(57)【要約】本発明は、ここでは“ＬＴＲＰＣ７”（長い過渡受容体電位チャンネル（Ｌｏｎｇ Ｔｒａｎｓｉｅｎｔ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ Ｃｈａｎｎｅｌ））と命名される新規ファミリーのＡＴＰ調節カルシウム膜貫通チャンネルポリペプチドの同定及び単離に関する。このポリペプチドを含むチャンネルは、ミリモル範囲の細胞質ＡＴＰの濃度に応じて閉じ、高い細胞内レベルのカルシウム及び／又はマグネシウムによる阻害を受け、かつ細胞内カルシウム貯蔵の欠失又は減少には応答しない。本発明は、さらに、結合にＬＴＲＰＣ７を利用する方法、及びＬＴＲＰＣ７活性を調節し、またＬＴＲＰＣ７透過性を測定する方法に関する。本発明は、さらに、ＬＴＲＰＣ７の発現を調節する方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＬＴＲＰＣ７に結合可能な候補生物活性薬剤のスクリーニング方法であって、以下の工程：
ａ）ＬＴＲＰＣ７タンパク質又はそのフラグメントを、前記候補薬剤と接触させる工程；及び
ｂ）前記候補薬剤の前記ＬＴＲＰＣ７タンパク質又はそのフラグメントに対する結合性を決定する工程
を含む方法。
【請求項２】
２種以上の前記候補薬剤のライブラリーを、前記ＬＴＲＰＣ７タンパク質又はそのフラグメントと接触させる、請求項１の方法。
【請求項３】
前記ＬＴＲＰＣ７タンパク質が、配列番号：１のアミノ酸１〜１８６５又は配列番号：４のアミノ酸１〜１８６３を含む、請求項１の方法。
【請求項４】
前記ＬＴＲＰＣ７タンパク質が、配列番号：３の配列２７２〜５８６９又は配列番号：６の配列２５５〜５８４６を含む核酸によってコードされる、請求項１の方法。
【請求項５】
候補生物活性薬剤のスクリーニング方法であって、以下の工程、
ａ）ＬＴＲＰＣ７チャンネルを、前記候補薬剤と接触させる工程、及び
ｂ）前記薬剤が、前記ＬＴＲＰＣ７チャンネルの多価カチオン透過性を調節するかどうかを検出する工程
を含む方法。
【請求項６】
前記調節活性が、前記ＬＴＲＰＣ７チャンネルを開く、請求項５の方法。
【請求項７】
前記調節活性が、前記ＬＴＲＰＣ７チャンネルを閉じる、請求項５の方法。
【請求項８】
前記多価カチオンが、Ｚｎ２＋、Ｎｉ２＋、Ｂａ２＋、Ｓｒ２＋、Ｃｏ２＋、Ｃｄ２＋、及びＭｇ２＋から成る群より選択される、請求項５の方法。
【請求項９】
ＬＴＲＰＣ７チャンネルの多価カチオン透過性を調節可能な候補生物活性薬剤のスクリーニング方法であって、以下の工程：
ａ）ＬＴＲＰＣ７をコードする核酸を含む組換え核酸と、この組換え核酸に作動可能に連結している、前記ＬＴＲＰＣ７を発現させることのできる誘導性プロモーターと、さらに多価カチオン指標とを含む組換え細胞を供給する工程；
ｂ）前記組換え細胞を誘導して、前記ＬＴＲＰＣ７を発現させる工程；
ｃ）前記組換え細胞を、多価カチオン及び前記候補薬剤と接触させる工程；及びｄ）前記多価カチオンの細胞内レベルを、前記指標で検出する工程
を含む方法。
【請求項１０】
前記接触が、前記候補薬剤の後に前記多価カチオンとの接触である、請求項９の方法。
【請求項１１】
前記多価カチオンが、Ｚｎ２＋、Ｎｉ２＋、Ｂａ２＋、Ｓｒ２＋、Ｃｏ２＋、Ｃｄ２＋、及びＭｇ２＋から成る群より選択される、請求項９の方法。
【請求項１２】
前記調節活性が、前記ＬＴＲＰＣ７チャンネルの前記多価カチオン透過性を高める、請求項９の方法。
【請求項１３】
前記調節活性が、前記ＬＴＲＰＣ７チャンネルの前記多価カチオン透過性を低減する、請求項９の方法。
【請求項１４】
前記指標が、蛍光分子を含む、請求項９の方法。
【請求項１５】
前記蛍光分子が、ｆｕｒａ−２を含む、請求項１４の方法。
【請求項１６】
前記検出が、さらに、未誘導組換え細胞内における細胞内多価カチオンレベルに対する前記細胞内多価カチオンレベルを含む、請求項９の方法。
【請求項１７】
ＬＴＲＰＣ７チャンネルの多価カチオン透過性の測定方法であって、以下の工程：
ａ）ＬＴＲＰＣ７を発現する組換え核酸と、さらに多価カチオン指標とを含む組換え細胞を供給する工程；
ｂ）前記組換え細胞を、選択的に前記指標と相互作用してシグナルを生成する多価カチオンと接触させる工程；及び
ｃ）前記多価カチオンの細胞内レベルを、前記指標シグナルを検出することによって測定する工程
を含む方法。
【請求項１８】
前記指標が、蛍光分子を含む、請求項１７の方法。
【請求項１９】
前記蛍光分子が、ｆｕｒａ−２を含む、請求項１８の方法。
【請求項２０】
前記多価カチオンが、Ｚｎ２＋、Ｎｉ２＋、Ｂａ２＋、Ｓｒ２＋、Ｃｏ２＋、Ｃｄ２＋、及びＭｇ２＋から成る群より選択される、請求項１７の方法。
【請求項２１】
さらに、前記組換え細胞を、候補生物活性薬剤と接触させる工程を含む、請求項１７の方法。
【請求項２２】
前記調節活性が、前記ＬＴＲＰＣ７チャンネルの前記多価カチオン透過性を高める、請求項２１の方法。
【請求項２３】
前記調節活性が、前記ＬＴＲＰＣ７チャンネルの前記多価カチオン透過性を低減する、請求項２１の方法。
【請求項２４】
前記測定工程が、さらに、前記細胞内多価カチオンレベルを、組換えＬＴＲＰＣ７を発現しない細胞内の細胞内多価カチオンレベルと比較する工程を含む、請求項２１の方法。
【請求項２５】
前記測定工程が、さらに、前記細胞内多価カチオンレベルを、組換えＬＴＲＰＣ７を発現しないが、前記候補薬剤と接触している細胞内の細胞内多価カチオンレベルと比較する工程を含む、請求項２１の方法。
【請求項２６】
ＬＴＲＰＣ７タンパク質又はそのフラグメントの発現を調節可能な候補生物活性薬剤のスクリーニング方法であって、以下の工程：
ａ）ＬＴＲＰＣ７タンパク質をコードする組換え核酸を発現可能な組換え細胞を供給する工程；
ｂ）前記細胞を、前記候補薬剤と接触させる工程；及び
ｃ）前記組換え核酸の発現に及ぼす前記候補薬剤の効果を決定する工程
を含む方法。
【請求項２７】
前記決定が、前記細胞の表現型である、請求項２６の方法。
【請求項２８】
前記決定工程が、前記候補薬剤の存在下でＬＴＲＰＣ７の発現レベルを決定する工程と、前記発現レベルを内因性ＬＴＲＰＣ７レベルと比較する工程を含む、請求項２６の方法。
【請求項２９】
イオンチャンネルの多価カチオン透過性を調節可能な候補生物活性薬剤のスクリーニング方法であって、以下の工程：
ａ）多価カチオン指標を含む細胞を供給する工程；
ｂ）前記細胞を、多価カチオン及び前記候補薬剤と接触させる工程；及び
ｃ）前記多価カチオンの細胞内レベルを前記指標で検出する工程
を含む方法。
【請求項３０】
前記調節活性が、前記イオンチャンネルの前記多価カチオン透過性を低減する、請求項２９の方法。
【請求項３１】
前記調節活性が、前記イオンチャンネルの前記多価カチオン透過性を高める、請求項２９の方法。
【請求項３２】
前記接触が、最初に前記候補薬剤で、次に前記多価イオンとの接触である、請求項２９の方法。
【請求項３３】
前記多価カチオン指標がｆｕｒａ−２であり、かつ前記多価カチオンがＭｎ２＋である、請求項２９の方法。
【請求項３４】
前記候補薬剤が、小分子、タンパク質、ポリペプチド又は核酸を含む、請求項１、５、９、１７、２６、及び２９のいずれか１項の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、本明細書では“ＬＴＲＰＣ７”（長い過渡受容体電位チャンネル（Ｌｏｎｇ Ｔｒａｎｓｉｅｎｔ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ Ｃｈａｎｎｅｌ））と命名される新規ファミリーのＡＴＰ調節カルシウム膜貫通チャンネルポリペプチドの同定及び単離に関する。このポリペプチドを含むチャンネルは、ミリモル範囲の細胞質ＡＴＰの濃度に応じて閉じ、高い細胞内レベルのカルシウム及び／又はマグネシウムによる阻害を受け、かつ細胞内カルシウム貯蔵の欠失又は減少には応答しない。本発明は、さらに、ＬＴＲＰＣ７をコードする組換え核酸、及びＬＴＲＰＣ７活性を調節するため及び多価カチオンに対するＬＴＲＰＣ７の透過性を測定するための候補生物活性物質を結合させるためにＬＴＲＰＣ７を利用する方法に関する。本発明は、さらに、ＬＴＲＰＣ７をコードする組換え核酸の細胞性発現を調節する方法に関する。
【０００２】
（発明の背景）
イオンチャンネルは、生細胞の細胞原形質膜内に包埋されている膜貫通多サブユニットタンパク質であり、原形質膜の細胞外側から細胞の細胞内領域に特定イオンを通過させる。特定イオン輸送は、細孔の立体配置の変化によって開閉できる中心の水性細孔によって促進される。イオンゲートが開いている時は、イオンが自由にチャンネルを通って流れる。イオンゲートが閉じている時は、イオンはチャンネルの透過が妨げられる。イオンチャンネルは、多細胞真核生物種及び無数の様々な細胞型内で見られる。イオンチャンネルは、電圧ゲート制御又はリガンドゲート制御のいずれかである。チャンネルゲート制御は、特定チャンネルを開閉するプロセスである。イオンチャンネルは、一連の異なる“オープン”又は“クローズド”状態を占有することができる。従って、ゲート制御プロセスは、チャンネルが特定レベルのゲート制御を達成する前に特定シーケンスの遷移状態又は選択的遷移状態を包含することが必要である。ゲート制御プロセスは、チャンネルが開閉する様式を何とかして変えるか或いは影響を及ぼす物質又は薬剤によって調節される。チャンネルは、神経伝達物質、内部一次若しくは二次メッセンジャー、又は他の生物活性薬剤のようなリガンドによってゲート制御されうる。リガンドは、チャンネルタンパク質上の１つ以上の結合部位に結合するか、又はチャンネルに関連する受容体に結合する。チャンネルが電圧ゲート制御される場合、膜電位の変化が、チャンネルタンパク質内の荷電要素の立体配置の変化によるチャンネルゲート制御を誘発する。チャンネルがリガンドゲート制御であろうと、電圧ゲート制御であろうと、チャンネルの一部の変化によって、異なる部分に影響が生じ、結果として透過経路の開閉となる。
【０００３】
（発明の概要）
本発明は、ミリモル範囲の細胞質ＡＴＰの濃度上昇に応じて閉じ、高い細胞内レベルのカルシウム及び／又はマグネシウムによる阻害を受け、かつ細胞内カルシウム貯蔵の欠失又は減少には応答しない、本明細書では“ＬＴＲＰＣ７”（長い過渡受容体電位チャンネル）と命名される新規ファミリーのＡＴＰ調節カルシウム膜貫通チャンネルポリペプチドの同定、単離及び使用に関する。本発明は、さらに、ＬＴＲＰＣ７をコードする組換え核酸、及びＬＴＲＰＣ７活性を調節するため及び多価カチオンに対するＬＴＲＰＣ７の透過性を測定するための候補生物活性物質を結合させるためにＬＴＲＰＣ７を利用する方法に関する。本発明は、さらに、ＬＴＲＰＣ７をコードする組換え核酸の細胞性発現を調節する方法に関する。
【０００４】
本発明の一実施形態は、ＬＴＲＰＣ７に結合する候補生物活性薬剤のスクリーニング方法を提供する。この方法では、ＬＴＲＰＣ７、又はそのフラグメントを候補薬剤と接触させ、その候補薬剤がＬＴＲＰＣ７に結合するかどうかを決定する。本発明の一実施形態は、ＬＴＲＰＣ７を２つ以上の候補薬剤のライブラリーと接触させてから、その候補薬剤の１つ以上のＬＴＲＰＣ７に対する結合性を決定する工程を備える。
【０００５】
さらなる実施形態では、ＬＴＲＰＣ７がイオンチャンネルを含み、ＬＴＲＰＣ７チャンネルと結合する候補薬剤がＬＴＲＰＣ７チャンネルの多価カチオン透過性を調節する。いくつかの実施形態では、ＬＴＲＰＣ７と結合する候補薬剤がＬＴＲＰＣ７チャンネルを開く。さらに別の実施形態では、ＬＴＲＰＣ７と結合する候補薬剤がＬＴＲＰＣ７チャンネルを閉じる。さらに別の実施形態では、ＬＴＲＰＣ７を透過する多価カチオンが、Ｃａ２＋、Ｍｎ２＋、Ｚｎ２＋、Ｎｉ２＋、Ｂａ２＋、Ｓｒ２＋、Ｃｏ２＋、Ｃｄ２＋、及びＭｇ２＋を包含する。
【０００６】
いくつかの実施形態では、ＬＴＲＰＣ７チャンネルは、ＬＴＲＰＣ７をコードする組換え核酸と、この組換え核酸に作動可能に連結している誘導性プロモーターと、ｆｕｒａ−２のような多価カチオン指標とを含む組換え細胞内にある。この組換え細胞を誘導してＬＴＲＰＣ７を発現させてから、候補薬剤と共に多価カチオンを含む溶液に接触させる。別の実施形態では、多価カチオンと接触させる前に候補薬剤と接触させる。多価カチオンの細胞内レベルを多価カチオン指標によって検出する。本発明の一実施形態は、Ｃａ２＋、Ｍｎ２＋、Ｚｎ２＋、Ｎｉ２＋、Ｂａ２＋、Ｓｒ２＋、Ｃｏ２＋、Ｃｄ２＋、及びＭｇ２＋を含む多価カチオン溶液と組換え細胞を接触させる工程を備える。いくつかの実施形態では、候補薬剤がＬＴＲＰＣ７チャンネルの多価カチオン透過性を高める。他の実施形態では、候補薬剤がＬＴＲＰＣ７の多価カチオン透過性を低減する。好ましい実施形態では、多価カチオン指標が蛍光分子を含む。本発明のさらに好ましい実施形態では、多価カチオン指標がｆｕｒａ−２を含む。代替実施形態では、候補薬剤の存在下でＬＴＲＰＣ７チャンネルの生成を誘導し、多価カチオン細胞内レベルを検出する。当該レベルを、候補薬剤の存在下又は非存在下、未誘導組換え細胞内で検出される多価カチオン細胞内レベルと比較する。
【０００７】
本発明の他の目的は、ＬＴＲＰＣ７チャンネルの多価イオン透過性を測定する方法を提供することである。この方法では、ＬＴＲＰＣ７をコードする組換え核酸と、この組換え核酸に作動可能に連結している構成性又は誘導性、好ましくは誘導性プロモーターと、細胞内カチオン指標とを含む組換え細胞が提供される。この組換え細胞を、選択的に指標と相互作用してシグナルを生成する多価カチオンを含む溶液と接触させる。そして、指標シグナルを検出することによってＬＴＲＰＣ７が発現されたときの多価カチオンの細胞内レベルを測定する。この測定値を組換えＬＴＲＰＣ７が発現されていない内因性レベルと比較する。
【０００８】
より広範な実施形態では、細胞を組換えＬＴＲＰＣ７発現細胞に限定しないが、チャンネルの活性を調節する薬剤を決定するため、何らかの組換え的に発現されるチャンネルタンパク質と共に使用可能ないずれの細胞をも含みうる。組換えチャンネルの発現は、好ましくは誘導性プロモーターの制御下である。
【０００９】
好ましい実施形態では、多価カチオン指標は、ｆｕｒａ−２のような蛍光分子を含む。本発明のさらなる実施形態では、選択的にカチオン指標と相互作用する多価カチオンは、Ｃａ２＋、Ｍｎ２＋、Ｚｎ２＋、Ｎｉ２＋、Ｂａ２＋、Ｓｒ２＋、Ｃｏ２＋、Ｃｄ２＋、及びＭｇ２＋である。いくつかの実施形態では、多価カチオン薬剤と共に組換え細胞を接触させる候補生物活性薬剤の活性を調節することが、ＬＴＲＰＣ７チャンネルの多価カチオン透過性を高め、他の実施形態では、透過性を低減する。さらに別の実施形態では、多価カチオン薬剤との接触前に組換え細胞を接触させる候補生物活性薬剤の活性を調節することが、ＬＴＲＰＣ７の多価カチオン透過性を高め、他の実施形態では、透過性を低減する。
【００１０】
さらに、本発明の１つの目的は、ＬＴＲＰＣ７の発現を調節可能な候補生物活性薬剤のスクリーニング方法を提供することである。この方法では、ＬＴＲＰＣ７、又はそのフラグメントをコードする組換え核酸を発現可能な組換え細胞が提供され、いくつかの実施形態では、普通にＬＴＲＰＣ７遺伝子に付随する５’及び／又は３’発現調節配列を含む。この組換え細胞を候補薬剤と接触させ、候補薬剤のＬＴＲＰＣ７発現に及ぼす効果を決定する。いくつかの実施形態では、候補薬剤は小分子、タンパク質、ポリペプチド、又は核酸（例えば、アンチセンス核酸）を含むことができる。本発明の別の実施形態では、候補生物活性薬剤の存在下でＬＴＲＰＣ７発現レベルを測定し、このレベルを内因性ＬＴＲＰＣ７発現レベルと比較する。
【００１１】
本発明の別の局面は、配列番号：１（図１２）の１〜約１８６５のアミノ酸配列を有するか、又は配列番号：４（図１５）の１〜約１８６３のアミノ酸配列を有する組換えＬＴＲＰＣ７タンパク質又はそのフラグメントであり、ＬＴＲＰＣ７は、ミリモル範囲の細胞質ＡＴＰの濃度に応じて閉じ、高い細胞内レベルのカルシウムによる阻害を受け、かつ細胞内カルシウム貯蔵の欠失又は減少には応答しない。
【００１２】
