(57)【要約】被験体の慢性真皮皮膚潰瘍（例えば、糖尿病性潰瘍など）の治癒を促進する方法が開示される。該方法は、非タンパク質分解的に活性化されたトロンビンレセプターのアゴニストの有効量を糖尿病性潰瘍に接触させることを含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
１）アミノ酸配列R1-Ala-Gly-Try-Lys-Pro-Asp-Glu-Gly-Lys-Arg-Gly-Asp-Ala-Cys-Glu-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Phe-Val-R2（配列番号５）、
式中、R1は-HまたはR3-C(O)-であり；
R2は-OHまたは-NR4R5であり；
R3は-HまたはC1〜C6アルキル基であり；
R4およびR5は独立して-H、C1〜C6アルキル基、または結合している窒素原子と一緒になって非芳香族複素環式基である；
を有するトロンビンペプチド誘導体；ただし、該トロンビンペプチド誘導体の1〜9および14〜23位の0、1、2または3アミノ酸が配列番号５の対応する位置のアミノ酸と異なるものとする；少なくとも14アミノ酸を有するトロンビンペプチド誘導体のN-末端切断フラグメント；または少なくとも18アミノ酸を有するトロンビンペプチド誘導体のC-末端切断フラグメントの有効量を慢性真皮皮膚潰瘍に接触させることを含む、被験体の慢性真皮皮膚潰瘍の治癒を促進する方法。
【請求項２】
R1が-Hであり、R2が-NH2である請求項１記載の方法。
【請求項３】
R1が-Hであり、R2が-OHである請求項１記載の方法。
【請求項４】
慢性真皮皮膚潰瘍が糖尿病性潰瘍である請求項１記載の方法。
【請求項５】
慢性真皮皮膚潰瘍が褥瘡性潰瘍、静脈うっ滞性潰瘍または動脈性潰瘍である請求項１記載の方法。
【請求項６】
糖尿病性潰瘍に１）アミノ酸配列R1-Ala-Gly-Try-Lys-Pro-Asp-Glu-Gly-Lys-Arg-Gly-Asp-Ala-Cys-Glu-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Phe-Val-R2（配列番号５）を有するトロンビンペプチド誘導体、ただし、該トロンビンペプチド誘導体の1〜9および14〜23位の0、1、2または3アミノ酸が配列番号５の対応する位置のアミノ酸の保存的置換であるものとする；２）少なくとも14アミノ酸を有するトロンビンペプチド誘導体のN-末端切断フラグメント；３）または少なくとも18アミノ酸を有するトロンビンペプチド誘導体のC-末端切断フラグメントを接触させる請求項４記載の方法。
【請求項７】
R1が-Hであり、R2が-NH2である請求項６記載の方法。
【請求項８】
R1が-Hであり、R2が-OHである請求項６記載の方法。
【請求項９】
糖尿病性潰瘍に１）アミノ酸配列R1-Ala-Gly-Try-Lys-Pro-Asp-Glu-Gly-Lys-Arg-Gly-Asp-Ala-Cys-X1-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-X2-Val-R2（配列番号２）（式中、X1はGluまたはGlnであり、X2はPhe、Met、Leu、HisまたはValである）を有するトロンビンペプチド誘導体：２）少なくとも14アミノ酸を有するトロンビンペプチド誘導体のN-末端切断フラグメント；または３）少なくとも18アミノ酸を有するトロンビンペプチド誘導体のC-末端切断フラグメントを接触させる請求項６記載の方法。
【請求項１０】
R1が-Hであり、R2が-NH2である請求項９記載の方法。
【請求項１１】
R1が-Hであり、R2が-OHである請求項９記載の方法。
【請求項１２】
糖尿病性潰瘍に１）アミノ酸配列R1-Ala-Gly-Try-Lys-Pro-Asp-Glu-Gly-Lys-Arg-Gly-Asp-Ala-Cys-Glu-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Phe-Val-R2（配列番号２）を有するトロンビンペプチド誘導体；２）少なくとも14アミノ酸を有するトロンビンペプチド誘導体のN-末端切断フラグメント；または少なくとも18アミノ酸を有するトロンビンペプチド誘導体のC-末端切断フラグメントを接触させる請求項９記載の方法。
【請求項１３】
R1が-Hであり、R2が-NH2である請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
R1が-Hであり、R2が-OHである請求項１２記載の方法。
【請求項１５】
アミノ酸配列H-Ala-Gly-Try-Lys-Pro-Asp-Glu-Gly-Lys-Arg-Gly-Asp-Ala-Cys-Glu-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Phe-Val-NH2（配列番号６）を有するトロンビンペプチド誘導体の有効量を糖尿病性潰瘍に接触させることを含む、被験体の糖尿病性潰瘍の治癒を促進する方法。
【請求項１６】
アミノ酸配列H-Ala-Gly-Try-Lys-Pro-Asp-Glu-Gly-Lys-Arg-Gly-Asp-Ala-Cys-Glu-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Phe-Val-NH2（配列番号６）を有するトロンビンペプチド誘導体の有効量を慢性真皮皮膚潰瘍に接触させることを含む、被験体の慢性真皮皮膚潰瘍の治癒を促進する方法。
【請求項１７】
１）アミノ酸配列R1-Asp-Asn-Met-Phe-Cys-Ala-Gly-Try-Lys-Pro-Asp-Glu-Gly-Lys-Arg-Gly-Asp-Ala-Cys-Glu-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Phe-Val-Met-Lys-Ser-Pro-Phe-R2（配列番号３）、
