(57)【要約】本発明によれば、ヘテロ多官能性サッカリドまたは関連するポリマーにより表面に固定化された、ＤＮＡのようなオリゴヌクレオチドが提供される。本発明はまた、変性ヘテロ多官能性サッカリドを使用する、ＤＮＡまたは他のオリゴヌクレオチドの固定化のための方法を提供する。本発明では、ポリサッカリドまたは他のポリマーは、オリゴヌクレオチドの非特異的結合を避ける長い、不活性な、親水性スペーサーアームとして機能する。本発明はさらに、典型的に、サンプルと接触させ、ハイブリダイゼーションを評価することによる、固定化オリゴヌクレオチドを使用する検出方法を提供する。
2004528834.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヘテロ多官能性サッカリドまたは関連するポリマーにより表面に固定化されたオリゴヌクレオチド。
【請求項２】
前記サッカリドがデキストランである請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項３】
前記サッカリドが二官能性である請求項１または２に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項４】
前記サッカリドがアニオン性官能基を有する請求項１から３のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項５】
前記サッカリドが共有結合反応性官能基を有する請求項１から４のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項６】
前記表面が、ミクロタイタープレート、磁性粒子、アガロース支持体、エポキシ−アクリル樹脂、ナイロン（登録商標）、ガラス表面、または金表面から選択される請求項１から５のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項７】
オリゴヌクレオチドがヘテロ多官能性ポリマーを使用して表面に固定化される、オリゴヌクレオチドの固定化方法。
【請求項８】
請求項１から６のいずれか一項記載のオリゴヌクレオチドを使用する検出方法。
【請求項９】
請求項１から６のいずれか一項記載の固定化オリゴヌクレオチドを使用する、固定化オリゴヌクレオチドに対するハイブリダイゼーションによるオリゴヌクレオチドのサンプル中のミューテーションの検出方法。
【請求項１０】
前記ミューテーションが単一塩基を含む請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
診断方法における使用のためのオリゴヌクレオチドの固定化におけるヘテロ多官能性ポリマーの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、リガンドの固定化、とりわけＤＮＡの固定化に関する。
【背景技術】
【０００２】
ミクロタイタープレートでの液体媒体における最も一般的なＤＮＡハイブリダイゼーション法は、ストレプタビジン被覆プレートを使用する。ビオチン化ＤＮＡプローブが、ビオチン−ストレプタビジン結合によって表面に固定化される。この結合は非常に強力であり、迅速に形成されるが、極端なハイブリダイゼーション条件には耐えられない。
【０００３】
配列中に特異的なミューテーションを有するＤＮＡ分子のハイブリダイゼーションによる検出は、ハイブリダイゼーションの間で極端な条件を必要とする。これらの極端な条件は、温度、塩、及び溶媒を含む。そのような条件では、ストレプタビジン−ビオチンＤＮＡプローブ複合体は壊れ、またはプレートから脱着される。非常に厳しいハイブリダイゼーションに必要なこれらの条件に耐えることができる、ミクロタイタープレートのプラスチックの表面上の活性基に対するＤＮＡの共有結合を通じたＤＮＡの固定化のための新たなシステムの開発が必要とされている。
【０００４】
DIAPOPS、NUCLEOLINKまたはCOVALINK (NUNC)のような市場で入手可能なプレートは、５’末端でリン酸化ＤＮＡプローブの固定化のために第二級アミノ基を使用している。しかしながら、固定化がこの方式で生じることを製造者が保証しているのにも拘わらず、ＤＮＡプローブは酸（それは固定化結合を加水分解する）での処理の後に回収されず、固定化収率は非常に低く、生成した固定化ＤＮＡはハイブリダイゼーションの高感度で特異的な実験を許容しない。
【０００５】
アミノ基の活性化のための最も単純なプロトコールは、ジアルデヒド（例えばグルタルアルデヒド）での変性である。これは、アミノ化ＤＮＡプローブと活性化プレートの後の反応を可能にする。第二級アミノ基を含むＮＨＳまたはＥＤＣのような二官能性試薬（市販ではＮＵＮＣプレート）もまた、表面でのＤＮＡの固定化のために使用されている。
【０００６】
しかしながら、これらの従来のプロトコールは、いずれかのタイプの高分子の固定化のため、特にＤＮＡプローブの固定化のため、主に以下のような多くの重要な制限を有する：
（ａ）アミノ化リガンドと活性化プレートの間の化学反応性は通常比較的低く、そのため生成したプレートの有効性と感度は低い；
（ｂ）ＤＮＡプローブはプレートの表面近傍に固定化され、そのことは固定化プローブとＰＣＲ増幅の遊離ＤＮＡ産物の間とのハイブリダイゼーションの立体障害を導くであろう；
（ｃ）支持体中の多くのアミノ基は反応しないだけではなく、アミノ−アルデヒド結合がイオン化可能な第二級アミノ基を生成する。両基はプレートに対するＤＮＡの非所望の非特異的な吸着を促進し得る。
【０００７】
かくして、原則として、市場で入手可能なプレートは、生体高分子の共有結合固定化のための最適な開始点を構成している一方で、問題は存在する。市販のプレートは通常、非常に高いｐＫを有するアミノ基を有する。その結果、これらのアミノ基は原則として、その活性化のためにあまり反応性でなく（例えばポリアルデヒドと）、さらにアニオン交換子としての著しい特性（この場合では非所望である）を示す。かくして、その反応性を非常に増大することが必要であり、同時にアニオン交換のための能力（オリゴヌクレオチドの非特異的な吸着）をできるだけ減少する必要が存する。