本発明の別の局面は、配列番号：１（図１２）［ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＡＫ４４２１１］の１〜約１８６５のアミノ酸配列を有するか、又は配列番号：４（図１５）［ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＡＫ５０３７７］の１〜約１８６３のアミノ酸配列を有する組換えＬＴＲＰＣ７タンパク質又はそのフラグメントをコードするＤＮＡ分子に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する単離組換え核酸である。本発明の一実施形態は、配列番号：３（図１４）［ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＹＯ３２９５０］の約２７２〜約５８６９の配列を含む組換え核酸分子か、又は配列番号：６（図１７）［ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＹＯ３２９５１］の約２５５〜約５８４６の配列を含む組換え核酸分子である。
【００１３】
本発明の別の局面は、１〜約７２５９（配列番号：３）［ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＹＯ３２９５０］の配列を含むＬＴＲＰＣ７遺伝子を含む単離組換え核酸分子であり、ここで、前記組換え核酸分子は、組換えＬＴＲＰＣ７タンパク質又は図１２（配列番号：１）の１〜約１８６５のアミノ酸配列を有するか、若しくは前記タンパク質配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するいずれかの好ましいそのフラグメントをコードする。
【００１４】
本発明の別の局面は、１〜約７１２３（配列番号：６）［ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＹＯ３２９５１］の配列を含むＬＴＲＰＣ７遺伝子を含む単離組換え核酸分子であり、ここで、前記組換え核酸分子は、組換えＬＴＲＰＣ７タンパク質又は図１５（配列番号：４）の１〜約１８６３のアミノ酸配列を有するか、若しくは前記タンパク質配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するいずれかの好ましいそのフラグメントをコードする。
【００１５】
本発明のさらなる実施形態では、ＬＴＲＰＣ７は、配列番号：１（図１２）を有する１〜約１８６５アミノ酸を含むアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。さらなる実施形態では、ＬＴＲＰＣ７は、配列番号：３（図１４）の約２７２〜約５８６９のヌクレオチドを含むヌクレオチドの核酸配列によってコードされる。
本発明のさらなる実施形態では、ＬＴＲＰＣ７は、配列番号：４（図１５）を有する１〜約１８６３アミノ酸を含むアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。さらなる実施形態では、ＬＴＲＰＣ７は、配列番号：６（図１７）の約２５５〜約５８４６のヌクレオチドを含むヌクレオチドの核酸配列によってコードされる。
【００１６】
（図面の簡単な説明）
図１は、ＬＴＲＰＣ７が推定イオンチャンネルのＬＴＲＰＣ７ファミリーの新規な偏在発現メンバーであることを示す。図１（Ａ）は、アミノ末端独特領域１〜４（これら領域は、それらの間の配列が異なるＬＴＲＰＣメンバー内で可変の長さ及び相同性レベルなので、ＬＴＲＰＣファミリー全体にわたって特に高い相同性によって定義される）、膜貫通ドメイン部（スパンはＴｍｐｒｅｄ及び疎水性解析に基づく）、コイルドコイル領域（ＣＯＩＬＳ出力グラフに基づく近似領域）、及びＭＨＣＫ／ＥＥＦ２αキナーゼ相同性ドメイン（ＢＬＡＳＴアラインメントから）を有するＬＴＲＰＣ７の概略図である。ヒトＬＴＲＰＣ７の予測タンパク質配列も提示される。図１（Ｂ）は、種々のヒト組織及び細胞系内におけるＬＴＲＰＣ７転写発現のノーザンブロット解析である。図１（Ｃ）は、種々のヒト組織及び細胞系内におけるＬＴＲＰＣ７転写発現のＲＴ−ＰＣＲ解析である。＋は、正確なサイズのバンドが存在したことを示し、＋＋は、予測サイズの強いバンドが存在したことを示す。ＰＣＲ分析の特異性は、腎臓、脾臓、及び白血球ライブラリーからの部分的なＬＴＲＰＣ７ ｃＤＮＡ’ｓのクローニングによって確認した。
【００１７】
図２は、ＬＴＲＰＣ７が細胞機能の基礎であることを示す。ＨＥＫ−２９３細胞内における誘導性ＬＴＲＰＣ７発現及びＬＴＲＰＣ７のＣｒｅ／ｌｏｘＰ−媒介誘導分裂が、ニワトリＢ細胞系ＤＴ−４０内にある。図２（Ａ）では、ｔｅｔリプレッサータンパク質を発現するＨＥＫ−２９３細胞を、ｔｅｔ−誘導性全ＣＭＶプロモーターの制御下、ＦＬＡＧ−ＬＴＲＰＣ７構成物で形質移入した。テトラサイクリン又はドキシサイクリン処理（それぞれ、中央及び右側レーン）の前（左側レーン）又は２４時間後の抗−ＦＬＡＧ免疫応答タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析。図２（Ｂ）は、ＨＥＫ−２９３細胞系由来の細胞を含有する組織培養プレートの代表的な領域の対比画像であり、テトラサイクリンで処理後０若しくは４日又は処理しない場合の上記特性を示す。図２（Ｃ）は、野生型及び突然変異ＬＴＲＰＣ７対立遺伝子の構造を示す。制限酵素部位（Ｘ，ＸｂａＩ）、サザン−ブロット解析のプローブ（黒線）エキソン（白長方形）、及びｌｏｘＰ部位（黒三角）が示される。予測膜貫通領域（図１のマウスＬＴＲＰＣ７アミノ酸残基９９７〜１１５８に対応する）の一部を含む３つのエキソンを、ｈｉｓＤ−標的対立遺伝子中のｈｉｓＤカセットと置換し、ｎｅｏ−ｌｏｘＰ−標的対立遺伝子中の２個のｌｏｘＰ配列に隣接させた。野生型及び突然変異対立遺伝子について、プローブで検出されたＸｂａＩフラグメントが示される。図２（Ｄ）は、野生型及び突然変異ＤＴ−４０細胞から調製したＸｂａＩ消化ＤＮＡのサザン−ブロット解析である。Ｃｒｅ／ｌｏｘＰ−媒介組換えによる誘導性遺伝子分裂では、２００ｎＭタモキシフェンを含有する培地中で４８時間培養した細胞をサザン−ブロット解析に供した（レーン４）。図２（Ｅ）は、細胞増殖に及ぼすＬＴＲＰＣ７不活性化の効果を示す。ｈｉｓＤ−及びｎｅｏ−ｌｏｘＰ−標的対立遺伝子（１×１０５細胞／ｍｌ）を隠しているＤＴ−４０野生型及び突然変異クローン（Ｖ７９−１及びＶ７９−２）を２００ｎＭのタモキシフェンの非存在下（白丸）又は存在下（白三角）で培養した。培養２日後に細胞数を１×１０５細胞／ｍｌに調整した。生細胞をトリパンブルー除去法で毎日監視した。
【００１８】
図３は、ＬＴＲＰＣ７がカチオンチャンネルであることを示す。パッチ−クランプ実験前に、２４時間テトラサイクリンでＨＥＫ−２９３細胞を誘導して、ＦＬＡＧ−ＬＴＲＰＣ７構成物を発現させた。図３（Ａ）は、それぞれ−８０と＋８０ｍＶで、組換えＬＴＲＰＣ７によって運ばれた平均の内向き及び外向き電流を示す。０ｍＭＡＴＰを含有する標準Ｋ−グルタミン酸（左側パネル、ｎ＝５＋／−ｓｅｍ）又はＣｓ−グルタミン酸内部溶液（中央パネル、ｎ＝７＋／−ｓｅｍ）で潅流した細胞は、Ｉ／Ｖ関係を外向きに整流することを特徴とするイオンコンダクタンスを活性化した（図３（Ｂ）の対応パネル参照）。この電流は、Ｋ又はＣｓをＮＭＤＧ−クロライド（右側パネル，ｎ＝３＋／−ｓｅｍ）で置換した場合は、存在しなかった。図３（Ｂ）は、それぞれ−１００ｍＶ〜＋１００ｍＶの範囲の５０ｍｓ持続時間の電圧ランプに応じる代表的な高分解能電流記録を示す。電流記録は、図３（Ａ）に示されるＫ−ベース（左側パネル）、Ｃｓ−ベース（中央パネル）、又はＮＭＤＧ−ベース（右側パネル）内部溶液による実験条件を受けた細胞から取った。ＮＭＤＧ−クロライド内部溶液で潅流した細胞内における２００秒での電流振幅の減少に留意せよ。
【００１９】
図４は、二価イオンによるＬＴＲＰＣ７の透過及び遮断を示す。パッチ−クランプ実験前に、Ｈ２４時間テトラサイクリンでＥＫ−２９３細胞を誘導して、ＦＬＡＧ−ＬＴＲＰＣ７構成物を発現させた。図４（Ａ）は、それぞれ、−８０及び＋８０ｍＶ（ｎ＝５）で組換えＬＴＲＰＣ７によって運ばれた平均の内向き及び外向き電流を示す。Ｃａ２＋のない細胞外溶液を適用すると、わずかに外向き電流が増えた。適用時間は、黒線で示される。図４（Ｂ）は、それぞれ、−８０及び＋８０ｍＶ（ｎ＝５）で組換えＬＴＲＰＣ７によって運ばれた平均の内向き及び外向き電流を示す。Ｍｇ２＋のない細胞外溶液を適用すると、わずかに外向き電流が増えた。適用時間は、黒線で示される。図４（Ｃ）は、それぞれ−８０及び＋８０ｍＶ（ｎ＝５）で組換えＬＴＲＰＣ７によって運ばれた平均の内向き及び外向き電流を示す。両方のＣａ２＋の除去は、内向きと外向きの両電流を大きく増加させた。図４（Ｄ）は、それぞれ−１００ｍＶ〜＋１００ｍＶの範囲で５０ｍｓの持続時間の電圧ランプに応じる高分解能電流記録を示す。図４（Ｃ）に示される実験条件を受けた細胞から重複痕跡を取り、二価のない適用直前（１９８ｓ）及び二価の再許容（３００ｓ）直前に誘発される電流を示す。内向き電流の外向きと内向き整流の線形化に留意せよ。図４（Ｅ）は、それぞれ−８０及び＋８０ｍＶ（ｎ＝５）で組換えＬＴＲＰＣ７によって運ばれた平均の内向き及び外向き電流を示す。等張性ＣａＣｌ２の適用（１２０ｍＭ，３２０ｍＯｓｍ）は、内向き電流を増強し、かつ外向き電流を強く阻害した。適用時間は、黒線で示される。
【００２０】
図５は、ＬＴＲＰＣ７がＡＴＰ欠失で活性化されることを示す。パッチ−クランプ実験前に、２４時間テトラサイクリンでＨＥＫ−２９３細胞を誘導して、ＦＬＡＧ−ＬＴＲＰＣ７構成物を発現させた。図５（Ａ）は、それぞれ−８０及び＋８０ｍＶ（ｎ＝５）で組換えＬＴＲＰＣ７によって運ばれた平均の内向き及び外向き電流を示す。細胞を種々のＡＴＰ濃度を含有する内部溶液で細胞内潅流させた（０ｍＭ ＡＴＰ ｎ＝７±ｓｅｍ；１ｍＭ ＡＴＰ ｎ＝５±ｓｅｍ；６ｍＭ ＡＴＰ ｎ＝５±ｓｅｍ）。図５（Ｂ）は、ピペット内ＡＴＰレベルの関数として＋８０ｍＶで測定した最大外向き電流の平均的な変化を示す。全細胞確立後に得られた第１データ記録を３００秒で誘発されたデータ記録から減算して電流サイズの変化を解析した。６ｍＭ ＡＴＰで、試運転後実際に電流が減少していることに留意せよ。
【００２１】
図６は、ＡＴＰ欠失−活性化コンダクタンスが偏在性であることを示す。ＡＴＰ依存電流の存在について種々の細胞系を解析した。野生型ＨＥＫ−２９３、ＲＢＬ−２Ｈ３、及びジャーカットＴ−白血球を、６ｍＭ ＡＴＰ（Ｅ；ｎ＝５±ｓｅｍ）で補充し、又はＡＴＰ無しの（Ｊ；ｎ＝５±ｓｅｍ）標準内部溶液で潅流させた。ＡＴＰの非存在下では、全３種の細胞型が、小さい外向き整流カチオン性コンダクタンスを発生し、ＡＴＰがピペット溶液内に包含されるときは存在しなかった。電流振幅を電気容量に対して規準化して電流密度を評価かつ比較した。活性化時間経過（左パネル）及び電流のＩ／Ｖ特色（右パネル）は、組換えＬＴＲＰＣ７コンダクタンスに非常に類似していた。野生型ＨＥＫ−２９３細胞を除き、全細胞確立直後（０秒）及び３００秒後に右パネル内の重複高分解能記録を得た。ＨＥＫ−２９３細胞は、我々の実験条件下で不活性化するのに数秒を要する電圧依存性Ｋ＋電流を有するので、基礎電流レベルを示すため、実験中８秒で獲得した電流記録を選んだ。
【００２２】
図７は、遷移金属による１０ｍＭ Ｃａ２＋の等モル置換を示す。Ｍｇ２＋はなく、１０ｍＭ Ｃａ２＋を含有する浴内に保たれている、ＬＴＲＰＣ７を過剰発現するＨＥＫ−２９３細胞内で全細胞電流を記録し、６０秒間１０ｍＭ Ｃａ２＋が試験カチオンと等モル的に置換されている、他の点では同一の外部溶液にさらした。溶液を変える直前に内向き及び外向き電流振幅が１に設定されるように、−８０及び＋８０ｍＶで平均の内向き及び外向き電流を生じさせた。図７（Ａ）は、１０ｍＭ Ｚｎ２＋（ｎ＝５）及び１０ｍＭ Ｎｉ２＋（ｎ＝５）への露出が、内向き電流を大きく増加させ、外向き電流を遮断することを示している。図７（Ｂ）は、１０ｍＭ Ｃｏ２＋（ｎ＝３）、１０ｍＭ Ｍｇ２＋（ｎ＝５）及び１０ｍＭ Ｍｎ２＋（ｎ＝５）が、内向き電流を軽く適度に増加させ、外向き電流を遮断することを示している。図７（Ｃ）では、１０ｍＭ Ｂａ２＋（ｎ＝６）、１０ｍＭ Ｓｒ２＋（ｎ＝３）及び１０ｍＭ Ｃｄ２＋（ｎ＝５）が、内向き電流を軽く適度に増加させ、かつ外向き電流を増加させることを示している。図７（Ｄ）では、下のパネルが、１０ｍＭ Ｃａ２＋での電流振幅に対して試験カチオンを運ぶ時の内向き電流の増加パーセンテージ（±Ｓ．Ｅ．Ｍ．）に基づくＬＴＲＰＣ７を通る透過の順位を示す。上のパネルは、各二価カチオンについて増加又は阻害パーセント（±Ｓ．Ｅ．Ｍ．）として外向き電流に及ぼす効果をプロットしている。
【００２３】
図８は、等張溶液中における二価の微量金属の透過性を示す。１ｍＭ Ｃａ２＋と２ｍＭ Ｍｇ２＋を含有する標準外部溶液中でＬＴＲＰＣ７を過剰発現しているＨＥＫ−２９３細胞内の全細胞電流を記録し、引き続き試験カチオンの等張溶液に６０秒間さらした。溶液を変える直前に内向き及び外向き電流振幅が１に設定されるように、−８０及び＋８０ｍＶで平均の内向き及び外向き電流を生じさせた。図８（Ａ）は、等張Ｃａ２＋（ｎ＝４）への露出が、内向き電流を増加させ、外向き電流を遮断することを示している。図８（Ｂ）は、等張Ｍｇ２＋（ｎ＝５）が同様の内向き電流の増加を生じさせ、外向き電流を遮断するが、回復が遅れることを示している。図８（Ｃ）及び図８（Ｄ）は、等張Ｃｏ２＋（ｎ＝３）及び等張Ｍｎ２＋（ｎ＝３）が、内向き電流を徐々に増加させ、外向き電流を強く遮断することを示している。
【００２４】
図９は、等張溶液中における毒性二価金属の透過性を示す。１ｍＭ Ｃａ２＋と２ｍＭ Ｍｇ２＋を含有する標準外部溶液中でＬＴＲＰＣ７を過剰発現しているＨＥＫ−２９３細胞内の全細胞電流を記録し、引き続き試験カチオンの等張溶液に６０秒間さらした。溶液を変える直前に内向き及び外向き電流振幅が１に設定されるように、−８０及び＋８０ｍＶで平均の内向き及び外向き電流を生じさせた。図９（Ａ）及び図９（Ｂ）では、等張Ｂａ２＋（ｎ＝３）及び等張Ｓｒ２＋（ｎ＝４）が内向き電流を適度に増加させ、外向き電流の阻害は比較的少ない。図９（Ｃ）では、等張Ｎｉ２＋（ｎ＝４）が内向き電流を大きく増加させ、外向き電流を強く遮断している。
【００２５】
図１０は、三価金属イオンによる透過及び遮断を示している。１０ｍＭ Ｃａ２＋を含有し、Ｍｇ２＋のない標準外部溶液中でＬＴＲＰＣ７を過剰発現しているＨＥＫ−２９３細胞内で、それぞれ−８０及び＋８０ｍＶにおける平均の内向き及び外向き電流を記録した（図１０（Ａ）及び１０（Ｂ））。図１０（Ａ）及び１０（Ｂ）では、Ｃｄ３＋又はＬａ３＋を１０ｍＭ（それぞれｎ＝５）で適用した。Ｃｄ３＋は、ＭａｇＮｕＭの強力なブロッカーであると思われる。
【００２６】
図１１は、ＬＴＲＰＣ７がＣａ２＋とＭｎ２＋の流入経路であることを示す。ＬＴＲＰＣ７を過剰発現しているＨＥＫ−２９３細胞内における［Ｃａ２＋］ｉのＭａｇＮｕＭ及びｆｕｒａ−２測定値の同時全細胞パッチクランプ記録。図１１（Ａ）は、Ｍｇ・ＡＴＰ（黒丸、ｎ＝６）の非存在下及び３ｍＭ Ｍｇ・ＡＴＰ（白丸、ｎ＝６）を有するＣｓ−グルタミン酸ベース内部溶液で潅流した細胞内で、それぞれ、−８０及び＋８０ｍＶにおける平均の内向き及び外向きＭａｇＮｕＭ電流を示す。異なるＹ軸の尺度に留意せよ。図１１（Ｂ）は、−１００〜＋１００ｍＶの５０−ｍｓ電圧ランプに応じて得られた代表的な高分解能電流記録を示し、０Ｍｇ・ＡＴＰで透析した細胞内におけるＭａｇＮｕＭ（＋５０ｍＶ以上の電位で強力な外向き整流）の特徴を示している。図１１（Ｃ）は、Ｍｇ・ＡＴＰの非存在下で［Ｃａ２＋］ｉの安定増加を示している（Ａ）内でパッチした細胞から記録された平均の細胞内Ｃａ２＋シグナルを示す。対照的に、ＬＴＲＰＣ７が３ｍＭ Ｍｇ・ＡＴＰによって遮断されるか、又はチャンネルを過剰発現しない対照ＨＥＫ細胞内では、［Ｃａ２＋］ｉは定常基底レベルのままである。図１１（Ｄ）は、ＨＥＫ−２９３細胞内での３６０ｎｍ励起で平均ｆｕｒａ−２蛍光がＬＴＲＰＣ７（ｎ＝５）の過剰発現を誘導し、誘導されないままの細胞（ｎ＝５）を形質移入したことを示している。
【００２７】
図１２は、１〜約１８６５の配列で構成される組換えＬＴＲＰＣ７タンパク質のアミノ酸配列を示す（配列番号：１）。
