(57)【要約】本発明の実施例および具体例は、とりわけ、ＣＤ１４７としても知られる以前に知られた細胞外マトリックスメタロプロテイナーゼ誘導蛋白質（ＥＭＭＰＲＩＮ）がシクロフィリン（ＣｙＰ）のシグナル変換細胞受容体であることを教示および開示する。したがって、新規な治療的介入標的としてＣｙＰ／ＥＭＭＰＲＩＮ相互作用を用いる、ＨＩＶ感染、ＡＩＤＳ、ＡＩＤＳ関連障害、慢性関節リウマチ（ＲＡ）、結合組織障害、癌あるいは局所的または全身性のＣｙＰ放出、合成または結合によって特徴付けられるいずれかの症状の治療法が開示される。さらに、抗−ＥＭＭＰＲＩＮ抗体、ならびにＣｙＰ／ＥＭＭＰＲＩＮ相互作用を阻害することによって作用する可溶性ＥＭＭＰＲＩＮ蛋白質およびペプチドを含む医薬組成物が開示される。本発明は、さらに、ＣｙＰ／ＥＭＭＰＲＩＮ相互作用を阻害する化合物の同定のためのスクリーニングアッセイを提供する。
2004505997.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
炎症性疾患、自己免疫疾患、組織潰瘍、腫瘍成長または転移あるいは治療が必要な患者における局所的または全身性のＣｙＰ放出、合成または結合によって特徴付けられるいずれかの症状を治療または予防する方法であって、抗−ＥＭＭＰＲＩＮ抗体、可溶性ＥＭＭＰＲＩＮ蛋白質またはポリペプチド、ＣｙＰ蛋白質またはポリペプチドおよびその組み合わせよりなる群から選択されるＣｙＰ／ＥＭＭＰＲＩＮアンタゴニストまたはアゴニストの治療上有効量を患者に投与することを特徴とする方法。
【請求項２】
炎症性または自己免疫疾患が関節炎、ＥＡＥ、ＡＲＤＳまたは歯周炎である請求項１記載の方法。
【請求項３】
ＣｙＰ／ＥＭＭＰＲＩＮアンタゴニストまたはアゴニストが抗−ＥＭＭＰＲＩＮ抗体である請求項１記載の方法。
【請求項４】
抗−ＥＭＭＰＲＩＮ抗体がＥＭＭＰＲＩＮの細胞外ドメインまたは膜貫通ドメインに結合する請求項３記載の方法。
【請求項５】
抗−ＥＭＭＰＲＩＮ抗体がＵＭ−８Ｄ６抗−ＣＤ１４７モノクローナル抗体によって認識されるエピトープに結合する請求項４記載の方法。
【請求項６】
ＣｙＰ／ＥＭＭＰＲＩＮアンタゴニストまたはアゴニストが、ＥＭＭＰＲＩＮ膜貫通ドメインに対応する配列番号２のおよその残基２０６からおよその残基２２９までにわたる配列から取り出した約５〜１４個のアミノ酸のアミノ酸配列を含むＥＭＭＰＲＮポリペプチドである請求項１記載の方法。
【請求項７】
炎症性疾患、自己免疫疾患、組織潰瘍、腫瘍成長または転移あるいは治療が必要な患者における局所的または全身性のＣｙＰ放出、合成または結合によって特徴付けられるいずれかの症状を治療または予防する方法であって、治療上有効量の式Ｉ：
Ｉ　　　　Ｒ１−Ｒ２−Ｒ３−Ｒ４−Ｒ５−Ｒ６−Ｐｒｏ−Ｒ７−Ｒ８−Ｒ９
［式中、Ｒ１−は、Ｈｉｓ−、ＳｅｒＨｉｓ−、ＡｒｇＳｅｒＨｉｓ−、Ｌｙｓ−、ＬｙｓＬｙｓ−、Ａｒｇ−であるか、または存在せず；Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は独立して、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ａｌａ、Ｍｅｔであるか、または存在せず；Ｒ５およびＲ８は独立して、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、ＡｌａまたはＭｅｔであり；Ｒ６およびＲ７は独立して、Ｐｈｅ、ＴｒｐまたはＴｙｒであり；−Ｒ９は、−Ｇｌｙ、−ＧｌｙＩｌｅ、−ＧｌｙＩｌｅＶａｌであるか、または存在しない］
で示される化合物を患者に投与することを特徴とする方法。
【請求項８】
式Ｉ中、Ｒ１−は、Ｈｉｓ−、ＳｅｒＨｉｓ−、ＡｒｇＳｅｒＨｉｓ−、Ｌｙｓ−、ＬｙｓＬｙｓ−、Ａｒｇ−であるか、または存在せず；Ｒ２−はＬｅｕであり；Ｒ３はＡｌａであり；Ｒ４はＡｌａであり；Ｒ５はＬｅｕであり；Ｒ６はＴｒｐであり；Ｒ７はＰｈｅであり；Ｒ８はＬｅｕであり；−Ｒ９は存在しない請求項７記載の方法。
【請求項９】
式Ｉ中、Ｒ１−は存在せず；Ｒ２−はＬｅｕであり；Ｒ３はＡｌａであり；Ｒ４はＡｌａであり；Ｒ５はＬｅｕであり；Ｒ６はＴｒｐであり；Ｒ７はＰｈｅであり；Ｒ８はＬｅｕであり；−Ｒ９は存在しない請求項８記載の方法。
【請求項１０】
細胞が機能的ＥＭＭＰＲＩＮ受容体を発現し、レトロウイルスがウイルス感染の組み込み前工程において該ＥＭＭＰＲＩＮ受容体を利用するレトロウイルス感染に対する細胞の感受性を減少させる方法であって、レトロウイルス感染の組み込み前工程を阻害するのに十分な量のＣｙＰＡ／ＥＭＭＰＲＩＮアンタゴニストまたはアゴニストと該細胞とを接触させることを特徴とし、ここに、ＣｙＰＡ／ＥＭＭＰＲＩＮアンタゴニストまたはアゴニストが抗−ＥＭＭＰＲＩＮ抗体、可溶性ＥＭＭＰＲＩＮ蛋白質またはポリペプチド、ＣｙＰＡ蛋白質またはポリペプチドおよびその組み合わせからなる群より選択される方法。
【請求項１１】
ＣｙＰＡ／ＥＭＭＰＲＩＮアンタゴニストまたはアゴニストが抗−ＥＭＭＰＲＩＮ抗体である請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
抗−ＥＭＭＰＲＩＮ抗体がＥＭＭＰＲＩＮの細胞外ドメインまたは膜貫通ドメインに結合する請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
抗−ＥＭＭＰＲＩＮ抗体がＵＭ−８Ｄ６抗−ＣＤ１４７モノクローナル抗体によって認識されるエピトープに結合する請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
ＣｙＰ／ＥＭＭＰＲＩＮアンタゴニストまたはアゴニストが、ＥＭＭＰＲＩＮ膜貫通ドメインに対応する配列番号２のおよその残基２０６からおよその残基２２９までにわたる配列から取り出した約５〜１４個のアミノ酸のアミノ酸配列を含むＥＭＭＰＲＮポリペプチドである請求項１０記載の方法。
【請求項１５】
細胞が機能的ＥＭＭＰＲＩＮ受容体を発現し、レトロウイルスがウイルス感染の組み込み前工程においてＥＭＭＰＲＩＮ受容体を利用するレトロウイルス感染に対する細胞の感受性を減少させる方法であって、該細胞をレトロウイルス感染の組み込み前工程を阻害するのに十分な量の式Ｉ：
Ｉ　　　　Ｒ１−Ｒ２−Ｒ３−Ｒ４−Ｒ５−Ｒ６−Ｐｒｏ−Ｒ７−Ｒ８−Ｒ９
［式中、Ｒ１−は、Ｈｉｓ−、ＳｅｒＨｉｓ−、ＡｒｇＳｅｒＨｉｓ−、Ｌｙｓ−、ＬｙｓＬｙｓ−、Ａｒｇ−であるか、または存在せず；Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は独立して、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ａｌａ、Ｍｅｔであるか、または存在せず；Ｒ５およびＲ８は独立して、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、ＡｌａまたはＭｅｔであり；Ｒ６およびＲ７は独立して、Ｐｈｅ、ＴｒｐまたはＴｙｒであり；−Ｒ９は、−Ｇｌｙ、−ＧｌｙＩｌｅ、−ＧｌｙＩｌｅＶａｌであるか、または存在しない］
で示される化合物と接触させることを特徴とする方法。
【請求項１６】
式Ｉ中、Ｒ１−は、Ｈｉｓ−、ＳｅｒＨｉｓ−、ＡｒｇＳｅｒＨｉｓ−、Ｌｙｓ−、ＬｙｓＬｙｓ−、Ａｒｇ−であるか、または存在せず；Ｒ２はＬｅｕであり；Ｒ３はＡｌａであり；Ｒ４はＡｌａであり；Ｒ５はＬｅｕであり；Ｒ６はＴｒｐであり；Ｒ７はＰｈｅであり；Ｒ８はＬｅｕであり；−Ｒ９は存在しない請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
式Ｉ中、Ｒ１−は存在せず；Ｒ２−はＬｅｕであり；Ｒ３はＡｌａであり；Ｒ４はＡｌａであり；Ｒ５はＬｅｕであり；Ｒ６はＴｒｐであり；Ｒ７はＰｈｅであり；Ｒ８はＬｅｕであり；−Ｒ９は存在しない請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
ＨＩＶ感染、ＡＩＤＳまたはＡＩＤＳ関連障害をその治療が必要な患者において治療または予防する方法であって、抗−ＥＭＭＰＲＩＮ抗体、可溶性ＥＭＭＰＲＩＮ蛋白質またはポリペプチド、ＣｙＰＡ蛋白質またはポリペプチドおよびその組み合わせよりなる群から選択されるＣｙＰＡ／ＥＭＭＰＲＩＮアンタゴニストまたはアゴニストの治療上有効量を患者に投与することを特徴とする方法。
【請求項１９】
ＣｙＰＡ／ＥＭＭＰＲＩＮアンタゴニストまたはアゴニストが抗−ＥＭＭＰＲＩＮ抗体である請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
抗−ＥＭＭＰＲＩＮ抗体がＥＭＭＰＲＩＮの細胞外ドメインまたは膜貫通ドメインに結合する請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
抗−ＥＭＭＰＲＩＮ抗体がＵＭ−８Ｄ６抗−ＣＤ１４７モノクローナル抗体によって認識されるエピトープに結合する請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
ＣｙＰ／ＥＭＭＰＲＩＮアンタゴニストまたはアゴニストが、ＥＭＭＰＲＩＮ膜貫通ドメインに対応する配列番号２のおよその残基２０６からおよその残基２２９までにわたる配列から取り出した約５〜１４個のアミノ酸のアミノ酸配列を含むＥＭＭＰＲＮポリペプチドである請求項１８記載の方法
【請求項２３】
ＨＩＶ感染、ＡＩＤＳまたはＡＩＤＳ関連障害をその治療が必要な患者において治療または予防する方法であって、治療上有効量の式Ｉ：
Ｉ　　　　Ｒ１−Ｒ２−Ｒ３−Ｒ４−Ｒ５−Ｒ６−Ｐｒｏ−Ｒ７−Ｒ８−Ｒ９
［式中、Ｒ１−は、Ｈｉｓ−、ＳｅｒＨｉｓ−、ＡｒｇＳｅｒＨｉｓ−、Ｌｙｓ−、ＬｙｓＬｙｓ−、Ａｒｇ−であるか、または存在せず；Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は独立して、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ａｌａ、Ｍｅｔであるか、または存在せず；Ｒ５およびＲ８は独立して、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、ＡｌａまたはＭｅｔであり；Ｒ６およびＲ７は独立して、Ｐｈｅ、ＴｒｐまたはＴｙｒであり；−Ｒ９は、−Ｇｌｙ、−ＧｌｙＩｌｅ、−ＧｌｙＩｌｅＶａｌであるか、または存在しない］
で示される化合物を患者に投与することを特徴とする方法。
【請求項２４】
式Ｉ中、Ｒ１−は、Ｈｉｓ−、ＳｅｒＨｉｓ−、ＡｒｇＳｅｒＨｉｓ−、Ｌｙｓ−、ＬｙｓＬｙｓ−、Ａｒｇ−であるか、または存在せず；Ｒ２はＬｅｕであり；Ｒ３はＡｌａであり；Ｒ４はＡｌａであり；Ｒ５はＬｅｕであり；Ｒ６はＴｒｐであり；Ｒ７はＰｈｅであり；Ｒ８はＬｅｕであり；−Ｒ９は存在しない請求項２３記載の方法。
【請求項２５】
式Ｉ中、Ｒ１−は存在せず；Ｒ２はＬｅｕであり；Ｒ３はＡｌａであり；Ｒ４はＡｌａであり；Ｒ５はＬｅｕであり；Ｒ６はＴｒｐであり；Ｒ７はＰｈｅであり；Ｒ８はＬｅｕであり；−Ｒ９は存在しない請求項２４記載の方法。
【請求項２６】
抗体がモノクローナル抗体である請求項３、１１または１９のいずれか１項記載の方法。
【請求項２７】
モノクローナル抗体が１本鎖抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体またはＦａｂフラグメントである請求項２６記載の方法。
【請求項２８】
ＨＩＶ感染、ＡＩＤＳまたはＡＩＤＳ関連障害、炎症性疾患、自己免疫疾患、組織潰瘍、腫瘍成長または転移あるいは治療が必要な患者における局所的または全身性のＣｙＰ放出、合成または結合によって特徴付けられるいずれかの症状に対して治療活性を有する試験化合物を同定する方法であって：
（ａ）試験化合物を機能的ＣｙＰ蛋白質および機能的ＥＭＭＰＲＩＮ蛋白質と接触させ、ここに、該蛋白質の少なくとも１つが検出可能なラベルを有し；
（ｂ）いずれかの得られるＥＭＭＰＲＩＮ／ＣｙＰ複合体を該ラベルの存在についてアッセイし；次いで
（ｃ）試験化合物がＣｙＰ蛋白質のＥＭＭＰＲＩＮ蛋白質への結合を阻害したかどうかを決定し、それにより、ＣｙＰ蛋白質のＥＭＭＰＲＩＮ蛋白質への結合を阻害する試験化合物が治療化合物として同定される
ことを特徴とする方法。
【請求項２９】
機能的ＥＭＭＰＲＩＮ蛋白質または機能的ＣｙＰ蛋白質のいずれかが固相上に固定されている請求項２８記載の方法。
【請求項３０】
ＣｙＰ蛋白質またはＥＭＭＰＲＩＮ蛋白質が放射能ラベル、蛍光レポーターまたはクエンチャー部分、比色または蛍光変化を触媒する酵素ラベルあるいはその組み合わせで標識されている請求項２８記載の方法。
【請求項３１】
炎症性または自己免疫疾患が関節炎、ＥＡＥ、ＡＲＤＳまたは歯周炎である請求項２８記載の方法。
【請求項３２】
ＨＩＶ感染、ＡＩＤＳまたはＡＩＤＳ関連障害、炎症性疾患、自己免疫疾患、腫瘍成長または転移あるいは治療が必要な患者における局所的または全身性のＣｙＰ放出、合成または結合によって特徴付けられるいずれかの症状に対して治療活性を有する試験化合物を同定する方法であって：
（ａ）試験化合物を機能的ＣｙＰ蛋白質の存在下、機能的ＥＭＭＰＲＩＮ蛋白質を発現している細胞と接触させ；次いで
（ｂ）試験化合物がＣｙＰ蛋白質のＥＭＭＰＲＩＮ蛋白質への結合を阻害するかどうかを決定し、それにより、ＣｙＰ蛋白質のＥＭＭＰＲＩＮ蛋白質への結合を阻害する試験化合物が治療化合物として同定される
ことを特徴とする方法。
【請求項３３】
炎症性または自己免疫疾患が関節炎、ＥＡＥ、ＡＲＤＳまたは歯周炎である請求項３２記載の方法。
【請求項３４】
細胞が組換え型ＥＭＭＰＲＩＮ、ＣＤ４、ＣＸＣＲ４またはその組み合わせを発現する請求項３２記載の方法。
【請求項３５】
ＣｙＰ蛋白質のＥＭＭＰＲＩＮ蛋白質への結合の阻害の決定が、ＣｙＰ／ＥＭＭＰＲＩＮアンタゴニストアッセイ、受容体感作または脱感作アッセイ、受容体アップまたはダウンレギュレーションアッセイ、ＥＭＭＰＲＩＮ媒介性シグナル変換アッセイ、Ｃａ２＋動員アッセイ、マトリックスメタロプロテイナーゼ発現または活性アッセイ、細胞成長率アッセイ、ＨＩＶ−１感染アッセイ、および細胞周期または細胞分化の特異的マーカーの検出に基づくアッセイよりなる群から選択されるアッセイに基づいている請求項３２記載の方法。
【請求項３６】
ＥＭＭＰＲＩＮ媒介性シグナル変換アッセイが、Ｒａｓ、ＰＫＡ、ＲＡＰ１、Ｂ−Ｒａｆ、ＭｅｋおよびＭＡＰＫよりなる群から選択される細胞内蛋白質のリン酸化または活性化状態の決定をし、それにより、該蛋白質のリン酸化または活性化状態を、対照細胞におけるそのリン酸化または活性化状態と比べて変化させる試験化合物が治療化合物として同定されることに基づく請求項３５記載の方法。
【請求項３７】
細胞周期または細胞分化の特異的マーカーが、細胞周期調節蛋白質サイクリンＤ１、サイクリンＥおよびｐ２１／Ｗａｆ１よりなる群から選択され、それにより、該細胞周期マーカーを、対照細胞におけるその状態と比べて変化させる試験化合物が治療化合物として同定される請求項３５記載の方法。
【請求項３８】
マトリックスメタロプロテイナーゼ発現アッセイがプロＭＭＰ−１、プロＭＭＰ−３、プロＭＭＰ−９、ＭＭＰ−１、ＭＭＰ−３またはＭＭＰ−９の発現または活性を測定する請求項３５記載の方法。
【請求項３９】
ＨＩＶ−１感染アッセイがウイルス性逆転写酵素活性またはウイルスに指示されたルシフェラーゼ発現を測定する請求項３５記載の方法。
【請求項４０】
式Ｉ：
Ｉ　　　　Ｒ１−Ｒ２−Ｒ３−Ｒ４−Ｒ５−Ｒ６−Ｐｒｏ−Ｒ７−Ｒ８−Ｒ９
［式中、Ｒ１−は、Ｈｉｓ−、ＳｅｒＨｉｓ−、ＡｒｇＳｅｒＨｉｓ−、Ｌｙｓ−、ＬｙｓＬｙｓ−、Ａｒｇ−であるか、または存在せず；Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は独立して、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ａｌａ、Ｍｅｔであるか、または存在せず；Ｒ５およびＲ８は独立して、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、ＡｌａまたはＭｅｔであり；Ｒ６およびＲ７は独立して、Ｐｈｅ、ＴｒｐまたはＴｙｒであり；−Ｒ９は、−Ｇｌｙ、−ＧｌｙＩｌｅ、−ＧｌｙＩｌｅＶａｌであるか、または存在しない］
で示される化合物またはその医薬上許容される塩、および医薬上許容される担体を含む医薬組成物。
【請求項４１】
式Ｉ中、Ｒ１−は、Ｈｉｓ−、ＳｅｒＨｉｓ−、ＡｒｇＳｅｒＨｉｓ−、Ｌｙｓ−、ＬｙｓＬｙｓ−、Ａｒｇ−であるか、または存在せず；Ｒ２はＬｅｕであり；Ｒ３はＡｌａであり；Ｒ４はＡｌａであり；Ｒ５はＬｅｕであり；Ｒ６はＴｒｐであり；Ｒ７はＰｈｅであり；Ｒ８はＬｅｕであり；−Ｒ９は存在しない請求項４０記載の医薬組成物。
【請求項４２】
式Ｉ中、Ｒ１−は存在せず；Ｒ２はＬｅｕであり；Ｒ３はＡｌａであり；Ｒ４はＡｌａであり；Ｒ５はＬｅｕであり；Ｒ６はＴｒｐであり；Ｒ７はＰｈｅであり；Ｒ８はＬｅｕであり；−Ｒ９は存在しない請求項４１記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（技術分野）
本発明は、シクロフィリン（ＣｙＰ）およびヒト細胞外マトリックスメタロプロテイナーゼ誘導蛋白質（ＥＭＭＰＲＩＮ）間のリガンド／受容体関係のアンタゴニストを利用するＨＩＶ感染、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）、慢性関節リウマチ（ＲＡ）、結合組織障害および癌の治療法を提供する。本発明は、さらに、ＣｙＰ／ＥＭＭＰＲＩＮ結合相互作用を修飾することによって治療活性を提供する抗−ＥＭＭＰＲＩＮ抗体およびＥＭＭＰＲＩＮまたはＥＭＭＰＲＩＮペプチドの可溶性形態を提供する。本発明は、さらに、ＣｙＰ／ＥＭＭＰＲＩＮ結合相互作用を修飾する化合物の同定のためのスクリーニングアッセイを提供する。
【０００２】
（背景技術）
本発明は、シクロフィリン、シクロフィリンの細胞受容体とのその同種相互作用およびシクロフィリン関連障害の治療に関する。例えば、シクロフィリンＡは、とりわけ、（１）ＨＩＶ感染由来の後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）に関連する症状および（２）炎症性疾患（例えば、慢性関節リウマチ）の病因に関与する。
【０００３】
（１）後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）
ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）は、レトロウイルスのレンチウイルスファミリーのメンバーである（Ｔｅｉｃｈら、ＲＮＡ Ｔｕｍｏｒ Ｖｉｒｕｓｅｓ， Ｗｅｉｓｓら、ｅｄｓ． ＣＳＨ−Ｐｒｅｓｓ， ｐｐ． ９４９−９５６， １９８４）。ＨＩＶは、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）と呼ばれる遅変性免疫系疾患の主要な原因として関係している（Ｂａｒｒｅ−Ｓｉｎｏｕｓｓｉら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２０： ８６８−８７０， １９８３； Ｇａｌｌｏら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２４： ５００−５０３， １９８４）。ヒトにおいて、ＨＩＶ複製は、ＣＤ４＋Ｔリンパ球およびマクロファージ集団において顕著に起こり、ＨＩＶ感染はＴ細胞の涸渇を導き、結局、免疫不全、日和見感染、神経機能不全、新生物成長および最終的には死を導く。
ＨＩＶウイルス粒子のコアは、キャプシド抗原（ＣＡ）蛋白質をウイルスＲＮＡゲノムおよび初期複製事象に必要な酵素と一緒に含む。ミリスチル化マトリックス抗原（ＭＡ）蛋白質は、ウイルスコアと感染された細胞膜由来の脂質膜外被との間の空間を埋める。ＨＩＶ外被表面糖蛋白質は、ウイルス出芽の間に細胞性プロテアーゼによって２つの糖蛋白質、ｇｐ４１およびｇｐ１２０に切断される１つの１６０Ｋｄ前駆体蛋白質として合成される。ウイルス性ｇｐ４１は膜貫通型糖タンパク質であり、ｇｐ１２０は、おそらく３量体または多量体形態において、ｇｐ４１と非共有結合したままの細胞外糖蛋白質である（Ｈａｍｍａｒｓｋｊｏｌｄ ＆ Ｒｅｄｏｓｈ， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ ９８９： ２６９−２８０， １９８９）。
【０００４】
ＣＤ４はＨＩＶ−１ウイルスの細胞受容体として作用するので、ＨＩＶはＣＤ４＋宿主細胞を標的とする（Ｄａｌｇｌｅｓｈら、Ｎａｔｕｒｅ ３１２： ７６３−７６７， １９８４； Ｋｌａｔｚｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ ３１２： ７６７−７６８， １９８４； Ｍａｄｄｏｎら、Ｃｅｌｌ ４７： ３３３−３４８， １９８６）。細胞中へのウイルス侵入は、ｇｐ１２０が細胞のＣＤ４受容体分子に結合することに依存し（ＭｃＤｏｕｇａｌら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３１： ３８２−３８５， １９８６； Ｍａｄｄｏｎら、Ｃｅｌｌ ４７： ３３３−３４８， １９８６）、ｇｐ１２０はＨＩＶのＣＤ４＋細胞に対する親和性を明らかにし、一方、ｇｐ４１はウイルス膜中の外被糖蛋白質複合体を固定する。これらのウイルス：細胞相互作用は感染に必要であるが、付加的なウイルス：細胞相互作用もまた必要とされるという証拠がある。
ＨＩＶ感染は世界的に流行しており、ＨＩＶ関連疾患は主要な世界的な健康問題の代表である。不運にも、ＨＩＶ感染および／またはＡＩＤＳに対する最終的に病気に効く抗レトロウイルス薬またはワクチンは存在しない。かかる薬剤およびワクチンを開発する試みは、ＨＩＶ生活環の種々の段階に対応する分子を標的としてきた（例えば、逆転写酵素、後期ウイルス性プロテアーゼ、およびワクチンの場合、ｇｐ１６０、ｇｐ１２０およびｇｐ４１）。また、ＨＩＶ感染の最も初期の段階である細胞中へのウイルスの侵入を阻害できる薬剤を開発するための試みもなされている。この点で、治療的介入の焦点がＨＩＶの認識された細胞表面受容体であるＣＤ４およびＣＣＲ５に向けられた。例えば、組換え型可溶性ＣＤ４は、いくつかのＨＩＶ−１株によるＣＤ４＋Ｔ細胞の感染を阻害することが示された（Ｓｍｉｔｈら、Ｓｉｃｉｅｎｃｅ ２３８： １７０４−１７０７， １９８７）。しかしながら、ある種の初代ＨＩＶ−１単離株は、組換え型ＣＤ４による阻害に対し比較的感受性ではない（Ｄａａｒら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８７：６５７４−６５７９， １９９０）。さらに、組換え型可溶性ＣＤ４の臨床試験は結論に達しない結果をもたらした（Ｓｃｈｏｏｌｅｙら、Ａｎｎ． Ｉｎｔ． Ｍｅｄ． １１２：２４７−２５３， １９９０； Ｋａｈｎら、Ａｎｎ． Ｉｎｔ． Ｍｅｄ． １１２：２５４−２６１， １９９０； Ｙａｒｃｈｏａｎら、Ｐｒｏｃ． Ｖｔｈ Ｉｎｔ． Ｃｏｎｆ． ｏｎ ＡＩＤＳ， ｐ．５６４， ＭＣＰ １３７， １９８９）。
したがって、たとえ、かなりの努力が抗レトロウイルス薬およびワクチンの設計および試験に向けられていても、効果的で非毒性の治療に対する当該分野における要望がある。
【０００５】
ＡＩＤＳに対する新規な治療的介入の標的；シクロフィリンＡ
シクロフィリンＡ（本明細書では以後、「ＣｙＰＡ」という）は、幅広い種類の細胞において発現される１９ＫＤ蛋白質である。ＣｙＰＡは免疫抑制剤シクロスポリンＡ（以後、「ＣｓＡ」という）に結合し（Ｅｔｚｋｏｒｎら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｂｉｏｌｏｇｙ ３； ９２９−９３３， １９９３； Ｌｉｕ， Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｔｏｄａｙ． １４： ２９０−２９５， １９９３（Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｔｏｄａｙ １４（８）：３９９， １９９３に正誤表が発表された）、ペプチジル−プロリルシス−トランスイソメラーゼ（ＰＰＩａｓｅ）活性および蛋白質折りたたみまたは「シャペロン」活性を有する（Ｇａｌａｔ， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２１６：６８９−７０７， １９９３； Ｋｏｆｒｏｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ． ３０：６１２７−６１３４， １９９１ （Ｂｉｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３０（４４）：１０８１８， １９９１において正誤表が発表された）。ＣｙＰＡは、免疫の調節に関与する関連細胞因子の１群である「イムノフィリンファミリー」のメンバーである（Ｇａｌａｔ， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２１６−６８９−７０７， １９９３； Ｆｒｕｍａｎら、ＦＡＳＥＢ． Ｊ． ８：３９１−４００， １９９４）。少なくとも４つの型の哺乳類シクロフィリンがクローン化されている（ＣｙＰＡ、ＣｙＰＢ、ＣｙＰＣおよびｈＣｙＰ３）（Ｆｒｉｅｄｍａｎら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ９０：６８１５−６８１９， １９９３）。
【０００６】
ＣｙＰＡは、移植片拒絶の予防において幅広く使用される強力な免疫抑制剤であるＣｓＡに対する宿主細胞受容体の１つであると認識される。ＣｓＡは、強力な免疫抑制、抗寄生虫、殺真菌および慢性抗炎症特性を示す疎水性環状ウンデカペプチドのファミリーのメンバーである。ＣｓＡは、Ｔ細胞活性化における初期段階を阻害することによってその免疫抑制効果を発揮すると考えられる。ＣｓＡは、Ｔ細胞増殖因子インターロイキン２（ＩＬ−２）のＲＮＡ転写を阻害し、前駆体細胞融解性Ｔリンパ球によるＩＬ−２受容体の発現を阻害することが見出された（Ｐａｌａｃｉｏｓ， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １２８： ３３７， １９８２）。ＣｙＰＡは、免疫抑制を顕在化するのに必要なレベルと一致した値である１０−８モル／Ｌの範囲の解離定数でＣｓＡに結合する（Ｈａｎｄｓｃｈｕｍａｃｈｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２６：５４４， １９８４）。
【０００７】
ＣｙＰＡとＨＩＶビリオンのＧａｇ蛋白質、詳細にはそのキャプシド抗原部分との機能的結合が同定された（ｌｕｂａｎら、Ｃｅｌｌ， １９９３）。ＣｙＰＡは特異的にＨＩＶ−１ビリオン中に組み込まれ、Ｇａｇ−シクロフィリン相互作用の崩壊がＣｙＰＡのビリオン中への組み込みおよびＨＩＶ−１複製の両方を妨げることが報告された（Ｆｒａｎｋｅら、Ｎａｔｕｒｅ ３７２：３５９−３６２， １９９５； Ｔｈａｌｉら、Ｎａｔｕｒｅ ３７２：３６３−３６５， １９９４）。これらのデータは、ＧａｇとＣｙＰＡとの相互作用が感染性ＨＩＶ−１ビリオンの形成に必要であるというモデル（Ｂｒａａｔｅｎら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ． ７０： ３５５１−３５６１， １９９６）と一致する。
【０００８】
ＣｓＡは、イン・ビトロでＧａｇ−シクロフィリン相互作用を干渉し、シクロフィリンのビリオン中への組み込みを阻害し、細胞培養におけるＨＩＶ−１の複製を阻害することが示された（Ｆｒａｎｋｅら、上掲；Ｔｈａｌｉら、上掲；Ｂｉｌｌｉｃｈら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ． ６９：２４５１−２４６１， １９９５）。ＣｓＡがＨＩＶ−１ウイルスと直接相互作用することは示されていない。ＣｓＡおよびその類似体がＨＩＶ生活環における２つの段階にて干渉すると仮定される。第１に、感染の確立の間にＣｙＰＡと相互作用することによる。ここに、ＣｓＡ処理は、環状ＨＩＶ ＤＮＡの形成およびプロウイルスＤＮＡの宿主ゲノム中への組み込みによって測定した場合、感染細胞のゲノム中への組み込みの前にＨＩＶ感染を阻害する（Ｓｈｅｒｒｙら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ９５： １７５８−１７６３， １９９８）。第２に、ウイルス複製の後期にてＣｙＰＡと相互作用し、ＨＩＶ−１粒子中へのＣｙＰＡ組み込みを妨げることによって、ウイルスを非感受性にすることによる（Ｂｉｌｌｉｃｈら、上掲）。したがって、研究活動は、抗ＨＩＶ剤を開発するための試みにおいて、ウイルス性Ｇａｇ蛋白質と細胞性ＣｙＰＡ蛋白質との間の相互作用を崩壊させることに集中している。
【０００９】
上述の観察にもかかわらず、患者におけるＨＩＶ感染の治療としてのＣｓＡの有用性は厳格に制限されている。第１に、ＣｓＡは強力な免疫抑制剤である。したがって、免疫系が損なわれるであろうＨＩＶ感染患者におけるその使用は禁忌である。さらに、ＣｓＡおよびその類似体のＨＩＶ阻害効果は、ＣｓＡを用いて免疫抑制を実現するのに必要な量よりも１０〜１００倍高い薬物濃度を必要とする。やや逆説的には、シクロスポリンの一般的に全身性免疫系を抑制する能力は、ＨＩＶ感染の治療として提案されている（米国特許第４８１４３２３号参照）。しかしながら、激しく免疫抑制された状態のＨＩＶ感染患者では、該治療法はひどい不利益を有する。
【００１０】
したがって、当該分野において、新規なＣｙＰＡ関連性介入標的および結合剤を同定し、特徴付けること、およびＨＩＶ感染の治療および予防のための新規な化合物および方法を同定するためのそれらの使用に対する要望がある。当該分野において、ＣｙＰＡが特異的に細胞と相互作用してＨＩＶ感染の媒介となる手段を同定および機構的に理解すること、およびかかるメカニズムの治療上の使用方法または新規な治療剤を見出すこと、または新規かつ有用な診断的および予後的アッセイを提供することに対する要望がある。
【００１１】
（２）慢性関節リウマチ
慢性関節リウマチ（以後、ＲＡという）は、関節の慢性炎症性疾患である。ＲＡは、相当な罹病率、機能的無能力および高い死亡率を伴う（Ｈａｒｒｉｓ， Ｎ． Ｅｎｇｌ． Ｊ． Ｍｅｄ． ３２２：１２７７−１２８９， １９９０ （Ｎ． Ｅｎｇｌ． Ｊ． Ｍｅｄ． ３２３：９９６， １９９０に正誤表が発表された；コメント参照））。米国において概算で２−４百万ケースのＲＡがあり、そのピークの発病率は３５歳〜４５歳である（Ｂｒｏｏｋｓ， 上掲）。ＲＡの病因は知られていない。
