(57)【要約】本発明は、イン・ビボにおける同種異系移植体拒絶を予防するための、イン・ビトロで遺伝的に修飾したＴ細胞、それらの製造方法、およびそれらの使用に関する。移植体レシピエントのＴ細胞はイン・ビトロで、移植体ドナーの細胞によるかまたは優性ＭＨＣ分子を発現する細胞によって刺激され、同時に免疫モジュレーション遺伝子と共に遺伝子導入によって形質導入される。前記遺伝子導入は、レトロウィルス、他のウィルス性ベクター系またはリポソームによって行うことができる。同種異系特異的Ｔ細胞を生成させ拡張させる実験に対して選択された条件により、イン・ビボへの適用に従って、Ｔ細胞が特異的に前記同種異系移植体内および排液リンパ節内に移動し、そしてその場所で、免疫モジュレーション遺伝子を発現することができることを保証する。本発明は、同種異系移植体（細胞、組織、器官）の拒絶を予防する効果的な手段を提供し従って、移植医学において同種異系移植体（細胞、組織、器官）の寛容性を誘導及び維持するための効果的な手段を提供する。
2004523202.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（イン・ビトロ）遺伝子修飾Ｔ細胞であって、移植体レシピエントのＴ細胞を移植体ドナーの細胞または優性ＭＨＣ分子を発現する細胞によってイン・ビトロで刺激し、そして同時にまたは後から、遺伝子形質導入によって免疫モジュレーション治療用遺伝子を導入することにより得られることを特徴とする、前記遺伝子修飾Ｔ細胞。
【請求項２】
同種異系反応性Ｔ細胞であることを特徴とする、請求項１に記載の（イン・ビトロ）遺伝子修飾Ｔ細胞。
【請求項３】
（ａ）治療用遺伝子を備えた遺伝子形質導入可能なレトロウィルスを生成する細胞系（パック細胞系）を培養し、
（ｂ）全血もしくは脾臓またはリンパ節からリンパ球を分離し（照射されたドナーＴ細胞または優性ＭＨＣ分子を発現する照射された細胞、およびレシピエントＴ細胞）、そして
（ｃ）混合されたリンパ球培養物（一次ＭＬＣ）と前記パック細胞系とからなる共培養物、またはパック細胞系との共培養を省略できるように、専らレトロウィルスを含む細胞培養上清を用いての形質導入を実施する
ことにより得られる、請求項１または２に記載の（イン・ビトロ）遺伝子修飾Ｔ細胞。
【請求項４】
レトロウィルスとして、モロニーマウス白血病ウィルスまたはレンチウィルスを用いることを特徴とする、請求項３に記載の（イン・ビトロ）遺伝子修飾Ｔ細胞。
【請求項５】
全血もしくは脾臓またはリンパ節からリンパ球を分離し（照射されたドナーＴ細胞または優性ＭＨＣ分子を発現する照射された細胞、および、レシピエントＴ細胞）、この混合されたリンパ球培養物によって製造された同種異系特異的なＴ細胞を、治療用遺伝子を備えたプラスミドを含有するリポソーム配合物と共にインキュベートするか、または遺伝子銃で撃つ、請求項１または２記載の（イン・ビトロ）遺伝子修飾Ｔ細胞。
【請求項６】
前記治療用遺伝子が、
（ａ）サイトカイン、
（ｂ）インターロイキン、
（ｃ）ノッチ−リガンド／レセプター
（ｄ）細胞保護遺伝子（例えば、抗細胞消滅遺伝子、熱ショック遺伝子）
であることを特徴とする、請求項１〜５のいずれか一項に記載の（イン・ビトロ）遺伝子修飾Ｔ細胞。
【請求項７】
治療用遺伝子が、
（ａ）ＩＬ−４または、
（ｂ）ＩＬ−１０もしくはウィルス性ＩＬ−１０（例えば、ＥＢＶまたはＣＭＶに由来する）
（ｃ）ＩＬ−１２ｐ４０または、
（ｄ）ＩＬ−１３または、
（ｅ）ヘムオキシゲナーゼ−１、
（ｆ）ＣＴＬＡ−４または、
（ｇ）ｈセラト−１または、
（ｈ）ｈデルタ−１または、
（ｉ）ノッチ１−４または、
（ｊ）ｂｃｌ−２または、
（ｋ）ｂｃｌ−ｘｌまたは、
（ｌ）ｂａｇ−１
であることを特徴とする、請求項６に記載の（イン・ビトロ）遺伝子修飾Ｔ細胞。
【請求項８】
遺伝子修飾Ｔ細胞を製造する方法であって、移植体レシピエントのＴ細胞を、移植体ドナーの細胞または優性ＭＨＣ分子を発現する細胞によってイン・ビトロで刺激し、同時にまたは後から、遺伝子導入によって免疫モジュレーション治療用遺伝子を形質導入することを特徴とする、遺伝子修飾Ｔ細胞の製造方法。
【請求項９】
前記細胞が同種異系反応性Ｔ細胞であることを特徴とする、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
（ａ）治療用遺伝子を備えた遺伝子形質導入可能なレトロウィルスを生成する細胞系（パック細胞系）を培養し、
（ｂ）全血からリンパ球を分離し（照射されたドナーＴ細胞または優性ＭＨＣ分子を発現する照射された細胞、および、レシピエントＴ細胞）、
（ｃ）混合されたリンパ球培養物（一次ＭＬＣ）と前記パック細胞系とからなる共培養物、またはパック細胞系との共培養を省略できるように、専らレトロウィルスを含む細胞培養上清を用いて形質導入を実施する
ことを特徴とする、請求項８または９に記載の方法。
【請求項１１】
レトロウィルスとして、モロニーマウス白血病ウィルスまたはレンチウィルスを使用することを特徴とする、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
全血もしくは脾臓またはリンパ節からリンパ球を分離し（照射されたドナーＴ細胞または優性ＭＨＣ分子を発現する照射された細胞、および、レシピエントＴ細胞）、この混合されたリンパ球培養物によって製造された同種異系特異的なＴ細胞を、治療用遺伝子を備えたプラスミドを含有するリポソーム配合物と共にインキュベートするか、または遺伝子銃で撃つことを特徴とする、請求項８または９に記載の方法。
【請求項１３】
前記治療用遺伝子が、
（ａ）サイトカイン、
（ｂ）インターロイキン、
（ｃ）ノッチ−リガンド／レセプター
（ｄ）細胞保護遺伝子（例えば、抗細胞消滅遺伝子、熱ショック遺伝子）
であることを特徴とする、請求項８〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記治療用遺伝子が、
（ａ）ＩＬ−４または、
（ｂ）ＩＬ−１０もしくはウィルス性ＩＬ−１０（例えば、ＥＢＶまたはＣＭＶに由来する）
（ｃ）ＩＬ−１２ｐ４０または、
（ｄ）ＩＬ−１３または、
（ｅ）ヘムオキシゲナーゼ−１、
（ｆ）ＣＴＬＡ−４または、
（ｇ）ｈセラト−１または、
（ｈ）ｈデルタ−１または、
（ｉ）ノッチ１−４または、
（ｊ）ｂｃｌ−２または、
（ｋ）ｂｃｌ−ｘｌまたは、
（ｌ）ｂａｇ−１
であることを特徴とする、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
請求項１〜７のいずれか一項に記載の（イン・ビトロ）遺伝子修飾Ｔ細胞を移植医学において使用する、（イン・ビトロ）遺伝子修飾Ｔ細胞の使用。
【請求項１６】