図１３は、ＬＴＲＰＣ７ ｃＤＮＡコード化配列の組換え核酸分子を示す（配列番号：２）。
図１４は、１〜約７，２５９の核酸配列で構成されるＬＴＲＰＣ７遺伝子の組換え核酸分子を示す（配列番号：３）。
図１５は、１〜約１８６３の配列で構成される組換えＬＴＲＰＣ７タンパク質のアミノ酸配列を示す（配列番号：４）。
図１６は、ＬＴＲＰＣ７ ｃＤＮＡコード化配列の組換え核酸分子を示す（配列番号：５）。
図１７は、１〜約７，１２３の核酸配列で構成されるＬＴＲＰＣ７遺伝子の組換え核酸分子を示す（配列番号：６）。
【００２８】
（好ましい実施形態の詳細な説明）
本発明は、部分的に、ＬＴＲＰＣ７イオンチャンネル活性を調節し、及び／又は細胞内におけるＬＴＲＰＣ７の発現を変える、ＬＴＲＰＣ７と結合する分子の同定に有用な方法に関する。本明細書で述べるようなＬＴＲＰＣ７チャンネルは、順次ＬＴＲＰＣ７核酸でコードされているＬＴＲＰＣ７ポリペプチドを含む。本明細書で述べるイオンチャンネルは、好ましくはＨＥＫ−２９３細胞内で形成され、本明細書で述べる独特なＬＴＲＰＣ７特性を１つ以上示す、１種以上の新規なＬＴＲＰＣ７ポリペプチドを含む。
【００２９】
本明細書で使用する場合、用語“ＬＴＲＰＣ７”（長い過渡受容体電位チャンネル）は、多数の新規ファミリーのＡＴＰ調節カルシウム膜貫通チャンネルポリペプチドを指す。このポリペプチドは、そのアミノ酸配列、それらをコードする核酸、及びＬＴＲＰＣ７の新規な特性によっても定義される。このような新規な特性としては、ミリモル範囲の細胞内ＡＴＰの濃度に応じるＬＴＲＰＣ７チャンネルの閉鎖、高い細胞内レベルのカルシウム及び／又はマグネシウムに応じるＬＴＲＰＣ７チャンネルの阻害、及び細胞内カルシウム貯蔵の欠失又は減少に対するＬＴＲＰＣ７チャンネルの無応答が挙げられる。ＬＴＲＰＣ７チャンネルのさらなる新規特性は、そのＭｎ２＋、Ｚｎ２＋、Ｎｉ２＋、Ｂａ２＋、Ｓｒ２＋、Ｃｏ２＋、及びＣｄ２＋のような二価重金属イオンに対する透過性である。６〜１０ミリモル範囲の細胞内ＡＴＰ濃度は、ＬＴＲＰＣ７チャンネルを閉じさせるが、０〜４ミリモル範囲の細胞内ＡＴＰ濃度は、ＬＴＲＰＣ７チャンネルを再び開かせる。
【００３０】
ＬＴＲＰＣ７ポリペプチド及びチャンネルは、“カルシウムファミリーの特徴づけ”，ＷＯ ００／４０６１４（その開示は参照によって明白に本明細書に取り込まれる）に開示されている“ＳＯＣ”（貯蔵操作型チャンネル（Ｓｔｏｒｅ Ｏｐｅｒａｔｅｄ Ｃｈａｎｎｅｌｓ））及び“ＣＲＡＣ”（カルシウム放出活性化チャンネル（Ｃａｌｃｉｕｍ Ｒｅｌｅａｓｅ Ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｃｈａｎｎｅｌｓ））ポリペプチド及びチャンネルとは機能的に異なる。ＳＯＣ及びＣＲＡＣタンパク質チャンネルは、“細胞内カルシウム貯蔵からのＣａ２＋の欠失に基づいて活性化され”（ＷＯ ００／４０６１４、２ページ参照）、さらに“高レベルの細胞内カルシウムによる阻害を受ける” （ＷＯ ００／４０６１４、１０ページ参照）。本発明のＬＴＲＰＣ７ポリペプチドは高い細胞内レベルのカルシウムによる阻害を受けるチャンネルを形成するが、本ＬＴＲＰＣ７チャンネルは、細胞内カルシウム貯蔵の欠失又は減少によって活性化されず、かつミリモル範囲の細胞内ＡＴＰ濃度に応じて閉じる。ＳＯＣ及びＣＲＡＣは、この様式では制御されない。
【００３１】
ＬＴＲＰＣ７ポリペプチドは、ＬＴＲＰＣファミリーの新規メンバーである。本明細書で配列番号：１（図１２）として開示される特定配列は、ヒト脾臓細胞から誘導し、本明細書で配列番号：４（図１５）として開示される特定配列は、マウス単球細胞から誘導した。しかし、ＬＴＲＰＣ７は、哺乳類種及び線虫（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）のような他の多細胞真核生物由来の組織中に広範に発現されると考えられる。
【００３２】
ＬＴＲＰＣ７は、天然源から誘導することができ、又は組換え修飾してＬＴＲＰＣ７変異体を生成することができる。用語“ＬＴＲＰＣ７配列”は、具体的には、天然に存在する先端切断若しくは分泌型（例えば、細胞外ドメイン配列）、天然に存在する変異型（例えば、選択的スプライス型）及び天然に存在する対立遺伝子変異体を包含する。ヒト脾臓細胞由来のＬＴＲＰＣ７ポリペプチドの自然配列は、配列番号：１（図１２）の１〜約１８６５のアミノ酸を含む全長又は成熟自然配列ＬＴＲＰＣ７ポリペプチドである。マウス単球細胞由来のＬＴＲＰＣ７ポリペプチドの自然配列は、配列番号：４（図１５）の１〜約１８６３のアミノ酸を含む全長又は成熟自然配列ＬＴＲＰＣ７ポリペプチドである。
【００３３】
本明細書で配列番号：１（図１２）として開示されるＬＴＲＰＣ７ポリペプチドは、アミノ酸配列１〜７５７を含むＮ−末端細胞内ドメイン；配列７５７〜１０７０を含む膜貫通ドメイン；配列１１４２〜１３００を含むコイルドコイルドメイン；配列１６４１〜１８２２を含むキナーゼドメイン；及び配列７５７〜８５５、９４２〜９５６、及び１０１８〜１０７０を含む３つの細胞外ドメインを含む。
本明細書で配列番号：４（図１５）として開示されるＬＴＲＰＣ７ポリペプチドは、アミノ酸配列１〜６９１を含むＮ−末端細胞内ドメイン；配列７５７〜１０９５を含む膜貫通ドメイン；配列１１４２〜１３００を含むコイルドコイルドメイン；配列１６４１〜１８２２を含むキナーゼドメイン；及び配列７７４〜８５４、９４２〜９５５、及び１０１８〜１０７０を含む３つの細胞外ドメインを含む。
【００３４】
本発明のＬＴＲＰＣ７ポリペプチド、又はそのフラグメントは、配列番号：１又は配列番号：４のアミノ酸配列と少なくとも約８０％アミノ酸配列同一性、さらに好ましくは少なくとも約８５％アミノ酸配列同一性、さらになお好ましくは少なくとも約９０％アミノ酸配列同一性、最も好ましくは少なくとも約９５％配列同一性を有するポリペプチドをも包含する。このようなＬＴＲＰＣ７ポリペプチドとしては、例えば、配列番号：１又は配列番号：４の配列のＮ−又はＣ−末端で、及び１個以上の内部ドメイン内で、１個以上のアミン酸残基が置換及び／又は欠失されているＬＴＲＰＣ７ポリペプチドが挙げられる。当業者には、アミノ酸の変更が、グリコシル化部位の数若しくは位置を変えるか、又は膜固着特性を変えるように、ＬＴＲＰＣ７ポリペプチド変異体の転写後プロセスを変えうることが判るだろう。しかし、すべてのＬＴＲＰＣ７タンパク質が、本明細書で定義するようなＬＴＲＰＣ７ポリペプチドの新規特性を１つ以上示す。
【００３５】
ここで同定されるＬＴＲＰＣ７ポリペプチド配列について“パーセント（％）アミノ酸配列同一性”は、配列を整列させ、かつ必要ならばギャップを導入して、最大パーセントの配列同一性を達成後、配列同一性の一部として何ら保存的置換を考慮せずに、配列番号：１（図１２）又は配列番号：４（図１５）のアミノ酸残基と同一である、候補配列中のアミノ酸残基のパーセンテージとして定義される。本明細書で用いる％同一性値は、Ａｔｓｃｈｕｌら，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，２６６：４６０−４８０（１９９６）；ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｗｕｓｔｌ／ｅｄｕ／ｂｌａｓｔ／ＲＥＡＤＭＥ．ｈｔｍｌから得たＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２によって生成する。ＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２は、いくつかの検索パラメーターを使用し、その多くはデフォルト値に設定する。調整可能なパラメーターは、以下のように設定する：オーバーラップスパン＝１、オーバーラップフラクション＝０．１２５、ワード閾値（Ｔ）＝１１。ＨＳＰ Ｓ及びＨＳＰ Ｓ２パラメーターは動的な値であり、特定配列の組成及び関心のある配列を検索する特定のデータベースの組成によって決まるプログラム自体によって確立されるが、この値を調整して感度を高めることができる。％アミノ酸配列同一性値は、整列領域内の整合同一残基の数を“より長い”配列の残基の総数で除して決定する。“より長い”配列は、整列領域内で最も現実的な残基を有するものである（アラインメントスコアを最大にするため、ＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２で導入したギャップは無視する）。
【００３６】
さらなる実施形態では、本明細書で使用する％同一性値は、ＰＩＬＥＵＰアルゴリズムを用いて生成する。ＰＩＬＥＵＰは、順次対生成様式アラインメントを用いて１群の関連配列から多配列アラインメントを創造する。ＰＩＬＥＵＰは、アラインメントを創造するために使用するクラスター形成関係を示す系図をプロットすることもできる。ＰＩＬＥＵＰは、Ｆｅｎｇ ＆ Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｖｏｌ．３５：３５１−３６０（１９８７）の順次アラインメント法の簡単にしたものを使用し、この方法は、Ｈｉｇｇｅｒ ＆ Ｓｈａｒｐ ＣＡＢＩＯＳ ５：１５１−１５３（１９８９）によって記述されているのと同様である。有用なＰＩＬＥＵＰパラメーターとしては、３．００のデフォルトギャップ質量、０．１０のデフォルトギャップ長、及び加重末端ギャップが挙げられる。
【００３７】
さらに別の実施形態では、オリゴ糖プローブ又は適切なゲノム若しくはｃＤＮＡライブラリーによる変性ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）プライマー配列を用いて、ヒト、マウス、又は他の生物由来のＬＴＲＰＣ７ポリペプチドを同定かつ単離することができる。当業者には明らかなように、特に有用なプローブ及び／又はＰＣＲプライマー配列は、配列番号：１及び／又は配列番号：４のヒト及び／又はマウスＮ−末端細胞内ドメイン、膜貫通ドメイン、及び／又はコイルドコイルドメインの全部若しくは一部をコードする配列番号：２、配列番号：３、配列番号：５、又は配列番号：６を含むヒトＬＴＲＰＣ７核酸配列及び／又はマウスＬＴＲＰＣ７核酸配列の独特な領域を包含する。本技術では一般に知られているように、好ましいＰＣＲプライマーは、ヌクレオチド数約１５〜約３５、好ましくは約２０〜約３０の長さからで、必要に応じイノシンを含みうる。ＰＣＲ反応の条件は、技術的に周知である。
【００３８】
好ましい実施形態では、ＬＴＲＰＣ７は、組換え技法を用いて、すなわち組換えＬＴＲＰＣ７核酸の発現を通じて生成される“組換えタンパク質”である。組換えタンパク質は、少なくとも１つ以上の特徴によって天然に存在するタンパク質と区別される。例えば、このタンパク質は、その野生型宿主中に普通に付随しているタンパク質及び化合物のいくらか又はすべてから単離又は精製することができるので、実質的に純粋である。例えば、単離タンパク質は、その天然状態で普通に付随している物質の少なくともいくらかが付随せず、好ましくは与えられた試料中の全タンパク質の少なくとも約０．５質量％、さらに好ましくは少なくとも約５質量％を構成する。実質的に純粋なタンパク質は、全タンパク質の少なくとも約７５質量％、好ましくは少なくとも約８０質量％、特に好ましくは少なくとも約９０質量％を構成する。この定義は、異なる生物又は宿主細胞内の一生物由来のタンパク質生成を包含する。代わりに、本タンパク質は、該タンパク質が高濃度レベルで生成されるように、誘導性プロモーター又は高発現プロモーターの使用を通じ、普通に見られるより有意に高濃度で製造することができる。代わりに、本タンパク質は、後述するような、エピトープタグ又はアミノ酸置換、付加及び欠失の追加におけるように、天然では普通見られない形態でありうる。
【００３９】
さらなる実施形態では、ＬＴＲＰＣ７変異体は、ロイシンのセリンと置換、すなわち保存的アミノ酸置換のように、あるアミノ酸を同様の構造及び／又は化学的性質を有する別のアミノ酸と置換することによって、組換え的に操作することができる。
さらに別の実施形態では、置換、欠失、付加又はそのいずれかの組合せを用いてＬＴＲＰＣ７変異体を生成することができる。一般に、これら変更は数個のアミノ酸について行い、分子の変化を最少にする。しかし、特定の環境ではより多くの変更に耐えられる。ＬＴＲＰＣ７ポリペプチドの特性の少ない変化が望ましい場合、置換は、通常以下に従って行われる。
2004535549.tif 000002
【００４０】
さらなる実施形態では、機能又は免疫学的同一性の実質的な変更は、チャート１に示される置換より低い保存性の置換を選択することで行われる。例えば、変化の領域内のポリペプチド骨格構造、例えば、α−らせん若しくはβ−シート構造；標的部位における分子の電荷若しくは疎水性；又は側鎖の大きさにもっと有意に影響を及ぼす置換を行うことができる。一般に、ポリペプチドの性質に最大の変化を生じさせると考えられる置換は以下の通りであり、（ａ）親水性残基、例えばセリル（ｓｅｒｙｌ）又はスレオニルは、疎水性残基、例えばロイシル、イソロイシル、フェニルアラニル、バリル又はアラニルに代えて（又はよって）置換され；（ｂ）システイン又はプロリンは、他のいずれの残基に代えて（又はよって）も置換され；（ｃ）陽性の側鎖を有する残基、例えばリジル、アルギニル又はヒスチジルは、陰性残基、例えばグルタミル又はアスパラチルに代えて（又はよって）置換され；或いは（ｄ）かさ高い側鎖を有する残基、例えばフェニルアラニンは、側鎖を持たない残基、例えばグリシンに代えて（又はよって）置換される。この実施形態のＬＴＲＰＣ７変異体は、本明細書で最初に定義したＬＴＲＰＣ７ポリペプチドの１つ以上の特性を示す。
【００４１】
さらなる実施形態では、変異体は、通常同質の生物活性を示し、天然に存在する類似体と同一の免疫応答を誘発するが、変異体を選択して、必要なようにＬＴＲＰＣ７変異体の特性を修飾することもある。代わりに、ＬＴＲＰＣ７ポリペプチドの生物活性が変わるように変異体を設計することができる。例えば、グリコシル化部位を変え、又は除去することができる。この核酸変異体によってコードされるタンパク質は、本明細書で定義したＬＴＲＰＣ７ポリペプチドの新規な特性を少なくとも１つ示す。
核酸変異体によってコードされるタンパク質は、本明細書で定義したＬＴＲＰＣ７ポリペプチドの新規な特性を少なくとも１つ示す。
本明細書で使用する場合、用語“ＬＴＲＰＣ７核酸”又は他の文法的に同等語は、前述したＬＴＲＰＣ７ポリペプチドの新規な特性を１つ以上示すＬＴＲＰＣ７ポリペプチドをコードする核酸を指す。ＬＴＲＰＣ７核酸は、配列番号：２（図１３）又は配列番号：３（図１４）、及び／又は配列番号：５（図１６）又は配列番号：６（図１７）に対して配列相同性を示し、相同性は、配列の比較又はハイブリダイゼーション分析によって決定される。
【００４２】
ＬＴＲＰＣ７ポリペプチドをコードするＬＴＲＰＣ７核酸は、図１３（配列番号：２）に示されるｃＤＮＡ及び／又は図１４（配列番号：３）に示されるゲノムＤＮＡ或いは図１６（配列番号：５）に示されるｃＤＮＡ及び／又は図１７（配列番号：６）に示されるゲノムＤＮＡに相同性である。このようなＬＴＲＰＣ７核酸は、好ましくは約７５％、さらに好ましくは約８０％、さらに好ましくは約８５％、最も好ましくは約９０％より高い相同性である。いくつかの実施形態では、相同性は約９３から９５若しくは９８％程度の高さである。この文脈の相同性は、配列類似性又は同一性を意味し、同一性が好ましい。相同性の目的で好ましい比較は、既知のＬＴＲＰＣ７配列に対するコード化の相異を含む配列を比較することである。この相同性は、技術的に公知の標準的な方法によって決定し、限定するものではないが、Ｓｍｉｔｈ ＆ Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）の局所相同性アルゴリズム、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ＆ Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）の相同性アラインメントアルゴリズム、Ｐｅａｒｓｏｎ ＆ Ｌｉｐｍａｎ，ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８５：２４４４（１９８８）の類似性検索法、これらアルゴリズムのコンピュータ処理の実行（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒｉｖｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩのＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、及びＴＦＡＳＴＡ）、Ｄｅｖｅｒｅｕｘら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１２：３８７−３９５（１９８４）によって記述されているＢｅｓｔ Ｆｉｔ配列決定プログラム、好ましくはデフォルト設定を用い、若しくは検査によって決定する。