式中、R1は-HまたはR3-C(O)-であり；
R2は-OHまたは-NR4R5であり；
R3は-HまたはC1〜C6アルキル基であり；
R4およびR5は独立して-H、C1〜C6アルキル基、または結合している窒素原子と一緒になって非芳香族複素環式基である；
を有するトロンビンペプチド誘導体；ただし、該トロンビンペプチド誘導体の1〜14および19〜33位の0、1、2または3アミノ酸が配列番号３の対応する位置のアミノ酸と異なるものとする；２）少なくとも14アミノ酸を有するトロンビンペプチド誘導体のN-末端切断フラグメント；または３）少なくとも18アミノ酸を有するトロンビンペプチド誘導体のC-末端切断フラグメントの有効量を慢性真皮皮膚潰瘍に接触させることを含む、被験体の慢性真皮皮膚潰瘍の治癒を促進する方法。
【請求項１８】
慢性真皮皮膚潰瘍が糖尿病性潰瘍である請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
慢性真皮皮膚潰瘍が褥瘡性潰瘍、静脈うっ滞性潰瘍または動脈性潰瘍である請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
R1が-Hであり、R2が-NH2である請求項１８記載の方法。
【請求項２１】
R1が-Hであり、R2が-OHである請求項１８記載の方法。
【請求項２２】
糖尿病性潰瘍に１）アミノ酸配列R1-Asp-Asn-Met-Phe-Cys-Ala-Gly-Try-Lys-Pro-Asp-Glu-Gly-Lys-Arg-Gly-Asp-Ala-Cys-Glu-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Phe-Val-Met-Lys-Ser-Pro-Phe-R2（配列番号３）を有するトロンビンペプチド誘導体、ただし、該トロンビンペプチド誘導体の1〜14および19〜33位の0、1、2または3アミノ酸が配列番号３の対応する位置のアミノ酸の保存的置換であるものとする；２）少なくとも14アミノ酸を有するトロンビンペプチド誘導体のN-末端切断フラグメント；３）または少なくとも18アミノ酸を有するトロンビンペプチド誘導体のC-末端切断フラグメントを接触させる請求項１９記載の方法。
【請求項２３】
糖尿病性潰瘍に１）アミノ酸配列R1-Asp-Asn-Met-Phe-Cys-Ala-Gly-Try-Lys-Pro-Asp-Glu-Gly-Lys-Arg-Gly-Asp-Ala-Cys-X1-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-X2-Val-Met-Lys-Ser-Pro-Phe-R2（配列番号４）（式中、X1はGluまたはGlnであり、X2はPhe、Met、Leu、HisまたはValである）を有するトロンビンペプチド誘導体：２）少なくとも14アミノ酸を有するトロンビンペプチド誘導体のN-末端切断フラグメント；または３）少なくとも18アミノ酸を有するトロンビンペプチド誘導体のC-末端切断フラグメントを接触させる請求項１９記載の方法。
【請求項２４】
R1が-Hであり、R2が-NH2である請求項２３記載の方法。
【請求項２５】
R1が-Hであり、R2が-OHである請求項２３記載の方法。
【請求項２６】
X1がGluであり、X2がPheである請求項２４記載の方法。
【請求項２７】
被験体がコンパニオン動物、農場動物または実験動物である請求項１記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
政府の援助
本発明は、国立衛生研究所からの助成金1R01-GM47572およびR44-DK53580により、全体または一部援助された。政府は本発明において一定の権利を有する。
【０００２】
関連出願
本願は、2001年7月27日に出願された米国特許仮出願第60/308,198号（その全教示が参考として本明細書に援用される）の利益を主張する。
【０００３】
発明の背景
真皮皮膚潰瘍は治療が特に困難である創傷の例である。なぜならば、この潰瘍は治癒に耐性があり、その結果しばしば慢性創傷となる。慢性真皮皮膚潰瘍の例としては、静脈疾患から生じたもの（静脈うっ滞性潰瘍）、過度の圧力（褥瘡性潰瘍）、動脈性潰瘍および糖尿病性潰瘍が挙げられる。
【０００４】
糖尿病性潰瘍は特に問題を含んでいる。例えば、糖尿病を有する７人の個体のうち一人が感染しやすい皮膚潰瘍を四肢に発症する。糖尿病性潰瘍の処置は、しばしば長くなり、集中的であり、高価であり、処置の失敗が普通である。最新のアプローチとしては、挫滅組織切、創傷包帯の頻繁な交換、特別に作られた履物、経口または静脈内抗生物質、完全なベッド静養、長い入院および外科的血管再生が挙げられる。幾つかの場合、潰瘍関連合併症は切断を要し得る。従って、一般的に慢性真皮皮膚潰瘍、特に糖尿病性潰瘍の治癒速度を加速する処置が必要である。
【０００５】
発明の要旨
非タンパク質分解的に活性化されたトロンビンレセプターのアゴニストが糖尿病性潰瘍の治癒速度を加速するのに有効であることがここに見出された。例えば、トロンビンペプチド誘導体TP508（1.0μgまたは10.0μgの用量で週２回局所投与される）は、糖尿病性潰瘍が治癒する速度を増加し、潰瘍の100％終結を経験する患者の割合を増加した。この発見に基づいて、慢性皮膚潰瘍の治癒を促進または加速する方法が本発明に開示される。
【０００６】
本発明の１つの態様は、患者の慢性真皮皮膚潰瘍の治癒を促進する方法である。この方法は、非タンパク質分解的に活性化されたトロンビンレセプターのアゴニストの有効量を慢性真皮皮膚潰瘍に接触させることを含む。
【０００７】
本明細書に開示される方法に使用されるトロンビンペプチド誘導体は、生成するのに高価ではなく、慣性真皮皮膚潰瘍が治癒する速度を加速するおよび潰瘍の完全終結の見込みを増加するのに有効である。これらはまた、もしあったとしても副作用をほとんど生じない。
