(57)【要約】目的のポリペプチドを個体に送達する方法が開示される。本方法は、調節因子に操作可能に連結した、目的のポリペプチドをコードする核酸を包含する免疫原性ベクターと、ｇＤ蛋白質、ｇＤ蛋白質の機能的断片、調節因子に操作可能に連結したｇＤ蛋白質をコードする核酸、又は調節因子に操作可能に連結したｇＤ蛋白質の機能的断片をコードする核酸から選ばれてなる１種以上とを、個体に投与することを包含する。調節因子に操作可能に連結した、目的のポリペプチドをコードする核酸を包含する免疫原性ベクター；並びにｇＤ蛋白質、ｇＤ蛋白質の機能的断片、調節因子に操作可能に連結したｇＤ蛋白質をコードする核酸、又は調節因子に操作可能に連結したｇＤ蛋白質の機能的断片をコードする核酸から選ばれてなる１種以上とを包含する組成物が開示される。個体における望ましくない免疫応答を阻害する方法が開示される。本方法は、望ましくない免疫応答を阻害するのに十分な量で、ｇＤ蛋白質、ｇＤ蛋白質の機能的断片、調節因子に操作可能に連結したｇＤ蛋白質をコードする核酸、又は調節因子に操作可能に連結したｇＤ蛋白質の機能的断片をコードする核酸から選ばれてなる１種以上を投与することを包含する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
目的のポリペプチドを個体に送達する方法にして、
ａ）調節因子に操作可能に連結した、目的のポリペプチドをコードする核酸を包含する免疫原性ベクター；並びに
ｂ）下記からなる群より選ばれてなる１種以上の成分
ｉ）　　ｇＤ蛋白質；
ｉｉ）　ｇＤ蛋白質の機能的断片；
ｉｉｉ）調節因子に操作可能に連結した、ｇＤ蛋白質をコードする核酸；及び
ｉｖ）　調節因子に操作可能に連結した、ｇＤ蛋白質の機能的断片をコードする核酸
を該個体に投与することを包含する方法。
【請求項２】
調節因子に操作可能に連結した、ｇＤ蛋白質をコードする核酸を、該個体に投与することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
該ｇＤ蛋白質をコードする核酸が、目的のポリペプチドを更にコードすることを特徴とする、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
ｇＤ蛋白質をコードする核酸と、目的のポリペプチドをコードする核酸とを、同じ配合で個体に投与することを特徴とする、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
ｇＤ蛋白質をコードする核酸と、目的のポリペプチドをコードする核酸とを、別の配合で個体に投与することを特徴とする、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
ｇＤ蛋白質を該個体に投与することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
ｇＤ蛋白質と、目的のポリペプチドをコードする核酸とを、同じ配合で投与することを特徴とする、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
ｇＤ蛋白質と、目的のポリペプチドをコードする核酸とを、別の配合で投与することを特徴とする、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
該目的のポリペプチドがヒトポリペプチドであることを特徴とする、請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
該免疫原性ベクターがウイルスベクターであることを特徴とする、請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
該ｇＤがＨＳＶ−１ｇＤであることを特徴とする、請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
該ｇＤがＨＳＶ−２ｇＤであることを特徴とする、請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
調節因子に操作可能に連結した、目的のポリペプチドをコードする核酸を包含する免疫原性ベクター；並びに
下記からなる群より選ばれてなる１種以上の成分
ｉ）　　ｇＤ蛋白質；
ｉｉ）　ｇＤ蛋白質の機能的断片；
ｉｉｉ）調節因子に操作可能に連結した、ｇＤ蛋白質をコードする核酸；及び
ｉｖ）　調節因子に操作可能に連結した、ｇＤ蛋白質の機能的断片をコードする核酸
を包含する組成物。
【請求項１４】
調節因子に操作可能に連結した、ｇＤ蛋白質をコードする核酸を包含する、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
ｇＤ蛋白質と目的のポリペプチドとをコードする核酸を包含する、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１６】
ｇＤ蛋白質を包含する、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１７】
該ｇＤ蛋白質が免疫原性ベクター内に組み込まれていることを特徴とする、請求項１６に記載の組成物。
【請求項１８】
該免疫原性ベクターがウイルスベクターであることを特徴とする、請求項１３〜１７のいずれかに記載の組成物。
