(57)【要約】本発明のプロドラッグは、治療剤の変性された形であり、そして治療剤、オリゴペプチド、安定化基及び任意には、リンカー基を含んで成る。プロドラッグは、酵素チメットオリゴペプチド又はＴＯＰにより分解できる。また、接合体内にＴＯＰ−分解性配列を用いることによってプロドラッグを企画する方法、及び本発明のプロドラッグにより患者を処理する方法が開示される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１）標的細胞に挿入できる治療剤、
（２）式 （ＡＡ）ｎ−ＡＡ４−ＡＡ３−ＡＡ２−ＡＡ１：
［式中、個々のＡＡは独立して、アミノ酸を表し、
ｎは、０〜１６の整数であり、
ＡＡ４は、遺伝的にコードされないアミノ酸を表し、
ＡＡ３は、いずれかのアミノ酸を表し、
ＡＡ２は、いずれかのアミノ酸を表し、そして
ＡＡ１は、いずれかのアミノ酸を表す］で表されるオリゴペプチド、
（３）安定化基、及び
（４）任意には、ＴＯＰにより分解できないリンカー基、
を含んで成り、ここで前記オリゴペプチドは、そのオリゴペプチドの第１の結合部位で前記安定化基に直接的に結合され、そして前記オリゴペプチドは、前記治療剤に直接的に結合されるか、又は前記オリゴペプチドの第２結合部位で治療剤に前記リンカー基を通して間接的に結合され、
前記安定化基は全血（ｗｈｏｌｅ ｂｌｏｏｄ）に存在する酵素による前記化合物の分解を妨げ、そして
前記化合物がＴＯＰにより分解できることを特徴とする化合物。
【請求項２】
ｎが０〜８の整数である請求項１記載の化合物。
【請求項３】
前記標的細胞が、腫瘍又は炎症細胞である請求項１記載の化合物。
【請求項４】
前記ＴＯＰが、前記治療剤のための標的細胞の細胞外付近に存在する請求項１記載の化合物。
【請求項５】
前記ＴＯＰが、オリゴペプチドのＡＡ３とＡＡ２との間の結合を分解する請求項１記載の化合物。
【請求項６】
活性部分を有するプロドラッグであり、前記プロドラッグの活性部分が、ＴＯＰによる分解の前よりもＴＯＰによる分解の後、前記標的細胞により一層、侵入することができ、前記活性部分が少なくとも前記治療剤を含む請求項１記載の化合物。
【請求項７】
前記プロドラッグの活性部分が、前記治療剤から成る請求項６記載の化合物。
【請求項８】
前記プロドラッグの活性部分が、前記治療剤及び少なくとも前記リンカー基を含む請求項６記載の化合物。
【請求項９】
前記プロドラッグの活性部分が、前記治療剤、及び前記オリゴペプチドのＡＡ１を含む請求項６記載の化合物。
【請求項１０】
前記プロドラッグの活性部分がさらに、ＡＡ１に結合されるオリゴペプチドのＡＡ２を含んで成る請求項９記載の化合物。
【請求項１１】
前記オリゴペプチドが、Ｄ−ＡｌａＴｈｉβＡｌａβＡｌａＬｅｕＡｌａＬｅｕ（配列番号１）、ＴｈｉβＡｌａβＡｌａＬｅｕＡｌａＬｅｕ（配列番号２）、βＡｌａβＡｌａＬｅｕＡｌａＬｅｕ（配列番号３）βＡｌａＡｌａＡｌａＩｌｅ（配列番号４）、βＡｌａＡｌａＡｌａＬｅｕ（配列番号５）、βＡｌａＰｈｅＴｙｒＬｅｕ（配列番号６）、βＡｌａＰｈｅＴｈｒＰｈｅ（配列番号７）、βＡｌａＰｈｅＧｌｙＩｌｅ（配列番号８）、βＡｌａＰｈｅＧｌｙＬｅｕ（配列番号９）、βＡｌａＰｈｅＰｈｅＰｈｅ（配列番号１０）、βＡｌａＰｈｅＰｈｅＩｌｅ（配列番号１１）、βＡｌａＰｈｅＰｈｅＬｅｕ（配列番号１２）、βＡｌａＰｈｅＡｌａＩｌｅ（配列番号１３）、βＡｌａＰｈｅＡｌａＬｅｕ（配列番号１４）、ＴｈｉＧｌｙＡｌａＬｅｕ（配列番号１５）、ＮａｌＧｌｙＡｌａＬｅｕ（配列番号１６）、βＡｌａＬｅｕＴｙｒＬｅｕ（配列番号１７）、βＡｌａＬｅｕＴｈｉＬｅｕ（配列番号１８）、βＡｌａＬｅｕＴｈｒＰｈｅ（配列番号１９）、βＡｌａＬｅｕＴｈｒＩｌｅ（配列番号２０）、βＡｌａＬｅｕＴｈｒＬｅｕ（配列番号２１）、βＡｌａＬｅｕＳｅｒＬｅｕ（配列番号２２）、βＡｌａＬｅｕＰｙｒＬｅｕ（配列番号２３）、βＡｌａＬｅｕＬｅｕＬｅｕ（配列番号２４）、βＡｌａＬｅｕＧｌｙＰｈｅ（配列番号２５）、βＡｌａＬｅｕＧｌｙＩｌｅ（配列番号２６）、ＴｈｉＬｅｕＧｌｙＬｅｕ（配列番号２７）、βＡｌａＬｅｕＧｌｙＬｅｕ（配列番号２８）、ＡｉｂＬｅｕＧｌｙＬｅｕ（配列番号２９）、βＡｌａＬｅｕＰｈｅＩｌｅ（配列番号３０）、βＡｌａＬｅｕＰｈｅＬｅｕ（配列番号３１）、βＡｌａＬｅｕＡｉｂＬｅｕ（配列番号３２）、βＡｌａＬｅｕＡｌａＡｌａ（配列番号３３）、βＡｌａＬｅｕＡｌａβＡｌａ（配列番号３４）、βＡｌａＬｅｕＡｌａＰｈｅ（配列番号３５）、βＡｌａＬｅｕＡｌａＧｌｙ（配列番号３６）、βＡｌａＬｅｕＡｌａＩｌｅ（配列番号３７）、βＡｌａＬｅｕＡｌａＬｅｕ（配列番号３８）、ＴｉｃＬｅｕＡｌａＬｅｕ（配列番号３９）、ＴｈｚＬｅｕＡｌａＬｅｕ（配列番号４０）、ＴｈｉＬｅｕＡｌａＬｅｕ（配列番号４１）、ＮａｌＬｅｕＡｌａＬｅｕ（配列番号４２）、ＮＡＡＬｅｕＡｌａＬｅｕ（配列番号４３）、Ｄ−ＬｅｕＬｅｕＡｌａＬｅｕ（配列番号４４）、Ｄ−ＡｌａＬｅｕＡｌａＬｅｕ（配列番号４５）、Ｄ−ＭｅｔＬｅｕＡｌａＬｅｕ（配列番号４６）、ＡＰＰＬｅｕＡｌａＬｅｕ（配列番号４７）、ＡｍｂＬｅｕＡｌａＬｅｕ（配列番号４８）、βＡｌａＬｅｕＡｌａＮａｌ（配列番号４９）、βＡｌａＬｅｕＡｌａＳｅｒ（配列番号５０）、βＡｌａＬｅｕＡｌａＴｙｒ（配列番号５１）、βＡｌａＭｅｔＴｙｒＰｈｅ（配列番号５２）、βＡｌａＭｅｔＴｙｒＬｅｕ（配列番号５３）、βＡｌａＭｅｔＧｌｙＩｌｅ（配列番号５４）、ＴｈｉＭｅｔＧｌｙＬｅｕ（配列番号５５）、βＡｌａＭｅｔＰｈｅＰｈｅ（配列番号５６）、βＡｌａＭｅｔＰｈｅＩｌｅ（配列番号５７）、ＴｉｃＭｅｔＡｌａＬｅｕ（配列番号５８）、ＮａｌＭｅｔＡｌａＬｅｕ（配列番号５９）、ＮＡＡＭｅｔＡｌａＬｅｕ（配列番号６０）、βＡｌａＭｅｔＡｌａＬｅｕ（配列番号６１）、ＡＰＰＭｅｔＡｌａＬｅｕ（配列番号６２）、βＡｌａＮｌｅＴｙｒＩｌｅ（配列番号６３）、βＡｌａＮｌｅＴｙｒＬｅｕ（配列番号６４）、βＡｌａＮｌｅＴｈｒＩｌｅ（配列番号６５）、βＡｌａＮｌｅＴｈｒＬｅｕ（配列番号６６）、βＡｌａＮｌｅＧｌｙＰｈｅ（配列番号６７）、βＡｌａＮｌｅＧｌｙＩｌｅ（配列番号６８）、βＡｌａＮｌｅＧｌｙＬｅｕ（配列番号６９）、βＡｌａＮｌｅＰｈｅＩｌｅ（配列番号７０）、βＡｌａＮｌｅＡｌａＩｌｅ（配列番号７１）、βＡｌａＮｌｅＡｌａＬｅｕ（配列番号７２）、βＡｌａＮｌｅＡｌａＰｈｅ（配列番号７３）、βＡｌａＮｖａＡｌａＬｅｕ（配列番号７４）、βＡｌａＰｈｅＴｙｒＩｌｅ（配列番号７５）、ＴｈｉＰｒｏＧｌｙＬｅｕ（配列番号７６）、ＴｈｉＰｒｏＡｌａＬｅｕ（配列番号７７）、ＮａｌＰｒｏＡｌａＬｅｕ（配列番号７８）、βＡｌａＰｒｏＡｌａＬｅｕ（配列番号７９）、βＡｌａＰｈｅ（Ｃｌ），ＡｌａＬｅｕ（配列番号８０）、βＡｌａＰｈｅ（ＮＯ２），ＡｌａＩｌｅ（配列番号８１）、βＡｌａＰｈｅ（ＮＯ２），ＡｌａＬｅｕ（配列番号８２）、βＡｌａＰｈｇＡｌａＬｅｕ（配列番号８３）、βＡｌａＰｙｒＡｌａＬｅｕ（配列番号８４）、ＴｉｃＴｈｒＧｌｙＬｅｕ（配列番号８５）、βＡｌａＴｈｉＧｌｙＩｌｅ（配列番号８６）、βＡｌａＴｈｉＡｌａＬｅｕ（配列番号８７）、βＡｌａＴｉｃＡｌａＩｌｅ（配列番号８８）、βＡｌａＴｉｃＡｌａＬｅｕ（配列番号８９）、βＡｌａＶａｌＡｌａＬｅｕ（配列番号９０）、βＡｌａＴｒｐＡｌａＬｅｕ（配列番号９１）、βＡｌａＴｙｒＴｙｒＰｈｅ（配列番号９２）、βＡｌａＴｙｒＴｙｒＩｌｅ（配列番号９３）、βＡｌａＴｙｒＴｙｒＬｅｕ（配列番号９４）、βＡｌａＴｙｒＴｈｒＬｅｕ（配列番号９５）、βＡｌａＴｙｒＰｈｅＬｅｕ（配列番号９６）、βＡｌａＴｙｒＧｌｙＩｌｅ（配列番号９７）、ＴｈｉＴｙｒＧｌｙＬｅｕ（配列番号９８）、βＡｌａＴｙｒＧｌｙＬｅｕ（配列番号９９）、βＡｌａＴｙｒＰｈｅＩｌｅ（配列番号１００）、βＡｌａＴｙｒＡｌａＩｌｅ（配列番号１０１）、ＴｈｉＴｙｒＡｌａＬｅｕ（配列番号１０２）、及びβＡｌａＴｙｒＡｌａＬｅｕ（配列番号１０３）からなる群から選択される請求項１記載の化合物。
【請求項１２】
前記オリゴペプチドのＡＡ１が、ロイシン、フェニルアラニン、イソロイシン、アラニン、グリシン、チロシン、２−ナフチルアラニン、セリン、ｐ−Ｃｌ−フェニルアラニン、ｐ−ニトロフェニルアラニン、１−ナフチルアラニン、トレオニン、ホモセリン、シクロヘキシルアラニン、チエニルアラニン、ホモフェニルアラニン、ノルロイシン及びβ−アラニンから成る群から選択される請求項１記載の化合物。
【請求項１３】
前記オリゴペプチドのＡＡ２が、アラニン、ロイシン、チロシン、グリシン、セリン、３−ピリジルアラニン、２−チエニルアラニン、ノルロイシン、ホモセリン、ホモフェニルアラニン、ｐ−Ｃｌ−フェニルアラニン、ｐ−ニトロフェニルアラニン、アミノイソ酪酸、トレオニン及びフェニルアラニンから成る群から選択される請求項１記載の化合物。
【請求項１４】
前記オリゴペプチドのＡＡ３が、ロイシン、チロシン、フェニルアラニン、ｐ−Ｃｌ−フェニルアラニン、ｐ−ニトロフェニルアラニン、バリン、ノルロイシン、ノルバリン、フェニルグリシン、トリプトファン、テトラヒドロイソキノリン−３−カルボン酸、３−ピリジルアラニン、アラニン、グリシン、チエニルアラニン、メチオニン、バリン及びプロリンから成る群から選択される請求項１記載の化合物。
【請求項１５】
前記オリゴペプチドのＡＡＡ４が、β−アラニン、チアゾリジン−４−カルボン酸、２−チエニルアラニン、２−ナフチルアラニン、Ｄ−アラニン、Ｄ−ロイシン、Ｄ−イチオニン、Ｄ−フェニルアラニン、３−アミノ−３−フェニルプロピオン酸、γ−アミノ酪酸、３−アミノ−４，４−ジフェニル酪酸、テトラヒドロイソキノリン−３−カルボン酸、４−アミノメチル安息香酸及びアミノイソ酪酸から成る群から選択される請求項１記載の化合物。
【請求項１６】
前記安定化基が、ジカルボン酸又は高級カルボン酸である請求項１記載の化合物。
【請求項１７】
前記安定化基が、琥珀酸、アジピン酸、グルタル酸、フタル酸、ジグリコール酸、フマル酸、ナフタレンジカルボン酸、ピロクルタミン酸、酢酸、１−ナフチルカルボン酸、２−ナフチルカルボン酸、１，８−ナフチルジカルボン酸、アコニット酸、カルボキシ桂皮酸、トリアゾールジカルボン酸、グルコン酸、４−カルボキシフェニルボロン酸、ポリエチレングリコール酸、ブタンジスルホン酸及びマレイン酸から成る群から選択される請求項１記載の化合物。
【請求項１８】
前記安定化基が、４個又はそれよりも多くの炭素原子を有する、非遺伝的にコードされるアミノ酸である請求項１記載の化合物。
【請求項１９】
前記安定化基が、アスパラギン酸のβ−カルボキシ基で前記オリゴペプチドに結合されるアスパラギン酸、又はグルタミン酸のγ−カルボキシ基で前記オリゴペプチドに結合されるグルタミン酸の１つである請求項１記載の化合物。
【請求項２０】
前記安定化基が、負に荷電されているか又は中性である請求項１記載の化合物。
【請求項２１】
前記安定化基が、患者に静脈内投与される場合、前記化合物と、血管の内部をおおう内皮細胞との間の相互作用を低めるために選択される請求項１記載の化合物。
【請求項２２】
前記治療剤が、アルキル化剤、抗増殖剤、チューブリン結合剤、ビンカアルカロイド、エネジイン、ポドフィロトキシン又はポドフィロトキシン誘導体、プテリジン種類の薬物、タキサン、アントラサイクリン、ドラスタチン、トポイソメラーゼインヒビター、及び白金錯体化学療法剤から成る群から選択される請求項１記載の化合物。
【請求項２３】
前記治療剤が、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、カリケアミシン、エトポシド、エトポシドホスフェート、ＣＣ−１０６５、ズオカルマイシン、ＫＷ−２１８９、メトトレキセート、メトプテリン、アミノプテリン、ジクロロメトトレキセート、ドセタキセル、パクリタキセル、エピチオロン、コンブレタスタチン、コンブレタスタチンＡ４ホスフェート、ドラスタチン１０、ドラスタチン１１、ドラスタチン１５、トポテカン、カンフォテシン、マイトマイシンＣ、ポルフィロマイシン、５−フルオロウラシル、６−メルカプトプリン、フルダラビン、タモキシフェン、シトシンアラビノシド、アデノシンアラビノシド、コルヒチン、シスプラチン、カルボプラチン、マイトマイシンＣ、ブレオマイシン、メルファラン、クロロキン、シクロポリンＡ、前記のいずれかの誘導体及び前記のいずれかの類似体から成る群から選択される請求項１記載の化合物。
【請求項２４】
前記オリゴペプチドが、前記治療剤に直接的に結合される請求項１記載の化合物。
【請求項２５】
前記オリゴペプチド配列が、アミノカプロン酸、ヒドライド基、エステル基、エーテル基及びスルフィドリル基から成る群から選択されたリンカー基を通して、前記オリゴペプチドの第２結合部位で治療剤に間接的に結合される請求項１記載の化合物。
【請求項２６】
前記化合物が、Ｓｕｃ−βＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘ、Ｓｕｃ−βＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｎｒ及びグルタリル−βＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘから成る群から選択される請求項１記載の化合物。
【請求項２７】
前記化合物が、ＣＤ１０によ分解に対して耐性である請求項１記載の化合物。
【請求項２８】
式 （ＡＡ）ｎ−ＡＡ４−ＡＡ３−ＡＡ２−ＡＡ１：
［式中、個々のＡＡは独立して、アミノ酸を表し、
ｎは、０〜１６の整数であり、
ＡＡ４は、遺伝的にコードされないアミノ酸を表し、
ＡＡ３は、いずれかのアミノ酸を表し、
ＡＡ２は、いずれかのアミノ酸を表し、そして
ＡＡ１は、いずれかのアミノ酸を表す］で表される、ＴＯＰにより分解できるオリゴペプチドを含んで成る接合体。
【請求項２９】
前記オリゴペプチドが、安定化基に結合される請求項２８記載の接合体。
【請求項３０】
前記オリゴペプチドが、治療剤に結合される請求項２８記載の接合体。
【請求項３１】
（１）（ａ）標的細胞に挿入できる治療剤、
（ｂ）式 （ＡＡ）ｎ−ＡＡ４−ＡＡ３−ＡＡ２−ＡＡ１：
［式中、個々のＡＡは独立して、アミノ酸を表し、
ｎは、０〜１６の整数であり、
ＡＡ４は、遺伝的にコードされないアミノ酸を表し、
ＡＡ３は、いずれかのアミノ酸を表し、
ＡＡ２は、いずれかのアミノ酸を表し、そして
ＡＡ１は、いずれかのアミノ酸を表す］で表されるオリゴペプチド、
（ｃ）安定化基、及び
（ｄ）任意には、ＴＯＰにより分解できないリンカー基を含んで成り、
ここで前記オリゴペプチドは、そのオリゴペプチドの第１の結合部位で前記安定化基に直接的に結合され、そして前記オリゴペプチドは、前記治療剤に直接的に結合されるか、又は前記オリゴペプチドの第２結合部位で治療剤に前記リンカー基を通して間接的に結合され、
前記安定化基は全血（ｗｈｏｌｅ ｂｌｏｏｄ）に存在する酵素により前記化合物の分解を妨げ、そして
前記化合物がＴＯＰにより分解できることを特徴とする化合物、及び
（２）医薬的に許容できるキャリヤーを含んで成る医薬組成物。
【請求項３２】
患者の処理方法であって、治療的有効量の
（１）標的細胞に挿入できる治療剤、
（２）式 （ＡＡ）ｎ−ＡＡ４−ＡＡ３−ＡＡ２−ＡＡ１：
［式中、個々のＡＡは独立して、アミノ酸を表し、
ｎは、０〜１６の整数であり、
ＡＡ４は、遺伝的にコードされないアミノ酸を表し、
ＡＡ３は、いずれかのアミノ酸を表し、
ＡＡ２は、いずれかのアミノ酸を表し、そして
ＡＡ１は、いずれかのアミノ酸を表す］で表されるオリゴペプチド、
（３）安定化基、及び
（４）任意には、ＴＯＰにより分解できないリンカー基を含んで成り、
ここで前記オリゴペプチドは、そのオリゴペプチドの第１の結合部位で前記安定化基に直接的に結合され、そして前記オリゴペプチドは、前記治療剤に直接的に結合されるか、又は前記オリゴペプチドの第２結合部位で治療剤に前記リンカー基を通して間接的に結合され、
前記安定化基は全血（ｗｈｏｌｅ ｂｌｏｏｄ）に存在する酵素により前記化合物の分解を妨げ、そして
前記化合物がＴＯＰにより分解できることを特徴とする化合物を、前記患者に投与することを含んで成る方法。
【請求項３３】
前記化合物が、静脈内投与される請求項３２記載の方法。
【請求項３４】
前記患者が、癌、新形成疾患、腫瘍、炎症性疾患及び感染性疾患から成る群から選択された医学的状態について処理される請求項３２記載の方法。
【請求項３５】
前記標的細胞が、多薬物耐性である請求項３２記載の方法。
【請求項３６】
患者への投与のためのプロドラッグを企画するための方法であって、
（１）式 （ＡＡ）ｎ−ＡＡ４−ＡＡ３−ＡＡ２−ＡＡ１：
［式中、個々のＡＡは独立して、アミノ酸を表し、
ｎは、０〜１６の整数であり、
ＡＡ４は、遺伝的にコードされないアミノ酸を表し、
ＡＡ３は、いずれかのアミノ酸を表し、
ＡＡ２は、いずれかのアミノ酸を表し、そして
ＡＡ１は、いずれかのアミノ酸を表す］で表されるオリゴペプチドを同定し、
（２）完全な血液に存在する酵素による前記オリゴペプチドの分解を妨げる安定化基に前記オリゴペプチドの第１の結合部位でそのオリゴペプチドを連結し、
（３）前記オリゴペプチドの第２の結合部位で治療剤にそのオリゴペプチドを直接的に又は間接的に連結し、
ここで段階（２）及び（３）はいずれかの順序で又は同時に行われ得、そしてさらに、接合体が段階（１）〜（３）の実施により形成され、
（４）前記接合体がＴＯＰにより分解できるかどうかを試験し、そして
（５）前記接合体がＴＯＰにより分解できる場合、その接合体をプロドラッグとして選択する、
ことを含んで成る方法。
【請求項３７】
前記第１の結合部位が、前記オリゴペプチドのＮ−末端である請求項３６記載の方法。
【請求項３８】
前記第２の結合部位が、前記オリゴペプチドのＣ−末端である請求項３６記載の方法。
【請求項３９】
前記第１の結合部位が、前記オリゴペプチドのＣ−末端である請求項３６記載の方法。
【請求項４０】
前記第２の結合部位が、前記オリゴペプチドのＮ−末端である請求項３６記載の方法。
【請求項４１】
請求項３６記載の方法により企画されるプロドラッグ。
【請求項４２】
処理の必要な患者における治療剤に対する耐性を処理するための方法であって、前記患者に、治療的有効量の、
（１）標的細胞に挿入できる治療剤、
（２）式 （ＡＡ）ｎ−ＡＡ４−ＡＡ３−ＡＡ２−ＡＡ１：
［式中、個々のＡＡは独立して、アミノ酸を表し、
ｎは、０〜１６の整数であり、
ＡＡ４は、遺伝的にコードされないアミノ酸を表し、
ＡＡ３は、いずれかのアミノ酸を表し、
ＡＡ２は、いずれかのアミノ酸を表し、そして
ＡＡ１は、いずれかのアミノ酸を表す］で表されるオリゴペプチド、
（３）安定化基、及び
（４）任意には、ＴＯＰにより分解できないリンカー基を含んで成り、
ここで前記オリゴペプチドは、そのオリゴペプチドの第１の結合部位で前記安定化基に直接的に結合され、そして前記オリゴペプチドは、前記治療剤に直接的に結合されるか、又は前記オリゴペプチドの第２結合部位で治療剤に前記リンカー基を通して間接的に結合され、
前記安定化基は全血（ｗｈｏｌｅ ｂｌｏｏｄ）に存在する酵素により前記化合物の分解を妨げ、そして
前記化合物がＴＯＰにより分解できることを特徴とする化合物を、投与する、
ことを含んで成る方法。
【請求項４３】
患者への投与のために意図される治療剤の毒性を低めるための方法であって、
ＴＯＰにより分解できるオリゴペプチドを、そのオリゴペプチドの第１の結合部位で安定化基に結合し、そして前記治療剤を前記オリゴペプチドの第２の結合部位で直接的に又は間接的に結合することによって、ＴＯＰにより分解できるプロドラッグを共有的に形成し、それにより前記プロドラッグが、患者に投与される場合、前記治療剤の低められた毒性を提供することを特徴とする方法。
【請求項４４】
前記プロドラッグが、接合されていない形での治療剤の用量に対して、プロドラッグ形での治療剤の高められた用量の患者への投与を可能にする請求項４３記載の方法。
【請求項４５】
前記オリゴペプチドが、
式 （ＡＡ）ｎ−ＡＡ４−ＡＡ３−ＡＡ２−ＡＡ１：
［式中、個々のＡＡは独立して、アミノ酸を表し、
ｎは、０〜１６の整数であり、
ＡＡ４は、遺伝的にコードされないアミノ酸を表し、
ＡＡ３は、いずれかのアミノ酸を表し、
ＡＡ２は、いずれかのアミノ酸を表し、そして
ＡＡ１は、いずれかのアミノ酸を表す］のものである請求項４３記載の方法。
【請求項４６】
診断又はアッセイのための製品であって、
（１）（ａ）マーカー、
（ｂ）式 （ＡＡ）ｎ−ＡＡ４−ＡＡ３−ＡＡ２−ＡＡ１：
［式中、個々のＡＡは独立して、アミノ酸を表し、
ｎは、０〜１６の整数であり、
ＡＡ４は、遺伝的にコードされないアミノ酸を表し、
ＡＡ３は、いずれかのアミノ酸を表し、
ＡＡ２は、いずれかのアミノ酸を表し、そして
ＡＡ１は、いずれかのアミノ酸を表す］で表されるオリゴペプチド、
（ｃ）安定化基、及び
（ｄ）任意には、ＴＯＰにより分解できないリンカー基を含んで成り、
ここで前記オリゴペプチドは、そのオリゴペプチドの第１の結合部位で前記安定化基に直接的に結合され、そして前記オリゴペプチドは、前記マーカーに直接的に結合されるか、又は前記オリゴペプチドの第２結合部位でマーカーに前記リンカー基を通して間接的に結合され、
前記安定化基は全血に存在する酵素により前記化合物の分解を妨げ、そして
前記化合物がＴＯＰにより分解できることを特徴とする化合物、及び
（２）任意には、前記マーカーの検出において有用な少なくとも１つの試薬、
を含んで成る製品。
【請求項４７】
プロドラッグの製造において、遊離治療剤を除去するための方法であって、
（１）任意に保護された安定化基−オリゴペプチド接合体を遊離治療剤によりカップリングし、
（２）治療剤−ポリマー樹脂複合体を形成するために、段階（１）の後に残存する遊離治療剤を結合するポリマー樹脂と段階（１）の反応体とを接触し、そして
（３）前記治療剤−ポリマー樹脂複合体を除去することを含んで成る方法。
【請求項４８】
前記ポリマー樹脂が、ポリスチレンメチルイソシアネート又はポリスチレンスルホニルクロライドである請求項４７記載の方法。
【請求項４９】
前記任意に保護された安定化基−オリゴペプチド接合体が、
式 （ＡＡ）ｎ−ＡＡ４−ＡＡ３−ＡＡ２−ＡＡ１：
［式中、個々のＡＡは独立して、アミノ酸を表し、
ｎは、０〜１６の整数であり、
ＡＡ４は、遺伝的にコードされないアミノ酸を表し、
ＡＡ３は、いずれかのアミノ酸を表し、
ＡＡ２は、いずれかのアミノ酸を表し、そして
ＡＡ１は、いずれかのアミノ酸を表す］で表されるオリゴペプチドを包含する請求項４７記載の方法。
【請求項５０】
（１）アルキル又はアリルエステル保護された安定化基−オリゴペプチド−治療剤接合体を製造するために、活性化剤の存在下で、アルキル又はアリルエステル保護された安定化基、オリゴヌクレオチド及び治療剤をカップリングし、
（２）前記カップリング段階の後に残存するカップリングされなかった治療剤を除去し、そして
（３）安定化基−オリゴペプチド−治療剤プロドラッグ化合物を製造するために、前記アルキル又はアリルエステル保護された安定化基−オリゴペプチド−治療剤接合体を保護解除する段階を含んで成るプロドラッグ化合物の製造方法。
【請求項５１】
アルキル又はアリルエステル保護された安定化基−オリゴペプチド及び治療剤は、２：１〜１：１のモル比で存在する請求項５０記載の方法。
【請求項５２】
前記モル比が１．７５：１〜１．５：１である請求項５１記載の方法。
【請求項５３】
前記モル比が、１．６６：１である請求項５２記載の方法。
【請求項５４】
前記カップリング段階が、
（ａ）ＤＭＦにおいてアルキル又はアリルエステル保護された安定化基、オリゴペプチド及び治療剤を組合し、
（ｂ）ＤＩＥＡを添加し、
（ｃ）接合体を形成するために活性剤の存在下で、アルキル又はアリルエステル保護された安定化基、オリゴペプチド及び治療剤を反応せしめ、そして
（ｄ）沈殿物を形成するために、ブライン溶液を添加することによって前記接合体を沈殿することを含んで成る請求項５０記載の方法。
【請求項５５】
前記治療剤が、アントラサイクリンである請求項５０記載の方法。
【請求項５６】
前記アントラサイクリンが、ドキソルビシンである請求項５５記載の方法。
【請求項５７】
前記活性剤が、ＨＡＴＵである請求項５４記載の方法。
【請求項５８】
ＤＩＥＡ及びアルキル又はアリルエステル保護された安定化基−オリゴペプチドが、３：１〜１．５：１のモル比で存在する請求項５４記載の方法。
【請求項５９】
前記モル比が、２．５：１〜２：１である請求項５８記載の方法。
【請求項６０】
前記モル比が、２．１８：１である請求項５９記載の方法。
【請求項６１】
前記反応段階が、０℃で行われる請求項５４記載の方法。
【請求項６２】
前記反応段階が、３０分間、行われる請求項５４記載の方法。
【請求項６３】
前記活性剤及びアルキル又はアリルエステル保護された安定化基−オリゴペプチドが、１．５：１〜１：１のモル比で存在する請求項５７記載の方法。
【請求項６４】
前記モル比が１．１：１である請求項６３記載の方法。
【請求項６５】
前記ブライン溶液が、水中、２０％（ｗ／ｖ）〜４０％（ｗ／ｖ）のＮａＣｌである請求項５４記載の方法。
【請求項６６】
前記ブライン溶液が、水中、２５％（ｗ／ｖ）〜３５％（ｗ／ｖ）のＮａＣｌである請求項６５記載の方法。
【請求項６７】
前記ブライン溶液が、水中、３０％（ｗ／ｖ）のＮａＣｌである請求項６６記載の方法。
【請求項６８】
前記沈殿段階が、５．０〜７．０のｐＨで行われる請求項５４記載の方法。
【請求項６９】
前記ｐＨが、５．８〜６．０である請求項６８記載の方法。
【請求項７０】
前記除去段階が、
（ａ）ＤＭＦに前記接合体を溶解し、
（ｂ）無水ＤＭＦにスキャベンジャー樹脂を溶解し、
（ｃ）接合体−樹脂混合物を形成するために、前記スキャベンジャ−樹脂に、前記カップリング段階で形成される、アルキル又はアリルエステル保護された安定化基−オリゴペプチド−治療剤接合体を添加し、
（ｄ）前記混合物を、０℃〜３０℃で２〜２４時間、維持し、ここでカップリングされていない治療剤が前記樹脂と反応し、
（ｅ）前記混合物から樹脂を除去し、そして
（ｆ）アルキル又はアリルエステル保護された安定化基−オリゴペプチド−治療剤接合体の沈殿物を形成するために、ブライン溶液を添加することによって前記残存物を沈殿せしめることを含んで成る請求項５０記載の方法。
【請求項７１】
前記スキャベンジャー樹脂が、ポリスチレンイソシアネート、ポリスチレンメチルイソシアネート、ポリスチレンチオイソシアネート、ポリスチレンメチルチオイソシアネート、ポリスチレンスルホニルクロライド、ポリスチレンメチルスルホニルクロライド及びポリスチレンベンズアルデヒドから成る群から選択される請求項７０記載の方法。
【請求項７２】
前記スキャベンジャー樹脂が、ポリスチレンイソシアネートである請求項７１記載の方法。
【請求項７３】
前記保護解除段階がさらに、酵素により保護解除することを含んで成る請求項５０記載の方法。
【請求項７４】
前記酵素が、エステラーゼである請求項７３記載の方法。
【請求項７５】
前記エステラーゼが、ブタ肝臓エステラーゼ、カンジダ・アンタルチカ（Ｃａｎｄｉｄａ ａｎｔａｒｔｉｃａ）Ｂリパーゼ、カンジダ・ルゴサ（Ｃａｎｄｉｄａ ｒｕｇｏｓａ）リパーゼ、プソイドモナス・セパシア（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｅｐａｃｉａ）リパーゼ、ＣＬＥＣ−ＣＡＢ（架橋されたカンジダ・アンタルチカＢリパーゼ）、ＣＬＥＣ−ＣＲ（架橋されたカンジダ・ルゴサリパーゼ）、ＣＬＥＣ−ＰＣ（プソイドモナス・セパシアリパーゼ）及びキラザイム（セファロース上に固定されるエステラーゼ）から成る群から選択される請求項７４記載の方法。
【請求項７６】
前記エステラーゼが、カンジダ・アンタルチカＢリパーゼである請求項７５記載の方法。
【請求項７７】
前記エステラーゼが、固体支持体上に架橋されるか、又は固定される請求項７４記載の方法。
【請求項７８】
前記保護解除段階が、
（ａ）遊離酵素を除去するために前記酵素を洗浄し、
（ｂ）前記洗浄された酵素を、アルキル又はアリルエステル保護された安定化基−オリゴペプチド−治療剤接合体に添加し、
（ｃ）前記安定化基−オリゴペプチド−治療剤プロドラッグ化合物を創造するために、前記酵素と前記接合体とを、１５℃〜４０℃で、５．０〜８．０のｐＨで、少なくとも１８時間、反応せしめ、そして
（ｄ）前記プロドラッグ化合物から前記酵素を分離する、
ことを含んで成る請求項７７記載の方法。
【請求項７９】
前記酵素と前記接合体との反応段階の後、団体支持体上に架橋されているか又は固定されている追加の酵素を添加することをさらに含んで成る請求項７８記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
序説：
技術分野：
本発明は、プロドラッグとして有用な新規化合物に関する。そのようなプロドラッグは、患者における疾病、特に腫瘍の処理のために使用され得る。
【０００２】
背景：
多くの治療剤、例えばアントラサイクリン及びビンカアルカロイドは、癌の処理のために特に効果的である。しかしながら、それらの分子はしばしば、急性毒性、特に骨髄及び粘膜毒性、及びアントラサイクリンの場合、慢性心臓毒性及びビンカアルカロイドの場合、慢性神経学的毒性によりインビボで特徴づけられる。同様に、メトトレキセートは、炎症反応、例えばリウマチ患者の処理のために使用され得るが、しかしその高い毒性がその適用を制限する。より特異的で且つ安全な抗腫瘍剤の開発が、腫瘍細胞に対する高い有効性、及びそれらの生成物の副作用（毒性、非腫瘍細胞の破壊、等）の数及び重症度の低下のために所望される。より特異的に抗炎症剤の開発がまた所望される。
【０００３】
毒性問題を最少にするために、治療剤は好都合には、プロドラッグの形で患者に提供される。プロドラッグは、それらの構造の化学的又は酵素的修飾により、インビボで、薬物（活性治療化合物）に転換できる分子である。毒性を低めるためには、この転換は、循環システム又は非標的組織よりもむしろ作用又は標的組織の部位に制限されるべきである。しかしながら、血液及び血清は、プロドラッグが患者の身体内の所望する部位に達する前、そのプロドラッグを分解するか又は活性化する酵素を含むので、プロドラッグはしばしば、血液及び血清において低い安定性により特徴づけられる。
【０００４】
そのような問題を克服する所望する種類のプロドラッグは、特許協力条約国際発行ＷＯ９６／０５８６３号及びアメリカ特許第５，９６２，２１６号（それらは引用により本明細書に組み込まれる）に開示されている。しかしながら、さらに有用なプロドラッグ化合物及びそのようなプロドラッグの製造方法が所望される。
権利不在状態で存在する類似する構造（特に、最も接近した構造）のプロドラッグに対して、血液において高い作用特異性、低められた毒性及び改良された安定性を示すプロドラッグが特に所望される。
【０００５】
発明の要約：
本発明の化合物は、安定化基に結合されるオリゴペプチドに直接的に又は間接的に接合される治療剤のプロドラッグ形である。前記化合物は、標的細胞により結合される酵素により分解できる。
【０００６】
より一般的には、本発明は、治療剤の新規プロドラッグ化合物、特に、従来技術の生成物に対して改良された治療性質、特に癌腫瘍の処理及び／又は炎症性反応、例えばリウマチ性疾患の処理における改良された治療性質を示す抗腫瘍治療剤を含んで成るプロドラッグとして記載され得る。改良された治療性質とは、低められた毒性及び高められた効能を包含する。血清及び血液における高い作用特異性、低められた毒性、改良された安定性を示し、そして標的細胞結合酵素により活性化されるまで、標的細胞中に移動しないプロドラッグが特に所望される。腫瘍の特徴づけを可能にするマーカー（診断、腫瘍進行、腫瘍細胞により分泌される因子のアッセイ、等）のプロドラッグ化学物がまた企画される。従って、本発明は、本発明の化合物を用いる診断又はアッセイキットを包含する。
【０００７】
本発明はまた、本発明の化合物、及び任意には、医薬的に許容できるキャリヤー、アジュバント、ビークル又は同様のものを含んで成る医薬組成物にも関する。
さらに、プロドラッグを創造するために治療剤を変性することによって毒性を低め、そして安全性指数を改良する方法が開示される。本発明の他の観点は、患者への投与のためのプロドラッグの企画方法、及び治療的用量の化合物を投与することによる患者の治療方法を包含する。
本発明のプロドラッグを創造するためのいくつかの方法もまた記載される。
【０００８】
特定の記載：
略語：
ＡＣＮ＝アセトニトリル；Ａｉｂ＝アミノイソ酪酸；Ａｌｌ＝アリル；Ａｌｏｃ＝アリルオキシカルボニル；Ａｍｂ＝４−（アミノメチル）安息香酸；ＡＡＰ＝３−アミノ−３−フェニルプロピオン酸；ＤＣＣ＝Ｎ， Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド；Ｂｏｃ＝ｔ−ブチルオキシカルボニル；Ｃａｐ＝アミノカプロン酸；Ｃｏｕ＝アミノメチルクマリン；ＤＢＮ＝１，５−ジアザビシクロ［４． ３． ０］ノン−５−エン；ＤＢＯ＝１，４−ジアザビシクロ［２． ２． ２］オクタン；ＤＢＵ＝１，８−ジアザビシクロ［５． ４． ０］ウンデク−７−エン；ＤＣＭ＝ジクロロメタン；ＤＩＣ＝Ｎ， Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド；ＤＩＥＡ＝ジイソプロピルエチレンアミン；Ｄｇ＝ジグリコール酸；ＤＭＦ＝ジメチルホルムアミド；
