(57)【要約】ヒト膜型セリンプロテアーゼ活性を調節する試薬及びヒト膜型セリンプロテアーゼ遺伝子産物と結合する試薬は、細胞外マトリックス分解を調節するのに用いることができる。そのような試薬は、癌（例えば悪性細胞の転移を抑制する）、神経変性疾患、骨粗鬆症又は慢性閉塞性肺疾患を処置するのに特に有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
膜型セリンプロテアーゼポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドであって、
ａ）配列番号２に示すアミノ酸配列と少なくとも約５０％一致するアミノ酸配列；配列番号２に示すアミノ酸配列；配列番号７に示すアミノ酸配列と少なくとも約５０％一致するアミノ酸配列；配列番号７に示すアミノ酸配列；及び配列番号７に示すアミノ酸配列から成る群より選択されるアミノ酸配列を含む膜型セリンプロテアーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
ｂ）配列番号１又は６に記載の配列を含むポリヌクレオチド；
ｃ）（ａ）および（ｂ）に明記するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド；
ｄ）遺伝コードの縮重のため、その配列が（ａ）〜（ｃ）に明記するポリヌクレオチド配列から逸脱しているポリヌクレオチド；並びに
ｅ）（ａ）〜（ｄ）に明記するポリヌクレオチド配列の断片、誘導体またはアレル変異体を表すポリヌクレオチド、
から成る群より選択されるポリヌクレオチド。
【請求項２】
請求項１に記載の任意のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【請求項３】
請求項２に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項４】
請求項１に記載のポリヌクレオチドによってコードされている、実質上精製された膜型セリンプロテアーゼポリペプチド。
【請求項５】
ａ）請求項３に記載の宿主細胞を、膜型セリンプロテアーゼポリペプチドの発現に好適な条件下で培養する工程；および、
ｂ）該宿主細胞培養から膜型セリンプロテアーゼポリペプチドを回収する工程、
を含む、膜型セリンプロテアーゼポリペプチドを生産する方法。
【請求項６】
ａ）請求項１に記載の任意のポリヌクレオチドを生物試料の核酸材料とハイブリダイズさせ、それによりハイブリダイゼーション複合体を形成させる工程；および、
ｂ）該ハイブリダイゼーション複合体を検出する工程、
を含む、生物試料中の膜型セリンプロテアーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを検出するための方法。
【請求項７】
ハイブリダイゼーション前に、生物試料の核酸材料を増幅させる、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
生物試料を、請求項１に記載のポリヌクレオチドまたは請求項４に記載の膜型セリンプロテアーゼポリペプチドと特異的に相互作用する試薬と接触させる工程を含む、請求項１に記載のポリヌクレオチドまたは請求項４に記載の膜型セリンプロテアーゼポリペプチドを検出するための方法。
【請求項９】
請求項６〜８のいずれかに記載の方法を実施するための診断キット。
【請求項１０】
被験化合物を、請求項１に記載の任意のポリヌクレオチドによってコードされている任意の膜型セリンプロテアーゼポリペプチドと接触させる工程；
該膜型セリンプロテアーゼポリペプチドに対する被験化合物の結合を検出する工程、
を含む膜型セリンプロテアーゼの活性を低下させる物質をスクリーニングする方法であって、該ポリペプチドと結合する被験化合物を、膜型セリンプロテアーゼの活性を低下させる可能性のある治療物質として同定する方法。
【請求項１１】
被験化合物を、請求項１に記載の任意のポリヌクレオチドによってコードされる膜型セリンプロテアーゼポリペプチドと接触させる工程；および、
該ポリペプチドの膜型セリンプロテアーゼ活性を検出する工程、
を含む膜型セリンプロテアーゼの活性を調節する物質をスクリーニングする方法であって、膜型セリンプロテアーゼ活性を増大させる被験化合物を膜型セリンプロテアーゼの活性を増大させる可能性のある治療物質として同定し、そして該ポリペプチドの膜型セリンプロテアーゼ活性を減少させる被験化合物を膜型セリンプロテアーゼの活性を減少させる可能性のある治療物質として同定する方法。
【請求項１２】
被験化合物を、請求項１に記載の任意のポリヌクレオチドと接触させ、該ポリヌクレオチドに対する被験化合物の結合を検出する工程を含む、膜型セリンプロテアーゼの活性を減少させる物質をスクリーニングする方法であって、該ポリヌクレオチドに結合する被験化合物を膜型セリンプロテアーゼの活性を減少させる可能性のある治療物質として同定する方法。
【請求項１３】
細胞を、請求項１に記載の任意のポリヌクレオチドまたは請求項４に記載の膜型セリンプロテアーゼポリペプチドと特異的に結合する試薬と接触させ、それにより膜型セリンプロテアーゼの活性を減少させる工程を含む、膜型セリンプロテアーゼの活性を減少させる方法。
【請求項１４】
請求項１０〜１２のいずれかに記載の方法によって同定される、膜型セリンプロテアーゼポリペプチドまたはポリヌクレオチドの活性を調整する試薬。
【請求項１５】
請求項２に記載の発現ベクターまたは請求項１４に記載の試薬および製薬的に許容し得る担体、を含む医薬組成物。
【請求項１６】
疾患において膜型セリンプロテアーゼの活性を調整する、請求項１５に記載の医薬組成物の使用。
【請求項１７】
該疾患が、癌、神経変性疾患、骨粗鬆症又は慢性閉塞性肺疾患である、請求項１６に記載の使用。
【請求項１８】
配列番号２又は７に示すアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするｃＤＮＡ。
【請求項１９】
配列番号１又は６を含む、請求項１８に記載のｃＤＮＡ。
【請求項２０】
配列番号１又は６から成る、請求項１８に記載のｃＤＮＡ。
【請求項２１】
配列番号２又は７に示すアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【請求項２２】
該ポリヌクレオチドが配列番号１又は６から成る、請求項２１に記載の発現ベクター。
【請求項２３】
配列番号２又は７に示すアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項２４】
該ポリヌクレオチドが配列番号１又は６から成る、請求項２３に記載の宿主細胞。
【請求項２５】
配列番号２又は７に示すアミノ酸配列を含む精製されたポリペプチド。
【請求項２６】
配列番号２又は７に示すアミノ酸配列から成る、請求項２５に記載の精製されたポリペプチド。
【請求項２７】
配列番号２又は７に示すアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む融合タンパク質。
【請求項２８】
配列番号２又は７に示すアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする発現ベクターを含む宿主細胞を、該ポリペプチドが発現される条件下で培養し；そして該ポリペプチドを単離する工程を含む、該ポリペプチドを生産する方法。
【請求項２９】
該発現ベクターが配列番号１又は６を含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
配列番号１又は６に記載の１１個の連続ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを、生物試料の核酸材料とハイブリダイズさせ、それによりハイブリダイゼーション複合体を形成させ；そして、該ハイブリダイゼーション複合体を検出する工程を含む、配列番号２又は７に示すアミノ酸配列を含むポリペプチドのコード配列を検出する方法。
【請求項３１】
ハイブリダイズさせる工程の前に、該核酸材料を増幅させる工程をさらに含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
配列番号１又は６に記載の１１個の連続するヌクレオチドを含むポリヌクレオチド；および、
請求項３０に記載の方法についての説明書、
を含む、配列番号２又は７に示すアミノ酸配列を含むポリペプチドのコード配列を検出するためのキット。
【請求項３３】
生物試料を、配列番号２又は７に示すアミノ酸配列を含むポリペプチドと特異的に結合する試薬と接触させて、試薬−ポリペプチド複合体を形成させる工程；および、
該試薬−ポリペプチド複合体を検出する工程、
を含む、該ポリペプチドを検出するための方法。
【請求項３４】
該試薬が抗体である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
配列番号２又は７に示すアミノ酸配列を含むポリペプチドと特異的に結合する抗体；および
請求項３３に記載の方法についての説明書、
を含む、該ポリペプチドを検出するためのキット。
【請求項３６】
被験化合物を、（１）配列番号２又は７に示すアミノ酸配列と少なくとも約５０％一致するアミノ酸配列、および（２）配列番号２又は７に示すアミノ酸配列、から成る群より選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドと接触させる工程；および
該ポリペプチドに対する被験化合物の結合を検出する工程、
を含むヒト膜型セリンプロテアーゼの活性を調整することができる物質をスクリーニングするための方法であって、該ポリペプチドに結合する被験化合物をヒト膜型セリンプロテアーゼの活性を調節する可能性のある物質として規定する方法。
【請求項３７】
接触させる工程が細胞においてである、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
インビトロにおける細胞である、請求項３６に記載の方法。
【請求項３９】
接触させる工程が無細胞系においてである、請求項３６に記載の方法。
【請求項４０】
該ポリペプチドが検出可能な標識を含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項４１】
被験化合物が検出可能な標識を含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項４２】
被験化合物が該ポリペプチドと結合している標識化リガンドに取って代わる、請求項３６に記載の方法。
【請求項４３】
該ポリペプチドが固体支持体と結合している、請求項３６に記載の方法。
【請求項４４】
被験化合物が固体支持体と結合している、請求項３６に記載の方法。
【請求項４５】
被験化合物を、（１）配列番号２又は７に示すアミノ酸配列と少なくとも約５０％一致するアミノ酸配列、および、（２）配列番号２又は７に示すアミノ酸配列、から成る群より選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドと接触させる工程；および
該ポリペプチドの活性を検出する工程、
を含むヒト膜型セリンプロテアーゼの活性を調整する物質をスクリーニングする方法であって、該ポリペプチドの活性を増大させる被験化合物をヒト膜型セリンプロテアーゼの活性を増大させる可能性のある物質として同定し、該ポリペプチドの活性を減少させる被験化合物をヒト膜型セリンプロテアーゼの活性を減少させる可能性のある物質として同定する方法。
【請求項４６】
接触させる工程が細胞においてである、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
インビトロにおける細胞である、請求項４５に記載の方法。
【請求項４８】
接触させる工程が無細胞系においてである、請求項４５に記載の方法。
【請求項４９】
被験化合物を、配列番号１又は６に示すヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによってコードされる産物と接触させる工程；および
該産物に対する被験化合物の結合を検出する工程、
を含むヒト膜型セリンプロテアーゼの活性を調整する物質をスクリーニングする方法であって、該産物に結合する被験化合物をヒト膜型セリンプロテアーゼの活性を調節する可能性のある物質として同定する方法。
【請求項５０】
該産物がポリペプチドである、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
該産物がＲＮＡである、請求項４９に記載の方法。
【請求項５２】
細胞を、配列番号１又は６に示すヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによってコードされる産物と特異的に結合する試薬と接触させ、それによりヒト膜型セリンプロテアーゼの活性を減少させる工程を含む、ヒト膜型セリンプロテアーゼの活性を減少させる方法。
【請求項５３】
該産物がポリペプチドである、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
該産物が抗体である、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
該産物がＲＮＡである、請求項５２に記載の方法。
【請求項５６】
該試薬がアンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
該試薬がリボザイムである、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
インビトロにおける細胞である、請求項５２に記載の方法。
【請求項５９】
該細胞がインビボにおいてである、請求項５２に記載の方法。
【請求項６０】
配列番号２又は７に示すアミノ酸配列を含むポリペプチドと特異的に結合する試薬；および製薬的に許容し得る担体、を含む医薬組成物。
【請求項６１】
該試薬が抗体である、請求項６０に記載の医薬組成物。
【請求項６２】
配列番号１又は６に示すヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドの産物と特異的に結合する試薬；および製薬的に許容し得る担体、を含む医薬組成物。
【請求項６３】
該試薬がリボザイムである、請求項６２に記載の医薬組成物。
【請求項６４】
該試薬がアンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項６２に記載の医薬組成物。
【請求項６５】
該試薬が抗体である、請求項６２に記載の医薬組成物。
【請求項６６】
配列番号２又は７に示すアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする発現ベクター；および製薬的に許容し得る担体、を含む医薬組成物。
【請求項６７】
該発現ベクターが配列番号１又は６を含む、請求項６６に記載の医薬組成物。
【請求項６８】
癌、神経変性疾患、骨粗鬆症又は慢性閉塞性肺疾患より選択される膜型セリンプロテアーゼ機能障害関連疾患を処置する方法であって、それを必要とする患者に、ヒト膜型セリンプロテアーゼの機能を調整する試薬の治療的有効量を投与し、それにより膜型セリンプロテアーゼ機能障害関連疾患の症状を回復させる方法。
【請求項６９】
該試薬が請求項３６に記載の方法によって同定される、請求項６８に記載の方法。
【請求項７０】
該試薬が請求項４５に記載の方法によって同定される、請求項６８に記載の方法。
【請求項７１】
該試薬が請求項４９に記載の方法によって同定される、請求項６８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（技術分野）
本発明は、治療効果を提供するためのヒト膜型セリンプロテアーゼ活性調節の分野に関する。
【０００２】
（背景技術）
転移性癌細胞は、接触させ且つプロテアーゼを用いて細胞外マトリックスを溶解させる原形質膜突起を用いて、細胞外マトリックスに侵入する。該プロテアーゼ活性を阻害する物質を用いることで、転移を抑制できる。またプロテアーゼは、細胞外マトリックスの分解が望まれる発生段階でも発現される。適当な細胞外マトリックス分解が生じない場合には、プロテアーゼ活性を有する分子を補給することで、必要な酵素活性を提供できる。このように、当分野には細胞外マトリックス分解を調節する新規プロテーゼ及び方法を同定する必要性がある。
【０００３】
（発明の概要）
ヒト膜型セリンプロテアーゼを調節する試薬及び方法を提供することが、本発明の目的である。本発明のこの目的及び他の目的は、以下に記載の１つ又はそれ以上の態様によって提供される。
【０００４】
本発明の１つの態様は、
配列番号２に示すアミノ酸配列と少なくとも約５０％一致するアミノ酸配列；および
配列番号２に示すアミノ酸配列；
配列番号７に示すアミノ酸配列と少なくとも約５０％一致するアミノ酸配列；および
配列番号７に示すアミノ酸配列、
から成る群より選択されるアミノ酸配列を含む膜型セリンプロテアーゼポリペプチドである。
【０００５】
本発明のさらに別の態様は、細胞外マトリックス分解を低下させる物質をスクリーニングする方法である。被験化合物を、
配列番号２に示すアミノ酸配列と少なくとも約５０％一致するアミノ酸配列；
配列番号２に示すアミノ酸配列；
配列番号７に示すアミノ酸配列と少なくとも約５０％一致するアミノ酸配列；および
配列番号７に示すアミノ酸配列；
から成る群より選択されるアミノ酸配列を含む膜型セリンプロテアーゼポリペプチドと接触させる。
【０００６】
被験化合物と膜型セリンプロテアーゼポリペプチドとの間の結合を検出する。それにより、膜型セリンプロテアーゼポリペプチドと結合する被験化合物を、細胞外マトリックス分解を低下させる可能性のある物質として同定する。その物質は、膜型セリンプロテアーゼの活性を低下させることによって機能し得る。
【０００７】
本発明の別の態様は、細胞外マトリックス分解を低下させる物質をスクリーニングする方法である。被験化合物を、膜型セリンプロテアーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであって、
配列番号１に示すヌクレオチド配列と少なくとも約５０％一致するヌクレオチド配列；
配列番号１に示すヌクレオチド酸配列；
配列番号６に示すヌクレオチド配列と少なくとも約５０％一致するヌクレオチド配列；および
配列番号６に示すヌクレオチド酸配列、
から成る群より選択されるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、と接触させる。
【０００８】
該ポリヌクレオチドに対する被験化合物の結合を検出する。該ポリヌクレオチドと結合する被験化合物を、細胞外マトリックス分解を低下させる可能性のある物質として同定する。この物質は、膜型セリンプロテアーゼｍＲＮＡと相互作用することを通じて膜型セリンプロテアーゼ量を減少させることによって機能し得る。
【０００９】
本発明の別の態様は、細胞外マトリックス分解を調節する物質をスクリーニングする方法である。被験化合物を、
配列番号２に示すアミノ酸配列と少なくとも約５０％一致するアミノ酸配列；
配列番号２に示すアミノ酸配列；
配列番号７に示すアミノ酸配列と少なくとも約５０％一致するアミノ酸配列；および
配列番号７に示すアミノ酸配列、
から成る群より選択されるアミノ酸配列を含む膜型セリンプロテアーゼポリペプチド、と接触させる。
【００１０】
該ポリペプチドの膜型セリンプロテアーゼ活性を検出する。それにより、被験化合物の非存在下の膜型セリンプロテアーゼ活性と比較して該ポリペプチドの膜型セリンプロテアーゼ活性を増大させる被験化合物を、細胞外マトリックス分解を増大させる可能性のある物質として同定する。それにより、被験化合物の非存在下の膜型セリンプロテアーゼ活性と比較して該ポリペプチドの膜型セリンプロテアーゼ活性を低下させる被験化合物を、細胞外マトリックス分解を低下させる可能性のある物質として同定する。
【００１１】
本発明のさらに別の態様は、細胞外マトリックス分解を低下させる物質をスクリーニングする方法である。被験化合物を、
配列番号１に示すヌクレオチド配列と少なくとも約５０％一致するヌクレオチド配列；
配列番号１に示すヌクレオチド酸配列；
配列番号６に示すヌクレオチド配列と少なくとも約５０％一致するヌクレオチド配列；および
配列番号６に示すヌクレオチド酸配列、
から成る群より選択されるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドの膜型セリンプロテアーゼ産物、と接触させる。
【００１２】
該膜型セリンプロテアーゼ産物に対する被験化合物の結合を検出する。それにより、膜型セリンプロテアーゼ産物と結合する被験化合物を、細胞外マトリックス分解を低下させる可能性のある物質として同定する。
【００１３】
本発明のさらなる別の態様は、細胞外マトリックス分解を調節する方法である。細胞を、膜型セリンプロテアーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチド又は該ポリヌクレオチドによってコードされている産物と特異的に結合する試薬、と接触させる［ここに、上記ポリヌクレオチドは、配列番号１に示すヌクレオチド配列と少なくとも約５０％一致するヌクレオチド配列；配列番号１に示すヌクレオチド酸配列；配列番号６に示すヌクレオチド配列と少なくとも約５０％一致するヌクレオチド配列；および、配列番号６に示すヌクレオチド酸配列から成る群より選択されるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを含む］。
【００１４】
それにより、細胞における膜型セリンプロテアーゼ活性を低下させる。
【００１５】
このように、本発明は、特に悪性細胞の転移活性を抑制するためのにかつ発生段階の細胞外マトリックス分解を増進するために使用できる、ヒト膜型セリンプロテアーゼ活性を調節するための試薬及び方法を提供する。
【００１６】
（本発明の詳しい説明）
本発明は、膜型セリンプロテアーゼポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドであって、
ａ）配列番号２に示すアミノ酸配列と少なくとも約５０％一致するアミノ酸配列；配列番号２に示すアミノ酸配列；配列番号７に示すアミノ酸配列と少なくとも約５０％一致するアミノ酸配列；および配列番号７に示すアミノ酸配列から成る群より選択されるアミノ酸配列を含む膜型セリンプロテアーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
ｂ）配列番号１又は６に記載の配列を含むポリヌクレオチド；
ｃ）（ａ）および（ｂ）に明記するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド；
ｄ）遺伝コードの縮重のため、その配列が（ａ）〜（ｃ）に明記するポリヌクレオチド配列から逸脱しているポリヌクレオチド；並びに
ｅ）（ａ）〜（ｄ）に明記するポリヌクレオチド配列の断片、誘導体またはアレル変異体を表すポリヌクレオチド、
から成る群より選択されるポリヌクレオチドに関する。
【００１７】
さらに、本出願人は、新たな膜型セリンプロテアーゼ、特にヒト膜型セリンプロテアーゼを同定したことを発見した。ＢＬＡＳＴアライメントは、エピシン（ｅｐｉｔｈｉｎ）、並びに他の細胞表面セリンプロテアーゼ、例えば肥満細胞プロテアーゼ６と非常に高い類似性を示す。セリンプロテアーゼの全ての活性部位残基が存在する。細胞表面会合を示すため、フィブロネクチンドメインもまた存在する。また、タンパク質には、他の典型的なプロテアーゼドメイン、例えばクリングル（Ｋｒｉｎｇｌｅ）及びアップルドメインが含まれる。
【００１８】
配列番号２に示すようなヒト膜型セリンプロテアーゼのＣ末端部分は、スイス プロット アクセッションＮｏ．Ｐ５６６７７（配列番号３）により同定されたマウスタンパク質（マウスエピシンと注記したもの）と３４４アミノ酸にわたって４３％一致する（図１）。推定全長ヒト膜型セリンプロテアーゼ（配列番号７）は、配列番号３に対して８６２アミノ酸にわてって３０％一致する（図５）。類似マウスホモログ（相同分子種のような）は小脳及び四丘体に発現される。
【００１９】
従って、ヒト膜型セリンプロテアーゼの活性の調整は、以前に同定されたセリンプロテアーゼと同じ目的、特に細胞外マトリックス分解と関連した目的に、並びに癌、骨粗鬆症、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）及び種々のＣＮＳ疾患などの疾患を処置するのに有用であると期待される。
【００２０】
ポリペプチド
本発明に係る膜型セリンプロテアーゼポリペプチドには、配列番号６または以下の定義による生物学的に活性なその変異体より選択される、少なくとも６、１０、１５、２５、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５又は３５０個の連続アミノ酸が含まれる。したがって、本発明の膜型セリンプロテアーゼポリペプチドは、膜型セリンプロテアーゼタンパク質の一部、完全長の膜型セリンプロテアーゼ分子、又は膜型セリンプロテアーゼ分子の全部または一部を含む融合タンパク質であり得る。
【００２１】
生物学的に活性な変異体
生物学的活性がある、即ち膜型セリンプロテアーゼ活性を保持している膜型セリンプロテアーゼポリペプチド変異体のもまた、膜型セリンプロテアーゼポリペプチドである。天然または非天然膜型セリンプロテアーゼポリペプチド変異体は、配列番号２又は７に示すアミノ酸配列と少なくとも約５０、５５、６０、６５、７０％、好ましくは、約７５、９０、９６または９８％一致するアミノ酸配列を有することが好ましい。推定される膜型セリンプロテアーゼポリペプチド変異体と配列番号２又は７に記載のアミノ酸配列との間の一致パーセントは、８のギャップ創作ペナルティーや２のギャップ伸長ペナルティーを有するＢｌｏｓｕｍ６２マトリックスを使用するＮｅｅｄｌｅｍａｎ／Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム （Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈ， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ４８； ４４３−４５３，１９７０）を用いて決定される （Ｓ． Ｈｅｎｉｋｏｆｆ及びＪ． Ｇ． Ｈｅｎｉｋｏｆｆ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８９：１０９１５−１０９１９，１９９２）。
【００２２】
一致パーセントの変異は、例えばアミノ酸置換、挿入または欠失に起因し得る。アミノ酸置換は１対１のアミノ酸の置き換えとして定義される。置換されたアミノ酸が類似の構造的および／または化学的性質を有する場合、置換は事実上保存的である。保存的置換の例は、イソロイシンまたはバリンによるロイシンの置換、グルタメートによるアスパルテートの置換、またはセリンによるスレオニンの置換である。
【００２３】
アミノ酸挿入または欠失はアミノ酸配列への、またはその内部での変化である。これらは典型的には約１〜５アミノ酸の範囲で起こる。生物学的または免疫学的活性を破壊することなく、どのアミノ酸残基が置換、挿入または欠失できるかを決定する際の指針は、当分野で周知のコンピュータープログラム、例えばＤＮＡＳＴＡＲソフトウェアを用いて見出すことができる。あるアミノ酸変化が生物学的に活性な膜型セリンプロテアーゼポリペプチドに影響するか否かは、当分野で周知のように、例えば実施例４に記載のように、フィブロネクチン結合又は膜型セリンプロテアーゼ活性を検定することにより容易に決定できる。
【００２４】
融合タンパク質
融合タンパク質は、膜型セリンプロテアーゼポリペプチドアミノ酸配列に対する抗体の作製に、そして様々な検定系での使用に有用である。例えば、融合タンパク質は、その活性部位やフィブロネクチンドメインを含有する膜型セリンプロテアーゼポリペプチドの一部と相互作用するタンパク質の同定に使用できる。タンパク質親和クロマトグラフィーまたはタンパク質−タンパク質相互作用のためのライブラリーに基づく検定、例えば酵母２−ハイブリッドまたはファージディスプレイ系などの方法を、この目的のために使用できる。このような方法は当分野で周知であり、薬物スクリーニングとしても使用できる。
【００２５】
膜型セリンプロテアーゼポリペプチド融合タンパク質は、ペプチド結合により互いに融合した二つのタンパク質セグメントを含んでいる。例えば、第一のタンパク質セグメントは、配列番号２若しくは７または上記のような生物学的に活性な変異体の少なくとも６、１０、１５、２５、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５又は３５０個の連続アミノ酸を含む。融合タンパク質は、そのプロテアーゼの活性部位及び図１〜５に規定される機能性ドメインの１つ又はそれ以上を含むことが好ましい。第一のタンパク質セグメントはまた、完全長膜型セリンプロテアーゼタンパク質を含み得る。
【００２６】
第二のタンパク質セグメントは完全長タンパク質またはタンパク質断片またはポリペプチドであってよい。融合タンパク質の構築に一般的に使用するタンパク質は、β−ガラクトシダーゼ、β−グルクロニダーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、自己蛍光タンパク質（青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）を包含する）、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、ルシフェラーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、およびクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）を包含する。さらに、融合タンパク質の構築には、ヒスチジン（Ｈｉｓ）標識、ＦＬＡＧ標識、インフルエンザへマグルチニン（ＨＡ）標識、Ｍｙｃ標識、ＶＳＶ−Ｇ標識、およびチオレドキシン（Ｔｒｘ）標識を包含するエピトープ標識を使用する。その他の融合構築は、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、Ｓ−標識、Ｌｅｘ ａ ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）融合物、ＧＡＬ４ ＤＮＡ結合ドメイン融合物、および単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ＢＰ１６タンパク質融合物を包含する。また、融合タンパク質はさらに、膜型セリンプロテアーゼポリペプチドコード配列と非相同タンパク質配列の間に位置する開裂部位を含むよう組み立てることができ、その結果、この膜型セリンプロテアーゼポリペプチドは、開裂され、非相同部分を無くすように精製できる。
【００２７】