イン・ビボでの同種異系移植体の拒絶反応の予防への、請求項１５に記載の使用。
【請求項１７】
同種異系移植体（細胞、組織、器官）に対する寛容性を誘導し、寛容性を維持するための手段としての、請求項１５または１６に記載の使用。
【請求項１８】
移植体レシピエントのＴ細胞を刺激するための、請求項１５〜１７のいずれか一項に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、イン・ビボの同種異系移植体拒絶反応を予防するための、イン・ビトロ遺伝子修飾Ｔ細胞、その製法およびその使用に関する。移植体レシピエントのＴ細胞は、イン・ビトロにおいて、移植体ドナーの細胞によるか、または優性ＭＨＣ分子を発現する細胞によって刺激され、そして同時に、遺伝子導入技術によって免疫モジュレーション遺伝子と共に形質導入される。遺伝子導入の後、形質導入されたＴ細胞は、免疫モジュレートされた遺伝子の発現を開始する。遺伝子導入は、レトロウィルスまたは他の非ウィルス遺伝子導入技術、例えばリポソーム配合物によって行うことができる。同種異系特異的な［ａｌｌｏｓｐｅｚｉｆｉｓｃｈｅｎ］Ｔ細胞を発生させ拡張させる選択された実験条件により、Ｔ細胞は、イン・ビボ適用後、特異的に移植体内および排液リンパ節内に移動し、次いでこの場所で、免疫モジュレーション遺伝子を発現することができる。本発明は、同種異系移植体（細胞、組織、器官）の拒絶を効果的に予防することを可能にし、従って、移植医学において、同種異系移植体（細胞、組織、器官）に対する寛容性を導入しかつ寛容性を維持するための有効手段となる。
【０００２】
シクロスポリンＡ、ＦＫ５０６、グルココルチコイド、またはＯＫＴ３（ＣＤ３に対するモノクローナル抗体（ｍＡｋ））による従来の免疫抑制による成功にもかかわらず、移植体拒絶の問題は、未だに満足に解決されていない。生涯にわたる薬剤による免疫抑制は、殆ど常に重大な副作用を招き、慢性的な拒絶反応を完全に予防することができるのはまれである。移植研究の目的は、短時間の治療で異種器官の生涯にわたる受容を達成することである。動物モデルの場合、このような要件にほぼ適ういくつかのアプローチがすでに存在する。このようなアプローチを理解するための基礎は、拒絶された組織または寛容された組織の詳細な分析である。この分析は常に、急性拒絶反応中、顆粒球、単球、およびリンパ球による組織の大規模な浸潤を示す。ＯＫＴ３によるＣＤ３陽性細胞の消耗が移植体を拒絶から保護するという事実は、Ｔリンパ球の臨界的な役割を示している（Ｏｄｅ−Ｈａｋｉｍ他、１９９６年）。同様に、免疫不全化された（Ｂ細胞およびＴ細胞のない）ＳＣＩＤマウスは、外来器官を拒絶することができない。Ｔ細胞集合内部では、ヘルパーＴ（Ｔｈ）細胞が拒絶反応のイニシエータであるように思われる。このことは、それぞれ、ＣＤ４もしくはＣＤ８のＴ細胞消耗させられたマウスにおいて示された。ＣＤ８を消耗させられた前記マウスは移植体を拒絶するが、これに対して、ＣＤ４を消耗させられた前記マウスの場合には拒絶することができない（Ｃａｎｐｏｓ他、１９９５年）。Ｔｈ１／Ｔｈ２の範例（Ｍｏｓｍａｎｎ他、１９８９年）に基づく場合には、急性拒絶の早期段階では、主にＴｈ１が関与する。ラットモデルの場合では、半定量的ＰＣＲを用いて、移植体内で特徴的なＴｈ−１サイトカイン（ＩＦＮ−γ，ＩＬ−２）の上昇を示すことができた（Ｓｉｅｇｌｉｎｇ他、１９９４ａ）。器官から獲得されたＣＤ４−細胞は、イン・ビトロ再刺激後、やはり大量にＴｈ１−サイトカインを生成する。
【０００３】
全ての治療プロトコルに共通する目標は、発生及び機能におけるＴｈ１−細胞の潜在的な損傷を阻害することである。従来の方法は、このことをリンパ球の広範囲な消耗または阻害によって試みるのに対し、比較的新しいアプローチは、Ｔ細胞活性化プロセスに介入する。ＣＤ４−レセプターに対するモノクローナル抗体は、そのシグナルを、ＴＣＲシグナルを介して変調する（Ｌｅｈｍａｎｎ他、１９９２年；Ｓｉｅｇｌｉｎｇ他、１９９４ｂ）。ＣＴＬＡ４−Ｉｇは、抗原提示細胞（ＡＰＣ）のＢ７分子と結合し、これにより共同刺激的シグナルをブロックする（Ｓａｙｅｇｈ他、１９９５年）。このような短期間の処理（約２週間）の終了時には、多くのモデルに安定的な寛容性が生じる（ＣｏｂｂｏｌｄおよびＷａｌｄｍａｎｎ、１９９８年）。このような寛容性の媒介物質は、おそらく調節ＣＤ４−細胞であろう。また、これらの細胞の同系動物間の移植も寛容性を誘導可能なことも示すことができる。この現象は、１９９３年に初めて「感染寛容性」として記載された（Ｑｉｎ他、１９９３年）。しかしながら、これらの実験は弱い「拒絶モデル」において成功したに過ぎない。ＣＤ４（ＲＩＢ５／２）に対する非消耗性抗体の補助によって、前記効果を強い拒絶反応モデルにおいても示すことが成功した（Ｏｎｏｄｅｒａ他、１９９６ａ）。半定量的ＰＣＲを用いることによって、移植された器官（いくつかの転移後も）において、インターロイキン−４（ＩＬ−４）ｍＲＮＡレベルが著しく高められたことを示すことができる。このことは、Ｔｈ２サイトカイン、特に。−４の重要性を示唆する。
【０００４】
ＩＬ−４の他に、一連のサイトカインは、Ｔｈ−１によって媒介される免疫反応をモジュレートすることができる。ＩＬ−４が誘導するＴｈ２細胞におけるナイーブなＣＤ４＋Ｔ細胞の分化は、それらにより発生し、そしてＩＦＮ−γの分泌を強く阻害する。こうして、Ｔｈ１応答の発生が抑制される（Ｂａｎｃｈｅｒｅａｕ、１９９１年）。主に単球／マクロファージとＴ細胞とによって形成されるＩＬ−１０は、多くの抗炎症特性を有している。例えば、（ｉ）ＩＬ−１０が、単球へのＭＨＣクラスＩＩの発現を阻害し、（ｉｉ）炎症性サイトカイン、例えば、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１およびＩＬ−８、およびＴＮＦ−αの生成を阻害し、並びに（ｉｉｉ）同種異系活性化リンパ球（ａｌｌｏｇｅｎ ａｋｔｉｖｉｅｒｔｅｒ ｌｙｍｐｈｏｚｙｔｅｎ）を抑圧することが示された（ｄｅ Ｗａａｌ Ｍａｌｅｆｙｔ他、１９９１ａ；ｄｅ Ｗａａｌ Ｍａｌｅｆｙｔ他、１９９１ｂ；Ｒａｌｐｈ他、１９９２年；Ｃａｓｓａｔｅｌｌａ他、１９９３年；Ｑｉｎ他、１９９７年）。Ｔｈ１細胞に対するＴ細胞とは無関係の更なる分化因子、すなわちＩＬ−１２が記載されている。このサイトカインは、マクロファージおよびＢ細胞から分泌され、ＮＫ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、およびＣＤ８＋Ｔ細胞のＩＦＮ−γ生成を高め、そしてナイーブなＣＤ４＋Ｔ細胞のＴｈ１細胞への分化を誘導する（Ｈｓｉｅｈ他、１９９３年；Ｇｅｒｍａｎｎ他、１９９３年；Ｋｅｎｎｅｄｙ他、１９９４年）。ＩＬ−１２は、４０ｋＤａ（ｐ４０）および３５ｋＤａ（ｐ３５）のサブユニットから成るヘテロ二量体糖タンパク質である。前記ＩＬ−１２ｐ４０サブユニットは、ヘテロ二量体の効果を特異的に阻害することが可能である。Ｍａｔｔｅｒｎ他（１９９３年）によれば、マウスのＩＬ−１２ｐ４０遺伝子を導入された、ＣＯＳ細胞の上清は、イン・ビトロでの種々のＩＬ−１２の効果を阻害する。ＩＬ−１２ｐ４０は、ＰＨＡおよびＩＬ−１２活性化脾臓細胞の増殖を阻害する。
