(57)【要約】本発明は、熱ショックタンパク質又はα（２）マクログロブリン（α２Ｍ）を含む組成物を製造する方法に関し、該組成物は、ある種の癌又は感染性疾患のある因子に対して免疫原性を有し、本明細書に記載の方法により製造される。本発明はさらに、免疫応答を誘発する方法、並びに、原発性及び転移性新生物疾患及び感染性疾患の予防及び治療方法に関する。具体的には、本発明は、個体に組成物を投与するステップを含む免疫応答の誘発方法を提供し、上記組成物は、第１の熱ショックタンパク質又はα２Ｍと、それと複合体化した上記の種の癌の抗原の抗原性又は上記感染性疾患の因子の抗原の抗原性を提示するペプチドとを含む所定量の精製された第１複合体と；等量又はそれ以上の第２の熱ショックタンパク質又はα２Ｍとを混合することにより製造され、ここで上記第２の熱ショックタンパク質又はα２Ｍは、上記の種の癌の抗原の抗原性又は上記感染性疾患の因子の抗原の抗原性を提示するペプチドとｉｎ ｖｉｔｒｏでそれぞれ複合体化されたものではなく、かつ上記の種の癌の癌組織又は上記感染性疾患因子に感染した細胞からそれぞれ複合体として単離される複合体の形態ではない。前記方法はさらに、癌細胞又は感染性疾患のある因子に対して抗原性を有するペプチドを含むｈｓｐ−ペプチド又はα２Ｍ−複合体で感作した、抗原提示細胞を投与するステップを含んでもよい。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ある種の癌又は感染性疾患のある因子に対して免疫原性を有する組成物を製造する方法であって、以下の（ａ）及び（ｂ）：
（ａ）第１の熱ショックタンパク質と、それと複合体化した上記の種の癌の抗原の抗原性若しくは上記感染性疾患の因子の抗原の抗原性を提示する第１ペプチド、とを含む、所定量の精製された第１複合体；又は、多数の異なる第１ペプチドを含む、所定量の異種第１複合体の精製された集団；及び
（ｂ）等量又はそれ以上の第２の熱ショックタンパク質であって、上記の種の癌の抗原の抗原性又は上記感染性疾患の因子の抗原の抗原性を提示するペプチドとｉｎ ｖｉｔｒｏで複合体化されたものではなく、かつ、上記の種の癌の癌組織又は上記感染性疾患因子に感染した細胞からそれぞれ複合体として単離される複合体の形態ではない、上記第２の熱ショックタンパク質；
を混合することを含む、上記方法。
【請求項２】
第１の熱ショックタンパク質と第２の熱ショックタンパク質の質量比が１：１である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
第１の熱ショックタンパク質と第２の熱ショックタンパク質の質量比が１：２である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
第１の熱ショックタンパク質と第２の熱ショックタンパク質の質量比が１：５である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
第１の熱ショックタンパク質と第２の熱ショックタンパク質の質量比が１：１０である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
第１の熱ショックタンパク質と第２の熱ショックタンパク質の質量比が１：１００である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
第１複合体が上記の種の癌の癌組織又は上記感染性疾患因子に感染した細胞からそれぞれ調製される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
第１複合体が、第１の熱ショックタンパク質を腫瘍特異的抗原又は上記感染性疾患因子の抗原と複合体化させることによりｉｎ ｖｉｔｒｏで調製される、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
第１の熱ショックタンパク質又は上記腫瘍特異的抗原若しくは上記感染性疾患因子の抗原が組換え体である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
第２の熱ショックタンパク質がどんな分子とも複合体化されていない、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
第２の熱ショックタンパク質が第２ペプチドと複合体化されて第２複合体を形成する、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
第２複合体がｉｎ ｖｉｔｒｏで形成される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
第２複合体が培養細胞中で形成される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
培養細胞が、組換え操作により熱ショックタンパク質を発現するものである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
第２の熱ショックタンパク質が、（ａ）に記載の量と混合した細胞溶解物又は抽出物中に存在する、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
第１の熱ショックタンパク質と第２の熱ショックタンパク質が同じものである、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
第１の熱ショックタンパク質と第２の熱ショックタンパク質が、それぞれｈｓｐ７０、ｈｓｐ９０、ｇｐ９６、カルレティキュリン、ｈｓｐ１１０、又はｇｒｐ１７０である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
第１の熱ショックタンパク質と第２の熱ショックタンパク質とが異なるものである、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
第１の熱ショックタンパク質が、ｈｓｐ７０、ｈｓｐ９０、ｇｐ９６、カルレティキュリン、ｈｓｐ１１０、又はｇｒｐ１７０である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
第２の熱ショックタンパク質が、ｈｓｐ７０、ｈｓｐ９０、ｇｐ９６、カルレティキュリン、ｈｓｐ１１０、又はｇｒｐ１７０である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
第１の熱ショックタンパク質と第１ペプチドが互いに非共有結合している、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
第２の熱ショックタンパク質が第２ペプチドと非共有結合している、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
第２の熱ショックタンパク質が第２ペプチドと共有結合している、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
第２の熱ショックタンパク質が第２ペプチドを含む融合タンパク質の形態である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２５】
第１の熱ショックタンパク質と第１ペプチドが互いに共有結合している、請求項１に記載の方法。
【請求項２６】
第２の熱ショックタンパク質が第２ペプチドと非共有結合している、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
第２の熱ショックタンパク質が第２ペプチドと共有結合している、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
第２の熱ショックタンパク質が第２ペプチドを含む融合タンパク質の形態である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２９】
第１の熱ショックタンパク質と第１ペプチドが互いに共有結合している、請求項１に記載の方法。
【請求項３０】
第２の熱ショックタンパク質が第２ペプチドと非共有結合している、請求項１６に記載の方法。
【請求項３１】
第２の熱ショックタンパク質が第２ペプチドと共有結合している、請求項１６に記載の方法。
【請求項３２】
第２の熱ショックタンパク質が第２ペプチドを含む融合タンパク質の形態である、請求項１６に記載の方法。
【請求項３３】
第１複合体が、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で検出される程度の見かけ均質性まで精製される、請求項１０に記載の方法。
【請求項３４】
第１複合体が、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で検出される程度の見かけ均質性まで精製される、請求項１１に記載の方法。
【請求項３５】
第２複合体が、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で検出される程度の見かけ均質性まで精製される、請求項１１に記載の方法。
【請求項３６】
癌が、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、滑膜性腫瘍、中皮腫、ユーイング腫、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、大腸癌、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭癌、乳頭腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支癌、腎細胞癌、肝細胞癌、胆管癌、絨毛癌、精上皮癌、胎生期癌、ウィルムス腫、子宮頸癌、精巣腫瘍、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神経膠腫、星状細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上皮細胞腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴音神経系腫、希突起神経膠腫、髄膜腫、黒色腫、神経芽細胞腫、網膜芽腫、白血病、リンパ腫、多発性骨髄腫、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症、及びＨ鎖病からなる群より選択される肉腫又は癌腫である、請求項１に記載の方法。
【請求項３７】
感染性疾患の因子が、ウイルス、細菌、原生動物、真菌、又は寄生生物である、請求項１に記載の方法。
【請求項３８】
ある種の癌又は感染性疾患のある因子に対して免疫原性を有する組成物を製造する方法であって、以下のステップ：
（ａ）上記の種の癌若しくはその転移の癌組織、又は上記感染性疾患因子に感染した細胞からそれぞれ第１の熱ショックタンパク質−ペプチド複合体を精製するステップ；及び
（ｂ）所定量の第１複合体と、等量又はそれ以上の第２の熱ショックタンパク質とを混合するステップであって、第２の熱ショックタンパク質は、上記の種の癌の抗原の抗原性又は上記感染性疾患の因子の抗原の抗原性を提示するペプチドとｉｎ ｖｉｔｒｏで複合体化されたものではなく、かつ、上記の種の癌の癌組織又は上記感染性疾患因子に感染した細胞からそれぞれ複合体として単離される複合体の形態ではない、上記ステップ；
を含む、上記方法。
【請求項３９】
ある種の癌又は感染性疾患のある因子に対して免疫原性を有する組成物を製造する方法であって、以下のステップ：
（ａ）精製した第１の熱ショックタンパク質を、上記の種の癌の腫瘍特異的抗原又は上記感染性疾患因子の抗原とそれぞれｉｎ ｖｉｔｒｏで複合体化させることにより、第１複合体を形成するステップ；及び
（ｂ）所定量の第１複合体と、等量又はそれ以上の第２の熱ショックタンパク質とを混合するステップであって、第２の熱ショックタンパク質は、上記の種の癌の抗原の抗原性又は上記感染性疾患の因子の抗原の抗原性を提示するペプチドとｉｎ ｖｉｔｒｏで複合体化されたものではなく、かつ、上記の種の癌の癌組織又は上記感染性疾患因子に感染した細胞からそれぞれ複合体として単離される複合体の形態ではない、上記ステップ；
を含む、上記方法。
【請求項４０】
第２の熱ショックタンパク質がどんな分子とも複合体化されていない、請求項３８又は３９に記載の方法。
【請求項４１】
第２の熱ショックタンパク質が、上記の種の癌の抗原の抗原性又は上記感染性疾患の因子の抗原の抗原性を提示しないペプチドとそれぞれｉｎ ｖｉｔｒｏで複合体化されたものである、請求項３８又は３９に記載の方法。
【請求項４２】
第２の熱ショックタンパク質が、ステップ（ａ）に記載の量と混合した細胞溶解物又は抽出物中に存在する、請求項３８又は３９に記載の方法。
【請求項４３】
以下の（ａ）及び（ｂ）：
（ａ）第１の熱ショックタンパク質と、それと複合体化した上記の種の癌の抗原の抗原性又は上記感染性疾患の因子の抗原の抗原性を提示するペプチド、とを含む、所定量の精製された第１複合体；及び
（ｂ）等量又はそれ以上の第２の熱ショックタンパク質であって、上記の種の癌の抗原の抗原性又は上記感染性疾患の因子の抗原の抗原性を提示するペプチドとｉｎ ｖｉｔｒｏで複合体化されたものではなく、かつ、上記の種の癌の癌組織又は上記感染性疾患因子に感染した細胞からそれぞれ複合体として単離される複合体の形態ではない、上記第２の熱ショックタンパク質；
を混合することにより製造される組成物。
【請求項４４】
以下の（ａ）及び（ｂ）：
（ａ）第１の熱ショックタンパク質と、それと複合体化したある種の癌の抗原の抗原性又は感染性疾患のある因子の抗原の抗原性を提示するペプチド、とを含む、精製された第１複合体；及び
（ｂ）等量又はそれ以上の第２の熱ショックタンパク質であって、上記の種の癌の抗原の抗原性又は上記感染性疾患の因子の抗原の抗原性を提示するペプチドとｉｎ ｖｉｔｒｏでそれぞれ複合体化されたものではなく、かつ、上記の種の癌の癌組織若しくは同じ組織型、又は上記感染性疾患因子に感染した細胞若しくは同じ細胞型からそれぞれ複合体として単離される複合体の形態ではない、上記第２の熱ショック蛋白質；
を含む組成物であって、上記の種の癌又は上記感染性疾患因子に対して免疫原性を有する、上記組成物。
【請求項４５】
個体においてある種の癌又は感染性疾患のある因子に対する免疫応答を誘発する方法であって、上記の種の癌又は上記感染性疾患の因子に対する免疫応答を誘発するのに有効な量の組成物を該個体に投与するステップを含み、上記組成物は、以下の（ａ）及び（ｂ）：
（ａ）第１の熱ショックタンパク質と、それと複合体化した上記の種の癌の抗原の抗原性又は上記感染性疾患因子の抗原の抗原性を提示するペプチド、とを含む、所定量の精製された第１複合体；及び
（ｂ）等量又はそれ以上の第２の熱ショックタンパク質であって、上記の種の癌の抗原の抗原性又は上記感染性疾患の因子の抗原の抗原性を提示するペプチドとｉｎ ｖｉｔｒｏでそれぞれ複合体化されたものではなく、かつ、上記の種の癌の癌組織若しくは同じ組織型、又は上記感染性疾患の因子に感染した細胞若しくは同じ細胞型からそれぞれ複合体として単離される複合体の形態ではなく、上記第２の熱ショック蛋白質；
を含む、上記方法。
【請求項４６】
第１の熱ショックタンパク質が、ｇｐ９６、ｈｓｐ７０、ｈｓｐ１１０又はｇｒｐ１７０であり、組成物の量が１〜１００μｇの範囲にある、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
組成物の量が２〜５０μｇの範囲にある、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
組成物の量が５〜２５μｇの範囲にある、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
第１の熱ショックタンパク質がｈｓｐ９０であり、組成物の量が１０〜５００μｇの範囲にある、請求項４５に記載の方法。
【請求項５０】
組成物の量が２０〜４００μｇの範囲にある、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
組成物の量が５０〜２５０μｇの範囲にある、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
第１の熱ショックタンパク質がカルレティキュリンであり、組成物の量が０．５〜５０μｇの範囲にある、請求項４５に記載の方法。
【請求項５３】
組成物の量が１〜２５μｇの範囲にある、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
組成物の量が２．５〜１０μｇの範囲にある、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
投与ステップを１週間間隔で繰り返す、請求項４５に記載の方法。
【請求項５６】
投与ステップを５回繰り返し、その際、１回目の投与は左腕に、２回目の投与は右腕に、３回目の投与は左腹部に、４回目の投与は右腹部に、５回目の投与は左大腿部に、６回目の投与は右大腿部にそれぞれ行い、１回目から６回目の投与を皮内に実施する、請求項４５に記載の方法。
【請求項５７】
上記の種の癌に対する免疫応答の誘発が望ましく、上記個体の自己由来の上記の種の癌又はその転移の癌組織から第１複合体を調製する、請求項４５に記載の方法。
【請求項５８】
上記の種の癌に対する免疫応答の誘発が望ましく、上記個体の同種異系の上記の種の癌又はその転移の癌組織から第１複合体を調製する、請求項４５に記載の方法。
【請求項５９】
さらに、インターフェロン−α、インターフェロン−γ、インターロイキン−２、インターロイキン−４、インターロイキン−６、及び腫瘍壊死因子からなる群より選択される、有効量の生物応答修飾物質を個体に投与するステップを含む、請求項４５に記載の方法。
【請求項６０】
癌が、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、滑膜性腫瘍、中皮腫、ユーイング腫、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、大腸癌、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭癌、乳頭腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支癌、腎細胞癌、肝癌、胆管癌、絨毛癌、精上皮癌、胎生期癌、ウィルムス腫、子宮頸癌、精巣腫瘍、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神経膠腫、星状細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上皮細胞腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴音神経系腫、希突起神経膠腫、髄膜腫、黒色腫、神経芽細胞腫、網膜芽腫、白血病、リンパ腫、多発性骨髄腫、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症、及びＨ鎖病からなる群より選択される肉腫又は癌腫である、請求項４５に記載の方法。
【請求項６１】
感染性疾患の因子が、ウイルス、細菌、原生動物、真菌、又は寄生生物である、請求項４５に記載の方法。
【請求項６２】
ある種の癌又は感染性疾患をその治療又は予防が望ましい個体において治療又は予防する方法であって、治療に有効な量の組成物を該個体に投与するステップを含み、上記組成物は、以下の（ａ）及び（ｂ）：
（ａ）第１の熱ショックタンパク質と、それと複合体化した上記の種の癌の抗原の抗原性又は上記感染性疾患因子の抗原の抗原性を提示するペプチド、とを含む、所定量の精製された第１複合体；又は、多数の異なる第１ペプチドを含む、所定量の異種第１複合体の精製された集団；及び
（ｂ）等量又はそれ以上の第２の熱ショックタンパク質であって、上記の種の癌の抗原の抗原性又は上記感染性疾患の因子の抗原の抗原性を提示するペプチドとｉｎ ｖｉｔｒｏで複合体化されたものではなく、かつ、上記の種の癌の癌組織若しくは同じ組織型、又は上記感染性疾患因子に感染した細胞若しくは同じ細胞型からそれぞれ複合体として単離される複合体の形態ではない、上記第２の熱ショック蛋白質；
を含む、上記方法。
【請求項６３】
組成物の量が０．１〜２μｇの範囲にある、請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
組成物の量が５〜２０μｇの範囲にある、請求項６２に記載の方法。
【請求項６５】
組成物の量が０．１〜２μｇの範囲にあり、第１の熱ショックタンパク質と第２の熱ショックタンパク質の質量比が１：１０である、請求項６２に記載の方法。
【請求項６６】
第１の熱ショックタンパク質がｈｓｐ７０又はｇｐ９６である、請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】
組成物の量が５〜２０μｇの範囲にあり、第１の熱ショックタンパク質と第２の熱ショックタンパク質の質量比が１：１０である、請求項６２に記載の方法。
【請求項６８】
第１の熱ショックタンパク質がｈｓｐ９０である、請求項６７に記載の方法。
【請求項６９】
第１の熱ショックタンパク質がｈｓｐ７０又はｇｐ９６である、請求項６７に記載の方法。
【請求項７０】
投与ステップを１週間間隔で繰り返す、請求項６２に記載の方法。
【請求項７１】
投与ステップを５回繰り返し、その際、１回目の投与は左腕に、２回目の投与は右腕に、３回目の投与は左腹部に、４回目の投与は右腹部に、５回目の投与は左大腿部に、６回目の投与は右大腿部にそれぞれ行い、１回目から６回目の投与を皮内に実施する、請求項６２に記載の方法。
【請求項７２】
上記の種の癌の治療又は予防が望ましく、上記個体の自己由来の上記の種の癌又はその転移の癌組織から第１複合体を調製する、請求項６２に記載の方法。
【請求項７３】
上記の種の癌の治療又は予防が望ましく、上記個体の同種異系の上記の種の癌又はその転移の癌組織から第１複合体を調製する、請求項６２に記載の方法。
【請求項７４】
さらに、インターフェロン−α、インターフェロン−γ、インターロイキン−２、インターロイキン−４、インターロイキン−６、及び腫瘍壊死因子からなる群より選択される、有効量の生物応答修飾物質を個体に投与するステップを含む、請求項６２に記載の方法。
【請求項７５】
癌が、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、滑膜性腫瘍、中皮腫、ユーイング腫、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、大腸癌、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭癌、乳頭腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支癌、腎細胞癌、肝癌、胆管癌、絨毛癌、精上皮癌、胎生期癌、ウィルムス腫、子宮頸癌、精巣腫瘍、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神経膠腫、星状細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上皮細胞腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴音神経系腫、希突起神経膠腫、髄膜腫、黒色腫、神経芽細胞腫、網膜芽腫、白血病、リンパ腫、多発性骨髄腫、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症、及びＨ鎖病からなる群より選択される肉腫又は癌腫である、請求項６２に記載の方法。
【請求項７６】
感染性疾患の因子が、ウイルス、細菌、原生動物、真菌又は寄生生物である、請求項６２に記載の方法。
【請求項７７】
ある種の癌又は感染性疾患のある因子に対して免疫原性を有する組成物を製造する方法であって、以下の（ａ）及び（ｂ）：
（ａ）熱ショックタンパク質と、それと複合体化した上記の種の癌の抗原の抗原性又は上記感染性疾患の因子の抗原の抗原性を提示する第１ペプチド、とを含む、所定量の精製された第１複合体；又は、多数の異なる第１ペプチドを含む、所定量の異種第１複合体の精製された集団；及び
（ｂ）等量又はそれ以上のα２Ｍ；
とを混合するステップを含む、上記方法。
【請求項７８】
ある種の癌又は感染性疾患のある因子に対して免疫原性を有する組成物を製造する方法であって、以下のステップ：
（ａ）上記の種の癌若しくはその転移の癌組織、又は上記感染性疾患因子に感染した細胞からそれぞれ熱ショックタンパク質−ペプチド複合体を精製するステップ；及び
（ｂ）所定量の第１複合体と、等量又はそれ以上のα２Ｍとを混合するステップ；
を含む、上記方法。
【請求項７９】
ある種の癌又は感染性疾患のある因子に対して免疫原性を有する組成物を製造する方法であって、以下のステップ：
（ａ）精製された熱ショックタンパク質を、上記の種の癌の腫瘍特異的抗原又は上記感染性疾患因子の抗原とｉｎ ｖｉｔｒｏでそれぞれ複合体化させることにより第１複合体を形成するステップ；及び
（ｂ）所定量の第１複合体と、等量又はそれ以上のα２Ｍとを混合するステップ；
を含む、上記方法。
【請求項８０】
以下の（ａ）及び（ｂ）：
（ａ）熱ショックタンパク質と、それと複合体化したある種の癌の抗原の抗原性又は感染性疾患のある因子の抗原の抗原性を提示するペプチド、とを含む、所定量の精製された第１複合体；及び
（ｂ）等量又はそれ以上のα２Ｍ；
を混合することにより製造される組成物。
【請求項８１】
以下の（ａ）及び（ｂ）：
（ａ）熱ショックタンパク質と、それと複合体化したある種の癌の抗原の抗原性又は感染性疾患のある因子の抗原の抗原性を提示するペプチドとを含む、精製された第１複合体；及び
（ｂ）等量又はそれ以上のα２Ｍ；
を含む組成物。
【請求項８２】
個体において、ある種の癌又は感染性疾患のある因子に対する免疫応答を誘発する方法であって、上記の種の癌又は上記感染性疾患因子に対する免疫応答を誘発するのに有効な量の組成物を上記個体に投与するステップを含み、上記組成物が、以下の（ａ）及び（ｂ）：
（ａ）熱ショックタンパク質と、それと複合体化した上記の種の癌の抗原の抗原性又は上記感染性疾患の因子の抗原の抗原性を提示するペプチドとを含む、所定量の精製された第１複合体；及び
（ｂ）等量又はそれ以上のα２Ｍ；
を含む、上記方法。
【請求項８３】
ある種の癌又は感染性疾患をその治療又は予防が望ましい個体において治療又は予防する方法であって、治療に有効な量の組成物を該個体に投与するステップを含み、上記組成物が、以下の（ａ）及び（ｂ）：
（ａ）熱ショックタンパク質と、それと複合体化した上記の種の癌の抗原の抗原性又は上記感染性疾患の因子の抗原の抗原性を提示するペプチドとを含む、所定量の精製された第１複合体；又は、多数の異なる第１ペプチドを含む、所定量の異種第１複合体の精製された集団；及び
（ｂ）等量又はそれ以上のα２Ｍ；
を含む、上記方法。
【請求項８４】
ある種の癌又は感染性疾患のある因子に対して免疫原性を有する組成物の製造方法であって、以下の（ａ）及び（ｂ）：
（ａ）α２Ｍと、それと複合体化した上記の種の癌の抗原の抗原性又は上記感染性疾患の因子の抗原の抗原性を提示する第１ペプチドとを含む、所定量の精製された第１複合体；及び
（ｂ）等量又はそれ以上の熱ショックタンパク質；
を混合するステップを含む、上記方法。
【請求項８５】
ある種の癌又は感染性疾患のある因子に対して免疫原性を有する組成物を製造する方法であって、以下のステップ：
（ａ）上記の種の癌若しくはその転移の癌組織、又は上記感染性疾患因子に感染した細胞からそれぞれα２Ｍ−ペプチド複合体を精製するステップ；及び
（ｂ）所定量の第１複合体と、等量又はそれ以上の熱ショックタンパク質とを混合するステップであって、該熱ショックタンパク質は、上記の種の癌の抗原の抗原性又は上記感染性疾患の因子の抗原の抗原性を提示するペプチドとｉｎ ｖｉｔｒｏでそれぞれ複合体化されたものではなく、かつ、上記の種の癌の癌組織又は上記感染性疾患の因子に感染した細胞からそれぞれ複合体として単離される複合体の形態ではない、上記ステップ；
を含む、上記方法。
【請求項８６】
ある種の癌又は感染性疾患のある因子に対して免疫原性を有する組成物を製造する方法であって、以下のステップ：
（ａ）精製されたα２Ｍタンパク質を、上記の種の癌の腫瘍特異的抗原又は上記感染性疾患因子の抗原とｉｎ ｖｉｔｒｏでそれぞれ複合体化させることにより第１複合体を形成するステップ；及び
（ｂ）所定量の第１複合体と、等量又はそれ以上の熱ショックタンパク質とを混合するステップであって、該熱ショックタンパク質は、上記の種の癌の抗原の抗原性又は上記感染性疾患の因子の抗原の抗原性を提示するペプチドとｉｎ ｖｉｔｒｏでそれぞれ複合体化されたものではなく、かつ、上記の種の癌の癌組織又は上記感染性疾患の因子に感染した細胞からそれぞれ複合体としてそれぞれ単離される複合体の形態ではない、上記ステップ；
を含む、上記方法。
【請求項８７】
以下の（ａ）及び（ｂ）：
（ａ）α２Ｍタンパク質と、それと複合体化したある種の癌の抗原の抗原性又は感染性疾患のある因子の抗原の抗原性を提示するペプチド、とを含む、所定量の精製された第１複合体；及び
（ｂ）等量又はそれ以上の熱ショックタンパク質であって、上記の種の癌の抗原の抗原性又は上記感染性疾患の因子の抗原の抗原性を提示するペプチドとｉｎ ｖｉｔｒｏでそれぞれ複合体化されたものではなく、かつ、上記の種の癌の癌組織又は上記感染性疾患の因子に感染した細胞からそれぞれ複合体として単離される複合体の形態ではない、上記熱ショックタンパク質；
を混合することにより製造される組成物。
【請求項８８】
以下の（ａ）及び（ｂ）：
（ａ）α２Ｍタンパク質と、それと複合体化したある種の癌の抗原の抗原性又は感染性疾患のある因子の抗原の抗原性を提示するペプチド、とを含む、精製された第１複合体；及び
（ｂ）等量又はそれ以上の熱ショックタンパク質であって、上記の種の癌の抗原の抗原性又は上記感染性疾患の因子の抗原の抗原性を提示するペプチドとｉｎ ｖｉｔｒｏでそれぞれ複合体化されたものではなく、かつ、上記の種の癌の癌組織若しくは同じ組織型、又は上記感染性疾患の因子に感染した細胞若しくは同じ細胞型からそれぞれ複合体として単離される複合体の形態ではない、上記熱ショックタンパク質；
を含む組成物であって、上記の種の癌又は上記感染性疾患因子に対して免疫原性を有する、上記組成物。
【請求項８９】
個体において、ある種の癌又は感染性疾患のある因子に対する免疫応答を誘発する方法であって、上記の種の癌又は上記感染性疾患因子に対する免疫応答を誘発するのに有効な量の組成物を上記個体に投与するステップを含み、上記組成物が、以下の（ａ）及び（ｂ）：
（ａ）α２Ｍタンパク質と、それと複合体化された上記の種の癌の抗原の抗原性又は上記感染性疾患の因子の抗原の抗原性を提示するペプチド、とを含む、所定量の精製された第１複合体；及び
（ｂ）等量又はそれ以上の熱ショックタンパク質であって、上記の種の癌の抗原の抗原性又は上記感染性疾患の因子の抗原の抗原性を提示するペプチドとｉｎ ｖｉｔｒｏでそれぞれ複合体化されたものではなく、かつ上記の種の癌の癌組織若しくは同じ組織型、又は上記感染性疾患の因子に感染した細胞若しくは同じ細胞型からそれぞれ複合体として単離される複合体の形態ではない、上記熱ショックタンパク質；
を含む、上記方法。
【請求項９０】
ある種の癌又は感染性疾患をその治療又は予防が望ましい個体において治療又は予防する方法であって、治療に有効な量の組成物を該個体に投与するステップを含み、該組成物が、以下の（ａ）及び（ｂ）：
（ａ）α２Ｍタンパク質と、それと複合体化された上記の種の癌の抗原の抗原性又は上記感染性疾患の因子の抗原の抗原性を提示するペプチド、とを含む、所定量の精製された第１複合体；又は、多数の異なる第１ペプチドを含む、所定量の異種第１複合体の精製された集団；及び
（ｂ）等量又はそれ以上の熱ショックタンパク質であって、上記の種の癌の抗原の抗原性又は上記感染性疾患の因子の抗原の抗原性を提示するペプチドとｉｎ ｖｉｔｒｏでそれぞれ複合体化されたものではなく、かつ、上記の種の癌の癌組織若しくは同じ組織型、又は上記感染性疾患の因子に感染した細胞若しくは同じ細胞型からそれぞれ複合体として単離される複合体の形態ではない、上記熱ショックタンパク質；
を含む、上記方法。
【請求項９１】
ある種の癌又は感染性疾患のある因子に対して免疫原性を有する組成物を製造する方法であって、以下の（ａ）及び（ｂ）：
（ａ）第１のα２Ｍと、それと複合体化した上記の種の癌の抗原の抗原性又は上記感染性疾患の因子の抗原の抗原性を提示する第１ペプチド、とを含む、所定量の精製された第１複合体；又は、多数の異なる第１ペプチドを含む、所定量の異種第１複合体の精製された集団；及び
（ｂ）等量又はそれ以上の第２のα２Ｍであって、上記の種の癌の抗原の抗原性又は上記感染性疾患の因子の抗原の抗原性を提示するペプチドとｉｎ ｖｉｔｒｏでそれぞれ複合体化されたものではなく、かつ、上記の種の癌の癌組織又は上記感染性疾患の因子に感染した細胞からそれぞれ複合体として単離される複合体の形態ではない、上記第２のα２Ｍ；
を混合するステップを含む、上記方法。
【請求項９２】
ある種の癌又は感染性疾患のある因子に対して免疫原性を有する組成物を製造する方法であって、以下のステップ：
（ａ）上記の種の癌の若しくはその転移の癌組織、又は上記感染性疾患因子に感染した細胞からそれぞれ第１のα２Ｍ−ペプチド複合体を精製するステップ；及び
（ｂ）第１複合体と、等量又はそれ以上の第２のα２Ｍとを混合するステップであって、上記第２のα２Ｍは、上記の種の癌の抗原の抗原性又は上記感染性疾患の因子の抗原の抗原性を提示するペプチドとｉｎ ｖｉｔｒｏでそれぞれ複合体化されたものではなく、かつ、上記の種の癌の癌組織又は上記感染性疾患の因子に感染した細胞からそれぞれ複合体として単離される複合体の形態ではない、上記ステップ；
を含む、上記方法。
【請求項９３】
ある種の癌又は感染性疾患のある因子に対して免疫原性を有する組成物を製造する方法であって、以下のステップ：
（ａ）精製された第１のα２Ｍを、上記の種の癌の腫瘍特異的抗原又は上記感染性疾患因子の抗原とｉｎ ｖｉｔｒｏで複合体化させることにより、第１複合体を形成するステップ；及び
（ｂ）所定量の第１複合体と、等量又はそれ以上の第２のα２Ｍとを混合するステップであって、上記第２のα２Ｍは、上記の種の癌の抗原の抗原性又は上記感染性疾患の因子の抗原の抗原性を提示するペプチドとｉｎ ｖｉｔｒｏでそれぞれ複合体化されたものではなく、かつ、上記の種の癌の癌組織又は上記感染性疾患因子に感染した細胞からそれぞれ複合体として単離される複合体の形態ではない、上記ステップ；
を含む、上記方法。
【請求項９４】
以下の（ａ）及び（ｂ）：
（ａ）第１のα２Ｍと、それと複合体化したある種の癌の抗原の抗原性又は感染性疾患のある因子の抗原の抗原性を提示するペプチド、とを含む、所定量の精製された第１複合体；及び
（ｂ）等量又はそれ以上の第２のα２Ｍであって、上記の種の癌の抗原の抗原性又は上記感染性疾患の因子の抗原の抗原性を提示するペプチドとｉｎ ｖｉｔｒｏでそれぞれ複合体化されたものではなく、かつ、上記の種の癌の癌組織又は上記感染性疾患因子に感染した細胞からそれぞれ複合体として単離される複合体の形態ではない、上記第２のα２Ｍ；
を混合することにより製造される組成物。
【請求項９５】
以下の（ａ）及び（ｂ）：
（ａ）第１のα２Ｍと、それと複合体化したある種の癌の抗原の抗原性又は感染性疾患のある因子の抗原の抗原性を提示するペプチド、とを含む、精製された第１複合体；及び
（ｂ）等量又はそれ以上の第２のα２Ｍであって、上記の種の癌の抗原の抗原性又は上記感染性疾患の因子の抗原の抗原性を提示するペプチドとｉｎ ｖｉｔｒｏでそれぞれ複合体化されたものではなく、かつ、上記の種の癌の癌組織若しくは同じ組織型、又は上記感染性疾患因子に感染した細胞若しくは同じ細胞型からそれぞれ複合体として単離される複合体の形態ではない、上記第２のα２Ｍ；を含む組成物であって、上記の種の癌又は上記感染性疾患因子に対して免疫原性を有する、上記組成物。
【請求項９６】
個体において、ある種の癌又は感染性疾患のある因子に対する免疫応答を誘発する方法であって、上記の種の癌又は上記感染性疾患因子に対する免疫応答を誘発するのに有効な量の組成物を上記個体に投与するステップを含み、上記組成物が、以下の（ａ）及び（ｂ）：
（ａ）第１のα２Ｍと、それと複合体化した上記の種の癌の抗原の抗原性又は上記感染性疾患の因子の抗原の抗原性を提示するペプチド、とを含む、所定量の精製された第１複合体；及び
（ｂ）等量又はそれ以上の第２のα２Ｍであって、上記の種の癌の抗原の抗原性又は上記感染性疾患の因子の抗原の抗原性を提示するペプチドとｉｎ ｖｉｔｒｏでそれぞれ複合体化されたものではなく、かつ、上記の種の癌の癌組織若しくは同じ組織型、又は上記感染性疾患の因子に感染した細胞若しくは同じ細胞型からそれぞれ複合体として単離される複合体の形態ではない、上記第２のα２Ｍ；
を含む、上記方法。
【請求項９７】
ある種の癌又は感染性疾患をその治療又は予防が望ましい個体において治療又は予防する方法であって、治療に有効な量の組成物を投与するステップを含み、該組成物が、以下の（ａ）及び（ｂ）：
（ａ）第１のα２Ｍと、それと複合体化した上記の種の癌の抗原の抗原性又は上記感染性疾患の因子の抗原の抗原性を提示するペプチド、とを含む、所定量の精製された第１複合体；又は、多数の異なる第１ペプチドを含む、所定量の異種第１複合体の精製された集団；及び
（ｂ）等量又はそれ以上の第２のα２Ｍであって、上記の種の癌の抗原の抗原性又は上記感染性疾患の因子の抗原の抗原性を提示するペプチドとｉｎ ｖｉｔｒｏでそれぞれ複合体化されたものではなく、かつ、上記の種の癌の癌組織若しくは同じ組織型、又は上記感染性疾患の因子に感染した細胞若しくは同じ細胞型からそれぞれ複合体として単離される複合体の形態ではない、上記第２のα２Ｍ；
を含む、上記方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本出願は、３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９（ｅ）に従い、２０００年９月１５日に出願された米国特許仮出願第６０／２３２，７７９号の利益を主張する。尚、該出願は、参照として本明細書にその全文を組み込むものとする。
【０００２】
