(57)【要約】本発明は、グルココルチコイドレセプター（ＧＲ）のトランス活性化活性を選択的にアンタゴナイズし、トランス抑制活性に影響しないグルココルチコイドレセプターリガンドの使用に関する。このプロフィールを有する化合物は、炎症及び免疫疾患の治療において従来のグルココルチコイドとの共投薬として使用することができる。この組み合わせ治療の利点は、グルココルチコイドの代謝的副作用がアンタゴナイズされ、グルココルチコイドの抗炎症又は抗免疫活性のみが保持されることにある。そのような組み合わせ治療においては、グルココルチコイドをより高い投与量で使用して、より良好な治療効果を奏することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
グルココルチコイド感受性標的遺伝子のグルココルチコイドレセプター（ＧＲ）介在トランス活性化においてアンタゴニスト活性を有するがアゴニスト活性を有さず、ＧＲ介在トランス抑制においてアンタゴニスト活性を有さないＧＲリガンドであって、｛３，５−ジブロモ−４−［５−イソプロピル−４−メトキシ−２−（３−メチル−ベンゾイル）−フェノキシ］フェニル｝−酢酸でないリガンド。
【請求項２】
炎症誘発又は免疫強化活性を有する遺伝子より選ばれるグルココルチコイド感受性標的遺伝子、例えば、炎症又は自己免疫疾患を含む免疫障害にそれぞれ関与するサイトカイン又は接着分子又は酵素をコードする遺伝子のグルココルチコイドレセプター（ＧＲ）介在トランス活性化においてアンタゴニスト活性を有するがアゴニスト活性を有さず、ＧＲ介在トランス抑制においてアンタゴニスト活性を有さない請求項１に記載のＧＲリガンド。
【請求項３】
グルココルチコイド投薬を必要とする、ヒトを含む哺乳類対象体を治療する方法であって、グルココルチコイド感受性標的遺伝子のグルココルチコイドレセプター（ＧＲ）介在トランス活性化においてアンタゴニスト活性を有するがアゴニスト活性を有さず、ＧＲ介在トランス抑制においてアンタゴニスト活性を有さないＧＲリガンドを、薬学的活性量で、共投薬として、該対象体に投与することを含む方法。
【請求項４】
前記リガンドが、｛３，５−ジブロモ−４−［５−イソプロピル−４−メトキシ−２−（３−メチル−ベンゾイル）−フェノキシ］フェニル｝−酢酸である請求項３に記載の方法。
【請求項５】
ヒトを含む哺乳類対象体のグルココルチコイド投薬に関連する副作用を防止又は抑制する方法であって、グルココルチコイド感受性標的遺伝子のグルココルチコイドレセプター（ＧＲ）介在トランス活性化においてアンタゴニスト活性を有するがアゴニスト活性を有さず、ＧＲ介在トランス抑制においてアンタゴニスト活性を有さないＧＲリガンドを、有効量で、共投薬として、該対象体に投与することを含む方法。
【請求項６】
前記リガンドが、｛３，５−ジブロモ−４−［５−イソプロピル−４−メトキシ−２−（３−メチル−ベンゾイル）−フェノキシ］フェニル｝−酢酸である請求項５に記載の方法。
【請求項７】
グルココルチコイド感受性標的遺伝子のグルココルチコイドレセプター（ＧＲ）介在トランス活性化においてアンタゴニスト活性を有するがアゴニスト活性を有さず、ＧＲ介在トランス抑制においてアンタゴニスト活性を有さないＧＲリガンドを含み、及び場合によりグルココルチコイドを含んでもよい医薬組成物。
【請求項８】
前記リガンドが、｛３，５−ジブロモ−４−［５−イソプロピル−４−メトキシ−２−（３−メチル−ベンゾイル）−フェノキシ］フェニル｝−酢酸である請求項７に記載の医薬組成物。
【請求項９】
ヒトを含む哺乳類対象体の炎症疾患又は自己免疫疾患を含む免疫疾患の治療における、又は、グルココルチコイドでの治療が必要とされる臨床状態の該対象体の治療における、グルココルチコイド薬剤との組み合わせでの共投薬としての、グルココルチコイド感受性標的遺伝子のグルココルチコイドレセプター（ＧＲ）介在トランス活性化においてアンタゴニスト活性を有するがアゴニスト活性を有さず、ＧＲ介在トランス抑制においてアンタゴニスト活性を有さないＧＲリガンドの使用。
【請求項１０】
ヒトを含む哺乳類対象体の呼吸性疾患、リウマチ様疾患、自己免疫疾患、アレルギー、血管疾患、皮膚疾患、胃腸管疾患、腎疾患、肝疾患、眼疾患、耳疾患、神経疾患、内分泌疾患、ショック、悪性腫瘍、移植、糖尿病及び肥満の治療における、グルココルチコイド薬剤との組み合わせでの共投薬としての、グルココルチコイド感受性標的遺伝子のグルココルチコイドレセプター（ＧＲ）介在トランス活性化においてアンタゴニスト活性を有するがアゴニスト活性を有さず、ＧＲ介在トランス抑制においてアンタゴニスト活性を有さないＧＲリガンドの使用。
【請求項１１】
前記リガンドが、｛３，５−ジブロモ−４−［５−イソプロピル−４−メトキシ−２−（３−メチル−ベンゾイル）−フェノキシ］フェニル｝−酢酸である請求項９又は１０に記載の使用。
【請求項１２】
ヒトを含む哺乳類対象体の炎症疾患又は自己免疫疾患を含む免疫疾患の治療用、又は、グルココルチコイドでの治療が必要とされる臨床状態の該対象体の治療用医薬組成物を製造するための、グルココルチコイド薬剤との組み合わせでの共投薬としての、グルココルチコイド感受性標的遺伝子のグルココルチコイドレセプター（ＧＲ）介在トランス活性化においてアンタゴニスト活性を有するがアゴニスト活性を有さず、ＧＲ介在トランス抑制においてアンタゴニスト活性を有さないＧＲリガンドの使用。
【請求項１３】
ヒトを含む哺乳類対象体の呼吸性疾患、リウマチ様疾患、自己免疫疾患、アレルギー、血管疾患、皮膚疾患、胃腸管疾患、腎疾患、肝疾患、眼疾患、耳疾患、神経疾患、内分泌疾患、ショック、悪性腫瘍、移植、糖尿病及び肥満の治療用医薬組成物を製造するための、グルココルチコイド薬剤との組み合わせでの共投薬としての、グルココルチコイド感受性標的遺伝子のグルココルチコイドレセプター（ＧＲ）介在トランス活性化においてアンタゴニスト活性を有するがアゴニスト活性を有さず、ＧＲ介在トランス抑制においてアンタゴニスト活性を有さないＧＲリガンドの使用。
【請求項１４】
前記リガンドが、｛３，５−ジブロモ−４−［５−イソプロピル−４−メトキシ−２−（３−メチル−ベンゾイル）−フェノキシ］フェニル｝−酢酸である請求項１２又は１３に記載の使用。
【請求項１５】
解離したグルココルチコイドレセプター（ＧＲ）アンタゴニストのスクリーニング方法であって、
ａ）候補物質をＧＲと接触させること；
ｂ）候補物質のＧＲに対する結合を測定すること；
ｃ）ＧＲに対して結合親和性を有する候補物質を選択すること；
ｄ）グルココルチコイド感受性標的遺伝子のＧＲ介在トランス活性化における、選択された候補物質の活性を測定すること；
ｅ）トランス活性化においてアンタゴニスト活性を有するがアゴニスト活性を有さない候補物質を選択すること；
ｆ）グルココルチコイド感受性標的遺伝子のＧＲ介在トランス抑制における、選択された候補物質の活性を測定すること；及び
ｇ）トランス抑制におけるアンタゴニスト活性を有さない候補物質を選択すること
を含む方法。
【請求項１６】
ＧＲ介在トランス活性化により、ラット肝細胞腫におけるチロシンアミノトランスフェラーゼ（ＴＡＴ）の誘発、又は、ＨｅＬａ細胞におけるＭＭＴＶ（マウス乳腺癌ウイルス）プロモーターの刺激が生じる請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
ＧＲ介在トランス抑制により、炎症誘発又は免疫強化活性を有する遺伝子、例えば、炎症又は自己免疫疾患を含む免疫障害にそれぞれ関与するサイトカイン又は接着分子又は酵素をコードする遺伝子の抑制が生じる請求項１５又は１６に記載の方法。