融合タンパク質は当分野で周知のように化学合成できる。好ましくは、融合タンパク質は二つのタンパク質セグメントを共有結合で連結することにより、または分子生物学分野で標準的な方法により調製する。例えば、当分野で知られているように、第二のタンパク質セグメントをコードしているヌクレオチドを有する適切なリーディングフレームに本明細書中で開示する膜型セリンプロテアーゼコード配列を含むＤＮＡ構築物を作製し、このＤＮＡ構築物を宿主細胞で発現させることによる組換えＤＮＡ法を用いて、融合タンパク質を調製できる。融合タンパク質構築用の多くのキットが、Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩ）、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（Ｌａ Ｊｏｌｌａ， ＣＡ）、ＣＬＯＮＴＥＣＨ（Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ， ＣＡ）、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ， ＣＡ）、ＭＢＬ ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（ＭＩＣ； Ｗａｔｅｒｔｏｗｎ， ＭＡ）、およびＱｕａｎｔｕｍ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｍｏｎｔｒｅａｌ， Ｃａｎａｄａ； １−８８８−ＤＮＡ−ＫＩＴＳ）といった企業から入手できる。
【００２８】
種相同体の同定
膜型セリンプロテアーゼポリペプチドのポリヌクレオチド（下記）を使用して他の種、例えばマウス、サル、または酵母由来のｃＤＮＡ発現ライブラリーをスクリーニングするために好適なプローブまたはプライマーを作製し、膜型セリンプロテアーゼポリペプチドの相同体をコードしているｃＤＮＡを同定し、そして当分野で周知のようにこのｃＤＮＡを発現させて、ヒト膜型セリンプロテアーゼポリペプチドの種相同体を得ることができる。
【００２９】
ポリヌクレオチド
膜型セリンプロテアーゼポリヌクレオチドは、一本鎖又は二本鎖であってよく、膜型セリンプロテアーゼポリペプチドのコード配列又はそのコード配列の相補物を含んでいてもよい。膜型セリンプロテアーゼのＣ末端部分の一部（配列番号２）のコード配列を配列番号１に示す。全長の膜型セリンプロテアーゼ（配列番号７）のコード配列を配列番号６に示す。
【００３０】
ヒト膜型セリンプロテアーゼポリペプチドをコードしている縮重ヌクレオチド配列、および、配列番号１又は６に示す膜型セリンプロテアーゼコード配列と少なくとも約５０、５５、６０、６５、７０、好ましくは約７５、９０、９６または９８％一致するホモローガスなヌクレオチド配列もまた、膜型セリンプロテアーゼポリヌクレオチドである。二つのポリヌクレオチド配列間の配列一致パーセントは、ＡＬＩＧＮのようなコンピュータープログラムを用いて決定するが、これは、ギャップオープンペナルティー−１２およびギャップエクステンションペナルティー−２によるアフィンギャップ検索を用いるＦＡＳＴＡアルゴリズムを使用するものである。相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）分子、種相同体および生物学的に活性な膜型セリンプロテアーゼポリペプチドをコードしている膜型セリンプロテアーゼポリヌクレオチドの変異体もやはり膜型セリンプロテアーゼポリヌクレオチドである。
【００３１】
変異体および相同体の同定
上記の膜型セリンプロテアーゼポリヌクレオチド変異体および相同体もまた膜型セリンプロテアーゼポリヌクレオチドである。典型的には、相同膜型セリンプロテアーゼポリヌクレオチド配列は、当分野で周知のように、ストリンジェントな条件下で候補ポリヌクレオチドを既知の膜型セリンプロテアーゼポリヌクレオチドにハイブリダイズさせることにより同定できる。例えば、以下の洗浄条件 −− ２Ｘ ＳＳＣ（０．３Ｍ ＮａＣｌ、０．０３Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）、０．１％ＳＤＳ、室温 ２回、各々３０分間；次いで２× ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、５０℃ １回、３０分間；次いで２× ＳＳＣ、室温 ２回、各々１０分間 −− を使用して、最大約２５−３０％の塩基対ミスマッチ（不対合）を含む相同配列を同定できる。より好ましくは、相同核酸鎖は１５−２５％の塩基対ミスマッチを、さらに好ましくは５−１５％の塩基対ミスマッチを含む。
【００３２】
本明細書に開示する膜型セリンプロテアーゼポリヌクレオチドの種相同体は、適当なプローブまたはプライマーを作製し、他の種、例えばマウス、サル、または酵母由来のｃＤＮＡ発現ライブラリーをスクリーニングすることによって同定できる。膜型セリンプロテアーゼポリヌクレオチドのヒト変異体は、例えばヒトｃＤＮＡ発現ライブラリーをスクリーニングすることにより同定できる。二本鎖ＤＮＡのＴｍは相同性が１％低下する毎に１−１．５℃低下することがよく知られている（Ｂｏｎｎｅｒら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ． ８１，１２３（１９７３））。故にヒト膜型セリンプロテアーゼポリヌクレオチドの変異体または他の種の膜型セリンプロテアーゼポリヌクレオチドは、推定の相同膜型セリンプロテアーゼポリヌクレオチドを、配列番号１又は６に記載のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドとハイブリダイズさせて被験ハイブリッドを形成させることによって同定できる。被験ハイブリッドの融解温度を、完全に相補的なヌクレオチド配列を有する膜型セリンプロテアーゼポリヌクレオチドを含むハイブリッドの融解温度と比較し、被験ハイブリッド中の塩基対ミスマッチの数またはパーセントを算出する。
【００３３】
ストリンジェントなハイブリダイゼーションおよび／または洗浄条件に従い膜型セリンプロテアーゼポリヌクレオチドまたはその相補物とハイブリダイズするヌクレオチド配列もまた膜型セリンプロテアーゼポリヌクレオチドである。ストリンジェントな洗浄条件は当分野で周知且つ理解されており、例えばＳａｍｂｒｏｏｋら、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ： Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ， ２ｄ ｅｄ．， １９８９， ９．５０−９．５１頁に開示されている。
【００３４】
典型的には、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件のためには、温度と塩濃度の組み合わせを、検討中のハイブリッドの理論的Ｔｍよりおよそ１２−２０℃低くなるよう選択すべきである。本明細書中に開示するコード配列を有する膜型セリンプロテアーゼポリヌクレオチドと、そのヌクレオチド配列と少なくとも約５０、５５、６０、６５、７０、好ましくは約７５、９０、９６、または９８％一致するポリヌクレオチド配列とのハイブリッドのＴｍは、例えばＢｏｌｔｏｎおよびＭｃＣａｒｔｈｙ， Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ４８，１３９０（１９６２）の式：
Ｔｍ＝８１．５℃−１６．６（ｌｏｇ１０［Ｎａ＋］）＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）−０．６３（％ホルムアミド）−６００／ｌ）、
［式中、ｌ＝塩基対で表したハイブリッドの長さ］
を用いて算出できる。
ストリンジェントな洗浄条件としては例えば、４×ＳＳＣ（６５℃）、または５０％ホルムアミド、４×ＳＳＣ（４２℃）、または０．５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ（６５℃）が挙げられる。高度ストリンジェントな洗浄条件は、例えば０．２×ＳＳＣ（６５℃）などである。
【００３５】
ポリヌクレオチドの調製
天然の膜型セリンプロテアーゼポリヌクレオチドは、膜構成成分、タンパク質および脂質といった他の細胞成分を含まないよう単離できる。ポリヌクレオチドは細胞から調製でき、標準的核酸精製技術を用いて単離、またはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）のような増幅技術を用いて合成、若しくは自動合成機を用いることによって合成できる。ポリヌクレオチドを単離する方法は機械的であり、当分野で知られている。ポリヌクレオチドを取得するためこのような任意の技術を用いて、単離された膜型セリンプロテアーゼポリヌクレオチドを得ることができる。例えば、制限酵素およびプローブを用いて膜型セリンプロテアーゼヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド断片を単離できる。単離したポリヌクレオチドは他の分子を含まないか、あるいは少なくとも７０、８０、または９０％含まない調製物である。
【００３６】
膜型セリンプロテアーゼｃＤＮＡ分子は、膜型セリンプロテアーゼｍＲＮＡを鋳型に用いて標準的分子生物学技術にて調製できる。その後膜型セリンプロテアーゼｃＤＮＡ分子は、当分野で周知でありＳａｍｂｒｏｏｋら．（１９８９）のようなマニュアルに開示される分子生物学技術を用いて複製できる。ヒトゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡのいずれかを鋳型として使用して膜型セリンプロテアーゼポリヌクレオチドのさらなるコピーを得るため、ＰＣＲのような増幅技術を用いることができる。
【００３７】
別法として、合成化学技術を用いて膜型セリンプロテアーゼポリヌクレオチドを合成することもできる。遺伝コードの縮重により、例えば配列番号２又は７に示すアミノ酸配列を有する膜型セリンプロテアーゼポリペプチドまたはその配列の生物学的に活性な変異体をコードする別のヌクレオチド配列の合成を可能にする。
【００３８】
全長ポリヌクレオチドの獲得
ＰＣＲに基づく様々な方法を用いて、開示したヒト膜型セリンプロテアーゼの一部をコードする核酸配列を伸長させ、プロモーターおよび調節要素といった上流配列を検出することができる。例えば制限部位ＰＣＲは、既知の座に隣接する未知配列を検索するため、ユニバーサルプライマーを使用する（Ｓａｒｋａｒ， ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ａｐｐｌｉｃ． ２，３１８−３２２，１９９３）。まず、ゲノムＤＮＡを、リンカー配列に対するプライマーと既知領域に特異的なプライマーの存在下で増幅する。次に、増幅させた配列を、同じリンカープライマーと最初のものの内部にある別の特異的プライマーを用いて、第二回目のＰＣＲを行なう。各回のＰＣＲ産物を適当なＲＮＡポリメラーゼで転写し、かつ逆転写酵素を行いて配列決定する。
【００３９】
既知領域に基づく異なる（ディバージェント）プライマーを用いて配列を増幅または伸長するために、逆ＰＣＲを使用することもできる（Ｔｒｉｇｌｉａら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １６，８１８６，１９８８）。ＯＬＩＧＯ ４．０６ Ｐｒｉｍｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓソフトウェア（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｉｎｃ．， Ｐｌｙｍｏｕｔｈ， Ｍｉｎｎ）のような市販ソフトウェアを用いて、長さ２２−３０ヌクレオチド長、５０％またはそれ以上のＧＣ含有量を持ち、約６８−７２℃の温度で標的配列とアニーリングするプライマーを設計できる。この方法は、幾つかの制限酵素を用いて、遺伝子の既知領域に適当な断片を作り出せる。次いでこの断片を分子内ライゲーションにより環化し、ＰＣＲ鋳型として使用する。
【００４０】
使用できるもう一つの方法は、ヒトおよび酵母人工染色体ＤＮＡ中の既知配列に隣接するＤＮＡ断片のＰＣＲ増幅を含む、捕捉ＰＣＲである（Ｌａｇｅｒｓｔｒｏｍら、ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ａｐｐｌｉｃ． １，１１１−１１９，１９９１）。この方法では、作製した二本鎖配列を、ＰＣＲの実施前に当該ＤＮＡ分子の未知断片中に入れるため、複数の制限酵素消化とライゲーションを行う。
【００４１】
未知配列を回収するために使用できるもう一つの方法はＰａｒｋｅｒら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １９，３０５５−３０６０，１９９１の方法である。さらに、ＰＣＲ、ネスティド（ｎｅｓｔｅｄ）プライマー、およびＰＲＯＭＯＴＥＲＦＩＮＤＥＲライブラリー（ＣＬＯＮＴＥＣＨ， Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ， Ｃａｌｉｆ．）を用いてゲノムＤＮＡ歩行を行なうことができる。このプロセスはライブラリーをスクリーニングする必要性を排除し、イントロン／エクソン接合点の発見に有用である。
【００４２】
スクリーニングで完全長ｃＤＮＡを求める場合、より大きなｃＤＮＡを含むようサイズ選択したライブラリーを使用するのが望ましい。また、遺伝子の５’領域を含む配列をより多く含んでいるという点で、無作為プライミングしたライブラリーが好ましい。無作為プライミングしたライブラリーの使用は、オリゴｄ（Ｔ）ライブラリーが完全長ｃＤＮＡを産生しない状況で特に好ましいであろう。ゲノムライブラリーは、配列を５’非転写調節領域へと伸長させるのに有用な場合がある。
【００４３】
市販品が入手可能な毛細管電気泳動系を用いて、ＰＣＲまたは配列決定産物のサイズを分析、またはヌクレオチド配列を確認することができる。例えば、毛細管配列決定は、電気泳動分離用の流動性ポリマー、レーザー励起する４種の異なる蛍光色素（各ヌクレオチドにつき１種ずつ）、および電荷結合素子カメラによる放射された波長の検出を利用することができる。出力／光強度は適当なソフトウェア（例えばＧＥＮＯＴＹＰＥＲおよびＳｅｑｕｅｎｃｅ ＮＡＶＩＧＡＴＯＲ、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を用いて電気信号に変換でき、試料のロードからコンピューター分析および電子的データ表示に至る全プロセスをコンピューター管理することができる。毛細管電気泳動は、特定の試料中に限られた量で存在するかも知れないＤＮＡの小片を配列決定するのに特に好ましい。
【００４４】
ポリペプチドの取得
膜型セリンプロテアーゼポリペプチドは、例えばヒト細胞からの精製によって、膜型セリンプロテアーゼポリヌクレオチドの発現によって、または直接的化学合成によって取得できる。
【００４５】
タンパク質精製
膜型セリンプロテアーゼポリペプチドは、原発腫瘍細胞、転移性細胞又は癌細胞系（例えば、大腸癌細胞系、ＨＣＴ１１６、ＤＬＤ１、ＨＴ２９、Ｃａｃｏ２、ＳＷ８３７、ＳＷ４８０及びＲＫＯ、乳癌細胞系２１−ＰＴ、２１−ＭＴ、ＭＤＡ−４６８、ＳＫ−ＢＲ３及びＢＴ−４７４、Ａ５４９肺癌細胞系、又はＨ３９２ グリア芽腫細胞系）、並びに膜型セリンプロテアーゼ発現構築物でトランスフェクトした細胞から精製することができる。脳組織、例えば小脳及び四丘体もまた有用な資源である。精製膜型セリンプロテアーゼポリペプチドは、当分野で周知の方法を用いて、細胞内で膜型セリンプロテアーゼポリペプチドと通常会合している他の化合物、例えば特定のタンパク質、炭水化物または脂質から分離される。そのような方法には、サイズ排除クロマトフラフィー、硫酸アンモニウム分画、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーおよび調製用ゲル電気泳動が挙げられるが、これらに制限されない。精製膜型セリンプロテアーゼポリペプチドの調製は、少なくとも８０％純粋；９０％、９５％または９９％純粋な調製であることが好ましい。調製物の純度は当分野で周知の任意の方法、例えばＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動によって評価できる。精製した調製物の酵素活性は、例えば実施例４に記載のように検定できる。
【００４６】
ポリヌクレオチドの発現
膜型セリンプロテアーゼポリペプチドを発現させるため、挿入されたコード配列の転写と翻訳に必要な要素を含む発現ベクター中に膜型セリンプロテアーゼポリヌクレオチドを挿入することができる。当業者に周知の方法を利用して、膜型セリンプロテアーゼポリペプチドをコードしている配列および適当な転写および翻訳調節要素を含む発現ベクターを構築できる。これらの方法には、インビトロ組換えＤＮＡ技術、合成技術、およびインビボ遺伝子組換えがある。このような技術は、例えばＳａｍｂｒｏｏｋら、（１９８９）およびＡｕｓｕｂｅｌら、ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ．， １９８９に記載されている。
【００４７】
膜型セリンプロテアーゼポリペプチドをコードしている配列を含み、そして発現する様々な発現ベクター／宿主系が利用できる。これらには、微生物、例えば組換えバクテリオファージ、プラスミド、またはコスミドＤＮＡ発現ベクターにより形質転換された細菌；酵母発現ベクターにより形質転換された酵母、ウイルス発現ベクター（例えばバキュロウイルス）により感染を受けた昆虫細胞系、ウイルス発現ベクター（例えばカリフラワーモザイクウイルス、ＣａＭＶ；タバコモザイクウイルス、ＴＭＶ）、若しくは細菌発現ベクター（例えばＴｉまたはｐＢＲ３２２プラスミド）により形質転換された植物細胞系、または動物細胞系が包含されるがこれらに限定される訳ではない。
【００４８】
調節要素または調節配列は、宿主細胞タンパク質と相互作用して転写と翻訳を実行するベクターの非翻訳領域−エンハンサー、プロモーター、５’および３’非翻訳領域−である。かかる要素はその強さと特異性において異なっている。利用するベクター系および宿主に応じて、構成的および誘導的プロモーターを包含する、多数の好適な転写および翻訳要素を使用できる。例えば、細菌系でクローニングを行う場合、ＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴファージミド（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ， ＬａＪｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆ．）またはｐＳＰＯＲＴ１プラスミド（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）等のハイブリッドｌａｃＺプロモーターのような誘導的プロモーターを使用できる。バキュロウイルスのポリヘドリンプロモーターは昆虫細胞に使用できる。植物細胞のゲノムから誘導したプロモーターまたはエンハンサー（例えば熱ショック、ＲＵＢＩＳＣＯ、および貯蔵タンパク質遺伝子）、または植物ウイルスから誘導したプロモーターまたはエンハンサー（例えば、ウイルスプロモーターまたはリーダー配列）を該ベクター中にクローニングすることができる。哺乳動物細胞系では、哺乳動物遺伝子由来の、または哺乳動物ウイルス由来のプロモーターが好ましい。膜型セリンプロテアーゼポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列を複数コピー含む細胞系を作製する必要がある場合は、ＳＶ４０またはＥＢＶに基づくベクターを適当な選択マーカーと共に使用することができる。
【００４９】
細菌および酵母発現系
細菌系では、膜型セリンプロテアーゼポリペプチドに対して意図する用途に応じて幾つかの発現ベクターを選択できる。例えば、抗体の誘導のため、大量の膜型セリンプロテアーゼポリペプチドが必要である場合は、容易に精製できる融合タンパク質の高レベル発現を指令するベクターが使用できる。このようなベクターは、ＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）のような多機能Ｅ．ｃｏｌｉクローニングおよび発現ベクターを包含するが、これに限定される訳ではなく、このＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴベクターにおいては、膜型セリンプロテアーゼポリペプチドをコードしている配列を、β−ガラクトシダーゼのアミノ末端Ｍｅｔとこれに続く７残基の配列と共にフレーム内で該ベクター中にライゲーションすることができ、その結果ハイブリッドタンパク質が生産される。ｐＩＮベクター（Ｖａｎ Ｈｅｅｋｅ ＆ Ｓｃｈｕｓｔｅｒ， Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２６４，５５０３−５５０９，１９８９）またはｐＧＥＸベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ， Ｍａｄｉｓｏｎ， Ｗｉｓ．）もまた、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）を伴う融合タンパク質として外来ポリペプチドを発現させるのに使用できる。一般に、このような融合タンパク質は可溶性であり、グルタチオン−アガロースビーズに吸着させ、その後遊離グルタチオンの存在下で溶離することにより、溶菌させた細胞から容易に精製できる。このような系で調製したタンパク質は、ヘパリン、トロンビン、または第Ｘａ因子プロテアーゼ開裂部位を含むよう設計でき、その結果、目的とするクローンポリペプチドをＧＳＴ部分から随意に解放することができる。
【００５０】
酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおいては、α因子、アルコールオキシダーゼ、およびＰＧＨのような構成的または誘導的プロモーターを含む幾つかのベクターが使用できる。総説としてＡｕｓｕｂｅｌら、（１９８９）およびＧｒａｎｔら、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． １５３，５１６−５４４，１９８７を参照されたい。
【００５１】
植物および昆虫発現系
植物発現ベクターを使用する場合、膜型セリンプロテアーゼポリペプチドをコードしている配列の発現は、幾つかのプロモーターのうち任意のものにより駆動できる。例えば、ＣａＭＶの３５Ｓおよび１９Ｓプロモーターのようなウイルスプロモーターを、単独で、またはＴＭＶ由来のオメガリーダー配列と組み合わせて使用できる（Ｔａｋａｍａｔｓｕ， ＥＭＢＯ Ｊ． ６，３０７−３１１，１９８７）。別法として、ＲＵＢＩＳＣＯの小サブユニットのような植物プロモーターまたは熱ショックプロモーターを使用することもできる（Ｃｏｒｕｚｚｉら、ＥＭＢＯ Ｊ． ３，１６７１−１６８０，１９８４；Ｂｒｏｇｌｉｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２４，８３８−８４３，１９８４；Ｗｉｎｔｅｒら、Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｐｒｏｂｌ．Ｃｅｌｌ Ｄｉｆｆｅｒ． １７，８５−１０５，１９９１）。これらの構築物は、直接ＤＮＡ形質転換または病原体媒介トランスフェクションにより植物細胞中に導入できる。このような技術は、幾つかの一般に入手可能な総説に記載されている（例えば、ＨｏｂｂｓまたはＭｕｒｒａｙ、ＭＣＧＲＡＷ ＨＩＬＬ ＹＥＡＲＢＯＯＫ ＯＦ ＳＣＩＥＮＣＥ ＡＮＤ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ， ＭｃＧｒａｗ Ｈｉｌｌ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｎ．Ｙ．， ｐｐ１９１−１９６，１９９２を参照のこと）。
【００５２】
昆虫系もまた膜型セリンプロテアーゼポリペプチドの発現に使用できる。例えば、かかる系の１つＡｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ核多角体病ウイルス（ＡｃＮＰＶ）は、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞またはＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａの幼虫で外来遺伝子を発現させるベクターとして使用する。膜型セリンプロテアーゼポリペプチドをコードしている配列を、ポリヘドリン遺伝子のような該ウイルスの非必須領域中にクローニングし、ポリヘドリンプロモーターの調節下に置くことができる。膜型セリンプロテアーゼポリペプチドをうまく挿入すると、ポリヘドリン遺伝子は不活性化し、コートタンパク質を欠く組換えウイルスが生成する。次いでこの組換えウイルスを、例えばＳ．ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞またはＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａの幼虫への感染に使用し、そこで膜型セリンプロテアーゼポリペプチドを発現させることができる（Ｅｎｇｅｌｈａｒｄら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ９１，３２２４−３２２７，１９９４）。
【００５３】
哺乳動物発現系
ウイルスに基づく多くの発現系を、哺乳動物宿主細胞に利用できる。例えば、発現ベクターとしてアデノウイルスを使用する場合、膜型セリンプロテアーゼポリペプチドをコードしている配列は、後期プロモーターおよび３部に分かれたリーダー配列を含むアデノウイルス転写／翻訳複合体中にライゲーションできる。該ウイルスゲノムの非必須Ｅ１またはＥ３領域における挿入を用いて、感染宿主細胞において膜型セリンプロテアーゼポリペプチドを発現できる生存ウイルスを取得できる（Ｌｏｇａｎ ＆ Ｓｈｅｎｋ， Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ８１，３６５５−３６５９，１９８４）。所望によりラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）エンハンサーのような転写エンハンサーを用いて、哺乳動物宿主細胞での発現を増大させることができる。
【００５４】
ヒト人工染色体（ＨＡＣ）もまた、プラスミドが内包し発現するＤＮＡ断片よりも大きなＤＮＡ断片の運搬に使用できる。６Ｍから１０ＭのＨＡＣを組み立て、常套的送達法により細胞に到達させる（例えば、リポソーム、ポリカチオンアミノポリマー、または小胞）。
【００５５】
さらに、膜型セリンプロテアーゼポリペプチドをコードしている配列のより効率的な翻訳を達成するために、特異的開始シグナルを使用できる。かかるシグナルはＡＴＧ開始コドンおよび連続配列を包含する。膜型セリンプロテアーゼポリペプチドをコードしている配列、その開始コドン、および上流配列を適当な発現ベクター中に挿入した場合、さらなる転写または翻訳調節シグナルは必要ないであろう。しかしながら、コード配列またはその断片のみを挿入した場合は、外因性の翻訳調節シグナル（ＡＴＧ開始コドンを包含する）を供給すべきである。開始コドンは挿入物全体を確実に翻訳させるために、正しいリーディングフレームになければならない。外因性翻訳要素および開始コドンは天然および合成両者の様々な起源であってよい。発現の効率は、使用する特定の細胞系に対し適切なエンハンサーを存在させることにより増強できる（Ｓｃｈａｒｆら、Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｐｒｏｂｌ．Ｃｅｌｌ Ｄｉｆｆｅｒ． ２０，１２５−１６２，１９９４）。
【００５６】
宿主細胞
宿主細胞菌株は、挿入した配列の発現を調節する能力または発現された膜型セリンプロテアーゼポリペプチドを所望の方法で処理できる能力を目的として選択できる。該ポリペプチドのこのような修飾には、アセチル化、カルボキシ化、グリコシル化、燐酸化、脂質化、およびアシル化が包含されるがこれらに限定されない。該ポリペプチドの「プレプロ」型を開裂する翻訳後プロセシングもまた、正しい挿入、折り畳み、および／または機能を促進するために使用できる。翻訳後活性のための特異的な細胞機構および特徴的メカニズムを持つ異なる宿主細胞（例えばＣＨＯ、ＨｅＬａ、ＭＤＣＫ、ＨＥＫ２９３およびＷＩ３８）が、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ；１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ， Ｍａｎａｓｓａｓ， ＶＡ ２０１１０−２２０９）から入手でき、外来タンパク質の正しい修飾およびプロセシングを確実とするために選択できる。
【００５７】
組換えタンパク質の長期高収量生産のために、安定な発現が好ましい。例えば、膜型セリンプロテアーゼポリペプチドを安定に発現する細胞系を、ウイルス複製起点および／または内因性発現要素、および同じまたは別のベクター上にある選択マーカー遺伝子を含む発現ベクターを用いて形質転換することができる。該ベクターの導入に続いて、細胞を強化培地で１−２日間生育させた後、培地を選択培地に交換することができる。選択マーカーの目的は選択に対する抵抗性を付与することであり、その存在が、導入された膜型セリンプロテアーゼ配列をうまく発現する細胞の生育と回収を可能にする。安定に形質転換された細胞の耐性クローンは、その細胞型にとって適当な組織培養技術を用いて増殖させることができる。
【００５８】
幾つかの選択系を用いて、形質転換された細胞系を回収できる。これらには、それぞれｔｋ−またはａｐｒｔ−細胞で使用できる単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（Ｗｉｇｌｅｒら、Ｃｅｌｌ １１，２２３−３２，１９７７）およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｌｏｗｙら、Ｃｅｌｌ ２２，８１７−２３，１９８０）遺伝子が包含されるが、これらに限定される訳ではない。さらに、代謝拮抗物質、抗生物質、または除草剤耐性を選択の基準に用いることができる。例えば、ｄｈｆｒはメソトレキサートに対する耐性を付与し（Ｗｉｇｌｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ７７，３５６７−７０，１９８０）ｎｐｔはアミノグリコシド、ネオマイシンおよびＧ−４１８に対する耐性を付与し（Ｃｏｌｂｅｒｅ−Ｇａｒａｐｉｎら、Ｊ．Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １５０，１０１４，１９８１）、そしてａｌｓおよびｐａｔはそれぞれクロルスルフロンおよびホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼに対する耐性を付与する（Ｍｕｒｒａｙ， １９９２，上記）。さらなる選択遺伝子、例えばｔｒｐＢが記載されており、それは細胞がトリプトファンの代わりにインドールを利用するようにさせ、ｈｉｓＤは細胞がヒスチジンの代わりにヒスチノールを利用するようにさせる（Ｈａｒｔｍａｎ ＆ Ｍｕｌｌｉｇａｎ， Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ８５，８０４７−５１，１９８８）。アントシアニンのような可視マーカー、β−グルクロニダーゼとその基質ＧＵＳ、およびルシフェラーゼとその基質ルシフェリンは、形質転換体を同定し、特異的ベクター系に帰すことのできる一過性または安定なタンパク質発現の量を定量するために使用できる（Ｒｈｏｄｅｓら、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ． ５５，１２１−１３１，１９９５）。
【００５９】
ポリペプチドの発現の検出
