(57)【要約】本発明は、ホエータンパク質とクリームを含むホモジェネート又はエマルジョンを形成し、ホエータンパク質とクリームを含むそのホモジェネート又はエマルジョンを取り込み、そしてそのホモジェネート又はエマルジョンを乳製品中へ取り込むことを含む、乳製品中へのホエータンパク質の取り込みを高めるための方法及び組成物を提供する。本発明は、ホエータンパク質／クリームのエマルジョン及び、それらのエマルジョンを取り込んだ乳製品をも提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）クリームと（ｉｉ）ホエータンパク質調製品の混合物を均質化工程にかけることを包む、乳製品添加物の製造方法。
【請求項２】
前記均質化工程が乳化を包む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ホエータンパク質調製品がホエータンパク質単離物とホエータンパク質濃縮物とから成る群から選ばれる、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ホエータンパク質調製品が加水分解されたホエータンパク質を包む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記ホエータンパク質調製品が約０．５％〜約２０％の加水分解度（ＤＨ）を示す、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記ホエータンパク質調製品が約１％〜約１０％の加水分解度（ＤＨ）を示す、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記ホエータンパク質調製品が約２％〜約８％の加水分解度（ＤＨ）を示す、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記加水分解されたホエータンパク質がホエータンパク質をｇｌｕ／ａｓｐ−特異的プロテアーゼと接触させることにより調製される、請求項４に記載の方法。
【請求項９】
前記均質化工程の前に、前記混合物をプロテアーゼと接触させる、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記均質化工程の前に、前記プロテアーゼを失活させることをさらに含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
請求項１に記載の方法を使用して製造された乳製品添加物。
【請求項１２】
前記添加物が少なくとも約２重量％のホエータンパク質：脂肪比を有する、請求項１１に記載の乳製品添加物。
【請求項１３】
前記添加物が少なくとも約４重量％のホエータンパク質：脂肪比を有する、請求項１２に記載の乳製品添加物。
【請求項１４】
前記添加物が少なくとも約８重量％のホエータンパク質：脂肪比を有する、請求項１３に記載の乳製品添加物。
【請求項１５】
前記添加物が少なくとも約１２重量％のホエータンパク質：脂肪比を有する、請求項１４に記載の乳製品添加物。
【請求項１６】
以下の：
（ｉ）（ａ）クリームと（ｂ）ホエータンパク質調製品を含む混合物を用意し；
（ｉｉ）上記混合物を均質化工程にかけ；そして
（ｉｉｉ）（ｉｉ）において製造された上記均質化された混合物を乳製品中に取り込む；
を包む、乳製品の製造方法。
【請求項１７】
前記均質化工程が乳化を包む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記ホエータンパク質調製品がホエータンパク質単離物とホエータンパク質濃縮物とから成る群から選ばれる、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
前記ホエータンパク質調製品が加水分解されたホエータンパク質を包む、請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
前記加水分解されたホエータンパク質が、ホエータンパク質をｇｌｕ／ａｓｐ−特異的プロテアーゼと接触させることにより調製される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
工程（ｉ）の混合物が、前記乳製品中の総脂肪量の約５％超を占める、請求項１６に記載の方法。
【請求項２２】
工程（ｉ）の混合物が、前記乳製品中、総脂肪量の約２０％超を占める、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
工程（ｉ）の混合物が、前記乳製品中、総脂肪量の約４０％超を占める、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
工程（ｉ）の混合物を、工程（ｉｉ）の前にプロテアーゼと接触させる、請求項１６に記載の方法。
【請求項２５】