【請求項１９】
該目的のポリペプチドがヒトポリペプチドであることを特徴とする、請求項１３〜１８のいずれかに記載の組成物。
【請求項２０】
該ｇＤがＨＳＶ−１ｇＤであることを特徴とする、請求項１３〜１９のいずれかに記載の組成物。
【請求項２１】
該ｇＤがＨＳＶ−２ｇＤであることを特徴とする、請求項１３〜１９のいずれかに記載の組成物。
【請求項２２】
免疫応答の抑制を必要とする個体内で免疫応答を抑制する方法にして、
該個体を同定し；望ましくない免疫応答を阻害するのに充分な量の、下記からなる群より選ばれてなる１種以上の成分：
ｉ）　　ｇＤ蛋白質；
ｉｉ）　ｇＤ蛋白質の機能的断片；
ｉｉｉ）調節因子に操作可能に連結した、ｇＤ蛋白質をコードする核酸；及び
ｉｖ）　調節因子に操作可能に連結した、ｇＤ蛋白質の機能的断片をコードする核酸
を該個体に投与することを包含する方法。
【請求項２３】
調節因子に操作可能に連結した、ｇＤ蛋白質をコードする核酸を、該個体に投与することを特徴とする、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
ｇＤ蛋白質を該個体に投与することを特徴とする、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
該個体が自己免疫／炎症の疾患又は病状を有することを特徴とする、請求項２２に記載の方法。
【請求項２６】
該個体が細胞、組織又は器官移植を受けている又は受けたことがあることを特徴とする、請求項２２に記載の方法。
【請求項２７】
該ｇＤがＨＳＶ−１ｇＤであることを特徴とする、請求項２２〜２６のいずれかに記載の方法。
【請求項２８】
該ｇＤがＨＳＶ−２ｇＤであることを特徴とする、請求項２２〜２６のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、抗ウイルス応答を阻害する方法、遺伝子を送達する改良された方法、自己免疫疾患を有する個体を治療する方法、及び炎症に関する疾病、疾患及び病状を有する個体を治療する方法に関する。本発明は、このような方法に有用な薬剤組成物に関する。本発明は、改良された遺伝子治療ベクター及びＨＳＶｇＤ又はそれをコードする遺伝子を包含する組成物；及びそれを調製し使用する方法に関する。本発明は、目的のポリペプチドをコードする核酸を含むベクターに対する細胞性免疫応答を阻害しつつ、個体にポリペプチドを送達する方法に関する。
【０００２】
（発明の背景）
遺伝子治療においては、機能的遺伝物質を個体に投与することで、疾病の原因である遺伝子欠陥を矯正する可能性、並びに治療用蛋白質をコードする遺伝物質を用いて治療用蛋白質を送達する可能性が見込まれている。個体内で欠損している又は欠陥のあるポリペプチドをコードする核酸を投与することによって疾病及び疾患を治療するプロトコルの開発が盛んに行われている。他には、治療上重要な蛋白質を、それを必要とする個体に送達する手段として、既存のものに代わる改良された手段の提供が遺伝子治療に期待されている。治療上重要な機能を有する蛋白質が発見されたことによって、多くの疾病及び疾患を治療する新規な方法が開発されており、そのような蛋白質の送達に遺伝子治療を用いることが更に注目を集めている。
【０００３】
遺伝物質を送達する方法の中でも、個体の細胞に感染することのできる免疫原性ベクター（最も一般的にはウイルスベクター）を使用する方法が最も幅広く用いられている。基本的には、目的の蛋白質をコードする遺伝物質（疾病の原因である欠陥遺伝子に機能を持たせた形態であれ、治療に有用な蛋白質をコードする配列である）を、個体細胞に感染することのできるベクターのゲノムに組み込むか、あるいは遺伝物質を個体細胞に送達する。
【０００４】
遺伝子治療用ウイルスベクターの作製に用いられるベクターは数多くあるが、例えばアデノウイルス、アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）、ワクシニアウイルス及びシミアンウイルス４（ＳＶ４Ｏ）が挙げられる。ある場合には、遺伝物質の送達が望まれている特定の組織に感染する能力に応じてウイルスベクターが選択される。また別の場合には、弱毒化されているために著しい病変を与えずに限定的に強度の感染が可能であるという観点からウイルスベクターが選択される。
【０００５】
免疫原性ベクターを用いる遺伝子治療プロトコルにおける最も重要な問題点の一つに、ベクターを投与される個体内においてベクターに対する免疫応答が誘導されることが挙げられる。免疫応答は、ベクターに感染したベクター含有細胞を標的にする。ベクターに感染した細胞が破壊されると治療の効果は低下する。更に、同じ遺伝子治療組成物又は同じベクターを使った他の遺伝子治療組成物を次に投与した場合、ベクターに対して誘導されたこの免疫応答によって効果が制限される。というのは、同じ遺伝子治療組成物に含まれる又は同じベクターを使った他の遺伝子治療組成物に含まれるベクターを、個体の免疫系が認識し、ワクチンが病原体との接触時に個体を保護するのと同様の方法で免疫応答を強化するからである。
【０００６】
免疫系には二種類ある。免疫系のうち体液系では、Ｂリンパ球様細胞によって分泌され特異的抗原を認識する抗体が関与する。特異的抗原に抗体が結合することによって、抗原が不活化される。抗体による抗原の結合は、結合抗原を破壊する他の免疫細胞を活性化させたりもする。
