(57)【要約】本発明は、エステル交換脂質の酵素的生産法の生産性を改善することに関する。特に、基質油の精製により酵素的エステル交換反応またはエステル化の生産性を大きく改善し、酵素の有効寿命を延長させることができる方法を開示する。精製媒体の一例は充填シリカゲルである。【特許請求の範囲】
【請求項１】
油脂の生産方法であって：
１種以上のグリセリド類、遊離脂肪酸類、モノヒドロキシルアルコール類、ポリヒドロキシルアルコール類およびエステル類からなる群から選択される１種の化合物または化合物の混合物を含む開始基質を形成する工程と、
前記開始基質を精製基質を生成するために１種以上の精製用媒体と接触させる工程と、
前記精製基質を、前記油脂を製造するエステル化またはエステル交換反応を実施するために、リパーゼ酵素活性を延長させたリパーゼと接触させる工程と
を含む方法。
【請求項２】
前記開始基質がグリセリド類を含み、前記グリセリド類がバター脂、ココアバター、ココアバター代用品、イリッペ脂、コクム（ｋｏｋｕｍ）バター、乳脂、アカテツ脂、フルワラ（ｐｈｕｌｗａｒａ）バター、沙羅双樹（ｓａｌ）脂、シア脂、ボルネオ脂、ラード、ラノリン、牛脂、羊脂、獣脂または他の動物脂、カノーラ（ｃａｎｏｌａ）油、カスター油、ココナツ油、コエンドロ油、トウモロコシ油、綿実油、ハシバミ油、麻実油、亜麻仁油、マンゴー核油、メドウフォーム（ｍｅａｄｏｗｆｏａｍ）油、牛脚油、オリーブ油、パーム油、パーム核油、ピーナッツ油、アブラナ油、米ぬか油、ベニバナ油、サザンカ（ｓａｓａｎｑｕａ）油、大豆油、ヒマワリ油、トール油、ツバキ油、植物油、メンハーデン（ｍｅｎｈａｄｅｎ）油、ギンダラ油、タラ肝油、オレンジラフィー（ｏｒａｎｇｅ  ｒｏｕｇｈｙ）油、パイルハード（ｐｉｌｅ  ｈｅｒｄ）、イワシ油、鯨油およびニシン油などの可塑性脂または固形脂に変換できる海産油、１，３−ジパルミトイル−２−モノオレイン（ＰＯＰ）、１（３）−パルミトイル−３（１）−ステアロイル−２−モノオレイン（ＰＯＳｔ）、１，３−ジステアロイル−２−モノオレイン（ＳｔＯＳｔ）、グリセロール、トリグリセリド、ジグリセリド、モノグリセリド、ベヘン酸トリグリセリド、トリオレイン、トリパルミチン、トリステアリン、パームオレイン、パームステアリン、パーム核オレイン、パーム核ステアリンおよび中鎖脂肪酸類のトリグリセリド類；またはそれらの部分的または完全水素添加加工油または分画加工油からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記開始基質がエステル類を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記エステル類がワックスエステル類、アルキルエステル類、メチルエステル類、エチルエステル類、イソプロピルエステル類、オクタデシルエステル類、アリールエステル類、プロピレングリコールエステル類、エチレングリコールエステル類、１，２−プロパンジオールエステル類および１，３−プロパンジオールエステル類からなる群から選択される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記エステル類がモノヒドロキシルアルコール類またはポリヒドロキシルアルコール類のエステル化またはエステル交換反応から形成される、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
前記モノヒドロキシルアルコール類または前記ポリヒドロキシルアルコール類が環状、直鎖または分枝鎖化合物の第一級、第二級または第三級アルコール類である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記モノヒドロキシルアルコール類がメチルアルコール、イソプロピルアルコール、アリルアルコール、エタノール、プロパノール、ｎ−ブタノール、イソ−ブタノール、ｓ−ブタノール、ｔ−ブタノール、ｎ−ペンタノール、イソ−ペンタノール、ｎ−ヘキサノールまたはオクタデシルアルコールからなる群から選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記ポリヒドロキシルアルコール類がグリセロール、プロピレングリコール、エチレングリコール、１，２−プロパンジオールおよび１，３−プロパンジオールからなる群から選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記開始基質が環状、直鎖または分枝鎖化合物の第一級、第二級または第三級モノヒドロキシルアルコール類を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記モノヒドロキシルアルコール類がメチルアルコール、イソプロピルアルコール、アリルアルコール、エタノール、プロパノール、ｎ−ブタノール、イソ−ブタノール、ｓ−ブタノール、ｔ−ブタノール、ｎ−ペンタノール、イソ−ペンタノール、ｎ−ヘキサノールまたはオクタデシルアルコールからなる群から選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記開始基質が環状、直鎖または分枝鎖化合物の第一級、第二級または第三級ポリヒドロキシルアルコール類を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記ポリヒドロキシルアルコール類がグリセロール、プロピレングリコール、エチレングリコール、１，２−プロパンジオールおよび１，３−プロパンジオールからなる群から選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記開始基質が１種以上の脂肪酸類を含み、前記１種以上の脂肪酸類が飽和、不飽和またはポリ不飽和である、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記１種以上の脂肪酸類が４個から２２個の炭素長の炭素鎖を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記脂肪酸がパルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸、アラキドン酸、エルカ酸、カプロン酸、カプリル酸、カプリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）、５−エイコセン酸、酪酸、γ−リノレン酸および共役リノール酸からなる群から選択される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記１種以上の精製用媒体および前記リパーゼが１本以上のカラムに充填される、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記カラムが前記開始基質、前記精製基質、前記１種以上の精製用媒体または前記リパーゼの温度を調節する被覆カラムである、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記精製基質を、バッチ・スラリー精製反応のために１つのタンク中で前記開始基質と前記１種以上の精製用媒体とを混合することによって、あるいは一連のバッチ・スラリー精製反応のために一連のタンク中で前記開始基質を混合することによって調製する、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記精製基質をろ過、遠心分離または濃縮によって１種以上の精製用媒体から分離してから、前記精製基質と前記リパーゼとを反応させる、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
バッチ・スラリー反応のためにタンク中で前記精製基質と前記リパーゼとを混合するか、あるいは前記精製基質を、前記リパーゼ含有カラムを通して流出させることをさらに含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記１種以上の精製用媒体のベッドをカラム内の前記リパーゼのベッド上に載せる、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
前記カラムが前記開始基質、前記精製基質、前記１種以上の精製用媒体または前記リパーゼの温度を調節する被覆カラムである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記リパーゼが培養真核細胞株または原核細胞株から得られる、請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
前記リパーゼが１，３−選択的リパーゼである、請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
前記リパーゼが非選択的リパーゼである、請求項１に記載の方法。
【請求項２６】
