(57)【要約】本発明は、哺乳動物細胞のウロキナーゼ型プラスミノーゲンアクティベータ（「ｕＰＡ」）遺伝子の発現を調節する方法であって、次の工程： 目的の遺伝子における標的ヌクレオチド配列を同定することと、前記標的配列に対して相補的なメチル化アンチセンス・オリゴヌクレオチド配列であって、前記標的ヌクレオチド配列のＣｐＧ領域と相補的な領域における非メチル化シトシンに代えて５メチル化 シトシンを有する前記オリゴヌクレオチド配列を取得することと、および前記細胞を前記オリゴヌクレオチド配列のコピーに適切な条件下で暴露することと、を含み、前記オリゴヌクレオチド配列が核に侵入し、そして前記標的配列と相互作用して前記標的ヌクレオチド配列のメチル化を促進する方法を提供する。
2004504028.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣｐＧアイランドを含有するｕＰＡ遺伝子の非翻訳領域の一部分と実質的に相補的なメチル化アンチセンス・デオキシオリゴヌクレオチド。
【請求項２】
請求項１に記載のオリゴヌクレオチドであって、前記オリゴヌクレオチドが相補的であるｕＰＡ遺伝子の非翻訳領域の前記一部分が、ｕＰＡ遺伝子のプロモータ領域の一部（ａ ｐａｒｔ）であるオリゴヌクレオチド。
【請求項３】
請求項１に記載のオリゴヌクレオチドであって、ＧＧＣＧＧを含むｕＰＡ遺伝子の一部分と相補的なオリゴヌクレオチド。
【請求項４】
請求項１に記載のオリゴヌクレオチドであって、前記ヌクレオチド配列が、標的ヌクレオチド配列のＣｐＧ領域と相補的な領域における非メチル化シトシンに代えて５メチル化シトシンを有する配列番号 ５，６，７，８， ９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６ および １７ と相補的なオリゴヌクレオチドからなる群から選択されるオリゴヌクレオチド。
【請求項５】
請求項４に記載のオリゴヌクレオチドであって、配列番号 ７，９，１４，１５，１６ および １７と相補的なオリゴヌクレオチドからなる群から選択されるオリゴヌクレオチド。
【請求項６】
請求項５に記載のオリゴヌクレオチドであって、１５ と ６０ ヌクレオチド長の間のオリゴヌクレオチド。
【請求項７】
転移リスクの評価を可能とする目的で、癌を有することが疑われる患者から得られたｕＰＡ遺伝子の非翻訳領域の一部分を増幅する方法であって、前記ｕＰＡ遺伝子の前記一部分をポリメラーゼ連鎖反応に供試することを含む方法。
【請求項８】
転移リスクの診断的アッセイの段階におけるｕＰＡ遺伝子の一領域と相補的な単一ストランドＤＮＡプライマーの使用であって、前記アッセイの一段階において、ｕＰＡ遺伝子の前記一領域が増幅され、そして続く段階において、前記一領域のメチル化の程度が決定される使用。
【請求項９】
請求項８に記載の使用であって、前記プライマーが相補的なｕＰＡ遺伝子の前記一領域がＣｐＧアイランドの２０ヌクレオチド内である使用。
【請求項１０】
ｕＰＡ遺伝子発現の調節における、ＣｐＧアイランドを含有するｕＰＡ遺伝子のプロモータ領域の一部分と相補的なメチル化アンチセンス・オリゴヌクレオチドの使用。
【請求項１１】
請求項１０に記載の使用であって、前記メチル化アンチセンス・オリゴヌクレオチドが、配列番号 ５から１７のうちの１つと相補的である使用。
【請求項１２】
配列番号 ５，６，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６ および １７からなる群から選択されるオリゴヌクレオチドと相補的なＤＮＡを含む細胞。
【請求項１３】
請求項１のオリゴヌクレオチド、および哺乳類細胞への前記オリゴヌクレオチドの配送に適切なトランスフェクション手段を含むキット。
【請求項１４】
処置しなければ転移する傾向にある哺乳類患者の癌細胞の転移を減少化する方法であって、以下の工程：
ａ） 前記患者の癌細胞のｕＰＡ遺伝子においてＣｐＧアイランドを含有する標的ヌクレオチド配列を同定することと；
ｂ） 前記標的配列と、実質的に相補的なメチル化アンチセンス・デオキシオリゴヌクレオチド配列であって、前記標的ヌクレオチド配列のＣｐＧアイランドと相補的な領域における非メチル化シトシンに代えて５メチル化シトシンを有する前記オリゴヌクレオチド配列を取得することと；および、
ｃ） 前記患者に前記オリゴヌクレオチド配列を投与することと；を含み、
前記オリゴヌクレオチド配列が腫瘍細胞の核に侵入し、そして前記標的配列と相互作用して前記標的ヌクレオチド配列のメチル化を促進する方法。
【請求項１５】
請求項１４に記載の方法であって、前記オリゴヌクレオチド配列が１５ と ６０塩基の間の鎖長を有する方法。
【請求項１６】
請求項１４に記載の方法であって、前記オリゴヌクレオチド配列が、５メチルシトシン残基の間が２８塩基を超えない２以上の ＣｐＧ配列を含有する方法。
【請求項１７】
請求項１４に記載の方法であって、前記オリゴヌクレオチド配列が、前記標的ヌクレオチド配列のＣｐＧ領域と相補的な領域における非メチル化シトシンに代えて５メチル化シトシンを有する配列番号 ５，６，７，８， ９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６ および １７と相補的なオリゴヌクレオチドからなる群から選択される方法。
【請求項１８】
請求項１７に記載の方法であって、前記配列が、配列番号 ７，９ および １５と相補的なオリゴヌクレオチドからなる群から選択される方法。
【請求項１９】
請求項１４に記載の方法であって、前記オリゴヌクレオチド配列がヌクレオチドアナログを含む方法。
【請求項２０】
哺乳類細胞のｕＰＡ　ＤＮＡ配列の一部分のメチル化状態を制御する方法であって、以下の工程：
ａ） 標的ヌクレオチド配列を同定することと；
ｂ） 前記標的配列と実質的に相補的なメチル化アンチセンス・デオキシオリゴヌクレオチド配列であって、前記標的ヌクレオチド配列のＣｐＧ領域と相補的な領域における非メチル化シトシンに代えて５メチル化シトシンを有する前記オリゴヌクレオチド配列を取得することと； および、
ｃ） 前記細胞を、前記オリゴヌクレオチド配列のコピーに適切な条件下で暴露することと；を含み、
前記オリゴヌクレオチド配列が核に侵入し、そして前記標的配列と相互作用する方法。
【請求項２１】
機能的ｕＰＡ遺伝子を有する哺乳類癌細胞の集団により提示される転移リスクを評価する方法であって：
ａ） ＣｐＧアイランドを含有する前記ｕＰＡ遺伝子　非翻訳領域の一部分におけるシトシン ５メチル化の程度を決定することと； および、
ｂ） （ａ）のメチル化の程度を参照値に対して比較することと；
を含む方法。
【請求項２２】
請求項２１に記載の方法であって、前記ＣｐＧアイランドが前記ｕＰＡ遺伝子　プロモータ領域に存在する方法。
【請求項２３】
請求項２２に記載の方法であって、前記ＣｐＧアイランドが配列 ＧＧＣＧＧ内に局在する方法。
