(57)【要約】本発明は、哺乳類多能性成体幹細胞（MASC）に関し、より詳細には、MASCを入手し、維持し、そして分化させる方法に関する。疾患の治療におけるMASCの使用もまた提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
中胚葉性、外胚葉性および内胚葉性起源の少なくとも一つの分化細胞型を形成するように分化誘導される能力を有する、単離された多能性成体幹細胞（MASC）。
【請求項２】
哺乳類の胚以外の器官または組織に由来することを特徴とする請求項１記載の細胞。
【請求項３】
骨芽細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、繊維芽細胞、骨髄間質、骨格筋、平滑筋、心筋、眼、内皮、上皮、肝、膵、造血、グリア、神経細胞および稀突起膠細胞の細胞型より成る群から選択される細胞を形成するように分化誘導される能力を有することを特徴とする請求項１記載の細胞。
【請求項４】
前記器官または組織が、骨髄、筋、脳、臍帯血および胎盤より成る群から選択されることを特徴とする請求項１記載の細胞。
【請求項５】
前記哺乳類がマウスであることを特徴とする請求項２記載の細胞。
【請求項６】
前記哺乳類がラットであることを特徴とする請求項２記載の細胞。
【請求項７】
前記哺乳類がヒトであることを特徴とする請求項２記載の細胞。
【請求項８】
分化がin vivoまたはex vivoで誘導されることを特徴とする請求項１記載の細胞。
【請求項９】
分化がin vivoまたはex vivoで誘導されることを特徴とする請求項３記載の細胞。
【請求項１０】
前記細胞が構成的にoct4および高レベルのテロメラーゼを発現することを特徴とする請求項１記載の細胞。
【請求項１１】
前記細胞がCD44、MHCクラスIおよびMHCクラスII発現について陰性であることを特徴とする請求項１０記載の細胞。
【請求項１２】
（a）請求項１記載の細胞を胚盤胞に導入する；
（b）（a）の胚盤胞を代理母に移植する；そして
（c）仔を発生および出生させる；
各工程を含むことを特徴とする、正常な非ヒト動物を作成する方法。
【請求項１３】
前記動物がキメラであることを特徴とする請求項１２記載の動物。
【請求項１４】
MASCの集団と該MASCを拡大させる培地とを含む組成物。
【請求項１５】
前記培地が、上皮成長因子（EOF）および血小板由来成長因子（PDGF）を含むことを特徴とする請求項１４記載の組成物。
【請求項１６】
前記培地が、白血病抑制因子（LEF）をさらに含むことを特徴とする請求項１５記載の組成物。
【請求項１７】
完全にまたは部分的に精製されたMASC子孫細胞の集団を含む組成物。
【請求項１８】
前記子孫細胞がさらに分化する能力を有することを特徴とする請求項１７記載の組成物。
【請求項１９】
前記子孫細胞が最終分化していることを特徴とする請求項１７記載の組成物。
【請求項２０】
前記子孫細胞が、骨芽細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、繊維芽細胞、骨髄間質、骨格筋、平滑筋、心筋、眼、内皮、上皮、肝、膵、造血、グリア、神経細胞または稀突起膠細胞の細胞型であることを特徴とする請求項１７記載の組成物。
【請求項２１】
（a）哺乳類から組織を得る；
（b）接着性細胞の集団を確立する；
（c）前記集団からCD45+細胞を除去する；
（d）CD45-細胞を回収する；そして
（e）CD45-細胞を拡大条件下で培養し、拡大した細胞集団を得る；
各工程を含むことを特徴とする、請求項１記載の細胞を単離および増殖するための方法。
【請求項２２】
請求項２１記載の方法によって得られた拡大した細胞集団。
【請求項２３】
請求項２１記載の方法の各工程を含み、さらに増殖した細胞を目的の分化因子の存在下で培養する工程を含むことを特徴とする、MASCをex vivoで分化させるための方法。
【請求項２４】
前記分化因子が、塩基性繊維芽細胞成長因子（bFGF）；血管内皮成長因子（VEGF）；ジメチルスルホキシド（DMSO）およびイソプロテレノール；そして、繊維芽細胞成長因子４（FGF４）および肝細胞成長因子（HGF）より成る群から選択されることを特徴とする請求項２３記載の方法。
【請求項２５】
請求項２３記載の方法によって得られた分化細胞。
【請求項２６】
前記細胞が、外胚葉、中胚葉または内胚葉であることを特徴とする請求項２５記載の分化細胞。
【請求項２７】
前記細胞が、骨芽細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、繊維芽細胞、骨髄間質、骨格筋、平滑筋、心筋、眼、内皮、上皮、肝、膵、造血、グリア、神経細胞または稀突起膠細胞の細胞型であることを特徴とする請求項２５記載の分化細胞。
【請求項２８】
請求項２１記載の方法の各工程を含み、かつ拡大した細胞集団を哺乳類宿主に投与する工程をさらに含み、前記細胞集団が定着しかつin vivoで組織特異的細胞に分化して、それによって、傷害、遺伝疾患、後天性疾患または医原性処置のために欠陥のある細胞または器官の機能が補強され、再構成され、または初めて提供されることを特徴とする、MASCをin vivoで分化させる方法。
【請求項２９】
前記組織特異的細胞が、骨芽細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、繊維芽細胞、骨髄間質、骨格筋、平滑筋、心筋、眼、内皮、上皮、肝、膵、造血、グリア、神経細胞または稀突起膠細胞の細胞型であることを特徴とする請求項２８記載の方法。
【請求項３０】
MASCが、in vivoで自己再生することを特徴とする請求項２８記載の方法。
【請求項３１】
前記細胞が、医薬として許容される基材と共に投与されることを特徴とする請求項２８記載の方法。
【請求項３２】
前記基材が生分解性であることを特徴とする請求項３１記載の方法。
【請求項３３】
前記投与が、局所注射、全身注射、非経口投与、経口投与、または胚への子宮内注射によってなされることを特徴とする請求項２８記載の方法。
【請求項３４】
局所注射がカテーテル投与を含むことを特徴とする請求項３３記載の方法。
【請求項３５】
前記疾患が、癌、心血管疾患、代謝疾患、肝疾患、糖尿病、肝炎、血友病、変性または外傷性神経疾患、自己免疫疾患、遺伝的欠陥、結合組織疾患、貧血、感染症および移植拒絶より成る群から選択されることを特徴とする請求項２８記載の方法。
【請求項３６】
請求項２８記載の方法によって得られた分化細胞。
【請求項３７】
請求項１１記載の細胞の治療上有効な量を、必要のある患者に投与する工程を含む治療方法。
【請求項３８】
前記患者において奇形種が形成されないことを特徴とする請求項３７記載の方法。
【請求項３９】
MASCまたはその子孫細胞の治療上有効な量を必要のある患者に投与する工程を含む治療方法。
【請求項４０】
前記患者の前処置がほとんどまたは全く必要とされないことを特徴とする請求項３９記載の方法。
【請求項４１】
前記前処置が、放射線照射または化学療法による骨髄機能廃絶を含むことを特徴とする請求項４０記載の方法。
【請求項４２】
MASCまたはその子孫細胞の投与の前または同時に耐性を誘導することが不要であることを特徴とする請求項３９記載の方法。
【請求項４３】
患者の後免疫抑制処置が、従来の薬理用量と比較して減少することを特徴とする請求項３９記載の方法。
【請求項４４】
前記子孫細胞がさらに分化する能力を有することを特徴とする請求項３９記載の方法。
【請求項４５】
前記子孫細胞が最終分化していることを特徴とする請求項３９記載の方法。
【請求項４６】
MASCまたは子孫細胞が、局所注射、全身注射、非経口投与、経口投与、または胚への子宮内注射によって投与されることを特徴とする請求項３９記載の方法。
【請求項４７】
局所注射がカテーテル投与を含むことを特徴とする請求項４６記載の方法。
【請求項４８】
細胞が医薬として許容される基材と共に投与されることを特徴とする請求項３９記載の方法。
【請求項４９】
前記基材が生分解性であることを特徴とする請求項４８記載の方法。
【請求項５０】
MASCまたはその子孫細胞が、ウイルス、細菌または真菌感染に抵抗するように免疫系を改変することを特徴とする請求項３９記載の方法。
【請求項５１】
MASCまたはその子孫が、傷害、遺伝疾患、後天性疾患または医原性処置のために欠陥のある細胞または器官の機能を補強し、再構成し、または初めて提供することを特徴とする請求項３９記載の方法。
【請求項５２】
前記器官が、骨髄、血液、脾臓、肝臓、肺、腸管、眼、脳、免疫系、循環系、骨、結合組織、筋、心臓、血管、膵臓、中枢神経系、末梢神経系、腎臓、膀胱、皮膚、上皮付属器、乳房−乳腺、脂肪組織、および口、食道、膣および肛門を含む粘膜より成る群から選択されることを特徴とする請求項５１記載の方法。
【請求項５３】
MASCがin vivoで自己再生することを特徴とする請求項５１記載の方法。
【請求項５４】
前記疾患が、癌、心血管疾患、代謝疾患、肝疾患、糖尿病、肝炎、血友病、変性または外傷性神経疾患、自己免疫疾患、遺伝的欠陥、結合組織疾患、貧血、感染症および移植拒絶より成る群から選択されることを特徴とする請求項５１記載の方法。
【請求項５５】
前記子孫細胞が、ex vivoまたはin vivoで分化することを特徴とする請求項４４記載の方法。
【請求項５６】
前記子孫細胞が、ex vivoまたはin vivoで分化することを特徴とする請求項４５記載の方法。
【請求項５７】
前記子孫細胞が、骨芽細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、繊維芽細胞、骨髄間質、骨格筋、平滑筋、心筋、眼、内皮、上皮、肝、膵、造血、グリア、神経細胞および稀突起膠細胞より成る群から選択されることを特徴とする請求項４５記載の方法。
【請求項５８】
MASCまたはその子孫細胞が、患者の一またはそれ以上の器官にホーミングしそこで定着し、それによって、傷害、遺伝疾患、後天性疾患または医原性処置のために欠陥のある細胞または器官の機能が補強され、再構成され、または初めて提供されることを特徴とする請求項３９記載の方法。
【請求項５９】
前記疾患が、癌、心血管疾患、代謝疾患、肝疾患、糖尿病、肝炎、血友病、変性または外傷性神経疾患、自己免疫疾患、遺伝的欠陥、結合組織疾患、貧血、感染症および移植拒絶より成る群から選択されることを特徴とする請求項５８記載の方法。
【請求項６０】
前記傷害が、虚血または炎症であることを特徴とする請求項５８記載の方法。
【請求項６１】
前記器官が、骨髄、血液、脾臓、肝臓、肺、腸管、眼、脳、免疫系、循環系、骨、結合組織、筋、心臓、血管、膵臓、中枢神経系、末梢神経系、腎臓、膀胱、皮膚、上皮付属器、乳房−乳腺、脂肪組織、および口、食道、膣および肛門を含む粘膜、より成る群から選択されることを特徴とする請求項５８記載の方法。
【請求項６２】
MASCが、in vivoで自己再生することを特徴とする請求項５８記載の方法。
【請求項６３】
MASCまたはその子孫細胞が、血管新生を促進することを特徴とする請求項３９記載の方法。
【請求項６４】
MASCまたはその子孫細胞が、治療薬を輸送するように遺伝子組み換えされていることを特徴とする請求項３９記載の方法。
【請求項６５】
前記治療薬が、抗血管新生薬であることを特徴とする請求項６４記載の方法。
【請求項６６】
前記投与が、人工血管を含む三次元マトリクスを介してなされることを特徴とする請求項３９記載の方法。
【請求項６７】
前記治療が、腹部大動脈瘤、心臓バイパス手術、末梢血管疾患または冠血管疾患に向けられたものであることを特徴とする請求項６６記載の方法。
【請求項６８】
骨髄、血液、脾臓、肝臓、肺、腸管、眼、脳、免疫系、骨、結合組織、筋、心臓、血管、膵臓、中枢神経系、腎臓、膀胱、皮膚、上皮付属器、乳房−乳腺、脂肪組織、および口、食道、膣および肛門を含む粘膜より成る群から選択される組織を作成するのに有効な量でMASCが存在することを特徴とする、MASCおよび医薬として許容される担体を含む治療用組成物。
【請求項６９】
（a）MASCを哺乳類提供者から取り出す；
（b）MASCを拡大して未分化細胞の拡大集団を形成する；そして
（c）拡大した細胞を患者に投与して、器官、組織または細胞の機能を回復させる；各工程を含むことを特徴とする、必要とする患者において器官、組織または細胞の機能を回復させる治療方法。
【請求項７０】
前記機能が酵素的であることを特徴とする請求項６９記載の方法。
【請求項７１】
前記機能が遺伝子的であることを特徴とする請求項６９記載の方法。
【請求項７２】
前記哺乳類提供者が患者であることを特徴とする請求項６９記載の方法。
【請求項７３】
前記器官、組織または細胞が、骨髄、血液、脾臓、肝臓、肺、腸管、眼、脳、免疫系、骨、結合組織、筋、心臓、血管、膵臓、中枢神経系、末梢神経系、腎臓、膀胱、皮膚、上皮付属器、乳房−乳腺、脂肪組織、および口、食道、膣および肛門を含む粘膜より成る群から選択されることを特徴とする請求項６９記載の方法。
【請求項７４】
（a）プロモーターに機能的に結合した被提供者のMHC抗原をコードする核酸配列をMASCにex vivoで導入して、MHC抗原をMASCによって発現させる；そして
（b）MHC抗原が移植されたMASCの拒絶を阻害するのに十分なレベルで発現されるように、MASCを患者に移植する；
各工程を含むことを特徴とする、患者に移植された異種MASCの拒絶を阻害する方法。
【請求項７５】
前記患者が、MASCの提供者と同一種または別の哺乳類種であることを特徴とする請求項７４記載の方法。
【請求項７６】
MASCが、局所注射、全身注射、非経口投与、経口投与、または胚への子宮内注射によって患者に移植されることを特徴とする請求項７４記載の方法。
【請求項７７】
局所注射がカテーテル投与を含むことを特徴とする請求項７６記載の方法。
【請求項７８】
細胞が、医薬として許容される基材と共に移植されることを特徴とする請求項７４記載の方法。
【請求項７９】
前記基材が生分解性であることを特徴とする請求項７８記載の方法。
【請求項８０】
（a）MASCにおいてMHC抗原の発現を遺伝子導入によってノックアウトし；そして
（b）前記遺伝子導入MASCを患者に移植する；各工程を含み、
前記MHC抗原がMASCによって発現されず、それによって移植されたMASCの拒絶が阻害されることを特徴とする、患者に移植された異種MASCの拒絶を阻害する方法
【請求項８１】
患者がMASCの提供者と同一種または別の哺乳類種であることを特徴とする請求項８０記載の方法。
【請求項８２】
MASCが、局所注射、全身注射、非経口投与、経口投与、または胚への子宮内注射によって患者に投与されることを特徴とする請求項８０記載の方法。
【請求項８３】
局所注射がカテーテル投与を含むことを特徴とする請求項８２記載の方法
【請求項８４】
細胞が、医薬として許容される基材と共に移植されることを特徴とする請求項８０記載の方法。
【請求項８５】
前記基材が生分解性であることを特徴とする請求項８４記載の方法。
【請求項８６】
（a）MASCを単離し；そして
（b）MASCを分化させて血液または血液成分を形成させる；
各工程を含むことを特徴とする、血液または個々の血液成分をex vivoで作成する方法。
【請求項８７】
前記個々の血液成分が、赤血球、白血球または血小板であることを特徴とする請求項８６記載の方法。
【請求項８８】
（a）MASCまたはその子孫細胞のゲノムまたはプロテオーム構成を分析する；
（b）バイオインフォマティクスおよび／またはアルゴリズムを用いたコンピュータ分析を介して前記分析を利用する；そして
（c）新規データを集め、さらに該新規データを既知データベースと比較して、新薬を発見する；
各工程を含むことを特徴とする薬物発見の方法。
【請求項８９】
（a）MASCのゲノムまたはプロテオーム構成を分析する；
（b）MASCの分化を誘導する；
（c）分化経路の中間細胞のゲノムまたはプロテオーム構成を分析する；
（d）分化経路の最終分化細胞のゲノムまたはプロテオーム構成を分析する；
（e）バイオインフォマティクスおよび／またはアルゴリズムを用いて、MASCおよびその子孫細胞のゲノムまたはプロテオーム構成を特徴づける；そして
（f）（e）で得られたデータを比較して、経路の構成要素を同定する；
各工程を含むことを特徴とする、分化経路の構成要素を同定する方法。
【請求項９０】
分化がin vitroで生じることを特徴とする請求項８９記載の方法。
【請求項９１】
分化がin vivoで生じることを特徴とする請求項８９記載の方法。
【請求項９２】
請求項９０記載の方法の結果と請求項９１記載の方法の結果とを比較する工程を含むことを特徴とする、in vitroの分化とin vivoの分化とを比較する方法。
【請求項９３】
（a）健康な提供者から単離されたMASCのゲノムまたはプロテオーム構成を分析する；
（b）疾患または傷害を罹患している提供者から単離されたMASCのゲノムまたはプロテオーム構成を分析する；
（c）バイオインフォマティクスおよび／またはアルゴリズムを用いて（a）からのデータを特徴づける；
（d）バイオインフォマティクスおよび／またはアルゴリズムを用いて（b）からのデータを特徴づける；
（e）（c）で得られたデータと（d）で得られたデータとを比較して、疾患または傷害の分子構成要素を同定する；
各工程を含むことを特徴とする、疾患または傷害の分子構成要素を同定する方法。
【請求項９４】
（a）MASC中の産物を同定する；そして
（b）前記産物をMASCから単離する；
各工程を含むことを特徴とする、治療上、診断上または研究上の有用性を有する産物をin vitroで作成する方法。
【請求項９５】
前記産物が、タンパク質、脂質、複合糖質、DNAおよびRNAより成る群から選択されることを特徴とする請求項９４記載の方法。
【請求項９６】
哺乳類において該哺乳類に投与された抗原に対する耐性を誘導する方法であって、前記抗原の投与の後またはそれと同時に、MASCまたはその子孫細胞の有効量を哺乳類に投与する工程を含み、それによって、その後の前記抗原での感作に対する哺乳類の体液性免疫反応が抑制されることを特徴とする方法。
【請求項９７】
血液をex vivoでMASC由来細胞と接触させる工程を含み、前記細胞が中空の繊維性の器具の内面を覆っていることを特徴とする、患者の血液から毒素を除去する方法。
【請求項９８】
前記細胞が腎または肝細胞であることを特徴とする請求項９７記載の方法。
【請求項９９】
前記患者の血液をex vivoでMASCまたはその子孫細胞と接触させる工程を含み、前記MASCまたはその子孫細胞が、治療薬を輸送するように遺伝子組み換えされていることを特徴とする、治療用産物を患者へ輸送するための方法。
【請求項１００】
MASCまたはその子孫細胞をex vivoで薬物と接触させ、さらに前記細胞の生存を観察する工程を含むことを特徴とする、薬物の毒性を試験する方法。
【請求項１０１】
前記子孫細胞が、肝、内皮、上皮および腎細胞より成る群から選択されることを特徴とする請求項１００記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連特許
本出願は２００１年１０月２５日提出の米国仮特許出願第６０/３４３，３８６号、２００１年８月７日提出の米国仮特許出願第６０/３１０，６２５号、２００１年２月１５日提出の米国仮特許出願第６０/２６９，０６２号、２００１年２月１４日提出の米国仮特許出願第６０/２６８，７８６号の利益を主張するものであり、これらは参照により本開示に含まれる。出願人はまた国際公開第０１/１１０１１号、第６０/１４７，３２４号および第６０/１６４，６５０号に基づく優先権を主張し、これらの出願は参照により本文に含まれる；その中の任意の教示を本発明の実施に用いることができる。本出願は、付録１に添付しまた本出願の一部である、国際公開第０１/１１０１１号の一部継続出願である。参照により本文に含まれる資料は先行技術とは認められない。
【０００２】
発明の分野
本発明は概して、哺乳類多能性成体幹細胞（MASC）に関し、より詳細には、MASCを入手し、維持し、そして分化させる方法に関する。疾患の治療におけるMASCの使用もまた提供される。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
幹細胞からの器官および組織の作成、および続くそれらの移植は、いくつかの疾患に有望な治療法を提供し、幹細胞を多くの分野で研究の中心としている。幹細胞技術は、数例を挙げれば糖尿病、パーキンソン病、肝疾患、心疾患、そして自己免疫疾患に有望な新しい治療法を提供する。しかし、器官および組織移植に付随する少なくとも二つの大きな問題がある。
【０００４】
第一に、提供器官および組織の不足がある。米国だけで移植に必要な器官のわずか5パーセントしか被提供者は入手できない（Evans, et al. 1992）。米国心臓協会によると、１９９７年に新しい心臓を必要とした米国人４０，０００人のうち２，３００人しか心臓を受け取っていない。米国肝臓協会は、毎年肝不全で死亡する３０，０００人近い患者に対して提供者は３，０００人に満たないと報告する。
【０００５】
第二の大きな問題は、被提供者の免疫系と移植組織との不適合の可能性である。提供器官または組織は宿主免疫系によって異物と認識されるため、金額的にも身体的にもかなりのコストで免疫抑制薬を患者に与えなければならない。
【０００６】
異種移植、すなわち別の生物種からの組織または器官の移植は、ヒト器官および組織の不足を克服する別の方法を提供できる。異種移植には先行計画という利点がある。器官を健康なうちに採取することができ、また患者は移植手術に先立って任意の有益な前処置を受けることができる。残念ながら、異種移植は、組織不適合の問題を克服しないばかりか、むしろそれを悪化させる。さらに、疾病対策センターによると、有害なウイルスが種間障壁を越えるという証拠がある。ブタは、器官および組織提供者として有力候補になっているが、しかしブタからヒトへの１種以上のウイルスの種間感染が記録されている。たとえば、７０名を超えるヒトが感染し死亡した疾患であるヘンドラウイルスの発生を封じ込めるため、１００万頭を越えるブタが近年マレーシアで屠畜された（Butler, D. 1999）。
【０００７】
幹細胞：定義および用途
移植のための器官および組織の最も期待される起源は、したがって、幹細胞技術の開発にある。理論上、幹細胞は自己再生する細胞分裂を行って表現型および遺伝子型の同一な娘細胞を無限回生じることができ、最終的に少なくとも一つの最終細胞型に分化することができる。患者自身の幹細胞から組織または器官を作成することによって、または被提供者の免疫系が異物と認識しないように異種細胞を遺伝子組み換えすることによって、移植組織を作成し、感染または組織拒絶という付随する危険なしに異種移植に伴う利点を提供することができる。
【０００８】
幹細胞はまた、遺伝子治療の結果を改善する見込みを提供する。患者自身の幹細胞をin vitroで遺伝子組み換えし、それからin vivoで再導入して目的の遺伝子産物を産生することができる。これらの遺伝子組み換え幹細胞は、体の特定の部位に埋め込むための、または全身投与のための、多数の細胞型を形成するように分化誘導される潜在力を有する。あるいは、異種幹細胞を遺伝子組み換えして被提供者の主要組織適合複合体（MHC）抗原を発現させるかまたはMHC抗原を全く発現させないようにすることができ、付随する拒絶の危険なしに提供者から被提供者へ細胞を移植することが可能になる。
【０００９】
幹細胞は、広範囲な増殖可能性を有し、いくつかの細胞系統に分化して、移植時に組織に再集合(repopulate)する細胞と定義される。典型的な幹細胞は胚性幹（ES）細胞であり、それはこれが無限の自己再生および多能性分化可能性を有するからである（Thomson, J. et al. 1995； Thomson, J.A. et al. 1998； Shamblott, M. et al. 1998； Williams, R.L. et al. 1988； Orkin, S. 1998； Reubinoff, B.E., et al. 2000）。これらの細胞は胚盤胞の内細胞塊に由来する（Thomson, J. et al. 1995； Thomson, J.A. et al. 1998； Martin, G.R.1981）かまたは、移植後胚由来の始原生殖細胞から得ることができる（胚性生殖細胞すなわちEG細胞）。ESおよびEG細胞はマウスから得られており、より最近は非ヒト霊長類およびヒトからも得られている。マウス胚盤胞に導入されたとき、ES細胞は当該マウス（動物）のすべての組織に寄与することができる（Orkin, S. 1998）。マウスES細胞はしたがって全能性である。出生後の動物に移植されたとき、 ESおよびEG細胞は奇形腫を生じ、これはまたそれらの多能性を示す。ES（およびEG）細胞は、発生段階特異的胎児性抗原（SSEA）1および4に対する抗体を用いた陽性染色法で同定することができる。
【００１０】
分子レベルでは、ESおよびEG細胞は、これらの未分化細胞に高度に特異的ないくつかの転写因子を発現している。これらには、oct-4とRex1、白血病抑制因子受容体（LIF-R）が含まれる。転写因子sox-2およびRox-1は、ESおよび非ES細胞の両方で発現している。oct-4は原腸未形成胚、卵割初期胚、胚盤胞の内細胞塊の細胞、および胚性癌（EC）細胞で発現している。成体動物では、oct-4は生殖細胞だけに見られる。
【００１１】
oct-4は、Rox-1と共同して、亜鉛フィンガータンパク質Rex-1の転写活性化を引き起こし、またESを未分化状態に維持するためにも必要である。oct-4遺伝子は、細胞がin vitroで分化誘導されるときダウンレギュレートされる。いくつかの研究が、oct-4がES細胞の未分化の表現型を維持するのに必要であることと、胚発生および分化の初期段階の決定において大きな役割を果たすことを示している。Sox-2は、ES/ECの未分化状態を保ち、マウスES細胞を維持するのに、oct-4と共に必要であるが、ヒトES細胞の維持には必要でない。ヒトまたはマウス始原生殖細胞は、LIFの存在を必要とする。ES細胞のもう一つの顕著な特徴は、高濃度のテロメラーゼの存在であり、それはこれらの細胞に無限の自己再生能力をin vitroで提供する。