【０００７】
免疫系のうち細胞系では、「異種」抗原を呈示する細胞を認識し破壊する、特異的な細胞型が関与する。免疫系のうちの細胞系に含まれる細胞の例として、細胞障害性Ｔ細胞（細胞障害性リンパ球又はＣＴＬとも称される）が挙げられる。ＣＴＬは、主要組織適合抗原複合体分子（ＭＨＣ）に会合した原形質膜表面上に呈示されるペプチド断片を認識する。「異種」ペプチドを呈示する細胞は細胞性免疫応答を誘導する。次いで細胞障害性Ｔ細胞が、異種ペプチド断片を呈示している細胞を破壊する。
【０００８】
器官、細胞又は組織移植を受けた患者の免疫系はドナーの器官、細胞又は組織を「異種」として認識し、ドナーの器官、細胞又は組織に対する免疫応答を強化する。患者の免疫応答を下方調節し、拒絶反応を避けるのに、免疫抑制剤が用いられている。
【０００９】
自己免疫疾患においては、免疫系は「自己」抗原を攻撃する。幾つかの自己免疫疾患はＴ細胞を媒介している。Ｔ細胞媒介性自己免疫疾患の例としては、慢性関節リウマチ（ＲＡ）、多発性硬化症（ＭＳ）、シェーグレン症候群、サルコイドーシス、インシュリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ）、自己免疫性甲状腺炎、反応性関節炎、強直性脊椎炎、強皮症、多発性筋炎、皮膚筋炎、乾癬、脈管炎、ウェゲネル肉芽腫症、クローン病及び潰瘍性大腸炎が挙げられる。 他の自己免疫疾患はＢ細胞を媒介している。Ｂ細胞媒介性自己免疫疾患の例としては、狼瘡（ＳＬＥ）、グレーヴズ病、重症筋無力症、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性血小板減少症、喘息、クリオグロブリン血症、原発性胆管硬化症及び悪性貧血が挙げられる。両種の疾患において、免疫応答は個体自身の抗原を対象としている。自己免疫疾患の治療としては、免疫応答を抑制することが考えられる。
【００１０】
安全性及び効果の向上した、改良された遺伝子治療ベクター、組成物及び方法が必要とされている。また、次回の治療投与あるいは同じベクターを用いた他の治療投与又はワクチン投与に対する個体の接触を制限してしまう、ウイルスベクターに対する免疫応答を、低減又は回避することのできる改良された遺伝子治療ベクター、組成物及び方法が必要とされている。さらに、細胞器官、細胞及び組織移植に関連した免疫応答を抑制する方法も必要とされている。目的のポリペプチドをコードするベクターに対する細胞性免疫応答を阻害しつつ、個体にポリペプチドを送達する方法が必要とされている。さらに、炎症・自己免疫の疾病及び疾患に関連する免疫応答を調節する方法も必要とされている。
【００１１】
（発明の概要）
本発明は、目的のポリペプチドを個体に送達する方法に関する。本方法は、調節因子に操作可能に連結した、目的のポリペプチドをコードする核酸を包含する免疫原性ベクターと、ｇＤ蛋白質、ｇＤ蛋白質の機能的断片、調節因子に操作可能に連結したｇＤ蛋白質をコードする核酸、及び調節因子に操作可能に連結したｇＤ蛋白質の機能的断片をコードする核酸、から選ばれてなる１種以上とを個体に投与することを包含する。
【００１２】
本発明は、調節因子に操作可能に連結した、目的のポリペプチドをコードする核酸を包含する免疫原性ベクターと；ｇＤ蛋白質、ｇＤ蛋白質の機能的断片、調節因子に操作可能に連結したｇＤ蛋白質をコードする核酸、又は調節因子に操作可能に連結したｇＤ蛋白質の機能的断片をコードする核酸、から選ばれてなる１種以上とを包含する組成物に関する。
【００１３】
本発明は、個体内での望ましくない免疫応答を阻害する方法に関する。本方法は、望ましくない免疫応答を阻害するのに充分な量の、ｇＤ蛋白質、ｇＤ蛋白質の機能的断片、調節因子に操作可能に連結したｇＤ蛋白質をコードする核酸、及び調節因子に操作可能に連結したｇＤ蛋白質の機能的断片をコードする核酸、から選ばれてなる１種以上を個体に投与することを包含する。
【００１４】
本発明は、拒絶反応又はそれに関連したあらゆる移植片対宿主疾患を避けるために、器官、組織又は細胞移植を受ける、受けている、又は受けたことがある個体を治療する方法に関する。本方法は、個体中の免疫応答を下方調節するのに充分な量の、ｇＤ蛋白質、ｇＤ蛋白質の機能的断片、調節因子に操作可能に連結したｇＤ蛋白質をコードする核酸、及び調節因子に操作可能に連結したｇＤ蛋白質の機能的断片をコードする核酸、から選ばれてなる１種以上を個体に投与することを包含する。
【００１５】
本発明は、自己免疫疾患を有する個体を治療する方法に関する。本方法は、個体中の免疫応答を下方調節するのに充分な量の、ｇＤ蛋白質、ｇＤ蛋白質の機能的断片、調節因子に操作可能に連結したｇＤ蛋白質をコードする核酸、及び調節因子に操作可能に連結したｇＤ蛋白質の機能的断片をコードする核酸、から選ばれてなる１種以上を個体に投与することを包含する。
【００１６】
図１Ａ−１Ｄは、実施例に記載した実験のデータを示す。免疫原性蛋白質をコードする遺伝子構造体と対照ベクター又はｇＤ蛋白質をコードする構造体とを注射した動物の免疫応答を比較した。
【００１７】
（本発明の好ましい態様の説明）
ここでいう「蛋白質」及び「ポリペプチド」の語は、交換可能に用いられ、蛋白質、ポリペプチド及びペプチドを含む蛋白様化合物のことを意味する。
【００１８】