【０００８】
発明の詳細な説明
真皮皮膚潰瘍とは、治癒プロセス中の欠陥、血管不全または圧力によって正常な治癒に失敗した組織の表面損失により生じる皮膚の損傷をいう。本発明の方法により処置され得る真皮皮膚潰瘍としては、褥瘡性潰瘍、糖尿病性潰瘍、静脈うっ滞性潰瘍および動脈性潰瘍が挙げられる。褥瘡性潰瘍とは、長期間皮膚領域にはたらいた圧力から生じる慢性潰瘍をいう。このタイプの創傷は、しばしばとこずれ（bedsore）または褥瘡（pressure sore）と呼ばれる。静脈うっ滞性潰瘍は、欠損血管からの血液または他の体液の停滞から生じる。動脈性潰瘍とは血流が充分にない動脈の周囲の領域における壊死皮膚をいう。
【０００９】
出願人らは、非タンパク質分解的に活性化されたトロンビンレセプター（以後、「NPAR」）を刺激または活性化する化合物が慢性真皮皮膚創傷の治癒を促進または刺激することを知見している。NPARを刺激する化合物はNPARアゴニストといわれる。NPARは、ほとんどの細胞の表面に存在する高親和性トロンビンレセプターである。このNPAR成分は、主としてトロンビン、タンパク質分解的に不活化されたトロンビン、およびトロンビン由来ペプチドの細胞への高親和性結合を司る。NPARは、そのタンパク質分解活性とは独立してトロンビンにより開始される多数の細胞性シグナルを媒介すると思われる。かかるシグナルの１つの例は、アネキシンVおよびサブトラクティブハイブリダイゼーションにより同定された他の分子のアップレギュレーションである（Sowerら, Experimental Cell Research 247:422(1999)を参照）。従って、NPARは、細胞表面でのトロンビンとのその高親和性相互作用ならびにトロンビンのタンパク質分解的に不活性な誘導体および下記のようなトロンビン由来ペプチドアゴニストによるその活性化により特徴付けられる。NPAR活性化は、有糸分裂促進性濃度以下（submitogenic concentration）のトロンビンまたは米国特許第5,352,664号および同第5,500,412号に開示されるようなプロテインキナーゼＣを活性化する分子の存在下で線維芽細胞に添加された場合、分子が細胞増殖を刺激する能力に基づいてアッセイされ得る。これら特許の全教示は参考として本明細書に援用される。NPARアゴニストは、この活性化または細胞への125I-トロンビン結合と競合する能力により同定され得る。
【００１０】
NPARアゴニストの１つの例は、トロンビンペプチド誘導体、すなわち約50未満のアミノ酸、好ましくは約33未満のアミノ酸を有し、かつプロトロンビンアミノ酸508〜530（Ala-Gly-Try-Lys-Pro-Asp-Glu-Gly-Lys-Arg-Gly-Asp-Ala-Cys-Glu-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Phe-Val：配列番号１）に対応するヒトトロンビンのフラグメントに充分な相同性を有するポリペプチドであり、このポリペプチドはNPARを活性化する。本明細書に記載されるトロンビンペプチド誘導体は、好ましくは約14〜23アミノ酸、より好ましくは約19〜23アミノ酸を有する。任意に、本明細書に記載されるトロンビンペプチドはC末端でアミド化され、および／またはN末端でアシル化され得る。
【００１１】
１つの態様において、慢性真皮皮膚潰瘍に投与されるトロンビンペプチド誘導体は、以下のアミノ酸配列を有する：R1-Ala-Gly-Try-Lys-Pro-Asp-Glu-Gly-Lys-Arg-Gly-Asp-Ala-Cys-Glu-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Phe-Val-R2：配列番号５。R1は-HまたはR3-C(O)-であり；R2は-OHまたは-NR4R5であり；R3は-HまたはC1〜C6アルキル基（好ましくは-CH3）であり；R4およびR5は独立して-H、C1〜C6アルキル基、または結合している窒素原子と一緒になって非芳香族複素環式基（例えば、ピペリジニル、モルホリニル、チオモルフィニルまたはピロリジニル）である（好ましくはR4およびR5は共に-Hである）。好ましくは、R1は-Hであり、かつR2は-NH2であるか；またはR1は-Hであり、かつR2は-OHである。あるいは、慢性真皮皮膚潰瘍に投与されるトロンビンペプチド誘導体は、配列番号３のアミノ酸配列：R1-Asp-Asn-Met-Phe-Cys-Ala-Gly-Try-Lys-Pro-Asp-Glu-Gly-Lys-Arg-Gly-Asp-Ala-Cys-Glu-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Phe-Val-Met-Lys-Ser-Pro-Phe-R2を有する。R1およびR2は上記のとおりである。しかしながら、トロンビンペプチド誘導体の1〜9および14〜23位の0、1、2または3アミノ酸が配列番号５の対応するアミノ酸と異なり得ることが理解される。トロンビンペプチド誘導体の1〜14および19〜33位の0、1、2または3アミノ酸が配列番号３の対応するアミノ酸と異なり得ることもまた理解される。好ましくは、配列番号３または配列番号５の対応するアミノ酸と異なるトロンビンペプチド誘導体のアミノ酸は保存的置換であり、より好ましくは、高度に保存的な置換である。あるいは、少なくとも14アミノ酸を有するトロンビンペプチド誘導体のN-末端切断フラグメントまたは少なくとも18アミノ酸を有するトロンビンペプチド誘導体のC-末端切断フラグメントは、慢性真皮皮膚潰瘍と接触させられ得る。
【００１２】
「C-末端切断フラグメント」とは、C末端からアミノ酸またはアミノ酸のブロックを除去した後に残っているフラグメントをいう。「N-末端切断フラグメント」とは、N末端からアミノ酸またはアミノ酸のブロックを除去した後に残っているフラグメントをいう。用語「C-末端切断フラグメント」および「N-末端切断フラグメント」は上記のようなN末端でのアシル化および／またはC末端でのアミド化を包含することが理解される。
