(57)【要約】本発明は、インビボで種に曝露された時、親の非修飾分子と比較して低減された免疫原性を有する修飾された人工タンパク質、好ましく融合タンパク質に関する。特に、本発明は、単一の成分としては通常強い免疫原性はないが、第２のタンパク質部分と結合して、通例、人工融合タンパク質を形成した際に、免疫性が増強されるタンパク質に関する。とりわけ、本発明は、本質的に免疫グロブリン分子またはその断片からなり、それらがそのＣ−末端を介して生物学的に活性な非免疫グロブリン分子、好ましくはポリペプチドもしくはタンパク質またはその生物学的に活性な断片のＮ−末端に共有結合的に融合した、修飾された、したがって、新規な免疫グロブリン（Ｉｇ）融合タンパク質に関する。本発明は、特定の実施形態としては、抗体のＦｃ部分が生物学的または薬学的効果を誘発する非免疫学的標的分子と上記のように融合した融合タンパク質に関する。本発明の分子は、１個または複数のアミノ酸残基位置で変更されたアミノ酸配列を有するが、変更されていない分子と比べた場合、基本的には同一の生物学的活性を有する。変更は、Ｔ細胞エピトープ（これは生体ホストにおける免疫反応に寄与する）と識別される分子の領域で行なう。したがって、本発明はさらに、ペプチド中のＭＨＣクラスＩＩ分子結合サイトに対しＴ細胞エピトープ値をコンピュータ支援された方法によって計算することを含む前記エピトープの識別により前記融合タンパク質を調製する新規な方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１のタンパク質／ポリペプチドおよび第２のタンパク質／ポリペプチドから実質的になり、第１のタンパク質が免疫グロブリン分子またはその断片であり、第２のタンパク質／ポリペプチドが非免疫グロブリン標的ポリペプチド（Ｘ）であって、各々が他方に直接またはリンカー分子によって連結している、親の融合タンパク質から誘導された免疫原性の修飾された融合タンパク質であって；前記親の融合タンパク質と異なるアミノ酸配列を有し、そのアミノ酸配列内のＴ細胞エピトープの数の減少によって、所与の種の免疫系にさらされた時、親の融合タンパク質に比べて低減された免疫原性を示す、修飾された融合タンパク質。
【請求項２】
前記Ｔ細胞エピトープがＭＣＨクラスＩＩ分子結合基に結合できるペプチド配列である請求項１に記載の修飾された融合タンパク質。
【請求項３】
標的ポリペプチド（Ｘ）がそのＮ−末端によって免疫グロブリン部分のＣ−末端に連結される請求項１または２に記載の修飾された融合タンパク質。
【請求項４】
所与の種がヒトである請求項１から３のいずれかに記載の修飾された融合タンパク質。
【請求項５】
融合成分がリンカー分子Ｌを介して融合される請求項１から３のいずれかに記載の修飾された融合タンパク質。
【請求項６】
前記リンカー分子Ｌが非免疫原性またはより低い免疫原性である請求項４に記載の修飾された融合タンパク質。
【請求項７】
免疫グロブリン部分のＣ−末端領域および非免疫グロブリン標的ポリペプチド（Ｘ）のＮ−末端領域で表わされる融合領域では、Ｔ細胞エピトープの数が低減されていない請求項１から６のいずれかに記載の修飾された融合タンパク質。
【請求項８】
免疫グロブリン部分またはその断片がより低い免疫原性である請求項１から７のいずれかに記載の修飾された融合タンパク質。
【請求項９】
標的ポリペプチド（Ｘ）部分がより低い免疫原性である請求項１から７のいずれかに記載の修飾された融合タンパク質。
【請求項１０】
前記免疫グロブリン分子またはその断片がＩｇＧ１またはＩｇＧ２である請求項１から９のいずれかに記載の修飾された融合タンパク質。
【請求項１１】
前記免疫グロブリン断片がＦｃ部分である請求項１から１０のいずれかに記載の修飾された融合タンパク質。
【請求項１２】
前記Ｆｃ部分がＦｃレセプターに対して低減された親の和性を有する請求項１１に記載の修飾された融合タンパク質。
【請求項１３】
下記式を有する免疫原性の修飾された請求項１１または１２に記載の修飾された融合タンパク質：
Ｆc−Ｌn−Ｘ
（式中、
Ｆc    は免疫グロブリン分子（抗体）のＦｃ部分であり、
Ｘ    は非免疫グロブリン標的ポリペプチドであり、
Ｌ    はリンカーペプチドであり、
ｎ    は０または１であり、
ここで、Ｘおよび／またはＬは、親の分子と比較して、誘導する免疫原性が低減されたアミノ酸残基の修飾を含む）。
【請求項１４】
少なくともＸが免疫原性を有しないか、または低減された免疫原性を有する請求項１３に記載の修飾された融合タンパク質。
【請求項１５】
さらにＦｃとＸの間の融合領域が、場合によっては、ＦｃとＬおよび／またはＬとＸの間の融合領域が、Ｔ細胞エピトープを有しないか、またはその数が低減された請求項１４に記載の修飾された分子。
【請求項１６】
下記式を有する請求項１から１０のいずれかに記載の修飾された融合タンパク質：
Ａ−Ｌn−Ｘ
（式中、
Ａ  は抗体全体またはそのｓＦｖ、Ｆａｂ，Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）2断片；
Ｘ  は非免疫グロブリン標的ポリペプチド；
Ｌ  はリンカーペプチド；
ｎ  ＝０または１であり、
ここで、Ａおよび／またはＸおよび／またはＬは、親の分子と比較して低減された免疫原性を誘導する、アミノ酸残基の修飾を含む）。
【請求項１７】
少なくともＡまたはＸがＴ細胞エピトープを有しないか、またはその数が低減された請求項１６に記載の修飾された融合タンパク質。
【請求項１８】
さらにＡとＸの間の融合領域が、場合によっては、ＡとＬおよび／またはＬとＸの間の融合領域が、免疫原性を有しないか、またはそれが低減された請求項１７に記載の修飾された分子。
【請求項１９】
Ａが以下の群：
抗−ＥＧＦレセプター（ＨＥＲ１）抗体
抗−ＨＥＲ２抗体
抗−ＣＤｘ抗体
抗−サイトカインレセプター抗体
抗−１７−１Ａ抗体、
抗−ＫＳＡ抗体
抗−ＧＰ  ＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体
抗−インテグリンレセプター抗体
抗−ＶＥＧＦレセプター抗体
から選択される請求項１６から１８のいずれかに記載の修飾された融合タンパク質。
【請求項２０】
抗体が以下の群：
モノクローナル抗体２２５および誘導体、
モノクローナル抗体４２５および誘導体
モノクローナル抗体ＫＳ  １／４および誘導体
モノクローナル抗体１４．１８、また誘導体
モノクローナル抗体４Ｄ５／ＨＥＲ２（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標））および誘導体
モノクローナル抗体１７−１Ａおよび誘導体
モノクローナル抗体７Ｅ３および誘導体
モノクローナル抗体ＬＭ６０９、Ｐ１Ｆ６および１４Ｄ９．Ｆ８および誘導体
モノクローナル抗体ＤＣ−１０１および誘導体
モノクローナル抗−ＩＩ−２Ｒ抗体（Ｚｅｎａｐａｘ（登録商標））および誘導体
から選択される請求項１９に記載の修飾された融合タンパク質。
【請求項２１】
標的ポリペプチドＸが以下の群：
サイトカイン、インテグリン阻害剤、可溶性サイトカインレセプター、糖タンパク質、ホルモン、糖タンパク質ホルモン、レプチン、成長ホルモン、成長因子、抗血友病因子、抗原、サイトカインレセプターアンタゴニスト
から選択される請求項１から２０のいずれかに記載の修飾された融合タンパク質。
【請求項２２】
標的ポリペプチドＸが以下の群：
ＩＬ−２、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＥＰＯ、ＴＰＯ、ＴＮＦα、可溶性ＴＮＦレセプター、ＩＬ−１２、ＩＬ−８、ＦＧＦ、ＴＧＦ、ＥＧＦ、ＶＥＧＦ、ＰＭＳＡ、ＩＧＦ、インシュリン、ｈＧｌｆ、ＲＧＤペプチド、エンドスタチン、アンギオスタチン、ＢＤＮＦ、ＣＮＴＦ、タンパク質ｃ、因子ＩＸおよびこれらの生物学的に活性な断片
から選択される請求項２１に記載の修飾された融合タンパク質。
【請求項２３】
以下の群：
ＭＡｂ  ＫＳ  １／４−ＩＬ２、ＭＡｂ  １４．１８−ＩＬ２
ＭＡｂ  ４２５−ＩＬ２、ＭＡｂ  ｃ４２５−ＩＬ２、ＭＡｂ  ｈ４２５−ＩＬ２、ＭＡｂ  ４２５−ＴＮＦａ
ＭＡｂ  ２２５−ＩＬ２、ＭＡｂ  ｃ２２５−ＩＬ２
ＭＡｂ  ４Ｄ５−ＩＬ２、ＭＡｂ  ＤＣ１０１−Ｉｌ２、ＭＡｂ  ＬＭ６０９−ＩＬ２、
Ｆｃ−ＩＬ２、Ｆｃ−ＴＮＦａ、Ｆｃ−Ｇ−ＣＳＦ、Ｆｃ−ＥＰＯ、Ｆｃ−レプチン、Ｆｃ−ＫＧＦ、
Ｆｃ−ＢＤＮＦ、Ｆｃ−ＣＮＴＦ、ＦＣ−β−セレブロシダーゼ、ＦＣ−ＴＰＯ、Ｆｃ−ＧＭ−ＣＳＦ
から選択される請求項１から２２のいずれかに記載の修飾された融合タンパク質。
【請求項２４】
請求項１から２３および３６のいずれかの融合タンパク質をコードするＤＮＡ配列。
【請求項２５】
（ｉ）シグナル配列
（ｉｉ）ＩｇＧｌ、ＩｇＧ２またはＩｇＧ３抗体のすべての領域またはＦｃ、ｓＦＶ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’またはＦ（ａｂ’）２領域をコードするＤＮＡ配列；および
（ｉｉ）ポリペプチド（Ｘ）をコードするＤＮＡ配列、ならびに、場合によっては
（ｉｉｉ）リンカー分子をコードするＤＮＡ配列
を含む請求項２４のＤＮＡ配列。
【請求項２６】
請求項２４または２５のＤＮＡ配列を含む発現ベクター。
【請求項２７】
請求項１から２３および３６のいずれかの融合タンパク質を、場合によっては適当な担体、賦形剤または希釈剤とともに含む医薬組成物。
【請求項２８】
（ｉ）親の融合タンパク質またはその一部のアミノ酸配列を決定すること；
（ｉｉ）インビトロまたはインシリコ技術を用いるか、または生物アッセイを用いてそのペプチドのＭＨＣ分子への結合を測定することを含む任意の方法により、融合タンパク質のアミノ酸配列内の１つまたは複数の潜在的なＴ細胞エピトープを識別すること；（ｉｉｉ）Ｔ細胞エピトープ配列の活性または数、および／または前記生物学的分子から誘導されるペプチドを結合することができるＭＨＣアロタイプの数（これはインビトロまたはインシリコ技術を用いるか、もしくは生物アッセイを用いてペプチドのＭＨＣ分子への結合、またはペプチド−ＭＨＣ複合体のＴ細胞への結合により測定される）を実質的に低減するか、または除去するように修飾して、初めに識別したＴ細胞エピトープ配列内の少なくとも１個のアミノ酸残基を変更することにより、新規な配列変種を設計すること；（ｉｖ）組換えＤＮＡ技術によってそのような配列変種を構成し、所望の特性を備えた１つまたは複数の変種を識別するために前記変種を試験すること；および（ｖ）場合によってはステップ（ｉｉ）〜（ｉｖ）を繰り返すこと
からなる各ステップを含む請求項１から２３に記載の免疫原性の修飾された融合タンパク質の製造方法であって、ステップ（ｉｉ）によるＴ細胞エピトープ配列の識別が、
（ａ）知られているアミノ酸残基配列を有するペプチド領域を選択すること；（ｂ）所定の均一サイズを有し、少なくとも３個のアミノ酸残基によって構成される、重複したアミノ酸残基セグメントを、その選択領域から連続的に採取すること；（ｃ）採取した前記アミノ酸残基セグメント中に存在する個々の疎水性アミノ酸残基側鎖に対する割り当て値を合計することにより、採取した前記セグメントの各々についてＭＨＣクラスＩＩ分子結合スコアを計算すること；および（ｄ）実質的にペプチドの治療上の有用性を低減させずに、ペプチドに対するＭＨＣクラスＩＩ結合スコア総合値を変更するために、そのセグメントについて計算したＭＨＣクラスＩＩ分子結合スコアに基づいて、修飾に適した前記セグメントの少なくとも１つを識別すること
により実現されることを特徴とする方法。
【請求項２９】
ステップ（ｃ）を、１２−６ファンデアワールスのリガンド−タンパク質エネルギー反発項およびリガンドコンホメーションエネルギー項を含むように改変したベームスコアリング関数（Ｂｏｅｈｍ  ｓｃｏｒｉｎｇ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ）を用い、（１）ＭＨＣクラスＩＩ分子モデルの第１のデータベースを提供すること；（２）前記ＭＨＣクラスＩＩ分子モデルについて許容されるペプチド骨格の第２のデータベースを提供すること；（３）前記第１のデータベースからモデルを選択すること；（４）前記第２のデータベースから許容されるペプチド骨格を選択すること；（５）採取した各セグメント中に存在するアミノ酸残基側鎖を識別すること；（６）採取した各セグメント中に存在するすべての側鎖に対する結合親の和性値を決定すること；および場合によっては、（７）前記各モデルと各骨格についてステップ（１）〜（５）を繰り返すことによって実行する請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
採取したアミノ酸残基セグメントが、１３個のアミノ酸残基によって構成される請求項２８または２９の方法。
【請求項３１】
採取した連続するアミノ酸残基が１〜５個のアミノ酸残基で重複する請求項２８から３０のいずれかの方法。
【請求項３２】
本来存在するＴ細胞エピトープ配列のいずれかにある１〜９個のアミノ酸残基が変更される請求項２８から３１のいずれかの方法。
【請求項３３】
本来存在するＴ細胞エピトープ配列のいずれかにある１個のアミノ酸残基が変更される請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
アミノ酸残基の変更が、特定の位置において本来存在するアミノ酸残基を他のアミノ酸残基によって置換、追加または欠失させるものである請求項３２または３３の方法。
【請求項３５】
前記生物学的分子の生物活性を回復するために、置換、欠失または追加によるさらに一層の変更が行われる請求項３４の方法。
【請求項３６】
以下の群：
（ｉ）Ｙ−（Ｌ）−Ｘ（ここで、Ｙはサイトカインであり、Ｘ、（Ｌ）は上に定義されるような分子である）、（ｉｉ）Ｐ−（Ｌ）−Ｘ（ここで、Ｐは通常ではない異常なグリコシル化部分を備えたタンパク質であり、Ｘおよび（Ｌ）は上に定義されるような分子である）、
（ｉｉｉ）Ａ−（Ｌ）−Ｘ（ここで、Ａは免疫グロブリンまたはその断片で、Ｘ（Ｌ）は上に定義されるような分子である）、
から選択され、
親の人工タンパク質のアミノ酸配列とは異なり、所与の生物種の免疫系に曝露された時、親の融合タンパク質に比べてＴ細胞エピトープ数が減少しているため低減された免疫原性を示すアミノ酸配列を有する親の人工タンパク質から誘導された、免疫原性の修飾された人工タンパク質であり、前記Ｔ細胞エピトープは、請求項２８から３５のいずれかで特定される方法によって得ることができるＭＣＨクラスＩＩ分子結合基に結合し得るペプチド配列である
免疫原性の修飾された人工タンパク質。
【請求項３７】
少なくともＡまたはＸまたはＹまたはＰの免疫原性が修飾された請求項３６の人工タンパク質。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、インビボで、ある生物種に曝露された時、親の非修飾分子と比較して低減された免疫原性を有する修飾された人工タンパク質、好ましく融合タンパク質に関する。特に、本発明は、単一の成分としては通常強い免疫原性はないが、第２のタンパク質部分と結合して、通例、人工融合タンパク質を形成した際に、免疫性が増強されるタンパク質に関する。とりわけ、本発明は、本質的に免疫グロブリン分子またはその断片からなり、それらがそのＣ−末端を介して生物学的に活性な非免疫グロブリン分子、好ましくはポリペプチドもしくはタンパク質またはその生物学的に活性な断片のＮ−末端に共有結合的に融合した、修飾された、したがって、新規な免疫グロブリン（Ｉｇ）融合タンパク質に関する。本発明は、特定の実施形態としては、抗体のＦｃ部分が生物学的または薬学的効果を誘発する非免疫学的標的分子と上記のように融合した融合タンパク質に関する。
【０００２】
本発明の分子は、１個または複数のアミノ酸残基位置で変更されたアミノ酸配列を有するが、変更されていない分子と比べた場合、基本的には同一の生物学的活性を有する。変更は、Ｔ細胞エピトープ（これは生体ホストにおける免疫反応に寄与する）と識別される分子の領域で行なう。したがって、本発明はさらに、ペプチド中のＭＨＣクラスＩＩ分子結合サイトにおけるＴ細胞エピトープ値をコンピュータ支援された方法によって計算することを含む前記エピトープの識別により前記融合タンパク質を調製する新規な方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
治療用融合タンパク質は、通例、人工分子であり、それらは単一成分の既知の好ましい特性を組み合わせるかまたは新しい特性を作り出すように生産される。例えば、融合タンパク質は、通常は免疫原でない融合パートナーを免疫原性にする免疫原部分を含むことがある。成分の各々が免疫原性であり、融合分子が通常望ましくないこうした特性を保持している場合もある。さらには、免疫原性がないか低い成分を融合することにより、融合生成物が結合、特に連結領域（ｊｕｎｃｔｉｏｎ  ｒｅｇｉｏｎ）での結合を形成して免疫原性となることもあり得る。
【０００４】
この意味において特に興味ある融合タンパク質は免疫コンジュゲート（ｉｍｍｕｎｏｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ）である。免疫コンジュゲートは数年前から知られているが、それらのうちの多くがインビトロおよびインビボで薬学的効能を示している。免疫コンジュゲートは、通例、免疫グロブリンまたはその断片に由来する部分、および免疫グロブリン分子に連結される標的ポリペプチドまたはタンパク質からなるキメラ分子である。本来、免疫コンジュゲートは完全な抗体とサイトカインのような細胞毒素剤から調製され、後者がそのＮ−末端を介して免疫グロブリンの定常領域のＣ−末端に融合したものか、あるいはそのＣ−末端を介して抗体の可変領域のＮ−末端に融合したものである（例えば、ＥＰ  ０４３９  ０９５、ＷＯ  ９２／０８４９５、米国特許第５，３４９，０５３号、ＥＰ  ０６５９  ４３９、ＥＰ  ０７０６  ７９９参照）。これらのキメラ分子は、抗体部分またはその断片の可変領域ＣＤＲ内の結合サイトによって、例えば、腫瘍細胞表面の特定の抗原を標的とすることにより、および免疫グロブリンに結合したサイトカインの同時的細胞毒性効果によって二機能的であり、したがって、理論的には、唯一または主として標的細胞を攻撃する。この情況で、さらに種々の抗体のｓＦｖ−、Ｆａｂ−、Ｆａｂ’またはＦ（ａｂ’）２断片からなる構成体を含む、三機能的、多機能的な免疫コンジュゲートが開発されている（いずれの場合も、免疫グロブリン部分の標的機能が有利に使用された）。
【０００５】
免疫グロブリンの別の修飾は抗体のＦｃ領域の使用である。抗体は、２つの機能的に独立した部分、すなわち、分子切断タイプに依存し抗原と結合する、「Ｆａｂ」、「Ｆａｂ」または「Ｆ（ａｂ’）２」として知られる可変領域と「Ｆｃ」として知られる補体または食細胞のようなエフェクター機能への連結部となる定常領域を含む。免疫グロブリンのＦｃ部分は長い血漿中半減期を有するが、Ｆａｂ断片は短命である（Ｃａｐｏｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３３７：５２５−５３１（１９８９））。
【０００６】
治療用タンパク質生成物は、より長い半減期とするかまたはＦｃレセプター結合、タンパク質Ａ結合、補体結合（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ  ｆｉｘａｔｉｏｎ）および胎盤トランスファーなど、すべて免疫グロブリンのＦｃタンパク質中に存在する機能を組込むためにＦｃ領域を使用して構築されてきた。例えば、ＩｇＧ１抗体のＦｃ領域はＣＤ３０−Ｌ（ホジキン病腫瘍細胞（Ｈｏｄｇｋｉｎ’ｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ）、未分化リンパ腫細胞（ａｎａｐｌａｓｔｉｃ  ｌｙｍｐｈｏｍａ  ｃｅｌｌｓ）、Ｔ−細胞白血病細胞および他の悪性細胞タイプ上に発現するＣＤ３０レセプターと結合する分子）のＮ末端に融合された（米国特許第５，４８０，９８１号）。抗炎症剤および抗拒絶剤であるＩＬ−１０はサイトカインの短い血中半減期を増大させるためにネズミＦｃγ２ａと融合された（Ｚｈｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１５４：５５９０−５６００（１９９５））。また、複数の研究により、ヒトＩｇＧ１のＦｃタンパク質と連結した腫瘍壊死因子レセプターの敗血症性ショック状態にある患者の治療への使用の評価が行われている（Ｆｉｓｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．，３３４：１６９７−１７０２（１９９６）；Ｖａｎ  Ｚｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１５６：２２２１−２２３０（１９９６））。ＡＩＤＳ治療のための治療用タンパク質を生産するため、ＦｃのＣＤ４レセプターとの融合も行なわれている（Ｃａｐｏｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３３７：５２５−５３１（１９８９）参照）。主として、Ｆｃは、タンパク質のＣ−末端およびＮ−末端をそれぞれ使用して標的タンパク質またはペプチドにそのＮ−末端またはＣ−末端を介して融合させることができる。ＦｃとＴＮＦおよびＥＰＯのキメラが、ＥＰ  ０４６４  ５３３（Ｈｏｅｃｈｓｔ／  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ）に開示されているが、ここでは、ＦｃのＮ−末端はタンパク質（Ｘ−Ｆｃ）のＣ−末端に結合している。同じ結合が、ＷＯ  ９７／００３１９（ＳＫＢ）およびＷＯ  ９７／２４４４０（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）に開示されたレプチン−Ｆｃキメラで選択されている。また、Ｆｃ−（ＩＬ−２）、Ｆｃ−ＥＰＯ、Ｆｃ−ＰＳＭＡ、Ｆｃ−（ＩＬ−１２）、Ｆｃ−ＴＮＦａ、Ｆｃ−（ＧＭ−ＣＳＦ）、Ｆｃ−ＴＮＦＲ、Ｆｃ−エンドスタチン（ｅｎｄｏｓｔａｔｉｎ）、Ｆｃ、アンギオスタチン（ａｎｇｉｏｓｔａｔｉｎ）、Ｆｃ−ｇｐｌ２０、Ｆｃ−レプチン、Ｆｃ−ＩＦＮａ、Ｆｃ−（Ｇ−ＣＳＦ）など、Ｆｃ−タンパク質キメラの逆向きの結合（Ｆｃ−Ｘ）について記載している多数の文献および特許出願が存在する。例としては、ＷＯ  ９６／０８５７０（Ｆｕｊｉ／Ｍｅｒｃｋ  ＫＧａＡ）、ＷＯ  ９８／２８４２７（Ａｍｇｅｎ）、ＷＯ  ９９／０２７０９（ベス・イスラエル医療センター（Ｂｅｔｈ  Ｉｓｒａｅｌ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃａｒｅ  Ｃｅｎｔｅｒ））およびＷＯ  ９９／５８６６２（Ｆｕｊｉ／Ｍｅｒｃｋ  ＫＧａＡ）がある。ＷＯ  ００／２４７８２（Ａｍｇｅｎ）は、非常に多数の可能なＦｃ−Ｘコンジュゲートについて開示しており、そこでは２つのパートナー間の結合はＦｃ−ＸでもＸ−Ｆ���でもよい。Ｆｃ−Ｘ分子の広範囲な開発は、レキシジェン／メルクＫＧａＡ（Ｌｅｘｉｇｅｎ／Ｍｅｒｃｋ  ＫＧａＡ）により実現され、米国特許第５，５４１，０８７号およびＷＯ  ９９／４３７１３、ＷＯ  ９９／２９７３２、ＷＯ  ９９／５２５６２、ＷＯ  ９９／５３９５８、ＷＯ  ００／１１０３３、ＷＯ  ０１／０７０８１、ＰＣＴ／ＥＰ００／１０８４３などに開示されている。したがって、抗原結合サイトを「失った」Ｘ−ＦｃおよびＦｃ−Ｘ分子は、結合サイトおよび、したがって、その抗原特異的標的機能が保存されている分子と同様に、有望な治療用タンパク質として大きな興味を引くものであり、種々の臨床適用のために類似体（ａｎａｌｏｇｕｅ）組成物を開発する必要がさらに存在する。非天然の治療用タンパク質は多くの場合特に免疫原性である。例えば、エンブレル（Ｅｎｂｒｅｌ）は、抗体のＦｃ領域に融合させた腫瘍壊死因子レセプター（ＴＮＦ−Ｒ）の細胞外領域からなる融合タンパク質である。エンブレルによって治療された患者の約１６％はこの融合タンパク質の抗体を生じると報告されている（Ｐｈｙｓｉｃｉａｎ’ｓ  Ｄｅｓｋ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ［２００１］ｐ．３３７２）。同様に、エリスロポエチン（Ｅｐｏ）と顆粒球／マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭＣＳＦ）からなる融合タンパク質は、免疫原性が高いことが見出されている（Ｃｏｓｃａｒｅｌｌａ  Ａ，ｅｔ  ａｌ．［１９９８］Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  １０：９６４−９；Ｃｏｓｃａｒｅｌｌａ  Ａ，Ｍｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．［１９９８］１０：１１５  ２２）。霊長目の動物に注入した時、Ｅｐｏ−ＧＭＣＳＦ融合タンパク質は融合タンパク質のＥｐｏ部分に対する強い抗体反応を引き起こし、この結果貧血が起こることが判明した。Ｃｅｒｅｄａｓｅ（商標）およびＣｅｒｅｚｙｍｅ（商標）はゴーシェ（Ｇａｕｃｈｅｒ）病を治療するために使用されるリソザイム酵素グルコセレブロシダーゼの形態である；遺伝子工学の結果、グルコセレブロシダーゼは異常な高マンノースグルコシル化に結び付く。ゴーシェ病患者はそのリソソーム中にグルコセレブロシダーゼを欠いており、その結果、患者のマクロファージは脂質を蓄積する傾向があり、泡状細胞となりやすい（Ｔｈｅ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂａｓｅｓ  ｏｆ  Ｉｎｈｅｒｉｔｅｄ  Ｄｉｓｅａｓｅ，８ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ［２００１］Ｓｃｒｉｖｅｒ  ｅｔ  ａｌ．ｅｄｓ．Ｃｈａｐｔｅｒ  １４６，“Ｇａｕｃｈｅｒ  Ｄｉｓｅａｓｅ．”ｐ．３６３５−３６６８）。Ｃｅｒｅｄａｓｅ（商標）またはＣｅｒｅｚｙｍｅ（商標）の投与後、治療用タンパク質はマクロファージ上のマンノースレセプターに結合し、エンドシトーシスされ、エンドソームを通してリソソーム（これはその適切な位置である）に輸送される。Ｃｅｒｅｄａｓｅで治療された患者は、しばしばグルコセレブロシダーゼへの抗体を生ずる（Ｐａｓｔｏｒｅｓ  ＧＭ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ［１９９３］８２：４０８−１６；Ｐｈｙｓｉｃｉａｎｓ’Ｄｅｓｋ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ［２００１］ｐ．１３２５−１３２６）。このような抗体は治療の妨害となり得る（Ｂｒａｄｙ  ＲＯ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ．［１９９７］１００（６）：Ｅ１１．）。抗体サイトカイン融合タンパク質を使用したフェーズＩ治験では、何人かの患者がこの治療用融合タンパク質に抗体反応を示した。この場合、抗体部分は１４．１８抗体のヒト化型であり、サイトカインはインターロイキン−２（ＩＬ−２）であった。反応する患者の血清の多くは、抗イディオタイプ（ｉｄｉｏｔｙｐｅ）抗体を高いレベルで含んでいた。
