(57)【要約】炎症状態の治療のために有用な医薬品としてのアデノシン−５’−三リン酸−２’，３’−ジアルデヒド（ｏＡＴＰ）の使用が開示される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
医薬品として使用するための化合物アデノシン−５’−三リン酸−２’，３’−ジアルデヒド。
【請求項２】
炎症および疼痛の治療において使用するための、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
アデノシン−５’−三リン酸−２’，３’−ジアルデヒドを活性成分として含む医薬品組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、炎症状態の治療のために有用な医薬品の調製におけるアデノシン−５’−三リン酸−２’，３’−ジアルデヒド（ｏＡＴＰ）の使用に関する。
【０００２】
ｏＡＴＰ分子はＡＴＰからリボースの２’−および３’位にあるヒドロキシルのジアルデヒドへの酸化により誘導される。そのような酸化はＰ．Ｎ．Ｌｏｗｅ　ｅｔ　ａｌ．、「過ヨウ素酸塩により酸化されたアデノシン三リン酸およびいくつかの関係化合物の調製および化学的性質（Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｃｈｅｍｉｃａｌ　ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ　ｏｆ　ｐｅｒｉｏｄａｔｅ−ｏｘｉｄｉｚｅｄ　ａｄｅｎｏｓｉｎｅ　ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ　ａｎｄ　ｓｏｍｅ　ｒｅｌａｔｅｄ　ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ）」、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｓｏｃｉｅｔｙ　Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ、Ｖｏｌ．７：１１３１〜１１３３、１９７９に記載のとおり、過ヨウ素酸塩を用いて実施することができる。
【０００３】
ＡＴＰ２’，３’−ジアルデヒド誘導体は、酵素のヌクレオチド部位のリシン非プロトン化残基と反応してシッフ塩基またはジヒドロモルホリノ誘導体を生成することができる（Ｃｏｌｍａｎ，Ｒ．Ｆ．（１９９０）、Ｔｈｅ　Ｅｎｚｙｍｅｓ−Ｓｉｇｍａｎ，Ｄ．Ｓ．、ａｎｄ　Ｂｏｙｅｒ，Ｐ．Ｄ．、ｅｄｓ−Ｖｏｌ　１９、ｐｐ．２８３〜３２３、Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ）ため、伝統的に、酵素のヌクレオチド部位の親和性標識として用いられている（Ｅａｓｔｅｒｂｒｏｏｋ−Ｓｍｉｔｈ，Ｂ．、Ｗａｌｌａｃｅ，Ｊ．Ｃ．＆　Ｋｅｅｃｈ，Ｄ．Ｂ．（１９７６）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６２、１２５〜１３０）。ｏＡＴＰ分子はまた、血小板活性化を調べ、ＡＴＰによるニワトリ骨格筋の刺激を阻害するためにも用いられている（Ｐｅａｒｃｅ，Ｐ．Ｈ．、Ｗｒｉｇｈｔ，Ｊ．Ｍ．Ｅｇａｎ．Ｃ．Ｍ．＆　Ｓｃｒｕｔｔｏｎ，Ｍ．Ｃ．（１９７８）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．８８、５４３〜５５４；Ｔｈｏｍａｓ，Ｓ．Ａ．、Ｚａｗｉｓａ，Ｍ．Ｊ．、Ｌｉｎ，Ｘ．＆　Ｈｕｍｅ，Ｒ．Ｉ．（１９９１）Ｂｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１０３　１９６３〜１９６９）。さらに、マクロファージ細胞株での試験により、ｏＡＴＰはＡＴＰによる原形質膜を透過可能にする作用を阻止し、膜のｅｃｔｏ−ＡＴＰアーゼによる外因性ＡＴＰの加水分解レベルを低下させ、かつＡＴＰによる腫脹、液胞化および細胞溶解作用を阻害することができると判明した（Ｍｕｒｇｉａ　ｅｔ　ａｌ．Ｔｈｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　（１９９３）ｂｙ　Ｔｈｅ　Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｓｏｃｉｅｔｙ　ｆｏｒ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ａｎｄ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｉｎｃ．　