マーカー遺伝子発現の存在は膜型セリンプロテアーゼポリヌクレオチドが存在することも示唆しているが、その存在と発現は確認する必要がある。例えば、膜型セリンプロテアーゼポリペプチドをコードしている配列がマーカー遺伝子配列内部に挿入されている場合、膜型セリンプロテアーゼポリペプチドをコードしている配列を含む形質転換された細胞は、マーカー遺伝子機能の不在によって同定できる。これとは別に、単一のプロモーターの調節下に膜型セリンプロテアーゼポリペプチドをコードしている配列と、マーカー遺伝子が直列（タンデム）に位置する場合がある。誘導または選択に応答してこのマーカー遺伝子は発現し、通常、膜型セリンプロテアーゼポリヌクレオチドの発現を示す。
【００６０】
これとは別に、膜型セリンプロテアーゼポリヌクレオチドを含み、膜型セリンプロテアーゼポリペプチドを発現する宿主細胞は、当業者に知られる様々な方法によって同定できる。これらの方法には、ＤＮＡ−ＤＮＡまたはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリダイゼーションおよびタンパク質生検またはイムノアッセイ技術（核酸またはタンパク質の検出および／または定量のための膜、溶液、またはチップに基づく技術を包含する）が包含されるがこれらに限定されない。
【００６１】
膜型セリンプロテアーゼポリペプチドをコードしているポリヌクレオチド配列の存在は、プローブまたは断片または膜型セリンプロテアーゼポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドの断片を使用するＤＮＡ−ＤＮＡまたはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリダイゼーションまたは増幅によって検出できる。核酸増幅に基づく検定は、膜型セリンプロテアーゼポリペプチドを含む形質転換体を検出するための、膜型セリンプロテアーゼポリヌクレオチドをコードしている配列から選択されるオリゴヌクレオチドの使用を含む。
【００６２】
膜型セリンプロテアーゼポリペプチドに対し特異的なポリクローナルまたはモノクローナル抗体のいずれかを使用して該ポリペプチドの発現を検出および測定するための様々なプロトコルが当分野で知られている。例として、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、および蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）がある。膜型セリンプロテアーゼポリペプチド上の２個の非干渉性エピトープに反応するモノクローナル抗体を用いる、２部位のモノクローナルに基づくイムノアッセイが使用でき、または、競合的結合検定を使用することができる。これらのおよびその他の検定はＨａｍｐｔｏｍら、ＳＥＲＯＬＯＧＩＣＡＬ ＭＥＴＨＯＤＳ： Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ， ＡＰＳ Ｐｒｅｓｓ， Ｓｔ．Ｐａｕｌ， Ｍｉｎｎ．， １９９０およびＭａｄｄｏｘら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ． １５８，１２１１−１２１６，１９８３に記載されている。
【００６３】
多岐にわたる標識およびコンジュゲーション技術が当業者に知られており、様々な核酸およびアミノ酸検定に使用できる。膜型セリンプロテアーゼポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドに関連する配列を検出するための標識化ハイブリダイゼーションまたはＰＣＲプローブを調製する手段は、標識したヌクレオチドを使用する、オリゴ標識化、ニック翻訳、末端標識化、またはＰＣＲ増幅を包含する。これとは別に、膜型セリンプロテアーゼポリペプチドをコードしている配列を、ｍＲＮＡプローブの産生のためのベクター中にクローニングすることもできる。このようなベクターは当分野で既知であり、市販品が入手でき、標識化ヌクレオチドおよび適当なＲＮＡポリメラーゼ、例えばＴ７、Ｔ３、またはＳＰ６を添加することによりインビトロでのＲＮＡプローブの合成に使用することができる。これらの方法は、市販の様々なキットを用いて実施できる（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ、 Ｐｒｏｍｅｇａ、およびＵＳ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ）。検出を容易にするために使用できる適当なリポーター分子または標識には、放射性核種、酵素、および蛍光、化学ルミネセント、または色素生成物質、ならびに基質、補助因子、阻害物質（インヒビター）、磁性粒子などが包含される。
【００６４】
ポリペプチドの発現および精製
膜型セリンプロテアーゼポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列で形質転換させた宿主細胞は、発現と、細胞培養からのタンパク質の回収に適した条件下で培養できる。形質転換細胞により生産されたポリペプチドは、その配列および／または使用したベクターに応じて分泌されまたは細胞内に貯留され得る。当業者には理解できるであろうが、膜型セリンプロテアーゼポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを含む発現ベクターは、原核または真核細胞膜を通った膜型セリンプロテアーゼポリペプチドの分泌を指令するシグナル配列を含むよう設計できる。
【００６５】
他の構築物を用いて、膜型セリンプロテアーゼポリペプチドをコードしている配列を、可溶性タンパク質の精製を促進するポリペプチドドメインをコードしているヌクレオチド配列と結合させることができる。このような精製促進ドメインは、金属キレート化ペプチド、例えば固定化金属上での精製を可能にするヒスチジン−トリプトファンモジュール、固定化免疫グロブリン上での精製を可能にするタンパク質Ａドメイン、およびＦＬＡＧＳ伸長／親和精製系で利用するドメインが包含されるが、これらに限定されない（Ｉｍｍｕｎｅｘ Ｃｏｒｐ．， Ｓｅａｔｔｌｅ， Ｗａｓｈ．）。精製ドメインと膜型セリンプロテアーゼポリペプチドとの間に開裂可能リンカー配列、例えば第Ｘａ因子またはエンテロキナーゼに特異的なリンカー配列を入れること（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ）も、精製を促進するために利用できる。このような発現ベクターの１つは、膜型セリンプロテアーゼポリペプチドと、チオレドキシンまたはエンテロキナーゼ開裂部位に先立つ６個のヒスチジン残基とを含む融合タンパク質の発現を提供する。このヒスチジン残基はＩＭＡＣ（Ｐｏｒａｔｈら、Ｐｒｏｔ．Ｅｘｐ．Ｐｕｒｉｆ． ３，２６３−２８１，１９９２に記載の固定化金属イオン親和クロマトグラフィー）による精製を促進し、一方エンテロキナーゼ開裂部位は融合タンパク質からの膜型セリンプロテアーゼポリペプチドの精製手段を提供する。融合タンパク質を含むベクターはＫｒｏｌｌら、ＤＮＡ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． １２，４４１−４５３，１９９３に開示されている。
【００６６】
化学合成
膜型セリンプロテアーゼポリペプチドをコードしている配列は、その全体または一部を、当分野で周知の化学的方法を用いて合成できる（Ｃａｒｕｔｈｅｒｓら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．Ｓｙｍｐ．Ｓｅｒ． ２１５−２２３，１９８０；Ｈｏｒｎら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．Ｓｙｍｐ．Ｓｅｒ． ２２５−２３２，１９８０）。これとは別に、膜型セリンプロテアーゼポリペプチド自身を、そのアミノ酸配列を合成するための化学的方法を用いて調製できる。例えば、膜型セリンプロテアーゼポリペプチドは、固相技術を用いて直接ペプチド合成により調製できる（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ， Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ． ８５，２１４９−２１５４，１９６３；Ｒｏｂｅｒｇｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６９，２０２−２０４，１９９５）。タンパク質合成は手動技術またはオートメーションを用いて実施できる。自動化合成は、例えばＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ４３１Ａペプチド合成機（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を用いて達成できる。膜型セリンプロテアーゼポリペプチドの種々の断片を別々に合成し、化学的方法を用いて合して完全長の分子を調製することもできる。
【００６７】
新たに合成したペプチドは、調製用高速液体クロマトグラフイー（例えばＣｒｅｉｇｈｔｏｎ， ＰＲＯＴＥＩＮＳ： ＳＴＲＵＣＴＵＲＥＳ ＡＮＤ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＰＲＩＮＣＩＰＬＥＳ， ＷＨ Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｎ．Ｙ．， １９８３）により実質的に精製できる。合成膜型セリンプロテアーゼポリペプチドの組成はアミノ酸分析または配列決定により確認できる（例えばエドマン分解法；Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ、上記を参照されたい）。さらに、直接合成中に膜型セリンプロテアーゼポリペプチドのアミノ酸配列の任意の部分を改変させ、そして／または化学的方法を用いて他のタンパク質由来の配列と合して、変異体ポリペプチドまたは融合タンパク質を調製することができる。
【００６８】
改変ポリペプチドの調製
当業者には理解できるであろうが、天然に存在しないコドンを有する膜型セリンプロテアーゼポリペプチドコード化ヌクレオチドを調製することは有利であり得る。例えば、特定の原核または真核宿主が好むコドンを選択して、タンパク質発現の速度を増大させ、または所望の性質、例えば天然に存在する配列から産み出される転写物の半減期より長い半減期を持つＲＮＡ転写物を調製することができる。
【００６９】
本明細書に開示するヌクレオチド配列は、当分野で一般的に知られる方法を用いて、膜型セリンプロテアーゼポリペプチドコード配列のクローニング、プロセシング、および／またはその遺伝子産物の発現の修飾を包含する様々な理由で、該ポリペプチドコード配列を改変させるように設計できる。無作為断片化によるＤＮＡシャフリングと遺伝子断片および合成オリゴヌクレオチドのＰＣＲ再集合を用いてヌクレオチド配列を設計できる。例えば、位置指定突然変異誘発を用いて、新たな制限部位を挿入し、グリコシル化パターンを変え、コドンの優先性を変え、スプライス変異体を調製し、突然変異を導入する等を実施できる。
【００７０】
抗体
当分野で知られているいかなる型の抗体も、膜型セリンプロテアーゼポリペプチドのエピトープに特異的に結合するよう作製できる。本明細書で使用する「抗体」とは、無傷の免疫グロブリン分子、およびその断片、例えばＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦｖを包含し、これらは膜型セリンプロテアーゼポリペプチドのエピトープに結合できる。典型的には、エピトープを形成するためには少なくとも６、８、１０、または１２の連続するアミノ酸が必要である。しかしながら、非連続アミノ酸を含むエピトープはより多くの、例えば少なくとも１５、２５、または５０のアミノ酸を必要とするかも知れない。
【００７１】
膜型セリンプロテアーゼポリペプチドのエピトープに特異的に結合する抗体は治療に使用でき、そして例えばウェスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、ラジオイムノアッセイ、免疫組織化学検定、免疫沈降、またはその他の当分野で既知の免疫化学的検定を含む（これらに限定されるわけではない）免疫化学検定に使用できる。所望の特異性を有する抗体の同定のため、様々なイムノアッセイが使用できる。競合的結合または免疫放射検定のための多数のプロトコルが当分野でよく知られている。このようなイムノアッセイは典型的には、免疫原と、その免疫原に特異結合する抗体との間の複合体形成の測定を含んでいる。
【００７２】
典型的には、膜型セリンプロテアーゼポリペプチドに特異的に結合する抗体は、免疫化学検定に使用する時、他のタンパク質が提供する検出シグナルより少なくとも５、１０、または２０倍高い検出シグナルを提供する。好ましくは、膜型セリンプロテアーゼポリペプチドに特異結合する抗体は、免疫化学検定で他のタンパク質を検出せず、膜型セリンプロテアーゼポリペプチドを溶液から免疫沈降させることができる。
【００７３】
膜型セリンプロテアーゼポリペプチドは、哺乳動物、例えばマウス、ラット、ウサギ、モルモット、サル、またはヒトを免疫してポリクローナル抗体を産生させるのに使用できる。所望により、膜型セリンプロテアーゼポリペプチドは、担体タンパク質、例えば牛血清アルブミン、チログロブリン、およびスカシガイヘモシアニンとコンジュゲートさせることができる。宿主の種に応じて、免疫学的反応を増大させるために種々のアジュバントを使用できる。このようなアジュバントは、フロイントアジュバント、鉱物性ゲル（例えば水酸化アルミニウム）、および界面活性物質（例えばリゾレシチン、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油性エマルジョン、スカシガイヘモシアニン、およびジニトロフェノール）を包含するがこれらに限定されない。ヒトに使用するアジュバントの中ではＢＣＧ（ｂａｃｉｌｌｉ Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ）およびＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐａｒｖｕｍが特に有用である。
【００７４】
膜型セリンプロテアーゼポリペプチドに特異的に結合するモノクローナル抗体は、培養中の連続的細胞系により抗体分子の産生を提供する任意の技術を用いて調製できる。これらの技術には、ハイブリドーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術、およびＥＢＶ−ハイブリドーマ技術があるがこれらに限定されない（Ｋｏｈｌｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ ２５６，４９５−４９７，１９８５； Ｋｏｚｂｏｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ８１，３１−４２，１９８５； Ｃｏｔｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ８０，２０２６−２０３０，１９８３； Ｃｏｌｅら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． ６２，１０９−１２０，１９８４）。
【００７５】
さらに、マウス抗体遺伝子をヒト抗体遺伝子にスプライシングして適当な抗原特異性と生物活性を持つ分子を得る、「キメラ抗体」の産生のために開発された技術が利用できる（Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ８１，６８５１−６８５５，１９８４； Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ ３１２，６０４−６０８，１９８４； Ｔａｋｅｄａら、Ｎａｔｕｒｅ ３１４，４５２−４５４，１９８５）。モノクローナルおよびその他の抗体はまた、これを治療に使用した場合に患者が該抗体に対する免疫反応を起こすのを防ぐため、「ヒト化」することができる。このような抗体は、治療に直接使用できるほど配列が充分ヒトに類似しているかも知れず、または幾つかの重要残基の変更を必要とするかも知れない。齧歯類の抗体とヒト配列の間の配列相違は、個々の残基の位置指定突然変異誘発により、または相補性決定領域全体の格子により、ヒト配列内の残基と相違する残基を置き換えることによって最小化することができる。別法として、ヒト化抗体はＧＢ２１８８６３８Ｂに記載のように組換え法を用いて調製できる。膜型セリンプロテアーゼポリペプチドに特異的に結合する抗体は、Ｕ．Ｓ．５５６５３３２に開示のように、部分的または完全にヒト化した抗原結合部位を含むことができる。
【００７６】
これに代わり、当分野で既知の方法を用いて、一本鎖抗体の調製のために記載した技術を適合させ、膜型セリンプロテアーゼポリペプチドに特異結合する一本鎖抗体を調製することができる。関連する特異性を持つが別個のイディオタイプ組成を有する抗体を、無作為組み合わせ免疫グロブリンライブラリーから鎖シャフリングによって調製することができる（Ｂｕｒｔｏｎ， Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ８８，１１１２０−２３，１９９１）。
【００７７】
一本鎖抗体はまた、ハイブリドーマｃＤＮＡを鋳型に用いて、ＰＣＲのようなＤＮＡ増幅法を用いて組み立てることができる（Ｔｈｉｒｉｏｎら、１９９６， Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ Ｐｒｅｖ． ５，５０７−１１）。一本鎖抗体は単一または二重特異性であり得、また、二価または四価であり得る。四価二重特異性一本鎖抗体の組み立ては例えばＣｏｌｏｍａ ＆ Ｍｏｒｒｉｓｏｎ， １９９７， Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １５，１５９−６３に教示されている。二価二重特異性一本鎖抗体の組み立てはＭａｌｌｅｎｄｅｒ ＆ Ｖｏｓｓ， １９９４， Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２６９，１９９−２０６に教示されている。
【００７８】
下記のように、一本鎖抗体をコードしているヌクレオチド配列を手動または自動ヌクレオチド合成を用いて組み立て、標準的組換えＤＮＡ法を用いて発現構築物中にクローニングし、そして細胞中に導入してコード配列を発現させることができる。別法として、一本鎖抗体を、例えば糸状ファージ技術を用いて直接調製することもできる（Ｖｅｒｈａａｒら、１９９５， Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ６１，４９７−５０１； Ｎｉｃｈｏｌｌａら、１９９３， Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ． １６５，８１−９１）。
【００７９】
膜型セリンプロテアーゼポリペプチドに特異結合する抗体はまた、リンパ球集団においてインビボ産生を誘導することによって、または、文献に開示されている極めて特異的な結合試薬のパネルまたは免疫グロブリンライブラリーをスクリーニングすることによって調製することもできる（Ｏｒｌａｎｄｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ８６，３８３３−３８３７，１９８９； Ｗｉｎｔｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ ３４９，２９３−２９９，１９９１）。
【００８０】
その他の型の抗体を、本発明方法において組み立て、治療に使用することができる。例えば、ＷＯ９３／０３１５１に開示のように、キメラ抗体を組み立てることができる。免疫グロブリンから誘導され多価且つ多重特異的である結合タンパク質、例えばＷＯ９４／１３８０４に記載の「ｄｉａｂｏｄｉｅｓ」もまた調製できる。
【００８１】
本発明に係る抗体は当分野で周知の方法により精製できる。例えば、抗体は、膜型セリンプロテアーゼポリペプチドが結合しているカラムを通過させることにより親和精製できる。次いで、結合した抗体を、高い塩濃度の緩衝液を用いてカラムから溶出することができる。
【００８２】
アンチセンスオリゴヌクレオチド
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、特定のＤＮＡまたはＲＮＡ配列に対し相補的なヌクレオチド配列である。いったん細胞中に導入されるとこの相補的ヌクレオチドは、該細胞が生産した天然配列と結合して複合体を形成し、転写または翻訳のいずれかを遮断する。好ましくはアンチセンスオリゴヌクレオチドは少なくとも１１ヌクレオチド長であるが、少なくとも１２、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、若しくは５０またはそれ以上のヌクレオチド長であってもよい。より長い配列もまた使用できる。アンチセンスオリゴヌクレオチド分子をＤＮＡ構築物に提供し、上記のように細胞中に導入して、その細胞における膜型セリンプロテアーゼ遺伝子産物のレベルを低下させることができる。
【００８３】
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、またはこの両者の組み合わせであってよい。オリゴヌクレオチドは、１つのヌクレオチドの５’末端を、アルキルホスホネート、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、アルキルホスホノチオエート、アルキルホスホネート、ホスホロアミデート、燐酸エステル、カルバメート、アセトアミデート、カルボキシメチルエステル、カルボネート、および燐酸トリエステルといった非ホスホジエステルヌクレオチド間結合を有する別のヌクレオチドの３’末端と共有結合させることにより、手動で、または自動合成機によって合成できる。Ｂｒｏｗｎ， Ｍｅｔｈ．Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２０，１−８，１９９４； Ｓｏｎｖｅａｕｘ， Ｍｅｔｈ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ． ２６，１−７２，１９９４； Ｕｈｌｍａｎｎら、Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ． ９０，５４３−５８３，１９９０を参照されたい。
【００８４】
膜型セリンプロテアーゼ遺伝子の制御、５’、または調節領域と二本鎖を形成するアンチセンスオリゴヌクレオチドを設計することにより、膜型セリンプロテアーゼ遺伝子発現の修飾が得られる。転写開始部位、例えば開始部位から−１０および＋１０位の間から誘導されるオリゴヌクレオチドが好ましい。同様に、「三重らせん」塩基対合法を用いて阻害を達成できる。三重らせん対合は、二重らせんがポリメラーゼ、転写因子またはシャペロンの結合に対して十分に開くという能力の阻害を引き起こすため、有用である。三本鎖ＤＮＡを用いる治療上の進歩が文献に記載されている（例えばＧｅｅら、Ｈｕｂｅｒ ＆ Ｃａｒｒ， ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＡＮＤ ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＩＣ ＡＰＰＲＯＡＣＨＥＳ， Ｆｕｔｕｒａ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．， Ｍｔ．Ｋｉｓｃｏ， Ｎ．Ｙ．， １９９４）。転写物がリボソームに結合するのを防ぐことによりｍＲＮＡの翻訳を遮断するアンチセンスオリゴヌクレオチドもまた設計できる。
【００８５】
アンチセンスオリゴヌクレオチドと膜型セリンプロテアーゼポリヌクレオチドの相補配列との間に好結果の複合体を形成させるためには、正確な相補性は必要ない。例えば膜型セリンプロテアーゼポリヌクレオチドに対し正確に相補的である２、３、４、若しくは５またはそれ以上の長さの連続するヌクレオチドを含み、その各々が、隣接する膜型セリンプロテアーゼヌクレオチドとは相補的ではない連続するある長さのヌクレオチドによって隔てられているアンチセンスオリゴヌクレオチドは、膜型セリンプロテアーゼｍＲＮＡに対して充分な標的化特異性を提供できる。好ましくは、相補的な連続ヌクレオチドの長さはそれぞれ少なくとも４、５、６、７若しくは８またはそれ以上のヌクレオチド長である。非相補的な介在配列は、好ましくは１、２、３、または４ヌクレオチド長である。当業者は、アンチセンス−センスの対の算出融点を容易に使用して、特定のアンチセンスオリゴヌクレオチドと特定の膜型セリンプロテアーゼポリヌクレオチド配列間で寛容されるミスマッチの程度を決定できるであろう。
【００８６】
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、膜型セリンプロテアーゼポリヌクレオチドとハイブリダイズする能力に影響を及ぼすことなく修飾できる。これらの修飾は該アンチセンス分子の内部、または一端若しくは両端である。例えば、ヌクレオシド間の燐酸結合は、アミノ基と末端リボースの間にいろいろな数の炭素残基を有するコレステリルまたはジアミン部分を加えることによって修飾できる。修飾された塩基および／または糖、例えばリボースの代わりのアラビノース、または３’ヒドロキシ基または５’燐酸基が置換されている３’，５’−置換オリゴヌクレオチドもまた修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドに使用できる。これらの修飾オリゴヌクレオチドは当分野で周知の方法により調製できる。例えば、Ａｇｒａｗａｌら、Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １０，１５２−１５８，１９９２； Ｕｈｌｍａｎｎら、Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ． ９０，５４３−５８４，１９９０； Ｕｈｌｍａｎｎら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ．Ｌｅｔｔ． ２１５，３５３９−３５４２，１９８７を参照されたい。
【００８７】
リボザイム
リボザイムは触媒活性を有するＲＮＡ分子である。例えば、Ｃｅｃｈ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３６，１５３２−１５３９； １９８７； Ｃｅｃｈ， Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ． ５９，５４３−５６８； １９９０， Ｃｅｃｈ， Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ． ２，６０５−６０９； １９９２， Ｃｏｕｔｕｒｅ ＆ Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂ， Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ． １２，５１０−５１５， １９９６を参照されたい。当分野で知られるように、リボザイムは、ＲＮＡ配列を開裂することにより遺伝子機能を阻害するのに使用できる（例えば、Ｈａｓｅｌｏｆｆら、米国特許５６４１６７３）。リボザイムの作用機構は、相補的標的ＲＮＡに対するリボザイム分子の配列特異的ハイブリダイゼーションと、その後のエンドヌクレオ分解的な（ｅｎｄｏｎｕｃｌｅｏｌｙｔｉｃ）開裂を含む。例には、特異的ヌクレオチド配列のエンドヌクレオ分解的な開裂を特異的且つ効果的に触媒できる、設計されたハンマーヘッドモチーフリボザイム分子がある。
【００８８】
膜型セリンプロテアーゼポリヌクレオチドのコード配列を用いて、膜型セリンプロテアーゼポリヌクレオチドから転写されたｍＲＮＡに特異結合するリボザイムを作製できる。他のトランスのＲＮＡ分子を極めて配列特異的に開裂できるリボザイムを設計し組み立てる方法が開発され、当分野で記載されている（Ｈａｓｅｌｏｆｆら、Ｎａｔｕｒｅ ３３４，５８５−５９１，１９８８）。例えば、リボザイムの開裂活性は、別個の「ハイブリダイゼーション」領域を該リボザイム中に組み入れることによって、特定のＲＮＡを標的とさせることができる。このハイブリダイゼーション領域は標的ＲＮＡに対し相補的な配列を含んでおり、したがってその標的と特異的にハイブリダイズする（例えばＧｅｒｌａｃｈら、ＥＰ３２１２０１を参照されたい）。
【００８９】
膜型セリンプロテアーゼＲＮＡ標的内部の特異的リボザイム開裂部位は、この標的分子を、以下の配列：ＧＵＡ、ＧＵＵ、およびＧＵＣを包含するリボザイム開裂部位についてスキャンすることにより同定できる。同定できたならば、該開裂部位を含む膜型セリンプロテアーゼ標的ＲＮＡの領域に対応する１５および２０の間のリボヌクレオチドを有する短いＲＮＡ配列を、標的を非機能的にし得る二次構造の特徴について評価できる。さらに、候補標的の適合性を、リボヌクレアーゼ防護検定を用いて相補的オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションに対する利用可能性を試験することによって評価できる。より長い相補配列を用いて、標的に対するハイブリダイゼーション配列の親和性を増大させることができる。リボザイムのハイブリダイズおよび開裂する領域は完全に一致し得る；従って、相補領域を介して膜型セリンプロテアーゼ標的ＲＮＡにハイブリダイズする時に、リボザイムの触媒領域が標的を開裂させ得る。
【００９０】
リボザイムはＤＮＡ構築物の一部として細胞内に導入できる。マイクロ注入、リポソーム媒介トランスフェクション、電気穿孔、または燐酸カルシウム沈殿といった機械的方法を用いて、膜型セリンプロテアーゼ発現の低下が望まれる細胞中にリボザイム含有ＤＮＡ構築物を導入することができる。これとは別に、細胞がＤＮＡ構築物を安定的に保持することが望まれる場合は、該構築物をプラスミド上で供給し、当分野で知られるように、別個の要素として維持するか、または細胞のゲノム中に組み込むことができる。ＤＮＡ構築物は、細胞中のリボザイムの転写を調節するために、プロモーター要素、エンハンサーまたはＵＡＳ要素、および転写ターミネーターシグナルといった転写調節要素を含み得る。
【００９１】
Ｈａｓｅｌｏｆｆら、米国特許５６４１６７３に教示のように、リボザイムは、標的遺伝子の発現を誘導する因子に応答してリボザイムの発現が起こるように設計することができる。リボザイムはまた、追加レベルの調節を提供するよう設計でき、その結果、膜型セリンプロテアーゼｍＲＮＡの破壊はリボザイムと標的遺伝子の両者が細胞に誘導された時にのみ起こる。
【００９２】
区別的に発現される遺伝子
遺伝子産物がヒト膜型セリンプロテアーゼと相互作用する遺伝子の同定方法をここに記載する。このような遺伝子は、癌、神経変性疾患、骨粗鬆症又は慢性閉塞性肺疾患を包含する（但しこれらに限定されない）疾患において区別して（区別的に）発現される遺伝子を表し得る。さらに、係る遺伝子は、このような疾患の進行または治療に関連する操作に応答して区別的に調節される遺伝子を表し得る。加えて、このような遺伝子は、組織または生物の発生の異なる段階で増大または低下する、一時的に調節される発現を示すことができる。区別的に発現される遺伝子はまた、その発現を、対照対実験条件の下で調節させることができる。さらに、ヒト膜型セリンプロテアーゼ遺伝子または遺伝子産物は、これ自体区別的発現について試験できる。
【００９３】
