(57)【要約】本発明は細胞内のユビキチン化を制御する方法および組成物を提供する。特に本発明は、ユビキチン化制御ドメインを含む精製されたポリペプチドを提供する。本発明はまた、作用物質をスクリーニングするために、抗体を生産するために、ならびに、例えば増殖性疾患、神経変性疾患、自己免疫疾患、代謝性疾患、および発育異常などの疾患を治療するために、そのようなポリペプチドを使用する方法を提供する。本発明はさらにユビキチン化制御ドメインに結合する抗体、ならびに、例えばTSG101タンパク質およびMDM2タンパク質間の相互作用を調節することなどにより、細胞内のユビキチン化を制御する作用物質および抗体を提供する。2004523527.tif 000004
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ユビキチン化制御ドメインを含むポリペプチドに特異的に結合する抗体。
【請求項２】
ユビキチン化制御ドメインがTSG101タンパク質のユビキチン化制御ドメインまたはその機能的断片である請求項1記載の抗体。
【請求項３】
TSG101タンパク質がヒトTSG101タンパク質である請求項2記載の抗体。
【請求項４】
ユビキチン化制御ドメインがヒトTSG101タンパク質のアミノ酸残基50位〜140位を含む請求項3記載の抗体。
【請求項５】
ユビキチン化制御ドメインがヒトTSG101タンパク質のアミノ酸残基1位〜140位を含む請求項3記載の抗体。
【請求項６】
ユビキチン化制御ドメインがヒトTSG101タンパク質のアミノ酸残基140位〜250位を含む請求項3記載の抗体。
【請求項７】
ユビキチン化制御ドメインを含むポリペプチドに対する抗体を免疫する段階を含む、ユビキチン化制御ドメインに特異的に結合する抗体を生産する方法。
【請求項８】
ユビキチン化制御ドメインがTSG101タンパク質のユビキチン化制御ドメインまたはその機能的断片である請求項7記載の方法。
【請求項９】
TSG101タンパク質がヒトTSG101タンパク質である請求項8記載の方法。
【請求項１０】
ユビキチン化制御ドメインがヒトTSG101タンパク質のアミノ酸残基50位〜140位を含む請求項9記載の方法。
【請求項１１】
ユビキチン化制御ドメインがヒトTSG101タンパク質のアミノ酸残基1位〜140位を含む請求項8記載の方法。
【請求項１２】
ユビキチン化制御ドメインがヒトTSG101タンパク質のアミノ酸残基140位〜250位を含む請求項9記載の方法。
【請求項１３】
被験者の細胞におけるMDM2タンパク質レベルの変化によって生じる、該被験者の病態を治療する方法であって、治療的有効量のユビキチン化制御ドメインを含む作用物質を該被験者に投与する段階を含む、方法。
【請求項１４】
被験者の細胞におけるTSG101タンパク質レベルの変化によって生じる、該被験者の病態を治療する方法であって、治療的有効量のTSG101タンパク質のMDM2との相互作用を調節する作用物質を該被験者に投与する段階を含む、方法。
【請求項１５】
以下の段階を含む被験者の増殖性疾患を治療する方法：
（a）p53のレベルに関して被験者をモニターする段階；および
（b）標的範囲内にp53のレベルを維持するために、ユビキチン化制御ドメイン含む作用物質を用いて、被験者を治療する段階。
【請求項１６】
以下の段階を含む被験者の増殖性疾患を治療する方法：
（a）TSG101のレベルに関して被験者をモニターする段階；および
（b）標的範囲内にTSG101の該レベルを維持するために、TSG101のMDM2との相互作用を調節する作用物質を用いて、被験者を治療する段階。
【請求項１７】
ユビキチン化制御ドメインがTSG101タンパク質のユビキチン化制御ドメインまたはその機能的断片である請求項13、14、15または16記載の方法。
【請求項１８】
TSG101タンパク質がヒトTSG101タンパク質である請求項17記載の方法。
【請求項１９】
ユビキチン化制御ドメインがヒトTSG101タンパク質のアミノ酸残基50位〜140位を含む請求項18記載の方法。
【請求項２０】
ユビキチン化制御ドメインがヒトTSG101タンパク質のアミノ酸残基1位〜140位を含む請求項18記載の方法。
【請求項２１】
ユビキチン化制御ドメインがヒトTSG101タンパク質のアミノ酸残基140位〜250位を含む請求項18記載の方法。
【請求項２２】
治療的有効量のTSG101タンパク質のMDM2との相互作用を調節する作用物質を被験者に投与する段階を含む、被験者の増殖性疾患を治療する方法。
【請求項２３】
細胞がユビキチン化制御ドメインを発現するように、制御配列に操作可能に連結されたユビキチン化制御ドメインをコードするポリヌクレオチドを含む細胞。
【請求項２４】
細胞がユビキチン化制御ドメインおよびMDM2タンパク質を発現するように、（i）制御配列に操作可能に連結されたユビキチン化制御ドメインをコードするポリヌクレオチド、および（ii）制御配列に操作可能に連結されたMDM2タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む、細胞。
【請求項２５】
細胞がユビキチン化制御ドメイン、MDM2タンパク質およびp53タンパク質を発現するように、（i）制御配列に操作可能に連結されたユビキチン化制御ドメインをコードするポリヌクレオチド、（ii）制御配列に操作可能に連結されたMDM2タンパク質をコードするポリヌクレオチド、および（iii）制御配列に操作可能に連結されたp53タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む、細胞。
【請求項２６】
ユビキチン化制御ドメインがTSG101タンパク質のユビキチン化制御ドメインまたはその機能的断片である請求項23、24、または25記載の方法。
【請求項２７】
TSG101タンパク質がヒトTSG101タンパク質である請求項26記載の方法。
【請求項２８】
ユビキチン化制御ドメインがヒトTSG101タンパク質のアミノ酸残基50位〜140位を含む請求項27記載の方法。
【請求項２９】
ユビキチン化制御ドメインがヒトTSG101タンパク質のアミノ酸残基1位〜140位を含む請求項27記載の方法。
【請求項３０】
ユビキチン化制御ドメインがヒトTSG101タンパク質のアミノ酸残基140位〜250位を含む請求項27記載の方法。
【請求項３１】
MDM2およびTSG101タンパク質のユビキチン化制御ドメイン、またはその機能的断片を含むポリペプチドを発現する細胞を含むスクリーニングアッセイ法を用いて、候補作用物質をスクリーニングする段階を含む、TSG101タンパク質とMDM2の相互作用を調節する作用物質を同定する方法。
【請求項３２】
以下の段階を含む、TSG101タンパク質とMDM2の相互作用を調節する能力を有する作用物質を同定する方法であって、該作用物質が段階（c）において比較されるMDM2レベルの差異によって、TSG101タンパク質とMDM2の相互作用を調節する能力を有するとして同定される方法：
（a）MDM2およびTSG101タンパク質のユビキチン化制御ドメイン、またはその機能的断片を含むポリペプチドを発現する第一の細胞を作用物質に接触させ、第一の細胞のMDM2レベルを測定する段階、
（b）TSG101タンパク質のユビキチン化制御ドメイン、またはその機能的断片ではなく、MDM2を発現する第二の細胞を作用物質に接触させ、第二の細胞のMDM2レベルを測定する段階；および
（c）（a）および（b）において測定されたMDM2レベルを比較する段階。
【請求項３３】
TSG101タンパク質がヒトTSG101タンパク質である請求項31または32記載の方法。
【請求項３４】
ユビキチン化制御ドメインがヒトTSG101タンパク質のアミノ酸残基50位〜140位を含む請求項33記載の方法。
【請求項３５】
ユビキチン化制御ドメインがヒトTSG101タンパク質のアミノ酸残基1位〜140位を含む請求項33記載の方法。
【請求項３６】
ユビキチン化制御ドメインがヒトTSG101タンパク質のアミノ酸残基140位〜250位を含む請求項33記載の方法。
【請求項３７】
ユビキチン化制御ドメインを含むポリペプチドを含む、ポリペプチドまたはその誘導体に細胞を接触させる段階を含む、該細胞のMDM2のレベルを調節する方法。
【請求項３８】
ユビキチン化制御ドメインを含むポリペプチドを含む、ポリペプチドまたはその誘導体に細胞を接触させる段階を含む、細胞のp53のレベルを調節する方法。
【請求項３９】
TSG101タンパク質のMDM2との相互作用を調節する能力を有する作用物質に細胞を接触させる段階を含む、該細胞のTSG101のレベルを調節する方法。
【請求項４０】
TSG101タンパク質のMDM2との相互作用を調節する能力を有する作用物質に細胞を接触させる段階を含む、該細胞のMDM2のレベルを調節する方法。
【請求項４１】
TSG101タンパク質のMDM2との相互作用を調節する能力を有する作用物質に細胞を接触させる段階を含む、該細胞のp53のレベルを調節する方法。
【請求項４２】
ユビキチン化制御ドメインに結合する細胞タンパク質を同定する段階を含む、ユビキチン化制御ドメインと相互作用する細胞タンパク質をスクリーニングする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の技術分野
本発明はタンパク質ユビキチン化および哺乳類細胞増殖に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
TSG101腫瘍感受性遺伝子は最初は、マウス繊維芽細胞におけるそのタンパク質産物の欠失に関連する可逆的な組織異常増殖により同定された（1）。NIT3T3においてアンチセンスRNAにより誘導されたTSG101欠失は、0.5％アガー中でのコロニー形成、単層細胞培養中でのフォーカス形成、および無胸腺ヌードマウス中での転移性腫瘍形成能の原因となる（1）。TSG101不活性化アンチセンスRNAを停止すると、TSG101欠失細胞において観察された核、微小管および紡錘体異常だけでなく悪性形質転換のこれらの特徴が逆転する（1、2）。TSG101タンパク質の定常状態レベルは、通常は細胞内において狭い範囲内に翻訳後的に（post-translationally)制御されており（3）、およびアデノウイルスプロモーターからのTSG101の過剰発現は細胞周期異常（2）および悪性形質転換（1）の原因にもなりうる。正常細胞だけでなく様々なヒト腫瘍において観察される切断型TSG101転写物（4〜7）は異常なまたは交互RNAスプライシングに寄るもので（8）、かつ細胞ストレス（4、5）およびp53変異（5）の両方と関係があった。TSG101タンパク質は転写制御因子に共通のモチーフを含み（1）、かつステロイドホルモン受容体による転写活性化を調節することが可能である（9〜11）。
【０００３】
配列解析はまた、胚発生の最も早期の段階由来の哺乳類細胞において、および成体マウスの多数の組織において発現される（8）TSG101がユビキチン媒介性タンパク質分解の役割をさらに有する可能性を示唆した（12、13）。TSG101タンパク質のN末端領域は、ユビキチン結合酵素（E2酵素）の触媒活性領域に類似しているが、これら酵素の機能に重大な活性部位システイン残基を欠くドメイン（Ubc）を含み（12〜14）、このことはTSG101がユビキチン化のドミナントネガティブ阻害物として作用する可能性があるとの推測につながる（12、13）。
【０００４】
p53は、細胞増殖および細胞死の両方に関係するMDM2の他に他の遺伝子を転写的に活性化する主要な腫瘍抑制因子である（15〜18）。その次に、MDM2は、そのユビキチン媒介性分解を促進することによりp53を負に制御する（19〜21）。p53/MDM2フィードバック調節にも関わらず、DNA傷害、低酸素および他の型のストレスの直ぐ後に細胞内にp53が蓄積し、それはMDM2およびp53のお互いへの作用はそれ自身制御されていることを示唆している（16）。そのような制御に関するいくつかの機構が提唱され（16、17）かつ、近年の証拠により、他の細胞タンパク質とのその相互作用により媒介されるMDM2安定性の変更はこのような過程において役割を有している可能性を示している（22〜24）。
