(57)【要約】微小突起アレイ（１０）、抗原性作用物質および免疫応答増強アジュバントを含有するリザーバ（１８）を有する皮膚貼付剤（２０）、ならびに動物（例えばヒト）にワクチン接種するためのそれの使用方法を開示する。好ましい一態様において、微小突起アレイ（１０）は光エッチングされかつ微小押抜きされたチタン箔（１４）から構成される。微小突起（１２）は、ワクチン抗原、およびグルコサミニルムラミルジペプチドのようなアジュバントを含有する液体製剤で被覆し、乾燥し、そして衝撃アプリケーターを使用してワクチン接種されるべき動物の皮膚に適用する。微小突起（１２）は、抗原性作用物質およびアジュバントの浸透を助長するための角質層を通る表面経路を創製する。抗原用量および穿通の深さを制御することができる。この技術は、効率および使用の便宜性を改良するための多様な治療的ワクチンに対する広範な応用可能性を有する。
2004538048.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
微小突起アレイであって、複数の角質層を貫通する微小突起を有し、前記微小突起は約５００μｍ未満の深さまで皮膚を貫通することにより角質層中に孔を切断するよう適合される大きさを有する該アレイ；ならびに
抗原性作用物質および免疫応答増強アジュバントを含有するリザーバであって、前記微小突起に関して前記孔と作用物質およびアジュバントを移す関係にあるように配置される該リザーバ、
を含んで成る、皮内ワクチン送達装置。
【請求項２】
免疫応答増強アジュバントが、リン酸アルミニウムゲル、水酸化アルミニウム、藻類グルカン、β−グルカン、コレラトキシンＢサブユニット、熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）、γ−イヌリン、ＧＭＤＰ（Ｎ−アセチルグルコサミン−（β１−４）−Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−グルタミン）、ＧＴＰ−ＧＤＰ、イミキモド（Ｉｍｉｑｕｉｍｏｄ）、インムテル［ＩｍｍＴｈｅｒ］ＴＭ（ＤＴＰ−ＧＤＰ）、ロキソリビン（Ｌｏｘｏｒｉｂｉｎｅ）、ＭＰＬ（Ｒ）、ＭＴＰ−ＰＥ、ムラメチド（Ｍｕｒａｍｅｔｉｄｅ）、プルーラン（Ｐｌｅｕｒａｎ）（β−グルカン）、ムラパルミチン（Ｍｕｒａｐａｌｍｉｔｉｎｅ）、ＱＳ−２１、Ｓ−２８４６３（４−アミノ−α，α−ジメチル−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−１−エタノール）、スクラボペプチド（Ｓｃｌａｖｏ  Ｐｅｐｔｉｄｅ）（１Ｌ−１β  １６３−１７１ペプチド）およびテラミド［Ｔｈｅｒａｍｉｄｅ］ＴＭよりなる群から選択される、請求項１記載の皮内ワクチン送達装置。
【請求項３】
アジュバントがグルコサミニルムラミルジペプチドを含んで成る、請求項１記載の皮内ワクチン送達装置。
【請求項４】
アレイが皮膚接触領域を有し、かつ、前記リザーバが、前記アレイの皮膚接触領域１ｃｍ２あたり最低約０．２μｇの抗原性作用物質負荷を有する、請求項１記載の内皮ワクチン送達装置。
【請求項５】
前記アレイが皮膚接触領域を有し、かつ、前記リザーバが、前記アレイの前記皮膚接触領域１ｃｍ２あたり最低約２μｇの抗原性作用物質負荷を有する、請求項１記載の内皮ワクチン送達装置。
【請求項６】
抗原性作用物質が、タンパク質、多糖、オリゴ糖、リポタンパク質、弱毒化もしくは殺されたウイルス、弱毒化もしくは殺された細菌およびそれらの混合物よりなる群から選択される、請求項１記載の皮内ワクチン送達装置。
【請求項７】
前記抗原性作用物質がワクチンを含んで成る、請求項１記載の皮内ワクチン送達装置。
【請求項８】
前記ワクチンが、インフルエンザワクチン、ライム病ワクチン、狂犬病ワクチン、麻疹ワクチン、流行性耳下腺炎ワクチン、水痘ワクチン、天然痘ワクチン、肝炎ワクチンおよびジフテリアワクチンよりなる群から選択される、請求項７記載の皮内ワクチン送達装置。
【請求項９】
前記アレイが金属より構成されかつ接着性の裏打ちを包含する、請求項１記載の皮内ワクチン送達装置。
【請求項１０】
前記アレイが約５ｃｍ２までの皮膚接触領域を有する、請求項１記載の皮内ワクチン送達装置。
【請求項１１】
リザーバ中の抗原性作用物質負荷に対するアジュバント負荷の重量比が約０．５：１ないし５０：１の範囲にある、請求項１記載の皮内ワクチン送達装置。
【請求項１２】
リザーバ中の抗原性作用物質負荷に対するアジュバント負荷の重量比が約１：１ないし１０：１の範囲にある、請求項１記載の皮内ワクチン送達装置。
【請求項１３】
前記リザーバが微小突起上に乾燥した固体のコーティングを含んで成る、請求項１記載の皮内ワクチン送達装置。
【請求項１４】
前記リザーバが前記アレイに積層された薄膜を含んで成る、請求項１記載の皮内ワクチン送達装置。
【請求項１５】
哺乳動物の皮膚部位上に微小突起アレイ（前記アレイは、約５００μｍ未満の深さまで皮膚を貫通するよう適合された大きさを有する皮膚を貫通する複数の微小突起と、微小突起に関して微小突起を貫通することにより形成される角質層中の切傷に作用物質およびアジュバントを移す関係にあるように配置された抗原性作用物質および免疫応答増強アジュバントを含有するリザーバを有する）を据えること；
前記微小突起を皮膚に貫通させること；ならびに
前記抗原性作用物質および前記アジュバントを、前記リザーバから哺乳動物に皮内で送達させること
を含んで成る、哺乳動物のワクチン接種方法。
【請求項１６】
免疫応答増強アジュバントが、リン酸アルミニウムゲル、水酸化アルミニウム、藻類グルカン、β−グルカン、コレラトキシンＢサブユニット、熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）、γ−イヌリン、ＧＭＤＰ（Ｎ−アセチルグルコサミン−（β１−４）−Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−グルタミン）、ＧＴＰ−ＧＤＰ、イミキモド（Ｉｍｉｑｕｉｍｏｄ）、インムテル［ＩｍｍＴｈｅｒ］ＴＭ（ＤＴＰ−ＧＤＰ）、ロキソリビン（Ｌｏｘｏｒｉｂｉｎｅ）、ＭＰＬ（Ｒ）、ＭＴＰ−ＰＥ、ムラメチド（Ｍｕｒａｍｅｔｉｄｅ）、プルーラン（Ｐｌｅｕｒａｎ）（β−グルカン）、ムラパルミチン（Ｍｕｒａｐａｌｍｉｔｉｎｅ）、ＱＳ−２１、Ｓ−２８４６３（４−アミノ−α，α−ジメチル−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−１−エタノール）、スクラボペプチド（Ｓｃｌａｖｏ  Ｐｅｐｔｉｄｅ）（１Ｌ−１β  １６３−１７１ペプチド）およびテラミド［Ｔｈｅｒａｍｉｄｅ］ＴＭよりなる群から選択される、請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
アジュバントがグルコサミニルムラミルジペプチドを含んで成る、請求項１５記載の方法。
【請求項１８】
アレイが皮膚接触領域を有し、かつ、前記リザーバが、前記アレイの皮膚接触領域１ｃｍ２あたり最低約０．２μｇの抗原性作用物質負荷を有する、請求項１５記載の方法。
【請求項１９】
前記アレイが皮膚接触領域を有し、かつ、前記リザーバが、前記アレイの前記皮膚接触領域１ｃｍ２あたり最低約２μｇの抗原性作用物質負荷を有する、請求項１５記載の方法。
【請求項２０】
抗原性作用物質が、タンパク質、多糖、オリゴ糖、リポタンパク質、弱毒化もしくは殺されたウイルス、弱毒化もしくは殺された細菌およびそれらの混合物よりなる群から選択される、請求項１５記載の方法。