本発明は、国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ）により与えられた承認番号ＣＡ４４７８６及びＣＡ６４３９４の下に、政府の支援を得てなされたものである。従って、政府は、本発明に所定の権利を有する。
【０００３】
１．導入
本発明は、感染性疾患、及び原発性・転移性新生物疾患の予防及び治療に有用な組成物を製造する方法、並びに、これらの方法によって製造される組成物に関する。上記組成物は、熱ショックタンパク質（ｈｓｐ）又はα−２−マクログロブリン（α２Ｍ）と、それと複合体化した感染性疾患のある因子又はある種の癌の抗原の抗原性を提示するペプチド（「特異的抗原」、この複合体は「特異的複合体」である）、とを含む第１複合体と、特異的抗原ではないペプチド（非特異的抗原）と任意により複合体化された第２のｈｓｐ又はα２Ｍとを含むものである。第２のｈｓｐ又はα２Ｍは、ペプチドと複合体化されている又はいないにかかわらず、希釈体として作用する（「希釈体」）。特異的複合体と希釈体とを含む組成物は、希釈複合体と呼ばれる。希釈複合体における特異的複合体と希釈体との比は少なくとも１：１である。ｈｓｐとしては、限定するものではないが、ｈｓｐ７０、ｈｓｐ９０、ｈｓｐ９６、カルレティキュリン、ｈｓｐ１１０、又はｇｒｐ１７０が挙げられ、これが単独又は互いに組み合わされて、抗原分子と非共有又は共有結合する。本発明の実施に際しては、希釈複合体を単独で又は特異的複合体で感作した抗原提示細胞の投与と組み合わせて、投与することができる。
【０００４】
２．発明の背景
２．１．ワクチン
ワクチン接種により、多くの国々でポリオ、破傷風、鶏痘及び麻疹などの特定の疾患が根絶された。この手法は、免疫系の能力を利用して、感染性疾患に抵抗し、これを予防するものであった。
【０００５】
伝統的なワクチンの製造方法では、不活化又は弱毒化した病原体を使用する。病原性微生物の好適な不活化によって、該微生物は生物学的薬物として無害になるが、その免疫原性は破壊されない。これら「死滅させた」粒子を宿主に注射すると、免疫応答が誘発され、これにより、生きた微生物への将来の感染を予防することができる。しかし、ワクチンとして不活化した病原体を用いる上での大きな懸念事項は、すべての微生物を不活化できないことである。これが達成されたとしても、死滅させた病原体はその宿主内で増殖しないため、あるいは、その他の未知の理由から、獲得された免疫は往々にして不完全で、寿命が短く、従って、多数回の免疫感作が必要になる。最後に、不活化の過程が微生物の抗原を改変し、それらの免疫原としての有効性を低下させることもある。
【０００６】
弱毒化とは、疾患発生能力を本質的に喪失させた病原性微生物系統の作製を意味する。これを達成する方法の一つは、異常な生育条件及び／又は細胞培養物における多数回の継代に微生物を付すことである。次に、病原性は喪失しているが、まだ免疫応答を誘発可能な突然変異体を選択する。弱毒化した病原体は、宿主細胞において実際に複製するため優れた免疫原をつくり、長期間持続する免疫を誘発することが多い。しかし、生ワクチンの使用にはいくつかの問題があり、最も懸念されるのは、弱毒化が不十分であることと、病原性に逆転する危険性である。
【０００７】
前記の方法に代わるものとして、サブユニットワクチンの使用がある。これは、関連免疫物質を含む成分のみを用いた免疫を行うものである。新しい有望な別の方法では、ワクチンとしてＤＮＡ又はＲＮＡを用いる。このような遺伝子ワクチンは、概念から、臨床試験で研究中の実体へと進歩してきている（Ｗｅｉｎｅｒ及びＫｅｎｎｅｄｙ， １９９９年７月、Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｍｅｒｉｃａｎ， ｐｐ．５０−５７参照）。
【０００８】
ワクチンは、各種アジュバントと一緒に製剤化され接種されることが多い。アジュバントは、少量の抗原又は免疫原を単独で投与した場合より少ない用量を用いて、持続性が高くかつ高レベルの免疫を獲得するために機能する。しかし、アジュバント作用の機構は予測不可能で複雑であることから、完全には理解されていない（Ｓｕｚｕｅら、１９９６、Ｂａｓｅｌ：Ｂｉｒｋｈａｕｓｅｒ Ｖｅｒｌａｇ， ４５４−５５）。
【０００９】
不活化及び弱毒化病原体に関連する危険性のために、最小限量のワクチンで免疫応答を増強又は増幅することができるのが理想的かつ有利である。さらに、アジュバントの機構作用が完全に理解されておらず、いまだに予測不可能であることから、既存のワクチン接種方法に代わり、被験者の免疫応答を増強する別の方法が強く求められている。
【００１０】
２．２．熱ショックタンパク質と、抗原提示におけるそれらの役割
ストレスタンパク質としても知られる熱ショックタンパク質（ｈｓｐ）は、多量に存在し、可溶性で、かつ高度に保存された細胞内分子である。ｈｓｐは、細胞内シャペロンとして、タンパク質成熟の多数の生化学的経路に関与し、ストレス及び正常の細胞ホメオスタシスの時期に活発に機能する（Ｍｉｚｚｅｎ， １９９８、Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ １０：１７４）。多くのストレスは、細胞のタンパク質の三次元構造又は折りたたみを破壊し得る。残った未修正の誤って折りたたまれたタンパク質は、凝集体を形成し、これが最終的に細胞を死滅させることもある。ｈｓｐは、これらの損傷タンパク質に結合し、それらが適正なコンホメーションに再度折りたたまれるのを助ける。正常な（ストレスを受けていない）細胞ホメオスタシスでは、ｈｓｐは、細胞代謝に必要とされる。ｈｓｐは、新しく合成されたポリペプチドが折りたたまれるのを助けるため、他のタンパク質との未成熟相互作用を防止する。また、ｈｓｐは、細胞の様々な小器官全体にわたるタンパク質の輸送も補助する。
【００１１】
主要なｈｓｐは、ストレスをうけた細胞中に非常に高レベルで蓄積することができるが、ストレスを受けていない細胞での蓄積は低から中レベルである。例えば、高度に誘導性の哺乳動物ｈｓｐ７０は、平常温度ではほとんど検出されないが、熱ショックを受けた細胞では最も活発に合成されるタンパク質の一つとなる（Ｗｅｌｃｈら、１９８５， Ｊ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． １０１：１１９８−１２１１）。対照的に、ｈｓｐ９０及びｈｓｐ６０タンパク質は、全部ではないが、大部分の哺乳動物細胞において、平常温度で多量に存在し、熱によってさらに誘導される（Ｌａｉら、１９８４， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． ４：２８０２−２８１０；ｖａｎ Ｂｅｒｇｅｎ ｅｎ Ｈｅｎｅｇｏｕｗｅｎら、１９８７， Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ． １：５２５−５３１）。
【００１２】
ｈｓｐは、免疫及び抗原特性を有することがわかっている。特定の腫瘍から単離したｇｐ９６又はｐ８４／８６でマウスを免疫感作すると、これらのマウスは、その特定の腫瘍に対して免疫性を獲得するが、抗原的に異なる腫瘍に対しては免疫性を獲得しない（Ｓｒｉｖａｓｔａｖａら、１９８８， Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ ２８：２０５−２０７；Ｓｒｉｖａｓｔａｖａら、１９９１， Ｃｕｒｒ． Ｔｏｐ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １６７：１０９−１２３）。さらに、ｈｓｐ７０は、それが単離された腫瘍に対しては免疫を誘発するが、抗原的に異なる腫瘍に対しては誘発しないことが明らかにされた。しかし、ペプチドを欠失したｈｓｐ７０は、その免疫原活性を喪失することがわかった（Ｕｄｏｎｏ及びＳｒｉｖａｓｔａｖａ、１９９３， Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １７８：１３９１−１３９６）。これらの研究結果から、熱ショックタンパク質はそれ自体では免疫原性ではないが、抗原ペプチドとの非共有結合複合体を形成し、この複合体が、抗原ペプチドに対する特異的免疫を誘発する可能性があることが示唆される（Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ、１９９３， Ａｄｖ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ６２：１５３−１７７；Ｕｄｏｎｏら、１９９４， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， １５２：５３９８−５４０３；Ｓｕｔｏら、１９９５， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２６９：１５８５−１５８８）。
【００１３】
腫瘍の免疫原性、さらに具体的には、腫瘍に由来する熱ショック／ストレスタンパク質調製物の免疫原性に関するＳｒｉｖａｓｔａｖａ及びその他による研究結果に基づき、哺乳動物の腫瘍細胞からストレスタンパク質−ペプチド複合体を単離し、この複合体を哺乳動物に戻し投与する方法が開発された（米国特許第５，７５０，１１９号）。腫瘍に由来するストレスタンパク質複合体は、同じ腫瘍から得られた細胞を用いた追加免疫（チャレンジ）に対する抵抗性を付与することができる（米国特許第５，８３７，２５１号）。免疫原性が高い癌細胞由来のストレスタンパク質調製物は、それぞれの腫瘍細胞型に対して免疫原性が低い癌細胞由来のストレスタンパク質調製物と比較して優れた抵抗性を賦与した（米国特許第５，８３７，２５１号）。Ｓｒｉｖａｓｔａｖａに与えられた米国特許第６，０１７，５４０号及び同第５，８３０，４６４号も参照されたい。
【００１４】
養子免疫療法において用いる目的で、ｉｎ ｖｉｔｒｏで抗原提示細胞を感作するのにｈｓｐ−ペプチド複合体を用いることについては、米国特許第５，９８５，２７０号に記載されている。
【００１５】
ｈｓｐ−ペプチド複合体はまた、病原体感染細胞から単離することができ、ウイルスのような病原体や、細菌、原生動物、真菌及び寄生生物などのその他の細胞内病原体によって起こる感染の治療及び予防に用いることができる。米国特許第５，９６１，９７９号を参照されたい。
【００１６】
さらに、免疫原性ｈｓｐ−ペプチド複合体は、ｈｓｐと抗原ペプチドとのｉｎ ｖｉｔｒｏでの複合体形成により調製することもでき、このような複合体を癌及び感染性疾患の治療及び予防に使用することは、米国特許第５，９３５，５７６号及び同第６，０３０，６１８号に記載されている。癌及び感染性疾患の治療のために、所定の抗原と組み合わせて熱ショックタンパク質を使用することも、１９９７年２月２７日付けのＰＣＴ公報ＷＯ９７／０６８２１号に記載されている。
【００１７】
細胞溶解物からのｈｓｐ−ペプチド複合体の精製については既に記載されている。例えば、２０００年４月１１日付けの米国特許第６，０４８，５３０号に記載されている。
【００１８】
２．３．α２−マクログロブリン
α−マクログロブリンは、補体成分であるＣ３、Ｃ４及びＣ５をも含む構造的に関連したタンパク質のタンパク質スーパーファミリーのメンバーである。ヒト血漿タンパク質α（２）マクログロブリン（α２Ｍ）は、主にプロテイナーゼインヒビター並びに血漿性及び炎症性液性プロテイナーゼスカベンジャー分子として知られている７２０ｋＤａのホモ四量体タンパク質である（総説としては、Ｃｈｕ及びＰｉｚｚｏ， １９９４， Ｌａｂ． Ｉｎｖｅｓｔ． ７１： ７９２を参照されたい）。α（２）マクログロブリンは１４７４アミノ酸の前駆体として合成され、そのうちシグナル配列として機能する最初の２３個が切り離されて１４５１アミノ酸の成熟タンパク質となる（Ｋａｎら， １９８５， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ８２： ２２８２−２２８６）。
【００１９】
α（２）マクログロブリンは求核性アミノ酸側鎖を有するタンパク質及びペプチドに共有結合により無差別に結合し（Ｃｈｕら， １９９４， Ａｎｎ． Ｎ．Ｙ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ７３７： ２９１−３０７）、それらをα２Ｍ受容体（α２ＭＲ）を発現する細胞に標的化する（Ｃｈｕ及びＰｉｚｚｏ， １９９３， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５０： ４８）。α２Ｍのα２Ｍ受容体への結合はα２ＭのＣ末端部分により仲介され（Ｈｏｌｔｅｔら， １９９４， ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ． ３４４： ２４２−２４６）、その重要な残基が特定されている（Ｎｉｅｌｓｅｎら， １９９６， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７１： １２９０９−１２９１２）。
【００２０】
プロテイナーゼ活性の阻害について一般的に知られているように、α２Ｍは複数の結合部位で種々のプロテアーゼに結合する（例えばＨａｌｌら， １９８１， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｍ． １００（１）： ８−１６を参照されたい）。α２Ｍとプロテアーゼが相互作用すると、トランスフォーメーションと呼ばれる複雑な構造的再編成がおこる。これは、プロテイナーゼがチオエステルによって「トラップ」された後に、α２Ｍの「ベイト（ｂａｉｔ； おとり）」領域内において開裂が起こる結果である。当該コンホメーション変化により受容体結合に必要な残基が露出し、α２Ｍプロテイナーゼ複合体がα２ＭＲに結合することが可能になる。メチルアミンは、プロテイナーゼにより誘導されたのと同様のコンホメーション変化と開裂を引き起こすことができる。この受容体に認識されないα２Ｍの未開裂の形態のものは、しばしば「遅延型」形態（ｓ−α２Ｍ）と称される。開裂した形態は「急速型」形態（ｆ−α２Ｍ）と称される（Ｃｈｕら， １９９４， Ａｎｎ． Ｎ．Ｙ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ７３７： ２９１−３０７に概説されている）。
【００２１】
プロテイナーゼ阻害機能のほかに、α２Ｍは、抗原と複合体を形成したときに、マクロファージのような抗原提示細胞に取り込まれてＴ細胞ハイブリドーマに提示されるその抗原の能力をｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて最大で２桁高め（Ｃｈｕ及びＰｉｚｚｏ， １９９４， Ｌａｂ． Ｉｎｖｅｓｔ． ７１： ７９２）、Ｔ細胞の増殖を誘導することができる（Ｏｓａｄａら， １９８７， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ． １４６： ２６−３１）ことが、研究により明らかになっている。更なる証拠により、α２Ｍと抗原との複合体形成は、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて未処理脾臓細胞による抗体産生を高め（Ｏｓａｄａら， １９８８， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ． １５０： ８８３）、実験用ウサギ（Ｃｈｕら， １９９４， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５２： １５３８−１５４５）及びマウス（Ｍｉｔｓｕｄａら， １９９３， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ． １０１： １３２６−１３３１）でのｉｎ ｖｉｖｏにおける抗体反応を誘起することが示唆されている。しかしながらこれらの研究は何れも、α２Ｍ−抗原複合体がｉｎ ｖｉｖｏにおいて細胞傷害性Ｔ細胞の応答を誘導することができるか否かを示すものではない。
【００２２】
α２Ｍは、抗原と複合体を形成することができ、それがα２ＭＲ（ＬＤＬ（低密度リポタンパク質）受容体関連タンパク質（ＬＲＰ）又はＣＤ９１としても知られている）を介して抗原提示細胞（ＡＰＣ）に取り込まれる（２０００年６月２日に出願された特許仮出願第６０／２０９，２６６号を参照されたい。この出願はその全内容を参照により本明細書に組み入れる）。α２Ｍは、熱ショックタンパク質ｇｐ９６とα２ＭＲとの結合と直接競合する（Ｂｉｎｄｅｒら， ２０００， Ｎａｔｕｒｅ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １（２）， １５１−１５４）。さらに、ｉｎ ｖｉｔｒｏで調製されたα２Ｍ−抗原ペプチド複合体は、動物に投与されると、該抗原分子に特異的な細胞傷害性Ｔ細胞応答を引き起こす（Ｂｉｎｄｅｒら， ２００１， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １６６：４９９６８−７２）。従って、ｈｓｐ及びα２Ｍはいくつかの共通する機能的性質（例えばペプチドとの結合能、α２ＭＲによる認識と取り込み、細胞傷害性Ｔ細胞応答の刺激など）を有するため、α２Ｍは癌及び感染性疾患に対する免疫療法として有用となる可能性がある。
【００２３】
２．４．免疫応答
生物の免疫系は、病原体又はその他の有害な因子に対する２種類の応答、すなわち、体液性応答及び細胞性応答により反応する（Ａｌｂｅｒｔｓ， Ｂら、１９９４， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｅｌｌ． １１９５−９６）。休止Ｂ細胞が、抗原により活性化されて、増殖し、抗体分泌細胞に成熟すると、これらは、特有の抗原結合部位を有する抗体を産生及び分泌する。この抗体分泌反応は、体液性応答として知られている。これに対し、Ｔ細胞の多様な応答は、集合的に細胞媒介性免疫反応と呼ばれている。Ｔ細胞には、２つの主要クラス、すなわち、細胞傷害性Ｔ細胞とヘルパーＴ細胞がある。細胞傷害性Ｔ細胞は、ウイルス又はその他の細胞内微生物に感染した細胞を直接死滅させる。対照的に、ヘルパーＴ細胞は、その他の細胞の応答を刺激するのを助ける：例えば、ヘルパーＴ細胞は、マクロファージ、樹状細胞及びＢ細胞を活性化するのを助ける（Ａｌｂｅｒｔｓ， Ｂら、１９９４， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｅｌｌ． １２２８参照）。細胞傷害性Ｔ細胞及びヘルパーＴ細胞のいずれも、標的細胞内部の外来タンパク質抗原の分解によって産生されるペプチド断片の形態の抗原を認識することから、両者とも、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）分子に依存する。該分子は、これらのペプチド断片と結合し、これらを細胞表面に運搬して、そこでこれらをＴ細胞に提示する（Ａｌｂｅｒｔｓ， Ｂら、１９９４， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｅｌｌ． １２２８参照）。ＭＨＣ分子は、一般に、抗原提示細胞（ＡＰＣ）上に多量にみいだされる。
【００２４】
２．５．抗原提示
マクロファージや樹状細胞などの抗原提示細胞（ＡＰＣ）は、自然免疫及び獲得免疫応答の基本成分である。抗原は、一般に、他の細胞、すなわち、ＡＰＣの表面上のＴ細胞又はＢ細胞に「提示」される。ＡＰＣは、リンパ及び血液由来の抗原を捕獲し、インターナリゼーション及び分解後に、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）の細胞表面分子に結合して、Ｔ細胞に抗原ペプチド断片を提示する。次に、ＡＰＣは、Ｔ細胞を活性化（細胞性応答）して、クローン増大を起こし、これらの娘細胞が、細胞傷害性Ｔ細胞又はヘルパーＴ細胞中のいずれかに発達し、これらが今度は、同じＭＨＣ結合抗原を含むＢ（体液性応答）細胞を活性化させ、クローン増大及び特異的抗体産生を引き起こす（Ａｌｂｅｒｔｓ， Ｂら、１９９４， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｅｌｌ． １２３８−４５参照）。
【００２５】
２つのタイプの抗原プロセシング機構が認識されている。第１のタイプは、ＡＰＣによるエンドサイトーシスを介したタンパク質の取込み、小胞内での抗原断片化、クラスＩＩＭＨＣ分子との会合、並びに、細胞表面上の発現によるものである。この複合体は、ＣＤ４を発現するヘルパーＴ細胞により認識される。もう一つは、細胞内で合成される、ウイルス抗原のようなタンパク質に用いられ、細胞質内でのタンパク質断片化によるものである。このようにして産生されたペプチドは、クラスＩＭＨＣ分子と会合し、ＣＤ８を発現する細胞傷害性Ｔ細胞により認識される（Ａｌｂｅｒｔｓ， Ｂら、１９９４， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｅｌｌ． １２３３−３４参照）。
【００２６】
Ｔ細胞の刺激には、Ｔ細胞及びＡＴＣの両方によって発現する多数の補助分子が関連する。共刺激分子は、ＡＰＣ表面上のＴ細胞、例えば、Ｂ７−１、Ｂ７−２、ＣＤ４０、ＩＣＡＭ−１及びＭＨＣＩＩ、並びに、Ｔ細胞表面上のＣＤ２８、ＣＤ４０Ｌ、Ｔ細胞抗原表面受容体（ＴＣＲ）及びＣＤ４の増加及び活性化を促進する補助分子である（例えば、Ｂａｎｃｈｅｒｅａｕ及びＳｔｅｉｎｍｅｎ， １９９８， Ｎａｔｕｒｅ ３９２：２４５−２５２参照）。刺激時に、共刺激分子は、インターロイキン１（ＩＬ−１）又はインターロイキン２（ＩＬ−２）、インターフェロンなどのサイトカインの放出を誘発し、これらが、Ｔ細胞増殖及び表面受容体の発現を促進する（例えば、Ｐａｕｌ， １９８９， Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ． １０９−１０参照）。
【００２７】
３．発明の概要
本発明は、ある種の癌又は感染性疾患のある因子に対して免疫原性を有する組成物を製造する方法を提供し、該方法は、（ｉ）第１の熱ショックタンパク質（「特異的ｈｓｐ」）と、それと複合体化した上記の種の癌の抗原の抗原性又は上記感染性疾患の因子の抗原の抗原性を提示する第１ペプチド、とを含む、所定量の精製された第１複合体（「特異的複合体」）；又は、多数の異なる第１ペプチドを含む、所定量の異種第１複合体の精製された集団；及び（ｉｉ）上記の種の癌の抗原の抗原性又は上記感染性疾患の因子の抗原の抗原性を提示するペプチドとｉｎ ｖｉｔｒｏで複合体化されたものではなく、かつ、上記の種の癌の癌組織又は上記感染性疾患の因子に感染した細胞からそれぞれ複合体として単離される複合体の形態ではない、等量又はそれ以上の第２の熱ショックタンパク質（「非特異的ｈｓｐ」）；を混合するステップを含む。一実施形態では、上記異種第１複合体の集団における各第１の熱ショックタンパク質を、異なる第１ペプチドと結合させる。
【００２８】
これに代わり、本発明は、ある種の癌又は感染性疾患のある因子に対して免疫原性を有する組成物を製造する方法を提供し、該方法は、（ｉ）第１の熱ショックタンパク質（「特異的ｈｓｐ」）と、それと複合体化した上記の種の癌の抗原の抗原性又は上記感染性疾患の因子の抗原の抗原性を提示する第１ペプチド、とを含む、所定量の精製された第１複合体（「特異的複合体」）；又は、多数の異なる第１ペプチドからなる、所定量の異種第１複合体の精製された集団；及び（ｉｉ）等量又はそれ以上のα２Ｍ（「非特異的α２Ｍ」）；を混合するステップを含む。一実施形態では、異種第１複合体の上記集団における各第１の熱ショックタンパク質を、異なる第１ペプチドと結合させる。好ましい実施形態では、α２Ｍは、上記の種の癌の抗原の抗原性又は上記感染性疾患の因子の抗原の抗原性を提示するペプチドとｉｎ ｖｉｔｒｏで複合体化されたものではなく、及び／又は、上記の種の癌の癌組織又は上記感染性疾患の因子に感染した細胞からそれぞれ複合体として単離される複合体の形態ではない。
【００２９】
あるいは、本発明は、ある種の癌又は感染性疾患のある因子に対して免疫原性を有する組成物を製造する方法を提供し、該方法は、（ｉ）第１のα２Ｍ（「特異的α２Ｍ」）と、それと複合体化した上記の種の癌の抗原の抗原性又は上記感染性疾患の因子の抗原の抗原性を提示する第１ペプチド、とを含む、所定量の精製された第１複合体（「特異的複合体」）；又は、多数の異なる第１ペプチドを含む、所定量の異種第１複合体の精製された集団；及び（ｉｉ）等量又はそれ以上の第２のα２Ｍ（「非特異的α２Ｍ」）；を混合するステップを含む。好ましい実施形態では、第２のα２Ｍは、上記の種の癌の抗原の抗原性又は上記感染性疾患の因子の抗原の抗原性を提示するペプチドとｉｎ ｖｉｔｒｏで複合体化されたものではなく、及び／又は、上記の種の癌の癌組織又は上記感染性疾患の因子に感染した細胞からそれぞれ複合体として単離される複合体の形態ではない。
【００３０】
さらに別の実施形態では、本発明は、ある種の癌又は感染性疾患のある因子に対して免疫原性を有する組成物を製造する方法を提供し、該方法は、（ｉ）α２Ｍ（「特異的α２Ｍ」）と、それと複合体化した上記の種の癌の抗原の抗原性又は上記感染性疾患の因子の抗原の抗原性を提示する第１ペプチド、とを含む、所定量の精製された第１複合体（「特異的複合体」）；及び（ｉｉ）等量又はそれ以上の熱ショックタンパク質（「非特異的ｈｓｐ」）；を混合するステップを含む。好ましい実施形態では、上記熱ショックタンパク質は、上記の種の癌の抗原の抗原性又は上記感染性疾患の因子の抗原の抗原性を提示するペプチドとｉｎ ｖｉｔｒｏで複合体化されたものではなく、及び／又は、上記の種の癌の癌組織又は上記感染性疾患の因子に感染した細胞からそれぞれ複合体として単離される複合体の形態ではない。
【００３１】
本発明は、さらに、ある種の癌又は感染性疾患のある因子に対して免疫原性を有する組成物を製造する方法を提供し、該方法は、上記の種の癌若しくはその転移の癌組織、又は上記感染性疾患因子に感染した細胞から第１の熱ショックタンパク質−ペプチド複合体（「特異的複合体」、そのｈｓｐ成分が「特異的ｈｓｐ」である）を精製するステップ；及び、所定量の第１複合体と、等量又はそれ以上の第２の熱ショックタンパク質（「非特異的ｈｓｐ」）とを混合するステップを含み、ここで、第２の熱ショックタンパク質は、上記の種の癌の抗原の抗原性又は上記感染性疾患の因子の抗原の抗原性を提示するペプチドとｉｎ ｖｉｔｒｏで複合体化されたものではなく、かつ、上記の種の癌の癌組織又は上記感染性疾患の因子に感染した細胞からそれぞれ複合体として単離される複合体の形態ではない。
【００３２】
これ以外に、本発明は、ある種の癌又は感染性疾患のある因子に対して免疫原性を有する組成物を製造する方法を提供し、該方法は、上記の種の癌若しくはその転移の癌組織、又は上記感染性疾患因子に感染した細胞から第１の熱ショックタンパク質−ペプチド複合体（「特異的複合体」、そのｈｓｐ成分が「特異的ｈｓｐ」である）を精製するステップ；及び、所定量の第１複合体と、等量又はそれ以上のα２Ｍ（「非特異的α２Ｍ」）とを混合するステップを含む。好ましい実施形態では、上記α２Ｍは、上記の種の癌の抗原の抗原性又は上記感染性疾患の因子の抗原の抗原性を提示するペプチドとｉｎ ｖｉｔｒｏで複合体化されたものではなく、及び／又は、上記の種の癌の癌組織又は上記感染性疾患の因子に感染した細胞からそれぞれ複合体として単離される複合体の形態ではない。
【００３３】
さらに、本発明は、ある種の癌又は感染性疾患のある因子に対して免疫原性を有する組成物を製造する方法を提供し、該方法は、上記の種の癌若しくはその転移の癌組織、又は上記感染性疾患因子に感染した細胞から第１のα２Ｍ−ペプチド複合体（「特異的複合体」、そのα２Ｍ成分が「特異的α２Ｍ」である）を精製するステップ；及び、所定量の第１複合体と、等量又はそれ以上の第２のα２Ｍ（「非特異的α２Ｍ」）とを混合するステップを含む。好ましい実施形態では、上記第２のα２Ｍは、上記の種の癌の抗原の抗原性又は上記感染性疾患の因子の抗原の抗原性を提示するペプチドとｉｎ ｖｉｔｒｏで複合体化されたものではなく、及び／又は、上記の種の癌の癌組織又は上記感染性疾患因子に感染した細胞からそれぞれ複合体として単離される複合体の形態ではない。
【００３４】
別の実施形態では、本発明はさらに、ある種の癌又は感染性疾患のある因子に対して免疫原性を有する組成物を製造する方法を提供し、該方法は、上記の種の癌若しくはその転移の癌組織、又は上記感染性疾患因子に感染した細胞からα２Ｍ−ペプチド複合体（「特異的複合体」、そのα２Ｍ成分が「特異的α２Ｍ」である）を精製するステップ；及び、所定量の第１複合体と、等量又はそれ以上の熱ショックタンパク質（「非特異的ｈｓｐ」）とを混合するステップを含む。好ましい実施形態では、上記熱ショックタンパク質は、上記の種の癌の抗原の抗原性又は上記感染性疾患の因子の抗原の抗原性を提示するペプチドとｉｎ ｖｉｔｒｏで複合体化されたものではなく、及び／又は、上記の種の癌の癌組織又は上記感染性疾患の因子に感染した細胞からそれぞれ複合体として単離される複合体の形態ではない。
【００３５】
本発明はさらに、ある種の癌又は感染性疾患のある因子に対して免疫原性を有する組成物を製造する方法を提供し、該方法は、第１の熱ショックタンパク質（「特異的ｈｓｐ」）を、上記の種の癌の腫瘍特異的抗原又は上記感染性疾患因子の抗原をｉｎ ｖｉｔｒｏで複合体化させることにより、第１複合体（「特異的複合体」）を形成するステップ；及び、所定量の第１複合体と、等量又はそれ以上の第２の熱ショックタンパク質（「非特異的ｈｓｐ」）とを混合するステップを含み、ここで、該第２の熱ショックタンパク質は、上記の種の癌の抗原の抗原性又は上記感染性疾患の因子の抗原の抗原性を提示するペプチドとｉｎ ｖｉｔｒｏで複合体化されたものではなく、かつ、上記の種の癌の癌組織又は上記感染性疾患の因子に感染した細胞からそれぞれ複合体として単離される複合体の形態ではない。
【００３６】
これ以外に、本発明はさらに、ある種の癌又は感染性疾患のある因子に対して免疫原性を有する組成物を製造する方法を提供し、該方法は、第１の熱ショックタンパク質（「非特異的ｈｓｐ」）を、上記の種の癌の腫瘍特異的抗原又は上記感染性疾患因子の抗原とｉｎ ｖｉｔｒｏで複合体化させることにより、第１複合体（「特異的複合体」）を形成するステップ；及び、所定量の第１複合体と、等量又はそれ以上のα２Ｍ（「非特異的α２Ｍ」）とを混合するステップを含む。好ましい実施形態では、上記α２Ｍは、上記の種の癌の抗原の抗原性又は上記感染性疾患の因子の抗原の抗原性を提示するペプチドとｉｎ ｖｉｔｒｏで複合体化されたものではなく、及び／又は、上記の種の癌の癌組織又は上記感染性疾患因子に感染した細胞からそれぞれ複合体として単離される複合体の形態ではない。
【００３７】
その他にも、本発明はさらに、ある種の癌又は感染性疾患のある因子に対して免疫原性を有する組成物を製造する方法を提供し、該方法は、第１のα２Ｍ（「非特異的α２Ｍ」）を、上記の種の癌の腫瘍特異的抗原又は上記感染性疾患因子の抗原とｉｎ ｖｉｔｒｏで複合体化させることにより、第１複合体（「特異的複合体」）を形成するステップ；及び、所定量の第１複合体と、等量又はそれ以上の第２のα２Ｍ（「非特異的α２Ｍ」）とを混合するステップを含む。好ましい実施形態では、第２のα２Ｍは、上記の種の癌の抗原の抗原性又は上記感染性疾患の因子の抗原の抗原性を提示するペプチドとｉｎ ｖｉｔｒｏで複合体化されたものではなく、及び／又は、上記の種の癌の癌組織又は上記感染性疾患因子に感染した細胞からそれぞれ複合体として単離される複合体の形態ではない。
【００３８】
本発明はさらに、ある種の癌又は感染性疾患のある因子に対して免疫原性を有する組成物を製造する方法を提供し、該方法は、α２Ｍ（「特異的α２Ｍ」）を、上記の種の癌の腫瘍特異的抗原又は上記感染性疾患因子の抗原とｉｎ ｖｉｔｒｏで複合体化させることにより、第１複合体（「特異的複合体」）を形成するステップ；及び、所定量の第１複合体と、等量又はそれ以上の熱ショックタンパク質（「非特異的ｈｓｐ」）とを混合するステップを含む。好ましい実施形態では、上記熱ショックタンパク質は、上記の種の癌の抗原の抗原性又は上記感染性疾患の因子の抗原の抗原性を提示するペプチドとｉｎ ｖｉｔｒｏで複合体化されたものではなく、及び／又は、上記の種の癌の癌組織又は上記感染性疾患の因子に感染した細胞からそれぞれ複合体として単離される複合体の形態ではない。
【００３９】
本発明はさらに、（ｉ）第１の熱ショックタンパク質（「特異的ｈｓｐ」）と、それと複合体化したある癌の抗原の抗原性又は感染性疾患のある因子の抗原の抗原性を提示するペプチド、とを含む、所定量の精製された第１複合体（この複合体が「特異的複合体」である）；及び（ｉｉ）等量又はそれ以上の第２の熱ショックタンパク質（「非特異的ｈｓｐ」）；を混合することにより製造される組成物を提供し、該第２の熱ショックタンパク質は、上記の種の癌の抗原の抗原性又は上記感染性疾患の因子の抗原の抗原性を提示するペプチドとｉｎ ｖｉｔｒｏで複合体化されたものではなく、かつ、上記の種の癌の癌組織又は上記感染性疾患の因子に感染した細胞からそれぞれ複合体として単離される複合体の形態ではない。
【００４０】
別の実施形態では、本発明はさらに、（ｉ）第１の熱ショックタンパク質（「特異的ｈｓｐ」）と、それと複合体化したある種の癌の抗原の抗原性又は感染性疾患のある因子の抗原の抗原性を提示するペプチド、とを含む、所定量の精製された第１複合体（この複合体が「特異的複合体」である）；及び（ｉｉ）等量又はそれ以上のα２Ｍ（「非特異的α２Ｍ」）；を混合することにより製造される組成物を提供する。好ましい実施形態では、上記α２Ｍは、上記の種の癌の抗原の抗原性又は上記感染性疾患の因子の抗原の抗原性を提示するペプチドとｉｎ ｖｉｔｒｏで複合体化されたものではなく、及び／又は、上記の種の癌の癌組織又は上記感染性疾患の因子に感染した細胞からそれぞれ複合体として単離される複合体の形態ではない。
【００４１】
別の実施形態では、本発明はさらに、（ｉ）第１のα２Ｍ（「特異的α２Ｍ」）と、それと複合体化したある種の癌の抗原の抗原性又は感染性疾患のある因子の抗原の抗原性を提示するペプチド、とを含む、所定量の精製された第１複合体（この複合体が「特異的複合体」である）；及び（ｉｉ）等量又はそれ以上の第２のα２Ｍ（「非特異的α２Ｍ」）；を混合することにより製造される組成物を提供する。好ましい実施形態では、上記第２のα２Ｍは、上記の種の癌の抗原の抗原性又は上記感染性疾患の因子の抗原の抗原性を提示するペプチドとｉｎ ｖｉｔｒｏで複合体化されたものではなく、及び／又は、上記の種の癌の癌組織又は上記感染性疾患因子に感染した細胞からそれぞれ複合体として単離される複合体の形態ではない。
【００４２】
さらに別の実施形態では、本発明は、（ｉ）α２Ｍ（「特異的α２Ｍ」）と、それと複合体化したある種の癌の抗原の抗原性又は感染性疾患のある因子の抗原の抗原性を提示するペプチド、とを含む所定量の精製された第１複合体（この複合体が「特異的複合体」である）；及び（ｉｉ）等量又はそれ以上の熱ショックタンパク質（「非特異的ｈｓｐ」）；を混合することにより製造される組成物を提供する。好ましい実施形態では、上記熱ショックタンパク質は、上記の種の癌の抗原の抗原性又は上記感染性疾患の因子の抗原の抗原性を提示するペプチドとｉｎ ｖｉｔｒｏで複合体化されたものではなく、及び／又は、上記の種の癌の癌組織又は上記感染性疾患因子に感染した細胞からそれぞれ複合体として単離される複合体の形態ではない。
【００４３】
本発明はさらに、（ｉ）第１の熱ショックタンパク質（「特異的ｈｓｐ」）と、それと複合体化したある種の癌の抗原の抗原性又は感染性疾患のある因子の抗原の抗原性を提示するペプチド、とを含む、精製された第１複合体（この複合体が「特異的複合体」である）；及び（ｉｉ）上記の種の癌の抗原の抗原性又は上記感染性疾患の因子の抗原の抗原性を提示するペプチドとｉｎ ｖｉｔｒｏで複合体化されたものではなく、かつ、上記の種の癌の癌組織又は上記感染性疾患因子に感染した細胞からそれぞれ複合体として単離される複合体の形態ではない、第２の熱ショックタンパク質（「非特異的ｈｓｐ」）を含む組成物を提供し、ここで、第１の熱ショックタンパク質の量は、第２の熱ショックタンパク質に対し等量以下であり、上記組成物は、上記の種の癌又は上記感染性疾患因子に対してそれぞれ免疫原性を有する。
【００４４】
別の実施形態では、本発明はさらに、（ｉ）第１の熱ショックタンパク質（「特異的ｈｓｐ」）と、それと複合体化したある種の癌の抗原の抗原性又は感染性疾患のある因子の抗原の抗原性を提示するペプチド、とを含む、精製された第１複合体（この複合体が「特異的複合体」である）；及び（ｉｉ）α２Ｍ（「非特異的α２Ｍ」）；を含む組成物を提供し、ここで、第１の熱ショックタンパク質の量はα２Ｍに対し等量以下であり、上記組成物が、上記の種の癌又は上記感染性疾患因子に対してそれぞれ免疫原性を有する。好ましい実施形態では、上記α２Ｍは、上記の種の癌の抗原の抗原性又は上記感染性疾患の因子の抗原の抗原性を提示するペプチドとｉｎ ｖｉｔｒｏで複合体化されたものではなく、及び／又は、上記の種の癌の癌組織又は上記感染性疾患因子に感染した細胞からそれぞれ複合体として単離される複合体の形態ではない。
【００４５】
別の実施形態では、本発明はさらに、（ｉ）第１のα２Ｍ（「特異的α２Ｍ」）と、それと複合体化したある種の癌の抗原の抗原性又は感染性疾患のある因子の抗原の抗原性を提示するペプチド、とを含む、精製された第１複合体（この複合体が「特異的複合体」である）；及び（ｉｉ）第２のα２Ｍ（「非特異的α２Ｍ」）；を含む組成物を提供し、ここで、第１のα２Ｍの量は第２のα２Ｍに対し等量以下であり、上記組成物は、上記の種の癌又は上記感染性疾患因子に対してそれぞれ免疫原性を有する。好ましい実施形態では、上記α２Ｍは、上記の種の癌の抗原の抗原性又は上記感染性疾患の因子の抗原の抗原性を提示するペプチドとｉｎ ｖｉｔｒｏで複合体化されたものではなく、及び／又は、上記の種の癌の癌組織又は上記感染性疾患因子に感染した細胞からそれぞれ複合体として単離される複合体の形態ではない。
【００４６】
さらに別の実施形態では、本発明は、（ｉ）α２Ｍ（「特異的α２Ｍ」）と、それと複合体化したある種の癌の抗原の抗原性又は感染性疾患のある因子の抗原の抗原性を提示するペプチド、とを含む、精製された第１複合体（この複合体が「特異的複合体」である）；及び（ｉｉ）熱ショックタンパク質（「非特異的ｈｓｐ」）；を含む組成物を提供する。好ましい実施形態では、上記熱ショックタンパク質は、上記の種の癌の抗原の抗原性又は上記感染性疾患の因子の抗原の抗原性を提示するペプチドとｉｎ ｖｉｔｒｏで複合体化されたものではなく、及び／又は、上記の種の癌の癌組織又は上記感染性疾患因子に感染した細胞からそれぞれ複合体として単離される複合体の形態ではない。
