(57)【要約】本発明は、組換えＭＧＤＧシンターゼを含み、１，２−ｓｎ−ジアシルグリセロールで強化された細胞の膜分画、それらの製造方法、ＭＧＤＧシンターゼ活性を誘導する分子をスクリーニングするためのそれらの使用、および該膜分画を使ったＭＧＤＧシンターゼ活性を誘導する分子をスクリーニングする方法に関するものである。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
総タンパク質重量に対して、少なくとも１重量％のＤＡＧを含み、かつ、球状小胞の形態であることを特徴とする少なくとも１つの組換えＭＧＤＧシンターゼを含む脂質小葉からなる原核細胞または真核動物由来の原形質膜分画。
【請求項２】
ＭＧＤＧシンターゼ／ＤＡＧモル比が、１０未満であることを特徴とする請求項１に記載の分画。
【請求項３】
ＭＧＤＧシンターゼ／ＤＡＧモル比が、０．１２未満であることを特徴とする請求項２に記載の分画。
【請求項４】
分画が、脂質二重層を形成する球状膜小胞の形態であることを特徴とする先の請求項のいずれか１つに記載の分画。
【請求項５】
膜小胞が、０．１μｍ〜１０μｍのサイズであることを特徴とする先の請求項のいずれか１つに記載の分画。
【請求項６】
ＭＧＤＧシンターゼが、脂質二重層の内面に位置することを特徴とする請求項４または５に記載の分画。
【請求項７】
小胞が、非反転型、反転型または混合型の小胞の形態であることを特徴とする請求項４〜６のいずれか１つに記載の分画。
【請求項８】
分画が、同一の脂質小葉中でＭＧＤＧシンターゼとＤＡＧとからなる混合型の小胞の形態であることを特徴とする請求項７に記載の分画。
【請求項９】
−第１工程で、原核細胞または真核動物を、植物ＭＧＤＧシンターゼをエンコードする遺伝子を含む構築物を使って形質転換する、
−第２工程で、上記細胞を、上記細胞によるＭＧＤＧシンターゼの合成を誘導するために、タンパク質合成を促進する培地で培養する、
−第３工程で、上記工程で培養した細胞を、少なくとも１つのホスホリパーゼＣを含む反応培地で培養する、および
−第４工程で、こうしてＤＡＧで富化された細胞を、少なくとも１つの組換えＭＧＤＧシンターゼと、該膜分画の総タンパク質重量に対して少なくとも１重量％のＤＡＧとを含み、球状小胞の形態である膜分画を得るために分画化する
からなることを特徴とする先の請求項のいずれか１つで定義されている膜分画の製造方法。
【請求項１０】
原核細胞が、細菌であることを特徴とする請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
バチルス・セレウスのホスホリパーゼＣを使用することを特徴とする請求項９または１０に記載の方法。
【請求項１２】
ホスホリパーゼＣを、反応培地１ｍｌあたり１Ｕ〜２０Ｕの濃度で使用することを特徴とする請求項９〜１１のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１３】
膜の分画化を、機械的なショック、熱ショック、浸透ショック、電気ショックまたは物理的なショックによって行うことを特徴とする請求項９〜１２のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１４】
ＭＧＤＧシンターゼ活性に影響を与える分子を、選抜および／またはスクリーニングするための請求項１〜８のいずれか１つで定義されている膜分画の使用。
【請求項１５】
ＭＧＤＧシンターゼ活性を抑制する分子を選抜および／またはスクリーニングするために、寄生体に対する有効成分または除草剤として使用することができる請求項１４に記載の使用。
【請求項１６】
−ｐＨ ４〜１１を有する水性相中で、試験基質と、十分な量の請求項１〜８のいずれか１つで定義されている膜分画および放射性同位元素で標識されたＵＤＰ−ガラクトースとを培養することからなる工程、
−膜分画の洗浄からなる工程、
−膜分画の分離からなる工程、そして
−ＭＧＤＧシンターゼ活性の測定からなる工程
からなることを特徴とするＭＧＤＧシンターゼ活性に影響を与える分子を選抜および／またはスクリーニングするための方法。
【請求項１７】
水性培養相が、バッファーを含み、ｐＨ ６〜８を有することを特徴とする請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
ＵＤＰ−ガラクトース量が、反応培地１μｌあたり０．１〜１０ｎｍｏｌであることを特徴とする請求項１６または１７に記載の方法。
【請求項１９】
膜分画の分離からなる工程を、遠心分離またはろ過にて行うことを特徴とする請求項１６〜１８のいずれか１つに記載の方法。
【請求項２０】
ＭＧＤＧシンターゼ活性の測定を、膜分画に取り込まれた放射性同位元素で標識されたガラクトース量を測定することで行うことを特徴とする請求項１６〜１９のいずれか１つに記載の方法。
【請求項２１】
ウエルの底がフィルターからなり、該ウエルが請求項１〜８のいずれか１つで定義されている膜分画を含むことを特徴とする多数のウエルからなるマイクロタイタープレート。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、組換えモノガラクトシルジアシルグリセロール（ＭＧＤＧ）シンターゼを含み、１，２−ｓｎ−ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）で富化された細胞の膜分画、該製造方法、ＭＧＤＧシンターゼ活性に影響を及ぼす分子のスクリーニングのためのそれらの使用、およびこれらの膜分画を使ったＭＧＤＧシンターゼ活性に影響を及ぼす分子のスクリーニング方法に関するものである。
ＭＧＤＧは、今日までに解析されている全てのプラストの中にあることが知られている：それは、最も多量な色素体膜の脂質であり、５０％以上のグリセロリピドを示す。ＭＧＤＧは、プラスト生物発生（ｂｉｏｇｅｎｅｓｉｓ）および細胞生存には欠くことができないものであり、他の膜系、特に動物細胞では存在しない（Ｄｏｕｃｅ，Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１９７４，１８３，８５２−８５３）；その生合成は、次の反応によってＭＧＤＧシンターゼとも称されるウリジン５’−ジホスフェートガラクトース（ＵＤＰ−ｇａｌ）１，２−ジアシルグリセロール３−β−Ｄ−ガラクトシルトランスフェラーゼ（ＥＣ ２．４．１．４６）によって、エンベロープ中で触媒される：
【０００２】
【化１】
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【０００３】
