(57)【要約】本発明は、前立腺癌を診断する方法、前立腺癌の進行性を測定する方法、及び、転移の可能性のある前立腺癌を識別する方法、を提供するものである。本発明の診断及び予後検定法には、Pin1の抗体ベースの検出ステップと、Pin1 RNAの増幅ステップとを含む方法が包含される。本発明の診断及び予後検定法を、PSA検査、直腸指診、及びグリーソン前立腺腫瘍等級システムを含む、前立腺癌診断の他の方法と組み合わせて用いてもよい。【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象の生体試料中のPin1レベルを評価するステップであって、但しこの場合、Pin1レベルの上昇は前立腺癌の指標である、ステップと、
前立腺癌の診断が簡便化するように、対象のTDPCAを評価するステップと
を含む、対象の前立腺癌の診断を簡便化する方法。
【請求項２】
対象の生体試料中のPin1レベルを評価するステップであって、但しこの場合、Pin1レベルの上昇は前立腺癌の指標であり、前記対象は、前立腺癌の可能性があると以前にTDPCAにより分類されていた、ステップと
を含む、対象の前立腺癌の診断を簡便化する方法。
【請求項３】
対象の生体試料中のPin1レベルを評価するステップであって、但しこの場合、Pin1レベルの上昇は前立腺癌の進行性の指標である、ステップ、
を含む、対象の前立腺癌の進行性を測定する方法。
【請求項４】
対象の生体試料中のPin1レベルを評価するステップであって、但しこの場合、Pin1レベルの上昇は転移性前立腺癌の指標である、ステップ、
を含む、対象の転移性前立腺癌を識別する方法。
【請求項５】
対象の生体試料中のPin1レベルを評価する前記ステップが、Pin1に対する抗体又はその一フラグメントに前記生体試料を接触させるステップと、前記抗体の前記生体試料への結合量を調べるステップと、前記生体試料に結合した抗体量を、所定の基礎レベルに比較するステップと、を含む、
請求項１、２、３、又は４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記対象が、前立腺癌に関連する状態について治療を受けているか、又は、受けたことがあり、但しこの場合、Pin1レベルは対象の治療に対する応答の指標である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項７】
前記生体試料が体液を含む、請求項１、２、３、又は４のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
前記体液が、血液、血清、精液、前立腺液、精漿、及び尿からなる群より選択される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記抗体がポリクローナル抗体である、請求項５に記載の方法。
【請求項１０】
前記生体試料が前立腺組織を包含する、請求項１、２、３、又は４のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項５に記載の方法。
【請求項１２】
前記抗体が標識化抗体である、請求項５に記載の方法。
【請求項１３】
前記抗体の生体試料への結合量が、標識化抗体が発するシグナルの強度によって決定される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記抗体の生体試料への結合量が、標識化抗体に結合した生体試料中の細胞数、により決定される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記抗体の生体試料への結合量が、ラジオイムノアッセイにより決定される、請求項５に記載の方法。
【請求項１６】
前記抗体の生体試料への結合量が、酵素免疫検定法により決定される、請求項５に記載の方法。
【請求項１７】
生体試料中のPin1核酸レベルを検出するステップと、
前記生体試料中のPin1レベルをコントロール試料中のPin1レベルと比較するステップであって、但しこの場合、前記コントロール試料に比較したときの前記生体試料中のPin1レベルの上昇は前立腺癌の指標である、ステップと
を含む、対象の前立腺癌を診断する方法。
【請求項１８】
生体試料中のPin1核酸レベルを検出するステップと、
前記生体試料中のPin1レベルをコントロール試料中のPin1レベルと比較するステップであって、但しこの場合、前記コントロール試料に比較したときの前記生体試料中のPin1レベルの上昇は前立腺癌転移の指標である、ステップと
を含む、対象の前立腺癌転移を診断する方法。
【請求項１９】
生体試料中のPin1核酸レベルを検出する前記ステップが、Pin1 RNAを増幅するステップを含む、請求項１７又は１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記生体試料が唾液、痰、粘液、骨髄、血清、血液、尿、リンパ液、涙、精液、精漿、前立腺液、及び前立腺組織からなる群より選択される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記生体試料が血液試料である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記生体試料が前立腺組織試料である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
前記増幅するステップが、ポリメラーゼ連鎖反応を行うステップを含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２４】
前記TDPCAが、対象が前立腺癌異常を有することを示す直腸指診である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項２５】
前記TDPCAが、前立腺酸性ホスファターゼ、前立腺分泌タンパク質、前立腺特異膜抗原、ヒトカリクレイン（原語：kallekrein）2、前立腺特異トランスグルタミナーゼ、及びインターロイキン8からなる群より選択される、前立腺癌マーカを検出する検査である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項２６】
前記TDPCAが前立腺特異抗原を検出する検査である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項２７】
前記TDPCAが、対象の血清中の前立腺特異抗原を検出する検査である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項２８】
前記対象の有する前立腺特異抗原の血清濃度が約2乃至約10ng/mlである、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記対象の有する前立腺特異抗原の血清濃度が約4乃至約8ng/mlである、請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
前記対象の有する前立腺特異抗原の血清濃度が約3乃至約7ng/mlであり、対象が約４０歳乃至約６０歳である、請求項２７に記載の方法。
【請求項３１】
前記対象の有する前立腺特異抗原の血清濃度が約5乃至約9ng/mlであり、対象が約６０歳乃至約８０歳である、請求項２７に記載の方法。
【請求項３２】
前記対象の有する前立腺特異抗原の血清濃度が約4ng/ml未満であり、PSA速度が１年当たり約0.7ng/mlを越える、請求項２７に記載の方法。
【請求項３３】
前記対象の有する前立腺特異抗原の血清濃度が約4乃至約8ng/mlであり、遊離前立腺特異抗原率が約15乃至約25%である、請求項２７に記載の方法。
【請求項３４】
前記前立腺癌試料が4乃至9のグリーソン計を有する、請求項４に記載の方法。
【請求項３５】
前記グリーソン計が6又は7である、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
対象のテスト試料中のPin1レベルを評価するステップと、
前記テスト試料中のPin1レベルを、正常組織中のPin1レベルに比較するステップであって、但しこの場合、テスト試料のPin1レベルの上昇は、前記対象が、Pin1阻害化合物を包含する治療に応答する可能性があることの指標である、ステップと
を含む、ある前立腺癌患者が、Pin1阻害化合物を包含する治療に応答する可能性があるかどうかを決定する方法。
【請求項３７】
対象のテスト試料中のPin1レベルを評価するステップと、
前記テスト試料中のPin1レベルが転移性に成るであろう癌の指標となっているかどうかを決定するステップと、
を含む、ある患者に転移性前立腺癌発症のリスクがあるかどうかを決定する方法。
【請求項３８】
前記テスト試料が針生検で採集される、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記テスト試料がヒト血清から採集される、請求項３７に記載の方法。
【請求項４０】
対象のテスト試料中のPin1レベルを評価するステップと、
前記テスト試料中のPin1レベルが、PSA障害を発症する指標となっているかどうかを調べるステップと、を含む、ある患者にPSA障害が発症するリスクがあるかどうかを決定する方法。
【発明の詳細な説明】
【関連出願】
【０００１】
本出願は、その内容全体を引用をもってここに援用することとする、２００１年２月９日提出の米国仮出願６０／２６７，５５２号、及び２００２年１月１０日出願の米国仮出願番号６０／ＸＸＸ，ＸＸＸ号に基づく優先権を主張するものである。
【発明の背景】
【０００２】
米国内、そして実際には世界中で報告されている癌症例数の増加は大きな懸念である。現在では、特定の種類の癌に利用できる治療法が一握りの数しかなく、またこれらの治療には、悪性腫瘍の初期の検出だけでなく、悪性度の重症度の信頼性ある評価が必要である。前立腺癌（PCA）は米国の男性で最も診断される頻度の高い癌であり、男性の癌死の二番目の原因である（Karp et al., 1996, Cancer Res. 56:5547-5556)。１９９５年には４万人を越えるアメリカ人がPCAで死亡したと推定され、約244,000 の新しい症例の前立腺癌が検出され(Cancer Facts and Figures-1995, American Cancer Society, Inc., 1995)、これらの数は毎年、恐るべき速度で増加してきた。さらに、アフリカ系アメリカ人男性の前立腺癌発現率は白人のそれに比べて37%高い (Jaroff, L. (April 1, 1996), Time)。
【０００３】
前立腺癌が提示する変わった課題の一つは、大半の前立腺腫瘍が生命に危険を及ぼさないことである。解剖検査から見積もると、およそ１１００万人のアメリカ人男性が前立腺癌を有する(Dhom, 1983, J. Cancer Res. Clin. Oncol., 106:210-218)ことが分かる。癌細胞は、７０代又は８０代の男性の前立腺に見つかることが多い。しかしながら、これらの男性全員が前立腺癌（PCA）を発症することはなく、解剖によれば、他の原因で死亡する男性の３分の１が前立腺癌の顕微鏡的集塊を示す (Nutr. Act. Newsletter, 23(2):12で引用されたThayer, W., (March 19, 1996)）。前立腺癌の死亡率は５５歳を越えると上昇し、新たな前立腺癌の症例はこの死亡率よりも速く上昇している。これらの数値は、通常は遅く、かつだらだらと長く続く進行過程を示す前立腺癌の臨床上の観察と一致する。このような疾患の進行の結果、患者の存命中に臨床的な懸念が生じるような症例に前立腺癌が発展していく場合はほとんどない。現在の方法で検出できた場合でも、癌の分化が進み、臓器限局的であり、そして局所性だと思われる場合は、高齢の患者を治療で延命することは通常はできない。
【０００４】
残念ながら、性質上進行性の前立腺癌は、現在の方法で臨床的に検出できた時点では既に転移している場合がしばしばある。転移性前立腺癌患者の生存率は大変低い。これら極端な二者の間にあるのが、存命中には転移するであろうが、まだしていない段階の前立腺腫瘍を有する患者である。これらの患者の場合、前立腺を外科的に除去することが治癒的であり、また寿命も長くなる。従って、新たに診断された患者がどのグループに属するかを精確に判断できることが、最適な治療を決定すること、そして患者の生存にとって重要である。
【０００５】
前立腺の異常に関する現在の主な診断ツールは、正常な男性では１ミリリットル当たり０乃至４ナノグラムの範囲である、血中の前立腺特異抗原（PSA）のレベルの測定である。前立腺特異抗原（PSA）の存在は、標準的な抗体ベースの検出キットを用いれば、血液試料から比較的容易に測定することができる。前立腺肥大は良性の前立腺肥大症（BPH）として知られる状態であり、４５歳を越えた男性の約半分に見つかる。BPHがあると、前立腺の大きさに比例してPSAレベルが上昇しており、PCAの診断をつけにくくする可能性がある。さらに、PCAのある男性のかなりの比率で、PSAレベルが正常である。PSA検査はPCA及びBPHを区別するには幾分、非特異的であり、ある程度の偽陰性の結果を出す（Garnick, M., (1993), Am. Inst. Med., 118:804-818）。大半の症例では、PSAの上昇は、癌ではなくBPH又は前立腺症が原因である。PSA検査はそれまでの手法に比べて大きな進歩ではあるが、このようにまだ不足な点が多くある。
【０００６】
臨床的及び病理学的段階や、組織学的な等級付けシステム（例えばグリーソン法など）が、腫瘍の分化の程度及び腺パターンの種類に基づいて患者群を予後別に示すのに用いられてきた (Carter and Coffey, In: J. P. Karr and H. Yamanak (eds.), Prostate Cancer: The Second Tokyo Symposium, pp. 19-27, New York: Elsevier, 1989.; Diamond et al., J. Urol., 128: 729-734, 1982)が、これらのシステムは、癌の進行性を充分に予測するものではない。原発病巣の組織切片を「核の球形」について解析するコンピュータ・システム画像解析の使用が、個々の患者の管理に役立つと示されてきた (Diamond et al., 1982, J. Urol., 128:729-734)が、この方法を使用する場合は、この疾患の進行を研究する上では限られている。
【０００７】
現在でも、前立腺癌と闘う上で新しい方法が求められており、従って、前立腺癌の診断、病期決定、予後及び観察のための特異的な方法及び試薬を提供できれば有益であろう。
【０００８】
発明の概要
