(57)【要約】ヒトスフィンゴシンキナーゼ様タンパク質を調節する試薬およびヒトスフィンゴシンキナーゼ様タンパク質遺伝子産物と結合する試薬は、細胞内シグナル伝達、結果として細胞増殖およびアポトーシスを調節するために使用することができる。そのような調節は、癌、喘息、アレルギー（慢性関節リウマチ等の自己免疫疾患を含むがこれに限られない）、中枢および末梢神経系の障害（例えばパーキンソン病）の処置に特に有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトスフィンゴシンキナーゼ様タンパク質をコードする単離されたポリヌクレオチドであって、
ａ）配列番号２に示すアミノ酸配列と少なくとも約５０％一致するアミノ酸配列；および配列番号２に示すアミノ酸配列から成る群より選択されるアミノ酸配列；配列番号１０に示すアミノ酸配列と少なくとも約５０％一致するアミノ酸配列；および配列番号１０に示すアミノ酸配列から成る群より選択されるアミノ酸配列配列番号１１に示すアミノ酸配列と少なくとも約５０％一致するアミノ酸配列；および配列番号１１に示すアミノ酸配列から成る群より選択されるアミノ酸配列を含むヒトスフィンゴシンキナーゼ様タンパク質をコードするポリヌクレオチド；
ｂ）配列番号１または９に記載の配列を含むポリヌクレオチド；
ｃ）（ａ）および（ｂ）に明記するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド；
ｄ）遺伝コードの縮重のため、その配列が（ａ）〜（ｃ）に明記するポリヌクレオチド配列から逸脱しているポリヌクレオチド；並びに
ｅ）（ａ）〜（ｄ）に明記するポリヌクレオチド配列の断片、誘導体またはアレル変異体を表すポリヌクレオチド、
から成る群より選択されるポリヌクレオチド。
【請求項２】
請求項１に記載の任意のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【請求項３】
請求項２に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項４】
請求項１に記載のポリヌクレオチドによってコードされている、実質上精製されたヒトスフィンゴシンキナーゼ様タンパク質。
【請求項５】
ａ）請求項３に記載の宿主細胞を、ヒトスフィンゴシンキナーゼ様タンパク質の発現に好適な条件下で培養する工程；および、
ｂ）該宿主細胞培養からヒトスフィンゴシンキナーゼ様タンパク質を回収する工程、
を含む、ヒトスフィンゴシンキナーゼ様タンパク質を産生する方法。
【請求項６】
ａ）請求項１に記載の任意のポリヌクレオチドを生物試料の核酸材料とハイブリダイズさせ、それによりハイブリダイゼーション複合体を形成さ細胞工程；および、
ｂ）該ハイブリダイゼーション複合体を検出する工程、
を含む、生物試料中のヒトスフィンゴシンキナーゼ様タンパク質をコードするポリヌクレオチドを検出するための方法。
【請求項７】
ハイブリダイゼーション前に、生物試料の核酸材料を増幅さ細胞、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
生物試料を、請求項１に記載のポリヌクレオチドまたは請求項４に記載のヒトスフィンゴシンキナーゼ様タンパク質と特異的に相互作用する試薬と接触さ細胞工程を含む、請求項１に記載のポリヌクレオチドまたは請求項４に記載のヒトスフィンゴシンキナーゼ様タンパク質を検出するための方法。
【請求項９】
請求項６〜８のいずれかに記載の方法を実施するための診断キット。
【請求項１０】
被験化合物を、請求項１に記載の任意のポリヌクレオチドによってコードされている任意のヒトスフィンゴシンキナーゼ様タンパク質と接触さ細胞工程；
該ヒトスフィンゴシンキナーゼ様タンパク質に対する被験化合物の結合を検出する工程、
を含むヒトスフィンゴシンキナーゼ様タンパク質の活性を低下さ細胞物質をスクリーニングする方法であって、該ポリペプチドと結合する被験化合物を、ヒトスフィンゴシンキナーゼ様タンパク質の活性を低下さ細胞可能性のある治療物質として同定する方法。
【請求項１１】
被験化合物を、請求項１に記載の任意のポリヌクレオチドによってコードされるヒトスフィンゴシンキナーゼ様タンパク質と接触さ細胞工程；および、
該ポリペプチドのヒトスフィンゴシンキナーゼ様タンパク質活性を検出する工程、
を含むヒトスフィンゴシンキナーゼ様タンパク質の活性を調節する物質をスクリーニングする方法であって、ヒトスフィンゴシンキナーゼ様タンパク質活性を増大さ細胞被験化合物をヒトスフィンゴシンキナーゼ様タンパク質の活性を増大さ細胞可能性のある治療物質として同定し、そして該ポリペプチドのヒトスフィンゴシンキナーゼ様タンパク質活性を減少さ細胞被験化合物をヒトスフィンゴシンキナーゼ様タンパク質の活性を減少さ細胞可能性のある治療物質として同定する方法。
【請求項１２】
被験化合物を、請求項１に記載の任意のポリヌクレオチドと接触させ、該ポリヌクレオチドに対する被験化合物の結合を検出する工程を含む、ヒトスフィンゴシンキナーゼ様タンパク質の活性を減少さ細胞物質をスクリーニングする方法であって、該ポリヌクレオチドに結合する被験化合物をヒトスフィンゴシンキナーゼ様タンパク質の活性を減少さ細胞可能性のある治療物質として同定する方法。
【請求項１３】
細胞を、請求項１に記載の任意のポリヌクレオチドまたは請求項４に記載の任意のヒトスフィンゴシンキナーゼ様タンパク質と特異的に結合する試薬と接触させ、それによりヒトスフィンゴシンキナーゼ様タンパク質の活性を減少さ細胞工程を含む、ヒトスフィンゴシンキナーゼ様タンパク質の活性を減少さ細胞方法。
【請求項１４】
請求項１０〜１２のいずれかに記載の方法によって同定される、ヒトスフィンゴシンキナーゼ様タンパク質またはポリヌクレオチドの活性を調節する試薬。
【請求項１５】
請求項２に記載の発現ベクターまたは請求項１４に記載の試薬および製薬的に許容し得る担体、を含む医薬組成物。
【請求項１６】
疾患においてヒトスフィンゴシンキナーゼ様タンパク質の活性を調節する、請求項２に記載の発現ベクターまたは請求項１４記載の試薬の使用。
【請求項１７】
該疾患が、癌、喘息、アレルギー、自己免疫疾患あるいは中枢神経系若しくは末梢神経系疾患である、請求項１６に記載の使用。
【請求項１８】
配列番号２、１０または１１に示すアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするｃＤＮＡ。
【請求項１９】
配列番号１または９を含む、請求項１８に記載のｃＤＮＡ。
【請求項２０】
配列番号１または９から成る、請求項１８に記載のｃＤＮＡ。
【請求項２１】
配列番号２、１０、１１に示すアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【請求項２２】
該ポリヌクレオチドが配列番号１または９から成る、請求項２１に記載の発現ベクター。
【請求項２３】
配列番号２、１０、１１に示すアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項２４】
該ポリヌクレオチドが配列番号１または９から成る、請求項２３に記載の宿主細胞。
【請求項２５】
配列番号２、１０、１１に示すアミノ酸配列を含む精製されたポリペプチド。
【請求項２６】
配列番号２、１０、１１に示すアミノ酸配列から成る、請求項２５に記載の精製されたポリペプチド。
【請求項２７】
配列番号２、１０、１１に示すアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む融合タンパク質。
【請求項２８】
配列番号２、１０、１１に示すアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする発現ベクターを含む宿主細胞を、該ポリペプチドが発現される条件下で培養し；そして該ポリペプチドを単離する工程を含む、該ポリペプチドを産生する方法。
【請求項２９】
該発現ベクターが配列番号１または９を含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
配列番号１または９に記載の１１個の連続ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを、生物試料の核酸材料とハイブリダイズさせ、それによりハイブリダイゼーション複合体を形成させ；そして、該ハイブリダイゼーション複合体を検出する工程を含む、配列番号２、１０、１１に示すアミノ酸配列を含むポリペプチドのコード配列を検出する方法。
【請求項３１】
ハイブリダイズさ細胞工程の前に、該核酸材料を増幅さ細胞工程をさらに含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
配列番号１または９に記載の１１個の連続するヌクレオチドを含むポリヌクレオチド；および、
請求項３０に記載の方法についての説明書、
を含む、配列番号２、１０、１１に示すアミノ酸配列を含むポリペプチドのコード配列を検出するためのキット。
【請求項３３】
生物試料を、配列番号２、１０、１１に示すアミノ酸配列を含むポリペプチドと特異的に結合する試薬と接触させて、試薬−ポリペプチド複合体を形成さ細胞工程；および、
該試薬−ポリペプチド複合体を検出する工程、
を含む、該ポリペプチドを検出する方法。
【請求項３４】
該試薬が抗体である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
配列番号２、１０、１１に示すアミノ酸配列を含むポリペプチドと特異的に結合する抗体；および
請求項３３に記載の方法についての説明書、
を含む、該ポリペプチドを検出するためのキット。
【請求項３６】
被験化合物を、（１）配列番号２、１０、１１に示すアミノ酸配列と少なくとも約５０％一致するアミノ酸配列、および（２）配列番号２、１０、１１に示すアミノ酸配列、から成る群より選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドと接触さ細胞工程；および
該ポリペプチドに対する被験化合物の結合を検出する工程、
を含むヒトヒトスフィンゴシンキナーゼ様タンパク質の活性を調節することができる物質をスクリーニングする方法であって、該ポリペプチドに結合する被験化合物をヒトヒトスフィンゴシンキナーゼ様タンパク質の活性を調節する可能性のある物質として同定する方法。
【請求項３７】
接触さ細胞工程が細胞においてである、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
細胞がインビトロである、請求項３６に記載の方法。
【請求項３９】
接触さ細胞工程が無細胞系においてである、請求項３６に記載の方法。
【請求項４０】
該ポリペプチドが検出可能な標識を含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項４１】
被験化合物が検出可能な標識を含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項４２】
被験化合物が該ポリペプチドと結合している標識化リガンドに取って代わる、請求項３６に記載の方法。
【請求項４３】
該ポリペプチドが固体支持体と結合している、請求項３６に記載の方法。
【請求項４４】
被験化合物が固体支持体と結合している、請求項３６に記載の方法。
【請求項４５】
被験化合物を、（１）配列番号２、１０、１１に示すアミノ酸配列と少なくとも約５０％一致するアミノ酸配列、および、（２）配列番号２、１０、１１に示すアミノ酸配列、から成る群より選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドと接触さ細胞工程；および
該ポリペプチドの活性を検出する工程、
を含むヒトヒトスフィンゴシンキナーゼ様タンパク質の活性を調節する物質をスクリーニングする方法であって、該ポリペプチドの活性を増大さ細胞被験化合物をヒトヒトスフィンゴシンキナーゼ様タンパク質の活性を増大さ細胞可能性のある物質として同定し、該ポリペプチドの活性を減少さ細胞被験化合物をヒトヒトスフィンゴシンキナーゼ様タンパク質の活性を減少さ細胞可能性のある物質として同定する方法。
【請求項４６】
接触さ細胞工程が細胞においてである、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
細胞がインビトロである、請求項４５に記載の方法。
【請求項４８】
接触さ細胞工程が無細胞系においてである、請求項４５に記載の方法。
【請求項４９】
被験化合物を、配列番号１または９に示すヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによってコードされる産物と接触さ細胞工程；および　該産物に対する被験化合物の結合を検出する工程、
を含むヒトヒトスフィンゴシンキナーゼ様タンパク質の活性を調節する物質をスクリーニングする方法であって、該産物に結合する被験化合物をヒトヒトスフィンゴシンキナーゼ様タンパク質の活性を調節する可能性のある物質として同定する方法。
【請求項５０】
該産物がポリペプチドである、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
該産物がＲＮＡである、請求項４９に記載の方法。
【請求項５２】
細胞を、配列番号１または９に示すヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによってコードされる産物と特異的に結合する試薬と接触させ、それによりヒトヒトスフィンゴシンキナーゼ様タンパク質の活性を減少さ細胞工程を含む、ヒトヒトスフィンゴシンキナーゼ様タンパク質の活性を減少さ細胞方法。
【請求項５３】
該産物がポリペプチドである、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
該産物が抗体である、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
該産物がＲＮＡである、請求項５２に記載の方法。
【請求項５６】
該試薬がアンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
該試薬がリボザイムである、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
細胞がインビトロである、請求項５２に記載の方法。
【請求項５９】
細胞がインビボである、請求項５２に記載の方法。
【請求項６０】
配列番号２、１０、１１に示すアミノ酸配列を含むポリペプチドと特異的に結合する試薬；および製薬的に許容し得る担体、を含む医薬組成物。
【請求項６１】
該試薬が抗体である、請求項６０に記載の医薬組成物。
【請求項６２】
配列番号１または９に示すヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドの産物と特異的に結合する試薬；および製薬的に許容し得る担体、を含む医薬組成物。
【請求項６３】
該試薬がリボザイムである、請求項６２に記載の医薬組成物。
【請求項６４】
該試薬がアンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項６２に記載の医薬組成物。
【請求項６５】
該試薬が抗体である、請求項６２に記載の医薬組成物。
【請求項６６】
配列番号２、１０、１１に示すアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする発現ベクター；および製薬的に許容し得る担体、を含む医薬組成物。
【請求項６７】
該発現ベクターが配列番号１または９を含む、請求項６６に記載の医薬組成物。
【請求項６８】
癌、喘息、アレルギー、自己免疫疾患あるいは中枢神経系若しくは末梢神経系疾患より選択されるヒトスフィンゴシンキナーゼ様タンパク質機能障害関連疾患を処置する方法であって、それを必要とする患者に、ヒトヒトスフィンゴシンキナーゼ様タンパク質の機能を調節する試薬の治療的有効量を投与し、それによりヒトスフィンゴシンキナーゼ様タンパク質機能障害関連疾患の症状を回復さ細胞工程を含む方法。
【請求項６９】
該試薬が請求項３６に記載の方法によって同定される、請求項６８に記載の方法。
【請求項７０】
該試薬が請求項４５に記載の方法によって同定される、請求項６８に記載の方法。
【請求項７１】
該試薬が請求項４９に記載の方法によって同定される、請求項６８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の属する技術分野
本発明は、ヒトヒトスフィンゴシンキナーゼ様タンパク質の調節に関する。
【０００２】
発明の背景
プロテアーゼは、アミノ酸間のペプチド結合を加水分解し、代謝および他の生物学的プロセスにおいて重要な役割を担う。これらは、酵素前駆体を機能的酵素にプロセッシングすることによって酵素活性を調節し、細胞外に酵素を放出し、加水分解によって酵素を活性化する。プロテアーゼの差次的発現またはその他の選択的活性化は疾患状態に関与している。多数のヒト疾患はプロテアーゼ量と関連している。手短かな再考に関しては、米国特許第６，００１，８１４号を参照のこと。例えば、ＨＩ．Ｖ．タンパク質はポリタンパク質前駆体として翻訳され、これはＨＩ．Ｖ．がコードするプロテアーゼによる成熟分子として放出されるまで不活性である。したがって、プロテアーゼおよびプロテアーゼアゴニストおよびアンタゴニストの同定は、医学上重要である。
【０００３】
プロテアーゼの１クラスはセリンプロテアーゼである。このセリンプロテアーゼクラスは、キモトリプシン、カテプシンＧ、トリプシンおよびトロンビンを含む種々のプロテアーゼから構成される。セリンプロテアーゼは、セリン−１９５、ヒスチジン−５７およびアスパラギン酸−１０２（これらはキモトリプシンの番号付け体系に基づく）からなる触媒性の三つ組を特徴とする。Ｌａｎｇ および Ｓｃｈｕｌｌｅｒ は、ＥＭＢＬデータベースに配列を寄託した。これはＥＭＢＬ受入れ番号第ＡＦ０６４８１９号（扁平上皮細胞癌中で異常発現された遺伝子のｃＤＮＡ配列として記載されている）、ＤＥＳＣ１である。ＤＥＳＣ１はセリンプロテアーゼである。ＤＥＳＣ１は、扁平上皮細胞舌癌または転移性頚部結節組織中ではなく、正常な口頭上皮中に発現される。
【０００４】
このことは、疾患状態におけるこの遺伝子および同様の遺伝子に関する役割を示唆する。関連する遺伝子の単離およびこれらの遺伝子およびそれぞれの遺伝子産物のアゴニストおよびアンタゴニストの同定に関する必要が存在する。
【０００５】
発明の要旨
本発明の課題は、ヒトヒトスフィンゴシンキナーゼ様タンパク質を調節する試薬および方法を提供することである。本発明のこの課題および他の課題は、以下に記載の１またはそれ以上の態様によって提供される。
【０００６】
本発明の一態様は、以下からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むヒトスフィンゴシンキナーゼ様タンパク質である：
配列番号２に示されるアミノ酸配列と少なくとも約５０％の同一性を有するアミノ酸配列；
配列番号２で示されるアミノ酸配列；
配列番号１０に示されるアミノ酸配列と少なくとも約５０％の同一性を有するアミノ酸配列；
配列番号１０で示されるアミノ酸配列；
配列番号１１に示されるアミノ酸配列と少なくとも約５０％の同一性を有するアミノ酸配列；および
配列番号１１で示されるアミノ酸配列。
【０００７】
本発明のさらに別の態様は、細胞外基質分解を減少さ細胞物質のスクリーニング方法である。試験（被験）化合物を、以下からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むヒトスフィンゴシンキナーゼ様タンパク質と接触さ細胞：
配列番号２に示されるアミノ酸配列と少なくとも約５０％の同一性を有するアミノ酸配列；
配列番号２で示されるアミノ酸配列；
配列番号１０に示されるアミノ酸配列と少なくとも約５０％の同一性を有するアミノ酸配列；
配列番号１０で示されるアミノ酸配列；
配列番号１１に示されるアミノ酸配列と少なくとも約５０％の同一性を有するアミノ酸配列；および
配列番号１１で示されるアミノ酸配列
【０００８】
試験化合物およびヒトスフィンゴシンキナーゼ様タンパク質間の結合を検出する。ヒトスフィンゴシンキナーゼ様タンパク質と結合する試験化合物は、これにより、細胞外基質分解を減少さ細胞のに有望な物質として同定される。この物質はヒトスフィンゴシンキナーゼ様タンパク質の活性を減少さ細胞ことによって機能し得る。
【０００９】
本発明の別の態様は、細胞外基質分解を減少さ細胞物質のスクリーニング方法である。試験化合物を、以下からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むヒトスフィンゴシンキナーゼ様タンパク質をコードするポリヌクレオチドと接触さ細胞：
配列番号１に示されるヌクレオチド配列と少なくとも約５０％の同一性を有するヌクレオチド配列；ならびに、
配列番号１で示されるヌクレオチド配列；
配列番号９で示されるヌクレオチド配列と少なくとも約５０％の同一性を有するヌクレオチド配列；
配列番号９に示されるヌクレオチド配列。
【００１０】
このポリヌクレオチドに対する試験化合物の結合を検出する。このポリヌクレオチドと結合する試験化合物は、細胞外基質分解を減少さ細胞のに有望な物質として同定される。この物質はヒトスフィンゴシンキナーゼ様タンパク質ｍＲＮＡと相互作用することを介し、ヒトスフィンゴシンキナーゼ様タンパク質の量を減少さ細胞ことによって機能し得る。
【００１１】
本発明の別の態様は、細胞外基質分解を調節する物質をスクリーニングする方法である。試験化合物を、以下からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むヒトスフィンゴシンキナーゼ様タンパク質と接触さ細胞：
配列番号２に示されるアミノ酸配列と少なくとも約５０％の同一性を有するアミノ酸配列；
配列番号２で示されるアミノ酸配列；
配列番号１０に示されるアミノ酸配列と少なくとも約５０％の同一性を有するアミノ酸配列；
配列番号１０で示されるアミノ酸配列；
配列番号１１に示されるアミノ酸配列と少なくとも約５０％の同一性を有するアミノ酸配列；および
配列番号１１で示されるアミノ酸配列。
【００１２】
ポリペプチドのヒトスフィンゴシンキナーゼ様タンパク質活性を検出する。このポリペプチドのヒトスフィンゴシンキナーゼ様タンパク質活性を、試験化合物の不存在下におけるヒトスフィンゴシンキナーゼ様タンパク質活性と比較して増大さ細胞試験化合物は、これにより、細胞外基質分解の増大に関して有望な物質として同定される。このポリペプチドのヒトスフィンゴシンキナーゼ様タンパク質活性を、試験化合物の不存在下におけるヒトスフィンゴシンキナーゼ様タンパク質活性と比較して減少さ細胞試験化合物は、これにより、細胞外基質分解の減少に関して有望な物質として同定される。
【００１３】
本発明のさらに別の態様は、細胞外基質分解を減少さ細胞物質のスクリーニング方法である。試験化合物を、以下からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドのヒトスフィンゴシンキナーゼ様タンパク質産物と接触さ細胞：
配列番号１に示されるヌクレオチド配列と少なくとも約５０％の同一性を有するヌクレオチド配列；ならびに、
配列番号１で示されるヌクレオチド配列；
配列番号９で示されるヌクレオチド配列と少なくとも約５０％の同一性を有するヌクレオチド配列；
配列番号９に示されるヌクレオチド配列。
【００１４】
ヒトスフィンゴシンキナーゼ様タンパク質産物に対する試験化合物の結合を検出する。ヒトスフィンゴシンキナーゼ様タンパク質産物と結合する試験化合物は、これにより、細胞外基質分解の減少に関して有望な物質として同定される。
【００１５】
本発明のさらに別の態様は、細胞外基質分解を減少さ細胞方法である。細胞を、以下からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む、ヒトスフィンゴシンキナーゼ様タンパク質をコードするポリヌクレオチドまたはこのポリヌクレオチドによってコードされる産物と特異的に結合する試薬と接触さ細胞：
配列番号１に示されるヌクレオチド配列と少なくとも約５０％の同一性を有するヌクレオチド配列；ならびに、
配列番号１で示されるヌクレオチド配列；
配列番号９で示されるヌクレオチド配列と少なくとも約５０％の同一性を有するヌクレオチド配列；
配列番号９に示されるヌクレオチド配列。
【００１６】
細胞内のヒトスフィンゴシンキナーゼ様タンパク質活性はこれにより減少する。したがって本発明は、例えばこの酵素の活性部位におけるアゴニストまたはアンタゴニストとして作用し得る試験化合物を同定するのに使用可能なヒトヒトスフィンゴシンキナーゼ様タンパク質を提供する。ヒトヒトスフィンゴシンキナーゼ様タンパク質およびその断片はまた、この酵素をブロックし、効率的にその活性を減少さ細胞ことができる特異的抗体を生じさ細胞のに有用である。
。
【００１７】
本発明の詳しい説明
本発明は、ヒトスフィンゴシンキナーゼ様タンパク質をコードする単離されたポリヌクレオチドであって、
ａ）配列番号２に示すアミノ酸配列と少なくとも約５０％一致するアミノ酸配列；および配列番号２に示すアミノ酸配列から成る群より選択されるアミノ酸配列；配列番号１０に示すアミノ酸配列と少なくとも約５０％一致するアミノ酸配列；および配列番号１０に示すアミノ酸配列から成る群より選択されるアミノ酸配列配列番号１１に示すアミノ酸配列と少なくとも約５０％一致するアミノ酸配列；および配列番号１１に示すアミノ酸配列から成る群より選択されるアミノ酸配列を含むヒトスフィンゴシンキナーゼ様タンパク質をコードするポリヌクレオチド；
ｂ）配列番号１または９に記載の配列を含むポリヌクレオチド；
ｃ）（ａ）および（ｂ）に明記するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド；
ｄ）遺伝コードの縮重のため、その配列が（ａ）〜（ｃ）に明記するポリヌクレオチド配列から逸脱しているポリヌクレオチド；並びに
ｅ）（ａ）〜（ｄ）に明記するポリヌクレオチド配列の断片、誘導体またはアレル変異体を表すポリヌクレオチド、
から成る群より選択されるポリヌクレオチドに関する。
【００１８】
さらに、新規ヒトスフィンゴシンキナーゼ様タンパク質、特にヒトヒトスフィンゴシンキナーゼ様タンパク質が本発明の発見であることが本出願人により発見された。ヒトヒトスフィンゴシンキナーゼ様タンパク質は、ＥＭＢＬ受入れ番号第ＡＦ２４４５４７号（配列番号３）を用いて同定され、セリンプロテアーゼＤＥＳＣ１（図１２）と注釈されるタンパク質と２３２アミノ酸にわたって２８％の同一性を有する。ヒトスフィンゴシンキナーゼ様タンパク質はジアシルグリセロールキナーゼドメインを含有し、これは図１３において太字で示される。
