参照文献の一部を記載する。以下の文献の内容は参照により本明細書に組み入れる。
【００８６】
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【図面の簡単な説明】
【図１】
２つの出発サイズのデキストラン分子、すなわち１０ｋＤ（ＤｘＴ１０）及び２０ｋＤ（ＤｘＴ２０）から合成したデキストラン−ヘモグロビンに対する、赤血球沈降速度（ＥＳＲ）及び排泄率（ＥＸＣ）のサイズ依存性を示す。
【図２】
標準タンパク質を用いた、ゲルろ過カラムＳｕｐｅｒｄｅｘＴＭ２００，２６／６００の較正直線を示す。
【図３】
ＦＰＬＣ及びＭｉｎｉＤａｗｎレーザー検出器を用いて測定した、４つの最も好ましいＤｘＨｂ調製物の分子量分布を示す。
【図４】
実施例５の実験結果を示す。
【図５】
実施例５の実験結果を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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