【請求項２１】
前記抗原性作用物質がワクチンを含んで成る、請求項１５記載の方法。
【請求項２２】
前記ワクチンが、インフルエンザワクチン、ライム病ワクチン、狂犬病ワクチン、麻疹ワクチン、流行性耳下腺炎ワクチン、水痘ワクチン、天然痘ワクチン、肝炎ワクチンおよびジフテリアワクチンよりなる群から選択される、請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
前記アレイが金属より構成されかつ接着性の裏打ちを包含する、請求項１５記載の方法。
【請求項２４】
前記アレイが約５ｃｍ２までの皮膚接触領域を有する、請求項１５記載の方法。
【請求項２５】
リザーバ中の抗原性作用物質負荷に対するアジュバント負荷の重量比が約０．５：１ないし５０：１の範囲にある、請求項１５記載の方法。
【請求項２６】
リザーバ中の抗原性作用物質負荷に対するアジュバント負荷の重量比が約１：１ないし１０：１の範囲にある、請求項１５記載の方法。
【請求項２７】
前記リザーバが微小突起上に乾燥した固体のコーティングを含んで成る、請求項１５記載の方法。
【請求項２８】
前記リザーバが前記アレイに積層された薄膜を含んで成る、請求項１５記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
２００１年４月２０日出願の米国特許出願第６０／２８５，５７２号および２００１年１２月２０日出願の同第６０／３４２，５５２号明細書からの優先権を主張する。
【背景技術】
【０００２】
ワクチン接種は、経口、鼻、筋肉内（ＩＭ）、皮下（ＳＣ）および皮内（ＩＤ）を包含する多様な投与経路により達成することができる。投与経路が免疫応答の型に影響を与える可能性があることが十分に報告されている。非特許文献１を参照されたい。
【０００３】
商業的ワクチンの大多数はＩＭもしくはＳＣ経路により投与される。ほとんど全部の場合で、それらはシリンジおよび針を用いる慣習的注入により投与されるとは言え、高速液体ジェット注入器がいくらかの成功を有している。例えば非特許文献２を参照されたい。
【０００４】
近年、針を含まないワクチン送達系の開発における成長する興味が出現した。独立した研究室がタンパク質およびＤＮＡに基づく抗原を包含する巨大分子に対する針を含まない免疫感作を立証した。Ｇｌｅｎｎらは、未治療の皮膚に適用されたアジュバント、コレラトキシンと混合された破傷風トキソイドを含有する溶液が、抗コレラトキシン抗体を誘導することが可能であることを立証した。非特許文献３。Ｔａｎｇらは、ヒト癌胎児性抗原をコードするアデノウイルスベクターの局所投与が抗特異的抗体を誘導することを立証した。非特許文献４。Ｆａｎらもまた、Ｂ型肝炎表面抗原をコードする裸のＤＮＡの局所適用が細胞性および体液性免疫応答を誘導することができることを立証した。非特許文献５。
【０００５】
皮膚は既知の免疫器官である。例えば、非特許文献６および非特許文献７を参照されたい。皮膚に進入する病原体は、多様な機構により微生物を排除することが可能な特化された細胞の高度に組織化されかつ多彩な集団と直面する。表皮ランゲルハンス細胞は強力な抗原提示細胞である。リンパ球および皮膚マクロファージは真皮全体に浸透する。ケラチノサイトおよびランゲルハンス細胞は多彩な夥しい数の免疫学的有効成分を発現するか、もしくはそれらを生成させるよう誘導することができる。集合的に、これらの細胞は、生得のおよび特異的な免疫応答の双方を最終的に制御する複雑な一連の事象を調整する。事実、免疫感作のための経路としてのこの器官の活用が探究されている。例えば、非特許文献４；非特許文献５；および非特許文献８を参照されたい。最近の刊行物は貼付剤を使用する経皮的ワクチン接種を論考している。非特許文献９を参照されたい。しかしながら、今日まで、特異的にヒトの表皮および／真皮への抗原の実際的な信頼できかつ最小限に侵襲的な送達方法は開発されていない。慣習的な針を用いる皮内注入への大きな制限は、非常に高レベルの眼と手の協調ならびに指の器用さを必要とする。
【０００６】
皮膚の主要な障壁、角質層は、親水性かつ高分子量の薬物、ならびにタンパク質、裸のＤＮＡおよびウイルスベクターのような巨大分子に対して不浸透性である。結果として、経皮送達は、一般に、制限された親水性をもつ低分子量化合物（＜５００ダルトン）の受動的送達に制限されていた。
【０００７】
多数のアプローチが、角質層障壁を回避するための試みにおいて評価されてきた。化学的浸透増強剤、除毛、閉塞、および水和技術が、巨大分子に対する皮膚浸透性を増大させる可能性がある。しかしながら、これらの方法は延長された装着時間（ｗｅａｒｉｎｇ  ｔｉｍｅ）なしで治療的用量を送達することが可能でないかもしれず、また、それらは比較的不十分な送達手段である可能性がある。さらに、刺激しない濃度で、化学的浸透増強剤の効果は制限される。紙やすり擦傷、テープによる剥ぎ取り（ｔａｐｅ  ｓｔｒｉｐｐｉｎｇ）および分岐された針を包含する物理的浸透増強方法もまたを評価されている。これらの技術は浸透性を増大させる一方、薬物吸収に対するそれらの効果の大きさを予測することが困難である。別の物理的浸透エンハンサー、レーザー焼灼は、より再現可能な効果を提供するかもしれないが、しかし、それは現在厄介かつ高価である。能動的経皮送達方法は、イオントフォレーシス、電気穿孔、ソノフォレーシス（超音波）、および固体薬物を含有する粒子の弾道送達（ｂａｌｌｉｓｔｉｃ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ）を包含する。能動輸送を使用する送達系（例えばソノフォレーシス）は開発中であり、そして、巨大分子の送達はこうした系を用いて可能である。しかしながら、この段階で、これらの系がヒトにおける巨大分子の成功裏のかつ再現可能な送達を可能にすることができるかどうかは未だ既知でない。
【０００８】
微小突起アレイ貼付剤技術が、皮膚を通り経皮的に送達されることができる薬物の数を増大させるために開発されている。適用に際して、微小突起は皮膚の輸送障壁（角質層）を通る表面経路を創製して、親水性かつ巨大分子の送達を助長する。
【非特許文献１】
ＬｅＣｌｅｒｃら，“Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  ａ  Ｆｏｒｅｉｇｎ  Ｅｐｉｔｏｐｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ａｔ  ｔｈｅ  Ｓｕｆａｃｅ  ｏｆ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｂａｃｔｅｒｉａ：Ｉｍｐｏｒｔａｎｃｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｒｏｕｔｅ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ，”Ｖａｃｃｉｎｅ，１９８９．７：ｐｐ  ２４２−２４８
【非特許文献２】
Ｐａｒｅｎｔ  ｄｕ  Ｃｈａｔｅｌｅｔら，Ｖａｃｃｉｎｅ，Ｖｏｌ．１５，ｐｐ  ４４９−４５８（１９９７）
【非特許文献３】
Ｇｌｅｎｎら，Ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．３９１，ｐｐ  ８５１（１９９８）
【非特許文献４】
Ｔａｎｇら，Ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．３８８，ｐｐ  ７２９−７３０（１９９７）