【００１２】
Ｔ細胞依存性メカニズムによって開始すると考えられる持続性炎症性滑膜炎は、代表的なＲＡの１つであり、通常、対称性多発関節炎として周囲の関節に影響を及ぼす（Ｂｒｏｏｋｓ，上掲）。該炎症性滑膜炎は、（ａ）酸素ラジカルおよび蛋白質分解酵素を放出する好中球を浸潤させ、（ｂ）好中球プロテアーゼによって自体活性化されるマトリックスメタロプロテイナーゼのプロ酵素形態を放出し、次いで軟骨崩壊を引き起こす内在性繊維芽細胞様滑膜細胞によって、悪化すると考えられている。したがって、滑膜炎症は軟骨崩壊および骨腐食、次いで関節変形をもたらす（Ｚｖａｉｆｌｅｒ ＆ Ｆｉｒｅｓｔｅｉｎ， Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ． ３７： ７８３−７８９， １９９４； Ｓｅｗｅｌｌ ＆ Ｔｒｅｎｔｈａｍ， Ｌａｎｃｅｔ ３４１： ２８３−２８６， １９９３）。
【００１３】
Ｔ細胞関与
ＲＡの開始および永久化におけるＴ細胞の役割について強力な証拠が蓄積しているが、他の細胞型（例えば、樹状細胞、繊維芽細胞様滑膜細胞、および初代Ｂ細胞）は特徴的な進行性の関節崩壊に寄与している（Ｔｈｏｍａｓら、Ｊ． Ｌｅｕｋｏｃ． Ｂｉｏｌ． ６６： ２８６−２９２， １９９９； ＭｃＣａｃｈｒｅｎ， Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ． ３４： １０８５−１０９３， １９９１； Ｚｖａｉｆｌｅｒ ＆ Ｆｉｒｅｓｔｅｉｎ， 上掲）。相当な証拠が好中球および好中球生産物が関節崩壊に関与することを示す（Ｅｄｗａｒｄｓ ＆ Ｈａｌｌｅｔｔ， Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｔｏｄａｙ １８：３２０−３２４， １９９７； Ｈａｒｒｉｓ， 上掲；Ｋａｋｉｍｏｔｏら、Ｃｅｌｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ． １６５： ２６−３２， １９９５； Ｊａｎｕｓｚ ＆ Ｄｕｒｈａｍ， Ｉｎｆｌａｍｍ． Ｒｅｓ． ４６：５０３−５０８， １９９７； Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ９２：５１７−５２１， １９９５）。
【００１４】
したがって、慢性関節リウマチは、複数の細胞型が関与する複雑な進行性の疾患である。ＲＡ患者における治療的介入戦略は、第１に、該疾患の発病および進行を阻害することに向けられており、第２に、関節の損傷および傷害の媒介となる局所的な関節炎症を阻害することに向けられている（Ｈａｒｒｉｓ， Ｎ． Ｅｎｇｌ． Ｊ． Ｍｅｄ． ３２２： １２７７−１２８９， １９９０ （Ｎ． Ｅｎｇｌ． Ｊ． Ｍｅｄ． ３２３：９９６， １９９０に正誤表が発表された；コメント参照），Ｂｒｏｏｋｓ， Ｌａｎｃｅｔ ３４１：２８６−２９０， １９９３）。
【００１５】
ＲＡにおける滑液の過形成に対する刺激は、古典的には、免疫媒介性炎症過程として記載されてきた（Ｚｖａｉｆｌｅｒ ＆ Ｆｉｒｅｓｔｅｉｎ， Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ． ３７： ７８３−７８９９， １９９４）。かかる炎症は、ＲＡ滑膜の内膜下浸潤物中における有力な細胞である活性化したＣＤ４＋細胞によって生成される因子に対する応答であると考えられる（Ｚｖａｉｆｌｅｒ ＆ Ｆｉｒｅｓｔｅｉｎ， Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ． ３７： ７８３−７８９９， １９９４； ＭｃＣａｃｈｒｅｎ， Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ． ３４： １０８５−１０９３， １９９１）。さらに、特異的クラスＩＩ ＭＨＣ多形がＲＡに対する危険性を与えるという観察は、Ｔ細胞がＲＡの発達において中枢的な役割を果たすことを強く示唆する（Ｇｒｅｇｅｒｓｅｎら、Ａｍ． Ｊ． Ｍｅｄ． ８５： １７−１９． １９８８； Ｗｉｎｃｈｅｓｔｅｒら、Ｒｈｅｕｍ． Ｄｉｓ． Ｃｌｉｎ． Ｎｏｒｔｈ Ａｍ． １８：７６１−７８３， １９９２）。
【００１６】
Ｔ細胞がＲＡの病因の肝要な役割を果たすという事実は、ＲＡ患者における治療薬としてのシクロフィリンＡ（以後、「ＣｓＡ」という）の使用をもたらした（Ｙｏｃｕｍ， Ｓｅｍｉｎ． Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ． ２９： ２７−３５， １９９９； Ｂｒｏｏｋｓ， Ｌａｎｃｅｔ ３４１： ２８６−２９０， １９９３； ｄｅ Ｗｙｎｔｅｒら、Ｓｔｅｍ． Ｃｅｌｌｓ １６： ３４９−３５６， １９９８）。ＣｓＡは、シクロフィリンの細胞内貯蔵への結合を介して作用すると推定される強力な免疫抑制剤である（Ｅｒｌａｎｇｅｒ， Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｔｏｄａｙ． １３： ４８７−４９０， １９９２； Ｌｉｕ， Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｔｏｄａｙ １４： ２９０−２９５， １９９３ （Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｔｏｄａｙ １４（８）：３９９， １９９３に正誤表が発表された（コメント参照））。
【００１７】
ＲＡにおける非Ｔ細胞因子；好中球およびマトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰｓ）
２つの主張が、ＲＡ関連病理において、Ｔ細胞のほかに他の因子の決定的な関与を示す。第１に、Ｔ細胞産物がＲＡ滑液または抽出物中で明らかにされなかった（Ｅｄｗａｒｄｓ ＆ Ｈａｌｌｅｔｔ， Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｔｏｄａｙ １８：３２０−３２４， １９９７）。第２に、Ｔ細胞媒介性免疫応答の修飾に基づく現行の戦略は効き目がなく、深刻な毒性を伴う可能性がある。さらに、特に、該疾患がいったん確立されたならば（すなわち、およそ１年目以降に）、かかるＴ細胞に基づく戦略が骨および軟骨破壊の進行を制限できるという証拠がない（Ｚｖａｉｆｌｅｒ ＆ Ｆｉｒｅｓｔｅｉｎ， Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ． ３７： ７８３−７８９， １９９４； Ｙｏｃｕｍ， Ｓｅｍｉｎ． Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ． ２９：２７−３５， １９９９）。
【００１８】
好中球
ＲＡは、滑液中の大量の好中球の蓄積によって特徴付けられる。Ｃ５ａ、ロイコトリエンＢ４、血小板活性化因子（ＰＡＦ）およびＩＬ−８のような化学誘引物質（Ｈａｒｒｉｓ， Ｎ． Ｅｎｇｌ． Ｊ． Ｍｅｄ． ３２２： １２７７−１２８９， １９９０ （Ｎ． Ｅｎｇｌ． Ｊ． Ｍｅｄ． ３２３： ９９６， １９９０に正誤表が発表された；コメント参照）； Ｅｄｗａｒｄｓ ＆ Ｈａｌｌｅｔｔ， Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｔｏｄａｙ １８： ３２０−３２４， １９９７； Ｐｒｅｍａｃｋ ＆ Ｓｃｈａｌｌ， Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ． ２： １１７４−１１７８， １９９６）は、特徴的な好中球流入の顕在化において役割を果たすと考えられる。好中球は、おそらく細胞破壊物および免疫複合体の食作用によって、滑液内で活性化し、その結果、脱顆粒およびプロテイナーゼおよび反応性オキシダントの放出をもたらす（Ｈａｒｒｉｓ， Ｎ． Ｅｎｇｌ． Ｊ． Ｍｅｄ． ３２２： １２７７−１２８９， １９９０ （Ｎ．Ｅｎｇｌ． Ｊ． Ｍｅｄ． ３２３： ９９６， １９９０に正誤表が発表された；コメント参照））。さらに、活性化された好中球は、ＲＡ滑液中で検出可能なサイトカインの多く：ＩＬ−１β、ＩＬ−８、ＩＬ−１２、ＴＮＦ−α、ＴＧＦ−およびＧＲＯ−αを分泌する（Ｅｄｗａｒｄｓ ＆ Ｈａｌｌｅｔｔ， Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｔｏｄａｙ １８： ３２０−３２４， １９９７）。好中球はまた、おそらく、破壊する関節中に酵素（例えば、エラスターゼ）を放出するので、組織破壊において中心的な役割を果たす（Ｓｗｅｌｌ ＆ Ｔｒｅｎｔｈａｍ， Ｌａｎｃｅｔ ３４１： ２８３−２８６， １９９３； Ｅｄｗａｒｄｓ ＆ Ｈａｌｌｅｔｔ， Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｔｏｄａｙ １８： ３２０−３２４， １９９７）。したがって、特異的な阻害剤（例えば、ＭＤＬ１０１、１４６およびＯＮＯ−５０４６）を用いて好中球エラスターゼを阻害することは、関節炎動物モデルにおいて軟骨破壊の減少をもたらす（Ｊａｎｕｓｚ ＆ Ｄｕｒｈａｍ， Ｉｎｆｌａｍｍ． Ｒｅｓ． ４６：５０３−５０８， １９９７； Ｋａｋｉｍｏｔｏら、Ｃｅｌｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ． １６５： ２６−３２， １９９５）。
【００１９】
マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰｓ）
マトリックスメタロプロテイナーゼ（以後、「ＭＭＰｓ」という）は、細胞外マトリックス成分を破壊することのできる構造的に関連する亜鉛メタロエンドペプチダーゼの群を含む（Ｎａｇａｓｅら、Ｍａｔｒｉｘ Ｓｕｐｐｌ． １：２３７−２４４， １９９２； Ｇｉａｍｂｅｒｎａｒｄｉら、Ｍａｔｒｉｘ Ｂｉｏｌ． １６： ４８３−４９６， １９９８）。ＭＭＰｓは、ＭＭＰ活性が種々の細胞型において正確に調節される正常組織リモデリング過程において重要な有益な役割を果たす。ＭＭＰ活性は、前駆体活性化（プロＭＭＰからＭＭＰへ）または内在性阻害剤、例えば、α２−マクログロブリンおよびメタロプロテイナーゼの組織阻害剤（ＴＩＭＰｓ）による活性化された種の阻害のいずれかによって、細胞性遺伝子発現レベルにて調節されるだけでなく、蛋白質レベルでも調節される（Ｎａｇａｓｅら、Ｍａｔｒｉｘ Ｓｕｐｐｌ． １：２３７−２４４， １９９２； Ｏｇａｔａら、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７０：１８５０６−１８５１１， １９９５； Ｚｕｃｋｅｒら、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７３： １２１６−１２２２， １９９８）。
しかしながら、ＭＭＰｓの脱調節作用は、関節炎、歯周炎、組織潰瘍、ならびに癌細胞侵入および転移などの多くの結合組織疾患における細胞外マトリックスの病理学的破壊に寄与する（Ｋａｈａｒｉら、Ｅｘｐ． Ｄｅｒｍａｔｏｌ． ６： １９９−２１３， １９９７； Ｋｅｙｓｚｅｒら、Ｊ． Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ． ２６： ２５１−２５８， １９９９； Ｂｅｎｂｏｗら、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７４： ２５３７１−２５３７８， １９９９； Ｋｅｙｓｚｅｒら、Ｚ． Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ ５７： ３９２−３９８， １９９８）。
【００２０】
ＲＡの新規な治療的介入標的：シクロフィリン
ＲＡにおける病理学的プロセスの正確な原因はまだ論争中である。典型的には、ＲＡの治療は、非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）および遅効性抗リューマチ薬（ＳＡＡＲＤ）の組み合わせを用いる多くの専門分野にわたるアプローチを含んでいた。かかる組み合わせ療法は、しばしば効果的であるが、重大な副作用をもたらす。例えば、ＮＳＡＩＤは関節炎症の重大な症状の軽減を提供するが、腎臓および胃に蓄積して、胃腸の不快感、腎臓損傷および皮膚反応を包含する有害な反応をもたらす可能性がある（Ｙｏｃｕｍ， Ｓｅｍｉｎ． Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ． ２９： ２７−３５， １９９９； Ｂｒｏｏｋｓ， Ｌａｎｃｅｔ ３４１： ２８６−２９０， １９９３）。
したがって、ＲＡの新規な治療法の設計を可能にするであろう新規な治療標的を同定することに対し、当該分野において要望がある。ＲＡにおける治療的介入のための３つの幅広い病理学的プロセス領域は：異常なＴ細胞活性化応答；滑液細胞の異常増殖ならびに滑液細胞による過剰なサイトカインおよびＭＭＰ生産；および末梢血から管外部位への白血球の移動である。
【００２１】
シクロフィリンＡ
上記の３つプロセス領域の全てに関連する１の特異的治療標的は、ＣｓＡの遍在的に分布した宿主細胞受容体であるシクロフィリンＡ（以後、「ＣｙＰＡ」という）である。ＣｙＰＡは、完全に細胞内蛋白質ではないが、また、炎症刺激に応答して細胞により分泌される（Ｓｈｅｒｒｙら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８９： ３５１１−３５１５， １９９２）。細胞外ＣｙＰＡは、イン・ビトロでの強力な好中性および好酸性化学誘引物質であり、イン・ビボで注射されたとき、好中球の迅速な流入によって特徴付けられる炎症応答を顕在化する（Ｓｈｅｒｒｙら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８９： ３５１１−３５１５， １９９２； Ｘｕら、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６７： １１９６８−１１９７１， １９９２； Ｌｅｉｖａ ＆ Ｌｙｔｔｌｅ， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ． １８６： １１７８−１１８３６， １９９２）。ＣｙＰＡの白血球誘引活性はＣｓＡの存在下で阻害されるが、ＣｓＡの非免疫抑制類似体であるシクロフィリンＧによって阻害されない（Ｓｈｅｒｒｙら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８９： ３５１１−３５１５， １９９２； Ｘｕら、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６７： １１９６８−１１９７１， １９９２）。
【００２２】
ＲＡ患者の関節中の滑液は、高レベルのＣｙＰＡを含有しており、かかるＣｙＰＡレベルは滑液中の好中球の数および疾患の重篤度の両方と相関する（Ｂｉｌｌｉｃｈら、Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １８５： ９７５−９８０， １９９７）。滑液中に放出されたＣｙＰＡが好中球を誘引しており、それが到達すると活性化し、次いで、蛋白質分解性酵素およびオキシダントを放出し、軟骨破壊を促進し、疾患を悪化させると仮定するのが論理的である。したがって、ＲＡを軽減することにおけるＣｓＡの有効性は２つの方法において明らかにされうる。第１に、そのＴ細胞活性化干渉能を介して作用することができ、よって疾患プロセスの開始を干渉しうる。第２に、ＣｓＡは、活性な疾患の期間中、関節において放出されるＣｙＰＡに結合することによって作用することができ、それにより、ＣｙＰＡの好中性化学誘引活性を阻害しうる。
しかしながら、ＣｓＡ処理は本質的に毒性であり、その結果、肝臓破壊、免疫抑制をもたらし、また、日和見感染に感染しやすくなる。これらの毒性影響は、ＣｓＡが膜浸透性であり、全ての細胞中に容易に侵入するという事実の結果である。
【００２３】
したがって、当該分野において、ＲＡ病因および進行、ＨＩＶ感染およびこれらのプロセスのメカニズムの悪化の基本的病態生理学のさらなる理解を得る必要がある。したがって、当該分野において、新規なシクロフィリン関連介入標的を同定し、特徴付ける必要があり、また、炎症疾患を治療するための、およびＨＩＶ感染を予防するための新規な化合物および方法を同定するためにかかる標的を使用する必要がある。当該分野において、シクロフィリンが特異的に細胞と相互作用してシグナル変換およびＨＩＶ感染の媒介となる手段を同定し、そのメカニズムを理解する必要がある。最後に、当該分野において、いったん同定されたならば、かかるメカニズムがどのように治療上使用できるかを理解するか、または新規な治療剤を見出すか、またはこれらの症状の新規かつ有用な診断的および予後的アッセイを提供する必要がある。
【００２４】
（発明の開示）
本発明は、以前に知られた細胞外マトリックスメタロプロテイナーゼ誘導蛋白質（”ＥＭＭＰＲＩＮ”）（配列番号２）（ＣＤ１４７としても知られる）がシクロフィリン（”ＣｙＰ”）の新規な細胞表面受容体であるという驚くべき知見に基づいている。したがって、本発明の実施例および具体例は、ＨＩＶ−１感染、後天性免疫不全症候群（”ＡＩＤＳ”）、炎症性および自己免疫疾患（例えば、慢性関節リウマチ（”ＲＡ”）、ＥＡＥ、ＡＲＤＳおよび歯周炎）、結合組織障害、腫瘍成長または移転、あるいは治療の必要な患者における局所的または全身性のＣｙＰ放出、合成または結合によって特徴付けられるいずれかの症状などの徴候のための治療法、医薬組成物およびかかる徴候に対する治療活性を有する試験化合物のスクリーニングアッセイを提供する。
【００２５】
治療法
本発明は、炎症性疾患、自己免疫疾患、組織潰瘍、腫瘍成長または転移、あるいは治療の必要な患者における局所的または全身性のＣｙＰ放出、合成または結合によって特徴付けられるいずれかの症状を治療または予防するための方法であって、治療上有効量のＣｙＰ／ＥＭＭＰＲＩＮアンタゴニストまたはアゴニストを患者に投与することを特徴とする方法を提供する。好ましくは、ＣｙＰ／ＥＭＭＰＲＩＮアンタゴニストまたはアゴニストは、抗−ＥＭＭＰＲＩＮ抗体、可溶性ＥＭＭＰＲＩＮ蛋白質またはポリペプチド、ＣｙＰ蛋白質またはポリペプチドおよびその組み合わせである。好ましくは、炎症性または自己免疫疾患は、関節炎、ＥＡＥ、ＡＲＤＳまたは歯周炎である。好ましくは、ＣｙＰ／ＥＭＭＰＲＩＮアンタゴニストまたはアゴニストは、抗−ＥＭＭＰＲＩＮ抗体である。好ましくは、抗−ＥＭＭＰＲＩＮ抗体はＥＭＭＰＲＩＮの細胞外ドメインまたは膜貫通ドメインに結合する。好ましくは、抗−ＥＭＭＰＲＩＮ抗体はモノクローナル抗体である。好ましくは、抗−ＥＭＭＰＲＩＮモノクローナル抗体は、１本鎖抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体またはＦａｂフラグメントである。最も好ましくは、抗−ＥＭＭＰＲＩＮ抗体は、ＵＭ−８Ｄ６抗−ＣＤ１４７モノクローナル抗体によって認識されるエピトープに結合する。好ましくは、ＣｙＰ／ＥＭＭＰＲＩＮアンタゴニストまたはアゴニストは、ＥＭＭＰＲＩＮ膜貫通ドメインに対応する配列番号２のおよその残基２０６からおよその残基２２９までにわたる配列から取り出した約５〜１４個のアミノ酸のアミノ酸配列を含むＥＭＭＰＲＮポリペプチドである。
【００２６】
本発明は、さらに、炎症性疾患、自己免疫疾患、組織潰瘍、腫瘍成長または転移あるいは治療の必要な患者における局所的または全身性のＣｙＰ放出、合成または結合によって特徴付けられるいずれかの症状を治療または予防する方法であって、治療上有効量の式Ｉ：
Ｉ　　　　Ｒ１−Ｒ２−Ｒ３−Ｒ４−Ｒ５−Ｒ６−Ｐｒｏ−Ｒ７−Ｒ８−Ｒ９
［式中、Ｒ１−は、Ｈｉｓ−、ＳｅｒＨｉｓ−、ＡｒｇＳｅｒＨｉｓ−、Ｌｙｓ−、ＬｙｓＬｙｓ−、Ａｒｇ−であるか、または存在せず；Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は独立して、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ａｌａ、Ｍｅｔであるか、または存在せず；Ｒ５およびＲ８は独立して、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、ＡｌａまたはＭｅｔであり；Ｒ６およびＲ７は独立して、Ｐｈｅ、ＴｒｐまたはＴｙｒであり；−Ｒ９は、−Ｇｌｙ、−ＧｌｙＩｌｅ、−ＧｌｙＩｌｅＶａｌであるか、または存在しない］
で示される化合物を患者に投与することを特徴とする方法を提供する。好ましくは、Ｒ１−がＨｉｓ−、ＳｅｒＨｉｓ−、ＡｒｇＳｅｒＨｉｓ−、Ｌｙｓ−、ＬｙｓＬｙｓ−、Ａｒｇ−であるか、または存在せず；Ｒ２−がＬｅｕであり；Ｒ３がＡｌａであり；Ｒ４がＡｌａであり；Ｒ５がＬｅｕであり；Ｒ６がＴｒｐであり；Ｒ７がＰｈｅであり；Ｒ８がＬｅｕであり；−Ｒ９が存在しない式Ｉである。好ましくは、Ｒ１−が存在せず；Ｒ２がＬｅｕであり；Ｒ３がＡｌａであり；Ｒ４がＡｌａであり；Ｒ５がＬｅｕであり；Ｒ６がＴｒｐであり；Ｒ７がＰｈｅであり；Ｒ８がＬｅｕであり；−Ｒ９が存在しない式Ｉである。
【００２７】
本発明は、さらに、細胞が機能的ＥＭＭＰＲＩＮ受容体を発現し、レトロウイルスがウイルス感染の組み込み前工程において該ＥＭＭＰＲＩＮ受容体を利用するレトロウイルス感染に対する細胞の感受性を減少させる方法であって、レトロウイルス感染の組み込み前工程を阻害するのに十分な量のＣｙＰ／ＥＭＭＰＲＩＮアンタゴニストまたはアゴニストと該細胞とを接触させることを特徴とする方法を提供する。好ましくは、ＣｙＰ／ＥＭＭＰＲＩＮアンタゴニストまたはアゴニストは、抗−ＥＭＭＰＲＩＮ抗体、可溶性ＥＭＭＰＲＩＮ蛋白質またはペプチド、ＣｙＰ誘導体またはペプチド、およびその組み合わせである。好ましくは、ＣｙＰ／ＥＭＭＰＲＩＮアンタゴニストまたはアゴニストは、抗−ＥＭＭＰＲＩＮ抗体である。好ましくは、抗−ＥＭＭＰＲＩＮ抗体はＥＭＭＰＲＩＮの細胞外ドメインまたは膜貫通ドメインに結合する。好ましくは、抗−ＥＭＭＰＲＩＮ抗体はモノクローナル抗体である。好ましくは、抗−ＥＭＭＰＲＩＮモノクローナル抗体は、１本鎖抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体またはＦａｂフラグメントである。最も好ましくは、抗−ＥＭＭＰＲＩＮ抗体は、ＵＭ−８Ｄ６抗−ＣＤ１４７モノクローナル抗体によって認識されるエピトープに結合する。好ましくは、ＣｙＰ／ＥＭＭＰＲＩＮアンタゴニストまたはアゴニストは、ＥＭＭＰＲＩＮ膜貫通ドメインに対応する配列番号２のおよその残基２０６からおよその残基２２９までにわたる配列から取り出した約５〜１４個のアミノ酸のアミノ酸配列を含むＥＭＭＰＲＮポリペプチドである。
【００２８】
本発明は、さらに、細胞が機能的ＥＭＭＰＲＩＮ受容体を発現し、レトロウイルスがウイルス感染の組み込み前工程においてＥＭＭＰＲＩＮ受容体を利用するレトロウイルス感染に対する細胞の感受性を減少させる方法であって、該細胞をレトロウイルス感染の組み込み前工程を阻害するのに十分な量の式Ｉ：
Ｉ　　　　Ｒ１−Ｒ２−Ｒ３−Ｒ４−Ｒ５−Ｒ６−Ｐｒｏ−Ｒ７−Ｒ８−Ｒ９
［式中、Ｒ１−は、Ｈｉｓ−、ＳｅｒＨｉｓ−、ＡｒｇＳｅｒＨｉｓ−、Ｌｙｓ−、ＬｙｓＬｙｓ−、Ａｒｇ−であるか、または存在せず；Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は独立して、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ａｌａ、Ｍｅｔであるか、または存在せず；Ｒ５およびＲ８は独立して、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、ＡｌａまたはＭｅｔであり；Ｒ６およびＲ７は独立して、Ｐｈｅ、ＴｒｐまたはＴｙｒであり；−Ｒ９は、−Ｇｌｙ、−ＧｌｙＩｌｅ、−ＧｌｙＩｌｅＶａｌであるか、または存在しない］
で示される化合物と接触させることを特徴とする方法を提供する。好ましくは、Ｒ１−がＨｉｓ−、ＳｅｒＨｉｓ−、ＡｒｇＳｅｒＨｉｓ−、Ｌｙｓ−、ＬｙｓＬｙｓ−、Ａｒｇ−であるか、または存在せず；Ｒ２がＬｅｕであり；Ｒ３がＡｌａであり；Ｒ４がＡｌａであり；Ｒ５がＬｅｕであり；Ｒ６がＴｒｐであり；Ｒ７がＰｈｅであり；Ｒ８がＬｅｕであり；−Ｒ９が存在しない式Ｉである。好ましくは、Ｒ１−が存在せず；Ｒ２がＬｅｕであり；Ｒ３がＡｌａであり；Ｒ４がＡｌａであり；Ｒ５がＬｅｕであり；Ｒ６がＴｒｐであり；Ｒ７がＰｈｅであり；Ｒ８がＬｅｕであり；−Ｒ９が存在しない式Ｉである。
【００２９】
本発明は、さらに、ＨＩＶ感染、ＡＩＤＳまたはＡＩＤＳ関連障害をその治療が必要な患者において治療または予防する方法であって、治療上有効量のＣｙＰＡ／ＥＭＭＰＲＩＮアンタゴニストまたはアゴニストを患者に投与することを特徴とする方法を提供する。好ましくは、ＣｙＰ／ＥＭＭＰＲＩＮアンタゴニストまたはアゴニストは、抗−ＥＭＭＰＲＩＮ抗体、可溶性ＥＭＭＰＲＩＮ蛋白質またはペプチド、ＣｙＰＡ誘導体またはペプチドおよびその組み合わせである。好ましくは、ＣｙＰ／ＥＭＭＰＲＩＮアンタゴニストまたはアゴニストは抗−ＥＭＭＰＲＩＮ抗体である。好ましくは、抗−ＥＭＭＰＲＩＮ抗体は、ＥＭＭＰＲＩＮの細胞外ドメインまたは膜貫通ドメインに結合する。好ましくは、抗−ＥＭＭＰＲＩＮ抗体はモノクローナル抗体である。好ましくは、抗−ＥＭＭＰＲＩＮモノクローナル抗体は、１本鎖抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体またはＦａｂフラグメントである。最も好ましくは、抗−ＥＭＭＰＲＩＮ抗体はＵＭ−８Ｄ６抗−ＣＤ１４７モノクローナル抗体によって認識されるエピトープに結合する。
【００３０】
本発明は、さらに、ＨＩＶ感染、ＡＩＤＳまたはＡＩＤＳ関連障害をその治療が必要な患者において治療または予防する方法であって、治療上有効量の式Ｉ：
Ｉ　　　　Ｒ１−Ｒ２−Ｒ３−Ｒ４−Ｒ５−Ｒ６−Ｐｒｏ−Ｒ７−Ｒ８−Ｒ９
［式中、Ｒ１−は、Ｈｉｓ−、ＳｅｒＨｉｓ−、ＡｒｇＳｅｒＨｉｓ−、Ｌｙｓ−、ＬｙｓＬｙｓ−、Ａｒｇ−であるか、または存在せず；Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は独立して、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ａｌａ、Ｍｅｔであるか、または存在せず；Ｒ５およびＲ８は独立して、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、ＡｌａまたはＭｅｔであり；Ｒ６およびＲ７は独立して、Ｐｈｅ、ＴｒｐまたはＴｙｒであり；−Ｒ９は、−Ｇｌｙ、−ＧｌｙＩｌｅ、−ＧｌｙＩｌｅＶａｌであるか、または存在しない］
で示される化合物を患者に投与することを特徴とする方法を提供する。好ましくは、Ｒ１−がＨｉｓ−、ＳｅｒＨｉｓ−、ＡｒｇＳｅｒＨｉｓ−、Ｌｙｓ−、ＬｙｓＬｙｓ−、Ａｒｇ−であるか、または存在せず；Ｒ２がＬｅｕであり；Ｒ３がＡｌａであり；Ｒ４がＡｌａであり；Ｒ５がＬｅｕであり；Ｒ６がＴｒｐであり；Ｒ７がＰｈｅであり；Ｒ８がＬｅｕであり；−Ｒ９が存在しない式Ｉである。好ましくは、Ｒ１−が存在せず；Ｒ２がＬｅｕであり；Ｒ３がＡｌａであり；Ｒ４がＡｌａであり；Ｒ５がＬｅｕであり；Ｒ６がＴｒｐであり；Ｒ７がＰｈｅであり；Ｒ８がＬｅｕであり；−Ｒ９が存在しない式Ｉである。
【００３１】
スクリーニングアッセイ
本発明はさらに、ＨＩＶ感染、ＡＩＤＳまたはＡＩＤＳ関連障害、炎症性疾患、自己免疫疾患、腫瘍成長または転移あるいは治療が必要な患者における局所的または全身性のＣｙＰ放出、合成または結合によって特徴付けられるいずれかの症状に対して治療活性を有する試験化合物を同定する方法であって：（ａ）試験化合物を機能的ＣｙＰ蛋白質および機能的ＥＭＭＰＲＩＮ蛋白質と接触させ、ここに、該蛋白質の少なくとも１つが検出可能なラベルを有し；（ｂ）いずれかの得られるＥＭＭＰＲＩＮ／ＣｙＰ複合体を該ラベルの存在に関してアッセイし；次いで（ｃ）試験化合物がＣｙＰ蛋白質のＥＭＭＰＲＩＮ蛋白質への結合を阻害したかどうかを決定し、それにより、ＣｙＰ蛋白質のＥＭＭＰＲＩＮ蛋白質への結合を阻害する試験化合物が治療化合物として同定されることを特徴とする方法を提供する。好ましくは、機能的ＥＭＭＰＲＩＮ蛋白質または機能的ＣｙＰ蛋白質のいずれかを固相上に固定する。好ましくは、ＣｙＰ蛋白質またはＥＭＭＰＲＩＮ蛋白質を放射能ラベル、蛍光レポーターまたはクエンチャー部分、比色または蛍光変化を触媒する酵素ラベルまたはその組み合わせで標識する。好ましくは、炎症性または自己免疫疾患は関節炎、ＥＡＥ、ＡＲＤＳまたは歯周炎である。
【００３２】
本発明は、さらに、ＨＩＶ感染、ＡＩＤＳまたはＡＩＤＳ関連障害、炎症性疾患、自己免疫疾患、腫瘍成長または転移あるいは治療の必要に患者における局所的または全身性のＣｙＰ放出、合成または結合によって特徴付けられるいずれかの症状に対する治療活性を有する試験化合物を同定する方法であって：（ａ）試験化合物を機能的ＣｙＰ蛋白質の存在下、機能的ＥＭＭＰＲＩＮ蛋白質を発現している細胞と接触させ；次いで（ｂ）試験化合物がＣｙＰ蛋白質のＥＭＭＰＲＩＮ蛋白質への結合を阻害するかどうかを決定し、それにより、ＣｙＰ蛋白質のＥＭＭＰＲＩＮ蛋白質への結合を阻害する試験化合物が治療化合物として同定されることを特徴とする方法を提供する。好ましくは、炎症性または自己免疫疾患は関節炎、ＥＡＥ、ＡＲＤＳまたは歯周炎である。好ましくは、細胞は組換えＥＭＭＰＲＩＮ、ＣＤ４、ＣＸＣＲ４またはその組み合わせを発現する。好ましくは、ＣｙＰ蛋白質のＥＭＭＰＲＩＮ蛋白質への結合の阻害の決定は、ＣｙＰ／ＥＭＭＰＲＩＮアンタゴニストアッセイ、受容体感作または脱感作アッセイ、受容体アップレギュレーションまたはダウンレギュレーションアッセイ、ＥＭＭＰＲＩＮ媒介性シグナル変換アッセイ、Ｃａ２＋動員アッセイ、マトリックスメタロプロテイナーゼ発現または活性アッセイ、細胞成長率アッセイ、ＨＩＶ−１感染アッセイ、および細胞サイクルまたは細胞分化の特異的マーカーの検出に基づくアッセイよりなる群から選択されるアッセイを基礎とする。好ましくは、ＥＭＭＰＲＩＮ媒介性シグナル変換アッセイは、細胞内蛋白質のリン酸化または活性化状態の決定に基づき、ここに、細胞内蛋白質は、Ｒａｓ、ＰＫＡ、ＲＡＰ１、Ｂ−Ｒａｆ、ＭｅｋおよびＭＡＰＫよりなる群から選択され、それにより、該細胞内蛋白質のリン酸化または活性化状態を対照細胞におけるそのリン酸化または活性化状態と比べて変化させる試験化合物が治療化合物として同定される。好ましくは、細胞周期または細胞分化の特異的マーカーは、細胞周期調節蛋白質サイクリンＤ１、サイクリンＥおよびｐ２１／Ｗａｆ１よりなる群から選択され、それにより、該細胞周期マーカーを対照細胞におけるその状態と比べて変化させる試験化合物が癌治療化合物として同定される。好ましくは、マトリックスメタロプロテイナーゼ発現アッセイは、プロＭＭＰ−１、プロＭＭＰ−３、プロＭＭＰ−９、ＭＭＰ−１、ＭＭＰ−３またはＭＭＰ−９の発現または活性を測定する。好ましくは、ＨＩＶ−１感染アッセイは、ウイルス性逆転写酵素活性またはウイルスに指示されるルシフェラーゼ発現を測定する。