ＭＧＤＧシンターゼは、無秩序な方法で基質を結合し（Ｍａｒｅｃｈａｌら．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ，１９９４，２６９，５７８８−５７９８）、酸化感受性システインを有し、触媒にとって重要な二元機能酵素である（Ｍａｒｅｃｈａｌら．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ，１９９５，２７０，５７１４−５７２２）。
それ故、ＭＧＤＧシンターゼは、プラスト生物発生に不可欠な酵素でもあり、それ故、潜在的に除草性の分子を選抜したりスクリーニングしたりするために特別上等な標的である。加えて、マラリア（熱帯熱原虫（Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）を含むマラリア原虫類（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）の４種）、トキソプラズマ症（トキソプラズマ・ゴンディイ（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ ｇｏｎｄｉｉ））および獣医学の分野の悩みの原因、例えば、コクシジウム症（アメーバ（Ｅｉｍｅｒｉａ））の原因となる寄生体は、寄生体の生存に必須であると実証されている退化クロロプラスト（アピコプラスト（ａｐｉｃｏｐｌａｓｔ））を含む （Ｇ．ＭｃＦａｄｄｅｎおよびＤａｖｉｄ Ｒｏｏｓ，”Ａｐｉｃｏｍｐｌｅｘａｎ ｐｌａｓｔｉｄｓ ａｓ ｄｒｕｇ ｔａｒｇｅｔｓ”，１９９９，７，Ｎｏ．８，３２８−３３３）。
【０００４】
これらアピコプラストを含む寄生体は、アピコンプレクサン寄生体と称される。
それ故、ＭＧＤＧシンターゼ活性に対して抑制作用を有する分子は、潜在的に高い除草能力および抗−アピコンプレクサン寄生能力を有し、有利には、前記アピコンプレクサン寄生体に対する有効な新規薬品として、また除草剤として使用することができる。
除草剤として、またはアピコンプレクサン寄生体に対する有効成分として使用することができるＭＧＤＧシンターゼ活性を抑制する生成物を選抜またはスクリーニングするためのＭＧＤＧシンターゼの使用は、特に特許出願ＦＲ−Ａ−２ ７９０ ９１５で既に提唱されている。
【０００５】
その出願によれば、その様な産物の選抜および／またはスクリーニングは、試験基質と生物膜に埋め込まれたＭＧＤＧシンターゼとを培養し、培養後、特異的な酵素活性を測定することからなる方法に従って行われる。
その前出願で使用した生物膜は、特に、植物から単離した色素体膜または組換えＭＧＤＧシンターゼを過剰発現する大腸菌のその他の膜分画である。
【０００６】
ＭＧＤＧシンターゼによって行われるガラクトシル化活性の測定は、現時点では大変複雑であり、特に次の理由から、容易には縮小化できない：
（１）２つの基質の添加：酵素の２つの基質（ＤＡＧおよびＵＤＰ−ｇａｌ）を、培地に同時に添加されなければならない。特にこれら２つの基質は、非常に異なる物理化学特性：一方は高親水性（ＵＤＰ−ｇａｌ）、他方は高疎水性（ＤＡＧ）を有しているという事実のため、系の同質性が問題である。それゆえ、これら２つの基質の導入の制御は、縮小化するのが困難である。
（２）界面活性剤の添加：ＤＡＧは疎水性が高いため、水−混和性ではない。それゆえ、酵素がこの外的基質に接近するためには、界面活性剤、例えば生物膜を砕き、ミセルの形態で全ての疎水性分子を再配置させる３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルフォネート（ＣＨＡＰＳ）を、培地に導入しなければならない。ミセルは、あまりにも細かいため、ろ過または遠心分離によって反応培地から分離できない（ストークス半径３．８ ｎｍ；Ｍａｒｅｃｈａｌら，１９９４、前述）。
（３）相分離：反応産物（ＭＧＤＧ）を含む液相を抽出するため、有機溶媒（クロロホルムおよびメタノール）の混合物を、Ｂｌｉｇｈらが記載した方法（Ｃａｎ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，１９５９，３７，９１１−９１７）に従って、反応の最後に添加した。二相が形成し、脂質は、低有機相で回収される。二相の形成および有機相の抽出は、あまりにも複雑な工程であり、縮小化された工程で用いることができない。
【０００７】
現在、ＭＧＤＧシンターゼ活性に影響を及ぼす分子の検索の状況で、潜在的に除草剤またはアピコンプレクサン寄生体に対する有効成分として使用できる多数の分子を試験するための簡単で、比較的安価で、迅速かつ縮小化された方法を有することは不可欠である。
発明者らは、これらの問題を改善するために、本発明の対象を開発した。
特に、発明者らは、同一の脂質小葉中にＭＧＤＧシンターゼおよびＤＡＧの両方を含む新規な生物膜分画を開発した。これらの膜は、ＭＧＤＧシンターゼ活性に影響を及ぼす分子（抑制剤または活性剤）の自動化されたハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）用の酵素方法で使用することができる。
【０００８】
それゆえ、本発明の対象は、前記分画が総タンパク質重量に対して少なくとも１重量％のＤＡＧ を含み、球状小胞の形態であることを特徴とし、少なくとも１つの組換えＭＧＤＧシンターゼを含む脂質小葉からなる原核細胞または真核動物由来の原形質膜分画である。
事実、発明者らは、反応培地の容量をかなり減少できるＭＧＤＧシンターゼ活性に影響を与える分子をスクリーニングおよび／または選抜する方法で上記膜分画中にＭＧＤＧシンターゼおよびＤＡＧが同時に存在することにより、これらの膜分画を使用でき、結果として該方法の縮小化を可能にすることができることを実証した。
【０００９】
これら膜分画によって、対照ＭＧＤＧシンターゼ／ＤＡＧ混合を促進する界面活性剤の添加が省かれ、酵素反応は、直接膜内で起こる。
発明の好ましい実施態様に従うと、ＭＧＤＧシンターゼ／ＤＡＧモル比は、１０未満、さらには、特に０．１２未満である。
特に、酵素／基質比は、ミカエリス−メンテン酵素学的モデルを利用できる測定条件を重視すべきである：特に、基質は、初期反応の制限因子となるべきではない。
【００１０】
発明による膜分画は、脂質二重層を形成する球状小胞の形態が好ましい。
これら膜小胞は、通常、０．１μｍ〜１０μｍの間のサイズである。
ＭＧＤＧシンターゼは、これら小胞内で、通常、脂質二重層の内面に位置している。
