(57)【要約】サイトカインまたは生物活性断片を任意選択的に抗生物質と共に投与することによって、動物の成長成績を改善するための方法および組成物について開示する。適した核酸配列によってコードされるサイトカインまたは活性断片を投与してもよい。
2004528026.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
一つもしくは複数のサイトカインまたはその生物活性断片の成長促進量を、それを必要とする動物に投与する段階を含む、動物の成長成績を改善する方法。
【請求項２】
サイトカインまたはその断片が、任意選択的に薬学的担体、アジュバント、または賦形剤と共に投与される、請求項1記載の方法。
【請求項３】
組成物が相乗的成長促進作用を示す、サイトカインまたはその生物活性断片を、抗生物質と共に、任意選択的に薬学的担体、アジュバント、または賦形剤と組み合わせて含む組成物を、それを必要とする動物に投与する段階を含む、動物の成長成績を改善する方法。
【請求項４】
成長成績が、該化合物または組成物を投与していない動物の成長成績と比較して増強されている、一つまたは複数のサイトカインの成長促進量が得られるように、内因性のサイトカインレベルを増加または補足する化合物または組成物を、それを必要とする動物に投与する段階を含む、動物の成長成績を改善する方法。
【請求項５】
化合物または組成物が、一つまたは複数のサイトカインの成長促進量の投与の前に、投与と共に、または投与の後に投与される、請求項4記載の方法。
【請求項６】
サイトカインが、インターロイキン1（IL-1）、インターロイキン2（IL-2）、インターロイキン3（IL-3）、インターロイキン4（IL-4）、インターロイキン5（IL-5）、インターロイキン6（IL-6）、インターロイキン7（IL-7）、インターロイキン10（IL-10）、インターロイキン11（IL-11）、インターロイキン12（IL-12）、インターロイキン13（IL-13）、顆粒球マクロファージ-コロニー刺激因子（GM-CSF）、顆粒球コロニー刺激因子（G-CSF）、マクロファージ-コロニー刺激因子（M-CSF）、エリスロポエチン（Epo）、幹細胞因子（SCF）、白血球阻害因子（LIF）、腫瘍増殖因子β（TGFβ）、および腫瘍壊死因子α（TNFα）からなる群より選択される、請求項1〜3のいずれか一項記載の方法。
【請求項７】
サイトカインが、インターロイキン3（IL-3）、インターロイキン4（IL-4）、インターロイキン5（IL-5）、および顆粒球マクロファージ-コロニー刺激因子（GM-CSF）からなる群より選択される、請求項6記載の方法。
【請求項８】
サイトカインが、インターロイキン3（IL-3）、インターロイキン4（IL-4）、またはインターロイキン5（IL-5）のいずれかである、請求項6記載の方法。
【請求項９】
抗生物質の投与がサイトカインの前または後である、請求項3、6〜8のいずれか一項記載の方法。
【請求項１０】
抗生物質を投与する段階をさらに含む、請求項1、2、4、または5のいずれか一項記載の方法。
【請求項１１】
抗生物質が、アモキシシリン、ペニシリン、プロカイン、アンピシリン、クロキサシリン、ペニシリンG、ベンザチン、ベネタミン、セフチオフル、セファロニウム、セフロキシム、エリスロマイシン、タイロシン、チルミコシン、オレアンドマイシン、キタサマイシン、リンコマイシン、スペクチノマイシン、テトラサイクリン、オキシテトラサイクリン、クロルテトラサイクリン、ネオマイシン、アプラマイシン、ストレプトマイシン、アボパルシン、ジメトリダゾール、スルホンアミド（トリメトプリムおよびジアベリジンを含む）、バシトラシン、バージニアマイシン、モネンシン、サリノマイシン、ラサロシッド、ナラシンおよびオラキンドクスまたはその組み合わせからなる群より選択される、請求項6〜10のいずれか一項記載の方法。
【請求項１２】
抗生物質が、リンコマイシン、スペクチノマイシン、もしくはアモキシシリン、またはその組み合わせのいずれかである、請求項11記載の方法。
【請求項１３】
投与が、経口、局所、または非経口投与である、請求項1〜12のいずれか一項記載の方法。
【請求項１４】
非経口投与が、皮下注射、エアロゾル、静脈内、筋肉内、髄腔内、胸骨内の注射、注入技術、または封入された細胞のいずれかである、請求項13記載の方法。
【請求項１５】
投与が1回投与単位または多数回投与単位のいずれかである、請求項1〜14のいずれか一項記載の方法。
【請求項１６】
投与が水および／または飼料の添加剤として経口投与される、請求項1〜13のいずれか一項記載の方法。
【請求項１７】
動物の成長成績が、成長速度の増加、飼料利用効率の増加、最終体重の増加、可食部重量の増加、および脂肪含有量の減少からなる群より選択される、請求項1〜16のいずれか一項記載の方法。
【請求項１８】
動物の成長成績の改善が、免疫増強、抗寄生虫もしくは抗微生物作用、抗炎症作用、またはストレスの減少によって起こる、請求項1〜17のいずれか一項記載の方法。
【請求項１９】
動物が偶蹄目または鳥類のいずれかである、請求項1〜17のいずれか一項記載の方法。
【請求項２０】
偶蹄目が、ウシ、ブタ、ヒツジ、ラクダ、ヤギ、およびウマからなる群より選択される、請求項19記載の方法。
【請求項２１】
鳥類がニワトリ、七面鳥、ガチョウ、およびカモからなる群より選択される、請求項19記載の方法。
【請求項２２】
動物がウシ、ブタ、またはヒツジのいずれかである、請求項18記載の方法。
【請求項２３】
一つもしくは複数のサイトカインまたはその生物活性断片と、一つもしくは複数の抗生物質とを含む成長促進組成物。
【請求項２４】
薬学的担体、アジュバント、または賦形剤をさらに含む、請求項23記載の成長促進組成物。
【請求項２５】
サイトカインが、インターロイキン1（IL-1）、インターロイキン2（IL-2）、インターロイキン3（IL-3）、インターロイキン4（IL-4）、インターロイキン5（IL-5）、インターロイキン6（IL-6）、インターロイキン7（IL-7）、インターロイキン10（IL-10）、インターロイキン11（IL-11）、インターロイキン12（IL-12）、インターロイキン13（IL-13）、顆粒球マクロファージ-コロニー刺激因子（GM-CSF）、顆粒球コロニー刺激因子（G-CSF）、マクロファージ-コロニー刺激因子（M-CSF）、エリスロポエチン（Epo）、幹細胞因子（SCF）、白血球阻害因子（LIF）、腫瘍増殖因子β（TGFβ）、および腫瘍壊死因子α（TNFα）からなる群より選択される、請求項23または24に記載の成長促進組成物。
【請求項２６】
サイトカインが、インターロイキン3（IL-3）、インターロイキン4（IL-4）、インターロイキン5（IL-5）、および顆粒球マクロファージ-コロニー刺激因子（GM-CSF）からなる群より選択される、請求項25記載の成長促進組成物。
【請求項２７】
サイトカインが、インターロイキン3（IL-3）、インターロイキン4（IL-4）、またはインターロイキン5（IL-5）のいずれかである、請求項25記載の成長促進組成物。
【請求項２８】
抗生物質が、アモキシシリン、ペニシリン、プロカイン、アンピシリン、クロキサシリン、ペニシリンG、ベンザチン、ベネタミン、セフチオフル、セファロニウム、セフロキシム、エリスロマイシン、タイロシン、チルミコシン、オレアンドマイシン、キタサマイシン、リンコマイシン、スペクチノマイシン、テトラサイクリン、オキシテトラサイクリン、クロルテトラサイクリン、ネオマイシン、アプラマイシン、ストレプトマイシン、アボパルシン、ジメトリダゾール、スルホンアミド（トリメトプリムおよびジアベリジンを含む）、バシトラシン、バージニアマイシン、モネンシン、サリノマイシン、ラサロシッド、ナラシンおよびオラキンドクス、またはその組み合わせからなる群より選択される、請求項23〜27のいずれか一項記載の成長促進組成物。
【請求項２９】
抗生物質が、リンコマイシン、スペクチノマイシン、もしくはアモキシシリン、またはその組み合わせである、請求項28記載の成長促進組成物。
【請求項３０】
核酸分子の発現によりサイトカインまたはその断片の成長促進量が生じる、一つもしくは複数のサイトカインまたはその生物活性断片をコードする核酸分子を、それを必要とする動物に投与する段階を含む、動物の成長成績を改善する方法。
【請求項３１】
核酸分子が、皮下、静脈内、もしくは筋肉内注射によって、またはエアロゾルとして投与される、請求項30記載の方法。
【請求項３２】
核酸分子が約1 μg〜2000 μg/用量の量で投与される、請求項30記載の方法。
【請求項３３】
核酸分子が約5μg〜1000 μg/用量の量で投与される、請求項30記載の方法。
【請求項３４】
核酸分子が約6 μg〜200 μg/用量の量で投与される、請求項30記載の方法。
【請求項３５】
核酸分子がベクターにおいてまたは裸のDNA分子として投与される、請求項27記載の方法。
【請求項３６】
ベクターがブタアデノウイルスベクターである、請求項35記載の方法。
【請求項３７】
以下を含む、サイトカインの有効量をインビボで輸送する構築物：
a）サイトカインまたはその生物活性断片をコードするヌクレオチド配列；
b）サイトカインまたはその生物活性断片が産生され、次にこれが動物の成長成績を改善するように、調節配列がa）のヌクレオチド配列の発現を制御することができる、調節配列を含むベクター。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、広く動物の成長成績を改善する方法に関する。特に、本発明は、一つもしくは複数のサイトカインまたはその生物活性断片の成長促進量を、それを必要とする動物に投与する段階を含む、動物の成長成績を改善する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
世界の食糧需要は常に増加しており、食糧生産速度を増加させることに対して一定の圧力がある。家畜学の目標は、最少の商業的支出で特定の産業標準を一貫して満たす食用動物を生産することである。
【０００３】
この目標を達成するため、家畜学の環境は、提供された条件が、許容される成長成績を得る方向に向いていなければならない。言い換えれば、条件は、屠殺時に、それぞれの屠畜体が、明記された産業標準を満たす可食部重量と脂肪含有量とを特徴とする、許容される成長速度（生存体重の単位増加速度）、許容される飼料利用効率（生存体重における単位増加あたりに必要な飼料の量）、および許容される最終体重が可能となるために十分でなければならない。
【０００４】
1950年代初期において、研究者らは、意外にもニワトリの肉をすりつぶした中に含まれる抗生物質成分が「成長因子」であることを発見した。この知見によって、家畜と家禽産業は劇的に変化して、これは製薬企業にとって経済的な恵みとなった。飼育動物は現在では、非常に制御された条件で生産され、多様な成長促進添加剤を加えた特殊飼料を与えられている。
【０００５】
ペニシリン、テトラサイクリン、およびスルファメタジンのような抗生物質の少量を動物に添加すると、ブタおよびウシの成長を促進することが発見されて以来、動物に日常的に抗生物質を投与することはほぼ世界中に広まった。1979年では、米国において飼育された肉牛および子牛肉牛の約70％、ブタの90％、およびブロイラーのほぼ100％が、その毎日の飼料の一部として抗生物質を消費した。この使用は、アメリカにおける抗生物質の売り上げのほぼ40％を占め、消費者は食費を年間350万ドル節約すると推定される。
【０００６】
成長促進に関して最適にした近代的条件で飼育された動物は、通常ダイズまたは綿実食（オーストラリアでは肉および骨または血の多い食事が広く用いられる）の形の蛋白質を高い比率で含み、そしてトウモロコシまたはモロコシの一種（オーストラリアではコムギとオオムギ）であるマイロのような穀粒を高い比率で含む糧食を与えられる。用いられている飼料添加剤には、同様に体重増加速度を増加させるジエチル-スチルベステロールのようなホルモン、閉じこめられた状態によって引き起こされるストレスの作用によって疾患または体重減少が起きないようにするトランキライザー（ブタでは広く用いられていない）が含まれる。
【０００７】
ウシは通常、体重増加1 kgを生じるために飼料5 kgが必要である。最適な成長促進条件と栄養に富む飼料とがあれば、ウシは飼料わずか3 kgで体重が1 kg増加する。
【０００８】
ホルモンと抗生物質とは、食用動物の成長速度を大きく改善したが、そのような添加剤を利用することは問題があった。成長刺激剤として一般的に用いられているホルモンの一つ、ジエチル-スチルベステロールまたはDESは、発癌物質であることが示されており、ほとんどの国において今後の使用が禁止されている。
【０００９】
抗生物質を動物飼料に混合すると、化合物は環境中に広がって微生物に抗生物質を曝露する。微生物が抗生物質に絶えず曝露されると、微生物に生物学的圧力が加えられ、抗生物質に対して耐性を示すようになる。これによって、抗生物質に耐性で、特に重度の難治性の感染症を引き起こす微生物が起こりうる。
【００１０】
抗生物質耐性微生物は、制御が難しいために、おそらく重篤な病原体である。この微生物が動物またはヒトにおいて感染症を引き起こせば、感染症は従来の抗生物質では制御されない可能性がある。感染症が重度であれば、どの抗生物質が感染細菌に対して有効であるかを決定する時間がないかも知れない。この問題は、疾患の治療のために自身が抗生物質を服用している人々が食肉中の抗生物質耐性菌を消費した場合に、特に重篤となった。抗生物質は、呼吸器および消化管における正常な微生物の多くを阻害する。これによって耐性菌は、迅速に増殖してより重度の疾患を引き起こすことが可能となる。過去数年間に米国において報告されたサルモネラ食中毒による死者のほとんどは、食品からの抗生物質耐性菌と人々の無効な抗生物質治療とが組み合わさった結果であった。
【００１１】
飼料ロット中の抗生物質耐性菌の出現が増加しつつあること、そして抗生物質耐性菌によって引き起こされた多くのいくつかの重篤な流行病の結果として、動物飼料における抗生物質の使用を禁止するように政府の圧力が高まっている。実際に、世界保健機構およびオーストラリア政府は、感染症を制御するために環境に優しい代替方法を用いる必要性を明記した。家畜飼料および水からの様々な抗生物質の即時禁止または除去は、（i）動物における感染症の発生率を増加させ、その結果、成長成績を低下させる、（ii）動物の健康、受精能力、および交配成績をさらに減少させる可能性がある。その結果、健康を増強することによって疾患を減少させると共に、食用動物の新しい、安全で有効な成長刺激剤が直ちにそしてますます必要となっている。
【００１２】
抗生物質を用いないで、動物の成長を促進する様々な試みは、多くの入念で遠回しの手段を用いていた。これらには、ホルモンまたは複合体から生成される陽イオンを有する複合体の塩を皮下に埋め込むことが含まれた（例えば、米国特許第6,197,815号；米国特許第3,991,750号；米国特許第4,067,994号を参照のこと）。これらの試みはいずれも、単純または有効であることが証明されなかった。したがって、抗生物質または手の込んだ方法論を用いることに依存しない動物の成長成績を改善させる方法がなおも必要である。
【００１３】
本出願人は意外にも、特定のサイトカイン、特にインターロイキンを投与すると、必要な抗生物質の量を減少させながら動物の成長成績を増加させることを見出した。
【００１４】
如何なる特定の理論または仮説に拘束されたくはないが、出願人は、サイトカインを投与した動物において認められた成長成績の増加は、四つの重要な作用の相互作用によって起こると考えている。これらは以下の通りである：
1）免疫増強作用；
2）抗寄生虫および抗菌作用；
3）ストレスの減少；ならびに
4）抗炎症作用。
【００１５】
これらの作用はそれぞれ、単独または共に、動物の健康および幸福に強く影響を及ぼし、これが次に動物の成長成績およびそれによって食肉の品質に影響を及ぼす。例えば：
1）免疫増強作用
a）TH1/TH2免疫応答
免疫サイトカイン調節ネットワークと体内の他の調節系との間に相互作用が起こる。感染症または抗原に対する免疫応答は互いに急激に一方に片寄りうる。免疫応答は、T細胞反応タイプによって一般化することができる。Tヘルパー1（TH1）型の反応は主に細胞性免疫に関与するが、TH2パターンの反応は、しばしば液性免疫に関連する。TH1およびTH2型のT細胞サブセットは、サイトカインパターンによって規定される多くの免疫応答の調節に関係している。TH2細胞は、サイトカインであるインターロイキン（IL）-4、IL-5、IL-10、およびIL-13を発現する。一方、TH1細胞は、IL-2、IFNγ、およびTNFβを発現する。これらのTH2サイトカインはB細胞の発達に影響を及ぼし、抗体の分泌のような液性反応を増強する。双方のタイプのTH細胞は、それらが分泌するサイトカインによって互いに影響を及ぼす。例えば、IL-10のようなTH2サイトカインは、TH1機能を抑制することができる。TH1反応をダウンレギュレートすることが知られているTGFβのような他のサイトカインも同様に、TH1またはTH2発達に影響を及ぼしうる。TH2反応を調節するサイトカインは、免疫パラメータに影響を及ぼしてそれによって、健康または生産性を増加させる可能性がある。
【００１６】
b）抗体のアイソタイプスイッチ
抗体は、感染症を消失させるまたは感染症から保護するために必要である。成熟B細胞は、抗原刺激後に抗体クラススイッチのプロセスを経る。TH細胞は、物理的接触およびスイッチ因子と呼ばれるサイトカインによってアイソタイプスイッチを調節する。単独または組み合わせてアイソタイプスイッチに関係することが知られているサイトカインのいくつかは、IL-4、IL-5、TGFβ、IL-1、IL-2、IL-6、およびIL-13である。IL-4とIL-5は、相乗作用してIgG1反応を増強する。例えば、最適なIgG1反応も同様にIL-2を必要とする。IL-1は、IL-5の存在下でIgA産生を増強しうる。TGFβはIgA産生を誘導する。
【００１７】
c）造血
造血は、赤血球および免疫細胞（白血球）を含む血球形成プロセスである。骨髄は、生後に新しい血球を生成する主要な起源である。造血幹細胞を維持するためのプロセス、すなわちその増殖、免疫系にとって重要な異なる系列への分化および成熟、を維持するためには造血増殖因子が必要である。造血増殖因子には、様々なコロニー刺激因子（IL-3のような）、Epo、SCF、様々なインターロイキン（IL-1、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-11、IL-12）、LIF、TGFβ、MIP1α、TNFαが含まれる。これらの因子の多くは多機能性である。
【００１８】
d）免疫機能障害
ほとんどの産生形質に関する遺伝能は、出生時に予め決まっている。この能力が達成されるか否かは、多くの要因（ストレス、疾患、栄養、免疫等）によって左右される。抗原曝露のレベルおよびタイプは、免疫系の「片寄り」に影響を及ぼしてこれを確立する。ほとんどの免疫応答は、細菌およびウイルスに対して免疫を促進するタイプ、または多くの寄生虫に対する免疫を促進するタイプに偏っている。動物の遺伝子型はこの片寄りに影響を及ぼしうるが、新生児が抗原および感染症に始めて接すると、免疫反応性を一つまたは他のタイプに向かわせることができる。この片寄りは、その後の抗原曝露に応じて変化する。産生形質に関する選択に基づく交配プログラムは、費用が高く、免疫コンピテンスまたは反応性の障害を有するように思われた。この変化は、水および飼料に対する抗生物質添加剤の持続的な使用によってさらに悪化して、それによっておそらく、有効な免疫応答を発揮する遺伝的能力の変化が起こる。
【００１９】
e）粘膜の免疫
家畜において感染症が最も起こりやすい領域は粘膜部位、主に消化管および肺である。このように、粘膜免疫系は、病原体および疾患に対する第一線の防御である。サイトカイン、特に、IL-5、IL-4、IL-6、およびIL-10は、粘膜における免疫応答の調節および有効性において有意な役割を有する。
【００２０】
IL-5およびIL-6は、粘膜免疫系におけるリンパ球のB-1およびB-2亜集団に作用する。IL-5またはIL-6の産生、またはその受容体産生のいずれかに欠損があれば、粘膜における保護反応に関与する抗体アイソタイプであるIgAの産生が有意に障害される。同様に、IL-5、IL-6、およびケモカインMIP-1αは、粘膜ワクチンに対するIgA反応を増加させる能力を有する。IL-4は、主にTH2反応を増強することによって、粘膜組織において免疫調節役割を有し、このように抗体産生を増強する。IL-4は、TH2経路の関与によって、肺における粘膜免疫応答の発達にとって必須であると考えられている。IL-4およびIL-5はいずれも、肺において協調して作用し、IL-4は、未経験のT細胞をTH2表現型に拘束して、このTH2表現型はその後活性化されるとIL-5を分泌して、その結果好酸球が蓄積される。さらに、IL-4およびIL-10は粘膜寛容において役割を有し、このように、腸管におけるアレルギー型の反応を調節して低下させ、腸管における慢性的な炎症状態に対する動物の感受性を減少させるために役立つ。
【００２１】
IL-4、IL-5、およびIL-10のようなサイトカインの輸送により、臨床レベル以下であっても粘膜病原体に対する動物の抵抗性を増強して、それによって家畜の成長および生産に対する無症状疾患の有害な作用を減少させる可能性がある。粘膜の免疫を改善することによって、疾患の流行ならびに抗生物質の治療および予防的使用に関連する費用も同様に減少する可能性がある。
【００２２】
2）抗寄生虫および抗菌作用
a）抗寄生虫作用
病原体に対する後天性免疫応答は、一般的に二つのタイプの一つ、すなわち細胞性（TH1）または抗体性（TH2）に分けられ、これはサイトカインによって制御される。TH2反応に関係するサイトカインは、それらが外部寄生虫および消化管寄生虫から保護して、TH1サイトカインによって誘導される炎症を抑制することから、魅力的な治療標的である。TH2サイトカインは、好酸球増加症、IgE合成、および粘液産生を誘導し、これらは寄生虫および他の消化管寄生虫に対する保護を増強する。したがって、保護的な粘膜の免疫応答の発達において重要であり、好酸球増加症を誘導することができるIL-3、IL-4、IL-5、IL-6およびGM-CSFのようなサイトカインは、寄生虫感染症の制御における可能性な候補物質である。
【００２３】
b）抗菌作用
微生物感染症は、栄養、ワクチン、化学物質および抗生物質の進歩にもかかわらず、経済的影響および健康に関して依然として世界中の問題である。微生物病原体に対する免疫応答は、二つの認識系を組み入れる。最も重要な防御は自然免疫であり、これに、必要であればその後の適応免疫（細胞性免疫および抗体反応）が続く。貪食細胞のような細胞は主に自然免疫応答を行う。IL-6、IL-15、IL-18のようなサイトカインは、感染症に対する反応において初期に生得の細胞によって生成され、GM-CSF、G-CSF、SCF、IL-3、SCF、IL-6、IL-1、IL-4、IL-5のような他のサイトカインは、その発達および機能を調節する。これらのサイトカインは、病原体の早期検出および保護的免疫応答の方向にとって、特に感染症の期間および重症度を減少させると共に、特にサイトカインによる前処理または持続的な処理によって新しい感染症の発生率を減少させるために、おそらく重要であるかも知れない。
【００２４】
3）ストレスの減少
食用ブタ飼育環境における多くの病態は、飼料の摂取、成長速度および屠畜体の品質の低下に関与する。それによってストレス物質が多くの種における成績に影響を及ぼすメカニズムを評価するための広汎な研究努力にもかかわらず、畜産における積年の問題は解決されていない。ストレス、特に初期および持続的なストレスによって、免疫機能障害、視床下部-脳下垂体-副腎皮質（HPA）活性および脳における化学物質の不均衡が起こる。神経および免疫系は、統合されて、互いに依存する神経免疫ネットワークを形成する。抑うつ、物理的または情動的ストレスは、免疫機能を変化させる内分泌系を活性化させ、これが次に脳における生理的および化学的変化を誘発する。サイトカインは、免疫、内分泌、および中枢神経系の間の相互作用を媒介する。これまで免疫抑制性であると考えられていたが、ストレスはTH1/TH2免疫応答のシフトを誘導して、それによって免疫抑制ではなくて免疫調節障害が起こるという証拠が増加しつつある。サイトカインが恒常性経路に影響を及ぼす可能性から、免疫系の活性を評価する必要がある。