前記プロテアーゼが、工程（ｉｉ）又は工程（ｉｉｉ）の前に失活される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２６】
工程（ｉ）の混合物がホスホリパーゼをさらに包む、請求項１６に記載の方法。
【請求項２７】
前記乳製品がチーズである、請求項１６に記載の方法。
【請求項２８】
前記チーズが熟成させた又は熟成されていないチーズから成る群から選ばれる、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記熟成したチーズがチェダーであり、そして前記熟成されていないチーズがモッツァレラ又はクリームチーズである、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記乳製品がヨーグルトである、請求項１６に記載の方法。
【請求項３１】
請求項１６に記載の方法によって製造された乳製品。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明はチーズその他の乳製品中へのホエータンパク質の取り込みを改善する方法に関する。
発明の背景
ホエーはチーズ製造における副生成物である。ホエータンパク質は乳中総タンパク質量の約２０％を占める。伝統的に、ホエーは使用されない廃棄物として処分されるか、又は、肥料若しくは動物飼料として使用される。しかしながら、最近、商業的に有用な製品にホエーを加工することに努力が払われている。本発明はチーズその他の乳製品中へのホエータンパク質の取り込みを高める方法に関する。
【０００２】
本発明の前には、チーズへのホエータンパク質の取り込み方法は、乳又はホエーの限外濾過又は熱変性による乳の濃縮に限られていた。しかしながら、これらの方法のいずれかを用いた、かなりの量のホエータンパク質のチーズへの取り込みは、チーズの物理特性に不利な影響を与える。例えば、モッツァレラのようなフレッシュチーズは、ホエータンパク質に因り伸縮性および溶融性の低下を示し（Ｂｕｌｌｅｔｉｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｄａｉｒｙ　Ｆｅｄｅｒａｔｉｏｎ　Ｎ　２４０／１９８９）、一方、例えば、チェダーのような熟成チーズは不充分な熟成を示す（Ｒ．Ｃ．　Ｌａｗｒｅｎｃｅ，　Ｂｕｌｌｅｔｉｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｄａｉｒｙ　Ｆｅｄｅｒａｔｉｏｎ　２４０：　１−１５，　１９８９）。
【０００３】
本発明はチーズその他の乳製品の補充物として有用な組成物を形成するための、クリームによるホエータンパク質の乳化に関する。
【０００４】
ホエータンパク質の界面活性特性は、植物油ベースのエマルジョンにおいて乳化剤として利用され得る（Ｈｕａｎｇ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｊ．　Ａｇｒｉｃ．　Ｆｏｏｄ　Ｃｈｅｍ．　４４：３４３７，　１９９６；　Ａｇｂｏｏｌａ，　ｅｔ　ａｌ；　Ｊ，Ａｇｒｉｃ．　Ｆｏｏｄ　Ｃｈｅｍ．；　４６：８４，１９９８；Ｓｉｎｇｈ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｊ．　Ｄａｉｒｙ　Ｓｃｉ．　８１：９１８，　１９９８）。（乳化剤スイートバターミルク、大豆レシチン、脂肪代替品、及び天然カゼインミセルとして使用する）クリームのホモジェネート又はエマルジョンは低脂肪チーズの製造において使用されてきた（Ｐｏｄｕｖａｌ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｊ．Ｄａｉｒｙ　Ｓｃｉ．；　８２：１，１９９９；　Ｒｕｄａｎ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｊ．　Ｄａｉｒｙ　Ｓｃｉ．；　８１：２０７７，　１９９８；　Ｒｕｄａｎ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｊ．　Ｄａｉｒｙ　Ｓｃｉ．８１：２０６５，　１９９８；　Ｌｅｌｉｅｖｒｅ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｊ．　Ｓｏｃ．　Ｄａｉｒｙ　Ｔｅｃｈｎｏｌ．　４３：１，　１９９０）。しかしながら、本発明の前には、乳製品に添加され得るホエーの量を最大限にするための担体としてクリームが使用されたことはなかった。
【０００５】
したがって、本技術分野において、チーズの性質に悪影響を及ぼすことなく、チーズその他の乳製品中へのホエータンパク質の取り込みを高めることができる方法および組成物が必要とされる。
発明の要約