これら小胞は、非反転型（ｎｏｎｉｎｖｅｒｔｅｄ）、反転型または混合型の小胞の形態であってもよい。
事実、膜の崩壊は、反転型または非反転型の小胞の形成を可能にする：しかし両者の場合、ＭＧＤＧシンターゼは、表面上、殆どＤＡＧの反対側にある。反転型と非反転型の小胞との間での融合は、同一の脂質小葉中でＭＧＤＧシンターゼとＤＡＧとを有する小胞の新たなファミリーを生成することができる。
【００１１】
このタイプの混合型小胞は、増大された触媒活性（利用しやすい基質（ａｃｃｅｓｓｉｂｌｅ ｓｕｂｔｒａｔｅ））を提示することができ、この結果、本発明によれば好ましい。
発明の対象は、上記膜分画を製造する方法でもあり、：
−第１工程で、原核細胞または真核動物を、植物ＭＧＤＧシンターゼをエンコードする遺伝子を含む構築物を使って形質転換する、
−第２工程で、上記細胞を、上記細胞によるＭＧＤＧシンターゼの合成を誘導するために、タンパク質合成を促進する培地で培養する、
−第３工程で、上記工程で培養した細胞を、少なくとも１つのホスホリパーゼＣを含む反応培地で培養する、および
−第４工程で、こうしてＤＡＧで富化された細胞を、少なくとも１つの組換えＭＧＤＧシンターゼと、該膜分画の総タンパク質重量に対して少なくとも１重量％のＤＡＧとを含み、球状小胞の形態である膜分画を得るために分画化する
からなることを特徴とする。
【００１２】
この方法に従って使用できる原核細胞の中で、本発明による特に好ましいいものは、例えば大腸菌のような細菌が挙げられる。
この方法に従って使用できる真核細胞の中で、酵母、例えばサッカロミセス・セルビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）由来の細胞、昆虫、例えばキイロショウジョウバエ由来の細胞、および、従来、遺伝子を発現させるのに使用されている哺乳類細胞、例えばＣＯＳ細胞およびＣＨＯ細胞が挙げられる。
第１工程で、細胞の形質転換は、細菌細胞で行われるのが好ましく、より好ましくは大腸菌細胞である。
【００１３】
形質転換は、特許出願ＦＲ−Ａ−２ ７９０ ９１５に記載の方法に従って、例えばシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）ＭＧＤＧシンターゼＡをエンコードする配列を含むプラスミドｐＥＴ−Ｙ３ａを使い、ヒートショックにて行うことができる（Ｍｉｅｇｅら．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９９９，２６５，９９０−１００１）。
ＭＧＤＧシンターゼの発現を促進するために、第２工程で使用される培地は、富化培地であり、培養する細胞のタイプの機能によって選択される。細菌細胞について特殊な場合、特に大腸菌の場合、ルリアット・ブロース（ＬＢ）培地を使用できる。
【００１４】
本発明による製造方法の第３工程でのＰＬＣの使用は、原形質細胞膜におけるＤＡＧでの富化に不可欠である。
特に、これら細胞膜は、リン脂質、特にホスファチジルエタノールアミン（リン脂質の８０％）が富んでいる。これらリン脂質は、極頭（ｐｏｌａｒ ｈｅａｄ）には特異的ではないＰＬＣによって加水分解される。
ＰＬＣは、次の反応によって、ホスファチジルエタノールアミンをＤＡＧに変換するのを触媒する：
【００１５】
【化２】
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【００１６】
それゆえ、ＰＬＣは、そのリン脂質の加水分解によって、ＤＡＧで細胞膜を富化させることができる。
発明に従って使用されるＰＬＣの特性は、ＤＡＧで富化されるように意図した膜のリン脂質に対して活性であるならば、重要ではない。
発明の特に好ましい実施態様によれば、バチルス・セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ）のホスホリパーゼＣが使用される。
ＰＬＣは、好ましくは、反応培地１ｍｌあたり１Ｕ〜２０Ｕ／ｍｌの間の濃度、さらに好ましくは５〜１２Ｕ／ｍｌの間の濃度で使用される。
【００１７】
もちろん、第３工程で使用される反応培地は、通常、ＰＬＣの正確な機能化に適合されるべきｐＨの緩衝液培地である。このｐＨは、通常、６〜８の間である。
第４工程で、膜小胞の形態で自発的に癒着する膜分画を発生させるため、膜を分画化する。膜の分画は、例えばフレンチプレスを使った機械的なショック、熱ショック（凍結／解凍）、あるいは、浸透、電気または他の物理的なショック、例えば超音波で行うことができる。
その結果、得られた膜分画は、任意に、例えばパーコールのクッションで精製することができる。
【００１８】
発明による膜分画の製造が終われば、それらをＭＧＤＧシンターゼ活性に影響を及ぼす分子を選抜またはスクリーニングするのに使用する前に任意に凍結することができる。
それゆえ、発明の対象は、ＭＧＤＧシンターゼ活性に影響を及ぼす分子を選抜および／またはスクリーニングするための上記膜分画の使用でもある。
特に、発明の対象は、寄生体に対する有効成分として、または除草剤として使用することができ、ＭＧＤＧシンターゼ活性を抑制する分子を選抜またはスクリーニングするための上記膜分画の使用である。
【００１９】
発明の対象は、ＭＧＤＧシンターゼ活性に影響を及ぼす分子を選抜および／またはスクリーニングする方法でもあり、：
−ｐＨ ４〜１１を有する水性相中で、試験基質と、十分な量の先に定義した膜分画および放射性同位元素で標識されたＵＤＰ−ガラクトースとを培養することからなる工程、
−膜分画の洗浄からなる工程、
−膜分画の分離からなる工程、そして
−ＭＧＤＧシンターゼ活性の測定からなる工程
からなることを特徴とする。
【００２０】
この方法に従って、酵素反応は膜分画内で直接起こり、そのサイズは、遠心分離またはろ過による反応培地からの分離物と適合している。この方法を使えば、事実、ＭＧＤＧは、放射性同位元素で標識され、組み込まれたガラクトースの放射能の簡便な測定を行うことができる膜分画で捕捉されるので、反応産物を抽出するために有機溶媒を使う必要はもはやない。
発明の好ましい実施態様によれば、水性培養相は、緩衝液を含み、ｐＨ ６〜８である。
【００２１】
一例に、緩衝液は、特に、３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸またはＫＣｌ／Ｋ２ＨＰＯ４混合物であってもよい。
培地で使用されるＵＤＰ−ガラクトース量は、もちろん、反応の制限因子を構成しないように、十分であるべきである。この量は、好ましくは反応培地１μｌあたり０．１〜１０ｎｍｏｌである。