【００２５】
4．抗炎症
慢性炎症はしばしば、家畜において認められ、持続的な感染症および環境刺激によって誘発される免疫活性化に関連する。炎症は、感染症に対する免疫応答の開始において重要な役割を果たすが、慢性的な免疫の活性化、特に持続的な感染症または微生物の負荷によるものは、成長および発達に有害な影響を及ぼすことがあり得て、ワクチン接種の有効性を低下させうる。過度の免疫活性化の結果には、炎症性サイトカインの産生、発熱、食欲不振、筋肉からのアミノ酸吸収、および食肉産生からの栄養の再指向が含まれる。抗炎症機能を有するサイトカインは、慢性的な免疫活性化の病態を減少させることができるであろう。これには、IL-4およびIL-10のようなサイトカインが含まれうるであろう。
【発明の開示】
【００２６】
発明の概要
その最も広い意味において、本発明は、一つもしくは複数のサイトカインまたはその生物活性断片の成長促進量をそれを必要とする動物に投与する段階を含む、動物の成長成績を改善する方法を提供する。
【００２７】
本発明はまた、成長成績が、該化合物または組成物を投与されていない動物の成長成績と比較して増強されている、一つまたは複数のサイトカインの成長促進作用が産生されるように、内因性のサイトカインレベルを増加させるまたは補助する化合物または組成物をそれを必要とする動物に投与する段階を含む、動物の成長成績を改善する方法を提供する。
【００２８】
好ましくは、化合物または組成物は、一つまたは複数のサイトカインの成長促進量を投与する前、同時に、または投与した後に投与される。
【００２９】
本発明はまた、該組成物が相乗的成長促進作用を発揮する、サイトカインまたはその生物活性断片を抗生物質と共に、任意選択的に薬学的担体、アジュバント、または賦形剤と共に含む組成物を、それを必要とする動物に投与する段階を含む、動物の成長成績を改善する方法を提供する。
【００３０】
好ましくは、サイトカインは、動物の成長成績を改善することができる如何なるサイトカインまたはサイトカインの組み合わせである。より好ましくは、サイトカインには、インターロイキン1（IL-1）、インターロイキン2（IL-2）、インターロイキン3（IL-3）、インターロイキン4（IL-4）、インターロイキン5（IL-5）、インターロイキン6（IL-6）、インターロイキン7（IL-7）、インターロイキン10（IL-10）、インターロイキン11（IL-11）、インターロイキン12（IL-12）、インターロイキン13（IL-13）、顆粒球マクロファージ-コロニー刺激因子（GM-CSF）、顆粒球コロニー刺激因子（G-CSF）、マクロファージ-コロニー刺激因子（M-CSF）、エリスロポエチン（Epo）、幹細胞因子（SCF）、白血球阻害因子（LIF）、腫瘍増殖因子β（TGFβ）、および腫瘍壊死因子α（TNFα）の一つまたは複数が含まれる。
【００３１】
さらにより好ましくは、サイトカインは、インターロイキン3（IL-3）、インターロイキン4（IL-4）、インターロイキン5（IL-5）、および顆粒球マクロファージ-コロニー刺激因子（GM-CSF）からなる群より選択される。最も好ましくは、サイトカインは、インターロイキン3（IL-3）、インターロイキン4（IL-4）、またはインターロイキン5（IL-5）のいずれかである。
【００３２】
一つの特定の態様において、サイトカインは、一つまたは複数の他のサイトカイン、薬学的担体、アジュバント、または賦形剤および／または抗生物質と共に組成物に処方される。如何なる既知の薬学的担体、アジュバント、または賦形剤も、それがサイトカインの成長促進作用に負の影響を及ぼさない限り、用いてもよい。
【００３３】
したがって、第二の局面において、本発明は、一つもしくは複数のサイトカインまたはその生物活性断片と一つまたは複数の抗生物質とを含む成長促進組成物を提供する。好ましくは、組成物は、一つまたは複数のサイトカインと一つの抗生物質とを含む。最も好ましくは、組成物は、一つのサイトカイン、一つの抗生物質および薬学的担体、アジュバント、または賦形剤を含む。
【００３４】
抗生物質を含む組成物は、動物における微生物負荷を制限するために役立ち、それによって動物における成長成績を改善するためにサイトカインを補助する。特に好ましい抗生物質、従来の動物生産環境において既に用いられているものである。しかし、特に、好ましい抗生物質は、アモキシシリン、ペニシリン、プロカイン、アンピシリン、クロキサシリン、ペニシリンG、ベンザチン、ベネタミン、セフチオフル、セファロニウム、セフロキシム、エリスロマイシン、タイロシン、チルミコシン、オレアンドマイシン、キタサマイシン、リンコマイシン、スペクチノマイシン、テトラサイクリン、オキシテトラサイクリン、クロルテトラサイクリン、ネオマイシン、アプラマイシン、ストレプトマイシン、アボパルシン、ジメトリダゾール、スルホンアミド（トリメトプリムおよびジアベリジンを含む）、バシトラシン、バージニアマイシン、モネンシン、サリノマイシン、ラサロシッド、ナラシンおよびオラキンドクスまたはその組み合わせからなる群より選択される。最も好ましくは、抗生物質はリンコマイシン、スペクチノマイシン、またはアモキシシリンである。
【００３５】
サイトカインの活性、投与様式、動物の年齢および体重に応じて、異なる用量のサイトカインを用いることができる。しかし、特定の状況では、これより高いまたはより低い用量が適当であるかも知れない。用量の投与は、個別の用量単位の形での1回投与、またはより少ない用量単位を数回、および一定の間隔での分割用量の多数回投与によって行うことができる。
【００３６】
しかし、如何なる特定の動物に関する特定の用量レベルも、用いる特定のサイトカインの活性、年齢、体重、全身健康状態、性別、飼料、投与時間および投与経路、排泄速度、ならびにサイトカインまたは抗生物質の組み合わせを含む様々な要因に依存するであろうと理解される。しかし、一般的に好ましい投与経路は、経口、局所、および非経口投与からなる群より選択される。
【００３７】
非経口投与には、皮下注射、エアロゾル、静脈内、筋肉内、髄腔内注射、注入技術または封入された細胞が含まれる。
【００３８】
本発明のサイトカインまたは組成物は、動物の水および／または飼料の添加剤として投与してもよい。
【００３９】
動物の成長成績は、成長速度の増加、飼料の利用効率の増加、最終体重の増加、可食部重量の増加または脂肪含有量の減少を含む如何なる既知の手段によって決定してもよい。さらに、改善された動物の成長成績は、免疫増強、抗寄生虫もしくは抗菌作用、抗炎症作用、またはストレスの減少によって起こる可能性があることは当業者によって認識されるであろう。より好ましくは、免疫増強は、TH1/TH2免疫応答、抗体アイソタイプスイッチ、造血、免疫機能の改善、粘膜の免疫、食欲、内分泌または神経内分泌プロセスのような恒常性プロセスに及ぼす有用な作用によって起こるであろう。
【００４０】
本明細書に開示の方法および組成物は、成長成績を改善することが望ましい転帰である如何なる動物にとっても有用となる可能性があることは当業者によって認識されるであろう。しかし、本発明は、食用動物、すなわち食肉生産のために日常的に飼育されている動物にとって特に有用である。好ましくは、動物は、高等偶蹄目または鳥類である。偶蹄目には、ウシ、ブタ、ヒツジ、ラクダ、ヤギおよびウマが含まれる。鳥類には、ニワトリ、七面鳥、ガチョウ、およびカモが含まれる。より好ましくは、本発明は、ウシ、ブタ、ラクダ、ヤギ、ウマおよびニワトリからなる群より選択される。最も好ましくは、動物はウシ、ブタ、またはヒツジである。
【００４１】
第三の局面において、サイトカインは、該核酸分子が動物において発現されると、サイトカインの成長促進量が産生されるように、該サイトカインをコードする核酸分子として動物に投与される。このように、本発明は、該核酸分子の発現が、一つまたは複数のサイトカインの有効な成長促進量を産生する、一つもしくは複数のサイトカインまたはその生物活性断片をコードする核酸分子をそれを必要とする動物に投与する段階を含む、動物の成長成績を改善する方法を提供する。
【００４２】
核酸分子は、DNA、cDNA、RNA、またはそのハイブリッド分子であってもよい。核酸分子という用語は、完全長の分子またはその生物活性断片を含むことは明確に理解されるであろう。
【００４３】
好ましくは、核酸分子は、インターロイキンをコードするDNA分子である。最も好ましくは、DNAは、インターロイキン3、インターロイキン4、またはインターロイキン5をコードする。
【００４４】
核酸分子は動物ゲノムに組み入れてもよく、または染色体外要素として存在してもよい。
【００４５】
核酸分子は如何なる既知の方法によって投与してもよい；しかし、好ましくは、皮下、静脈内、もしくは筋肉内に注射するか、またはエアロゾルとして投与する。
【００４６】
投与される核酸の量は、核酸分子によってコードされる特定のサイトカインと共に投与経路および部位に依存するであろう。本明細書に記載するように、動物における成長成績を改善するためには、サイトカインをコードする核酸分子200 μgの量を導入すれば十分である。このように、好ましくは、サイトカインをコードする核酸分子約200 μg〜1,000 μgの量を好ましくは動物に導入する。
【００４７】
核酸分子はまた、ブタアデノウイルスベクターのようなベクターにおいて輸送してもよい。同様に裸のDNA分子として輸送してもよい。
【００４８】
したがって、もう一つの局面において、本発明は、以下を含む、サイトカインの有効量をインビボで輸送するための構築物を提供する：
a）サイトカインまたはその生物活性断片をコードするヌクレオチド配列；
b）サイトカインまたはその生物活性断片が産生され、それが次に動物における成長成績を改善するように、調節配列がa）のヌクレオチド配列の発現を制御することができる、調節配列を含むベクター。
【００４９】
構築物の改変型および変種は、化学的もしくは酵素的処理によってインビトロで作製してもよく、または組換えDNA技術によってインビボで作製してもよい。そのような構築物は、例えば、一つまたは複数のヌクレオチド置換、欠失、または挿入のために開示の構築物と異なってもよいが、本発明の構築物または核酸分子の生物活性を実質的に保持している。
【００５０】
発明の詳細な説明
本発明の実践は、特に明記していなければ、当業者の範囲内である慣例的な分子生物学、細胞生物学、および組換えDNA技術を利用する。そのような技術は当業者に十分に既知であり、文献において十分に説明されている。例えば、Sambrook and Russelの「Molecular Cloning：A Laboratory Manual」、（2001）（グリーン出版、ニューヨーク）；「Cloning：A Practical Approach」、第I巻およびII巻（D.N. Glover編、1985）（グリーン出版、ニューヨーク）；「Oligonucleotide Synthesis」、（M.J. Gait編、1984）；「Nucleic Acid Hybridization」、（B.D. Hames and S.J. Higgins編、1985）；「Antibodies：A Laboratory Manual」、（Harlow and Lane編、1988）；「Transcription and Translation」、（B.D. Hames and S.J. Higgins編、1984）；「Animal Cell Culture」、（R.I. Freshney編、1986）；「Immobilised Cells and Enzymes」、（IRL出版、1986）；B. Perbal、「A Practical Guide to Molecular Cloning」、（1984）およびSambrookら、「Molecular Cloning：A Laboratory Manual」、（1989）；Ausubel, F.ら1989〜1999、「Current Protocols in Molecular Biology」、（グリーン出版、ニューヨーク）を参照のこと。
【００５１】
本発明の方法および組成物を記述する前に、本発明は変化する可能性があるために、本発明は記述の特定の材料および方法に制限されないと理解される。同様に、本明細書において用いた用語は、特定の態様を説明する目的に限られ、添付の請求の範囲に限って制限される本発明の範囲を制限すると解釈されない。本明細書および添付の請求の範囲において用いられるように、単数形「一つ」、「一つ（an）」、および「その」は、内容が明らかにそうでないことを明記しているのでなければ複数形が含まれることに注意しなければならない。このように、例えば、「一つのサイトカイン」という用語には、そのようなサイトカインの複数が含まれ、「一つの抗生物質」という用語は、当業者に既知の一つまたは複数の抗生物質およびその同等物を意味する等である。特に明記していない限り、本明細書において用いられる全ての技術および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解される意味と同じ意味を有する。本明細書に記載のものと類似または同等の如何なる材料および方法も用いて本発明を実践または試験することができるが、好ましい材料および方法をここに記述する。
【００５２】
本明細書において言及した全ての出版物は、出版物において報告され、本発明に関連して用いてもよいプロトコール、試薬、およびベクターを説明および開示する目的で引用される。本明細書の如何なる開示も、先行発明に基づいて、本開示がなされた日付を早める権利が本発明者にはないと自認したと解釈されるべきではない。
【００５３】
本発明の説明にあたって、下記の定義に従って以下の用語を用いる。
【００５４】
定義
本発明の方法および組成物は、動物の「成長成績」を改善するために有用である。「成長成績」という用語は、成長速度および動物の飼料利用効率の基準に対する言及として、そして同様に動物の最終体重ならびに動物の屠畜体の可食部重量および脂肪含有量に対する言及として、当技術分野で既知である。動物の「成長速度」は、動物の生存体重における単位増加速度であり、「飼料利用効率」は、動物の生存体重の単位あたりの増加にとって必要な飼料の量である。動物の「最終体重」は、特定の年齢での屠殺時の動物の体重であり、「可食部重量」は、そこから内臓、脚、豚足、または蹄を除去した屠畜体の重量である。「脂肪含有量」は、可食部屠畜体の脂肪含有量である。成長速度、飼料利用効率、最終体重、ならびに屠畜体の可食部重量および脂肪含有量の基準を測定する方法は、当業者に既知である。例えば、Manipulating Pig Production VI、VII＆VIII、1997、1999および2001、P.D. Cranwell編、オーストラリアブタ科学協会、ウェリビー、ビクトリア州、オーストラリアを参照のこと。成長速度は、経時的な生存体重の連続的な測定から得られる。飼料利用効率は、経時的な飼料消失と生存体重との連続的な測定から得られる。屠畜体の脂肪含有量は伝統的に、P2位での背部脂肪の厚さのミリメートルで表した測定から想定する。したがって、本発明において、「成長成績」という用語は、成長速度、飼料利用効率、動物の屠畜体の最終または可食部重量および脂肪含有量、の一つまたは複数の基準における改善を意味する。
【００５５】
本明細書において用いられるように、「動物」という用語は、成長成績の増加が望ましい如何なる動物も意味する。例えば動物には、哺乳類の偶蹄目、または鳥綱トリが含まれる。
【００５６】
偶蹄目は、9個の系統を通して分布する約150の生存種を含む：ブタ（イノシシ科）、アメリカイノシシ（ペッカリー科）、カバ（カバ科）、ラクダ（ラクダ科）、マメジカ（マメジカ科）、キリンおよびオカピ（キリン科）、シカ（シカ科）、エダツノカモシカ（プロングホーン科）、およびウシ、ヒツジ、ヤギ、およびカモシカ（ウシ科）。これらの動物の多くは様々な国において食用動物として用いられている。より重要なことは、本発明に関して、ヤギ、ヒツジ、ウシ、およびブタのような経済的に重要な動物の多くは、非常に類似の生物学を有し、高い程度のゲノム相同性を共有する。最も重要なことは、ヤギ、ヒツジ、ウマ、およびロバのような特定の動物は品種間交配させることができることは周知である。
【００５７】
本明細書において用いられるように「トリ」および「鳥類」という用語は、卵または食肉を出荷することを目的として飼育されるニワトリ、七面鳥、カモ、ガチョウ、ウズラ、およびキジを含むがこれらに限定されない全ての鳥類種が含まれると解釈される。この用語にはまた、如何なるトリ種の雄および雌の双方が含まれる。したがって、「トリ」および「鳥類」という用語は特に、ニワトリの雌鶏、雄鶏、および雄ガモ、七面鳥、カモ、ガチョウ、ウズラ、およびキジを含むと解釈される。ニワトリおよび七面鳥が好ましい。
【００５８】
全ての偶蹄目は、それらが例えば、インターロイキン、GM-CSF、インターフェロンα、β、およびγを有するという点において類似のサイトカイン系を有する。ほとんどの種において、これらのサイトカインをコードする遺伝子は、特定の染色体上の特定の領域にマップされる。例えば、ヒトでは、インターロイキン5遺伝子は、GM-CSF、M-CSF、IL-3、およびIL-4をコードする遺伝子と同じ領域の染色体5q23-31にマップされる。より重要なことは、サイトカインの多くは、異なる種の間での高い程度のアミノ酸配列相同性を有する。例えば、ブタインターロイキン5は、ウシ、ヒツジ、およびウマのような動物とそのアミノ酸の90％も共有することは周知である（例えば、Sylvinら、（2000）、Immunogenetics、51：59〜64を参照のこと）。実際に、マウスとヒトのような異なる種でも70％ものアミノ酸配列同一性を共有する（例えば、Dictionary of Cytokines（1995）、Horst Ibelgaufts、VCH出版、バインハイムを参照のこと）。さらに、ヒトIL-10は、ウシ、マウス、およびヒツジIL-10と有意な程度の配列相同性を有することが知られている（Dutiaら、（1994）Gene；149：393〜4）。表1は、ブタと比較してウシ、ヒツジ、ヒトおよびマウスに対するIL-3、IL-4、およびIL-5のアミノ酸配列同一性の一覧を示す。
【００５９】
同様に、多くのサイトカインが種間交叉反応性を有することは当技術分野において周知である。例えば、IL-4は、何らかの種間交叉反応性を有するが、IL-5は高レベルの交叉反応性を有する（Dictionary of Cytokines（1995）、Horst Ibelgaufts、VCH出版、バインハイム）。しかし、先行技術の文献に記載される交叉反応性は、インビトロアッセイおよびいくつかのインビボ実験に関連するが、成長成績に関連していないことに注目しなければならない。
【００６０】
サイトカインはまた、刺激または非刺激性のいずれかでサイトカイン受容体の発現を調節し、それによって他のサイトカインによってサイトカインの生物活性を制御することが知られている。いくつかのサイトカインは、調節作用を有する可能性がある共通の受容体サブユニットを共有する。
【００６１】
（表１）ブタ配列に対するアミノ酸配列同一性
IL-3：ウシ48％  ヒツジ47％  ヒト39％  マウス29％
IL-4：ウシ80％  ヒツジ78％  ヒト63％  マウス42％
IL-5：ウシ90％  ヒツジ88％  ヒト65％  マウス42％  ウマ83％
同一性はGenbank（アメリカ）Blast検索によって決定した。
【００６２】
例えば、GM-CSF受容体は、IL-2β、IL-3、IL-6、IL-7、Epo、およびプロラクチン受容体を含む造血増殖因子の他の受容体と有意な相同性を示す（例えば、Cytokines Online Pathfinder Encyclopaedia−www.copewithcytokines.deを参照のこと）。IL-3がマウスマクロファージ上でのGM-CSF受容体の発現をアップレギュレートすることができること、IL-3が同様にヒトおよびマウス骨髄細胞上のIL-1受容体発現をアップレギュレートすること、IL-4がIL-1 1型受容体発現をアップレギュレートして、IL-2受容体発現をダウンレギュレートすることも同様に知られている。さらに、IL-7は、IL-4受容体発現をアップレギュレートして、TNFαはIL-3とGM-CSF受容体発現の双方をアップレギュレートする（Dictionary of Cytokines（1995）、Horst Ibelgaufts、VCH出版、バインハイム）。このように、サイトカイン自身は、他のサイトカインの内因性の発現または生物活性を調節するためにおそらく用いることができるであろう。
【００６３】
偶蹄類と類似のように、鳥類も同様に、インターロイキンを含む共通のサイトカイン系を有する。したがって、本明細書において用いられる「トリインターロイキン」、または「鳥類インターロイキン」という用語は、如何なる鳥類によっても産生されるインターロイキンに対応する如何なるインターロイキンも意味する。「トリ」という用語は、トリインターロイキンの様々な種を含むと解釈され、そのいくつかは既知である（例えば、米国特許第5,028,421号および第5,106,617号；M.Baggiolini and K. Clemetson、PCT出願国際公開公報第90/06321号；H. Aschauer and P. Peveri、PCT出願国際公開公報第89/04836号を参照のこと）。
【００６４】
簡単に説明すると、トリインターロイキンは、鳥類ドナーからリンパ球を（最も都合がよいのは鳥類ドナーの脾細胞から）採取して、コンカナバリンAのようなT細胞分裂促進物質を含む培地（好ましくは血清不含培地）においてリンパ球を増殖させ、および選択的に培地からインターロイキンを回収する段階によって得てもよい。
【００６５】
様々な鳥類種のIL-2およびIL-8の交叉反応性は、IL-2反応細胞を用いる既知のバイオアッセイ技法によって日常的に決定することができる（例えば、Gimbroneら、Science 246：1601、1603、n.14（1989））。当業者は、サイトカインの既知の交叉反応性および当業者に既知の単純なスクリーニング試験に基づいて、処理される鳥類に関する適当なサイトカイン組成物を選択することができるであろう。
【００６６】
本出願人が承知している限り、トリインターロイキンの類似体はまだ合成されていない。しかし、様々な鳥類以外のIL-2の交叉反応性に基づいて、トリインターロイキンの合成類似体を、利用可能であれば、本発明において活性に関して一般的な方法でスクリーニングすることができ、それらが天然に存在するインターロイキンと実質的に同じように本発明において機能するはずであると予想される。
【００６７】
食用動物の多くにとって共通の祖先および生物学レベル、ウシ、ヒツジ、ヤギ、およびブタのような多くの種に及ぶサイトカインの高度のアミノ酸相同性、ならびにこれらのサイトカインの種間反応性レベルを考慮すると、当業者は本明細書に開示の組成物および方法が全ての食用動物および全てのサイトカインに応用できることを認識するであろう。
【００６８】
本明細書に開示の組成物および方法は本発明の他の局面を含むように直接補外してもよいことは当業者によってさらに認識されるであろう。例えば、データは特定のサイトカインに関して示される；しかし、これらは本発明を制限すると解釈してはならない。実際に、開示のサイトカインは、本発明の幅を示すために特に選択された。例えば、IL-5、IL-3およびGM-CSFは全て、好酸球レベルを増加させることができるサイトカインである。IL-4のようなサイトカインは、IL-13と類似の機能を有する（Dictionary of Cytokines（1995）、Horst Ibelgaufts、VCH出版、バインハイム）。
【００６９】
さらに、多くのサイトカインが受容体または受容体サブユニットを共有する。例えば、IL-3、IL-5、およびGM-CSFは、受容体サブユニットを共有する（Dictionary of Cytokines（1995）、Horst Ibelgaufts、VCH出版、バインハイム）。IL-4は、IL-2およびIL-7と共通のサブユニットを共有する（Dictionary of Cytokines（1995）、Horst Ibelgaufts、VCH出版、バインハイム）。いくつかのサイトカインは類似の遺伝子構造を有し、例えばIL-3、IL-4、GM-CSF、およびIL-13は、ヒトおよびマウスでは一つの染色体上に集合する（Dictionary of Cytokines（1995）、Horst Ibelgaufts、VCH出版、バインハイム）。