本発明は、（ｉ）クリーム及び（ｉｉ）ホエータンパク調製品の混合物を均質化／乳化の工程にかけることによって行われる、乳製品添加物の製造方法を提供する。ホエータンパク質調製品は、非限定的に、ホエータンパク質単離物（ＷＰＩ）又はホエータンパク質濃縮物（ＷＰＣ）を包含する。いくつかの態様においては、ホエータンパク質調製物は、タンパク質分解によって形成された、加水分解されたホエータンパク質を含み；最も好ましくは、ホエータンパク質調製品を加水分解するために用いるプロテアーゼは限定的な基質特異性をもち、そして加水分解されたホエータンパク質調製品は、例えば、約０．５〜２０％の、好ましくは約１〜１０％の、そして最も好ましくは約２〜８％の、限定的な加水分解度（ＤＨ）を示す。他の態様においては、加水分解されたホエータンパク質調製品は、高いＤＨ、例えば、３０％、４０％、又は５０％を示す。
【０００６】
いくつかの態様においては、ホエータンパク質−クリーム混合物は、均質化／乳化段階の前、又は後に、プロテアーゼと接触される。前者の場合、プロテアーゼは均質化の前に失活されることができる。
【０００７】
他の局面においては、本発明は、ホエータンパク質とクリームの混合物を均質化又は乳化することによって製造される乳製品添加物を提供する。いくつかの態様では、添加物は、少なくとも約２重量％、好ましくは少なくとも約４重量％、より好ましくは少なくとも約８重量％、そして最も好ましくは少なくとも約１２重量％のホエータンパク質：脂肪比を有する。
【０００８】
さらに他の局面では、本発明は、以下の：
（ｉ）（ａ）クリームと（ｂ）ホエータンパク質調製品の混合物を用意し；
（ｉｉ）その混合物を均質化／乳化の工程にかけ；そして
（ｉｉｉ）（ｉｉ）において製造された均質化／乳化した混合物を乳製品中に取り込む；
ことによって行われる、乳製品の製造方法を提供する。
【０００９】
好ましくは、工程（ｉ）の混合物は、その乳製品中の総脂肪量の少なくとも約５％、好ましくは少なくとも約２０％、そしてより好ましくは少なくとも約４０％を構成する。いくつかの態様では、工程（ｉ）の混合物はホスホリパーゼをさらに包含する。
【００１０】
さらに他の局面では、本発明は、本発明に係る乳製品添加物を包含する乳製品、及び本発明に係る方法を用いて製造された乳製品を包含する。そのような製品は、非限定的に、（熟成したおよび熟成していないチーズを含む）チーズ、ヨーグルト、スプレッド、クリーム、等を含む。
発明の詳細な説明
本発明は、ホエータンパク質とクリームの混合物を均質化し、そしてそのホモジェネートを乳製品中へ取り込むことにより、チーズその他の乳製品中でのホエータンパク質の使用を高めるための方法及び組成物を包含する。
【００１１】
ホエータンパク質をクリームエマルジョンの形態で添加することによる、乳製品中のホエー量の増加は、例えば乳の限外濾過のような、他の手段によりホエーが加えられるときに観察される不利な影響を減少させる。さらに、本発明に従うホエーの添加は、限外濾過や熱変性のようなプロセッシング工程が避けうるという利点を提供する。また、本発明に係る方法および組成物は、チーズ中に取り込まれるクリーム脂肪の量をも増加させる（脂肪歩止まり）。
【００１２】
本明細書中に使用するとき、「均質化（ｈｏｍｏｇｅｎｉｚａｔｉｏｎ）」は、例えばホエータンパク質とクリームの混合物のような、混合物の油相と水相の細かい分散を形成するいかなる工程をも指す。「乳化（ｅｍｕｌｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ）」は、小滴の安定な懸濁液を形成し、そして／又は、脂肪相が水相から分離される場合、ホエータンパク質が脂肪相に同伴するように、脂肪に結合するところのそれに由来するホエータンパク質またはペプチドの量を増加させる、均質化の工程を指す。好ましくは、本発明に係る方法はホエータンパク質とクリームを含むエマルジョンの形成をもたらす。
【００１３】
本発明に従って形成されるホエータンパク質／クリームのホモジェネート／エマルジョンは、非限定的に、（熟成した及び熟成していないチーズを含む）チーズ、ヨーグルト、スプレッド、クリーム、等を含む、高濃度のホエータンパク質が望まれるところのさまざまな乳製品において利用される。
ホエータンパク質：
本発明において使用されるホエータンパク質は、本分野において知られたいかなる方法によっても得られうる。典型的には、ホエータンパク質は、チーズホエーの、一度以上の限外濾過、電気透析、蒸発、又は逆浸透により、回収される。例えば、米国特許第３，５４７，９００号；及び、Ｈｏｒｔｏｎ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｆｏｏｄ　Ｔｅｃｈｎｏｌ．２６：３０，　１９７２を参照のこと。レンネットの使用、酸性化、又は濾過によるカゼインの濃縮による、チーズ生産を含む、チーズ工程に由来するホエーも使用され、そして、例えば、チェダーチーズ、スイスチーズ、モッツァレラチーズ、等を含む、チーズ源からのホエーも使用されうる。