培養工程は、周囲温度で少なくとも１０秒間、より好ましくは１〜４５分行われるのが好ましい。
【００２２】
培養工程の最後で、反応を、培地を冷却させるか（通常、約４℃の温度）、または遠心分離で停止させるのが好ましい。
反応が終了したら、膜分画に組み込まれていない過剰な放射性同位元素で標識されたＵＤＰ−ガラクトースを除去するために、膜分画の洗浄からなる工程を行う。
１回以上の連続した洗浄を、通常水を使って行ってもよい。
そして、膜分画を遠心分離またはろ過にて分離する。後者の技術は、マイクロプレートでの方法の縮小化に特に適している。
【００２３】
ＭＧＤＧシンターゼの活性の測定は、膜分画に組み込まれた放射性同位元素で標識されたガラクトースの量を測定することで行う。この測定は、従来、放射線計測器を使って行われている。
本発明によるＭＧＤＧシンターゼ活性に影響を及ぼす分子を選抜および／またはスクリーニングする方法は、少ない反応量を使い、先行技術で以前に示されている方法の場合のような界面活性剤または有機溶媒を使用していないため、容易に縮小化することができる。
【００２４】
それゆえ、発明の対象は、ウエルの底がフィルターからなり、該ウエルが上記の膜分画を含むことを特徴とする多数のウエルからなるマイクロタイタープレートでもある。
これらのマイクロプレートは、使用する前に冷凍庫で保存することができる。それらは、分離可能な底を任意に備えていてもよい。
【００２５】
本発明によるマイクロプレートは、ウエルの底でフィルターによって保持された膜分画に組み込まれ、放射性同位元素で標識されたガラクトースの放射能を直接測定することで、ＭＧＤＧシンターゼ活性を測定することができる。
それゆえ、それらを、ＭＧＤＧシンターゼ活性へ影響を与えるそれらの活性について、分子の巨大な化学ライブラリーを試験するのに使用してもよい。
【００２６】
最後に、発明の対象は、抗寄生体薬品または除草剤を製造するための、本発明によるスクリーニングおよび選抜する方法に従って選抜されるＭＧＤＧシンターゼ活性を抑制する少なくとも１つの分子の使用である。
上記取り決めとは別に、発明は、本発明による膜分画製造の実施例、ＭＧＤＧシンターゼ活性の測定の比較例、アピコンプレクサン寄生体中のＭＧＤＧの存在の実証例、および添付図に言及する次の記載から明らかになるであろうその他の取り決めからもなる。：
−図１は、ＤＡＧで富化された膜分画に１時間当たり組み込まれるガラクトースのｎｍｏｌ数を、タンパク質のμｇ数の関数として表している、
−図２Ａは、１時間およびタンパク質（ＤＡＧで富化された膜分画）１ｍｇあたりに組み込まれるガラクトースのｎｍｏｌ数を、ＤＡＧのμｍｏｌ数の関数として表している、
−図２Ｂは、１時間およびタンパク質１ｍｇあたりに組み込まれるガラクトースのμｍｏｌの逆数をＤＡＧのμｍｏｌの逆関数として示すラインウェーバーおよびバークタイプの逆座標プロットを表している、
−図３は、トキソプラズマ・ゴンディイの膜脂質によって組み込まれ、標識されたガラクトースの量を表している。
【００２７】
しかし、これらの実施例は、発明の対象を例示する目的でのみ挙げたものであり、限定するものではないことをないことを明確に理解すべきである。
【００２８】
実施例１：ＭＧＤＧシンターゼおよびＤＡＧを含む膜分画の製造
１）大腸菌での組換えＭＧＤＧシンターゼの製造
Ａ−細菌の形質転換
細菌を、特許出願ＦＲ−Ａ−２ ７９０ ９１５に記載の方法に従って形質転換する。
全ての培養物を、滅菌条件下で製造する。コンピテント細菌（大腸菌の菌株ＢＬ２１またはＢＬＲ）を、プラスミドｐＥＴ−Ｙ３ａを用いて、ヒートショックにて形質転換する。これにより、ＭＧＤＧシンターゼの想定される配列が２２アルギニン残基を含み、そのうち１７が大腸菌中では実際に使われることがほとんどないＡＧＧまたはＡＧＡコドンによってエンコードされているという事実から、問題を克服することができる。
【００２９】
プラスミドｐＥＴ−Ｙ−３ａは、特許出願ＦＲ−Ａ−２ ７９０ ９１５に記載されており、希なコドンＡＧＡ／ＡＧＧと関連するアルギニントランスファーＲＮＡをエンコードするａｒｇ Ｕ遺伝子（またはＤＮＡ Ｙ）を、プラスミドｐＥＴ−３ａ（Ｎｏｖａｇｅｎ）に挿入して構築される。プラスミドｐＥＴ−Ｙ３ａは、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）ＭＧＤＧシンターゼＡをエンコードする配列（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド：ＩＰＴＧで誘導可能なプロモーターの制御下で）、カルベニシリン耐性遺伝子およびアルギニントランスファーＲＮＡをエンコードする配列を含む。このＡＲＧ４ ｔＲＮＡは、ＭＧＤＧシンターゼのようなタンパク質合成を可能にし、それらの配列は、細菌で希なＡｒｇコドンを多く含む。
【００３０】
Ｂ−大腸菌での組換えＭＧＤＧシンターゼＡの製造
組換え細菌から単離されたコロニーを、抗生物質（最終濃度２０μｇ／ｍｌのカルベニシリン）の存在下の８ｍｌのルリアット・ブロース（ＬＢ）培地に移す。前培養物を規則的な攪拌をしながら３７℃で培養し、０．５の値が得られるまで６００ｎｍでの光学濃度（ＯＤ）を測定して細菌生育の進展を追跡する。
前培養物を５００ｍｌのＬＢ培地（カルベニシリン最終濃度２０μｇ／ｍｌ）に移し、規則的な攪拌をしながら３７℃で培養する。そして、６００ｎｍで０．５が測定されるＯＤでは、細菌群は、著しいタンパク質合成の時期である指数増殖期にある。
【００３１】
ＩＰＴＧの添加（最終濃度０．４ｍＭ）は、組換えＭＧＤＧシンターゼの合成を誘導することができる。
そして、培養物を、その活性形態でタンパク質の生産を促進させるため、振とうしながら２８℃で３時間培養する。
誘導された細菌の懸濁液を、２５０ｍｌの２つの分画に分け、５０００ｒｐｍで１５分間遠心分離に付す（Ｓｏｒｖａｌｌ（登録商標）ＲＣＳＣ遠心機、ＧＳ−３ローター）。
回収したペレットを、１０ｍｌの培地（ＬＢ、カルベニシリン最終濃度２０μｇ／ｍｌ）で再懸濁し、５０００ｒｐｍで１５分間遠心分離する（Ｓｏｒｖａｌｌ（登録商標）ＲＣＳＣ、ＳＬＡ ６００ ＴＣローター）。
上清を除去し、細菌ペレットを−８０℃で保存する。
【００３２】
２）ホスホリパーゼＣを使った処理によるＤＡＧでの細菌膜の富化