【００４７】
本発明はさらに、個体においてある種の癌又は感染性疾患のある因子に対して免疫応答を誘発する方法を提供し、該方法は、上記の種の癌又は上記感染性疾患因子に対して免疫応答を誘発するのに有効な量の精製された組成物を上記個体に投与するステップを含み、上記組成物は、（ｉ）第１の熱ショックタンパク質（「特異的ｈｓｐ」）と、それと複合体化した上記の種の癌の抗原の抗原性又は上記感染性疾患の因子の抗原の抗原性を提示するペプチド、とを含む、所定量の精製された第１複合体（「特異的複合体」）；及び（ｉｉ）等量又はそれ以上のα２Ｍ（「非特異的α２Ｍ」）；を含む。好ましい実施形態では、上記α２Ｍは、上記の種の癌の抗原の抗原性又は上記感染性疾患の因子の抗原の抗原性を提示するペプチドとｉｎ ｖｉｔｒｏで複合体化されたものではなく、及び／又は、上記の種の癌の癌組織又は上記感染性疾患因子に感染した細胞からそれぞれ複合体として単離される複合体の形態ではない。
【００４８】
本発明はさらに、個体においてある種の癌又は感染性疾患のある因子に対して免疫応答を誘発する方法を提供し、該方法は、上記の種の癌又は上記感染性疾患因子に対して免疫応答を誘発するのに有効な量の精製された組成物を上記個体に投与するステップを含み、上記組成物は、（ｉ）第１のα２Ｍ（「特異的α２Ｍ」）と、それと複合体化した上記の種の癌の抗原の抗原性又は上記感染性疾患の因子の抗原の抗原性を提示するペプチド、とを含む、所定量の精製された第１複合体（「特異的複合体」）；及び（ｉｉ）等量又はそれ以上の第２のα２Ｍ（「非特異的α２Ｍ」）；を含む。好ましい実施形態では、上記第２のα２Ｍは、上記の種の癌の抗原の抗原性又は上記感染性疾患の因子の抗原の抗原性を提示するペプチドとｉｎ ｖｉｔｒｏで複合体化されたものではなく、及び／又は、上記の種の癌の癌組織又は上記感染性疾患因子に感染した細胞からそれぞれ複合体として単離される複合体の形態ではない。
【００４９】
本発明はさらに、個体においてある種の癌又は感染性疾患のある因子に対して免疫応答を誘発する方法を提供し、該方法は、上記の種の癌又は上記感染性疾患因子に対して免疫応答を誘発するのに有効な量の精製された組成物を上記個体に投与するステップを含み、上記組成物は、（ｉ）第１の熱ショックタンパク質（「特異的ｈｓｐ」）と、それと複合体化した上記の種の癌の抗原の抗原性又は上記感染性疾患の因子の抗原の抗原性を提示するペプチド、とを含む、所定量の精製された第１複合体（「特異的複合体」）；及び（ｉｉ）等量又はそれ以上の第２の熱ショックタンパク質（「非特異的ｈｓｐ」）；を含み、ここで、該第２の熱ショックタンパク質は、上記の種の癌の抗原の抗原性又は上記感染性疾患の因子の抗原の抗原性を提示するペプチドとｉｎ ｖｉｔｒｏでそれぞれ複合体化されたものではなく、かつ、上記の種の癌の癌組織又は上記感染性疾患因子に感染した細胞からそれぞれ複合体として単離される複合体の形態ではない。
【００５０】
別の実施形態では、本発明はさらに、個体においてある種の癌又は感染性疾患のある因子に対して免疫応答を誘発する方法を提供し、該方法は、上記の種の癌又は上記感染性疾患因子に対して免疫応答を誘発するのに有効な量の精製された組成物を上記個体に投与するステップを含み、上記組成物は、（ｉ）第１の熱ショックタンパク質（「特異的ｈｓｐ」）と、それと複合体化した上記の種の癌の抗原の抗原性又は上記感染性疾患の因子の抗原の抗原性を提示するペプチド、とを含む、所定量の精製された第１複合体（「特異的複合体」）；及び（ｉｉ）等量又はそれ以上のα２Ｍ（「非特異的α２Ｍ」）；を含む。好ましい実施形態では、上記α２Ｍは、上記の種の癌の抗原の抗原性又は上記感染性疾患の因子の抗原の抗原性を提示するペプチドとｉｎ ｖｉｔｒｏで複合体化されたものではなく、及び／又は、上記の種の癌の癌組織又は上記感染性疾患因子に感染した細胞からそれぞれ複合体として単離される複合体の形態ではない。
【００５１】
別の実施形態では、本発明はさらに、個体においてある種の癌又は感染性疾患のある因子に対して免疫応答を誘発する方法を提供し、該方法は、上記の種の癌又は上記感染性疾患因子に対して免疫応答を誘発するのに有効な量の精製された組成物を上記個体に投与するステップを含み、上記組成物は、（ｉ）第１のα２Ｍ（「特異的α２Ｍ」）と、それと複合体化した上記の種の癌の抗原の抗原性又は上記感染性疾患の因子の抗原の抗原性を提示するペプチド、とを含む、所定量の精製された第１複合体（「特異的複合体」）；及び（ｉｉ）等量又はそれ以上の第２のα２Ｍ（「非特異的α２Ｍ」）；を含む。好ましい実施形態では、上記第２のα２Ｍは、上記の種の癌の抗原の抗原性又は上記感染性疾患の因子の抗原の抗原性を提示するペプチドとｉｎ ｖｉｔｒｏで複合体化されたものではなく、及び／又は、上記の種の癌の癌組織又は上記感染性疾患因子に感染した細胞からそれぞれ複合体として単離される複合体の形態ではない。
【００５２】
さらに別の実施形態では、本発明はさらに、個体におけるある種の癌又は感染性疾患のある因子に対して免疫応答を誘発する方法を提供し、該方法は、上記の種の癌又は上記感染性疾患因子に対して免疫応答を誘発するのに有効な量の精製された組成物を上記個体に投与するステップを含み、上記組成物は、（ｉ）α２Ｍ（「特異的α２Ｍ」）と、それと複合体化した上記の種の癌の抗原の抗原性又は上記感染性疾患の因子の抗原の抗原性を提示するペプチド、とを含む、所定量の精製された第１複合体（「特異的複合体」）；及び（ｉｉ）等量又はそれ以上の熱ショックタンパク質（「非特異的ｈｓｐ」）；を含む。好ましい実施形態では、上記熱ショックタンパク質は、上記の種の癌の抗原の抗原性又は上記感染性疾患の因子の抗原の抗原性を提示するペプチドとｉｎ ｖｉｔｒｏで複合体化されたものではなく、及び／又は、上記の種の癌の癌組織又は上記感染性疾患因子に感染した細胞からそれぞれ複合体として単離される複合体の形態ではない。
【００５３】
本発明はさらに、ある種の癌又は感染性疾患をその治療又は予防が望ましい個体において治療又は予防する方法を提供し、該方法は、治療に有効な量の精製された組成物を該個体に投与するステップを含み、上記組成物は、（ｉ）第１の熱ショックタンパク質（「特異的ｈｓｐ」）と、それと複合体化した上記の種の癌の抗原の抗原性又は上記感染性疾患の因子の抗原の抗原性を提示するペプチド、とを含む、所定量の精製された第１複合体（「特異的複合体」）；及び（ｉｉ）等量又はそれ以上の第２の熱ショックタンパク質（「非特異的ｈｓｐ」）；を含み、ここで、該第２の熱ショックタンパク質は、上記の種の癌の抗原の抗原性又は上記感染性疾患の因子の抗原の抗原性を提示するペプチドとｉｎ ｖｉｔｒｏでそれぞれ複合体化されたものではなく、かつ、上記の種の癌の癌組織又は上記感染性疾患因子に感染した細胞からそれぞれ複合体として単離される複合体の形態ではない。
【００５４】
別の実施形態では、本発明はさらに、ある種の癌又は感染性疾患をその治療又は予防が望ましい個体において治療又は予防する方法を提供し、該方法は、治療に有効な量の精製された組成物を該個体に投与するステップを含み、上記組成物は、（ｉ）α２Ｍ（「特異的α２Ｍ」）と、それと複合体化した上記の種の癌の抗原の抗原性又は上記感染性疾患の因子の抗原の抗原性を提示するペプチド、とを含む、所定量の精製された第１複合体（「特異的複合体」）；及び（ｉｉ）等量又はそれ以上の熱ショックタンパク質（「非特異的ｈｓｐ」）；を含む。好ましい実施形態では、上記熱ショックタンパク質は、上記の種の癌の抗原の抗原性又は上記感染性疾患の因子の抗原の抗原性を提示するペプチドとｉｎ ｖｉｔｒｏで複合体化されたものではなく、及び／又は、上記の種の癌の癌組織又は上記感染性疾患因子に感染した細胞からそれぞれ複合体として単離される複合体の形態ではない。
【００５５】
別の実施形態では、本発明はさらに、ある種の癌又は感染性疾患をその治療又は予防が望ましい個体において治療又は予防する方法を提供し、該方法は、治療に有効な量の精製された組成物を上記個体に投与するステップを含み、上記組成物は、（ｉ）第１の熱ショックタンパク質（「特異的ｈｓｐ」）と、それと複合体化した上記の種の癌の抗原の抗原性又は上記感染性疾患の因子の抗原の抗原性を提示するペプチド、とを含む、所定量の精製された第１複合体（「特異的複合体」）；及び（ｉｉ）等量又はそれ以上のα２Ｍ（「非特異的α２Ｍ」）；を含む。好ましい実施形態では、上記α２Ｍは、上記の種の癌の抗原の抗原性又は上記感染性疾患の因子の抗原の抗原性を提示するペプチドとｉｎ ｖｉｔｒｏで複合体化されたものではなく、及び／又は、上記の種の癌の癌組織又は上記感染性疾患因子に感染した細胞からそれぞれ複合体として単離される複合体の形態ではない。
【００５６】
別の実施形態では、本発明はさらに、ある種の癌又は感染性疾患をその治療又は予防が望ましい個体において治療又は予防する方法を提供し、該方法は、治療に有効な量の精製された組成物を上記個体に投与するステップを含み、上記組成物は、（ｉ）第１のα２Ｍ（「特異的α２Ｍ」）と、それと複合体化した上記の種の癌の抗原の抗原性又は上記感染性疾患の因子の抗原の抗原性を提示するペプチド、とを含む、所定量の精製された第１複合体（「特異的複合体」）；及び（ｉｉ）等量又はそれ以上の第２のα２Ｍ（「非特異的α２Ｍ」）；を含む。好ましい実施形態では、上記第２のα２Ｍは、上記の種の癌の抗原の抗原性又は上記感染性疾患の因子の抗原の抗原性を提示するペプチドとｉｎ ｖｉｔｒｏで複合体化されたものではなく、及び／又は、上記の種の癌の癌組織又は上記感染性疾患因子に感染した細胞からそれぞれ複合体として単離される複合体の形態ではない。
【００５７】
前記方法及び組成物のいくつかの特定の実施形態では、特異的ｈｓｐ又は特異的α２Ｍと、非特異的ｈｓｐ又は非特異的α２Ｍとの質量比は、１：１、１：２、さらに好ましくは１：５、そして最も好ましくは１：１０である。別の実施形態では、特異的ｈｓｐ又は特異的α２Ｍと、非特異的ｈｓｐ又は非特異的α２Ｍとの質量比は、１：１００、１：５００又は１：１，０００である。さらに別の実施形態では、特異的ｈｓｐ又は特異的α２Ｍと、非特異的ｈｓｐ又は非特異的α２Ｍとの質量比は、１：３、１：４、１：９、１：１９、１：２４、１：４９又は１：９９である。
【００５８】
前記方法及び組成物の一実施形態では、非特異的ｈｓｐ又は非特異的α２Ｍはどんな分子とも複合体化されていない。他の実施形態では、非特異的ｈｓｐ又は非特異的α２Ｍを第２ペプチドと複合体化させることにより、第２複合体（「非特異的複合体」又は「希釈複合体」）を形成する。
【００５９】
前記方法及び組成物の特定の実施形態では、特異的ｈｓｐと非特異的ｈｓｐは同じものであってもよい。
【００６０】
α２Ｍを含む特異的複合体が肝臓癌細胞から単離される、前記方法及び組成物の好ましい実施形態では、非特異的ｈｓｐは、特異的複合体が単離された細胞（例えば、特異的複合体が単離された細胞と同じ遺伝子型を有する細胞）から単離されるものではない。
【００６１】
前記方法及び組成物のいくつかの特定の実施形態では、非特異的ｈｓｐ又は非特異的α２Ｍは、特異的複合体と混合する細胞溶解物又は抽出物中に存在するものであってもよい。α２Ｍを含む溶解物は、好ましくは肝細胞から調製し、さらに好ましくはα２Ｍを発現する培養中の組換え細胞から調製する。
【００６２】
前記方法及び組成物の特異的複合体及び／又は非特異的複合体の成分（すなわち、ｈｓｐ又はα２Ｍ、及びその複合体化抗原分子）は、共有結合していてもよいし又は非共有結合していてもよい。好ましくは、特異的複合体及び／又は非特異的複合体は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で検出される程度の見かけ上の均質性まで精製される。
【００６３】
上に開示した方法のいくつかの実施形態では、免疫応答を誘発する、又は癌若しくは感染性疾患を予防若しくは治療する組成物中の特異的複合体の量は、０．１〜２μｇの範囲にある。別の実施形態では、特異的複合体組成物の量は５〜２０μｇの範囲にある。いくつかの特定の実施形態では、上記組成物中の特異的複合体の量は０．１〜２μｇの範囲にあり、第１の熱ショックタンパク質又はα２Ｍと第２の熱ショックタンパク質又はα２Ｍの質量比は１：１０である。これら実施形態の好ましい態様では、第１の熱ショックタンパク質はｈｓｐ７０又はｇｐ９６である。
【００６４】
さらに別の実施形態では、上記組成物中の第１複合体の量は５〜２０μｇの範囲にあり、特異的熱ショックタンパク質又はα２Ｍと非特異的熱ショックタンパク質又はα２Ｍの質量比は１：１０である。これら実施形態の一態様では、特異的熱ショックタンパク質はｈｓｐ９０である。この実施形態の別の態様では、特異的熱ショックタンパク質はｈｓｐ７０又はｇｐ９６である。
【００６５】
上に開示した方法の他の実施形態では、免疫応答を誘発する、又は癌若しくは感染性疾患を予防若しくは治療する組成物中の希釈複合体の投与量は、１〜１００μｇ、さらに好ましくは２〜５０μｇ、そして最も好ましくは約５〜２５μｇであり、その際、特異的複合体は、ｇｐ９６、ｈｓｐ７０、ｈｓｐ１１０又はｇｒｐ１７０を含む。特異的複合体がｈｓｐ９０を含む場合、希釈複合体の投与量は、好ましくは１０〜５００μｇ、さらに好ましくは２０〜４００μｇ、より好ましくは約５０〜２５０μｇである。他の実施形態では、特異的複合体がカルレティキュリンを含む場合、希釈複合体の投与量は、好ましくは０．５〜５０μｇ、さらに好ましくは１〜２５μｇ、より好ましくは約２〜１５μｇ、そして最も好ましくは２．５〜１０μｇである。特異的複合体がα２Ｍを含む場合、希釈複合体の用量は、好ましくは１μｇ〜１０ｍｇ、さらに好ましくは２μｇ〜５ｍｇ、より好ましくは５μｇ〜５００μｇ、そして最も好ましくは約５〜２５０μｇである。
【００６６】
ある種の癌に対する免疫応答の誘発、又はその予防若しくは治療が望ましい一実施形態において、第１複合体は、個体の自己由来の上記の種の癌又はその転移の癌組織から調製する。ある種の癌に対する免疫応答の誘発、又はその予防若しくは治療が望ましい別の一実施形態において、第１複合体は、個体の同種異系の上記の種の癌又はその転移の癌組織から調製する。
【００６７】
４．発明の詳細な説明
本発明は、熱ショックタンパク質調製物のワクチン接種の効率向上に関する。特に、本発明は、熱ショック／ストレスタンパク質−ペプチド複合体の新しい製剤を提供する。また、癌及び感染性疾患の予防及び治療のための製剤の使用方法、並びに、被験者において免疫応答を誘発する方法も提供する。本発明は、癌組織又は感染組織のような抗原源から単離されたｈｓｐ−ペプチド複合体の供給が制限される状況において有用である。腫瘍源に由来するｈｓｐ−ペプチド複合体の量は、往々にしてあまりに制限があるため、免疫療法の全過程を達成することができない。これについては、例えば、Ｌｅｗｉｓら、１９９９、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ＡＳＣＯ １８、要旨番号１６８７を参照されたい。
【００６８】
何らかの理論に拘束されるわけではないが、本発明は、部分的に、癌又は感染性疾患の治療又は予防に現在用いられているｈｓｐ−ペプチド複合体に基づくワクチン中に多量の抗原ペプチドが存在し、これがレシピエントの免疫系を刺激することにより、癌又は感染性疾患に対する免疫応答が誘発されるという認識に基づいている。腫瘍に由来する１０μｇのｇｐ９６−ペプチド調製物をマウスにワクチン接種すると、マウスは、その腫瘍に対して抵抗性を示す（Ｓｒｉｖａｓｔａｖａら、１９８６、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８３：３４０７−３４１１）。ペプチドの分子量が無視できるものと仮定すれば、１０μｇのｇｐ９６−ペプチド複合体調製物は、アボガドロ数から計算して、約６×１０１３分子のｇｐ９６を含んでいる。また、所与の調製物には、等モル量のｈｓｐ及びペプチドが存在すると仮定すれば、約６×１０１３分子のペプチドがこの調製物には存在することになる。これらのことから、本発明者らは、約０．０１％のペプチドが、抗原供与源に特異的な抗原ペプチドであると推定した。従って、１０μｇのｇｐ９６−ペプチド調製物をワクチン接種に用いる場合、これは、約１０９個の供与源特異的抗原ペプチドを含む。
【００６９】
免疫応答では、抗原提示細胞（ＡＰＣ）により提示される抗原と接触後、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）は、インターナリゼーションによりＴ細胞表面からダウンレギュレートされる。一般に、ＴＣＲがダウンレギュレートされた後、ＡＰＣの表面上の抗原が自由になって、別のＴＣＲと結合する（ｅｎｇａｇｅ）と考えられる。ＭＨＣによる抗原提示に関連して、単一抗原は、２００回までＴＣＲと連続的に結合することができる（Ｖａｌｕｔｔｉら、１９９５， Ｎａｔｕｒｅ ３７５：１４８−１５１）。さらに、Ｔ細胞の最大活性化は、共刺激分子の不在下で約８，０００回のＴＣＲの結合、又は共刺激分子の存在下で約１，５００回のＴＣＲの結合時に起こることがわかっている（Ｖｉｏｌａ及びＬａｎｚａｖｅｃｃｈｉａ， １９９６， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７３：１０４−１０６）。
【００７０】
計算した１０９個のペプチドの１％だけがＡＰＣにより生産的に伝達（ｃｈａｎｎｅｌｅｄ）されて細胞表面に提示されると仮定すれば、１０μｇのｈｓｐ−ペプチド複合体の投与後、実際には１０７個のペプチドが提示される。これらのペプチドが１０５個のＡＰＣにより提示される場合には、各ＡＰＣは約１００個の抗原ペプチドを提示する。各抗原分子は、２００回までＴ細胞受容体と結合することができる。ＡＰＣ１個につき１００個の抗原ペプチド（その各々が２００回まで受容体と結合することができる）が提示されるとすると、１０μｇのｈｓｐ−ペプチド複合体の投与後、Ｔ細胞１個につき２０，０００回まで受容体結合の事象が起こり得る。Ｔ細胞刺激は、共刺激分子の存在下では約１，５００回のＴ細胞受容体の結合しか必要としないため、１０μｇのｈｓｐ−ペプチド複合体の投与は、特に共刺激分子の存在下ではＴ細胞刺激の強力な刺激となる。具体的には、本発明者の計算によれば、被験者に免疫応答を誘発するには、わずか１，５００のＴＣＲ結合、すなわち、１０μｇのｈｓｐ−ペプチド複合体の投与後にＴ細胞１個につき起こり得る２０，０００のＴＣＲ結合事象の７．５％しか必要とされない。従って、抗原ペプチドを含む供与源から、１０μｇのｈｓｐ−ペプチド複合体（又は、同等モル質量のα２Ｍ−ペプチド複合体）を含む組成物の約１０％を単離するだけでよい。残りの用量は、希釈体、すなわち、非特異的、ｈｓｐ、ｈｓｐ−ペプチド複合体、α２Ｍ、α２Ｍ−ペプチド複合体を含むことができる。希釈体として、限定するものではないが、非特異的ｈｓｐ−ペプチド複合体若しくはα２Ｍ−ペプチド複合体、ｈｓｐ又はα２Ｍを含む細胞抽出物又は溶解物が挙げられる。従って、例えば、腫瘍細胞から精製した約１μｇのｇｐ９６を、正常細胞から精製した約９μｇのｇｐ９６と混合することにより、合計量１０μｇの組成物を得ることができる。
【００７１】
本発明の一実施形態では、本発明の免疫原組成物は、（ｉ）目的とする抗原供与源に特異的な抗原ペプチドを含む、初期量のｈｓｐ−ペプチド複合体又はα２Ｍ−ペプチド複合体の調製物と、（ｉｉ）目的とする抗原供与源に特異的な抗原ペプチドを有意な量では含まない、ｈｓｐ、α２Ｍ、ｈｓｐ−ペプチド複合体又はα２Ｍ−ペプチド複合体の調製物を混合することにより製剤化し、その結果、初期量の調製物によって達成できる免疫原投与の回数を増加できるようにする。実際には、本発明の製剤化方法により、抗原ペプチドを含むｈｓｐ−ペプチド又はα２Ｍ−ペプチド複合体の調製物を、得られたｈｓｐ−ペプチド又はα２Ｍ−ペプチド複合体がｉｎ ｖｉｖｏ又はｉｎ ｖｉｔｒｏで特異的免疫応答を誘発、刺激、増強又は持続する能力を減弱することなく、「希釈」する。さらに、「希釈複合体」は、等量の対応する「特異的複合体」を含む非希釈調製物より高い免疫原性又は抗原性を有することもある。
【００７２】
従って、本発明の方法は、癌又は感染性疾患の治療又は予防が望ましい個体において免疫応答を誘発する方法であって、腫瘍細胞又は感染性疾患の因子に対して免疫応答を誘発するのに有効な量の、主として、抗原分子に結合したｈｓｐ又はα２Ｍからなる第１の「特異的複合体」と、「希釈体」とを含む組成物を、任意の経路、好ましくは皮下、さらに好ましくは皮内に、投与するステップを含む方法を包含する。この希釈体は、ｈｓｐ、特異的抗原ペプチドではない分子と複合体化したｈｓｐ、α２Ｍ、又は、好ましくは特異的抗原ペプチドではない抗原分子と複合体化したα２Ｍとしうる。従って、上記希釈体は、非複合体化ｈｓｐ、α２Ｍ、又は、別の実施形態では、ペプチド（しかし、これに限定されるわけではない）などの別の分子と複合体化したｈｓｐ又はα２Ｍを含みうる。希釈体はまた、ｈｓｐ又はα２Ｍを含む細胞抽出物又は溶解物でもよい。希釈体は、特異的複合体と質量又はモルが等しい量で、組成物（「希釈複合体」と呼ばれる）中に存在し、さらに好ましくは特異的複合体の過剰量（質量又はモルのいずれか）で存在する。投与する希釈複合体の量は、希釈複合体中の特異的複合体の量に応じて変動する。希釈複合体、又は希釈複合体の特異的複合体成分に関して、投与量を測定することができる。希釈複合体の投与量は、特異的複合体がｇｐ９６又はｈｓｐ７０を含む場合、好ましくは１〜１００μｇであり、さらに好ましくは２〜５０μｇであり、最も好ましくは約５〜２５μｇである。特異的複合体がｈｓｐ９０を含む場合には、希釈複合体の投与量は、好ましくは１０〜５００μｇであり、さらに好ましくは２０〜４００μｇであり、より好ましくは約５０〜２５０μｇである。別の実施形態では、希釈複合体の投与量は、希釈複合体の合計量とは関係なく、ｇｐ９６又はｈｓｐ７０含有特異的複合体を１、２、５又は１０μｇ含む。さらに別の実施形態では、希釈複合体の投与量は、希釈複合体の合計量とは関係なく、ｈｓｐ９０含有特異的複合体を１０、２０、５０又は１００μｇ含む。これ以外の投与量については、前掲の第４．１３．１節に記載されている。
【００７３】
特異的複合体及び希釈体の両方で、本発明の実施に用いることができるｈｓｐとしては、限定するものではないが、ｈｓｐ７０、ｈｓｐ９０、ｇｐ９６、カルレティキュリン、ｈｓｐ１１０、ｇｒｐ１７０が挙げられ、それぞれ単独又は組み合わせて用いることができる。好ましくは、ｈｓｐはヒトｈｓｐである。特異的複合体及び希釈体のｈｓｐは、同じｈｓｐであってもよいし又は異なるｈｓｐであってもよい。
【００７４】
特異的複合体及び希釈体の両方で、本発明の実施に用いることができるα２Ｍポリペプチド又はα２Ｍ抗原分子複合体は、組換え手法により発現させることができる（例えば、第４．２．６節及び第４．６．２節に記載されている）。これ以外に、α２Ｍポリペプチドは、市販のものを購入してもよいし、あるいは、組織（例えば、α２Ｍが主に発現する肝組織）又は血液から精製することもできる。
【００７５】
本発明の実施に際し、いずれかの通常の投与経路を用いた、ｈｓｐ−ペプチド又はα２Ｍ−ペプチド複合体の投与による治療は、任意により、希釈複合体で希釈した特異的複合体を用いてｉｎ ｖｉｔｒｏで感作しておいた抗原提示細胞の投与を行う養子免疫療法と場合により組み合わせてもよい。
【００７６】
特定の実施形態では、本発明は、原発性及び転移性新生物疾患の予防及び治療のための方法及び組成物に関する。
【００７７】
本発明により、特定の治療法、医薬組成物、及びキットが提供される。
【００７８】
別途記載のない限り、本明細書で用いる用語「ｈｓｐ」、「α２Ｍ」、「複合体」は、単数形で使用する場合も、複数のｈｓｐ、α２Ｍタンパク質、並びに、ｈｓｐとペプチド又はα２Ｍとペプチドからなる複数の複合体を包含し、ｈｓｐ、α２Ｍ、ｈｓｐ−ペプチド複合体又はα２Ｍ−ペプチド複合体の集団を意味することもある。
【００７９】
本明細書で用いる用語「特異的複合体」とは、目的とする抗原供与源に特異的な抗原ペプチドを含むｈｓｐ−ペプチド又はα２Ｍ−ペプチド複合体を意味する。「特異的複合体」とは、目的とする抗原供与源に特異的な抗原ペプチドと共有又は非共有結合したｈｓｐ又はα２Ｍの分子複合体を含む、ｈｓｐ−ペプチド又はα２Ｍ−ペプチド複合体の集団を意味する。抗原の供与源は、治療及び／又は予防の目的用途に応じて異なる。腫瘍組織、腫瘍細胞、癌細胞、又は病原体に感染した細胞が抗原ペプチドの供与源となり得るが、これらに限定されるわけではない。免疫原量の本発明の特異的複合体は、少なくとも１回の投与により、被験者において、目的とする抗原供与源に特異的な抗原ペプチドに対する免疫応答を誘発、刺激、増強、及び／又は持続することができる量である。
【００８０】
本明細書で用いる用語「希釈体」とは、ｈｓｐ、α２Ｍ、及びｈｓｐ−又はα２Ｍ−分子複合体を意味する。希釈体が、ｈｓｐ又はα２Ｍ調製物を含む場合には、ｈｓｐ又はα２Ｍ調製物は、目的とする抗原供与源に特異的な抗原ペプチドを有意な量では含んでいないのが好ましい。希釈体は、ｈｓｐ又はα２Ｍを単独で、あるいは、他の分子（ペプチドなど）と共有又は非共有結合したｈｓｐ又はα２Ｍを含んでいてもよい。一実施形態では、希釈体は、単に組換え手法により発現させた精製ｈｓｐ又はα２Ｍからなる。別の実施形態では、希釈体は、一細胞系から調製したｈｓｐ−ペプチド又はα２Ｍ−ペプチド複合体である。さらに別の実施形態では、希釈体は、希釈複合体を投与しようとする被験者の正常（すなわち、非癌又は非感染）細胞から調製したｈｓｐ−ペプチド又はα２Ｍ−ペプチド複合体であり、従って、目的とする抗原ペプチドを発現する細胞から調製した特異的ｈｓｐ−ペプチド又はα２Ｍ−ペプチド複合体集団の非抗原ペプチド成分として存在する非特異的抗原ペプチドを含む。別の実施形態では、希釈体は、有意なレベルの目的抗原ペプチドを発現しない細胞から得た細胞抽出物又は溶解物である。また、ｈｓｐ−ペプチド又はα２Ｍ−ペプチド複合体を含む希釈体は、無視できる量の目的の抗原供与源に特異的な抗原ペプチドを含んでいてもよい。しかし、この希釈体は、それだけを被験者に投与しても、被験者において、目的とする抗原供与源に特異的な抗原ペプチドに対する免疫応答を特異的に、誘発、刺激、増強、及び／又は持続することはできない。
【００８１】
特異的複合体又は希釈体／非特異的複合体を細胞又は細胞系から精製する場合には、例えば、適切な転写及び翻訳シグナルの制御下で、ｈｓｐ又はα２Ｍ発現構築物で細胞をトランスフェクションすることによって、細胞又は細胞系は、対応するｈｓｐ又はα２Ｍを組換え手法により発現することができる。
【００８２】
本明細書で用いる用語「希釈複合体」とは、本発明の製剤化方法に従い、希釈体と特異的複合体を混合することによって得られる免疫原性ｈｓｐ又はα２Ｍ分子複合体を意味する。
【００８３】
いくつかの特定の実施形態では、本発明は、特異的複合体及び希釈体の免疫原性混合物を含む希釈複合体を提供する。本発明の希釈複合体において、第１のｈｓｐ／α２Ｍ（すなわち、特異的ｈｓｐ／α２Ｍ）と第２のｈｓｐ／α２Ｍ（すなわち、非特異的ｈｓｐ／α２Ｍ）、又は特異的複合体と希釈体の質量比は、例えば、１：１、１：２、１：３、１：４、１：５、１：９、１：１０、１：２４、１：４９、１：５０、１：９９、１：１００、１：５００、１：１，０００など、任意でよい。
【００８４】
本発明によれば、特異的複合体又は希釈複合体の被験者に対する免疫原投与により、被験者において、目的とする抗原供与源に特異的な抗原ペプチドに対する免疫応答を誘発、刺激、増強、及び／又は持続する。被験者への毎回の投与には、免疫原性のある用量の特異的複合体又は希釈複合体を用いる。特異的複合体の初期物理的量に応じて、得られる希釈複合体を複数回の用量に分けることができる。その際、各用量は、投与した際に免疫原性がある。例えば、１回の免疫原性投与のみで十分な特異的複合体の免疫原量を、本発明に従って希釈した後、複数回の投与で使用することができる。
【００８５】
さらに別の実施形態では、本発明は、治療及び／又は予防用途のために、単一回の免疫原投与に有用な用量の希釈複合体を含む医薬製剤又は組成物を提供する。免疫原用量は、様々な被験者及び様々な治療又は予防用途に応じて異なる。
【００８６】
実際に、本発明の製剤は、１回の投与につき含まれる、腫瘍組織又は病原体感染組織から単離した特異的複合体がこれまでより少量である。１回の投与につき使用する特異的複合体の量が少ないため、これまでより多数回の免疫原性投与を実施することができる。免疫原投与は、これまでより長い期間にわたり、及び／又は同じ患者の複数部位に実施することができる。限定された量の特異的複合体を用いて行なうことができる免疫原投与の回数を増やすことにより、治療法の経済性及び適応性が向上する。
【００８７】
従って、別の実施形態では、本発明はさらに、単回の免疫原投与に十分な用量の希釈複合体を含む医薬製剤又は組成物を各々が含む複数の容器を含むキットを提供する。本発明はまた、免疫原量の特異的複合体を含む容器と、希釈体を含む容器とを含むキットも提供する。場合によっては、本発明の方法に従って特異的複合体を調製する指示書をキットに加えてもよい。
【００８８】
さらに別の実施形態では、本発明は、免疫原量の希釈複合体、又はその医薬製剤若しくは組成物を投与することにより、感染性疾患又は癌の治療又は予防が望ましい被験者において免疫応答を誘発する方法を提供する。好ましくは、この投与は、皮内又は皮下に実施する。
【００８９】
さらに別の実施形態では、本発明の医薬製剤又は組成物の使用方法は、場合に応じて、養子免疫療法と組み合わせて実施してもよい。抗原提示細胞（ＡＰＣ）は、当業者には公知のＡＰＣ、例えば、限定するものではないが、マクロファージ、樹状細胞、Ｂリンパ球及びその組合せなどから選択することができ、好ましくは樹状細胞である。ＡＰＣは、有効量の特異的複合体又は希釈複合体を用いて感作することができる。ｈｓｐ−ペプチド感作又はα２Ｍ−ペプチド感作ＡＰＣは、ｈｓｐ−ペプチド複合体の投与と同時に、又はその投与前若しくは後に投与することができる。特異的複合体は、ＡＰＣを感作するのに用いるｈｓｐ−ペプチド又はα２Ｍ−ペプチド複合体と同じでもよいし、異なるものでもよい。ＡＰＣと本発明の組成物を同時に投与する特定の実施形態では、ＡＰＣ及び本発明の組成物は、同じ組成物（ＡＰＣ、特異的複合体、及び非特異的複合体；又はＡＰＣ及び希釈複合体を含む）又は異なる組成物のいずれに存在してもよい。本発明の養子免疫療法では、ｈｓｐ−ペプチド又はα２Ｍ−ペプチド複合体と一緒にインキュベートすることにより、免疫抗原提示細胞を活性化することができる。好ましくは、ｉｎ ｖｉｖｏで細胞を使用する前に、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの腫瘍又は感染性因子に対する反応性の測定を実施しておく。このｉｎ ｖｉｔｒｏでの追加免疫（ｂｏｏｓｔ）後のクローン選択及び／又は増加、並びに、患者投与は、有用な治療／予防手法となる。
【００９０】
好ましい実施形態では、特異的抗原が癌抗原の抗原性を提示する本発明の組成物の特異的複合体は、これらが投与される個体の自己由来のものである。すなわち、特異的複合体は、個体の細胞から単離され、これらの細胞は、感染性疾患因子に感染しているか、又は、前癌、癌（転移を含む）細胞である（例えば、特異的複合体は、患者の感染組織又は腫瘍生検から調製する）。また希釈体も、個体の自己由来のものであり、例えば、個体の正常細胞から調製又は単離することができる。別の実施形態では、特異的複合体は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで形成する（例えば、外因性抗原分子との複合体を所望する場合）。同様に、ｈｓｐ−ペプチド複合体又はα２Ｍ−ペプチド複合体を含む又はそれからなる希釈体は、例えば、該個体又は他者に本来由来するクローン化ｈｓｐ又はα２Ｍを用いて、組換え生産方法により作製することができる。癌の予防又は治療に関する特定の実施形態では、特異的複合体及び希釈体の両者におけるｈｓｐ及び／又はα２Ｍは、それらを投与する患者の自己由来のものである（患者に由来する）。ｈｓｐ、α２Ｍ及び／又は抗原分子は、天然の供与源から精製する、化学的に合成する、又は組換え手法により生産することができる。
【００９１】
特異的複合体の生成のため、ｈｓｐ又はα２Ｍと複合体化させるのに用いる外因性抗原及びその断片及び誘導体は、当業者には公知のもの、並びに、当業者には公知の標準的免疫検定、例えば、抗体若しくはＭＨＣ分子（抗原性）と結合する、又は免疫応答（免疫原性）を誘発する能力により、容易に理解されるものから選択することができる。ｈｓｐ又はα２Ｍ及び抗原分子の特異的複合体は、患者の癌（腫瘍細胞又は転移細胞を含む）若しくは前癌組織、又は癌細胞系から単離するか、あるいは、ｉｎ ｖｉｔｒｏで生成することができる（抗原分子として外因性抗原を用いる実施形態において必要となる）。α２Ｍを含む複合体を細胞又は細胞系から精製する場合、細胞又は細胞系は、組換え手法により、α２Ｍを発現するのが好ましい。
【００９２】
様々な実施形態において、本発明は、宿主個体の免疫能を増強し、感染性因子に対する特異的免疫、又は前新生物及び新生物細胞に対する特異的免疫を誘発する組成物の組合せを提供する。本発明の治療法及び医薬組成物について以下に説明する。これらの組成物は、感染性疾患の発病及び進行を予防し、腫瘍細胞の発生を予防し、腫瘍細胞の増殖及び進行を阻害する能力を有することから、このような組成物が、感染性疾患の因子及び腫瘍細胞に対する特異的免疫を誘導できることがわかる。
【００９３】
従って、本発明は、希釈複合体を含む組成物を投与するステップを含む、個体における癌の予防及び治療方法を提供し、上記希釈複合体は、ｈｓｐ又はα２Ｍとペプチドの特異的複合体と、ｈｓｐ、α２Ｍ、又はｈｓｐ若しくはα２Ｍ−ペプチド複合体を含む希釈体とを含み、任意により特異的複合体で感作したＡＰＣと組み合わせてもよい。希釈複合体を単独又は感作ＡＰＣと組み合わせて投与することにより、宿主個体の免疫能を刺激し、前新生物及び／又は新生物細胞に対する特異的免疫を誘発する。本明細書で用いる「前新生物」細胞とは、正常から新生物形態への遷移状態にある細胞を意味するが、分子生物学研究によりますます支持されている形態学的証拠から、前新生物は多数の段階を経て進行することがわかっている。非新生物細胞増殖は、一般に、過形成（ｈｙｐｅｒｐｌａｓｉａ）、化生（ｍｅｔａｐｌａｓｉａ）、あるいは極めて著しくは異形成（ｄｙｓｐｌａｓｉａ）からなる（このような異常増殖条件については、Ｒｏｂｂｉｎｓ及びＡｎｇｅｌｌ， １９７６， Ｂａｓｉｃ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ， 第２版、Ｗ．Ｂ． Ｓａｕｎｄｅｒｓ Ｃｏ．， Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ， ｐｐ． ６８−７９）。過形成は、構造又は機能に著しい改変を起こすことなく、組織又は器官の細胞数が増加する、制御された細胞増殖の形態である。一例に過ぎないが、子宮内膜過形成は、子宮内膜癌に先行して起こる。化生は、成体又は完全に分化した１細胞型が別の成体細胞型に代わる、制御された細胞増殖の形態である。化生は、上皮又は結合組織細胞に起こることがある。異型の化生により、いくらか無秩序の化生上皮が起こる。異形成は、癌の前兆であることが多く、主に上皮にみられる。これは、非新生物細胞増殖の最も無秩序の形態であり、個体細胞均質性及び細胞の構築配向の喪失を引き起こす。異形成細胞は、往々にして異常に大きな、濃く染色される核を有し、多態性を呈示する。異形成は、典型的に、慢性過敏又は炎症が存在する箇所に発生し、子宮頚部、呼吸管、口腔及び膀胱によくみられる。前新生物病変は新生物に進行する可能性があるが、これらは、長期間安定した状態を維持し、特に、刺激因子が除去される、又は病変がその宿主による免疫攻撃に圧倒されると、退行することさえある。本発明の組成物で治療することができる癌としては、限定するものではないが、ヒト肉腫及び癌腫が挙げられる。ヒト肉腫及び癌腫は、ｈｓｐ複合体感作ＡＰＣによる養子免疫療法にも応答する。
【００９４】
本発明の治療法、及び希釈複合体を含む医薬組成物は、別の免疫応答増強剤又は生物応答修飾物質と一緒に用いてもよく、その例として、限定するものではないが、サイトカインＩＦＮ−α、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＴＮＦ、又は免疫細胞に作用する他のサイトカインが挙げられる。本発明のこの態様によれば、本発明の組成物は、１以上の上記サイトカインによる治療と組み合わせて投与する。別の実施形態では、本発明の組成物は、癌治療のための放射線療法又は１以上の化学療法剤と一緒に投与する。
【００９５】
癌治療のほかにも、本発明の組成物を用いて、例えば、家族歴により癌の素因を有する個体、又は環境要因のために癌に罹患するリスクが高い個体において、多様な癌を予防することもできる。
【００９６】
４．１．癌又は感染性疾患に対する免疫応答を誘発し、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＡＰＣを感作するための精製ｈｓｐ−ペプチド複合体又は２αＭ−ペプチド複合体を含む治療用組成物
希釈複合体を含む組成物を投与することにより、特異的複合体における複合体化した抗原分子（希釈体中のｈｓｐ、α２Ｍ又は分子ではない）に対する有効な特異的免疫応答が誘発される。本明細書に記載した方法に従い、本発明の組成物に用いる各特異的複合体は、合計タンパク質（ｍｇ）の６０〜１００％、又は合計タンパク質（ｍｇ）の少なくとも７０％、８０％若しくは９０％の範囲で精製する。別の実施形態では、各特異的複合体を、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）によりアッセイした場合の見かけ均質性まで精製する。
【００９７】
好ましい実施形態では、癌患者から採取した腫瘍細胞から、ｈｓｐ７０、ｈｓｐ９０、ｇｐ９６、カルレティキュリン、ｈｓｐ１１０、又はｇｒｐ１７０とペプチドとの非共有結合複合体を手術後に調製及び精製して、本発明の組成物における特異的複合体として用いる。
【００９８】