【０００５】
同種異系移植体に関する実験的および臨床的な研究において、急性拒絶段階に種々のサイトカインが発現することが判った。サイトカインの細胞起源は、Ｔｈ１−細胞、Ｔｈ２−細胞、細胞障害ＣＤ８＋Ｔ細胞にさかのぼることができるだけでなく、非リンパ球細胞（マクロファージ、内皮細胞、肥満細胞）にもさかのぼることができる（Ｄａｌｌｍａｎ他、１９９１年）。Ｔｈ１−サイトカインが、急性移植体拒絶の発生の上で鍵となる役割を担っていることが示唆されている。このことは、寛容性を有する動物の移植体におけるサイトカイン発現パターンの研究に基づく。このことに関しては、抗ＣＤ４モノクローナル抗体を用いた効果的な寛容性誘導のための実験において示すことができる（ＢｅｎｊａｍｉｎおよびＷａｌｄｍａｎｎ、１９９８年；Ｔａｋｅｕｃｈｉ、１９９２年；Ｓｉｅｇｌｉｎｇ他、１９９４ａ）。このメカニズム、特に、寛容性誘導にＣＤ４＋Ｔ細胞の消耗が必要でないことは、完全には明らかでない。抗ＣＤ４処理による寛容性誘導は、移植体内のＴｈ１サイトカイン発現の顕著な抑制と関連する。その結果得られる推論は、Ｔｈ１サイトカインが、同種異系移植体拒絶時の重要な役割を担っている、ということである（Ｓｉｅｇｌｉｎｇ他、１９９４ａ、Ｌｅｈｍａｎｎ他、１９９７年）。
【０００６】
Ｔｈ２サイトカインの意味はあまり明らかではない。寛容性を有する動物の場合、単独のＴｈ２応答は移植反発を引き起こさない。動物の移植体内のＴｈ２サイトカインの持続性は、付帯徴候として評価することができ、しかも、Ｔｈ１応答の阻害にとっては決定的であり、ひいては移植体反応にとって決定的な基準を意味することが可能である。抗原接触直後のＴ細胞応答の一時的なＴｈ１／Ｔｈ２サイトカインのアンバランスが、免疫応答を永続的に形成することができるという観察により、この推測が立証される（Ｓｃｏｔｔ、１９９１年）。第１のイン・ビトロ実験は、移植モデルにおいて、移植体浸透細胞の機能にも影響を与えることができることを示している。ＩＦＮ−γを生成する細胞の頻度は、組み換えられたＩＬ−４の影響下で、５０〜７０％低下することができる（Ｍｅｒｖｉｌｌｅ他、１９９３年）。このことから、同種異系応答箇所でのＩＬ−４の一時的な過剰発現が、移植体の受容をもたらし得るという仮説を導き出すことができる。組み換えアデノウィルスの使用によってエクス・ビボエクス・ビボ遺伝子導入が行われた後でのＩＬ−４の過剰発現は、未処理の移植体またはリポーターコンストラクトで処理された移植体と比較して、ラットの同種異系腎臓移植モデルにおける移植体受容を著しく延長する（Ｋａｔｏ他、１９９９ａ）。しかしながら、同種異系移植体に対する寛容性を誘導する上でのＩＬ−４の役割については、論文において対立した意見が論じられている。例えば、それぞれ、アデノウィルス導入移植体またはＩＬ−４遺伝子導入移植体によるＩＬ−４の局部的な過剰生産が、移植受容を延長することが示された（Ｓｍｉｔｈ他、１９９７年；Ｍｕｅｌｌｅｒ他、１９９７年）。他方において、ＩＬ−４を生成する遺伝子導入移植体またはシクロスポリンＡ治療と組み合わせるＩＬ−４体系的な適用が、同種異系移植体の生存時間を延長できることが判っている（Ｔａｋｅｕｃｈｉ他、１９９７年；Ｒａｂｉｎｏｖｉｔｃｈ他、１９９７年）。この場合留意しなければならないことは、使用する方法の記載はかなり頻繁に不十分であり、従って、方法論的な問題が結果に影響を与えるかどうか決定を下すことはできないという点である。
【０００７】
ＩＬ−４とは異なり、移植体受容を延長することに対するＩＬ−１０の意味については、ほとんど異論の余地はない。従って、例えば、ＴＧＦ−β１およびｖＩＬ−１０、エプスタイン−バール−ウィルスでコードされた、ヒトまたはマウスＩＬ−１０に対するホモログの過剰発現が、種々の同種異系心臓移植体モデルにおいて、移植体受容を延長することが判った（Ｑｉｎ他、１９９５年；Ｊｏｓｉｅｎ他、１９９８年）。Ｋａｔｏ他は、組換えアデノウィルスによってＩＬ−４およびｖＩＬ−１０を共適用すると、強拒絶モデルにおける同種異系腎臓移植体の生存時間を著しく延長することを示すことができた（Ｋａｔｏ他、１９９９ｂ）。面白いことに、このようなモデルにおいてＩＬ−４を単独で適用しても、移植体受容の延長には影響を与えなかったことに注意されたい。
【０００８】
更に、ＩＬ−１２ｐ４０の過剰発現も、移植体生存時間に対してポジティブな効果を与えるように見える。従って、ＩＬ−１２ｐ４０の局部的な適用は、Ｔｈ１を媒体とする免疫応答を阻害し、ＩＬ−１２ｐ４０に対応するｃＤＮＡと一緒に導入された同種異系筋芽細胞の拒絶を予防することを示すことができた（Ｋａｔｏ他、１９９７年）。同様の結果が、糖尿病マウスの島細胞（ｉｎｓｅｌｚｅｌｌ）移植モデルにおいて得られた。この場合、ＩＬ−１２ｐ４０の過剰発現は、Ｔｈ１媒介自己攻撃を予防した（Ｒｏｔｈｅ他、１９９７年；Ｋａｔｏ他、１９９８年）。組換えアデノウィルスによるＩＬ−４およびＩＬ−１２ｐ４０の共適用は、強拒絶モデルにおける同種異系腎臓移植体の生存時間を著しく延長する（Ｋａｔｏ他、１９９９ｂ）。
【０００９】
サイトカイン転移上の多くの実験の主要な問題は、今なおサイトカインの適用にある。サイトカインの、体系的な付与は、生理学的な状況に相当する局部的な環境を決して創ることができない。さらに、サイトカインの半減期は血清中では極めて短く、このことは、所望の血清レベルを達成するには、治療用タンパク質を絶え間なく補充しなければならないことを意味する（Ｈ．−Ｄ． Ｖｏｌｋ，私的な報告）。
【００１０】
ドナー器官のアデノウィルス媒介遺伝子導入によって、移植体内のサイトカイン発現を上昇させることができるが、しかしながら、この発現は大抵の場合、短時間でしかないか、または活性化によっては全く生じない。
【００１１】
対照的に、レトロウィルス導入Ｔ細胞は安定的かつ永続的にタンパク質を出現させることができる（Ｂｌａｅｓｅ他、１９９５年）。特に活性化されたＴ細胞は、それらの導入遺伝子の増加した発現を示す（Ｑｕｉｎｎ他、１９９８年；Ｈａｍｍｅｒ他、２０００年）。
【００１２】
Ｂｒｏｍｂｅｒｇ他は、「Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，第５９巻、６、８０９〜８１６、１９９５年」に、移植体への直接的な、レトロウィルスもしくはアデノウィルス遺伝子導入のための方法を記載している。しかしながら、前記組み換えウィルスにさらすことから患者を保護することはできない。