【非特許文献５】
Ｆａｎら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１７，ｐｐ  ８７０−８７２（１９９９）
【非特許文献６】
Ｆｉｃｈｔｅｌｉｕｓら，Ｉｎｔ．Ａｒｃｈ．Ａｌｌｅｒｇｙ，１９７０，Ｖｏｌ．３７，ｐｐ  ６０７−６２０
【非特許文献７】
Ｓａｕｄｅｒ，Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ，１９９０，Ｖｏｌ．９５，ｐｐ  １０５ｓ−１０７ｓ
【非特許文献８】
Ｂｏｓ，Ｊ．Ｄ．編  Ｓｋｉｎ  Ｉｍｕｕｎｅ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＳＩＳ），Ｃｕｔａｎｅｏｕｓ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ，第２版，１９９７，ＣＲＣ  プレス（ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ），ｐｐ  ４３−１４６
【非特許文献９】
Ｇｌｅｎｎら，“Ｔｒａｎｓｃｕｔａｎｅｏｕｓ  Ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ：Ａ  Ｈｕｍａｎ  Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｔｒａｔｅｇｙ  Ｕｓｉｎｇ  ａ  Ｐａｔｃｈ”，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｖｏｌ．６，Ｎｏ．１２，２０００年１２月，ｐｐ  １４０３−１４０６
【発明の開示】
【０００９】
複数の角質層を貫通する微小突起を有する微小突起アレイを、哺乳動物、とりわけヒトにおける強力な免疫応答を誘導するために、抗原性作用物質および免疫応答増強アジュバントを皮内で送達させるために使用する。免疫応答増強アジュバントは、抗原性作用物質に対する皮膚の免疫応答を増強させるのに有効である量で皮内で送達される。該アジュバントの使用は、好ましくは、患者における治療上有効な抗原抗体力価効果をなお達成しつつ、より少量の抗原性作用物質の送達を見込む（すなわち用量節約（ｄｏｓｅ  ｓｐａｒｉｎｇ））。
【００１０】
好ましくは、抗原性作用物質はワクチン抗原を含んで成り、その抗原は、典型的には、タンパク質、多糖、藻類糖（ａｌｅｇｏｓａｃａｒｉｄｅｓ）、リポタンパク質および／または弱毒化もしくは殺されたウイルスの形態にある。本発明での使用にとりわけ好ましい抗原性作用物質は、肝炎ウイルス、肺炎ワクチン、インフルエンザワクチン、水痘ワクチン、天然痘ワクチン、狂犬病ワクチンおよび百日咳ワクチンを包含する。
【００１１】
免疫応答増強アジュバントは、好ましくは、抗原に対する哺乳動物の免疫応答を増強することが既知でありかつ患者において有害な皮膚反応を促進しない物質から選択する。Ｇｅｒｂｕアジュバント、すなわちＮ−アセチルグルコサミン−（β  １−４）−Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−グルタミン（ＧＭＤＰ）が最も好ましい。
【００１２】
抗原性作用物質および免疫応答増強アジュバントを含有するリザーバは、好ましくは微小突起アレイに積層された薄膜の形態のゲル物質であることができるが、しかし、微小突起上に直接コーティングとして塗布される物質がより好ましい。最も好ましくは、コーティングは微小突起の皮膚を貫通する先端上にのみ塗布される。
【００１３】
使用において、微小突起アレイを、ワクチン接種されるべき動物の皮膚に適用し、そして、アレイを動物の皮膚に対して押しつけて微小突起を皮膚の最外層（すなわち角質層）に貫通させる。最も好ましくは、微小突起アレイを、皮膚に対し微小突起アレイを密着させるアプリケーターを使用してワクチン接種されるべき動物の皮膚に適用して、微小突起を皮膚に貫通させる。本発明の抗原性作用物質およびアジュバントの皮内送達のために、微小突起は角質層を通りかつ下にある皮膚の表皮および真皮層に貫通すべきである。好ましくは、微小突起は重大な出血を引き起こす深さまで皮膚に穿通しない。出血を回避するために、微小突起は約４００μｍ未満、好ましくは約２００μｍ未満の深さまで皮膚を貫通すべきである。微小突起は、抗原性作用物質およびアジュバントの浸透を助長するための角質層を通る表面経路を創製する。抗原の用量および微小突起の穿通の深さは容易に制御される。本皮内ワクチンおよび動物のワクチン接種方法は、有効性および使用の便宜性を改良するために、多様な治療的ワクチンに対する広範な応用性を有する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
本発明は、皮内ワクチン、ならびに、動物にワクチン接種するために有用な抗原性作用物質および免疫応答増強アジュバントの経皮送達方法を提供する。「皮内（ｉｎｔｒａｄｅｒｍａｌ）」、「皮内（ｉｎｔｒａｃｕｔａｎｅｏｕｓ）」、「皮内で（ｉｎｔｒａｄｅｒｍａｌｌｙ）」および「皮内で（ｉｎｔｒａｃｕｔａｎｅｏｕｓｌｙ）」という用語は、抗原性作用物質（例えばワクチン抗原）およびアジュバントが、皮膚中に、ならびにとりわけ皮膚の表皮層および／もしくは下にある真皮層に送達されることを意味するために本明細書で使用する。
【００１５】
「微小突起」という用語は、生存する動物、とりわけヒトの皮膚の角質層を通り下にある真皮層もしくは表皮および真皮層中に貫通もしくは切断するよう適合される貫通要素を指す。該貫通要素は出血を引き起こす深さまで皮膚を貫通すべきでない。典型的には、該貫通要素は５００μｍ未満、および好ましくは２５０μｍ未満の微小突起長さを有する。該微小突起は、典型的には、約７５ないし５００μｍの幅および約５ないし５０μｍの厚さを有する。微小突起は、針、中空針、刃、ピン、パンチおよびそれらの組合せのような多様な形状（ｃｏｎｆｉｇｕｒａｔｉｏｎ）および／もしくは形状（ｓｈａｐｅ）に成形してよい。
【００１６】
本明細書で使用されるところの「微小突起アレイ」という用語は、角質層を貫通するための一列に配置された複数の微小突起を指す。微小突起アレイは、薄いシートから複数の微小突起をエッチングもしくは押抜きすること、および微小突起をシートの面から折り畳むかもしくは曲げて図１およびＴｒａｕｔｍａｎら、米国特許第６，０８３，１９６号明細書に示されるもののような形状（ｃｏｎｆｉｇｕｒａｔｉｏｎ）を形成することにより成形してよい。微小突起アレイはまた、Ｚｕｃｋ、米国特許第６，０５０，９８８号明細書に開示されるところの細片（１個もしくは複数）のそれぞれの縁に沿って微小突起を有する１個もしくはそれ以上の細片を形成することによるような他の既知の様式で成形してもよい。他の微小突起アレイ、およびそれの作成方法は、Ｇｏｄｓｈａｌｌら、米国特許第５，８７９，３２６号明細書およびＫａｍｅｎ、米国特許第５，９８３，１３６号明細書に開示される。微小突起アレイはまた、乾燥した（ｄｒｙ）抗原性作用物質およびアジュバントを保持する複数の中空針の形態にあってもよい。
【００１７】
