(57)【要約】連結システムは、第１の容器（５１２）および第２の容器（５２２）を利用して、シリンジを連結し得る。シリンジを使用して、粘性材料を混合し得、そして／または粘性材料を分配し得る。さらに、粘性材料を混合および／または分配する際に使用される部品を備えるキットが提供される。本発明の連結デバイスは、以下：連結デバイス本体であって、以下：第１の容積サイズを有する第１のシリンジと連結するために作動可能な、第１の容器；第２の容積サイズを有する第２のシリンジと連結するために作動可能な、第２の容器；該第１の容器から該第２の容器へと流体が流れ得るように、該第１の容器と該第２の容器との間に配置されるチャネル；を備え、ここで、該第１の容積サイズが、該第２の容積サイズとは異なる。
2004503381.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
連結デバイスであって、以下：
連結デバイス本体であって、以下：
第１の容積サイズを有する第１のシリンジと連結するために作動可能な、第１の容器；
第２の容積サイズを有する第２のシリンジと連結するために作動可能な、第２の容器；
該第１の容器から該第２の容器へと流体が流れ得るように、該第１の容器と該第２の容器との間に配置されるチャネル；
を備え、
ここで、該第１の容積サイズが、該第２の容積サイズとは異なる、連結デバイス本体、
を備える、連結デバイス。
【請求項２】
前記第１の容器が、第１のバレルサイズを受容する大きさであり、そして前記第２の容器が、該第１のバレルサイズとは異なる第２のバレルサイズを受容する大きさである、請求項１に記載の連結デバイス。
【請求項３】
前記チャネルが、約０．４ミリメートル〜約０．６ミリメートルの範囲の直径の、実質的に円筒形であるように構成されている、請求項１に記載の連結デバイス。
【請求項４】
前記第１の容器が、２５０マイクロリットルのシリンジと連結されるよう作動可能である、請求項１に記載の連結デバイス。
【請求項５】
前記第２の容器が、１０マイクロリットルのシリンジと連結されるよう作動可能である、請求項１に記載の連結デバイス。
【請求項６】
前記第１の容器が、２５０マイクロリットルのシリンジと連結されるよう作動可能であり、そして前記第２の容器が、１０マイクロリットルのシリンジと連結されるよう作動可能である、請求項１に記載の連結デバイス。
【請求項７】
前記チャネルが、前記第１のシリンジから前記第２のシリンジへと、粘性材料を移動させるために作動可能である、請求項１に記載の連結デバイス。
【請求項８】
前記連結デバイス本体が、非金属材料から構成されている、請求項１に記載の連結デバイス。
【請求項９】
前記非金属材料がＰＥＥＫを含む、請求項８に記載の連結デバイス。
【請求項１０】
前記第１のシリンジと前記連結デバイスとを連結する際に使用するための、第１のフェルールをさらに備える、請求項１に記載の連結デバイス。
【請求項１１】
前記第２のシリンジと前記連結デバイスとを連結する際に使用するための、第２のフェルールをさらに備える、請求項１に記載の連結デバイス。
【請求項１２】
第１のシリンジと第２のシリンジとを連結する方法であって、該方法は、以下：
第１の容器および第２の容器、ならびに該第１の容器と該第２の容器との間に配置されるチャネルを有する、連結デバイス本体を提供する工程；
第１のシリンジを該第１の容器に連結し、そして第２のシリンジを該第２の容器に連結する工程であって、ここで、該第１のシリンジが、該第２のシリンジの容積サイズとは異なる容積サイズを有する、工程、
を包含する、方法。
【請求項１３】
前記第１の容器が、第１のバレルサイズを受容する大きさであり、そして前記第２の受容器が、該第１のバレルサイズとは異なる第２のバレルサイズを受容する大きさである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記チャネルが、約０．４ミリメートル〜約０．６ミリメートルの範囲の直径の、実質的に円筒形状を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記チャネル内に針を配置する工程をさらに包含する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
前記第１のシリンジを前記第１の容器に連結する工程が、２５０マイクロリットルのシリンジを該第１の容器に連結する工程を包含する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１７】
前記第２のシリンジを前記第２の容器の連結する工程が、１０マイクロリットルのシリンジを該第２の容器に連結する工程を包含する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１８】
粘性材料を、前記第１のシリンジから前記第２のシリンジへと移動させる工程をさらに包含する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１９】
前記粘性材料が、約１００，０００センチポアズ〜約３００，０００センチポアズの範囲の粘度を有する、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
非金属材料を、前記連結デバイス本体として利用する工程をさらに包含する、請求項１２に記載の方法。
【請求項２１】
ＰＥＥＫを、前記非金属材料として利用する工程をさらに包含する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
第１のフェルールを前記第１の容器に配置する工程であって、該第１のフェルールが、前記第１のシリンジを該第１の容器に連結するよう構成されている、工程をさらに包含する、請求項１２に記載の方法。
【請求項２３】
第２のフェルールを前記第２の容器に配置する工程であって、該第２のフェルールが、前記第２のシリンジを該第２の容器に連結するよう構成されている、工程をさらに包含する、請求項１２に記載の方法。
【請求項２４】
さらに、以下：