【００４３】
好ましい実施形態では、本明細書で用いる％同一性値は、ＰＩＬＥＵＰアルゴリズムを用いて生成する。ＰＩＬＥＵＰは、順次対生成様式アラインメントを用いて１群の関連配列から多配列アラインメントを創造する。ＰＩＬＥＵＰは、アラインメントを創造するために使用するクラスター形成関係を示す系図をプロットすることもできる。ＰＩＬＥＵＰは、Ｆｅｎｇ ＆ Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｖｏｌ．３５：３５１−３６０（１９８７）の順次アラインメント法の簡単にしたものを使用し、この方法は、Ｈｉｇｇｅｒ ＆ Ｓｈａｒｐ ＣＡＢＩＯＳ ５：１５１−１５３（１９８９）によって記述されているのと同様である。有用なＰＩＬＥＵＰパラメーターとしては、３．００のデフォルトギャップ質量、０．１０のデフォルトギャップ長、及び加重末端ギャップが挙げられる。
【００４４】
好ましい実施形態では、ＢＬＡＳＴアルゴリズムを使用する。ＢＬＡＳＴは、Ａｌｔｓｃｈｕｌら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０，（１９９０）及びＫａｒｌｉｎら，ＰＮＡＳ ＵＳＡ ９０：５８７３−５７８７（１９９３）に記述されている。特に有用なＢＬＡＳＴプログラムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌら，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，２６６：４６０−４８０（１９９６）；ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｗｕｓｔｌ／ｅｄｕ／ｂｌａｓｔ／ＲＥＡＤＭＥ．ｈｔｍｌから得たＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２である。ＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２は、いくつかの検索パラメーターを使用し、その多くはデフォルト値に設定する。調整可能なパラメーターは、以下のように設定する：オーバーラップスパン＝１、オーバーラップフラクション＝０．１２５、ワード閾値（Ｔ）＝１１。ＨＳＰ Ｓ及びＨＳＰ Ｓ２パラメーターは動的な値であり、特定配列の組成及び関心のある配列を検索する特定のデータベースの組成によって決まるプログラム自体によって確立されるが、この値を調整して感度を高めることができる。％アミノ酸配列同一性値は、整列領域内の整合同一残基の数を“より長い”配列の残基の総数で除して決定する。“より長い”配列は、整列領域内で最も現実的な残基を有するものである（アラインメントスコアを最大にするため、ＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２で導入したギャップは無視する）。
【００４５】
好ましい実施形態では、“パーセント（％）アミノ酸配列同一性”は、候補配列中の、配列番号：２（図１３）、配列番号：３（図１４）、配列番号：５（図１６）及び／又は配列番号：６（図１７）のヌクレオチド残基配列と同一であるヌクレオチド残基のパーセンテージとして定義される。好ましい方法は、ＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２のＢＬＡＳＴＮモジュールを利用し、デフォルトパラメーターに設置し、オーバーラップスパン及びオーバーラップフラクションをぞれぞれ１及び０．１２５に設定する。
このアラインメントは、整列させる配列内のギャップの導入を含む。さらに、配列番号：２（図１３）、配列番号：３（図１４）、配列番号：５（図１６）及び／又は配列番号：６（図１７）のヌクレオシドより多いか又は少ないヌクレオシドを含有する配列では、相同性のパーセンテージは、ヌクレオシドの総数に関する相同性ヌクレオシドの数に基づいて決定されることが分かる。従って、例えば、本明細書で同定し、かつ後述するような配列より短い配列の相同性は、より短い配列中のヌクレオシドの数を用いて決定される。
【００４６】
上述したように、ＬＴＲＰＣ７核酸は、ハイブリダイゼーション研究を通じて決定されるような相同性によっても定義することができる。ハイブリダイゼーションは、低厳密性条件下、さらに好ましくは適度な厳密性条件下、最も好ましくは高厳密性条件下で測定される。このような相同性核酸によってコードされるタンパク質は、本明細書で定義するＬＴＲＰＣ７ポリペプチドの新規な特性を少なくとも１つ示す。従って、例えば、高厳密性下、配列番号：２（図１３）、配列番号：３（図１４）、配列番号：５（図１６）又は配列番号：６（図１７）として示される配列を有する核酸及びその補体にハイブリダイズする核酸は、ＬＴＲＰＣ７特性を有するタンパク質をコードするＬＴＲＰＣ７核酸配列とみなされる。
【００４７】
ハイブリダイゼーション反応の“厳密性”は、当業者によって容易に決定可能であり、一般に、プローブ長、洗浄温度、及び塩濃度によって決まる実験に基づいた計算である。一般に、長いプローブほど妥当なアニーリングに高い温度を必要とし、プローブが短いほど低温が必要である。ハイブリダイゼーションは、通常、相補鎖がその融点未満の環境に存在すると再アニールする、変性ＤＮＡの能力に依存する。プローブとハイブリダイズ可能な配列との間の所望相同性の度合が高いほど、使用可能な相対温度が高い。結果として、高い相対温度は、反応条件をより厳密にさせる傾向にあり、低温は低厳密性にさせる。ハイブリダイゼーション反応の厳密性のさらなる実施例については、Ａｕｓｕｂｅｌら，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，（１９９５）を参照せよ。
【００４８】
“厳密な条件”又は“高厳密性条件”は、本明細書で定義する場合、以下の定義と同一である：（１）洗浄では低イオン強度及び高温、例えば５０℃で０．０１５Ｍ塩化ナトリウム／０．００１５Ｍクエン酸ナトリウム／０．１％ドデシル硫酸ナトリウムを利用する；（２）ハイブリダイゼーションの際、ホルムアルデヒドのような変性剤、例えば、０．１％ウシ血清アルブミン／０．１％Ｆｉｃｏｌｌ／０．１％ポリビニルピロリドン／７５０ｍＭ塩化ナトリウム、７５ｍＭクエン酸ナトリウムを有するｐＨ６．５の５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液を有する５０％（ｖ／ｖ）ホルムアルデヒドを４２℃で利用する；又は（３）５０％ホルムアルデヒド、５×ＳＳＣ（０．７５Ｍ ＮａＣｌ、０．０７５Ｍクエン酸ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）、０．１％ピロリン酸ナトリウム、５×デンハート液、超音波処理サケ血清ＤＮＡ（５０μｇ／ｍｌ）、０．１％ＳＤＳ、及び１０％硫酸デキストランを４２℃で利用し、４２℃で０．２×ＳＳＣ（塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム）及び５５℃で５０％ホルムアルデヒドで洗浄後、５５℃でＥＤＴＡを含有する０．１×ＳＳＣから成る高厳密性洗浄を行う。
【００４９】
“適度な厳密条件”は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒａｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，１９８９に記述されているのと同一であり、上述した条件より低い厳密性の洗浄溶液及びハイブリダイゼーション条件（例えば、温度、イオン強度及び％ＳＤＳ）の使用を含む。適度に厳密な条件の例は、２０％ホルムアルデヒド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１５ｍＭクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハート液、１０％硫酸デキストラン、及び２０ｍｇ／ｍＬ変性剪断サケ血清ＤＮＡを含む溶液中３７℃で一晩中インキュベーション後、約３７〜５０℃で１×ＳＳＣ中でフィルターを洗浄する。当業者は、プローブ長などのような因子を適応させるための必要性に応じた温度、イオン強度等の調整のし方を認識している。一般に、厳密条件は、所定のイオン強度ｐＨにおける特定配列の熱的融点（Ｔｍ）より約５〜１０℃低く選択される。Ｔｍは、該標的に相補的なプローブの５０％が、平衡状態で標的配列にハイブリダイズする温度（所定のイオン強度、ｐＨ及び核酸濃度下）である（標的配列が過剰に存在する場合、Ｔｍで、５０％のプローブが平衡状態で占有される）。厳密条件は、ｐＨ７．０〜８．３で、塩濃度が約１．０Ｍ未満のナトリウムイオン、典型的には約０．０１〜１．０Ｍナトリウムイオン濃度（又は他の塩）であり、かつ温度が、短いプローブ（例えば、１０〜５０ヌクレオチド）では少なくとも約３０℃、長いプローブ（例えば、５０ヌクレオチドより長い）では少なくとも６０℃である条件である。厳密条件は、ホルミアミドのような不安定化剤の添加によっても達成することができる。
【００５０】
別の実施形態では、より低厳密ハイブリダイゼーション条件を使用し、例えば、技術的に公知なように、適度又はそれより低い厳密性条件を使用しうる。ハイブリダイゼーション反応の厳密性に関するさらなる詳細については、Ａｕｓｕｂｅｌら，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，（１９９５）を参照せよ。
【００５１】
本明細書で定義されるようなＬＴＲＰＣ７核酸は、特定されるように、一本鎖又は二本鎖でよく、或いは二本鎖又は一本鎖配列の両方の部分を含むことができる。当業者には明らかなように、一本鎖（“Ｗａｔｓｏｎ”）の描写は、他の鎖（“Ｃｒｉｃｋ”）の配列をも定義するので、本明細書で記述する配列は、該配列の補体をも包含する。核酸は、ＤＮＡ、ゲノム及びｃＤＮＡの両方、ＲＮＡ又はハイブリッドでよく、核酸は、デオキシリボ−及びリボ−ヌクレオチドのいずれの組合せ、及びウラシル、アデニン、チミン、シトシン、グアニン、イノシン、キサンチンヒポキサンチン、イソシトシン、イソグアニン等を含む塩基のいずれの組合せをも含むことができる。本明細書で使用する場合、用語“ヌクレオシド”は、ヌクレオチド及びヌクレオシドとヌクレオシド類似体、及びアミノ酸修飾ヌクレオシドのような修飾ヌクレオシドを包含する。さらに、“ヌクレオシド”は、非天然類似体構造を包含する。従って、本明細書では、例えば、それぞれ塩基を含有する、ペプチド核酸の個々の単位をヌクレオシドとして言及する。
【００５２】
本明細書で定義されるようなＬＴＲＰＣ７核酸は、組換え核酸である。用語“組換え核酸”によって、本明細書では、もとは、一般にポリメラーゼ及びエンドヌクレアーゼによる核酸の操作によって、普通天然には見られない形態でインビトロ生成された核酸を意味する。従って、線形の単離核酸、又は普通結合されないＤＮＡ分子の連結によってインビトロ生成される発現ベクターは、両方ともこの発明の目的の組換え体とみなされる。一度組換え核酸が生成され、かつ宿主細胞若しくは生体内に再導入されると、それは、非組換え的に、すなわちインビトロ操作よりはむしろ宿主細胞のインビボ細胞機構によって複製することが分かる；しかし、このような核酸は、一度組換え的に生成されると、引き続き非組換え的に複製されるが、本発明の目的では、まだ組換え体とみなされる。この定義には、ＬＴＲＰＣ７核酸分子の相同体及び対立遺伝子が包含される。この定義には、さらに、遺伝的に修飾したＬＴＲＰＣ７核酸分子が包含される。
【００５３】
全長自然配列（ヒト）ＬＴＲＰＣ７遺伝子（配列番号：３）及び／又は全長自然配列（マウス）ＬＴＲＰＣ７（配列番号：６）、又はその一部をｃＤＮＡライブラリー用のハイブリダイゼーションプローブとして用いて、他の多細胞真核生物種由来の全長ＬＴＲＰＣ７遺伝子を単離するか、又は特定のＬＴＲＰＣ７ヌクレオチドコード配列に対して所望の配列同一性を有する、さらに別の遺伝子（例えば、該ＬＴＲＰＣ７ポリペプチド若しくは他の真核生物種由来のＬＴＲＰＣ７ポリペプチドの天然に存在する変異体をコードする遺伝子）を単離する。任意に、プローブの長さは約２０〜約５０塩基である。ハイブリダイゼーションプローブは、配列番号：２のヌクレオチド配列、配列番号：３のヌクレオチド配列、配列番号：５のヌクレオチド配列、配列番号：６のヌクレオチド配列、又はＬＴＲＰＣ７の特定の自然ヌクレオチド配列のプロモーター、エンハンサー要素及びイントロンを含むゲノム配列から誘導することができる。例として、スクリーニング方法は、既知のＤＮＡ配列を用いてＬＴＲＰＣ７遺伝子のコード領域を単離して約４０塩基の選択プローブを合成する工程を含む。
【００５４】
ハイブリダイゼーションプローブは、３２Ｐ若しくは３５Ｓのような放射性ヌクレオチド、又はアビジン／ビオチンカップリング系を介してプローブに結合するアルカリホスファターゼのような酵素的標識を含む種々の標識によって標識することができる。本発明のＬＴＲＰＣ７遺伝子の配列に相補的な配列を有する標識プローブを使用してヒトｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ又はｍＲＮＡのライブラリーをスクリーニングし、該ライブラリーのメンバーがハイブリダイズするプローブを決定することができる。ハイブリダイゼーションは、以下のように以前に記述されている。
【００５５】
ＰＣＲ法でプローブを用いて、密接に関連するＬＴＲＰＣ７ヌクレオチドコード配列の同定用配列のプールを生成することもできる。ＬＴＲＰＣ７ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を使用して、当該ＬＴＲＰＣ７をコードする遺伝子のマッピング用、及び遺伝障害を有する個体の遺伝解析用のハイブリダイゼーションプローブを構築することもできる。ここで提供されるヌクレオチド配列は、インサイツハイブリダイゼーション、既知染色体マーカーに対する連係解析、及びライブラリーによるハイブリダイゼーションスクリーニングのような公知の方法を用いて、染色体及び染色体の特定領域の地図上の位置を決めることができる。
【００５６】
別の実施形態では、ＬＴＲＰＣ７ポリペプチドをコードするＤＮＡは、ＬＴＲＰＣ７ ｍＲＮＡを保有し、かつ検出可能レベルでそれを発現すると考えられる組織から調製したｃＤＮＡライブラリーから得ることができる。従って、ヒトＬＴＲＰＣ７ ＤＮＡは、ヒト組織から調製したｃＤＮＡライブラリー、又はヒト脾臓組織から調製したｃＤＮＡ脾臓ライブラリーから好都合に得ることができる。ＬＴＲＰＣ７コード遺伝子は、多細胞真核生物ゲノムライブラリーから又はオリゴヌクレオチド合成によっても得ることができる。
【００５７】