前記精製用媒体が活性炭、石炭製活性炭、木製活性炭、泥炭製活性炭、ココナツ殻製活性炭、天然鉱物、加工鉱物、モンモリロナイト、アタパルジャイト、ベントナイト、パリゴルスカイト（ｐａｌｙｇｏｒｓｋｉｔｅ）、フーラー土、ジアトマイト（ｄｉａｔｏｍｉｔｅ）、スメクタイト（ｓｍｅｃｔｉｔｅ）、ホルマイト（ｈｏｒｍｉｔｅ）、石英砂、石灰岩、カオリン、ボールクレー、タルク、ピロフィライト、パーライト、シリカ、珪酸ナトリウム、シリカヒドロゲル、シリカゲル、ヒュームドシリカ、沈殿シリカ、透析シリカ、繊維状物質、セルロース、セルロースエステル類、セルロースエーテル類、微結晶セルロース、アルミナ、ゼオライト、澱粉、モレキュラーシーブス、以前に使用された固定化リパーゼ、珪藻土、イオン交換樹脂、サイズ排除クロマトグラフィ樹脂、キレート化樹脂、キラル樹脂、もみがら灰、逆相用シリカ、および漂白土からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項２７】
前記精製用媒体が２００〜７５０ｍ2／ｇの表面積、３〜４２５のメッシュ値、４〜２００μの平均粒度、２０〜１５０Åの平均細孔半径および０．６８〜１．１５ｃｍ3／ｇの平均細孔容積を有するシリカである、請求項１に記載の方法。
【請求項２８】
前記シリカが約６０Åの平均細孔サイズで、３５〜６０メッシュである、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記リパーゼに接触させた後、前記油脂の１つ以上の物性を測定することにより酵素活性をモニターする工程と、
前記精製基質を前記リパーゼに接触させる持続時間を調整する、または前記開始基質、前記精製基質、前記１種以上の精製用媒体または前記リパーゼの温度を調整する工程と、
前記酵素活性を最適にするために前記物性の変化に応じて前記１種以上の精製用媒体の量並びに種類を調整する工程と、
をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３０】
前記１つ以上の物性が前記油脂のメトラー滴点温度を含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記１つ以上の物性が前記油脂の固形脂含量温度プロフィルを含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
生産された前記油脂が１，３−ジグリセリド類である、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、油脂を生産する方法に関する。具体的には、本発明は、油脂の生産においてグリセリド類、遊離脂肪酸類、モノヒドロキシルアルコール類、ポリヒドロキシルアルコール類およびエステル類のエステル交換反応またはエステル化に用いられるリパーゼの酵素活性を延長させることに関する。
【背景技術】
【０００２】
関連技術
油脂は、水酸基がカルボン酸でエステル化されているグリセロール部分からなるトリグリセリドで構成されている。固形脂は、飽和脂肪酸を有するトリグリセリドによって形成される傾向があるが、不飽和脂肪酸を有するトリグリセリドは室温で液体（油）になる傾向がある。１個の脂肪酸と２個のアルコール基または２個の脂肪酸と１個のアルコール基を各々有するモノグリセリドおよびジグリセリドもまた、微量成分として油脂中に見られる。
【０００３】
多くの油脂は、植物性物質または動物性物質の加工から容易に得られる。しかし、いくつかの油脂は、よく知られた化学的または酵素的エステル交換反応またはエステル化方法によって得られる。これらの方法によって、グリセリド上の１個以上の脂肪酸アシル基が転移、加水分解または別の脂肪酸アシル基と置換される。化学的方法には過酷なアルカリ条件、高温が必要であり、無駄な副産物を生成する。生産された変色油脂は、中和、洗浄および遠心分離して触媒を除去し、最後に漂白する必要がある。これらの問題に加えて、化学的エステル交換反応または化学的エステル化は、グリセリドの位置または転移、加水分解または置換される脂肪酸の種類において非特異的である。このように特異的な油脂を化学的に生産することは非常に困難または不可能である。これとは対照的に、酵素的エステル交換反応法またはエステル化法はより簡便で、より清浄で環境に優しく、またグリセリドの脂肪酸アシル基の修飾に関して特異性が高い。
【０００４】
グリセリドにおけるこのエステル交換反応またはエステル化に作用することのできる酵素はリパーゼ類として知られている。リパーゼ類は、原核微生物または真核微生物から得られ、典型的には３つの分類の１つに属する（エー・アール・マクレー（Ｍａｃｒａｅ，Ａ．Ｒ．）、Ｊ．Ａ．Ｏ．Ｃ．Ｓ．６０卷：ｐ．２４３Ａ〜２４６Ａ（１９８３年））。
【０００５】
第一の種類として、脂肪酸を任意のグリセリド位置から遊離、またはグリセリド位置へ結合できる非特異的リパーゼ類が挙げられる。これらのリパーゼ類の与える化学的方法上の利益はほとんどない。このようなリパーゼ類は、カンジダ−シリンドラカエ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｃｙｌｉｎｄｒａｃａｅ）、瘡コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｎｅｓ）および黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）から得られている（マクレー（Ｍａｃｒａｅ）、１９８３年；米国特許第５，１２８，２５１号明細書）。リパーゼの第二の種類は、特異的脂肪酸を特異的グリセリド類へ付加するか、または特異的グリセリド類から除去するだけである。したがって、このようなリパーゼ類は、特異的グリセリド類の生産または修飾においてのみ有用である。このようなリパーゼ類は、ゲオトリクム−カンジドゥム（Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ  ｃａｎｄｉｄｉｕｍ）およびクモノスカビ属（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｕｓ）、およびケカビ属（Ｍｕｃｏｒ）から得られている（マクレー（Ｍａｃｒａｅ）、１９８３年；米国特許第５，１２８，２５１号明細書）。リパーゼ類の最後の種類は、１位および３位の末端におけるグリセリド炭素からの脂肪酸の除去または付加を触媒する。このようなリパーゼ類は、サーモミセス−ラヌギノーサ（Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ  ｌａｎｕｇｉｎｏｓａ）、リゾムコール−ミエイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉ）、黒色アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）、ムコール−ジャバニクス（Ｍｕｃｏｒ  ｊａｖａｎｉｃｕｓ）、リゾープス−デレマ（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｄｅｌｅｍａｒ）およびリゾプス−アリズス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ａｒｒｈｉｚｕｓ）から得られている（マクレー（Ｍａｃｒａｅ）、１９８３年）。
【０００６】
この最後の酵素の種類は広汎な応用性を有している。例えば、ココアバターは、主に（約７０〜８０重量％）飽和オレイン酸飽和（ＳＯＳ）トリグリセリド類（ＥＰ０１８８１２２  Ａ１）からなる。チョコレート製品が室温ではその形態を保っているが、人の体温下でわずかに溶ける独特の特性を提供するのはこのトリグリセリドの組成である（米国特許第４，２７６，３２２号明細書）。これらのＳＯＳトリグリセリド類としては、１，３−ジパルミトイル−２−モノオレイン（ＰＯＰ）、１（３）−パルミトイル−３（１）−ステアロイル−２−モノオレイン（ＰＯＳｔ）、１，３−ジステアロイル−２−モノオレイン（ＳｔＯＳｔ）が挙げられる。このように、中間位置にオレイン酸エステル基を有するオレイン酸に富んだグリセリド類は１，３−特異的リパーゼの存在下、パルミチン酸やステアリン酸と共に温置することにより、ＰＯＰ、ＰＯＳｔおよびＳｔＯＳｔ、すなわちココアバター代用品を生産することができる（米国特許第４，２７６、３２２号明細書）。ココアバター代用品の生産により、ココアバターの供給量および価格の大きな変動が食品製造業者に与える影響が緩和される。
【０００７】
１，３−特異的リパーゼ類はまた、米国特許第６，００４，６１１号明細書に記載されているように１，３−ジグリセリドの製造においても有用である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
これらの利点にもかかわらず、酵素的エステル交換反応またはエステル化は多量の精製リパーゼ提供の費用のため高価な方法である。さらに、時間の経過および大量の油脂への曝露により、リパーゼの酵素活性が低下する。本発明は、リパーゼの酵素活性を延長させる方法を提供することにより、これらの問題を軽減する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
発明の概要