【０００９】
Ｄｎｒ＝ダウノルビシン；Ｄｏｘ＝ドキソルビシン；Ｄｏｘ−ＨＣＬ＝ドキソルビシンの塩酸塩；Ｅｔ２Ｏ＝ジエチルエーテル；Ｆｍｏｃ＝９−フルオレニルメチルオキシカルボニル；Ｇｌ＝グルタル酸；ＯＳＵ＝Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド；ＨＡＴＵ＝Ｏ−（７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート；ＨＢＴＵ＝２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート；ＨＥＰＥＳ＝ヒドロキシエチルピペリジン；ＨＯＢｔ＝Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾール；ＨＰＬＣ＝高圧液体クロマトグラフィー；ＭｅＯＨ＝メタノール；ＭｅＯＳｕｃ＝メチルヘミスクシネート／メチルヘミスクシニル；ＭＤＲ＝多薬物耐性；ＭＴＤ＝最大耐性用量；ＮＡＡ＝３−アミノ−４，４−ジフェニル酪酸；
【００１０】
ＮａＩ＝２−ナフチルアラニン；Ｎａｐｈ＝１，８−ナフタレンジカルボン酸；ＮＩｅ＝ノルロイシン；ＮＭＰ＝Ｎ−メチルピロリジン；Ｎｖａ＝ノルバリン；ＰＡＭ樹脂＝４−ヒドロキシメチルフェニルアセトアミドメチル；Ｐｈｇ＝フェニルグリシン；Ｐｙｇ＝ピログルタミン酸；Ｐｙｒ＝３−ピリジルアラニン；ｒＲＴＯＰ＝組換えラットＴＯＰ；ＲＴ，ｒｔ＝室温；ＳＤ−ＭＴＤ＝単一用量−最大許容用量；ＳＤ＝単一用量；ＲＤ−ＭＴＤ＝反復用量−最大許容用量；ＲＤ＝反復用量；Ｓｕｃ＝琥珀酸／スクシニル；ＴＣＥ＝トリクロロエチル；ＴＦＡ＝トリフルオロ酢酸；ＴＨＦ＝テトラヒドロフラン；Ｔｈｉ＝２−チエニルアラニン；Ｔｈｚ＝チアゾリジン−４−カルボン酸；Ｔｉｃ＝テトラヒドロイソキノリン−３−カルボン酸；ＴＯＰ＝チメット（Ｔｉｍｅｔ）オリゴペプチダーゼ。
【００１１】
本発明は、治療剤のプロドラッグ形として記載され得る化合物を包含する。それらの治療剤の個々は、安定化基に結合されるオリゴペプチドに直接的に又は間接的に結合することによって変性される。プロドラッグ及び特に、そのプロドラッグのオリゴペプチド部分は、標的細胞により結合される酵素により分解できる。酵素は好ましくは、トロウアーゼ（ｔｒｏｕａｓｅ）であり、そしてより好ましくは、チメットオリゴペプチダーゼである。
【００１２】
プロドラッグ：
本発明のプロドラッグは、治療剤の変性された形であり、いくつかの部分、例えば
（１）治療剤、
（２）オリゴペプチド、及び
（３）安定化基、及び
（４）任意には、リンカー基を含んで成る。
プロドラッグの部分の個々は、下記により詳細に論じられる。プロドラッグのそれらの部分の典型的な配向は次のとおりである：
【００１３】
（安定化基）−（オリゴペプチド）−（任意のリンカー基）−（治療剤）。
安定化基は、オリゴペプチドの第１の結合部位でそのオリゴペプチドに直接的に連結される。オリゴペプチドは、そのオリゴペプチドの第２の結合部位で治療剤に直接的に又は間接的に連結される。オリゴペプチド及び治療剤が間接的に連結される場合、リンカー基が存在する。
【００１４】
プロドラッグの２種の部分の直接的な結合は、それらの２種の部分間に存在する共有結合を意味する。従って、安定化基及びオリゴペプチドは、オリゴペプチドの第１結合部位、典型的にはオリゴペプチドのＮ−末端で共有化学結合を通して直接激に結合される。オリゴペプチド及び治療剤が直接的に結合される場合、それらはオリゴペプチドの第２の結合部位でもう１つのものに共有結合される。オリゴペプチドの第２の結合部位は典型的には、オリゴペプチドのＣ−末端であるが、しかしオリゴペプチド上の他の位置ででもあり得る。
【００１５】
プロドラッグの２つの部分の間接的結合は、その２つの部分の個々がリンカー基に共有結合されることを意味する。他の態様においては、プロドラッグは、治療剤へのオリゴペプチドの間接的結合を有する。従って、典型的には、オリゴペプチドは、治療剤に共有結合されるリンカー基に共有結合される。
【００１６】
本発明のプロドラッグは、そのオリゴペプチド部分内で分解できる。プロドラッグは、典型的には、インビボ変性を受け、そしてプロドラッグの活性部位、すなわち輸送−成分部分が標的細胞に侵入する。プロドラッグのオリゴペプチド部分内の第１の分解は、分解生成物の１つとして、プロドラッグの輸送成分部分を残すことができる。他方では、１又は複数のペプチダーゼによるさらなる分解は、細胞に侵入することができるプロドラッグの一部をもたらすために必要とされる。プロドラッグの活性又は輸送成分部分は、少なくとも治療剤を有し、そして直接的に、又は標的細胞内のさらなる転換に基づいて治療効果を発揮するために標的細胞内に侵入できるプロドラッグのその部分である。従って、前記化合物は活性部分を有し、そして活性部分は、標的細胞により結合される酵素による分解の前よりも、標的細胞により結合される酵素による分解の後、標的細胞により侵入することができる。
【００１７】
安定化基及びオリゴペプチドの構造は、血液又は非標的組織に存在できる酵素によるプロドラッグのクリアランス及び代謝を制限するよう選択され、そしてさらに、細胞中へのプロドラッグの輸送を制限するよう選択される。安定化基は、プロドラッグの分解を阻止し、そしてプロドラッグの好ましい電荷又は他の物理的特性の提供において使用することができる。オリゴペプチドのアミノ酸配列は、標的細胞により結合される酵素、より特定には、トロウアーゼ酵素、及びさらにより特定には、チメットオリゴペプチダーゼが（“ＴＯＰ”）による特定の分解を確保するよう企画される。
【００１８】
プロドラッグ形への治療剤の変性により不活性化される、治療剤、特に抗腫瘍及び／又は抗炎症性治療剤を製造することが所望される。本発明によれば、標的細胞は通常、腫瘍細胞又は炎症反応において沈殿する細胞、特にリウマチ性疾患に関連するそれらの細胞、例えばマクロファージ、好中球及び単球である。治療剤のプロドラッグ形への変性は、治療剤の副作用をいくらか減じる。治療剤のプロドラッグ形への変性はさらに、接合されていない形での治療剤の用量に対して、プロドラッグ形での治療剤の高められた用量の患者への投与を可能にする。
【００１９】
標的細胞においては、治療剤（任意には、１又は２つのアミノ酸及びたぶんまた、リンカー基に結合される）は、その特定の細胞内作用部位に対して直接的に作用するか、又は細胞内ペプチダーゼの作用下での変性の後、標的細胞を殺害するか、又はその増殖を阻止する。正常細胞はインビボでＴＯＰをほとんどか又はまったく放出しないので、本発明の化合物は不活性を維持し、そして正常細胞に侵入しないか又は比較的少量で侵入する。ＴＯＰは身体において広く分布されると思われるが、それは典型的には、細胞内酵素として存在する。従って、それは一般的に、循環においてペプチドプロドラッグに接近できない。腫瘍の環境下で、ＴＯＰは壊死組織から放出されると思われる。
【００２０】
プロドラッグは、患者に投与され、安定形で血流を通して担持され、そして標的細胞の付近にある場合、ＴＯＰにより作用を及ぼされる。酵素活性は正常細胞の細胞外付近内に最少に存在するので、プロドラッグは維持され、そしてその活性部分（治療剤を包含する）は最少に正常細胞中に侵入する。しかしながら、腫瘍又は他の標的細胞付近において、局部環境におけるＴＯＰの存在は、プロドラッグの分解を引き起こす。安定化基が除去されると、追加のアミノ酸が標的細胞付近での他のペプチダーゼにより除去され得る。図２に示される例は、細胞外分解され、そして標的細胞中に侵入する、Ｎ−キャップドテトラペプチドプロドラッグを示す。標的細胞内で、それは、例えば標的細胞を殺害するか又はその増殖を阻止することによって、治療効果を提供するためにさらに変性され得る。プロドラッグの活性部位は正常細胞にある程度、侵入するが、その活性部分は主に標的細胞付近でプロドラッグの残りから開放される。従って、正常細胞に対する毒性が最少にされる。
【００２１】
この方法は、標的組織が正常細胞又は組織により開放されない酵素を放出する場合、標的細胞破壊のために特に有用であり、そしてそのために企画される。本明細書において、“正常細胞”とは、その意図される使用のために適切な態様で、プロドラッグの投与に基づいてプロドラッグにより遭遇される非標的細胞を意味する。正常（すなわち、非特異的）細胞は、インビボでプロドラッグの残りからのプロドラッグの活性部分（例えば、治療剤）を結合する結合を分解することを担当する標的細胞酵素、例えばＴＯＰをほとんど又はまったく生成しないので、本発明の化合物は、不活性で維持され、そして正常細胞に侵入しない。
【００２２】
他の態様においては、プロドラッグの配向は、逆転され、その結果、安定化基がオリゴペプチドのＣ−末端に結合され、そして治療剤がオリゴペプチドのＮ−末端に直接的に又は間接的に結合される。従って、他の態様においては、オリゴペプチドの第１の結合部位は、オリゴペプチドのＣ−末端であり得、そしてオリゴペプチドの第２の結合部位は、オリゴペプチドのＮ−末端であり得る。リンカー基は、任意には、治療剤とオリゴペプチドとの間に存在することができる。本発明のプロドラッグのもう１つの態様は、一次態様と同じ態様で機能する。
【００２３】
標的細胞結合酵素：
本発明のプロドラッグは、患者の身体内の標的化される部位で、又はその近くで、標的細胞により結合される酵素との相互作用を通しての選択的活性化を利用するよう企画される。そのようなタイプの酵素の１つは、引用により本明細書に組み込まれるＰＣＴ／ＵＳ９９／３０３９３号により詳細に記載されるトロウアーゼである。
【００２４】
トロウアーゼは、標的組織でプロドラッグを活性化すると思われるタイプの酵素である。トロウアーゼは、オリゴペプチド分解部位のカルボキシ側でのロイシンとイソロイシンとの間の著しい程度の区別を示す種類のエンドペプチダーゼである。適切なアッセイ条件下で、トロウアーゼはＳｕｃ−βＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｎｒを容易に分解するが、しかしそれは、Ｓｕｃ−βＡｌａ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｎｒとは、少なくとも２０倍低い活性を有することを特徴とする。ＴＯＰは、トロウアーゼ種類の酵素のメンバーである。
【００２５】
標的細胞は、トロウアーゼを開放すると思われる。たぶん、前記酵素は、標的細胞により、又は標的細胞により結合される正常細胞、例えば、基質細胞、好中球、マクロファージ又はＢ細胞により生成される。標的細胞結合の酵素は、細胞外表面により結合されるか、又はその表面（少なくとも活性部位）上に結合され、分泌され、開放され、又は標的細胞の細胞外付近に他の態様で存在することができる。その結果、トロウアーゼは、標的細胞の細胞外付近において分泌されるか、又はその付近で他の態様で存在することができる。多くの場合、本発明のプロドラッグは、癌の処理のための治療剤を含み、そして標的細胞は腫瘍細胞である。従って、トロウアーゼは腫瘍細胞により細胞外に分泌され得、又はそれは、例えば一般的に腫瘍により結合される相当量の細胞溶解物が存在するので、細胞外に存在することができる。細胞溶解物はまた、炎症性組織、すなわちもう１つの標的細胞部位により結合される。
【００２６】
しかしながら、トロウアーゼ活性は、ヒト血漿において低い。トロウアーゼ活性は、癌細胞抽出物、及び培養された癌細胞、赤血球細胞及び種々のヒト組織、特に腎臓からのならし培地において観察されている。ＨｅＬａ（頸部癌）細胞均質物の超遠心分離（１４５，０００倍、３０分）上清液からのトロウアーゼの部分精製スキームは、次の通りに４種の段階から成る：
１．２０ｍＭのトリエチルアミンクロライド、ｐＨ７．２、０．０１％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００中、０〜０．５ＭのＮａＣｌ線状グラジエントにより溶解される１５Ｑカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いてのアニオン交換クロマトグラフィー；
【００２７】
２．ＣｏＣｌ２により予備充填され、そして１０ｍＭのリン酸ナトリウム、０．５ＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．２、０．０１％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００， ０．０２％のＮａＮ３中、０〜２００ｍＭのイミダゾール線状グラジエント溶解されるＣｈｅｌａｔｉｎｇ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ （Ｐｈａｒｍａｃｉａ） を用いての親和性クロマトグラフィー；
３．分離用電気泳動；及び
４．０．３ｍｌ／分で５０ｍＭのリン酸カリウム、２００ｍＭの硫酸カリウム（ｐＨ７．０）により溶出される７．８ｍｍ×６０ｃｍのＴＳＫ Ｇｅｌ Ｇ−３０００ＳＷＸＬ（ＴｏｓｏＨａａｓ）を用いてのゲル濾過高性能液体クロマトグラフィー。
【００２８】
トロウアーゼ分解の後に開放されるプロドラッグの一部のさらなる分解は、たぶん、アミノ−エキソペプチダーゼにより、細胞内又は細胞外で生じ得る。インビトロ実験は、広い特異性のアミノ−エキソペプチダーゼがヒト血液及び癌細胞環境において存在することを示す。
【００２９】
証拠は、ＴＯＰがトロウアーゼの例であることを示す。ＨｅＬａ細胞抽出物から単離され、そしてＭＣＦ−７／６ヒト癌細胞からのならし培地又は均質物において研究されたトロウアーゼは、Ｓｕｃ−βＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘの初期分解を触媒する。それらの源から単離されたトロウアーゼは、ＴＯＰであると思われる。構造的及び機能的証拠は、癌細胞において見出されるトロウアーゼがチメットオリゴペプチダーゼ又は“ＴＯＰ”であることを示す。
【００３０】
文献によれば、ＴＯＰ又はＥＣ３． ４． ２４． １５は、６〜１７個のアミノ酸を有する種々のオリゴペプチドの内部（エンド）分解を触媒するエチール活性化された亜鉛メタロペプチダーゼである（Ｄａｎｄｏ、など．， “Ｈｕｍａｎ ｔｈｉｍｅｔ ｏｌｉｇｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ”， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｊ． ２９４： ４５１−４５７ （１９９３））。それはまた、Ｐｚ−ペプチダーゼ、コラゲナーゼ様ペプチダーゼ、キナーゼＡ、アミロイジンプロテアーゼ、及びメタロエンドペプチダーゼとしても言及される。
【００３１】
前記酵素は、鶏胚（Ｍｏｒａｌｅｓ， など．， “ＰＺ−ｐｅｐｔｉｄａｓｅ ｆｒｏｍ ｃｈｉｃｋ ｅｍｂｒｙｏｓ． Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ， ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ， ａｎｄ ａｃｔｉｏｎ ｏｎ ｃｏｌｌａｇｅｎ ｐｅｐｔｉｄｅｓ”， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２５２： ４８５５−４８６０ （１９９７））、鶏肝臓（Ｂａｒｒｅｔｔ，など．， “Ｃｈｉｃｋｅｎ ｌｉｖｅｒ ＰＺ−ｐｅｐｔｉｄａｓｅ， ａ ｔｈｉｏｌ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｍｅｔａｌｌｏ−ｅｎｄｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ”， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｊ． ２７１： ７０１−７０６ （１９９０））、ラット精巣（Ｏｒｌｏｗｓｋｉ． など．， “Ｅｎｄｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ ２４．１５ ｆｒｏｍ ｒａｔ ｔｅｓｔｅｓ． Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｅｎｚｙｍｅ ａｎｄ ｉｔｓ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｔｏｗａｒｄ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ａｎｄ ｎａｔｕｒａｌ ｐｅｐｔｉｄｅｓ， ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ｅｎｋｅｐｈａｌｉｎ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｐｅｐｔｉｄｅｓ”， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｊ． ２６１： ９５１−９５８ （１９８９））、及びヒト赤血球（Ｄａｎｄｏ， など．， “Ｈｕｍａｎ ｔｈｉｍｅｔ ｏｌｉｇｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ”， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｊ． ２９４： ４５１−４５７ （１９９３））から単離されて来た。
【００３２】
この酵素のための遺伝子は、クローン化され、そしてＤＮＡ配列はヒト脳（Ｄｏｖｅｙなど．， ＷＯ９２／０７０６８号）、ラット精巣（Ｐｉｅｒｏｔｔｉなど．， “Ｅｎｄｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ−２４．１５ ｉｎ ｒａｔ ｈｙｐｏｔｈａｌａｍｉｃ／ｐｉｔｕｉｔａｒｙ／ｇｏｎａｄａｌ ａｘｉｓ”， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ． ７６： ９５−１０３ （１９９１））、及びブタ肝臓（Ｋａｔｏなど．， “Ｃｌｏｎｉｎｇ， ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ ｔｉｓｓｕｅ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｏｆ ｐｏｒｃｉｎｅ ｔｈｉｍｅｔ ｏｌｉｇｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ． Ａ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｗｉｔｈ ｓｏｌｕｂｌｅ ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ”， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２２１： １５９−１６５ （１９９４））から得られた。
【００３３】
ＴＯＰは、ＨｅＬａ（Ｋｒａｕｓｅなど．， “Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ａｌｉｇｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ （Ｍｏｐ） （ＥＣ ３． ４． ２４． １６） ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｃｅｒｖｉｃａｌ ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ Ｈｅｌａ”， Ｊ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ６６： ２９７−３０８ （１９９７））； ＡＴ−２０細胞（Ｃｒａｃｋなど．， “Ｔｈｅ ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｅｔａｌｌｏｅｎｄｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ ＥＣ ３． ４． ２４． １５ ａｔ ｔｈｅ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｒａｒ ｓｕｒｆｅｃｅ ｏｆ ｔｈｅ ＡｔＴ−２０ Ｃｅｌｌ ｐｌａｓｍａ ｍｅｍｂｒａｎｅ”， Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ． ８３５： １１３−１２４ （１９９９）； Ｆｅｒｒｏなど．， “Ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ｏｆ ｍｅｔａｌｌｏｅｎｄｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ ２４． １５ （ＥＣ ３． ４． ２４． １５）”， ＤＮＡ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． １８： ７８１−７８９ （１９９９）；
【００３４】
Ｇａｒｒｉｄｏなど．， “Ｃｏｎｆｏｃａｌ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ ｒｅｖｅａｌｓ ｔｈｉｍｅｔ ｏｌｉｇｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ （ＥＣ ３． ４． ２４． １５） ａｎｄ ｎｅｕｒｏｌｙｓｉｎ （ＥＣ ３． ４． ２４． １６） ｉｎ ｔｈｅ ｃｌａｓｓｉｃａｌ ｓｅｃｒｅｔｏｒｙ ｐａｔｈｗａｙ”， ＤＮＡ Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． １８： ３２３−３３１ （１９９９））； Ｍａｄｉｎ−Ｄａｒｂｙイヌ腎臓細胞（Ｏｌｉｖｅｉｒａなど．， “Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｉｏｌ−， ａｓｐａｒｔｙｌ−， ａｎｄ ｔｈｉｏｌ−ｍｅｔａｌｌ−ｐｅｐｔｉｄａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｉｎ ｍａｄｉｎ−ｄａｒｂｙ ｃａｎｉｎｅ ｋｉｄｎｅｙ ｃｅｌｌｓ”， Ｊ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ７６： ４７８−４８８ （２０００））； 及び前立腺癌細胞系（など．， “Ｎｅｕｒｏｔｅｎｓｉｎ ｉｓ ｍｅｔａｂｏｌｉｚｅｄ ｂｙ ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ｐｒｏｔｅａｓｅｓ ｉｎ ｐｒｏｓｔａｔｅ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ”， Ｐｅｐｔｉｄｅｓ １９： ２５３−２５８ （１９９８））の抽出物において免疫学的に又は官能的に同定されている。
【００３５】
ＨｅＬａ細胞から精製されたトロウアーゼは、例１２において見られるように、既知のヒト酵素配列の十分な長さに対して分配されるすべての残基の３３％を満たすトリプシンフラグメントの質量：電荷比に基づいて、ヒトＴＯＰとの配列同一性を示す。部分的に精製されたＨｅＬａ細胞画分（Ｆ１）及びＭＣＦ−７／６細胞均質物と共に特定の抗−ＴＯＰ抗体調製物を用いての免疫沈殿はまた、例１３に見られるように、構造的同一性を示す。ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動による７４ＫＤの精製されたＨｅＬａ細胞トロウアーゼのサイズは、ＴＯＰについて報告される範囲内である。
【００３６】
ＨｅＬａ細胞から同時精製するマイナーな６３ＫＤバンドは、これまで報告されたことはなく、そして抽出の間に形成されるＴＯＰのタンパク質加水分解生成物であり得る。例９に見られるように、生来のＨｅＬａ細胞トロウアーゼのゲル濾過評価されたサイズは、７８ＫＤの報告されるＴＯＰサイズよりもむしろ６８ＫＤであるが、しかしながら、その差異はそのような生来のタンパク質サイズ評価方法の固有の誤差により説明され得る。精製された癌細胞トロウアーゼの等電点は、ＴＯＰについて報告される範囲内にある、例９に見られる５．２である。
【００３７】
ＴＯＰ及びヒト癌細胞トロウアーゼは、例６に見られるように、９種の異なった実験化合物と同じ基質特異性を示す。この特異性は、Ｓｕｃ−βＡｌａ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘの分解よりも約１２倍早い速度でＳｕｃ−βＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘを分解する能力を包含する。前記癌細胞トロウアーゼはまた、ＴＯＰと実質的に同じｐＨ最適性（例１１を参照のこと）及びインヒビタープロフィール（例８を参照のこと）を有する。
【００３８】
ＴＯＰに関しては（Ｂａｒｒｅｔｔなど．， “Ｃｈｉｃｋｅｎ ｌｉｖｅｒ ＰＺ−ｐｅｐｔｉｄａｓｅ， ａ ｔｈｉｏｌ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｍｅｔａｌｌ−ｅｎｄｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ”， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｊ． ２７１： ７０１−７０６ （１９９７））、癌細胞トロウアーゼは、メタロペプチダーゼインヒビターＥＤＴＡ及び１，１０−フェナントロリンにより阻害されるが、しかしセリン、チオール、又は酸プロテイナーゼインヒビター、例えばアミノエチルベンゼン−スルホネート、Ｅ６４、ペプスタチン、ロイペプチン、アプロチニン、ＣＡ０７４又はフマギリンによっては阻害されない。ＴＯＰについて報告されるように、ＥＤＴＡ処理された癌細胞トロウアーゼは、Ｃｏ２＋（５０〜１００μＭ）又はＭｎ２＋（５０〜１００μＭ）により再活性化される。
【００３９】
ＥＤＴＡ−不活性化された鶏（Ｂａｒｒｅｔｔなど．， “Ｃｈｉｃｋｅｎ ｌｉｖｅｒ ＰＺ−ｐｅｐｔｉｄａｓｅ， ａ ｔｈｉｏｌ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｍｅｔａｌｌｏ−ｅｎｄｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ”， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｊ． ２７１： ７０１−７０６ （１９９０））、又はラット（Ｏｒｌｏｗｓｋｉなど．， “Ｅｎｄｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ ２４． １５ ｆｒｏｍ ｒａｔ ｔｅｓｔｅｓ． Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｅｎｚｙｍｅ ａｎｄ ｉｔｓ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｔｏｗａｒｄ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ａｎｄ ｎａｔｕｒａｌ ｐｅｐｔｉｄｅｓ， ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ｅｎｋｅｐｈａｌｉｎ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｐｅｐｔｉｄｅｓ”， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｊ． ２６１： ９５１−９５８（１９８９））を再活性化することもまた可能である。
【００４０】
ＴＯＰはまた、Ｚｎ２＋により再活性化されるが、しかしながら、Ｚｎ２＋再活性化は、ＥＤＴＡ−処理されたＭＣＦ−７／６細胞均質物に関してはみられない。ＥＤＴＡ処理及び除去のために使用される特定の方法は、癌細胞トロウアーゼによる結果に影響を及ぼすことができる。１００μＭほどの低い濃度のＺｎ２＋がＴＯＰに対して阻害性である事実はまた、１つの要因でもあり得る。１００μＭでのＺｎ２＋は、Ｓｕｃ−βＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−ＤｏｘのＨｅｌａ細胞画分１による加水分解を完全に阻害する。ＥＤＴＡにより不活性化された癌細胞トロウアーゼは、第二銅イオンにより再活性化され得ない。最終的に、ヒト培養された細胞トロウアーゼは、例１０に見られるように、ＴＯＰメタロエンドペプチダーゼのユニークチオール感受性を示す。
【００４１】
ＴＯＰ活性は、空気−不活性化された調製物のチオール活性化により示されるように、酵素添加された溶液（例えば、血液）において阻害され、そして軽い還元（低酸素性）環境において活性化され得る（Ｓｈｒｉｍｐｔｏｎなど．， “Ｔｈｉｏｌａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｅｎｄｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ ＥＣ ３． ４． ２４． １５． Ａ ｎｏｖｅｌ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｆｏｒ ｔｈｅ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｃａｔａｌｙｔｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ”， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７２： １７３９５−１７３９９ （１９９７））。従って、それは、低酸素性環境、例えば腫瘍組織において活性化されるプロドラッグを企画する一般的なアプローチのための有用な酵素である。
【００４２】
ＣＤ１０（ＣＡＬＬＡ、ネプリリシン、中性エンドペプチダーゼ、ＥＣ ３． ４． ２４． １１）は、限定された数の癌腫瘍タイプを包含する多くの細胞の外側の細胞膜に結合されるオリゴペプチダーゼである。それはまた、近位腎臓細管の刷子縁において高濃度で、及び結腸組織及び多数の免疫系細胞、例えばＢ−リンパ球において低レベルで存在するので、それはペプチジルプロドラッグの全身性活性化に寄与することができる。この付与された全身性活性化は、ＣＤ１０基質でないペプチジルプロドラッグに比較される場合、正常組織に高められた毒素を導くことができた。Ｓｕ−βＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘは、ＣＤ１０のための基質であり、そして例１７に示されるように、分解はＡｌａとＬｅｕ（ＡＡ２とＡＡ１）との間で生じる。
【００４３】
ＣＤ１０は、グリシン又はアラニンがＰ１’分解部位に存在する場合、不十分に分解し（Ｐｏｚｇａｙなど．， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ （１９８６））［基質特異性下でのＣＤ１０特許を参照のこと］、従って、Ｓｕｃ−βＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｄｏｘ及びβＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ａｌａ−ＤｏｘはＣＤ１０により不十分に分解されることが予測される。他方では、下記に示されるように、Ｓｕｃ−βＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｄｏｘ及びたぶん、Ｓｕｃ−βＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｄｏｘは、ＴＯＰにより十分に分解された。従って、本発明の好ましい態様は、Ｓｕｃ−βＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｄｏｘ又はＳｕｃ−βＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｄｏｘにより例示されるように、ＣＤ１０によってではなく、ＴＯＰにより活性化される化合物である。
理想的には、非ＣＤ１０含有腫瘍を処理する場合、プロドラッグはＣＤ１０酵素により分解できない。
【００４４】
安定化基：
プロドラッグの重要な部分は、プロドラグが患者に投与される場合、循還血液におけるプロドラッグ化合物の分解を保護するよう作用し、そして比較的損なわれていない標的細胞の付近へのプロドラッグの到達を可能にする安定化基である。安定化基は典型的には、血液、血清及び正常組織に存在するプロテイナーゼ及びペプチダーゼによるプロドラッグの分解を保護する。特に、安定化基はオリゴペプチドのＮ−末端をキャップし、そして従って、時々、Ｎ−キャップ又はＮ−ブロックとして言及されるので、それは、他方では、プロドラッグが敏感であるペプチダーゼに対して保護するよう作用する。