【０００７】
多くのペプチド、ポリペプチドおよびタンパク質の治療での使用は、哺乳動物、特に人間におけるそれらの免疫原性のために制約を受ける。例えば、免疫抑制を受けていない患者にネズミ抗体を投与する場合、そうした患者の大多数は、ヒト抗ネズミ抗体（ＨＡＭＡ）をつくることによって導入された外来物質に免疫反応を示す（例えば、Ｓｃｈｒｏｆｆ，Ｒ．Ｗ．ｅｔ  ａｌ（１９８５）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．４５：８７９−８８５；Ｓｈａｗｌｅｒ，Ｄ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ（１９８５）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３５：１５３０−１５３５）。２つの重大な結果がある。第１は、患者の抗ネズミ抗体が、治療用抗体または免疫コンジュゲートと（これらが例えば腫瘍に結合してその治療機能を果たす機会を得る前に）結合してこれらを除去してしまうことがあるという点である。第２に、患者がネズミ抗体へのアレルギー反応を深め、将来さらに何らかのネズミ免疫グロブリンにさらされたときアナフィラキシーショックを起こす危険があり得るという点である。
【０００８】
いくつかの方法がＨＡＭＡ問題に対処すべく用いられ、この結果、治療用モノクローナル抗体の人体での使用が可能になっている（（例えばＷＯ８９／０９６２２およびＥＰ０２３９４００、ＥＰ０４３８３１０、ＷＯ９１／０９９６７を参照）。これらの組換えＤＮＡ手法は、一般に最終的な抗体構成体においてマウス遺伝子情報を低減させる一方、最終構成体中のヒト遺伝子情報を増加させるものである。それにもかかわらず、得られた「ヒト化」抗体は、依然として患者に免疫反応を誘発する場合があった［Ｉｓｓａｃｓ  Ｊ．Ｄ．（１９９０）  Ｓｅｍ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２：４４９，４５６；Ｒｅｂｅｌｌｏ，Ｐ．Ｒ．ｅｔ  ａｌ（１９９９）Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ６８：１４１７−１４２０］。これらの方法論に共通する特徴は、ヒト抗体タンパク質の中に存在するのと同一のアミノ酸残基（アミノ酸残基配列の顕著な特徴領域でもよい）を、通常げっ歯類に由来する治療用抗体に導入することであった。異なる種の抗体分子中の構造的（および機能的）保存度が比較的高いため、抗体については、この方法が可能である。しかし、治療用途に使えると考えられるペプチド、ポリペプチドおよびタンパク質については、ホスト種（例えばヒト）に治療用タンパク質について構造上の同族体が存在しない場合もあり、このような方法は適用できない。さらに、これらの方法は、ヒトアミノ酸残基配列の一般的な導入は再モデル化された抗体に免疫原性を与えないであろうということを前提としていた。しかし、ある短いペプチド配列（「Ｔ細胞エピトープ」）は、細胞内でのペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の分解中に放出され得るものであり、続いて、Ｔ−細胞の活性化を起動すべく主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）分子によって提示されることが知られている。ＭＨＣクラスＩＩによって提示されたペプチドについて、Ｔ細胞のこのような活性化は、次いで、例えば、Ｂ細胞の直接の刺激による抗体応答を引き起こし、そうした抗体を産生する。従って、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質から潜在的なＴ細胞エピトープを除去することが望ましいであろう。ヒトに由来する、しかも人体内に存在するのと同じアミノ酸配列を有するタンパク質でさえ、人体内で免疫反応を引き起こすことがある。顕著な例としては、とりわけ、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子［Ｗａｄｈｗａ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ（１９９９）Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５：１３５３−１３６１］やインターフェロンアルファ２［Ｒｕｓｓｏ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ（１９９６）Ｂｒｉ．Ｊ．Ｈａｅｍ．９４：３００−３０５；Ｓｔｅｉｎ，Ｒ．ｅｔ  ａｌ（１９８８）Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．Ｍｅｄ．３１８：１４０９−１４１３］の治療上の使用が挙げられる。
【０００９】
過去２、３年の間に、様々な生物学的機能を有する抗体および標的タンパク質を非免疫原性または少なくとも低免疫原性とする解決策を示唆するいくつかの技術が公表されている。その例は以下の通りである：ＷＯ  ９２／１０７５５およびＷＯ  ９６／４０７９２（Ｎｏｖｏ  Ｎｏｒｄｉｓｋ）、ＥＰ  ０５１９  ２５  ５９６（Ｍｅｒｃｋ  ＆  Ｃｏ．）、ＥＰ  ０６９９  ７５５（Ｃｅｎｔｒｏ  ｄｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉａ  Ｍｏｅｌｃｕｌａｒ）、ＷＯ  ９８／５２９７６、およびＷＯ  ９８／５９２４４およびＷＯ  ００／３４３１７（ＢｉｏｖａｔｉｏｎＬｔｄ．）。
【００１０】
先行技術に開示されたタンパク質からのＴ細胞エピトープの除去に関する一般的な方法は、（例えばＷＯ  ９８／５２９７６、ＷＯ  ００／３４３１７）、次のステップを含む：
（ａ）ポリペプチドまたはその一部のアミノ酸配列を決定すること；
（ｂ）インビトロまたはインシリコ技術を用いるか生物学的アッセイを用いてペプチドのＭＨＣ分子への結合により測定することを含む任意の方法によりタンパク質のアミノ酸配列内の１つまたは複数の潜在的なＴ細胞エピトープを識別すること；
（ｃ）インビトロまたはインシリコ技術を用いるか生物学的アッセイを用いてペプチドのＭＨＣ分子への結合により測定されたＴ細胞エピトープ活性を実質的に低減するか除去するように、識別された潜在的なＴ細胞エピトープ内において１つまたは複数のアミノ酸を修飾した新規な配列変種を設計すること。この配列変種は、上記の配列変更によって新しい潜在的なＴ細胞エピトープが生成されないように作製され、それには、新たな潜在的なＴ細胞エピトープがＴ細胞エピトープ活性を実質的に低減または除去されるように順次修飾されるようにする。
（ｄ）組換えＤＮＡ技術によってそのような配列変種を構成し、所望の特性を備えた１つまたは複数の変種を識別するために前記変種を試験すること。
【００１１】
合成ペプチドとの組合せで、ヒトまたは実験動物の末梢血試料から得られたＴ細胞クローンと結合し得る組換えＭＨＣ分子の可溶性複合体を開発する他の技術が、当技術分野で使用され［Ｋｅｒｎ，Ｆ．ｅｔ  ａｌ（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ４：９７５−９７８；Ｋｗｏｋ，Ｗ．Ｗ．ｅｔ  ａｌ（２００１）ＴＲＥＮＤＳ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｏｌｏｇｙ  ２２：５８３−５８８］、さらにエピトープ識別戦略において開発されるかもしれない。
【００１２】
潜在的Ｔ細胞エピトープ（ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｅｐｉｔｏｐｅｓ）は、ＭＨＣクラスＩＩ分子に結合する能力を備えた任意のアミノ酸残基配列として一般に定義される。このようなＴ細胞エピトープは、ＭＨＣ結合を起させることで測定できる。一般的な理解では、「Ｔ細胞エピトープ」は、ＭＨＣ分子に結合した際に、Ｔ細胞レセプター（ＴＣＲ）によって認識され、少なくとも原理的には、これらＴ細胞の活性化を引き起こし得るエピトープを意味する。しかし、ＭＨＣクラスＩＩ分子に結合することが判明しているある種のペプチドはタンパク質配列において保持され得ると通常理解されている（このようなペプチドは、最終タンパク質が投与される有機体内で免疫寛容となるためである）。
【００１３】
本発明は、治療目的で同種（ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ）の有機体に導入された可溶性タンパク質は、免疫反応を引き起こし、その可溶性タンパク質に結合するホスト抗体の発生展開をもたらすことがあるという現実上の問題を克服することを想定している。とりわけ１つの例を挙げれば、このタンパク質が内生的に生産されるという事実にもかかわらず多数のヒト患者が抗体を作るインターフェロンアルファ２である［Ｒｕｓｓｏ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ（１９９６）Ｂｉｒｔ.  Ｊ．  Ｈａｅｍ．９４：３００−３０５；Ｓｔｅｉｎ，Ｒ．ｅｔ  ａｌ（１９８８）Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．  Ｊ．  Ｍｅｄ．  ３１８：１４０９−１４１３］。
【００１４】
ＭＨＣクラスＩＩ分子は、ヘルパーＴ細胞の選択および活性化に中心的な役割を果たす高度に多型的なタンパク質のグループである。ヒトの白血球抗原グループＤＲ（ＨＬＡ−ＤＲ）はこのグループタンパク質で優越的なアイソタイプで、本発明の主な焦点である。しかし、アイソタイプＨＬＡ−ＤＱおよびＨＬＡ−ＤＰも同様の機能を果たし、したがって本発明は、これらにも等しく適用可能である。ＭＨＣ  ＨＬＡ−ＤＲ分子はホモダイマーであり、その各「半分」はα鎖とβ鎖からなるヘテロダイマーである。各ヘテロダイマーは、９〜２０個の範囲のアミノ酸長のペプチドに結合するリガンド結合領域を有するが、結合溝に収容できるのは最高９〜１１個のアミノ酸である。リガンド結合領域は、α鎖の１〜８５のアミノ酸およびβ鎖の１〜９４のアミノ酸で構成される。ＤＱ分子は、相同的な（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ）構造を有することが最近示されており、ＤＰ族タンパク質も非常に類似していると予想される。ヒトでは、およそ７０種類の異なるＤＲアイソタイプのアロタイプ（ａｌｌｏｔｙｐｅ）が知られており、ＤＱについては３０種類の異なるアロタイプが、また、ＤＰについては４７種類の異なるアロタイプが知られている。各個人は２〜４個のＤＲ対立遺伝子、２個のＤＱおよび２個のＤＰ対立遺伝子を有する。多数のＤＲ分子の構造が解明されており、それらの構造は、ペプチドの疎水性残基（ポケット残基）と結合する多数の疎水性ポケットを有する開放端のペプチド結合溝を指している［Ｂｒｏｗｎ  ｅｔ  ａｌ  Ｎａｔｕｒｅ（１９９３）３６４：３３；Ｓｔｅｒｎ  ｅｔ  ａｌ（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ  ３６８：２１５］。クラスＩＩ分子の様々なアロタイプを識別する多型は、ペプチド結合溝内の様々な異なるペプチド結合表面に寄与し、集団レベルで外来タンパク質を認識する能力に関する最大の柔軟性を保証し、病原性有機体への免疫反応を引き起こす。
【００１５】
リガンド結合領域には相当な量の多型が存在し、これは異なる地理的な集団および民族グループ内で区別される「ファミリー」を備えている。この多型は、ペプチド結合領域の結合特性に影響し、したがって、ＤＲ分子の異なる「ファミリー」は、幾分かは重複があるかもしれないが、異なる配列特性を備えたペプチドに対して特異性を有するであろう。この特異性は、Ｔｈ細胞エピトープの認識（クラスＩＩ  Ｔ細胞反応）を決定し、これは最終的には、Ｔｈ細胞エピトープが由来するのと同じタンパク質上に存在するＢ細胞エピトープに対する抗体反応を駆動する原因となる。したがって、個人におけるタンパク質への免疫反応は、その個人のＨＬＡ−ＤＲアロタイプのペプチド結合特異性に関する機能としてのＴ細胞エピトープ認識によって重大な影響を受ける。したがって、世界的な人口レベルにおいてタンパク質またはペプチド内のＴ細胞エピトープを識別するためには、ＨＬＡ−ＤＲアロタイプのできるだけ多様なセット（それにより、世界人口のできるだけ高い割合をカバーする）の結合特性を考慮することが望ましい。
【００１６】
免疫反応誘導の主要な要因は、ＭＨＣクラスＩＩ分子上で提示されることによってＴ細胞活性を刺激できるペプチドのタンパク質内の存在である。したがって、免疫性を除去するか低減するためには、Ｔ細胞エピトープを識別しタンパク質から除去することが望ましい。
【００１７】
上に挙げた方法および関連する方法によれば、免疫原性およびアレルギー原性が低減していることが明らかにされた何種類かの生物学的分子、基本的には通常の標的タンパク質および抗体が調製されている。その例は以下の通りである：ＷＯ  ９９／５５３６９（ＳＫＢ）、ＷＯ  ９９／４０１９８およびＷＯ  ９６／２１０１６（Ｌｅｕｖｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ＆  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ＶＺＷ）、ＷＯ  ００／０８１９６（Ｄｕｋｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）、ＷＯ  ９６／２１０３６（Ｃｈｉｒｏｎ  Ｖｉｒａｇｅｎ）、ＷＯ  ９７／３１０２５（Ｃｈｉｒｏｎ  Ｃｏｒｐ．）、ＷＯ  ９８／３０７０６（Ａｌｌｉａｎｃｅ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｃｏｒｐ．）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１８】
上に挙げたこれらのすべての適用例で、免疫応答の誘導が低い単一のタンパク質または抗体が開示されている。しかし、部分的にコンピュータを用いた方法により、前記分子の配列内のＴ細胞エピトープの数を特別に低減することによって、融合タンパク質、特に免疫グロブリン融合タンパク質を完全にまたは部分的に脱免疫化（ｄｅ−ｉｍｍｕｎｉｚｅ）することを示唆する記載は全くない。ＷＯ  ９７／２４１３７（Ｔａｎｎｏｘ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．）では、Ｆｃ部分のＮ−末端とＩＦＮαのＣ−末端との間に非免疫原性リンカー分子を含むＩＦＮα−Ｆｃキメラが開示されている。
【００１９】
したがって、多少なりとも免疫原性を有しかないか、あるいは低い免疫コンジュゲートなどの生物学的分子を提供する必要が依然として存在する。とりわけ、Ｆｃコンジュゲート、好ましくはＦｃ−Ｘキメラ（ここでＸは治療上有益なタンパク質またはポリペプチドから選択される）の提供は特に有益である。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
本発明は以下の４つの一般的な態様に関する：
（ａ）組換えタンパク質または新規タンパク質が免疫原性となりそうな場合、したがって、脱免疫原化法の適用が適切な場合を見極める助けとするため、融合タンパク質および他の人工タンパク質を含む状況に免疫反応メカニズムの詳細を新規に適用すること；
（ｂ）特にヒトに、特に治療用に投与される生物学的に活性な新規人工タンパク質；
（ｃ）通常、免疫原性が増強されている人工タンパク質において、１個または複数のＴ細胞エピトープ候補を識別し、１個または複数のＴ細胞エピトープを除去するように変異を導入することを含む、改善され免疫原性が低減された人工タンパク質の設計方法、および
（ｄ）世界的に多様な数のＭＨＣクラスＩＩ分子についてＴ細胞エピトープを識別し計算する便利かつ有効な計算方法、およびこの知識に基づき、改善された特性を備えた生物学的分子の新しい配列変種の設計および構築方法。一旦、Ｔ細胞エピトープが人工タンパク質において識別されたならば、それらは（ｃ）に記載の変異によって除去される。
【００２１】
免疫系細胞上の表面レセプターに結合可能な成分を有する人工タンパク質は、一般に特に免疫原性である。免疫細胞表面レセプターに結合する部分を有する結果として免疫原性である人工タンパク質は、免疫原性を低減させる本発明方法の特に良い候補である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
特定の理論に拘束されるものではないが、図１〜６は、Ｆｃレセプター、サイトカインレセプターまたはオリゴ糖レセプターなどの免疫細胞表面レセプターに結合する部分を含んでいる人工タンパク質の概略を示す。
【００２３】
本発明の１つの方法は、免疫細胞表面レセプターに結合する部分を含む人工タンパク質を識別し（これは配列検査により行なうことができる）、人工タンパク質中のＴ細胞エピトープ候補を識別し、Ｔ細胞エピトープの数を低減した人工タンパク質の変異誘導体を設計し、１個または複数の変異誘導体を生産し、変異誘導体について活性および場合によっては他の所望の特性を試験し、Ｔ細胞エピトープの低減度、保持された活性、および、場合によっては、他の保持された所望の特性が最適のバランスを有する変異誘導体を選択するステップからなる。他の所望の特性としては、これらに限定されるものではないが、薬物動態学的特性およびタンパク質発現および製造特性（ａｓｓｅｍｂｌｙ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ）が挙げられる。
【００２４】
凝集体を形成する傾向がある人工タンパク質は発明の方法によって改善することができる別のカテゴリーのタンパク質である。
【００２５】
本発明によって特に改善することができる人工タンパク質の１つのクラスは、Ｆｃ−ＸおよびＸ−Ｆｃ融合タンパク質と同様に全抗体を含む融合タンパク質などのＩｇ融合タンパク質である。特に、本発明の方法により、機能的なＦｃレセプター結合サイトを含む免疫グロブリン融合タンパク質を特に改善できる。
【００２６】
本発明は、腫瘍特異的抗原、他の組織特異的抗原または他の疾病特異的抗原を認識するＶ領域を含む融合タンパク質を含む、そうした抗体融合タンパク質の改善形を提供する。１つの好ましい実施形態では、これらの抗体は各々がＩＬ−２などのサイトカインに融合される。
【００２７】
例えば、本発明は、腫瘍指向性（ｔｕｍｏｒ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ）抗ＥｐＣＡＭ抗体ＫＳ  １／４、および抗ＧＤ２抗体１４．１８を含む融合タンパク質であって、抗体のＶ領域がＴ細胞エピトープを除去する変異を含むものを提供する。
【００２８】
別個の実施形態では、抗体部分に融合される部分は、Ｔ細胞エピトープが除去されるように変異される。例えば、本発明は、Ｔ細胞エピトープを除去するようにＩＬ−２部分が変更された抗体−ＩＬ−２融合タンパク質を開示する。
【００２９】
著しく改善することができるＩｇ融合タンパク質の別の一般的なクラスはＦｃ−ＸおよびＸ−Ｆｃ融合タンパク質である。特定の理論に拘束されるものではないが、これらのタンパク質は特に免疫原性であると考えられる。それは、通常、未変更の抗体においては軽鎖により何らかの立体滴保護を受けているＦｃレセプター結合サイトが露出しているからである。いずれにせよ、Ｆｃ融合タンパク質が融合パートナー単独よりも免疫原性となり得ることは実験的に確認されている（ＷＯ０１／０７０８１）。
【００３０】
免疫原性融合タンパク質の別のクラスはサイトカインに融合されたタンパク質である。特定の理論に拘束されるものではないが、これらのタンパク質は特に免疫原性となり得る。融合パートナータンパク質が免疫細胞、例えば融合パートナータンパク質を認識する抗体を持つ細胞に結合するとき、サイトカインは、ある種の方法で細胞を刺激するからである（図４を参照）。
【００３１】
特に免疫原性の人工タンパク質のクラスは正常なタンパク質であるが不適当なオリゴ糖を含むものである。例えば、免疫細胞上の特定のレセプターによって結合されるオリゴ糖を含むタンパク質は、多くの場合に免疫原性であることがわかっている。例えば、タンパク質、好ましくは、リソソーム記憶の不調を治療するために使用できる、ベータ−グルコセレブロシダーゼのようなタンパク質は、高マンノースオリゴ糖を含んでいる。このような免疫原性タンパク質は本発明によって修飾された時、免疫原性の著しい低減を示す。
【００３２】
本発明は、融合タンパク質に組み入れられる以下のタンパク質部分の免疫原性の低減された形態を提供する：エリスロポエチン、レプチン（ｌｅｐｔｉｎ）、ケラチノサイト（ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ）成長因子、Ｇ−ＣＳＦ  ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１Ｒアンタゴニスト、ｓＴＮＦＲ、ＴＮＦ阻害剤、ｓＴＮＦＲ−Ｆｃ（Ｅｎｂｒｅｌ（登録商標））、ＢＮＴＦ、ＣＮＴＦ、インターフェロンファミリーのメンバー、ｈＧＨ、β−グルコセレブロシダーゼ。ここに挙げたこれらすべての生物学的に活性なタンパク質部分は、本発明によるよく知られた非修飾（親の）タンパク質部分に由来する。
【００３３】
本発明によって修飾されたタンパク質は、「発明の詳細な記載」中に示す方法によって生産することができる。この方法は、計算上の手段（コンピュータ手段）によるＴ細胞エピトープの新規な識別方法を含んでいる。この方法のステップは、本発明に従って行なうことが好ましく、実施例１により詳細に記載される。
【００３４】
本発明は、本発明の好ましい実施形態として、親の融合タンパク質に由来する変更または修飾された融合タンパク質であって、前記親の融合タンパク質が実質的に免疫グロブリン分子またはその断片と非免疫グロブリン標的ポリペプチド（Ｘ）とからなり、後者はそのＮ−末端によって免疫グロブリン分子またはその断片のＣ末端に好ましくは連結されており、変更された融合タンパク質は前記親の融合タンパク質のそれと異なるアミノ酸配列を有し、所与の種（好ましくは人間）の免疫系にさらされたときに親の融合タンパク質よりも低減された免疫性を示すものを開示し特許請求の範囲に記載する。
【００３５】
本発明によって実際上用いられる戦略を、抗体サイトカイン融合を例として詳細に説明する。これらの一般的な戦略は以下を含む：