関心のある遺伝子又はそれによってコードされるタンパク質を同定するために設計されたプローブ（ＬＴＲＰＣ７ ＤＮＡ若しくは少なくとも約２０〜８０塩基対のオリゴヌクレオチドに対する抗体のような）でライブラリーをスクリーニングすることができる。ｃＤＮＡ又はゲノムライブラリーの選択プローブによるスクリーニングは、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒａｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９８９）に記述されているような標準的な手順を用いて行うことができる。ＬＴＲＰＣ７をコードする遺伝子を単離するための代替手段は、ＰＣＲ方法論を使用することである［Ｓａｍｂｒｏｏｋら，前出；Ｄｉｅｆｆｅｎｂａｃｈら，ＰＣＲ Ｐｒｉｍｅｒ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒａｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９９５）］。
【００５８】
後述する実施例は、ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング方法について述べる。プローブとして選択されるオリゴヌクレオチド配列は、偽陽性が最少であるように、十分長くかつ十分に明瞭であるべきだ。オリゴヌクレオチドは、好ましくは、スクリーニングされるライブラリー内のＤＮＡにハイブリダイズするとすぐに検出できるように標識される。標識の方法は技術的に周知であり、３２Ｐ−標識ＡＴＰのような放射標識、ビオチン化若しくは酵素標識化の使用が挙げられる。適度な厳密性及び高い厳密性を含むハイブリダイゼーション条件は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，前出に提供されており、前述した。
【００５９】
このようなライブラリースクリーニング法で同定された配列は、ＧｅｎＢａｎｋのような公共データベース又は他の私有配列データベースに供託されかつ入手可能な他の公知配列と比較し、整列させることができる。分子の定義領域内又は全長配列を越えた配列同一性は（アミノ酸又はヌクレオチドのいずれかのレベルで）、相同性を評価するための種々のアルゴリズムを利用するＡＬＩＧＮ、ＤＮＡｓｔａｒ、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ２及びＩＮＨＥＲＩＴのようなコンピュータソフトウェアプログラムを用いた配列アラインメントを通じて決定することができる。
【００６０】
本明細書で定義したようなＬＴＲＰＣ７ポリペプチドをコードする核酸は、配列番号：２（図１３）、配列番号：３（図１４）、配列番号：５（図１６）、又は配列番号：６（図１７）のヌクレオチド配列の全部又は一部を用いて、選択ｃＤＮＡ若しくはゲノムライブラリーをスクリーニングすることで得ることができる。前出のＳａｍｂｒｏｏｋらの文献に記述されているような従来のプライマー伸長手順を用いて、ｃＤＮＡに逆転写されていないであろうｍＲＮＡの前駆体及びプロセシング中間体を検出する。
ＬＴＲＰＣ７ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列（又はその相補体）は、ハイブリダイゼーションプローブとしての使用、染色体及び遺伝子マッピングにおける使用、並びにアンチセンスＲＮＡ及びＤＮＡの生成における使用を含め、分子生物学の技術で種々の用途がある。
【００６１】
別の実施形態では、本明細書で定義されるようなＬＴＲＰＣ７核酸は、天然に存在するＬＴＲＰＣ７核酸を検出する診断用途を含む種々の用途で有用であり、並びにスクリーニング用途；例えば、ＬＴＲＰＣ７核酸配列に対する核酸プローブを含むバイオチップを製造することができる。それゆえに、最も広い意味では、本明細書の“核酸”若しくは“オリゴヌクレオチド”又は文法的に同等語は、一緒に共有結合している少なくとも２個のヌクレオチドを意味する。
【００６２】
別の実施形態では、上述したような配列番号：２（図１３）又は配列番号：５（図１６）のＬＴＲＰＣ７核酸配列は、より大きい遺伝子のフラグメント、すなわち核酸セグメントである。この文脈の“遺伝子”は、コード領域、非コード領域、及びコード領域と非コード領域の混合領域を包含する。従って、当業者には明らかなように、本明細書で提供される配列を使用すれば、より長い配列又は全長配列をクローニングするための技術的に周知の方法を用いてＬＴＲＰＣ７遺伝子の追加配列を得ることができる；参照によって明白に本明細書に取り込まれる、前出のＭａｎｉａｔｉｓら、及びＡｕｓｕｂｅｌらの文献を参照せよ。
【００６３】
上述したように、一度ＬＴＲＰＣ７核酸が同定されると、それをクローン化し、必要ならば、その構成部分を組み換えて全体的なＬＴＲＰＣ７遺伝子を形成することができる。一度その天然源から単離され、例えば、プラスミド若しくは他のベクター内に含まれ、又はそこから線状核酸セグメントとして切除されると、組換えＬＴＲＰＣ７核酸をさらにプローブとして用いて、他の多細胞真核生物から他のＬＴＲＰＣ７核酸、例えば追加コード領域を同定かつ単離することができる。
【００６４】
別の実施形態では、上述したように、ＬＴＲＰＣ７ポリペプチドをコードするＬＴＲＰＣ７核酸（例えば、ｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡ）を、クローニング用（該ＤＮＡの増幅）又は発現用の複製ベクター中に挿入することができる。種々のベクターを公然と入手できる。ベクターは、例えば、プラスミド、コスミド、ウイルス粒子、又はファージの形態でよい。種々の手順によって、適切な核酸配列をベクター中に挿入することができる。一般に、技術的に公知の方法で適切な制限エンドヌクレアーゼ部位中にＤＮＡを挿入する。ベクター成分としては、限定するものではないが、通常、１個以上のシグナル配列、複製の起点、１個以上のマーカー遺伝子、エンハンサー要素、プロモーター、及び転写終結配列が挙げられる。これら成分を１個以上含有する好適なベクターの構築は、当業者に公知の標準的な連結法を利用する。
【００６５】
このようなベクターを含む宿主細胞も準備する。例として、宿主細胞は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）、ＣＯＳ細胞、及びＨＥＫ細胞を含む哺乳類細胞系でよい。宿主細胞のさらに特有な例としては、ＳＶ４０で形質転換されたサル腎臓ＣＶ１系（ＣＯＳ−７、ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５１）；ヒト胚性腎臓系（２９３又は懸濁液培養中成長のためにサブクローン化された２９３細胞、Ｇｒａｈａｍら，Ｊ．Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ．，３６：５９（１９７７））；チャイニーズハムスター卵巣細胞／−ＤＨＦＲ（ＣＨＯ，Ｕｒｌａｕｂ及びＣｈａｓｉｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７：４２１６（１９８０））；マウスセルトリ細胞（ＴＭ４，Ｍａｔｈｅｒ，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．，２３：２４３−２５１（１９８０））；ヒト肺細胞（Ｗ１３８，ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７５）；ヒト肝臓細胞（Ｈｅｐ Ｇ２，ＨＢ ８０６５）；及びマウス乳癌（ＭＭＴ ０６０５６２，ＡＴＣＣ ＣＣＬ５１）が挙げられる。適切な宿主の選択は、本技術のスキル内であると考えられる。好ましい実施形態では、ＨＥＫ−２９３細胞を宿主細胞として使用する。ＬＴＲＰＣ７ポリペプチドの製造方法がさらに提供され、ＬＴＲＰＣ７ポリペプチドの発現に好適な条件下で宿主細胞を培養する工程及び該ＬＴＲＰＣ７ポリペプチドを細胞培養から回収する工程を含む。
【００６６】
別の実施形態では、発現及びクローン化ベクターを使用し、通常、ｍＲＮＡ合成に向けるためＬＴＲＰＣ７コード化核酸配列に作動可能に結合する構成性又は誘導性プロモーターを含む。可能性のある種々の宿主細胞によって認識されるプロモーターは周知である。哺乳類宿主細胞中のＬＴＲＰＣ７ ＤＮＡコード化ベクターの転写は、好ましくは誘導性プロモーター、例えば、異種哺乳類プロモーター、例えばアクチンプロモーター若しくは免疫グロブリンプロモーター、及び熱ショックプロモーターから得られるプロモーターによって制御される。本発明で実施可能な誘導性プロモーターの例としては、単一若しくは二成分系で用いられ、かつ熱ショックで誘導されるｈｓｐ ７０プロモーター；銅若しくはカドミウムで誘導されるメタロチオネインプロモーター（Ｂｏｎｎｅｔｏｎら，１９９６，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．３８０（１−２）：３３−３８）；ショウジョウバエレチノイドによって誘導されるショウジョウバエオプシンプロモーター（Ｐｉｃｋｉｎｇら，１９９７，Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｅｙｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ．６５（５）：７１７−２７）；及びテトラサイクリン誘導性完全ＣＮＶプロモーターが挙げられる。特定した全プロモーターの中で、テトラサイクリン誘導性完全ＣＭＶプロモーターが最も好ましい。構成性プロモーターの例としては、特定プロモーター及びエンハンサー又は局所位置効果によって発現が制御されるＣＡＬ４エンハンサートラップ系（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｆｒｕｉｔｆｌｙ．ｏｒｇ．；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｓｔｏｒｇ．ｕ−ｓｔｒａｓｂｇ．ｆｒ：７０８１）；及び構成性であるか、又はそれが作動可能に結合するプロモーターのタイプによって誘導されうる大腸菌由来のトランス活性化因子応答プロモーターが挙げられる。
【００６７】
ベクター中にエンハンサー配列を挿入することで、ＬＴＲＰＣ７をコードするＤＮＡの、より高等な真核生物による転写を増やすことができる。エンハンサーは、通常、約１０〜３００ｂｐのＤＮＡのシス作用性要素であり、プロモーターに作用してその転写を増やす。現在哺乳類遺伝子由来の多くのエンハンサー配列が知られている（グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α−フェトプロテイン、及びインスリン）。しかし、通常真核生物細胞ウイルス由来のエンハンサーを使用する。例としては、複製起源の後期側のＳＶ４０エンハンサー（ｂｐ １００−２７０）、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製起源の後期側のポリオーマエンハンサー、及びアデノウイルスエンハンサーが挙げられる。エンハンサーは、ＬＴＲＰＣ７コード領域に５’又は３’位で、ベクター中にスプライスすることができるが、好ましくはプロモーターから部位５’に位置する。
【００６８】
本発明の方法は、ＬＴＲＰＣ７ポリペプチド又はＬＴＲＰＣ７に結合する候補生物活性薬剤を同定するためのＬＴＲＰＣ７ポリペプチドをコードするか、ＬＴＲＰＣ７イオンチャンネルの活性を調節するか、若しくは細胞内のＬＴＲＰＣ７の発現を変える核酸を利用する。
本明細書で使用する場合、用語“候補生物活性薬剤”は、ＬＴＲＰＣ７に結合し、ＬＴＲＰＣ７イオンチャンネルの活性を調節し、及び／又は細胞内のＬＴＲＰＣ７の発現を変えるいずれの分子をも示す。ここで述べるような分子は、オリゴペプチド、小有機分子、多糖、又はポリヌクレオチド等でよい。一般に、多数の分析混合物を平行して異なる薬剤濃度で実験し、種々の濃度に対する差次的な応答を得る。典型的には、これら濃度の１つは負の対照として、すなわちゼロ濃度又は検出のレベル未満で働く。
【００６９】
候補薬剤は、多数の化学分類を包含するが、典型的には、有機分子、好ましくは１００より多く約２，５００ダルトン（Ｄ）未満の分子量を有する小有機化合物である。好ましい小分子は、２０００未満、又は１５００未満若しくは１０００未満又は５００Ｄ未満である。候補薬剤は、タンパク質との構造的相互作用、特に水素結合に必要な官能基を含み、通常、少なくとも１個のアミン、カルボニル、ヒドロキシル又はカルボキシル基、好ましくは少なくとも２個の官能化学基を含む。候補薬剤は、１個以上の上記官能基で置換されている環式炭素若しくはヘテロ環式構造及び／又は芳香族若しくは多芳香族構造を含むことが多い。候補薬剤は、ペプチド、糖、脂肪酸、ステロイド、プリン、ピリミジン、その誘導体、構造類似体又は組合せを含む生物分子の中からも見出される。
【００７０】
候補薬剤は、合成又は天然化合物のライブラリーを含む種々多様な起源から得られる。例えば、ランダムオリゴヌクレオチドの発現を含む種々多様な有機化合物及び生物分子のランダム及び定方向合成に多数の手段が利用可能である。代わりに、植物及び動物抽出物の形態の天然化合物のライブラリーが利用可能であり、又は容易に製造される。さらに、天然の又は合成的に生成されたライブラリー及び化合物は、従来の化学的、物理的及び生化学的手段によって容易に修飾される。公知の薬物を、アシル化、アルキル化、エステル化、アミド化のような定方向又はランダム化学修飾に供して構造類似体を生成することができる。
【００７１】
好ましい実施形態では、候補生物活性薬剤がタンパク質である。ここで、“タンパク質”は、少なくとも２つの共有結合したアミノ酸を意味し、タンパク質、ポリペプチド、オリゴペプチド及びペプチドを包含する。タンパク質は、天然に存在するアミノ酸とペプチド結合、又は合成ペプチド擬態構造で構成される。従って、本明細書で使用する場合、“アミノ酸”、又は“ペプチド残基”は、天然に存在するアミノ酸と合成アミノ酸の両者を意味する。例えば、ホモ−フェニルアラニン、シトルリン及びノルエロイシンは、本発明の目的でアミノ酸とみなされる。“アミノ酸”は、プロリン及びヒドロキシプロリンのようなイミノ酸残基をも包含する。側鎖は、（Ｒ）又は（Ｓ）立体配置のいずれかでよい。好ましい実施形態では、アミノ酸は（Ｓ）又はＬ−立体配置である。天然に存在しない側鎖を使用する場合、非アミノ酸置換基を使用して、例えば、インビボ分解を阻止又は遅延させることができる。
【００７２】
好ましい実施形態では、候補生物活性薬剤は、天然に存在するタンパク質又は天然に存在するタンパク質のフラグメントである。従って、例えば、タンパク質含有細胞抽出物、又はタンパク質性細胞抽出物のランダム若しくは定方向消化物を使用することができる。このように、本発明の方法のスクリーニング用に多細胞真核生物タンパク質のライブラリーを作ることができる。この実施形態で特に好ましくは、多細胞真核生物タンパク質、及び哺乳類タンパク質のライブラリーであり、後者が好ましく、ヒトタンパク質が特に好ましい。
【００７３】
好ましい実施形態では、候補生物活性薬剤は、約５〜約３０個のアミノ酸、好ましくは約５〜約２０個のアミノ酸、特に好ましくは約７〜１５個のアミノ酸のペプチドである。ペプチドは、概要を上述したような天然に存在するタンパク質の消化物、ランダムペプチド、又は“偏りのある”ランダムペプチドでありうる。本明細書の“ランダム化”又は文法的な同等語は、各核酸及びペプチドが、それぞれ本質的にランダムなヌクレオチド及びアミノ酸から成ることを意味する。一般にこれらランダムペプチド（又は後述する核酸）は化学的に合成されるので、いずれの位置にも、いずれのヌクレオチド又はアミノ酸も組み込むことができる。合成プロセスを設計して、ランダム化タンパク質又は核酸を生成し、該配列の長さにわたる可能な組合せの全部若しくは大部分を形成し、ひいてはランダム化候補生物活性タンパク質性薬剤のライブラリーを形成することができる。
【００７４】
一実施形態では、ライブラリーは完全にランダム化され、どの位置にも配列優先度又は定常性がない。好ましい実施形態では、ライブラリーが偏っている。すなわち、配列内のいくつかの位置は定常に保持され、又は限定数の可能性から選択される。例えば、好ましい実施形態では、ヌクレオチド又はアミノ酸残基は、定義された、例えば疎水性アミノ酸、親水性残基、立体的に偏った（小さいか又は大きい）残基の分類内で、核酸結合ドメインの生成に向け、システインの生成に向け、架橋のため、ＳＨ−３ドメイン用のウロリン、リン酸化部位用のセリン、スレオニン、チロシン若しくはヒスチジン等、又はプリン等にランダム化される。
【００７５】