本発明は、１種以上のグリセリド類、遊離脂肪酸類、モノヒドロキシルアルコール類、ポリヒドロキシルアルコール類およびエステル類からなる群から選択された１つの化合物または化合物の混合物を含む開始基質を形成する工程と、この開始基質を１種以上の精製用媒体と接触させて精製基質を生成する工程と、エステル化またはエステル交換反応をさせるためにこの精製基質をリパーゼの酵素活性が延長されたリパーゼと接触させて油脂を作成する工程とを含む、油脂の生産方法に関する。
【００１０】
本発明の一実施形態において、前記開始基質は、バター脂、ココアバター、ココアバター代用品、イリッペ脂、コクム（ｋｏｋｕｍ）バター、乳脂、アカテツ脂、フルワラ（ｐｈｕｌｗａｒａ）バター、沙羅双樹（ｓａｌ）脂、シア脂、ボルネオ脂、ラード、ラノリン、牛脂、羊脂、獣脂または他の動物脂、カノーラ（ｃａｎｏｌａ）油、カスター油、ココナツ油、コエンドロ油、トウモロコシ油、綿実油、ハシバミ油、麻実油、亜麻仁油、マンゴー核油、メドウフォーム（ｍｅａｄｏｗｆｏａｍ）油、牛脚油、オリーブ油、パーム油、パーム核油、ピーナッツ油、アブラナ油、米ぬか油、ベニバナ油、サザンカ（ｓａｓａｎｑｕａ）油、大豆油、ヒマワリ油、トール油、ツバキ油、植物油、メンハーデン（ｍｅｎｈａｄｅｎ）、ギンダラ油、タラ肝油、オレンジラフィー（ｏｒａｎｇｅ  ｒｏｕｇｈｙ）油、パイルハード（ｐｉｌｅ  ｈｅｒｄ）、イワシ油、鯨油およびニシン油などの可塑性脂または固形脂に変換できる海産油、１，３−ジパルミトイル−２−モノオレイン（ＰＯＰ）、１（３）−パルミトイル−３（１）−ステアロイル−２−モノオレイン（ＰＯＳｔ）、１，３−ジステアロイル−２−モノオレイン（ＳｔＯＳｔ）、グリセロール、トリグリセリド、ジグリセリド、モノグリセリド、ベヘン酸トリグリセリド、トリオレイン、トリパルミチン、トリステアリン、パームオレイン、パームステアリン、パーム核オレイン、パーム核ステアリンおよび中鎖脂肪酸類のトリグリセリド類；またはそれらの部分的または完全水素添加加工油または分画加工油からなる群から選択されたグリセリド類を含む。
【００１１】
本発明の他の実施形態において、前記開始基質はエステル類を含む。前記エステル類は、ワックスエステル類、アルキルエステル類、メチルエステル類、エチルエステル類、イソプロピルエステル類、オクタデシルエステル類、アリールエステル類、プロピレングリコールエステル類、エチレングリコールエステル類、１，２−プロパンジオールエステル類および１，３−プロパンジオールエステル類からなる群から選択されることが好ましい。また、前記エステル類は、モノヒドロキシルアルコール類またはポリヒドロキシルアルコール類のエステル化またはエステル交換反応から形成されることが好ましい。前記モノヒドロキシルアルコール類または前記ポリヒドロキシルアルコール類は、環状、直鎖または分枝鎖化合物の第一級、第二級または第三級アルコール類であることが好ましい。また、前記モノヒドロキシルアルコール類がメチルアルコール、イソプロピルアルコール、アリルアルコール、エタノール、プロパノール、ｎ−ブタノール、イソ−ブタノール、ｓ−ブタノール、ｔ−ブタノール、ｎ−ペンタノール、イソ−ペンタノール、ｎ−ヘキサノールまたはオクタデシルアルコールからなる群から選択されることが好ましい。また、前記ポリヒドロキシルアルコール類はグリセロール、プロピレングリコール、エチレングリコール、１，２−プロパンジオールおよび１，３−プロパンジオールからなる群から選択されることが好ましい。
【００１２】
本発明の他の実施形態において、前記開始基質は環状、直鎖または分枝鎖化合物の第一級、第二級または第三級モノヒドロキシルアルコール類を含む。前記モノヒドロキシルアルコール類はメチルアルコール、イソプロピルアルコール、アリルアルコール、エタノール、プロパノール、ｎ−ブタノール、イソ−ブタノール、ｓ−ブタノール、ｔ−ブタノール、ｎ−ペンタノール、イソ−ペンタノール、ｎ−ヘキサノールまたはオクタデシルアルコールからなる群から選択されることが好ましい。
【００１３】
本発明の他の実施形態において、前記開始基質は環状、直鎖または分枝鎖化合物の第一級、第二級または第三級ポリヒドロキシルアルコール類を含む。前記ポリヒドロキシルアルコール類は、グリセロール、プロピレングリコール、エチレングリコール、１，２−プロパンジオールおよび１，３−プロパンジオールからなる群から選択されることが好ましい。
【００１４】
本発明の他の実施形態において、前記開始基質は１種以上の脂肪酸を含んでおり；前記１種以上の脂肪酸類は飽和、不飽和またはポリ不飽和である。前記１種以上の脂肪酸類は４個から２２個の炭素長の炭素鎖を含むことが好ましい。また、前記脂肪酸はパルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸、アラキドン酸、エルカ酸、カプロン酸、カプリル酸、カプリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）、５−エイコセン酸、酪酸、γ−リノレン酸および共役リノール酸からなる群から選択されることが好ましい。また、前記１種以上の脂肪酸類は６個から２２個の炭素長の炭素鎖を含むことが好ましい。
【００１５】
本発明の他の実施形態において、１種以上の精製用媒体およびリパーゼが１本以上のカラムに充填される。前記カラムは前記開始基質、前記精製基質、前記１種以上の精製用媒体または前記リパーゼの温度を調節する被覆カラムであることが好ましい。
【００１６】
本発明の他の実施形態において、バッチ・スラリー精製反応のために１つのタンク中で前記開始基質と前記１種以上の精製用媒体とを混合するか、あるいは一連のバッチ・スラリー精製反応のために一連のタンク中で前記開始基質を混合することにより前記精製基質を調製する。前記精製基質をろ過、遠心分離または濃縮によって１種以上の精製用媒体より分離してから、前記精製基質と前記リパーゼとを反応させることが好ましい。また、本発明の方法は、バッチ・スラリー反応のためにタンク中で前記精製基質と前記リパーゼとを混合するか、あるいは前記精製基質を、前記リパーゼ含有カラムを通して流出させる工程をさらに含むことが好ましい。
【００１７】
本発明の他の実施形態において、前記１種以上の精製用媒体のベッドをカラム内の前記リパーゼのベッド上に載せる。前記カラムは前記開始基質、前記精製基質、前記１種以上の精製用媒体または前記リパーゼの温度を調節する被覆カラムであることが好ましい。
【００１８】
本発明の他の実施形態において、前記リパーゼは培養真核細胞株または原核細胞株から得られる。
【００１９】
本発明の他の実施形態において、前記リパーゼが１，３−選択的リパーゼである。
【００２０】
本発明の他の実施形態において、前記リパーゼは非選択的リパーゼである。
【００２１】
本発明の他の実施形態において、前記精製用媒体は活性炭、石炭製活性炭、木製活性炭、泥炭製活性炭、ココナツ殻製活性炭、天然鉱物、加工鉱物、モンモリロナイト、アタパルジャイト、ベントナイト、パリゴルスカイト（ｐａｌｙｇｏｒｓｋｉｔｅ）、フーラー土、ジアトマイト（ｄｉａｔｏｍｉｔｅ）、スメクタイト（ｓｍｅｃｔｉｔｅ）、ホルマイト（ｈｏｒｍｉｔｅ）、石英砂、石灰岩、カオリン、ボールクレー、タルク、ピロフィライト、パーライト、シリカ、珪酸ナトリウム、シリカヒドロゲル、シリカゲル、ヒュームドシリカ、沈殿シリカ、透析シリカ、繊維状物質、セルロース、セルロースエステル類、セルロースエーテル類、微結晶セルロース；アルミナ、ゼオライト、澱粉、モレキュラーシーブス、以前に使用された固定化リパーゼ、珪藻土、イオン交換樹脂、サイズ排除クロマトグラフィ樹脂、キレート化樹脂、キラル樹脂、もみがら灰、逆相用シリカ、および漂白土からなる群から選択される。
【００２２】
本発明の他の実施形態において、前記精製用媒体が２００〜７５０ｍ2／ｇの表面積、３〜４２５のメッシュ値、４〜２００μの平均粒度、２０〜１５０Åの平均細孔半径および０．６８〜１．１５ｃｍ3／ｇの平均細孔容積を有するシリカである。前記シリカは約６０Åの平均細孔サイズで３５〜６０メッシュであることが好ましい。
【００２３】
本発明の他の実施形態において、本方法は、（ａ）前記リパーゼに接触させた後、前記油脂の１つ以上の物性を測定することにより酵素活性をモニターする工程と；（ｂ）前記精製基質を前記リパーゼに接触させる持続時間を調整すること、または前記開始基質、前記精製基質、前記１種以上の精製用媒体または前記リパーゼの温度を調整する工程と；（ｃ）前記酵素活性を最適にするために前記物性の変化に応じて前記１種以上の精製用媒体の量並びに種類を調整する工程と、をさらに含む。前記１つ以上の物性は前記油脂のメトラー滴点温度を含むことが好ましい。また、前記１つ以上の物性は前記油脂の固形脂含量温度プロフィルを含むことが好ましい。
【００２４】
本発明の他の実施形態において、生産された前記油脂は１，３−ジグリセリド類である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２５】
好ましい実施形態の詳細な説明