【００１９】
配列番号２をコードする配列は、配列番号１に示される。配列番号１０および１１をコードする配列は、配列番号９に示される。関連ＥＳＴ（配列番号４〜８）は、Ｂリンパ球、Ｔリンパ球、胚組織、肝臓、卵巣、脳および腎臓において発現される。
【００２０】
本発明のヒトヒトスフィンゴシンキナーゼ様タンパク質は、癌、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、心血管および末梢神経系または中枢神経系疾患の処置および診断に有用であることが予想される（Ｌｉｕ， ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．　２７５， １９５１３−２０，２０００）参照）。また、ヒトヒトスフィンゴシンキナーゼ様タンパク質および遺伝子は、ヒトヒトスフィンゴシンキナーゼ様タンパク質および遺伝子アゴニストおよびアンタゴニストをスクリーニングするのに用いることもできる。
【００２１】
ポリペプチド
本発明に係るヒトスフィンゴシンキナーゼ様タンパク質には、配列番号２に示すアミノ酸配列、または以下定義による生物学的に活性なその変異体より選択される、少なくとも６、１０、１５、２５、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２７５、３００、３２０または３２６個の連続アミノ酸が含まれる。したがって、本発明のヒトスフィンゴシンキナーゼ様タンパク質は、ヒトスフィンゴシンキナーゼ様タンパク質の一部、完全長のヒトスフィンゴシンキナーゼ様タンパク質、又はヒトスフィンゴシンキナーゼ様タンパク質の全部または一部を含む融合タンパク質であり得る。本発明に係るヒトスフィンゴシンキナーゼ様タンパク質には、配列番号１０に示すアミノ酸配列、または以下定義による生物学的に活性なその変異体より選択される、少なくとも６、１０、１５、２５、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２７５、３００、３２０、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００、５２５または５３７個の連続アミノ酸が含まれる。したがって、本発明のヒトスフィンゴシンキナーゼ様タンパク質は、ヒトスフィンゴシンキナーゼ様タンパク質の一部、完全長のヒトスフィンゴシンキナーゼ様タンパク質、又はヒトスフィンゴシンキナーゼ様タンパク質の全部または一部を含む融合タンパク質であり得る。本発明に係るヒトスフィンゴシンキナーゼ様タンパク質には、配列番号１１に示すアミノ酸配列、または以下定義による生物学的に活性なその変異体より選択される、少なくとも６、１０、１５、２５、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２７５、３００、３２０、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００、５２５、５５０または５６２個の連続アミノ酸が含まれる。したがって、本発明のヒトスフィンゴシンキナーゼ様タンパク質は、ヒトスフィンゴシンキナーゼ様タンパク質の一部、完全長のヒトスフィンゴシンキナーゼ様タンパク質、又はヒトスフィンゴシンｅｐｉｔｏｐｅ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ ｔｈｅｒｅｏｆ）， ａｎｄ ｓｍａｌｌ ｏｒｇａｎｉｃ ｏｒ ｉｎｏｒｇａｎｉｃ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ．キナーゼ様タンパク質の全部または一部を含む融合タンパク質であり得る。
【００２２】
生物学的に活性な変異体
生物学的活性がある、即ちセリンプロテアーゼ、および、好ましくはトリプシンセリンプロテアーゼ活性を保持しているヒトスフィンゴシンキナーゼ様タンパク質変異体もまた、ヒトスフィンゴシンキナーゼ様タンパク質である。天然または非天然ヒトスフィンゴシンキナーゼ様タンパク質変異体は、配列番号２、１０、１１に示すアミノ酸配列と少なくとも約３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０％、好ましくは、約７５、９０、９６、９８％一致するアミノ酸配列またはその断片を有することが好ましい。推定されるヒトスフィンゴシンキナーゼ様タンパク質変異体と配列番号２に記載のアミノ酸配列との間の一致（同一性）パーセントは、Ｂｌａｓｔ２整列（アライメント）プログラムを用いて決定される。
【００２３】
一致パーセントの変異は、例えばアミノ酸置換、挿入または欠失に起因し得る。アミノ酸置換は１対１のアミノ酸の置き換えとして定義される。置換されたアミノ酸が類似の構造的および／または化学的性質を有する場合、置換は事実上保存的である。保存的置換の例は、イソロイシンまたはバリンによるロイシンの置換、グルタメートによるアスパルテートの置換、またはセリンによるスレオニンの置換である。
【００２４】
アミノ酸挿入または欠失はアミノ酸配列への、またはその内部での変化である。これらは典型的には約１〜５アミノ酸の範囲で起こる。ヒトスフィンゴシンキナーゼ様タンパク質の生物学的または免疫学的活性を破壊することなく、どのアミノ酸残基が置換、挿入または欠失できるかを決定する際の指針は、当分野で周知のコンピュータープログラム、例えばＤＮＡＳＴＡＲソフトウェアを用いて見出すことができる。あるアミノ酸変化が生物学的に活性なヒトスフィンゴシンキナーゼ様タンパク質に影響するか否かは、例えばＬｉｕ， ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７５， １９５１３−１９５２０，２０００に記載のように、セリンプロテアーゼ活性を検定することにより容易に決定できる。
【００２５】
融合タンパク質
融合タンパク質は、ヒトスフィンゴシンキナーゼ様タンパク質アミノ酸配列に対する抗体の作製に、そして様々な検定系での使用に有用である。例えば、融合タンパク質は、ヒトスフィンゴシンキナーゼ様タンパク質の一部と相互作用するタンパク質の同定に使用できる。タンパク質親和クロマトグラフィーまたはタンパク質相互作用のためのライブラリーに基づく検定、例えば酵母２−ハイブリッドまたはファージディスプレイ系をこの目的のために使用できる。このような方法は当分野で周知であり、薬物スクリーニングとしても使用できる。
【００２６】
ヒトスフィンゴシンキナーゼ様タンパク質融合タンパク質は、ペプチド結合により互いに融合した二つのポリペプチドセグメントを含んでいる。第一のポリペプチドセグメントは、配列番号２または上記のような生物学的に活性な変異体の少なくとも６、１０、１５、２５、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２７５、３００、３２０または３２６個の連続アミノ酸を含む。第一のポリペプチドセグメントはまた、完全長ヒトスフィンゴシンキナーゼ様タンパク質を含み得る。本発明に係るヒトスフィンゴシンキナーゼ様タンパク質には、配列番号１０に示すアミノ酸配列、または以下定義による生物学的に活性なその変異体より選択される、少なくとも６、１０、１５、２５、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２７５、３００、３２０、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００、５２５または５３７個の連続アミノ酸が含まれる。したがって、本発明のヒトスフィンゴシンキナーゼ様タンパク質は、ヒトスフィンゴシンキナーゼ様タンパク質の一部、完全長のヒトスフィンゴシンキナーゼ様タンパク質、又はヒトスフィンゴシンキナーゼ様タンパク質の全部または一部を含む融合タンパク質であり得る。本発明に係るヒトスフィンゴシンキナーゼ様タンパク質には、配列番号１１に示すアミノ酸配列、または以下定義による生物学的に活性なその変異体より選択される、少なくとも６、１０、１５、２５、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２７５、３００、３２０、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００、５２５、５５０または５６２個の連続アミノ酸が含まれる。したがって、本発明のヒトスフィンゴシンキナーゼ様タンパク質は、ヒトスフィンゴシンキナーゼ様タンパク質の一部、完全長のヒトスフィンゴシンキナーゼ様タンパク質、又はヒトスフィンゴシンキナーゼ様タンパク質の全部または一部を含む融合タンパク質であり得る。
【００２７】
第二のポリペプチドセグメントは完全長タンパク質またはタンパク質断片であってよい。融合タンパク質の構築に一般的に使用するタンパク質は、β−ガラクトシダーゼ、β−グルクロニダーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、自己蛍光タンパク質（青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）を包含する）、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、ルシフェラーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、およびクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）を包含する。さらに、融合タンパク質の構築には、ヒスチジン（Ｈｉｓ）標識、ＦＬＡＧ標識、インフルエンザへマグルチニン（ＨＡ）標識、Ｍｙｃ標識、ＶＳＶ−Ｇ標識、およびチオレドキシン（Ｔｒｘ）標識を包含するエピトープ標識を使用する。その他の融合構築は、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、Ｓ−標識、Ｌｅｘ ａ ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）融合物、ＧＡＬ４ ＤＮＡ結合ドメイン融合物、および単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ＢＰ１６タンパク質融合物を包含する。また、融合タンパク質はさらに、ヒトスフィンゴシンキナーゼ様タンパク質コード配列と非相同タンパク質配列の間に位置する開裂部位を含むよう組み立てることができ、その結果、このヒトスフィンゴシンキナーゼ様タンパク質は、開裂され、非相同部分を無くすように精製できる。
【００２８】
融合タンパク質は当分野で周知のように化学合成できる。好ましくは、融合タンパク質は二つのポリペプチドセグメントを共有結合で連結することにより、または分子生物学分野で標準的な方法により調製する。例えば、当分野で知られているように、第二のポリペプチドセグメントをコードしているヌクレオチドを有する適切なリーディングフレームに配列番号１または９より選ばれるコード配列を含むＤＮＡ構築物を作製し、このＤＮＡ構築物を宿主細胞で発現さ細胞ことによる組換えＤＮＡ法を用いて、融合タンパク質を調製できる。融合タンパク質構築用の多くのキットが、Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩ）、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（Ｌａ Ｊｏｌｌａ， ＣＡ）、ＣＬＯＮＴＥＣＨ（Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ， ＣＡ）、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ， ＣＡ）、ＭＢＬ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（ＭＩＣ； Ｗａｔｅｒｔｏｗｎ， ＭＡ）、およびＱｕａｎｔｕｍ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｍｏｎｔｒｅａｌ， Ｃａｎａｄａ； １−８８８−ＤＮＡ−ＫＩＴＳ）といった企業から入手できる。
【００２９】
種相同体の同定
ヒトスフィンゴシンキナーゼ様タンパク質のポリヌクレオチド（下記）を使用して他の種、例えばマウス、サル、または酵母由来のｃＤＮＡ発現ライブラリーをスクリーニングするために好適なプローブまたはプライマーを作製し、ヒトスフィンゴシンキナーゼ様タンパク質の相同体をコードしているｃＤＮＡを同定し、そして当分野で周知のようにこのｃＤＮＡを発現させて、ヒトヒトスフィンゴシンキナーゼ様タンパク質の種相同体を得ることができる。
【００３０】
ポリヌクレオチド
ヒトスフィンゴシンキナーゼ様タンパク質ポリヌクレオチドは、一本鎖又は二本鎖であってよく、ヒトスフィンゴシンキナーゼ様タンパク質のコード配列又はその相補物を含んでいてもよい。ヒトヒトスフィンゴシンキナーゼ様タンパク質のコード配列を、配列番号１および９に示す。
【００３１】
ヒトヒトスフィンゴシンキナーゼ様タンパク質をコードしている縮重ヌクレオチド配列、および、配列番号１に示すヌクレオチド配列と少なくとも約５０、５５、６０、６５、７０、好ましくは約７５、９０、９６または９８％一致するホモローガスなヌクレオチド配列もまた、ヒトスフィンゴシンキナーゼ様タンパク質ポリヌクレオチドである。二つのポリヌクレオチド配列間の配列一致パーセントは、ＡＬＩＧＮのようなコンピュータープログラムを用いて決定するが、これは、ギャップオープンペナルティー−１２およびギャップエクステンションペナルティー−２によるアフィンギャップ検索を用いるＦＡＳＴＡアルゴリズムを使用するものである。相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）分子、種相同体および生物学的に活性なヒトスフィンゴシンキナーゼ様タンパク質をコードしているヒトスフィンゴシンキナーゼ様タンパク質ポリヌクレオチドの変異体もやはりヒトスフィンゴシンキナーゼ様タンパク質ポリヌクレオチドである。
【００３２】
ポリヌクレオチド変異体および相同体の同定
上記のヒトスフィンゴシンキナーゼ様タンパク質ポリヌクレオチド変異体および相同体もまたヒトスフィンゴシンキナーゼ様タンパク質ポリヌクレオチドである。典型的には、相同ヒトスフィンゴシンキナーゼ様タンパク質ポリヌクレオチド配列は、当分野で周知のように、ストリンジェントな条件下で候補ポリヌクレオチドを既知のヒトスフィンゴシンキナーゼ様タンパク質ポリヌクレオチドにハイブリダイズさ細胞ことにより同定できる。例えば、以下の洗浄条件−２Ｘ ＳＳＣ（０．３Ｍ ＮａＣｌ、０．０３Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）、０．１％ＳＤＳ、室温 ２回、各々３０分間；次いで２× ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、５０℃ １回、３０分間；次いで２× ＳＳＣ、室温 ２回、各々１０分間−を使用して、最大約２５−３０％の塩基対ミスマッチ（不対合）を含む相同配列を同定できる。より好ましくは、相同核酸鎖は１５−２５％の塩基対ミスマッチを、さらに好ましくは５−１５％の塩基対ミスマッチを含む。
【００３３】
本明細書に開示するヒトスフィンゴシンキナーゼ様タンパク質ポリヌクレオチドの種相同体はさらに、適当なプローブまたはプライマーを作製し、他の種、例えばマウス、サル、または酵母由来のｃＤＮＡ発現ライブラリーをスクリーニングすることによって同定できる。ヒトスフィンゴシンキナーゼ様タンパク質ポリヌクレオチドのヒト変異体は、例えばヒトｃＤＮＡ発現ライブラリーをスクリーニングすることにより同定できる。二本鎖ＤＮＡのＴｍは相同性が１％低下する毎に１−１．５℃低下することがよく知られている（Ｂｏｎｎｅｒら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ． ８１，１２３（１９７３））。故にヒトヒトスフィンゴシンキナーゼ様タンパク質ポリヌクレオチドの変異体または他の種のヒトスフィンゴシンキナーゼ様タンパク質ポリヌクレオチドは、推定の相同ヒトスフィンゴシンキナーゼ様タンパク質ポリヌクレオチドを、配列番号１に記載のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドまたはその相補物とハイブリダイズさせて被験ハイブリッドを作製することによって同定できる。被験ハイブリッドの融解温度を完全に相補的なヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含むハイブリッドの融解温度と比較し、被験ハイブリッド中の塩基対ミスマッチの数またはパーセントを算出する。
【００３４】
ストリンジェントなハイブリダイゼーションおよび／または洗浄条件に従いヒトスフィンゴシンキナーゼ様タンパク質ポリヌクレオチドまたはその相補物とハイブリダイズするヌクレオチド配列もまたヒトスフィンゴシンキナーゼ様タンパク質ポリヌクレオチドである。ストリンジェントな洗浄条件は当分野で周知且つ理解されており、例えばＳａｍｂｒｏｏｋら、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ： Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ， ２ｄ ｅｄ．， １９８９， ９．５０−９．５１頁に開示されている。
【００３５】
典型的には、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件のためには、温度と塩濃度の組み合わせを、検討中のハイブリッドの理論的Ｔｍよりおよそ１２−２０℃低くなるよう選択すべきである。配列番号１または６に示すヌクレオチド配列を有するヒトスフィンゴシンキナーゼ様タンパク質ポリヌクレオチドまたはその相同体と、それらのヌクレオチド配列のいずれか１つと少なくとも約５０、５５、６０、６５、７０、好ましくは約７５、９０、９６、または９８％一致するポリヌクレオチド配列とのハイブリッドのＴｍは、例えばＢｏｌｔｏｎおよびＭｃＣａｒｔｈｙ， Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ４８，１３９０（１９６２）の式：
Ｔｍ＝８１．５℃−１６．６（ｌｏｇ１０［Ｎａ＋］）＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）−０．６３（％ホルムアミド）−６００／ｌ）、
［式中、ｌ＝塩基対で表したハイブリッドの長さ］
を用いて算出できる。
【００３６】
ストリンジェントな洗浄条件としては例えば、４× ＳＳＣ（６５℃）、または５０％ホルムアミド、４× ＳＳＣ（４２℃）、または０．５× ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ（６５℃）が挙げられる。高度ストリンジェントな洗浄条件は、例えば０．２× ＳＳＣ（６５℃）などである。
【００３７】
ポリヌクレオチドの調製
天然に存在するヒトスフィンゴシンキナーゼ様タンパク質ポリヌクレオチドは、膜構成成分、タンパク質および脂質といった他の細胞成分を含まないよう単離できる。ポリヌクレオチドは細胞から調製でき、標準的核酸精製技術を用いて単離、またはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）のような増幅技術を用いて合成、若しくは自動合成機を用いることによって調製できる。ポリヌクレオチドを単離する方法は機械的であり、当分野で知られている。ポリヌクレオチドを取得するためこのような任意の技術を用いて、単離されたヒトスフィンゴシンキナーゼ様タンパク質ポリヌクレオチドを得ることができる。例えば、制限酵素およびプローブを用いてヒトスフィンゴシンキナーゼ様タンパク質ヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド断片を単離できる。単離したポリヌクレオチドは他の分子を含まないか、あるいは少なくとも７０、８０、または９０％含まない調製物である。
【００３８】
ヒトスフィンゴシンキナーゼ様タンパク質ｃＤＮＡ分子は、ヒトスフィンゴシンキナーゼ様タンパク質ｍＲＮＡを鋳型に用いて標準的分子生物学技術にて調製できる。その後ヒトスフィンゴシンキナーゼ様タンパク質ｃＤＮＡ分子は、当分野で周知でありＳａｍｂｒｏｏｋら．（１９８９）のようなマニュアルに開示される分子生物学技術を用いて複製できる。ヒトゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡのいずれかを鋳型として使用して本発明に係るポリヌクレオチドのさらなるコピーを得るため、ＰＣＲのような増幅技術を用いることができる。
【００３９】
別法として、合成化学技術を用いてヒトスフィンゴシンキナーゼ様タンパク質ポリヌクレオチドを合成することもできる。遺伝コードの縮重により、例えば配列番号２、１０、１１に示すアミノ酸配列を有するヒトスフィンゴシンキナーゼ様タンパク質またはその生物学的に活性な変異体をコードする別のヌクレオチド配列の合成を可能にする。
【００４０】
完全長ポリヌクレオチドの入手
ＰＣＲに基づく様々な方法を用いて、配列番号１および９に開示した核酸配列を伸長させ、プロモーターおよび調節要素といった上流配列を検出することができる。例えば制限部位ＰＣＲは、既知の座に隣接する未知配列を検索するため、ユニバーサルプライマーを使用する（ＢＡＳＩＣ ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ， Ｄａｖｉｓ ｅｔ ａｌ．， ｅｄｓ．， Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｐｒｅｓｓ， Ｎ． Ｙ．， １９８６）。まず、ゲノムＤＮＡを、リンカー配列に対するプライマーと既知領域に特異的なプライマーの存在下で増幅する。次に、増幅させた配列を、同じリンカープライマーと最初のものの内部にある別の特異的プライマーを用いて、第二回目のＰＣＲを行なう。各回のＰＣＲ産物を適当なＲＮＡポリメラーゼで転写し（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ， Ｌａ Ｊｏｌｌａ， Ｃａｌｉｆ． ９２０３７）逆転写酵素を行いて配列決定する（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， １９８９， ｐｇ． １．２０）。
【００４１】
既知領域に基づく異なるプライマーを用いて配列を増幅または伸長するために、逆ＰＣＲを使用することもできる（Ｄａｖｉｓ ｅｔ ａｌ．， １９８６）。市販ソフトウェアを用いて、標的配列とアニーリングするプライマーを設計できる。この方法は、幾つかの制限酵素を用いて、遺伝子の既知領域に適当な断片を作り出細胞。次いでこの断片を分子内ライゲーションにより環化し、ＰＣＲ鋳型として使用する。生じる放射能画像のプレートを複写するために比較する。各スポットは、ポジティブなコロニーかプラークに相当する。コロニーあるいはプラークは選択され拡張される。また、ＤＮＡは詳しい分析および配列用のコロニーから分離する。
【００４２】
ポジティブななｃＤＮＡクローンはそれらが、部分的な配列からの１つのプライマーおよびベクターからの別のプライマーを備えたＰＣＲを使用して含んでいる、補足配列の量を決定すると分析される。クローンで、１つの、より大きな、オリジナルの部分的な配列よりＰＣＲ産物をベクター挿入する、ｍＲＮＡサイズがノーザンブロッティング分析から決定するともに、それらが同じ大きさのインサートを含むかどうか決めるために順番に並べる、制限消化およびＤＮＡによって分析されるか類似している。
【００４３】
使用できるもう一つの方法は、ヒトおよび酵母人工染色体ＤＮＡ中の既知配列に隣接するＤＮＡ断片のＰＣＲ増幅を含む、エキソヌクレアーゼＩＩＩである（ＭｃＣｏｍｂｉｅ ｅｔ ａｌ．， Ｍｅｔｈｏｄｓ ３，３３−４０，１９９１）。この方法では、作製した二本鎖配列を、ＰＣＲの実施前に当該ＤＮＡ分子の未知断片中に入れるため、さらに複数の制限酵素消化とライゲーションを行うことができる。
【００４４】
様々なＰＣＲに基づいた方法はプロモーターおよび規定する要素のように上流に検知するキナーゼ様蛋白質が順番に並べる、ヒトスフィンゴシンの示された部分をコード化する核酸配列を拡張するために使用することができた。例えば、制限部位ＰＣＲは、既知の軌跡（ＳａｒｋａｒおよびＰＣＲ方法Ａｐｐｌｉｃ。 ２，３１８−３２２、１９９３年）に隣接している未知の配列を検索するために普遍的なプライマーを使用する。ゲノムのＤＮＡは、結合物配列へのプライマーおよび既知の領域への効薬がある状態で最初に増幅される。その後、増幅された配列は、同じ結合物プライマー、および第１のものに内部別の特定のプライマーを備えたＰＣＲの第２ラウンドにさらされる。ＰＣＲの各丸の産物は適切なＲＮＡポリメラーゼで転写され、逆転写酵素を使用して順番に並べられる。
【００４５】
さらに逆ＰＣＲは、既知の領域（Ｔｒｉｇｌｉａ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １６， ８１８６， １９８８）に基づいた分岐するプライマーを使用して、配列を増幅するか拡張するために使用することができた。プライマーはＯＬＩＧＯ ４．０６のように、商業的に利用可能なソフトウェアを使用して、設計することができた、分析ソフトウェア（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｉｎｃ．， Ｐｌｙｍｏｕｔｈ， Ｍｉｎｎ）、５０％以上のＧＣの内容を持っており、かつ緩冷するために長さで２２−３０のヌクレオチドであるために、約６８−７２℃の温度で目標配列をアニ−ルする。方法は、遺伝子の既知の領域の適切な破片を生成するためにいくつかの制限酵素を使用する。その後、分子内の酵素によって破片に切断される。また、その破片はＰＣＲテンプレートとして使用される。
【００４６】
未知配列を回収するために使用できるもう一つの方法はＰＣＲ（それはヒトとイーストの中の既知の配列に隣接しているＤＮＡ破片のＰＣＲ増幅を含んでいる）を捕らえる、人工染色体ＤＮＡ（Ｌａｇｅｒｓｔｒｏｍら、Ａｐｐｌｉｃ　ＰＣＲ法。 １、１１１−１１９、１９９１年）である。この方法では、多数の制限酵素消化がＰＣＲを実行する前に、ＤＮＡ分子の未知の破片に巧みに計画された二重らせん構造の配列を入れるために使用される。
【００４７】