【請求項２４】
機能的ｕＰＡ遺伝子を有する哺乳類癌細胞集団の転移リスクを評価する方法であって：
ｃ） 標的ヌクレオチド配列を増幅することと；
ｄ） 前記標的ヌクレオチド配列のｕＰＡ メチル化の程度を決定することと； および、
ｅ） 工程ｂ）のメチル化の程度と参照値とを比較することと、を含む方法。
【請求項２５】
請求項２４に記載の方法であって、工程（ａ）開始前に前記ｕＰＡ遺伝子の一部分における非メチル化シトシンを別の塩基に転換すること、を更に含む方法。
【請求項２６】
請求項２４に記載の方法であって、前記ｕＰＡ遺伝子を患者の１以上の悪性細胞から取得すること、との最初の工程を更に含む方法。
【請求項２７】
請求項２６に記載の方法であって、悪性腫瘍が、乳癌， 前立腺癌， 肺癌および 結腸癌からなる群から選択される方法。
【請求項２８】
哺乳類ｕＰＡ遺伝子の非翻訳領域の一部分と相補的なＤＮＡ分節（ＤＮＡ ｓｅｇｍｅｎｔｓ）を含むＤＮＡの集団。
【請求項２９】
請求項２８に記載の集団であって、その主要部分として、 前記ｕＰＡ遺伝子の非翻訳領域に由来するＤＮＡを含む集団。
【請求項３０】
請求項２８に記載の集団であって、前記主要部分が、前記ｕＰＡ遺伝子の前記一部分と同一の配列を有するＤＮＡ および 前記ｕＰＡ遺伝子の前記一部分と相補的なＤＮＡ、から構成される集団。
【請求項３１】
ｕＰＡ遺伝子　プロモータ領域のメチル化状態の決定に基づいて癌の悪性度を決定するためのキットであって、ｕＰＡ遺伝子　プロモータ領域の一部分のメチル化特異的ポリメラーゼ連鎖反応増幅における使用に適切なプライマーおよび請求項２５に記載の方法を実行するための説明書を含む前記キット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、遺伝子発現の分野、より具体的にはウロキナーゼ型プラスミノーゲン（「ｕＰＡ」）アクティベータ遺伝子の発現を予想および制御することに関する。
【０００２】
異常な遺伝子発現は、種々の癌において頻繁に観察される。特定の遺伝子の不適切な制御が多くの癌の発生に役割をもつと信じられている。
【０００３】
遺伝子制御を調節する様々な方法が、当該技術分野において知られている。その多くは遺伝子産物の転写もしくは翻訳に重要な配列において変異を引き起こす。しかしながら、いくつかの遺伝子の発現が、ヌクレオチドの選択的メチル化により制御されていることを最近の証拠は示している（例えば、 Ｈｏｌｉｄａｙ， ＵＳ ５８４０４９７， および Ｓｈｅｉｋｈｎｅｊａｄ， ＵＳ ５８７４４１６）。シトシン―グアノシン配列（「ＣｐＧ」）のシトシン （「Ｃ」）の５’ポジションにおけるＤＮＡのメチル化は、遺伝子発現の制御に関与するとされている。特に、いくつかのメチル化遺伝子は、それらの非メチル化カウンターパートよりも低レベルで発現されるようである （Ｂｅｓｔｅｒｍａｎ， ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｄｅｒｎ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ， Ａｐｒｉｌ， ２０００，５１−５８）。
【０００４】
癌の発生後の疾患管理における遺伝子制御の役割はあまり明らかではない。ある種の癌は他の癌よりも転移しやすいように思われる。腫瘍転移は、長期の罹病率および死亡率における主要な因子である。
【０００５】
ウロキナーゼ型プラスミノーゲンアクティベータ（「ｕＰＡ」）は、転移に何らかの役割をもつ蛋白質である。ｕＰＡは、ラミニン、フィブロネクチンおよびコラーゲンなどの細胞外マトリックス成分の分解に重要であると思われ、腫瘍細胞の管外遊出（ｅｘｔｒａｖａｓａｔｉｏｎ）を促進すると思われる。またｕＰＡは、腫瘍血管形成、細胞移動および接着の促進に関係していると示された。ｕＰＡを発現しない腫瘍細胞は、一般的に良性もしくは非転移性である。ｕＰＡを発現する腫瘍細胞は、一般的により攻撃的（ａｇｇｒｅｓｓｉｖｅ）であり、転移する傾向が高い。しかしながら、ｕＰＡ発現が腫瘍細胞内で観察される時までに転移は既に生じており、患者が回復するチャンスを減少させることになる。
【０００６】
従って、本発明の課題は、遺伝子発現、および特にｕＰＡ遺伝子発現を制御する方法を提供することである。
【０００７】
驚くべきことに、ｕＰＡ遺伝子内の特定の標的ヌクレオチド配列が同定された。本発明は、これらの標的配列（メチル化されていてもよい）に対応し、ｕＰＡ遺伝子発現を減少させるアンチセンス・オリゴヌクレオチド配列を提供するものである。ｕＰＡ遺伝子発現を減少させる能力は、腫瘍の転移および血管形成に対抗する価値ある治療ツールである。
【０００８】
加えて、ｕＰＡ遺伝子の領域が同定され、これは癌細胞集団が転移する可能性を予測するのに有用である。具体的には、ｕＰＡ遺伝子の非翻訳領域における標的配列内のＣｐＧアイランドのメチル化の程度が、転移リスクの指標である。これらの標的領域ＣｐＧアイランドにおいて、低レベルのメチル化を有する細胞は、より転移する可能性がある。
【０００９】
いくつかの遺伝子の発現は、当該遺伝子内の特定の領域の選択的なメチル化により制御される。しかしながら、治療上もしくは診断上におけるｕＰＡ遺伝子のメチル化／脱メチル化の有用な標的領域を同定すること、およびインビボでかかる領域をメチル化する手段の開発は、これまで難しいとされてきた。
【００１０】
本発明の一態様において、哺乳類患者の腫瘍細胞の転移を減少させる方法であって、ｕＰＡ遺伝子の標的配列と相補的なメチル化されたアンチセンス・オリゴヌクレオチドを前記患者に投与することによる方法が提供される。
【００１１】
本発明に従って、哺乳類細胞のｕＰＡ遺伝子の発現を制御する方法が提供される。前記方法は以下の工程： （ａ）ｕＰＡ遺伝子の標的ヌクレオチド配列を同定することと； （ｂ）前記標的配列と実質的に相補的なメチル化されたアンチセンスデオキシオリゴヌクレオチド配列であって、前記標的ヌクレオチド配列のＣｐＧ領域と相補的な領域における非メチル化シトシンに代えて５’メチル化シトシンを有する前記オリゴヌクレオチド配列を取得することと； 並びに（Ｃ）前記細胞を前記オリゴヌクレオチド配列のコピーと適切な条件下で暴露することと；を含み、前記オリゴヌクレオチド配列が核内に侵入し、そして前記標的配列と相互作用して前記標的ヌクレオチド配列のメチル化を促進する方法である。
【００１２】
本発明の更なる別態様において、ｕＰＡ遺伝子の非翻訳領域の一部分と相補的で、且つＣｐＧアイランドを含有するメチル化アンチセンス・オリゴヌクレオチドが提供される。
【００１３】
本発明の更なる別態様において、患者の癌細胞の集団の転移リスクを評価する方法が提供され、該方法は： （ａ）細胞集団からｕＰＡ標的配列の一部分を増幅することと； （ｂ）前記標的配列のｕＰＡメチル化の程度を決定することと；および（ｃ）工程（ｂ）のｕＰＡメチル化の程度と参照値とを比較することと、を含む方法である。