前工程でＭＧＤＧシンターゼを誘導した５ｍｌの細菌のペレットを、５ｍｌの１０ｍＭ ３−（Ｎ−モルフォリノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、ｐＨ７．８、１ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ）および１０％（ｗ／ｖ）グリセロールに再懸濁する。
２０μｌのバチルス・セレウスのホスホリパーゼＣ（ＰＬＣ）（ホスファチジルクロリン  クロリンホスホヒドロラーゼ、ＥＣ ３．１．４．３）を、最終濃度８Ｕ／ｍｌに達するように添加する。反応を、攪拌しながら環境温度で３時間行い、ＥＤＴＡ（最終濃度０．４Ｍ）を添加することで停止させる。
【００３３】
３）細菌膜の精製
ＰＬＣで処理されることで膜がＤＡＧで富化され、前の工程で上記のようにして得られた誘導された細菌の溶液を、５０ｍｌの５ｍＭ ＭＯＰＳ、ｐＨ７．８、０．５ｍＭ ＤＴＴ、５％（ｗ／ｖ）グリセロールに入れる。
細菌を、フレンチプレスを使って高圧（８００ｐｓｉ）で破壊する：そして水性溶液中の膜を、それ自体で自発的に小胞および反転型小胞に組織化する。
得られた６ｍｌの溶解物を、３５％のパーコールのクッション（１０ｍＭ ＭＯＰＳ、ｐＨ ７．８、１ｍＭ ＤＴＴ、１０％グリセロール中）に置き、そして４℃の温度にて、５０００ｒｐｍで１０分間遠心分離する（Ｓｏｒｖａｌｌ（登録商標）ＲＣ ＳＣ、ＨＢ−６ローター）。
【００３４】
ＭＧＤＧシンターゼと、総タンパク質重量に対して少なくとも１重量％のＤＡＧとを含む脂質二重層からなる小胞を得る。
そして、４つの分画を形成する：上清（チューブの上部）、上清／パーコール界面、３５％パーコールのクッションおよびペレット。
全ての膜分画を回収し、１０ｍＭ ＭＯＰＳ、ｐＨ ７．８、１ｍＭ ＤＴＴ、１０％（ｗ／ｖ）グリセロールの５倍量の希釈液で洗浄し、４℃の温度にて、５０００ｒｐｍで１５分間遠心分離する（Ｓｏｒｖａｌｌ（登録商標）ＲＣＳＣ、ＨＢ−６ローター）。
【００３５】
上清を除去し、そして、もろいペレットを、４℃の温度にて１３０００ｒｐｍで１０分間再び遠心分離（エッペンドルフ遠心機 ５８０４）するため、注意深く１ｍｌの洗浄媒体に入れる。
ペレットを、５００μｌの１０ｍＭ ＭＯＰＳ、ｐＨ ７．８、１ｍＭ ＤＴＴ、１０％（ｗ／ｖ）グリセロールに再懸濁させ、−２０℃で保存する。
【００３６】
実施例２：先行技術と本発明とによるＭＧＤＧ合成活性の比較測定
１−ＢｌｉｇｈおよびＤｙｅｒ（１９５９）の方法によるＭＧＤＧ合成活性の従来の測定
この方法は、ＢｉｌｉｇｈおよびＤｙｅｒ”Ａ Ｒａｐｉｄ Ｍｅｔｈｏｄ Ｏｆ Ｔｏｔａｌ Ｌｉｐｉｄ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ”，Ｃａｎ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，１９５９，３７，９１１−９１７．による論文に記載された。
ガラクトシル化活性の測定は、放射性（１４Ｃ）ＵＤＰ−ｇａｌを起源とするガラクトースを、反応培地の脂質分画に組み込むことを基にしている。
反応を環境温度で行う。１００μｇのＤＡＧ疎水性基質（１ｍｇ／ｍｌ）と２００μｇのホスファチジルグリセロール（ＰＧ）のクロロホルム溶液（１０ｍｇ／ｍｌ）とをチューブに導入し、アルゴン下で乾燥させ、そして１１μｌの界面活性剤媒体（８５ｍＭ ＣＨＡＰＳ、０．７ Ｍ ＭＯＰＳ、１４ｍＭ ＤＴＴ）、７５μｌのＫＣｌ（１Ｍ）および７５μｌのＫＨ２ＰＯ４（１Ｍ）で再懸濁する。
界面活性剤、この場合ＣＨＡＰＳの存在は、界面活性剤、ＤＡＧ、ＰＧおよびサンプル起源のＭＧＤＧシンターゼを含む混合ミセルを形成することを可能にする。
１５０μｌのサンプル添加後、反応培地の最終組成（最終容量３００μｌ中、５０ｍＭ ＭＯＰＳ、１ｍＭ ＤＴＴ、２５０ｍＭ ＫＣｌ、２５０ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、６ｍＭ ＣＨＡＰＳ）は、表面希釈モデル（Ｍａｒｅｃｈａｌら，１９９５前述）の基準を満たす。
この実施例は、界面活性剤としてＣＨＡＰＳを使用するが、他の界面活性剤、例えばコール酸塩、デオキシコール酸塩、トリトン−Ｘ １００（登録商標）、ＮＯＮＩＤＥＴ（登録商標）、オクチルグルコシドまたはラウリルジメチルアミン酸化物（ＬＤＡＯ）を使用することもできる。
【００３７】
反応を、１０μｌのＵＤＰ−［１４Ｃ］−ガラクトース（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｎｕｃｌｅａｒ ２５ Ｂｑ／μｍｏｌ、１０ｍＭ）を導入することで開始する。反応を、１．５ｍｌの１／２（ｖ／ｖ）クロロホルム／メタノール混合物を添加することで停止させる。
０．５ｍｌのクロロホルムと０．６ｍｌの水との添加は、１０００ｒｐｍで１０分間遠心分離（エッペンドルフＡ−４−４４遠心分離器，５８０４ローター）した後、明瞭な二重相（チューブの上部中の高放射性水性相と底部中の有機相）を得ることができる。
水性相は酵素で使用されない残留ＵＤＰ−ｇａｌの放射能を含むが、有機相は、反応の疎水性生成物：ＭＧＤＧの放射能を含んでいる。
ＵＤＰ−［１４Ｃ］−ｇａｌを有さない同一容量の水性相を使って水性相を２回洗浄した後、生産されたＭＧＤＧを含む有機相を計数バイアルに移す。
回収された分画をアルゴン下で乾燥させ、１０ｍｌのシンチレーション液に入れ、サンプルの放射能を見積もる。
ガラクトシル化活性は、タンパク質のｍｇおよび時間あたりに脂質分画に取り込まれるガラクトースのμｍｏｌ数で定義される。
【００３８】
ＩＩ−発明に従った遠心分離後の膜の精製による測定
この測定は、酵素（ＭＧＤＧシンターゼ）と、その疎水性基質（ＤＡＧ）との両方を隔絶する膜の小胞からなるサンプルについてのみ行うことができる。そして、この場合に限り、酵素および基質を接触させるために、もはや界面活性剤を添加する必要はない。
使用される反応培地は、有機溶媒での脂質の抽出後、従来の方法で得られたものとは異なる。
実施例１、工程３で得られるようなＭＧＤＧシンターゼおよびＤＡＧを含む膜分画サンプルを、２５０ｍＭ ＫＣｌおよび２５０ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４を含む最終容量３００μｌに懸濁させる。
反応を、ＵＤＰ−放射性同位元素で標識された［１４Ｃ］ｇａｌを添加することで開始させる。
反応を、１０分間氷に移すことで停止させる。
【００３９】
（膜に取り込まれない）余分なＵＤＰ−［１４Ｃ］ｇａｌの洗浄を、４℃の温度にて、１３０００ｒｐｍで、１０分間サンプルを遠心分離し、そして５００μｌの滅菌水中にペレットを入れて行う。