・融合タンパク質中でアミノ酸配列を検討し、胸腺中でのＴ細胞の否定的選択（ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）の間に期待される存在および豊富さに基づいて、免疫原性の可能性に関してそれらに優先順位を付ける。例えば、完全に非自己エピトープは識別され、変異によるＴ細胞エピトープ除去では最高の優先順位となる。Ｔ細胞エピトープ除去について最低の優先順位となるのは、抗体定常領域または再配列されない抗体Ｖ領域で見出される配列など、血清中に豊富に存在するタンパク質である。変異によるＴ細胞エピトープの除去について中間の優先順位とされるのは、サイトカインなど、豊富ではないが存在するタンパク質で見出される自己配列である。特定の理論に拘束されるものではないが、豊富ではないが存在するタンパク質は、否定的Ｔ細胞選択を促進するには十分な量では胸腺中には存在せず、したがって、非自己Ｔ細胞エピトープと認識されるのかもしれない。
・変異によるＴ細胞エピトープ除去のために領域を選択する場合、それは、豊富なタンパク質中の天然に存在するヒト配列と比較される。変異はいずれかの非自己配列を自己配列により類似させるように導入する。例えば、マウスＶ領域の免疫性を低減するために、配列を再配列されないヒトＶ領域と比較し、最も密接に関連する配列を見出す。いくつかのアミノ酸をマウスからヒトに変換する「化粧張り」（ｖｅｎｅｅｒｉｎｇ）変化を導入する。これは、いくつかの非自己Ｔ細胞エピトープを自己Ｔ細胞エピトープに変換する効果があり、米国特許第５７１２１２０号によって開示された免疫原性を低減する方法であり、またさらにいくつかのＢ細胞エピトープを除去する効果がある。しかし、超可変領域配列に由来するＴ細胞エピトープを除去することが依然必要である。
・残るＴ細胞エピトープの大部分またはすべてを除去するために、上に定義したコンピュータベースの基準によって変異を導入して、ペプチドがＭＨＣクラスＩＩ分子の溝に結合することを防ぐ。抗体Ｖ領域の場合には、抗原結合への干渉を回避するためにＣＤＲ自体の外部に位置する変化を導入することが望ましい。
・任意のタイプの融合タンパク質の場合には、一般に融合結合部は非自己Ｔ細胞エピトープを含む。これらのＴ細胞エピトープも変異によって除去してよい。
【００３６】
特定の実施形態として、本発明には、キメラ免疫グロブリンまたはその断片が含まれ、それらにおいては、低減された免疫原性、Ｔ細胞エピトープの数の減少またはＭＨＣクラスＩＩ分子に結合するペプチドの数の減少が、変更された融合タンパク質の免疫グロブリン部分に対してのみならず標的ポリペプチド部分Ｘにも位置する。
【００３７】
本発明は、免疫グロブリン分子および非免疫グロブリン標的ポリペプチド（Ｘ）をリンカー分子（Ｌ）を介して融合した、本発明によって定義されるキメラ免疫グロブリンを含む。本発明の特定の実施形態として、このリンカー分子はそれ自身免疫原性を有しないか、免疫原性が低減されている。したがって、本発明はリンカー分子だけが脱免疫された免疫コンジュゲートを含んでもよい。免疫原性が低減されているか免疫原性を有しないリンカー分子は当技術分野において知られており、あるいは知られた方法によってまたは本発明による方法によって調製できる。本発明はさらに、融合分子の標的タンパク質（Ｘ）部分と同様に免疫グロブリン部分も、また、場合によっては、リンカー分子および結合領域（以下を参照）の免疫原性が修飾されたそのような免疫グロブリン融合タンパク質を含む。あるいは、分子の１個だけまたは複数だがすべてではない部分だけが本発明によって修飾される。
【００３８】
本発明は、さらに、基本的にはいずれの免疫グロブリンクラスから由来したものでものよい前記免疫コンジュゲートに関する；しかし、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）が好ましい。本発明は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４に由来するキメラ免疫グロブリンを提供することを目的とする。ＩｇＧ１とＩｇＧ２免疫グロブリンが好ましい；ＩｇＧ２免疫グロブリンが最も好ましい。
【００３９】
ヒト起源の組換えタンパク質でもヒト化抗体でも、人体において不適当な免疫反応を誘発し得ることが示されているため、本発明は、免疫グロブリン部分および標的ポリペプチド部分（Ｘ）が非ヒトのみならずヒト由来のものから選択され得る融合タンパク質を提供することを目的とする。ヒト化された分子またはヒトに由来する分子は、通例、Ｔ細胞エピトープの数はより少ないので、修飾しなければならないアミノ酸残基数がより少ないため、そのような分子は脱免疫には好ましい。
【００４０】
本発明による免疫コンジュゲート（免疫グロブリン（Ｉｇ）融合タンパク質）は、さらに、ｓＦｖ、Ｆａｂ，Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２およびＦｃ抗体の断片を含む。免疫グロブリン部分が抗体のＦｃ領域、好ましくはＩｇＧ１またはＩｇＧ２抗体である上に定義したおよび下記の融合タンパク質を提供することは、本発明の特定的かつ好適な目的である。本発明によってＦｃレセプターへの親和性が低減されたＦｃ−Ｘ分子は、本発明の好適対象物である。Ｆｃレセプターに対して親和性が低減したＦｃ分子は当技術分野ではよく知られており、Ｆｃ領域のアミノ酸配列の修飾により調製できる（例えばＷＯ  ９９／４３７１３）。
【００４１】
本発明は詳細には以下のものを指す：
・実質的に、第１のタンパク質／ポリペプチドおよび第２のタンパク質／ポリペプチドからなり、第１のタンパク質は免疫グロブリン分子またはその断片であり、第２のタンパク質／ポリペプチドは非免疫グロブリン標的ポリペプチド（Ｘ）であって、各々は他方に直接またはリンカー分子を介して連結され；修飾された前記融合タンパク質は、前記親の融合タンパク質のアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を有し、アミノ酸配列内のＴ細胞エピトープの数が低減されているため、所与の種の免疫系にさらされた時、前記親の融合タンパク質と比較して低減された免疫原性を示す親の融合タンパク質に由来する免疫原性が修飾された融合タンパク質；
・対応する融合タンパク質（ここで、Ｔ細胞エピトープはＭＨＣクラスＩＩ分子結合基に結合し得るペプチド配列である）；
・対応する融合タンパク質（ここで、標的ポリペプチド（Ｘ）はそのＮ−末端によって免疫グロブリン部分のＣ−末端に連結する）；
・対応する修飾された融合タンパク質（ここで、所与の種は人間である）；
・対応する融合タンパク質（ここで、融合成分はリンカー分子Ｌを介して融合される）；
・請求項４による修飾された融合タンパク質（ここで、前記リンカー分子Ｌは非免疫原性であるか免疫原性が低減されている）；
・対応する融合タンパク質（ここで、免疫グロブリン部分のＣ−末端領域および非免疫グロブリン標的ポリペプチド（Ｘ）のＮ−末端領域によって表わされる結合領域はＴ細胞エピトープを有しないかその数が低減されている；
・対応する融合タンパク質（ここで、免疫グロブリン部分またはその断片、または、標的ポリペプチド（Ｘ）部分は免疫原性が低減されている）；
・対応する融合タンパク質（ここで、前記免疫グロブリン分子またはその断片が、ＩｇＧ１またはＩｇＧ２である）；・
・対応する融合タンパク質（ここで、前記免疫グロブリン断片はＦｃ部分であり、ここで、好ましくは、Ｆｃ部分はＦｃレセプターに対して親和性が低減されている）；
・下記式を有する免疫原性の修飾された融合タンパク質：
Ｆc−Ｌn−Ｘ
（式中、
Ｆc    は免疫グロブリン分子（抗体）のＦｃ部分であり、
Ｘ    は非免疫グロブリン標的ポリペプチドであり、
Ｌ    はリンカーペプチドであり、
ｎ    は０または１であり、
ここで、Ｘおよび／またはＬは、親の分子と比較して、誘導する免疫原性が低減されたアミノ酸残基修飾を含む）。
【００４２】
これらの免疫原性の修飾されたＦｃ融合分子の好ましい実施形態は以下のものである：
Ｆｃ−Ｘm（Ｘだけが修飾されている）、
Ｆｃ−Ｌm−Ｘm（ＸとＬが免疫原性が低減するように修飾されている）、
Ｆｃ−Ｘm（ＸおよびＸとＦｃとＬの間の結合領域が修飾されている）、
Ｆｃ−Ｌm−Ｘm（ＸとＬおよびＸとＦｃとＬとの間の結合領域が修飾されている）；
・対応するＦｃ−Ｌ−Ｘ融合タンパク質（ここで、少なくともＸが免疫原性に関して修飾されている）；
・下記式を有する免疫原性の修飾された融合タンパク質：
Ａ−Ｌn−Ｘ
（式中、
Ａ  は抗体全体またはｓＦｖ、Ｆａｂ，Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）2断片；
Ｘ  は非免疫グロブリン標的ポリペプチド；
Ｌ  はリンカーペプチド；
ｎ  ＝０または１であり、
ここで、Ａおよび／またはＸおよび／またはＬは、親の分子と比較して低減された免疫原性を誘導するアミノ酸残基修飾を含む）。
【００４３】
これら免疫原性の修飾された融合分子の好ましい実施形態は次のとおりである：
Ａ−Ｘm（Ｘだけ、場合によってはＸとＡとの間の結合領域が修飾されている）、
Ａm−Ｘm（ＡとＸ、場合によってはＡ−Ｘ結合領域が修飾されている）、
Ａ−Ｌm−Ｘm（ＸとＬだけが免疫原性が低減するように修飾されている）、
Ａm−Ｘ（Ａだけ、場合によってはＡ−Ｘ結合領域が免疫原性が低減するように修飾されている）；
Ａm−Ｌm−Ｘm（Ａ、ＬとＸ、場合によってはＡ−Ｌ−Ｘ結合領域が免疫原性について修飾されている）、
・対応するＡ−（Ｌ）−Ｘ融合分子（少なくともＸまたはＡが免疫原性について修飾されている）；
・対応する融合タンパク質。ここで、Ａは以下の群から選択される：
抗−ＥＧＦレセプター（ＨＥＲ１）抗体
抗−ＨＥＲ２抗体
抗−ＣＤｘ抗体（ここで、ｘは１〜２５の整数である）
抗−サイトカインレセプター抗体
抗−１７−１Ａ抗体、
抗−ＫＳＡ抗体
抗−ＧＰ  ＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体
抗−インテグリン（ｉｎｔｅｇｒｉｎ）レセプター抗体
抗−ＶＥＧＦレセプター抗体；
・対応する融合タンパク質。ここで、抗体は以下の群から選択される：
モノクローナル抗体２２５および誘導体、
モノクローナル抗体４２５および誘導体
モノクローナル抗体ＫＳ  １／４および誘導体
モノクローナル抗体１４．１８、また誘導体
モノクローナル抗体４Ｄ５／ＨＥＲ２（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標））および誘導体
モノクローナル抗体１７−１Ａおよび誘導体
モノクローナル抗−ＣＤ３抗体
モノクローナル抗体７Ｅ３および誘導体
モノクローナル抗体ＬＭ６０９、Ｐ１Ｆ６および１４Ｄ９．Ｆ８および誘導体
モノクローナル抗体ＤＣ−１０１および誘導体
モノクローナル抗−ＩＩ−２Ｒ抗体（Ｚｅｎａｐａｘ（登録商標））および誘導体
・対応する融合タンパク質。ここで、標的ポリペプチドＸは以下の群から選択される：
サイトカイン、インテグリン（ｉｎｔｅｇｒｉｎ）阻害剤、可溶性サイトカインレセプター、糖タンパク質、ホルモン、糖タンパク質ホルモン、レプチン、成長ホルモン、成長因子、抗血友病因子（ａｎｔｉhｈａｅｍｏｐｈｉｌｉｃ  ｆａｃｔｏｒｓ）、抗原、サイトカインレセプターアンタゴニスト；
・対応する融合タンパク質。ここで、標的ポリペプチドＸは以下の群から選択される：
ＩＬ−２、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＥＰＯ、ＴＰＯ、インターフェロンファミリーのメンバー、ＴＮＦα、可溶性ＴＮＦレセプター、ＩＬ−１２、ＩＬ−８、因子ＶＩＩＩ、ＦＧＦ、ＴＧＦ、ＥＧＦ、ＶＥＧＦ、ＰＭＳＡ、ＩＧＦ、インシュリン、ＲＧＤペプチド、エンドスタチン（ｅｎｄｏｓｔａｔｉｎ）、アンギオスタチン（ａｎｇｉｏｓｔａｔｉｎ）、ＢＤＮＦ、ＣＮＴＦ、タンパク質ｃ、因子ＶＩＩＩおよびＩＸ並びにこれらの生物学的に活性な断片、
・以下の群から選択される、より特定された対応する融合タンパク質：
ＭＡｂ  ＫＳ  １／４−ＩＬ２、ＭＡｂ  １４．１８−ＩＬ２
ＭＡｂ  ４２５−ＩＬ２、ＭＡｂ  ｃ４２５−ＩＬ２、ＭＡｂ  ｈ４２５−ＩＬ２、ＭＡｂ  ４２５−ＴＮＦａ
ＭＡｂ  ２２５−ＩＬ２、ＭＡｂ  ｃ２２５−ＩＬ２
ＭＡｂ  ４Ｄ５−ＩＬ２、ＭＡｂ  ＤＣ１０１−ＩＬ２、ＭＡｂ  ＬＭ６０９−ＩＬ２、
Ｆｃ−ＩＬ２、Ｆｃ−ＴＮＦａ、Ｆｃ−Ｇ−ＣＳＦ、Ｆｃ−ＥＰＯ、Ｆｃ−レプチン、Ｆｃ−ＫＧＦ、
Ｆｃ−ＢＦＮＦ、ＦＣ−β−セレブロシダーゼ、Ｆｃ−ＴＰＯ、Ｆｃ−ＧＭ−ＣＳＦ；
・以下の群：
（ｉ）Ｙ−（Ｌ）−Ｘ（ここで、Ｙはサイトカインであり、Ｘ、（Ｌ）は上に定義されるような分子である）、
（ｉｉ）Ｐ−（Ｌ）−Ｘ（ここで、Ｐは通常でないグルコシル化部分を備えたタンパク質であり、Ｘおよび（Ｌ）は上に定義されるような分子である）、
（ｉｉｉ）Ａ−（Ｌ）−Ｘ（ここで、Ａ、Ｘ（Ｌ）上に定義されるような分子である）、
から選択され、親の人工タンパク質のアミノ酸配列とは異なり、所与の種の免疫系に曝露された時親の融合タンパク質に対してＴ細胞エピトープ数が減少しているため低減された免疫原性を示すアミノ酸配列を有する免疫原性の修飾された人工タンパク質分子であり、前記Ｔ細胞エピトープは、本発明で特定される方法によって得ることができるかまたは得られるＭＣＨクラスＩＩ分子結合基に結合し得るペプチド配列である。
・上および以下に特定されるいずれかの融合タンパク質をコードするＤＮＡ配列；
・以下を含む対応する融合タンパク質をコードするＤＮＡ配列；
（ｉ）シグナル配列
（ｉｉ）ＩｇＧｌ、ＩｇＧ２またはＩｇＧ３抗体のすべての領域またはＦｃ、ｓＦＶ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’またはＦ（ａｂ’）２領域をコードするＤＮＡ配列；および
（ｉｉ）ポリペプチド（Ｘ）をコードするＤＮＡ配列、そして場合によっては
（ｉｉｉ）リンカー分子をコードするＤＮＡ配列；
・対応するＤＮＡ配列を含む発現ベクター；
・上および以下に特定される融合タンパク質を、場合によっては、適当な担体、賦形剤または希釈剤または他の治療上有効な薬剤（例えば、化学療法剤または細胞毒性剤など）含む医薬組成物；
・以下のステップ：
（ｉ）親の融合タンパク質またはその一部のアミノ酸配列を決定すること；
（ｉｉ）インビトロまたはインシリコ技術を用いるか生物学的アッセイを用いてペプチドのＭＨＣ分子への結合により測定することを含む任意の方法により融合タンパク質のアミノ酸配列内の１つまたは複数の潜在的なＴ細胞エピトープを識別すること；（ｉｉｉ）Ｔ細胞エピトープ配列の活性または数および／または前記生物学的分子から誘導されるペプチドを結合することができるＭＨＣ分子アロタイプの数（これらはインビトロまたはインシリコ技術を用いるか生物学的アッセイを用いてペプチドのＭＨＣ分子への結合、またはペプチド−ＭＨＣ複合体のＴ細胞への結合により測定される）を実質的に低減するか除去するように修飾して、最初に識別されたＴ細胞エピトープ配列内の少なくとも１個のアミノ酸残基を変更することにより新規な配列変種を設計すること；（ｉｖ）組換えＤＮＡ技術によってそのような配列変種を構成し、所望の特性を備えた１つまたは複数の変種を識別するために前記変種を試験すること；および（ｖ）場合によってはステップ（ｉｉ）〜（ｉｖ）を繰り返すこと；
を含むことで特定される免疫原性の修飾された融合タンパク質の製造方法であって、ステップ（ｉｉ）によるＴ細胞エピトープ配列の識別が
（ａ）知られているアミノ酸残基配列を有するペプチド領域を選択すること；（ｂ）予め定義した均一サイズを有し、少なくとも３個のアミノ酸残基によって構成される重複したアミノ酸残基セグメントを選択された領域から連続的に採取すること；（ｃ）採取された前記セグメント中に存在する個々の疎水性アミノ酸残基側鎖に対し割り当てられた値を合計することにより、採取された前記セグメントの各々についてＭＨＣクラスＩＩ分子結合スコアを計算すること；および（ｄ）実質的にペプチドの治療上の有用性を低減させずに、ペプチドに対するＭＨＣクラスＩＩ結合スコア全体を変更するために、そのセグメントについて計算されたＭＨＣクラスＩＩ分子結合スコアに基づいて、修飾に適した前記セグメントの少なくとも１つを識別することにより実行されることを特徴とする方法；
・ステップ（ｃ）を、好ましくは、１２−６ファンデアワールスのリガンド−タンパク質エネルギー反発項（１２−６  Ｖａｎ  Ｄｅｒ  Ｗａａｌ’ｓ  ｌｉｇａｎｄ−ｐｒｏｔｅｉｎ  ｅｎｅｒｇｙ  ｒｅｐｕｌｓｉｖｅ  ｔｅｒｍ）およびリガンドコンホメーションエネルギー項を含むように修飾されたベームスコアリング関数（Ｂｏｅｈｍ  ｓｃｏｒｉｎｇ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ）を用い、（１）ＭＨＣクラスＩＩ分子モデルの第１のデータベースを提供すること；（２）前記ＭＨＣクラスＩＩ分子モデルについて許容されるペプチド骨格の第２のデータベースを提供すること；（３）前記第１のデータベースからモデルを選択すること；（４）前記第２のデータベースから許容されるペプチド骨格を選択すること；（５）採取された各セグメント中に存在するアミノ酸残基側鎖を識別すること；（６）採取された各セグメント中に存在するすべての側鎖について結合親和性値を決定すること；および（７）場合によっては、前記各モデルと各骨格についてステップ（１）〜（５）を繰り返すことによって実行する対応する方法；
・採取されたアミノ酸残基セグメントが１３個のアミノ酸残基および／または１〜５個のアミノ酸残基の重複した連続する採取されたアミノ酸残基からなる対応する方法；
・本来存在するＴ細胞エピトープ配列中のいずれかにおいて１〜９個のアミノ酸残基、好ましくは１つのアミノ酸残基が変更される対応する方法；
・アミノ酸残基の変更が、特定の位置において本来存在するアミノ酸残基を他のアミノ酸残基によって置換、追加または欠失させるものである対応する方法；
・前記生物学的分子の生物学的活性を回復するために、置換、欠失または追加によるさらに一層による変更が行なわれる対応する方法。
【００４４】
本発明によるポリペプチドは、ＰＭＳＡその他の抗原も含む。望ましくない、また、強過ぎる免疫反応を誘導する抗原を、本発明の方法によって修飾することができ、低減されているが、抗原（例えば、ワクチン）として使用するのには十分に強い免疫原性を有する抗原を得ることができる。本発明はさらに、基本的には同じ生物学的活性および同様（低減された）免疫原性を有する、特定のポリペプチド、タンパク質、融合タンパク質、免疫グロブリンまたは免疫コンジュゲートの変種その他の修飾を含む。上に言及したタンパク質はすべてよく知られており、当技術分野において記述され、既に市販されている。それらのうちのほとんどは証明された治療上の利益を有することが知られている。リーダー配列またはシグナル配列およびリンカー配列を用いてもよい。
【００４５】
免疫グロブリン成分をそのＣ−末端またはその断片によって非免疫グロブリン標的ポリペプチド（Ｘ）Ｎ−末端に、場合によっては上記ステップ（ｉｉ）によるリンカー分子を介して連結することにより、融合タンパク質を製造することは、以下によって実行される：
（ｉ）ポリペプチドＸをコードするＤＮＡ配列、免疫グロブリン分子またはその断片［ｓＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）2、Ｆｃ］をコードするＤＮＡ配列、および場合によってはリンカー分子をコードするＤＮＡ配列を含む遺伝子構成体（ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ）を調製すること、および
（ｉｉ）遺伝子を発現システムによって発現すること。
【００４６】
本発明による免疫コンジュゲートは強化された特性を有することが明らかになった。したがって、タンパク質分解の低減、安定性の増大および強化された血清循環半減期を、明確に低減された免疫原性および／またはアレルギー原性とともに測定することができる。予想外なことに、免疫原性の低減は、特に本発明によるＦｃ−Ｘ分子が使用されるときには多くの場合、半減期をさらに増大させる。免疫原性の低減は、修飾されていない融合タンパク質と比較して、本発明による融合タンパク質を所与の種においてより許容性の高いものとし、したがって、必要な場合より高用量で投与することができる。
（発明の詳細な説明）
「Ｔ細胞エピトープ」という用語は、本発明による理解によれば、然るべき程度にＭＨＣクラスＩＩ分子（またはヒト以外の種におけるその等価物）に結合可能で、Ｔ細胞を刺激するかつ／または（必ずしも測定可能な程度に活性化せずに）ＭＨＣクラスＩＩとの複合体中でＴ細胞と結合可能なアミノ酸配列を意味する。
【００４７】
本明細書および添付する特許請求の範囲において「ペプチド」という用語は、２個以上のアミノ酸を含む化合物である。アミノ酸は、ペプチド結合（以下に定義される）によって互いに連結される。ペプチドの生物学的生産に関わる２０個の異なる天然アミノ酸が存在し、これらが任意の数、任意の順序で連結して、ペプチド鎖または環を形成する。ペプチドの生物学的生産で使用される天然アミノ酸はすべてＬ‐配置である。合成ペプチドは、Ｌ−アミノ酸、Ｄ−アミノ酸またはこれら２種の異なる配置のアミノ酸の様々な組合せを使用して従来の合成方法を用いて調製できる。ペプチドによっては数単位のアミノ酸しか含まないものもある。短いペプチド、例えば、アミノ酸単位が１０個未満のものは、時に「オリゴペプチド」と呼ばれる。他のペプチドは多数のアミノ酸残基、例えば、１００まであるいはそれ以上の個以上を含み、「ポリペプチド」と呼ばれる。従来、「ポリペプチド」は、３個以上のアミノ酸を含む任意のペプチド鎖と考えられ、「オリゴペプチド」は通常、特に「短い」タイプのポリペプチドと見なされる。したがって、本願では、「ポリペプチド」へのどのような言及もオリゴペプチドを含むと理解される。さらに、「ペプチド」へのどのような言及もポリペプチド、オリゴペプチドおよびタンパク質を含む。アミノ酸の個々の異なる配置は異なるポリペプチドまたはタンパク質を形成する。形成することができるポリペプチドの数、したがって異なるタンパク質の数は、実際上、無制限である。
【００４８】
これまでに使用し以下に使用する「免疫原性のより低い、あるいは低減された」という用語は、相対的な用語である。これは、本発明によって修飾された分子と、同じタイプの種の生体内で曝露された時にそれぞれの本来の出所分子が示す免疫原性との比較に関する。本発明において「修飾されたタンパク質」という用語は、Ｔ細胞エピトープの数が低減され、したがって所与の種の免疫系に曝露された時、親のタンパク質に対して誘発される免疫原性が低減されたタンパク質をいう。
【００４９】
本発明において「修飾されていないタンパク質」という用語は、「修飾されたタンパク質」と比較して「親の」タンパク質をいうもので、多数のＴ細胞エピトープを有し、したがって、所与の種の免疫系にさらされた時、修飾されたタンパク質に比べ強い免疫原性を有する。
【００５０】
本明細書および特許請求の範囲で使用する「生物学的に活性なタンパク質」という用語は、本発明によれば、ポリペプチド、タンパク質、抗体などの免疫グロブリン、抗体断片、融合タンパク質、酵素、抗原などを含み、特に断らない限り、それは生物学的および／または治療上の効果を誘導する。
【００５１】
本発明において「サイトカイン」という用語は、細胞によって生産され分泌され、そのサイトカインに対するレセプターを有する細胞の特定の反応を誘い出すタンパク質、その類似体およびその断片について記載するために用いられる。好ましくは、サイトカインは、インターロイキン−２（ＩＬ−２）などのインターロイキン、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）などの造血因子、ＴＮＦａなどの腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）およびリンホトキシンなどのリンホカインを含む。好ましくは、本発明の抗体−サイトカイン融合タンパク質はサイトカインの生物学的活性を示す。基本的には、本発明は、そのレセプターコードによって最近分類された（Ｉｎｇｌｏｔ、１９９７、Ａｒｃｈｉｖｕｍ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉａｅ  ｅｔ  Ｔｈｅｒａｐｉａｅ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｉｓ（４５）：３５３）サイトカインをすべて包含する。
【００５２】
「単一鎖Ｆｖ」または「ｓｃＦｖ」という語句は、伝統的な２本鎖抗体の重鎖および軽鎖が連結されて１本鎖を形成する抗体を指す。典型的には、リンカーペプチドは、適切なフォールディングを可能とし活性な結合サイトを生成するように２本鎖間に挿入される。