ここでいう「ｇＤ」は、ヒト単純疱疹ウイルス１（ＨＳＶ−１）又はヒト単純疱疹ウイルス２（ＨＳＶ−２）のいずれかに由来する糖蛋白質Ｄのことを意味する。好ましい態様においては、ｇＤはＨＳＶ−１由来のものである。
【００１９】
ここでいう「個体」の語は、本発明で標的に用いられる脊椎動物のことを意味する。本発明で企図される「個体」の例としては、ヒト、高次霊長類、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、トリ及び他の哺乳類が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００２０】
ここでいう「免疫原性ベクター」は、免疫応答を引き起こすベクターを意味する。免疫原性ベクターの例としては、ウイルス性及び細菌性ベクターが挙げられるが、これらに限定されるものではない。本発明のある態様は、個体に投与するベクターがウイルス性のものであることを特徴とする方法に関する。ウイルスベクターの例としては、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、ワクシニアウイルス及びＳＶ４Ｏウイルスが挙げられるが、これらに限定されるものではない。好ましい態様においては、ベクターはアデノウイルスである。本発明のある態様は、個体に投与するベクターが細菌性のものであることを特徴とする方法に関する。細菌ベクターの例としては、サルモネラ、マイコバクテリウム及びＢＣが挙げられるが、これらに限定されるものではない。遺伝子治療に有用であり本発明に適用することのできる免疫原性ベクターの例としては、米国特許第５，７５６，２８３号び米国特許第５，７０７，６１８号に記載の組換えアデノウイルスベクターが挙げられる（参照して説明に代える）。
【００２１】
ここでいう「目的のポリペプチド」とは、遺伝子治療用に望まれるポリペプチドを意味する。「目的のポリペプチド」の例としては、遺伝子治療法における治療用又は代償性蛋白質として有用なヒト及び非ヒトポリペプチドが挙げられる。
【００２２】
ここでいう「治療用蛋白質」の語は、その存在が個体に治療上の利点を与える蛋白質を意味する。
【００２３】
ここでいう「代償性蛋白質」の語は、内生遺伝子の欠損や欠陥、機能しない又は部分的にしか機能しない内生遺伝子が原因で、機能が完全な内生蛋白質が欠損している場合、その存在が欠損を補う蛋白質のことをいう。
【００２４】
遺伝子治療に関する本発明のある態様においては、遺伝子構造体は代償性遺伝子又は治療用蛋白質をコードする遺伝子のいずれかを含む。代償性遺伝子の例としては、ジストロフィンをコードする遺伝子、嚢胞性繊維症の患者において欠陥遺伝子を補う遺伝子、インシュリンをコードする遺伝子、ＡＤＡの患者において欠陥遺伝子を補う遺伝子、及び第ＶＩＩＩ因子をコードする遺伝子が挙げられる。治療用蛋白質をコードする遺伝子の例としては、エリスロポエチン、インターフェロン、ＬＤＬ受容体、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−２、ＩＬ−４及びＴＮＦをコードする遺伝子が挙げられる。更に、有毒物質に特異的に結合する単鎖抗体部分をコードする遺伝子構造体を投与することもできる。
【００２５】
ある好ましい態様においては、ジストロフィン遺伝子はミニ遺伝子の一部分として提供され、筋ジストロフィーの個体を治療するのに用いられる。ある好ましい態様においては、ジストロフィン蛋白質の部分をコードする配列を含むミニ遺伝子が提供される。ジストロフィン異常は、軽度のベッカー筋ジストロフィー（ＢＭＤ）及び重度のデュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）両方の原因となっている。ＢＭＤではジストロフィンが作られはするが、寸法及び／又は量において異常なものが作られる。患者は軽度〜中程度の症状を呈する。ＤＭＤでは蛋白質が作られず、患者は１３歳まで車椅子に頼り切りになり、一般には２０歳までに死亡する。ある患者、特にＢＭＤの患者においては、ミニ遺伝子の発現により産生されたジストロフィン蛋白質の部分を本発明に従って送達することで、筋機能を改良することができる。
【００２６】
ある好ましい態様においては、ＩＬ−２、ＩＬ−４、インターフェロン又はＴＮＦをコードする遺伝子を、個体内の腫瘍細胞に送達するか、あるいは取り出した腫瘍細胞に送達し次いで個体に再導入する。ある態様においては、γインターフェロンをコードする遺伝子を、多発性硬化症の個体に投与する。
【００２７】
ある態様においては、目的のポリペプチドはヒト成長ホルモンをコードする遺伝子によってコードされる。
【００２８】
ここでいう「投与」の語は、ポリペプチドを個体に送達することをいう。また「投与」の語は、ポリペプチドをコードする核酸を、及びポリペプチドを、個体に送達することをいう。この語は、筋肉内、静脈内、鼻腔内、腹膜内、皮内、髄腔内、脳室内、皮下、経皮又は局所送達経路、或いは洗浄による送達経路を含むが、これらに限定されるものではない。本発明により企図される投与方法には、注射器、静脈内ライン、経皮パッチ、又は針のない注射器の使用が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００２９】