【００１２】
幹細胞は大部分の器官または組織で特定されている。最もよく特徴づけられているのは造血幹細胞（HSC）である。この中胚葉由来細胞は、細胞表面マーカーおよび機能上の特徴に基づいて精製されている。骨髄（BM）、血液、臍帯血、胎児肝臓および卵黄嚢から単離されたHSCは、血液細胞を生じる前駆細胞であって、すなわち続く翻訳が複数の造血系統を再び開始し、被提供者の生命のために造血を再び開始することができる。（Fei, R., et al., 特許文献１；McGlave, et al, 特許文献２；Simmons, P., et al, 特許文献３；Tsukamoto, et al, 特許文献４；Schwartz, et al, 特許文献５；DiGuisto, et al, 特許文献６；Tsukamoto, et al,特許文献７；Hill, B., et al, 1996を参照） 致死量の放射線を受けた動物またはヒトに移植されたとき、HSCは赤芽球、好中球-マクロファージ、巨核球およびリンパ球造血細胞プールに新たに定着することができる。In vitroで、造血幹細胞を少なくとも数度自己再生する細胞分裂を行うよう誘導することができ、そしてin vivoでみられるように同一の系統に分化するよう誘導することができる。したがって、この細胞は幹細胞の基準を満たす。造血系統の細胞を形成するようにのみ分化する幹細胞は、しかし、他の損傷した組織、たとえば、高用量の化学療法薬物によって損傷した心臓または肺の組織を修復するための細胞の起源を提供することはできない。
【００１３】
幅広く研究されてきたもう一つの幹細胞は神経幹細胞（NSC）である（Gage F.H. 2000；SvendsenC.N. et al, 1999； Okabe S. et al, 1996）。NSCは初め胎児脳の脳室下領域および嗅球で見出された。最近まで、成体脳は幹細胞の能力を有する細胞を含まないと信じられていた。しかし、げっ歯類、より最近はまた非ヒト霊長類およびヒトにおけるいくつかの研究が、幹細胞が成体脳に存在し続けることを示している。これらの幹細胞はin vivoで増殖でき、そして連続的に少なくとも一部の神経細胞をin vivoで再生する。ex vivoで培養したとき、NSCは増殖するように誘導することができ、またさまざまな型の神経細胞およびグリア細胞に分化するように誘導することができる。脳に移植されたとき、NSCは定着し神経細胞およびグリア細胞を生じることができる。したがって、この細胞も、造血幹細胞でも、幹細胞の定義を満たす。
【００１４】
Clarke et al.は、マウス胚盤胞またはニワトリ胚に注入されたLac-Z遺伝子導入マウス由来のNSCは、そのキメラマウスまたはニワトリ胚のいくつかの組織に寄与することを報告した（Clarke, D. L. et al. 2000）。LacZ発現細胞は、中枢神経系だけでなく、中胚葉派生物、また肝臓および腸の上皮細胞でさまざまな程度のモザイクで見出されたが、造血機構を含む他の組織ではみられなかった。これらの研究はしたがって、成体NSCは以前知られていたよりも顕著に大きな分化可能性を有しうるが、ESまたはFurcht et al. （国際出願番号PCT/USOO/21387）およびここに記載された、成体から得られた多能性成体幹細胞（MASC）の全能性は持たないことを示唆した。MASC、MAPCおよびMFCの用語は、成体から得られた多能性成体幹細胞を記載するために交換して使用可能である。
【００１５】
変性および外傷性脳疾患の治療は、細胞置換療法を用いて大きく進歩しうる。NSC は成体哺乳類脳の脳室下領域（SVZ）および海馬で見出されており（Ciccolini et al, 1998；Morrison et al., 1999；Palmer et al., 1997；Reynolds and Weiss, 1992；Vescovi et al., 1999）、上衣および脳の他の非神経性とされる領域にもまた存在しうる（Doetsch et al, 1999；Johansson et al, 1999；Palmer et al, 1999）。胎児または成体脳由来NSCは、ex vivoで増殖させ星状細胞、稀突起膠細胞および機能する神経細胞に分化するよう誘導することができる （Ciccolini et al, 1998； Johansson et al, 1999； Palmer et al, 1999；Reynolds et al, 1996；Ryder et al, 1990；Studer et al, 1996； Vescovi et al, 1993）。In vivoでは、時間を変えて培養した未分化のNSCはグリア細胞、GABA性およびドーパミン作用性神経細胞に分化する（Flax et al, 1998；Gage et al, 1995；Suhonen et al, 1996）。NSCの最も広く用いられている起源は同種異系胎児脳であり、これは免疫学的および倫理的問題を共に提起する。代案としては、NSCは自家脳から得ることができる。事前の神経病状がNSCの、培養され神経細胞およびグリア細胞にex vivoで分化するよう誘導される能力に影響するかどうかは知られていないため、また既に疾患のある脳における追加の手術が基礎疾患を悪化させる可能性があるため、この手法は魅力がより低い。
【００１６】
置換戦略のための神経細胞およびグリアの理想的な起源は、成体の、容易に利用可能な脳以外の自己組織から採取しうる細胞で、またin vitroで増殖可能でありex vivoまたはin vivoで患者に欠けている細胞型に分化しうるものである。近年の報告は、BM由来細胞はin vitroでNSC条件下で培養したとき、または中枢神経系に入ったとき、神経外胚葉性細胞の表現型の特徴を獲得することを示唆している（Sanchez-Ramos et al., 2000；Woodbury et al, 2000）。この能力を有するBM細胞の表現型は知られていない。神経外胚葉性の性質を獲得する細胞の他の細胞型への分化のための能力もまた未知である。
【００１７】
幹細胞の性質を有するもう一つの組織特異的細胞が間葉性幹細胞（MSC）で、Fridenshtein（1982）によって最初に記載された。MSCは当初は胚性中胚葉から得られそして成体BMから単離され、分化して筋、骨、軟骨、脂肪、骨髄間質、および腱を形成することができる。胚発生の間、中胚葉は肢芽中胚葉、骨、軟骨、脂肪、骨格筋そしておそらく内皮を生じる組織に発展する。中胚葉はまた器官中胚葉に分化し、これは心筋、平滑筋、または内皮および造血前駆細胞から成る血島を生じうる。初期中胚葉つまりMSCはしたがって、いくつかの細胞および組織型の起源を提供しうる。いくつかのMSCが単離されている。（たとえば、 Caplan, A., et al,特許文献８；Young, H., et al, 特許文献９；Caplan, A., et al, 特許文献１０；Bruder, S., et al.特許文献１１；Caplan, A., et al.,特許文献１２；Masinovsky, B.,特許文献１３；Pittenger, M.,特許文献１４；Jaiswal, N., et al.,1997,；Cassiede P., et al, 1996；Johnstone, B., et al, 1998；Yoo, et al, 1998；
Gronthos, S., 1994を参照）。
【００１８】
記載されている多くのMSCのうち、すべてが、一般に間葉起源と考えられている細胞を形成する限られた分化を示している。現在まで、報告された最も多能性のMSCはPittenger, et alによって単離された、SH2+SH4+CD29+CD44+CD71+CD90+CD106+CD120a+CD124-CD14-CD34-CD45-表現型を発現する細胞である。この細胞は分化して間葉起源のいくつかの細胞型を形成する能力があるが、明らかに、分化可能性は間葉性系統の細胞に限られていて、この細胞を単離したチームが注目したように拡大培養中に造血細胞は決して見つからなかった（Pittenger, et al, 1999）。
【００１９】
消化管幹細胞（Potten, C. 1998）、上皮幹細胞（Watt, F. 1997）、そして円形細胞ともいう肝幹細胞（Alison, M. et al. 1998）を含む他の組織特異的幹細胞が同定されている。これらの大部分は比較してよく特徴づけられていない。
【００２０】
ES細胞に比べて、組織特異的幹細胞の有する自己再生能力はより小さく、そして複数の系統に分化するが全能性ではない。組織特異的細胞が、ES細胞にみられると上記に記載されたマーカーを発現しているかどうかを扱った研究は無い。さらに、組織特異的または系統決定した幹細胞におけるテロメラーゼ活性の程度は、理由の一部としてこれらの細胞の多数の高度に増幅した集団を得るのは困難であるため、十分に調べられていない。最近まで、組織特異的幹細胞は同一の組織の細胞にだけ分化することができると考えられていた。いくつかの最近の文献は、成体器官特異的幹細胞にはさまざまな組織の細胞に分化する能力がありうると示唆している。しかし、これらの型の細胞の真の性質は完全には解っていない。いくつかの研究は、BM移植時に移植された細胞は骨格筋に分化しうることを示している（Ferrari 1998；Gussoni1999）。このことは、骨髄に存在する間葉性細胞にありうる分化可能性の範囲内と考えることができる。Jacksonは、筋サテライト細胞は造血細胞に分化しうると発表し、これも胚の内臓中胚葉内での表現型の転換である（Jackson 1999）。他の研究は、ある胚葉（たとえば内臓中胚葉）由来の幹細胞が、胚発生中に別の胚葉から生じると考えられる組織に分化することができることを示している。たとえば、骨髄移植を受けたヒトまたは動物に検出される内皮細胞またはその前駆細胞は、少なくとも一部は骨髄提供者に由来する（Takahashi, 1999；Lin, 2000）。このように、内臓神経中胚葉でなく内臓中胚葉に由来する、MSCのような性質の子孫が、注入される骨髄と共に移植される。さらに驚くべきことには、げっ歯類とヒトの両方で提供者骨髄に由来する肝上皮細胞と胆管上皮細胞が被提供者に見られることを示す報告がある（Petersen, 1999；Theise, 2000； Theise, 2000）。同様に、NSCは造血細胞に分化しうることを３つのグループが示している。最後に、Clarke et al. は、胚盤胞に注入されたとき組織キメラマウスのすべての組織に寄与できる細胞をNSCと呼ぶことを報告している（Clarke et al, 2000）。
【００２１】
これらの研究の大半は単一の細胞が異なる器官の組織に分化できることを決定的に示していないことを指摘する必要がある。また、任意の器官から単離された幹細胞は、必ずしも系統が決定した細胞ではない可能性がある。実際、大部分の研究者は開始細胞の表現型を特定しなかった。例外はWeissmanとGrompeによる研究で、彼らは、肝臓に定着した細胞はHSC中に高度に濃縮されているLin-Thy1LowSca1+骨髄細胞に存在したことを示した。同様に、MulliganグループはHSCで高度に濃縮されている骨髄Sp細胞は筋および内皮に分化できることを示し、またJackson et al.は筋Sp細胞が造血再構成を担うことを示した（Gussoni et al., 1999）。
【００２２】
異種ES細胞から作成された組織および器官の移植には、移植拒絶から保護するため、ある種の細胞表面マーカーの発現を阻害するように細胞にさらに遺伝子組み換えを行うか、または化学療法の免疫抑制剤の使用を続けるかが必要である。このように、ES細胞研究は移植のための器官の供給が限られているという問題に有望な新しい解決法を提供するが、異種細胞または組織の移植を維持するための免疫抑制の必要に伴う問題と危険は残る。人口の大多数を対照とする治療法に備えて免疫学的に互換性のある細胞を提供するためには、ES細胞の免疫学的に異なる株を推定２０株確立する必要がある。
【００２３】
自家または組織型別の一致する同種異系幹細胞の起源として、胚でなく成長した個体からの細胞を用いることは、移植ES細胞の使用に伴う組織不適合の問題を緩和するかまたは克服し、またES細胞研究に伴う倫理的二律背反も解決する。自家幹細胞を組織移植に用いることに伴う最大の短所は、これまでのところその比較的限られた分化可能性にある。
【００２４】
成熟した生物とくにヒトからいくつかの幹細胞が単離されているが、これらの細胞は、多能性であることが報告されているにもかかわらず、複数の細胞型に分化する可能性は限られていることを示している。
【特許文献１】
米国特許第５，６３５，３８７号明細書
【特許文献２】
米国特許第５，４６０，９６４号明細書
【特許文献３】
米国特許第５，６７７，１３６号明細書
【特許文献４】
米国特許第５，７５０，３９７号明細書
【特許文献５】
米国特許第５，７５９，７９３号明細書
【特許文献６】
米国特許第５，６８１，５９９号明細書
【特許文献７】
米国特許第５，７１６，８２７号明細書
【特許文献８】
米国特許第５，４８６，３５９号明細書
【特許文献９】
米国特許第５，８２７，７３５号明細書
【特許文献１０】
米国特許第５，８１１，０９４号明細書
【特許文献１１】
米国特許第５，７３６，３９６号明細書
【特許文献１２】
米国特許第５，８３７，５３９号明細書
【特許文献１３】
米国特許第５，８３７，６７０号明細書
【特許文献１４】
米国特許第５，８２７，７４０号明細書
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２５】
このように、複数の分化可能性を有する幹細胞が以前に他の研究者らおよび本発明者らによって単離されているとはいえ、繊維芽細胞、肝、骨芽細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、骨格筋、内皮、間質、平滑筋、心筋そして造血細胞を含むさまざまな系統の幅広い細胞型へ分化する可能性を有する前駆細胞は記載されていない。細胞および組織移植と遺伝子治療が、期待される医療の進歩を提供するなら、最大またはもっとも広範囲の分化可能性を有する幹細胞または前駆細胞が求められる。必要なのは、ES細胞と成体において同等なものである。
【００２６】
BM、筋そして脳は、以前思われていたより大きな見かけの可塑性が見出された３つの組織である。BMは、いくつかの中胚葉性（Ferrari G. et al, 1998； Gussoni E. et al, 1999；Rafii S. et al, 1994；Asahara T. et al., 1997；Lin Y. et al, 2000；Orlic D. et al, 2001 ；Jackson K. et al, 2001）、内胚葉性（Petersen B.E. et al, 1999；Theise, N.D. et al, 2000；Lagasse E. et al, 2000； Krause D. et al, 2001）、そして神経外胚葉性（Mezey D.S. et al, 2000； Brazelton T.R., et al, 2000；Sanchez Ramos J. et al, 2000；Kopen G. et al, 1999）、および皮膚（Krause, D. et al, 2001）の構造に寄与しうる細胞を含む。筋由来の細胞は造血機構に寄与しうる（Jackson K. et al, 1999；Scale P. et al, 2000）。NSCが造血細胞 （Bjornson C. et al, 1999；Shih C. et al., 2001）、平滑筋筋芽細胞（Tsai R.Y. et al, 2000） に分化しうること、またマウス胚盤胞に注入されたときNSCがいくつかの細胞型を生じることの証拠もある（Clarke, D.L. et al, 2000）。
【００２７】
本研究は、多能性成体前駆細胞の特徴を有する細胞を、複数の異なる器官すなわちBM、筋そして脳から培養して単離することができることを示す。その細胞は同じ形態、表現型、in vitro分化能力を有し、非常に似通った発現遺伝子プロファイルを有する。
【課題を解決するための手段】
【００２８】
本発明は、哺乳類、好ましくはマウス、ラットまたはヒトから単離された多能性成体幹細胞（MASC）である。当該細胞は胚以外の器官または組織に由来し、分化して中胚葉、外胚葉そして内胚葉起源の少なくとも一つの分化細胞型を形成するよう誘導することのできる能力を有する。好適な一実施形態においては、MASCが単離された器官または組織は骨髄、筋、脳、臍帯血または胎盤である。
【００２９】
MASCから得ることのできる分化細胞の例は、骨芽細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、繊維芽細胞、骨髄間質、骨格筋、平滑筋、心筋、眼、内皮、上皮、肝、膵、造血、グリア、神経細胞または稀突起膠細胞である。分化はin vivoまたはex vivoで誘導することができる。
【００３０】
本発明のMASCはまた、oct4および高濃度のテロメラーゼを構成的に発現し、CD44、MHCクラスIおよびMHCクラスII発現は陰性である細胞と要約される。治療法としては、治療上有効な量で患者に投与されたこの細胞である。この治療の驚くべき利点は、奇形腫がin vivoで形成されないことである。
【００３１】
本発明の目的は、MASCを含む正常な非ヒト動物を作成することである。好ましくは、当該動物はキメラである。
【００３２】
本発明の別の一実施形態は、MASCの集団とそのMASCの集団を拡大させる培地を含む組成物である。一部の場合には、培地が上皮成長因子（EOF）、血小板由来成長因子（PDGF）および白血病抑制因子（LIF）を含むことが有益である。
【００３３】
本発明はまた、完全にまたは部分的に精製したMASCの子孫細胞の集団を含む組成物を提供する。子孫細胞はさらに分化する能力を有していてもよく、最終分化していてもよい。
【００３４】
好ましい一実施形態においては、子孫細胞は骨芽細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、繊維芽細胞、骨髄間質、骨格筋、平滑筋、心筋、眼、内皮、上皮、肝、膵、造血、グリア、神経細胞または稀突起膠細胞細胞型である。
【００３５】
本発明はまた、哺乳類から組織を入手し、接着細胞の集団を確立し、その集団からCD45+細胞を除去し、CD45-細胞を回収して拡大条件下で培養して拡大した細胞集団を得ることによって、MASCを単離し増殖させる方法を提供する。本発明の目的はしたがって、この方法によって拡大した細胞集団を作成することである。
【００３６】
本発明の一つの態様は、MASCを単離して増殖させ、次いで増殖した細胞を目的の分化因子の存在下で増殖させることによって、MASCをex vivoで分化させる方法である。好ましい分化因子は、塩基性繊維芽細胞成長因子（bFGF）、血管内皮成長因子（VEGF）、ジメチルスルホキシド（DMSO）およびイソプロテレノール；あるいは繊維芽細胞成長因子4（FGF4）および肝細胞成長因子（HGF）である。本発明の別の態様は分化細胞それ自体である。
【００３７】
本発明は、MASCを単離して拡大し、次いで拡大した細胞集団を哺乳類宿主に投与し、そこで前記細胞集団が定着しin vivoで組織特異的細胞に分化し、それによって傷害、遺伝疾患、後天性疾患または医原性処置のために欠陥のある細胞または器官の機能が補強され、再構成され、あるいは初めて提供されるように、MASCをin vivoで分化させる方法を含む。この方法を用いて、MASCはin vivoで自己再生することができる。
【００３８】
本発明のさらにもう一つの態様は、ex vivoまたはin vivo分化で得られた分化細胞である。好適な一実施形態においては、分化細胞は外胚葉、中胚葉または内胚葉である。好適な別の一実施形態においては、分化細胞は骨芽細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、繊維芽細胞、骨髄間質、骨格筋、平滑筋、心筋、眼、内皮、上皮、肝、膵、造血、グリア、神経細胞または稀突起膠細胞細胞型である。
【００３９】
この技術の重要な用途は、MASCまたはその子孫の治療上有効な量を投与することによって患者を治療する方法である。子孫細胞はさらに分化する能力を有していてもよく、最終分化していてもよい。この手法の予期しなかった利点は、放射線照射、化学療法、免疫抑制剤または他の薬物または処置を用いた患者の前処置および／または後処置の必要が減少または消滅することである。処置前または処置中の耐性の誘導もまた必要でない。
【００４０】
そのような治療法は、癌、心血管疾患、代謝疾患、肝疾患、糖尿病、肝炎、血友病、変性または外傷性神経疾患、自己免疫疾患、遺伝的欠陥、結合組織疾患、貧血、感染症および移植拒絶を含むさまざまな疾患および症状を治療することができる。
【００４１】
MASCまたはその子孫は、カテーテル投与、全身注射、非経口投与、経口投与、または胚への子宮内注射を含む局所注射を介して投与される。投与は医薬として許容される基材と共に行うことができ、基材は生分解性であってもよい。
【００４２】
患者に投与されたMASCまたはその子孫は、ウイルス、細菌または真菌感染に抵抗するよう免疫系を改変する。
【００４３】
驚くべきことに、MASCまたはその子孫が患者に投与されたとき、奇形腫は形成されない。
【００４４】
患者に投与されたとき、MASCまたはその子孫はまた、傷害、遺伝疾患、後天性疾患または医原性処置のために欠陥のある細胞または器官の機能を補強し、再構成し、あるいは初めて提供することもできる。器官は骨髄、血液、脾臓、肝臓、肺、腸管、脳、免疫系、循環系、骨、結合組織、筋、心臓、血管、膵臓、中枢神経系、末梢神経系、腎臓、膀胱、皮膚、上皮付属器、乳房-乳腺、脂肪組織、および口、食道、膣および肛門を含む粘膜のうち任意のものである。この方法によって治療可能な疾患の例は、癌、心血管疾患、代謝疾患、肝疾患、糖尿病、肝炎、血友病、変性または外傷性神経疾患、自己免疫疾患、遺伝的欠陥、結合組織疾患、貧血、感染症および移植拒絶である。
【００４５】
MASCまたはその子孫は患者の中で一またはそれ以上の器官にホーミングし、それによって傷害、遺伝疾患、後天性疾患または医原性処置のために欠陥のある細胞または器官の機能が補強され、再構成され、あるいは初めて提供されるように、そこで定着するが、これは驚くべきことでまた予期しなかったことである。好適な一実施形態においては、傷害は虚血または炎症である。
【００４６】
好適な別の一実施形態においては、MASCまたはその子孫は血管新生を促進する。
【００４７】
本発明の別の態様では、MASCまたはその子孫は、治療薬、好ましくは抗血管新生剤を輸送するように遺伝子組み換えされている。
【００４８】
本発明は、MASCが骨髄、血液、脾臓、肝臓、肺、腸管、脳、免疫系、骨、結合組織、筋、心臓、血管、膵臓、中枢神経系、腎臓、膀胱、皮膚、上皮付属器、乳房-乳腺、脂肪組織、および口、食道、膣および肛門を含む粘膜から成る群から選択された組織を産生するのに有効な量で存在するMASCおよび医薬として許容される担体を含む治療用組成物を提供する。
【００４９】
本発明はさらに、哺乳類提供者からMASCを取り出して未分化細胞の拡大集団を形成し、拡大した細胞を患者に投与し、そこで器官、組織または細胞の機能が回復される工程を含む、器官、組織または細胞の機能を患者に回復させるための治療法を提供する。回復される機能は酵素的または遺伝子的でありうる。好適な一実施形態においては、当該哺乳類提供者は患者である。
【００５０】
本発明はMASCにex vivoで操作のためプロモーターに結合した被提供者のMHC抗原をコードする核酸配列を導入し、そこでMHC抗原がMASCによって発現され、そしてMASCを患者に移植し、そこでMHC抗原が移植されたMASCの拒絶を阻害するのに十分なレベルで発現される工程を含む、患者に移植された異種MASCの拒絶を阻害する方法を提供する。患者はMASCの提供者と同一種であるかまたは別の哺乳類種である。
【００５１】
患者に移植された異種MASCの拒絶を阻害する別の方法は、遺伝子導入によってMASCにおいてMHC抗原の発現をノックアウトし、そして遺伝子導入MASCを患者に移植することを含む。MHC抗原はMASCによって発現されておらず、移植細胞の拒絶は阻害される。
【００５２】
本発明の一つの目的は、MASCを単離しMASCを分化させて血液または血液成分を形成させる過程によって、血液または個別の血液成分をex vivoで作成する方法である。好ましくは、その個別の血液成分は赤血球、白血球または血小板である。
【００５３】
本発明の別の態様は、MASCまたはその子孫のゲノムまたはプロテオーム構成を分析し、その分析をバイオインフォマティクスおよび／またはアルゴリズムを用いたコンピュータ分析を介して使用し、新規データを集め既知データベースと比較してこれらを比較対照する工程を含む薬物発見の方法である。
【００５４】
さらなる態様は、MASCまたはその子孫のゲノムまたはプロテオーム構成を分析し、MASCの分化をin vitroまたはin vivoで誘導し、分化経路の中間細胞のゲノムまたはプロテオーム構成を分析し、分化経路の最終分化細胞のゲノムまたはプロテオーム構成を分析し、バイオインフォマティクスおよび／またはアルゴリズムを用いてMASCおよびその子孫のゲノムまたはプロテオーム構成を特徴づけ、そして得られたデータを比較して経路の構成要素を同定する工程を含む、分化経路の構成要素を同定する方法である。この方法を用いて、in vitroで起こる分化とin vivoで起こる分化とを比較することができ、それによってその二つの系の基本的な差異を特徴づけることができる。
【００５５】
本発明は、MASC中の産物を同定し、当該産物をMASCから単離することによって、治療上、診断上または研究上の有用性を有する産物をin vitroで作成する方法を提供する。好適な一実施形態においては、当該産物はタンパク質、脂質、複合糖質、DNAまたはRNAである。