【００３３】
医薬組成物
本発明はさらに、式Ｉの化合物またはその医薬上許容される塩および医薬上許容される担体を含んでなる医薬組成物を提供し、ここに、式Ｉは
Ｉ　　　　Ｒ１−Ｒ２−Ｒ３−Ｒ４−Ｒ５−Ｒ６−Ｐｒｏ−Ｒ７−Ｒ８−Ｒ９
［式中、Ｒ１−は、Ｈｉｓ−、ＳｅｒＨｉｓ−、ＡｒｇＳｅｒＨｉｓ−、Ｌｙｓ−、ＬｙｓＬｙｓ−、Ａｒｇ−であるか、または存在せず；Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は独立して、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ａｌａ、Ｍｅｔであるか、または存在せず；Ｒ５およびＲ８は独立して、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、ＡｌａまたはＭｅｔであり；Ｒ６およびＲ７は独立して、Ｐｈｅ、ＴｒｐまたはＴｙｒであり；−Ｒ９は、−Ｇｌｙ、−ＧｌｙＩｌｅ、−ＧｌｙＩｌｅＶａｌであるか、または存在しない］
である。好ましくは、Ｒ１−がＨｉｓ−、ＳｅｒＨｉｓ−、ＡｒｇＳｅｒＨｉｓ−、Ｌｙｓ−、ＬｙｓＬｙｓ−、Ａｒｇ−であるか、または存在せず；Ｒ２がＬｅｕであり；Ｒ３がＡｌａであり；Ｒ４がＡｌａであり；Ｒ５がＬｅｕであり；Ｒ６がＴｒｐであり；Ｒ７がＰｈｅであり；Ｒ８がＬｅｕであり；−Ｒ９が存在しない式Ｉである。好ましくは、Ｒ１−が存在せず；Ｒ２−がＬｅｕであり；Ｒ３がＡｌａであり；Ｒ４がＡｌａであり；Ｒ５がＬｅｕであり；Ｒ６がＴｒｐであり；Ｒ７がＰｈｅであり；Ｒ８がＬｅｕであり；−Ｒ９が存在しない式Ｉである。
【００３４】
図面の簡単な記載
図１（左側のパネル）は、本発明によって単離されたｃＤＮＡクローン（配列番号１）によってコードされるヒトＥＭＭＰＲＩＮ蛋白質の概略図を示す。２６９アミノ酸ＥＭＭＰＲＩＮ蛋白質は、シグナルペプチド（ｓｐ）、細胞外ドメイン（ｅｃｄ）、膜貫通ドメイン（ｔｍ）および細胞内ドメイン（ｉｃｄ）を包含する数個の機能的ドメインに分けられる。結合研究に用いられたＥＭＭ．Ｃ１およびＥＭＭ．Ｃ２構築物の両方がシグナルペプチドを欠き、一方（ＥＭＭ．Ｃ１）は細胞外ドメインのみを有していた。図１の右側のパネルは、［３５Ｓ］−標識したＥＭＭＰＲＩＮがＣｙＰＡセファロースアフィニティー樹脂によって特異的に保持されたことを示す。アフィニティーに結合されたＥＭＭＰＲＩＮを溶出し、電気泳動およびオートラジオグラフィーによって分析した。ＥＭＭＰＲＩＮはＣｙＰＡを欠く対照樹脂によって保持されなかった。
図２は、空のベクターで安定にトランスフェクトされたＣＨＯ細胞（ＣＨＯ）またはＥＭＭＰＲＩＮ発現ＣＨＯ細胞系統（ＣＨＯ−ＥＭＭ）におけるＥＭＭＰＲＩＮ発現のＦＡＣＳ分析を示す。ＥＭＭＰＲＩＮ発現は、抗−ＣＤ１４７（Ｍ６ＦＴ）、市販の抗−ＥＭＭＰＲＩＮ抗体（Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ， Ｉｎｃ．； Ｆｌａｎｄｅｒｓ， ＮＪ）を用いてＦＡＣＳによって分析された。ＣＨＯ細胞は安定にトランスフェクトされて高レベルのＥＭＭＰＲＩＮを発現することができる。
【００３５】
図３は、ＣＨＯ（ＥＭＭＰＲＩＮ発現なし）またはＣＨＯ−ＥＭＭ細胞（安定な構造的ＥＭＭＰＲＩＮ発現）におけるＣａ２＋動員が外来的に加えられたＣｙＰＡ（１０μｇ／ｍｌ）によって誘導されたことを示す（左側のパネル）。ＣＨＯ−ＥＭＭ細胞におけるＣｙＰＡに誘導されたシグナリングは、抗−ＣＤ１４７ｍＡｂ（Ｍ６ＦＴ）抗体（すなわち、抗−ＥＭＰＲＩＮｍＡＢ）によって阻害されたが、イソ型対照抗体によって阻害されなかった（右側のパネル）。
図４は、ゲニステイン（チロシンキナーゼ阻害剤）がＣＨＯ−ＥＭＭ細胞においてＣｙＰＡにより誘導されるＥＭＭＰＲＩＮ媒介性Ｃａ２＋動員を完全に排除したことを示す。ＣｙＰＡにより誘導されるＣａ２＋動員は、細胞内シグナルの変換に関与することが知られている種々のキナーゼの種々の阻害剤を用いて前処理されたＣＨＯ−ＥＭＭ細胞において測定された。曲線は、上方から下方へ、阻害剤なし、百日咳毒（ＰＴＸ）Ｂ−オリゴマー（ケモカイン受容体の交差脱感作を誘導する）、ＰＴＸ（Ｇｉ−ＧｏおよびＧｔ−蛋白質ファミリーのメンバーによって媒介されるシグナリング経路を不活性化する）、ＰＤ９８０５９（ＭＡＰＫ阻害剤）、ビシンドリルマレイミドＩ（ＰＫＣ阻害剤）およびゲニステインでの前処理を示す。ゲニステインは、ＣＨＯ−ＥＭＭ細胞においてＣｙＰＡにより誘導されるＣａ２＋動員を完全に排除した。
【００３６】
図５は、ＷＩ−３８ヒト初代肺繊維芽細胞におけるマトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）発現に対するＣｙＰＡ処理の影響のウェスタンイムノブロット分析を示す。ヒトＷＩ−３８繊維芽細胞をＣｙＰＡまたは培地のみで処理し、次いで、上清を収集し、ろ過し、マウスモノクローナル抗体（Ｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ， Ｌａ Ｊｏｌｌａ， ＣＡ）を用いて、ＭＭＰ−１、ＭＭＰ−３およびＭＭＰ−９反応性についてウェスタンイムノブロットによって分析した。ＣｙＰＡ−処理は、プロＭＭＰ−１の発現および放出を活性化し、プロＭＭＰ−３のそれを増加させた。
【００３７】
図６は、ルシフェラーゼ（左側および中央パネル）およびＨＩＶ−１逆転写酵素活性（右側パネル）の分析を示し、細胞表面ＥＭＭＰＲＩＮ発現がＣＨＯ−ＥＭＭＰＲＩＮ（ＣＨＯ−ＥＭＭ）細胞のＭｕＬＶ−およびＨＩＶ−１ＬＡＶ−偽型ＨＩＶ−１（Ｌｕｃ−ＨＩＶ−１）感染をＣＨＯ（対照）細胞と比べて増加させること、その増加効果が抗−ＣＤ１４７ｍＡｂ（ＵＭ−８Ｄ６）によって大いに減少されること、およびその増加効果がプロウイルスＤＮＡの組み込みの前の段階で明らかにされることを示す。
左側のパネルは、ルシフェラーゼを発現しているＭｕＬＶ−偽型ＨＩＶ−１で感染させたＣＨＯ（対照）またはＣＨＯ−ＥＭＭ（ＥＭＭＰＲＩＮを構造発現している）細胞におけるルシフェラーゼ発現（感染後４日目に測定され、対照に相対的なパーセンテージとして表した）を示す。細胞表面ＥＭＭＰＲＩＮの存在はルシフェラーゼ発現を５〜６倍に増加させた。さらに、この増加は、感染中に抗−ＣＤ１４７ｍＡｂ（ＵＭ−８Ｄ６）を加えた場合、大いに減少された。
中央パネルは、ＣＤ４−およびＣＸＣＲ−発現ベクターで一過性トランスフェクトし、次いで、侵入に関してＣＤ４およびＣＸＣＲ４に依存するＨＩＶ−１ＬＡＶ由来のＥｎｖを有する偽型であるＬｕｃ−ＨＩＶ−１で感染させたＣＨＯまたはＣＨＯ−ＥＭＭ細胞の３連培養におけるルシフェラーゼ発現を示す。ルシフェラーゼ発現は、対照（ＣＨＯ／ＣＤ４／ＣＸＣＲ４細胞；１００％とする）に相対的な発現のパーセンテージとして表わす。ルシフェラーゼ発現における３〜４倍の増加がＥＭＭＰＲＩＮを発現している細胞において観察された。
右側のパネルは、ＣＤ４−およびＣＸＣＲ４−発現ベクターで一過性トランスフェクトし、次いで、抗−ＣＤ１４７ｍＡｂ（ＵＭ−８Ｄ６）またはイソ型に合致する不適切な抗体の存在下、ＥｎｖＭｕＬＶ−またはＥｎｖＬＡ１−偽型ｌｕｃ−ＨＩＶ−１で感染させたＣＨＯおよびＣＨＯ−ＥＭＭ細胞における逆転写酵素活性を示す。ウイルス性ＤＮＡは、ＰＣＲによって、初期逆転写産物に特異的なプライマーＬＴＲ Ｒ／Ｕ５を用いて、感染の２時間後に分析された。結果は、ダイレクトイメージャー（Ｐａｃｋａｒｄ）において定量化され、対照（イソ型で処理したＣＨＯ／ＣＤ４／ＣＸＣＲ４細胞；１００とする）に相対的なＬＴＲ／ｇａｇ−特異的シグナルに関連する放射能として表わす。ＥｎｖＭｕＬＶおよびＥｎｖＬＡＶ−偽型ウイルスでの感染後のＬＴＲ Ｒ／Ｕ５逆転写産物の量は、ＣＨＯ／ＣＤ４／ＣＸＣＲ４細胞と比べてＣＨＯ−ＥＭＭ／ＣＤ４／ＣＸＣＲ４細胞において３〜４倍に増加した。さらに、抗−ＣＤ１４７ｍＡｂはＥＭＭＰＲＩＮの増加効果を減少させた。
【００３８】
図７Ａは、抗−ＣＤ１４７ｍＡｂがヒト初代ＰＢＭＣにおけるＨＩＶ−１複製を阻害したことを示す。ＰＨＡ活性化ＰＢＭＣの３連培養物をＴ−リンパ親和性Ｘ４株ＨＩＶ−１ＬＡＶまたはマクロファージ親和性Ｒ５ＨＩＶ−１ＡＤＡ（左側のパネル）、あるいはＬＡＶまたはＡＤＡ株由来の外被を有するルシフェラーゼを発現している組換えＨＩＶ−１偽型（右側のパネル）のいずれかで感染させた。抗−ＣＤ１４７ｍＡｂ（ＵＭ−８Ｄ６）またはイソ型に合致した対照ｍＡｂを感染の３０分前に加え、実験の間中存在させた。ウイルス複製は、２１日目の培養上清におけるＲＴ活性（左側のパネル）または感染後４日目のルシフェラーゼ活性（右側のパネル）によって評価した。結果は、対照（イソ型に合致した不適切なｍＡｂで処理した細胞；１００％とする）に相対的なＲＴまたはルシフェラーゼ活性として表わす。結果は、ＥＭＭＰＲＩＮがＨＩＶ−１感染に関与したことを示す。
【００３９】
図７Ｂは、抗−ＣＤ１４７ｍＡｂがヒトＰＢＭＣへのＨＩＶ付着を阻害しなかったことを示す。３連ＰＢＭＣ培養物を３７℃にて、抗−ＣＤ１４７ｍＡｂ（ＵＭ−８Ｄ６；５０μｇ／ｍｌ）、抗−ＣＤ４ｍＡｂ（５μｇ／ｍｌ）またはヘパリナーゼＩＩＩ（３ｘ１０−４ＩＵ／ｍｌ）で前処理し、次いで洗浄し、ＨＩＶ−１ＬＡＶ（ｐ２４の１０ｎｇ／ｍｌ）と一緒に４℃で１時間インキュベートした。細胞に結合したウイルス性ｐ２４の量をＥＬＩＳＡによってアッセイした。示される結果は、異なるドナー由来のＰＢＭＣを用いて行った３つの実験のうち１つの代表実験についてのものである。抗−ＣＤ１４７ｍＡｂ（ＵＭ−８Ｄ６）は、ヒトＰＢＭＣへのＨＩＶ−１ＬＡＶ付着を阻害しなかったが、抗−ＣＤ４ｍＡｂは付着を有意に減少させた。
【００４０】
図７Ｃは、抗−ＣＤ１４７ｍＡｂが、ＰＢＭＣとＨＩＶ−１ ＡＤＡおよびＬＡＶ外被を発現しているＨｅＬａ細胞との間のＨＩＶ Ｅｎｖ媒介性融合を阻害せず、また、ウイルス性ｐ２４の細胞インターナリゼーションを減少させなかったことを示す。左側のパネル：ＰＢＭＣとＨＩＶ−１Ｅｎｖ（Ｘ４ ＬＡＶまたはＲ５ Ｂａ−Ｌ）を発現しているＨｅＬａ細胞との間の融合は、抗−ＣＤ１４７（ＵＭ−８Ｄ６；５０μｇ／ｍｌ）または抗−ＣＤ４（５μｇ／ｍｌ）ｍＡｂの存在下、β−Ｇａｌ発現によって評価された（「方法」実施例６を参照のこと）。結果は、正の対照（非処理細胞；１００％とする）に相対的なβ−Ｇａｌ活性として表わし、同じドナー由来の細胞を用いる３つの独立した測定値の平均±ＳＤとして示す。右側のパネル：ウイルス−細胞融合の分析の場合、ＰＢＭＣをＨＩＶ−１ＬＡＶと一緒にインキュベートした（「方法」、実施例６を参照のこと）。次いで、細胞をトリプシン（０．０２５％、３０分間、３７℃）で処理し、溶解し、ウイルス性ｐ２４をＥＬＩＳＡにより溶解物中において測定した。これらのデータは、抗−ＣＤ１４７ｍＡｂ（ＵＭ−８Ｄ６）のＨＩＶ−１感染に対する阻害効果が融合後メカニズムによって媒介されたことを示す。
【００４１】
図７Ｄは、抗−ＣＤ１４７ｍＡｂがＨＩＶ−１逆転写量を減少させたことを示す。左上および右側のパネル：ＰＨＡ−活性化ヒトＰＢＭＣを抗−ＣＤ１４７ｍＡｂ（ＵＭ−８Ｄ６；５０μｇ／ｍｌ）または抗−ＣＤ４ｍＡｂ（２μｇ／ｍｌ）、または対応するイソ型に合致した対照ｍＡｂ（５０μｇ／ｍｌ）のいずれかで、ＨＩＶ−１感染の２時間前に処理した。ＨＩＶ−１逆転写の分析は、ＨＩＶ−１ＬＡＶでのＰＢＭＣの感染の２時間後に、「ストロング−ストップ」初期逆転写産物に特異的なＬＴＲ Ｒ／Ｕ５プライマーを用いて行った。ＰＣＲ結果は、ダイレクトイメージャー（Ｐａｃｋａｒｄ）において定量化され、抗体−非処理対照（１００％とする）に相対的な処理細胞におけるカウントパーセンテージとして示す。抗−ＣＤ１４７ｍＡｂ（ＵＭ−８Ｄ６）は、逆転写産物の量をおよそ２倍減少させた。予測どおり（実施例６参照）、抗−ＣＤ４ｍＡｂはＬＴＲ Ｒ／Ｕ５増幅フラグメントの量をより一層減少させた。左下のパネル：細胞あたり１つのＨＩＶ−１ゲノムを含有する８Ｅ５／ＬＡＩ細胞の希釈物をＰＣＲ標準物として用いた。
【００４２】
図７Ｅは、ＨＩＶ−１蛋白質の細胞レベル以下の分布に対する抗−ＣＤ１４７ｍＡｂの影響を示す。５０μｇ／ｍｌの抗−ＣＤ１４７ｍＡｂ（Ａｎｃｅｌｌ）またはイソ型に合致した対照ｍＡｂの存在下、ＭＴ−４細胞に４℃にてＨＩＶ−１ＬＡＩを接種した。アリコート（１ｘ１０６細胞）を蛋白質分析のために３０分後に回収し（すなわち、０時間ｐ．ｉ．時点試料）（上方のパネル）、一方、接種した培養物を３７℃に移し、１．５時間インキュベートした（下方のパネル）。細胞分画を行い（「方法」、実施例６参照）、サイトソル（Ｃ）、膜（Ｍ）および細胞骨格（ＣＳ）画分中の蛋白質を、アクチン、ＣＡおよびＭＡに対するモノクローナル抗体を用いるウェスタンブロットおよびＥＣＬによって分析した。ウイルス性ＭＡ蛋白質およびＣＡは、抗−ＣＤ１４７ｍＡｂの不在下、感染の１．５時間後に膜（Ｍ）から各々、細胞骨格（ＣＳ）およびサイトソル画分へ輸送された（イソ型パネル、各々、レーン「ＣＳ」および「Ｃ」）。しかしながら、ＭＡおよびＣＡの両方が抗−ＣＤ１４７ｍＡｂ（ＵＭ−８Ｄ６）で処理されたＭＴ−４細胞における細胞膜画分に結合したままであり（α−ＣＤ１４７パネル、レーン「Ｍ」）、それは、ＥＭＭＰＲＩＮがＨＩＶ−１脱外被の調節に関与したことを示す。
【００４３】
図８は、ＣｓＡ耐性ＨＩＶウイルス株の複製が抗−ＣＤ１４７ｍＡｂによって阻害されなかったことを示す。２９３Ｔ細胞をシクロスポリンＡ（１μＭ）の不在下（”Ｃ”）または存在下（”ＣｓＡ”）、ＨＩＶ−１ＮＬ４−３（”ＷＴ”）（左のパネル）または変異体（”Ａ２２４Ｅ”）（右のパネル）ウイルスの分子クローンでトランスフェクトした。ウイルス生産性のトランスフェクト細胞を洗浄し、４連でさらに４日間、ＣＤ８＋Ｔ細胞涸渇ＰＢＭＣおよび抗−ＣＤ１４７ｍＡｂ（ＵＭ−８Ｄ６；１００μｇ／ｍｌ）を添加して（”２９３Ｔ＋ＣＤ４＋Ｔ細胞”）または添加しないで（”２９３Ｔ”）培養した。ウイルス複製は、培養上清中のＲＴ活性を測定することによってアッセイした。結果は平均±ＳＥとして示す。抗−ＣＤ１４７ｍＡｂ（ＵＭ−８Ｄ６）は、ＣｓＡ耐性Ａ２２４Ｅウイルスの複製を阻害しなかったが、野生型ウイルスの複製を有意に減少させた。
【００４４】
図９は、ＥＭＭＰＲＩＮ膜貫通領域のアミノ末端由来の８アミノ酸ポリペプチド（配列番号３）がＥｎｖＭｕＬＶ偽型ルシフェラーゼ発現性ＨＩＶ−１によるＣＨＯ−ＥＭＭ細胞の感染を阻害したことを示す。左側のパネルは、ＣＤ１４７の概略構造（”ｓｐ”＝シグナルペプチド、”ｅ”＝細胞外ドメイン、”ｔ”＝膜貫通ドメインおよび”ｃ”＝細胞質ドメイン）およびその膜貫通ドメイン由来の２つのペプチド（”ペプチド１”および”ペプチド２”）を示す。右側のパネルは、所定濃度のペプチド１、２および”スクランブルペプチド１”の存在下、組換えＥｎｖＭｕＬＶ−偽型ルシフェラーゼ発現性ＨＩＶ−１で感染させたＣＨＯおよびＣＨＯ−ＥＭＭ細胞の感染後４日目のルシフェラーゼ発現データを示す。ペプチド１（ＬＡＡＬＷＰＦＬ）は、ＥＭＭＰＲＩＮ膜貫通ドメインのアミノ酸２０６−２１３に対応する８アミノ酸配列（配列番号３）である。ペプチド２（ＧＩＶＡＥＶＬＶＬ）は、ＥＭＭＰＲＩＮ膜貫通ドメインのアミノ酸２１４−２２２に対応する９アミノ酸ポリペプチド配列（配列番号４）である。ランダム化した配列対照であるスクランブルペプチド１（ＦＡＷＰＬＬＬＡ）は、ペプチド１のアミノ酸残基のランダム化配列にしたがって作成された。
【００４５】
発明の詳細な記載
定義
ＣｙＰは蛋白質シクロフィリンを示し、その少なくとも４つの型、ＣｙＰＡ（シクロスポリンＡの宿主細胞受容体）、ＣｙＰＢ、ＣｙＰＣおよびｈＣｙＰ３、シクロフィリンのいずれかの誘導体、またはシクロフィリンに対応するアミノ酸配列を有するいずれかのフラグメントまたはペプチドが知られている。ＣｙＰのポリペプチドまたはペプチドフラグメントは、ＣｙＰポリペプチドまたはＣｙＰペプチドと呼ばれ、ＣｙＰ、ＣｙＰポリペプチドまたはペプチドフラグメントの誘導体、およびＣｙＰ、ＣｙＰポリペプチドまたはペプチドフラグメントの無関係な蛋白質への融合（本明細書において、各々、ＣｙＰ誘導体およびＣｙＰ融合蛋白質という）を包含する。機能的ＣｙＰとは、その同種のＣｙＰ結合蛋白質またはリガンドにイン・ビボまたはイン・ビトロで結合する蛋白質をいう。例えば、機能的ＣｙＰＡは、ＥＭＭＰＲＩＮ、ＣｓＡ、ＨＩＶ−ｇａｇ蛋白質（特に、そのキャプシド抗原部分と）またはその組み合わせに結合するＣｙＰＡ蛋白質、ペプチド、ポリペプチドまたは融合蛋白質である。
【００４６】
ＣｙＰ結合蛋白質は、シクロフィリン特異的結合活性を有するいずれかの細胞結合蛋白質、細胞表面結合蛋白質または受容体、細胞外受容体、可溶性受容体または細胞内結合蛋白質を意味する。例えば、本明細書に開示されるように、ＥＭＭＰＲＩＮは細胞表面ＣｙＰ結合蛋白質（すなわち、ＣｙＰの細胞表面受容体）である。
ＣｓＡはシクロスポリンＡ、シクロスポリンＡのいずれかの誘導体、またはシクロスポリンＡに対応するアミノ酸配列を有するいずれかのフラグメントまたはペプチドである。
【００４７】
ＥＭＭＰＲＩＮ（配列番号２）は、ヒト細胞外マトリックスメタロプロテイナーゼ誘導蛋白質であり、細胞表面ＣｙＰＡまたはＣｙＰＢ受容体である。ＥＭＭＰＲＩＮは別名で、当該分野において、ＣＤ１４７、バシジンおよびＭ６−抗原と呼ばれる。ＥＭＭＰＲＩＮのポリペプチドまたはペプチドフラグメントは、ＥＭＭＰＲＩＮポリペプチドまたはＥＭＭＰＲＩＮペプチドと呼ばれ、ＥＭＭＰＲＩＮ、ＥＭＭＰＲＩＮポリペプチドまたはペプチドフラグメントの誘導体、およびＥＭＭＰＲＩＮ、ＥＭＭＰＲＩＮポリペプチドまたはペプチドフラグメントの無関係な蛋白質への融合（本明細書において、各々、ＥＭＭＰＲＩＮ誘導体およびＥＭＭＰＲＩＮ融合蛋白質という）を包含する。機能的ＥＭＭＰＲＩＮ蛋白質、ペプチド、ポリペプチドまたは融合蛋白質は、ＣｙＰ蛋白質、ペプチドまたはその誘導体に結合するか、あるいはレトロウイルス関連ＣｙＰＡ蛋白質またはペプチドにイン・ビボまたはイン・ビトロで結合するＥＭＭＰＲＩＮ蛋白質、ペプチド、ポリペプチド、融合蛋白質、細胞受容体、可溶性受容体または細胞内結合蛋白質をいう。
【００４８】
ＣＤ１４７はＥＭＭＰＲＩＮ（配列番号２）を意味する。
抗−ＥＭＭＰＲＩＮ抗体は抗−ＣＤ１４７抗体を意味する。
抗−ＣＤ１４７または抗−ＥＭＭＰＲＩＮ抗体は、ＥＭＭＰＲＩＮまたはＥＭＭＰＲＩＮの保存的変種またはＥＭＭＰＲＩＮのペプチドフラグメントの１以上のエピトープを特異的に認識する抗体を意味し、限定するものではないが、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）、ヒト化またはキメラ抗体、１本鎖抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆａｂ発現ライブラリーによって生産されるフラグメント、抗−イディオタイプ（抗−Ｉｄ）抗体、および上記のいずれかのエピトープ結合フラグメントを包含する。
【００４９】
抗−ＣＤ１４７ｍＡｂ（ＵＭ−８Ｄ６）またはＵＭ−８Ｄ６抗−ＣＤ１４７モノクローナル抗体は詳細には、Ａｎｃｅｌｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ （Ｂａｙｐｏｒｔ， ＭＮ）から市販されているネズミＩｇＧ１抗−ＣＤ１４７モノクローナル抗体をいう。該抗体を下記の実施例５−７に使用した。
抗−ＣＤ１４７ｍＡＢ（Ｍ６Ｆ）は詳細には、Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ， Ｉｎｃ． （”ＲＤＩ”， Ｆｌａｎｄｅｒｓ， ＮＪ）から市販されている抗−ＣＤ１４７モノクローナル抗体ＲＤＩ−ＣＤ１４７−Ｍ６ＦＴをいう。該抗体を下記の実施例２に使用した。
【００５０】
ＭＭＰｓは、マトリックスメタロプロテイナーゼを意味する。プロＭＭＰは、蛋白質分解性切断によって活性化できる対応するＭＭＰの不活性チモーゲン（プロ酵素）形態を意味する。例えば、ＭＭＰ−１はプロＭＭＰ−１の蛋白質分解性切断によって生産される。
ＰＩＣはＨＩＶ−１組み込み前複合体を意味する。
ＭＡはＨＩＶ−１マトリックス抗原蛋白質を意味する。
ＣＡはＨＩＶ−１キャプシド抗原蛋白質を意味する。
ＰＨＡはフィトヘマグルチニン抗原を意味する。
２９３Ｔ細胞は、当該分野で認識されたＨＩＶ−１感受性胚性腎細胞系統をいう。
【００５１】
ＣＨＯ細胞は、当該分野で認識されたチャイニーズハムスター卵巣細胞系統をいう。
ＣＨＯ−ＥＭＭ細胞は、高レベルのＥＭＭＰＲＩＮを構造発現する安定にトランスフェクトされたＣＨＯ細胞系統をいう。
ＭＴ−４細胞は当該分野で認識されたヒトＴ細胞系統をいう。
ＰＢＭＣは初代ヒト末梢血単核細胞をいう。
Ａ２２４Ｅは、当該分野で認識されたＣｓＡ耐性ＨＩＶ−１ ＣＡ変異株をいう。
【００５２】
概観
本発明は、シクロフィリン（”ＣｙＰ”）と細胞外マトリックスメタロプロテイナーゼ誘導因子（”ＥＭＭＰＲＩＮ”）との間のリガンド／受容体関係という出願人の驚くべき知見に基づく。さらに、ＥＭＭＰＲＩＮの細胞外ドメインに結合する抗−ＣＤ１４７（すなわち、抗−ＥＭＭＰＲＩＮ）モノクローナル抗体がＣｙＰのＥＭＭＰＲＩＮへの結合（実施例１）、ＣｙＰ／ＥＭＭＰＲＩＮ媒介性シグナル変換（実施例２）およびＣｙＰＡ−関連ＨＩＶ−１感染／複製を阻害した。したがって、ＣｙＰ／ＥＭＭＰＲＩＮ相互作用を修飾する薬剤はＣｙＰ−およびＥＭＭＰＲＩＮ−の両方に関連する治療的有用性を有する。
【００５３】
治療およびスクリーニング方法
本発明は、ＣｙＰ／ＥＭＭＰＲＩＮ相互作用を修飾し、それにより、ＨＩＶ−１感染、後天性免疫不全症候群（”ＡＩＤＳ”）、炎症性および自己免疫疾患（例えば、慢性関節リウマチ（”ＲＡ”）、ＥＡＥ、ＡＲＤＳ、歯周炎）、腫瘍成長または転移あるいは治療の必要な患者における局所的または全身性のＣｙＰＡ放出、合成または結合によって特徴付けられるいずれかの症状などの徴候に対する治療法において治療的有用性を有する試験化合物を同定するためのスクリーニング法（例えば、アッセイ）を提供する。本発明の方法によって達成される化合物は、小型分子、大型分子（例えば、ＥＭＭＰＲＩＮまたはＣｙＰ蛋白質、そのペプチド）および抗体を包含する。
【００５４】
ＥＭＭＰＲＩＮ、および／またはＣｙＰと相互作用して、これらの分子間の結合を模倣、変調または拮抗するか、および／またはＥＭＭＰＲＩＮ、ＣｙＰまたはＥＭＭＰＲＩＮ：ＣｙＰ複合体の活性を変調する化合物を同定するために、細胞性および非細胞性アッセイを用いることができる。細胞ベースのアッセイは、例えば、ＥＭＭＰＲＩＮ、ＣｙＰまたはＥＭＭＰＲＩＮ：ＣｙＰ複合体の活性、移動または細胞コンパートメント化、あるいは他の蛋白質（例えば、ＨＩＶ−１ ＭＡおよびＣＡ蛋白質）のＥＭＭＰＲＩＮ媒介性細胞コンパートメント化に影響を及ぼす化合物または組成物を同定するために用いることができる。該アッセイは、他のパラメーターのなかでも、ＥＭＭＰＲＩＮ、ＣｙＰ、またはＥＭＭＰＲＩＮ：ＣｙＰ複合体への直接の結合を測定できるか、または下流のシグナル変換経路に関与する細胞内因子に対する間接的な影響または該細胞内因子による間接的な影響を測定できる。かかる細胞ベースのアッセイは、ＥＭＭＰＲＩＮおよび／またはＣｙＰ蛋白質またはペプチドあるいは無関係の蛋白質またはペプチドとのその融合を発現する細胞、細胞系統、または操作された細胞もしくは細胞系統を利用する。該細胞は、さらに、ＥＭＭＰＲＩＮ媒介性シグナリング活性を変調する化合物の同定を援助するために、ＥＭＭＰＲＩＮ、ＣｙＰ、またはＥＭＭＰＲＩＮ：ＣｙＰ複合体によって変換されるシグナルに連結されたレポーター分子を組み込むように操作することができる。
【００５５】
ＥＭＭＰＲＩＮおよびＣｙＰ蛋白質、ポリペプチドおよび融合蛋白質は、抗体を生産するための、ならびに診断および治療のための、ＥＭＭＰＲＩＮ、ＣｙＰ、またはＥＭＭＰＲＩＮ：ＣｙＰ複合体と相互作用する、および／またはＥＭＭＰＲＩＮ、ＣｙＰ、またはＥＭＭＰＲＩＮ：ＣｙＰ複合体の活性を変調する化合物をスクリーニングするための細胞および非細胞ベースのアッセイにおいて使用される。
【００５６】
ＥＭＭＰＲＩＮまたはＣｙＰ蛋白質産物は、ＥＭＭＰＲＩＮアンタゴニストまたはアゴニストとして治療上使用される。かかるＥＭＭＰＲＩＮまたはＣｙＰ蛋白質産物は、限定するものではないが、１以上のＥＭＭＰＲＩＮまたはＣｙＰドメイン（例えば、ＣｙＰのＥＭＭＰＲＩＮ相互作用ドメイン）に対応するペプチドまたはポリペプチド、１以上のＥＭＭＰＲＩＮまたはＣｙＰドメイン（例えば、ＥＭＭＰＲＩＮの場合、細胞外および／または膜貫通ドメインなど）を欠く末端切断型ＥＭＭＰＲＩＮまたはＣｙＰポリペプチド、ＥＭＭＰＲＩＮまたはＣｙＰ融合蛋白質産物（例えば、ＥＧＦＰおよびＦＬＡＧ融合を包含するＧＳＴ融合、またはエピトープタグ付加融合）、およびＥＭＭＰＲＩＮまたはＣｙＰ蛋白質もしくはペプチド誘導体または複合体を包含する。
【００５７】
例えば、有効量の適当な可溶性ＥＭＭＰＲＩＮ蛋白質またはペプチド、またはＥＭＭＰＲＩＮ融合蛋白質（例えば、ＥＭＭＰＲＩＮＨＡ）を患者に投与し、それにより、それが内在性ＣｙＰと相互作用し、あるいは、内在性ＣｙＰを「活性化」、「中和」または「排除」して、ＥＭＭＰＲＩＮ、ＣｙＰ、またはＥＭＭＰＲＩＮ：ＣｙＰ複合体の活性を変調する。また別の具体例において、かかるＥＭＭＰＲＩＮ産物をコードしているヌクレオチド構築物を用いて、かかるＥＭＭＰＲＩＮ産物をイン・ビボで発現するように宿主細胞を遺伝子操作する。これらの遺伝子操作された細胞は、体内で「バイオリアクター」として機能し、別法で内在性ＣｙＰを「活性化」、「中和」または「排除」するであろう適当な可溶性ＥＭＭＰＲＩＮ産物の連続的な供給をデリバリーする。
【００５８】
別法では、ＥＭＭＰＲＩＮに対する抗体、あるいはＥＭＭＰＲＩＮアゴニストもしくはアンタゴニストであり、および／またはＥＭＭＰＲＩＮ媒介性シグナル変換を変調し、およびＥＭＭＰＲＩＮ媒介性シグナル変換経路における下流の標的に対して作用する他の薬剤を治療剤として用いる。
【００５９】
ＣｙＰ／ＥＭＭＰＲＩＮ結合相互作用は、慢性関節リウマチ（ＲＡ）のような局所的または全身性のＣｙＰ放出、合成または結合によって特徴付けられる症状のための新規な治療的介入標的である
ＣｙＰ／ＥＭＭＰＲＩＮ結合相互作用は、ＲＡのようなＣｙＰＡ−関連治療的徴候のための新規な介入標的である。なぜならば、（１）ＥＭＭＰＲＩＮはＣｙＰ結合蛋白質であり；（２）ＥＭＭＰＲＩＮはＣｙＰのシグナリング受容体であり、チロシンキナーゼ依存性シグナル変換の媒介となり；および（３）ＣｙＰ処理はＷＩ−３８初代ヒト繊維芽細胞におけるプロＭＭＰ−１およびプロＭＭＰ−３の発現および放出を活性化および増強するからである。
【００６０】
（１）ＥＭＭＰＲＩＮはＣｙＰＡ結合蛋白質として同定された。
詳細には、ＥＭＭＰＲＩＮ ｃＤＮＡクローン（配列番号１）が単離され、始めに標準的な酵母２−ハイブリッドプロトコールによってＣｙＰＡ相互作用蛋白質として同定された（実施例１および図１）。次いで、ＣｙＰＡ／ＥＭＭＰＲＩＮ結合相互作用を、［３５Ｓ］−標識化ＥＭＭＰＲＩＮのＣｙＰＡセファロースアフィニティー樹脂へ特異的結合を明らかにすることによって確認した（実施例１、図１、右側のパネル）。
【００６１】
（２）ＥＭＭＰＲＩＮはＣｙＰのシグナリング受容体として同定され、チロシンキナーゼ依存性シグナル変換の媒介となった。
詳細には、ＣｙＰＡまたはＣｙＰＢはＣＨＯ−ＥＭＭ細胞（ＥＭＭＰＲＩＮ発現ベクターで安定にトランスフェクトされており、ＥＭＭＰＲＩＮを構造的に発現している）においてＣａ２＋動員を誘導したが、対照ＣＨＯ細胞（ＥＭＭＰＲＩＮを発現しない）において誘導しなかった（実施例２および図３、左側のパネル）。さらに、イソ型対照抗体ではなく、抗−ＣＤ１４７ｍＡｂ（Ｍ６ＦＴ）（すなわち、抗−ＥＭＭＰＲＩＮ ｍＡｂ）がＣＨＯ−ＥＭＭ細胞におけるＣｙＰＡ媒介性Ｃａ２＋動員を阻害した（図３、右側のパネル）。さらに、チロシンキナーゼ阻害剤ゲニステインは、ＣＨＯ−ＥＭＭ細胞におけるＣｙＰＡにより誘導されるシグナリングの阻害において有効であった（図４）。したがって、ＥＭＭＰＲＩＮはＣｙＰＡおよびＣｙＰＢの細胞受容体として同定され、チロシンキナーゼ依存性経路を介する細胞内シグナル変換の媒介をした。
【００６２】
（３）ＣｙＰＡ処理は、ＷＩ−３８初代ヒト繊維芽細胞においてプロＭＭＰ−１の発現を活性化し、プロＭＭＰ−３の放出を増強した。
ＷＩ−３８初代ヒト繊維芽細胞のＣｙＰＡでの処理は、メタロプロテイナーゼチモーゲンプロＭＭＰ−１の発現および放出を活性化し、プロＭＭＰ−３の放出を増強した（実施例４および図５）。メタロプロテイナーゼＭＭＰ−１およびＭＭＰ−３は、ＲＡ患者の滑液中において上昇されることが知られており、ＲＡ疾患関連病理に寄与すると考えられる。活性型ＭＭＰ−１およびＭＭＰ−３種は、通常、周囲の組織によって放出される蛋白質分解酵素（例えば、ＲＡ患者の滑液中の蛋白質分解酵素）によって、対応する分泌された不活性型チモーゲン、プロＭＭＰ−１およびプロＭＭＰ−３から生じる。
【００６３】
したがって、ＥＭＭＰＲＩＮがＭＭＰ生産を刺激するメカニズムは、ＥＭＭＰＲＩＮを細胞−細胞相互作用に関与する付着型分子として狭く特徴付ける初期の文献によって示されたものより複雑である。ＥＭＭＰＲＩＮはまた、（本明細書に開示されるように）、その可溶性リガンドであるＣｙＰＡを介してシグナルを受けることによってＭＭＰ生産を刺激したシグナル変換受容体として同定された。
【００６４】
したがって、本発明は、活性なＲＡ疾患の間、炎症した関節中に放出されたＣｙＰが、好中球表面のＥＭＭＰＲＩＮへのＣｙＰ結合を介して関節に好中球を誘引するモデルを支持する。これらの好中球は次いで、ＣｙＰ依存性およびＣｙＰ非依存性メカニズムを介して関節中で活性化されて、ＲＡ疾患を悪化させる酵素（例えば、好中球エラスターゼ）を放出する。したがって、抗−ＥＭＭＰＲＩＮ抗体またはＥＭＭＰＲＩＮアゴニストもしくはアンタゴニストとして作用する他の薬剤は、ＲＡあるいは局所的または全身性のＣｙＰ放出、合成または結合によって特徴付けられる他の症状（すなわち、ＣｙＰ−関連治療的徴候）の治療または予防のための治療的有用性を有する。