【００４５】
理想的には、安定化基は、それが、ヒト血液において３７℃で２時間のプロドラッグ化合物の貯蔵により試験される場合、変性、すなわち分解からプロドラッグを保護するよう作用し、そして所定のアッセイ条件下で、ヒト血液に存在する酵素によるプロドラッグの分解を、２０％以下、好ましくは２％以下もたらす場合、本発明のプロドラッグにおいて有用である。
【００４６】
より特定には、安定化基は、
（１）アミノ酸以外であるか、又は
（２）（ｉ）４又はそれ以上の炭素原子を有する非遺伝的にコードされるアミノ酸であるか、又は（ｉｉ）アスパラギン酸のβ−カルボキシル基又はグルタミン酸のγ−カルボキシル基で、オリゴペプチドのＮ−末端に結合されるアスパラギン酸又はグルタミン酸であるアミノ酸である。
【００４７】
例えば、ジカルボン酸（又は高級カルボン酸）又は医薬的に許容できるその塩が、安定化基として使用され得る。複数のカルボン酸を有する化学基はまだ、安定化基として使用され得る。複数のカルボン酸を有する化学基がまた、プロドラッグの一部として許容されるので、ジカルボン酸（又は高級カルボン酸）を有する末端基は、典型的なＮ−キャップである。従って、Ｎ−キャップは、アミドがペプチドのアミノ末端に結合され、そして残るカルボン酸が遊離し、そして結合されていない、複数のカルボン酸を有する化学基のモノアミド誘導体であり得る。このためには、Ｎ−キャップは好ましくは、琥珀酸、アジピン酸、グルタミン酸又はフタル酸であり、そして琥珀酸が最も好ましい。
【００４８】
本発明のプロドラッグ化合物において有用なＮ−キャップの他の例は、ジグリコール酸、フマル酸、ナフタレンジカルボン酸、ピログルタミン酸、酢酸、１−又は２−ナフチルカルボン酸、１，８−ナフチルジカルボン酸、アコニット酸、カルボキシ桂皮酸、トリアゾールジカルボン酸、グルコン酸、４−カルボキシフェニルホウ素酸、（ＰＥＧ）ｎ−類似体、例えばポリエチレングルコール酸、ブタンジスルホン酸、マレイン酸、イソニペコチン酸及びニペコチン酸を包含する。
【００４９】
さらに、マウスにおける凝集する正に荷電されたプロドラッグの静脈内投与は、急性毒性をもたらした。しかしながら、そのような毒性は、このプロドラッグ上の荷電が、負に荷電された安定化基による誘導体化により逆転される場合、観察されなかった。この効果は、下記でより詳細に論じられる。
従って、治療剤の凝集が関係する場合、結合された安定化基に負に荷電されるか、又は中性である。
【００５０】
急性毒性：
多くの細胞毒性化合物は本来、低い溶解性を有する。例えば、正に荷電されたアントラサイクリンは、高濃度で凝集体を形成し、そしてそれらの凝集体は、静脈内投与される場合、静脈内凝固を誘発する。トロウアーゼは、ペプチド配列の特異的部位を認識する。それらの疎水性配列の１つ（例えば、βＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ）が細胞毒性化合物（例えば、ドキソルビシン）に接合される場合、それは、濃縮されたボーラスとして静脈内注射される場合、大きな凝集体を形成することができる低可溶性化合物をもたらす。
【００５１】
ほとんどのペプチドは生理学的ｐＨで、暴露される正に荷電されたアミノ末端を有するので、それらの凝集体はインビボで、多陽性的に荷電された表面を形成できる。静脈内に与えられるそれらの凝集体は、投与の数分（通常、３０分以下）以内で、マウスにおいて凝固カスケード及び死を誘発する。これは、懸濁液での凝集体を生成する手段で配合されるいずれかの正に荷電されたプロドラッグを、治療使用のために不適切にする。
【００５２】
いくつかの実験は、正に荷電された凝集体がペプチド接合されたドキソルビシンにより形成される仮説を支持する。レーザー光散乱及びサイズ排除限外濾過による、類似して配列された溶液の試験は、少量の材料のみが１０ｋＤ以下の分子量を有することを示した。凝集体の平均分子サイズは、約７０ｋＤであることが見出された。動物がＩＶ用量で付随してヘパリンを投与される場合（例２２を参照のこと）、急性毒性は非常に低められるか又は排除された。動物が同じ薬剤（同じ合計用量）の希釈溶液を与えられる場合、急性毒性は存在しなかった。それらの結果は、文献の報告と一緒に考慮すると、不十分な溶解性のために、凝集体を形成する化合物のペプチドプロドラッグが最適な治療を行わない結論を支持する。
【００５３】
この問題の凝集体の溶液は、それらのペプチドプロドラッグをより実際的にする。それらのペプチドプロドラッグが、所望する配合される濃度での不十分な溶解性のために凝集体を形成する場合、ペプチド鎖上の安定化基は、負に荷電されるか、又は中性の官能性で終結すべきである。例えば、ペプチドプロドラッグ上の安定化基としてのスクシニルの使用は、プロドラッグの急性毒性を緩和する（例２２を参照のこと）。これは、ヒトのための実験的な治療としてのペプチドプロドラッグの使用における重要な問題を解決する。
【００５４】
オリゴペプチド：
オリゴペプチドは一般的に、短い長さの、典型的には１２個の又はそれよりも少ないアミノ酸のポリペプチドとして定義される。しかしながら、本発明のプロドラッグにおいて有用なオリゴペプチドは、少なくとも４個の長さのアミノ酸である。上限端で、１２個以下又は１２個のアミノ酸のオリゴペプチドが最も有用であるが、但し、オリゴペプチドは１２個よりも長い長さのアミノ酸の鎖長を有し、そして科学分野において一般的に認識されるような用語の定義及びさらに、本発明の範囲内にある。従って、本発明のプロドラッグのオリゴペプチド部分は、４個又はそれよりも多くのアミノ酸を有する。典型的には、本発明のプロドラッグのオリゴペプチド部分は、４〜１２個のアミノ酸を有する。好ましくは、それは４又は５個のアミノ酸を有する。
【００５５】
番号付けスキーム：
前記オリゴペプチドは、式 又は配列（ＡＡ）ｎ−ＡＡ４−ＡＡ３−ＡＡ２−ＡＡ１：
［式中、個々のＡＡは独立して、アミノ酸を表し、
ｎは、０〜１６の整数であり、
ＡＡ４は、遺伝的にコードされないアミノ酸を表し、
ＡＡ３は、いずれかのアミノ酸を表し、
ＡＡ２は、いずれかのアミノ酸を表し、そして
ＡＡ１は、いずれかのアミノ酸を表す］を有する。
これは、位置配列Ｐ（ｎ＋２）…Ｐ２−Ｐ１−Ｐ１’−Ｐ２’に対応する。ＴＯＰは、Ｐ１とＰ１’位置間を分解すると思われる。オリゴペプチドは、右側でカルボキシル末端（又はＣ末端）及び左側でアミノ末端（又はＮ末端）を伴なって、従来の態様で書かれる。従って、上記式においては、ＡＡ１はカルボキシル末端である。
【００５６】
好ましいアミノ酸：
特にことわらない限り、すべてのアミノ酸は、Ｌ配置で存在する。下記でさらに詳細に記載されるように阻止機能を供給する。非遺伝的にコードされるアミノ酸であるＡＡ４を除いて、いずれのアミノ酸でも、プロドラッグのオリゴペプチド部分に存在することができるが、一定のアミノ酸が好ましい。
【００５７】
Ｐ２位置、すなわちＡＡ４においては、次のアミノ酸の１つが最も好ましくは、存在する：β−アラニン、チアゾリジン−４−カルボン酸、２−チエニルアラニン、２−ナフチルアラニン、Ｄ−アラニン、Ｄ−ロイシン、Ｄ−メチオニン、Ｄ−フェニルアラニン、３−アミノ−３−フェニルプロピオン酸、γ−アミノ酪酸及び３−アミノ−４，４−ジフェニル酪酸。テトラヒドロイソキノリン−３−カルボン酸、４−アミノメチル安息香酸、ニペコチン酸、イソニペコチン酸又はアミノイソ酪酸がまた、Ｐ２位置において好ましい。
【００５８】
Ｐ１又はＡＡ３位置においては、次のアミノ酸の１つが最も好ましい：ロイシン、チロシン、フェニルアラニン、ｐ−Ｃ１−フェニルアラニン、ｐ−ニトロフェニルアラニン、バリン、ノルロイシン、ノルバリン、フェニルグリシン、トリプトファン、テトラヒドロイソキノリン−３−カルボン酸、３−ピリジルアラニン、アラニン、グリシン又はチエニルアラニン。Ｐ１位置においては、メチオニン、バリン又はプロリンがまた好ましい。
【００５９】
Ｐ１’位置においては、ＡＡ２は、最も好ましくは次のアミノ酸から選択される：アラニン、ロイシン、チロシン、グリシン、セリン、３−ピリジルアラニン、２−チエニルアラニン、ノルロイシン、ホモセリン、ホモフェニルアラニン、ｐ−Ｃ１−フェニルアラニン又はｐ−ニトロフェニルアラニン。この位置においては、アミノイソ酪酸、トレオニン及びフェニルアラニンがまた好ましい。
【００６０】
Ｐ２又はＡＡ１位置においては、次のアミノ酸の１つが最も好ましくは存在する：ロイシン、フェニルアラニン、イソロイシン、アラニン、グリシン、チロシン、２−ナフチルアラニン、セリン、ｐ−Ｃ１−フェニルアラニン、ｐ−ニトロフェニルアラニン、１−ナフチルアラニン、トレオニン、ホモセリン、シクロヘキシルアラニン、チエニルアラニン、ホモフェニルアラニン又はノルロイシン。Ｐ２’位置におけるβ−アラニンがまた好ましい。
【００６１】
本発明のプロドラッグにおいて特に有用なオリゴペプチドは、図１０Ａ−１０Ｄに示されるそれら、特に次のものの１つを包含する：Ｄ−ＡｌａＴｈｉβＡｌａβＡｌａＬｅｕＡｌａＬｅｕ（配列番号１）、ＴｈｉβＡｌａβＡｌａＬｅｕＡｌａＬｅｕ（配列番号２）、βＡｌａβＡｌａＬｅｕＡｌａＬｅｕ（配列番号３）βＡｌａＡｌａＡｌａＩｌｅ（配列番号４）、βＡｌａＡｌａＡｌａＬｅｕ（配列番号５）、βＡｌａＰｈｅＴｙｒＬｅｕ（配列番号６）、βＡｌａＰｈｅＴｈｒＰｈｅ（配列番号７）、βＡｌａＰｈｅＧｌｙＩｌｅ（配列番号８）、βＡｌａＰｈｅＧｌｙＬｅｕ（配列番号９）、βＡｌａＰｈｅＰｈｅＰｈｅ（配列番号１０）、βＡｌａＰｈｅＰｈｅＩｌｅ（配列番号１１）、βＡｌａＰｈｅＰｈｅＬｅｕ（配列番号１２）、βＡｌａＰｈｅＡｌａＩｌｅ（配列番号１３）、βＡｌａＰｈｅＡｌａＬｅｕ（配列番号１４）、ＴｈｉＧｌｙＡｌａＬｅｕ（配列番号１５）、ＮａｌＧｌｙＡｌａＬｅｕ（配列番号１６）、βＡｌａＬｅｕＴｙｒＬｅｕ（配列番号１７）、βＡｌａＬｅｕＴｈｉＬｅｕ（配列番号１８）、βＡｌａＬｅｕＴｈｒＰｈｅ（配列番号１９）、βＡｌａＬｅｕＴｈｒＩｌｅ（配列番号２０）、
【００６２】
βＡｌａＬｅｕＴｈｒＬｅｕ（配列番号２１）、βＡｌａＬｅｕＳｅｒＬｅｕ（配列番号２２）、βＡｌａＬｅｕＰｙｒＬｅｕ（配列番号２３）、βＡｌａＬｅｕＬｅｕＬｅｕ（配列番号２４）、βＡｌａＬｅｕＧｌｙＰｈｅ（配列番号２５）、βＡｌａＬｅｕＧｌｙＩｌｅ（配列番号２６）、ＴｈｉＬｅｕＧｌｙＬｅｕ（配列番号２７）、βＡｌａＬｅｕＧｌｙＬｅｕ（配列番号２８）、ＡｉｂＬｅｕＧｌｙＬｅｕ（配列番号２９）、βＡｌａＬｅｕＰｈｅＩｌｅ（配列番号３０）、βＡｌａＬｅｕＰｈｅＬｅｕ（配列番号３１）、βＡｌａＬｅｕＡｉｂＬｅｕ（配列番号３２）、βＡｌａＬｅｕＡｌａＡｌａ（配列番号３３）、βＡｌａＬｅｕＡｌａβＡｌａ（配列番号３４）、βＡｌａＬｅｕＡｌａＰｈｅ（配列番号３５）、βＡｌａＬｅｕＡｌａＧｌｙ（配列番号３６）、βＡｌａＬｅｕＡｌａＩｌｅ（配列番号３７）、βＡｌａＬｅｕＡｌａＬｅｕ（配列番号３８）、ＴｉｃＬｅｕＡｌａＬｅｕ（配列番号３９）、ＴｈｚＬｅｕＡｌａＬｅｕ（配列番号４０）、
【００６３】
ＴｈｉＬｅｕＡｌａＬｅｕ（配列番号４１）、ＮａｌＬｅｕＡｌａＬｅｕ（配列番号４２）、ＮＡＡＬｅｕＡｌａＬｅｕ（配列番号４３）、Ｄ−ＬｅｕＬｅｕＡｌａＬｅｕ（配列番号４４）、Ｄ−ＡｌａＬｅｕＡｌａＬｅｕ（配列番号４５）、Ｄ−ＭｅｔＬｅｕＡｌａＬｅｕ（配列番号４６）、ＡＰＰＬｅｕＡｌａＬｅｕ（配列番号４７）、ＡｍｂＬｅｕＡｌａＬｅｕ（配列番号４８）、βＡｌａＬｅｕＡｌａＮａｌ（配列番号４９）、βＡｌａＬｅｕＡｌａＳｅｒ（配列番号５０）、βＡｌａＬｅｕＡｌａＴｙｒ（配列番号５１）、βＡｌａＭｅｔＴｙｒＰｈｅ（配列番号５２）、βＡｌａＭｅｔＴｙｒＬｅｕ（配列番号５３）、βＡｌａＭｅｔＧｌｙＩｌｅ（配列番号５４）、ＴｈｉＭｅｔＧｌｙＬｅｕ（配列番号５５）、βＡｌａＭｅｔＰｈｅＰｈｅ（配列番号５６）、βＡｌａＭｅｔＰｈｅＩｌｅ（配列番号５７）、ＴｉｃＭｅｔＡｌａＬｅｕ（配列番号５８）、ＮａｌＭｅｔＡｌａＬｅｕ（配列番号５９）、ＮＡＡＭｅｔＡｌａＬｅｕ（配列番号６０）、
【００６４】
βＡｌａＭｅｔＡｌａＬｅｕ（配列番号６１）、ＡＰＰＭｅｔＡｌａＬｅｕ（配列番号６２）、βＡｌａＮｌｅＴｙｒＩｌｅ（配列番号６３）、βＡｌａＮｌｅＴｙｒＬｅｕ（配列番号６４）、βＡｌａＮｌｅＴｈｒＩｌｅ（配列番号６５）、βＡｌａＮｌｅＴｈｒＬｅｕ（配列番号６６）、βＡｌａＮｌｅＧｌｙＰｈｅ（配列番号６７）、βＡｌａＮｌｅＧｌｙＩｌｅ（配列番号６８）、βＡｌａＮｌｅＧｌｙＬｅｕ（配列番号６９）、βＡｌａＮｌｅＰｈｅＩｌｅ（配列番号７０）、βＡｌａＮｌｅＡｌａＩｌｅ（配列番号７１）、βＡｌａＮｌｅＡｌａＬｅｕ（配列番号７２）、βＡｌａＮｌｅＡｌａＰｈｅ（配列番号７３）、βＡｌａＮｖａＡｌａＬｅｕ（配列番号７４）、βＡｌａＰｈｅＴｙｒＩｌｅ（配列番号７５）、ＴｈｉＰｒｏＧｌｙＬｅｕ（配列番号７６）、ＴｈｉＰｒｏＡｌａＬｅｕ（配列番号７７）、ＮａｌＰｒｏＡｌａＬｅｕ（配列番号７８）、βＡｌａＰｒｏＡｌａＬｅｕ（配列番号７９）、βＡｌａＰｈｅ（Ｃｌ），ＡｌａＬｅｕ（配列番号８０）、
【００６５】
βＡｌａＰｈｅ（ＮＯ２），ＡｌａＩｌｅ（配列番号８１）、βＡｌａＰｈｅ（ＮＯ２），ＡｌａＬｅｕ（配列番号８２）、βＡｌａＰｈｇＡｌａＬｅｕ（配列番号８３）、βＡｌａＰｙｒＡｌａＬｅｕ（配列番号８４）、ＴｉｃＴｈｒＧｌｙＬｅｕ（配列番号８５）、βＡｌａＴｈｉＧｌｙＩｌｅ（配列番号８６）、βＡｌａＴｈｉＡｌａＬｅｕ（配列番号８７）、βＡｌａＴｉｃＡｌａＩｌｅ（配列番号８８）、βＡｌａＴｉｃＡｌａＬｅｕ（配列番号８９）、βＡｌａＶａｌＡｌａＬｅｕ（配列番号９０）、βＡｌａＴｒｐＡｌａＬｅｕ（配列番号９１）、βＡｌａＴｙｒＴｙｒＰｈｅ（配列番号９２）、βＡｌａＴｙｒＴｙｒＩｌｅ（配列番号９３）、βＡｌａＴｙｒＴｙｒＬｅｕ（配列番号９４）、βＡｌａＴｙｒＴｈｒＬｅｕ（配列番号９５）、βＡｌａＴｙｒＰｈｅＬｅｕ（配列番号９６）、βＡｌａＴｙｒＧｌｙＩｌｅ（配列番号９７）、ＴｈｉＴｙｒＧｌｙＬｅｕ（配列番号９８）、βＡｌａＴｙｒＧｌｙＬｅｕ（配列番号９９）、βＡｌａＴｙｒＰｈｅＩｌｅ（配列番号１００）、βＡｌａＴｙｒＡｌａＩｌｅ（配列番号１０１）、ＴｈｉＴｙｒＡｌａＬｅｕ（配列番号１０２）、及びβＡｌａＴｙｒＡｌａＬｅｕ（配列番号１０３）。
【００６６】
阻止アミノ酸：
プロドラッグのオリゴペプチドは、上記番号付けスキームによれば、オリゴペプチド配列のＡＡ４として、すなわち位置配列の位置Ｐ２で阻止アミノ酸を包含する。その阻止アミノ酸は、遺伝的にコードされないアミノ酸である。
【００６７】
位置Ｐ２での阻止アミノ酸の機能は、ＴＯＰによるプロドラッグの分解のための選択性を維持し、そしてプロドラッグ化合物の治療剤部分に最も接近して連結される（直接的に又は間接的に連結される）オリゴペプチドのその部分における他の酵素によるオリゴペプチドの分解を阻害するか、又は前記酵素のための分解部位の提供を回避することである。より特定には、位置Ｐ２で阻止アミノ酸を配置することによって、オリゴペプチド配列ＡＡ４−ＡＡ３−ＡＡ２−ＡＡ１及び位置配列Ｐ２−Ｐ１−Ｐ１’−Ｐ２’の４個のアミノ酸のペプチド連鎖内の所望しない分解が減じられる。トロウアーゼはオリゴペプチドのＰ１位置とＰ１’位置との間を分解すると思われる。
【００６８】
血液及び正常細胞は種々のペプチダーゼに関連しているので、プロドラッグが標的細胞に接近して存在するまで、位置Ｐ２での阻止アミノ酸の配置は、プロドラッグのオリゴペプチド部分を保護するよう作用する。特に、位置Ｐ２に阻止アミノ酸を配置することによって、オリゴペプチドは、Ｐ２とＰ１との間の所望しない分解から保護される。その阻止アミノ酸が存在しない場合、プロドラッグは、血液及び正常組織に存在するエキソペプチダーゼ及びエンドペプチダーゼの両者に対して攻撃されやすく、ここで前記種類の酵素は、他方では、プロドラッグがその標的物に達する前、そのプロドラッグを分解する。下記例１４は、プロドラッグのこの重要な特徴を示す。
【００６９】
ＴＯＰによるスクリーニング：
ＴＯＰは、さらなる使用のためのオリゴペプチドを選択するために使用され得る重要な酵素であり、そして従って、本発明のもう１つの観点は、
式 （ＡＡ）ｎ−ＡＡ４−ＡＡ３−ＡＡ２−ＡＡ１：
［式中、個々のＡＡは独立して、アミノ酸を表し、
ｎは、０〜１６の整数であり、
ＡＡ４は、遺伝的にコードされないアミノ酸を表し、
ＡＡ３は、いずれかのアミノ酸を表し、
ＡＡ２は、いずれかのアミノ酸を表し、そして
ＡＡ１は、いずれかのアミノ酸を表す］で表されるで表される、ＴＯＰにより分解できるオリゴペプチドである。
前記オリゴペプチドは、ＴＯＰによる分解性について試験する場合、治療剤及び／又は安定化基に結合され得る。
【００７０】
治療剤：
本発明に従ってプロドラッグに変性するために特に好都合である治療剤は、狭い治療窓を有するそれらの剤である。狭い治療窓を有する薬剤又は治療剤は、その毒性が一般的な医学的基準により明らかである用量が、効能が明らかである用量に非常に接近するものである。
本発明のプロドラッグを形成するために、安定化基及びオリゴペプチド、及び任意には、リンカー基に接合される治療剤は、癌、炎症性疾患、又はいくつかの他の医学的状態の処理のために有用であり得る。好ましくは、治療剤は、次の種類の成分から選択される：
【００７１】
アルキル化剤、抗増殖剤、チューブリン結合剤、ビンカアルカロイド、エネジイン、ポドフィロトキシン又はポドフィロトキシン誘導体、プテリジン種類の薬物、タキサン、アントラサイクリン、ドラスタチン、トポイソメラーゼインヒビター、及び白金錯体化学療法剤。
【００７２】
特に、治療剤は、好都合には、次の化合物又はその誘導体又は類似体から選択される：ドキソルビシン、ダウノルビシン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、カリケアミシン、エトポシド、エトポシドホスフェート、ＣＣ−１０６５、ズオカルマイシン、ＫＷ−２１８９、メトトレキセート、メトプテリン、アミノプテリン、ジクロロメトトレキセート、ドセタキセル、パクリタキセル、エピチオロン、コンブレタスタチン、コンブレタスタチンＡ４ホスフェート、ドラスタチン１０、ドラスタチン１１、ドラスタチン１５、トポテカン、カンフォテシン、マイトマイシンＣ、ポルフィロマイシン、５−フルオロウラシル、６−メルカプトプリン、フルダラビン、タモキシフェン、シトシンアラビノシド、アデノシンアラビノシド、コルヒチン、シスプラチン、カルボプラチン、マイトマイシンＣ、ブレオマイシン、メルファラン、クロロキン、シクロポリンＡ、クロロキン、メイタンシン又はシスプラチン。
【００７３】
誘導体とは、命名された化合物ともう１つの化学的成分との反応に起因し、そして前記命名された化合物の医薬的に許容できる塩、酸、塩基又はエステルを包含する化合物を意味する。類似体とは、前記命名された化合物に類似する構造及び機能性質、例えば生物学的活性を有する化合物を意味する。
【００７４】
リンカー基：
オリゴペプチドと治療剤との間のリンカー基は、例えば次のような理由のために好都合であり得る：
１．ＡＡ１アミノ酸の酵素的開放又は他の酵素的活性化段階を促進するために立体的な考慮のためのスペーサーとして；
２．治療剤とオリゴペプチドとの間に適切な結合化学を提供するために；
３．プロドラッグ接合体を製造する合成方法を改良するために（例えば、収率又は特異性を増強するために、接合の前、リンカー基により治療剤又はオリゴペプチドを予備誘導体化することによって）；
【００７５】
４．プロドラッグの物性を改良するために；
５．薬剤の細胞内開放のための追加の機構を提供するために。
リンカー構造は、必要とされる官能性により指図される。可能性あるリンカー化学の例は、ヒドラジド、エステル、エーテル及びスルフヒドリルである。アミノカプロン酸は、二官能価リンカー基の例である。アミノカプロン酸がリンカー基に使用される場合、それは、オリゴペプチドの番号付けスキームにおいてアミノ酸として数えられない。
【００７６】
任意に存在するリンカー基は、ＴＯＰにより分解できず、すなわちそれは、生理学的条件下でＴＯＰにより分解できない。
特に有用な態様は、トロウアーゼにより分解できるが、しかしＣＤ１０又は他の全身性又は血液酵素による分解に対して耐性である化合物である。
【００７７】
プロドラッグの企画：
プロドラッグの企画方法は、本発明のもう１つの観点であり、そして上記に記載されるように、最初に、オリゴペプチドの同定を必要とする。次に、オリゴペプチドが、そのオリゴペプチドの第１の結合部位で、安全な血液に存在する酵素によるオリゴペプチド分解を妨げる安定化基に結合され、そしてオリゴペプチドの第２の結合部位で治療剤に直接的に又は間接的に結合される。治療剤及び安定化基へのオリゴペプチドの結合は、いずれの順序でも又は同時にでも行われ得る。その得られる接合体は、ＴＯＰによる分解性について試験される。得られる接合体はまた、完全な血液における安定性について試験され得る。完全な血液において安定する試験化合物が選択される。
【００７８】
第１の結合部位は通常、オリゴペプチドのＮ末端であるが、しかしオリゴペプチドのＣ末端、又はオリゴペプチドのもう１つの部分でもあり得る。第２の結合部位は通常、オリゴペプチドのＣ末端であるが、しかしオリゴペプチドのＮ末端又はオリゴペプチドのもう１つの部分でもあり得る。そのような方法により企画されるプロドラッグはまた、本発明の一部である。
【００７９】
さらに、本発明は、患者への投与のために意図される治療剤の毒性を低めるための方法を包含する。特に、治療剤の変性されたプロドラッグ形は、トロウアーゼにより分解できるか、又はより特定には、ＴＯＰにより分解できるオリゴペプチドに治療剤を直接的に又は間接的に結合することによって形成される。オリゴペプチドはまた、安定化基にも結合される。このようにして形成されるプロドラッグは、患者に投与される場合、治療剤の低められた毒性を提供する。この態様での治療剤の変性はまた、接合されていない形での治療剤の用量に対して、患者への治療剤の高められた用量の投与を可能にする。
【００８０】
医薬組成物：
本発明はまた、本発明の化合物、特にプロドラッグ化合物、及び任意には、医薬的に許容できるキャリヤー、例えば、アジュバント又はビークル、又は同様のものを含んで成る医薬組成物を包含する。
本発明はまた、医薬的状態の処理のために指図される医薬製品の調製のためへの前記医薬組成物の使用にも関する。
【００８１】
例えば、医薬組成物は、患者に非経口、特に静脈内、筋肉内又は腹腔内投与され得る。非経口投与のための本発明の医薬組成物は、無菌の水性又は非水性溶液、懸濁液又はエマルジョンを包含する。医薬的に許容できる溶媒又はビールとして、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、注射できる有機エステル、例えばエチルオレエート、又はシクロデキストリンが使用され得る。等張塩溶液は、医薬組成物の一部であり得る。それらの組成物はまた、湿潤剤、乳化剤及び／又は分散剤を含むことができる。
【００８２】
殺菌は、いくつかの手段で、例えば細菌学的フィルターを用いて、組成物に殺菌剤を導入することにより、又は照射により行われ得る。それらはまた、無菌水又はいずれか他の無菌の注射用媒体への使用の時点で溶解され得る無菌の固体組成物の形で調製され得る。
医薬組成物はまた、当業界において良く知られており、そしてそれらが投与される医学的状態の処理を改良し、そして延長するために、本発明の化合物を組合して使用され得るアジュバント（例えば、ビタミンＣ、酸化防止剤、等）を含んで成る。
【００８３】
本発明の化合物の患者への投与のための用量は一般的に、Ｂｒｕｃｅ Ａ． Ｃｈａｂｎｅｒ ａｎｄ Ｊｅｒｒｙ Ｍ． Ｃｏｌｌｉｎｓ， Ｃａｎｃｅｒ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ， Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｅｄ．， ＩＳＢＮ ０−３９７−５０９００−６ （１９９０） に記載される、当業界において知られている治療剤の少なくとも通常の用量であり、又はそれらは、プロドラッグ製剤の卓越した有効性、又は処理される患者の特定の環境を適合するために、処理する医者の判断内で調節され得る。従って、投与される用量は、本発明の化合物の調製のために使用される治療剤に従って変化する。
【００８４】
プロドラッグ化合物による処理：
治療的有効用量の医薬組成物を患者に、特に非経口又は静脈内投与することを包含する、医薬的状態の治療的処理のための方法はまた、本発明の範囲内である。従って、患者を処理するための方法は、治療的有効量の
（１）標的細胞に挿入できる治療剤、
（２）式 （ＡＡ）ｎ−ＡＡ４−ＡＡ３−ＡＡ２−ＡＡ１：
［式中、個々のＡＡは独立して、アミノ酸を表し、
ｎは、０〜１６の整数であり、
ＡＡ４は、遺伝的にコードされないアミノ酸を表し、
ＡＡ３は、いずれかのアミノ酸を表し、
ＡＡ２は、いずれかのアミノ酸を表し、そして
ＡＡ１は、いずれかのアミノ酸を表す］で表されるオリゴペプチド、
（３）安定化基、及び
（４）任意には、ＴＯＰにより分解できないリンカー基を含んで成り、
【００８５】
ここで前記オリゴペプチドは、そのオリゴペプチドの第１の結合部位で前記安定化基に直接的に結合され、そして前記オリゴペプチドは、前記治療剤に直接的に結合されるか、又は前記オリゴペプチドの第２結合部位で治療剤に前記リンカー基を通して間接的に結合され、
前記安定化基は全血に存在する酵素により前記化合物の分解を妨げ、そして
【００８６】
前記化合物が標的細胞に関連する酵素により分解できることを特徴とする化合物を、前記患者に投与することを包含する。標的細胞により結合される酵素は好ましくは、トロウアーゼ及びより好ましくは、ＴＯＰである。
プロドラッグ化合物は、多くの医学的状態、例えば癌、新形成性疾患、腫瘍、炎症性患者及び感染性疾患の処理のために有用である。好ましくは疾病の例は、乳癌、結腸直腸癌、肝臓癌、肺癌、前立腺癌、卵巣癌、脳癌及び膵臓癌である。本発明のプロドラッグ化合物はまた、多薬剤耐性標的細胞の問題を取り組むことにおいても有用である。
【００８７】
例えば、反復される化学療法に続いて、多くの腫瘍細胞は多薬剤耐性（ＭＤＲ）を進行する。ＭＤＲは、インビトロ及び臨床学的に明らかであり、そして特に、ドキソルビシン及び他のアドリアマイシン類似体の場合、明らかである。一般的に広範囲の輸送−関連細胞膜タンパク質の発現又は活性における変化を包含する、ＭＤＲの作用の種々の基本的機構が存在する。それらは、細胞からドキソルビシン又は他の治療剤を活動的に輸送するＰ−糖タンパク質のポンプを包含する。
【００８８】
ＭＤＲを進行する腫瘍においては、腫瘍細胞を殺害するのに有効な用量は、それが全体的な毒性用量に達するまで上昇する。従って、他方では、非常に効果的な化学療法は、許容できない副作用レベル及び死亡率のために、薬剤としてはもはや有用ではない。しかしながら、本明細書に教授されるようなプロドラッグを形成するために変性される化学療法又は他の治療剤は、治療剤に対する標的細胞のそのような耐性を妨げることにおいて有用である。
【００８９】
従って、患者に、治療的有効量の、
（１）標的細胞に挿入できる治療剤、
（２）式 （ＡＡ）ｎ−ＡＡ４−ＡＡ３−ＡＡ２−ＡＡ１：
［式中、個々のＡＡは独立して、アミノ酸を表し、
ｎは、０〜１６の整数であり、
ＡＡ４は、遺伝的にコードされないアミノ酸を表し、
ＡＡ３は、いずれかのアミノ酸を表し、
ＡＡ２は、いずれかのアミノ酸を表し、そして
ＡＡ１は、いずれかのアミノ酸を表す］で表されるオリゴペプチド、
（３）安定化基、及び
（４）任意には、ＴＯＰにより分解できないリンカー基を含んで成り、
【００９０】
ここで前記オリゴペプチドは、そのオリゴペプチドの第１の結合部位で前記安定化基に直接的に結合され、そして前記オリゴペプチドは、前記治療剤に直接的に結合されるか、又は前記オリゴペプチドの第２結合部位で治療剤に前記リンカー基を通して間接的に結合され、
前記安定化基は全血に存在する酵素により前記化合物の分解を妨げ、そして
前記化合物がＴＯＰにより分解できることを特徴とする化合物を投与することを含んで成る、処理の必要な患者における治療剤に対する耐性を処理するための方法を包含する。
【００９１】
医薬的に許容できるビークル（例えば、等張塩溶液）に配合されるプロドラッグ化合物は、０．０５ｍｇ／ｋｇ／用量／日〜３００ｍｇ／ｋｇ／用量／日の範囲の静脈内用量で動物又はヒトに投与され得る。それはまた、静脈内点滴又は他の遅い注入方法を通して投与され得る。ヒト患者は本発明のプロドラッグの通常の受容体であるが、但し獣医学的使用もまた企画される。
【００９２】
診断又はアッセイ：
診断又はアッセイのために製品、例えばキットはまた、本発明の範囲内である。そのような製品は好ましくは、上記のような化合物を使用するが、但し、マーカー例えばクマリンが治療剤の代わりにオリゴペプチド及び安定化基に接合されている。マーカーは、オリゴペプチドに接合され得、そして当業界において知られているいずれかの方法により容易に検出できるいずれかの成分を意味する。マーカーの検出において有用な少なくとも１つの試薬が典型的には、キットの一部として包含される。
【００９３】
従って、製品は、
（１）（ａ）マーカー、
（ｂ）式 （ＡＡ）ｎ−ＡＡ４−ＡＡ３−ＡＡ２−ＡＡ１：
［式中、個々のＡＡは独立して、アミノ酸を表し、
ｎは、０〜１６の整数であり、
ＡＡ４は、遺伝的にコードされないアミノ酸を表し、
ＡＡ３は、いずれかのアミノ酸を表し、
ＡＡ２は、いずれかのアミノ酸を表し、そして
ＡＡ１は、いずれかのアミノ酸を表す］で表されるオリゴペプチド、
（ｃ）安定化基、及び
（ｄ）任意には、ＴＯＰにより分解できないリンカー基を含んで成り、
【００９４】
ここで前記オリゴペプチドは、そのオリゴペプチドの第１の結合部位で前記安定化基に直接的に結合され、そして前記オリゴペプチドは、前記マーカーに直接的に結合されるか、又は前記オリゴペプチドの第２結合部位でマーカーに前記リンカー基を通して間接的に結合され、
前記安定化基は全血に存在する酵素により前記化合物の分解を妨げ、そして
前記化合物がＴＯＰにより分解できることを特徴とする化合物、及び
（２）任意には、前記マーカーの検出において有用な少なくとも１つの試薬を包含する。
製品は、腫瘍を診断するか、又はプロドラッグ治療により処理に対して敏感な患者を同定するために、患者サンプルと共に使用され得る。
【００９５】
工程化学の一般的方法：
オリゴペプチド：ペプチドの合成のための一般的方法：
本発明のプロドラッグ接合体におけるペプチド又はオリゴペプチド配列は、固相ペプチド合成（Ｂｏｃ又はＦｍｏｃ化学のいずれかを用いて）方法により、又は溶液相合成により合成され得る。一般的なＢｏｃ及びＦｍｏｃ方法は広く使用され、そして次の文献に記載されている：Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｊ．Ａ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ．， ８８： ２１４８ （１９６３）； Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ ａｎｄ Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ， Ｔｈｅ Ｐｒｅｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ， Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｙ， Ｂｅｒｌｉｎ， ７−１６１ （１９９４）； Ｓｔｅｗａｒｔ， Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ， Ｐｒｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ， Ｒｏｃｋｆｏｒｄ， （１９８４）。
【００９６】
一般的なＦｍｏｃ固相方法：
好ましい固相合成方法（自動又は手動）を用いて、所望する長さ及び配列のペプチドが、固体樹脂に結合される成長する鎖へのアミノ酸の段階的付加を通して合成される。有用なＦｍｏｃ　適合性樹脂の例は、Ｗａｎｇ樹脂、ＨＭＰＡ−ＰＥＧＡ樹脂、Ｒｉｎｋ酸樹脂又はヒドロキシエチル−フォトリンカー樹脂を包含するが、但しそれらだけには限定されない。ペプチド鎖のＣ末端はポリマー樹脂に共有結合され、そして保護されたα−アミノ酸が、カップリング試薬と共に段階的態様で添加された。好ましいα−アミノ保護基は、カップリング条件に対して安定し、そして軽いアルカリ性条件下で容易に除去され得るＦｍｏｃ基である。反応溶媒は好ましくは、ＤＭＦ、ＮＭＰ、ＤＣＭ、ＭｅＯＨ及びＥｔＯＨであるが、しかしそれらだけには限定されない。
【００９７】
