(57)【要約】本発明はヌクレアーゼを用いてハイブリダイズされていない核酸プローブを基板から除去することによって、遺伝子分析用の検出デバイスの基板上に固定化されハイブリダイズされた核酸の検出感度を増加させる方法を提供する。本発明の方法では、標的核酸とハイブリダイズしていない一本鎖プローブによって発生するバックグラウンドシグナル、あるいは標的核酸とプローブとの非特異的結合によるシグナルが減少または除去されるので、核酸ハイブリダイゼーションの検出感度および精度を高められる。また、本発明の方法では、洗浄によってバックグラウンドシグナルを減少させる従来の方法で発生するハイブリダズされた核酸の損失を最小限に抑えることができる。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
遺伝子分析用の検出デバイスの基板上に固定化されハイブリダイズされた核酸の検出感度を増加させる方法であって、ヌクレアーゼを用いて該基板からハイブリダイズされていない核酸プローブを除去することを特徴とする、上記方法。
【請求項２】
遺伝子分析用の検出デバイスの基板が、ガラス、石英、シリコンまたはプラスチックであることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
遺伝子分析用の検出デバイスがチップであり、該チップの上に核酸が高密度で固定化されていることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
核酸がＤＮＡ、ＲＮＡまたはＰＮＡであることを特徴とする、請求項１または３に記載の方法。
【請求項５】
ヌクレアーゼが一本鎖の核酸を切断するエキソヌクレアーゼもしくはエンドヌクレアーゼまたはそれらの混合物であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
エキソヌクレアーゼまたはエンドヌクレアーゼが、エキソヌクレアーゼＩ、Ｓ１ヌクレアーゼ、マングビーン（ｍｕｎｇ ｂｅａｎ）ヌクレアーゼ、リボヌクレアーゼＡ、リボヌクレアーゼＴ１またはヌクレアーゼＰ１であることを特徴とする、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
ハイブリダイズされた核酸が、蛍光、電気化学的シグナル、質量、電荷または光学的シグナルの差により検出されることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の背景
発明の利用分野
本発明は、ハイブリダイズされた核酸の検出感度を増加させる方法に関し、さらに詳しくは、ヌクレアーゼを用いてハイブリダイズされていない核酸プローブを基板から除去することによって、遺伝子分析用の検出デバイスの基板上に固定化されハイブリダイズされた核酸の検出感度を増加させる方法に関する。
【０００２】
発明の背景
高脂血症は死亡率の高い心血管系の疾患を引き起こす決定的な要因である。現在、高脂血症治療薬として開発された物質は大部分が、コレステロール生合成酵素の一つであるＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素の阻害剤であって、高コレステロール血症および高脂血症の治療に有用である。
【０００３】
プローブに基づくアッセイは核酸の検出、定量化および分析に有用である。核酸プローブは、標的核酸の存在を調べるため、細菌、真菌、ウイルスまたはその他の生物体のサンプル分析に久しく使用されてきた（米国特許第４，８５１，３３０号；米国特許第５，２８８，６１１号；米国特許第５，５６７，５８７号；米国特許第５，６０１，９８４号；米国特許第５，６１２，１８３号参照）。さらに、プローブに基づくアッセイは遺伝病を診断するにも有用である。それにもかかわらず、プローブに基づくアッセイは、特異性、感度および信頼性の要件を満たしていないため、当技術分野で商業的に応用されていない。