【００５６】
本発明には、哺乳類において、前記哺乳類に投与された抗原に対する耐性を誘導する方法が含まれ、その方法は、続いての前記抗原を用いた感作に対する前記哺乳類の体液性免疫反応が抑制されるように、前記抗原の投与の後またはそれと同時にMASCまたはその子孫の有効量を前記哺乳類に投与する工程を含む。
【００５７】
血液をex vivoでMASC由来細胞と接触させることを含み、ここで前記細胞が中空の繊維性の器具の内面を覆っている、患者の血液から毒素を除去する方法もまた含まれる。好適な一実施形態においては、当該細胞は腎または肝細胞である。
【００５８】
本発明の一つの目的は、前記患者の血液をex vivoでMASCまたはその子孫と接触させることを含み、ここで前記MASCまたはその子孫は治療薬を輸送するように遺伝子組み換えされている、治療用産物を患者へ輸送するための方法である。さらなる一つの目的は、MASCまたはその子孫をex vivoで前記薬物と接触させ細胞生存を観察することを含む、薬物の毒性を試験するための方法である。好適な一実施形態においては、当該子孫細胞は肝、内皮、上皮および腎細胞より成る群から選択される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５９】
下記の詳細な説明は、説明の目的で提示され、しかし本発明を記載の特定の実施例に限定することを意図せず、本願に引用して援用する添付の図面と共に理解することができる。
【００６０】
図１は、骨髄（BM）、筋および脳由来MASCの拡大可能性を示す図である。
【００６１】
図２は、遺伝子発現の（A）筋および脳MASCそして（B）骨髄および筋MASCにおける遺伝子発現を示す散布図である。
【００６２】
図３は、未分化MASCおよびVEGFとともに培養したMASCのFACS分析を示す図である。プロットはイソ型対照IgG染色プロファイル（細線）に対し特異的抗体染色プロファイル（太線）を示す。図Aは未分化MASCの表現型を示す。MASCは低レベルのp2ミクログロブリン、Flk1、Fit 1およびAC 133を発現しているが、他のどの抗内皮マーカーでも染色されない；図Bは14日間、10ng/mLのVEGFとともに培養したMASCの表現型を示す。MASCは内皮細胞に伴う低レベルの大部分のマーカーを発現しているが、AC 133の発現は失っている；そして図Cは3〜9日間10ng/mLのVEGFとともに培養したMASCの表現型を示す。MASCはVEGFとともに培養した３日目までにAC 133の発現を失い、TekおよびVE-カドヘリンの発現を３日目までに獲得し、CD34およびHIP12を9日目までに獲得している。
【００６３】
図４はmMASCの定着とin vivo分化の顕微鏡写真である。スライドは蛍光または共焦点顕微鏡法で検査した。図A、G、J、N、QおよびSは、mMASCを注射されていない対照NOD-SCID動物の同一に染色された組織を示す。図A〜Fは、抗β-gal-FITC抗体および各種造血抗原に対するPE-結合抗体で染色した、対照（A）および試験（B〜F）動物からの骨髄（BM）サイトスピンの顕微鏡写真を示す。A〜B:CD45、C:CD19、D:MAC1、E:GR1、F:TER119およびDAPI；図G〜Iは、抗β-gal-FITC抗体および抗CD45-PE抗体で染色した、対照（G）および試験動物（H、I）からの脾臓断面の顕微鏡写真を示す。提供者由来抗β-gal+細胞が塊になって見られる。Hは10倍でIは60倍の倍率である；図J〜Mは、抗β-gal-FITCで染色した、対照マウス（J）および試験動物（K〜M）からの肝臓断面の顕微鏡写真を示す。J〜Lはマウス抗CK-18/抗マウス-Cy5に加えてCD45-PEと、そしてMはマウス抗アルブミン/抗マウスCy3抗体と同時染色されている。J〜K、LおよびMはそれぞれ20倍、60倍および10倍の倍率である；図N〜Pは、抗β-gal-FITCに加えてマウス抗pan-CK/抗マウス-Cy5抗体（N〜P）で染色された、対照マウスおよび試験動物（O〜P）からの腸断面の顕微鏡写真を示す。NおよびPはCD45-PE抗体で同時染色した。β-gal+Pan-CK+CD45-上皮細胞が絨毛の周囲の50%を覆っている（黒矢印、図P）。CD45について同時染色した（P）絨毛の中心のPan-CK-/β-gal+細胞（白矢印-図O）； 図Q〜Rは抗β-gal-FITCに加えてマウス抗pan-CK/抗マウス-Cy5およびCD45-PE抗体で染色した対照マウス（Q）および試験動物（R）からの肺断面の顕微鏡写真を示す。いくつかのβ-gal+pan-CK+提供者細胞が被提供者動物の肺胞の内面を覆っているのが見られる（R）。造血起源のCD45+/pan-CK-細胞が上皮細胞から明らかに見られる；そして図S〜Tは抗β-gal-FITC、抗vWF-PEおよびTO-PRO3で染色した対照マウス（S）および試験動物で成長した移植後16週間の胸腺リンパ腫（T）の血管断面の顕微鏡写真を示す。
【００６４】
β-gal+提供者細胞は、腫瘍細胞は抗β-Gal抗体で染色されなかったので被提供者起源である胸腺リンパ腫内でvWF+内皮細胞に分化した。
【００６５】
図５はMASC由来内皮細胞の共焦点蛍光顕微鏡法を用いた免疫組織化学的評価を示す図である。（a）VEGF中で14日間培養したMASC。接着受容体αvβ5について、および接着結合タンパク質ZO-1、β-およびγ-カテニンについて、典型的な膜染色が見られる。目盛り棒＝50μm。（b）VEGF処理後0日目（上図）および21日目（下図）のMASCの明視野での形態。棒＝25μm。
【００６６】
図６はMASC由来内皮細胞の顕微鏡写真である。図AはMASC由来内皮からのvWFのヒスタミン媒介放出を示す。ミオシンに対する抗体を用いた染色が、ミオシンストレスファイバーの数の増殖、およびギャップ結合の拡大（矢印）を伴う細胞骨格の変化を示す（実験３回の代表例）。目盛り棒＝60μm；図BはMASC由来内皮がa-LDLを取り込むのを示す。7日間後、細胞はTie-1を発現したが、今度はa-LDLを取り込まなかった。しかし、9日目のvvWF発現の獲得はaLDL取り込みを伴った（実験１０回の代表例）。目盛り棒＝100μｍ；そして図CはMASC由来内皮による血管形成を示す。6時間後、典型的な血管をみることができた（実験６回の代表例）。目盛り棒＝200μｍ。
【００６７】
図７はMASC由来内皮細胞のFACS分析を示す図である。プロットはイソ型対照IgG染色プロファイル（細線）に対する特異的抗体染色プロファイル（太線）を示す（実験＞３回の代表例）。プロットの上の数字は対照IgG染色および特異的抗体染色についての平均蛍光強度（MFI）である。図Aはフローサイトメトリー分析で、MASC由来内皮細胞で低酸素がFlk1およびTek発現をアップレギュレートするのを示す；図BはMASC由来内皮細胞によるVEGF産生を低酸素がアップレギュレートするのを示す。VEGFレベルはELISAで測定し、結果は実験６回の平均±SEMで示す；そして図CはIL-1aがクラスIIHLA抗原の発現を誘導し接着受容体の発現を増加させることを示す。プロットはイソ型対照IgG染色プロファイル（細線）に対する特異的抗体染色プロファイル（太線）を示す（実験３回の代表例）。プロットの上の数字は対照IgG染色および特異的抗体染色についてのMFIを示す。
【００６８】
図８はヒトMASC由来内皮細胞の顕微鏡写真である。図C〜Fは抗ヒトβ2-ミクログロブリン-FITC（図C）または抗マウス-CD31-FITC（図D）のいずれか、および両者の融合（図E）、抗vWF-Cy3（図F）および３つの染色パターンの融合（図G）の３次元再構成図を示す。図AおよびBは抗ヒトβ2-ミクログロブリン-FITCおよび抗vWF-Cy3、または抗マウスCD31-Cy5および抗vWF-Cy3、のいずれかで染色した一つの切片の共焦点像を示す。目盛り棒＝100μｍ。図HはヒトMASC由来内皮細胞（上図）またはヒト包皮繊維芽細胞s（下図）を注射したマウスにおいて抗β2-ミクログロブリン-FITCおよび抗vWFで染色した穿孔した耳で創傷治癒が結果として高度に血管新生した部分を生じたのを示す。目盛り棒＝20μm。C＝軟骨。D＝真皮。図Iは腫瘍血管新生がin vivoでMASCから生じた内皮細胞に由来し、結果として抗β2-ミクログロブリン-FITC、抗vWFおよびTOPRO-3で染色した腫瘍中に高度に血管申請した部分を生じるのを示す。目盛り棒＝20μｍ。
【００６９】
図９はhMSC由来神経細胞様細胞におけるスパイク生成および発現した電位依存性ナトリウム電流を表す図である。図Aはスパイク生成および発現した電位依存性ナトリウム電流を示した培養hMSC由来神経細胞の顕微鏡写真を示す（ピペットの影が細胞を指す）。図BはhMSC由来神経細胞から得た電流固定記録を示す図である。図Cは同じhMSC由来神経細胞から得たリークを差し引いた電流記録を示す図である。
【００７０】
図１０は肝細胞様表現型を確認した定量的RT-PCRおよびウェスタンブロット分析を示す図である。図AおよびBはFGF4およびHGF、またはFGF4単独と、それぞれ21および28日間Matrigel（商標）で培養したmMASC（A）およびhMASC（B）を示す。αFP、Cyp2b9 およびCyp2bl3については、未分化MASCでは転写物が検出されなかったため、ブロットの下の数字は肝臓から得たmRNAとの相対比である。Li＝マウスまたはヒト肝臓mRNA；NT＝テンプレート無し。マウス５例とヒト１例の試験の代表例として、図CはFGF4およびHGF、またはFGF4単独と、21日間Matrigelで培養したhMASC（B）を示す。FH＝Matrigel上のFGF4およびHGF誘導性hMASC、Huh＝対照として用いたHuh7細胞株。
【００７１】
図１１は肝細胞様細胞の顕微鏡写真を示す。FGF4によって誘導されたMASCはグリコーゲンを産生する。グリコーゲン貯蔵は染色濃部の集積として見られる（試験３回の代表例）。目盛り棒＝25μｍ。
【００７２】
定義
ここでは、以下の用語は以下の意味を持つものとする:
「拡大」は分化なしでの細胞の増殖を意味することとする。
【００７３】
「中間細胞」は、MASCの分化の間に生じる、MASCまたはその最終分化した子孫の一部の特徴を有するがすべての特徴は有しない細胞である。中間細胞は特定の経路に決定された前駆細胞であってもよいが、特定の細胞型に決定されていてはならない。
【００７４】
「正常」は病気、突然変異、または奇形を有しない動物、すなわち健康な動物を意味することとする。
【００７５】
「自己再生」は外的刺激を加えられることなしに増殖する細胞の能力を意味することとする。組織または器官で局所的に産生されるサイトカインまたは他の成長因子の存在は外的刺激とならないこととする。
【００７６】
「ホーミング」は、追加の細胞が必要である部位に特異的に移動する、一部のMASCまたはその子孫の能力を意味することとする。
【００７７】
「発現のノックアウト」は、特定の遺伝子の機能の消失を意味することとする。
【００７８】
ここでは、「ゲノムまたはプロテオーム構成」は任意の細胞の遺伝子またはタンパク質構成要素を意味することとする。
【００７９】
「高レベルのテロメラーゼ活性」はヒト不死細胞株MCF7で観察されるレベルの２倍と関連づけることができる。Soule et al. （1973） J. Cancer Inst.
51:1409-1416。
【００８０】
技術用途
MASC技術は哺乳類の体内の損傷細胞、疾患細胞、機能不全細胞または死細胞に置き換えるのに用いることができる。さらにこれらの細胞は、自家または同種異系細胞を用いて、天然または人工の担体、基材、または高分子とともにあるいはこれら無しで、たとえば鎌状赤血球病、血友病または、たとえばゴーシェ病、ニーマン・ピック病、ムコ多糖症などのように処理の欠陥のために産物が体内に蓄積する「貯蔵病」といったタンパク質機能に影響する遺伝子突然変異のように遺伝的な、失われた細胞、異常な機能または細胞または器官を修正するために、宿主に注射することができる。瀕死細胞または死細胞の回復の例は、黄斑変性症および他の神経変性疾患の治療におけるMASCまたはその分化した子孫の用途となりうる。
【００８１】
これらのMASCを宿主動物の器官/組織に「ホーミング」させて組み込み増殖および分化する能力を考えると、MASCはおそらく虚血心および心筋細胞自体にも新しい内皮細胞を提供するのに用いることができる可能性があり、多数の他の例が存在する。
【００８２】
組織または器官の機能への一時的な利益が望ましい効果を有しうる医学的状況があり得る。たとえば、正常な肝機能が回復できるようにするために十分なバイオ人工肝臓を接続し、肝移植の必要を防いだ肝障害患者の例がある。これはたとえば、C型肝炎というひとつの肝疾患だけでも、重大で満たされていない医療上の必要である。現在C型肝炎に感染している米国人は4〜5百万人存在し、これらの人々の50%が将来肝硬変になり肝移植を必要とするという推定がある。このことはぜひ救済を要する公衆衛生上の大問題である。自家または同種異系MASCに由来する肝細胞は、C型肝炎または他の肝疾患において移植できる。そのような移植は、提供者自身の肝細胞が回復できるように一時的に肝機能を提供するか、または永久的に損傷肝臓に再定着し提供者細胞によって正常な肝機能が回復するようにすることができる。
【００８３】
未分化のMASCがヒトまたは他の哺乳類に投与されその後被提供者の中で特定の細胞に分化する多くの細胞療法に加えて、MASCの子孫細胞はex vivoで分化させてその後に精製した細胞または細胞の混合物として治療上の利益を提供するために投与することができる。これらの未分化状態のMASCはまた、治療上の利益を有する薬物または分子を輸送する担体または媒体として使用することができる。これは、癌、心血管疾患、炎症性疾患、免疫疾患、感染症、などを含むがこれに限定されないいくつかの疾患のうち任意のものを治療するのに用いることができる。そこで例として、細胞、おそらく新規のまたは高いレベルの血管新生分子を発現している内皮細胞を、患者に投与することができ、それは既存の血管に組み込まれて血管新生をたとえば心臓で促進する；同様に、血管新生を抑制する分子を産生し、血液細胞に組み込まれてそれ以上の形成をたとえば糖尿病性網膜症または新たな血管形成が疾患の病因、蔓延および程度の鍵となる癌において抑制する内皮細胞を得ることができる。
【００８４】
BMに定着して血液をex vivoで形成する能力は、影で重要な医療上の用途を有する。たとえば、血液のex vivo産生に関して、輸血および血液製剤の注射は世界中でまだ行われていて、その安全性は病原体の感染のために変わりやすい。輸血は、HIV、BおよびC型肝炎、そして現在は狂牛病またはCJD、クロイツフェルト-ヤコブ病の差し迫った危険に繋がってきた。血液、特に赤血球をin vitroで産生する能力は、血液をヒトから集めることの安全かつ信頼できる代替法を提供しうる。提供者からの採血を完全に代替することは決して無いと思われる。hMASCまたはその造血性の子孫を、たとえばヒツジといった動物に胎内で注入し、ヒト造血細胞を形成しヒト血液成分または医療上の用途のあるタンパク質の起源として使うことができる。同じことが肝細胞、膵島または多くの他の細胞型についていえるが、ヒト細胞をin vitroで産生することの代替案を提供し、動物を細胞の工場として用いる。このことは発生が予測される血液不足を補助することができる。hMASCはまた、考えられる限りでは、いくつかの欠陥のうち任意の一つを修正するためにヒト胚に移植することができる。
【００８５】
これらのMASCは特異的に分化した細胞のクローン集団を生じることができるため、これらは薬物発見の豊かな基盤である。これにはこの周辺の、遺伝子を発現させること、遺伝子発現を分析すること、活性化の新規の遺伝子活性化パターンの発見、プロテオミクスおよびタンパク質発現および修飾のパターンが含まれる。これはデータベースと、これらのデータを公開または自己所有のデータベースと比較したこれらのデータを分析するためのアルゴリズムとを用いて、バイオインフォマティクスで分析される。既知の薬物または物質がどのように挙動するかの情報を、MASC、その分化した子孫、および利用可能なヒトの集団から得られた情報と比較することができる。経路、標的、および受容体を同定することができる。新薬、抗体または他の化合物が生物学的に望ましい反応を生じるのを発見することができる。同様に、MASCおよびその分化した子孫を、データベース、バイオインフォマティクスおよびアルゴリズムと組み合わせて、望ましくない反応についてのモニターとして用いることができる。
【００８６】
ヒト、マウス、ラットまたは他の哺乳類に由来するこれらのMASCは現在までに知られた唯一の、正常の、非-悪性の、継代の遅い細胞でさえ非常に高レベルのテロメラーゼを発現する体細胞（非-生殖細胞）であるように見える。テロメアはMASCで伸長していて核型的には正常である。哺乳類に注射されたMASCは、複数の器官へホーミングするので、特定の器官に新たに到着したMASCは自己再生できる可能性がある。このように、MASCは自分自身だけでなく、損傷したか、死亡したか、でなければ遺伝的または後天性疾患のために異常な機能を有した細胞型である、自己再生する分化した細胞型でも、器官に再定着する可能性を有する。
【００８７】
たとえば、I型糖尿病では膵島のインシュリン産生ベータ細胞が進行性に失われる。各種の腎疾患では機能の進行性消失と、一部の場合では糸球体の消滅がある。もし糖尿病の場合には、MASCまたは分化した子孫が膵臓にホーミングして、それ自身でまたは膵臓の中で内因性細胞との相互作用によって、膵島が形成されるように誘導しうる。これは糖尿病を改善する効果を有しうる。最終的には、MASCの自己再生する能力をin vivoで制御する、すなわち促進または抑制し、そして分化した子孫、たとえば、膵島前駆細胞、肝細胞前駆細胞、血球前駆細胞、神経および／または心前駆細胞への移行を制御する、すなわち促進または抑制する、条件、物質または薬物が見出されうる。MASCを用いて、増殖し分化する内因性前駆細胞を器官の中で誘導しうる、経路、活性化の方法および制御を見出しうる。
【００８８】
細胞組織または器官の区画に再定着し自己再生しそしてまた分化するこの同じ能力は、多数の用途と、医療上の満たされていない深い必要性を満たす前例の無い効用を有しうる。たとえば、酵素欠損症が存在するある種の遺伝疾患は、BM移植によって治療されている。これはしばしば、疾患の後遺症が脳または骨または他の場所に残りうる疾患の合併症に助けとなりうるが治癒はしない。MASCおよび遺伝子組み換えMASCは、多数の遺伝的および後天性疾患を改善する希望をもたらす。これらはまた、診断上または研究上の目的および薬物発見に有用となる。
【００８９】
本発明はまた、MASCのゲノムまたはプロテオーム構成を分析し、バイオインフォマティクスによるその分析、アルゴリズムによるコンピュータ分析と組み合わせて、新たなデータベースを収集し既知のデータベースと比較しこれらを対照することを含む；薬物発見、ゲノミクス、プロテオミクス、および経路の同定のための方法を提供する。これによって、治療上の利益を有する可能性のある新規化合物、抗体、タンパク質、小分子有機化合物、または他の生物活性分子に関する標的の定義に繋がりうる、主要構成要素、経路、新規遺伝子および／または遺伝子とタンパク質発現とタンパク質修飾の新たなパターン（プロテオミクス）が同定できる。
【００９０】
以下の実施例は本発明を説明するために提供され、しかし本発明を限定しない。
【実施例１】
【００９１】
マウス多能性成体幹細胞（mMASC）の選択、培養および特徴づけ
細胞単離と拡大
すべての組織はミネソタ大学学内動物実験委員会からのガイドラインに従って得た。BM単核細胞（BMMNC）はBMのフィコール・ハイパック分離によって得た。BMは5〜6週齢のROSA26マウスまたはC57/BL6マウスから得た。あるいは、筋および脳組織を3日齢のマウス129匹から得た。前肢および後肢の近位部からの筋を摘出しよく挽いた。その組織を0.2%コラゲナーゼ（Sigma Chemical Co, St Louis, MO）を用いて1時間、37℃で処理し、次いで0.1%トリプシン（Invitrogen, Grand Island, NY）で45分間処理した。細胞をその後よく磨砕し、70μｍフィルターを通した。細胞懸濁液を回収して、10分間、1600rpmで遠心分離した。脳組織は切開してよく挽いた。細胞を0.1% トリプシンおよび0.1% DNAse（Sigma）とともに30分間、37℃でインキュベートして解離させた。細胞をその後よく磨砕し、70μｍフィルターを通した。細胞懸濁液を回収して、10分間、1600rpmで遠心分離した。
【００９２】
BMMNCまたは筋または脳懸濁液を、1xl05/cm2で拡大培地[2%PCS添加低グルコースDulbecco最小必須培地（LG-DMEM）に、血小板由来成長因子（PDGF）と上皮成長因子（EGF）および白血病抑制因子（LIF）を各10ng/mL]に平板播種し、5xl03/cm2で維持した。3〜4週間後、トリプシン/EDTAで回収した細胞からCD45+/グリコフォリン（Gly）-A+細胞を磁気マイクロビーズを用いて除去した。結果として得られたCD45-/Gly-A-細胞を10細胞/ウェルでFN被覆96穴プレートに再播種し、0.5〜1.5x103/cm2の間の細胞密度で拡大した。MASCの拡大可能性は由来する組織にかかわらず同様であった（図1）。
【００９３】
MASCの特徴づけ
表現型的には、BM、筋および脳由来の、FNで培養したmMASCは、CD13+、CD44-、CD45-、クラスIおよびクラスII組織適合抗原-、低Flk1およびcKifで、国際出願番号PCT/US00/21387に記載されたhMASCの特徴と同一であった。細胞をIV型コラーゲン、ラミニンまたはMatrigelで培養したときのほうが、最初の2〜3ヶ月間の細胞拡大はより大きかったが、細胞はMSCの表現型の特徴を有した、すなわち、CD44を発現しCD13を発現しなかった。ヒト細胞と同様に、FNで培養したmMASCはoct-4の転写物とLIF-Rとを発現した。
【００９４】
10個のCD45-/GlyA-細胞を播種したウェルの約１％から、連続的に成長する培養が得られた。これは、培養MASCを開始しうる細胞が稀であっておそらくCD45-/GlyA-細胞の1/1,000より少ないことを示唆する。FNで培養したmMASC は直径8〜10μｍで大きい核と少ない細胞質を有する。いくつかの集団が＞ 100 PDの間培養されている。細胞の形態と表現型は培養期間を通じて変化しないままであった。
【００９５】
40および102 PDを経過したmMASCを採取し、テロメア長を評価した。テロメア長はPharmingen（New Jersey, USA）のテロメア長分析キットを用いて取扱説明書に従って測定した。40 PDの間培養したmMASCの平均テロメア長（ATL）は27Kbであった。102PD後に再試験したとき、ATLは変化しないままであった。mMASCの核型分析には、以前に記載した通り細胞を採取前に1:2希釈で12時間継代培養し、トリプシン-EDTAを用いて回収し、1.5時間コルセミド処理し、続いて低張KClを用いて細胞溶解し、酸/アルコールで固定した（Verfaillie et al., 1992）。細胞遺伝学的分析は月単位で行い、45 PD後に高二倍体となった、試験には使われなくなった一つの集団を除いて正常核型を示した。
【００９６】
46から＞80PD後に得られたマウスMASCを、ES細胞の未分化状態を維持するのに重要な二つの転写因子であるoct4およびRex1の発現レベルについて、定量的（Q）-RT-PCRによって試験した。マウスMASC、神経外胚葉性に分化した子孫（bFGFの添加後1〜7日目）およびマウスES細胞からRNAを抽出した。RNAを逆転写し、結果として得られたCDNAを下記の反応条件で40回増幅した（ABI PRISM 7700, Perkin Elmer/Applied Biosystems）: 2μLのDNA溶液と、1X TaqMan SYBR Green Universal Mix PCR反応緩衝液を用いた最初の変性（95℃で10分間）後、二段階PCR（95℃で15秒間、60℃で60秒間）を40サイクル。プライマーは表1に列記する。
【表１】
2004529621.tif 000002
【００９７】
mRNAレベルはGAPDHをハウスキーピング遺伝子として用いて標準化し、マウスES細胞中のレベルと比較した。oct4およびRex1 mRNAは、BM、筋および脳由来MASC中に同様のレベルで存在した。Rex1 mRNAレベルはmMASCおよびmES細胞で同様であった一方、oct4 mRNAレベルはMASCでES細胞より約1,000倍低かった。
【００９８】
マウスBM、筋および脳由来MASCの発現遺伝子プロファイルは非常に類似している
異なる組織に由来するMASCが同様であるかどうかさらに評価するために、BM、筋および脳由来MASCの発現遺伝子プロファイルをU74A Affimetrix遺伝子アレイを用いて検討した。要約すると、45回細胞分裂の間培養した2〜3xl06個のBM、筋または脳由来MASCからmRNAを抽出した。CDNAの調製、6,000個のマウス遺伝子と6,000個のESTクラスターを含むU74Aアレイとのハイブリッド形成、およびデータ取り込みは取扱説明書に従って行った（すべてAffimetrix, Santa Clara, CAより）。データ分析はGeneChip（登録商標）ソフトウェア（Affimetrix）を用いて行った。2.2倍の因数での発現増加または減少（Iyer V.R. et al., 1999；ScherfU. et al., 2000；Alizadeh A.A. et al, 2000）を有意とみなし、r2値を直線回帰分析を用いて決定した（図2）。
【００９９】
３種類の組織に由来するMASCの発現遺伝子プロファイルの比較は、BM由来のMASCで筋由来と比べて遺伝子の1%未満が2.2倍より大きく異なるレベルで発現していたことを示した。同様に、BM由来のMASCで脳由来と比べて遺伝子の1%未満だけが2.2倍より大きく異なるレベルで発現していた。異なるMASC集団間の相関係数は＞0.975であったため、異なる組織に由来するMASCは非常に相同であり、上記の表現型および実施例5に記載の分化の特徴と合致する。