カップリング剤の例は、ＤＣＣ、ＤＩＣ、ＨＡＴＵ、ＨＢＴＵである。Ｎ−末端保護基の分解は、０〜４０℃でＤＭＦ中、１０〜１００％のピペリジンにおいて達成され、そして温度は周囲温度が好ましい。合成の最後で、最終Ｆｍｏｃ保護基が、上記Ｎ−末端分解方法を用いて除去される。樹脂上の残るペプチドは、酸性条件下で樹脂を処理することによって、いずれかの酸感受性側鎖保護基と共に樹脂から分解される。例えば、酸性分解条件は、ジクロロメタン中、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）の混合物である。ヒドロキシエチル−フォトリンカー樹脂が使用される場合、分解を誘発するための適切な波長は、λ３６５ｎｍの紫外線である。この工程の図示は、図３に与えられる。
【００９８】
固相合成を通しての一般的Ｎ−キャップ方法：
Ｎ−末端誘導体化されたペプチドの調製は便利には、固相上で達成される。ペプチド合成が完結する場合、末端Ｆｍｏｃが除去され、そしてペプチドはまだ、固体支持体上に存在する。次に、選択のＮ−キャップが、ペプチドのＮ−末端上に、標準のペプチドカップリング条件を用いてカップリングされる。Ｎ−キャップのカップリングの完結に基づいて、ペプチドが、上記方法を用いて、樹脂から分解される。
【００９９】
一般的なＢｏｃ固相方法：
Ｂｏｃ化学を用いての固相方法に関しては、Ｍｅｒｒｉｖｉｅｌｄ樹脂又はＰＡＭ樹脂が有用である。アミノ酸は、カップリング剤により活性化されたＢｏｃ−保護されたアミノ酸の連続的付加により、固相上の成長鎖にカップリングされる。カップリング剤の例は、ＤＣＣ、ＤＩＣ、ＨＡＴＵ、ＨＢＴＵである。反応溶媒は、ＤＭＦ、ＤＣＭ、ＭｅＯＨ及びＮＭＰであり得る。Ｂｏｃ保護基の分解は、０〜４０℃で、ＤＣＭ中、１０〜１００％のＴＦＡにおいて達成され、温度に関しては、周囲温度が好ましい。ペプチド鎖アセンブリーの完結に基づいて、Ｎ末端保護基（通常、Ｂｏｃ）が上記のようにして除去される。ペプチドは、ジクロロメタン中、液体ＨＦ又はトリフルオロメタンスルホン酸を用いて、樹脂から除去される。溶液相合成によるＦｍｏｃオリゴペプチドの一般的調製方法：
【０１００】
他方では、プロドラッグペプチド中間体は、Ｂｏｃ又はＦｍｏｃ化学を用いて、溶液相合成を通して製造され得る。この方法の図示（図４）においては、Ｃ−末端Ｌｅｕテトラペプチドが一般的に例として使用されるが、しかし類似する反応が他のＣ−末端テトラペプチドにより行われ得ることが理解されるであろう。このペプチドは、固相方法に類似する段階的アセンブリー（Ｎ−末端方向又はＣ−末端方向に）により、又は単一のアミノ酸による２種の適切に保護されたジペプチド又はトリペプチドのカップリングを通して増大され得る。
【０１０１】
溶液相合成の１つの方法は、図４に示される、Ｆｍｏｃ化学を用いてのプロドラッグペプチド中間体の段階的増大である。そのＣ−末端は、副生成物の形成を低めるために保護されるべきである。図４におけるＣ−末端Ｒ基は、Ｍｅ， ｔＢｕ， ベンジル又はＴＣＥである。（Ｎ−キャプがメチルスクシニルである場合、Ｃ−末端Ｒ基はメチルであり得ないことを注意すること。）ＤＭＦは溶媒として与えられるが、他の溶媒、例えばＤＭＳＯ、ＣＨ３ＣＮ又はＮＭＰ（又はそれらの混合物）がそれと置換され得る。
【０１０２】
ピリジン、Ｅｔ３Ｎ又は他の塩基が成長するペプチド鎖保護のアミノ末端の保護解除において、ピペリジンにより置換され得る。同様に、ＨＢＴＵは活性剤として上記図に与えられるが、他の活性剤、例えばＤＣＣ、ＤＩＣ、ＤＣＣ＋ＨＯＢｔ、Ｏｓｕ、活性化されたエステル、アジド又はトリフェニルホスホリルアジドが使用され得る。さらに、保護されたペプチド酸クロライド又は酸ブロミドが、アミノ酸又はペプチドフラグメントに直接的にカップリングするために使用され得る。オリゴペプチドアセンブリーの完結に基づいて、Ｎ−末端保護解除された及びＣ−末端保護されたペプチドは所望するＮ−キャップに容易に受容される。
【０１０３】
溶液相合成を通してのＮ−キャップオリゴペプチドの一般的調製方法：
溶液相合成により、Ｎ−キャップされたオリゴペプチドを構成する場合、Ｎ−キャップはわずかに改良された方法により合成される必要がある（図４）。最初に、ＦｍｏｃオリゴペプチドのＣ−末端は、Ｎ−キャップ上のＣ−末端の選択的保護解除に適合できる、酸不安定性又は水素化感受性保護基により保護される必要がある。次に、Ｆｍｏｃ保護基は、Ｎ−末端を表すためにオリゴペプチドから除去される必要がある。
【０１０４】
保護解除されたＮ−末端及び保護されたＣ−末端を有するオリゴペプチドは、所望するＮ−キャップの活性化されたヘミエステルと反応せしめられる。Ｎ−キャップは、塩基及び適切な溶媒においてアミノ酸、例えばＤＣＣ又はＨＡＴＵを活性化するための方法を用いて活性化され得る。他方では、メチル−ヘミスクシネートが使用される場合、カップリングはまた、有機又は無機塩基、例えばＤＩＥＡ、トリエチルアミン又はＣｓ２ＣＯ３の存在下で不活性溶媒を用いて、メチルヘミスクシニルクロライド（又は他の酸ハロゲン化物）を通して行われ得る。
【０１０５】
そのような合成の１つの例は、メチル−ヘミスクシネート及びβＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕベンジルエステルを反応することによってであり得る。カップリング方法は、一般的に当業界において使用される方法のいずれか１つの方法であり得る（例えば、Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ， Ｍ．， Ｔｈｅ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ， Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ， １８５ （１９８４）； Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ， Ｍ．， Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ， Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ， １５９ （１９８４） を参照のこと）。次に、ベンジル基が、βＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕの所望するＮ−キャップメチル−スクシニル形を提供する触媒水素化により除去され得る。適切な、選択的に除去できるＣ−末端保護基の他の例は、ｔＢｕ、アルコキシ−メチル及びＴＣＥであり得るが、但しそれらだけには限定されない。この段階を達成するための他の方法は、文献に記載される。
【０１０６】
上記方法のいずれかの組合せ、例えばジ−又はトリペプチドの“フラグメントの縮重”が、考慮され得る。反応条件は、当業界において良く知られており、そして与えられる引例に記載される。上記方法の利点は、溶液相合成により生成される生成物の容易な精製である。
【０１０７】
プロドラッグ接合体：
接合及び保護解除段階のための一般的方法：
本明細書に記載されるオリゴペプチド−治療剤のＮ−キャップ形は、ペプチド合成に使用される標準の活性化試薬のいずれかを用いて、ダウノルビシン、ドキソルビシン又はいずれかの適切な治療剤によりオリゴペプチドのＦｍｏｃ形（ＦｍｏｃがオリゴペプチドのＮ−末端に結合されることを意味する）をカップリングすることにより合成され得る（図５）。溶媒は、トルエン、酢酸エチル、ＤＭＦ、ＤＭＳＯ、ＣＨ３ＣＮ、ＮＭＰ、ＴＨＦ、ＤＣＭ又は当業界において知られているようないずれかの他の不活性溶媒であり得、そして試薬はそこに溶解できる。好ましい溶媒は、ＤＭＦ及びＮＭＰである。
【０１０８】
適切な温度範囲は−２５〜＋２５℃であり、そして周囲温度が好ましい。活性化剤は、次のものの１つから選択され得る：ＰｙＢＯＰ、ＨＢＴＵ、ＨＡＴＵ、ＥＤＣ、ＤＩＣ、ＤＣＣ、ＤＣＣ＋ＨＯＢＴ、ＯＳｕ、活性化されたエステル、アジド又はトリフェニルホスホリルアジド。ＨＢＴＵ又はＨＡＴＵが好ましい活性化剤である。他方では、保護されたペプチドの酸クロライド又は酸ブロミドがまた、このカップリング反応のために使用され得る。２〜４当量、好都合には２〜２．５当量の塩基が、カップリング反応のために必要とされる。塩基は、無機塩基、例えばＣｓＣＯ３、Ｎａ２又はＫ２ＣＯ３、又は有機塩基、例えばＴＥＡ、ＤＩＥＡ、ＤＢＵ、ＤＢＮ、ＤＢＯ、ピリジン、置換されたピリジン、Ｎ−メチル−モルホリン、等、好ましくはＴＥＡ又はＤＩＥＡから選択され得る。反応は、−１５°〜５０℃、好都合には−１０℃〜１０℃の温度で行われ得る。
【０１０９】
反応時間は、５〜９０分であり、そして好都合には、２０〜４０分である。生成物は、反応混合物を水中に注ぎ、そして形成される沈殿物を濾過することによって単離される。粗生成物は、ＤＣＭ、ＴＨＦ、酢酸エチル、又はアセトニトリル、好ましくはジクロロメタン又はアセトニトリルからの再結晶化により、さらに精製され得る。次に、オリゴペプチド治療剤接合体の単離されたＦｍｏｃ形が、１０〜１００倍過剰の塩基を用いて、−１０〜５０℃の温度で、２〜９０分間、好ましくは３〜８分間、保護解除される。理想的には、５〜６０当量の塩基が好ましい。ピペチジンは、Ｆｍｏｃ基を保護解除するための好ましい塩基である。オリゴペプチド治療剤接合体の保護解除されたアミノ末端は、オリゴペプチド−治療剤の最終Ｎ−キャップ形を得るために、活性化されたヘミ−エステルとして無水二酸によりアシル化される。
【０１１０】
他方では、最終プロドラッグは、オリゴペプチドの保護されたＮ−キャップ形、例えばスクシニル−Ｎ−キャップオリゴペプチドのメチル−ヘミエステルから同様にして調製され、そして治療剤に接合され得る。この方法は図６に例示される。
保護されたＮ−キャップ−オリゴペプチド治療剤は、治療剤の安定性に適合できる方法により保護解除される。例えば、アントラサイクリンは、メチル基により保護され、そしてエステラーゼにより保護解除され得る。他の治療剤に関しては、ベンジル保護基及び触媒水素化が保護解除するために選択され得る。
【０１１１】
負に荷電されたＮ−キャップオリゴペプチド治療剤の塩形への転換は、次の群から選択された溶媒により行われ得る：アルコール（例えば、メタノール、エタノール又はイソプロパノール）、水、アセトニトリル、テトラヒドロフラン、ジグリメ（ｄｉｇｌｙｍｅ）又は他の極性溶媒。ナトリウム源は、１モル当量のＮａＨＣＯ３、ＮａＯＨ、Ｎａ２ＣＯ３、ＮａＯＡｃ、ＮａＯＣＨ３（一般的に、ナトリウムアルコキシド）又はＮａＨである。Ｎａ＋（例えば、強い又は弱いイオン交換体）により荷電されたイオン交換カラムはまた、適切な場合、Ｎ−キャップオリゴペプチド治療剤の塩形を製造するこの最後の段階のためにも有用である。ナトリウムは、単に例として記載される。
【０１１２】
一般的に、プロドラッグは、そのプロドラッグの溶解性を改良するために、医薬的に許容できる塩形に転換され得る。Ｎ−キャップ−オリゴペプチド治療剤は、医薬的に許容できる塩、例えばＮａＨＣＯ３、Ｎａ２ＣＯ３、ＮａＯＨ、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、ＫＨＣＯ３、Ｋ２ＣＯ３、ＣａＣＯ３、ＮＨ４ＯＨ、ＣＨ３ＮＨ２、（ＣＨ３）２ＮＨ、（ＣＨ３）３Ｎ、アセチルトリエチルアンモニウムにより中和される。プロドラッグの好ましい塩形は、ナトリウムであり、そして好ましい中和化塩はＮａＨＣＯ３である。
【０１１３】
アントラサイクリン型分子、例えばドキソルビシン及びダウノルビジンが、非常に低い濃度で有機溶媒においてゲルを形成することは記載されている（Ｍａｔｚａｎｋｅなど．， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２０７： ７４７−５５ （１９９２）； Ｃｈａｉｒｅｓ など．， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２１： ３９２７−３２（１９８２）；Ｈａｙａｋａｗａなど．， Ｃｈｅｍ． ｐｈａｒｍ． Ｂｕｌｌ． ３９： １２８２−６ （１９９１）。これは、ペプチドアントラサイクリン接合体を製造する場合、高収率の汚染されていない生成物を得るためには相当の障害であり得る。ゲル形成は、所望しない副反応の形成に寄与する。
【０１１４】
この問題を最少にするための１つの手段は、カップリング反応のために非常に希釈した溶液（１〜２％）を使用することであるが、しかしながらそれは工程の環境（多量の廃棄物、複雑な単離）において実際的でない。この問題を克服するためには、ウレア又は他のカオトロピック剤が、ゲルを形成する強い疎水性及び水素結合力を破壊するために使用され得る。従って、カップリング反応がウレア含有溶媒、好都合には、ＤＭＦ又はＮＭＰ中、ウレアの２０％〜飽和溶液において行われる場合、副反応は、反応の濃度が１０％を超える場合でさえ、２％以下に維持され得る。これは、高濃度での接合段階を実際的にし、そして良好な収率を生成する。
【０１１５】
一般的な酵素方法：
酸又は塩基により触媒される十分なＮ−キャップ化合物への保護されたＮ−キャップ−オリゴペプチド治療剤の加水分解は、適度な酸性又は塩基性条件下でさえ、多くの治療剤の不安定性のために、複数な反応混合物を誘導する。酵素は基質又は生成物を破壊しないで、加水分解を促進することができる。この反応のために適切な酵素は、エステラーゼ又はリパーゼであり得、そしてそれらの性質的には、水溶性形で存在するか、又は交差カップリング又は結合により、市販の固体支持体材料に固定され得る。
【０１１６】
評価される可溶性酵素のうち、カンジダ　アンタルクチカ（Ｃａｎｄｉｄａ Ａｎｔａｒｃｔｉｃａ）“Ｂ”リパーゼ（Ａｌｔｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ）が特に有用である。交差カップリングにより固定される酵素の例は、ＣｈｉｒｏＣＬＥＣ−ＰＣＴＭ （Ａｌｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ） である。カンジダ　アンタルクチカ“Ｂ”リパーゼ（Ａｌｔｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ）は、ＮＨＳ活性化ＳｅｐｈａｒｏｓｅＴＭ ４ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ （Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）との反応により固定され得る。加水分解の間、その反応混合物のｐＨは、注意して調節され、そしてＮａＨＣＯ３溶液の調節された添加を通して、５．５〜７．５、好都合には５．７〜６．５のｐＨ−開始により維持される。反応が完結される場合、生成物は、濾過された反応混合物の凍結乾燥により単離される。固定された酵素は、フィルターケーク上に存続し、そして所望により、再使用され得る。
【０１１７】
一般的なアリル又はアルキルエステル方法：
プロドラッグはまた、治療剤によりＮ−キャップオリゴペプチドのアリル−ヘミエステル又はアルキル−ヘミエステル形をカップリングし、そして接合体から遊離酸形を生成することにより調製され得る。図８は、スクシニル−β−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ及びドキソルビシンによるこの工程を例示する。
ドキソルビシンによるアリル−スクシニル−β−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕのカップリングは、オリゴペプチド接合方法のいずれか１つの方法により行われ得る。
【０１１８】
アリル−スクシニル−βＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−ドキソルビシンはまた、ドキソルビシンへの保護されたテトラペプチド前駆体のカップリングが図５に示される前記方法に記載されるように、類似して、βＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕと、既知方法（Ｃａｓｉｍｉｒなど．， Ｔｅｔ． Ｌｅｔｔ． ３６： ３４０９ （１９９５））を通して調製されたアリルヘミスクシネートとを反応せしめることによって合成され得る。適切な不活性溶媒は、ＴＨＦ、ジクロロメタン、酢酸エチル、トルエン、好ましくは反応が進行するにつれて、生成物酸形が沈殿するＴＨＦである。単離された酸は、前記のようにして、そのナトリウム塩に転換される。反応時間は、０〜６０℃、好ましくは１５〜３０℃の温度で、１０〜１８０分、好都合には１０〜６０分である。
【０１１９】
アリル又はアルキル基の除去は、当業界において良く知られており、そして専門文献に記録されているように、受容体分子へのアリル又はアルキル基のＰｄ（０）， 又はＮｉ（０）， 好都合にはＰｄ（０）促進された移行により行われ得る（Ｇｅｎｅｔなど．， Ｔｅｔ． Ｌｅｔｔ． ５０： ４９７ （１９９４）； Ｂｒｉｃｏｕｔ など．， Ｔｅｔ． Ｌｅｔｔ． ５４： １０７３ （１９９８）； Ｇｅｎｅｔなど．， Ｓｙｎｌｅｔｔ ６８０ （１９９３）； Ｗａｌｄｍａｎｎなど．， Ｂｉｏｏｒｇ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． ７： ７４９ （１９９８）； Ｓｈａｐｈｉｒｏなど．， Ｔｅｔ． Ｌｅｔｔ． ３５： ５４２１ （１９９４））。触媒の量は、基質に対して０．５〜２５モル％であり得る。
【０１２０】
一般的なトリチル又は置換されたトリチル方法：
プロドラッグはまた、図７に示される方法により合成され得る。このアプローチは、Ｒ’−オリゴペプチド（ここで、Ｒ’はトリチル又は置換されたトリチルである）を利用する。治療剤によるＲ’−オリゴペプチドのカップリングは、治療剤による保護されたオリゴペプチドの接合についての前記方法のいずれか１つの方法により、０〜２０℃で３０〜１２０分間、行われ得る。
【０１２１】
トリチル又は置換されたトリチル基の除去は、正に荷電されたプロドラッグを得るために、酸性条件下で達成され得る。この正に荷電されたプロドラッグは、図４に示され、そして前述のように、Ｎ−キャップされる。トリチル保護解除は、酢酸、蟻酸及び希塩酸により達成され得る。
プロドラッグは、無水琥珀酸との反応により、スクシニル又はグルタリルβＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ治療剤に転換され得る。スクシニル又はグルタリルβＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ治療剤は、いずれかの医薬的に許容できる塩に転換され得る。カップリング段階のための溶媒、ＤＭＦ、ＤＭＳＯ、ＣＨ３ＣＮ、ＮＭＰ、又はいずれかの他の適切な溶媒は、当業界において知られている。
【０１２２】
一般的な逆方向固相接合方法：
本発明のプロドラッグ化合物は、“段階的様式”の逆方向（Ｎ−末端からＣ−末端の方向）方法を通して、固相化学を用いることによって合成され得る。
１つの手段は、スクシニル−ヘミエステル、例えばスクシニル−ベンジルエステル又は−アリルエステルを固定するために樹脂を使用することである。選択される樹脂の例は、“Ｗａｎｇ樹脂”（Ｗｏｎｇ， Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ， ９５： １３２８ （１９７３）； Ｚｈａｎｇなど．， Ｔｅｔ． Ｌｅｔｔ． ３７： ５４５７ （１９９６））、“Ｒｉｎｋ樹脂”（Ｒｉｎｋ， Ｔｅｔ． Ｌｅｔｔ． ２８： ３７８７ （１９８７））、“トリチル−、又は置換された−トリチル樹脂”（Ｃｈｅｎなど．， Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． １１６： ２６１１ （１９９４）； Ｂａｒｔｏｓなど．， Ｐｅｐｔｉｄｅｓ Ｐｒｏｃ． ２２ｎｄ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｍｐａｓｉｕｍ （１９９２）； Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ ａｎｄ Ｅｂｅｒｌｅ （Ｅｄｓ．）， Ｅｓｃｏｍ Ｌｅｉｄｅｎ． Ｐｐ． ２８１ （１９９３））である。
【０１２３】
次に、固定されたエステルが保護解除され、そして例えば、同様にＣ−末端保護されたβ−アラニンと反応せしめられる。次に、それらの段階が、ロイシン、アラニン及び最終的にロイシンエステルにより反復され、続いて、固定されたスクシニル−テトラペプチドへのドキソルビシンのカップリングを行う。次に、分子が、遊離プロドラッグ、例えば、遊離Ｓｕｃ−βＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘを形成するために、軽い酸性条件を用いることによって樹脂から生成されるこの方法論は、図９のスキーム上に表される。もう１つのバージョンの相合成は、固定されたスクシニルオリゴペプチドを用いる。次に、これがＣ−末端保護解除され、続いてドキソルビシン又は他の治療剤へのカップリング段階を伴ない、そして最終的に、図９のスキーム上に表されるように、樹脂から生成される。次に、プロドラッグ分子の酸形が最終的に、上記のようにして、そのナトリウム塩に転換され得る。
【０１２４】
一般的な大規模化合物合成：
プロドラッグ化合物は、本発明の単純且つ効果的な三段階工程を用いて合成され得る。第１段階は、治療剤へのアルキル−エステル保護されたオリゴペプチドフラグメントのカップリングを包含する。第１段階の好ましい態様は、ＭｅＯＳｕｃ−βＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘを得るために、カップリング剤としてＨＡＴＵを用いてのドキソルビシによるＭｅＯＳｕｃ−βＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−ＯＨのカップリングを包含する（図１６）。この段階の焦点は、加水分解段階が純度に対する影響を有さないことが見出されたので、メチルエステルの純度及び収率に対してである。
【０１２５】
第２段階は、プロドラッグ化合物を、少なくとも９０％の最終純度で良好な収率で直接的に付与する、酵素（エステラーゼ）によるアルキル−エステル基の加水分解である。例えば、第２段階は、Ｓｕｃ−βＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘのナトリウム塩を、高い純度で定量的収率で直接的に付与する、酵素（ＣＬＥＣ ＣＡＢ， 架橋されたカンジダ　アンタルクチカ“Ｂ”リパーゼ）による、ＭｅＯＳｕｃ−βＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘにおけるメチルエステル基の加水分解であり得る。
【０１２６】
最終段階は、加水分解段階の後、生成物を単離することである。ほとんどの治療剤は毒性物質であるので、カップリングされた生成物からいずれかの遊離治療剤を排除する特別な段階を付加することが好ましい。最終段階の焦点は、最終生成物、例えばＳｕｃ−βＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘを、加水分解段階の後、単離することである。これは、０．２ミクロンのフィルターを用いて、加水分解段階からの反応混合物を濾過し、そして次に、Ｓｕｃ−βＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘ． Ｎａを得るために、前記濾過を凍結乾燥することによって、単純に達成される。
【０１２７】
遊離治療剤の除去：
接合されていない治療剤は、プロドラッグの製造段階の後期に存在することができる。例えば、治療剤としてドキソルビシンを用いての（安定化基）−（オリゴペプチド）接合体のカップリング段階の間、多くの場合、反応は完全には進行しなかったことが見出された。カップリングされた生成物に残存する約２〜４％の残留ドキソルビシンが存在した。酸洗浄により生成物からドキソルビシンを完全に除去するために初期試みは、完全な除去をもたらさなかった。ＭｅＯＳｕｃ−βＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘの大規模合成に関しては、ドキソルビシンの完全な除去が決定的である。遊離治療剤の完全な除去は、スキャベンジング樹脂又はビーズを用いる、例４１及び図１４に概略される工程によりもたらされた。
【０１２８】
ＭｅＯＳｕｃ−βＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘ及び残留ドキソルビシンを含む粗生成物がＤＭＦに溶解され、そしてポリスチレンメチルイソシアネート又はポリスチレンスルホニルクロライド樹脂又はビーズが添加された。反応は６０分間、撹拌された。ドキソルビシンの遊離アミノ基が、ウレア又はスルホンアミド誘導体を形成するために、ビーズ上のイソシアネート又はスルホニルクロライド基と反応する。次に、固体ビーズに結合されるドキソルビシンを有するそれらのビーズが、濾過により、所望の生成物から分離された。所望する生成物は、ＤＭＦ溶液に残存する。このアプローチは、生成物から残留治療剤を除去するための非常に穏かで且つ効果的な方法であると思われる。
【０１２９】
従って、本発明は、
（１）式 （ＡＡ）ｎ−ＡＡ４−ＡＡ３−ＡＡ２−ＡＡ１：
［式中、個々のＡＡは独立して、アミノ酸を表し、
ｎは、０〜１６の整数であり、
ＡＡ４は、遺伝的にコードされないアミノ酸を表し、
ＡＡ３は、いずれかのアミノ酸を表し、
ＡＡ２は、いずれかのアミノ酸を表し、そして
ＡＡ１は、いずれかのアミノ酸を表す］で表されるＦｍｏｃ−保護されたオリゴペプチドを選択し、
【０１３０】
（２）Ｆｍｏｃ−保護されたオリゴペプチド−治療剤接合体を形成するために、治療剤の存在下で活性化剤によりＦｍｏｃ−保護されたオリゴペプチドを活性化することによって、治療剤に前記Ｆｍｏｃ−保護されたオリゴペプチドをカップリングし、
（３）オリゴペプチド−治療剤接合体を形成するために、前記Ｆｍｏｃ−保護されたオリゴペプチド−治療剤接合体を、それと塩基とを接触することによって保護解除し、そして
（４）化合物を形成するために、安定化基に前記オリゴペプチド−治療剤接合体をカップリングすることを含んで成る、化合物の製造方法を包含する。
【０１３１】
他方では、化合物の製造方法は、次の段階：
（１）式 （ＡＡ）ｎ−ＡＡ４−ＡＡ３−ＡＡ２−ＡＡ１：
［式中、個々のＡＡは独立して、アミノ酸を表し、
ｎは、０〜１６の整数であり、
ＡＡ４は、遺伝的にコードされないアミノ酸を表し、
ＡＡ３は、いずれかのアミノ酸を表し、
ＡＡ２は、いずれかのアミノ酸を表し、そして
ＡＡ１は、いずれかのアミノ酸を表す］で表されるオリゴペプチドを選択し、
【０１３２】
（２）アルキルエステル−保護された安定化基−オリゴペプチド接合体を形成するために、前記オリゴペプチドをアルキルエステル−保護された安定化基にカップリングし、
（３）アルキルエステル−保護された安定化基−オリゴペプチド−治療剤接合体を形成するために、アルキルエステル−保護された安定化基−オリゴペプチド接合体を、治療剤の存在下で活性剤により活性化することによって、治療剤にアルキルエステル−保護された安定化基−オリゴペプチド接合体をカップリングし、そして
（４）化合物を形成するために、前記アルキルエステル−保護された安定化基−オリゴペプチド治療剤接合体を保護解除する段階を含んで成る。
【０１３３】
本発明の化合物はまた、次の段階：
（１）式 （ＡＡ）ｎ−ＡＡ４−ＡＡ３−ＡＡ２−ＡＡ１：
［式中、個々のＡＡは独立して、アミノ酸を表し、
ｎは、０〜１６の整数であり、
ＡＡ４は、遺伝的にコードされないアミノ酸を表し、
ＡＡ３は、いずれかのアミノ酸を表し、
ＡＡ２は、いずれかのアミノ酸を表し、そして
ＡＡ１は、いずれかのアミノ酸を表す］で表されるオリゴペプチドを選択し、
【０１３４】
（２）アリルエステル−保護された安定化基−オリゴペプチド接合体を形成するために、前記オリゴペプチドをアリルエステル−保護された安定化基にカップリングし、
（３）アリルエステル−保護された安定化基−オリゴペプチド−治療剤接合体を形成するために、アリルエステル−保護された安定化基−オリゴペプチド接合体を、治療剤の存在下で活性剤により活性化することによって、治療剤にアリルルエステル−保護された安定化基−オリゴペプチド接合体をカップリングし、そして
（４）化合物を形成するために、前記アリルエステル−保護された安定化基−オリゴペプチド治療剤接合体を保護解除する、
段階により製造される。
【０１３５】
本発明の化合物のさらにもう１つの製造方法は、次の段階：
（１）式 （ＡＡ）ｎ−ＡＡ４−ＡＡ３−ＡＡ２−ＡＡ１：
［式中、個々のＡＡは独立して、アミノ酸を表し、
ｎは、０〜１６の整数であり、
ＡＡ４は、遺伝的にコードされないアミノ酸を表し、
ＡＡ３は、いずれかのアミノ酸を表し、
ＡＡ２は、いずれかのアミノ酸を表し、そして
ＡＡ１は、いずれかのアミノ酸を表す］で表されるトリチル−保護されたオリゴペプチドを選択し、
【０１３６】
（２）トリチル−保護されたオリゴペプチド−治療剤接合体を形成するために、治療剤の存在下で活性化剤によりトリチル−保護されたオリゴペプチドを活性化することによって、治療剤に前記トリチル−保護されたオリゴペプチドをカップリングし、
（３）オリゴペプチド−治療剤接合体を形成するために、前記トリチル−保護されたオリゴペプチド−治療剤接合体を、酸性条件下で保護解除し、そして
（４）化合物を形成するために、安定化基に前記オリゴペプチド−治療剤接合体をカップリングする、
ことを含んで成る。
【０１３７】
それらの方法のいずれかに関するもう１つの可能な段階は、スキャベンジング樹脂又はビーズの使用により、カップリングされていない治療剤を除去することである。さらに、化合物は、所望により、医薬的に許容できる塩により中和され得る。
【０１３８】
従って、プロドラッグの製造方法においては、本発明は、
（１）任意に保護された安定化基−オリゴペプチド接合体を遊離治療剤によりカップリングし、
（２）治療剤−ポリマー樹脂複合体を形成するために、段階（１）の後に残存する遊離治療剤を結合するポリマー樹脂と段階（１）の反応体とを接触し、そして
（３）前記治療剤−ポリマー樹脂複合体を除去することを含んで成る、遊離治療剤を除去するための方法を包含する。
前記ポリマー樹脂は、ポリスチレンメチルイソシアネート又はポリスチレンスルホニルクロライドであり得る。
【０１３９】
特定の化合物：
本発明の化合物は、プロドラッグ、すなわちＳｕｃ−βＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘ、Ｓｕｃ−βＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｎｒ、及びＧ１−βＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘを包含する。
さらに、本発明のプロドラッグの調製方法において主要な次の中間化合物は本発明の一部である：
【０１４０】
βＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ
トリチル−βＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘ
ジフェニルメチル−βＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘ
ベンジルオキシカルボニル−βＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘ
Ｆｍｏｃ−βＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−ＯＢｎ
βＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−ＯＢｎ
メチル−スクシニル−βＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−ＯＢｎ
メチル−スクシニル−βＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ
Ｆｍｏｃ−βＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ
Ｆｍｏｃ−Ｔｈｉ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ
Ｆｍｏｃ−βＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｎｒ
Ｆｍｏｃ−Ｔｈｉ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｄｎｒ
Ｓｕｃ−Ｔｈｉ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｄｎｒ
Ｇ１−βＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘ
βＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘラクテート
アリル−スクシニル−βＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘ
Ｓｕｃ−βＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ
Ｓｕｃ−βＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕのメチルエステル
Ｆｍｏｃ−βＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘ
メチル−スクシニル−βＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘ、及び
アリル−ヘミスクシネート。
【０１４１】
実施例
例１．ＭＣＦ７／６細胞ホモジュネートの調製
ＭＣＦ７／６細胞を、ＤＭＥＭ：Ｆ１２（１：１）、５０ｍｇ／ｌのウシ血清アルブミン、ＩＴＳ−Ｘ（１０ｍｇ／ｌのインスリン、５．５ｍｇ／ｌのトランスフェリン、６．７μｇ／ｌの亜セレン酸ナトリウム、２ｍｇ／ｌのエタノールアミン）、及び脂質濃縮物（Ｇｉｂｃｏ＃２１９００−０３０）を含む血清フリー培地において集密性まで増殖した。１００ｍｌの細胞を、４℃で１０，０００×ｇで２０分間、遠心分離し、そして上清液をデカントすることによって収穫した。ペレットを、２ｍｌのリン酸緩衝溶液（Ｇｉｂｃｏ）に再懸濁し、そして１８，０００×ｇで１０分間、遠心分離した。上清液をデカントした後、細胞（約３００μｌの湿潤物）を、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．２）（ナトリウム塩）１０ｍｌにおいて粉砕することによって均質化した。そのホモジュネートを、４℃で１８，０００×ｇで５分間、遠心分離し、そして上清液をアリコートし、そして化合物のスクリーニングへの続く使用のために−２０℃以下で貯蔵した。
【０１４２】
例２．ＭＣＦ７／６ならし培地の調製
ＭＣＦ７／６細胞を、１０％ウシ胎児血清、０．０５％（ｗ／ｖ）のＬ−グルタミン、２５０ＩＵ／ｍｌのペニシリン及び１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを含むＤＭＥＭ／Ｆ１２（１：１）において集密性まで増殖した。次に、細胞を、リン酸緩衝溶液により２度、洗浄し、そしてＭＤＥＭ／Ｆ１２（１：１）、０．０２％のＢＳＡ、ＩＴＳ−Ｘ（１０ｍｇ／ｌのインスリン、５．５ｍｇ／ｌのトランスフェリン、６．７μｇ／ｌの亜セレン酸ナトリウム、２ｍｇ／ｌのエタノールアミン）において、５％のＣＯ２下で、３７℃で２４時間インキュベートした。次に前記ならし培地をデカントし、そしてＹＭ１０（１０，０００ＭＷのカットオフ）限外濾過膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を備えた、撹拌された細胞装置を用いて、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．２）により１度、交換し、そして２０倍に濃縮した。この溶液を、化合物のスクリーニングへの使用のために、−２０℃で、アリコートで貯蔵した。
【０１４３】
例３．ＨｅＬａ細胞アニオン交換画分プール（ＰＩ）の調製
商業的に生成された３０×１０１０個のＨｅＬａ細胞（ヒト頚部癌、Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｅｎｔｅｒ， Ｓｅｎｅｆｆｅ， Ｂｅｌｇｉｕｍ）を、１０８ｍｌのリシン水溶液において、音波処理機及びＤｏｕｎｃｅホオジナイザーにより均質化した。そのリシン溶液は、０．０２％（ｗ／ｖ）のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００， ０．０４％（ｗ／ｖ）のアジ化ナトリウム、及びプロテアーゼのインヒビターのカクテル（２つの錠剤／５０ｍｌのＣｏｍｐｌｅｔｅＴＭ， ＥＤＴＡ−フリーの錠剤、Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）を含んだ。細胞ホモジネートを、５０００×ｇで４℃で３０分間、遠心分離し、そしてペレットを、Ｄｏｕｎｃｅホモジナイザーを用いて、第２の１０８ｍｌのリシン溶液において均質化し、そして前記のように遠心分離した。上清液を組合し、そして１４５，０００×ｇで４℃で９０分間、遠心分離した。
【０１４４】
その超遠心分離上清液の一部を、０．０１％（ｗ／ｖ）のＸ−１００及び０．０２％（ｗ／ｖ）のアジ化ナトリウムを含む、２０ｍＭのトリエタノールアミン−ＨＣｌ（ｐＨ７．２）緩衝液（平衡化緩衝液）により２倍に希釈した。約１８０ｍｇのタンパク質に対応する前記の得られる溶液３０ｍｌを、２．６×９．４ｃｍのＳｏｕｒｃｅＴＭ １５Ｑ （Ａｍｅｒｓｈｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ） 低圧アニオン交換クロマトグラフィーカラム上に４℃で負荷した（１ｍｌ／分）。次に、カラムを２５０ｍｌの平衡化緩衝液により、１ｍｌ／分の流速で洗浄した。
【０１４５】
タンパク質を、ＮａＣｌ線状濃度グラジエント（平衡化緩衝液において０〜０．５Ｍ；グラジエントの合計体積は１０００ｍｌであった）において、３ｍｌ／分の流速で溶出した。２分の画分を集め、そして基質としてβＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘを用いて、酵素活性決定に使用した。Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘへのその転位を、アントラサイクリン成分の蛍光検出を用いて、逆相高性能クロマトグラフィーにより定量化した。最高の活性レベルを含む画分をプールし（画分＃４３〜４６；約０．１３ＭのＮａＣｌ）、プロテアーゼインヒビター（ＣｏｍｐｌｅｔｅＴＭ， ＥＤＴＡ−フリー錠剤、Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）を補充し、そして−８０℃でアリコートとして貯蔵した。
【０１４６】
例４．ＨｅＬａ細胞トロウアーゼの精製
ＨｅＬａ細胞画分１（Ｆ１）を、例３に記載のようにして、５０×１０１０のＨｅＬａ細胞から調製し、但し、例３とは異なって、約３５０ｍｇのタンパク質の負荷による６回の実験を行い、そして５０μＭのＣｏＣｌ２を、平衡化及び溶出緩衝液に添加した。Ｆ１画分を、限外濾過（３０ＫＤ ＭＷＣＯ）により濃縮し、そして１．２５％のＥＤＴＡの存在下で、４℃で２時間インキュベートした。ＥＤＴＡを、平衡化された脱塩カラム（ＰＤ１０）上で除去し、そして平衡化緩衝液（２０ｍＭのリン酸、０．０１％のＴｒｉｔｏｎ−Ｘ１００、０．０２％のＮａＮ３、０．５ＭのＮＡＣｌ、ｐＨ７．２）により溶出した。
【０１４７】
次に、Ｆ１画分に対応する約２０ｍｇのタンパク質を、２５０ｍｌの５％ＥＤＴＡ、２５０ｍｌの水、２５０ｍｌの０．１ｍｌの０．１ＭのＣｏＣｌ２、２５０ｍｌの水及び２５０ｍｌの平衡化緩衝液により前もって連続的に処理された、１２×１５０ｍｍのＣｈｅｌａｔｉｎｇ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）カラム上に負荷した。サンプル吸着の後、カラムを１５０ｍｌの平衡化緩衝液により洗浄し、そして６００ｍｌの０〜０．２Ｍのイミダゾールグラジエントにより溶出した。すべての段階は、０．１ｍｌ／分の流速で行われた。４０分の画分を集めた。活性含有画分（約１ｍｌのタンパク質）をプールし、限外濾過により濃縮し、そして電気泳動サンプル緩衝液（０．１２Ｍのトリス−ＨＣｌ、５％のグリセロール、０．０１％のブロモフェノールブルー、ｐＨ６．８）により希釈した（１：１）。
【０１４８】
このサンプルを、分離用ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分別した。モデル４９１ＰｒｅｐＣｅｌｌ（ＢｉｏＲａｄ）を、０．３７Ｍのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．８）により緩衝された、３７×１２０ｍｍの７％Ｔ、２．５％Ｃ分解ゲル、及び０．１２Ｍのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ６．８）により緩衝された、３７×５ｍｍの４％Ｔ、２．６％Ｃ濃縮ゲルと共に使用した。電極緩衝液は、２５ｍＭのトリス、１９２ｍＭのグリシン（ｐＨ８．３）であり、そして溶出緩衝液は、１００ｍＭのトリエタノールアミン、０．０１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００， ５０μＭのＣｏＣｌ２（ｐＨ７．２）であった。３０ｍＡで３０分後、分離を、４０ｍＡで約２４時間、行った。１２分の画分を、０．４ｍｌ／分の溶出流速により集めた。
【０１４９】
活性を含む画分（約１５０μｇのタンパク質）をプールし、限外濾過により濃縮し、そしてサンプルを、平衡化されたゲル濾過ＨＰＬＣカラム（Ｔｏｓｏ Ｈａａｓ ＴＳＫ Ｇ３０００ＳＫＸＬ， ７．８×６００ｍＭ）に適用し、そして０．２ＭのＫ２ＳＯ４を含む、５０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）により０．３ｍｌ／分で溶出した。０．５分の画分を集めた。活性を含む画分を、−８０℃で貯蔵した。
【０１５０】
例５．トロウアーゼ及びヒト血液による可能性あるプロドラッグのスクリーニング
消化生成物のＨＰＬＣ分析に基づいて、プロドラッグの遊離毒性への活性化が、一連の酵素触媒された分解反応を通して生じる。例えば、プロドラッグ、Ｓｕｃ−βＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘを、癌細胞の抽出物又は癌細胞ならし培地において、少なくとも２種の酵素により触媒される２段階で、Ｌｅｕ−Ｄｏｘに転換する。初期エンドペプチダーゼ分解が、ＡＡ３（Ｐ１）及びＡＡ２（Ｐ１’）アミノ酸間で生じる、Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘを生成する。続いて、エキソペプチダーゼはアラニンを除去し、活性毒素、すなわちドキソルビシンが開放される細胞中に摂取されることが知られているロイシル−ドキソルビシンを得る。
【０１５１】
改良された治療指数を有するプロドラッグのための良好な候補体を、完全なヒト血液において比較的安定性である癌細胞により活性化する。３種の異なった癌調製物を用いて、種々のＮ−キャップされたペプチジル−毒素をスクリーンした。それらの３種の調製物は次の通りであった：
（ａ）ＭＣＦ７／６（乳癌）細胞ホモジネート；
（ｂ）ＭＣＦ７／６（乳癌）ならし培地；及び
（ｃ）ＨｅＬａ（頸部癌）細胞抽出物アニオン交換画分プール。
【０１５２】
単一のアミノ酸毒素接合体（すなわち、ＡＡ１−（任意のリンカー）−治療剤）に加水分解される化合物をさらに、完全なヒト血液において安定性について試験した。完全な血液を、市販の酸緩衝されたクエン酸完全血液収集管（Ｄｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いて集めた。
試験化学物を、１２．５μｇ／ｍｌの濃度で、癌酵素の３種の異なった調製物及び完全な血液と共に３７℃で２時間インキュベートした。インキュベーションに続いて、３種の体積のアセトニトリルを添加し、反応を停止し、そして混合物からタンパク質を除去した。サンプルを、１８．０００ｇで５分間、遠心分離し、そして上清液１００μｌを、ＨＰＬＣによる分析の前、水３００μｌと共に混合した。
【０１５３】
ＨＰＬＣ分析のために、５０μｌのサンプルを、４．６×５０ｍＭの２μ ＴＳＫ Ｓｕｐｅｒ−ＯＤＳクロマトグラフィーカラム上に４０℃で注入し、そして２０ｍＭの水性アンモニウムホルメート（ｐＨ４．５）緩衝液中、２６％〜６８％のアセトニトリルの３分の線状グラジエントにより、２ｍｌ／分で溶出した。検出は、２３５ｎｍの励起波長及び５６０ｎｍの発光波長を用いて、蛍光により行われた。
【０１５４】
所定の条件下でトロウアーゼにより分解され、そしてヒト血液において安定する試験化合物のオリゴペプチド部分が、図１０Ａ−１０Ｃに示される。図１０Ａ−１０Ｃに示されるすべてのオリゴペプチドに関して、試験化合物はスクシニル安定化基及びダウノルビシン治療剤を有した。さらに、配列番号１を有するオリゴペプチドを、安定化基としてアミノメチル安息香酸、及び治療剤としてダウノルビシンを用いて試験した。配列番号３５を有するオリゴペプチドを、安定化基としてジグリコール酸及びマレイ酸、治療剤としてダウノルビシンを用いて試験した。
【０１５５】
配列番号３８を有するオリゴペプチドをまた、多くの追加の安定化基及び治療剤により試験した。特に、配列番号３８のオリゴペプチドの試験化合物は、次のモノを包含した：アダマンテンカルボニル−βＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｎｒ、ジフェニル−アセチルβＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｎｒ、マレイン酸−βＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘ、４−モルホリンカルボニル−βＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｎｒ、ＰＥＧ−βＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘ、２−フロイル−βＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｎｒ、アセチル−βＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｎｒ、ジグリコール酸−βＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘ及びＮａｐｔｈ−βＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘ。
少数の例外を伴なって、癌酵素分解についての結果は、ＨｅＬａ細胞、ＭＦＣ７／６細胞ホモジネート又はＭＣＦ７／６ならし培地からの部分的に精製された画分について同じであった。
【０１５６】
例６．加水分解率
異なったプロドラッグについての加水分解率、又は免疫沈殿の後、トロウアーゼ及びＴＯＰ活性の測定値の比較のために、酵素試験溶液（上記例１〜４において調製されるような）を、１００μＭのＭｎＣｌ２を含む１０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．２）において、３７℃で２時間までの間、１０μｇ／ｍｌの基質と共にインキュベートした。反応を、３体積のアセトニトリルを添加することにより、停止した。沈殿されたタンパク質を遠心分離により、除去し、そして上清液を、上記例５に記載のようにして、ＨＰＬＣ分析の前、３体積の水に希釈した。加水分解された基質の画分を、基質及び生成物についての合計ピーク領域により生成物についてのピーク領域を割り算することによって計算した。
【０１５７】
部分的に精製されたＨｅＬａ細胞トロウアーゼの基質特異性は、Ｇｌｕｃｋｓｍａｎ ａｎｄ Ｒｏｂｅｒｔｓ， “Ｓｔｒａｔａｇｉｅｓ ｆｏｒ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｉｎｇ， ｃｌｏｎｉｎｇ， ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ｓｏｌｕｂｌｅ ｅｎｄｏｐｅｐｔｉｄａｓｅｓ”， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅｓ， ２３： ２９６−３１６ （１９９５）） の方法によれば、Ｅ．コリにおいて生成される組換えラットＴＯＰ（ｒＲＴＯＰ）の特異性に実質的に同一であった。９種のペプチジル試験化合物が、ＨｅＬａ細胞Ｆ１及びｒＲ−ＴＯＰによる類似する加水分解率を有することが見出された（表１）。すべてのペプチジルＤｏｘ基質に関して、Ｄｏｘ結合の反応生成物は、ＡＡ２−ＡＡ１−Ｄｏｘであった。例えばＳｕｃ−βＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘは、Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘ及びたぶん、Ｓｕｃ−βＡｌａ−Ｌｅｕに分解された。
【０１５８】
【表１】
2004510703.tif 000002
従って、癌細胞トロウアーゼ及びＴＯＰは、ほぼ同一の基質特異性を有する。
【０１５９】
例７．精製されたＣＤ１０による加水分解
等量の精製されたブタ腎臓ＣＤ１０（Ｅｌａｓｔｉｎ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ Ｃｏｍｐａｎｙ）を、１２．５μｇ／ｍｌの種々のペプチジルドキソルビシン化合物と共に、ｐＨ７．４の５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００において３７℃で１０時間までの間インキュベートした。反応生成物を、蛍光検出を用いて、ＨＰＬＣにより分析した。加水分解率は、インキュベーション期間で実質的に直線的であった。観察される生成物は、Ｌｅｕ−ドキソルビシンであった。表２は、１０時間にわたって加水分解された個々の試験化合物の％を提供する。さらに、それらの結果は、標準の試験化合物、Ｓｕｃ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘに対して表される。
【０１６０】
【表２】
2004510703.tif 000003
【０１６１】
例８．Ｔｏｐ及びＨｅＬａ細胞トロウアーゼの阻害及び不活性化
金属酵素について予測されるように、ＴＯＰは金属キレート化剤、例えばＥＤＴＡ及び１，１０−フェナントロリンへの暴露により不活性化される（Ｂａｒｒｅｎｔｔなど．， “Ｔｈｉｍｅｔ ｏｌｉｇｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ ａｎｄ ｏｌｉｇｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ Ｍｏｒ ｎｅｕｒｏｌｙｓｉｎ”， Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． ２４８： ５２９−５５６ （１９９５））。ペプチド化合物Ｎ−［１−（ＲＳ）−カルボキシプロピル−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−ｐ−アミノベンゾエート（Ｃｐｐ−ＡＡＦ−ｐＡＢ）］は、より選択性で且つ感受性のインヒビターである（Ｋｎｉｇｈｔ ａｎｄ Ｂａｒｒｅｔｔ， “Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ／ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ ｉｎ ｔｈｅ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｉｍｅｔ ｌｉｇｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ ｂｙ ｃａｒｂｏｘｙｐｈｅｎｙｌｐｒｏｐｙｌ−ｐｅｐｔｉｄｅｓ”， ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ ２９４： １８３−１８６ （１９９１））。
【０１６２】
Ｃｐｐ−ＡＡＦ−ｐＡＢはまた、密接に関連する金属ペプチダーゼ神経溶解素を阻害するが、単なる神経溶解素活性は５ｍＭのジペプチドＰｒｏ−Ｉｌｅにより阻害される（Ｓｅｒｉｚａｗａなど．， “Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｍｉｔｏｃｈｅｏｎｄｒｉａｌ ｍｅｔａｌｌｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ ｒｅｖｅａｌｓ ｎｅｕｒｏｌｙｓｉｎ ａｓ ａ ｈｏｍｏｌｏｇｕｅ ｏｆ ｔｈｉｍｅｔ ｏｌｉｇｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ”， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７０： ２０９２−２０９８ （１９９５））。ＭＣＦ−７／６細胞ホモジネートによる研究においては、トロウアーゼ活性は、１ｍＭのＥＤＴＡ及び２ｍＭの１，１０−フェナントロリンにより９倍、阻害されたが、ところが非金属ペプチダーゼのインヒビターは効果的でなかった。
【０１６３】
従って、５０μＭのアミノエチルベンゼンスルホニルフルオリド、４μｇ／ｍｌアプロチニン（両者ともセリンペプチダーゼを阻害する）、２０μＭのＥ−６４（システインペプチダーゼを阻害する）、１．５μＭのペプスタチン（アスパラギン酸ペプチダーゼを阻害する）、２０μＭのロイペプチン（セリン及びシステインペプチダーゼを阻害する）、又は１μＭのＣＡ−０７４（カテプシンＢを阻害する）により阻害されなかった。ＨｅＬａ細胞画分についての試験においては、１．３μＭのＣｐｐ−ＡＡＦ−ｐＡＢがＳｕｃ−βＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘ加水分解を完全に阻害したが、しかし５ｍＭのＰｒｏ−Ｉｌｅは効果を有さなかった。
【０１６４】
Ｂａｒｒｅｔｔ ａｎｄ Ｂｒｏｗｎ （“Ｃｈｉｃｋｅｎ ｌｉｖｅｒ Ｐｚ−ｐｅｐｔｉｄａｓｅ， ａ ｔｈｉｏｌ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｍｅｔａｌｌｏ−ｅｎｄｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ”， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｊ． ２７１： ７０１−７０６ （１９９０）） は、ＥＤＴＡに対する透析の後、再活性化を測定するために、精製された鶏ＴＯＰを使用した。５０μＭの濃度で、Ｚｎ２＋は活性を完全に回復した。同じ濃度での他の２価のカチオンは、次の有効性の順序で活性を一部、回復した：Ｍｎ２＋＞Ｃａ２＋＞Ｃｏ２＋＞Ｃｄ２＋。他の２価のカチオン、例えばＣｕ２＋は効果を有さなかった。過剰のＺｎ２＋（１００μＭ以上）は阻害性であった。ＥＤＴＡにより処理されたＭＣＦ−７／６細胞ホモジネートによる再構成実験においては、活性は、５０μＭのＣｏ２＋又はＭｎ２＋により完全に回復されたが、しかしＺｎ２＋又はＣｕ２＋によって回復されなかった。
【０１６５】
例９．ゲル濾過及び等電点電気泳動
ＭＣＦ−７／６細胞ホモジネートは、保持用量の活性ゲル濾過クロマトグラフィー画分に基づいて、６８ＫＤのおおよその分子量を有した。それらの測定値に関しては、ＭＣＦ−７／６細胞ホモジネート及びタンパク質分子量標準を、Ｓｕｐｅｒｏｓｅ Ｓ１２， １０×３００カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）上で分別した。ＨｅＬａ細胞からの精製されたトロウアーゼを、例１１に記載される方法を用いて、７４及び６３ＫＤに対応する２種のタンパク質バンドに、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）により分離した。
【０１６６】
約７４及び６３ＫＤのバンドが、抗−チミットオリゴペプチダーゼ抗体により染色されたＨｅＬａ細胞Ｆ１のＳＤＳ ＰＡＧＥウェスターンイムノブロットにおいて観察された。７４ＫＤのバンドがまた、ＭＣＦ−７／６、ＭＤＳ−ＭＤ−２３１及びＥＡ ｈｙ９２６細胞の粗ホモジネートのＳＤＳ ＰＡＧＥウェスターンブロットにおいて観察された。それらの結果は、７８ＫＤとしてＤＮＡ配列から推定され、そして種々のＳＤＳ ＰＡＧＥ決定において７４〜８０ＫＤとして報告されている、ヒト、ラット及びブタＴＯＰの分子量と一致する（Ｂａｒｒｅｔｔなど．， “Ｔｈｉｍｅｔ ｏｌｉｇｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ ａｎｄ ｏｌｉｇｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ Ｍｏｒｎｅｕｒｏｌｙｓｉｎ”， Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． ２４８： ５２９−５５６ （１９９５））。
【０１６７】
５．２の等電点が、Ｍｏｎｏ Ｐ ＨＲ５／５， ５×４０ｍｍカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ） 上でのクロマトフォーカシングによりＭＣＦ−７／６細胞ホモジネートトロウアーゼについて決定された。この結果は、種々の源からのＴＯＰについて一般的に報告される５．０±０．２７ｐＩ値と一致する（Ｔｉｓｌｊａｒ， “Ｔｈｉｍｅｔ ｏｌｉｇｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ−ａ ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ ａ ｔｈｉｏｌ ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｍｏｔａｌｌｏ−ｅｎｄｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ ａｌｓｏ ｋｎｏｗｎ ａｓ Ｐｚ−ｐｅｐｔｉｄａｓｅ ｅｎｄｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ ２４．１５ ａｎｄ ｅｎｄｏ−ｏｌｉｇｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ”， Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． Ｈｏｐｐｅ． Ｓｅｙｌｅｒ． ３７４： ９１−１００ （１９９３））。
【０１６８】
例１０．チオール活性化
ＭＣＦ−７／６ならし培地を、示される濃度でのジチオトレイトール（ＤＴＴ）と共に室温で３０分間、プレーインキュベートした。次に、１０μｇ／ｍｌのＳｕｃ−βＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘを添加し、そして３７℃でインキュベートした。加水分解生成物を抽出し、そして上記のようにして、Ｌｕｎａ　Ｃ１８−３μ、４．６×１００ｍｍカラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）上で分析した。残留Ｓｕｃ−βＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘ基質を、内部標準として、硼酸よりもむしろｐＨ３．０のクエン酸緩衝液及びＮ−スクシニルドキソルビシンを用いて抽出し、そして、上記のようなＬｕｎａ Ｃ１８−３μカラム上で分析した。
【０１６９】
ほとんどの金属ペプチダーゼとは異なって、ＴＯＰは、低レベルのチオール還元剤、例えば５０μＭのジチオトレイトール（ＤＴＴ）又は１ｍＭのメルカプトエタノールにより活性化されるが、しかし高濃度、例えば５ｍＭのＤＴＴで阻害される（Ｏｒｌｏｗｓｋｉ， など． “Ｅｎｄｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ ２４．１５ ｆｒｏｍ ｒａｔ ｔｅｓｔｅｓ． Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｅｎｚｙｍｅ ａｎｄ ｉｔｓ ｓｐｅｃｉｆｉｘｉｔｙ ｔｏｗａｒｄ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ａｎｄ ｎａｔｕｒａｌ ｐｅｐｔｉｄｅｓ， ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ｅｎｋｅｐｈａｌｉｎ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｐｅｐｔｉｄｅｓ，” Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ ２６１： ９５１−９５８ （１９８９）； Ｔｉｓｌｊａｒ ａｎｄ Ｂａｒｒｅｔｔ “Ｔｈｉｏｌ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｍｅｔａｌｌｏ−ｅｎｄｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ ｏｆ Ｐｚ−ｐｅｐｔｉｄａｓｅ ｉｎ ｒａｔ ａｎｄ ｒａｂｂｉｔ，” Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ２６７： ５３１−５３３ （１９９０）； Ｌｅｗ， など． “Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ ｂｅｔｗｅｅｎ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｒａｔ ｔｅｓｔｅｓ ｅｎｄｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ ＥＣ ３． ４． ２４． １５ ａｎｄ ｔｈｅ ｎａｔｉｖｅ ｂｒａｉｎ ｅｎｚｙｍｅ， “Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ ２０９： ７８８−７９５ （１９９５））。
【０１７０】
Ｓｈｒｉｍｐｔｏｎなど．， “Ｔｈｉｏｌ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｅｎｄｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ ＥＣ ３． ４． ２４． １５。Ａ ｎｏｖｅｌ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｆｏｒ ｔｈｅ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｃａｔａｌｙｔｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ”， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７２： １７３９５−１７３９９ （１９９７） は、還元剤がＴＯＰ酵素タンパク質の不活性ジスルフィド結合のダイマーの形成を逆転することによって活性化することを示した。同様に、ＭＣＦ−７／６細胞ならし培地によるＤＴＴ前処理実験は、高レベルでの阻害性を伴なって、１ｍＭのＤＴＴでＳｕｃ−βＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘ加水分解の１０倍の活性化を示した（図１３）。従って、ＴＯＰ及び癌細胞トロウアーゼの両者は、低レベルのチオール還元剤により活性化される。
【０１７１】
例１１．ｐＨ最適性
上記例１において調製されるようなＭＦＣ−７／６細胞ホモジネートを、種々のｐＨレベルで緩衝された１００ｍＭのトリエタノールアミンにおいて、βＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｃｏｎと共に３７℃でインキュベートした。Ｌｅｕ−Ｃｏｕの量を、ロイシンアミノペプチダーゼによる反応生成物の処理、及び得られるアミノメチルクマリン濃度の分光蛍光計による測定により決定した。ＴＯＰは、消光された蛍光基質による１０分間のアッセイに関して、７．８のｐＨ最適性を有する（Ｂａｒｒｅｔｔ、１９９５）。
【０１７２】
消光された蛍光基質Ｍｃｃ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＤＮＰ）によるアッセイは、Ｂａｒｒｅｔｔなど．， （“Ｔｈｉｍｅｔ ｏｌｉｇｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ ａｎｄ ｏｌｉｇｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ Ｍ ｏｒ ｎｅｕｒｏｌｙｓｉｎ”， Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． ２４８： ５２９−５５６ （１９９５）） に記載される通りであった。ＭＣＦ−７／６細胞ホモジネートトロウアーゼ活性ｐＨ最適性は、βＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｃｏｕアッセイを用いてのＭＣＦ−７／６細胞ホモジネート活性について７．２〜７．７であった。従って、ＴＯＰ及びトロウアーゼ活性は、類似するｐＨで最適化される。
【０１７３】
例１２．精製されたＨｅＬａ細胞トロウアーゼトリプシン消化物の質量分光学