第１のフェルールを前記第１の容器に配置する工程であって、該第１のフェルールが、前記第１のシリンジを該第１の容器に連結するよう構成されている、工程；
第２のフェルールを前記第２の容器に配置する工程であって、該第２のフェルールが、前記第２のシリンジを該第２の容器に連結するよう構成されている、工程、
を包含する、請求項１２に記載の方法。
【請求項２５】
ＬＣＰを混合する方法であって、以下：
シリンジバレルを有する第１のシリンジを提供する工程；
脂質材料を該シリンジバレル内に配置する工程；
タンパク質材料を該シリンジバレルに添加する工程；
該脂質材料と該タンパク質材料を、該シリンジバレル内で混合して、該ＬＣＰを該シリンジバレル内で形成する工程、
を包含する、方法。
【請求項２６】
第２のシリンジを利用して、前記タンパク質材料を前記第１のシリンジバレルに添加する工程をさらに包含する、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記タンパク質材料および前記脂質材料を、前記第２のシリンジに移動させる工程をさらに包含する、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記ＬＣＰ材料を、複数の保持位置に分配する工程をさらに包含する、請求項２５に記載の方法。
【請求項２９】
前記保持位置が、ウェルプレートにおけるウェルのアレイを含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記ＬＣＰ材料をマイクロウェルアレイに分配する工程をさらに包含する、請求項２５に記載の方法。
【請求項３１】
さらに、以下：
前記ＬＣＰ材料をコンテナ中に分配する工程；
結晶化促進材料を該コンテナに添加する工程；
該コンテナ内で、該ＬＣＰ材料および該結晶化促進材料から、タンパク質結晶を成長させる工程、
を包含する、請求項２５に記載の方法。
【請求項３２】
前記ＬＣＰ材料を前記コンテナ中に分配する工程の前に、前記結晶化促進材料を乾燥させる工程をさらに包含する、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
粘性材料を移動させる方法であって、該方法は、以下：
ある容量の粘性材料を含む、第１のシリンジバレルを提供する工程であって、該第１のシリンジバレルは、第１の容積サイズを有する、工程；
連結デバイスを提供する工程；
該第１のシリンジバレルを、該連結デバイスに連結する工程；
第２のシリンジバレルを提供する工程であって、該第２のシリンジバレルは、該第１のシリンジバレルの該第１の容積サイズとは異なる第２の容積サイズを有する、工程；
該第２のシリンジバレルを、該連結デバイスに連結する工程；
該容量の粘性材料の少なくとも一部を、該第１のシリンジバレルから該第２のシリンジバレルへと、該連結デバイスを通して移動させる工程、
を包含する、方法。
【請求項３４】
前記粘性材料を、前記連結デバイスのチャネルを通して移動させる工程をさらに包含する、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記粘性材料を、前記チャネル内に配置した針を通して移動させる工程をさらに包含する、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
約２０ミリメートル未満の長さを有する針を利用する工程をさらに包含する、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
約０．６５ミリメートルの外径を有する針を利用する工程をさらに包含する、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記粘性材料が、約１００，０００センチポアズ〜約３００，０００センチポアズの範囲の粘度を有する、請求項３３に記載の方法。
【請求項３９】
前記粘性材料が、脂質中間層材料を含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項４０】
粘性材料を分配するための装置であって、該装置は、以下：
シリンジバレル；
該シリンジバレル内に配置される、シリンジプランジャー；
約２０ミリメートル未満の長さ、および約０．４ミリメートル〜約０．７２ミリメートルの範囲の外径を有する、針；
使用の間に該針と該シリンジバレルとを連結するために作動可能である、フェルール、
を備える、装置。
【請求項４１】
前記粘性材料が脂質中間層を含む、請求項４０に記載の装置。
【請求項４２】
前記シリンジバレルが、前記粘性材料が前記針から出る場合に破損されないよう構成されている、請求項４０に記載の装置。
【請求項４３】
ＬＣＰ混合キットであって、以下：
複数のシリンジを流体連絡させて連結するための連結デバイスであって、該連結デバイスは、第１の容器および第２の容器を有し、ここで、該第１の容器は、該第２の容器とは異なる連結サイズを有する、連結デバイス；
該連結デバイスと連結するために作動可能である、第１のシリンジ；ならびに　該連結デバイスと連結するために作動可能である、第２のシリンジ、
を備える、ＬＣＰ混合キット。
【請求項４４】
前記第１のシリンジより小さな容積を有する、第３のシリンジをさらに備える、請求項４３に記載のＬＣＰ混合キット。
【請求項４５】
前記第１のシリンジと前記第２のシリンジとを連結するために作動可能である、第２の連結具をさらに備える、請求項４４に記載のＬＣＰ混合キット。
【請求項４６】
予め決定された量のＬＣＰを繰り返し計量するための、反復分配器をさらに備える、請求項４３に記載のＬＣＰ混合キット。
【請求項４７】
ウェルプレートをさらに備える、請求項４３に記載のＬＣＰ混合キット。
【請求項４８】
脂質材料をさらに含む、請求項４３に記載のＬＣＰ混合キット。
【請求項４９】
緩衝溶液をさらに含む、請求項４３に記載のＬＣＰ混合キット。
【請求項５０】
ＬＣＰを含有する物質を分配する方法であって、該方法は、以下：
該物質を、第１のシリンジ内で混合する工程；