【００１４】
ホエータンパク質調製品は、典型的にβ−ラクトグロブリン、及び／又は、α−ラクトアルブミンを含み、例えば、Ｄａｖｉｓｃｏ（Ｌｅ　Ｓｕｅｕｒ　ＭＮ）；　Ｂｉｏ−Ｉｓｏｌａｔｅｓ　ＰＬＣ（Ｄｅｅｓｉｄｅ，ＵＫ）；　ＮＺＭＰ　Ｎｏｒｔｈ　Ａｍｅｒｉｃａ（Ｓａｎｔａ　Ｒｏｓａ　ＣＡ）；　Ｆｏｒｍｏｓｔ　Ｆａｒｍｓ（Ｂａｒａｂｏｏ　ＷＩ）；および、ＭＤ　Ｆｏｏｄｓ（Ｕｎｌｏｎ　ＮＪ）から、ホエータンパク質濃縮物（ＷＰＣ）又はホエータンパク質単離物（ＷＰＩ）として商業的に入手できる。ＷＰＩ調製物は典型的には０．５未満〜１重量％の脂肪を含む。ＷＰＣ調製物は典型的には３％超の脂肪を含む。一方、例えば、マイクロフィルトレーション、イオン交換、又は熱処理のような、追加のプロセッシング工程を受けたＷＰＣは、より少ない脂肪を含むことができる。
クリーム：
本発明に係るホモジェネート／エマルジョンの形成において使用されるクリームの成分は、非限定的に、脂質に富む画分および脂質の少ない画分への乳の分別により作られるクリームを含む、カゼイン：脂質比が重量対重量として約０．５未満であるところの脂質含有調製品又は混合であってもよい。この脂質に富むクリーム画分は典型的には１０％超の脂肪、最も典型的には約３０〜４０％の脂肪を含む。本発明に使用されるクリームの成分は、上記の脂質に富む乳画分から希釈、濃縮、又は乾燥されうる。乳から作られる３０〜４０％の脂肪クリームは典型的には、約０．５ｗ／ｗ％のホエータンパク質と約１．７ｗ／ｗ％のカゼインを含み；結果として、ホエータンパク質：脂肪比は約１．２〜１．９％、そしてカゼイン：脂肪比は５〜１０％となる。
【００１５】
本発明において使用されるクリームは、例えば、非限定的に、ウシ、ヤギ、およびヒツジの乳を含む、乳のような、脂質を含む源に由来することができる。
ホエータンパク質とクリームの均質化／乳化：
本発明は、クリームとホエータンパク質の混合物を均質化工程にかけることにより行われる、乳製品添加物の製造方法を提供する。
【００１６】
典型的には、（タンパク質対脂肪の重量対重量で）少なくとも約２％、好ましくは少なくとも約４％、より好ましくは約８％超、最も好ましくは約１２％超のホエータンパク質：脂肪比で、混合物が、クリームとホエータンパク質調製品の間で形成される。例えば、３０％の脂肪を含むクリーム（すなわち、３０ｇ脂肪／１００ｇクリーム）では、本発明は少なくとも約０．６ｇのホエータンパク質／１００ｇのクリーム、好ましくは少なくとも約１．２ｇのホエータンパク質／１００ｇのクリーム；より好ましくは少なくとも約２．４ｇのホエータンパク質／１００ｇのクリーム、そして、最も好ましくは少なくとも約４．８ｇのホエータンパク質／１００ｇのクリームを含む混合物を提供する。
【００１７】
その後、上記ホエータンパク質：クリームの混合物は均質化工程、好ましくは乳化工程にかけられる。非限定的に、高圧乳製品均質機、ロータリー配合機、超音波処理装置、又は乱流中に発生する速い強圧波動を伝えるいかなる装置をも含む、高いせん断力を産む機械的攪拌のいかなる方法も均質化に使用されうる。
ホエータンパク質加水分解：
いくつかの態様では、本発明のホモジェネート又はエマルジョンの形成において使用されるホエータンパク質調製品は、クリームと接触される前または後に、そして好ましくはホモジェネート又はエマルジョンが形成される前に、タンパク質分解に供される。
【００１８】
ある一連の態様においては、タンパク質分解されたホエータンパク質調製品は限られた加水分解度（ＤＨ）を示す。この加水分解度は、約０．５％〜２０％が好ましく、約１％〜１０％がさらに好ましく、約２％〜８％が最も好ましい。他の一連の態様においては、タンパク質分解されたホエータンパク質調製品は、より高いＤＨ、例えば、少なくとも約３０％、４０％、又は５０％を示す。ＤＨは、非限定的に、ＯＰＡ（ｏ−フタルジアルデヒド）法（Ｃｈｕｒｃｈ　ｅｔ　ａｌ．，　Ａｎａｌ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．　１４６：３４３，　１９８５）（例えば下記の実施例１を参照のこと）を用いて遊離のアミノ基を計測し、アミノ窒素／総窒素を比較し；ｐＨの低下を計測し；重量オスモル濃度の増加を計測する、などを含む、本技術分野において知られた方法を用いても計測されることができる。
【００１９】
プロテアーゼ：