【００５３】
本発明の中で使用する「Ｆｃ領域（Ｆｃ  ｒｅｇｉｏｎ）」または「Ｆｃ領域（Ｆｃ  ｄｏｍａｉｎ）」という用語は、免疫グロブリン重鎖定常領域のカルボキシル末端部分、またはＦｃレセプターを結合することができるその類似体もしくは部分を意味するものと理解される。知られているように、各免疫グロブリン重鎖定常領域は４つまたは５つの領域を含む。領域は順番に以下のように名付けられている：ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３（−ＣＨ４）。ＣＨ４はＩｇＭ（これはヒンジ領域を持っていない）中に存在する。本発明の実施において有用な免疫グロブリン重鎖定常領域使用は好ましくは免疫グロブリンヒンジ領域を含み、好ましくはＣＨ３領域も含む。免疫グロブリン重鎖定常領域は最も好ましくは、免疫グロブリンヒンジ領域、ＣＨ２領域およびＣＨ３領域を含む。したがって、本発明において好ましいＦｃ領域は、ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３領域からなる。本明細書において、免疫グロブリン「ヒンジ領域」という用語は、免疫グロブリンヒンジ領域全体または第２の免疫グロブリンヒンジ領域と１個または複数のジスルフィド結合を形成するのに十分な免疫グロブリンヒンジ領域の少なくとも一部を意味すると理解される。
【００５４】
本発明において、「シグナル配列」という用語は融合タンパク質の分泌を指示し、その後宿主細胞中で翻訳後に開裂するセグメントを意味するために理解される。本発明のシグナル配列は、小胞体の薄膜を横切ってタンパク質の輸送を始めるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドである。本発明において有用なシグナル配列は、抗体軽鎖シグナル配列、例えば抗体１４．１８（Ｇｉｌｌｉｅｓ  ｅｔ．ａｌ．（１９８９）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．１２５：１９１）および当技術分野で知られている他のシグナル配列（例えばＷａｔｓｏｎ，１９８４，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １２：５１４５参照）を含む。
【００５５】
「変異体または変種」という用語は、特定のタンパク質に関して使用され、人体内において問題のタンパク質と同じ活性を実質的に保持する、関連タンパク質の一部欠失体（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）または他の誘導体などの任意の分子を包含する。こうした他の誘導体は、アミノ酸の追加、欠失、置換または再配置や化学的修飾により調製できる。
【００５６】
好適な免疫グロブリン重鎖定常領域は、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭと呼ばれる免疫グロブリンクラスのいずれに属する抗体に由来するものでもよいが、ＩｇＧクラスに由来する免疫グロブリン重鎖定常領域が好ましい。
【００５７】
さらに、免疫グロブリン重鎖定常領域は、当技術分野でＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４と呼ばれるＩｇＧ抗体サブクラスのうちのいずれに由来するものでもよいと考えられる。免疫グロブリン重鎖定常領域は、免疫グロブリンクラス中で相互相同性を有する。例えば、ＩｇＧのＣＨ２領域はＩｇＡとＩｇＤのＣＨ２領域およびＩｇＭとＩｇＥのＣＨ３領域と相同である。適当な免疫グロブリン重鎖定常領域の選択は、米国特許第５，５４１，０８７号および米国特許第５，７２６，０４４号に詳細に議論されている。特別の結果を達成するため、ある免疫グロブリンクラスおよびサブクラスからの特定の免疫グロブリン重鎖定常領域配列の選択することは、当業者のなし得るレベル内にあると考えられる。場合によっては、免疫グロブリン重鎖定常領域を、例えば、ある活性、例えば、抗体の補体結合（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ  ｆｉｘｉａｔｉｏｎ）や抗体依存細胞仲介細胞毒性（ＡＤＣＣ：ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｃｅｌｌ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）刺激を低減させるか除去するように、遺伝子工学または他の手法によってなされる変異、欠失その他により修正することが好ましい。
【００５８】
Ｆｃ領域は、免疫グロブリン重鎖定常領域が検知できる抗体応答を生成しない場合、免疫原性がないか、弱いと考えられる。
【００５９】
さらに、免疫グロブリン重鎖定常領域内のアミノ酸の置換や欠失は、本発明を実施する上で有用であろうと考えられる。一例としては、上部ＣＨ２領域でアミノ酸置換を導入してＦｃレセプターへの親和性を低減させたＦｃ変種を形成することが考えられる（Ｃｏｌｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５９：３６１３）。生体内循環半減期が増大された抗体に基づく融合タンパク質は、Ｆｃレセプターへの親和性が低減された融合タンパク質を構築し、Ｆｃレセプターに結合する抗体アイソタイプからの配列の使用を避けることにより得ることができる（ＷＯ  ９９／４３７１３）。例えば、４種の知られたＩｇＧ  アイソタイプのうち、ＩｇＧ１（Ｃγｌ）およびＩｇＧ３（Ｃγ３）はＦｃＲγ１と高い親和性をもって結び付くことが知られており、一方、ＩｇＧ４の結合親和性は１０分の１であり、ＩｇＧ２（Ｃγ２）はＦｃＲγ１に結合しない。したがって、Ｃγ２の定常領域（Ｆｃ領域）またはＣγ４  Ｆｃ領域を有する融合タンパク質を構築し、Ｃγ１  Ｆｃ領域またはＣγ３  Ｆｃ領域を有する構成体を避けることにより、Ｆｃレセプターへの結合親和性が低減された抗体に基づく融合タンパク質を得ることができた。また、増強された生体内循環半減期を有する抗体に基づく融合タンパク質は、結合を縮小するか除去するために、Ｆｃレセプターへの結合親和性を有するアイソタイプ中のＦｃレセプターに結合することに必要な配列を修飾することにより得ることができる。
【００６０】
ＦｃγＲ結合のために重要な配列はＬｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ（Ｃγ１中の残基２３４から２３７）であり、ヒンジ領域に隣接するＣＨ２領域中に位置する（Ｃａｎｆｉｅｌｄ  ａｎｄ  Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７３：１４８３−１４９１（１９９１））。有効なＦｃＲ結合に必要な別の重要な構造成分は、Ａｓｎ297に共有結合的に結合したＮ−連結した炭水化物鎖の存在である。この構造を酵素で除去するかＡｓｎ残基を変異させることにより、ＦｃγＲクラスのすべてに対する結合が解消される、あるいは少なくとも劇的に低減する。
【００６１】
生じる抗体に基づく融合タンパク質は、連結していない第２非免疫グロブリンタンパク質より長い生体内循環半減期を有する。リガンドの二量化は、リガンドとそのレセプターの間のみ掛けの結合親和性を増加させることができる。例えば、Ｆｃ−Ｘ融合タンパク質の１つのＸ部分が細胞上のレセプターにある親和性で結合し得る場合、同じＦｃインターフェロンアルファ融合タンパク質の第２のＸ部分は、はるかに高いアビディティ（見掛け親和性）で同じ細胞上の別のレセプターに結合することがある。これは、第１のＸ部分が既に結合した後の、第２のＸ部分のレセプターへの物理的な接近のために生じるのかもしれない。抗原に結合する抗体の場合には、見掛け親和性は少なくとも１万倍増加し得る。各タンパク質サブユニット（つまり「Ｘ」）はそれ自身の独立した機能を有し、多価とした際に、その機能は付加的でも相乗的でもよい。したがって、通常二量体のＦｃ分子の融合またはポリペプチドＸへの別の抗体断片の融合は、Ｘの活性を高め得る。
【００６２】
本発明の実行において有用な、ヒト免疫グロブリンＦｃ領域、特にＦｃγ１、Ｆｃγ２およびＦｃγ３をコードする核酸配列およびこれを定義するアミノ酸配列は、従来技術に記載されており、例えば、ＷＯ  ００／４０６１５、ＷＯ  ００／６９９１３、ＷＯ  ００／２４７８２に開示され、あるいはＧｅｎｂａｎｋおよび／またはＥＭＢＬデータベースに、例えば、ＡＦ０４５５３６．１（Ｍａｃａｃａ  ｆｕｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）、ＡＦ０４５５３７．１（Ｍａｃａｃａ  ｍｕｌａｔｔａ）、ＡＢ０１６７１０（Ｆｅｌｉｘ  ｃａｔｕｓ）、Ｋ００７５２（Ｏｒｙｃｔｏｌａｇｕｓ  ｃｕｎｉｃｕｌｕｓ）、Ｕ０３７８０（Ｓｕｓ  ｓｃｒｏｆａ）、２４８９４７（Ｃａｍｅｌｕｓ  ｄｒｏｍｅｄａｒｉｕｓ）、Ｘ６２９１６（Ｂｏｓ  ｔａｕｒｕｓ）、Ｌ０７７８９（Ｍｕｓｔｅｌａ  ｖｉｓｏｎ）、Ｘ６９７９７（Ｏｖｉｓ  ａｒｉｅｓ）、Ｕ１７  １６６（Ｃｒｉｃｅｔｕｌｕｓ  ｍｉｇｒａｔｏｒｉｕｓ）、Ｘ０７１８９（Ｒａｔｔｕｓ  ｒａｔｔｕｓ）、ＡＦ５７６１９．１（Ｔｒｉｃｈｏｓｕｒｕｓ  ｖｕｌｐｅｃｕｌａ）またはＡＦ０３５１９５（Ｍｏｎｏｄｅｌｐｈｉｓ  ｄｏｍｅｓｔｉｃａ）に見られる。
【００６３】
したがって、以前に報告されたベクター（Ｌｏ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｅｎｅｅｒｉｎｇ  １１：４９５−５００）は、ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ配列をマウスＩｇＧ２ａ  ＦｃをコードするｃＤＮＡ由来の配列に置き替えることにより修飾された（米国特許第５，７２６，０４４号）。
【００６４】
本発明は、Ｆｃレセプター結合などの天然免疫グロブリンの不適当な特性を除去し、かつ／または安定性のような望ましい特性を導入する、免疫グロブリン成分中の変異を包含する。例えば、Ａｎｇａｌ  Ｓ．，Ｋｉｎｇ  Ｄ．Ｊ．，Ｂｏｄｍｅｒ  Ｍ．Ｗ．，Ｔｕｒｎｅｒ  Ａ．，Ｌａｗｓｏｎ  Ａ．Ｄ．Ｇ．，Ｒｏｂｅｒｔｓ  Ｇ．，Ｐｅｄｌｅｙ  Ｂ．およびＡｄａｉｒ  Ｒ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１３０，ｐｐ１０５−１０８，１９９３は、残基２４１（Ｋａｂａｔナンバリング）がセリンからプロリンに変更されたＩｇＧ４分子について記載する。この変更は、ＩｇＧ４分子の血清中半減期を増加させる。Ｃａｎｆｉｅｌｄ  Ｓ．Ｍ．およびＭｏｒｒｉｓｏｎ  Ｓ．Ｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ｖｏｌ１７３ｐｐ１４８３−１４９１は、ＩｇＧ３中、残基２４８（Ｋａｂａｔナンバリング）のロイシンをグルタミン酸塩に、およびマウスＩｇＧ２ｂの中のグルタミン酸塩をロイシンにする変更について記載する。前者におけるロイシンのグルタミン酸塩への置換は、免疫グロブリン分子のＦｃγＲ１レセプターに対する親和性を減少させ、また、後者におけるグルタミン酸塩のロイシンへの置換は、親和性を増加させる。ＥＰ  ０３０７  ４３４は、ＩｇＧ中の残基２４８（Ｋａｂａｔナンバリング）でのＬからＥへの変異を含む様々な変異について記載している。定常領域またはその断片は好ましくはヒトＩｇＧ重鎖定常領域の全体または実質部分である。ＩｇＧ成分は、ＣＨ２およびＣＨ３領域、並びに重鎖間ジスルフィド結合に寄与するシステイン残基を含むヒンジ領域を含むのが好ましい。例えばＩｇＧ成分がＩｇＧ４に由来する場合、それは、ＩｇＧ４ヒンジ領域のシステイン残基８および１１を含む（Ｐｉｎｃｋ  Ｊ．Ｒ．ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ  Ｃ．，Ｎａｔｕｒｅ，１２１，６ｐｐ９４１−９４２，１９６７）。
【００６５】
本発明の方法は、Ｍａｎｉａｔｉｓ  ｅｔ．ａｌ．（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  −Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ；Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，１９８２）およびＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｖｏｌｓ  Ｉ，ＩＩ  ａｎｄ  ＩＩＩ（Ｄ．Ｍ．Ｇｌｏｖｅｒ編．，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  Ｌｔｄ）またはＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ，ＵＳＡ）に記載されているような慣用の組換え技術によって実行してもよい。
【００６６】
特に本発明の方法は、以下のステップを含み得る：
（ｉ）前記化合物をコードするヌクレオチド配列を含むＤＮＡポリマーを宿主細胞の中で発現し得る複製可能な発現ベクターを準備すること；
（ｉｉ）前記ベクターを用いて宿主細胞を形質転換すること；
（ｉｉｉ）形質転換された宿主細胞を、前記ＤＮＡポリマーの発現により前記化合物が生産される条件下で培養すること；および
（ｉｖ）前記化合物を回収すること。
【００６７】
本発明は、ＤＮＡポリマーを適当なモノ、ジまたはオリゴマーのヌクレオチド単位の縮合により製造する方法を提供する。製造は、化学的に、あるいは酵素を用い、または２つの方法の組合せによって、適宜インビトロまたはインビボで実行できる。したがって、ＤＮＡポリマーは、Ｄ．Ｍ．Ｒｏｂｅｒｔｓ  ｅｔ  ａｌ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １９８５，２４，５０９０−５０９８に記載されるような慣用の方法によって、適当なＤＮＡ断片を酵素により連結することによって製造してもよい。ＤＮＡ断片は、必要なヌクレオチド配列を含むＤＮＡを適当な制限酵素を用いて消化することによって得ることもできるし、化学的合成法や、ＤＮＡまたはＲＮＡのテンプレート上の酵素による重合によって、またはこれらの方法の組合せによって製造してもよい。制限酵素による消化は、０．１〜１０μｇのＤＮＡを用いて２０℃〜７０℃の温度で適当なバッファー中で行なうことができる。ＤＮＡの酵素的重合は、ＤＮＡポリメラーゼＩ（クレノー（Ｋｌｅｎｏｗ）断片）などのＤＮＡポリメラーゼを使用し、必要なヌクレオシド三リン酸であるｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄｌＴＰを含む適当なバッファー中、１０℃〜３７℃の温度で、一般に５０μｌ以下の容積においてインビトロで行なうことができる。ＤＮＡ断片の酵素的連結は、４０℃から室温で適当なバッファー中、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼのようなＤＮＡリガーゼを使用することで以下に一般に５０μｌ以下の容積において行なうことができる。
【００６８】
ＤＮＡポリマーまたは断片の化学合成は、“Ｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｇｅｎｅ  Ｆｒａｇｍｅｎｔｓ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”（Ｈ．Ｇ．ＧａｓｓｅｎおよびＡ．Ｌａｎｇ編），Ｖｅｒｌａｇ  Ｃｈｅｍｉｅ，Ｗｅｉｎｈｅｉｍ（１９８２），または、他の科学的刊行物、例えば、Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ，Ｈ．Ｗ．Ｄ．Ｍａｔｔｈｅｓ，Ｍ．Ｓｉｎｇｈ，Ｂ．Ｓ．ＳｐｒｏａｔおよびＲ．Ｃ．Ｔｉｔｍａｓ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９８２，１０，６２４３；Ｂ．Ｓ．ＳｐｒｏａｔおよびＷ．Ｂａｎｎｗａｒｔｈ，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，１９８３，２４，５７７１；Ｍ．Ｄ．ＭａｔｔｅｕｃｃｉおよびＭ．Ｈ  Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，１９８０，２１，７１９；Ｍ．Ｄ．ＭａｔｔｅｕｃｃｉおよびＭ．Ｈ．Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ，１９８１，１０３，３１８５；Ｓ．Ｐ．Ａｄａｍｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ，１９８３，１０５，６６１；Ｎ．Ｄ．Ｓｉｎｈａ，Ｊ．Ｂｉｅｍａｔ，Ｊ．ＭｃＭａｎｎｕｓおよびＨ．Ｋｏｅｓｔｅｒ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９８４，１２，４５３９；およびＨ．Ｗ．Ｄ．Ｍａｔｔｈｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊｏｕｒｎａｌ，１９８４，３，８０１に記載されているような固相技術を使用して、慣用のリン酸トリエステル、リン酸塩またはホスホアミダイト（ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ）化学によって行なうことができる。好ましくは、自動ＤＮＡシンセサイザーを使用する。
【００６９】
ＤＮＡ分子は、必要なコード配列を含むベクターを適当な制限酵素で消化するか、またはポリメラーゼチェーンリアクション法の使用によって得てもよい。ＤＮＡ分子の正確な構造およびそれらが得られる方法は、所望の製品の構造に依存する。化合物をコードするＤＮＡ分子構築の適当な戦略設計は、当業者が日常的に扱う問題である。
【００７０】
組換え宿主細胞中における化合物をコードするＤＮＡポリマーの発現は、宿主細胞中で、ＤＮＡポリマーを発現し得る複製可能な発現ベクターによって行なうことができる。発現ベクターは新規であり、本発明の一部をなす。複製可能な発現ベクターは、本発明に従って、宿主細胞と適合性をもつベクターを開裂することによって完全なレプリコンを有する線状のＤＮＡセグメントを得、ライゲート条件下に、この線状セグメントを前記線状セグメントとともに化合物をコードする１個または複数のＤＮＡ分子と組み合わせることにより製造できる。線状セグメントおよび１個を超えるＤＮＡ分子のライゲーションは、必要に応じ同時にまたは連続して行なうことができる。したがって、ＤＮＡポリマーは、必要に応じ、予め形成しておいてもよいし、ベクターの構築の間に形成してもよい。有用な発現ベクターは、Ｌｏ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｅｒｉｎｇ  １１：４９５に記載されており、ここでは、ＦｃＸ遺伝子の転写はヒトサイトメガロウイルスおよびＳＶ４０ポリアデニル化シグナルのエンハンサー／プロモーターを利用している。適当なベクターは、プラスミド、バクテリオファージ、コスミド、および、例えばバキュロウイルス（ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓｅｓ）、牛痘またはＳｅｍｌｉｋｉ  Ｆｏｒｅｓｔウィルスに由来する組換えウィルスを含む。したがって、以前に報告されたベクター（Ｌｏ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｅｎｅｅｒｉｎｇ  １１：４９５−５００）は、ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ配列をマウスＩｇＧ２ａ  ＦｃをコードするｃＤＮＡからの配列（米国特許第５，７２６，０４４号）に置き替えることにより修飾された。
【００７１】
ベクターの選択は部分的には宿主細胞（それはＥ．ｃｏｌｉのように原核生物でもよいし、またはマウスＣ１２７細胞、マウスミエローマ細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞、ＣＯＳ細胞またはＨｅｌａ細胞などの真核生物、菌類、例えば、糸状菌類または単細胞の酵母、あるいはショウジョウバエなどの昆虫細胞でもよい）によって決まるであろう。現時点で、本発明で使用される好ましい宿主細胞には、不死ハイブリドーマ細胞、ＮＳ／０ミエローマ細胞、２９３細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞、ＨＥＬＡ細胞およびＣＯＳ細胞が含まれる。宿主細胞はさらに遺伝子組換え動物でもよい。
【００７２】
ＤＮＡポリマー製造のために上に記載されるように、重合とライゲーションを行なうことができる。制限酵素を用いた消化は、ＤＮＡ  ０．１〜１０μｇを用いて２０℃〜７０℃の温度で適当なバッファー中において行なうことができる。組換え宿主細胞は、本発明に従って、形質転換条件下、本発明の複製可能な発現ベクターを用いて宿主細胞を形質転換することにより製造される。適当な形質転換条件は慣用のものでよく、例えば上に引用したＭａｎｉａｔｉｓら、または“ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ”Ｖｏｌ．ＩＩ，Ｄ．Ｍ．Ｇｌｏｖｅｒ編，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  Ｌｔｄ．１９８５に記載されている。形質転換の条件は宿主細胞によって選択され決定される。したがって、Ｅ．ｃｏｌｉのようなバクテリアの宿主はＣａＣｌ2溶液（Ｃｏｈｅｎ  ｅｒ  ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１９７３，６９，２１１０）やＲｂＣｌ、ＭｎＣｌ2、酢酸カリウムおよびグリセリンの混合物を含む溶液、次いで、３−［Ｎ−モルホリノール−プロパン−スルホン酸、ＲｂＣｌおよびグリセリンで処理してもでもよい。培養する哺乳類細胞は細胞上にベクターＤＮＡをカルシウム共沈することによって形質転換した。本発明は、さらに、本発明の複製可能な発現ベクターで形質転換された、あるいはこれに感染した宿主細胞にも及ぶ。例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓらおよび上記“ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ”に記載されているように、ＤＮＡポリマーの発現を許す条件下での形質転換宿主細胞の培養は、慣用の方法に従って行なわれる。したがって、好ましくは、細胞に栄養素が供給され、４５℃より下の温度で培養する。発現生成物は、宿主細胞により従来法によって回収される。したがって、宿主細胞がＥ．ｃｏｌｉのようにバクテリアの場合は、それは物理的、化学的または酵素により溶解させ、生じる溶解物からタンパク質生成物を分離できる。生成物がバクテリア細胞から分泌される場合は、ペリプラズム空間（ｐｅｒｉｐｌａｓｍｉｃ  ｓｐａｃｅ）または栄養培地から回収してもよい。宿主細胞が哺乳類の場合、生成物は栄養培地から一般的に分離してもよい。ＤＮＡポリマーは、生成物を発現する、安定した形質転換哺乳類細胞系の分離のために設計されたベクターに組み込んでもよい：例えば、ウシ乳頭腫ウィルスベクター、またはチャイニーズハムスター卵巣細胞中で増幅されたベクターがある（ＤＮＡ  ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｖｏｌ．１１  Ｄ．Ｍ．Ｇｌｏｖｅｒ編  ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  １９８５；Ｋａｕｆｍａｎ，Ｒ．Ｊ．，ＭｏｌｅｃｕｌａｒおよびＣｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ５，１７５０−１７５９，１９８５；Ｐａｖｌａｋｉｓ  Ｇ．Ｎ．およびＨａｍｅｒ，Ｄ．Ｈ．，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（ＵＳＡ）８０，３９７−４０１，１９８３；Ｇｏｅｄｄｅｌ，Ｄ．Ｖ．ｅｔ  ａｌ．，およびＥＰ  ０  ０９３  ６１９，１９８３）。
【００７３】
本発明の免疫コンジュゲートはリンカー分子を含んでもよい。リンカーは、好ましくはペプチド結合によって互いに連結したアミノ酸から構成される。したがって、好ましい実施形態では、リンカーは、ペプチド結合によって連結した１〜２０個のアミノ酸（ここでアミノ酸は２０種類の天然に存在するアミノ酸から選択される）から構成される。これらのアミノ酸のうちのいくつかは、当業者にはよく理解されているようにグルコシル化してもよい。さらに好ましい実施形態では、１〜２０個のアミノ酸は、グリシン、アラニン、プロリン、アスパラギン、グルタミンおよびリジンから選択される。さらにより好ましくは、リンカーは、大部分が、立体的に妨害されていないグリシンとアラニンなどのアミノ酸から構成される。したがって、好ましいリンカーは下記のようなポリグリシンである：