【００７０】
IL-1、3、4、5、6、11、および12は、既知の造血増殖因子である。類似の造血増殖因子には、GM-CSF、G-CSF、M-CSF、Epo、幹細胞因子（SCF）、LIF、TGFβ、およびTNFαが含まれる（Dictionary of Cytokines（1995）、Horst Ibelgaufts、VCH出版、バインハイム）。
【００７１】
IL-5はEpo、M-CSF、およびG-CSFと同様に、既知の遅延作用型系列特異的因子である。IL-3およびIL-4と同じ早期作用型多能性を有するサイトカインには、GM-CSFが含まれる（Dictionary of Cytokines（1995）、Horst Ibelgaufts、VCH出版、バインハイム）。
【００７２】
多くのサイトカインが、B細胞に対して活性を有するTH2サイトカイン（TH2；CD4+ヘルパー細胞）であると考えられている。これらには、IL-4、IL-5、IL-6およびIL-10が含まれる。IL-3はTH1およびTH2の双方によって分泌される（Dictionary of Cytokines（1995）、Horst Ibelgaufts、VCH出版、バインハイム）。
【００７３】
IL-5はまた、他の種において循環中の好酸球をアップレギュレートすることが知られている。さらにIL-5は、初期造血前駆細胞の強力な調節物質であり、好酸球の増殖、活性化、および分化を刺激する。サイトカインIL-3もまた、好酸球の増殖、活性化、および分化を刺激することが知られている。IL-3は、ほぼ全てのタイプの造血前駆細胞の増殖を支持する。IL-3は、造血幹細胞をプライミングする初期作用型因子であると考えられており、IL-3の活性の多くが他のサイトカインとの同時刺激によって増強される、またはそれらに依存する。もう一つのサイトカイン（GM-CSF）は、好酸球の産生を増加させることが報告されている（Dictionary of Cytokines（1995）、Horst Ibelgaufts、VCH出版、バインハイム）。IL-3と同様に、GM-CSFは多くのタイプの造血前駆細胞の増殖を支持して、幹細胞をプライミングする。
【００７４】
もう一つの例において、IL-25はIL-4、IL-5およびIL-13遺伝子発現を誘導することが示されている。これらのサイトカインの誘導によってTH2様反応が起こり、これらは、血清IgE、IgG(1)、およびIgAレベルの増加、血中好酸球増加症、ならびに好酸球滲出物、粘液産生の増加、および上皮細胞過形成／過栄養を含む肺および消化管における病的な変化によって示される。さらに、これらのデータは、IL-25が、MHCクラスII（高い）、CD11c（鈍い）および系列（-）であるアクセサリ細胞によるTH2-型サイトカインの産生を誘導することを示した（例えば、Fort MMら（2001）、Immunity、15（6）：985〜95を参照のこと）。
【００７５】
前述は全て、含まれる動物のタイプに関して本開示の発明の幅を説明する。しかし、「サイトカイン」という用語はまた、広く解釈され、開示の実験データに限定されないことは容易に認められるであろう。例えば、「サイトカイン」という用語には、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、顆粒球マクロファージ-コロニー刺激因子（GM-CSF）、顆粒球コロニー刺激因子（G-CSF）、マクロファージコロニー刺激因子（M-CSF）、エリスロポエチン（Epo）、幹細胞因子（SCF）、白血球阻害因子（LIF）、腫瘍増殖因子β（TGFβ）、および腫瘍壊死因子α（TNFα）の一つまたは複数が含まれる。
【００７６】
本明細書において用いられるように、「成長促進量」という用語は、上記のように成長成績の増加を生じるために有効な本発明のサイトカインの量を意味する。例えば、成長速度の増加、飼料利用効率、最終体重の増加、屠畜体可食部重量の増加、または脂肪含有量の減少。
【００７７】
本明細書において用いられるように、「投与」という用語は、本発明の組成物の輸送様式を意味する。この用語はまた、組成物の用量も意味する。サイトカインの活性ならびに動物の年齢および体重に応じて、投与様式およびサイトカインの用量は変化するであろう。如何なる特定の動物に関する特異的用量レベルも、用いる特定のサイトカインの活性、年齢、体重、全身健康、性別、飼料、投与時期、投与経路、排泄速度およびサイトカインまたは抗生物質の組み合わせを含む多様な要因に依存すると理解される。しかし、一般的に好ましい投与経路は、経口、局所および非経口投与からなる群より選択される。
【００７８】
非経口投与には、皮下注射、エアロゾル、静脈内、筋肉内、髄腔内、注射または注入技術、および封入された細胞が含まれる。
【００７９】
本明細書において用いられるように、「アップレギュレート」または「アップレギュレートする」という用語は、蛋白質またはペプチドの産生、分泌、または利用能の増加（そしてこのように濃度の増加）を誘導することを意味する。動物または鳥類において内因性のインターロイキンをアップレギュレートする方法は、無処理の動物または鳥類と比較して動物または鳥類におけるサイトカインの産生、分泌、または利用能の増加を誘導する方法を意味する。
【００８０】
「内因性」という用語は、調べる被験体、細胞、またはシステムを起源とすることを意味する。したがって、サイトカインの内因性レベルを補足することは、動物におけるサイトカインの全量が通常存在する量より高くなるように、化合物または複数の化合物を動物に投与することを意味する。サイトカインの内因性レベルを増加させることは、動物の細胞または組織によるサイトカインの産生を増加させ、それによって動物におけるサイトカインの全量を有効に増加させるように、化合物または複数の化合物を動物に投与することを意味する。サイトカインの内因性レベルはまた、サイトカインの代謝回転速度を減少させることによって有効に増加させてもよい。例えば、本発明の化合物または複数の化合物は、動物に投与した場合、蛋白質分解酵素の作用を阻害することによって内因性のサイトカインの蛋白質分解速度を減少させる可能性がある。さらに、化合物または複数の化合物は、サイトカインの内因性レベルを減少させて、それによって有効な免疫応答のためにサイトカインを投与する必要性を提供してもよい。
【００８１】
多くの物質、特に死菌もしくは細菌抽出物、または植物起源の非特異的マイトゲンは、IL-3、IL-4、およびIL-5を含む内因性のサイトカインのアップレギュレーションを刺激することができるが、それらはまた、家畜の成長および生産性に対して有害な作用を及ぼしうる前炎症性サイトカインメディエータのアップレギュレーションも刺激する。しかし、何らかの寄生虫、特にぜん虫の抽出物は、サイトカインの産生を増加させることが示されている（例えば、Ehigiator HNら、（2000）、Infection and Immunity、68：4913〜4922、Zang XXら、（2000）、Journal of Immunology 165：5161〜5169を参照のこと）。例えば、魚油、オメガ3脂肪酸、ビタミンEおよびAのような物質を含む飼料は、炎症反応の減少に関連しており、このようにサイトカインの発現の減少に関連している。
【００８２】
カンナバノイド（cannabanoid）
(+)-HU-211およびDMH-11Cのようなカンナバノイドの合成低親和性リガンドは、おそらくTNFαおよび他の急性期サイトカインの産生および作用を阻害することによって、抗炎症作用を引き起こすことが示されている。さらに、TNFならびにGM-CSF、IL-6、IFNγ、およびIL-12のような他のサイトカインも同様に、マリファナおよびTHCのような高親和性の精神活性リガンドに対する暴露後に認められている。しかし、これらのリガンドのいくつかは、IL-1、IL-4、IL-10およびIL-6のようなインターロイキン、TNFαのようなサイトカイン、ならびにIL-8、MIP-1、およびRANTESのようなケモカインを減少させるのではなくて増加させることも示されている。内因性のリガンド、アナンダミドは、プロラクチンに対する増殖反応を抑制するか、またはIL-3およびIL-6のようなサイトカインに対する反応を増強することが培養において示されている。このエイコサノイドはまた、インターロイキンおよび他のサイトカインの産生を増加させることが示されている。カンナビノイドの受容体は、これらの作用の全てではないがいくつかに関係していることが示されている（Kleinら、（2000）、Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine、225：1〜8）。
【００８３】
脂肪酸
n-3多価不飽和脂肪酸（PUFA）は、ヒトにおいて免疫調節作用を有することが知られている。例えば、αリノレン酸（ALNA）、長鎖n-3 PUFA、およびエイコサペンタエン酸（EPA）プラスドコサヘキサエン酸（DHA）。今日まで、ほとんどの研究は、エクスビボで免疫細胞の機能を調べていたが、免疫状態／反応のインビボ測定を報告する研究の数は限られている。ALNAまたはEPAプラスDHAのいずれかが高レベルであれば、好中球および単球の化学遊走性が減少し、好中球および単球による反応性酸素種の産生が減少し、単球およびT-リンパ球による前炎症性サイトカインの産生が減少し、ならびにTリンパ球増殖が障害される。類似の証拠は、齧歯類においても認められている（Calder PC（1997）、Nutrition Research、21：309〜341；Calder PC（1997）、Annals of Nutrition and Metabolism、41：203〜234）。
【００８４】
アスコルビン酸およびトコフェロールは、ヒトおよび動物における研究において抗炎症作用を発揮する。一般的に、n-6多価不飽和脂肪酸は、炎症のサイトカイン媒介局面を増強するのに対し、n-3PUFAsおよび一価不飽和脂肪酸は抑制する。さらに、n-6 PUFAsおよびコレステロールはサイトカイン産生を増強し、n-3 PUFAsは抑制する（Grimble RF（1998）、Nutrition Research、18：1297〜1317）。
【００８５】
ビタミン
ビタミンDホルモンは、トランスフォーミング増殖因子TGFβ-1およびインターロイキン4（IL-4）産生を刺激し、これらは次に、炎症性T細胞活性を抑制する可能性がある（Deluca and Cantorna（2001）、FASEB Journal、15：2579〜2585）。
【００８６】
ヒトではビタミンEの増加によって、IL-4産生の増加が起こる（Pallast EGら、（1999）、American Journal of Clinical Nutrition、69：1273〜1281）。低蛋白質飼料を与えたマウスは、小腸粘膜におけるIL-4およびIL-5濃度が低く、固有層におけるIL-4およびIL-5含有細胞がより少なかった（p＜0.05）。レチニルアセテート（1 mg）は、IL-5レベルならびにIL-4-およびIL-5-含有細胞数を有意に回復した。コレラ毒素（CT）20 μgによる免疫後、蛋白質欠損マウスの腸粘膜は、対照マウスより有意に少ないCT特異的IgAを含んだ。レチニルアセテート1 mgによる処理によって、蛋白質欠乏マウスにおける抗CT IgAレベルの減少が防止され、CT 0.1 mgに対する暴露後のその生存率を改善した。これらの結果は、ビタミンAを経口で大量に補充すると、おそらくTH2サイトカイン産生を刺激して、それによって感染症に対する抵抗性を誘導することによって、蛋白質異栄養の際の粘膜IgAレベルを保護する可能性があることを示唆している（Nikawa T.ら（1999）、Journal of Nutrition、129：934〜941）。レチン酸（RA）は、生殖系列の転写レベルでのアイソタイプスイッチングを調節することができ、IL-5の助けを借りてIgAに対するスイッチングを指示して、IgG1スイッチングを阻害する（Tokuyama H and Tokuyama Y（1999）、Cellular Immunology、192：41〜47）。
【００８７】
「生物活性断片」という用語は、それが由来する全または完全なサイトカインと実質的に類似である、動物において生物学的または生理学的作用を有するサイトカインの一部を意味する。例えば、インターロイキン3の生物活性断片は、免疫エピトープもしくは他の生物活性部位のいずれかを含むアミノ酸残基約5個以上を有する、またはその部分がIL-3生物活性を保持するIL-3の如何なる部分であってもよい。例えば、インターロイキン3の一部が上記のように造血幹細胞をプライミングする能力を保持する場合、この部分は、IL-3の「生物活性断片」である。
【００８８】
もう一つの実施例において、IL-5の断片は、以下の特徴の一つまたは複数を保持する必要があるであろう：
（i）好酸球の増殖、活性化、および／または分化を刺激する；
（ii）プレ活性化B細胞の増殖および分化を誘導する；
（iii）胸腺細胞から細胞障害性細胞の産生を促進する；または
（iv）IgMおよびIgA抗体の産生および分泌を刺激する。
【００８９】
典型的に、そのようなIL-5の断片は、IL-5受容体に対するIL-5の結合を競合的に阻害することができる断片である。
【００９０】
サイトカインまたはその生物活性断片のアミノ酸配列のアミノ酸配列変種もまた含まれる。例えば、一つまたは複数のアミノ酸残基を、サイトカイン配列または先に定義したその断片のN-またはC-末端、またはその中に付加する場合。サイトカイン配列またはその断片の一つまたは複数のアミノ酸残基が欠失している、および選択的に一つまたは複数のアミノ酸残基に置換されているサイトカイン配列のアミノ酸配列変種、または先に定義したその断片；および得られた産物が天然に存在しないアミノ酸であるように、アミノ酸残基が共有結合によって改変されている、上記のサイトカインの誘導体またはその断片。この場合も、サイトカインのこれらの変種は全て、サイトカインの変種がそれが由来する完全なサイトカインの生物活性を保持する限り、「生物活性断片」という用語に含まれる。
【００９１】
本明細書において用いられるように、「薬学的担体、アジュバント、または賦形剤」とは、サイトカインおよび／または抗生物質を動物に輸送するための薬学的に許容される溶媒、懸濁物質、または腑形剤である。担体は、液体または固体であってもよく、意図される計画された投与様式で選択される。
【００９２】
「実質的に相同である」という用語は、核酸および／またはアミノ酸配列の双方を意味することができ、特定の被験配列、例えば、変異体配列が一つまたは複数の置換、欠失、または付加によって参照配列とは異なるが、その真の作用は参照配列と被験配列との間に有害な機能的相違が生じないことを意味する。本発明の目的に関して、同等の生物活性および同等の発現特徴を有する配列は、実質的に相同であると見なされる。より程度の低い同一性、比較可能な生物活性、および同等の発現特徴を有する配列は、同等物であると見なされる。
【００９３】
「微生物の」とは、細菌、真菌（例えば、酵母）、ウイルス（例えば、バキュロウイルス）、または植物発現系において作製された組換え型蛋白質を意味する。その結果、「組換え型微生物の」とは、無傷の内因性の物質を本質的に含まず、関連する本来のグリコシル化を伴わない動物蛋白質を定義する。ほとんどの細菌培養物、例えば大腸菌培養物において発現される蛋白質は、グリコシル化改変を含まないであろう；酵母および昆虫細胞において発現された蛋白質は、哺乳類細胞において発現されたものとは異なるグリコシル化パターンを有するであろう。
【００９４】
「核酸分子」または「ポリ核酸分子」は、本明細書において、全ての形のデオキシリボ核酸およびリボ核酸、すなわち一本鎖および二本鎖DNA、cDNA、mRNA等を意味する。
【００９５】
「二本鎖DNA分子」とは、デオキシリボヌクレオチド（アデニン、グアニン、チミン、またはシトシン）のその正常な二重らせんの重合型を意味する。この用語は、分子の一次構造および二次構造のみを意味し、如何なる特定の三次構造にそれらを限定しない。このように、この用語には、中でも直線状のDNA分子分子（例えば、制限断片）、ウイルス、プラスミド、および染色体において認められる二本鎖DNAが含まれる。特定の二本鎖DNA分子の構造を検討する場合、配列は、転写されていないDNA鎖に沿って5'から3'方向における配列のみを与える通常の慣例に従って本明細書に記載してもよい（すなわち、mRNAと相同な配列を有する鎖）。
【００９６】
DNA配列は、遺伝子コードに従うDNA分子配列の翻訳によってアミノ酸配列が得られる場合、アミノ酸配列に「対応する」（すなわち、DNA配列はアミノ酸配列を「コードする」）。
【００９７】
二つの配列が同じアミノ酸配列をコードする場合、一つのDNA配列はもう一つのDNA配列に「対応する」。
【００９８】
二つのDNA配列は、DNA配列の規定の長さに対してヌクレオチドのマッチが少なくとも約85％、好ましくは少なくとも約90％、および最も好ましくは少なくとも約95％である場合に「実質的に類似」である。実質的に類似である配列は、サザンハイブリダイゼーション実験において、例えば特定の系に関して規定されたストリンジェントな条件において同定することができる。適当なハイブリダイゼーション条件を決定することは当業者の範囲内である。例えば、Sambrookらの「DNA Cloning」、第I、IIおよびIII巻、Nucleic Acid Hybridizationを参照のこと。しかし、通常、核酸分子のハイブリダイゼーションまたはアニーリングに関する「ストリンジェントな条件」は、以下の通りである：
（1）洗浄のために低イオン強度および高温、例えば、0.015 M NaCl/0.0015 Mクエン酸ナトリウム／0.1％ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）を50℃を用いる、または
（2）ホルムアミドのような変性剤、例えば50％（容積／容積）ホルムアミドを0.1％ウシ血清アルブミン／0.1％フィコール／0.1％ポリビニルピロリドン／50 mM燐酸ナトリウム緩衝液pH 6.5と共に750 mM NaCl、75 mMクエン酸ナトリウム42℃をハイブリダイゼーションの際に用いる。
【００９９】
もう一つの例は、50％ホルムアミド、5×SSC（0.75 M NaCl、0.075 Mクエン酸ナトリウム）、50 mM燐酸ナトリウム（pH 6.8）、0.1％ピロ燐酸ナトリウム、5×デンハルト溶液、超音波処理サケ精子DNA（50 μg/ml）、0.1％SDS、および10％デキストラン硫酸を42℃で用いて、0.2×SSCおよび0.1％SDSで42℃で洗浄することである。
【０１００】
DNA構築物の「異種」領域またはドメインは、自然界でより大きい分子に会合した状態で認められないより大きいDNA分子内のDNAの同定可能な部分である。このように、異種領域が哺乳類遺伝子をコードする場合、遺伝子は通常、起源となる生物のゲノムにおいて哺乳類のゲノムDNAに隣接しないDNAによって隣接されるであろう。異種領域のもう一つの例は、コード配列そのものが自然界に存在しない構築物である（例えば、ゲノムコード配列がイントロンまたは本来の遺伝子とは異なるコドンを有する合成配列を含むcDNA）。対立遺伝子変種または天然に存在する変異事象は、本明細書に記載のDNAの異種領域を生じない。
【０１０１】
「コード配列」は、蛋白質またはペプチド配列に対応するまたはコードするコドンのフレーム内配列である。二つのコード配列は、配列またはその相補的配列が同じアミノ酸配列をコードすれば、互いに対応する。適当な調節配列に会合したコード配列は、インビボでポリペプチドに転写および翻訳される可能性がある。ポリアデニル化シグナルおよび転写終了配列は通常、コード配列の3'に存在するであろう。
【０１０２】
「プロモーター配列」は、細胞においてRNAポリメラーゼに結合して、下流（3'方向）のコード配列の転写を開始することができるDNA調節領域である。コード配列は、プロモーター配列に結合するRNAポリメラーゼがコード配列をmRNAに転写して、次に、コード配列によってコードされる蛋白質に翻訳される場合、細胞においてプロモーター配列の「制御下」にある。
【０１０３】
本発明の目的に関して、プロモーター配列は、その3'末端でコード配列の翻訳開始コドンから始まり、バックグラウンド以上の検出可能なレベルで転写を開始させるために必要な塩基または要素の最小数を含むように上流に伸長する。プロモーター配列内において、転写開始部位（ヌクレアーゼS1によるマッピングによって簡便に規定される）と共に、RNAポリメラーゼの結合に関与する蛋白質結合ドメイン（コンセンサス配列）が認められるであろう。真核細胞プロモーターは、しばしば「TATA」ボックスおよび「CAT」ボックスを含むが必ずしも含むとは限らない；原核細胞プロモーターは、−10および−35コンセンサス配列の他にシャイン-ダルガルノ配列を含む。
【０１０４】
細胞は、そのような外因性DNAが細胞壁内部に導入される場合に外因性DNAによって「形質転換」されている。外因性DNAは、細胞のゲノムを構成する染色体DNAに組み入れられても（共有結合）、組み入れられなくてもよい。原核細胞および酵母において、例えば、外因性DNAは、プラスミドのようなエピソーム要素上で維持してもよい。真核細胞に関して、安定に形質転換された細胞は、外因性DNAが染色体の複製を通して娘細胞に遺伝される細胞である。この安定性は、真核細胞が、外因性DNAを含む娘細胞の集団を含む細胞株またはクローンを確立できることによって証明される。
【０１０５】
DNAの「組み込み」は、マイクロインジェクション、バイオリスティックス、電気穿孔、またはリポフェクションを用いた細胞へのDNAの質量移入後の非相同的組換えを用いて行ってもよい。相同的組換え、および／または制限酵素媒介組み込み（REMI）、またはトランスポゾンのようなもう一つの方法も同様に含まれ、改善された組み込み法であると見なしてもよい。
【０１０６】
「クローン」は、分裂によって単細胞または共通の祖先に由来する細胞集団である。
【０１０７】
「細胞」、「宿主細胞」、「細胞株」、および「細胞培養」は、本明細書において互換的に用いられ、そのような用語は全て、子孫を含むと解釈すべきである。「細胞株」は、多くの世代に関してインビトロで安定な増殖を行うことができる一次細胞のクローンである。このように、「形質転換体」および「形質転換細胞」という用語には、培養物を継代した回数にかかわらず、一次被験細胞およびそれに由来する培養物が含まれる。同様に、全ての子孫は、故意または偶然の変異により、DNA含有量が正確に同一である必要はないと理解すべきである。
【０１０８】
ベクターは、DNA、RNA、または蛋白質のような外来物質を生物に導入するために用いられる。典型的なベクターには、組換え型ウイルス（DNAに関して）およびリポソーム（蛋白質に関して）が含まれる。「DNAクローニングベクター」は、プラスミド、ファージ、またはコスミドのような自律的に複製するDNA分子である。典型的に、DNA分子クローニングベクターは、一つまたは少数の制限エンドヌクレアーゼ認識部位を含み、その部位でそのようなDNA配列がベクターの本質的な生物学的機能を喪失することなく決定することができるように切断してもよく、その中にその複製およびクローニングを行うためにDNA断片をスプライシングしてもよい。クローニングベクターはまた、クローニングベクターによって形質転換した細胞の同定において用いるために適したマーカーを含んでもよい。
【０１０９】
「発現ベクター」は、DNAクローニングベクターと類似であるが、適当な宿主細胞による蛋白質の合成を指示することができる調節配列を含む。これは通常、RNAポリメラーゼに結合して、mRNAの転写を開始するプロモーターのみならず、mRNAのポリペプチドへの翻訳を指示するリボソーム結合部位および開始シグナルを意味する。適切な部位および正しい読み取り枠で発現ベクターにDNA配列を組み入れた後、ベクターによって適当な宿主細胞の形質転換を行うと、DNA配列に対応するmRNAの産生が可能となり、通常、DNA配列によってコードされる蛋白質の産生が可能となる。
【０１１０】