【００１３】
ペプチドは、N末端のアミン-NH2がアシル基R3-C(O)-NH-（式中、R3は上記のとおりである）として誘導される場合、N末端でアシル化される。従って、R1がR3-C(O)-である場合、N末端はアシル基であり；R1が-Hである場合、N末端は非置換アミンである。
【００１４】
ペプチドは、C末端のカルボン酸-COOHがアミド-CONR4R5（式中、R4およびR5は上記のとおりである）として誘導される場合、C末端でアミド化される。従って、R2が-OHである場合、C末端はカルボン酸であり；R1が-NR4R5である場合、C末端はアミド化される。
【００１５】
開示された方法における使用のための好ましいトロンビンペプチド誘導体は、配列番号２のアミノ酸配列：R1-Ala-Gly-Try-Lys-Pro-Asp-Glu-Gly-Lys-Arg-Gly-Asp-Ala-Cys-X1-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-X2-Val-R2を有する。R1およびR2は上記のとおりである。開示された方法における使用のための別の好ましいトロンビンペプチド誘導体は、配列番号４のアミノ酸配列：R1-Asp-Asn-Met-Phe-Cys-Ala-Gly-Try-Lys-Pro-Asp-Glu-Gly-Lys-Arg-Gly-Asp-Ala-Cys-X1-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-X2-Val-Met-Lys-Ser-Pro-Phe-R2を有する。X1はGluまたはGlnであり、X2はPhe、Met、Leu、HisまたはValであり；R1およびR2は上記のとおりである。あるいは、これらの好ましいトロンビンペプチド誘導体のN末端切断フラグメント、少なくとも14アミノ酸を有するN末端切断フラグメントまたはこれらの好ましいトロンビンペプチド誘導体のC末端切断フラグメント、少なくとも18アミノ酸を有するC末端切断フラグメントがまた、開示された方法において使用され得る。
【００１６】
TP508はトロンビンペプチド誘導体の例であり、式中、R1が-HでありR2が-NH2である配列番号５のアミノ酸配列（配列番号６）を有する。トロンビンペプチド誘導体の別の例は、式中、R1が-HでありR2が-OHである配列番号５のアミノ酸配列を有する（「デアミドTP508」）。開示された方法において使用され得るトロンビンペプチド誘導体の他の例としては、TP508（またはデアミドTP508）のN末端切断フラグメント、少なくとも14アミノ酸を有するN末端切断フラグメントまたはTP508（またはデアミドTP508）のC末端切断フラグメント、少なくとも18アミノ酸を有するC末端切断フラグメントが挙げられる。
【００１７】
「保存的置換」は、正味同じ電荷ならびにほぼ同じサイズおよび形を有する別のアミノ酸でのアミノ酸の置換である。脂肪族または置換脂肪族アミノ酸側鎖を有するアミノ酸は、その側鎖における総炭素およびヘテロ原子数が多くて約４まで異なっている場合、ほぼ同じサイズを有する。これらは、その側鎖における分岐数が多くて１まで異なっている場合、ほぼ同じ形を有する。その側鎖にフェニル基または置換フェニル基を有するアミノ酸は、ほぼ同じサイズおよび形を有すると考えられる。５つのグループのアミノ酸が以下に列挙される。ポリペプチドのアミノ酸を同じ群由来の別のアミノ酸で置換することにより、保存的置換を生じる：
【００１８】
グループI：グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、スレオニン、システイン、およびC1〜C4脂肪族側鎖またはC1〜C4ヒドロキシル置換脂肪族側鎖（直鎖または一分岐鎖）を有する天然に存在しないアミノ酸。
【００１９】
グループII：グルタミン酸、アスパラギン酸およびカルボン酸置換C1〜C4脂肪族側鎖（非分岐または１分岐点）を有する天然に存在しないアミノ酸。
【００２０】
グループIII：リジン、オルニチン、アルギニンおよびアミンまたはグアニジの置換C1〜C4脂肪族側鎖（非分岐または１分岐点）を有する天然に存在しないアミノ酸。
【００２１】
グループIV：グルタミン、アスパラギンおよびアミド置換C1〜C4脂肪族側鎖（非分岐または１分岐点）を有する天然に存在しないアミノ酸。
【００２２】
グループV：フェニルアラニン、フェニルグリシン、チロシンおよびトリプトファン。
【００２３】
「高度に保存された置換」は、１つのあるアミノ酸を、側鎖に同じ官能基を有し、ほぼ同じ大きさおよび形状を有する別のアミノ酸と置換えることである。脂肪族または置換脂肪族アミノ酸側鎖を有するアミノ酸は、その側鎖内での炭素およびヘテロ原子の総数の違いが２つを超えない場合、ほぼ同じ大きさを有する。これらは、その側鎖内の分枝数が同じである場合、ほぼ同じ形状を有する。高度に保存された置換の例としては、ロイシンの代わりにバリン、セリンの代わりにトレオニン、グルタミン酸の代わりにアスパラギン酸およびフェニルアラニンの代わりにフェニルグリシンが挙げられる。高度に保存されたものでない置換の例としては、バリンの代わりにアラニン、セリンの代わりにアラニンおよびセリンの代わりにアスパラギン酸が挙げられる。
【００２４】
「被験体」は、好ましくはヒトであるが、処置を必要とする動物、例えば、コンパニオン動物（例えば、イヌ、ネコなど）、農場動物（例えば、ウシ、ブタ、ウマなど）ならびに実験動物（例えば、ラット、マウス、モルモットなど）でもあり得る。
【００２５】