本発明は、対象の前立腺癌の診断を簡便化する方法を提供し、当該方法は、対象の生体試料中のPin1レベルを評価するステップであって、但しこの場合、Pin1レベルの上昇は前立腺癌の指標である、ステップと、前立腺癌の診断が簡便化するように、対象に対するTDPCAを評価するステップと、を含む。
【０００９】
さらに本発明は、対象の前立腺癌の診断を簡便化する方法を提供し、当該方法は、対象の生体試料中のPin1レベルを評価するステップであって、但しこの場合、Pin1レベルの上昇は前立腺癌の指標であり、前記対象は、前立腺癌の疑いがあるが確かではない、と以前にTDPCAにより分類されている、ステップを含む。
【００１０】
別の局面では、本発明は、対象の前立腺癌の進行性を測定する方法を包含するものであり、当該方法は、対象の生体試料中のPin1レベルを評価するステップを含み、但しこの場合、Pin1レベルの上昇は前立腺癌の進行性の指標である。
【００１１】
さらに本発明は、対象の転移性前立腺癌を識別する方法を提供するものであり、当該方法は、対象の生体試料中のPin1レベルを評価するステップを含み、但しこの場合、Pin1レベルの上昇は転移性前立腺癌の指標である。
【００１２】
さらに本発明は、転移性前立腺癌を発症するリスクのある対象を識別する方法を提供するものであり、当該方法は、対象の生体試料中のPin1レベルを評価するステップを含み、但しこの場合、Pin1レベルの上昇は、当該対象に転移性前立腺癌が発症するリスクがあることの指標である。
【００１３】
さらに本発明は上記の方法であって、但し対象の生体試料中のPin1レベルを評価するステップが、Pin1に対する抗体又はその一フラグメントに前記生体試料を接触させるステップと、前記抗体の前記生体試料への結合量を決定するステップと、前記生体試料に結合した抗体量を、所定の基礎レベルに比較するステップと、を含む方法も提供する。前記抗体の生体試料への結合量は、標識化抗体が発するシグナルの強度、及び／又は、標識化抗体に結合した生体試料中の細胞数、により、調べることができる。
【００１４】
さらに本発明は、上記の方法であって、この場合Pin1レベルを、生体試料中のPin1核酸レベルを検出するステップと、前記生体試料中のPin1レベルをコントロール試料中のPin1レベルと比較するステップと、により評価する方法も包含する。例えば、いくつかの実施態様では、Pin1核酸を、ハイブリダイゼーション・プローブ及び／又は核酸増幅法を用いて検出する。
【００１５】
本発明の診断検定法及び予後検定法は、前立腺癌を診断する他の方法と組み合わせて用いることもできる。本発明の検定法と組み合わせて使用できる前立腺診断法の例には、限定はしないが、医業の当業者に公知のPCAに関する現在の診断法、例えば、PSA検査、直腸内診、経直腸的超音波検査法又は磁気共鳴画像法（MRI）、骨スキャンニング、Ｘ線、骨格検査、静脈性腎盂造影法、CATスキャン、及び生検、がある。ある実施態様では、本発明の上記の診断検定及び予後検定の対象を、直腸指診で前立腺異常があることで識別した。別の実施態様では、当該対象を、上昇したPSAレベルを有することで識別した。他の実施態様では、本発明の方法と組み合わせて使用できる前立腺癌のマーカには、前立腺酸性ホスファターゼ、前立腺分泌タンパク質、前立腺特異膜抗原、ヒトカリクレイン（原語：kallekrein）2、前立腺特異トランスグルタミナーゼ、ケラチン-19、及びインターロイキン8、がある。
【００１６】
本発明の診断及び予後検定法は、PSAレベルがグレーゾーンにあり、前立腺生検を行うべきかどうかがはっきりしない場合に、特に有用である。例えば、本発明の診断及び予後検定法を、対象の有する前立腺特異抗原の血清濃度が約４乃至約８ｎｇ／ｍｌであるときに用いてよい。本発明の予後検定法はまた、グリーソン計がグレーゾーン以内にあって、予後が通常では、はっきりしない場合、例えばグリーソン・スコアが４乃至８の間であるか、グリーソン・スコアが６乃至７である場合にも、特に有用である。
【００１７】
さらに本発明の診断及び予後検定法を、前立腺癌の病期決定のための他の方法と組み合わせて用いることもできる。本発明の検定法は、従来の病期決定法では、前立腺癌の予後が不明瞭なままであるときに、特に有用である。例えば、進行性がT2又はT3の病期の前立腺癌は、本発明の検定法を用いると、より良く評価することができる。
【００１８】
また本発明は、Pin1活性（例えばPin1遺伝子発現又は酵素活性）に対して刺激もしくは阻害作用を有する作用物質又はモジュレータを含んで成る治療計画に対して、対象が応答する可能性があるかどうかを調べる方法も包含する。例えば、本発明の診断及び予後法を用いてPin1レベルが上昇していると判明した者などの個人に、正常でないPin1活性に関連する障害（例えば癌などの増殖性障害）を（予防的又は治療的に）治療するために、Pin1阻害剤を投与することができる。このような治療と関連して、ファーマコゲノミックス（即ち、ある個人の遺伝子型と、その個人の外来の化合物又は薬物に対する応答との間の関係の研究）を考慮してもよい。治療薬の代謝の違いが原因で、薬学的に活性な薬物の投与量と血中濃度との間の関係が変化して、重篤な毒性や治療の失敗につながる場合がある。
【００１９】
このように、内科医又は臨床医は、Pin1阻害剤の使用が有効であるかを判断する際に、関係するファーマコゲノミックス研究で得られた知見の応用を考慮してもよい。ファーマコゲノミックスというアプローチで生まれた情報を、ある個人の予防もしくは治療的処置のための適切な投薬量及び治療計画を決定するために用いることができる。ここで解説する例示的なスクリーニング検定の一つで同定されたモジュレータなど、Pin1分子又はPin1モジュレータで対象を治療する場合に、この知見を投薬量又は薬物の選択に応用すると、副作用又は治療の失敗を避けることができ、ひいては、治療もしくは予防効果を高めることができる。このように、ここで解説する方法を用いると、どのPin1モジュレータ又は阻害剤を投与すべきか、そしてPin1分子又はPin1モジュレータのどちらを投与すべきか、を判断したり、Pin1分子又はPin1モジュレータを用いた治療の投薬量及び／又は治療計画を調整することができる。
【００２０】
また本発明の診断及び予後検定法は、前立腺癌に関連する状態のための治療を受けつつある、又は受けた対象の快復を評価する上でも有用である。例えば、前立腺治療（即ち前立腺除去術）を受けた後の快復を評価するために、本発明の検定法を単独で、又は、PSA障害と組み合わせて用いることができる。
【００２１】
さらに本発明は、ここに解説する方法に従って生体試料中のPin1ポリペプチド又は核酸の存在を検出するためのキットも包含する。このようなキットを用いると、ある対象が前立腺癌に罹患しているか、又は、前立腺癌発症のリスクが高いかどうかを判断したり、転移性前立腺癌を有する、又は、転移性前立腺癌のリスクのある対象を識別することができる。例えば、当該キットには、Pin1又はPin1をコードするmRNAを生体試料中で検出可能な標識化化合物又は作用物質と、前記試料中のPin1又はPin1 mRNAの量を調べる手段（例えば当該ポリペプチドに結合する抗体、又は、Pin1をコードするDNAもしくはmRNAに結合するオリゴヌクレオチド・プローブなど）とを含めることができる。キットにはさらに、血清検定を簡便化するために使用できる免疫磁気ビーズを含めることもできる。さらにキットには、本発明の方法を実施するための指示、及び／又は、本キットを用いて得られた結果を解釈するための指示、を含めることもできる。
【００２２】
抗体ベースのキットの場合、本キットは、例えば（１）本発明のマーカに相当するポリペプチドに結合する第一抗体（例えば固体の支持体に付着させたもの）、及び選択的に、（２）前記ポリペプチド又は前記第一抗体のいずれかに結合すると共に、検出可能な標識に結合させた第二の異なる抗体、を含んで成るものとすることができる。
【００２３】
オリゴヌクレオチドベースのキットの場合、本キットは、例えば（１）本発明のマーカに相当するポリペプチドをコードする核酸配列にハイブリダイズする、例えば検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドなどのオリゴヌクレオチド、又は（２）本発明のマーカに相当する核酸分子を増幅するために有用な一対のプライマ、を含んで成るものとすることができる。さらに本キットを、例えば緩衝剤、保存剤、又はタンパク質安定化剤などを含んで成るものとしてよい。さらに本キットを、前記検出可能な標識（例えば酵素又は基質）を検出するために必要な成分を含んで成るものとすることができる。また本キットに、検定可能であり、前記生体試料に比較可能な一コントロール試料又は一連のコントロール試料を含めることもできる。本キットの各構成成分を、個々の容器内に封入し、これら多種の容器のすべてを、本キットを用いて行われる検定の結果を解釈するための指示と一緒に、一個のパッケージに入れてもよい。
【００２４】
いくつかの実施態様では、前立腺癌を診断するためのキットには、対象の試料中のPin1レベルを検定するための少なくとも一種の試薬と、対象の試料中のPin1の検定レベルに基づいて前立腺癌を診断するために前記少なくとも一種の試薬を用いる際の指示と、が含まれる。対象の前立腺癌の進行性を評価するためのキットの一例は、対象の試料中のPin1レベルを検定するための少なくとも一種の試薬と、対象の試料中のPin1の検定レベルに基づいて前立腺癌の進行性を評価するために前記少なくとも一種の試薬を用いる際の指示と、を含むものである。
【００２５】
発明の詳細な説明
本発明は、前立腺癌を診断する方法、前立腺癌の進行性を測定する方法、及び、転移の可能性がある前立腺癌を識別する方法、を提供するものである。本発明の診断及び予後検定法は、Pin1の抗体ベースの検出及びPin1 RNAの増幅を伴う方法を包含する。本発明の診断及び予後検定法を、PSA検査、直腸指診、及びグリーソン前立腺腫瘍等級システムを含め、他の前立腺癌診断法と組み合わせて用いてもよい。本方法は、その測定の精度や、侵襲的手術を行わずにこれらの方法を使用できることから、現在利用できる方法から向上したものである。
【００２６】
定義
「Pin1」は、リン酸化Ser/Thr-Pro結合のみの異性化反応を触媒する高度に保存されたタンパク質である(登録番号：AAC50492 及びU49070; Lu et al., 1996 Nature 380:544-547; Rananathan, R. et al.1997 Cell 89:875-86;  Yaffe, et al. 1997, Science 278:1957-1960;  Shen, et al. 1998,Genes Dev. 12:706-720;  Lu, et al. 1999, Science 283:1325-1328; Crenshaw, et al. 1998, Embo J. 17:1315-1327;  Lu, et al. 1999, Nature 399:784-788;  Zhou, et al. 1999, Cell Mol. Life Sci. 56:788-806)。さらに、Pin1は、リン酸化Ser/Thre-Pro結合モジュールとして働くN末端WWドメインを含有する(Sudol, M. (1996) Prog. Biophys. Mol. Biol. 65:113-32)。このリン酸化依存的相互作用により、Pin1は、その標的をCdc25、Wee 1、Myt1、Tau-Rad4、及びRNAポリメラーゼIIラージ・ドメインのC末端ドメインを含むリン酸化基質のサブセットに設定される(Crenshaw, D.G., et al. (1998) Embo. J. 17:1315-27; Shen, M. (1998) Genes Dev. 12:706-20; Wells, N.J. (1999) J. Cell. Sci. 112: 3861-71)。
【００２７】
「癌」には、調節を外れた又は制御不能となった細胞成長を特徴とする悪性の新生物が包含される。用語「癌」には、原発性悪性腫瘍（例えば、その細胞が、対象の体内で、最初の腫瘍部位以外の部位に遊走していないものなど）及び続発性悪性腫瘍（例えば、最初の腫瘍部位とは異なる二次的な部位への腫瘍細胞の遊走である転移から生ずるものなど）が含まれる。
【００２８】
「退形成」とは、癌の組織学的特徴を言う。これらの特徴には、正常な組織構造の乱れ、細胞の密集、極性不全と呼ばれる細胞の方向性の消失、「多形現象」と呼ばれる、細胞の大きさ及び形状の不均質性、がある。退形成の細胞学的特徴には、核対細胞質比（核対細胞質比は、悪性細胞の場合、50%を越える場合がある）の増加、核の多形現象、核膜に沿った核クロマチンの凝集、核クロマチンの着色の増加、簡略化した小胞体、遊離型リボゾームの増加、ミトコンドリアの多形減少、オルガネラの大きさ及び数の減少、核小体の肥大及び数の増加、及び時には、中間径フィラメントの存在、がある。
【００２９】
「新生物」又は「新生物性形質転換」とは、新生物、組織腫瘤、又は腫瘍の形成及び成長に至る病的プロセスである。このようなプロセスには、良性又は悪性腫瘍を含め、細胞成長の制御不能が含まれる。新生物には、組織の異常な腫瘤、正常組織を越え、かつ、正常組織とは不調和であり、当該変化を惹起した刺激が停止した後でも同じ過度な態様が続く成長、が含まれる。新生物は、構造的編成の部分的若しくは完全な欠落や、正常組織との機能的調和の部分的もしくは完全な欠落を示すことがあり、通常は明確な組織腫瘤を形成する。
【００３０】
新生物は、発生源の組織に形態学的及び機能的に類似する傾向がある。例えば膵臓の島組織から生じた新生物はこの島組織に類似し、分泌顆粒を含有し、インシュリンを分泌する。新生物の臨床上の特徴は、その源の組織の機能から生ずると考えられる。
【００３１】
ある新生物の組織学的及び他の特徴を評価することにより、その新生物が良性か悪性であるかを判断することができる。浸潤及び転移（新生物の遠位の部位への広がり）は、悪性腫瘍に限定的な属性である。良性の新生物も、膨大になることがあるという事実はあるが、これらは隣接する非新生物性組織とは別個かつ識別可能なままに留まる。良性の腫瘍は一般に、境界がはっきりとし、円形で、嚢を有し、また灰色又は白色であり、均一な構造を有する。対照的に、悪性腫瘍は一般に指状の突起を有し、境界は不規則ではっきりとせず、多様な色及び構造を有する。良性腫瘍は成長するときに隣接組織を押しのける。良性腫瘍は、肥大するにつれて隣接組織を圧迫し、時には萎縮を生ずることがある。良性腫瘍と周囲組織との間の接合部が線維状の結合組織膜に変化して、良性腫瘍の外科的除去が簡単に行える場合がある。対照的に、悪性腫瘍は局部浸潤性であり、隣接組織内部に成長して、その境界には嚢がなく、また不規則なために、悪性腫瘍の外科的除去の際には、正常な組織の境界を幅広く取り除かねばならないことが多い。良性の新生物は悪性腫瘍よりも遅く成長する傾向がある。また良性の新生物は悪性腫瘍よりも自律性が低い傾向にある。良性の新生物は、発生源の組織と組織学的に非常に類似する傾向がある。発生源の組織に類似する癌である、より高度に分化した癌は、分化の低い癌よりも予後が良好な傾向がある。悪性腫瘍は、良性腫瘍よりも、異常な機能（即ち、異常なもしくは過剰な量のホルモン分泌）を有している場合が多い。