本発明の皮内ワクチンは、それから伸長する複数の角質層を貫通する微小突起を有しかつ抗原性作用物質（例えばワクチン抗原）および免疫応答増強アジュバントを含有するリザーバを有する微小突起アレイを包含する。リザーバは、該リザーバが貫通する微小突起により角質層を通って切断されたスリットに抗原性作用物質を移す（ｔｒａｎｓｍｉｔｔｉｎｇ）およびアジュバントを移す関係にあるように、微小突起に関して、微小突起アレイ中で配置される。一態様において、リザーバは微小突起アレイの皮膚近位もしくは皮膚遠位側に積層された薄いポリマー性薄膜の形態の物質（例えばゲル物質）であることができる。この型のリザーバはＴｈｅｅｕｗｅｓら  第ＷＯ  ９８／２８０３７号明細書（その開示は引用することにより本明細書に組み込まれる）に開示される。より好ましくは、抗原性作用物質およびアジュバントは、微小突起、最も好ましくは微小突起の貫通する先端上に直接塗布されるコーティング中にある。適する微小突起のコーティング、およびこうしたコーティングを塗布するのに有用な装置は、２００１年１０月２６日出願の米国特許出願第１０／０４５，８４２号；２００１年３月１５日出願の同第１０／０９９，６０４号；ならびに、２００１年４月２０日出願の米国仮出願第６０／２８５，５７６号明細書からの従属を主張して、これと付随して出願された別の出願（それらの開示は引用することにより本明細書に組み込まれる）に開示される。微小突起は、角質層を通り下にある表皮層もしくは表皮および真皮層に貫通するよう適合されるが、しかし、好ましくは、毛細血管床に達しそして重大な出血を引き起こすほど深く穿通しない。典型的には、微小突起は約４００μｍ未満、および好ましくは約３００μｍ未満の深さまでの皮膚穿通を可能にする長さを有する。皮膚の角質層を貫通することに際して、コーティング中に含有される抗原性作用物質およびアジュバントが、ワクチン接種療法のために皮膚中に放出される。
【００１８】
図１は、本発明での使用のための角質層を貫通する微小突起部材１０の一態様を具体的に説明する。図１は、複数の微小突起１２を有する部材１０の一部分を示す。微小突起１２は、開口部１６を有するシート１４から実質的に９０°の角度で伸長する。部材１０は、皮膚に系２０を接着させるための裏打ち２２および接着剤２４を包含する作用物質送達もしくはサンプリング系２０（図３に示される）に組み込まれてよい。図１、２および３に示される微小突起部材１０の態様において、微小突起１２は、薄い金属シート１４から複数の微小突起１２をエッチングもしくは押抜きすること、および微小突起１２をシートの面から曲げることにより成形する。ステンレス鋼およびチタンのような金属が好ましい。金属の微小突起部材およびそれの作成方法は、Ｔｒａｕｔｍａｎら、米国特許第６，０８３，１９６号明細書；Ｚｕｃｋ  米国特許第６，０５０，９８８号明細書；およびＤａｄｄｏｎａら，米国特許第６，０９１，９７５号明細書（それらの開示は引用することにより本明細書に組み込まれる）に開示される。本発明で使用することができる他の微小突起部材は、シリコンチップエッチング技術を使用してシリコンをエッチングすること、もしくはエッチングされた微小金型を使用してプラスチックを成形すること（ｍｏｌｄｉｎｇ）により形成される。シリコンおよびプラスチックの微小突起部材はＧｏｄｓｈａｌｌら  米国特許第５，８７９，３２６号明細書（その開示は引用することにより本明細書に組み込まれる）に開示される。
【００１９】
図２は、抗原を含有するコーティング１８を有する微小突起１２を有する微小突起部材１０を具体的に説明する。コーティング１８は、微小突起１２を部分的にもしくは完全に覆ってよい。コーティングは、タンパク質抗原および場合によってはいずれかの免疫応答増強アジュバントの揮発性の液体の溶液もしくは懸濁物に微小突起を浸積することにより、微小突起１２に塗布することができる。該液体の溶液もしくは懸濁物は約１ないし２０重量％の抗原性作用物質濃度を有するべきである。該揮発性液体は、水、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド、エタノール、イソプロピルアルコールおよびそれらの混合物であることができる。これらのうちで水が最も好ましい。
【００２０】
本発明で使用することができる適する抗原性作用物質は、タンパク質、多糖、オリゴ糖、リポタンパク質、弱毒化もしくは殺された、サイトメガロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、ヒトパピローマウイルス、風疹ウイルスおよび水痘帯状疱疹のようなウイルス、弱毒化もしくは殺された、百日咳菌、破傷風菌、ジフテリア菌、グループＡ連鎖球菌属、レジオネラ・ニューモフィラ菌、髄膜炎菌、緑膿菌、肺炎連鎖球菌、梅毒トレポネーマおよびコレラ菌のような細菌、ならびにそれらの混合物の形態の抗原を包含する。抗原性作用物質を含有する多数の商業的に入手可能なワクチンもまた、本発明で利用性を有するかもしれず、そして、インフルエンザワクチン、ライム病ワクチン、狂犬病ワクチン、麻疹ワクチン、流行性耳下腺炎ワクチン、水痘ワクチン、天然痘ワクチン、肝炎ワクチン、百日咳ワクチンおよびジフテリアワクチンを包含する。
【００２１】
抗原性作用物質と一緒になって本発明で使用することができる適する免疫応答増強アジュバントは、リン酸アルミニウムゲル；水酸化アルミニウム；藻類グルカン（ａｌｇａｌ  ｇｌｕｃａｎ）、β−グルカン；コレラトキシンＢサブユニット、熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）；γ−イヌリン、ＧＭＤＰ（Ｎ−アセチルグルコサミン−（β１−４）−Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−グルタミン）；ＧＴＰ−ＧＤＰ；イミキモド（Ｉｍｉｑｕｉｍｏｄ）；インムテル［ＩｍｍＴｈｅｒ］ＴＭ（ＤＴＰ−ＧＤＰ）；ロキソリビン（Ｌｏｘｏｒｉｂｉｎｅ）、ＭＰＬ（Ｒ）；ＭＴＰ−ＰＥ；ムラメチド（Ｍｕｒａｍｅｔｉｄｅ）；プルーラン（Ｐｌｅｕｒａｎ）（β−グルカン）；ムラパルミチン（Ｍｕｒａｐａｌｍｉｔｉｎｅ）；ＱＳ−２１；Ｓ−２８４６３（４−アミノ−α，α−ジメチル−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−１−エタノール）；スカルボペプチド（Ｓｃａｌｖｏ  Ｐｅｐｔｉｄｅ）（１Ｌ−１β  １６３−１７１ペプチド）；およびテラミド［Ｔｈｅｒａｍｉｄｅ］ＴＭを包含する。
【００２２】
本発明の微小突起アレイ皮内ワクチンは、好ましくは、衝撃条件下で患者の皮膚に適用する。例えば、２００１年１０月１２日出願のＴｒａｕｔｍａｎら  米国特許出願第０９／９７６，７９８号明細書（その開示は引用することにより本明細書に組み込まれる）に記述される型の偏らされた（ｂｉａｓｅｄ）（例えばばねに駆動される）衝撃アプリケーターを、本発明の被覆された微小突起アレイを適用するのに使用することができる。最も好ましくは、被覆された微小突起アレイは、１０ｍｓｅｃもしくは未満に微小突起アレイの１ｃｍ２あたり最低０．０５ジュールの衝撃で適用される。
【００２３】
本発明で有用な好ましい抗原性作用物質を含有するおよびアジュバントを含有するリザーバは、微小突起の表面上に直接固体コーティングの形態にある。好ましくは、コーティングは液体状態で塗布し、そしてその後乾燥させる。抗原性作用物質およびアジュバントを含有する揮発性の液体の溶液もしくは懸濁物を、浸積、噴霧および／もしくは他の既知の微小液体分散技術により微小突起アレイに塗布することができる。その後、コーティングを乾燥させて固体の抗原およびアジュバントを含有するコーティングを形成させる。好ましくは、皮膚組織中に浸透する微小突起アレイの部分のみを抗原性作用物質で被覆する。適する微小突起被覆方法および装置は、２００２年３月１５日出願のＴｒａｕｔｍａｎら  米国特許出願第１０／０９９，６０４号明細書（その開示は引用することにより本明細書に組み込まれる）に開示される。その中に開示される被覆方法および本明細書に開示されるコーティング組成物を使用して、われわれは、５００μｍ未満の微小突起長さを有する典型的な金属（すなわちチタン）微小突起アレイ中の皮膚に貫通する微小突起の先端のみを正確かつ均一に被覆することが可能であった。