明細書中の目的のために、用語の基質とは、以下の物質の１種または任意の組合せを言う：グリセリド類、トリグリセリド類、ジグリセリド類、モノグリセリド類、遊離脂肪酸類、モノヒドロキシルアルコール類、ポリヒドロキシルアルコール類またはエステル類。用語の開始基質とは、開始基質を１種以上の精製用媒体と接触させることによる精製工程がまだ完了されていない基質を言う。用語の精製基質とは、精製されていて、リパーゼに接触する用意ができている基質を言う。用語の生産物とは、リパーゼの酵素的エステル交換反応活性またはエステル化活性により作成または生産されたエステル化またはエステル交換脂肪類、油類、グリセリド類、トリグリセリド類、ジグリセリド類、モノグリセリド類、遊離脂肪酸類、モノヒドロキシルアルコール類、ポリヒドロキシルアルコール類またはエステル類と交換可能に用いられる。生産物はまた、リパーゼと接触させた結果、エステル交換脂肪類、油類、グリセリド類、トリグリセリド類、ジグリセリド類、モノグリセリド類、遊離脂肪酸類、モノヒドロキシルアルコール類、ポリヒドロキシルアルコール類またはエステル類の含量が比例的に増加した室温での液体または固体を言う。エステル交換生産物またはエステル化生産物は、生産物がさらなる酵素的エステル交換反応またはエステル化反応を受けた開始基質または精製基質の内容物とは区別される。開始基質または精製基質の内容物は、酵素的エステル交換反応またはエステル化反応を受けていないか、あるいは１回以上受けたことがあり得る。用語の脂肪酸とは、用語の遊離脂肪酸または脂肪酸アシル基と交換可能に用いられる。
【００２６】
本発明は、１種以上のグリセリド類、遊離脂肪酸類、モノヒドロキシルアルコール類、ポリヒドロキシルアルコール類およびエステル類からなる群から選択される１種の化合物または化合物の混合物を含む開始基質を形成する工程と；前記開始基質を、精製基質を生成するために１種以上の精製用媒体と接触させる工程と；前記精製基質を、前記油脂を作成するエステル化またはエステル交換反応を実施するためにリパーゼ酵素活性を延長させたリパーゼと接触させる工程とを含む油脂を生産する方法に関する。
【００２７】
また、本発明は、１種以上のグリセリド類、遊離脂肪酸類、モノヒドロキシルアルコール類、ポリヒドロキシルアルコール類およびエステル類からなる群から選択される１種の化合物または化合物の混合物を含む開始基質を形成する工程と；前記開始物質の含量と相対的に含量を比例的に増加した化合物を含む精製基質を生成するために、前記開始基質を１種以上の精製用媒体と接触させる工程と；生産物を作成するエステル化またはエステル交換反応を実施するために、前記精製基質をリパーゼ酵素活性を延長させたリパーゼと接触させる工程とを含む油脂を生産する方法に関する。
【００２８】
エステル化またはエステル交換反応は、グリセリド、モノグリセリド、ジグリセリド、トリグリセリド、モノヒドロキシルアルコール、ポリヒドロキシルアルコール、エステルまたは遊離脂肪酸上にアシル基を付加、加水分解、再配置または置換させる方法である。前記アシル基は、モノグリセリド、ジグリセリド、トリグリセリド、エステルまたは遊離脂肪酸から誘導できる。前記アシル基のアルキル部分は、直鎖または分枝鎖、飽和または不飽和であってもよく、あるいは酸素、硫黄または窒素を含む非炭素置換基を含有してもよい。エステル交換反応またはエステル化は、好ましくは培養真核細胞株または原核細胞株から得られるリパーゼにより影響を受ける。前記リパーゼは、基質に関して非特異的または特異的であってもよい。前記リパーゼは、グリセリドの１位および３位の末端エステル類のエステル交換反応を触媒する１，３−選択的リパーゼであることが好ましい。前記リパーゼは好ましくは、非選択的、非特異的リパーゼであってもよい。
【００２９】
前記開始基質は、１種のグリセリド油脂から構成でき、無作為化として知られた方法で物性を変更することができる。例えば、完全水素添加パーム核油を無作為化できるリパーゼで処理すると、生産物の成分は種々の物性を有する。カンジダ−シリンドラカエ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｃｙｌｉｎｄｒａｃａｅ）リパーゼなどの１，３−選択的リパーゼ類および非選択リパーゼ類の双方とも、この無作為化方法ができる。
【００３０】
本発明に有用なリパーゼ類が得られる多くの微生物がある。米国特許第５，２１９，７３３号明細書には、エイ・イオフルガス（Ａ．ｉｏｆｕｒｇｕｓ）およびエイ・リポリチクム（Ａ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃｕｍ）などのアクロモバクター（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ）属；シー・ビスコスム変異株・パラリポリチクム（Ｃ．ｖｉｓｃｏｓｕｍ  ｖａｒ．ｐａｒａｌｉｐｏｌｙｔｉｃｕｍ）などのクロモバクテリウム（Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属；瘡コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｎｅｓ）などのコリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属； 黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）などのブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）属；黒色アスペルギルス（Ａ．ｎｉｇｅｒ）およびエイ・オリゼー（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）などのアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属；シー・シリンドラシー（Ｃ．ｃｙｌｉｎｄｒａｃｅａ）、シー・アンタークチカ・ビー（Ｃ．ａｎｔａｒｃｔｉｃａ  ｂ）、シー・ローサ（Ｃ．ｒｏｓａ）およびシー・ルゴーサ（Ｃ．ｒｕｇｏｓａ）などのカンジダ属；エイチ・ラヌギノーサ（Ｈ．ｌａｎｕｇｉｎｏｓａ）などのフミコーラ（Ｈｕｍｉｃｏｒａ）属；ピー・カセイコラム（Ｐ．ｃａｓｅｉｃｏｌｕｍ）、ピー・クルストサム（Ｐ．ｃｒｕｓｔｏｓｕｍ）、ピー・シクロピウム（Ｐ．ｃｙｃｌｏｐｉｕｍ）およびピー・ロキフォルチ（Ｐ．ｒｏｑｕｅｆｏｒｔｉ）などのペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属；ティー・エルノビー（Ｔ．ｅｒｎｏｂｉｉ）などのトルロプシス（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ）属；エム・ミエイ（Ｍ．ｍｉｅｈｅｉ）、エム・ジャポニクス（Ｍ．ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）およびエム・ジャバニクス（Ｍ．ｊａｖａｎｉｃｕｓ）などのケカビ（Ｍｕｃｏｒ）属；枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）などのバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属；ティー・イバダネンシス（Ｔ．ｉｂａｄａｎｅｎｓｉｓ）およびティー・ラヌギノーサ（Ｔ．ｌａｎｕｇｉｎｏｓａ）などのサーモミセス（Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ）属（エイチ・ザング（Ｚｈａｎｇ，Ｈ．）ら、Ｊ．Ａ．Ｏ．Ｃ．Ｓ．７８卷：ｐ．５７〜６４（２００１年）を参照）；アール・デレマ（Ｒ．ｄｅｌｅｍａｒ）、アール・ジャポニクス（Ｒ．ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）、アール・アリズス（Ｒ．ａｒｒｈｉｚｕｓ）およびアール・ネベウス（Ｒ．ｎｅｖｅｕｓ）などのクモノスカビ（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）属；緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、ピー・フラギ（Ｐ．ｆｒａｇｉ）、ピー・セパシア（Ｐ．ｃｅｐａｃｉａ）、ピー・メフィチカ変異株・リポリチカ（Ｐ．ｍｅｐｈｉｔｉｃａ  ｖａｒ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）、およびピー・フルオレッセンス（Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）などのシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属；アルカリゲネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）属；アール・ミエイ（Ｒ．ｍｉｅｈｅｉ）などのリゾムコール（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ）属；エイチ・ローサ（Ｈ．ｒｏｓａ）などのフミコロ（Ｈｕｍｉｃｏｌｏ）属；およびジー・カンジドゥム（Ｇ．ｃａｎｄｉｄｉｕｍ）などのゲオトリクム（Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ）属のものを含む微生物例を記載している。これらの微生物から得���れたリパーゼ類の幾つかは、精製酵素として商品入手できる。