【００１４】
図１は、実施例６の結果のイメージおよびグラフ形式の図である。
【００１５】
図２は、実施例７の結果のイメージおよびグラフ形式の図である。
【００１６】
図３は、ヒトｕＰＡ遺伝子の非翻訳領域の一部分の図であり、実施例８に記述される異なった細胞株におけるシトシンメチル化状態を示している。
【００１７】
ｕＰＡ遺伝子の配列は既知である（Ｒｉｃｃｏ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， １３ （８）， ２７５９ （１９８５） また、ＮＣＢＩ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ． Ｘ０２４１９）。転写領域は、ヌクレオチド１２２７で開始される。ヌクレオチド１〜１２２６は、プロモータ領域を含む非転写領域である。ｕＰＡプロモータ領域およびメチル化され得る最初のｕＰＡエクソンの中の一般的な部位は、既に同定されている （Ｉｎｔ． Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ， ８１，４４３−４５０，１９９９）。しかしながら、制御活性を有する特定のメチル化部位は、これまで同定されておらず、かかる部位をメチル化してｕＰＡ発現を減少化する方法も提案されていない。
【００１８】
本明細書中で使用される標的ヌクレオチド配列（時々は「標的配列」と呼称される）は、１以上のＣｐＧアイランド（ｕＰＡ遺伝子の非翻訳領域に局在する）を含んでいる配列である。「ＣｐＧアイランド」は、５’メチル化に適したシトシン（「Ｃ」）残基の間が２８塩基以下（ｎｏ ｍｏｒｅ ｔｈａｎ ２８ ｂａｓｅｓ）である２以上のシトシン―グアノシン　ジヌクレオチド（ＣｐＧ）配列を含むＤＮＡの領域である。従って、本明細書の開示を考慮して、当業者はｕＰＡ非翻訳領域の標的配列を同定することができる。
【００１９】
本明細書に使用される「指定配列（ｄｅｓｉｇｎａｔｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ）」は、標的ヌクレオチド配列との相互作用に適切なメチル化オリゴヌクレオチド配列である。好ましくは、１５と１５０塩基の間の鎖長を有する指定配列が使用される。より好ましくは、１５と６０塩基の間の鎖長を有する指定配列が使用される。更により好ましくは、１５から３０塩基の間の鎖長を有する指定配列が使用される。指定配列の例は、表１に示される。しかしながら、本明細書の開示を考慮して、他の指定配列が意図され、標準的な処理法にしたがい容易に合成できることは当業者に明らかである。
【００２０】
好ましくは、ｕＰＡ非翻訳領域内のｕＰＡプロモータ領域の一部分と実質的に相補で、且つＣｐＧアイランドを含むデオキシヌクレオチド　メチル化オリゴヌクレオチド配列が使用される。いくつかの例においては、配列番号 ５−１７、より好ましくは配列番号 ６，７，１０，１１ および １３−１６、更により好ましくは配列番号 ７ および １５と実質的に相補的なメチル化オリゴヌクレオチドの使用が望ましい。いくつかのケースにおいては、配列５’ＧＧＣＧＧを含むｕＰＡ遺伝子の非翻訳領域の一部分と相補的なメチル化オリゴヌクレオチドの使用が望ましい。
【００２１】
本明細書で使用される、「減少化配列（ｒｅｄｕｃｉｎｇ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ）」は、少なくとも１つの細胞株において、ｕＰＡ遺伝子発現の減少化に効果的な指定配列である。
【００２２】
本明細書で使用される、「妨害配列（ｉｍｐｅｄｉｎｇ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ）」は、ＭＡＴＲＩＧＥＬＴＭを介して侵入する高度に浸潤性の腫瘍細胞（ｉｎｖａｓｉｖｅ ｔｕｍｏｕｒ ｃｅｌｌｓ）の能力の妨害に著しく効果的な指定配列である。
【００２３】
標的ヌクレオチド配列の選択的メチル化は、本明細書において開示される標的ヌクレオチド配列をメチル化する方法を使用して容易に実行でき、細胞の核内において、標的ヌクレオチド配列を含む細胞が、実質的に相補的なメチル化オリゴヌクレオチドに対して、メチル化オリゴヌクレオチド と 標的ヌクレオチド配列との間の相互作用を許容する条件下で暴露される。
【００２４】
オリゴヌクレオチドが標的配列と実質的に相補的であるとは、２つの配列の塩基が、前記オリゴヌクレオチドの鎖長の少なくとも７５％に対し相補的　（Ｃ）に対応してＧおよびＡに対応してＴ）であり、標的配列のＣｐＧアイランドが前記オリゴヌクレオチドの対応する部分の塩基配列（しかし、必ずしもメチル化されてない）と厳密に相補的であり、且つ前記オリゴヌクレオチドが細胞中の標的配列と安定な複合体を形成できる場合である。
【００２５】
表１に、対応する指定配列と相補的である、いくつかの標的配列を記載する。標的配列がＧのすぐ５’側に５メチル・シトシンを含有する場合には、指定配列は好ましくは前記Ｇの相補的ヌクレオチドとして５メチルシトシンを含み、５’ＣｍＧ ３’に対する相補的配列は ５’ＣｍＧ３’である（例えば、配列番号１と相補的な指定配列は、ＣＣｍＧＧＧＣＴＴＡＴＴＧＣＴＴＴＣｍＧである）。
【００２６】
好ましくは、メチル化アンチセンス・オリゴヌクレオチド配列は、標的ヌクレオチド配列のＣｐＧ領域と相補的な領域において５メチルシトシン残基間が２８塩基以下の２以上のメチル化シトシンを含む。
【００２７】
ヌクレオチドアナログが、適切な環境下で指定配列のヌクレオチドの一部もしくは全てを置換するために使用されるが、好ましくはＣｐＧ領域のＣおよびＧはアナログにより置換されないことは容易に理解されるだろう。従って、実質的に相補的なオリゴヌクレオチドは、適切なアナログで置換した一部もしくは全てのヌクレオチドモノマーを有してもよい。特に、ホスホチオエート（ｐｈｏｓｐｈｏｔｈｉｏａｔｅｓ）、メチルホスホネート（ｍｅｔｈｙｌ ｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅｓ）またはＰ−エトキシホスホナート（Ｐ‐ｅｔｈｏｘｙｐｈｏｓｐｈａｎａｔｅｓ）などのアナログは、いくつかの条件下において利点を発揮できる。かかるヌクレオチドは、一般的にヌクレアーゼに耐性であり、それゆえより高いヌクレオチド安定性を提供し得る。メチルホスホネートおよびＰ−エトキシホスホナートは、高効率でリポソームに導入でき、且つ本来のヌクレオチドよりＲＮａｓｅＨまたは補体（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）を活性化する傾向が低い。本明細書の開示および公知の標準技術を考慮して、アナログを含有する適切なオリゴヌクレオチド配列を生産および同定することは当業者の能力の範囲内である。
【００２８】