慢性皮膚潰瘍の治癒を促進するために本発明において使用される組成物は、トロンビンペプチド誘導体またはNPARアゴニストが溶解または懸濁された状態の局所局部投与に好適な医薬用担体をさらに含有し得る。薬学的に許容され得る担体の例としては、例えば、生理食塩水、エーロゾル、市販の不活性ガス、またはアルブミン、メチルセルロースもしくはコラーゲンマトリックスが添加された液体が挙げられる。かかる製剤の典型は、軟膏、クリームおよびゲルである。軟膏は、典型的には、例えば固定油または炭化水素類を含有する油性基剤、例えば、白色ワセリンもしくは鉱油など、あるいは、例えば吸収性無水物質からなる吸収性基剤、例えば無水ラノリンを用いて調製される。基剤の形成の後、活性成分を所望の濃度で添加する。クリームは、一般に、典型的にはワックス、ワセリン、鉱油などの固定油、炭化水素類などを含有してなる油相（内部相）と、水および付加塩などの任意の水溶性物質を含有してなる水相（連続相）とを含有する。二相は、乳化剤、例えば、ラウリル硫酸ナトリウムなどの界面活性剤；アカシアコロイド状クレー、ハチの巣などの親水性コロイドの使用により安定化される。エマルジョンの形成時に、活性成分を所望の濃度で添加する。ゲルは、先に記載したような、油性基剤、水、またはエマルジョン−懸濁液基剤から選ばれる基剤からなる。基剤には、基剤中でマトリックスを形成し、その粘性を半固体粘稠度まで増加させるゲル化剤を添加する。ゲル化剤の例は、ヒドロキシプロピルセルロース、アクリル酸ポリマーなどである。活性成分は、ゲル化剤の添加前の時点で所望の濃度で製剤に添加されるか、または、ゲル化プロセスの後に混合することもできる。
【００２６】
本発明は、慢性真皮皮膚潰瘍の治癒の促進に関する。処置方法は、慢性真皮皮膚が、無処置のときよりも処置によってより速やかに治癒する場合、「治癒を促進」する。あるいはまた、処置方法は、慢性真皮皮膚潰瘍が、無処置のときよりも完治する可能性が高い場合、「治癒を促進」する。
【００２７】
「有効量」は、NPARアゴニストまたはトロンビンペプチド誘導体の非存在下のときよりも、創傷治癒の増大ならびに内皮細胞、ケラチノサイトおよび線維芽細胞の成長および増殖の増大をもたらす、NPARアゴニストまたはトロンビンペプチド誘導体の量である。あるいはまた、「有効量」は、NPARアゴニストまたはトロンビンペプチド誘導体の非存在下のときよりも慢性皮膚潰瘍が完治する可能性の増大をもたらす、NPARアゴニストまたはトロンビンペプチド誘導体の量である。該アゴニストは、所望の治療効果を達成するのに充分な期間、投与される。投与量は、所望される表皮の成長量、被験体の健康、体格、体重、年齢および性別、慢性真皮皮膚潰瘍の性状（例えば、真皮皮膚潰瘍の重篤度のタイプ）に依存する。典型的には、約0.1μg/日〜約1mg/日のNPARアゴニストまたはトロンビンペプチド誘導体（好ましくは約1μg/日〜約100μg/日）を、慢性真皮皮膚潰瘍に直接塗布することにより投与する。一般に、充分な医薬用担体または不活性溶剤を使用して創傷を覆う。
【００２８】
慢性真皮皮膚潰瘍が処置される特定の例においては、慢性真皮皮膚潰瘍に、トロンビンペプチド誘導体またはNPARアゴニストとともに、１種類以上のさらなる薬理学的活性剤を同時投与することが有利であり得る。例えば、感染は、どのような慢性真皮皮膚潰瘍にも脅威であり得る。本発明の一局面は、慢性真皮皮膚潰瘍に、抗菌剤、殺菌薬または抗生物質を同時投与することである。疼痛および炎症を管理することもまた慢性真皮皮膚潰瘍の処置の重要な局面である。NPARアゴニストおよびトロンビンペプチド誘導体は、鎮痛剤または抗炎症剤などの痛み緩和剤とともに慢性真皮皮膚潰瘍に同時投与することもできる。
【００２９】
トロンビンペプチド誘導体は、固相ペプチド合成（例えば、BOCまたはFMOC）法、液相合成、または前述の方法の組み合わせを含む他の適当な技術により合成することができる。確立され広く使用されているBOC法およびFMOC法は、Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 88: 2149 (1963); Meienhofer, Hormonal Proteins and Pepetides, C.H.Li編, Academic Press, 1983, pp. 48-267;ならびに Barany および Merrifield, The Peptides, E. Gross および J. Meienhofer編, Academic Press,New York, 1980, pp. 3-285に記載されている。固相ペプチド合成の方法は、Merrifield, R.B., Science, 232: 341 (1986);Carpino, L.A. および Han, G.Y., J. Org. Chem., 37: 3404 (1972);ならびに Gauspohl, H ら、Synthesis, 5:315 (1992) に記載されている。これら６報の教示は参照によりその全体が本明細書に取り込まれる。
【００３０】
本発明を、なんら限定することを意図しない以下の実施例により説明する。
【００３１】
実施例
方法論  −  試験計画
本試験は、合成トロンビンペプチドTP508を慢性糖尿病潰瘍の治癒の加速について評価する複数の施設での無作為二重盲検３群(three-arm)フェーズIIaパイロット試験とした。患者を３つの局所処置群：1マイクログラムのTP508含有生理食塩水を週に２回塗布、10マイクログラムのTP508含有生理食塩水を週に２回塗布、または生理食塩水プラセボを週に２回塗布、の１つに無作為に割り当てた。すべての患者は、初期シャープ(sharp)デブリドマン、創傷洗浄、創傷包帯および創傷圧迫解除(offloading)からなる標準的な糖尿病潰瘍治療の治療計画を受けた。20週までか、または創傷がふさがるまでか、いずれか早い方まで創傷を週に２回評価した。患者が臨床的感染を発症するか、または創傷状態か有意に悪化した場合は、試験から除外した。各創傷評価の際（週に２回）に、創傷面積の測定のために創傷の周囲の輪郭を書き、創傷をデジタルカメラで撮影した。患者の登録時、5、10、15および20週に血液化学および血液学試験を行った。ラジオグラフィー評価を５週ごとに行い、下方の骨組成に対する影響を調べた。