精製されたＨｅＬａトロウアーゼを一晩、凍結乾燥し、３０μｌのサンプル充填緩衝液に９０℃で１分間、溶解し、遠心分離し、不溶性材料を除去し、そして小形式ゲルに基づいてのＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離した。操作条件は、４５分間、３０ｍＡ， ３００Ｖであった。クーマシーブルーＲ２５０による染色の後、７４及び６３ＫＤの分子量に対応する２つのバンドが明らかであった。
【０１７４】
個々のバンドの２×２ｍｍ断片を、小管に移し、そして次の個々の溶液と共に撹拌しながら、１５分の段階で洗浄した：２５ｍＭの炭酸水素（アンモニウム）、水中、５０％のアセトニトリル、２５ｍＭの炭酸水素（アンモニウム）。次に、サンプルを、遠心分離濃縮機（Ｓｐｅｅｄｖａｃ）において乾燥し、そして０．５μｇのトリプシンを含む、２５ｍＭの炭酸水素アンモニウム溶液１０μｌと共に３７℃で３時間インキュベートした。Ｎａｎｏｓｐｒａｙ−ＭＳのために、トリプシン消化物の一部を、アセトニトリルにより抽出し、遠心分離真空濃縮機（Ｓｐｅｅｄｖａｃ）において乾燥し、そして分析の前、ＺｉｐＴｉｐＴＭ Ｃ１８ 微抽出装置により精製した。
【０１７５】
７４ＫＤのバンドからのトリプシン消化されたタンパク質を、ＭＡＬＤＩ−ｔｏｆ（マトリックス助力のレーザー脱着イオン化−飛行の時間）質量分光計により分析した。トリプシン消化物の質量スペクトルを、レフレクターモードで作動する遅延された抽出性を備えたＢｉｆｌｅｘ（Ｂｒｕｋｅｒ）ＭＡＬＤＩ−ｔｏｆ質量分光計上で獲得した。０．４μｌの個々の消化物（２５ｍＭの炭酸水素アンモニウムにおける）を、ニトロセルロースと共に混合された乾燥薄層α−シアノ−４−ヒドロキシ−桂皮酸（ＣＣＡ）マトリックス（イソプロパノール：アセトン（１：１）中、飽和ＣＣＡ：５ｎｇ／ｍｌのニトロセルロース（４：３；ｖ／ｖ））において、サンプルプローブ上に直接的に折出した。サンプルを、分析の前、０．１％のＴＦＡにより洗浄した。
【０１７６】
個々の消化物に関して得られるペプチド質量フィンガープリントを、ＭＳ−ＦＩＴ（ｈｔｔｐ：／／ｐｒｏｓｐｅｃｔｏｒ．ｕｃｓｆ．ｅｄｕ／ｕｃｓｆｈｔｍ１３．２／ｍｓｆｉｔ．ｈｔｍ）を用いて既知のタンパク質配列からの予測される消化物パターンに適合せしめた。表３に示されるように、予測されるヒトＴＯＰトリプシン断片化パターンへの観察される分子イオンの比較は、予測される質量を有する２０のバンドをもたらした。それらの適合性は、既知のヒトＴＯＰ配列の３３％を占めた（Ｔｈｏｍｐｓｏｎなど．， “Ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ａ ｍｅｔａｌｌｏｅｎｄｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ ｆｒｏｍ ｈｕｍａｎ ｂｒａｉｎ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ａｂｉｌｉｔｙ ｔｏ ｃｌｅａｖｅ ａ ｂｅｔａ−ＡＰＰ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ”， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃａｍｍｕｎ． ２１３： ６６−７３ （１９９５））。トリプシン消化の後、６３ｋＤのバンドのＭＡＬＤＩ−ｔｏｆ分析は、それが、カルボキシ末端の小さな部分の不在を除いて、同じ配列を共有したことを示した。
【０１７７】
【表３】
2004510703.tif 000004
【０１７８】
エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）四極子飛行時間（Ｑ−ｔｏｆ）タンデム質量分光測定を、ナノスプレーモードで作用するＺ−スプレーイオン源を有するＱ−ｔｏｆ装置（Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ）を用いて行った。約３〜５μｌの精製されたサンプルを、サンプル針（ＰＲＯＴＡＮＡ Ｉｎｃ．， Ｏｄｅｎｓｅ， ＤＫ）中に導入し、ＭＳ及びＭＳ／ＭＳ実験を行った。平均細管電位は１０００Ｖであり、そしてサンプルコーンを５０Ｖに設定した。ヒト［Ｇｌｎ１］−フィブリノペプチドＢを用いて、ＭＳ／ＭＳモードで装置を検量した。ＭＳ／ＭＳスペクトルを、ＭａｘＥｎｔ３を用いて変換し、そして配列を、ＰｅｐＳｅｑ（Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ Ｂｉｏｌｙｎｘ）を用いて決定した。
【０１７９】
構造同一性のさらなる確認のために、２種のＨｅＬａ細胞トリプシン処理された７４ＫＤのフラグメントを、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）四極子飛行時間（Ｑ−ｔｏｆ）タンデム質量分光測定により配列決定した。表４に示されるように、両フラグメントは、ヒトＴＯＰの既知配列と完全に一致した（Ｔｈｏｍｐｓｏｎなど．， “Ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ａ ｍｅｔａｌｌｏｅｎｄｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ ｆｒｏｍ ｈｕｍａｎ ｂｒａｉｎ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ａｂｉｌｉｔｙ ｔｏ ｃｌｅａｒｅ ａ ｂｅｔａ−ＡＰＰ ｓｕｂｅｔｒａｔｅ ｐｅｐｔｉｄｅ”， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ． ２１３： ６６−７３ （１９９５））。比較によれば、前記配列は、ラット及びブタＴＯＰの配列と接近するが、しかし同一ではない。
【０１８０】
【表４】
2004510703.tif 000005
【０１８１】
例１３．免疫沈殿
免疫沈殿を２段階で行った。第１段階においては、５μｌの試験酵素を、１０ｍＭのヒドロキシエチルピペラジン（ＨＥＰＥＳ）（ｐＨ７．２）、１５０ｍＭのＮａＣｌ溶液において、１：２５０に希釈された抗−ＴＯＰ又は不適切なウサギＩｇＧ（１０μｌ）と共に４℃で１時間インキュベートした。第２段階においては、この混合物を、同じ緩衝液において平衡化された１５μｌのプロテインＡセファロース（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ） に添加し、そして４℃で１時間インキュベートした。微小遠心分離の後、残留酵素活性を、上清液において決定した。
【０１８２】
免疫沈殿は、構造同一性のさらなる表示を提供する。部分的に精製されたＨｅＬａトロウアーゼ（Ｆ１）活性を、ウサギ抗−ＴＯＰ、続くＳｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）ビース固定のプロテインＡとのインキュベーションの後、溶液から完全に除去した。同様に、ＭＣＦ−７／６細胞ホモジネートトロウアーゼ活性を、ウサギ抗−ＴＯＰ抗体による免疫沈殿により８０％に低めた。対照実験は、同じ条件下で、ｒＲ−ＴＯＰが完全に免疫沈殿されたが、しかし不適切なウサギ抗体とのインキュベーションはｒＲ−ＴＯＰ、ＨｅＬａ細胞トロウアーゼ活性、又はＭＣＦ７／６トロウアーゼ活性のいずれも免疫沈殿しなかったことを示した。
【０１８３】
例１４．トロウアーゼについての特異性は、位置Ｐ２での非遺伝的にコードされたアミノ酸により提供される
特異性は、位置Ｐ２での、遺伝的にコードされたアミノ酸によりむしろ非遺伝的にコードされたアミノ酸の組み込みにより付与される。特に、位置Ｐ２での非遺伝的にコードされたアミノ酸β−アラニンを含む、Ｓｕｃ−βＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｎｒを、例１〜３に記載される３種の調製物の個々と共に、例５に記載のようにしてインキュベートした。次に、分解の程度を、その得られる混合物のＨＰＬＣ分析により評価した。
【０１８４】
それらの結果を、Ｐ２位置での遺伝的にコードされたアミノ酸Ｌ−アラニンの位置を除いて同じ化合物により行われる同じインキュベーションについて得られる結果と比較し、例えばＳｕｃ−βＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｎｒ対Ｓｕｃ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｎｒを比較した。細胞ホモジネートによる分解の程度（割合）は、Ｐ２のＬ−アラニン化合物対Ｐ２のβ−アラニン化合物について１．３倍高かった。しかしながら、部分的に精製されたトロウアーゼ調製物に関して、Ｐ２のＬ−アラニン化合物の分解の程度は、Ｐ２のβ−アラニン化合物のその程度のわずか０．６倍であった。それらの結果は、Ｐ２でのＬ−アラニンの存在が酵素のより粗製の混合物のために第２の分解部位を提供したことを示唆し；従って、インビボでの活性薬剤の開放が腫瘍組織に局在化される傾向を減じる。
【０１８５】
例１５．プロドラッグは分解の前、不良な細胞摂取を有する
前骨髄球性白血病細胞、すなわちＨＬ−６０を、１０％熱不活性化されたウシ胎児血清（ＦＣＳ）を含むＲＰＭＩ培地において培養した。研究の日、細胞を集め、洗浄し、そして１０％のＦＣＳを含むＲＰＭＩに、０．５×１０６個の細胞／ｍｌの濃度で再建濁した。１００μｌ／ウェルの細胞懸濁液を、９６ウェルプレートに添加した。ドキソルビシン又は試験化合物の一連の希釈溶液（３倍の増大）を製造し、そして１００μｌの化合物をウェルに添加した。最終的に、１０μｌの１００μＣｉ／ｍｌの３Ｈ−チミジンをウェル当たり添加し、そしてプレートを２４時間インキュベートした。プレートを、９６ウェル収穫機（Ｐａｃｋａｒｄ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ） を用いて収穫し、そしてＰａｃｋａｒｄ Ｔｏｐ Ｃｏｕｎｔカウンター上で計数した。４パラメーターロジスティック曲線を、Ｐｒｉｓｍソフトフェアを用いて、薬剤モル濃度の関数として、３Ｈ−チミジン組み込みに適合せしめ、ＩＣ５０値を決定した。
【０１８６】
【表５】
2004510703.tif 000006
【０１８７】
ドキソルビシンは、ＨＬ６０細胞における０．０７５μＭのＩＣ５０を伴なって、可能性ある細胞毒性活性を示す。対照的に、プロドラッグＳｕｃ−βＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘは、ＨＬ−６０増殖アッセイにおいては、不良な細胞摂取及び５０μＭ以上のＩＣ５０を有する。インビボ分解研究は、ロイシル−ドキソルビシンが、プロドラッグＳｕｃ−βＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘのタンパク質加水分解の後に形成される中間体であることを示す。従って、ロイシル−ドキソルビシンを試験し、そして０．２２２μＭのＩＣ５０を有することを示した。それらのデータは、ロイシル−ドキソルビシンが、それが活性ドキソルビシンを開放するために分解される細胞により摂取される概念を支持する。
【０１８８】
例１６．マウスにおける比較代謝
２つのグループのＩＣＲ正常雌マウスに、約１００μモル／ｋｇのＳｕｃ−βＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘ又は１０μモル／ｋｇのドキソルビシン（Ｄｏｘ）の１回のＩＶボーラス用量を投与した。血漿を、５分、１，２，４又は６時間で、個々のグループにおける３匹の個々の動物から得た。親、ジペプチジル−ドキソルビシン（ＡＬ−Ｄｏｘ）、α−アミノ−ドキソルビシン（Ｌ−Ｄｏｘ）及びドキソルビシン濃度を、蛍光検出（λｅｘ＝４８０ｎｍ，λｅｍ＝５６０）を用いて、逆相グラジエントＨＰＬＣにより、血漿サンプルの抽出物において分析した。量を、マウスの血漿における１０〜２０００ｎｇ／ｍｌのドキソルビシン溶液の測定値に対する線状標準曲線適合性を用いて決定した。
【０１８９】
６時間までの時間の経路に基づけば、Ｌ−Ｄｏｘが最初の２時間、主要代謝物であり、そしてジペプチジル−接合体ＡＬ−Ｄｏｘが、Ｌ−Ｄｏｘとほぼ同じ時間で形成されるよりマイナーな生成物であった。ドキソルビシンは、後で出現し、そしてその血漿濃度は、現在及び前に測定されたドキソルビシン薬物動力学プロフィールから（Ｖａｎ ｄｅｒ ｖｉｊｇｈなど．， “Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ａｎｄ ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ ｏｆ ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ ａｎｄ ４’−ｅｐｉｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ ｉｎ ｐｌａｓｍａ， ｈｅａｒｔ ａｎｄ ｔｕｍｏｒ ｏｆ ｔｕｍｏｒ−ｂｅａｒｉｎｇ ｍｉｃｅ”， Ｃａｎｃｅｒ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． ２６ （１）： ９−１２ （１９９０）； 及びＴａｂｒｉｚｉ−Ｆａｒｄなど．， “Ｅｖａｌｕａｔｕｉｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ａ Ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ Ｐｒｏｄｒｕｇ ｉｎ Ｆｅｍａｌｅ ＩＣＲ （ＣＤ１（商標）） Ｍｉｃｅ Ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ Ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ”， Ｐｒｏｃ． Ａｍｅｒ． Ａｓｓｏｃ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ４２： ２３４ （２００１））及びドキソルビシン対照グループにより予測されるような他の代謝物よりも、時間にわたってよりゆっくり低下する。
【０１９０】
これは、続くエキソペプチダーゼ活性による連続的な分解と一致する。ドキソルビシンについての血漿濃度時間曲線下の領域（ＡＵＣ）（表６）は、Ｓｕｃ−βＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘが、ドキソルビシンのみへの同等のドキソルビシン暴露を生成したことを示す。これらの化合物の投与の後、ドキソルビシン暴露は、マウス安全性研究において最大の許容される用量として表される相対的安全性に類似することが注目されるべきである。
【０１９１】
【表６】
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【０１９２】
その結果、１０倍の用量のＳｕｃ−βＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘが、ドキソルビシンに対する類似する暴露を生成した。この研究においては、Ｓｕｃ−βＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘは、その単一回の用量（ＳＤ）及び反復用量（ＲＤ）ＭＴＤの約２倍で投与され、そしてドキソルビシンはそのＳＤ ＭＴＤの約２５％で投与されるが、しかしＲＤ ＭＴＤに等しい用量で投与された。血漿からの分解されていないＳｕｃ−βＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘの急速なクリアランスは明らかに、ドキソルビシンに比較して、Ｓｕｃ−βＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘ化合物の高い相対的許容性をもたらす。ドキソルビシンは比較的より遅くクリアランスされる。従って、プロドラッグは、ＭＴＤにおける相対的差異により示されるように、過剰の薬物を安全にクリアランスしながら、効果的レベルのドキソルビシン暴露への投与を可能にするので、反復−用量処理、例えば化学療法に使用されるそれらの処理において好都合である。
【０１９３】
例１７．プロドラッグは、腫瘍異種移植モデルにおいて効果的であり、且つ十分に許容できる
Ｓｕｃ−βＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘは、エストロゲン−依存性ＭＣＦ−７／６乳癌及びアトリアマイシン体制結腸直腸癌ＣＸＦ２８０／１０及びＬＳ−１７４Ｔを包含する、いくつかのヌードマウス異種移植モデルにおけるヒト腫瘍の増殖を阻害することにおいて効果的であることがわかっている。
【０１９４】
例えば、皮下移植されたＬＳ１７４Ｔ腫瘍を有する１０匹のマウスのグループがＳｕｃ−βＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘ治療剤の週５回静脈内用量により処理される場合、生存の平均日（ＭＳＤ）における有意な用量依存性延長が観察され、そして５７（グループ２）、６４（グループ３）及び７１（グループ４）ｍｇ／ｋｇのＳｕｃ−βＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘの用量で、ビークル処理された対照（グループ１）に比較して、腫瘍のサイズ（腫瘍体積）の低下が観察され、そして最高の用量は４０ｍｇ／ｋｇのドキソルビシンに等しかった（図１１を参照のこと）。薬剤は、抗腫瘍効能を示す用量の反復用量レベル及び頻度下で、安全且つ十分に許容できた。いくらかの用量依存性体重の低下が観察された。研究の支持においては、腎臓毒性及び骨髄抑制は、１０６．８ｍｇ／ｋｇまでの用量のＳｕｃ−βＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘで観察されなかった。
【０１９５】
例１８．Ｓｕｃ−βＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘはドキソルビシンよりもインビボでより許容される
本発明の典型的なテトラペプチドプロドラッグＳｕｃ−βＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘは、マウスにおいて良好に許容される。第２の１回の用量の最大許容用量（ＳＤ−ＭＴＤ）研究においては、５匹の正常ＩＣＲマウスのグループが、ボーラス用量のＳｕｃ−βＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘを静脈内投与された。マウスを毎日、４９日間、観察し、そして体重を週２度、測定した。試験される用量レベルは、それぞれ、０， ２９， ４２又は５６ｍｇ／ｋｇのドキソルビシンに等しい、０， ５０， ７５又は１００ｍｇ／ｋｇであった。いずれの用量レベルでも、２４時間以内に急性毒素は存在しなかった。
【０１９６】
毒性の用量及び時間依存性徴候が、この研究の間、観察された。毒性、例えば部分的な後脚の麻痺及び有意な体重の低下（それらの初期体重の２０％以上）が、７５及び１００ｍｇ／ｋｇの用量グループにおいて観察された。３５日までに、死亡率は、７５ｍｇ／ｋｇの用量グループの４０％に観察された。４９日での生存率及び毒性の徴候の欠失に基づいて、Ｓｕｃ−βＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−ＤｏｘについてのＳＤ−ＭＴＤは、５０ｍｇ／ｋｇ（２８ｍｇ／ｋｇのドキソルビシンに相当する）であることが決定された。
【０１９７】
この用量は非常に許容され、そして悪影響は観察されなかった。従って、ＳＤ−ＭＴＤは、ドキソルビシンのみについてのＳＤ−ＭＴＤ（１６ｍｇ／ｋｇ）よりも、モル濃度に基づいて約１．８倍、高かった。表７を参照のこと。これは、試験される範囲にわたって１４ｍｇ／ｋｇのドキソルビシン等量の増分での用量の範囲に基づいてのおおよそのＳＤ−ＭＴＤ決定である。
【０１９８】
プロドラッグの毒性プロフィールに関する予備観察は、それが一般的に、ドキソルビシンのその観察、例えば後での麻痺及びるいそうと一致することを示した。しかしながら、ドキソルビシンの特徴的なＧＩ−毒性、心臓毒性及び骨髄抑制の形跡の欠失を包含する、毒性プロフィールにおける好ましいシフトを示すいくつかの差異が見られた。腎臓に対する著しい効果は観察されなかった。
【０１９９】
【表７】
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【０２００】
例１９．プロドラッグは比較体よりもより安全で且つより効果的である
有意に高い用量のＳｕｃ−βＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘが投与され、それは、ドキソルビシンと比較して、ＬＳ−１７４Ｔヒト結腸直腸癌異種移植モデルにおける有意な毒性を有さない効力を達成することができる。４９（グループ３）、５７（グループ４）及び６５ｍｇ／ｋｇ（グループ５）の十分に許容される用量でのＳｕｃ−βＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘは、急速に増殖するアドリアマイシン耐性ＬＳ−１７４Ｔ腫瘍の阻害（図５）及び腫瘍担持のマウスの生存性の延長（図１２）において、３．０ｍｇ／ｋｇ （グループ２）及び塩溶液（グループ１）でのドキソルビシンに比較して、卓越した効力を示した。用量制限毒性（心臓毒性及び骨髄抑制）が、ヒトにけるドキソルビシンの反復投与により観察された。従って、本発明者のドキソルビシンよりも高い用量のＳｕｃ−βＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘが投与され、それが全身性毒性よりも腫瘍阻害を好むことを示した。
【０２０１】
例２０．プロドラッグは適度なドキソルビシン感受性腫瘍に対して有用である
適度なドキソルビシン感受性のヒト乳癌異種移植体であるＭＸ−１腫瘍を、皮下（Ｓ．Ｃ．）移植し、そして投与の開始（日０）の前、少なくとも週１度、次に研究の間、週２度、マウスを計量し、そして腫瘍を測定した（カリパスによる）。投与の開始の直前（研究日２〜日０）、マウスを、腫瘍の重量に基づいて、種々のグループにランダマイズした。腫瘍が１．５ｇのカットオフ重量（エンドポイント）に達した後、マウスを安楽死せしめた。研究は、日６０で終結された。
【０２０２】
【表８】
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【０２０３】
対照グループ腫瘍は急速に増殖し、そしてすべての動物を、日２４までに、癌エンドポイントで終結した。腫瘍は比較的均等な増殖特性を示し、日１５〜２４の範囲の癌エンドポンとに達した。ドキソルビシンは、腫瘍担持のマウスの存在性を有意に延長することにおいて効果的であった（表８）。用量応答性を、ＭＸ−１腫瘍増殖の阻害及びマウス生存性の延長の両者においてＳｕｃ−βＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘについて確立した（図１８及び表８）。７１ｍｇ／ｋｇでのＳｕｃ−βＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘは、腫瘍増殖の阻害及びマウス生存性の延長において、ドキソルビシンよりも有意に良好であった（表８）。Ｓｕｃ−βＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘ及びドキソルビシンのすべての３種の用量レジメは、非常に良好に許容された。Ｓｕｃ−βＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘ７１ｍｇ／ｋｇグループにおける１０匹のマウスのうちわずか１匹が、研究の最後の方で、２０％までの重量の低下を有した（日４６の後）。
【０２０４】
例２１．プロドラッグは、多薬剤耐性機構の回避において有用である
Ｓｕｃ−βＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘは、異種移植モデルにおいてマウスに移植されるＭＤＲヒト細胞系に対して、遊離ドキソルビシンよりも活性的であることが示されている。変性された形、特にＳｕｃ−βＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘとしてのプロドラッグ形で腫瘍に供給されるドキソルビシンは、その用量グループにおいて生存の有意な延長をもたらす腫瘍増殖の遅延において活性を示す。
【０２０５】
表９及び図１５は、Ｓｕｃ−βＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘに関して、ＭＤＲヒト結腸直腸癌ＬＳ１７４−Ｔにおける生存性の用量依存性上昇が存在することを示す。ＬＳ１７４Ｔは、壊死中心を有する異種細胞形態学を示す、非常に攻撃的で且つ急速に増殖する腫瘍である。それは従来の化学療法に対して非常に耐性であり、そして数日以内に十分に確立されたようになる腫瘍がいくつかの動物において常に存在するので、それらの動物は腫瘍の増殖を阻害する試みを急速に促進し、従って、動物は、処理にもかかわらず、腫瘍エンドポイントに達する。ドキソルビシンは単独で、このモデルにおいて完全に不活性であり、腫瘍の増殖又は生存性に対して効果をもたらさない。
【０２０６】
【表９】
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【０２０７】
特に、表９は、ヌードマウス（Ｑ７Ｄｘ５）におけるＬＳ１７４Ｔ結腸直腸癌異種移植において、ドキソルビシンに比較して、３用量レベルでのＳｕｃ−βＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘの効果の要約を提供する。測定されるパラメーターは、１５００ｍｇ（腫瘍死）の予定されたカットオフサイズに達する腫瘍のために、終結により決定される、計算された平均生存日（ＭＤＳ）、長期生存体（ＬＴＳ）の数、及び毒性死（体重の２０％以上の損失）を示すマウスの数による用量レジメの許容性を包含する。日６０でのＬＴＳの数は、すべてのグループにおいてゼロであった。毒性死は、いずれのグループにおいても観察されなかった。ビークル対象グループからの統計学的有意性：＊：ｐ＜０．０５；＊＊：ｐ＜（不対ｔ−検定）。
【０２０８】
対照グループ腫瘍は急速に増殖し、そしてすべての動物を、日３３までに、癌エンドポイントで終結した。腫瘍は異質の増殖特性を示し、日１５〜３３の癌エンドポイントに達した。ドキソルビシン（３ｍｇ／ｋｇ）は、ＬＳ１７４Ｔ腫瘍増殖の阻害又は生存性の延長において無効果であった。用量応答性を、マウス生存性の延長においてＳｕｃ−βＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘについて確立した（表９）。６４ｍｇ／ｋｇでのＳｕｃ−βＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘは、マウス生存性の延長において、ドキソルビシンよりも有意に良好であった（表９）。５７ｍｇ／ｋｇでのＳｕｃ−βＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘは、ＬＳ１７４Ｔ腫瘍増殖を有意に阻害した（図１５及び表９）。Ｓｕｃ−βＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘ及びドキソルビシンのすべての３種の用量レジメは、非常に良好に許容され、そして毒性エンドポイントのために終結は存在しなかった。
【０２０９】
さらに、３種の良好に許容される用量レベル（Ｑ７ｄｘ５）で投与されるＳｕｃ−βＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘ（但し、ドキソルビシンではない）は、メジアン腫瘍重量に対して用量依存性阻害効果を示した（図１５）。
図１５は、ヌードマウス及びビークル対照におけるＬＳ１７４Ｔ腫瘍結腸直腸癌異種移植の腫瘍増殖に対する、ドキソルビシンに比較してのＳｕｃ−βＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘの効果を示す。グループＤは、日１９でビークル対照グループとは統計学的に有意に異なった（ｐ＜０．０５）。
それらの結果は、腫瘍における高濃度での活性細胞毒性の局部生成がＭＤＲ経路を克服する治療剤のプロドラッグ形の秘訣であり得ることを示唆する。
【０２１０】
例２２．βＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘ凝集
不十分な溶解性のアントラサイクリン薬剤は、水性緩衝液において調製される場合、凝集体を形成することが示されている（Ｍｅｎｏｚｚｉなど．， “Ｓｅｌｆ−ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｏｆ ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ ａｎｄ ｒｅｌａｔｅｄ ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ ｉｎ ａｑｕｅｏｕｓ ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ”， Ｊ． Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔ． Ｓｃｉ．， ７３： ７６６−７７０ （１９８４）； Ｃａｎｆａｌｏｎｉｅｒｉなど．， “Ｔｈｅ ｕｓｅ ｏｆ ｎｅｗ ｌｅｓｅｒ ｐａｒｔｉｃｌｅ ｓｉｚｅｒ ａｎｄ ｓｈａｐｅ ａｎａｌｙｓｅｒ ｔｏ ｄｅｔｅｃｔ ａｎｄ ｅｖａｌｕａｔｅ ｇｅｌａｔｉｎｏｕｓ ｍｉｃｒｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｓｕｓｐｅｎｄｅｄ ｉｎ ｒｅｃｏｎｓｔｉｔｕｔｅｄ ａｎｔｈｒａｃｙｃｌｉｎｅ ｉｎｆｕｓｉｏｎ ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ”， Ｊ． Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔ． Ｂｉｏｍｅｄ． Ａｎａｌ． ９： １−８ （１９９１））。
【０２１１】
１７．４μＭ／ｍｌの水溶液におけるβＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘ凝集体サイズの評価を、それらの溶液をＡｍｉｃｏｎ ＣｅｎｔｒｉｃｏｎＴＭ フィルター単位を通して濾過する試みにより行った。ドキソルビシン（１７．４μＭ／ｍｌ）及びβＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘ（１７．４μＭ／ｍｌ）をそれぞれ蒸留水に溶解し、そして３，０００， １０，０００， ３０，０００及び５０，０００分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）を有するＣｅｎｔｒｉｃｏｎフィルター中に配置した。個々のフィルター単位を、１５００ｇで２時間、遠心分離した。フィルターを通して保持され、そして通過する薬剤の量を、λ４７５ｎｍで定量化し、そして％に転換した。
【０２１２】
表１０は、ドキソルビシンの８１％が３，０００ＭＷＣＯフィルターを通して通過し、そして接合体、すなわちβＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘのわずか５％が３，０００ＭＷＣＯフィルターを通過したことを示す。データは、５０，０００ＭＷＣＯがβＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘの４０％以上を保持することを示す。それらのデータは、有意な％のβＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘ凝集体が５０ＫＤよりも大きい（＞５０分子／凝集体）ことを示す。従って、βＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘはいくつかの条件下で凝集することができる。
【０２１３】
【表１０】
2004510703.tif 000011
【０２１４】
例２３．マウスにおけるβＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘの静脈内注入