本発明の目的に関して、プロモーター配列は、その3'末端でコード配列の翻訳開始コドンから始まり、バックグラウンド以上に検出可能なレベルで転写を開始するために必要な塩基または要素の最小数を含むように上流に伸長する。プロモーター配列内において、転写開始部位（ヌクレアーゼS1によるマッピングによって簡便に定義される）と共にRNAポリメラーゼの結合に関係する蛋白質結合ドメイン（コンセンサス配列）が認められるであろう。
【０１１１】
「外因性」要素は、宿主細胞に対して異物であるか、または宿主細胞に対して同種であるが、宿主細胞において要素が通常認められない位置に存在する要素である。
【０１１２】
DNAの「消化」は、DNAにおける特定の位置に限って作用する酵素によるDNAの触媒的切断に関する。そのような酵素は、制限酵素または制限エンドヌクレアーゼと呼ばれ、DNAにおいてそのような酵素の切断を受ける部位は制限部位と呼ばれる。DNA内に多数の制限部位が存在すれば、消化によって、二つまたはそれ以上の直線状DNA断片（制限断片）を生じるであろう。本明細書において用いられる様々な制限酵素が市販されており、その反応条件、共因子、および酵素の製造元によって確立された他の必要条件を用いる。制限酵素は一般的に、それぞれの制限酵素が最初に得られた微生物を表す大文字の次に他の文字が続き、特定の酵素を指定する数値からなる省略語によって示される。一般的に、DNA約1 μgは、緩衝液約20 μl中の酵素約1〜2単位によって消化される。特定の制限酵素に関する適当な緩衝液および基質の量は、製造元によって明記され、および／または当技術分野で周知である。
【０１１３】
制限消化物からのDNAの所定の断片の「回収」または「単離」は、典型的に電気泳動によってポリアクリルアミドまたはアガロースゲル上で「制限断片」と呼ばれる消化産物を分離すること、既知の分子量のマーカーDNA断片の移動度と比較したその移動度に基づいて関係する断片を同定すること、所望の断片を含むゲルの一部を切除すること、および例えば、電気的溶出によってゲルからDNAを分離することによって行われる。
【０１１４】
「ライゲーション」は、二つの二本鎖DNA断片の間にホスホジエステル結合を形成するプロセスを意味する。特に明記していない限り、ライゲーションは、既知の緩衝液、およびライゲーションすべきDNA断片のほぼ等モル量0.5 μgあたりT4 DNAリガーゼ10単位の条件を用いて行われる。
【０１１５】
「オリゴヌクレオチド」は、Engelsら、Agnew Chem. Int. Ed. Engl. 28：716〜734（1989）に記述されるような既知の方法（例えば、トリエステル、ホスホアミダイト、またはホスホネート科学を含む）によって化学合成される、長さが短い、一本鎖または二本鎖ポリデオキシオリゴヌクレオチドである。次に、それらを例えば、ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって精製する。
【０１１６】
本明細書において用いられる「ポリメラーゼ連鎖反応」または「PCR」は、一般的に米国特許第4,683,195号に記載されるように、所望のヌクレオチド配列のインビトロ増幅方法を意味する。一般的に、PCR法は、鋳型核酸に選択的にハイブリダイズすることができる二つのオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、プライマー伸長合成のサイクルを繰り返すことを伴う。典型的に、PCR法において用いられるプライマーは、増幅されるヌクレオチド配列に隣接する両端でまたは隣接する鋳型内でヌクレオチド配列と相補的であるが、増幅されるヌクレオチド配列と相補的なプライマーも同様に用いてもよい。Wangら、PCR Protocols、70〜75頁（アカデミック出版、1990）；Ochmanら、PCR Protocols、219〜227頁；Trigliaら、Nucl.Acids Res. 16：8186（1988）。
【０１１７】
「PCRクローニング」とは、総ゲノムDNAおよび総細胞RNAから転写したcDNAを含む、適した細胞または組織起源から核酸に存在する特定の所望のヌクレオチド配列を増幅するためにPCR方法を用いることを意味する。Frohmanら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85：8998〜9002（1988）；Saikiら、Science 239：487〜492（1988）；Mullisら、Meth. Enzymol. 155：335〜350（1987）。
【０１１８】
「ベクター」または「構築物」は、（1）遺伝子発現において調節的役割を有する遺伝子要素または複数の要素、例えば、プロモーターまたはエンハンサー、（2）mRNAに転写され、蛋白質に翻訳される構造またはコード配列、および（3）適当な転写開始および終了配列と共に転写単位を含む、プラスミド、ウイルス、またはゲノム組み込み体を意味する。酵母または真核細胞発現系において用いることが意図される構造単位には、宿主細胞によって翻訳された蛋白質の細胞外分泌を可能にするリーダー配列が含まれるであろう。または、リーダーまたは輸送配列なく組換え型蛋白質を発現する場合、N-末端メチオニン残基を含んでもよい。この残基は、最終産物を生成するために、発現された組換え型蛋白質からその後切断してもよく、しなくてもよい。一般的に、組換え型発現ベクターには、宿主細胞の形質転換を可能にする複製開始点および選択マーカー、ならびに下流の構造配列の転写を誘導するために高度に発現された遺伝子に由来するプロモーターが含まれるであろう。異種構造配列は、翻訳開始および終了配列、ならびに好ましくは翻訳された蛋白質のペリプラスム間隙または細胞外媒体への分泌を指示することができるリーダー配列と共に適当な相で構築される。選択的に、異種配列は、所望の特徴、例えば発現された組換え型蛋白質の安定化または単純な精製、を付与するN-末端同定ペプチドを含む融合蛋白質をコードしうる。本発明の好ましい組換え型発現ベクターは、ウイルスベクター（例えば、ブタアデノウイルスベクター）、哺乳類細胞（例えば、ブタ細胞）、植物細胞、および細菌細胞である。
【０１１９】
「免疫応答」という用語は、脊椎動物被験者の免疫系による抗原または抗原性決定因子に対する如何なる反応も意味する。例としての免疫応答には、本明細書において下記に定義するように、液性免疫応答（例えば、抗原特異的抗体の産生）、および細胞性免疫応答（例えば、リンパ球の増殖）が含まれる。
【０１２０】
「全身性免疫応答」という用語は、Bリンパ球のような免疫系の細胞が発達するリンパ節、脾臓、および腸管関連リンパ様組織における免疫応答を意味する。例えば、全身性免疫応答は、血清IgG'sの産生を含みうる。さらに、全身性免疫応答は、血流において循環する抗原特異的抗体、ならびに脾臓およびリンパ節のような全身性の器官でのリンパ様組織における抗原特異的細胞を意味する。対照的に、腸管関連リンパ様組織（GALT）は、腸の抗原／病原体に反応する抗原特異的細胞がGALTにおいて誘導され、検出可能であることから、粘膜免疫系の成分である。
【０１２１】
好ましい態様
一つの特に好ましい態様において、本発明は、一つもしくは複数のサイトカインまたはその生物活性断片の成長促進量を、それを必要とする動物に投与する段階を含む、成長成績を増加させる方法を提供する。
【０１２２】
サイトカインは、全ての食用動物種において内因性に発現され、これらの多くが高度の交叉反応性を有することから、一つの種に由来するサイトカインを、異なる種の動物に投与してもよく、およびその逆も可能となるということになる。例えば、動物がブタである場合、IL-5のようなヒトサイトカインを開示の方法において用いてもよい。特定のサイトカインが、動物において内因性に発現されるサイトカインと同一である必要はない。
【０１２３】
サイトカインを動物に投与する目的は、その成長成績を改善することである。成長成績の改善は、抗生物質のみを投与した動物と比較して、一つまたは複数のサイトカインを一つまたは複数の抗生物質と共に投与した動物において認められる。他所で考察されているように、成長成績は測定可能である；しかし、成長成績の増加が起こる理由はやや複雑である。如何なる特定の理論または仮説に拘束されたくはないが、出願人は、サイトカインの投与は、それによって成長成績の改善が起こる多くの補足的な方法において作用すると考えている。例えば、出願人は、食用動物の免疫を改善することによって、家畜の損失を回避して、その結果成長成績が改善することを発見した。このように、本発明は、感染症に対する動物の感受性を減少させる方法を提供する。方法は、細菌、ウイルス、または寄生虫による感染症に対する感受性を減少させるために有用である。
【０１２４】
本出願人はまた、一つまたは複数のサイトカインを一つまたは複数の抗生物質と共に投与しても同様に、用いる抗生物質の全量を減少させながら動物の成長成績が改善することを発見した。抗生物質は、投与されたサイトカインが成長成績に対して作用を発揮することができる閾値レベルにまで、動物における微生物負荷を制限すると考えられている。
【０１２５】
したがって、出願人は、成長促進剤自体として機能するよりむしろこれが可能であれば、サイトカインの投与が、サイトカインによって活性化されうる免疫応答の液性免疫および細胞性免疫を活性化することによって、成長成績の改善を引き起こす可能性があると理解されるであろうと考えている。例えば、IL-5は、好酸球の分化、増殖、および活性化、ならびにIgA分泌を誘導し、それによってそうでなければ動物の成長成績を制限するであろう動物における微生物負荷を減少させる。特に、本明細書に記載するように、IL-5と抗生物質とを投与して、「食用ブタの」飼育環境において維持した動物の群では死亡を認めず、この群の動物は一般的に、IL-5および抗生物質を投与していない他の群の動物と比較して健康および状態が改善された。
【０１２６】
本発明の方法は一つの態様において以下を伴う：
（1）一つもしくは複数の抗生物質の投与前、と共に、またはその後に一つもしくは複数のサイトカインを投与する；または
（2）一つもしくは複数のサイトカインと一つもしくは複数の抗生物質とを含む組成物を投与する；
（3）如何なる抗生物質も投与せずに一つもしくは複数のサイトカインを投与する。
【０１２７】
本発明のサイトカイン（複数）または組成物（複数）は、慣例的な非毒性の薬学的に許容される担体、アジュバント、および賦形剤を含む単位投与製剤において、経口、局所、または非経口投与してもよい。本明細書において用いられるように、非経口という用語には、皮下注射、エアロゾル、静脈内、筋肉内、髄腔内、頭蓋内、注射または注入技術が含まれる。
【０１２８】
本発明はまた、本発明の成長成績を改善する新規方法において用いられる適した局所、経口、および非経口薬剤を提供する。本発明の組成物は、錠剤、水性もしくは油性懸濁液、ロゼンジ、トローチ、粉剤、顆粒剤、乳剤、カプセル剤、シロップ剤、またはエリキシル剤として経口投与してもよい。経口投与のための組成物は、薬学的に洗練された美味な調製物を生成するために、甘味料、着香料、着色剤、および保存剤からなる群より選択される一つまたは複数の物質を含んでもよい。錠剤は、錠剤の製造に適している非毒性の薬学的に許容される担体、アジュバント、または賦形剤と混合して活性成分を含む。
【０１２９】
これらの担体、アジュバント、または賦形剤は、例えば、（1）炭酸カルシウム、乳糖、燐酸カルシウム、または燐酸ナトリウムのような不活性希釈剤；（2）コーンスターチまたはアルギン酸のような造粒剤および崩壊剤；（3）デンプン、ゼラチンまたはアカシアのような結合剤；ならびに（4）ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、またはタルクのような潤滑剤であってもよい。これらの錠剤は、コーティングしなくともよく、または消化管における崩壊および吸収を遅らせて、それによって持続的な作用をより長期間にわたって提供するために既知の技術によってコーティングしてもよい。例えば、モノステアリン酸グリセリルまたはジステアリン酸グリセリルのようなタイムディレイ材料を用いてもよい。例えば、モノステアリン酸グリセリルまたはジステアリン酸グリセリルのようなタイムディレイ材料を用いてもよい。コーティングはまた、放出を制御するための浸透圧治療錠を形成するために、米国特許第4,256,108号、第4,160,452号、および第4,265,874号に記載される技術を用いて行ってもよい。
【０１３０】
本発明の方法において有用な抗体と共にサイトカインは、例えばインビボ適用のため、注射による非経口投与のため、または個別にもしくは共に徐々に一定時間潅流することによって投与することができる。投与は、静脈内、動脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、腔内、または経皮であってもよい。
【０１３１】
非経口投与のための調製物には、滅菌の水性または非水性溶液、懸濁液、および乳液が含まれる。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油のような植物油、およびオレイン酸エチルのような注射可能有機エステルである。水性担体には、生理食塩液および緩衝培地を含む水、アルコール／水溶液、乳液、または懸濁液が含まれる。非経口溶媒には、塩化ナトリウム溶液、リンゲルデキストロース、デキストロースおよび塩化ナトリウムが含まれ、乳酸加リンゲル静脈内溶媒には、液体および栄養補給剤、電解質補給剤（リンゲルデキストロースに基づくもののように）等が含まれる。抗菌剤、抗酸化剤、キレート剤、増殖因子、および不活性ガス等のような保存剤および他の添加剤も同様に、存在してもよい。
【０１３２】
本発明には、成長成績を改善するために有用な様々な組成物が含まれる。本発明の一つの態様に従う組成物は、一つまたは複数のサイトカインまたはその生物学的断片を、一つまたは複数の抗生物質と共に、または含まずに、担体、アジュバント、賦形剤、または添加剤を用いて、動物に投与するために適した形にすることによって調製される。
【０１３３】
本発明のこの局面において用いるために適した抗生物質は、動物の水および／または飼料に対する添加剤として、および動物における微生物負荷を制限するために家畜学において慣例的に用いられるものである。これらの抗生物質の例には、リンコマイシン、スペクチノマイシン、およびアモキシシリンが含まれる。オーストラリアにおける食用動物に関する抗生物質使用の詳細な分析は、「食用動物における抗生物質の使用：動物およびヒトにおける抗生物質耐性菌（The use of antibiotics in food-producing animals：antibiotic-resistant bacteria in animals and humans.）」、Report of the Joint Expert Advisory Committee on Antibiotic Resistance.（JETACAR）、オーストラリア連邦、1999に記載されている。
【０１３４】
抗生物質は、動物における微生物負荷を減少させる目的で、動物に慣例的に投与される量と同じ量で動物に投与することができる。抗生物質のこれらの量は、当業者に既知であり、上記のJETACARにおいて参照されている。
【０１３５】
しばしば用いられる担体、アジュバント、または賦形剤には、炭酸マグネシウム、二酸化チタン、乳糖、マンニトール、および他の糖、タルク、乳蛋白質、ゼラチン、デンプン、ビタミン、セルロース、およびその誘導体、動物性および植物性油、ポリエチレングリコール、および滅菌水、アルコール、グリセロールおよび多価アルコールのような賦形剤が含まれる。静脈内賦形剤には、液体および栄養補給剤が含まれる。保存剤には、抗菌剤、抗酸化剤、キレート剤、および不活性ガスが含まれる。他の薬学的に許容される担体には、その内容が参照として本明細書に組み入れられる、例えばRemington's Pharmaceutical Sciences、第15版、Easton、マック出版社、1405〜1412、1461〜1487（1975）、およびThe National Formulary、XIV、第14版、Washington：アメリカ製薬工業会（1975）に記載されるように、塩、保存剤、緩衝液等を含む水溶液、非毒性賦形剤が含まれる。薬学的組成物の様々な成分のpHおよび正確な濃度は、当技術分野において日常的な技術に従って調節される。Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis for Therapeutics（第7版）を参照のこと。
【０１３６】
本発明に係る薬学的組成物は、成長促進量を局所または全身投与してもよい。この用途のために有効な量は、当然、サイトカインならびに動物の体重および全身状態に依存するであろう。典型的に、インビトロで用いられる用量は、組成物のインサイチューでの投与にとって有用な量の有用な指標となる可能性がある。例えば、Langer、Science 249：1527（1990）において様々な検討が記述されている。経口で用いるための製剤は、活性成分が、不活性な固体希釈剤、例えば炭酸カルシウム、燐酸カルシウム、またはカオリンと混合される、硬ゼラチンカプセルの形であってもよい。それらはまた、活性成分が、水、またはピーナッツ油、液体パラフィンもしくはオリーブ油のような油性媒体と混合される、軟ゼラチンカプセルの形であってもよい。
【０１３７】
水性懸濁液は通常、水性懸濁液の製造のために適した賦形剤と混合して活性材料を含む。そのような賦形剤は、（1）カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン、トラガカントゴム、およびアカシアゴムのような懸濁剤；（2）（a）レシチンのような天然に存在するホスファチド；（b）アルキレンオキサイドと脂肪酸との縮合産物、例えばステアリン酸ポリオキシエチレン；（c）エチレンオキサイドと長鎖脂肪族アルコールとの縮合産物、例えばヘプタデカエチレンオキシセタノール；（d）モノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビトールのような、エチレンオキサイドと、脂肪酸とヘキシトールとに由来する部分的エステルとの縮合産物、または（e）エチレンオキサイドと、脂肪酸とヘキシトール無水物とに由来する部分的エステルとの縮合産物、例えば、モノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン、であってもよい分散剤または湿潤剤であってもよい。
【０１３８】
組成物は、滅菌で注射可能な水性または油脂性懸濁液の形であってもよい。この懸濁液は、先に述べたそれらの適した分散剤または湿潤剤および懸濁剤を用いて既知の方法に従って調製してもよい。滅菌注射可能調製物はまた、非毒性の非経口許容希釈剤または溶媒中の滅菌注射可能溶液または懸濁液、例えば1,3-ブタンジオールの溶液としてであってもよい。用いてもよい許容される媒体および賦形剤は、水、リンゲル液、および等張塩化ナトリウム溶液である。さらに、滅菌の固定油は、溶媒または懸濁培地として慣例的に用いられている。この目的のために、合成モノまたはジグリセリドを含む如何なる商標の固定油も用いてもよい。さらに、オレイン酸のような脂肪酸も、注射剤の調製に用いられる。
【０１３９】
本発明のサイトカインおよび組成物は、小さい単層小胞、大きい単層小胞、および多層小胞のようなリポソーム輸送系の形で投与してもよい。リポソームは、コレステロール、ステアリルアミン、またはホスファチジルコリンのような多様なホスホリピッドから形成することができる。
【０１４０】
本発明のサイトカインまたは組成物の用量レベルは、体重1 kgあたり約1 μg〜約50 μgの次数であり、好ましい用量範囲は、約5μg〜約20 μg/kg体重/用量（多数回または1回）（1用量あたり動物あたり約100 μg〜約500 μg）である。1回量を得るために担体材料と混合してもよいサイトカインの量は、動物および特定の投与様式に応じて変化するであろう。例えば、ブタに対する静脈内投与を意図する製剤は、組成物全体の約5〜95％まで変化してもよい担体材料の適当な都合のよい量と共にサイトカイン約20 μg〜1 gを含んでもよい。用量単位剤形は一般的に、サイトカイン約5 μg〜500 mgを含むであろう。
【０１４１】
しかし、如何なる特定の動物の特定の用量レベルも、用いる特定のサイトカインの活性、年齢、体重、全身健康、飼料、投与時期、投与経路、排泄速度および薬剤の併用を含む多様な要因に依存するであろうと理解される。
【０１４２】
本発明の一つの特に好ましい態様において、サイトカインまたは複数のサイトカインは、外から投与されるよりむしろインビボで発現される。例えば、機能的プロモーターとの機能的な読み取り枠において、サイトカインをコードする構造的DNA配列を、適した翻訳開始および終了シグナルと共に挿入することによって、インビボでサイトカインを発現させることができる発現ベクターが作製される。ベクターは、宿主内での増幅を確実にするために、一つまたは複数の表現型選択マーカーおよび複製開始点を含む。形質転換のために適した原核細胞宿主には、大腸菌、枯草菌（Bacillus subtilis）、ネズミチフス菌（Salmonella typhimurium）、ならびにシュードモナス（Pseudomonas）属、ストレプトモナス（Streptomonas）属、およびブドウ球菌（Staphylococcus）属の様々な種が含まれるが、他の菌も選択肢として用いてもよい。適した宿主株の形質転換および発現後、細胞をさらなる期間培養する。細胞は典型的に、遠心、物理的または化学的手段による破壊によって回収し、得られた粗抽出物はをさらなる精製のために保持する。様々な哺乳類細胞培養系も同様に、組換え型蛋白質を発現させるために用いてもよい。哺乳類の発現系の例には、Gluzman、Cell 23：175（1981）に記載されるサル腎線維芽細胞のCOS-7細胞株、および適合性のベクターを発現することができる他の細胞株、例えば、C127、3T3、CHO、Hela、およびBHK細胞株ならびに当然ブタの細胞が含まれる。哺乳類発現ベクターは、複製開始点、適したプロモーター、およびエンハンサーを含み、同様に、如何なる必要なリボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライスドナーおよびアクセプター部位、転写終了配列、ならびに5'隣接非転写配列を含むであろう。SV40ウイルスゲノムに由来するDNA配列、例えば、SV40開始点、初期プロモーター、エンハンサー、スプライス部位、およびポリアデニル化部位を用いて、必要な非転写遺伝子要素を提供してもよい。細菌培養において産生された組換え型蛋白質は通常、細胞沈降物から初回抽出を行った後、1回またはそれ以上の塩析、水性イオン交換またはサイズ排除クロマトグラフィー段階によって単離する。蛋白質復元段階は必要に応じて、成熟蛋白質の構造を完成させるために用いることができる。最後に、最終精製段階のために高速液体クロマトグラフィー（HPLC）を用いることができる。蛋白質の発現に用いられる微生物細胞は、凍結融解の繰り返し、超音波処理、機械的破壊、または細胞溶解剤の使用を含む如何なる都合のよい方法によっても破壊することができる。精製のためのタグ配列を発現する発現系を用いると、精製が単純となるであろう。本明細書に規定する組換え型発現系は、発現されるDNAセグメントまたは合成遺伝子に結合した調節要素が誘導されると、異種蛋白質を発現するであろう。細胞不含翻訳系も同様に、本発明のDNA構築物に由来するRNAを用いてブタサイトカインを産生するために用いることができる。原核細胞宿主および真核細胞宿主について用いられる適当なクローニングおよび発現ベクターは、その開示が参照として本明細書に組み入れられる、Maniatis、Molecular Cloning：A Laboratory Manual（コールドスプリングハーバー、ニューヨーク、1985）に記載されている。
【０１４３】
特定のサイトカインをコードする核酸は、プラスミドDNAまたはウイルスベクター（ベクターはアデノウイルス、レトロウイルス、ポックスウイルスに由来する、特にワクシニアウイルスまたはMVAウイルス、ヘルペスウイルス、アデノ随伴ウイルス等に由来する）の形であると都合がよい。特定のサイトカインをコードする核酸は、感染性のウイルス粒子によって、または合成ベクター（陽イオン脂質、リポソーム、陽イオンポリマー等）、操作された細胞（該核酸によってトランスフェクトまたは形質導入された細胞）、もしくは操作されていない細胞（該核酸を本来含む）の形で輸送される。
【０１４４】