該物質を、該第１のシリンジから第２のシリンジへと移動させる工程であって、該第２のシリンジが、該第１のシリンジの容積サイズより小さな容積サイズを有する、工程；
該第２のシリンジを利用して、該ＬＣＰを分配する工程、
を包含する、方法。
【請求項５１】
前記ＬＣＰをコンテナ内に分配する工程をさらに包含する、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記ＬＣＰをウェルプレートのウェルに分配する工程をさらに包含する、請求項５０に記載の方法。
【請求項５３】
前記ＬＣＰをマイクロアレイに分配する工程をさらに包含する、請求項５０に記載の方法。
【請求項５４】
前記ＬＣＰを、タンパク質結晶を成長させる際に使用するための溶液中に分配する工程をさらに包含する、請求項５０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（関連出願の引用）
本願は、２０００年７月１８日に出願された、発明の名称「ＰＲＯＣＥＤＵＲＥ　ＡＮＤ　ＳＹＲＩＮＧＥ　ＡＰＰＡＲＡＴＵＳ　ＦＯＲ　ＳＣＲＥＥＮＩＮＧ　ＬＩＰＩＤＩＣ　ＭＥＳＯＰＨＡＳＥＳ　ＦＯＲ　ＰＲＯＴＥＩＮ　ＣＲＹＳＴＡＬＬＩＺＡＴＩＯＮ」の米国特許出願番号６０／２１９，０１６（これは、全ての目的で本明細書中に参考として援用される）の利益を主張する。
【０００２】
本発明の実施形態は、一般に、脂質中間層のような粘性材料を調製するためのシステムに関する。
【０００３】
（背景）
タンパク質の三次元構造は、極度に高い商業価値を有する。なぜならこれらは、目的のタンパク質に結合する新規薬物分子の、合理的な（構造に基づく）設計および操作の使用を可能にするからである。さらに、これらは、所望の特性を有する新規タンパク質の合理的な操作を容易にする。タンパク質のＸ線結晶学的構造決定の１つの方法は、以下を包含する：（１）精製されたタンパク質の調製；（２）このタンパク質の結晶化；（３）タンパク質の単結晶の単離および強い集光したＸ線ビームとの整列；（４）この単結晶をこのＸ線ビーム内で回転させることによる、完全なＸ線回折データセットの収集；（５）Ｘ線点の位置および強度の尺度である回折点を、記録デバイスで捕捉する工程；（６）その結晶の実験的な電子密度マップを誘導するための、Ｘ線回折データのコンピュータ分析。これらのマップは、次に、結晶を形成したタンパク質の三次元化学モデルを誘導するために使用される。しかし、Ｘ線回折法を使用してタンパク質の三次元構造をほぼ原子解像度で決定する際の一般的な問題は、タンパク質の結晶化の律速工程である。
【０００４】
膜タンパク質とは、全ての生存細胞を囲む脂質二重層（膜）に結合し、そして／または貫通する、広いクラスのタンパク質である。膜タンパク質は、代表的に、細胞膜を横切る物質および／またはシグナルの制御された移動に関与する。このようにする際に、膜タンパク質は、生存細胞の内側と外側との間での迅速な連絡を可能にする。膜タンパク質の例としては、イオンチャンネル、シグナル伝達レセプター、ホルモンレセプター、光レセプター、および接着タンパク質が挙げられる。このような膜タンパク質は、市場でのいくつかの大きな影響を与える薬物、および製薬会社において開発中の種々の薬物の、多数の栄養物を処理するための標的である。
【０００５】
歴史的に、膜タンパク質は、結晶化させることが悪評高いほど困難であった。このことは、これらのタンパク質の疎水性（水を嫌う）および／または親油性（脂肪を好む）性質に起因する。この性質は、これらのタンパク質を多量で精製することを困難にし、そしてこれらのタンパク質の、水溶液への全体的な溶解度を低下させる。これらの要因は、膜タンパク質の結晶化を困難にする。なぜなら、これらのタンパク質は、可溶性（非膜結合）タンパク質のために使用される結晶化方法による結晶成長の核形成のために必要である、水溶液中の濃度において、不安定である傾向があるからである。
【０００６】
１９９６年に、ＬａｎｄａｕおよびＲｏｓｅｎｂｕｓｃｈは、膜タンパク質の結晶化のための脂質立方相の新規使用を記載した。この方法によれば、界面活性剤によって可溶化された膜タンパク質が、モノオレイン（またはモノパルミトレイン）および水（または緩衝溶液）と混合され、その後、複数回遠心分離される。この大規模な方法は、２〜３時間にわたる材料の穏やかな混合によって、粘性の相同写像の立方相（三次元に拡張し、そして水性チャネルによって浸透される、硬化した脂質二重層）を作製することを可能にする。膜タンパク質は、脂質二重層に含まれ得、そして三次元に拡散し得、このことにより、これらのタンパク質は、脂質中間層でのタンパク質の結晶成長を導き得る、多くの潜在的な空間充填配置（例えば、いわゆる「脂質立方相」（ＬＣＰ））を探求し得る。
【０００７】
ＬａｎｄａｕおよびＲｏｓｅｎｂｕｓｃｈの元のＬＣＰ結晶化法は、小さなガラスバイアルの使用を包含し、このバイアルの中に、モノオレイン、タンパク質および緩衝水が添加され、その後、複数の遠心分離がなされて、ＬＣＰが作製される。ＬＣＰが作製された後に、少量の乾燥塩が添加され、そしてこのバイアルが密封され、そしてインキュベートされる。結晶成長が、各ガラスバイアルを立体顕微鏡で試験することによって、モニタリングされる。この元の脂質中間層のプロトコルは、長たらしく、時間を浪費し、そして蒸気拡散に基づく従来の結晶化のために必要とされる量より多くの最初のタンパク質材料を必要とする。乾燥塩の添加が、特に時間を浪費する。なぜならこの工程は、正確な秤量工程を必要とするからである。さらに、結晶成長の観察は長たらしい。なぜならこの工程は、複数のチューブを取り扱う事象を包含するからである。これらの制限に起因して、ＬａｎｄａｕおよびＲｏｓｅｎｂｕｓｃｈのＬＣＰ法は、一般に、タンパク質結晶学社会によって使用を押し付けられなかった。
【０００８】
（要旨）