急性毒性はたぶん、正に荷電されたポリマー、例えばプロタミン、ポリリシン又はそれらの凝集体、及び血管の管腔表面の相互作用を通して生じることは知られている（Ｄｅｌｕｃｉａなど．， “Ｅｆｆｉｃａｃｙ ａｎｄ ｔｏｘｉｃｉｔｙ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｌｙ ｃｈａｒｇｅｄ ｐｏｌｙｃａｔｉｏｎｉｃ ｐｒｏｔａｍｉｎｅ−ｌｉｋｅ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｆｏｒ ｈｅｐａｒｉｎ ａｎｔｉｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ ｒｅｖｅｒｓａｌ”， Ｊ． Ｖａｓｅ． Ｓｕｒｇ． １８： ４９−６０ （１９９３）； Ｅｋｒａｍｉなど．， “Ｃａｒｂａｍｙｌａｔｉｏｎ ｄｅｃｒｅａｓｅ ｔｈｅ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ ｂｕｔ ｎｏｔ ｔｈｅ ｄｒｕｇ−ｃａｒｒｉｅｒ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｆｏ ｐｏｌｙｌｙｓｉｎｅｓ”， Ｊ． Ｄｒｕｇ Ｔａｒｇ． ２： ４６９−４７５ （１９９４））。
【０２１５】
ヘパリンはウサギ心筋に対する硫酸プロタミンの毒性効果を減じることはさらに示されている（Ｗａｋｅｆｉｌｄなど．， “Ｈｅｐａｒｉｎ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｒｅｄｕｃｔｉｏｎｓ ｏｆ ｔｈｅ ｔｏｘｉｃ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｐｒｏｔａｍｉｎｅ ｓｕｌｆａｔｅ ｏｎ ｒａｂｂｉｔ ａｙｏｃａｒｄｉｕｍ”， Ｊ． Ｖａｓｃ． Ｓｕｒｇ． １６： ４７−５３ （１９９２））。ここで見られる急性毒性が正に荷電されたプロドラッグ凝集体によるものであった仮説を試験するために、βＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘ（１７４μＭ／ｍｌ）を、対照に比較されるように、４．０００Ｉ．Ｕ．のヘパリンによる１時間の静脈内前処理に続いて、マウスに与えた。表１２は、ヘパリンに続いて、これまで急性致死容量のβＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘが有意に低い毒性であったことを示す。
【０２１６】
それらのデータは、急性毒性が、プロタミン又はポリリシンについて見られる効果に類似する効果を引き起こす正に荷電された凝集体によるものである仮説を指示する。本発明の負及び中性に荷電されたプロドラッグは、この所望しない副作用を克服する。
【０２１７】
【表１１】
2004510703.tif 000012
【０２１８】
前述の仮説に従って、負に荷電された成分による、βＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘの末端アミノ基のキャッピングが、２５０ｍｇ／ｋｇ（Ｄｏｘ−ＨＣｌ）ほどの高い用量レベルでの急性毒素効果の完全な消出をもたらした。
この証拠として、関連する実験において、すべての動物は、グループ当たり３〜５匹のマウスが２５０ｍｇ／ｋｇ（Ｄｏｘ−ＨＣｌ）のＳｕｃ−βＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘ又はＧ１−βＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘの静脈内ボーラスにより処理された場合、８日まで生存した。
【０２１９】
残る例についての分析方法：
固相又は溶液相アプローチを用いて合成されるペプチド配列は、分析用ＨＰＬＣ（方法Ａ， Ｂ ＆ Ｄ）が８０％以上の純度である粗生成物を示す場合、さらに精製しないで使用された。そうでなければ、材料は分離用ＨＰＬＣ方法Ｃを用いて精製された。
【０２２０】
ＨＰＬＣ方法Ａ：
分析用ＨＰＬＣ分析は、溶媒Ａ（０．１％ＴＦＡ／Ｈ２Ｏ）及び溶媒Ｂ（０．１％ＴＦＡ／ＡＣＮ）のグラジエントにより溶離するＣ−１８カラム（４μｍ， ３．９×１５０ｍｍのＩＤ、１ｍｌ／分の流速）を用いてＷａｔｅｒｓ ２６９０上で行われ、そしてデータはＷａｔｅｒ Ｍｉｌｌｅｎｎｉｕｍシステムを用いてλ２５４ｎｍで処理された。分析用ＨＰＬＣグラジエントは、９０％の溶媒Ａで開始し、そして１４分間にわたって（線状）の１００％の溶媒Ｂで終結した。この方法及び次の方法についての化合物の純度は、ピークの曲線下での相対的％領域として評価された。
【０２２１】
ＨＰＬＣ方法Ｂ：
分析用ＨＰＬＣ分析は、溶媒Ａ（８０％の２０ｍＭの蟻酸アンモニウム及び２０％のアセトニトリル）及び溶媒Ｂ（２０％の２０ｍＭの蟻酸アンモニウム及び８０％のアセトニトリル）のグラジエントにより溶離するＣ−１８カラム（３．５μｍ， ４．６×１５０ｍｍのＩＤ、１ｍｌ／分の流速）を用いてＷａｔｅｒｓ ２６９０上で行われ、そしてデータはＷａｔｅｒ Ｍｉｌｌｅｎｎｉｕｍシステムを用いてλ２５４ｎｍで処理された。分析用ＨＰＬＣグラジエントは、１００％の溶媒Ａで開始し、そして１４分間にわたって（線状）の１００％の溶媒Ｂで終結した。
【０２２２】
ＨＰＬＣ方法Ｃ：
粗生成物の分離用精製は、溶媒Ａ（Ｈ２Ｏ）及び溶媒Ｂ（ＭｅＯＨ）のグラジエントにより溶離するＣ−４カラム（１５μｍ， ４０×１００ｍｍのＩＤ、３０ｍｌ／分の流速）を用いて、Ｗａｔｅｒｓ Ｄｅｌｔａ Ｐｒｅｐ ４０００システムにより達成された。分離用ＨＰＬＣグラジエントは、８０％の溶媒により開始し、そして７０分間にわたって１００％の溶媒Ｂに進行する（線状）。データは、Ｗａｔｅｒｓ Ｍｉｌｌｅｎｎｉｕｍ Ｓｙｓｔｅｍを用いてλ２５４ｎｍで処理された。
【０２２３】
ＨＰＬＣ方法Ｄ：
分析用ＨＰＬＣは、ＴＳＫ ｓｕｐｅｒＯＤＳカラム（ＴｏｓｏＨａａｓ）を用いて、Ｈｅｗｌｅｔｔ Ｐａｃｋａｒｄ装置上で達成された；溶媒Ａ（水中、０．１％のＴＦＡ）；溶媒Ｂ（アセトニトリル中、０．１％のＴＦＡ）；グラジエント：２分での３０〜３６％のＢ、１０分での３６〜４１％のＢ、３分での４１〜９０％のＢ、５分での９０％のＢ、検出波長λ２５４ｎｍ。
【０２２４】
ＮＭＲ及びＭＳ：
追加の構造決定は、ＮＭＲ及びＭＳ技法により行われ、そして結果は、本発明の化合物を支持した。
ＴＬＣ方法：
ＴＬＣ分析は、溶出のためのＤＣＭ／ＭｅＯＨ／Ｈ２Ｏ／８８％の蟻酸（８５／１５／１／２）を用いて、シリカゲル６０Ｆ−２５４ｎｍ−０．２５ｍｍプレート（Ｍｅｒｃｋ）上で行われた。
【０２２５】
ニンヒドリン試験：
数ミリグラムの生成物を試験に導入し、そして２滴の溶液Ａ（エタノール中、５０ｍｇ／ｍｌのニンヒドリン）、２滴の溶液Ｂ（エタノール中、４ｍｇ／ｍｌのフェノール）、次に、２滴の溶液Ｃ（１００ｍｌのピリジン中、２ｍｌの０．０１ＭのＫＳＣＮ）を添加した。その混合物を、煮沸水浴に５分間放置した。遊離アミンの存在下で、溶液は紫色になる。
【０２２６】
特異的オリゴペプチド合成例：
市販の試薬源：
ドキソルビシン及びダウノルビシンはＭｅｉｊｉ（Ｊａｐａｎ）により、Ｐｄ （ＰＰｈ３）４はＳｔｒｅｍ Ｃｈｅｍ （Ｎｅｗｂｕｒｙｐｏｒｔ， ＭＡ） により、ＰＥＧはＳｈｅａｒｗａｔｅｒ（Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ， ａｌａｂａｍａ）により、溶媒ＨＡＴＵはＡｌｄｒｉｃｈ （Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ， ＷＩ） により供給され；すべての樹脂及びアミノ酸は、ＡＢＩ （Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ， ＣＡ）， Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ （Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ）， Ａｄｖａｎｃｅｄ ＣｈｅｒｎＴｅｃｈ （Ｌｏｕｉｓｖｉｌｌｅ， ＫＹ）， Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ （Ｌｏｕｉｓｖｉｌｌ， ＫＹ） 又はＳｙｎＰｅｐ（Ｄｕｂｌｉｎ， ＣＡ）により供給された。
【０２２７】
例２４．Ｆｍｏｃ形のβＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕベンジルエステル
Ｆｍｏｃ形のβＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ（２４．３４ｇ， ０．０４モル）を、ＤＭＦ（３５０ｍｌ）及び磁気撹拌機と共に丸底フラスコ中に添加した。テトラペプチドを溶解した後、臭化ベンジル（４．７６ｍｌ、０．０４モル）、続いて炭酸セシウム（１３．０４ｇ、０．０４モル）を、前記溶液に撹拌しながら添加した。その反応混合物を室温で１．５時間、撹拌した。次に、反応混合物を、４５０ｍｌの氷冷却された水を含むフラスコ中にゆっくりと注いだ。多量の白色固形物が沈殿し、これを吸引濾過により集めた。生成物を水（２×２００ｍｌ）により洗浄し、そして真空デシケーターに配置した。生成物（２４．２ｇ， ８７％）をＨＰＬＣにより同定した（純度：９５％）。Ｃ４０Ｈ５０Ｎ４Ｏ７について計算されたＭＳ ｍ／ｚ： ６９．４； 実測値：６９９．５。
【０２２８】
例２５．βＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕベンジルエステル
丸底フラスコ（２５ｍｌ）において、Ｆｍｏｃ形のβＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕベンジルエステル（０．７ｇ、１．０ｍモル）を、無水ＤＭＦ５ｍｌに溶解した。ピペリジン（１．２ｍｌ、１２．１ｍモル）を前記溶液に添加し、そしてその混合物を室温で２４分間、撹拌した。反応を水（６ｍｌ）により停止し、そして酢酸エチル（２×１０ｍｌ）により抽出した。組合された有機層をさらに、水（２×５ｍｌ）、ブライン（５ｍｌ）により洗浄し、そして硫酸ナトリウム上で乾燥した。白色固形物（０．８ｇ）を、溶媒の除去の後に得た。生成物の純度はわずか６７％であった。Ｃ２５Ｈ４０Ｎ４Ｏ５について計算されるＭＳｍ／ｚ：４７６．３；実測値：４７７．２。
【０２２９】
例２６．メチルスクシニル−Ｎ−キャップ形のβＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕベンジルエステル
丸底フラスコ（２５０ｍｌ）において、メチルヘミスクシネート（３．１９８， ２４．２ｍモル）を、無水ＤＭＦ （５０ｍｌ） に溶解した。ＤＩＥＡ（４．２２ｍｌ、２４．２ｍモル）、続いてＨＢＴＵ（９．１７ｇ、２４．２ｍモル）を前記溶液に添加した。その混合物を室温で４５分間、撹拌した。この混合物に、無水ＤＭＦ（１５０ｍｌ）中、βＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕベンジルエステル（粗、１０．１４ｇ、２１．３ｍモル）の溶液を添加した。その混合物を、室温で２．５時間、連続して撹拌した。
【０２３０】
次に、その反応混合物を、２００ｍｌの氷冷却された水を有するフラスコ中に、撹拌しながらゆっくりと注いだ。多量の白色固形物が沈殿し、これを酢酸エチル（３×２００ｍｌ）により抽出した。組合された有機層をさらに、水（２×２００ｍｌ）、ブライン（２００ｍｌ）により洗浄し、そして硫酸ナトリウム上で乾燥した。白色固形物を、溶媒の除去の後に得た。酢酸エチルにおけるこの粗生成物の再結晶化により、８０％の純度の生成物７．５３ｇ（６０％）を得た。Ｃ３０Ｈ４６Ｎ４Ｏ８について計算されるＭＳ ｍ／ｚ： ５９１．４； 実測値：５９０．３３．
【０２３１】
例２７．メチルスクシニル−Ｎ−キャップ形のβＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ
メチルスクシニル−Ｎ−キャップ形のβＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕベンジルエステル（１．０ｇ、８６％の純度、１．４６ｍモル）を、メタノール１００ｍｌを含む三角フラスコ中に添加した。その溶液は、数分間の撹拌の後、曇った。メタノール５０ｍｌを添加したが、しかし溶液はまだ透明ではなかった。その溶液を水素化反応容器中に移した。この容器に、Ｐｄ−Ｃ（９０ｍｇ、１０％の湿潤、５０％の水、０．０４２ｍモル）を添加した。室温で２時間の水素化の後、反応を停止し、そして触媒を濾過した。白色固形物（０．７７ｇ、７８％）を、溶媒の除去の後に得た。Ｃ２３Ｈ４０Ｎ４Ｏ８について計算されたＭＳｍ／ｚ：５０１．２；実測値：５００．３。
【０２３２】
例２８．Ｎ−キャップアリル−ヘミスクシネートの合成
この分子を、Ｃａｓｉｍｉｒ， Ｊ．Ｒなど．， Ｔｅｔ． Ｌｅｔｔ．３６ （１９）： ３４０９， （１９９５） の方法に従って調製した。１０．０７ｇ（０．１モル）の無水琥珀酸及び５．８０８ｇ（０．１モル）のアリル−アルコールを、１００ｍｌのトルエンにおいて６時間、環流した。その反応混合物を減圧下で濃縮した（１５．５ｇ；９８％）。得られる材料は、続く反応への使用のために十分な純度であった。半固形生成物の純度及び同一性を、１Ｈ ＮＭＲ及び１３Ｃ ＮＭＲ， 並びにＬＣ／ＭＳにより確かめた。
【０２３３】
例２９．アリル−スクシニル−βＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘの合成
丸底フラスコ（５０ｍｌ）において、Ｎ−キャップ−アリールヘミスクシニル形のβＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ（１ｇ， １．９ｍモル）及びドキソルビシン（１．１ｇ、１．９ｍモル）を、無水ＤＭＦ（５０ｍｌ）に溶解した。その混合物を５分間撹拌した後、ＤＩＥＡ（０．６６ｍｌ、３．８ｍモル）、続いてＨＡＴＵ（０．７６ｇ、１．９ｍモル）を前記溶液に添加し、その混合物を室温で２時間、撹拌した。ＤＭＦを回転蒸発器により除去し、そして残留物を１：１のＤＣＭ：ＭｅＯＨ（４．０ｍｌ）に採取した。この溶液に、１００ｍｌのエーテルを、撹拌しながら、ゆっくりと添加した。赤色の沈殿物が形成され、そして吸引濾過によりそれを集めた。固形物をエーテル（２×２ｍｌ）におより洗浄し、そして真空デシケーターにおいて乾燥し、アリル−スクシニル−βＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘ治療剤を得、これは方法Ｂによれば、９０％ＨＰＬＣ純度を有した。
【０２３４】
例３０．アリル−スクシニル−βＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−ＬｅｕドキソルビシンからのＳｕｃ−βＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘの調製
ＴＨＦ２ｍｌ中、０．１ｇ（０．０９５ｍモル）のアリル−スクシニル−βＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕドキソルビシンの撹拌溶液に、窒素雰囲気下で、０．０５ｇ（０．０９５ｍモル）のテトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウムを固形物として添加した。１０分後、反応の間に形成される沈殿物を濾過し、ＴＨＦにより洗浄した。乾量：０．１ｇ。その固形物を、スクシニル−βＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘであることが、ＨＰＬＣ、１Ｈ ＮＭＲ， ＬＣ／ＭＳにより同定された。
【０２３５】
例３１．Ｆｍｏｃ形のβＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕの合成
Ｆｍｏｃ形のβＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕを、標準のＦｏｍｃ化学と共に固相アプローチを用いて合成した。典型的な合成は、Ｗａｎｇのアルコキシ樹脂（０．６０ｍモル／ｇ負荷量）を使用した。Ｆｏｍｃ−保護されたアミノ酸を、固相ペプチド合成のために使用した。樹脂上での１ｍＭのペプチドの規模に関しては、３当量のアミノ酸を、２当量のＤＩＥＡと共に樹脂に添加される５分前、活性剤としてのＨＢＴＵにより予備活性化した。カップリング反応を２時間、行い、そして次に、ＤＭＦ（２５ｍｌ×３）及びＤＣＭ（２５ｍｌ×３）により洗浄した。カップリング反応を、類似する条件下で２当量のアミノ酸を用いて反復した。
【０２３６】
反応の進行を、ニンヒドリン試験を用いてモニターし、そしてニンヒドリン試験が２時間後、不完全な反応を示す場合、カップリング段階を３度、反復した。保護解除を、ＤＭＦ中、２０％ピペリシンを用いて、１５〜２０分間、行った。カップリング段階を、所望するペプチドが樹脂上にアセンブリーされるまで、次のアミノ酸により反復した。樹脂からのペプチドの最終分解を、９５％のＴＦＡ及び５％の水の溶液により樹脂を処理することによって達成した。反応混合物を室温で２時間、撹拌した後、樹脂を減圧下で濾過し、そしてＴＦＡにより２度、洗浄した。濾液を組合し、そしてペプチドを、４００ｍｌの冷エーテルを添加することによって沈殿した。ペプチドを減圧下で濾過し、そして乾燥し、Ｆｍｏｃ形のβＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ（方法Ａによる９４％のＨＰＬＣ純度）を得た。粗ペプチドを、さらに精製しないで、次の段階のために使用した。
【０２３７】
例３２．Ｆｍｏｃ形のＴｈｉ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｌｅｎの合成
Ｆｍｏｃ形のＴｈｉ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｌｅｎを、標準のＦｏｍｃ化学及びＷａｎｇのアルコキシ樹脂（０．６０ｍモル／ｇ負荷量）と共に固相アプローチを用いて合成した。Ｆｏｍｃ−保護されたアミノ酸及びＦｏｍｃ−Ｔｈｉ−ＯＨを、固相ペプチド合成のために使用した。樹脂上での１ｍＭのペプチドの規模に関しては、３当量のアミノ酸を、２当量のＤＩＥＡと共に樹脂に添加される５分前、活性剤としてのＨＢＴＵにより予備活性化した。
【０２３８】
カップリング反応を２時間、行い、そして次に、ＤＭＦ（２５ｍｌ×３）及びＤＣＭ（２５ｍｌ×３）により洗浄した。カップリング反応を、類似する条件下で２当量のアミノ酸を用いて反復した。反応の進行を、ニンヒドリン試験を用いてモニターし、そしてニンヒドリン試験が２時間後、不完全な反応を示す場合、カップリング段階を３度、反復した。保護解除を、ＤＭＦ中、２０％ピペリシンを用いて、１５〜２０分間、行った。カップリング段階を、所望するペプチドが樹脂上にアセンブリーされるまで、次のアミノ酸により反復した。
【０２３９】
樹脂からのペプチドの最終分解を、９５％のＴＦＡ及び５％の水の溶液により樹脂を処理することによって達成した。反応混合物を室温で２時間、撹拌した後、樹脂を減圧下で濾過し、そしてＴＦＡにより２度、洗浄した。濾液を組合し、そしてペプチドを、４００ｍｌの冷エーテルを添加することによって沈殿した。ペプチドを減圧下で濾過し、そして乾燥し、Ｆｍｏｃ形のＴｈｉ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｌｅｎ（方法Ａによる８８％のＨＰＬＣ純度）を得た。粗Ｆｍｏｃ形のＴｈｉ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｌｅｎを、さらに精製しないで、次の段階のために使用した。
【０２４０】
例３３．Ｆｍｏｃ形のβＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｎｒ治療剤の合成
ダウノルビシン・ＨＣｌ（１８５ｍｇ， ０．３２９ｍモル）及びＦｍｏｃ形のβＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ（２００ｍｇ， ０．３２ｍモル）を、室温で無水ＤＭＦ（１５ｍｌ）に溶解した。この急速に撹拌された溶液に、ＤＩＥＡ（０．１１５ｍｌ， ０．６５８ｍモル）を、１回で添加し、そしてその反応混合物を室温で１５分間、撹拌した。その反応混合物を、氷浴を用いて０℃に冷却し、そして１３８ｍｇ（０．３６２ｍモル）のＨＡＴＵを、１０分間にわたってゆっくりと添加した。
【０２４１】
反応混合物を、室温でさらに９０分間、撹拌した。氷冷却された水（２００ｍｌ）を、反応混合物に添加し、赤色の沈殿物の形成をもたらした。沈殿物を、粗フリット上に集め、３×５０ｍｌの水及び３×５０ｍｌのジエチルエーテルにより洗浄し、そして減圧下で乾燥し、Ｆｍｏｃ形のβＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｎｒ治療剤を得た（９４％の収率、方法Ａによる９５％のＨＰＬＣ純度）。この生成物を、さらに精製しないで、次の段階のために使用した。
【０２４２】
例３４．Ｆｍｏｃ形のＴｈｉ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｄｎｒ治療剤の合成
ダウノルビシン・ＨＣｌ（９０ｍｇ， ０．１６ｍモル）及びＦｍｏｃ形のＴｈｉ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｄｎｒ（１２０ｍｇ， ０．１６ｍモル）を、室温で無水ＤＭＦ（１５ｍｌ）に溶解した。この急速に撹拌された溶液に、ＤＩＥＡ（０．５６ｍｌ， ０．１６ｍモル）を、１回で添加し、そしてその反応混合物を室温で１５分間、撹拌した。その反応混合物を、氷浴を用いて０℃に冷却し、そして６１ｍｇ（０．１６ｍモル）のＨＡＴＵを、１０分間にわたってゆっくりと添加した。
【０２４３】
反応混合物を、室温でさらに９０分間、撹拌した。氷冷却された水（１５０ｍｌ）を、反応混合物に添加し、赤色の沈殿物の形成をもたらした。沈殿物を、粗フリット上に集め、３×５０ｍｌの水及び３×５０ｍｌのジエチルエーテルにより洗浄し、そして減圧下で乾燥し、Ｆｍｏｃ形のＴｈｉ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｄｎｒ治療剤を得た（９４％の収率、方法Ａによる９１％のＨＰＬＣ純度）。この生成物を、さらに精製しないで、次の段階のために使用した。
【０２４４】
例３５．Ｆｍｏｃ−βＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−ドキソルビシンの調製
ダウノルビシン・ＨＣｌ（３．０ｇ， ５．１７ｍモル）及びＦｍｏｃ−βＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ（３．１５ｇ， ５．１７ｍモル）を、室温で窒素雰囲気下で無水ＤＭＦ（２３０ｍｌ）に溶解した。この急速に撹拌された溶液に、ＤＩＥＡ（１．７９８ｍｌ， １０．３４ｍモル）を、１回で添加し、そしてその反応混合物を室温で１５分間、撹拌した。その反応混合物を、氷／ブライン浴において約−２℃に冷却し、そして５８ｍｌのＤＭＦ中、２．５６ｇ（６．７３ｍモル）のＨＡＴＵを、撹拌しながら１２分間にわたって滴化した。
【０２４５】
反応混合物を、−２℃でさらに３０分間、撹拌し、次にＤＩＥＡ（０．２８５ｍｌ， １．６４ｍモル）１回で添加した。０℃での水（５８０ｍｌ）を、反応混合物に添加し、柔毛状の赤色の沈殿物の形成をもたらした。沈殿物を、粗ガラスフリット上に集め、３×５０ｍｌの水及び３×５０ｍｌの水性ジエチルエーテルにより洗浄し、そして１６時間、空気乾燥し、Ｆｍｏｃ形のβＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘ５．１２ｇを得た（８９．７％の収率、方法Ｂによる９０．２３％のＨＰＬＣ純度）。
【０２４６】
例３６．Ｆｍｏｃ−βＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘからのスクシニル−βＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘの調製
無水ＤＭＦ２３０ｍｌ中、５．０ｇ（４．４１ｍモル）のＦｍｏｃ−βＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕの溶液に、室温で窒素下で、２１．８ｍｌ （２２０ｍモル）のピペリジンを一度に添加し、赤色から紫色への色彩変化をもたらした。反応混合物を室温で５分間、撹拌し、次にドライアイス／アセトン浴において約−２０℃に冷却した。２２．５ｇ（０．２２５モル）の無水琥珀酸を一度に添加し、そして反応温度を−５℃以下に維持した。−１０℃〜−５℃で約２分間の撹拌の後、色彩は、紫色から赤／オレンジ色に変化した。冷却浴を除き、そしてその反応混合物を１０分間、撹拌した。次に、反応混合物の体積を、回転蒸発により約１００ｍｌに減じ、そして次に、１２５ｍｌのクロロホルムにより希釈した。
【０２４７】
この溶液に、１４００ｍｌのジエチルエーテルをすばやく添加し、赤色の沈殿物の形成をもたらした。この沈殿物を、中位のガラスフリット上に単離し、そして５×２００ｍｌのジエチルエーテルと共に粉砕し、８９．１３％のＨＰＬＣ純度の材料を得た。沈殿物を１×２０ｍｌのジエチルエーテルにより再び洗浄し、そして空気乾燥し、３．６２ｇのＳｕｃ−βＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘを得た（８１％の物理的収率、８８．２％のＨＰＬＣ純度）。この材料を０℃で３０ｍｌの水において撹拌し、そして３３．９８ｍｌ（０．９５当量）の０．１Ｍの水性ＮａＨＣＯ３を添加し、そして得られる懸濁液を、すべての固形物が溶解するまで、撹拌した。この溶液を凍結乾燥し、３．７７ｇのＳｕｃ−βＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘを得た（９９％の物理的収率、方法Ｂによる８９．０６％のＨＰＬＣ純度）。
【０２４８】
例３７．Ｎ−キャップスクシニル形のβＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｎｒ−治療剤の合成
ピペリジン（０．４４２ｍｌ、４．４８ｍモル）を、５ｍｌの無水ＤＭＦ中、Ｆｍｏｃ形のβＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｎｒ（１００ｍｇ、０．０８９ｍモル）の溶液に添加した。その反応混合物を室温で５分間、撹拌し、そして次に、ドライアイス／アセトン浴を用いて、−２０℃に冷却した。無水琥珀酸（４５８ｍｇ、４．５４ｍモル）を、前記冷却された反応応答物に一度に添加した。
【０２４９】
反応を、−５℃で５分間、次に室温でさらに９０分間、急速に撹拌した。２５０ｍｌの無水ジエチルエーテルを、反応混合物に添加し、そして得られる赤色の沈殿物を、中位のガラスフリット上で単離した。フィルターケークを、２回の連続的な５０ｍｌのジエチルエーテルにより洗浄し、そして減圧下で乾燥し、Ｎ−キャップスクシニル形のβＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｎｒ−治療剤を得た（８０％の収率、方法Ｂによる８８％のＨＰＬＣ純度）。ＬＣ／ＭＳは、９９５（予測される分子量９９６）の分子量を付与した。
【０２５０】
例３８．Ｎ−キャップスクシニル形のＴｈｉ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｄｎｒ治療剤の合成
５ｍｌの無水ＤＭＦ中、Ｆｍｏｃ形のＴｈｉ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｄｎｒ（１００ｍｇ、０．０７９ｍモル）の溶液に、ピペリジン（０．３９１ｍｌ、３．９５ｍモル）を一度に添加し、赤色から紫色への色彩変化をもたらした。その反応混合物を、室温で５分間、撹拌し、そして次に、ドライアイス／アセトン浴を用いて−２０℃に冷却した。次に４０７ｍｇ（４．０２ｍモル）の無水琥珀酸を、前記冷却された混合物に一度に添加した。反応を−５℃で５分間、次に室温でさらに９０分間、急速に撹拌した。２００ｍｌの無水ジエチルエーテルを反応混合物に添加し、赤色の沈殿物をもたらした。この沈殿物を中位のガラスフリット上で単離し、３×５０ｍｌのジエチルエーテルにより洗浄し、そして減圧下で乾燥し、Ｎ−キャップスクシニル形のＴｈｉ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｄｎｒ治療剤を得た（８０％の収率、方法Ａによる８１％のＨＰＬＣ純度）。ＬＣ／ＭＳは、１１４１の分子量（１１４２の予測される分子量）を与えた。
【０２５１】
例３９．Ｎ−キャップグルタリル形のβＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘ治療剤のナトリウム塩の合成
ピペリジン（４３６μｌ、４．４１３ｍモル）を、ＤＭＦ（４．５ｍｌ）中、Ｆｍｏｃ形のβＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘ（１００ｍｇ、０．０８８ｍモル）の溶液に添加した。室温で５分間、撹拌した後、反応混合物を−５℃に冷却し、そして無水グルタミン酸（６２４ｍｇ、５．４７２ｍモル）をすばやく添加した。冷却浴を、色彩が変化するとできるだけ早く除去し、そしてその混合物を室温でさらに１０分間、撹拌した。
【０２５２】
ＤＭＦを回転蒸発により除去し、そして残留物をクロロホルム（２．５ｍｌ）に溶解した。ジエチルエーテル（１４ｍｌ）を添加し、そして得られる沈殿物を濾過した。フィルターケークをジエチルエーテルにより洗浄し、空気乾燥し、次に、水（１４ｍｌ）に再懸濁した。ナトリウム塩を、固体の完全な溶解まで、０．０２５ＭのＮａＯＨ（４ｍｌ、０．１０ｍモル）の懸濁液への滴下により形成した。次に、この溶液を凍結乾燥し、Ｇ１−βＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘのナトリウム塩を得た（９７％の収率、方法Ｄによる８７％のＨＰＬＣ純度）。
【０２５３】
例４０．
接合体、すなわち酵素経路のための前駆体を調製するための“ウレア方法”
メチルスクシニル−Ｎ−キャップ形のβＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ及びドキソルビシンのカップリング
無水窒素雰囲気下で、２６．０４ｇ（５２．０ｍモル）のメチルスクシニル−Ｎ−キャップ形のβＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ、２３．２６ｇ （４０．２ｍモル） のドキソルビシン塩酸塩を、８００ｍｌの無水ウレア−飽和（約３０％ｗ／ｖ）ＤＭＦ及び１９．９４８ｍｌ（１１４．１６ｍモル）のＤＩＥＡに懸濁し／溶解した。この混合物を、約２５分間にわたって、０〜３℃に冷却した。
【０２５４】
この点で、２１．２ｇ（５６．０ｍモル）のＨＡＴＵを、約１００ｍｌのウレア飽和ＤＭＦにおける溶液として、１０分間にわたって添加した（この溶液の体積は最少に維持されるべきである）。反応混合物を−２〜２℃で１０分間、撹拌し、そして２％（ｖ／ｖ）の酢酸を含む氷冷却されたブライン４０００ｍｌ中に、激しく撹拌しながら、約５分間にわたって注いだ、生成物を、中位の多孔性ガラス濾過器上で濾過し、水により十分に洗浄し、そして減圧下で乾燥した。４３ｇの物理的収率：１０４．４７％、方法Ｂによる９３．４５％のＨＰＬＣ純度。
【０２５５】
例４１．メチルスクシニル−Ｎ−キャップ形のβＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘ治療剤の合成
丸底フラスコ（５０ｍｌ）において、Ｎ−キャップ−メチルヘミスクシニル形のβＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ（０．２５ｇ， ０．５ｍモル）及びドキソルビシン（０．２９ｇ、０．５ｍモル）を、無水ＤＭＦ（２０ｍｌ）に溶解した。その混合物を５分間撹拌した後、ＤＩＥＡ（０．１７ｍｌ、１．０ｍモル）、続いてＨＡＴＵ（０．１９ｇ、０．５ｍモル）を前記溶液に添加した。その混合物を室温で４時間、撹拌した。ＤＭＦを回転蒸発器により除去し、そして残留物を１：１の塩化メチレン：メタノール（４．０ｍｌ）に採取した。この溶液に、４０ｍｌのエーテルを、撹拌しながら、ゆっくりと添加した。赤色の沈殿物が形成され、そして吸引濾過によりそれを集めた。固形物をエーテル（２×１０ｍｌ）により洗浄し、そして真空デシケーターにおいて乾燥た。０．５０ｇの生成物（９８％）を得た。
【０２５６】
例４２．ＭｅＯＳｕｃ−βＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘからの遊離ドキソルビシンの除去
ＭｅＯＳｕｃ−βＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘ（２００ｍｇ、０．１９４ｍモル）、ＤＩＥＡ（０．０６８ｍｌ、０．３８８ｍモル）及び無水ＤＭＦ（１０ｍｌ）を、磁気撹拌棒を備えた５０ｍｌのフラスコに配置した。ＭｅＯＳｕｃ−βＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘが完全に溶解した場合、イソシアネート樹脂（３４０ｍｇ、０．５８２ｍモル；５ｍｌのジクロロメタンにおいて５分間、予備膨潤された）を添加し、そして得られる溶液を室温で２時間、定期的なＨＰＬＣモニターを伴なって、撹拌した。ＨＰＬＣクロマトグラフィーは、Ｄｏｘが４５分以内の樹脂処理で完全に除去されたことを示した。