Ｖｏｌ．２６８　Ｎｏ．１１　ｐｐ８１９９）。ｏＡＴＰはＰ２ｚ／Ｐ２Ｘ７プリン受容体に対する拮抗作用を有することが示唆されている。Ｐ２ｚ／Ｐ２Ｘ７を発現する小神経膠細胞からのＩＬ−１β（インターロイキン１β）のＬＰＳ（＝ｌｙｐｏ多糖）依存性放出は事実、ｏＡＴＰによって選択的に阻害される（Ｆｅｒｒａｒｉ　Ｄ．ｅｔ　ａｌ．　Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．（１９９７）Ｖｏｌ．１８５　Ｎ．３　Ｐａｇ．５７９〜５８２）。
【０００４】
現在、ｏＡＴＰはインビボで顕著な抗炎症および抗侵害受容作用を発揮することが明らかにされている。実験モデルとして、フロイントの完全アジュバント（ＦＣＡ）を足底内注入した後の、ラット後ろ足の片側炎症を用いている。処置ラットの対照側足、ならびに未処置ラットの足を対照として用いた。ＦＣＡにより誘導された炎症は、注入後３時間から２４〜４８時間まで、足体積の増加、高体温、および痛覚過敏により証明された。痛覚過敏は、侵害受容閾値を評価することができる、痛覚測定試験（足圧試験）によって評価した。ｏＡＴＰの足底内注入は、痛覚（侵害受容）を有意に低減し、すなわち侵害受容の閾値を高めた。ｏＡＴＰは異なる用量でも必ず、有意な用量依存性の鎮痛作用を引き起こし、この作用は約１２〜２４時間持続し、作用のピークは投与後１時間ですでに認められた。さらに、ｏＡＴＰ処理ラットの足は、他の炎症徴候（腫脹および高体温）の減少も示した。さらなる試験において、ｏＡＴＰと、関節炎性病変に用いられる公知の抗炎症薬であるジクロフェナクとの間の比較により、ｏＡＴＰがジクロフェナクよりも有意に高い鎮痛作用を引き起こすことが判明した。ラットを白血球漏出阻害剤フコイジン（ｆｕｃｏｉｄｉｎ）で前処置した試験では、ｏＡＴＰ活性は炎症部位における白血球動員と無関係であることが明らかとなった。炎症部位のＡＴＰレベルは未処置ラットで有意に高く、このことはｏＡＴＰが外因性ＡＴＰの産生をいくらか阻止し、したがってその炎症誘発活性を防止することを示唆している。
【０００５】
本発明は、炎症および疼痛状態を治療する医薬品としての、ｏＡＴＰの使用に関する。本発明はさらに、活性成分としてのｏＡＴＰを、医薬品として許容される賦形剤と共に含む、医薬品組成物に関する。経口、局所または非経口投与に適した剤形は、例えば、錠剤、糖衣錠、カプセル剤、顆粒剤、散剤、坐剤、シロップ、液剤、懸濁剤、クリーム、軟膏、ゲル、ペースト、ローション、乳剤、スプレーである。医薬品組成物は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ　Ｈａｎｄｂｏｏｋ、Ｍａｃｋ　Ｐｕｂ．Ｃｏ．、ＮＹ、ＵＳＡ、ＸＶＩＩ　Ｅｄ．の記載に従って調製することができる。１日１回以上で投与する単位用量あたりの活性成分の量は、治療する疾患の重症度および患者の状態に応じて、体重１ｋｇあたり０．０５から１００ｍｇの範囲でありうる。１日用量は通常、１〜３００ｍｇ、好ましくは１０〜１００ｍｇの範囲となる。
【０００６】
本発明の化合物は、他の現在用いられている抗炎症薬との組み合わせで用いることもできる。
【０００７】
下記の実施例は、本発明をさらに例示するものである。
【０００８】
実施例１：ｏＡＴＰの薬理活性
ラットにおける炎症の誘導
体重約２５０ｇの雄Ｆｉｓｃｈｅｒ近交系ラット（Ｃｈａｒｌｅｓ　Ｒｉｖｅｒ　Ｉｔａｌｙ、Ｃａｌｃｏ、Ｌｅｃｃｏ、イタリア）を用いた。ラットに、短時間のイソフルラン麻酔下でフロイントの完全アジュバント（ＦＣＡ）（０．１５ｍｌ）を右後ろ足に足底内注入した。この注入により、足体積の増加、高体温および痛覚過敏によって証明される片側の炎症が誘導された（注入後３時間から２４〜４８時間まで）。痛覚過敏は、痛覚測定計（Ｕｇｏ　Ｂａｓｉｌｅ、Ｃｏｍｅｒｉｏ、イタリア）を用いて足圧閾値（グラム）、すなわち侵害受容閾値を示す、足の引き戻しを誘発するのに要する圧を調べる痛覚測定試験によって評価した。各試験には６から８匹のラットを用いた。これらの試験中、ラットは「標準倫理指針」（ＮＩＨ、１９８５）に従って扱った。
【０００９】
ｏＡＴＰによる処置