ポリＧｌｙ（特に（Ｇｌｙ）2〜（Ｇｌｙ）7）、
ポリ（Ｇｌｙ−Ａｌａ）、
ポリＡｌａ。
【００７４】
適当なリンカーの他の特定の例は以下の通りである：
（Ｇｌｙ）3Ｌｙｓ（Ｇｌｙ）4
（Ｇｌｙ）3ＡｓｎＧｌｙＳｅｒ（Ｇｌｙ）2
（Ｇｌｙ）3Ｃｙｓ（Ｇｌｙ）4および
ＧｌｙＰｒｏＡｓｎＧｌｙＧｌｙ
ＧｌｙとＡｌａの組合せも好ましい。ここに示されたリンカーは典型例である；この。本発明の範囲内のリンカーははるかに長いものでもよいし、他の残基を含んでいてもよい。非ペプチドリンカーも可能である。ペプチドリンカーは上記載と同様の方法で変更して誘導体としてもよい。
【００７５】
本発明の好ましいリンカーは免疫原性を有しないか免疫原性が低い。上に挙げたリンカーペプチドは少なくとも免疫原が低い。しかし、抗体またはｓＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’またはＦ（ａｂ’）２またはＦｃ領域と標的タンパク質との間に上記リンカーペプチド分子を介して連結を形成すると、連結領域内に新たな免疫原性エピトープが形成され、単一（脱免疫性）成分の免疫原性と比較して免疫原性の増大した免疫コンジュゲートがもたらされる可能性がある。この状況もリンカー分子がない融合タンパク質に拡張できる。したがって、本発明は、さらに、本発明の融合タンパク質の脱免疫化領域、いわゆる融合領域または結合領域に関する。Ｃ（及びＮ）末端を介して第２のタンパク質分子（それはリンカー分子でもよい）に第１のタンパク質分子を融合させる場合、人工的で、したがって、通常まだ免疫系には見られたことのない配列領域が作られる。この領域は免疫原であると認められる。このアミノ酸残基の領域は、本発明によれば、各タンパク質末端（ＮまたはＣ末端）のおよそ１０の残基を含む。したがって、完全な融合領域は、約２０個のアミノ酸残基、好ましくは２〜１６個、より好ましくは２〜１０個のアミノ酸残基（各融合パートナーについて言えば、それぞれ１〜８個および１〜５個のアミノ酸残基）を含む。
【００７６】
本発明は更にＦｃ変種も含む。そのような更なるＦｃ変種は、本発明の融合分子には必要とされない構造上特徴または機能的活性をもたらす天然Ｆｃの１個または複数のサイトを除去して得ることができる。これらのサイトは、例えば、残基を置換または欠失させ、あるいはサイト内に残基を挿入し、またはサイトを含んでいる部分を切り詰めて除去することができる。挿入された残基または置換される残基は、ペプチドミメティックス（ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃｓ）やＤ−アミノ酸などの変更されたアミノ酸でもよい。例えば、１個または複数のグルコシル化サイトを除去してもよい。典型的にはグルコシル化する残基（例えばアスパラギン）は細胞毒性応答を与えるものでもよい。このような残基を欠失させるか、グルコシル化していない残基（例えばアラニン）で置換してもよい。特定の必要がある場合は、ＡＤＣＣサイトおよびＣｌｑ結合サイトなどの補体（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）相互作用に関わるサイトを除去してもよい。
【００７７】
本発明は、本発明の標的ポリペプチド（Ｘ）の誘導体も含む。このような誘導体は、さらに、（Ｘ）の可溶性、吸収性、生物学的半減期などを改善し得る。あるいは、修飾された（Ｘ）は不適当な副作用などを解消したり、緩和するものでもよい。典型的な誘導体は、（Ｘ）が、あるいはその一部が環状になっている化合物も含む。例えば、ペプチド部分は２個以上のＣｙｓ残基（それらはジスルフィド結合を形成することによって環化可能である）を、例えばリンカー中に含むように修飾してもよい。化合物は相互連結するか、または分子間の架橋が可能になる。例えば、そのペプチド部分は、１つのＣｙｓ残基を含み、かつそれにより、同種の分子により分子間ジスルフィド結合を形成することができるように修飾してもよい。
【００７８】
最後の実施態様では、本発明は、本発明で開示された方法によって得られる前記生物学的に活性なタンパク質を含む医薬組成物、並びに修飾された分子および医薬組成物を使用するヒトの治療処理用方法に関する。
【００７９】
本発明の治療用組成物は、ここに記載されるような適当な薬剤とともに生理学的に耐え得る担体を含み、有効成分はそこに溶かされたか分散されている。本発明において「薬剤として許容できる」、「生理学的に耐え得る」およびその文法的な変形は、それらが組成物、担体、希釈剤および試薬を指すときには、交換可能に使用され、哺乳動物に不適当な生理学的影響（吐き気、めまい、消化器の不調など）を及ぼすことなく投与可能な物質を表わす。これに溶解されたまたは分散された活性成分を含む薬学的組成物の製造は、当技術分野において十分に理解されており、処方に基づいて制限する必要はない。典型的には、このような組成物は液体の溶液または懸濁液のいずれかとして注入可能なものとして製造されているが、使用に先立って液体を用いて溶液や懸濁液とするのに適当な固体の形でも製造できる。調製物は乳化してもよい。活性成分は、薬剤として許容可能で活性成分と適合性を有する賦形剤と、ここに記載する治療方法で使用するにふさわしい量において混合することができる。適当な賦形剤は、例えば、水、食塩水、ブドウ糖、グリセリン、エタノールその他およびこれらの組合せである。さらに、必要ならば、組成物は、湿潤剤、乳化剤、ｐＨ緩衝剤その他、活性成分の有効性を増強する薬剤などの補助物質を少量含んでもよい。
【００８０】
本発明の治療用組成物は、成分の薬剤として許容できる塩類を含むことができる。薬剤として許容できる塩類は、例えば塩酸、リン酸などの無機酸、酢酸、酒石酸、マンデル酸などの有機酸を（ポリペプチドの遊離アミノ基とで形成）用いて形成される酸付加塩類）を含む。遊離カルボキシル基と形成される塩類も、例えば、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウムまたは水酸化鉄などの無機塩基およびイソプロピルアミン、トリメチルアミン、２−エタノールアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどの有機塩基から誘導できる。特に好ましいのは、環状ポリペプチドαｖアンタゴニストの製造時に使用されるＨＣＩ塩である。生理学上耐え得る担体は当技術分野においてよく知られている。液体の担体の典型例は、活性成分および水に加えて他の物質を含んでいないか、生理学的ｐＨでのリン酸ナトリウムなどのバッファー、また、生理的食塩水あるいはこれらの両方（リン酸塩バッファー生理食塩水等）を含む無菌の水溶液である。さらに、水性担体は、１種を超える緩衝塩、並びに塩化ナトリウムおよび塩化カリウムなどの塩類、ブドウ糖、ポリエチレングリコールおよび他の溶質を含むことができる。液体組成物はさらに、水に加え、または水を含まずに液相を含むことができる。そのような追加的液相に典型的なのはグリセリン、綿実油などの植物油および水油エマルションである。
【００８１】
典型的には、本発明による修飾された抗体または抗体断片の形を取る修飾された免疫グロブリンの治療上有効量は、生理学上耐え得る組成物として投与された際、血漿濃度が１ミリリッター（ｍｌ）当たり約０．０１マイクログラム（μｇ）から約１００マイクログラム（μｇ）、好ましくは約１μｇ／ｍｌから５μｇ／ｍｌ、および通常約５μｇ／ｍｌを達成するのに十分な量である。つまり、投薬量としては、１日または数日間の１日１回または複数回投与において、約０．１ｍｇ／ｋｇから約３００ｍｇ／ｋｇまで、好ましくは約０．２ｍｇ／ｋｇから約２００ｍｇ／ｋｇまで、最も好ましくは約０．５ｍｇ／ｋｇから約２０ｍｇ／ｋｇまで変わる。免疫治療剤がモノクローナル抗体の断片またはコンジュゲートの形をしている場合、量は、抗体全体の質量に対する断片／コンジュゲートの質量に基づいて容易に調節できる。好ましい血漿中モル濃度は約２マイクロモル（μＭ）から約５ミリモル（ｍＭ）であり、好ましくは１００μＭ〜１ｍＭ抗体アンタゴニストである。
【００８２】
非免疫治療的ペプチドまたはタンパク質である本発明による治療上有効な薬剤量は、典型的には、生理学上耐え得る組成物中で投与した時、血漿濃度として１ミリリッター（ｍｌ）当たり約０．１マイクログラム（μｇ）から約２００μｇ／ｍｌ、好ましくは約１μｇ／ｍｌから約１５０μｇ／ｍｌを達成するような分子の量である。１モル当たり約５００グラムの質量を有するタンパク質に基づいて計算すると、好ましい血漿中モル濃度は約２マイクロモル（μＭ）〜約５ミリモル（ｍＭ）、好ましくは約１００μＭ〜１ｍＭポリペプチドアンタゴニストである。
【００８３】
本発明の医薬組成物は、本発明の組合せ療法に伴う副作用を低減するか回避する薬剤で患者を治療すること（「補助的療法」）を包含する語句も含み得る。こうした薬剤としては、以下に限られるものではないが、例えばそれは抗癌剤の有毒効果を緩和する薬剤が含まれる。前記添加剤は、化学療法、放射線療法または手術に伴う吐き気の発生を防止するか低減し、骨髄抑制（ｍｙｅｌｏｓｕｐｐｒｅｓｓｉｖｅ）抗癌剤の投与に伴う感染の発生を低減する。添加剤は当技術分野においてよく知られている。本発明による修飾されたタンパク質は、ＢＣＧおよび免疫系刺激剤などの補助剤とともに投与してもよい。
【００８４】
さらに、組成物は、免疫治療剤、化学療法剤および細胞毒素として有効な放射線標識同位体を含む抗新生物剤または他の細胞毒素剤、例えば、細胞毒素ペプチド（例えばサイトカイン）や細胞毒素薬などを含んでもよい。活性薬剤、好ましくは本発明による化学的アンタゴニストまたは（化学的）化学療法剤（免疫治療剤でも非免疫グロブリンペプチド／タンパク質でないもの）の典型的な投薬量は、１日当たりキログラム体重当たり１０ｍｇ〜１００ｍｇ、好ましくは２０〜２００ｍｇ、より好ましくは５０〜１００ｍｇである。
【００８５】
以下、実施例により本発明をより詳細に説明する。しかし、このリストは本発明を限定するものではない。
【実施例】
【００８６】
（実施例１）
次の例は、本発明で開示される融合タンパク質の配列内において免疫原性配列領域（Ｔ細胞エピトープ）を識別するための好ましい方法について詳細に記載するものである。しかし、この分子は他の知られている方法で得ることができる点が指摘されるべきであろう。
【００８７】
本発明による免疫コンジュゲートを得るために修飾された分子のＴ細胞エピトープの識別は、先行技術（ＷＯ  ９２／１０７５５およびＷＯ  ９６／４０７９２（Ｎｏｖｏ  Ｎｏｒｄｉｓｋ）、ＥＰ  ０５１９  ５９６（Ｍｅｒｃｋ  ＆  Ｃｏ．）、ＥＰ  ０６９９  ７５５（Ｃｅｎｔｒｏ  ｄｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉａ  Ｍｏｅｌｃｕｌａｒ）、ＷＯ９８／５２９７６およびＷＯ  ９８／５９２４４（Ｂｉｏｖａｔｉｏｎ  Ｌｔｄ．）または関連する方法に記載されている別の方法で達成できる。しかし、前記エピトープの識別がここに詳細に記載する以下の新しい方法によって実現される場合、有利な免疫コンジュゲートを得ることができる：
タンパク質、ポリペプチドまたは免疫グロブリンの全体的構造を決定するのに重要な役割を果たす要因は多数存在する。第１に、ペプチド結合、アミノ酸を鎖状に互いに連結するその結合は、共有結合である。この結合は構造において平面であり、実質的に置換アミドである。「アミド」は基−ＣＯＮＨ−を含む有機化合物の任意の基である。
【００８８】
隣接アミノ酸のＣαを連結する平面状ペプチド結合は以下に示すように表わすことができる：
【００８９】
【化１】
2004532620.tif 000002
【００９０】
Ｏ＝ＣおよびＣ−Ｎ原子は比較的剛性な平面内にあるので、これらの軸の周りに自由な回転は生じない。このため、破線によって模式的に描いた平面は時として「アミド平面」または「ペプチド平面」と呼ばれ、この平面には、ペプチド骨格の酸素（Ｏ）、炭素（Ｃ）、窒素（Ｎ）および水素（Ｈ）原子が載る。このアミド平面の相対する両隅にはＣα原子が位置する。ペプチド平面すなわちアミド平面内では、Ｏ＝ＣおよびＣ−Ｎ原子の周りの回転が実質的にないので、ポリペプチド鎖はＣα原子を連結する一連の平面状ペプチド結合を含む。
【００９１】
ポリペプチドまたはタンパク質の全体構造またはコンホメーションを規定する上で重要な役割を果たす第２の要因は、共通なＣα連結の周りの各アミド平面の回転角である。「回転角」および「ねじり角」という用語は以下では同義語と見なされる。アミド平面にＯ、Ｃ、ＮおよびＨ原子が載ると仮定すると（コンホメーションによってはこれらの原子のうちいくつかは平面から若干ずれるかもしれないが、これは通常有効な仮定である）、これらの回転角はＮとＲポリペプチドの骨格のコンホメーション、つまり、隣接残基間に存する構造を定義する。これらの２つの角度はφおよびψとして知られている。したがって、１組の角度、φiおよびψi（ここで、添字ｉはポリペプチド鎖の特定の残基を表わす）はポリペプチドの２次構造を有効に規定する。角度φおよびψを定義するのに使用される慣用規則、すなわち、所与のポリペプチドについてのアミド平面が角度０を形成する参照ポイント、並びに角度φの定義および角度ψの定義は、文献に定義される。例えば、Ｒａｍａｃｈａｎｄｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．Ａｄｖ．Ｐｒｏｔ．Ｃｈｅｍ．２３：２８３−４３７（１９６８）、特に２８５−９４ページ参照（これらのページは言及によって本願に組み込まれる）。
【００９２】
本発明の方法は任意のタンパク質に適用することができ、ヒトでは、ＭＨＣクラスＩＩ分子結合溝の主要なポケット１アンカー位置が、特定のアミノ酸側鎖に対してよく設計された特異性を有するという発見に部分的に基づいている。このポケットの特異性は、ＭＨＣクラスＩＩ分子のベータ鎖の位置８６でのアミノ酸の同一性によって決定される。このサイトはポケット１の底に位置し、このポケットに収容され得る側鎖の大きさを決定する。Ｍａｒｓｈａｌｌ，Ｋ．Ｗ．、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５２：４９４６−４９５６（１９９４）。この残基がグリシンである場合、すべての疎水性脂肪族および芳香族アミノ酸（疎水性脂肪族は以下のものである：バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン。また、芳香族は以下のものである：フェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファン）は、ポケット内に収容され得る（芳香族側鎖が優先される）。このポケット残基がバリンである場合、このアミノ酸側鎖はポケット内部に突出するので、収容できるペプチド側鎖のサイズを制限する（例えば、疎水性脂肪族側鎖だけが収容可能である）。したがって、アミノ酸残基配列において、疎水性脂肪族および芳香族側鎖を有するアミノ酸が存在する場合にはいつでも、ＭＨＣクラスＩＩ制限Ｔ細胞エピトープが存在する可能性がある。しかし、側鎖が疎水性脂肪族である場合は、芳香族側鎖の場合と比較して、（全人口において、ポケット１タイプの分布がほぼ均一であると定すれば）Ｔ細胞エピトープに関連する可能性はおよそ２倍である。
【００９３】
本発明を具体化する計算方法は、以下のようにＴ細胞エピトープを含むペプチド領域の可能性を特徴づける：
（１）予め定義した長さのペプチドセグメントの１次配列を走査し、存在する疎水性脂肪族と芳香族側鎖をすべて識別する。（２）疎水性脂肪族側鎖には芳香族側鎖用のそれより大きな値、好ましくは芳香族側鎖に割り当てる値の約２倍を割り当てる（例えば、疎水性脂肪族側鎖に対しては値２を、芳香族側鎖に対しては値１を割り当てる）。（３）ペプチド内の予め定義した一定の長さの各重複するアミノ酸残基セグメント（ウィンドウ）について存在が決定された値を合計し、特定のセグメント（ウィンドウ）に対する値の合計を、セグメント（ウィンドウ）の中間位置で単一のアミノ酸残基、好ましくは、採取されたセグメント（ウィンドウ）の中間点付近の残基に割り当てる。この手続きを、採取された各重複するアミノ酸残基セグメント（ウィンドウ）について繰り返す。したがって、ペプチドの各アミノ酸残基は、特定のセグメント（ウィンドウ）内に存在するＴ細胞エピトープの可能性に関係のある値を割り当てられる。（４）上記ステップ３に記載するように計算し割り当てた値は、評価するアミノ酸残基配列全体のアミノ酸座標に対してプロットすることができる。（５）予め定義した値（例えば値１）のスコアを有する配列のすべての部分は、Ｔ細胞エピトープを含むと認められ、必要ならば、修飾することができる。本発明のこの特定の実施態様は、Ｔ細胞エピトープを含むであろうペプチド領域を記述できる一般的な方法を提供する。これらの領域内のペプチドに対する修飾は、ＭＨＣクラスＩＩ結合特性を修飾する可能性を有する。
【００９４】
本発明の別の実施態様によれば、ＭＨＣクラスＩＩ対立遺伝子モデルによりペプチドの相互作用を考慮に入れたより精巧な計算方法を使用してＴ細胞エピトープをより高精度で予想できる。
【００９５】
特にこの実施態様によるペプチド内に存在するＴ細胞エピトープの計算上の予想では、すべての知られたＭＨＣクラスＩＩ分子の構造に基づく少なくとも４２個のＭＨＣクラスＩＩ対立遺伝子のモデルの構築が考えられ、Ｔ細胞エピトープの計算による識別におけるこれらのモデルの使用、相対的なペプチド骨格アルファ炭素（Ｃα）位置の知られた変わりやすさを考慮に入れるための各モデルのペプチド骨格のライブラリーの構築、ペプチドとＭＨＣクラスＩＩ分子の間の相互作用において重要な位置での２０個のアミノ酸置換各々のための各モデルを備えた各骨格ドック（ｄｏｃｋ）のアミノ酸側鎖コンホメーションのライブラリーの構築、および特定のＭＨＣクラスＩＩ分子に収容（ｄｏｃｋ）された特定のペプチドについての最適な骨格および側鎖コンホメーション選択のための、これら骨格および側鎖コンホメーションライブラリーの使用、並びにこの相互作用からの結合スコアの誘導が考えられる。
【００９６】
ＭＨＣクラスＩＩ分子のモデルは相同モデリングによって、ブルックヘブン（Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ）タンパク質データバンク（「ＰＤＢ」）で見出された多数の同様の構造から誘導できる。これらは、エネルギー最小化のためのＣＨＡＲＭｍ力場（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ  Ｉｎｃ．、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、Ｃａ．から入手可能）と共に、シミュレートされたアニーリング機能を組み込んだ半自動的な相同モデリングソフトウェア（Ｍｏｄｅｌｌｅｒ，Ｓａｌｉ  Ａ．＆  Ｂｌｕｎｄｅｌｌ  ＴＬ．、１９９３．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ  ２３４：７７９−８１５）によって形成できる。別のモデリング方法も同様に利用できる。
【００９７】
本願の方法は、ＭＨＣクラスＩＩ分子の小さな集合について結合溝内の各位置での各アミノ酸選択肢の実験により得た結合データのライブラリーを使用する他の計算方法（Ｍａｒｓｈａｌｌ，Ｋ．Ｗ．、ｅｔ  ａｌ．、Ｂｉｏｍｅｄ．Ｐｅｐｔ．Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ、１（３）：１５７−１６２）（１９９５）や溝内の特定タイプの結合ポケットの結合特性を定義するために実験による同様の結合データを使用し（ここでもまたＭＨＣクラスＩＩ分子の比較的小さな部分集合を使用する）、次いでこのポケットライブラリーからポケットタイプを「混合およびマッチング」して人為的に別の「仮想的な」ＭＨＣクラスＩＩ分子を生成するさらに別の計算方法（Ｓｔｕｒｎｉｏｌｏ  Ｔ．、ｅｔ  ａｌ．、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ、１７（６）：５５５−５６１（１９９９）と著しく異なる。先行技術は両方とも、分析が複雑である点および多数のペプチド変種を合成する必要により、少数のＭＨＣクラスＩＩ分子しか実験的に走査できない。したがって、第１の先行技術の方法は、少数のＭＨＣクラスＩＩ分子の予想しかできない。第２の先行技術の方法は、異なるクラスＩＩ対立遺伝子間においては、１個の分子中で類似したアミノ酸で裏打ちされているポケットは同じ結合特性を持つという仮定も前提としており、ポケットライブラリーに含まれるポケットを含むそうしたＭＨＣクラスＩＩ分子だけが「仮想的に」生成されるという欠点をさらに有する。本明細書に述べるモデリング手法を使用すれば、任意の数およびタイプのＭＨＣクラスＩＩ分子の構造を推定でき、したがって、全集団を代表する対立遺伝子を特異的に選択できる。さらに、走査されるＭＨＣクラスＩＩ分子の数は、複雑な実験によって追加データを生成する必要以上にさらにモデルを生成することにより増加させることができる。
【００９８】
骨格ライブラリーの使用により、走査されている様々なペプチドについて、特定のＭＨＣクラスＩＩ分子に収容された時のＣα原子位置における変化を考慮に入れることができる。この点もまた、上記の先行技術における計算方法（これらは、特定のポケット中でアミノ酸結合を走査するため単純化されたペプチド骨格の使用に依存している）と対照的である。これらの単純化された骨格は、「実際の」ペプチドで見つかる骨格構成の代表ではないであろうし、その結果、ペプチド結合の予想が不正確になる。本発明の骨格ライブラリーは、タンパク質データバンク内で見出されるＭＨＣクラスＩＩ分子に結合するすべてのペプチドの骨格を重ね、結合溝内に位置する１１個のアミノ酸各々のＣα原子間の根平均平方（ＲＭＳ）偏差を記録することに生成される。このライブラリーは、より大きな変わりやすさの可能性までも考慮に入れるために、少数（現在１３個）の適切な利用可能なマウスおよびヒト構造から誘導できる一方、各Ｃ”−αについてのＲＭＳ数値は、５０％増加する。その後、各アミノ酸の平均のＣα位置が決定され、その半径がその位置でのＲＭＳ偏差プラス５０％と等しい球がこの点のまわりに描かれる。この球体は許容されるＣα位置をすべて表わす。
【００９９】
最小のＲＭＳ偏差を有するＣα（これは、上記のポケット１中のアミノ酸であり、結合溝中の１１個の残基の位置２と等価である）を動かして、球体は３−次元的にグリッド化され、次いで、グリッド内の各頂点はそのアミノ酸のＣαのために可能な位置として使用される。結果として得られるアミド平面は、引き続くアミノ酸へのペプチド結合に対応し、これらのＣαの各々にグラフトされ、次のＣαを位置付けるためにφおよびψ角を所定の間隔で回転させる。次のＣαがＣαに対して「許容される位置の球」内にある場合にはジペプチドの向きが許容され、それが球の外部になる場合には、ジペプチドは拒絶される。その後、先行するＣαのあらゆる組合せから９個の後続Ｃαがすべて位置付けられるまで、ペプチドがポケット１  Ｃα「種子」から成長するように後続Ｃα位置の各々についてこのプロセスを繰り返す。次いで、ポケット１の前の単一Ｃαについてこのプロセスをもう一度繰り返して結合溝内に位置する骨格Ｃα位置のライブラリーを生成する。
【０１００】
生成された骨格の数はいくつかの要因に依存する：「許容される位置の球」の大きさ；ポケット１位置の「１次球」のグリッドの精密さ；後続Ｃαを位置付けるために用いるφおよびψの段階的回転角の精密さ。このプロセスを使用すると、大きな骨格ライブラリーを生成できる。骨格ライブラリーが大きい程、ＭＨＣクラスＩＩ分子の結合溝内の特定のペプチドに対して最もよく適合するものが見つかる可能性は大きくなる。各対立遺伝子について、結合領域のアミノ酸との衝突により、必ずしもすべての骨格がＭＨＣクラスＩＩ分子のすべてのモデルに収容されるのには適さないため、その対立遺伝子によって収容され得る骨格を含むライブラリーの部分集合が生成される。骨格ライブラリーの使用は、ＭＨＣクラスＩＩ分子モデルと共に、各許容される骨格に収容される各ＭＨＣクラスＩＩ分子について結合溝の各位置の各アミノ酸の許容される側鎖コンホメーションからなる徹底的なデータベースを作成する。このデータセットは、単純な立体的重なり関数を用いて生成され、ここで、ＭＨＣクラスＩＩ分子は骨格と結合し、アミノ酸側鎖は所望の位置で骨格上にグラフトされる。各々の側鎖の回転可能な結合を設定した間隔で段階的に回転させ、得られる原子位置は注意する結合に依存する。結合溝の側鎖の原子との原子の相互作用が注意され、位置は次の基準によって許容されるか拒絶される：ここまでに位置付けられたすべての原子の重なりの合計は、予め決めた値を超過してはならない。