【０００４】
最近、ヒトゲノムの配列を解析するために、ゲノム配列解析および疾病診断を目的としたＤＮＡチップを開発しようとする動きが盛んである。ＤＮＡチップは、シリコンやガラスなどの固相表面上に、塩基配列が知られている一本鎖ＤＮＡプローブを高密度で固定化させることにより作製される。このようなチップ上で未知のサンプルを結合させると、チップ上のプローブと未知のサンプル中のその相補的ＤＮＡとの間でハイブリダイゼーションが起こる。ＤＮＡチップ上のこのハイブリダイゼーションを検出することによって、未知のサンプル中の核酸配列を決定することができる。
【０００５】
かかるＤＮＡチップを使用すれば、膨大な量の遺伝情報を短時間で同時に分析できるのみならず、遺伝子間の相互関係までも解明でき、今後遺伝病や癌の診断、突然変異の探索、病原菌の検出、遺伝子発現の分析、新薬の開発など幅広い応用分野が予想される。また、ＤＮＡチップは、例えば、それを微生物または環境汚染のセンサーとして用いて解毒物質をコードする遺伝子をスクリーニングすることにより解毒物質を大量生産したり、医薬用農作物、低脂肪肉類の生産にも応用できるなど、殆んどの生物関連産業に革命的な発展を期することができる。
【０００６】
ＤＮＡチップは、使用するプローブの種類に応じてオリゴチップとｃＤＮＡチップという２つのグループに分類でき、また、チップの作製方法に基づいてフォトリソグラフィーチップと、ピン方式のスポッティングチップと、インクジェット方式のスポッティングチップと、電気アドレッシングＤＮＡチップとに分類できる。それにもかかわらず、これまでの全てのＤＮＡチップは、チップ上に種々の一本鎖ＤＮＡプローブが固定されており、分析しようとする標的ＤＮＡとのハイブリダイゼーションの程度を測定することで所望の情報が得られるという共通点を有する。
【０００７】
従って、ＤＮＡチップにおいてプローブＤＮＡと標的ＤＮＡとのハイブリダイゼーションの正確なシグナルが確実に得られる検出方法を開発することは、正確な分析結果を得るうえで極めて重要である。
【０００８】
従来のＤＮＡチップは、標的ＤＮＡを蛍光標識し、それをチップ上のプローブと反応させた後、共焦点顕微鏡やＣＣＤカメラを使用してチップ表面上の残留蛍光シグナルを検出するというものである（米国特許第６，１４１，０９６号参照）。蛍光イメージ分析においては、既存の高価な共焦点型のスキャナーを使用せず、比較的安価なＣＣＤ型のスキャナーでもシグナルを検出できるようにするため、チップ表面に結合される蛍光の量を増やそうとする多様な研究がなされてきた。例えば、三次元のヒドロゲルパッドを用いる方法（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２５９：３４−４１、１９９８参照）、デンドリマーを用いてプローブと蛍光物質の密度を増加させる方法（米国特許第６，１１７，６３１号参照）、一定の形の細孔があるガラス基板を使用して多孔質表面にプローブを固定させる方法（Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ Ｂｉｏｃｈｉｐ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ｐｐ．８７−１１７、Ｍａｒｋ Ｓｃｈｅｎａ編、２０００ Ｂｉｏ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ Ｂｏｏｋｓ、Ｎａｔｉｃｋ、ＭＡ、Ｕ．Ｓ．Ａ．）などの多くの新たな試みが行われている。
【０００９】
しかし、従来技術によるこのような光学的検出法は、少量のハイブリダイゼーションシグナルを検出し難く、常にバックグラウンドノイズのためシグナルを正確に検出するのが困難であり、また小型化が難しく、デジタル化した出力が見られないという問題点を抱えている。このような短所を一部解決するため、光学シグナルの代わりに電気的シグナルで結果を導き出せる新たな検出法の開発に関しても多くの研究がなされつつある。