さらに好ましい変種に従って、関係する核酸は、複製に関して欠損である（宿主細胞において自律的に複製することができない）アデノウイルスベクターによって運ばれる。アデノウイルスに関する技術は、当技術分野の現状において記述されている（例えば、Graham and PrevecのMethods in Molecular Biology、1991、第7巻、109〜128頁、E. J. Murey編、ヒューマンプレスインクを参照のこと）。都合のよいことに、本発明の文脈において用いられるアデノウイルスベクターは、アデノウイルスのゲノムに由来し、少なくともITRs（逆方向末端反復配列）およびカプシド化配列を含み、E1アデノウイルス領域の全てまたは一部を欠損する。さらに、これはE3アデノウイルス領域の全てまたは一部を欠損しうる。しかし、都合のよい態様に従って、ポリペプチド、特に宿主の免疫系からの逃避を可能にする糖蛋白質gp19k（Goodingら、Critical Review of Immunology、1990、10：53〜71）をコードするE3領域の一部を保持することが好ましい。さらに、ベクターは、特にE2、E4、L1、L2、L3、L4、およびL5領域から選択される一つまたは複数の領域の全てまたは一部に影響を及ぼすさらなる欠失または変異を含みうる（例えば、国際出願国際公開公報第94/28152号を参照のこと）。この点を説明するために、E2 A領域のDBP（DNA結合蛋白質の意味）遺伝子に影響を及ぼす温度感受性変異を挙げてもよい（Ensingerら、J. Virol. 1972、10：328〜339）。もう一つの変種、または魅力的な組み合わせは、オープンリーディングフレーム（ORFs）6および7をコードする配列を除くE4領域を欠失することを含む（このような限定的な欠失は、E4機能が実行されるために必要ではない；Ketnerら、Nucleic Acids Res. 1989、17：3037〜3048）。好ましくは、関係する遺伝子（複数）は、欠失したアデノウイルス領域、特にE1領域の代わりにベクターに挿入される。いくつかの関係する遺伝子を用いる場合、それらは、ウイルスゲノムの同じ部位または異なる部位に挿入することができ、同じ調節要素の制御下で、または異なる要素の制御下に置くことができ、適当であれば、その発現レベルでの干渉現象を最小限にするために、それらのいくつかを互いに対して反対方向に置くことができる。組換え型アデノウイルスベクターのゲノムは、分子生物学技術または相同的組換え（国際公開公報第96/17070号を参照のこと）によって調製することができる。
【０１４５】
本発明の文脈において用いられるアデノウイルスベクターは、感染性のウイルス粒子を形成するために必要なペプチドを産生するために、トランスで欠損する機能（複数）を供給することができる補足細胞株において増殖させる。例えば、E1機能を補足するために細胞株293（Grahamら、J. Gen. Virol. 1977、36：59〜72）または二重の補足を行うために国際出願国際公開公報第97/04119号に記載される細胞株が利用されるであろう。同様に、欠損機能を全て補足するために適当な細胞株とヘルパーウイルスを用いることが可能である。産生されるウイルス粒子は、細胞培養物から回収され、必要であれば当技術分野の技術を用いて精製される（塩化セシウム勾配、クロマトグラフィー段階等）。
【０１４６】
本発明の文脈において用いられるアデノウイルスベクターは、ヒト、イヌ、トリ、ウシ、ネズミ、ヒツジ、ブタ、もしくはサル起源のアデノウイルスのゲノム、または異なる起源のアデノウイルスゲノム断片を含むハイブリッドに由来しうる。より詳しくは、イヌ起源のCAV-1またはCAV-2アデノウイルス、トリ起源のDAV、またはウシ起源の3型Badを挙げてもよい（Zakharchukら、Arch. Virol. 1993：128：171〜176；Spibey and Cavanagh、J. Gen. Virol. 1989、70：165〜172；Jouvenneら、Gene 1987、60：21〜28；Mittalら、J. Gen. Virol. 1995、76：93〜102）。しかし、調べる特定の動物種に対して特異的であるアデノウイルスベクターが好ましいであろう。例えば、ブタアデノウイルス（PAV）がブタに投与されるであろう。
【０１４７】
明細書を通して、「含む」ならびに「含む（comprising）」および「含む（comprises）」のようなその用語の変化形は、「含むがこれらに限定されない」ことを意味し、他の添加剤、成分、整数または段階を除外すると解釈されない。
【０１４８】
本発明は、以下の非制限的な実施例のみを参照としてさらに説明する。しかし、以下の実施例は説明するためであって、上記の本発明の普遍性に対する制限であると如何なるようにも解釈してはならないと理解すべきである。例えば、実施例の大半はブタに関するが、本発明は、例えば、ヒツジ、ウシ、およびニワトリを含む本明細書に開示の他の動物にも適用できると理解すべきである。
【０１４９】
実施例1 IL-5を投与したブタにおける循環血中の好酸球レベルに及ぼす影響
本試験は、組換え型ブタIL-5蛋白質およびDNA輸送ブタIL-5が、ブタの血液中の好酸球数に及ぼす影響を比較した。
【０１５０】
実験デザイン
2004528026.tif 000003
注記：
Genegun：金粒子をコーティングしたDNA
IM：筋肉内注射
−  処理あたりブタ6匹、約7〜8週齢（離乳期）、平均体重約15 kg
−  実験は、実験環境（PC2封じ込め施設）において投薬飼料Barastoc EziWean 150を与えた後、Bunge Grolean Creepを自由に与えて行った。
【０１５１】
組換え型IL-5を大腸菌において発現させて、GSTタグシステムを用いて精製した。（例えば、Smith, D.B. and Johnson, K.S.、（1988）、Gene 67：31〜40を参照のこと）。IL-5をGSTタグから切断して精製し、活性を確認するためにバイオアッセイにおいて試験した。
【０１５２】
IL-5 cDNA（シグナル配列を含む）をpCI DNAベクターにクローニングした。DNAは、Qiagen Giga Prepキット（Qiagen Inc、アメリカ）を用いて精製した。
【０１５３】
白血球および好酸球の総数をスライドガラスから計数した。
【０１５４】
行ったプロトコール
−4日  血液検査のための採血
−3日  血液検査のための採血
0日    体重測定および平均体重を標準化するように群分け
血液検査のための採血および全ての処理の投与（先に示したように1、2、3、4、5）、8時間後血液検査のための採血
1日    治療1の再投与、血液検査のための採血
2日    血液検査のための採血
3日    血液検査のための採血
4日    血液検査のための採血
7日    血液検査のための採血、体重測定
9日    血液検査のための採血
11日   血液検査のための採血、体重測定
16日   体重測定
【０１５５】
図1は、各治療群のブタから採取した血液の白血球数（WBC）における好酸球の百分率を示す。組換え型IL-5によって、数日間にわたって血液中の好酸球数が持続的に増加し、2回投与は1回投与より有効であることが容易に認められうる。各治療群のブタには好酸球の反応に変動を認め、すなわち高および低反応体と二相性の反応も明白であった。得られたもう一つの結論は、組換え型IL-5は、好酸球数の増加において、DNAより有効であったという点である。
【０１５６】
図2は、WBC数に関して群の間に有意差を認めなかったことを示しているが、図3は、対照と比較したWBCの好酸球百分率の増加に関する好酸球指数（統計分析）を示し、組換え型IL-5が好酸球の増加においてDNAより有効であること、そして組換え型蛋白質の2回投与は1回より有効であることを示している。分析は、曲線下面積を測定するPrism統計パッケージを用いた。さらに、図3は、IL-5の遺伝子銃輸送が好酸球の反応に関してpCI親プラスミド対照と類似であることを示している。
【０１５７】
図4に示すように、pCI DNA対照群と比較して全てのIL-5処理群の群全体の体重増加の増加（初回処理後16日間にわたって）を認めた（5〜20％の増加）。興味深いことに、DNA輸送IL-5は、組換え型IL-5より体重増加に対してより大きい影響を有するように思われた。この結果は、IL-5 DNAの発現によって媒介されるIL-5の持続的な投与がより有効となりうることを示唆している。
【０１５８】
図5および6は、IL-5を処理したブタが対照（pCI）より高い平均体重を有することを示している。これは、最終平均体重（図5）として、または試験期間を通して（図6）示される。体重増加の増加（初回処理後16日間にわたって、図6）は、IL-5 DNA処理ブタに関してより明白であり、IL-5処理ブタは全てpCI DNA対照群と比較してより高い最終平均体重増加を有する。
【０１５９】
この試験から、組換え型IL-5の投与によって、好酸球数の持続的な増加（WBCの百分率）が起こること、そして2回投与は1回より良好であることが明らかに示された。IL-5のDNAを投与した場合、組換え型蛋白質と同じレベルの反応を生じなかったが、好酸球の数は筋肉内注射によって増加した。遺伝子銃輸送は皮膚表面およびその隣接する下部にDNAを輸送するが、筋肉内注射は明らかに組織（筋肉）内に入ることから、輸送様式は重要であるかも知れない。
【０１６０】
実験は、実験環境において投薬飼料を用いて行ったが、ブタの体重増加に軽度から中等度の改善を示した（pCI対照と比較して体重増加の5〜20％増加）。この結果は、IL-5が成長促進剤として作用しうることを示した（明白な疾患または感染症の証拠を認めなかったため、微生物負荷の測定は行わなかった）。
【０１６１】
図4〜6は全て、IL-5を投与した群の体重増加の一般的増加（16日間にわたって）および総体重を示し、DNA輸送IL-5は、組換え型IL-5と比較して体重増加の増加が得られた傾向を認め、これはDNA対照より高い。
【０１６２】
血液中の好酸球数に及ぼすIL-5の影響は一過性であった（7日間）。
【０１６３】
実施例2  血液中の好酸球数に及ぼすIL-5高用量および多数回投与の影響
この試験は、組換え型IL-5の2用量（100 μg/500 μg）を比較して、好酸球数を上昇させるために1用量（100 μg）の多数回注射（×1/×2/×4）を比較した。
【０１６４】
実験デザイン
2004528026.tif 000004
注記：
Dは実験日である。
−  ブタ6匹／処理群。血液学および体重を測定した。
【０１６５】
実験は、実験環境（PC2封じ込め施設）において投薬飼料Barastoc EziWean 150の後にBunge Grolean CREEPを自由に与えて行った。総血球数および分別血球数は、Cell Dyn 3700血液学装置を用いて行った。
【０１６６】
行ったプロトコール
−4日  血液検査のための採血
−3日  血液検査のための採血、および体重測定
0日    血液検査のための採血および全ての処理の投与（先に示したように1、2、3、4、5）、8時間後血液検査のための採血
1日    血液検査のための採血、治療4および5の再投与
2日    血液検査のための採血
3日    血液検査のための採血
4日    血液検査のための採血、治療5の再投与
7日    血液検査のための採血、治療5の再投与
9日    血液検査のための採血
11日   血液検査のための採血
14日   体重測定
【０１６７】
図7から、IL-5の投与は、WBCの百分率に関する血液中の好酸球数を増加させたことが認められうる。分析は、曲線下面積を測定するPrism統計パッケージを用いた。高用量および多数回投与は統計学的に有意であり、100 μgの4回注射（0、1、4、7日目）は、より高用量（500 μg）の1回注射より有効であった。IL-5 100 μgの1回投与と2回投与は、循環中の好酸球の百分率を上昇させることに関して同等であった。
【０１６８】
実施例3  投与形態の効果
本試験は、異なる投与経路を用いて、組換え型蛋白質としてのIL-5の投与またはDNAの投与を比較した。それぞれの処理は、2週間の間に6回投与した（0、1、3、6、8、10日）。
【０１６９】
実験デザイン
2004528026.tif 000005
ブタ6匹／処理群。血液学を測定した。
【０１７０】
実験は、実験環境（PC2封じ込め施設）において投薬飼料Barastoc EziWean 150の後にBunge Grolean CREEPを自由に与えて行った。
【０１７１】
総血球数および分別血球数は、Cell Dyn 3700血液学装置を用いて行った。
【０１７２】
行ったプロトコール
0日    体重測定、血液検査のための採血および全ての治療の投与（1、2、3、4、5）
1日    血液検査のための採血、全ての治療の再投与
2日    血液検査のための採血
3日    血液検査のための採血、全ての治療の再投与
6日    血液検査のための採血、全ての治療の再投与
7日    血液検査のための採血
8日    血液検査のための採血、全ての治療の再投与
9日    血液検査のための採血
10日   血液検査のための採血、全ての治療の再投与
13日   血液検査および血清のための採血
15日   血清のための採血
21日   血液検査および血清のための採血
【０１７３】
図8から認められうるように、組換え型IL-5 IMとDNA IL-5 IMの複数回投与の効果は、血液中の好酸球（WBCの百分率）の持続およびレベルの増加であった。
【０１７４】
組換え型IL-5およびIL-5 DNAを2週間の間6回筋肉内注射すると、循環中の好酸球数を有意に増加させた（それぞれ、p＜0.05およびp＜0.01）。組換え型IL-5および遺伝子銃輸送IL-5 DNAを鼻腔内に輸送すると、DNA対照と比較して好酸球数に対してわずかな増加を示したが、これは統計学的に有意ではなかった（図9を参照のこと）。
【０１７５】
実施例4 IL-5を投与したブタの成長成績と免疫の改善
本試験は、離乳期（28日齢離乳期は試験の0日目であり、離乳期は42日まで持続する）から仕上げ段階（93〜113日）、および屠殺時（試験開始後133日）のブタの成長速度および健康を比較することによって、IL-5がブタの成長成績および免疫を改善するか否かを評価した。食用ブタのブタ舎の環境において、標準的な離乳期の投薬水および飼料を与えて、および与えずに、ブタに組換え型ブタサイトカインIL-5を投与して、生理食塩液を対照として用いた。
【０１７６】
実験デザイン
2004528026.tif 000006
【０１７７】
処理あたりブタ40匹を20のグループにおいて混合し、うち4個は、標準的な薬物を含む水および飼料を含み、4個は薬物を含む水および飼料を含まなかった。
【０１７８】
実験開始時の各群の総体重は同等であった。ブタは全て、試験開始時（0日）28日齢の雄性離乳期ブタであった。
【０１７９】
IL-5は生理食塩液において1 ml/ブタを注射した。
【０１８０】
体重は開始時、毎週1回、および試験終了時に測定した。最初の提案は、離乳期全体にわたって体重を測定するようにデザインした；しかし、IL-5投与による成長反応が有意であったために、体重測定は屠殺時まで継続した（ブタは161日齢であった）。
【０１８１】
開始時（治療前）および離乳期終了時に血液および血清試料を採取した。血液および血清は、試料を注射する前に採取した。
【０１８２】
組換え型ブタIL-5は大腸菌において発現させ、Qiagen Incアメリカの説明書およびClontech社、アメリカ、Talonマニュアル説明書に記述されるようにポリヒスチジンタグシステムを用いて精製した。IL-5は、実験開始前にバイオアッセイにおいて生物活性に関して調べた。
【０１８３】
行ったプロトコール
2004528026.tif 000007
2004528026.tif 000008
注記：
+  投薬（＋抗生物質）飼料および水
− 非投薬（抗生物質なし）飼料および水
A＆B＝サイトカイン処理および生理食塩液処理
【０１８４】
試験開始時、それぞれの群の平均体重および偏差を均等にした。このように、IL-5投薬群において認められた全体重または平均体重の増加は、IL-5の投与によるものであって、単に試験開始時の体重の差によるものではなかった。
【０１８５】
図10は、離乳期全体の各群の総体重を、体重増加と各群に残っているブタの数との組み合わせとして表した。これらは、全てのブタが重度の病原体の曝露を受けたために、おそらく感染症に対する耐性の反映である（ブタパラインフルエンザ菌（H. parasuis）「グラッサー病」による死亡、APPおよびブタ赤痢）。
【０１８６】
抗生物質を投薬したブタは、投薬していないブタより一貫して高い複合体重を有する（生理食塩液非投薬群の体重は、生理食塩液投薬群の体重の89％である）。
【０１８７】
IL-5投薬群は、総複合体重が投薬対照群より一貫して有意に高い（生理食塩液投薬群より1週目5.5％、2週目6.3％、3週目8.8％、4週目11.1％、5週目13.4％、6週目18.6％高く、ブタ20匹の群に関して6週間の間に、すなわち治療期間の間に89 kgである）。
【０１８８】
群の体重のグラフは、IL-5群と投薬生理食塩液対照群の間の体重差が、成長および仕上げ段階の間にさらに増加したことを示している（下記の結果を参照のこと）。
【０１８９】
図11は、離乳期の間の各群における個々のブタの平均体重を示す。死亡は通常、より低い体重のブタについて起こり、それによってこれらの群では平均体重がわずかに高くなったことに注意しなければならない。
【０１９０】
IL-5投薬群は、生理食塩液投薬対照と比較して6週間の間に一貫してより高い平均体重を有し、それは時間と共に増加するように思われた（W1 5.5％、W2 6.3％、W3 8.8％、W4 5.5％、W5 7.8％、W6 6.8％）。
【０１９１】
IL-5投薬群はIL-5投与の間ブタ1匹あたりの体重増加および増加速度（ROG）に関して生理食塩液投薬対照より一貫して増加した（ROG：W1 45.6％、W2 19.6％、W3 18.2％、W4 8.8％、W5 11.3％、W6 9.1％）。
【０１９２】
IL-5非投薬群は、最後の週（6週目）を除いて非投薬生理食塩液対照に対して一貫して小さい平均体重増加を示す。
【０１９３】
IL-5は、投薬した飼料および水と組み合わせた場合に、成長促進剤としておそらく作用して有意な作用を有する。抗生物質群では死亡を認めなかったことから（後に記述）、IL-5は免疫刺激剤としても作用する可能性がある。IL-5投薬群におけるブタの成長成績は、他の全ての群より一貫していた（一般的により狭い範囲とより大きい体重、図12）。これは、IL-5投与のもう一つの有用な作用であった。
【０１９４】
より小さいブタの体重が特にIL-5投与によって増加したように思われた。
【０１９５】
感染疾患または毎週の体重測定によって測定した体重減少による死亡に関する生産の損失を図13に示す。IL-5投薬群では死亡を認めず（図13）、先に記述したように（図10）群全体の体重の増加に及ぼすIL-5の正の作用に影響を及ぼす要因であった。死亡の大多数にはまた、先の体重減少が含まれたが、死亡としてのみ記録された。抗生物質投薬群は、非投薬群と比較して離乳期間の間の1またはそれ以上の週間の間に体重が減少したブタの数が少なかった。離乳後1週目は、大多数の（＞80％）ブタの体重が減少した。これらの結果からの有意な結論は、投薬IL-5処理群のブタは、体重減少を認めず、感染性による死亡もないということであった。非投薬群におけるIL-5処理も同様に、生産の損失を減少させた。
【０１９６】
表2は、上記の試験に関する剖検報告書を示す。
【０１９７】
（表２）剖検報告書の概要
2004528026.tif 000009
【０１９８】
表2からの結論は、離乳期ブタ80例からの死亡例は6例に過ぎなかったことであった（感染疾患5例、出血性外傷1例）。IL-5投薬群のブタは、他の群と比較して優れた状態および健康であることが報告された。
【０１９９】
IL-5および生理食塩液処理後に採血を行い、1時点のみを表す。図14に示すように、IL-5処理は、投薬および非投薬群の双方においてWBCの％好酸球に対して実質的な作用を有した。全般的な知見として、IL5プラス投薬は、抗生物質を含まないIL-5より高い好酸球数を示した。
【０２００】
IL-5は、投薬および非投薬処理の双方において血液の％好酸球を増加させたが、生理食塩液対照に対する成長の改善（成長速度または1日あたりの平均体重増加、平均体重増加、または総体重として測定）は、IL-5プラス抗生物質では抗生物質を含まないIL-5より高かった。このことは、％好酸球の増加のみが成長促進のメカニズムではない可能性があることをを示した。図15は、好酸球の絶対数と成長速度との正の関係が存在することを示している。
【０２０１】
離乳期間に対する増加速度を図16に示す。平均体重、総体重および体重増加と同様に、IL-5は投薬群のブタにおいて増加速度を一貫して増加させることが認められた。
【０２０２】
増加速度は、非投薬群と比較して投薬群において一貫して高く、非投薬IL-5群の増加速度は一般的に非投薬生理食塩液対照群より高かった。
【０２０３】
生産期間全体での治療群における全てのブタの総体重を図17に示す。IL-5投薬群は他の全ての群と比較して総体重が有意に増加することは明らかである。この増加は、IL-5投薬群に関するより高い平均体重増加（または増加速度もしくは1日増加平均）と死亡例がないことの組み合わせであるように思われる。離乳期間終了時のIL-5投薬群の総体重の増加は、屠殺時まで持続した。
【０２０４】
試験の間の個々のブタの平均体重を図18に示す。IL-5投薬群は他の全ての群より一貫して高い平均体重を示し、投薬群のブタは一般的に、非投薬群より高い平均体重を示した。死亡は典型的に、平均体重より小さいブタにおいて起こり、これによってその群の平均体重は人為的に増加するであろう。
【０２０５】
IL-5処理群は、ほぼ全ての時点で各抗生物質レジメを有するそれぞれの生理食塩液対照より高い平均体重を示す（図19および20）。抗生物質の添加によらず、IL-5を処理したブタは、各生理食塩液対照と比較して離乳期および成長期の間に一貫してより高い平均体重を示した。この傾向は仕上げ期間の際には持続せず、平均体重間の差は消失した。
【０２０６】
結果はまた、水に抗生物質を添加しない生理食塩液対照と比較して、抗生物質の添加によって、離乳期、成長期、および仕上げ期間の間に一貫して高い平均体重増加が起こることを示した（図21）。再度、平均体重のこれらの差はまた、仕上げ期間の間に減少した。この理由はなおも不明である；しかし影響を及ぼした可能性がある二つの混同される事象がある：
1）離乳期間に限って抗生物質を添加せず、生育期と仕上げ期間に提供した。したがって、抗生物質は、非投薬群におけるブタの成長速度または健康を増加した可能性がある。
2）仕上げ期間開始時に個々のブタ舎にブタを移した（93日）。これは食用ブタ飼育に関して標準的に行われることではないが、飼料変換比データを得るために行った。
【０２０７】
IL-5による処理は、おそらくより小さいブタの体重を増加させることによって、屠殺までの個々のブタの体重の変動を減少させた（図22）。
【０２０８】
IL-5処理は、屠殺時の屠畜体の可食部百分率に対して統計学的に有意な作用（p＜0.045）を有することが判明した（図23）。IL-5処理は、抗生物質投与にかかわらず、可食部百分率を改善した。温屠畜体重量の結果を図24に示す。IL-5は、ブタに抗生物質による投薬を行った場合、生理食塩液対照と比較して温屠畜体重量を増加させた。しかし、このIL-5の作用は、抗生物質を添加しないブタでは明白ではなかった。
【０２０９】
これらの結果は、IL-5処理は、双方の投薬レジメにおいて可食部百分率を増加させること、および抗生物質添加の存在で温屠畜体重量を増加させることによって屠殺特徴に対して正の作用を有することを示している。
【０２１０】
実施例5 IL-5を投与したブタの成長成績および／または免疫の反復
本試験は、標準的なブタ舎の環境において、組換え型ブタサイトカインIL-5を投与して、生理食塩液を対照として用い、標準的な離乳期投薬水および飼料を与えたまたは与えずに、抗生物質の減少量を与えた、雄性および雌性の離乳初期ブタ（28日齢から：試験0週目）、離乳期（0〜6週）、成長期（6〜13週）、および仕上げ段階（13〜19週）から屠殺時（19週）までの成長速度および健康を比較することによって、ブタの成長成績および／または免疫を改善するためにIL-5の評価を反復した。