未知配列を回収するために使用できるもう一つの方法はＰａｒｋｅｒら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １９，３０５５−３０６０，１９９１の方法である。さらに、ＰＣＲ、ネスティド（ｎｅｓｔｅｄ）プライマー、およびＰＲＯＭＯＴＥＲＦＩＮＤＥＲライブラリー（ＣＬＯＮＴＥＣＨ， Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ， Ｃａｌｉｆ．）を用いてゲノムＤＮＡ歩行を行なうことができる（ＣＬＯＮＴＥＣＨ， Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ， Ｃａｌｉｆ．）。このプロセスはライブラリーをスクリーニングする必要性を排除し、イントロン／エクソン接合点の発見に有用である。
【００４８】
スクリーニングで完全長ｃＤＮＡを求める場合、より大きなｃＤＮＡを含むようサイズ選択したライブラリーを使用するのが望ましい。遺伝子の５’領域を含む配列をより多く含んでいるという点で、無作為プライミングしたライブラリーが好ましい。無作為プライミングしたライブラリーの使用は、オリゴｄ（Ｔ）ライブラリーが完全長ｃＤＮＡを産生しない状況で特に好ましいであろう。ゲノムライブラリーは、配列を５’非転写調節領域へと伸長さ細胞のに有用な場合がある。
【００４９】
市販品が入手可能な毛細管電気泳動系を用いて、ＰＣＲまたは配列決定産物のサイズを分析、またはヌクレオチド配列を確認することができる。例えば、毛細管配列決定は、電気泳動分離用の流動性ポリマー、レーザー励起する４種の異なる蛍光色素（各ヌクレオチドにつき１種ずつ）、および電荷結合素子カメラによる放射された波長の検出を利用することができる。出力／光強度は適当なソフトウェア（例えばＧＥＮＯＴＹＰＥＲおよびＳｅｑｕｅｎｃｅ ＮＡＶＩＧＡＴＯＲ、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を用いて電気シグナルに変換でき、試料のロードからコンピューター分析および電子的データ表示に至る全プロセスをコンピューター管理することができる。毛細管電気泳動は、特定の試料中に限られた量で存在するかも知れないＤＮＡの小片を配列決定するのに特に好ましい。
【００５０】
ポリペプチドの取得
ヒトスフィンゴシンキナーゼ様タンパク質は、例えばヒト細胞からの精製によって、ヒトスフィンゴシンキナーゼ様タンパク質ポリヌクレオチドの発現によって、または直接的化学合成によって取得できる。
【００５１】
タンパク質精製
ヒトスフィンゴシンキナーゼ様タンパク質を、その酵素を発現する任意の細胞（ＨＣＴ１１６， ＤＬＤ１， ＨＴ２９， Ｃａｃｏ２， ＳＷ８３７， ＳＷ４８０，およびＲＫＯ， 乳癌細胞系 ２１−ＰＴ， ２１−ＭＴ， ＭＤＡ−４６８， ＳＫ−ＢＲ３， およびＢＴ−４７４，Ａ５４９を含む）から精製することができる。ヒト正常上皮細胞および初期癌細胞は、セリンプロテアーゼＤＥＳＣ１ヒトスフィンゴシンキナーゼ様タンパク質の特に有用なソースを提供する。精製ヒトスフィンゴシンキナーゼ様タンパク質は、当分野で周知の方法を用いて、細胞内でヒトスフィンゴシンキナーゼ様タンパク質と通常会合している他の化合物、例えば特定のタンパク質、炭水化物または脂質から分離される。そのような方法には、サイズ排除クロマトフラフィー、硫酸アンモニウム分画、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーおよび調製用ゲル電気泳動が挙げられるが、これらに制限されない。精製ヒトスフィンゴシンキナーゼ様タンパク質の調製は、少なくとも８０％純粋；９０％、９５％または９９％純粋な調製であることが好ましい。調製物の純度は当分野で周知の任意の方法、例えばＬｉｎ ｅｔａｌ．， Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７４， １８２３１−３６，１９９９に記載のＳＤＳポリキャピラリーゲル電気泳動によって評価できる。
【００５２】
ポリヌクレオチドの発現
ヒトスフィンゴシンキナーゼ様タンパク質ポリヌクレオチドを発現さ細胞ため、挿入されたコード配列の転写と翻訳に必要な要素を含む発現ベクター中にそのポリヌクレオチドを挿入することができる。当業者に周知の方法を利用して、ヒトスフィンゴシンキナーゼ様タンパク質をコードしている配列および適当な転写および翻訳調節要素を含む発現ベクターを構築できる。これらの方法には、インビトロ組換えＤＮＡ技術、合成技術、およびインビボ遺伝子組換えがある。このような技術は、例えばＳａｍｂｒｏｏｋら、（１９８９）およびＡｕｓｕｂｅｌら、ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ．， １９８９に記載されている。
【００５３】
ヒトスフィンゴシンキナーゼ様タンパク質をコードしている配列を含み、そして発現する様々な発現ベクター／宿主系が利用できる。これらには、微生物、例えば組換えバクテリオファージ、プラスミド、またはコスミドＤＮＡ発現ベクターにより形質転換された細菌；酵母発現ベクターにより形質転換された酵母、ウイルス発現ベクター（例えばバキュロウイルス）により感染を受けた昆虫細胞系、ウイルス発現ベクター（例えばカリフラワーモザイクウイルス、ＣａＭＶ；タバコモザイクウイルス、ＴＭＶ）、若しくは細菌発現ベクター（例えばＴｉまたはｐＢＲ３２２プラスミド）により形質転換された植物細胞系、または動物細胞系が包含されるがこれらに限定される訳ではない。
【００５４】
調節要素または調節配列は、宿主細胞タンパク質と相互作用して転写と翻訳を実行するベクターの非翻訳領域−エンハンサー、プロモーター、５’および３’非翻訳領域−である。かかる要素はその強さと特異性において異なっている。利用するベクター系および宿主に応じて、構成的および誘導的プロモーターを包含する、多数の好適な転写および翻訳要素を使用できる。例えば、細菌系でクローニングを行う場合、ＢＬＵＥＳＣＲＩ．Ｐ．Ｔファージミド（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ， ＬａＪｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆ．）またはｐＳＰＯＲＴ１プラスミド（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）等のハイブリッドｌａｃＺプロモーターのような誘導的プロモーターを使用できる。バキュロウイルスのポリヘドリンプロモーターは昆虫細胞に使用できる。植物細胞のゲノムから誘導したプロモーターまたはエンハンサー（例えば熱ショック、ＲＵＢＩＳＣＯ、および貯蔵タンパク質遺伝子）、または植物ウイルスから誘導したプロモーターまたはエンハンサー（例えば、ウイルスプロモーターまたはリーダー配列）を該ベクター中にクローニングすることができる。哺乳動物細胞系では、哺乳動物遺伝子由来の、または哺乳動物ウイルス由来のプロモーターが好ましい。ヒトスフィンゴシンキナーゼ様タンパク質をコードしているヌクレオチド配列を複数コピー含む細胞系を作製する必要がある場合は、ＳＶ４０またはＥＢＶに基づくベクターを適当な選択マーカーと共に使用することができる。
【００５５】
細菌および酵母発現系
細菌系では、ヒトスフィンゴシンキナーゼ様タンパク質に対して意図する用途に応じて幾つかの発現ベクターを選択できる。例えば、抗体の誘導のため、大量のヒトスフィンゴシンキナーゼ様タンパク質が必要である場合は、容易に精製できる融合タンパク質の高レベル発現を指令するベクターが使用できる。このようなベクターは、ＢＬＵＥＳＣＲＩ．Ｐ．Ｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）のような多機能Ｅ．ｃｏｌｉクローニングおよび発現ベクターを包含するが、これに限定される訳ではない。ＢＬＵＥＳＣＲＩ．Ｐ．Ｔベクターにおいては、ヒトスフィンゴシンキナーゼ様タンパク質をコードしている配列を、β−ガラクトシダーゼのアミノ末端Ｍｅｔとこれに続く７残基の配列と共にフレーム内で該ベクター中にライゲーションすることができ、その結果ハイブリッドタンパク質が産生される。ｐＩＮベクター（Ｖａｎ Ｈｅｅｋｅ ＆ Ｓｃｈｕｓｔｅｒ， Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２６４，５５０３−５５０９，１９８９）またはｐＧＥＸベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ， Ｍａｄｉｓｏｎ， Ｗｉｓ．）もまた、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）を伴う融合タンパク質として外来ポリペプチドを発現さ細胞のに使用できる。一般に、このような融合タンパク質は可溶性であり、グルタチオン−アガロースビーズに吸着させ、その後遊離グルタチオンの存在下で溶離することにより、溶菌させた細胞から容易に精製できる。このような系で調製したタンパク質は、ヘパリン、トロンビン、または第Ｘａ因子プロテアーゼ開裂部位を含むよう設計でき、その結果、目的とするクローンポリペプチドをＧＳＴ部分から随意に解放することができる。
【００５６】
酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおいては、α因子、アルコールオキシダーゼ、およびＰＧＨのような構成的または誘導的プロモーターを含む幾つかのベクターが使用できる。総説としてＡｕｓｕｂｅｌら、（１９８９）およびＧｒａｎｔら、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． １５３，５１６−５４４，１９８７を参照されたい。
【００５７】
植物および昆虫発現系
植物発現ベクターを使用する場合、ヒトスフィンゴシンキナーゼ様タンパク質をコードしている配列の発現は、幾つかのプロモーターのうち任意のものにより駆動できる。例えば、ＣａＭＶの３５Ｓおよび１９Ｓプロモーターのようなウイルスプロモーターを、単独で、またはＴＭＶ由来のオメガリーダー配列と組み合わせて使用できる（Ｔａｋａｍａｔｓｕ， ＥＭＢＯ Ｊ． ６，３０７−３１１，１９８７）。別法として、ＲＵＢＩＳＣＯの小サブユニットのような植物プロモーターまたは熱ショックプロモーターを使用することもできる（Ｃｏｒｕｚｚｉら、ＥＭＢＯ Ｊ． ３，１６７１−１６８０，１９８４；Ｂｒｏｇｌｉｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２４，８３８−８４３，１９８４；Ｗｉｎｔｅｒら、Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｐｒｏｂｌ．Ｃｅｌｌ Ｄｉｆｆｅｒ． １７，８５−１０５，１９９１）。これらの構築物は、直接ＤＮＡ形質転換または病原体媒介トランスフェクションにより植物細胞中に導入できる。このような技術は、幾つかの一般に入手可能な総説に記載されている（例えば、ＨｏｂｂｓまたはＭｕｒｒａｙ、ＭＣＧＲＡＷ ＨＩＬＬ ＹＥＡＲＢＯＯＫ ＯＦ ＳＣＩＥＮＣＥ ＡＮＤ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ， ＭｃＧｒａｗ Ｈｉｌｌ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｎ．Ｙ．， ｐｐ１９１−１９６，１９９２）。
【００５８】
昆虫系もまたヒトスフィンゴシンキナーゼ様タンパク質の発現に使用できる。例えば、かかる系の１つＡｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ核多角体病ウイルス（ＡｃＮＰＶ）は、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉ．ｐ．ｅｒｄａ細胞またはＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａの幼虫で外来遺伝子を発現さ細胞ベクターとして使用する。ヒトスフィンゴシンキナーゼ様タンパク質をコードしている配列を、ポリヘドリン遺伝子のような該ウイルスの非必須領域中にクローニングし、ポリヘドリンプロモーターの調節下に置くことができる。ヒトスフィンゴシンキナーゼ様タンパク質をうまく挿入すると、ポリヘドリン遺伝子は不活性化し、コートタンパク質を欠く組換えウイルスが生成する。次いでこの組換えウイルスをＳ．ｆｒｕｇｉ．ｐ．ｅｒｄａ細胞またはＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａの幼虫への感染に使用し、そこでヒトスフィンゴシンキナーゼ様タンパク質を発現さ細胞ことができる（Ｅｎｇｅｌｈａｒｄら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ９１，３２２４−３２２７，１９９４）。
【００５９】
哺乳動物発現系
ウイルスに基づく多くの発現系を用いて哺乳動物宿主細胞でヒトスフィンゴシンキナーゼ様タンパク質を発現さ細胞ことができる。例えば、発現ベクターとしてアデノウイルスを使用する場合、ヒトスフィンゴシンキナーゼ様タンパク質をコードしている配列は、後期プロモーターおよび３部に分かれたリーダー配列を含むアデノウイルス転写／翻訳複合体中にライゲーションできる。該ウイルスゲノムの非必須Ｅ１またはＥ３領域における挿入を用いて、感染宿主細胞においてヒトスフィンゴシンキナーゼ様タンパク質を発現できる生存ウイルスを取得できる（Ｌｏｇａｎ ＆ Ｓｈｅｎｋ， Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ８１，３６５５−３６５９，１９８４）。所望によりラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）エンハンサーのような転写エンハンサーを用いて、哺乳動物宿主細胞での発現を増大さ細胞ことができる。
【００６０】
ヒト人工染色体（ＨＡＣ）もまた、プラスミドが内包し発現するＤＮＡ断片よりも大きなＤＮＡ断片の運搬に使用できる。６Ｍから１０ＭのＨＡＣを組み立て、常套的送達法により細胞に到達さ細胞（例えば、リポソーム、ポリカチオンアミノポリマー、または小胞）。
【００６１】
さらに、ヒトスフィンゴシンキナーゼ様タンパク質をコードしている配列のより効率的な翻訳を達成するために、特異的開始シグナルを使用できる。かかるシグナルはＡＴＧ開始コドンおよび連続配列を包含する。ヒトスフィンゴシンキナーゼ様タンパク質をコードしている配列、その開始コドン、および上流配列を適当な発現ベクター中に挿入した場合、さらなる転写または翻訳調節シグナルは必要ないであろう。しかしながら、コード配列またはその断片のみを挿入した場合は、外因性の翻訳調節シグナル（ＡＴＧ開始コドンを包含する）を供給すべきである。開始コドンは挿入物全体を確実に翻訳さ細胞ために、正しいリーディングフレームになければならない。外因性翻訳要素および開始コドンは天然および合成両者の様々な起源であってよい。発現の効率は、使用する特定の細胞系に対し適切なエンハンサーを存在さ細胞ことにより増強できる（Ｓｃｈａｒｆら、Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｐｒｏｂｌ．Ｃｅｌｌ Ｄｉｆｆｅｒ． ２０，１２５−１６２，１９９４）。
【００６２】
宿主細胞
宿主細胞菌株は、挿入した配列の発現を調節する能力または発現されたヒトスフィンゴシンキナーゼ様タンパク質を所望の方法で処理できる能力を目的として選択できる。該ポリペプチドのこのような修飾には、アセチル化、カルボキシ化、グリコシル化、燐酸化、脂質化、およびアシル化が包含されるがこれらに限定されない。該ポリペプチドの「プレプロ」型を開裂する翻訳後プロセシングもまた、正しい挿入、折り畳み、および／または機能を促進するために使用できる。翻訳後活性のための特異的な細胞機構および特徴的メカニズムを持つ異なる宿主細胞（例えばＣＨＯ、ＨｅＬａ、ＭＤＣＫ、ＨＥＫ２９３およびＷＩ３８）が、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ；１０８０１ Ｕｎｉ．ｖ．ｅｒｓｉｔｙ Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ， Ｍａｎａｓｓａｓ， ＶＡ ２０１１０−２２０９）から入手でき、外来タンパク質の正しい修飾およびプロセシングを確実とするために選択できる。
【００６３】
組換えタンパク質の長期高収量産生のために、安定な発現が好ましい。例えば、ヒトスフィンゴシンキナーゼ様タンパク質を安定に発現する細胞系を、ウイルス複製起点および／または内因性発現要素、および同じまたは別のベクター上にある選択マーカー遺伝子を含む発現ベクターを用いて形質転換することができる。該ベクターの導入に続いて、細胞を強化培地で１−２日間生育させた後、培地を選択培地に交換することができる。選択マーカーの目的は選択に対する抵抗性を付与することであり、その存在が、導入されたヒトスフィンゴシンキナーゼ様タンパク質配列をうまく発現する細胞の生育と回収を可能にする。安定に形質転換された細胞の耐性クローンは、その細胞型にとって適当な組織培養技術を用いて増殖さ細胞ことができる。例えば、ＡＮＩＭＡＬ ＣＥＬＬ ＣＵＬＴＵＲＥ， Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，ｅｄ．，１９８６を参照されたい。
【００６４】
幾つかの選択系を用いて、形質転換された細胞系を回収できる。これらには、それぞれｔｋ−またはａｐｒｔ−細胞で使用できる単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（Ｗｉｇｌｅｒら、Ｃｅｌｌ １１，２２３−３２，１９７７）およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｌｏｗｙら、Ｃｅｌｌ ２２，８１７−２３，１９８０）遺伝子が包含されるが、これらに限定される訳ではない。さらに、代謝拮抗物質、抗生物質、または除草剤耐性を選択の基準に用いることができる。例えば、ｄｈｆｒはメソトレキサートに対する耐性を付与し（Ｗｉｇｌｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ７７，３５６７−７０，１９８０）ｎｐｔはアミノグリコシド、ネオマイシンおよびＧ−４１８に対する耐性を付与し（Ｃｏｌｂｅｒｅ−Ｇａｒａｐｉｎら、Ｊ．Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １５０，１０１４，１９８１）、そしてａｌｓおよびｐａｔはそれぞれクロルスルフロンおよびホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼに対する耐性を付与する（Ｍｕｒｒａｙ， １９９２，上記）。さらなる選択遺伝子が記載されている。例えば、ｔｒｐＢは細胞がトリプトファンの代わりにインドールを利用するようにさせ、ｈｉｓＤは細胞がヒスチジンの代わりにヒスチノールを利用するようにさ細胞（Ｈａｒｔｍａｎ ＆ Ｍｕｌｌｉｇａｎ， Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ８５，８０４７−５１，１９８８）。アントシアニンのような可視マーカー、β−グルクロニダーゼとその基質ＧＵＳ、およびルシフェラーゼとその基質ルシフェリンは、形質転換体を同定し、特異的ベクター系に帰すことのできる一過性または安定なタンパク質発現の量を定量するために使用できる（Ｒｈｏｄｅｓら、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ． ５５，１２１−１３１，１９９５）。
【００６５】
発現の検出
マーカー遺伝子発現の存在はヒトスフィンゴシンキナーゼ様タンパク質ポリヌクレオチドが存在することも示唆しているが、ヒトスフィンゴシンキナーゼ様タンパク質の存在と発現は確認する必要がある。例えば、ヒトスフィンゴシンキナーゼ様タンパク質をコードしている配列がマーカー遺伝子配列内部に挿入されている場合、誘導または選択に応答して、通常、ヒトスフィンゴシンキナーゼ様タンパク質ポリヌクレオチドの発現を示す。
【００６６】
これとは別に、ヒトスフィンゴシンキナーゼ様タンパク質ポリヌクレオチドを含み、ＰＩ−ヒトスフィンゴシンキナーゼ様タンパク質を発現する宿主細胞は、当業者に知られる様々な方法によって同定できる。これらの方法には、ＤＮＡ−ＤＮＡまたはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリダイゼーションおよびタンパク質生検またはイムノアッセイ技術（核酸またはタンパク質の検出および／または定量のための膜、溶液、またはチップに基づく技術を包含する）が包含されるがこれらに限定されない。例えば、ヒトスフィンゴシンキナーゼ様タンパク質をコードしているポリヌクレオチド配列の存在は、プローブまたは断片またはヒトスフィンゴシンキナーゼ様タンパク質をコードしているポリヌクレオチドの断片を使用するＤＮＡ−ＤＮＡまたはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリダイゼーションまたは増幅によって検出できる。核酸増幅に基づく検定は、ヒトスフィンゴシンキナーゼ様タンパク質を含む形質転換体を検出するための、ヒトスフィンゴシンキナーゼ様タンパク質ポリヌクレオチドをコードしている配列から選択されるオリゴヌクレオチドの使用を含む。
【００６７】
ヒトスフィンゴシンキナーゼ様タンパク質に対し特異的なポリクローナルまたはモノクローナル抗体のいずれかを使用して該ポリペプチドの発現を検出および測定するための様々なプロトコルが当分野で知られている。例として、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、および蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）がある。ヒトスフィンゴシンキナーゼ様タンパク質上の２個の非干渉性エピトープに反応するモノクローナル抗体を用いる、２部位のモノクローナルに基づくイムノアッセイが使用でき、または、競合的結合検定を使用することができる。これらのおよびその他の検定はＨａｍｐｔｏｍら、ＳＥＲＯＬＯＧＩＣＡＬ ＭＥＴＨＯＤＳ： Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ， ＡＰＳ Ｐｒｅｓｓ， Ｓｔ．Ｐａｕｌ， Ｍｉｎｎ．， １９９０およびＭａｄｄｏｘら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ． １５８，１２１１−１２１６，１９８３に記載されている。
【００６８】
多岐にわたる標識およびコンジュゲーション技術が当業者に知られており、様々な核酸およびアミノ酸検定に使用できる。ヒトスフィンゴシンキナーゼ様タンパク質をコードしているポリヌクレオチドに関連する配列を検出するための標識化ハイブリダイゼーションまたはＰＣＲプローブを調製する手段は、標識したヌクレオチドを使用する、オリゴ標識化、ニック翻訳、末端標識化、またはＰＣＲ増幅を包含する。これとは別に、ヒトスフィンゴシンキナーゼ様タンパク質をコードしている配列を、ｍＲＮＡプローブの産生のためのベクター中にクローニングすることもできる。このようなベクターは当分野で既知であり、市販品が入手でき、標識化ヌクレオチドおよび適当なＲＮＡポリメラーゼ、例えばＴ７、Ｔ３、またはＳＰ６を添加することによりインビトロでのＲＮＡプローブの合成に使用することができる。これらの方法は、市販の様々なキットを用いて実施できる（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ、 Ｐｒｏｍｅｇａ、およびＵＳ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ）。検出を容易にするために使用できる適当なリポーター分子または標識には、放射性核種、酵素、および蛍光、化学ルミネセント、または色素生成物質、ならびに基質、補助因子、インヒビター、磁性粒子などが包含される。
【００６９】
ポリペプチドの発現および精製
ヒトスフィンゴシンキナーゼ様タンパク質をコードしているヌクレオチド配列で形質転換させた宿主細胞は、発現と、細胞培養からのタンパク質の回収に適した条件下で培養できる。形質転換細胞により産生されたポリペプチドは、その配列および／または使用したベクターに応じて分泌されまたは細胞内に貯留され得る。当業者には理解できるであろうが、ヒトスフィンゴシンキナーゼ様タンパク質をコードしているポリヌクレオチドを含む発現ベクターは、原核または真核細胞膜を通った可溶性ヒトスフィンゴシンキナーゼ様タンパク質の分泌を指令する、または膜結合ヒトスフィンゴシンキナーゼ様タンパク質の膜挿入を指令する、シグナル配列を含むよう設計できる。
【００７０】
上に論じたように、他の構築物を用いて、ヒトスフィンゴシンキナーゼ様タンパク質をコードしている配列を、可溶性タンパク質の精製を促進するポリペプチドドメインをコードしているヌクレオチド配列と結合さ細胞ことができる。このような精製促進ドメインは、金属キレート化ペプチド、例えば固定化金属上での精製を可能にするヒスチジン−トリプトファンモジュール、固定化免疫グロブリン上での精製を可能にするタンパク質Ａドメイン、およびＦＬＡＧＳ伸長／親和精製系で利用するドメインが包含されるが、これらに限定されない（Ｉｍｍｕｎｅｘ Ｃｏｒｐ．， Ｓｅａｔｔｌｅ， Ｗａｓｈ．）。精製ドメインとヒトスフィンゴシンキナーゼ様タンパク質との間に開裂可能リンカー配列、例えば第Ｘａ因子またはエンテロキナーゼに特異的なリンカー配列を入れること（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ）もまた、精製を促進するために利用できる。このような発現ベクターの１つは、ヒトスフィンゴシンキナーゼ様タンパク質と、チオレドキシンまたはエンテロキナーゼ開裂部位に先立つ６個のヒスチジン残基とを含む融合タンパク質の発現を提供する。このヒスチジン残基はＩＭＡＣ（Ｐｏｒａｔｈら、Ｐｒｏｔ．Ｅｘｐ．Ｐｕｒｉｆ． ３，２６３−２８１，１９９２に記載の固定化金属イオン親和クロマトグラフィー）による精製を促進し、一方エンテロキナーゼ開裂部位は融合タンパク質からのヒトスフィンゴシンキナーゼ様タンパク質の精製手段を提供する。融合タンパク質を含むベクターはＫｒｏｌｌら、ＤＮＡ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． １２，４４１−４５３，１９９３に開示されている。
【００７１】
化学合成