発現が正常対疾病状態で相違する程度は、標準的特性決定技術、例えば区別的ディスプレイ（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｄｉｓｐｌａｙ）技術によって視覚化されるに充分大きいというだけでよい。発現の相違を視覚化することのできる、その他のこのような標準的特性決定技術は、定量的ＲＴ（逆転写酵素）、ＰＣＲ、およびノーザン分析を包含するが、これらに限定されない。
【００９４】
区別的に発現される遺伝子の同定
区別的に発現される遺伝子を同定するためには、目的とする組織から全ＲＮＡ、または好ましくはｍＲＮＡを単離する。例えば、ＲＮＡ試料は、実験対象の組織から、そして対照となる対象の対応組織から取得する。ｍＲＮＡの単離に対して不利に選択しない任意のＲＮＡ単離技術を、係るＲＮＡ試料の精製に利用できる。例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら、ｅｄ．， ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ． Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９８７−１９９３を参照されたい。当業者に周知の技術、例えばＣｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ、米国特許４８４３１５５の一段階ＲＮＡ単離プロセスを用いて多数の組織試料を容易に処理することができる。
【００９５】
区別的に発現される遺伝子が産生したＲＮＡを表す、集められたＲＮＡ試料内部の転写物は、当業者に周知の方法により同定する。これらには、例えば、ディファレンシャルスクリーニング（Ｔｅｄｄｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ． ８５，２０８−１２，１９８８）、差引きハイブリダイゼーション（Ｈｅｄｒｉｃｋら、Ｎａｔｕｒｅ ３０８，１４９−５３； Ｌｅｅら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ． ８８，２８２５，１９８４）、および好ましくはディファレンシャルディスプレイ（Ｌｉａｎｇ ＆ Ｐａｒｄｅｅ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５７，９６７−７１，１９９２； 米国特許５２６２３１１）が包含される。
【００９６】
区別的発現の情報はこれ自体、ヒト膜型セリンプロテアーゼの関与する疾病の治療のための関連法を示唆している。例えば、治療は、区別的に発現される遺伝子および／またはヒト膜型セリンプロテアーゼをコードしている遺伝子の発現の調節を包含し得る。区別的発現の情報は、区別的に発現される遺伝子若しくは遺伝子産物またはヒト膜型セリンプロテアーゼ遺伝子若しくは遺伝子産物の活性または発現が、アップレギュレーションであるかダウンレギュレーションであるかを示すことができる。
【００９７】
スクリーニング方法
本発明は、細胞外マトリックス分解を調節するため、膜型セリンプロテアーゼポリペプチド若しくはポリヌクレオチドと結合する及び／又は、例えば膜型セリンプロテアーゼポリペプチド若しくはポリヌクレオチドの発現若しくは活性の促進作用又は抑制作用を有するモジュレーター、即ち候補化合物又は被験化合物、を同定する方法を提供する。細胞外マトリックス分解を低下させることは、悪性細胞が転移するのを予防するか、又は抑制するのに有用である。例えば不適切に低い細胞外マトリックス分解レベルにより特徴付けられる発育障害又は再生においては、細胞外マトリックス分解の増大が望まれ得る。
【００９８】
本発明は、膜型セリンプロテアーゼポリペプチドまたは膜型セリンプロテアーゼポリヌクレオチドに結合する、またはその活性を調節する、被験化合物をスクリーニングするための検定を提供する。好ましくは、被験化合物は膜型セリンプロテアーゼポリペプチドまたはポリヌクレオチドに結合する。より好ましくは、被験化合物は、膜型セリンプロテアーゼポリペプチドの膜型セリンプロテアーゼ活性又は膜型セリンプロテアーゼポリヌクレオチドの発現を、被験化合物の不在時に比較して少なくとも約１０、好ましくは約５０、より好ましくは約７５、９０、または１００％低下させる。
【００９９】
被験化合物
被験化合物は当分野で既知の薬理学的物質であってよく、または薬理活性を持っていることが前もって分かっていない化合物であってよい。この化合物は天然に存在する、または実験室で設計されたものであってよい。これらは、微生物、動物、または植物から単離されたものであってよく、そして組換え的に調製され、または当分野で既知の化学的方法により合成されたものであってよい。所望により被験化合物は、生物学的ライブラリー、空間的アドレス特定可能な並行固相または液相ライブラリー、デコンボルーションを要する合成ライブラリー法、「一ビーズ一化合物」ライブラリー法、および親和クロマトグラフィー選択を用いる合成ライブラリー法を包含する（但しこれらに限定される訳ではない）当分野で既知の数多くの組み合わせライブラリー法のいずれかを用いて取得できる。生物学的ライブラリーアプローチはポリペプチドライブラリーに限定されているが、他の４種のアプローチはポリペプチド、非ペプチドオリゴマー、または化合物の小分子ライブラリーに適用できる。Ｌａｍ， Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓ． １２，１４５，１９９７を参照されたい。
【０１００】
分子ライブラリーの合成法は当分野でよく知られている（例えば、ＤｅＷｉｔｔら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ． ９０，６９０９，１９９３； Ｅｒｂら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ． ９１，１１４２２，１９９４； Ｚｕｃｋｅｒｍａｎｎら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ． ３７，２６７８，１９９４； Ｃｈｏら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６１，１３０３，１９９３； Ｃａｒｅｌｌら、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ． ３３，２０５９，１９９４； Ｃａｒｅｌｌら、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ． ３３，２０６１； Ｇａｌｌｏｐら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ． ３７，１２３３，１９９４を参照されたい）。化合物のライブラリーは溶液で（例えば、Ｈｏｕｇｈｔｅｎ， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １３，４１２−４２１，１９９２）、またはビーズ（Ｌａｍ， Ｎａｔｕｒｅ ３５４，８２−８４，１９９１）、チップ（Ｆｏｄｏｒ， Ｎａｔｕｒｅ ３６４，５５５−５５６，１９９３）、細菌または胞子（Ｌａｄｎｅｒ、米国特許５２２３４０９）プラスミド（Ｃｕｌｌら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ． ８９，１８６５−１８６９，１９９２）、またはファージ（Ｓｃｏｔｔ ＆ Ｓｍｉｔｈ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９，３８６−３９０， １９９０； Ｄｅｖｌｉｎ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９，４０４−４０６，１９９０）；Ｃｗｉｒｌａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９７，６３７８−６３８２，１９９０； Ｆｅｌｉｃｉ， Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ． ２２２，３０１−３１０，１９９１； およびＬａｄｎｅｒ、米国特許５２２３４０９）上に提供できる。
【０１０１】
ハイスループットスクリーニング
被験化合物は、高（ハイ）スループットスクリーニングを用いて、膜型セリンプロテアーゼポリペプチドまたはポリヌクレオチドに結合する能力、または膜型セリンプロテアーゼ活性若しくは膜型セリンプロテアーゼ遺伝子発現に影響を及ぼす能力についてスクリーニングできる。ハイスループットスクリーニングを使用して、多くの個別的化合物を並行して試験でき、その結果多数の被験化合物を迅速にスクリーニングできる。最も広範に確立されている技術は９６ウェル微量定量プレートを利用するものである。この微量定量プレートのウェルは、典型的には５０から５００μｌの範囲の検定容量を必要とする。このプレートに加えて、９６ウェルフォーマットに適合させた多くの機器、材料、ピペット、ロボット、プレート洗浄機、およびプレート読み取り機が市販されている。
【０１０２】
別法として、「自由フォーマット検定」、または試料間に物理的障壁を持たない検定が使用できる。例えば、組み合わせペプチドライブラリーのための、単純な均質検定で色素細胞（メラノサイト）を用いる検定が、Ｊａｙａｗｉｃｋｒｅｍｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ． １９，１６１４−１８（１９９４）に記載されている。ペトリ皿中のアガロースの下にこの細胞を入れ、次いで組み合わせ化合物を伴っているビーズをアガロースの表面に載せる。組み合わせ化合物はこのビーズから化合物を部分的に放出する。化合物がゲルマトリックス中へと局所的に拡散するにつれて活性化合物が細胞の色の変化を惹起するため、活性化合物を暗色色素領域として視覚化することができる。
【０１０３】
自由フォーマット検定のもう一つの例は、生体分子スクリーニング学会第１回年次総会（Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，Ｐａ．、１９９５年１１月７−１０日）で報告されたＣｈｅｌｓｋｙ、「組み合わせライブラリーのスクリーニングのための戦略：新規な、そして伝統的なアプローチ」により記載されている。Ｃｈｅｌｓｋｙは、カルボニックアンヒドラーゼのための単純な均質酵素検定をアガロースゲルの内部に入れ、その結果ゲル中の酵素がゲル全体に色の変化を惹起するようにさせた。その後、光リンカーを介して組み合わせ化合物を持つビーズをゲル内部に入れ、すると該化合物はＵＶ光により部分的に放出された。酵素を阻害する化合物は、色の変化がより少ない局所阻害領域として観察された。
【０１０４】
さらに別の例がＳａｌｍｏｎら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ２，５７−６３（１９９６）に記載されている。この例では、組み合わせライブラリーを、寒天中で生育する癌細胞への細胞毒性効果を有する化合物についてスクリーニングした。
【０１０５】
もう一つのハイスループットスクリーニング法がＢｅｕｔｅｌら、米国特許５９７６８１３に記載されている。この方法では、被験試料を多孔性マトリックスに入れる。次に１またはそれ以上の検定成分を、マトリックス、例えばゲル、プラスチックシート、フィルター、またはその他の形の容易に操作できる固体担体の内部、上、または底に入れる。試料がこの多孔性マトリックスに導入されるとこれらは充分ゆっくりと拡散し、その結果、被験試料が混ざらずに検定が遂行できる。
【０１０６】
結合検定
結合検定について、被験化合物は、膜型セリンプロテアーゼポリペプチドの活性部位又はフィブロネクチンドメインと結合しかつ占領し、これにより該活性部位又はフィブロネクチンドメインが基質に接近できなくなり、その結果、正常な生物学的活性を妨げる小分子であることが好ましい。このような小分子の例は、小ペプチドまたはペプチド様分子を包含するが、これらに限定される訳ではない。結合検定では、被験化合物または膜型セリンプロテアーゼポリペプチドのいずれかが検出可能な標識、例えば蛍光、放射性同位元素、化学ルミネセント、または酵素標識（例えば西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、またはルシフェラーゼ）を含むことができる。そこで、膜型セリンプロテアーゼポリペプチドに結合している被験化合物の検出は、例えば放射能の放出を直接計数することにより、またはシンチレーション計数により、または検出可能産物への適当な基質の変換を測定することにより、達成できる。
【０１０７】
別法として、膜型セリンプロテアーゼポリペプチドへの被験化合物の結合を、反応体のいずれをも標識せずに測定することができる。例えば、マイクロフィジオメーターを用いて、被験化合物と標的ポリペプチドとの結合を検出できる。マイクロフィジオメーター（例えばサイトセンサーＴＭ）とは、細胞がその環境を酸性化する速度を光アドレッサブル電位差センサー（ＬＡＰＳ）を用いて測定する分析機器である。この酸性化速度の変化は、被験化合物と膜型セリンプロテアーゼポリペプチドの相互作用の指標として使用できる（ＭｃＣｏｎｎｅｌｌら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５７，１９０６−１９１２，１９９２）。
【０１０８】
被験化合物が膜型セリンプロテアーゼポリペプチドに結合する能力の測定はまた、実時間Ｂｉｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ Ａｎａｌｙｓｉｓ（ＢＩＡ）のような技術を用いて達成できる（Ｓｊｏｌａｎｄｅｒ ＆ Ｕｒｂａｎｉｃｚｋｙ， Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ． ６３，２３３８−２３４５，１９９１、およびＳｚａｂｏら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ． ５，６９９−７０５，１９９５）。ＢＩＡは、いかなる反応体をも標識せずに、生体特異的相互作用を実時間で研究するための技術である（例えばＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標））。光学的現象表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）の変化を、生体分子間の実時間反応の指標に使用できる。
【０１０９】
本発明のさらに別の態様では、膜型セリンプロテアーゼポリペプチドを２ハイブリッド検定または三ハイブリッド検定（例えば、米国特許５２８３３１７； Ｚｅｒｖｏｓら、Ｃｅｌｌ ７２，２２３−２３２，１９９３； Ｍａｄｕｒａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２６８，１２０４６−１２０５４，１９９３； Ｂａｒｔｅｌら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １４，９２０−９２４，１９９３； Ｉｗａｂｕｃｈｉら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ８，１６９３−１６９６，１９９３； およびＢｒｅｎｔ ＷＯ９４／１０３００）における「おとりタンパク質」として使用し、膜型セリンプロテアーゼポリペプチドに結合またはこれと相互作用してその活性を調節する他のタンパク質を同定することができる。
【０１１０】
２ハイブリッド系は殆どの転写因子のモジュール的性格に基づくものであり、それは、分離可能なＤＮＡ結合および活性化ドメインから成っている。簡潔に述べると、この検定は二種の異なるＤＮＡ構築物を利用する。例えば、一方の構築物においては、膜型セリンプロテアーゼポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドが、既知の転写因子のＤＮＡ結合ドメインをコードしているポリヌクレオチドに融合する（例えばＧＡＬ−４）。別の構築物においては、未同定タンパク質（「餌」または「試料」）をコードしているＤＮＡ配列が、既知の転写因子の活性化ドメインをコードしているポリヌクレオチドに融合する。もし「おとり」および「餌」タンパク質がインビボで相互作用してタンパク質依存複合体を形成できたならば、該転写因子のＤＮＡ結合および活性化ドメインは極めて近位に招来される。この近位性が、転写因子に応答する転写調節部位と機能的に結合しているリポーター遺伝子（例えばＬａｃＺ）の転写を可能にする。リポーター遺伝子の発現が検出でき、機能的転写因子を含む細胞コロニーを単離し、膜型セリンプロテアーゼポリペプチドと相互作用するタンパク質をコードしているＤＮＡ配列取得に使用することができる。
【０１１１】
反応体の一方または両方の非結合型からの結合型の分離を促進するため、そして検定の自動化の便宜を図るため、膜型セリンプロテアーゼポリペプチド（またはポリヌクレオチド）または被験化合物のいずれかを固定化することが望ましいかも知れない。したがって、膜型セリンプロテアーゼポリペプチド（またはポリヌクレオチド）または被験化合物のいずれかを固体支持体に結合させることができる。好適な固体支持体は、ガラスまたはプラスチックスライド、組織培養プレート、微量定量ウェル、管、シリコンチップ、またはビーズ（ラテックス、ポリスチレン、またはガラスビーズを包含するがこれらに限定されない）のような粒子を包含するがこれらに限定されない。共有および非共有結合、受動吸収、またはそれぞれポリペプチドまたは被験化合物に付着させた結合部分と固体支持体の対、の使用を包含する、当分野で既知の任意の方法を用いて膜型セリンプロテアーゼポリペプチド（またはポリヌクレオチド）または被験化合物を固体支持体に付着させることができる。被験化合物は好ましくは整列して固体支持体に結合させ、その結果個々の被験化合物の位置を追跡することができる。膜型セリンプロテアーゼポリペプチド（またはポリヌクレオチド）への被験化合物の結合は、反応体を入れるのに適した任意の容器で達成できる。かかる容器の例には微量定量プレート、試験管、および微量遠沈管がある。
【０１１２】
一つの態様において、膜型セリンプロテアーゼポリペプチドは、膜型セリンプロテアーゼポリペプチドを固体支持体に結合させるドメインを含む融合タンパク質である。例えば、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ融合タンパク質をグルタチオンセファロースビーズ（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ， Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ， Ｍｏ．）上またはグルタチオン誘導体化微量定量プレート上に吸着させ、次いでこれを被験化合物または被験化合物および非吸着膜型セリンプロテアーゼポリペプチドに合し；次にこの混合物を複合体形成が行われる条件下でインキュベートする（例えば、塩およびｐＨに関して生理的条件）。インキュベーションの後、ビーズまたは微量定量プレートのウェルを洗浄して未結合成分を除去する。反応体の結合は上記のように直接的または間接的に測定できる。別法として、複合体を固体支持体から解離させた後に結合を測定することもできる。
【０１１３】
本発明に係るスクリーニング検定には、タンパク質またはポリヌクレオチドを固体支持体上に固定化するためのその他の技術を使用することもできる。例えば、膜型セリンプロテアーゼポリペプチド（またはポリヌクレオチド）または被験化合物のいずれかを、ビオチンとストレプトアビジンのコンジュゲーションを利用して固定化できる。当分野で周知の技術（例えばビオチニル化キット、Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ， Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，Ｉｌｌ．）を用いて、ビオチニル化した膜型セリンプロテアーゼポリペプチドまたは被験化合物をビオチン−ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド）から調製し、ストレプトアビジン被覆した９６ウェルプレート（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ）のウェルに固定化できる。別法として、膜型セリンプロテアーゼポリペプチド、ポリヌクレオチド、または被験化合物に特異的に結合するが、所望の結合部位、例えば膜型セリンプロテアーゼポリペプチドの活性部位又はフィブロネクチンドメインに干渉しない抗体をプレートのウェルに誘導体化することができる。未結合の標的またはタンパク質を抗体コンジュゲーションによりウェル中に捕捉できる。
【０１１４】
ＧＳＴ−固定化複合体について上に記載した方法に加え、このような複合体を検出する方法には、膜型セリンプロテアーゼポリペプチド（又はポリヌクレオチド）または被験化合物に特異結合する抗体を用いる、複合体の免疫検出、膜型セリンプロテアーゼポリペプチドの膜型セリンプロテアーゼ活性検出へと引き継がれる酵素結合検定、および非還元条件下でのＳＤＳゲル電気泳動がある。
【０１１５】
膜型セリンプロテアーゼポリペプチドまたはポリヌクレオチドに結合する被験化合物を求めるスクリーニングは、無傷の細胞で実施することもできる。膜型セリンプロテアーゼポリペプチドまたはポリヌクレオチドを含む任意の細胞が、細胞に基づく検定系で使用できる。膜型セリンプロテアーゼポリヌクレオチドは細胞中に天然に存在し、または上記のような技術を用いて導入できる。腫瘍性細胞系、例えば大腸癌細胞系 ＨＣＴ１１６、ＤＬＤ１、ＨＴ２９、Ｃａｃｏ２、ＳＷ８３７、ＳＷ４８０及びＲＫＯ、乳癌細胞系 ２１−ＰＴ、２１−ＭＴ、ＭＤ−Ａ４６８、ＳＫ−ＢＲ３及びＢＴ−４７４、Ａ５４９肺癌細胞系、並びにＨ３９２グリア芽腫細胞系を含む、原発細胞又は樹立した細胞系のいずれかを用いることができる。無傷な細胞を被験化合物と接触させる。膜型セリンプロテアーゼポリペプチド−被験化合物複合体を放出させるため、この細胞を溶解させた後に、膜型セリンプロテアーゼポリペプチド又はポリヌクレオチドに対する被験化合物の結合を上記のように検出する。
【０１１６】
酵素検定
膜型セリンプロテアーゼポリペプチドの膜型セリンプロテアーゼ活性を増大または低下させる能力について、被験化合物を試験できる。膜型セリンプロテアーゼ活性は、例えば実施例４に記載の方法を用いて測定できる。膜型セリンプロテアーゼ活性は、精製膜型セリンプロテアーゼポリペプチド、細胞抽出物又は無傷な細胞を被験化合物のいずれかと接触させた後に測定することができる。膜型セリンプロテアーゼ活性を少なくとも約１０、好ましくは約５０、より好ましくは約７５、９０又は１００％にまで低下させる被験化合物を、細胞外マトリックス分解を低下させる可能性のある治療物質として同定する。膜型セリンプロテアーゼ活性を少なくとも約１０、好ましくは約５０、より好ましくは約７５、９０又は１００％増大させる被験化合物を、細胞外マトリックス分解を増大させる可能性のある治療物質として同定する。
【０１１７】
遺伝子発現
別の態様では、膜型セリンプロテアーゼ遺伝子の発現を増大または減少させる被験化合物を同定する。膜型セリンプロテアーゼポリヌクレオチドを被験化合物と接触させ、膜型セリンプロテアーゼポリヌクレオチドのＲＮＡまたはポリペプチド産物の発現を測定する。被験化合物存在下での膜型セリンプロテアーゼｍＲＮＡまたはポリペプチドの発現レベルを、該被験化合物不在下での膜型セリンプロテアーゼｍＲＮＡまたはポリペプチドの発現レベルと比較する。すると被験化合物を、この比較に基づく発現のモジュレーターとして同定できる。例えば、膜型セリンプロテアーゼｍＲＮＡまたはポリペプチドの発現が、被験化合物の不在時よりも存在時により大きい場合は、この被験化合物を、発現が低い膜型セリンプロテアーゼｍＲＮＡまたはポリペプチド発現の刺激物質または増強物質と同定する。そうではなく、ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現が、被験化合物の不在時よりも存在時により小さい場合は、この被験化合物を、膜型セリンプロテアーゼｍＲＮＡまたはポリペプチド発現の阻害物質と同定する。
【０１１８】
細胞における膜型セリンプロテアーゼｍＲＮＡまたはポリペプチド発現のレベルは、ｍＲＮＡまたはタンパク質を検出するための当分野で周知の方法により決定できる。定性または定量的方法のいずれかが使用できる。膜型セリンプロテアーゼポリヌクレオチドのポリペプチド産物の存在は、例えばラジオイムノアッセイのような免疫化学的方法、ウエスタンブロッティング、および免疫組織化学を包含する、当分野で周知の様々な技術を用いて決定できる。別法として、ポリペプチド合成は、膜型セリンプロテアーゼポリペプチド内への標識アミノ酸の取り込みを検出することにより、インビボで、細胞培養で、またはインビトロ翻訳系で決定できる。
【０１１９】
このようなスクリーニングは、無細胞検定系または無傷の細胞のいずれかで実施できる。膜型セリンプロテアーゼポリヌクレオチドを発現するいかなる細胞も細胞に基づく検定系で使用できる。膜型セリンプロテアーゼポリヌクレオチドは細胞内に天然に存在するか、または上記のような技術を用いて導入することができる。腫瘍性細胞系、例えば大腸癌細胞系ＨＣＴ１１６、ＤＬＤ１、ＨＴ２９、Ｃａｃｏ２、ＳＷ８３７、ＳＷ４８０及びＲＫＯ、乳癌細胞系２１−ＰＴ、２１−ＭＴ、ＭＤＡ−４６８、ＳＫ−ＢＲ３及びＢＴ−４７４、Ａ５４９肺癌細胞系並びにＨ３９２グリア芽腫細胞系を含む一次培養または樹立された細胞系のいずれかを使用できる。
【０１２０】
標的及び経路遺伝子並びにタンパク質の同定
本明細書中に記載したのは、その産物がヒト膜型セリンプロテアーゼと相互作用する遺伝子を同定する方法である。このような遺伝子は癌、ＣＮＳ疾患、ＣＯＰＤ及び骨粗鬆症において区別的に発現される遺伝子を表す場合がある。さらに、このような遺伝子は、該疾患の進行と関係のある操作又は処置に対する応答において区別的に調節される遺伝子を表す場合がある。そのような区別的に発現される遺伝子は、「標的」及び／又は「フィンガープリント」遺伝子を表し得る。そのような区別的に発現される遺伝子の同定法を以下に記載する。そのような区別的に発現される遺伝子をさらに特徴付ける方法や、それらを標的及び／又はフィンガープリント遺伝子として同定する方法もまた、以下に記載する。
【０１２１】
さらに、癌、ＣＮＳ疾患、ＣＯＰＤ及び骨粗鬆症に関与する「経路遺伝子」と称される遺伝子を同定する方法を記載する。本明細書中で用いられるような「経路遺伝子」は、その遺伝子産物がこれらの疾患に関与する遺伝子産物と相互作用する能力を表す遺伝子を意味する。経路遺伝子は、区別的に発現される遺伝子であっても良く、従って標的及び／又はフィンガープリント遺伝子の特徴を有していても良い。
【０１２２】
「区別的発現」は、遺伝子の時間及び／又は組織発現パターンにおける定量的及び定性的な差異の両方を意味する。従って、区別的に発現される遺伝子は、その発現が疾患状態に対する正常状態、又は実験条件に対するコントロール条件下において定性的に活性化又は完全に不活性化され得る。このような定性的に調節される遺伝子は、正常又は疾患患者のいずれかにおいては検出できるが、両方では検出できない所定の組織又は細胞型内での発現パターンを提示し得る。あるいは、このような定性的に調節される遺伝子は、コントロール患者又は被験患者のいずれかにおいては検出できるが、両方では検出できない所定の組織又は細胞型内での発現パターンを提示し得る。「検出できる」は、当業者には周知の標準技術である区別的ディスプレイ、ＲＴ−ＰＣＲ及び／又はノーザン分析を介して検出可能なＲＮＡ発現パターンを意味する。
【０１２３】
区別的に発現される遺伝子はその発現が調製され得る、即ち疾患状態に対する正常状態、又は実験条件に対するコントロール条件下において定量的に増大又は減少され得る。発現が体重疾患に対する正常体、又は実験状態に対するコントロール状態おいて異なる程度は、例えば以下に記載の区別的ディスプレイ技術などの標準特性決定技術を介して視覚化するのに十分な大きさであることのみが必要である。発現の差異を視覚化できる他の該標準特性決定技術には、定量的ＲＴ（逆転写酵素）ＰＣＲ及びノーザン分析が挙げられる（これらに制限される訳ではない）。
【０１２４】
区別的に発現される遺伝子には、標的遺伝子及び／又はフィンガープリント遺伝子などをさらに記載することができる。「フィンガープリント遺伝子」は、その発現パターンを予後又は診断評価の一部として利用するか、あるいは別の方法として種々の疾患の処置に有用な化合物を同定する方法に用いることができる区別的に発現される遺伝子を意味する。また、フィンガープリント遺伝子は標的遺伝子又は経路遺伝子の特徴も有し得る。
【０１２５】
「標的遺伝子」は、標的遺伝子発現レベル又は標的遺伝子産物の活性を調整することで作用し、症状を改善することができる癌、ＣＯＰＤ、ＣＮＳ疾患又は骨粗鬆症に関与する区別的に発現される遺伝子を意味する。また、標的遺伝子は、フィンガープリント遺伝子及び／又は経路遺伝子の特徴も有し得る。
【０１２６】
区別的に発現される遺伝子の同定
種々の方法は、癌、ＣＯＰＤ、ＣＮＳ疾患又は骨粗鬆症に関与する遺伝子を同定するために利用できる。区別的に発現される遺伝子を同定するため、ＲＮＡ、全量又はｍＲＮＡのいずれかを上記の実例を利用して被検体組織の１つ又はそれ以上から単離できる。ＲＮＡ試料は、実験被検体の組織から、及びコントロール被検体の相当する組織から得られる。ｍＲＮＡの単離が非選択的な任意のＲＮＡ単離技術を、このＲＮＡ試料の精製に利用できる。例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら著、ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ． Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９８７−１９９３を参照のこと。多数の組織試料は、当業者に周知の技術、例えばＣｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ、米国特許４，８４３，１５５に記載の単一工程ＲＮＡ単離プロセスなどを用いて、容易に処理できる。
【０１２７】
区別的に発現される遺伝子により産生されたＲＮＡに相当する回収したＲＮＡ試料内の転写物は、当業者には周知の種々の方法を利用することで同定することができる。例えば、区別的（差異）スクリーニング （Ｔｅｄｄｅｒら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ８５， ２０８−１２，１９８８）、減算ハイブリダイゼーション （Ｈｅｄｒｉｃｋら、Ｎａｔｕｒｅ ３０８， １４９−５３； Ｌｅｅら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ８８， ２８２５，１９８４）、及び好ましくは区別的ディスプレイ  （Ｌｉａｎｇ ＆ Ｐａｒｄｅｅ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５７， ９６７−７１，１９９２； 米国特許５，２６２，３１１） を、区別的に発現される遺伝子から誘導された核酸配列を同定するのに利用できる。
【０１２８】
区別的スクリーニングには、ライブラリーの１のコピーを１つの細胞型のｍＲＮＡ集団に相当する全量細胞ｃＤＮＡプローブを用いてスクリーニングする一方で、ｃＤＮＡライブラリーの重複コピーを第二の細胞型のｍＲＮＡ集団に相当する全量ｃＤＮＡプローブを用いてスクリーニングする、ｃＤＮＡライブラリーの重複スクリーニングが含まれる。例えば、１のｃＤＮＡプローブはコントロール被検体から誘導された細胞型又は組織の全量細胞ｃＤＮＡプローブに相当し得る一方で、第二のｃＤＮＡプローブは実験被検体から誘導された同じ細胞型又は組織の全量細胞ｃＤＮＡプローブに相当し得る。一方のプローブとはハイブリダイズするが他方のプローブとはハイブリダイズしないクローンは、実験被験者に対してコントロール被験者の目的の細胞型において区別的に発現された遺伝子から誘導されたクローンを示す可能性がある。