【００３２】
「前立腺癌」は前立腺の腺癌である。前立腺は、身体による精液形成を促すクルミ大の器官である。前立腺は尿道が膀胱の頸部に接合する位置にある。用語「前立腺癌（PCA）」とは、ここで用いる場合、前立腺の触診可能な腫瘍の出現と、前立腺の顕微鏡的に検出可能な新形成性もしくは形質転換性の細胞の両方を言う。後者の場合、前記細胞学的に検出可能な前立腺癌は、患者も医者も 癌細胞の存在を検知しないという点で無症状である場合がある。前立腺癌は通常、ゆっくりと進行し、通常、検出されるまでには隣接組織及びリンパ腺に広がっている。前立腺癌が前立腺からは遠位の更なる部位に転移している場合には、その状態は、この状態を臓器限局型前立腺癌から区別するために、転移癌（MC）、又は、転移した前立腺癌と記述される。PCAの致死性は、前立腺の腺癌細胞が遠位の部位、通常は中軸骨格、に内転移した結果である。この疾患が進行するにつれ、骨格、肺、及び肝臓を含む他の器官も癌性になることがある。
【００３３】
「良性前立腺肥大」は、年齢に関係した前立腺の非癌性肥大を包含し、４５歳を越えた男性の50%を越える男性が罹患する。良性の前立腺肥大（BPH）は無症状、即ち、その個人に対して何の不快もないことがあり、ここでは前立腺癌の必然的な発症を意味することは意図していない。BPH には、前立腺の成長の度合いに比例した、前立腺特異抗原というタンパク質の産生増加が伴う。これが理由で、BPH患者におけるPCAの診断は、PSA検査を単独で用いるだけでは、その後の無症状な成長から判別することは難しいであろう。
【００３４】
BPHは「問題のある」前立腺肥大として顕れたり、又は、進行して「問題のある」前立腺肥大となることがあり、その症状には、尿しぶり、頻尿、排尿ちゅうちょ、及び陰茎勃起不全、がある。これらの同じ症状はPCAにも伴う (M. Garnick, (1993), Annals Int. Med., 118(10):804-818)ため、臨床医はPCA及び問題のある前立腺肥大を、症状の突然の発現や、更なる診断検査で判別している。BPH 及び問題のある前立腺肥大はまた、進行してPCAになる場合もあるが、正常な患者と同様、BPH患者集団にもあらゆる範囲の診断の可能性が見られるために、これらの用語は、疾患の進行を除外することも、又は意味することも、意図してはいない。
【００３５】
癌に関してここで用いる「浸潤性」又は「進行性」とは、ある腫瘍がその境界を越えて隣接組織へ広がる傾向や、転移に関するその腫瘍の特徴を言う(Darnell, J. (1990), Molecular Cell Biology, Third Ed., W.H.Freeman, NY)。浸潤癌は臓器限局癌とは対照的なものと捉えることができる。例えば、皮膚の基底細胞癌は非浸潤性であるか、又はごく僅かに浸潤性の腫瘍であり、原発腫瘍の部位に限局しており、大きさは増大するが転移性ではない。対照的に、黒色腫は隣接組織及び遠位の組織に対する浸潤性が高い。腫瘍の浸潤性には、しばしば、基質物質及び基底膜を分解するコラゲナーゼなどのタンパク質分解酵素の同化作用が伴うことがあり、こうしてその腫瘍は嚢の境界を越え、またその腫瘍が位置する特定の組織の境界を越えて広がることができるのである。
【００３６】
前立腺癌に関してここで用いる「臓器限局型」とは、前立腺の境界を越えて転移していない、即ち、当業者に公知の技術により、前立腺を越えた何らかの器官又は組織に見つからない、前立腺癌を言う。しかしながら、いくつかの数の細胞が転移したにもかかわらず、当業者が通常用いる技術では検出されないことがあることも、無視できない。
【００３７】
ここで用いる用語「転移」とは、患者において最初の器官から更なる遠位の部位へと癌が広がる状態を言う。腫瘍転移のプロセスは、局部的な浸潤及び細胞間マトリックスの破壊、血管、リンパ管又は他の輸送管内への侵入、血中での生存、二次的部位への血管外遊出、及び新しい位置での成長を含む、多段階の事象である(Fidler, et al., Adv. Cancer Res. 28, 149-250 (1978), Liotta, et al., Cancer Treatment Res. 40, 223-238 (1988), Nicolson, Biochim. Biophy. Acta 948, 175-224 (1988) and Zetter, N. Eng. J. Med. 322, 605-612 (1990))。悪性細胞の運動能の上昇が、動物やヒトの腫瘍において、転移の可能性の増大と関連づけられている (Hosaka, et al., Gann 69, 273-276 (1978) and Haemmerlin, et al., Int. J. Cancer 27, 603-610 (1981))。
【００３８】
「転移性前立腺癌」には、局部的なリンパ節又は遠位の部位へ広がった前立腺癌も含まれる。前立腺癌の転移が最もよく起きる部位は骨である。前立腺癌の骨転移は、結局のところ、特徴的には溶骨性ではなく造骨性（即ち正味では骨形成となる）である。骨転移は脊髄に最も頻繁に見られ、その次に大腿骨、骨盤、胸郭、頭蓋骨及び上腕骨と続く。転移がよく起きる他の部位には、リンパ節、肺、肝臓及び脳がある。転移性前立腺癌は、典型的には、開放又は腹腔鏡による骨盤リンパ節切除術、全身RIスキャン、骨格Ｘ線撮影法、及び／又は、骨病変部生検、によって診断される。
【００３９】
「対象」は、原核生物及び真核生物などの生物を包含する。対象の例には、哺乳動物、例えばヒト、イヌ、ウシ、ウマ、カンガルー、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ネコ、マウス、ウサギ、ラット、及びトランスジェニック非ヒト動物がある。最も好適な対象はヒトである。
【００４０】
「TDPCA」は前立腺癌の診断を容易に行うために行われる検査である。例えば、TDPCAには、前立腺酸性ホスファターゼ、前立腺分泌タンパク質、前立腺特異膜抗原、ヒトカリクレイン2、前立腺特異トランスグルタミナーゼ、及びインターロイキン8、から成る群より選択される前立腺癌マーカを検出する検査が含まれる。TDPCAの例には、PSA検査、直腸検査、経直腸的超音波検査法、又は磁気共鳴画像法（MRI）、骨スキャンニング、Ｘ線、骨格調査、静脈性腎盂造影法、CAT−スキャン、及び生検、がある。ある実施態様では、TDPCAは直腸指診である。ある好適な実施態様では、TDPCAは対象の血清中の前立腺特異抗原を検出するための検査である。TDPCAにはPin1を検出するための検査は含まれない。
【００４１】
「生体試料」には、固体及び体液試料が含まれる。本発明の生体試料には、細胞、細胞のタンパク質又は膜抽出物、血液又は生物学的流体、例えば腹水又は脳液（例えば脳脊髄液）など、が含まれよう。固体の生体試料の例には、糞便、直腸、中枢神経系、骨、乳房組織、腎組織、子宮頚管、子宮内膜、頭部／頚部、胆嚢、耳下腺組織、前立腺、脳、脳下垂体、腎臓組織、筋肉、食道、胃、小腸、結腸、肝臓、脾臓、膵臓、甲状腺組織、心臓組織、肺組織、膀胱、脂肪組織、リンパ節組織、子宮、卵巣組織、副腎組織、精巣組織、扁桃、及び胸腺から採取した試料、が含まれる。「体液試料」の例には、血液、血清、精液、前立腺液、精漿、尿、唾液、痰、粘液、骨髄、リンパ、及び涙、から採取した試料が含まれる。Pin1 RNAを増幅するために好適な試料には、末梢静脈血試料及び前立腺組織試料がある。本発明の検定で用いる試料は、静脈穿刺及び外科的生検などの標準的方法により得ることができる。ある実施態様では、当該生体試料は、針生検で得られる前立腺組織試料である。
【００４２】
ここで用いる「ファーマコゲノミックス」とは、例えば遺伝子配列決定、統計遺伝学、及び遺伝子発現解析などのゲノム技術を、臨床上の開発中の薬物及び市場にある薬物に応用することを言う。より具体的には、この用語は、ある患者の遺伝子が彼又は彼女の薬物に対する応答をどのように決定するか（例えばある患者の「薬物応答表現型」又は「薬物応答遺伝子型」）を調べる研究を言う。このように、本発明の別の局面は、ある個人の薬物応答遺伝子型に従って、その個人の予防的もしくは治療的処置を調節するための方法を提供するものである。
【００４３】
診断及び予後法
以下に詳述するように、本発明の検出法は、例えばin vitroの生体試料中やin vivoで、mRNA、タンパク質、cDNA、又はゲノムDNAを検出するために用いることができる。例えば、mRNAを検出するためのin vitro手法には、ノーザン・ハイブリダイゼーション及びin situハイブリダイゼーションがある。本発明のマーカに相当するポリペプチドを検出するためのin vitro手法には、酵素結合免疫吸着検定法（ELISA）、ウェスタン・ブロット、免疫沈降法、免疫組織化学法及び免疫蛍光法がある。ゲノムDNAを検出するためのin vitro手法には、サザン・ハイブリダイゼーションがある。さらに、本発明のマーカに相当するポリペプチドを検出するためのin vivo手法には、当該ポリペプチドに対する標識化抗体を対象に導入する方法がある。例えば、前記抗体は、対象内でのその存在及び位置を標準的な画像技術により検出できる放射性マーカで標識することができる。これらの方法で用いる、Pin1に対する核酸プローブや抗体は、Pin1の核酸配列及びアミノ酸配列が判明しているため、容易にデザインすることができる(Hunter et al., WO 97/17986 (1997); Hunter氏らの米国特許第5,952,467号及び第5,972,697号)。
【００４４】
Ｉ．  抗体ベースの検定法
上記の方法の実施態様では、対象から採取した生体試料中のPin1レベルを評価するステップは、前記生体試料を抗Pin1抗体又はその一フラグメントに接触させるステップと、前記生体試料への前記抗体の結合量を決定するステップと、前記生体試料へ結合した抗体の量を、所定の基礎レベルに比較するステップと、を含む。
【００４５】
正常な（即ち非癌性の）生体試料中のPin1レベルは、多種の方法で評価することができる。ある実施態様では、非癌性と思われる前立腺細胞の一部分のうちのPin1レベルを評価し、この正常レベルを、癌性と疑われる前立腺細胞の一部分のPin1レベルと比較することにより、この正常な発現レベルを決定する。代替的には、ある試料中、又は、癌に罹患していない個人から採取された試料中、のPin1レベルを評価することにより、マーカの「正常な」発現レベルを決定してもよい。
【００４６】
「抗体」には、免疫グロブリン分子や、免疫グロブリン分子の免疫活性決定基、即ち、抗原に特異的に結合する（免疫反応する）抗原結合部位を含有する分子、が含まれる。構造的には、最も簡単な形の天然型抗体（例えばIgG）は、２本のコピーの重（H）鎖及び２本の軽（L）鎖、という４本のポリペプチド鎖がすべてジスルフィド結合により共有結合したものから成る。大型及び多様な組の抗体の結合特異性は、H鎖及びL鎖の可変（V）決定基に見られ、一次構造を採るこの分子のうちの数領域は、この組で定常（C）である。抗体には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、全免疫グロブリン、及び免疫グロブリンの抗原結合フラグメント、が含まれる。
【００４７】
抗体を成すタンパク質の結合部位、即ち、その抗体の抗原結合機能は、天然型抗体の数々のフラグメントを解析することで位置特定されている。従って、抗原結合フラグメントも、本用語「抗体」の指すところと、意図されている。抗体という用語に包含される結合フラグメントの例には、VL、VH、CL及びCH1ドメインから成るFabフラグメント；VH及びCH1ドメインから成るFdフラグメント；抗体の一本の腕のVL及びVHドメインから成るFVフラグメント；VHドメインから成るdAbフラグメント (Ward et al., 1989 Nature 341:544-546 ) ；単離された相補性決定領域 (CDR)；及び、ヒンジ領域でジスルフィド架橋により連結された２本のFab'フラグメントを含んで成る二価のフラグメントであるF(ab')2フラグメント、がある。これらの抗体フラグメントは、当業者に公知の常法を用いて得られ、これらの フラグメントは、インタクト抗体と同じ態様で実用性についてスクリーニングされている。用語「抗体」には、さらに、ある抗体分子を由来とする少なくとも一つの抗原結合決定基を有する二重特異的分子及びキメラ分子も含まれるものと、意図されている。
【００４８】
本発明の診断及び予後検定法では、当該抗体はポリクローナル抗体でも、又はモノクローナル抗体でもよいが、ある好適な実施態様では標識化抗体である。
【００４９】
ポリクローナル抗体は、動物、通常は哺乳動物を、免疫原（抗原）及び適宜アジュバントを複数回皮下又は腹腔内注射して免疫することで、産生される。例示的な実施態様としては、免疫応答を惹起できる約1μg乃至1mgのタンパク質と、フロイント完全アジュバントなどの促進性担体製剤か、又は、明礬などの凝集剤とを配合し、この組成物を複数の部位に皮内注射することにより、あるタンパク質、ペプチド又は誘導体に対して動物を免疫することが多い。後に、初回の免疫原量の1/5乃至1/10などのより少量をフロイント完全アジュバント（又は他の適したアジュバント）に加えて複数の部位に皮下注射することで、少なくとも一回の後続投与を行って、動物を追加刺激する。その後動物の採血をし、血清を検定して、特異抗体価を調べ、その抗体価が上昇しなくなるまで（即ちプラトーに達するまで）動物を再度追加刺激し、検定する。
【００５０】
抗体分子の集団であって、そのそれぞれが、免疫原中に見つかる多くの異なる抗原決定基の一つに特異的であり、またそれぞれがその抗原決定基に対する特異的親和性を特徴とするような大きな一組の抗体を包含する抗体分子集団は「ポリクローナル」と呼ばれる。抗原決定基は抗原性を決める最も小さな決定基であり、一個のタンパク質の場合、６個乃至８個の残基長のペプチドを含んで成る (Berzofsky, J. and I. Berkower, (1993) in Paul, W., Ed., Fundamental Immunology, Raven Press, N.Y., p.246)。親和性は低い方の例えば10-6Mから高い方の例えば10-11Mまでの範囲がある。哺乳動物の血清から採集されるポリクローナル抗体画分は公知の手法により単離され、例えばプロテインＡなどの免疫グロブリン分子に選択的に結合する親和性マトリックスを用いたクロマトグラフィなどにより単離するとIgG画分が得られる。抗体の純度及び特異性を高めるために、固相固定免疫原を用いた免疫親和性クロマトグラフィにより、特異抗体をさらに精製してもよい。免疫原が抗体分子と免疫反応して、固相に固定された免疫複合体を形成するのに充分な時間、固相に固定された免疫原と、抗体を接触させる。結合した抗体を、例えばpHを次第に低くした緩衝剤やイオン強度を高くした緩衝剤を用いるなど、標準的な手法により固相から溶出させ、 溶出した画分を検定し、特異抗体を含有するものを配合する。