【０１００】
マウス特異的培養条件を用いて、mMASC培養を100細胞分裂以上維持している。mMASC培養は、-HMG-LacZについて遺伝子導入したC57B1/6マウス、ROSA26マウスおよびC57BL/6マウス由来の骨髄を用いて開始した。
【実施例２】
【０１０１】
ラット多能性成体幹細胞（VMASC）の選択と培養
Sprague DawleyまたはWistarラット由来のBMおよびMNCをmMASCについてと同様の条件下で得て播種した。21〜28日間後、細胞からCD45+細胞を除去し、結果として得られたCD45-細胞を10細胞/ウェルで継代培養した。
【０１０２】
mMASCと同様に、rMASCは＞100PDの間培養して拡大している。ラットMASC培養の拡大 条件には、EGF、PDGF-BBおよびLIFの添加と、I型コラーゲン、ラミニンまたはMatrigelでなくFNでの培養が必要であった。rMASCはCD44、CD45およびMHCクラスIおよびIIについて陰性で、高レベルのテロメラーゼを発現した。100細胞分裂を超えて生育する正常細胞の能力は前例が無く、予想外で、20年以上の従来の定説に反する。
【０１０３】
42PD、72 PD、80 PD、および100 PDを経過したラット MASCを採取してテロメア長を評価した。42 PD、72 PD、80 PD、and 100 PD後のサザンブロット分析で測定されたように、テロメアは培養中に短縮しなかった。ラットMASCの毎月の細胞遺伝学的分析では正常核型が見られた。
【実施例３】
【０１０４】
ヒト多能性成体幹細胞（hMASC）の選択と培養
BMは健康なボランティア提供者（2〜50歳）から、研究におけるヒト被験者の使用に関するミネソタ大学委員会からのガイドラインを用いたインフォームド・コンセント後に得られた。BMMNCはフィコール・パック密度勾配遠心分離によって得られ、depleted of CD45+およびグリコフォリン-A+細胞を磁気マイクロビーズ（Miltenyii Biotec, Sunnyvale, CA）を用いて除去した。
【０１０５】
拡大条件: 5x103個のCD45-/GlyA-細胞を200uLの拡大培地[1Xインシュリン-トランスフェリン-セレン（ITS）、1Xリノール酸ウシ血清アルブミン（LA-BSA）、10-8Mデキサメタゾン、10-4Mアスコルビン酸-2-リン酸（すべてSigma）、100Uペニシリンおよび1,000Uストレプトマイシン（Gibco）を添加した58%DMEM-LG、40%MCDB-201（Sigma Chemical Co, St Louis, MO）に、10 ng/mlのEOF（Sigma）および10ng/mlのPDGF-BB（R&D Systems, Minneapolis, MN）を含む胎児ウシ血清（PCS）（Hyclone Laboratories, Logan, UT）を0〜10%添加]で希釈し、5ng/mlのFN（Sigma）で被覆した96穴プレートのウェルに播種した。培地は4〜6日毎に交換した。ウェルの＞40〜50%に密集成長したら、接着細胞を0.25%トリプシン-EDTA（Sigma）を用いて剥離して、MASC拡大培地に1:4希釈で5ng/mlのFNで被覆したより大きな培養容器に再播種し、2〜8x103細胞/cm2の間の細胞密度を維持した。
【０１０６】
未分化のMASCはCD31、CD34、CD36、CD44、CD45、CD62-E、CD62-L、CD62-P、HLA-クラスIおよびII、cKit、Tie、Tek、αvβ3、VE-カドヘリン、血管内皮細胞接着分子（VCAM）、細胞内接着分子（ICAM）-1を発現しなかった。MASCは低い/非常に低いレベルのβ2-ミクログロブリン、αvβ5、CDw90、AC133、Flk1およびFlt1、そして高レベルのCD13とCD49bを発現した（図3）。
【実施例４】
【０１０７】
免疫表現型分析
免疫蛍光
1.培養細胞を4%パラホルムアルデヒドおよびメタノールメタノールを用いて室温で固定し、一次抗体と、そして二次抗体とあるいは二次抗体無しで、連続して各30分間インキュベートした。各工程の間に、スライドをPBS/BSAで洗浄した。細胞は蛍光顕微鏡法（Zeiss Axiovert； Carl Zeiss, Inc., Thornwood, NY）および共焦点蛍光顕微鏡法（共焦点1024顕微鏡； Olympus AX70, Olympus Optical Co. LTD, Japan）によって検査した。任意の培養中の異なる細胞型の頻度を評価するために、任意の抗体について染色陽性となった細胞を４つの視野（視野あたり細胞50〜200個）で計数した。2.採取組織:血液およびBMのサイトスピン標本をアセトン（Fisher Chemicals）で10分間、室温で固定した。固形器官については、組織の5μｍ厚の新鮮凍結切片をスライドグラスに乗せ、ただちにアセトン中で10分間、室温で固定した。イソ型血清で20分間インキュベート後、サイトスピン調製物または組織切片を、組織特異的抗原、β-galおよび核対比染色剤（DAPIまたはTO-PRO-3）について連続的に染色した。
【０１０８】
カバースリップはSlowfade-antifadeキット（Molecular Probes Inc., Eugene, OR, USA）を用いて乗せた。スライドは蛍光顕微鏡法および共焦点蛍光顕微鏡法によって検査した。
【０１０９】
3.抗体：細胞は4%パラホルムアルデヒドを用いて室温で、またはメタノールを用いて-20℃で固定し、一次抗体、およびFITCまたはCy3結合抗マウス-または抗ウサギ-IgG抗体を用いて連続的に各30分間インキュベートした。各工程の間にスライドをPBS＋1%BSAを用いて洗浄した。PEまたはFITC結合抗CD45、抗CD31、抗CD62E、抗Mac1、抗Gr1、抗CD19、抗CD3、および抗Ter119抗体はBD Pharmingenより入手した。GFAP（クローンG-A-5、1:400）、ガラクトセレブロシド（GalC）（ポリクローナル、1:50）、MBP（ポリクローナル、1:50）、GABA（クローンGB-69、1:100）、パルブアルブミン（クローンPARV-19、1:2000）、TuJl（クローンSDL.3D10、1:400）、NF-68（クローンNR4、1:400）、NF-160（cloneNN18、1:40）、そしてNF-200（クローンN52、1:400）、NSE（ポリクローナル、1:50）、MAP2-AB（クローンAP20、1:400）、Tau（ポリクローナル、1:400）、TH（クローンTH-2、1:1000）、DDC（クローンDDC-109、1:100）、TrH（クローンWH-3、1:1000）、セロトニン（ポリクローナル、1:2000）、グルタミン酸（クローンGLU-4、1:400）、速筋ミオシン（クローンMY-32；1:400希釈）に対する抗体はSigmaから入手した。DAPIおよびTOPRO-3はMolecular Probesから入手した。vWF（ポリクローナル；1:50）、Neuro-D（ポリクローナル、1:50）、c-ret（ポリクローナル、1:50）andNurrI（ポリクローナル、1:50）に対する抗体はSanta Cruz Biotechnology Inc., Santa Cruz, CAから入手した。PSA-NCAM （ポリクローナル、 1 :500）に対する抗体はPhanmingen, San Diego, CAから、そしてセロトニン輸送体（クローンMAB1564、1:400）、DTP（ポリクローナル、1:200）、Naゲート電位チャンネル（ポリクローナル、1:100）、グルタミン酸-受容体-5、-6および-7（クローン371、1:500）およびNMDA（ポリクローナル1:400）受容体に対する抗体はChemicon International, Temecula, CAから入手した。抗ネスチン（1:400）抗体はスウェーデンのLund大学のDr. U. Lendahlより寄贈を受けた。NSE（1:50）pan-サイトケラチン（カタログ番号C-2562；1:100）、CK-18（C-8541；1:300）、アルブミン（A-6684；1:100）に対する抗体はすべてSigmaから入手した。Flk1、Flt1、Tek、HNF-1pに対するポリクローナル抗体はSanta Cruz Biotechnology Inc., Santa Cruz, CAから入手した。抗ネスチン（1:400）抗体はスウェーデンのLund大学のDr. U. Lendahlより寄贈を受けた。対照-マウス、-ウサギまたは-ラットIgGとFITC/PE/Cy3-およびCy5-標識二次抗体はSigmaから入手した。ウサギ抗β-gal-FITC抗体はRockland Immunochemicals, USAから入手した。TO-PRO-3 Molecular Probes Inc.から入手し、DAPはSigmaから入手した。
【０１１０】
B.X-GAL染色；組織切片はβ-ガラクトシダーゼ酵素活性についてInvitrogenのβ-gal染色キットを用いて染色した（pH7.4）。組織切片を10分間のかわりに5分間インキュベートした固定工程以外は取扱説明書に従った。
【０１１１】
C.FACS:FACSについては、未分化MASCを剥離して、抗CD44、CD45、CD13、cKit、MHC-クラスIおよびII、またはb2-ミクログロブリン（BD Pharmingen）および二次FITCまたはPE結合抗体を用いて連続的に染色し、FACS-Calibur（Becton Dickinson）を使用した分析まで2%パラホルムアルデヒドで固定した。
【実施例５】
【０１１２】
MASCからの分化系統の単一細胞起源
mMASCまたはrMASCの分化能力を、hMASCまたはES細胞の中胚葉、神経外胚葉、および内胚葉への分化について何が記載されているかに基づいて選択した分化因子（サイトカイン）を加えることによって試験した。分化には、EOF、PDGF-BBおよびLIFを含まないが、系統特異的サイトカインを含む無血清培地に、l〜2x104細胞/cm2で細胞を再播種することを要した。分化は組織特異的マーカー[遅筋ミオシンおよびMyoD（筋）、von-Willebrand因子（vWF）およびTek（内皮）、NF200およびMAP2（神経外胚葉性）、そしてサイトケラチン-18およびアルブミン（内胚葉性）]についての免疫組織化学、RT-PCR、および機能試験によって判定した。
【０１１３】
神経外胚葉性細胞へのMASC分化
Palmer et al.は神経前駆細胞をPDGF-BBを用いて培養で拡大できること、およびPDGFの除去と分化因子としてbFGFの添加によってその分化を誘導できることを示した。これらの研究およびhMASCを用いて行われた研究に基づき、mMASCおよびrMASCを、PDGF-BBおよびEGFを含まないが100ng/mLのbFGFを含むFN被覆ウェルに播種した。神経細胞様細胞の成熟の進行が培養期間を通じて見られた。7日間後、細胞の大多数がネスチンを発現した。14日間後、MASCの15〜20%が星状細胞の（GFAP+）、15〜20%が稀突起膠細胞の（ガラクトセレブロシド（GalC）+）、そして50〜60%が神経細胞の（神経フィラメント-200（NF-200）+）形態的および表現型の特徴を獲得した。NF200、GFAPまたはGalCは同一の細胞には見つからず、神経細胞様細胞が神経細胞のマーカーを不適切に発現したhMASCまたはグリア細胞である可能性は低いことを示唆した。神経細胞様細胞はまたTau、MAP2およびNSEも発現した。神経細胞の約50%がガンマ-アミノ酪酸（GABA）およびパルブアルブミンを、30%がチロシンヒドロキシラーゼおよびドーパ-デカルボキシラーゼ（DDC）を、そして20%がセロトニンおよびトリプトファンヒドロキシラーゼを発現した。MASCを40PD、または90PD以上拡大したとき、分化は同様であった。実施例1で記載の通り実施したQ-RT-PCRによって、神経外胚葉性マーカーの発現が確認された: 2日目にMASCはotx1およびotx2 mRNAを発現し、7日間後にはネスチンmRNAが検出された。
【０１１４】
繊維芽細胞成長因子（FGF）-8bの分化因子としての効果を次に試験した。これはin vivoで中脳の発生のために重要であり、in vitroでマウスES細胞からhMASCについてドーパミン作用性およびセロトニン作用性神経細胞を誘導するのに用いられる。密集成長したhMASC（n＝8）を10ng/mLのFGF-8b＋EGFと培養したとき、神経細胞マーカーについて染色陽性であるが稀突起膠細胞および星状細胞について陽性でない細胞への分化が見られた。神経細胞はGABA性（GABA+；40±4%）、ドーパミン作用性（DOPA、TH、DCCおよびDTP+、26±5%）そしてセロトニン作用性（TrH、セロトニンおよびセロトニン-輸送体+、34±6%）神経細胞の特徴を有した。DOPA+神経細胞はNurr1に対する抗体で染色され、中脳DA神経細胞への分化を示唆した。FGF-8b誘導性神経細胞は成熟神経細胞の電気生理学的特徴を有しなかった。したがって、FGF-8bで支持された3週齢の細胞を、グリア芽腫細胞株であるU-87と、FGF-8bと共にさらに2〜3週間培養した。
【０１１５】
神経細胞は細胞の大きさおよび数、長さ、および神経突起の複雑さの増大したより成熟した形態を獲得し、そして成熟神経細胞の電気生理学的特徴（1μMテトロドトキシン（TTX）によって可逆的に遮断される一時的な内向き電流は、一時的なタイムコースと内向き電流の電位依存活性化とともに、成熟神経細胞にだけ見られる電位活性化ナトリウム電流に典型的である）を獲得した。
【０１１６】
hMASC（n＝13）を10ng/mの脳由来神経分化誘導因子（BDNF）＋EOFと共に培養したとき、分化はDOPA、TH、DCC、DTPおよびNurr1陽性神経細胞に限定された。BDNFはES細胞およびNSCからの神経分化を支援するが（Peault, 1996；Choi et al. 1998）、DA様神経細胞への限定的分化を示した研究は無い。
【０１１７】
同様の結果が、bFGFで誘導されたmMASCとbFGFおよびBDNFで誘導されたrMASCについて見られた。MASC由来神経細胞についてのさらなる研究が実施例10に示されている。
【０１１８】
内皮細胞へのMASC分化
中胚葉の例として、内皮への分化を誘導した。未分化のmMASCまたはrMASCは内皮マーカーCD31、CD62E、TekまたはvWFを発現しなかったが、低レベルのFlk1を発現した。mMASCまたはrMASCをFN被覆ウェルで10 ng/mLの内皮分化因子VEGF-Bと共に培養した。14日間のVEGF処理後、MASCの＞90%が、経過したPD数にかかわらず、内皮分化に合致してFlt1、CD31、vWFまたはCD62を発現した。初代内皮細胞のように、MASC由来内皮細胞はMatrigelに再播種後6時間以内に血管を形成した。
【０１１９】
同様に、hMASCはFlk1およびFlt1を発現するが、CD34、Muc18（P1H12）、PECAM、E-およびP-セレクチン、CD36、またはTie/Tekは発現しない。hMASCを2xl04細胞/cm2、20ng/mLの血管内皮成長因子（VEGF）を含む無血清培地で培養したとき、細胞はCD34、VE-カドヘリン、VCAMおよびMuc-18を7日目以降に発現した。14日目に、細胞はTie、Tek、Flk1およびFlt1、PECAM、P-セレクチンおよびE-セレクチン、CD36、vWF、そしてコネキシン-40も発現した。さらに、細胞は低比重リポタンパク質（LDL）を取り込むことができた。組織化学染色からの結果はウェスタンブロットによって確認された。血管形成を誘導するために、14日間VEGFと共に培養したMASCを、10ng/mLVEGF-Bを含むMatrigelに再播種して６時間経過した。＞2%PCSで培養されたhMASCを用いたときは、内皮分化は見られなかった。さらに、PCSが分化の間に培地中に残されたとき、内皮細胞は生じなかった。
【０１２０】
hMASCを継代培養したとき少なくとも 1 000-倍の拡大が得られ、hMASCから生じた内皮 前駆細胞が顕著な増殖能力を持ち続けていることを示唆した。細胞の拡大は、PCSが７日後に培養に添加されたときさらに大きかった。hMASC由来内皮細胞が皮下にヒト大腸癌を移植されたNOD-SCIマウスに静脈注射で投与されたとき、ヒト内皮細胞が腫瘍で血管新生に寄与するのが見られた。したがって、治療上の利益を得るため、すなわち、たとえば癌において血管新生を阻害するため、または肢あるいはたとえば心臓のようなその他の器官において血管新生を促進するために、遺伝子組み換え内皮細胞を組み込むことが可能である。MASC由来内皮細胞に関するさらなる研究は実施例9に示されている。
【０１２１】
内胚葉へのMASC分化
mMASCまたはrMASCが内胚葉細胞に分化できるかどうかを試験した。分化因子であるケラチノサイト成長因子（KGF）、肝細胞成長因子（HGF）およびFGF-4と共に、ラミニン、コラーゲン、FNまたはMatrigel被覆ウェルのいずれかでの培養を含むいくつかの異なる培養条件を試験した。10ng/mLのFGF4＋10ng/mLのHGFを含むMatrigelに再播種したとき、MASCの約70%が肝細胞様細胞の形態的および表現型の特徴を獲得した。細胞は類上皮細胞になり、細胞の約10%が二核になり、そして細胞の約70%がアルブミン、サイトケラチン（CK）-18、およびHNF-1Pについて染色陽性となった。
【０１２２】
FGF4およびHGFを含む培養で生じた内胚葉性様細胞もまた、未分化のMASCとFGF4およびHGF誘導性MASCの上清中の尿素レベルをSigma尿素窒素キット640を用いて取扱説明書に従って測定することによって判定された、肝細胞の機能的特徴を有した。未分化のMASC培養においては尿素は検出されなかった。尿素産生はFGF4およびHGFの添加１４日後に10μg/細胞/時間であり、25日目まで同様のレベルで検出可能であった。これは単層で生育した初代ラット肝細胞と同等である。アルブミンの存在は、尿素産生と共にMASCからin vitroの肝細胞分化の概念を支持する。MASC由来肝細胞に関するさらなる研究は実施例11に示されている。
【０１２３】
内胚葉系統前駆細胞が存在する可能性が高いことを考えると、MASCは肝臓と膵臓の外分泌および内分泌構成部分の両方、および他の内胚葉由来細胞組織系統のさまざまな細胞を形成する細胞を生じる可能性が高い。
【０１２４】
筋または脳に由来するMASCは、BM由来MASCについて上に記載した方法を用いて、中胚葉（内皮細胞）、神経外胚葉（星状細胞および神経細胞）および内胚葉（肝細胞様細胞）に分化するよう誘導された。
【０１２５】
形質導入
分化した細胞が単一細胞由来でありMASCが実際に「クローン」多能性細胞であることを示すため、MASCにレトロウイルスベクターを導入した培養細胞を作成し、そして未分化の細胞とその子孫はゲノムの同一部位にレトロウイルス挿入配列を有することが見出された。
【０１２６】
40から＞90PDの間拡大した、二つの独立して得られたROSA26MASC、二つのC57BL/6MASCおよび一つのrMASC集団を用いて、またeGFPを導入した「クローン」マウスおよび「クローン」rMASCについて、試験を行った。eGFP導入細胞および非導入細胞の間に差異は見られなかった。注目すべきこととして、eGFP発現は分化したMASCで持続した。
【０１２７】
具体的には、EGF, PDGF-BBおよびLIFを含むFNで３週間培養したマウスおよびラットBMMNCに連続２日間、eGFP腫瘍レトロウイルスベクターを導入した。その後、CD45+およびGlyA+細胞を除去し、細胞を10細胞/ウェルで継代培養した。eGFP導入ラットBMMNCを85PDの間拡大した。または、80PDSの間拡大したマウスMASCを用いた。未分化MASCの継代培養は、75PDの間維持した培養から100個のMASCを播種してそれを＞5xl06個に再拡大することによって作成した。拡大したMASCはin vitroで内皮、神経外胚葉および内胚葉に分化するよう誘導した。系統分化は、実施例4に記載の通り、これらの細胞型に特異的な抗体で染色することによって示した。
【０１２８】
中胚葉性および神経外胚葉性子孫細胞の単一細胞起源
中胚葉性および神経外胚葉性の分化した子孫細胞が単一細胞起源であることを証明するため、レトロウイルスマーキングを用いた（Jordan et al, 1990；Nolta et al., 1996）。20PD後に得たhMASCの画分にMFG-eGFPレトロウイルスを形質導入した。eGFP+hMASCを、同一提供者由来の非導入MASCで希釈し、導入細胞の終濃度を〜5%とした。これらの混合物を100細胞/ウェルで播種し、培養を＞2xl07細胞が得られるまで拡大した。それぞれ5xl06個のMASCを、骨格筋筋芽細胞、内皮および神経外胚葉性系統に分化するよう誘導した。分化条件下で14日後、細胞を採取してレトロウイルス組み込み部位、およびeGFPと神経外胚葉性、筋および内皮マーカーとの同時発現を同定するために用いた。
【０１２９】
筋芽細胞分化については、hMASCを2xl04細胞/cm2で2%PCS、EGFおよびPDGF含有拡大培地に播種し、3μMの5-アザシチジンを用いて同じ培地中で24時間処理した。その後、細胞は2%PCS、EGFおよびPDGF-BBを含む拡大培地中で維持した。内皮分化については、hMASCを2xl04細胞/cm2で、EGFおよびPDGFを含まないが10ng/mlのVEGF-Bを含む無血清拡大培地で14日間培養した。
【０１３０】
免疫蛍光評価は、培養中の細胞の5〜10%が5-アザシチジンでeGFPおよび骨格筋アクチンについて染色陽性に分化するよう誘導され、細胞の5〜10%がeGFPおよびvWFについて同時染色される内皮に分化するよう誘導され、そして細胞の5〜10%が、eGFP、およびNF-200かGFAPかMBPのいずれかについて同時染色される神経外胚葉に分化するよう誘導されたことを示した。レトロウイルス挿入部位を定義するため、MASCおよび分化した子孫の宿主ゲノム隣接領域を配列決定した。別々の集団におけるレトロウイルス挿入配列の数は１から７の間であった。表2に示す通り、集団A16で染色体7にマッピングされた、筋、内皮および神経外胚葉性細胞でレトロウイルス挿入配列に隣接する、単一の同一の配列が同定された。
【表２】
2004529621.tif 000003
【０１３１】
3'LTRに特異的なプライマーを設計し、また隣接するゲノム配列に特異的なプライマーは表３に示す通りで、そしてリアルタイムPCRを用いて、レトロウイルス挿入部位は未分化細胞と分化した細胞とで同一であることが確認された。これらの結果は、隣接配列とeGFP DNA配列とが同様の量で存在することを証明した。クローンA12はそれぞれ染色体1と7に位置する２個のレトロウイルス挿入配列を含み、両方の隣接配列をhMASCだけでなく筋、内皮および神経外胚葉性系統にも検出することができた。これが２個のレトロウイルス要素を有する単一細胞の子孫かまたは２個の細胞の子孫のどちらを示すのか判定するため、リアルタイムPCRを用いて染色体1および7のeGFP隣接配列の相対量を比較した。hMASC、筋、内皮および神経外胚葉性細胞に両方の隣接配列が同様の量存在したことが見出され、２個のレトロウイルス挿入配列を有する単一細胞がeGFP陽性hMASCおよび分化した子孫の元になった可能性が高いことを示唆した。3個以上のレトロウイルス挿入配列を含む他の集団においては、我々は挿入配列が単一細胞の複数の挿入部位に由来するのかそれともeGFP陽性画分に寄与する複数の細胞に由来するのか判定することはできなかった。にもかかわらず、2個の集団において筋、内皮および神経外胚葉に分化した子孫細胞は単一のBM由来前駆細胞に由来するという我々の発見は、中胚葉性系統および神経外胚葉の３つの異なる系統の細胞において単一細胞レベルで分化するBMから原始細胞を培養することが可能であることを初めて決定的に証明する。
【表３】
2004529621.tif 000004
【実施例６】
【０１３２】
体内の多くの器官への哺乳類MASCのホーミングと定着
定着してin vivoで組織特異的細胞に分化する能力を有するかどうか調べるため、mMASCを試験した。mMASCをLacZ遺伝子導入C57Black6、ROSA26マウスから実施例１に記載の通り育成した。LacZマウス由来の106個のmMASCを、注射の４〜６時間前に250Radの全身照射ありまたは無しで、NOD-SCIDマウス尾静脈に静脈注射した。動物は注射後4〜24週間で頸椎脱臼により屠殺した。
【０１３３】
組織採取
血液および骨髄: 0.5〜1mlの血液を動物の屠殺時に得た。大腿骨および脛骨を洗浄してBMを回収した。表現型分析については、血液およびBM中の赤血球を氷冷塩酸アンモニウムを用いて除去し（Stem Cell Technologies Inc., Vancouver, Canada）、105個の細胞をサイトスピン遠心分離に用いた。連続移植については、大腿骨2本および脛骨2本からの5xl07個の細胞を個々の二次被提供者に尾静脈注射によって移植した。二次被提供者は7〜10週間後に屠殺した。
【０１３４】
固形器官:肺はPBSで1:4希釈したOCT化合物（Sakura-Finetek Inc, USA）の1mlで膨張させた。被提供者動物の脾臓、肝臓、肺、腸、骨格筋、心筋、腎臓および脳の標本を採取しOCT中で-80℃にて、および定量的PCR用にRNA Later（Ambion Inc., Austin, TX, USA）中で-20℃にて低温保存した。
【０１３５】
mMASCは定着してin vivoで組織特異的細胞に分化する
β-gal/ネオマイシン（NEO）導入遺伝子含有細胞の定着（Zambrowicz et al., 1997）は、β-galについて免疫組織化学によって、およびNEOについてQPCRによって試験された。免疫組織化学およびQ-PCRは実施例5および1にそれぞれ記載された通り実施した。プライマーは表１に列記されている。