この洗浄工程を３回繰り返す。得られたペレットを、真空下で１時間遠心分離にて乾燥させる（エッペンドルフ濃縮器５３０１スピード−バック）。そして、乾燥サンプルを、計数バイアルに移すため、１／２（ｖ／ｖ）クロロホルム／メタノール混合物に入れ、アルゴン下で乾燥させ、１０ｍｌのシンチレーション液で可溶化する。
サンプルの放射能を、Ｋｏｎｔｒｏｎ（登録商標）（Ｂｅｔａｍａｔｉｃ）計測器を使って見積もる。
ガラクトシル化活性は、タンパク質のｍｇおよび時間あたりに取り込まれるガラクトースのμｍｏｌ数で定義される。
【００４０】
ＩＩＩ−変性条件下でのポリアクリルアミドゲル電気泳動
解析されるサンプルを、負荷媒体（０．１５ＭトリスＨＣｌ、ｐＨ ６．８、１０％ グリセロール、０．０２％ ＳＤＳ、０．０１％ ブロモフェノールブルー、０．０２５％ ＤＴＴ）に懸濁させ、そして４分間沸騰させる。
アクリルアミド溶液を、０．１９２Ｍグリシンおよび０．１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を含む２５ｍＭトリス緩衝液（分離ゲルｐＨ８．３、スタッキングゲルｐＨ６．５）中で製造する。
スタッキングゲル（５％アクリルアミド）上および分離ゲル（１２％アクリルアミド）上での電気泳動を、環境温度にて、１００Ｖの定電圧下で、０．１９２Ｍグリシン（ｐＨ８．３）および０．１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳを含む２５ｍＭトリス緩衝液で行う（Ｕ．Ｋ．Ｌａｅｍｍｌｉ，Ｎａｔｕｒｅ，１９７０，２２７，６８０−６８３）。
ブロモフェノールブルーがゲルを離れた時点で移動を止める。
そして、クマシーブルー（０．５％（ｗ／ｖ）クマシーブリリアントブルー８２５０、２５％メタノール、１０％（ｖ／ｖ）酢酸）でタンパク質を染色する。
ゲルを、２５％イソプロパノール、１０％（ｖ／ｖ）酢酸の連続浴で脱色する。
【００４１】
ＩＶ−タンパク質のアッセイ
原理：タンパク質を、Ｌｏｗｒｙ法（Ｌｏｗｒｙら．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９５１，１９３，２６５−２７５）にて、２つの同時に着色された反応を測定することでアッセイする。
“ビューレット”反応と類似した第一反応は、タンパク質のペプチド結合（−ＣＯ−ＮＨ−）とアルカリ媒体中のＣｕ２＋イオンとの錯体の形成をもたらし、第二反応は、チロシンのフェノールによるフォリン−シオカルト試薬の還元をもたらす。この方法は、２〜２００ｍｇ／ｍｌの濃度範囲を有する溶液をアッセイすることを可能にする。
実験手法：アッセイされるサンプルの容量を、滅菌水を使って２００μｌに調節し、そして、１ｍｌのアッセイ試薬を即席で製造する（５０容量の２％ ＣＯ３Ｎａ２、０．１Ｎ ＮａＯＨと１容量のＣｕＳＯ４、０．５％ ＳＨ２Ｏ、１％酒石酸ナトリウム）。
２０℃で１０分間の反応後、１００μｌのフォリン−シオカルト試薬を添加し、反応を２０℃で３０分間インキュベートする。
アッセイされるサンプル中のタンパク質の量を、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を使って設定した基準範囲を使って７５０ｎｍでの吸光度を比較することで測定する。
【００４２】
Ｖ−結果
Ａ− ＵＤＰ−Ｇａｌの存在下でのガラクトシル化活性の測定を可能にするため、組換え細菌はＤＡＧで人工的に富化されているに違いない
導入工程（実施例１、工程１、図１）の間に行われる細菌サンプルの総タンパク質の解析は、ＩＰＴＧを使った導入が、タンパク質の約３０％を占めるＭＧＤＧシンターゼＡの蓄積をもたらすことを示す。
ＤＡＧの存在下および不在下でＭＧＤＧシンターゼＡを発現する誘導される細菌の粗の抽出物中で測定されるガラクトシル化活性の比較を行った。
ガラクトシル化活性を、ＢｌｉｇｈおよびＤｙｅｒ（上記参照）の方法に従って、ＰＧの不在下で、２８℃で誘導される、および５０μｇのＤＡＧの存在下に置かれることでも可能である２０μｌの細菌培養物について脂質を抽出することで測定した。
得られた結果を以下の表１に表す：
【００４３】
【表１】
2004529612.tif 000005
【００４４】
これらの結果は、かなりのガラクトシル化活性が、２７０μＭのＤＡＧで培養したこの抽出物中で観察され、一方、ＤＡＧの外的導入なしで培養された細菌膜にはガラクトースの組み込みが実質的にないことを示す。
結果として、細菌膜は、組換え酵素の活性の独立した測定を行うに十分な量の内生ＤＡＧを有していない。
【００４５】
Ｂ− ＰＬＣを使った細菌膜の処理は、ガラクトシル化活性を測定するのに利用できるＤＡＧを生成する
ＭＧＤＧシンターゼのガラクトシル化活性を、ＰＬＣによる内生ＤＡＧの合成後、または外的ＤＡＧの添加後に測定した。この活性を、３μｌのＰＬＣ（２０００Ｕ／ｍｌ）、５０μｇのＤＡＧ（１ｍｇ／ｍｌおよび任意に１または１０μｌのＣａＣｌ２の存在下で）の存在下または不在下にて、２８℃で誘導した２０μｌの同一の細菌培養物で測定した。
結果を以下の表２に表す：
【００４６】
【表２】
2004529612.tif 000006
【００４７】
これらの結果は、ＰＬＣを使った細菌膜の処理が、２７０μＭの外的ＤＡＧを添加した後に得られたものよりも大きいガラクトシル化活性を計測できることを示す。
それゆえ、ＰＬＣは、リン脂質の加水分解によって、ＤＡＧを使って細菌膜を負荷することを可能にする。ＤＡＧを添加した際に得られたガラクトースの取り込みが乏しいのは、添加されたＤＡＧの割合が大変少ないのは、ＰＬＣの不在下で細菌膜へ浸透でき、ＭＧＤＧシンターゼに対する基質として作用できるという事実で説明される。
ＰＬＣの活性剤であるカルシウムが、測定されるガラクトースの取り込みに影響を与えておらず、細菌懸濁液のＣａ２＋濃度がＰＬＣの最適活性を測定するのに十分であることを示唆していることに留意するのも重要である。
【００４８】
Ｃ−放射性ガラクトースのＤＡＧで富化された膜への取り込み
前記実施例１、工程Ｂ−３）で記載したように、放射性ガラクトースの溶解された膜小胞への取り込みを測定し、溶解されていないがＭＧＤＧシンターゼＡの発現が誘導された細菌による放射性ガラクトースの取り込みと比較した。ガラクトシル化活性を、１５０μｇのＰＧ（１０ｍｇ／ｍｌ）および１００μｇの外的ＤＡＧ（１ｍｇ／ｍｌ）の存在下ならびに不在下で、１５０μｌのサンプル（前記）について測定する。
得られた結果を以下の表３に挙げる。
【００４９】
【表３】
2004529612.tif 000007