メチル化アンチセンス・ヌクレオチドは、癌細胞への効果的な取り込み、該ヌクレオチドとその対応する標的配列との相互作用、該標的配列のシトシンのメチル化、が可能な任意の鎖長のものであってよい。アンチセンス・メチル化オリゴヌクレオチドの厳密な鎖長は、安定な複合体が標的配列（センス鎖）とアンチセンス・メチル化オリゴヌクレオチドとの間に形成されるかぎり重要なことではない。メチル化オリゴヌクレオチド配列は、好ましくは約１５と６０ヌクレオチド長の間、より好ましくは約１５と３０ヌクレオチド長の間である（Ｍａｔｓｕｎｏ ｅｔ ａｌ．， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌ． ３１３， ｐｇ． ３５９）。
【００２９】
本発明は如何なる特定の作用機構にも限定されものではないが、本発明の機構は、おそらく標的ヌクレオチド配列へのアンチセンス配列の結合に関するものであり、これによりＤＮＡメチルトランスフェラーゼ（Ｍｔａｓｅ）酵素をヘミメチル化基質（ａ ｈｅｍｉｍｅｔｈｙｌａｔｅｄ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）と共に供給し、鋳型としてメチル化アンチセンス鎖を使用して、ＤＮＡ　Ｍｔａｓｅに相補的ＧＣ部位をメチル化させるものである。
【００３０】
非メチル化シトシンに代わり５メチル化シトシンを有し、且つ特定のヌクレオチド配列のＣｐＧアイランドと相補的なＤＮＡオリゴヌクレオチド配列を合成する方法は、当該技術分野において既知であり、もし望むならば、かかるオリゴヌクレオチドは業者に注文するか、または標準法により合成し得る。同様に、天然ヌクレオチドとアナログ単量体とを組み合わせるオリゴヌクレオチドを合成および精製する技術は、当該技術分野において既知である。
【００３１】
核へのオリゴヌクレオチドの取り込みに適切な条件下で哺乳類細胞をオリゴヌクレオチドに暴露する方法（これによりＤＮＡが細胞にトランスフェクションされる方法であり、例えば、ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮＴＭなどの薬剤を使用する）は、当該技術分野において既知である。「適切な条件」という用語が本明細書中で使用される場合、この用語は特定の様式で細胞の核へ特定の指定配列の取り込みを許容させる条件を意味しており、該様式とは前記指定配列と標的配列との間の相互作用を容認する様式であり、その発現を減少させるのに十分な標的配列内のシトシンの５メチル化を生じる。当業者は本明細書の開示を考慮して特定オリゴヌクレオチドに関する「適切な条件」を決定し得る。
【００３２】
当該技術分野において既知である、アンチセンス・ヌクレオチドを配送（ｄｅｌｉｖｅｒｙ）する全ての適切な方法が本発明に利用できる。しかしながら、リポソームが特に考慮される。陽イオン性脂質〔サイトフェクチン（ｃｙｔｏｆｅｃｔｉｎｓ）とも呼称される〕は既知の配送ビヒクル（ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｖｅｈｉｃｌｅ）であり、いくつかの状況下で適切なものである（Ｓｅａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ （２０００）， ３１３ （Ｐａｒｔ Ａ） ｐｇ ３２２−３４１）。
【００３３】
オリゴヌクレオチド配送の別の有用な方法は、細胞への侵入を増強し得る比較的小さな分子に前記オリゴヌクレオチドをカップリングすることである。デンドリマー（Ｄｅｎｄｒｉｍｅｒｓ）、アンブレラ両親媒性物質（ｕｍｂｒｅｌｌａ ａｍｐｈｉｐｈｉｌｅｓ）、輸送増強蛋白質（ｔｒａｎｓｐｏｒｔ ｅｎｈａｎｃｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎｓ） およびリガンド・リンカー・アンチセンス・コンジュゲート（ｌｉｇａｎｄ−ｌｉｎｋｅｒａｎｔｉｓｅｎｓｅ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ）は、オリゴヌクレオチド配送を可能とするため、その各々を本発明のメチル化相補的オリゴヌクレオチドと組み合わせることができる〔Ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ （２０００）， ３１３ （Ｐａｒｔ Ａ） ｐｇ． ２９７−３２１； また Ｈｕｇｈｅｓ ｅｔ ａｌ．， Ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ （２０００）， ３１３ （Ｐａｒｔ Ａ） ｐｇ． ３４２−３５８〕。当業者は本明細書の開示を考慮して、配送されるオリゴヌクレオチド、処理される細胞型、患者症状並びに他の因子（毒性および血漿との相互作用を含む）に関連する任意の利用可能な配送技術から容易に選択できる。
【００３４】
細胞に指定配列を導入する他の方法は、本明細書の開示を考慮することによって当業者に明らかとなる。例えば、本発明のメチル化アンチセンスオリゴを含有するウイルスベクターで哺乳類細胞を感染させることによるトランスフェクションも、哺乳類細胞へＤＮＡを配送する方法として本発明により意図される。同様にウイルスベクターを、哺乳類検体に感染させることにより、検体内の細胞の治療に使用し得る。検体は、注射（薬学的に許容される担体中に混合された指定配列を ｉ． ｖ． または ｉ． ｐ． または筋肉内注射するなどの注射）によって指定配列を受け取ることもできる。腫瘍部位への直接の注射が、いくつかの状況下では好ましい。治療はスケジュール管理された一定の間隔をおいて反復できる。
【００３５】
好ましくは、数種の治療が１〜４週間実行された後、患者の癌細胞におけるｕＰＡ　ｕｔｒのメチル化が、実質的に本発明の診断方法に従って決定され、標準と比較される。患者の癌細胞が、同様の試料供給源から採取した正常、非悪性細胞と比較してｕＰＡ　ｕｔｒの顕著な脱メチル化を示す場合、治療は少なくともメチル化が正常レベルに達するまで継続されるべきである。いくつかのケースでは、顕著な脱メチル化発生の可能性を減少させるために進行中の基礎治療において指定配列を投与することが望まれる。
【００３６】
従って、本明細書の開示を考慮して、ｕＰＡ遺伝子を有する細胞に指定配列を導入して、標的配列のメチル化およびｕＰＡ発現の減少を生じさせることは当業者の能力範囲内である。
【００３７】
患者のバイオプシー又はより好ましくは生物学的液体もしくは粘液の何れかから採取される癌の悪性度を評価する診断検査も提供される。侵襲性の低い技術を要求する診断ツールは、患者の不快さの軽減に有益であり、且つ診断のコストをも軽減できる。適切な療法および／または生活計画の選択を助けるとの観点から、早期癌の攻撃性を類別化する方法を有することは有用である。
【００３８】