本発明は、ＨＳＶウイルスが感染個体の免疫系を避け弱体化させるのに用いている攻撃手段の一つである、ｇＤ蛋白質及び／又はそれをコードする核酸分子を用いた、改良された遺伝子治療ベクターを提供する。このＨＳＶ由来の攻撃手段を用いて、ベクターに対する個体の免疫応答を低減させることで、遺伝子治療ベクターの効力を増すことができる。その上更に、本発明はＨＳＶｇＤ蛋白質及び／又はそれをコードする核酸分子を用いて、望まれない免疫応答に関する疾病又は病状を有する個体を治療する。
【００３０】
本発明は、ｇＤポリペプチドの送達が細胞性免疫応答を抑制するという驚くべき発見に基づいてなされたものである。従って遺伝子治療プロトコルにおいてｇＤを用いると、遺伝子治療ベクターとそれに感染した細胞とに対する免疫応答が低減し、遺伝子治療プロトコルの効力が増す。炎症又は自己免疫の疾患など、望まれない免疫応答に関する疾病又は病状を有する、或いは組織又は器官移植を経た個体にｇＤを送達すると、免疫応答が低下する。ｇＤをコードする配列を遺伝子治療構造体自体に組み込むことができるので、このｇＤの免疫抑制活性を生かして特に好適にｇＤを遺伝子治療に用いることができる。加えてこのｇＤの免疫抑制活性を、自己免疫疾患治療における他の免疫抑制治療（ステロイドを用いたものなど）に代わる手段として用いることができる。
【００３１】
以下のようなｇＤのアミノ酸配列及びｇＤをコードするＤＮＡ配列は、以下のジェンバンク登録番号のものが公開されている。Ｅ０３１１…単純疱疹ウイルス１型（ＨＳＶ−１）ミヤマ株の表面蛋白質ｇＤをコードするＤＮＡ；Ｅ０３０２３…ＨＳＶ−１の表面蛋白質ｇＤをコードするＤＮＡ；Ｅ００４０２…単純疱疹ウイルス−１（ＨＳＶ−１）糖蛋白質Ｄ（ｇＤ）遺伝子；Ｅ００４０１…単純疱疹ウイルス−１（ＨＳＶ−１）糖蛋白質Ｄ（ｇＤ）遺伝子；Ｅ００４００…単純疱疹ウイルス−２（ＨＳＶ−２）糖蛋白質Ｄ（ｇＤ）遺伝子；Ｅ００３９５…単純疱疹ウイルス−１（ＨＳＶ−１）糖蛋白質Ｄ（ｇＤ）遺伝子；Ｅ００３９４…単純疱疹ウイルス−２（ＨＳＶ−２）糖蛋白質Ｄ（ｇＤ）遺伝子；Ｋ０１４０８…単純疱疹ウイルス２型（ＨＳＶ−２）糖蛋白質Ｄ（ｇＤ−２）遺伝子とそのフランキング配列；並びにＪ０２２１７…ＨＳＶ１糖蛋白質Ｄ遺伝子が挙げられる（それぞれ、各ジェンバンク登録番号に付属の文献及び登録番号に対応した文献をここに参照して説明に代える）。米国特許第５，９５８，８９５号、第５，５８３，０２８号及び第５，９５５，０８８号には、単離したｇＤ蛋白質又はｇＤ蛋白質をコードする核酸分子についての記載がある（ここに参照して説明に代える）。
【００３２】
ｇＤの機能的断片とは、免疫抑制活性を保持したままｇＤ蛋白質の末端を切除した形のものである。機能的断片は好ましくは約５、より好ましくは１０以上、さらにより好ましくは２５以上のアミノ酸の長さである。機能的断片は、ｇＤ断片の免疫抑制活性を負の対照と比較することによって、簡単に同定することができる。ｇＤ断片の存在によって免疫応答が低減するということは、断片が機能的断片であるということを意味する。
【００３３】
本発明の一つの特徴は、目的のポリペプチドを個体に送達する方法にして、調節因子に操作可能に連結した目的のポリペプチドをコードする核酸を包含する免疫原性ベクターと、ｇＤポリペプチド又はその機能的断片、あるいは調節因子に操作可能に連結したｇＤをコードする核酸又はその機能的断片のいずれか、あるいはそれらの組合せとを、個体に投与することを包含する方法に関する。本発明の一つの特徴によると、遺伝子治療プロトコルにおいて、ｇＤ蛋白質又はその機能的断片の個体への送達が、目的の蛋白質のコード配列を送達するための免疫原性ベクターの送達と組み合わせて行われる。ｇＤは、蛋白質又はその機能的断片として、或いはｇＤ蛋白質又はその機能的断片をコードする配列を含む核酸分子として、あるいはそれらの組合せとして送達することができる。ｇＤは、遺伝子治療ベクターと同じ配合で送達してもよいし、別々に送達してもよい。ｇＤは、遺伝子治療ベクターの送達と同時に、それより前に、又はそれに引き続いて、送達してもよい。ある好ましい態様においては免疫原性ベクターは、ｇＤ蛋白質又はその機能的断片をコードする配列を含む核酸分子を包含する。ある好ましい態様においては免疫原性ベクターは、ｇＤ蛋白質又はその機能的断片を包含する。ある好ましい態様においては免疫原性ベクターは、ｇＤ蛋白質及び／又はその機能的断片をコードする配列を含む核酸分子と、ｇＤ蛋白質及び／又はその機能的断片自体とを包含する。目的のポリペプチドをコードする核酸が個体に送達されると発現し、目的のポリペプチドが個体内で産生される。蛋白質として送達された、又は核酸分子「プロドラッグ」として送達され発現したｇＤ蛋白質が存在することで、免疫原性ベクターに対する免疫応答が阻害される。
【００３４】
本発明は、改良された遺伝子治療組成物及び方法を提供する。個体内で産生されない、少量しか産生されない又は突然変異体として産生されるポリペプチドが、目的のポリペプチドをコードする核酸を包含するベクターを用いた遺伝子治療を通じて、目的のポリペプチドに置き換えられる。目的のポリペプチドを用いることで、目的のポリペプチドが存在しない状態を補う。ベクターを個体に投与すると、ベクターに対する免疫応答が個体に生じる。目的のポリペプチドをコードする遺伝子治療ベクターと組み合わせて、蛋白質として又は核酸分子「プロドラッグ」としてｇＤを送達することで、免疫原性ベクターに対するこの免疫応答を阻害し、よって遺伝子治療の効果を向上させる。