【０１２９】
減算ハイブリダイゼーション技術には、一般的に異なる２つの資源（例えばコントロール及び実験組織又は細胞型）から得られるｍＲＮＡの単離、ｍＲＮＡ又はその単離したｍＲＮＡから逆転写した一本鎖ｃＤＮＡのハイブリダイゼーション、及びハイブリダイズした結果二本鎖となった配列の全ての除去、が含まれる。ハイブリダイズせずに残った一本鎖ｃＤＮＡは、２つのｍＲＮＡ資源にて区別的に発現された遺伝子から誘導されたクローンを示す可能性がある。その後、この一本鎖ｃＤＮＡは、区別的に発現される遺伝子から誘導されたクローンを含むライブラリーを構築するための出発物質として用いられる。
【０１３０】
区別的ディスプレイ技術は、区別的に発現される遺伝子から誘導された配列の同定を可能にする、周知のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ； Ｍｕｌｌｉｓ に記載されている実験態様、米国特許４，６８３，２０２）を利用する手順を表す。はじめに単離したＲＮＡを、当業者に周知の標準技術を利用して逆転写を行ない一本鎖ｃＤＮＡとする。逆転写反応におけるプライマーには、オリゴｄＴ含有プライマーが含まれるが、これに制限される訳ではない。
【０１３１】
次にこの技術は、任意の所定の細胞内に存在するＲＮＡ転写物の無作為サブセットを表すクローンを増幅できる、下記のＰＣＲプライマーの組みを用いる。異なるプライマーの組みを利用することで、細胞内に存在するｍＲＮＡのそれぞれを増幅できる。このように増幅された転写物中で、区別的に発現される遺伝子から生産された転写物は同一であり得る。
【０１３２】
プライマーの組みの３’オリゴヌクレオチドプライマーは、ｍＲＮＡのポリ（Ａ）テイル又はｍＲＮＡポリ（Ａ）テイルから逆転写したｃＤＮＡの相補物とハイブリダイズし、その５’端がｄＴヌクレオチドである１０〜１３長、好ましくは１１長のオリゴｄＴを含み得る。第二に、３’プライマーの特異性を増大させるために、プライマーは１つ又はそれ以上の、好ましくは２つのヌクレオチドをその３’端にさらに含み得る。統計的に目的の試料中に存在するｃＲＮＡ誘導配列のサブセットが該プライマーとハイブリダイズするだけであるから、加えたそのヌクレオチドはこのプライマーが目的の試料中に存在するｍＲＮＡ誘導配列のサブセットのみを増幅できる。これは、増幅した配列を示す各々のバンドを、より正確にかつ完全に視覚化し、かつ特徴付けできる点で好ましい。
【０１３３】
５’プライマーは、目的の組織から誘導されたｃＤＮＡ配列とハイブリダイズする能力を有することが統計学的に期待されるヌクレオチド配列を含み得る。このヌクレオチド配列は任意のものであってよく、５’オリゴヌクレオチドプライマーの長さは、約９〜約１５ヌクレオチドの範囲、好ましくは約１３ヌクレオチドであり得る。任意のプライマー配列により、生産された増幅部分ｃＤＮＡは様々な長さになるため、種々のクローンを標準変性シークエンシングゲル電気泳動により分離できる。
【０１３４】
ＰＣＲ反応条件は、増幅産物収量及び特性を最適化し、さらに標準ゲル電気泳動技術を利用して分解することができる長さの増幅産物を産生する条件を選ぶべきである。そのような反応条件は当業者には周知であり、重要な反応パラメーターには、例えば上述のようにオリゴヌクレオチドプライマーの長さ及びヌクレオド配列、並びにアニーリング温度及び伸長工程の温度及び反応時間が挙げられる。
【０１３５】
２つの異なる細胞型のｍＲＮＡを逆転写及び増幅した結果得られるクローンパターンは、シークエンシングゲル電気泳動により表示され、比較される。区別的に発現される遺伝子は、２つのバンドパターンにおける差異によって示される。
【０１３６】
ひとたび区別的に発現される可能性のある遺伝子が、例えば上記のようなバルク技術により同定されると、その区別的に発現されると推定される遺伝子の区別的発現を実証すべきである。実証は、例えばノーザン分析、定量的ＲＴ ＰＣＲ又はＲＮａｓｅ保護などの周知の技術を介して実施することができる。実証を行なうと、区別的に発現される遺伝子をさらに特徴付けることができ、下記のように標的遺伝子及び／又はフィンガープリント遺伝子として同定することができる。
【０１３７】
例えば区別的提示を通じて得られた区別的に発現される遺伝子の増幅配列は、相当する遺伝子の全長クローンを単離するのに用いることができる。遺伝子の全長コード部分は、当分野で周知の分子生物学的技術による過度の実験を行なうことなく、容易に単離することができる。例えば、単離した区別的に発現される増幅断片を標識化し、ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするのに用いることができる。あるいは、標識化断片を、ゲノムライブラリーをスクリーニングするのに用いることができる。
【０１３８】
また、ＰＣＲ技術は、全長ｃＤＮＡ配列を単離するのに利用することもできる。上記のように、区別的提示を通じて得られた単離、増幅された遺伝子断片は、その遺伝子内の幾つかの無作為部位に５’末端を有し、遺伝子の転写部分の３’端に相当する部位に３’末端を通常有している。ひとたび増幅断片由来のヌクレオチド配列情報を得ると、この遺伝子の残部（即ち、区別的提示を利用する場合、遺伝子の５’端）を、例えばＲＴ−ＰＣＲを用いて得ることができる。
【０１３９】
このような全長遺伝子配列の同定及びクローニングのための手順の１つの態様においては、ＲＮＡを標準的な手順に次いで適当な組織又は細胞資源から単離することができる。そして、第一ストランド合成を開始するため、増幅断片に対応するｍＲＮＡと相補的なオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、ＲＮＡの逆転写反応を行なうことができる。プライマーはｍＲＮＡと逆行性であるため、伸長はｍＲＮＡの５’端方向へ進行する。その後に得られるＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドは、標準的な末端転写反応を用いてグアニンで「テイル」され、このハイブリッドをＲＮａｓｅ Ｈを用いて消化し、次いで第二の鎖合成がポリＣプライマーを用いて開始され得る。２つのプライマーを用い、遺伝子の５’部分をＰＣＲを用いて増幅する。次いで、得られた配列を単離し、事前に単離した配列を用いて組換えし、本発明の区別的に発現される遺伝子の全長ｃＤＮＡを調製する。クローニングストラテジー及び組換えＤＮＡ技術の総括については、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９、およびＡｕｓｕｂｅｌら、１９８９を参照のこと。
【０１４０】
経路遺伝子の同定
経路遺伝子を同定する方法を本明細書中に記載する。「経路遺伝子」は、その遺伝子産物が癌、ＣＯＰＤ、ＣＮＳ疾患又は骨粗鬆症と関連する遺伝子産物と相互作用する能力を示す遺伝子を意味する。経路遺伝子は、区別的に発現される場合があり、それ故、標的及び／又はフィンガープリント遺伝子の特徴を有する場合がある。
【０１４１】
遺伝子産物と癌、ＣＯＰＤ、ＣＮＳ疾患又は骨粗鬆症と関連することが知られている遺伝子産物との間の相互作用を同定して経路遺伝子産物を同定するため、タンパク質−タンパク質相互作用を検出するに好適な任意の方法を用いることができる。そのような周知の遺伝子産物は、細胞タンパク質又は細胞外タンパク質であり得る。そのような周知の遺伝子産物と相互作用するこの遺伝子産物は経路遺伝子産物を表し、それらをコードする遺伝子は経路遺伝子を表す。
【０１４２】
用いることができる従来の方法の中には、同時−免疫沈降、クロスリンキング及び勾配カラム又はクトマトグラフカラムを通じる同時−精製があり得る。このような手順を利用することで、経路遺伝子産物を同定することができる。ひとたび同定できると、経路遺伝子を標準的な技術と併せて用い、その対応する経路遺伝子を同定することができる。例えば、少なくともその経路遺伝子産物のアミノ酸配列の一部を、当業者に周知の技術、例えばエドマン分解技術（例えば、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ， ＰＲＯＴＥＩＮＳ： ＳＴＲＵＣＴＵＲＥＳ ＡＮＤ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＰＲＩＮＣＩＰＬＥＳ， Ｗ． Ｈ． Ｆｒｅｅｍａｎ ＆ Ｃｏ．， Ｎ． Ｙ．， ｐｐ． ３４−４９，１９８３を参照のこと）を用いて確認することができる。得られたアミノ酸配列は、経路遺伝子配列をスクリーニングするのに用いることができるオリゴヌクレオチド混合物を作製するための基準（ガイド）として用いることができる。スクリーニングは、例えば標準的なハイブリダイゼーション又はＰＣＲ技術により達成することができる。オリゴヌクレオチド混合物を作製するための技術及びスクリーニング技術は周知である（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ， １９８９， 及びＩｎｎｉｓら著．， ＰＣＲ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ： Ａ ＧＵＩＤＥ ＴＯ ＭＥＴＨＯＤＳ ＡＮＤ ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮＳ， １９９０， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを参照のこと）。
【０１４３】
癌、ＣＯＰＤ、ＤＮＳ疾患又は骨粗鬆症と関連するタンパク質と相互作用するタンパク質をコードする経路遺伝子を同時に同定できる方法を用い得る。それらの方法には、例えば該疾患と関連のあることが周知又は示唆されている標識化タンパク質を用いて発現ライブラリーを探索すること、λｇｔ１１ライブラリーの抗体探索の周知技術と類似する様式でこのタンパク質を用いること、が挙げられる。
【０１４４】
インビボにおけるタンパク質相互作用を検出する方法、２−ハイブリッド系を、限定する目的でなはく単に例示として詳細に記載する。この系の形式の１つは、Ｃｈｉｅｎら、１９９１， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ８８， ９５７８−８２，１９９１に記載されており、クローンテック社（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ） （Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ， Ｃａｌｉｆ．）から商業的に入手することができる。簡単に述べると、この系を利用して、２ハイブリッドタンパク質をコードするプラスミドを構築する：一方は、周知のタンパク質と融合する転写活性因子タンパク質のＤＮＡ結合ドメインから成り、この場合、周知のタンパク質は体重障害並びに／又は、食欲調節及び／若しくは体重調節、に関連するプロセスに関与することが知られているタンパク質である、もう一方は、ｃＤＮＡライブラリーの一部としてこのプラスミド中に組換えられたｃＤＮＡによりコードされている未知タンパク質と融合する転写活性化因子タンパク質の活性化ドメインから成る。その調節領域が転写活性化因子の結合部位を含むレポーター遺伝子（例えば、ｌａｃＺ）を含むプラスミドを、酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株中に形質転換する。いずれのハイブリッドタンパク質も単独では、レポーター遺伝子の転写を活性化できない：ＤＮＡ結合ドメインハイブリッドは活性化機能を提供できないために活性化できず、活性化ドメインハイブリッドは活性化因子の結合部位に配置できないために活性化できない。２ハイブリッドタンパク質の相互作用は、機能性活性化因子タンパク質を再構成することで、レポーター遺伝子産物の検定により検出されるレポーター遺伝子の発現が生じる。
【０１４５】
２−ハイブリッド系又は関連する方法論は、既知の「おとり」遺伝子産物と相互作用するタンパク質の活性化ドメインライブラリーをスクリーニングするのに用いることができる。限定を目的とするものではなく例示として、体重障害及び／又は食欲調節若しくは体重調節に関連することが知られている遺伝子産物を、おとり遺伝子産物として用いることができる。これらには、ニューロペプチドＹ、ガラニン、インターロスタチン（ｉｎｔｅｒｏｓｔａｔｉｎ）、インスリン及びＣＣＫなどのホルモンの受容体細胞内ドメインが挙げられる（これらに制限される訳ではない）。全ゲノム又はｃＤＮＡ配列は、活性化ドメインをコードしているＤＮＡと融合している。このライブラリー及びＤＮＡ結合ドメインと融合しているおとり遺伝子産物のハイブリッドをコードするプラスミドを、酵母レポーター株中に同時形質転換し、得られた形質転換体をレポーター遺伝子を発現するものについてスクリーニングする。例えば、ＧＡＬ４タンパク質のＤＮＡ結合ドメインをコードしているＤＮＡと翻訳的に融合するよう、おとり遺伝子をベクター中にクローニングすることができる（限定を目的とするものではない）。これらのコロニーを精製し、レポーター遺伝子発現に影響するライブラリープラスミドを単離する。その後、ＤＮＡシークエンシングを用い、ライブラリープラスミドによりコードされるタンパク質を同定する。
【０１４６】
おとり遺伝子産物と相互作用するタンパク質を検出できる細胞系のｃＤＮＡライブラリーは、当分野で機械的に実施される方法を用いて調製できる。本明細書中に記載する特定の系に基づいて、例えばＧＡＬ４の活性化ドメインに翻訳的に融合するよう、ｃＤＮＡ断片をベクター中に挿入できる。このライブラリーはＧＡＬ活性化配列を含むプロモーターにより誘導されるｌａｃＺ遺伝子を含むおとり遺伝子ＧＡＬ４融合プラスミドと一緒に、このライブラリーを酵母株中に同時形質転換できる。ＧＡＬ４活性化ドメインと融合しており、おとり遺伝子産物と相互作用するタンパク質をコードしているｃＤＮＡは活性ＧＡＬ４タンパク質を再構成し、それによりｌａｃＺ遺伝子の発現を誘導する。ｌａｃＺを発現するクローンは、Ｘ−ｇａｌの存在下では青色コロニーとして検出できる。次いで、ｃＤＮＡをその株から精製し、当分野で機械的に実施される技術を使用して、おとり遺伝子相互作用タンパク質を生産し単離するのに用いる。ひとたび経路遺伝子を単離同定すると、下記のようにさらに特徴づけることができる。
【０１４７】
区別的に発現される遺伝子及び経路遺伝子の特徴づけ
区別的に発現される遺伝子及び経路遺伝子、例えば上記方法を介して同定されるもの、及び改法により同定される遺伝子を、例えば本明細書中にて論ずる方法を利用して、さらに特徴づけることができる。そのような遺伝子は、本明細書中では「同定された遺伝子」と称する。例えば本明細書中に記載の分析により、同定された遺伝子の生物学的機能を調節する情報が得られる。さらに、区別的に発現される遺伝子の生物学的機能の評価により、それらを標的遺伝子及び／又はフィンガープリント遺伝子として設計できる。
【０１４８】
特に、そのさらなる特徴づけにより区別的に発現される遺伝子発現の調整又は該遺伝子産物の調整が目的の疾患の多くを回復させ得ることが示された区別的に発現される遺伝子の多くは、以上に定義したとおり「標的遺伝子」として設計される。そのような標的遺伝子及び標的遺伝子産物は、以下に論じるものと共に、下記の化合物発見ストラテジーの中心を成す。さらにそのような標的遺伝子、標的遺伝子産物及び／又は調整化合物は、下記の処置方法の一部として用いることができる。
【０１４９】
そのさらなる特徴づけにより該調整が目的の体重障害に良い影響を及ぼさないが、その発現パターンが例えば悪性状態に相関する遺伝子発現「フィンガープリント」パターンに寄与できることを示す区別的に発現される遺伝子の多くは、「フィンガープリント遺伝子」として設計される。また、標的遺伝子のそれぞれがフィンガープリント遺伝子として機能でき、経路遺伝子の全部又は一部もまた同様に機能できることに注意すべきである。
【０１５０】
さらに、経路遺伝子を本明細書中に記載の技術に従い特徴付けることができる。経路遺伝子が区別的に発現されること、及び該遺伝子発現調整又は該遺伝子産物の活性の調整により目的の障害の多くを回復させ得ることを示す情報を与える経路遺伝子を、「標的遺伝子」として設計することもできる。このような標的遺伝子及び標的遺伝子産物は、上記のものと共に以下に論じる化合物発見ストラテジーの中心を成し、処置方法の一部として用いることができる。
【０１５１】
１つ又はそれ以上の経路遺伝子の特徴づけにより、区別的発現を喪失しているが、遺伝子活性又は発現の調整することで、なおも症状を回復させ得る形跡を明らにできる。この場合、それらの遺伝子及び遺伝子産物もまた、化合物発見ストラテジーの中心と考えることができる。経路遺伝子の特徴により、遺伝子発現又は遺伝子産物活性の調整が目的とする障害に良い影響がないが、その発現が区別的に発現され、例えば癌と相関する遺伝子発現フィンガープリントパターンに寄与することが示される場合においては、その経路遺伝子をフィンガープリント遺伝子としてさらに設計できる。
【０１５２】
同定された遺伝子をさらに特徴付けるために、種々の技術を利用することができる。第一に、例えば同定された遺伝子産物の生物学的な機能に関する情報を得ることができる１つ又はそれ以上の既知配列モチーフに対するホモログを明らかにするため、当業者に周知の標準的な技術を利用することで得ることができる同定遺伝子のヌクレオチド配列を用いることができる。
【０１５３】
第二に、同定された遺伝子により産生されるｍＲＮＡの組織及び／細胞型分布の同定は、当業者には周知の標準的な技術を利用することで実施できる。そのような技術には、例えばノーザン、ＲＮａｓｅ保護及びＲＴ−ＰＣＲ分析を挙げることができる。こられの分析により、目的の障害に寄与すると期待される組織又は細胞型において、例えば同定される遺伝子が発現されるか否かに関する情報が得られる。また、これらの分析により、どの同定された遺伝子が目的の障害に寄与すると期待され得る組織において好ましくは高レベル調節を示すかに関するデータが得られるため、定常状態ｍＲＮＡ調節に関する定量的な情報を得ることもできる。さらに、標準的インシチュハイブリダイゼーション技術を利用して、所定の組織内のどの細胞が同定された遺伝子を発現するかに関する情報を得ることができる。このような分析により、組織内の細胞のサブセットだけが体重障害に関連すると考えられる場合でも、所定の障害に関連する同定された遺伝子の生物学的機能に関する情報を得ることができる。
【０１５４】
第三に、標準的な技術を利用して、ゲノムマップ、例えばマウスゲノムマップ（Ｃｏｐｅｌａｎｄ及びＪｅｎｋｉｎｓ， Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ７， １１３−１８， １９９１）及びヒトゲノムマップ（Ｃｏｈｅｎら、 Ｎａｔｕｒｅ ３６６， ６９８−７０１， １９９３）に遺伝子を配置するのに、同定された遺伝子配列を用いることができる。例えばどの既知遺伝子障害マップに対して遺伝子領域内にマップする遺伝子が一致するかにより、ヒト疾患に対するその遺伝子の重要度に関しての情報を、このようなマッピング情報により得ることができる。
【０１５５】
第四に、同定された遺伝子の生物学的機能を、関連するインビボ及びインビトロ系を利用することでより直接的に判断することができる。インビボ系には、従来から目的の症状を示す動物系、又は該症状を示すようにされた動物系が含まれ得る（これらに制限される訳ではない）。さらにこのような系は、ＣＮＳ障害、癌、骨粗鬆症及び／又はＣＯＰＤのさらなる特徴づけに関する系を含む場合があり、そして自然発症動物系及びトランスジェニック動物系を含む場合がある（これらに制限される訳ではない）。インビトロ系には、目的の障害に寄与すると知られている又は寄与すると思われる細胞型を含む細胞に基づく系を含む場合がある（これらに制限される訳ではない）。該細胞は野生型細胞であってよく、又は目的の障害に寄与すると知られている又は思われる修飾を含む非野生型細胞であってもよい。
【０１５６】
同定された遺伝子の生物学的機能をさらに特徴付ける際には、これらの遺伝子発現をインビボ及び／又はインビトロ系で調整できる、即ち、例えばトランスジェニック動物系及び／又は細胞系において過剰発現させるか又は低発現させて調整し、次いでその系におけるその後の効果を検定する。あるいは、同定された遺伝子産物の活性を、目的のインビボ及び／又はインビトロ系での活性レベルを増大させるか又は低下させて調整し、次いでその後の効果を検定し得る。
【０１５７】
このような特徴づけを通じて得られた情報により、目的の遺伝子が関与する障害を処置するのに関連する方法が提供され得る。さらに、目的の遺伝子が関与する該障害を処置するのに関連する方法は、このような特徴づけから得られる情報により提供され得る。例えば、処置には遺伝子発現及び／又は遺伝子産物活性の調整が含まれ得る。本明細書中に記載の手順などの特徴づけ手順により、該調整が目的の遺伝子又は遺伝子産物の発現又は活性を増大又は低下させるのに関与するはずであると示唆しよう。
【０１５８】
医薬組成物
本発明はさらに、治療効果を達成するために患者に投与できる医薬組成物を提供する。本発明に係る医薬組成物は、例えば膜型セリンプロテアーゼポリペプチド、膜型セリンプロテアーゼポリヌクレオチド、膜型セリンプロテアーゼポリペプチドに特異的に結合する抗体、または類似体、アゴニスト、アンタゴニスト、又は膜型セリンプロテアーゼポリペプチドの阻害物質を含み得る。この組成物は単独で、または少なくとも１種類の他の物質、例えば安定化化合物と組み合わせて投与でき、これは、食塩水、緩衝化食塩水、デキストロース、および水を包含する（但しこれらに限定されない）任意の無菌で生物学的適合性のある製薬的担体中で投与できる。この組成物は単独で、または他の物質、薬物またはホルモンと組み合わせて患者に投与できる。
【０１５９】
活性成分に加えてこれらの医薬組成物は、賦形剤および補助物質を含む適当な製薬的に許容し得る担体を含有でき、これらは、製薬的に使用できる調製物への活性化合物の処理を促進する。本発明に係る医薬組成物は、経口、静脈内、筋肉内、動脈内、髄内、髄腔内、心室内、経皮、皮下、腹腔内、鼻腔内、非経口、局所、舌下、または直腸手段を包含する（但しこれらに限定されない）多くの経路により投与できる。経口投与用医薬組成物は、当分野で既知の製薬的に許容し得る担体を用いて経口投与に適した用量に調合できる。このような担体により、該医薬組成物を、患者が内服するための錠剤、丸剤、糖衣剤、カプセル剤、液体、ゲル、シロップ剤、スラリー剤、懸濁剤などに調合できる。
【０１６０】
経口使用のための医薬製剤は、活性化合物を、固体賦形剤と合し、得られた混合物を所望により粉砕し、そしてこの細粒混合物を、所望ならば適当な補助物質を加えた後に処理して錠剤または糖衣剤核を得る。好適な賦形剤は炭水化物またはタンパク質増量剤、例えば乳糖、シュクロース、マンニトール、またはソルビトールを包含する糖；トウモロコシ、小麦、米、馬鈴薯、またはその他の植物由来の澱粉；セルロース、例えばメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、またはカルボキシメチルセルロースナトリウム；アラビアゴムおよびトラガカントゴムを包含するゴム；ならびにゼラチンおよびコラーゲンのようなタンパク質である。所望により崩壊剤または可溶化剤、例えば架橋ポリビニルピロリドン、寒天、アルギン酸、またはその塩、例えばアルギン酸ナトリウムを添加できる。
【０１６１】
糖衣剤核は、濃縮糖溶液のような適当な被覆剤と共に使用でき、これはさらに、アラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、ｃａｒｂｏｐｏｌゲル、ポリエチレングリコール、および／または二酸化チタン、ラッカー溶液、および適当な有機溶媒または溶媒混合物を含むことができる。製品の同定のためまたは活性化合物の量、即ち用量をあらわすために染料または色素を錠剤または糖衣被覆剤に添加できる。
【０１６２】
経口的に使用できる医薬調合物は、ゼラチン製の押してはめ込むカプセル剤、ならびに、ゼラチンおよび被覆剤、例えばグリセロールまたはソルビトールでできた軟封入カプセル剤を包含する。押してはめ込むカプセル剤は、活性成分を、乳糖または澱粉のような増量剤または結合剤、タルクまたはステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、および所望により安定剤と混合して含有できる。軟カプセル剤では、活性化合物を、安定剤を加えたまたは加えない適当な液体、例えば脂肪油、液体、または液体ポリエチレングリコールに溶解または懸濁できる。
【０１６３】
非経口投与に好適な医薬製剤は、水溶液、好ましくは生理学的適合性の緩衝液、例えばハンクス溶液、リンゲル溶液、または生理学的に緩衝化した食塩水中で調合できる。水性注射用懸濁剤は、該懸濁液の粘度を増加させる物質、例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、またはデキストランを含有できる。さらに、活性化合物の懸濁剤は適当な油性注射用懸濁剤として調製できる。好適な親油性溶媒または媒質は、胡麻油のような脂肪油、またはオレイン酸エチルまたはトリグリセリドのような合成脂肪酸エステル、またはリポソームを包含する。非脂質ポリカチオンアミノポリマーもまた送達に使用できる。所望により懸濁剤は、化合物の溶解性を増し高濃縮溶液の調製を可能にするような適当な安定剤または物質を含むことができる。局所または鼻腔投与のためには、透過すべき特定の障壁に対し適当な浸透剤を製剤に使用する。このような浸透剤は当分野で一般に知られている。
【０１６４】
本発明に係る医薬組成物は当分野で既知の方法で、例えば常套的混合、溶解、細粒化、糖衣剤製造、すりつぶし、乳化、カプセル化、捕捉、または凍結乾燥プロセスによって製造できる。この医薬組成物は塩として提供でき、塩酸、硫酸、酢酸、乳酸、クエン酸、リンゴ酸、琥珀酸などを包含する（但しこれらに限定されない）多くの酸を用いて調製できる。塩は、水性または他のプロトン性溶媒において、対応する遊離塩基型よりもより可溶性の傾向がある。別の場合には、好ましい調製物は、ｐＨ範囲４．５から５．５において以下のもの：１−５０ｍＭヒスチジン、０．１％−２％シュクロース、および２−７％マンニトール、の全てまたは任意のものを含有できる凍結乾燥粉末であってよく、これを使用前に緩衝液と合する。
【０１６５】
調合と投与のための技術のさらなる詳細は、ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＳＣＩＥＮＣＥＳ（Ｍａａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．， Ｅａｓｔｏｎ， Ｐａ）の最新版に見出すことができる。医薬組成物を製造した後、これらを適当な容器に入れ、適応状態の治療のためにラベルを貼る。このようなラベル表示は、投与の量、頻度、および投与方法を包含する。
【０１６６】
治療上の適応および方法
慢性閉塞性肺（又は気道）疾患（ＣＯＰＤ）は、慢性気管支炎による肺気腫及び末梢気道閉塞の併発が一般的な原因である、気流閉塞として生理的に定義される状態である（Ｓｅｎｉｏｒ＆Ｓｈａｐｉｒｏ， Ｐｕｌｍｏｎａｒｙ Ｄｉｓｅａｓｅｓ ａｎｄ Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ， ３ｄ ｅｄ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ， １９９８， ｐｐ． ６５９−６８１，１９９８； Ｂａｒｎｅｓ， Ｃｈｅｓｔ １１７， １０Ｓ−１４Ｓ， ２０００）。肺気腫は、肺空気間隙の異常な拡張を引き起こす肺胞壁の破壊によって特徴付けられる。慢性気管支炎は、連続２年間それぞれに３ヶ月間の慢性多産咳（ｃｈｒｏｎｉｃ ｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ ｃｏｕｇｈ）が見られるというように臨床的に定義される。ＣＯＰＤにおいては、気流閉塞は通常進行性であり、希に好転することがある。ＣＯＰＤの発症において、タバコの喫煙はかなり重要な危険因子であるが、この疾患は非喫煙者にも発症する。
【０１６７】
気道の慢性炎症は、ＣＯＰＤの鍵となる病態的特徴である（Ｓｅｎｉｏｒ＆Ｓｈａｐｉｒｏ， １９９８）。炎症細胞群には、増加した数の貪食細胞、好中球およびＣＤ＋８リンパ球が含まれる。吸引した刺激物、例えばタバコの煙が、気道に常在する貪食細胞を活性化し、同様にケモカイン（例えば、インターロイキン−８）及び他の走化因子を放出することになる上皮細胞を活性化する。これらの走化因子が作用して、血液から肺組織及び気道へ輸送する好中球／単球を増加させる。気道に補充された好中球及び単球が、ダメージを与える可能性のある種々の媒介物、例えばタンパク質分解酵素や活性酸素種を放出し得る。マトリックス分解、並びに気道壁の肥大化、界面活性剤機能障害及び粘液過分泌を伴う肺気腫、これら全てが障害性気流及びガス交換を引き起こす炎症性応答となる可能性がある後遺症である。
【０１６８】
ＣＯＰＤは肺細胞外マトリックスに対する損傷（ダメージ）により特徴付けられ、そして肺気腫は肺実質に影響を及ぼす病理過程として考えられ得る。この過程は、最終的に気道壁の破壊を通じて持続的な空域拡張を引き起こす（Ｓｅｎｉｏｒ及びＳｈａｐｉｒｏ， ｉｎ ＰＵＬＭＯＮＡＲＹ ＤＩＳＥＡＳＥＳ ＡＮＤ ＤＩＳＯＲＤＥＲＳ， ３ｒｄ ｅｄ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ， １９９８， ｐｐ． ６５９−６８１，１９９８）。遺伝的なα１−アンチトリプシン欠損（α１−ＡＲ）及び好中球エラスターゼの一次阻害が個体に早期の肺気腫を発症させる素因となること、及び実験動物においてエラストリティック（ｅｌａｓｔｏｌｙｔｉｃ）酵素を肺内点下注入することで肺気腫を発症するという発見により、肺気腫の病因についてのエラスターゼ：アンチエラスターゼ仮説が導かれる（Ｅｒｉｋｓｓｏｎ， Ａｃｔａ Ｍｅｄ Ｓｃａｎｄ １７７ （Ｓｕｐｐｌ．）， ４３２，１９６５， Ｇｒｏｓｓ， Ｊ． Ｏｃｃｕｐ． Ｍｅｄ． ６，４８１−８４，１９６４）。これに続いて、肺実質内におけるエラスチン破壊が肺気腫の発症の理由であるという概念が導かれる。
【０１６９】
好中球、マクロファージ、Ｔリンパ球及び好酸球を含む広範囲の免疫細胞及び炎症性細胞は、肺細胞外マトリックスの破壊に寄与し得るタンパク質分解酵素を含む（Ｓｈａｐｉｒｏ， １９９９）。加えて、多くのプロテアーゼの種々のクラスが、肺マトリックス破壊に寄与する可能性があると同定された。これらには、セリンプロテアーゼ、マトリックスメタロプロテイナーゼ及びシステインプロテアーゼが含まれる。これらの酵素クラスの多くは、エラスチンを加水分解でき、ＣＯＰＤ患者において亢進されていることが示された（好中球エラスターゼ， ＭＭＰ−２，９，１２） （Ｃｕｌｐｉｔｔら、Ａｍ． Ｊ Ｒｅｓｐｉｒ． Ｃｒｉｔ． Ｃａｒｅ Ｍｅｄ． １６０， １６３５−３９，１９９９， Ｓｈａｐｉｒｏ， Ａｍ． Ｊ Ｃｒｉｔ． Ｃａｒｅ Ｍｅｄ． １６０ （５）， Ｓ２９−Ｓ３２， １９９９）。
【０１７０】