【００６５】
ＣｙＰ／ＥＭＭＰＲＩＮ結合相互作用は、ＨＩＶ−１感染および／またはＡＩＤＳもしくはＡＩＤＳ関連障害の治療または予防などの局所的または全身性のＣｙＰ放出、合成または結合によって特徴付けられる症状のための新規な治療的介入標的である。
ＣｙＰＡ／ＥＭＭＰＲＩＮ結合相互作用は、ＨＩＶ感染および／またはＡＩＤＳもしくはＡＩＤＳ関連障害のための新規な介入標的である。なぜならば、（１）細胞表面ＥＭＭＰＲＩＮは、ＭｕＬＶ−、およびＨＩＶ−１コアを担持するＨＩＶ−１偽型レトロウイルスによるＣＨＯ細胞の細胞性感染の組み込み前工程に対して実質的な増強効果を有し、（２）細胞表面ＥＭＭＰＲＩＮは、初代ヒト細胞（末梢血単核細胞；ＰＢＭＣ）のＨＩＶ感染の組み込み前工程に対して実質的な増強効果を有し；および（３）抗−ＣＤ１４７ｍＡｂ（ＵＭ−８Ｄ６）の阻害効果に対するウイルス耐性はＣｓＡに対する耐性に相関するからである。
【００６６】
（１）細胞表面ＥＭＭＰＲＩＮは、ＭｕＬＶ−、およびＨＩＶ−１コアを担持するＨＩＶ−１−偽型レトロウイルスによるＣＨＯ細胞の細胞性感染の組み込み前工程に対して実質的な増強効果を有した。
ＣＨＯ細胞の細胞表面上のＥＭＭＰＲＩＮ蛋白質の存在は、ＭｕＬＶ偽型ＨＩＶによる感染を増強した（実施例５および図６、左側のパネル）。さらに、この増強は、抗−ＣＤ１４７ｍＡｂ（ＵＭ−８Ｄ６）によって大いに減少され（実施例５および図６、左側のパネル）、かかる感染はＥＭＭＰＲＩＮ膜貫通ドメインペプチド１（配列番号３）によって阻害された（実施例８および図９）。
【００６７】
さらに、ＥＭＭＰＲＩＮは、ＨＩＶ−１偽型ＨＩＶによるＣＨＯ／ＣＤ４／ＣＸＣＲ４細胞（ＣＤ４−およびＣＸＣＲ４−発現ベクターでトランスフェクトされたＣＨＯ細胞）感染を増強した（実施例５および図６、中央のパネル）。さらに、ＥｎｖＡＤＡ−偽型ｌｕｃ−ＨＩＶ−１によるＰＨＡ−活性化ヒトＰＢＭＣの感染はペプチド１（配列番号３）によって阻害された（実施例８）。
【００６８】
最後に、ＥＭＭＰＲＩＮは、ウイルス組み込み前段階にてＨＩＶ感染を増強した。詳細には、ＨＩＶ−特異的逆転写は、ＥＭＭＰＲＩＮの存在下で（すなわち、ＣＨＯ−ＥＭＭ／ＣＤ４／ＣＸＣＲ４において、ＣＨＯ／ＣＤ４／ＣＸＣＲ４細胞と比べて）３〜４倍増加した。有意には、抗−ＣＤ１４７ｍＡｂはこの増強効果を減少させ（図６、右側のパネル）、それはＥＭＭＰＲＩＮがウイルス組み込み前段階で作用することを示す。
【００６９】
（２）細胞表面ＥＭＭＰＲＩＮは、ＰＢＭＣのＨＩＶ感染の融合後の組み込み前工程に対して実質的な増強効果を有した。
抗−ＥＭＭＰＲＩＮ ｍＡｂ（ＵＭ−８Ｄ６）は、ヒト初代ＰＢＭＣ中でのＨＩＶ−１株の複製を阻害した（実施例６および図７Ａ）。詳細には、イソ型に合致した対照ｍＡｂではなく、抗−ＣＤ１４７ｍＡｂ（ＵＭ−８Ｄ６）が初代ＰＢＭＣ中でのマクロファージ−親和性（ＡＤＡ）およびＴ細胞系統−適応性（ＬＡＶ）ＨＩＶ−１株の複製を阻害した（実施例６および図７Ａ、左側および右側のパネル）。
【００７０】
有意には、抗−ＣＤ４ｍＡｂとは対照的に、抗−ＣＤ１４７ｍＡｂ（ＵＭ−８Ｄ６）は、ヒトＰＢＭＣをＨＩＶ−１と一緒に４℃でインキュベーション後に細胞結合型ウイルス性ｐ２４の量を測定することによって決定した場合、ヒトＰＢＭＣに対するＨＩＶ結合を阻害しなかった（実施例６および図７Ｂ）。したがって、抗−ＣＤ１４７ｍＡｂ（ＵＭ−８Ｄ６）は、ウイルス結合と組み込みとの間の工程にてＨＩＶ−１感染を阻害したのである。
【００７１】
さらに、抗−ＣＤ４ｍＡｂとは対照的に、抗−ＣＤ１４７ｍＡｂ（ＵＭ−８Ｄ６）は、ＰＢＭＣとＨＩＶ−１ ＡＤＡおよびＬＡＶ外被を発現しているＨｅＬａ細胞との間のＨＩＶ Ｅｎｖ媒介性融合を阻害せず（実施例６および図７Ｃ、左側のパネル）、また、ウイルス性ｐ２４の細胞性インターナリゼーションも減少させなかった（実施例６および図７Ｃ、左のパネル）。したがって、本発明によると、ＥＭＭＰＲＩＮはＨＩＶ−１感染における融合後工程で作用する。
【００７２】
したがって、抗ＣＤ１４７ｍＡｂ（ＵＭ−８Ｄ６）は、ＨＩＶ−１感染の間、初期および後期の両方のＨＩＶ−１逆転写量を減少させた（実施例６および図７Ｄ）。ＨＩＶ−１逆転写は、組み込み前の複合体（”ＰＩＣ”）の進行性成熟を示す融合後過程である。したがって、抗−ＣＤ１４７ｍＡｂ（ＵＭ−８Ｄ６）は、ウイルス−細胞融合と逆転写の開始との間のＨＩＶ−１感染における工程を干渉した。
【００７３】
さらに、抗−ＣＤ１４７ｍＡｂ（ＵＭ−８Ｄ６）は、新たな感染後初期のＨＩＶ−１マトリックス（ＭＡ）およびキャプシド（ＣＡ）蛋白質の正常な移動を阻害した。詳細には、抗−ＣＤ１４７ｍＡｂ（ＵＭ−８Ｄ６）の存在下、ウイルスは細胞膜に保持され、それは、ＥＭＭＰＲＩＮがＨＩＶ−１脱外被において役割を果たすことを示す（実施例６および図７Ｅ）。
【００７４】
（３）抗−ＣＤ１４７ｍＡｂの阻害効果に対するウイルス耐性は、ＣｓＡに対する耐性と相関した。
ヒトＰＢＭＣにおけるＡ２２４Ｅ（ＣｓＡ−耐性、ＣＡ変異体ＨＩＶ株）の複製は、抗−ＣＤ１４７ｍＡｂ（ＵＭ−８Ｄ６）での処理に対し耐性であった（実施例７および図８）。
したがって、抗−ＣＤ１４７ｍＡｂは、ウイルス−細胞融合と逆転写の開始との間のＨＩＶ−１感染におけるＣｙＰＡ依存性工程（すなわち、融合後の組み込み前工程）を干渉した。したがって、ＥＭＭＰＲＩＮは、ＨＩＶ−１感染における融合後の組み込み前工程（例えば、ウイルス脱外被）の媒介となった。
【００７５】
したがって、理論に拘束されることなく、ＣｙＰＡがＨＩＶ−１感染の媒介となるメカニズムは、ビリオン中のＨＩＶ−ｇａｇ蛋白質および細胞表面ヘパラン（本発明以前には、「独占的なＣｙＰＡ受容体」でると断言されていた、Ｓａｐｈｉｒｅら、ＥＭＢＯ Ｊ． １８：６７７１−６７８５， １９９９）と相互作用する蛋白質としてＣｙＰＡを狭く特徴付けている先行技術によって示されるよりも複雑である。驚くべきことに、本明細書に開示されるように、ＥＭＭＰＲＩＮはＨＩＶ−１感染におけるＣｙＰＡ依存性工程の媒介となった。よって、ＣｙＰＡは、ＨＩＶ−１感染の間のＨＩＶ−ｇａｇ、ヘパランおよびＥＭＭＰＲＩＮとの複数の相互作用に関与した。さらに、ＥＭＭＰＲＩＮは、新たな感染後初期のＨＩＶ−１ ＭＡおよびＣＡ蛋白質の正常な移動の媒介となった。抗−ＣＤ１４７ｍＡｂ（ＵＭ−８Ｄ６）が新規なＣｙＰＡ／ＥＭＭＰＲＩＮ結合相互作用（およびそれにより媒介されるシグナル変換）を拮抗したという証明は、さらに、ＨＩＶ−１感染および／またはＡＩＤＳ、および／または局所的または全身性のＣｙＰＡ放出もしくは合成によって特徴付けられる他の症状（すなわち、ＣｙＰＡ−関連治療的徴候）の治療または予防のための方法において有用な該相互作用を修飾する他の薬剤の使用を可能にする。
【００７６】
ＣｙＰ／ＥＭＭＰＲＩＮ結合相互作用は、癌のような局所的または全身性のＣｙＰ放出、合成もしくは結合によって特徴付けられる症状のための新規な治療的介入標的である。
ＣｙＰＡ／ＥＭＭＰＲＩＮ結合相互作用は、癌のための新規な介入標的である。なぜならば、（１）ＥＭＭＰＲＩＮ発現腫瘍細胞は、それと共培養された繊維芽細胞中のＭＭＰｓの発現をアップレギュレートすることが知られており（Ｂｉｓｗａｓら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５５： ４３４−４３９， １９９５）；（２）本明細書中で開示されるように、ＣｙＰはヒト繊維芽細胞中のＭＭＰ生産を活性化および／または増強し；および（３）ＭＭＰｓの脱調節された作用は、例えば、関節炎、歯周炎、組織潰瘍を包含する多くの結合組織疾患における、および癌細胞侵入および転移における細胞外マトリックスの病理学的破壊に寄与するからである（Ｋａｈａｒｉら、Ｅｘｐ． Ｄｅｒｍａｔｏｌ． ６：１９９−２１３， １９９７； Ｋｅｙｓｚｅｒら、Ｊ． Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ． ２６： ２５１−２５８， １９９９； Ｂｅｎｂｏｗら、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７４： ２５３７１−２５３７８， １９９９； Ｋｅｙｓｚｅｒら、Ｚ． Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ ５７： ３９２−３９８， １９９８）。
【００７７】
ＥＭＭＰＲＩＮ蛋白質、ポリペプチドおよび抗体
ＥＭＭＰＲＩＮまたはＣｙＰ蛋白質およびポリペプチド、および変異形態、末端切断形態または欠失形態のＥＭＭＰＲＩＮまたはＣｙＰおよび／またはＥＭＭＰＲＩＮまたはＣｙＰ融合蛋白質は、限定するものではないが、抗体の生産、診断アッセイの試薬として、例えば、ＨＩＶ−１感染、ＡＩＤＳ、ＲＡおよび癌の治療および予防に使用できる治療化合物のためのスクリーニングアッセイの試薬として、および例えば、ＨＩＶ−１感染、ＡＩＤＳおよびＡＩＤＳ関連障害、ＲＡおよび癌の治療に有用な医薬的試薬としての使用を包含する種々の使用のために調製することができる。
【００７８】
ＥＭＭＰＲＩＮおよびＣｙＰ蛋白質およびポリペプチドの生産
ＥＭＭＰＲＩＮをコードしているｃＤＮＡ配列を、対応する推定アミノ酸配列（配列番号２）と共に配列番号１に示す。図１は、ＥＭＭＰＲＩＮのシグナルペプチド、細胞外（ｅｃｄ）、膜貫通（ｔｍ）および細胞内（ｉｃｄ）ドメインを概略的に示す。ＥＭＭＰＲＩＮまたはＣｙＰの１以上のドメイン（例えば、ＥＭＭＰＲＩＮｅｃｄまたはｔｍドメイン）に対応するペプチド、末端切断型または欠失型ＥＭＭＰＲＩＮまたはＣｙＰ（例えば、１以上の領域またはドメインが欠失しているＥＭＭＰＲＩＮまたはＣｙＰ）ならびに全長ＥＭＭＰＲＩＮまたはＣｙＰ、ＥＭＭＰＲＩＮまたはＣｙＰペプチドあるいは末端切断型ＥＭＭＰＲＩＮまたはＣｙＰが無関係の蛋白質に融合している融合蛋白質（例えば、ＧＳＴ、ＦＬＡＧおよびＥＧＦＰ融合）もまた、本発明の範囲内である。例えば、かかる可溶性ＥＭＭＰＲＩＮ蛋白質、ペプチドまたは融合蛋白質、または循環性ＣｙＰに結合して「活性化」、「中和」または「排除」する抗体（抗−イディオタイプ抗体を包含する）を本明細書に記載のように用いて、例えば、ＨＩＶ−１感染、ＡＩＤＳ、ＲＡおよび癌を治療または予防することができる。この目的のために、ＥＭＭＰＲＩＮの個々のドメインに対応するペプチド、ＥＭＭＰＲＩＮの可溶性欠失変異体、またはＥＭＭＰＲＩＮ蛋白質全体を別のポリペプチド（例えば、ＩｇＦｃポリペプチド、またはエピトープタグ）に融合することができる。別法では、ＥＭＭＰＲＩＮ受容体のアゴニストまたはアンタゴニストとして作用するＣｙＰ蛋白質、ペプチドまたは融合蛋白質を本明細書に記載のように用いて、例えば、ＨＩＶ−１感染、ＡＩＤＳおよびＡＩＤＳ関連障害、ＲＡおよび癌を治療または予防することができる。
【００７９】
かかるペプチド、ポリペプチド、および融合蛋白質は、組換えＤＮＡ技術によって調製できる。例えば、１以上のＥＭＭＰＲＩＮ領域またはドメインをコードしているヌクレオチド配列を合成またはクローン化し、可溶性受容体または可溶性結合蛋白質またはペプチドのような可溶性ＥＭＭＰＲＩＮ蛋白質をコードするように一緒に連結する（例えば、配列番号３、配列番号４、配列番号５）。１以上のＥＭＭＰＲＩＮ領域またはドメインをコードしているＤＮＡ配列を直接またはペプチドスペーサーをコードするリンカーオリゴヌクレオチドを介して一緒に連結することができる。かかるリンカーは、フレキシブルなグリシンに富むアミノ酸配列をコードすることができ、それにより、一緒に繋ぎ合わされたドメインにＥＭＭＰＲＩＮリガンド（例えば、ＣｙＰＡまたはＣｙＰＢ）に結合できるコンホメーションをとらせる。別法では、個々の領域またはドメインをコードしているヌクレオチド配列を用いてＥＭＭＰＲＩＮペプチドを発現することができる。１以上のＣｙＰ領域またはドメインをコードしているヌクレオチド配列を用いて、同様の構造を調製することができる。
【００８０】
ＥＭＭＰＲＩＮまたはＣｙＰの適当な領域をコードしているヌクレオチド配列を発現させてかかるポリペプチドを生産するために、種々の宿主発現ベクター系を用いてもよい。得られるペプチドまたはポリペプチドが可溶性誘導体である場合、該ペプチド、ポリペプチドを培養培地から回収することができる。ポリペプチドまたは蛋白質が分泌されない場合、ＥＭＭＰＲＩＮまたはＣｙＰ産物を宿主細胞自体から回収することができる。
【００８１】
宿主発現ベクター系はまた、ＥＭＭＰＲＩＮまたはＣｙＰまたは機能的等価物を発現する操作された宿主細胞を包含する。かかる発現系からのＥＭＭＰＲＩＮまたはＣｙＰ蛋白質、ペプチドおよび融合蛋白質の精製または濃縮は、当業者によく知られた適当な方法を用いて達成できる。しかしながら、かかる操作された宿主細胞自体は、ＥＭＭＰＲＩＮまたはＣｙＰ蛋白質、ペプチドおよび融合蛋白質の構造的および機能的特徴を保持することだけでなく、例えば、薬物スクリーニングアッセイにおいて、生物学的活性を評価することも重要である状況において使用されうる。
【００８２】
本発明の目的に使用されうる宿主発現ベクター系は、限定するものではないが、ＥＭＭＰＲＩＮまたはＣｙＰヌクレオチド配列を含有する組換えバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡまたはコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換された細菌（例えば、イー・コリ（Ｅ． ｃｏｌｉ）、ビー・ズブチリス（Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ））などの微生物；ＥＭＭＰＲＩＮまたはＣｙＰヌクレオチド配列を含有する組換え酵母発現ベクターで形質転換された酵母（例えば、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ピチア（Ｐｉｃｈｉａ））；ＥＭＭＰＲＩＮまたはＣｙＰ配列を含有する組換えウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）で感染させた昆虫細胞系；ＥＭＭＰＲＩＮまたはＣｙＰヌクレオチド配列を含有する組換えウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス、ＣａＭＶ；タバコモザイクウイルス、ＴＭＶ）で感染させた、またはＥＭＭＰＲＩＮまたはＣｙＰヌクレオチド配列を含有する組換えプラスミド発現ベクター（例えば、Ｔｉプラスミド）で形質転換された植物細胞系；または哺乳動物細胞のゲノム由来のプロモーター（例えば、メタロチオネインプロモーター）または哺乳動物ウイルス由来のプロモーター（例えば、アデノウイルス後期プロモーター、またはワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター）を含有する組換え発現構築物を収容している哺乳動物細胞系（例えば、ＣＯＳ、ＣＨＯ、ＢＨＫ、２９３、３Ｔ３、ＭＣＦ−７、Ｈｓ５７８Ｔ）を包含する。
【００８３】
細菌系において、ＥＭＭＰＲＩＮまたはＣｙＰ遺伝子産物の発現が意図される使用に依存して、いくつかの発現ベクターが有利に選択されうる。例えば、大量のかかる蛋白質を生産しようとする場合、ＥＭＭＰＲＩＮまたはＣｙＰ蛋白質、ペプチドおよび融合蛋白質の医薬組成物の生産のために、またはＥＭＭＰＲＩＮまたはＣｙＰ蛋白質に対する抗体を生産するために、容易に精製される融合蛋白質産物の高レベルの発現を指示するベクターが望ましい。かかるベクターは、限定するものではないが、融合蛋白質が生産されるようにＥＭＭＰＲＩＮまたはＣｙＰＡコーディング配列がベクター中にフレーム内においてｌａｃＺコーディング領域と個々に連結されうるイー・コリ発現ベクターｐＵＲ２７８（Ｒｕｔｈｅｒら、ＥＭＢＯ Ｊ． ２：１７９１， １９８３）；ｐＩＮベクター（Ｉｎｏｕｙｅ ＆ Ｉｎｏｕｙｅ， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １３： ３１０１−３１０９， １９８５； Ｖａｎ Ｈｅｅｋｅ ＆ Ｓｃｈｕｓｔｅｒ， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６４： ５５０３−５５０９， １９８９）などを包含する。また、ＰＧＥＸベクターを使用して、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）との融合蛋白質として外来性ポリペプチドを発現させてもよい。一般に、かかる融合蛋白質は可溶性であり、グルタチオン−アガロースビーズへの吸着、次いで、遊離のグルタチオンの存在下での溶離によって溶解細胞から容易に精製することができる。クローン化された標的遺伝子産物をＧＳＴ部分からはずすことができるように、ＰＧＥＸベクターは、トロンビンまたは因子Ｘａプロテアーゼ切断部位を包含するように設計される。
【００８４】
別法では、発現されている融合蛋白質に特異的な抗体または他のアフィニティー相互作用の利用がいずれかの融合蛋白質の精製を容易にできるようにする。例えば、ワクシニア発現／アフィニティー精製系は、ヒト細胞系統において発現された非変性融合蛋白質の容易な発現および精製を可能にする（Ｊａｎｋｎｅｃｈｔら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８８： ８９７２−８９７６， １９９１）。該系において、目的の遺伝子のオープンリーディングフレームが翻訳的に６個のヒスチジン残基よりなるアミノ末端タグに融合するように、目的の遺伝子をワクシニア組換えプラスミド中にサブクローン化する。組換えワクシニアウイルスで感染させた細胞由来の抽出物をＮｉ２＋：ニトリロ酢酸−アガロースカラム上に負荷し、イミダゾール含有バッファーを用いてヒスチジンタグ付加された蛋白質を選択的に溶出させる。
【００８５】
昆虫系
昆虫系において外来遺伝子を発現させるために、オートグラファ・カリフォルニカ（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）多角体病ウイルス（ＡｃＮＰＶ）をベクターとして用いることができる。該ウイルスは、スポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）細胞中で増殖する。ＥＭＭＰＲＩＮ−またはＣｙＰ−コーディング配列は、ウイルスの非必須領域（例えば、ポリヒドリン遺伝子）中に個々にクローン化し、ＡｃＮＰＶプロモーター（例えば、ポリヒドリンプロモーター）の調節下に置いてもよい。ＥＭＭＰＲＩＮ−またはＣｙＰ−コーディング配列の成功した挿入は、ポリヒドリン遺伝子の不活性化および非閉塞性組換えウイルス（すなわち、ポリヒドリン遺伝子によってコードされるタンパク質性外被を欠くウイルス）の生産をもたらすであろう。次いで、組換えウイルスを用いて細胞を感染させ、ここに、挿入遺伝子を発現させる（Ｓｍｉｔｈら、Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ４６： ５８４， １９８３； Ｓｍｉｔｈ， 米国特許第４，２１５，０５１号）。
【００８６】
哺乳動物宿主細胞において、いくつかのウイルスに基づく発現系を用いてもよい。アデノウイルスを発現ベクターとして用いる場合、目的のＥＭＭＰＲＩＮまたはＣｙＰヌクレオチド配列をアデノウイルス転写／翻訳調節複合体、例えば、後期プロモーターおよびトリパータイト（ｔｒｉｐａｒｔｉｔｅ）リーダー配列に連結してもよい。次いで、該キメラ遺伝子をアデノウイルスゲノム中にイン・ビトロまたはイン・ビボ組換えによって挿入してもよい。ウイルスゲノムの非必須領域（例えば、領域Ｅ１またはＥ３）における挿入は、生存能力があり、かつ、感染宿主においてＥＭＭＰＲＩＮまたはＣｙＰ遺伝子産物を発現できる組換えウイルスをもたらすであろう（Ｌｏｇａｎ ＆ Ｓｈｅｎｋ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８１： ３６５５−３６５９， １９８４）。特異的開始シグナルもまた、挿入されたＥＭＭＰＲＩＮまたはＣｙＰヌクレオチド配列の効率のよい翻訳に必要とされうる。これらのシグナルは、ＡＴＧ開始コドンおよび隣接配列を包含する。それ自体の開始コドンおよび隣接配列を包含する全ＥＭＭＰＲＩＮまたはＣｙＰ遺伝子またはｃＤＮＡが適当な発現ベクター中に挿入される場合、付加的な翻訳調節シグナルは必要とされないこともある。しかしながら、ＥＭＭＰＲＩＮ−またはＣｙＰ−コーディング配列の部分のみが挿入される場合、おそらくＡＴＧ開始コドンを包含する外来性翻訳調節シグナルが提供されなければならない。さらに、開始コドンは、インサート全体の翻訳を確実にするために、所望のコーディング配列のリーディングフレームと共に「フレーム内」になければならない。これらの外来性翻訳調節シグナルおよび開始コドンは、天然および合成の両方の種々の起源であることができる。発現効率は、適当な転写エンハンサーエレメント、転写ターミネーターなどを含むことによって増加しうる（Ｂｉｔｔｎｅｒら、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． １５３： ５１６−５４４， １９８７）。
【００８７】
さらに、挿入配列の発現を変調するか、または所望される特異的様式で遺伝子産物を修飾および加工処理する宿主細胞株を選択してもよい。蛋白質産物のかかる修飾（例えば、グリコシル化）およびプロセッシング（例えば、切断）は、蛋白質の機能にとって重要である。異なる宿主細胞は、蛋白質および遺伝子産物の翻訳後プロセッシングおよび修飾のための特徴的および特異的メカニズムを有する。発現された外来性蛋白質の正確な修飾およびプロセッシングを確実にするために適当な細胞系統または宿主系を選択することができる。したがって、一次転写産物の正しいプロセッシング、グリコシル化、および遺伝子産物のリン酸化のための細胞機構を有する真核生物宿主細胞を用いてもよい。かかる哺乳動物宿主細胞は、限定するものではないが、ＣＨＯ、ＶＥＲＯ、ＢＨＫ、ＨｅＬａ、ＣＯＳ、ＭＤＣＫ、２９３、３Ｔ３、ＭＣＦ−７、Ｈｓ５７８ＴおよびＷＩ３８細胞系統を包含する。
【００８８】
組換え蛋白質の長期間の高収率の生産のために、安定な発現が好ましい。例えば、ＥＭＭＰＲＩＮまたはＣｙＰ配列を安定に発現する細胞系統を操作してもよい。ウイルスの複製起点を含有する発現ベクターを用いるよりもむしろ、適当な発現調節エレメント（例えば、プロモーター、エンハンサー配列、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位など）によって調節されるＤＮＡおよび選択マーカーを用いて宿主細胞を形質転換することができる。外来性ＤＮＡの導入後、操作した細胞を栄養培地中で１−２日間増殖させてもよく、次いで、選択培地に移す。組換えプラスミド中の選択マーカーは該選択に対する耐性を与え、細胞の染色体中にプラスミドを安定に組み込ませ、増殖させて、次いで、細胞系統中にクローン化し、膨張することができる細胞増殖巣を形成させる。該方法は、有利なことに、ＥＭＭＰＲＩＮまたはＣｙＰ遺伝子産物を発現する安定な細胞系統（例えば、下記実施例２において論じられるＣＨＯ−ＥＭＭ細胞系統）を操作するために使用されうる。かかる操作された細胞系統は、特に、ＥＭＭＰＲＩＮ遺伝子産物の内在活性に影響を及ぼす化合物のスクリーニングおよび評価において有用でありうる。
【００８９】
限定するものではないが、各々、ｔｋ−、ｈｇｐｒｔ−またはａｐｒｔ−細胞において用いることのできるヘルペス単純ウイルスチミジンキナーゼ（Ｗｉｇｌｅｒら、Ｃｅｌｌ １１：２２３， １９７７）、ヒポキサチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｓｚｙｂａｌｓｋａ ＆ Ｓｚｙｂａｌｓｋｉ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． ＵＳＡ ４８： ２０２６， １９６２）、およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｌｏｗら、Ｃｅｌｌ ２２： ８１７， １９８０）遺伝子を包含するいくつかの選択系を用いてもよい。また、抗−代謝産物耐性を下記の遺伝子：メソトレキセートに対する耐性を与えるｄｈｆｒ（Ｗｉｇｌｅｒら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７７：３５６７， １９８０； Ｏ’Ｈａｒｅら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７８： １５２７， １９８１）；マイコフェノール酸に対する耐性を与えるｇｐｔ（Ｍｕｌｌｉｇａｎ ＆ Ｂｅｒｇ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７８：２０７２， １９８１）；アミノグリコシドＧ−４１８に対する耐性を与えるｎｅｏ（Ｃｏｌｂｅｒｒｅ−Ｇａｒａｐｉｎら、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １５０：１， １９８１）およびヒグロマイシンに対する耐性を与えるｈｙｇｒｏ（Ｓａｎｔｅｒｒｅら、Ｇｅｎｅ ３０： １４７， １９８４）の選択の基礎として用いることができる。
【００９０】
ＥＭＭＰＲＩＮまたはＣｙＰＡポリペプチドに対する抗体
ＥＭＭＰＲＩＮまたはＣｙＰの１以上のエピトープあるいはＥＭＭＰＲＩＮまたはＣｙＰの保存的変種のエピトープあるいはＥＭＭＰＲＩＮまたはＣｙＰのペプチドフラグメントを特異的に認識する抗体もまた、本発明に包含される。かかる抗体は、限定するものではないが、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）、ヒト化またはキメラ抗体、１本鎖抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆａｂ発現ライブラリーによって生産されるフラグメント、抗−イディオタイプ（抗−Ｉｄ）抗体、および上記のいずれかのエピトープ結合フラグメントを包含する。
【００９１】
かかる抗体は、正常または異常なＥＭＭＰＲＩＮ活性の変調のための方法として用いられ（実施例２、５、６および７参照）、したがって、例えば、ＨＩＶ−１感染、ＡＩＤＳ、ＲＡおよび癌の治療および／または予防のための方法の一部として有用である。
さらに、本発明の抗体は、例えば、生物学的試料中のＥＭＭＰＲＩＮの検出において用いられるので、ＥＭＭＰＲＩＮの異常量について患者または組織試料を試験しうるところの診断的または予後的技術の一部として有用である。かかる抗体は、また、例えば、ＥＭＭＰＲＩＮ遺伝子産物の発現および／または活性に対する試験化合物の影響を評価するための化合物スクリーニングスキームと一緒に使用される。さらに、かかる抗体は、下記される遺伝子療法技術と一緒に使用して、例えば、正常および／または操作されたＥＭＭＰＲＩＮ−またはＣｙＰ−発現細胞を患者へのその導入前に評価することができる。
【００９２】
抗体産生
抗体の産生のために、種々の宿主動物をＥＭＭＰＲＩＮまたはＣｙＰ、ＥＭＭＰＲＩＮまたはＣｙＰペプチド（例えば、膜貫通型、細胞外またはＣｙＰ−相互作用ドメインなどのＥＭＭＰＲＩＮまたはＣｙＰの機能的ドメインに対応するもの）、末端切断型ＥＭＭＰＲＩＮまたはＣｙＰポリペプチド（１以上のドメイン、例えば、膜貫通型またはＣｙＰ−相互作用ドメインが欠失しているＥＭＭＰＲＩＮまたはＣｙＰ）、ＥＭＭＰＲＩＮまたはＣｙＰの機能的等価物あるいはＥＭＭＰＲＩＮまたはＣｙＰの変異体を用いる注射によって免疫化する。かかる宿主動物は、限定するものではないが、ウサギ、マウス、ハムスターおよびラットを包含する。宿主種に依存する種々のアジュバンドを用いて、免疫学的応答を増加させてもよく、該アジュバンドは、限定するものではないが、フロイントの（完全および不完全）アジュバンド、水酸化アルミニウムなどのミネラルゲル、リゾレシチンなどの表面活性物質、プルロニック（ｐｌｕｒｏｎｉｃ）ポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油性エマルジョン、スカシガイヘモシアニン、ジニトロフェノール、および潜在的に有用なヒトアジュバンド、例えば、ＢＣＧ（ｂａｃｉｌｌｅ Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ）およびコリネバクテリウム・パルバム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ）を包含する。
【００９３】
ポリクローナル抗体は、免疫化された動物の血清由来の抗体分子の異種集団である。特定の抗原に対する抗体の同種集団であるモノクローナル抗体は、培養中の継続的細胞系統による抗体分子の生産を提供するいずれかの技術によって得られる。これらは、限定するものではないが、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ（Ｎａｔｕｒｅ ２５６： ４９５−４９７， １９７５；および米国特許第４，３７６，１１０号）のハイブリドーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｓｂｏｒら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ ４：７２， １９８３； Ｃｏｌｅら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８０： ２０２６−２０３０， １９８３）およびＥＢＶ−ハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ， Ａｌａｎ Ｒ． Ｌｉｓｓ， Ｉｎｃ． ｐｐ． ７７−９６， １９８５）を包含する。かかる抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびそのいずれかのサブクラスを包含するいずれかの免疫グロブリンクラスのものであってもよい。本発明のｍＡｂを生産するハイブリドーマは、イン・ビトロまたはイン・ビボで培養してもよい。イン・ビボでの高力価のｍＡｂの生産により、これは現在の好ましい生産方法とされる。
【００９４】
さらに、適当な抗原特異性のマウス抗体分子由来の遺伝子を適当な生物学的活性のヒト抗体分子由来の遺伝子と一緒にスプライシングすることによる、「キメラ抗体」の生産のために開発された技術（Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８１： ６８５１−６８５５， １９８４； Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ， ３１２： ６０４−６０８， １９８４； Ｔａｋｅｄａら、Ｎａｔｕｒｅ， ３１４： ４５２−４５４， １９８５）を用いることができる。キメラ抗体は、異なる部分が異なる動物種に由来する分子、例えば、ネズミｍＡｂ由来の可変領域およびヒト免疫グロブリン定常領域（ヒト化）を有する分子である。