【００３１】
上記生物から得られたリパーゼ類は、通常の当業者に知られた通常の方法により好適な担体を用いて本発明用に固定化される。米国特許第４，７９８，７９３号明細書；米国特許第５，１６６，０６４号明細書；米国特許第５，２１９，７３３号明細書；米国特許第５，２９２，６４９号明細書；および米国特許第５，７７３，２６６号明細書には、固定化リパーゼおよび調製法の例を記載している。調製法の例としては、エントラッピング法、無機担体共有結合法、有機担体共有結合法および吸着法が挙げられる。下記実施例に用いられるリパーゼは、ノボザイムス（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ）（デンマーク）から入手したが、他社により調製された精製リパーゼおよび／または固定化リパーゼを代用できる。本発明では、粗製酵素調製またはリパーゼを過剰発現できる微生物細胞、このような細胞の培養物、培養物処理により得られた基質酵素溶液、または酵素含有組成物を用いることも考慮されている。
【００３２】
米国特許第４，９４０，８４５号明細書および米国特許第５，２１９，７３３号明細書には、幾つかの有用な担体の特徴を記載している。有用な担体は微細孔であり、疎水性の多孔質表面を有していることが好ましい。通常、細孔は、約１０Åから約１，０００Åの平均半径を有し、約２０から約８０容積％、より好ましくは約４０から約６０容積％の多孔度を有する。細孔により、担体に担体粒子当たりの酵素結合面積の増加が供される。好ましい無機担体の例としては、多孔質ガラス、多孔質セラミックス、セライト、酸化チタンなどの多孔質金属粒子、ステンレス鋼またはアルミナ、多孔質シリカゲル、モレキュラーシーブ、活性炭、粘土、カオリナイト、パーライト、ガラス繊維、珪藻土、ベントナイト、ヒドロキシアパタイト、リン酸カルシウムゲル、および無機担体のアルキルアミン誘導体が挙げられる。好ましい有機担体の例としては、微細孔テフロン、脂肪族オレフィンポリマー（例えば、ポリエチレン、ポリプロピレン、スチレンのホモポリマーまたはコポリマーまたはそれらの混合物または前処理無機支持体）ナイロン、ポリアミド類、ポリ炭酸塩類、ニトロセルロースおよびアセチルセルロースが挙げられる。他の好適な有機担体としては、疎水性多孔質表面を提供するアルキル基、フェニル基、トリチル基または他の類似の疎水性基を有するアガロースゲルなどの親水性多糖類が挙げられる（例えば、「オクチルセファロース（Ｏｃｔｙｌ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）ＣＬ−４Ｂ」、「フェニルセファロース（Ｐｈｅｎｙｌ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）ＣＬ−４Ｂ」、双方ともファルマシア・ファイン・ケミカルズ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｆｉｎｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）の製品）。微細孔吸着樹脂としては、スチレンまたはアルキルアミンポリマー、キレート樹脂、「ダウエックス（ＤＯＷＥＸ）ＭＷＡ−１」（イオン交換基として第三級アミンを有し、基本的にはジビニルベンゼンと交差結合したポリスチレン鎖から構成され、平均細孔半径が１５０Åおよび粒度が２０〜５０メッシュを有するダウ・ケミカル・カンパニー（Ｄｏｗ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．））により製造された弱塩基性アニオン交換樹脂）などのイオン交換樹脂、およびセルロース担体の親水性基を遮蔽することにより調製されたものなどの親水性セルロース樹脂、例えば「セルロファイン（Ｃｅｌｌｕｌｏｆｉｎｅ）ＧＣ７００−ｍ」（チッソコーポレーション（Ｃｈｉｓｓｏ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）の製品、粒度が４５〜１０５μｍ）から作製されたものが挙げられる。
【００３３】
本発明の方法において、遊離脂肪酸は４０個の炭素長までの炭素鎖を有するカルボン酸である。前記遊離脂肪酸類は、飽和、不飽和またはポリ不飽和である。
【００３４】
本発明に有用な脂肪酸類の例としては、飽和直鎖または飽和分枝脂肪酸、不飽和直鎖または不飽和分枝脂肪酸、ヒドロキシ脂肪酸およびポリカルボン酸が挙げられる。脂肪酸類は、天然物でもよく、天然品を加工または精製または合成的に製造してもよい。有用な脂肪酸における最長の炭素鎖の長さに関して上限または下限はないが、それらの長さは、約６個から約３４個の炭素長であることが好ましい。本発明に有用な特定の脂肪酸は、米国特許第４，８８３，６８４号明細書；米国特許第５，１２４，１６６号明細書；米国特許第５，１４９，６４２号明細書；米国特許第５，２１９，７３３号明細書；米国特許第５，３９９，７２８号明細書に記載されている。
【００３５】
米国特許第５，２１９，７３３号明細書に記載された偶数の炭素原子数を有する有用な飽和直鎖脂肪酸類の例としては、酢酸、酪酸、カプロン酸、カプリル酸、カプリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、アラキジン酸、ベヘン酸、リグノセリン酸、ヘキサコサン酸、オクタコサン酸、トリアコンタン酸およびｎ−ドトリアコンタン酸が挙げられ、またプロピオン酸、ｎ−吉草酸、エナント酸、ペラルゴン酸、ヘンデカン酸、トリデカン酸、ペンタデカン酸、ヘプタデカン酸、ノナデカン酸、ヘンエイコサン酸、トリコサン酸、ペンタコサン酸およびヘプタコサン酸などの奇数の炭素原子数を有するものが挙げられる。
【００３６】
米国特許第５，２１９，７３３号明細書に記載されている有用な飽和分枝脂肪酸類の例としては、イソ酪酸、イソカプロン酸、イソカプリル酸、イソカプリン酸、イソラウリン酸、１１−メチルドデカン酸、イソミリスチン酸、１３−メチル−テトラデカン酸、イソパルミチン酸、１５−メチル−ヘキサデカン酸、イソステアリン酸、１７−メチルオクタデカン酸、イソアラキン酸、１９−メチル−エイコサン酸、ａ−エチル−ヘキサン酸、ａ−ヘキシルデカン酸、ａ−ヘプチルウンデカン酸、２−デシルテトラデカン酸、２−ウンデシルテトラデカン酸、２−デシルペンタデカン酸、２−ウンデシルペンタデカン酸、およびファイン・オキソコール（Ｆｉｎｅ  ｏｘｏｃｏｌ）１８００酸（ニッサン・ケミカル・インダストリーズ社の製品）が挙げられる。
【００３７】
米国特許第５，２１９，７３３号明細書に記載されている有用な飽和奇数炭素分枝脂肪酸類の例としては、６−メチル−オクタン酸、８−メチル−デカン酸、１０−メチル−ドデカン酸、１２−メチル−テトラデカン酸、１４−メチル−ヘキサデカン酸、１６−メチル−オクタデカン酸、１８−メチル−エイコサン酸、２０−メチル−ドコサン酸、２２−メチル−テトラコサン酸、２４−メチル−ヘキサコサン酸および２６−メチルオクタコサン酸などのイソブチル基末端のアンテイソ脂肪酸類が挙げられる。
【００３８】
米国特許第５，２１９，７３３号明細書に記載されている有用な不飽和脂肪酸類の例としては、４−デセン酸、カプロレン酸、４−ドデセン酸、５−ドデセン酸、ラウロレン酸、４−テトラデセン酸、５−テトラデセン酸、９−テトラデセン酸、パルミトレン酸、６−オクタデセン酸、オレイン酸、９−オクタデセン酸、１１−オクタデセン酸、９−エイコセン酸、シス−１１−エイコセン酸、セトレイン酸、１３−ドコセン酸、１５−テトラコセン酸、１７−ヘキサコセン酸、６，９，１２，１５−ヘキサデカテトラエン酸、リノール酸、リノレン酸、ａ−エイコステアリン酸、ｂ−エイコステアリン酸、プニシン酸（ｐｕｎｉｃｉｃ  ａｃｉｄ）、６，９，１２，１５−オクタデカテトラエン酸、パリナリン酸、５，８，１１，１４−エイコサテトラエン酸、５，８，１１，１４，１７−エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）、７，１０，１３，１６，１９−ドコサペンタエン酸、４，７，１０，１３，１６，１９−ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）などが挙げられる。
【００３９】
米国特許第５，２１９，７３３号明細書に記載されている有用なヒドロキシ肪酸類の例としては、α−ヒドロキシラウリン酸、α−ヒドロキシミリスチン酸、α−ヒドロキシパルミチン酸、α−ヒドロキシステアリン酸、ω−ヒドロキシラウリン酸、α−ヒドロキシアラキン酸、９−ヒドロキシ−１２−オクタデセン酸、リシノール酸、α−ヒドロキシベヘン酸、９−ヒドロキシ−トランス−１０，１２−オクタデカジエン酸、カモレン酸（ｋａｍｏｌｅｎｉｃ  ａｃｉｄ）、イプロリン酸（ｉｐｕｒｏｌｉｃ  ａｃｉｄ）、９，１０−ジヒドロキシステアリン酸、１２−ヒドロキシステアリン酸などが挙げられる。