本明細書に記載の方法に従い、ｈｓｐ又はＭＨＣ抗原と内在的に複合化させた免疫原又は抗原ペプチドを特異的抗原分子として用いることができる。例えば、様々な腫瘍抗原（例えば、チロシナーゼ、ｇｐ１００、メラン−Ａ、ｇｐ７５、ムチンなど）、並びに、限定するものではないが、免疫不全ウイルスＩ型（ＨＩＶ−Ｉ）、ヒト免疫不全ウイルスＩＩ型（ＨＩＶ−ＩＩ）、Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、インフルエンザウイルス、水痘ウイルス、単純ヘルペスウイルスＩ型（ＨＳＶ−Ｉ）、単純ヘルペスウイルスＩＩ型（ＨＳＶ−ＩＩ）、ウシ疫ウイルス、ライノウイルス、エコーウイルス、ロタウイルス、ＲＳウイルス、パピローマウイルス、パポバウイルス、サイトメガロウイルス、エキノウイルス（ｅｃｈｉｎｏｖｉｒｕｓ）、アルボウイルス、ハンタウイルス（ｈｕｎｔａｖｉｒｕｓ）、コクサッキーウイルス、流行性耳下腺ウイルス、麻疹ウイルス、風疹ウイルス及びポリオウイルスなどのウイルスタンパク質に対する細胞傷害性Ｔ細胞応答を刺激するようなペプチドを調製することができる。抗原ペプチドは、ｉｎ ｖｉｖｏでｈｓｐ又はα２Ｍと自然に複合体化させてもよいし、細胞から単離した複合体でもよく、あるいは、ｈｓｐ／α２Ｍ及び抗原分子の各々の精製された調製物からｉｎ ｖｉｔｒｏで生産することもできる。
【００９９】
別の特定の実施形態では、癌の抗原（例えば、腫瘍）又は感染性因子（例えば、ウイルス抗原、細菌抗原など）は、天然の供与源からの精製により、化学的合成により、あるいは、組換え手法により取得した後、以下に説明するｉｎ ｖｉｔｒｏ手順により、ｈｓｐ又はα２Ｍと複合体化させることができる。
【０１００】
用いる特異的複合体が細胞内にｉｎ ｖｉｖｏで生産される複合体である実施形態では、以下の第４．２．１節〜第４．２．５節に記載するような精製手順例を用いることができる。これ以外に、ｉｎ ｖｉｔｒｏでｈｓｐと複合体化させることにより抗原分子を用いようとする実施形態では、ｈｓｐは、このような用途のために、ＡＴＰ又は低ｐＨの存在下で内在性ｈｓｐ−ペプチド複合体から精製する（あるいは、化学的に合成する、又は組換え手法により生産する）ことができる。抗原分子をｉｎ ｖｉｔｒｏでα２Ｍと複合体化させる実施形態では、α２Ｍを組換え手法により発現させた後、以下の第４．２．６節に記載する方法に従い抗原分子と共有又は非共有的に複合体化させることができる。本明細書に記載するプロトコールを用いて、あらゆる真核細胞、例えば、組織、単離した細胞、予め選択した細胞内病原体に感染した不死化真核細胞系、腫瘍細胞又は腫瘍細胞系から特異的複合体及び希釈体を単離することができる。
【０１０１】
４．２．熱ショックタンパク質
本発明の実施に有用な熱ショックタンパク質は、本明細書中ではストレスタンパク質とも称し、以下の基準を満たすあらゆる細胞タンパク質の中から選択することができる。またこれは、細胞がストレス刺激に晒された際にその細胞内濃度が増大するタンパク質であり、他のタンパク質又はペプチドと結合可能であり、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）の存在下又は低ｐＨにおいて結合タンパク質又はペプチドを放出することができ、さらに上記の性質のいずれかを有する任意の細胞タンパク質と少なくとも３５％の相同性を示すものである。
【０１０２】
最初のストレスタンパク質は、熱ショックタンパク質（ｈｓｐ）として同定されたものである。その名が意味するように、ｈｓｐは熱ショックに応答して細胞により合成される。現在までに、ｈｓｐにはファミリーメンバーの分子量に基づいて５つの主要なクラスがある。これらのクラスは、ｓｈｓｐ（小さい熱ショックタンパク質）、ｈｓｐ６０、ｈｓｐ７０、ｈｓｐ９０、及びｈｓｐ１００と呼ばれ、この数値は、そのｈｓｐのおおよその分子量（キロダルトン）を反映している。主要なｈｓｐファミリーの他、小胞体に内在するタンパク質であるカルレティキュリンもまた、抗原分子と複合体化させた場合に免疫応答を誘発するのに有用な別の熱ショックタンパク質として同定されている（Ｂａｓｕ及びＳｒｉｖａｓｔａｖａ， １９９９， Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １８９：７９７−２０２）。上記ファミリーの多くのメンバーは、他のストレス刺激、例えば、栄養欠乏、代謝破壊、酸素ラジカル、及び細胞内病原体による感染などに応答して誘導されることが見出されている（Ｗｅｌｃｈ， Ｍａｙ １９９３， Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｍｅｒｉｃａｎ ５６−６４； Ｙｏｕｎｇ， １９９０， Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ８：４０１−４２０； Ｃｒａｉｇ， １９９３， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６０：１９０２−１９０３； Ｇｅｔｈｉｎｇら， １９９２， Ｎａｔｕｒｅ ３５５：３３−４５； 及びＬｉｎｄｑｕｉｓｔら， １９８８， Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ２２：６３１−６７７を参照のこと。この開示内容は参照により本明細書に組み入れられる）。これら３つのファミリーに属するｈｓｐ／ストレスタンパク質は、本発明の実施に用いることができると考えられる。
【０１０３】
主要なｈｓｐは、ストレスをうけた細胞中に非常に高レベルで蓄積するが、これらはストレスをうけていない細胞においては低〜中程度のレベルで存在する。例えば、誘導性の高い哺乳動物ｈｓｐ７０は、通常の温度ではほとんど検出されないが、熱ショックをうけた細胞においては最も活発に合成されるタンパク質となる（Ｗｅｌｃｈら， １９８５， Ｊ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． １０１：１１９８−１２１１）。対照的に、ｈｓｐ９０及びｈｓｐ６０タンパク質は、通常の温度で全てではないが大部分の哺乳動物細胞中に多量に存在し、熱によりさらに誘導される（Ｌａｉら， １９８４， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． ４：２８０２−１０；ｖａｎ Ｂｅｒｇｅｎ ｅｎ Ｈｅｎｅｇｏｕｗｅｎら， １９８７， Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ． １：５２５−３１）。
【０１０４】
熱ショックタンパク質は現存するタンパク質のうちで最も高度に保存されたタンパク質に入る。例えば、大腸菌由来のｈｓｐ７０であるＤＮＡＫは、擦過傷（ｅｘｃｏｒｉａｔｅ）からのｈｓｐ７０タンパク質に対して約５０％のアミノ酸配列同一性を有する（Ｂａｒｄｗｅｌｌら， １９８４， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ８１：８４８−８５２）。ｈｓｐ６０及びｈｓｐ９０ファミリーも同様に高いレベルのファミリー内保存性を示す（Ｈｉｃｋｅｙら， １９８９， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． ９：２６１５−２６２６； Ｊｉｎｄａｌ， １９８９， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． ９：２２７９−２２８３）。さらに、ｈｓｐ６０、ｈｓｐ７０及びｈｓｐ９０ファミリーは、配列の点では例えば３５％を超えるアミノ酸同一性を有し、ストレスタンパク質に関係しているが、その発現レベルがストレスによって変化しないタンパク質を含むことが発見されている。従って、本明細書中で使用する熱ショックタンパク質又はストレスタンパク質の定義は、ストレス刺激に応答して細胞内での発現レベルが増大する上記３つのファミリーのメンバーと少なくとも３５％〜５５％、好ましくは５５％〜７５％、最も好ましくは７５％〜８５％のアミノ酸同一性を有する他のタンパク質、その変異型タンパク質、類似体及び変異体も含まれるものとする。典型的なｈｓｐタンパク質の精製は、組換え手法によるｈｓｐの生成として後述する。
【０１０５】
４．２．１．ｈｓｐ７０−ペプチド複合体の調製及び精製
ｈｓｐ７０−ペプチド複合体の精製は、以前に記載されており、例えば、Ｕｄｏｎｏら、１９９３， Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １７８：１３９１−１３９６を参照されたい。使用できる手順を以下に記載するが、これは例として示すに過ぎず、本発明を何ら制限するものではない：
最初に、３０ｍＭ炭酸水素ナトリウム（ｐＨ７．５）と１ｍＭフェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）とからなる、３容量の１×溶解バッファーに腫瘍細胞を懸濁させる。次に、ペレットを氷上で音波処理することにより、９９％以上の細胞を溶解させるが、これは顕微鏡検定により決定される。音波処理に代わり、細胞を機械的せん断により溶解させてもよく、この手法では、細胞は、典型的に３０ｍＭ炭酸水素ナトリウム（ｐＨ７．５）と１ｍＭ  ＰＭＳＦ中に再懸濁させ、氷上で２０分インキュベートした後、９５％以上の細胞が溶解するまで、ダウンス型（Ｄｏｕｎｃｅ）ホモジナイザーで均質化する。
【０１０６】
次に、溶解物を１，０００ｇで１０分遠心することにより、破壊されていない細胞、核及びその他の細胞屑を除去する。得られた上清を１００，０００ｇで９０分遠心した後、上清を回収してから、２ｍＭ  Ｃａ２＋及び２ｍＭ  Ｍｇ２＋を含むリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で平衡化させたＣｏｎＡセファロースと混合する。機械的せん断により細胞を溶解させる場合には、、上清を等量の２×溶解バッファーで希釈した後、ＣｏｎＡセファロースと混合する。次に、上清をＣｏｎＡセファロースと４℃で２〜３時間結合させる。結合しなかった物質を回収し、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ａｃｅｔａｔｅ（ｐＨ７．５）、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＰＭＳＦに対して３６時間透析する（１００容量ずつ３回）。次に、透析物を１７，０００ｒｐｍ（Ｓｏｒｖａｌｌ ＳＳ３４ローター）で２０分遠心する。得られた上清を回収し、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ａｃｅｔａｔｅ（ｐＨ７．５）、２０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ及び１５ｍＭ  ２−メルカプトエタノール中で平衡化させたＭｏｎｏＱ ＦＰＬＣカラムにアプライする。このカラムを２０ｍＭから５００ｍＭのＮａＣｌ勾配で展開させた後、溶離した分画をドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により分離してから、適当な抗ｈｓｐ７０抗体（Ｓｔｒｅｓｓｇｅｎ製のクローンＮ２７Ｆ３−４由来のものなど）を用いたイムノブロッティングにより特性決定する。
【０１０７】
抗ｈｓｐ７０抗体と強い免疫反応性を示す分画をプールし、ｈｓｐ７０−ペプチド複合体を硫酸アンモニウム、具体的には、５０％〜７０％の硫酸アンモニウムカットで沈殿させる。得られた沈殿物を１７，０００ｒｐｍ（ＳＳ３４ Ｓｏｒｖａｌｌローター）での遠心分離により回収した後、７０％硫酸アンモニウムで洗浄する。洗浄した沈殿物を溶解させ、残留する硫酸アンモニウムをＳｅｐｈａｄｅｘ（登録商標）Ｇ２５カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）上でのゲルろ過により全て除去する。必要であれば、このようにして得られたｈｓｐ７０調製物を前述のように、ＭｏｎｏＱ ＦＰＬＣカラムを用いて再精製することもできる。
【０１０８】
この方法を用いて、ｈｓｐ７０−ペプチド複合体を見かけ均質性まで精製することができる。典型的には、１ｇの細胞／組織から、１ｍｇのｈｓｐ７０−ペプチド複合体を精製することができる。
【０１０９】
ｈｓｐ７０−ペプチド複合体を精製するための改良法は、細胞タンパク質を、固相基質に固定したＡＤＰ又はＡＴＰの非加水分解性類似体と接触させることにより、溶解物中のｈｓｐ７０を、ＡＤＰ又は非加水分解性ＡＴＰ類似体と結合させた後、結合ｈｓｐ７０を溶離することを含む。好ましい方法では、固相基質に固定したＡＤＰ（例えば、ＡＤＰ−アガロース）を用いたカラムクロマトグラフィーを用いる。得られたｈｓｐ７０調製物は、これまでより純度が高く、混入ペプチドを全く含まない。ｈｓｐ７０の収率も約１０倍以上有意に高まる。これ以外に、ＡＤＰに代わり、ＡＴＰの非加水分解性類似体を用いるクロマトグラフィーを用いて、ｈｓｐ７０−ペプチド複合体を精製することもできる。例として、限定するものではないが、ＡＤＰ−アガロースクロマトグラフィーによるｈｓｐ７０−ペプチド複合体の精製は、次のように実施することができる：
ＭｅｔｈＡ肉腫細胞（５億個の細胞）を低張性バッファー中で均質化させ、溶解物を４℃にて１００，０００ｇで９０分遠心する。上清をＡＤＰ−アガロースカラムにアプライする。カラムをバッファー中で洗浄し、５カラム容量の３ｍＭ  ＡＤＰで溶離する。ｈｓｐ７０−ペプチド複合体は、溶離する合計１５分画のうち２〜１０分画に溶離する。溶離した分画をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析する。この手順を用いて、ｈｓｐ７０−ペプチド複合体を見かけ均質性まで精製することができる。
【０１１０】
４．２．２．ｈｓｐ９０−ペプチド複合体の調製及び精製
用いることができる手順を以下に記載するが、これは例として示すに過ぎず、本発明を制限するものではない：
最初に、３０ｍＭ炭酸水素ナトリウム（ｐＨ７．５）と１ｍＭフェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）とからなる、３容量の１×溶解バッファーに腫瘍細胞を懸濁させる。次に、このペレットを氷上で音波処理することにより、９９％以上の細胞を溶解させるが、これは顕微鏡検定により決定される。音波処理に代わり、細胞を機械的せん断により溶解させてもよく、この手法では、細胞は、典型的に３０ｍＭ炭酸水素ナトリウム（ｐＨ７．５）と１ｍＭ  ＰＭＳＦ中に再懸濁させ、氷上で２０分インキュベートした後、９５％以上の細胞が溶解するまで、ダウンス型（Ｄｏｕｎｃｅ）ホモジナイザーで均質化させる。
【０１１１】
次に、溶解物を１，０００ｇで１０分遠心することにより、破壊されていない細胞、核及びその他の細胞屑を除去する。得られた上清を１００，０００ｇで９０分再度遠心した後、上清を回収してから、２ｍＭ  Ｃａ２＋及び２ｍＭ  Ｍｇ２＋を含むＰＢＳで平衡化させたＣｏｎＡセファロースと混合する。機械的せん断により細胞を溶解させる場合には、上清を等量の２Ｘ溶解バッファーで希釈した後、ＣｏｎＡセファロースと混合する。次に、上清をＣｏｎＡセファロースと４℃で２〜３時間結合させる。結合しなかった物質を回収し、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ａｃｅｔａｔｅ（ｐＨ７．５）、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＰＭＳＦに対して３６時間透析する（１００容量ずつ３回）。次に、透析物を１７，０００ｒｐｍ（Ｓｏｒｖａｌｌ ＳＳ３４ローター）で２０分遠心する。得られた上清を回収し、溶解バッファーで平衡化させたＭｏｎｏＱ ＦＰＬＣカラムにアプライする。次に、２００ｍＭから５００ｍＭのＮａＣｌの塩勾配で、タンパク質を溶離する。
【０１１２】
溶離した分画をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分別した後、３Ｇ３（Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｂｉｏｒｅａｇｅｎｔｓ）などの抗ｈｓｐ９０抗体を用いて、イムノブロッティングすることにより、ｈｓｐ９０−ペプチド複合体を含む分画を同定する。この手順を用いて、ｈｓｐ９０−ペプチド複合体を見かけ均質性まで精製することができる。典型的には、１ｇの細胞／組織から、１５０〜２００μｇのｈｓｐ９０−ペプチド複合体を精製することができる。
【０１１３】
４．２．３．ｇｐ９６−ペプチド複合体の調製及び精製
用いることができる手順を以下に記載するが、これは例として示すに過ぎず、本発明を何ら制限するものではない：
３０ｍＭ炭酸水素ナトリウムバッファー（ｐＨ７．５）と１ｍＭ  ＰＭＳＦとからなる、３容量のバッファーに腫瘍のペレットを再懸濁させ、細胞を氷上で２０分膨潤させる。次に、９５％以上の細胞が溶解するまで、細胞ペレットをダウンス型（Ｄｏｕｎｃｅ）ホモジナイザー（ホモジナイザーの適切なクリアランスは、各細胞型に応じて変動する）で均質化させる。
【０１１４】
溶解物を１，０００ｇで１０分遠心することにより、破壊されていない細胞、核及びその他の細胞屑を除去する。次に、この遠心分離ステップで得られた上清を１００，０００ｇで９０分再遠心する。１００，０００ペレット又は上清のいずれかから、ｇｐ９６−ペプチド複合体を精製することができる。
【０１１５】
上清から精製したら、この上清を等量の２×溶解バッファーで希釈した後、２ｍＭ  Ｃａ２＋及び２ｍＭ  Ｍｇ２＋を含むＰＢＳで平衡化させたＣｏｎＡセファロースと４℃で２〜３時間混合する。次に、このスラリーをカラムにパッキングした後、ＯＤ２８０がベースラインに下降するまで、１×溶解バッファーで洗浄する。次に、２ｍＭ  Ｃａ２＋及び２ｍＭ  Ｍｇ２＋を含むＰＢＳ中に溶解させた１／３カラム床容量の１０％α−メチルマンノシド（α−ＭＭ）でカラムを洗浄した後、カラムをパラフィン片で密封してから、３７℃で１５分インキュベートする。次に、カラムを室温まで冷却し、カラム底部からパラフィンを除去する。５カラム容量のα−ＭＭバッファーをカラムに導入し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより溶離液を分析する。典型的には、得られる物質は約６０〜９５％純粋であるが、これは、用いた細胞型及び組織対溶解バッファー比によって異なる。次に、５ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７）を含むバッファーで平衡化させたＭｏｎｏＱ ＦＰＬＣカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）にサンプルをアプライする。０〜１ＭのＮａＣｌ勾配を用いてカラムからタンパク質を溶離させると、ｇｐ９６分画が、４００ｍＭ〜５５０ｍＭ  ＮａＣｌの間で溶離する。
【０１１６】
しかし、この手順は、２つの別のステップ（単独又は組み合わせて用いることができる）によって改変することにより、見かけ上均質なｇｐ９６−ペプチド複合体を一貫して生成することも可能である。１つの任意ステップは、ＣｏｎＡ精製ステップの前に硫酸アンモニウム沈殿を行なうものであり、もう一つの任意ステップは、ＣｏｎＡ精製ステップ後で、しかもＭｏｎｏＱ ＦＰＬＣステップ前にＤＥＡＥ−セファロース精製を実施するものである。
【０１１７】
第１の任意ステップを以下に例として説明するが、このステップでは、１００，０００ｇ遠心ステップから得られた上清を、硫酸アンモニウムの添加により、最終濃度が５０％硫酸アンモニウムとなるようにする。硫酸アンモニウムは、氷水のトレイ内に配置したビーカー中の溶液を穏やかに攪拌しながら、ゆっくりと添加する。この溶液を４℃で０．５〜１２時間攪拌し、得られた溶液を６，０００ｒｐｍで遠心分離する（Ｓｏｒｖａｌｌ ＳＳ３４ローター）。このステップから得られた上清を取り出し、硫酸アンモニウム溶液の添加により、７０％硫酸アンモニウム飽和に到らせた後、６，０００ｒｐｍで遠心する（Ｓｏｒｖａｌｌ ＳＳ３４ローター）。このステップから得られたペレットを回収し、７０％硫酸アンモニウムを含むＰＢＳ中に懸濁させることにより、ペレットをすすぐ。この混合物を６，０００ｒｐｍで遠心（Ｓｏｒｖａｌｌ ＳＳ３４ローター）した後、２ｍＭ  Ｃａ２＋及びＭｇ２＋を含むＰＢＳ中にペレットを溶解させる。非溶解物質を１５，０００ｒｐｍでの短い遠心（Ｓｏｒｖａｌｌ ＳＳ３４ローター）により除去する。次に、溶液をＣｏｎＡセファロースと混合した後、前記と同様の手順を実施する。
【０１１８】
第２の任意ステップを以下に例として説明するが、このステップでは、ＣｏｎＡカラムから溶離した分画を含むｇｐ９６をプールした後、透析により、又は好ましくはＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ２５カラム上でのバッファー交換により、バッファーを５ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７）、３００ｍＭ  ＮａＣｌと交換する。バッファー交換後、予め５ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７）、３００ｍＭ  ＮａＣｌで平衡化させておいたＤＥＡＥ−セファロースと溶液を混合する。タンパク質溶液とビーズを１時間穏やかに混合し、カラムに注ぎ込む。次に、２８０ｎｍでの吸光度がベースラインに降下するまで、カラムを５ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７）、３００ｍＭ  ＮａＣｌで洗浄する。次に、５容量の５ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７）、７００ｍＭ  ＮａＣｌを含むカラムから、結合したタンパク質を溶離する。タンパク質を含む分画をプールし、５ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７）で希釈することにより、塩濃度を１７５ｍＭまで低下させる。５ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７）で平衡化させたＭｏｎｏＱ ＦＰＬＣカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に、得られた物質を導入し、ＭｏｎｏＱ ＦＰＬＣカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）と結合したタンパク質を前記と同様に溶離する。
【０１１９】
しかし、当業者であれば、通常の実験により、第２の任意ステップを精製プロトコールに組み込む利点の評価を理解できる。さらに、任意ステップの各々を加える利点が、出発材料の供与源によって異なることも理解できる。
【０１２０】
ｇｐ９６分画を１００，０００ｇペレットから単離する場合、このペレットを１％デオキシコール酸ナトリウム又は１％オクスチル（ｏｘｔｙｌ）グルコピラノシドのいずれかを含む５容量のＰＢＳ（ただし、Ｍｇ２＋及びＣａ２＋は含まない）中に懸濁させ、氷上で１時間インキュベートする。懸濁液を２０，０００ｇで３０分遠心し、得られた上清をＰＢＳのいくつかの変種（同様に、Ｍｇ２＋及びＣａ２＋を含まない）に対して透析することにより、界面活性剤を除去する。透析物を１００，０００ｇで９０分遠心し、上清を回収した後、カルシウム及びマグネシウムを上清に添加することにより、それぞれ、最終濃度を２ｍＭとする。次に、非改変又は改変した方法のいずれかでサンプルを精製することにより、ｇｐ９６−ペプチド複合体を１００，０００ｇ上清から単離する（前記参照）。
【０１２１】
以上の手順を用いて、ｇｐ９６−ペプチド複合体を見かけ均質性まで精製することができる。約１０〜２０μｇのｇｐ９６を１ｇ細胞／組織から単離することができる。
【０１２２】
４．２．４．ｈｓｐ１１０−ペプチド複合体の調製及び精製
用いることができる手順（Ｗａｎｇらにより、２００１， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １６６（１）：４９０−７に記載）を以下に記載するが、これは例として示すに過ぎず、本発明を何ら制限するものではない：
ダウンス型（Ｄｏｕｎｃｅ）ホモジネートにより、５容量の低張バッファー（３０ｍＮ炭酸水素ナトリウム（ｐＨ７．２）とプロテアーゼ阻害剤）中で細胞又は組織、例えば、腫瘍細胞組織のペレット（４０〜６０ｍｌ）を均質化させる。溶解物を４，５００×ｇ、次に１００，０００×ｇで２時間遠心する。細胞又は組織が、肝臓由来のものである場合には、得られた上清をまず青色セファロースカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に導入して、アルブミンを除去する。それ以外の場合には、結合バッファー（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５；１００ｍＭ  ＮａＣｌ；１ｍＭ  ＭｇＣｌ２；１ｍＭ  ＣａＣｌ２；１ｍＭ  ＭｎＣｌ２；及び１５ｍＭ  ２−ＭＥ）で予め平衡化させたＣｏｎＡ−セファロースカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ、ニュージャージー州ピスカタウェイ）に、得られた上清を導入する。１５％α−Ｄ−ｏ−メチルマンノシドを含む結合バッファー（Ｓｉｇｍａ、ミズーリ州セントルイス）を用いて、結合したタンパク質を溶離する。
【０１２３】
ＣｏｎＡ−セファロース非結合物質を、まず、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５；１００ｍＭ  ＮａＣｌ；及び１５ｍＭ  ２−ＭＥの溶液に対して透析した後、ＤＥＡＥ−セファロースカラムに導入し、１００〜５００ｍＭのＮａＣｌの塩勾配により、溶離する。ｈｓｐ１１０を含む分画を回収、透析した後、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５；２００ｍＭ  ＮａＣｌ；及び１５ｍＭ  ２−ＭＥで平衡化させたＭｏｎｏＱ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）１０／１０カラムに導入する。結合したタンパク質は、２００〜５００ｍＭのＮａＣｌ勾配で溶出する。分画をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した後、Ｗａｎｇら、１９９９， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １６２：３３７８に記載されているように、ｈｓｐ１１０の抗体（Ａｂ）を用いたイムノブロッティングを実施する。ｈｓｐ１１０を含む分画をプールし、これをＣｅｎｔｒｉｐｌｕｓ（Ａｍｉｃｏｎ、マサチューセッツ州ビバリー）により濃縮した後、Ｓｐｅｒｏｓｅ １２カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に導入する。４０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０；１５０ｍＭ  ＮａＣｌ；及び１５ｍＭ  ２−ＭＥにより、０．２ｍｌ／分の流速でタンパク質を溶離する。
【０１２４】
４．２．５．ｇｒｐ１７０−ペプチド複合体の調製及び精製
用いることができる手順（Ｗａｎｇらにより、２００１， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １６６（１）：４９０−７に記載）を以下に記載するが、これは例として示すに過ぎず、本発明を何ら制限するものではない：
ダウンス型（Ｄｏｕｎｃｅ）ホモジネートにより、５容量の低張バッファー（３０ｍＮ炭酸水素ナトリウム（ｐＨ７．２）とプロテアーゼ阻害剤）中で細胞又は組織、例えば、腫瘍細胞組織のペレット（４０〜６０ｍｌ）を均質化させる。溶解物を４，５００×ｇ、次に１００，０００×ｇで２時間遠心する。細胞又は組織が、肝臓由来のものである場合には、得られる上清をまず青色セファロースカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に導入して、アルブミンを除去する。それ以外の場合には、結合バッファー（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５；１００ｍＭ  ＮａＣｌ；１ｍＭ  ＭｇＣｌ２；１ｍＭ  ＣａＣｌ２；１ｍＭ  ＭｎＣｌ２；及び１５ｍＭ  ２−ＭＥ）で予め平衡化させたＣｏｎＡ−セファロースカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ、ニュージャージー州ピスカタウェイ）に、得られた上清を導入する。１５％α−Ｄ−Ｏ−メチルマンノシドを含む結合バッファー（Ｓｉｇｍａ、ミズーリ州セントルイス）を用いて、結合したタンパク質を溶離する。
【０１２５】
ＣｏｎＡ−セファロース結合物質を、まず、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）及び１５０ｍＭ  ＮａＣｌに対して透析した後、ＭｏｎｏＱ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）カラムに導入し、１５０〜４００ｍＭのＮａＣｌ勾配により、溶離する。プールした分画を濃縮した後、Ｓｕｐｅｒｏｓｅ １２カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）にアプライする。均質なｇｒｐ１７０を含む分画を回収する。
【０１２６】
４．２．６．α２Ｍ−抗原分子複合体
以下に、本発明において使用するためのα２Ｍポリペプチド又はα２Ｍポリペプチド−抗原分子複合体を組換え細胞から精製するための方法、及び、当該技術分野において既知の僅かな改変を有する、細胞培養物からのα２Ｍポリペプチド又はα２Ｍ−抗原分子複合体の精製方法を記載する。組換え細胞には、例えば、抗原分子を発現する細胞及びα２Ｍポリペプチドを組換え操作により発現する細胞が含まれる。かかる細胞は、感染性因子に感染した細胞及び癌細胞を含むがこれらに限られない種々の起源に由来するものであってよい。
【０１２７】
本発明は、α２Ｍポリペプチド上に存在するアフィニティーラベルの特性に基づくアフィニティー精製による組換えα２Ｍポリペプチド−抗原分子複合体の精製方法を提供する。１つの手法はタグとその結合パートナーとの間の特異的分子相互作用に基づいている。もう一つの手法は、抗体の、タグ上に存在するエピトープへの免疫特異的結合に依存している。当該技術分野において周知のアフィニティークロマトグラフィーの原理は一般的にこれらの手法の両方に適用可能である。
【０１２８】
α２Ｍポリペプチド−抗原分子複合体を産生するために、α２Ｍポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を細胞内に導入することができる。ある抗原分子が細胞内に存在する場合は、α２Ｍポリペプチドは細胞内で該抗原分子と会合し、α２Ｍポリペプチドと抗原分子との間の共有結合による又は非共有結合による複合体を形成することができる。α２Ｍポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を導入することができる細胞としては、上皮細胞、内皮細胞、ケラチノサイト、線維芽細胞、筋細胞、肝細胞；Ｔリンパ球、Ｂリンパ球、単球、マクロファージ、好中球、好酸球、巨核球、顆粒球等の血液細胞；種々の幹細胞又は前駆細胞、特に、例えば骨髄、臍帯血、末梢血、胎児肝等から得た造血幹細胞又は前駆細胞が挙げられるがこれらには限らない。細胞型の選択は、治療又は予防する腫瘍又は感染性疾患の種類に依存し、当業者により決定され得る。ある特定の実施形態では、α２Ｍポリペプチドをコードする核酸配列を含む発現構築物を抗原性の細胞に導入する。本明細書中で用いる場合、抗原性の細胞には、感染性因子又は病原体に感染した細胞、非感染性の形態又は非病原性の形態の感染性因子又は病原体に（例えばヘルパー感染性因子の使用により）感染した細胞、弱毒化された形態の感染性因子又は病原体の非病原性の変異体若しくは複製ができない変異体に感染した細胞又はそれらを発現するように操作された細胞、癌の原因となる感染性因子（例えばウイルス）に感染しているものの未だ新生物性ではない前新生物性細胞；あるいは、突然変異原若しくは癌原因物質（例えばＤＮＡ損傷性物質、放射線など）に曝された抗原性の細胞が含まれうる。使用できる他の細胞は前新生物性細胞であって、形態、生理学的機能又は生化学的機能によって特性付けられるような正常の形態から新生物性の形態への移行の途上にあるものである。好ましくは本発明の方法に使用する癌細胞及び前新生物性細胞は哺乳動物起源のものである。本発明のこの態様から考えられる哺乳動物には、ヒト、ペット動物（例えばイヌ及びネコ）、家畜動物（例えばヒツジ、ウシ、ヤギ、ブタ及びウマ）、実験動物（例えばマウス、ラット及びウサギ）、及び捕獲した又は自由な野生動物が含まれる。
【０１２９】
種々の実施形態では、任意の癌細胞、好ましくはヒト癌細胞を、α２Ｍポリペプチド−抗原分子複合体を産生するための本発明の方法に使用することができる。癌細胞は、発現されたα２Ｍポリペプチドと共有結合により又は非共有結合により会合する抗原ペプチドを提供する。次に、α２Ｍポリペプチド−抗原分子複合体を該細胞から精製してかかる癌を治療するために使用する。本発明の方法で調製される免疫原性組成物により治療又は予防しうる癌には、肉腫及び癌腫のような腫瘍が含まれるがこれらには限らない。本発明の方法により影響を受ける癌の例を第４．９節に列記する。このように、前新生物性の病変、癌（複数の離れた部位に転移した癌を含む）から単離した任意の組織又は細胞は本発明の方法に使用することができる。例えば、充実性組織のみならず、異常に増殖している組織に見られる細胞、循環する白血病細胞、転移性の病変を使用することができる。
【０１３０】
他の実施形態では、前新生物性病変、癌組織又は癌細胞に由来する細胞系もまた、該細胞系の細胞が標的癌細胞上の抗原と共通する少なくとも１以上の抗原決定基を有している限り、使用することができる。癌組織、癌細胞、癌原因物質に感染した細胞、他の前新生物性細胞、及びヒト起源の細胞系が好ましい。
【０１３１】
癌細胞及び前新生物性細胞は当該技術分野において既知の任意の方法により同定できる。例えば、癌細胞は、形態、酵素アッセイ、増殖アッセイ、細胞質遺伝学的特性決定、ＤＮＡマッピング、ＤＮＡ配列決定、癌原因ウイルスの存在、又は突然変異原若しくは癌原因物質への曝露の履歴、イメージングなどにより同定できる。癌細胞はまた、外科的技術、内視鏡検査技術又は他の生検技術により得ることもできる。癌細胞のある特徴的な特性が知られている場合は、アフィニティークロマトグラフィー及び蛍光活性化細胞選別（例えば、癌細胞が発現する抗体に対する、蛍光により標識した抗体を用いる）のような、しかしながらこれらには限らない、当該技術分野で既知の任意の生化学的方法及び免疫学的方法により癌細胞を得る又は精製することもできる。
【０１３２】
癌組織、癌細胞又は細胞系統は単一の個体から得てもよいし、又は複数の個体からプールしてもよい。クローンの、同種の、又は精製された癌細胞の集団を使用することは必須ではない。また、標的癌細胞上の少なくとも１以上の抗原決定基がα２Ｍポリペプチドを発現するために使用する細胞に存在している限りは、ｉｎ ｖｉｖｏでの最終的な標的の細胞（例えば対象のレシピエントの腫瘍からの細胞）を使用する必要もない。加えて、離れた転移癌に由来する細胞を用いて原発癌に対する免疫原性組成物を調製することもできる。細胞の混合物は、該混合物中の細胞のうちの相当数が癌細胞であり且つ標的癌細胞と少なくとも１つの抗原決定基が共通しているのであれば、使用することができる。ある特定の実施形態では、α２Ｍポリペプチドを発現するのに使用する癌細胞は精製されている。
【０１３３】
４．２．７．感染性疾患の治療又は予防のためのｈｓｐ複合体の調製
別の実施形態において、感染性疾患を有する患者を治療することが望まれる場合には、上記第４．２．１節〜第４．２．５節に記載した方法を用いて、感染性生物に感染した細胞、又は例えば細胞系の若しくは患者由来の感染性因子の抗原の発現構築物でトランスフェクトした細胞から、ｈｓｐ−ペプチド複合体を単離する。第４．２．６節に記載の方法を同様に用いて、感染性因子に感染した細胞又は感染性因子の抗原を発現する細胞からα２Ｍ−ペプチド複合体を単離することもできる。このような感染性生物としては、第４．９．１節に詳述するように、限定するものではないが、ウイルス、細菌、原生動物、真菌及び寄生生物が挙げられる。
【０１３４】
４．３．抗原分子
以下の小節に、本発明の「特異的複合体」の抗原／免疫原成分として有用なペプチドについて概説し、また、そのようなペプチドの同定方法、例えばｈｓｐと抗原分子とのｉｎ ｖｉｔｒｏにおける複合体化のためのペプチドの組換え発現に使用するペプチドの同定について概説する。しかし、本発明の実施において、例えば特異的複合体を癌細胞又は病原体に感染した組織から直接精製する場合には、特異的複合体の抗原分子の正体を知らなくてもよい。
【０１３５】
４．３．１．抗原／免疫原成分の単離
抗原ペプチド及び／又は成分は、ＡＴＰ又は低ｐＨのいずれかの存在下においてｈｓｐ−複合体から溶出可能であることがわかっている。これらの実験条件を使用して、細胞から有用な抗原決定基を含むと考えられるペプチド及び／又は抗原成分を単離することができる。各抗原ペプチドは、単離した後、そのアミノ酸配列を慣例的なアミノ酸配列決定法を用いて決定しうる。続いて、かかる抗原分子は、化学合成法又は組換え手法により生成し、精製し、そしてｉｎ ｖｉｔｒｏにおいてｈｓｐと複合体化させることにより、本発明の特異的複合体を形成することができる。
【０１３６】
同様に、免疫原性を有する可能性のあるペプチドは、当該技術分野で周知の技法を用いてＭＨＣ−ペプチド複合体から溶出することができる（Ｆａｌｋ， Ｋ．ら， １９９０ Ｎａｔｕｒｅ ３４８：２４８−２５１；Ｅｌｌｉｏｔｔ， Ｔ．ら， １９９０， Ｎａｔｕｒｅ ３４８：１９５−１９７；Ｆａｌｋ， Ｋ．ら， １９９１， Ｎａｔｕｒｅ ３５１：２９０−２９６）。
【０１３７】
従って、免疫原性又は抗原性を有する可能性のあるペプチドは、内因性ストレスタンパク質−ペプチド複合体又は内因性ＭＨＣ−ペプチド複合体のいずれかから単離し、その後抗原分子として用いて、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいてｈｓｐと複合体化させることにより、本発明の特異的複合体を形成することができる。上記の複合体のいずれかからペプチド及び／又は抗原成分を単離するプロトコールの例は、第４．３．２節及び第４．３．３節に後述する。
【０１３８】
４．３．２．ストレスタンパク質−ペプチド複合体からのペプチド
ストレスタンパク質−ペプチド複合体からペプチドを溶出させるには、２つの方法を用いることができる。１つの手法は、ストレスタンパク質−ペプチド複合体をＡＴＰの存在下にてインキュベートすることを含む。もう１つの手法は該複合体を低いｐＨのバッファー中でインキュベートすることを含む。