【０１３６】
1%を超える抗β-gal細胞の検出として定義される定着が、すべての被提供者 動物の造血組織（血液、BMおよび脾臓）ならびに肺、肝臓および腸の上皮に表4および図4に示す通り見られた。
【表４】
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【０１３７】
BM（図4B〜F）および脾臓（図4H〜I）のβ-gal+細胞は、抗CD45、抗CD19、抗Mad、抗Gr1および抗TER119抗体と同時染色された。同様の結果が末梢血について見られた。注目すべきこととして、β-gal+CD3+T細胞はキメラマウスで見られたにもかかわらず、血液、BMまたは脾臓のいずれにもβ-gal+CD3+T細胞は見られなかった。この理由は現在のところ不明である。
【０１３８】
脾臓での定着は主に提供者細胞の塊として起こり、MASCが脾臓にホーミングするとき、CFU-Sと同様に、MASCは局部的に増殖し分化して提供者細胞のコロニーを形成するという仮説と合致した。mMASCの造血細胞へのin vivo分化は、mMASCにHSCが混入したことが原因ではないと考えられる。最初に、BMMNCはmMASC培養を開始する前にカラム選択によってCD45細胞を除去されている。次に、brachyury（Robertson et al, 2000）、GATA-2およびGATA-1（Weiss et al., 1995）を含む初期中胚葉性または造血転写因子は、CDNAアレイ分析によって示される通り、未分化のmMASCでは発現していない。第三に、mMASCに用いた培養条件は、HCSについては支持的でない。第四に、hMASCを造血支持細胞とサイトカインと共に培養することによってhMASCからin vitroで造血分化を誘導する試みはどれも成功しなかった（Reyes et al., 2001）。
【０１３９】
顕著なレベルのmMASC定着がまた肝臓、腸および肺でも見られた。三色染色免疫組織化学を用いて、上皮（CK+）および造血（CD45+）細胞を肝臓、腸および肺の同一組織切片において同定した。肝臓では、β-gal+提供者由来細胞は肝細胞（CK18+CD45+またはアルブミン+）の束を形成し、任意の５μｍの切片の約5〜10%を占めた（図4K〜M）。被提供者起源のいくつかのCK18+CD45+β-gal-造血細胞は上皮細胞から明瞭に同定された。Albumin+β-gal+およびCK18+β-gal+細胞は、肝幹細胞および円形細胞からの肝再生でみられるパターンで、門脈路周囲の肝細胞束に定着した（Alison et al., 1998；Petersen et al., 1999）。このことと、切片20枚のうち5枚のみが提供者細胞を含んでいたこととは、幹細胞は肝臓のすべての部分でなく一部分に定着し、そこで増殖して肝細胞に分化するという概念と合致する。
【０１４０】
腸における定着もまた腸上皮幹細胞について知られていることと合致した。腸では、個々の陰窩は4〜5個の長寿命の幹細胞を含む（Potten, 1998）。これらの幹細胞の子孫は陰窩の中部および上部で数回の分裂を経て上皮細胞を生じ、これは上方へ、陰窩外へ出て、隣接する絨毛へ移動する。提供者由来のβ-gal+panCK+CD45-上皮細胞がいくつかの絨毛を完全に覆っていた（図4O〜P）。一部の絨毛では、β-gal+panCK+CD45-細胞は周囲の50%だけを構成し（黒矢印、図4P）、定着が両方の陰窩でなく一方であったことを示唆した。いくつかのβ-gal+panCK-細胞が腸絨毛の中心に明瞭に見られた（白矢印、図4O）。これらの細胞はCD45について同時染色され（図4P）、これらが提供者由来造血細胞であることを示した。肺では、提供者細胞の大多数がβ-gal+panCK+CD45-肺胞上皮細胞を生じた一方、大部分の造血細胞は被提供者起源であった（panCK-CD45+β-gal-）（図4R）。
【０１４１】
免疫組織化学によって検出された定着のレベルは、NEOについてQ-PCRで測定されたレベルと一致した（表4）。定着レベルは、MASCの静脈注射の4〜24週間後に分析した動物で同様であった（表4）。
【０１４２】
骨格筋または心筋には寄与は見られなかった。上皮組織および造血機構とは対照的に、組織傷害の非存在下で骨格筋または心筋において細胞の交代はわずかであるかまたは全く見られなかった。したがって、これらの組織への幹細胞の顕著な寄与は期待されない。しかし、上皮細胞が迅速な交代を受ける２つの器官である皮膚および腎臓において定着は見られなかった。胚盤胞注射実験（実施例8）において、mMASCはこれらの細胞型に分化できることが示される；出生後の被提供者におけるこれらの器官で定着が見られないことの可能な説明は、mMASCはこれらの器官へホーミングしないというもので、現在評価中の仮説である。mMASCは神経外胚葉様細胞にex vivoで分化したが、脳においてmMASCの顕著な定着は見られず、脳で見つかった稀な提供者細胞は神経外胚葉性マーカーで同時標識されなかった。２つの最近の論文が、BM移植を受けた動物の脳において神経外胚葉の特徴を有する提供者由来細胞を検出することができることを示した。しかし、血液脳関門の破壊に伴う条件である、移植前の完全除去の準備方法または新生動物への移植が用いられた。細胞は、血液脳関門が完全であるかまたは最小の損傷しか受けていない、照射を受けていない成体動物、または低用量の照射を受けた動物に注入された。このことはCNSにおいてmMASC定着が見られなかったことを説明しうる。
【０１４３】
密集MASCはin vivoで分化しない
対照として、注射前にROSA26-MASCを注入し密集となるまで培養した。密集を形成させたMASCは、ex vivoで中胚葉外の細胞の中で分化する能力を失い、古典的MSCのように挙動する（Reyes, M. et al. 2001）。106個の密集mMASCの注射によって顕著なレベルの提供者細胞定着は生じなかった。β-gal+細胞はBM中に少数しか見られなかったが、これらの細胞は抗CD45抗体で同時標識されず、MSCは組織に定着しうるが局所的信号に答えて組織特異的細胞に分化することはもうできないことを示している。
【０１４４】
マウス骨髄中のMASC由来細胞は連続的に移植できる
ROSA26MASCを植え付けたマウスに由来するBMを、二次被提供者に定着する細胞を含むかどうか試験した。mMASCの静脈注射から11週間後に一次被提供者から回収した1.5x107個のBM細胞を、放射線照射を受けた二次NOD-SCID 被提供者に移植した（図4:動物SR-1およびSR-2）。7および10週間後、二次被提供者を屠殺し、被提供者動物の血液、BM、脾臓、肝臓、肺および腸を、ROSA26提供者細胞の定着に関して、NEO遺伝子について免疫組織化学およびQ-PCRによって分析した。一次被提供者でのように、定着の同様なパターンが二次被提供者に見られた。BM、脾臓およびPB細胞の4〜8%がβ-gal+CD45+であった；腸上皮細胞の６および8%がβ-gal+pan-CK+で、そして肺上皮細胞の4および5%がβ-gal+pan-CK+であった。二次被提供者の肝臓における定着のレベルは一次被提供者より低かった（1および3%に対し5および8%のβ-gal+CK18+）。これは、mMASCが一次被提供者のBM中に持続し、二次被提供者に移植されたとき造血細胞ならびに上皮細胞に分化しうることを示唆する。
【０１４５】
MASC由来細胞はインシュリンをin vivoで産生することができる。ROSA26マウス由来MASCを放射線照射したNOD-SCIDマウスに、ここに記載の通り注射した。結果として得られるMASC由来細胞は、ストレプトゾトシン糖尿病モデルでLacZおよびインシュリンについて同時染色する。
【０１４６】
要約
「幹細胞可塑性」における決定的な疑問の一つは、定着し分化した提供者mMASCが機能するかどうかである。ここに記載した結果は、老齢NOD-SCIDマウスに普通見られるように、一個体の動物が16週間後に胸腺および脾臓にリンパ腫を生じたことを示す（Prochazka et al., 1992）。表現型分析はこのB細胞リンパ腫が宿主由来であることを示した:CD19+細胞はβ-gal-であった。腫瘍の脈管構造中のCD45-vWF+細胞の約40%が抗β-gal抗体で染色され、腫瘍中の血管新生が一部は提供者mMASCに由来することを示した（図4T）。このことはMASCが機能する子孫をin vivoで生じることを示唆する。同様に、たとえば造血機構および腸上皮のような放射線感受性の器官において、低用量放射線照射後にmMASC定着および分化のレベルがより高いことは（表4、p＜0.001）、mMASCが宿主組織に機能的に寄与している可能性を示唆する。
【０１４７】
これらの結果は、哺乳類MASCを精製し、ex vivoで拡大し、そして静脈注射し、体内のさまざまな部位にホーミングさせ、多数の器官に定着させられること、および細胞がこれらの各種器官中で１ヶ月またはより長期間生存することを示した。そのような提供者細胞、未分化の子孫、および分化した子孫は、蛍光マーカーによって、BM、脾臓、肝臓および肺を含むがこれに限定されない器官に見出される。これらの細胞は、一またはそれ以上の区画に再定着させ、細胞または器官の機能を強化または回復するのに用いることができる。
【実施例７】
【０１４８】
in vitro造血および赤血球産生の実証
ヒトBM由来のMASCは、単一細胞レベルで、神経外胚葉性、内胚葉性、および内皮細胞を含む多くの中胚葉性系統に分化する。内皮および血液は個体発生において非常に密接に関連しているため、MASCが造血細胞に分化できると仮説を立てることができる。GlyA、CD45およびCD34陰性であるeGFP導入ヒトMASC（n＝20）を、マウス卵黄嚢中胚葉性細胞株YSM5と、細胞凝集塊懸濁液として6日間、10ng/mLのbFGFおよびVEGFを添加した無血清培地中で共に培養した。6日後、eGFP+細胞（すなわちMASC子孫）だけが残りYSM5細胞は死亡していた。
【０１４９】
残った細胞を、10%胎児ウシ血清を含む、10ng/mL骨形成タンパク質（BMP）4、VEGF、bFGF、幹細胞因子（SCF）、Flt3L、hyperIL6、トロンボポエチン（TPO）、およびエリスロポエチン（EPO）を添加したメチルセルロース培養に移し2週間培養した。これらの培養中に、接着性eGFP+細胞、および接着性細胞に付着した多数のコロニーを形成する小さく丸い非接着性細胞の両方が検出された。非接着性および接着性画分を別々に回収し、10ng/mLのVEGFおよびbFGFを添加した10%FCS含有培地で7日間培養した。接着性細胞はvWFについて染色陽性で、ECMに播種されたとき血管を形成し、a-LDLを取り込むことができ、内皮の性質を示した。非接着性細胞の5〜50%がヒト特異的GlyAおよびHLA-クラスIについてフローサイトメトリーによって染色陽性であった。Gly-A+/HLAクラスI+細胞をFACSによって選択した。ライト-ギムザ染色で、これらの細胞は原始赤芽球の特徴的形態および染色パターンを示した。細胞は免疫ペルオキシダーゼでベンジジン+およびヒトH+であった。RT-PCRでこれらの細胞はヒト特異的Hb-eを発現したが、しかしHb-aは発現しなかった。
【０１５０】
20%FCSおよびEPOを含むメチルセルロース分析に再播種したとき、10日後に小さい赤芽球コロニーがみられ、これらのコロニーの100%がヒト特異的GlyAおよびHbについて染色陽性であった。MASCの選択はBMからのCD45+およびGlyA+細胞の除去に依存し、そして培養MASCはCD45-およびGlyA-でありFACSおよびCDNAアレイ分析の両方を用いて常に検査されているため、MASCへの造血細胞の混入は非常に可能性が低い。
【実施例８】
【０１５１】
細胞の胚盤胞注射後の、複数の器官のキメラによって示されたMASCの多能性性質のin vivoの証拠
これらの細胞の治療への応用に重要なのは、MASCの増殖して適当な細胞型にin vivoで分化する能力である。これまで、体内で組織および器官の群全体に寄与する能力のある唯一の細胞はES細胞である。MASCがES細胞の完全な能力を示すことができるかどうか分析するため、MASCを初期胚盤胞に導入してその子孫細胞の運命を観察することによって、各種組織の形成への寄与を判定するため分析した。
【０１５２】
MASCはβ-ガラクトシダーゼ（β-gal）遺伝子について遺伝子導入したROSA26マウスの骨髄から作成し（Rafii, S., et al. 1994, Blood 84: 10-13）、実施例1に記載の通り拡大した。55〜65PD後に得られた１または10〜12個のROSA26 MASCを88および40個の3.5日目のC57BL/6胚盤胞にそれぞれ微量注入した。胚盤胞（8個/母体）を16匹の仮母に移植し、マウスを表5に示す通り発生および出生させた。
【表５】
2004529621.tif 000006
【０１５３】
７匹の仮母が出産し、この期間の他の研究でみられる出産率と合致した。一腹当たりの個体数は1〜8の間で変動し、合計37匹であった。微量注入した胚盤胞から生まれた個体は正常個体と同様の大きさで、明白な異常は示さなかった。
【０１５４】
4週間後、尾を切断して、NEOについてQ-PCRによってβ-gal/NEO導入遺伝子含有細胞の尾への寄与を評価することで、キメラ現象について動物を評価した。キメラ現象のパーセントは、試験検体中のNEOコピー数を、ROSA26マウス由来の組織中のコピー数と、取扱説明書に従って比較することによって測定した（7700 ABI PRISM Detector Software 1.6）。10〜12個のMASCが注入された胚盤胞由来のマウスの70%、および1個のMASCが微量注入された胚盤胞由来のマウスの50%でキメラ現象を検出することができた（図5）。キメラ現象の程度は0.1%〜＞45%の幅に分布した。6〜20週間後、動物を屠殺した。一部のマウスを液体窒素で凍結して記載の通りに薄切片を切断した。全身マウス切片はX-Galで染色した。その後、各切片を完全に含むデジタル画像1000組を集め、個々の全身マウス切片の合成画像を生成した。単一のMASCが注入された胚盤胞に由来する代表的な非キメラ個体（NEOについてのQ-PCRによって）では、X-Gal染色は見られなかった。対照的に、その個体は尾切断分析によるNEOについてのR-PCRによると45%キメラであり、単一のROSA26由来MASCがすべての体細胞組織に寄与していた。
【０１５５】
他の個体については、複数の器官を採取して、MASC由来細胞の存在に関してX-GAL染色、抗β-gal-FITC抗体を用いた染色、およびNEOについてのQ-PCRによって分析した。NEO+細胞を尾切断部に有した個体は、X-GAL染色および抗β-gal-FITC抗体を用いた染色によって示された通り、ROSA26由来MASCが脳、網膜、肺、心筋および骨格筋、肝臓、腸、腎臓、脾臓、BM、血液、および皮膚を含むすべての組織に寄与していた。
【０１５６】
ROSA26 MASCを微量注入された胚盤胞から生じた個体では、キメラ現象はX-GAL染色および抗β-gal染色によって検出した。β-gal+細胞は、組み込まれた組織に典型的なマーカーを発現した。中枢神経系でNF200およびGFAPについて、また骨格筋でジストロフィンについて、β-gal+細胞は抗β-gal+FITCおよび抗NF200、またはGFAPおよびTOPRO3と同時染色した（倍率20倍で観察）。肺組織は肺胞および気管支で抗β-gal-FITCおよびpan-CKについて染色された（またTOPRO3も）（倍率20倍で観察）。骨格筋は抗β-gal-FITC、ジストロフィン-PEおよびTOPRO3で染色され、倍率20倍で観察された。心臓は抗β-gal-FITC、心トロポニン-I-Cy3およびTOPRO3で染色され、倍率20倍で観察された。肝臓は抗β-gal-FITCおよびpan-CK-PEおよびTOPRO3で染色された（倍率40倍および10倍で観察した）。腸は抗β-gal-FITC、pan-CK-PEおよびTOPRO3で染色され、倍率20倍で観察した。腎臓は抗β-gal-FITCで染色され（糸球体、尿細管）、倍率20倍で観察された。骨髄染色は抗β-gal-FITCおよびCD45-PE、GR1-PEおよびMAC1-PEについて観察された。脾臓染色は抗β-gal-FITCおよびCD45-PE、CD3-PEおよびCD19-PEについて観察された。NEOについてQ-PCRを用いて推定した定着のレベルはX-GALおよび抗β-gal-FITC染色によって推定されたレベルと一致した。
【０１５７】
要約
これらのデータは、BM由来の単一MASCが発生中のマウスに一体化し、さまざまな運命の細胞を生じ、マウスの３つの胚葉すべての組織および器官の生成に寄与することを初めて実証する。すべての生きた個体は、キメラ現象の程度にかかわらず、盛況な機能する期間を有したので、これらの試験はまた、MASCはin vivoで３つの胚葉の機能する細胞に分化することができることも示唆する。胚盤胞に注入されたときまたは生後に注入されたとき、MASCが生殖細胞に寄与するかどうかは、まだ試験されていない。
【実施例９】
【０１５８】
血管内皮前駆細胞の起源
血管芽細胞と呼ばれる原始内皮前駆細胞が内皮細胞に分化し凝集して一次毛管網となるin situ 分化である脈管形成は、胚発生中の脈管系の発達を担っている（Hirashima et al, 1999）。対照的に、既存の血管から発芽する過程による新しい血管の形成と定義される血管新生は、発生中と出生後生活の両方に起こる（Holash et al, 1999；Yang et al., 2001）。最近まで、出生後生活における血管形成は、既存の血管からの内皮細胞の発芽に媒介されると考えられていた。しかし、近年の研究は、内皮「幹細胞」が成体生活まで持続し、そこで新しい血管の形成に寄与する可能性があることを示唆していて（Peichev et al, 2000；Lin et al, 2000；Gehling et al., 2000；Asahara et al., 1997；Shi et al, 1998）、成体における血管新生は発生中のように少なくとも部分的に脈管形成の過程に依存することを示唆する。内皮細胞の前駆細胞はBMおよび末梢血から単離されている（Peichev et al., 2000；Watt et al., 1995）。これらの血管内皮前駆細胞の個体発生は未知である。
【０１５９】
発生中に、内皮細胞は中胚葉に由来する。VEGF受容体2であるFlk1は、大動脈−生殖隆起−中腎領域（Medvinsky et al., 1996；Fong et al., 1999；Peault, 1996）および胎児肝臓（Fong et al., 1999）にみられる両能性の幹細胞である血管芽細胞を特徴づけ、そして胚様体の血管芽細胞への決定はFlk1の発現を伴う（Ghoi et al., 1998；Choi, 1998）。血管芽細胞が成体生活に持続するかどうかは不明であり、HSCおよび血管内皮前駆細胞だけが記載されている。血管芽細胞のように、血管内皮前駆細胞はFlk1を発現し（Peichev et al., 2000）、一つの論文はHSCが出生後生活においてFlk1を発現することを示唆した（Ziegler et al., 1999）。発生の間、血管芽細胞の内皮系統への決定は、VE-カドヘリン、CD31、そして少し後にCD34の連続的発現によって特徴づけられる（Nishikawa et al, 1998；Yamashita et al, 2000）。出生後生活において、血管内皮前駆細胞はBMおよび血液から、AC133、Flk1、CD34に対する抗体、およびH1P12抗体を用いて選択されている（Peichev et al, 2000；Lin et al, 2000；Gehling et al, 2000）。AC133はまた、NSCs（Uchida et al, 2000）および消化管上皮細胞（Corbeil et al, 2000）を含む他の細胞にも見つかっている。成熟内皮への分化に当たって、AC133受容体は速やかに失われる（Peichev et al, 2000；Gehling et al, 2000）。循環内皮細胞上にみられる別の受容体は、ムチンであるMUC18で、H1P12抗体によって認識される（Lin et al, 2000）。MUC18は血管内皮前駆細胞の内皮への分化時に失われる。CD34は血管内皮前駆細胞ならびに造血前駆細胞（Peichev et al., 2000； Baumhueter et al, 1994）および肝円形細胞（Crosby et al, 2001 ）で発現されている。この抗原もまた血管内皮前駆細胞の内皮への分化時に失われる。大部分の成熟内皮細胞は、微小血管内皮細胞を除き、もうCD34を発現しない。
【０１６０】
in vivoで定着してMASCからの血管新生に寄与する多数の内皮細胞のin vitro生成は、ここで初めて記載される。MASCは培養して＞80 PDの間拡大することができ、MASCから生じた内皮細胞は少なくともさらに20 PD拡大することができる。MASCはしたがって臨床治療のための内皮細胞の理想的な起源となりうる。さらに、MASCは個体発生上「血管芽細胞」より成熟していないため、このモデルは内皮の決定および分化を特徴づけるのに有用と思われる。
【０１６１】
hMASCは内皮の表現型の特徴を有する細胞に分化する
MASCは実施例3に記載の通り採取し培養した。内皮分化を誘導するため、MASCを2x104細胞/cm2でFN-被覆ウェル中に、EGFおよびPDGF-BBを含まないが10ng/mL VEGFを含む無血清拡大培地に再播種した。一部、PCSを添加した。培養は4〜5日間毎に培地交換して維持した。ある場合には、細胞は９日後に1:4希釈で同一の培養条件下で20＋ PDの間継代培養した。
【０１６２】
MASCからの内皮分化をより広範囲に定義するため、3〜18日後に細胞のFACSおよび免疫組織化学的分析を実施した。未分化MASC上のFlk1およびFlt1の発現は低く、９日目に最大で、18日目まで持続した。BMまたは血管内皮前駆細胞に存在するVE-カドヘリン（Peichev et al., 2000；Nishikawa et al., 1998）は未分化MASCでは発現されておらず、しかしVEGFを加えた培養の３日後に発現し18日目まで持続した。MASCは内皮ならびに造血前駆細胞に見出されるAC133を低レベルで発現したが（Peichev et al., 2000；Gehling et al., 2000）、しかし３日後にはもう検出不能であった。内皮および造血前駆細胞に存在するCD34（Peichev et al., 2000；Asahara et al., 1997；Rafii et al., 30 1994）は、未分化MASCには存在せず（図4A）しかし９日目から18日目まで発現された。抗体H1P12によって認識されるムチンであるMUC18は、血管内皮前駆細胞を血液から生成するのに用いられている（Lin et al., 2000）。MASCはH1P12では染色されなかったが、VEGFで9日間処理したMASCは染色陽性であり、しかし発現は18日目までに失われた。
【０１６３】
内皮特異的インテグリンであるαvβ3（Eliceiri et al, 2000）は、未分化MASCには存在せず、一方αvβ5は非常に低いレベルで発現されていた。インテグリンの発現は分化の間次第に増加し、14日目までに最大となった（図5）。血管新生に重要であるが内皮細胞分化には重要でないチロシンキナーゼ受容体TieおよびTek（Partanen et al, 1999）はMASCでは発現していなかった。Tekの発現は3日後、Tieは7日後にみられた（図6）。MASCはまたvWFも発現していなかったが、vWFは9日目以降発現された（Rosenberg et al, 1998；Wagner et al, 1982）。CD31、CD36、CD62-Pを含む他の成熟内皮マーカー（Tedder et al, 1995）（図7）、および接着結合タンパク質ZO-1 、p-カテニン、そしてy-カテニン（図5）が14日後検出された（Li et al, 1990；Van Rijen et al,.1997；Petzelbauer et al, 2000）。VCAMまたはCD62-Eは、下記のように内皮がIL-1αで活性化されない限り、分化のどの時点でも高いレベルでは発現されなかった。内皮への分化は、β2-ミクログロブリンおよび、HLA-クラスIIでなく低レベルのHLA-クラスI抗原の獲得を伴った。
【０１６４】
より高い濃度のFCSは、骨芽細胞、軟骨芽細胞および脂肪細胞にだけ分化する古典的MSCの生育を支持するため（Reyes et al, 2001； Pittenger et al, 1999）、内皮分化は、2%PCSまたはそれ以下を用いて拡大されたMASCからだけ得られるが、10%PCSを用いて拡大したときには得られないことは以前に報告されている（Reyes et al, 2001）。FCSが分化の最初の7日間に存在したとき、内皮分化は誘導することができない。非密集MASC（＜lx104細胞/cm2）が分化するよう誘導されたとき、内皮はみられなかった。MASCがVEGFへの曝露の9日後に、10ng/mLVEGFを含む無血清培地を用いて継代培養されたとき、細胞は少なくともさらに12PDを経ることができた。10%FCSおよび10ng/mLのVEGFが継代培養用の培地に添加されたとき、MASC由来内皮細胞は、MASCの経過したPDの数に関わらず、さらに20＋PDを経ることができた。
【０１６５】
未分化のMASCと比較して、内皮細胞はより大きく、核/細胞質比はより低かった。結果はMASCが20（n＝30）または50＋（n＝25）PDを経た培養から用いられたときと同様であった。
【０１６６】
MASC由来内皮の機能的特徴