【００２４】
本発明により皮内で送達されるアジュバントおよび抗原性作用物質の相対量は、送達されている特定の抗原性作用物質およびアジュバントに依存して変動することができる一方、典型的には、送達される抗原に対する送達されるアジュバントの重量比は、約０：５ないし５０：１の範囲、およびより好ましくは約１：１ないし１０：１の範囲にあるべきである。これらのアジュバント対抗原性作用物質送達比を達成するために、リザーバは、好ましくは、すぐ上に開示された同一の重量比の抗原性作用物質および免疫応答増強アジュバントの負荷を含有する。
【００２５】
さらに、微小突起先端のコーティングを用いて、微小突起アレイの１ｃｍ２あたり最低０．２μｇ、および好ましくはアレイの１ｃｍ２あたり最低２μｇの抗原性作用物質およびアジュバントの負荷が容易に達成される。典型的な５ｃｍ２のアレイについて、これは、大部分のワクチン接種に十分以上である、最低１μｇ、および好ましくは最低１０μｇの抗原性作用物質およびアジュバントの負荷になる。抗原性作用物質およびアジュバントの微小突起先端のコーティングで、送達効率（Ｅｄｅｌ）は大きく高められる。Ｅｄｅｌは、予め決められた時間の期間あたりのコーティングから放出される抗原性作用物質およびアジュバントの重量パーセントと定義する。抗原性作用物質およびアジュバントを含有する溶液もしくは懸濁物の先端コーティングで、１時間に最低３０％、および好ましくは１５分に最低５０％のＥｄｅｌを達成することができる。従って、本発明は、従来技術で使用される慣習的なマクロタイン（ｍａｃｒｏｔｉｎｅ）皮膚貫通装置を上回る大きな費用の利点を提供する。
【００２６】
以下の実施例において、微小突起の皮膚浸透の深さ、モデル抗原（すなわちＯＶＡ）送達、および免疫応答を惹起する皮内で送達されるモデル抗原の能力をモルモットで評価した。これらの実験において、微小突起は約１００μｍの平均深さまで皮膚に穿通した。多様な用量のＯＶＡを、コーティング溶液濃度、装着時間および系の大きさを変動させることにより得た。２ｃｍ２の微小突起アレイを用いて、１ないし８０μｇのＯＶＡを送達させ、そして５秒で約２０μｇの送達速度を達成した。用量依存性の一次および二次抗原特異的抗体応答が誘導された。１および５μｇの用量で、抗体応答は、皮内投与後に観察されるものと同等であり、かつ、筋肉内もしくは皮下投与後に観察されるものより５０倍までより大きかった。ＯＶＡを含むアジュバントＧＭＤＰの固体コーティングは増強された抗体応答をもたらした。従って、微小突起アレイ貼付剤技術は、乾燥した抗原の皮内投与を可能にする。
【００２７】
微小突起アレイによる皮内ＯＶＡ送達の制御は、コーティング溶液の濃度、装着時間および系の大きさを変動させることにより達成され、そして、これらの変数の組合せが投薬量のより大きな順応性を見込む。これらの結果は他のタンパク質抗原にもまた応用可能である。さらに、大部分の化合物は乾燥状態でより安定であるため、微小突起アレイ技術はコールドチェーン保存を排除する可能性を有する。
【００２８】
該微小突起アレイ系はモルモットで良好に耐えられた。一次免疫感作後の軽度かつ一時的な適用部位の紅斑は、皮膚への微小突起の浅い浸透と矛盾しない。微小突起アレイもしくはＩＤ注入を用いる追加刺激投与後、中程度の紅斑および浮腫が混合型免疫学的応答を示唆する。
【実施例１】
【００２９】
免疫感作研究は２目的、すなわち、無毛モルモット（ＨＧＰ）における微小突起アレイからの変動する量のＯＶＡの送達により引き起こされる免疫応答を測定すること、および、該結果を、ＧＭＤＰアジュバントと一緒の低濃度のＯＶＡを使用する微小突起アレイでの免疫感作に対して比較すること、を有した。異系交配雄性および雌性胸腺機能正常ＨＧＰを、バイオロジカル  リサーチ  ラブス（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｓ）（スイス、系統ｉｂｍ：ＧＯＨＩ−ｈｒ）およびチャールズ  リバー  ラブス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｓ）（ミシガン、系統ＩＡＦ：ＨＡ−ＨＯ−ｈｒ）から得た。動物は２５０ないし１０００グラムであった。動物を検疫し、個別に収容し、そして、実験動物管理公認協会（Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ａｎｄ  Ａｃｃｒｅｄｉｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ）により公認された施設で維持した。該研究は実験動物の管理原則（Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ）（ＮＩＨ刊行物番号８５−２３、１９８５年改訂）を厳守した。
【００３０】
これらの研究で使用された微小突起アレイは、１もしくは２ｃｍ２の領域にわたって１ｃｍ２あたり１９０個の微小突起の密度で３３０μｍの突起を有する。該微小突起アレイは、自動ＣＡＤで生成される微小突起アレイの設計、光化学的エッチングおよび成形を組み込む制御された製造工程を使用して製造した。第一に、薄い積層物レジストを約３０μｍ厚のチタンのシートに塗布した。レジストは、所望のパターンをもつマスクを使用して接触露光し、そして印刷回路板の製造で使用されるものに非常に類似の工程を使用して現像した。その後、現像されたシートを酸エッチングし、そして、微小突起を、成形ツールを使用してシートの面に関して約９０°の角度で曲げた。完成された微小突起アレイは、図１に示されるとおり正確な微小突起をもつスクリーンであった。
【００３１】
微小突起アレイを、卵アルブミン（ＯＶＡ）およびグルコサミニルムラミルジペプチド（ＧＭＤＰ）、もしくは対照としてのＯＶＡのみで被覆した。ＧＭＤＰ（ファルミトラ（Ｐｈａｒｍｉｔｒａ）、英国）を使用する研究のために、微小突起アレイを、ＯＶＡ（１％）およびＧＭＤＰ（１０％）を含有する溶液中に浸積した。ＯＶＡ単独を使用する比較研究のため、アレイを、滅菌水中１％、５％もしくは２０％ＯＶＡ（等級Ｖ、シグマ  ケミカル  カンパニー（ＳＩＧＭＡ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．）、ミズーリ州セントルイス）中での浸積によりＯＶＡで被覆した。過剰の溶液を強制空気により除去し、そしてアレイを室温で１時間もしくはそれ以上風乾した。フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）標識ＯＶＡ（モレキュラー  プローブス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）、オレゴン州ポートランド）を使用した研究のためには、蛍光化合物単独を、５％ＯＶＡもしくはそれ未満を含有するいずれのコーティング溶液についても使用した。２０％のＯＶＡコーティング溶液については、未標識のＯＶＡ（１５％）をＦＩＴＣ−ＯＶＡ（５％）と混合した。
【００３２】