ヒトスフィンゴシンキナーゼ様タンパク質をコードしている配列は、その全体または一部を、当分野で周知の化学的方法を用いて合成できる（Ｃａｒｕｔｈｅｒｓら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．Ｓｙｍｐ．Ｓｅｒ． ２１５−２２３，１９８０；Ｈｏｒｎら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．Ｓｙｍｐ．Ｓｅｒ． ２２５−２３２，１９８０）。これとは別に、ヒトスフィンゴシンキナーゼ様タンパク質自身を、そのアミノ酸配列を合成するための化学的方法、例えば固相技術を用いる直接ペプチド合成を用いて調製できる（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ， Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ． ８５，２１４９−２１５４，１９６３；Ｒｏｂｅｒｇｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６９，２０２−２０４，１９９５）。タンパク質合成は手動技術またはオートメーションを用いて実施できる。自動化合成は、例えばＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ４３１Ａペプチド合成機（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を用いて達成できる。所望により、ヒトスフィンゴシンキナーゼ様タンパク質の断片を別々に合成し、化学的方法を用いて合して完全長の分子を調製することもできる。
【００７２】
新たに合成したペプチドは、調製用高速液体クロマトグラフイー（例えばＣｒｅｉｇｈｔｏｎ， ＰＲＯＴＥＩＮＳ： ＳＴＲＵＣＴＵＲＥＳ ＡＮＤ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＰＲＩＮＣＩ．Ｐ．ＬＥＳ， ＷＨ Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｎ．Ｙ．， １９８３）により実質的に精製できる。合成ヒトスフィンゴシンキナーゼ様タンパク質の組成はアミノ酸分析または配列決定により確認できる（例えばエドマン分解法；Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ、上記を参照されたい）。さらに、直接合成中にヒトスフィンゴシンキナーゼ様タンパク質のアミノ酸配列の任意の部分を改変させ、そして／または化学的方法を用いて他のタンパク質由来の配列と合して、変異体ポリペプチドまたは融合タンパク質を調製することができる。
【００７３】
改変ポリペプチドの調製
当業者には理解できるであろうが、天然に存在しないコドンを有するヒトスフィンゴシンキナーゼ様タンパク質コード化ヌクレオチドを調製することは有利であり得る。例えば、特定の原核または真核宿主が好むコドンを選択して、タンパク質発現の速度を増大させ、または所望の性質、例えば天然に存在する配列から産み出される転写物の半減期より長い半減期を持つＲＮＡ転写物を調製することができる。
【００７４】
本明細書に開示するヌクレオチド配列は、当分野で一般的に知られる方法を用いて、ヒトスフィンゴシンキナーゼ様タンパク質またはｍＲＮＡ産物のクローニング、プロセシング、および／または発現を修飾する改変を包含する（但しこれらに限定される訳ではない）様々な理由で、該ポリペプチドコード配列を改変さ細胞ように設計できる。無作為断片化によるＤＮＡシャフリングと遺伝子断片および合成オリゴヌクレオチドのＰＣＲ再集合を用いてヌクレオチド配列を設計できる。例えば、位置指定突然変異誘発を用いて、新たな制限部位を挿入し、グリコシル化パターンを変え、コドンの優先性を変え、スプライス変異体を調製し、突然変異を導入する等を実施できる。
【００７５】
抗体
当分野で知られているいかなる型の抗体も、ヒトスフィンゴシンキナーゼ様タンパク質のエピトープに特異的に結合するよう作製できる。本明細書で使用する「抗体」とは、無傷の免疫グロブリン分子、およびその断片、例えばＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦｖを包含し、これらはヒトスフィンゴシンキナーゼ様タンパク質のエピトープに結合できる。典型的には、エピトープを形成するためには少なくとも６、８、１０、または１２の連続するアミノ酸が必要である。しかしながら、非連続アミノ酸を含むエピトープはより多くの、例えば少なくとも１５、２５、または５０のアミノ酸を必要とするかも知れない。
【００７６】
ヒトスフィンゴシンキナーゼ様タンパク質のエピトープに特異的に結合する抗体は治療に使用でき、そして免疫化学検定、例えばウェスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、ラジオイムノアッセイ、免疫組織化学検定、免疫沈降、またはその他の当分野で既知の免疫化学的検定に使用できる。所望の特異性を有する抗体の同定のため、様々なイムノアッセイが使用できる。競合的結合または免疫放射検定のための多数のプロトコルが当分野でよく知られている。このようなイムノアッセイは典型的には、免疫原と、その免疫原に特異結合する抗体との間の複合体形成の測定を含んでいる。
【００７７】
典型的には、ヒトスフィンゴシンキナーゼ様タンパク質に特異的に結合する抗体は、免疫化学検定に使用する時、他のタンパク質が提供する検出シグナルより少なくとも５、１０、または２０倍高い検出シグナルを提供する。好ましくは、ヒトスフィンゴシンキナーゼ様タンパク質に特異結合する抗体は、免疫化学検定で他のタンパク質を検出せず、ヒトスフィンゴシンキナーゼ様タンパク質を溶液から免疫沈降さ細胞ことができる。
【００７８】
ヒトスフィンゴシンキナーゼ様タンパク質は、哺乳動物、例えばマウス、ラット、ウサギ、モルモット、サル、またはヒトを免疫してポリクローナル抗体を産生さ細胞のに使用できる。所望により、ヒトスフィンゴシンキナーゼ様タンパク質は、担体タンパク質、例えば牛血清アルブミン、チログロブリン、およびスカシガイヘモシアニンとコンジュゲートさ細胞ことができる。宿主の種に応じて、免疫学的反応を増大さ細胞ために種々のアジュバントを使用できる。このようなアジュバントは、フロイントアジュバント、鉱物性ゲル（例えば水酸化アルミニウム）、および界面活性物質（例えばリゾレシチン、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油性エマルジョン、スカシガイヘモシアニン、およびジニトロフェノール）を包含するがこれらに限定されない。ヒトに使用するアジュバントの中ではＢＣＧ（ｂａｃｉｌｌｉ Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ）およびＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐａｒｖｕｍが特に有用である。
【００７９】
ヒトスフィンゴシンキナーゼ様タンパク質に特異的に結合するモノクローナル抗体は、培養中の連続的細胞系により抗体分子の産生を提供する任意の技術を用いて調製できる。これらの技術には、ハイブリドーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術、およびＥＢＶ−ハイブリドーマ技術があるがこれらに限定されない（Ｋｏｈｌｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ ２５６，４９５−４９７，１９８５； Ｋｏｚｂｏｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ８１，３１−４２，１９８５； Ｃｏｔｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ８０，２０２６−２０３０，１９８３； Ｃｏｌｅら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． ６２，１０９−１２０，１９８４）。
【００８０】
さらに、マウス抗体遺伝子をヒト抗体遺伝子にスプライシングして適当な抗原特異性と生物活性を持つ分子を得る、「キメラ抗体」の産生のために開発された技術が利用できる（Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ８１，６８５１−６８５５，１９８４； Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ ３１２，６０４−６０８，１９８４； Ｔａｋｅｄａら、Ｎａｔｕｒｅ ３１４，４５２−４５４，１９８５）。モノクローナルおよびその他の抗体はまた、これを治療に使用した場合に患者が該抗体に対する免疫反応を起こすのを防ぐため、「ヒト化」することができる。このような抗体は、治療に直接使用できるほど配列が充分ヒトに類似しているかも知れず、または幾つかの重要残基の変更を必要とするかも知れない。齧歯類の抗体とヒト配列の間の配列相違は、個々の残基の位置指定突然変異誘発により、または相補性決定領域全体の格子により、ヒト配列内の残基と相違する残基を置き換えることによって最小化することができる。別法として、ヒト化抗体はＧＢ２１８８６３８Ｂに記載のように組換え法を用いて調製できる。ヒトスフィンゴシンキナーゼ様タンパク質に特異的に結合する抗体は、Ｕ．Ｓ．５５６５３３２に開示のように、部分的または完全にヒト化した抗原結合部位を含むことができる。
【００８１】
これに代わり、当分野で既知の方法を用いて、一本鎖抗体の調製のために記載した技術を適合させ、ヒトスフィンゴシンキナーゼ様タンパク質に特異結合する一本鎖抗体を調製することができる。関連する特異性を持つが別個のイディオタイプ組成を有する抗体を、無作為組み合わせ免疫グロブリンライブラリーから鎖シャフリングによって調製することができる（Ｂｕｒｔｏｎ， Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ８８，１１１２０−２３，１９９１）。
【００８２】
一本鎖抗体はまた、ハイブリドーマｃＤＮＡを鋳型に用いて、ＰＣＲのようなＤＮＡ増幅法を用いて組み立てることができる（Ｔｈｉｒｉｏｎら、１９９６， Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ Ｐｒｅｖ． ５，５０７−１１）。一本鎖抗体は単一または二重特異性であり得、また、二価または四価であり得る。四価二重特異性一本鎖抗体の組み立ては例えばＣｏｌｏｍａ ＆ Ｍｏｒｒｉｓｏｎ， １９９７， Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １５，１５９−６３に教示されている。二価二重特異性一本鎖抗体の組み立てはＭａｌｌｅｎｄｅｒ ＆ Ｖｏｓｓ， １９９４， Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２６９，１９９−２０６に教示されている。
【００８３】
下記のように、一本鎖抗体をコードしているヌクレオチド配列を手動または自動ヌクレオチド合成を用いて組み立て、標準的組換えＤＮＡ法を用いて発現構築物中にクローニングし、そして細胞中に導入してコード配列を発現さ細胞ことができる。別法として、一本鎖抗体を、例えば糸状ファージ技術を用いて直接調製することもできる（Ｖｅｒｈａａｒら、１９９５， Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ６１，４９７−５０１； Ｎｉｃｈｏｌｌａら、１９９３， Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ． １６５，８１−９１）。
【００８４】
ヒトスフィンゴシンキナーゼ様タンパク質に特異結合する抗体はまた、リンパ球集団においてインビボ産生を誘導することによって、または、文献に開示されている極めて特異的な結合試薬のパネルまたは免疫グロブリンライブラリーをスクリーニングすることによって調製することもできる（Ｏｒｌａｎｄｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ８６，３８３３−３８３７，１９８９； Ｗｉｎｔｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ ３４９，２９３−２９９，１９９１）。
【００８５】
その他の型の抗体を、本発明方法において組み立て、治療に使用することができる。例えば、ＷＯ９３／０３１５１に開示のように、キメラ抗体を組み立てることができる。免疫グロブリンから誘導され多価且つ多重特異的である結合タンパク質、例えばＷＯ９４／１３８０４に記載の「ｄｉａｂｏｄｉｅｓ」もまた調製できる。
【００８６】
本発明に係る抗体は当分野で周知の方法により精製できる。例えば、抗体は、ヒトスフィンゴシンキナーゼ様タンパク質が結合しているカラムを通過さ細胞ことにより親和精製できる。次いで、結合した抗体を、高い塩濃度の緩衝液を用いてカラムから溶出することができる。
【００８７】
アンチセンスオリゴヌクレオチド
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、特定のＤＮＡまたはＲＮＡ配列に対し相補的なヌクレオチド配列である。いったん細胞中に導入されるとこの相補的ヌクレオチドは、該細胞が産生した天然配列と結合して複合体を形成し、転写または翻訳のいずれかを遮断する。好ましくはアンチセンスオリゴヌクレオチドは少なくとも１１ヌクレオチド長であるが、少なくとも１２、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、若しくは５０またはそれ以上のヌクレオチド長であってもよい。より長い配列もまた使用できる。アンチセンスオリゴヌクレオチド分子をＤＮＡ構築物に提供し、上記のように細胞中に導入して、その細胞におけるヒトスフィンゴシンキナーゼ様タンパク質遺伝子産物のレベルを低下さ細胞ことができる。
【００８８】
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、またはこの両者の組み合わせであってよい。オリゴヌクレオチドは、１つのヌクレオチドの５’末端を、アルキルホスホネート、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、アルキルホスホノチオエート、アルキルホスホネート、ホスホロアミデート、燐酸エステル、カルバメート、アセトアミデート、カルボキシメチルエステル、カルボネート、および燐酸トリエステルといった非ホスホジエステルヌクレオチド間結合を有する別のヌクレオチドの３’末端と共有結合さ細胞ことにより、手動で、または自動合成機によって合成できる。Ｂｒｏｗｎ， Ｍｅｔｈ．Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２０，１−８，１９９４； Ｓｏｎｖｅａｕｘ， Ｍｅｔｈ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ． ２６，１−７２，１９９４； Ｕｈｌｍａｎｎら、Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ． ９０，５４３−５８３，１９９０を参照されたい。
【００８９】
ヒトスフィンゴシンキナーゼ様タンパク質遺伝子の制御、５’、または調節領域と二本鎖を形成するアンチセンスオリゴヌクレオチドを設計することにより、ヒトスフィンゴシンキナーゼ様タンパク質遺伝子発現の修飾が得られる。転写開始部位、例えば開始部位から−１０および＋１０位の間から誘導されるオリゴヌクレオチドが好ましい。同様に、「三重らせん」塩基対合法を用いて阻害を達成できる。三重らせん対合は、二重らせんがポリメラーゼ、転写因子またはシャペロンの結合に対して十分に開くという能力の阻害を引き起こすため、有用である。三本鎖ＤＮＡを用いる治療上の進歩が文献に記載されている（例えばＧｅｅら、Ｈｕｂｅｒ ＆ Ｃａｒｒ， ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＡＮＤ ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＩＣ ＡＰＰＲＯＡＣＨＥＳ， Ｆｕｔｕｒａ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．， Ｍｔ．Ｋｉｓｃｏ， Ｎ．Ｙ．， １９９４）。転写物がリボソームに結合するのを防ぐことによりｍＲＮＡの翻訳を遮断するアンチセンスオリゴヌクレオチドもまた設計できる。
【００９０】
アンチセンスオリゴヌクレオチドとヒトスフィンゴシンキナーゼ様タンパク質ポリヌクレオチドの相補配列との間に好結果の複合体を形成さ細胞ためには、正確な相補性は必要ない。例えばヒトスフィンゴシンキナーゼ様タンパク質ポリヌクレオチドに対し正確に相補的である２、３、４、若しくは５またはそれ以上の長さの連続するヌクレオチドを含み、その各々が、隣接するヒトスフィンゴシンキナーゼ様タンパク質ヌクレオチドとは相補的ではない連続するある長さのヌクレオチドによって隔てられているアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ヒトスフィンゴシンキナーゼ様タンパク質ｍＲＮＡに対して充分な標的化特異性を提供できる。好ましくは、相補的な連続ヌクレオチドの長さはそれぞれ少なくとも４、５、６、７若しくは８またはそれ以上のヌクレオチド長である。非相補的な介在配列は、好ましくは１、２、３、または４ヌクレオチド長である。当業者は、アンチセンス−センスの対の算出融点を容易に使用して、特定のアンチセンスオリゴヌクレオチドと特定のヒトスフィンゴシンキナーゼ様タンパク質ポリヌクレオチド配列間で寛容されるミスマッチの程度を決定できるであろう。
【００９１】
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ヒトスフィンゴシンキナーゼ様タンパク質ポリヌクレオチドとハイブリダイズする能力に影響を及ぼすことなく修飾できる。これらの修飾は該アンチセンス分子の内部、または一端若しくは両端である。例えば、ヌクレオシド間の燐酸結合は、アミノ基と末端リボースの間にいろいろな数の炭素残基を有するコレステリルまたはジアミン部分を加えることによって修飾できる。修飾された塩基および／または糖、例えばリボースの代わりのアラビノース、または３’ヒドロキシ基または５’燐酸基が置換されている３’，５’−置換オリゴヌクレオチドもまた修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドに使用できる。これらの修飾オリゴヌクレオチドは当分野で周知の方法により調製できる。例えば、Ａｇｒａｗａｌら、Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １０，１５２−１５８，１９９２； Ｕｈｌｍａｎｎら、Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ． ９０，５４３−５８４，１９９０； Ｕｈｌｍａｎｎら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ．Ｌｅｔｔ． ２１５，３５３９−３５４２，１９８７を参照されたい。
【００９２】
リボザイム
リボザイムは触媒活性を有するＲＮＡ分子である。例えば、Ｃｅｃｈ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３６，１５３２−１５３９； １９８７； Ｃｅｃｈ， Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ． ５９，５４３−５６８； １９９０， Ｃｅｃｈ， Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ． ２，６０５−６０９； １９９２， Ｃｏｕｔｕｒｅ ＆ Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂ， Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ． １２，５１０−５１５， １９９６を参照されたい。当分野で知られるように、リボザイムは、ＲＮＡ配列を開裂することにより遺伝子機能を阻害するのに使用できる（例えば、Ｈａｓｅｌｏｆｆら、米国特許５６４１６７３）。リボザイムの作用機構は、相補的標的ＲＮＡに対するリボザイム分子の配列特異的ハイブリダイゼーションと、その後のエンドヌクレオ分解的な（ｅｎｄｏｎｕｃｌｅｏｌｙｔｉｃ）開裂を含む。例には、特異的ヌクレオチド配列のエンドヌクレオ分解的な開裂を特異的且つ効果的に触媒できる、設計されたハンマーヘッドモチーフリボザイム分子がある。
【００９３】
ヒトスフィンゴシンキナーゼ様タンパク質ポリヌクレオチドのコード配列を用いて、ヒトスフィンゴシンキナーゼ様タンパク質ポリヌクレオチドから転写されたｍＲＮＡに特異結合するリボザイムを作製できる。他のトランスのＲＮＡ分子を極めて配列特異的に開裂できるリボザイムを設計し組み立てる方法が開発され、当分野で記載されている（Ｈａｓｅｌｏｆｆら、Ｎａｔｕｒｅ ３３４，５８５−５９１，１９８８）。例えば、リボザイムの開裂活性は、別個の「ハイブリダイゼーション」領域を該リボザイム中に組み入れることによって、特定のＲＮＡを標的とさ細胞ことができる。このハイブリダイゼーション領域は標的ＲＮＡに対し相補的な配列を含んでおり、したがってその標的と特異的にハイブリダイズする（例えばＧｅｒｌａｃｈら、ＥＰ３２１２０１を参照されたい）。
【００９４】
ヒトスフィンゴシンキナーゼ様タンパク質ＲＮＡ標的内部の特異的リボザイム開裂部位は、この標的分子を、以下の配列：ＧＵＡ、ＧＵＵ、およびＧＵＣを包含するリボザイム開裂部位についてスキャンすることにより同定できる。同定できたならば、該開裂部位を含む標的ＲＮＡの領域に対応する、１５および２０の間のリボヌクレオチドを有する短いＲＮＡ配列を、標的を非機能的にし得る二次構造の特徴について評価できる。さらに、候補のヒトスフィンゴシンキナーゼ様タンパク質ＲＮＡ標的の適合性を、リボヌクレアーゼ防護検定を用いて相補的オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションに対する利用可能性を試験することによって評価できる。より長い相補配列を用いて、標的に対するハイブリダイゼーション配列の親和性を増大さ細胞ことができる。リボザイムのハイブリダイズおよび開裂する領域は、相補領域を介して標的ＲＮＡにハイブリダイズする時、リボザイムの触媒領域が標的を開裂し得るといったように、完全に相関している。
【００９５】
リボザイムはＤＮＡ構築物の一部として細胞内に導入できる。マイクロ注入、リポソーム媒介トランスフェクション、電気穿孔、または燐酸カルシウム沈殿といった機械的方法を用いて、ヒトスフィンゴシンキナーゼ様タンパク質発現の低下が望まれる細胞中にリボザイム含有ＤＮＡ構築物を導入することができる。これとは別に、細胞がＤＮＡ構築物を安定的に保持することが望まれる場合は、該構築物をプラスミド上で供給し、当分野で知られるように、別個の要素として維持するか、または細胞のゲノム中に組み込むことができる。リボザイムコード化ＤＮＡ構築物は、細胞中のリボザイムの転写を調節するために、プロモーター要素、エンハンサーまたはＵＡＳ要素、および転写ターミネーターシグナルといった転写調節要素を含み得る。
【００９６】
リボザイムはＤＮＡの構築物するとともに細胞へ導入することができた。顕微鏡下注射、リポソームを媒介としたトランスフェクション、エレクトロポレーションあるいはリン酸カルシウム沈殿のような機械的方法はリボザイムを含んでいるＤＮＡを導入するために使用することができた。構築物を、それがスフィンゴシンを減少さ細胞と望まれる細胞へ、キナーゼ様蛋白質を発現さ細胞。二者択一で、細胞が安定してＤＮＡを保持することが望まれる場合、構築する、それはプラスミド上で供給することができ、個別の要素として維持する。あるいは当分野で知られている細胞のゲノムへ統合される。ＤＮＡ、構築する、細胞のリボザイムの転写のコントロールのためにプロモーター要素、エンハンーか、ＵＡＳ要素、およびターミネーターシグナルのような規定する要素を含むことができた。
【００９７】
Ｈａｓｅｌｏｆｆら、米国特許５６４１６７３に教示のように、リボザイムは、標的遺伝子の発現を誘導する因子に応答してリボザイムの発現が起こるように設計することができる。リボザイムはまた、追加レベルの調節を提供するよう設計でき、その結果、ｍＲＮＡの破壊はリボザイムと標的遺伝子の両者が細胞に誘導された時にのみ起こる。
【００９８】
示差的に発現した遺伝子
産物が蛋白質キナーゼのようなヒトスフィンゴシンと対する遺伝子の識別用方法はここに記述される。そのような遺伝子は、含んでいる障害で示差的に発現されるが、制限されない遺伝子を発現し得る、癌、アレルギーを含んでいるが喘息、中枢障害および末梢神経系障害また自己免疫疾患に制限されていなかった。さらに、そのような遺伝子は、そのような疾病の進行か治療に適切な操作に応じて差別的に調節される遺伝子を発現し得る。さらに、そのような遺伝子は増加し、一時的に調節された発現を行っているかもしれないか、あるいは組織か有機物の異なる段階で減少する。示差的に発現された遺伝子は、さらにコントロール対実験の条件の下でその発現を調節し得る。さらに、ヒトスフィンゴシン、キナーゼ様遺伝子あるいは遺伝生成物それ自体差異の発現に関して試験する。
【００９９】
病気の状態において発現が異なる程度は、差異のディスプレイ技術のような標準の特性を記述する技術によって視覚化されるように単に十分に大きい必要があります。発現差が視覚化されるかもしれないような他の標準の特性記述技術としては量的ＲＴ、ＰＣＲ（逆転写酵素）、またノーザン分析が含まれるがこれに制限されない。
【０１００】
示差的発現した遺伝子の同定
示差的発現した遺伝子の識別示差的に発現された遺伝子を識別するために、ＲＮＡあるいは総ｒｍＲＮＡを目的組織から分離する。例えば、ＲＮＡサンプルは、実験の組織およびコントロールの対応組織から得られます。ｍＲＮＡ分離に対して選択しないどんなＲＮＡ隔離技術もそのようなＲＮＡサンプルの精製のために利用し得る（例えばＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．， ｅｄ．”ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９８７−１９９３）。多くの組織サンプルは、例えばＣｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ、Ｕ．Ｓ．特許４，８４３，１５５の単一のステップのＲＮＡ隔離プロセスのように、当業者に周知の技術を使用して、容易に処理される。