【請求項１８】
ＧＲ介在トランス抑制により、ＨｅＬａ細胞におけるＴＮＦ−α−誘発性のＩＣＡＭ−１プロモーター活性の抑制、又は、ＴＨＰ１−細胞におけるＬＰＳ−誘発性のＩＬ−８生成の抑制が生じる請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
更に、候補物質をグルココルチコイド薬剤と共に対象体へ共投与し、かつ、候補物質がグルココルチコイドの全身性副作用を低減するがグルココルチコイドの抗炎症活性を保持する能力を測定することによるインビボでの候補物質の試験を行う工程を含む請求項１５〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
高速処理スクリーニングアッセイ（ＨＴＳ）である請求項１５〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
治療を必要とするヒトを含む哺乳類対象体を治療する方法であって、呼吸性疾患、リウマチ様疾患、自己免疫疾患、アレルギー、血管疾患、皮膚疾患、胃腸管疾患、腎疾患、肝疾患、眼疾患、耳疾患、神経疾患、内分泌疾患、ショック、悪性腫瘍、移植、糖尿病又は肥満より選ばれる状態の該対象体に対して、グルココルチコイド薬剤との組み合せでの共投薬として、グルココルチコイド感受性標的遺伝子のグルココルチコイドレセプター（ＧＲ）介在トランス活性化においてアンタゴニスト活性を有するがアゴニスト活性を有さず、ＧＲ介在トランス抑制においてアンタゴニスト活性を有さないＧＲリガンドを投与することを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明は、選択的に、グルココルチコイドレセプター（ＧＲ）のトランス活性化活性（ｔｒａｎｓａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ａｃｔｉｖｉｔｙ）にアンタゴナイズし、トランス抑制活性（ｔｒａｎｓｒｅｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｃｔｉｖｉｔｙ）に影響しないグルココルチコイドレセプターリガンド（“解離した（ｄｉｓｓｏｃｉａｔｅｄ）ＧＲアンタゴニスト”）の使用に関する。このプロフィールを有する化合物は、炎症又は免疫疾患の治療において、従来のグルココルチコイドとの共投薬（ｃｏ−ｍｅｄｉｃａｔｉｏｎ）として使用することができる。この組み合わせ療法の利点は、グルココルチコイドの代謝的副作用がアンタゴナイズされ、グルココルチコイドの抗炎症又は免疫抑制活性のみが保持されることにある。そのような組み合わせ療法においては、より高い投与量でグルココルチコイドを使用して、より優秀な治療効果を達成することができる。
【０００２】
発明の背景
グルココルチコイドはよく知られており、急性及び慢性炎症性疾患、例えば、喘息、リウマチ様関節炎、炎症性腸疾患、多発性硬化症及びアトピー性皮膚炎の治療用に使用されることが多い。抗炎症治療についての新たな標的を調べる多大な労力にもかかわらず、現在及び近い将来では結局グルココルチコイドが、その広範な治療範囲及び優秀な治療効果のために炎症性疾患治療用薬剤として最も重要なものとされるであろう。不運にも、少なくとも１つのグルココルチコイドでの長期的な全身及び局所的治療は、その副作用のために制限される。
グルココルチコイドの全身及び局所適用に関連する最も共通の副作用は、ＨＰＡ軸の抑制及び２次副腎抑制誘発の危険を含む代謝作用、誘発される糖新生、誘発されるアミノ酸分解、電解質濃度の変化、脂質代謝における変化、成長遅延、骨粗鬆症、創傷治癒の障害を含むスキン効果、及びスキンシニング（ｓｋｉｎ ｔｈｉｎｎｉｎｇ）である。
【０００３】
分子レベルで、グルココルチコイドレセプター（ＧＲ）は、ＧＲ、熱ショックタンパク及びイムノフィリンからなる複数タンパクの複合体の一部として局在している。グルココルチコイドのＧＲへの結合により、この複合体からのＧＲの放出及びＧＲの核へのトランスロケーションが誘発される。
リガンド活性化レセプターダイマーは、グルココルチコイド調節遺伝子のプロモーター領域において特定のＤＮＡ配列（グルココルチコイド応答部位、ＧＲＥ）へ結合することにより、及び、他のトランス活性化部位及び転写開始複合体成分との相互作用（ＧＲの活性をトランス活性化すること）により、遺伝子発現を活性化する。
リガンド活性化レセプターは、また、標的遺伝子の転写を抑制するが、これは、ネガティブなグルココルチコイド応答部位（ｎＧＲＥ）への結合により、又は、ＤＮＡへの結合なしでの、ポジティブに作用する転写部位、例えば、ＮＦ−ｋＢ、ＡＰ−１による直接的なタンパク−タンパク相互作用（ＧＲのトランス抑制活性）による。ＧＲは、そのモノマー形態で標的遺伝子をトランス抑制することができるが、ＤＮＡ結合のためには、ＧＲのダイマー化又はトリマー化が必要とされる。
【０００４】
グルココルチコイドがその抗炎症活性に介在する主要なメカニズムは、炎症過程に関与するサイトカイン（例えば、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１０、ＩＬ−６、ＩＬ−８及びＲＡＮＴＥＳ）、接着分子（例えば、ＩＣＡＭ−１、ＶＣＡＭ）及び酵素（例えば、ＣＯＸ−２）をコードする遺伝子の転写であるが（最近の所見として、Ｂａｒｎｅｓ， ＰＪ， Ｃｌｉｎ． Ｓｃｉｅｎｃｅ， ９４， ５５７−５７２ （１９９８）； Ｒｅｓｃｈｅ−Ｒｉｇｏｎ， Ｍ ａｎｄ Ｇｒｏｎｅｍｅｙｅｒ， Ｈ， Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｃｈｅｍ． Ｂｉｏｌ．， ２， ５０１−５０７ （１９９８）； Ｃａｔｏ， ＡＣ ａｎｄ Ｗａｄｅ， ＥＤ， Ｂｉｏｅｓｓａｙｓ， １８， ３７１−８ （１９９６）； Ｂａｒｎｅｓ ＰＪ ａｎｄ Ａｄｃｏｃｋ Ｊ， Ｔｒｅｎｄｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． Ｓｃｉ．， １４： ４３６−４４１ （１９９３）参照）、グルココルチコイドの副作用は、主に、ＧＲ−ＤＮＡ−相互作用（トランス活性化）に介在するとされる。
従って、ＧＲのトランス抑制活性のみ又はそれを主に誘発するグルココルチコイドがより低い副作用を示すであろうことが想定されるのが合理的である。
それを必要とする対象体での種々の医薬用途におけるグルココルチコイドの既知の緩和又は治癒効果のために、グルココルチコイドの副作用を低減し得る化合物を得ることが望まれる。
【０００５】
発明の記載
本発明は、ヒトを含む哺乳類対象体において、グルココルチコイド投薬に関連する副作用を防止又は抑制する方法であって、グルココルチコイド感受性標的遺伝子のグルココルチコイドレセプター（ＧＲ）介在トランス活性化においてアンタゴニスト活性を有するがアゴニスト活性を有さず、ＧＲ介在トランス抑制においてアンタゴニスト活性を有さないＧＲリガンドを、有効量で、共投薬として、該対象体に投与することを含む方法を提供する。
本発明における“アンタゴニスト”は、ＧＲに結合し、それにより、内在性又は外来性アゴニストの結合を防止する物質であってもよい。
本発明における“アゴニスト”は、ＧＲに結合することにより、既知のグルココルチコイド介在性細胞作用を誘発する内在性又は外来性グルココルチコイドであってもよい。
【０００６】
本発明における“部分的アゴニスト”は、ＧＲに結合し、かつ、アゴニスト及びアンタゴニスト活性を示す物質である。