本発明の１つの実施形態において、連結デバイスが提供され、このデバイスは、第１のシリンジと連結するために作動可能である第１の容器；第２のシリンジと連結するために作動可能である第２の容器；ならびにこの第１の容器から第２の容器へと流体が流れることを可能にするように、これらの第１の容器と第２の容器との間に配置される、チャネルを備える。この第１の容器は、第２の容器とは異なる大きさであり、これによって、異なる大きさのシリンジが互いに連結されることが可能になり得る。このような配置は、有用であり得る。なぜならこれは、大きなシリンジとより小さなシリンジの連結、および大きなシリンジからより小さなシリンジへの流体の移動を容易にし得るからである。さらに、針のようなチューブが、チャネル内に配置され、これによって、一方のシリンジから他方のシリンジへの流体の流れを容易にし得る。また、本発明のこの実施形態は、ＰＥＥＫ（ポリエーテルエーテルケトン）材料のような断熱材料から構成され、これによって、実験室作業者から連結システム内に配置された材料への熱交換を低下させ得る。また、第１のフェルールが、第１の容器に配置され、これによって、第１の容器と第１のシリンジとの間の連結を容易にし得る。同様に、第２のフェルールが、第２の容器と共に利用されて、第２のシリンジとの連結を容易にし得る。
【０００９】
本発明の別の実施形態において、粘性材料（例えば、脂質立方相材料）を移動させる方法が使用されて、粘性材料を第１のシリンジバレルから第２のシリンジバレルに移動させ得る。この方法は、ある容量の粘性材料を含む第１のシリンジバレルを提供する工程であって、この第１のシリンジバレルが、第１の容積サイズを有する、工程；連結デバイスを提供する工程；この第１のシリンジバレルを、連結デバイスに連結する工程；第１のシリンジバレルとは異なる容積サイズを有する、なお別のシリンジバレルを提供する工程；この第２のシリンジバレルを、連結デバイスに連結する工程；および空気圧を利用して、粘性材料の少なくとも一部を、第１のシリンジバレルから第２のシリンジバレルへと移動させる工程によって、達成され得る。この方法は、流体または粘性材料を、大きなシリンジから、この材料を少量で分配するためにより適切なシリンジまたはコンテナに移動させることを、容易にし得る。例えば、この方法は、脂質中間層（例えば、ＬＣＰ）を、この脂質中間層が２つの大きなシリンジによって混合された後に（なぜなら、小さなシリンジ内で脂質中間層を混合することは非常に困難であるので）移動させるために、特に使用され得る。連結デバイスのチャネルは、粘性材料を移動させるために使用され得る。さらに、このチャネル内に配置される針は、移動プロセスの間にこのシリンジの破損を防止するように、十分に短い長さを有するものが選択され得る。
【００１０】
本発明の別の実施形態において、粘性材料を、例えばマイクロウェルに分配するためのシリンジが提供され得る。例えば、シリンジの針が、約２０ｍｍ未満の長さおよび約０．４ｍｍ〜約０．７２ｍｍの針の外径、ならびに約０．１０ｍｍ〜約０．１６ｍｍの針の内径を有するような構成にされ得る。さらに、この針は、操作の間にシリンジ装置の破損を引き起こさずに、脂質中間層材料を分配するように、適切な大きさにされ得る。
【００１１】
本発明のなお別の実施形態において、脂質中間層または他の粘性材料を、分配または混合するための装置のキットが提供され得る。例えば、以下を備えるキットが提供され得る：脂質材料を受容するために十分な開口部を有する、第１のシリンジ；タンパク質溶液を保持するために作動可能である、第２のシリンジまたは容器；ならびにこの脂質材料をタンパク水溶液と混合する間に、これら２つのシリンジを一緒に連結するために作動可能である、連結デバイス。同様に、一旦混合された脂質中間層材料を分配するために作動可能である、より小さなシリンジが、このキットの一部として提供され得る。さらに、大きなシリンジをより小さなシリンジに連結すること、および脂質中間層材料の、この大きなシリンジから小さなシリンジへの移動を容易にする連結デバイスが、提供され得る。また、分配シリンジと共に使用するための半自動分配器が提供され、そして溶液と脂質中間層材料との混合物を保持するためのマイクロウェルが、提供され得る。このキットの種々の構成要素は、種々の組み合わせで提供され得る。
【００１２】
（詳細な説明）
タンパク質構造は、通常、それぞれの結晶のＸ線回析によって決定される。膜タンパク質は、従来の方法（例えば、拡散蒸着方法）を使用して結晶化することが特に困難である。しかし、全ての公知ゲノムにおいてゲノムの約３０％が膜タンパク質をコードするので、それらの構造は、極めて高い関心が持たれる。
【００１３】
いくつかの以前の試験方法は、実験を実施するために関与する時間および消費する材料の量に起因して、望ましくなかった。つまり、わずか数回の結晶化実験しか、１人の人間によって１日で設定され得ない。しばしば、多く（数百〜数千）の結晶化条件が、リードを見出すために試験されるので、このような試験方法は、関与する過剰な操作工程数に起因して、望ましくなかった。さらに、このような方法において、試験材料の固有の消費が存在する。これらの試験材料（例えば、脂質およびタンパク質）は、開始するには少ないので、しばしば、この材料の消費は、十分な数の試験の実施を妨げる。
【００１４】
さらに、ＬＣＰ結晶化実験設定における問題は、高い粘性の脂質相材料を物理的に操作する困難性に基づく。例えば、ＬＣＰ材料の機械的特性は、脂質を操作するために通常使用されるピペッティングを容易に可能にしない。また、ＬＣＰは、材料が粘着性でかつ迅速に脱水するので、固体として処理され得ない。しかし、脂質材料は、チキソトロープ性であり、十分な圧力が適用される場合（例えば、容積式シリンジにおいて）に流動する。
【００１５】
以前の脂質中間相結晶化方法におけるいくつかの困難性を軽減するために、本発明の種々の実施形態が開発された。従って、例えば、操作工程は、１回の結晶化設定について消費する材料を減少し、そして／または、行われる試験数を増加するために標準的なマルチウェルプレートの使用を可能にするように、実行され得る。さらに、その関与する操作活動は、自動化に適合性であり、それ故、結晶化設定は、機械による高スループット様式で準備され得る。
【００１６】