前記診断方法の一態様において、調査対象となる細胞集団のｕＰＡ遺伝子の非翻訳領域（「ｕｔｒ」）の一部分が検査され、そのメチル化状態が決定される。メチル化状態は、メチル化感受性制限酵素およびメチル化特異的ポリメラーゼ連鎖反応（「ｍｓＰＣＲ」）の使用を含む、任意の適切な手段により評価し得る。都合よく、ｍｓＰＣＲを、ｕＰＡ遺伝子の非翻訳領域を選択的に増幅するために使用した。そして、そのＰＣＲ増幅産物は、ｕＰＡ　ｕｔｒのメチル化状態を決定する従来の手段を使用して分析できる。ｕＰＡ　ｕｔｒ、および特にそのプロモータ領域、において比較的低レベルのメチル化を有する細胞は、重大な転移リスクを示すものである。
【００３９】
メチル化状態は、任意の適切な方法にしたがって等級分けし得る。例えば、特定ｕＰＡ遺伝子領域のメチル化状態は、同一または類似の試料供給源から採取した正常、非悪性組織と比較し得る。正常参照試料より低メチル化である試料には、転移リスクが存在すると考えられる。いくつかの例において、試料は、同一もしくは類似の組織供給源および高度に浸潤性であることが知られている試料（規定の特性を有する細胞株など）に由来する細胞とも比較し得る。高度に浸潤性の細胞のメチル化状態に密接に類似するメチル化状態を有する試料は、より大きなメチル化度を有する試料よりも、より大きな転移リスクを提示していると評価される。
【００４０】
例えば、乳癌細胞を検査する場合、適切な「正常」参照試料は、患者と同様の年齢および民族的背景を有する健常者検体から採取した正常乳房上皮細胞である。高度に浸潤性である細胞に関する参照試料は、ＭＤＡ−２３１細胞が適切であろう。前記診断方法は、ｕＰＡ関連の転移リスクを提示している任意の癌に対して適用し得る。前記診断方法は、乳癌， 前立腺癌， 肺癌および 結腸癌への使用に特に適切である。
【００４１】
ｍｓＰＣＲを実施する方法は当該技術分野において既知であり、本明細書の開示を考慮してｕＰＡ　ｕｔｒ を増幅することに容易に適用できる〔 例えば Ｈｅｒｍａｎ， ｅｔ ａｌ．， ＰＮＡＳ ９３： ９８２１ （１９９６）を参照のこと〕。
【００４２】
ｍｓＰＣＲにより増幅される領域は、好ましくは１以上のＣｐＧアイランドを含有するｕＰＡ　非翻訳領域の少なくとも一部分を含む。いくつかのケースにおいて、ＣｐＧアイランドを含有するｕＰＡ　プロモータの少なくとも一部分を含む領域を増幅することが望ましい。なお好ましくは、増幅される領域は、ｕＰＡ塩基対 ５９２から８９１を含む。いくつかのケースにおいて、配列 ５’ＧＧＣＧＧを含むｕＰＡ遺伝子の非翻訳領域の一部分を増幅することが望ましい。本発明の診断方法の一態様において、増幅されるｕＰＡ領域は、 配列番号 ５から１７のうちの一配列、好ましくは配列番号 ７， ９，１４，１５，１６ および １７のうちの一配列、更により好ましくは 配列番号 ７，９ および １５のうちの一配列、と同一または実質的に相同なヌクレオチド配列を含む。ｍｓＰＣＲ プライマーは、ｕＰＡ遺伝子の一部分、および好ましくはｕＰＡ　ｕｔｒの一部分と相補的である。更に好ましくは、前記プライマーが相補的なｕＰＡ遺伝子の領域は、ＣｐＧアイランドの２０ヌクレオチド以内である。ＰＣＲ プライマーの選択において考慮される因子は既知であり、当業者は本明細書の開示を考慮して適切なプライマーを調製できる。
【００４３】
本発明は、機能的ｕＰＡ遺伝子を有する哺乳類癌細胞の集団により提示される転移リスクを評価する方法であって： （ａ）１つのＣｐＧアイランドを含有するｕＰＡ遺伝子 ５’非翻訳領域の一部分におけるシトシンメチル化の程度を決定することと； および （ｂ）（ａ）のメチル化の程度を参照値に対して比較することと、を含む方法を提供する。
【００４４】
療法として、本発明のメチル化オリゴヌクレオチド方法は、ｍＲＮＡを産生する遺伝子の転写ではなくｍＲＮＡの翻訳を阻害するように作用すると考えられる従来型のアンチセンス組成物とは区別され、顕著な利点を提案するものである。本発明のプロモータ特異的メチル化オリゴヌクレオチドは、転写レベルで遺伝子活性を阻害できるので、細胞は自身のｍＲＮＡをリサイクルして阻害から免れることはできない。
【００４５】
プロモータまたは非転写領域の選択領域におけるメチル化インプリンティングは、遺伝的な様式でｕＰＡ遺伝子を抑制（ｓｉｌｅｎｃｅ）でき、さもなければオリゴヌクレオチドの阻害効果を減弱するであろう細胞性のリサイクリングを阻害する。
【００４６】
従って、本発明は、大量の化学的に修飾されたアンチセンス薬剤を連続的に配送する必要性を軽減した。
【００４７】
【実施例】
＜実施例１＞
高レベルのｕＰＡを発現しているヒト腫瘍細胞が選択される。適切な細胞株には、ＰＣ−３ および ＭＤＡ−ＭＢ−２３１ 細胞株が含まれる。
【００４８】
選択された細胞は、特定の選択された指定配列の段階的用量（ｇｒａｄｅｄ ｄｏｓｅｓ）で処理される。最適な用量レベルは、経験的に決定される。前記用量レベルは、好ましくは０．５から３０ マイクログラム／ｍｌの範囲であり、より好ましくは１から１５ マイクログラム ／ｍｌの範囲であり、および 更により好ましくは５から１０ マイクログラム／ｍｌの範囲である。
【００４９】
腫瘍細胞のコントロール集団は、ＰＢＳ（リン酸緩衝塩類溶液）または非特異的オリゴヌクレオチド（使用された指定配列と同様の長さを有するが、シトシンからメチルシトシンへの変更を有さない）の何れかで治療される。
【００５０】
前記腫瘍細胞は、オリゴヌクレオチドと共に適切な条件下で６および４８時間インキュベーションされる。当業者はインキュベーションの正確な期間を配列特性および本明細書の開示内容を考慮して経験的に決定できる。
【００５１】
オリゴヌクレオチドと前記腫瘍細胞のインキュベーション後、細胞性ＲＮＡを抽出し、そして当該技術分野において既知の方法によるノーザンブロット分析を使用してｕＰＡ　ｍＲＮＡについて評価される。アクチン、シクロフィリン（ｃｙｃｌｏｐｈｉｌｉｎｅ）または１８ｓ　ＲＮＡの発現が、ｕＰＡ発現の定量においてコントロールとして使用される。指定配列で治療された腫瘍細胞株は、統計的に有意な ｕＰＡ遺伝子発現の減少を示す。いくつかの指定配列は、いくつかの細胞株のｕＰＡ遺伝子発現を減少させるが、他の発現は減少させない。
【００５２】
従って、本明細書に含まれる開示内容を考慮して、特異的細胞株におけるｕＰＡ発現の減少化に効果的なメチル化オリゴヌクレオチドをスクリーニングすることは当業者の能力の範囲内である。少なくとも１つの細胞株においてｕＰＡの発現の減少化に効果的な指定配列は、「減少化」配列（”ｒｅｄｕｃｉｎｇ”ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ）である。
【００５３】
＜実施例２＞
ＭＡＴＲＩＧＥＬ ＴＭを介した腫瘍細胞の通過を妨害する指定配列の能力（細胞の転移性素因の測定）は、当該技術分野の既知の処置法による２区画ボイデンチャンバー侵入アッセイ（ａ ｔｗｏ ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔ Ｂｏｙｄｅｎ ｃｈａｍｂｅｒ ｉｎｖａｓｉｏｎ ａｓｓａｙ）を使用して評価される（Ａｌｂｉｎｉ， Ａ． ｅｔ ａｌ．， Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， ４７： ３２３９−３２４５， １９８７）。