【０１０１】
したがって、コンホメーション探索の厳格性は、結合の段階的回転で用いる間隔と全重なりについて予め決めた限界の関数である。特定のポケットが剛性であると知られている場合、この後者の値は小さくなり得るが、ポケット側鎖の位置に比較的柔軟性があると知られている場合は、比較的柔軟である。したがって、許容は結合溝ポケット内の柔軟性における変化を模倣するようになすことができる。次いで、ＭＨＣクラスＩＩ分子の各々に収容された時、このコンホメーション探索を各骨格のすべての位置にあるすべてのアミノ酸について繰り返し側鎖コンホメーションの徹底的なデータベースを作成する。
【０１０２】
適切な数式を用いて、上記骨格／側鎖コンホメーションの大きなデータベースの走査により経験的に導き出さなければならないペプチドリガンドコンホメーションと組み合わさるＭＨＣクラスＩＩ分子モデル間の結合エネルギーを評価する。したがって、９〜２０アミノ酸の範囲で長さが変化する（もっとも、長さは各走査に対しては一定にしておく）可能なペプチドに、以下の計算を施すことにより、タンパク質を潜在的なＴ細胞エピトープについて走査する：ＭＨＣクラスＩＩ分子をその分子に許容されるペプチド骨格とともに選択し、所望のペプチド配列に対応する側鎖をグラフトする。骨格上の特定の位置での原子の識別および特定の側鎖に関する原子間距離データを、そのアミノ酸の許容される各コンホメーションについて集める（上記データベースから得られる）。これを骨格に沿って各側鎖に対して繰り返し、スコアリング関数を用いてペプチドスコアを導く。その骨格のための最良のスコアを保持し、選択されたモデルについて各許容される骨格に対してこのプロセスを繰り返す。すべての許容される骨格から得られたスコアを比較し、最高のスコアをそのＭＨＣクラスＩＩモデル中の所望のペプチドについてのペプチドスコアであると見なす。次いで、このプロセスを、走査されているタンパク質に由来するあらゆる可能なペプチドを備えた各モデルについて繰り返し、ペプチド対モデルのスコアを表示する。
【０１０３】
本発明の情況では、結合親和性計算のために提示される各リガンドは、上に議論されるようなペプチドまたはタンパク質から選択されるアミノ酸セグメントである。したがって、リガンドは、知られた配列のペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質にから得られ、長さ９〜２０個のアミノ酸に関するアミノ酸の選択された伸張物である。「アミノ酸」および「残基」という用語は以下においては同義語と見なされる。リガンドは、骨格ライブラリーから得た骨格上にグラフトされて検査されるペプチドの連続アミノ酸の形をしており、ペプチド骨格のＣ”−α原子の座標を介して、ＭＨＣクラスＩＩ分子モデルライブラリーから得られるＭＨＣクラスＩＩ分子の結合溝中に位置し、各側鎖に対して許容されるコンホメーションは許容されるコンホメーションデータベースから選択される。関連する原子同一性および原子間距離もこのデータベースから検索し、ペプチド結合スコアを計算するために使用する。ＭＨＣクラスＩＩ結合ポケットへの高い結合親和性を備えたリガンドには、部位指図突然変異生成に対する候補としてフラグが立てられる。フラグが立てられたリガンド（したがって対象タンパク質）でアミノ酸置換を行ない、これはその後、結合親和性を予め定義した閾値以下に低減する変更を決定するためにスコアリング関数を使用して再試験する。次いで、これらの変更を対象タンパク質に組み入れ、Ｔ細胞エピトープを除去する。ＭＨＣクラスＩＩ分子のペプチドリガンドと結合溝の間は、共有結合以外の相互作用（水素結合、静電気的相互作用、疎水性（親の油性）相互作用およびファンデアワールス相互作用を含むが、これらに限定されない）を含む。これらは、以下に詳細に述べるペプチドスコアリング関数に含まれている。水素結合は極性または帯電基間で形成され得るもので、２つの他の原子によって共有された水素原子からなる非共有結合であることが理解されるべきである。水素受容体が部分的に負帯電を有する一方で、水素供与体の水素は正電荷を有する。ペプチド／タンパク質相互作用のために、水素結合供与体は、水素と結合した窒素または酸素もしくは窒素に結合した水素のいずれでもよい。水素結合受容体原子は水素と結合していない酸素、水素が全く結合しておらず１個か２個の結合がある窒素、または１つの結合のみある硫黄でもよい。水素を結合した酸素またはイミン窒素（例えばＣ＝ＮＨ−）などのある種の原子は、水素受容体とも供与体ともなり得る。水素結合エネルギーは３〜７ｋｃａｌ／ｍｏｌの範囲で変動し、ファンデアワールス結合よりはるかに強いが共有結合よりは弱い。水素結合はまた指向性が強く、供与体原子、水素原子および受容体原子が同一直線上にある場合に、最も強い。静電的結合は反対荷電のイオン対間で形成され、相互作用の強さはクーロンの法則による原子間の距離の二乗に反比例する。イオン対間の最適距離は約２．８Åである。タンパク質／ペプチド相互作用では、静電的結合がアルギニン、ヒスチジンまたはリジンとアスパラギン酸塩またはグルタミン酸塩との間で形成され得る。それらは水素結合に強さにおいてほぼ類似しているが、結合の強さは、イオン化基のｐＫａおよび媒体の誘電率に依存するであろう。
【０１０４】
親油性（脂肪親和性）相互作用は、タンパク質とペプチドリガンド間に生じる好適な疎水性−疎水性接触である。通常、これらは結合溝のポケット内に埋没したペプチドの疎水性アミノ酸側鎖間に、それらが溶媒に曝露しないように生じるであろう。疎水性残基の溶媒への曝露は、周囲の溶分子が互いに水素結合を強いられ、かご状のクラスレート構造を形成するので非常に不利である。結果として生じるエントロピーの減少は非常に不利である。脂肪親和性の強い原子は、極性でもなく水素受容体でもない硫黄や非極性の炭素原子などである。
【０１０５】
ファンデアワールス結合は３〜４Å離れた原子間で見られる非特異的な結合である。これは水素結合や静電的結合より弱く特異性も低い。原子のまわりの電荷分布は時間とともに変化し、どの瞬間でも、電荷分布は対称ではない。電荷分布におけるこの一時的な非対称性は、近隣の原子にも同様の非対称性を引き起こす。この結果生じる原子間引力は、ファンデアワールス接触距離で最大に達するが、約２〜約１Åに至ると非常に急速に低減する。反対に、原子間の隔たりが接触距離未満になるとともに、原子の外殻電子雲が重なるため、強い斥力が支配的になる。引力は静電的結合や水素結合に比べて比較的弱いが（約０．６Ｋｃａｌ／ｍｏｌ）、斥力は特に、ペプチドリガンドがタンパク質に成功裡に結合するかどうか決する上で非常に重要であろう。
【０１０６】
１つの実施形態では、ベーム（Ｂｏｅｈｍ）スコアリング関数（ＳＣＯＲＥ１手法）が結合定数を評価するために使用される。（Ｂｏｅｈｍ，Ｈ．Ｊ．、Ｊ．Ｃｏｍｐｕｔ  Ａｉｄｅｄ  Ｍｏｌ．Ｄｅｓ．、８（３）：２４３−２５６（１９９４）、その内容は言及によってその全体が本願に組み入れられる）。別の実施形態では、スコアリング関数（ＳＣＯＲＥ  ２手法）が、Ｔ細胞エピトープを含むリガンドの指標として結合親和力を評価するために使用されるＢｏｅｈｍ，Ｈ．Ｊ．、Ｊ．Ｃｏｍｐｕｔ  Ａｉｄｅｄ  Ｍｏｌ．Ｄｅｓ．、１２（４）：３０９−３２３（１９９８）、その内容は言及によってその全体が本願に組み入れられる）。しかし、上記の文献に記述されているベーム（Ｂｏｅｈｍ）スコアリング関数は、タンパク質へのリガンドの結合親和力を評価するために使用されるが、この場合、リガンドがタンパク質に成功裡に結合することが既に知られており、タンパク質／リガンド複合体はその構造が解明されタンパク質データバンク（「ＰＤＢ」の中に存在するものである。したがって、スコアリング関数は、陽性であることが知られた結合データを利用して開発されている。陽性および陰性バインダー間の区別を考慮に入れるために、方程式に反発項を加えなければならない。さらに、結合エネルギーのより満足な評価は、上記のベーム（Ｂｏｅｈｍ）関数の領域ベースのエネルギー項を用いるのではなく対同士のやり方で脂肪親和性の強い相互作用を計算することに達成される。したがって、好ましい実施形態では、結合エネルギーは修正されたベーム（Ｂｏｅｈｍ）スコアリング関数を使用して評価される。修正されたベーム（Ｂｏｅｈｍ）スコアリング関数では、タンパク質とリガンド間の結合エネルギー（ΔＧbind）は、以下のパラメーターを考慮して評価される：リガンド（ΔＧo）の並進エントロピーと回転エントロピーの全面的な喪失による結合エネルギーの低減；少なくとも１個のパートナーが中性である、理想的な水素結合からの寄与（ΔＧhb）；摂動のないイオン間相互作用（ΔＧionic）からの寄与；脂肪親和性リガンド原子と脂肪親和性受容体原子の間の脂肪親和性相互作用（ΔＧlipo）；リガンド中の内部自由度の凍結による結合エネルギーの喪失、つまり、各Ｃ−Ｃ結合の周りの回転自由度が低減する（ΔＧrot）；タンパク質とリガンド間の相互作用エネルギー（ＥvdW）。これらの項を考慮すると方程式１が与えられる：
（ΔＧbind）＝（ΔＧo）＋（ΔＧhbｘＮhb）＋（ΔＧionicｘＮionic）＋（ΔＧlipoｘＮlipo）＋（ΔＧrot＋Ｎrot）＋（ＥvdW）
式中、Ｎは特定の項の相互作用を特徴付ける数であり、１つの実施形態では、ΔＧo、ΔＧhb、ΔＧionic、ΔＧlipoおよびΔＧrotは、それぞれ５．４、−４．７、−４．７、−０．１７および１．４の値を与えられる定数である。
【０１０７】
Ｎhbは方程式２：
Ｎhb＝Σh-bondsｆ（ΔＲ，Δα）×ｆ（Ｎneighb）×ｆpcs
によって計算される。
【０１０８】
ｆ（ΔＲ，Δα）は、理想状態からの水素結合の大きな偏差を説明し、方程式３によって計算されるペナルティ関数である：
ｆ（ΔＲ，Δ−α）＝ｆ１（ΔＲ）×ｆ２（Δα）
ここで、ｆ１（ΔＲ）＝１（ΔＲ＜＝ＴＯＬの場合）、
または    ＝１−（ΔＲ−ＴＯＬ）／０．４（ΔＲ＜＝０．４＋ＴＯＬの場合）、
または    ＝０（ΔＲ＞０．４＋ＴＯＬの場合）。
さらに、ｆ２（Δα）＝１（Δα＜３０°の場合）
または    ＝１−（Δα−３０）／５０（Δα＜＝８０°の場合）
または    ＝０（Δα＞８０°の場合）。
【０１０９】
ＴＯＬは水素結合長さ（＝０．２５Å）で許容される偏差、
ΔＲはＨ−Ｏ／Ｎ水素結合長さの理想的な値（＝１．９Å）からの偏差、
Δαは水素結合角度∠N/O-H,O/Nの理想的な値（＝１８０°）からの偏差、
ｆ（Ｎneighb）は、タンパク質表面の凹面と凸面の部分を識別し、したがってタンパク質表面で見られるものではなくポケットで見られる極性相互作用に大きな重みを割り当てる。この関数は下記方程式４：
ｆ（Ｎneighb）＝（Ｎneighb／Ｎneighb,0）α（ここで、α＝０．５）
によって計算される。
【０１１０】
Ｎnejghbは任意の所与のタンパク質原子に５Åより接近している非水素タンパク質原子の数であり、
Ｎneighb,0＝定数２５である。
【０１１１】
ｆpcsは１つの水素結合当たり極性接触表面積を考慮に入れた関数であり、したがって強い水素結合と弱い水素結合を区別し、その値は次の基準によって決定される：
ｆpcs＝β（Ａpolar／ＮHB＜１０Å2の場合）、
またはｆpcs＝１（Ａpolar／ＮHB＞１０Å2の場合）
Ａpolarはタンパク質リガンド接触表面の大きさであり、
ＮHBは水素結合の数であり、
βは定数＝１．２である。
【０１１２】
修正されたベーム（Ｂｏｅｈｍ）スコアリング関数の実行のためには、イオン相互作用からの寄与、ΔＧionicを上記水素結合からの寄与と同様の方法で計算する（同じ幾何学依存性が仮定されるため）。
【０１１３】
Ｎlipo項は方程式５によって計算される：
Ｎlipo＝ΣILｆ（ｒIL）
ｆ（ｒIL）はすべての脂肪親和性リガンド原子について、１また、すべての脂肪親和性タンパク質原子についてＬであり、以下の基準により計算される：
ｆ（ｒIL）＝１（ｒIL＜＝Ｒ１ｆ（ｒIL）＝（ｒIL−Ｒ１）／（Ｒ２−Ｒ１）でＲ２＜ｒIL＞Ｒ１の場合、
ｆ（ｒIL）＝０（ｒIL＞＝Ｒ２の場合）。
【０１１４】
ここで、Ｒ１はｒ１vdw＋ｒLvdw＋０．５および
Ｒ２＝Ｒ１＋３．０であり、
ｒ１vdwは、原子１のファンデアワールスの半径であり、
ｒLvdwは、原子Ｌのファンデアワールスの半径である。
【０１１５】
Ｎrotはアミノ酸側鎖の回転可能な結合の数であり、非環式のｓｐ3−ｓｐ3結合およびｓｐ3−ｓｐ2結合の数である。末端ＣＨ3またはＮＨ3の回転は考慮に入れない。
【０１１６】
最後の項Ｅvdwは方程式６によって計算される：
Ｅvwd＝ε1ε2（（ｒ1vwd＋ｒ2vwd）12／ｒ12−（ｒ1vwd＋ｒ2vwd）6／ｒ6）。
【０１１７】
ここでε1とε2は原子同一性に依存する定数であり、
ｒ1vwd＋ｒ2vwdはファンデアワールスの原子半径であり、
ｒは１対の原子間の距離である。
【０１１８】
方程式６に関して、１つの実施形態では、定数ε1とε2はそれぞれ原子ごとに以下の値を与えられる：Ｃ：０．２４５、Ｎ：０．２８３、Ｏ：０．３１６、Ｓ：０．３１６（つまり、炭素、窒素、酸素および硫黄のそれぞれの原子について）。方程式５および６については、ファンデアワールスの半径はそれぞれ原子ごとに以下の値を与えられる：Ｃ：１．８５、Ｎ：１．７５、Ｏ：１．６０、Ｓ：２．００Å。
【０１１９】
タンパク質リガンド相互作用についての現時点での理解の制約内ではあるが、上記の方程式に現われるすべての所定の値および定数がすべて決定されることは理解されるべきである（特に本願で試みられている計算のタイプについて）。したがって、このスコアリング関数がさらに精緻化された場合には、これらの値および定数を変更することが可能で、したがって、リガンドへのタンパク質の結合エネルギーを評価する項において所望の結果を与える適当な数値を使用してもよく、したがって、本発明の範囲内である。
【０１２０】
上記のように、スコアリング関数は、側鎖コンホメーション、原子同一性および原子間の距離のデータベースから抽出されたデータに適用される。本発明を説明する目的のために言えば、このデータベースに含まれるＭＨＣクラスＩＩ分子の数は４２個のモデルと４つの解決された構造である。本発明の計算方法の構築はモジュール化された性質を有するため、新しいモデルを加えペプチド骨格ライブラリーと側鎖コンホメーション関数を用いて走査するだけで、上記のペプチドスコアリング関数によって処理できる追加のデータセットを作成できることは上記の説明から明らかである。これにより、走査されたＭＨＣクラスＩＩ分子のレパートリーを容易に増加させることが可能になり、あるいは、データが入手できる場合には構造および関連データを置き換えて、既存の対立遺伝子のより正確なモデルを作成することができる。
【０１２１】
本発明の予想方法は、様々なＭＨＣクラスＩＩ分子に対する有する親和性が実験的に測定された多数のペプチドを含むデータセットにより較正できる。計算値を実験値と比較することによって、すべての実験的に測定したＴ細胞エピトープが正確に予想されることがわかれば有益性の一端を決定できる。
【０１２２】
利用可能ないくつかの精巧な方法論と比較して、上記のスコアリング関数は比較的単純であるが、計算が非常に急速に実行されることが理解されるべきである。また、目的が、選択されたＭＨＣクラスＩＩタンパク質の結合溝に収容される各ペプチドについて真の結合エネルギーそれ自身計算するものではないことも理解されるべきである。根本的な目的は、選択されたタンパク質の１次構造（すなわち、アミノ酸配列）に基づいてＴ細胞エピトープの位置を予想する助けとして相対的な結合エネルギーデータを得ることである。比較的高い結合エネルギー、すなわち選択された閾値以上の結合エネルギーは、リガンド中のＴ細胞エピトープの存在を示唆するあろう。次いで、リガンドに少なくとも１回のアミノ酸置換を施し、結合エネルギーを再計算すればよい。計算が迅速性を有するため、ペプチド配列のこれらの操作はコストに見合う利用可能なコンピューターハードウェアにおいてプログラムのユーザインターフェース内で対話式に実行できる。したがって、コンピューターハードウェアへの大きな投資は要求されない。
【０１２３】
同じ目的のために他の利用可能なソフトウェアを使用できるかもしれないことは当業者には明白であろう。特に、タンパク質結合サイト内にリガンドをドッキングさせ得るより精巧なソフトウェアを、エネルギー最小化と共に使用してもよい。ドッキングソフトウェアの例は次の通りである：ＤＯＣＫ（Ｋｕｎｔｚ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１６１：２６９  ２８８（１９８２））、ＬＵＤＩ（Ｂｏｅｈｍ，Ｈ．Ｊ．、Ｊ．Ｃｏｍｐｕｔ  Ａｉｄｅｄ  Ｍｏｌ．Ｄｅｓ．、８：６２３−６３２（１９９４））およびＦＬＥＸＸ（Ｒａｒｅｙ  Ｍ．、ｅｔ  ａｌ．、ＩＳＭＢ、３：３００−３０８（１９９５））。分子モデリングおよび操作ソフトウェアの例としては：ＡＭＢＥＲ（Ｔｒｉｐｏｓ）およびＣＨＡＲｍ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ  Ｉｎｃ．）。これらの計算方法の使用は、必要な計算を行なうために要求される処理時間の長さにより本発明方法の処理能力を厳しく制限するであろう。しかし、本発明の方法によって「バインダーとして陽性」であると判明したペプチドについて結合エネルギーのより正確な計算結果を得るために「第２のスクリーン」として、このような方法を使用し得るというのもあり得ることである。洗練された分子の機械的または分子の動的な計算のための処理時間の制限は、これらの計算を行なうソフトウェアの設計およびコンピューターハードウェアの現在の技術制限の両者によって決まる。将来的には、より効率的なコードが書かれ、さらにコンピュータープロセッサー速度の持続的な増加によって、より扱いやすい時間枠内でそのような計算を行なうことが実現可能になるかもしれない。巨大分子に適用されるエネルギー関数および折り畳まれたタンパク質構造内で起こる様々な相互作用についての考慮に関するさらに詳しい情報は以下に見られる：Ｂｒｏｏｋｓ，Ｂ．Ｒ．，ｅｔ  ａｌ．、Ｊ；Ｃｏｍｐｕｔ．Ｃｈｅｍ．、４：１８７−２１７（１９８３）。一般的なタンパク質−リガンド相互作用に関するさらに詳細な情報は以下に見られる：Ｄａｕｂｅｒ−Ｏｓｇｕｔｈｏｒｐｅ  ｅｔ  ａｌ．、ｐｒｏｔｅｉｎｓ４（１）：３１−４７（１９８８）。その内容の全体は言及によって本願に組み入れられる。有用な背景的事項は、例えば以下に見られる：Ｆａｓｍａｎ，Ｇ．Ｄ．、ｅｄ．、Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｔｈｅ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ、Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ＩＳＢＮ：０−３０６  ４３１３−９。
（実施例２）
Ｆｃ−レプチンの脱免疫形
レプチンは、脂肪量（ａｄｉｐｏｓｅ  ｍａｓｓ）を維持するホメオスタシス機構（ｈｏｎｅｏｓｔａｔｉｃ  ｍｅｃｈａｍｉｓｍｓ）に関わる分泌型シグナリング１４６アミノ酸残基タンパク質である（例えばＷＯ  ００／４０６１５、ＷＯ  ９８／２８４２７、ＷＯ  ９６／０５３０９）。タンパク質（またそのアンタゴニスト）は、糖尿病、高血圧およびコレステロール代謝の治療のために重要な治療上の可能性を提示する。
【０１２４】
Ｆｃ−レプチンは血清中半減期がレプチン自体と比較して非常に改善された融合タンパク質である（ＷＯ  ００４０６１５）。しかし、ＦｃがヒトＩｇＧ１またはヒトＩｇＧ３に由来する場合のようにある種のＦｃレプチンは、皮下注射による投与のようなある状況下で増強された免疫原性を示す可能性がある。フェーズＩの治験において、レプチン単独で、少なくとも、何らかの免疫原性を有することが見出された。本発明は、ＭＨＣクラスＩＩ結合能力ゆえに潜在的なＴ細胞エピトープであると識別されたレプチン１次配列内の配列を開示する。この開示は、特に、約１４６個のアミノ酸残基を含むヒトレプチン部分に関する。
【０１２５】
他にも修飾されたレプチンは提供されているが（米国特許第５，９００，４０４号；Ｗ０９６／０５３０９）、これらの手法は、例えばレプチンの商用生産における改良を志向するものであり、例えば、インビトロでの安定性を改善したものである。このような教示は、タンパク質の免疫原特性に対するＴ細胞エピトープの重要性を認識していないし、本発明のスキームによる特定かつ制御された特性に直接影響を及ぼすものとは考えられていない。具体的なＦｃ−レプチン形：Ｆｃγ１−レプチン、Ｆｃγ２−レプチン、両方の形、好ましくはリンカーペプチド、および場合によってはＦｃレセプターへの親和性が低減するように修飾されたＦｃ領域を有するもの。
【０１２６】
レプチン中の修飾配列を以下に示す：
免疫原性が修飾されていないヒト肥満タンパク質（レプチン）の配列の一部であって、潜在的なＭＨＣクラスＩＩ結合活性を有するアミノ酸配列は、本発明の方法によって識別された以下の群から選択される：
潜在的ヒトＭＨＣクラスＩＩ結合活性を有するヒトレプチン中のペプチド配列。
【０１２７】
【表１】
2004532620.tif 000003
【０１２８】
ヒトレプチン（ＷＴ＝野生型）の潜在的なＴ細胞エピトープの除去をもたらす置換。
【０１２９】
【表２】
2004532620.tif 000004
【０１３０】
上に挙げたペプチド配列のうちのいずれも、免疫原性のない、または低減された配列を得るために１個または複数のアミノ酸を交換することにより修飾するために使用することができる。
（実施例３）
Ｆｃ−ＩＬ−１Ｒａの脱免疫形
本発明は１個または複数のＴ細胞エピトープを除去したインターロイキン−１レセプターアンタゴニスト（ＩＬ−１Ｒａ）の修飾された形を提供する。ＩＬ−１は様々な組織に対する多面発現的効果（ｐｌｅｉｏｔｒｏｐｉｃ  ｅｆｆｅｃｔｓ）を有する重要な炎症および免疫調整サイトカインであるが、慢性関節リウマチ（ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ  ａｒｔｈｒｉｔｉｓ）および局所的組織損害を伴う他の疾病に関連した病理的態様の原因ともなっている。ＩＬ−１の作用を阻害できるＩＬ−１レセプターアンタゴニストが精製され、遺伝子がクローン化されている［Ｅｉｓｅｎｂｕｒｇ  Ｓ．Ｐ．ｅｔ  ａｌ（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ，３４３：３４１−３４６；Ｃａｒｔｅｒ，Ｄ．Ｂ．ｅｔ  ａｌ（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ，３４４：６３３−６３７］。他にもＩＬ−１Ｒａ分子が提供されている［例えば、米国特許第５，０７５，２２２号］。このタンパク質の組換え形は、ＩＬ−１の作用が有害な疾病症状の治療の可能性を有する。しかし、増強された特性を備えたＩＬ−１Ｒａ類似体が継続的に必要とされている。強化が望まれている点としては前記治療剤の別スキーム、並びに発現および精製の様式（ｍｏｄａｌｉｔｙ）が含まれるが、また特に、タンパク質の生物学的特性における改良も含まれる。ヒトに投与した際のインビボ特性の改善は特に必要である。この点では、ヒトに免疫反応を引き起こす可能性が低減されているか存在しないＩＬ−１Ｒａの提供が強く望まれている。そのようなタンパク質は、対象とするヒトの体内で増加した循環時間を示すことが期待され、ＩＬ−１Ｒａについて多数の例が示されている慢性または再発性の疾病状態において特に有益であろう。本発明は、インビボで増強された特性を示すと期待されるＩＬ−１Ｒａタンパク質の修飾形を提供する。この開示は特に、１５２個のアミノ酸残基からなるヒトＩＬ−１Ｒａタンパク質（Ｅｉｓｅｎｂｕｒｇ，Ｓ．Ｐ．ｅｔ  ａｌ（１９９１）  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８８：５２３２−５２３６）に関する。
具体的なＦｃ−ＩＬ−１Ｒａ形：Ｆｃγ１−ＩＬ−１Ｒａ、Ｆｃγ２−ＩＬ−１Ｒａ、両方の形、好ましくはリンカーペプチド、および場合によってはＦｃレセプターへの親和性が低減するように修飾されたＦｃ領域を有するもの。
潜在的ヒトＭＨＣクラスＩＩ結合活性を有するヒトインターロイキン−１レセプターアンタゴニスト（ＩＬ−１Ｒａ）中のペプチド配列。
【０１３１】
【表３】
2004532620.tif 000005
【０１３２】
ヒトインターロイキン−１レセプターアンタゴニスト（ＩＬ−１Ｒａ）（ＷＴ＝野生型）の潜在的なＴ細胞エピトープの除去をもたらす置換。
【０１３３】
【表４】
2004532620.tif 000006
【０１３４】
（実施例４）
Ｆｃ−ＢＮＤＦの脱免疫形