本明細書中に記載される本発明の種々の実施形態は、以前の試験手順における固有の問題のいくつかを満足させ得る。例えば、試験目的に必要とされるＬＣＰ材料の量は、いくつかの方法において必要とされる１０〜２０μｌから、０．２μｌに減少され得る。従って、この少ない試験材料の１／５０または１／１００への減少は、実施され得る試験数を劇的に増加し得る。
【００１７】
図１、２、３および４は、粘性材料（例えば、１センチポアズ〜３００，０００センチポアズの範囲の粘度を有する材料（例えば、１００，０００センチポアズ〜３００，０００センチポアズの範囲の粘度を有し得る、ＬＣＰ材料））を調製し、そしてマイクロウェル中にその材料を導入させるための、本発明の１つの実施形態に従うプロセスの概要を例示する。図１において、第１のシリンジ２００（例えば、２５０μｌシリンジ）が、類似または等しい容積サイズを有する第２のシリンジ３００に連結されているのが示される。連結デバイス１００は、第１のシリンジから第２のシリンジへの材料の移動を容易にするように、それぞれのシリンジのバレルを連結しているのが示される。ＬＣＰの調製において、脂質は、一方のシリンジのバレル中に導入され得（例えば、スパチュラを使用することによって）、そしてタンパク質溶液が、第２のシリンジ中に導入され得る。各シリンジが互いのシリンジ内へ交互に材料を押し出すときに、混合が生じる。
【００１８】
図２において、ＬＣＰ混合物が作製されると、このＬＣＰ混合物は、ＬＣＰ材料の分配（例えば、マイクロウェルへの分配）を容易にするように、より小さいシリンジに移され得る。より小さいシリンジの使用は、ＬＣＰをより小さくかつより正確な量で分配するのを補助し、かつより狭い所でシリンジ針を操作するのを可能にする。例えば、図２において、混合されたＬＣＰ材料を含む第１のシリンジ２００は、連結デバイス（５００として示される）によってより小さいシリンジ４００に連結されている。シリンジ２００のプランジャーを押して、ＬＣＰ材料を、連結デバイス５００のチャネルを介してより小さいシリンジ４００に移動させ得る。
【００１９】
図３において、より小さいシリンジ４００は、半自動分配器６００に連結されているのが示される。この分配器６００は、正確な量のＬＣＰ材料を分配するのを可能にする。このような分配操作は、図４に示される。ここでは、半自動分配器６００およびシリンジ４００が、マイクロウェルプレート７００のウェル７１０内にＬＣＰ材料を押し出しているのが示される。次いで、このウェルを使用して、ＬＣＰと結晶化促進剤とを合わせ得る。次いで、得られた結晶を、Ｘ線回析によって試験し、タンパク質の三次元構造を決定し得る。
【００２０】
図５は、図１の連結デバイス１００をより詳細に示す。針１１０が、図１に示される第１のシリンジと第２のシリンジとの間で材料を移動するためのチャネルを提供するにように、この連結デバイスを通されて配置されている。針の長さは、図５において、「Ｌ」として示される。さらに、直径「Ｄ」が、針について示される。連結デバイスは、第１の容器１２０および第２の容器１２２を有する。この実施形態において、第１の容器および第２の容器は、等しいサイズのシリンジバレルへの連結を可能にするように、等しい寸法を有する。代表的なＮａｔｉｏｎａｌ　Ｐｉｐｅ　Ｔｈｒｅａｄ（ＮＰＴ）継手が、シリンジバレルに連結デバイスをねじで取り付けるために利用され得る。図５において、テフロン（登録商標）製のフェルール１２４および１２６のようなフェルールも示され、これは、それぞれ、第１の容器内および第２の容器内でかつ針上に配置され、シリンジのバレルを受容し、そして連結デバイス１００との気密連結を容易にする。矢印で示されるように、第１のテフロン（登録商標）製フェルール１２４が、第１の容器１２０内に配置され得、そして第２のテフロン（登録商標）製フェルール１２６が、第２の容器１２２内に配置され得る。従って、２つのシリンジの確実な連結は、これらのフェルールが操作中にシリンジのバレルに対して配置された場合に、これらのフェルールを利用することによって達成され得る。
【００２１】
図６は、なお別の連結デバイスを例示する。図６における実施形態は、連結本体５１０、第１の容器５１２および第２の容器５２２を有する連結システム（５００として示される）を例示する。第１の容器は、シリンジ５６１のバレルを受けるように適切なサイズである。図６において、このシリンジのバレルは、受容フェルール（５３０として示される）と嵌合する（例えば、操作中の流体の損失を制限するように互いに物理的に配置されるために）ように配置され得る。受容フェルール５３０は、第１の容器５２２に取り付けられる。同様に、第２の別のより小さいシリンジ５６２が、第２の容器５１２に連結され得る。この第２のシリンジはまた、受容フェルール５５０と嵌合し、このフェルール５５０は、第２のシリンジの寸法と適合するように適切なサイズである。チューブ５２０は、第１のシリンジおよび第２のシリンジが連結デバイスによって連結された場合に第１のシリンジから第２のシリンジへの流体の移動を容易にするように、連結デバイスを通して配置される。例えば、チューブは、第１のシリンジおよび第２のシリンジが、連結デバイスに作動的に連結された場合に、第１のシリンジおよび第２のシリンジの両方のバレル内に配置され得る。
【００２２】
図７は、粘性材料（例えば、ＬＣＰ）を分配するために作動可能な、分配針を例示する。この分配針は、粘性材料がシリンジバレルに移された後に、シリンジに連結され得る。図７は、シリンジのバレルを受容するための第１の容器６０２を有する、連結デバイス６００を示す。フェルール６１０が、シリンジのバレルとの連結または嵌合を容易にするように容器中に取り付けられているのが示される。また、長さＮおよび内径Ｘを有する針６２０が、連結本体のフェルール６１０および第１の容器を通して配置されているのが示され、この針６２０は、シリンジ５６２のバレルが第１の容器６０２と作動的に連結される場合に、シリンジのバレル内に配置される。
【００２３】