【００１３】
本発明の課題は、公知の手段および方法の欠点が存在せず、同種異系移植体拒絶を予防するための新しい可能性を提供することである。この課題は、治療用遺伝子を発現する、イン・ビトロで遺伝子修飾された同種異系反応性Ｔ細胞（ａｌｌｏｒｅａｋｔｉｖｅ Ｔ−ｚｅｌｌｅｎ）を提供することによって解決された。
【００１４】
同種異系移植体拒絶を予防するための新しい方法を発見するという課題は、詳細に述べるならば、移植体レシピエントのＴ細胞をイン・ビトロで、移植体ドナーの細胞によるか、または優性ＭＨＣ分子を発現する細胞によって刺激し、同時にまたは後から、免疫モジュレーション（治療用の、例えば、ＥＢＶまたはＣＭＶなどに由来するウィルス性ＩＬ−１０、ＩＬ−４、ＩＬ−１２ｐ４０）遺伝子を遺伝子形質導入によって遺伝子導入することにより解決された。前記遺伝子導入の後、その形質導入されたＴ細胞は、免疫モジュレーター遺伝子の発現を開始する。前記遺伝子導入は、レトロウィルスまたは非ウィルス性の方法（リポソーム、遺伝子銃）によって行うことができる。選択された試験条件により、同種異系特異的な、形質導入されたイン・ビトロのＴ細胞が発生し、拡張する。修飾されたＴ細胞は、同系異種特性に基づいて、それらのイン・ビボ適用の後、同種異系移植体移植の時点で、同種異系移植体内及び排出リンパ節内にも移動し、そしてその場所で免疫モジュレーション（治療用）遺伝子を発現するという特性を有している。
【００１５】
本発明は、同種異系移植体（細胞、組織、器官）の拒絶を効果的に予防することを可能にする。
つまり本発明による修飾された細胞は、その同種異系特異性に基づいて移植体内に移動する。本発明による細胞の活性化レベルに応じて、ＩＬ−４、ＩＬ−１０、およびＩＬ−１２ｐ４０を生成することにより、抗体接触箇所に直接的に、それぞれＴｈ２サイトカインまたはＴｈ１アンタゴニストの局部的な環境が提供されることが判った。このことは、ＩＬ−４、ＩＬ−１０、またはＩＬ−１２ｐ４０を生成する、同種異系反応性のＴ細胞を、レトロウィルス遺伝子形質導入によりイン・ビトロで発生させることに成功したことを意味する。
【００１６】
ここで焦点となるのは、移植された組織自体の導入遺伝子の発現である。従来、このような細胞（発生させられたＴ細胞）は、主に腫瘍と戦うために使用されてきた。この場合、エクス・ビボで発生させられた腫瘍特異的なＴ細胞は、炎症前駆性サイトカイン（例えばＴＮＦ−α）と共に導入された。このサイトカインは、後にそれらが浸透する時に腫瘍及びその転移と「戦う」。
【００１７】
虚血／再灌流、感染、または拒絶発症によってストレスを与えられた移植体は、自己由来のストレスタンパク質をも発現し、免疫応答（例えば熱ショックタンパク質−ＨＳＰ７０、特異的自己反応性Ｔ細胞）を起こすことができる。このような細胞も、イン・ビトロで発生させることができ、生物学的「薬物配達」系として利用することができる。また、直接的な同種異系反応性Ｔ細胞（ドナーＭＨＣ分子に対する）の代わりに、間接的な同種異系反応性Ｔ細胞（レシピエントＭＨＣによって提供されるドナーＭＨＣペプチドに対する）を発生させて使用することができる。両アプローチの利点は、直接的な同種異系反応性Ｔ細胞と比較して、移植体に対する反応性が少ないことである。本発明により、イン・ビトロ導入された遺伝子修飾Ｔ細胞は、いわゆる両種性（ａｍｐｈｏｔｒｏｐｈｅｎ）細胞系の細胞培養上清と一緒に培養もしくは一緒にインキュベーションすることによって得られる。これらの細胞系は例えば、治療用導入遺伝子を有する組換えレトロウィルスを生成する。本発明によるイン・ビトロで形質導入された遺伝子修飾Ｔ細胞の製造手順は、次のステップからなる：
＊治療用の導入遺伝子に対応してコード化する、遺伝子導入可能な組換えレトロウィルスを生成する（トランスフェクションにより）、パック（Ｖｅｒｐａｃｋｕｎｇ）細胞系の製造；
＊前記同種異系反応性Ｔ細胞のイン・ビトロでの発生；これは、治療用導入遺伝子を有する遺伝子導入可能なレトロウィルスを生成する細胞系を培養することを意味する。さらに、リンパ球（ドナーＴ細胞または優性ＭＨＣ分子を発現する細胞およびレシピエントＴ細胞）を、全血から分離する。ドナーＴ細胞もしくは優性ＭＨＣ分子を発現する細胞系は、これらの細胞の増殖を予防するために、照射されなければならない。次いで、混合されたリンパ球培養物（一次ＭＬＣ）とレトロウィルス生成パック細胞系との共培養を実施する。レトリウィルス遺伝子導入は、前記リンパ球培養物（ドナーＴ細胞または優性ＭＨＣ分子を発現する細胞およびレシピエントＴ細胞）に加えたパック細胞系のウィルス上清を用いるだけで実施することもでき、これにより、パック細胞系との共培養が不要になる；
＊非ウィルス性遺伝子導入法を用いる場合も、混合されたリンパ球培養物（ドナーＴ細胞または優性ＭＨＣ分子を発現する細胞およびレシピエントＴ細胞）とパック細胞系との共培養が不要である。こうして生じるまたは生じた同種異系反応性Ｔ細胞は、治療用遺伝子をコードするプラスミドを用いた非ウィルス性遺伝子導入法によってイン・ビトロで直接的に導入される。
【００１８】
同種異系反応性Ｔ細胞は、治療用遺伝子の「普遍的（ｕｎｉｖｅｒｓｅｌｌｅｒ）」ベヒクルとして用いることができる。「普遍的」担体には、主に、以下のものが含まれる：
＊細胞から分泌され、そして他の細胞、例えば同種異系反応性細胞または移植体浸透性細胞に、免疫調節の影響を与える遺伝子生成物（例えば、サイトカイン（ＩＬ−１３、ＩＬ−１０遺伝子とホモログなサイトカイン、例えば、ＣＭＶ  ＩＬ−１０）；
＊調節Ｔ細胞の細胞表面に発現し、そして他の細胞（同種異系反応性細胞または移植体浸透性細胞）との相互作用によって免疫調節作用を示す遺伝子生成物〔例えば、ＣＴＬＡ−４、またはノッチ−リガンド／レセプターのファミリーに属する遺伝子、例えばｈセラト（ｈＳｅｒｒａｔｅ）−１、ｈデルタ（ｈＤｅｌｔａ）１もしくはノッチ（Ｎｏｔｃｈ）１−４〕；
＊細胞内で発現し、そして細胞保護作用のために調節Ｔ細胞に延長された生存時間を与える遺伝子生成物（例えば、抗細胞消滅遺伝子、例えばｂｃｌ−２、ｂｃｌ−ｘｌ、ｂａｇ−１）；
＊細胞保護遺伝子（例えば、抗細胞消滅遺伝子、熱ショック遺伝子）。
【００１９】
治療用遺伝子（導入遺伝子）として好ましいのは、ＩＬ−４、ＩＬ−１０、ｖＩＬ−１０、およびＩＬ−２ｐ４０である。ヘムオキシゲナーゼ−１も使用することができる。
導入された遺伝子修飾Ｔ細胞は、種々の用法〔静脈投与（ｉｖ），腹腔内投与（ｉｐ）〕、これらの種々の組み合わせ、および／または、種々の用量で、種々の時点で使用することができる。
【００２０】