微小突起アレイ上に被覆されたＯＶＡの量はＦＩＴＣ−ＯＶＡを使用して測定した。装置上に被覆された乾燥したＯＶＡを、装置をガラスシンチレーションバイアル中で１０ｍＬのホウ酸（０．１Ｍ、ｐＨ９）中に室温で１時間浸積することにより抽出した。抽出された物質のアリコートは、発光分光測光法（励起４９４ｎｍ、発光５２０ｎｍ）による既知の標準品に対する定量のため、ホウ酸でさらに希釈した。ＦＩＴＣ−ＯＶＡで被覆された微小突起アレイは、蛍光顕微鏡検査により視覚的にもまた検査した。
【００３３】
被覆および乾燥した後に、微小突起アレイを、ポリイソブチレン接着剤を用いて、低密度ポリエチレンの裏打ちに固定した。最終的な系は、図３に示されるところの構造および８ｃｍ２の総表面積を有し、また、該アレイは１ｃｍ２もしくは２ｃｍ２いずれかの皮膚接触領域を有した。
【００３４】
麻酔されたＨＧＰの治療部位（胸郭側方領域）をイソプロピルアルコール拭取物（ｗｉｐｅ）（７０％）で浄化し、そして乾燥させた。皮膚部位は、系が衝撃アプリケーターを使用して適用される際に、人的に軽く伸長させた。適用後に、伸長張力を解除し、そして、系を、指定された時間の期間の間、皮膚上に残した。５秒間以上皮膚上に残された装置については、ＨＧＰをヴェットラップ［Ｖｅｔｗｒａｐ］（Ｒ）（３Ｍ、ミネソタ州セントポール）で覆い、そして個別に収容した。
【００３５】
微小突起の穿通の深さを評価するために、系を適用直後に除去し、そして、皮膚部位を、インディアインクを吸収された綿棒で染色した。色素はおよそ１５秒間、２つの相反する方向への円形の動きで適用した。その後、過剰の色素をガーゼでぬぐい取り、そしてイソプロピルアルコール拭取物を使用して、微小突起アレイにより創製された経路のみが見えるまで、皮膚からいかなる色素も除去した。その後、ＨＧＰを安楽死させ、そして皮膚部位を取り出しかつ凍結させた。各凍結された皮膚部位を１個の８ｍｍ生検パンチを用いて生検した。生検を、最初の切片は２０μｍでおよび残部は５０μｍで皮膚表面に平行に断面に切った。その後、個々の皮膚切片を顕微鏡用スライド上に載せ、そして各薄片中の染色された孔を計数した。これらのデータ、および既知密度の微小突起から、特定の皮膚切片中で染色された経路のパーセンテージを計算し、そして深さの関数としてプロットした。いくつかの研究では、ビデオ顕微鏡検査系（ハイ−スコープ（Ｈｉ−Ｓｃｏｐｅ）ＫＨ２２００、株式会社ハイロックス（Ｈｉｒｏｘ  Ｃｏ）、日本）を使用して皮膚部位を写真撮影した。
【００３６】
各ＨＧＰは、上述されたとおり適用された、乾燥被覆されたＦＩＴＣ−ＯＶＡ微小突起アレイを受領した。系の除去後に、治療された皮膚部位を７０％イソプロピルアルコールで徹底的に洗浄して、皮膚表面上のいかなる残余のＯＶＡも除去した。ＨＧＰを安楽死させ、そして８ｍｍの皮膚生検を採取した。各組織サンプルを、０．１ｍＬの脱イオン水を含むシンチレーションバイアルに入れた。その後、水酸化ハイアミン（ｈｙａｍｉｎｅ  ｈｙｄｒｏｘｉｄｅ）（０．９ｍＬ、メタノール中１Ｍ、ＪＴ  ベイカー（ＪＴ  Ｂａｋｅｒ）、ニュージャージー州フィリップスバーグ）を添加し、そしてサンプルを６０℃で一夜インキュベートした。その後、溶解された物質を、２ｍＬの水酸化ハイアミン／水（９：１）でさらに希釈し、そして蛍光を蛍光測定法により定量しかつ既知の標準品と比較した。バックグラウンド対照サンプルは未治療の皮膚を包含した。最小３個の複製物を各実験条件について使用した。
【００３７】
基礎の血液サンプルを、全部の動物から免疫感作日の前に得た。免疫感作の日に、ＨＧＰを麻酔し、そして治療部位を７０％イソプロピルアルコールで浄化しかつ乾燥させた。針注入により実施される免疫感作のために、ＯＶＡを滅菌水に溶解した。２５ゲージ針を伴う滅菌の１ｍＬシリンジ（ベクトン  ディッキンソン（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）、ニュージャージー州フランクリンレイクス）を使用した。ＩＤおよびＳＣ注入をＨＧＰの側背領域で実施した。後肢の大腿四頭筋をＩＭ注入に使用した。乾燥被覆されたＯＶＡを含有する微小突起アレイは上述されたとおり適用した。
【００３８】
各ＨＧＰは、一次免疫感作（第０日）、次いで同一の物品を用いる４週間後の二次（すなわち追加刺激）免疫感作を受領した。一次免疫感作後に、ＨＧＰを麻酔し、そして血液を前大静脈から収集した。血清サンプルを、抗ＯＶＡ抗体の存在についてイムノアッセイにより評価した。
【００３９】
免疫化されないおよび免疫化されたＨＧＰからの血清を、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）によりＯＶＡに対する抗体の存在について試験した。簡潔には、９６穴ポリスチレンプレート（マキシソープ（Ｍａｘｉｓｏｒｐ）、ヌンク（ＮＵＮＣ）、ニューヨーク州ロチェスター）を０．１ｍＬ／ウェルのＯＶＡ（０．２Ｍ  重炭酸ナトリウム／炭酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ９．６中１０μｇ／ｍＬ）で被覆し、そして４℃で一夜インキュベートした。プレートをＰＢＳ−トゥイーン（Ｔｗｅｅｎ）緩衝液で洗浄し、その後２００μＬのＰＢＳ／カゼイン（０．５％）／トゥイーン（Ｔｗｅｅｎ）−２０（０．０５％）緩衝液で室温で１時間被覆した。その後、プレートを再度洗浄し、そして試験血清を添加した（１００μＬ／ウェルの２ないし５倍の連続希釈物、３個の複製物、室温で１時間）。洗浄した後に、１００μＬのペルオキシダーゼ結合ヤギ抗モルモットＩｇＧ抗体（ジャクソン  イムノリサーチ  ラボラトリーズ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、フィラデルフィア州ウェストグローブ）を添加し、そして室温で１時間インキュベートした。インキュベーション後に、プレートを洗浄し、１００μＬの基質（ＡＢＴＳ、ベクトン  ディッキンソン（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）、ニュージャージー州フランクリンレイクス）を添加し、そしてそれらを室温で３５分間インキュベートした。吸光度（４０５／４９０ｎｍ）を、スペクトラマックス（ＳｐｅｃｔｒａＭＡＸ）２５０（モレキュラー  デバイシーズ  コーポレーション（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、カリフォルニア州サニーベール）を使用して測定した。結果は、免疫化されない対照血清サンプルに関する終点抗体力価として表す。
【００４０】
結果は平均のそれに関連する標準誤差を伴う平均として提示する。群間の比較は分散分析（ＡＮＯＶＡ）により実施した。
【００４１】
微小突起アレイ貼付剤をＨＧＰに適用し、そして皮膚の紅斑、浮腫および出血の兆候について視覚的に評価した。未処置の皮膚と比較した場合に、検出可能な紅斑ないし軽度の反応は、全体として適用過程後に観察されなかった。発生したいかなる紅斑も一過性であり、典型的には２４時間もしくはそれ未満以内に解消した。浮腫もしくは出血の兆候は明らかでなかった。インディアインク技術を使用する微小突起の穿通の評価は、微小突起の＞９５％が角質層障壁を通って穿通したことを示した。さらに、比較的均一の穿通パターンが観察された。治療された部位から採取された皮膚生検は、微小突起のおよそ５０％が約１００μｍの深さまで穿通したことを示した（図４）。いずれの微小突起も３００μｍより深く穿通しなかった。
【００４２】