【００９５】
別法では、１本鎖抗体の生産のために記載された技術（米国特許第４，９４６，７７８号；Ｂｉｒｄ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３−４２６， １９８８； Ｈｕｓｔｏｎら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８５： ５８７９−５８８３， １９８８；およびＷａｒｄら、Ｎａｔｕｒｅ ３３４： ５４４−５４６， １９８９）を、ＥＭＭＰＲＩＮまたはＣｙＰ遺伝子産物に対する１本鎖抗体を生産するように適応させる。１本鎖抗体は、アミノ酸架橋を介してＦｖ領域のＨ鎖およびＬ鎖フラグメントを連結することによって形成され、その結果、１本鎖ポリペプチドを生じる。
【００９６】
特異的エピトープを認識する抗体フラグメントは既知の技術によって生産される。例えば、かかるフラグメントは、限定するものではないが、抗体分子のペプシン消化によって生産されるＦ（ａｂ’）２フラグメント；およびＦ（ａｂ’）２フラグメントのジスルフィド架橋を還元することによって生じるＦａｂフラグメントを包含する。別法では、Ｆａｂ発現ライブラリーを構築して（Ｈｕｓｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２４６： １２７５−１２８１， １９８１）、所望の特異性を用いるモノクローナルＦａｂフラグメントの迅速かつ容易な同定を可能にする。
【００９７】
次いで、ＥＭＭＰＲＩＮまたはＣｙＰに対する抗体を利用して、当業者によく知られた技術を用い、ＥＭＭＰＲＩＮまたはＣｙＰを「模倣」する抗−イディオタイプ抗体を生産する（Ｇｒｅｅｎｓｐａｎ ＆ Ｂｏｎａ， ＦＡＳＥＢ Ｊ． ７：４３７−４４４， １９９３； およびＮｉｓｓｉｎｏｆｆ， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １４７： ２４２９−２４３８， １９９１）。例えば、ＣｙＰに結合し、ＥＭＭＰＲＩＮの結合を拮抗的に阻害するＥＭＭＰＲＩＮまたはＣｙＰに対する抗体を用いて、ＥＭＭＰＲＩＮまたはＣｙＰを「模倣」し、それによって、ＥＭＭＰＲＩＮを結合および中和する抗−イディオタイプを生じる。かかる中和性抗−イディオタイプまたはかかる抗−イディオタイプのＦａｂフラグメントは、ＥＭＭＰＲＩＮを中和するための治療計画において用いられる。
【００９８】
別法では、ＥＭＭＰＲＩＮ活性のアンタゴニストとして作用する、すなわち、ＥＭＭＰＲＩＮによる活性化またはシグナリングを阻害するＥＭＭＰＲＩＮに対する抗体を生産する（下記の実施例２において示される）。かかる抗体は、例えば、ＨＩＶ−１感染、ＡＩＤＳおよびＡＩＤＳ関連障害、ＲＡまたは癌を治療するために、治療上使用される。同様に、ＥＭＭＰＲＩＮのアゴニストとして作用する抗体を生産する。かかる抗体はＥＭＭＰＲＩＮに結合し、そのシグナル変換活性を活性化する。
【００９９】
例えば、ＨＩＶ−１感染、ＡＩＤＳおよびＡＩＤＳ関連障害、ＲＡ、癌および局所的または全身性のＣｙＰ放出、合成または結合によって特徴付けられる症状の治療において有用な薬物のスクリーニングアッセイ
ＥＭＭＰＲＩＮ活性またはＥＭＭＰＲＩＮ遺伝子発現を変調し、それいよって、例えば、ＨＩＶ−１感染、ＡＩＤＳ、ＲＡまたは癌を変調する化合物または組成物を同定するために、多くの異なるアッセイ系（例えば、均一、不均一、細胞ベースおよび非細胞ベース）を設計し、使用できる。下記の系はキット中に処方されてもよい。この目的のために、試薬（例えば、ＥＭＭＰＲＩＮまたはＣｙＰ蛋白質あるいはＥＭＭＰＲＩＮまたはＣｙＰ蛋白質を発現している細胞）を種々の容器、例えば、バイアル、チューブ、ミクロタイターウェルプレート、ボトルなどの中にパックする。他の試薬、例えば、正の対照試料、負の対照試料、ＥＭＭＰＲＩＮまたはＣｙＰ蛋白質、ペプチド、バッファー、細胞培養培地、抗体などを分離した容器中に入れ、キットを提供することができる。
【０１００】
スクリーニングアッセイの基本的な設計および原理
本明細書中で論じられる特定の具体例に限らず、他の当該分野で認識された可能性のなかでも、ＥＭＭＰＲＩＮ、ＣｙＰまたはＣｙＰ：ＥＭＭＰＲＩＮ複合体に結合するか；ＣｙＰとＥＭＭＰＲＩＮとの間の相互作用を干渉するか；あるいは蛋白質（例えば、ＨＩＶ−１ ＭＡおよびＣＡ蛋白質）のＥＭＭＰＲＩＮ−媒介性シグナル変換またはＥＭＭＰＲＩＮ−媒介性細胞コンパートメント化をもたらす化合物または組成物を同定するために、下記のアッセイが設計される。ＣｙＰ／ＥＭＭＰＲＩＮ相互作用のアンタゴニストまたはアゴニストとして、あるいはＥＭＭＰＲＩＮ−媒介性シグナル変換または他のＥＭＭＰＲＩＮ−媒介性活性の修飾剤として同定された化合物は、例えば、ＨＩＶ−１感染、ＡＩＤＳおよびＡＩＤＳ関連障害、ＲＡまたは癌の治療および予防に対する治療的有用性を有する。
【０１０１】
ＣｙＰ／ＥＭＭＰＲＩＮ相互作用を阻害する化合物を同定するためのアッセイの原理は、試験化合物、機能的ＣｙＰおよびＥＭＭＰＲＩＮ蛋白質（または一部、ＥＭＭＰＲＩＮ蛋白質を含む細胞調製物）を含有する反応混合物を調製し、成分が相互作用し、結合する（すなわち、除去および／または検出できる複合体が形成される）のに十分な時間、該反応混合物をインキュベートすることを含む。例えば、アンタゴニスト活性について化合物を試験するために、反応混合物を試験化合物の存在下および不在下で調製する。試験化合物は、最初に反応混合物中に含有されてもよく、またはＣｙＰおよびＥＭＭＰＲＩＮ蛋白質の添加後に加えられてもよい。対照反応混合物は、試験化合物を用いずにインキュベートするか、または対照薬剤と共にインキュベートする。次いで、いずれかのＣｙＰ：ＥＭＭＰＲＩＮ複合体の形成を検出する。対照反応中で複合体が形成するが、試験化合物を含有する反応混合物中では形成しないことは、該化合物がＣｙＰ／ＥＭＭＰＲＩＮ相互作用を拮抗することを示す。さらに、試験化合物ならびに正常なＣｙＰおよびＥＭＭＰＲＩＮ蛋白質を含有する反応混合物内での複合体形成をまた、試験化合物および誘導体化または変異体ＣｙＰまたはＥＭＭＰＲＩＮ蛋白質を含有する反応混合物内での複合体形成と比較してもよい。
【０１０２】
均一および不均一アッセイフォーマット
ＣｙＰ／ＥＭＭＰＲＩＮ相互作用のアンタゴニストおよびアゴニストのためのスクリーニングアッセイは、均一または不均一フォーマットのいずれかにおいて行われる。均一アッセイは、細胞ベースまたは非細胞ベースのいずれかであり、ここに、全反応が液相中で行われる。不均一アッセイは、一般に（常にではない；例えば、細胞表面ＥＭＭＰＲＩＮを展示している固定化細胞）非細胞ベースであり、リガンドまたは受容体のいずれかを固相上に固定し、反応の最後に固相上に固定された複合体を検出することを含む。
【０１０３】
いずれかのアプローチにおいて、反応物の添加順序を変えて、試験されている化合物について異なる情報を得る。例えば、拮抗によって、リガンド／受容体相互作用を干渉する試験化合物は、試験物質の存在下で反応を行うことによって；すなわち、リガンドおよび相互作用する細胞性または細胞外受容体より前または同時に、試験物質を反応混合物に加えることによって同定される。別法では、予め形成された複合体を崩壊させる試験化合物、例えば、該複合体由来の成分の１つを置き換えるより高い結合定数を有する化合物を、リガンド／受容体複合体が形成した後に反応混合物に試験化合物を加えることによって試験する。種々のフォーマットを簡単に下記する。
【０１０４】
不均一の細胞ベースおよび非細胞ベースアッセイ
不均一アッセイ系において、リガンドあるいは相互作用する細胞または細胞外受容体のいずれかを固体表面上に固定する一方で、非固定種を直接的または間接的に標識する。実際には、ミクロタイタープレートを利用する。固定される種は、非共有または共有結合によって固定される。非共有結合は、固体表面をリガンド、受容体蛋白質または受容体を発現している細胞の溶液で被覆し、所望により乾燥させることによって達成される。別法では、固定されるべき種に特異的な固定化抗体を用いて、固体表面に該種を固定する。該表面は予め調製していてもよい。
【０１０５】
アッセイは、試験化合物を用いて、または用いないで、被覆された表面に固定された種の結合パートナーを曝露することによって行われる。反応完了後に非反応成分は除去され（例えば、洗浄によって）、形成されたいずれの複合体も固体表面上に固定されたままであろう。
【０１０６】
固定された複合体の検出は、下記に限定されないいくつかの方法において達成される。第１に、非固定種が予め標識されている場合、固定された標識の検出は複合体が形成されたことを示す。第２に、非固定種が予め標識されていない場合、間接的な標識を用いて固定された複合体を検出する；例えば、最初に固定されない種に特異的な標識抗体を用いる（次いで、抗体は、直接的に標識されるか、または標識された抗−Ｉｇ抗体で間接的に標識されてもよい）。反応成分の添加順序に依存して、複合体形成を阻害するか、または予め形成された複合体を崩壊させる試験化合物が検出される。
【０１０７】
別法では、反応は、試験化合物の存在下または不在下で液相中で行うことができ、反応産物を非反応成分から分離し、次いで、複合体を例えば、溶液中で形成されたいずれかの複合体を固定するための結合成分の１つに特異的な固定化抗体を用い、他の結合パートナーに特異的な別の標識化抗体を用いてかかる固定された複合体を検出することによって、不均一に検出する。複合体形成を阻害するか、または予め形成された複合体を崩壊させる試験化合物は、最初の均一液相中における反応物添加の順序に依存して同定される。
【０１０８】
例えば、不均一アッセイにおいて、まず、固定化のために、リガンドまたは受容体蛋白質を慣例の組換えＤＮＡ技術を用いて調製する。例えば、ｐＧＥＸ−５Ｘ−１のような融合ベクターを用いて、得られる融合蛋白質中でその結合活性が維持されるような方法で、リガンド遺伝子コーディング領域をグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）遺伝子に融合する。相互作用する受容体を精製し、放射性異性体１２５Ｉで標識できるモノクローナル抗体を生産するために用いる。ＧＳＴ−リガンド融合蛋白質をグルタチオン−アガロースビーズに固定する。次いで、試験化合物の存在下または不在下で、相互作用および結合を起こさせる方法で、相互作用する受容体を加える。反応期間の最後に非結合材料を洗い去り、標識したモノクローナル抗体を該系に加え、複合体化した成分に結合させる。リガンド／受容体相互作用は、グルタチオン−アガロースビーズに結合したままの放射能量を測定することによって検出される。試験化合物による相互作用の阻害の成功は、測定される放射能の減少をもたらす。
【０１０９】
別法では、ＧＳＴ−リガンド融合蛋白質および相互作用受容体を、固体グルタチオン−アガロースビーズの不在下、液体中で一緒に混合する。該種を相互作用させる間または相互作用させた後に、試験化合物を加える。次いで、該混合物をグルタチオン−アガロースビーズに加え、非結合材料を洗い去る。リガンド／受容体相互作用の阻害の程度を、標識抗体を添加し、ビーズと結合した放射能を測定することによって検出する。
【０１１０】
したがって、本発明は、細胞ベースおよび非細胞ベースの不均一アッセイを提供し、ここに、組換え発現されたＥＭＭＰＲＩＮ蛋白質、ポリペプチドまたは融合蛋白質、またはＣｙＰ：ＥＭＭＰＲＩＮ複合体、またはＥＭＭＰＲＩＮ受容体を発現している細胞は固体基質（例えば、試験管、ミクロタイターウェル、またはカラム）に結合している。次いで、試験化合物を、固定化ＥＭＭＰＲＩＮ蛋白質、ポリペプチドまたは融合蛋白質、またはＣｙＰ：ＥＭＭＰＲＩＮ複合体のいずれかに結合できるその能力について、またはＣｙＰ蛋白質、ポリペプチドまたは融合蛋白質の固定化ＥＭＭＰＲＩＮ蛋白質、ポリペプチドまたは融合蛋白質への結合を拮抗または促進できるその能力についてアッセイする。
【０１１１】
したがって、ＥＭＭＰＲＩＮとＥＭＭＰＲＩＮリガンド、例えば、ＣｙＰＡまたはＣｙＰＢとの間の相互作用を模倣する化合物を同定するためのスクリーンが設計される。かかるスクリーンにおいて、試験化合物を標識し、固定化ＥＭＭＰＲＩＮ蛋白質、ポリペプチドまたは融合蛋白質に結合できるその能力についてアッセイする。本発明の別の態様において、ＥＭＭＰＲＩＮとＥＭＭＰＲＩＮリガンド、例えば、ＣｙＰＡまたはＣｙＰＢとの間の相互作用を拮抗する化合物を同定するためのスクリーンが設計される。かかるスクリーンにおいて、ＥＭＭＰＲＩＮリガンドを標識し、試験化合物を、標識リガンドのＥＭＭＰＲＩＮへの結合を拮抗できるその能力についいてアッセイする。
【０１１２】
均一の細胞ベースおよび非細胞ベースアッセイ
均一アッセイは、細胞ベースまたは非細胞ベースのいずれかであり、ここに、全反応を液相中で行う。
細胞ベースアッセイ
均一の細胞ベースアッセイ系を用いて、例えば、ＨＩＶ−１感染、ＡＩＤＳ、ＲＡまたは癌の治療のための化合物を同定するために、ＥＭＭＰＲＩＮの活性を変調する化合物についてスクリーンする。この目的のために、ＥＭＭＰＲＩＮまたはＣｙＰを内在性発現する細胞を化合物のスクリーンに用いる。別法では、２９３細胞、ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞、ＭＣＦ−７細胞、Ｈｓ５７８Ｔ細胞、繊維芽細胞などの細胞系統を遺伝子操作してＥＭＭＰＲＩＮまたはＣｙＰを発現させて、スクリーニング目的に用いる。好ましくは、ＣｙＰまたはＣｙＰペプチドまたは融合蛋白質による活性化に応答する機能的ＥＭＭＰＲＩＮ蛋白質を発現するように遺伝子操作された宿主細胞をアッセイの終了点として用いる。かかる終了点は、例えば、化学的、生理学的、生物学的、または表現型特性における当該分野で認識された変化、例えば、宿主細胞遺伝子またはレポーター遺伝子（例えば、ＭＭＰｓ）の誘導、ｃＡＭＰレベル、アデニリルシクラーゼ活性、カルシウム動員、宿主細胞Ｇ−蛋白質活性、宿主細胞キナーゼ活性、シグナル変換経路の活性化、細胞外酸性化率、増殖、分化、ウイルス感染に対する感受性、受容体改変（例えば、感作、脱感作、アップレギュレーションまたはダウンレギュレーション）などの測定によって提供される。
【０１１３】
スクリーニングアッセイにおいて有用であるためには、機能的ＥＭＭＰＲＩＮまたはＣｙＰ蛋白質を発現している宿主細胞は、有意なＥＭＭＰＲＩＮに基づく終了点応答、好ましくはバックグラウンドより５倍大きい誘導を提供すべきである。ＥＭＭＰＲＩＮに基づく誘導応答を最大化するために、宿主細胞は、好ましくは、その読出しに依存していくつかの特徴を有する。例えば、ＣＲＥレポーター遺伝子の誘導を検出するために、（ａ）低い天然レベルのｃＡＭＰ、（ｂ）高レベルのアデニリルシクラーゼ、（ｃ）高レベルの蛋白質キナーゼＡ、（ｄ）低レベルのホスホジエステラーゼおよび（ｅ）高レベルのｃＡＭＰ応答エレメント結合蛋白質を含む１組のアッセイ条件が有益である。さらに、ＣＲＥ受容体の誘導のための別の経路を排除して基底レベルを減少させる。ＥＭＭＰＲＩＮに基づく応答を増加させるために、より大量の好ましい因子（例えば、ＥＭＭＰＲＩＮアンタゴニストとして作用する化合物についてスクリーニングする場合、増強されたまたは構造的ＥＭＭＰＲＩＮおよび／またはＣｙＰ発現）またはより少量の好ましくない因子（例えば、ＥＭＭＰＲＩＮアゴニストについてスクリーニングする場合、増強されたＣｙＰ発現）を発現するように宿主細胞を操作する。
【０１１４】
かかる細胞系の使用において、ＥＭＭＰＲＩＮまたはＣｙＰ蛋白質を発現している細胞を試験化合物または対照に曝露する。曝露後、細胞をアッセイしてＥＭＭＰＲＩＮシグナル変換経路の成分の発現および／または活性を測定する。別法では、シグナル変換経路自体の活性をアッセイする。例えば、曝露後、細胞溶解物をカルシウム動員（実施例３参照）、ｃＡＭＰの誘導、または蛋白質チロシンキナーゼ（ＰＴＫ）（実施例３）、セリン／スレオニンキナーゼ、ｇ−蛋白質、Ｒａｓ、ＰＫＡ、ＲＡＰ１、Ｂ−Ｒａｆ、Ｍｅｋ、またはＭＡＰＫ活性またはリン酸化の変調についてアッセイする。特定のシグナル変換経路および上流のアクチベーターの活性化または不活化は多くの転写因子の活性化または不活化を導くことができ、それは、次いで、特に細胞増殖、分化、休止または死の媒介となることができる。これは、小型ＧＴＰ−結合蛋白質、Ｒａｐ１上の活性部位のＰＫＡのリン酸化ならびにその後のセリン／スレオニンキナーゼ、Ｂ−ＲａｆおよびＭＡＰＫの活性化を導くＭＡＰＫキナーゼ、Ｍｅｋの活性化によるＰＣ１２細胞の神経細胞分化において例示される。この同じ経路は、特定の前立腺癌細胞系統、例えばＬＮＣａＰおよびＰＣ−３ＭのＮＥ分化に関係している。
【０１１５】
ＥＭＭＰＲＩＮのアゴニストとして作用しうる化合物についてのスクリーニングにおいて、ＣｙＰをほとんど発現しないか、または発現しない細胞系統を用いて、対照と比較した試験化合物によるシグナル変換の活性化について試験することが有利である。ＥＭＭＰＲＩＮのアンタゴニストとして作用する化合物についてのスクリーニングにおいて、ＣｙＰを過剰発現させるか、または外来性ＣｙＰを提供して、対照と比較した試験化合物によるシグナル変換の阻害について試験することが有利である。
【０１１６】
ＥＭＭＰＲＩＮは、新たな感染後初期にＨＩＶ−１マトリックス（ＭＡ）およびキャプシド（ＣＡ）蛋白質の正常な細胞内移動の媒介となることが本明細書中に示された（実施例６および実施例７Ｅ）。よって、別の具体例において、試験化合物は、ウイルス感染後のＨＩＶ−１マトリックス（ＭＡ）およびキャプシド（ＣＡ）蛋白質の細胞内移動を調節するその能力に基づいて選択される。
【０１１７】
非細胞ベースアッセイ
均一な細胞ベースアッセイのほかに、均一な非細胞ベースアッセイ系を用いて、ＥＭＭＰＲＩＮ、ＣｙＰまたはＣｙＰ：ＥＭＭＰＲＩＮ複合体と相互作用する、例えば、それらに結合する化合物を同定する。かかる化合物は、ＥＭＭＰＲＩＮ活性のアゴニストまたはアンタゴニストとして作用し、例えば、ＨＩＶ−１感染、ＡＩＤＳ、ＲＡまたは癌の治療において使用される。組換えＥＭＭＰＲＩＮ蛋白質、ポリペプチド、融合蛋白質または可溶性ＥＭＭＰＲＩＮ蛋白質を発現させ、非細胞ベースアッセイにおいて利用して（ＣｙＰ蛋白質、ポリペプチドまたは融合蛋白質を用いて、または用いずに）、ＥＭＭＰＲＩＮ、ＣｙＰまたはＣｙＰ：ＥＭＭＰＲＩＮ複合体に結合する化合物を同定する。別法では、１以上のＥＭＭＰＲＩＮまたはＣｙＰドメインに対応するポリペプチド、または１以上のＥＭＭＰＲＩＮまたはＣｙＰドメインを含有する融合蛋白質を非細胞ベースアッセイ系において用いて、ＥＭＭＰＲＩＮ、ＣｙＰまたはＣｙＰ：ＥＭＭＰＲＩＮ複合体に結合する化合物を同定する。同定された化合物は、ＥＭＭＰＲＩＮ媒介性活性、例えば、シグナル変換を変調するのに治療上有用である。
【０１１８】
例えば、蛍光レポーター部分に基づくアッセイが均一の非細胞ベースアッセイの例である。かかるアッセイは、例えば、蛍光「レポーター部分」および「クエンチャー部分」を含み、その各々がリンカー部分（例えば、フォスフォルアミダイト、または当該分野で使用可能な他の適当なリンカー）に共有結合し、それにより、各々が相互作用蛋白質対の１メンバーに互いに結合する（例えば、レポーター部分はリガンドに結合し、クエンチャー部分は相互作用受容体に結合した）。適当なレポーターおよびクエンチャー分子の例は、５’蛍光レポーター色素６ＦＡＭ（「ＦＡＭ」；２，７−ジメトキシ−４，５−ジクロロ−６−カルボキシ−フルオレセイン）、ＴＥＴ（６−カルボキシ−４，７，２’，７’−テトラクロロフルオレセイン）および３’クエンチャー色素ＴＡＭＲＡ（６−カルボキシテトラメチルローダミン）（Ｌｉｖａｋら、ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ａｐｐｌ． ４： ３５７−３６２， １９９５； Ｇｉｂｓｏｎら、Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ． ６： ９９５−１００１；およびＨｅｉｄら、Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ． ６：９８６−９９４， １９９６）。
【０１１９】
レポーターおよびクエンチャー部分が極めて接近している場合、レポーター部分発光はクエンチング部分へ効率よく移動し、蛍光−発光スペクトル（例えば、５１８ｎｍ）はクエンチされるかまたは遮蔽される。しかしながら、分離すると、レポーター部分発光はもはやクエンチング部分へ効率よく移動せず、その結果、レポーター部分蛍光−発光スペクトルの増加をもたらす。典型的には、反応の間、クエンチング部分（例えば、ＴＡＭＲＡ）の蛍光強度があまり変化しないような蛍光色素が選択される。マグネシウムおよび塩濃度、反応条件（時間および温度）、蛋白質配列、大きさおよび組成を包含するいくつかの因子は、かかる蛍光に基づくアッセイの効率に影響を及ぼす。所定のゲノム座について最適な蛍光強度を生じるためのこれらの因子の最適化は、当業者に明らかである。
【０１２０】
したがって、本発明に包含される１の具体例において、予め形成されたＣｙＰ：ＥＭＭＰＲＩＮ複合体を調製し、ここに、ＣｙＰまたはＥＭＭＰＲＩＮのいずれか（または両方）は適当な蛍光タグで標識されており、複合体形成のために標識またはタグにより生じるシグナルはクエンチされる（例えば、米国特許第４，１０９，４９６号参照）。予め形成された複合体由来の種の１つと競合し、それを置換する試験物質の添加は、バックグラウンドより大きいシグナルの生成をもたらす。このように、ＣｙＰ：ＥＭＭＰＲＩＮ相互作用を拮抗する試験物質が同定される。
【０１２１】
スクリーニング化合物
上記のアッセイを用いて、ＥＭＭＰＲＩＮまたはＣｙＰ：ＥＭＭＰＲＩＮ複合体活性に影響を及ぼす化合物を同定する。例えば、ＥＭＭＰＲＩＮまたはＣｙＰ：ＥＭＭＰＲＩＮ複合体活性に影響を及ぼす化合物は、限定するものではないが、ＥＭＭＰＲＩＮに結合して天然リガンド（ＣｙＰ）の結合を阻害するかまたは阻害せず、シグナル変換を活性化する（アゴニスト）かまたは活性化を阻害する（アンタゴニスト）化合物、およびＣｙＰ（例えば、可溶性ＥＭＭＰＲＩＮ蛋白質またはペプチド、またはＣｓＡ誘導体）に結合し、それにより、ＣｙＰ−媒介性ＥＭＭＰＲＩＮ活性を拮抗または増強する化合物を包含する。
【０１２２】
ＥＭＭＰＲＩＮシグナル変換を変調する化合物（例えば、下流のシグナリング事象、カルシウム動員（実施例３参照）、ｃＡＭＰの誘導、蛋白質チロシンキナーゼ（ＰＴＫ）（実施例３）またはセリン／スレオニンキナーゼ、Ｇ蛋白質、Ｒａｓ、ＰＫＡ、ＲＡＰ１、Ｂ−Ｒａｆ、ＭｅｋまたはＭＡＰＫ活性またはリン酸化の変調（それは、ＣｙＰがＥＭＭＰＲＩＮに結合することによって活性化されるシグナルの変換に関係しうる）に影響を及ぼす化合物）もまた、本発明のアッセイ法によって同定される。本発明は、ＥＭＭＰＲＩＮの下流のシグナリング事象に影響を及ぼし、よって、ＣｙＰおよびＥＭＭＰＲＩＮのＨＩＶ感染、ＡＩＤＳ、ＲＡおよび癌に対する影響を変調するような化合物の同定および使用を提供する。
【０１２３】
しかしながら、ＥＭＭＰＲＩＮ遺伝子活性に影響を及ぼす化合物（ＥＭＭＰＲＩＮ遺伝子発現に影響を及ぼすことによって、転写に影響を及ぼすかまたはスプライス事象を干渉し、その結果、全長または末端切断型のＥＭＭＰＲＩＮの発現を変調できる分子、例えば、蛋白質または小型有機分子を包含する）もまた、本発明のアッセイ法によって同定される。
【０１２４】
本発明にしたがってスクリーンされる化合物は、限定するものではないが、ＥＭＭＰＲＩＮまたはＣｙＰ：ＥＭＭＰＲＩＮ複合体に結合し、ＣｙＰによって引き起こされる活性を模倣する（すなわち、アゴニスト）かまたはＣｙＰによって引き起こされる活性を阻害する（すなわち、アンタゴニスト）ペプチド、抗体およびそのフラグメント、および他の有機化合物（例えば、ペプチド模倣物）；ならびにＣｙＰに結合し、それにより、ＣｙＰ−媒介性ＥＭＭＰＲＩＮ活性を「活性化」または「中和」するペプチド、抗体またはそのフラグメント、および他の有機化合物（変異体または末端切断型ＥＭＭＰＲＩＮ分子（またはその一部）を包含する）を包含する。化合物は、限定するものではないが、ランダムペプチドライブラリー；（Ｌａｍら、Ｎａｔｕｒｅ ３５４： ８２−８４， １９９１； Ｈｏｕｇｈｔｅｎら、Ｎａｔｕｒｅ ３５４： ８４−８６， １９９１）、およびＤ−および／またはＬ−配置アミノ酸、ホスホペプチド（限定するものではないが、ランダムまたは部分変性した特異的（ｄｉｒｅｃｔｅｄ）ホスホペプチドライブラリーを包含する；例えば、Ｓｏｎｇｙａｎｇら、Ｃｅｌｌ ７２： ６７−７７８， １９９３）、抗体（限定するものではないが、ポリクローナル、モノクローナル、ヒト化、抗−イディオタイプ、キメラまたは１本鎖抗体、およびＦＡｂ、Ｆ（ａｂ’）２およびＦＡｂ発現ライブラリーフラグメント、およびそのエピトープ結合フラグメントを包含する）および小型有機または無機分子より作成されるコンビナトリアル化学に由来する分子ライブラリーのメンバーを包含するがそれに限定されるものではないペプチド、例えば可溶性ペプチドを包含する。本発明にしたがってスクリーンされる他の化合物は、限定するものではないが、血脳関門を横切り、適当な細胞中へ侵入し、（例えば、遺伝子発現に関与する調節領域または転写因子と相互作用することにより）ＥＭＭＰＲＩＮ遺伝子またはＥＭＭＰＲＩＮシグナル変換経路に関与するいくつかの他の遺伝子の発現に影響を及ぼすことのできる小型有機分子；またはＥＭＭＰＲＩＮの活性またはＥＭＭＰＲＩＮシグナル変換経路に関与するいくつかの他の細胞内因子の活性（例えば、カルシウム動員、ｃＡＭＰの誘導、蛋白質チロシンキナーゼ（ＰＴＫ）、セリン／スレオニンキナーゼ、Ｇ蛋白質、Ｒａｓ、ＰＫＡ、ＲＡＰ１、Ｂ−Ｒａｆ、ＭｅｋまたはＭＡＰＫ活性またはリン酸化の変調）に影響を及ぼすような化合物を包含する。
【０１２５】
また、ＣｙＰ／ＥＭＭＰＲＩＮ相互作用の同定により、当該分野で認められたコンピューターモデリング（例えば、Ｘ線結晶学、ＮＭＲに基づいた活性部位モデリングなど）およびデータベース検索技術を応用して、ＥＭＭＰＲＩＮ発現または活性を変調できる化合物の同定、またはすでに同定された該化合物の改善が可能となる。
【０１２６】
医薬処方および癌の治療法
ＣｙＰ−媒介性ＥＭＭＰＲＩＮ活性、例えば、ＥＭＭＰＲＩＮ−媒介性シグナル変換を減少または増強する本発明のアッセイにおいて同定された化合物を用いて、例えば、ＨＩＶ−１感染、ＡＩＤＳおよびＡＩＤＳ関連障害、ＲＡまたは癌を治療することができる。特定の方法、処方および投与様式は、治療上の徴候、および化合物の物理化学的特性、および標的器官または組織に依存するであろう。異なるアプローチが議論される。
【０１２７】
本発明によると、治療上関連のあるＥＭＭＰＲＩＮ発現細胞のイン・ビトロでの抗−ＣＤ１４７ｍＡｂを用いる処理は、ＨＩＶ−１による感染を阻害しただけでなく、ＣｙＰ−媒介性ＥＭＭＰＲＩＮシグナル変換をも阻害した（実施例２、３、５、６および７参照）。したがって、適当な患者におけるイン・ビボでのＣｙＰ−媒介性ＥＭＭＰＲＩＮ活性の拮抗（例えば、抗−ＥＭＭＰＲＩＮ抗体の投与による、または下流のシグナリング事象を標的とすることによって）は、例えば、ＨＩＶ−１感染、ＡＩＤＳおよびＡＩＤＳ関連障害、ＲＡまたは癌の治療において有用であろう。別法では、ＣｙＰ−媒介性ＥＭＭＰＲＩＮ活性のアゴニストは、例えば、正常な組織リモデリング過程を増強するのに有用である。
【０１２８】
治療化合物のＣｙＰ／ＥＭＭＰＲＩＮ相互作用に対する絶対的な特異性が明らかである必要はない。例えば、ＥＭＭＰＲＩＮおよび他の未知のＣｙＰ相互作用分子の両方を作動する化合物を使用することができた。かかる化合物は、例えばＨＩＶ−１感染、ＡＩＤＳ、ＲＡまたは癌治療を達成するように、関節、血液、胸部組織、前立腺またはその他へのデリバリーが最も効果的になるように、および潜在的な副作用が最小限になるように、投与することができた。ＣｙＰ／ＥＭＭＰＲＩＮ相互作用に対する特異性が明らかではない化合物は、他の分子（例えば、他のＣｙＰ相互作用蛋白質）の変調に起因しうる副作用を制御するための別の療法または薬剤と共に投与することができるが、ＣｙＰ／ＥＭＭＰＲＩＮ相互作用に対する優先性または選択性が明らかな化合物が好ましい。
【０１２９】
投与量決定
かかる化合物の毒性および治療効力は、細胞培養または実験動物において、例えば、ＬＤ５０（集団の５０％までの致死量）およびＥＤ５０（集団の５０％における治療上有効な投与量）を決定するための標準的な医薬および毒物学的手法によって決定される。毒性および治療的効果の間の投与量比は治療的指標であり、それは、ＬＤ５０／ＥＤ５０比として表すことができる。大きい治療的指標を示す化合物が好ましい。毒性副作用を示す化合物を用いてもよいが、非感染細胞への損傷の可能性を最小限にし、それにより副作用を減少させるために、かかる化合物が冒された組織の部位を標的とするデリバリーシステムを設計するよう取り計らうべきである。
【０１３０】
細胞培養アッセイおよび動物研究から得られたデータは、ヒトにおける使用のための投与量範囲を計画するのに使用される。かかる化合物の投与量は、好ましくは、毒性をほとんど伴わないか、または毒性を伴わないＥＤ５０を包含する循環濃度の範囲内にある。該投与量は、使用される投薬形態および利用される投与経路に依存して該範囲内で変化してもよい。本発明の方法で使用されるいずれかの化合物の場合、治療上有効な投与量は典型的に、細胞培養アッセイから最初に見積もられる。投与量は、細胞培養において決定されるＩＣ５０（すなわち、症状の最大阻害の半分を達成する試験化合物の濃度）を包含する循環血漿濃度範囲に達するように、動物モデルにおいて処方されてもよい。かかる情報を用いて、ヒトにおける有用な投与量をより正確に決定する。例えば、高速液体クロマトグラフィーによって、血漿中レベルを測定する。治療上有効な投与量はさらに、ＨＩＶ感染を阻害するのに十分な化合物の量をいう。治療上有効な投与量は、単独で、またはＨＩＶ感染もしくは関連疾患のための他の治療と組み合わせて補助療法として投与されてもよい。
【０１３１】
治療上有効な投与量はさらに、ＨＩＶ感染を阻害する、またはＡＩＤＳ−、ＲＡ−もしくは癌−関連過程の進行を阻害するのに十分な化合物の量をいう。治療上有効な投与量は、単独で、またはＨＩＶ感染もしくは関連疾患のための他の治療と組み合わせて補助療法として投与されてもよい。