非限定的に、セリンプロテアーゼ、メタロプロテアーゼまたはアスパルチルプロテアーゼを含む、ホエータンパク質を消化するプロテアーゼが使用されうる。有用なプロテアーゼの非限定的な例は、例えば、サブチリシンＰＢ９２（Ｍａｘａｃａｌ（商標登録），　Ｇｉｓｔ−Ｂｒｏｃａｄｅｓ　ＮＶ）、サブチリシン３０９（Ｓａｖｉｎａｓｅ（商標登録），　Ｎｏｖｏ　Ｎｏｒｄｉｓｋ）、Ｄｕｒａｚｙｍ（商標登録）およびサブチリシン１４７（Ｅｓｐｅｒａｓｅ（商標登録），Ｎｏｖｏ　Ｎｏｒｄｉｓｋ）のようなサブチリシン；　Ａｌｃａｌａｓｅ（商標登録）、及びＲｅｎｎｉｌａｓｅ（商標登録）である。他の好ましいセリン−プロテアーゼは、例えばＷＯ　８８／０３９４７、ＷＯ　９１／００３４５、及びＥＰ　４１５　２９６中に開示されている。有用なメタロプロテアーゼは、非限定的に、Ｎｅｕｔｒａｓｅ（商標登録）（Ｎｏｖｏ　Ｎｏｒｄｉｓｋ）を含む。他の有用なプロテアーゼは、非限定的に、Ｂａｃｔｏｓｏｌ（商標登録）ＷＯ及びＢａｃｔｏｓｏｌ（商標登録）ＳＩ（Ｓａｎｄｏｚ　ＡＧ）；　Ｔｏｙｏｚｙｍｅ（商標登録）（Ｔｏｙｏ　Ｂｏｓｅｋｉ　Ｃｏ．Ｌｔｄ．，　Ｊａｐａｎ）；　及びＰｒｏｔｅｉｎａｓｅ　Ｋ（商標登録）（Ｋａｏ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ　Ｌｔｄ．，　Ｊａｐａｎ）、及びＴｒｙｐｓｉｎ（Ｎｏｖｏ　ＮｏｒｄｉｓｋからのＰＴＮ）又は他のｌｙｓ／ａｒｇ−又はｌｙｓ−特異的プロテアーゼを含む。
【００２０】
いくつかの態様では、加水分解されたホエータンパク質調製品を製造するためにｇｌｕ／ａｓｐ−特異的プロテアーゼを用いた処理が使用される。本明細書中に使用するとき、ｇｌｕ／ａｓｐ−特異的プロテアーゼは、グルタミン酸及びアスパラギン酸残基のカルボキシル末端上のペプチド結合を加水分解するプロテアーゼをいう。本明細書中に使用するとき、精製されたｇｌｕ／ａｓｐ−特異的プロテアーゼ調製品は、有意な非−ｇｌｕ／ａｓｐ−特異的タンパク質分解活性を欠く調製品を指す；典型的には、（ＡＵとして計測される）この非−ｇｌｕ／ａｓｐ−特異的タンパク質分解活性は、慣用の特異的活性単位を用いて比較するとき、上記ｇｌｕ／ａｓｐ−特異的成分の特異的活性の、約４０％未満、好ましくは約２０％未満、そしてより好ましくは約５％未満の、特異的活性レベルにおいて存在する。
【００２１】
本発明の実施において有用なｇｌｕ／ａｓｐ−特異的プロテアーゼは、非限定的に、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ）　Ｖ８プロテアーゼ（Ｃｈｏｂｅｒｔ　ｅｔ　ａｌ　Ｊ．　Ａｇｒｉｃ．　Ｆｏｏｄ．　Ｃｈｅｍ．３６：２２０，　１９８８）及び、非限定的に、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、及びバチルス・プミリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｐｕｍｉｌｉｓ）を含むバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種に由来するｇｌｕ／ａｓｐ−特異的プロテアーゼを含む。ある一連の態様においては、例えば、米国特許第５，８６６，３５７号中に開示されるような、バチルス・リケニフォルミスの酵素が利用される。
【００２２】
ある態様においては、二つの酵素の混合物、好ましくはｇｌｕ／ａｓｐ−特異的プロテアーゼと別の非−ｇｌｕ／ａｓｐ−特異的プロテアーゼの混合物、最も好ましくはｇｌｕ／ａｓｐ−特異的プロテアーゼとｌｙｓ又はｌｙｓ／ａｒｇ残基に特異性をもつプロテアーゼとの混合物が使用される。
【００２３】
本発明において使用されるプロテアーゼは野生型または変異型の酵素を含む。酵素はそれらの起源細胞から単離され、又は本技術分野において周知の慣用方法を用いて組換えにより製造されることができる。
ホエータンパク質を加水分解する方法：
ある態様においては、ホエータンパク質は、クリームに接触させられる前に、タンパク質分解にかけられる。
【００２４】
この目的のため、重量対重量蛋白質で約０．５％〜約４０％、好ましくは約５％〜約３０％、より好ましくは約１０〜２０％、そして最も好ましくは約１２〜１５％に対応する濃度で、ホエータンパク質、好ましくはホエータンパク質単離物又はホエータンパク質濃縮物を含有する水性溶液が調製される。その溶液のｐＨは約５〜約８、好ましくは約６．０〜約７．８、そして最も好ましくは約６．５〜７．０である。互換性のある緩衝系も使用されうる。
【００２５】
４時間のインキュベーション時間に対して重量対重量でプロテアーゼ：基質タンパク質を約０．１〜５％；好ましくは約０．２〜２．５％、そして最も好ましくは約０．５〜１％の比で、プロテアーゼ、好ましくはｇｌｕ／ａｓｐ−特異的プロテアーゼ、そして最も好ましくはＢ．　リケニフォルミスのｇｌｕ／ａｓｐ−特異的プロテアーゼに相同なプロテアーゼを、上記水性タンパク質含有溶液に添加することにより、反応混合物を形成する。他の態様においては、４時間のインキュベーション時間に対して約０．１〜５００ｍＡＵ／ｇ基質タンパク質、好ましくは１〜５０ｍＡＵ／ｇ、より好ましくは１０〜２５ｍＡＵ／ｇの比で、プロテアーゼを添加する。１ＡＵ（Ａｎｓｏｎ　ｕｎｉｔ）は、フェノール試薬を使用した呈色により計測されるとき、１ミリ当量のチロシンに相当する、トリクロロ酢酸溶解性物質の量を遊離させる初速度で、１０分間、２５℃、ｐＨ７．５で変性ヘモグロビンを消化する酵素量として定義される。