hMASCのVEGFに誘導されて分化した子孫細胞が内皮細胞の機能的特徴を有するかどうか試験した。内皮細胞は、VEGFならびにVEGF受容体Flk1および血管新生受容体Tie-1およびTekの発現をアップレギュレートすることによって低酸素に応答する（Kourembanas et al, 1998）。hMASCおよびhMASC由来内皮細胞を、37℃で、20%または10%O2中で24時間インキュベートした。細胞をFlk1、Flt1、Tekに対する抗体およびIgG対照を用いて染色し、2%パラホルムアルデヒドで固定し、フローサイトメトリーで分析した。さらに、培養上清中のVEGF濃度をELISAキット（AP biotech, Piscataway, NJ）を用いて測定した。MASC由来内皮細胞および未分化のMASCは低酸素条件に24時間曝露された。
【０１６７】
Flk1およびTekの発現は、低酸素に曝露されたMASC由来内皮細胞で顕著に増加した（図7）一方、これらの受容体のレベルは未分化のMASCでは変化しなかった。さらに、低酸素内皮培養の培養上清中のVEGFレベルは4倍に増加した（図7B）一方、低酸素に曝露されたMASC培養中のVEGFレベルは変化しなかった。
【０１６８】
次に、MASC由来内皮細胞がHLA-抗原および細胞接着リガンドの発現を、たとえばIL-laのような炎症性サイトカインに応じてアップレギュレートするかどうか試験した（Meager, 1999；Steeber et al, 2001）。106個のMASCおよびMASC由来内皮細胞を、75ng/mlのIL-1a（R&DSystems）と共に無血清培地中で24時間インキュベートした。細胞を2%パラホルムアルデヒドで固定し、HLA-クラスI、クラスII、β2-ミクログロブリン、vWF、CD31、VCAM、CD62EおよびCD62Pに対する抗体、または対照抗体で染色し、FACScalibur（BectonDickinson）を用いて分析した。
【０１６９】
顕著に上昇したレベルのHLA-クラスIおよびII、β2-ミクログロブリン、VCAM、ECAM、CD62E、CD62PがFACS分析によって内皮細胞で見られた（図7C）。
【０１７０】
対照的に、未分化のMASCではFlkのアップレギュレーションのみがみられた。
【０１７１】
内皮細胞の別の特徴は、LDLを取り込むことである（Steinberg et al, 1985）これはVEGFを用いて分化するよう誘導されたMASCを2, 3, 5, 7, 9, 12および15および21、LDL-dil-acilと共にインキュベートして試験した。dil-Ac-LDL染色キットはBiomedical Technologies（Stoughton, MA）から購入した。分析は取扱説明書のように実施した。細胞は抗Tek、-Tie-1または-vWF抗体のいずれかを用いて同時標識した。3日後、Tekの発現が検出されたがa-LDLの取り込みは検出されなかった。7日後、細胞はTie-1を発現したが、a-LDLの顕著な量を取り込むことはなかった。しかし、９日目のvWFの発現の獲得はaLDLの取り込みを伴った（図6B）。
【０１７２】
内皮細胞は、Weibel Pallade体に貯蔵され内皮が活性化されるときin vivoで放出されるvWFを含む（Wagner et al, 1982）。これは細胞をヒスタミンで刺激することによってin vitroで誘導することができ（Rosenberg et al, 1998）、そのことはまた結果として細胞の細胞内骨格の活性化を生じる（Vischer et al, 2000）。MASC由来内皮細胞をFN被覆チャンバースライドに高密度で（104細胞/cm2）播種した。24時間後、細胞を10μMヒスタミン（Sigma）を用いて無血清培地中で25分間処理し、vWFおよびミオシンに対する抗体で染色した。未処理および処理細胞をメタノールで-20℃にて2分間固定し、vWFおよびミオシンに対する抗体で染色し、蛍光および／または共焦点顕微鏡法を用いて分析した。vWFは未処理内皮細胞の細胞質全体に存在した。ヒスタミン処理した内皮細胞の細胞質は顕著により少ない量のvWFを含み、vWFは核周囲領域でだけ検出可能であって、小胞体に存在するvWFを示している可能性が高かった（図6A）。ヒスタミン処理によって、ギャップ結合の拡大と、細胞骨格のミオシンストレスファイバーの数が増加する変化が生じた（図6A）。
【０１７３】
最後に、Matrigelまたは細胞外マトリクス（ECM）に播種されたとき「血管」を形成することができるかどうか判定するため内皮細胞を試験した（Haralabopoulos et al, 1997）。ウェル当たり0.5mlの細胞外マトリクス（Sigma）を24穴プレートに加え、３時間37℃でインキュベートした。ウェル当たり104個のMASCおよびMASC由来内皮細胞を0.5 mlのVEGF添加無血清培地に加え、37℃でインキュベートした。図6Cに示す通り、MASC由来内皮細胞のECM上での培養の結果、6時間以内に血管形成が起こった。
【０１７４】
hMASC由来内皮細胞が腫瘍-血管新生にin vivoで寄与する
NOD-SCIDマウスの繁殖コロニーをJackson Laboratories（Bar Harbor, ME）から入手したマウスから確立した。マウスは特定病原体フリーの条件に保ち、酸性水とオートクレーブ処理飼料とで維持した。水100ml当たりトリメトプリム60mgおよびスルファメトキサゾール300mg（Hoffmann-La Roche Inc.,Nutley, NJ）を週二回与えた。
【０１７５】
3個のルイス肺癌球状体を肩の皮下に移植した。腫瘍の移植の3および5日後、マウスに0.25x106個のヒトMASC由来内皮細胞またはヒト包皮繊維芽細胞を尾静脈注射によって注射した。14日後、動物を屠殺し、腫瘍を取り出してOTC化合物（Santura Finetek USA Inc, Torrance, CA）を用いて−80℃にて低温保存した。さらに、マウスを標識するために切目を入れた耳もまた切除してOTC化合物）を用いて−80℃にて低温保存した。組織の5μｍ厚の切片をスライドガラスに乗せ、下記の通り固定して染色した。
【０１７６】
ヒトおよびマウス内皮細胞の両方を認識する、抗ヒト-β2-ミクログロブリンまたはHLA-クラスI抗体を、抗マウス-抗CD31抗体と抗vWFか抗Tekか抗Tie-1抗体と組み合わせて用い、腫瘍それぞれの切片5枚について計数した分枝の長さと数のコンピュータを用いた分析は、マウスの中のヒトMASC由来内皮細胞を受けた腫瘍は、対照マウスの腫瘍より1.45±0.04倍大きい血管質量を有したことを示した。これらの最初の試験は、腫瘍中の一部の血管は、vWFかTieかTekのいずれかについて同時標識されたがマウス-CD31については標識されない抗ヒト-β2-ミクログロブリンHLA-クラスI陽性細胞を含んだことを示し、ヒトMASC由来内皮細胞が腫瘍血管新生にin vivoで寄与したことを示した。
【０１７７】
寄与の程度をより良く定めるため、連続した5μｍスライドを得て、抗ヒト-β2-ミクログロブリン-FITCまたは抗マウス-CD31-Cy5のいずれか、および抗vWF-Cy3を用いた別の方法で染色した。すべてスライドを共焦点顕微鏡法で検査した。異なる図をその後集めて3次元とし、腫瘍血管へのヒトおよびマウス内皮細胞の相対的な寄与を測定した。ヒトMASC由来内皮細胞を注射した動物から得られた腫瘍を分析したとき、腫瘍血管の約35%が抗ヒト-β2-ミクログロブリンおよびvWFについて陽性であり、一方、内皮細胞の約40%が抗マウスCD31抗体について染色陽性であった（図8A-G）。内皮細胞を受けなかったかまたはヒト 繊維芽細胞を受けた動物中の腫瘍は、抗β2-ミクログロブリンまたは抗HLA-クラス-I抗体で陽性に染色される内皮細胞を含まなかった。
【０１７８】
MASC由来内皮細胞がまた創傷治癒血管新生に寄与するかどうかも分析した。マウスを標識するために切目を入れた耳の領域をその後調べた。耳の傷における血管新生は、一部はMASC由来内皮細胞に由来した。腫瘍中の血管と同様に、創傷の治癒した皮膚に存在するヒト内皮細胞の割合は30〜45%であった（図9H）。
【０１７９】
未分化のhMASCは内皮細胞にin vivoで分化する
106個の未分化MASCを6週齢のNOD-SCIDマウスの静脈に注射した。動物は12週間飼育してその後屠殺した。１個体において、胸腺腫瘍が検出されたが、これは老齢NOD-SCIDマウスに普通に見られる（Prochazka et al., 1992）。胸腺を切除してOTC化合物中に-80℃にて低温保存した。組織の10um厚の切片をスライドグラスに乗せ、下記の通り固定し染色した。
【０１８０】
すべての造血細胞はマウスCD45について染色陽性であったがヒトCD45についてはそうでなく、これらがマウス起源であったことを示す。腫瘍はその後抗ヒトβ2-ミクログロブリン-FITC抗体とヒトおよびマウス内皮細胞の両方を認識する抗vWF-Cy3抗体とを用いて染色した。脈管構造の約12%がhMASC由来であった（図9I）。ヒトβ2-ミクログロブリンが血管構造の外側で検出されなかったため、この造血要素はヒト起源でないことをこれらの研究はさらに確認した。
【０１８１】
免疫組織化学とデータ分析
in vitro 培養: 未分化のMASCまたは内皮に分化するよう2-18日間誘導されたMASCをFN被覆chamber スライドに播種し、2% パラホルムアルデヒド （Sigma）を用いて4分間、室温で固定した。細胞骨格染色については、チャンバースライドをメタノールを用いて2分間、-20℃で固定した。細胞内リガンドについては、細胞を0.1 Triton-X（Sigma）を用いて10分間透過処理し、一次抗体（抗体）、およびFITC、PEまたはCy5結合抗マウス-、ヤギ-またはウサギ-IgG抗体と連続的に各30時間インキュベートした。それぞれの工程の間に、スライドをPBS＋1%BSAで洗浄した。CD31、CD34、CD36、CD44、HLA-クラスIおよびII、β2-ミクログロブリンに対する一次抗体は1:50希釈で使用した。VCAM、ICAM、VE-カドヘリン、セレクチン、HIP12、ZO-1、コネキシン-40、コネキシン-43、MUC18、avb3、avb5、B-カテニンおよびy-カテニン（Chemicon）およびTek、Tie、vWF（Santa Cruz）に対する一次抗体は、1:50希釈で使用した。ストレスファイバーsはミオシンに対する抗体（軽鎖20kD、クローンno.MY-21；1:200）を用いて染色した。二次抗体はSigmaから購入し、下記の希釈度で使用した:抗ヤギIgG-Cy-3（1:40）、抗ヤギIgG-FITC（1:160）、抗マウスIgG-Cy-3（1:150）そして抗マウスIgG-FITC（1:320）、抗ウサギ-FITC（1:160）および抗ウサギ-Cy-3（1:30）。TOPRO-3はSigmaから購入した。細胞は、蛍光顕微鏡法によってZeiss Axiovert顕微鏡（Carl Zeiss, Inc., Thomwood, NY）を用いて、また共焦点蛍光顕微鏡法によって共焦点1024顕微鏡（Olympus AX70, 5 Olympus Optical Co. LTD, Japan）を用いて検査した。
【０１８２】
腫瘍または正常組織:組織はクリオスタットを用いて5〜10μm厚の切片に切断した。切片はアセトンを用いて10分間、室温で固定し、0.1 Triton Xで5分間透過処理した。スライドをvWF、TieまたはTekについて一夜インキュベートし、次いでFITC、PEまたはCy5結合抗マウス-、ヤギ-またはウサギ-IgG抗体を用いた二次インキュベーション、そしてマウスCD45-PEまたはヒトCD45-FITC、ヒトβ2-ミクログロブリン-FITC、マウスCD31-FITCまたはTOPRO-3に対する抗体を用いた連続インキュベーションを60分間行った。各工程の間に、スライドをPBS＋1%BSAで洗浄した。スライドは、蛍光顕微鏡法によってZeiss Axiovert顕微鏡を用いて、また共焦点蛍光顕微鏡法によって共焦点1024顕微鏡を用いて検査した。3次元再構成は、5μm厚のスライドからの連続0.5μm共焦点写真の、合計350枚の写真の集合から成った。スライドはvWF-Cy3を用いて染色し、またはヒトβ2-ミクログロブリン-FITCあるいはマウスCD31-FITCを用いて二重染色した。各スライドからの写真はMetamorphソフトウェア（Universal Imaging Corp）で次のスライドと並べ、3次元再構成は3D Doctorソフトウェア（Able software Corp）で行った。
【０１８３】
ヒト（緑）およびマウス内皮細胞（青で彩色）の3次元の血管への相対的な寄与量を各色の立方画素として計算した。各色の面積も、寄与の正確な割合を得るため、スライドを通じた４つの血管について平方画素として計算した。４つの異なる主要の別のスライドについても各色の面積を計算した。
【０１８４】
要約
この研究の中心となる発見は、BMからMSCと共に精製される細胞は、in vitroで成熟内皮細胞と識別できない機能上の特徴を有する内皮細胞に分化する能力を持つことである。そのような内皮細胞は創傷治癒および腫瘍形成の状況下で血管新生にin vivoで寄与すること、また未分化のMASCはin vivoの局所的な信号に応答して腫瘍血管新生に寄与する内皮細胞に分化できることも示されている。
【０１８５】
内皮に分化する同じ細胞が他の中胚葉性細胞型、また非中胚葉性起源の細胞にも分化するように、ここで定義される細胞は血管芽細胞に先行し、および個体発生における血管芽細胞にさえ先行する。
【０１８６】
MASCは内皮細胞のマーカーを発現する細胞に分化することも示されているが、VEGFが内皮細胞のようなMASC機能を誘導することが証明された。内皮細胞は動脈壁内の輸送中にリポタンパク質を修飾する（Adams et al, 2000）。内皮細胞は、血流力学的な力、またはたとえばヒスタミンのような血管作用薬に曝露されると幅が広がる細胞間接着を通しての透過障壁を維持する（Rosenberg et al, 1998； Li et al, 1990；Van Rijen et al, 1997；Vischer et al, 2000）。内皮細胞はたとえばvWF、組織因子およびプラスミノーゲン活性化因子阻害因子といった出血を止めるための凝固前期分子を放出し（Vischer et al, 2000）、炎症に反応して接着分子の発現レベルを変化させることによって白血球が出て行くのを調節する（Meager, 1999；Steeber et al, 2001）。内皮はまた、血管密度を増大させることを目的にVEGFを産生しVEGF受容体を発現することによって低酸素に反応する（Kourembanas et al, 1998）。したがって、MASCから生じた内皮細胞が、in vitroで試験したとき、これらのすべての仕事を行うことができることが実証されている。
【０１８７】
最後に、in vitroで生じたMASC由来内皮細胞が、in vivoでの創傷治癒と同様に、腫瘍部位に移動して腫瘍血管新生に寄与することによって血管新生刺激に応答することが証明されている。この発見は、MASCから生じた内皮細胞が成熟内皮のすべての機能上の特徴を有することを確認する。内皮細胞が腫瘍血管新生および血管新生に寄与する程度は35〜45%で、内皮細胞の他の起源について記載されているのと同様のレベルである（Conway et al, 2001 ；Ribatti et al, 2001）。さらに、in vivoで腫瘍の微環境にもたらされた血管新生刺激は、MASCを腫瘍床へ集め、腫瘍の脈管構造に寄与する内皮細胞への分化を誘導するのに十分であることがわかった。これらの試験はしたがって、骨髄に存在する細胞が、脈管形成と類似の過程において、新しい血管形成に寄与できることを示した他のグループによって報告されている研究を拡張し（Peichev et al, 2000；Lin et al, 2000；Gehling et al, 2000；Asahara et al, 1997）、この過程を担う前駆細胞は同定されている。これは、出生後BMに存在する細胞を内皮細胞のごく初期の前駆細胞と同定する、我々の知る限り最初の報告である。
【実施例１０】
【０１８８】
神経細胞の誘導
中胚葉性細胞型の他に、機能する神経細胞、ならびに星状細胞および稀突起膠細胞にex vivoで分化することができるかどうか判定するために、単一の成体BM由来hMASCまたはmMASCを試験した。前に実施例1および3にそれぞれ記載した通り、mMASCおよびhMASCを選択し培養して拡大した。ヒト神経前駆細胞（hNPC）はClonetics（San Diego, CA）から購入した。hNPCを取扱説明書のように培養し分化させた。
【０１８９】
電気生理学:標準の全細胞パッチクランプ記録を用いてMASC由来神経細胞の生理学的性質を検討した。電位固定および電流固定記録を、Dagan3911拡張ユニットで改装したDagan 3900Aパッチクランプアンプ（Dagan Corporation, Minneapolis）を用いて得た。ホウケイ酸ガラス製のパッチピペットをナリシゲ社ピペット製作器（型番PP-83）で引き延ばし、ナリシゲ社マイクロフォージ（型番MF-83）を用いて研磨した。パッチピペットを、（単位mM）142.0KF、7.0Na2S04、3.0MgS04、1.0CaCl2、5.0HEPES、ll.0EGTA、1.0グルタチオン、2.0グルコース、1.0ATP（マグネシウム塩）、0.5GTP（ナトリウム塩）を含む細胞内液で満たした。大部分の記録について、蛍光顕微鏡法を用いて全細胞パッチ記録の設定が達成されていることを目視で確認するために、蛍光色素5,6-カルボキシフルオレセイン（0.5mm； Eastman Kodak Chemicals）もピペット溶液に添加した。ピペット抵抗は11〜24MΩの幅であった。記録用標準細胞外液は以下を含む（単位mM）: 155NaCl、5.0KC1、CaCl2、1.0MgCl2、10HEPES、グルコース。一部の実験については1μMのTTXを標準対照溶液に添加した。記録用細胞内液および細胞外液のpHは、NaOHを用いてそれぞれ7.4と7.8に調整した。すべての試薬はSigmaから入手した。実験の実施とデータ回収および保存にはPClamp 8.0（Axon Instruments, Foster City）を用いた。示したデータは8.4mVの液相界面電位について補正し、これはJPCALCソフトウェアパッケージを用いて計算した。データのオフライン分析と画像表示はClamp fit 8.0（Axon Instruments, Foster City）およびPrism（Graphpad, San Diego）を用いて構成した。
【０１９０】
形質導入:レトロウイルス上清は、オランダ、ロッテルダム大学のDr. G.Wagemakerより提供されたMFG-eGFP含有PG13細胞を（Bierhuizen et al., 1997）MASC拡大培地と48時間インキュベートして作成し、濾過して-80℃で凍結した。MASCをレトロウイルス上清および8μg/mlプロタミン（Sigma）と6時間インキュベートした。これを24時間後に繰り返した。形質導入効率はFACSによって分析した。
【０１９１】
5遺伝子マイクロアレイ分析:RNAをhMASC、bFGFまたはFGF-8b＋EGF誘導細胞からRNeasy miniキット（Qiagene）を用いて単離し、DNase I（Promega）を用いて37℃にて1時間消化し、RNeasyを用いて再精製した。取扱説明書に従って作成した[32P]dATP標識CDNAプローブをヒトNeurobiology Atlas Array（Clonetech # 7736- 1 , Clonetech Laboratories, Palo Alto, CA, USA）と68℃にて18〜20時間ハイブリッド形成させ、その後、2xSSC、1%SDSで68℃にて各30分間4回、0.lxSSC、0.5%SDSで68℃にて30分間、そして１回2xSSCで室温にて5分間洗浄した。アレイはホスホイメージャースクリーンスキャナ（Molecular Dynamics, Storm 860）で読み取り、Atlas Image 1.0（Clontech）を用いて分析した。未分化の細胞と分化した細胞の間の２倍より大きい差を有意とみなした。
【０１９２】
レトロウイルス挿入配列のPCR分析:PCRを用いて、ヒトゲノムDNA中のMFGベクターの3' LTRから隣接配列3'を増幅した。106個のMASCまたは内皮か筋芽細胞か神経外胚葉に分化した子孫からDNAを、細胞から標準法によって調製した。300ngのゲノムDNAをAscIで消化し、splinkeretteリンカーを5'末端に結合させた（Devon R. S. et al., 1995）。splinkeretteリンカーに用いた２種のオリゴヌクレオチドは下記の通りであった: aattTAGCGGCCGCTTGAATTtttttttgcaaaaa、（ヘアピンループ形成配列は小文字で、大文字は第二のsplinkeretteオリゴヌクレオチドの相補部分である）、およびagtgtgagtcacagtagtctcgcgttcgAATTAAGCGGCCGCTA、（下線の配列はPCRおよびRT工程で用いたリンカー特異的プライマー（LSプライマー）の配列でもある）。eGFP遺伝子中の配列を認識する5'-ビオチン-T7結合プライマー[ビオチン-ggc-cag-tga-att-gta-ata-cga-ctc-act-ata-ggc-tgg-CAC-ATG-GTC-CTG-CTG-GAG-TTC-GTG-AC；下線部は効率的なin vitro転写に必要な最小のプロモーター配列を示し、大文字はeGFP特異的配列である]およびLSプライマーを用いて、隣接領域を10回、Advantage2ポリメラーゼ（Clontech）を使用して増幅した。ビオチン標識増幅産物はストレプトアビジン-磁性ビーズ（ストレプトアビジン磁性粒子； Roche）を用いて捕捉し、結果として生じる産物をさらにT7RNAポリメラーゼを用いて約1,000倍に増幅し、それからDNAase1処理した。結果として生じる産物をagtgtgagtcacagtagtctcgcgttcsplinkeretteプライマーを用いてsuperscriptIIの説明書（Gibco）に従って逆転写し、続いて30回のnested PCRによって3'LTR用のプライマー[ggc caa gaa cag atg gaa cag ctg aat atg]を用いて増幅した。内皮、筋、および神経外胚葉に分化した細胞と未分化のMASC由来のヒトゲノム中の隣接配列を配列決定した。
【０１９３】
複数の分化した子孫に同一の挿入部位が存在することを実証するため、宿主隣接ゲノム中に特異的プライマーを作成した。リアルタイムPCR増幅（ABI PRISM 7700, Perkin Elmer/Applied Biosystems）を、eGFP配列と比較して隣接配列を定量するために用いた。増幅のための反応条件は下記の通りであった: 2μLのDNA溶液、1X TaqMan SYBR Green Universal Mix(Perkin Elmer/Applied Biosystems）PCR反応緩衝液を用いた最初の変性（95℃で10分間）後、二段階PCR（95℃で15秒間、60℃で60秒間）を40サイクル。使用したプライマーは下記の通りであった:クローンA16:LTRプライマー＝CCA-ATA-AAC-CCT-CTT-GCA-GTT-G；隣接配列染色体7＝TCC-TGC-CAC-CAG-AAA-TAA-CC；クローンA12染色体7配列:LTRプライマー＝GGA-GGG-TCT-CCT-CTG-AGT-GAT-T、隣接配列＝CAG-TGG-CCA-GAT-CTC-ATC-TCA-C；クローンA12染色体1配列:LTR＝GGA-GGG-TCT-CCT-CTG-AGT-GAT-T；隣接配列＝GCA-GAC-GAG-GTA-GGC-ACT-TG。隣接配列の相対量は、eGFP配列と比較して取扱説明書に従って7700 ABI PRISM検出ソフトウェア1.6を用いて計算した。
【０１９４】
神経移植:新生（生後1日目〜3日目）雄Sprague Dawleyラット（Charles River Laboratories）をこの試験に用いた。ラットは低温麻酔によって麻酔した。改良定位頭部固定器を用いて頭蓋を固定し、頭皮を反転して頭蓋を露出した。hMASCは0.25%トリプシン/EDTAを用いて採取し、2回洗浄し、PBSに再懸濁した。hMASCの生存能力は85%より大であった。リン酸 緩衝液に0.7x104細胞/μlの濃度で懸濁したhMASCの2μlの量を、Hamiltonシリンジに付けた先細ガラスマイクロピペットで、下記の座標を用いて定位固定的に脳室内に注入した（ブレグマからのmm）:AP-0.6、ML0.8、DV2.1、toothbarは-1に設定した。注射後、頭皮を縫合し仔ラットを回復させた。
【０１９５】
移植の4および12週間後、ラットを抱水クロラール（350mg/kg、i.p.）で麻酔し、断頭して脳を摘出し、粉末ドライアイス中で凍結し、-80℃で保存した。新鮮凍結脳をクリオスタットを用いて切断し、染色の直前に4%パラホルムアルデヒドで20分間固定した。切片を、2%正常ロバ血清（Jackson Immuno Labs）および0.3% triton Xを含むブロッキング/透過処理溶液を用いて１時間室温にてインキュベートした。以降の工程のために、一次および二次抗体を同じブロッキング/透過処理溶液で希釈した。一次抗体（Chemicon製マウス抗ヒト核（1:25）、抗ヒト角膜（1:25）および抗NeuN（1:200）；DAKO製ウサギ抗GFAP（1:250）、Sigma製ウサギ抗NF200（1:300）を4℃にて一夜インキュベートし、各10分間3回PBSで洗浄し、次いで二次Cy3（1:200）抗体およびFITC（1:100）抗体（すべてJackson Immuno Labs）と2時間室温でインキュベートした。スライドはZeiss Axiovert顕微鏡を用いた蛍光顕微鏡法および共焦点1024顕微鏡を用いた共焦点蛍光顕微鏡法によって検査した。
【０１９６】
hMASCはbFGFと共に培養したとき神経細胞、星状細胞および稀突起膠細胞表現型を獲得する。