本発明によるイン・ビトロで形質導入された遺伝子修飾Ｔ細胞は、イン・ビボの同種異系移植体拒絶を予防するのに適しており、同種異系の細胞、組織、および器官の移植に使用することができる。わずかな例としては、幹細胞、骨髄、皮膚、腎臓、心臓、肝臓、肺、中枢神経系細胞、又はランゲルハンス島を挙げることができる。この場合、移植体レシピエントのＴ細胞は、移植体ドナーの細胞または優性ＭＨＣ分子を発現する細胞によって刺激され、同時に遺伝子導入によって形質導入される。遺伝子導入の際には、免疫モジュレーション遺伝子が導入される。その結果、同種異系移植体に対して寛容性を誘発もしくは維持することができるＴ細胞が発生する。
【００２１】
本発明の本質は、公知のもの、すなわち、両種性細胞系、レトロウィルス性ベクター、混合されたリンパ球培養物、および新しいエレメント、すなわち、混合されたリンパ球培養物（一次ＭＬＣ）と治療用レトロウィルスを生成する細胞系とからなる共培養物の組み合わせにある。これにより、遺伝子修飾Ｔ細胞が生じる。この細胞は、治療用遺伝子を発現することができ、また、同種異系特異性に基づき、同種異系移植体内および排出リンパ節内に移動することができる。この方法は、同種異系移植体（細胞、組織、器官）の拒絶を効果的に予防するので成功であり、従って移植医学に有効な方法を提供する。
【００２２】
治療用Ｔ細胞の本発明による主な使用は、同種同系移植体拒絶の予防である。本発明による（イン・ビトロ）導入された遺伝子修飾Ｔ細胞は、同種異系移植体（細胞、組織、器官）に対する寛容性を導入し、寛容性を維持し、移植体レシピエントのＴ細胞を刺激するための手段として使用することができる。
本発明を実施例により、より詳しく説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。
【００２３】
【実施例】
《実施例１：治療用Ｔ細胞系の製造》
〈細胞系の発生〉
先ず、治療用導入遺伝子を有する組換えレトロウィルスを生成する細胞系を製造する。複製不能感染性レトロウィルスを生成するための出発点として、ＮＩＨ／３Ｔ３から誘導された細胞系ＰＴ６７（Ｒｅｔｒｏｐａｃｋ（商標、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を使用する。ＰＴ６７は、モロニーマウス白血病ウィルス（ＭｏＭｕＬＶ）の遺伝子ｇａｇ、ｐｏｌ、およびｅｎｖ（１０Ａ１−ステム）を含有する。前記細胞を、ＤＭＥＤ１０％ＦＣＳ、４ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１００Ｕ／ｍＬペニシリン、および１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン中、３７℃、５％ＣＯ２雰囲気中で培養する。前記遺伝子ではなく治療用遺伝子及びパックシグナルを含むレトロウィルス性ベクターによるこれらの細胞系のトランスフェクションにより、複製不能レトロウィルス（すなわち、前記ウィルスは、標的細胞に感染することができるが、複製して別の細胞に感染することができない）の生成が可能になる（Ｃｏｆｆｏｉｎ他、１９９６年；Ａｕｓｕｂｅｌ他、１９９６年）。ＰＴ６７−細胞のトランスフェクションは、標準的プロトコル（Ｍａｎｉａｔｉｓ）に従って、燐酸カルシウム−トランスフェクションによって実施する。Ｇ４１８（０．５ｍｇ／ｍＬ）による選択により、複製不能レトロウィルスおよび前記治療用遺伝子を生成するクローン及び細胞系を確立する。ＩＬ−４およびＩＬ−１０ＥＬＩＳＡ試験を用いて前記治療用遺伝子の生成が最も高い細胞系を発見することができるの場合には、これらの細胞系を別の全ての実験に使用することができる。ＩＬ−１２ｐ４０の場合には、ＥＬＩＳＡ試験を用いることができない。この場合には、バイオアッセイ（活性化脾臓細胞によるＩＦＮ−γ生成の阻止）で生物学的活性を直接的に検出する。
【００２４】
《実施例２：イン・ビトロにおける同種異系反応性Ｔ細胞の生成》
混合されたリンパ球培養（レシピエントＴ細胞と一緒に培養した照射されたドナーＴ細胞）を開始する前の１〜２日間、治療用導入遺伝子を有する組換えレトロウィルスを生成する細胞系を培養する（ＤＭＥＭ＋１０％ＦＣＳ＋最終濃度０．５ｍｇ／ｍＬの選択抗生物質Ｇ４１８）。
【００２５】
一日目には、混合されたリンパ球培養物（一次ＭＣＬ）とレトロウィルス生成細胞系とからなる共培養を開始する：このために、前記細胞系の細胞をトリプシン化し、１，２００ｒｐｍで５分間遠心分離し、そしてＦＣＳを有さないＴ細胞培地（ＴＣＭ）中に入れる。次いで、細胞をカウントし、９６穴プレート播く（ウェル当たり２ｘ１０５〜２ｘ１０６）。次いで、前記細胞を、ＣＯ２インキュベータ内で３７℃（５％ＣＯ２）で３〜４時間成長させ、その後、Ｔ細胞を加えた。
【００２６】
移植体レシピエントのＴ細胞は予め末梢血液から、フィコール勾配（Ｆｉｋｏｌｌｇｒａｄｉｅｎｔｅｎ）によって標準的プロトコルに従って分離した。抗原提示用に、移植体ドナーの細胞（Ｔ細胞）も標準的プロトコルに従って分離する。優性ＭＨＣエピトープを発現する細胞系を使用する場合には、これらを１〜２日前に解凍し、使用までＣＯ２インキュベータ内で培養する。
抗原提示のために（移植体レシピエントのＴ細胞のための刺激細胞として）使用する細胞は、混合されたリンパ球培養物に加えられる前に、３０ｇｙで１０分間照射して、望ましくない増殖を阻止しなければならない。
【００２７】
抗原提示細胞の照射後、これらの細胞を遠心分離し、ＦＣＳを含まない２０ｍＬ−ＴＣＭ中に再懸濁させる。次いで、細胞数を測定し、３％自己血清および４μｇ／ｍＬポリブレン中を加えた後に、移植体レシピエント細胞及び抗原提示細胞をそれぞれ３．５ｘ１０５〜４ｘ１０５個ずつ有するＴＣＭ５０μＬを、９６穴丸底プレート中に入れ（総容積１００μＬ）、そして３７℃で、ＣＯ２インキュベータ内で完全静止状態でインキュベートする。
【００２８】
〈四日目〉
五日目に、前記ＭＬＣを、前記丸底プレートから平底プレートに移す。培養物の上清の最初の約５０μＬをピペットによって取り出し（廃棄し）、次いでＴ細胞を、気泡なしで２〜３回再懸濁させて、９６穴平底プレート中に移す。さらに、１００μＬの培地（＋ｈｒＩＬ−２，２５Ｕ／ｍＬ）（新たに調製されたものであることが好ましい）を加える。次いで、その細胞を、３７℃、ＣＯ２雰囲気（５％）下でさらに４８時間、で培養する。
【００２９】
〈六日目〉
六日目に、Ｇ４１８選択を実施する。すなわち、レトロウィルス遺伝子導入の間に導入されなかった全ての細胞が、Ｇ４１８選択の間に死滅する。逆に、レトロウィルスによって導入された細胞だけがＧ４１８選択を生き延びる。この段階から、細胞は常にＧ４１８下で培養されなければならない（Ｇ４１８の最終濃度０．４ｍｇ／ｍＬ）。次いで、前記培地中で、細胞をさらに４８時間培養する。