本発明の“共投薬”は、本発明のリガンド少なくとも１つと一緒にグルココルチコイドを処置することであってもよく、それは、両者の同時処置、又は、同時ではない処置、例えば、適切なグルココルチコイドの処置前又は後に本発明のリガンドを用い得る処置を意味する。
本発明におけるリガンドの有効量は、グルココルチコイド処置により生じる少なくとも１つの副作用を低減するのに十分であり、低減されるべき副作用より有害な別の副作用を誘発しない薬理学的に活性な量である。
本発明における副作用は、治療される対象体にとって不快な又はネガティブな、グルココルチコイドの処置により生じる各作用であってもよい。
【０００７】
本発明は、また、前記トランス抑制活性を保持しながら、前記トランス活性化活性（ｔｒａｎｓａｃｔｉｎｇ ａｃｔｉｖｉｔｙ）を低減し得る物質を提供する。そのような本発明の物質は、また、“本発明のリガンド”と称され、グルココルチコイド感受性標的遺伝子のグルココルチコイドレセプター（ＧＲ）介在トランス活性化においてアンタゴニスト活性を有するがアゴニスト活性を有さず、ＧＲ介在トランス抑制においてアンタゴニスト活性を有さないＧＲリガンドである。前記リガンドの好ましい例は、｛３，５−ジブロモ−４−［５−イソプロピル−４−メトキシ−２−（３−メチル−ベンゾイル）−フェノキシ］フェニル｝−酢酸である。
治療にグルココルチコイドのトランス抑制活性を主に又はそれのみを使用する目的は、本発明に従って、選択的にＧＲのトランス活性化活性のみを抑制し、かつ、トランス抑制活性を抑制しない物質（“解離したＧＲアンタゴニスト”）を確認することにより達成することができる。
【０００８】
他の実施態様においては、本発明は、グルココルチコイド副作用を低減する本発明のリガンドの所望の機能を有する物質を確認する方法を提供する。
そのような本発明の方法は、解離したグルココルチコイドレセプター（ＧＲ）アンタゴニストのスクリーニング方法であって、
ａ）候補物質をＧＲと接触させること；
ｂ）候補物質のＧＲに対する結合を測定すること；
ｃ）ＧＲに対して結合親和性を有する候補物質を選択すること；
ｄ）グルココルチコイド感受性標的遺伝子のＧＲ介在トランス活性化における、選択された候補物質の活性を測定すること；
ｅ）トランス活性化においてアンタゴニスト活性を有するがアゴニスト活性を有さない候補物質を選択すること；
ｆ）グルココルチコイド感受性標的遺伝子のＧＲ介在トランス抑制における、選択された候補物質の活性を測定すること；及び
ｇ）トランス抑制におけるアンタゴニスト活性を有さない候補物質を選択すること
を含む方法であってもよい。
【０００９】
本発明の好ましいＧＲ介在トランス活性化により、例えば、ラット肝細胞種におけるチロシンアミノトランスフェラーゼの誘導、又は、例えば、Ｈｅｌａ細胞におけるＭＭＴＶ（マウス乳腺癌ウイルス）プロモーターの刺激がもたらされる。
本発明の好ましいＧＲ介在トランス抑制により、例えば、炎症誘発又は免疫強化活性を有する遺伝子、例えば、炎症又は例えば自己免疫疾患を含む免疫障害にそれぞれ関与するサイトカイン又は接着分子又は酵素をコードする遺伝子の抑制がもたらされる。例えば、トランス抑制により、Ｈｅｌａ細胞におけるＴＮＦ−α誘発性ＩＣＡＭ−１プロモーター活性の抑制、又は、例えば、ＴＨＰ−１細胞におけるリポポリサッカライド（ＬＰＳ）誘発性インターロイキン−８（ＩＬ−８）生成の阻害がもたらされ得る。
本発明における“グルココルチコイド感受性標的遺伝子”は、例えば、炎症誘発又は免疫強化活性を有する遺伝子、例えば、炎症又は例えば自己免疫疾患を含む免疫障害にそれぞれ関与するサイトカイン又は接着分子又は酵素をコードする遺伝子であってもよい。
【００１０】
本発明は、解離したＧＲアンタゴニスト、即ち、グルココルチコイド感受性標的遺伝子のグルココルチコイドレセプター（ＧＲ）介在トランス活性化においてアンタゴニスト活性を有するがアゴニスト活性を有さず、ＧＲ介在トランス抑制においてアンタゴニスト活性を有さないＧＲリガンドを提供し、それは、上記スクリーニング法を用いて見い出すことができ、また、異化の薬学的プロフィールを示し得る：
−グルココルチコイドレセプターに対する高い親和性、
−ＧＲによる標的プロモーターのトランス活性化においてアンタゴニスト活性だが、アゴニスト活性でない（トランス活性化における十分なアンタゴニスト）、及び
−ＧＲによる標的プロモーターのトランス抑制においてアンタゴニスト活性でない。
本発明の前記物質は、全体的な活性によりトランス抑制においてアンタゴニズムが生じない限り、トランス抑制におｋてアゴニスト又は部分アゴニスト活性を有していてもよく又は有していなくてもよい。
前記リガンドの好ましい例は、｛３，５−ジブロモ−４−［５−イソプロピル−４−メトキシ−２−（３−メチル−ベンゾイル）−フェノキシ］フェニル｝−酢酸である。
【００１１】
所望の薬理学的プロフィイールを示す物質は、その後、候補物質をグルココルチコイド薬剤と共に対象体へ共投与し、かつ、候補物質がグルココルチコイドの副作用、好ましくは全身性副作用を低減するが、グルココルチコイドの抗炎症活性を保持する能力を測定することによるインビボ試験に付することができる。
他の態様においては、本発明は、ヒトを含む哺乳類対象体における、
−炎症性障害又は疾患、
−自己免疫疾患を含む免疫障害又は疾患、
−グルココルチコイドでの治療が必要とされる臨床状態、
−疾患、例えば、呼吸性疾患、リウマチ様疾患、自己免疫疾患、アレルギー、血管疾患、皮膚疾患、胃腸管疾患、腎疾患、肝疾患、眼疾患、耳疾患、神経疾患、内分泌疾患、ショック、悪性腫瘍、移植、糖尿病及び肥満、
の治療における、少なくとも１つのグルココルチコイド薬剤との共投薬としての、解離したＧＲアンタゴニストの使用に関する。
【００１２】
本発明は、また、ヒトを含む哺乳類対象体の炎症疾患又は自己免疫疾患を含む免疫疾患の治療用、又は、グルココルチコイドでの治療が必要とされる臨床状態の該対象体の治療用医薬組成物を製造するための、グルココルチコイド薬剤との組み合わせでの共投薬としての、グルココルチコイド感受性標的遺伝子のグルココルチコイドレセプター（ＧＲ）介在トランス活性化においてアンタゴニスト活性を有するがアゴニスト活性を有さず、ＧＲ介在トランス抑制においてアンタゴニスト活性を有さないＧＲリガンドの使用に関する。
本発明は、また、ヒトを含む哺乳類対象体の呼吸性疾患、リウマチ様疾患、自己免疫疾患、アレルギー、血管疾患、皮膚疾患、胃腸管疾患、腎疾患、肝疾患、眼疾患、耳疾患、神経疾患、内分泌疾患、ショック、悪性腫瘍、移植、糖尿病及び肥満の治療用医薬組成物を製造するための、グルココルチコイド薬剤との組み合わせでの共投薬としての、グルココルチコイド感受性標的遺伝子のグルココルチコイドレセプター（ＧＲ）介在トランス活性化においてアンタゴニスト活性を有するがアゴニスト活性を有さず、ＧＲ介在トランス抑制においてアンタゴニスト活性を有さないＧＲリガンドの使用に関する。
【００１３】
本発明は、また、治療を必要とするヒトを含む哺乳類対象体を治療する方法であって、呼吸性疾患、リウマチ様疾患、自己免疫疾患、アレルギー、血管疾患、皮膚疾患、胃腸管疾患、腎疾患、肝疾患、眼疾患、耳疾患、神経疾患、内分泌疾患、ショック、悪性腫瘍、移植、糖尿病又は肥満より選ばれる状態の該対象体に対して、グルココルチコイド薬剤との組み合せでの共投薬として、グルココルチコイド感受性標的遺伝子のグルココルチコイドレセプター（ＧＲ）介在トランス活性化においてアンタゴニスト活性を有するがアゴニスト活性を有さず、ＧＲ介在トランス抑制においてアンタゴニスト活性を有さないＧＲリガンドを投与することを含む方法に関する。