好ましい実施形態では、候補活性薬剤は核酸である。
タンパク質について一般的に上述したように、核酸候補生物活性薬剤は、天然に存在する核酸、ランダム核酸、又は“偏りのある”ランダム核酸でありうる。例えば、タンパク質について概要を述べたように、原核生物又は真核生物ゲノムの消化物を使用することができる。
好ましい実施形態では、候補生物活性薬剤は、文献で入手可能な種々多様の
有機化学成分である。
【００７６】
好ましい実施形態では、アンチセンスＲＮＡ及びＤＮＡを特定のＬＴＲＰＣ７遺伝子のインビボ発現を遮断するための治療薬として使用することができる。細胞膜で制限される摂取によってそれらの細胞内濃度が低いにもかかわらず、インヒビターとして作用する細胞中に短いアンチセンスオリゴヌクレオチドを移入できることは既に示されている（Ｚａｍｅｃｎｉｋら，（１９８６），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８３：４１４３−４１４６）。アンチセンスオリゴヌクレオチドを、例えばその負に荷電しているリン酸ジエステル基を非荷電基で置換することで修飾してその摂取を促進することができる。好ましい実施形態では、ＬＴＲＰＣ７アンチセンスＲＮＡ及びＤＮＡを使用して、ｍＲＮＡへのＬＴＲＰＣ７遺伝子転写を妨げ、タンパク質へのＬＴＲＰＣ７ ｍＲＮＡの翻訳を阻害し、かつ既存のＬＴＲＰＣ７タンパク質の活性を遮断することができる。
【００７７】
本明細書で使用する場合、多価カチオン指標は、容易に細胞膜を透過し、又は他の様式で、例えばリポソーム等を介して細胞中に運ばれやすい分子であり、細胞に入ると、多価カチオンとの接触によって促進されるか又はクエンチされる蛍光を示す。本発明で有用な多価カチオン指標の例は、Ｈａｕｇｌａｎｄ，Ｒ．Ｐ．Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｆｌｕｏｒｅｓｅｎｔ Ｐｒｏｂｅｓ ａｎｄ Ｒｅｓｅｒｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ．第６版，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ，ｐｐ．５０４−５５０（１９９６）；（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐｒｏｂｅｓ．ｃｏｍ／ｈａｎｄｂｏｏｋ／ｓｅｃｔｉｏｎｓ／２０００．ｈｔｍｌ）に詳述されており、参照によってその全体が本明細書に取り込まれる。
【００７８】
結合分析の好ましい実施形態では、例えば蛍光、化学発光、化学、若しくは放射性シグナルでＬＴＲＰＣ７又は候補生物活性薬剤を標識して、候補薬剤のＬＴＲＰＣ７に対する結合を検出する手段を与える。標識は、アルカリホスファターゼ若しくは西洋わさびペルオキシダーゼのような酵素でもよく、適宜の物質と共に与えると検出可能な産物を生成する。代わりに、標識は、酵素と結合するが、該酵素によって触媒されず或いは変わらない酵素インヒビターのような標識化合物又は小分子でよい。標識は、エピトープタグ又は特異的にストレプトアビジンに結合するビオチンのような成分又は化合物でもよい。ビオチンの例では、上述したようにストレプトアビジンを標識し、それによって、結合したＬＴＲＰＣ７に検出可能なシグナルを与える。技術的に公知なように、解析前に非結合標識ストレプトアビジンを除去する。代わりに、ＬＴＲＰＣ７を表面に固定化又は共有結合させ、かつ標識候補生物活性薬剤と接触させることができる。代わりに、候補生物活性薬剤のライブラリーをバイオチップに固定化又は共有結合させ、かつ標識ＬＴＲＰＣ７と接触させることができる。バイオチップを利用する手順は、技術的に周知である。
【００７９】
好ましい実施形態では、無処置細胞内、好ましくはＬＴＲＰＣ７をコードする核酸と、そこに作動可能に結合された誘導性プロモーターを含むベクターで形質転換されているＨＥＫ−２９３細胞内でＬＴＲＰＣ７のイオン透過性を測定する。誘導前に細胞内イオンの内因性レベルを測定し、誘導後に測定する細胞内イオンのレベルと比較する。ｆｕｒａ−２のような蛍光分子を用いて細胞内イオンレベルを検出することができる。この分析法で、マンガンのような重金属イオンに対するＬＴＲＰＣ７透過性を測定することができる。
【００８０】
好ましい実施形態では、どのタイプのイオンチャンネルのイオン透過性も、無処置細胞内、好ましくはＬＴＲＰＣ７をコードする核酸と、そこに作動可能に結合された誘導性プロモーターを含むベクターで形質転換されているＨＥＫ−２９３細胞内で測定することができる。誘導前に細胞内イオンの内因性レベルを測定し、誘導後に測定する細胞内イオンのレベルと比較する。ｆｕｒａ−２のような蛍光分子を用いて細胞内イオンレベルを検出することができる。この分析法で、マンガンのような重金属イオンに対するＬＴＲＰＣ７透過性を測定することができる。このシステムを用いて、ＬＴＲＰＣ７について述べたような組換えイオンチャンネルのイオン透過性を調節する候補生物活性薬剤を同定することもできる。
【００８１】
細胞内のＬＴＲＰＣ７の発現レベルを調節する候補生物活性薬剤をスクリーニングするための好ましい実施形態では、細胞内のＬＴＲＰＣ７の発現を完全に抑制し、それによって細胞の表現型を変える候補薬剤を使用することができる。さらに好ましい実施形態では、細胞内のＬＴＲＰＣ７の発現を促進し、それによって細胞の表現型を変える候補薬剤を使用することができる。これら候補薬剤の例としては、アンチセンスｃＤＮＡ及びＤＮＡ、調節結合タンパク質及び／又は核酸、並びにＬＴＲＰＣ７をコードする核酸の転写又は翻訳を調節する本明細書で述べる他の候補生物活性薬剤のいずれも挙げられる。
【００８２】
一実施形態では、本発明は、ヒトＬＴＲＰＣ７ポリペプチド上の独特なエピトープ、例えば、配列番号：１（図１２）の１〜約１８６５のアミノ酸を含むタンパク質の独特なエピトープに特異的に結合する抗体を提供する。
別の実施形態では、本発明は、マウスＬＴＲＰＣ７ポリペプチド上の独特なエピトープ、例えば、配列番号：４（図１５）の１〜約１８６３のアミノ酸を含むタンパク質の独特なエピトープに特異的に結合する抗体を提供する。
別の実施形態では、本発明は、配列番号：１（図１２）のヌクレオチド７５７〜８５５又は９４２〜９５６又は１０１８〜１０７０を含むヒトＬＴＲＰＣ７細胞外ドメイン由来のエピトープに特異的に結合する抗体を提供する。
別の実施形態では、本発明は、配列番号：４（図１５）のヌクレオチド７７４〜８５４又は９４２〜９５５又は１０１８〜１０７０を含むマウスＬＴＲＰＣ７細胞外ドメイン由来のエピトープに特異的に結合する抗体を提供する。
【００８３】
抗−ＬＴＲＰＣ７ポリペプチド抗体は、ポリクロナール抗体を含むことができる。ポリクロナール抗体の調製方法は、当業者には公知である。例えば、免疫化剤、及び所望によりアジュバントの１回以上の注射によって、ポリクロナール抗体を哺乳類内で産生させることができる。典型的には、複数回皮下若しくは腹腔内注射で、免疫化剤及び／又はアジュバントを哺乳類に注射する。免疫化剤は、ＬＴＲＰＣ７ポリペプチド又はその融合タンパク質を含むことができる。免疫化する哺乳類で免疫原性であることが分かっているタンパク質に免疫化剤を複合させることが有用である。このような免疫原性タンパク質の例としては、限定するものではないが、鍵穴カサガイヘモシアニン、血清アルブミン、ウシチログロブリン、及び大豆トリプシンインヒビターが挙げられる。利用可能なアジュバントの例としては、フロイント完全アジュバント及びＭＰＬ−ＴＤＭアジュバント（モノホスホリルリピドＡ、合成コリノミコール酸トレハロース）が挙げられる。当業者は、過度に実験することなく、免疫化手順を選択することができる。
【００８４】
抗−ＬＴＲＰＣ７ポリペプチド抗体は、さらにモノクロナール抗体を含みうる。モノクロナール抗体は、Ｋｏｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５（１９７５）によって記述されているようなハイブリドーマ法を用いて調製することができる。ハイブリドーマ法では、通常免疫化剤でマウス、ハムスター、又は他の適宜の宿主動物を免疫化し、該免疫化剤に特異的に結合する抗体を産生するか又は産生可能なリンパ球を誘発する。代わりに、リンパ球をインビトロ免疫化することができる。
【００８５】
免疫化剤は、通常ＬＴＲＰＣ７ポリペプチド又はその融合タンパク質を含む。一般に、ヒト起源の細胞が望ましい場合は末梢血リンパ球（“ＰＢＬｓ”）を使用し、非ヒト哺乳類起源の細胞が望ましい場合は脾臓細胞又はリンパ節細胞を使用する。そして、ポリエチレングリコールのような適切な融合剤を用いて、リンパ球を不死化細胞系と融合させてハイブリドーマ細胞を形成する［Ｇｏｄｉｎｇ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，（１９８６）ｐｐ．５９−１０３］。不死化細胞系は、通常形質転換された哺乳類細胞、特にげっ歯類、ウシ及びヒト起源の骨髄腫細胞である。通常、ラット又はマウス骨髄腫細胞系を利用する。好ましくは非融合不死化細胞の成長又は生存を阻害する１種以上の物質を含有する適切な培養液中でハイブリドーマ細胞を培養することができる。例えば、親細胞が酵素ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴ又はＨＰＲＴ）を欠いている場合、ハイブリドーマ用培養液は、通常ヒポキサンチン、アミノプテリン、及びチミジンを含み（“ＨＡＴ培地”）、これら物質は、ＨＧＰＲＴ−欠乏細胞の成長を妨げる。
【００８６】
好ましい不死化細胞系は、効率的に融合し、選択した抗体産生細胞によって抗体の安定した高レベル発現を支持し、かつＨＡＴ培地のような培地に感受性な細胞系である。さらに好ましい不死化細胞系は、マウス骨髄腫系であり、例えば、Ｓａｌｋ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｃｅｌｌ Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ Ｃｅｎｔｅｒ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ及びＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄから得ることができる。ヒトモノクロナール抗体の生産用のヒト骨髄腫及びマウス−ヒトヘテロ骨髄腫細胞系も記述されている［Ｋｏｚｂｏｒ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３３：３００１（１９８４）；Ｂｒｏｄｅｕｒら，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，（１９８７）ｐｐ．５１−６３］。
【００８７】
そして、ハイブリドーマ細胞を培養する培養液をＬＴＲＰＣポリペプチドに対向しているモノクロナール抗体の存在について分析することができる。好ましくは、該ハイブリドーマ細胞によって産生されるモノクロナール抗体の結合特異性は、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）又は酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）のような免疫沈降法又はインビトロ結合アッセイによって決定する。このような方法及びアッセイは技術的に公知である。例えば、モノクロナール抗体の結合親和性はＭｕｓｏｎ及びＰｏｌｌａｒｄ，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１０７：２２０（１９８０）のスキャッチャード解析によって決定することができる。
【００８８】
所望のハイブリドーマ細胞を同定後、限界希釈手順によってクローンをサブクローン化し、かつ標準的な方法［Ｇｏｄｉｎｇ，前出］で成長させることができる。この目的に好適な培地としては、例えばダルベッコの変性イーグル培地及びＲＰＭＩ−１６４０培地が挙げられる。代わりに、ハイブリドーマ細胞を哺乳類の腹水としてインビボ成長させることができる。
サブクローンによって分泌されたモノクロナール抗体は、例えば、タンパク質Ａ−セファロース、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動法、透析法、又はアフィニティークロマトグラフィーのような通常の免疫グロブリン精製手順によって、培養液又は腹水から単離又は精製することができる。
【００８９】
モノクロナール抗体は、米国特許第４，８１６，５６７号で述べられているような組換えＤＮＡ法によっても調製することができる。本発明のモノクロナール抗体をコードするＤＮＡは、通常の手順によって（例えば、マウス抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合可能なオリゴヌクレオチドプローブを用いることで）、容易に単離かつ配列決することができる。本発明のハイブリドーマ細胞は、このようなＤＮＡの好ましい起源として役立つ。一度単離すると、該ＤＮＡを発現ベクター中に配置し、そうでなければ免疫グロブリンタンパク質を産生しないシミアンＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、又は骨髄腫細胞のような宿主細胞中に形質移入し、この組換え宿主細胞内でモノクロナール抗体の合成を達成することができる。また、例えば、相同性マウス配列に代えてヒト重鎖及び軽鎖定常部のコード配列で置換することによって［米国特許第４，８１６，５６７号；Ｍｏｒｒｉｓｏｎら，前出］又は非免疫グロブリンポリペプチドのコード配列のすべて又は一部を免疫グロブリンコード配列に共有結合させることによって、ＤＮＡを修飾することもできる。このような非免疫グロブリンポリペプチドを本発明の抗体の定常部と置換し、又は本発明の抗体の一抗原結合部位の可変部と置換してキメラ二価抗体を創造することができる。
【００９０】
抗−ＬＴＲＰＣ７ポリペプチド抗体は、さらに一価抗体を含むことができる。一価抗体の調製方法は技術的に周知である。例えば、１つの方法は、免疫グロブリン軽鎖及び修飾重鎖の組換え発現を含む。一般に、重鎖の架橋を阻止するように、ＦＣ領域のいずれかの位置で重鎖の先端を切取る。代わりに、関連するシステイン残基を別のアミノ酸残基と置換し、又は欠失させて架橋を阻止する。インビトロ法も一価抗体の調製に適する。抗体のフラグメント、特にＦａｂフラグメントを生成するための抗体の消化は、技術的に公知の常用手技によって達成することができる。
【００９１】
抗−ＬＴＲＰＣ７ポリペプチド抗体は、さらにヒト化抗体又はヒト抗体を含むことができる。非ヒト（例えば、マウス）抗体のヒト化形態は、キメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖又はその非ヒト免疫グロブリン由来の最少配列を含むフラグメント（Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２若しくは抗体の他の抗原結合サブ配列）である。ヒト化抗体は、レシピエントの相補性決定領域（ＣＤＲ）由来残基が、所望の特異性、親和性及び能力を有するマウス、ラット又はウサギのような非ヒト種（ドナー抗体）のＣＤＲ由来の残基で置換されているヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）を含む。いくつかの例では、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク残基が、対応する非ヒト残基で置換されている。ヒト化抗体は、レシピエント抗体にも移入されたＣＤＲ若しくはフレームワーク配列にも見られない残基を含むこともできる。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、通常２つの可変部の実質的にすべてを含み、該ＣＤＲ領域のすべて又は実質的にすべては、非ヒト免疫グロブリンのＣＤＲ領域に対応し、かつＦＲ領域のすべて又は実質的にすべては、ヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のＦＲ領域である。ヒト化抗体は、最適には、免疫グロブリン定常部（Ｆｃ）、通常ヒト免疫グロブリンの定常部の少なくとも一部をも含む［Ｊｏｎｅｓら，前出，Ｎａｔｕｒｅ，３２１：５２２−５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら，Ｎａｔｕｒｅ，３３２：３２３−３２９（１９８８）；及びＰｒｅｓｔａ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．，２：５９３−５９６（１９９２）］。