膜型セリンプロテアーゼは、マウスエピチン（ｅｐｉｔｈｉｎ）のヒト相同分子種（オルソログ）、膜型セリンプロテアーゼＩＩ型である（Ｋｉｍら、Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ ４９，４２０−４２８，１９９９）。エピチンの機能は知られていないが、細胞表面にてペプチド又はタンパク質のプロセッシングに関与するようである。さらに、膜型セリンプロテアーゼは、腫瘍進行中の細胞外マトリックス分解に寄与し得る酵素、ヒトマトリプターゼ（ｍａｔｒｉｐｔａｓｅ）と高い相同性を示す（Ｌｉｎら、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７４，１８２３１−１８２３６，１９９９）。肺における膜型セリンプロテアーゼの発現は、それが組織修復に関与すること、及びＣＯＰＤなどの疾患における肺マトリックス分解に重要な役割があることを示している。そのため、膜型セリンプロテアーゼはＣＯＰＤの治療標的である可能性がある。ヒト膜型セリンプロテアーゼ活性を調節して、ＣＯＰＤを処置するのに用いることができる。
【０１７１】
癌を処置するために、ヒト膜型セリンプロテアーゼの発現又は活性を調節する分子を用いることができる。癌は、基本的に発癌性細胞形質転換によって発症する疾患である。形質転換細胞をそれらの正常な対応物から区別し、かつ癌の病態生理に基づく、形質転換細胞の特徴は幾つかある。それらには、非制御型細胞性増殖、通常の死誘導シグナルに対する不応答（不死化）、増大した細胞運動性及び侵襲性、新たな血管新生の誘導を通じた血液供給を補充させるための増大した能力（血管新生）、遺伝子の不安定性、並びに調節不全遺伝子発現が挙げられる。薬剤耐性の獲得とともに、これらの異常な生理機能の種々の組み合わせににより、最終的に臓器不全および患者の死となる難治性疾患状態に頻繁に陥る。
【０１７２】
最も一般的な癌治療は、細胞増殖を標的とし、形質転換細胞と正常細胞との間の効率に関するその特異な増殖能に基づいている。このアプローチは、幾つかの重要な正常細胞タイプもまた高増殖であり、かつ癌細胞が高頻度にこれらの物質に対して耐性となるという現実により妨げられている。従って、従来の抗癌治療についての治療指数は珍しく２．０を超えている。
【０１７３】
ゲノミクス誘導性分子の標的同定の到来は、癌患者に安全で、かつより効率的な処置を提供できる治療介入のための新たな癌特異的標的同定の可能性を開いた。従って、新たに発見される腫瘍関連遺伝子及びその産物は疾患におけるその機能（群）について試験でき、そして革新的な治療を発見し、かつ開発するための道具として用いることができる。以上に概説した生理学的プロセスの多くに重要な働きをする遺伝子は、癌標的として特徴付けることができる。
【０１７４】
ゲノミクスを通じて同定される遺伝子又は遺伝子断片は、すぐに１つ又はそれ以上の非相同（ヘテローガス）発現系において発現させ、機能性組換えタンパク質を生産させることができる。このタンパク質は、その生物学的機能についてインビトロで特徴付けられ、次いでその生化学活性の化学修飾因子（モジュレーター）を同定するため、ハイスループット分子スクリーニングプログラムにおける道具として用いられる。標的タンパク質活性の活性化物質及び／又は阻害物質をこの様式で同定し、次いで、細胞およびインビボ疾患モデルにて抗癌活性について試験する。生物学的モデルにおける反復試験や、詳細な薬物動態力学的分析及び中毒学的分析を用いたリード化合物の最適化により、薬物開発及び次のヒトでの試験に関する基礎が形成される。
【０１７５】
ヒト膜型セリンプロテアーゼ遺伝子は、細胞外マトリックス分解を低下させることについての、特に転移性癌を処置又は予防することについての治療標的を提供する。例えば、ヒトエフリン様セリンプロテアーゼのフィブロネクチンドメインをブロックすることで、フィブロネクチンに対する応答における腫瘍細胞の遊走又は転移を抑制又は予防することができる（９、１０）。本発明に基づきその転移を抑制できる癌には、腺癌、黒色腫、副腎癌、膀胱癌、骨肉腫、乳癌、頚部癌、胆嚢癌、肝臓癌、肺癌、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、精巣癌、子宮癌が挙げられる。異なる器官の毛細血管床に付着している循環腫瘍細胞は上皮細胞裏に侵入し、それらが転移性を確立する血管外組織（群）へ侵入するため、その下にある基底膜（ＢＭ）を分解する（１、２）。転移性腫瘍細胞は、隣接する内皮細胞間にある細胞間結合を又はその付近をしばしば攻撃する。このような転移性細胞の攻撃により、その細胞間結合は断裂し、内皮細胞境界は退縮し、そして内皮を破り曝された基底ＢＭに向かって遊走する（１、１１）。
【０１７６】
ひとたび内皮細胞及びＢＭの間に位置すると、侵入性細胞は血管区画から遊走するために内皮下のＢＭ糖タンパク質及びプロテオグリカンを分解する。ＢＭ分解には幾つかの細胞性酵素（例えば、コラーゲナーゼＩＶ、プラスミノーゲン活性化物質、カテプシンＢ、エラスターゼ）が関与すると考えられている（２、１１）。従って、腫瘍細胞侵入及び転移を抑制するに、ヒト膜型セリンプロテアーゼ活性の抑制を用いることができる。
【０１７７】
また、ヒト膜型セリンプロテアーゼ分子を調節して、骨粗鬆症を処置することができる。骨粗鬆症は、低骨量や骨組織の微細構造劣化によって特徴付けられ、骨脆弱性を高め、骨折の危険性を増大させる結果となる疾患である。これは、最も一般的なヒト代謝性骨障害である。確立された骨粗鬆症には、骨折が存在する。骨代謝回転は、骨内部の２種の主な効果細胞：骨再吸収に関係する破骨細胞と、骨基質を合成し且つミネラル化する骨芽細胞、との作用によって生じる。破骨細胞と骨芽細胞との作用は、非常に協調的である。破骨細胞前駆型は、代謝回転部位に補充される；それらは分化して融合し、後に骨を再吸収する成熟破骨細胞を形成する。骨表面に付着した場合、破骨細胞は特殊化した破骨細胞周辺膜と骨基質との間の強固に規定された連結部にて、酸性の微小環境を作り出し、骨基質の局所的可溶化を引き起こす。これにより、続く脱ミネラル化骨コラーゲンのタンパク質分解を容易にする。基質分解により、基質関連成長因子およびサイトカインが放出されると考えられており、それにより、時間的および空間的に調節された様式で骨芽細胞が補充される。骨芽細胞は、新たな骨基質タンパク質を合成し、かつ分泌し、引き続いてこの新たな基質をミネラル化する。このことは、正常な骨格においては、正味の骨量変化にはならない生理学的プロセスである。骨粗鬆症などの病理学的状態においては、再吸収と形成との間の均衡が変化する結果、骨喪失が生じる。ＷＯ９９／４５９２３を参照のこと。
【０１７８】
破骨細胞自身が、現在利用できる全ての骨粗鬆症物質（フッ化物を除く場合がある）の直接的または間接的な標的である。抗再吸収治療は、処置個体の更なる骨喪失を予防する。骨髄に存在し、さらに脂肪細胞、軟骨細胞、繊維芽細胞および筋細胞となる多能性幹細胞から、骨芽細胞は誘導される。骨芽細胞活性の選択的増進は、骨粗鬆症治療の非常に望ましい目的である、というのはさらなる骨喪失を予防するよりも、骨量を増大させることになるからである。効果的な同化治療は、現在利用可能な処置よりも骨折の危険性をかなり減少させると期待されている。
【０１７９】
新たに発見したポリペプチドに対するアゴニストまたはアンタゴニストは、破骨細胞分化、骨基質に対する破骨細胞吸着、または骨基質を分解する破骨細胞機能を直接変化させることによって、抗再吸収として作用し得る。アゴニストまたはアンタゴニストは、破骨細胞の分化または機能の効果分子（例えばサイトカイン、ペプチドまたはステロイドホルモン、プロテアーゼなど）の合成および／または修飾を妨げることによって、破骨細胞機能を間接的に変化させ得るであろう。
【０１８０】
新たに発見されたポリペプチドに対するアゴニストまたはアンタゴニストは、骨芽細胞分化および／またはその骨基質形成機能を直接増進することにより、同化として作用することができる。さらに、このアゴニストまたはアンタゴニストは、増殖因子、ペプチドまたはステロイドホルモンの合成を増進すること、または阻害分子の合成を低下させることによって、骨芽細胞機能を間接的に変化させ得る。
【０１８１】
このアゴニストおよびアンタゴニストは、新たに発見されたポリペプチドの作用を模倣し、増強し又は阻害するのに用いることができ、それらは骨粗鬆症、パジェット病、骨移植および特に歯移植の分解を処置するのに有用であり得る。
【０１８２】
また、ヒト膜型セリンプロテアーゼ活性は、神経変性疾患に関与するタンパク質、例えばジェンストマン−ストラウスラー（Ｇｅｎｓｔｍａｎｎ−Ｓｔｒａｕｓｓｌｅｒ）症候群、クロイツフェルト−ヤコブ病及びスクレイピーのプリオンタンパク質アミロイドプラークを分解するために用いることができる。処置できるＣＮＳ障害には、脳損傷、脳血管疾患及びこれらの予後、パーキンソン病、皮質基底核変性症、運動ニューロン疾患、痴呆（ＡＬＳ、多発性硬化症、外傷性脳損傷、脳卒中、脳卒中後、外傷後脳損傷および小血管性脳血管疾患を含む）が挙げられる。また、痴呆症、例えばアルツハイマー病、血管性痴呆、レビ小体痴呆、前頭側頭骨痴呆、及び第１７染色体に関連したパーキンソニズム、前頭側頭骨痴呆症（ピック病、進行性核麻痺（ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ ｎｕｃｌｅａｒ ｐａｌｓｙ）、皮質基底核変性症、ハンチントン病、視床退縮（ｔｈａｌａｍｉｃ ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）、クロイツフェルト−ヤコブ病、ＨＩＶ性痴呆症、痴呆症を伴う統合失調症、及びコルサコフ精神病を含む）を処置できる。同様に、認知関連障害、例えば穏和な認知障害、加齢関連性記憶障害、加齢関係性認知減退、血管性認知障害、注意欠陥障害、注意欠陥多動性障害、及び学習障害を患った子供の記憶障害を、ヒト膜型セリンプロテアーゼの活性を調節することによって処置できる。
【０１８３】
ＣＮＳ障害に関連する疼痛もまた、ヒト膜型セリンプロテアーゼの活性を調節することによって処置できる。処置できる疼痛には、中枢神経系障害と関連するもの、例えば多発性硬化症、脊髄損傷、坐骨神経痛、失敗した腰部手術（ｆａｉｌｅｄ ｂａｃｋ ｓｕｒｇｅｒｙ）症候群、外傷性脳損傷、癲癇、パーキンソン病、脳卒中後、及び脳や脊髄における血管破壊（例えば、梗塞、出血、血管新生異常）が挙げられる。非中枢神経因性疼痛には、乳房切除術後疼痛、反射性交感神経性ジストロフィー（ＲＤＳ）、三叉神経痛ラジオキュロパシー（ｔｒｉｇｅｍｉｎａｌ ｎｅｕｒａｌｇｉａｒａｄｉｏ−ｃｕｌｏｐａｔｈｙ）、術後の疼痛、ＨＩＶ／ＡＩＤＳ関連疼痛、癌疼痛、代謝神経痛（例えば、糖尿病性神経障害、結合組織疾患に対する第２の血管炎神経障害）、例えば肺癌種、白血病、リンパ腫、前立腺、大腸若しくは胃癌種、三叉神経痛及び疱疹後神経痛と関連する腫瘍随伴性多発神経障害が挙げられる。癌及び癌処置と関連する疼痛もまた処置でき、頭痛（例えば前兆を伴う片頭痛、前兆を伴わない片頭痛、および他の片頭痛障害）、偶発性及び慢性緊張性頭痛、緊張型様頭痛、群発性頭痛や慢性発作性片頭痛も処置できる。
【０１８４】
本発明は、上記のスクリーニング検定によって同定される新規物質の使用にさらに関する。従って、本明細書に記載するように同定される被験化合物を適当な動物モデルに使用することは、本発明の範囲内にある。例えば、本明細書に記載するように同定される物質（例えば、調整物質、アンチセンス核酸分子、特異的な抗体、リボザイム又はポリペプチド結合パートナー）を、そのような物質を用いた処置の効果、毒性又は副作用を決定するために、動物モデルに用いることがある。あるいは、本明細書に記載するように同定された物質を、該物質の作用機構を決定するために、動物モデルに使用する場合がある。さらに、本発明は、本明細書に記載の処置に対する上記スクリーニング検定によって同定される新規物質の使用に関する。
【０１８５】
膜型セリンプロテアーゼ活性に影響を及ぼす試薬を、膜型セリンプロテアーゼ活性を低下させるために、インビトロ又はインビボのいずれかにおいてヒト細胞に投与することができる。試薬は、ヒト膜型セリンプロテアーゼ遺伝子の発現産物と結合することが好ましい。その発現産物がポリペプチドである場合、試薬は抗体であることが好ましい。エックスビボにおけるヒト細胞の処置については、抗体を、人体から取り出しておいた幹細胞の調製物に添加することができる。その後、その細胞を、当分野で周知のように、クローン増殖させるか、又はさせずに同じ又は別の人体に移すことができる。
【０１８６】
１つの態様においては、試薬を、リポソームを用いて送達する。リポソームは、投与した動物中にて、少なくとも約３０分間、より好ましくは少なくとも約１時間、さらにより好ましくは少なくとも約２４時間安定であることが好ましい。リポソームは、試薬、特にポリヌクレオチドを、動物（例えばヒト）の特定の部位に標的化することができる脂質組成物を含む。リポソームの脂質組成物は、動物の特有の器官、例えば肺や肝臓を標的化できることが好ましい。
【０１８７】
本発明に有用なリポソームは、標的化した細胞の原形質膜と融合でき、その内容物を細胞に送達できる脂質組成物を含む。好ましくは、リポソームのトランスフェクション効率は約１０６細胞に送達されるリポソーム１６ｎｍｏｌ当たりＤＮＡ約０．５μｇであり、より好ましくは約１０６細胞に送達されるリポソーム１６ｎｍｏｌ当たりＤＮＡ約１．０μｇであり、さらにより好ましくは約１０６細胞に送達されるリポソーム１６ｎｍｏｌ当たりＤＮＡ約２．０μｇである。好ましくは、リポソームは直径が、約１００〜５００ｎｍであり、より好ましくは約１５０〜４５０ｎｍであり、さらにより好ましくは約２００〜４００ｎｍである。
【０１８８】
本発明に用いるに適したリポソームは、例えば当業者に知られる遺伝子送達法に標準的に用いられるリポソームを含む。より好ましいリポソームは、ポリカチオン脂質組成物を有するリポソームおよび／またはポリエチレングリコールと連結されたコレステロールバックボーン（骨格鎖）を有するリポソームを含む。あるいは、リポソームは特定の細胞タイプを標的化できる化合物、例えばリポソームの外側表面に曝される細胞特異的リガンドを包含する。
【０１８９】
リポソームを、試薬、例えばアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはリボザイムと複合化させることは、当分野で標準的な方法 （例えば、米国特許５，７０５，１５１を参照のこと） を用いて達成することができる。好ましくは、ポリヌクレオチド約０．１μｇ〜約１０μｇをリポソーム約８ｎｍｏｌと複合化する、より好ましくはポリヌクレオチド約０．５μｇ〜約５μｇをリポソーム約８ｎｍｏｌと複合化する、さらにより好ましくはポリヌクレオチド約１０μｇをリポソーム約８ｎｍｏｌと複合化する。
【０１９０】
別の態様においては、抗体を、受容体媒介性標的化送達を用いて、インビボにて特定の組織に送達することができる。受容体媒介性ＤＮＡ送達技術は、例えばＦｉｎｄｅｉｓら、Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １１， ２０２−０５ （１９９３）； Ｃｈｉｏｕら、ＧＥＮＥ ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣＳ： ＭＥＴＨＯＤＳ ＡＮＤ ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮＳ ＯＦ ＤＩＲＥＣＴ ＧＥＮＥ ＴＲＡＮＳＦＥＲ （Ｊ． Ａ． Ｗｏｌｆｆら、） （１９９４）； Ｗｕ ＆ Ｗｕ， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６３， ６２１−２４ （１９８８）； Ｗｕら、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６９， ５４２−４６ （１９９４）； Ｚｅｎｋｅら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ８７， ３６５５−５９ （１９９０）； Ｗｕら、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６６， ３３８−４２ （１９９１） にて教示されている。
【０１９１】
試薬が一本鎖抗体の場合、抗体をコードするポリヌクレオチドを構築して、充分確立された技術、例えばトランスフェリン−ポリカチオン媒介性ＤＮＡトランスファー、裸の又はカプセル封入核酸を用いるトランスフェクション、リポソーム媒介性細胞融合、ＤＮＡ被覆ラテックス（ｌａｔｅｘ）ビーズの細胞内輸送、プロトプラスト融合、ウイルスインフェクション、エレクトロポレーション、「遺伝子銃」及びＤＥＡＥ−若しくはリン酸カルシウム−媒介性トランスフェクションを含む技術（これらに制限されない）を用いて、エックスビボ又はインビボにて細胞内に導入できる。
【０１９２】
治療的有効量の決定
治療的有効量の決定は、充分当業者の能力の範囲内にある。治療的有効量とは、治療的有効量の不在下で起こる細胞外マトリックス分解と比較して細胞外マトリックス分解を増大させまたは低下させる活性成分の量を指す。
【０１９３】
いかなる化合物に関しても、治療的有効量は最初に細胞培養検定で、または動物モデル、通常マウス、ウサギ、イヌ、またはブタで見積もることができる。動物モデルは適当な濃度範囲および投与経路の決定にも使用できる。次にこのような情報を用いて人間での有用な用量と投与経路を決定できる。
【０１９４】
治療的有効性および毒性、例えばＥＤ５０（集団の５０％で治療的に有効な用量）およびＬＤ５０（集団の５０％で致死的な用量）は、細胞培養または実験動物における標準的薬学的方法により決定できる。治療効果に対する毒性効果の用量比が治療指数であり、比ＬＤ５０／ＥＤ５０で表すことができる。
【０１９５】
大きな治療指数を示す医薬組成物が好ましい。細胞培養検定および動物研究から得られるデータを、人間への使用のための用量範囲を処方する際に使用する。かかる組成物に含まれる用量は、好ましくは殆どまたは全く毒性を持たないＥＤ５０を包含する循環濃度の範囲内である。この用量は、使用する用量型、患者の感受性、および投与経路に応じてこの範囲内で変わる。
【０１９６】
正確な用量は、治療を必要とする対象に関連する因子に照らして医師が決定する。用量および投与は、充分なレベルの活性成分を提供するよう、または所望の効果を維持するよう、調節する。考慮できる因子は、疾病状態の重篤度、対象の全身健康状態、年齢、体重、および対象の性別、食餌、投与の時間および頻度、薬物の組み合わせ、反応の感受性、および療法に対する寛容／応答を包含する。長時間作用性医薬組成物は、その製剤の半減期およびクリアランス率に応じて３から４日毎、毎週、または２週間に１回投与することができる。
【０１９７】
標準的な用量は投与経路に応じて０．１から１０００００マイクログラムまで変えることができ、約１ｇまでの総用量とすることができる。特定の用量および送達方法についての指針は文献に提供されており、一般に当分野の医師が入手できる。当業者は、ヌクレオチド用にはタンパク質またはそれらの阻害物質用のものとは異なる製剤を使用するであろう。同様に、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの送達は特定の細胞、状態、場所などに特異的である。
【０１９８】
抗体の有効なインビボ用量は、約５μｇから約５０μｇ／ｋｇ、約５０μｇから約５ｍｇ／ｋｇ、約１００μｇから約５００μｇ／ｋｇ（患者の体重）、および約２００から約２５０μｇ／ｋｇ（患者の体重）の範囲である。一本鎖抗体をコードしているポリヌクレオチドの投与のためには、有効なインビボ用量は、約１００ｎｇから約２００ｎｇ、５００ｎｇから約５０ｍｇ、約１μｇから約２ｍｇ、約５μｇから約５００μｇ、および約２０μｇから約１００μｇのＤＮＡの範囲である。
【０１９９】
発現産物がｍＲＮＡである場合、試薬は好ましくはアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはリボザイムである。アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはリボザイムを発現するポリヌクレオチドは、上記のように多岐にわたる方法によって細胞中に導入できる。
【０２００】
好ましくは、試薬は、膜型セリンプロテアーゼポリヌクレオチドの発現または膜型セリンプロテアーゼポリペプチドの活性を、該試薬の不在時と比較して少なくとも約１０、好ましくは約５０、より好ましくは約７５、９０、または１００％低下させる。膜型セリンプロテアーゼポリヌクレオチドの発現レベルまたは膜型セリンプロテアーゼポリペプチドの活性を低下させるよう選択した機構の有効性は、当分野で周知の方法、例えば膜型セリンプロテアーゼ特異的ｍＲＮＡへのヌクレオチドプローブのハイブリダイゼーション、定量的ＲＴ−ＰＣＲ、膜型セリンプロテアーゼポリペプチドの免疫学的検出、または膜型セリンプロテアーゼ活性の測定を用いて評価できる。
【０２０１】
上記のいずれの態様においても、本発明に係る任意の医薬組成物は他の適当な治療薬と組み合わせて投与できる。併用療法に使用するための適当な物質の選択は、常套的製薬原理に従い、当業者により実施することができる。治療薬の組み合わせは、相乗的に働いて、上記の様々な疾患の治療または予防を奏効させる。このアプローチを用いて、より低い各物質の用量で治療効果を達成することができ、したがって有害な副作用の可能性を低減することができる。
【０２０２】
上記の治療方法のいずれも、例えばイヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ウサギ、サル、および最も好ましくはヒトといった哺乳動物を包含する、このような治療を必要とする任意の対象に適用することができる。
【０２０３】
以上の開示内容は、本発明を一般的に記載するものであり、本明細書中に列挙した全ての特許及び特許出願は、本明細書中に明確に包含される。より完全な理解は以下の具体的実施例を参照することによって得られ、それらの実施例は例示のみの目的で提供するものであり、本発明の範囲を限定する意図は無い。
【０２０４】
実施例１
膜型セリンプロテアーゼ活性の検出
配列番号６に記載のポリヌクレオチドを発現ベクターｐＣＥＶ４中に挿入し、得られたｐＣＥＶ４−膜型セリンプロテアーゼポリペプチド発現ベクターを、ヒト胚腎臓２９３細胞中にトランスフェクトする。この細胞から抽出物を得て、膜型セリンプロテアーゼ活性は米国特許５，５００，３４４に記載のようにチオベンジルエステル基質を用いて測定する。細粒及びカラム画分由来の酵素活性をモニターするため、０．５ｍＭ ５，５’−ジチオビス−（２−ニトロ安息香酸）（ＤＴＮＢ）（シグマ）を用いて室温で検定し、ＨＳＢｚｌ脱離基を検出する（ε４１０＝１３６００Ｍ−１ｃｍ−１）。
【０２０５】
ＢＬＴ−エステラーゼ活性はマクロタイター検定（Ｇｒｅｅｎｏｙ及びＳｈａｗ， Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ９３， ２２３−２２６，１９７９）を用いて評価する。簡単には、試料５０μｌを、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１ｍＭ ＣａＣｌ２、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、ｐＨ ７．２に作製した１ｍＭ ＤＴＮＢ１００μｌに添加する。この反応は、ＢＬＴ（シグマ）５０μｌを添加することによって始まり、最終濃度５００μＭを得る。メターゼ（Ｍｅｔａｓｅ）決定のために、０．１Ｍ ＨＥＰＥＳ、０．０５Ｍ ＣａＣｌ２、ｐＨ ７．５中の試料の希釈物５０μｌを、１ｍＭ ＤＴＮＢ１００μｌに添加し、この反応は、Ｂｏｃ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｍｅｔ−Ｓベンジル（Ｂｚｌ）５０μｌを添加することで始まり、最終濃度１５０μＭを得る。検定の期間は色の発色に拠り、その割合はＤｙｎａｔｅｃｈ ＭＲ５０００マイクロプレートリーダーにて測定（Ｏ．Ｄ．４１０）する。試料とＤＴＮＢ単独のコントロール、又はＤＴＮＢと基質単独のコントロールを行なう。
【０２０６】
酵素活性のより感度の良い比較のために、ペプチドチオベンジルエステル基質を用いてプロテアーゼ活性を測定する。キマーゼ基質Ｓｕｃ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−ＳＢｚｌをＢＡＣＨＥＭ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｉｎｃ．， Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，Ｐａから購入する。Ｚ−Ａｒｇ−ＳＢｚｌ （トリプターゼ基質、Ｋａｍら、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６２， ３４４４−３４５１， １９８７）；Ｂｏｃ−Ａｌａ−Ａｌａ−ＡＡ−ＳＢｚｌ （ＡＡ＝Ａｓｐ、Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｎｌｅ又はＳｅｒ）、及びＳｕｃ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｍｅｔ−ＳＢｚｌ （Ｏｄａｋｅら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３０， ２２１７−２２２７，１９９１）；Ｈａｒｐｅｒら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２３，２９９５−３００２，１９８４） を事前に合成する。Ｂｏｃ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｓｐ−ＳＢｚｌはＡｓｐ−ａｓｅの基質であり、Ｍｅｔ、Ｌｅｕ又はＮｌｅを含むペプチドチオベンジルエステルはＭｅｔ−ａｓｅ ＳＰの基質である。検定は、０．０１Ｍ ＣａＣｌ２及び８％ Ｍｅ２Ｏを含むｐＨ７．５の０．１Ｍ ＨＥＰＥＳ緩衝液中、室温で０．３４ｍＭ ４，４’−ジチオジピリジン（アルドリチオール−４、Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．， Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ， Ｗｉｓ．）を用いて行ない、４，４’−ジチオジピリジンと反応してチオピリドンを放出するＨＳＢｚｌ脱離基を検出する（ε３２４＝１９８００Ｍ−１ｃｍ−１、Ｇｒａｓｅｔｔｉ及びＭｕｒｒａｙ， Ａｒｃｈ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． １１９， ４１−４９，１９６７）。初速度は、酵素ストック溶液１０〜２５μｌを緩衝液２．０ｍｌ、４，４’−ジチオジピリジン１５０μｌ及び基質２５μｌを含むキュベットに添加した時に、Ｂｅｃｋｍａｎ３５スペクトロフォトメーターを用いて３２４ｎｍで測定する。バックグラウンドの基質の加水分解速度を補正するため、同量の基質及び４，４’−ジチオジピリジンを基準細胞に加える。それぞれの基質濃度について初速度を２回測定し、それぞれの場合の平均を出す。基質濃度は１００〜１３３μＭである。配列番号７のポリペプチドは膜型セリンプロテアーゼ活性を有すると示される。
【０２０７】
実施例２
組換えヒト膜型セリンプロテアーゼの発現
ピキア パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）発現ベクターｐＰＩＣＺＢ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ） を用いて、大量の組換えヒト膜型セリンプロテアーゼポリペプチドを酵母中に生産させる。コード化ＤＮＡ配列は配列番号６に記載のヌクレオチド配列から誘導する。ベクターｐＰＩＣＺＢ中に挿入する前に、ＤＮＡ配列を、その５’端に開始コドン、及び３’端にエンテロキナーゼ開列部位、Ｈｉｓ６レポータータグや終止コドンを含ませるといった周知の方法によって修飾する。さらに、その両末端に制限エンドヌクレアーゼの認識配列を加える。
【０２０８】
対応する制限酵素を用いてｐＰＩＣＺＢのマルチクローニングサイトを消化した後に、修飾したＤＮＡ配列をｐＰＩＣＺＢ中にライゲートする。この発現ベクターは、ピキア パストリスにて酵母プロモーターにより誘導される誘導性発現用に設計する。得られたｐＰＩＣＺ／ｍｄ−Ｈｉｓ６ベクターを用いて、酵母を形質転換する。
【０２０９】
この酵母を、５リッター攪拌フラスコ中で通常の条件下にて培養し、組換え産物タンパク質を、８Ｍウレアの存在下で親和性クロマトグラフィー（Ｎｉ−ＮＴＡ−樹脂）により培養物から単離する。結合したポリペプチドを、ｐＨ３．５の緩衝液を用いて溶出し、中性化する。Ｈｉｓ６レポータータグからのポリペプチドの分離は、製造元の指示に従い、エンテロキナーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ）を用いる部位特異的タンパク質分解により行なう。精製膜型セリンプロテアーゼポリペプチドを得る。
【０２１０】
実施例３
アンチセンスオリゴヌクレオチドによる細胞外マトリックス分解の阻害
試験に用いた細胞系はヒト大腸癌細胞株ＨＣＴ１１６である。細胞は、１０〜１５％胎仔ウシ血清を含むＲＰＭＩ−１６４０中、濃度１０，０００細胞／ｍｌにて細胞外マトリックス成分を含む基質上で組織培養皿において３７℃、９５％空気／５％ＣＯ２雰囲気にて培養する。
【０２１１】
ホスホロチオネートオリゴリボヌクレオチドを、ホスホロアミド化化学を用いるＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｍｏｄｅｌ ３８０Ｂ ＤＮＡ合成機にて合成する。被験オリゴヌクレオチドは、２４ｂｐの配列である：５’−ＣＧＧ−ＧＴＣ−ＧＣＡ−ＡＣＡ−ＣＴＡ−ＣＣＴ−ＣＡＴ−ＴＴＡ−３’（配列番号１の１〜２４部位のヌクレオチドと相補的である）。コントロールとして、別に（無作為）配列５’−ＴＣＡ−ＡＣＴ−ＧＡＣ−ＴＡＧ−ＡＴＧ−ＴＡＣ−ＡＴＧ−ＧＡＣ−３’を用いる。アセンブリー及び脱保護に続き、オリゴヌクレオチドを、２回エタノール沈殿し、乾燥させ、そしてリン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）中に所望の濃度で懸濁する。これらのオリゴヌクレオチドの純度は、キャピラリーゲル電気泳動法及びイオン交換ＨＰＬＣにより試験する。精製オリゴヌクレオチドを、１日に１度、濃度１０μＭで培養培地に７日間加える。
【０２１２】
７日間の被験オリゴヌクレオチド添加の結果、ウェスタンブロッティングで決定されるように、ヒト膜型セリンプロテアーゼの発現が有意に減少する。この効果は、コントロールオリゴヌクレオチドでは観察されない。３〜７日後、細胞外マトリックス基質の整合性をマイクロスコープを用いて試験する。被験皿の細胞外マトリックスは大部分が無傷であるのに対して、コントロール皿では細胞外マトリックス基質の分解が生じていた、このことはヒト膜型セリンプロテアーゼの阻害が細胞外マトリックスを分解する癌細胞の能力に影響を及ぼすことを示している。
【０２１３】
実施例４
膜型セリンプロテアーゼポリペプチドに結合する被験化合物の同定
グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼタンパク質を含み９６ウェル マイクロタイタープレートのグルタチオン誘導化ウェルに吸着した精製膜型セリンプロテアーゼポリペプチドを、小分子ライブラリー由来の被験化合物と生理緩衝溶液中ｐＨ７．０で接触させる。膜型セリンプロテアーゼポリペプチドは、配列番号２又は７に示されるアミノ酸配列を含む。被験化合物は蛍光標識を含む。試料を５分間〜１時間インキュベートする。コントロール試料は、被験化合物の非存在下にてインキュベートする。