【００２６】
反応混合物は、所望の加水分解度（ＤＨ）が達成されるまで、約２０〜７５℃、好ましくは約３０〜６５℃、より好ましくは約５０℃の温度でインキュベートされる。
【００２７】
各反応条件（例えば、ホエータンパク質調製品の濃度、酵素：基質比、ｐＨ、温度、および時間）は、例えば、ホエータンパク質及び／又は酵素の源、並びにホエータンパク質加水分解産物が意図されるところの最終用途に依存して、変更されうるということが理解されるであろう。さらに、反応条件の最適化は、条件のマトリックスを確立し、そしてそのマトリックス内の異なる点を試験することにより、日常的な実験を用いて達成されることができるということが理解されるであろう。例えば、１５分間〜２４時間の間の加水分解時間が用いられ、それに応じて酵素濃度が調節されうる。
【００２８】
ある一連の態様においては、ホエータンパク質調製品は、４時間にわたり、約１０〜２５ｍＡＵ／ｇタンパク質の濃度で、ｇｌｕ／ａｓｐ　−特異的プロテアーゼにより加水分解される。このような手順は、クリームエマルジョン中に比較的高濃度で組み込まれることのできる、ホエー由来両性ペプチドの混合物の製造をもたらす。さらに、乳化された生成物は高い水結合活性を示し、そして乳製品中で使用されるときに脂肪とタンパク質の間の強い相互作用を促して、例えば、モッツァレラチーズにおける低ｏｉｌｉｎｇ−ｏｆｆ（油の浮き出し）をもたらす。
【００２９】
ある態様においては、本発明に係る方法はプロテアーゼを失活させ又は除去する追加の工程を包含する。失活は、非限定的に、反応混合物の温度をその酵素の失活温度より高く上げることを含む、本技術分野において知られた方法によって達成されうる。失活温度は、酵素、ホエーの濃度、時間およびｐＨに依存して、変動しうる。バチルス・リケニフォルミスのｇｌｕ／ａｓｐ−特異的プロテアーゼがｐＨ７で５％超のホエータンパク質を含有する反応混合物中で使用されるとき、そのプロテアーゼを失活させるために７０℃又はそれより高い温度の処理が必要とされる。より低いｐＨ値ではより低い温度が使用されうる。さらに、約６０００バールより高い圧力増加、あるいは本技術分野において知られた他の方法を使用することもできる。プロテアーゼの除去は、例えば、濾過または固定化酵素の使用を含む固定化によって達成されうる。プロテアーゼの失活又は除去は、本技術分野において知られた方法を用いて、残存するタンパク質分解活性を試験することによりモニターされる。
【００３０】
いくつかの態様においては、本発明に係る方法は、例えば、分別；噴霧乾燥および凍結乾燥を含む乾燥；および、例えば蒸発又は膜濾過を使用して達成され得る濃縮によって、加水分解されたタンパク質を処理する１以上の追加の工程を包含する。
【００３１】
他の態様においては、ホエータンパク質調製品とクリームの混合物は均質化／乳化の前にプロテアーゼと接触される。
追加成分：
本発明の実施においては、クリーム中へのホエータンパク質の乳化とともに、非限定的に、ホスホリパーゼＡ１、Ａ２、Ｂ、Ｃ及びＤを含む、ホスホリパーゼを用いた処理が使用され得る。このような処理は、クリームの性質をさらに改変し、そしてそれによりクリーム中へのホエーの乳化を介してホエー添加の利益を高めるために、使用され得る。
【００３２】
本発明において使用されるホスホリパーゼは、非限定的に、例えばウシ又はブタの膵臓由来のホスホリパーゼのような、哺乳類のホスホリパーゼ、又はヘビの毒液又はハチの毒液由来のホスホリパーゼを含む。あるいは、ホスホリパーゼは、例えば糸状菌、酵母又は細菌からの、微生物起源を有することもできる。１の有用なホスホリパーゼはフザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）の株、特に、例えばＷＯ　９８／２６０５７、特にＷＯ　９８／２６０５７の請求項３６および配列番号２に記載のＤＳＭ　２６２７株からの、Ｆ．　オキシスポラム（ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）に由来する。さらなる態様においては、ホスホリパーゼはＰＣＴ／ＤＫ／００６６中に開示されるホスホリパーゼである。
【００３３】
本発明において使用されるホスホリパーゼは野生型又は変異型の酵素を包含しうる。酵素はそれらの起源細胞から単離され、又は本技術分野において周知の慣用方法を用いて組換えにより製造されることができる。
乳製品の生産：
本発明は、乳製品の製造方法および当該方法を用いて製造された乳製品をも包含する。当該方法は上述のホエータンパク質−クリームのホモジェネート又はエマルジョンを乳製品中にねり込むことにより実施される。ホモジェネート又はエマルジョンがその中に取り込まれるところの乳製品は、非限定的に、チーズ（熟成したと熟成していないチーズ両者）、ヨーグルト、バターを含むスプレッド、及びクリームを含む。本明細書中に使用されるとき、「取り込み（ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）」は乳製品調製のための本技術分野において知られた工程をいう。