【００９２】
非ヒト抗体をヒト化する方法は技術的に周知である。通常、ヒト化抗体は、非ヒトである起源から抗体の中に導入される１つ以上のアミノ酸残基を有する。この非ヒトアミノ酸残基は、しばしば“移入”残基と呼ばれ、通常“移入”可変部から取られる。ヒト化は、Ｗｉｎｔｅｒ及び共同研究者の方法に従い ［Ｊｏｎｅｓら，Ｎａｔｕｒｅ，３２１：５２２−５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら，Ｎａｔｕｒｅ，３３２：３２３−３２７（１９８８）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９：１５３４−１５３６（１９８８）］、ヒト抗体の対応配列をげっ歯類ＣＤＲｓ又はＣＤＲ配列で置換することによって本質的に達成することができる。従って、このような“ヒト化”抗体はキメラ抗体であり（米国特許第４，８１６，５６７号）、無処置ヒト可変部より実質的に少なく、非ヒト種由来の対応配列によって置換されている。実際に、ヒト化抗体は、通常いくつかのＣＤＲ残基及び可能ないくつかのＦＲ残基が、げっ歯類抗体中の類似部位由来の残基で置換されているヒト抗体である。
【００９３】
ヒト抗体は、ファージ表示ライブラリーを含む技術的に公知の種々の方法を用いて産生させることもできる［Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ及びＷｉｎｔｅｒ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２７：３８１（１９９１）；Ｍａｒｋｓら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１（１９９１）］。Ｃｏｌｅら及びＢｏｅｒｎｅｒらの方法もヒトモノクロナール抗体の調製に利用できる［Ｃｏｌｅら，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，ｐ．７７（１９８５）及びＢｏｅｒｎｅｒら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４７（１）；８６−９５（１９９１）］。同様に、ヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン座のトランスジェニック動物、例えば、内因性免疫グロブリン遺伝子が部分的又は完全に不活性化されているマウス中への導入によって調製することができる。抗原投与すると、ヒト抗体産生が観察され、遺伝子再配列、集合、及び抗体レパートリーを含め、あらゆる点でヒトに見られる場合と酷似している。このアプローチは、例えば米国特許第５，５４５，８０７；５，５４５，８０６；５，５６９，８２５；５，６２５，１２６；５，６３３，４２５；５，６６１，０１６号、及び以下の科学出版物に記述されている：Ｍａｒｋｓら，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０，７７９−７８３（１９９２）；Ｌｏｎｂｅｒｇら，Ｎａｔｕｒｅ ３６８ ８５６−８５９（１９９４）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ ３６８，８１２−１３（１９９４）；Ｆｉｓｈｗｉｌｄら，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １４，８４５−５１（１９９６）；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １４，８２６（１９９６）；Ｌｏｎｂｅｒｇ及びＨｕｓｚａｒ，Ｉｎｔｅｒｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３ ６５−９３（１９９５）。
【００９４】
抗−ＬＴＲＰＣ７ポリペプチド抗体は、さらにヘテロ複合抗体を含みうる。ヘテロ複合抗体は、２個の共有結合した抗体で構成される。このような抗体は、例えば、望ましくない細胞に対する免疫系細胞を標的するため［米国特許第４，６７６，９８０号］、及びＨＩＶ感染の治療のため［ＷＯ ９１／００３６０；ＷＯ ９２／２００３７３；ＥＰ ０３０８９］に提案されている。この抗体は、架橋剤を伴う方法を含む合成タンパク質化学で公知の方法によってインビトロ調製できると考えられる。例えば、免疫毒素は、ジスルフィド交換反応により、又はチオエーテル結合を形成することで作製することができる。この目的に好適な試薬の例としては、イミノチオレート及びメチル−４−メルカプトブチルイミデート並びに例えば、米国特許第４，６７６，９８０号に開示されているものが挙げられる。
【００９５】
さらなる実施形態では、抗−ＬＴＲＰＣ７ポリペプチド抗体は種々の用途を持ちうる。例えば、抗−ＬＴＲＰＣ７ポリペプチド抗体は、ＬＴＲＰＣ７ポリペプチドの診断アッセイ、例えば、その特異的細胞、組織、又は血清内での発現の検出に使用することができる。均一相又は不均一相で行われる競合結合アッセイ、直接若しくは間接サンドイッチアッセイ及び免疫沈降アッセイのような技術的に公知の種々の診断アッセイ法を使用することができる［Ｚｏｌａ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｃｉｅｓ：Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，（１９８７）ｐｐ．１４７−１５８］。診断アッセイで使用する抗体は、検出可能成分で標識することができる。検出可能成分は、直接又は間接的に検出可能なシグナルを生成できなければならない。例えば、検出可能な成分は、３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓ、又は１２５Ｉのような放射性同位体、フルオレッセインイソチオシアネート、ローダミン、若しくはルシフェリンのような蛍光若しくは化学発光化合物、又はアルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ若しくは西洋わさびペルオキシダーゼのような酵素でよい。抗体を検出可能成分に複合させるため技術的に公知のいずれの方法も利用することができ、Ｈｕｎｔｅｒら，Ｎａｔｕｒｅ，１４４：９４５（１９６２）；Ｄａｖｉｄら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１３：１０１４（１９７４）；Ｐａｉｎら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．，４０：２１９（１９８１）；及びＮｙｇｒｅｎ，Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．ａｎｄ Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．，３０：４０７（１９８２）に記述されている方法が挙げられる。
さらに、本発明の方法でＬＴＲＰＣ７抗体を使用して、該抗体の、多価カチオンに対するＬＴＲＰＣ７チャンネルの透過性を調節する能力をスクリーニングすることができる。
【００９６】
（実施例）
実施例で言及する商業的に入手可能な試薬は、特に指摘しない限り、製造業者の手引きに従って使用した。
実施例１：ｃＤＮＡｓの単離及び配列解析。ヒトＬＴＲＰＣ７の一部の配列をリンパ球ＥＳＴライブラリーから同定したら、対応するＥＳＴクローンを購入して配列決定した（受入れ番号ＡＡ４１９４０７を得た）。ＡＡ４１９４０７の５’又は３’末端からの部分的な配列を用いてＧｅｎｅＴｒａｐｐｅｒＩＩ法（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）により白血球、脾臓、及び腎臓ライブラリーをスクリーニングし、それぞれのｍＲＮＡの５’及び３’末端に向けて元の配列を伸長させた。生成したクローンを、標準的な蛍光ジデオキシ配列決定法を用いて両方向に配列決定し、Ａｓｓｒｍｂｙｌｉｇｎ（Ｏｘｆｏｒｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ，Ｌｏｎｄｏｎ，ＵＫ）を用いて一部のコンティグを構築した。ＬＴＲＰＣ７では、まず多数のより短いクローンの末端配列から得たいくつかの配列確認を有するＡＳ８、ＧＴ２、Ｂ５、及びＤ２と命名された４つの重なりクローンの配列から利用可能なコード配列を構築した。我々は、同様のアプローチでマウスＬＴＲＰＣ７転写物をもクローン化し、ＭＡ７及びＭＡ５と命名された２つの重なりクローンから完全配列コンティグを構築した。予測マウスＬＴＲＰＣ７タンパク質は、ヒト型と、〜９５％のアミノ酸同一性を示した。完全なマウス及びヒトＬＴＲＰＣ７ ｃＤＮＡ配列及び予測タンパク質は、公開前にＧｅｎｂａｎｋに寄託される。予測タンパク質及び疎水性解析は、Ｍａｃｖｅｃｔｏｒプログラム（Ｏｘｆｏｒｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を用いて得、膜貫通スパニング領域の予測は、ＥＭＢｎｅｔＥＮＲｆｕ１２でＴＭｐｒｅｄプログラムを用いて行い、コイルドコイル解析は、ＩＳＲＥＣコイルサーバーＥＮＲｆｕ１３を用いて行い、かつＢＬＡＳＴアラインメントは、ＮＣＢＩアドバンストＢＬＡＳＴサーバーを用いて得た。
【００９７】
実施例２：ノーザンブロット法。ヒト組織及び細胞系用の多組織ノーザンブロットは、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）から得、製造業者の手順に従ってすべてのハイブリダイゼーションを行った。ＬＴＲＰＣ７ノーザンブロットは、クローンＡＳ８から利用可能なＬＴＲＰＣ７コード配列の最大の５’末端に対応する５００ｂｐフラグメントから製造したｄＵＴＰ標識ＲＮＡプローブを用いて行った。このプローブは、Ａｍｂｉｏｎ（Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）からのＴ７−定方向ＲＮＡプローブ合成キットを用いて生成した。
【００９８】
実施例３：ＲＴ−ＰＣＲ発現解析。ＲＴ−ＰＣＲ解析は、製造業者の手順に従い、指示されたヒト組織ｃＤＮＡライブラリーから行った（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）。ＬＴＲＰＣ７では、使用したオリゴは、２７８ｂｐバンドを生成するためのＧＴＣＡＣＴＴＧＧＡＡＡＣＴＧＧＡＡＣＣ及びＣＧＧＴＡＧＡＴＧＧＣＣＴＴＣＴＡＣＴＧだった。ＰＣＲは、標準的な方法を用い、３０秒間９４度、３０秒間５５度、及び６０秒間７２度の３０サイクルを行った。正確な大きさのバンドの臭化エチジウム染色の近似強度を、１−２＋から目視評価した。この反応で使用したＬＴＲＰＣ７プライマーは、初期ＥＳＴ配列から生成されており、次のクローンから得られるＬＴＲＰＣ７配列の対応領域に基づくプライマーの５’末端に単一の塩基対ミスマッチを含むことに留意せよ。
【００９９】
実施例４：真核生物発現構成物、形質移入。真核生物細胞内でＬＴＲＰＣ７を発現させる目的で、ＰＣＲを使用して、２つの重なりマウスＬＴＲＰＣ７クローンからエピトープ標識発現構成物を生成した。開始メチオニンを除去し、それをコザック配列、ＦＬＡＧタグ及び付加配列ＧＣＧＧＣＣＧＣＡＴで置換し、かつ終止コドンの直後にＳｐｅＩ部位を置くことによってＬＴＲＰＣ７コード配列を修飾した。この修飾の結果、以下のアミノ酸配列で開始する発現タンパク質となる：ＭＧＤＹＫＤＤＤＤＫＲＰＨに次いで、第２アミノ酸で開始するマウスＬＴＲＰＣ７コード配列。この構成物は、β−アクチンプロモーターから構成性ＬＴＲＰＣ７発現させるｐＡＰｕｒｏベクターから、及びＣＭＶプロモーターからテトラサイクリン−制御発現させるｐｃＤＮＡ４／ＴＯベクターから発現された。ＦＬＡＧ−ＬＴＲＰＣ７／ｐＡＰｕｒｏベクターを用いていくつかの細胞系内におけるＬＴＲＰＣ７の発現を試みたが、過渡的な発現実験では、非常に低い発現しか観察されず、安定クローン内では、どんな時も発現が観察されなかった。エレクトロポレーションによって、ｔｅｔリプレッサータンパク質を発現するＨＥＫ−２９３細胞中にＦＬＡＧ−ＬＴＲＰＣ７／ｐＣＤＮＡ４／ＴＯ構成物を形質移入し、ゼオシン（ｚｅｏｃｉｎ）内でクローンを選択した。テトラサイクリン−誘導ＦＬＡＧ−ＬＴＲＰＣ７発現の解析のためいくつかの抵抗性クローンを選択した。ｐＡｐｕｒｏ−媒介構成性発現ではＬＴＲＰＣ７を発現させられないことから予想されるように、すべてのクローンは、低く／検出できない基礎発現を有し、かつすべてのクローンがＦＬＡＧ−ＬＴＲＰＣ７タンパク質を発現し、引き続きテトラサイクリン／ドキシサイクリン誘導の数日後に成長阻止及び有意な毒性効果を示すことが分かった。次の電気生理学解析のため、最高の誘導性発現を伴うクローンを選択した。
【０１００】
実施例５：免疫沈降及びＳＤＳ／ＰＡＧＥ−ウエスタンブロット法。抗−ＦＬＡＧ免疫沈降は、１０７個のＨＥＫ−２９３細胞のライセートから行った。免疫沈降タンパク質を溶解緩衝液で３回洗浄し、６％ポリアクリルアミドゲルを用いるＳＤＳ／ＰＡＧＥで分離し、ＰＶＤＦ膜に移し、かつ抗−ＦＬＡＧ免疫ブロット法で解析した。全手順は、前述したＥＮＲｆｕ１４のような標準的な方法を用いた。
【０１０１】
実施例６：ＬＴＲＰＣ７が誘導性欠乏しているＤＴ−４０細胞の生成。低厳密性条件下、プローブとして推定膜貫通領域を含む０．５−ｋｂのマウスＬＴＲＰＣ７ ｃＤＮＡフラグメントを用いてλＦＩＸＩＩニワトリゲノムライブラリーをスクリーニングすることによって、ニワトリＬＴＲＰＣ７ゲノムフラグメントを得た。通常のターゲティングベクター（ＬＴＲＰＣ７を不活性化させるｐＬＴＲＰＣ７−ｈｉｓＤ及びｐＬＴＲＰＣ７−ｂｓｒ）は、推定膜貫通領域の一部に対応するゲノムフラグメント含有エキソンをｈｉｓＤ又はｂｓｒカセットで置換して構築した。これらカセットを、５’及び３’側のそれぞれ３．５及び５．７ｋｂのニワトリＬＴＲＰＣ７ゲノム配列に隣接させた。誘導性ターゲティングベクター、ｐＬＴＲＰＣ７−ｎｅｏ／ｌｏｘＰを生成するため、ＨＳＶチミジンキナーゼ及びｌｏｘＰ隣接ｐＧＫ−ｎｅｏを有するベクターｐＫＳＴＫＮＥＯＬＯＸＰ用の２つのｌｏｘＰ部位間にＬＴＲＰＣ７の推定膜貫通領域を挿入した。そして、ｌｏｘＰ隣接領域の３．５−ｋｂフラグメント５’上流及び２．６−ｋｂフラグメント３’下流を挿入した。
【０１０２】
主文で簡単に述べたように、ｌｔｒｐｃ７遺伝子内で遺伝的に欠乏性のＤＴ−４０細胞を生成する最初の試みでは、ターゲティング構成物、ｐＬＴＲＰＣ７−ｂｓｒ及びｐＬＴＲＰＣ７−ｈｉｓＤを引き続きＤＴ−４０細胞中に導入した。ｐＬＴＲＰＣ７−ｂｓｒを用いることによる最初の対立遺伝子ターゲティングは高頻度で（７１％）成功したが、２つの標的対立遺伝子を隠しているクローンは、ｐＬＴＲＰＣ７−ｈｉｓＤによる数ラウンドの形質移入後には得られなかった。ｐＬＴＲＰＣ７−ｈｉｓＤによる形質移入は、最初の対立遺伝子ターゲティングにも働いたので、これら結果は、ｌｔｒｐｃ７遺伝子の不活性化は、ＤＴ−４０細胞の致死性につながることを示唆している。
【０１０３】
これら結果に基づき、ｌｔｒｐｃ７遺伝子の破壊のためにＣｒｅ−ｌｏｘＰ系を利用した。タモキシフェン−調節キメラＣｒｅ酵素ＥＮＲｆｕ１５をコードする発現プラスミドｐＡＮＭｅｒＣｒｅＭｅｒ−ｈｙｇを線状にし、野生型ＤＴ−４０中に導入した。ハイグロマイシンＢの存在下（２ｍｇ／ｍｌ）形質移入体を選択し、誘導性−Ｃｒｅ発現についてウエスタンブロット解析で抵抗性クローンをスクリーニングした。そして、この誘導性−Ｃｒｅを発現するクローン中にｐＬＴＲＰＣ７−ｎｅｏ／ｌｏｘＰを形質移入し、ハイグロマイシンＢ（２ｍｇ／ｍｌ）とＧ４１８（２μｇ／ｍｌ）の両方で選択した。サザンブロット解析によるターゲティングの成功を確認後、細胞を２００ｎＭタモキシフェンの存在下培養してＣｒｅ−媒介組換えの可能性を調べた。そして、ｐＴＲＰＣ７−ｈｉｓＤを可能なクローン中に形質移入し、ハイグロマイシンＢ（２ｍｇ／ｍｌ）、Ｇ４１８（２ｍｇ／ｍｌ）及びヒスチジノール（０．５ｍｇ／ｍｌ）で選択した。