【０１３２】
処方および使用
本発明の化合物の処方および投与のための技術は、例えば、”Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ” Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．， Ｅａｓｔｏｎ， ＰＡ， 最新版において見出される。本発明にしたがう使用のための医薬組成物は、１以上の生理学上許容される担体または賦形剤を用いて常法において処方される。
したがって、該化合物およびその生理学上許容される塩および溶媒和物は、例えば、吸入または吹き入れ（口または鼻を介する）、経口、バッカル、直腸、経粘膜、または腸内投与、粘膜内、皮下、骨髄内注射ならびにくも膜下、直接的脳室内、静脈内、腹腔内、鼻腔内、または眼内注射を包含する非経口デリバリーを包含する適当な経路を介する投与のために処方され、デポーまたは徐放性製剤に処方されてもよい。さらに、本発明の薬剤を標的とされるドラッグデリバリーシステムにおいて、例えば、抗−ＣＤ４抗体で被覆したリポソームにおいて投与してもよい。かかるリポソームは、ＣＤ４を発現している細胞を標的とし、該細胞によって選択的に拾い上げられる。
【０１３３】
経口投与の場合、医薬組成物は、医薬錠許容される賦形剤、例えば：結合剤（例えば、糊化トウモロコシ澱粉、コムギ澱粉、コメ澱粉、ジャガイモ澱粉、ゼラチン、トラガカントゴム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチル−セルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、および／またはポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）；充填剤（例えば、ラクトース、シュークロース、マンニトール、またはソルビトール、微結晶セルロースまたはリン酸水素カルシウム）；滑沢剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルクまたはシリカ）；崩壊剤（例えば、ジャガイモ澱粉、澱粉グリコール酸ナトリウム、架橋ポリビニルピロリドン、寒天、またはアルギン酸もしくはその塩、例えば、アルギン酸ナトリウム）；または湿潤剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウム）を用いて常法によって調製される、例えば、錠剤、丸薬、糖衣錠、カプセル、液剤、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁液などの形態をとる。錠剤は、当該分野でよく知られた方法によって被覆される。経口投与用の液体調製物は、例えば、溶液、シロップまたは懸濁液であり、またはそれらは、使用前に水または他の適当なビヒクルで復元するための乾燥産物として提供されてもよい。かかる液体調製物は、医薬上許容される添加物、例えば、懸濁化剤（例えば、ソルビトールシロップ、セルロース誘導体または水素添加食用脂肪）；乳化剤（例えば、レシチンまたはアラビアゴム）；非水性ビヒクル（例えば、アーモンド油、油性エステル、エチルアルコールまたは分別植物油）；および保存料（例えば、メチルまたはプロピル−ｐ−ヒドロキシベンゾエートまたはソルビン酸）を用いて常法によって調製される。該調製物はまた、緩衝塩、フレーバー、着色料および甘味料を適宜含有していてもよい。経口投与用調製物は、活性化合物の制御された放出を与えるように適当に処方されうる。バッカル投与の場合、組成物は、常法において処方される錠剤またはロゼンジの形態をとっていてもよい。
【０１３４】
吸入による投与の場合、本発明による使用のための化合物は、通常、適当なプロペラント、例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素または他の適当なガスを用いて、加圧パックまたはネブライザーから与えられるエーロゾルスプレーの形態でデリバリーされる。加圧エーロゾルの場合、投薬単位は、計量した量をデリバリーするためのバルブを提供することによって決定されうる。吸入器または吹き入れ器中において使用するための化合物と適当な粉末基剤、例えば、ラクトースまたは澱粉の粉末混合物を含有しているゼラチンのカプセルおよびカートリッジを処方してもよい。
【０１３５】
注射の場合、本発明の薬剤を水性溶液、好ましくは生理学上相溶性のバッファー、例えば、ハンク溶液、リンガー溶液または生理学的セーラインバッファー中で処方してもよい。
化合物は、ボーラス注射による注射または連続的注入による非経口投与用に処方されてもよい。注射用処方は、保存料を添加したアンプルまたは複数回投与量用の容器中における単位投与量形態において提供されうる。非経口投与用の医薬処方は、水溶性形態における活性化合物の水溶液を包含する。さらに、活性化合物の懸濁液は、適当な油性注射懸濁液として調製されうる。適当な脂肪親和性溶媒またはビヒクルは、ゴマ油のような脂肪油、またはオレイン酸エチルまたはトリグリセリドのような合成脂肪酸エステル、またはリポソームを包含する。水性注射懸濁液は、懸濁液の粘性を増加する物質、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトールまたはデキストランを含有しうる。所望により、懸濁液はまた、高濃度溶液の調製可能とするために、適当な安定化剤または化合物の可溶性を増加させる薬剤を含有してもよい。
【０１３６】
経粘膜投与の場合、浸透されるべき障壁に適当な浸透剤を処方に用いる。
さらに、化合物はまた、デポー製剤として処方されうる。かかる長期作用性処方は、植え込みによって（例えば、皮下または筋内に）または筋内注射によって投与されうる。したがって、例えば、化合物は、適当な高分子または疎水性材料（例えば、許容できる油中のエマルジョンとして）またはイオン交換樹脂と共に、または可溶性の乏しい誘導体として、例えば、可溶性の乏しい塩として処方されうる。
【０１３７】
ＣｙＰ／ＥＭＭＰＲＩＮ相互作用のモジュレーターとして同定された本発明の化合物の多くは、医薬上適合性のカウンターイオンとの塩として提供されうる。医薬上適合性の塩は、限定するものではないが、塩酸、硫酸、酢酸、乳酸、酒石酸、リンゴ酸、コハク酸などを包含する多くの酸または塩基と共に形成されうる。塩は、対応する遊離の塩基形態である水性または他のプロトン性溶媒中でより可溶性である傾向がある。医薬上許容される塩、担体または賦形剤の例は、当業者によく知られており、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， １８ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ， Ａ．Ｒ． Ｇｅｎｎａｒｏ， Ｅｄ．， Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．， Ｅａｓｔｏｎ， ＰＡ， １９９０において見出すことができる。かかる塩は、限定するものではないが、ナトリウム、カリウム、リチウム、カルシウム、マグネシウム、鉄、亜鉛、塩化水素、臭化水素、ヨウ化水素、酢酸塩、クエン酸塩、酒石酸塩、リンゴ酸塩などを包含する。
【０１３８】
所望により、化合物を、活性成分を含有する１以上の単位投与形態を含有しうるパックまたはディスペンサー装置中に提供してもよい。パックは、例えば、金属またはプラスチック箔、例えばブリスターパックを含みうる。パックまたはディスペンサー装置には、投与説明書が付随しうる。
【０１３９】
ＥＭＭＰＲＩＮ活性を制御し、ＨＩＶ−１感染、ＡＩＤＳおよびＡＩＤＳ関連障害、ＲＡ、癌または局所的もしくは全身性のＣｙＰ放出、合成もしくは結合によって特徴付けられる他の症状を治療または予防することに対する細胞ベースの遺伝子療法アプローチ
患者におけるＥＭＭＰＲＩＮ遺伝子発現および／またはＥＭＭＰＲＩＮ活性の全レベルを変調するために利用されうる付加的な方法は、可溶性ＥＭＭＰＲＩＮまたはＣｙＰドメイン、その融合蛋白質（例えば、ＥＭＭＰＲＩＮまたはＣｙＰの融合Ｉｇ分子）、またはシクロフィリン（ＣｙＰを包含する）変異体、例えばＣｙＰ／ＥＭＭＰＲＩＮ相互作用を干渉することによって、ＨＩＶ感染またはＥＭＭＰＲＩＮ媒介性シグナル変換を阻害するＥＭＭＰＲＩＮまたはＣｙＰの分子デコイまたは他の模倣物を発現する適当な組換え（遺伝子操作された）または非組換え細胞の導入を包含する。かかる細胞、好ましくは自己細胞は、適当な解剖学上の部位に（例えば、ＲＡ関節に）、またはそれらが可溶性分子の供給をデリバリーする「バイオリアクター」として機能しうる体内の異なる部位に配置される組織移植片の一部として、イン・ビボで投与される。かかる可溶性ＥＭＭＰＲＩＮまたはＣｙＰポリペプチドおよび融合蛋白質は、適当な濃度で発現される場合、内在性ＥＭＭＰＲＩＮ活性を拮抗または作動することにおいて、あるいは場合により、ＥＭＭＰＲＩＮの天然リガンド（すなわち、ＣｙＰ）を中和、「排除」または「活性化」することにおいて有用であり、かくして、例えば、ＨＩＶ−１感染、ＡＩＤＳおよびＡＩＤＳ関連障害、ＲＡおよび癌の治療のために、ＥＭＭＰＲＩＮ活性のモジュレーターとして作用する。かかる細胞ベースの遺伝子療法技術は、当業者によく知られている（Ａｎｄｅｒｓｏｎら、米国特許第５，３９９，３４９号；Ｍｕｌｌｉｇａｎ ＆ Ｗｉｌｓｏｎ， 米国特許第５，４６０，９５９号）。例えば、これらの方法は、近年、ヒト糖尿病の治療への応用が成功し、それにより、糖尿病患者は、インスリン分泌性膵臓小島細胞の移植（生着）によって毎日のインスリン注射から開放された（Ｓｈａｐｉｒｏら、Ｎ． Ｅｎｇｌ． Ｊ． Ｍｅｄ． ３４３： ２３０−２３８， ２０００）。
【０１４０】
実施例１
ＥＭＭＰＲＩＮはＣｙＰ相互作用蛋白質である。
該実施例は、ＣｙＰＡを「餌（ｂａｉｔ）」として（すなわち、相互作用標的として）用いる酵母２−ハイブリッドプロトコール（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｉｎｃ．； Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ， ＣＡ）を用いるイン・ビトロ実験を提供して、Ｂリンパ球から調製されたｃＤＮＡ「捕獲（ｐｒｅｙ）」ライブラリーをスクリーニングすることによってＣｙＰＡ−相互作用蛋白質を同定する。特に、以前に知られた膜貫通蛋白質ＥＭＭＰＲＩＮは、本発明の該具体例においてＣｙＰＡ−相互作用蛋白質として同定された。
【０１４１】
方法　酵母２−ハイブリッドスクリーニング
簡単に言うと、ヒトＣｙＰＡとして同定された「発現された配列タグ」をＡＴＣＣ（ＡＴＣＣ＃７８８０９Ｄ）から得た。イン・ビトロでの翻訳および配列決定は、該配列が全長ＣｙＰＡ ｃＤＮＡ（本質的にＧｅｎＢａｎｋ＃Ｙ０００５２と相同性）を示すことを確認した。配列をベクターｐＡＳ２−１（ＣｌｏｎＴｅｃｈ）中にクローン化して、ＣｙＰＡ−ＧＡＬ４ ＤＮＡ結合ドメイン（ＢＤ）融合蛋白質をコードしているプラスミドｐＡＳ２−１−ＣｙＰＡを作成した。該プラスミドを「餌」として用いて、ＧＡＬ４活性化ドメイン（ＡＤ）をコードしているｐＳＥ１１０７中に構築されたヒトＢ−細胞ｃＤＮＡライブラリー（すなわち、「捕獲」ライブラリー）（Ｄｒ． Ｓ． Ｆｉｅｌｄｓ， ＳＵＮＹ， Ｓｔｏｎｙ Ｂｒｏｏｋ由来）（ライブラリー複雑度≒１０８）をスクリーンした。
【０１４２】
スクリーニングは、ＭＡＴＣＨＭＡＫＥＲＴＭ（登録商標）２−ハイブリッドシステム２（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｉｎｃ．； Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）を用いて本質的に製造者による示唆通りに行った。対照実験において、ｐＡＳ２−１−ＣｙｐＡは、酵母レポーター宿主株（Ｙ１８７またはＹ１９０）中に単独で導入された場合、または「空の」ＧＡＬ４活性化ドメイン（ＡＤ）ベクター（ｐＡＣＴ２，Ｃｌｏｎｔｅｎｃｈ）と同時形質転換した場合、ＧＡＬ４プロモーター由来の転写を活性化しなかった（ベータ−ガラクトシダーゼ活性として測定された）（負の対照）。ｐＡＳ２−１−ＣｙｐＡがｐＧＡＤ４２４−ＧＡＧ構築物（全長ＨＩＶ−１ｇａｇ蛋白質とＧＡＬ４ ＡＤとの間の融合を発現している；Ｌｕｂａｎ ら、Ｃｅｌｌ ７３： １０６７−１０７８， １９９３）と同時形質転換された場合に、強力な正のシグナルが検出された（正の対照）。実際のスクリーニングは、ｐＡＳ２−１−ＣｙｐＡをｐＳＥ１１０７−細胞ライブラリーと一緒にＹ１９０酵母レポーター宿主株中へ同時形質転換することによって行われた。相互作用性同時形質転換体についての選択は、３連のドロップ−アウトプレート（ＳＤ／−Ｈｉｓ／−Ｔｒｐ／−Ｌｅｕ）上に培養物を播種し、次いで、標準的なフィルターアッセイプロトコールによりｌａｃＺレポーター遺伝子の発現についてコロニーを試験することによって行った。全ての青色コロニーをさらに、ＣｌｏｎＴｅｃｈプロトコールにたがってシクロヘキシイミドカウンター−選択によってスクリーンして、偽陽性を同定した。最後に、真の陽性コロニー由来のプラスミドを単離し、配列決定した。
【０１４３】
単離したＥＭＰＲＩＮクローン
約１０６個のｃＤＮＡクローンをスクリーンした。数ラウンドのスクリーニングの後、１０個のクローンを真の陽性として選択し（上記の「方法」を参照）、配列決定した。該スクリーンにおいて比較的強く相互作用したクローンのうち１つは、その配列決定された５’側の１８６個のヌクレオチドにおいてヒト細胞外マトリックスメタロプロテイナーゼ誘導因子（ＥＭＭＰＲＩＮ）ｃＤＮＡ（ＤｅＣａｓｔｒｏら、Ｊ． Ｉｎｖｅｓｔ． Ｄｅｒｍａｔｏｌ． １０６： １２６０−１２６５， １９９６）と９７％同一であるインサートを有した。ＥＭＭＰＲＩＮは、ＣｙＰＡ相互作用性クローンのなかで唯一の膜貫通蛋白質であり、それによりＣｙＰＡ受容体という役目の良好な候補物質とされたので、さらなる分析のために選択された（図１）。ＥＭＭＰＲＩＮ（ヒト）のＤＮＡおよび蛋白質配列を各々、配列番号１および配列番号２に示す。
【０１４４】
ＥＭＭＰＲＩＮは、５０−６０ｋＤａの分子量および特徴的なシグナルペプチド（ｓｐ）、細胞外（ｅｃｄ）、膜貫通（ｔｍ）および細胞内（ｉｃｄ）ドメインを有する２６９−アミノ酸の高度にグリコシル化された細胞表面蛋白質である（図１、左パネル）。構造的に、ＥＭＭＰＲＩＮは免疫グロブリン（Ｉｇ）スーパーファミリーに属する（Ｍｉｙａｕｃｈｉら、Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． （Ｔｏｋｙｏ） １０７： ３１６−３２３， １９９０； Ｋａｓｉｎｒｅｒｋら、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １４９： ８４７−８５４， １９９２）。別法では、ＥＭＭＰＲＩＮは、ヒトにおいてＣＤ１４７、バシジン（ｂａｓｉｇｉｎ）およびＭ６−抗原（Ｍｉｙａｕｃｈｉら、Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． （Ｔｏｋｙｏ） １０７： ３１６−３２３， １９９０； Ｋａｓｉｎｒｅｒｋら、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １４９： ８４７−８５４， １９９２）、ニワトリにおいてニューロセリンおよびＨＴ７（Ａｌｂｒｅｃｈｔら、Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ． ５３５： ４９−６１， １９９０）、マウス胚においてバシジンおよびｇｐ４２蛋白質（Ａｌｔｒｕｄａら、Ｇｅｎｅ ８５： ４４５−４５１， １９８９； Ｉｇａｋｕｒａら、Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ． ２２４： ３３−３６， １９９６）およびラットにおいてＯＸ−４７（Ｆｏｓｓｕｍら、Ｅｕｒ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２１： ６７１−６７９， １９９１）細胞ともいう。これらの分子の全てに関するアミノ酸配列および予測第三構造は、高いホモロジーおよび決定的なアミノ酸の保存を共有する。
【０１４５】
ＥＭＭＰＲＩＮは、いくつかの腫瘍細胞の細胞表面上に発現され、それにより、培養中、非常に高レベルのコラゲナーゼ活性を生じるように繊維芽細胞を刺激する（Ｂｉｓｗａｓら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５５： ４３４−４３９， １９９５）。コラゲナーゼおよび他のメタロプロテイナーゼの分泌は、基底膜の細胞外マトリックス成分の分解、腫瘍細胞侵入および転移における決定的な工程を導き、慢性関節リウマチにおける軟骨崩壊に寄与する（ＭｃＣａｃｈｒｅｎ， Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ． ３４： １０８５−１０９３， １９９１； Ｆｉｒｅｓｔｅｉｎ， Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ． ３９： １７８１−１７９０， １９９６）。
【０１４６】
ＥＭＭＰＲＩＮはまた、幅広い正常細胞において発現される。例えば、ＥＭＭＰＲＩＮは、網膜発達におけるニューロン−グリア細胞相互作用（Ｆａｄｏｏｌ ＆ Ｌｉｎｓｅｒ， Ｄｅｖ． Ｄｙｎ． １９６： ２５２−２６２， １９９３）および免疫応答および細胞−細胞認識の調節（Ｂｅｒｄｉｔｃｈｅｖｓｋｉら、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７２： ２９１７４−２９１８０， １９９７）に関与することが知られている。バシジン欠失マウスは、両性の生殖不能症を示し、短期間の記憶および学習における欠陥を示す（Ｉｇａｋｕｒａら、Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ． ２２４： ３３−３６４９， １９９６）。ＥＭＭＰＲＩＮの発現は、ＰＨＡによるＴ細胞活性化においてアップレギュレートされる。該アップレギュレーションは、該表面におけるＥＭＭＰＲＩＮの二量体化を導き、それにより、容易に抗体認識可能になる（Ｅｄｗａｒｄｓ ＆ Ｈａｌｌｅｔｔ， Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｔｏｄａｙ １８： ３２０−３２４， １９９７）。
【０１４７】
ＥＭＭＰＲＩＮがＣｙＰＡ結合蛋白質である確認
本発明の別の具体例において、固定化ＣｙＰＡおよびイン・ビトロで転写および翻訳された［３５Ｓ］−標識化ＥＭＭＰＲＩＮを用いてアフィニティー樹脂結合分析を行って、酵母２−ハイブリッド実験において観察されたＥＭＭＰＲＩＮ−ＣｙＰＡ相互作用を確認した。図１は、［３５Ｓ］−標識化ＥＭＭＰＲＩＮが特にＣｙＰＡ−誘導体化セファロースビーズによって保持されたことを示す（図１、右側のパネル）。
【０１４８】
方法　［３５Ｓ］−標識化ＥＭＭＰＲＩＮの調製
ＥＭＭ．Ｃ１（ｅｃｄ、ｔｍおよびｉｃｄドメインを含有する）およびＥＭＭ．Ｃ２（ｔｍおよびｉｃｄドメインを欠く）フラグメントをｐＴ７Ｂｌｕｅベクター中にクローン化し、標準的なＰｒｏｍｅｇａプロトコールにしたがって、ＴｎＴ−結合型網状赤血球ライゼートシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いる結合型イン・ビトロ転写−翻訳反応に付した。
【０１４９】
ＣｙＰＡアフィニティービーズの調製および結合反応条件
ＣｙＰＡアフィニティー樹脂は、製造者の指示書にしたがって、組換え体ヒトＣｙＰＡをセファロースに結合させることによって調製した。簡単に言うと、１ｇの凍結乾燥したＣＮＢｒ−活性化セファロース４Ｂ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ； Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ， ＮＪ）を１ｍＭ ＨＣｌ中で再水和し、焼結ガラス漏斗上、１ｍＭ ＨＣｌ（２００ｍｌ／ｇ凍結乾燥粉末）で１５分間洗浄した。洗浄した樹脂を、３．３ｍｌの０．１Ｍ ＮａＨＣＯ３／０．５Ｍ ＮａＣｌバッファー（ｐＨ８）中に溶解した６ｍｇの組換え体ヒトＣｙＰＡと混合した。混合物を室温で２時間振盪し、そのとき、０．１５ｍｌの１Ｍエタノールアミン−ＨＣｌ（ｐＨ９．０）を加え、混合物をさらに２時間振盪させて過剰の反応性基をクエンチし、次いで、樹脂を三サイクルの別のｐＨで広範囲に洗浄した。対照樹脂は、最初のカップリング工程の間にＣｙＰＡが加えられなかったことをのぞき、同様に処理された。結合反応は、結合バッファー（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ，ｐＨ６．８；１５０ｍＭ ＫＯＡｃ；２ｍＭ Ｍｇ（ＯＡｃ）２；２ｍＭ ＤＴＴ；０．１％Ｔｗｅｅｎ２０；０．１ｍＭ ＰＭＳＦ，１μｇ／ｍｌアプロチニン，１μｇ／ｍｌペプスタチン）中、室温で９０分間行った。
【０１５０】
ＥＭＭＰＲＩＮは、ＣｙＰＡ−被覆セファロースビーズによって特異的に保持された。
［３５Ｓ］−標識化ＥＭＭＰＲＩＮのアリコートをＣｙＰＡアフィニティー樹脂または対照樹脂と一緒にインキュベートした。結合した蛋白質を標準Ｌａｅｍｍｌｉバッファーで溶出し、電気泳動およびオートラジオグラフィーによって明らかにした（図１、右側のパネル）。［３５Ｓ］−標識化ＥＭＭＰＲＩＮは、ＣｙＰＡセファロースビーズによって特異的に保持されたが、ＣｙＰＡを欠く対照ビーズには保持されなかった。
【０１５１】
該特異的なイン・ビトロ結合相互作用は、全長ＥＭＭＰＲＩＮ構築物ＥＭＭ．Ｃ２（ｅｃｄ、ｔｍおよびｉｃｄドメインを含有する）でのみ観察され、ｔｍおよびｉｃｄドメインを欠くＥＭＭ．Ｃ１ ＥＭＭＰＲＩＮ構築物では観察されなかった。さらに、ＣｙＰＡは、無傷細胞上の細胞表面ＥＭＭＰＲＩＮに結合し、細胞内シグナリングを誘導する（下記参照）。これらの結果は、おそらく、セファロースビーズ上のＣｙＰＡに対するｅｃｄ ＣｙＰ−結合部位の適当な提示のためにＥＭＭＰＲＩＮ膜貫通および／または細胞内ドメインが必要であること、またはＣｙＰＡが直接ｔｍドメインと、ｅｃｄまたはｔｍドメインのいずれかと、または両方のドメインと相互作用するメカニズムを反映する。
【０１５２】
実施例２
ＥＭＭＰＲＩＮはＣｙＰＡに対するシグナリング受容体である。
該実施例は、ＥＭＭＰＲＩＮ−トランスフェクトＣＨＯ細胞が高レベルのＥＭＭＰＲＩＮを細胞表面上に発現したこと、ＣｙＰＡおよびＣｙＰＢがかかるＣＨＯ−ＥＭＭＰＲＩＮ細胞においてＣａ２＋動員を誘導したこと、およびかかるＣＨＯ−ＥＭＭＰＲＩＮ細胞におけるＣｙＰにより誘導されるＣａ２＋動員が抗−ＥＭＭＰＲＩＮ抗体の添加によって阻害されたことを明らかにし、ＥＭＭＰＲＩＮがＣｙＰのシグナリング受容体であることを示すイン・ビトロ実験およびアッセイを提供する。
【０１５３】
実施例１の具体例に示される結果（図１）は、イン・ビトロで発現されたＥＭＭＰＲＩＮがセファロースアフィニティー樹脂上に固定されたＣｙＰＡに結合することを明らかにする。ＣｙＰが細胞表面に発現されたＥＭＭＰＲＩＮに結合するかどうか、該相互作用が細胞内シグナリングカスケードを引き起こすかどうかを評価するために、さらに実験が行われた。
【０１５４】
ＣＨＯ細胞系統はＥＭＭＰＲＩＮ−陰性であるが、高レベルのＥＭＭＰＲＩＮを発現するようにトランスフェクトされた。
試験された全てのヒトおよびほとんどのマウス細胞系統は、すでにＥＭＭＰＲＩＮを発現していた。したがって、ＣｙＰ−ＥＭＭＰＲＩＮ相互作用の分子メカニズムを分析するために、検出可能なＥＭＭＰＲＩＮを有さないＣＨＯ細胞が選択された。ヒトＥＭＭＰＲＩＮ発現ベクターですでに一過性トランスフェクトされているＣＨＯ細胞の不均一集団をブライアン・トゥール（Ｂｒｉａｎ Ｔｏｏｌｅ）博士（Ｔｒｕｆｔｓ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ； Ｂｏｓｔｏｎ， ＭＡ）から得た。高レベルのＥＭＭＰＲＩＮを安定に発現した個々のクローンを、市販の抗−ヒトＥＭＭＰＲＩＮモノクローナル抗体（抗−ＣＤ１４７、Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ， Ｉｎｃ．； Ｆｌａｎｄｅｒｓ， ＮＪ）を用いるＦＡＣＳソーティングによって該不均一集団から単離した。図２は、最も高レベルのＥＭＭＰＲＩＮをその表面に発現しているＣＨＯクローン（ＣＨＯ−ＥＭＭ）のＦＡＣＳ分析を示す。ＣＨＯ−ＥＭＭクローンを増殖させ、さらなる実験の全てに使用した。
【０１５５】
外来的に加えられたＣｙＰＡまたはＣｙＰＢは、ＣＨＯ−ＥＭＭＰＲＩＮ細胞においてＣａ２＋動員を誘導した。
ＥＭＭＰＲＩＮ−トランスフェクト（ＣＨＯ−ＥＭＭ）および対照（ベクター−トランスフェクト）ＣＨＯ細胞におけるカルシウムの細胞内貯蓄の相対的動員を分析して、ＣｙＰ−ＥＭＭＰＲＩＮ相互作用が細胞内シグナル変換を導くかどうかを決定した。
【０１５６】
方法　Ｃａ２＋動員
Ｃａ２＋動員アッセイは、本質的にＳｈｅｒｒｙら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ９５： １７５８−１７６３， １９９８に記載のとおりに行った。簡単に言うと、３ｘ１０６個のＦｕｒａ−２−ＡＭ−負荷ＣＨＯまたはＣＨＯ−ＥＭＭ細胞（５ｘ１０６細胞／ｍｌ）を１試料あたり１０μｇのヒトＣｙＰＡで刺激し、３４０および３８０ｎｍの蛍光発光をＰｅｒｋｉｎ−ＥｌｍｅｒルミネセンススペクトロメーターＬＳ５０Ｂ上で測定した。
ＣｙＰＡは、ＣＨＯ−ＥＭＭにおいて特徴的なＣａ２＋動員を誘導したが、対照ＣＨＯ細胞において誘導しなかった（図３、左側のパネル）。付加的な実験が１０μｇ／ｍｌ ＣｙＰＡ濃度でのシグナリング応答の飽和を示したので、図３に示される結果は該濃度を用いて得られた。これらの結果は、ＥＭＭＰＲＩＮがＣｙＰＡのシグナル変換受容体であることを明らかにする。同様の結果が、ＣＨＯ−ＥＭＭ Ｃａ２＋動員アッセイにおいてＣｙＰＢを用いて得られた。
【０１５７】
ＣＨＯ−ＥＭＭＰＲＩＮ細胞におけるＣｙＰにより誘導されるＣａ２＋動員は、抗−ＥＭＭＰＲＩＮ抗体の添加によって阻害された。
観察されたカルシウム動員が特異的にＥＭＭＰＲＩＮ媒介性であったという付加的な証拠を得るために、抗−ＥＭＭＰＲＩＮ抗体またはイソ型対照抗体の存在下でのカルシウム動員実験を行った（図３、右側のパネル）。
【０１５８】
方法　Ｃａ２＋動員
Ｃａ２＋動員アッセイは、抗−ＣＤ１４７ｍＡｂ（Ｍ６ＦＴ）（Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ， Ｉｎｃ）およびイソ型対照抗体（３３８１４Ｘ， Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）をＦｕｒａ−２−ＡＭ負荷工程の間に５００ｎｇ／ｍｌ濃度で加えたことを除き、本明細書に上記されたとおりに行った。
【０１５９】
抗−ＣＤ１４７ｍＡｂ（Ｍ６ＦＴ）の存在下、ＣｙＰＡはＣＨＯ−ＥＭＭ細胞においてＣａ２＋シグナリングを誘導せず（図３、右側パネル）、細胞表面ＥＭＭＰＲＩＮに結合する抗−ＣＤ１４７抗体およびＣｙＰＡが相互に排他的であることを確立した。付加的な対照実験は、抗−ＣＤ１４７ｍＡｂ（Ｍ６ＦＴ）自体が、ＣＨＯまたはＣＨＯ−ＥＭＭ細胞においてＣａ２＋シグナリングを誘導しなかったことを示した。合わせて考慮し、使用された抗体の文書で証明された特異性を考慮すると、これらのデータはＥＭＭＰＲＩＮがＣｙＰＡのシグナリング受容体であることを証明する。
【０１６０】
実施例３
ＣＨＯ−ＥＭＭＰＲＩＮ細胞におけるＣｙＰＡにより誘導されるＣａ２＋動員はゲニステインによって阻害された。
該実施例は、ＣｙＰに誘導されるＥＭＭＰＲＩＮ媒介性Ｃａ２＋動員が既知の細胞内シグナル変換経路を介して起きることを明らかにするイン・ビトロ実験およびアッセイを提供する。ＣｙＰＡにより誘導されるＣａ２＋動員は、細胞内シグナルの変換に関与することが知られている種々のキナーゼの阻害剤で前処理された細胞において測定された。特に、チロシンキナーゼ阻害剤、ゲニステインは、ＥＭＭＰＲＩＮを安定に発現したＣＨＯ−ＥＭＭ細胞においてＣｙＰＡにより誘導されるＣａ２＋動員を完全に排除した（図４）。
【０１６１】
方法　Ｃａ２＋動員の阻害分析
ＣＨＯ−ＥＭＭＰＲＩＮ細胞は、まず、細胞のＦｕｒａ−２負荷の間、下記の薬剤：ビス−インドリルマレイミド（１０ｎＭ）、ＰＫＣ阻害剤；ＰＤ９８０５９（１００μＭ）、ＭＡＰＫ阻害剤およびゲニステイン（６７μＭ）、チロシンキナーゼ阻害剤で４５分間前処理した。次いで、該細胞を１０μｇ／ｍｌのＣｙＰＡで刺激し、上記のようにＣａ２＋動員分析に付した。別法では、Ｇｉ−ＧｏおよびＧｔ−蛋白質ファミリーのメンバーによって媒介されるシグナリング経路を不活化するボルデテラ・パルツシス（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）毒素（ＰＴＸ；１００ｎｇ／ｍｌ）、または近年、ケモカイン受容体の交差−脱感作を誘導することが示された（Ａｌｆａｎｏら、Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １９０： ５９７−６０６， １９９９）ＰＴＸ Ｂ−オリゴマー（１００ｎｇ／ｍｌ）を１０μｇ／ｍｌ ＣｙＰＡでの刺激およびＣａ２＋動員分析の１２時間前に加えた。
【０１６２】
ゲニステインは、ＣＨＯ−ＥＭＭ細胞においてＣｙＰＡに誘導されるＥＭＭＰＲＩＮ−媒介性Ｃａ２＋動員を完全に排除した。
図４は、ビス−インドリルマレイミドＩ（ＰＫＣ阻害剤）およびＰＤ９８０５９（ＭＡＰＫ阻害剤）が、ＣＨＯ−ＥＭＭ細胞におけるＣｙＰＡにより誘導されるＣａ２＋動員に対して影響を及ぼさなかったことを示す。同様に、百日咳毒（ＰＴＸ）またはＰＴＸ Ｂ−オリゴマーでの細胞の処理は、ＣＨＯ−ＥＭＭ細胞におけるＣｙＰＡにより誘導されるＣａ２＋シグナリングを阻害しなかった。対照的に、チロシンキナーゼの阻害剤であるゲニステインは、ＣｙＰＡに刺激されたＣＨＯ−ＥＭＭＰＲＩＮ細胞においてＣａ２＋動員を完全に排除した（図４、下方の曲線）。これらのデータは、ＣｙＰＡに誘導されるＥＭＭＰＲＩＮ−媒介性シグナル変換がチロシンキナーゼ依存性経路を介して起こることを示す。
【０１６３】
実施例４
ＣｙＰＡ−処理は、培養された繊維芽細胞によるプロＭＭＰ発現および放出をアップレギュレートした。