【０２１１】
この試験（離乳期／成長期／仕上げ試験）は、抗生物質を正常量、減少量添加して、および添加せずに水を供給した場合の離乳期から屠殺時までのIL-5を提供した効果と対照（生理食塩液）の効果とを調べるためにデザインした。実験は、食用ブタ飼育条件でIL-5が抗生物質の代用となりうるか否かを評価して、ブタの一生を通してサイトカインを連続的に投与した場合の成長成績および可食部特徴に及ぼす影響を決定した。
【０２１２】
実験技法
本実験は、ブタを28日齢で離乳させて食用ブタ飼育環境において行った。注射は全て1 mlであった。処理あたりブタ16匹、処理あたり雄性8匹および雌性8匹であった。各処理におけるブタの総体重は実験開始時では類似であった。
【０２１３】
治療プロトコール
2004528026.tif 000010
7群は、比較のために食用飼育ブタ舎で先の試験を繰り返した。
【０２１４】
用いた記号
−は、試験を通して水または飼料に抗生物質を添加しなかったことを意味する。
0.5は、試験を通して通常用量の単一の抗生物質を用いたことを示す。
＋は、試験を通して用いた通常の抗生物質レジメを意味する。
IL-5+は、離乳期／成長期／仕上げ期に投与したIL-5を意味する。
IL-5+pは、離乳期のみに投与したIL-5を意味する。
【０２１５】
処理
A．生理食塩液1 mlを頚部筋肉内注射
B．IL-5 100 μgの1mlを頚部筋肉内注射
離乳期：1週間に2回注射
成長期および仕上げ期：1週間に1回注射
【０２１６】
ブタを離乳させて、実験開始時（0日、0週）に体重を測定し、離乳期間（6週）終了まで毎週、成長期終了時（13週）および仕上げ段階（19週）と、成長期（9週）および仕上げ段階（16週）に1回体重を測定した。血液および血清試料は、試験開始時（処理前）および離乳期、成長期、および仕上げ期の終了時に採取した。血液および血清は、処理注射前に採取した。血液学（総血球数および分別血球数）検査を行った。
【０２１７】
試験開始時、開始体重の混同する影響を減少させるために、全ての群の平均体重および偏差を均等にした。このように、成長に及ぼす正の効果は処理による効果であった。
【０２１８】
残念なことに、離乳後に下痢病が全ての処理群に大流行した。下痢病について最も可能性が高い原因は大腸菌であった。この感染症（複数）の影響によって、食用飼育ブタ舎での先の試験と比較して体重増加が減少した。図25は、抗生物質を加えたおよび加えない生理食塩液対照の平均体重を、本実験と先の実験とで比較している。この図は、本試験からの生理食塩液対照がより高い平均体重で開始しているが、離乳期終了時には生理食塩液投薬群に関して得られた平均体重（約2 kg少ない）がより低かったことを示している、感染疾患（下痢病）は、非投薬生理食塩液群では投薬群より初期段階で罹患した。異なる抗生物質レジメの群の総体重を図26、27、および28に示す。
【０２１９】
体重は、開始時から離乳期終了時まで測定した。これらのデータは、各処理群における残っているブタの体重および数の差を表す。結果から、IL-5の投与は、総体重に対して、特に抗生物質添加量を減少した場合または加えなかった場合に有用な作用を示すことが認められうる。これらの結果は、IL-5投与が感染疾患にもかかわらず対照よりブタの成長速度を増加させることができることを示している。この利益はまた、離乳期の間の如何なる所定の週における感染性疾患による死亡または体重減少によって測定される生産性の損失にも反映された（図29）。
【０２２０】
ブタパラインフルエンザ菌（H. parasuis）による死亡は、IL-5+群（離乳期2日後、おそらく試験開始時までに感染していた）において起こった。他の死亡は全て下痢病の結果であった。体重減少は、個々のブタの1回またはそれ以上の毎週の体重減少として定義した。IL-5処理群は、それぞれの生理食塩液対照と比較して生産性の損失が少なかった。抗生物質の添加も同様に、生産性の損失を減少させた。体重減少はまた、特にブタが雌ブタから離され、移動して、異なる社会群に混合され、乾燥飼料を与えられる離乳初期ではストレスの結果であった。IL-5を処理した群は、離乳期の間、水または飼料に抗生物質を添加しなかった生理食塩液対照と比較して一貫してより高い平均体重を示した（図30）。より高い平均体重はおそらく、疾患の重症度および関連する体重減少の減少が原因であった。さらに、IL-5は溶血性の大腸菌チャレンジの臨床効果を減少させることが示された。IL-5処理ブタにおけるより高い平均体重増加のパターンは、減少レベルおよび正常レベルの抗生物質添加でも繰り返された（それぞれ、図31および32）。しかし、IL-5処理の正の効果は、抗生物質を添加しなかった場合に認められたほど強くなかった（図30）。
【０２２１】
離乳期を通して各群の平均体重を、図30、31、および32の下に示し、図34に離乳期全体に増加した平均体重を示す。IL-5処理ブタは、ほぼ全ての時点で、各抗生物質レジメを有するそれぞれの生理食塩液対照より高い平均体重を示した（図30〜32）。標準誤差のバー（標準偏差／sqrt（残っている数））は、抗生物質レジメを行わないおよび正常抗生物質レジメの双方に関してサイトカインと生理食塩液対照とで重ならず、IL-5処理に関して平均体重の有意な増加を示した。さらに、全てのサイトカイン処理群の平均体重は全ての生理食塩液対照群より高く、このことは成長成績および／または健康に及ぼすIL-5の有用な影響を示している。雄性および雌性ブタの間の平均体重に明白または有意な傾向を認めなかった（データは示していない）。
【０２２２】
図33は、試験を通して生理食塩液処理ブタの平均体重に及ぼす三つの異なる抗生物質レジメの影響を示す。抗生物質の添加は明らかに、この試験においてブタの平均体重の増加を増加させ、健康および生産性を増加するために成長促進および／または免疫刺激が必要であることを証明している。
【０２２３】
IL-5を処理した群のブタは、水または飼料に抗生物質を添加した、または添加しないそれぞれの生理食塩液対照と比較して、離乳期の間に一貫してより高い平均体重増加を示した（図34）。これらの結果はまた、抗生物質を添加すると、水に抗生物質を添加しない生理食塩液対照と比較して離乳期の間に一貫してより高い平均体重が得られることを示した。
【０２２４】
図35は、非抗生物質生理食塩液対照と比較して離乳期での平均体重の増加を示す。得られた結論は、抗生物質の添加によって、離乳期、成長期、および仕上げ期において生理食塩液対照（抗生物質を用いない）より一貫して高い平均体重が得られたということであった。同様に、抗生物質の量を減少させると、最終平均体重は6.6 kg/ブタ（〜8％）に増加したが、通常量の抗生物質は、最終平均体重を10.1 kg/ブタ（〜12％）に増加した。
【０２２５】
図36に示すように、IL-5投与（抗生物質を用いない）によって、離乳期、成長期、および仕上げ期において対照より一貫して高い平均体重が得られた。IL-5は、生理食塩液対照と比較して最終平均体重を12.3 kg（〜15％）まで増加させた。抗生物質量を減少させた生理食塩液対照（生理食塩液0.5）と比較した平均体重を図37に示す。IL-5投与（抗生物質量を減少）は、離乳期、成長期、および仕上げ期間において生理食塩液対照（抗生物質量を減少）より一貫して高い平均体重を示した。IL-5は同様に、生理食塩液対照に対して最終平均体重を6 kg（〜7％）増加させた。
【０２２６】
図38は、通常量の抗生物質を添加した生理食塩液対照（生理食塩液+）と比較した平均体重を示す。IL-5投与（通常量の抗生物質）は、離乳期間終了時（6週）から成長期間終了時（13週）までの間に生理食塩液対照（通常量の抗生物質）より一貫して高い平均体重を示した。
【０２２７】
IL-5+ -は、W、G、F期間に投与したが、IL-5 +pは離乳期間のみに投与した。IL-5+は最終平均体重を1.3 kg減少（〜-1.5％）させたが、IL-5+pは、最終平均体重を1.7 kg（〜2％）増加させた。その結果、IL-5を処理した群のブタは、水または飼料に抗生物質を添加していない生理食塩液対照と比較して離乳期、成長期、および仕上げ期の間に一貫して高い平均体重を示した。結果はまた、抗生物質を添加すると、水に抗生物質を添加していない生理食塩液対照と比較して離乳期、成長期、および仕上げ期間の間に一貫してより高い平均体重が得られることを示した。IL-5処理は体重増加および感染疾患による死亡の減少に関して、抗生物質添加と同等であった。通常量の抗生物質添加群において、生理食塩液対照群は、離乳期末期から成長期末期まで全てのサイトカイン処理と比較して減少した平均体重を示した。この傾向は、仕上げ期間の間に持続せず、全ての通常量の抗生物質群の最終平均体重は類似であった。この変化の理由は不明であり、食用飼育ブタ舎におけるこれまでの試験について認められた。これは、仕上げ期間（IL-5+は13週では4.7 kg高く、19週では1.3 kg低かった）の際のIL-5+と生理食塩液対照の間の平均体重の6 kgの差によって強調された。この相違はまた、IL-5+とIL-5+pの間の差によっても強調された（IL-5+は、IL-5+ pと比較して13週では1.3 kg高く、19週では2 kg低かった）。
【０２２８】
図39は、サイトカイン処理が、非投薬群を除き、P2値によって測定した類似の背部脂肪値を示したことを示している。個々のブタの最終体重に対してP2をプロットすると、生理食塩液とIL-5群との間の主な差は、生理食塩液群の個々の体重がより低いことが原因であった（図40）。それぞれの期間においてFCRを測定したが、明白な差は検出されなかった（データは示していない）。
【０２２９】
全ての群に関する好酸球レベルも決定して、これらを図41に示す。
【０２３０】
血液学および分別血球数算定は、試験中の様々な時点で行った。これらのパラメータには、好酸球レベルを除き群の間で有意差を認めなかった（図41）。IL-5は血液中の好酸球レベル（絶対数および分別血球数の双方に関して）を有意に増加させた。
【０２３１】
IL-5投与によって、生理食塩液対照と比較してブタの平均体重は実質的に増加した。これは、抗生物質を添加しない群において特に明白であった（IL-5：最終平均体重の増加12.3 kgまたは約15％）。離乳期および成長期では、通常の抗生物質群の生理食塩液対照とサイトカイン処理の間に差を認めたが、これは仕上げ期間の終了時まで持続しなかった。成長期の終了時、通常量の抗生物質IL-5処理ブタは、生理食塩液対照と比較して平均体重を増加させた。これらの体重増加の増加は実質的であったが、屠殺時の体重増加の増加には至らなかった。
【０２３２】
IL-5は、全ての抗生物質処理群において離乳期の間の生産性の損失を減少するように思われた。IL-5は、大腸菌チャレンジの有害な作用を減少することが示された。IL-5は、水または飼料に抗生物質を添加したまたは添加しない場合の、特に自然感染の場合の感染に対する抵抗性を増加させる可能性がある。
【０２３３】
IL-5は、感染チャレンジからブタを保護して、おそらく重度の疾患チャレンジがなければブタにおいて成長促進作用を有するように思われる。IL-5投与はまた、体重または体重増加の変動を減少させるように思われた。
【０２３４】
IL-5は、疾患チャレンジの作用を減少させ、非投薬対照と比較して抗生物質の非存在下で平均体重を一貫して増加させた。
【０２３５】
IL-5投与は、試験の間、平均体重の増加に対して実質的な影響を及ぼし、離乳期にIL-5を投与した、または離乳期、成長期、および仕上げ期を通して連続的にIL-5を投与した群の間に有意差を認めなかった。
【０２３６】
IL-5試験の概要
飼料および水に治療下レベルの抗生物質を添加すると、離乳期においてより高い（＞10％）平均体重、体重増加、または総体重が得られた（双方の試験に関して）。
【０２３７】
離乳期終了時の抗生物質投薬群の成長成績の増加は、屠殺時の加工生産性の増加（2〜10％）に至った（双方の試験）（同様に温屠畜体重量、1回目の試験）。この増加は、1回目の試験において成長期および仕上げ期間に抗生物質を添加しなかった場合により大きかった可能性がある（ブタは全てこれらの期間に投薬された）。2回目の試験では屠殺時の平均体重に関して、非抗生物質および通常量の抗生物質添加生理食塩液対照の間に有意差を認めた（p＜0.001）。
【０２３８】
IL-5は、血液中の循環好酸球を有意に増加させた（双方の試験において）。
【０２３９】
IL-5プラス投薬の成長成績および健康に及ぼす有用な作用は、1回目の試験において顕著であった。これは、生理食塩液投薬対照群と比較して治療期間終了時の総体重の18％の増加、体重増加の9％増加、または平均体重の7％増加から明らかであった（1回目の試験）。この結果は、IL-5プラス通常量の投薬群が、離乳期においてそれぞれの投薬生理食塩液対照（用いた雄性および雌性ブタ）に対して体重増加の11％の増加、および平均体重の7％の増加を示した2回目の試験においても繰り返された。
【０２４０】
抗生物質の添加によって、離乳期のブタの体重減少に関して生産性の損失は減少した（双方の試験）。IL-5はまた、それぞれの生理食塩液対照と比較しても生産性の損失を減少させた（双方の試験）。
【０２４１】
重度の疾患チャレンジを認め、IL-5投薬群を除く全ての群において10〜20％の死亡率を認めた（1回目の試験）。IL-5は同様に、体重減少に関する生産性の損失を減少させ、投薬群において感染症に対する抵抗性を増強させる可能性があるが、これは非投薬群では明白ではなかった。2回目の試験では重度の離乳後下痢病が起こったが、完全な抗生物質添加および／またはIL-5またはIRAPによって、生産性の損失は減少した。
【０２４２】
IL-5投与による成長成績の増加および生産性の損失の減少の他に、IL-5を投与した場合に離乳期のブタの体格および成長の変動が減少した。この傾向は、IL-5群に関して最終体重（133日）まで持続した。2回目の試験ではIL-5投与によって類似の傾向を認めたが、変動の減少は有意ではなかった。
【０２４３】
IL-5処理群は、それぞれの生理食塩液対照と比較して有意に高い平均体重および平均体重の増加を示した（2回目の試験）。これは、抗生物質の使用量を減少させるために、または抗生物質を添加せずに飼育したブタの成長速度を増加させるために特に重要であった。これは、全てのサイトカイン処理群（抗生物質レジメを行った場合、行わなかった場合、および減少量で行った場合）が、それぞれの生理食塩液対照より高い平均体重および平均体重増加を示す、すなわち抗生物質を添加していないIL-5処理群は、完全に投薬した生理食塩液群と同等またはそれより高い平均体重を示す、という事実によって強調された。
【０２４４】
最も適切な生産パラメータの一つは、加工屠畜体重量である（温屠畜体重量−内臓、ブタの足、および頭部）。抗生物質投薬生理食塩液群のブタは、非投薬生理食塩液の群よりほぼ3 kg高い平均温屠畜体重量を有した。対照的に、投薬IL-5処理ブタは、投薬生理食塩液対照より温屠畜体重量が6 kg増加した。IL-5処理群は全て、生理食塩液非投薬対照と比較して同等またはより高い平均温屠畜体重量を示した。様々な免疫および血液学パラメータを測定した。最も明白な傾向は、IL-5投与による好酸球を伴ったが、全てのパラメータおよび生産特性を、独立した起源による統計学的な差に関して分析した。表3は、試験中の死亡数を示す（42および133日）。1群20匹で開始した。
【０２４５】
（表３）試験中の死亡数
2004528026.tif 000011
【０２４６】
表3から得られた結論は、試験中にIL-5投薬群において死亡を認めなかった点である。同様に、試験終了までに10〜20％の範囲で他の全ての群において死亡を認め、ほとんどの死亡は離乳期の間に起こった。
【０２４７】
IL-5投薬ブタおよびIL-5非投薬ブタは、他の群より一貫した体重範囲を有する傾向があり、これはいくつかのブタ飼育業にとっては経済的利益である（図22）。IL-5投薬群のみが全て個々の体重が90 kgを超えていた（IL-5投薬群は死亡例がなく、他の群における死亡は一般的により体重の少ないブタを含むことに注目）。
【０２４８】
図23に示すように、IL-5処理ブタは、それぞれの生理食塩液対照より有意に高い％可食部を有した（p＜0.045）。投薬群のブタは、非投薬群より高い％可食部を有する。IL-5投薬群のブタは、生理食塩液投薬対照より実質的に高い温屠畜体重量を有する。投薬群は、非投薬群より高い温屠畜体重量を有する（図24）。
【０２４９】
実施例6  出血性大腸菌に感染した離乳期ブタに対する組換え型IL-5の輸送
本研究は、IL-5が出血性大腸菌のような感染症に曝露されたブタの健康を改善できるか否かを調べた。
【０２５０】
一つの目的は、IL-5が離乳時に大腸菌に感染したブタにおける成長を改善できるか否かを決定することであった。さらなる目的は、IL-5が感染率を減少させて、大腸菌に感染したブタの健康を改善できるか否かを決定することであった。最後に、離乳期ブタにおける大腸菌感染症に対してIL-5の予防能または治療能の評価を、現在の抗生物質治療と比較して決定できることが期待された。
【０２５１】
平均体重5.4 kgの雄性離乳期ブタを、群の間の平均体重が同等になるように8群に割付した。ブタを群ごとのブタ舎に収容した。ブタに固形飼料および水を自由に与えた。
【０２５２】
ブタにサイトカインまたは抗生物質アプラランを処理して、図42に概要を示すスケジュールに従って大腸菌をチャレンジした。大腸菌は、108cfu/mlを含む8 ml用量で経口投与した。図42に概要を示すように、大腸菌の初回チャレンジの−2日目、0日目、および+6日目に静脈穿刺によってブタから採血した。血液は先に記述したように、免疫パラメータに関してアッセイした。ブタの体重は−2日目、および7日目の試験終了時に測定した。
【０２５３】
それぞれのブタに関して、チャレンジ後2日目から6日目まで毎日糞試料を採取した。これらの試料をヒツジ血液寒天上で培養して大腸菌負荷を定量した。チャレンジ後毎日の糞の状態を、臨床兆候に関する指摘と共に正常、湿潤、または下痢として記入した。
【０２５４】
実験終了時、ブタを安楽死させて、試料を、小腸（小腸の長さに沿って25％、50％および75％）、盲腸および結腸を含む消化管の異なる領域、ならびに糞から採取した。これらの死後試料も同様に、ヒツジ血液寒天上に播種して大腸菌負荷を定量した。ヒツジ血液寒天上での増殖は、0〜5点として採点し（0は増殖を認めない、1は一次接種物での増殖を意味し、2は一次線条での増殖を意味し、3は二次線条における増殖を意味し、4は三次線条における増殖を意味し、および5は最終線条における大腸菌の増殖を意味する）、群の平均値および標準誤差を計算した。
【０２５５】
表4は、サイトカイン実験に適用した処理および用量を示す。
【０２５６】
（表４）サイトカイン実験に適用した処理および用量（1群あたりN=8）
2004528026.tif 000012
【０２５７】
図42は、大腸菌チャレンジによるサイトカイン実験に関する事象のタイムライン順序を示す。IL-5またはアプラランを処理したブタは、生理食塩液を処理したブタと比較して食欲が改善したことが認められうる（図43）。この摂取量の改善は、飼料変換率を効率よく変化させなかった（データは示していない）。食欲の増加は、健康が改善したことおよび炎症反応が減少したことの指標であった。チャレンジの期間が短かったために、5日間のチャレンジ期間の間に体重増加に関して処理群の間に有意差を認めなかった。
【０２５８】
IL-5およびアプラランによって処理したブタは、生理食塩液を処理した対照群のブタと比較して糞への大腸菌の排泄の減少を示した（図44）。アプラランまたはIL-5を処理したブタは、2日目から5日目までの細菌の排泄を減少させた。チャレンジ後6日目では、全ての群からの細菌排泄は同等であった。全体として、アプララン処理群は、全ての処理の中で最も少ない細菌排泄を示した。
【０２５９】
治療群に関して全チャレンジ期間に対して記録された糞スコアは、生理食塩液処理対照と比較してアプララン処理ブタに関して糞排泄の80％減少を示したのに対し、IL-5処理ブタは、生理食塩液処理対照と比較して細菌排泄の43％減少を示した（図45および46）。
【０２６０】
食用ブタ飼育状況において、感染したブタからの細菌の排泄が減少すればさらに、群れまたはブタ舎の他のメンバーにおける感染症をさらに減少させ、それによって離乳期のブタの健康を改善して、後期段階での成長能を増強するであろう。
【０２６１】
湿糞または下痢の存在として記録される臨床兆候は、IL-5またはアプラランを処理したブタにおいて減少した（図47）。IL-5を処理したブタは、湿糞および下痢を記録した症例が、生理食塩液対照またはアプララン処理より少なかった。アプラランを処理したブタは、生理食塩液対照より湿糞の記録がより少なかったが、チャレンジ後期間では下痢の発生の軽微な増加を示した（図47）。
【０２６２】
これらの臨床兆候を生理食塩液対照と比較して症状の減少百分率として記述した場合、われわれは、IL-5処理が臨床兆候の64％減少を引き起こしたのに対し、アプラランは臨床兆候を27％減少させたことを発見した（図48）。
【０２６３】
臨床症状の結果は、IL-5およびアプラランがいずれも、大腸菌による感染症の外面的な兆候を減少させることができたことを示した。健康に関するこの測定において、IL-5は、大腸菌感染症に対する現行の抗生物質治療であるアプラランと同様の効果を示した。
【０２６４】
アプラランおよびIL-5処理はいずれも、生理食塩液処理対照と比較して消化管（GIT）のほとんどの領域における細菌負荷を減少させた（図49）。IL-5処理の影響は小腸において最も顕著であった。
【０２６５】
全ての培養物スコアをそれぞれのブタに関して記録して、群の平均総スコアを計算するために用いた場合（図50）、IL-5を処理したブタは、可能性がある30点のうちスコアが15点未満であり、生理食塩液対照ブタに関しては17/30、およびアプララン処理ブタに関しては12/30であった。これらのデータを生理食塩液対照（図51）と比較して大腸菌培養物スコアの減少百分率として表記した場合、IL-5の予防的適用によって、消化管における大腸菌量は15％減少した。
【０２６６】
これらの結果は、生理食塩液対照と比較した場合、細菌負荷がIL-5処理ブタにおいて減少したことを示し、若いブタにおける出血性大腸菌の制御に対する本調製物の価値をさらに強調する。
【０２６７】
大腸菌培養物に関する死後の結果を腸管における位置に基づいて分離すると、IL-5およびアプラランの作用に差が認められる可能性がある（図52）。小腸は分泌性の下痢が発現される部位であるため、小腸（前腸）における大腸菌細菌負荷は、疾患の重症度に相関する。IL-5による処理は、生理食塩液対照と比較して小腸における細菌負荷を36％減少させ、アプラランは小腸における細菌負荷を32％減少させた。後腸領域（盲腸および結腸）において、アプラランに関して記録された細菌負荷は、全ての処理の中で最低であった（図49）。IL-5が前腸において細菌負荷を減少させることができることは、処理によって出血性の大腸菌感染症に関連した疾患の重症度が減少する可能性があることを示唆した。このように、IL-5は、ブタの生産に及ぼすこの疾患の有害な影響を制御するために、養豚業において現在投与されている抗生物質の代用または補助となる可能性がある。
【０２６８】
結論
IL-5はブタの健康を改善した、すなわちIL-5は、出血性大腸菌感染症が存在する場合の出血性下痢に関連した糞の変化に関して、疾患の臨床兆候を減少させた。同様に、IL-5はチャレンジの際の食欲を改善した。
【０２６９】
IL-5処理によって得られた健康の改善は、ブタにおける出血性大腸菌を治療する現行の方法である抗生物質アプラランによる処理によって得られた改善より、場合によっては大きかった。
【０２７０】
IL-5処理によって、生理食塩液処理対照と比較して感染の経過における糞中の細菌排泄が減少した。IL-5を処理したブタは、チャレンジ後3/5日において生理食塩液対照より有意に少ない細菌排泄を示した。そのような結果は、食用ブタ飼育状態において、環境における細菌負荷を減少させることによって、感染率が減少する可能性があることを示唆した。
【０２７１】
IL-5投与の効果によって、生理食塩液処理対照と比較してGITのほとんどの領域において細菌数が減少した。
【０２７２】
有意に、IL-5は、大腸菌感染症の経過において分泌性下痢が通常存在する部位である小腸（前腸）における細菌負荷を36％減少させた。小腸における細菌負荷は、疾患の重症度に関連しているため、IL-5は、疾患の進行および病理に対して有意な治療効果を有する可能性がある。