【０１０４】
実施例７：電気生理学。パッチ−クランプ実験では、カバーガラス上で成長した細胞を記録チャンバーに移し、以下の組成（ｍＭで）の標準的な変性リンゲル液内で保持した：ＮａＣｌ １４５、ＫＣｌ ２．８、ＣｓＣｌ １０、ＣａＣｌ２ １、ＭｇＣｌ２ ２、グルコース １０、Ｈｅｐｅｓ・ＮａＯＨ １０、ｐＨ７．２。公称Ｃａ２＋及び／又はＭｇ２＋のない細胞外溶液又は等張Ｃａ２＋溶液（１２０ｍＭ ＣａＣｌ２）を広い付刃ピペットから圧力放出によって加えた。細胞内ピペット充填溶液は以下を含んでいた（ｍＭで）：Ｃｓ−グルタミン酸 １４５、ＮａＣｌ ８、ＭｇＣｌ２ １、Ｃｓ−ＢＡＰＴＡ １０、ＣｓＯＨでｐＨ７．２に調整。数実験では、Ｃｓ−グルタミン酸を等量のＫ−グルタミン酸又はＮ−メチル−Ｄ−グルタミン−クロライドで置換した。パッチ−クランプ実験は、２１〜２５℃で密封全細胞配置で行った。高分解能電流記録は、コンピュータ配備パッチ−クランプ増幅器システムで得た（ＥＰＣ−９，ＨＥＫＡ，Ｌａｍｂｒｅｃｈｔ，独国）。Ｓｙｌｇａｒｄ−コートパッチピペットは、標準的な細胞内溶液で充填後２〜４Ｍの抵抗を持っていた。全細胞配置の確立直後、２００〜４００秒の時間にわたって０．５Ｈｚの割合で、０ｍＶの保持電位から−１００〜＋１００の電圧範囲に及ぶ５０ｍｓの持続時間の電圧ランプを与えた。内部溶液がグルタミン酸を含む場合は、すべての電圧を内外溶液間の１０ｍＶの液界電位について補正した。電流を２．３ｋＨｚで透過し、１００μｓ間隔でデジタル化した。容量性電流及び直列抵抗を決定し、ＥＰＣ−９の自動容量補正によって各電圧ランプ前に補正した。−８０ｍＶ又は＋８０ｍＶの電圧で電流振幅を測定することによって、個々のランプ電流記録から、所定電位における低分解能暫時発生電流を抽出した。
【０１０５】
実施例８：他の二価金属イオンによる１０ｍＭ Ｃａ２＋の等モル置換。ＬＴＲＰＣ７は、負の膜電位で二価カチオン選択性であるイオンチャンネルを意味し、その活性はＭｇ・ヌクレオチドの分子内レベルで調節される（Ｎａｄｌｅｒら，２００１）。このチャンネルは、すべての二価イオンを除去すると容易に一価イオンを透過するが、生理的条件下でＬＴＲＰＣ７によって運ばれる内向き電流は、大部分、優性な細胞外イオン種Ｃａ２＋及びＭｇ２＋によって運ばれる。それゆえに、ＬＴＲＰＣ７によって運ばれるイオン電流は、ＭａｇＮｕＭと命名された（マグネシウム・ヌクレオチド−調節金属イオン電流）。ＬＴＲＰＣ７の他の二価イオンに対する透過特性を評価するため、１０ｍＭ Ｃａ２＋が１０ｍＭの他の二価カチオンで置換されている場合の置換実験でイオン電流を測定した（図７）。この実験では、ＬＴＲＰＣ７を発現するＨＥＫ−２９３細胞を、１０ｍＭ Ｃａ２＋を含み、Ｍｇ２＋のない浴溶液内に保ち、以前に述べられているような（Ｎａｄｌｅｒら，２００１）全細胞パッチ−クランプでＭａｇＮｕＭの発生を監視した。電流が最大振幅に達したとき、吹きピペットで加えた１０ｍＭの試験カチオンを含む細胞外溶液に、細胞を６０秒間過渡的にさらした。
【０１０６】
図７に示されるように、１０ｍＭ二価遷移金属イオンの等モル置換実験の結果、ＬＴＲＰＣ７−媒介の内向き及び外向き電流の特徴的な変化をもたらした。発現レベルにおける変異の応答及び補正をよりよく比較するため、Ｃａ２＋置換直前の電流値を１に設定して、内向き電流の変化が１０ｍＭ Ｃａ２＋の電流値に関係するように、外向き及び内向きの両電流を規準化した。一般に、すべての試験した二価金属イオンは、負の膜電位でのＬＴＲＰＣ７の透過において、少なくともＣａ２＋と同程度に効率的であり、Ｃａ２＋よりかなり効率的である場合さえあった。内向き及び外向きの両電流挙動を考慮すると、二価金属イオンの効果を以下の３群におおまかに分類することができる。第１群、Ｚｎ２＋及びＮｉ２＋は、内向き電流を大きく増加させると共に外向き電流を遮断した（図７Ａ）。Ｚｎ２＋及びＮｉ２＋は共に、内向き電流の増加がＣａ２＋と比べて３倍大きく（図７Ｄ）、一方外向き電流の阻害は、Ｎｉ２＋よりＺｎ２＋であまり明白でなかった。また、有意なＢａ２＋内向き電流も観察したので（図７Ｃ及び７Ｄ）、このイオンを第１群に置いてもよいが、Ｂａ２＋は外向き電流を抑制しなかったので、代わりにこのイオンは、外向き電流の抑制に同様に効果のない他の二価体を保持する第３群に配置することを選んだ。第２群、Ｃｏ２＋、Ｍｇ２＋、及びＭｎ２＋は、内向き電流の増加のより適度な（２倍未満）増加を特徴とするが、この場合もやはり外向き電流の遮断を伴う（図７Ｂ及び７Ｄ）。外向き電流の最高の遮断はＭｇ２＋によって起こり、部分的に、ＭａｇＮｕＭ電流の強い独立サプレッサーであることを前述した（Ｎａｄｌｅｒら，２００１）［Ｍｇ２＋］ｉの増加に起因すると考えられる。また、この効果は、初期増加後に観察されるＭｇ２＋内向き電流の進行性減衰の根底にありうる。最初の２群とは対照的に、第３群、Ｂａ２＋、Ｓｒ２＋、及びＣｄ２＋は、内向き電流の増加を適度にするためにわずかに伴う外向き電流の増加によって区別される（図７Ｃ及び７Ｄ）。これより、上記観察された電流変化は、上記試験した各二価カチオンに対する透過性がＣａ２＋又はＭｇ２＋のどちらかと同じ又はより高いＬＴＲＰＣ７と非常に一致していると結論することができる。
【０１０７】
内向き電流変化の解釈は、上記実験が、二価イオンと一緒に例えばＮａ＋イオンを共輸送させるであろう可能なイオン−イオン相互作用を除外できないので、絶対的であるはずはない。正電位における外向き電流は、二価イオンが細胞に入るための十分な推進力を経験しないので、もはや一価の外向き流動を妨げない電位における一価イオンの電流を意味する（Ｈｉｌｌｅ，１９９２）。その挙動は、（１）正の膜電位で二価イオンによって強いられる透過遮断の程度を決定する、二価イオンのネルンスト平衡電位、及び（２）チャンネルがサイトゾルにアクセスした後のチャンネルの細胞内側における関連する二価イオンの効果を含む、数因子の複雑な相関である。後者の効果は、特に、ＬＴＲＰＣ７のゲート制御における補助因子として重要な役割を演じ、それゆえに細胞内に蓄積されればＭａｇＮｕＭを不活性化できるＭｇ２＋に関連する。同様に阻害は、Ｃａ２＋でも見られ、ＬＴＲＰＣ７を透過するための第２の主要な生理的二価カチオンであるが、我々の実験条件下では、［Ｃａ２＋］ｉの阻害作用は、１０ｍＭ ＢＡＰＴＡを含むことで、より制限されうる。Ｍｇ２＋も他の二価イオンもこのキレート剤で有意には緩衝しないので、これら二価体のサイトゾルレベルが有意に増加し、それによって外向き方向の一価イオンの遮断を誘発できると考えられる。従って、いずれの二価イオンの外向き電流を遮断するための効力は、透過度の正味の結果及びチャンネル細孔の内口におけるその調節効果である。外向き電流の挙動の解釈に係わる複雑さにかかわらず、上記観察された電流変化は、上記試験した各二価カチオンに対する透過性がＣａ２＋又はＭｇ２＋のどちらかと同じ又はより高いＬＴＲＰＣ７と非常に一致していると結論することができる。
【０１０８】
実施例９：等張溶液内における必須二価微量金属イオンの透過。ＬＴＲＰＣ７を通る二価カチオン流入を探索するための等張溶液の使用は、イオン−イオン相互作用から生じる透過特性の複雑化を回避するので、内向き電流の疑いのない解釈を可能にし、維持又は増加する内向き電流は、利用可能な細胞外カチオンの透過とだけ一致しうる。１２０ｍＭの各二価イオンの等張溶液は、標準浴及びピペット溶液から１０ｍＯｓｍ以内の適切な浸透圧を与えた。この一連の実験では、１ｍＭ Ｃａ２＋及び２ｍＭ Ｍｇ２＋を含有する標準的な細胞外溶液内に細胞を浸した。２００秒で、ＭａｇＮｕＭが全振幅に達したとき、各遷移金属の等張溶液を６０秒間吹きピペットで加えた。
【０１０９】
選択した等張二価イオン溶液の適用前、中及び後の内向き及び外向き電流の発生は、図８に示される。この実験は、一般に細胞生理に必須の微量金属とみなされる二価イオンの等張溶液が、ＬＴＲＰＣ７を通る内向き電流の増加を誘発し、同時に外向き電流を強く抑制したことを実証している。ほとんどすべての場合に、内向き電流は、等張金属溶液にさらした後、前の等張レベルに戻る。
【０１１０】
実施例１０：等張溶液内における毒性二価金属イオンの透過。生理的に関連する微量金属イオンに加え、上記アッセイをＢａ２＋、Ｓｒ２＋及びＮｉ２＋のような毒性金属イオンに拡張した（図９）。これら金属イオンは、ＬＴＲＰＣ７を通る有意な内向き電流を異なる程度に維持した。この系列中で最も透過性のイオン種はＮｉ２＋だった。等張溶液内で試験したすべての二価イオンの透過順序は、ピークの内向き電流に基づく。Ｎｉ２＋は、最も透過性のイオンであり、次いでＢａ２＋とＳｒ２＋である。これら二価イオンは、Ｃａ２＋及びＭｇ２＋より効率的に輸送される。全体として、この透過順序は、図７の１０ｍＭ二価カチオン置換実験で観察されたことと非常によく一致している。
【０１１１】
次に、ＬＴＲＰＣ７を透過しないと疑われる一連の毒性金属イオンについて試験した（図１０）。実際に、Ｌａ３＋及びＧｄ３＋は共に１０ｍＭで有意な透過の徴候がなく、内向き電流を阻害した（図１０Ａ及び１０Ｂ）。外向き電流も完全に抑制されたので、Ｇｄ３＋は、より強力なインヒビターと考えられる。しかし、このことがサイトゾル側からの外向き電流の二次的な遮断を引き起こすいくらか制限されたＧｄ３＋流入に起因するかどうかを決定することが残っている。対照的に、同濃度のＬａ３＋は、強力かつ持続的に内向き電流を阻害するが、外向き電流の抑制はずっと効率が低かった。電圧−又は貯蔵−作動型Ｃａ２＋チャンネルを正常に完全抑制するイオン濃度も調べ、１０μＭのＧｄ３＋又はＬａ３＋は、ＬＴＲＰＣ７によって運ばれる内向き又は外向き電流の抑制に無効であることが分かった（データ示さず）。
【０１１２】
ＬＴＲＰＣ７を通るＣａ２＋及びＭｎ２＋流入及びＭｇ・ＡＴＰによる遮断。上記透過データに基づき、ＬＴＲＰＣ７は、種々多様な微量及び毒性金属イオンの可能な流入経路とみなさなければならないと結論する。しかし、上記実験は、完全な細胞内カルシウム緩衝作用の条件下で行ったので、ＬＴＲＰＣ７が生理的条件下でどのようにして機能するかをよく反映していない。さらに、上記実験は細胞内イオン濃度の直接測定を含まない。そこで、この問題に焦点を当てた２セットの実験を行った。第１に、細胞内Ｃａ２＋が緩衝していない状態のままで、かつＬＴＲＰＣ７がパッチピペット［ＡＴＰ］ｉの操作によって活性化又は抑制されている条件下でＬＴＲＰＣ７のＣａ２＋透過を分析した。この目的のため、ＬＴＲＰＣ７を発現するＨＥＫ−２９３細胞を、Ｃａ２＋及びＭｎ２＋をそれぞれ２ｍＭ有する浴液内で保ち、２００μＭ ｆｕｒａ−２を含有するＣｓ−グルタミン酸ベース内部溶液で潅流した。全細胞パッチ−クランプ下、０ｍＶの保持電位から、０．５Ｈｚの割合で５０秒にわたって−１００〜＋１００ｍＶに及ぶ反復電圧ランプを送りながらＭａｇＮｕＭの同時発生を監視した。Ｍｇ・ＡＴＰがピペット内にない場合、ＭａｇＮｕＭは、内向き及び外向きの両電流の増加（図１１Ａ）及びその特徴的な電流−電圧関係（図１１Ｂ）によって立証されるように、急速に活性化された。平行して、蛍光測定は、［Ｃａ２＋］ｉの周期的な５秒の−８０ｍＶ（ｎ＝６）への過分極の際に［Ｃａ２＋］ｉが過渡的に増加するので、Ｃａ２＋流入に起因する［Ｃａ２＋］ｉの安定した増加を明かにした（図１１Ｃ）。対照的に、内部溶液が３ｍＭ Ｍｇ・ＡＴＰを含む細胞内では、ＬＴＲＰＣ７活性の変化はほとんどなく、この条件下で［Ｃａ２＋］ｉは同様に安定したままだった。この条件下で観察される［Ｃａ２＋］ｉの過分極−作動変化の振幅が暫時減少するのは、ｆｕｒａ−２が、その最終濃度２００μＭでサイトゾルと平衡化するにつれて、Ｃａ２＋緩衝化が高まることによると考えられる。ＡＴＰのない溶液で潅流したＬＴＲＰＣ７を過剰発現しない対照細胞は、３ｍＭ ＡＴＰで潅流した細胞と非常によく似た挙動だった（図７Ｃのドットトレース）。従って、細胞外Ｃａ２＋及びＭｇ２＋の生理的濃度では、ＭａｇＮｕＭの活性化は、ＬＴＲＰＣ７を過剰発現する細胞内の有意なＣａ２＋流入を可能にするようである。
【０１１３】
第２アプローチでは、無処置細胞内におけるＬＴＲＰＣ７活性をｆｕｒａ−２蛍光のＭｎ２＋クエンチを用いて分析した（図１１Ｄ）。この実験では、ＬＴＲＰＣ７を過剰発現するＨＥＫ−２９３細胞をｆｕｒａ−２−ＡＭと共に充填し、１ｍＭ Ｃａ２＋及び２ｍＭ Ｍｇ２＋を有する標準的な外部溶液内に浸した。Ｃａ２＋−非依存性蛍光を３６０ｎｍで監視し（ｆｕｒａ−２の等吸収波長）、かつ１２０秒後、１ｍＭ Ｍｎ２＋、１ｍＭ Ｃａ２＋、及び０Ｍｇ２＋を含有する外部溶液を１８０秒間適用した。ベースラインのクエンチレベルを決定するため、この手順を同一のテトラサイクリン−誘導性組換えＬＴＲＰＣ７構成物で形質移入したが、未誘導のままであるＨＥＫ−２９３細胞に適用した。図１１Ｄに明白に示されるように、１ｍＭ Ｍｎ２＋の適用は、誘導されてＬＴＲＰＣ７を発現しているＨＥＫ−２９３細胞（ｎ＝５）では３６０ｎｍシグナルを明白にクエンチしたが、未誘導細胞内では（ｎ＝５）、３６０ｎｍシグナルのＭｎ２＋−誘導クエンチは、際だって劇的に少なかった。最初の６０秒間のＭｎ２＋露出の線形回帰は、未誘導細胞に比し（２．９％／分）、誘導細胞内で１０倍高率のｆｕｒａ−２蛍光のＭｎ２＋−誘導クエンチを生じさせた（２８％／分）。この結果は、無処置細胞内における基礎的なＬＴＲＰＣ７活性が、Ｍｎ２＋用の重要な流入経路を構成し、かつ特にＭｎ２＋は透過性二価体の順位でかなり低く位置するので、他の透過金属イオンのためにも同様に作用することを示唆している（図９参照）。
【図面の簡単な説明】
【図１】
ＬＴＲＰＣ７が推定イオンチャンネルのＬＴＲＰＣ７ファミリーの新規な偏在発現メンバーであることを示す。
【図２】
ＬＴＲＰＣ７が細胞機能の基礎であることを示す。
【図３】
ＬＴＲＰＣ７がカチオンチャンネルであることを示す。
【図４】
二価イオンによるＬＴＲＰＣ７の透過及び遮断を示す。
【図５】
ＬＴＲＰＣ７がＡＴＰ欠失で活性化されることを示す。
【図６】
ＡＴＰ欠失−活性化コンダクタンスが偏在性であることを示す。
【図７】
遷移金属による１０ｍＭ Ｃａ２＋の等モル置換を示す。
【図８】
等張溶液中における二価の微量金属の透過性を示す。
【図９】
等張溶液中における毒性二価金属の透過性を示す。
【図１０】
三価金属イオンによる透過及び遮断を示している。
【図１１】
ＬＴＲＰＣ７がＣａ２＋とＭｎ２＋の流入経路であることを示す。
【図１２】
１〜約１８６５の配列で構成される組換えＬＴＲＰＣ７タンパク質のアミノ酸配列を示す（配列番号：１）。
【図１３】
ＬＴＲＰＣ７ ｃＤＮＡコード化配列の組換え核酸分子を示す（配列番号：２）。
【図１４】
１〜約７，２５９の核酸配列で構成されるＬＴＲＰＣ７遺伝子の組換え核酸分子を示す（配列番号：３）。
【図１５】
１〜約１８６３の配列で構成される組換えＬＴＲＰＣ７タンパク質のアミノ酸配列を示す（配列番号：４）。
【図１６】
ＬＴＲＰＣ７ ｃＤＮＡコード化配列の組換え核酸分子を示す（配列番号：５）。
【図１７】
１〜約７，１２３の核酸配列で構成されるＬＴＲＰＣ７遺伝子の組換え核酸分子を示す（配列番号：６）。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｅ】
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【図３Ａ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｅ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｄ】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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