【０００５】
哺乳類細胞の増殖を調節する新規のおよびより良い方法に対する、継続的必要性が当技術分野に存在する。本発明はこの必要性に応える。
【発明の開示】
【０００６】
発明の概要
本発明は細胞内のユビキチン化を制御する方法および組成物を提供する。特に本発明は、ユビキチン化制御ドメインを含む精製されたポリペプチドを提供する。本発明はまた、作用物質をスクリーニングするために、抗体を生産するために、および、例えば増殖性疾患、神経変性疾患、自己免疫疾患、代謝性疾患、および発育異常などの疾患を治療するために、そのようなポリペプチドを使用する方法を提供する。本発明はさらにユビキチン化制御ドメインに結合する抗体、ならびに、例えばTSG101タンパク質およびMDM2タンパク質間の相互作用を調節することなどにより、細胞内のユビキチン化を制御する作用物質および抗体を提供する。
【０００７】
ある態様においては、本発明はユビキチン化制御ドメインを含むポリペプチドに特異的に結合する抗体を提供する。ある好ましい態様においては、本発明は、例えばヒトTSG101タンパク質などのTSG101タンパク質のユビキチン化制御ドメイン、またはその機能的断片に結合する抗体を提供する。別の好ましい態様においては、本発明は、ヒトTSG101タンパク質のアミノ酸残基1位〜140位、例えば配列番号：1のアミノ酸残基1位〜140位を含むユビキチン化制御ドメインに結合する抗体を提供する。さらに別の好ましい態様においては、ユビキチン化制御ドメインは、ヒトTSG101のアミノ酸残基50位〜140位、例えば配列番号：1のアミノ酸残基50位〜140位を含む。さらに別の好ましい態様においては、本発明は、ヒトTSG101タンパク質のアミノ酸残基140位〜250位、例えば配列番号：1のアミノ酸残基140位〜250位を含むユビキチン化制御ドメインに結合する抗体を提供する。さらに別の態様においては、ユビキチン化制御ドメインは、ヒトTSG101のアミノ酸残基10位〜140位、20位〜140位、30位〜140位、40位〜140位、1位〜160位、1位〜180位、1位〜200位、1位〜220位、50位〜250位または1位〜250位、例えば配列番号：1のアミノ酸残基10位〜140位、20位〜140位、30位〜140位、40位〜140位、1位〜160位、1位〜180位、1位〜200位、1位〜220位、50位〜250位または1位〜250位を含んでもよい。本発明はまた、ユビキチン化制御ドメインに特異的に結合するそのような抗体を生産する方法も提供する。本発明の方法においては、抗体はユビキチン化制御ドメインを含むポリペプチドに対して免疫される。ユビキチン化制御ドメインを含む任意のポリペプチドが本発明の抗体を生産するために使用されることが可能である。
【０００８】
他の態様においては、本発明は、Ubcドメイン以外のドメインに、例えばコイルドコイルドメイン、またはステディボックスドメインなどにおいてTSG101タンパク質に結合し、その結合がユビキチン化制御ドメインの機能を調節する抗体を提供する。
【０００９】
本発明はまた、細胞がユビキチン化制御ドメインを発現するように、制御配列に操作可能に連結されたユビキチン化制御ドメインをコードするポリヌクレオチドを含む細胞も提供する。本発明はまた、細胞がユビキチン化制御ドメインおよびMDM2タンパク質を発現するように、（i）制御配列に操作可能に連結されたユビキチン化制御ドメインをコードするポリヌクレオチド、および（ii）制御配列に操作可能に連結されたMDM2タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む細胞も提供する。本発明はまた、細胞がユビキチン化制御ドメイン、MDM2タンパク質およびp53タンパク質を発現するように、（i）制御配列に操作可能に連結されたユビキチン化制御ドメインをコードするポリヌクレオチド、（ii）制御配列に操作可能に連結されたMDM2タンパク質をコードするポリヌクレオチド、および（iii）制御配列に操作可能に連結されたp53タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む細胞も提供する。ユビキチン化制御ドメインは、例えばヒトTSG101タンパク質などのTSG101タンパク質のユビキチン化制御ドメイン、またはその機能的断片であることが可能である。好ましい態様においては、ユビキチン化制御ドメインは、ヒトTSG101タンパク質のアミノ酸残基1位〜140位、例えば配列番号：1のアミノ酸残基1位〜140位を含む。別の好ましい態様においては、ユビキチン化制御ドメインは、ヒトTSG101タンパク質のアミノ酸残基50位〜140位、例えば配列番号：1のアミノ酸残基50位〜140位を含む。さらに別の好ましい態様においては、ユビキチン化制御ドメインは、ヒトTSG101タンパク質のアミノ酸残基140位〜250位、例えば配列番号：1のアミノ酸残基140位〜250位を含む。さらに別の態様においては、ユビキチン化制御ドメインは、ヒトTSG101タンパク質のアミノ酸残基10位〜140位、20位〜140位、30位〜140位、40位〜140位、1位〜160位、1位〜180位、1位〜200位、1位〜220位、50位〜250位または1位〜250位、例えば配列番号：1のアミノ酸残基10位〜140位、20位〜140位、30位〜140位、40位〜140位、1位〜160位、1位〜180位、1位〜200位、1位〜220位、50位〜250位または1位〜250位を含んでもよい。
【００１０】
本発明はTSG101タンパク質とMDM2タンパク質の相互作用を調節する作用物質を同定する方法を提供する。本方法は、MDM2およびTSG101タンパク質のユビキチン化制御ドメイン、またはその機能的断片を含むポリペプチドを発現する細胞を含むスクリーニングアッセイ法を用いて候補作用物質をスクリーニングする段階を含む。ある特定の態様においては、（a）MDM2およびTSG101タンパク質のユビキチン化制御ドメイン、またはその機能的断片を含むポリペプチドを発現する細胞を作用物質に接触させ、細胞のMDM2レベルを測定する段階、（b）TSG101タンパク質のユビキチン化制御ドメイン、またはその機能的断片ではなく、MDM2を発現する細胞を作用物質に接触させ、細胞のMDM2レベルを測定する段階、ならびに（c）（a）および（b）において測定されたMDM2レベルを比較する段階を含む、TSG101タンパク質とMDM2の相互作用を調節する能力を有する作用物質を同定する方法を提供する。段階（c）において決定されるMDM2レベルの差異が、TSG101タンパク質とMDM2の相互作用を調節する能力を有するとして作用物質を同定する。
【００１１】
本発明はまた細胞内のMDM2またはp53のレベルを調節する方法も提供する。本発明は、ユビキチン化制御ドメインを含むポリペプチドを含むポリペプチドまたはその誘導体に細胞を接触させる段階を含む。
【００１２】
本発明はまた細胞内のTSG101またはMDM2あるいはp53のレベルを調節する方法も提供する。本発明はTSG101タンパク質とMDM2の相互作用を調節する能力を有する作用物質に細胞を接触させる段階を含む。
【００１３】
本発明はさらに、TSG101またはMDM2あるいはp53のレベルの正常範囲からの逸脱の結果である疾患または任意の他の望ましくない病態の被験者を治療する方法を提供する。治療されることが可能な被験者はヒトまたは非ヒト哺乳類を含む。
【００１４】
ある態様においては、本発明は、被験者の細胞内におけるMDM2タンパク質のレベルの変化から生じる病態の被験者を治療する方法を提供する。方法は、ユビキチン化制御ドメインを含む、治療的に有効な量の作用物質を被験者に投与する段階を含む。
【００１５】
別の態様においては、本発明は、被験者の細胞内におけるTSG101タンパク質のレベルの変化から生じる病態の被験者を治療する方法を提供する。方法は、治療的に有効な量のTSG101タンパク質とMDM2の相互作用を調節する作用物質を被験者に投与する段階を含む。
【００１６】
さらに別の態様においては、（a）p53のレベルに関して被験者をモニターする段階、および（b）p53のレベルを標的範囲内に維持するためにユビキチン化制御ドメインを含む作用物質を用いて被験者を治療する段階を含む被験者の増殖性疾患を治療するための方法を提供する。
【００１７】
本発明はまた増殖性疾患の被験者を治療するための方法も提供する。方法は、TSG101とMDM2の相互作用を調節する能力を有する治療的に有効な量の作用物質を被験者に投与する段階を含む。特定の態様においては、発明は、（a）TSG101のレベルに関して被験者をモニターする段階、および（b）TSG101のレベルを標的範囲内に維持するためにTSG101とMDM2の相互作用を調節する能力を有する作用物質を用いて被験者を治療する段階を含む被験者の増殖性疾患を治療するための方法を提供する。
【００１８】
ユビキチン化制御ドメインが使用される本発明の任意の方法において、ユビキチン化制御ドメインは、例えばヒトTSG101タンパク質などのTSG101タンパク質のユビキチン化制御ドメイン、またはその機能的断片であることが可能である。好ましい態様においては、ユビキチン化制御ドメインは、ヒトTSG101タンパク質のアミノ酸残基1位〜140位、例えば配列番号：1のアミノ酸残基1位〜140位を含む。別の好ましい態様においては、ユビキチン化制御ドメインは、ヒトTSG101タンパク質のアミノ酸残基50位〜140位、例えば配列番号：1のアミノ酸残基50位〜140位を含む。さらに別の好ましい態様においては、ユビキチン化制御ドメインは、ヒトTSG101タンパク質のアミノ酸残基140位〜250位、例えば配列番号：1のアミノ酸残基140位〜250位を含む。さらに別の態様においては、ユビキチン化制御ドメインは、ヒトTSG101タンパク質のアミノ酸残基10位〜140位、20位〜140位、30位〜140位、40位〜140位、1位〜160位、1位〜180位、1位〜200位、1位〜220位、50位〜250位または1位〜250位、例えば配列番号：1のアミノ酸残基10位〜140位、20位〜140位、30位〜140位、40位〜140位、1位〜160位、1位〜180位、1位〜200位、1位〜220位、50位〜250位ま
たは1位〜250位を含んでもよい。
【００１９】
発明の詳細な説明
本発明を記載される前に、本発明は記載された特定の態様に制限されることなく、当然変わってもよいものとして理解されるべきである。本発明の範囲は添付された特許請求範囲によってのみ制限されるものであり、本明細書において使用されている用語も特定の態様を記載する目的のためだけであり、および、制限的であることを意図していないことも理解されるべきである。
【００２０】
他に定義されなければ、本明細書において使用されている全ての技術および科学用語は、この発明が属する技術の当業者により共通に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書において記載されているものと類似のまたは均等の任意の方法および物質が本発明の実施または試験において使用されることが可能であるけれども、好ましい方法および物質がここに記載されている。本明細書において言及されている全ての刊行物は、刊行物が引用されているものと関連して、方法および／または物質を開示および記載するために参照として本明細書に組み入れられる。
【００２１】