【０１３９】
簡潔に説明すると、対象とする複合体をＣｅｎｔｒｉｃｏｎ１０ ａｓｓｅｍｂｌｙ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）により遠心し、該複合体と弱く会合した低分子量物質を取り出す。高分子量の画分を取り出し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析することができる。一方で、低分子量のものは下記のようにＨＰＬＣにより分析できる。ＡＴＰとインキュベートするプロトコールでは、高分子量画分中のストレスタンパク質−ペプチド複合体を１０ｍＭ ＡＴＰとともに３０分間室温にてインキュベートする。低いｐＨのプロトコールでは、酢酸又はトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）をストレスタンパク質−ペプチド複合体に添加して最終濃度が１０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）になるようにし、そして該混合物を室温にて、又は沸騰水浴中で、又はその間の任意の温度にて１０分間インキュベートする（Ｖａｎ Ｂｌｅｅｋら， １９９０， Ｎａｔｕｒｅ ３４８：２１３−２１６；及びＬｉら， １９９３， ＥＭＢＯ ＪｏｕＲＮＡｌ １２：３１４３−３１５１参照）。
【０１４０】
得られたサンプルを先に記載したようにＣｅｎｔｒｉｃｏｎ１０ ａｓｓｅｍｂｌｙにより遠心分離する。高分子量画分及び低分子量画分を回収する。残りの高分子量のストレスタンパク質−ペプチド複合体はＡＴＰ又は低ｐＨとともに再度インキュベートして残存するペプチドを取り出すこともできる。
【０１４１】
得られた低分子量画分をプールし、蒸発濃縮し、そして０．１％ＴＦＡ中に溶解する。次に溶解した物質を逆相高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により、例えば０．１％ＴＦＡにより平衡化したＶＹＤＡＣ Ｃ１８逆相カラムを用いて分画する。次に、結合した物質を、約０．８ｍｌ／分の流速にて、０．１％ＴＦＡ中０〜８０％のアセトニトリルの直線的な勾配をかけてカラムを展開することにより溶出させる。ペプチドの溶出はＯＤ２１０によりモニターでき、ペプチドを含む画分を集めることができる。
【０１４２】
４．３．３．ＭＨＣ−ペプチド複合体からのペプチド
免疫原性を有する可能性のあるペプチドのＭＨＣ分子からの単離は当該技術分野において周知であるので、本明細書では詳しくは記載しない（Ｆａｌｋら， １９９０， Ｎａｔｕｒｅ ３４８：２４８−２５１； Ｒｏｔｚｓｃｈｅら， １９９０， Ｎａｔｕｒｅ ３４８：２５２−２５４； Ｅｌｌｉｏｔｔら， １９９０， Ｎａｔｕｒｅ ３４８：１９１−１９７； Ｆａｌｋら， １９９１， Ｎａｔｕｒｅ ３５１：２９０−２９６； Ｄｅｍｏｔｚら， １９８９， Ｎａｔｕｒｅ ３４３：６８２−６８４； Ｒｏｔｚｓｃｈｅら， １９９０， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：２８３−２８７を参照されたい。なおこれらの開示内容は参照により本明細書に組み入れる）。
【０１４３】
簡潔に説明すると、ＭＨＣ−ペプチド複合体は通常のイムノアフィニティーの手順により単離できる。ペプチドは、次に、アセトニトリル中約０．１％ ＴＦＡの存在下にてＭＨＣ−ペプチド複合体をインキュベートすることによりＭＨＣ−ペプチド複合体から溶出させることができる。溶出したペプチドは上記のように逆相ＨＰＬＣにより分画し精製することができる。
【０１４４】
溶出したペプチドのアミノ酸配列は、当該技術分野において周知である手動の又は自動化されたアミノ酸配列決定技術の何れかにより決定することができる。潜在的に保護するペプチドのアミノ酸配列を決定した後、該ペプチドは、通常のペプチド合成又はその他の当該技術分野において周知のプロトコールを用いて所望の量を合成できる。
【０１４５】
上記で単離したペプチドのアミノ酸配列と同じアミノ酸配列を有するペプチドは、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ， １９６３， Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ．， ８５：２１４９に述べられている手順と類似の手順を用いて固相ペプチド合成によって合成することができる。合成の際に、保護された側鎖を有するＮ−α−保護アミノ酸を、そのＣ末端で不溶性のポリマー支持体、例えばポリスチレンビーズに連結された伸長させるポリペプチド鎖に段階的に添加する。ペプチドは、Ｎ−α−脱保護アミノ酸のアミノ基を、Ｎ−α−保護アミノ酸（このアミノ酸はジシクロヘキシルカルボジイミドなどの試薬と反応させることによって活性化させている）のα−カルボキシル基と連結させることによって合成される。活性化カルボキシルに遊離アミノ基が結合することによってペプチド結合が形成される。最も一般的に用いられるＮ−α−保護基としては、酸に対して不安定なＢｏｃ、及び塩基に対して不安定なＦｍｏｃが挙げられる。
【０１４６】
簡単に説明すると、最初にＮ−α−保護アミノ酸のＣ末端をポリスチレンビーズに結合させる。続いてこのＮ−α−保護基を除去する。脱保護されたα−アミノ基を、次の（別の）Ｎ−α−保護アミノ酸の活性化α−カルボキシル基と連結させる。この工程を繰り返し行い、所望のペプチドを合成する。次に得られたペプチドを不溶性のポリマー支持体から切り出し、アミノ酸側鎖を脱保護する。長いペプチドは、複数の保護ペプチド断片を縮合することにより誘導することができる。適切な化学反応、樹脂、保護基、保護アミノ酸、及び試薬についての詳細は当該技術分野で周知であり、本明細書中では詳述しない（Ａｔｈｅｒｔｏｎら， １９８９， Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ， ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ、及びＢｏｄａｎｓｚｋｙ， １９９３， Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｔｅｘｔｂｏｏｋ， 第２版， Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇを参照されたい）。
【０１４７】
得られたペプチドの精製は、慣例的な手順、例えばゲル浸透、分配及び／若しくはイオン交換クロマトグラフィーを用いた分取ＨＰＬＣなどを用いて達成される。適切なマトリックス及びバッファーの選択については当該技術分野で周知であり、本明細書では詳述しない。
【０１４８】
４．３．４．外来性抗原分子
抗原又はその抗原性部分は、ｈｓｐと複合体化するための抗原分子として使用するために、当該技術分野で公知のものから選択してもよいし、あるいは抗体若しくはＭＨＣ分子に結合可能な（抗原性をもつ）又は免疫応答を起こすことができる（免疫原性をもつ）ものをイムノアッセイにより決定してもよい。免疫原性及び抗原性を抗体への結合を検出することにより測定するために、ラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ（酵素免疫測定法）、「サンドイッチ」イムノアッセイ、免疫放射定量アッセイ、ゲル拡散沈降素反応、免疫拡散アッセイ、ｉｎ ｖｉｖｏ イムノアッセイ（例えばコロイド金標識、酵素標識、又はラジオアイソトープ標識を用いる）、ウエスタンブロット、免疫沈降反応、凝集アッセイ（例えばゲル凝集アッセイ、血球凝集アッセイ）、補体結合アッセイ、免疫蛍光アッセイ、プロテインＡアッセイ、免疫電気泳動アッセイ等の技術を用いる競合アッセイ系及び非競合アッセイ系を含むがこれらに限らない当該技術分野において既知の種々のイムノアッセイを使用することができる。一態様では、抗体結合は一次抗体上のラベルを検出することにより検出する。他の態様では、一次抗体を、二次抗体又は一次抗体への試薬の結合を検出することにより検出する。更なる態様では、二次抗体を標識化する。イムノアッセイで結合を検出するための多くの方法が当該技術分野において既知であり、それらを使用することが考えられる。免疫原性を検出するための一実施形態では、Ｔ細胞が介在する応答を標準的な方法により、例えばｉｎ ｖｉｔｒｏでの細胞傷害性アッセイ又はｉｎ ｖｉｖｏでの遅延型過敏反応アッセイにより、アッセイすることができる。
【０１４９】
抗原分子として用いるために有用であると考えられる抗原又はその誘導体は、種々の基準、例えば、（ある病原体による感染の治療又は予防を望む場合には）病原体の感染性の中和における抗原の関与（Ｖａｃｃｉｎｅｓ ８５， Ｌｅｒｎｅｒら（編）， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ｐｐ． ３８８−３８９中のＮｏｒｒｂｙ， １９８５， Ｓｕｍｍａｒｙ）、種類若しくは群の特異性、患者の抗血清若しくは免疫細胞による認識、及び／又は抗原に特異的な抗血清又は免疫細胞による防御効果の証明により同定することができる。加えて、病原体が原因である疾患の治療又は予防を望む場合には、抗原にコードされているエピトープは、好ましくは時間的な、又は同じ病原体の異なる単離株間での抗原性の変動が小さいか又は全くない程度を示すべきである。
【０１５０】
好ましくは、癌の治療又は予防を望む場合は、既知の腫瘍特異的抗原分子又はその断片若しくは誘導体を使用する。例えば、このような腫瘍特異的抗原分子又は腫瘍関連抗原分子には、ＫＳ １／４全癌抗原（ｐａｎｃａｒｃｉｎｏｍａ ａｎｔｉｇｅｎ）（Ｐｅｒｅｚ及びＷａｌｋｅｒ， １９９０， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １４２：３６６２−３６６７； Ｂｕｍａｌ， １９８８， Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ ７（４）：４０７−４１５）； 卵巣癌抗原（ＣＡ１２５）（Ｙｕら， １９９１， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５１（２）： ４６８−４７５）； 前立腺性酸フォスファタ−ゼ（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）（Ｔａｉｌｅｒら， １９９０， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １８（１６）：４９２８）； 前立腺特異的抗原（Ｈｅｎｔｔｕ及びＶｉｈｋｏ， １９８９， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍ． １６０（２）：９０３−９１０； Ｉｓｒａｅｌｉら， １９９３， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５３：２２７−２３０）； 黒色腫−関連抗原ｐ９７（Ｅｓｔｉｎら， １９８９， Ｊ． Ｎａｔｌ． Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ． ８１（６）：４４５−４４６）； 黒色腫抗原ｇｐ７５（Ｖｉｊａｙａｓａｒｄａｈｌら， １９９０， Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １７１（４）：１３７５−１３８０）： 高分子量黒色腫抗原（Ｎａｔａｌｉら， １９８７， Ｃａｎｃｅｒ ５９：５５−６３）及び前立腺特異的膜抗原が含まれるがこれらに限らない。ｈｓｐと複合体化させうる他の外因性抗原としては、癌細胞において高頻度に突然変異を起こす部分又はタンパク質、例えば発癌遺伝子（ｒａｓ、特に４つのアミノ酸残基（１２，１３，５９若しくは６１）においてのみ起こる、活性化する突然変異を有するｒａｓの突然変異体（Ｇｅｄｄｅ−Ｄａｈｌら， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２４（２）：４１０−４１４））、腫瘍抑制遺伝子（例えばｐ５３、これについて細胞傷害性Ｔ細胞応答を刺激しうる種々の突然変異体若しくは多型性ｐ５３ペプチド抗原が同定されている（Ｇｎｊａｔｉｃら， １９９５， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２５（６）：１６３８−１６４２）などが挙げられる。
【０１５１】
ある特定の実施形態では、ある特定の腫瘍に特異的な抗原又はその断片若しくは誘導体を、ｈｓｐと複合体化させて特異的複合体を形成し、続いて希釈体と混合して、該腫瘍を有する患者に投与するために選択する。
【０１５２】
好ましくは、ウイルス性疾患の治療又は予防を望む場合には、既知のウイルスのエピトープを含む分子を使用する。例えばかかる抗原エピトープは、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、インフルエンザ、水痘、アデノウイルス、単純ヘルペスウイルスＩ型（ＨＳＶ−Ｉ）、単純ヘルペスウイルスＩＩ型（ＨＳＶ−ＩＩ）、牛疫、ライノウイルス、エコーウイルス、ロタウイルス、呼吸器合胞体（ＲＳ）ウイルス、パピローマウイルス、パポバウイルス、サイトメガロウイルス、エキノウイルス、アルボウイルス、ハンタウイルス、コクスサッキーウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、麻疹ウイルス、風疹ウイルス、ポリオウイルス、ヒト免疫不全ウイルスＩ型（ＨＩＶ−Ｉ）、及びヒト免疫不全ウイルスＩＩ型（ＨＩＶ−ＩＩ）を含むがこれらに限らないウイルスから調製することができる。好ましくは、細菌感染症の治療又は予防を望む場合には、既知の細菌のエピトープを含む分子を使用する。例えば、かかる抗原エピトープは、マイコバクテリア（ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ）、リケッチア（ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ）、マイコプラズマ（ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）、ナイセリア（ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）及びレジオネラ（ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ）を含むがこれらに限らない細菌から調製することができる。
【０１５３】
好ましくは、原生動物感染症の治療又は予防を望む場合には、既知の原生動物のエピトープを含む分子を使用する。例えばかかる抗原エピトープは、リーシュマニア（ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ）、コクジジオア（ｋｏｋｚｉｄｉｏａ）、及びトリパノゾーマ（ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ）を含むがこれらに限らない原生動物から調製することができる。
【０１５４】
また好ましくは、寄生生物感染症の治療又は予防を望む場合には、既知の寄生生物のエピトープを含む分子を使用する。例えば、かかる抗原エピトープは、クラミジア（ｃｈｌａｍｙｄｉａ）及びリケッチアを含むがこれらに限らない寄生生物から調製することができる。
【０１５５】
４．４．ストレスタンパク質−抗原分子複合体のｉｎ ｖｉｔｒｏ生成
ｈｓｐ又はα２Ｍと、それらが内在的にｉｎ ｖｉｖｏで結合したペプチドとの複合体を用いない実施形態では、ｈｓｐと抗体分子との複合体をｉｎ ｖｉｔｒｏで生成する。当業者には理解されるように、前述の手順で単離した、又は化学的に合成した、あるいは、組換え手法により生産したペプチドを、各種の精製された天然又は組換えストレスタンパク質とｉｎ ｖｉｔｒｏで再構成して、非共有結合ストレスタンパク質−抗原分子複合体を生成することができる。あるいは、外因性抗原又は抗原若しくは免疫原断片又はその誘導体をストレスタンパク質と複合体化させて、本発明の免疫療法又は予防ワクチンの特異的複合体として用いることができる。ストレスタンパク質と抗原分子をｉｎ ｖｉｔｒｏで複合体化させる好ましいプロトコール例を以下に説明する。
【０１５６】
複合体化の前に、ｈｓｐをＡＴＰ又は低ｐＨで前処理することにより、目的とするｈｓｐと会合している可能性のあるペプチドを全て除去する。ＡＴＰ手法を用いる場合には、Ｌｅｖｙら、１９９１， Ｃｅｌｌ ６７：２６５−２７４により記載されているように、過剰なＡＴＰをアピラーゼ（ａｐｙｒａｎａｓｅ）の添加により調製物から除去する。低ｐＨ手順を用いる場合には、ｐＨ調節試薬の添加により、バッファーのｐＨを中性ｐＨとなるよう再調節する。
【０１５７】
抗原分子（１μｇ）と前処理したｈｓｐ（９μｇ）を混合して、抗原分子約５：ストレスタンパク質１のモル比を達成する。次に、２０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．２）、３５０ｍＭ  ＮａＣｌ、３ｍＭ  ＭｇＣｌ２と１ｍＭフェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）を含むバッファーなどの好適な結合バッファー中で、上記混合物を４〜４５℃で、１５分〜３時間インキュベートする。調製物をＣｅｎｔｒｉｃｏｎ１０アセンブリー（Ｍｉｌｉｐｏｒｅ）により遠心分離することにより、非結合ペプチドを全て除去する。ペプチドとストレスタンパク質との会合は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによりアッセイすることができる。これは、内在性ｈｓｐ−ペプチド複合体から解離したペプチドとＭＨＣ−ペプチド複合体から単離されるペプチドとのｉｎ ｖｉｔｒｏ複合体形成の好ましい方法である。
【０１５８】
ｈｓｐ７０と、タンパク質などの外因性抗原分子との複合体を生成するのに好ましい本発明の別の実施形態では、５〜１０μｇの精製ｈｓｐを等モル量の抗原分子と一緒に、容量が１００μＬの２０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．５）、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、３ｍＭ  ＭｇＣｌ２及び１ｍＭ  ＡＤＰにおいて３７℃で１時間インキュベートする。このインキュベーション混合物をさらにリン酸緩衝化生理食塩水中で１ｍｌまで希釈する。
【０１５９】
ｇｐ９６又はｈｓｐ９０とペプチドとの複合体を生成するのに好ましい本発明の別の実施形態では、５〜１０μｇの精製ｇｐ９６又はｈｓｐ９０を等モル量又は過剰量の抗原ペプチドと一緒に、２０ｍＭリン酸ナトリウムバッファーｐＨ７．５、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、３ｎＭ  ＭｇＣｌ２を含むバッファーのような好適なバッファーにおいて６０〜６５℃で５〜２０分インキュベートする。このインキュベーション混合物を室温まで冷却させ、必要であれば、Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ１０アセンブリー（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて１回以上遠心分離することにより、非結合ペプチドを全て除去する。
【０１６０】
複合体形成の後、場合により、例えば以下に説明する混合リンパ球標的細胞アッセイ（ＭＬＴＣ）を用いて、免疫原ストレスタンパク質−抗原分子複合体をｉｎ ｖｉｔｒｏでアッセイしてもよい。このアッセイは、希釈体との混合前又は後に実施することができる。特異的複合体を単離し、希釈した後、場合により、以下に説明する好ましい投与プロトコール及び賦形剤を用いて、これら複合体をさらに動物モデルにおいて特性決定してもよい。
【０１６１】
４．４．１．α２Ｍと抗原分子のｉｎ ｖｉｔｒｏ複合体化
α２Ｍポリペプチドと抗原分子の複合体は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで生成することができる。α２Ｍポリペプチド−抗原分子複合体は、α２Ｍポリペプチドを抗原ペプチドと結合することによりｉｎ ｖｉｔｒｏで生成することができる。このようなα２Ｍ−抗原分子複合体の形成方法について以下に説明する。
【０１６２】
一般に、α２Ｍをプロテアーゼと混合すると、α２Ｍの「べイト（ｂａｉｔ）」領域の切断が起こり、プロテイナーゼがチオエステルにより「補足（トラップ）」され、コンホメーションの変化が起こり、これによって、α２Ｍ複合体とα２Ｍ受容体との結合が可能になる。α２Ｍのタンパク質分解活性化の間、非タンパク質分解リガンドは、活性化チオエステルと共有結合することができる。非タンパク質分解リガンドはまた、熱を用いて、求核活性化反応が逆転する間にアンモニア又はメチルアミンにより活性化α２Ｍ分子に組み込むこともできる（Ｇｒｏｎ及びＰｉｚｚｏ， １９９８， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ３７：６００９−６０１４）。α２Ｍ分子によるペプチドの偶然の補足を可能にする条件を用いて、本発明での使用のためにα２Ｍ−抗原複合体を調製する。このような共有結合の方法は、以前記載されている（Ｏｓａｄａら、１９８７， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ． １４６：２６−３１；Ｏｓａｄａら、１９８８， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ． １５０：８３３；Ｃｈｕ及びＰｉｚｚｏ， １９９３， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５０：４８；Ｃｈｕら、１９９４， Ａｎｎｕ． Ｎ．Ｙ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ７３７：２９１−３０７；Ｍｉｔｓｕｄａら、１９９３， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ． １０１：１３２６−１３３１）。このようにして、一実施形態では、α２Ｍ抗原分子複合体は、Ｇｒｏｎ及びＰｉｚｚｏ， １９９８， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ３７：６００９−６０１４により記載されたように調製することができる。Ｇｒｏｎ及びＰｉｚｚｏの方法により、抗原分子に共有結合したα２Ｍの複合体が得られる。
【０１６３】
例えば、α２Ｍポリペプチドを、プロテアーゼ、アンモニア又は、メチルアミンやエチルアミンなどのその他の小さなアミン求核試薬の存在下で、抗原分子と混合する。用いることができるプロテアーゼとして、限定するものではないが、トリプシン、ブタ膵臓エラスターゼ（ＰＥＰ）、ヒト好中球エラスターゼ、カテプシンＧ、Ｓ．アウレウス（Ｓ． ａｕｒｅｕｓ）Ｖ−８プロテイナーゼトリプシン、α−キモトリプシン、Ｖ８プロテアーゼ、パパイン、及びプロテイナーゼＫが挙げられる（Ａｕｓｕｂｅｌら編、”Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ”， Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、ニューヨーク、１７．４．６−１７．４．８参照）。α２Ｍポリペプチドと抗原分子をｉｎ ｖｉｔｒｏで複合体化させる好ましいプロトコール例を以下に示す。抗原分子（１μｇ〜２０ｍｇ）とα２Ｍポリペプチド（１μｇ〜２０ｍｇ）を、プロテアーゼ、例えばトリプシン（約５００μｌ ＰＢＳ中０．９２ｍｇのトリプシン）の存在下で、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）（１００μｌ〜５ｍｌ）中で混合することにより、約５：１の抗原分子：α２Ｍポリペプチドモル比を達成する。この混合物を３７℃で５〜１５分インキュベートする。５００μｌの４ｍｇ／４ｍｌ  ｐ−Ａフェニルメチルスルホニルフルオリド（ｐ−ＡＰＭＳＦ）を上記溶液に添加することにより、トリプシン活性を阻害し、２５℃で２時間インキュベートする。調製物をＣｅｎｔｒｉｃｏｎ１０アセンブリー（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）により遠心分離することにより、非結合ペプチドを全て除去する。あるいは、遊離抗原分子をゲル透過カラムを通過させることにより除去することができる。ペプチドとα２Ｍポリペプチドの会合は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによりアッセイすることができる。これは、ＭＨＣ−抗原分子複合体から単離した抗原分子、又は内在性α２Ｍ−抗原分子複合体から解離したペプチドをｉｎ ｖｉｔｒｏで複合体化させる好ましい方法である。
【０１６４】
α２Ｍ−抗原分子複合体を生成する前記の方法では、α２Ｍポリペプチドが、抗原分子と共有結合している複合体を生成する。α２Ｍと抗原分子の共有結合複合体はまた、第４．５節（後掲）において熱ショックタンパク質及び抗原分子について記載した架橋方法によっても生成することができる。
【０１６５】
非共有結合α２Ｍ−抗原分子複合体を生成する、さらに好ましい方法では、Ｂｌａｃｈｅｒｅら、Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １８６（８）：１３１５−２２（その全文を参照として本明細書に組み込む）に記載された方法に従い、α２Ｍ−抗原分子複合体を調製する。Ｂｌａｃｈｅｒｅ は、ｈｓｐと抗原分子のｉｎ ｖｉｔｒｏ複合体化を教示している。Ｂｌａｃｈｅｒｅにより記載されたプロトコールを改変して、ｈｓｐ成分をα２Ｍで置換することもできる。Ｂｉｎｄｅｒら（２００１， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １６６：４９６８−７２）は、Ｂｌａｃｈｅｒｅの方法により、抗原分子に結合したα２Ｍの複合体が生成されることを証明している。
【０１６６】
抗原分子は、種々の供与源から単離してもよいし、化学的に合成してもよいし、又は、組換え手法により生産してもよい。このような方法は、免疫療法用ワクチン又は予防用ワクチンの中規模又は大規模生産のために容易に適合させることができる。
【０１６７】
複合体化の後に、免疫原性α２Ｍ−抗原分子複合体は、任意により例えば下記の混合リンパ球標的細胞アッセイ（ＭＬＴＣ）を用いてｉｎ ｖｉｔｒｏでアッセイすることができる。免疫原性複合体を単離した後には、それらを、任意により以下に検討する好ましい投与プロトコール及び賦形剤を用いて動物モデルにおいて更に特性決定してもよい。
【０１６８】
４．５．共有結合ｈｓｐ−ペプチド複合体の形成
ｈｓｐ又はα２Ｍと抗原分子との非共有結合複合体の他に、抗原分子は、特異的複合体及び希釈体のいずれか又は両方においてｈｓｐ及び／又はα２Ｍと共有結合により結合させることもでき、これは特異的複合体と希釈体を混合する前又は後に行うことができる。ｈｓｐ−ペプチド複合体は、好ましくはそれらを第４．２．１節〜第４．２．５節に記載のように細胞又は組織から精製した後に架橋する。共有結合した複合体は、Ｂ細胞応答が望まれる場合の選択肢の１つである。共有結合α２Ｍ−抗原分子複合体の生成方法は第４．２．６節に記載している。
【０１６９】
一実施形態において、ｈｓｐは、化学的架橋により抗原分子と共有結合させる。化学的架橋方法は当該技術分野において周知である。例えば好ましい実施形態では、グルタルアルデヒド架橋を使用することができる。グルタルアルデヒド架橋はペプチドとｈｓｐとの共有結合による複合体形成のために使用されている（Ｂａｒｒｉｏｓら， １９９２， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２２： １３６５−１３７２を参照されたい）。好ましくは、１〜２ｍｇのｈｓｐ−ペプチド複合体を０．００２％のグルタルアルデヒドの存在下にて２時間かけて架橋させる。グルタルアルデヒドはリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）に対する終夜にわたる透析により除去される（Ｌｕｓｓｏｗら， １９９１， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２１：２２９７−２３０２）。一実施形態においては、以下のプロトコールを採用する。場合により、ｈｓｐはＡＴＰ又は低ｐＨで前処理した後で複合体形成を行ってもよく、それによりｈｓｐポリペプチドと結合する可能性のあるペプチドを除去する。好ましくは、１ｍｇのｈｓｐを０．００２％のグルタルアルデヒドの存在下にて２時間かけて１ｍｇのペプチドと架橋させる。グルタルアルデヒドはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に対する終夜にわたる透析により除去される（Ｌｕｓｓｏｗら， １９９１， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２１：２２９７−２３０２）。
【０１７０】
化学的架橋のための他の方法もまた使用してよく、さらに光架橋等のタンパク質を共有結合により結合させるための他の方法もまた使用してよい（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ａｕｓｕｂｅｌら（編）， Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを参照されたい）。
【０１７１】
他の実施形態においては、ｈｓｐと特異的抗原は紫外線（ＵＶ）架橋法により架橋する。
【０１７２】
４．６．α２Ｍ−又はｈｓｐ−抗原分子融合タンパク質
本発明の特定の実施形態において、α２Ｍ−又はｈｓｐ−抗原分子複合体は、組換え融合タンパク質である。このような組換え融合タンパク質は、抗原分子の配列と連結されたｈｓｐ又はα２Ｍの配列から構成され、本発明の特異的複合体及び／又は希釈体において使用することができる。このような組換え融合タンパク質を生成するには、当該技術分野で公知の組換え方法を利用して、例えば第４．７節に後述するように抗原分子をコードする配列と融合されたｈｓｐ又はα２Ｍをコードする核酸配列を用いて発現ベクターを構築する（Ｓｕｚｕｅら、１９９７， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ９４：１３１４６−５１）。続いて、ｈｓｐ−及びα２Ｍ−抗原ペプチド融合体を発現させ単離する。その分子の抗原ペプチド部分を特異的に設計することによって、かかる融合タンパク質を、免疫応答を誘発するために、また標的とする癌及び感染性疾患に対する免疫療法において用いることができる。
【０１７３】
４．７．ｈｓｐ、α２Ｍ及び抗原ペプチドの組換え発現
本発明の特定の実施形態では、組成物及び方法は、組換えｈｓｐを単独で、又は抗原分子に複合体化させて、あるいは、組換え手段によりｈｓｐを増強したレベルで発現する細胞から調製されたｈｓｐ−抗原分子複合体として含む。本発明の別の実施形態では、組成物及び方法は、組換えα２Ｍ又は、組換えα２Ｍを含むα２Ｍ−抗原分子複合体を含む。これに関して、当業者に公知の方法を用いて、組換えｈｓｐ又はα２Ｍ配列を獲得及び操作することができる。以上記載したものは、ｈｓｐ又はα２Ｍの組換え発現の非制限的例である。このような方法は、抗原分子の組換え発現にも適用可能である。
【０１７４】
４．７．１．ｈｓｐ配列
多くのｈｓｐのアミノ酸配列及びヌクレオチド配列は、ＧｅｎＢａｎｋなどの配列データベースから一般に入手可能である。Ｅｎｔｒｅｚなどのコンピュータープログラムを用いて、データベースを閲覧することができ、目的とするアミノ酸配列及び遺伝子配列をアクセッション番号により検索することができる。また、これらのデータベースは、アラインメントスコアや統計によって類似の配列を分類する、ＦＡＳＴＡ及びＢＬＡＳＴのようなプログラムを用いて、問合せ配列に対し様々な程度の類似性を有する配列を同定するために検索することもできる。本発明の組成物、方法、並びに、ｈｓｐ−抗原分子複合体の調製に用いることができるｈｓｐのヌクレオチド配列としては、限定するものではないが下記のものが挙げられる：ヒトｈｓｐ７０、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｍ２４７４３（Ｈｕｎｔら、１９９５， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ， Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ８２：６４５５−６４８９）；ヒトｈｓｐ９０、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｘ１５１８３（Ｙａｍａｚａｋｉら、Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １７：７１０８）；ヒトｈｓｐ９６、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｘ１５１８７（Ｍａｋｉら、１９９０， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ， Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ８７：５６５８−５５６２）；ヒトＢｉＰ、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｍ１９６４５（Ｔｉｎｇら、１９８８， ＤＮＡ ７：２７５−２８６）；ヒトｈｓｐ２７、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｍ２４７４３（Ｈｉｃｋｅｙら、１９８６， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １４：４１２７−４５）；マウスｈｓｐ７０、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｍ３５０２１（Ｈｕｎｔら、１９９０， Ｇｅｎｅ ８７：１９９−２０４）：マウスｇｐ９６、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｍ１６３７９（Ｓｒｉｖａｓｔａｖａら、１９８７， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ， Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ８５：３８０１−３８１１）；及びマウスＢｉＰ、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｕ１６２７７（Ｈａａｓら、１９８８， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ， Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ８５：２２５０−２２５４）。遺伝コードの縮重のために、本明細書で用いる用語「ｈｓｐ遺伝子」は、天然に存在するヌクレオチド配列だけではなく、ｈｓｐをコードするその他すべての縮重ＤＮＡ配列も包含する。
【０１７５】
目的とするｈｓｐをコードするヌクレオチド配列を同定した後、ヌクレオチド配列、又はその断片を取得し（例えば、市販の供与源から、あるいは、以下に説明するＰＣＲにより）、これを組換え発現用の発現ベクターにクローニングする。次に、上記発現ベクターを宿主細胞に導入することにより、ｈｓｐを増加させることができる。ｈｓｐの組換え生産の方法は、周知であり、本明細書に例示するとおりである。
【０１７６】
上記ＤＮＡは、標準的な分子生物学的方法を用いて、ＤＮＡ増幅を行うことによって、又はある組織、細胞培養物、若しくはクローン化ＤＮＡ（例えば、ＤＮＡ「ライブラリー」）から直接的に分子クローニングを行うことによって得ることができる（例えば、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ， １９８７， ｖｏｌｕｍｅ １５４， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ − Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ａｕｓｕｂｅｌら（編） Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを参照されたい。なお、各文献は参照によりその全体を本明細書に組み入れる）。ゲノムＤＮＡ由来のクローンはコード領域の他に調節領域及びイントロンＤＮＡ領域を含んでいる可能性がある。ｃＤＮＡ由来のクローンはエキソン配列のみを含んでいることとなる。起源がどうであれ、ｈｓｐ遺伝子は、遺伝子の増殖のためには適切なベクター中にクローニングする必要がある。
【０１７７】
好ましい実施形態では、関連する又は相同なｈｓｐの既知の配列から設計したプライマーを用いて、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によりゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡからＤＮＡを増幅できる。ＰＣＲを用いて、ＤＮＡクローン又はゲノムＤＮＡ若しくはｃＤＮＡライブラリーにおける所望の配列を増幅した後、選択ｓるう。ＰＣＲは、例えばサーマルサイクラー及びＴａｑポリメラーゼ（商標名ＧｅｎｅＡｍｐで市販）を用いて行なうことができる。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、目的の遺伝子又は遺伝子断片を得るために一般に用いられている。例えば、所望する任意の長さのｈｓｐをコードするヌクレオチド配列を、オープンリーディングフレームをコードするヌクレオチド配列に隣接するＰＣＲプライマーを用いて生成することができる。或いは、ｈｓｐ遺伝子配列を、そのような部位が利用可能である場合は制限エンドヌクレアーゼを用いて適当な部位で切断して、ｈｓｐ遺伝子をコードするＤＮＡの断片を取り出すことができる。都合のよい制限部位が利用可能でない場合は、当該技術分野において既知の部位特異的突然変異誘発法及び／又はＤＮＡ増幅法により適当な位置にそのような部位を作製することができる（例えば、Ｓｈａｎｋａｒａｐｐａら， １９９２， ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄ Ａｐｐｌ． １：２７７−２７８を参照されたい）。次に、ｈｓｐをコードするＤＮＡ断片を単離し、正常な翻訳リーディングフレームが維持されるように注意しながら適当な発現ベクターに連結する。