コーティング溶液中のＯＶＡの濃度を増大させることは、微小突起アレイ上のＯＶＡの増大された負荷をもたらした。１％ＯＶＡコーティング溶液を用いて、被覆されたＯＶＡの量はおよそ７μｇ／ｃｍ２であった。５％ＯＶＡコーティング溶液で被覆された微小突起アレイは約４０μｇ／ｃｍ２の乾燥被覆されたＯＶＡを含有し、そして、２０％ＯＶＡコーティング溶液で被覆されたものは約２４０μｇ／ｃｍ２の乾燥被覆されたＯＶＡを含有した（表１）。蛍光顕微鏡検査による観察結果は、コーティングが薄い無定形ガラス質物質として存在したことを示した。最大濃度で、平均の計算された厚さは約３μｍであり、これは顕微鏡的観察結果と一致した。３種のＯＶＡ濃度で被覆された２ｃｍ２の微小突起アレイからのＯＶＡ送達を、ＨＧＰ皮膚上に５秒間適用された系で評価した。これらの研究は、１％、５％および２０％のＯＶＡコーティング溶液が、平均でそれぞれ約１、６および１０μｇ／ｃｍ２のタンパク質の送達をもたらしたことを見出した（表１）。
【００４３】
【表１】
2004538048.tif 000003
【００４４】
微小突起貼付剤アレイ（２ｃｍ２）をフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）標識卵アルブミンで被覆した。アレイを無毛モルモット（ｎ＝３）に５秒間適用した。
【００４５】
２０％ＯＶＡ溶液で被覆された２ｃｍ２の装置を使用して、皮膚中へのタンパク質の送達はより長い適用時間とともに増大した（図５）。５秒適用は皮膚中におよそ２０μｇのＯＶＡを送達した。３０分適用は５０μｇのＯＶＡを送達し、そして１時間適用はおよそ８０μｇを送達した。結果は、送達された量に対する時間の関数としての直線関係を示す。
【００４６】
免疫感作研究を、微小突起アレイからのＯＶＡの送達がＨＧＰにおける免疫応答を誘導することができるかどうかを決定するために実施した。動物を、送達研究により確立されたとおり、１、５、２０もしくは８０μｇのＯＶＡ／群を受領する４処置群（ｎ＝３ないし５／群）に分割した。表２は、ＯＶＡコーティング濃度、貼付剤装着時間、および近似用量の抗原を送達するのに使用された装置表面積を要約する。
【００４７】
【表２】
2004538048.tif 000004
【００４８】
各ＨＧＰは一次免疫感作を受領した。その４週間後に、追加刺激免疫感作を同一のプライミング条件下で実施した。ＥＬＩＳＡによりＯＶＡ特異的抗体（ＩｇＧ）力価のレベルを測定するために、血清を１週間間隔で各動物から収集した。
【００４９】
微小突起アレイにより送達される１、５、２０および８０μｇのＯＶＡに対する各ＨＧＰの免疫応答を図６に示す。比較的低レベルのＯＶＡ特異的抗体が、一次免疫感作２週間後に観察された。次の４週間にわたって、抗体力価の全般的増大が観察された。セロコンバージョン率は、増大する抗原用量および増大する時間とともに増大した。２０もしくは８０μｇの用量のＯＶＡを受領した全動物は、一次免疫感作後２週間までにセロコンバージョンした。全動物は、試験された全用量で、追加刺激免疫感作後にセロコンバージョンしていた。抗体力価の劇的な増大が追加刺激投与１週間後に観察された。一般に、ピーク抗体力価は追加刺激免疫感作１週間後に観察された。その後、抗体力価は、次の追加刺激処置を投与するまで減少した。
【００５０】
付加的な試験を、微小突起アレイでの免疫感作を慣習的なＩＤ、ＳＣおよびＩＭ注入と比較するために実施した。試験されたＯＶＡの用量は１、５、２０および８０μｇであった。一次免疫感作後に採取された血清サンプルは、針投与を使用するＯＶＡに対する抗体応答の動力学が、微小突起アレイを使用して観察されたものに類似であったことを立証した。全処置群において、ＯＶＡ用量の増大はＯＶＡ特異的抗体力価の増大をもたらした。より多い抗原用量は、一次免疫感作後の増大されたセロコンバージョン率と相関した（データは示されない）。低用量のＯＶＡ（すなわち１μｇのＳＣ、１および５μｇのＩＭ）で免疫化された数匹の動物を除き、全部の他のＨＧＰは、追加刺激免疫感作２週間後に、検出可能な抗ＯＶＡ抗体を有した。
【００５１】
ＡＮＯＶＡを実施して、追加刺激免疫感作１週間後の抗体力価を分析して、多様な処置群間の可能な差異を評価した（図７）。有意の用量−応答効果が抗原送達の全方法について観察された。微小突起アレイを使用して２０もしくは８０μｇのＯＶＡで免疫化された動物は、慣習的ＩＤ、ＳＣもしくはＩＭ注入により免疫化されたものに匹敵する抗体力価を有した。微小突起アレイを介して５μｇのＯＶＡを受領する動物は、ＩＭの針注入でみられるものより有意により大きい（２４倍）抗体力価を有した。微小突起アレイにより送達された１μｇの用量のＯＶＡは、ＳＣ（１０倍）もしくはＩＭ（５０倍）注入経路に比較してより高い抗体レベルをもたらした。
【００５２】
ＯＶＡと共処方されかつ微小突起アレイ上に乾燥被覆されたアジュバントが抗体応答を高めることができたかどうかを決定するための研究を実施した。ＯＶＡおよびＧＭＤＰで乾燥被覆された微小突起アレイを使用する免疫感作研究は、１５μｇのＧＭＤＰと一緒におよそ１μｇのＯＶＡを送達し、そして、非アジュバント対照を上回る抗体力価の有意の増大をもたらした。ＩＤ投与後に、抗体力価の増大は２５０％であった。微小突起アレイ投与後に、抗体力価の増大は１３００％であった（図８）。
【００５３】
低抗原用量（１μｇ）の送達後の抗体応答は、アジュバントＧＭＤＰの共送達により高めることができた。ＯＶＡおよびＧＭＤＰを乾燥被覆されたアレイを用いる送達研究は、アジュバントの存在が送達されたＯＶＡの量に有意に影響を及ぼさなかったことを立証した（データは示されない）。微小突起アレイを使用して皮膚中に送達されるＧＭＤＰの量を直接定量することはできなかったとは言え、われわれは、約１５μｇのＧＭＤＰが物質移動の計算に基づき皮膚中に送達されたと推定した。この用量で、ＧＭＤＰは、ＩＤおよび微小突起アレイ双方の投与経路で抗体応答を促進したが、しかし、該効果は、ＧＭＤＰおよびＯＶＡの微小突起アレイの共投与後に有意により大きかった。加えて、ＧＭＤＰおよびＯＶＡを送達した微小突起アレイで生成される抗体力価は、ＧＭＤＰの非存在下で２０μｇもしくはより大きなＯＶＡ用量で達成された力価レベルに近づき、これは、有意の用量節約効果を立証する。微小突起アレイ送達とＩＤとの間で観察される増強の差異はこの時点で理解されていないが、しかし、ＩＤもしくは微小突起アレイ投与後の皮膚の異なる層中の抗原およびアジュバントの局在化の微妙な差異の結果であるかもしれない。実際に、実験は、ＯＶＡが主として微小突起アレイ送達後に表皮層中に局在化することを立証した（データは示されない）。こうした好ましい局在化は、ランゲルハンス細胞のような関連する表皮細胞のアジュバントへの増大する曝露をもたらすかもしれず、それが高められた活性化を誘発するかもしれない。
【００５４】
微小突起アレイはＨＧＰでよく耐えられた。一次免疫感作後に、適用部位の紅斑は軽度でありかつ２４時間以内に消散した。加えて、感染症のいかなる兆候も動物のいずれでも観察されなかった。微小突起アレイもしくはＩＤ注入を用いる追加刺激投与後に、中程度の皮膚の紅斑および浮腫が観察された。この皮膚反応は迅速に出現しかつ数日持続し、混合型免疫学的応答を示唆した。
【００５５】