【００５１】
ここで用いる「モノクローナル抗体」又は「モノクローナル抗体組成物」とは、単一の分子組成の抗体分子の製剤を言う。モノクローナル抗体組成物は、ある特定の抗原決定基に対して単一の結合特異性及び親和性を示す。モノクローナル抗体は、細胞を培養で継続的に成長させることで抗体分子を産生させる技術を用いて、調製することができる。これらには、限定はしないが、最初にケーラー及びミルスタインが記述したハイブリドーマ技術 (1975, Nature 256:495-497; Brown et al. 1981 J. Immunol 127:539-46; Brown et al., 1980, J Biol Chem 255:4980-83; Yeh et al., 1976, PNAS 76:2927-31; 及び Yeh et al., 1982, Int. J. Cancer 29:269-75を参照されたい)及びより最近のヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術(Kozbor et al., 1983, Immunol Today 4:72)、EBV-ハイブリドーマ技術(Cole et al., 1985, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96)、及びトリオーマ技術、がある。ハイブリドーマを作製する技術は公知である（概略的には Current Protocols in Immunology, Coligan et al. ed., John Wiley & Sons, New York, 1994を参照されたい）。本発明のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞は、例えば標準的なELISA検定を用いるなどして、目的のポリペプチドに結合する抗体についてハイブリドーマ培養上清をスクリーニングすることで、検出される。
【００５２】
モノクローナル抗体は以下のステップにより調製できる。すべての手順において、動物を、ポリクローナル抗体の調製に関して上述したようにタンパク質（又はそのペプチド）などの抗原で免疫する。この免疫は、典型的には、免疫学的に有効量、即ち、免疫応答を生じさせるのに充分な量の免疫原を、免疫コンピテント動物に投与することで、行われる。好ましくは、当該哺乳動物はウサギ、ラット又はマウスなどのげっ歯類であるとよい。次に、この哺乳動物を、上述したように高親和抗体分子がこの哺乳動物に生ずるのに充分な期間、追加刺激スケジュールに維持する。抗体産生細胞の懸濁液を、所望の抗体を分泌している免疫後の各哺乳動物から取り出す。高親和抗体が生ずるのに充分な時間が経過後、当該動物（例えばマウス）をと殺し、抗体産生リンパ球をリンパ節、脾臓及び末梢血のうちの一つ以上から得る。脾細胞が好ましく、当業者に公知の方法を用いて、生理培地中で個々の細胞になるよう機械的に分離することができる。この抗体産生細胞を、マウス骨髄腫系細胞に融合させて不死化させる。マウスリンパ球はマウス同種骨髄腫細胞に対して効率で安定な融合を起こすが、ラット、ウサギ及びカエル体細胞も使用できる。所望の抗体を産生する動物の脾細胞は、一般的にはポリエチレングリコールなどの融合剤の存在下で、骨髄腫細胞に融合させることで不死化されている。例えばメリーランド州ロックビルのアメリカン・タイプカルチャー・コレクション（ATCC）から入手可能なP3-NS1/1-Ag4-1、P3-x63-Ag8.653 又はSp2/O-Ag14 骨髄腫系など、融合相手として適した数多くある骨髄腫細胞株のいずれかを、標準的な手法で用いる。
【００５３】
融合により作製された、所望のハイブリドーマを含有する細胞を、未融合の親骨髄腫もしくはリンパ球もしくは脾細胞を淘汰するようデザインされたHAT培地などの選択培地で培養する。ハイブリドーマ細胞を選抜し、限界希釈条件下で成長させて、単離されたクローンを得る。各クローン・ハイブリドーマの上清を、所望の特異性及び親和性を持つ抗体の産生について、例えば免疫に用いたものなどの所望の抗原を調べる免疫検定法などによりスクリーニングする。硫安沈殿法、イオン交換クロマトグラフィ、及びアフィニティ・クロマトグラフィなどの常法により、産生細胞の培養物からモノクローナル抗体を単離する (Zola et al., Monoclonal Hybridoma Antibodies: Techniques And Applications, Hurell (ed.), pp. 51-52, CRC Press, 1982)。これらの方法に従って作製されたハイブリドーマは、当業者に公知の手法を用い、in vitroの培養で増殖させることも、又はin vivo（腹水中）で増殖させることもできる。
【００５４】
モノクローナル抗体分泌性ハイブリドーマを作製する代わりに、本発明のポリペプチドに対するモノクローナル抗体は、組換えコンビナトリアル免疫グロブリン・ライブラリ（例えば抗体ファージ・ディスプレイ・ライブラリ）を目的のポリペプチドでスクリーニングすることによっても、同定及び単離することができる。ファージ・ディスプレイ・ライブラリを作製及びスクリーニングするためのキットは市販のものを利用できる（例えばファルマシア・リコンビナント・ファージ抗体システム、カタログ番号27-9400-01；及びストラータジーンSurfZAPファージ・ディスプレイ・キット、カタログ番号240612)。加えて、抗体ディスプレイ・ライブラリを作製及びスクリーニングするための使用に特に適した方法及び試薬の例は、例えば、米国特許第5,223,409号；PCT 公報WO 92/18619；PCT 公報 WO 91/17271；PCT公報WO 92/20791；PCT公報WO 92/15679；PCT 公報WO 93/01288；PCT公報 WO 92/01047；PCT 公報WO 92/09690；PCT 公報WO 90/02809；Fuchs et al. (1991) Bio/Technology 9:1370-1372; Hay et al. (1992) Hum. Antibod. Hybridomas 3:81-85; Huse et al. (1989) Science 246:1275- 1281; Griffiths et al. (1993) EMBO J. 12:725-734に見ることができる。
【００５５】
さらに、ヒト部分及び非ヒト部分の両方を含んで成り、標準的な組換えDNA技術を用いて作製可能な、キメラ及びヒト化モノクローナル抗体などの組換え抗体も、本発明の範囲内にある。このようなキメラ及びヒト化モノクローナル抗体は、例えばPCT公報WO 87/02671；ヨーロッパ特許出願第184,187号；ヨーロッパ特許出願第171,496号；ヨーロッパ特許出願第173,494号；PCT公報WO 86/01533；米国特許第4,816,567号；ヨーロッパ特許出願第125,023号；Better et al. (1988) Science 240:1041-1043; Liu et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA  84:3439-3443; Liu et al. (1987) J. Immunol. 139:3521- 3526; Sun et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:214-218; Nishimura et al. (1987) Cancer Res. 47:999-1005; Wood et al. (1985) Nature 314:446-449; and Shaw et al. (1988) J. Natl. Cancer Inst. 80:1553-1559）; Morrison (1985) Science 229:1202-1207; Oi et al. (1986) Bio/Techniques 4:214; 米国特許第5,225,539号; Jones et al. (1986) Nature 321:552-525; Verhoeyan et al. (1988) Science 239:1534; 及びBeidler et al. (1988) J. Immunol. 141:4053-4060に解説された方法を用いるなど、当業で公知の組換えDNA技術により、作製できる。
【００５６】
ここで用いる「標識化抗体」には、検出可能な手段で標識された抗体が包含され、酵素標識、放射性標識、蛍光標識、化学発光標識、及び／又は、生物発光標識された抗体が含まれる。
【００５７】
抗体を検出可能に標識できる方法の一つは、抗体の酵素への連結によるものである。この酵素は、後に基質に暴露すると、この基質と反応して、分光光度分析法、蛍光光度分析法、又は視覚的手段などににより検出可能な化学成分を生じることとなる。Pin1特異抗体を検出可能に標識するために使用できる酵素には、限定はしないが、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、ブドウ球菌のヌクレアーゼ、デルタ-V-ステロイドイソメラーゼ、酵母アルコールデヒドロゲナーゼ、アルファ-グリセロホスフェートデヒドロゲナーゼ、トリオースホスフェートイソメラーゼ、西洋わさびペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、アスパラギナーゼ、グルコースオキシダーゼ、ベータ-ガラクトシダーゼ、リボヌクレアーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコース-VI-ホスフェートデヒドロゲナーゼ、グルコアミラーゼ及びアセチルコリンエステラーゼ、がある。
【００５８】
検出は、多種の免疫検定法のいずれを用いて行ってもよい。例えば、抗体を放射性標識すると、放射免疫検定法を用いて抗体を検出することができる。放射免疫検定法（RIA）の解説は、Laboratory Techniques and Biochemistry in Molecular Biology, by Work, T. S., et al., North Holland Publishing Company, NY (1978)に、特に、Chard, T氏の標題「An Introduction to Radioimmune Assay and Related Techniques」の章に見られよう。
【００５９】
放射性同位元素はガンマ・カウンタ又はシンチレーション・カウンタ又はオージオラジオグラフィなどを用いるなどの手段により検出できる。本発明の目的のために特に有用な同位元素は、3H、131I、35S、14C、及び好ましくは125Iである。
【００６０】
さらに、抗体を蛍光化合物で標識することも可能である。蛍光標識された抗体を適した波長の光に暴露すると、その存在を蛍光により検出することができる。最もよく用いられている蛍光標識化合物の仲には、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、フィコエリトリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、o-フタルデヒド及びフルオレスカミン、がある。
【００６１】
さらに抗体は、例えば152Eu又は他のランタニド族などの蛍光放出金属を用いても検出可能に標識できる。これらの金属は当該の抗体に、例えばジエチレントリアミン五酢酸（DTPA）又はエチレンジアミン四酢酸（EDTA）などの金属キレート基を用いて付着させることができる。
【００６２】
さらに抗体は、それを化学発光化合物に結合させることでも、検出可能に標識できる。こうして、化学発光のタグの付いた抗体の存在を、化学反応の過程で生じる発光の存在を検出することにより、判断する。特に有用な化学発光標識化合物の例は、ルミノール、ルシフェリン、イソルミノール、セロマティック（原語：theromatic）アクリジニウムエステル、イミダゾール、アクリジニウム塩及びシュウ酸エステルである。
【００６３】
同様に、生物発光化合物を用いて本発明の抗体を標識してもよい。生物発光は、生物系で見られる化学発光の一種であり、この場合、触媒タンパク質は化学発光反応の効率を高める。生物発光タンパク質の存在は、発光の存在を検出することにより、判断される。標識付けのために重要な生物発光化合物はルシフェリン、ルシフェラーゼ及びエクオリンである。
【００６４】
本発明の診断及び予後検定法においては、抗体の生体試料への結合量を、標識された抗体が放出するシグナル強度、及び／又は、生体試料中で、標識された抗体に結合した細胞数、により、決定することができる。
【００６５】
血清検定法
癌マーカを検出するための血清検定法は非侵襲的な方法であり、患者にはより受け容れやすく、また、多数の試料をスクリーニングするツールともなる。更なる長所には、転移性の表現型への進行という後期段階ではなく、初期の事象に関係する抗原を当該抗体が認識することである。血清検定法は、癌を診断するために、ここに紹介した他の検定法と組み合わせて用いることができる。
【００６６】
目的のタンパク質に対する抗体を磁気ビーズに結合させ、一集団を濃縮するために用いることができる。免疫磁気選抜法がこの目的のために既に用いられてきており、この方法の例は、例えば米国特許第5,646,001号; Ree et al. (2002) Int. J. Cancer 97:28-33; Molnar et al. (2001) Clin. Cancer Research 7:4080-4085; and Kasimir-Bauer  et al. (2001) Breast Cancer Res. Treat. 69:123-32に見ることができる。目的の細胞上の細胞表面タンパク質に特異的な、ポリクローナルもしくはモノクローナルの抗体を磁気基質に付着させて、目的の表面タンパク質を発現する細胞のみを選抜できるようにする。ある一細胞集団が選抜されたら、Pin1の存在についてテストするために以下の検定を行うことができる。
【００６７】
免疫検定法
生体試料中の抗原（即ちPin1）の量は、ラジオイムノアッセイ、免疫放射定量測定法、及び／又は酵素免疫検定法により調べてもよい。
【００６８】