【０００８】
市販のＤＮＡプローブは、オリゴヌクレオチドの３’または５’末端の一方に加えられた第一級アミン残基で得ることができる。ハイブリダイゼーション方法を最適化するために、第一級アミン基が直鎖状脂肪族鎖からなる比較的大きなスペーサーアーム（Ｃ５−Ｃ７）によってオリゴヌクレオチドから離れているように、プローブが製造される。しかしながら、これらの長い脂肪族鎖に結合したアミン基はむしろ高いｐＫを有し、プローブのアルデヒド基とあまり反応性ではない。これらのアミノ化プローブの反応性を最適化する一つの方法は、十分にアルカリのｐＨで固定化を実施することによるであろう。問題は、プレートのアルデヒド基の低い安定性のため、及び固定化反応におけるオリゴヌクレオチドの塩基のアミノ基による非所望の沈殿が起こり得るため、このことが損傷を引き起こすであろうということである。
【０００９】
別法として、より短いスペーサーアームを有する市販のプローブを使用することが挙げられ、この場合これらのアミンの反応性はかなり増大する。しかしながら、あまりに短いスペーサーアームの使用は、固定化ＤＮＡと遊離ＤＮＡの間のハイブリダイゼーションの立体障害の顕著な増大を導く。
【００１０】
ＤＮＡプローブまたは他のリガンドの固定化のために使用される表面があまりに不活性であり、いずれのイオン化基をも有さない場合には、一官能性デキストラン(J. Biochem. Biophys. Meth. (1985) 10, 321-328（非特許文献１）; Nuc. Acid. Res (1987) 15, 13, 5373-5390（非特許文献２）; WO 98/22620（特許文献１）; WO 94/03530（特許文献２）)の単純な使用が、生体分子の妥当な固定化を得るために十分であろう。これらのポリマーの使用は、プレート上で活性化できる全ての基に対して、大量のアルデヒド基の導入を可能にする。さらにこれらのポリマーは、生体高分子と固定化リガンドとの間の相互作用を容易にするのに必要なスペーサーアームを提供する。しかしながら、これらの方法の主要な欠点は、表面に残存する正の荷電による、ハイブリダイズされるＤＮＡの高い非特異的吸着である。この欠点は、プローブに相補的なＤＮＡの非特異的吸着をブロックするために、予備ハイブリダイゼーション工程または大量の外因性のＤＮＡを使用することによって減少される。
【００１１】
【非特許文献１】
J. Biochem. Biophys. Meth. (1985) 10, 321-328
【非特許文献２】
Nuc. Acid. Res (1987) 15, 13, 5373-5390
【特許文献１】
国際公開第９８／２２６２０号パンフレット
【特許文献２】
国際公開第９４／０３５３０号パンフレット
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明によれば、ヘテロ多官能性サッカリドまたは関連するポリマーにより表面に固定化された、ＤＮＡのようなオリゴヌクレオチドが提供される。
【００１３】
本発明はまた、変性ヘテロ多官能性サッカリドを使用する、ＤＮＡまたは他のオリゴヌクレオチドの固定化のための方法を提供する。
【００１４】
本発明では、ポリサッカリドまたは他のポリマーは、オリゴヌクレオチドの非特異的結合を避ける長い、不活性な、親水性スペーサーアームとして機能する。
【００１５】
本発明はさらに、典型的に、サンプルと接触させ、ハイブリダイゼーションを評価することによる、固定化オリゴヌクレオチドを使用する検出方法を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
簡便なため、詳細はＤＮＡに関して記載されるが、本発明はＲＮＡまたはＰＮＡを含む他のオリゴヌクレオチドでも使用できる。
【００１７】
ここで提供される解決策は、一方でアルデヒド基のようなＤＮＡの固定化のための、他方で負に荷電した基のようなサンプルのＤＮＡの非特異的な吸着を避けるための、ヘテロ官能基を有する、立体障害を避けるためのスペーサーアームとしての、ヘテロ官能性デキストランまたは他のポリマー、好ましくは親水性ポリマーを使用することである。固定化の後、ＤＮＡプローブは、可溶性ＤＮＡに匹敵する自由度を有する。この解決策は、脂肪族基を有するアミド結合を介して、第一級アミノ基の最終ブロッキングにより増強されても良い。
【００１８】
かくして本発明のポリサッカリドはヘテロ多官能性であり、典型的に誘導体を含む天然または合成のポリサッカリドに基づく。適切なサッカリドは、デキストラン、カルボキシメチルデキストラン、ヒドロキシエチル−及びヒドロキシプロピル−デンプン、グリコーゲン、アガロース誘導体、ヒドロキシエチル−及びヒドロキシプロピル−セルロース、カラゲナート、アミロース、ペクチン及び天然ゴム及び誘導体、並びに求核性官能基を有する合成ポリマー、例えばポリビニルアルコール、ポリアリルアルコール、ポリエチレングリコール、及び置換化アクリラートを含む。好ましいサッカリドはデキストランである。
【００１９】
好ましい態様では、本発明は、ＤＮＡ分子の固定化のためのアルデヒドまたは他の反応性基と、ポリマーの固定化を改良し、ＤＮＡの非特異的な吸着に関与する支持体上の正の荷電をブロッキングするための負に荷電した基（例えばカルボキシ基、スルファート基、またはホスファート基）とを含む、ヘテロ多官能性ポリマーの使用に基づく、ＤＮＡの固定化方法を提供する。
【００２０】
ＤＮＡプローブの固定化方法は、最初にアミノ化プレートを負の荷電を有する低濃度の基を含む高分子量のヘテロ多官能性ポリマー（例えば２０，０００から４０，０００，０００ドルトンの間のデキストラン）で変性し、後にアミノ化プレートの表面の正の荷電のブロックを最適化する高濃度の負の荷電を含むより低分子量のポリマー（例えば６，０００から３４０，０００ドルトンの間のデキストラン）で第二の変性を実施するという、いくつかの工程の使用に基づくことができる。
【００２１】