【００３４】
チーズまたはヨーグルトの製造のために、凝乳または酸性化の前に乳の脂肪含有量はしばしば特定の値、例えばチェダーに関しては、典型的には２〜１４％、例えば、３．５％に調整される。特定の脂肪含有量は乳、クリーム、脱脂乳または脱脂粉乳を混合することによって得られうる。本発明に係る乳化したクリームは、典型的には乳製品中の総脂肪量の約５％超、好ましくは約２０％超、そしてより好ましくは４０％超を占めるであろう。
【００３５】
ほとんどのチーズに関しては、乳化したクリームは典型的には、レンネットの添加前又は同時に、あるいはレンネット誘導凝固の前に添加される。クリームチーズに関しては、乳化したクリームは、凝乳／酸性化の前又は同時に添加され、そして／又は、乳化したクリームは（特に包装前にさらなる均質化にかけられる「ホットパック（ｈｏｔ　ｐａｃｋ）」型では）カード（ｃｕｒｄ）が形成された後にそのカードに混合される。プロセスチーズに関しては、乳化したクリームは、いろいろな段階で、例えば、調理前に他の成分と混合されたり、または、そのようなチーズがクリームチーズの成分として使用される場合、レンネットの添加前または同時に限外濾過したチーズに添加されることができる。ヨーグルトに関しては、乳化したクリームは、典型的には、スターターカルチャーの添加前又は同時に添加される。
【００３６】
本発明に係る方法は慣用の乳製品よりもかなり高いレベルのホエータンパク質を含む乳製品の製造をもたらす。例えば、本発明に係る方法を用いて製造した乳製品は重量でその製品の少なくとも約１％、好ましくは少なくとも約２％、より好ましくは少なくとも約４％のホエータンパク質を含む。他の局面においては、本発明に係る方法を用いて製造した乳製品中のホエータンパク質は重量でその製品の総タンパク質量の少なくとも約３％、好ましくは少なくとも約５％、より好ましくは少なくとも約１０％、そして最も好ましくは少なくとも約１５％を占める。より好ましい態様においては、本発明に係る方法を用いて製造したチーズは、添加されたホエーに起因すると予想される、低下した伸縮性又は溶融性あるいは不充分な熟成を示さずに有意に高い量のホエータンパク質を含有する。さらに、本発明に係る方法を用いて製造された（「ｏｉｌｉｎｇ−ｏｆｆ」）チーズは、好ましくは、同一の方法であるが本発明のホエータンパク質／クリームホモジェネートなしで製造されたチーズからの遊離油の放出に比較して、減少された遊離油の放出を示す。
【００３７】
以下の実施例は本発明の非限定的な説明として意図される。
実施例１：ホエータンパク質のタンパク質分解
以下の実験はホエータンパク質を特定条件下で限定された加水分解にかけるために行われる。
【００３８】
方法：
２０％の固形分を含むホエータンパク質溶液を、ＷＰＣ（Ｄａｖｉｓｃｏ　ＨｉＰｒｏ　ＷＰＣ　８０％）及びＷＰＩ（Ｄａｖｉｓｃｏ　ＢｉＰｒｏ　ＷＰＩ　９０％）から再構成し、そして酵素対基質比１４ｍＡＵ／ｇのＢ．　リケニフォルミスのｇｌｕ／ａｓｐ−特異的プロテアーゼ不存在下または存在下、５０℃で、２４０〜３００分間、ｐＨ７．０で処理した。その後その反応混合物を噴霧乾燥した。
【００３９】
加水分解産物を以下のようにＯＰＡによりＤＨについて分析した：ＯＰＡ試薬を７．６２０ｇのテトラホウ酸ニナトリウム１０水和物（Ａｌｄｒｉｃｈ　２２，１３３−３）と２００ｍｇのドデシル硫酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ　Ｌ−３７７１）を１５０ｍｌの水に溶解することにより調製した。１６０ｍｇのｏ−フタルジアルデヒド９７％（Ｓｉｇｍａ　Ｐ−０６５７）を４ｍｌのエタノールに溶解し、そして上記混合物に添加し、その後１７６ｍｇのジチオスレイトール９９％（Ｓｉｇｍａ　Ｄ−９１６３）を添加し、そして上記混合物を脱イオン水を用いて全量２００ｍｌに調製した。３ｍｌのＯＰＡ試薬を試験管に添加し、その後４００μｌのセリン標準液またはサンプルを添加した。混合後、その混合物を厳密に２分間インキュベートし、その後３４０ｎｍにおける吸光度を測定した。ＤＨを次の式を用いて計算した：
【００４０】
【数１】
2004505644.tif 000002
【００４１】
【数２】
2004505644.tif 000003
【００４２】
結果：
上記の方法は、７．３％のＤＨまでのＷＰＩの加水分解および６．７％のＤＨまでのＷＰＣの加水分解をもたらした。
実施例２：ホエータンパク質／クリームのエマルジョンを取り込む乳製品の製造
次の実験を、チーズの性質に対する本発明に係る乳製品添加物のチーズ中含有物の効果をテストするために実施した。