本発明の更なる態様においては、上記で確認した解離されたＧＲアンタゴニストを本発明に従って共投薬として用いることにより、グルココルチコイド、好ましくは従来のグルココルチコイドでの炎症性疾患の治療に関連する副作用を防止又は抑制する方法を提供する。
図１及び実施例１に記載のスクリーニングスキームを用いることにより、以下の式：
【００１４】
2004519439.tif 000002
（＝｛３，５−ジブロモ−４−［５−イソプロピル−４−メトキシ−２−（３−メチル−ベンゾイル）−フェノキシ］フェニル｝−酢酸）
【００１５】
を有する化合物ＥＸＲＳ１３７０ＳＥ（ＷＯ９９／６３９７６に従って製造）が、所望の薬理学的プロフィールを示す化合物であることを確認した（実施例２〜６）。
本発明のスクリーニング法が、実施例１の具体的実施態様に制限されず、当業者が気付くであろう変更がその上予見されることが当業者により理解されるであろう。例えば、ＧＲ介在トランス活性化における候補物質の推測されるアンタゴニスト又はアゴニスト活性は、本願明細書における実施例に記載のラット肝細胞腫における内在性アミノトランスフェラーゼ遺伝子又はＭＭＴＶ（マウス乳腺癌ウイルス）プロモーターの代わりに、他の既知のグルココルチコイド応答部位（ＧＲＥ）及び／又はＧＲによりトランス活性化されることが知られる遺伝子及び／又はトランス活性化に関与する他の部位を用いることにより決定することができる。
同様に、ＧＲ介在トランス抑制における候補物質の活性を測定するために、そのようなトランス抑制に感受性であることが知られる遺伝子のいずれか、特には、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１０、ＩＬ−６、ＩＬ−８及びＲＡＮＴＥＳを含むサイトカイン、例えばＩＣＡＭ−１、ＶＣＡＭなどの接着分子、及び、例えばＣＯＸ−２などの、炎症過程に関与する酵素、及び／又は、ＧＲ介在トランス抑制に関与する他の部位、例えば、ネガティブなグルココルチコイド応答部位（ｎＧＲＥ）及びポジティブに作用する転写部位、例えばＮＦ−ｋＢ、ＡＰ−１を使用してもよい。
【００１６】
好ましくは、本発明の方法は、高速処理スクリーニングアッセイ（ｈｉｇｈ ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ａｓｓａｙ）（ＨＴＳ）である。ＨＴＳは、多数の化合物を同時に試験する実験セットアップに関する。好ましくは、前記ＨＴＳセットアップは、マイクロプレートにおいて行うことができ、部分的又は十分に自動化することができ、かつ、電子デバイス、例えば、データの保存、分析、生命情報科学を利用する解釈のためのコンピュータと関連していてもよい。好ましくは、前記自動化は、多数のマイクロプレートを取り扱い可能で、１日あたり数千回試験することが可能なロボットを包含し得る。好ましくは、無細胞系において所望の抑制機能を示す試験化合物は、また、本発明に従って、細胞系を用いる細胞ベース系において試験されるであろう。用語ＨＴＳは、また、超高速処理スクリーニング（ＵＨＴＳ）フォーマットを含む。好ましくは、前記ＵＨＴＳフォーマットは、３８４−又は１５３６ウエルマイクロプレート、マイクロリットル未満又はナノリットル未満のピペッタ、改良されたプレートリーダー及び蒸発手段を用いて行うことができる。ＨＴＳ法は、ＵＳ ５８７６９４６Ａ又はＵＳ ５９０２７３２Ａに開示されており、これらは、本願明細書に含まれるものとする。その分野の専門家は、以下に記載の方法を、イベンティブステップなしに、ＨＴＳ又はＵＨＴＳフォーマットに適合させることができる。
【００１７】
本発明のスクリーニング法により確認される解離されたＧＲアンタゴニストは、それ自体で、又は、好ましくは、グルココルチコイド薬剤との組み合わせでの共投薬としてそれを含む医薬組成物中において、炎症又は自己免疫疾患を含む免疫疾患の治療、及び、グルココルチコイドでの治療が必要とされる臨床状態に使用することができる。共投薬のグルココルチコイド薬剤は、そのような治療に適切なグルココルチコイドであってもよく、これらとしては、コルチゾール、コルチゾン、コルチコステロン、デキサメタゾン、プレドニゾロンなどが挙げられるがこれらに制限される訳ではない。
前記解離したグルココルチコイドレセプターアンタゴニストは、哺乳類、及びより好ましくはヒト患者において、本願明細書に記載の生物学的状態又は生涯を治療するのに有用であろう。
前記解離したＧＲアンタゴニストの使用により、従来の全身及び局所的なグルココルチコイド投薬に関連する副作用が防止又は抑制されるであろう。
そのような副作用としては、ＨＰＡ軸の抑制及び２次副腎抑制誘発の危険を含む代謝作用、誘発される糖新生、誘発されるアミノ酸分解、電解質濃度の変化、脂質代謝における変化、成長遅延、骨粗鬆症、筋疾患、高血圧症、消化性潰瘍、創傷治癒の障害を含むスキン効果、及びスキンシニングが挙げられるが、これらに制限される訳ではない。
【００１８】
治療されるべき又は防止されるべき疾患及び状態の例としては、急性又は慢性炎症性疾患又は自己免疫疾患を含む免疫疾患、少なくとも１つのグルココルチコイドでの治療が必要とされる他の臨床状態、例えば、次に記載のものが挙げられるが、これらに制限される訳ではない：
−呼吸性疾患、
−肺疾患、例えば、喘息、特に、喘息の悪化又は喘息発作重積状態、又は、閉塞性肺疾患、特に、ＣＯＰＤ、又は、気管支炎、又は、拘束性肺疾患、特に、アレルギー性肺胞隔炎、又は、肺水腫、特に、中毒性肺水腫、又は、サルコイドーシス、又は、肉芽腫症など、
−アレルギー性疾患、例えば、アレルギー性鼻炎、水腫、血清病、接触性皮膚炎、薬物反応、じんま疹、ハチ刺され、血管神経性水腫、アナフィラキシーなど、
−関節炎、例えば、リウマチ様関節炎、変形性関節炎など、
−リウマチ性心炎、
−リウマチ熱、
【００１９】
−結合組織疾患、例えば、全身性硬化症又は全身性エリテマトーデス、皮膚筋炎、多発性筋炎、又は、混合型結合組織疾患、多発性軟骨炎、シェーグレン症候群など、
−血管疾患、例えば、結節性多発性動脈炎、肉芽腫性多発性動脈炎など、
−皮膚疾患、例えば、乾癬、アトピー性皮膚炎、湿疹など、
−胃腸疾患、例えば、慢性潰瘍性大腸炎などの炎症性腸疾患、クローン病、胃炎、又は、食道炎など、
−腎疾患、例えば、糸球体腎炎、間質性腎炎、
−肝疾患、例えば、亜急性肝炎ネクロシス、慢性活動性肝炎、アルコール性肝炎、又は、Ｂ型肝炎ウイルスなどによる慢性感染症などの種々の起源の非アルコール性肝炎、又は、肝硬変など、
−眼疾患、例えば、角膜炎、ブドウ膜炎、虹彩炎、結膜炎、眼瞼炎、脈絡膜炎、視神経炎（ｎｅｕｒｉｔｉｓ ｎｅｒｖｕｓ ｏｐｔｉｃｉ）など、
−耳疾患、例えば、外耳炎、中耳炎など、
【００２０】
−脳水腫、例えば、腫瘍、特に、転移性である腫瘍と関連するか又はトラウマ又は脳血管性偶発症状により生じるものなど、
−トラウマにより生じるか又は他の疾患に関連するショック、
−神経性疾患、例えば、多発性硬化症、急性脳脊髄炎、髄膜炎、重症筋無力症、及び種々の形態の発作など、
−悪性腫瘍、即ち、急性リンパ球性白血病、リンパ腫、乳癌、又は、前立腺癌、
−突発性血小板減少症、又は、溶血性貧血、
−臓器移植、例えば、組織拒否の抑制、移植片対宿主病など、
−抗嘔吐治療、特に、化学療法を受ける患者に対する抗嘔吐療法における共治療としてのもの、
−内分泌疾患、例えば、甲状腺炎、副腎過形成、
−腱炎、滑液包炎、
−クッシング症候群、
−代謝性疾患、例えば、糖尿病、特に、２型糖尿病、又は、肥満症。