無水酢酸または他の同様な試薬の使用は、第二のより小さいデキストランの使用を置換し、非特異的な吸着を減少することができるであろう。この態様では、無水物は、表面に残存する第一級アミノ基をブロックし、アスパラギン酸デキストランは、第二級アミノ基をブロックし、サンプルからのＤＮＡの非特異的な吸着を除去する。
【００２２】
一つの態様では、スペーサーアームは、例えばアスパラギン酸でのその変性、ミクロタイタープレートまたは他の表面でのその固定化、及びアミノ化ＤＮＡプローブとのその後の反応を別個にデザインできるように、後に活性化できる生体ポリマーである。
【００２３】
関連する態様では、本発明は、固定化の収率を増大する短いリンカーによりＤＮＡ配列に連結した３’または５’末端でのアミノ基を有するＤＮＡプローブの使用に基づく。
【００２４】
本発明は、ハイブリダイゼーションの特異性を増大するために、各種の濃度のホルムアミド（５から５０％）の存在下での遊離ＤＮＡと、ミクロタイタープレートまたは他の表面に固定化されたＤＮＡのハイブリダイゼーションの実験を実施することが可能である。
【００２５】
ＤＮＡプローブ及びいずれかの他の生体ポリマーまたはアミノ化リガンドの固定化は、診断において興味ある各種の表面、例えばミクロタイタープレート、磁性粒子、アガロース支持体、エポキシ−アクリル樹脂、ナイロン（登録商標）、ガラス表面、金表面等を活性化するための多官能性アルデヒド−デキストランまたは他のヘテロ多官能性ポリマーを使用して実施できる。
【００２６】
表面の活性化のための一般的方法は、それらをアミノ化し（低いｐＫを有する低濃度のアミノ基を導入することによって）、後にアルデヒド−デキストランのような本発明のヘテロ多官能性ポリマーで変性を実施することである。
【００２７】
全ての場合で、デキストランのようなポリマーは、ＤＮＡプローブのアミノ基、または診断分野、ゲノム分野、及びタンパク質分野で興味ある他のリガンドのアミノ基との反応を許容するように酸化できる。
【００２８】
本発明で提案される解決策は、アミノ基とオリゴヌクレオチドの３’または５’末端との間で短い（長い代わりに）脂肪族リンカーの使用であり、アミノ基の反応性を増大し、固定化収率を増大する。
【００２９】
ヘテロ官能性アスパラギン酸−アルデヒドデキストランの使用は、物理的吸着を介したアミノ化表面の容易な変換を許容し、引き続き共有結合アミノ−アルデヒド反応を許容する。アルデヒド−デキストランの特徴は、支持体におけるアミンのｐＫが高い場合、直接的なアミン−アルデヒド反応を困難にする。
【００３０】
デキストラン−アルデヒドは、カルボキシル基、エポキシド基、ヒドロキシル基等を含む表面を活性化するために使用できる。最も複雑な場合（有機媒体に耐性ではないプラスチックプレート）では、全ての化学的変性は水性媒体で実施できる。
【００３１】
ここで提供されるＤＮＡプローブの固定化のための共有結合は、以下の条件に適合するため許容可能である：
ａ．−ｐＨ、温度、並びにハイブリダイゼーション混合物中の塩、溶媒、及び求核試薬の存在に耐性な、非常に安定な化学結合が存在する；
ｂ．−ハイブリダイゼーションを容易にし、より大量のプローブの固定化を許容するスペーサーアーム；
ｃ．−特にＤＮＡ（カチオン性表面に吸着する高い能力を有するポリアニオン）の静電的吸着に関する非常に不活性な支持体；
ｄ．−プローブの塩基の完全な配列とのハイブリダイゼーションを許容する、ＤＮＡプローブの末端を介した単一結合によるプローブの固定化。
【００３２】
本発明の方法は、活性化できる、例えばアミノ、ヒドロキシル、カルボキシル、またはエポキシド基を含むいずれの表面（ミクロタイタープレート、磁性粒子等）でも、ＤＮＡ及び他の高分子の固定化のために使用できる。例として、最も複雑で頻繁な問題は、主にＤＮＡプローブまたはアミノ基を含む他のリガンドを結合するための市販のアミノ化ミクロタイタープレートの使用で詳細に記載されている。
【００３３】
本発明の好ましい実施態様では、非常に高分子量のヘテロ多官能性ポリマー（アニオン基とアルデヒド基を有する）の使用は、アミノ化ミクロタイタープレートの変性について提案されている。これらのポリマーは、カルボキシ基とアルデヒド基を含み、それはアミノ化プレートの活性化のための優れた特性をポリマーに与える。これらの有益な特性は以下のものを含む：
ａ．−これらのヘテロ多官能性ポリマーは、高いｐＫを有するアミノ基を有する場合であっても、アミノ化プレートと非常に容易に反応する。最初に前記ポリマーはプレートにイオン的に吸着され、次いでそれらの共有結合が近隣の基の間でのアミノ−アルデヒド反応によって生じる（吸着化ポリマーとプレート）；
ｂ．−プレートにイオン的に、及び共有結合的に吸着したこれらの大きなポリマーは、ＤＮＡの負の荷電と、アミノ化された市販のプレートのアミノ基の正の荷電との間での非特異的なイオン性相互作用を減少する非常に陽性の効果を有する；
ｃ．−これらのポリアルデヒドポリマーは、アミノ化された市販のプレート上に最初に存在する各アミノ基に対して大量のアルデヒド基の生成を許容するため、オリゴヌクレオチドプローブの固定化を改良する；
ｄ．−これらの親水性ポリマーは、ハイブリダイゼーションのための接近可能な体積に表面を変換するため、固定化ＤＮＡアームと遊離ＤＮＡとの間でのハイブリダイゼーションを容易にするための優れたスペーサーアームである。前述のように、小さなスペーサーアームによりオリゴヌクレオチドの３’または５’末端に結合したアミノ基を有する合成プローブは良好な反応性（アミノ基の低いｐＨ）を有するが、ハイブリダイゼーション実験について立体障害を生成する。スペーサーアームとしてのデキストランの使用は、これらの障害を完全に除去し、このタイプのプローブの使用を許容する。
【００３４】
多くの場合では、既に天然で取り込んでいる（カラゲナート等）特定の基（例えばイオン性の性質の）を有するポリサッカリドを使用することが可能である。ほとんどの糖は、記載された方法の一つによって活性化できる。他の場合では、例えばアルデヒドデキストランのような一官能性ポリマーを使用し、制御された方式で所望の基を導入することができ、ここでそのような基は、カルボン酸、ホスファート、スルファート、アミノ酸、アミン等のような負に荷電した基を含む。前記ポリマー分子は非常に大きく、科学文献に記載された多くの各種の方法によって活性化できる多くの基を有する。もしこれらの変性が、例えば小さなパーセンテージの変性可能な基に連続的に影響するように部分的に使用されたならば、測定可能である多官能性ポリマーを得ることができる。