【０２５７】
次に、反応混合物をフリットを通して濾過し、樹脂を除去した。樹脂を１０ｍｌのＤＭＦにより洗浄し、そしてそのＤＭＦ洗浄物を、前記濾過された反応混合物と組合した。次に、濾過された反応混合物を、高い真空ポンプ及び３０℃の水浴を備えた回転蒸発機上で赤色のガム上に濃縮した。その赤色のガム上残留物を、５ｍｌのＤＭＦに懸濁し、そして次に、その溶液を、急速に撹拌された無水ジエチルエーテル溶液中にゆっくりと添加した。赤色の生成物が形成され、次にこれを、フリット上で濾過し、そしてジエチルエーテルにより洗浄し、そして減圧下で乾燥し、ＭｅＯＳｕｃ−βＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘ（１７６ｍｇ、８６％の収率）を得た。
【０２５８】
例４３．架橋された酵素の使用によるメチルスクシニル−Ｎ−キャップ形のβＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘ治療剤の加水分解
メチルスクシニル−Ｎ−キャップ形のβＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘ治療剤（１．０ｇ、０．９７５ｍモル）及び１００ｍｌのＤＭＦを、５００ｍｌのフラスコに配置した。その懸濁液を磁気撹拌機により激しく撹拌した。メチルスクシニル−Ｎ−キャップ形のβＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘ治療剤が完全に溶解した場合、４００ｍｌの脱イオン水を添加し、そしえ得られる溶液を３５℃で撹拌した。１ｇの洗浄されたＣＬＥＣ−ＰＣ（Ａｌｔｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ）固定された酵素のスラリーを、３アリコートの脱イオン水によりすすぎ、次に使用の前、２０％の水性ＤＭＦ１０ｍｌに再懸濁した。得られる懸濁液を、定期的なＨＰＬＣモニターを伴なって、３５℃で撹拌した。
【０２５９】
すべてのメチルスクシニル−Ｎ−キャップ形のβＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘ治療剤が消費された場合（約１８時間）、その反応混合物を、０．４５μＭのナイロン膜フィルターを通して濾過し、ＣＬＥＣ−ＰＣ酵素を除去した。ＣＬＥＣ−ＰＣケークを、３×１０ｍｌのメタノールにより洗浄し、そしてメタノール洗浄物を、前記濾過された反応混合物と組合した。次に、濾過された反応混合物及びメタノール洗浄物を、高い真空ポンプ及び３０℃での水浴を備えた回転蒸発器上で、赤色のガム状物に濃縮した。次に、その赤色のガム状物を、室温で５０ｍｌの脱イオン水に懸濁し、そして機械的撹拌機を通して激しく撹拌した。
【０２６０】
この懸濁液に、１００ｍｌの脱イオン水中、７７．８ｍｇ（０．９２６ｍモル、０．９５当量）の炭酸水素ナトリウムの溶液を、２分間にわたって添加した。その懸濁液を室温で２０分間、撹拌した。反応混合物を、０．４５μＭのナイロン膜フィルターを通して濾過し、そして連結乾燥した。スクシニル−Ｎ−キャップ形のβＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘ治療剤のナトリウム塩０．９３６ｇを単離した（約１００％の収率；方法Ｂによる８４％のＨＰＬＣ純度）。１Ｈ及び１３Ｃ　ＮＭＲスペクトルを、それぞれ６００及び１５０ＭＨｚの分光計、及びエレクトロスプレーＭＳ上で記録し、それは、所望する構造と一致した。
【０２６１】
例４４．可溶性酵素の使用によるメチルスクシニル−Ｎ−キャップ形のβＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘ治療剤の加水分解
１１．０ｇ（１０．７２ｍモル）のメチルスクシニル−Ｎ−キャップ形のβＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘ治療剤を、ＨＰＬＣ品種の水に懸濁し、そしてＵｌｔｒａｔｕｒｒａｘ Ｔ８ホモジナイザーにより６０分間、均質化し、細かく分割された懸濁液を生成した。この懸濁液を３５℃で撹拌し（５００ｒｐｍ）、そして７６ｍＭの水性炭酸水素ナトリウムによりｐＨ＝６．０５に調節した。次に、１．０ｇのＣ．アンタルクチカ“Ｂ”リパーゼ（Ａｌｔｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ）を添加し、そして反応混合物を３５℃で４８時間、撹拌した。４８時間の反応時間の間、ｐＨを、７６ｍＭの炭酸水素ナトリウムの定期的な添加による５．３〜６．２の間に維持し、そして反応をＨＰＬＣにより定期的にモニターした。４８時間後、反応はＨＰＬＣによれば、約９８％の完結であった。
【０２６２】
次に、反応混合物を７６ｍＭの水性炭酸水素ナトリウムによりｐＨ＝７に調節し、そしてセライト５２１のパッドを通して濾過した。次に、透明にされた反応混合物を、５ｍｌの氷酢酸により約３のｐＨに酸性化し、ゴム状の赤色沈殿物の形成をもたらした。沈殿物をセライト５２１濾過、セライトパッドのメタノールによる続くすすぎ、１０〜２０μＭのガラス濾過器を通してのメタノール溶液の濾過及び濾過された溶液の回転蒸発により単離した。７．３１ｇのゴム状の赤色生成物を得た。この生成物を、７０ｍｌの７６ｍＭの炭酸水素ナトリウム（０．９５当量）における溶解によりナトリウム塩に転換し、そして凍結乾燥し、７．３０ｇ（６６．１％の物理的収率）のスクシニル−Ｎ−キャップ形のβＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘ治療剤のナトリウム塩を得た（ＨＰＬＣによる８４．５％の純度）。
生成物は、例４５のものと同一であった。
【０２６３】
例４５．メチルスクシニル−Ｎ−キャップ形のβＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘ治療剤の固定されたカンジダ・アンタルクチカ“Ｂ”リパーゼ加水分解
３０．０ｇのカンジダ　アンタルクチカ“Ｂ”リパーゼ（Ａｌｔｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ）を、３００ｍｌの水に溶解し、そして３×４Ｌの５０ｍＭの水性炭酸水素ナトリウム（ｐＨ＝６．４）に対して透析した。透析の後、その透析された溶液の体積は３００ｍｌであった。３６０ｍｌのＦｈａｒｍａｃｉａ ＮＨＳ−Ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗを、粗ガラス濾過器に置き、そして５×４５０ｍｌの氷冷却された１ｍＭの水性ＨＣｌによりすすいだ。そのすすがれたＮＨＳ−Ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅを、前記透析された酵素溶液と組合した。得られる懸濁液を、周囲温度（約２２℃）で２．０時間、撹拌した。
【０２６４】
セファロース／酵素接合体を、粗ガラス濾過器上で単離し、そして次に、１０００ｍｌの１００ｍＭの水性ＴＲＩＳ（ｐＨ＝７．４５）において１５分間、撹拌した。この懸濁液を濾過し、そしてもう１つの１０００ｍｌの１００ｍＭの水性ＴＲＩＳ緩衝液（ｐＨ＝７．４５）と共に４℃で一晩インキュベートした。朝、固定された酵素を濾過し、そして水による洗浄の後、２０００ｍｌの三ツ首丸底フラスコに配置した。４３ｇのメチルスクシニル−Ｎ−キャップ形のβＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘを添加し、そして固形物を８００ｍｌの脱イオン水に懸濁した。
【０２６５】
フラスコに、オーバーヘッド撹拌機、及び注射器ポンプを調節することによって反応混合物のｐＨを５．９〜６．２に維持するよう設定されたｐＨ−安定装置を固定した。注射器ポンプを、０．１Ｍの炭酸水素ナトリウムにより充填した。反応の進行をＨＰＬＣにより追跡した。６日後、固定された酵素を濾過し、そして溶液相を凍結乾燥した。次に、乾燥固形物を約１１ｍｌの無水ＴＨＦに懸濁し、そして濾過した。４２．６６ｇ、９８．３４％の物理的収率、方法Ｂによる９３．４５％（２５４ｎｍ）、９４．４３％（４８０ｎｍ）ＨＰＬＣ純度。
【０２６６】
例４６．βＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘ治療剤の乳酸塩［βＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘラクテート］の合成
ピペリジン（２６ｍｌ、２６４ｍモル）を、ＤＭＦ（２６５ｍｌ）中、Ｆｍｏｃ形のβＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘ治療剤（６．００ｇ、５．３ｍモル）の溶液に添加した。室温で５分間の撹拌の後、反応混合物を、氷−塩浴に配置し、そして予備冷却（４℃）をされた１０％乳酸緩衝液（ｐＨ３）（６００ｍｌ）をすぐに添加した。その水溶液を、ＤＣＭ（３×５００ｍｌ）により抽出し、そして過剰の塩を、固相抽出により除去した。
【０２６７】
Ｃ１８ ＯＤＳ−Ａシリカゲル（１２０ｇ）を、ガラス濾過器において条件づけし（５００ｍｌのメタノール、２×５００ｍｌの水）、そして粗生成物乳酸塩の水溶液において条件づけし（５００ｍｌのメタノール、２×５００ｍｌの水）、そして粗生成物乳酸塩の水溶液を充填した。水（２×５００ｍｌ）による洗浄及び乾燥の後、フィルターケークをメタノールに溶解した。メタノールを蒸発し、そして残留物を水に溶解した。得られる溶液を、凍結乾燥し、３．５４ｇのβＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘ治療剤の乳酸塩を得た（６７％の収率、方法Ｂによる８９％ＨＰＬＣ純度）。
【０２６８】
例４７．βＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘ治療剤の乳酸塩から出発してのスクシニル−Ｎ−キャップ形のβＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘ治療剤の合成
ＤＩＥＡ（４１７μｌ、２．４０ｍモル）を、ＤＭＦ（３５ｍｌ）中、βＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘ治療剤の乳酸塩（１．２００ｇ、１．２０ｍモル）の溶液に添加した。室温での１５分間の撹拌の後、９７％の無水琥珀酸（０．１４４ｇ、１．４４ｍモル）を添加した。混合物を２時間、撹拌し、そしてＤＭＦを回転蒸発により除去した。
【０２６９】
残留物を、ＣＨＣｌ３／ＣＨ３ＯＨ（４／１）（６ｍｌ）の混合物に溶解し、そして１：１のＥｔ２Ｏ：ヘキサンの混合物２００ｍｌを添加した。その混合物を３０分間、撹拌した後、沈殿物を定量紙（Ｗｈａｔｍａｎ４２）上で濾過し、洗浄し（１：１のＥｔ２Ｏ：ヘキサン）、そして空気乾燥した。フィルターケークを、水（１５０ｍｌ）に懸濁し、そして１ＭのＮａＯＨ（±１．２当量、１．５ｍｌ）を、完全な溶解（ｐＨ＝７．２）まで、滴下した。その溶液を凍結乾燥し、１．２１８ｇのスクシニル−Ｎ−キャップ形のβＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘ治療剤（９７％の収率；方法ＢによるＨＰＬＣ純度：８０．２％）。
【０２７０】
例４８．Ｆｍｏｃ形のβＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘ治療剤から出発してのスクシニル−Ｎ−キャップ形のβＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘ治療剤の合成
ピペリジン（２１８０μｌ、２２．０６ｍモル）を、ＤＭＦ（２１．５ｍｌ）中、Ｆｍｏｃ形のβＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘ治療剤（０．５０ｇ、０．４４ｍモル）の溶液に添加した。室温での５分間の撹拌の後、反応混合物を、すばやく、−５℃に冷却し、そして無水琥珀酸（２．２５ｇ、２２．５１ｍモル）をすぐに添加した。冷浴を、色彩が変化するとできるだけすぐに除去し、その混合物を室温で１０分間、撹拌した。
【０２７１】
ＤＭＦを回転蒸発により除去し、そして残留物をクロロホルム（１２．５ｍｌ９に溶解した。ジエチルエーテル（３６０ｍｌ）をすばやく添加した。沈殿物がすぐに出現した。沈殿物をＷｈａｔｍａｎ４２紙上で濾過し、Ｅｔ２Ｏにより洗浄した。固形物を水（１２０ｍｌ、ｐＨ＝４．１）に懸濁し、そして０．０２５ＭのＮａＯＨ（２０ｍｌ、０．５３ｍモル）を、完全な溶解（ｐＨ＝７．４）まで、滴下した。次に、溶液を凍結乾燥し、スクシニル−Ｎ−キャップ形のβＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘ治療剤を得た（８９％の収率；及び方法Ｄによる９１％のＨＰＬＣ純度）。
【０２７２】
例４９．メチルスクシニル−Ｎ−キャップのβＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘ治療剤の大規模合成
６９．６ｇのドキソルビシン・ＨＣｌ（１２０ｍモル）及び１００ｇのＭｅＯＳｕｃ−βＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ（１９９ｍモル）を、室温下で無水ＤＭＦ（１０Ｌ）に溶解した。７６ｍｌのＤＩＥＡ（４３４ｍモル）を、反応混合物に添加し、そしてその反応混合物を、室温で、窒素下で１０分間、撹拌した。次に、反応混合物を、１０分にわたって０℃に冷却した。別々のフラスコにおいて、ＤＭＦ（５００ｍｌ）中、８６４ｇＨＡＴＵ（２２０ｍモル）の溶液を分離した。そのＨＡＴＵ溶液を、前記反応混合物に、その混合物を０℃で維持しながら、２０分間にわたってゆっくりと添加した。反応混合物を３０分間、０℃で撹拌した。
【０２７３】
水（２５Ｌ）中、ＮａＣｌ（７．５ｋｇ、少なくとも３０％ｗ／ｖ）の溶液を分離し、そして０℃に冷却した。次に、反応混合物を、冷却されたブライン溶液に、撹拌しながら１２０分間にわたってゆっくりと添加した。前記溶液の色は赤色を維持し、青色の溶液は、ｐＨが酢酸の添加により、５．８〜６．０にすぐに調節する必要があることを示した。温度を、約５℃で維持した。赤色の沈殿物を、中位の多孔性ガラス濾過器上で濾過し、水により洗浄し、そしてＰ２Ｏ５上で真空下を乾燥し、１１５ｇのＭｅＯＳｕｓ−βＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘを得た。
【０２７４】
例５０．微量のドキソルビシンを除去するためにＰｓ−イソシアネートビーズによるＭｅＯＳｕｃ−βＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘの処理
１４６．４のＰＳ−イソシアネートビース（２４０ｍモル；Ａｒｇｏｎａｕｔ Ｌａｂ， Ｓａｎ Ｃａｒｌｏｓ， ＣＡにより供給される）を、１．５Ｌの無水ＤＭＦに溶解し、そして室温で５〜１０分間、膨潤した。膨潤されたビーズを、ガラス濾過器を通して濾過し、そして追加の５００ｍｌの無水ＤＭＦにより洗浄した。１１５ｇのＭｅＯＳｕｃ−βＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘ（１１２ｍモル）を、１０００ｍｌの無水ＤＭＦに溶解し、そして２．１ｍｌのＤＩＥＡ（１２ｍモル）、続いて膨潤されたＰＳ−イソシアネートビーズを添加した。反応混合物を室温で撹拌し、そしてドキソルビシンピークの量が０．１％以下になるまで、ＨＰＬＣを用いてモニターした。
【０２７５】
バッチのサイズに依存して、２〜１２時間を要した。ＨＰＬＣ分析を、Ｗａｔｅｒ ２６９０カラムを用いて行った：Ｗａｔｅｒ Ｓｙｍｍｅｔｒｙ ｓｈｉｅｌｄ Ｃ８ ３．５μＭ ４．６×１５０ｍｍ（カタログ番号ＷＡＴ０９４２６９）、溶媒：Ａ−８０％の２０ｍＭの蟻酸アンモニウム（ｐＨ＝４．５）、２０％アセトニトリル、溶媒：Ｂ−２０％蟻酸アンモニウム（ｐＨ＝４．５）、８０％アセトニトリル。カラム温度：調節された室温、サンプル温度；４℃、運転時間：３７．５分、検出器：２５４ｎｍ， 流速：１．０ｍｌ／分、注入量１０μｇ（０．５ｍｇ／ｍｌ×０．０２ｍｌ）、移動相Ａ及びＢ．グラジエント：１００％移動相〜１００％移動相Ｂの３７．５分の洗浄グラジエント（７．５分の平衡化遅延を伴なう）。
【０２７６】
ドキソルビシンピークの量が０．１％以下である６時間で、反応混合物を、粗ガラス濾過を通して濾過し、ビーズを除いた。３．５ｌの水中、１．１ｋｇのＮａＣｌのブライン溶液（少なくとも３０％ｗ／ｖ）を調製し、そして０℃に冷却した。次に、濾過された反応混合物を、冷却されたブライン溶液に撹拌しながら４５分間にわたってゆっくりと添加した。溶液の色彩は赤のままであり、青色の溶液は、ｐＨが酢酸の添加により５．８〜６．０にすぐに調節する必要があることを示した。赤色の沈殿物を中位のガラス濾過器を通して濾過し、水により洗浄し、そしてＰ２Ｏ５上で減圧下で乾燥し、いずれの残留ドキソルビシンも有さないＭｅＯＳｕｃ−βＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘを得た。
【０２７７】
ＭｅＯＳｕｃ−βＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘを、ＩＬのＭｅＯＨに溶解し、そして次に、メタノール溶液を、撹拌しながら、６０分間にわたって、１４Ｌの冷却されたエチルエーテルにゆっくりと添加した。赤色の沈殿物を、中位のガラス濾過器を通して濾過し、エーテル（１Ｌ）により洗浄し、そして真空下で乾燥し、１１０ｇのＭｅＯＳｕｃ−βＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘを得た。純度は、例４４に記載のようにして、ＨＰＬＣにより９６．５％であることが決定された。Ｃ５０Ｈ６７Ｎ５Ｏ１８についてのＭＳｍ／ｚ計算値：１０２５；実測値：１０４８（Ｍ＋＋Ｎａ）。
【０２７８】
例５１．Ｓｕｃ−βＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘを生成するためにＭｅＯＳｕｃ−βＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘの酵素的加水分解
ＣＬＥＣ−ＣＡＢ（Ｃａｎｄｉｄａ Ａｎｔａｒｔｉｃａ “Ｂ” リパーゼ）酵素を、溶液形で購入し（Ａｌｔｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ．， Ｂｏｓｔｏｎ， ＭＡから）、ここで酵素の濃度は溶液１ｍｌ当たりの乾燥酵素の重量により定義される。粗酵素懸濁液を数分間、振盪し、均質溶液を得た。５０４ｍｌ（３２９ｍモル）のこの均質溶液をフラスコにアリコートした。２．５Ｌの脱イオン水を添加し、そしてこのスラリーを、磁気撹拌機を用いて１０分間、撹拌した。酵素溶液を粗ガラス濾過器を用いて、酵素を乾燥しないで濾過した。酵素をフラスコに戻した。酵素を水に懸濁し、そしてさらに３度、濾過した。
【０２７９】
酵素ケークを、５５０ｍｌの脱イオン水に再懸濁し、そしてＲＢフラスコに移した。この懸濁液に、１０９ｇのＭｅＯＳｕｃ−βＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘ（１０５ｍモル）を添加し、そしてその反応混合物を室温（２５℃）で撹拌した。反応混合物のｐＨを、１ＮのＮａＨＣＯ３溶液により充填された注射器ポンプを備えたｐＨ−装置により、５．８〜６．１に維持した。反応の進行を、例４４に記載のようにして、定期的なＨＰＬＣモニターにより追跡した。２４時間後、反応は、ＨＰＬＣにより決定される場合、９４％の完結性であると思われる。
【０２８０】
反応を早めるために、追加のＣＬＥＣ酵素を、２４時間後、必要とした。１６８ｍｌのＣＬＥＣ酵素（均質溶液）を、上記のようにカラム型で洗浄した。酵素ケークを、１．１Ｌの脱イオン水に再懸濁し、そして反応金剛物に添加した。反応混合物を、定義的にＨＰＬＣによりモニターしながら、室温で撹拌し、そしてｐＨを、５．８〜６．１に維持した。６０時間後、反応は、ＨＰＬＣによりモニターされる場合、９９．９％の完結性であった。
【０２８１】
ＣＬＥＣ酵素を、０．２μＭのフィルターを通しての濾過により反応混合物から除去し、そして５００ｍｌの脱イオンによりすすいだ。次に、濾過を凍結乾燥し、９５．２ｇのＳｕｃ−βＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘ・Ｎａを得た（８７％の物理的収率；Ｃ４９Ｈ６５Ｎ５Ｏ１８についてのＭＳｍ／ｚ計算値：１０１１；実測値：（Ｍ＋＋Ｎａ）。
プロドラッグ化合物Ｓｕｃ−βＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘを、質量スペクトル分析、ＦＴＩＲ、ＮＭＲにより十分に特徴づけた。
Ｓｕｃ−βＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘの質量スペクトル分析は、Ｓｕｃ−βＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘ（Ｃ４９Ｈ６５Ｎ５Ｏ１８Ｎａ）についての計算されたｍ／ｚ（１０３３）と適合する、分子イオンピーク（ｍ／ｚ；１０３４）の存在を明確に示す。
【０２８２】
Ｓｕｃ−βＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘのサンプルをまた、ＦＴＩＲにより分析した。そのスペクトルは、上記材料の対照標準のスペクトルと適合した。主要吸収率についての割り当ては、次の通りである：
ヒドロキシル　　　　３３７９ｃｍ−１
Ｃ−Ｈ　　　　　　　　３０００−２７００
カルボニル　　　　１６５０−１７２５
【０２８３】
最終的に、サンプルをＮＭＲにより分析した。化学シフト及び割り当ては、表１３に列挙され、そして図１７に示される。Ｓｕｃ−βＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘの構造と一致する、２１５．２， １８７．７， １８７．４ｐｐｍでケトン領域に３個の炭素が存在する。後者の２つは、類似する化学シフトを有し、その結果、１８７．７及び１８７．４ｐｐｍで、（２）及び（３）に割り当てられる。従って、残るケトンは（１）である。それらの割り当てからのさらなる証拠は、ＨＭＱＣ及びＨＭＢＣスペクトルから発生し；それらの３個はいずれのＨＭＱＣピークも示さず、その結果、陽子化されず、そして（１）のみが、４．７７ｐｐｍでのプロトンに対して、広範囲のＣ−Ｈカップリング（ＨＭＢＣ）を有し、これはプロトンシングレットであり、従ってこれが（４）である。ＨＭＱＣスペクトルから、６５．７ｐｐｍでの炭素がそれらのプロトンに連結される。
【０２８４】
３．９６ｐｐｍでの１Ｈ ＮＭＲシグナルは化学シフト及びメトキシ基の領域を有し；それらのプトロンは５７．２ｐｐｍで炭素にカップリングされ、そして構造（５）における唯一のメトキシに割り当てられる。１３Ｃ化学シフトはまた、メトキシと一致する。プロトンの広範囲Ｃ−Ｈカップリングは、（６）であるべきである、１６２．３ｐｐｍでの炭素に対してである。
【０２８５】
ＨＭＱＣスペクトルは、１２０．５、１２０．３及び１３７．２ｐｐｍで３種の陽子化された芳香族が存在することを示し；前記芳香族プロトンは、いずれの広範囲のＣ−Ｈカップリングも、隣接するプロトン間でのいずれのカップリングも示さなかった。芳香族プロトンシグナルは非常に広く、このことは、いずれかの観察されるカップリングの欠失を説明する、短いＴ２緩和時間を示す。このカップリングの欠失が存在する場合、それらの３種の部位をユニークに割り当てることは不可能でありそして集合的に、（７）（８）及び（９）に割り当てられる。
【０２８６】
１５７．２及び１５６．１ｐｐｍでの２種の陽子化されていない芳香族炭素は、（１０）及び（１１）と一致する化学シフト、すなわち酸素に結合される芳香族炭素を有する。広範囲のカップリングは観察されない。
１１２．３及び１１２．０ｐｐｍでの１３Ｃ ＮＭＲシグナルは、芳香族炭素と一致し、そして（２）及び（１３）に割り当てられる。１２１．３での１３Ｃ ＮＭＲシグナルもまた、この効果を示し、その結果、（１４）に割り当てられる。残る３種の陽子化されていない芳香族炭素は、その領域において、（１５）、（１６）及び（１７）の最後の３種の炭素に割り当てられる。
【０２８７】
いずれかの芳香族炭素へのいずれかの広範囲のＣ−Ｈカップリングの欠失は、予測されず、そしてカップリングが、短いＴ２緩和時間又は平面形状のために、非常に小さいか又は存在しないことを示す。
１８１〜１７４ｐｐｍで６種のカルボニル炭素が存在し；それらのうち、１８０．６ｐｐｍでの１つが、ナトリウム塩と一致する化学シフトを有する唯一の１つであり、その結果、（１８）に割り当てられる。このピークは、解決されていない、２．４ｐｐｍでのプロトンへの広範囲のＣ−Ｈカップリングを示す。残る５種のカルボニル炭素は、すべて１ｐｐｍ化学シフト範囲内に存在し、そして可能な（１９）、（２０）、（２１）、（２２）、（２３）ではない。
【０２８８】
１０２．３ｐｐｍでの炭素は、２種の別々の酸素に結合される炭素と一致する化学シフトを有し、これは、（２５）に割り当てられる。このプロトンは、３０．６ｐｐｍで炭素にカップリングされる。Ｃ−Ｏ領域（８０〜６０ｐｐｍ）における炭素のうち、１つのみが７７．４ｐｐｍで陽子化され、その結果、（２６）であるべきである。これは、プロトン又は炭素のいずれかへの広範囲のＣ−Ｈカップリングを有さない。
【０２８９】
すべてのメチンが酵素に結合されている、８０〜６０ｐｐｍにおいて、まだ割り当てられていない３個の炭素が存在する。それらはすべて、類似する化学シフト（７１．２、６９．９及び６８．８ｐｐｍ）を有するが、しかし６８．８ｐｐｍでの炭素が、（２８）でのメチルへの広範囲のカップリングを示すことは明白であると思われる。６９．９での炭素はまた、（２８）でのメチルへの広範囲のカップリングを示し、その結果、（２７）に隣接すべきであり、そして（２９）に割り当てられる。従って、残るメチンは（３０）である。
【０２９０】
３．６ｐｐｍ（２９）でのプロトンは、４７．２ｐｐｍで、１つの炭素のみへの広範囲のＣ−Ｈカップリングを示す。唯一の隣接する割り当てられていない炭素は（３１）であるべきである。（３１）のプロトンは、他のプロトンをオーバーラップし、そして広範囲の相互関係は不可能である。
残る４個のメチルは、イソプロピル領域に存在し、そして１つは１．２５／１．３４ｐｐｍで存在し、そして最後の残るメチル（３２）に対応するべきである。このメチルプロトンは、（３３）であるべきである。５１．３ｐｐｍでの１つの炭素のみへの広範囲のカップリングを示す。（３３）のプトロンは、他のプロトンと厳格にオーバーラップし、そしていずれかの広範囲の相互関係のためには使用され得ない。
【０２９１】
残る４個のメチルはすべて、イソプロピルメチル、すなわち集合的にラベルされた（３４）から生じるべきである。（３４）のプロトンは、対合されたメチル間での、及び２５．９／２５．８及び４１．６／４１．７ｐｐｍでの炭素に対して広範囲のカップリングを示し；メチンは、（３５）（３６）に割り当てられ、そしてメチレンは（３７）（３８）に割り当てられる。それらのプロトンのすべては、１．５〜１．８ｐｐｍでオーバーラップするが、しかし５４．７／５３．５ｐｐｍでのメチニンへの広範囲のカップリングを示し、これはアミドに隣接するメチニンであり、そして（３９）（４０）に割り当てられる。
【０２９２】
すべてメチレンである残る５個の炭素は、カルボニルへの広範囲のカップリングを示し、その結果、そのようなカルボニルに隣接すべきであり、そして（４１）、（４２）及び（４３）に割り当てられ；１Ｈ ＮＭＲ化学シフトはすべて、２．４ｐｐｍでオーバーラップし、そして３７．２、３４．４及び３３．８ｐｐｍで炭素に対応する。３７．２での炭素がほとんどの差異であるので、それはナトリウム塩カルボニル（４１）に割り当てられ、そして他の２つは、アミドカルボニル（４２）、（４３）に割り当てられる。残る２つのメチレンは、特定の割り当て（４４）、（４５）のためには類似すぎる。
割り当てられない１つの部位が存在する。この割り当てられた部位を包含する、構造と一致する、５．５〜１．５ｐｐｍ領域に３０のプロトンが存在する。従って、炭素シグナルは、窒素に隣接するメチレンに関して一致する、約５０ｐｐｍでの溶媒シグナル下に隠されていると思われる。
【０２９３】
【表１２】
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【０２９４】
本明細書に言及されるすべての出版物及び特許出願は、個々の出版物又は特許出願が特異的に且つ個々に引用により組み込まれていることを示されているかのように、同じ程度に引用により本明細書に組み込まれる。
本発明は現在、十分に記載されているが、多くの変更及び修飾が本発明の範囲内で行われ得ることは、当業者に明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１Ａ−１Ｄは、略語、名称及び構造の表である。
【図２】
図２は、標的細胞の細胞外付近及び標的細胞内での本発明のプロドラッグの分解の典型的なスキームである。
【図３】
図３は、本発明の典型的な中間体であるＦｍｏｃ−βＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕの合成を示す。
【図４】
図４は、本発明の典型的な中間体であるメチル−スクシニル−βＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕの“Ｆｍｏｃ−経路”合成を示す。
【図５】
図５は、本発明の典型的な化合物であるＳｕｃ−βＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘの塩形の“Ｆｍｏｃ−経路”合成を示す。
【図６】
図６は、本発明の典型的な化合物であるＳｕｃ−βＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘの塩形の“エステル−経路”合成を示す。
【図７】
図７は、本発明の典型的な中間体であるアミノ保護されたβＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘの合成を示す。
【図８】
図８は、本発明の典型的な化学であるＳｕｃ−βＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘの塩形の“アリルエステル経路”を示す。
【図９】
図９は、本発明の典型的な化合物であるＳｕｃ−βＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘの“樹脂経路”を示す。
【図１０】
図１０Ａ−１０Ｃは、本発明のプロドラッグにおいて有用なオリゴペプチドの表である。
【図１１】
図１１は、薬剤と共に又は薬剤を伴わないでビークルを与えられる動物についてのマウス異種移植片モデルにおける生存性のグラフである。
【図１２】
図１２は、ドキソルビシンプロドラッグ及びドキソルビシンを比較するマウス異種移植片モデルにおける生存性のグラフである。
【図１３】
図１３は、ＤＴＴの濃度を高めることによるＨｅＬａ細胞トロウアーゼの活性化及び次に阻害のグラフである。
【図１４】
図１４は、スキャベンジング樹脂又はビーズの使用を通しての遊離治療剤の除去を示す。
【図１５】
図１５は、マウス異種移植片モデルにおける腫瘍増殖阻害のグラフである。
【図１６】
図１６は、本発明の典型的な中間体であるＭｅＯＳｕｃ−βＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘの大規模合成を示す。
【図１７】
図１７は、本発明の典型的な化合物であるＭｅＯＳｕｃ−βＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−ＤｏｘについてのＮＭＲ割り当てを示す。
【図１８】
図１８は、雌ヌードマウスにおけるＭＸ−１ヒト乳癌腫瘍の増殖に対してのＳｕｃ−βＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘ及びドキソルビシン化合物、及びビークルの効果の比較を示す。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１８】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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