【００３２】
包含／除外基準
本試験において30〜65歳の年齢範囲の男女を参加させた。妊娠の可能性のある女性は、許容可能な産児制限方法を使用しなければならず、試験に入る前に、妊娠について尿検査を受けた。本試験に登録するためには、血糖およびＨgｂＡ１Ｃにより患者の糖尿病病理学を臨床的に証明しなければばらなかったが、糖尿病症状以外は患者は適度に良好な健康状態でなければならなかった。処置対象の潰瘍（試験腫瘍）は、膝蓋骨の下、ワグナーグレード１（創傷は表皮を貫通して真皮に侵入していなければならない）、グレード２または軽度グレード３から骨膜（骨または腱を巻き込まず）に位置していなければならなかった。試験潰瘍は、直径1.0cm（面積0.9cm2）〜直径7.0cm（面積約38.5cm2）でなければならなかった。また、試験潰瘍は、その時点で治癒しないまま最低８週〜最大２年、存在していたものでなければならなかった。患者のベースラインでの創傷酸素分圧(oxygen tension)（TcPO2）測定値は、加熱酸素センサーでの測定により20mmHg以上でなければならなかった。また、患者は、試験の指示を理解し、従い、処置計画および任意の指図された創傷圧迫解除に従い、インフォームドコンセントに同意することができることが求められた。
【００３３】
患者数（計画および解析）
試験は、各処置群あたり20名、合計60名の登録患者で計画された。合計60名の患者を登録し、本試験にて処置した。これらの60名の患者のうち、12名は早々に試験を中断した。４名の患者は創傷の感染のため中断し、２名は骨髄炎のため中断し、１名は切断のため中断し、１名は心筋梗塞のため中断し、２名は非医学的理由により試験から除外し、１名は創傷悪化のため、１名は許容され得ない投薬を受けていた。試験中断の原因はいずれも薬剤使用とは関係していなかった。
【００３４】
有効性（ｉ）
第１有効性終点は、完全創傷閉鎖を達成した患者の割合とした。完全創傷閉鎖は、臨床医による視診によって調べたとき、排膿および感染のない100％上皮形成と定義した。処置群間の割合の差を比較した。第２終点としては、試験創傷の100％閉鎖までの時間、80％および50％創傷閉鎖までの時間、ならびに3、5、10、15および20週での創傷閉鎖の量（ベースラインの創傷サイズからの変化の割合として）を含めた。
【００３５】
有効性（ｉｉ）
有効性終点をより良好に調べるために３つの異なる患者解析群を規定した。治療意図(Intent-To-Treat)（ITT）群は、試験薬物を受けた患者60名すべてを含み、主に安全性評価のために使用された。プロトコルに従う(Per-Protocol)群は、該プロトコルにより最も高いコンプライアンスを保証することが意図される所定の組の基準を満たした40名の患者を含めた。有効群（Efficacy Group）は、創傷治癒の正確な評価を可能にするために最も直接的に関連するようにアンブラインディング(unblinding)前に選択された基準を満たす46名の患者を含めた。第１および第２終点の結果を各患者群について記載する。第１終点での処置効果について同様の正の用量応答傾向がすべての処置群について見られ、効果はプロトコルに従う群において最も顕著であった。
【００３６】
第１終点
第１有効性終点は、20週間以内に完全創傷閉鎖を達成した患者の割合とした。以下の表は、３つの解析集団について閉鎖の第１有効性終点の結果をまとめている。
【００３７】
【表１】
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ＰＰ  −プロトコルに従う集団
ＩＴＴ−治療意図集団
ＥＦ  −有効集団
【００３８】
これらの結果は、調べたすべての集団において100％閉鎖について用量応答関係を示し、1.0μg処置は生理食塩水プラセボ対照よりも4〜15％多い閉鎖をもたらし、10μg処置は生理食塩水プラセボ対照よりも13〜24％多い閉鎖をもたらした。具体的には、プロトコルに従う処置群（PP）では、生理食塩水プラセボ群では15名中5名すなわち33％が治癒し、1μg処置群では11名中5名すなわち45％が治癒し、10μg群では14名中8名すなわち57％が治癒した。より厳格なプロトコルに従う群のものよりも僅かに小さい創傷および僅かに大きい創傷を含むように選択した有効（EF）群でも、この傾向が見られ、プラセボ群では38％が治癒し、1μg群では53％が治癒し、10μg群では60％が治癒した。この差は、治療意図（ITT）集団においても認められたが、この群は、治癒したが本試験のための慢性糖尿病創傷として規定されるべきプロトコルを満たさなかったいくつかの小さくかつ表在性の創傷を含めたため、生理食塩水プラセボ群での治癒率は高かった（48％）。
【００３９】
これらの結果は、Regranex（登録商標）についての臨床試験と好都合に比較され、ここで、４つの統制された無作為臨床試験から収集したデータは、ビヒクルプラセボ創傷254例のうち83例すなわち33％が20週までに治癒し、Regranex（登録商標）処置創傷の285例のうち122例すなわち43％が20週までに治癒したことを示す（FOI, FDA Clinical Review of BLA-96-1408, 1997年12月９日 OMJ Pharmaceuticals、55頁、ならびにhttp/www.fda.gov/cber/products.becamj121697.htm, 2001年3月5日更新、2001年７月25日アクセス（これらの刊行物の全教示は、参照により本明細書に取りこまれる）。
【００４０】
第２終点
第２終点は、100％閉鎖までの時間、80％閉鎖までの時間、50％閉鎖までの時間、および3、5、10、15および20週でのベースラインの創傷サイズからの変化の割合として創傷閉鎖の量を含む。Kaplan-Meier生存解析技術を用いて時間対事象終点を調べた。
【００４１】