本発明は１個または複数のＴ細胞エピトープを除去したヒト脳由来神経栄養因子（ＢＮＤＦ：ｂｒａｉｎ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｆａｃｔｏｒ）の修飾された形を提供する。ＢＮＤＦはタンパク質の神経成長因子ファミリーの糖タンパク質である。成熟した１１９個のアミノ酸糖タンパク質は、神経細胞集団の存続を促進する神経成長因子を産生するために、より大きな前駆体から加工される  ［Ｊｏｎｅｓ  Ｋ．Ｒ．  ＆  Ｒｅｉｃｈａｒｄｔ，Ｌ．Ｆ．（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  Ｕ．Ｓ．Ａ．８７：８０６０−８０６４］。他にも修飾ＢＮＤＦ分子  ［米国特許第５，７７０，５７７号］および組換えＢＮＤＦ分子の商用生産への手法［米国特許５，９８６，０７０号］が提供されている。そのような神経細胞はすべて中枢神経系に位置するかこれに直接に接続するものである。ＢＮＤＦの組換え製造は、タンパク質の治療の可能性を、神経再生および変性疾患（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ  ｄｉｓｅａｓｅ）の治療の促進のための探索を可能にする。具体的なＦｃ−ＢＮＤＦ形：Ｆｃγ１−ＢＮＤＦ、Ｆｃγ２−ＢＮＤＦ、両方の形、好ましくはリンカーペプチド、および場合によってはＦｃレセプターへの親和性が低減するように修飾されたＦｃ領域を有するもの。
潜在的ヒトＭＨＣクラスＩＩ結合活性を有するヒト脳由来神経栄養因子（ＢＮＤＦ）中のペプチド配列。
【０１３５】
【表５】
2004532620.tif 000007
【０１３６】
ヒト脳由来神経栄養因子（ＢＮＤＦ）（ＷＴ＝野生型）の潜在的なＴ細胞エピトープの除去をもたらす置換。
【０１３７】
【表６】
2004532620.tif 000008
【０１３８】
【表７】
2004532620.tif 000009
【０１３９】
（実施例５）
Ｆｃ−ＥＰＯの脱免疫形
本発明は１個または複数のＴ細胞エピトープを除去したヒトエリスロポエチン（ＥＰＯ）の修飾された形を提供する。ＥＰＯは赤血球前駆細胞の赤血球への成熟に関わる１６５個のアミノ酸残基糖タンパク質ホルモンである。天然に存在するＥＰＯは、胎児期の肝臓によって、および成人の腎臓によって生産され、血中を循環して骨髄中の赤血球の生産を刺激する。貧血は、ほとんど常に腎不全の結果（腎臓からのＥＰＯが減少することによる）である。組換えＥＰＯは、慢性の腎不全に起因する貧血の有効な治療法として使用される。
【０１４０】
ヒトエリスロポエチンのアミノ酸配列１〜１６５を有する組換えＥＰＯ（哺乳類細胞の中で発現されたもの）［Ｊａｃｏｂｓ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ，３１３：８０６−８１０；Ｌｉｎ，Ｆ．−Ｋ．ｅｔ  ａｌ（１９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８２：７５８０−７５８５］は、いずれも末端にシアル酸残基を含む３個のＮ結合した、および、１個のＯ結合したオリゴ糖を含む。後者は、肝アシアロ糖タンパク質（ａｓｉａｌｏｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ）結合タンパク質による循環系からのＥＰＯの迅速除去を回避し得るようにすることにおいて重要である。
【０１４１】
脱免疫されていないＦｃ−ＥＰＯは知られている（例えば、ＷＯ  ９９／５８６６２、ＷＯ  ９９／０２７０９）。
具体的なＦｃ−ＥＰＯ形：Ｆｃγ１−ＥＰＯ、Ｆｃγ２−ＥＰＯ、両方の形、好ましくはリンカーペプチド、および場合によってはＦｃレセプターへの親和性が低減するように修飾されたＦｃ領域を有するもの。ＥＰＯはグリコシル化または部分グリコシル化されていてもよく、修飾されたグリコシル化パターンを有してもよい。
潜在的ヒトＭＨＣクラスＩＩ結合活性を有するヒトエリスロポエチン（ＥＰＯ）中のペプチド配列。
【０１４２】
【表８】
2004532620.tif 000010
【０１４３】
ヒトエリスロポエチン（ＥＰＯ）（ＷＴ＝野生型）の潜在的なＴ細胞エピトープの除去をもたらす置換。
【０１４４】
【表９】
2004532620.tif 000011
【０１４５】
【表１０】
2004532620.tif 000012
【０１４６】
（実施例６）
Ｇ−ＣＳＦの脱免疫形
本発明は１個または複数のＴ細胞エピトープを除去したヒト顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）の修飾された形を提供する。Ｇ−ＣＳＦは重要な造血性（ｈａｅｍｏｐｏｉｅｔｉｃ）サイトカインであり、現在は、血中の好中球（ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌｓ）の増加が有益である症状の治療において使用されている。これらは癌療法、様々な感染症、および敗血症のような関連する症状を含む。Ｇ−ＣＳＦは単独でも、あるいは他の化合物、また、骨髄移植用の造血細胞のエクスビボ（ｅｘ  ｖｉｖｏ）拡張ではサイトカインと組み合わせて使用される。
【０１４７】
ヒトＧ−ＣＳＦの２つの形が、一般にこのサイトカインに認められている。１つは１７７個のアミノ酸のタンパク質であり、他方は、１７４個のアミノ酸のタンパク質であり［Ｎａｇａｔａ  ｅｔ  ａｌ．（１９８６），ＥＭＢＯ  Ｊ．５：５７５−５８１］、１７４個のアミノ酸形は、インビボで、最も大きな特異的生物学的活性を有することが判明した。組換えＤＮＡ技術は、商用規模の量でのＧ−ＣＳＦの生産を可能にし、これは真核生物宿主細胞システムと原核生物宿主細胞システムの両方の利用されている。この開示は、特に、ヒトＧ−ＣＳＦとして認識されているの両方の形、すなわち、１７７個のアミノ酸種および１７４個のアミノ酸種であるタンパク質に関する。
【０１４８】
Ｇ−ＣＳＦの他のポリペプチド類似体およびペプチド断片は、サイト特異的アミノ酸置換または化学的付加物による修飾によって修飾された形を含め、以前に開示されている。したがって、米国特許第４，８１０，６４３号は、特定のＣｙｓ残基を別のアミノ酸で置換した類似体、および第１の（Ｎ−末端）位置にＡｌａ残基を有するＧ−ＣＳＦを開示する。ＥＰ  ０  ３３５  ４２３は、Ｇ−ＣＳＦ活性を有するポリペプチド中の少なくとも１個のアミノ基の修飾を開示する。ＥＰ  ０  ２７２  ７０３は、Ｎ−末端の近くでアミノ酸を除去または置換したＧ−ＣＳＦ誘導体を開示する。ＥＰ  ０  ４５９  ６３０は、Ｃｙｓ  １７およびＡｓｐ２７をＳｅｒ残基に置換したＧ−ＣＳＦ誘導体を開示する。ＥＰ  ０  ２４３  １５３は、組換え生成物の収率を増すために、少なくとも１個の酵母ＫＥＸ２プロテアーゼプロセッシングサイトの不活性化により修飾されたＧ−ＣＳＦを開示し、米国特許第４，９０４，５８４号は、リジンが変更されたタンパク質を開示する。ＷＯ  ９０／１２８７４はＣｙｓに変更された変種をさらに開示し、オーストラリア特許ＡＵ  １０９４８／９２は、原核生物の発現の後の分子フォールディングを支援するためにＧ−ＣＳＦ分子のいずれかの末端にアミノ酸を付加して例を開示する。さらにオーストラリア特許；ＡＵ  ７６３８０／９１は、Ｇ−ＣＳＦ  １７４アミノ酸形の位置５０〜５６、および１７７アミノ酸形の内の５３〜５９の位置におけるＧ−ＣＳＦ変種を開示する。さらに特にＨｉｓ残基での変更も開示されている。
脱免疫されていないＦｃ−Ｇ−ＣＳＦは例えば、ＷＯ  ９９／５８６６２により知られている。
具体的なＦｃ−Ｇ−ＣＳＦ形：Ｆｃγ１−Ｇ−ＣＳＦ、Ｆｃγ２−Ｇ−ＣＳＦ、両方の形、好ましくはリンカーペプチド、および場合によってはＦｃレセプターへの親和性が低減するように修飾されたＦｃ領域を有するもの。
潜在的ヒトＭＨＣクラスＩＩ結合活性を有するヒト顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）中のペプチド配列。
【０１４９】
【表１１】
2004532620.tif 000013
【０１５０】
ヒト顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）（ＷＴ＝野生型）の潜在的なＴ細胞エピトープの除去をもたらす置換。
【０１５１】
【表１２】
2004532620.tif 000014
【０１５２】
（実施例７）
ＫＧＦの脱免疫形
本発明は１個または複数のＴ細胞エピトープを除去したヒトケラチノサイト成長因子（ＫＧＦ）の修飾された形を提供する。ＫＧＦはタンパク質の繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）／ヘパリン結合成長因子ファミリーのメンバーである。これは主に肺中で発現される分泌型糖タンパク質で、ケラチノサイトおよび他の上皮細胞の成長を刺激することにより傷の治癒を促進する［Ｆｉｎｃｈ  ｅｔ  ａｌ  （１９８９），Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４：７５２−７５５；Ｒｕｂｉｎ  ｅｔ  ａｌ  （１９８９），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８６：８０２−８０６］。糖タンパク質の成熟（被加工）形は１６３個のアミノ酸残基を含み、特別の細胞系の培養後、調整した培地から分離でき［Ｒｕｂｉｎ  ｅｔ  ａｌ，（１９８９）上掲箇所］、あるいは組換え技術を用いて製造できる［Ｒｏｎ  ｅｔ  ａｌ（１９９３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：２９８４−２９８８］。このタンパク質は、多数の重要な疾病および傷修復において、上皮細胞成長を刺激する治療上の価値がある。この開示は特に１６３個のアミノ酸残基からなるヒトＫＧＦタンパク質の成熟（被加工）形に関する。他にもＫＧＦ分子を提供した例はあり［例えば米国、６，００８，３２８；ＷＯ９０／０８７７１；］修飾されたＫＧＦも含まれるが［Ｒｏｎ  ｅｔ  ａｌ（１９９３）、上掲箇所；ＷＯ９５０１４３４］。
具体的なＦｃ−ＫＧＦ形：Ｆｃγ１−ＫＧＦ、Ｆｃγ２−ＫＧＦ、両方の形、好ましくはリンカーペプチド、および場合によってはＦｃレセプターへの親和性が低減するように修飾されたＦｃ領域を有するもの。
潜在的ヒトＭＨＣクラスＩＩ結合活性を有するヒトケラチノサイト成長因子（ＫＧＦ）中のペプチド配列。
【０１５３】
【表１３】
2004532620.tif 000015
【０１５４】
ヒトケラチノサイト成長因子（ＫＧＦ）（ＷＴ＝野生型）の潜在的なＴ細胞エピトープの除去をもたらす置換。
【０１５５】
【表１４】
2004532620.tif 000016
【０１５６】
（実施例８）
対応するＦｃ融合体内のｓＴＮＦ−Ｒ（Ｉ）およびｓＴＮＦ阻害剤の脱免疫形
Ｆｃ−ｓＴＮＦ−Ｒ（Ｉ）およびＦｃ−ｓＴＮＦ阻害剤は、ｓＴＮＦ−Ｒ（Ｉ）およびｓＴＮＦ阻害剤自体と比較して血清半減期が長い融合タンパク質である。しかし、ＦｃがヒトＩｇＧ１かヒトＩｇＧ３に由来するような場合、ある種のＦｃ−ＴＮＦ−ＲＩは、皮下注射による投与のようなある状況の下では増強された免疫原性を示す可能性がある。本発明は、１個または複数のＴ細胞エピトープが除去された可溶性腫瘍壊死因子レセプタータイプＩ（ｓＴＮＦ−ＲＩ）の修飾された形を提供する。ｓＴＮＦ−ＲＩ（可溶性腫瘍壊死因子レセプタータイプＩ）は、これまでに記載例のあるヒト腫瘍壊死因子レセプターの誘導体であり［Ｇｒａｙ，Ｐ．Ｗ．ｅｔ  ａｌ（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８７：７３８０−７３８４；Ｌｏｅｔｓｃｈｅｒｅ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ，（１９９０）Ｃｅｌｌ  ６１：３５１−３５９；Ｓｃｈａｌｌ，Ｔ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ（１９９０）Ｃｅｌｌ  ６１：３６１−３７０］、完全なレセプターの細胞外領域を含みおよそ３０ＫＤａ分子量を示す。別の可溶性ＴＮＦ阻害剤、特に４０ＫＤａ形も知られている［米国特許第６，１４３，８６６号］。可溶性型は腫瘍壊死因子アルファと高い親和性で結合し、サイトカインの細胞毒素活性をインビトロで阻害する。腫瘍壊死因子レベルが過大となって病態的な結果を惹起している場合には、ｓＴＮＦ−ＲＩの組換体調製物は、疾病の治療に重要な治療上の価値を有する。悪液質（ｃａｈｅｘｉａ）、敗血症および慢性関節リウマチなどを含む自己免疫疾患などの症状が、ｓＴＮＦ−ＲＩのこうした治療剤の標的となり得る。Ｂｒｅｗｅｒら（米国特許第６，１４３，８６６号）を含む他の人たちは修飾されたｓＴＮＦ−ＲＩ分子を提供している。
潜在的ヒトＭＨＣクラスＩＩ結合活性を有するヒト３０ＫＤａ  ｓＴＮＦ−ＲＩ中のペプチド配列：
【０１５７】
【表１５】
2004532620.tif 000017
【０１５８】
潜在的ヒトＭＨＣクラスＩＩ結合活性を有するヒト４０ＫＤａ  ｓＴＮＦ阻害剤中のペプチド配列は以下の通りである：
【０１５９】
【表１６】
2004532620.tif 000018
【０１６０】
（実施例９）
可溶性ＴＮＦ−Ｒ２
Ｆｃ−ｓＴＮＦ−Ｒ２は、ｓＴＮＦ−Ｒ２自体と比較して血清半減期が長い融合タンパク質である。しかし、ＦｃがヒトＩｇＧ１かヒトＩｇＧ３に由来するような場合、ある種のＦｃ−ｓＴＮＦ−Ｒ２は、皮下注射による投与のようなある状況の下では増強された免疫原性を示す可能性がある。
【０１６１】
可溶性腫瘍壊死因子レセプター２（ｓＴＮＦ−Ｒ２）はこれまでに記載例のあるヒト腫瘍の誘導体であり［Ｓｍｉｔｈ，Ｃ．Ａ．ｅｔ  ａｌ（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４８：１０１９  １０２３；Ｋｏｈｎｏ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８７：８３３１−８３３５；Ｂｅｌｔｉｎｇｅｒ，Ｃ．Ｐ．ｅｔ  ａｌ（１９９６）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ３５：９４−１００］、完全なレセプターの細胞外領域を含む。可溶性型は腫瘍壊死因子と高い親和性で結合し、サイトカインの細胞毒素活性をインビトロで阻害する。腫瘍壊死因子レベルが過大となって病態的な結果を惹起している場合には、ＴＮＦ−Ｒ２の組換体調製物は、疾病の治療に重要な治療上の価値を有する。エタナーセプト（ｅｔｈａｎｅｒｃｅｐｔ）と名付けられた特別の組換え製剤は、慢性関節リウマチの治療のための臨床的な承認を獲得しており、これおよび他の同様の薬剤は悪液質、敗血症および自己免疫疾患その他の症状の治療に有益である。エタナーセプトは、ヒトＩｇＧ１分子のＦｃ領域と組み合わさったヒトＴＮＦＲ２分子の細胞外の領域を含む二量体の融合タンパク質である。二量体の分子は９３４個のアミノ酸を含む［米国特許第５，３９５，７６０号；米国特許第５，６０５，６９０号；米国特許第５，９４５，３９７号］。
潜在的ヒトＭＨＣクラスＩＩ結合活性を有するヒトＴＮＦＲ２タンパク質のＴＮＦ結合領域中のペプチド配列：
【０１６２】
【表１７】
2004532620.tif 000019
【０１６３】
（実施例１０）
ベータ−グルコセレブロシダーゼ（β−ＧＣＲ）の非天然形
Ｆｃ−β−ＧＣＲは、β−ＧＣＲ自体と比較して血清半減期が長い融合タンパク質である。しかし、ＦｃがヒトＩｇＧ１かヒトＩｇＧ３に由来するような場合、ある種のＦｃ−β−ＧＣＲは、皮下注射による投与のようなある状況の下では増強された免疫原性を示す可能性がある。本発明は、１個または複数のＴ細胞エピトープが除去されたヒトＧＣＲ、好ましくはＦｃ−β−ＧＣＲの修飾された形を提供する。
【０１６４】
ベータ−グルコセレブロシダーゼ（ｂ−Ｄ−グルコシル−Ｎ−アシルスフィンゴシングルコヒドロラーゼ（Ｅ．Ｃ．３．２．１．４５））は、４９７個のアミノ酸残基からなる単量体糖タンパク質である。この酵素は糖脂質グルコセレブロシドのグルコースとセラミドへの加水分解を触媒する。ＧＣＲ活性の欠乏は、ゴーシェ病と呼ばれるリソソーム性蓄積（ｌｙｓｏｓｏｍａｌ  ｓｔｏｒａｇｅ）をもたらす。疾病は、肝臓、脾臓、骨髄および他の器官に蓄積するグルコセレブロシド結合−組織マクロファージ（ｇｌｕｃｏｃｅｒｅｂｒｏｓｉｄｅ  ｅｎｇｏｒｇｅｄ  ｔｉｓｓｕｅ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ）の蓄積によって特徴付けられる。この疾病は、重篤さにより段階があり、血液に関する問題はあるが神経には関わらないタイプｌから神経に広範囲に関与する誕生後初期に現われるタイプ２があり、例外なく進行的で２歳以内に致死する。タイプ３疾病も分類によっては認められ、やはり神経への関与を示す。従来、ゴーシェ病の唯一の有用な治療法はヒト胎盤に由来したＧＣＲ（アルグセラーゼ（ａｌｇｌｕｃｅｒａｓｅ）として知られている）の投与であったが、最近では、組換えＧＣＲ（「セレダーゼ（Ｃｅｒｅｄａｓｅ）および「セレザイム（Ｃｅｒｅｚｙｍｅ）」）製剤が、タイプＩの治療に効果があることが示されている［Ｎｉｅｄｅｒａｕ，Ｃ．ｅｔ  ａｌ（１９９８）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｒｅｓ．３：２５−３０］。
【０１６５】
本発明によれば、グルコセレブロシダーゼの特別の商用形を検討して、特に免疫原性であるかが試験される。これは、これらが組替えにより高マンノースオリゴ糖を有するためである。ＣｅｒｅｄａｓｅまたはＣｅｒｅｚｙｍｅのようなこうしたタンパク質を投与すると、非天然のタンパク質には、マクロファージや樹状細胞などの抗原提示細胞上のマンノースレセプターが優先的に結合する。次いで、非天然タンパク質は取り込まれ、その部分はペプチドに分解され、ペプチドはＭＨＣクラスＩＩによってＴ細胞レセプターに提示される。誘導されたペプチドがＭＨＣクラスＩＩに結合できないようにグルコセレブロシダーゼ配列を変化させることによって、免疫原性が低減される。
【０１６６】
他にも、修飾ＧＣＲを含むＧＣＲ分子が提供されているが［米国特許第５，２３６，８３８号］、この教示は、タンパク質の免疫原の特性へのＴ−細胞エピトープの重要性を認識したものではない。
潜在的ヒトＭＨＣクラスＩＩ結合活性を有するヒトβ−ＧＣＲ中のペプチド配列：
【０１６７】
【表１８】
2004532620.tif 000020
【０１６８】
（上記の続き）
【０１６９】
【表１９】
2004532620.tif 000021
【０１７０】
（実施例１１）
Ｆｃ−ＩＬ２の脱免疫形
Ｆｃ−ＩＬ２の非脱免疫形は、例えばＷＯ  ９６／０８５７０に記載されている。
具体的Ｆｃ−ＩＬ２形：Ｆｃγ１−ＩＬ２、Ｆｃγ２−ＩＬ２、両方の形、好ましくはリンカーペプチド、および場合によってはＦｃレセプターへの親和性が低減するように修飾されたＦｃ領域を有するもの。
（実施例１２）
Ｆｃ−ＩＬ１２の脱免疫形
Ｆｃ−ＩＬ１２の非脱免疫形は、例えばＷＯ  ９９／２９７３２に記載されている。
具体的Ｆｃ−ＩＬ１２形：Ｆｃγ１−ＩＬ１２、Ｆｃγ２−ＩＬ１２、両方の形、好ましくはリンカーペプチド、および場合によってはＦｃレセプターへの親和性が低減するように修飾されたＦｃ領域を有するもの。
（実施例１３）
Ｆｃ−ＴＮＦａの脱免疫形
Ｆｃ−ＴＮＦａの非脱免疫形は、例えばＷＯ  ９９／４３７１３に記載されている。
具体的Ｆｃ−ＴＮＦａ形：Ｆｃγ１−ＴＮＦａ、Ｆｃγ２−ＴＮＦａ、両方の形、好ましくはリンカーペプチド、および場合によってはＦｃレセプターへの親和性が低減するように修飾されたＦｃ領域を有するもの。
（実施例１４）
Ｆｃ−ＧＭ−ＣＳＦの脱免疫形
Ｆｃ−ＧＭ−ＣＳＦの非脱免疫形は、例えばＷＯ  ９９／４３７１３およびＷＯ  ０１／０７０８１に記載されている。
具体的Ｆｃ−ＧＭ−ＣＳＦ形：Ｆｃγ１−ＧＭ−ＣＳＦ、Ｆｃγ２−ＧＭ−ＣＳＦ、両方の形、好ましくはリンカーペプチド、および場合によってはＦｃレセプターへの親和性が低減するように修飾されたＦｃ領域を有するもの。
（実施例１５）
Ｆｃ−スブチリシンの脱免疫形
具体的Ｆｃ−スブチリシン形：Ｆｃγ１−スブチリシン、Ｆｃγ２−スブチリシン、両方の形、好ましくはリンカーペプチド、および場合によってはＦｃレセプターへの親和性が低減するように修飾されたＦｃ領域を有するもの。
（実施例１６）
Ｆｃ−インシュリンの脱免疫形
具体的Ｆｃ−インシュリン形：Ｆｃγ１−インシュリン、Ｆｃγ２−インシュリン、両方の形、好ましくはリンカーペプチド、および場合によってはＦｃレセプターへの親和性が低減するように修飾されたＦｃ領域を有するもの。
（実施例１７）
Ｆｃ−ＰＳＭＡの脱免疫形
Ｆｃ−ＰＳＭＡの非脱免疫形は、例えばＷＯ  ９６／０８５７０およびＷＯ  ０１／０７０８に記載されている。
具体的Ｆｃ−ＰＳＭＡ形：Ｆｃγ１−ＰＳＭＡ、Ｆｃγ２−ＰＳＭＡ、両方の形、好ましくはリンカーペプチド、および場合によってはＦｃレセプターへの親和性が低減するように修飾されたＦｃ領域を有するもの。
（実施例１８）
サイトカインに融合させた抗ＥＧＦＲ抗体を含む脱免疫された融合タンパク質
ヒト化されたおよびネズミのモノクローナル抗体４２５（ｈＭＡｂ  ４２５、米国特許第５，５５８、８６４号；ＥＰ  ０５３１  ４７２）、ネズミおよびキメラのモノクローナル抗体２２５（ｃＭＡｂ  ２２５、米国特許第４，９４３，５３３号およびＥＰ  ０３５９  ２８２）並びにネズミおよびヒト化されたＭＡｂ  ４Ｄ５（ｈＭａｂ  ４Ｄ５＝Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標））を本発明に従って脱免疫し、脱免疫ＩＬ２または修飾されていないＩＬ−２に融合した。サイトカインへの抗体の融合は、免疫原性を低減する必要が特に大きい状況を表わす。通常、治療用抗体は、治療用抗体の有効性を中和する抗イディオタイプ抗体を誘導し得る。これは特に治療用抗体が中または低レベルで投与される場合に起こり、これに対し寛容を引き起こすことができるのは非常に高レベルの場合に当てはまる。例えば、治療用抗体ＨｅｒｃｅｐｔｉｎおよびＲｉｔｕｘａｎは、数百ミリグラムの高用量で一般に与えられる。対照的に、抗体サイトカイン融合は、一般に数ミリグラム程度のより低用量で与えられる。したがって、抗体サイトカイン融合の服用量は、抗イディオタイプ抗体の形成を促進する傾向がある範囲にある。連結したサイトカインの存在は、既に免疫原性である抗体の免疫原性をさらに大きくする傾向がある。抗体４２５は抗原ＥＧＦ−Ｒに向けられ大腸癌細胞で反応する非ヒト抗体である。実施例１３に記載されるように、この抗体はＩＬ−２に融合された。ＩＬ−２または別のサイトカインの存在は、抗体の免疫原性を特にＶ領域で増強する。
【０１７１】
以下、本発明を、モノクローナルの抗ＥＧＦＲ抗体４２５−ＩＬ２構成体（これは高い治療値を有することが示された）についてより詳細に記載する。しかし、本発明はこの抗体や前記構成体およびその各既存の形に限定されるものではなく、他の抗ＥＧＦＲ抗体およびそれらの融合構成体、好ましくはサイトカイン融合免疫グロブリン、とりわけキメラ抗体２２５（ｃ２２５−Ｉｌ−２）（これは非常に類似した特性を有する）にも及び得る。基本的に、抗ＥＧＦＲ抗体の非ヒト、キメラまたはヒト化されたバージョンを用いて前記ＩＬ−２融合分子を合成できる。特に断らない限り、可変重鎖および軽鎖中のアミノ酸はすべてＫａｂａｔら（１９９１年）（免疫学的に興味のあるタンパク質の配列、米国保健福祉省）に従ってナンバリングしている。潜在的なＴ細胞エピトープは、エピトープの最初のアミノ酸を重鎖および軽鎖の最初のアミノ酸から線状に数えて番号を付けている。
【０１７２】
１．マウスサブグループフレームワークとの比較
ネズミ４２５のＶＨ（重鎖）およびＶＫ（軽鎖）のアミノ酸配列を、Ｋａｂａｔネズミ重鎖および軽鎖サブグループ中のコンセンサス配列と比較した。４２５  ＶＨはネズミ重鎖サブグループＪＩＢに割り当てることができる。このサブグループについてのコンセンサス配列との比較は、４２５のＶＨ中の位置９４でのセリンが異常なことを示す。この位置での最も一般的な残基はアルギニンである。４２５  ＶＫはマウスカッパ鎖サブグループＶｌに割り当てることができる。このサブグループについてコンセンサス配列との比較は、４２５ＶＫ中の位置４５〜４７、６０および１００の残基がこのサブグループでは異常なことを示す。Ｋａｂａｔに従いアミノ酸残基を番号付けする。
【０１７３】
２．ヒトフレームワークとの比較