「ラジオイムノアッセイ」は、標識された（即ち放射性標識された）形の抗原を用いて、抗原を検出及びその濃度を測定する技術である。抗原用の放射性標識の例には、3H、14C、及び125I、がある。試料（即ち生体試料）中の抗原（即ちPin1）の濃度は、当該抗原に対する抗体への結合をめぐって、その試料中の抗原を、標識された（即ち放射性の）抗原と競合させることにより、測定される。標識された抗原と、標識されていない抗原との間の競合的結合を確実に行わせるためには、標識された抗原を、抗体の結合部位を飽和するのに充分な濃度で存在させる。試料中の抗原濃度が高いほど、抗体に結合する標識された抗原の濃度は低くなる。
【００６９】
ラジオイムノアッセイでは、抗体に結合した標識済み抗原の濃度を調べるために、抗原-抗体複合体を、遊離抗原から分離しなければならない。遊離抗原から抗原-抗体複合体を分離する方法の一つは、抗アイソタイプ抗血清を用いて抗原-抗体複合体を沈降させる方法である。遊離抗原から抗原-抗体複合体を分離する別の方法は、抗原-抗体複合体をホルマリン不活化させたS.アウレウス（S. aureus）で沈降させる方法である。遊離抗原から抗原-抗体複合体を分離するさらに別の方法は、抗体をセファロース・ビーズ、ポリスチレンのウェル、ポリ塩化ビニルのウェル、又は微量定量ウェルに結合（即ち共有結合）させる「固相ラジオイムノアッセイ」を行う方法である。抗体に結合した標識済み抗原の濃度を、既知の濃度の抗原を有する試料に基づく標準曲線に比較することにより、生体試料中の抗原の濃度を決定することができる。
【００７０】
「免疫放射定量測定法」（IRMA）は、抗体試薬を放射性標識する免疫検定法である。IRMAには、例えばウサギ血清アルブミン（RSA）などのタンパク質への結合などの手法により、多価抗原結合体の作製が必要である。この多価抗原結合体は、１分子当たり少なくとも２個の抗原残基を有していなければならず、またこれら抗原残基は、少なくとも二つの抗体がこの抗原に結合できるよう、充分な距離、離れていなければならない。例えば、IRMAにおいては、前記多価抗原結合体をプラスチック製の球などの固体表面に付着させることができる。標識されていない「試料」抗原と、放射性標識された抗原に対する抗体とを、前記多価抗原結合体で被覆した球を入れた試験管に加える。この試料中の抗原は、抗原抗体結合部位をめぐって前記多価抗原結合体と競合する。適したインキュベーション時間後、結合しなかった反応体を洗浄により取り除き、固相上の放射能量を決定する。結合した放射性抗体の量は、試料中の抗原の濃度に反比例する。
【００７１】
最もよく行われている酵素免疫検定法は「酵素結合免疫吸着検定（ELISA）」である。この「酵素結合免疫吸着検定（ELISA）」は、標識された（即ち酵素を結合させた）形の抗体を用いて、抗原を検出及びその濃度を測定する技術である。
【００７２】
「サンドイッチ式ELISA」では、抗体（即ち抗Pin1）を固相（即ち微量定量プレート）に結合させ、抗原（即ちPin1）を含有する生体試料に暴露する。次にこの固相を洗浄して結合しなかった抗原を洗い落とす。次に、標識された（即ち酵素を結合させた）を、結合した抗原（存在する場合）に結合させて、抗体-抗原-抗体のサンドイッチを形成させる。抗体に結合させることのできる酵素の例は、アルカリホスファターゼ、西洋わさびペルオキシダーゼ、ルシフェラーゼ、ウレアーゼ、及びβ-ガラクトシダーゼである。酵素を結合させた抗体は基質と反応して、検定の可能な着色した反応生成物を生成する。
【００７３】
「競合的ELISA」では、抗原（即ちPin1）を含有する試料と一緒に抗体をインキュベートする。次に、この抗原-抗体混合物を、抗原で被覆してある固相（即ち微量定量プレート）に接触させる。試料中に存在する抗原が多いほど、固相に結合可能な遊離抗体は少ないことになる。次に、標識された（即ち酵素を結合させた）二次抗体をこの固相に加えて、この固相に結合した一次抗体の量を調べる。
【００７４】
「免疫組織化学検定法」では、検定しようとするタンパク質に特異的な抗体に組織切片を暴露することにより、該組織を前記特異タンパク質について検査する。次に、数多くある方法のいずれかによりこの抗体を視覚化して、タンパク質の存在及び存在量を調べる。抗体を視覚化するのに用いる方法の例は、例えば、抗体に酵素（例えばルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ、西洋わさびペルオキシダーゼ、又はβ-ガラクトシダーゼ）を連結する方法や、又は化学的方法（例えばDAB／基質クロマゲン（原語：chromagen））である。
【００７５】
ＩＩ．  Pin1核酸ベースの診断法及び予後法
さらに本発明は、対象の前立腺癌を診断する方法であって、生体試料中のPin1核酸レベルを検出するステップと、前記生体試料中のPin1レベルを、コントロール試料中のPin1レベルと比較するステップであって、但しこの場合、コントロール試料に比較したときの前記生体試料中のPin1レベルの上昇は前立腺癌の指標である、ステップと、を含む方法も包含するものである。
【００７６】
加えて、本発明は、対象の前立腺癌転移を診断する方法であって、生体試料中のPin1核酸レベルを検出するステップと、前記生体試料中のPin1レベルを、コントロール試料中のPin1レベルと比較するステップであって、この場合、コントロール試料に比較したときの前記生体試料中のPin1レベルの上昇は前立腺癌転移の指標である、ステップと、を含む方法にも関する。
【００７７】
上記の方法の一実施態様では、生体試料中のPin1核酸レベルを検出する前記ステップは、Pin1 RNAを増幅するステップを含む。上記の方法の別の実施態様では、生体試料中のPin1核酸レベルを検出する前記ステップは、前記Pin1 RNAをプローブでハイブリダイズするステップを含む。
【００７８】
Pin1マーカの絶対的発現レベルに基づいて決定する代わりに、前記マーカの正規化された発現レベルに基づいて決定してもよい。発現レベルを正規化するには、マーカの発現を、構成的に発現するハウスキーピング遺伝子など、マーカでない遺伝子の発現に比較することにより、マーカの絶対的発現レベルを補正することで、行う。正規化に適した遺伝子には、アクチン遺伝子などのハウスキーピング遺伝子、又は上皮細胞特異遺伝子がある。この正規化により、発現レベルを、患者の試料などのある試料と、非前立腺癌試料などの別の試料とで、又は、異なる源から採った試料間で比較することが可能となる。
【００７９】
代替的には、発現レベルを相対的発現レベルとして提供することもできる。あるマーカの相対的発現レベルを決定するには、10又はそれ以上、好ましくは50又はそれ以上の、正常細胞対癌細胞の単離物の試料について当該マーカの発現レベルを決定してから、問題の試料中の発現レベルを決定する。より多くの数の試料で検定した遺伝子のそれぞれの平均発現レベルを決定し、これを当該マーカの基線発現レベルとして用いる。こうして、この生体試料について調べたマーカの発現レベル（絶対的発現レベル）を、そのマーカについて得られた平均発現値で除算する。こうして相対的発現レベルが得られる。
【００８０】
mRNAレベルの検出に好適な診断法の一つは、検出しようとする遺伝子のコードするmRNAにハイブリダイズできる核酸分子（プローブ）に、単離されたmRNAを接触させるステップを含む方法である。本発明の核酸分子の配列に基づいたプローブを用いると、Pin1に相当する転写産物を検出することができる。この核酸プローブは、例えば、完全長cDNAでも、又はその一部分でもよく、例えば少なくとも7、15、30、50、100、250又は500 ヌクレオチド長であると共に、本発明のマーカをコードするmRNA又はゲノムDNAにストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズするのに充分なオリゴヌクレオチドである。このプローブでmRNAがハイブリダイゼーションするということは、問題のマーカが発現していることを示す。ある実施態様では、前記プローブは、例えば放射性同位元素、蛍光化合物、酵素、又は酵素コファクタなどの標識基をそれに付着させて含有する。
【００８１】
ある形態では、例えば単離したmRNAをアガロース・ゲル上に泳動させ、そしてmRNAをゲルからニトロセルロースなどのメンブレンに移すなどにより、mRNAを固体の表面上に固定し、プローブに接触させる。代替的な形態では、例えばアフィメトリックス（原語：Affymetrix）遺伝子チップアレイなど、プローブを固体の表面上に固定し、mRNAをそのプローブに接触させる。当業者であれば、本発明のマーカがコードするmRNAのレベルを検出するための使用に向け、公知のmRNA検出法を容易に適合させることができる。
【００８２】
「増幅」とは、特定の核酸分子の濃度がその初期濃度に比較して増加するような、又は、検出可能なシグナルの濃度が増加するような、テンプレート依存的プロセスや、ベクタが媒介する増殖を言う。ここで用いる場合のテンプレート依存的プロセスという用語は、プライマ分子のテンプレート依存的伸長が関与するプロセスを言うものと、意図する。テンプレート依存的プロセスという用語は、RNAもしくはDNA分子の核酸合成を言い、 このとき新たに合成される核酸鎖の配列は、周知の相補的塩基対の法則によって決定される（例えばWatson, J. D. et al., In: Molecular Biology of the Gene, 4th Ed., W. A. Benjamin, Inc., Menlo Park, Calif. (1987)を参照されたい。典型的には、ベクタに媒介させる方法は、核酸断片のDNAもしくはRNAベクタへの導入、ベクタのクローン的増幅、及び、増幅された核酸断片の回収、といったステップを含む。このような方法の例は、Cohen氏ら（米国特許第4,237,224号)、Maniatis, T. et al., Molecular Cloning (A Laboratory Manual), Cold Spring Harbor Laboratory, 1982に紹介されている。
【００８３】
試料中に存在する目的の標的配列を増幅するには、数多くのテンプレート依存的プロセスを利用できる。最も良く知られた増幅法の一つはMullis氏らの米国特許第4,683,195号、Mullis氏らの米国特許第4,683,202号、及びMullis氏らの米国特許第4,800,159号、及びInnis et al., PCR Protocols, Academic Press, Inc., San Diego Calif., 1990に詳述されたポリメラーゼ連鎖反応(PCR）である。簡単に説明すると、PCRでは、標的配列の対向する相補鎖数領域に相補的な二本のプライマ配列を作製する。過剰量のデオキシヌクレオシドトリホスフェートを反応混合液にDNAポリメラーゼ（例えばTaq ポリメラーゼ）と一緒に加える。標的配列が試料中に存在すれば、プライマがこの標的に結合して、前記ポリメラーゼが、ヌクレオチドを付け加えていくことで標的配列に沿ってこのプライマを伸長させる。この反応混合液の温度を上下させると、伸長したプライマは標的から解離して反応生成物を形成し、過剰なプライマが標的と反応生成物とに結合する、といったこのプロセスが繰り返される。好ましくは、増幅したmRNA量を定量するために、逆転写酵素PCR増幅法を行うとよいであろう。ポリメラーゼ連鎖反応法は当業者に公知である。
【００８４】
もう一つの増幅法は、ヨーロッパ特許320,308B1号に開示されたリガーゼ連鎖反応（LCR）である。LCRでは、二本の相補的なプローブ対を作製し、標的配列の存在下で、各対を、対向する標的相補鎖にそれらが当接するように結合させる。リガーゼの存在下では、これらの二本のプローブ対は連結して単一の単位を形成することとなる。PCRと同様、温度のサイクリングにより、結合して連結した単位は標的から解離して、今度は過剰プローブ対のライゲーションのための「標的配列」として働く。Whiteley氏らは、米国特許第4,883,750号で、プローブ対を標的配列に結合させるための、LCRと同様な代替的増幅法を解説している。
【００８５】
PCT出願PCT/US87/00880に解説されたQbetaレプリカーゼも、本発明においてさらに別の増幅法として用いてよい。この方法では、標的の一領域に相補的な一領域を有するRNAの複製配列をRNAポリメラーゼの存在下で試料に加える。このポリメラーゼにより前記複製配列のコピーが生じ、このコピーを後に検出することができる。
【００８６】
鎖置換増幅法（SDA）は、核酸を等温増幅させる別の方法であり、複数回の鎖置換及び合成、即ちニック翻訳、を含む。修復鎖反応（RCR）と呼ばれる同様の方法は、本発明で有用と思われるもう一つの増幅法であり、増幅させたい領域全体に複数のプローブをアニールさせた後、４つの塩基のうち２つだけが存在する修復反応を行わせるステップを含む。他方の２つの塩基は容易に検出できるようにビオチン化誘導体として加えることができる。同様なアプローチはSDAでも用いられている。
【００８７】
前立腺特異的な配列は、サイクリックプローブ反応（CPR）法を用いても検出できる。CPRでは、非前立腺特異的DNAの3'末端配列及び5'末端配列と、前立腺特異的RNAの中間配列とを有するプローブを、試料中に存在するDNAにハイブリダイズさせる。ハイブリダイゼーション後、この反応液を RNaseHで処理し、消化後に放出されるシグナルを生ずる別個の産物として、プローブの産物を同定する。最初のテンプレートは別のサイクリング・プローブにアニールさせて、この反応が繰り返される。このように、CPRは、前立腺癌特異的に発現される核酸にプローブをハイブリダイズさせることで生ずるシグナルを増幅するステップを含む。
【００８８】
英国出願第2 202 328号及びPCT 出願PCT/US89/01025に解説されたさらに別の増幅法も、本発明に従って用いてよい。前者の出願では、「修飾」されたプライマを、PCRに似たテンプレート及び酵素依存的合成で用いる。これらのプライマは、捕獲部分（例えばビオチン）及び／又は検出子部分（例えば酵素）で標識することで、修飾してもよい。後者の出願では、過剰量の標識されたプローブを試料に加える。標的配列の存在下でプローブを結合させ、触媒作用により開裂させる。開裂後、標的配列はそのまま遊離するため、過剰量のプローブが結合できる。標識されたプローブの開裂が、標的配列の存在のシグナルとなる。
【００８９】
他の核酸増幅法には、核酸配列ベースの増幅法(NASBA)及び3SRを含め、転写ベースの増幅系 (TAS) (Kwoh D., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 1989, 86:1173、Gingeras T. R.氏らのPCT 出願WO 88/1D315）がある。NASBAでは、標準的なフェノール／クロロホルム抽出、臨床試料の熱変性、溶解緩衝液での処理や、DNA及びRNAの単離用のミニスピン・カラム、又は、RNAの塩化グアニジウム抽出、により、増幅用の核酸を調製することができる。これらの増幅技術は、前立腺特異的配列を有するプライマのアニーリング・ステップを含む。重合後、DNA/RNAハイブリッドをRNase Hで消化し、二本鎖DNA分子を再度熱変性させる。いずれの場合でも、一本鎖DNAに第二の前立腺特異的プライマを加えて重合させることで、完全に二本鎖にさせる。こうしてこの二本鎖DNA分子は、T7 又はSP6などのポリメラーゼにより乗算的に転写される。等温的サイクル反応では、RNAを二本鎖DNAに逆転写させ、T7 又は SP6などのポリメラーゼで再度転写させる。その結果生成される、切断型又は完全長型である産物が、前立腺癌特異的配列を示す。