【０２１４】
被験化合物を含む緩衝液をウェルから洗い出す。膜型セリンプロテアーゼポリペプチドに対する被験化合物の結合を、ウェルの内容物の蛍光測定により検出する。ウェル中の蛍光を、被験化合物をインキュベートしていないウェルの蛍光と比較して少なくとも１５％増大させる被験化合物を、膜型セリンプロテアーゼポリペプチドと結合する化合物と同定する。
【０２１５】
実施例５
膜型セリンプロテアーゼ活性を低下させる被験化合物の同定
ヒト大腸癌細胞株ＨＣＴ１１６由来の細胞抽出物を、小分子ライブラリー由来の被験化合物と接触させ、膜型セリンプロテアーゼ活性について検定する。被験化合物非存在下の被験化合物もまた検定する。プロテアーゼ活性は、米国特許５，５００，３４４に記載のようにチオベンジルエステル基質を用いて測定できる。細粒及びカラム画分の酵素活性をモニターするため、０．５ｍＭ ５，５’−ジチオビス−（２−ニトロ安息香酸）（ＤＴＮＢ）（シグマ）を用いて室温で検定を行ない、ＨＳＢｚｌ脱離基を検出する（ε４１０＝１３６００Ｍ−１ｃｍ−１）。
【０２１６】
ＢＬＴエステラーゼ活性はマイクロタイター検定（Ｇｒｅｅｎ及びＳｈａｗ， Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ９３， ２２３−２２６，１９７９）を用いて評価する。簡単には、試料５０μｌを、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１ｍＭ ＣａＣｌ２、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、ｐＨ ７．２に作製した１ｍＭ ＤＴＮＢ１００μｌに添加する。この反応は、ＢＬＴ（シグマ）５０μｌを添加することによって始まり、最終濃度５００μＭを得る。メターゼ（Ｍｅｔａｓｅ）決定のために、０．１Ｍ ＨＥＰＥＳ、０．０５Ｍ ＣａＣｌ２、ｐＨ ７．５中の試料の希釈物５０μｌを、１ｍＭ ＤＴＮＢ１００μｌに添加し、この反応は、Ｂｏｃ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｍｅｔ−Ｓベンジル（Ｂｚｌ）５０μｌを添加することで始まり、最終濃度１５０μＭを得る。検定の期間は色の発色に拠り、その割合はＤｙｎａｔｅｃｈ ＭＲ５０００マイクロプレートリーダーにて測定（Ｏ．Ｄ．４１０）する。試料とＤＴＮＢ単独のコントロール、又はＤＴＮＢと基質単独のコントロールを行なう。
【０２１７】
酵素活性のより感度の良い比較のために、ペプチドチオベンジルエステル基質を用いてプロテアーゼ活性を測定する。キマーゼ基質Ｓｕｃ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−ＳＢｚｌをＢＡＣＨＥＭ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｉｎｃ．， Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，Ｐａから購入する。Ｚ−Ａｒｇ−ＳＢｚｌ （トリプターゼ基質、Ｋａｍら、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６２， ３４４４−３４５１， １９８７）；Ｂｏｃ−Ａｌａ−Ａｌａ−ａａ−ＳＢｚｌ （ＡＡ＝Ａｓｐ、Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｎｌｅ又はＳｅｒ）、及びＳｕｃ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｍｅｔ−ＳＢｚｌ （Ｏｄａｋｅら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３０， ２２１７−２２２７，１９９１）；Ｈａｒｐｅｒら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２３，２９９５−３００２，１９８４） を事前に合成する。Ｂｏｃ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｓｐ−ＳＢｚｌはＡｓｐ−ａｓｅの基質であり、Ｍｅｔ、Ｌｅｕ又はＮｌｅを含むペプチドチオベンジルエステルはＭｅｔ−ａｓｅ ＳＰの基質である。検定は、０．０１Ｍ ＣａＣｌ２及び８％ Ｍｅ２Ｏを含むｐＨ７．５の０．１Ｍ ＨＥＰＥＳ緩衝液中、室温で０．３４ｍＭ ４，４’−ジチオジピリジン（アルドリチオール−４、Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．， Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ， Ｗｉｓ．）を用いて行ない、４，４’−ジチオジピリジンと反応してチオピリドンを放出するＨＳＢｚｌ脱離基を検出する（ε３２４＝１９８００Ｍ−１ｃｍ−１、Ｇｒａｓｅｔｔｉ及びＭｕｒｒａｙ， Ａｒｃｈ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． １１９， ４１−４９，１９６７）。初速度は、酵素ストック溶液１０〜２５μｌを緩衝液２．０ｍｌ、４，４’−ジチオジピリジン１５０μｌ及び基質２５μｌを含むキュベットに添加した時に、Ｂｅｃｋｍａｎ３５スペクトロフォトメーターを用いて３２４ｎｍで測定する。バックグラウンドの基質の加水分解速度を補正するために、同量の基質及び４，４’−ジチオジピリジンを基準細胞に加える。それぞれの基質濃度について初速度を２回測定し、それぞれの場合の平均を出す。基質濃度は１００〜１３３μＭである。配列番号７のポリペプチドに膜型セリンプロテアーゼ活性があることが示される。
【０２１８】
コントロール抽出物と比較して抽出物の膜型セリンプロテアーゼ活性を少なくとも２０％低下させる被験化合物を、膜型セリンプロテアーゼンヒビター（阻害物質）と同定する。
【０２１９】
実施例６
膜型セリンプロテアーゼ遺伝子発現を低下させる被験化合物の同定
被験化合物を、乳癌細胞株ＭＤＡ−４６８培養に投与し、３７℃で１０〜４５分間インキュベートする。同じタイプの細胞培養を、被験化合物を加えず同じ時間インキュベートし、ネガティブコントロールとする。
【０２２０】
ＲＮＡを、Ｃｈｉｒｇｗｉｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍ． １８， ５２９４−９９，１９７９に記載のように２つの培養物から単離する。ノーザンブロットを全ＲＮＡ２０〜３０μｇを用いて調製し、エクスプレスハイブ（Ｅｘｐｒｅｓｓｈｙｂ）（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）にて６５℃で、３２Ｐ−標識化膜型セリンプロテアーゼ特異的プローブを用いてハイブリダイズさせる。このプローブは配列番号１又は６の相補物より選ばれる少なくとも１１個の連続ヌクレオチドを包含する。被験化合物の非存在下にて得られるシグナルと比較して膜型セリンプロテアーゼ特異的シグナルを低下させる被験化合物を、膜型セリンプロテアーゼ遺伝子発現の阻害物質として同定する。
【０２２１】
実施例７
膜型セリンプロテアーゼ遺伝子産物と特異的に結合する試薬を用いた乳癌の処置  配列番号１又は６の相補物より選択される少なくとも１１個の連続ヌクレオチドを含むアンチセンス膜型セリンプロテアーゼオリゴヌクレオチドの合成は、ホスホラミダイト手順を用いるファルマシア ジーン アセンブリー シリーズ シンセサイザー（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｇｅｎｅ Ａｓｓｅｍｂｌｅｒ ｓｅｒｉｅｓ ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ）にて実施する（Ｕｈｌｍａｎｎら、Ｃｈｅｍ． Ｒｅｖ． ９０， ５３４−８３， １９９０を参照のこと）。アセンブリーおよび脱保護に続き、オリゴヌクレオチドを２度エタノール沈殿させ、乾燥させ、そしてリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中に所望の濃度に懸濁する。これらのオリゴヌクレオチドの純度は、キャピラリーゲル電気泳動及びイオン交換ＨＰＬＣにより試験する。オリゴヌクレオチド調製のエンドトキシンレベルは、リムルスアメーバ様検定（Ｌｉｍｕｌｕｓ Ａｍｅｂｏｃｙｔｅ Ａｓｓａｙ）（Ｂａｎｇ， Ｂｉｏｌ． Ｂｕｌｌ． （Ｗｏｏｄｓ Ｈｏｌｅ， Ｍａｓｓ．） １０５， ３６１−３６２， １９５３） を用いて決定する。
【０２２２】
濃度０．１〜０．０１μＭでアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む水性組成物を、針（ニードル）を用いて乳癌（腫瘍）に直接注射する。ニードルは腫瘍に設置し、水性組成物を腫瘍内に注入しながら引き抜く。
【０２２３】
乳癌は、日又は週の期間に渡りモニターする。アンチセンスオリゴヌクレオチドの更なる注射を、その期間の間に行なうことができる。乳癌の転移は、乳癌細胞の膜型セリンプロテアーゼ活性の低下により抑制される。
【０２２４】
実施例８
膜型セリンプロテアーゼの組織特異的発現
ＣＯＰＤの病因における膜型セリンプロテアーゼの働きを確立するための最初の段階として、ヒト細胞及び組織の広い範囲から単離されたＲＮＡ試料を用いた実時間定量的ＰＣＲ（ＴａｑＭａｎ）を使用して、遺伝子発現プロファイルを行なった。全ＲＮＡ試料は、商品供給業者から購入するか、又は研究室内で精製した。２つのＲＮＡパネルをプロファイリングのために使用した：全身器官パネル（表１）及び呼吸器特異的パネル（表２）。
【０２２５】
実時間定量的ＰＣＲ。この技術は、ＰＣＲの動力学的分析の発展法であり、Ｈｉｇｕｃｈｉら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０， ４１３−１７，１９９２、及びＨｉｇｕｃｈｉら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １１， １０２６−３０，１９９３に初めて記載された。原理は、ＰＣＲの指数関数相内の所定の任意のサイクルにおいては、産物の量が最初の鋳型のコピー数と比例することである。ＰＣＲ増幅は、標的配列と相補的であり、かつ蛍光レポーター染色及び消光染色で標識化されたオリゴヌクレオチドプローブ（ＴａｑＭａｎプローブ）の存在下で行なう。ＰＣＲの伸長相の間に、プローブはＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼの５’−３’エンドヌクレアーゼ活性により開裂され、フルオロフォアを消光染色の効果から放出する（Ｈｏｌｌａｎｄら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ８８， ７２７６−８０， １９９１）。蛍光発光は、特異的増幅産物量と直接比例して増大するため、ＰＣＲ産物の指数関数的増幅相を検出し、初期鋳型濃度を決定するのに用いることができる（Ｈｅｉｄら、Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ． ６， ９８６−９４， １９９６、及びＧｉｂｓｏｎら、Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ． ６， ９９５−１００１， １９９６）。
【０２２６】
ＲＮＡ抽出及びｃＤＮＡ調製。表２に挙げた「研究室内」試料のそれぞれから全ＲＮＡを、キアゲン（Ｃｒａｗｌｅｙ， Ｗｅｓｔ Ｓｕｓｓｅｘ， ＵＫ）のＲＮｅａｓｙシステムを使用して、製造元のプロトコルに従い単離した。精製したＲＮＡの濃度は、ＲｉｂｏＧｒｅｅｎ ＲＮＡ定量キット （Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ Ｅｕｒｏｐｅ， Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を用いて決定した。商品提供業者から購入した試料のＲＮＡ濃度もまた、ＲｉｂｏＧｒｅｅｎを使用して決定した。ｃＤＮＡの調製については、全ＲＮＡ１μｇを、ＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴＴＭ ＲＮａｓｅ Ｈ−逆転写酵素（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｐａｉｓｌｅｙ， ＵＫ）２００Ｕ、１０ｍＭ ジチオスレイトール、各々のｄＮＴＰ ０．５ｍＭ及び５μＭ ランダムヘキサマー（ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ， Ｗａｒｒｉｎｇｔｏｎ， Ｃｈｅｓｈｉｒｅ， ＵＫ）を用いて製造元のプロトコルに従い、終量２０μｌ中にて逆転写した。
【０２２７】
ＴａｑＭａｎ定量分析。特異的プライマー及びプローブは、ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓの推奨に基づいて設計した、以下にそれらを列記する：
フォワードプライマー：５’−ＴＴＴＣＣＡＣＣＴＡＣＧＧＧＡＴＣＡＴＣＡ−３’
リバースプライマー：５’−ＡＧＧＣＡＴＣＴＣＴＣＴＴＧＣＣＴＧＡＣＡ−３’プローブ：５’−（ＦＡＭ）−ＴＧＣＣＴＧＣＡＣＡＧＡＧＣＡＴＣＣＧＡＧＡＡ−３’
（ここに、ＦＡＭは６−カルボキシ−フルオレセインである）。
定量的ＰＣＲはそれぞれの試料由来の逆転写されるＲＮＡ１０ｎｇを用いて実施した。それぞれの測定は２回行なう。
【０２２８】
検定反応混合は以下のとおりである：１×最終ＴａｑＭａｎユニバーサルＰＣＲマスター混合（２×ストック溶液から）（ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ， ＣＡ）；９００ｎＭ フォワードプライマー；９００ｎＭ リバースプライマー；２００ｎＭ プローブ；１０ｎｇ ｃＤＮＡ；及び２５μｌにする水。
【０２２９】
以下の工程のそれぞれを一回行なった：５０℃で２分間、そして９５℃で１０分間のプレ（前）ＰＣＲ。以下の工程は４０回行なう：９５℃で１５秒の変性、６０℃で１分のアニーリング／伸長。
【０２３０】
実時間定量的ＰＣＲは、ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ７７００シークエンス検出器を用いて行なった。普遍基準曲線の補間法により初期鋳型濃度（コピー数）を決定するために、それぞれの反応について得られたＣＴ値を用いた。それぞれの試料中の標的遺伝子の発現レベルは、遺伝子発現の最も少ない試料に関して計算した。
【０２３１】
種々のヒト組織に渡る膜型セリンプロテアーゼの相対発現を図１３に示す。この遺伝子の充分な発現は、肺、前立腺、骨格筋、精巣及び胸腺において検出された。この遺伝子は、試験した他の組織では、非常に低いレベルかで発現されていないか、又は全く発現されていなかった。特に興味深かったのは、肺における膜型セリンプロテアーゼの発現であった、このことは、肺の構成細胞型の幾つかの遺伝子発現を分析することで更に調査した。これらの試料において、炎症細胞型では発現はほとんどない又は無かったが、上皮細胞では顕著な発現があった（図１４）。
【表１−１】
2004526407.tif 000002
【表１−２】
2004526407.tif 000003
【表２】
2004526407.tif 000004
【０２３２】
実施例９
化合物／標的確証のインビボ試験
１．疼痛：
急性痛
急性痛は、主にラットについてはホットプレート（熱板）で測定される。ホットプレート試験の２つの変法を用いる：典型的な変法は、動物を熱表面（５２〜５６℃）に置き、動物が侵害防御機構行動、例えば、ステップ又は足舐めを見せるまでの潜伏時間を測定する。もう１つの変法は、実験動物を自然温度表面に置く温度上昇ホットプレートである。次いで、この表面を、動物が後足を舐め始めるまで連続的ではあるがゆっくり熱する。後足を舐め始めた時に達している温度を、疼痛の閾値の尺度とする。
【０２３３】
化合物を媒体処置コントロール群に対して試験する。物質適用は、疼痛試験前に、異なる適用経路（静脈内、腹腔内、経口、くも膜下腔内、脳室内、皮下、皮内、経皮的）を介して異なる時点で行なう。
【０２３４】
持続痛は、主にラットについてはホルマリン試験又はカプサイシン試験を用いて測定する。１〜５％ホルマリン又は１０〜１００μｇカプサイシン溶液を、実験動物の片方の後ろ足に注射する。ホルマリン又はカプサイシンを適用した後、その動物は、たじろぎ、患部の足を舐めたり、噛んだりして侵害防御応答を見せる。９０分までの期間内の侵害防御応答の数が、疼痛強度の尺度である。
【０２３５】
化合物を媒体処置コントロール群に対して試験する。物質適用は、ホルマリン投与又はカプサイシン投与の前に、異なる適用経路（静脈内、腹腔内、経口、くも膜下腔内、脳室内、皮下、皮内、経皮的）を介して異なる時点で行なう。
【０２３６】
神経因性疼痛は、主にラットにおいては片側坐骨神経損傷の種々の変法により誘導される。操作は感覚消失下で行なわれる。坐骨神経損傷の第一の変法は、共通の坐骨神経周辺を紐でゆるく締め付けることによって行なわれる。第二の変法は、共通の座骨神経の直径が約半分になるまできつく縛ることである。次の変法は、モデル群を用いて、Ｌ５とＬ６脊髄神経又はＬ５脊髄神経のみ、のいずれかをきつく縛ったもの又は切除したものを作製する。第四の変法は、坐骨神経の３つの末端分枝の２つ（脛骨神経及び共通腓骨神経）を軸索切除し、腓腹神経を無傷で残すことを包含するのに対し、最後の変法は、脛骨分枝のみを軸索切除し、腓腹神経及び共通神経を傷付けずに残すことを含む。コントロール動物は偽手術を用いて処置する。
【０２３７】
操作後に、神経損傷動物は、慢性機械的異痛症（アロディニア）、冷アロディニア及び温熱性痛覚過敏症を発症する。機械的アロディニアは、圧力変換法（ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ ｖｏｎ Ｆｒｅｙ Ａｎｅｓｔｈｅｓｉｏｍｅｔｅｒ， ＩＩＴＣ Ｉｎｃ．−Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ， Ｗｏｏｄｌａｎｄ Ｈｉｌｌｓ， ＳＡ， ＵＳＡ； Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ ｖｏｎ Ｆｒｅｙ Ｓｙｓｔｅｍ， Ｓｏｍｅｄｉｃ Ｓａｌｅｓ ＡＢ， Ｈｏｕｒｂｙ， Ｓｗｅｄｅｎ）により測定する。温熱性痛覚過敏症は、患部の後足の侵害防御応答を疼痛強度の尺度として計数する放射熱源法（Ｐｌａｎｔａｒ Ｔｅｓｔ， Ｕｇｏ Ｂａｓｉｌｅ， Ｃｏｍｅｒｉｏ， Ｉｔａｌｙ）又は冷却プレート（５〜１０℃）により測定する。冷却誘導型疼痛の更なる試験は、患部の後肢にアセトンを足裏投与した後の侵害防御応答をカウントすること、又は侵害防御応答の期間である。一般に慢性痛は、活性のサーカディアンリズムを記録すること（Ｓｕｒｊｏ及びＡｒｎｄｔ， Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔ ｔ ｚｕ Ｋｏｕｌｎ， Ｃｏｌｏｇｎｅ， Ｇｅｒｍａｎｙ）、及び進行の差をスコアリングすること（フットプリントパターン； ＦＯＯＴＰＲＩＮＴＳプログラム， Ｋｌａｐｄｏｒら、１９９７． フットプリントパターン分析の低コスト法、Ｊ． Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． Ｍｅｔｈｏｄｓ ７５，４９−５４）により評価する。
【０２３８】
化合物を、偽手術コントロール群及び媒体処置コントロール群に対して試験する。物質適用は、疼痛試験前に、異なる適用経路（静脈内、腹腔内、経口、くも膜下腔内、脳室内、皮下、皮内、経皮的）を介して異なる時点で行なう。
【０２３９】
炎症痛
炎症痛は、主にラットにおいては一方の後足にカラゲナン０．７５ｍｇ又は完全フロインドアジュバンドを注射することによって引き起こす。動物は、機械的アロディニア及び温熱性痛覚過敏症を伴う浮腫を発症する。機械的アロディニアは、圧力変換器法（ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ ｖｏｎ Ｆｒｅｙ Ａｎｅｓｔｈｅｓｉｏｍｅｔｅｒ， ＩＩＴＣ Ｉｎｃ．−Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ， Ｗｏｏｄｌａｎｄ Ｈｉｌｌｓ， ＳＡ， ＵＳＡ）により測定する。温熱性痛覚過敏症は、放射熱源法（Ｐｌａｎｔａｒ Ｔｅｓｔ， Ｕｇｏ Ｂａｓｉｌｅ， Ｃｏｍｅｒｉｏ， Ｉｔａｌｙ， Ｐａｗ ｔｈｅｒｍａｌ ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒ， Ｇ． Ｏｚａｋｉ， Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ， ＵＳＡ）により測定する。浮腫測定については、２つの方法を用いる。第一の方法は、動物を屠殺して、患部の後足を細分し、重量を測ることである。第二の方法は、プレチスモメーター（Ｕｇｏ Ｂａｓｉｌｅ， Ｃｏｍｅｒｉｏ， Ｉｔａｌｙ）における水の押しのけ容積を測定することによる足のボリューム（量）の差を含む。
【０２４０】
化合物を、非炎症コントロール群及び媒体処置コントロール群に対して試験する。物質適用は、疼痛試験前に、異なる適用経路（静脈内、腹腔内、経口、くも膜下腔内、脳室内、皮下、皮内、経皮的）を介して異なる時点で行なう。
【０２４１】
ストレプトゾトシン５０〜８０ｍｇ／ｋｇを単回腹腔内注射して処置したラットは、１〜３週間以内に超高血糖及び機械的アロディニアを発症する。機械的アロディニアは圧力変換器法（ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ ｖｏｎ Ｆｒｅｙ Ａｎｅｓｔｈｅｓｉｏｍｅｔｅｒ， ＩＩＴＣ Ｉｎｃ．−Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ， Ｗｏｏｄｌａｎｄ Ｈｉｌｌｓ， ＳＡ， ＵＳＡ）により測定する。
【０２４２】
化合物を、糖尿病及び非糖尿病媒体コントロール群に対して試験する。物質適用は、疼痛試験前に、異なる適用経路（静脈内、腹腔内、経口、くも膜下腔内、脳室内、皮下、皮内、経皮的）を介して異なる時点で行なう。
【０２４３】
２．パーキンソン病
６−ヒドロキシドパミン（６−ＯＨ−ＤＡ）病変
ドーパミン作動性黒質線条体及び線条体淡蒼球経路の変性は、パーキンソン病における中心的な病理現象である。この疾患は、ラットにおいて６−ＯＨ−ＤＡを内側前脳束（ＭＦＢ）中に単回／逐次片側定位（ｓｅｑｕｅｎｔｉａｌ ｕｎｉｌａｔｅｒａｌ ｓｔｅｒｅｏｔａｘｉｃ）注射して実験的に模倣した。
【０２４４】
実験開始時の体重が２００±２５０ｇの雄ウィスターラット（Ｈａｒｌａｎ Ｗｉｎｋｅｌｍａｎｎ， Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いる。実験セッションにない場合、ラットは食料及び水を自由に得ることができ、昼／夜１２時間のサイクルのもと温度や湿度が制御された環境下で飼育する。以下のインビボプロトコールは、政府の権限により認可されている。苦しむ動物を最小限にし、用いる動物の数を減らし、及びインビボ技術の代替案を利用するあらゆる努力をする。
【０２４５】
動物に、モノアミンオキシダーゼによる６−ＯＨＤＡの代謝を阻害するためパージリン（Ｓｉｇｍａ， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ， ＵＳＡ； 腹腔内へ５０ｍｇ／ｋｇ）と、ノルアドレナリン作動性ターミナルによる６−ＯＨＤＡの取り込みを防止するためデスメチルイミプラミンＨＣｌ（Ｓｉｇｍａ； 腹腔内へ２５ｍｇ／ｋｇ）とを、外科手術の日に投与する。３０分後、そのラットをペントバービタルナトリウム（５０ｍｇ／ｋｇ）を用いて麻酔し、定位固定フレームに移す。ＤＡ黒質線条体経路を損傷させるため、６−ＯＨＤＡ ＨＢｒ（Ｓｉｇｍａ）８μｇを含む０．０１％ アスコルビン酸塩４μｌを、左内側前脳側（十字縫合（ブレグマ）及び頭蓋骨表面に対して２．４ｍｍ 前側、１．４９ｍｍ 側方、−２．７ｍｍ 腹側）に１μｌ／分の割合で注射する。ニードル（針）は拡散させるために更に５分間、所定の位置に置く。
【０２４６】
ステッピング試験
前肢無動症（アキネジア）は、損傷設置後の３週間、改変ステッピング試験プロトコルを用いて評価する。簡単には、実験者が片手でこの動物の後肢を固定し、表面から一方の後足をわずかに持ち上げて、その動物を維持する。一方の足をはテーブルについており、初めはフォアハンド方向、その次はバックハンド方向へゆっくり側方移動させる（５秒で１ｍ）。調整ステップの数を、両足について移動のバックハンド方向及びフォアハンド方向においてカウントする。試験の順序は、右足フォアハンド及びバックハンド調整ステップ、その次に左足フォアハンド及びバックハンド方向である。この試験は、第１回目の試験に先立ち３日間の最初のトレーニングの後、連続して３日間で３回繰り返す。フォアハンド調整ステップは、損傷動物と健康なコントロール動物の間に一致した差がないことは明らかである。従って、分析はバックハンド調整ステップに限定される。
【０２４７】
バランス試験
ステッピング試験セッションの間に、姿勢検証後のバランス調整も測定する。ラットはステッピング試験に記載のように同じ位置で維持し、側方移動に変えて、実験者がテーブルについた足を前方向へ傾ける。この演習はバランスの喪失の結果となり、前肢移動でバランスを回復するラットの能力を０〜３の範囲スケールでスコアーする。スコアー０は正常な足設置に与えられる。前肢運動は遅れるが、姿勢バランスの回復が検出される場合は、スコアー１を与える。スコアー２は、バランス回復は成功していないが、筋肉収縮により証明されるように十分とは言えないが明らかな前肢反応を表し、スコアー３は行動の反応のないものに与える。この試験は、第１回目の試験に先立ち３日間の最初のトレーニングの後、３日間連続してそれぞれの側（足）で１日に３回繰り返す。
【０２４８】
階段試験（足到達）
初期又は第二の損傷設置後の３週間の足到達（リーチング）行動を評価するのに、階段試験の改良法を使用する。中心に台と両端に取り外し可能な階段のあるプレキシガラス試験ボックスを用いる。この器具は、それぞれの階段で同じ側の足のみを用い、独立して足の使用を測定できるように設計することができる。それぞれの試験において、動物を１５分間この試験ボックスに置く。各々の側のダブル階段を、７×３飼料の粒（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ ｆｏｏｄ ｐｅｌｌｅｔｓ， ｆｏｒｍｕｌａ ： Ｐ， ｐｕｒｉｆｉｅｄ ｒｏｄｅｎｔ ｄｉｅｔ， サイズ４５ｍｇ； Ｓａｎｄｏｗｎ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で満たす。それぞれの試験の後、各々の足について食べた粒（上手く回収した粒）の数と取得した粒（触ったが、落とした）の数、及びその成功率（食べた粒／取得した粒）を別々に計数する。３日間の食料不足（１日当たり１２ｇ／動物）後の動物を１１日間試験する。全ての分析は最後の５日間のみで行なう。
【０２４９】
ＭＰＴＰ処置
神経毒である１−メチル−４−フェニル−１，２，３，６−テトラヒドロ−ピリジン（ＭＰＴＰ）は、げっ歯類、ヒト以外の霊長類及びヒトにおいて中脳ドーパミン作動性（ＤＡｅｒｇｉｃ）ニューロン変性を引き起すことで、多くのパーキンソン病症状を再現する。ＭＰＴＰは、ドーパミンレベル及びその代謝物レベル、並びに線条体におけるドーパミン作動性ターミナル数の顕著な減少を引き起こし、同様に黒質、パルス緻密質におけるチロシン ヒドロキシラーゼ（ＴＨ）−免疫応答細胞体の著しい喪失を引き起こす。
【０２５０】
重篤で、長期に及ぶ損傷を与え、かつ死亡率を減少させるために、ＭＰＴＰを動物に単回注射し、その後重症度について損傷の７〜１０日後に試験する。ＭＰＴＰの連続注射は、１、２及び３日目に投与する。１日に１度食塩水中のＭＰＴＰヒドロクロライド（シグマ）４ｍｇ／ｋｇを、動物に適用する。注射は全て腹腔内（ｉ．ｐ．）で行ない、ＭＰＴＰストック溶液は、注射と注射との間凍結しておく。動物を１１日目に断頭する。
【０２５１】
免疫組織化学
行動実験が終了した時点で、全ての動物をチオペンタール（腹腔内へ１ｇ／４０ｍｌ、Ｔｙｒｏｌ Ｐａｒｍａ）３ｍｌで麻酔する。マウスは、０．０１Ｍ ＰＢＳ（ｐＨ ７．４）で２分間、次いでＰＢＳ中の４％ パラホルムアルデヒド（Ｍｅｒｃｋ）で１５分間、経肛門的に還流する。その脳を取り出し、４％ パラホルムアルデヒド中に、４℃にて２４時間置く。その後、脱水のために、それを４℃の０．１Ｍ ＰＢＳ中の２０％ スクロース（Ｍｅｒｃｋ）溶液に移し、それらを染み込ませる。その脳を−２０℃のメチルブタン中で２分間凍結させ、−７０℃で保存する。スレッジマイクロトーム（ｍｏｄ． ３８００−Ｆｒｉｇｏｃｕｔ， Ｌｅｉｃａ）を用いて、２５μｍの切片を、脳梁（ＡＰ １．７ｍｍ）の膝部から海馬（ＡＰ ２１．８ｍｍ）まで、及びＡＰ２４．１６からＡＰ ２６．７２から得る。４６の切片をカットし、０．２５Ｍ トリスバッファー（ｐＨ ７．４）中に免疫組織化学について分類して保存する。
【０２５２】
一連の切片を、遊離−浮動性チロシンデヒドロキシラーゼ（ＴＨ）免疫組織化学についての処理する。０．１Ｍ ＰＢＳ中で３回すすいだ後、内因性のペルオキシダーゼ活性を、０．３％ Ｈ２Ｏ２±ＰＢＳ中で１０分間クエンチする。ＰＢＳ中ですすいだ後、切片を、ブロッキング物質として１０％ 正常ウシ血清（シグマ）中で５分間予めインキュベートし、一次抗ラットＴＨラビット抗血清（希釈率１：２０００）のいずれかに移す。
【０２５３】
一晩中室温でインキュベートした後、ＴＨ免疫応答に対する切片をＰＢＳ中ですすぎ（２×１０分）、ヤギで産生させたビオチン標識化抗ラビット免疫グロブリンＧ（希釈率１：２００）（Ｖｅｃｔｏｒ）中で９０分間インキュベートし、繰り返しすすぎ、そしてＶｅｃｔａｓｔａｉｎ ＡＢＣ（Ｖｅｃｔｏｒ）溶液中に移し１時間置く。０．００５％ Ｈ２Ｏ２を加えた０．１Ｍ ＰＢＳ中の３，．３’−ジアミノベンジジン テトラヒドロクロリド（ＤＡＢ；Ｓｉｇｍａ）は、続く可視化反応における色素原として働く。切片を、ゼラチンコーティングスライドに盛り、乾燥させるために一晩中置き、上方（ａｓｃｅｎｄｉｎｇ）アルコール濃度中で脱水化し、かつブチルアセテート中で透明になるヘマトキシリンを用いて対比染色（ｃｏｕｎｔｅｒ−ｓｔａｉｎｅｄ）する。
【０２５４】
ローターロッド試験
我々は、ＩＢＭ互換パソコン、ＣＩＯ−２４データ取得カード、コントロールユニット、及び４線ロータロッドユニットを含むＣＲ−１ Ｒｏｔａｍｅｘシステム（Ｃｏｌｕｍｂｕｓ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ， Ｃｏｌｕｍｂｕｓ， ＯＨ）を用いるＲｏｚａｓおよびＬａｂａｎｄｅｉｒａ−Ｇａｒｃｉａ（１９９７）が記載した手順の改良法を使用する。このロータロッドユニットは、回転軸（半径７．３ｃｍ）と、それぞれのマウスに対する個別のコンピューターとから成る。このシステムソフトウェアーは、回転スピードを変えるように（０〜８０ｒｐｍ）セッションプロトコールを予めプラグラムすることができる。赤外線ビームは、マウスがロータロッドの真下の底辺鉄柵（ｂａｓｅ ｇｒｉｄ）に落ちた時を検出するために用いる。このシステムでは、落下をマウスについての実験の終了として記録し、ローターロッドにおける全時間、並びに落下時間及び全組み立て（ｓｅｔ−ｕｐ）パラメーターを記録する。また、このシステムでは、トレーニングを目的として、微弱電流を底辺鉄柵を通じて流すことができる。