【００５４】
高度に浸潤性の腫瘍細胞が、ボイデンチャンバーの１区画に配置される。ＭＡＴＲＩＧＥＬ ＴＭを介して侵入する高度に浸潤性の腫瘍細胞の能力に関して、高度に浸潤性の腫瘍細胞を減少化配列と共にインキュベーションする影響（ｉｍｐａｃｔ）が、適切な条件下において減少化配列で一細胞集団をインキュベーションすること、そしてこの集団と減少化配列に暴露しない集団とを比較することによって評価される。ＭＡＴＲＩＧＥＬＴＭを介して侵入する高度に浸潤性の腫瘍細胞の能力を顕著に妨害するそれらの指定配列は、特に興味深い。これらは、「妨害配列（ｉｍｐｅｄｉｎｇ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ）」である。
【００５５】
＜実施例３＞
インビボの腫瘍細胞を使用することにより、ｕＰＡ発現を減弱するメチル化オリゴヌクレオチドの能力が、遺伝子発現を推定する標準法により評価される（例えば、 Ｘｉｎｇ， Ｒ． ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， ５７： ３５８５−３５９３， １９９７）。
【００５６】
１，０００，０００　ｕＰＡ発現細胞を、４〜６週齢の雌／Ｃ／ｎｕ／ｎｕマウスの乳房脂肪パッド （ｍａｍｍａｒｙ ｆａｔ ｐａｄｓ）に接種する。そして動物に、ＰＢＳ、非特異的オリゴヌクレオチドまたは妨害配列の何れかを腹腔内（ ｉ． ｐ．）に注射する。この ｉ． ｐ．処理は、７〜８週の各週で反復され、動物は定期的に監視され、腫瘍容積が決定される。
【００５７】
妨害配列を投与された動物と他の動物の間で観察された腫瘍成長速度の統計的に有意な減速は、妨害配列が腫瘍成長の減速に有利に作用したことを示している。
【００５８】
本試験の終了時、全ての動物は殺傷され、肺およびリンパ節における巨視的および微視的な腫瘍転移の存在が評価される。巨視的および微視的な転移における統計的に有意な減少が、妨害配列で処理した動物とコントロール動物の間で観察された。
【００５９】
＜実施例４＞
実施例３のように動物はｕＰＡ発現細胞を接種される。しかしながら、腫瘍は、オリゴヌクレオチドで処理を開始する前に触知可能（ｐａｌｐａｂｌｅ）または測定可能（２−５０ ｍｍ 平方）な段階まで動物中で成長させる。腫瘍成長が評価される。本実施例は、当該技術分野の既知の処置にしたがって、且つ本明細書中に含まれる開示を考慮して実施される。妨害配列で処理された動物と他の動物との間で観察された統計学的な有意差は、癌の進展の逆転化（ｒｅｖｅｒｓｉｎｇ）または減速化における妨害配列の有効性を示している。
【００６０】
従って、遺伝子発現のメチル化ヌクレオチド制御に関する方法が提供されたことは明白である。
【００６１】
＜実施例５＞
腫瘍細胞は、腫瘍バイオプシーまたはヒト癌患者の血液、尿、もしくは粘液の何れかから採取される。メチル化特異的ＰＣＲが、ｕＰＡプロモータ領域のＤＮＡを増幅するために使用される（ｕＰＡは、非腫瘍細胞においては最小限しか発現していないので、これらは顕著に干渉しない）。ＤＮＡ配列分析を、ｕＰＡ遺伝子のメチル化状態の程度および変化を測定するために実行する。腫瘍細胞のメチル化状態が、多様な転移攻撃性（ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ ａｇｇｒｅｓｓｉｖｅｎｅｓｓ）を提示しているコントロール細胞の対応するＤＮＡ領域のメチル化状態と比較される。攻撃的な細胞型は、正常細胞よりもｕＰＡプロモータ領域において低レベルのメチル化を有することが発見された。ｕＰＡプロモータ領域　脱メチル化は、ヒト癌患者の転移に関する増大リスクと関連させることができる。
【００６２】
＜実施例６＞
ヒト乳癌細胞 ＭＣＦ−７を培地中で維持し、６５％コンフルエント細胞をビヒクル単体 （ＭＣＦ−７） または ２５ ｕＭの脱メチル化剤５ ａｚｃ （ＭＣＦ−７＋５ａｚｃ）で１０日間処理した。ＭＤＡ−２３１ 細胞を、ｕＰＡ発現のポジティブコントロール（ＭＤＡ−２３１） として使用した。この期間の終了時、 ２０μｇの各群から採取した細胞性ＲＮＡを１．１％アガロース／ホルムアルデヒドゲル上で電気泳動し、そしてヒト ｕＰＡ　ｃＤＮＡ または ３２Ｐラベル１８ ｓ ＲＮＡプローブで検出した。結果は、図１に示される。全てのブロット（図１Ａ）は、デデンシトメトリースキャン（図１ｂ）により定量された。コントロール細胞の有意差は、アスタリスクで示される（ｐ ＜ ０．０５）。
【００６３】
顕著レベルのｕＰＡを発現しないＭＣＦ−７ 細胞のメチル化阻害剤５−ａｚｃによる処理は、ノーザンブロット分析により認められたようにｕＰＡ　ｍＲＮＡの著しい誘発を生じる。
【００６４】
＜実施例７＞
２つの異なる処理用量による実験、ヒト乳癌細胞 ＭＤＡ−２３１は： 配列番号１５と相補的なメチル化アンチセンス・オリゴヌクレオチド（ｍＡＳ）、配列番号１５のオリゴヌクレオチド（ｍＳ）、または配列番号１５と相補的な非メチル化アンチセンス・オリゴヌクレオチド（ＡＳ）、のうちの１つでトランスフェクションされた。トランスフェクションを、ＬＩＰＦＥＣＴＡＭＩＮＴＭ （ＧＩＢＣＯＴＭ） を使用し、製造者の指示にしたがって１８時間続行させた。この処理の終了時、各治療群から採取された２０マイクログラムの細胞性ＲＮＡを、標準法に従って取得し、そして１．１％アガロース／ホルムアルデヒドゲル上で電気泳動し、そして毛管作用によりナイロン膜にブロットした。ブロットを、３２Ｐラベルしたヒト ｕＰＡ　ｃＤＮＡ または３２Ｐラベルした１８ ｓ ＲＮＡプローブでハイブリダイズした。１８ ｓ ｍＲＮＡ発現に対するｕＰＡ発現の比が計算された。
【００６５】
この実施例の結果を、図２に図示する。すべてのブロット（図２Ａ）は、デンシトメトリースキャン（図２Ｂ）により定量された。コントロール細胞の有意差は、アスタリスクで示される（ｐ ＜ ０．０５）。３０マイクロモル ｍＡＳ によるＭＤ−２３１ 細胞の処理は、ｍＳ または ＡＳ オリゴヌクレオチドで処理したコントロール細胞群と比較してノーザンブロット分析と同様の実験条件下でｕＰＡ　ｍＲＮＡ発現の顕著な阻害を生じた。
【００６６】
＜実施例８＞
ヒト乳癌細胞 および ヒト前立腺癌細胞のｕＰＡ遺伝子 プロモータにおけるメチル化状態の決定。
【００６７】