本明細書および添付されている特許請求範囲において使用されているように、文脈が他に明確に書きとめていなければ、単数形の「a」、「an」および「the」は複数の対象を含むことは注意されなければならない。したがって、例えば「単一の細胞」への言及は、複数のそのような細胞を含み、および「そのポリヌクレオチド」への言及は、1つまたはそれ以上のポリヌクレオチドへの言及、当業者に既知のそれらの均等物などを含む。
【００２２】
本明細書において論じられる刊行物は、本出願の申請日に先だって、その開示のためだけに提供される。そのような刊行物に先行するため先行発明の効力によって本発明が権利化されないことを許可するものとして、解釈されるべきではない。さらに提供されている刊行物の日付は、実際の刊行日とは異なっているかもしれないので、自主的に確認される必要があるかもしれない。
【００２３】
定義
「ポリヌクレオチド」および「核酸分子」の用語は、任意の長さの多量体型核酸に言及するために本明細書において交換可能に使用されている。ポリヌクレオチドはデオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチドおよび／またはそれらの類似体を含んでもよい。ヌクレオチドは、既知または未知の、任意の三次元構造をとってもよく、および任意の機能を発揮してもよい。「ポリヌクレオチド」の用語は、一本鎖、二本鎖および三重らせん分子を含む。「オリゴヌクレオチド」は一般的には約5ヌクレオチドから約100ヌクレオチドの間の一本鎖または二本鎖DNAのポリヌクレオチドを言及している。しかしながら、本開示の目的には、オリゴヌクレオチドの長さに上限は存在しない。オリゴヌクレオチドはまたオリゴマーまたはオリゴとしても知られており、および、遺伝子から単離されても良く、または当技術分野において既知の方法により化学的に合成されてもよい。
【００２４】
以下はポリヌクレオチドの非制限の態様である：遺伝子または遺伝子断片、エクソン、イントロン、mRNA、tRNA、rRNA、リボザイム、cDNA、組換えポリヌクレオチド、分岐型ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離されたDNA、任意の配列の単離されたRNA、核酸プローブ、およびプライマー。核酸分子はまたメチル化核酸分子および核酸分子類似体などの修飾核酸分子を含んでもよい。プリンおよびピリミジンの類似体は当技術分野において既知である。核酸は天然に生じる、例えばDNAまたはRNAであってもよく、または当技術分野において既知であるように合成類似体であってもよい。そのような類似体は、アッセイ条件下での優れた安定性のために、プローブとしての使用が好ましいかもしれない。骨格鎖、糖、またはヘテロ環塩基内の変更を含む天然構造の修飾は、細胞内安定性および結合親和性を増加させることが示されてきた。ホスホロチオエート；非ブリッジング酸素が共に硫黄で置換されているホスホロジチオエート；アルキルホスホトリエステルおよびボラノホスフェイトは、骨格鎖化学の有用な変化の一つである。アキラルホスフェイト誘導体は3'-O-5'-S-ホスホロチオエート、3'-S-5'-O-ホスホロチオエート、3'-CH2-5'-O-ホスホナートおよび3'-NH-5'-O-ホスホロアミデートを含む。ペプチド核酸は全部のリボースホスホジエステル骨格鎖をペプチド結合で置換している。
【００２５】
糖修飾もまた安定性および親和性を増強するために使用される。天然のβ-アノマーに対して塩基が反転されている、デオキシリボースのα-アノマーが使用されてもよい。リボース糖の2'-OHが、親和性に妥協することなく分解に対する抵抗性を与えるために、2'-O-メチルまたは2'-O-アリル糖に変更されてもよい。
【００２６】
ヘテロ環塩基の修飾は適切な塩基対合を維持しなければならない。いくつかの有用な置換はデオキシチミジンに対するデオキシウリジン；デオキシシチジンに対する5-メチル-2'-デオキシシチジンおよび5-ブロモ-2'-デオキシシチジンを含む。5-プロピニル-2'-デオキシウリジンおよび5-プロピニル-2'-デオキシシチジンは、各々デオキシチミジンおよびデオキシシチジンと置換された時に、親和性および生物学的活性増加することを示している。
【００２７】
本明細書において交換可能に使用される「ポリペプチド」および「タンパク質」の用語はコードされているおよびコードされていないアミノ酸、化学的または生化学的に修飾された、または誘導されたアミノ酸、および修飾ペプチド骨格鎖を含むポリペプチドを含むことができる任意の長さの多量体型アミノ酸に、言及する。その用語は、非相同アミノ酸配列を有する融合タンパク質、非相同および相同リーダー配列との融合物、N末端メチオニン残基を有するまたは有さない；免疫学的にタグ付けされたタンパク質などを、制限することなく含む融合タンパク質を含む。
【００２８】
本明細書において使用されているように、「単離された」の用語は、抗体、組換え宿主細胞、単離されたポリペプチドなどの文脈において使用される時には、抗体、宿主細胞、ポリペプチドなどが天然に生じるものとは異なる環境に存在する抗体、宿主細胞、ポリペプチドなどを記載することを意図している。「単離された」は、関心対象の抗体、宿主細胞、またはポリペプチドなどに関して十分に濃縮された、および／または関心対象の抗体、宿主細胞、ポリペプチドなどが部分的にまたは十分に精製されているサンプル内に存在する抗体、宿主細胞、ポリペプチドなどを含むことを意図する。
【００２９】
本明細書において使用されているように、「十分に精製された」の用語は、その天然の環境から移され、およびそれが天然では関連している他の成分が少なくとも60％解放された、好ましくは75％解放された、および最も好ましくは90％解放された物質（例えば抗体または他のポリペプチド）に言及している。
【００３０】
抗体結合の文脈における「特異的に結合する」の用語は、特定のポリペプチド、すなわちユビキチン化制御ポリペプチドに対する抗体の高い結合活性および／高親和性結合に言及している。特定のユビキチン化制御ポリペプチド上のエピトープに対する抗体結合は、好ましくは、例えば、結合条件を適合させることにより、抗体がほとんど独占的に特定のユビキチン化制御ポリペプチドエピトープに結合する、および他の任意のエピトープには結合しない、およびそのエピトープを含まない他の任意のポリペプチドには結合しないように、異なるエピトープよりも特定のユビキチン化制御ポリペプチドエピトープにより強く結合するなど、任意の他のエピトープ、特に、関心対象の特定のポリペプチドと関連して、または同じサンプル中の分子に存在するかもしれないものに対する同じ抗体の結合よりもより強い。対象ポリペプチドに特異的に結合する抗体は弱いが検出可能なレベル（例えば、関心対象のポリペプチドに対して示された結合の10％またはそれ未満）で他のポリペプチドに結合する能力を有してもよい。そのような弱い結合、すなわちバックグラウンド結合は、例えば適切な対照を使用することにより、対象ポリペプチドに対する特異的な抗体結合から容易に識別される。一般的に本発明の抗体は特定のユビキチン化制御ポリペプチドに10−7Mまたはそれ以上の結合親和性を、好ましくは10−8Mまたはそれ以上の結合親和性を有する（例えば10−9M、10−10M、10−11Mなど）。一般的には10−6Mまたはそれ未満の結合親和性を有する抗体は、現在使用されている通常の方法を用いては検出可能なレベルでは抗原に結合しないだろう点で有用ではない。
【００３１】
「治療」の用語は、哺乳類、特にヒトにおける任意の疾患または病態の任意の治療を包含するため本明細書において使用されている、および、a）疾患の素因を有すかもしれないがそれを有するとはまだ診断されていない被験者において疾患、病態、または疾患または病態の症候群が生じるのを防ぐ段階；b）疾患、病態、または疾患または病態の症候群を阻害する、例えばその進行を阻止する、および／またはその開始または発現を遅延させる段階、；c）および／または疾患、病態、または疾患または病態の症候群を回復する、例えば病態または疾患および／または症候群の緩快を引き起こす段階を含む。
【００３２】
「被験者」または「個人」または「患者」は、診断または治療が所望される任意の哺乳類被験体、特にヒトを意味する。他の被験体はウシ、イヌ、ネコ、モルモット、ウサギ、ラット、マウス、ウシなどを含んでもよい。
【００３３】
単純化の理由のために、この開示はしばしば遺伝子またはタンパク質にその一般名により言及する。そのような症例においては、その開示は遺伝子またはタンパク質の任意の哺乳類の類似体に同等に適用可能であることが理解されるであろう。この開示はまたしばしば遺伝子またはタンパク質に特定の種に関してその名により言及する。そのような症例においては、特に示されなければ、その開示は遺伝子またはタンパク質の任意の哺乳類の類似体に同等に適用可能であることが理解されるであろう。例えば、特に示されなければ、MDM2は任意の哺乳類類似体のMDM2タンパク質のを包含することが理解されるであろう。
【００３４】
概要
p53腫瘍抑制タンパク質およびMDM2腫瘍タンパク質は、細胞MDM2生産を増加調節し、p53活性を阻止し、およびp53崩壊を促進するフィードバック調節ループを形成する。Tsg101はその欠失がNIH3T3細胞の悪性形質転換、およびヌードマウスにおいて転移性腫瘍を生成する能力を生じる遺伝子として発見された。そのタンパク質産物は、ユビキチン結合酵素（E2）酵素の触媒領域の特徴を有するが、しかしユビキチン結合酵素活性に重大な活性部位システインを欠くドメインであるUbcを含む。ユビキチン化制御の不良は、神経変性疾患、自己免疫疾患、発育異常、代謝性疾患、およびガンを含む疾患と関係している（例えば参照41を参照されたい）。TSG101のアミノ残基140位〜250位は、NEDD4（発生的に制御されているユビキチンタンパク質リガーゼ）などの他のタンパク質に対する結合部位であると示唆されているプロリンリッチドメインを含む。NEDD4は、ユビキチン媒介性代謝回転に関して血中ナトリウム濃度の主要な制御因子である上皮性ナトリウムチャネル（ENaC）を標的とする（Staubら、EMBO.J.1996、15：2371〜2380を参照されたい）。ここでは本発明者らは、ユビキチン化制御ドメイン、例えばTSG101のUbcドメインが細胞におけるユビキチン化を制御することを報告する。そのような制御は、例えば、ユビキチン媒介性タンパク質分解、翻訳、DNA修復、因子およびキナーゼの転写活性化およびトランスロケーションなどにおいて役割を果たすかもしれない（例えば、参照40、41を参照されたい）。例えば、本発明者らは、タンパク質崩壊に影響することにより、両方のタンパク質および、またp53の細胞レベルを調節する別個の自己制御ループにおいてTSG101はMDM2に関係することを示している。本発明者らは、TSG101のUbcドメインまたはその機能的断片（例えば生物学的に活性のある断片など）がMDM2のユビキチン化に干渉すること、TSG101がMDM2崩壊を阻害し、その定常状態レベルを上昇させること、およびこれらの事象はp53タンパク質の下方制御に関連していることを示す。逆に、野生型および変異体繊維芽細胞におけるパルスチェイスおよびウエスタンブロット実験は野生型p53の過剰発現による、内在性MDM2遺伝子の増幅による、またはMDM2発現構築物のトランスフェクションによるMDM2上昇は、本発明者らが26Sプロテアソーム依存性崩壊により引き起こされることを示す、TSG101の消失を促進する。本発明者らの結果は、TSG101をMDM2/p53回路の制御因子および標的の両方として同定する。
【００３５】
本発明の特定の局面はここでより詳細に記載されるであろう。
【００３６】
ポリペプチド組成物