【０１０１】
示差的に発現された遺伝子によって酸性されたＲＮＡを集めたＲＮＡサンプル内の記録は、当業者に周知の方法によって識別される。それらは例えば、差異ふるい分け（Ｔｅｄｄｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ． ＳＡ． ８５， ２０８−１２，１９８８）をがふくまれる。Ｓｃｉ。Ｕ．ＳＡ。８５、２０８−１２、１９８８年、ハイブリダイゼーション（Ｈｅｄｒｉｃｋ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３０８， １４９−５３； Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ． Ｓ． Ａ． ８８， ２８２５，１９８４）および示差的ディスプレイ（Ｌｉａｎｇ ＆ Ｐａｒｄｅｅ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５７， ９６７−７１，１９９２； Ｕ． Ｓ．　Ｐａｔｅｎｔ ５，２６２，３１１）特許５，２６２，３１１が含まれる。
【０１０２】
それ自体、ヒトスフィンゴシンを含む病気の治療用の適切な方法を示唆する、キナーゼ様蛋白質。例えば、処理は、示差的に発現された遺伝子および（または）蛋白質キナーゼのようなヒトスフィンゴシンをコード化する遺伝子の発現の調節を含んでいるかもしれない。示差的発現の情報は示すかもしれません、かどうか、発現か活性、その、示差的に発現された遺伝子か遺伝生成物、あるいは遺伝子か遺伝生成物キナーゼのようなヒトスフィンゴシンは上の調節されるか下方調節される。
【０１０３】
スクリーニング方法
本発明は、調節物質、即ち、それはスフィンゴシンにキナーゼ様蛋白質ポリペプチドあるいはポリヌクレオチドを結合、または、例えばスフィンゴシンの発現あるいは活性に刺激的か抑制する効果があるする候補または試験化合物を同定する方法を提供する。キナーゼ様蛋白質ポリペプチドあるいはポリヌクレオチド、ポリアミンの低下を調節するために減少した細胞内のシグナリングは、有害な細胞が転移するのを防ぐか抑えるのに役立つ。
【０１０４】
本発明は、ヒトスフィンゴシンキナーゼ様タンパク質またはヒトスフィンゴシンキナーゼ様タンパク質ポリヌクレオチドに結合する、またはその活性を調節する、被験化合物をスクリーニングするための検定を提供する。好ましくは、被験化合物はヒトスフィンゴシンキナーゼ様タンパク質またはポリヌクレオチドに結合する。より好ましくは、被験化合物は、ヒトスフィンゴシンキナーゼ様タンパク質活性を、被験化合物の不在時に比較して少なくとも約１０、好ましくは約５０、より好ましくは約７５、９０、または１００％低下または増大さ細胞。
【０１０５】
被験化合物
被験化合物は当分野で既知の薬理学的物質であってよく、または薬理活性を持っていることが前もって分かっていない化合物であってよい。これらは、微生物、動物、または植物から単離されたものであってよく、そして組換え的に調製され、または当分野で既知の化学的方法により合成されたものであってよい。所望により被験化合物は、生物学的ライブラリー、空間的アドレス特定可能な並行固相または液相ライブラリー、デコンボルーションを要する合成ライブラリー法、「一ビーズ一化合物」ライブラリー法、および親和クロマトグラフィー選択を用いる合成ライブラリー法を包含する（（Ｌａｍ， ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３５４， ８２−８４， １９９１； Ｈｏｕｇｈｔｅｎ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３５４， ８４−８６，１９９１））当分野で既知の数多くの組み合わせライブラリー法のいずれかを用いて取得できる。生物学的ライブラリーアプローチはポリペプチドライブラリーに限定されているが、他の４種のアプローチはポリペプチド、非ペプチドオリゴマー、Ｆａｂ， Ｆ （ａｂ’） ２ およびＦａｂ発現が含まれる。
【０１０６】
化合物は天然に存在する、または実験室で設計されたものであってよい。これらは、微生物、動物、または植物から単離されたものであってよく、そして組換え的に調製され、または当分野で既知の化学的方法により合成されたものであってよい。所望により被験化合物は、生物学的ライブラリー、空間的アドレス特定可能な並行固相または液相ライブラリー、デコンボルーションを要する合成ライブラリー法、「一ビーズ一化合物」ライブラリー法、および親和クロマトグラフィー選択を用いる合成ライブラリー法を包含する（但しこれらに限定される訳ではない）当分野で既知の数多くの組み合わせライブラリー法のいずれかを用いて取得できる。生物学的ライブラリーアプローチはポリペプチドライブラリーに限定されているが、他の４種のアプローチはポリペプチド、非ペプチドオリゴマー、または化合物の小分子ライブラリーに適用できる。Ｌａｍ， 抗ｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓ． １２，１４５，１９９７を参照されたい。
【０１０７】
分子ライブラリーの合成法は当分野でよく知られている（例えば、ＤｅＷｉｔｔら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ． ９０，６９０９，１９９３； Ｅｒｂら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ． ９１，１１４２２，１９９４； Ｚｕｃｋｅｒｍａｎｎら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ． ３７，２６７８，１９９４； Ｃｈｏら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６１，１３０３，１９９３； Ｃａｒｅｌｌら、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ． ３３，２０５９，１９９４； Ｃａｒｅｌｌら、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ． ３３，２０６１； Ｇａｌｌｏｐら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ． ３７，１２３３，１９９４を参照されたい）。化合物のライブラリーは溶液で（例えば、Ｈｏｕｇｈｔｅｎ， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １３，４１２−４２１，１９９２）、またはビーズ（Ｌａｍ， Ｎａｔｕｒｅ ３５４，８２−８４，１９９１）、チップ（Ｆｏｄｏｒ， Ｎａｔｕｒｅ ３６４，５５５−５５６，１９９３）、細菌または胞子（Ｌａｄｎｅｒ、米国特許５２２３４０９）プラスミド（Ｃｕｌｌら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ． ８９，１８６５−１８６９，１９９２）、またはファージ（Ｓｃｏｔｔ ＆ Ｓｍｉｔｈ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９，３８６−３９０， １９９０； Ｄｅｖｌｉｎ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９，４０４−４０６，１９９０）；Ｃｗｉｒｌａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９７，６３７８−６３８２，１９９０； Ｆｅｌｉｃｉ， Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ． ２２２，３０１−３１０，１９９１； およびＬａｄｎｅｒ、米国特許５２２３４０９）上に提供できる。
【０１０８】
ハイスループットスクリーニング
被験化合物は、高（ハイ）スループットスクリーニングを用いて、ヒトスフィンゴシンキナーゼ様タンパク質またはポリヌクレオチドに結合する能力、またはヒトスフィンゴシンキナーゼ様タンパク質活性若しくはヒトスフィンゴシンキナーゼ様タンパク質遺伝子発現に影響を及ぼす能力についてスクリーニングできる。ハイスループットスクリーニングを使用して、多くの個別的化合物を並行して試験でき、その結果多数の被験化合物を迅速にスクリーニングできる。最も広範に確立されている技術は９６ウェル微量定量プレートを利用するものである。この微量定量プレートのウェルは、典型的には５０から５００μｌの範囲の検定容量を必要とする。このプレートに加えて、９６ウェルフォーマットに適合させた多くの機器、材料、ピペット、ロボット、プレート洗浄機、およびプレート読み取り機が市販されている。
【０１０９】
別法として、「自由フォーマット検定」、または試料間に物理的障壁を持たない検定が使用できる。例えば、組み合わせペプチドライブラリーのための、単純な均質検定で色素細胞（メラノサイト）を用いる検定が、Ｊａｙａｗｉｃｋｒｅｍｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ． １９，１６１４−１８（１９９４）に記載されている。ペトリ皿中のアガロースの下にこの細胞を入れ、次いで組み合わせ化合物を伴っているビーズをアガロースの表面に載細胞。組み合わせ化合物はこのビーズから化合物を部分的に放出する。化合物がゲルマトリックス中へと局所的に拡散するにつれて活性化合物が細胞の色の変化を惹起するため、活性化合物を暗色色素領域として視覚化することができる。
【０１１０】
自由フォーマット検定のもう一つの例は、生体分子スクリーニング学会第１回年次総会（Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，Ｐａ．、１９９５年１１月７−１０日）で報告されたＣｈｅｌｓｋｙ、「組み合わせライブラリーのスクリーニングのための戦略：新規な、そして伝統的なアプローチ」により記載されている。Ｃｈｅｌｓｋｙは、カルボニックアンヒドラーゼのための単純な均質酵素検定をアガロースゲルの内部に入れ、その結果ゲル中の酵素がゲル全体に色の変化を惹起するようにさせた。その後、光リンカーを介して組み合わせ化合物を持つビーズをゲル内部に入れ、すると該化合物はＵＶ光により部分的に放出された。酵素を阻害する化合物は、色の変化がより少ない局所阻害領域として観察された。
【０１１１】
さらに別の例がＳａｌｍｏｎら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｉ．ｖ．ｅｒｓｉｔｙ ２，５７−６３（１９９６）に記載されている。この例では、組み合わせライブラリーを、寒天中で生育する癌細胞への細胞毒性効果を有する化合物についてスクリーニングした。
【０１１２】
もう一つのハイスループットスクリーニング法がＢｅｕｔｅｌら、米国特許５９７６８１３に記載されている。この方法では、被験試料を多孔性マトリックスに入れる。次に１またはそれ以上の検定成分を、マトリックス、例えばゲル、プラスチックシート、フィルター、またはその他の形の容易に操作できる固体担体の内部、上、または底に入れる。試料がこの多孔性マトリックスに導入されるとこれらは充分ゆっくりと拡散し、その結果、被験試料が混ざらずに検定が遂行できる。
【０１１３】
結合検定
結合検定について、被験化合物は、例えば本酵素のＡＴＰ／ＧＴＰ結合部位またはヒトスフィンゴシンキナーゼ様タンパク質の活性部位に結合してこれを占有する結果、正常な生物活性を妨げるような、小分子であることが好ましい。このような小分子の例は、小ペプチドまたはペプチド様分子を包含するが、これらに限定される訳ではない。結合検定では、被験化合物またはヒトスフィンゴシンキナーゼ様タンパク質のいずれかが検出可能な標識、例えば蛍光、放射性同位元素、化学ルミネセント、または酵素標識（例えば西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、またはルシフェラーゼ）を含むことができる。そこで、ヒトスフィンゴシンキナーゼ様タンパク質に結合している被験化合物の検出は、例えば放射能の放出を直接計数することにより、またはシンチレーション計数により、または検出可能産物への適当な基質の変換を測定することにより、達成できる。
【０１１４】
別法として、ヒトスフィンゴシンキナーゼ様タンパク質への被験化合物の結合を、反応体のいずれをも標識せずに測定することができる。例えば、マイクロフィジオメーターを用いて、被験化合物とヒトスフィンゴシンキナーゼ様タンパク質との結合を検出できる。マイクロフィジオメーター（例えばサイトセンサーＴＭ）とは、細胞がその環境を酸性化する速度を光アドレッサブル電位差センサー（ＬＡＰＳ）を用いて測定する分析機器である。この酸性化速度の変化は、被験化合物とヒトスフィンゴシンキナーゼ様タンパク質の相互作用の指標として使用できる（ＭｃＣｏｎｎｅｌｌら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５７，１９０６−１９１２，１９９２）。
【０１１５】
被験化合物がヒトスフィンゴシンキナーゼ様タンパク質に結合する能力の測定はまた、実時間Ｂｉｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ Ａｎａｌｙｓｉｓ（ＢＩＡ）のような技術を用いて達成できる（Ｓｊｏｌａｎｄｅｒ ＆ Ｕｒｂａｎｉｃｚｋｙ， Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ． ６３，２３３８−２３４５，１９９１、およびＳｚａｂｏら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ． ５，６９９−７０５，１９９５）。ＢＩＡは、いかなる反応体をも標識せずに、生体特異的相互作用を実時間で研究するための技術である（例えばＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標））。光学的現象表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）の変化を、生体分子間の実時間反応の指標に使用できる。
【０１１６】
本発明のさらに別の態様では、ヒトスフィンゴシンキナーゼ様タンパク質を二ハイブリッド検定または三ハイブリッド検定（例えば、米国特許５２８３３１７； Ｚｅｒｖｏｓら、Ｃｅｌｌ ７２，２２３−２３２，１９９３； Ｍａｄｕｒａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２６８，１２０４６−１２０５４，１９９３； Ｂａｒｔｅｌら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １４，９２０−９２４，１９９３； Ｉｗａｂｕｃｈｉら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ８，１６９３−１６９６，１９９３； およびＢｒｅｎｔ ＷＯ９４／１０３００）における「おとりタンパク質」として使用し、ヒトスフィンゴシンキナーゼ様タンパク質に結合またはこれと相互作用してその活性を調節する他のタンパク質を同定することができる。
【０１１７】
二ハイブリッド系は殆どの転写因子のモジュール的性格に基づくものであり、それは、分離可能なＤＮＡ結合および活性化ドメインから成っている。簡潔に述べると、この検定は二種の異なるＤＮＡ構築物を利用する。例えば、一方の構築物においては、ヒトスフィンゴシンキナーゼ様タンパク質をコードしているポリヌクレオチドが、既知の転写因子のＤＮＡ結合ドメインをコードしているポリヌクレオチドに融合できる（例えばＧＡＬ−４）。別の構築物においては、未同定タンパク質（「餌」または「試料」）をコードしているＤＮＡ配列が、既知の転写因子の活性化ドメインをコードしているポリヌクレオチドに融合できる。もし「おとり」および「餌」タンパク質がインビボで相互作用してタンパク質依存複合体を形成できたならば、該転写因子のＤＮＡ結合および活性化ドメインは極めて近位に招来される。この近位性が、転写因子に応答する転写調節部位と機能的に結合しているリポーター遺伝子（例えばＬａｃＺ）の転写を可能にする。リポーター遺伝子の発現が検出でき、機能的転写因子を含む細胞コロニーを単離し、ヒトスフィンゴシンキナーゼ様タンパク質と相互作用するタンパク質をコードしているＤＮＡ配列取得に使用することができる。
【０１１８】
反応体の一方または両方の非結合型からの結合型の分離を促進するため、そして検定の自動化の便宜を図るため、ヒトスフィンゴシンキナーゼ様タンパク質（またはポリヌクレオチド）または被験化合物のいずれかを固定化することが望ましいかも知れない。したがって、ヒトスフィンゴシンキナーゼ様タンパク質（またはポリヌクレオチド）または被験化合物のいずれかを固体支持体に結合さ細胞ことができる。好適な固体支持体は、ガラスまたはプラスチックスライド、組織培養プレート、微量定量ウェル、管、シリコンチップ、またはビーズ（ラテックス、ポリスチレン、またはガラスビーズを包含するがこれらに限定されない）のような粒子を包含するがこれらに限定されない。共有および非共有結合、受動吸収、またはそれぞれポリペプチド（またはポリヌクレオチド）または被験化合物に付着させた結合部分と固体支持体の対、の使用を包含する、当分野で既知の任意の方法を用いてヒトスフィンゴシンキナーゼ様タンパク質（またはポリヌクレオチド）または被験化合物を固体支持体に付着さ細胞ことができる。被験化合物は好ましくは整列して固体支持体に結合させ、その結果個々の被験化合物の位置を追跡することができる。ヒトスフィンゴシンキナーゼ様タンパク質（またはポリヌクレオチド）への被験化合物の結合は、反応体を入れるのに適した任意の容器で達成できる。かかる容器の例には微量定量プレート、試験管、および微量遠沈管がある。
【０１１９】
一つの態様において、ヒトスフィンゴシンキナーゼ様タンパク質は、ヒトスフィンゴシンキナーゼ様タンパク質を固体支持体に結合さ細胞ドメインを含む融合タンパク質である。例えば、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ融合タンパク質をグルタチオンセファロースビーズ（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ， Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ， Ｍｏ．）上またはグルタチオン誘導体化微量定量プレート上に吸着させ、次いでこれを被験化合物または被験化合物および非吸着ヒトスフィンゴシンキナーゼ様タンパク質に合し；次にこの混合物を複合体形成が行われる条件下でインキュベートする（例えば、塩およびｐＨに関して生理的条件）。インキュベーションの後、ビーズまたは微量定量プレートのウェルを洗浄して未結合成分を除去する。反応体の結合は上記のように直接的または間接的に測定できる。別法として、複合体を固体支持体から解離させた後に結合を測定することもできる。
【０１２０】
さらに固体の支持体中のポリペプチドあるいはポリヌクレオチドを固定するための他の技術は発明の分析の中で使用することができた。例えば、キナーゼ様蛋白質ポリペプチド（あるいはポリヌクレオチド）あるいは試験が合成するスフィンゴシンがそうでありうるかは、ビオチンとストレプタビジンの利用する結合を固定する。キナーゼ様蛋白質ポリペプチドあるいは試験化合物から準備することができる、ビオチン化されたスフィンゴシン、（例えばｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｉｏｎ ｋｉｔ， Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ， Ｒｏｃｋｆｏｒｄ， Ｉｌｌ）において有名な技術を使用し、ストレプタビジンを施した９６ウェルにおいて固定されるビオチン−ＮＨＳ（Ｎ−ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ）プレート（ピアス・ケミカル）。別法では、抗体、特にスフィンゴシンにキナーゼ様蛋白質ポリペプチド・ポリヌクレチド、あるいは試験化合物を結合さ細胞。しかしそれは活性部位あるいはスフィンゴシンのフィブロネクチン領域のように、拘束力のある部位に干渉をしない、キナーゼ様蛋白質ポリペプチドはプレートのウェルから得られることができる。抗体結合は遊離の目的タンパク質をウェルに閉じ込めることができた。
【０１２１】
本発明に係るスクリーニング検定には、タンパク質またはポリヌクレオチドを固体支持体上に固定化するためのその他の技術を使用することもできる。例えば、ヒトスフィンゴシンキナーゼ様タンパク質（またはポリヌクレオチド）または被験化合物のいずれかを、ビオチンとストレプトアビジンのコンジュゲーションを利用して固定化できる。当分野で周知の技術（例えばビオチニル化キット、Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ， Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，Ｉｌｌ．）を用いて、ビオチニル化したヒトスフィンゴシンキナーゼ様タンパク質（またはポリヌクレオチド）または被験化合物をビオチン−ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド）から調製し、ストレプトアビジン被覆した９６ウェルプレート（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ）のウェルに固定化できる。別法として、ヒトスフィンゴシンキナーゼ様タンパク質、ポリヌクレオチド、または被験化合物に特異的に結合するが、所望の結合部位、例えばＡＴＰ／ＧＴＰ結合部位またはヒトスフィンゴシンキナーゼ様タンパク質の活性部位に干渉しない抗体をプレートのウェルに誘導体化することができる。未結合の標的またはタンパク質が抗体コンジュゲーションによりウェル中に捕捉できる。
【０１２２】
ＧＳＴ−固定化複合体について上に記載した方法に加え、このような複合体を検出する方法には、ヒトスフィンゴシンキナーゼ様タンパク質または被験化合物に特異結合する抗体を用いる、複合体の免疫検出、ヒトスフィンゴシンキナーゼ様タンパク質の活性検出へと引き継がれる酵素結合検定、および非還元条件下でのＳＤＳゲル電気泳動がある。
【０１２３】
ヒトスフィンゴシンキナーゼ様タンパク質またはポリヌクレオチドに結合する被験化合物を求めるスクリーニングは、無傷の細胞で実施することもできる。ヒトスフィンゴシンキナーゼ様タンパク質またはポリヌクレオチドを含む任意の細胞が、細胞に基づく検定系で使用できる。ヒトスフィンゴシンキナーゼ様タンパク質ポリヌクレオチドは細胞中に天然に存在し、または上記のような技術を用いて導入できる。ヒトスフィンゴシンキナーゼ様タンパク質またはポリヌクレオチドに対する被験化合物の結合は、上記のように測定する。
【０１２４】
酵素検定
ヒトヒトスフィンゴシンキナーゼ様タンパク質のセリンプロテアーゼ活性を増大または低下さ細胞能力について、被験化合物を試験できる。セリンプロテアーゼ活性は、例えばＬｉｕｅｔａｌ．， ２ ： Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７５， １９５１３−２０，２０００に記載のように測定できる。酵素検定は、精製ヒトスフィンゴシンキナーゼ様タンパク質、細胞膜調製物または無傷の細胞と、被験化合物とを接触させた後に実施できる。ヒトスフィンゴシンキナーゼ様タンパク質のトランスケトラーゼ活性を少なくとも約１０、好ましくは約５０、より好ましくは約７５、９０または１００％低下さ細胞被験化合物を、ヒトスフィンゴシンキナーゼ様タンパク質活性を低下さ細胞可能性のある治療物質として同定する。ヒトヒトスフィンゴシンキナーゼ様タンパク質のセリンプロテアーゼ、好ましくはセリンプロテアーゼトリプシン活性を少なくとも約１０、好ましくは約５０、より好ましくは約７５、９０または１００％増大さ細胞被験化合物を、ヒトヒトスフィンゴシンキナーゼ様タンパク質活性を増大さ細胞可能性のある治療物質として同定する。
【０１２５】
遺伝子発現
別の態様では、ヒトスフィンゴシンキナーゼ様タンパク質遺伝子の発現を増大または減少さ細胞被験化合物を同定する。ヒトスフィンゴシンキナーゼ様タンパク質ポリヌクレオチドを被験化合物と接触させ、ＲＮＡまたはヒトスフィンゴシンキナーゼ様タンパク質ポリヌクレオチドのポリペプチド産物の発現を測定する。被験化合物存在下での適当なｍＲＮＡまたはポリペプチドの発現レベルを、該被験化合物不在下でのｍＲＮＡまたはポリペプチドの発現レベルと比較する。すると被験化合物が、この比較に基づく発現のモジュレーターとして同定できる。例えば、ｍＲＮＡまたはポリペプチドの発現が、被験化合物の不在時よりも存在時により大きい場合は、この被験化合物を、該ｍＲＮＡまたはポリペプチド発現の刺激物質または増強物質と同定する。そうではなく、ｍＲＮＡまたはポリペプチドの発現が、被験化合物の不在時よりも存在時により小さい場合は、この被験化合物を、該ｍＲＮＡまたはポリペプチド発現のインヒビターと同定する。
【０１２６】
細胞におけるヒトスフィンゴシンキナーゼ様タンパク質ｍＲＮＡまたはポリペプチド発現のレベルは、ｍＲＮＡまたはポリペプチドを検出するための当分野で周知の方法により決定できる。定性または定量的方法のいずれかが使用できる。ヒトスフィンゴシンキナーゼ様タンパク質ポリヌクレオチドのポリペプチド産物の存在は、例えばラジオイムノアッセイのような免疫化学的方法、ウエスタンブロッティング、および免疫組織化学を包含する、当分野で周知の様々な技術を用いて決定できる。別法として、ポリペプチド合成は、ヒトスフィンゴシンキナーゼ様タンパク質内への標識アミノ酸の取り込みを検出することにより、インビボで、細胞培養で、またはインビトロ翻訳系で決定できる。
【０１２７】
このようなスクリーニングは、無細胞検定系または無傷の細胞のいずれかで実施できる。ヒトスフィンゴシンキナーゼ様タンパク質ポリヌクレオチドを発現するいかなる細胞も細胞に基づく検定系で使用できる。ヒトスフィンゴシンキナーゼ様タンパク質ポリヌクレオチドは細胞内に天然に存在するか、または上記のような技術を用いて導入することができる。一次培養または確立された細胞系、例えばＣＨＯまたはヒト胚性腎２９３細胞のいずれかを使用できる。
【０１２８】
医薬組成物