トータル細胞ゲノムＤＮＡを、ＭＤＡ−２３１， ＬＮＣａｐ および ＭＣＦ−７ 細胞から抽出した。２マイクログラムのゲノムＤＮＡを、５５℃の亜硫酸水素ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ）で１４時間処理した、この処理は全ての非メチル化シトシン（ｃ）のウラシル（Ｕ）への転換を生じる。引き続く増幅の間に、それらのウラシルは、更にｕＰＡの５’ＵＴＲ ５７２−５９１ ｂｐ （ｃａｇｇｔｇｃａｔｇｇｇａｇｇａａｇｃａ） および ８９２−９１１ ｂｐ （ｇａｇｔｇｃｃｇｃｇｇｔｃｃｔｇａｇａｔ） に対応するｕＰＡ プライマーを使用したネスティッドＰＣＲによる増幅を介してチミジン（Ｔ）へと転換される。これにより、試料中のシトシン メチル化のレベルの迅速な検出が可能となる。
【００６８】
ｕＰＡ　ｕｔｒの一部分の比較図を数種の細胞型を比較する様式で提供する図３において示されたように、ＭＣＦ−７ 細胞（４行目）中のｕＰＡプロモータのＣｐＧアイランド内で９０％を越えるシトシンがメチル化される。図３の最上段の行は、ｕＰＡ遺伝子の非翻訳領域部の非修飾配列を示す。対照的に、高いｕＰＡレベルを呈するＭＤ−２３１ 細胞は、非メチル化シトシンを含有している（５行目）。従って、ｕＰＡ　ｕｔｒのメチル化状態は、ｕＰＡ発現 および 転移リスクの指標である。
【００６９】
【表１】
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【００７０】
［配列表］
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【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は、実施例６の結果のイメージおよびグラフ形式の図である。
【図２】
図２は、実施例７の結果のイメージおよびグラフ形式の図である。
【図３】
図３は、ヒトｕＰＡ遺伝子の非翻訳領域の一部分の図であり、実施例８に記述される、異なる細胞株におけるシトシンメチル化状態を示している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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2004504028.tif 000085
【手続補正書】
【提出日】平成14年9月9日(2002.9.9)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヌクレオチド１および１２２６の間に局在し且つＣｐＧアイランドを含有するｕＰＡ遺伝子の非翻訳領域内の標的配列と、実質的に相補的で且つ安定な複合体を形成する能力のあるメチル化アンチセンス・デオキシオリゴヌクレオチドであって、ＣｐＧと相補的な領域における非メチル化 シトシンに代えて５メチル化 シトシンを有する配列番号１， ２， ３， ４， ５， ６， ７， ８， ９， １０， １１， １２， １３， １４， １５， １６ および １７のうちの少なくとも１つと実質的に相補的なオリゴヌクレオチドからなる群から選択される前記オリゴヌクレオチド。
【請求項２】
請求項１に記載のオリゴヌクレオチドであって、前記オリゴヌクレオチドが相補的である標的配列が、ｕＰＡ遺伝子のプロモータ領域の一部であるオリゴヌクレオチド。
【請求項３】
請求項１に記載のオリゴヌクレオチドであって、ＧＧＣＧＧを含む標的配列と実質的に相補的なオリゴヌクレオチド。
【請求項４】
請求項１、２または３の何れか１項に記載のオリゴヌクレオチドであって、配列番号 ７， ９， １１， １３， １４ および １５のうちの少なくとも１つと相補的なオリゴヌクレオチド。
【請求項５】
請求項４に記載のオリゴヌクレオチドであって、配列番号 ７， ９ および １１と相補的なオリゴヌクレオチドからなる群から選択されるオリゴヌクレオチド。
【請求項６】
請求項１〜５の何れか１項に記載のオリゴヌクレオチドであって、１５ と ６０ ヌクレオチド長の間のオリゴヌクレオチド。
【請求項７】
配列番号１， ２， ３， ４， ５， ６， ７， ８， ９， １０， １１， １２， １３， １４， １５， １６ または １７のうちの少なくとも１つのヌクレオチド配列を有する領域を含むｕＰＡ遺伝子の非翻訳領域の一部分を増幅する方法であって、それは転移リスクの評価を可能とするとの目的のために癌を有することが疑われる患者から得られ、前記ｕＰＡ遺伝子の前記一部分をポリメラーゼ連鎖反応に供試することを含む方法。
【請求項８】
転移リスクの診断的アッセイの段階において、配列番号１， ２， ３， ４， ５， ６， ７， ８， ９， １０， １１， １２， １３， １４， １５， １６， または １７のうちの１つの配列内に局在するＣｐＧアイランドの２０ヌクレオチド内にあるｕＰＡ遺伝子の一領域と、実質的に相補的で且つ安定な複合体を形成する能力のある単一ストランドＤＮＡ プライマーの使用であって、前記アッセイの一段階において、ｕＰＡ遺伝子の前記一領域が増幅され、そして続く段階において、前記一領域のメチル化の程度が決定される使用。
【請求項９】
ｕＰＡ遺伝子発現の調節における、ｕＰＡ遺伝子に局在する配列番号１， ２， ３， ４， ５， ６， ７， ８， ９， １０， １１， １２， １３， １４， １５， １６ および １７のうちの少なくとも１つと相補的なメチル化アンチセンス・オリゴヌクレオチドの使用。
【請求項１０】
請求項９に記載の使用であって、前記オリゴヌクレオチドがＣｐＧアイランドを含有するｕＰＡ遺伝子のプロモータ領域の一部分と相補的である使用。
【請求項１１】
請求項９に記載の使用であって、前記メチル化アンチセンス・オリゴヌクレオチドが配列番号 ７， ９， １１， １３， １４ および １５のうちの１つと相補的である使用。
【請求項１２】
配列番号１ から １７からなる群から選択されるオリゴヌクレオチドと相補的なＤＮＡを含む細胞。
【請求項１３】
請求項１のオリゴヌクレオチド、および哺乳類細胞への前記オリゴヌクレオチドの配送に適切なトランスフェクション手段を含むキット。
【請求項１４】
処置しなければ転移する傾向にある哺乳類患者の癌細胞の転移を減少化する方法であって、以下の工程：
ａ） 前記患者の癌細胞のｕＰＡ遺伝子において、ＣｐＧアイランドを含有する配列番号１， ２， ３， ４， ５， ６， ７， ８， ９， １０， １１， １２， １３， １４， １５， １６ または １７のうちの少なくとも１つを含む標的ヌクレオチド配列を同定することと；
ｂ） 前記標的配列と、実質的に相補的で且つ安定な複合体を形成する能力のあるメチル化アンチセンス・デオキシオリゴヌクレオチド配列であって、前記標的ヌクレオチド配列のＣｐＧアイランドと相補的な領域における非メチル化 シトシンに代えて５メチル化 シトシンを有している前記オリゴヌクレオチド配列を取得することと；および、
ｃ） 前記患者に前記オリゴヌクレオチド配列を投与することと；を含み、
前記オリゴヌクレオチド配列が腫瘍細胞の核に侵入し、そして前記標的配列と相互作用して前記標的ヌクレオチド配列のメチル化を促進する方法。
【請求項１５】