【００３０】
〈八日目：再刺激２“〉
第１の刺激の八日後に、細胞の再刺激を実施する。このために、第１の刺激に関して既に説明したように、移植体ドナーのＰＢＭＣまたは優性ＭＨＣエピトープを発現する細胞系使用する。細胞を、再び照射し（１０分間、３０Ｇｙ）、次いで遠心分離し（１，２００ｒｐｍ、５分間）、次いでＦＣＳを含まないＴＣＭ２０ｍＬ中に加え、そして細胞数を計数する。再刺激用に、ＭＬＣ細胞を含有する９６穴マイクロタイタープレートから１００μＬを取り出し、次いで刺激細胞６ｘ１０５個を加える。さらに、３％自己血清およびＧ４１８濃度０．４ｍｇ／ｍＬの環境を確立する。次いで、細胞をさらに２日間培養する。
【００３１】
〈十日目〉
十日目には、新鮮なＴＣＭ培地（＋ｈｒＩＬ−２，２５Ｕ／ｍＬ）を添加する〔１００μＬを取り出し、次いで１００ｍＬのＴＣＭ培地（＋ｈｒＩＬ−２，２５Ｕ／ｍＬ）＋Ｇ４１８，０．４ｍｇ／ｍＬを添加する〕。次いで、細胞をさらに２日間培養する。
【００３２】
〈十二日目〉
細胞培養プレートには、さらなる再刺激ステップによって増加させて臨床において適用するのに十分な数の細胞を収集することができる、増殖細胞（ブラスト）が存在するはずである。十四日目にも、生成したブラストを特別なフィコール勾配（フィコール３０００）を用いて、清浄及び分離することができる。前記勾配後２４時間、次の再刺激（３“）を実施する。
前記刺激には、移植体ドナーのＰＢＭＣ細胞、または優性ＭＨＣ分子を発現する細胞系、またはこれらの分子に対する遺伝子を導入されて遺伝子を構成的に発現する細胞系（Ｋ． Ｗｏｏｄ）を使用することができる。
【００３３】
《実施例３：共培養のための別の実施例》
Ｔ細胞の導入のために、両種性細胞系との共培養の代わりに、レトロウィルスを含有する両種性細胞系の細胞培養上清だけを利用することになる。
【００３４】
《実施例４：バイオアッセイ》
前記上清中の治療用遺伝子の存在は、次のものによってわかる：
ＩＬ−４、ＥＬＩＳＡ、脾臓細胞におけるＭＨＣ−ＩＩアップレギュレーションｖＩＬ−１０、ＥＬＩＳＡ、マクロファージによるＴＮＦ−α生成の阻害、単球におけるＭＨＣ−ＩＩ発現の減少
ＩＬ−１２ｐ４０、ＥＬＩＳＡなし、脾臓細胞の刺激後におけるＩＦＮ−γ生成の阻害
【００３５】
《実施例５：同種異系特異的なＴｖＩＬ−１０リンパ球の免疫調節ポテンシャル》
ｖＩＬ−１０に関して遺伝子導入したリンパ球によるナイーブなＴ細胞の増殖の阻害は、イン・ビトロで、混合されたリンパ球培養物（ＭＬＣ）中で最初に検出することができた。このようなイン・ビトロ系は、同種異系器官移植後のＴ細胞反応性の状態を模倣しようとする。このために、ナイーブなレシピエント細胞（この細胞により移植体レシピエント細胞に相当させようとしている）を、０日目に膜染料ＳＮＡＲＦ（商標）で着色した。この染料は、同じ部分に細胞分裂するときに均等に両方の細胞に引き渡されるので、蛍光強度が減少するという特性を有している。次いで、着色されたレシピエント細胞は、照射された刺激細胞（この細胞により、移植体特異的な細胞を模造しようとしている）と共に、１：１の比（それぞれ３．５ｘ１０５個の細胞）で、９６穴平底プレートに播く。これらを１．２０（５％）の比で添加物に供給して、ナイーブなリンパ球の抗原誘導増殖に対する治療用ＴｖＩＬ−１０Ｔ細胞の影響を調べる。対照添加物としては、同系対照を使用し、さらに、同種異系特異的なＴＥＧＦＰリンパ球（いわゆる治療用遺伝子とは無関連の対照遺伝子、増強緑色蛍光タンパク質を有する）を同じ比で使用した。蛍光強度およびその減少の測定は、蛍光流量細胞測定法（ＦＡＣＳ）によって、一日目〜四日目に行った。治療用Ｔ細胞を含まない同種異系対照に比べて、ＴｖＩＬ−１０リンパ球を有する添加物中で検出できた増殖阻害は、三日目および四日目で約７０〜８０％でることを示すことができた（図１および図２）。
【００３６】
《実施例６：ＴｖＩＬ−１０細胞による、ナイーブなＴリンパ球中のインターフェロン−γ生成の阻害》
ナイーブなＴリンパ球中のインターフェロン−γの生成をＴｖＩＬ−１０細胞によって阻止することを、ＭＬＣ中においても検出した。同一の実験法が使用した。今回は、流量細胞測定器に蛍光通路１内で照射する他の膜染料（ＣＦＳＥ）を使用した。。ＩＦＮ−γの検出は、ＰＥマーキングされたＩＦＮ−γに対するモノクローナル細胞内抗体によって、ＦＡＣＳ内で四日目に実施した。同種異系特異的なＴｖＩＬ−１０リンパ球との培養後の、ナイーブなＴリンパ球中におけるＩＦＮ−γ生産の減衰は四日目で５０％である（図３）。
【００３７】
遺伝子導入ＴｖＩＬ−１０細胞を、ＴＥＧＦＰ細胞および同種異系特異的な非遺伝子導入リンパ球と、タンパク質およびＲＮＡレベルで比較することにより、治療用細胞のサイトカイン発現パターン（ｒＩＬ−２、ｒＩＦＮ−γ、ｒＩＬ−１０等）が他の細胞と異なるか否かがわかる。さらに、活性化マーカー（ｒＣＤ２５）、細胞消滅（ＦａｓＬ）、および抗細胞消滅（Ｂａｇ−１）遺伝子発現パターンも分析する。このような実験は、治療用細胞を一義的に特徴付け、このようなリンパ球の可能な作用モードを分析することに貢献する。
【００３８】
《実施例７：非ウィルス法による、同種異系反応性Ｔ細胞への遺伝子導入》
ウィルス性遺伝子導入のほかに、同種異系反応性の遺伝子修飾Ｔ細胞を生成させるための非ウィルス性遺伝子導入も実験することになろう。この目的に際しては、混合されたリンパ球培養物で製造された同種異系特異的Ｔ細胞を、例えば治療用遺伝子を備えたプラスミドを含有する或るリポソーム配合物と共にインキュベートするか、または遺伝子銃で処理する。この実験法には、ウィルス生成パック細胞系との共培養は不要である。
【００３９】
《実施例８：他のウィルス性ベクター系による、同種異系反応性Ｔ細胞における遺伝子導入》
マウスのモロニー白血病ウィルス（ＭｏＭｕＬＶ）をベースとするレトロウィルス性遺伝子導入の他に、同種異系反応性の遺伝子修飾Ｔ細胞の製造も、他のウィルス性ベクター系によって保護するであろう。このことには、レンチウィルス性コンストラクト（これはヒト免疫不全ウィルス（ＨＩＶ）系レトロウィルスを意味する）、アデノ関連ウィルスウィルス（ＡＡＶ）系コンストラクト、およびサイトメガロウィルス（ＣＭＶ）系コンストラクトによる遺伝子導入が含まれる。
【００４０】
《文献》