【００３５】
本特許の骨格内で使用できるストラテジーの非制限的な例として、ポリアスパラギン酸／ポリアルデヒドデキストランの調製、及びアミノ化表面を有する支持体の活性化のためのその使用が記載されるであろう。
ａ．−デキストラン分子の酸化は、よく知られている化学量論を有する反応である：各グルコース分子は二分子のペリオダートを消費し、二つのアルデヒド基を生産する。もしポリマーのグルコースを完全に酸化する量より少ないペリオダートが添加されなならば、部分的及び完全に制御された変性を得ることができる；
ｂ．−本発明者の研究グループは、エチレンジアミンまたはアミノ酸のようなアミノ化化合物でのこれらのアルデヒドの変換を可能にする各種の方法をデザインし、デキストランの各グルコース分子に対して一分子のこれらの化合物を導入することを試みた。例えばｐＨ８でトリメチルアミノボラートの存在下での、１．５Ｍのアスパラギン酸ナトリウム中のデキストラン−アルデヒドのインキュベーションは、デキストラン分子のアルデヒド基の定量的な変性を許容する。ホウ化水素での還元の後、アルデヒド−アミノ結合は非常に安定な結合に変換され、いずれの未反応のアルデヒドもが不活性アルコールに変換されるであろう。もしこのデキストラン分子がその丁度２０％のグルコース分子の酸化を受けたならば、８０％の完全なグルコースと、２０％のアスパラギン酸基で変性されたグルコースを有するポリマーを得ることができる；
ｃ．−従前のポリマーを、グルコース分子の別の部分的な酸化にかけ、ポリアルデヒド／ポリアスパラタートを得ることができる；
ｄ．−もしこれが、支持体表面が特定の正の荷電を有する条件下で、アミノ基を有する固体（例えばプレートまたは磁性粒子、あるいはいずれかの他のアミノ化表面）と共にインキュベートされたならば、前記ポリマーは表面に吸着し、アルデヒドと第一級アミノ基の濃度を増大するであろう。これらの基の反応性もまた増大し、表面でのポリマーの共有結合固定化が加速されるであろう。ホウ化水素での還元の後、アミノ−アルデヒド結合は、非常に安定な結合に変換され、アルデヒドは不活性なアルコールに変換されるであろう；
ｅ．−固定化ポリマーを有する支持体は、５０ｍＭのペリオダートでの酸化にかけられ、アルデヒド基を生成する。かくして使用の準備ができた活性化プレートが得られる。
【００３６】
原則として、タンパク質の固定化のための科学文献に記載されたほとんどの化学システムは、各種の支持体：ミクロタイタープレート、磁性粒子、エポキシ−アクリル樹脂、アガロースゲル、シリカ、ガラス、ナイロン（登録商標）等上の多官能性ポリマーの固定化について妥当である。各種の支持体上のポリマーの固定化のために使用できる化学システムの非制限的な例として、支持体の活性化のためのいくつかの可能性が以下に挙げられる：
ａ．−アミン基。アミノ化支持体は、アミノ基と反応可能な文献に記載されたいずれかの基を有する活性化ポリマー（例えばポリアルデヒド、ポリエポキシド）と直接反応させることができる；
ｂ．−カルボキシル基。このタイプの基は、前述の場合のように反応できるアミノ基を得るために、エチレンジアミン及びカルボジイミドで完全にまたは部分的に変性することができる（全部の負の荷電または全部の正の荷電を有する表面を得させる）。カルボキシル基はまた、アミノ基のｐＫが十分に低いならば（例えばデキストラン−エチレンジアミン）直接アミノ化ポリマーと反応することもできるであろう；
ｃ．−エポキシド基。エポキシド支持体は、ポリオール（例えばｐＨ１２でのインキュベーションにより）あるいはチオール化またはアミノ化ポリオールを直接固定化するために使用できる。それらはまた、アミノ化支持体を得るためにジアミンで変性でき（例えばｐＨ１１で１Ｍエチレンジアミンでのインキュベーションにより）、（ａ）の場合のように使用できる。酸性またはアルカリ性加水分解の後に、それらはペリオダートで酸化してアルデヒドを得ることができ、次いでそれがジアミンまたは固定化アミノ化ポリマーで変性できる；
ｄ．−ヒドロキシル基。このタイプの基は、アルカリｐＨでエピクロロヒドリンと反応させられて、ヒドロキシル基をエポキシド基に変換でき、再び（ｃ）の場合を与える；
ｅ．−シリカート、アルミナート、ガラス等。これらの固体は、一般的なアミノ化支持体についてのアミノまたはエポキシド基、あるいは前述のプロトコールに従って使用されるエポキシドで誘導化されたトリメトキシシランで活性化可能であるシラノールを提供する。
【００３７】
支持体上の固定化のためのポリサッカリドの活性化の可能性は広範に存在する。各種の支持体上の固定化のためのポリマーの活性化のために使用できる化学システムの非制限的な例として、最も単純な例のいくつかとして以下のものが挙げられる：
ａ．−ポリアルデヒドの調製。ほとんどのポリサッカリドは、ペリオダートで酸化してアルデヒド基を与えることができる。例えばデキストランの場合、２分子のペリオダートが各グルコース分子について消費され、二つのアルデヒド基を生ずる。（水中で可溶性であるように低分子量の）デキストランを使用して、１分子のペリオダートは二つのアルデヒド基を直接生産する。これらのポリアルデヒドは、アミノ化支持体と反応でき、ホウ化水素での還元の後、第二級アミノ結合（非常に安定）によって固体に結合したままであり、かくして完全に不活性なポリオールを生産できる；
ｂ．−ポリエポキシドの調製。ポリサッカリドは、アルカリｐＨでエピクロロヒドリンで部分的に変性し、アルコールからエポキシド基を導入できる。これらのエポキシド基は、アミノ化支持体と反応させられて、エポキシド基を有する活性化支持体を生産できる；
ｃ．−ポリアミンの調製。二つの前記のポリマーは、エチレンジアミンで変性し、かくしてエポキシドまたはアルデヒド支持体と反応するために理想的な低いｐＫの第一級アミノ基を有するアミノ化ポリマーを生産できる。
【００３８】