【００１０】
導電性の金属化合物を使用して、ＤＮＡハイブリダイゼーションを電気化学的な技法で検出する方法が報告されている（米国特許第６，０９６，２７３号；米国特許第６，０９０，９３３号参照）。この方法では、ＤＮＡがハイブリダイズした時に導電性金属複合体のレドックスマーカーを測定することにより、ＤＮＡハイブリダイゼーションを電気化学的に検出するものである（Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．７０：４６７０−４６７７、１９９８； Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１９：９８６１−９８７０、１９９７； Ａｎａｌｙｔｉｃａ Ｃｈｉｍｉｃａ Ａｃｔａ、２８６：２１９−２２４、１９９４； Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．８：９０６−９１３、１９９７参照）。
【００１１】
その他にも、蛍光物質や他の標識物質を使用せずにハイブリダイゼーションを分析する方法について研究が盛んになされているが、一例としてミクロ作製されたカンチレバー（ｃａｎｔｉｌｅｖｅｒ）を用いてＤＮＡオリゴマープローブと標的ＤＮＡ間の分子間結合力を測定する方法があり、この方法では１個の塩基差まで分析することができる（Ｓｃｉｅｎｃｅ、２８８：３１６−３１８、２０００参照）。さらに、水晶の微量天秤を用いて（Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．７０：１２８８−１２９６、１９９８参照）、またはＭＡＬＤＩ質量分析計（マトリックス支援レーザー脱離／イオン化質量分析計：Ｍａｔｒｉｘ Ａｓｓｉｓｔｅｄ Ｌａｓｅｒ Ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ／Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）を用いて、ＤＮＡハイブリダイゼーションによって生じた質量差を測定する方法などが開発されている（Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．６９：４５４０−４５４６、１９９７； 米国特許第６，０４３，０３１号参照）。
【００１２】
前述した通り、ＤＮＡの相補的な結合を用いるＤＮＡチップの全ての検出方法においては、ハイブリダイゼーション前のシグナルとハイブリダイゼーション後のシグナルの差を最大にすることによって、ハイブリダイズしたＤＮＡに対する検出選択性を高めることが可能である。したがって、ハイブリダイズされていない一本鎖ＤＮＡプローブによって発生するバックグラウンドシグナル、あるいは標的ＤＮＡとプローブとの非特異的結合によるシグナルを減少させたり除去できれば、ハイブリダイズされたＤＮＡに対する検出の精度および選択性を向上させることができると期待される。
【００１３】
発明の概要
本発明者らは、ヌクレアーゼを用いて、ハイブリダイゼーション後にハイブリダイズしないで残っている一本鎖核酸プローブを除去することによって、核酸のハイブリダイゼーション検出感度を劇的に増加させうることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１４】
したがって、本発明の目的は、遺伝子分析用の検出デバイスの基板上に固定化されハイブリダイズされた核酸の検出感度を増加させる方法であって、ヌクレアーゼを用いて該基板からハイブリダイズされていない核酸プローブを除去することを特徴とする方法を提供することにある。
【００１５】
本発明の上記および他の目的および特徴は、添付の図面を参照することで以下の説明から明らかになるであろう。
【００１６】
発明の詳細な開示