いくつかの態様においては、本発明はユビキチン化制御ドメインを含む単離されたポリペプチドを提供する。対象ポリペプチドは以下により詳細に記載されるようにユビキチン化制御ドメインに対する抗体を生成するために免疫原として有用である。対象ポリペプチド（「ユビキチン化制御ポリペプチド」と称する）もまた、細胞内のMDM2ポリペプチドのユビキチン化を減少させ、それにより細胞内のMDM2ポリペプチドレベルを増加させるために有用である。例えば、対象ユビキチン化制御ポリペプチド（融合タンパク質であってもよい）をコードする対象ポリヌクレオチド（以下により詳細に記載される）を含む対象発現ベクターが、対象ポリペプチドが生産される宿主細胞内に導入される。対象ポリペプチドは細胞内の1つまたはそれ以上のタンパク質のユビキチン化を制御する。
【００３７】
本明細書において使用されるように、ユビキチン化制御ドメインは、例えばユビキチン結合酵素（E2酵素）の制御を介し、ユビキチン化を制御するポリペプチドに言及する。これらの態様のいくつかにおいては、ユビキチン化制御ドメインはTSG101のユビキチン化制御ドメイン、例えばヒトTSG101のユビキチン化結合酵素様Ubcドメインのアミノ酸配列を有する。いくつかの態様においては、ユビキチン化制御ドメインはTSG101、例えばヒトTSG101（配列番号：1；ジェンバンクアクセション番号U82130.1/GI：1772663）のユビキチン化制御ドメインの機能的断片のアミノ酸配列を有する。
【００３８】
本明細書において使用されているように、ユビキチン化結合酵素様Ubcドメインの機能的断片はユビキチン化を制御するUbcドメインの任意の断片に言及する。そのような活性を有する任意の断片は、例えば本出願に記載されているような方法により、容易に決定される。ある一つの態様においては、ユビキチン化制御ドメインはヒトTSG101タンパク質のアミノ酸残基1位〜140位、例えば配列番号：1のアミノ酸残基1位〜140位を含む。別の態様においては、ユビキチン化制御ドメインは、ヒトTSG101タンパク質のアミノ酸残基50位〜140位、例えば配列番号：1のアミノ酸残基50位〜140位を含む。さらに別の態様においては、ユビキチン化制御ドメインは、ヒトTSG101タンパク質のアミノ酸残基140位〜250位、例えば配列番号：1のアミノ酸残基140位〜250位を含む。さらに別の態様においては、ユビキチン化制御ドメインは、ヒトTSG101タンパク質のアミノ酸残基10位〜140位、20位〜140位、30位〜140位、40位〜140位、1位〜160位、1位〜180位、1位〜200位、1位〜220位、50位〜250位または1位〜250位、例えば配列番号：1のアミノ酸残基10位〜140位、20位〜140位、30位〜140位、40位〜140位、1位〜160位、1位〜180位、1位〜200位、1位〜220位、50位〜250位または1位〜250位を含んでもよい。TSG101のヌクレオチドおよびアミノ酸配列は米国特許第5,891,668号にもまた開示されている。実施例においてTSG101Bと名づけられた構築物は、概してTSG101のUbcドメインである挿入物を含み、およびユビキチン化制御ドメインの一例である。またはユビキチン化制御ドメインは、ユビキチン結合酵素の機能に重大である活性部位システインを欠くように変更されたユビキチン結合酵素由来のUbcドメインであってもよい。
【００３９】
対象ユビキチン化制御ポリペプチドは、例えば対象ユビキチン化制御ポリペプチドがインフレームで非相同ポリペプチド（例えばTSG101ポリペプチド以外のポリペプチド）に融合されている融合タンパク質として提供されることが可能である。対象ユビキチン化制御ポリペプチドは、インフレームで非相同ポリペプチド（「融合相手」）のカルボキシ末端またはアミノ末端に融合され、または融合相手の内部部位にインフレームで融合されてもよい。融合相手は、特定の機能、例えば、融合タンパク質の特定の細胞分画への局在；融合タンパク質の安定化；融合タンパク質の別のタンパク質、核酸、タンパク質上の炭水化物残基などへの結合；酵素活性；などのために提供されるものであることが可能である。
【００４０】
融合相手ポリペプチドは天然または非天然（例えば天然には見出されないアミノ酸配列を有する）ポリペプチド；動物、植物、真性細菌、古細菌、菌類、原虫またはウイルス由来のポリペプチドであることが可能である。融合相手ポリペプチドは、任意の既知の天然に生じる、または非天然に生じるポリペプチドであることが可能である。断片または挿入物は、制限することなく、機能的ドメイン、例えば酵素触媒ドメイン、転写因子のDNA結合ドメイン、受容体のリガンド結合ドメインなど；構造ドメイン；タンパク質機能を阻害する断片；などを含む。
【００４１】
対象融合タンパク質は、融合相手ポリペプチドおよびユビキチン化制御ポリペプチドに加えて、免疫学的タグを含んでもよい。免疫学的タグは、もし存在するならば、アミノ末端、カルボキシ末端に存在する、または融合相手ポリペプチドおよび金属イオン親和性ペプチドの間に配置される。免疫学的タグは当技術分野において既知であり、および、典型的には、そのエピトープに特異的な抗体により認識されるエピトープを含む約6から約50アミノ酸の間の配列である。そのようなタグの非制限的な例はヘマグルチニン（HA；例えば、CYPYDVPDYA）、FLAG（例えば、DYKDDDDK）、c−myc（例えばCEQKLISEEDL）などである。
【００４２】
対象ポリペプチドの生産
対象ポリペプチドは合成的に生産されることが可能であり、また、遺伝子組換え的に生産されることが可能であり、すなわちユビキチン化制御ドメインを含むポリペプチドをコードするコード領域を含むポリヌクレオチドが発現ベクターに組み込まれることが可能であり、およびユビキチン化制御ドメインコード領域が転写および翻訳されることが可能である。
【００４３】
ユビキチン化制御ドメイン含有ポリペプチドは任意の既知の方法を用いて合成的に生産されることが可能である。そのような技術が当業者に既知である、固相ペプチド合成技術を活用してもよい、Jones、「The  Chemical  Synthesis  of  Peptides」（クラレンドン（Clarendon）出版、オックスフォード）（1994）を参照されたい。一般的にそのような方法においては、ペプチドは、固相結合された成長ペプチド鎖に活性化単量体単位を連続的に付加することを通じて生産される。
【００４４】
発現に関しては、発現カセットが活用されてもよい。発現ベクターは、転写開始領域の転写調節下にコード領域が操作可能に連結された、誘導可能または構成的であることができる、転写および翻訳開始領域および転写および翻訳終結領域を提供するであろう。これらの調節領域は対象遺伝子に天然のものであってもよく、または外来性起源に由来してもよい。
【００４５】
発現ベクターは一般的には、非相同タンパク質をコードする核酸配列の挿入に対応するためにプロモーター配列の近くに位置する便利な制限部位を有する。発現宿主内で機能する選択マーカーが存在してもよい。発現ベクターは、外来性融合ペプチドが付加的な機能性、すなわちタンパク質合成、安定性、規定された抗血清に対する反応性の増加、酵素マーカー、例えばβガラクトシダーゼなどを提供する、融合タンパク質の生産のために使用されてもよい。
【００４６】
発現カセットは、転写開始領域、ユビキチン化制御ドメインを含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、および転写終結領域を含むように調製されてもよい。DNAの導入後、構築物を含む細胞が選択可能マーカーにより選択され、細胞が拡大され、およびその後発現のために使用されてもよい。
【００４７】
ポリペプチドは、発現の目的に依存して、通常の方法にしたがって、原核生物または真核生物において発現されてよい。タンパク質の大規模生産のためには、大腸菌、枯草菌、出芽酵母などの単細胞生物、バキュロウイルスベクターと組み合わせて昆虫細胞、または脊椎動物、特に哺乳類などの高等生物の細胞、例えばCOS7細胞が発現宿主細胞として使用されてもよい。いくつかの状況においては、タンパク質が天然のフォールディングおよび翻訳後修飾から利益を得るであろう、真核細胞中で遺伝子を発現することが望ましい。小ペプチドは実験室において合成されることも可能である。完全なアミノ酸配列のサブセットであるポリペプチドは、機能に重要なタンパク質部分を同定および調査するために、またはこれらの領域に対する抗体を免疫するために使用されてもよい。
【００４８】
発現宿主を活用することにより、タンパク質またはその断片を大量に入手であるため、タンパク質は通常の方法にしたがって単離および精製されてもよい。溶解物は、発現宿主から調製されてもよく、およびHPLC、排除クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、親和性クロマトグラフィー、または他の精製技術を用いて精製されてもよい。
【００４９】
ポリヌクレオチドおよび宿主細胞
本発明はさらに、そのようなポリヌクレオチドを含む遺伝子組換えベクター（「構築物」）、ならびにユビキチン化制御ドメインを含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、特に単離されたポリヌクレオチドを提供する。遺伝子組換えベクターは対象ポリヌクレオチドの増殖のために有用である（クローン化ベクター）。対象ポリペプチドが細胞の中で生産されるように、細胞の中で対象ポリヌクレオチドの発現を実行するためにも有用である（発現ベクター）。いくつかのベクターは、クローン化および発現機能の両方を達成する。適切なベクターの選択は十分当技術の技能範囲内である。多くのそのようなベクターは商業的に入手可能である。ベクターは制限することなく、プラスミド；コスミド；ウイルスベクター；人工染色体（YAC、BACなど）；ミニ染色体；などを含む。ベクターは、例えば「Short  Protocols  in  Molecular  Biology」、（1999）F．Ausubelら編、Wiley  ＆  Sonsを含む、当業者によく知られている多数の刊行物において十分に記載されている。
【００５０】
対象ポリヌクレオチドは、例えばTSG101タンパク質のアミノ酸残基1位〜140位、50位〜140位、140位〜250位、10位〜140位、20位〜140位、30位〜140位、40位〜140位、1位〜160位、1位〜180位、1位〜200位、1位〜220位、50位〜250位または1位〜250位、例えば配列番号1において開示されたアミノ酸配列を有するタンパク質のアミノ酸残基1位〜140位、50位〜140位、140位〜250位、10位〜140位、20位〜140位、30位〜140位、40位〜140位、1位〜160位、1位〜180位、1位〜200位、1位〜220位、50位〜250位または1位〜250位などのユビキチン化制御ドメインを含むポリペプチドなど、対象ユビキチン化制御ドメインをコードする。いくつかの態様においては、対象ポリヌクレオチドは対象融合タンパク質をコードする。
【００５１】
本発明の核酸組成物は対象タンパク質の全てまたは一部をコードしてもよい。二本鎖または一本鎖断片は通常の方法にしたがって、オリゴヌクレオチドを化学合成すること、制限酵素消化、PCR増幅などによりDNA配列から取得できる。
【００５２】
構築物は、リン酸カルシウム沈殿法、エレクトロポレーション法、リポフェクション法、感染法（ベクターがウイルスベクターであるとき）などを含む標準的方法を用いて宿主細胞内に導入されてもよい。
【００５３】
発明はさらに対象遺伝子組換えベクターを含む宿主細胞を提供する。本発明はさらに、本発明のポリヌクレオチドを含む、単離された宿主細胞であってもよい、宿主細胞を提供する。大腸菌、枯草菌などの原核生物、バキュロウイルスベクターと組み合わせて昆虫細胞、出芽酵母などの酵母細胞、または両生類（例えばアフリカツメガエル卵細胞）および哺乳類を含む脊椎動物などの高等生物の細胞、特に哺乳類、例えばCOS細胞、CHO細胞、293細胞、3T3細胞などを含む真核生物を含む適切な宿主細胞が発現宿主細胞として使用されてもよい。宿主細胞は対象ポリヌクレオチドの増殖の目的のために、対象ポリペプチドの生産のために、または対象mRNAおよび／またはタンパク質および／または細胞内の活性のレベルを調節する作用物質を同定するための細胞系の方法において使用されることが可能である。