本発明はさらに、治療効果を達成するために患者に投与できる医薬組成物を提供する。本発明に係る医薬組成物は、例えばヒトスフィンゴシンキナーゼ様タンパク質、ヒトスフィンゴシンキナーゼ様タンパク質ポリヌクレオチド、リボザイムまたはアンチセンスオリゴヌクレオチド、ヒトスフィンゴシンキナーゼ様タンパク質に特異的に結合する抗体、または類似体、ヒトスフィンゴシンキナーゼ様タンパク質活性のアゴニスト、アンタゴニスト、又はインヒビターを含み得る。この組成物は単独で、または少なくとも１種類の他の物質、例えば安定化化合物と組み合わせて投与でき、これは、食塩水、緩衝化食塩水、デキストロース、および水を包含する（但しこれらに限定されない）任意の無菌で生物学的適合性のある製薬的担体中で投与できる。この組成物は単独で、または他の物質、薬物またはホルモンと組み合わせて患者に投与できる。
【０１２９】
活性成分に加えてこれらの医薬組成物は、賦形剤および補助物質を含む適当な製薬的に許容し得る担体を含有でき、これらは、製薬的に使用できる調製物への活性化合物の処理を促進する。本発明に係る医薬組成物は、経口、静脈内、筋肉内、動脈内、髄内、髄腔内、心室内、経皮、皮下、腹腔内、鼻腔内、非経口、局所、舌下、または直腸手段を包含する（但しこれらに限定されない）多くの経路により投与できる。経口投与用医薬組成物は、当分野で既知の製薬的に許容し得る担体を用いて経口投与に適した用量に調合できる。このような担体により、該医薬組成物を、患者が内服するための錠剤、丸剤、糖衣剤、カプ細胞剤、液体、ゲル、シロップ剤、スラリー剤、懸濁剤などに調合できる。
【０１３０】
経口使用のための医薬製剤は、活性化合物を、固体賦形剤と合し、得られた混合物を所望により粉砕し、そしてこの顆粒混合物を、所望ならば適当な補助物質を加えた後に処理して錠剤または糖衣剤核を得る。好適な賦形剤は炭水化物またはタンパク質増量剤、例えば乳糖、シュクロース、マンニトール、またはソルビトールを包含する糖；トウモロコシ、小麦、米、馬鈴薯、またはその他の植物由来の澱粉；細胞ロース、例えばメチル細胞ロース、ヒドロキシプロピルメチル細胞ロース、またはカルボキシメチル細胞ロースナトリウム；アラビアゴムおよびトラガカントゴムを包含するゴム；ならびにゼラチンおよびコラーゲンのようなタンパク質である。所望により崩壊剤または可溶化剤、例えば架橋ポリビニルピロリドン、寒天、アルギン酸、またはその塩、例えばアルギン酸ナトリウムを添加できる。
【０１３１】
糖衣剤核は、濃縮糖溶液のような適当な被覆剤と共に使用でき、これはさらに、アラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、ｃａｒｂｏｐｏｌゲル、ポリエチレングリコール、および／または二酸化チタン、ラッカー溶液、および適当な有機溶媒または溶媒混合物を含むことができる。産物の同定のためまたは活性化合物の量、即ち用量をあらわすために染料または色素を錠剤または糖衣被覆剤に添加できる。
【０１３２】
経口的に使用できる医薬調合物は、ゼラチン製の押してはめ込むカプ細胞剤、ならびに、ゼラチンおよび被覆剤、例えばグリセロールまたはソルビトールでできた軟封入カプ細胞剤を包含する。押してはめ込むカプ細胞剤は、活性成分を、乳糖または澱粉のような増量剤または結合剤、タルクまたはステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、および所望により安定剤と混合して含有できる。軟カプ細胞剤では、活性化合物を、安定剤を加えたまたは加えない適当な液体、例えば脂肪油、液体、または液体ポリエチレングリコールに溶解または懸濁できる。
【０１３３】
非経口投与に好適な医薬製剤は、水溶液、好ましくは生理学的適合性の緩衝液、例えばハンクス溶液、リンゲル溶液、または生理学的に緩衝化した食塩水中で調合できる。水性注射用懸濁剤は、該懸濁液の粘度を増加さ細胞物質、例えばカルボキシメチル細胞ロースナトリウム、ソルビトール、またはデキストランを含有できる。さらに、活性化合物の懸濁剤は適当な油性注射用懸濁剤として調製できる。好適な親油性溶媒または媒質は、胡麻油のような脂肪油、またはオレイン酸エチルまたはトリグリセリドのような合成脂肪酸エステル、またはリポソームを包含する。非脂質ポリカチオンアミノポリマーもまた送達に使用できる。所望により懸濁剤は、化合物の溶解性を増し高濃縮溶液の調製を可能にするような適当な安定剤または物質を含むことができる。局所または鼻腔投与のためには、透過すべき特定の障壁に対し適当な浸透剤を製剤に使用する。このような浸透剤は当分野で一般に知られている。
【０１３４】
本発明に係る医薬組成物は当分野で既知の方法で、例えば常套的混合、溶解、顆粒化、糖衣剤製造、すりつぶし、乳化、カプ細胞化、捕捉、または凍結乾燥プロセスによって製造できる。この医薬組成物は塩として提供でき、塩酸、硫酸、酢酸、乳酸、クエン酸、リンゴ酸、琥珀酸などを包含する（但しこれらに限定されない）多くの酸を用いて調製できる。塩は、水性または他のプロトン性溶媒において、対応する遊離塩基型よりもより可溶性の傾向がある。別の場合には、好ましい調製物は、ｐＨ範囲４．５から５．５において以下のもの：１−５０ｍＭヒスチジン、０．１％−２％シュクロース、および２−７％マンニトール、の全てまたは任意のものを含有できる凍結乾燥粉末であってよく、これを使用前に緩衝液と合する。
【０１３５】
調合と投与のための技術のさらなる詳細は、ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＳＣＩＥＮＣＥＳ（Ｍａａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．， Ｅａｓｔｏｎ， Ｐａ）の最新版に見出すことができる。医薬組成物を製造した後、これらを適当な容器に入れ、適応状態の治療のためにラベルを貼る。このようなラベル表示は、投与の量、頻度、および投与方法を包含する。
【０１３６】
治療上の適応および方法
新規のヒトスフィンゴシン、キナーゼ様蛋白質配列、そして具体的なｍＲＮＡの５’末端の配列はアンチセンスの核酸生産の中で使用することができた。ヒトスフィンゴシンの過少発現、キナーゼ様蛋白質、そしてヒトスフィンゴシンキナーゼ蛋白質遺伝子の疾病に関連する変化を発見する際に薬ふるい分けで使用用の蛋白質を発現する細胞キナーゼのようなヒトスフィンゴシンを生産するために、配列も宿主細胞へ感染することができる。キナーゼ様蛋白質がそうでありうるヒトスフィンゴシンの調節物質は、試薬として、アレルギー、伝染、外傷あるいは有毒化合物への接触と関係する、あるいは伝染のような疾患、遺伝病、自己免疫疾患、癌、神経組織変成の疾患および心臓血管疾患を治療する。より明確には、ヒトスフィンゴシンは蛋白質を抑制する試薬キナーゼのように、腫瘍増殖および侵入の予防において、および癌細胞アポトーシスの促進において有益である；慢性関節リウマチ、糖尿病性網膜症、乾癬および癌のような疾病状態、および心臓病、傷治療および骨髄移植中の新しい血液成長の促進の阻止；アテローム性動脈硬化症と喘息のような疾病状態の平滑筋細胞増殖の抑制；虚血の組織傷でのようなストレスへの細胞の反応性の調節；心臓の機能維持；そして炎症性の細胞の組織侵入、活性化およびアポトーシスの抑制。
【０１３７】
１．アレルギー　蛋白質活性キナーゼのようなスフィンゴシンの調節は、アレルギーを治療する方法を提供する。アレルギー反応の病因の第一歩はアレルゲンに応じて免疫グロブリンＥ（免疫グロブリンＥ）抗体の生産である。アレルゲンへの接触に際して、反応する個人のＢ細胞はアレルゲンに特有の免疫グロブリンＥ分子を分泌する。免疫グロブリンＥ分子は、マスト細胞と好塩基性細胞上で存在する高い類似免疫グロブリンＥ受容体（ＦｃＲＩ）に拘束する。（Ｕ．Ｓ．特許５，９７７，０７２を参照）。
【０１３８】
免疫グロブリンＥ結合は、アレルギーと炎症性のレスポンスを促進する様々な血管に作用するメディエーターの放出を活性化する。アレルゲン分子をには形成する境界免疫グロブリンＥ分子によって２つ以上のＦｃＲＩｓが架橋される場合は常に、活性化が生じます。そのような集合体は、細胞質の小粒および鉛板からプロスタグランジン、ロイコトリエン、サイトカイニンおよび過敏反応の他のエフェクターの合成にヒスタミンとプロテアーゼを放出する、生化学のカスケードを開始する。
【０１３９】
マスト細胞と好塩基性細胞は炎症の部位で蓄積し、活性化に際して、顆粒細胞／マクロファージコロニー刺激因子、インターロイキン−３およびインターロイキン−６のような血液生成成長因子を分泌する。これらの要因は、好中球、マクロファージおよびエオシン好性の細胞のような炎症性の細胞を補充し、活性化することにより、炎症性の反応を広めます。活性化された細胞は、進行中の炎症、腫瘍侵入、血管形成、繊維症および血栓症の領域で蓄積する。ＦｃＲＩによる細胞の免疫グロブリンＥ依存の活性化は局所的な組織防御、組織維持および改変へ指図された、炎症性の反応および免疫調節 （Ｇａｇａｒｉ， Ｅ． ｅｔ ａｌ （１９９７） Ｂｌｏｏｄ ８９： ２６５４−２６６３）に帰着する。
【０１４０】
ＦｃＲＩに拘束する免疫グロブリンＥは、休止する条件の下の受容体に結合するキナーゼを活性化する。燐酸化された受容体はスフィンゴシン・キナーゼ（それはスフィンゴシン−１−リン酸塩（ＳＰＰ）の生産を引き起こし、マスト細胞中のカルシウム動員に寄与する）を活性化する。燐酸化された受容体は、さらにリンとＳｙｋのようなチロシン・キナーゼ（それらはＣ．が燐酸化したホスホリパーゼを含む細胞質の分子のチロシン燐酸化を引き起こす）を活性化する、ホスホリパーゼＣ加水分解ホスファチジルイノシトール４，５−ビホスフェート、またイノシトール１，４、５−トリホスフェートおよびジアシルグリセロールを放出する。後のものは、細胞内と細胞外の出所からのＣａ２＋を動員し、蛋白質キナーゼＣ（Ｐａｏｌｉｎｉ， Ｒ． ｅｔ ａｌ． （１９９１） Ｎａｔｕｒｅ ３５３： ８５５−８５８； ａｎｄ Ｂｅａｖｅｎ， Ｍ． Ａ． ａｎｄ Ｂａｕｍｇａｒｔｎｅｒ， Ｒ． Ａ． （１９９６） Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． ｉｍｍｕｎｏｌ． ８： ７６６−７７２）を活性化する。
【０１４１】
ＳＰＰは、細胞の内部で、および細胞外にＥＤＧファミリー（ＥＤＧ １、３、５、６および８）のＧＰＣＲのための配位子としてＣａ２＋動員、細胞活性化、増殖および存続を調節する別のメッセンジャーの役割をし、種々の生物学の機能を有する。ＳＰＰは、スフィンゴシン、セラミダーゼおよびスフィンゴシン・キナーゼの連続する作用によって細胞外の刺激に応じて合成される。多くの細胞系が、両方のの転写と翻訳のレベルにスフィンゴシン・キナーゼ活性が調節されＳＩ．Ｐ．生産に重大な役割を果たすことを示した。
【０１４２】
２． スフィンゴシン・キナーゼは、喘息および他の炎症性の疾病の病因において重要であり得る。洗浄流体中のＳＰＰレベルの著しい高台は分節の抗原投与に続く喘息において観察された。ＳＰＰ（それ自体あるいはＰＤＧＦを備えた共同作用の中で）もＩＬ−６生産を調節するために報告された。さらに、スフィンゴシンとＳＩ．Ｐ．の間のバランスがマスト細胞の活性化には決定的であることが実証されました、細胞系、スフィンゴシンキナーゼＩがそれらの刺激用の任意のスイッチの役割をするところで、多くの喘息の徴候の開始物質として関係している。
【０１４３】
スフィンゴシン・キナーゼ様蛋白質はジアシルグリセロールキナーゼのある点で２つの既知のスフィンゴシン・キナーゼと類似しています、スフィンゴシン・キナーゼにＤ−トレオスフィンゴシンを燐酸化する能力を与えるために推定される、触媒現象の領域。しかしながら、それは、そのＮ−末端でさらに相同（ＰＨ）領域を持っている点で、他の２つのスフィンゴシン・キナーゼと異なります（下記の図形を参照）。ＰＨは蛋白質を示すことで見つかった領域で、イノシトール・リン酸塩、Ｇ蛋白質のベータ／ガンマサブユニット、蛋白質の燐酸化されたＳｅｒ／Ｔｈｒ残留物および薄膜を拘束する能力を含む多数の機能があります。キナーゼ様３つのヒトスフィンゴシン・キナーゼ、ＳＰＨＫ１、ＳＰＨＫ ２およびスフィンゴシン、３８４、６１８のおよび５３７アミノ酸の蛋白質をそれぞれコード化する。長さの差に加えて、スフィンゴシン・キナーゼは、さらに組織分配の差を示する。３つの、スフィンゴシン、キナーゼ状、ほぼすべての組織で発現し、最も広い分配を持つように見える。しかしながら、顕著に、それが微小血管の内皮の細胞の中で最も高く発現される、ということを細胞系が身体の全体にわたって分かった。これはそのスフィンゴシンをキナーゼ様およびより多くの、したがって、他のスフィンゴシン・キナーゼより、それらの付着分子発現、細胞から細胞の接触、サイトカイニンおよび成長因子分泌、増殖および血管形成を調節して、内皮の細胞の活性化に重要な役割を果たしてもよい。
【０１４４】
３．癌　癌は、基本的に発癌性細胞形質転換によって発症する疾患である。形質転換細胞をそれらの正常な対応物から区別し、かつ癌の病態生理に基づく形質転換細胞の特徴は幾つかある。それらには、非制御型細胞性増殖、通常の死誘導シグナルに対する不応答（不死化）、増大した細胞運動性及び侵襲性、新たな血管新生の誘導を通じた血液供給を補充するための増大した能力（血管新生）、遺伝子の不安定性、並びに調節不全遺伝子発現が挙げられる。薬剤耐性の獲得とともに、これらの異常な生理機能の種々の組み合わせににより、最終的に臓器不全および患者の死となる難治性疾患状態に頻繁に陥る。
【０１４５】
最も一般的な癌治療は、細胞増殖を標的とし、形質転換細胞と正常細胞との間の効率に関するその特異な増殖能に基づいている。このアプローチは、幾つかの重要な正常細胞タイプもまた高増殖であり、かつ癌細胞が高頻度にこれらの物質に対して耐性となるという現実により妨げられている。従って、従来の抗癌治療についての治療指数は珍しく２．０を超えている。
【０１４６】
ゲノミクス誘導性分子の標的同定は、癌患者に安全で、かつより効率的な処置を提供できる治療介入のための新たな癌特異的標的を同定する可能性を開いた。従って、新たに発見される腫瘍関連遺伝子及びその産物を疾患におけるそれらの機能（群）について試験でき、そして革新的な治療を発見し、かつ開発するために道具として用いることができる。以上に概説した生理学的プロセスの多くに重要な働きがある遺伝子は、癌標的として特徴付けることができる。
【０１４７】
遺伝子は処置として使用できる。また、ゲノミクスを通じて同定される遺伝子又は遺伝子断片は、すぐに１つ又はそれ以上の非相同（ヘテローガス）発現系において発現させ、機能性組換えタンパク質を産生さ細胞ことができる。このタンパク質は、その生物学的機能についてインビトロで特徴付けられ、その後その生化学活性の化学修飾因子（モジュレーター）を同定するため、ハイスループット分子スクリーニングプログラムにおける道具として用いられる。標的タンパク質活性のアゴニスト及び／又はアンタゴニストをこの様式で同定し、次いで、細胞およびインビボ疾患モデルにて抗癌活性について試験する。生物学的モデルにおける反復試験や、詳細な薬物動態力学的分析及び中毒学的分析を用いたリード化合物の最適化により、薬物開発及び次のヒトでの試験についての基礎を形成する。
【０１４８】
４．自己免疫疾患　免疫系の主要な生理学の機能は伝染性の生物の除去である。さらに、保護免疫の原因であるエフェクターメカニズムは宿主組織を害することができた。いくつかの状況で、特定の免疫反応はほとんど保護を有しない。また、有害な結果は支配的である。この最良の例は自己抗原に対する病理学の免疫反応によって引き起こされた自己免疫疾患である。（Ｕ． Ｓ． Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ． ６，０９８，６３１）。
【０１４９】
潜在的に有害な免疫反応は、応答性のリンパ細胞を機能的に不活性化するか殺すことによって防御し得る。リンパ細胞応答の抑制に関与する主要な細胞崩壊のメカニズムはＦａｓを媒介としたアプロティックな方法である。
【０１５０】
この方法を使用して、宿主が生き残るように、免疫系は積極的に潜在的に有害な細胞を除去するＡ． Ａｂｂａｓ，”Ｄｉｅ ａｎｄ Ｌｅｔ Ｌｉ．ｖ．ｅ： Ｅｌｉｍｉｎａｔｉｎｇ
Ｄａｎｇｅｒｏｕｓ Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ，”Ｃｅｌｌ ８４： ６５５ （１９９６）参照。Ｆａｓを媒介とした細胞死の異常は、ＦａｓおよびＦａｓ配位子がそれら自身正常な状況のさえ自己免疫に帰着するかもしれない。例えば、アポトーシスが禁じられ、増殖道が刺激される場合、活性化されたリンパ細胞は除去を回避し、疾病を引き起こすかもしれない。
【０１５１】
自己免疫疾患の確立している治療は、炎症の最終の共通のあるいは免疫学のメディエーターのいずれかを阻止することを目的とする。両方のアプローチは非特異性で、したがって、筋骨の副作用、同化作用の副作用、神経学と結合組織副作用、免疫抑制、骨髄および胃腸の毒性、肝臓障害、肺疾病、過敏反応、聴覚障害、腎臓部の毒性（皮膚と粘膜の毒性）のような厳しい副作用に関係する。Ｒ． Ｍｉｌｌｉｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｌａｎｃｅｔ １： ８１２ （１９８４）， Ｊ． Ａ． Ｅｎｇｅｌｂｒｅｃｈｔ ｅｔ ａｌ．， Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ ａｎｄ Ｒｈｅｕｍａｔｉｓｍ ２６： １２７５ （１９８３）， Ｇ． Ｗ． Ｃａｎｎｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ ａｎｄ． Ｒｈｅｕｍａｔｉｓｍ ２６： １２６９ （１９８３）， Ｓｉｍｏｎ ａｎｄ Ｍｉｌｌｓ，”Ｎｏｎｓｔｅｒｏｉｄａｌ 抗ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ Ｄｒｕｇｓ，”Ｎ． Ｅｎｇ． Ｊ． Ｍｅｄ． ３０２： １１７９． （１９８０）， Ｋａｔｚ ｅｔ ａｌ．， Ａｎｎ． Ｉｎｔ． Ｍｅｄ． １０１： １７６ （１９８４）， Ｗ． Ｆ． Ｋｅａｎ ｅｔ ａｌ．， Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ ａｎｄ Ｒｈｅｕｍａｔｉｓｍ ２３： １５８ （１９８０）．
【０１５２】
したがって、自己免疫疾患用の現在の治療は、重大な副作用の高い発生率に関係する。更に、いくつかの薬物治療は徴候的な救済を行うかもしれないが、多くの場合では、それらは著しく共同の破壊のような徴候の進行を修正しない。必要なものはより低い毒性を備えた、治療がよりよくであるそのようなもの、許容された、そして自己免疫疾患の治療に、より適切な有効な治療法である。
【０１５３】
ＳＰＰはＦａｓを媒介とした細胞死道を阻止すると示された。Ｏ． Ｃｕｖｉｌｌｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，”Ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｃｅｒａｍｉｄｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ Ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ Ｂｙ Ｓｐｈｉｎｇｏｓｉｎｅ−ｌ−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ，”Ｎａｔｕｒｅ ３８１： ８００ （１９９６）を参照。したがって、蛋白質活性キナーゼのようなスフィンゴシンの阻止は、ＳＰＰの構成を防ぐことによりＦａｓ介在のアポトーシスの阻止を逆にすることへの実行可能な方法である。ＳＰＰはスフィンゴシン・キナーゼの活性によってスフィンゴシンから生産される。ＳＰＰの正味の影響はセラミドを媒介とした細胞死の阻止である。したがって、スフィンゴシンの調節、キナーゼ様蛋白質は、例えば慢性関節リウマチ、全身エリテマトーである、墓の疾病、多発性硬化症（ＭＳ）およびタイプのような自己免疫疾患を治療するか防ぐ方法を提供し得る。
【０１５４】
本発明は、上記のスクリーニング検定によって同定される新規物質の使用にさらに関する。従って、本明細書に記載するように同定される被験化合物を適当な動物モデルに使用することは、本発明の範囲内にある。例えば、本明細書に記載するように同定される物質（例えば、調節物質、アンチセンス核酸分子、特異的な抗体、リボザイム又はヒトスフィンゴシンキナーゼ様タンパク質結合分子）を、そのような物質を用いた処置の効果、毒性又は副作用を決定するために、動物モデルに用いることがある。あるいは、本明細書に記載するように同定された物質を、該物質の作用機構を決定するために、動物モデルに使用する場合がある。さらに、本発明は、本明細書に記載の処置に対する上記スクリーニング検定によって同定される新規物質の使用に関する。
【０１５５】
ヒトスフィンゴシンキナーゼ様タンパク質活性に影響を及ぼす試薬を、ヒトスフィンゴシンキナーゼ様タンパク質活性を低下さ細胞ために、インビトロ又はインビボのいずれかにおいてヒト細胞に投与することができる。試薬は、ヒトヒトスフィンゴシンキナーゼ様タンパク質遺伝子の発現産物と結合することが好ましい。その発現産物がタンパク質である場合、試薬は抗体であることが好ましい。エックスビボにおけるヒト細胞の処置については、抗体を、人体から取り出しておいた幹細胞の調製物に添加することができる。その後、その細胞を、当分野で周知のように、クローン増殖さ細胞か、又はさせずに同じ又は別の人体に移すことができる。
【０１５６】
１つの態様においては、試薬を、リポソームを用いて送達する。リポソームは、投与した動物中にて、少なくとも約３０分間、より好ましくは少なくとも約１時間、さらにより好ましくは少なくとも約２４時間安定であることが好ましい。リポソームは、試薬、特にポリヌクレオチドを、動物（例えばヒト）の特定の部位に標的化することができる脂質組成物を含む。リポソームの脂質組成物は、動物の特有の器官、例えば肺、肝臓、脾臓、心臓、脳、リンパ節及び皮膚を標的化できることが好ましい。
【０１５７】
本発明に有用なリポソームは、標的化した細胞の原形質膜と融合でき、その内容物を細胞に送達できる脂質組成物を含む。好ましくは、リポソームのトランスフェクション効率は約１０６細胞に送達されるリポソーム１６ｎｍｏｌ当たりＤＮＡ約０．５μｇであり、より好ましくは約１０６細胞に送達されるリポソーム１６ｎｍｏｌ当たりＤＮＡ約１．０μｇであり、さらにより好ましくは約１０６細胞に送達されるリポソーム１６ｎｍｏｌ当たりＤＮＡ約２．０μｇである。好ましくは、リポソームは直径が、約１００〜５００ｎｍであり、より好ましくは約１５０〜４５０ｎｍであり、さらにより好ましくは約２００〜４００ｎｍである。
【０１５８】
本発明に用いるに適したリポソームは、例えば当業者に知られる遺伝子送達法に標準的に用いられるリポソームを含む。より好ましいリポソームは、ポリカチオン脂質組成物を有するリポソームおよび／またはポリエチレングリコールと連結されたコレステロールバックボーン（骨格鎖）を有するリポソームを含む。あるいは、リポソームは特定の細胞タイプを標的化できる化合物、例えばリポソームの外側表面に曝される細胞特異的リガンドを包含する。
【０１５９】
リポソームを、試薬、例えばアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはリボザイムと複合化さ細胞ことは、当分野で標準的な方法 （例えば、米国特許５，７０５，１５１を参照のこと） を用いて達成することができる。好ましくは、ポリヌクレオチド約０．１μｇ〜約１０μｇをリポソーム約８ｎｍｏｌと複合化する、より好ましくはポリヌクレオチド約０．５μｇ〜約５μｇをリポソーム約８ｎｍｏｌと複合化する、さらにより好ましくはポリヌクレオチド約１０μｇをリポソーム約８ｎｍｏｌと複合化する。
【０１６０】
別の態様においては、抗体を、受容体媒介性標的化送達を用いて、インビボにて特定の組織に送達することができる。受容体媒介性ＤＮＡ送達技術は、例えばＦｉｎｄｅｉｓら、Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １１， ２０２−０５ （１９９３）； Ｃｈｉｏｕら、ＧＥＮＥ ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣＳ： ＭＥＴＨＯＤＳ ＡＮＤ ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮＳ ＯＦ ＤＩＲＥＣＴ ＧＥＮＥ ＴＲＡＮＳＦＥＲ （Ｊ． Ａ． Ｗｏｌｆｆら、） （１９９４）； Ｗｕ ＆ Ｗｕ， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６３， ６２１−２４ （１９８８）； Ｗｕら、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６９， ５４２−４６ （１９９４）； Ｚｅｎｋｅら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ８７， ３６５５−５９ （１９９０）； Ｗｕら、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６６， ３３８−４２ （１９９１） にて教示されている。
【０１６１】
試薬が一本鎖の抗体である場合、抗体をコード化するポリヌクレオチドも構築し、細胞へ、ｅｘ ｖｉ．ｖ．ｏ、あるいは生体内で導入することができる。しかし、トランスフェリン−ポリカチオン化したＤＮＡトランスファー（核酸あるいはカプ細胞に入れられた核酸を備えたトランスフェクション）は、細胞の融合をリポソーム介在した、ＤＮＡを上塗りを施したラテックス玉の細胞内の輸送、プロトプラスト融合、ウィルス感染、エレクトロポレーション、「遺伝子銃」ＤＥＡＥ−あるいはリン酸カルシウムを媒介としたトランスフェクション。
【０１６２】
治療的有効量の決定
治療的有効量の決定は、充分当業者の能力の範囲内にある。治療的有効量とは、治療的有効量の不在下で起こるヒトスフィンゴシンキナーゼ様タンパク質活性に比較してヒトスフィンゴシンキナーゼ様タンパク質活性を増大させまたは低下さ細胞活性成分の量を指す。
【０１６３】
いかなる化合物に関しても、治療的有効量は最初に細胞培養検定で、または動物モデル、通常マウス、ウサギ、イヌ、またはブタで見積もることができる。動物モデルは適当な濃度範囲および投与経路の決定にも使用できる。次にこのような情報を用いてヒトでの有用な用量と投与経路を決定できる。
【０１６４】
治療的有効性および毒性、例えばＥＤ５０（集団の５０％で治療的に有効な用量）およびＬＤ５０（集団の５０％で致死的な用量）は、細胞培養または実験動物における標準的薬学的方法により決定できる。治療効果に対する毒性効果の用量比が治療指数であり、比ＬＤ５０／ＥＤ５０で表すことができる。
【０１６５】