【００４０】
米国特許第５，２１９，７３３号明細書に記載されている有用なポリカルボン酸類の例としては、蓚酸、クエン酸、マロン酸、コハク酸、グルタール酸、アジピン酸、ピメリン酸、スベリン酸、アゼライン酸、セバシン酸、Ｄ，Ｌ−リンゴ酸などが挙げられる。
【００４１】
本発明の反応用に、これらの脂肪酸は単独で使用でき、あるいは同一基または異なる基の少なくとも２種のこのような酸を混合して使用できる。好ましくは、遊離酸類は４個から３４個の炭素長の炭素鎖を有する。より好ましくは、遊離酸類は４個から２６個の炭素長の炭素鎖を有する。最も好ましくは、遊離酸類は４個から２２個の炭素長の炭素鎖を有する。遊離脂肪酸は、以下の群から選択されるのが好ましい：パルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸、アラキドン酸、エルシン酸、カプロン酸、カプリル酸、カプリン酸、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）、ラウリン酸、ミリスチン酸、５−エイコセン酸、酪酸、γ−リノレン酸および共役リノール酸。種々の植物および動物油脂（魚油脂肪酸類など）から誘導された脂肪酸並びに植物および動物油脂の加工または精製脂肪酸（ＥＰＡおよびＤＨＡを濃縮した分画魚油脂肪酸など）を添加することもできる。中鎖脂肪酸類（エイ・メロリー（Ｍｅｒｏｌｌｉ、Ａ．）らによりＩＮＦＯＲＭ、８卷：ｐ．５９７〜６０３（１９９７年）に記載される）も使用できる。また遊離脂肪酸類は、６個から３６個、６個から２４個または６個から２２個の炭素長の炭素鎖を有することが好ましい。
【００４２】
本発明に有用なグリセリド類は、化学式ＣＨ2ＲＣＨＲ’ＣＨ2Ｒ’’により表される分子を含み、式中Ｒ、Ｒ’およびＲ’’は、アルコール類（ＯＨ）、またはＲ’’’が飽和、不飽和またはポリ不飽和、炭素長４０個までの直鎖または分枝鎖炭素であるＯＣ（Ｏ）Ｒ’’’により表されるアシル脂肪酸類である。Ｒ、Ｒ’およびＲ’’は、同一であってもまたは異なってもよい。エステル類Ｒ、Ｒ’およびＲ’’は、明細書中に記載された任意の脂肪酸類から得ることができる。本発明に適したグリセリド類は、Ｒ、Ｒ’およびＲ’’の全てがアシル基であるトリグリセリド類、Ｒ、Ｒ’およびＲ’’のうち２個がアシル基であり、１個のアルコール官能性が存在するジグリセリド類、Ｒ、Ｒ’およびＲ’’のうち１個だけがアシル基であり、２個のアルコール官能性が存在するか、またはグリセロールであるモノグリセリド類を含む。本発明の出発物質として有用なグリセリド類は、天然油脂、加工油脂、精製油脂および合成油脂を含む。精製油脂は、ミネソタ州セントポール、イーガン（Ｅａｇａｎ）出版、シー・スタウファー（Ｓｔａｕｆｆｅｒ，Ｃ．）署「油脂」に記載されている。
【００４３】
本発明の方法に適したグリセリド類は、以下のものから選択される：バター脂、ココアバター、ココアバター代用品、イリッペ脂、コクム（ｋｏｋｕｍ）バター、乳脂、アカテツ脂、フルワラ（ｐｈｕｌｗａｒａ）バター、沙羅双樹（ｓａｌ）脂、シア脂、ボルネオ脂、ラード、ラノリン、牛脂、羊脂、獣脂または他の動物脂、カノーラ（ｃａｎｏｌａ）油、カスター油、ココナツ油、コエンドロ油、トウモロコシ油、綿実油、ハシバミ油、麻実油、亜麻仁油、マンゴー核油、メドウフォーム（ｍｅａｄｏｗｆｏａｍ）油、牛脚油、オリーブ油、パーム油、パーム核油、ピーナッツ油、アブラナ油、米ぬか油、ベニバナ油、サザンカ（ｓａｓａｎｑｕａ）油、大豆油、ヒマワリ油、トール油、ツバキ油、植物油、メンハーデン（ｍｅｎｈａｄｅｎ）油、ギンダラ油、タラ肝油、オレンジラフィー（ｏｒａｎｇｅ  ｒｏｕｇｈｙ）油、パイルハード（ｐｉｌｅ  ｈｅｒｄ）、イワシ油、鯨油およびニシン油などの可塑性脂または固形脂に変換できる海産油、１，３−ジパルミトイル−２−モノオレイン（ＰＯＰ）、１（３）−パルミトイル−３（１）−ステアロイル−２−モノオレイン（ＰＯＳｔ）、１，３−ジステアロイル−２−モノオレイン（ＳｔＯＳｔ）、グリセロール、トリグリセリド、ジグリセリド、モノグリセリド、ベヘン酸トリグリセリド、トリオレイン、トリパルミチン、トリステアリン、パームオレイン、パームステアリン、パーム核オレイン、パーム核ステアリンおよび中鎖脂肪酸類のトリグリセリド類。水素添加油脂または分画油脂などの加工油も使用できる。分画脂肪の例としては、パームオレイン、パームステアリン、パーム核オレインおよびパーム核ステアリンが挙げられる。上記の完全水素添加油類または部分水素添加油類のいずれも有用である。
【００４４】
上記に掲げた油類の水素添加体または不飽和体も本発明とって有用である。本発明の方法にとり、これらの脂肪酸エステル類は単独で使用でき、あるいはこれらの少なくとも２種を混合して使用できる。また、１種以上のこれらのエステル類は、１種以上の脂肪酸類と共に使用できる。
【００４５】
本発明に有用なアルコール類の例としては、モノヒドロキシルアルコール類またはポリヒドロキシルアルコール類を含む。前記モノヒドロキシルアルコール類は、メチルアルコール、イソプロピルアルコール、アリルアルコール、エタノール、プロパノール、ｎ−ブタノール、イソ−ブタノール、ｓ−ブタノール、ｔ−ブタノール、ｎ−ペンタノール、イソ−ペンタノール、ｎ−ヘキサノールまたはオクタデシルアルコールなどの１個以上の炭素を有する環状、直鎖または分枝鎖化合物の第一級、第二級または第三級アルコール類であってもよい。ヒドロキシル基は、フェノールなどの芳香族環に付加できる。ポリヒドロキシルアルコール類の例としては、グリセロール、プロピレングリコール、エチレングリコール、１，２−プロパンジオールおよび１，３−プロパンジオールが挙げられる。
【００４６】
米国特許第５，２１９，７３３号明細書には、本発明に有用な他のアルコール類を示している。これらのアルコール類としては、限定しないが、１４−メチルヘキサデカノール−１、１６−メチルオクタデカノール−１、１８−メチルノナデカノール、１８−メチルエイコサノール、２０−メチルヘンエイコサノール、２０−メチルドコサノール、２２−メチルトリコサノール、２２−メチルテトラコサノール、２４−メチルペンタコサノール−１および２４−メチルヘキサコサノールが挙げられる。
【００４７】
開始基質にはエステル類を含むことができる。グリセリド以外に有用な他のエステル類の例としては、ワックスエステル類、メチル、エチル、イソプロピルまたはオクタデシルエステル類などのアルキルエステル類、アリールエステル類、プロピレングリコールエステル類、エチレングリコールエステル類、１，２−プロパンジオールエステル類および１，３−プロパンジオールエステル類が挙げられる。エステル類は、モノヒドロキシルアルコール類またはポリヒドロキシルアルコール類のエステル化またはエステル交換反応から形成できる。
【００４８】
本発明は、実施例４に記載されているようにバッチ・スラリータイプ反応が使用でき、リパーゼ類および基質のスラリーを激しく攪拌することによりそれらの良好な接触を確実にする。エステル交換反応またはエステル化反応は、固定化リパーゼ類で具備された固定ベッド反応器中で実施されることが好ましい。
【００４９】
油脂は、少量の不純物の存在のため一部分解を受ける。これらの不純物並びに酸化油脂などの分解産物は、リパーゼ酵素活性に有害な影響を与える可能性がある。他の酸化種としては、自己増殖ラジカル反応経路を開始する試薬、脂肪類、油類または酵素類を酸化できる酸素または他の反応性酸素種（過酸化物、オゾン、スーパーオキシドなど）が挙げられる。しかしながら、これらの有害作用は十分に理解されていない。本発明は、酵素の有効寿命を延長させるために基質油を精製することにより、酵素的エステル交換反応またはエステル化の生産性を大いに改善する方法を開示する。下記の実施例は、酵素的エステル交換反応またはエステル化の生産性が基質油の精製により大いに改善されていることを示している。精製手段の一例は、基質のプレカラム精製のためにカラム中に充填されたシリカゲルである。しかしながら、シリカゲルを充填リパーゼの上部に充填ベッドとして提供できることも考慮されている。
【００５０】
本発明の精製用媒体は、２００〜７５０ｍ2／ｇの表面積、３〜４２５のメッシュ値、４〜２００μの平均粒度、２０〜１５０Åの平均細孔半径および０．６８〜１．１５ｃｍ3／ｇの平均細孔容積を有するシリカであることが好ましい。また、前記シリカゲルは約６０Åの平均細孔サイズで３５〜６０メッシュであることが好ましい。
【００５１】