本発明は、塩基配列が既知である一本鎖ＤＮＡプローブを遺伝子分析用の検出デバイスの基板上に固定させ、標的ＤＮＡをＤＮＡチップにハイブリダイズさせた後、ヌクレアーゼを用いて残留する一本鎖ＤＮＡプローブを除去するステップを含む、ハイブリダイズした核酸に対する検出感度を増加させる方法を提供する。遺伝子分析用検出デバイスの基板は、平坦で、非多孔質の基板であって、ガラス、石英、シリコン、プラスチックなどである。
【００１７】
図１は、ヌクレアーゼを用いてハイブリダイズされたＤＮＡに対する検出選択性を向上させる原理を示した模式図であるが、ここで、（Ａ）はＤＮＡプローブが固定されたＤＮＡチップの表面を示し、（Ｂ）は標的ＤＮＡとチップ上のプローブとのハイブリダイゼーション後のＤＮＡチップの表面を示し、（Ｃ）はチップ上でヌクレアーゼ処理を行った後のＤＮＡチップの表面を示す。核酸プローブとしてはＤＮＡ、ＲＮＡまたはＰＮＡ（ペプチド核酸）がある。ヌクレアーゼには、一本鎖核酸を消化するエキソヌクレアーゼまたはエンドヌクレアーゼ単独、またはこれらの混合物が含まれ、これらの具体的な例としては、エキソヌクレアーゼＩ、Ｓ１ヌクレアーゼ、マングビーン（ｍｕｎｇ ｂｅａｎ）ヌクレアーゼ、リボヌクレアーゼＡ、リボヌクレアーゼＴ１またはヌクレアーゼＰ１などがある。
【００１８】
本発明の前述した方法は、現在多用されている蛍光検出法、電気化学的検出法、質量変化を用いた検出法、電荷量変化を用いた検出法または光学的性質の差を用いた検出法など、ハイブリダイズされた二本鎖核酸から一本鎖核酸を効率的に区別する全ての検出法に適用することが可能である。
【００１９】
以下、実施例を通して本発明をさらに詳述するが、これらの実施例は本発明を単に具体的に説明するためのもので、本発明の範囲を制限するものではない。
【００２０】
実施例１：  ハイブリダイゼーション反応前のエキソヌクレアーゼＩ処理による一本鎖ＤＮＡプローブの除去
実施例１−１：  プローブの固定
アルデヒド基がコーティングされているスライドガラス（ＳｕｐｅｒＡｌｄｅｈｙｄｅ ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ、ＴｅｌｅＣｈｅｍ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｃ．， Ｕ．Ｓ．Ａ．）上に、５’末端または３’末端がアミン基で置換されているオリゴマー（１５ｍｅｒ、１００ｐｍｏｌｅ／μｌ）を、ピペットを用いて０．５μｌずつスポッティングする方法でプローブＤＮＡを固定化した。スポッティング後にスライドガラスを１２時間乾燥させ、２５℃で洗浄してガラス表面に結合されていないプローブＤＮＡとスポッティング溶液の残留物を除去し、その後再び乾燥させた。このスライドガラスを、０．２％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）で５分間２回、２５℃蒸溜水で５分間２回、９５℃蒸溜水で５分間２回、２５℃水素化ホウ素ナトリウムで５分間２回、０．２％（ｗ／ｖ）ＳＤＳで１分間３回、２５℃蒸溜水で１分間２回洗浄した。その後、固定化されたオリゴマープローブを蛍光物質ＦＩＴＣ（フルオレセイン−５−イソチオシアネート）で標識した。
【００２１】
実施例１−２：  エキソヌクレアーゼＩの酵素反応
実施例１−１と同様な方法でプローブを固定化させたスライドガラス上で、緩衝溶液２０μｌ中の１０単位のエキソヌクレアーゼＩを３７℃で１〜２時間反応させた。
【００２２】
実施例１−３：  イメージ分析
Ｓｃａｎａｒｒａｙ ５０００（ＧＳＩ Ｌｕｍｏｎｉｃｓ、ＵＳＡ）を使用することによって蛍光シグナルを分析した。
【００２３】
図２は、ＤＮＡプローブが固定化されたＤＮＡチップ表面でエキソヌクレアーゼＩの酵素反応を行い、ＦＩＴＣで標識された標的ＤＮＡをハイブリダイズさせた後、蛍光イメージを分析した結果を示す写真である。
【００２４】