【００２１】
本発明の医薬組成物は、本発明のリガンド、即ち、ＧＲ介在トランス活性化においてアンタゴニスト活性を有するがアゴニスト活性を有さず、ＧＲ介在トランス抑制においてアンタゴニスト活性を有さないＧＲリガンドを、活性成分として含むであろうし、また、薬学的に許容可能なキャリヤーを含んでいてもよい。医薬組成物は、また、場合により、グルココルチコイド又は他の治療成分を含んでいてもよい。
投与すべき量は、使用する具体的な活性成分、具体的な対象体の年令及び体調、治療されるべき状態の重症度、及び、選択する投与ルートに依存して変動するであろうし；適切な投与量は、当業者が容易に決定可能である。治療効果を達成するための投与量は、約１〜約１００，０００μｇ／ｋｇ、好ましくは、約１０〜約３０，０００μｇ／ｋｇ、及びより好ましくは、１０〜３０，０００μｇ／ｋｇであろう。
【００２２】
本発明の医薬組成物は、経口、直腸、局所及び非経口（皮下、筋肉内及び静脈内を含む）投与に適する組成物を含んでいてもよいが、所定のケースにおいて最適なルートは、活性成分が投与される状態の重症度及び性質及び具体的な対象体に依存するであろう。医薬組成物は、有利には、単回投与形態にあってもよく、適切な所定量の活性成分及び薬学的に許容可能なキャリヤーを含んでいてもよい。
そのようなキャリヤーの一般例は、水、塩溶液、アルコール、ポリエチレングリコール、ポリヒドロキシエトキシル化ヒマシ油、ゼラチン、ラクトース、デンプン、アミロース、ステアリン酸マグネシウム、タルク、珪酸、脂肪酸モノグリセリド及びジグリセリド、ペンタエリスリトール脂肪酸エステル、微結晶性セルロース、ヒドロキシメチルセルロース及びポリビニルピロリドンである。
組成物は、製薬分野において既知の方法のいずれかにより製造することができ、そのような方法は、一般に、活性成分を液体キャリヤー又は微粉砕固体キャリヤー又はその両方と均質かつ親密に混合し、及びその後、必要であれば、生成物の所定形状への成形を、例えば、圧縮又は成形により行う工程を含む。
【００２３】
適切には、組成物は、デポー組成物又は徐放製剤の形態にあってもよい。
経口投与用組成物は、カプセル、トローチ、ウエハ、接種可能な又はバッカルタブレットとして、パウダー又は粒状物として、又は、水性液体、非水性液体、例えば、アルコール又はオイル中の溶液又はサスペンション、水中油型エマルション又は油中水型エマルション、例えばエリキシル及びシロップなどとして配合することができる。カプセルは、例えば、徐放性カプセルの形態にあってもよく、その主なカプセルは、その内容物を数時間にわたり放出し、それにより患者の血液中において薬剤のレベルを一定に保つ、活性成分のマイクロカプセルを含む。
非経口投与に適する医薬組成物は、適切には界面活性剤、例えば、ヒドロキシプロピルセルロースと混合された水中における活性成分の溶液又はサスペンションとして製造することができる。分散体は、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、及びそれらの油中混合物において製造することができる。
【００２４】
注入に適する医薬形態としては、無菌水溶液又は分散体、及び、無菌注入溶液又は分散液の即席製造用無菌パウダーが挙げられる。全てのケースにおいて、その形態は、無菌である必要があり、かつ、容易な注入性（ｓｙｒｉｎｇａｂｉｌｉｔｙ）が得られる程度に流動性である必要がある。それは、製造及び貯蔵条件下において適するものである必要があり、また、微生物、例えば、バクテリア及び菌類の汚染作用から保護される必要がある。キャリヤーは、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール及び液体ポリエチレングリコール）、適切なそれらの混合物、及び植物油を含む溶媒又は分散媒であってもよい。適切な流動性は、例えば、コーティング、例えば、レシチンの使用により、分散液のケースにおいては所望の粒径を保つことにより、及び／又は界面活性剤の使用により達成することができる。微生物作用から保護するために、種々の抗バクテリア剤及び抗菌剤、例えば、パラベン（ｐａｒａｂｅｎ）、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどが含まれていてもよい。また、吸収遅延剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンを注入組成物に導入するのが有用であるかもしれない。
【００２５】
適切な局所用配合物としては、経皮的デバイス、例えば、プラスター、エアロゾル、クリーム、軟膏、ローション、散布剤などが挙げられる。
直腸投与に適する医薬組成物は、好ましくは、活性成分及び適切なキャリヤー、例えば、カカオバターを含む坐薬であろう。
上記キャリヤーに加えて、上記医薬組成物は、不活性希釈剤、緩衝液、フレーバー、バインダー、例えば、トラガカントガム、アカシア、トウモロコシデンプン、又は、ゼラチン；潤滑剤、例えば、ステアリン酸マグネシウム；崩壊剤、例えば、トウモロコシデンプン、馬鈴薯デンプン、アルギン酸；界面活性剤又は分散剤；粒状化剤；増粘剤；酸化防止剤を含む保存剤；等張剤、例えば糖又は塩化ナトリウムなどを含んでいてもよい。
本発明を、更に、以下の実施例により説明するが、これは、本発明を制限することを意味するものではない。
【００２６】
実施例１
以下のスクリーニング法を用いて、解離したグルココルチコイドアンタゴニスト化合物ＥＸＲＳ１３７０ＳＥを確認した。
第１工程において、候補物質を、ＳＦ２１昆虫細胞中に発現されたヒトＧＲと接触させ、候補物質のＧＲへの結合を、実施例２に詳細するように測定し、ＧＲに対する結合親和性を有する候補物質を選択した。
第２工程において、選択した候補物質を使用して、２つのグルココルチコイド感受性標的遺伝子、即ち、コンストラクトｐＨＨＬｕｃを導入したＨｅｌａ細胞（Ｎｏｒｄｅｅｎ， ＳＫ， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ， ４５４−８， １９８８）におけるグルココルチコイド感受性ＭＭＴＶ（マウス乳腺癌ウイルス）プロモーターと実施上関連するルシフェラーゼ遺伝子、及び、ラット肝細胞腫における内在性チロシンアミノトランスフェラーゼ遺伝子のＧＲ介在トランス活性化を抑制し；ＧＲ介在トランス活性化においてアンタゴニスト活性を有するがアゴニスト活性を有さない候補物質を選択したが、これは、標的遺伝子の発現ニボー（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｎｉｖｅａｕ）を測定することにより、例えば、ルシフェラーゼアッセイ（更に詳細には実施例４を参照されたい）を行うことにより、候補物質の存在又は不在下において行った。
【００２７】
第３工程において、２つのグルココルチコイド感受性標的遺伝子、即ち、トランスフェクトされたＨｅＬａ細胞（Ｌｅｄｅｂｕｒ， ＨＣ ａｎｄ Ｐａｒｋｓ， ＴＰ， Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ， ２７０， ９３３−４３， １９９５）におけるグルココルチコイド感受性ＩＣＡＭ−１プロモーターと実施上関連するルシフェラーゼ遺伝子、及び、ＴＨＰ−１細胞における内在性ＩＬ−８遺伝子のＧＲ介在トランス抑制における、選択された候補物質の活性を測定したが、これは、標的遺伝子の発現ニボーを測定することにより、例えば、“ＯｐｔＥＩＡヒトＩＬ−８セット”（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ， Ｃａｔ． Ｎｏ． ２６５４ＫＩ）を用いるＥＬＩＳＡにより、又は、ルシフェラーゼアッセイ（更に詳細には実施例５又は６を参照されたい）を行うことにより、候補物質の存在又は不在下において行い、トランス抑制活性を有さない候補物質、即ち、ＥＸＲＳ１３７０ＳＥを選択した。