該実施例は、ＣｙＰ−処理が初代肺繊維芽細胞におけるマトリックスメタロプロテイナーゼ（以後、「ＭＭＰ」という）発現をアップレギュレートするかどうかを決定するためのイン・ビトロ実験およびアッセイを提供する。本発明の具体例は、ＣｙＰＡ−処理がＷＩ−３８培養ヒト初代肺繊維芽細胞によるＭＭＰ−１の発現および放出を活性化し、ＭＭＰ−３のそれを増強したことを明らかにする（図５）。
【０１６４】
方法　初代ヒト肺繊維芽細胞のＣｙＰ−処理；ウェスタンイムノ−ブロット分析
まず、初代ＷＩ−３８ヒト肺繊維芽細胞（高レベルのＥＭＭＰＲＩＮを発現している）を８０％集密度まで増殖させ、一晩、血清欠乏にし、次いで、単独または１００ｎｇ／ｍｌ ＣｙＰＡの存在下で５時間インキュベートした。次いで、細胞上清および膜を収集し、特異的マウス抗体を用いるウェスタンイムノ−ブロット分析によってＭＭＰ発現について分析した（Ｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ； Ｌａ Ｊｏｌｌａ， ＣＡ）。
【０１６５】
ＣｙＰＡ処理は、ＷＩ−３８繊維芽細胞によるプロＭＭＰ−１の発現および放出を活性化し、プロＭＭＰ−３の発現および放出を増強した。
ＭＭＰ−１、ＭＭＰ−３およびＭＭＰ−９は、慢性関節リウマチ患者の滑液中で上昇することが報告されており、疾患関連病理に寄与すると考えられるので（Ｓｏｒｓａら、Ｓｅｍｉｎ． Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ． ２２： ４４−５３， １９９２； Ｋｅｙｓｚｅｒら、Ｊ． Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ． ２６： ２５１−２５８， １９９９； Ｓｏら、Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ （Ｏｘｆｏｒｄ）． ３８： ４０７−４１０， １９９９； ＭｃＣａｃｈｒｅｎ， Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ． ３４： １０８５−１０９３， １９９１）、ＣｙＰＡがＭＭＰ−１、ＭＭＰ−３およびＭＭＰ−９の発現を誘導するかという疑問を調べた。
図５は、非処理繊維芽細胞ではなく、ＣｙＰＡで処理されたＷＩ−３８繊維芽細胞がＭＭＰ−１を培養流体中に発現および放出したことを示す。さらに、ＣｙＰＡは、ＭＭＰ−３の発現および放出を増強し、さもなければ、それはこれらの細胞によって構造的に分泌された。ＭＭＰ−９は、非処理またはＣｙＰＡ−処理細胞の上清流体中で観察されなかった。
【０１６６】
さらに、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によって評価される分子量に基づき、プロ酵素形態のＭＭＰ−１およびＭＭＰ−３がＣｙＰＡに応答して放出されたことが決定された。チモグラフィーを用いて活性なＭＭＰを分析する平行実験では、各々、成熟した活性なＭＭＰ−１およびＭＭＰ−３に相当するであろう４５ｋＤａおよび３３ｋＤａのバンドが現れなかった。ＭＭＰ発現は本発明の具体例にしたがって、培養中の休止繊維芽細胞の精製された集団において調べられていたので、これは驚くべきことではなかった。ＭＭＰファミリーの全メンバーは、周囲の細胞および組織によって放出される蛋白質分解性酵素によって細胞外でその後に活性化される不活性なチモーゲン（例えば、プロＭＭＰ−１およびプロＭＭＰ−３）として分泌されることが知られている（Ｗｏｅｓｓｎｅｒ， ＦＡＳＥＢ Ｊ． ５：２１４５−２１５４， １９９１）。正常な関節と比べて炎症を起こしたＲＡ関節では、プロＭＭＰ−１およびプロＭＭＰ−３をその活性形態へ最終的に切断する酵素の供給源であると考えられる好中球の数が著しく増加している。次いで、活性化したＭＭＰｓは、軟骨を分解するように作用して関節崩壊を導く（Ｅｄｗａｒｄｓ ＆ Ｈａｌｌｅｔｔ， Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｔｏｄａｙ １８： ３２０−３２４， １９９７）。
【０１６７】
これらのデータは、イン・ビボでのマトリックスメタロプロテイナーゼ活性のＥＭＭＰＲＩＮ−媒介性刺激のための二元的メカニズムであって、それにより、ＥＭＭＰＲＩＮが細胞外ＣｙＰリガンドを介するシグナルを受け（すなわち、シグナル変換細胞受容体として）、別の細胞上のカウンター受容体との細胞−細胞付着−型相互作用を介してシグナルを与える（すなわち、固定された細胞表面「リガンド」として）メカニズムを支持する。
【０１６８】
実施例５
細胞表面ＥＭＭＰＲＩＮは、ＨＩＶ−１コアを担持するＭｕＬＶ−偽型レトロウイルスによるＣＨＯ細胞の細胞感染の組み込み前工程に対する実質的な増強効果を有した。
該実施例は、ＣＨＯ細胞において、ＥＭＭＰＲＩＮがＨＩＶ感染に関与することを示すイン・ビトロ実験およびアッセイを提供する。特に、本発明の具体例によると、細胞表面ＥＭＭＰＲＩＮの存在は、ＨＩＶ−１コアを有するＭｕＬＶ−偽型レトロウイルスによる細胞感染の組み込み前工程に対して実質的な増強効果を有した（図６）。
【０１６９】
方法　ＣＨＯ細胞系統
ＨＩＶ−１感染におけるＥＭＭＰＲＩＮの役割を調べるためのＤＮＡトランスフェクション実験において、ＥＭＭＰＲＩＮを発現しないＣＨＯ細胞が最初に使用された。これは、試験された全ての潜在的にＨＩＶ−１感受性のヒト細胞（初代Ｔ細胞およびマクロファージ、Ｔリンパ球および単核細胞ＨＯＳ、２９３ＴおよびＨｅＬａ細胞系統）がすでに比較的高レベルのＥＭＭＰＲＩＮを発現していたからである。いくつかのＣＨＯ−ＥＭＭクローンが、ブライアン・トゥール博士（Ｔｕｆｔｓ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｂｏｓｔｏｎ， ＭＡ）によって提供され、高レベルのＥＭＭＰＲＩＮを発現していたＥＭＭＰＲＩＮ−トランスフェクトＣＨＯ細胞から選択された（実施例２参照）。対照（ｐｃＤＮＡ−トランスフェクト）ＣＨＯ細胞においてＥＭＭＰＲＩＮは検出されなかった。
【０１７０】
ＣＨＯ細胞のトランスフェクション
７５ｃｃフラスコ中８０％集密度まで増殖させたＣＨＯ細胞を、Ｆｕｇｅｎｅ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を用い、製造者によって提供されたプロトコールにしたがって、１０μｇのＣＤ４またはＣＸＣＲ４発現ベクター（各々、ｐＢＡＢＥ−Ｔ４およびｐＢＡＢＥ−ＣＸＣＲ４）でトランスフェクトした。トランスフェクション効率は、フローサイトメトリック分析によって明らかにしたところ、典型的に１５−２０％であった。
【０１７１】
抗体
抗−ＣＤ１４７ｍＡｂ（ＵＭ−８Ｄ６）は、Ａｎｃｅｌｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ（Ｂａｙｐｏｒｔ， ＭＮ）から得、イソ型に合致した（ＩｇＧ１κ）対照ｍＡｂはＢＤ ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ （Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ） から得た。抗−ＣＤ４ｍＡｂは、Ｂｅｃｋｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ （Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ， ＮＪ） から得た。
【０１７２】
ルシフェラーゼを発現している偽型ＨＩＶ−１変種での感染
Ｅｎｖ−偽型ルシフェラーゼ発現ＨＩＶ−１組換え体を用いる単一サイクルアッセイを本質的に以前の記載（Ｃｏｎｎｏｒら、Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １８５： ６２１−６２８， １９９７； Ｄｒａｇｉｃら、Ｎａｔｕｒｅ ３８１： ６６７−６７３， １９９６）どおりに行った。簡単に言うと、偽型ルシフェラーゼレポーターウイルスを、外被欠損ＮＬ４−３構築物を発現しているプラスミドおよびＸ４株ＨｘＢ２または両栄養性ネズミ白血病ウイルス（ＭｕＬＶ）のいずれか由来のウイルス性外被を発現しているプラスミドでの２９３Ｔ細胞の同時トランスフェクションによって生産した。培養４日後に、偽型ウイルスで感染された細胞（１０６細胞あたり５ｎｇのｐ２４）をレポーター溶解バッファー（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて溶解し、Ｄｙｎｅｘ ＭＬＸミクロプレートルミノメーターを用いて、相対光単位においてルシフェラーゼ活性を測定した。
【０１７３】
ＥＭＭＰＲＩＮは、ＭｕＬＶ偽型ＨＩＶによるＣＨＯ細胞感染を増強した。
ＥＭＭＰＲＩＮがＨＩＶ感染を増強するかどうかを決定するために、ネズミ白血病ウイルス（ＭｕＬＶ）の両栄養性外被を有する偽型の組換えルシフェラーゼ発現性ＨＩＶ−１でのＣＨＯ−ＥＭＭまたは対照ＣＨＯ細胞の感染のルシフェラーゼ活性分析を行った。
ＣＨＯ−ＥＭＭまたは対照（ｐｃＤＮＡ−トランスフェクト）ＣＨＯ細胞の三連培養を５０μｇ／ｍｌの抗−ＣＤ１４７（すなわち、抗−ＥＭＭＰＲＩＮ）ｍＡｂまたはイソ型に合致した対照ｍＡｂの存在または不在下、ＭｕＬＶ由来のＥｎｖを有する偽型のルシフェラーゼ発現性ＨＩＶ−１（Ｌｕｃ−ＨＩＶ−１）で感染させた。３７℃で１時間感染させる前に、ヘパリナーゼＩＩＩ（３ｘ１０−４ＩＵ／ｍｌ）を細胞に加えた。ルシフェラーゼ発現を感染の４日後に測定し、１００％とされる対照（ＣＨＯ−ｐｃＤＮＡ細胞）に相対的な発現のパーセンテージとして表す。
細胞表面ＥＭＭＰＲＩＮは、ＣＨＯ細胞においてルシフェラーゼ発現を５−ないし６−倍増加した（図６、左側のパネル）。さらに、該増加は、抗−ＣＤ１４７ｍＡｂが感染の間に加えられた場合、大きく減少した（図６、左側のパネル、第三の垂直バー）。
【０１７４】
ＥＭＭＰＲＩＮはＨＩＶ−１偽型ＨＩＶによるＣＨＯ細胞感染を増強した。
ＥＭＭＰＲＩＮがＨＩＶ−１外被を有する偽型のウイルスの複製を増強するかどうかを決定するために、ＣＨＯ−ＥＭＭまたは対照ＣＨＯ細胞をＣＤ４−およびＣＸＣＲ４−発現ベクターで一過性トランスフェクトし、次いで、ＬＡＶ外被を有する偽型のルシフェラーゼ発現性ＨＩＶ−１構築物で感染させた。
ＣＨＯまたはＣＨＯ−ＥＭＭ細胞の三連培養をＣＤ−４発現性ｐＢＡＢＥ−Ｔ４およびＣＸＣＲ４−発現性ｐＢＡＢＥ−ＣＸＣＲ４で一過性トランスフェクトし、侵入のためにＣＤ４およびＣＸＣＲ４に依存するＨＩＶ−１ＬＡＶ由来のＥｎｖを有する偽型のＬｕｃ−ＨＩＶ−１で感染させた。ルシフェラーゼ発現を上記のように検出し、１００％とされる対照細胞（ＣＨＯ／ＣＤ４／ＣＸＣＲ４）に相対的な発現のパーセンテージとして表す。
ＭｕＬＶ外被を用いる上記の結果と同様に、ルシフェラーゼ発現における３−ないし４−倍の増加が、ＥＭＭＰＲＩＮを発現している細胞において観察された（図６、中央のパネル）。
【０１７５】
ＥＭＭＰＲＩＮはウイルス組み込み前段階でＨＩＶ感染を増強した。
ＥＭＭＰＲＩＮのＨＩＶ感染に対する増強効果がプロウイルスＤＮＡの組み込み前の段階で発現するかどうかを決定するために、感染ＣＨＯ細胞中、抗−ＣＤ１４７ｍＡｂの存在下または不在下でＨＩＶ−１逆転写量を測定した。
ＣＨＯおよびＣＨＯ−ＥＭＭ細胞の２連培養をＣＤ４−およびＣＸＣＲ４−発現ベクターで一過性トランスフェクトし、次いで、抗−ＣＤ１４７ｍＡｂ（ＵＭ−８Ｄ６）またはイソ型に合致した対照抗体の存在下、ＥｎｖＭｕＬＶまたはＥｎｖＬＡＶのいずれかを有する偽型のｌｕｃ−ＨＩＶ−１で感染させた。感染の２時間後、ＬＴＲ Ｒ／Ｕ５プライマー（配列番号２）（配列番号３）、および初期逆転写産物に特異的なプローブ（配列番号４）（Ｓｃｈｍｉｄｔｍａｙｅｒｏｖａら、Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７２： ４６３３−４６４２， １９９８）を用いて、ウイルスＤＮＡをＰＣＲによって分析した。結果をダイレクトイメージャー（Ｄｉｒｅｃｔ Ｉｍａｇｅｒ）（Ｐａｃｋａｒｄ）で定量化し、１００％とされる対照細胞（イソ型処理したＣＨＯ／ＣＤ４／ＣＸＣＲ４）に相対的なＬＴＲ／ｇａｇ−特異的シグナルに関連する放射能として表した。
【０１７６】
ＥｎｖＭｕＬＶ−およびＥｎｖＬＡＶ−偽型ウイルスでの感染後のＬＴＲ Ｒ／Ｕ５逆転写産物の量は、ＣＨＯ／ＣＤ４／ＣＸＣＲ４細胞と比べたＣＨＯ−ＥＭＭ／ＣＤ４／ＣＸＣＲ４細胞において３−ないし４−倍に増加した（図６、右側パネル）。さらに、ルシフェラーゼ発現に対する上記の抗−ＣＤ１４７ｍＡｂ（ＵＭ−８Ｄ６）効果と一致して、抗−ＣＤ１４７ｍＡｂ（ＵＭ−８Ｄ６）は、ＣＤ１４７の該増強効果を減少させた（図６、右側のパネル、各シリーズにおける最後の垂直バー）。抗−ＣＤ１４７ｍＡｂ（ＵＭ−８Ｄ６）によるＣＤ１４７活性の不完全な抑制の理由は、おそらく、ＣＨＯ−ＥＭＭ細胞における高レベルのＥＭＭＰＲＩＮ発現および／またはウイルス付随ＣｙＰＡと比べた該抗体によって認識されるＥＭＭＰＲＩＮエピトープにおける差に起因した。
【０１７７】
したがって、ＥＭＭＰＲＩＮは、ＨＩＶ−１コアを有するレトロウイルスによる細胞感染の組み込み前工程に対する増強効果を有した。有意には、該効果は、偽型化に使用されたＥｎｖの同一性に依存しなかった。したがって、ＨＩＶ−１感染の増強におけるＥＭＭＰＲＩＮの活性は、侵入に用いられる受容体の性質に依存しないようである。かかる受容体独立性作用様式は、ＣｙＰＡの活性に似ており、それは、ヘパランとの相互作用を介して偽型ＨＩＶ−１コア含有ウイルスの付着の媒介となることが報告されている（Ｓａｐｈｉｒｅら、ＥＭＢＯ Ｊ． １８：６７７１−６７８５， １９９９）。しかしながら、ヘパランは、ルシフェラーゼ発現ＥｎｖＭｕＬＶ−偽型ＨＩＶ−１の複製に対するＥＭＭＰＲＩＮの増強効果に必要とされない。ＨＩＶ−１付着を有意に減少させたＣＨＯ−ＥＭＭ細胞のヘパリナーゼＩＩＩでの処理（図７Ｂ）は、ＥＭＭＰＲＩＮ−媒介性ルシフェラーゼ活性を減少させなかった（図６、左側パネル）。
したがって、本発明のデータは、ヘパラン（潜在的にｇｐ１２０−媒介性付着に関与する（Ｍｏｎｄｏｒら、Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７２： ３６２３−３６３４， １９９８））がウイルス組み込み前のＨＩＶ−１感染工程に対するＥＭＭＰＲＩＮ−媒介性増強効果に寄与しないメカニズムと一致する。
【０１７８】
実施例６
細胞表面ＥＭＭＰＲＩＮは、初代ヒトＰＢＭＣのＨＩＶ−１感染の融合後の組み込み前工程に対する実質的な増強効果を有した。
該実施例は、ＥＭＭＰＲＩＮがヒト初代末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）のＨＩＶ感染に関与することを示すイン・ビトロ実験およびアッセイを提供する。特に、ＰＢＭＣ上の細胞表面ＥＭＭＰＲＩＮの存在は、Ｔ細胞適応性またはマクロファージ栄養性ＨＩＶ−１株による、またはＨＩＶ−１コアを有する偽型レトロウイルスによる細胞感染の融合後の組み込み前工程に対する実質的な増強効果を有した（図７Ａ−Ｅ）。
【０１７９】
方法　末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の調製および感染
ヒト初代末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）は、標準的なＦｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ勾配遠心分離法を用いて、全血から得られた。ＰＨＡ（５μｇ／ｍｌ）を用いて２日間、細胞を活性化し、次いで、種々の濃度の抗−ＣＤ１４７ｍＡｂ（ＵＭ−８Ｄ６）またはイソ型に合致した対照ｍＡｂの存在下、ＨＩＶ−１ＬＡＶまたはＨＩＶ−１ＡＤＡ（１ｘ１０６細胞あたり５ｘ１０３ｃｐｍのＲＴ活性）で感染させた。ウイルス複製は、培養上清中のＲＴ活性を測定することによってアッセイされた。
【０１８０】
ルシフェラーゼ発現性偽型ＨＩＶ−１変種での感染
偽型Ｌｕｃ−ＨＩＶ−１株の調製およびその感染は、外被がＬＡＶまたはＡＤＡ株のいずれか由来であることを除き、上記実施例５に記載のとおりに行った。
【０１８１】
ウイルス付着アッセイ
ＰＨＡ−活性化ＰＢＭＣを３７℃で２時間、抗−ＣＤ１４７ｍＡｂ（ＵＭ−８Ｄ６；５０μｇ／ｍｌ）、抗−ＣＤ４ｍＡｂ（５μｇ／ｍｌ）またはヘパリナーゼＩＩＩ（３ｘ１０−４ＩＵ／ｍｌ）と一緒にインキュベートし、次いで、洗浄し、ＨＩＶ−１ＬＡＶ（１０ｎｇ／ｍｌのｐ２４）と一緒に４℃で１時間インキュベートした。４℃でＨＩＶ−１ＬＡＶを用いる１時間のインキュベーション期間に、ヘパリナーゼではなく抗体が存在した。細胞の広範囲な洗浄後、細胞結合したウイルス性ｐ２４の量をＥＬＩＳＡによってアッセイした。
【０１８２】
融合アッセイ　細胞−細胞融合
ＨＩＶ−１ Ｅｎｖ−媒介性細胞融合は、比色融合技術（Ａｌｋｈａｔｉｂら、Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７０： ５４８７−５４９４， １９９６）を用いてアッセイした。簡単に言うと、初代ＰＨＡ−活性化ＰＢＭＣをＴ７ ＲＮＡポリメラーゼを発現しているワクシニアウイルス（ｖＴＦ７−３，Ｆｕｅｒｓｔら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ８３： ８１２２−８１２６， １９８６）で感染させ、抗−ＣＤ１４７ｍＡｂ（ＵＭ−８Ｄ６）またはイソ型に合致した対照ｍＡｂの存在下で２．５時間、ＨＩＶ−１Ｅｎｖ（Ｘ４ ＥｎｖＬＡＶを発現するためのｖＣＢ−４１、およびＲ５ ＥｎｖＢａ−Ｌを発現するためのｖＣＢ−４３；Ｂｒｏｄｅｒ ＆ Ｂｅｒｇｅｒ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ９２： ９００４−９００８， １９９５）およびＴ７プロモーターに連結されたイー・コリｌａｃＺ遺伝子（ｖＣＢ−２１Ｒ−ｌａｃＺ，Ａｌｋｈａｔｉｂら、Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７０： ５４８７−５４９４， １９９６）を発現しているワクシニアウイルスに同時感染させたＨｅＬａ細胞を５：１の比率で用いて同時インキュベートして細胞融合させた。細胞融合を評価するために、β−Ｇａｌ活性を測定する標準的な比色アッセイを洗剤性細胞溶解液と共に用いた。得られた結果は、正の対照（非抗体処理、１００％とする）に相対的なβ−Ｇａｌ活性として表し、同じドナー由来の細胞を用いる３つの独立した測定値の平均±ＳＤとして下記に示した。
【０１８３】
ウイルス−細胞融合
ウイルス−細胞融合の分析のために、ＰＨＡ−活性化ＰＢＭＣをＨＩＶ−１ＬＡＶと一緒に３７℃で２時間、所定の抗体の存在下または不在下（すなわち、「対照」）でインキュベートした。細胞をトリプシン（０．０２５％、３７℃で３０分）で処理し、溶解し、溶解液中、ＥＬＩＳＡによって細胞内に取り込まれたウイルス性ｐ２４を測定した。細胞を４℃にて抗体を用いずにウイルスと一緒にインキュベートし、次いで、トリプシンの存在下３７℃に移すことによって、該アッセイのバックグラウンド（すなわち、４℃「対照」）を決定した。該値は、トリプシンの存在下でどうにか細胞に侵入することのできるウイルスの量を反映する。
【０１８４】
ＰＣＲによるＨＩＶ−１特異的ＤＮＡの検出（逆転写酵素アッセイ）
ＰＨＡ−活性化ヒトＰＢＭＣを、ＨＩＶ−１感染の２時間前に、抗−ＣＤ１４７ｍＡｂ（ＵＭ−８Ｄ６；５０μｇ／ｍｌ）、抗−ＣＤ４ｍＡｂ（２μｇ／ｍｌ）または対応するイソ型に合致した対照ｍＡｂ（５０μｇ／ｍｌ）で処理した。次いで、ＰＢＭＣのＨＩＶ−１ＬＡＶでの感染の２時間後に所定のプライマーを用い、本質的にＳｃｈｍｉｄｔｍａｙｅｒｏｖａら、Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７２： ４６３３−４６４２， １９９８に記載の通りに、ＨＩＶ−１逆転写の分析を行った。
【０１８５】
簡単に言うと、細胞をプロテイナーゼＫを含有する標準ＰＣＲバッファー中に溶解した。プロテイナーゼＫは熱不活性化され、２５μｌアリコートを、０．２μＭオリゴヌクレオチドプライマー、２００μＭの各デオキシヌクレオチド、５０ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．３）、２ｍＭ ＭｇＣｌ２および１．２５ＵのＴａｑポリメラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）を含有する全量５０μｌの３５サイクルのＰＣＲに付した。各サイクルは、９４℃の変性工程３０秒、アニーリング工程（プライマーの各ペアにつきＴｍ−５℃）３０秒および７２℃の伸長工程１分より構成された。アガロースゲル電気泳動後、増幅されたＤＮＡを、［３２Ｐ］−標識プローブを用いるサザンブロットハイブリダイゼーションによって分析した。次いで、インスタント・イメージャー（Ｐａｃｋａｒｄ）を用いて正しいサイズの増幅フラグメントを定量し、抗体非処理対照（１００％とする）と比較した抗体処理におけるカウントのパーセンテージとして表した。下記のプライマーおよびプローブを用いた：ＬＴＲ Ｒ／Ｕ５、センスプライマー（５’−ＧＧＣＴＡＡＣＴＡＧＧＧＡＡＣＣＣＡＣＴＧ−３’）［配列番号６］、アンチセンスプライマー（５’−ＣＴＧＣＴＡＧＡＧＡＴＴＴＴＣＣＡＣＡＣＴＧＡＣ−３’）［配列番号７］、およびプローブ（５’−ＴＧＴＧＴＧＣＣＣＧＴＣＴＧＴＴＧＴＧＴＧ−３’）［配列番号８］；ＬＴＲ／ｇａｇプライマー、センスプライマー（５’−ＣＡＧＡＴＡＴＣＣＡＣＴＧＡＣＣＴＴＴＧＧ−３’）［配列番号９］、アンチセンスプライマー（５’−ＧＣＴＴＡＡＴＡＣＴＧＡＣＧＣＴＣＴＣＧＣＡ−３’）［配列番号１０］、およびプローブ（５’−ＧＡＧＧＣＴＴＡＡＧＣＡＧＴＧＧＧＴＴＣ−３’）［配列番号１１］（Ｓｃｈｍｉｄｔｍａｙｅｒｏｖａら、上掲参照）。
【０１８６】
細胞分画およびウェスタンブロット分析
いくつかの修飾を伴う以前に公表されたプロトコール（Ｂｕｋｒｉｎｓｋａｙａら、Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １８８： ２１１３−２１２５， １９９８）を用いて、ＨＩＶ−１ＬＡＩに感染させたＭＴ−４細胞の細胞画分を調製した。簡単に言うと、細胞をペレット化し、低張性バッファー（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ６．９、１０ｍＭ ＫＣｌ、０．１ｍＭ ＰＭＳＦおよび１μｇ／ｍｌアプロチニン）中、氷上で１５分間インキュベートした。次いで、細胞をＤｏｕｎｃｅホモジェネーションによって崩壊させ、核を１，５００ｘｇで５分間ペレット化し、捨てた。上清画分を除去し、１８，０００ｘｇで４５分間遠心分離した。この第２の遠心分離由来の上清を保存し、本明細書においてこれを「サイトソル」画分という。細胞骨格および膜画分を含有する第２遠心分離由来のペレットを、１％ｎ−オクチル−β−Ｄ−グリコピラノシドを補足したＮＴＥＮＴバッファー（１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．２、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、０．１ｍＭ ＰＭＳＦおよび１μｇ／ｍｌアプロチニン）中に再懸濁し、１８，０００ｘｇで３０分間遠心分離した。この第３の遠心分離由来の上清を保存し、本明細書においてこれを「膜」画分といい、一方、対応するペレットは「細胞骨格」画分を示す。２ｘ１０６細胞／レーンの等価物由来の細胞画分を１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で分画し、ＭＡ、ＣＡ（どちらもＡＢＩ由来）およびアクチン（Ｓｉｇｍａ）に対するモノクローナル抗体を用いるウェスタンブロットアッセイによって分析した。
【０１８７】
抗−ＥＭＭＰＲＩＮ ｍＡｂは、ヒト初代ＰＢＭＣにおけるＨＩＶ−１株の複製を阻害した。
抗−ＣＤ１４７（すなわち、抗−ＥＭＭＰＲＩＮ）ｍＡｂ（ＵＭ−８Ｄ６）を用いて、初代ヒトＰＢＭＣにおけるＥＭＭＰＲＩＮ活性のメカニズムをさらに研究した（図７Ａ）。
ＰＨＡ−活性化ＰＢＭＣの三連培養にＴ細胞系統−適応性Ｘ４ ＨＩＶ−１ＬＡＶ株またはマクロファージ−栄養性Ｒ５ＨＩＶ−１ＡＤＡ株のいずれか（図７Ａ、左パネル）、またはＬＡＶまたはＡＤＡ株のいずれか由来の外被を有する偽型のルシフェラーゼ−発現性組換えＨＩＶ−１（図７Ａ、右パネル）を感染させた。所定量の抗−ＣＤ１４７ｍＡｂ（ＵＭ−８Ｄ６）（右パネルにおける実験に５０μｇ／ｍｌが使用された）またはイソ型に合致した対照ｍＡｂ（全対照試料において５０μｇ／ｍｌ）を感染の３０分前に加え、実験期間中存在した。ウイルス複製は、２１日目の培養上清中のＲＴ活性によって（図７Ａ、左パネル）、または感染後４日目のルシフェラーゼ活性によって（右パネル）評価された。結果は、対照（イソ型に合致した無関係のｍＡｂで処理された細胞；１００％とする）に相対的なＲＴのパーセンテージ（ＬＴＲ Ｒ／Ｕ５プライマー（配列番号６）および（配列番号７）、およびプローブ（配列番号８）を用いる）またはルシフェラーゼ活性として示される。
イソ型に合致した対照ｍＡｂではなく、抗−ＣＤ１４７ｍＡｂ（ＵＭ−８Ｄ６）が、初代ＰＢＭＣにおいてマクロファージ−栄養性（ＡＤＡ）およびＴ細胞系統−適応性（ＬＡＶ）ＨＩＶ−１株の複製を阻害した（図７Ａ、左パネル）。同様の結果が、ＡＤＡまたはＬＡＶ外被を有する偽型の組換えルシフェラーゼ−発現ウイルスを用いて観察された（図７Ａ、右パネル）。
【０１８８】
抗−ＣＤ１４７ｍＡｂ（ＵＭ−８Ｄ６）は、ヒトＰＢＭＣへのＨＩＶ付着を阻害しなかった。
ＨＩＶ−１複製の異なる初期工程（例えば、ウイルス付着、融合、脱外被など）に対する抗−ＣＤ１４７ｍＡｂ（ＵＭ−８Ｄ６）の効果を分析して、ＨＩＶ感染に対するその阻害活性のメカニズムを定義付けた（図７Ｂ）。
【０１８９】
ウイルス付着工程は、ウイルス粒子を細胞と一緒に４℃でインキュベートし、次いで、細胞に結合したウイルス性ｐ２４の量を測定することによって分析された。詳細には、上記の該実施例の「方法」に記載のように、三連ＰＢＭＣ培養を３７℃で抗−ＣＤ１４７ｍＡｂ（ＵＭ−８Ｄ６；５０μｇ／ｍｌ）、抗−ＣＤ４（５μｇ／ｍｌ）ｍＡｂまたはヘパリナーゼＩＩＩ（３ｘ１０−４ＩＵ／ｍｌ）で前処理し、次いで洗浄し、ＨＩＶ−１ＬＡＶ（１０ｎｇ／ｍｌのｐ２４）と一緒に４℃で１時間インキュベートした。細胞に結合したｐ２４の量をＥＬＩＳＡによってアッセイし、結果を異なるドナー由来の細胞を用いて行った三つの実験のうち１つの代表的実験について示す。
【０１９０】
有意には、抗−ＣＤ１４７ｍＡｂ（ＵＭ−８Ｄ６）は、ヒトＰＢＭＣへのＨＩＶ−１ＬＡＶ付着を阻害しなかったが、抗−ＣＤ４ｍＡｂはそれを有意に減少した（図７Ｂ）。予測どおり、ＨＩＶ−１ＬＡＶ付着はまた、ＨＩＶ−１付着におけるヘパランの仮定された役割と一致して（Ｓａｐｈｉｒｅら、ＥＭＢＯ Ｊ． １８：６７７１−６７８５， １９９９（宿主ＣｙＰＡは、ヘパランを介して標的細胞へのＨＩＶ−１付着の媒介となる）；Ｍｏｎｄｏｒら、Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７２： ３６２３−３６３４， １９９８（ＨｅＬａ ＣＤ４＋細胞へのＨＩＶ−１付着はＣＤ４−独立性のｇｐ１２０依存性であり、細胞表面ヘパランを必要とする）、ヘパリナーゼＩＩＩでの細胞の前処理によって減少した。したがって、これらのデータは、抗−ＣＤ１４７ｍＡｂ（ＵＭ−８Ｄ６）がウイルス付着と組み込みとの間のどこかの工程でＨＩＶ感染を阻害したことを示す。
【０１９１】
抗−ＣＤ１４７ｍＡｂ（ＵＭ−８Ｄ６）は、ＰＢＭＣとＨＩＶ−１ ＡＤＡおよびＬＡＶ外被を発現しているＨｅＬａ細胞との間のＨＩＶ Ｅｎｖ−媒介性融合を阻害せず、また、ウイルス性ｐ２４の細胞インタナリゼーションも減少しなかった。
ＰＢＭＣとＨＩＶ−１ ＡＤＡおよびＬＡＶ外被を発現しているＨｅＬａ細胞との間のＨＩＶ−１ Ｅｎｖ−媒介性融合に対する抗−ＣＤ１４７ｍＡｂ（ＵＭ−８Ｄ６）の効果を分析して、ＥＭＭＰＲＩＮが複製のウイルス細胞融合工程に関与するかどうかを決定した（図７Ｃ、左パネル）。さらに、ＨＩＶ−１感染に関連して、融合に対する抗−ＣＤ１４７ｍＡｂ（ＵＭ−８Ｄ６）の効果を、トリプシン処理後のＨＩＶ−１ＬＡＶ−接種したＰＢＭＣに結合したままであるウイルス性ｐ２４の量（すなわち、細胞内に取り込まれたｐ２４に相当する）を測定することによって分析した（図７Ｃ、右パネル）。
【０１９２】
細胞−細胞融合
ＰＢＭＣとＨＩＶ−１ Ｅｎｖ（Ｘ４ ＬＡＶまたはＲ５ Ｂａ−Ｌ）を発現しているＨｅＬａ細胞との間の融合を抗−ＣＤ１４７（ＵＭ−８Ｄ６；５０μｇ／ｍｌ）または抗−ＣＤ４（５μｇ／ｍｌ）ｍＡｂの存在下、該実施例の「方法」において本明細書に上記されるようにβ−Ｇａｌ発現によって評価した。Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ発現性ＰＢＭＣとＴ７プロモーターに連結されたイー・コリＬａｃＺ遺伝子のみを発現しているＨｅＬａ細胞との共培養において検出されたバックグラウンド活性を全ての値から引いた。抗−ＣＤ１４７ｍＡｂ（ＵＭ−８Ｄ６）は、ＨＩＶ−１ ｅｎｖ−媒介性細胞−細胞融合を阻害しなかったが、予想通り、抗−ＣＤ４ｍＡｂは有意に細胞融合を減少させた（図７Ｃ、左パネル）。
【０１９３】
ウイルス−細胞融合
ウイルス−細胞融合の分析のために、上記の該実施例の「方法」に記載されるようにＰＢＭＣをＨＩＶ−１ＬＡＶと一緒にインキュベートした。抗−ＣＤ１４７ｍＡｂ（ＵＭ−８Ｄ６）は、ウイルス性ｐ２４インターナリゼーションを阻害しなかったが、予想通り、抗−ＣＤ４ｍＡｂは細胞内に取り込まれたｐ２４の量をバックグラウンドレベルまで減少させた（図７Ｃ、右パネル）。したがって、抗−ＣＤ１４７抗体は、ウイルス−細胞融合の結果としてトリプシン消化に対して耐性になったウイルス性蛋白質の量を減少しなかった。
したがって、図７Ｃ（両方のパネル）の合わせた結果は、ＨＩＶ−１感染に対する抗−ＣＤ１４７ｍＡｂの阻害効果が融合後メカニズムによって媒介されることを示す。
【０１９４】
抗ＣＤ１４７ｍＡｂ（ＵＭ−８Ｄ６）は初期および後期の両方のＨＩＶ−１逆転写の量を減少させた。
半定量的なＰＣＲ法を用いて、組み込み前の複合体（ＰＩＣ）の進行性成熟を代表する融合後工程であるＨＩＶ−１特異的逆転写の量を分析した（図７Ｄ）。