大きな治療指数を示す医薬組成物が好ましい。細胞培養検定および動物研究から得られるデータを、ヒトへの使用のための用量範囲を処方する際に使用する。かかる組成物に含まれる用量は、好ましくは殆どまたは全く毒性を持たないＥＤ５０を包含する循環濃度の範囲内である。この用量は、使用する用量型、患者の感受性、および投与経路に応じてこの範囲内で変わる。
【０１６６】
正確な用量は、治療を必要とする対象に関連する因子に照らして医師が決定する。用量および投与は、充分なレベルの活性成分を提供するよう、または所望の効果を維持するよう、調節する。考慮できる因子は、疾病状態の重篤度、対象の全身健康状態、年齢、体重、および対象の性別、食餌、投与の時間および頻度、薬物の組み合わせ、反応の感受性、および療法に対する寛容／応答を包含する。長時間作用性医薬組成物は、その製剤の半減期およびクリアランス率に応じて３から４日毎、毎週、または２週間に１回投与することができる。
【０１６７】
標準的な用量は投与経路に応じて０．１から１０００００マイクログラムまで変えることができ、約１ｇまでの総用量とすることができる。特定の用量および送達方法についての指針は文献に提供されており、一般に当分野の医師が入手できる。当業者は、ヌクレオチド用にはタンパク質またはそれらのインヒビター用のものとは異なる製剤を使用するであろう。同様に、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの送達は特定の細胞、状態、場所などに特異的である。
【０１６８】
この試薬が一本鎖抗体である場合、この抗体をコードしているポリヌクレオチドを組み立て、トランスフェリン−ポリカチオン−媒介ＤＮＡ転移、裸のまたはカプ細胞内核酸を用いるトランスフェクション、リポソームの媒介する細胞融合、ＤＮＡ被覆ラテックスビーズの細胞内輸送、プロトプラスト融合、ウイルス感染、電気穿孔、「遺伝子銃」、およびＤＥＡＥ−または燐酸カルシウム−媒介トランスフェクションを包含する（但しこれらに限定される訳ではない）充分確立した技術を用いて、ｅｘ ｖｉ．ｖ．ｏまたはインビボで細胞内に導入できる。
【０１６９】
抗体の有効なインビボ用量は、約５μｇから約５０μｇ／ｋｇ、約５０μｇから約５ｍｇ／ｋｇ、約１００μｇから約５００μｇ／ｋｇ（患者の体重）、および約２００から約２５０μｇ／ｋｇ（患者の体重）の範囲である。一本鎖抗体をコードしているポリヌクレオチドの投与のためには、有効なインビボ用量は、約１００ｎｇから約２００ｎｇ、５００ｎｇから約５０ｍｇ、約１μｇから約２ｍｇ、約５μｇから約５００μｇ、および約２０μｇから約１００μｇのＤＮＡの範囲である。
【０１７０】
発現産物がｍＲＮＡである場合、試薬は好ましくはアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはリボザイムである。アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはリボザイムを発現するポリヌクレオチドは、上記のように多岐にわたる方法によって細胞中に導入できる。
【０１７１】
好ましくは、試薬は、ヒトスフィンゴシンキナーゼ様タンパク質遺伝子の発現またはヒトスフィンゴシンキナーゼ様タンパク質の活性を、該試薬の不在時と比較して少なくとも約１０、好ましくは約５０、より好ましくは約７５、９０、または１００％低下さ細胞。ヒトスフィンゴシンキナーゼ様タンパク質遺伝子の発現レベルまたはヒトスフィンゴシンキナーゼ様タンパク質の活性を低下さ細胞よう選択した機構の有効性は、当分野で周知の方法、例えばヒトスフィンゴシンキナーゼ様タンパク質特異的ｍＲＮＡへのヌクレオチドプローブのハイブリダイゼーション、定量的ＲＴ−ＰＣＲ、ヒトスフィンゴシンキナーゼ様タンパク質の免疫学的検出、またはヒトスフィンゴシンキナーゼ様タンパク質活性の測定を用いて評価できる。
【０１７２】
上記のいずれの態様においても、本発明に係る任意の医薬組成物は他の適当な治療薬と組み合わせて投与できる。併用療法に使用するための適当な物質の選択は、常套的製薬原理に従い、当業者により実施することができる。治療薬の組み合わせは、相乗的に働いて、上記の様々な疾患の治療または予防を奏効さ細胞。このアプローチを用いて、より低い各物質の用量で治療効果を達成することができ、したがって有害な副作用の可能性を低減することができる。
【０１７３】
上記の治療方法のいずれも、例えばイヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ウサギ、サル、および最も好ましくはヒトといった哺乳動物を包含する、このような治療を必要とする任意の対象に適用することができる。
【０１７４】
本明細書に引用する全ての特許および特許出願は、引用により特に本明細書の一部とする。上記の内容は本発明を一般的に記載するものである。より完全な理解は以下の具体的実施例を参照することによって得られ、それらの実施例は例示のみの目的で提供するものであり、本発明の範囲を限定する意図は無い。
【０１７５】
実施例１
スフィンゴシンキナーゼ様タンパク質活性の検出
配列番号１のポリヌクレオチドを発現ベクターｐＣＥＶ４に挿入し、得られた発現ベクターｐＣＥＶ４−ヒトスフィンゴシンキナーゼ様タンパク質をヒト胎児腎２９３細胞にトランスフェクトする。チオベンジルエステル基質を用いて、トランスフェクト細胞の細胞抽出物のプロテアーゼ活性を測定する。顆粒およびカラムフラクション由来の酵素活性をモニターするため、室温で、０．５ｍＭ ５，５’−ジチオビス−（２−ニトロ安息香酸）（ＤＴＮＢ）（Ｓｉｇｍａ）を用いて検定を行い、ＨＳＢｚｌ脱離基を検出（４１０＝１３６００Ｍ−１ｃｍ−１）する。さらに、ミクロタイター検定（Ｇｒｅｅｎ ａｎｄ Ｓｈａｗ， Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ９３， ２２３−２２６， １９７９）を用いてＢＬＴ−エラスターゼ活性を見積もる。簡単には、サンプル５０μＬを、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１ｍＭ ＣａＣｌ２、１ｍＭ ＭｇＣｌ２からなる１ｍＭ ＤＴＮＢ１００μＬ、ｐＨ７．２に加える。ＢＬＴ（Ｓｉｇｍａ）５０μＬを加えて、最終濃度５００ｕｍにすることによって反応を開始さ細胞。メターゼ（Ｍｅｔａｓｅ）測定では、０．１Ｍ ＨＥＰＥＳ、０．０５Ｍ ＣａＣｌ２、ｐＨ７．５中のサンプル希釈物５０μＬを、１ｍＭ ＤＴＮＢ１００μＬに加え、Ｂｏｃ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｍｅｔ−Ｓ ベンジル（Ｂｚｌ）５０μＬを加え、最終濃度１５０ｕｍにすることによって反応を開始さ細胞。検定の時間は呈色度合いに応じ、その割合（ｒａｔｅ）は Ｄｙｎａｔｅｃｈ ＭＲ ５０００ マイクロプレートリーダーで測定（Ｏ．Ｄ．４１０）する。サンプルおよびＤＴＮＢのみまたはＤＴＮＢおよび基質のみのコントロールを実行する。
【０１７６】
実施例２
ヒトスフィンゴシンキナーゼ様タンパク質と結合する被験化合物の同定
グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼタンパク質を含み９６ウェル マイクロタイタープレートのグルタチオン誘導化ウェルに吸着させた精製ヒトスフィンゴシンキナーゼ様タンパク質を、生理緩衝溶液ｐＨ７．０の小分子ライブラリー由来の被験化合物と接触さ細胞。ヒトスフィンゴシンキナーゼ様タンパク質は、配列番号２、１０、１１に示すアミノ酸配列を含む。被験化合物は蛍光標識を含む。この試料を５分間〜１時間インキュベートする。コントロール試料は、被験化合物の非存在下にてインキュベートする。
【０１７７】
被験化合物を含む緩衝液を、ウェルから洗い出す。ヒトスフィンゴシンキナーゼ様タンパク質に対する被験化合物の結合を、ウェル内容物の蛍光測定により検出する。被験化合物をインキュベートしていないウェルの蛍光と比較して少なくとも１５％ウェルの蛍光を増大さ細胞被験化合物を、ヒトスフィンゴシンキナーゼ様タンパク質と結合する化合物と同定する。
【０１７８】
実施例３
ヒトスフィンゴシンキナーゼ様タンパク質遺伝子発現を低下さ細胞被験化合物の同定
被験化合物を、ヒトスフィンゴシンキナーゼ様タンパク質発現構築物でトランスフェクトしたヒト細胞培養に投与し、３７℃で１０〜４５分間、インキュベートする。トランスフェクトしていない同じタイプの細胞培養を、被験化合物を加えず、同じ時間インキュベートし、ネガティブコントロールとする。ＲＮＡを、Ｃｈｉｒｇｗｉｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍ． １８， ５２９４−９９，１９７９に記載のように２つの培養物から単離する。ノーザンブロットを全ＲＮＡ２０〜３０μｇを用いて調製し、エクスプレスハイブ（Ｅｘｐｒｅｓｓｈｙｂ）（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）中６５℃にて、３２Ｐ−標識化ヒトスフィンゴシンキナーゼ様タンパク質特異的プローブを用いてハイブリダイズさ細胞。このプローブは配列番号１または９の相補物より選ばれる少なくとも１１個の連続ヌクレオチドを包含する。被験化合物の非存在下にて得られるシグナルと比較して、ヒトスフィンゴシンキナーゼ様タンパク質特異的シグナルを低下さ細胞被験化合物を、ヒトスフィンゴシンキナーゼ様タンパク質遺伝子発現のインヒビターとして同定する。
【０１７９】
実施例４
ヒトスフィンゴシンキナーゼ様タンパク質遺伝子発現を低下さ細胞被験化合物の同定
トランスフェクトしていない同じタイプの細胞培養を、被験化合物を加えず、同じ時間インキュベートし、ネガティブコントロールとする。ＲＮＡを、Ｃｈｉｒｇｗｉｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍ． １８， ５２９４−９９，１９７９に記載のように２つの培養物から単離する。ノーザンブロットを全ＲＮＡ２０〜３０μｇを用いて調製し、エクスプレスハイブ（Ｅｘｐｒｅｓｓｈｙｂ）（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）中６５℃にて、３２Ｐ−標識化ヒトスフィンゴシンキナーゼ様タンパク質特異的プローブを用いてハイブリダイズさ細胞。このプローブは配列番号１または９の相補物より選ばれる少なくとも１１個の連続ヌクレオチドを包含する。被験化合物を、ヒトスフィンゴシンキナーゼ様タンパク質発現構築物でトランスフェクトしたヒト細胞培養に投与し、３７℃で１０〜４５分間、インキュベートする。トランスフェクトしていない同じタイプの細胞培養を、被験化合物を加えず、同じ時間インキュベートし、ネガティブコントロールとする。ＲＮＡを、Ｃｈｉｒｇｗｉｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍ． １８， ５２９４−９９，１９７９に記載のように２つの培養物から単離する。ノーザンブロットを全ＲＮＡ２０〜３０μｇを用いて調製し、エクスプレスハイブ（Ｅｘｐｒｅｓｓｈｙｂ）（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）中６５℃にて、３２Ｐ−標識化ヒトスフィンゴシンキナーゼ様タンパク質特異的プローブを用いてハイブリダイズさ細胞。このプローブは配列番号１または９の相補物より選ばれる少なくとも１１個の連続ヌクレオチドを包含する。被験化合物の非存在下にて得られるシグナルと比較して、ヒトスフィンゴシンキナーゼ様タンパク質特異的シグナルを低下さ細胞被験化合物を、ヒトスフィンゴシンキナーゼ様タンパク質遺伝子発現のインヒビターとして同定する。
【０１８０】
実施例５
ヒトスフィンゴシンキナーゼ様タンパク質遺伝子産物と特異的に結合する試薬を用いた乳癌の処置
配列番号１および９の相補物より選択される少なくとも１１個の連続ヌクレオチドを含むアンチセンスヒトスフィンゴシンキナーゼ様タンパク質オリゴヌクレオチドの合成は、ホスホラミダイト手順を用いて、ファルマシア ジーン アセンブリー シリーズ シンセサイザー（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｇｅｎｅ Ａｓｓｅｍｂｌｅｒ ｓｅｒｉｅｓ ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ）にて実施する（Ｕｈｌｍａｎｎら、Ｃｈｅｍ． Ｒｅｖ． ９０， ５３４−８３， １９９０を参照のこと）。アセンブリーおよび脱保護に続き、オリゴヌクレオチドを２度エタノール沈殿させ、乾燥させ、そしてリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中に所望の濃度に懸濁する。これらのオリゴヌクレオチドの純度は、キャピラリーゲルゲル電気泳動及びイオン交換ＨＰＬＣにより試験する。オリゴヌクレオチド調製のエンドトキシンレベルは、リムルスアメーバ様検定（Ｌｉｍｕｌｕｓ Ａｍｅｂｏｃｙｔｅ Ａｓｓａｙ）（Ｂａｎｇ， Ｂｉｏｌ． Ｂｕｌｌ． （Ｗｏｏｄｓ Ｈｏｌｅ， Ｍａｓｓ．） １０５， ３６１−３６２， １９５３） を用いて決定する。
【０１８１】
アンチセンスオリゴヌクレオチドを、患者の乳癌に０．１〜１００ｕｍの濃度で直接投与する。患者の乳癌の大きさを数日または数週間の期間で観察する。スフィンゴシンキナーゼ様タンパク質活性の減少のため腫瘍の成長が抑制される。
【０１８２】
実施例６
スフィンゴシンキナーゼ様遺伝子産物に特異的に結合する慢性関節リウマチの処理
配列番号１および９は、ホスホロアミダート法（Ｕｈｌｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．， Ｃｈｅｍ． Ｒｅｖ． ９０， ５３４−８３，１９９０）を使用して、Ｐｈａｒｍａｃｉａ遺伝子アセンブラー・シリーズ・シンセサイザー上で実行する。試薬にに配列番号の補足から少なくとも１１の接触するヌクレオチドを含むキナーゼ様蛋白質オリゴヌクレオチドが選んだ、アンチセンスのスフィンゴシンのキナーゼ様蛋白質遺伝生成物合成を特に結び付ける試薬を備えた。続いて、オリゴヌクレオチドは乾燥し、２度エタノール沈殿され、所望の濃度でリン酸塩バッファーを用いた食塩水（ＰＢＳ）を中へ留去した。これらのオリゴヌクレオチドの精製はゲルによって試験し、電気泳動にかける、またイオン交換ＨＰＬＣ。オリゴヌクレオチド準備での菌体内毒素レベルはリムルス属変形細胞分析（生物学的な雄牛）を使用して決定した。（Ｂａｎｇ， Ｂｉｏｌ． Ｂｕｌｌ．（Ｗｏｏｄｓ Ｈｏｌｅ， Ｍａｓｓ．） １０５， ３６１−３６２，１９５３）
【０１８３】
０．１−１００ ｕｍの濃度でアンチセンスのオリゴヌクレオチドを含んでいる水の構成は、針を使用して、患者を処置する。
【０１８４】
慢性関節リウマチアテローム性動脈硬化症の重篤は、膝関節から関節滑液を分泌する流体を取り除き、関節滑液を分泌するＴ細胞を分離し、Ｔ細胞がＦａｓを媒介としたＤＮＡ分割に強いかどうか決めることにより、数日か数週の期間の間モニターされる。簡潔に、Ｔ細胞は、０．２％のトリトンＸ−１００、ｐＨ ８を牽制するＴＥバッファーの中で溶解されました。破片にされたＤＮＡは、４℃に２０分でｍｉｃｒｏｆｕｇｉｎｇすることにより完全な染色質から１４，０００ｒｐｍで遠心したた。生じる上澄みは、３７℃に、プロテイナーゼＫの１ｍｇ／ｍｌで一晩処理し、次に、フェノール／クロロホルム／イソアミールアルコール（２５： ２４： １）で３回抽出した。ＤＮＡは、一晩で−２０℃で０．３Ｍの酢酸ナトリウム、ｐＨ ５．２がある状態で、無水エタノールの３回の追加によって促進され、次に、２０分で４Ｃに１４，０００ｒｐｍに遠心分離によってペレット化した。小球は、７５％エタノールで２度洗浄し、１０を含んでいるＴＥの３０のゲルに溶かした、ＲＮａｓｅのｇ／ｍｌ、一晩、３７のＣＤＮＡでは、サンプルは１の上の電気泳動によって分離した。エチジウム臭化物がある状態での８％のアガロース・ゲル。アンチセンスのオリゴヌクレオチドの追加の注入は、その時間の間与えることができた。慢性関節リウマチは、蛋白質活性キナーゼのような減少したスフィンゴシンにより抑えられた。
【０１８５】
実施例７
増殖阻止分析：アンチセンスのオリゴヌクレオチドは、癌細胞系の成長を抑えます。試験のために使用された細胞系はヒト結腸癌細胞系ＨＣＴ１１６であった。細胞は、多くの０．５ｍｌで１ミリリッター当たり１０，０００個の細胞の濃度の１０−１５％の胎児の子牛血清を添加したＲＰＭＩ−１６４０において培養し、９５％の空気／５％ＣＯ２大気中で３７℃に維持した。
【０１８６】
ホスホロチオエートオリゴリボヌクレオチドはホスホロアミダート化学を使用して、Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓモデル３８０Ｂ ＤＮＡシンセサイザー上で合成した。２４の基礎のシーケンスは試験・オリゴヌクレオチドとして使用した：（１）５’−ＴＧＧ ＴＴＴ ＣＧＴ ＡＡＡ ＴＧＡ ＣＣＡ ＴＡＡ ＡＴＡ−３’（配列番号２、１０および１１の位置１〜２４でのヌクレオチドに相補的）。コントロールとして、別の（ランダム）シーケンスを使用した：５’−ＴＣＡ ＡＣＴ ＧＡＣ ＴＡＧ ＡＴＧ ＴＡＣ ＡＴＧ ＧＡＣ−３’。オリゴヌクレオチドは２度エタノール沈殿した、乾燥した、またリン酸塩を留去した、バッファーした。オリゴヌクレオチドの精製は、キャピラリーゲル電気泳動およびイオン交換ＨＰＬＣによって試験した。精製されたオリゴヌクレオチドは、１０ ｕＭの濃度で培地に加えられた。
【０１８７】
７日の間の試験・オリゴヌクレオチドの追加は、ウェスタンブロッティングにより決定されるような蛋白質キナーゼのようなヒトスフィンゴシンの著しく縮小された発現に帰着した。この結果はコントロール・オリゴヌクレオチドで観察されなかった。３〜７日後に、培養細胞中の細胞の数は細胞カウンターを使用して数えた。試験オリゴヌクレオチド（１００％として発現された）で処理した培養細胞中の細胞の数は、対照オリゴヌクレオチドで処理した培養細胞中の細胞の数と比較した。試験オリゴヌクレオチドで処理した培養細胞中の細胞の数は、ヒトスフィンゴシンの阻止が蛋白質キナーゼのように癌細胞に反増殖の効果があることを示して、対照の最高３０％であった。
【０１８８】
実施例８
発現プロフィルの定量
Ｈｉｇｕｃｈｉら、１９９２年、Ｈｉｇｕｃｈｉら、１９９３．に記述された、定量的の合成酵素連鎖反応（ＰＣＲ）分析に最初に基づき、ＰＣＲの指数関数的な過程内の所定の、産物の量がテンプレート・コピーの初期の数に比例する。この技術の使用、特別の遺伝子の発現レベル、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）として染色体から転写される、ｍＲＮＡのＤＮＡコピー（ｃＤＮＡ）を最初に作り、次に、ｃＤＮＡ上で量的ＰＣＲを実行することにより測定される、量的逆の転写合成酵素連鎖反応（量的ＲＴ−ＰＣＲ）を行った。
【０１８９】
異なるヒト組織からのＲＮＡの定量的のＲＴ−ＰＣＲ分析は、ＬＢＲＩ−２２１、スフィンゴシンのキナーゼ様ｍＲＮＡ（配列番号： ２、１０および１１）の組織分配を調査するために実行した。ほとんどの場合、ＲＴ−ＰＣＲ（ライフ・テクノロジーズ、ロックヴィル、ＭＤ（アメリカ））のＳＵＰＥＲＳＣＲＩ．Ｐ．Ｔ合成システムを使用して、第１のｃＤＮＡを合成するために、様々な組織（ヒトＲＮＡパネルＩ．Ｖ．およびＣｌｏｎｔｅｃｈ研究所、パロアルト（ＣＡ）、アメリカ）からのＲＮＡの合計の２５ ｕｇをテンプレートとして使用した。第１鎖のｃＤＮＡ合成は交雑するｏｌｉｇｏ（ｄＴ）を使用して、メーカーのプロトコルによって行なった。３’ｐｏｌｙにｍＲＮＡのＡ後部、また合成反応を準備した。その後、第１鎖のｃＤＮＡのおよそ１０ナノグラムは合成酵素連鎖反応の中でテンプレートとして使用した。他の場合に、商業的に利用可能なｃＤＮＡｓ（ヒト免疫系ＭＴＣパネルおよびヒト血液分数ＭＴＣパネル、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ研究所、パロアルト（ＣＡ）、アメリカ）の１０ナノグラム、合成酵素連鎖反応の中でテンプレートとして使用した。合成酵素連鎖反応はＤＮＡを拘束力のある蛍光灯染料ＳＹＢＲグリーンがある状態で、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（Ｒｏｃｈｅの分子のＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ、インディアナポリス（ＩＮ）、アメリカ）の中で実行した、私、それは二重らせん構造のＤＮＡが反応（モリソン、１９９８年ら）でうまく合成されるときに限り生産され、ＤＮＡ二重らせんの小さな溝に拘束した。二重らせん構造のＤＮＡに拘束する際、ＳＹＢＲグリーンＩは、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ装置によって定量的に測定することができる光を放射した。合成酵素連鎖反応はオリゴヌクレオチドプライマーＬＢＲＩ２２１−Ｌ３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １２）、および放射された光の強度のＬＢＲＩ２２１−Ｒ２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １３）および測定を使用して、実行した、反応が放射された光の８５のＣ．強度の温度に達した時反応の各サイクルに続いて、得られた、既知の濃度の同時に反応させられた標準との比較によってテンプレートｃＤＮＡの１ナノグラム当たり遺伝子記録のコピー番号に変換した。
【０１９０】
様々な組織タイプ中の１個の細胞当たりｍＲＮＡ転写レベルの差を修正するために、正常化法は、５つの異なる処理を遺伝子の様々な組織の中で同様に計算された発現レベルを使用して実行した：グリ細胞アルデヒド−３−ホスファターゼ（Ｇ３ＰＤＨ）、ヒポキサンチン・グアニンホスホリボシル転移酵素ＡＲＴ、ベータアクチン、ｐｏｒｐｈｏｂｉｌｉｎｏｇｅｎデアミナーゼ（ＰＢＧＤ）。処理をする遺伝子発現のレベルは、すべての組織（アダムズら、１９９３年、アダムズら、１９９５年、Ｌｉｅｗら、１９９４年）のために比較的一定であると考えられ、したがって細胞の相対的な数に接近するゲージとして使用することができた。ＲＮＡの合計はｃＤＮＡ合成ステップの中で使用した。処理をする遺伝子のわずかに異なるセットの使用および発現レベルを測定するＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒシステムの使用を除いて、正常化法は、ＲＮＡマスター汚れユーザ・マニュアル、付録Ｃ（１９９７年、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ研究所、パロアルト（ＣＡ）、アメリカ）に記述された方法と同様に行った。すべての組織サンプル中の５つの処理をする遺伝子の発現レベルは、要するに、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒおよび一定の量のスタートするＲＮＡ（２５ｐ。 ｇ）を使用して、１つの遺伝子当たり３つの無所属反応で測定した。既知の濃度の同時に反応させられた標準との比較に由来した各遺伝子の計算されたコピー番号は記録した。また、すべての組織サンプル中の各遺伝子のコピーの中間の番号が決定した。その後、各組織サンプルについては、中間のものに関する各処理遺伝子の発現は計算した。また、５つの処理をする遺伝子上のこれらの値の平均を求めた。その後、各組織の正常化要因は、組織の各々に見合う対応する価値によって標準として任意に選択された組織のうちの１つに見合う最終価値の分割により計算した。組織サンプル中の特別の遺伝子の発現に対する実験的に得られた値を標準化するために、得られた値に試験された組織のための正常化要因を掛けた。ヒト血液分数ＭＴＣパネル（それは組織が活性化されたか否かどうかに依存する、いくつかの処理をする遺伝子における劇的な変化を示した）にそれらが由来したこと以外のこの正常化方法は、すべての組織のために使用した。これらの組織では、正常化が、単一の処理遺伝子、ベータ−２−ミクログロブリンで行なった。
【０１９１】
結果は１４と１５、左側の第１鎖のｃＤＮＡの１０ナノグラムについてｍＲＮＡの実験的に得られたコピー番号を示し、右側上の標準化された値それらのサプライヤーとカタログの番号に加えてｃＤＮＡ合成のために使用されたＲＮＡは、表および２に示した。
【０１９２】
スフィンゴシン・キナーゼに特に拘束する試薬を備えた喘息の治療
配列番号１および９の相補鎖から少なくとも１１の接触するヌクレオチドを含むキナーゼ様蛋白質オリゴヌクレオチドから選択される、アンチセンスのスフィンゴシンの蛋白質遺伝生成物合成：１と９は、ホスホロアミダート法（Ｕｈｌｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．， Ｃｈｅｍ． Ｒｅｖ． ９０， ５３４−８３，１９９０）を使用して、Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｇｅｎｅ Ａｓｓｅｍｂｌｅｒシリーズ・シンセサイザー上で実行した。構築と脱保護に続いて、オリゴヌクレオチドは乾燥し、２度エタノール沈殿され、希望の濃度でリン酸塩バッファーを用いた食塩水（ＰＢＳ）を中へ留去した。これらのオリゴヌクレオチドの精製はキャピラリーゲルによって試験した、電気泳動にかけ、イオン交換ＨＰＬＣ。オリゴヌクレオチド準備での菌体内毒素レベルは、リムルス属変形細胞分析（Ｂａｎｇ， Ｂｉｏｌ． Ｂｕｌｌ．　（Ｗｏｏｄｓ Ｈｏｌｅ， Ｍａｓｓ．） １０５， ３６１−３６２，１９５３）を使用して決定した。
【０１９３】
アンチセンスのオリゴヌクレオチドを含んでいる水性製剤は、吸入によって患者に処置した。
【０１９４】
喘息の重篤度は徴候の変化に注意する、肺機能を測定する、あるいは洗浄によって肺からサンプリングされた流体の中で多くの炎症性の細胞あるいは炎症性のメディエーターの濃度のような肺炎症のマーカーの変化を測定することにより、数日または数週の期間の間モニターした。喘息は、蛋白質活性キナーゼのような減少したスフィンゴシンにより縮小した。
【０１９５】
実施例１０
新規化合物の生体内の確認
１． Ｔ細胞の活性に対する試験は共刺激分子サイトカイニン、サイトカイニン受容体、シグナル伝達分子あるいはＴ細胞活性化に関与する他の分子の発現か活性を調節する試薬を評価するために使用した。
【０１９６】
マウスはサイトカイニン産生モデルを反−ＣＤ３−誘導した：
ＢＡＬＢ／ｃハツカラットは、１４５の２Ｃ１１（精製ハムスター抗マウスＣＤ３モノクローナル抗体， ＰＨＡＲＭＩＮＧＥＮ）の１０のＡｇの単一の静脈注射を注入した。化合物は、反ＣＤ３ ｍＡｂ注入に先立って腹腔内で６０分処理した。血液は、抗体注入の後に９０分集めた。血清を３０００ ｒで遠心分離によって得た。