【０１７８】
別の実施形態では、ゲノムＤＮＡからのｈｓｐ遺伝子の分子クローニングのために、ＤＮＡ断片を生成してゲノムライブラリーを形成する。関連するｈｓｐをコードする配列のうちの幾つかは入手し精製して標識化することができるので、ゲノムＤＮＡライブラリー中のクローニングされたＤＮＡ断片を、標識化プローブに対する核酸ハイブリダイゼーションによりスクリーニングできる（Ｂｅｎｔｏｎ及びＤａｖｉｓ， １９７７， Ｓｃｉｅｎｃｅ １９６：１８０； Ｇｒｕｎｓｔｅｉｎ及びＨｏｇｎｅｓｓ， １９７５， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ７２：３９６１）。これにより、該プローブと実質的な相同性を有するＤＮＡ断片がハイブリダイズすることとなる。制限酵素消化、及び、既知の制限酵素地図から予想される断片サイズとの比較により、適当な断片を同定することもまた可能である。
【０１７９】
ｈｓｐゲノムＤＮＡを単離することに替わる方法としては、限定されるものではないが、既知の配列から遺伝子配列自体を化学的に合成すること、又は、ｈｓｐをコードするｍＲＮＡに対するｃＤＮＡを合成することが挙げられる。例えば、ｈｓｐ遺伝子のｃＤＮＡクローニングのためのＲＮＡは、ｈｓｐを発現する細胞から単離できる。ｃＤＮＡライブラリーを当該技術分野で既知の方法により作製して、ゲノムＤＮＡライブラリーをスクリーニングするために開示されている方法などの方法によりスクリーニングすることができる。ｈｓｐに対する抗体が入手できるのであれば、ｈｓｐは、ｈｓｐ合成クローンである可能性の有るものへの標識化抗体の結合により同定することができる。
【０１８０】
ｈｓｐをコードするヌクレオチド配列のクローニングのための他の特定の実施形態を以下に示す（これは例であって限定するためのものではない）：ある特定の実施形態では、あるファミリーに属するｈｓｐをコードするヌクレオチド配列は、低〜中程度のストリンジェンシーの条件下においてｈｓｐをコードするヌクレオチド配列を含むプローブとハイブリダイゼーションすることにより同定し、得ることができる。例示のためであって限定するものではないが、ストリンジェンシーが低い条件を用いる手順は次の通りである（またＳｈｉｌｏ及びＷｅｉｎｂｅｒｇ， １９８１， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７８：６７８９−６７９２を参照されたい）。ＤＮＡを含むフィルターを、３５％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１％ ＰＶＰ、０．１％ Ｆｉｃｏｌｌ、１％ ＢＳＡ、５００μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡを含む溶液中に６時間４０℃にて前処理する。ハイブリダイゼーションを、次の改変を加えた同じ溶液中で行なう：０．０２％ ＰＶＰ、０．０２％ Ｆｉｃｏｌｌ、０．２％ ＢＳＡ、１００μｇ／ｍｌ サケ精子ＤＮＡ、１０％（重量／容積）硫酸デキストラン、及び、５〜２０×１０６ｃｐｍ３２Ｐ−標識化プローブを用いる。フィルターを、４０℃にて１８〜２０時間にわたりハイブリダイゼーション混合物中でインキュベートし、次いで、１．５時間５５℃にて、２×ＳＳＣ、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、５ｍＭ ＥＤＴＡ及び０．１％ ＳＤＳを含有する溶液中で洗浄する。洗浄液を新鮮な溶液と入れ替え、更に１．５時間６０℃にてインキュベートする。フィルターを水気を取り乾燥させ、オートラジオグラフィーのために露光させる。必要であれば、フィルターを３回目については６５〜６８℃にて洗浄し、フィルムに再露光する。使用しうる、他のストリンジェンシーの低い条件（例えば異種間ハイブリダイゼーションについて使用する場合）は、当該技術分野において周知である。
【０１８１】
発現されるペプチド配列にアミノ酸の置換を引き起こす目的で、又は、以後の操作が容易になるように制限部位を作製／欠失するために、当該技術分野において既知の突然変異誘発のためのあらゆる技術を用いて、ＤＮＡ配列における個々のヌクレオチドを改変することができる。かかる技術には、限定するものではないが、化学的突然変異誘発、ｉｎ ｖｉｔｒｏ部位特異的突然変異誘発（Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎら， １９７８， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ ２５３：６５５１）、オリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発（Ｓｍｉｔｈ， １９８５， Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｇｅｎｅｔ． １９：４２３−４６３； Ｈｉｌｌら， １９８７， Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． １５５：５５８−５６８）、ＰＣＲに基づく重複伸長（Ｈｏら， １９８９， Ｇｅｎｅ ７７：５１−５９）、ＰＣＲに基づくメガプライマー突然変異誘発（Ｓａｒｋａｒら， １９９０， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ， ８：４０４−４０７）などが含まれる。改変は、例えば二本鎖ジデオキシＤＮＡ配列決定により確認することができる。
【０１８２】
特定の実施形態において、選択したｈｓｐの分泌形態をコードする核酸を用いて、本発明の組成物を調製し及び／又は本発明の方法を実施することができる。そのような核酸は、例えば、ＥＲ保持シグナルであるＫＤＥＬをコードする配列を欠失させることにより構築することができる。場合により、このＫＤＥＬコード配列を分子標識（例えばマウスＩｇＧ１のＦｃ部分）と置換することにより、ｈｓｐの認識と精製を容易にすることができる。米国特許出願第０９／２５３，４３９号（参照により本明細書に組み入れる）は、ｇｐ９６のＥＲ保持シグナルを欠失させた結果、ｇｐ９６−Ｉｇペプチド複合体がトランスフェクト癌細胞から分泌され、マウスＩｇＧ１とＫＤＥＬ−欠失ｇｐ９６を融合させた結果、ＥＬＩＳＡ及びＦＡＣＳによる検出が容易となり、プロテインＡを用いるアフィニティークロマトグラフィーにより精製することができたことを示している。
【０１８３】
４．７．２．α２Ｍ配列
α２Ｍポリペプチドは、組換えＤＮＡ手法により、合成方法により、又は天然α２Ｍポリペプチドの酵素的若しくは化学的切断により生成することができる。以下に、α２Ｍポリペプチドを生成する方法を記載する。
【０１８４】
様々な態様では、本発明はα２Ｍ、並びにその断片、誘導体、類似体及び変異体のアミノ酸配列を含む組成物に関する。α２Ｍをコードする核酸、並びに、かかる核酸に相補的な核酸及びハイブリダイズ可能な核酸が提供される。
【０１８５】
任意の真核細胞が、α２Ｍ遺伝子のコード領域を得るための核酸供与源として利用できる。α２Ｍをコードする核酸配列は、脊椎動物、哺乳動物並びにヒトを含む霊長類から単離できる。
【０１８６】
天然のα２Ｍポリペプチドのアミノ酸配列及び核酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋなどの配列データベースにおいて一般的に入手できる。本発明のα２Ｍポリペプチドの調製に使用できるα２Ｍ配列の例としては、限定するものではないが次のものが挙げられる：ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｍ１１３１３、Ｐ０１０２３、ＡＡＡ５１５５１（Ｋａｎら， １９８５， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ． ８２：２２８２−２２８６参照）。遺伝コードの縮重により、本明細書中において用いる用語「α２Ｍ遺伝子」は、天然のヌクレオチド配列を指すだけでなく、α２Ｍポリペプチドをコードする他の全ての縮重ＤＮＡ配列を包含する。Ｅｎｔｒｅｚなどのコンピュータープログラムを用いてデータベースを閲覧することができ、目的のあらゆるアミノ酸配列データ及び遺伝子配列データをアクセッション番号により検索することができる。これらのデータベースはまた、アライメントスコア及び統計値により類似の配列を分類する、ＦＡＳＴＡ及びＢＬＡＳＴのようなプログラムを用いて問合せ配列に対して様々な程度の類似性を有する配列を同定するために検索することもできる。ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索は、本発明の核酸分子と相同のヌクレオチド配列を得るために、ＮＢＬＡＳＴプログラム（スコア＝１００，ワード長＝１２）を用いて行なうことができる。ＢＬＡＳＴタンパク質検索は、本発明のタンパク質分子と相同のアミノ酸配列を得るために、ｘＢＬＡＳＴプログラム（スコア＝５０，ワード長＝３）を用いて行なうことができる。比較のためにギャップ付きアライメントを得るには、Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴをＡｌｔｓｃｈｕｌら， １９９７， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２５：３３８９−３４０２に記載のように使用することができる。あるいは、ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴを用いて、分子間の距離関係を検出する反復検索を行なうこともできる（Ａｌｔｓｃｈｕｌら， １９９７， 前掲）。ＢＬＡＳＴ、Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴ及びＰＳＩ−ＢＬＡＳＴプログラムを利用する場合は、各プログラム（例えばＸＢＬＡＳＴ及びＮＢＬＡＳＴ）のデフォルトパラメーターを用いることができる（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖを参照されたい）。
【０１８７】
上記ＤＮＡは、当該技術分野で既知の標準的な方法を用いてＤＮＡ増幅を行うことによって得ることができるし、あるいは、ある組織、細胞培養物、又はクローン化ＤＮＡ（例えば、ＤＮＡ「ライブラリー」）から直接的に分子クローニングを行うことによって得ることができる。ゲノムＤＮＡ由来のクローンはコード領域の他に調節領域及びイントロンＤＮＡ領域を含んでいる可能性がある；ｃＤＮＡ由来のクローンはエキソン配列のみを含んでいることとなる。起源がどうであれ、α２Ｍ遺伝子は、遺伝子の増殖のためには適切なベクター中にクローニングする必要がある。
【０１８８】
好ましい実施形態では、関連する又は相同なα２Ｍの既知の配列から設計したプライマーを用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によりゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡからＤＮＡを増幅できる。ＰＣＲを用いて、ＤＮＡクローン又はゲノムＤＮＡ若しくはｃＤＮＡライブラリーにおける所望の配列を増幅した後、選択する。ＰＣＲは、例えばサーマルサイクラー及びＴａｑポリメラーゼ（商標名ＧＥＮＥ ＡＭＰで市販）を用いて行なうことができる。増幅するＤＮＡには任意の種からのｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡが含まれ得る。関連するｈｓｐの既知の核酸配列を示すオリゴヌクレオチドプライマーをＰＣＲにおいてプライマーとして使用できる。好ましい態様において、オリゴヌクレオチドプライマーは、異なる種のα２Ｍ遺伝子の間で高度に保存されたα２Ｍ遺伝子の少なくとも一部分を示す。ＰＣＲ反応に使用するために、幾つかの異なる縮重プライマーの合成を選択してもよい。ＰＣＲ反応を開始するのに用いるハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーを変化させて、既知のα２Ｍヌクレオチド配列と単離した核酸相同体との間のヌクレオチド配列類似性の程度をより高くする又はより低くすることもできる。異種間でのハイブリダイゼーションには、低いストリンジェンシー条件が好ましい。同種間でのハイブリダイゼーションには適度にストリンジェントな条件が好ましい。首尾よく増幅を行なった後に、α２Ｍをコードする配列をクローニングして配列決定することができる。増幅するα２Ｍ遺伝子のコード領域の大きさが単一のＰＣＲで増幅するには大きすぎる場合は、好ましくは重複した領域を伴った、遺伝子全体にわたる複数回のＰＣＲを行ない、該ＰＣＲの産物を互いに連結して全体をコードする配列を形成することができる。あるいは、α２Ｍ遺伝子のある部分断片を増幅する場合には、該部分断片をクローニングして完全なｃＤＮＡ又はゲノムクローンを単離するためのプローブとして利用することができる。
【０１８９】
別の実施形態では、ゲノムＤＮＡからのα２Ｍ遺伝子の分子クローニングのために、ＤＮＡ断片を生成してゲノムライブラリーを形成する。関連するα２Ｍをコードする配列のうちの幾つかは入手し精製して標識化することができるので、ゲノムＤＮＡライブラリー中のクローニングされたＤＮＡ断片を、標識化プローブに対する核酸ハイブリダイゼーションによりスクリーニングできる（Ｂｅｎｔｏｎ及びＤａｖｉｓ， １９７７， Ｓｃｉｅｎｃｅ １９６：１８０； Ｇｒｕｎｓｔｅｉｎ及びＨｏｇｎｅｓｓ， １９７５， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ７２：３９６１）。これにより、該プローブと実質的な相同性を有するＤＮＡ断片がハイブリダイズすることとなる。制限酵素消化、及び、既知の制限酵素地図が入手できるのであればそれから予想される断片サイズとの比較により、適当な断片を同定することもまた可能である。
【０１９０】
α２ＭゲノムＤＮＡを単離することに替わる方法としては、限定されるものではないが、既知の配列から遺伝子配列自体を化学的に合成すること、又は、α２ＭをコードするｍＲＮＡに対するｃＤＮＡを作製することが挙げられる。例えば、α２Ｍ遺伝子のｃＤＮＡクローニングのためのＲＮＡは、α２Ｍを発現する細胞から単離できる。ｃＤＮＡライブラリーを当該技術分野で既知の方法により作製して、ゲノムＤＮＡライブラリーをスクリーニングするために開示されている方法などの方法によりスクリーニングすることができる。α２Ｍに対する抗体が入手できるのであれば、α２Ｍは、α２Ｍ合成クローンである可能性の有るものへの標識化抗体の結合により同定することができる。
【０１９１】
α２Ｍをコードするヌクレオチド配列のクローニングのための他の特定の実施形態を以下に示す（これは例であって限定するためのものではない）：
ある特定の実施形態では、あるファミリーに属するα２Ｍタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、低〜中程度のストリンジェンシーの条件下においてα２Ｍをコードするヌクレオチド配列を含むプローブとハイブリダイゼーションすることにより同定し、得ることができる。
【０１９２】
例示のためであって限定するものではないが、ストリンジェンシーが低い条件を用いる手順は次の通りである（またＳｈｉｌｏ及びＷｅｉｎｂｅｒｇ， １９８１， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７８：６７８９−６７９２を参照されたい）。ＤＮＡを含むフィルターを、３５％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１％ ＰＶＰ、０．１％ Ｆｉｃｏｌｌ、１％ ＢＳＡ、５００μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡを含む溶液中に６時間４０℃にて前処理する。ハイブリダイゼーションを、次の改変を加えた同じ溶液中で行なう：０．０２％ ＰＶＰ、０．０２％ Ｆｉｃｏｌｌ、０．２％ ＢＳＡ、１００μｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡ、１０％（重量／容積）硫酸デキストラン、及び、５〜２０×１０６ｃｐｍ３２Ｐ−標識化プローブを用いる。フィルターを、４０℃にて１８〜２０時間にわたりハイブリダイゼーション混合物中でインキュベートし、次いで、１．５時間５５℃にて、２×ＳＳＣ、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、５ｍＭ ＥＤＴＡ及び０．１％ＳＤＳを含有する溶液中で洗浄する。洗浄液を新鮮な溶液と入れ替え、更に１．５時間６０℃にてインキュベートする。フィルターを水気を取り乾燥させ、 オートラジオグラフィーのために露光させる。必要であれば、フィルターを３回目については６５〜６８℃にて洗浄し、フィルムに再露光する。使用しうる、他のストリンジェンシーの低い条件（例えば異種間ハイブリダイゼーションについて使用する場合）は、当該技術分野において周知である。
【０１９３】
あるα２Ｍ遺伝子断片を適当なクローニングベクターに挿入して宿主細胞に導入し、遺伝子配列の多数のコピーを生成することができる。限定されるものではないが、バクテリオファージ（例えばλ誘導体）、又は、プラスミド（例えばｐＢＲ３２２若しくはｐＵＣプラスミド誘導体又はＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））のような当該技術分野において既知の数多くのベクター−宿主系を用いることができる。
【０１９４】
発現されるペプチド配列にアミノ酸の置換を引き起こす目的で、又は、以後の操作が容易になるように制限部位を作製／欠失するために、当該技術分野において既知の突然変異誘発のためのあらゆる技術を用いて、ＤＮＡ配列における個々のヌクレオチドを改変することができる。かかる技術には、限定するものではないが、化学的突然変異誘発、ｉｎ ｖｉｔｒｏ部位特異的突然変異誘発（Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎら， １９７８， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ ２５３：６５５１）、オリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発（Ｓｍｉｔｈ， １９８５， Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｇｅｎｅｔ． １９：４２３−４６３； Ｈｉｌｌら， １９８７， Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． １５５：５５８−５６８）、ＰＣＲに基づく重複伸長（Ｈｏら， １９８９， Ｇｅｎｅ ７７：５１−５９）、ＰＣＲに基づくメガプライマー突然変異誘発（Ｓａｒｋａｒら， １９９０， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ， ８：４０４−４０７）などが含まれる。改変は、二本鎖ジデオキシＤＮＡ配列決定により確認することができる。
【０１９５】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、目的の遺伝子又は遺伝子断片を得るために一般に用いられている。例えば、所望する任意の長さのα２Ｍポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を、α２Ｍ又はそのペプチド結合ドメインをコードするヌクレオチド配列に隣接するＰＣＲプライマーを用いて生成することができる。或いは、α２Ｍ遺伝子配列を、そのような部位が利用可能である場合は制限エンドヌクレアーゼを用いて適当な部位で切断して、α２Ｍ又はそのペプチド結合ドメインをコードするＤＮＡの断片を取り出すことができる。都合のよい制限部位が利用可能でない場合は、当該技術分野において既知の部位特異的突然変異誘発法及び／又はＤＮＡ増幅法により適当な位置にそのような部位を作製することができる（例えば、Ｓｈａｎｋａｒａｐｐａら， １９９２， ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄ Ａｐｐｌ． １：２７７−２７８を参照されたい）。次に、α２Ｍ又はそのペプチド結合ドメインをコードするＤＮＡ断片を単離し、正常な翻訳リーディングフレームが維持されるように注意しながら適当な発現ベクターに連結する。
【０１９６】
本発明のα（２）マクログロブリンポリペプチドは、発現される細胞からの回収及び精製が容易になるように融合タンパク質として発現させることができる。例えば、α２Ｍポリペプチドが、培養培地中に分泌されるように、それがＥＲ膜を横切って輸送を指令するシグナル配列リーダーペプチドを含んでいてもよい。更には、α２Ｍポリペプチドは、α２Ｍポリペプチドの、抗原ペプチドの結合に関与しない任意の位置（例えば、カルボキシル末端等）に融合されたアフィニティーラベルなどのアフィニティーラベルを含んでいてもよい。アフィニティーラベルを用いて、アフィニティーパートナー分子に結合することによりタンパク質の精製を容易にすることができる。
【０１９７】
このような融合タンパク質の種々の産生方法が当該技術分野において周知である。それらの産生をもたらす操作は、遺伝子又はタンパク質のレベルで、好ましくは遺伝子のレベルで行なうことができる。例えば、α２Ｍポリペプチドのクローニングされたコード領域を、当該技術分野において既知の多くの組換えＤＮＡ法のうちのいずれかにより改変することができる（Ｓａｍｂｒｏｏｋら， １９９０， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， 第２版， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ； Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋの第８章の Ａｕｓｕｂｅｌら）。置換、欠失、挿入又はそれらの任意の組合わせを導入するか又は結合することによってα２Ｍポリペプチドをコードする最終的なヌクレオチド配列を得ることは、以後の議論から明らかであろう。
【０１９８】
種々の実施形態では、組換えＤＮＡ技術を用いてα２Ｍポリペプチドを含む融合タンパク質を作製することができる。例えば、α２Ｍポリペプチドがペプチドで標識された融合タンパク質として発現されるように、アフィニティーラベルの配列を含むベクター内に適切なリーディングフレームでα２Ｍ遺伝子断片を導入することにより、α２Ｍポリペプチドをコードする組換え遺伝子を構築することができる。特定の結合パートナーに認識され得るアフィニティーラベルが、α２Ｍポリペプチドのアフィニティー精製のために使用できる。
【０１９９】
好ましい実施形態では、アフィニティーラベルはα２Ｍのアミノ末端からカルボキシル末端にて融合される。カルボキシル末端において融合が起こる正確な部位は重要ではない。最適な部位は、日常的な実験により決定できる。
【０２００】
当該技術分野において既知の種々のアフィニティーラベルを使用することができ、例えば、限定されるものではないが、免疫ブロブリン定常領域、ポリヒスチジン配列（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌ． ２， Ａｕｓｕｂｅｌら編， Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈ． Ａｓｓｏｃ． ＆ Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ中の、Ｐｅｔｔｙ， １９９６， Ｍｅｔａｌ−ｃｈｅｌａｔｅ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ；Ｓｍｉｔｈ， １９９３， Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏ． ４：２２０−２２９）、大腸菌マルトース結合タンパク質（Ｇｕａｎら， １９８７， Ｇｅｎｅ ６７：２１−３０）、及び種々のセルロース結合ドメイン（米国特許第５，４９６，９３４号；第５，２０２，２４７号；第５，１３７，８１９号；Ｔｏｍｍｅら， １９９４， Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ． ７：１１７−１２３）などが挙げられる。例えば緑色蛍光タンパク質の一部分などの他のアフィニティーラベルにより、α２Ｍポリペプチドに蛍光特性を付与できる。他の可能性のあるアフィニティーラベルは、モノクローナル抗体に利用可能である短いアミノ酸配列であり、例えば限定されるものではないが、以下の周知の例、すなわちＦＬＡＧエピトープ、アミノ酸４０８−４３９でのｍｙｃエピトープ、インフルエンザウイルスヘマグルチニン（ＨＡ）エピトープなどが挙げられる。他のアフィニティーラベルは特異的な結合パートナーにより認識され、従って、固相支持体上に固定化され得る結合パートナーへのアフィニティー結合により単離が容易となる。いくつかのアフィニティーラベルは、α２Ｍポリペプチドに新しい構造上の特性、例えば多量体を形成する能力をもたらすことができる。結合したペプチドによるα２Ｍポリペプチドの二量体化は、抗原提示の過程でα２Ｍポリペプチドとそのパートナーとの間の相互作用の結合力を上昇させることができる。これらのアフィニティーラベルは、一般的には通常はホモポリマーとして存在するタンパク質から導かれる。ＣＤ８の細胞外ドメイン（Ｓｈｉｎｕｅら， １９８８， Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １６８：１９９３−２００５）若しくはＣＤ２８（Ｌｅｅら， １９９０． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １４５：３４４−３５２）、又は鎖間のジスルフィド結合のための部位を含む免疫グロブリン分子の一部分のようなアフィニティーラベルにより、多量体が形成され得る。当業者であれば理解されるように、限定されないが、ＤＮＡクローニング、ＤＮＡ増幅、及び合成方法を含む多くの方法を用いて、上記アフィニティーラベルのコード領域を得ることができる。アフィニティーラベル並びにその検出及び単離のための試薬には市販されているものがある。
【０２０１】
好ましいアフィニティーラベルは、免疫グロブリン分子の非可変部分である。典型的には、かかる部分は少なくとも、免疫グロブリン重鎖の定常領域の機能的に働くＣＨ２及びＣＨ３ドメインを含む。融合はまた、定常ドメインのＦｃ部分のカルボキシル末端、又は重鎖若しくは軽鎖のＣ１に対してすぐ接するアミノ末端の領域を用いて行なう。好適な免疫グロブリンに基づくアフィニティーラベルは、ＩｇＧ−１、−２、−３若しくは−４サブタイプ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤ又はＩｇＭから得ることができるが、好ましくはＩｇＧ１からである。α２Ｍポリペプチドをヒトに対してｉｎ ｖｉｖｏで使用することを意図するのであれば、好ましくは、ヒト免疫グロブリンを使用する。免疫グロブリン軽鎖又は重鎖定常領域をコードする多くのＤＮＡが、知られているか、又はｃＤＮＡライブラリーから容易に入手可能である。例えば、Ａｄａｍｓら， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， １９８０， １９：２７１１−２７１９； Ｇｏｕｇｈら， １９８０， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， １９：２７０２−２７１０； Ｄｏｌｂｙら， １９８０， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ．， ７７：６０２７−６０３１； Ｒｉｃｅら， １９８２， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ．， ７９：７８６２−７８６５； Ｆａｌｋｎｅｒら， １９８２， Ｎａｔｕｒｅ， ２９８：２８６−２８８； 及びＭｏｒｒｉｓｏｎら， １９８４， Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ， ２：２３９−２５６を参照されたい。免疫グロブリンの検出に関しては、多くの免疫学的試薬及びラベル系が利用可能であるので、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、免疫沈降、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）等を使用するなど当該技術分野において既知の種々の免疫学的技術により、α２Ｍポリペプチド−Ｉｇ融合タンパク質は容易に検出及び定量することができる。同様に、アフィニティーラベルが容易に入手できる抗体に対するエピトープである場合は、かかる試薬を使用し、上記の技術を用いて、アフィニティーラベルを含むα２Ｍポリペプチドを検出、定量及び単離することができる。多くの例において、α２Ｍポリペプチドに特異的な抗体を作製する必要はない。
【０２０２】
特に好ましい実施形態は、α２Ｍポリペプチドの、ヒト免疫グロブリンＧ−１（ＩｇＧ１；Ｂｏｗｅｎら， １９９６， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５６：４４２−４９を参照されたい）のヒンジ、ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインへの融合体である。このヒンジ領域は、通常はＩｇ分子中の他のシステインとのジスルフィド結合に関与する３つのシステイン残基を含む。当該システインはいずれもペプチドが標識として機能するためには必要ではないので、これらのシステイン残基のうちの１つ以上が、例えばセリンのような他のアミノ酸残基により任意に置換されていてもよい。
【０２０３】
当該技術分野において既知の種々のリーダー配列は、細菌細胞及び哺乳動物細胞からα２Ｍポリペプチドを効率的に分泌させるために使用することができる（ｖｏｎ Ｈｅｉｊｎｅ， １９８５， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １８４：９９−１０５）。リーダーペプチドは、対象とする宿主細胞に基づいて選択され、細菌、酵母、ウイルス、動物及び哺乳動物の配列を含んでいてもよい。例えば、ヘルペスウイルス糖タンパクＤリーダーペプチドが種々の哺乳動物細胞に使用するのに好適である。哺乳動物細胞に使用するための好ましいリーダーペプチドは、マウス免疫グロブリンκ鎖のＶ−Ｊ２−Ｃ領域から得ることができる（Ｂｅｒｎａｒｄら， １９８１， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ７８：５８１２−５８１６）。細菌細胞においてα２Ｍポリペプチド発現を標的化するための好ましいリーダー配列には、大腸菌タンパク質ＯｍｐＡ（Ｈｏｂｏｍら， １９９５， Ｄｅｖ． Ｂｉｏｌ． Ｓｔａｎｄ． ８４：２５５−２６２）、ＰｈｏＡ（Ｏｋａら， １９８５， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ８２：７２１２−１６）、ＯｍｐＴ（Ｊｏｈｎｓｏｎら， １９９６， Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ７：１０４−１１３）、ＬａｍＢ及びＯｍｐＦ（Ｈｏｆｆｍａｎ及びＷｒｉｇｈｔ， １９８５， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８２：５１０７−５１１１）、β−ラクタマーゼ（Ｋａｄｏｎａｇａら， １９８４， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２５９：２１４９−５４）、エンテロトキシン（Ｍｏｒｉｏｋａ−Ｆｕｊｉｍｏｔｏら， １９９１， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６６：１７２８−３２）及びスタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）プロテインＡ（Ａｂｒａｈｍｓｅｎら， １９８６， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １４：７４８７−７５００）及びＢ．ズブチリス（Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ）エンドグルカナーゼ（Ｌｏら， Ａｐｐｌ． Ｅｎｖｉｒｏｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ５４：２２８７−２２９２）並びに人工及び合成シグナル配列（ＭａｃＩｎｔｙｒｅら， １９９０， Ｍｏｌ． Ｇｅｎ． Ｇｅｎｅｔ． ２２１：４６６−７４； Ｋａｉｓｅｒら， １９８７， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２３５：３１２−３１７）が含まれるがこれらには限らない。
【０２０４】
ライブラリーから容易に得ることができる、合成により生産することができる、又は業者から入手することができる所望のアフィニティーラベル又はリーダーペプチドをコードするＤＮＡ配列は、本発明の実施のために好適である。かかる方法は当該技術分野において周知である。
【０２０５】
４．７．３．発現系
ｈｓｐ若しくはα２Ｍ、及び／又は抗原分子あるいはｈｓｐ−抗原分子又はα２Ｍ−抗原分子融合体をコードするヌクレオチド配列は、組換え細胞において増殖及び発現するための発現構築物を作製するために発現ベクターに挿入することができる。発現構築物とは、本明細書中で使用する場合、適切な宿主細胞中でのｈｓｐ、α２Ｍ、及び／又は抗原分子の発現を可能にする１以上の調節領域と機能的に連結されたｈｓｐ、α２Ｍ、及び／又は抗原分子をコードするヌクレオチド配列を指す。「機能的に連結された」とは、調節領域と発現しようとするｈｓｐ、α２Ｍ、及び／又は抗原分子のポリペプチド配列とが、ｈｓｐ、α２Ｍ、及び／又は抗原分子の配列が転写及び最終的には翻訳されるように連結され、配置されている関係を指す。ｈｓｐ、α２Ｍ、及び／又は抗原分子の発現のために、種々の発現ベクターを用いることが可能であり、例えば限定するものではないが、プラスミド、コスミド、ファージ、ファージミド、又は改変ウイルスが挙げられる。例えば、λ誘導体などのバクテリオファージ、ｐＢＲ３２２若しくはｐＵＣプラスミド誘導体又はＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）などのプラスミドなどが挙げられる。典型的には、そのような発現ベクターは、適当な宿主細胞において該ベクターが増殖するための機能的な複製起点、ｈｓｐ遺伝子配列若しくは抗原分子をコードする配列を挿入するための１以上の制限エンドヌクレアーゼ部位、及び１以上の選択マーカーを含む。
【０２０６】
哺乳動物宿主細胞中でのｈｓｐ、α２Ｍ、及び／又は抗原分子の発現には、種々の調節領域を用いることができ、そのようなものとしては例えば、ＳＶ４０初期及び後期プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）前初期プロモーター、及びラウス肉腫ウイルスの長い末端反復配列（ＲＳＶ−ＬＴＲ）プロモーターが挙げられる。哺乳動物細胞で有用と考えられる誘導性プロモーターとしては、限定はされないが、メタロチオネインＩＩ遺伝子、マウス乳癌ウイルスグルココルチコイド応答性の長い末端反復配列（ＭＭＴＶ−ＬＴＲ）、β−インターフェロン遺伝子、及びｈｓｐ７０遺伝子と結合しているものが挙げられる（Ｗｉｌｌｉａｍｓら， １９８９， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ４９：２７３５−４２； Ｔａｙｌｏｒら， １９９０， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．， １０：１６５−７５）。
【０２０７】
下記の動物の調節領域は、組織特異性を示しトランスジェニック動物で用いられており、そのような領域も特定の組織型の細胞中でｈｓｐ及び／又は抗原分子の組換え発現のために用いることができる：膵臓の腺房細胞で活性のあるエラスターゼＩ遺伝子制御領域（Ｓｗｉｆｔら， １９８４， Ｃｅｌｌ ３８：６３９−６４６； Ｏｒｎｉｔｚら， １９８６． Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｓｙｍｐ． Ｑｕａｎｔ． Ｂｉｏｌ． ５０：３９９−４０９； ＭａｃＤｏｎａｌｄ， １９８７， Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ７：４２５−５１５）；膵臓のβ細胞で活性のあるインスリン遺伝子制御領域（Ｈａｎａｈａｎ， １９８５， Ｎａｔｕｒｅ ３１５：１１５−１２２）；リンパ系細胞で活性のある免疫グロブリン遺伝子制御領域（Ｇｒｏｓｓｃｈｅｄｌら， １９８４， Ｃｅｌｌ ３８：６４７−６５８； Ａｄａｍｅｓら， １９８５， Ｎａｔｕｒｅ ３１８：５３３−５３８； Ａｌｅｘａｎｄｅｒら， １９８７， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． ７：１４３６−１４４４）；精巣、乳房、リンパ系及びマスト細胞中で活性のあるマウス乳癌ウイルス制御領域（Ｌｅｄｅｒら， １９８６， Ｃｅｌｌ ４５：４８５−４９５）；肝臓中で活性のあるアルブミン遺伝子制御領域（Ｐｉｎｋｅｒｔら， １９８７， Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌ． １：２６８−２７６）；肝臓中で活性のあるα−フェトプロテイン遺伝子制御領域（Ｋｒｕｍｌａｕｆら， １９８５． Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． ５：１６３９−１６４８； Ｈａｍｍｅｒら， １９８７， Ｓｃｉｅｎｃｃ ２３５：５３−５８）；肝臓中で活性のあるα１−アンチトリプシン遺伝子制御領域（Ｋｅｌｓｅｙら， １９８７， Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌ． １：１６１−１７１）；骨髄細胞中で活性のあるβ−グロビン遺伝子制御領域（Ｍｏｇｒａｍら， １９８５， Ｎａｔｕｒｅ ３１５：３３８−３４０； Ｋｏｌｌｉａｓら， １９８６， Ｃｅｌｌ ４６：８９−９４）；脳の希突起神経膠細胞中で活性のあるミエリン塩基性タンパク質遺伝子制御領域（Ｒｅａｄｈｅａｄら， １９８７， Ｃｅｌｌ ４８：７０３−７１２）；骨格筋中で活性のあるミオシン軽鎖−２遺伝子制御領域（Ｓａｎｉ， １９８５， Ｎａｔｕｒｅ ３１４：２８３−２８６）；及び視床下部で活性のある性腺刺激ホルモン放出ホルモン遺伝子制御領域（Ｍａｓｏｎら， １９８６， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３４：１３７２−１３７８）。