ヘテロ多官能性デキストランで活性化された支持体へのＤＮＡプローブの固定化は、ＤＮＡによって調節できる。
【００３９】
ａ．−小さなオリゴヌクレオチド（１２−２０塩基程度）の固定化
市販のＤＮＡプローブは、第一級アミノ基で変性して使用される。二つの異なるタイプのプローブが典型的に使用される：
ｉ．−長いスペーサーアーム（Ｃ７程度）によってオリゴヌクレオチドから離された第一級アミノ基を有するプローブ。
このプローブは、その比較的長いスペーサーアームが、固定化プローブと可溶性ＰＣＲ産物との間のハイブリダイゼーションの過程を嗜好するため、活性化表面に直接固定化することが適切であるようである。しかしながら、前記アミノ基は比較的高いｐＫを有し（約１０．５−１１）、そのため固定化が非常に困難である。
【００４０】
ｉｉ．−比較的短いスぺーサーアーム（Ｃ３程度）によってオリゴヌクレオチドから離された第一級アミノ基を有するプローブ。例えば以下のもの：
【００４１】
【化１】
2004528834.tif 000003
このプローブのアミノ基は、ホスホジエステルの近接性、並びにそのベータヒドロキシル基のため、かなり小さいｐＫ（８．０−９．０）を有する。それ故、それは前記の場合に記載されたアミノ基よりずっと反応性であり、アルデヒド基で活性化されたプレートにより容易に固定化される。ハイブリダイゼーションの立体障害の起こりうる問題は、プローブがスペーサーアームとして機能するデキストラン分子に対して結合するため重要ではないはずである。
【００４２】
ｂ．−ＰＣＲによって一般的に得られた長いＤＮＡ分子（４０塩基対より長い程度）の固定化
プレートに固定化されるＤＮＡの分子は、以下の各種の市販試薬のタイプで事前にアミノ化されるであろう：
【００４３】
【化２】
2004528834.tif 000004
３−（トリフルオロアセチルアミノ）プロピル−（２−シアノエチル）−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロリル）−ホスホロアミダイト
【００４４】
かくしてプローブは、低ｐＫのアミノ基で変性され、それらはプローブに結合したデキストランのアルデヒド基と反応させられるであろう。
【００４５】
しかしながら、長いプローブ、主にｃＤＮＡを得るための最も有用な方法は、細胞ｍＲＮＡまたはそれを含むクローンからの逆転写による合成であり、５’末端でＮＨ２基を有するプライマーの一方を使用するＰＣＲによって後に増幅される。
【００４６】
前記の方法のいずれかによって５’末端でラベルされたＤＮＡ分子は、本特許に記載されたオリゴヌクレオチドに対するのと同じ方法を使用して、表面に固定化できる。
【００４７】
ｃ．−ＤＮＡ類似体の固定化
ＲＮＡまたはＰＮＡのようなＤＮＡの他の類似体もまた、本発明の方法体系を使用して固定化のために適している。
【００４８】
本発明では、一連のオリジナルの貢献が、診断上興味ある表面（例えばミクロタイタープレート、磁性粒子等）の表面へのＤＮＡプローブ及び他のリガンドの共有結合固定化に対してなされる：
１．−プローブの固定化のための有用な空間の量を増大するための（二次元表面の体積への変換）、非常に高分子量のデキストランまたは他のポリマーの使用；
２．−固定化プローブとＰＣＲ産物との間のハイブリダイゼーションを容易にするための、スペーサーアームとしてのデキストランまたは他のポリマーの使用；
３．−高いｐＫのアミノ化プレートに対するデキストラン−アルデヒド−カルボキシルのような大きなヘテロ多官能性ポリマーの固定化（迅速に物理的吸着を生じ、その後迅速な共有結合固定化し、固定化の速度と収率の増大を導く）；
４．−固定化オリゴヌクレオチドまたは試験される可溶性ＤＮＡと、プレートとの間の考え得る静電的相互作用を中和するための、高濃度のアスパラギン酸残基を有するデキストランのような、より小さい非常に荷電したポリマーでのプレートの第二の変性。無水酢酸は、前述のような同様な機能を実行可能である；
５．−プローブとプレートとの間で、オリゴヌクレオチド塩基のアミノ基に影響しない、オリゴヌクレオチドの５’または３’末端に局在する単一の非常に安定な結合による、プローブの共有結合にためのプレートに結合した、例えばデキストランといったポリマーの第二の活性化；
６．−スペーサーアームとしてのデキストランまたは他のポリマーの使用は、固定化に使用することができるアミノ化オリゴヌクレオチドプローブの選択において、ずっと大きな選択肢を与えてくれる。かくして例えば、プローブにおいてスペーサーアームを必要とせず、オリゴヌクレオチドから短い距離のアミノ基を有するオリゴヌクレオチドの３’または５’末端でアミノ化プローブを使用できる。これらのアミノ基は比較的低いｐＫを有し、そのためプレートのデキストラン−アルデヒドに対して非常に反応性である。かくしてアミノ化プローブの固定化は、プローブの末端で導入されたアミノ基が、デキストランのアルデヒド基と容易に反応する非常に選択的で穏やかな条件において実施できる一方、オリゴヌクレオチド配列の塩基のアミノ基は、プレート上の固定化デキストランのアルデヒド基と反応せずに変化しないままである。
【００４９】
好ましい実施態様では、他のものの中で以下の利点を達成した：
ａ．−エポキシド基の活性化は、アルカリｐＨでエチレンジアミンと反応させることによって実施できる；
ｂ．−カルボキシル基は、エチレンジアミンで活性化できるが、この場合は、酸性ｐＨとカルボキシジイミドの存在が必要である；
ｃ．−ヒドロキシル基は、アルカリｐＨでエピクロロヒドリンで活性化でき、かくして（ａ）に記載されたように活性化される支持体上のエポキシド基を形成できる。
【００５０】
エポキシド基を含む支持体はまた、事前のアミノ化を必要とすることなくデキストランで誘導化できる。エポキシド基は、還元剤としてホウ化水素を使用して、非常にアルカリのｐＨでデキストランのヒドロキシル基と反応し、これらのアルカリｐＨでのデキストランの酸化を防止する。最後に残余のエポキシ基は、ブロックまたは破棄されても良い。
【実施例】
【００５１】