【０１９７】
ＩＬ−２およびＩＬ−４のようなサイトカイニンあるいは他の分泌された分子の血清レベルは、ＥＬＩＳＡによって決定した。ＣＤ３の下流のシグナリングを調節する蛋白質はこのモデル中で評価することができた。
【０１９８】
２． Ｂ細胞の活性に対する試験は、Ｂ細胞受容体の発現か活性を調節する試薬、あるいは、Ｂ細胞活性化／免疫グロブリンクラス・スイッチングに含まれる他の分子を評価するために使用した。マウス反免疫グロブリンＤは免疫グロブリンＥ産生モデルを引き起こした。ＢＡＬＢ／ｃハツカラットは、精製されたヤギ抗マウス免疫グロブリンＤ抗体あるいはＰＢＳ（日０として定義された）の０．８ｍｇを静脈内で注入した。化合物は、日０〜日６まで腹腔内で処理した。日に、７つの血液を集めた。また、血清は３０００ ｒで遠心分離によって得られた。免疫グロブリンＥの合計の血清レベルはＹＡＭＡＳＡのＥＬＩＳＡキットによって決定した。また、他のＩｇサブタイプはＩｇ ＥＬＩＳＡ ＫＩＴ（Ｒｏｕｇｉｅｒ Ｂｉｏ−ｔｅｃｈ’ｓ， Ｍｏｎｔｒｅａｌ， Ｃａｎａｄａ）によって測定した。免疫グロブリンＤの下流のシグナリングおよびＩｇクラス・スイッチングを調節する蛋白質は評価することができた。
【０１９９】
３． 単球／マクロファージの活性に対する試験は分子（転写要因）を示す発現か活性を調節する試薬を評価するために使用した。
【０２００】
マウスはＴＮＦａ産生モデルをＬＰＳ−引き起こした：
化合物は腹腔内の注入によってＢＡＬＢ／ｃハツカラットに処理した、そして１時間後に、腹腔内の注入によってＬＰＳ（２００およびｕｇ／マウス）を与えられたハツカラット。ＬＰＳ注入およびプラズマが得られた９０分後、血液が集めた。サンプル中のＴＮＦａ濃度はＥＬＩＳＡキットを使用して決定した。ＮＦ−ＫＢ活性化のようなＬＰＳ刺激の影響を下流に調節する蛋白質は評価することができた。
【０２０１】
４． エオシン好性の細胞の活性に対する試験は分子、細胞骨格の分子あるいは付着分子を示して、エオトキシン受容体の発現か活性を調節する試薬を評価するために使用した。
【０２０２】
マウスは好酸球増加モデルをエオトキシン誘導した：
ＢＡＬＢ／ｃハツカラットは、皮内に注入した、６および３日目に２．５ｍｌのエアポーチを準備するために日０において、化合物を腹腔内処理した。また、３０分後に、ＩＬ−５（３００ナノグラム／マウス）は静脈内投与した。さらに３０分の後に、エオタキシンは注入した（３ ｐｇ／マウス、ｉ ｄ）。エオタキシン注入の４時間後に、ａｉｒｐｏｕｃｈ浸出物中の白血球を集めた。また、細胞の合計の数が数えられた。浸出物中の差異の細胞数はＧｒｕｎｗａｌｄ Ｇｉｍｓａにより実行した。エオタキシン受容体によってシグナリングを調節するか、エオシン好性の売買を調節する蛋白質は評価することができた。
【０２０３】
５． ラットにおける受動皮膚アナフィラキシー（ＰＣＡ）
６週齢、のオスのＷｉｓｔａｒラットに皮下投与し （ｉ ｄ）感作し、軽い麻酔下で０．１のｕｇ／ｍｌマウス反ＤＮＰ免疫グロブリンＥ単クローン抗体（ＳＰＥ−７）の５０ ｇｌで処理した。２４時間の後に、ラットは、０．６ｍｇのＤＮＰ−ＢＳＡ（３０）（ＬＳＬ ＣＯ。ＬＴＤ）を含有する食塩水の１ｍｌおよびエヴァンスの０．００５ｇで静脈内で投与した。化合物は、腹腔内で（ｉ．ｐ．）注入した。増感、抗原投与および合成の処理のないラットはコントロールとして使用した。また、感作、抗原投与をしたラットは阻止を決定するために使用した。抗原投与の３０分後に、ラットを屠殺した。また、後部の皮膚を切除した。皮膚中のエヴァンスの青い染料は、６３℃にて６２０ｎｍの吸光度でフォルムアミドの中で一晩抽出した、その後、漏らされた染料の光学の密度を得るために測定した。
【０２０４】
化合物によるＰＣＡの阻害パーセントは以下のように計算した：
％阻害＝｛（平均媒質容量−試料容量）／（平均媒質値−平均対照値）｝×１００
ヒスタミン受容体、セロトニン受容体あるいはシステイニルロイコトリエン受容体に対する、マスト細胞顆粒減少、管の浸透性あるいは受容体敵を調節する１００の蛋白質を評価することができた。
【０２０５】
６． ラットにおけるアナフィラキシー性気管支収縮
６週齢の雄性ＷｉｓｔａｒラットにＳＰＥ−７で静脈内（ｉ．ｖ．）感作し、１日後に、ラットは、ウレタン（１０００ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．）およびガラニン（５０ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｖ．）を添加した麻酔下の１．５ｍｇのＤＮＰ−ＢＳＡ（３０）を含んでいる食塩水の０．３ｍｌで静脈内で抗原投与した。カニューレは、人工呼吸（２ｍｌ／ストローク、７０のストローク／分）のために気管に挿入した。肺の圧力（ＰＩ．Ｐ．）はカニューレの側面の腕を圧力変換器に接続し、記録した。ＰＩ．Ｐ．の変化は、抵抗および肺の従順の両方の変化を反映した。化合物を評価するために、化合物を抗原投与の５分前に投与した。
【０２０６】
ヒスタミン受容体、セロトニン受容体あるいはシステイニルロイコトリエン受容体に対する、マスト細胞顆粒減少、管の浸透性あるいは受容体敵を調節する蛋白質は評価することができた。平滑筋の短縮を調節する蛋白質も評価することができた。
【０２０７】
７． 平滑筋細胞あるいは内皮細胞へのＴ細胞付着Ｔ細胞の精製した集団は、羊赤血球で惹起し、抗体で覆われた磁気ビーズを使用して、ナイロンウールカラム上で分離した後ｆｉｃｏｌｌ密度遠心分離によって製造した。Ｔ細胞は３６〜４２時間有系分裂促進物質で活性化した。また、標識を活性化の最後の１６時間間で３Ｈチミジンで付した。気道平滑筋細胞あるいは気管支の微小血管の内皮の細胞は、肺移植組織、癌患者からの気管支切除、死体、あるいは商業的な供給元からの細胞系として得た。新鮮な組織が細胞の源として使用される場合、１．７ ｍＭをエチレングリコールで２度３０−６０分間消化した後、解剖によって平滑筋細胞および内皮の細胞を組織から分離したエチレングリコール−ビス−（ベータ−アミノエチルエーテル）−Ｎ、Ｎ’，Ｎ’−四酢酸、６４０のＵ／ｍＬコラゲナーゼ、１０ｍｇ／ｍｌのダイズ豆トリプシン抑制剤および１０のＵ／ｍＬエラスターゼ。平滑筋細胞か内皮の細胞はコンフルエントまで２４ウェル組織培養皿において培養した後、２４時間ＴＮＦａのような試験化合物および炎症性のメディエーターで処理した。付着を測定するために、６つの×１０５ Ｔ細胞を加えらた。３７個のＣ．Ｎｏｎａｄｈｅｒｅｎｔ細胞で１時間付着することが認められ、培地でで６回静かに洗うことにより除去した。最後に、残る付着細胞を、ＰＢＳ中の３００μＬの１％トリトン−Ｘ １００を加えることにより溶解し、シンチレーション計数器で放射能の量を計った。付着細胞／合計から回収された計数値×１００％として結合の百分率を計算した。
【０２０８】
表１：全血スクリーニング組織
2004510429.tif 000002
【０２０９】
表２：血液／肺スクリーニング組織
2004510429.tif 000003
【０２１０】
参考文献
１． Ｌｉｕ， ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２７５： １９５１３−１９５２０ （２０００）．
２． ＢａＭｒｕｋｅｒ， Ｔ． ａｎｄ Ｅ． Ｅ． Ｐｒｉｅｓｃｈｌ， Ｉｎｔ． Ａｒｃｈ． Ａｌｌｅｒｇｙ Ｉｍｕｎｏｌ．， １２２ ： ８５−９０ （２０００）．
３． Ｔａｋｅｓｈｉｔａ， ｅｔ ａｌ．， Ｊ， Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， Ｍ００２５６９２００ （２０００）．
４． Ｏｈｔａ ｅｔ ａｌ．， ＲＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ （１９９４）， ３５５ （３）， ２６７−７０．
５． Ｒ． Ｍｉｌｌｉｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｌａｎｃｅｔ １： ８１２−８１６ （１９８４）．
６． Ｊ． Ａ Ｅｎｇｅｌｂｒｅｃｈｔ ｅｔ ａｌ．， Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ ａｎｄ ＲｈｅＭａｔｉｓｍ ２６ （１０）： １２７５−１２７８ （１９８３）．
７． Ｇ． Ｗ． Ｃａｎｎｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ ａｎｄ ＲｈｅＭａｔｉｓｍ ２６ （１０）： １２６９−１２７４ （１９８３）．
８． Ｓｉｍｏｎ ａｎｄ Ｍｉｌｌｓ， Ｎ． Ｅｎｇ． Ｊ． Ｍｅｄ． ３０２ （２１）： １１７９−１２４３ （１９８０）．
９． Ｗ． Ｋａｔｚ ｅｔ ａｌ．， Ａｎｎ． Ｉｎｔ． Ｍｅｄ． １０１ ： １７６−１７９ （１９８４）．
１０． Ｗ． Ｆ． Ｋｅａｎ ｅｔ ａｌ．， Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ ａｎｄ Ｒｈｅｕｍａｔｉｓｍ ２３ （２）： １５８−１６４ （１９８０）．
１１． Ｓ． Ｎａｇａｔａ， Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ５７： １２９−１４４ （１９９４）．
１２． Ｒ． Ｎ． Ｋｏｌｅｓｎｉｃｋ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． ７２： ４７１−４７４ （１９９４）．
１３． Ｍ． Ｖｅｒｈｅｉｊ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３８０： ７５−７９ （１９９６）．
１４． Ｃ． Ｊ． ｖａｎ Ｋｏｐｐｅｎ ｅｔ ａｌ， Ｊ Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２１７ （４）： ２０８２−２０８７ （１９９６）．
１５． Ｏ． Ｃｕｖｉｌｌｉｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３８１ ： ８００−８０３ （１９９６）．
１６． Ａ． Ａｂｂａｓ， Ｃｅｌｌ ８４： ６５５−６５７ （１９９６）．
１７． Ｃ． Ｊａｃｏｂ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １４２ （５）： １５００−１５０５ （１９８９）．
１８． Ｋ． Ｇｏｏｄｅｍｏｔｅ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７０： １０２７２−１０２７７ （１９９５）．
１９． Ｇ． Ｈ． Ｆｉｓｈｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ ８１： ９３５−９４６ （１９９５）．
２０． Ｆ． Ｒｉｅｕｘ−Ｌａｕｃａｔ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６８： １３４７−１３４９ （１９９５）．
２１． Ｍ． Ａｄａｃｈｉ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． （ＵＳＡ） ９０： １７５６−１７６０ （１９９３）．
２２． Ｂ． Ｓ． Ａｎｄｒｅｗｓ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １４８： １１９８−１２１５ （１９７８）．
２３． Ｈ． Ｔａｋａｙａｍａ ｅｔ ａｌ．， Ａｄｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ６０： ２８９−３２１ （１９９５）．
２４． Ｄ． Ｗ． Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３７６： ３７−４３ （１９９５）．
２５． Ｍ． Ｔｅｗａｒｉ ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ ８１ ： ８０１−８６９ （１９９５）．
２６． Ａ． Ｍ． Ｃｈｉｎｎａｉｙａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ ８１ ： ５０５−５１２ （１９９５）．
２７． Ｓ． Ｍ． Ｋｒａｎｅ ａｎｄ Ｒ． Ｔ． Ｓａｌｚｍａｎ， Ａｍ Ｊ Ｍｅｄ． ： ７５ （４Ｂ）： １−９１ （１９８３）．
２８． Ｄ． Ｅ． Ｆｕｒｓｔ， Ａｒｔｈ． ＆ Ｒｈｅｕｍ． ３７ （１） ： １−９ （１９９４）．
２９． Ｂ． Ｏ． Ｂａｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ａｒｔｈ． ＆ Ｒｈｅｕｍ． ２７ （６）： ６０１−６０５ （Ｊｕｎ． １９８４）．
３０． Ｈ． Ｂ． Ｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．， Ａｎｎ． Ｉｎｔ． Ｍｅｄ． ９２： ２４−２９ （１９８０）．
３１． Ｃ． Ｊ． Ｍａｒｓｈａｌｌ， Ｎａｔｕｒｅ ３６７： ６８６ （１９９４）．
３２． Ｇ． Ｌ’Ａｌｌｅｍａｉｎ， Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｉｎ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５： ２９１−３３４ （１９９４）．
３３． Ｓ． Ａ． Ｓｕｓｉｎ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １８６ （１） ： ２５−３７ （１９９７）．
３４． Ｈｉｇｕｃｈｉ， Ｒ．， Ｄｏｌｌｉｎｇｅｒ， Ｇ．， Ｗａｌｓｈ， Ｐ． Ｓ． ａｎｄ Ｇｒｉｆｆｉｔｈ， Ｒ． （１９９２） Ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ． ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０： ４１３−４１７．
３５． Ｈｉｇｕｃｈｉ， Ｒ．， Ｆｏｃｋｌｅｒ， Ｃ．， Ｄｏｌｌｉｎｇｅｒ， Ｇ． ａｎｄ Ｗａｔｓｏｎ， Ｒ． （１９９３） Ｋｉｎｅｔｉｃ ＰＣＲ ａｎａｌｙｓｉｓ： ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ ｏｆ ＤＮＡ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｒｅａｃｔｉｏｎｓ． ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １１： １０２６−１０３０．
３６． Ｔ． Ｂ． Ｍｏｒｒｉｓｏｎ， Ｊ． Ｊ． Ｗｅｉｓ ＆ Ｃ． Ｔ． Ｗｉｔｔｗｅｒ． （１９９８） Ｑｕ抗ｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｌｏｗ−ｃｏｐｙ ｔｒａｎｓｃｒｉ．ｐ．ｔｓ ｂｙ ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ ｄｕｒｉｎｇ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２４： ９５４−９６２．
３７． Ａｄａｍｓ， Ｍ． Ｄ．， Ｋｅｒｌａｖａｇｅ， Ａ． Ｒ．， Ｆｉｅｌｄｓ， Ｃ． ＆ Ｖｅｎｔｅｒ， Ｃ． （１９９３） ３，４００ ｎｅｗ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｔａｇｓ ｉｄｅｎｔｉｆｙ ｄｉ．ｖ．ｅｒｓｉｔｙ ｏｆ ｔｒａｎｓｃｒｉ．ｐ．ｔｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｂｒａｉｎ． Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ． ４： ２５６−２６５．
３８． Ａｄａｍｓ， Ｍ． Ｄ．， ｅｔ ａｌ． （１９９５） Ｉｎｉｔｉａｌ ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｇｅｎｅ ｄｉ．ｖ．ｅｒｓｉｔｙ ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｐａｔｔｅｒｎｓ ｂａｓｅｄ ｕｐｏｎ ８３ ｍｉｌｌｉｏｎ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｏｆ ｃＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅ． Ｎａｔｕｒｅ ３７７ ｓｕｐｐ： ３−１７４．
３９． Ｌｉｅｗ， Ｃ． Ｃ．， Ｈｗａｎｇ， Ｄ． Ｍ．， Ｆｕｎｇ， Ｙ． Ｗ．， Ｌａｕｒｅｎｓｏｎ， Ｃ．， Ｃｕｋｅｒｍａｎ， Ｅ．， Ｔｓｕｉ， Ｓ． ＆ Ｌｅｅ， Ｃ． Ｙ． （１９９４） Ａ ｃａｔａｌｏｇ ｏｆ ｇｅｎｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ ｓｙｓｔｅｍ ａｓ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ ｂｙ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｔａｇｓ． Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９１ ： １０１４５ １０６４９．
【図面の簡単な説明】
【図１】スフィンゴシンキナーゼ様ポリペプチドのＤＮＡ配列（配列番号１）を示す。
【図２】図１のＤＮＡ配列の推定アミノ酸配列（配列番号２）を示す。
【図３】ＥＭＢＬ受入れ番号第ＡＦ２４５４４７号によって同定されるタンパク質のアミノ酸配列（配列番号３）を示す。
【図４】スフィンゴシンキナーゼ様ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列（配列番号４）を示す。
【図５】スフィンゴシンキナーゼ様ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列（配列番号５）を示す。
【図６】スフィンゴシンキナーゼ様ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列（配列番号６）を示す。
【図７】スフィンゴシンキナーゼ様ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列（配列番号７）を示す。
【図８】スフィンゴシンキナーゼ様ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列（配列番号８）を示す。
【図９】スフィンゴシンキナーゼ様ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列（配列番号９）を示す。
【図１０】スフィンゴシンキナーゼ様ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列（配列番号１０）を示す。
【図１１】スフィンゴシンキナーゼ様ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列（配列番号１１）を示す。
【図１２】配列番号３に対するスフィンゴシンキナーゼ様ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列（配列番号２）のＢＬＡＳＴＰアライメントを示す。
【図１３】ヒトスフィンゴシンキナーゼ様ポリペプチドのアミノ酸配列を示す。
【図１４】スフィンゴシンキナーゼ様ポリペプチド（配列番号１０）全血スクリーニングの発現プロファイルを示す。
【図１５】スフィンゴシンキナーゼ様ポリペプチド（配列番号１０）血液／肺スクリーニングの発現プロファイルを示す。
【図１２】
2004510429.tif 000004
【図１３】
2004510429.tif 000005
【図１４】
2004510429.tif 000006
【図１５】
2004510429.tif 000007
【国際公開パンフレット】
2004510429.tif 000008
2004510429.tif 000009
2004510429.tif 000010
2004510429.tif 000011
2004510429.tif 000012
2004510429.tif 000013
2004510429.tif 000014
2004510429.tif 000015
2004510429.tif 000016
2004510429.tif 000017
2004510429.tif 000018
2004510429.tif 000019
2004510429.tif 000020
2004510429.tif 000021
2004510429.tif 000022
2004510429.tif 000023
2004510429.tif 000024
2004510429.tif 000025
2004510429.tif 000026
2004510429.tif 000027
2004510429.tif 000028
2004510429.tif 000029
2004510429.tif 000030
2004510429.tif 000031
2004510429.tif 000032
2004510429.tif 000033
2004510429.tif 000034
2004510429.tif 000035
2004510429.tif 000036
2004510429.tif 000037
2004510429.tif 000038
2004510429.tif 000039
2004510429.tif 000040
2004510429.tif 000041
2004510429.tif 000042
2004510429.tif 000043
2004510429.tif 000044
2004510429.tif 000045
2004510429.tif 000046
2004510429.tif 000047
2004510429.tif 000048
2004510429.tif 000049
2004510429.tif 000050
2004510429.tif 000051
2004510429.tif 000052
2004510429.tif 000053
2004510429.tif 000054
2004510429.tif 000055
2004510429.tif 000056
2004510429.tif 000057
2004510429.tif 000058
2004510429.tif 000059
2004510429.tif 000060
2004510429.tif 000061
2004510429.tif 000062
2004510429.tif 000063
2004510429.tif 000064
2004510429.tif 000065
2004510429.tif 000066
2004510429.tif 000067
2004510429.tif 000068
2004510429.tif 000069
2004510429.tif 000070
2004510429.tif 000071
2004510429.tif 000072
2004510429.tif 000073
2004510429.tif 000074
2004510429.tif 000075
2004510429.tif 000076
2004510429.tif 000077
2004510429.tif 000078
2004510429.tif 000079
2004510429.tif 000080
2004510429.tif 000081
2004510429.tif 000082
2004510429.tif 000083
2004510429.tif 000084
2004510429.tif 000085
2004510429.tif 000086
2004510429.tif 000087
2004510429.tif 000088
2004510429.tif 000089
2004510429.tif 000090
2004510429.tif 000091
2004510429.tif 000092
2004510429.tif 000093
2004510429.tif 000094
2004510429.tif 000095
2004510429.tif 000096
2004510429.tif 000097
2004510429.tif 000098
2004510429.tif 000099
2004510429.tif 000100
2004510429.tif 000101
2004510429.tif 000102
2004510429.tif 000103
2004510429.tif 000104
2004510429.tif 000105
2004510429.tif 000106
2004510429.tif 000107
2004510429.tif 000108
2004510429.tif 000109
2004510429.tif 000110
2004510429.tif 000111
2004510429.tif 000112
2004510429.tif 000113
2004510429.tif 000114
2004510429.tif 000115
2004510429.tif 000116
2004510429.tif 000117
2004510429.tif 000118
2004510429.tif 000119
2004510429.tif 000120
2004510429.tif 000121
2004510429.tif 000122
2004510429.tif 000123
2004510429.tif 000124
2004510429.tif 000125
2004510429.tif 000126
2004510429.tif 000127
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004510429.tif 000128
【国際調査報告】
2004510429.tif 000129
2004510429.tif 000130
2004510429.tif 000131
2004510429.tif 000132
2004510429.tif 000133