ネズミ４２５のＶＨ（可変重鎖）およびＶＫ（可変カッパ軽鎖）のアミノ酸配列を、ヒト生殖細胞系ＶＨ（Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ，Ｉ．Ｍ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７：７７６−７９８）のディレクトリの配列およびＶＫ（Ｃｏｘ，Ｊ．Ｐ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．，（１９９４）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：８２７−８３６）配列、そしてさらにヒト生殖細胞系Ｊ領域配列（Ｒｏｕｔｌｅｄｇｅ，Ｅ．Ｇ．ｅｔ  ａｌ．，ｉｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃ  ａｎｄ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｍａｎ，Ｃｌａｒｋ，Ｍ．ｅｄ．Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｔｉｔｌｅｓ，Ｎｏｔｔｉｎｇｈａｍ，ＵＫ，ｐｐ１３−４４，１９９１）と比較した。重鎖および軽鎖のネズミ４２５の配列は、例えばＥＰ  ０５３１  ４７２から得ることができる。
【０１７４】
４２５ＶＨに対し選択される参照ヒトフレームワークは、ヒトＪＨ６を有するＶＨ１ＧＲＲとした。ディレクトリ中のＶＨ１ＧＲＲ配列は残基８８で終了する。したがって、ネズミ配列の位置９４における異常なセリンに対応する残基はない。この生殖細胞系配列は、４個のアミノ酸が変更されている再配置された成熟抗体遺伝子中に見出された。４２５ＶＫに対し選択される参照ヒトフレームワークはヒトＪＫ２を有するＬ６／ｖｇとした。この生殖細胞系配列は、アミノ酸変更のない再配置された成熟抗体重鎖中に見出された。
【０１７５】
３．「化粧張り」（“ｖｅｎｅｅｒｅｄ”）配列の設計
参照ヒトフレームワーク配列の識別に続いて、４２５ＶＨ及びＶＫのフレームワーク内の特定されていないアミノ酸残基を、ヒト参照フレームワーク配列の対応するアミノ酸に変更されなかった。抗体構造および結合のために重要と考えられる残基はこの方法では除外され変更しなかった。この段階で保持されたネズミ残基は大部分、非表面の埋没残基で、例えばＮ−末端での残基（これは最終抗体（１〜８個、好ましくは１〜５個のアミノ酸残基）のＣＤＲに近接している）とは別のものである。この方法により、表面の残基が主としてヒト性となり埋没残基が本来のネズミ配列内となるので「化粧張り」（“ｖｅｎｅｅｒｅｄ”）抗体に広く類似した配列を生じる。
【０１７６】
４．ペプチドスレッディング（ｔｈｒｅａｄｉｎｇ）分析
ネズミおよび「化粧張り」（“ｖｅｎｅｅｒｅｄ”）の４２５ＶＨとＶＫの配列を本発明による方法を用いて分析した。アミノ酸配列はすべての可能な１３ｍｅｒｓに分割する。引き続いて、１３ｍｅｒペプチドをＨＬＡ−ＤＲ  アロタイプの結合溝モデルに提示し、各対立遺伝子について各ペプチドに対し結合スコアを割り当てる。ペプチドの各ポケット結合側鎖においてコンホメーションスコアを計算する。このスコアは立体的な重なり、結合溝内のペプチドと残基間に起こり得る水素結合、ペプチドとポケット残基の間の静電気の相互作用および好適な接触に基づく。次いで、各側鎖のコンホメーションを変更し、スコアを再計算する。最も高いコンホメーションスコアを決定し、次いで、溝結合疎水性残基、非溝の親の水性残基、および結合溝に嵌まり込む残基の数に基づいて結合スコアを計算する。ヒトＭ  ＨＣクラスＩＩに知られているバインダーであるペプチドは、ほとんど偽陰性のない高い結合スコアを達成する。したがって、この分析で有意な結合スコアを達成するペプチドは潜在的なＴ細胞エピトープであると考えられる。ペプチドスレッディング分析の結果を、４２５ＶＨおよび４２５ＶＫについて表１に示す。潜在的なＴ細胞エピトープを、１３ｍｅｒの第１残基の線形的な番号によって示す。
【０１７７】
【表２０】
2004532620.tif 000022
【０１７８】
５．潜在的なＴ細胞エピトープの除去
置換するアミノ酸残基の番号付けは、Ｋａｂａｔに従う。潜在的なＴ細胞エピトープは、１３ｍｅｒの最初の残基の線形的な番号によって示す。
【０１７９】
化粧張り４２５重鎖可変領域から潜在的なＴ−細胞エピトープを除去するために必要なアミノ酸置換は、以下の通りであった：
・残基４１（Ｋａｂａｔ番号４１）のアラニンをプロリンに置換することで、番号３１の残基における潜在的なエピトープが除去される。
・残基４５（Ｋａｂａｔ番号４５）のロイシンをプロリンに置換することで、番号４３の残基における潜在的なエピトープが除去される。位置４５のプロリンはヒト生殖細胞系ＶＨ配列ＤＰ５２に見出される。
・残基４８（Ｋａｂａｔ番号４８）のイソロイシンをアラニンに置換することで、番号４６の残基における潜在的なエピトープが除去される。
・残基６８（Ｋａｂａｔ番号６７）のアラニンをバリンに置換することで、番号５８の残基における潜在的なエピトープが除去される。
・残基７０（Ｋａｂａｔ番号６９）のロイシンをイソロイシンに置換することで、番号６２の残基における潜在的なエピトープが除去される。
・残基９１（Ｋａｂａｔ番号８７）のセリンをトレオニンに置換することで、番号８１および８４の残基における潜在的なエピトープが除去される。
【０１８０】
化粧張り４２５軽鎖可変領域から潜在的なＴ細胞エピトープを除去するために必要なアミノ酸置換は、以下の通りであった。
・残基３５（Ｋａｂａｔ番号３６）のチロシンをヒスチジンに置換することで、番号２７の残基における潜在的なエピトープが除去される。
・残基５０（Ｋａｂａｔ番号５１）のトレオニンをアラニンに置換することで、番号４３の残基における潜在的なエピトープが除去される。この残基はＣＤＲ２内にある。アラニンは、一般にヒトおよびネズミ抗体の両方でこの位置に見出される。このエピトープを除去する別の置換は位置４５（Ｋａｂａｔ番号４６）でのロイシンをアラニンに代えることである。潜在的なエピトープを除去する保存的な置換はない。アラニンはいくつかの抗体でこの位置に見出される。
・残基９４（Ｋａｂａｔ番号９５）のイソロイシンをプロリンに置換することで、番号９２の残基における潜在的なエピトープが除去される。Ｋａｂａｔ残基９５はＣＤＲＬ３内にある。プロリンは、一般にマウス抗体配列でこの位置に見出され、ＣＤＲ外では、この潜在的なエピトープを除去する変化はない。
・残基１０３（Ｋａｂａｔ番号１０４）のロイシンをバリンに置換することで、番号９３の残基における潜在的なエピトープが除去される。
【０１８１】
６．脱免疫配列の設計
脱免疫された重鎖および軽鎖可変領域配列を、潜在的なＴ細胞エピトープの除去に必要な変更および抗体構造及び結合のために重要であろうフレームワーク残基についての考慮を入れて設計した。化粧張り配列に基づく脱免疫配列に加え、ネズミ配列に基づくＶＨおよびＶＫそれぞれについて追加的な配列を設計し、マウスペプチドスレッデッドバージョン（ＭｏＰＴ）と名付けた。このバージョンについては、Ｔ−細胞エピトープを除去するためにネズミ配列に直接変更を行なったが、ＣＤＲ外では、結合に有害でないと考えられる変更はない。この脱免疫バージョンでは配列表面（Ｂ−細胞）エピトープを除去する試みは行なわなかった。
【０１８２】
主要な脱免疫化ＶＨは、上記第５項の置換１〜６を含み、潜在的なＴ細胞エピトープは含まない。必要な様々な置換の抗体結合に対する影響を試験するためさらに４個の脱免疫化ＶＨ配列を設計した。主要な脱免疫化配列（４２５  ＶＨ１ＧＲＲ−ＶＨ−ｖ１）に行なわれた累積的な変更および残っている潜在的なＴ細胞エピトープを表２に詳しく示す。マウススレッデッドバージョンを、比較のために含む。
【０１８３】
【表２１】
2004532620.tif 000023
【０１８４】
主要な脱免疫化ＶＫは、上記第５項の置換１〜４を含み、潜在的なＴ細胞エピトープは含まない。必要な様々な置換の抗体結合に対する影響を試験するためさらに４個の脱免疫化ＶＫ配列を設計した。バージョン２は、同じ潜在的Ｔ細胞エピトープを別の置換で除去したバージョン１の代替物である。主要な脱免疫化配列（４２５  Ｌ６−ｖｇ−ＶＫ−ｖ１）に行なわれた累積的な変更および残っている潜在的なＴ細胞エピトープを表３に詳しく示す。マウススレッデッドバージョンを、比較のために含む。
【０１８５】
【表２２】
2004532620.tif 000024
【０１８６】
表４：ネズミＭＡｂ４２５のＶＨおよびＶＫの本来の、および「化粧張り」された配列
【０１８７】
【表２３】
2004532620.tif 000025
【０１８８】
表５：ＭＡｂ４２５の可変重鎖および軽鎖の脱免疫配列
【０１８９】
【表２４】
2004532620.tif 000026
【０１９０】
既に言及したように、本発明による修飾された抗ＥＧＦＲ抗体−サイトカイン構成体、好ましくはＭＡｂ  ４２５−Ｉｌ２は、好ましくは癌治療用の医薬組成物および医薬キットにおいて使用できる。「癌」および「腫瘍」は、典型的には無秩序な細胞成長によって特徴付けられる哺乳動物における生理学的症状を指すか述べるものである。本発明の医薬組成物によって、胸部、心臓、肺、小腸、大腸、脾臓、腎臓、膀胱、頭部および首、卵巣、前立腺、脳、膵臓、皮膚、骨、骨髄、血液、胸腺、子宮、睾丸、頚部および肝臓の腫瘍等を治療することができる。
【０１９１】
抗体４２５と同様に、同様の融合構成体を、モノクローナル抗体２２５を使用してネズミ、キメラ形式またはヒト化型において得ることができる。
（実施例１９）
１４．１８抗体−ＩＬ２およびＫＳ−１／４−ＩＬ２の脱免疫形
サイトカインインターロイキン−２（ＩＬ−２）を、腫瘍随伴抗原上皮細胞付着分子（ｔｕｍｏｒ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ａｎｔｉｇｅｎｓ  ｅｐｉｔｈｅｌｉｄ  ｃｅｌｌ  ａｄｏｈｅｓｉｏｎ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ：ＥｐＣＡＭ、ＫＳＡ、ＫＳ  １／４抗原）を対する特異的モノクローナル抗体ＫＳ−１／４およびｃｈｌ４．１８並びにジシアロガングリオシド（ｄｉｓｉａｌｏｇａｎｇｌｉｏｓｉｄｅ）  ＧＤにそれぞれ融合して、融合タンパク質ｃｈ１４．１８−ＩＬ２およびＫＳ−１／４−ＩＬ２をそれぞれ形成した（米国特許第５，６５０，１５０号、ＥＰ  ０  ３３８  ７６７）。これらの抗体は本発明によって脱免疫化され、免疫原性が修飾されたＩＬ２または修飾されていないＩＬ−２に融合した。
【０１９２】
抗ＥｐＣＡＭ抗体ＫＳ  １／４
モノクローナル抗体ＫＳ  １／４は、腺癌細胞上で高密度に見出され、さらにはるかに低いレベルではあるが正常の上皮細胞に見出される、４０，０００ダルトンの細胞表面抗原ＥｐＣＡＭ（上皮細胞付着分子）に特異的に結合するネズミ抗体である。この抗体は、疾病の検出に有効であることが示された。
【０１９３】
ＩＬ−２およびＩＬ−１２などの単一および組み合わせられたサイトカインへのＫＳ−１／４の様々な融合は記載されている（Ｗ０９８／２５９７８、Ｗ００１／５８９５７ＡおよびＷＯ  ０１／１０９１２）。これらの融合タンパク質は癌の動物モデルに有効である。しかし、サイトカインの存在により、これらの融合タンパク質は特に免疫原性となる。ヒトホストへの投与に応じて免疫反応を誘発する傾向が低減された変更されたＫＳ抗体分子が必要とされている。本発明によって修飾されたＫＳ抗体を提供するＭａｂ  ＫＳ  １／４の修飾された配列を下に示す。Ｖ領域のＴ細胞エピトープが変異により完全に除去された、ＫＳ−１／４の変異型は、コンピュータアルゴリズムについての述べたセクション中における上記所与の基準によって定義されるところによれば、哺乳類細胞中で有効に発現しＥｐＣＡＭ抗原への親和性はわずか約８分の１に低減した。この分子はＶＨｖ１／ＶＫｖ１と名付けられた。第２の抗体（ＶＨｖ２／ＶＫｖ１）は、同様に親和性が約３分の１に低減し、ＶＨｖ１／ＶＫｖｌとは１個のアミノ酸置換において異なっている。これらの２つの抗体はＫＳ−ＩＬ２融合タンパク質として哺乳類細胞中で発現された。ＫＳ（ＶＨｖ１／ＶＫｖｌ）−ＩＬ２およびＫＳ（ＶＨｖ２／ＶＫｖｌ）は、免疫療法による広いスペクトルのヒト癌治療に関して本発明で最も好ましい実施形態である。
【０１９４】
１．マウスサブグループフレームワークとの比較
ネズミＫＳ  ＶＨおよびＶＫのアミノ酸配列を、Ｋａｂａｔネズミ重鎖および軽鎖サブグループ（Ｋａｂａｔ、１９９１年）についてのコンセンサス配列と比較した。ネズミＫＳ  ＶＨはサブグループのいずれにも割り当てることができないが、サブグループＩＩ（Ａ）およびＶ（Ａ）に近似している。異常な残基は、通常はバリンである位置２、通常グルタミン酸である４６、通常トレオニンである６８に見出される。残基６９はより一般的にはロイシンまたはイソロイシンである。８２ｂでは、セリンが最もしばしば見出される。ネズミＫＳ  ＶＫはサブグループＶＩ（「図２」に割り当てることができる。異常な残基は、一般には両方ともロイシンである４６および４７に見出される。残基５８は異常である（この位置で通常見出されるのはロイシンまたはバリンのいずれかである）。
【０１９５】
２．ヒトフレームワークとの比較
ネズミＫＳ  ＶＨおよびＶＫのアミノ酸配列をヒト生殖細胞系ＶＨ（Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ、１９９２年）およびＶＫ（ＣＯＸ  ｅｔ  ａｌ、１９９４）配列ディレクトリ、およびさらにヒト生殖細胞系Ｊ領域配列（Ｒｏｕｔｌｅｄｇｅ  ｅｔ  ａｌ、１９９３年）配列と比較した。ＫＳ  ＶＨに対して選択される参照ヒトフレームワークはヒトＪＨ６を有するＤＰ１０とした。この生殖細胞系配列は、アミノ酸変更を持たない再配置された成熟抗体遺伝子で見出される。ＫＳ  ＶＫに対して選択される参照ヒトフレームワークはＢ１とした。フレームワーク−２としては、成熟したヒト抗体ＩＭＥＶ配列を使用した（Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ、１９９１における）。この配列は、ＣＤＲ２の直近に隣接しているネズミ配列と同一である。Ｊ領域配列はヒトＪＫ４とした。この生殖細胞系配列は再配置された成熟抗体軽鎖としては見つかっていない。
【０１９６】
３．化粧張り（ｖｅｎｅｅｒｅｄ）配列の設計
参照ヒトフレームワーク配列の識別に続いて、４２５ＶＨ及びＶＫフレームワークの内の特定されていないアミノ酸残基を、ヒト参照配列の対応するアミノ酸に変更した。抗体構造および結合２のために重要であると考えられる残基はこの方法では除外され変更しなかった。この段階で保持されたネズミ残基は大部分、非表面の埋没残基で、例えばＮ−末端での残基（これは最終抗体（１〜８個、好ましくは１〜５個のアミノ酸残基）のＣＤＲに近接している）とは別のものである。この方法により、表面の残基が主としてヒト性となり埋没残基が本来のネズミ配列内となるので「化粧張り」（“ｖｅｎｅｅｒｅｄ”）抗体に広く似ている配列を生じる。
【０１９７】
４．ペプチドスレッディング分析
ネズミおよび化粧張りのＫＳ  ＶＨとＶＫの配列を本発明による方法を用いて分析した。アミノ酸配列はすべての可能な１３ｍｅｒｓに分割する。引き続いて、１３ｍｅｒペプチドをＨＬＡ−ＤＲアロタイプの結合溝モデルに提示し、各対立遺伝子において各ペプチドに対し結合スコアを割り当てる。ペプチドの各ポケット結合側鎖についてコンホメーションスコアを計算する。このスコアは立体的な重なり、結合溝内のペプチドと残基間に起こり得る水素結合、ペプチドとポケット残基の間の静電気の相互作用および好適な接触に基づく。次いで、各側鎖のコンホメーションを変更し、スコアを再計算する。最も高いコンホメーションスコアを決定し、次いで、溝結合疎水性残基、非溝の親の水性残基、および結合溝に嵌まり込む残基の数に基づいて結合スコアを計算する。ヒトＭ  ＨＣクラスＩＩに知られているバインダーであるペプチドは、ほとんど偽陰性のない高い結合スコアを達成する。したがって、この分析で有意な結合スコアを達成するペプチドは潜在的なＴ細胞エピトープであると考えられる。ペプチドスレッディング分析の結果を、ネズミおよび化粧張り配列について表１に示す。
【０１９８】
【表２５】
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【０１９９】
５．潜在的なＴ細胞エピトープの除去
エピトープを構成する特定のペプチドにおいてアミノ酸置換を行なうことにより潜在的なＴ細胞エピトープを除去する。置換は、可能な場合には同様の物理化学的特性のアミノ酸を挿入することにより行なった。しかし、いくつかの潜在的なエピトープを除去するために、異なる大きさ、電荷または疎水性のアミノ酸に置換する必要があってもよい。結合に影響を及ぼし得るＣＤＲ内で変更を行なう必要がある場合には、特定のアミノ酸置換を伴うまたは伴わない変種を作る必要がある。置換するアミノ酸残基の番号付けは、Ｋａｂａｔに従う。潜在的なＴ細胞エピトープは、１３ｍｅｒの最初の残基の線形的な番号によって示す。
【０２００】
化粧張りＫＳ重鎖可変領域から潜在的なＴ−細胞エピトープを除去するために必要なアミノ酸置換は、以下の通りであった：
１．残基３８（Ｋａｂａｔ番号３８）のリジンをアルギニンに置換することで、残基番号３０における潜在的なエピトープが除去される。
２．残基７２（Ｋａｂａｔ番号７１）のロイシンをアラニンに、および残基７０（Ｋａｂａｔ番号６９）のフェニルアラニンをイソロイシン置換することで、残基番号６２における潜在的なエピトープが除去される。Ｋａｂａｔ番号６９のイソロイシンおよびＫａｂａｔ番号７１のアラニンは、ヒト生殖細胞系  ＶＨ配列ＤＰ１０に見出される。
３．残基７９（Ｋａｂａｔ番号７８）のアラニンをロイシンに置換することで、残基番号７８における潜在的なエピトープが除去される。
４．残基９１（Ｋａｂａｔ番号８７）のメチオニンをトレオニンに置換することで、残基番号８９における潜在的なエピトープが除去される。
５．ＣＤＲＨ３において、イソロイシン残基１００（Ｋａｂａｔ番号９６）をメチオニンに置換することで、残基番号９８における潜在的なエピトープが除去される。ＣＤＲＨ３外ではこの潜在的なエピトープを除去する変更はない。
【０２０１】
化粧張りＫＳ軽鎖可変領域から潜在的なＴ−細胞エピトープを除去するために必要なアミノ酸置換は、以下の通りであった：
１．残基３２（Ｋａｂａｔ番号３３）のメチオニンをイソロイシンに置換することで、残基番号２７における潜在的なエピトープが除去される。この残基はＣＤＲ２の内にある。イソロイシンはヒト抗体で一般にこの位置に見出される。
２．残基（Ｋａｂａｔ番号３）のロイシンをバリンに置換することで、位置１の残基における潜在的なエピトープが除去される。
３．残基５９（Ｋａｂａｔ番号６０）のアラニンをセリンに置換することで、残基番号５１における潜在的なエピトープが除去される。
【０２０２】
６．脱免疫配列の設計
脱免疫された重鎖および軽鎖配列を、潜在的なＴ細胞エピトープの除去に必要な変更および抗体構造及び結合のために重要であろうフレームワーク残基についての考慮を入れて設計した。化粧張り配列に基づく脱免疫配列に加え、ネズミ配列に基づくＶＨおよびＶＫそれぞれについて追加的な配列を設計し、マウスペプチドスレッデッドバージョン（ＭｏＰＴ）と名付けた。このバージョンについては、Ｔ−細胞エピトープを除去するためにネズミ配列に直接変更を行なったが、結合に有害であると考えられないＣＤＲ外の変更のみである。この脱免疫バージョンでは配列表面（Ｂ−細胞）エピトープを除去する試みは行なわなかった。主要な脱免疫化ＶＨは、上記第５項の置換１〜５を含み、さらに残基４３（Ｋａｂａｔ番号４３）の変更を含む。ネズミ配列に見られるリジンでヒトフレームワーク由来のグルタミンを置き換えた。リジンは正電荷を持ち、したがってグルタミンとは著しく異なる。この領域はＶＨ／ＶＬ接点を含んでもよい。主要な脱免疫ＶＨは潜在的なＴ細胞エピトープを含まない。必要な様々な置換の抗体結合に対する影響を試験するためさらに４個の脱免疫化ＶＨ配列を設計した。主要な脱免疫化配列（ＫＳＤＩＶＨｖ１）に行なわれた累積的な変更および残っている潜在的なＴ細胞エピトープを表２に詳しく示す。
【０２０３】
【表２６】
2004532620.tif 000028
【０２０４】
主要な脱免疫化ＶＫは、上記第５項の置換１〜３を含む。必要な様々な置換の抗体結合に対する影響を試験するためさらに３個の脱免疫化ＶＫ配列を設計した。主要な脱免疫化配列（ＫＳＤＩＶＫｖ１）およびに行なわれた累積的な変更および残っている潜在的なＴ細胞エピトープを表３に詳しく示す。
【０２０５】
【表２７】
2004532620.tif 000029
【０２０６】
修飾されたエピトープバージョンの配列：
【０２０７】
【表２８】
2004532620.tif 000030
【０２０８】
【表２９】
2004532620.tif 000031
【０２０９】
ＭＡｂ  １４．１８−ＩＬ−２
同様に、本発明に従ってモノクローナル抗体１４．１８をＩＬ−２に融合し脱免疫化した。
ネズミおよび化粧張り１４．１８配列の潜在的なＴ細胞エピトープは以下の通りである：
【０２１０】
【表３０】
2004532620.tif 000032
【０２１１】
脱免疫化１４．１８ＶＨのアミノ酸変更および潜在的エピトープは以下の通りである：
【０２１２】
【表３１】
2004532620.tif 000033
【０２１３】
脱免疫化１４．１８ＶＫのアミノ酸変更および潜在的エピトープは以下の通りである：
【０２１４】
【表３２】
2004532620.tif 000034
【０２１５】
修飾されたエピトープバージョンの配列：
【０２１６】
【表３３】
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【０２１７】
【表３４】
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【０２１８】
以上の記載および例は、説明のための例示であり限定的に解してはならない。本発明の技術思想および範囲内でさらに別の変更も可能であり、それらは当業者には自明であろう。
【図面の簡単な説明】
【０２１９】
【図１】融合タンパク質が免疫原性の増強を示すメカニズムのうちの１つを説明した説明図であり、図１ａは、Ｆｃレセプターを有する細胞に結合するＦｃ部分に融合したタンパク質（「Ｘ」）を示し、図１ｂは、「Ｘ」部分を優先的に分解するように処理した融合タンパク質を示し、図１ｃは、ＭＨＣ分子によってＴ細胞に提示される「Ｘ」のペプチド残部を示す。
【図２】Ｆｃ部分と第２の部分を含む融合タンパク質について増強された免疫原性のメカニズムを示す説明図であり、図２ａは、その表面上の「Ｘ」に特異的な抗体を発現するＢ細胞への融合タンパク質の結合を示し、融合タンパク質には、特異的抗体および抗体と未だ結合していないＦｃレセプターの両者が結合する。
【図３】融合タンパク質が増強された免疫原性を示す第２のメカニズムを説明した説明図であり、図１ａは、表面結合抗体を有するＢ細胞に結合するサイトカイン部分に融合したタンパク質（「Ｘ」）を示し、図３ｂは、処理されている融合タンパク質を示し、図３ｃは、付加的なＸサイトカイン融合タンパク質がＢ細胞の表面に結合されるのと同時に、「Ｘ」のペプチド残部がＭＨＣ分子によってＴ細胞に提示されている状態を示す。
【図４】組換えタンパク質が増強された免疫原性を示す別のメカニズムを説明した説明図であり、この場合、サイトカインＸ融合タンパク質が直接にＢ細胞を活性化し、Ｂ細胞は、Ｘに対する特定の抗体を合成し、これがＢ細胞の近傍におけるサイトカインの局所的濃度を増加させる。
【図５】組換えタンパク質が増強された免疫原性を表示す別のメカニズムを説明した説明図であり、図５ａは、特定のグルコシル化部分を有するタンパク質の、免疫細胞上でそのグルコシル化部分に対する細胞表面レセプターへの結合を示し、図５ｂは、グルコシル化したタンパク質の取り出しおよび分解を示し、図５ｃは、グルコシル化したタンパク質のペプチド残部をＭＨＣ分子がＴ細胞に提示する状態を示す。
【図６】抗体サイトカイン融合タンパク質が増強された免疫原性を表わすメカニズムを示した説明図であり、図６ａは、抗体−サイトカイン融合タンパク質のＣＤＲに特異的な抗体を発現するＢ細胞への抗体−サイトカイン融合タンパク質の結合を示し、融合タンパク質には、特異的抗体および抗体と未だ結合していないＦｃレセプターの両者が結合し、図６ｂは、処理されている融合タンパク質を示し、図６ｃは、付加的な抗体−サイトカイン融合タンパク質がＢ細胞の表面に結合されるのと同時に、ＣＤＲのペプチド残部がＭＨＣ分子によってＴ細胞に提示されている状態を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際公開パンフレット】
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2004532620.tif 000134
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004532620.tif 000135
【国際調査報告】
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2004532620.tif 000137
2004532620.tif 000138
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