【０２０８】
宿主細胞内でのｈｓｐ、α２Ｍ又は抗原分子の発現効率は、ＳＶ４０ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、サイトメガロウイルス、免疫グロブリン遺伝子、メタロチオネイン、β−アクチン内に見出されるものなどの適切な転写エンハンサーエレメントを発現ベクター中に含ませることによって増強することができる（Ｂｉｔｔｎｅｒら， １９８７， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ． １５３：５１６−５４４； Ｇｏｒｍａｎ， １９９０， Ｃｕｒｒ． Ｏｐ． ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １：３６−４７を参照されたい）。
【０２０９】
発現ベクターはまた、２つ以上のタイプの宿主細胞でのベクターの維持と複製を可能にする、又はそのベクターを宿主の染色体中に組み入れることを可能にする配列をも含むことができる。そのような配列としては、限定はされないが、複製起点、自律複製配列（ＡＲＳ）、セントロメアＤＮＡ、及びテロメアＤＮＡが挙げられうる。また、少なくとも２つのタイプの宿主細胞中で複製し維持されうるシャトルベクターを用いることも有利でありうる。
【０２１０】
さらに、発現ベクターは、ｈｓｐ、α２Ｍ、及び／又は抗原分子をコードするＤＮＡを含んでいる宿主細胞を最初に単離若しくは同定するための選択可能若しくはスクリーニング可能なマーカー遺伝子を含むことができる。ｈｓｐ、α２Ｍ、及び／又は抗原分子の長期にわたる高収率の産生のためには、哺乳動物細胞における安定した発現が好ましい。哺乳動物細胞では多数の選択系を用いることができ、そのようなものとしては、限定はされないが、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（Ｗｉｇｌｅｒら， １９７７， Ｃｅｌｌ １１：２２３）、ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｓｚｙｂａｌｓｋｉ及びＳｚｙｂａｌｓｋｉ， １９６２， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ４８：２０２６）、及びアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｌｏｗｙら， １９８０， Ｃｅｌｌ ２２：８１７）の遺伝子をそれぞれｔｋ−、ｈｇｐｒｔ−、若しくはａｐｒｔ−胞中で用いることができる。また、代謝拮抗物質耐性も次のものの選択の基礎として用いることができる：ジヒドロ葉酸還元酵素（ｄｈｆｒ）（この酵素はメトトレキセートに対する耐性を付与する；Ｗｉｇｌｅｒら， １９８０， Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７７：３５６７；Ｏ’Ｈａｒｅら， １９８１， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７８：１５２７）；ｇｐｔ（これはミコフェノール酸への耐性を付与する；ＭｕｌｌｉｇａｎとＢｅｒｇ， １９８１， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７８：２０７２）；ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｎｅｏ）（これはアミノグリコシドＧ−４１８に対する耐性を付与する；Ｃｏｌｂｅｒｒｅ−Ｇａｒａｐｉｎら， １９８１， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １５０：１）；及びハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｈｙｇ）（これはハイグロマイシンに対する耐性を付与する；Ｓａｎｔｅｒｒｅら， １９８４， Ｇｅｎｅ ３０：１４７）。他の選択マーカー、例えば、限定はされないが、ヒスチジノール及びＺｅｏｃｉｎＴＭも用いることができる。
【０２１１】
ｈｓｐ若しくはα２Ｍのコード配列、又は抗原分子をコードする配列をベクターのクローニング部位に挿入するために、調節機能を有するＤＮＡ配列、例えばプロモーターなどを、その各コード配列に結合しなければならない。これを行うためには、当該技術分野で周知の技術を用いて、適切な適合する制限酵素切断部位を提供するリンカー若しくはアダプターを、ｈｓｐ、α２Ｍ又は抗原分子をコードするｃＤＮＡ又は合成ＤＮＡの末端に連結することができる（Ｗｕら， １９８７， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ． １５２：３４３−３４９）。制限酵素を用いた切断を行った後、連結前に、一本鎖のＤＮＡ末端を消化するか、又は充填することによって平滑末端が作製されるように改変することができる。あるいはまた、所望の制限酵素切断部位は、所望の制限酵素切断部位を含んでいるプライマーを用いたＰＣＲの使用によってそのＤＮＡを増幅させて、ＤＮＡの断片中に導入することができる。
【０２１２】
調節領域と機能的に連結されたｈｓｐ、α２Ｍ、及び／又は抗原分子のコード配列を含む発現構築物を、それ以上クローニングすることなく、本発明のｈｓｐ、α２Ｍ、及び／又は抗原分子の複合体の発現及び産生のための適切な宿主細胞中に直接的に導入することができる（例えば、米国特許第５，５８０，８５９号を参照）。発現構築物にはまた、コード配列の宿主細胞ゲノム中への組み込み（例えば相同組換えによる）を容易にするＤＮＡ配列を含ませることができる。この場合には、宿主細胞中でのｈｓｐ、α２Ｍ、及び／又は抗原分子の増加と発現のために、適切な宿主細胞に適した複製起点を含む発現ベクターを用いる必要がない。
【０２１３】
ｈｓｐ若しくはα２Ｍのコード配列、又は抗原分子をコードする配列のクローニングされた配列を含む発現構築物を、当該技術分野で既知の種々の技術によって哺乳動物宿主細胞内に導入することができ、そのような技術としては、限定されないが、リン酸カルシウム介在トランスフェクション（Ｗｉｇｌｅｒら， １９７７， Ｃｅｌｌ １１：２２３−２３２）、リポソーム介在トランスフェクション（Ｓｃｈａｅｆｅｒ−Ｒｉｄｄｅｒら， １９８２， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２１５：１６６−１６８）、エレクトロポレーション（Ｗｏｌｆｆら， １９８７， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８４：３３４４）、及びマイクロインジェクション（Ｃａｐｐｅｃｈｉ， １９８０， Ｃｅｌｌ ２２：４７９−４８８）が挙げられる。
【０２１４】
適切にプロセシングされたｈｓｐ−ペプチド複合体の長期にわたる高収率の産生には、哺乳動物細胞中での安定な発現が好ましい。本発明の組成物に組み込むｈｓｐ−ペプチド複合体を生成するためのｈｓｐ若しくはα２Ｍ及び抗原分子を安定に発現する細胞系は、選択マーカーを含有するベクターを用いて操作することができる。例えば限定するものではないが、発現構築物の導入後、操作された細胞を１〜２日間、富化培地中で増殖させ、次いで選択培地に換える。発現構築物中の選択マーカーは、その選択に対する耐性を付与し、最適な形としては細胞が安定にその発現構築物を染色体中に組み込み、培養下で増殖して細胞系へと増殖することができる。そのような細胞は長期間培養することができ、その一方でｈｓｐ又はα２Ｍ、及び抗原分子は連続的に発現される。
【０２１５】
本明細書中に記載するクローニングベクター及び発現ベクターのいずれも、当該技術分野で周知の技術により既知のＤＮＡ配列から合成し組み立てることができる。調節領域及びエンハンサーエレメントは、天然及び合成のどちらであってもよい種々の起源のものとすることができる。ベクター及び宿主細胞には市販されているものもある。有用なベクターの非限定的な例は、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， １９８８， Ａｕｓｕｂｅｌら編， Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈ． Ａｓｓｏｃ． ＆ Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅの補遺５（これは参照により本明細書中に組み入れる）；並びにＣｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｉｎｃ．， 及びＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ， Ｉｎｃのような業者のカタログに記載されている。
【０２１６】
あるいは、いくつかのウイルスに基づく発現系もまた、ｈｓｐ、α２Ｍ、及び／又は抗原分子の組換え発現のために、哺乳動物細胞と共に利用できる。ＤＮＡウイルスのバックボーンを利用するベクターは、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）（Ｈａｍｅｒら， １９７９， Ｃｅｌｌ １７：７２５）、アデノウイルス（Ｖａｎ Ｄｏｒｅｎら， １９８４， Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ４：１６５３）、アデノ随伴ウイルス（ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎら， １９８８， Ｊ Ｖｉｒｏｌ ６２：１９６３）、及びウシパピローマウイルス（Ｚｉｎｎら， １９８２， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ７９：４８９７）に由来している。アデノウイルスが発現ベクターとして利用される場合は、供与ＤＮＡ配列をアデノウイルス転写／翻訳制御領域（例えば後期プロモーター及び三部リーダー配列）に連結することができる。次にこのキメラ遺伝子をｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎ ｖｉｖｏ組換え手法によりアデノウイルスゲノム中に挿入することができる。ウイルスゲノムの非必須領域（例えば、領域Ｅ１又はＥ３）へ挿入すればその結果として、感染宿主内で生存することができ且つ異種産物を発現することができる組換えウイルスが得られることになる（例えばＬｏｇａｎ及びＳｈｅｎｋ， １９８４， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． （ＵＳＡ） ８１：３６５５−３６５９を参照されたい）。
【０２１７】
ウシパピローマウイルス（ＢＰＶ）は、ヒトを含む多くの高等脊椎動物に感染することができ、そしてそのＤＮＡはエピソームとして複製する。安定で、多コピー型の（２０〜３００コピー／細胞）染色体外エレメントとして哺乳動物細胞中に存在する多くのシャトルベクターが、組換え遺伝子発現のために開発されている。典型的には、これらのベクターは、ＢＰＶ ＤＮＡ（全ゲノム又は６９％形質転換断片）のある部分断片、広範な宿主範囲を有するプロモーター、ポリアデニル化シグナル、スプライスシグナル、選択マーカー、及び該ベクターが大腸菌内で増殖することが可能となる「無毒の」プラスミド配列を含む。細菌内での構築及び増殖の後に、該発現遺伝子構築物を、例えばリン酸カルシウム共沈又はエレクトロポレーションの技術により、培養した哺乳動物細胞内へトランスフェクトする。形質転換された表現型を表さないこれらの宿主細胞については、形質転換体の選択はヒスチジノール及びＧ４１８耐性のような優性選択マーカーを用いて行われる。例えばｐＢＣＭＧＳＮｅｏ及びｐＢＣＭＧＨｉｓのようなＢＰＶベクターを用いて、ｈｓｐ、α２Ｍ、及び／又は抗原分子を発現することができる（Ｋａｒａｓｕｙａｍａら， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １８：９７−１０４； Ｏｈｅら， Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ， ６：３２５−３３）。該ベクターは続いてｈｓｐ、α２Ｍ又は抗原分子の発現のために広範な細胞型にトランスフェクトすることができる。
【０２１８】
あるいは、ワクシニア７．５Ｋプロモーターを使用することもできる（例えば、Ｍａｃｋｅｔｔら， １９８２， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． （ＵＳＡ） ７９：７４１５−７４１９； Ｍａｃｋｅｔｔら， １９８４， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ４９：８５７−８６４； Ｐａｎｉｃａｌｉら， １９８２， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． （ＵＳＡ） ７９：４９２７−４９３１を参照されたい）。ヒト宿主細胞を使用する場合は、エプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）起点（ＯｒｉＰ）及びＥＢＶ核抗原１（ＥＢＮＡ−１；トランス作用複製因子）に基づくベクターを使用することができる。かかるベクターは広範なヒト宿主細胞に使用できる（例えば、ＥＢＯ−ｐＣＤ（Ｓｐｉｃｋｏｆｓｋｙら， １９９０， ＤＮＡ Ｐｒｏｔ Ｅｎｇ Ｔｅｃｈ ２：１４−１８）、ｐＤＲ２及びλＤＲ２（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから入手可能））。
【０２１９】
組換えｈｓｐ、α２Ｍ、及び／又は抗原分子の発現はまた、レトロウイルスに基づく発現系を用いて実施することもできる。トランスフェクションとは対照的に、レトロウイルスは、例えば主な造血細胞を含む広範な細胞型に効率的に感染して遺伝子を導入することができる。モロニーマウス白血病ウイルスのようなレトロウイルスでは、ウイルス遺伝子配列の大部分を取り除き、ｈｓｐ、α２Ｍ、及び／若しくは抗原分子のコード配列又は抗原分子をコードする配列で置換することができる。この際、失われたウイルスの機能はトランス活性で供給することができる。レトロウイルスベクターで感染する宿主の範囲はまた、ベクターパッケージングに用いるエンベロープの選択により操作することができる。
【０２２０】
例えば、あるレトロウイルスベクターは、５’長い末端反復配列（ＬＴＲ）、３’ＬＴＲ、パッケージングシグナル、細菌の複製起点及び選択マーカーを含むことができる。ＮＤ関連抗原ペプチドＤＮＡは５’ＬＴＲと３’ＬＴＲとの間の位置に挿入されて、５’ＬＴＲプロモーターからの転写によりクローニングされたＤＮＡが転写されるようになる。５’ＬＴＲは、ＬＴＲプロモーターを含むがこれには限らないプロモーター、Ｒ領域、Ｕ５領域及びプライマー結合部位をこの順で含む。これらのＬＴＲエレメントのヌクレオチド配列は当該技術分野において周知である。また異種プロモーター並びに複数の薬剤選択マーカーを、感染細胞の選択を容易にするために発現ベクターに含めることもできる（ＭｃＬａｕｃｈｌｉｎら， １９９０， Ｐｒｏｇ． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ． 及び Ｍｏｌｅｃ． Ｂｉｏｌ． ３８：９１−１３５；Ｍｏｒｇｅｎｓｔｅｒｎら， １９９０， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ． １８：３５８７−３５９６；Ｃｈｏｕｌｉｋａら， １９９６， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ ７０：１７９２−１７９８；Ｂｏｅｓｅｎら， １９９４， Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ ６：２９１−３０２；Ｓａｌｍｏｎｓ及びＧｕｎｚｂｅｒｇ， １９９３， Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ４：１２９−１４１；及びＧｒｏｓｓｍａｎ及びＷｉｌｓｏｎ， １９９３， Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌ． ３：１１０−１１４を参照のこと）。
【０２２１】
組換え細胞は、温度、インキュベーション時間、吸光度、及び培地組成の標準的な条件下で培養することができる。あるいはまた、細胞は、ｈｓｐ、α２Ｍ又は抗原分子が内因的に発現される細胞の栄養素要求性及び生理学的要求性に適合する条件下で培養することができる。またｈｓｐ−抗原分子又はα２Ｍ−抗原分子複合体の産生を増強するために、改変された培養条件及び培地を用いてもよい。例えば、ｈｓｐ発現の誘導を促進する条件下にて組換え細胞を増殖させることができる。ｈｓｐ−抗原分子又はα２Ｍ−抗原分子複合体を産生するための最適な条件を確立するために、当該技術分野において既知の任意の技術を適用してもよい。
【０２２２】
４．８．希釈体として用いる細胞抽出物及び溶解物の調製
前述したように、本発明のいくつかの実施形態では、希釈体は、非複合体化ｈｓｐ及び／又は非特異的ｈｓｐ−ペプチド複合体を含む細胞溶解物又は抽出物でよい。例えば、ｈｓｐを含む細胞抽出物は、単純に細胞タンパク質の非分別調製物でよい。以下の第４．８．１節に記載する一実施形態では、ｈｓｐを含む細胞抽出物は、全細胞タンパク質を含む溶解物として調製することができる。第４．８．２節に記載する別の実施形態では、ｈｓｐを含む細胞抽出物は、可溶性細胞質ゾルタンパク質を含む溶解物として調製することができる。
【０２２３】
４．８．１．非分別細胞タンパク質を含む溶解物の調製
以下に、非分別細胞タンパク質を調製するのに用いることができる方法の一例を示すが、これに限定されるわけではない：
細胞（患者の生検に由来する腫瘍細胞若しくはｉｎ ｖｉｔｒｏで培養した腫瘍細胞、又は病原因子に感染した細胞系としうる）を、３０ｍＭ炭酸水素ナトリウム（ｐＨ７．５）と１ｍＭフェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）とからなる、３容量の１×溶解バッファーに懸濁させる。同じ溶解バッファー中で、機械的せん断により細胞を溶解させてもよく、これを氷上で約２０分インキュベートすることにより、細胞を低張膨潤させた後、９５％以上の細胞が溶解するまで、ダウンス型ホモジナイザーで均質化する。別の実施形態では、細胞をＰＢＳのような非低張バッファー中に再懸濁させ、これを凍結及び解凍、又は音波処理により溶解させる。一般に、少なくとも９０％の細胞が溶解するまで、必要に応じて２〜５回、好ましくは３回の凍結及び解凍サイクルを実施する。音波処理を用いて細胞を溶解させる場合には、超音波処理装置ＧＥ１３０を用いて、ＰＢＳ中かつ氷上で細胞を５サイクル音波処理するが、各サイクルは、超音波への暴露１０秒と、次の音波処理サイクルまでの静止３０秒とからなる。
【０２２４】
溶解物を１，０００×ｇで１０分遠心することにより、非破壊細胞、核及びその他の細胞屑を除去する。非分別細胞タンパク質を含む清澄化した細胞抽出物は、ＰＢＳ（リン酸緩衝化生理食塩水）又はその他の好適なバッファーに対して、一般に４℃で３６時間透析する（３回、各回１００容量ずつ）ことにより、本発明の非分別細胞タンパク質を得ることができる。必要であれば、ろ過又はさらなる低速遠心分離により、細胞抽出物における不溶性物質を除去することもできる。
【０２２５】
４．８．２．非分別細胞質ゾル細胞タンパク質を含む溶解物の調製
以下に、非分別細胞質ゾル可溶性タンパク質を調製するのに用いることができる方法の一例を示すが、これに限定されるわけではない：
第４．８．１節に記載したように調製した非分別細胞タンパク質を含む清澄化細胞抽出物を約１００，０００×ｇで約１時間再遠心した後、上清を回収する。この上清は、本発明の非分別細胞質ゾル可溶性タンパク質を含んでおり、これをＰＢＳ（リン酸緩衝化生理食塩水）又はその他の好適なバッファーに対して、４℃で３６時間透析する（３回、各回１００容量ずつ）。必要であれば、ろ過又はさらなる低速遠心分離により、調製物に残った不溶性物質を全て除去することもできる。
【０２２６】
４．８．３．細胞抽出物及び溶解物の供与源
細胞抽出物又は溶解物である希釈体は、上記希釈体を含む希釈複合体で治療しようとする腫瘍に特異的なｈｓｐ−抗原分子複合体を実質的なレベルでは発現しない、あるいは、上記希釈体を含む希釈複合体が、病原因子によって起こる感染性疾患の治療又は予防を目的とする場合には、感染性疾患の因子に関連する抗原を発現しない。本明細書で用いる用語「実質的なレベルの特異的抗原」とは、免疫原性を示すのに十分な、すなわち、これらが投与される被験者において特異的に免疫応答を誘発、刺激、増強及び／又は維持することができるレベルの抗原を意味する。
【０２２７】
溶解物又は抽出物が本発明で希釈体として用いるのに好適である細胞は、特異的複合体であるｈｓｐ−ペプチド複合体を調製する細胞と同じ細胞でなければ任意の細胞でよい。例えば、特異的複合体を調製するのに用いたものとは異なる細胞又器官型の溶解物又は抽出物を希釈体として使用することができ、また、特異的複合体を調製するのに用いた罹患細胞又は器官型の健康な対応部も使用することができる。
【０２２８】
一実施形態では、特異的複合体は、患者の原発性（非不死化）罹患細胞から調製し、希釈体は、患者の不死化細胞培養物から調製した溶解物とし、この不死化細胞培養物は、特異的複合体を調製する罹患細胞とは異なる抗原特性を有するものとする。
【０２２９】
別の実施形態では、希釈体は、特異的複合体を調製するのに用いたものとは異なる種に由来する細胞から調製した溶解物である。このような細胞は、特異的複合体が取得される細胞の非罹患対応部と同じ又は異なる細胞、組織若しくは器官型としうる。
【０２３０】
４．９．癌及び感染性疾患の予防と治療
本発明によれば、特異的複合体と、希釈体（すなわち、非特異的ｈｓｐ又はｈｓｐ−ペプチド複合体）とを含む希釈複合体である本発明の組成物を、癌又は感染性疾患に罹患したヒト被験者に投与する。一実施形態では、「治療」又は「治療すること」とは、癌若しくは感染性疾患、又は少なくとも１つの認識可能なその症状の改善を意味する。別の実施形態では、「治療」又は「治療すること」とは、必ずしも被験者により認識可能ではない、癌若しくは感染性疾患に関連する少なくとも１つの測定可能な物理的パラメーターの改善を意味する。さらに別の実施形態では、「治療」又は「治療すること」とは、物理的に（例えば、認識可能な症状の安定化）、生理的に（例えば、物理的パラメーターの安定化）、又はその両方のいずれかにより、癌又は感染性疾患の進行を阻止することを意味する。また別の実施形態では、「治療」又は「治療すること」とは、疾患又は障害の発症を遅延させることを意味する。
【０２３１】
特定の実施形態では、癌又は感染性疾患に対する予防対策として、本発明の組成物をヒト被験者に投与する。本明細書で用いる「予防」又は「予防すること」とは、所与の癌又は感染性疾患を獲得するリスクの低減を意味する。この実施形態の一例では、癌の遺伝的素因を有するヒト被験者に対し、予防対策として本発明の組成物を投与する。この実施形態の別の例では、限定するものではないが、化学薬品及び／又は放射線などの発癌因子への暴露を被る被験者、あるいは、感染性疾患の因子への暴露を被る被験者に、予防対策として、本発明の組成物を投与する。
【０２３２】
４．９．１．標的感染性疾患
本発明の方法により治療又は予防することができる感染性疾患は、限定するものではないが、ウイルス、細菌、真菌、原生動物及び寄生生物などの感染性因子により引き起こされる。
【０２３３】
本発明の方法により治療又は予防することができるウイルス性疾患として、限定するものではないが、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、インフルエンザ、水痘、アデノウイルス、単純ヘルペスＩ型（ＨＳＶ−Ｉ）、単純ヘルペスＩＩ型（ＨＳＶ−ＩＩ）、牛疫ウイルス、ライノウイルス、エコーウイルス、ロタウイルス、ＲＳウイルス、パピローマウイルス、パポバウイルス、サイトメガロウイルス、エキノウイルス、アルボウイルス、ハンタウイルス、コクサッキーウイルス、流行性耳下腺ウイルス、麻疹ウイルス、風疹ウイルス、ポリオウイルス、ヒト免疫不全ウイルスＩ型（ＨＩＶ−Ｉ）、及びヒト免疫不全ウイルスＩＩ型（ＨＩＶ−ＩＩ）により引き起こされる疾患が挙げられる。
【０２３４】
本発明の方法により治療又は予防することができる細菌性疾患は、限定するものではないが、マイコバクテリア、リケッチア、マイコプラズマ、ナイセリア及びレジオネラなどの細菌により引き起こされる。
【０２３５】
本発明の方法により治療又は予防することができる原生動物性疾患は、限定するものではないが、リーシュマニア、コクジジオア、及びトリパノソーマなどの原生動物により引き起こされる。
【０２３６】
本発明の方法により治療又は予防することができる寄生生物性疾患は、限定するものではないが、クラジミア及びリケッチアなどの寄生生物により引き起こされる。
【０２３７】
４．９．２．標的癌
本発明の方法により治療又は予防することができる癌には、肉腫及び癌腫、例えば、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、滑膜性腫瘍、中皮腫、ユーイング腫、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、大腸癌、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭癌、乳頭腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支癌、腎細胞癌、肝細胞癌、胆管癌、絨毛癌、精上皮癌、胎生期癌、ウィルムス腫、子宮頸癌、精巣腫瘍、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神経膠腫、星状細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上皮細胞腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴音神経系腫、希突起神経膠腫、髄膜腫、黒色腫、神経芽細胞腫、網膜芽腫、白血病（例えば急性リンパ性及び急性骨髄性白血病（骨髄芽球性白血病、前骨髄球性白血病、骨髄単球性白血病、単球性白血病、及び赤白血病）；慢性白血病（慢性骨髄性（顆粒球性）白血病及び慢性リンパ性白血病））；及び真性赤血球増加症、リンパ腫（ホジキン病及び非ホジキン病）、多発性骨髄腫、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症、及び、Ｈ鎖病が含まれるがこれらに限定されない。かかる癌の具体的な例は、以下の小節に記載する。
【０２３８】
ある特定の実施形態では癌は転移性である。他の特定の実施形態では、癌を有する患者は、ｈｓｐ−ペプチド複合体又はｈｓｐ感作ＡＰＣを投与する前に抗癌治療（例えば化学療法、放射線療法）を受けたために免疫抑制されている。
【０２３９】
本発明により提供される免疫療法を癌患者において使用することが望ましいのには多くの理由がある。第一には、癌患者が免疫抑制状態である場合には麻酔を用いた手術及びその後の化学療法は免疫抑制を悪化させることがある。適切な免疫療法を手術前の期間に行えばこの免疫抑制が回避されたり回復したりする可能性がある。このことは、感染の合併症の低減及び創傷の治癒の加速につながり得る。第二には、腫瘍の大きさは手術後において最も小さく、免疫療法はこの状況で効果的である可能性が高い。第三の理由は、腫瘍細胞は手術の際に循環系に流出するので有効な免疫療法をこの時点で適用すればこれらの細胞を排除することができる可能性があることである。
【０２４０】
本発明の予防及び治療方法は、癌患者の免疫能を手術の前、手術時、又は手術後に高めること、及び、癌細胞に対する腫瘍特異的免疫を誘導することを意図するものであり、その目的は癌の阻害であり、また、最終的な臨床上の目的は癌の完全な治癒及びその根除である。
【０２４１】
４．９．２．１．肝臓への転移性大腸癌（結腸直腸癌）
２０００年には約２２６，６００人のアメリカ人が消化管の癌と診断されるだろうと推定されている。最も注目すべきは、これら患者のうち約９３，８００人は結腸が原発部位であり、さらに約３６，４００人は直腸が原発部位となるということである。さらには、約４７，７００人が結腸癌で死亡し、さらに８，６００人が直腸癌で死亡することが予想されている（Ｃａｎｃｅｒ Ｆａｃｔｓ ＆ Ｆｉｇｕｒｅｓ ２０００， Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｓｏｃｉｅｔｙ（ＡＣＳ）、ジョージア州アトランタ、２０００）。結腸又は直腸癌（大腸癌）で死亡する患者の８０％が、肝臓に起こる転移性疾患を有する。ほとんどの肝臓転移腫瘍は、胃腸の原発部位から派生したものである。残念なことに、転移性肝臓病変の推移経過は深刻な予後をもたらし、全身化学療法では有意な応答率を誘発することも、生存期間を変えることもできない（Ｄｒｅｂｉｎ， Ｊ． Ａ．ら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｉｎ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ， Ｊ．Ｅ． Ｎｉｅｄｅｒｈｕｂｅｒ編、Ｂ．Ｃ． Ｄｅｃｋｅｒ， Ｍｏｓｂｙ， １９９３， ｐ．４２６）。
【０２４２】
大腸癌は、最初に局所リンパ節まで至った後、門静脈循環を介して肝臓に達する。肝臓は、転移の最も一般的な内臓部位である。医療処置を求める大腸癌患者の症状は、病変の解剖学的位置に応じて異なる。例えば、上方に向う結腸における病変は潰瘍であることが多く、これは便への慢性下血を招く。
【０２４３】
侵襲性大腸癌患者にとって治癒する可能性が最大の処置は、根本的な切除である。手術前に、ＣＥＡ力価を測定する。進行した大腸癌患者には、放射線療法及び化学療法を用いる。化学療法剤（例えば、５−フルオロウラシル）を用いた結果を併せても、腫瘍体積が５０％以上縮小した患者は２５％に満たなかった（Ｒｉｃｈａｒｄｓ， ２ｄ， Ｆ．， ら、１９８６， Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｏｎｃｏｌ． ４：５６５）。
【０２４４】
広範に拡大した転移を有する患者は、生存期間が限られており、全身化学療法はこの患者群にはほとんど効果がない。さらに、全身に投与する化学療法は、重度の下痢、粘膜炎及び／又は骨髄抑制など、種々の薬剤に付随する毒性が深刻であるため制限されることが多い。肝臓への放射線照射、全身化学療法、肝動脈結紮、腫瘍塞栓形成及び免疫療法などのその他の技法も全て研究されてきたが、ほとんどは、患者の生存期間を長くするのには無効であることがわかった。
【０２４５】
特定の実施形態では、本発明は、新生物疾患の進行を阻止するために肝臓に転移した大腸癌に罹患した個体において腫瘍特異的免疫を増強するための組成物及び方法を提供する。これらの新生物疾患を治療する好ましい方法は、希釈複合体を投与するステップを含み、ここで該複合体中の特異的複合体は、ペプチド複合体と結合した自己由来のｈｓｐを含み、腫瘍細胞に対する腫瘍特異的免疫を誘発するものである。一実施形態では、上記希釈体も自己由来のものであり、非癌組織から調製する。別の実施形態では、希釈体は同種異系のものであり、例えば、組換え手法により発現したｈｓｐである。より具体的には、特異的複合体がｇｐ９６を含む本発明の組成物の使用により、毒性を誘発することなく、従って、劇的な治療効果を奏しながら、癌患者における肝臓癌増殖のほぼ完全な阻害を達成することができる。
【０２４６】
従って、本発明の方法の一例として、抗原分子と結合したｇｐ９６を含む特異的複合体を含有する希釈複合体を、肝臓転移を伴なう又は伴なわない大腸癌と診断された患者に、様々な投与経路の１つにより投与する。好ましい経路は、様々な解剖学的部位、例えば、左腕、右腕、左腹部、右腹部、左大腿部、右大腿部などで皮内に行なうものである。注射部位は、各週の注射毎に変更する。本発明の方法により予防又は治療することができる原発性及び転移性癌の例については、以下の節に、例示として詳しく記載する（後掲）。
【０２４７】
４．９．２．２．肝細胞癌
肝細胞癌は、米国においては一般に高齢者の疾患である。多くの因子が肝細胞癌の原因となり得るが、この疾患は、通常、肝疾患を既に有する人に限られている。米国における肝細胞癌患者の約６０〜８０％が肝硬変を有し、肝硬変を有する個体の約４％が最終的に肝細胞癌を発症している（Ｎｉｅｄｅｒｈｕｎｂｅｒ， Ｊ．Ｅ．（編）、１９９３， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｈｅｒａｐｙ ｉｎ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ， Ｂ．Ｃ． Ｄｅｃｋｅｒ， Ｍｏｓｂｙ）。このリスクは、肝疾患が遺伝性血色素症又はＢ型肝炎ウイルス感染によって起こる患者で最も高い（Ｂｒａｄｂｅａｒ， Ｒ．Ａ．ら、１９８５， Ｊ． Ｎａｔｌ． Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ． ７５：８１；Ｂｅａｓｌｅｙ， Ｒ．Ｐ．ら、１９８１， Ｌａｎｃｅｔ ２：１１２９）。また、過去十年の間に、Ｃ型肝炎ウイルス感染も危険因子となることが明らかになってきた（Ｃｏｌｏｍｂｏ， １９９９， Ｂａｉｌｌｉｅｒｅｓ Ｂｅｓｔ Ｐｒａｃｔ Ｒｅｓ Ｃｌｉｎ Ｇａｓｔｏｅｎｔｅｒｏｌ １３（４）：５１９−２８）。肝細胞癌を引き起こす可能性がある肝硬変の他の原因としては、アルコール乱用や、メトトレキセートの長期投与によって生じる肝線維症が挙げられる。肝細胞癌に最もよくみられる症状は、右上腹部又は上胃部における痛みを伴なう塊の発生であり、これには体重減少が付随する。肝硬変患者において、肝細胞癌の発症前に、腹水、門脈圧亢進、及び、比較的突然の臨床上の悪化が起こる。ほとんどの患者で、血清アミノトランスフェラーゼやアルカリ性ホスファターゼ等の標準的肝機能試験に異常値が観察される。
【０２４８】
肝臓のＣＴスキャンを用いて、肝細胞癌の解剖学的分布を決定することができ、また、経皮針生検の位置を決定することもできる。肝細胞癌患者の約７０％が、血清α−フェトプロテイン濃度の上昇を示し（ＭｃＩｎｔｉｒｅ， Ｋ．Ｒ．ら、１９７５， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ３５：９９１）、その濃度は疾患の程度と相関している。
【０２４９】
根本的な切除だけが、肝細胞癌患者が治癒する唯一の望みを提供する。このような手術方法によれば、５年生存率は１２〜３０％である。肝移植によって、若い個体の生存率が改善されることもある。しかし、ほとんどの患者は、広範な肝硬変多病巣性の腫瘍パターン、又は適合するドナー器官の不足のために、手術候補とはならない。
【０２５０】
化学療法剤は、静脈内経路により又は肝内動脈カテーテルを通じてのいずれかで投与されている。このような治療は、肝臓への放射線照射と組み合わされて行なわれることもあった。ドキソルブシン又は５−フルオロウラシルの全身投与のいずれかで治療した患者の中には、測定可能な腫瘍サイズの５０％以上の縮小があったことが報告されている。しかし、化学療法は、往々にして、免疫抑制を誘発し、腫瘍を完全に消失させることは希であり、応答の持続時間も短い。肝細胞癌患者の予後は、肝硬変、及び肺又は骨への転移とネガティブに相関している。患者の平均生存期間は４〜６ヶ月でしかない。特定の実施形態では、本発明は、前新生物及び新生物細胞に放射線照射する際に、最終的に新生物疾患の進行を阻止するために、肝細胞癌に罹患した個体において特異的免疫を増強する組成物及び方法を提供する。
【０２５１】
４．９．２．３．乳癌
本発明の別の特定の態様は、乳癌の治療に関する。アメリカ癌協会（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｓｏｃｉｅｔｙ）は、２０００年には、１８４，２００人のアメリカ人女性が乳癌と診断され、４１，２００人が乳癌で死亡するであろうと推定した（Ｃａｎｃｅｒ Ｆａｃｔｓ ＆ Ｆｉｇｕｒｅｓ ２０００， Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｓｃｏｃｉｅｔｙ（ＡＣＳ）、ジョージア州アトランタ、２０００）。これにより、乳癌は、癌による女性の死亡原因において、肺癌に次いで第２位となる。乳癌の治療は、現在のところ、外科手術、放射線療法、ホルモン療法及び／又は化学療法を行う。２つの乳癌の特徴であるホルモン受容体と疾患の程度を考察することにより、いかにしてホルモン療法及び標準量化学療法を順次行なって生存率を改善し、クオリティーオブライフ（ＱＯＬ）を維持又は向上させるかを決定していた。多様な多薬剤療法が、乳癌患者の補助治療として用いられているが、このような薬剤として、限定するものではないが、２シクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチンメトトレキセート、５−フルオロウラシル及び／又はロイコボリンの組合せが挙げられる。特定の実施形態では、本発明は、女性における前新生物及び新生物乳房細胞に対する特異的免疫を増強するための希釈複合体のｈｓｐ組成物及び方法を提供する。加えて、本発明は、乳癌のリスクが高い女性における新生物細胞の発生を阻止し、癌細胞増殖及び転移を阻害するための希釈複合体の組成物及び方法を提供する。本発明の組成物は、単独で、又は互いに若しくは生物応答修飾物質と組み合わせて使用することができる。
【０２５２】
４．９．３．自己由来の実施形態