【００５４】
ユビキチン化制御ドメインに対する抗体
本発明のユビキチン化制御ドメインは免疫特異的にそのような免疫原に結合する抗体を生産するための免疫原として使用することができる。そのような抗体は制限されることなく、ポリクロナール、モノクロナール、キメラ、単鎖、Fab断片およびFab発現ライブラリーを含む。そのような抗体は、ユビキチン化制御ドメインと細胞内の他のタンパク質、例えばMDM2タンパク質および／またはp53タンパク質、の間の相互作用を調節するために有用である。多くの態様において、本発明の抗体は単離されている。
【００５５】
特定の態様においては、ヒトTSG101タンパク質のユビキチン化制御ドメインまたはその機能的断片を含むユビキチン化制御ドメインに対する抗体が生産される。別の態様においては、ヒトTSG101タンパク質のアミノ残基1位〜140位、例えば配列番号1のアミノ酸残基1位〜140位を含むポリペプチドに対する抗体が生産される。さらに別の態様においては、ヒトTSG101タンパク質のアミノ残基140位〜250位、例えば配列番号1のアミノ酸残基140位〜250位を含むポリペプチドに対する抗体が生産される。さらに別の態様においては、ヒトTSG101タンパク質のアミノ残基50位〜140位、例えば配列番号1のアミノ酸残基50位〜140位を含むポリペプチドに対する抗体が生産される。
【００５６】
当技術分野において既知である様々な処理は、ユビキチン化制御ドメインに対するポリクロナール抗体を生産するために使用されてもよい。特定の態様においては、例えばヒトTSG101タンパク質のユビキチン化制御ドメイン、またはその機能的断片である、ユビキチン化制御ドメインに対するウサギポリクロナール抗体が取得されることが可能である。抗体の生産のためには、ウサギ、マウス、ラットなどを含むがこれらに限定されない様々な宿主動物が、天然のユビキチン化制御ドメインまたは合成バーションあるいはその誘導体（例えば断片）を注射することにより免疫されることが可能である。宿主種に依存して、および制限することなくフロイント（完全および不完全）、水酸化アルミニウムなどのミネラルゲル、リゾレシチンなどの界面活性物質、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油乳濁液、キーホールリンペットヘモシアニン、ジニトロフェノールおよび、BCG（カルメット-ゲラン杆菌）およびコリネバクテリウム-パルヴムなどの潜在的に有用なヒトアジュバントを含む様々なアジュバントが免疫学的応答を増加させるために使用することができる。
【００５７】
ユビキチン化制御ドメインまたはその断片に対するモノクロナール抗体の調製のためには、培養中の連続した細胞株により抗体分子を生産するための任意の技術が使用されてもよい。例えば、トリオーマ技術、ヒトB細胞ハイブリドーマ技術（Kozborら、1983、Immunology  Today  4：72）およびヒトモノクロナール抗体を生産するためのEBVハイブリドーマ技術（Coleら、1985、「Monoclonal  Antibody  and  Cancer  Therapy」、Alan  R．Liss社、pp77〜96）ならびに元々はKohlerおよびMilstein（1975、Nature  256：495〜497）により開発されたハイブリドーマ技術。本発明の付加の態様においては、モノクロナール抗体は最近の技術を用いて無菌動物において生産されることが可能である（例えば、PCT/US90/02545を参照されたい）。本発明にしたがえば、ヒト抗体が使用されることができ、ヒト抗体はヒトハイブリドーマを用いることにより（Coleら、1983、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.  80：2026〜2030）またはヒトB細胞をEBVウイルスを用いてインビトロで形質転換することにより（Coleら、1985、「Monoclonal Antibodies and Career Therapy」、Alan  R．Liss社、pp77〜96）取得されることが可能である。実際本発明にしたがえば、ヒトユビキチン化制御ドメインに特異的なマウス抗体分子由来の遺伝子を、適切な生物学的活性を有するヒト抗体分子由来の遺伝子とともにスプライシングすることにより「キメラ抗体」を生産するために開発された技術（Morrisonら、1984、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.  6851〜6855；Neubergerら、1984、Nature  312：604〜608；Takedaら、1985、Nature  314：452〜454）が使用されることが可能である。そのような抗体は本発明の範囲内である。
【００５８】
本発明にしたがえば、単鎖抗体の生産のために記載されている技術（米国特許第4,946,778号）がユビキチン化制御ドメイン特異的単鎖抗体を生産するために適合されることが可能である。本発明の付加的な態様は、ユビキチン化制御ドメインに対する所望の特異性を有するモノクロナールFab断片を迅速および容易に同定することを可能にするためFab発現ライブラリー構築に関して記載された技術（Huseら、1989、Science  246：1275〜1281）を利用する。
【００５９】
分子のイディオタイプを含む抗体断片は既知の技術により作製されることが可能である。例えば、そのような断片は、抗体分子のペプシン消化により生産可能なF（ab'）2断片；F（ab'）2断片のジスルフィド結合を還元することにより作製可能であるFab'断片；抗体分子をパパインおよび還元剤で処理することにより作製可能であるFab断片、およびFv断片を含むが、これらに限定されるものではない。
【００６０】
抗体の生産においては、所望の抗体のスクリーニングは当技術分野において既知の技術（例えば酵素結合抗体免疫アッセイすなわちELSIA）を用いて達成されうる。例えばユビキチン化制御ドメインの特定のドメインを認識する抗体を選択するために、そのようなドメインを含むユビキチン化制御ドメインに結合する産物に関して、作製されたハイブリドーマをアッセイしてもよい。
【００６１】
ユビキチン化制御ドメインのエピトープに特異的な抗体もまた提供される。
【００６２】
前記の抗体は、本発明のユビキチン化制御ドメインの活性に関連する当技術分野において既知の方法において使用することができ、例えば、これらのタンパク質が相互作用する相手を決定するために、診断法において適切な生理学的サンプルにおいてそのレベルを測定することなどがある。
【００６３】
組成物
本発明はさらに、本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチド、作用物質、遺伝子組換えベクターおよび宿主細胞を含む薬学的組成物を含む組成物を提供する。これらの組成物は、ポリペプチド、作用物質、ポリヌクレオチド、遺伝子組換えベクターまたは宿主細胞の所望の用途にしたがって選択される緩衝液を含んでもよく、および意図された用途に対して適切な他の物質もまた含んでよい。当業者は、意図された用途に対して適切な、多様なものが当技術分野において既知である、適切な緩衝液を容易に選択することが可能である。いくつかの例においては、多様なものが当技術分野において既知である、および本明細書において詳細に議論される必要がない、薬学的に許容される賦形剤を含むことができる。薬学的に許容される賦形剤は、例えば、A．Gennaro（1995）「Remington：The  Science  and Practice  of  Pharmacy」19版、Lippincott、Williams＆Wilkinsを含む様々な刊行物において十分に記載されている。
【００６４】
本発明は、細胞内におけるTSG101のMDM2との相互作用を調節する作用物質、例えば抗体および低分子、および特にTSG101のユビキチン化ドメインのMDM2ポリペプチドへの結合を調節する作用物質を同定するためのスクリーニング法を提供する。一般的には、アッセイはインビトロアッセイである。いくつかの態様においては、アッセイは無細胞アッセイであり、および本発明のMDM2ポリペプチドおよびTSG101ポリペプチドまたはユビキチン化制御ポリペプチドを利用する。
【００６５】
本明細書において使用されているように「調節する」の用語は「増加させる」および「減少させる」を包含する。いくつかの態様においては、細胞においてTSG101/MDM2相互作用を減少させる作用物質が興味深い。そのような作用物質は、細胞分裂を促進し、アポトーシスを減少させ、または成長停止を減少させるための候補として関心対象となりうる。
【００６６】
「作用物質」、「物質」および「化合物」は本明細書において交換可能に使用される。候補作用物質は、合成、半合成または天然に生じる無機または有機分子であってもよい無数の化学薬品クラスを包含する。候補作用物質は50ダルトン以上および約2500ダルトン未満の分子量を有する低分子有機化合物であってもよい。候補作用物質はタンパク質との構造的相互作用に必須の官能基、特に水素結合を含んでもよく、および典型的には少なくともアミン、カルボニル、水酸基またはカルボキシル基を含む、および少なくとも2個の官能化学基を含んでもよい。候補作用物質は、1つまたはそれ以上の上記官能基により置換された、周期的炭素またはヘテロ環構造および／または芳香環またはポリ芳香環構造を含んでもよい。候補作用物質はまた、ペプチド、糖質、脂肪酸、ステロイド、プリン、ピリミジン、誘導体、構造類似体またはそれらの組み合わせを含む生体分子のなかにも見出される。
【００６７】
候補作用物質は合成または天然化合物のライブラリーを含む広範な起源から取得される。例えば、様々な有機化合物および、ランダム化オリゴヌクレオチドおよびオリゴペプチドの発現を含む生体分子のランダムおよび指向型合成に関して無数の方法が利用可能である。または、細菌、真菌、植物および動物抽出物の形態中の天然化合物のライブラリーが利用可能であるまたは容易に生産される。または天然または合成的に生産されたライブラリーおよび化合物は通常の化学的、物理的および生化学的方法を通じて容易に修飾され、およびコンビナトリアルライブラリーを生産するために使用されてもよい。構造類似体を生産するために、既知の薬物は、アシル化、アルキル化、エステル化、アミド化などの指向型またはランダム化学修飾に供されてもよい。
【００６８】
スクリーニングアッセイ法が結合アッセイ法である場合は、1つまたはそれ以上の分子が標識に連結されてもよく、そこでは標識は直接的または間接的に検出可能なシグナルを提供することが可能である。様々な標識は放射性同位元素、蛍光剤、化学発光剤、酵素、特異的結合分子、粒子、例えば磁性粒子などを含む。特異的結合分子はビオチンおよびストレプトアビジン、ジゴキシンおよび抗ジゴキシンなどを含む。特異的結合メンバーに関しては、相補的メンバーは通常は、既知の処理にしたがって、検出のための分子を用いて標識されるであろう。
【００６９】
様々な他の試薬はスクリーニングアッセイ法に含まれてもよい。これらは最適なタンパク質-タンパク質結合を促進する、および／または非特異的またはバックグラウンド相互作用を減少させるために使用される、塩、中性タンパク質、例えばアルブミン、洗浄剤などのような試薬を含む。プロテアーゼ阻害剤、ヌクレアーゼ阻害剤、殺菌剤などのアッセイの効率を改善する試薬が使用されてもよい。成分の混合物は、必要な結合のための任意の順で添加される。インキュベーションは任意の適切な温度、典型的には4℃から40℃の間で実施される。インキュベーション時間は最適な活性のために選択されるが、しかしまた迅速な高処理スクリーニングを促進するために最適化されてもよい。典型的には0.1時間から1時間で十分であろう。
【００７０】