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Ｌｅｈｍａｎｎ， Ｍ．， Ｆ．， Ｓｔｅｒｎｋｏｐｆ， Ｆ． Ｍｅｔｚ， Ｊ． Ｂｒｏｃｋ， Ｗ．−Ｄ． Ｄｏｅｃｋｅ， Ａ． Ｐｌａｎｔｉｋｏｗ， Ｂ． Ｋｕｔｔｌｅｒ， Ｈ．Ｊ． Ｈａｈｎ， Ｂ． Ｒｉｎｇｅｌ．， Ｈ．−Ｄ． Ｖｏｌｋ． Ａ ｎｏｖｅｌ ｈｉｇｈ−ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ａｎｔｉ−ＣＤ４ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｉｎｄｕｃｅｓ ｌｏｎｇ−ｔｅｒ ｍ ｓｕｒｖｉｖａｌ ｏｆ ｒａｔ ｓｋｉｎ ａｌｌｏｇｒａｆｔｓ． Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ １９９２， ５４：９５９−９６２．
Ｌｅｈｍａｎｎ， Ｍ．， Ｋｕｔｔｌｅｒ， Ｂ．， Ｓｉｅｇｌｉｎｇ， Ａ．， Ｆｏｒｄａｌｌａ， Ａ．， Ｒｉｅｄｅｌ， Ｈ．， Ｌａｃｈａ， Ｊ．， Ｈａｈｎ， Ｈ．−Ｊ．， Ｂｒｏｃｋ， Ｊ．， Ｖｏｌｋ， Ｈ．−Ｄ． Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ａｎｔｉ−ＣＤ４−ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｅｒｍａｎｅｎｔ ａｃｃｅｐｔａｎｃｅ ｏｆ ｒａｔ ｒｅｎａｌ ａｌｌｏｇｒａｆｔｓ． Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｃ． １９９３，２５： ２８５９．
【００４２】
Ｌｅｈｍａｎｎ， Ｍ．， Ｇｒａｓｅｒ Ｅ， Ｒｉｓｃｈ Ｋ， Ｈａｎｃｏｃｋ ＷＷ， Ｍｕｌｌｅｒ Ａ， Ｋｕｔｔｌｅｒ Ｂ， Ｈａｈｎ ＨＪ， Ｋｕｐｉｅｃ−Ｗｅｇｌｉｎｓｋｉ ＪＷ， Ｂｒｏｃｋ Ｊ， Ｖｏｌｋ ＨＤ． Ａｎｔｉ−ＣＤ４ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｉｎｄｕｃｅｄ ａｌｌｏｇｒａｆｔ ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ｉｎ ｒａｔｓ ｄｅｓｐｉｔｅ ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｃｅ ｏｆ ｄｏｎｏｒ−ｒｅａｃｔｉｖｅ Ｔ ｃｅｌｌｓ． Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ １９９７年１０月２７日；６４（８）；１１８１−７．
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Ｏｄｅ−Ｈａｋｉｍ， Ｓ．， Ｄｏｅｃｋｅ， Ｗ．Ｄ．， Ｋｅｒｎ， Ｆ．， Ｖｏｌｋ， Ｈ．Ｄ．， Ｒｅｉｎｋｅ， Ｐ． ＤＴＨ−ｌｉｋｅ ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｉｎ ｌａｔｅ ａｃｕｔｅ ｒｅｊｅｃｔｉｏｎ−ｒｏｌｅ ｏｆ ＣＤ４＋ Ｔ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ． Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ １９９６， ６１： １２３３−１３４０．
Ｏｎｏｄｅｒａ， Ｋ．， Ｌｅｈｍａｎｎ， Ｍ．， Ａｋａｌｉｎ， Ｅ．， Ｖｏｌｋ， Ｈ．−Ｄ．， Ｓａｙｅｇｈ， Ｍ．Ｈ．， Ｋｕｐｉｅｃ−Ｗｅｇｌｉｎｓｋｉ， Ｊ．Ｗ． Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ”ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ” ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ｔｏ ＭＨＣ−ｉｎｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ ｃａｒｄｉａｃ ａｌｌｏｇｒａｆｔｓ ｉｎ ＣＤ４ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｔｒｅａｔｅｄ ｓｅｎｓｉｔｉｚｅｄ ｒａｔ ｒｅｃｉｐｉｅｎｔｓ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １９９６ａ， １５７： １９４４−１９５０．
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Ｏｎｏｄｅｒａ， Ｋ．， Ｈａｎｃｋｏｃｋ， Ｗ．Ｗ．， Ｇｒａｓｅｒ， Ｅ．， Ｌｅｈｍａｎｎ， Ｍ．， Ｖｏｌｋ， Ｈ．−Ｄ．， Ｓａｙｅｇｈ， Ｍ． Ｈ．， Ｓｔｒｏｍ， Ｔ．Ｂ．， Ｋｕｐｉｅｃ−Ｗｅｇｌｉｎｓｋｉ， Ｊ．Ｗ． Ｔｈ２−ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ ａｎｄ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ”ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ” ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ｉｎ ｒａｔ ｃａｒｄｉａｃ ａｌｌｏｇｒａｆｔ ｒｅｃｉｐｉｅｎｔｓ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， １９９７， １５９；１５７２−１５８１．
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Ｓｉｅｇｌｉｎｇ， Ａ， Ｍ． Ｌｅｈｍａｎｎ， Ｈ． Ｒｉｅｄｅｌ， Ｃ． Ｐｌａｔｚｅｒ， Ｊ． Ｂｒｏｃｋ， Ｆ． Ｅｍｍｒｉｃｈ， Ｈ．−Ｄ．， Ｖｏｌｋ． Ａ ｎｏｎｄｅｐｌｅｔｉｎｇ ａｎｔｉ−ｒａｔ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｗｈｉｃｈ ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｓ Ｔ ｈｅｌｐｅｒ １−ｌｉｋｅ ｂｕｔ ｎｏｔ Ｔ ｈｅｌｐｅｒ ２−ｌｉｋｅ ｉｎｔｒａｇｒａｆｔ ｌｙｍｐｈｏｋｉｎｅ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ｉｎｄｕｃｅｓ ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ ｓｕｒｖｉｖａｌ ｏｆ ｒｅｎａｌ ｓｌｌｏｇｒａｆｔｓ． Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ １９９４ａ， ５７： ４６４−４６７．
【００４５】