針は、粘性材料（例えば、ＬＣＰ材料）の分配中にバレルの破損を妨げるような適切なサイズである。つまり、長さＮおよび内径Ｘは、ＬＣＰ材料が針を通して押し出される場合にシリンジの破損を妨げるように、選択され得る。代表的には、針について標準的なサイズ寸法（２６Ｓまたは２２Ｓ（例えば、それぞれ、Ｈａｍｉｌｔｏｎモデル番号８００７５および８００６４））の１つが、内径について使用され得る。１つの実施形態において、針の長さＮは、約２０ｍｍ未満（好ましくは、約１９ｍｍ未満、またはさらにより好ましくは、約１８ｍｍ未満）の長さであり、約０．４ｍｍ〜約０．７２ｍｍの外径、および約０．１０ｍｍ〜約０．１６ｍｍの内径を有するように選択される。
【００２４】
図８において、図６において示される連結デバイス５００の実施形態の断面を例示する。第１の直径を有する第１の容器５２２および第２のより小さい直径を有する第２の容器５１２を有する、連結本体５１０が提供される。チャネルは、連結本体５１０を通る、円筒状の穿孔５３５として示される。図８において、第１の容器および第２の容器は、シリンジからバレルを受容するためのＮＰＴ継手を有するのが示される。さらに、容器は、シリンジのバレルと嵌合するのを容易にするために、フェルールがその容器中に取り付けられるのを可能にする大きさである。同様の構成が、図５の連結デバイス１００に利用され得るが；これらの容器は、等しい大きさのシリンジを収容するように等しいサイズである。
【００２５】
図９は、本発明の１つの実施形態に従ってＬＣＰのような粘性材料を分配するためのプロセスの概要を例示する。このプロセスの準備として、通常、全てのシリンジ、フェルールおよび針が、蒸留水およびエタノールで徹底的に清浄化されていることを確実にする。シリンジの清浄化後、プランジャーを外して、使用前に風乾させる。さらに、シールテープ片を、マイクロウェルを覆うために切り取る。２５０μｌシリンジおよびプランジャーを選択し、そしてこれらを、ミキサー連結（例えば、図５に示される連結）と連結させ得る。この連結は、内側に白色テフロン（登録商標）製のフェルールが取り付けられた状態で、ねじで取り付けられ得る。次いで、この組み合わせは、天秤を較正するために使用され得る。
【００２６】
プランジャーは、再度、２５０μｌシリンジから外される。次いで、脂質アンプルまたは（脂質を含む遠心分離チューブ）を、フリーザーから取り出し得る。この脂質のワックス性のブロックを、使用者の手でアンプルまたはマイクロチューブを温めることによって融解し得る。例えば、モノオレインは、約３６℃で融解する。２００μｌチップと共に標準的な実験用ピペッターを使用して、スクリーニングされるタンパク質の量と等価な量の液体脂質を、取り出し得る。脂質は、そのプランジャーが外された２５０μｌガラスバレルシリンジの後端に注入される。このようにして、ブロック９１０に従って、ある量の脂質が提供され得る。
【００２７】
プランジャーは、２５０μｌシリンジのバレル内に押し戻され、そして地面に対して上方に向けられ、そしてガラスバレル中をゆっくりと上昇される。これは、脂質をバレル中で上昇させ、そして脂質中に捕捉され得るいかなる気泡をも除去する。２５０μｌシリンジを真っ直ぐに保持しながら、プランジャーを注意深く前方に移動させ、脂質が２５０−２５０連結デバイスの末端からちょうど出始めるまで、脂質をシリンジバレルに対して押し込む。これを行っている間に、全ての気泡が除去され得る。次いで、この２５０μｌシリンジを、空の２５０μｌシリンジと連結との組み合わせで０点を合わせた天秤を用いて、脂質と共に計量し；そして脂質の質量を記録する。代表的には、脂質は、約１ｍｇ／ｍｌである。
【００２８】
方法９００のブロック９２０において、タンパク質ストックが提供され得る。例えば、きれいな２５０μｌシリンジに、蒸留水を差し得る。差し水は、長い針を介して２５０μｌシリンジ内に水を吸引することによって達成され得る。この針は、テフロン（登録商標）製フェルールの内側に取り付けられている。シリンジを、地面に対して真っ直ぐ上に向け、そして全ての気泡が除去されるのを確実にするために、シリンジの末端を弾きながら水を押し出す。全ての水が、シリンジから押し出され、過剰な水は、シリンジ針をきれいなティッシュに接触させることによって針の先端から除去される。この水を差した２５０μｌシリンジを使用して、所望の量のタンパク質ストック（例えば、６．０のｐＨを有する１００μｌのリン酸緩衝液）を取り込む。この長い針を、タンパク質をロードした２５０μｌシリンジから注意深く取り外し、シリンジの頭部にテフロン（登録商標）製フェルールを残す。
【００２９】
第２のシリンジにタンパク質ストックをロードすることが達成されると、方法９００のブロック９３０に例示されるように、脂質およびタンパク質ストックを混合し、脂質立方相を形成し得る。これは、例えば、タンパク質をロードした２５０μｌシリンジを、連結デバイスの第２の容器に連結させることによって達成され得る。この容器には、脂質をロードした２５０μｌシリンジが既に連結されている。このタンパク質ストックを含むシリンジは、連結デバイスに対して過剰に締め付けないようにする。なぜなら、この締め付けが、シリンジを亀裂させ得るからである。脂質立方相は、タンパク質溶液を脂質と混合することによって作製される。これは、頭部同士を連結した２５０μｌシリンジのプランジャーを、数回前後に押し引きすることによって達成され得る。例えば、１回の押し引きが、室温（２５℃）にて毎秒行われ得る。最初の数回の押し引きの間に、混合物は、白色で濁るように変化するはずである。シリンジの先端は、漏れが検出されていないことを確かめるためにチェックされ得る。ゆっくりと押し引きし、そして過剰な力を与えないことによって、このアセンブリの破損を回避し得る。押し引きは、ＬＣＰ材料のいくらかが透明になり始めるまで、前後に継続させる（代表的には、１０回〜２０回の押し引き）。これは、ＬＣＰが形成し始めていることを示す。押し引きは、連結されたシリンジに対して角度的応力を生じないよう注意深く、約１００サイクル前後に継続する。良好な透明の混合物（例えば、濁った領域が残存しない）を得るために、代表的には、少なくとも５０〜１００サイクル必要とする。混合物が全体的には透明でない場合、連結されたシリンジの冷却（例えば、その連結されたシリンジを冷蔵庫に置くか、または数分間ベンチトップ上に放置することによって）を行い得る。使用者の手からの熱は、シリンジを温め得、これは、透明な立方体の相が形成されるのを困難にする。シリンジが冷却されると、押し引きを開始して、透明な立方相の均一な混合が得られ得る。