本発明に有用な精製用媒体が以下のものの１種から選択できることも考慮されている：活性炭、石炭製活性炭、木製活性炭、泥炭製活性炭、ココナツ殻製活性炭、天然鉱物、加工鉱物、モンモリロナイト、アタパルジャイト、ベントナイト、パリゴルスカイト（ｐａｌｙｇｏｒｓｋｉｔｅ）、フーラー土、珪藻土、ジアトマイト（ｄｉａｔｏｍｉｔｅ）、スメクタイト（ｓｍｅｃｔｉｔｅ）、ホルマイト（ｈｏｒｍｉｔｅ）、石英砂、石灰岩、カオリン、粘土、ボールクレー、タルク、ピロフィライト、パーライト、シリカ、珪酸ナトリウム、シリカヒドロゲル、シリカゲル、ヒュームドシリカ、沈殿シリカ、透析シリカ、トリシル（ＴｒｉＳｙｌ（登録商標））シリカ、繊維状物質、セルロース、セルロースエステル類、セルロースエーテル類、微結晶セルロース、アビセル（Ａｖｉｃｅｌ（登録商標））、アルミナ、ゼオライト、澱粉、モレキュラーシーブス、以前に使用された固定化リパーゼ、珪藻土、イオン交換樹脂、サイズ排除クロマトグラフィ樹脂、キレート化樹脂、キラル樹脂、もみがら灰、逆相用シリカ、および漂白土。精製用媒体は、樹脂状、顆粒状、微粒子状、膜状または繊維状であり得る。
【００５２】
本発明の方法において、１種以上の精製用媒体とリパーゼとを１種以上のカラムに充填する。複数種の精製用媒体を用いる場合は、それらを混合して単一のカラムに充填することもできるし、また異なったカラムに分離しておくこともできる。他の実施形態においては、１種以上の精製用媒体をカラム内の充填リパーゼのベッド上に載せる。あるいは、リパーゼをそれ自体のカラム充填することにより、リパーゼを精製用媒体から分離しておくことができる。開始基質における種々の不純物を除去する目的で１種以上の精製用媒体を用いることができる。カラムおよび他の流体導管は、開始基質、精製基質、精製用媒体またはリパーゼの温度を調節できるように被覆することができる。精製用媒体は反復使用のために再生することができる。
【００５３】
また、本発明の方法において、精製基質は、バッチ・スラリータイプ精製反応用の１つのタンク内で開始基質を１種以上の精製用媒体と混合することによって、または一連のバッチ・スラリータイプ精製反応用の一連のタンク内で開始基質を混合することによって調製する。これらのバッチ・スラリータイプ精製反応において、種々の精製用媒体を分離しておくことができ、または組合せることができる。１種の精製用媒体（または精製用媒体の特定の混合物）との反応後、ろ過、遠心分離または濃縮によって開始基質を精製用単一媒体（または複数媒体）から分離する。この分離ステップ後、開始基質を他の精製用媒体によってさらに精製するか、または精製基質として利用され、リパーゼと反応させる。このバッチ・スラリータイプ精製反応法によって調製された精製基質を、バッチ・スラリータイプエステル交換反応またはエステル化用タンク内でリパーゼと反応させることができる。あるいは、精製基質を、リパーゼカラムを通して流出させることができる。反応タンク、カラムおよび他の流体導管は、開始基質、精製基質、精製用媒体またはリパーゼの温度を調節できるように被覆することができる。加熱／冷却コイルまたは温度制御室などの他の温度調節法が考慮され、当業界でよく知られている。精製用媒体は反復使用のために再生することができる。
【００５４】
リパーゼの酵素活性は、温度、光および水分含量などの要因によっても影響される。温度は上記のとおり制御される。光は当業界に知られている種々の光遮断法または光ろ過法の使用によって遮ることができる。周囲の大気水分を含む水分含量は、本工程を閉鎖系として操作することにより制御される。この閉鎖系は、水分を追い出すために窒素陽圧下におくことができる。あるいは、基質、精製用ベッドまたはカラム、または充填リパーゼカラムの上部に窒素ガスベッドを載せることができる。ヘリウムまたはアルゴンなどの他の不活性気体を用いることもできる。これらの方法は、基質、生成物または酵素に大気酸素種（酸素を含む）を触れさせないというさらなる利点を有している。
【００５５】
樹脂製固定化リパーゼを開始基質または精製基質と混合して、スラリーを形成することができ、これを好適なカラムに充填する。開始基質は１種以上のグリセリド類、モノグリセリド類、ジグリセリド類、トリグリセリド類、遊離脂肪酸類、モノヒドロキシルアルコール類、ポリヒドロキシルアルコール類およびエステル類から調製される。基質がリパーゼとの接触およびエステル交換反応またはエステル化のために、カラムを連続的に流れることができるように基質の温度が調節される。固形グリセリドまたは脂肪酸を使用する場合は、基質を流体状態になるまで加熱する。基質を、重力下、ぜん動ポンプまたはピストンポンプの使用、吸引または真空ポンプの影響下、または遠心ポンプの使用により、カラムを通して流す。生産されたエステル交換油脂類を採集し、当業界によく知られた方法によって反応産物の混合物から所望のグリセリド類を分離する。この連続法によって、反応時に基質が空気に曝露される可能性が減少し、したがって不飽和脂肪酸類、グリセリド類などが用いられた場合、水分や酸素種に曝露されないという利点を有する。他に、上記のようなバッチ・スラリータイプの生産のための反応タンクを用いることもできる。これらの反応タンクも、酸素、水分または他の周囲酸化種への暴露を防ぐために空気に触れないように密封される。
【００５６】
本発明の方法は、リパーゼに接触させた後に前記油脂の１つ以上の物性を測定することにより酵素活性をモニターする工程と；前記精製基質を前記リパーゼに接触させる持続時間を調整する工程と；前記酵素活性を最適化するために前記物性の変化に応じて前記１種以上の精製用媒体の量並びに種類を調整する工程とを含む。
【００５７】
本発明の方法は、また、リパーゼに接触させた後に前記油脂の１つ以上の物性を測定することにより酵素活性をモニターする工程と；開始基質、精製基質、１種以上の精製用媒体またはリパーゼの温度を調整する工程と；および前記酵素活性を最適化するために前記物性の変化に応じて前記１種以上の精製用媒体の量並びに種類を調整する工程とを含む。
【００５８】
本発明において、リパーゼの酵素活性における変化は、充填したリパーゼを通って流出したエステル交換油脂をモニターすることにより追跡することができる。基質と生産物とでは、異なった特徴の物性を有し、リパーゼの活性測定に利用される。例えば、メトラー（Ｍｅｔｔｌｅｒ）滴点（ＭＤＰ、アメリカオイル化学者協会公式法（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｏｉｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｓ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  Ｏｆｆｉｃｉａｌ  Ｍｅｔｈｏｄ）＃Ｃｃ  １８〜８０）は、油脂混合物が液体になる温度を測定するための当業界でよく知られた方法である。また、種々の温度における生産物の固形脂肪含量（ＳＦＣ）プロフィルも測定することができる（ＭＤＰ、アメリカオイル化学者協会公式法（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｏｉｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｓ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  Ｏｆｆｉｃｉａｌ  Ｍｅｔｈｏｄ）＃Ｃｄ  １６ｂ〜９３）。
【００５９】
精製基質がリパーゼカラムを通過する場合、生産物のＭＤＰ温度の変化に応じて、基質の流速を減少させることにより、酵素活性が測定できる。基質と生産物は、各々特徴的なＭＤＰ温度を有する。リパーゼの酵素活性が低下するにつれて、生産物に変換される基質はより少なくなり、その結果、基質対生産物の比が増加する。この比の増加により流出油脂のＭＤＰ温度が変化し、非エステル交換基質のＭＤＰ温度値に向かっていく。この変化を最小化するために、基質の流速を減少させて基質が充填リパーゼに、より長時間曝露させるようにする。流速の減少により生産物：基質の比が増加し、その結果、流出油脂またはグリセリドのＭＤＰ温度はエステル交換生産物の温度を示す。しかし、流速の減少は生産物量の減少をもたらす。流速は、生産物が目標ＭＤＰを有するまで、反復的に減少させる。流速の減少は、所望のグリセリド生産物の減少に関連すると考えることができ、これは酵素活性の変化に関連すると考えることができる。このように、ＭＤＰ温度をモニターし、維持することは、酵素活性の変化を推定するために有用である。
【００６０】
ＳＦＣ温度プロフィルもまた、酵素活性の変化を推定するために有用である。ＳＦＣ温度プロフィルは、温度の関数としての固形脂肪含量の１つの尺度である。基質と生産物とは各々特徴的なＳＦＣ温度プロフィルを有する。リパーゼ活性が低下するにつれて、流出油脂のプロフィルが変化し、基質のプロフィルに向かっていく。所望のＳＦＣ温度プロフィルを維持するために、基質の流速を減少させる。上記のとおり、この流速の減少は、酵素活性の変化を推定するために有用である。このように、ＳＦＣ温度プロフィルをモニターし、維持することは、酵素活性の変化を推定するために有用である。
【００６１】