本発明はまたユビキチン化制御ドメインと相互作用する細胞タンパク質を同定するための方法を提供する。酵母ツーハイブリッドアッセイ法（例えばFieldsおよびSong、1989、Nature  340：245〜246および米国特許第5,283,173号を参照されたい）、免疫沈降法、ウエスタンブロット法（以下の実施例の節を参照されたい）を含むが、これらに限定されるものではなく、当技術分野において既知の任意の方法は、この目的のために使用されることが可能である。
【００７１】
対象アッセイ法において効果を有する作用物質はさらなる研究のために選択される、および細胞有用性、細胞毒性、生物学的適合性などに関して評価される。
【００７２】
無細胞インビトロアッセイ
いくつかの態様においては、スクリーニング法は無細胞インビトロスクリーニング法である。これらの方法は一般的にはTSG101タンパク質または対象ユビキチン化制御ポリペプチド、およびMDM2ポリペプチドを試験作用物質と接触させること；および存在するならば、MDM2ポリペプチドに対する、TSG101タンパク質またはユビキチン化制御ポリペプチドの結合に対する効果を決定する段階を含む。試験作用物質非存在の対照と比較して、2個のタンパク質間の結合の減少は、作用物質が結合を減少させる指標である。
【００７３】
ユビキチン化制御ポリペプチドがMDM2ポリペプチドに結合するかどうかは、例えばタンパク質2個のうち1個に特異的である抗体が使用される、免疫学的アッセイを用いて決定されることが可能である。酵素結合抗体免疫アッセイ法、免疫沈降法、ウエスタンブロット法などを制限されることなく含む様々な免疫学的アッセイ法が使用されることが可能である。必要であれば、タンパク質の1つ（例えばユビキチン化制御ポリペプチド）が上記のように免疫学的「タグ」とともに提供されることが可能で、かつタグに特異的な抗体が免疫学的アッセイ法において使用されることが可能である。または、ユビキチン化制御ポリペプチドはヒスチジンタグ（例えば、（His）6など）にインフレームで融合させることが可能であり、および金属イオンへの結合がユビキチン化制御ポリペプチド／MDM2結合形成を検出するために使用されることが可能である。さらにずっと、2個のタンパク質の1個、例えばユビキチン化制御ポリペプチド、が、例えばビオチンなどの特異的結合対の部分を用いて標識されることが可能である、およびユビキチン化制御ポリペプチドのMDM2タンパク質への結合は上述のように特異的結合対の相補的メンバーを用いて検出されることが可能である。
【００７４】
細胞系のインビトロアッセイ法
本発明はさらに、ユビキチン化制御ドメインのMDM2タンパク質への結合を調節する作用物質を同定するための細胞系のインビトロスクリーニング法を提供する。その方法は一般的には、MDM2および、TSG101タンパク質のユビキチン化制御ドメインまたはその機能的断片を含むポリペプチドを発現する細胞を試験作用物質に接触させる段階；およびMDM2タンパク質に対するユビキチン化制御ドメインの結合に対する作用物質の影響があれば、それを決定する段階を含む。
【００７５】
ある特定の態様においては、その方法は（a）MDM2ポリペプチドおよびTSG101タンパク質のユビキチン化制御ドメイン、またはその機能的断片を含むポリペプチドを発現する細胞を試験作用物質に接触させる段階；および（b）適切な対照と比較して、細胞におけるMDM2ポリペプチドのレベルに対する試験作用物質の影響があるならば、それを決定する段階を含む。適切な対照は、試験作用物質非存在下での、MDM2ポリペプチドおよびTSG101タンパク質のユビキチン化制御ドメイン、またはその機能的断片を含むポリペプチドを生産する細胞である。試験作用物質非存在下では、MDM2ポリペプチドのレベルは相対的に高いことが期待される。MDM2のユビキチン化制御ドメインに対する結合を減少させる試験作用物質存在下では、MDM2のレベルは、試験作用物質非存在下での細胞におけるよりも低いことが期待される。
【００７６】
MDM2およびTSG101タンパク質のユビキチン化制御ドメイン、またはその機能的断片を含むポリペプチドを生産する細胞は本明細書に記載される。
【００７７】
インビボスクリーニング法
スクリーニングは様々なレベルのTSG101を発現する生物に関しても実施されてもよい。この点に関して、記載されているように（38）TSG101ヘテロ接合体およびホモ接合体ノックアウトマウスが使用されてもよい。
【００７８】
作用物質
本発明はさらに、本発明のスクリーニングアッセイ法を用いて同定される作用物質および薬学的組成物を含む、作用物質を含む組成物を提供する。作用物質はユビキチン化制御ドメインおよびMDM2の結合を調節するために有用である。
【００７９】
対象組成物は周知の試薬および方法を用いて調剤されることが可能である。いくつかの態様においては、組成物は薬学的に許容される賦形剤を用いた調剤において提供される。広範囲の薬学的に許容される賦形剤は当技術分野において既知であり、および本明細書において詳細に議論される必要はない。薬学的に許容される賦形剤は、例えば、A．Gennaro（2000）「Remington: The Science and Practice of Pharmacy」20版、Lippincott、Williams＆Wilkins；「Pharmaceutical  Dosage  Forms  and  Drug  Delivery  System」（1999）H．C．Anselら編、第7版、Lippincott、Williams＆Wilkins；および「Handbook  of  Pharmaceutiacl  Excipients」（2000）A．H．Kibbeら編、第3版、Amer．Pharmaceutical．Assoc．）を含む様々な刊行物において十分に記載されている。
【００８０】
賦形剤、補助剤、担体または希釈剤などの薬学的に許容される賦形剤は社会一般に容易に利用可能である。さらに、pH適合および緩衝剤、等張性適合剤、安定化剤、湿潤剤などの薬学的に許容される補助物質は容易に公衆が利用可能である。
【００８１】
方法
本発明は以下の方法を提供する；哺乳類細胞の増殖を調節する方法；哺乳類細胞におけるTSG101のMDM2への相互作用を調節する方法；細胞におけるMDM2の崩壊速度を調節する方法；細胞におけるp53ポリペプチドのレベルを調節する方法；細胞におけるポリペプチドのユビキチン化を調節する方法；および、細胞におけるTSG101のレベルを維持する方法。
【００８２】
本発明は細胞におけるMDM2またはp53のレベルを調節する方法も提供する。その方法は、細胞を、ユビキチン化制御ドメインを含むポリペプチドを含む、ポリペプチドまたはその誘導体に接触させる段階を含む。
【００８３】
本発明はまた細胞内のMDM2またはTSG101あるいはp53のレベルを調節する方法も提供する。本発明はTSG101タンパク質とMDM2の相互作用を調節する能力を有する作用物質に細胞を接触させる段階を含む。
【００８４】
本発明はさらに、TSG101またはMDM2あるいはp53のレベルの正常範囲からの逸脱の結果である疾患または任意の他の望ましくない病態の被験者を治療する方法を提供する。治療可能な被験者はヒトまたは非ヒト哺乳類を含む。
【００８５】
ある態様においては、被験者の細胞内におけるMDM2タンパク質のレベルの変化から生じる病態の被験者を治療する方法を提供する。その方法は、ユビキチン化制御ドメインを含む治療的に有効な量の作用物質を被験者に投与する段階を含む。
【００８６】
別の態様においては、被験者の細胞内におけるTSG101タンパク質のレベルの変化から生じる病態の被験者を治療する方法を提供する。治療的に有効な量のTSG101タンパク質とMDM2の相互作用を調節する作用物質を被験者に投与する段階を含む方法。
【００８７】
さらに別の態様においては、（a）p53のレベルに関して被験者をモニターする段階、および（b）p53のレベルを標的範囲内に維持するためにユビキチン化制御ドメインを含む作用物質を用いて被験者を治療する段階を含む被験者の増殖性疾患を治療するための方法を提供する。
【００８８】
本発明はまた増殖性疾患の被験者を治療するための方法も提供する。方法は、治療的に有効な量のTSG101とMDM2の間の相互作用を調節する能力を有する作用物質を被験者に投与する段階を含む。特定の態様においては、発明は、（a）TSG101のレベルに関して被験者をモニターする段階、および（b）TSG101のレベルを標的範囲内に維持するためにTSG101とMDM2の相互作用を調節する能力を有する作用物質を用いて被験者を治療する段階を含む被験者の増殖性疾患を治療するための方法を提供する。
【００８９】
ユビキチン化制御ドメインが使用される本発明の任意の方法において、ユビキチン化制御ドメインは、例えばヒトTSG101タンパク質などのTSG101タンパク質のユビキチン化制御ドメイン、またはその機能的断片であってもよい。好ましい態様においては、ユビキチン化制御ドメインは、ヒトTSG101タンパク質のアミノ酸残基1位〜140位、例えば配列番号：1のアミノ酸残基1位〜140位を含む。別の好ましい態様においては、ユビキチン化制御ドメインは、ヒトTSG101タンパク質のアミノ酸残基50位〜140位、例えば配列番号：1のアミノ酸残基50位〜140位を含む。さらに別の好ましい態様においては、ユビキチン化制御ドメインは、ヒトTSG101タンパク質のアミノ酸残基140位〜250位、例えば配列番号：1のアミノ酸残基140位〜250位を含む。さらに別の態様においては、ユビキチン化制御ドメインは、ヒトTSG101タンパク質のアミノ酸残基10位〜140位、20位〜140位、30位〜140位、40位〜140位、1位〜160位、1位〜180位、1位〜200位、1位〜220位、50位〜250位または1位〜250位、例えば配列番号：1のアミノ酸残基10位〜140位、20位〜140位、30位〜140位、40位〜140位、1位〜160位、1位〜180位、1位〜200位、1位〜220位、50位〜250位または1位〜250位を含んでもよい。
【００９０】
実施例
以下の実施例は、当業者に本発明の作製法および使用法の完全な開示および記述を提供するために開示され、かつ発明者がそれらの発明と見なしているものの範囲を制限するすることも、および以下の実験が実施される全てのまたは唯一の実験であることを表すことも意図しない。使用されている数（例えば量、温度など）に関して正確さを保証するために努力がなされたが、しかしいくつかの実験誤差および逸脱は説明されるべきである。特に記されない限り、割合は重さでの割合、分子量は重量平均分子量、温度はセ氏度、および圧力は大気圧または大気圧の近似である。
【００９１】
材料および方法
プラスミドおよびベクター構築。全長ヒトTSG101cDNAは、pLLEXP1ベクター（1）のサイトメガロウイルスプロモーターおよびポリアデニル化部位の間に挿入された。HAタグ付き（ヒトインフルエンザヘマグルチニンペプチド、YPYDVPDY）、Flagタグ付き、およびc−Mycタグ付きTSG101およびTSG101欠失変異体cDNAがPCRにより作製され、またpLLEXP1を用いてクローン化もされた。ヒト野生型p53（pC53−SN3）（25）、ヒト変異体p53（pC53−Cx21an3、アミノ酸175変異、アルギニンからヒスチジン）（26）、ヒトMDM2（pCHDM1B）（27）およびHM−UbおよびHM−K48R−Ub（28）を発現するベクターが記載されている。緑色蛍光タンパク質（GFP）を発現するためにpCMV−GFP（クロンテック）が使用された。
【００９２】
細胞培養およびトランスフェクション