【０２７３】
IL-5処理は、小腸における重要な部位に存在する大腸菌の他に、疾患の臨床兆候である死後の腸に存在する大腸菌レベルの減少において、畜産業において現在用いられている抗生物質治療であるアプラランと同等の作用を示した。
【０２７４】
IL-5とアプラランの、細菌排泄、臨床兆候、および死後の細菌負荷に対する同等の効果の概要を表5に示す。
【０２７５】
（表５）若い離乳期のブタにおける出血性大腸菌感染症を制御するためのIL-5（IL-5）およびアプラランの治療効果を比較する概要。本実施例において暗い矢印は正の作用を示し、明るい矢印は負の作用を示す
2004528026.tif 000013
【０２７６】
実施例7  ブタ赤痢チャレンジに曝露したブタに対する予防としての組換え型IL-5の輸送
本実施例の一つの目的は、ブタ赤痢を引き起こす腸の炎症性病原体、Brachyspira（Serpulina）hyodysenteriaeに感染したブタの健康を、IL-5が改善できるか否かを決定することであった。さらなる目的は、ブタ赤痢をチャレンジした状態で、IL-5がブタの成長速度を改善できるか否かを決定することであった。
【０２７７】
平均開始体重が6.5 kgの雄性のブタを、ブタ8匹からなる治療群に割付した（表6）。ブタを群ごとのブタ舎に収容して、それぞれのブタ舎は、それぞれの治療群から同じ群を含む。1群8匹を別室に収容して、無処理対照として感染させなかった。ブタには固形飼料と水とを自由に与えた。
【０２７８】
ブタ赤痢をチャレンジする前に、ブタを表6に記載するように組換え型IL-5または生理食塩液によって処理した。サイトカインおよび抗生物質であるリンコマイシンを、表7に概要した間隔で筋肉内注射によって投与した。0日目、1日目および2日目に、細胞約108個を含む対数増殖期のスピロヘータ培養物120 mlを1回経口投与として与えて、ブタにBrachyspira hyodysenteriaeを感染させた。
【０２７９】
糞の綿棒標本および血液試料を、表7に記載する間隔でそれぞれのブタから採取した。糞の綿棒標本は、スピロヘータの有無に関して培養した。血液試料は、上記の実施例1に記載したように免疫学的パラメータに関してアッセイした。ブタは実験の間毎週体重を測定し、これは初回チャレンジ後19日および20日に安楽死によって終了した。後腸領域からの死後の綿棒標本をスピロヘータの有無に関して培養して、消化管組織の肉眼的な病態を記入した。
【０２８０】
（表６）ブタ赤痢感染症の予防的治療としてのIL-5の有効性を評価するためのチャレンジ試験に関する治療群の概要
2004528026.tif 000014
【０２８１】
（表７）ブタ赤痢感染症の予防的治療としてのIL-5の有効性を評価するための実験技法のプロトコール
2004528026.tif 000015
【０２８２】
ブタ赤痢に感染したブタの全ての群は、糞の培養によって検出するとチャレンジ後5日目から糞中にスピロヘータの排泄を認めた（図53）。IL-5を処理したブタは、チャレンジ後14日までに生理食塩液処理対照群と比較してスピロヘータの排泄レベルの減少を示し、IL-5処理動物の感染症が生理食塩液処理対照より速やかに寛解していることを示唆した。抗生物質リンコシンを処理したブタは、14日までに糞中へのスピロヘータ排泄の兆候を示さなかった。
【０２８３】
死後の後腸から採取したスピロヘータ培養物は、IL-5によってブタを処理すると、生理食塩液対照と比較して腸に存在するスピロヘータ数が減少することを示している（図54）。IL-5はまた、生理食塩液処理対照と比較して、盲腸、前結腸、後結腸、および糞におけるスピロヘータ培養スコアを減少させることができた。重要なことは、死後のスピロヘータ負荷を減少させるIL-5の作用は、リンコシン抗生物質によって示された作用と同等であった。スピロヘータの負荷に関してリンコシンと類似の結果を得たが、IL-5処理では変動が減少し、このことは、IL-5の適用によってより一貫した処理の結果が得られることを意味している。
【０２８４】
生理食塩液処理ブタと比較すると、IL-5処理によって、盲腸におけるスピロヘータ数の60％減少、前結腸では63％減少、後結腸では47％、および糞中のスピロヘータの68％減少を認めた（図55）。リンコシン処理によって、死後のスピロヘータ負荷はそれぞれ93％、89％、88％、および100％減少した。
【０２８５】
腸におけるスピロヘータ数の減少の他に、IL-5による処理はまた、糞の状態によって示される感染症に関連した臨床兆候を減少させた。図56は、IL-5処理ブタが、生理食塩液処理対照と比較して、赤痢に罹患した糞または湿糞（形をなさない異常に湿った糞）を示す兆候がより少なかったことを示している。生理食塩液処理ブタ8匹中、7匹は、糞の状態によって決定されるブタ赤痢の臨床発現を示し、その3匹は、本質的に赤痢様の粘液性の血性糞であった。IL-5による処理によって、糞中の臨床兆候の発生は感染したブタ8匹から3匹に減少した（図56）。リンコマイシン抗生物質を処理したブタの感染症の臨床兆候は無視できる程度であり、この群ではブタ8匹のみが湿糞を示し、非感染対照ブタの結果と同等であった。
【０２８６】
IL-5によるブタの処理によって、生理食塩液処理と比較して死後の後腸および糞中に存在するスピロヘータ数が減少した。IL-5は、糞の状態によって検出されるように、生理食塩液対照と比較してブタ赤痢感染症の臨床発現を減少させた。IL-5による糞状態の改善によって決定される健康の改善、ならびに死後の腸および糞におけるスピロヘータの存在の減少は、ブタの群れにおけるブタ赤痢感染症の現在の治療である抗生物質リンコシンを用いて得られた結果と同等であった。
【０２８７】
実施例8  ブタに対するIL-3の投与
本試験は、組換え型ブタサイトカインIL-3を投与して、生理食塩液を対照として用い、食用飼育ブタ舎の環境で標準的な離乳期の投薬水および飼料を与えた場合、または与えなかった場合の、離乳期（試験0日目で28日齢、離乳期は42日まで持続する）から仕上げ段階（93日から113日）および屠殺時（試験開始後133日）の成長速度および健康を比較することによって、IL-3がブタの成長成績および免疫を改善できるか否かを評価した。
【０２８８】
実験デザイン
2004528026.tif 000016
【０２８９】
処理あたりブタ40匹を群において混合して、4群には標準的な投薬水および飼料を与え、4群には投薬飼料または水を与えなかった。
【０２９０】
実験開始時のそれぞれの群の総体重は同等であった。試験開始時（0日）のブタは全て28日齢の離乳期であった。
【０２９１】
IL-3の生理食塩液溶液1 ml/ブタを注射した。
【０２９２】
体重は開始時、試験中、および試験終了時に測定した。試験は、開始後133日まで継続した、すなわち離乳期間の開始後133日目に最終体重を測定してから、動物を屠殺した。離乳期0〜42日、成長期42〜93日、仕上げ期93〜133日。処理は、離乳期のみに行った。
【０２９３】
血液および血清試料は開始時（処理前）および離乳期終了時に採取した。血液および血清は、試料を注射する前に採取した。
【０２９４】
材料および方法
組換え型ブタIL-3を大腸菌に発現させて、実施例4に記載するようにポリHisタグ系を用いて精製した。IL-3の生物活性は、実験開始前にバイオアッセイにおいて調べた。
【０２９５】
行ったプロトコール
2004528026.tif 000017
2004528026.tif 000018
注記：
+  投薬（＋抗生物質）飼料および水
− 非投薬（抗生物質なし）飼料および水
【０２９６】
試験開始時、平均体重および偏差は群の間で均等にした。図57は、IL-3が投薬および非投薬生理食塩液対照に対して増加速度を増加させたことを示し、増加速度は、非投薬群と比較して投薬群では一貫して高かった。
【０２９７】
図58は、IL-3投薬群が他の全ての群より高い平均体重を示したことを示している。同様に、投薬群のブタは一般的に、非投薬群より平均体重が大きいことを示している。
【０２９８】
投薬群においてIL-3を投与したブタの平均体重は、生理食塩液投薬対照の平均体重より3.5 kg多かった。投薬群は、非投薬群より高い平均体重を示した（投薬群と非投薬生理食塩液対照との間で約3.5 kgの差）（図59）。
【０２９９】
図60は、IL-3投薬群のブタが他の群より一貫した体重範囲を有したことを示し、これは、特に、最終体重または屠畜体の変動がより少ない必要がある場合、ブタ舎にとって経済的利益である。
【０３００】
IL-3非投薬群のブタは、それぞれの非投薬生理食塩液対照より実質的に高い％可食部を有し、それによってよりよい屠畜体品質を有した（図61）。屠殺時の平均温屠畜体重量もまた、IL-3処理投薬および非投薬群のブタではそれぞれの生理食塩液対照より良好であった（約4 kg/ブタおよび2 kg/ブタ）（図62）。投薬群はまた、非投薬群より高い温屠畜体重量を有した。
【０３０１】
生理食塩液およびIL-3処理投薬群のブタのFCRは類似であった、例えば、FCR生理食塩液+ 2.50およびIL-3+ 2.52（標準誤差のバーが重なり合う）。
【０３０２】
図63は、IL-3投薬群が、生理食塩液投薬群と比較して全てのブタの総体重に実質的な増加を示したことを示している（約10％の増加）。総体重の増加は、処理期間の間（離乳期、0〜42日）では明白でなかったが、反応の持続は、治療後持続した。
【０３０３】
実施例9  血球集団に及ぼすブタIL-3の影響を調べる
本試験は、ブタの血液中の細胞集団に及ぼす組換え型ブタIL-3蛋白質を投与する影響を調べた。
【０３０４】
行ったプロトコール
実験は、実験環境（PC2封じ込め施設）において投薬飼料（Barastoc EziWean 150後にBunge Grolean）を自由に与えて行った。
【０３０５】
実験デザイン
2004528026.tif 000019
【０３０６】
注射は、ブタの後肢に筋肉内注射した。ブタは試験開始時9週齢であった。
【０３０７】
血液試料は血液検査のために0、1、2、3、4、7、9、11、15、および17日に採取した。Abbott Cell-Dyn 3700を用いて完全な血液検査を行い、選択した塗末標本の検査を確認のために行った。
【０３０８】
総白血球数、リンパ球、単球、血小板、好中球、または赤血球数には有意な変化または傾向を認めなかった（データは示していない）。
【０３０９】
図64は、IL-3を毎日投与したブタにおいて好酸球の増加を認め、IL-3の高用量を1回投与したブタにおいてより小さい増加を認めた。指標（曲線下面積から計算）は群の平均の差を示している。生物学的傾向を認めたが、統計学的に有意ではなかった（図65）。
【０３１０】
IL-3処理群では、特に高用量を1回投与した群では好塩基球の数が増加したように思われるが、これは生物学的には有意である可能性があるが統計学的には有意ではなかった（図66）。
【０３１１】
実施例10  より長い期間に及ぶ細胞集団に及ぼすブタIL-3の影響を調べる
本試験は、8週間の間のブタの血液中の好酸球数に及ぼす組換え型ブタIL-3蛋白質の影響を比較した。
【０３１２】
行ったプロトコール
本試験は、実験環境（PC2封じ込め施設）において投薬飼料（Barastoc EziWean 150後にBunge Grolean）を自由に与えて行った。
【０３１３】
実験デザイン
2004528026.tif 000020
【０３１４】
注射は、ブタの後肢に筋肉内注射した。ブタは試験開始時5週齢であった。血液試料は血液検査のために0（注射前）、1、2、3、4、7、8、10、11、15、22、29、および57日に採取した。Abbott Cell-Dyn 3700を用いて完全な血液検査を行った。選択した塗末標本の検査を確認のために行った。
【０３１５】
1群ブタ6匹を用いるより大きい実験において、サイトカイン投与後長い期間にわたって末梢血液中の好酸球の絶対数に関して好酸球の統計学的に有意な増加を認めた（図67）。
【０３１６】
測定した他の細胞タイプ（総白血球数、リンパ球、単球、血小板、好中球、または赤血球数、データは示していない）に関して、この実験において統計学的に有意な傾向を認めなかった。
【０３１７】
実施例11  好酸球産生に及ぼすIL-5とIL-3の相乗効果
本実施例の目的は、IL-3とIL-5の作用が好酸球レベルおよび抗体産生を増加させるために相乗的に作用するか否かを決定することであった。
【０３１８】
IL-3は、IL-5の作用の前に前活性B細胞の増殖を刺激するため、IL-3とIL-5の双方を投与すると、いずれかのサイトカイン単独の投与より好酸球の産生に対してより大きい影響を及ぼすと考えられた。床が上昇した清浄なPC2条件で飼育したブタを用いて実験を行った。1群ブタ6匹による5個の処理を行った。ブタは5〜6週齢であった。組換え型サイトカインまたは生理食塩液の実験では、0、3、7および10日に動物に筋肉内注射した。処理には、IL-5およびIL-3単独、ならびに異なる部位で同時に投与した場合、または同じ動物に投与したが、IL-3はIL-5の1週間前に投与した場合が含まれる。処理は以下の通りであった：
1群−IL-3 100 μg
2群−IL-5 100 μg
3群−IL-3 100 μg＋IL-5 100 μg（異なる部位に）
4群−IL-3 100 μg（1週目）；IL-5 100 μg（2週目）
5群−生理食塩液
【０３１９】
ブタは、最初の2週間の間週に4回採血して、続く2週間では週に1回採血し、血液検査はCellDyn装置を用いて測定した。血清も同様に毎週採取して抗体レベルに関して試験した。
【０３２０】
総好酸球数および白血球数の百分率としての好酸球の分析を図68および69に示す。これらの図は、IL-3単独では好酸球の百分率を有意に増加しなかったが、IL-5は単独で好酸球レベルの有意な増加を引き起こしたことを示している。WBCの好酸球百分率は、IL-5のそれぞれの反復投与によって増加し、4回注射後では、当初の値の約10倍であった。IL-3とIL-5とを同時に投与しても、好酸球の産生に対して如何なる相乗作用も示さないように思われた（IL-5処理群のブタより高くない）。しかし、IL-3の2用量を最初の週に処理すると、第二の週に投与されたIL-5に対する反応をプライミングして、その後IL-5を2回投与すると、好酸球レベルを刺激して、これはIL-5を4回投与する場合と同等であった（非IL-3処理ブタにおいて）。IL-3は、好酸球前駆体を含む前駆細胞を産生する幹細胞に対して初期に作用する造血サイトカインである。これらの結果は、IL-3がIL-5のその後の作用を増強する好酸球前駆細胞を増加したことを示している。
【０３２１】
図70〜73は、調べたそれぞれの抗体アイソタイプに関する平均力価において検出された傾向を示す。標準誤差のバーは、それぞれの場合において重なり、含まれなかった。一般的に、IL-3＋IL-5は、抗体産生によって測定した場合にIL-5またはIL-3単独よりB-細胞に及ぼす刺激作用が大きく、相加作用を示唆した。このパターンは、総Ig（図70）、IgA（図71）、IgG1（図72）、およびIgG2（図73）アイソタイプに関して認められたが、IgMに関しては認められなかった（データは示していない）。
【０３２２】
結論
IL-5は、循環中の好酸球を劇的に増加させたのに対し、IL-3は、比較すると軽微な増加を生じた。IL-3およびIL-5は、同時に投与した場合には好酸球産生に対して相乗的に作用しないように思われる；しかし、IL-3は、循環中の好酸球レベルに関してIL-5に対する反応をプライミングするように思われる。
【０３２３】
IL-3およびIL-5は、抗体産生を相乗的に増加するように思われるが、血清中の抗体レベルの有意な増加は、清浄な実験条件で維持したブタについては検出されなかった。文献から、IL-5は細菌のエンドトキシン（例えば、LPS）の場合に限ってIgA産生を増加させることが認められる。おそらく、食用飼育ブタ舎の環境では、高いエンドトキシンレベルにそのように天然に曝露されるであろう。
【０３２４】
実施例12 Actinobacillus pleuropneumoniaeに感染したブタにおける成長を改善するためのプラスミドおよび組換え型サイトカインの輸送
以下の実験は、IL-4が、生理食塩液処理対照および非ステロイド性抗炎症薬（NSAID）であるフルニクスを処理した陽性対照と比較して、免疫学的にチャレンジしたブタの成長を改善できるか否かを決定するためにデザインした。これは、また、IL-4がプラスミドを通して輸送できるか否かを決定するように工夫した。
【０３２５】
実験デザイン
開始時の平均体重が52 kgである雄性のブタを5個の治療群に割付した（表8）。ブタを群ごとに収容して、それぞれのブタ舎は、それぞれの治療群から同じ群を含んだ。ブタには固形飼料と水とを自由に与えた。
【０３２６】
組換え型IL-4および生理食塩液を2 ml用量として耳の後に皮下投与した。プラスミドを1 ml用量として後肢に筋肉内投与した。フルニクスは、製造元の説明書に従って、2 ml用量として頚部に筋肉内投与した。投与の時間割の概要を下記の表9に示す。
【０３２７】
（表８）サイトカイン実験において適用された処理および用量（1群あたりN＝4）
2004528026.tif 000021
【０３２８】
（表９）Actinobacillus pleuropneumoniae感染症の予防的治療としてのIL-4の有効性を評価するための実験技法のプロトコール
2004528026.tif 000022
【０３２９】
Actinobacillus pleuropneumoniae（App）の間欠的な利用のために、Appチャレンジは2室で個別に行い、表9に概要を示すようにそれぞれの部屋に関して異なる時間割で行った。各チャレンジ前、上記のようにブタに組換え型サイトカイン、フルニクス、またはプラスミドを処理した；チャレンジに関する処理の時期を表9に記載する。ブタを麻酔して、0日目に7.5×105pfuを気管内に感染させた。
【０３３０】
チャレンジ後0時間、24時間、および14日目に静脈穿刺によってブタから血液を採取した。先に記述したように免疫学パラメータに関して血液をアッセイした。
【０３３１】
簡単に説明すると、自動細胞カウンターを用いて行う白血球数；染色した血液塗末標本について手動で行った分別白血球数；フローサイトメトリーによるリンパ球サブセットの計数；フローサイトメトリーによって決定した好中球機能；チミジン取り込みアッセイを用いて決定するマイトゲンに反応したリンパ球増殖、を含む標準的な技術を用いて血液試料についてアッセイを行った；総IgGおよびIgAレベルは間接的サンドイッチELISAを用いて同定した；前炎症性サイトカインに関するmRNAレベルはRT-PCRによって検出した。さらに血清中のTNFレベルを、L929標的細胞を用いてバイオアッセイによって測定した。ブタは、プラスミドの投与後毎週、およびチャレンジ後2週間体重測定を行った。
【０３３２】
チャレンジの週の間、IL-4は、生理食塩液処理対照と比較してブタの成長を改善した（図74）。生理食塩液、フルニクス、または対照プラスミドを処理したブタは体重減少を示したが、IL-4またはプラスミドIL-4を処理したブタは、チャレンジの週の間正の成長を示した。チャレンジ後の週において、全ての群のブタの体重が増加した。生理食塩液を処理したブタは有意に回復したが、IL-4を処理したブタは、体重が増加し続けた。プラスミドまたはフルニクスを処理したブタは、チャレンジの2週目において全ての群の中で成長が最も悪かった。
【０３３３】
Appをチャレンジ後2週間に及ぶ体重増加（図75）は、組換え型IL-4処理によって、生理食塩液処理対照と比較して体重増加が増加したことを示したが、この結果は統計学的に有意ではなかった。屠殺時に体重の差を認めた。フルニクスは、生理食塩液処理対照と比較して、成長に関して処理の成績が最も悪かった。IL-4プラスミドを処理したブタは、そのプラスミド処理対照と比較して2週間のチャレンジ期間の間かなりの成長の増強を示した（図75）が、生理食塩液処理対照の成長と同等であった。
【０３３４】
前炎症性サイトカイン、TNFαおよびIL-6は、チャレンジ前のレベルと比較してAppによるチャレンジ後いくつかの群において上昇した。興味深いことに、NSAIDフルニクスは、TNFαの産生を阻害できず（図76）、これはこの群において認められる成長不良を説明するために役立つかも知れない。IL-4、プラスミド対照、およびIL-4プラスミドは、チャレンジ後13日において、生理食塩液対照およびフルニクス処理対照よりTNF産生レベルが減少した。
【０３３５】
全ての処理は、生理食塩液対照と比較してチャレンジ後24時間でIL-6の産生を減少させた（図77）。残念なことに、試料採取の誤りによってAppチャレンジ後13日で、IL-6のデータを生理食塩液処理群から回収できなかった。チャレンジ13日後、プラスミドまたは組換え型のいずれかとしてIL-4を処理したブタは、フルニクスを処理したブタと比較して前炎症性サイトカインであるIL-6のレベルが減少した。プラスミドIL-4は、プラスミド対照と比較してIL-6の産生を減少しなかった。組換え型IL-4は、Appによるチャレンジ後13日目でIL-6産生を検出不可能なレベルまで減少させた。
【０３３６】
抗炎症性サイトカイン処理は、循環中の前炎症性サイトカインレベルの減少を引き起こし、場合によっては成長を改善させたが、前炎症性サイトカインと成長障害との関係はなおも不明である。しかし、重要なことは、前炎症性サイトカインレベルが減少したブタの群は、典型的に、チャレンジ後最初の週において成長阻害が最も少なかった群であった。
【０３３７】
ブタの成長の改善の他に、われわれは、サイトカイン処理がAppチャレンジに曝露されたブタの健康を改善しうることを発見した。図78のデータはチャレンジの最初の週に行われた30回の症状観察のうち観察1回あたりの平均臨床スコアを示す。それぞれのブタが示した嗜眠、咳、および呼吸パラメータのような症状の重症度は0〜8のスコアをつけて、死亡または安楽死させたブタは、それぞれのその後の症状観察時に任意にスコア8を割り当てた。組換え型IL-4を処理したブタは、生理食塩液処理ブタと比較して疾患の臨床兆候をわずかに減少させた（図78）。プラスミドとして投与したIL-4も同様に、生理食塩液およびプラスミド対照ブタと比較して臨床症状を減少させた。組換え型として投与したIL-4は、生理食塩液によって処理したブタと比較して臨床症状の存在を36％減少させたが、プラスミド型で投与したIL-4は、生理食塩液処理対照と比較して62％（プラスミド処理対照と比較して45％の減少）の減少を引き起こした。プラスミドまたは組換え型として投与したIL-4は、App感染症の臨床症状を減少させる上でフルニクスより有効であった。
【０３３８】
試験終了時にブタを安楽死させて、肺を死後の剖検のために摘出した。肺を胸膜炎に関して0〜5までのスコアをつけて（図79）、罹患した肺の重量を測定して、肺の全重量の百分率として表記することによって胸膜肺炎の程度を決定した（図80）。フルニクスを処理したブタは、生理食塩液対照より胸膜炎が少なかった。IL-4を処理したブタは、生理食塩液処理対照と同じレベルの胸膜炎を示した。プラスミドとして投与してIL-4を処理したブタは、プラスミド処理対照より胸膜炎が少なかったが、胸膜炎のレベルは、生理食塩液処理対照のレベルより低かった（図79）。App病変に罹患した肺の百分率は、生理食塩液処理対照と比較してフルニクス、組換え型IL-4、またはプラスミドIL-4を処理したブタにおいて大きく減少した（図80）。
【０３３９】
結論
組換え型IL-4は、Appチャレンジの最初の週の間に生理食塩液処理対照と比較してブタの成長を大きく増加させることができた。IL-4を処理したブタは、チャレンジの2週間後である実験終了時の体重が、生理食塩液処理ブタより4.8 kg重く、これは成長が73％改善したことを表す。フルニクスを処理したブタは、2週間のチャレンジ期間において成長が最も悪かった。
【０３４０】
プラスミドIL-4は、Appチャレンジの最初の週の間、生理食塩液処理対照およびプラスミド処理対照と比較してブタの成長を改善することができた。2週間のチャレンジ試験の終了時、IL-4プラスミド処理ブタはそれぞれのプラスミド処理ブタより重かったが、生理食塩液処理ブタと同じ体重であった。
【０３４１】