【００３５】
本発明はまた、望ましくない免疫応答（自己免疫／炎症の疾患及び病状など）、並びに器官／組織／細胞移植過程によって特徴付けられる疾病及び病状を有する個体を治療する方法を提供する。本発明によると、望ましくない免疫応答に関する疾病又は病状を有する個体を治療する方法は、ｇＤ蛋白質又はその機能的断片、あるいはｇＤ蛋白質又はその機能的断片をコードする核酸、あるいはそれらの２種以上の組合せを個体に投与することを包含する。ｇＤ蛋白質又はその機能的断片をコードする核酸を個体に送達するとき、コード配列は調節因子に操作可能に連結している。ｇＤは、蛋白質又はその機能的断片として或いはｇＤ蛋白質又はその機能的断片をコードする配列を有する核酸分子として或いはそれらの組合せとして、送達することができる。ある態様においてはｇＤを、ｇＤ蛋白質をコードする配列及び／又はその機能的断片を有する核酸分子として送達する。ある態様においては、ｇＤ及び／又はその機能的断片を蛋白質として送達する。蛋白質として個体内に送達されたｇＤ蛋白質が、又はコードする核酸分子の発現によって個体内に産生されたｇＤ蛋白質が、望まれない免疫応答を阻害する。
【００３６】
本発明のある態様によると、自己免疫疾患及び疾病を有する個体を治療する方法が提供される。Ｔ細胞媒介性自己免疫疾患の例としては、慢性関節リウマチ（ＲＡ）、多発性硬化症（ＭＳ）、シェーグレン症候群、サルコイドーシス、インシュリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ）、自己免疫性甲状腺炎、反応性関節炎、強直性脊椎炎、強皮症、多発性筋炎、皮膚筋炎、乾癬、脈管炎、ウェゲネル肉芽腫症、クローン病及び潰瘍性大腸炎が挙げられる。これらの疾病はそれぞれ、内生抗原に結合し、自己免疫疾患に関連する炎症カスケードを引き起こすＴ細胞受容体によって特徴付けられる。
【００３７】
本発明のある態様によると、例えば細胞、組織及び器官移植を含む移植過程にある、免疫抑制を必要とする個体を治療する方法が提供される。そのような場合においては、移植物質の拒絶が低減し、移植片対宿主疾患といった副作用の程度や頻度が低下する。
【００３８】
他の態様によると、免疫抑制を誘導して炎症に由来する損傷を避けることができる。例えば脊髄が損傷し一連の反応が起きた結果、脊髄と周囲の組織に炎症が起こるが、本発明を用いることによって脊髄の炎症とそれに付随する問題の両方を阻害することができ、治療用ポリペプチドを個体に送達することができる。例えば、目的のポリペプチドが軸索誘導蛋白質である場合、本発明を用いることによって、脊髄の炎症を阻害し且つ軸索の再生を刺激することができる。
【００３９】
上述したように、ある態様においてはｇＤを単独で送達し、ある態様においては免疫原性ベクターを含む遺伝子治療剤と組み合わせてｇＤを送達する。
【００４０】
本発明のある態様においては、ｇＤ、その機能的断片、ｇＤをコードする核酸、又はｇＤの機能的断片をコードする核酸、から選ばれてなる１種以上の組合せを患者に投与する。
【００４１】
本発明のある態様においては、ｇＤ又はその機能的断片を、蛋白質として投与する。ある態様においては、ｇＤ又はその機能的断片を、目的のポリペプチドをコードする核酸と同じ配合で個体に投与する。他の態様においては、ｇＤ又はその機能的断片を、目的のポリペプチドをコードする核酸とは別の配合で個体に投与する。ある態様においては、ｇＤ又はその機能的断片を含む配合を、目的のポリペプチドをコードする核酸を含む配合と同時に個体に投与する。ある態様においては、ｇＤ又はその機能的断片を、免疫原性ベクター内に組み込んだ蛋白質として投与する。
【００４２】
本発明のある態様においては、ｇＤ又はその機能的断片をコードする核酸を投与する。本発明のある態様においては、目的のポリペプチドが第１の核酸によりコードされ、ｇＤ又はその機能的断片が第２の核酸によってコードされる。ある態様においては、ｇＤ又はその機能的断片をコードする核酸を、目的のポリペプチドをコードする核酸と同じ配合で個体に投与する。他の態様においては、ｇＤ又はその機能的断片をコードする核酸を、目的のポリペプチドをコードする核酸とは別の配合で個体に投与する。ある態様においては、ｇＤ又はその機能的断片をコードする核酸を含む配合を、目的のポリペプチドをコードする核酸を含む配合と同時に個体に投与する。本発明の好ましい態様においては、ｇＤ又はその機能的断片をコードする核酸と目的のポリペプチドとは、免疫原性ベクターのゲノムである、同じ核酸によってコードされる。ある態様においては、ｇＤ又はその機能的断片をコードする核酸を、目的のポリペプチドをコードする免疫原性ベクターの存在しない環境で投与する。
【００４３】