Saos−2、U2OS、SJSA−1およびNIH3T3がアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ATCC） から取得された。細胞は、10％ウシ胎児血清入りのDMEM（Saos−2、NIH3T3、p53−/−MEFならびに、p53−/−およびMDM2−/−MEF；参照（29））またはRPMI（U2OSおよびSJSA−1）中で培養された。トランスフェクションは、リポフェクタミン（ライフテクノロジーズ）またはFuGENE（商標）6（ロッシュ）を用いて、メーカーにより記載されているように実施された。
【００９３】
免疫沈降およびウエスタンブロット解析
免疫沈降およびウエスタンブロット解析は記載されているように実施された（30）。細胞は氷上でNP−40溶解緩衝液を用いて溶解され、およびタンパク質抽出物は予洗されたピアスタンパク質A/Gアガロースビーズ（0.5mlタンパク質抽出物につき50μlの50％懸濁液）を用いて事前に除去された。事前に除去されたタンパク質抽出物は回転振動台上で4℃にて8時間〜一晩の間抗体と共にインキュトされ、その後さらに2時間予洗されたピアスタンパク質A/Gアガロースビーズ（0.5mlタンパク質抽出物につき10μl〜15μlの50％懸濁液）と共にインキュベートされた。免疫複合体はNP−40緩衝液を用いて4回洗浄され、SDSローディング緩衝液に溶解され、かつ10％−SDSポリアクリルアミドゲル（バイオラッド）上で分画された。タンパク質はその後ニトロピュア膜（MSI）に転写され、および特異的抗体および適切なホースラディッシュペルオキシダーゼ結合二次抗体を用いてインキュベートされた（サンタクルーズおよびプロメガ）。膜はリン酸緩衝食塩水中（PBS）で洗浄され、およびECL（サンタクルーズ）を用いて可視化された。ウエスタンブロットのオートラジオグラムはスキャンマスター3tm（ホーテック（Howtek））を用いてスキャンされ、およびクアンティティワンプログラム（Qunatity  One  Program）（pdi）を用いて解析された。免疫沈降法に使用された抗体はウサギ抗TSG101（1：200、クロンテック）、抗p53（Ab−1、1：400、カルビオケム）、抗MDM2（SMP−14、1：200、サンタクルーズバイオテクノロジー）および抗ヘマグルチニン（HA）（1：200、クロンテック）であった。ウエスタンブロットに使用された抗体はウサギ抗TSG101（1：200、クロンテック）、抗p53（DO−1、1：1000、サンタクルーズバイオテクノロジー）、抗ヘマグルチニン（HA）（1：500、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（HRP）標識、ロッシュ）および抗Flag（1：500、M2、コダック）、抗αチューブリン（1：20000、ネオマーク（Neomark））、抗ウサギIgG（1：5000、HRP標識、プロメガ）、および抗マウスIgG（1：10000、HRP標識、サンタクルーズバイオテクノロジー）であった。抗GFP抗体はクロンテックから取得され、および1：500希釈にて使用された。
【００９４】
MDM2のインビボユビキチン化
HM−UbまたはHM−K48R−Ubが、TSG101変異体タンパク質BまたはFを発現するベクターとともに、または挿入物を欠くまたはTSG101cDNAをアンチセンス方向に発現する対照とともに、共トランスフェクションによりSJSA−1細胞に導入された。24時間後、トランスフェクトされた細胞培養はMG132（2μl）を用いてさらに12時間処理され、6M塩酸グアニジンを用いて溶解され、および20秒間超音波処理された。Hisタグ付きタンパク質はNi−NTAスピンカラム（キアゲン）を用いて精製され、0.8ml洗浄緩衝液（8M  尿素、0.1M  NaH2PO4、0.01Mトリス塩酸、pH6.2）を用いて4回洗浄され、およびpH4の洗浄緩衝液を用いて1回および250mMイミダゾールを含むpH4洗浄緩衝液を用いてもう1回溶出された。精製タンパク質は上述のようにウエスタンブロッティングにより解析された。
【００９５】
パルスチェイス実験
NIH3T3、p53−／−MEFおよび、p53−／−/MDM2−／−MEF細胞（1x106）は100mmプレート上に24時間播種され、および［35S］メチオニンを用いて2時間パルス標識され、予め加温されたPBSを用いて2回洗浄され、10％ウシ胎児血清で補完されたDMEM中で培養することにより0時間、2時間、4時間、8時間、12時間チェイスされた。パルス標識された細胞由来の細胞溶解物は抗TSG101抗体を用いて（10μg/500μg総タンパク質）免疫沈降され、10％−SDSポリアクリルアミドゲル中の電気泳動により分離され、およびフォスフォイメージャー（Phosphoimager）（イメージクアント（ImageQuant）ストーム840（Storm840）、モリキュラーダイナミクス）を用いて解析された。
【００９６】
結果
TSG101とp53およびMDM2の物理的および機能的相互作用
腫瘍形成に関連していることが以前に示されているタンパク質とTSG101との間の物理的および機能的相互作用を同定することを目的としている調査の間に、本発明者らはTSG101がp53およびMDM2の両者に結合することが可能であることを発見した。これは、これらタンパク質の組み合わせを発現する構築物を共トランスフェクトされたSaos−2ヒト骨肉腫細胞の抽出物のウエスタンブロット結果を表す図1において示されている。ヒトTSG101、p53またはMDM2タンパク質を発現する構築物（各プラスミドに関して2μgのDNA）が、方法に示されているようにSaos−2細胞にトランスフェクトすることにより導入された。トランスフェクトされた細胞集団由来のタンパク質抽出物が、示された抗体により免疫沈降された。IP：免疫沈降、IB：免疫ブロット。（a）ウエスタンブロットにおける天然またはHA−タグ付きTSG101またはp53タンパク質は抗p53モノクロナール抗体（AB−1；1：1000；二次抗体はヤギ抗マウスHRP、1：1000希釈）または（b）HRP-標識された抗HA抗体（1：500希釈）により検出された。（c）および（d）抗MDM2抗体を用いて解析された、免疫沈降されたタンパク質のウエスタンブロット検出。
【００９７】
TSG101に対する抗体により細胞抽出物から免疫沈降された複合体は、タグなし、または検出のために使用されたインフルエンザBヘマグルチニン（HA）ペプチドエピトープに融合されたものとしてのp53タンパク質を含んでいた、および逆にp53に対する抗体を用いて免疫沈降された複合体中にはTSG101を同定した（図1aおよびb）。同様に、抗MDM2抗体を用いて検出される、および小型ユビキチン様タンパク質、SUMO−1（24）とのMDM2複合体を表す90kDバンドは、天然またはエピトープタグ付加されたTSG101に対する抗体を用いて免疫沈降されたSaos−2細胞タンパク質複合体中に存在した（図1cおよびd）。
【００９８】
MDM2はp53の分解ならびに自身の崩壊を媒介するユビキチンタンパク質リガーゼである（31、32）。TSG101がMDM2および/またはp53と相互作用する能力が、MDM2およびp53の定常状態レベルに機能的な結果を有することが図2において示されている：図2（a）：p53およびHA−TSG101を過剰発現する示された構築物はトランスフェクションによりSaos−2細胞に導入された、およびp53およびHA−TSG101レベルがウエスタンブロッティングにより48時間後に解析された。＋は25ngのトランスフェクトされたp53発現ベクターDNAまたは4μgのHA−TSG101発現ベクターDNAを示す、＋＋は8μgのHA−TSG101発現ベクターDNAを示す。細胞αチューブリンに対して相対的なp53バンドの密度は、露光されたフィルムをスキャンすることにより決定された。図2（b）：p53およびHA−TSG101を過剰発現する同一の構築物は、トランスフェクションによりp53−／−/MDM2−／−MEF細胞に導入された、およびp53およびHA−TSG101レベルがaのように解析された。
【００９９】
TSG101過剰発現はp53およびMDM2の両者の定常状態の細胞レベルに多様な効果を有する。図2aに見られるように、内在性MDM2タンパク質は合成するが天然p53は合成しない、Saos−2細胞におけるTSG101の過剰生産は、トランスフェクトされた構築物から発現されるp53のレベルを70％減少させた。p53およびMDM2の両者においてヌルの染色体変異を保持する、およびしたがってこれらのタンパク質のうちいずれを合成する能力も欠失する、同一にトランスフェクトされた細胞（すなわち、p53−／−/MDM2−／−マウス胎児繊維芽細胞（MEF）（29、33、34）；図2b）においては、本発明者らはTSG101のp53に対する効果を全く観察しなかった、これはp53レベルのTSG101媒介性減少はMDM2の存在を必要とすることを示唆する。
【０１００】
本発明者らが採用した実験条件下では、Saos−2細胞の50％未満の集団がTSG101発現構築物によりトランスフェクトされたけれども（データ非開示）、これは細胞集団全体の抽出物においてMDM2レベルを上昇させるのに十分であった（図2a）、これはTSG101がMDM2を上昇させることによりp53を下方調節するとの考えを支持している。この結論の直接的な証拠は、Saos−2細胞がp53、MDM2およびTSG101を発現する構築物を別個にまたは組み合わせてトランスフェクトされた実験により提供された。図2（c）：示されたタンパク質を過剰発現する構築物がトランスフェクションによりSaos−2細胞に導入された、およびp53およびMDM2レベルがaのように解析された。＋は25ngのトランスフェクトされたp53発現ベクターDNA、1μgのMDM2発現ベクターDNA、4μgのTSG101発現ベクターDNAを示す。共トランスフェクトされたCMVベースの発現ベクター由来のMDM2の過剰発現はp53タンパク質レベルの減少を結果として生じた（図2c、レーン1〜2）；共トランスフェクトされた細胞におけるTSG101の同時の過剰生産はMDM2タンパク質レベルのさらなる上昇と関連しており（図2c、レーン3およびレーン5）およびp53の顕著なさらなる減少と関連していた（レーン3）。
【０１０１】
TSG101のMDM2崩壊への影響
MDM2は通常は15分〜20分の短い半減期を有している（35）。図2（d）：Saos−2細胞はTSG101発現構築物の非存在または存在下で、MDM2発現構築物によりトランスフェクトされた。細胞タンパク質は指示された時間においてシクロヘキシミドを添加した後抽出された、および抗MDM2抗体を用いて（a）のようにウエスタンブロッティングにより解析された。トランスフェクション効率を標準化するためにGFP発現ベクターが共トランスフェクトされた。発現されたGFPタンパク質は抗GFP抗体を用いて検出された。図2（e）：5個の別々の実験を代表する（d）に示された実験に関するMDM2分解の図上表示。図2dおよびeに見られるように、TSG101はMDM2分解を阻害し、その半減期を延長する。この実験においては、CMVプロモーターからMDM2を発現する構築物を用いてトランスフェクトされた、またはMDM2およびTSG101の両者を発現する構築物とともに共トランスフェクトされた細胞が、タンパク質合成を止めるためにシクロヘキシミドを用いて処理された、およびMDM2タンパク質が指示された時間で採取されたサンプルのウエスタンブロット解析によりアッセイされた。以前の決定と矛盾がない、MDM2に関して観察された半減期（約15分）は、同時にTSG101を過剰発現する細胞においてはほぼ2倍になった（28分に）。
【０１０２】
TSG101のユビキチン結合酵素様UbcドメインはMDM2のユビキチン化を阻害する