皮膚は抗原提示細胞および皮膚関連のリンパ様組織が豊富であり、それを免疫感作の理想的な標的としている。実際、多数の研究が、抗原のＩＤもしくは上皮（ｅｐｉｃｕｔａｎｅｏｕｓ）投与が他の投与経路に比較して効果的な免疫応答および用量節約効果につながることを立証している。しかしながら、慣習的ＩＤ投与の重大な制限は、穿通の深さを正確に制御することにおける困難であり、熟練した人員を必要とする。われわれの結果は、微小突起アレイ上に被覆されたＯＶＡを再現可能な様式で皮内に送達することができることを立証する。さらに、特異的免疫が微小突起アレイによるＯＶＡ送達後に誘導された。一次および二次双方の抗原特異的抗体応答が、微小突起アレイ上に被覆された乾燥した抗原を使用して生成された。該応答は用量依存性であった。微小突起アレイ系を用いて投与されたＯＶＡに対する抗体応答の動力学は、慣習的注入を使用して観察されるものに類似であった。１および５μｇの用量での微小突起投与は、同一の皮下もしくは筋肉内投与後に観察されるものより５０倍までより高い免疫応答を生じた。アジュバント、グルコサミニルムラミルジペプチドを微小突起上にＯＶＡとともに乾燥被覆することは、増強された抗体応答をもたらした。
【実施例２】
【００５６】
２０重量％卵アルブミンを含有する水性溶液を調製した。卵アルブミンはその後の分析のためのＦＩＴＣで標識した。微小突起アレイ（微小突起長さ２５０μｍ、アレイあたり５９５個の微小突起）は２ｃｍ２の面積を有した。微小突起の先端を、２００２年３月１５日出願の同時係属中の米国特許出願第１０／０９９，６０４号明細書に開示される装置および方法を使用して、ＯＶＡ溶液を運搬する回転するドラムの上をアレイを通過させることにより、この溶液で被覆した。いくつかのアレイ上には複数のコーティングを実施した。蛍光顕微鏡検査は、全部の場合で、コーティングが微小突起先端の最初の１００μｍに制限されたことを示した。蛍光測定法による定量は、１．８μｇ、３．７μｇおよび４．３μｇが、それぞれ１、２、および４回の被覆後にアレイ上に被覆されたことを立証した。
【００５７】
これらの微小突起アレイのいくつかを、皮膚中への卵アルブミン送達の評価のために無毛モルモット（１群あたり３匹の動物）に適用した。動物の脇腹の皮膚を、系の適用時に人的に二方向に
【００５８】
【化１】
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【００５９】
伸長した。適用は、２００１年１０月１２日出願の米国特許出願第０９／９７６，７９８号明細書に開示される型のばねで駆動される衝撃アプリケーターを使用する衝撃アプリケーター（総エネルギー＝０．４ジュール、１０ミリ秒未満で送達される）を用いて実施した。適用された系は、アクリレート接着剤で低密度ポリエチレン薄膜の裏打ちの中央に接着された、卵アルブミン被覆された微小突起アレイを含んだ（７ｃｍ２の円板）。適用後に、伸長張力を解除し、また、系は、皮膚との５秒もしくは１時間の接触後に除去した。系の除去後に、残余の薬物を皮膚から徹底的に洗浄し、そして、８ｍｍ皮膚生検を適用の場所から採取した。皮膚に送達される卵アルブミンの総量を、水酸化ハイアミン（メタノール中１Ｍ）に皮膚生検を溶解することにより測定した。定量は蛍光測定法により実施した。図９および１０に提示される結果は、４．５μｇまでのＯＶＡが、５秒および１時間の装着時間後に、それぞれ５５および８５％より高い送達効率を伴い無毛モルモットの皮膚に送達されることができることを立証する。送達効率はまた、コーティングの厚さに比較的依存しないことも見出された。
【００６０】
同一の微小突起アレイを、類似の方法論を使用して未標識の卵アルブミンで被覆した。アレイ上に被覆されたタンパク質の量を総タンパク質アッセイにより評価した。５μｇの標的用量の卵アルブミン（ＯＶＡ）を、２０％ＯＶＡコーティング溶液を使用して、許容できる再現性（４．６±０．５μｇ）で被覆した。免疫感作研究を、これらのアレイを用いて６匹の無毛モルモットの１群で実施した。系および動物での系の適用は、全モルモットでの装着時間が５秒であったことを除き、上述されたと同一であった。付加的な３群の動物は、０．１、１．０および１０μｇの卵アルブミンの皮内投与を受領した。血液サンプルを多様な時間間隔で採取し、そしてＥＬＩＳＡにより卵アルブミンに対する抗体（ＩｇＧ）力価を評価した。一次免疫感作の２および３週間後に、微小突起アレイ貼付剤で投与された全動物は、抗卵アルブミンＩｇＧ抗体を発生しており、抗原で先端被覆された微小突起アレイが免疫応答の誘導において有効であることを立証した（図１１を参照）。用量応答が、皮内に投与された卵アルブミンの増大する用量とともに観察された。この用量応答からの外挿は、微小突起アレイで得られた抗体応答が約１．５ないし４μｇの卵アルブミンの皮内送達と一致したことを立証した。
【００６１】
上述されたものに類似の実験を、２重量％卵アルブミンおよび１０重量％ＧＭＤＰを含有する水性コーティング溶液を使用して実施する。８回の被覆をアレイあたりに実施する。被覆されかつ皮膚中に送達されるＧＭＤＰを、被覆かつ送達される卵アルブミンの量およびコーティング製剤中の卵アルブミンに対するＧＭＤＰの比から推定する。分析は、各微小突起アレイが１１μｇのＧＭＤＰおよび２．２μｇの卵アルブミンで被覆されることを示す。走査型電子顕微鏡検査は、コーティングが、微小突起間のコーティングの良好な均一性を伴うガラス質の無定形マトリックスとして存在することを示す。コーティングは微小突起の最初の１５０μｍに制限される。無毛モルモットでの送達研究は、ＧＭＤＰが卵アルブミンのものに類似の送達効率で送達されることを示す（図１２）。
【００６２】
本発明の微小突起アレイ貼付剤は、効率を改良しかつ便宜性を提供するために、多様な治療的ワクチンの皮内送達に広範に応用可能である。
【図面の簡単な説明】
【００６３】
【図１】発明にかかる、本発明の微小突起アレイの透視図である。
【図２】発明にかかる、微小突起上に固体の抗原を含有するコーティングを有する微小突起アレイの透視図である。
【図３】発明にかかる、実施例１で使用される皮内抗原送達装置の側断面図である。
【図４】発明にかかる、動物の皮膚における微小突起の皮膚穿通の深さを示すグラフである。
【図５】発明にかかる、実施例１で実施された研究の時間に対する送達された卵アルブミンのグラフである。
【図６】発明にかかる、微小突起アレイにより送達されたＯＶＡで免疫化された個々のモルモットからの時間に対する卵アルブミン特異的抗体（ＩｇＧ）力価のグラフであり、ここで、矢印は初回および追加刺激免疫感作の時間を示す。
【図７】発明にかかる、皮内、皮下および筋肉内送達と微小突起送達を比較する、ＯＶＡで免疫化された無毛モルモットにおける卵アルブミン特異的抗体（ＩｇＧ）力価のグラフである。
【図８】発明にかかる、追加刺激投与１週間後の微小突起アレイおよび皮内注入を介する送達を比較する、単独および免疫応答増強アジュバントと一緒のＯＶＡで免疫化されたモルモットからの抗体（ＩｇＧ）力価のグラフである。
【図９】発明にかかる、実施例２に詳細に論考されるところの、微小突起アレイ上に被覆されかつ５秒および１時間の装着時間にわたって動物中に送達される卵アルブミンの量を示すグラフである。
【図１０】発明にかかる、実施例２に記述される方法で達成される卵アルブミン送達効率を示すグラフである。
【図１１】発明にかかる、皮内注入により投与される数用量の卵アルブミンと、卵アルブミン被覆された微小突起アレイを比較する抗体力価のグラフである。
【図１２】発明にかかる、実施例２で論考されるところの、微小突起アレイ上に被覆されかつ多様な装着時間にわたって動物中に送達されるＧＭＤＰおよび卵アルブミンの量を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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