プロトコルに従う集団において、10μg処置群での100％閉鎖までのメジアン時間は87日であったのに対し、1μg処置群では122日であった。生理食塩水対照群では、100％閉鎖までのメジアン時間は140日までには達成されなかった。したがって、このプロトコルに従う群における治癒期間は、10μg処置群において、プラセボ対照と比べて少なくとも53日間短縮されたようである。プロトコルに従う集団における100％閉鎖までの時間のKaplan-Meier解析により、14週までに、プラセボ対照創傷閉鎖の確率は30％であり、1μg処置創傷閉鎖の確率は約40％であり、10μgで処置された創傷閉鎖の確率は60％を超えることが予測される。
【００４２】
同様の投薬効果が80％創傷閉鎖までの時間においても見られ、10μg処置群での80％閉鎖までのメジアン時間は32日であったのに対し、1μg処置群では47日であり、生理食塩水対照群では57日であった。50％創傷閉鎖までの時間においては明白な用量影響はなく、10μg処置群での50％閉鎖までのメジアン時間は21日であったのに対し、1μg処置群では32日であり、生理食塩水対照群では28日であった。
【００４３】
有効群においては、10μg処置群での100％創傷閉鎖までのメジアン時間は87日であったのに対し、1μg群では116日であった。生理食塩水対照群では、100％閉鎖までのメジアン時間は達成されなかった。80％創傷閉鎖までの時間については、10μg用量群でのメジアン時間は46日であったのに対し、1μg用量群では49日であり、生理食塩水対照群では39日であった。50％閉鎖までの時間については、10μg処置群ではメジアン時間は21日であったのに対し、1μg群および生理食塩水対照群では、それぞれ29日および28日であった。
【００４４】
治療意図集団においては、10μg創傷群での100％創傷閉鎖までのメジアン時間は87日であったのに対し、1μg群では105日であり、生理食塩水対照群では102日であった。80％創傷閉鎖までの時間については、10μg用量群でのメジアン時間は31日であったのに対し、1μg用量群では49日であり、生理食塩水対照群では29日であった。50％閉鎖までの時間については、10μg処置群でのメジアン時間は17日であったのに対し、1μg群および生理食塩水対照群では、それぞれ29日および17.5日であった。
【００４５】
これらの結果は、TP508で処置した患者の潰瘍閉鎖割合の増加を示し、治癒の加速を反映するメジアン治癒期間を示す。
【００４６】
本発明をその好ましい態様に関して具体的に示し記載したが、当業者は、添付の特許請求の範囲により包含される本発明の範囲を逸脱することなく本明細書において形態および詳細の種々の変更を行いうることを理解されたい。
【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【手続補正書】
【提出日】平成15年8月25日(2003.8.25)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
非タンパク質分解的に活性化されたトロンビンレセプターのアゴニストの有効量を単独でまたは抗菌薬、消毒薬、抗生物質、鎮痛薬もしくは抗炎症薬との組み合わせで慢性真皮皮膚潰瘍に接触させることを含む、被験体の慢性真皮皮膚潰瘍の治癒を促進する方法。
【請求項２】
慢性真皮皮膚潰瘍が糖尿病性潰瘍である請求項１記載の方法。
【請求項３】
慢性真皮皮膚潰瘍が褥瘡性潰瘍、静脈うっ滞性潰瘍または動脈性潰瘍である請求項１記載の方法。
【請求項４】
アゴニストがトロンビンペプチド誘導体である請求項１〜３いずれか記載の方法。
【請求項５】
アゴニストがアミノ酸配列R1-Ala-Gly-Try-Lys-Pro-Asp-Glu-Gly-Lys-Arg-Gly-Asp-Ala-Cys-Glu-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Phe-Val-R2（配列番号：５）：
式中、R1は-HまたはR3-C(O)-であり；
R2は-OHまたは-NR4R5であり；
R3は-HまたはC1〜C6アルキル基であり；
R4およびR5は独立して-H、C1〜C6アルキル基、または結合している窒素原子と一緒になって非芳香族複素環式基である；
を有するトロンビンペプチド誘導体；
ただし、該トロンビンペプチド誘導体の1〜9および14〜23位の0、1、2または3アミノ酸が配列番号：５の対応する位置のアミノ酸と異なるものとする；少なくとも14アミノ酸を有するトロンビンペプチド誘導体のN-末端切断フラグメント；または少なくとも18アミノ酸を有するトロンビンペプチド誘導体のC-末端切断フラグメントである請求項４記載の方法。
【請求項６】
R1が-Hであり、R2が-NH2である請求項５記載の方法。
【請求項７】
R1が-Hであり、R2が-OHである請求項５記載の方法。
【請求項８】
トロンビンペプチド誘導体がアミノ酸配列R1-Ala-Gly-Try-Lys-Pro-Asp-Glu-Gly-Lys-Arg-Gly-Asp-Ala-Cys-Glu-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Phe-Val-R2（配列番号：５）を有し、ただし、該トロンビンペプチド誘導体の1〜9および14〜23位の0、1、2または3アミノ酸が配列番号：５の対応する位置のアミノ酸の保存的置換であるものとする；トロンビンペプチド誘導体のN-末端切断フラグメントが少なくとも14アミノ酸を有し；またはトロンビンペプチド誘導体のC-末端切断フラグメントが少なくとも18アミノ酸を有する、請求項４記載の方法。
【請求項９】
R1が-Hであり、R2が-NH2である請求項８記載の方法。
【請求項１０】
R1が-Hであり、R2が-OHである請求項８記載の方法。
【請求項１１】