Ｓｉｅｇｌｉｎｇ， Ａ， Ｍ． Ｌｅｈｍａｎｎ， Ｃ． Ｐｌａｔｚｅｒ， Ｆ． Ｅｍｍｒｉｃｈ， Ｈ．−Ｄ． Ｖｏｌｋ Ａ ｎｏｖｅｌ ｍｕｔｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ｃｏｍｐｅｔｉｔｏｒ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｆｏｒ ｑｕａｎｉｔａｔｉｖｅ ＰＣＲ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｃｙｔｏｋｉｎｅ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｒａｔｓ． １９９４ｂ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈ． １７７： ２３−２８．
Ｓｕｚｕｋｉ， Ｔ．， Ｔａｇｈａｒａ， Ｈ．， Ｎａｒｕｌａ， Ｓ．， Ｍｏｏｒｅ， Ｋ．Ｗ．， Ｒｏｂｂｉｎｓ， Ｐ．Ｄ．， Ｌｏｔｚｅ， Ｍ．Ｔ． Ｖｉｒａｌ Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ １０ （ＩＬ−１０）， ｔｈｅ Ｈｕｍａｎ Ｈｅｒｐｅｓ Ｖｉｒｕｓ ４ Ｃｅｌｌｕｌａｒ ＩＬ−１０ Ｈｏｍｏｌｏｇｕｅ， Ｉｎｄｕｃｅｓ Ｌｏｃａｌ Ａｎｅｒｇｙ ｔｏ Ａｌｌｏｇｅｎｉｃ ａｎｄ Ｓｙｎｇｅｎｉｃ Ｔｕｍｏｒｓ． Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １９９５， １８２：４７７−４８６．
Ｔａｋｅｕｃｈｉ Ｔ．， Ｕｅｋｉ， Ｔ．， Ｓｕｎａｇａ Ｓ．， Ｉｋｕｔａ Ｋ， Ｓａｓａｋｉ Ｙ．， Ｌｉ Ｂ．， Ｍｏｒｉｙａｍａ Ｎ．， Ｍｉｙａｚａｋｉ Ｊ．， Ｋａｗａｂｅ Ｋ． Ｍｕｒｉｎｅ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ ４ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｈｅａｒｔ ａｌｌｏｇｒａｆｔ ｓｕｒｖｉｖａｌ ｐｒｏｌｏｎｇｅｄ ｗｉｔｈ ｄｏｗｎｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｔｈ１ ｃｙｔｏｋｉｎｅ ｍＲＮＡ ｉｎ ｇｒａｆｔｓ． Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ １９９７ ７月１５日； ６４（１）： １５２−７．
ＶａｎＢｕｓｋｉｒｋ， Ａ．Ｍ．， Ｗａｋｅｌｙ， Ｍ．Ｅ．， Ｏｒｏｓｚ， Ｃ．Ｇ． Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ ｏｆ ｐｏｌａｒｉｚｅｄ ＴＨ２−ｌｉｋｅ ｃｅｌｌ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ ｉｎｔｏ ＳＣＩＤ ｍｏｕｓｅ ｃａｒｄｉａｃ ａｌｌｏｇｒａｆｔ ｒｅｃｉｐｉｅｎｔｓ ｒｅｓｕｌｔｓ ｉｎ ａｃｕｔｅ ａｌｌｏｇｒａｆｔ ｒｅｊｅｃｔｉｏｎ． Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ １９９６ ７月２７日；６２（２）：２２９−３８．
【００４６】
《略語一覧》
ＡＡＶ  アデノ伴生ウィルス
Ａｇ    抗原
Ａｋ    抗体
ＡＰＣ  抗原提示細胞
Ｂ細胞  Ｂ細胞
Ｂ７−分子  ＡＰＣへの表面マーカー、Ｔセルの活性化に重要
ｂａｇ−１  Ｂｃｌ−２伴生アタノ遺伝子、抗細胞消滅遺伝子、Ｂｃｌ−２と相互作用する。
ｂｃｌ−２  Ｂ細胞ロイケミア−２、抗細胞消滅遺伝子
ｂｃｌ−ｘｌ  Ｂｃｌ−２相同物、抗細胞消滅遺伝子
ｃＤＮＡ  相補的ＤＮＡ、コピーＤＮＡ
ＣＤ    分化クラスター（ｃｌｕｓｔｅｒ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ、表面分子のための専門語）
ＣＤ４  特異的表面マーカーおよびＴヘルパー細胞
ＣＭＶ  サイトメガロウィルス
（ＲＩＢ５／２）    ＣＤ４−分子に方向付けされたモノクローナル抗体に対応する符号
ＣＤ８  Ｔ−    細胞障害性Ｔ細胞における特異的な表面マーカー
ＣＭＶ  ＩＬ−１０  サイトメガロウィルスＩＬ−１０、ヒトＩＬ−１０もしくはｖＩＬ−１０とホモログ
ＣＴＬＡ−４  細胞毒性Ｔ細胞後期抗体
ＣＴＬＡ４−Ｉｇ  融合蛋白、ＣＴＬＡ−４（細胞障害性Ｔ細胞後期抗体）と、ＩｇＧ抗体のＦｃ部分とから成る
ＤＭＥＭ  ダルベッコ改変イーグル培地
ＤＮＡ  デオキシリボ核酸
ＥＢＶ  エプスタイン−バールウィルス
ＥＧＦＰ  増強増強緑色蛍光タンパク質、緑色発光レポーター遺伝子
ＥＬＩＺＡ  酵素結合イムノソルベントアッセイ
ｇｙ    Ｇｒａｙ（Ｇｙ）
ｈＤｅｌｔａ１  ホモサピエンスデルタ（ショウジョウバエ）−１状（ノッチリガンド［Ｎｏｔｃｈ−ｌｉｇａｎｄ］のファミリーに由来）
ｈＳｅｒｒａｔｅ−１  ホモサピエンスセラト１（ノッチリガンドのファミリーに由来）
ＦＣＳ  牛胎児血清
ＩＦＮ  インターフェロン
Ｉｇ    免疫グロブリン
ＩＬ    インターロイキン
ｋＤａ  キロ・ダルトン
ｍａｂ  モノクローナル抗体
ＭＨＣ  主要組織適合性複合体
ＭＬＣ  混合されたリンパ球培養物
ｍＲＮＡ  メッセンジャーリボ核酸
ＮＩＨ／３Ｔ３  マウス繊維芽細胞
ＮＫ細胞  ナチュラルキラー細胞
Ｎｏｔｃｈ（ノッチ）１−４  ホモサピエンスノッチ（ショウジョウバエ）ホモログ１−４（ノッチレセプター）
ＯＫＴ３    ＣＤ３に対するｍａｂ
ＰＢＭＣ    末梢血液単核細胞
ＰＣＲ    ポリメラーゼ連鎖反応
ＰＨＡ    フィトヘマグルチニン
ＳＣＩＤ−マウス    ＢおよびＴ細胞を有していない免疫不全マウス
ＴＣＭ    Ｔ細胞培地
ＴＣＲシグナル  Ｔ細胞レセプター
ＴＧＦ    トランスフォーミング成長因子
Ｔリンパ球  胸腺に関連または由来するリンパ球
Ｔ細胞  胸腺に由来するＴリンパ球
Ｔｈ１−細胞  Ｔヘルパー１表現型を有するＴ細胞
Ｔｈ２      Ｔヘルパー２表現型を有するＴ細胞
ＴＮＦ    腫瘍壊死因子
ｖＩＬ−１０  ウィルス性インターロイキン１０、エプスタイン−バールウィルスに由来し、ヒトＩＬ−１０に対して高い相同性を有する。
【図面の簡単な説明】
【図１】
三日目の増殖阻止率を示す棒グラフである。（実施例５）
【図２】
四日目の増殖阻止率を示す棒グラフである。（実施例５）
【図３】
四日目のＩＦＮ−γ生産を示す棒グラフである。（実施例６）
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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