【００３０】
外部の熱から粘性混合物を遮断するのに有用な１つの材料は、ＰＥＥＫのような非金属性材料である。このＰＥＥＫ材料は、これらのデバイス（特に、連結デバイス）を成形するのに使用され得る。これは、実験作業者の指から粘性材料に熱が容易に移動しない耐久性の材料である。従って、これは、ＬＣＰ材料の調製のスピード化を補助する。なぜなら、ＬＣＰ材料が冷却するのを待つ必要がそれほどないからである。さらに、これは、熱の発生を回避することによって、弱いタンパク質材料に対する損傷を回避するのに有用であり得る。
【００３１】
ＬＣＰの作製を達成すると、ＬＣＰを、分配デバイス（例えば、より小さいシリンジ）に移し得る。方法９００のブロック９４０において、ＬＣＰは、分配ユニット（例えば、１０μｌシリンジ）に移される。（この１０μｌシリンジを、ＬＣＰを混合するために使用するのは難しい。なぜなら、開口部が小さすぎるので、脂質材料を（例えば、スパチュラを用いて）容易に導入し得ないからである；しかし、これらは、少量のＬＣＰ材料の正確な分配を可能にする）。ＬＣＰを含むシリンジおよび空のシリンジの現存している連結は、取り外されて、これによって、ＬＣＰ材料をなお含む連結から、１本の２５０μｌシリンジが取り外される。次いで、２５０μｌ−１０μｌシリンジ連結を、ＬＣＰを含む２５０μｌシリンジにねじで取り付ける。この組み合わせは、図６について議論されたように、２５０μｌシリンジのテフロン（登録商標）製フェルールを用いて気密密着を形成するように、指で締め付けられる。次いで、１０μｌシリンジを、同様に、連結デバイスと連結させる。これは、１０μｌシリンジを反復分配器（例えば、Ｈａｍｉｌｔｏｎによって製造される半自動分配器Ｍｏｄｅｌ　ＰＢ６００）内に最初に組み立てることによって達成され得る。この反復分配器は、その印付きの棒および十分に伸ばされるプランジャーアームから構成される。ドーナツ状のシリンジホルダーナットを使用して、１０μｌシリンジを反復分配器に手で締め付ける。次いで、ＬＣＰをロードした２５０μｌシリンジに対して既にねじで取り付けられた連結デバイスを、反復分配器中に取り付けた１０μｌシリンジに対してねじで取り付ける。次いで、これらの連結を、穏やかに手で締め付ける。次いで、２５０μｌシリンジのプランジャーを、穏やかに押し、これによって、ＬＣＰ材料を１０μｌシリンジに押し入れる。１０μｌシリンジのプランジャーを穏やかに引くことが、しばしば、有効である。なぜなら、陽圧が、２５０μｌシリンジのプランジャーに対して付与されるからである。これは、１０μｌシリンジのＬＣＰ充填を容易にする。このシリンジプランジャーは、バレルの上部（９〜１０μｌの目印）に到達すると、シリンジプランジャーの金属の先端が、反復分配器のプランジャーアーム中の穴に入るように向けられる。次いで、ロックねじを、プランジャーをプランジャーアームに保持するように締め付ける。プランジャーの方向におけるわずかな変更が、プランジャーでの密接した適合を確実にするために必要とされ得る。
【００３２】
この段階で、方法９００のブロック９５０に示されるように、ここで、ＬＣＰが分配され得る。２つのシリンジは、互いに取り外され、２５０μｌシリンジに連結された連結ユニットと、反復分配器に連結された１０μｌシリンジとを引き離す。小さいテフロン（登録商標）製フェルールは、１０μｌシリンジの先端に残される。次いで、短いシリンジ針（図７に示されるように）を、１０μｌシリンジのテフロン（登録商標）製フェルール上に組み立て、そしてナットを用いて手で締め付ける。次いで、使用者がその短いスチール針から立方相が出るのを確認し得るように、分配器を数回クリックする。これが生じる場合、ＬＣＰのヘビ状の糸が、針から押し出される。
【００３３】
ＬＣＰ材料を分配する前に、結晶化促進剤が導入される。これは、マイクロシリンジピペットを使用して、結晶化剤の１μｌアリコートを結晶化プレートの液滴チャンバに移すことによって達成され得る。プレートのシールは、必要に応じて、この操作のために残され得る。分配は、以下の工程によって達成され得る：（１）マイクロシリンジをプランジャーに対して十分押し込む；（２）所望の結晶化剤についてのプレートシール入口孔を通して針を突き刺す；（３）プランジャーを解除し、マイクロシリンジ内に２μｌの結晶化剤を引き込む；および（４）マイクロシリンジをシールから引き出し、そしてそれを使用して、１μｌの結晶化剤を所望のプレート液滴チャンバ位置に分配する。結晶化剤の相互汚染を防止するために、各結晶化剤を分配する前に、１０ｍｌプールの水で３回の迅速な充填／分配サイクルを行う。Ｎｕｎｃ製の７２ウェルＴｅｒａｓａｋｉプレートを使用する場合、各結晶化剤溶液の１μｌをある列の６ウェルに充填する。Ｃｌｏｖｅｒプレートを使用する場合、各結晶化剤溶液の１μｌをある列の８ウェルに充填する。
【００３４】
次いで、ＬＣＰを、各ウェル内に分配し得る。例えば、ＬＣＰをロードした反復分配器から、結晶化剤を含む各液滴チャンバ中の結晶化溶液中に、２００ナノリットルのＬＣＰを注入する。結晶化剤の相互汚染を防止するために、各分配工程の間に１０ｍｌプールの水にシリンジの先端をつけ、吸収性のティッシュ上に押し当てて乾かす。次いで、液滴チャンバを、シールテープでシールし得る。次いで、ＬＣＰ結晶化プレートを、−１０℃と５０℃との間で、または、代表的には、４℃と２５℃との間で、観察を行う時間まで保存し得る。
【００３５】
ＬＣＰ材料は、種々の異なるコンテナに分配され得る。例えば、マイクロタイタープレート（例えば、９６ウェルプレート、１５３６ウェルプレートなど）が使用され得る。これらに加えて、代替的なフットプリントもまた使用され得る。さらに、マイクロアレイが、コンテナとして利用され得る。従って、ＬＣＰ材料は、マイクロアレイ上に沈着され、複数の異なる試験手順が実施されるのを可能にし得る。さらに、ロボットを使用して、ＬＣＰ材料および関連する試験溶液を沈着し得る。従って、複数のシリンジを使用して、ＬＣＰ試験を用いる使用のための異なる化学物質を分配し得る。同様に、ＬＣＰの機械化分配は、コンピュータ上に格納されたソフトウェアの使用を介して達成され得る。