TSG101のUbcドメインは結合酵素機能に必要とされるシステインを欠くので（12〜14）、TSG101はユビキチンまたはその標的タンパク質と非生産的な複合体を形成することによりユビキチン化を阻害する、および結果として真正なE2反応を干渉する可能性があると以前に推測されていた（12、13）。共トランスフェクト構築物から発現されるMDM2の定常状態レベルに対する変異体TSG101タンパク質の効果を示す、図3aにおいて見られる結果は、MDM2を安定化するTSG101の能力はUbcドメイン由来の配列の欠失によりはっきりと減少することを示す。またはそれらは、機能的E2酵素においてシステインを含む「活性部位」位置を囲む残基を含むTSG101のUbcドメインの「a」領域の過剰発現が、MDM2の蓄積を引き起こすのに十分であるということも示している（構築物A）。TSG101のUbcドメインの「b」領域の存在は「a」領域の効果を増強し、およびUbcaの非存在下でさえもMDM2のいくらかの安定化につながる（構築物B対AおよびE対F）。
【０１０３】
大部分はUbcドメインからなる（構築物TSB101B）またはこのドメインを欠く（構築物TSG101F）切断型TSG101タンパク質のさらなる解析は、TSG101のUbcドメインの過剰発現は内在性MDM2のユビキチン化を干渉することを示した（図3b）。左側のパネルで示されている実験においては、Hisタグ付きユビキチンに結合された細胞タンパク質はNi−NTAカラムクロマトグラフィーにより単離され、および抗MDM2抗体を用いたウエスタンブロッティングによりMDM2がこのタンパク質プールの中に同定された。TSG101およびそのUbcドメインが内在性のおよび外因性のMDM2の両方の細胞レベルを全体的に増加させる能力にもかかわらず（図2）、TSG101のUbcドメインを過剰発現する細胞は、対照に対して、ユビキチン化MDM2における減少を示した（図3b左パネル、レーン1およびレーン2）。TSG101のUbcドメインがMDM2のユビキチン化を減少させることが可能であることは、細胞タンパク質上から開始するユビキチン鎖が、ユビキチン鎖伸長を妨害するUb変異体（K48R）（28）を用いてタグ付けされた実験においてもまた証明された；これはタグ付きタンパク質を保護し、および内在性のMDM2に対するUb添加の程度がMDM2の免疫沈降により評価されることを可能にする（図3b右パネル）。
【０１０４】
図3（a）TSG101のc−Mycタグ付き全長および欠失変異体を発現する示された構築物（A〜F、8μg）、HAタグ付きMDM2を発現する構築物（1.5μg）、およびGFPを発現する構築物（2ng）がトランスフェクションによりU2OS細胞に導入された。HA−MDM2、c−Mycタグ付きTSG101（A〜F）およびGFPはトランスフェクション48時間後に、抗HA、抗c−Myc、および抗GFP抗体を用いたウエスタンブロッティングにより検出された。（b）示された構築物は、His6およびc−Mycの両方でタグ付けされたユビキチン（HM−Ub、5μg、左パネル）またはHis6およびc−Mycでタグ付けされたドミナントネガティブ変異体ユビキチン（HM−K48R−Ub、5μg、右パネル）を発現する。これらは、GFP発現構築物（2ng）、TSG101変異体BまたはFを発現する構築物（各4μg）、アンチセンスTSG101を発現する構築物（4μg）、またはDNA挿入物を含まない構築物（4μg）を用いてSJSA−1細胞に共トランスフェクトされた。タンパク質抽出物はNi−NTAカラムに適用され、およびユビキチン標識MDM2が溶出され、および抗MDM2抗体を用いたウエスタンブロッティングにより検出された。タンパク質抽出物の1/20はトランスフェクション効率を標準化するためにウエスタンブロットによりGFPを検出するために使用された。
【０１０５】
MDM2はTSG101の崩壊を調節する
以前の業績が、TSG101過剰および欠乏の両方が異常な細胞増殖につながりうること（1）およびTSG101タンパク質の定常状態レベルはタンパク質分解により狭い範囲内に制御されていること（3）を示してきた。ちょうどTSG101がそのユビキチン化および崩壊を負に制御することによりMDM2レベルを調節するように、MDM2がTSG101のタンパク質分解において平行して主要な役割を有していることを本発明者らは発見した。MDM2の作用は、最初は、α-チューブリンに対して相対的に内在性TSG101の細胞内濃度が、MDM2を生産する能力があるp53−／−MEF細胞よりも、p53−／−/MDM2−／−MEFにおいて顕著に高いとの観察により最初は示唆された（図4a）。すでに示されているように、自身およびp53の両方の分解を媒介するMDM2がまたTSG101の崩壊にも影響を与えるとの概念の正当性はまた複数の系統の証拠により支持された。最初に、図4bで見られたパルスチェイス実験は、内在性TSG101の崩壊はp53−／−MEFにおいて加速されるが、p53およびMDM2の両方が変異されたMEFにおいては減少することを示している。第二に、遺伝子増幅の結果MDM2の多数のコピーを含むSJSA−1細胞（16）は、MDM2の単一の染色体コピーを含む細胞（U2OSおよびSaos−2）と比較して、内在性TSG101の重大な欠乏を示した（図4c）。三番目には、CMVプロモーターから発現されたFlagタグ付きTSG101タンパク質の用量依存性減少が、外因性MDM2を生産する構築物を用いて共トランスフェクトされたSaos−2細胞において観察された（図4d）。Saos−2細胞はp53を欠失するので、この実験はまたTSG101のMDM2媒介性加速はp53を必要としないことを示す。最後には、内在性MDM2生産を活性化するp53の過剰発現（1、16）はTSG101の減少に関連している一方で、内在性MDM2の増加能を欠失している変異体p53タンパク質の過剰発現はTSG101のレベルに全く影響を与えなかった（図4e）。
【０１０６】
MDM2のTSG101分解に対する影響が、p53のそれと同様に、26Sプロテアソームにより実行されることは、プロテアソーム阻害剤、MG132の添加が内在性TSG101の蓄積を結果として生じた実験により示された（図4f）。さらに、MG132存在下においては、プロテアソーム阻害剤存在下では通常の40倍以上まで蓄積するMDM2の過剰発現は、TSG101の崩壊を加速することはできなかった、これはTSG101のMDM2促進性崩壊はプロテアソーム作用を必要とすることを確認する（図4g）。
【０１０７】
図4（a）マウス繊維芽細胞NIH3T3細胞、p53−／−マウス胎児繊維芽細胞（MEF）およびp53およびMDM2の両者において変異されたマウス繊維芽細胞由来のタンパク質抽出物（各40μg）を用いたウエスタンブロッティングにより細胞TSG101タンパク質レベルを検出した。TSG101タンパク質バンドの相対的密度は細胞αチューブリンに対して標準化した後計算された。（b）NIH3T3、p53−／−MEFおよび、p53−／−/MDM2−／−MEFの細胞培養は35S−メチオニンを用いて1時間パルス標識され、および0時間、2時間、4時間、8時間、および12時間チェイスされた。35S標識されたTSG101は抗TSG101抗体により免疫沈降され、SDSゲルで分離され、およびイメージクアント（Image Quant）により可視化および定量された。（c）Flagタグ付きTSG101およびMDM2発現ベクターが共トランスフェクションによりSaos−2細胞に導入された。DNAのトランスフェクト量は、0.5μgのFlag−TSG101発現ベクターに対しては＋により、および1から4μgのMDM2発現ベクターに関しては＋から＋＋＋＋により示されている。（d）MDM2、HAタグ付きTSG101、および／または変異体または野生型p53タンパク質を発現するベクターの組み合わせがトランスフェクションによりSaos−2細胞に導入された、およびトランスフェクタントのタンパク質抽出物は示されているように抗体を用いたウエスタンブロッティングにより解析された。この記載において、トランスフェクタントは、HA−TSG101を発現する1μgのプラスミドDNA、MDM2を発現する1μgのプラスミドDNA、および以下のp53発現構築物：＋および＋＋、各々1μgおよび2μgを受容した。p53変異は175番目のアミノ酸のアルギニンをヒスチジンに置換した。（e）Saos−2細胞培養は、MG132（2μM）を用いて24時間示されているように処理された、および細胞タンパク質抽出物は抗TSG101抗体を用いたウエスタンブロッティングにより解析された。（f）SJSA−1、U2OSおよびSaos−2細胞のタンパク質抽出物は、MDM2、p53、TSG101およびαチューブリンに対する抗体を用いたウエスタンブロットにより解析された。MDM2/TSG101の比率は細胞αチューブリンを用いて標準化された後に決定された。示された構築物はトランスフェクションによりSaos−2細胞に導入された（図4dにおいて示されている濃度）。トランスフェクトされた細胞は、MG132非存在または存在下において24時間の間培養された、および細胞タンパク質抽出物は抗HAおよび抗MDM2抗体を用いたウエスタンブロッティングにより解析された。HA−TSG101およびMDM2タンパク質バンドの密度は細胞αチューブリンに対して相対的に示される。
【０１０８】
参照
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2004523527.tif 000003
【０１０９】
本発明はその特定の態様に対する参照とともに記載されているけれども、本発明の真の精神および範囲から逸脱することなく、さまざまな変化が実施されてもよく、および均等物が置換されてもよいことは当業者により理解されるべきである。加えて、特定の状況、材料、物質の組成物、過程、過程段階、または段階を本発明の目的、精神および範囲に適合させるために多くの修飾が実施されてもよい。
【０１１０】
その各々が全ての目的のために全体として参照として本明細書に組み入れられる、様々な参照が本明細書において引用される。そのような参照は制限することなくLiら（2001）Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.  98、1619〜1624を含む。
【図面の簡単な説明】
【０１１１】
【図１】図1A〜1DはTSG101とp53およびMDM2の相互作用のウエスタンブロット解析の結果を描写する。
【図２】図2A〜EはTSG101発現のp53の細胞レベルおよびMDM2分解に対する影響を示す実験の結果を描写する。
【図３】図3Aおよび3BはTSG101のUbcドメインのMDM2分解およびユビキチン化に対する影響を示す実験の結果を描写する。
【図４】図4A〜4GはTSG101のMDM2依存性タンパク質分解を示す実験の結果を描写する。
【図５】図5はTSG101/MDM2およびp53/MDM2フィードバック調節ループの機能的相互作用を示すモデルを描写する。
【図６】図6はヒトTSG101タンパク質の390アミノ酸の配列（配列番号：1）（ジェンバンク（登録商標）アクセション番号U82130.1/GI：1772663）を描写する。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図２Ｅ】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
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【図４Ｆ】
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【図４Ｇ】
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【図５】
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【図６】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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