ＦＣＡ注入から２４時間後に、ラットの炎症足に異なる用量のｏＡＴＰ（５６から３３６μＭ）の足底内注入を行い、ｏＡＴＰ注入時を時間０と考えた。得られた侵害受容閾値を下記の表１に示す。
【００１０】
【表１】
2004505922.tif 000002
【００１１】
データは足圧閾値（ｇで評価）の平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．で表している。時間０’（未処置炎症足）に対しｐ＜０．０５
＊マン−ホイットニー（Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ）検定。
【００１２】
ｏＡＴＰ　５６μｍの代わりにｏＡＴＰ　３５μｍを用いて、または炎症プロセス（ＦＣＡ注入）を２４時間ではなく６もしくは１２時間誘導して、同様の結果が得られた。さらに、ｏＡＴＰ処置した足は未処置の足に比べて、痛みが少なく、炎症徴候（腫脹、高体温）の低下も認められた。
【００１３】
ｏＡＴＰは、用いた最少用量ですでに有意に高い効果が得られたが、用量依存性の効果が証明された。しかし、低用量では鎮痛効果の持続時間が短く、これはおそらく、Ｐ２Ｘ７受容体の不完全な飽和によると考えられる。
【００１４】
用いた最大ｏＡＴＰ用量の効果を、他の一連の実験で、炎症プロセスを４８時間前に誘導しておいたラットの足で、さらに長い時間試験した（表２）。データから、ｏＡＴＰ注入により侵害受容閾値は、時間と共に漸減するとはいうものの、非常に長時間有意に高まることが明らかにされている。
【００１５】
【表２】
2004505922.tif 000003
【００１６】
対照足（非炎症対照側の足および未処置の足の両方）の侵害受容閾値は、侵害受容閾値すなわち足圧閾値をｇで評価して、約１００〜１５０であった。
【００１７】
ＡＴＰ（０．９ｍｍｏｌｅ）（細胞外ＡＴＰは細胞溶解性で、したがって侵害受容信号を開始することができると考えられる）の足底内注入により、炎症足では６５±４．２から５０±４．１への低下が見られたのに比べて、非炎症足では炎症足よりも侵害受容閾値の有意に大幅な低下が引き起こされた（非炎症足で、１２０±３．２からＡＴＰの足底内注入の２４０分後に見られた２５±３．０なる値）。この結果はおそらく、細胞溶解性ＡＴＰは非炎症足に比べて炎症足にはすでに大量に存在することを示している。他方、ｏＡＴＰは、非炎症足においても、侵害受容閾値を短時間高めるのに有効で、最低ｏＡＴＰ濃度（＝５６μＭ）ですでに有効であった。非炎症足の用量／作用曲線は実際、異なる濃度の分子を用いて重ね合わせ可能であった（ｏＡＴＰ投与後１２０分まで）。ｏＡＴＰ鎮痛効果が、内因性β−エンドルフィンを産生することができる炎症細胞の活性化に多少なりとも関係しているかどうかを確認するために、一部のラットにフコイジン（１０ｍｇ／ｋｇ）を静脈内注入した。フコイジンは実際、白血球漏出およびそれらの炎症部位への蓄積を阻害する。フコイジンによる前処置を、ラットの片足にＦＣＡを注入する３０分前に、両足に行った。疼痛圧閾値（ＰＰＴ）を、ｏＡＴＰ注入（２２４μｍ）の前後に非炎症足および炎症足の両方で測定した。得られた結果を図１のグラフに示す。ｏＡＴＰを注入しても、非炎症足のＰＰＴ値が有意に変わることはなかったが、炎症足では、炎症誘発性ＦＣＡの注入によって有意に低下したＰＰＴレベルがｏＡＴＰ処置により回復した。したがって、ｏＡＴＰ鎮痛効果は、白血球動員とは無関係であった。
【００１８】
最後に、ｏＡＴＰ抗侵害受容効果を、公知の抗炎症および鎮痛薬であるジクロフェナクと比較した。基準疼痛閾値を評価した後、ラット後ろ足の片側炎症をＦＣＡ注入により誘導した。注入の３時間後、ラットを２群に分け、一方はｏＡＴＰ（３３６μＭ）、他方はジクロフェナク（１５ｍｇ）で局所処置を行った。ｏＡＴＰの鎮痛効果はジクロフェナクの効果よりも有意に高かった（代表的試験の結果を図２に示す）。ｏＡＴＰおよびジクロフェナクの濃度は、ラットに足底内注入する前に、分子が滅菌食塩水に十分溶解できるように選択した。
【００１９】
最後に、ラットにｏＡＴＰを静脈内注入すると、試験した足底内用量で、反射はまだ明らかに存在していたが、約２時間の用量依存的な疼痛軽減が誘導された。
【００２０】
ＡＴＰ含有量を、ｏＡＴＰ処置ラットの足および対照側未処置の足で評価した。足の皮下組織を炎症足および非炎症足の両方から摘出し、液体窒素中で速やかに凍結した。凍結組織試料を秤量し、リン酸緩衝液中でホモジナイズし、次いでＫ２ＣＯ３で処理して中和し、最後に遠心分離した。発光法に従い、上清をＡＴＰアッセイに用いた。