神経外胚葉性分化を実施例5に記載の通りに行った。要約すると、細胞をFN被覆チャンバースライドまたは培養平板で、60%DMEM-LG、40%MCDB-201（Sigma Chemical Co, St Louis, MO）を含み1X ITS、1X LA-BSA、10-8Mデキサメタゾン、10-4Mアスコルビン酸-2-リン酸（AA）（すべてSigma）、100Uペニシリンおよび1,000Uストレプトマイシン（Gibco）を添加した無血清培地を用いて培養した。一部の培養には、我々はl00ng/mLのbFGFを添加した一方、別の培養には10ng/mLのEOF＋10ng/mLのFGF-8bを添加した（すべてR&D Systems）。細胞は継代培養しなかったが、培地は3〜5日間毎に交換した。
【０１９７】
bFGFと共に再播種してから2週間後、表6に示す通り、細胞の26±4%が星状細胞（GFAP+）、28±3%が稀突起膠細胞（MBP+）そして46±5%が神経細胞（NF200+）マーカーを発現した。
【表６】
2004529621.tif 000007
【０１９８】
hMASCをより高い細胞密度（2x104細胞/cm2）で再播種して分化を誘導したとき神経外胚葉性の表現型を有する細胞は検出されず、細胞-細胞相互作用がbFGF誘導性の 神経外胚葉性分化を阻害することを示した。
【０１９９】
20または60PDを経たhMASCを用いて分化を誘導したとき、星状細胞様、稀突起膠細胞様および神経細胞様細胞の分布に差は無かった。しかし、20 PDの間拡大したhMASCをbFGFと共に培養したとき、細胞の＞50%が死亡した一方、＞30 PD の間拡大したhMASC培養の＞70%が生存して、神経細胞様、星状細胞様または稀突起膠細胞様の表現型を獲得した。このことは、すべてのhMASCを神経の特徴を獲得するように誘導することはできないが、in vitroで長期間生存するhMASCの部分集団が神経細胞の分化を担っている可能性があることを示唆する。hMASCの核型は培養期間にかかわらず正常であることが示されている（Reyes et al, 2001）。hMASCの神経外胚葉性様細胞への分化はしたがって、長期間の培養後のMASCの変質が原因である可能性は低い。
【０２００】
大部分の星状細胞様および稀突起膠細胞様細胞は3週間後に死亡した。神経細胞様細胞の漸進的な成熟が培養期間を通じてみられた。1週間後、bFGF処理hMASCはNeuroD、ネスチン、ポリシアル酸付加型神経細胞接着分子（PSA-NCAM）、およびチューブリン-β-III（TuJI）について染色陽性となった（表6）。2週間後、bFGF処理細胞はNF68、-160、および-200、NSE、MAP2-AB、そしてTauについて染色陽性となった。bFGF誘導性神経細胞はGABA作用性、セロトニン作用性またはドーパミン作用性神経細胞のマーカーを発現しなかったが、グルタミン酸およびグルタミン酸受容体-5、-6および-7とN-メチル-D-アスパラギン酸（NMDA）受容体、およびNa+ゲート電位チャンネルを発現した。
【０２０１】
神経外胚葉性分化のさらなる確認は、14日間、100ng/mLのbFGFを用いて分化を誘導された2つの独立したhMASC集団のCDNAアレイ分析から得られた。ネスチン、otx 1
およびotx2の発現レベルは免疫組織化学的特徴づけと一致し、mRNAの＞2倍の上昇がネスチン、GFAP、グルタミン酸-受容体4、5、および6、そしてグルタミン酸、およびいくつかのナトリウムゲート電位チャンネルについて検出されたが、しかしTHまたはTrH mRNAレベルに上昇は見られなかった。mRNAレベルの＞2倍の上昇は、脳だけに見られる転写因子である哺乳類achaete-scute相同体1（MASH I）mRNA（Franco Del Arno et al., 1993）、およびephrin-A5 mRNA（O'Leary and Wilkinson, 1999）についても見られた。星状細胞特異的マーカーのGFAPおよびS100A5、そして稀突起膠細胞特異的マーカーのミエリン-稀突起膠細胞糖タンパク前駆体およびミエリンタンパク質ゼロ（PMZ）、ならびにハンチンチン、そして主要プリオンタンパク質前駆体mRNAが、bFGFへの曝露後、＞2倍高く発現された。2倍より大きい上昇は、いくつかのグリシン受容体、GABA受容体、ヒドロキシトリプトファン受容体-Aおよび神経細胞のアセチルコリン受容体、グリシン輸送体タンパク質、シナプトブレビンおよびシナプトソーム補助タンパク質（SNAP）25についても見られた。最後に、bFGFはBDNFおよびグリア由来神経分化誘導因子（GDNF）の発現を誘導した。
【０２０２】
hMASCのように、mMASCはbFGFと共に培養したとき神経細胞、星状細胞および稀突起膠細胞表現型を獲得する。
【０２０３】
他の種に由来するMASCを、同様の結果が得られるかどうか判定するために試験した。40-90 PDの間拡大したmMASCを、104細胞/cm2でhMASCに用いたのと同一の条件で再播種した。14日後、mMASCは星状細胞（GFAP+）、稀突起膠細胞（MBP+）および神経細胞（NF-200+、NSE+およびTau）の形態的および表現型の特徴を獲得した。NF200とGFAPまたはMBPは同一の細胞では決して見つからなかった。未分化のmMASCとは対照的に、bFGF処理mMASは顕著に大きく、神経突起が＞40μｍ延長した。
【０２０４】
神経細胞様細胞が神経細胞の機能的特徴を有するかどうか、そしてbFGF誘導性細胞が電位依存性Na+電流を示すかどうか判定するため、パッチクランプを用いた。一部の細胞はカルシウム電流を発現し、4個の細胞ではカルシウム電流に媒介されるスパイク生成の証拠があったにもかかわらず、mMASC由来神経細胞様細胞（n＝59）のどれにも、ナトリウム電流または速いスパイク生成は見られなかった。このように、ナトリウムゲート電位チャンネルmRNAおよびタンパク質の発現にもかかわらず、bFGF誘導性細胞は機能する電位依存性Na+電流を有しなかった。
【０２０５】
hMASCはEGFおよびFGF-8bと共に培養したとき、中脳ドーパミン作用性、セロトニン作用性またはおよびGABA性表現型を獲得する。
中脳後脳境界および吻側前脳に発現されるFGF-8bは、中脳および前脳のドーパミン作用性神経細胞と後脳のセロトニン作用性神経細胞の分化を誘導する（Ye et al, 1998）。In vitroでは、FGF-8bはドーパミン作用性およびセロトニン作用性神経細胞をマウスES細胞から誘導するのに用いられている（Lee et al., 2000）。
【０２０６】
20〜60PDの間拡大したhMASC（n＝8）を2x104細胞/cm2でFNに、ITSとAAと10ng/mLのFGF-8bおよび10ng/mLのEGFを含む無血清培地に再播種した。80%を超える細胞が3週間生存した。FGF-8bおよびEGFは神経細胞のマーカーについて陽性染色する細胞への分化を誘導した（図6）（7日目:PSA-NCAM、ネスチンおよびTuJI；14日目:NF-68、NF-160、NF-200；21日目:MAP2-AB、NSE、Tau、およびNa+ゲート電位チャンネル）が、稀突起膠細胞および星状細胞へは誘導しなかった。bFGFに誘導される分化についての我々の観察とは対照的に、104細胞/cm2でEGFおよびFGF-8bと共に播種した細胞は分化しなかった。2〜3週間後、細胞はGABA性（GABA+、パルブアルブミン+）、ドーパミン作用性（TH+、DCC+、およびDTP+）およびセロトニン作用性（TrH+およびセロトニン+）神経細胞の特徴を有した（表6）。細胞はまたGABA-A受容体とグルタミン酸受容体も発現した。ドーパミン作用性 表現型を有する細胞はまた、中脳ドーパミン作用性神経細胞でのみ発現される核転写因子Nurr1（Saucedo-Cardenas et al., 1998）ならびに、ドーパミン作用性神経細胞で発現されるグリア細胞系統由来の神経分化誘導因子（GDNF）受容体複合体の構成要素である膜結合受容体タンパク質チロシンキナーゼである癌原遺伝子cRet（Trupp et al., 1996）に対する抗体について陽性に染色された。このことは、FGF-8bが中脳ドーパミン作用性神経細胞と一致する表現型を誘導することを示唆する。
【０２０７】
ここでも、免疫組織化学的試験からの結果は、14日間FGF-8b＋EGFと共に分化を誘導されたhMASCについてのCDNAアレイ分析によって確認された。免疫組織化学的特徴づけと一致して、mRNAの＞2倍の上昇がTH、TrH、グルタミン酸、いくつかのグルタミン酸受容体、およびナトリウムゲート電位チャンネルについて検出された。パルブアルブミンとGABAはこのアレイ上に存在しないため、それらの発現はmRNA分析では確認できなかった。免疫組織化学によってみられるほぼ限定的な神経分化と一致して、tGFAP、S100A5mRNA、あるいは稀突起膠細胞特異的マーカーであるPMZのmRNAの発現に上昇は見られなかった。FGF-8b＋EGFに誘導された細胞は＞2倍多いチロシンキナーゼ受容体（Trk）A、BDNFとGDNF、いくつかのグリシン-、GABA-およびヒドロキシトリプタミン-受容体、そしていくつかのシナプスタンパク質を発現した。
【０２０８】
グリア芽腫細胞株U87との共培養は神経細胞の成熟を促進する
使用した培養条件にかかわらず、hMASC由来神経細胞は培養中で3〜4週間を超えて生存しない。どの培養も3週間後にグリア細胞を含まなかったため、グルタミン酸とグルタミン酸受容体の両方を発現する神経細胞がグルタミン酸の毒性のために死亡した可能性がある（Anderson and Swanson, 2000）。あるいは、神経細胞の生存、分化、成熟に必要な、グリア細胞によって供給される因子が培養中に存在しない可能性がある（Blondel et al., 2000； Daadi and Weiss, 1999； Wagner et al., 1999）。この仮説を検証するために、3週齢のFGF-8b＋EGF培養からの細胞を、グリア芽腫細胞株U-87と、FGF-8b＋EGFを添加した無血清培地でさらに2週間共培養した。
【０２０９】
神経膠腫細胞株U-87[American Tissue Cell Collection （Rockville, MD）]はDMEM＋10%FCS中に維持した（Hyclone Laboratories, Logan, UT）。3週齢のFGF-8b＋EGF含有培養からの細胞を、親油性色素PKH26（Sigma）で取扱説明書の通りに標識した。標識細胞をFN被覆チャンバースライドにFGF-8b＋EGF含有無血清培地中に1,000個のU-87細胞と共に再播種し、培地を3〜5日間毎に交換しながらさらに2〜3週間維持した。MASC由来細胞中に存在するPKH26がU-87細胞株に移動しないのを確実にするため、U-87細胞をBSA含有培地および20μlのPKH26色素で7日間培養した。神経膠腫細胞の標識は検出されなかった。
【０２１０】
これらの無血清条件下で、U-87細胞は増殖をやめたが生存した。hMASC由来細胞を蛍光顕微鏡法で確認できるようにするため、hMASC由来神経細胞はU-87細胞との共培養前に膜色素PKH26で標識した。U-87細胞と同じサイトカインと後3週間共培養したFGF-8b＋EGF誘導神経細胞は、少なくともさらに2週間生存した。神経細胞は、細胞の大きさが増大し、また神経突起の数、長さと複雑さが増大した、より成熟した形態を獲得した。電流注入後の全細胞電流固定および電位固定によって、U-87細胞との共培養後の、hMASC由来のPKH26標識神経細胞の電気生理学的特徴を評価した（図9B）。電流固定によって、FGF-8b＋EGF/U-87培養中に存在する8個中4個のKH26標識hMASC由来細胞が、注入電流に対するスパイク生成を示した。スパイク生成および非スパイク生成細胞の静止膜電位はそれぞれ-64.9±5.5mVおよび29.7±12.4mVであった。試験した個々の細胞について、スパイク生成および非スパイク生成細胞の入力抵抗はそれぞれ194.3（37.3）および216.3（52.5）MΩであった。図9Bにスパイク生成が観察された細胞の一つの例を示す。上図はスパイク生成細胞から対照 条件下で得られた一群の電圧記録を示す。DC電流を最初に細胞に注入して-100〜-120 mVの範囲に保つ。電流注入手順を、中図に示す通り、次いで膜電位を異なるレベルにするのに用いた。この例に示す通り、細胞を活動電位の閾値にするのに十分大きな脱分極電流の段階が、単一のスパイクを引き起こす。下図は、細胞のスパイク生成が1μｍTTXでブロックされうることを示し、活動電位がNaゲート電位チャンネルによって媒介されていることを示唆する。同じ細胞の電位固定モードから得られた、リークを差し引いた電流記録（図9C）は、タイムコースの中で一過性でありまた-58mVよりも正である電位で活性化される内向き電流、および外向き電流を示した。一過性の内向き電流は1μｍTTXで可逆的にブロックされた。この薬理は、内向き電流の一過性のタイムコースおよび電位依存性の活性化と共に、成熟神経細胞および骨格筋細胞だけにみられる電位依存性Na+電流に典型的である（Sah et al., 1997；Whittemore et al., 1999）。これらの神経細胞様細胞中に骨格筋マーカーは検出されなかった。これらの試験は、FGF-8b＋EGFでの処理と神経膠腫との共培養はTTX感受性電位依存性Na+電流という興奮可能な神経細胞の基本的な特徴を細胞に与える結果になることを示唆する。
【０２１１】
ラット新生仔の脳室に移植されたhMASCは星状細胞および神経細胞のマーカーを発現する細胞に分化する
1.4xl04個のhMASCを定位的に生後1日目〜3日目のSprague Dawleyラットの側脳室に注射した。4および12週間後、動物を屠殺し、ヒト細胞の存在およびhMASCが神経外胚葉に分化した証拠について分析した。ヒト核またはヒト核膜に対する抗体を用いた染色によって同定されたヒト細胞は、SVZに、4週間後には分析した個体の側脳室から最大400μｍ離れて観察することができ、12週間後には、ヒト細胞は、たとえば海馬中におよび脳弓に沿って、脳実質のより深くにもみることもできた。一部のヒト細胞は典型的な星状細胞の形態を有し抗GFAP抗体で陽性染色された一方、別の細胞は抗Neu-N抗体、NF-200および抗ヒト核膜抗体で陽性染色された。三重染色は、ヒト核抗原陽性Neu-N陽性細胞はGFAPを同時発現しなかったことを示した。
【０２１２】
要約
この試験の中心的な発見は、単一の出生後BMに由来するMASCを中胚葉性細胞型だけでなく成熟神経細胞の特徴ならびに星状細胞と稀突起膠細胞の特徴を有する細胞に分化するよう誘導することができるということである。MASCの神経外胚葉性の性質を有する細胞への時間依存性ならびに培養方法依存性の成熟が示された。二重染色は、神経細胞またはグリア細胞は真正であり結果は不適切に発現された神経細胞のまたはグリアのマーカーが原因でないことを決定的に実証した。これらの結果はmRNAレベルで確認された。レトロウイルスマーキング試験を用いて、レトロウイルスベクターに隣接する宿主細胞ゲノム領域配列はすべての系統で同一であったため、神経細胞、星状細胞および稀突起膠細胞が、筋および内皮にも分化する単一のMASCに由来することが示された。hMASCは成熟神経細胞の表現型だけでなく電気生理学的特徴すなわちTTX感受性電位依存性Na+電流も獲得した。最後に、MASCはin vivoで神経細胞および星状細胞のマーカーを発現する細胞にも分化できることが示された。
【０２１３】
レトロウイルス挿入配列の3'-LTRに隣接するゲノム配列のPCRに基づく配列決定と組み合わせてhMASCのレトロウイルスマーキングを用いて、神経細胞は星状細胞および稀突起膠細胞、ならびに内皮および筋に分化するのと同一のhMASCに由来することが示された（Jordan et al, 1990）このことはMASCが単一細胞レベルで、中胚葉性および神経外胚葉性の系統の細胞に分化できることを決定的に示す。中胚葉性細胞型だけでなく神経外胚葉性細胞型にも分化する能力を有する細胞である多能性成体幹細胞すなわちMASCは新たに命名された。Sanchez-Ramos et al.（Sanchez-Ramos et al, 2000）およびWoodbury et al. （Woodbury et al., 2000）は、ヒトまたはげっ歯類のMSC集団はin vitroで星状細胞および神経細胞のマーカーを発現することができるが稀突起膠細胞のマーカーを発現することはできないことを示した。しかし、どちらの試験も、神経外胚葉性マーカーを獲得した同じ細胞が中胚葉性細胞にも分化できるという証拠は提供しなかった。さらに、どちらの試験も、神経細胞のマーカーを発現する細胞が機能する神経細胞の特徴も獲得したことは示さなかった。このように、神経分化について示唆に富むが、これらの報告はMSCからの神経およびグリア分化を決定的に示さなかった。
【０２１４】
ラット新生仔の脳室に移植されたhMASCは神経脳室下領域中および海馬中へ移動でき、そこで局所的信号に応答して星状細胞および神経細胞のマーカーを発現する細胞に分化することも示された。脳の非神経性領域より胚性領域に行われるほうが、また移植が成体動物と比べて新生仔に行われるほうが、NSCの特定の神経細胞の 表現型への移動と分化はずっと大きな程度で起こるため、このモデルが選択された（Bjorklund and Lindvall, 2000；Svendsen and Caldwell, 2000）。hMASCは多能性であり神経外胚葉の外側で細胞に分化するにもかかわらず、hMASCは奇形腫を形成しなかった。脳室下領域の外側に移動した細胞の数は4週間後では少なく、しかし12週間後では増加した。
【０２１５】
MASCを出生後のBMから単離し、拡大して星状細胞、稀突起膠細胞または神経細胞の細胞型に分化するよう誘導するのが容易に可能であることによって、NSC移植における主要な問題の一つ、すなわち適当な提供者組織の入手可能性を回避しうる。
【実施例１１】
【０２１６】
肝細胞様細胞へのMASC分化
胚発生中に、肝臓の形態形成の最初の兆候は腹側内胚葉性上皮の肥厚であり、マウスでは胎生7.5〜8.5日目の間に起こる（Zaret K.S., 2001）。最初の内胚葉形成とそれに続く内胚葉決定に関わるシグナルについてはあまり知られていない。原腸胚形成の初期には（e6-e7）内胚葉は前後方向さえ決定されていない（Melton D., 1997）。しかし、近年の研究は、ex vivoでの内胚葉のFGF4への曝露は、このとき肝マーカーを発現する能力のある初期内胚葉を後側化することを示した（Wells J.M. et al.t 1999）。マウスで胎生8.5日目までに、最終的な内胚葉が腸管を形成しHNF3Pを発現する（Zaret K.S., 2000）。前腸内胚葉は、ともに隣接する心中胚葉に産生される酸性（a）FGFおよびbFGFによって肝細胞系統に誘導され（Zaret K.S., 2001）、これらは既定の膵の運命でなく肝の運命を誘導するために必要である（Zaret K.S., 2001）。transversum間葉に産生される基礎形態形成タンパク質（BMP）も、これらが内胚葉がFGFに応答する能力を高めるGATA4 転写因子のレベルを上昇させるのでまた必要である（Zaret K.S., 2001）GATA4およびHNF3pが肝決定に必要であり、またこれらは中でもアルブミンといった肝細胞特異的発現のマーカーをアップレギュレートするので、肝細胞分化に繋がる下流の事象の重要なエフェクターである。
【０２１７】
大部分の場合、成熟肝細胞は数度の細胞分裂を経ることができ肝細胞置換を担っている。結果として、肝臓幹細胞の存在および機能に関して大きな議論が存在している。化学的傷害による広範囲の肝臓壊死の間、または肝細胞をその増殖をブロックする化学物質で処理したとき、円形細胞と呼ばれる円形のより小さな細胞の集団が出現し増殖する（Petersen, B.E., 2001 ）。これらの円形細胞は肝臓における「幹細胞」部分を構成する可能性がある。円形細胞は、へリング管と呼ばれる胆道の最小単位内に存在し、そこから肝実質へ移動する（Theise N.D., et al., 1999）。円形細胞は両能性であり、in vitroおよびin vivoで肝細胞と胆道上皮の両方を生じる。円形細胞はいくつかの造血マーカーたとえばThy1.1、CD34、Flt3-受容体、およびcKitを発現し、そしてまたαFP、CK19、γ-グルタミル-トランスフェラーゼ、そしてOV-6を発現する。円形細胞の起源は不明である（Petersen, B.E., 2001 ；Kim T.H. el al, 1997；Petersen, B.E., 2001）。
【０２１８】
最近まで、肝細胞は内胚葉性起源の細胞およびその前駆細胞からだけ得られると信じられていた。しかし、近年の研究は非内胚葉細胞もまた肝細胞をin vivoおよび in vitroで形成することを示唆する（Petersen, B.E., 2001；Pittenger M.F. et al., 1999）。骨髄（BM）移植後、円形細胞は提供者BMに由来する（Theise N.D., et al., 1999）。I型チロシン血症の動物モデルであるFAH-/-マウスへの濃縮した造血幹細胞（HSC）の移植は、多数の提供者LacZ+肝細胞の増殖という結果になり、動物は肝臓の生化学機能を回復した（Lagasse E. et al., 2000）。さらに、単一HSCは造血機構に再定着するだけでなく肺、皮膚、肝臓および腸の上皮に寄与する可能性がある（Krause D.S. et al., 2001）。in vitroでオンコスタチンM（OSM）の存在下または非存在下でデキサメタゾン（Dex）処理した外分泌性膵腫瘍細胞は肝細胞表現型を獲得しうる（Shen C.N. et al., 2000）。最後に、マウス胚性幹（ES）細胞は自発的に肝細胞表現型を獲得し、この過程はaFGF、HGF、OSM、およびDexを用いた処理によって促進される（Hamazaki T. et al., 2001）。
【０２１９】
単一HSCはin vitroで中胚葉性および神経外胚葉性細胞に分化するだけでなく、肝細胞の形態的、表現型および機能的特徴を有する細胞にも分化しうることが個々に実証された。
【０２２０】
mMASC、rMASC、およびhMASCはFGF4および／またはHGFと共に培養されたとき肝細胞様表現型を獲得する。
mMASC、rMASCおよびhMASCを記載した通りに選択し培養した。肝細胞様 細胞へのMASCの分化のための最適条件を決定するため、さまざまな細胞外マトリクス（ECM）成分、およびin vivoまたはES細胞から肝細胞分化を誘導することが知られているサイトカイン（Zaret K.S., 2001）の、mMASCまたはrMASCの肝細胞への分化に対する効果を試験した。分化には細胞周期停止が必要であるため、細胞密度の効果もまた試験した。肝細胞様細胞への分化を実証するため、14日後に細胞をアルブミン、CK18、およびHNF3pに対する抗体を用いて染色した。
【０２２１】
mMASCまたはrMASCのアルブミン、CK18、およびHNF3p陽性類上皮細胞への最適分化は、表7Aに示すようにMASCが21.5x10３細胞/cm2で10ng/mlのFGF4および20ng/mlのHGF存在下でMatrigelに播種したときに見られた。14日後、アルブミン、CK18、およびHNF3p陽性類上皮細胞の割合は61.4±4.7%であり、細胞の17.3%が二核であった。FNに播種したときも、細胞の53. 1±6.3%だけが染色され二核細胞がより少なかった（10.9%）が、CK18およびHNF3p陽性類上皮細胞への分化がみられた。
【０２２２】
FGF4またはHGFのいずれかとの培養によってアルブミン、CK18、およびHNF3p陽性類上皮細胞が得られたが、しかし表7Aに示すようにmMASCまたはrMASCをFGF4とHGFの両方で処理したときのほうがアルブミン、CK18、およびHNF3p陽性細胞の割合はより高かった。aFGF、bFGF、FGF7、BMP、またはOSMの添加では肝細胞マーカーについて陽性である細胞の割合は上昇しなかった一方、1%DMSOおよび0.1mM〜10mM酪酸ナトリウムは肝細胞マーカーについて陽性である細胞へのmMASCまたはrMASCの分化を支持しなかった。
【０２２３】
2.5〜25x10３細胞/cm2の細胞密度を試験したとき、肝細胞マーカーを有する細胞の割合の最高値は、21.5x10３細胞/cm2で播種した細胞について見られた。細胞を＜12.5x10３細胞/cm2で播種したときは肝細胞分化は見られなかった。
【０２２４】
hMASCを3-30x10３細胞/cm2で、aFGF、bFGF、FGF7、1%DMSO、HGF、および/またはFGF4を含む、10ng/mLFNまたは1%Matrigelに播種した。10ng/mlのFGF4単独、20ng/mlのHGF単独、または両者の組で処理した細胞だけがアルブミン、CK18、およびHNF3pを発現する類上皮細胞に分化した。15-30x10３細胞/cm2で播種したhMASCは類上皮細胞に分化した一方、3x10３細胞/cm2で播種したhMASCは死亡した。mMASCまたはrMASCのように、アルブミン、CK18、およびHNF3p陽性類上皮細胞の割合はhMASCをMatrigel（91.3%±4.4）で培養したときのほうがFN（89.5%±5.4）で培養したときよりも高く、そして表7Bに示す通り、二核細胞の割合はMatrigel（31.3%）でのほうがFN（28.7%）でよりも高かった。
【表７】
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【０２２５】
肝細胞様細胞へのMASC分化の表現型の特徴づけ