請求項１４に記載の方法であって、前記オリゴヌクレオチド配列が１５ と ６０塩基の間の長さを有する方法。
【請求項１６】
請求項１４に記載の方法 であって、前記オリゴヌクレオチド配列が、配列番号７， ９， １１， １３， １４ および １５と相補的なオリゴヌクレオチドからなる群から選択される方法。
【請求項１７】
請求項１６に記載の方法であって、前記配列が、配列番号 ７， ９ および １１と相補的なオリゴヌクレオチドからなる群から選択される方法。
【請求項１８】
請求項１４に記載の方法であって、前記オリゴヌクレオチド配列が、ヌクレオチドアナログを含む方法。
【請求項１９】
哺乳類細胞のｕＰＡ　ＤＮＡ配列の一部分のメチル化状態を制御する方法であって、以下の工程：
ａ） 配列番号１， ２， ３， ４， ５， ６， ７， ８， ９， １０， １１， １２， １３， １４， １５， １６ または １７のうち少なくとも１つを含む標的ヌクレオチド配列を同定することと；
ｂ） 前記標的配列と、実質的に相補的で且つ安定な複合体を形成する能力のあるメチル化アンチセンス・デオキシ−オリゴヌクレオチド配列であって、前記標的ヌクレオチド配列のＣｐＧと相補的な領域における非メチル化 シトシンに代えて５メチル化 シトシンを有する前記オリゴヌクレオチド配列を取得することと；および、
ｃ） 前記細胞を、適切な条件下で前記オリゴヌクレオチド配列のコピーに暴露することと；を含み、
前記オリゴヌクレオチド配列が核に侵入し、そして前記標的配列と相互作用する方法。
【請求項２０】
機能的ｕＰＡ遺伝子を有する哺乳類癌細胞の集団により提示される転移リスクを評価する方法であって：
ａ） 配列番号１， ２， ３， ４， ５， ６， ７， ８， ９， １０， １１， １２， １３， １４， １５， １６ または １７のうちの少なくとも１つの配列を有するｕＰＡ遺伝子　非翻訳領域のＣｐＧアイランド含有部分において、シトシン ５ メチル化の程度を決定することと；および、
ｂ） （ａ）のメチル化の程度を参照値に対して比較することと、を含む方法。
【請求項２１】
請求項２０に記載の方法であって、前記ＣｐＧアイランド含有部分がｕＰＡ遺伝子　プロモータ領域に存在する方法。
【請求項２２】
請求項２１に記載の方法であって、前記ＣｐＧアイランド含有部分が配列 ＧＧＣＧＧを含む方法。
【請求項２３】
機能的ｕＰＡ遺伝子を有する哺乳類癌細胞集団の転移リスクを評価する方法であって：
ａ） 配列番号１， ２， ３， ４， ５， ６， ７， ８， ９， １０， １１， １２， １３， １４， １５， １６ または １７のうちの少なくとも１つを含む標的ヌクレオチド配列を増幅することと；
ｂ） 前記標的ヌクレオチド配列のｕＰＡ メチル化の程度を決定することと；および、
ｃ） 工程ｂ）のメチル化の程度と参照値とを比較することと、を含む方法。
【請求項２４】
請求項２３に記載の方法であって、工程（ａ）開始前に前記ｕＰＡ遺伝子の一部分における非メチル化 シトシンを別の塩基に転換すること、を更に含む方法
【請求項２５】
請求項２３に記載の方法であって、前記ｕＰＡ遺伝子を患者の１以上の悪性細胞から取得すること、との最初の工程を更に含む方法。
【請求項２６】
請求項２５に記載の方法であって、悪性腫瘍が 乳癌， 前立腺癌， 肺癌および結腸癌からなる群から選択される方法。
【請求項２７】
配列番号１， ２， ３， ４， ５， ６， ７， ８， ９， １０， １１， １２， １３， １４， １５， １６ および １７のうちの少なくとも１つを含む標的配列と実質的に相補的なＤＮＡ分節（ＤＮＡ ｓｅｇｍｅｎｔｓ）を含むＤＮＡの集団。
【請求項２８】
請求項２７に記載の集団であって、その主要部分として、ヌクレオチド１と１２２６の間のｕＰＡ遺伝子の非翻訳領域に相補的なＤＮＡを含む集団。
【請求項２９】
請求項２７に記載の集団であって、前記主要部分が、ｕＰＡ遺伝子の一部分と同一の配列を有するＤＮＡ および ｕＰＡ遺伝子の一部分と相補的なＤＮＡ、から構成される集団。
【請求項３０】
ｕＰＡ遺伝子　プロモータ領域のメチル化状態の決定に基づいて癌の悪性度を決定するためのキットであって、配列番号１， ２， ３， ４， ５， ６， ７， ８， ９， １０， １１， １２， １３， １４， １５， １６ または １７のうちの少なくとも１つを含有するｕＰＡ遺伝子　プロモータ領域の一部分のメチル化 特異的ポリメラーゼ連鎖反応増幅における使用に適切なプライマー および請求項２３に記載の方法を実行するための説明書を含む前記キット。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００３】
遺伝子制御を調節する様々な方法が、当該技術分野において知られている。その多くは遺伝子産物の転写もしくは翻訳に重要な配列において変異を引き起こす。しかしながら、いくつかの遺伝子の発現が、ヌクレオチドの選択的メチル化により制御されていることを最近の証拠は示している（例えば、 Ｈｏｌｉｄａｙ， ＵＳ ５８４０４９７， および Ｓｈｅｉｋｈｎｅｊａｄ， ＵＳ ５８７４４１６）。シトシン―グアノシン配列（「ＣｐＧ」）のシトシン （「Ｃ」）の５’ポジションにおけるＤＮＡのメチル化は、遺伝子発現の制御に関与するとされている。特に、いくつかのメチル化遺伝子は、それらの非メチル化カウンターパートよりも低レベルで発現されるようである （Ｂｅｓｔｅｒｍａｎ， ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｄｅｒｎ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ， Ａｐｒｉｌ， ２０００，５１−５８）。関連する他の文献には、Ｘｉｎｇ 等の Ｉｎｔ． Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ， ８１：４４３（１９９９）、並びに Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ ＷＯ ９７／４６７０５ および ＷＯ ９９／２４５６０が含まれる。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２４】
オリゴヌクレオチドが標的配列と実質的に相補的であるとは、２つの配列の塩基が、前記オリゴヌクレオチドの鎖長の少なくとも７５％に対し相補的（Ｃに対応してＧおよびＡに対応してＴ）であり、標的配列のＣｐＧアイランドが前記オリゴヌクレオチドの対応する部分の塩基配列（しかし、必ずしもメチル化されてない）と厳密に相補的であり、且つ前記オリゴヌクレオチドが細胞中の標的配列と安定な複合体を形成できる場合である。




【国際調査報告】
2004504028.tif 000086
2004504028.tif 000087
2004504028.tif 000088
2004504028.tif 000089
2004504028.tif 000090