図２において、（Ａ）は３’末端が表面に固定され、５’末端がＦＩＴＣで標識されたプローブを使用した場合のチップの表面を示し、（Ｂ）は５’末端が表面に固定され、３’末端がＦＩＴＣで標識されたプローブを使用した場合のチップの表面を示し、（Ｃ）は５’末端が表面に固定され、３’末端が未標識のＯＨ基であるプローブを使用した場合のチップの表面を示す。（Ａ）および（Ｂ）において、（Ｉ）はエキソヌクレアーゼＩ酵素を反応させる前のＤＮＡチップの表面を示す蛍光イメージの写真であり、（ＩＩ）はチップ上のＤＮＡプローブにエキソヌクレアーゼＩ酵素を反応させた後のＤＮＡチップの表面を示す蛍光イメージの写真である。（Ｃ）において、（Ｉ）はエキソヌクレアーゼＩ酵素を反応させることなく、チップ上のＤＮＡプローブとＦＩＴＣで標識された標的ＤＮＡをハイブリダイズさせた後のＤＮＡチップの表面を示す蛍光イメージの写真であり、（ＩＩ）はチップ上のＤＮＡプローブにエキソヌクレアーゼＩ酵素を反応させ、ＦＩＴＣで標識された標的ＤＮＡをハイブリダイズさせた後のＤＮＡチップの表面を示す蛍光イメージの写真である。
【００２５】
図２に示した通り、（Ａ）のように３’末端が表面に固定されているプローブを使用する場合と、（Ｂ）のように３’末端が蛍光物質で標識されているプローブを使用する場合には、エキソヌクレアーゼＩが適切に反応しないので、その酵素の反応前（Ｉ）と後（ＩＩ）とで蛍光イメージにさほどの変化はなかった。一方、（Ｃ）のように３’末端にＯＨ基が残されているプローブを使用する場合は、エキソヌクレアーゼＩによってそのプローブＤＮＡが効果的に除去され、エキソヌクレアーゼＩ反応の有無によって蛍光イメージに大きな差異が生じる。
【００２６】
この結果は次のようなエキソヌクレアーゼＩ酵素の性質とよく一致する。エキソヌクレアーゼＩ酵素は一本鎖ＤＮＡを３’から５’の方向に加水分解することが知られているが、この酵素は二本鎖ＤＮＡの末端を認識することなく一本鎖ＤＮＡの３’末端だけを認識し、特にＯＨ基のある３’末端を認識する。
【００２７】
実施例２：  ハイブリダイゼーション反応後のエキソヌクレアーゼＩ処理による一本鎖ＤＮＡプローブの除去
実施例２−１：  プローブの固定
実施例１−１と同様な方法でＤＮＡオリゴマーを固定化した。
【００２８】
実施例２−２：  標的ＤＮＡのハイブリダイゼーション
実施例１−１と同様な方法でプローブを固定させたスライドガラス上に、ＦＩＴＣで標識した標的ＤＮＡ（１５ｍｅｒの完全に一致したオリゴヌクレオチド）を溶解させたハイブリダイゼーション溶液（ＵｎｉＨｙｂＴＭ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ、ＴｅｌｅＣｈｅｍ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｃ．， ＵＳＡ）１０μｌを添加し、カバーガラスを載せて３７℃で２〜４時間反応させた。
【００２９】
実施例２−３：  エキソヌクレアーゼＩの酵素反応
実施例２−２と同様な方法でＤＮＡプローブをハイブリダイズさせたスライドグラス上で、実施例１−２と同様な方法で酵素反応を行った。
【００３０】
実施例２−４：  イメージ分析
実施例１−３と同様な方法で蛍光イメージを分析した。
【００３１】
図３は、ＤＮＡチップ上のＤＮＡプローブとＦＩＴＣで標識された標的ＤＮＡとをハイブリダイズさせた後、エキソヌクレアーゼＩで処理したＤＮＡチップの表面を示す蛍光イメージの写真である。図３において、（Ｉ）はエキソヌクレアーゼＩ酵素を反応させずに、チップ上のＤＮＡプローブとＦＩＴＣで標識された標的ＤＮＡとをハイブリダイズさせた後のＤＮＡチップの表面を示し、（ＩＩ）はチップ上のＤＮＡプローブとＦＩＴＣで標識された標的ＤＮＡとをハイブリダイズさせた後にエキソヌクレアーゼＩ酵素で処理したＤＮＡチップの表面を示す。
【００３２】
図３に示した通り、ＤＮＡハイブリダイゼーション後にエキソヌクレアーゼＩで処理した結果、蛍光シグナルがやや減少したことが分かる。また、対照スポット（図３において上から５番目のスポット）がエキソヌクレアーゼＩ処理後にほぼ完全に除去されたことから、非特異的バックグラウンドシグナルが除去されたと推察される。