【００９０】
Davey, C. 氏らは、ヨーロッパ特許第329,822B1号で、一本鎖RNA（「ssRNA」）、ssDNA、及び二本鎖DNA（dsDNA）のサイクル合成を含む核酸増幅プロセスを開示しているが、このプロセスを本発明で用いてもよい。ssRNAは一番目のプライマオリゴヌクレオチドの一番目のテンプレートであり、逆転写酵素（RNA-依存的DNA ポリメラーゼ）により伸長させる。次に、生じたDNA:RNA二本鎖から、リボヌクレアーゼH (DNAもしくはRNAのいずれかと二本鎖を形成した状態のRNAに特異的なRNaseであるRNaseH）の作用により、RNAを取り除く。その結果得られるssDNAは、二番目のプライマの二番目のテンプレートであり、この二番目のプライマは、そのテンプレートに対して相同な5'末端に、RNAポリメラーゼプロモータ（例えばT7 RNAポリメラーゼ）の配列を含有する。次にこのプライマをDNAポリメラーゼ（例えばE. coli DNA ポリメラーゼ Iの大型の「クレノウ」断片）で伸長させると、プライマ同士の間に最初のRNAの配列と同一な配列を有すると共に、さらに一端にプロモータ配列も有する二本鎖DNA (「dsDNA」) 分子が生ずる。このプロモータ配列を適したRNAポリメラーゼで用いると、前記のDNAの数多くのRNAコピーを作製することができる。その後これらのコピーを再度サイクルに投入すると、大変迅速な増幅が可能である。この増幅法は、酵素を適正に選択すれば、各サイクルで酵素を添加することなく等温で行うことができる。このプロセスのサイクル的な性質のおかげで、開始配列はDNAの形又はRNAの形のいずれでも選択することができる。
【００９１】
Miller, H. I.氏らのPCT出願WO 89/06700 は、プロモータ／プライマ配列を標的一本鎖DNA（「ssDNA」）にハイブリダイズさせた後、この配列の数多くのRNAコピーを転写させることに基づいた核酸配列増幅スキームを開示している。このスキームはサイクル方式ではなく、即ち、新たなテンプレートは生成物であるRNA転写産物からは生じない。他の増幅法には、Frohman, M. A., In: PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications 1990, Academic Press, New York)が開示した「レース（原語：race）法」及び「片側PCR法」 (Ohara, O., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 1989, 86:5673-5677)がある。
【００９２】
生成物である「ジ-オリゴヌクレオチド」の配列を有する核酸の存在下で二本（又はそれ以上）のオリゴヌクレオチドを連結することで、このジ-オリゴヌクレオチドを増幅することに基づく方法(Wu, D. Y. et al., Genomics 1989, 4:560)も、本発明の増幅ステップで用いてよい。
【００９３】
増幅後、増幅産物の存在又は非存在を検出してもよい。増幅された産物は、限定はしないがマキサム及びギルバート法を含め、当業で公知のいかなる方法で配列決定してもよい。こうして、配列決定された増幅後の産物を、前立腺癌特異的な配列であることが既知の配列に比較する。代替的には、当該の核酸を様々な大きさの個々の断片に断片化してもよい。例えば、DNA断片は、限定はしないが、アガロースゲル・マトリックスを通じた電気泳動などの方法により、分子量に従って分離してもよい。次にこのゲルをサザン・ハイブリダイゼーションで解析する。簡単に説明すると、ゲル中のDNAを、限定はしないがニトロセルロースのシート及びナイロン・メンブレンなどのハイブリダイゼーション基質又はマトリックスに移す。標識済みのプローブを、マトリックス上の特定の位置にある相補DNAにハイブリダイズするよう、所定のハイブリダイゼーション条件下でこのマトリックスに付着させる。プローブは安定な二本鎖を形成できる長さのものでよい。プローブの大きさは約200乃至約10,000ヌクレオチド長の範囲内であってよく、好ましくは約200ヌクレオチド長である。視覚化又は検出のための多種の標識が当業者に公知であり、例えば、限定はしないが、蛍光染色、臭化エチジウム染色、例えばアビジン／ビオチン、32P標識などの放射性標識、等がある。好ましくは、PCR産物などの産物を、アガロース・ゲルに泳動させて、臭化エチジウムなどの染料を用いて視覚化するとよい。こうしてこのマトリックスをオートラジオグラフィで解析して、このプローブにハイブリダイズする特定の断片の位置を特定してもよい。
【００９４】
ＩＩＩ．  Pin1検出と組み合わせて用いる検定法
Ａ．  PSA検定
血中の「前立腺特異抗原（PSA）」レベルが、前立腺の異常に関する、現在のところ主な診断ツールである。前立腺特異抗原（PSA）の存在は、標準的な抗体ベースの検出キットを用いて、血液試料から比較的容易に測定することができる。良性前立腺肥大症（BPH）として知られる状態である前立腺の肥大は、４５歳を越えた男性の約半分に見られる。BPHがあると、PSAレベルは前立腺の大きさに比例して高くなるが、これによりPCAの診断が難しくなる可能性がある。さらに、PCA患者のうちの有意な比率が正常なPSAレベルを有する。PSA検査はPCA及びBPHを区別するには幾分、非特異的であり、ある程度の偽陰性の結果を生ずる(Garnick, M., (1993), Am. Inst. Med., 118:804-818)。症例の大半では、PSAの上昇は、癌ではなくBPH又は前立腺炎が原因である。血中の前立腺特異抗原（PSA）の正常レベルは年齢と共に上昇し、４０歳乃至４９歳の男性の場合の0-2.5ng/mlから、７０歳乃至７９歳の男性の場合の0-6.5ng/mlまでの幅がある。（年齢に伴う正常PSAレベルの変動については、以下の表１を参照されたい。前立腺癌はPSAレベルが4.1乃至10ng/mlの間の男性の約３分の１に検出されるであろう。PSAレベルが10ng/mlより上の男性の約３分の２が前立腺癌を有する。前立腺癌を有する男性の約２０％は4ng/ml未満のPSAレベルを有する。
【００９５】
【表１】
2004532390.tif 000002
【００９６】
血清PSA濃度に加え、遊離PSA率及びPSA速度を用いても、前立腺癌を診断する参考にすることができる。
【００９７】
PSAは血中で、結合したタンパク質及び遊離したタンパク質という、２つの形で存在する。結合したPSAの例は、α1-アンチキモトリプシンに結合したPSA（PSA-ACT）又はα2-マクログロブリンに結合したPSAである。BPHでは、概して、前立腺癌でよりも高いパーセンテージの遊離（結合した形に対して）PSAがある。例えば、遊離PSA率が0乃至14%で、PSAレベルが約4.1乃至10ng/mlという場合が、生検で前立腺癌陽性となる見込み64%と関係する。別の例では、遊離PSA率が15 乃至 24%で、PSAレベルが約4.1 乃至 10ng/mlという場合が、生検で前立腺癌陽性となる見込み37%と関係する。遊離PSA率に基づいて陽性前立腺生検の確率を示す下の表２を参照されたい。
【００９８】
【表２】
2004532390.tif 000003
【００９９】
「PSA速度」はPSA濃度の変化の速度である。前立腺癌はBPHよりもPSAレベルをより急速に上昇させると思われるため、PSA速度の高さは前立腺癌の可能性の高さと相関する。例えば、PSA速度が１年当たり0.75 ng/ml よりも高ければ、PSAが4ng/ml未満であっても、前立腺癌を示すものかも知れない。
【０１００】
本発明の診断及び予後検定法は、PSAレベルがグレーゾーン以内にあって、前立腺生検を行うべきかどうかが明確でない場合に特に有用である。例えば、本発明の診断及び予後検定法は、（ａ）対象の有する前立腺特異抗原の血清濃度が約2乃至約10ng/mlであるとき；（ｂ）対象の有する前立腺特異抗原の血清濃度が約4乃至約8ng/mlであるとき；（ｃ）対象の有する前立腺特異抗原の血清濃度が約3乃至約7ng/mlであり、そして対象が約40乃至約60歳であるとき；（ｄ）対象の有する前立腺特異抗原の血清濃度が約5乃至約9ng/mlであり、そして対象が約60乃至約80歳であるとき；（ｅ）対象の有する前立腺特異抗原の血清濃度が約4ng/ml未満であり、そしてPSA速度が１年当たり約0.7ng/mlを越えるとき；及び（ｆ）対象の有する前立腺特異抗原の血清濃度が約4乃至約8ng/mlであり、遊離前立腺特異抗原率が約15乃至約25%であるときに、前立腺癌を検出し、対象の見込みを評価するために用いてよい。
【０１０１】
Ｂ．前立腺癌の病期決定の方法
PSAの上昇や、ここに開示したものなどの他の前立腺癌マーカレベルの検出以外で、PCAを診断及び病期決定するための他の現在の方法は、医業の当業者に公知であり、直腸検査、経直腸的超音波検査法（TRUS）又は磁気共鳴画像法（MRI）、骨スキャンニング、Ｘ線、骨格調査、静脈性腎盂造影法、CAT-スキャン、及び生検、がある (Garnick, M. (1993), Annals of Internal Medicine, 118:803-818; 及びGarnick, M. (1994), Scientific American, 270:72-81にレビューがある)。
【０１０２】
直腸指診
「直腸指診」（DRE）においては、臨床医は手袋をはめた指で直腸壁を介して前立腺後部を評価する。臨床医は、前立腺の後方表面をチェックして堅さ、塊、又は肥大した前立腺などの異常を調べることとなる。ある実施態様では、本発明の上記の診断及び予後検定法での対象を、直腸指診で前立腺に異常があるとして識別した。
【０１０３】
ABCDスケール及びTNM病期決定システム
前立腺癌（PCA）の病期は通常、A、B、C及びDで分類されたスケールに従って評価される。病期Aの腫瘍は顕微鏡的である。病期A1は比較的に小さな区域に限局しており、よく分化した組織から成る腫瘍を指す。病期A2腫瘍はより散在して分化が低いものである。病期B腫瘍は直腸検査で指に感じるのに充分な大きさのものである。そして病期Cの前立腺癌は、腺全体に広がり、典型的には前立腺の境界を越えて周囲構造を圧迫するようになったものである。病期Dの腫瘍は、例えばリンパ節、骨、又は他の器官に転移したものである。代替的には、腫瘍はTNM病期決定システムでも病期を決定されており、このシステムでは、腫瘍は、次第に悪化する疾患順のT1aからT4bまでのスケールでランク付けされている（例えばT1c腫瘍は触診不能かつ目で見えず、前立腺特異抗原の血中レベル上昇で検出されたもの）。前立腺癌を病期決定するためのTNMシステムは、下の表３に要約されている。A2、B、又は Cの病期と特徴付けられた腫瘍のうちで25%乃至 50%がその後の検査で転移性であることが判明する。前立腺腫瘍組織の除去又は破壊のための手法を含む方法が、非転移性癌に利用されることが多い。例えば、根治的前立腺切除術は、病期A、B及び何らかの病期C腫瘍（即ち、腫瘍成長が前立腺の境界を大きく越えて広がっていないもの）や病期T1cの腫瘍に用いるのが好ましい。Ｘ線治療（例えば外部又は組織内）は、好ましくは、病期A、B又はC腫瘍や、T1c腫瘍に用いるとよい。更なる診断ツールが、多様な治療に適した症例を判別するのに役立つかも知れない。
【０１０４】
【表３】
2004532390.tif 000004
【０１０５】
グリーソン・スコア法
前立腺癌患者の予後を判断するために通常用いられているもう一つのシステムはグリーソン・スコア法システムである。「グリーソン・スコア」又は「グリーソン等級」は、顕微鏡下で観察した前立腺癌組織切片の検査に基づく1（よく分化したもの）から5（分化の低いもの）までの数値である。グリーソンスコアが低い程、前立腺癌組織は正常前立腺組織の構造により似ており、その癌の進行性が低い可能性が高い。
【０１０６】
「合計グリーソン・スコア」又は「グリーソン計」は前立腺癌組織で最も共通の組織学的パターン２つのグリーソン・スコアに基づく2（低分化度が最も低いもの）から10（最も未分化）までの数値である。グリーソン計が低いほど、その患者の予後は良好である。最も多いグリーソン計は、癌予後に関してしばしばグレーゾーンとなる6及び7である。下記の表4A-4D（パーチン（原語：Partin）係数表）は、PSAレベル、グリーソン・スコア、及び前立腺癌の病期に基づく、臓器限局性前立腺癌の確率を示す。
【０１０７】
【表４Ａ】
2004532390.tif 000005
【０１０８】
数値はすべて、予想上の確率をパーセントで示す（95%信頼区間）；楕円は確率を計算するのに充分なデータがないことを示す。
【０１０９】
【表４Ｂ】
2004532390.tif 000006
【０１１０】
数値はすべて、予想上の確率をパーセントで示す（95%信頼区間）；楕円は確率を計算するのに充分なデータがないことを示す。
【０１１１】
【表４Ｃ】
2004532390.tif 000007
【０１１２】
数値はすべて、予想上の確率をパーセントで示す（95%信頼区間）；楕円は確率を計算するのに充分なデータがないことを示す。
【０１１３】
【表４Ｄ】
2004532390.tif 000008
【０１１４】
数値はすべて、予想上の確率をパーセントで示す（95%信頼区間）；楕円は確率を計算するのに充分なデータがないことを示す。
【０１１５】
前立腺特異抗原（PSA）検査が、前立腺癌の診断ツールとして開発されたことにより、臨床的な前立腺癌のより初期かつより精確な検出が可能となった。この検査の開発前には、大半の腫瘍は指診で発見されており、これらの腫瘍は必然的に大型で、しばしば高い等級であった。これらの腫瘍の有意な部分が既に転移性であった。PSA検査の出現により、その大半が中間の等級（グリーソン・スコアで6-7）の、より小型の腫瘍の検出が可能となった。
【０１１６】
初期前立腺腫瘍を検出できる能力が向上したにもかかわらず、どの患者が無痛性の疾患経過を辿るか、そしてどの患者に転移性疾患が発症するかを判断することは、特に中級の腫瘍の患者では困難である。PSA観察後に、どの患者が積極的な治療を受けるべきか、そしてどの患者が積極度の低い治療を受けるべきかという治療上の決定は、これらの中級の患者の場合、特に難しい。ある特定の腫瘍の潜在的転帰を判別できれば、その患者に対する治療経過の選択が大きく左右されるであろう。従って、本発明の予後検定法は、予後が通常は明確でないグリーソン計がグレーゾーン内にある場合（即ちグリーソン計が6又は7である場合）にも、特に有用である。