トロンビンペプチド誘導体がアミノ酸配列R1-Ala-Gly-Try-Lys-Pro-Asp-Glu-Gly-Lys-Arg-Gly-Asp-Ala-Cys-X1-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-X2-Val-R2（配列番号：２）（式中、X1はGluまたはGlnであり、X2はPhe、Met、Leu、HisまたはValである）を有し；またはトロンビンペプチド誘導体のN-末端切断フラグメントが少なくとも14アミノ酸を有し；またはトロンビンペプチド誘導体のC-末端切断フラグメントが少なくとも18アミノ酸を有する、請求項８記載の方法。
【請求項１２】
R1が-Hであり、R2が-NH2である請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
R1が-Hであり、R2が-OHである請求項１１記載の方法。
【請求項１４】
トロンビンペプチド誘導体がアミノ酸配列R1-Ala-Gly-Try-Lys-Pro-Asp-Glu-Gly-Lys-Arg-Gly-Asp-Ala-Cys-Glu-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Phe-Val-R2（配列番号：２）を有し；トロンビンペプチド誘導体のN-末端切断フラグメントが少なくとも14アミノ酸を有し；またはトロンビンペプチド誘導体のC-末端切断フラグメントが少なくとも18アミノ酸を有する、請求項１１記載の方法。
【請求項１５】
R1が-Hであり、R2が-NH2である請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
R1が-Hであり、R2が-OHである請求項１４記載の方法。
【請求項１７】
トロンビンペプチド誘導体がアミノ酸配列H-Ala-Gly-Try-Lys-Pro-Asp-Glu-Gly-Lys-Arg-Gly-Asp-Ala-Cys-Glu-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Phe-Val-NH2（配列番号：６）を有する、請求項４記載の方法。
【請求項１８】
トロンビンペプチド誘導体がアミノ酸配列R1-Asp-Asn-Met-Phe-Cys-Ala-Gly-Try-Lys-Pro-Asp-Glu-Gly-Lys-Arg-Gly-Asp-Ala-Cys-Glu-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Phe-Val-Met-Lys-Ser-Pro-Phe-R2（配列番号：３）、
式中、R1は-HまたはR3-C(O)-であり；
R2は-OHまたは-NR4R5であり；
R3は-HまたはC1〜C6アルキル基であり；
R4およびR5は独立して-H、C1〜C6アルキル基、または結合している窒素原子と一緒になって非芳香族複素環式基である；
を有し；ただし、該トロンビンペプチド誘導体の1〜14および19〜33位の0、1、2または3アミノ酸が配列番号：３の対応する位置のアミノ酸と異なるものとする；トロンビンペプチド誘導体のN-末端切断フラグメントが少なくとも14アミノ酸を有し；またはトロンビンペプチド誘導体のC-末端切断フラグメントが少なくとも18アミノ酸を有する、請求項４記載の方法。
【請求項１９】
R1が-Hであり、R2が-NH2である請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
R1が-Hであり、R2が-OHである請求項１８記載の方法。
【請求項２１】
トロンビンペプチド誘導体がアミノ酸配列R1-Asp-Asn-Met-Phe-Cys-Ala-Gly-Try-Lys-Pro-Asp-Glu-Gly-Lys-Arg-Gly-Asp-Ala-Cys-Glu-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Phe-Val-Met-Lys-Ser-Pro-Phe-R2（配列番号：３）を有し、ただし、該トロンビンペプチド誘導体の1〜14および19〜33位の0、1、2または3アミノ酸が配列番号：３の対応する位置のアミノ酸の保存的置換であるものとする；トロンビンペプチド誘導体のN-末端切断フラグメントが少なくとも14アミノ酸を有し；またはトロンビンペプチド誘導体のC-末端切断フラグメントが少なくとも18アミノ酸を有する、請求項１８記載の方法。
【請求項２２】
トロンビンペプチド誘導体がアミノ酸配列R1-Asp-Asn-Met-Phe-Cys-Ala-Gly-Try-Lys-Pro-Asp-Glu-Gly-Lys-Arg-Gly-Asp-Ala-Cys-X1-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-X2-Val-Met-Lys-Ser-Pro-Phe-R2（配列番号４）（式中、X1はGluまたはGlnであり、X2はPhe、Met、Leu、HisまたはValである）を有し；トロンビンペプチド誘導体のN-末端切断フラグメントが少なくとも14アミノ酸を有し；トロンビンペプチド誘導体のC-末端切断フラグメントが少なくとも18アミノ酸を有する、請求項１８記載の方法。
【請求項２３】
R1が-Hであり、R2が-NH2である請求項２２記載の方法。
【請求項２４】
R1が-Hであり、R2が-OHである請求項２２記載の方法。
【請求項２５】
X1がGluであり、X2がPheである請求項２２記載の方法。
【請求項２６】
被験体がコンパニオン動物、農場動物または実験動物である請求項１〜２５いずれか記載の方法。
【請求項２７】
非タンパク質分解的に活性化されたトロンビンレセプターのアゴニストの有効量を慢性真皮皮膚潰瘍にプロテアーゼインヒビター剤の非存在下で接触させることを含む、被験体の慢性真皮皮膚潰瘍の治癒を促進する方法。
【国際調査報告】
2004538320.tif 000023
2004538320.tif 000024
2004538320.tif 000025
2004538320.tif 000026