ある態様においては、ｇＤをコードする配列を、免疫原性ベクターとは別に又は存在しない環境で送達する。ＤＮＡを直接投与して細胞に蛋白質を送達する組成物及び方法については、これまでに様々なプロトコルを用いた報告がなされている。そのような方法の例は、米国特許第５，５９３，９７２号、米国特許第５，７３９，１１８号、米国特許第５，５８０，８５９号、米国特許第５，５８９，４６６、米国特許第５，７０３，０５５号、米国特許第５，６２２，７１２号、米国特許第５，４５９，１２７号、米国特許第５，６７６，９５４号、米国特許第５，６１４，５０３号、及びＰＣＴ／ＵＳ９５／１２５０２に記載がある（ここに参照して説明に代える）。ＤＮＡを直接投与して細胞に蛋白質を送達する組成物及び方法については、ＰＣＴ／ＵＳ９０／０１５１５、ＰＣＴ／ＵＳ９３／０２３３８、ＰＣＴ／ＵＳ９３／０４８１３１及びＰＣＴ／ＵＳ９４／００８９９にも記載がある（ここに参照して説明に代える）。これらの出願に記載の送達プロトコルに加えて、ＤＮＡを送達する別の方法が、米国特許第４，９４５，０５０号及び第５，０３６，００６号に記載されている（ここに参照して説明に代える）。例えば米国特許第４，２３５，８７１号、米国特許第４，２４１，０４６号及び米国特許第４，３９４，４４８号に記載のように（ここに参照して説明に代える）、リポソームを媒介するＤＮＡ転移によって核酸分子を送達することができる。
【００４４】
目的のポリペプチドをコードする配列を有する核酸を包含する免疫原性ベクターを包含する調合物は、方法及び投与の部位に応じて調製する。そのような調合物は、当業者が容易に調製できるものである。核酸と更に任意に含まれるポリペプチドの他に、緩衝液、賦形剤、安定剤、担体及び希釈液を更に調合物に含んでいてもよい。
【００４５】
ｇＤ蛋白質又はその断片、並びに薬学的に許容可能な担体又は希釈液を包含する薬剤組成物は、使用される投与方法に応じて選択された成分を用いて、当業者が調製することのできるものである。好適な薬学的担体については、当分野で標準的な参考文献である「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」（Ａ．Ｏｓｏｌ）の最新版に記載がある（ここに参照して説明に代える）。
【００４６】
非経口投与の場合、例えば薬学的に許容可能な非経口賦形剤と組み合わせた、溶液、懸濁液、乳濁液又は凍結乾燥粉末としてｇＤ蛋白質を配合することができる。そのような賦形剤の例としては、水、食塩水、リンゲル液、デキストロース溶液及び５％ヒト血清アルブミンが挙げられる。リポソーム及び非水系賦形剤（固定油など）を用いてもよい。賦形剤又は凍結乾燥粉末は、等張性を保持する添加物（例えば塩化ナトリウム、マンニトル）や化学的安定性を保持する添加物（例えば緩衝液、防腐剤）を含んでいてもよい。調合物は、一般的な方法で滅菌する。例えば１．５重量％の活性成分を０．９％塩化ナトリウム溶液に溶解することによって、注射投与に好適な非経口組成物を調製する。
【００４７】
ｇＤ蛋白質又はその断片を包含する薬剤組成物は、活性薬剤が効力を発揮すべき哺乳動物体中の部位に、活性薬剤が到達することができるものであれば、どのような手段を用いて投与してもよい。経口投与では蛋白質は消化されやすいので、吸収を最適化するために、非経口投与すなわち静脈内、皮下、筋肉内の投与が一般的に用いられる。
【００４８】
投与量は、薬力学的特性；投与方法及び経路；受容者の年齢、健康状態、体重；症状の性質及び程度；同時に行われている治療の種類；並びに治療の頻度、といった要素に応じて変える。通常、ｇＤ蛋白質の１日の投与量は約０．１〜１００ｍｇ／ｋｇ（体重）である。一般に、０．５〜５０、好ましくは１〜１０ｍｇ／ｋｇ／日を、１〜６回／日に分割するか持続放出型で投与すると、望ましい結果が効果的に得られる。
【００４９】
本発明の別の特徴は、ｇＤをコードする核酸分子と薬学的に許容可能な担体又は希釈液とを包含する薬剤組成物に関する。本発明によると、ｇＤ蛋白質をコードする遺伝物質を、発現可能な形状で個体内に送達する。遺伝物質であるＤＮＡ又はＲＮＡは、個体の細胞に吸収され発現する。そのように産生されたｇＤは、免疫原性ベクターに対する免疫応答又は別の望ましくない免疫応答（例えば自己免疫・炎症の疾病及び病状、並びに移植過程に関連するもの）のいずれかを阻害することができる。従ってｇＤをコードする遺伝物質を包含する薬剤組成物が、ｇＤ蛋白質を包含する薬剤組成物と同様に有用である。ｇＤ又はｇＤコード配列を含む核酸分子を、免疫原性ベクターに組み込んでもよい。
【００５０】
個体細胞内で発現するのに必要な調節因子に操作可能に連結した、ｇＤ蛋白質をコードするヌクレオチド配列は、様々な方法を用いて薬剤組成物として送達することができる。例えば、ウイルスベクター（アデノウイルス又はレトロウイルスベクターなど）を用いる方法又は直接の核酸移転が挙げられるが、これらに限定されるものではない。ウイルスベクターを用いて目的の蛋白質をコードする核酸を送達する方法としては、様々なものが報告されている。レトロウイルスベクターやアデノウイルスベクター等の組換えウイルスベクターは、一般的な方法及び出発材料で調製することができる。組換えウイルスベクターには、ｇＤをコードするヌクレオチド配列を包含させる。そのようなベクターは、薬学的に許容可能な担体又は希釈液と組み合わせて用いる。得られる薬剤調製物を個体に投与することができる。個体がウイルスベクターに感染すると、ｇＤが感染細胞内で産生される。
【００５１】
あるいは、ｇＤをコードするヌクレオチド配列を包含する分子を、感染性ベクターを用いることなく、薬剤組成物として投与することもできる。核酸分子はＤＮＡであってもＲＮＡであってもよいが、好ましくはＤＮＡである。ＤＮＡ分子は線状であっても環状であってもよく、好ましくはプラスミドである。核酸分子を薬学的に許容可能な担体又は希釈液と組み合わせて用いる。
【００５２】