【０２５５】
３．痴呆
物体認識課題
物体認識課題は、げっ歯類の認識性能における実験操作の効果を評価するために設計した。ラットを、同一の物体が２個ある開けた空間に置く。ラットは、最初の対物認識課題試行の間中、両方の物体を調べる。２度目の試行では、例えば２４時間の保持間隔の後、最初の試行で用いた２個の物体の内の１個「知っている」物体と新しい物体とを、その開けた空間に置く。この物体それぞれを調べる時間を記録する。ＯＲ課題における基礎的な基準は、ラットが２度目の試行で２個の物体を探索するのにかけた時間である。保持の良さは、「知っている」物体よりも新たな物体に対する探索時間が長いことに反映される。
【０２５６】
最初の試行の前に推定される認識エンハンサーを投与することで、習得及び最終的な固定プロセスにおける効果を評価することができる。最初の試行後の被験化合物の投与は、固定プロセスにおける効果を評価できるのに対して、２度目の試行前の投与では、想起プロセスにおける効果を測定できる。
【０２５７】
受動的回避課題
受動的回避課題により、ラット及びマウスにおける記憶性能を評価する。抑制的回避機器は、明区画と暗区画との２つの区画を持つ箱から成る。この２つの区画は、実験者が操作できるギロチンドアによって分けられている。ギロチンドアを上げた場合、２ｃｍの敷居で２つの区画は分けられている。ドアを開けた場合の暗区画の照度は約２ｌｕｘである。明区画の中央の床の明度は約５００ｌｕｘである。
【０２５８】
２４時間のセッション間間隔で分けられた２つの習慣セッション、１つのショックセッション及び保持セッションが与えられる。ラットは、習慣セッションと保持セッションにおいて３００秒間器具内を探索することができる。ラットをギロチンドアの反対の壁に頭を向けた状態で、明区画に置く。１５秒の適応時間の後、ギロチンドアを器具内の全領域を自由に動き回れるように開ける。通常、ラットはまぶしい明領域を避け、数秒の内に暗区画に入るであろう。
【０２５９】
ショックセッションにおいては、ラットが４本の足で暗区画に入るやいなや区画間のギロチンドアを下ろし、すぐさま１ｍＡのフットショックを２秒間与える。ラットを器具から取り出し、ホーム籠に戻す。保持セッション中の手順は、習慣セッションの手順と同じである。
【０２６０】
ステップ通過潜伏、すなわち保持セッション中に暗区画に入る最初の潜伏（秒）は、動物の記憶性能の指標である；暗区画に入る潜伏が長ければ長いほど、保持はよりよい。ショックセッションの３０分前に、スコポラミン１ｍｇ＊ｋｇ−１と一緒に被験化合物を与える。スコポラミンは、２４時間後の保持セッション中の記憶性能を損なわせる。被験化合物が、スコポラミン処置コントロールと比較して侵入潜伏を増大させる場合、認識増進させる可能性があり得る。
【０２６１】
モーリス水脱出課題
モーリス水脱出課題により、げっ歯類における空間方向学習を測定する。ラット及びマウスの認知機能において推定される治療効果を調査するのに広く用いられている試験系である。動物のこの性能は、水面下約１ｃｍのところに沈んでいる避難用台のある円形水タンクにおいて評価する。避難用台は、水タンク中を泳いでいる動物には見えない。机、コンピューター設備、第二の水課題を備え、実験者が居る室内の備品及び優しく響く柵上のラジオにより、膨大な迷路外合図を与える。
【０２６２】
動物は、日々の獲得セッション５日の間に４回の試行を受ける。試行は、動物をプール中に置き、タンクの壁に頭を向けることによって始める。四分区画、北、西、南及び東の４つの開始位置のそれぞれは一連の４回の試行で１度は用いる（それらの順序は無作為である）。その避難用台はいつも同じ場所にある。試行は、初めにどんな出来事があっても、動物が避難用台に上った時か又は９０秒経過した時に終了する。その動物はその台上に３０秒間留まることができる。その後台から下し、次の試行を始める。動物が９０秒以内に台を見つけられなかった場合でも、実験者がその動物を台の上に置き、３０秒間そこに留まらせる。５日目の日々のセッションの第４回目の試行後に、探知試行として更なる試行を行なう：それは、台を取りだし、動物が４つの４分円内で過ごす時間を３０秒又は６０秒間測定する。この探知試行において、動物は全て、獲得セッションの間に避難用台が置いてあった４分円の反対側の同じ開始位置から始める。
【０２６３】
動物の性能を評価するため、獲得トレーニングの間に４つの異なる基準：避難潜伏、移動距離、台への距離及び水泳速度を得る。探知試行については以下の基準：４分円内における時間（秒）及び４つの４分円内での移動距離（ｃｍ）を評価する。この探知試行は、動物が避難用台の位置をどれくらい良く学習したかについての情報をさらに与える。動物が、獲得セッション中に台のあった４分円内で、その他の４分円における時間および距離よりも、より多くの時間を費やし、より多くの距離を泳いだ場合、これは結論として、台の位置をよく学習したことを示す。
【０２６４】
推定される認知増進化合物の効果を評価するために、認知機能を損なわせる特定の脳損傷を持つラット若しくはマウス、又は正常な学習を妨げるスコポラミン若しくはＭＫ−８０１などの化合物で処置した動物、又は認知欠損を患っている高齢動物を用いる。
【０２６５】
Ｔ迷路自発的択一課題
Ｔ迷路自発的択一課題（ＴｅＭＣＡＴ）により、マウスの空間認知性能を評価する。Ｔ迷路のスタートアームと２つのゴールアームは、実験者が手動で操作できるギロチンドアを備えている。トレーニングの開始時、マウスをスタートアーム置く。ギロチンドアは閉めてある。最初の試行、「強制試行」では、左又は右のいずれかのゴールアームはギロチンドアを下げてブロックする。マウスがスタートアームから離れた後、迷路を乗り越え、最終的に開いているゴールアームに入り、そしてスタート地点にもどり、そこでギロチンドアを下げることによって５秒間閉じ込められる。次に動物は、１４回の「自由選択」試行の間に左と右のゴールアームを自由に選ぶことができる（全てのギロチンドアは開いている）。マウスが一方のゴールアームに入るとすぐに、もう一方のゴールアームを閉じる。マウスは最終的にスタートアームに戻り、マウスはスタートアームに５秒間閉じ込められた後、望むいずれのゴールアームにも自由に向かうことができる。１回のセッション中１４回の自由選択試行が完了した後、動物を迷路から取り出す。トレーニングの間には、マウスに決して手を触れない。
【０２６６】
１４回後の試行の択一パーセントを計算する。このパーセントと最初の強制試行及び連続１４回の選択試行を完了するのに要した時間（秒）とを分析する。認知欠損は、通常、トレーニングセッションの開始３０分前にスコポラミンを注射することによって誘導する。スコポラミンは、択一パーセントレベルを偶然レベルか又はそれより低いレベルにまで下げる。通常トレーニング試行の前に投与される認知エンハンサーは、少なくとも部分的には偶発的択一率のスコポラミン誘導型低下を拮抗し得る。
【０２６７】
実施例１０
増殖阻害検定：アンチセンスオリゴヌクレオチドは癌細胞系の増殖を抑制する
試験に用いられる細胞系はヒト大腸癌細胞系ＨＣＴ１１６である。細胞は、１０〜１５％胎児ウシ血清を含むＰＲＭＩ−１６４０中、濃度１０，０００細胞／ｍｌ ０．５ｍｌ量にて３７℃、９５％空気／５％ＣＯ２雰囲気下で培養する。
【０２６８】
ホスホロチオネート オリゴリボヌクレオチドは、ホスホロアミデイト（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏａｍｉｄｉｔｅ）ケミストリーを用いる応用バイオシステム モデル３８０Ｂ ＤＮＡシンセサイザーにおいて合成する。配列番号１の１〜２４位置のヌクレオチドと相補的な２４塩基の配列を、被験オリゴヌクレオチドとして用いる。コントロールとして、他の（ランダム）配列：５’−ＴＣＡ ＡＣＴ ＧＡＣ ＴＡＧ ＡＴＧ ＴＡＣ ＡＴＧ ＧＡＣ−３’を用いる。アセンブリーと脱保護に次いで、オリゴヌクレオチドを、エタノール沈殿２回、乾燥、そしてリン酸緩衝液中に所望の濃度に懸濁する。オリゴヌクレオチドの純度は、キャピラリーゲル電気泳動及びイオン交換ＨＰＬＣによって試験する。精製オリゴヌクレオを、培養培地に７日間、１日ごとに１度１０μＭ濃度を加える。
【０２６９】
７日間の被験オリゴヌクレオチド添加により、ヒトセリンパルミトイルトランスフェラーゼの発現は、ウェスタンブロッティングにより決定されるように有意に低下する。この効果は、コントロールオリゴヌクレオチドでは観察されない。３〜７日の後、培養中の細胞の数を、自動細胞カウンターを用いて計数する。被験オリゴヌクレオチドで処理した培養中の細胞の数を、コントロールオリゴヌクレオチドで処理した培養中の細胞の数（１００％と表す）と比較する。被験オリゴヌクレオチドで処理した培養中の細胞の数は、コントロールの３０％を超えない、このことはヒトセリンパルミトイルトランスフェラーゼの阻害が、癌細胞において抗増殖効果を有することを示している。
【０２７０】
実施例１１
化合物／標的確証のインビボ試験
１．急性機械的検定
１．１．分裂促進血漿ホルモンレベルの低下
この非腫瘍検定では、内因性の循環ホルモンレベル又は生物学的刺激に応答して生産されるホルモンレベルのいずれかを低下させる化合物の能力を測定する。げっ歯類に被験化合物を投与（経口、腹腔内、静脈内、筋肉内又は皮下投与）する。被験化合物投与後の所定時間に、血漿を採集する。目的のホルモンレベルについて、血漿を検定する。ホルモンの標準循環レベルが低すぎる、及び／又は可変過ぎて一致した結果が得られない場合は、生物学的刺激で前処理してホルモンレベルを亢進することができる（即ち、ＬＨＲＨ ３０ｎｇ／マウス用量をマウスに筋肉内注射して、テストステロン合成を群発させることができる）。血漿採集の時期を調整して、誘導したホルモン応答のピークを一致させることができよう。化合物効果を、媒体処置コントロール群と比較する。Ｆ試験は分散が一致するか、一致しないかを決定するために行ない、次いでスチューデントｔ試験を行なう。媒体コントロール群と比較して有意性はｐ値０．０５以下である。
【０２７１】
１．２．活性検定の中空繊維メカニズム
中空繊維は、所望の細胞系（群）を用いて調製し、げっ歯類に腹腔内及び／又は皮下移植する。化合物は、経口、腹腔内、静脈内、筋肉内又は皮下投与する。繊維を、特定のげっ歯類検定プロトコル（遺伝子発現（ｄＤＮＡ、ＰＣＲ又はＴａｑｍａｎ）、特定の生化学活性（例えば、ｃＡＭＰレベル）についての検定を含み得る）に基づいて回収する。結果は、群間の分散をＦ試験によって比較し（媒体コントロール群と比較して有意性はｐ値０．０５以下である）、スチューデントｔ試験又は順位和試験によって分析する。
【０２７２】
２．亜急性機能インビボ検定
２．１．ホルモン依存的組織量の低下
これは、ホルモン依存性組織（即ち、雄の精嚢及び雌の子宮）の質量を低下させる化合物の能力を測定する別の非腫瘍検定である。げっ歯類に、被験化合物を所定のスケジュールに基づき、所定の期間（即ち、１週間）投与（経口、腹腔内、静脈内、筋肉内又は皮下）する。この実験の最後に、動物の体重を測り、標的器官を切除し、全ての体液を搾り出し、その器官の重量を記録する。また、血漿も回収できる。血漿は、目的のホルモンレベル又は被験物質レベルについて検定することができる。器官重量を直接比較するか、それらを動物の体重について標準化することができる。化合物の効果を、媒体処置コントロール群と比較する。Ｆ試験は分散が一致するか、一致しないかを決定するために行ない、次いでスチューデントｔ試験を行なう。媒体コントロール群と比較して有意性はｐ値０．０５以下である。
【０２７３】
２．２．中空繊維増殖検定
中空繊維は、所望の細胞系（群）を用いて調製し、げっ歯類に腹腔内及び／又は皮下移植する。化合物は、経口、腹腔内、静脈内、筋肉内又は皮下投与する。繊維を、特定のげっ歯類検定プロトコルに基づいて回収する。細胞増殖は、細胞数マーカー（即ち、ＭＴＴ又はＬＤＨ）を測定することによって決定する。細胞数と出発接種材料からの細胞数の変化を、群間の分散をＦ試験（媒体コントロール群と比較して有意性はｐ値０．０５以下である）によって比較した後、スチューデントｔ試験又は順位和試験によって分析する。
【０２７４】
２．３．抗血管新生モデル
２．３．１．角膜血管新生
成長因子を伴う若しくは伴わないヒドロンペレット又は細胞を、げっ歯類の角膜に外科的に作ったマイクロポケット中に移植する。化合物（ヒドロンペレット中に成長因子と混合した化合物）を、全身又は局所投与することができる。移植の７日後にコロイド性カーボンを心臓内注入した後すぐに、角膜を回収し、そして１０％ホルマリン中に固定する。読み取りは、定性的スコアリング及び／又はイメージ分析で行なう。定性的スコアを順位和試験により比較する。イメージ分析データは、血管新生領域（ピクセル内）を測定することによって評価し、群平均をスチューデントｔ試験（２テイル）によって比較する。成長因子又は細胞のみの群と比較して、有意性はｐ値０．０５以下である。
【０２７５】
２．３．２．マトリゲル（Ｍａｔｒｉｇｅｌ）血管新生
細胞又は成長因子を含有するマトリゲルを、皮下注射する。化合物を、経口、腹腔内、静脈内、筋肉内又は皮下投与する。マトリゲルプラグを、所定の時点（群）で回収し、読み取りのために調製する。読み取りは、ヘモグロビン濃度及び／又は組織学試験についてのＥＬＩＳＡを基礎とする検定である（即ち、容器カウント、内皮表面マーカーの特殊染色：ＣＤ３１、因子−８）。読み取りは、群間の分散をＦ試験によって比較した後（媒体コントロール群と比較して有意性はｐ値０．０５以下である）、スチューデントｔ試験によって分析する。
【０２７６】
３．原発性抗腫瘍効果
３．１．初期治療モデル
３．１．１．皮下腫瘍
腫瘍細胞又は破砕物（フラグメント）を、０日目に皮下移植する。媒体及び／又は化合物を、ある時、通常１日目に開始する所定のスケジュールに基づいて経口、腹腔内、静脈内、筋肉内又は皮下投与し、次いでその能力について腫瘍重量（ｂｕｒｄｅｎ）を測定する。体重及び腫瘍測定を週に２、３回記録する。正味の体重及び腫瘍重量の平均を、それぞれのデータ収集日ごとに計算する。抗腫瘍効果は、既定の日に処置腫瘍のサイズ（Ｔ）及びコントロール腫瘍のサイズ（Ｃ）を、群間の分散をＦ試験により比較した後（有意性はｐ０．０５以下で決められる）、スチューデントｔ試験により比較することで最初に決定することができる。また、この実験は、腫瘍成長遅延をモニターし記録して腫瘍測定を継続する場合には、投与の終了後にも継続できる。腫瘍成長遅延は、予め定めたサイズに達したコントロール群の中央時間で、該サイズに達した処置群とコントロール群の中央時間を割ったものの差として表される。成長遅延は、評価サイズに達した個々の腫瘍についての時間からカプラン−マイヤー曲線を作成することによって比較する。有意性はｐ０．０５以下である。
【０２７７】
３．１．２．腹腔内／頭蓋内腫瘍モデル
腫瘍細胞を、０日目に腹腔内又は頭蓋内注射する。化合物を、１日目に開始する所定のスケジュールに基づき、経口、腹腔内、静脈内、筋肉内又は皮下投与する。羅患率及び／又は死亡率の観察を、１日に２回記録する。体重は１週間に２回測定し記録する。羅患率／死亡率のデータを、生存中央値の期間で表し、長期生存数は分けて示す。生存時間を用いて、カプラン−マイヤー曲線を作成する。この実験のコントロール群と比較した対数範囲試験による有意性はｐ０．０５以下である。
【０２７８】
３．２．疾患モデルの確立
腫瘍細胞又は破砕物を、皮下的に移植し、処置を開始するのに所望のサイズにまで成長させる。所定のサイズ範囲に達する、マウスを処置群に無作為に分ける。化合物を、所定のスケジュールに従い、経口、腹腔内、静脈内、筋肉内又は皮下投与する。腫瘍重量及び体重を、１週間に２〜３回測定し記録する。インキュベート後の幾日かに渡って全群の腫瘍重量の平均値を、比較のためにグラフにする。Ｆ試験は分散が一致するか、一致しないかを決定するために行ない、次いでスチューデントｔ試験を処置終了時点の処置群及びコントロール群の腫瘍サイズを比較するために行なう。コントロール群と比較して有意性はｐ値０．０５以下である。腫瘍測定は、投与を止め腫瘍成長遅延をモニターした後に、記録することができる。腫瘍成長遅延は、所定のサイズに達したコントロール群の中央時間で、所定のサイズに達した処置群とコントロール群の中央時間を割ったのものの差として表される。成長遅延は、評価サイズに達した個々の腫瘍についての時間からカプラン−マイヤー曲線を作成することによって比較する。媒体コントロール群と比較して有意性はｐ値０．０５以下である。
【０２７９】
３．３．同所性疾患モデル
３．３．１．哺乳類脂肪体検定
哺乳動物の腺癌起源の腫瘍細胞又は破砕物を、外科的に露出させて表出させ、げっ歯類の乳腺脂肪体（ｆａｔ ｐａｄ）に直接移植する。その脂肪体を元あった場所に戻し、外科部分を閉じる。また、ホルモンを、腫瘍の成長を補助するためにげっ歯類に投与することもできる。化合物を所定のスケジュールに基づき、経口、腹腔内、静脈内、筋肉内又は皮下投与する。腫瘍重量及び体重を、１週間に２〜３回測定し記録する。接種後の幾日かに渡って全群の腫瘍重量の平均値を、比較のためにグラフにする。Ｆ試験は分散が一致するか、一致しないかを決定するために行ない、次いでスチューデントｔ試験を処置終了時の処置群及びコントロール群の腫瘍サイズを比較するために行なう。コントロール群と比較して有意性はｐ値０．０５以下である。
【０２８０】
腫瘍測定は、投与を止め腫瘍成長遅延をモニターした後に、記録することができる。腫瘍成長遅延は、所定のサイズに達したコントロール群の中央時間で、所定のサイズに達した処置群とコントロール群の中央時間を割ったのものの差として表される。成長遅延は、評価サイズに達した個々の腫瘍の中央時間からカプラン−マイヤー曲線を作成することによって比較する。媒体コントロール群と比較して有意性はｐ値０．０５以下である。さらに、このモデルは、このタイプの腫瘍の自発的転移速度を増大させる機会を提供する。転移反応は、標的器官当たりの目視できる病巣（フォーカス）の数を計数すること、又は標的器官重量を測定することによって、この研究の最後に評価することができる。これらの終点の平均値を、Ｆ試験を行なった後（この実験のコントロール群と比較して有意性はｐ値０．０５以下である）、スチューデントｔ試験によって比較する。
【０２８１】
３．２．２．前立腺内検定
前立腺癌器官の腫瘍細胞又は破砕物を、外科的に露出させたげっ歯類の前立腺の背葉に直接移植する。移植組織が精嚢に侵入しないことを検証しながら、腫瘍を特に背葉に移植することができるので、腹部切除して前立腺を外面化する。上手く接種した前立腺を腹部に移し、腹部に沿った切開部及び皮膚を閉じる。また、ホルモンを、腫瘍の成長を助けるためにげっ歯類に投与することもできる。化合物を、所定のスケジュールに基づき、経口、腹腔内、静脈内、筋肉内又は皮下投与する。体重を１週間に２〜３回測定し記録する。所定の時点で実験を終了し、動物を解剖する。原発性腫瘍サイズを、解剖範囲に装着させるキャリパーミクロメーターや接眼マイクロメーターのいずれかを用いて三次元測定する。Ｆ試験は分散が一致するか、一致しないかを決定するために行ない、次いでスチューデントｔ試験を処置終了時の処置群及びコントロール群の腫瘍サイズを比較するために行なう。コントロール群と比較して有意性はｐ値０．０５以下である。このモデルは、このタイプの腫瘍の自発的転移速度を増大させる機会を与える。転移反応は、標的器官（即ち、肺）当たりの目視できる病巣の数を計数すること、又は標的器官（即ち、局所的リンパ節）重量を測定することによって、この研究の最後に評価することができる。これらの終点の平均値を、Ｆ試験を行なった後（この実験のコントロール群と比較して有意性はｐ値０．０５以下である）、スチューデントｔ試験によって比較する。
【０２８２】
３．３．３．気管支内検定
肺器官の腫瘍細胞を、皮膚を切開し、気管を曝すことによって、気管支内に移植することができる。気管支は、斜端の２５ゲージニードルを用いて穴を開け、腫瘍細胞を、主要な気管支に屈曲９０°の平滑端の２７ゲージニードルを用いて接種する。化合物を、所定のスケジュールに基づき、経口、腹腔内、静脈内、筋肉内又は皮下投与する。体重を１週間に２〜３回測定し記録する。所定の時点で実験を終了し、動物を解剖する。原発性腫瘍サイズを、解剖範囲に装着させるキャリパーミクロメーターや接眼マイクロメーターのいずれかを用いて三次元測定する。Ｆ試験は分散が一致するか、一致しないかを決定するために行ない、次いでスチューデントｔ試験を処置終了時の処置群及びコントロール群の腫瘍サイズを比較するために行なう。コントロール群と比較して有意性はｐ値０．０５以下である。このモデルは、このタイプの腫瘍の自発的転移速度を増大させる機会を与える。転移反応は、標的器官（即ち、反対側の肺）当たりの目視できる病巣の数を計数すること、又は標的器官重量を測定することによって、この研究の最後に評価することができる。これらの終点の平均値を、Ｆ試験を行なった後（この実験のコントロール群と比較して有意性はｐ値０．０５以下である）、スチューデントｔ試験によって比較する。
【０２８３】
３．３．４．盲腸内検定
胃腸器官の腫瘍細胞を、腹部の皮膚を切開し、腸を外面化することで盲腸内移植することができる。腫瘍細胞を、２７又は３０ゲージニードルを用いて、腸の管腔を貫通することなく、盲腸壁に接種することができる。化合物を、所定のスケジュールに基づき、経口、腹腔内、静脈内、筋肉内又は皮下投与する。体重を１週間に２〜３回測定し記録する。所定の時点で実験を終了し、動物を解剖する。原発性腫瘍サイズを、解剖範囲に装着させるキャリパーミクロメーターや接眼マイクロメーターのいずれかを用いて三次元測定する。Ｆ試験は分散が一致するか、一致しないかを決定するために行ない、次いでスチューデントｔ試験を処置終了時の処置群及びコントロール群の腫瘍サイズを比較するために行なう。コントロール群と比較して有意性はｐ値０．０５以下である。このモデルは、このタイプの腫瘍の自発的転移速度を増大させる機会を与える。転移反応は、標的器官（即ち、肝臓）当たりの目視できる病巣の数を計数すること、又は標的器官重量を測定することによって、この研究の最後に評価することができる。これらの終点の平均値を、Ｆ試験を行なった後（エンドポイント両方の実験におけるコントロール群と比較して有意性はｐ値０．０５以下である）、スチューデントｔ試験によって比較する。
【０２８４】
４．続発性（転移性）抗腫瘍効果
４．１．自発転移
腫瘍細胞を皮下接種させ、腫瘍を肺又は肝臓への自発的転移研究のため予め定めた範囲にまで成長させる。次いで、この原発性腫瘍を切除する。腫瘍転移の初期段階を阻害することを目的とした治療を評価するために原発性腫瘍を切除するまでの期間を含むことある所定のスケジュールに従い、化合物を、経口、腹腔内、静脈内、筋肉内又は皮下投与する。罹患率及び／又は死亡率の観察を毎日記録する。１週間に２回、体重を測定し記録する。可能な指標（エンドポイント）には、生存時間、標的器官当たりの目視できる病巣の数、又は標的器官重量が挙げられる。生存時間をエンドポイントとして用いた場合、他の値は定まらない。生存データは、カプラン−マイヤー曲線を作成するのに用いる。この実験のコントロール群と比較して対数範囲試験による有意性はｐ０．０５以下である。解剖マイクロスコープの下で決定されるような目視できる腫瘍の病巣数の平均と、標的器官重量の平均値は、Ｆ試験を行なった後（エンドポイント両方の実験におけるコントロール群と比較して有意性はｐ値０．０５以下である）、スチューデントｔ試験によって比較する。
【０２８５】
４．２．強制的転移
腫瘍細胞を、尾静脈、門脈、又は心臓の左心室、実験用（強制的）肺、肝臓及び骨転移研究それぞれにおいて注射する。化合物を、所定のスケジュールに基づいて、経口、腹腔内、静脈内、筋肉内又は皮下投与する。罹患率及び／又は死亡率の観察を毎日記録する。１週間に２回、体重を測定し記録する。可能な指標には、生存時間、標的器官当たりの目視できる病巣の数、又は標的器官重量が挙げられる。生存時間をエンドポイントとして用いた場合、他の値は決定されない。生存データは、カプラン−マイヤー曲線を作成するのに用いる。この実験のコントロール群と比較して対数範囲試験による有意性はｐ０．０５以下である。解剖マイクロスコープの下で決定される目視できる腫瘍の病巣数の平均と、標的器官重量の平均値は、Ｆ試験を行なった後（両方エンドポイントの実験における媒体コントロール群と比較して有意性はｐ値０．０５以下である）、スチューデントｔ試験によって比較する。
【０２８６】
実施例１２
ＣＯＰＤ動物モデルにおける被験化合物効果の同定
ギニアピッグを、１回タバコの煙に５０分間曝す。曝した後１０分〜２４時間の間に動物を屠殺し、その肺をＲＮＡｌａｔｅｒＴＭに置く。肺組織をホモジナイズし、キアゲンＲＮｅａｓｙＴＭ Ｍａｘｉキットを用いて、全ＲＮＡを抽出した。Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ ＲｉｂｏＧｒｅｅｎＴＭ ＲＮＡ定量法を用いて、それぞれの試料におけるＲＮＡ量を定量する。
【０２８７】
全ＲＮＡを定量し、得られたｃＤＮＡを実時間ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に用いる。そのｃＤＮＡを、センス−及びアンチセンス−プライマー、並びに膜型セリンプロテアーゼ遺伝子の６−カルボキシ−テトラメチル−ローダミン標識化プローブを含む溶液に加える。サイクロフィリンをハウスキーピング遺伝子として用いる。膜型セリンプロテアーゼ遺伝子の発現を、それぞれの試料についての増幅曲線を作り出すＴａｑＭａｎ実時間ＰＣＲシステムを用いて測定する。この曲線から閾（ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ）サイクル値を計算する：その増幅標的量が固定された閾値に達する機能サイクル数。膜型セリンプロテアーゼ遺伝子の多数コピーを含む試料は、少ないコピーを含む試料よりも早く閾に達する。閾を０．２に設定し、閾サイクルＣＴを増幅曲線から計算する。膜型セリンプロテアーゼ遺伝子のＣＴ値を、ハウスキーピング遺伝子のＣＴ値を用いて標準化する。
【０２８８】
膜型セリンプロテアーゼ遺伝子の発現は、空気に曝したコントロール動物と比較して、タバコ煙曝露１０分〜３時間後の動物とでは、少なくとも３倍増大する。
【０２８９】
以下のように被験化合物を評価する。動物を、タバコ煙曝露５分〜１時間前に被験化合物で前処理し、次いでタバコ煙曝露を行なった３時間後までに屠殺する。コントロール動物は、被験化合物の際に選んだ投与経路を介して、被験化合物の媒体で前処理する。媒体処置したタバコの煙曝露動物に見られる発現と比較して、膜型セリンプロテアーゼ遺伝子のタバコ煙誘導性上方制御を低下させる被験化合物を、膜型セリンプロテアーゼ遺伝子発現の阻害物質として同定する。
【０２９０】
参考文献
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【図面の簡単な説明】
【図１】膜型セリンプロテアーゼポリペプチドをコードするＤＮＡ配列（配列番号１）。
【図２】図１に記載のＤＮＡ配列から推定されるアミノ酸配列（配列番号２）。
【図３】スイス プロット アクセッションＮｏ．Ｐ５６６７７により同定されるタンパク質のアミノ酸配列（配列番号３）。
【図４】膜型セリンプロテアーゼポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号４）。
【図５】膜型セリンプロテアーゼポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号５）。
【図６】膜型セリンプロテアーゼポリペプチドをコードするＤＮＡ配列（配列番号６）。
【図７】図６に記載のＤＮＡ配列から推定されるアミノ酸配列（配列番号７）。
【図８】配列番号３（Ｐ５６６７７）と配列番号２とのＢＬＡＳＴＰアライメント。
【図９】ＢＬＯＣＫＳ検索結果。
【図１０】ｐｆａｍ｜ｈｍｍ｜ｔｒｙｐｓｉｎ（配列番号１４）と配列番号２とのＨＭＭＰＦＡＭアライメント。
【図１１】ｐｆａｍ｜ｈｍｍ｜ｌｄｌ＿ｒｅｃｅｐｔ＿ａ（配列番号１５）と配列番号２とのＨＭＭＰＦＡＭアライメント。
【図１２】配列番号３（Ｐ５６６７７）と配列番号７とのＢＬＡＳＴＰアライメント。
【図１３】種々のヒト組織におけるヒト膜型セリンプロテアーゼの相対発現。
【図１４】種々のヒト呼吸組織及び細胞におけるヒト膜型セリンプロテアーゼの相対発現。
【図１５】プロサイト検索結果。
【図１６】ＢＬＯＣＫＳ検索結果。
【図１７】ｐｆａｍ｜ｈｍｍ｜ｔｒｙｐｓｉｎに対する１５４＿ｖ４＿ＴＲ１のＨＭＭＰＦＡＭ−アライメント。
【図１８】ｐｆａｍ｜ｈｍｍ｜ｌｄｌ＿ｒｅｃｅｐｔ＿ａに対する１５４＿ｖ４＿ＴＲ１（配列番号６）のＨＭＭＰＦＡＭ−アライメント。
【図１９】ｐｆａｍ｜ｈｍｍ｜ｌｄｌ＿ｒｅｃｅｐｔ＿ａに対する１５４＿ｖ４＿ＴＲ１（配列番号６）のＨＭＭＰＦＡＭ−アライメント。
【図２０】ｐｆａｍ｜ｈｍｍ｜ｌｄｌ＿ｒｅｃｅｐｔ＿ａに対する１５４＿ｖ４＿ＴＲ１（配列番号６）のＨＭＭＰＦＡＭ−アライメント。
【図２１】ヒト膜型セリンプロテアーゼのエクソン−イントロン構造（１５４−ｖ４）。２つの参照配列（ｒｅｆｓｅｑ）ゲノム配列：第３染色体３ｑ１３．２−３ｑ１３．３３上にあると注釈されるＮＴ＿０２２４８４．２及び位置は未決定の第８染色体上にあると注釈されるＮＴ＿０２３８１８．２を用いた。ＮＴ＿０２３８１８．２は、幾つかのヌクレオチドで異なることを除き、ほとんど一致する配列であるＮＴ＿０２２４８４．２の約半分をカバーする。Ｇｅｎｓｃａｎ、Ｇｅｎｅｗｉｓｅ及びＧｅｎｅｉｄを組み合わせて用い、エクソンを予想する。実験データを用いて、幾つかのエクソンの妥当性を決定し、利用したゲノム配列間の矛盾を解消する。ＮＴ＿０２２４８４．２とのアライメントにおけるエクソン／イントロン構造を示す。ＮＴ＿０２３８１８．２とのアライメントは、ＮＴ＿０２２４８４．２に対する矛盾と共にエクソンに提供される。
【図８】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２−１】
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【図１２−２】
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【図１２−３】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６−１】
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【図１６−２】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１−１】
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【図２１−２】
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【図２１−３】
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【図２１−４】
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【図２１−５】
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【図２１−６】
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【図２１−７】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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