【０１１７】
以下の実施例では、本発明をさらに解説するが、以下の実施例をさらに限定的なものと捉えてはならない。本出願全体を通じて引用された全参考文献、係属中の特許出願及び公開済み特許の内容を、引用をもって援用することをここに明示しておく。
【０１１８】
実施例
実施例１  −  ヒト組織でのPin1発現を調べる一次スクリーニング
材料及び方法
ヒト生体試料
ホルマリン固定し、パラフィン包埋した正常ヒト器官の切片をノバジェン社（ウィスコンシン州マジソン）から得た。調べた器官には：前立腺、脳、脳下垂体、腎臓、筋肉、食道、胃、小腸、結腸、肝臓、脾臓、膵臓、甲状腺、心臓、肺、膀胱、脂肪、リンパ節、子宮、卵巣、副腎、精巣、扁桃及び胸腺が含まれていた。
【０１１９】
１９の異なるヒト腫瘍組織のホルマリン固定し、パラフィン包埋された切片をノバジェン社及びイムジェニックス社（カリフォルニア州サンディエゴ）の両方から得た。調べた癌には：前立腺、胃、乳房、膵臓、肺、肝臓、腎臓、卵巣、甲状腺、膀胱、子宮頚管、結腸、食道、リンパ腫、子宮内膜、頭部／頚部、胆嚢、黒色腫、耳下腺が含まれていた。
【０１２０】
抗体
ウサギを組換えヒトPin1で免疫して作製された、市販のポリクローナル抗体（Ab-1）（マサチューセッツ州オンコジーン・リサーチ・プロダクツ社）をこの研究に用いた。この抗体の特異性をウェスタン・ブロット法及び親和性精製法で検査し、確認した。
【０１２１】
免疫組織化学法
正常及び腫瘍組織の両方について、ホルマリン固定し、パラフィンに包埋して4乃至6μm厚の切片にした組織に対し、免疫組織化学検査を行った。この切片をキシレンで脱パラフィンし、勾配（100、95及び75%）にしたエタノールで再水和化した後、3%H2O2／メタノールに１５分間、浸漬した。抗原の回収のために、切片をクエン酸緩衝液（pH6.0）（バイオジェネックス社）中に入れて１５分間、電子レンジにかけた。次に切片を10%正常ヤギ血清のTBS溶液で遮断した後、1:800の一次抗体と一緒に一晩、４℃でインキュベートした。ビオチン化ヤギ抗ウサギ抗体（カリフォルニア州バーリンゲイム、ベクター・ラボラトリーズ社）と一緒に３０分間、室温でインキュベートした後、標準的なアビジン-ビオチン-複合体(ABC) 処理 (ベクター社、ベクタステイン・エリートABCキット)を行った。ジアミノベンジジン（DAB）をクロモゲンとして用いた後、ヘマトキシリンで対比染色した。陰性コントロールについては、一次抗体を省略し、予め吸収させた抗体による事前免疫染色では、何ら特異的反応性は見られなかった。
【０１２２】
結果
正常組織
２５個の器官から採った正常ヒト生体試料を検討した。正常組織では、高レベルのPin1が検出された正常な腎臓、脳、膵島細胞及び精巣組織を除き、Pin1レベルは低かった。
【０１２３】
腫瘍組織
１９の異なる種類の通常のヒト癌から採った260個の腫瘍試料を検討した。異なる19腫の癌のすべてで、Pin1の過剰発現が示された。Pin1タンパク質過剰発現の発生率は癌の種類によって異なる（表５）。
【０１２４】
【表５】
2004532390.tif 000009
【０１２５】
実施例２  −  ヒト前立腺癌の予後マーカとしてのPin1の使用
材料及び方法
計４２人の前立腺癌患者に根治的前立腺切除術が１９８８年から１９９６年の間に行われた。医療歴を調べて前立腺腫瘍の臨床段階を遡及的に評価した。各新生物の等級をグリーソン・スコアシステムを用いて決定した。
【０１２６】
抗体
市販のヒトポリクローナルPin1抗体（マサチューセッツ州オンコジーン・リサーチ・プロダクツ社）をこの研究に用いた。この抗体を、CNBrで活性化させたセファロース4Bカラム（アマーシャム・ファルマシア・バイオテック社）を用いて親和性精製した。精製後の抗体を、組換えヒトPin1タンパク質を含有するウェスタン・ブロットで検査した。
【０１２７】
免疫組織化学染色
ヒト前立腺癌切片を、アビジン−ビオチン−ペルオキシダーゼ複合体（ABC）法（カリフォルニア州バーリンゲイム、ベクター社）を用いてPin1について染色した。ホルマリン固定され、パラフィン包埋してある5μmの組織切片をキシレンで脱パラフィンし、勾配にしたアルコールで再水和化し、3%過酸化水素（シグマ社）メタノール溶液中に１５分間置いて、内因性ペルオキシダーゼ活性を遮断した。抗原の回収のためには、切片をpH6.0のクエン酸緩衝液（バイオジェネックス社）中に入れて１５分間、電子レンジにかけた。次に切片を、非特異的結合を防ぐために二次抗体と同じ種の10%正常血清で４０分間、処理してから、抗Pin1抗体と一緒に一晩、４℃で1:800(v/v)希釈度でインキュベートした。切片をTBSで４回（各５分間）洗浄した後、ビオチン化ヤギ抗ウサギIgG抗体と一緒に４０分間、インキュベートした。予め形成されたアビジン−ビオチン複合体と一緒に４０分間、インキュベートした後、特異的に結合した抗体をペルオキシダーゼ基質である3,3'-ジアミノベンジジンテトラヒドロクロリド(DAB)を用いて視覚化した。切片をギルのヘマトキシリンで対比染色した。陰性コントロールには、一次抗体のない切片、又は、Pin1抗体の代わりに正常血清を含んだ切片が含まれていた。
【０１２８】
議論
親和性精製されたポリクローナルPin1抗体を用いて、42人のヒト前立腺の症例のパラフィン切片に免疫組織化学検査を行った。陽性の免疫染色が、新形成性前立腺の上皮細胞の細胞質や核に観察されたが、正常前立腺では観察されないか、又は、観察されたにしてもごく僅かであった。腫瘍周囲の間質細胞は、Pin1発現を全く示さないか、又はごく僅かに示した。調査した標本の中で、グリーソン・スコアが4から5のよく分化した癌は概してPin1着色を示さないか、又は、ごく低いレベルの染色を示した。いくつかの症例では、等級の高い前立腺間質新生物（PIN)が、Pin1免疫染色を示したが、通常は悪性の病変よりも低い程度であった。グリーソン・スコアが6乃至7の分化が中程度の前立腺癌は、部分的に陽性の免疫染色を示したが、このとき全ての癌細胞がPin1を発現していた訳ではなく、また癌性の病変すべてが同じ標本中にあった訳ではない。グリーソン・スコアが8乃至10の分化の低い前立腺癌は、最も広汎かつ強力なPin1免疫反応を示した。
【０１２９】
全ての前立腺癌標本のPin1染色レベルを図１に要約する。これらの結果から、Pin1発現とグリーソン・スコアとの間に全体的な相関関係があり、等級の高い腫瘍（グリーソン・スコアが8乃至10）は、低い等級（グリーソン・スコアが4乃至5）の腫瘍よりも高い率で陽性染色を示すことが分かった。興味深いことに、グリーソン・スコアが6乃至7であり、分化が中程度の前立腺癌は、Pin1発現レベルに従って３つのグループに分けることができるようである。グループＩ：切片全体の癌細胞の30%未満がPin1に関して着色する；グループＩＩ：癌細胞の30乃至50%がPin1に関して着色する；グループＩＩＩ：50%を越えるものがPin1に関して着色する。４２の症例中８件（19%）がグループＩと分類された。１５件 (36%)の症例がグループＩＩと分類された；そして１９件 (45%) がグループＩＩＩと分類された。
【０１３０】
グリーソン等級システムは、前立腺癌用の最も普通に用いられている臨床上の慣例であり、高いグリーソン・スコアは、高率の再発及び転移を示し、低いグリーソン・スコアは低い死亡率を示す。中間の等級（グリーソン・スコアが6乃至7）の患者は多様な転帰を有する。前立腺癌を有すると診断される人の大半は、このグループに属し、診断する臨床医にとって最も大きな課題となる。グループＩの患者は無痛性の疾患経過を示すようであり、転移性疾患を発症するリスクも低い。グループＩＩＩの患者は進行して転移性疾患を発症する可能性が高い。従って、前立腺癌のPin1染色は、前立腺癌の生物学的進行性の程度を測定するための有用なツールである。
【０１３１】
患者の３年間又はそれ以上の臨床的追跡調査を表６に要約する。前立腺特異抗原（PSA）は前立腺癌を早期に診断したり、また治療の効果を観察するために最もよく用いられている。手術後、PSAレベルは検出不能である。追跡調査でPSAレベルが検出可能になれば、原発腫瘍の再発又は転移の発生のいずれかを示すPSA障害と呼ばれる。Pin1発現及びPSAの追跡調査に基づくと、手術時に腫瘍が高レベルのPin1発現を示した患者は、PSA障害を経験する可能性が高かった傾向があることが見出された。表７はPin1発現とPSA障害との間の相関関係を示す。Pin1発現が低レベル（腫瘍細胞の0-30%が陽性）の患者は、低率のPSA障害を示し（12.5%）、それに続き、Pin1発現が中間のレベル（30-50%）がより高率の障害（64%）を示す。Pin1発現（50-100%）が高レベルの患者は、PSA障害を高率（78%）で示した。
【０１３２】
【表６】
2004532390.tif 000010
【０１３３】
【表７】
2004532390.tif 000011
【０１３４】
上のデータが示すように、最も広汎なPin1染色を示す患者は、Pin1染色が低い患者よりも再発性疾患を発症するリスクが高く、Pin1は、ヒト前立腺癌患者の転移性進行及び疾患の転帰の指標として機能するバイオマーカとして用いることができる。
【０１３５】
実施例３  −  生化学的障害の予後マーカとしてのPin1
材料及び方法
研究対象：
良性前立腺肥大症（BPH）又は癌のある3400人を越える患者が、根治的前立腺除去術をベイラー・カレッジ・オブ・メディシン連携機関（ザ・メソディスト・ホスピタル、ベン・タウブ・ホスピタル、セイント・ルークズ・ホスピタル及びザ：ヒューストン・ベテランズ・アフェアズ・メディカル・センター）で受け、組織をヒストロジー・コアのベイラー・プロステイトSPORE組織バンクに提供した。これらの患者の根治的前立腺切除標本を、例えば Sakr, W.A., et al. (1996) Cancer 15; 78:366-778 又は Ohori, M. et al. (1999) J. Urol. 161:500-4が前に解説した手法に従って、全組織標本スライドを用いて処理した。これらの患者のうち1291人は、１９８３年から１９９８年までの間に、それまでに放射線又はホルモン治療など、何の形の合併療法を受けることなく、一人の外科医の手術を受けていた。これらは87.9 % が白人系、7.4 % がヒスパニック、3.5 %がアフリカ系アメリカ人系、そして1.2 % がアジア系又は中東系である。完全な人口統計学的、臨床学的及び追跡データをメディカル・インフォーマティックス・コアで入手でき、これらのデータには患者の年齢、血中PSAレベル、臨床学的病期、及び生検病理学的情報が含まれていた。根治的前立腺除去術を行うするための後向きコホート研究への参加基準は、１）術前治療なし２）１９８３年から１９９８年までの間に一人の外科医の手術を受けていること３）前記組織銀行に根治的前立腺切除標本があること４）前立腺癌が手術標本中に存在して、組織マイクロアレイ用に円筒形標本をくり抜くのに充分な大きさがあること、である。計622人の患者が上記の基準を満たし、大型の転帰アレイを作製するためにくり抜かれた。
【０１３６】
根治的前立腺除去標本：
手術後、例えば以前にSakr, W.A., et al. (1996) Cancer 15; 78:366-778 or Ohori, M. et al. (1999) J. Urol. 161:500-4に解説された手法に従って、前立腺標本を5mm厚の組織全標本にスライスした。次にこの組織切片を、常法に従って10%中性緩衝ホルマリンに固定し、パラフィンに包埋した。標準的なプロトコルに従った一人の病理医が、各標本から採ったH&E染色後の全組織標本切片を評価した。
【０１３７】
コホートへの参加及び追跡：
上記の患者集団に関するデータを、SPOREプロトコルを用いて蓄積し、前立腺癌情報システム（SPIS）のSPOREを用いてメディカル・インフォーマティックス・コアに集めた。一人の病理医が、病期決定、病理学的段階、マージン（原語：margin）、嚢の穿通、精嚢浸潤、生検及び前立腺除去術一次及び二次グリーソン等級、リンパ節の状態、腫瘍の体積及び地理的位置を含む病理学的分析を行った。前記参加基準に合致した患者の臨床学的及び病理学的データは、患者の識別因子を取り除いた状態で、分析用に入手できる。制度としてのレビュー・ボード（原語：Review Board）が認可した同意書を用いて、全患者から同意を得た。
【０１３８】
アレイの作製及び組織切片：
各標本毎に、最大及び／又は最高のグリーソン癌増殖巣と定義される指標腫瘍を特定し、全組織標本切片上にマップした。視覚的組織アレイ作製装置（メリーランド州シルバー・スプリング、ビーチャー・インスツルメンツ社）を用いて組織マイクロアレイを作製した。これまでの研究では、0.6mmの穿孔を３つ組にして行うと、Ki67などの低発現マーカであっても、前立腺の完全切片を免疫組織化学的マーカを研究した場合の結果を、確実に再現できることが示されている。従って我々は、マップされた指標腫瘍内のグリーソン等級が最も高い区域を３つ組にして0.6ミリメートル穿孔してコアを採り、それらをレシピエント・ブロックに移した。腫瘍から離れた正常な周辺帯の区域もBPHの区域と同様に囲んだ。BPHのない遷移帯を、BPHの非存在下で選択した。次に、囲んだ区域をブロックに移し、３つ組の0.6mmのコアを、正常な周辺帯及びBPHの囲まれた区域からも得た。切片全体に渡って着色が充分かどうかを評価するために、ブロックのそれぞれ一つずつに、予め確立されたパターンに内部コントロールを配置した。各0.6mm厚のコントロールコア内で異なる最高１０種類の組織を含有するソーセージ内部コントロールも、標準コントロールと一緒に配置した。
【０１３９】
最終的な組織アレイの組は、622人の患者のそれぞれ一人につき9個のコアを有する１５個のブロックから成り、総計約5500個のコアを有することとなった。作製した各ブロック毎に、各コアの座標及び出所の区域及び症例を含むデータベースを作製した。アレイのブロック及び組織から5μmの切片を、免疫染色に向けて移動用のテープを使わずに切り出した。
【０１４０】
免疫組織化学