本発明によると、ｇＤ蛋白質をコードする核酸配列を包含する薬剤組成物は、個体に直接投与してもよいし、個体から取り出した細胞内にエクスビボで送達してから再移植してもよい。いずれの方法によっても、個体本体に存在する細胞内に遺伝物質が導入される。好ましい投与経路の例としては、筋肉内、腹腔内、皮内及び皮下注射が挙げられる。あるいは薬剤組成物を、個体から取り出した細胞内に様々な手段で導入することができる。そのような手段の例としては、トランスフェクション、電気穿孔法及び 微粒子銃が挙げられる。核酸分子が細胞に吸収されてから、細胞を個体に再移植する。
【００５３】
本発明のこの特徴による薬剤組成物は、調合物中に約１ｎｇ〜１０ｍｇの核酸、ある態様においては、約０．１〜約２０００μｇのＤＮＡを包含する。ある好ましい態様においては、薬剤組成物は約１〜約１０００μｇのＤＮＡを含む。ある好ましい態様においては、薬剤組成物は約１〜約５００μｇのＤＮＡを含む。ある好ましい態様においては、薬剤組成物は約２５〜約２５０μｇのＤＮＡを含む。最も好ましくは、薬剤組成物は約１００μｇのＤＮＡを含む。
【００５４】
本発明のこの態様による薬剤組成物は、採用される投与方法に応じて配合される。当業者は、ｇＤをコードする核酸分子を容易に配合することができる。注射が投与方法として選択された場合には、滅菌された等張の非発熱性調合物が用いられる。一般に、等張性を得るための添加物としては、塩化ナトリウム、デキストロース、マンニトル、ソルビトール及びラクトースが挙げられる。リン酸緩衝食塩水などの等張液が好ましい。安定剤としてはゼラチン及びアルブミンが挙げられる。
【００５５】
核酸発現の調節因子としては、プロモーター、開始コドン、停止コドン及びポリＡシグナルが挙げられる。これらの調節因子が、目的のポリペプチド（及び任意にｇＤポリペプチド）をコードする配列と操作可能に連結しており、核酸が投与される個体内で調節因子が作動可能であることが必要である。例えば、開始及び終止コドンが、コード配列と共に枠内にあることが必要である。プロモーター及びポリＡシグナルが、個体の細胞内で機能することも必要である。
【００５６】
本発明の実施に有用なプロモーターの例としては；シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）由来のプロモーター；マウス乳癌ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター；ＨＩＶ末端反復配列（ＬＴＲ）プロモーター等のヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）由来のプロモーター；モロニーウイルス由来のプロモーター；ＡＬＶ由来のプロモーター；ＣＭＶ最初期プロモーター等のサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）由来のプロモーター；エプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）由来のプロモーター；ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）由来のプロモーター；並びにヒトアクチン、ヒトミオシン、ヒトヘンモグロビン、ヒト筋肉クレアチン及びヒトメタロチオネインなどのヒト遺伝子由来のプロモーターが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００５７】
本発明の実施に有用なポリＡシグナルの例としては、ＳＶ４ＯポリＡシグナル及びＬＴＲポリＡシグナルが挙げられるが、これらに限定されるものではない。特にｐＣＥＰ４プラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州サンディエゴ）に含まれるＳＶ４０ポリＡシグナル（ＳＶ４０ポリＡシグナルと称される）を用いる。
【００５８】
実施例
図１Ａ−１Ｄに示すように様々な組合せで遺伝子構造体を用いて、ブピバカインで促進したＤＮＡ接種を行って動物を免疫化した。図１Ａ、１Ｃ及び１Ｄのそれぞれにおいて、ｇＤ構造体を加えて投与したところ、投与したもう一方の遺伝子構造体によってコードされる抗原に対する免疫応答が低下した。図１Ｂは抗ｇＤ応答を示す。これらのデータは、ｇＤをコードする構造体と第二の免疫原性蛋白質をコードする第二の構造体とを共に投与すると、第二の免疫原性蛋白質に対する免疫応答が低下することを示している。
【００５９】
上記実施例は、本発明を例証するためのものであって、本発明をいかなる意味においても制限するものではない。当業者は、本発明の精神及び範囲内で本発明の改変が可能であると理解できよう。ここに引用した全ての文献は、参照して説明に代えるものとする。
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１Ａ−１Ｄは、実施例に記載した実験のデータを示す。免疫原性蛋白質をコードする遺伝子構造体と対照ベクター又はｇＤ蛋白質をコードする構造体とを注射した動物の免疫応答を比較した。
【図１】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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