【００５０】
これらの結果によると、ＤＡＧまたはＰＧの添加なしで溶解された細菌で測定されたガラクトシル化活性が、ＭＧＤＧシンターゼとＤＡＧとの両方を含む小胞が形成され、酵素がその触媒能を維持していたことを指す。
それらは、溶解された分画の活性が、溶解されていない分画のものよりも大きいことも示す。この観察は、ＭＧＤＧシンターゼＡが、細菌膜の脂質二重層の内面に位置することと一致する。特に、ＰＬＣのみが脂質二重層の外側に接近するため、内面に位置するＭＧＤＧシンターゼの分画は形成されたＤＡＧの一部のみを捕捉することができ、これは膜の小葉外部から小葉内部に横切る移動を受ける。膜の破壊は、反転型および非反転型の小胞の形成を可能にするが、両者の場合には、ＭＧＤＧシンターゼは、表面上、殆どＤＡＧと反対側にある。反転型と非反転型の小胞との間での融合は、同一膜小葉で、酵素およびＤＡＧを有する小胞の新たなファミリーを生成してもよい。このタイプの小胞は、増大された触媒活性（利用しやすい基質）を発揮してもよい。小胞のこれら３つの集団、反転型、非反転型および混合型の生成が、同程度に起こりうる場合、溶解されたサンプルの活性は、本場合で観察される溶解されていないサンプルに対して１．３３の力価で増大される。
【００５１】
Ｄ−小型化されえるアッセイの開発
１）ＰＬＣの役割の実証
ＰＬＣで処理することで、ＭＧＤＧシンターゼＡおよび任意にＤＡＧで富化された膜小胞を含む溶解された細菌の懸濁は、前記のように３５％のパーコール勾配（９ｍｌ）で分画される。上清および界面（Ｓ＋ＳＬ：６ｍｌ）に相当する分画ならびにペレット（Ｐ：１ｍｌ）に相当する分画も回収する。ガラクトシル化活性およびタンパク質の量を、採取した様々な分画（Ｓ＋ＳＬ＝６ｍｌ、Ｐ＝１ｍｌ）ならびに沈殿した分画（６ｍｌのＤ）でも測定する。
得られた結果を、以下の表４に挙げる。
【００５２】
【表４】
2004529612.tif 000008
【００５３】
これらの結果は、ＰＬＣでの処理でＤＡＧでの富化を受けた膜は、それらがＰＬＣでの処理を受けていないために、ＤＡＧで富化されていない膜よりも多くのＵＤＰ−ｇａｌを変換できることを示す。
変性条件下でのアクリルアミドゲル電気泳動による分画の解析は、上清からペレットに亘るＭＧＤＧシンターゼに相当するポリペプチドに対する富化を示す。ペレット中の低ガラクトシル化活性（表４）は、主に封入体（不活性酵素）でのこの分画の富化を示唆する。それゆえ、ミカエリス−メンテン酵素学の妥当性に対する基準関数として、ＭＧＤＧシンターゼの酵素活性を解析するためにＤＡＧで富化された膜と結合するＭＧＤＧシンターゼＡを含むＳ＋ＳＬ分画を選択した。
【００５４】
２）ＭＧＤＧシンターゼの酵素活性の解析
結果を図１に挙げ、初期率（時間あたりに取り込まれるガラクトースのｎｍｏｌ）を、タンパク質／チューブのμｇ数の関数として表す。初期率を、ＰＬＣで処理し、および処理されたＳ＋ＳＬ分画（２５、５０、７５μｇのタンパク質）中に存在する様々な量の膜の、培養１５および３０分後のガラクトースの取り込みを測定することで決定した。
この図１は、ガラクトースの取り込みが、ＵＤＰ−ｇａｌの存在下で培養したサンプル量の１次関数であることを示す。曲線の傾きは、時間およびタンパク質のｍｇあたりに取り込まれる３４０ｎｍｏｌのガラクトース活性を想定することができる。
ＰＬＣでの処理後に得られたＤＡＧの量は測定されないが、サンプルのタンパク質の量がたとえいくらであったとしても、膜小胞中のこの基質の濃度は一定のままである。この点で、ＤＡＧの表面濃度（膜表面のユニットあたりのモル分画またはＤＡＧのモル）およびＵＤＰ−ｇａｌのモル濃度は、一定である。結果として、初期反応率は、タンパク質の量に直接比例し、酵素量を制限する特性を表している。直線の関係は、ミカエリス−メンテン酵素学解析における条件を確認する条件の１つである。
【００５５】
３） 細菌膜中で、ＰＬＣでの処理によって生成されるＤＡＧ量の評価
ＰＬＣで処理されておらず、パーコール勾配で精製された５μｇの膜の活性（組み込まれたガラクトースのｎｍｏｌ数／時間／ｍｇ）を、導入された種々のＤＡＧ量について測定した（図２Ａ）。初期率を、培養１５および３０分後のガラクトースの取り込みを測定することで決定した。測定を、導入された種々のＤＡＧ量について行った（１２．５μｇ：２５μｇ：３７．５μｇ；３００μｌ反応培地あたり）。
測定は、ラインウェーバー−バーク タイプの反転型座標プロットを設定することを可能にする（図２Ｂ）。
【００５６】
ＰＬＣで処理されていない膜上で行われた測定が、ＤＡＧ内容物を評価する基準曲線を構成している場合、本質的な活性が３４０ｎｍｏｌ／ｈ／ｍｇである５μｇのサンプルは、ＤＡＧ ０．５μｇが添加され、処理されていない同等のサンプルに匹敵すると考えられる。
その結果、そこから、ＰＬＣでの処理が、タンパク質のμｇあたり約０．１μｇのＤＡＧを得ることが可能であることを推定することができる。
【００５７】
４）ＭＧＤＧシンターゼおよびＤＡＧで富化された膜の溶解前後のガラクトシル化活性の測定
ガラクトースを取り込むために−２０℃で１日間凍結された膜の能力を測定し、凍結工程を受けていない膜と比較した。
２つのサンプル間で、有意差は観察されなかった。
結果として、この特性は、膜サンプルを製造することを可能にし、およびＭＧＤＧシンターゼ活性に影響を与える分子をスクリーニングするための、活性の喪失なしに冷条件下でサンプルを保存することからなる工程からなってもよい自動化装置で膜サンプルを再現的に扱うことを可能にする。
【００５８】
５）ガラクトシル化活性の単純化された測定は、ＭＧＤＧシンターゼおよびＤＡＧで富化された膜サンプルを含む
ホスホリパーゼＣでの処理によってＤＡＧで富化され、任意に精製されたＭＧＤＧシンターゼを含む膜小胞を、それゆえこれら同一な小胞中のＭＧＤＧの生産を測定するのに使用することができる。
５０μｇの膜小胞（５０μｇのＭＧＤＧシンターゼおよび５０μｇのＤＡＧに匹敵する）を、チューブ（チューブ Ｎｏ．１）に含まれる水性相（２５０ｍＭ ＫＣｌ、２５０ｍＭ Ｋ２ＨＰＯ４、最終容量３００μｌ、ｐＨ ７．８）に懸濁する。
比較として、対照チューブ（チューブ Ｎｏ．２）を作製した：５０μｇのＭＧＤＧシンターゼと５０μｇのＤＡＧとを、チューブ Ｎｏ．１で使用したのと同一の水性相に懸濁した。
【００５９】
反応を、各々のチューブで、ガラクトースに１４Ｃを使って放射性同位元素で標識された１０μｌのＵＤＰ−ｇａｌを添加することで開始し、そして３０分後、４℃まで冷却することで停止させる。