第４工程において、候補物質をインビボ試験に付したが、これは、種々の炎症モデル、例えば、クロトン油誘発性耳水腫、カラギーナン誘発性手水腫におけるデキサメタゾン又はプレドニゾロンの共投与、及び、グルココルチコイドの全身性副作用、例えば、肝臓中のＴＡＴの誘導、血糖及び遊離脂肪酸レベル、腎機能を測定することにより行い；ＥＸＲＳ１３７０ＳＥは、全身性副作用を全く示さないか低減された全身性副作用を示し、また、グルココルチコイドの抗炎症活性を保持していた。
【００２８】
実施例２
ＳＦ２１昆虫細胞において発現したヒトＧＲに対するＥＸＲＳ１３７０ＳＥの親和性
組換えＧＲバキュロウイルスの構成
ヒトＧＲ−α遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ受け入れ番号Ｍ１０９０１）を、ｐＣＲ２．１ベクター（インビトロゲン）への全長のヒトＧＲ−αｃＤＮＡを含むプラスミドからのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅した。ＤＮＡシークエンシングをＰＣＲ生成物について行って、ＧＲ遺伝子配列が正確であることを確認した。ＧＲ遺伝子を、その後、ｐＡｃＧ２Ｔバキュロウイルス転移ベクター（ファーミンゲン）にサブクローニングして、ＧＳＴ融合ＧＲ全長（ＦＬ）構築物をｐＡｃＧ２Ｔ−ＧＳＴ−ＧＲ−ＦＬとした。ＧＳＴ−ＧＲ−ＦＬポリペプチドを発現する組換えバキュロウイルスを、直線化バキュロウイルスＤＮＡを有する構築物の組換えにより生じさせた。ＧＳＴ−ＧＲ−ＦＬポリペプチドの発現を、組換えＧＳＴ−ＧＲ−ＦＬバキュロウイルスと、ＳＦ２１細胞において、熱ショックタンパク、ｈｓｐ９０、ｐ２３及びｈｓｐ７０を発現する３つのほかの組換えバキュロウイルスの共接種により行った。細胞を、感染後７２時間後に収集し、ＧＳＴ−ＧＲ−ＦＬポリペプチドを含むサイトゾル製造を以下のように行った。
【００２９】
ＧＳＴ−ＧＲ−ＦＬポリペプチドのサイトゾル製造
全ての手順は４℃で行った。細胞をグレース培地で１回洗浄し、遠心分離して、洗浄溶液を除去した。細胞を、湿潤細胞質量を超える数容量の緩衝液Ａ中において再懸濁し、窒素ボンベへ適用した。ボンベをシールし、撹拌下に約７００ＰＳＩに加圧した。懸濁細胞塊／緩衝液混合物を、敏速に、適切な受け入れ容器に収集した。細胞塊を、その後、顕微鏡で観察して、全ての又はほとんどの細胞が破裂しているのを確認した。稀に、窒素ボンベにおける第２通過が必要とされる場合もある。細胞破壊片を、４，０００×ｇで１５分間遠心分離により除去した。上清液をとり、更に、１００，０００×ｇで７５分間の超遠心分離にかけた。透明な上清のアリコートを、液体窒素中において凍結し、使用するまで−８０℃で保存した。緩衝液Ａは、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ／Ｎａ＋（ｐＨ７．５）、１０ｍＭの亜硫酸水素ナトリウム（ｐＨ７．５）、１ｍＭのＤＴＴからなり、新たに４μｇ／ｍＬのロイペプチン、４μｇ／ｍＬのペプスタチン、１ｍＭのＰＭＳＦ、１ｍＭのモリブデン酸ナトリウムを添加した。
【００３０】
ＧＲ競合結合アッセイ
このアッセイにより、試験化合物が、昆虫細胞ライセート調製物中に存在する組換えヒトＧＲに対する結合性について、［６，７−３Ｈ（Ｎ）］−デキサメタゾンと競合する能力を調べた。このアッセイ緩衝液は：１０ｍＭのＴＥＳ、２０ｍＭのＮａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ、１．５ｍＭのＥＤＴＡ、１０％ｖ／ｖのグリセロール、１ｍＭのジチオスレイトール（ｐＨ＝７．４）である。試験化合物を、１ｍＭのニートＤＭＳＯ中に溶解し、その後、更に、１０％ｖ／ｖＤＭＳＯを補充したアッセイ緩衝液中において１０×アッセイ濃度に希釈した。化合物を、その後、連続的に、９６ウエルのポリプロピレンプレートにおいて、１０％ＤＭＳＯ含有緩衝液中において、１０×アッセイ濃度で希釈した。結合反応混合物を、９６ウエルのポリフィルトロニクス  ユニフィルター３５０ホワイトマイクロタイターフィルタープレート（０．４５μｍのＰＶＤＦ膜）において、以下のアッセイ成分の連続添加により製造した：４５μＬのアッセイ緩衝液及び２５μＬの細胞ライセートを含む７０μＬのＧＲ反応混液、１０μＬの１０×試験化合物溶液、及び２０μＬの３Ｈ−デキサメタゾン（アッセイ緩衝液中、５ｎＭ）。プレートをシールし、４℃で１８〜２０時間インキュベートし、その後、アッセイ緩衝液中の２％ｗ／ｖデキストラン−木炭１００μＬを添加した。室温で５分間のインキュベーション後、反応混合物を吸引ろ過して、木炭を除去し、ろ液をパッカードオプティプレートに収集した。１５０μＬのマイクロシント２０を各ウエルに添加し、室温で≧１時間の地、プレートをパッカードトップカウントプレートリーダーでカウントした。ＩＣ５０値を、４つのパラメーターのロジスティック状態（ｅｑｕａｔｉｏｎ）について、１分あたりのカウントの反復的非線形カーブフィッティングにより測定した。
上記アッセイにおいて、ＥＸＲＳ１３７０ＳＥは、ＨＰＬＣ分析による溶液中での測定された化合物についての補正後、６９ｎＭのＩＣ５０値に戻った。
【００３１】
実施例３
ＥＸＲＳ１３７０ＳＥは、ラット肝細胞腫においてチロシンアミノトランスフェラーゼ（ＴＡＴ）の誘導においてアゴニスト活性を示さなかったが、これらの細胞においてデキサメタゾン誘発性ＴＡＴ誘導についてのアンタゴニスト活性を示した。
Ｈ４−ＩＩ−Ｅ−Ｃ３ラット肝細胞腫を、一晩、９６ウエルのプレート（２０，０００細胞／２００μｌ／ウエル）において、１０％熱不活性化ＦＢＳ（ウシ胎児血清）を含むＥＭＥＭ培地中においてインキュベートした。翌日、細胞を、記載の濃度のデキサメタゾン又はＥＸＲＳ１３７０ＳＥ（ＤＭＳＯ中に溶解し、最終的なＤＭＳＯ濃度が０．１％）で１８時間刺激した。コントロール細胞を、０．１％ＤＭＳＯで処理した。１８時間後、細胞を、０．１％トリトンＸ−１００を含む緩衝液中において溶解し、ＴＡＴ活性を、測光アッセイにおいて、基質としてチロシン及びα−ケトグルタル酸塩を用いて測定した（図３ａ）。
アンタゴニスト活性の測定のために、肝細胞腫を、ＥＸＲＳ１３７０ＳＥを細胞に施す直前にデキサメタゾン（３ｅ−９ｍｏｌ／ｌ）を添加することにより前刺激した。ステロイド性の、非解離性ＧＲ／ＰＲアンタゴニストＲＵ４８６をコントロールとして使用した（図３ｂ）。
【００３２】
実施例４
ＥＸＲＳ１３７０ＳＥは、ＨｅＬａ細胞においてＭＭＴＶ（マウス乳腺癌ウイルス）プロモーターの刺激において、アゴニスト活性を示さないがアンタゴニスト活性を示した。
ＨｅＬａ細胞に、安定に、ルシフェラーゼ遺伝子のフロントにおいてクローン化したＭＭＴＶ−ＬＴＲ（転写開始点に関し−２００〜＋１００）のフラグメントを含むｐＨＨＬｕｃ−構築物、及び、アンチバイオチカムジェネチシン（ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｕｍ ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ）についての抵抗性を構成的に発現するｐｃＤＮＡ３．１プラスミド（インビトロゲン）を共導入した。ＭＭＴＶ−プロモーターの最適な誘導性を有するクローンを選択し、更なる実験に用いた。