また、酵素活性は、生産物の光学分光学的特徴の変化に応じて油脂基質の流速を減少させることにより測定できる。基質と生産物とは各々特徴的な光学スペクトルを有する。リパーゼ活性が低下するにつれて、特徴的な分光学的シグナルを増加させる生産物量が減少する。ここでもまた、流速を、流出生産物が再びその特徴的な分光学的シグナルを示すまで反復的に減少させる。流速の減少は、所望のグリセリド生産物の減少に関連すると考えることができ、これは酵素活性の変化に関連すると考えることができる。このように、生産物の光学スペクトルをモニターし、維持することは、酵素活性の変化を推定するために有用である。あるいは、油脂基質の屈折率の変化をモニターすることができる。
【００６２】
バッチ・スラリータイプ生産用タンク内で精製基質をリパーゼと反応させる場合、生産物の物性変化を、上記のようにモニターすることもできる。バッチ・スラリータイプ法において、開始基質を精製用単一媒体（または複数媒体）と接触させる至適時間が決定される。また、精製基質をリパーゼと接触させる至適時間も決定される。
【００６３】
生産物のＭＤＰ温度、ＳＦＣ温度プロフィル、光学分光学的シグナルまたは他の物理的変化を調べることにより、リパーゼ活性を精密にモニターすることができる。いくらかの量の活性低下は不可避のため、基質の流速は時間の経過とともに減少するはずである。しかし、精製用媒体の量と種類の実験によって、酵素活性低下を減少させる至適システムが用意される。
【００６４】
このように、本発明は前記リパーゼを通して流出後、前記油脂の１つ以上の物性測定により酵素活性をモニターする工程と、前記基質混合物または前記精製基質混合物の流速、カラム滞留時間または温度を調整する工程と、および前記酵素活性を最適化するために前記物性変化に応じて、前記精製用媒体の量と種類を調整する工程とを含む。
【００６５】
開始温度が１種以上のグリセリド油からなっている場合、生産物のエステル交換油は食用油として望ましいものとするために、脱臭などの通常の精油工程に供することができる。開始基質がグリセリド類と遊離脂肪酸類からなっている場合、本法によって得られた所望のグリセリド類は、米国特許第５，２１９，７３３号明細書などの通常の方法によって反応混合物から分離できる。バッチ・スラリータイプ法の場合、エーテルなどの好適な溶媒を用い、アルカリによって未反応脂肪酸原料を除去し、脱水し、溶媒層を乾燥し、この層から溶媒を除去して所望の生産物を分離することができる。所望の生産物は、例えば、カラムクロマトグラフィによって精製できる。本発明の方法により、マーガリン、ショートニングおよびココアバター代用品などの他の菓子脂肪類用にトランス脂肪酸を有さないか、または少ないエステル交換脂肪またはエステル化脂肪を生産することが好ましい。
【００６６】
このようにして得られた所望の油脂は、多様な料理への応用に利用できる。
【００６７】
以下の実施例は、前記酵素の生産性に及ぼす基質前処理の効果を示している。
【実施例】
【００６８】
以下の実施例は、例証となるだけで、添付の特許請求の範囲により定義された本発明の範囲を限定する意図なない。
【００６９】
実施例１および２において、エステル交換反応はいかなる前処理もなく実施された。両実施例において、酵素活性の急速な低下がカラム操作の初期に観察された。この急速な活性低下期における推定半減期は、６日から１４日であり；次に活性低下速度は、２８日から３０日の推定半減期を示した。活性の急速低下は、約３０日間のカラム操作後、再度観察された。対照的に、実施例３は、シリカ精製用カラムによる操作が初期の急速な酵素活性低下期を有さなかったことを示している。推定半減期は約３０日であり；次に活性低下は、より緩やかとなり、第二の推定半減期は約５０日であった。
実施例１：２２ｇの酵素（ノボザイムス（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ）のリポザイム（Ｌｉｐｏｚｙｍｅ（登録商標））ＴＬ  ＩＭ）を、液体ダイズ油と混合し、被覆ガラスカラム（直径２．７ｃｍ）に充填した。ダイズ油を、実際の基質（完全水素添加ダイズ油：液体ダイズ油＝２７：７３）をポンプで吸引することにより流出させた。カラムと基質を６５℃に維持した。酵素反応の程度は、メトラー（Ｍｅｔｔｌｅｒ）滴点（ＭＤＰ）として測定された基質と生産物の融解性の変化により極めてよくモニターできた。カラムの油流は、１１７〜１１８°Ｆで生産物のＭＤＰを有するように調整した。酵素活性は、生産物が１１７〜１１８°Ｆ付近の類似ＭＤＰｓを有する流速を比較することにより推定された。
【００７０】
表１は、これらの結果の要約である。最初の２週間で活性の急降下があり；次いで活性降下は緩やかになった。１３日目における酵素活性は４日目の約６０％レベルであった。３０日目後にもう１回、活性急降下があった。図１（閉鎖ひし形）に、より詳細なデータを示す。
表１．実施例１におけるシリカ前処理なしのカラム操作結果の要約
４日目まで        ：カラムからのダイズ油の流出＆流速調整
４日目〜７日目    ：３日間で２５％の活性降下（６日目が推定半減期）
７日目〜１０日目  ：３日間で１３％の活性降下（１２日目が推定半減期）
１０日目〜１３日目：３日間で１１％の活性降下（１４日目が推定半減期）
１３日目〜２５日目：１２日間で２０％の活性降下（３０日目が推定半減期）
２６日目          ：カラムから全排出した
１３日目〜３５日目：２２日間で４０％の活性降下（２９日目が推定半減期）
２７日目〜３５日目：８日間で２０％の活性降下（２０日目が推定半減期）
３６日目〜４１日目：５日間で２５％の活性降下（１０日目が推定半減期）
実施例２：反復実験のため、ピストンポンプの替わりにぜん動ポンプを使用すること以外、実施例１の記載と同一の方法で酵素カラムを調製し、操作した。表２は、これらの結果の要約である。実施例１と同じく、最初の２週間で活性の急降下があり；次いで活性降下は緩やかになった。しかし、３５日目後にもう１回、活性急降下があった。図１（開放四角形）に、より詳細なデータを示す。
表２．実施例２におけるシリカ前処理なしのカラム操作結果の要約
２日目まで        ：ダイズ油の流出＆流速調整
２日目〜８日目    ：６日間で４４％の活性降下（７日目が推定半減期）
２日目〜１２日目  ：１０日間で４９％の活性降下（１０日目が推定半減期）
１２日目〜３５日目：２３日間で２８％の活性降下（４０日目が推定半減期）
３５日目〜４６日目：１１日間で３７％の活性降下（１５日目が推定半減期）
４５日目〜５１日目：６日間で１８％の活性降下（１６日目が推定半減期）
実施例３：酵素カラムは、実施例１および２に記載されたとおり調製し、３８ｇのシリカゲル（３５〜６０メッシュ、６０Å）を酵素ベッドの上部に載せた。カラム操作および分析条件は、前記実施例と同一であった。表３はこれらの結果の要約である。
【００７１】
カラム操作の初期に活性の急降下がなく、この時点での推定半減期は約３０日であった。カラムをより延長された期間操作すると、より長い推定半減期が観察された。図１（開放三角形）に、より詳細なデータを示す。
表３．シリカ前カラム処理をしたカラム操作結果の要約
２日目まで        ：ダイズ油の流出＆流速調整
２日目〜９日目    ：７日間で１３％の活性降下（２８日目が推定半減期）
９日目〜３４日目  ：２５日間で４６％の活性降下（２７日目が推定半減期）
３４日目〜４６日目：１２日間で１５％の活性降下（４１日目が推定半減期）
４５日目〜６０日目：１５日間で１５％の活性降下（５０日目が推定半減期）
実施例４：１Ｌフラスコ中の４００ｇの基質油（完全水素添加ダイズ油：トウモロコシ油＝２７：７３）を７０℃に加熱してから、４０ｇのノボザイムス（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ）のリポザイム（Ｌｉｐｏｚｙｍｅ（登録商標））ＴＬ  ＩＭリパーゼを加えた。酵素／油スラリーをこの温度で激しく攪拌し、反応の１、２、３、４、８、１８時間後にサンプル採取した。バッチ反応後、２．７ミクロン粒子保持のろ紙を通してスラリーをろ過することにより酵素を生産物油から分離した。表４に、サンプルのＳＦＣ温度プロフィルおよび遊離脂肪酸含量を示す。バッチ反応により、１０倍以上の遊離脂肪酸が得られた。本反応は、反応８時間後に平衡に達すると思われた。
【００７２】
【表１】
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上記明細書中に述べた全ての公表文献は、引用文献としてそれらの全てがここに組込まれている。
【００７３】
前述の発明は、明快さと理解を目的にかなり詳細に記載したが、本開示の解釈から本発明および添付された特許請求の範囲から逸脱せずに形態と内容において種々変更できることが、当業者によって認識されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００７４】
【図１】ピストンポンプが精製用媒体なしに使用（閉鎖ひし形）、ぜん動ポンプが精製用媒体なしに使用（開放四角形）、ピストンポンプが精製用媒体と共に使用される（開放三角形）、生成物流速の減少により測定されたリパーゼ酵素活性の低下を示すグラフである。
【図１】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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