肝細胞分化を免疫蛍光および共焦点顕微鏡法によって肝細胞分化の初期（HNF3P、GATA4、CK19、αFP）および後期（CK18、アルブミン、HNF1α）マーカーについて経時的に、さらに評価した。FGF4およびHGFを含むMatrigelに播種したmMASCまたはrMASCは、表8Aに示す通り、直径8μmから15μmに大きくなった。21〜28日目に、細胞の約60%は類上皮細胞で、より小さな丸型または紡錘型細胞に囲まれていた。未分化のmMASCまたはrMASCは肝臓特異的転写因子または細胞質マーカーのどれも発現しなかった。4日後、細胞はHNF3J3、GATA4およびαFP、低レベルのCK19を発現し、ごく少数の細胞がHNF1α、アルブミンまたはCK18について染色陽性であった。7日目に、その大きな類上皮細胞はHNF30、GATA4、HNF1αについて染色陽性であり、アルブミンおよびCK18について染色が強まった。少数の細胞だけがαFPを発現した。14、21および28日後、その大きな類上皮細胞はGATA4、HNF30、HNF1α、CK18およびアルブミンについて染色陽性であったが、しかしαFPまたはCK19についてはそうでなかった。類上皮細胞の小塊を取り囲むより小さな細胞はCK19およびαFPについて染色陽性であった。
【０２２６】
FGF4およびHGF、またはFGF4単独を含むMatrigelに播種したhMASCは、21日目までに直径10〜12μmから20〜30μmに大きくなった。7日後、細胞はHNF3p、GATA4および低レベルのCK19を発現した一方、アルブミンまたはCK18について染色陽性の細胞は少数しかなかった。14および21日後、類上皮細胞の＞90%がGATA4、HNF3p、HNF1α、HNF4、CK18およびアルブミンについて染色陽性であった一方、図10Bに示す通り、少数の細胞だけがαFPまたはCK19について染色陽性であった。
【表８】
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【０２２７】
肝細胞様細胞は神経外胚葉および内胚葉に分化したのと同じ単一hMASCに由来する
単一のmMASCまたはrMASCが内皮、神経外胚葉と、CK18およびアルブミン陽性内胚葉細胞に分化することが示されている。単一のhMASCが中胚葉および神経外胚葉に分化することも示されている。同じ単一のhMASCを、肝細胞様細胞に分化することができるかどうか試験した。MASCは記載の通りに得て培養して拡大した。分化のためには、mMASCまたはrMASCを25x10３細胞/cm2で0.01〜10μg/mlのフィブロネクチン（FN）、0.01〜8μg/mlのコラーゲン（Sigma Chemical Co, St. Louis, MO）または1%Matrigel（Becton-Dickinson）に、無血清培地[60%低グルコースDMEM（DMEM-LG； Gibco-BRL, Grand Island, NY）、40%MCDB-201（Sigma）に、1Xインシュリン/トランスフェリン/セレン、4.7μg/mlリノール酸、1mg/mlウシ血清アルブミン（BSA）、10-8M デキサメタゾン, lO-4Mアスコルビン酸-2-リン酸（すべてSigma）、100U/mlペニシリン、100U/mlストレプトマイシン（Gibco）を添加]に2% PCS（Hyclone, Logan Utah）および各10 ng/mLの上皮成長因子（EGF）（Sigma）、白血病抑制因子（LIF； Chemicon, Temecula, CA）と血小板由来成長因子（PDGF-BB； R&D Systems, Minneapolis, MN）を加えた中に播種した。hMASCを15-30x10３細胞/cm2で0.1μg/ml FNまたは1% Matrigelに、LIFを含まない同じ培地中に播種した（Reyes M., 2002）。8〜12時間後、培地を除去し、細胞をリン酸緩衝液（PBS）（Fischer）で2回洗浄し、そして5-50ng/ml HGF、aFGF、bFGF、FGF4、FGF7、またはOSM；または10mg/mlジメチルスルホキシド（DMSO）、または0.1〜1mM 酪酸ナトリウムを添加した無血清培地中で培養した。
【０２２８】
hMASCへのeGFPの形質導入はレトロウイルス含有eGFP-CDNAを用いて行い、＞5X106細胞に拡大した。20%は筋、内皮、神経外胚葉および内胚葉に分化するよう誘導された。クローンA16については単一のレトロウイルス挿入部位が未分化のMASCならびに中胚葉性と神経外胚葉性の分化した細胞に存在し、またEGFP+クローンA16MASCはCK18およびアルブミン陽性細胞に分化した。同じ挿入部位が、同じ細胞集団から作成したFGF4処理MASCに存在し（5'-TAG CGGCCGCTTGAATTCGAACGCGAGACTACTGTGACT CACACT-3'、染色体7）、単一のhMASCが、中胚葉および神経外胚葉以外に、内胚葉に分化することを証明した。
【０２２９】
定量的RT-PCRはFGF4およびHGFが肝細胞決定および分化を誘導することを示す。
定量的RT-PCRによって肝細胞分化は肝細胞分化の初期（HNFSp, GATA4, CK1 9, αFP）および（CK18、アルブミン、HNF1α、シトクロムP450）マーカーについて確認された。RNAを3xl05個のMASCまたは肝細胞に分化するよう誘導されたMASCから抽出した。mRNAを逆転写し、CDNAを下記の通り増幅した:ABI PRISM 7700 （Perkin Elmer/Applied Biosystems）を使用して、2μLのDNA溶液、1X TaqMan SYBR Green Universal Mix PCR反応緩衝液を用いた最初の変性（95℃で10分間）後、二段階PCR（95℃で15秒間、60℃で60秒間）を40サイクル。増幅に用いたプライマーは表9に列記する。
【表９】
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【０２３０】
mRNAレベルはβ-アクチン（マウスおよびヒト）または18S（ラット）をハウスキーピング遺伝子として用いて標準化し、そして新規に単離されたラットまたはマウス肝細胞、７日間培養したラット肝細胞中のｍRNAレベル、またはClontech, Palo Alto, Californiaより購入したヒト成体肝臓RNA由来のmRNAと比較した。
【０２３１】
0日目には、mMASCおよびrMASCは低レベルのアルブミン、αFP、CK18、CK19、TTR、HNF3P、HNF1αおよびGATA4 mRNAを発現したが、CYP2B9とCYP2B13（マウス）またはCYP2B1（ラット）mRNAは発現しなかった（図10）。mMASCまたはrMASCの、FGF4とHGFを用いた処理後、HNF3J5およびGATA4 mRNAの発現は2日目に増加し、4日目までに最大となり、わずかに減少して14日目までに一定となった。αFP、およびCK19のmRNAは2日目以降増加し、4日目までに最大となり、以降は減少した。TTR mRNAは4日目以降増加し、7日目までに最大となり一定となった。CK18、アルブミン、HNF1αおよびP450酵素mRNAは7日目以降増加し、14日目に最大となった。14日目と21日目の間に、FGF4およびHGFに誘導されたMASCはアルブミン、TTR、CK18、CYP2B9およびCYP2B13（マウス）とCYP2B1（ラット）mRNAを発現した。
【０２３２】
未分化のhMASCは低レベルのアルブミン、CK18、およびCK19、CYP1B1を発現したが、しかしαFP（図10）とCYP2B6 mRNAは発現しなかった。アルブミン、CK18、CK19、CYP1B1 mRNAのレベルは、0日目(MASC）培養と比較して、FGF4単独とまたはFGF4およびHGFと14日間培養したhMASCでは顕著に増加した。アルブミン、CK18およびCYP1B1 mRNAのレベルは増加を続け、28日目にはより高かった。CYP1B1は特異的肝細胞マーカーではないが、そのアップレギュレーションは肝細胞決定および成熟を示唆する。新鮮肝臓mRNAの0.5%〜1.0%である低いレベルのCYP2B6を14日目と21日目に見ることができたが0日目には見られなかった。未成熟肝細胞マーカー（CK19とαFP）のmRNAレベルは分化が進行するにつれ減少し、FGF4単独で誘導した培養でより高かった一方、成熟肝細胞（CK18とアルブミン）のmRNAレベルはFGF4とHGF誘導性hMASCでより高かった。
【０２３３】
ウェスタンブロットはFGF4＋HGFが肝細胞決定と分化を誘導することを実証する
発現 of 肝細胞特異的遺伝子の発現は、ウェスタンブロットによっても確認され、Reyes et al.（2000）に記載された通り実施した。αFP、ヒト アルブミン、CK18に対する抗体をブロッキング緩衝液で1:1000に希釈した。ヤギ抗β-actin（1:1000）はSanta Cruzより入手した。二次抗体はHRP結合ヤギ抗マウスおよびHRP結合ロバ抗ヤギであった（Amersham, Arlington Heights）。ECLは取扱説明書に従って実施した（Amersham）。未分化のhMASCはCK18、アルブミン、またはαFPタンパク質を発現しなかった（図1OB）。FGF4単独でまたはFGF4およびHGFで35日間処理後、hMASCはアルブミンとCK18を発現したが、αFPを発現せず、組織化学的分析と一致した。
【０２３４】
mMASC、rMASCおよびhMASCは肝細胞の機能する活性を獲得する
5種類の異なる分析を用いて、肝細胞の形態的および表現型の特徴を有する細胞が肝細胞の機能的特性も有するかどうかを判定した。
【０２３５】
肝細胞様細胞による尿素産生と分泌を分化の全期間を通じてさまざまな時点で測定した。尿素濃度は比色分析（Sigma型番640-1）によって取扱説明書の通りに測定した。単層で生育したラット肝細胞と、胎児マウス肝臓原基を陽性対照として、そして培地を陰性対照として用いた。この分析法は最低10mg/mlの尿素濃度を検出できる。この分析法はアンモニアも測定するため、試料はウレアーゼの添加前と後に評価した。
【０２３６】
尿素またはアンモニアは培地単独の中には検出されなかった。未分化のMASCは尿素を産生しなかった。FGF4とHGFを用いた処理後、MASCによる尿素産生は時間依存的に増加した。尿素産生の時間的経過はマウスとラット培養で同様であった。FGF4とHGFを用いて処理したhMASCについては、尿素は4日目には検出されず、マウスおよびラット培養と12日目まで同様で、マウスおよびラット培養中の尿素を21日目に上回った。MASC由来肝細胞に産生された尿素のレベルは、ラット初代肝細胞の単層培養でのレベルと同様であった。三つの種すべてについて、Matrigel上で分化した細胞はFNと比較して顕著に多い尿素を産生した。
【０２３７】
アルブミン産生を分化の全期間を通じてさまざまな時点で測定した。ラットアルブミン濃度は以前に記載した競合的酵素結合免疫検定法（ELISA）によって測定した（Tzanakakis E.S., et al., 2001 ；Wells J.M et al.y 2000）。ヒトおよびマウスアルブミン濃度は、適切な場合にヒトまたはマウスアルブミンおよび抗ヒトまたは抗マウスアルブミン抗体をラット成分と替えて、同様のELISA法を用いて測定した。ペルオキシダーゼ結合抗ヒトアルブミンと対照ヒトアルブミンはCappelから入手した。ペルオキシダーゼ結合アフィニティ精製抗マウスアルブミンと対照マウスアルブミンはBethyl Laboratories （Montgomery, Texas）から入手した。ELISAの特異性を確実にするため、ヒト、マウス、およびラット抗体は、2時間、37℃にて3%BSAの蒸留水（dH2O）溶液中でインキュベートした。ELISAは少なくとも1 ng/mlの感度を有した。
【０２３８】
未分化のMASCはアルブミンを分泌しなかった。FGF4とHGFを用いた処理後、mMASC、rMASCおよびhMASCはアルブミンを時間依存性に産生した。尿素産生について見られたように、Matrigel上で分化した細胞はFN上で培養したときと比較してより多量のアルブミンを産生した。アルブミンはヒト培養で3日目に検出されなかったにもかかわらず、マウス、ラット、およびヒト細胞は同様のレベルのアルブミンを分泌した。マウス、ラットおよびヒトMASC由来肝細胞に産生されたアルブミンのレベルは、ラット初代肝細胞の単層培養でみられるレベルと同様であった。
【０２３９】
次にシトクロムP450活性を、MASC由来肝細胞の凝集塊とラット初代肝臓肝細胞の球状コロニーでPROD分析を用いて評価した。mMASC-肝細胞凝集塊は、14日目のFGF4およびHGF処理mMASCを5x10４細胞/cm2で非-組織培養プレートに播種し、これを振とう器に毎分10回転で5時間かけて作成した。細胞凝集塊はPrimariaシャーレに移し、1mMフェノバルビタールの存在下または非存在下で4日間緊密化させた。hMASC-肝細胞凝集塊はハンギングドロップ法で作成した。要約すると、FGF4およびHGFで24日間処理したhMASCを103個、1mMフェノバルビタールの存在下または非存在下で100μLの液滴に入れた。4日後、凝集塊を回収し、シトクロムP450活性をPROD分析によって評価した。ペントキシレゾルフィン（PROD）（Molecular Probes, Eugene, Oregon）はシトクロムP450によってO-脱アルキル化され、非蛍光化合物から蛍光化合物レゾルフィンに変化する（Tzanakakis E.S. et al., 2001 ）。PROD代謝によって生じた蛍光強度から結果としてシトクロムP450（CYP）活性を推定する。insituでのレゾルフィンの測定および検出は、記載の通り共焦点顕微鏡法を用いて実施した（Tzanakakis E.S. et al., 2001 ）。
【０２４０】
未分化のmMASCまたはhMASCの凝集塊にPROD活性はみられなかった。しかし、凝集塊を形成するよう誘導されたmMASC（FGF4およびHGFと18日間）およびhMASC（28日間、FGF4単独）は顕著なPROD活性を有した。MASC由来肝細胞凝集塊のPROD活性はラット初代肝細胞凝集塊の活性と同様であった。いくつかの異なる細胞がP450活性を有するが、P450活性のフェノバルビタールによるアップレギュレーションは肝細胞にだけ見られる。したがって、P450もまたフェノバルビタールの存在下または非存在下で試験した。フェノバルビタール無しでは、いくつかのP450酵素が部分的にPROD代謝に加わり、上昇した蛍光値をこれらの検体に与える。対照的に、フェノバルビタールに誘導された凝集塊では、PROD活性は、マウスシトクロムCyp2b9、Cyp2blO、およびCyp2bl3、ラットシトクロムCyp2bl/2（Tzanakakis E.S. et al, 2001）、そしてヒトではCYP2B6によってほぼ完全に代謝された。したがって増加した蛍光活性は、規定のシトクロムP450酵素のタンパク質発現における実際の増加より小さい。凝集塊を96時間フェノバルビタールと共に培養したとき、PROD 活性に32%〜39%の増加がみられ、機能する肝細胞特異的Cyp2b9、Cyp2blO、およびCyp2bl3がmMASCに、およびCYP2B6がhMASC由来肝細胞に存在することを示唆した。
【０２４１】
MASC由来肝細胞を、FGF4処理hMASCをLDL-dil-acilとインキュベートすることによって、LDLを取り込む能力について評価した。細胞を抗CKl8または抗Pan-CKとHNF-3pまたはGATA4抗体を用いて同時標識した。7日間後、a-LDLの低レベルの取り込みが検出され、増加して21日目に最大となった。
【０２４２】
肝細胞のもう一つの代謝機能はグリコーゲン産生または糖新生である。グリコーゲン貯蔵のレベルは、FGF4およびHGF誘導マウスMASCとFGF誘導hMASCを3日目、7日目、14日目、21日目に、過ヨウ素酸シッフ（PAS）染色によって分析した。PASのためには、スライドを1%過ヨウ素酸で5分間酸化しdH2Oで３回洗浄した。その後、スライドをシッフ試薬で15分間処理し、dH2O中で5-10分間洗浄し、Mayer's hematoxylinを用いて1分間染色してdH2O中で洗浄した。グリコーゲン貯蔵は最初に4日目までに見られ、最大レベルは21日目以降に見られた（図ll）。
【０２４３】
肝細胞単離と培養
肝細胞は4-6週齢雄Sprague-Dawleyラットから記載の通り採取した（Seglen P.O., 1976）。採取後の肝細胞の生存数は90〜95%の幅であった。肝細胞は記載の通り培養した（Tzanakakis E.S. et al., 2001 ；Tzanakakis E.S. et al, 2001）。単層を形成するためには、肝細胞を；8μg/cm2コラーゲン（Cohesion Technologies, Palo Alto, CA）で被覆した35 mM Fischer平板培地（Fischer Scientific, Pittsburgh, PA）上で培養した。spheroidsを形成するためには、肝細胞を35-mm Primaria（商標）シャーレで培養した。（Becton Dickinson）。両方の条件下で、播種密度は5x10４細胞/cm2であった。最初の平板培養の12時間後、培地を交換して死細胞および付着していない細胞を除去した。培地はその後48時間毎に交換した。
【０２４４】
要約
出生後のマウス、ラットおよびヒトBM由来の単一のMASCはin vitroで肝細胞の表現型および機能を有する内胚葉性細胞型へ分化できることが示されている。細胞分化条件下で培養されたMASCは、原始および成熟肝細胞マーカーを時間依存性に発現し、マーカーは二重および三重標識細胞の免疫蛍光顕微鏡法によって示された。非肝細胞マーカーは肝細胞抗原と同時発現されなかったため、タンパク質発現プロファイルは肝細胞特異的であって擬似的ではなかった。免疫組織化学からの結果はウェスタンブロットによって確認された。さらに、RT-PCRは、内胚葉決定に重要であることが判っている転写因子HNF3βおよびGATA4、および続いての肝細胞分化に必要なたとえばHNF3βといった転写因子、そしてたとえばCK19、CK18、αFPおよびアルブミンといった細胞質タンパク質、のアップレギュレーションを確認した。
【０２４５】
FGF4単独、またはFGF4およびHGFの両方が、MASCを肝細胞の形態的および表現型の特徴を有する細胞に分化させたことが示されたが、肝細胞の機能上の特徴の獲得を示すことができない限り、これだけでは細胞が肝細胞に分化したことは証明されない。したがって、機能する肝細胞を同定するため、いくつかの機能試験が組み合わせて行われた。mMASC、rMASCまたはhMASCは尿素およびアルブミンを産生し、フェノバルビタール誘導性シトクロムP450活性を含み、Dil-acil-LDLを取り込むことができ、グリコーゲン顆粒を含んだ。尿素産生は肝細胞活性に特異的であるが、腎尿細管上皮もまた尿素を産生する（Hedlund E. et al., 2001）。対照的に、アルブミン産生は肝細胞の存在および代謝活性についての特異的試験である（Hedlund E. et al., 2001）。シトクロム P450は、肝細胞にみられるが、多くの他の細胞型にも存在する（Jarukamjorn K. et al., 1999）。
【０２４６】
しかし、ラットにおけるCyp2bl活性（Tzanakakis E.S. et al., 2001）、マウスにおけるCyp2b9およびCyp2bl3（Li-Masters T. et al., 2001；Zelko I. Et al., 2000）、そしてヒトにおけるCYP2B6は比較的に肝細胞特異的と考えられている。P450のこれらの形の存在はRT-PCRによって示された。P450活性がフェノバルビタールによって誘導可能な場合、示した通り、肝細胞に関する特異性はさらに向上する（Rader D.J. et al., 2000）。
【０２４７】
LDL取り込みは肝細胞で見られるが（Oh S.H. et al., 2000）、たとえば内皮といった他の細胞も同様の能力を有する（Avital I. et al., 2001）。最後に、肝細胞だけがグリコーゲンを産生し貯蔵することができる。総合すると、これらの機能試験は、in vitroでFGF4およびHGFを用いて処理したマウス、ラットまたはヒト由来MASCは肝細胞マーカーを発現するだけでなく肝細胞代謝活性に合致する機能的特徴も有することを示す。
【０２４８】
いくつかの研究は、BM由来細胞は肝細胞様細胞にin vivoおよびin vitroで分化しうることを示している（Petersen B.E. et al., 1999；Theise N.D. et al.,2000；Krause D.S. et al., 2001；Pittenger M.F. et al., 1999；Wang S. et al., 2001；Lagasse E. et al., 2000）。しかし、大部分の研究は、肝細胞表現型を有する細胞に分化するBM細胞の表現型について取り組んでいない。肝細胞マーカーについて染色陽性となる細胞が肝細胞の機能的特徴を有するかどうか、および肝細胞に分化する細胞がたとえば造血細胞のような中胚葉性細胞にも分化できるかどうかはは未知である。Lagasse et al.は、マウスBM中に存在するcKit+Thy１lowSca1+Lin+-細胞は肝細胞の表現型だけでなく肝細胞の機能を有する細胞に分化することを示した（Lagasse E. et al., 2000）。わずか50個の細胞が移植されたときにそのような結果を見ることができるにもかかわらず、この研究では造血細胞に分化するのと同一の細胞が肝細胞にも分化することは証明されなかった。Krause et al.は単一の細胞が造血機構に再定着し稀な肝細胞を生じることができることを示した。しかし、肝細胞の機能的評価は行われなかった（Krause D.S. et al.,2001）。Avita et al.は、マウスBM中のThy-1+細胞であるβ2m-がアルブミン、HNF4、C/EBPct、およびシトクロム P450 3A2 mRNAおよびタンパク質（Wilmut I., et al., 1997）、通常は肝臓でみられる肝細胞前駆細胞の表現型を発現することを最近報告した。このように、BM中にそのような肝細胞前駆細胞が存在することは、最近の研究で注目されたin vivoでの骨髄の肝細胞への分化を説明しうる（Krause D.S. et al, 2001；Lagasse E. et al., 2000）。
【０２４９】
機能する肝細胞様細胞を生じる細胞が他の細胞型も生じるかどうかという疑問に対処するため、レトロウイルスマーキングが用いられた（Reyes M. et al., 2001；Jiang Y., 2002）。アルブミン、GK18およびHNF1αを発現している細胞を、内皮および神経外胚葉性の表現型を有する細胞に分化するのと同じmMASCおよびrMASCから生じうることが最近示されている（Jiang Y.,2002）。hMASCについても同様の結果がみられることが確認されている。中胚葉性および神経外胚葉性の表現型とsingle hMASCからの機能を有する細胞を得ることを示した最近発表された研究を拡張して（Reyes M., 2002）、同じsingle hMASCがまた肝細胞の形態および表現型を有する細胞に分化することがここに示される。このように、肝細胞マーカーを発現せず機能する肝細胞活性を有しないMASCがBM中に存在し、培養条件に従って、これが肝細胞の表現型および肝細胞の機能的特徴、または中胚葉性および神経外胚葉性細胞の表現型のおよび機能の特徴を獲得することが初めて示される。
【実施例１２】
【０２５０】
血友病マウスを治療するためのLacZ遺伝子導入MASCの移植
MASCはβ-gal/NEO導入遺伝子を含むROSA26マウスから得て（106細胞/マウス）、先に放射線照射することなく血友病マウス（N＝5）に静脈注射した。動物はMASC移植後1ヶ月（N＝2）および2ヶ月（N＝3）で屠殺した。骨髄サイトスピンおよび肝臓、脾臓、骨格筋、心臓、肺および腸の凍結断面を、FITC-結合抗β-gal抗体とpan-サイトケラチンまたはCD45を用いてβ-gal抗原の存在について染色した。組織はまたQ-PCRによってβ-gal遺伝子について実施例6に記載の通り分析した。
【０２５１】
予備分析では、注射後2ヶ月で分析した３個体（M3）のうち１個体が提供者細胞に由来する肺上皮細胞を0.1%有することが免疫組織化学およびQ-PCRによって示された。免疫組織化学は、個体M5で脾臓、骨髄および腸に、＜1%のCD45+提供者細胞が定着していることを示した。個体M4の組織は免疫組織化学的にいくらかの提供者由来細胞を有していた；この個体についてのPCRデータは結果待ちである。
【０２５２】
個別に参照により含まれるように、すべての公開、特許および特許出願は参照により本開示に含まれる。前期の明細書において本発明はその特定の好ましい実施形態に関連して記載され、説明の目的で多くの詳細が示されている一方、本発明は他の実施形態を許し、またここに記載された詳細のあるものは本発明の基本原理を離れることなく相当に変化させうることは、当業者に明らかとなる。
【参考文献】
【０２５３】
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【図面の簡単な説明】
【０２５４】
【図１】図１は、骨髄（BM）、筋および脳由来MASCの拡大可能性を示す図である。
【図２】図２は、遺伝子発現の（A）筋および脳MASCそして（B）骨髄および筋MASCにおける遺伝子発現を示す散布図である。
【図３】図３は、未分化MASCおよびVEGFとともに培養したMASCのFACS分析を示す図である。
【図４】図４は、mMASCの定着とin vivo分化の顕微鏡写真である。
【図５】図５は、MASC由来内皮細胞の共焦点蛍光顕微鏡法を用いた免疫組織化学的評価を示す図である。
【図６】図６は、MASC由来内皮細胞の顕微鏡写真である。
【図７】図７は、MASC由来内皮細胞のFACS分析を示す図である。
【図８】図８は、ヒトMASC由来内皮細胞の顕微鏡写真である。
【図９】図９は、hMSC由来神経細胞様細胞におけるスパイク生成および発現した電位依存性ナトリウム電流を表す図である。
【図１０】図１０は、肝細胞様表現型を確認した定量的RT-PCRおよびウェスタンブロット分析を示す図である。
【図１１】図１１は、肝細胞様細胞の顕微鏡写真を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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