組換え型IL-4、プラスミド対照、およびプラスミドIL-4は、成長成績の不良に関連している前炎症性サイトカインTNFαおよびIL-6の産生を減少させることができた。フルニクスはIL-6の産生のみを減少させることができた。
【０３４２】
IL-4は、プラスミドとして投与したIL-4と同様に、チャレンジの間疾患の臨床症状の重症度を減少させた。
【０３４３】
フルニクスは、死後に認められた胸膜炎のレベルを減少させることができた。フルニクス、組換え型IL-4およびプラスミドIL-4は全て、生理食塩液処理およびプラスミド処理対照と比較して、App病変に罹患した肺の割合を減少させた。
【０３４４】
実施例13  予防としての組換え型IL-4の輸送
本実施例の目的は、IL-4が、ブタ赤痢を引き起こす腸の炎症性病原体Brachyspira（Serpulina）hyodysenteriaeに関連したブタの健康を改善できるか否かを決定することであった。さらなる目的は、IL-4がブタ赤痢のチャレンジ条件でブタの成長速度を改善できるか否かを決定することであった。
【０３４５】
実験デザイン
平均開始体重6.5 kgの雄性のブタを1群8匹からなる治療群に割付した（表10）。ブタを群ごとに収容して、それぞれのブタ舎は、治療群のそれぞれから同じ群を含んだ。1群8匹を別室に収容して、無処理対照として感染させないままとした。ブタには、固形飼料と水とを自由に与えた。
【０３４６】
ブタ赤痢のチャレンジの前に、表10に記載するように、ブタに組換え型IL-4または生理食塩液を処理した。サイトカインおよび抗生物質リンコシンは、表11に概要した間隔で筋肉内注射によって投与した。0日、1日、および2日目に、細胞約108個を含む対数増殖期のスピロヘータ培養物120 mlを経口投与することによってブタをBrachyspir hyodysenteriaeに感染させた。
【０３４７】
糞綿棒標本および血液試料は、表11に記載した間隔でそれぞれのブタから採取した。糞綿棒標本は、スピロヘータの有無に関して培養した。血液試料は、先の実施例1に記載したように免疫学的パラメータに関してアッセイした。ブタは、実験を通して毎週体重測定して、初回チャレンジ後19および20日目に安楽死させた。後腸領域からの死後の綿棒標本をスピロヘータの有無に関して培養し、消化管の肉眼的病理状態を記入した。
【０３４８】
（表１０）ブタ赤痢感染症の予防的治療としてのIL-4の有効性を評価するためのチャレンジ試験に関する治療群の概要（1群あたりN＝8）
2004528026.tif 000023
【０３４９】
（表１１）ブタ赤痢感染症の予防的治療としてのIL-4の有効性を評価するための実験技法のプロトコール
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【０３５０】
ブタ赤痢に感染した全ての群のブタは、糞培養によって検出すると、チャレンジ後5日目から糞中にスピロヘータを排泄した（図81）。IL-4を処理したブタは、チャレンジ後14日までにスピロヘータ排泄レベルの減少を示し、このことは、IL-4処理動物の感染症は生理食塩液処理対照より速やかに寛解したことを示唆している。抗生物質リンコシンを処理したブタは、14日までに糞のスピロヘータ排泄の兆候を示さなかった。非チャレンジブタは、試験期間中如何なるスピロヘータも排泄しなかった（図81）。
【０３５１】
死後の後腸から採取したスピロヘータ培養物は、IL-4によってブタを処理すると、生理食塩液対照と比較して腸に存在するスピロヘータ数が有意に減少した（0＜0.05；図82）ことを示す。IL-4は、生理食塩液処理対照と比較して盲腸、前腸、後腸、および糞におけるスピロヘータ培養スコアを減少させることができた。重要なことは、IL-4は、死後の盲腸および結腸におけるスピロヘータ数を減少させる上で、リンコシン抗生物質処理と同じ作用を示した。予想されるように、ブタ赤痢をチャレンジしなかったブタは、死後の後腸または糞にスピロヘータを有しなかった。
【０３５２】
生理食塩液処理ブタと比較して、IL-4処理によって、盲腸におけるスピロヘータ数は91％、前結腸では93％、後結腸では84％、および糞中のスピロヘータは86％減少した。
【０３５３】
腸におけるスピロヘータ数の減少の他に、IL-4による処理はまた、糞の状態によって示される感染に関連した臨床兆候を減少させた。図83は、生理食塩液処理対照と比較して赤痢罹患糞（湿って粘液様の血便）または湿糞（異常に湿った形をなさない糞）の兆候がより少なかったことを示している。生理食塩液を処理したブタ8匹中、7匹は、糞の状態によって決定されるブタ赤痢の臨床発現を示し、そのうち3匹は、本質的に下痢様の粘液性の血様糞であった。IL-4による処理によって、糞における臨床兆候の発生率は感染したブタ8匹から3匹に減少し、重度のブタ赤痢感染症に関連した血様粘液様糞の兆候を示したのはブタ1匹に過ぎなかった（図83）。抗生物質リンコマイシンを処理したブタは、感染の臨床兆候をほとんど示さず、この群ではブタ1匹が湿糞を示したに過ぎず、これは、感染していない対照ブタの結果と同等であった。
【０３５４】
治療群の間に認められたスピロヘータ数および臨床兆候の存在の差に関して予想されるように、死後の腸においても感染に関連した病態の程度に差を認めた（図84および85）。IL-4による処理によって、赤痢に関連した病態の兆候および病態の重症度は、前結腸において生理食塩液と比較して減少し、後結腸では病態の発症は完全に予防された。リンコシンによる処理では、前および後結腸における病理的症状の発生率が減少したが、盲腸における病理的変化の重症度も減少した（データは示していない）。
【０３５５】
そのような結果は、IL-4およびリンコシンがいずれもブタの健康に対してブタ赤痢感染症の有害な作用を減少させることができたことを確認した。IL-4は、免疫系に対して抗炎症作用を有することが知られており、このように、赤痢に関連した腸における炎症性の病理的変化の減少は、このサイトカインの抗炎症特性とスピロヘータ負荷の減少の双方に帰因する可能性がある（図82に認められるように）。
【０３５６】
ブタにおけるブタ赤痢感染症の重症度をさらに減少させるために、IL-4による処理は、チャレンジ相（図86）の間のブタの成長速度、最終屠殺重量（図87）、および体重増加（図88）を改善することがでた。チャレンジまたは処理の前に、群は6.5 kgという同じ平均体重を示す（図86、−7日）。19日および20日目の試験終了までに、IL-4を処理したブタは体重が15.1 kgであったのに対し、生理食塩液を処理したブタは13.6 kgであり（図87）、最終体重は11％改善した。同様に、試験終了時、リンコシンを処理したブタの体重は12.2 kgであり、チャレンジしていないブタの体重は12.1 kgであった。
【０３５７】
IL-4を処理したブタに関してチャレンジ期間に増加した総体重は8.5 kgであり、これに対し、生理食塩液およびリンコマイシン処理では6.9 kgならびにチャレンジしていないブタでは6.5 kgであった（図88）。生理食塩液または抗生物質処理と比較してIL-4処理によって生じた試験期間中の増加の改善は、チャレンジ前の7日目から屠殺時の19および20日で24％であった（図88）。意外にも、チャレンジしていないブタは、全ての群の中で最も悪い成長成績を示し、これは、交叉汚染を予防するために別室に収容した結果である可能性があり、このように部屋の影響を除外できない。治療群の間で体重に関して有意差を認めなかったが、IL-4による処理は、より小さいブタによって得られた体重を増加させることによって変動を減少させた。チャレンジモデルを用いた先の経験において、そして実際の状況において、感染に最も罹りやすいブタは、体重が少ない傾向がある。IL-4が、チャレンジ条件でより小さいブタの体重を増加させることができることは、これらのより小さい動物の、食用ブタ飼育条件において認められる感染症に対する感受性を減少させることができる可能性がある。
【０３５８】
結論
ブタをIL-4によって処理すると、死後の後腸および糞に存在するスピロヘータ数が生理食塩液処理と比較して有意に減少した。IL-4は、生理食塩液対照と比較して、糞状態によって検出されるブタ赤痢感染症の臨床発現を減少させた。
【０３５９】
IL-4またはリンコシンを処理したブタは、生理食塩液を処理したブタと比較して、ブタ赤痢に通常関連する肉眼的病理の兆候の減少を示した。臨床兆候の減少、病態の減少、ならびに腸および糞中のスピロヘータ数の減少によって決定されるように、IL-4処理による健康の改善は、ブタの群れにおけるブタ赤痢感染症に関する現行の治療法である抗生物質リンコシンを用いた場合に得られた結果と同等であった。
【０３６０】
ブタをIL-4によって処理すると、他の全ての治療群と比較して成長の改善が得られた。試験終了時、IL-4を処理したブタは、その生理食塩液処理対照より体重が12％重く、リンコシンを処理したブタより体重が15％重かった。
【０３６１】
実験期間に増加した体重は、生理食塩液またはリンコシン処理と比較してIL-4処理群では24％重かった。体重の増加は、より小さい開始重量を有するブタにおいて最も顕著であった。
【０３６２】
IL-4は、感染症に曝露されたブタの成長および健康を改善するための予防薬として作用する。
【０３６３】
IL-4は、二つの感染症モデルにおいてブタの健康を改善することが示されている：Actinobacillus pleuropneumoniae（App）およびBrachyspira（Serpulina）hyodysenteriae（ブタ赤痢）。双方のモデルにおける健康の改善は、感染時の臨床症状の減少および死後の感染症に関連した病態の減少として記述された。ブタ赤痢モデルにおいて、スピロヘータ排泄の減少も同様に認めた。IL-4による予防的治療がブタの健康を改善できることは、現行の標準的な抗生物質治療の成績と同等であった。このように、IL-4は、抗生物質に対する代用薬もしくは補助治療薬として、またはブタにおけるAppおよびブタ赤痢に対する予防薬としての可能性を有する。IL-4が健康促進剤として作用する可能性は、抗生物質治療の同時適用によってさらに増強する可能性がある。
【０３６４】
さらに、IL-4は、双方の疾患チャレンジモデルの下でブタの成長成績を改善することが示された。この作用は、これらの感染症を治療するために用いられる現行の治療的抗生物質を投与した群では認められなかった。このように、IL-4は、健康推進特性のみならず、成長推進特性も示す。
【図面の簡単な説明】
【０３６５】
【図１】いくつかの輸送戦略を用いて輸送したIL-5による処理の4日前および処理の12日後の治療群における個々のブタに関する白血球（WBC）の好酸球百分率を示す。
【図２】IM注射または遺伝子銃によって輸送した組換え型IL-5、またはIL-5 DNAによって処理した個々のブタに関する経時的な白血球の絶対数を示す。
【図３】好酸球の増加に対して異なる輸送方法を比較する好酸球指数（WBCの好酸球の百分率に関する統計学的分析）を示す。
【図４】様々な手段によって輸送した組換え型IL-5、またはpCI IL-5のいずれかによって処理したブタに関して16日間の群全体の体重増加を示す。
【図５】様々な手段によって輸送した組換え型IL-5、またはpCI IL-5のいずれかによって処理したブタに関してそれぞれの治療群におけるブタ1匹あたりに増加した全体重の平均を示す。バーは、群の平均値および標準誤差を示す。
【図６】様々な手段によって輸送した組換え型IL-5、またはpCI IL-5のいずれかによって処理したブタの0、7、11、および16日目での平均体重を示す。バーは群の平均値および標準誤差を示す。
【図７】IL-5投与後11日間のWBCの好酸球平均百分率の統計学的比較を示す。
【図８】WBCの好酸球百分率に及ぼす異なるIL-5投与経路の影響を示す。
【図９】異なるIL-5投与経路による好酸球指数（統計分析）を示す。
【図１０】飼料中に抗生物質を添加した場合または添加しなかった場合の、IL-5または生理食塩液のいずれかによって処理したブタに関する離乳期の処理群の総体重を示す。
【図１１】飼料中に抗生物質を添加した場合または添加しなかった場合の、IL-5または生理食塩液のいずれかによって処理した群における離乳期のブタ1匹あたりの平均体重を示す。
【図１２】飼料中に抗生物質を添加した場合または添加しなかった場合の、IL-5または生理食塩液のいずれかによって処理したブタにおける離乳期終了時での各群のブタの個々の体重を示す。
【図１３】飼料中に抗生物質を添加した場合または添加しなかった場合の、IL-5または生理食塩液のいずれかによって処理した群に関する個々のブタの、感染疾患によって引き起こされた死亡または体重減少によって定義される生産の損失を示す。
【図１４】飼料中に抗生物質を添加した場合または添加しなかった場合の、IL-5または生理食塩液のいずれかによって処理した群における個々のブタに関するWBCの好酸球百分率を示す。
【図１５】飼料中に抗生物質を添加した場合または添加しなかった場合の、IL-5（白丸）または生理食塩液（黒丸）のいずれかによって処理したブタに関して離乳期の間に増加した体重対好酸球の絶対数の変化の回帰プロットを示す。
【図１６】飼料中に抗生物質を添加した場合または添加しなかった場合の、IL-5または生理食塩液のいずれかによって処理した群における離乳期のブタ1匹あたりの平均体重増加速度を示す。
【図１７】飼料中に抗生物質を添加した場合または添加しなかった場合の、IL-5または生理食塩液のいずれかによって処理した群に関して離乳期、成長期、および仕上げ期での処理群の総体重を示す。
【図１８】試験中に、飼料中に抗生物質を添加した場合または添加しなかった場合の、IL-5または生理食塩液のいずれかによって処理した群に関するブタの平均体重総生産を示す。バーは群の平均値および標準誤差を示す。
【図１９】抗生物質の非存在下でIL-5処理と生理食塩液処理との平均体重の差の比較を示す。
【図２０】飼料中に抗生物質を添加したブタにおけるIL-5処理と生理食塩液処理との平均体重の差の比較を示す。
【図２１】体重に及ぼす飼料中の抗生物質の影響を説明するために二つの投薬レベルに対する生理食塩液処理の比較を示す。
【図２２】抗生物質を添加した場合または添加しなかった場合の、生理食塩液またはIL-5のいずれかによって処理した個々のブタの最終体重を示す。
【図２３】抗生物質を添加した場合または添加しなかった場合の、生理食塩液またはIL-5のいずれかによって処理したブタの群における可食部の割合の平均値を示す。バーは群の平均値および標準誤差を示す。
【図２４】抗生物質を添加した場合または添加しなかった場合の、生理食塩液またはIL-5のいずれかによって処理したブタに関する平均温屠畜体重量を示す。バーは群の平均値および標準誤差を示す。
【図２５】食用飼育ブタ舎の環境において行った二つの試験（実施例4および5）から、抗生物質を添加した場合と添加していない場合の生理食塩液対照ブタに関する離乳期を通しての平均体重の比較を示す。バーは、群の平均値および標準誤差を示す。
【図２６】飼料中に抗生物質を添加しなかった場合のIL-5または生理食塩液のいずれかによって処理したブタにおける離乳期の群の総体重を示す。
【図２７】飼料中の抗生物質が減少レベルで存在する場合の、IL-5または生理食塩液のいずれかによって処理したブタにおける離乳期の群の総体重を示す。
【図２８】飼料中の抗生物質が正常レベルで存在する場合の、IL-5または生理食塩液のいずれかによって処理したブタにおける離乳期の群の総体重を示す。
【図２９】抗生物質の異なる三つのレベルを飼料中に添加した場合の、生理食塩液またはIL-5のいずれかによって処理したブタにおける各群の個々のブタの、感染性疾患によって引き起こされた死亡または体重減少として定義された生産の損失を示す。
【図３０】飼料中に抗生物質を添加しなかった場合の、IL-5または生理食塩液のいずれかによって処理したブタの群に関する離乳期を通しての平均体重を示す。
【図３１】IL-5または生理食塩液によって処理して、抗生物質の減少レベルを飼料に添加した場合のブタの群に関する離乳期を通しての平均体重を示す。
【図３２】IL-5または生理食塩液によって処理して、抗生物質の正常レベルを飼料に添加した場合のブタの群に関する離乳期を通しての平均体重を示す。
【図３３】飼料または水に抗生物質の異なる三つのレベルを添加した生理食塩液処理対照群に関する離乳期を通しての平均体重の比較を示す。
【図３４】離乳期を通しての各群におけるブタの平均体重増加を示す。バーは、群の平均値および標準誤差を示す。
【図３５】抗生物質を添加していない対照に対する抗生物質を添加した対照の平均体重の差を示す。
【図３６】抗生物質を添加していない生理食塩液対照とIL-5処理との平均体重の差を示す。
【図３７】抗生物質の減少量を添加した生理食塩液対照とIL-5処理との平均体重の差を示す。
【図３８】抗生物質の正常量を添加した生理食塩液対照とIL-5処理との平均体重の差を示す。
【図３９】各群に関してP2の平均値（屠殺前の背部脂肪測定）を示す。バーは群の平均値と標準偏差を示す。
【図４０】抗生物質を添加していないIL-5処理および対照に関する個々のブタのP2対最終体重のプロットを示す。
【図４１】各群に関する絶対好酸球レベルの平均値を示す。
【図４２】大腸菌をチャレンジしたサイトカイン実験に関する一連の事象を示すスケジュールを示す。
【図４３】生理食塩液、アプララン、またはIL-5によって処理したブタにおける大腸菌チャレンジの際のブタ1匹あたりの1日飼料摂取量を示す。
【図４４】大腸菌を初回チャレンジ後5日目のブタから採取した糞から培養した大腸菌を示す。データ点は、群の平均値と標準偏差を示す。
【図４５】大腸菌チャレンジ5日間の総糞培養スコアを示す。
【図４６】生理食塩液対照と比較して総糞培養スコアの減少百分率を示す。
【図４７】大腸菌チャレンジ後5日間のブタのそれぞれの群からの下痢および湿糞の形での臨床兆候の発生率を示す。バーは各群の総記録を示す；各群の最大記録は40である。
【図４８】生理食塩液対照と比較したサイトカイン処理動物における下痢および湿糞の臨床兆候の減少を示す。
【図４９】死後の消化管に沿って異なる領域で採取した試料からのヒツジ血液寒天上での細菌増殖に関する大腸菌培養スコアを示す。SIは小腸である。バーは群の平均値および標準誤差を示す。
【図５０】死後のブタから採取した総大腸菌培養スコアの平均値を示す。バーは個々の総細菌スコアの群の平均値および標準誤差である。
【図５１】生理食塩液対照と比較して死後の総大腸菌培養スコアの変化百分率を示す。
【図５２】生理食塩液対照と比較して前腸および後腸領域から得た大腸菌培養スコアの変化百分率を示す。
【図５３】IL-5、リンコシン、または生理食塩液を処理して、その後ブタ赤痢菌をチャレンジした後のブタの糞におけるスピロヘータ排泄レベルを示す。
【図５４】死後の盲腸、前結腸、後結腸、および糞から培養したスピロヘータ数の比較を示す。バーは群の平均値および標準誤差を示す。
【図５５】生理食塩液対照と比較して百分率で表した死後の腸から培養したスピロヘータ数の減少を示す。
【図５６】死後の糞の状態によって示されるブタ赤痢感染症の臨床兆候の発現を示す。赤痢を示す兆候は、湿って血液を伴う粘液状の糞（dys）、または湿って形をなさない糞（wet）である。バーは1群ブタ8匹における発生率を示す。
【図５７】離乳期（すなわち治療期間）における群の平均体重増加速度を示す。
【図５８】試験中の各群におけるブタの平均体重の比較を示す。
【図５９】各群におけるブタの最終平均体重を示す。
【図６０】各群におけるブタの個々の体重を示す。
【図６１】各処理におけるブタの平均可食部百分率を示す。
【図６２】屠殺時の各群におけるブタの平均温屠畜体重量を示す。
【図６３】抗生物質処理群における全ての生存ブタの総体重の比較を示す。
【図６４】IL-3の異なる用量を投与したブタの血液中の好酸球の絶対レベルの平均値を対照群と比較して示す。
【図６５】各群の好酸球指数（統計分析）を示す。
【図６６】各群の好塩基球指数（統計分析）を示す。
【図６７】各群のブタの血液中の絶対好酸球数の平均値のグラフを示す。
【図６８】各治療群における個々のブタの好酸球百分率を示す。
【図６９】各治療群に関するWBCの好酸球百分率の平均値を示す。
【図７０】各群の血清中の総Ig力価の平均値の比較を示す。
【図７１】各群の血清中のIgA力価の平均値の比較を示す。
【図７２】IgG1レベルの比較を示す。
【図７３】IgG2レベルの比較を示す。
【図７４】Appを慢性的にチャレンジした間に組換え型サイトカイン、プラスミドサイトカイン、フルニクス、または生理食塩液によって処理したブタにおける平均体重増加を示す。
【図７５】生理食塩液、フルニクス、組換え型サイトカインまたはプラスミドサイトカインによって処理したブタにおけるAppを14日間チャレンジした間に増加した総体重を示す。
【図７６】フルニクス、組換え型サイトカイン、またはプラスミドサイトカインによって処理して、Appチャレンジに曝露したブタの血清中のTNFαレベルを示す。
【図７７】RT-PCRによって測定した末梢血中のIL-6のレベルを示す。ブタに、フルニクス、組換え型サイトカイン、またはプラスミドサイトカインによって処理してAppをチャレンジした。生理食塩液処理のデータは、Appチャレンジ後13日目で入手できなかった。
【図７８】チャレンジの最初の1週間での症状観察30回のうちの観察1回あたりの治療群の間の疾患の臨床兆候の有無を示す。観察1回あたりの最大スコアは、8であった。
【図７９】生理食塩液、フルニクス、またはIL-4を処理した後、Appをチャレンジしたブタにおける胸膜炎スコア（0〜5）として表記した剖検時の胸膜炎の程度を示す。
【図８０】抗炎症性サイトカインまたはフルニクスを処理した後、Appをチャレンジしたブタにおける、重量あたりの％罹患肺として表記した剖検時の胸膜肺炎の程度を示す。
【図８１】IL-4、リンコシン、または生理食塩液による処理後にブタ赤痢菌をチャレンジしたブタの糞中のスピロヘータ排泄レベルを示す。
【図８２】死後の盲腸、前結腸、後結腸、および糞から培養したスピロヘータ数の比較を示す。バーは、群の平均値および標準誤差を示す。
【図８３】死後の糞の状態によって示されるブタ赤痢感染症の臨床兆候の発現を示す。赤痢を示す兆候は、湿って血液を伴う粘液状の糞（dys）、または湿って形をなさない糞（wet）である。バーは1群ブタ8匹における発生率を示す。
【図８４】死後の前結腸において認められるブタ赤痢感染症に関連した肉眼的病態の兆候を示す。病態は、斑状発赤と軽度の大腸炎が存在する場合は軽度、または内容物中に血液が存在するような赤痢に一般的に関連した組織もしくは内容物の変化、広汎な発赤、および腸組織の炎症組織を伴う場合はより重度として表される。
【図８５】死後の後結腸において認められるブタ赤痢感染症に関連した肉眼的病態の兆候を示す。病態は、斑状発赤と軽度の大腸炎が存在する場合は軽度、または内容物中に血液の存在のような赤痢に一般的に関連した組織もしくは内容物の変化、広汎な発赤、および腸組織の炎症組織を伴う場合はより重度として表される。
【図８６】ブタ赤痢チャレンジの間の毎週のブタの体重を示す。バーは、群の平均値および標準誤差である。
【図８７】ブタ赤痢チャレンジ終了時、感染後19および20日でのブタの平均体重を示す。バーは群の平均値および標準誤差を示す。
【図８８】チャレンジの7日前からチャレンジ後19および20日での屠殺までのブタ赤痢試験の期間に及ぶ平均体重増加を示す。バーは、群の平均値および標準誤差を示す。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図１−３】
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【図１−４】
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【図１−５】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図２−３】
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【図２−４】
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【図２−５】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【国際調査報告】
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2004528026.tif 000352