ＰＨＡ−活性化ヒトＰＢＭＣをＨＩＶ−１感染の２時間前に、抗−ＣＤ１４７ｍＡｂ（ＵＭ−８Ｄ６；５０μｇ／ｍｌ）または抗−ＣＤ４ｍＡｂ（２μｇ／ｍｌ）、または対応するイソ型に合致した対照ｍＡｂ（５０μｇ／ｍｌ）のいずれかで処理した。次いで、「方法」に上記されるようなＨＩＶ−１ＬＡＶでのＰＢＭＣの感染の２時間後に、プライマーＬＴＲ Ｒ／Ｕ５（配列番号６）および（配列番号７）、および「ストロング−ストップ（ｓｔｒｏｎｇ−ｓｔｏｐ）」初期逆転写産物意特異的なプローブ（配列番号８）を用いて、ＨＩＶ−１逆転写の分析を行った（Ｓｃｈｍｉｄｔｍａｙｅｒｏｖａら、Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７２： ４６３３−４６４２， １９９８）。ＰＣＲ結果をダイレクトイメージャー（Ｐａｃｋａｒｄ）上で定量化し、抗体非処理対照（１００％とする）に相対的な処理試料中のカウントのパーセンテージとして示す。細胞あたり１個のＨＩＶ−１ゲノムを含有する８Ｅ５／ＬＡＩ細胞の希釈（Ｆｏｌｋｓら、Ｊ． Ｅｘｐ．Ｍｅｄ． １６４： ２８０−２９０， １９８６）をＰＣＲ標準として用いた（図７Ｄ、左下パネル）。データは、２連で行った３つの独立した実験を示す。
【０１９５】
抗−ＣＤ１４７ｍＡｂ（ＵＭ−８Ｄ６）は、「ストロング−ストップ」逆転写産物の量を約２倍減少させた（図７Ｄ、左上および右側のパネル）。この短いＤＮＡフラグメントは、ウイルス侵入後すぐに生産され、その量は逆転写の開始を反映する（Ｚａｃｋら、Ｃｅｌｌ ６１： ２１３−２２２， １９９０）。予想通り、抗−ＣＤ４ｍＡｂは、ウイルス付着およびウイルス−細胞融合に対する該ｍＡｂの本明細書に記載した効果に一致して（図７Ｂおよび７Ｃ）、より一層ＬＴＲ Ｒ／Ｕ５−増幅フラグメントの量を減少させた（図７Ｄ、左上および右側のパネル）。抗−ＣＤ１４７ｍＡｂ（ＵＭ−８Ｄ６）の同様の効果が、後期逆転写産物を各々、増幅および検出するＬＴＲ／ｇａｇプライマー（配列番号９）および（配列番号１０）ならびにプローブ（配列番号１１）を用いて検出されたＰＣＲフラグメントの量において観察された（Ｓｃｈｍｉｄｔｍａｙｅｒｏｖａら、Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７２： ４６３３−４６４２， １９９８）。
【０１９６】
したがって、該具体例の結果は、図７Ａ、７Ｂおよび７Ｃにおいて本明細書中に提示されるデータと共に、抗−ＣＤ１４７ｍＡｂ（ＵＭ−８Ｄ６）がウイルス−細胞融合と逆転写の開始との間の工程を干渉したことを示す。かかる活性の１つの有望なメカニズムは、いずれかの特定の理論に限定されるものではなく、組み込み前の複合体（ＰＩＣ）形成の阻害であり、それにより、ＣＤ１４７はＨＩＶ−１脱外被において役割を果たす。
【０１９７】
抗ＣＤ１４７ｍＡｂ（ＵＭ−８Ｄ６）は、新たな感染後初期にＨＩＶ−１マトリックス（ＭＡ）およびキャプシド（ＣＡ）蛋白質の正常な移動を阻害し、それは、ＥＭＭＰＲＩＮがＨＩＶ−１脱外被に関与したことを示す。
ウイルス「脱外被」はＨＩＶ感染後すぐに起こり、ウイルスマトリックス蛋白質（ＭＡ）および核蛋白質複合体からのウイルス性キャプシド蛋白質（ＣＡ）の解離を含む（Ｂｕｋｒｉｎｓｋｙら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９０： ６１２５−６１２９， １９９３； Ｍｉｌｌｅｒら、Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７１： ５３８２−５３９０， １９９７）。詳細には、ＭＡは膜から細胞骨格へ移動するが、ＣＡはサイトソル中に保持される（Ｂｏｕｋｒｉｎｓｋａｙａら、Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １８８： ２１１３−２１２５， １９９８）。蛋白質再配置の該パターンは、ＨＩＶ−１逆転写複合体と細胞骨格の結合に相関し、ＰＩＣ形成の初期工程における細胞骨格の関与を示唆する（Ｂｕｋｒｉｎｓｋａｙａら、ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １８８： ２１１３−２１２５， １９９８）。
【０１９８】
新たな感染後初期のＨＩＶ−１マトリックス（ＭＡ）およびキャプシド（ＣＡ）蛋白質の細胞内分布は、ＥＭＭＰＲＩＮが感染の間のＨＩＶ−１「脱外被」工程に関与したかどうかを決定するために研究された（図７Ｅ）。
ＭＴ−４細胞に４℃にて、抗−ＣＤ１４７ｍＡｂ（ＵＭ−８Ｄ６；５０μｇ／ｍｌ）またはイソ型に合致した対照ｍＡｂの存在下でＨＩＶ−１ＬＡＶを接種した。アリコート（１ｘ１０６細胞）を蛋白質分析のために３０分後に回収し（すなわち、０時間ｐ．ｉ．時点試料）（図７Ｅ、上方パネル）、一方、接種した培養物を３７℃に移し、１．５時間インキュベートした（図７Ｅ、下方パネル）。細胞分画を該実施例の「方法」に上記したように行い、サイトソル（Ｃ）、膜（Ｍ）および細胞骨格（ＣＳ）画分中の蛋白質をアクチン、ＣＡおよびＭＡに特異的なモノクローナル抗体を用いるウェスタンブロッティングおよびＥＣＬによって分析した。
【０１９９】
得られたウイルスＭＡおよびＣＡ蛋白質の細胞内分布は、抗−ＣＤ１４７ｍＡｂの不在下、本明細書に上記した先行文献におけるものと一致した。すなわち、感染の１．５時間後、ウイルスＭＡおよびＣＡ蛋白質は、各々、膜（Ｍ）から細胞骨格（ＣＳ）およびサイトソル画分中へ特徴的な移動を行った（図７Ｅ、イソ型パネル、各々、レーン「ＣＳ」および「Ｃ」）。
しかしながら、かかる蛋白質移動は抗−ＣＤ１４７ｍＡｂ（ＵＭ−８Ｄ６）で処理したＭＴ−４細胞において観察されず、ここに、ＭＡおよびＣＡの両方は細胞膜画分と結合したままであった（図７Ｅ、α−ＣＤ１４７パネル、レーン「ＭＴ」）。したがって、抗−ＣＤ１４７ｍＡｂ（ＵＭ−８Ｄ６）の存在下、ウイルスは細胞膜に保持され、それは、ＥＭＭＰＲＩＮが感染の間のＨＩＶ−１脱外被工程の調節に関与することを示す。
【０２００】
実施例７
抗−ＣＤ１４７ｍＡｂの阻害効果に対するウイルス耐性はＣｓＡに対する耐性と相関した。
該実施例は、抗−ＣＤ１４７ｍＡｂの阻害効果に対するＨＩＶ耐性がＣｓＡに対する耐性に相関したことを示し、該抗体がウイルス感染におけるＣｙＰＡ−依存性工程を干渉したことを示すイン・ビトロ実験およびアッセイを提供する。詳細には、ヒトＰＢＭＣにおけるＡ２２４Ｅ（ＣｓＡ−耐性、ＣＡ変異ＨＩＶ株）の複製は抗−ＣＤ１４７ｍＡｂ（ＵＭ−８Ｄ６）での処理に対して耐性であった（図８）。
【０２０１】
方法　新たなＨＩＶ感染のための共培養プロトコール
２９３Ｔ細胞を同系野生型またはＡ２２４Ｅ ＣＡ変異体ウイルスの分子クローンでトランスフェクトし、ＣｓＡ（１μＭ）の存在下または不在下で３日間培養した。トランスフェクション後３日目に細胞を洗浄し、ＣｓＡを用いずにさらに４日間培養するか、または抗−ＣＤ１４７ｍＡｂ（ＵＭ−８Ｄ６；１００μｇ／ｍｌ）の存在下または不在下でＣｓＡを添加せずに（両方のウイルスの複製に影響を及ぼしたＴ細胞に対する該薬剤のウイルスに無関係な免疫抑制効果を回避するために）、ＰＨＡ−活性化ＣＤ８＋Ｔ細胞−欠乏ＰＢＭＣ（１個の２９３Ｔ細胞につき２０個の血液単核細胞）との共培養に用いた。共培養の４日後、ウイルス複製を、実施例６の「方法」に上記したように、ＬＴＲ Ｕ／５プライマー（配列番号６）および（配列番号７）ならびにプローブ（配列番号８）を用いて培養上清中の逆転写酵素（ＲＴ）活性によってアッセイした。
【０２０２】
ヒトＰＢＭＣ中におけるＡ２２４Ｅ（ＣｓＡ−耐性、ＣＡ変異ＨＩＶ株）の複製は、抗−ＣＤ１４７ｍＡｂでの処理に対して耐性であった。
ＣｓＡはＣｙＰＡと相互作用し、それにより、イン・ビトロでＧａｇ（ＣＡ抗原部分）−ＣｙＰＡ相互作用を干渉し、シクロフィリンのビリオン中への組み込みを阻害し、細胞培養においてＨＩＶ−１の複製を阻害することが示された。上記した本明細書中の「背景」におけるまとめを参照のこと。これらのデータは、ＧａｇとＣｙＰＡの相互作用が感染性ＨＩＶ−１ビリオンの形成に必要であるというモデルと一致する（Ｓｈｅｒｒｙら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ９５： １７５８−１７６３， １９９８）。したがって、ＣｓＡ−耐性ＨＩＶ株（例えば、ＣｓＡ耐性、ＣｙＰＡ−依存特性を与えるＣＡ変異を有する株）による感染は、ＣｙＰＡに依存しないか、またはＣｙＰＡ受容体アンタゴニストによって特異に影響を及ぼされていることが無理なく予測され得る。
【０２０３】
したがって、抗−ＣＤ１４７ｍＡｂの阻害効果がＣｓＡに対する耐性と相関するかどうかを決定するために、ＣｓＡ耐性を与えるＣＡ変異を有するＡ２２４Ｅウイルス株による感染が分析された。かかる相関は、ＣＤ１４７抗体がウイルス感染におけるＣｙＰＡ−依存工程を干渉する付加的な証拠であろう。
該実施例の「方法」において本明細書に上記したように、２９３Ｔ細胞をシクロスポリンＡ（１μＭ）の不在下（”Ｃ”）または存在下（”ＣｓＡ”）、ＨＩＶ−１ＮＬ４−３（ＷＴ）（図８、左パネル）または変異体Ａ２２４Ｅ（図８、右パネル）ウイルスの分子クローンでトランスフェクトした。ウイルス生産性トランスフェクト細胞を洗浄し、ＣＤ８＋Ｔ細胞欠損ＰＢＭＣおよび抗−ＣＤ１４７ｍＡｂ（ＵＭ−８Ｄ６；１００μｇ／ｍｌ）を添加して（”２９３Ｔ＋ＣＤ４＋Ｔ細胞”）または添加せずに（”２９３Ｔ”）さらに４日間、４連で培養した。ウイルス複製は、「方法」において上記したように、培養上清中のＲＴ活性を測定することによってアッセイした。結果を平均±ＳＥとして示す。
【０２０４】
該系において生産されたウイルスの量は、トランスフェクトされた２９３Ｔ細胞から生産されたウイルスの蓄積よりもむしろＴ細胞の新規な感染の効力を反映する。抗−ＣＤ１４７ｍＡｂ（ＵＭ−８Ｄ６）は、ＣｓＡ−耐性Ａ２２４Ｅウイルスの複製を阻害しなかったが、野生型ウイルスの複製は有意に減少された。ＣｓＡ−処理した２９３Ｔ細胞から収集されたＡ２２４Ｅウイルスは、そのＣｓＡ−耐性表現型と一致して、非処理細胞から収集されたウイルスと同レベルまで複製したが（Ｂｒａａｔｅｎら、Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７０： ５１７０−５１７６， １９９６）、ＣｓＡの存在下で収集された野生型ウイルスは有意に減弱された。
したがって、抗−ＣＤ１４７ｍＡｂ（ＵＭ−８Ｄ６）の阻害効果に対するウイルス耐性はＣｓＡに対する耐性と相関した。これらのデータは、該抗体がウイルス感染におけるＣｙＰＡ−依存工程を干渉する付加的な証拠を提供する。
【０２０５】
実施例８
ＥＭＭＰＲＩＮの膜貫通領域由来のペプチドは、ＨＩＶ−１コアを有する偽型レトロウイルスによるＣＨＯ−ＥＭＭ細胞およびヒトＰＢＭＣの感染を実質的に阻害した。
該実施例は、ＥＭＭＰＲＩＮ蛋白質の膜貫通領域由来のペプチドがＨＩＶ−１感染を阻害することを示すイン・ビトロ実験およびアッセイを提供する。詳細には、ＥＭＭＰＲＩＮ膜貫通ドメインのアミノ末端領域（配列番号２参照）に対応する８−アミノ酸ポリペプチド（配列番号３）が、各々、ＣＨＯ−ＥＭＭ細胞（図９）およびヒトＰＢＭＣのＥｎｖＭｕＬＶ−およびＥｎｖＡＤＡ−偽型ｌｕｃ−ＨＩＶ−１ウイルスによる感染を阻害した。
【０２０６】
方法
ＣＨＯ細胞系統、ＥｎｖＭｕＬＶ−偽型ｌｕｃ−ＨＩＶ−１変種でのＣＨＯ細胞の感染および１サイクルのルシフェラーゼアッセイは、実施例５の「方法」に上記したとおりであった。ＰＨＡ−活性化ヒトＰＢＭＣの調製およびＥｎｖＡＤＡ−偽型ｌｕｃ−ＨＩＶ−１での感染は、実施例５および６の「方法」に上記したとおりであった。ＰＢＭＣルシフェラーゼアッセイは、ＣＨＯ細胞系統のために記載したとおりに行った。
【０２０７】
ペプチド
ペプチド１（配列番号３）、２（配列番号４）およびスクランブルペプチド１（配列番号５）は、Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ （Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ， Ａｌａｂａｍａ）からカスタムポリペプチドとして得た。
【０２０８】
ＣＤ１４７の膜貫通領域由来のペプチドは、ＣＨＯ−ＥＭＭ細胞のＭｕＬＶ−偽型ＨＩＶ−１感染を阻害する。
ＥＭＭＰＲＩＮ膜貫通ドメインは、ＥＭＭＰＲＩＮ蛋白質配列（配列番号２）のアミノ酸２０４−２２８に対応する。本発明の新規なＥＭＭＰＲＩＮ／ＣｙＰ相互作用を考慮して、ＥＭＭＰＲＩＮ膜貫通領域内のサブ領域に対応するペプチドを調製して、それらがＨＩＶ−１感染を阻害することができるかを決定した。ペプチド１（ＬＡＡＬＷＰＦＬ）は、ＥＭＭＰＲＩＮのアミノ酸２０６−２１３に対応する８アミノ酸配列（配列番号３）である。ペプチド２（ＧＩＶＡＥＶＬＶＬ）は、ＥＭＭＰＲＩＮのアミノ酸２１４−２２２に対応する９アミノ酸ポリペプチド配列（配列番号４）である。「スクランブルペプチド１」（ＦＡＷＰＬＬＬＡ）、ランダム化した配列対照は、ペプチド１のアミノ酸残基のランダム化配列にしたがって作成された。
【０２０９】
ＣＨＯおよびＣＨＯ−ＥＭＭ（”ＣＨＯ．ＣＤ１４７”）細胞を上記のように、所定濃度のペプチド１、２またはスクランブルペプチド１の存在下、またはペプチドの不在下、ＭｕＬＶ外被を有する偽型の組換えルシフェラーゼ発現性ＨＩＶ−１で感染させた。ルシフェラーゼ発現は、感染の４日後にルミノメーターを用いて測定された。
【０２１０】
図９は、ＣＨＯ−ＥＭＭ細胞のＭｕＬＶ−偽型ＨＩＶ−１感染が、濃度に依存してペプチド１（配列番号３）によって実質的および特異的に阻害されたことを示す。ＨＩＶ−１感染は本質的に、１ｎＭのペプチド１の存在下で阻害された。ペプチド２もスクランブルペプチド１も、該アッセイにおいてＨＩＶ−１感染を阻害しなかった。
【０２１１】
ＣＤ１４７の膜貫通領域由来のペプチドは、ヒトＰＢＭＣのＨＩＶ−１感染を阻害する。
ＰＨＡ−活性化ヒトＰＢＭＣ培養体を所定濃度のペプチド１、２またはスクランブルペプチド１の存在下、ＥｎｖＡＤＡ−偽型ｌｕｃ−ＨＩＶ−１で感染させた。ＣＨＯ−ＥＭＭ細胞のＥｎｖＭｕＬＶ−偽型ＨＩＶ−１感染について上記したように、ＰＢＭＣのＥｎｖＡＤＡ−偽型ｌｕｃ−ＨＩＶ−１感染は本質的に１ｎＭペプチド１の存在下で阻害された。ペプチド２もスクランブルペプチド１も、該アッセイにおいてＥｎｖＡＤＡ−偽型ｌｕｃ−ＨＩＶ−１感染を阻害しなかった。
【０２１２】
ＥＭＭＰＲＩＮ膜貫通ポリペプチドはＣｙＰ／ＥＭＭＰＲＩＮ相互作用を拮抗する。
ＣＨＯ−ＥＭＭ細胞およびＰＢＭＣの各々、ＥｎｖＭｕＬＶ−およびＥｎｖＡＤＡ−偽型ｌｕｃ−ＨＩＶ−１による感染の阻害におけるペプチド１（配列番号３）の上記で同定された活性は、ＣｙＰＡ−被覆セファロースビーズによるＥＭＭＰＲＩＮの保持に関する上記実施例１に示したデータの解釈に関連する。実施例１において、ＥＭＭＰＲＩＮとＣｙＰＡとの間の特異的イン・ビトロ結合相互作用は、全長ＥＭＭＰＲＩＮ（ｅｃｄ、ｔｍおよびｉｃｄドメインを含有している）蛋白質でのみ観察され、ｔｍおよびｉｃｄドメインを欠くＥＭＭＰＲＩＮでは観察されなかった。実施例１で述べたように、該結果は、セファロースビーズ上のＣｙＰＡに対するｅｃｄ−ＣｙＰ結合部位の適当な提示のためにＥＭＭＰＲＩＮ膜貫通および／または細胞内ドメインが必要であることを反映するか、またはＣｙＰＡが直接ｔｍドメインと、ｅｃｄまたはｔｍドメインと、または両方のドメインと相互作用するメカニズムと一致した。
【０２１３】
いずれかの特定のメカニズムに拘束されることなく、ＥＭＭＰＲＩＮ膜貫通ペプチド１によるＨＩＶ−１感染の上記で同定された阻害は、ＣｙＰが直接、ＥＭＭＰＲＩＮ膜貫通ドメインの領域と相互作用し、ここに、該相互作用がＣＨＯ−ＥＭＭ細胞およびＰＢＭＣの両方においてペプチド１（配列番号３）によって有効に拮抗されたＣｙＰ／ＥＭＭＰＲＩＮ相互作用のためのメカニズムと一致する。
【０２１４】
要約：
ＣｙＰ／ＥＭＭＰＲＩＮ結合相互作用を修飾する薬剤は、ＨＩＶ−１感染、ＡＩＤＳおよびＡＩＤＳ−関連障害、ＲＡおよび癌のような局所的または全身性のＣｙＰ放出、合成または結合によって特徴付けられる症状の治療または予防に有用である。
【０２１５】
慢性関節リウマチ（ＲＡ）
本発明の実施例および具体例は、ＣｙＰが以前に知られた幅広く分布した細胞表面蛋白質、ＥＭＭＰＲＩＮと相互作用し、特異的に該蛋白質に結合することを示す。有意には、ＥＭＭＰＲＩＮは本発明の以前にはリガンドが知られておらず、単に、細胞−細胞相互作用の媒介となることのできる（すなわち、細胞−表面「リガンド」として作用することのできる）潜在的な接着分子であると考えられていた。
【０２１６】
さらに、本発明の実施例および具体例は、ＣｙＰが、その表面にＥＭＭＰＲＩＮを構造発現するＣＨＯ−ＥＭＭ細胞においてシグナル変換を誘導することを明らかにする。該応答は、抗−ＥＭＭＰＲＩＮ特異的抗体の添加によって阻害されたので、特異的であることが示された。さらに、チロシンキナーゼ阻害剤ゲニステインは、ＣＨＯ−ＥＭＭ細胞においてＣｙＰにより誘導されるＣａ２＋動員を完全に排除し、ＥＭＭＰＲＩＮ−媒介性Ｃａ２＋動員が既知の細胞内シグナル変換経路を介して起こることを示した。
【０２１７】
さらに、培養したヒト初代肺繊維芽細胞のＣｙＰでの処理は、プロＭＭＰ−１の放出を誘導し、プロＭＭＰ−３の生産を増強した。これら２つのマトリックスメタロプロテイナーゼは、ＲＡ患者の滑液および組織中でアップレギュレートされることが知られている（ＭｃＣａｃｈｒｅｎ， Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ． ３４： １０８５−１０９３， １９９１； Ｋｅｙｓｚｅｒら、Ｊ． Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ． ２６： ２５１−２５８， １９９１； Ｋｅｙｓｚｅら、Ｚ． Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ ５７： ３９２−３９８， １９９８； Ｍａｔｓｕｙａｍａ， Ｐｅｄｉａｔｒ． Ｉｎｔ． ４１： ２３９−２４５， １９９９）。
【０２１８】
本発明の実施例および具体例は、ＣｙＰＡが好中球に対し化学走性であり（Ｓｈｅｒｒｙら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８９： ３５１１−３５１５， １９９２； Ｘｕら、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６７： １１９６８−１１９７１， １９９２； Ｌｅｉｖａ ＆ Ｌｙｔｔｌｅ， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ． １８６： １１７８−１１８３， １９９２）、ＣｙＰＡが活性なＲＡ疾患患者の関節において顕著にアップレギュレートされ、ＲＡ疾患の重篤度と相関する（Ｂｉｌｌｉｃｈら、Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １８５：９７５−９８０， １９９７）という本発明者らおよびその他による以前の証明を考慮して、ＣｙＰが、ＲＡ関節に存在する好中球および繊維芽細胞上に発現されているＥＭＭＰＲＩＮへの結合および該ＥＭＭＰＲＩＮを介するシグナリングを介して、慢性関節リウマチに関連する病理のいくつかの媒介となることを示す。
【０２１９】
該相互作用を阻害することは、炎症を起こした関節中への好中球の浸潤を抑制し、滑膜中へ放出されるプロＭＭＰ−１およびプロＭＭＰ−３の量を減少させ、それにより、疾患関連病理を減少させ、最終的に患者に利益を提供するであろう。
【０２２０】
ＨＩＶ−１感染および後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）
本発明の実施例および具体例はまた、付加的および新規な関係分子としてＥＭＭＰＲＩＮを提供し、かくして、ＨＩＶ−１感染の間にウイルス性蛋白質および細胞性蛋白質間の複雑な相互作用における新規な治療的介入標的を提供する。詳細には、抗−ＣＤ１４７（すなわち、抗−ＥＭＭＰＲＩＮ）ｍＡｂ（ＵＭ−８Ｄ６）は、ウイルス−細胞融合後であって逆転写を支持する機能的組み込み前複合体（ＰＩＣ）の形成前であるＨＩＶ−１複製における工程を阻害した。
【０２２１】
特定の理論に限定されることなく、本発明に一致した最も有望なメカニズムは、ＥＭＭＰＲＩＮがウイルスの脱外被および逆転写を起こすことのできる細胞レベル以下のコンパートメント（すなわち、細胞骨格）中への移動を容易にすることである。有意には、抗−ＣＤ１４７（ＵＭ−８Ｄ６）は、ＣｙＰＡ−独立性感染を展示するＣｓＡ−耐性ＨＩＶ−１変異体（ＣＡ蛋白質変異を有するＡ２２４Ｅ）の複製を阻害しなかったが、ウイルス感染におけるＣｙＰＡ−依存性工程を干渉する。
よって、ＨＩＶウイルスは、その目的に全ＣｙＰＡ／ＥＭＭＰＲＩＮ相互作用経路を徴用する。
【０２２２】
癌および結合組織疾患
本発明はまた、癌および多くの結合組織疾患の治療法を提供する。かかる有用性は、（１）ＥＭＭＰＲＩＮ−発現性腫瘍細胞がそれと共培養された繊維芽細胞においてＭＭＰｓの発現をアップレギュレートすることを示されたという事実（Ｂｉｓｗａｓら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５５： ４３４−４３９， １９９５）によって、（２）本明細書中に開示されたような、ヒト繊維芽細胞におけるＣｙＰにより活性化および／または増強されるＭＭＰ生産によって、および（３）ＭＭＰｓの脱調節された作用が、例えば、関節炎、歯周炎、組織潰瘍を包含する多くの結合組織疾患ならびに癌細胞侵入および転移において細胞外マトリックスの病理学上の崩壊に寄与する（Ｋａｈａｒｉら、Ｅｘｐ． Ｄｅｒｍａｔｏｌ． ６： １９９−２１３， １９９７； Ｋｅｙｓｚｅｒら、Ｊ． Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ． ２６： ２５１−２５８， １９９９； Ｂｅｎｂｏｗら、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７４：２５３７１−２５３７８， １９９９； Ｋｅｙｓｚｅｒら、Ｚ． Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ ５７： ３９２−３９８， １９９８）。
【図面の簡単な説明】
【図１Ａ】図１Ａは、本発明によって単離されたｃＤＮＡクローン（配列番号１）によってコードされるヒトＥＭＭＰＲＩＮ蛋白質の概略図を示す。
【図１Ｂ】図１Ｂは、［３５Ｓ］−標識したＥＭＭＰＲＩＮがＣｙＰＡセファロースアフィニティー樹脂によって特異的に保持されたことを示す。
【図２】図２は、空のベクターで安定にトランスフェクトされたＣＨＯ細胞（ＣＨＯ）またはＥＭＭＰＲＩＮ発現ＣＨＯ細胞系統（ＣＨＯ−ＥＭＭ）におけるＥＭＭＰＲＩＮ発現のＦＡＣＳ分析を示す。
【図３】図３は、ＣＨＯ（ＥＭＭＰＲＩＮ発現なし）またはＣＨＯ−ＥＭＭ細胞（安定な構造的ＥＭＭＰＲＩＮ発現）におけるＣａ２＋動員が外来的に加えられたＣｙＰＡ（１０μｇ／ｍｌ）によって誘導されたことを示す（左側のパネル）。
【図４】図４は、ゲニステイン（チロシンキナーゼ阻害剤）がＣＨＯ−ＥＭＭ細胞においてＣｙＰＡにより誘導されるＥＭＭＰＲＩＮ媒介性Ｃａ２＋動員を完全に排除したことを示す。
【図５】図５は、ＷＩ−３８ヒト初代肺繊維芽細胞におけるマトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）発現に対するＣｙＰＡ処理の影響のウェスタンイムノブロット分析を示す。
【図６】図６は、ルシフェラーゼ（図６Ａおよび図６Ｂ）およびＨＩＶ−１逆転写酵素活性（図６Ｃ）の分析を示す。
【図７Ａ】図７Ａは、抗−ＣＤ１４７ｍＡｂがヒト初代ＰＢＭＣにおけるＨＩＶ−１複製を阻害したことを示す。
【図７Ｂ】図７Ｂは、抗−ＣＤ１４７ｍＡｂがヒトＰＢＭＣへのＨＩＶ付着を阻害しなかったことを示す。
【図７Ｃ】図７Ｃは、抗−ＣＤ１４７ｍＡｂが、ＰＢＭＣとＨＩＶ−１ ＡＤＡおよびＬＡＶ外被を発現しているＨｅＬａ細胞との間のＨＩＶ Ｅｎｖ媒介性融合を阻害せず、また、ウイルス性ｐ２４の細胞インターナリゼーションを減少させなかったことを示す。
【図７Ｄ】図７Ｄは、抗−ＣＤ１４７ｍＡｂがＨＩＶ−１逆転写量を減少させたことを示す。
【図７Ｅ】図７Ｅは、ＨＩＶ−１蛋白質の細胞レベル以下の分布に対する抗−ＣＤ１４７ｍＡｂの影響を示す。
【図８】図８は、ＣｓＡ耐性ＨＩＶウイルス株の複製が抗−ＣＤ１４７ｍＡｂによって阻害されなかったことを示す。
【図９】図９は、ＥＭＭＰＲＩＮ膜貫通領域のアミノ末端由来の８アミノ酸ポリペプチド（配列番号３）がＥｎｖＭｕＬＶ偽型ルシフェラーゼ発現性ＨＩＶ−１によるＣＨＯ−ＥＭＭ細胞の感染を阻害したことを示す。左側のパネルは、ＣＤ１４７の概略構造（”ｓｐ”＝シグナルペプチド、”ｅ”＝細胞外ドメイン、”ｔ”＝膜貫通ドメインおよび”ｃ”＝細胞質ドメイン）およびその膜貫通ドメイン由来の２つのペプチド（”ペプチド１”および”ペプチド２”）を示す。右側のパネルは、所定濃度のペプチド１、２および”スクランブルペプチド１”の存在下、組換えＥｎｖＭｕＬＶ−偽型ルシフェラーゼ発現性ＨＩＶ−１で感染させたＣＨＯおよびＣＨＯ−ＥＭＭ細胞の感染後４日目のルシフェラーゼ発現データを示す。
【図１Ｂ】
2004505997.tif 000003
【図２】
2004505997.tif 000004
【図３】
2004505997.tif 000005
【図４】
2004505997.tif 000006
【図５】
2004505997.tif 000007
【図６】
2004505997.tif 000008
【図７Ａ】
2004505997.tif 000009
【図７Ｂ】
2004505997.tif 000010
【図７Ｃ】
2004505997.tif 000011
【図７Ｄ】
2004505997.tif 000012
【図７Ｅ】
2004505997.tif 000013
【図８】
2004505997.tif 000014
【図９】
2004505997.tif 000015
【国際公開パンフレット】
2004505997.tif 000016
2004505997.tif 000017
2004505997.tif 000018
2004505997.tif 000019
2004505997.tif 000020
2004505997.tif 000021
2004505997.tif 000022
2004505997.tif 000023
2004505997.tif 000024
2004505997.tif 000025
2004505997.tif 000026
2004505997.tif 000027
2004505997.tif 000028
2004505997.tif 000029
2004505997.tif 000030
2004505997.tif 000031
2004505997.tif 000032
2004505997.tif 000033
2004505997.tif 000034
2004505997.tif 000035
2004505997.tif 000036
2004505997.tif 000037
2004505997.tif 000038
2004505997.tif 000039
2004505997.tif 000040
2004505997.tif 000041
2004505997.tif 000042
2004505997.tif 000043
2004505997.tif 000044
2004505997.tif 000045
2004505997.tif 000046
2004505997.tif 000047
2004505997.tif 000048
2004505997.tif 000049
2004505997.tif 000050
2004505997.tif 000051
2004505997.tif 000052
2004505997.tif 000053
2004505997.tif 000054
2004505997.tif 000055
2004505997.tif 000056
2004505997.tif 000057
2004505997.tif 000058
2004505997.tif 000059
2004505997.tif 000060
2004505997.tif 000061
2004505997.tif 000062
2004505997.tif 000063
2004505997.tif 000064
2004505997.tif 000065
2004505997.tif 000066
2004505997.tif 000067
2004505997.tif 000068
2004505997.tif 000069
2004505997.tif 000070
2004505997.tif 000071
2004505997.tif 000072
2004505997.tif 000073
2004505997.tif 000074
2004505997.tif 000075
2004505997.tif 000076
2004505997.tif 000077
2004505997.tif 000078
2004505997.tif 000079
2004505997.tif 000080
2004505997.tif 000081
2004505997.tif 000082
2004505997.tif 000083
2004505997.tif 000084
2004505997.tif 000085
2004505997.tif 000086
2004505997.tif 000087
2004505997.tif 000088
2004505997.tif 000089
2004505997.tif 000090
2004505997.tif 000091
2004505997.tif 000092
2004505997.tif 000093
2004505997.tif 000094
2004505997.tif 000095
2004505997.tif 000096
2004505997.tif 000097
2004505997.tif 000098
2004505997.tif 000099
2004505997.tif 000100
2004505997.tif 000101
2004505997.tif 000102
2004505997.tif 000103
2004505997.tif 000104
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004505997.tif 000105
【国際調査報告】
2004505997.tif 000106
2004505997.tif 000107
2004505997.tif 000108
2004505997.tif 000109