【００３３】
細胞を、３％ＣＣＳ（木炭処理ウシ血清）を補充したＤＭＥＭ媒体ｗ／ｏフェノールレッド中において一晩培養し、その後、９６ウエルのプレート（２０，０００細胞／１００μ／ウエル）に移した。翌日、ＭＭＴＶ−プロモーターの活性化を、ＥＸＲＳ１３７０ＳＥ又はデキサメタゾン（ＤＭＳＯ中に溶解し、最終濃度が０．１％）の添加により刺激した。コントロール細胞は、ＤＭＳＯのみで処理した。２４時間後、細胞を、細胞溶解試薬（プロメガ，Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｅ１５３１）で溶解し、ルシフェラーゼアッセイ試薬（プロメガ，Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｅ１５０１）を添加し、フラッシュルミネッセンスを、ＢＭＧルミノメーターを用いて測定した（図４ａ）。
アンタゴニスト活性の測定のために、ＭＭＴＶ−プロモーターを、ＥＸＲＳ１３７０ＳＥを施す直前に３ｅ−８ｍｏｌ／ｌのデキサメタゾンを添加することにより前処理した。ステロイド系非選択的ＧＲ／ＰＲアンタゴニストＲＵ４８６をコントロールとして使用した（図４ｂ）。
【００３４】
実施例５
ＥＸＲＳ１３７０ＳＥは、Ｕ−９３７細胞におけるＬＰＳ誘発ＩＬ−８分泌のＧＲ介在抑制においてアゴニスト活性を示さず、かつ、アンタゴニスト活性を示さなかった。
Ｕ−９３７相棒を、１０％ＣＣＳ（木炭処理ウシ血清）を含むＲＰＭＩ１６４０培地中において４日間インキュベートした。細胞を、９６ウエルのプレート（４０，０００細胞／１００μｌ／ウエル）に移し、デキサメタゾン又はＥＸＲＳ１３７０ＳＥ（ＤＭＳＯ中に溶解）の存在又は不在下で１μｇ／ｍｌのＬＰＳ（ＰＢＳ中に溶解）により刺激した。コントロール細胞は、０．１％ＤＭＳＯのみで処理した。
１８時間後、細胞上清におけるＩＬ−８濃度を、“ＯｐｔＥＩＡヒトＩＬ−８セット”（ファーミンゲン，Ｃａｔ．Ｎｏ．２６５４ＫＩ）を用いるＥＬＩＳＡにより測定した（図５ａ）。
アンタゴニスト活性の測定のために、ＬＰＳ誘発ＩＬ−８分泌を、ＥＸＲＳ１３７０ＳＥを施す直前に３ｅ−８ｍｏｌ／ｌのデキサメタゾンを添加することにより抑制した。ステロイド系の非解離性ＧＲ／ＰＲアンタゴニストＲＵ４８６をコントロールとして使用した（図５ｂ）。
【００３５】
実施例６
ＥＸＲＳ１３７０ＳＥは、ＨｅＬａ細胞におけるＩＣＡＭ−プロモーターのＴＮＦ−α誘発活性の抑制において、アゴニスト活性を示さず、かつ、アンタゴニスト活性を示さなかった。
ＨｅＬａ細胞に、安定に、ルシフェラーゼ遺伝子のフロントにおいてクローン化したヒトＩＣＡＭ−プロモーター（転写開始点に関し−１３５３〜−９）の１．３ｋｂフラグメントを含む構築物、及び、アンチバイオチカムジェネチシンについての抵抗性を構成的に発現するｐｃＤＮＡ３．１プラスミド（インビトロゲン）を共導入した。ＩＣＡＭ−プロモーターの最良の誘発性を有するクローンを選択し、更なる実験に用いた。細胞を、３％ＣＣＳを補充したＤＭＥＭ培地中において９６ウエルのプレート（２０，０００細胞／１００μｌ／ウエル）に移した。翌日、ＩＣＡＭ−プロモーターの活性化を、２０ｎｇ／ｍｌの組換えＴＮＦ−α（Ｒ＆Ｄシステム，Ｃａｔ．Ｎｏ．２１０−ＴＡ）の添加により誘発した。同時に、細胞を、ＥＸＲＳ１３７０ＳＥ又はデキサメタゾン（ＤＭＳＯ中に溶解し、最終濃度が０．２％）で処理した。コントロール細胞は、ＤＭＳＯのみで処理した。２４時間後、細胞を、細胞溶解試薬（プロメガ，Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｅ１５３１）で溶解し、ルシフェラーゼアッセイ試薬（プロメガ，Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｅ１５０１）を添加し、フラッシュルミネッセンスを、ＢＭＧルミノメーターを用いて測定した（図６ａ）。
アンタゴニスト活性の測定のために、ＩＣＡＭ−プロモーターのＴＮＦ−α誘発活性化を、ＥＸＲＳ１３７０ＳＥを施す直前に３ｅ−８ｍｏｌ／ｌのデキサメタゾンを添加することにより抑制した。ステロイド系の非解離性ＧＲ／ＰＲアンタゴニストＲＵ４８６をコントロールとして使用した（図６ｂ）。
【００３６】
実施例７
ＥＸＲＳ１３７０ＸＸは、動物実験において解離したアンタゴニストグルココルチコイド活性を示した。１００ｍｇ／ｋｇの投与量で経口投与したＥＸＲＳ１３７０ＸＸは、耳炎症モデルにおいてプレドニゾロンの抗炎症作用を有意にアンタゴナイズしなかったが、肝臓におけるプレドニゾロン誘発性チロシンアミノトランスフェラーゼ誘導を有意にアンタゴナイズし得た。
ハーランから得た、体重約２０〜２５ｇの雌性アルビノマウス（Ｈａｎ：ＮＭＲＩ）を使用した。その動物に、標準化ペッレット食餌（アルトミン８０１３）を与え、水を自由に摂取することができるようにした。動物を、１２時間の明暗サイクルで調節された部屋（ｃｌｉｍａｔｅ ｒｏｏｍ）に入れ、グループ化した。
【００３７】
ＥＸＲＳ１３７０ＸＸを、ＷＯ９９／６３９７６に従って製造した。プレドニゾロンを、薬局からウルバゾンソルビル（登録商標）として購入した。ＰＭＡ（ホルボール１２−ミリステート１３−アセテート）、及びミフェプリストン（Ｍｉｆｅｐｒｉｓｔｏｎｅ）（１１β−［４−ジメチルアミノ］フェニル−１７β−ヒドロキシ−１７［１−プロピニル］エストラ−４，９−ジエン−３−オン：ＲＵ−４８６）を、シグマから得た（それぞれ、Ｐ−８１３９及びＭ−８０４６）。
全ての試験化合物は、１００ｍｇ／ｋｇの投与量で経口投与（０．２ｍｌ／１０ｇ体重（ｂｗ））した。化合物は、０．２％ヒドロキシプロピルメチルセルローズ及びオリーブオイル混合物（１：１（ｖ／ｖ））に“溶解”した。
【００３８】
耳水腫：
マウスをエーテルにより軽く麻酔し、５０ｎｇのＰＭＡ（５μｌ）をそれぞれの左耳に施した。右耳は未処理のままとし；溶剤のみではいずれの遅発応答（ｌａｔｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ）も生じなかった。その動物を２４時間後にエーテルで犠牲にし、バイオプシー（直径８ｍｍ）を両耳からパンチアウトして、好中球の上昇について右耳と左耳を比較評価した。組織サンプルは、１ｍｌの０．５％ＨＴＡＢ（ヘキサデシル−トリメチル−アンモニウム−臭化物；シグマＨ−５８８２；０．０５Ｍのリン酸緩衝液中に溶解し、ｐＨ６．０）中において、組織ホモジナイザー（ＩＫＡ−Ｕｌｔｒａｔｕｒｒａｘ Ｔ５； Ｊａｎｋｅ ＆ Ｋｕｎｋｅｌ， Ｓｔａｕｆｅｎ／Ｂｒｅｉｓｇａｕ）を３０，０００ＲＰＭで１５秒間、冷却下に用いてホモジナイズした。遠心分離（１６，０００ｇ、５分間）した後、上清を、ミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）についての処理まで凍結した。ＭＰＯ、好中球マーカー酵素についての上清における測定は、好中球集積についての定量指数に役立つ。
ＭＰＯは、分光光度的に、４５０ｎｍで、Ｂｒａｄｌｅｙ（１９８２）の方法のマイクロプレートバージョン及び動的測定に適するマイクロプレートリーダー（Ｖｍａｘ； Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ， Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ）を用いて測定した。その値は、１分あたりのミリ光学的密度（△ｍＯ．Ｄ．／分）での上昇として示す（表１ａ及びｂ）。