【００４３】
Ｉ．方法：
Ａ．ホエータンパク質加水分解：　８０％ＷＰＣ（Ｄａｖｉｓｃｏ　ＨｉＰｒｏ　ＷＰＣ　８０％）から、５％のタンパク質を含むホエータンパク質溶液を再構築した。その溶液のｐＨを６．５に調整し、そしてその溶液を５０℃に置いた。その後Ｂ．リケニフォルミスのｇｌｕ／ａｓｐ−特異的プロテアーゼを、０、７．５、および２５０ＡＵ／ｋｇタンパク質の酵素：基質比で添加し、そして５０℃で１時間インキュベートした。その後その反応混合物を７５℃で３時間インキュベートして、その酵素を失活させ、その後そのサンプルを凍結乾燥した。
【００４４】
Ｂ．チーズ生産：
加水分解されたホエータンパク質調製品及び加水分解されていないホエータンパク質調製品を重量にして最終濃度４％のタンパク質になるように３０％クリームに添加し、そしてその混合物を手持ちサイズのホモジェナイザー（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｉｅｓ　Ｍｏｄｅｌ　Ｘ−５−２０）を用いてスピード１で０．５分間にわたり均質化した。
【００４５】
その後均質化された混合物を低温殺菌脱脂乳と混合して、３．５％脂肪を含むチーズ乳を提供した。その乳を３５℃に平衡化し、そしてスターターカルチャーを添加した。チーズ乳１当り、（２５０ｍｌの脱脂乳にＬＨ１００とＴＡ０６１（Ｒｈｏｄｉａ，　Ｍａｄｉｓｏｎ　ＷＩ）をそれぞれ０．１８グラム溶かし、そして３５℃で３０分間インキュベートすることによって形成された）スターターカルチャー溶液４０ｍｌを添加した。その混合物をｐＨ６．４に達するまで約１５分間ゆるやかに攪拌した。その後、レンネット（酸性アスパラギンリゾムコー・ミエヘイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ　ｍｉｅｈｅｉ）プロテアーゼ，乳Ｌ当たり２ＫＲＵ）を添加し、そしてその乳を３分間攪拌した。その後、その乳を切断前に約３５分間放置した。その後上記チーズをじょうごとチーズクロスを用いて４１℃で１時間濾過し、そしてホエーを回収した。そのカードがｐＨ５．３に達したとき、それを５分間５７℃の水浴内のバケツ内に注いだ。チーズを手で伸ばし、そしてそのチーズが５７℃に戻す必要があるときは水浴内に戻した。チーズを１０〜１５分間冷水中で混ぜ（ｔｅｍｐｅｒｅｄ）、そして一晩冷蔵した。
【００４６】
Ｃ．分析：　チーズのタンパク質含量をＬＥＣＯ装置内でＤｕｍａｓ　Ｃｏｍｂｕｓｔｉｏｎ法を用いて計測した。水分含量をＣＥＭ　Ａｕｔｏｍａｔｉｃ　Ｖｏｌａｔｉｌｉｔｙ　Ｃｏｍｐｕｔｅｒ，　Ｍｏｄｅｌ　ＡＶＣ−８０（ＣＥＭ　Ｃｏｒｐ．，　Ｍａｔｔｈｅｗｓ，　ＮＣ）を用いて計測した。ホエータンパク質を、標準曲線をつくるためのホエータンパク質を用いて、Ｂｉｏ−Ｒａｄのタンパク質試薬を用いて計測した。
【００４７】
溶融度（ｍｅｌｔａｂｉｌｉｔｙ）を、（ｉ）チーズサンプルをブレンダー内で２０秒間粉砕し；（ｉｉ）３ｇの粉砕されたチーズを２．２ｃｍの金属の環内に成型し、そして（ｉｉｉ ）ガラスのペトリ皿の中央に上記環を置くことにより計測した。その後チーズサンプルをオーブン内で１００℃で１４分間加熱した。溶融の前後でそのチーズにより占有された面積を計測した。溶融度を次のように計算した：
【００４８】
【数３】
2004505644.tif 000004
【００４９】
溶融度は対照チーズの溶融度に対して正規化し、そして対照溶融度のパーセンテージとして表した。
【００５０】
ＩＩ．結果
結果を以下の表に示す。
【００５１】
【表１】
2004505644.tif 000005
【００５２】
結果は、とくにエマルジョンを作るために用いられたホエータンパク質が乳化前にタンパク質分解消化を受けたときに、チーズミルクにホエータンパク質／チーズのエマルジョンを補充することが、そのチーズ中へのホエータンパク質の高められた取り込みをもたらすことを示している。このことは、補充のホエータンパク質がチーズ製造工程の結果として形成されるホエー中には回収されないが、そのチーズ中に残るという観察に反映される。
【００５３】
さらに、ホエータンパク質による補充の結果としてチーズの水分含量の検出可能な上昇がある。最後に、本発明に係る方法における加水分解したホエータンパク質の使用はホエータンパク質補充から生じる溶融度の低下を反転させる。
【００５４】
本明細書中に引用した特許、特許出願、及び引用文献の全てを、それらを全体として、本明細書中に援用する。
【００５５】
本発明の多くの変形が、それ自体上記詳細な記載に照らして当業者に示唆されるであろう。そのような自明の変形は、添付の充分に意図された請求範囲内にある。
【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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