例として、最も複雑な固定化プロトコールが記載されよう：そこでは高いｐＫのアミン基でアミノ化されたミクロタイタープレート（あまり反応性ではなく、可溶性ＤＮＡとの非特異的な相互作用に関与する）上のアミノ化ＤＮＡプローブの固定化が実施される。
【００５２】
実施例１
２，０００，０００のデキストランで活性化したアミノ化プレート上のアミノ化オリゴヌクレオチドの固定化
アルデヒド−デキストランの調製
固体のナトリウムペリオダート（０．８７２ｇ）を、デキストランの溶液（５０ｍｌの水中に１．６７ｇのデキストラン、分子量２×１０６）に加える。混合物を攪拌し（磁性スターラーで）、ペリオダートを溶解する。次いでデキストランの酸化反応を、室温で２時間進行させる。一度反応が終結したら、５リットルの蒸留水で７回溶液を透析し、ペリオダート試薬と反応の副産物：ホルムアルデヒドを除去する。かくしてジアルデヒドとして酸化されたポリマー中に存在する２０％のグルコース分子を有するデキストランが得られる。
【００５３】
アルデヒド−デキストランを有するアミノ化プレートの変性
２０ｍｌのアルデヒド−デキストランに対して、１ｍｌのリン酸バッファー５００ｍＭ、ｐＨ７を加え、引き続き１５０ｍＭの濃度に到達するまでパウダー状のトリメチルアミノボラートを加える。この溶液を磁性スターラーで４５分間攪拌する。次いで３５０μｌをアミノ化プレート（例えばCostar社により供給されるもの）の各ウェルに加え、それらを放置して室温で２４時間反応させる。この時間の後、プレートを空にし、それを逆さまに保持することによって乾燥し、フィルター紙の上にそれを軽く叩く。最後に、デキストランとプレートのとの間で形成された結合を、各ウェルに１０ｍｇ／ｍｌのホウ化水素ナトリウムを含む３５０μｌの炭酸バッファー５００ｍＭ、ｐＨ１０．５を加えることによって、残余のアルデヒド基（非常に不活性なヒドロキシル基を形成する）と共に還元する（非常に安定な第二級アミノ結合を形成する）。３０分後、プレートを過剰な水で洗浄し、それを逆さまに保持することによって乾燥し、フィルター紙の上にそれを軽く叩く。
【００５４】
アミノ化オリゴヌクレオチドの固定化
プレートに固定化されたデキストランを、各ウェルに１００μｌのナトリウムペリオダート５０ｍＭを加えることによって一度以上酸化する。室温で１時間後、プレートを過剰な蒸留水で洗浄する。次に、３’末端でアミノ化された３６９ｎｇのプローブとＮａＣｌ３３０ｍＭとを含む１５μｌのリン酸バッファー６５ｍＭ、ｐＨ７．０を各ウェルに加える。固定化デキストランとプローブを、穏やかに振動しながら５５℃で７２時間オーブンで、接着紙でシールしたプレートをインキュベーションすることによって反応させる。この時間の後、固定化プローブを有するプレートを、それを逆さまに保持することによって乾燥し、フィルター紙の上にそれを軽く叩き、炭酸バッファー５００ｍＭ、ｐＨ１０．５中の３５０μｌのホウ化水素ナトリウム（１００ｍｇ／ｍｌ）を添加し、室温で１時間放置することによって還元する。最後に、プレートを蒸留水で洗浄し、それを逆さまに保持することによって乾燥し、フィルター紙の上にそれを軽く叩く。
【００５５】
ハイブリダイゼーションの結果
上記記載のプロトコールを使用して、Ｃ型肝炎ウイルスの特異的プローブを、アミノ化ミクロタイタープレートに固定化した。プローブは３’末端でアミノ化された(5'-GGG AGA GCC ATA GTG GTC TGC GGA A-3'-C3-NH2)。プローブの相補的配列を含むＣ型肝炎ウイルスのＲＮＡの増幅断片のハイブリダイゼーションによる検出のため、前記プレートを使用した。約５０ｎｇ／μｌのＤＮＡを含む臨床サンプルから得られた、ｄＵＴＰ−ジゴキシゲニンでラベルされた１５μｌの増幅産物と、１：５のその一連の希釈物をアッセイした。５０℃で１時間、１００μｌのハイブリダイゼーションバッファー（ＴｒｉｓＨＣｌ５ｍＭ、ｐＨ７．５、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１×ＳＳＣ及び２×デンハルト）を含むウェルでハイブリダイゼーションを実施した。この後、ハイブリダイズしたＤＮＡを、製造者(Roche)に記載された検出試薬と条件を使用して、取り込まれたラベル化ジゴキシゲニンの検出によって評価した。最後に、４０５ｎｍでの吸収を測定した。得られた結果が以下に示されている。
【００５６】
【表１】
2004528834.tif 000005
【００５７】
それ故、プレートに固定化されたプローブは、その相補的なＤＮＡとハイブリダイズでき、１．２ｎｇ／μｌのＤＮＡの量を検出し、それはストレプタビジン−ビオチンの市販のプレートより５倍低いと結論付けた。しかしながら、相補的配列を含まない増幅されたラベル化ＤＮＡでインキュベーションを実施した場合、３０ｎｇ／μｌの高濃度では、相補的ＤＮＡで得られたシグナルとほぼ同じ大きさで存在する。これは、支持体とのイオン的相互作用のため、サンプルのＤＮＡの非常に高い非特異的残存が存在することを示す。臨床サンプルでの診断方法におけるこの実施例に記載されたミクロタイタープレートの使用は、偽の陽性の結果を導くであろう。実施例２及び３は、これらの非特異的相互作用の除去を記載する。
【００５８】
実施例２
２，０００，０００のアスパラギン酸デキストランで活性化されたアミノ化プレート上のアミノ化オリゴヌクレオチドの固定化
アスパラギン酸−アルデヒド−デキストランの調製
固体のナトリウムペリオダート（０．８７２ｇ）を、デキストランの溶液（５０ｍｌの水中に１．６７ｇのデキストラン、分子量２×１０６）に加える。混合物を攪拌し（磁性スターラーで）、ペリオダートを溶解する。次いでデキストランの酸化反応を、室温で２時間進行させる。一度反応が終結したら、５リットルの蒸留水で７回溶液を透析し、ペリオダート試薬と反応の副産物：ホルムアルデヒドを除去する。かくしてジアルデヒドとして酸化されたポリマー中に存在する２０％のグルコース分子を有するデキストランが得られる。
【００５９】