【００３９】
ＴＡＴ誘発：
８時間後、化合物を投与し、動物を犠牲にし、パンチ片（直径８ｍｍ）を肝臓からとり、即座に液体窒素中において凍結した。調節された（ｗｅｉｇｈｔｅｄ）肝臓パンチ片を３分間解凍し、１ｍｌのリン酸緩衝液（ｐＨ７．６）の添加後、上述したような組織ホモジナイザーを用いてホモジナイズした。遠心分離後、上清を、処理まで、−２０℃で凍結した。処理のために、サンプルを解凍し、タンパクを、Ｆａ． Ｐｉｅｒｃｅ （Ｎｏ ２３２２５）から商業的に入手可能な９６ウエルマイクロタイタープレートを利用するキットを用いて測定した。チロシンアミノトランスフェラーゼ（ＴＡＴ）の活性を、リン酸緩衝液中において１：１００に希釈した上清において測定した。その反応は、ｐＨ７．６でのピロドキサール−５−ホスフェート及びαケトグルタル酸中におけるチロシンの添加により開始し、３７℃で３０分間インキュベートした。反応を、１０ＭのＫＯＨの添加により停止し、更なる３０分間のインキュベーションを、ｐ−ヒドロキシ−ベンジルアルデヒドの形成のために行い、それは、４９２ｎｍで、マイクロプレートリーダーを用いて測定することができた。その値（光学的密度）は、タンパク濃度（Ｏ．Ｄ．／ｍｇタンパク）に関連して計算した（表１ａ及びｂ）。
【００４０】
表１ａ：プレドニゾロンの抗炎症作用（マウスの耳における、ミエロペロキシダーゼの上昇として測定される、ＰＭＡ誘発性好中球インフラックスの抑制）及びプレドニゾロンの代謝作用（マウスの肝臓における、チロシンアミノトランスフェラーゼの誘導）におけるＥＸＲＳ１３７０ＸＸのアンタゴニスト活性。耳炎症のケースにおけるコントロールはＰＭＡで処理した動物であり、ＴＡＴ誘導についてのコントロール動物は、ビヒクルのみで処理したものである。
ＥＸＲＳ１３７０ＸＸは、プレドニゾロンによる耳炎症の抑制を有意にアンタゴナイズしなかった（ｐ＝０．０８、不対データについてのステューデントｔ試験）。しかしながら、ＥＸＲＳ１３７０ＸＸは、プレドニゾロンによるＴＡＴ誘導を有意にアンタゴナイズした（ｐ＝０．００３、不対データについてのステューデントｔ試験）。
2004519439.tif 000003
【００４１】
表１ｂ：プレドニゾロンの抗炎症作用（マウスの耳における、ミエロペルオキシダーゼの上昇として測定される、ＰＭＡ誘発好中球インフラックスの抑制）及びプレドニゾロンの代謝作用（マウスの肝臓における、チロシンアミノトランスフェラーゼ（ＴＡＴ）の誘導）におけるミフェプリストン（ＲＵ−４８６）のアンタゴニスト活性。耳炎症のケースにおけるコントロールはＰＭＡで処理した動物であり、ＴＡＴ誘導についてのコントロール動物はビヒクルのみで処理したものである。
2004519439.tif 000004
【図面の簡単な説明】
【図１】
解離されたＧＲアンタゴニストを確認するためのスクリーニングスキームを示す。
【図２】
ＧＲ競合結合測定における試験化合物ＥＸＲＳ１３７０ＳＥにより得られた代表的データを示す。データの点及び誤差バーは、単回試験での３つのアッセイプレートにおける３つの測定の平均及び標準偏差である。
【図３ａ】
ＥＸＲＳ１３７０ＳＥによる、ラット肝細胞腫における、チロシンアミノトランスフェラーゼの誘導を示す。
【図３ｂ】
Ｒ４８６及びＥＸＲＳ１３７０ＳＥによる、ラット肝細胞腫における、デキサメタゾン（３ｅ−９ｍｏｌ／ｌ）で前刺激したチロシンアミノトランスフェラーゼの抑制を示す。
【図４ａ】
デシサメタゾン、プレドニゾロン及びＥＸＲＳ１３７０ＳＥによる、ＨｅＬａ細胞における、ＭＭＴＶ−プロモーターの誘発を示す。
【図４ｂ】
Ｒ４８６及びＥＸＲＳ１３７０ＳＥによる、ＨｅＬａ細胞における、デキサメタゾン（３ｅ−８ｍｏｌ／ｌ）で前刺激したＭＭＴＶ−プロモーターの抑制を示す。
【図５ａ】
デキサメタゾン及びＥＸＲＳ１３７０ＳＥによる、ＩＬ−８誘発（１μｇ／ｍｌ  ＬＰＳ）の抑制を示す。
【図５ｂ】
ＲＵ４８６又はＥＸＲＳ１３７０ＳＥとの競合、及びデキサメタゾン（３ｅ−８ｍｏｌ／ｌ）によるＩＬ−８誘発（１μｇ／ｍｌ  ＬＰＳ）の抑制を示す。
【図６ａ】
デキサメタゾン、プレドニゾロン及びＥＸＲＳ１３７０ＳＥによる、ＩＣＡＭプロモーター誘発（２０ｎｇ／ｍｌ  ＴＮＦ−α）の抑制を示す。
【図６ｂ】
ＲＵ４８６又はＥＸＲＳ１３７０ＳＥとの競合、及びデキサメタゾン（３ｅ−８ｍｏｌ／ｌ）によるＩＣＡＭプロモーター誘発（２０ｎｇ／ｍｌ  ＴＮＦ−α）の抑制を示す。
【図１】
2004519439.tif 000005
【図２】
2004519439.tif 000006
【図３ａ】
2004519439.tif 000007
【図３ｂ】
2004519439.tif 000008
【図４ａ】
2004519439.tif 000009
【図４ｂ】
2004519439.tif 000010
【図５ａ】
2004519439.tif 000011
【図５ｂ】
2004519439.tif 000012
【図６ａ】
2004519439.tif 000013
【図６ｂ】
2004519439.tif 000014
【国際公開パンフレット】
2004519439.tif 000015
2004519439.tif 000016
2004519439.tif 000017
2004519439.tif 000018
2004519439.tif 000019
2004519439.tif 000020
2004519439.tif 000021
2004519439.tif 000022
2004519439.tif 000023
2004519439.tif 000024
2004519439.tif 000025
2004519439.tif 000026
2004519439.tif 000027
2004519439.tif 000028
2004519439.tif 000029
2004519439.tif 000030
2004519439.tif 000031
2004519439.tif 000032
2004519439.tif 000033
2004519439.tif 000034
2004519439.tif 000035
2004519439.tif 000036
2004519439.tif 000037
2004519439.tif 000038
2004519439.tif 000039
2004519439.tif 000040
2004519439.tif 000041
2004519439.tif 000042
2004519439.tif 000043
2004519439.tif 000044
2004519439.tif 000045
2004519439.tif 000046
2004519439.tif 000047
2004519439.tif 000048
2004519439.tif 000049
2004519439.tif 000050
2004519439.tif 000051
2004519439.tif 000052
2004519439.tif 000053
2004519439.tif 000054
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004519439.tif 000055
【国際調査報告】
2004519439.tif 000056
2004519439.tif 000057
2004519439.tif 000058
2004519439.tif 000059