切片を脱パラフィンし、再水和化した。次にこれらをアンティジェン・リトリーバル・シトラ（原語：Antigen Retrieval Citra）溶液（pH6.0) (カリフォルニア州サンラモン、バイオジェネックス社、カタログ番号HK086-9K)に入れて、1300 ワットの電子レンジ（パナソニック社、インバータ、Genius1300W）内で２分間、この溶液を沸騰温度になるまで全出力レベルで加熱した。沸騰を始めた時点ですぐに電子レンジの出力レベルを10%まで低下させ、さらに１５分間、スライドの加熱を続けた。切片の内因性ペルオキシダーゼは3% H2O2 中に１０分間置いて失活させた。次に切片を3%正常ウマ血清の0.2 Mリン酸緩衝生理食塩水(PBS) pH 7.4 溶液で遮断した後、TBSで1:10,000に希釈したPin1ポリクローナル抗体（マサチューセッツ州ケンブリッジ、オンコジーン・リサーチ・プロダクツ社、カタログ番号PC270、4mg/ml)中で一晩、４℃でインキュベートした。 次に、これらを標準的なアビジンビオチン複合体(ABC)免疫染色法に従ってABCキット（カリフォルニア州、ベクター・ラブ社）で処理した。免疫反応生成物を3,3'-ジアミノベンジジン/H2O2溶液で視覚化した。免疫反応の特異性を確認するために、いくつかの切片を、Pin1抗体の代わりにPBS中、又は、正常ウサギ血清中でインキュベートした。
【０１４１】
デジタル化
各スライドを異なる画像システムを用いて二回、デジタル化した。まずBLISS自動画像システムを用いてマイクロアレイスライドをデジタル化した。これにより、各マイクロアレイ点の高解像度の画像が、マイクロアレイ・スライド上の点の座標に関する情報と共に生成される。これらの画像をベイラー・カレッジ・オブ・メディシンで用いて視覚的準定量化を行い、臨床データベースとの相関付けをした。
【０１４２】
クロマビジョン（原語：ChromaVision）・システム（カリフォルニア州サンファンカピストラノ、クロムビジョン・メディカル・システムズ社）を用いてマイクロアレイ・スライドをデジタル化し、自動画像解析を行った。
【０１４３】
免疫組織化学検査の定量：
正常な前立腺上皮、BPH及び前立腺癌のPin1免疫染色を、自動画像解析及び視覚的準定量法を用いて、顕微鏡及び画像解析で評価し、Pin1陽性細胞及びPin1染色の強度のパーセンテージで記録した。アレイの３つ組という性質のために、各測定で３つの値が得られた。最も高い値と、３つの値の平均を解析で考慮し、４つの解釈値：強度高(PIH)、 強度平均 (PIA)、パーセンテージ高（P%H）及びパーセンテージ平均（P%A）、を出した。
【０１４４】
自動画像解析：自動画像解析：複数の組織の解析にあたって自動顕微鏡及びコンピュータ画像処理を一枚のスライドに組み合わせる自動細胞画像システム（ACIS）（カリフォルニア州サン・ファン・カピストラノ、クロマビジョン・メディカル・システムズ社）を用いて、各微小組織アレイ切片をスキャンし、画像取り込みした。この研究では、ACISを用いて、ジアミノデンジジン（原語：diaminodenzidine）クロマゲン（DAB）及びヘマトキシリン対比染料を用いて染色されたガラス製スライド上の微小組織アレイ切片を解析した。光学顕微鏡で観察したときの陽性染色（茶色）は、当該タンパク質の存在を示すものであり、色の強度はタンパク質量（発現）と直接相関している。ACISは255のレベルの免疫組織化学染色の強度（0-255）を認識して、これらを所定の個々の区域毎の分解スコアに変換することができる。しかしながら、このシステムは大変感度が高いために、一般名DABのための閾値の基本リミットは、メーカによって30に予め設定されている。従って、非常に明るい茶色であるはずと思われる30未満の強度は、この研究では0として処理された。免疫染色後の組織切片全体を４倍の対物レンズを用いてスキャンし、画像を１０倍の対物レンズを用いて取り込んだ。この研究では、我々は、所定の個々の組織のドット全部について強度採点法及び陽性率採点法（茶色の面積を青色プラス茶色の面積で除算したパーセンテージ）を用いた。免疫組織化学染色は、病理医の採点の知識なしに定量された。
【０１４５】
視覚的準定量：陽性細胞のパーセンテージ（標識率%）を以下：いずれの細胞も染色されなかったとき、0：細胞のうちの最高33%、66%及び100%が免疫反応性であるとき1、2及び3：と定義した。標識強度（I）は準定量され、この場合0は染色なしの場合、1は弱いが明確な染色有りの場合、2は中程度の染色が中間の拡大能で見られた場合、そして3は強い染色が低拡大能で見られた場合である。
【０１４６】
統計学的分析：
臨床／病理学的パラメータとPin1発現との間の関係をスペアマン相関係数検査法を用いて評価した。生存率分析には、用いるエンドポイントは、血清PSAレベルが２回の連続する測定で0.4ng/mlを越えたときと定義される癌の生化学的再発であると定義した（カリフォルニア州サンディエゴ、ハイブリテック社）。再発までの時間を、手術日と、生化学的な再発を判別した日の間の時間間隔と定義した。再発のない生存のためのPin1の予想値を、カプラン−マイヤー保険統計解析及びログ・ランク検定を用いて決定した。PIN1陽性及びPIN1陰性患者に関してカプラン−マイヤー生存曲線を作製した。グループ間のこの生存曲線の違いを前記ログ・ランク検定で統計上の有意性についてテストした。コックス単変量及び多変量比例ハザード回帰モデルを用いて、HR（再発の相対的リスク）を評価した。多変量解析では、モデルをLN、サージカル・マージン（原語：surgical margin）、SVI、グリーソンの等級、ECE、UICC、及び術前PSA レベルについて調節した。解析はすべてバイオスタットによる統計ソフトウェア（パワー・アンド・プレシジョン（ニュージャージー州イングルウッド、ＰＣバージョン）で行った。
【０１４７】
結果
580人の患者の腫瘍標本から有効な情報が得られた。患者の年齢は37歳から80歳までの範囲であり、中間値は63歳であった。追跡情報（中間追跡期間、61ヶ月）は578人の患者から得ることができ、その中で111人（19.2%）が再発した。他の臨床上の特徴は表８に見られる。
【０１４８】
【表８】
2004532390.tif 000012
【０１４９】
正常及びBPH:
Pin1染色は核に起き、正常な前立腺、前立腺癌及びBPHで、様々な強度及びパーセンテージで見られた。しかしながら、PIN1過剰発現への傾向が、正常な前立腺上皮及びBPHに比較して、前立腺癌でみとめられた（表９を参照されたい）。
【０１５０】
【表９】
2004532390.tif 000013
【０１５１】
単変量解析は、BPH組織でのPIN1平均強度値のみが統計上有意であることを示しているが、しかし多変量解析では失われる（表１０）。このデータは、正常もしくは過形成性前立腺組織におけるPIN1発現は、PCaの生化学的障害を予測するためには使用できないことを示している。
【０１５２】
【表１０】
2004532390.tif 000014
【０１５３】
前立腺癌：
前立腺癌におけるPIN1発現は核性であり、細胞の0乃至91%に見られ、中間値は細胞の18%、そして平均は10%である。
【０１５４】
Ａ）画像解析
１）相関関係
臨床上の因子及び病理学的因子との相関関係は、PIN1発現が、リンパ節転移及び臨床上の病期と関係していたことを示した（表８を参照されたい）。
【０１５５】
２）生存解析：
「PIN 1強度高」(PIH)、「PIN 1 % 高(P%H)、「PIN 1 % 平均」（P%A）の継続的な測定は、PSA再発までの時間に関する有意な予測子であり、他方「PIN 1 強度平均」(PIA) は単変量的には有意でなかった（表１１）。この発見は、染色の強度が、強度が最も大きい区域即ちホット・スポットと通常でも関係しているために、驚くべきことではない。同じ関係で、免疫反応性細胞のパーセンテージの平均は、標識率の優れた尺度である。
【０１５６】
【表１１】
2004532390.tif 000015
生化学的再発の予測子としてのPIN1の単変異量及び多変量解析
【０１５７】
測定はすべて正規分布していないため、中間値をまず考えられるカットオフとしてテストした。結論は、連続的測定と同じままだった。次に、PIN1の４つの測定値すべてについて最適なカットオフを特定し、再発までの時間を予測する能力についてテストした。
【０１５８】
PIH±を、「PIN 1強度高」＜100 及び「PIN 1 強度高」≧100と定義した。PIH±のハザード比は2.6（1.6、4.5）で、p-値＝0.0003だった（図２）。100のカットオフは PIA±にも用い、ハザード比は3.6 (1.7、7.7)で、p-値＝0.0012だった（図３）。
【０１５９】
「PIN 1 % 高」及び「PIN 1 % 平均」には、それぞれ70及び60のカットオフを用いた。P%H［HR＝2.0 (1.2, 3.5)］（図３）及びP%A［2.9 (1.7、5.2)］（図４）は、両方とも、再発までの時間の有意な予測子だった（P＝0.0118 及びp=0.0003）。
【０１６０】
カプラン−マイヤー生存曲線（表８）も、PIN1陽性腫瘍を有する患者は、PIN1陰性である患者に比較して、再発までの時間が実質的に短いことを実証している。
【０１６１】
多変量モデルでは、これらの関係をLN、サージカル・マージン、SVI、グリーソンの等級、ECE、UICC、及び術前PSAレベルに関して調節した。４つの別々の測定値すべてが、有意な独立した予測子であることが示された。ハザード比（表８）は、PIN1が、これらの通常用いられているマーカと同様に、そしておそらくは遙かに優れた、再発の予測子であることを示している。
【０１６２】
３」グリーソン6及び7の患者
グリーソン等級6乃至7の患者のサブグループでPIH±もテストした。PCA癌患者の大半はこの分類に入るが、このグループの患者はPCAで最も予測の難しい分類になっている。現在では、生化学的再発、転移又は死亡を予測するマーカはない。単変量解析では、PIN1は依然、この分類の患者の生化学的再発の強力な予測子であり、p値は0.0356で、ハザード比は2.6 (1.6、4.5)だった。後者は多変量解析では、最も高いもの中でも3.4 (1.7、6.9)まで増加した（図６）。このデータは、PIN1の状況が、依然、この難しい前立腺癌患者グループでの再発までの時間の強力で有意かつ独立した予測子であることを強く示唆している。
【０１６３】
Ｂ）視覚的準定量
調査した患者の57.5%で、視覚的準定量によりPIN1発現を明らかにしたが、これらの大半は低発現群だった（322人のうち256人）。ヒトの眼は発現の強度や画像解析を判別できなかったため、この結果はオン／オフ現象としてのみ、有意性を示すものである。強度に関係なく染色が存在することは、生化学的再発の有意な予測子であった。発現のない238人の患者のうち37人しか再発しなかった一方で、発現のある307人の患者のうち72人が再発したため、ハザード比は単変量解析については1.6、そして多変量解析については1.9（1.3-3.0）となった（図７）。
【０１６４】
PIN1がPCAで発現している場合、その癌細胞の大半は免疫反応性であり、50%を越える症例で、細胞の100%が免疫反応性を有していた。陽性腫瘍率は再発までの時間の有意な継続的予測子（HR=1.004  p=0.0343）であった。最適なカットオフを10%で選択した結果、患者の区分は上記の強度法と100%一致した。このカットオフは画像解析で得られるものより実質的に低い。しかしながら、この技術はPIN1を発現している癌細胞のパーセントを測定するものであり、画像解析は免疫反応性のコアのパーセンテージを測定するものであることを強調しておくことは、重要である。
【０１６５】
コアの陽性率（＜90% 対 90-100）は、単変量解析では再発までの時間の有意な予測子であるように思われた（p＜0.0001）が、多変量モデルでの公知の臨床学的及び病理学的予測子に照らして調節すると、もはや有意ではなかった（p=0.7242）。
【０１６６】
Ｃ）視覚及び画像解析結果間の相関関係
視覚的及び機械的測定の間に高度に有意な相関関係があった。相関係数は比較的に低い（表１２）が、我々はこれは視覚的測定の遙かに不連続な性質のためだと考える。
【０１６７】
【表１２】
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【０１６８】
結論
ここに提供したデータは、根治的前立腺除去術で治療した前立腺癌患者における生化学的障害の優れた予後マーカとしてPIN1を確立するものである。PIN1発現の上昇と、癌のリンパ節転移及び臨床上の病期や臨床転帰の悪さとの関係は、疾患の進行へのその関与を示唆している。
【０１６９】
前記の視覚的研究は、Pca細胞の少数（＞10%）によるPIN1発現の何らかの強度は、PCA患者の生化学的再発を予測する大変強力な予測子であることを我々に教唆してくれる。視覚的及び自動画像解析の結果は有意に相関していたが、後者で観察されたハザード比の方が高かったことは、弁別力がより高いことを実証している。画像解析が、様々な発現強度を弁別できること、そして、カットオフ値を用いて異なる生存率のグループを決定できることは、明白である。100を越える強度の患者は、生化学的再発率が高い。
【０１７０】
これらの結果は、PIN1を根治的前立腺除去術標本に用いることができることを明白に示唆している。我々は、ラベリング比の視覚的観察を、画像解析による発現強度測定の高い弁別力と組み合わせて用いると、根治的前立腺除去術を受けた患者の生化学的再発を弁別することができると提案するものである。さらに、組織マイクロアレイ・コアは生検よりも同様な量の組織を有するため、PIN1はプレセラピー生検で用途があるだろうと大変期待している。そうであれば、PIN 1を用いて、確実性が高い、予断を許さない待機患者を選別することができるかも知れない。
【０１７１】
等価物
当業者であれば、日常的な実験によって、ここに解説した本発明の具体的な実施態様及び方法の等価物を数多く、認識し、又は確認できることであろう。このような等価物は以下の請求の範囲の包含するところと、意図されている。
【図面の簡単な説明】
【０１７２】
【図１】図１は、Pin1発現と、グリーソン計との間の相関関係を、グリーソン・スコアが4乃至10の42検体のヒト前立腺癌標本に基づいて示す。各シンボルは異なる個体からの標本を表す。
【図２】図２は、Pin1高（P1H）強度値100を２つのグループの間のカットオフとして用いて、再発なしの生存を時間の関数として示す。
【図３】図３は、Pin1平均（P1A）強度値100を２つのグループの間のカットオフとして用いて、再発なしの生存を時間の関数として示す。
【図４】図４は、Pin%高（P%H）強度値70を２つのグループの間のカットオフとして用いて、再発なしの生存を時間の関数として示す。
【図５】図５は、Pin%平均（P%A）強度値60を２つのグループの間のカットオフとして用いて、再発なしの生存を時間の関数として示す。
【図６】図６は、グリーソン6及び7の患者の生化学的再発のマーカとしてのPin1の多変量解析を、PIHスコア100を二つのグループ間のカットオフとして用いて示す。
【図７】図７は、視覚的Pin1強度高（PMIH）値0及び＞0を二つのグループ間のカットオフとして用いて、再発なしの生存の解析を時間の関数として示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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