酸化されたデキストランを、２００ｍＭのトリメチルアミノボラートを含むアスパラギン酸ナトリウム３Ｍ、ｐＨ７．５の等容量（５０ｍｌ）の溶液と混合する。反応混合物を１５時間激しく磁性攪拌しながら維持する。この時間の後、１００ｍｇ／ｍｌのホウ化水素ナトリウムを含む５ｍｌの炭酸バッファー５００ｍＭ、ｐＨ１０．５を加える。この混合物を２０−２５℃で磁性攪拌しながら３０分間インキュベートする。次いで過剰なホウ化水素ナトリウムを、濃縮塩酸を使用して反応混合物のｐＨを６．００に低下することによって破壊する。アスパラギン酸で変性され還元されたデキストランを、約１／５０の割合で蒸留水に対して１０回透析する。
【００６０】
前記デキストランを、０．８７２ｍｇのペリオダートで２０％でもう一度酸化し、２時間混合物を攪拌する。ポリアスパラギン酸及びポリアルデヒドデキストランを、１／１００の割合で蒸留水に対して１０回透析する。
【００６１】
アスパラギン酸−アルデヒド−デキストランを有するアミノ化プレートの変性
２０ｍｌのアスパラギン酸−アルデヒド−デキストランに対して、１ｍｌのリン酸バッファー５００ｍＭ、ｐＨ７を加え、引き続き１５０ｍＭの濃度に到達するまでパウダー状のトリメチルアミノボラートを加える。この溶液を磁性スターラーで４５分間攪拌する。次いで３５０μｌをアミノ化プレート（例えばCostar社により供給されるもの）の各ウェルに加え、それらを放置して室温で２４時間反応させる。この時間の後、プレートを空にし、それを逆さまに保持することによって乾燥し、フィルター紙の上にそれを軽く叩く。最後に、デキストランとプレートのとの間で形成された結合を、各ウェルに１０ｍｇ／ｍｌのホウ化水素ナトリウムを含む３５０μｌの炭酸バッファー５００ｍＭ、ｐＨ１０．５を加えることによって、残余のアルデヒド基（非常に不活性なヒドロキシル基を形成する）と共に還元する（非常に安定な第二級アミノ結合を形成する）。３０分後、プレートを過剰な水で洗浄し、それを逆さまに保持することによって乾燥し、フィルター紙の上にそれを軽く叩く。
【００６２】
アミノ化オリゴヌクレオチドの固定化
プレートに固定化されたアスパラギン酸−アルデヒド−デキストランを、各ウェルに１００μｌのナトリウムペリオダート５０ｍＭを加えることによって一度以上酸化する。室温で１時間後、プレートを過剰な蒸留水で洗浄する。次に、３’末端でアミノ化された３６９ｎｇのプローブとＮａＣｌ３３０ｍＭとを含む１５μｌのリン酸バッファー６５ｍＭ、ｐＨ７．０を各ウェルに加える。固定化デキストランとプローブを、穏やかに振動しながら５５℃で７２時間オーブンで、接着紙でシールしたプレートをインキュベーションすることによって反応させる。この時間の後、固定化プローブを有するプレートを、それを逆さまに保持することによって乾燥し、フィルター紙の上にそれを軽く叩き、炭酸バッファー５００ｍＭ、ｐＨ１０．５中の３５０μｌのホウ化水素ナトリウム（１００ｍｇ／ｍｌ）を添加し、室温で１時間放置することによって還元する。最後に、プレートを蒸留水で洗浄し、それを逆さまに保持することによって乾燥し、フィルター紙の上にそれを軽く叩く。
【００６３】
ハイブリダイゼーションの結果
ハイブリダイゼーションの条件とサンプルは、上述の実施例に記載されたものと同じであった。得られた結果は以下のものであった。
【００６４】
【表２】
2004528834.tif 000006
【００６５】
それ故、プレートに固定化されたプローブは、その相補的なＤＮＡとハイブリダイズでき、１．２ｎｇ／μｌのＤＮＡの量を検出すると結論付けた。しかしながら、相補的配列を含まない増幅されたラベル化ＤＮＡでインキュベーションを実施した場合、３０ｎｇ／μｌの高濃度では、支持体とのイオン的相互作用のため、有意な非特異的残存が未だに存在する。しかしながら得られたシグナルは、以前のサンプル（０．４１）よりずっと低く、デキストラン残基中の負の荷電の導入が、支持体とサンプルのＤＮＡの非特異的相互作用を完全には除去しないことを示す。実施例３及び４は、これらの相互作用の完全な除去を記載する。
【００６６】
２，０００，０００Ｄのアスパラギン酸デキストラン及び２９８，０００Ｄのアスパラギン酸デキストランで二重に活性化されたアミノ化プレート上のアミノ化オリゴヌクレオチドの固定化
アスパラギン酸−アルデヒド−デキストランの調製
一方は２，０００，０００Ｄの分子量を有し、他方は２９８，０００Ｄの分子量を有する二つのデキストランを、実施例２に記載されたプロトコールに従って別個に活性化した。
【００６７】
アスパラギン酸−アルデヒド−デキストランを有するアミノ化プレートの変性
最初に、実施例２に記載されたプロトコールに従って、２，０００，０００Ｄの分子量のアスパラギン酸−アルデヒド−デキストランを固定化した。次に、同じプロトコールに従って、２９８，０００Ｄの分子量のアスパラギン酸−アルデヒド−デキストランを固定化した。
【００６８】
アミノ化オリゴヌクレオチドの固定化
実施例１に記載されたプロトコールに正確に従った。
【００６９】
ハイブリダイゼーションの結果
ハイブリダイゼーションの条件とサンプルは、前記の実施例に記載されたものと同じであった。得られた結果は以下の通りであった：
【００７０】
【表３】
2004528834.tif 000007
【００７１】
この場合では、固定化プローブに相補的でないＤＮＡとのハイブリダイゼーションでは、シグナルはほとんど得られず、前記の場合で得られた非特異的な残存はほぼ完全に消失したことを示す。しかしながら、特異的なハイブリダイゼーションは実施例３のものと同程度のままであり、０．２４ｎｇ／μｌ（希釈１／３１２５）の感度限界を有する。さらに、ストレプタビジン−ビオチンを使用して固定化されたプローブを有するプレートでの従来のハイブリダイゼーション法で得られた感度と比較すると、感度は同程度である。
【００７２】
固定化共有結合の強さの指標として、これらのプレートは、２０分間の飽和ＮａＣｌ溶液中でのボイルの後、ハイブリダイゼーションの結果を再生産した。これは、アミノ化プローブの非常に強い共有結合固定化が得られていることを示し、且つこのプローブが、相補的配列を含む溶液中のＤＮＡとのハイブリダイゼーションに対して機能的であることを示す。
【００７３】
実施例４
２，０００，０００Ｄのアスパラギン酸デキストリンで二重に活性化され、無水酢酸でブロックされたアミノ化プレート上でのアミノ化オリゴヌクレオチドの固定化