【００３６】
図１０は、脂質およびタンパク質ストックを混合する方法のより詳細な図を例示する。方法１０００のブロック１０１０において、第１のシリンジを連結するのに作動可能な第１の容器が、連結デバイスに提供される。ブロック１０２０に例示されるように、この連結デバイスにはまた、第２のシリンジを連結するのに作動可能な第２の容器が提供される。ブロック１０３０に例示されるように、チャネルが、第１の容器と第２の容器との間に配置され、第１の容器と第２の容器との間に流体が流れるのを可能にする。例えば、ブロック１０４０に示されるように、針が、そのチャネル中に配置され得る。ブロック１０５０において、第１のシリンジが、第１の容器に連結され、一方、ブロック１０６０に例示されるように、第２のシリンジが、第２の容器に連結される。次いで、脂質およびタンパク質ストックは、各シリンジのプランジャーを反復的かつ交互に押し込むことによって混合され得る。粘性材料が形成され得、そして第１のシリンジから第２のシリンジへ、および第２のシリンジから第１のシリンジへ移動され得る。このプロセスは、例えば、ＬＣＰ材料が形成されるまで、繰り返され得る。
【００３７】
同様に、図１１ａおよび１１ｂは、粘性材料（例えば、ＬＣＰ材料）を移動および分配するための方法１１００を例示する。ブロック１１１０において、第１のシリンジが提供され、これは、ＬＣＰ材料を含む。ブロック１１２０において、連結デバイスが提供され、そしてブロック１１３０に例示されるように、この連結デバイスは、その連結上の容器を利用して第１のシリンジに連結される。ブロック１１４０において、第２のシリンジが提供され、これは、第１のシリンジの容積サイズよりも小さい容積サイズを有する。この第２のシリンジもまた、例えば、連結デバイスの容器を用いて、この連結デバイスに連結される。次いで、ブロック１１６０に示されるように、圧力を用いて、粘性材料の一部を第１のシリンジから第２のシリンジに移し得る。
【００３８】
粘性材料が第１のシリンジから第２のシリンジに移された後、ブロック１１７０に示されるように、第２のシリンジは、第１のシリンジから分離され得る。次いで、ブロック１１８０に示されるように、針が提供され得る。次いで、ブロック１１８４に例示されるように、針および第２のシリンジは、互いに連結され得る。次いで、ブロック１１８６および１１８８にそれぞれ示されるように、反復分配器が提供され得、第２のシリンジが、その分配器内に設置され得る。次いで、ブロック１１９０に示されるように、マルチウェルプレートが提供され、次いで、ブロック１１９２に示されるように、反復分配器を使用して、マルチウェルプレート上に粘性材料部分を分配し得る。さらに、ブロック１１９４に示されるように、結晶化促進材料が添加され得る。粘性材料は、結晶化促進材料を分配する前にマルチウェルプレートに分配される必要はなく；むしろ、これらは、いずれの順序でも分配され得る。
【００３９】
本発明の別の実施形態において、粘性材料（例えば、ＬＣＰ）の混合および分配を容易にするように、これらの装置の様々な要素がキット形式で提供され得る。従って、上記の種々の要素が、任意の組み立てられていない組み合わせで、キットとして提供され得る。
【００４０】
種々の実施形態を、２５０μｌシリンジおよび１０μｌシリンジに関して説明してきたが、他のサイズをそれらに代わって使用することも可能である。さらに、シリンジを用いて本発明を説明してきたが、他のデバイスも同様に使用され得ることが理解されるべきである。従って、シリンジが、閉じたチャンバを有する任意の容量測定デバイスを包含することが意図され、それらが、上記のように、粘性材料（例えば、ＬＣＰ）を移すために使用され得ることが理解されるべきである。
【００４１】
本発明の実施形態の装置および方法ならびにそれに付随する利点の多くは、本明細書から理解されると考えられ、そして種々の変化が、本発明の精神および範囲から逸脱することも、その材料の利点の全てを犠牲にすることもなく、本発明の部分の形態、構築および配置においてなされ得、先に記載の本明細書中の形態が、本発明の単なる例示的な実施形態であることは明らかである。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、連結デバイスを介して連結された２つのシリンジを利用して粘性材料（例えば、ＬＣＰ）を混合するための、本発明の実施形態を例示する。
【図２】図２は、図１の混合された材料を大きいシリンジからより小さいシリンジに移すための、本発明の実施形態を例示する。
【図３】図３は、図２のより小さいシリンジが反復性の微量分配デバイスに連結されている、本発明の実施形態を例示する。
【図４】図４は、図３の小さいシリンジからウェルプレート（例えば、マイクロウェルプレート）へ材料を分配するための、本発明の実施形態を例示する。
【図５】図５は、等しいサイズの２つのシリンジを連結するために利用される、本発明の実施形態を例示する。
【図６】図６は、異なるサイズの２つのシリンジを連結するための、本発明の実施形態を例示する。
【図７】図７は、シリンジ上の分配針として使用するための、本発明の実施形態を例示する。
【図８】図８は、図６に示される本発明の実施形態の断面図である。
【図９】図９は、本発明の１つの実施形態に従ってＬＣＰまたは他の粘性材料を分配する方法のためのフローチャートを例示する。
【図１０】図１０は、本発明の１つの実施形態に従って粘性材料を混合する方法のためのフローチャートを例示する。
【図１１】図１１ａおよび１１ｂは、本発明の１つの実施形態に従って粘性材料を移す方法のためのフローチャートを例示する。
【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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