そして、チューブ Ｎｏ．１の反応培地を１３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、５００μｌの水を使って数回洗浄し、再び１３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離する。
チューブ Ｎｏ．２を、前記のように有機溶媒を用いる従来の脂質抽出法を使って処理した。
遠心分離ペレット（チューブ Ｎｏ．１）中で回収された放射能を、放射線計測器を使って測定したところ、４０２６ｄｐｍであった。
【００６０】
チューブ Ｎｏ．２中の脂質の抽出後に測定した放射能を、同一の方法で測定したところ、４１３６ｄｐｍであった。
結果として、各々のチューブについて測定された放射能に有意差はなく、本発明によるＭＧＤＧシンターゼ活性を測定する方法を有効とすることができる。
発明に従って製造された膜小胞のサンプルは、ミカエリス法によって酵素学的な活性の測定に対応する条件下で、酵素およびその疎水性補助基質を含む。加えて、このサンプルは、遠心分離、伸張、ろ過によって、ガラクトシル化活性の測定を単純化し、縮小化することができる。
【００６１】
ＶＩ−結論
この実施例は、ミカエリス−メンテン法に関連するガラクトシル化活性を測定するために、組換えＭＧＤＧシンターゼを発現する細胞の培養物由来の膜分画およびマイクロプレートで縮小化できる測定法を使用できることを実証した。
組み込まれた放射能を、反応培地の凝集中で簡単に回収することができ、遠心分離によって集めることができることも実証した。その結果、この系で生成されたＭＧＤＧは、精密ろ過による測定系が測定に十分な膜の中に蓄積し、活性分子のハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）には、この酵素アッセイを使用することを可能にする。特に、潜在的に除草能力を有する新規の分子を選択するために、この方法によって“化学ライブラリー”をスクリーンすることができる。さらに、このように生産されるＭＧＤＧシンターゼＡに特異的な抑制剤は、ガラクトリピド合成の生理学的な研究を行うことができる効果的な薬理学的ツールであろう。
【００６２】
実施例３：アピコンプレクサン寄生体中でのＭＧＤＧ合成の実証
この実施例の目的は、アピコンプレクサン寄生体、トキソプラズマ・ゴンディイ中のＭＧＤＧの存在、および、結果として抗寄生体特性を有する分子を検索するための標的となるＭＧＤＧシンターゼが、明らかにアピコンプレクサン中に存在することを実証することである。
２×１０８細胞のトキソプラズマ・ゴンディイを、タキゾイドの形態で、２％（ｗ／ｖ）のグリセロールおよび５０ｍＭのＫＣｌを含む０．１ｍｌの１０ｍＭ ３−（Ｎ−モルフォリノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、ｐＨ ７．８ならびに１ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ）の１：１０混合物に懸濁し、４μ ＣｉのＵＤＰ−［３Ｈ］−ガラクトース（７．５ｎｍｏｌ）の存在下で、３０分間培養する。
【００６３】
グリコリピドをＢｌｉｇｈおよびＤｙｅｒ，１９５９（上記）の方法に従って抽出し、対照脂質（ＭＧＤＧ；ウシ脳モノガラクトシルセレブロシド（ＭＧＣＢ）；ジガラクトシルジアシルグリセロール（ＤＧＤＧ）；トリガラクトシルジアシルグリセロール（トリＧＤＧ）およびテトラガラクトシルジアシルグリセロール（テトラＧＤＧ））の存在下で、６０μシリカゲルプレート上で６５／２５／４（ｖ／ｖ）のクロロホルム／メタノール／水 混合物を使って解明される薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）にて解析する。
そして、標識された脂質の放射能を、ＴＬＣ−解析装置（ＬＢ２８４２自動ＴＬＣスキャナー）を使って検出する。
【００６４】
得られた結果を図３に挙げ、トキソプラズマ・ゴンディイ細胞によって取り込まれ、ラベルされたガラクトース量（ｃｐｍ）を、センチメートルでの移動の関数として図示する。
この図で、ＭＧＣＢと同程度移動する３つの第一ピークを観察することができ、それに対して最後のピークは、ＭＧＤＧと同程度移動する。
【００６５】
移動後、脂質を、０．２％のオルシノールおよび７５％の硫酸からなる溶液をシリカゲルプレートにスプレーし、そして１００℃の温度で１５分間加熱することで目視する（結果は示さず）。
ＭＧＤＧに相当するピークは、０．１Ｎ水酸化カリウムの水／メタノール 混合物において、３時間のアルカリ加水分解後に消失する。
脂質の完全な同定を、緑色コーヒー豆由来のα−ガラクトシダーゼとウシ精巣由来のβ−ガラクトシダーゼとを使った極頭の加水分解後、および穏やかな条件下でアルカリ加水分解での脱アシル化（０．１Ｎ ＫＯＨの水／エタノール混合物で３時間）後に行う。
【００６６】
ピーク４は、β−ガラクトシダーゼを使った加水分解に感受性であり、ガラクトースが、ＭＧＤＧに関しては、ベータ位で明確に結合されるのを示している。
さらに、アルカリ加水分解後、ピーク４は、消失し、そのことは、トキソプラズマ・ゴンディイの膜に存在する脂質が、明らかに、ジアシルグリセロールの半分を含むことを実証している。
この実験例は、トキソプラズマ・ゴンディイのタキゾイトの膜中のＭＧＤＧの存在を実証し、植物ＭＧＤＧシンターゼの抑制剤を検索する用途が抗アピコンプレクサン寄生体剤の同定であることを確証している。
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は、ＤＡＧで富化された膜分画に１時間当たり組み込まれるガラクトースのｎｍｏｌ数を、タンパク質のμｇ数の関数として表している。
【図２Ａ】
図２Ａは、１時間およびタンパク質（ＤＡＧで富化された膜分画）１ｍｇあたりに組み込まれるガラクトースのｎｍｏｌ数を、ＤＡＧのμｍｏｌ数の関数として表している。
【図２Ｂ】
図２Ｂは、１時間およびタンパク質１ｍｇあたりに組み込まれるガラクトースのμｍｏｌの逆数をＤＡＧのμｍｏｌの逆関数として示すラインウェーバーおよびバークタイプの逆座標プロットを表している。
【図３】
図３は、トキソプラズマ・ゴンディイの膜脂質によって組み込まれ、標識されたガラクトースの量を表している。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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