【００３３】
実施例３：  ハイブリダイゼーション後のエキソヌクレアーゼＩ処理による一本鎖ＤＮＡプローブの除去に関する定量分析
実施例３−１：  プローブの固定
表面リアクターとしてのストレプトアビジンを結合させたチップ上に、１００ｎＭの３５ｍｅｒオリゴマーＤＮＡを流速１０μｌ／分の速度で５分間固定化させた。その後、チップを１Ｍ ＮａＣｌを含む５０ｍＭ ＮａＯＨ溶液で１分間２回洗浄した。上記オリゴマーＤＮＡ（プローブ）の末端にはビオチンが結合されている。
【００３４】
このプロセスをＳＰＲ（表面プラスモン共鳴：Ｓｕｒｆａｃｅ Ｐｌａｓｍｏｎ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ）３０００システム（ＢＩＡＣｏｒｅ）で分析した（図４参照）。図４において、実線は５’末端がチップ表面に固定され、３’末端がＯＨ基を有するプローブを示し、点線は３’末端がチップ表面に固定され、５’末端がＯＨ基を有するプローブを示す。
【００３５】
図４に示した通り、５’末端で固定されたプローブを使用する場合は、共鳴シグナルの変化が８４２．４ＲＵであり、３’末端で固定されたプローブを使用する場合は、共鳴シグナルの変化が８９２．９ＲＵであった。ＳＰＲ実験で通常１ＲＵの変化は１ｐｇ／ｍｍ２に相当することを考慮すると、２つの固定化されたプローブの量はほぼ同じであることが分かった。
【００３６】
実施例３−２：  エキソヌクレアーゼＩの酵素反応
実施例３−１と同様な方法でプローブを固定させたチップ上で、１単位／μｌのエキソヌクレアーゼＩ酵素を流速１０μｌ／分で５分間反応させた後、ＳＰＲ分析を行った。
【００３７】
図４に示した通り、５’末端で固定されたプローブを使用する場合は、共鳴シグナルが６０２．２ＲＵ減少したが（実線）、３’末端で固定されたプローブを使用する場合は、共鳴シグナルにほとんど差異がなかった（点線）。これらの結果より、エキソヌクレアーゼＩ酵素は一本鎖ＤＮＡの３’末端のＯＨ基を特異的に認識して加水分解することが分かった。
【００３８】
上述したように、本発明は、ヌクレアーゼを用いてハイブリダイズされていない核酸プローブを基板から除去することによって、遺伝子分析用検出デバイスの基板上に固定化されハイブリダイズされた核酸の検出感度を増加させる方法を提供する。本発明の方法では、標的核酸とハイブリダイズしていない一本鎖プローブによって発生するバックグラウンドシグナル、あるいは標的核酸とプローブとの非特異的結合により発生するシグナルが減少または除去されるので、核酸ハイブリダイゼーションの検出感度および精度を高められる。また、本発明の方法では、洗浄によってバックグラウンドシグナルを減少させる従来の方法で発生するハイブリダズされた核酸の損失を最小限に抑えることができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は、ヌクレアーゼを用いて、ハイブリダイズした核酸の検出選択性を向上させる原理を示した模式図である。
【図２】
図２は、ＤＮＡプローブが固定化されたＤＮＡチップ表面でエキソヌクレアーゼＩ酵素を反応させ、ＦＩＴＣで標識された標的ＤＮＡをハイブリダイズさせたＤＮＡチップの表面を示す蛍光イメージの写真である。
【図３】
図３は、チップ上のＤＮＡプローブとＦＩＴＣで標識された標的ＤＮＡをハイブリダイズさせた後、エキソヌクレアーゼＩで処理したＤＮＡチップの表面を示す蛍光イメージの写真である。
【図４】
図４は、ＢＩＡｃｏｒｅアッセイによるＤＮＡチップ上の固定化プローブの量の変化を示したグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
2004519689.tif 000024
2004519689.tif 000025