アスパラギン酸−アルデヒド−デキストランの調製：
２，０００，０００Ｄの分子量を有するデキストランを、実施例２に記載されたプロトコールに従って別個に活性化した。
【００７４】
アスパラギン酸−アルデヒド−デキストランでのアミノ化プロトコールの変性
２，０００，０００Ｄの分子量のアスパラギン酸−アルデヒド−デキストランを、実施例２に記載されたプロトコールに従って固定化した。固定化の後、残余の活性基を、１０分間アセトニトリル中の１０％無水酢酸の溶液とインキュベーションすることによってブロックし、プレートを水で洗浄して乾燥した。
【００７５】
アミノ化オリゴヌクレオチドの固定化
実施例１に記載されたプロトコールに正確に従った。
【００７６】
ハイブリダイゼーションの結果
ハイブリダイゼーションの条件及びサンプルは、前記の実施例で記載されたものと同じであった。得られた結果は以下の通りであった：
【００７７】
【表４】
2004528834.tif 000008
【００７８】
この場合、固定化プローブに相補的でないＤＮＡでのハイブリダイゼーションからは、シグナルは得られず、非特異的な残存が完全に消失したことを示す。しかしながら、特異的なハイブリダイゼーションは同程度のままであり、０．２４ｎｇ／μｌ（希釈１／３１２５）の感度限界を有する。さらに、ストレプタビジン−ビオチンを使用して固定化されたプローブを有するプレートでの従来のハイブリダイゼーション法で得られた感度と比較すると、感度は同程度である。
【００７９】
固定化共有結合の強さの指標として、これらのプレートは、２０分間の飽和ＮａＣｌ溶液中でのボイルの後、ハイブリダイゼーションの結果を再生産した。
【００８０】
かくして本発明では、長い、不活性な、親水性スペーサーアームとしてのデキストランまたは他のポリサッカリドの使用が、臨床診断で興味ある表面で、ＤＮＡプローブ（または他の興味あるリガンド）の共有結合固定化の方法を改良することを示す。そのような表面は、ミクロタイタープレート、磁性粒子、マイクロアレイ、バイオセンサー等を含む。これらの新規な方法の例は、アミノ化された市販のプレートの活性化のための、例えばアスパラギン酸及びアルデヒド基を含むヘテロ多官能性ポリマーの使用と、３’または５’末端で結合したアミノ基を含むＤＮＡプローブの適切な固定化のためのそれらの後の使用を構成する。かくして、非常に安定な化学結合（第二級アミン）によって、配列の末端の一方でＤＮＡプローブの共有結合固定化を達成することが可能である。さらに、相補的な可溶性ＤＮＡのハイブリダイゼーションについての立体障害を防止するための、プレートの表面からの距離を、固定化ＤＮＡプローブが維持することを確保することも可能である。スペーサーアームとしての負の荷電を有するデキストランの使用はまた、固定化ＤＮＡプローブを、可溶性ＤＮＡの考え得る非特異的な吸着に対してほぼ完全に不活性とすることもできる。さらにより興味深いことに、無水酢酸でのプレートの最終ブロッキングは、非特異的なＤＮＡのトレースでさえ十分に防止できる。この方式で固定化されたＤＮＡの新規なプレートは、従来のプローブ（ストレプタビジン−ビオチン複合体によってミクロタイタープレートに結合される）は安定ではない劇的な実験条件（例えばホルムアミドの存在下、または６０℃より高温でのハイブリダイゼーション）でハイブリダイゼーションの実験を実施することを許容する。これらの非常に厳格なハイブリダイゼーション実験の実施は、プローブの全ての塩基とハイブリダイズするＤＮＡの正確な一致が存在しない全てのハイブリダイゼーションを避けることを許容する。この方式では、疾患の考え得るマーカーとして関連する遺伝子中の単一塩基のミューテーションを検出することが可能である。
【図面の簡単な説明】
【００８１】
【図１】図１は、従来技術を説明する図である。
【図２】図２は、本発明を説明する図である。
【図１】
2004528834.tif 000009
【図２】
2004528834.tif 000010
【国際公開パンフレット】
2004528834.tif 000011
2004528834.tif 000012
2004528834.tif 000013
2004528834.tif 000014
2004528834.tif 000015
2004528834.tif 000016
2004528834.tif 000017
2004528834.tif 000018
2004528834.tif 000019
2004528834.tif 000020
2004528834.tif 000021
2004528834.tif 000022
2004528834.tif 000023
2004528834.tif 000024
2004528834.tif 000025
2004528834.tif 000026
2004528834.tif 000027
2004528834.tif 000028
2004528834.tif 000029
2004528834.tif 000030
2004528834.tif 000031
2004528834.tif 000032
2004528834.tif 000033
2004528834.tif 000034
2004528834.tif 000035
2004528834.tif 000036
2004528834.tif 000037
2004528834.tif 000038
2004528834.tif 000039
2004528834.tif 000040
2004528834.tif 000041
2004528834.tif 000042
2004528834.tif 000043
2004528834.tif 000044
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004528834.tif 000045
2004528834.tif 000046
【国際調査報告】
2004528834.tif 000047
2004528834.tif 000048
2004528834.tif 000049