【００２１】
ＡＴＰ値はｏＡＴＰ処置した足よりも未処置の足のホモジネートで有意に高かった（未処置ラットの新鮮組織１ｇあたり１０５０±９０ｎｍｏｌｅに対し、ｏＡＴＰ処置ラットの新鮮組織１ｇあたり３２０±２２ｎｍｏｌｅ−値はそれぞれ７つの実験の平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．）。これは、ｏＡＴＰがある組織構造による外因性ＡＴＰの産生を、その膜受容体に結合して阻止し、それにより外因性ＡＴＰによって引き起こされる損傷を低減することを示している。
【００２２】
実施例２：ｏＡＴＰ処置後の末梢皮下組織におけるＡＴＰ含有量の変化
−ラットの足におけるＡＴＰ含有量アッセイ
発明者らは、別のラット群で、炎症プロセスおよび／またはｏＡＴＰ処置により足底内組織において誘導されたＡＴＰ含有量の変化を調べた。設定された時間に、足の皮下組織を摘出し、いかなる代謝活性も阻止するために、液体窒素中で速やかに凍結した。凍結組織を氷冷した６％（ｗ／ｖ）ＨＣｌＯ４中、ポリトロン（Ｋｉｎｅｍａｔｉｃａ　ＧｍｂＨ、Ｌｕｚｅｒｎ、スイス）でホモジナイズし、ヌクレオチドを抽出した。以前に記載されている方法（Ｍａｒｎｉ　ｅｔ　ａｌ．、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ（１９８８）、４６：８３０〜８３５）に従い、ホモジネートを遠心分離し、上清をＡＴＰの定量のために用いた。ＡＴＰアッセイを発光法（Ｆｅｒｒｅｒｏ　ｅｔ　ａｌ．、Ｒｅｓ　Ｃｏｍｍｕｎ　Ｃｈｅｍ　Ｐａｔｈ　Ｐｈａｒｍａｃ　１９８４；４５：５５〜６７）により実施した。
【００２３】
−結果
発明者らは、ｏＡＴＰで処置した炎症足（２４時間のＦＣＡ処置による）および非炎症足で、ｏＡＴＰ投与の６および１２時間後、ならびに対照側未処置の足でＡＴＰレベルを測定した。図３に示すとおり、非炎症組織において、ｏＡＴＰ処置はＡＴＰレベルを有意に変化させることはなかった。データは代謝物の細胞内レベルを表していると考えられ、これはｏＡＴＰ処置によって有意に変化することはない。これとは対照的に、炎症組織のＡＴＰレベルは非炎症組織よりも有意に高く、ｏＡＴＰ処置によって有意に低下した。実際、細胞からのＡＴＰ放出（細胞外ＡＴＰ）は、細胞の損傷を必要とし、炎症または他の変性プロセス中に起こる。ｏＡＴＰと、多くの細胞および知覚神経末端上に局在する受容体との結合は、細胞外ＡＴＰと同じ構造との結合を競合的に阻害するため、ＡＴＰに関係する細胞毒性を制限し、疼痛の軽減を引き起こすと考えられる。発明者らの結果より、炎症組織におけるｏＡＴＰ処置は、炎症または他の細胞により、おそらくはそれらの活性化の阻止を通じて、ＡＴＰのさらなる産生を制限することも明らかにされている。
【００２４】
図３：炎症または非炎症足のＡＴＰレベルに対するｏＡＴＰ足底内注入の効果　ラットの足にｏＡＴＰ（３５μＭ）を足底内注入した後、６および１２時間の時点のＡＴＰ含有量：炎症（２４　ＦＣＡ投与による）（黒）、炎症−ｏＡＴＰ処置（斜線）、非炎症（白）、非炎症−ｏＡＴＰ処置（横線）。＊炎症未処置の足と比較してｐ＜０．００５、ウィルコクソン検定。データは７つの実験の平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．で表している。
【図面の簡単な説明】
【図１】
ＡＴＰ注入の前後における非炎症足及び炎症足の疼痛圧閾値の結果を示す。
【図２】
ｏＡＴＰ抗侵害受容効果をジクロフェナクと比較した結果を示す。
【図３】
炎症または非炎症足のＡＴＰレベルに対するｏＡＴＰ足底内注入の効果を示す。
【図１】
2004505922.tif 000004
【図２】
2004505922.tif 000005
【図３】
2004505922.tif 000006
【国際公開パンフレット】
2004505922.tif 000007
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004505922.tif 000020
【国際調査報告】
2004505922.tif 000021
2004505922.tif 000022
2004505922.tif 000023