ｈｓｐの特異的免疫原性は、ｈｓｐ自体に由来するのではなく、それらに結合したペプチドに由来する。本発明の好ましい実施形態では、癌ワクチンとして用いる本発明の組成物における特異的複合体は、自己由来の（ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ）複合体であるため、癌免疫療法における最も困難な問題の２つを回避することができる。１つは、実験動物の癌と同様、ヒト癌は、抗原が異なる可能性があることである。本発明の好ましい実施形態では、特異的複合体のｈｓｐは、それらが由来する癌細胞の抗原ペプチドの抗原ペプチドと同じであり（ｃｈａｐｅｒｏｎｅ）、上記の問題を回避する。２つめは、癌免疫療法の現在最も一般的な手法が、癌細胞系のＣＴＬ−認識エピトープの決定に焦点を絞っていることである。この手法では、癌に対する細胞系及びＣＴＬが利用可能でなければならない。これらの試薬は、ヒト癌の大部分には利用不可能である。ｈｓｐ−ペプチドの自己由来の特異的複合体の使用に関する本発明の実施形態では、癌免疫療法は、細胞系又はＣＴＬの利用可能性に依存せず、また、癌細胞の抗原エピトープの決定も必要としない。これらの利点によって、ペプチド複合体に結合した自己由来のｈｓｐは、魅力的な対癌免疫原となる。自己由来の実施形態の一例では、希釈体も、それを投与する個体の自己由来のものとしうるが、特異的複合体の抗原分子を含まないと予想される別の細胞供与源に由来するものとする。この実施形態の別の例では、希釈体は、本発明の組成物を投与しようとする個体によってコードされる熱ショックタンパク質を発現する細胞培養系列から調製することができる。この実施形態の別の例では、希釈体の熱ショックタンパク質は、本発明の組成物を投与しようとする個体の同種異系のものであってもよい。
【０２５３】
４．１０．ｈｓｐ−及びα２Ｍ−ペプチド複合体の免疫原性の決定
当該技術分野では公知の方法を用いて、本発明の特異的複合体及び希釈複合体を免疫原性について任意にアッセイしてもよい。また、希釈体をアッセイすることにより、目的とする抗原供与源に対する抗原性の欠如、又は対照複合体として、確認することもできる。例として、限定するものではないが、以下に挙げる手順の１つを用いることができる。好ましい実施形態では、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイを用いる（後掲、第４．１０．４節を参照）。
【０２５４】
４．１０．１．ＭＬＴＣアッセイ
簡単に説明すると、任意の好適な投与経路を用いて、マウスに所定量の特異的複合体及び希釈複合体を注射する。陰性対照として、例えば非特異的又は希釈体として用いる、ｈｓｐ−ペプチド又はα２Ｍ−ペプチド複合体を他のマウスに注射する。特異的抗原を含むことがわかっている細胞、例えば、腫瘍細胞又は感染性疾患の因子に感染した細胞は、このアッセイの陽性対照として用いることができると考えられる。マウスには、７〜１０日あけて、２回注射する。最後の免疫感作から１０日後に、脾臓を取り出して、リンパ球を放出させる。放出されたリンパ球は、後に、目的とする抗原を発現した死細胞の添加によりｉｎ ｖｉｔｒｏで刺激することができる。
【０２５５】
例えば、８×１０６個の免疫脾細胞は、１０％ウシ胎児血清を含む３ｍｌのＲＰＭＩ培地中で目的とする抗原を含む、４×１０４個のマイトマイシンＣ処理又はγ線照射（５〜１０，０００ラド）細胞（又は、場合によっては、適当な遺伝子でトランスフェクトした細胞）で刺激することができる。特定の事例では、Ｔ細胞増殖因子の供与源として、３３％二次混合リンパ球培養物上清を培地に含有させる（Ｇｌａｓｅｂｒｏｏｋら、１９８０， Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １５１：８７６）。免疫感作後の一次細胞傷害性Ｔ細胞応答を試験するため、脾細胞を刺激なしで培養する。いくつかの実験では、免疫感作したマウスの脾細胞を、抗原が異なる細胞で再刺激することにより、細胞傷害性Ｔ細胞応答の特異性を決定する。
【０２５６】
６日後、４時間の５１Ｃｒ−放出アッセイで細胞傷害性について培養物を試験する（Ｐａｌｌａｄｉｎｏら、１９８７， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ４７：５０７４−５０７９及びＢｌａｃｈｅｒｅら、１９９３， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ １４：３５２−３５６）。このアッセイでは、混合したリンパ球培養物を標的細胞懸濁液に添加することにより、様々なエフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）比（通常１：１〜４０：１）とする。２０ｍＣｉ５１Ｃｒ／ｍｌを含む培地中で１×１０６個の標的細胞を３７℃で１時間インキュベートすることにより、標的細胞を前標識する。標識後、これらの細胞を３回洗浄する。各アッセイ点（Ｅ：Ｔ比）を三連で試験し、好適な対照を用いて、自然５１Ｃｒ放出（リンパ球はアッセイに一切添加しない）及び１００％放出（界面活性剤で溶解させた細胞）を測定する。細胞混合物を４時間インキュベートした後、２００ｇで５分遠心することにより、細胞をペレット化する。上清に放出された５１Ｃｒの量をガンマカウンターで測定する。細胞傷害性率（％）は、試験サンプル中のｃｐｍから自然放出したｃｐｍを引いた差を、界面活性剤を用いた放出ｃｐｍの合計から自然放出ｃｐｍを引いた差で割った商として評価する。
【０２５７】
ＭＨＣクラスＩカスケードを阻止するために、Ｋ−４４ハイブリドーマ細胞（抗ＭＨＣクラスＩハイブリドーマ）に由来する濃縮ハイブリドーマ上清を試験サンプルに添加して、最終濃度を１２．５％にする。
【０２５８】
４．１０．２．ＣＤ４＋Ｔ細胞増殖アッセイ
Ｋｒｕｓｅ及びＳｅｂａｌｄ， １９９２， ＥＭＢＯ Ｊ． １１：３２３７−３２４４に記載されているのとほぼ同様に、一次Ｔ細胞を脾臓、新鮮な血液又はＣＳＦから取得した後、ＦＩＣＯＬＬ−ＰＡＱＵＥ ＰＬＵＳ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、スエーデンＵｐｓａｌｌａ）を用いた遠心分離により精製する。末梢血単核細胞を、抗原分子を発現する細胞の溶解物と一緒に７〜１０日インキュベートする。溶解物中の抗原を処理及び提示するために、任意によりアッセイの２４〜４８時間前に抗原提示細胞を培養物に添加してもよい。次に、遠心分離により細胞を回収し、ＲＰＭＩ １６４０倍地中で洗浄する（ＧｉｂｃｏＢＲＬ、メリーランド州Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ）。５×１０４個の活性化Ｔ細胞／ウェルを、９６ウェルプレート上の１０％ウシ胎児血清、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１００単位／ｍｌペニシリンＧ、及び１００μｇ／ｍｌ硫酸ストレプトマイシンを含むＲＰＭＩ １６４０倍地中で３７℃で７２時間培養し、次いで、１μｌＣｉ３Ｈ−チミジン（Ｄｕｐｏｎｔ ＮＥＮ、マサチューセッツ州ボストン）／ウェルで６時間パルスした後、回収し、ＴＯＰＣＯＵＮＴシンチレーションカウンター（Ｐａｃｋａｒｄ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ Ｃｏ．、コネティカット州メリデン）で放射能測定した。
【０２５９】
４．１０．３．抗体応答アッセイ
本発明の特定の実施形態では、ｈｓｐ−ペプチド又はα２Ｍ−ペプチド複合体のワクチン接種に応答して産生された抗体を測定することにより、該複合体の免疫原性を決定する。実施形態の一例では、ＰＢＳ中のワクチン（例えば、Ａβ４２）に用いたペプチドの精製された非ｈｓｐ又はα２Ｍ複合体化形態の０．７５μｇ／ｍｌ溶液を５０μｌ／ウェルで、マイクロプレート（９６ウェルイムノプレートＩＩ、Ｎｕｎｃ）を４℃で１６時間、２０℃で１時間かけてコーティングする。ウェルを空にし、１ウェルにつき、２００μｌのＰＢＳ−Ｔ−ＢＳＡ（０．５％（ｖ／ｖ）ＴＷＥＥＮ２０及び１％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミンを含むＰＢＳ）で２０℃で１時間かけてブロッキングした後、ＰＢＳ−Ｔで３回洗浄する。ワクチン接種した動物（モデルマウス又はヒト患者など）から得た５０μｌ／ウェルの血漿又はＣＳＦを２０℃で１時間かけて添加・放置した後、プレートをＰＢＳ−Ｔで３回洗浄する。次に、必要に応じて、ＰＢＳ−Ｔ−ＢＳＡ中で１：１，５００に希釈したセイヨウワサビペルオキシダーゼ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）とコンジュゲートさせた５０μｌ／ウェルのヒツジ抗マウス又は抗ヒト免疫グロブリンと一緒に、次いで（前記と同様ＰＢＳ−Ｔでさらに３回洗浄後）、５０μｌのｏ−フェニレンジアミン（ＯＰＤ）−Ｈ２Ｏ２基質溶液と一緒に、２０℃で１時間インキュベートした後、抗ペプチド抗体活性を熱量計により測定する。５分後１５０μｌの２Ｍ  Ｈ２ＳＯ４で反応を停止し、Ｋｏｎｔｒｏｎ ＳＬＴ−２０光度計（ＳＬＴ Ｌａｂ−ｉｎｓｔｒ．， スイスチューリッヒ）により４９２ｎｍ（基準６２０ｎｍ）で吸光度を測定する。
【０２６０】
４．１０．４．サイトカイン検出アッセイ
本発明の希釈複合体に対するＣＤ＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞増殖応答は、特定のサイトカインのレベルの検出及び定量により測定することができる。一実施形態では、例えば、本発明の複合体の免疫原性を調べるＩＦＮ−γ検出アッセイを用いて、細胞内サイトカインを測定することができる。この方法の一例では、希釈複合体で治療する被験者からの末梢血単核細胞を、所与の腫瘍のペプチド抗原又は感染性疾患の因子のペプチド抗原で刺激する。次に、フローサイトメトリーにより検出可能なＴ細胞特異的標識抗体、例えば、ＦＩＴＣ−コンジュゲート抗ＣＤ８やＰｅｒＣＰ標識抗ＣＤ４抗体で、細胞を染色する。洗浄後、細胞を固定し、透過性にし、ヒトＩＦＮ−γと反応性の色素標識抗体（ＰＥ−抗ＩＦＮ−γ）と反応させる。標準的方法を用いて、サンプルをフローサイトメトリーにより分析する。
【０２６１】
これ以外にも、フィルター免疫アッセイ、酵素結合イムノスポット（ＥＬＩＳＰＯＴ）アッセイを用いて、Ｔ細胞に存在する特定のサイトカインを検出することもできる。一実施形態では、例えば、ニトロセルロースを裏打ちした（ｂａｃｋｅｄ）マイクロプレートを、精製したサイトカイン特異的一次抗体、例えば、抗ＩＦＮ−γでコーティングした後、プレートをブロッキングし、他のタンパク質の非特異的結合によるバックグラウンドを回避する。希釈複合体で治療した被験者から得た、サイトカイン分泌細胞を含む単核血液細胞のサンプルをマイクロプレートのウェル上に希釈する。標識した、例えばビオチン標識した二次抗サイトカイン抗体を添加する。次に、抗体サイトカイン複合体を検出することができる。すなわち、酵素コンジュゲートストレプトアビジンにより、サイトカイン分泌細胞は、視覚、顕微鏡、又は電子検出方法により「スポット」として出現する。
【０２６２】
４．１０．５．四量体アッセイ
別の実施形態では、「四量体染色」アッセイ（Ａｌｔｍａｎら、１９９６， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７４：９４−９６）を用いて、抗原特異的Ｔ細胞を同定することができる。例えば、一実施形態では、腫瘍特異的抗原のような特異的ペプチド抗原を含むＭＨＣ分子を多量体化することにより、可溶性ペプチド四量体を作製してから、例えば、ストレプトアビジンと複合体化させることにより、標識する。次に、ＭＨＣ−ペプチド抗原複合体を、希釈複合体で治療する被験者から取得したＴ細胞集団と混合する。次に、ビオチンを用いて、目的とする抗原、すなわち、腫瘍特異的抗原を発現するＴ細胞を染色する。
【０２６３】
４．１１．養子免疫療法との組合せ
養子免疫療法とは、癌又は感染性疾患を治療するための治療上の手法であって、免疫細胞が、腫瘍細胞及び／若しくは抗原成分に対し特異的な免疫を直接的又は間接的に媒介する、あるいは場合によっては感染性疾患を治療するか又は腫瘍を退縮させることを目的として、免疫細胞を宿主に投与するものである（１９９９年１１月１６日に登録された米国特許第５，９８５，２７０号を参照されたい；この文献はその全体を参照により本明細書に組み入れるものとする）。本明細書に記載する方法に従って、任意ステップとして、抗原（若しくは免疫原）分子と複合体化したｈｓｐ又はα２ＭでＡＰＣを感作し、それを養子免疫療法に使用してもよい。
【０２６４】
特定の実施形態においては、任意の所望の投与経路を用いて希釈複合体を投与することにより行う治療法を、ｈｓｐ−ペプチド又はα２Ｍ−ペプチド複合体で感作したＡＰＣを用いる養子免疫療法と組合せてもよい。感作されたＡＰＣは、単独で、あるいは希釈複合体と同時に投与するか、又は希釈複合体を投与する前若しくは後に投与することができる。更には、投与経路を変えることができ、例えば限定されるものではなく、皮下投与、静脈内投与、又は筋肉内投与が挙げられるが、皮内投与が好ましい。
【０２６５】
４．１１．１．抗原提示細胞の獲得
抗原提示細胞（マクロファージ、樹状細胞及びＢ細胞を含むがこれらに限定されない）は、好ましくは、Ｉｎａｂａ， Ｋ．ら， １９９２， Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １７６：１６９３−１７０２に記載のようにヒトの末梢血又は骨髄からの幹細胞及び前駆細胞からｉｎ ｖｉｔｒｏで調製することにより得る。樹状細胞は当該技術分野において既知の種々の任意の方法により得ることができる。例えば限定するものではないが、樹状細胞は、Ｓａｌｌｕｓｔｏら、１９９４， Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １７９：１１０９−１１１８及びＣａｕｘら、１９９２， Ｎａｔｕｒｅ ３６０， ２５８−２６１（参照によりその全体を本明細書に組み入れる）に記載の方法により得ることができる。このましい態様においては、ヒトの血球から得られたヒト樹状細胞を使用する。
【０２６６】
ＡＰＣは当該技術分野において既知の種々の任意の方法により得ることができる。ある好ましい態様では、用いるヒトマクロファージをヒト血球から得る。例えばマクロファージを次のように得ることができるがこれに限定されない：
単核細胞を患者（好ましくは治療対象の患者）の末梢血から、フィコール−ハイパーク勾配遠心法により単離し、患者自身の血清又は他のＡＢ＋ヒト血清によりコーティングした組織培養ディッシュ上に播種する。該細胞を３７℃にて１時間インキュベートし、次いで付着しなかった細胞をピペッティングにより除く。該ディッシュに残された付着細胞に冷たい（４℃）リン酸緩衝化生理食塩水中１ｍＭのＥＤＴＡを添加し、室温にて１５分間静置する。細胞を回収し、ＲＰＭＩバッファーで洗浄し、ＲＰＭＩバッファー中に懸濁させた。マクロファージの数は、マクロファージ−コロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）と共に３７℃にてインキュベートすることにより増加させる。
【０２６７】
４．１１．２．ｈｓｐ−ペプチド複合体による抗原提示細胞の感作
ＡＰＣを、抗原分子と結合したｈｓｐ又はα２Ｍにより、好ましくは該細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏにて該複合体とインキュベートすることにより、感作させる。ＡＰＣを、本発明の特異的複合体又は希釈複合体により、ｉｎ ｖｉｔｒｏにて該複合体と共に３７℃にて１５分間〜２４時間インキュベートすることにより、感作させる。限定するものではないが例えば、４×１０７個のマクロファージを、１ｍｌあたり１０μｇのｇｐ９６−ペプチド複合体と共に、又は、１ｍｌあたり１００μｇのｈｓｐ９０−ペプチド複合体と共に、３７℃にて１５分間〜２４時間、１ｍｌの無添加ＲＰＭＩ培地中でインキュベートすることができる。細胞を３回洗浄し、患者に注射するのに適切な濃度（例えば１×１０７／ｍｌ）で好ましくは無菌の生理学的培地中に再懸濁する。好ましくは、感作されたＡＰＣを注入する患者は、もともとＡＰＣを単離した患者である（自己由来の実施形態）。
【０２６８】
場合により、感作されたＡＰＣの、例えば抗原特異的な、クラスＩに限定される細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）を刺激する能力を、該ＡＰＣがＣＴＬを刺激して腫瘍壊死因子を放出させる能力によりモニターすることができ、また、該ＡＰＣがかかるＣＴＬの標的として作用する能力によりモニターすることができる。
【０２６９】
４．１１．３．感作ＡＰＣの再注入
特異的複合体又は希釈複合体で感作したＡＰＣを、通常の臨床的な手順により、好ましくは皮内投与により、患者に全身的に再注入する。これらの活性化された細胞を、好ましくは、該細胞が由来する（自己由来）患者に全身投与することにより、再注入する。患者は、該患者の状態に応じて一般的に約１０６〜約１０１２個の感作マクロファージを投与される。治療計画においては場合により、患者に対し、上記に加えて、限定するものではないが、サイトカインＩＦＮ−α、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＴＮＦ又はその他のサイトカイン増殖因子など、適量の生物応答修飾物質を投与してもよい。
【０２７０】
４．１２．受動免疫療法
また、本発明の組成物は、癌及び感染性疾患に対する受動免疫療法にも用いることができる。受動免疫は、宿主を短期間保護するものであり、異種生物に対する予め形成させた抗体の投与によって達成される。例えば、感染性生物に感染した細胞から得た希釈複合体を含む本発明の組成物を用いて、好ましくは特異的又は希釈複合体の共有結合架橋後に、被験者において免疫応答を誘発することができる。この患者から採取した血清は、別の患者において上記感染性生物により引き起こされた疾患の治療又は予防に用いることもできる。場合により、血清中の特異的抗体を、例えばアフィニティー精製により精製してもよい。
【０２７１】
４．１３．癌治療のための組合せ療法
本発明の組成物は、放射線療法又は１以上の化学療法剤による治療と一緒に投与することができる。放射線療法において、放射線はγ線又はＸ線とすることができる。放射線療法の概要については、Ｈｅｌｌｍａｎ， 第１６章： Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ： Ｒａｄｉａｔｉｏｎ Ｔｈｅｒａｐｙ， 第６版、２００１， ＤｅＶｉｔａら編、Ｊ．Ｂ． Ｌｉｐｐｅｎｃｏｔｔ Ｃｏｍｐａｎｙ， フィラデルフィアを参照されたい。有用な化学療法剤として、下記のものが挙げられる：メトトレキセート、タキソール、メルカプトプリン、チオグアニン、ヒドロキシ尿素、シタラビン、シクロホスファミド、イホスファミド、ニトロソ尿素類、シスプラチン、カルボプラチン、マイトマイシン、ダカルバジン、プロカルビジン、エトポシド類、カムパテシン類、ブレオマイシン、ドキソルビシン、イダルビシン、ダウノルビシン、ダクチノマイシン、プリカマイシン、ミトキサントロン、アスパラギナーゼ、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビノレルビン、パクリタキセル、及びドセタキセル。特定の実施形態では、本発明の組成物は、放射線療法又は１以上の化学療法剤と同時に投与する。別の特定の実施形態では、本発明の組成物の投与前又は投与後、好ましくは本発明の組成物の投与から少なくとも１時間、５時間、１２時間、１日、１週間、１ヶ月、さらに好ましくは数ヶ月（３ヶ月以下）後に、化学療法又は放射線療法を実施する。
【０２７２】
４．１４．製剤化、投与及びキット
４．１４．１．製剤化及び投与
前述のように、本発明の組成物は、（ｉ）ｈｓｐ又はα２Ｍ分子複合体と、（ｉｉ）ｈｓｐ、α２Ｍ、又はｈｓｐ若しくはα２Ｍ分子複合体、すなわち、（ｉ）特異的複合体と（ｉｉ）希釈体との免疫原混合物を含む。各複合体は、均質の性質であってもよいし、又は熱ショックタンパク質−ペプチド複合体若しくはα２Ｍ分子複合体の混合物を含むものでもよい。特異的複合体と希釈体の両方がｈｓｐを含む場合には、特異的複合体及び希釈体は、各々が、同じ熱ショックタンパク質又は異なる熱ショックタンパク質を主として含むものでよい。特異的複合体及び希釈体は、各々又は両方共に、ｉｎ ｖｉｖｏ供与源から、例えば特異的複合体の場合には罹患組織からの精製により、また、希釈体の場合には非罹患組織からの精製により、あるいはｉｎ ｖｉｔｒｏ供与源から、例えば、熱ショックタンパク質及び会合ペプチドの組換え発現により、調製することができる。上記組成物は、特異的複合体の調製物と希釈体の調製物とを混合することにより、調製することもできる。本発明の希釈複合体において、特異的複合体と希釈体との質量比は、好ましくは１：１〜１：１，０００、さらに好ましくは１：１〜１：１００などの範囲にあり、例えば、１：１、１：２、１：５、１：１０、１：２０、１：５０、１：１００などである。
【０２７３】
投与する希釈複合体の量は、希釈複合体中の特異的複合体の量、並びに各々の成分に応じて変動する。投与量は、希釈複合体に関して、又は希釈複合体中の特異的複合体成分に関して、測定することができる。
【０２７４】
希釈複合体の投与量は、特異的複合体がｇｐ９６、ｈｓｐ７０、ｈｓｐ１１０又はｇｒｐ１７０を含む場合には、好ましくは１〜１００μｇであり、より好ましくは２〜５０μｇであり、最も好ましくは約５〜２５μｇである。
【０２７５】
特異的複合体がｈｓｐ９０を含む場合には、希釈複合体の投与量は、好ましくは１０〜５００μｇであり、より好ましくは２０〜４００μｇであり、さらにまた好ましくは５０〜２５０μｇである。
【０２７６】
特異的複合体がα２Ｍを含む場合には、希釈複合体の投与量は、好ましくは１μｇ〜１０ｍｇであり、さらに好ましくは２μｇ〜５ｍｇであり、またさらに好ましくは５μｇ〜５００μｇであり、最も好ましくは５〜２５０μｇである。
【０２７７】
特異的複合体がカルレティキュリンを含む場合には、希釈複合体の投与量は、好ましくは０．５〜５０μｇであり、さらに好ましくは１〜２５μｇであり、さらにまた好ましくは２μｇ〜１５μｇであり、最も好ましくは２．５〜１０μｇである。
【０２７８】
特異的複合体の量に関して、希釈複合体の投与量は、希釈複合体の合計量とは関係なく、ｇｐ９６、ｈｓｐ７０、ｈｓｐ１１０又はｇｒｐ１７０を含む特異的複合体を、１〜１０μｇ、２〜５μｇ、５〜１０μｇ、又は１０〜２０μｇで含む量である。この実施形態の具体例としては、希釈複合体の投与量は、ｇｐ９６、ｈｓｐ７０、ｈｓｐ１１０又はｇｒｐ１７０を含む特異的複合体を、約１μｇ、２μｇ、３μｇ、４μｇ、５μｇ、又は１０μｇで含む量である。
【０２７９】
別の実施形態では、希釈複合体の投与量は、希釈複合体の合計量とは関係なく、ｈｓｐ９０を含む特異的複合体を、５〜５０μｇ、１０〜１００μｇ、２０〜５０μｇ又は５０〜１００μｇで含む量である。この実施形態の具体例としては、希釈複合体の投与量は、ｇｐ９６、ｈｓｐ７０、ｈｓｐ１１０又はｇｒｐ１７０を含む特異的複合体を、約５μｇ、７．５μｇ、１０μｇ、１２．５μｇ、１５μｇ、２０μｇ、３０μｇ、４０μｇ又は５０μｇで含む量である。
【０２８０】
さらに別の実施形態では、希釈複合体の投与量は、希釈複合体の合計量とは関係なく、ｈｓｐ９０を含む特異的複合体を、５〜５０μｇ、１０〜１００μｇ、２０〜５０μｇ又は５０〜１００μｇで含む量である。この実施形態の具体例としては、希釈複合体の投与量は、ｇｐ９６、ｈｓｐ７０、ｈｓｐ１１０又はｇｒｐ１７０を含む特異的複合体を、約５μｇ、７．５μｇ、１０μｇ、１２．５μｇ、１５μｇ、２０μｇ、３０μｇ、４０μｇ又は５０μｇで含む量である。
【０２８１】
さらに別の実施形態では、希釈複合体の投与量は、希釈複合体の合計量とは関係なく、ｇｐ９６、ｈｓｐ７０、ｈｓｐ１１０又はｇｒｐ１７０を含む特異的複合体を、０．５〜５μｇ、１〜２．５μｇ、２．５〜５μｇ、又は５〜１０μｇで含む量である。この実施形態の具体例としては、希釈複合体の投与量は、カルレティキュリンを含む特異的複合体を、約０．５μｇ、１μｇ、１．５μｇ、２μｇ、２．５μｇ、又は５μｇで含む量である。
【０２８２】
以下の表１は、治療又は予防の各々を目的として、本発明の組成物を投与する特異的及び希釈ｈｓｐ及び／又はα２Ｍ量の組合せ例を示す：
【表１】
2004524820.tif 000002
【０２８３】
本発明の希釈複合体は、癌又は感染性疾患の治療又は予防を目的として、哺乳動物、好ましくはヒトに投与するための医薬製剤に製剤化することができる。適合可能な医薬担体中に配合される本発明の希釈複合体を含む組成物は、ヒト肉腫や癌腫などの記載した腫瘍の治療のために調製し、包装し及びラベル標識することができる。あるいは、医薬組成物は、好適な感染性疾患の治療のために製剤化することができる。
【０２８４】
薬剤の溶解度及び吸収部位は、治療薬の投与経路を選択する際に、考慮すべき要素である。本発明の実施形態では、所望の投与経路で、好ましくは皮下、さらに好ましくは皮内に、ｈｓｐ−ペプチド複合体を投与することができる。皮内投与の利点は、吸収が速いことである。
【０２８５】
希釈複合体が水溶性であれば、適切なバッファー（例えばリン酸緩衝化生理食塩水又は他の生理学的に混和可能な溶液、好ましくは無菌バッファー）中に製剤化することができる。あるいは、得られる複合体が水性媒質中で溶解性が低い場合は、Ｔｗｅｅｎ又はポリエチレングリコールのような非イオン性界面活性剤とともに製剤化してもよい。このように、希釈複合体及びその生理学的に許容される溶媒和物を、吸入法若しくは気体注入法（口若しくは鼻による）による投与、又は経口投与、舌下投与、非経口投与、直腸投与のために製剤化することができ、あるいは、腫瘍の場合は充実性腫瘍への直接注入のために製剤化することができる。
【０２８６】
経口投与のためには、医薬調製物は、液体状（例えば溶剤、シロップ剤又は懸濁剤）であってよく、あるいは使用直前に水若しくは他の好適なビヒクルにより再構成するための薬品として提供してもよい。かかる液体製剤は、懸濁化剤（例えばソルビトールシロップ、セルロース誘導体又は食用硬化油脂）；乳化剤（例えばレシチン又はアカシア）；非水性ビヒクル（例えばアーモンド油、油性エステル又は精製植物油）；保存剤（例えばメチル−若しくはプロピル−ｐ−ヒドロキシ安息香酸エステル、又はソルビン酸）などの薬学的に許容される添加物とともに通常の方法により調製することができる。医薬組成物は、例えば、結合剤（例えばα化トウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドン又はヒドロキシプロピルメチルセルロース）；充填剤（例えばラクトース、微結晶セルロース又はリン酸水素カルシウム）；滑沢剤（例えばステアリン酸マグネシウム、タルク又はシリカ）；崩壊剤（例えばジャガイモデンプン又はデンプングリコール酸ナトリウム）；又は湿潤剤（例えばラウリル硫酸ナトリウム）などの薬学的に許容される賦形剤とともに通常の方法により調製した錠剤又はカプセル剤の形態をとることもできる。錠剤は当該技術分野において周知の方法によりコーティングしてもよい。
【０２８７】
経口投与のための製剤は、希釈複合体を制御放出できるように好適に製剤化することもできる。
【０２８８】
舌下投与のために、かかる組成物は、通常の方法で製剤化された錠剤又はロゼンジ剤の形態をとり得る。
【０２８９】
希釈複合体は、注射による（例えばボーラス注射又は連続注入などによる）非経口投与用に製剤化することができる。注射用製剤は、単位投与剤形として、例えばアンプル又は複数投薬容器の中に保存剤を加えた形で提供することができる。本発明の組成物は、油性若しくは水性ビヒクル中の懸濁剤、溶剤又は乳剤などの形態であってもよく、懸濁化剤、安定化剤及び／又は分散剤等の製剤化用物質を含み得る。あるいは、有効成分は、使用する前に好適なビヒクル（例えば発熱物質を含まない無菌水）で構成するための粉末状のものであってもよい。
【０２９０】
また希釈複合体は、例えばカカオバター又は他のグリセリド等の従来の坐剤基剤を含む坐剤又は貯留浣腸等の直腸投与用組成物として製剤化してもよい。
【０２９１】
先に記載した製剤のほかに、希釈複合体は、デポ製剤として製剤化されてもよい。このような長時間作用する製剤は、埋込（例えば皮下又は筋肉内）により、又は筋肉内注射により、投与することができる。したがって、例えば希釈複合体は、好適なポリマー材料若しくは疎水性材料と一緒に（例えば許容可能な油中の乳剤として）、又はイオン交換樹脂と一緒に、あるいは例えば難溶性塩等の難溶性誘導体として、製剤化することができる。リポソーム及びエマルションは、親水性の薬物の送達ビヒクル又は担体として周知の例である。
【０２９２】
吸入法により投与する場合、本発明に従って使用する希釈複合体は、適切な噴射剤（例えばジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素又は他の好適な気体）を用いて、加圧パック又はネブライザーからエアロゾルスプレーとして都合よく送達される。加圧エアロゾルの場合、投与単位は、一定量を送達するためのバルブを備えることにより送達することができる。吸入器又は気体注入器で用いるカプセル及び薬包（例えばゼラチン製など）は、ラクトースやデンプンなどの好適な粉末基剤と希釈複合体との混合粉末を含むように製剤化することができる。
【０２９３】
本発明の組成物は、所望であれば、有効成分を含む単位投与剤形を１つ以上含むパック又はディスペンサーデバイスに入れて提供してもよい。このパックは、例えば金属箔又はプラスチック箔製のもの（例えばブリスターパック等）としうる。パック又はディスペンサーデバイスに、投与に関する説明書を添付してもよい。
【０２９４】
４．１４．２．キット
本発明はまた、本発明の方法及び／又は治療計画を行うためのキットをも提供する。一実施形態において、かかるキットは、１以上の容器内に、自己由来の投与のために特定の患者から単離される特異的複合体と組み合わせるための希釈体を含む。場合により、さらに、最適な抗原分子と複合体化させるための精製ｈｓｐ又はα２Ｍを第２容器中に提供してもよい。
【０２９５】
別の実施形態において、かかるキットは、１以上の容器内に、治療上又は予防上有効な量の希釈複合体、好ましくは精製された希釈複合体を薬学的に許容し得る形態で含んでいる。上記キットは場合によりさらに、第２容器中にＡＰＣ（好ましくは精製形態のもの）を含んでもよい。該ＡＰＣは感作されたものであってもよい。あるいは、上記キットは、さらに別の容器中に、ＡＰＣを感作するための特異的複合体又は希釈複合体を提供するものであってもよい。
【０２９６】
本発明のキットの容器内のｈｓｐ−ペプチド又はα２Ｍ−ペプチド複合体は、薬学的に許容される溶液の形態としうる。例えば、無菌の生理食塩水、デキストロース溶液、若しくは緩衝化溶液、又は薬学的に許容され得る無菌の溶液と組合わせられている。あるいは、ｈｓｐ又はα２Ｍ調製物は、凍結乾燥されているか又は乾燥されていてよい。この場合は、該キットは更に、場合により、注射する目的でｈｓｐ、α２Ｍ又はｈｓｐ−若しくはα２Ｍ−含有複合体を溶液として再構成するために、容器中に、好ましくは無菌の、薬学的に許容される溶液（例えば生理食塩水、デキストロース溶液等）を含んでもよい。
【０２９７】
別の実施形態において、本発明のキットは、場合により、抗原分子とｈｓｐ又はα２Ｍとの共有結合複合体の形成を促進する試薬、例えばグルタルアルデヒドなどの架橋剤を含んでもよい。
【０２９８】
他の実施形態では、本発明のキットは更に、複合体を注射するための、好ましくは無菌の形態で包装された針若しくはシリンジ、及び／又は包装されたアルコールパッドを含む。場合により、臨床医又は患者がｈｓｐ−ペプチド複合体を投与するための説明書を含んでもよい。
【０２９９】
４．１５．ｈｓｐ−ペプチド複合体を用いた癌の予防及び免疫療法における効果のモニタリング
希釈複合体による免疫療法の、新生物疾患の発症及び進行に対する効果は、当業者にとって既知の任意の方法によりモニターすることができる。その方法には、限定するものではないが、ａ）細胞性免疫の評価としての遅延型過敏性の測定；ｂ）細胞傷害性Ｔリンパ球のｉｎ ｖｉｔｒｏでの活性の測定；ｃ）腫瘍特異的抗原、例えば胎児性癌抗原（ＣＥＡ）のレベルの測定；ｄ）コンピューター断層撮影（ＣＴ）スキャン等の技法を用いた腫瘍の形態の変化の測定；及び、ｅ）リスクの高い個体における、特定の癌のリスクに関する推定バイオマーカーのレベルの変化の測定；並びに、ｆ）ソノグラムを用いた腫瘍の形態の変化の測定が挙げられる。
【０３００】
４．１５．１．遅延型皮膚過敏症試験
遅延型過敏性に関する皮膚試験は、ある抗原に対する全般的な免疫能及び細胞性免疫において非常に有用である。一群の共通皮膚抗原に対して反応できなくなることはアネルギーと称される（Ｓａｔｏ， Ｔ．ら， １９９５， Ｃｌｉｎ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｐａｔｈｏｌ． ７４：３５−４３）。
【０３０１】
皮膚試験の正しい技法では、抗原を４℃にて無菌状態で保存し、光から保護し、そして使用直前に再構成することが必要である。Ａ２５−又は２７−ゲージ針により、皮下投与ではなく皮内投与により抗原を確実に投与する。抗原の皮内投与の２４時間後及び４８時間後に、紅斑及び硬化（しこり）の両者の最大寸法を物差しで測定する。所定の抗原又は抗原群に対する活性低下を、より高い濃度の抗原を用いた試験、又は、あいまいな状況での中間的な試験を用いる反復的な試験によって確認する。
【０３０２】
４．１５．２．ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける細胞傷害性Ｔリンパ球の活性
フィコール−ハイパーク勾配遠心法により単離した８×１０６個の末梢血由来Ｔリンパ球を、１０％ウシ胎仔血清を含む３ｍｌのＲＰＭＩ培地中にて、４×１０４個のマイトマイシンＣ処理腫瘍細胞により再刺激する。場合により、３３％の二次混合リンパ球培養物の上清又はＩＬ−２を、Ｔ細胞増殖因子の供与源として培地中に含ませる。
【０３０３】
免疫後の細胞傷害性Ｔリンパ球の一次応答を測定するために、刺激用の腫瘍細胞を用いずにＴ細胞を培養する。他の実験では、Ｔ細胞を抗原性の異なる細胞により再刺激する。６日後に、４時間５１Ｃｒ放出アッセイにより培養物の細胞傷害性について試験する。標的物の自然な５１Ｃｒの放出は２０％未満のレベルとなるはずである。抗ＭＨＣクラスＩブロッキング活性のため、Ｗ６／３２ハイブリドーマの１０倍濃縮上清を最終濃度が１２．５％になるまで試験系に添加する（Ｈｅｉｋｅ Ｍ．ら， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ １５：１６５−１７４）。
【０３０４】
４．１５．３．腫瘍特異的抗原のレベル
全ての腫瘍上に特有の腫瘍抗原を検出するのは不可能かもしれないが、多くの腫瘍が正常細胞とは異なる抗原を提示する。モノクローナル抗体試薬は、抗原の単離や生化学的分析を可能にするとともに、形質転換細胞と形質転換されていない細胞との区別のため、及び形質転換細胞の細胞系統を確定するために、診断上非常に有益である。最も解明が進んでいるヒト腫瘍関連抗原は腫瘍胎児性抗原である。かかる抗原は胚形成の際に発現されるが、正常な成人の組織には存在しないか又は検出することが非常に難しい。この標準的な抗原が胎児性癌抗原（ＣＥＡ）である。この抗原は、胎児の腸及びヒトの大腸癌細胞に見られる糖タンパク質であるが正常な成人の大腸細胞には見られない。ＣＥＡは大腸癌細胞から流出して血清中に見られるので、元々は、血清中のこの抗原の存在は大腸癌の患者をスクリーニングするために用いることができると考えられていた。しかしながら、他の腫瘍（脾臓癌及び乳癌など）を有する患者も血清ＣＥＡレベルの上昇を示す。従って、治療を受ける癌患者においてＣＥＡレベルの下降及び上昇をモニターすることは腫瘍の進行及び治療への応答を予測するのに有用であることが分かっている。
【０３０５】
幾つかの他の腫瘍胎児性抗原がヒトの腫瘍を診断したりモニターするために有用である。例えば、通常は胎児の肝臓及び卵黄嚢細胞により分泌されるα−グロブリンであるα−フェトプロテインは、肝臓腫瘍及び生殖細胞腫瘍を有する患者の血清中に見いだされ、疾患状態のマーカーとして用いることができる。
【０３０６】
４．１５．４．コンピューター断層撮影（ＣＴ）スキャン
癌の正確なステージ分類のための技術の選択肢としてＣＴがある。ＣＴは転移を検出するための他のいかなるイメージング技法よりも高感度かつ特異的であることが判っている。
【０３０７】
４．１５．５．推定バイオマーカーの測定
特定の癌のリスクに対する推定バイオマーカーのレベルを、ペプチド複合体と結合したｈｓｐの効果をモニターするために測定する。例えば、前立腺癌のリスクが高い個体において、血清前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）をＢｒａｗｅｒ， Ｍ．Ｋ．ら， １９９２， Ｊ． Ｕｒｏｌ． １４７：８４１−８４５及びＣａｔａｌｏｎａら， １９９３， ＪＡＭＡ ２７０：９４８−９５８に記載の手順により測定する。あるいは、大腸癌のリスクがある個体において、第４．５．３節に記載したように、ＣＥＡを測定する。さらに、乳癌のリスクが高い個体において、エストラジオールの１６−α−ヒドロキシル化を、Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ， Ｊ．ら， １９８２， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７９：３０４７−３０５１に記載の手順により測定する。
【０３０８】
４．１５．６．音波検査（ソノグラム）
癌の正確なステージ分類のための技術の他に採り得る選択肢としてソノグラムがある。
【０３０９】
本発明は、本明細書に記載した特定の実施形態によりその範囲が制限されるものではない。実際に、本明細書に記載した以外にも本発明の様々な改変がなされることは、当業者であれば以上の説明及び添付する図面から明確に理解できる。そのような改変は、特許請求の範囲内に入るものする。
【０３１０】
本明細書中で種々の文献を引用したが、それらはその開示内容全体を参照により本明細書に組み入れるものとする。
【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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