(57)【要約】本発明は、種々の細胞／組織の分化、脱分化、成熟、組織化、修復、および再生を促進および／または調節する際のＴ細胞またはそれ由来の上清（特に、活性化Ｔ細胞）の使用のための方法に関する。組織修復および組織再生をインビトロおよびインビボで誘導するための方法が開示される。本発明はまた、活性化Ｔ細胞および／または活性化Ｔ細胞との共存培養から生じた細胞を含む細胞の組成物、ならびに組織修復および組織再生をインビボで誘導する際のそれらの使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
組織修復および／または組織再生を誘導するための方法であって、以下：
（ａ）細胞集団を提供する工程であって、ここで、その少なくとも一部が、活性化Ｔ細胞を含む、工程；
（ｂ）組織を該Ｔ細胞またはそれ由来の上清に曝露し；それによって組織の修復および／または再生を誘導する工程
を包含する、方法。
【請求項２】
前記組織が、骨組織、心筋組織、上皮組織、および神経組織からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記組織再生が、新脈管形成を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記組織再生が、新たな骨の形成を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記組織再生が、神経再生を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記組織修復が、損傷した組織の新生血管形成を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記損傷した組織が、心臓組織を含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
遺伝子ライブラリーであって、以下：
（ａ）Ｔ細胞を活性化する工程；
（ｂ）Ｔ細胞を、心筋層、骨、骨髄、皮膚、神経、内皮、および上皮からなる群より選択される組織供給源とともに、遺伝子発現における変化を誘導するに充分な長さの時間にわたって共存培養する工程；
（ｃ）該組織を収集する工程；
（ｄ）そこから遺伝子ライブラリーを作製する工程
を包含する方法によって作製された、遺伝子ライブラリー。
【請求項９】
患者またはエキソビボ神経細胞における軸索成長を刺激するための方法であって、該患者または該神経細胞に、活性化Ｔ細胞またはそれに由来する上清を含む神経栄養量の組成物を投与する工程を包含する、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の背景）
（発明の分野）
本発明は一般に、組織の修復および再生におけるＴ細胞（特に、活性化Ｔ細胞）の使用のための組成物および方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
（関連技術の説明）
創傷治癒は通常、以下を含む、協調した一連の事象である：（ａ）組織破壊および正常な組織構造の喪失；（ｂ）細胞の壊死および出血；止血（血餅形成）；（ｃ）血管うっ血および組織水腫を伴った、分葉細胞および単核炎症細胞の浸潤；（ｄ）単核細胞（マクロファージ）による、血餅ならびに損傷した細胞および組織の溶解；（ｅ）肉芽組織の形成（線維増殖および新脈管形成）。この一連の細胞事象は、多数の哺乳動物種において作製された全ての組織および器官由来の創傷において観察されている（Ｇａｉｌｅｔら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．６：７１７−７２５，１９９４）。それゆえ、上記の細胞の順序は、全ての哺乳動物組織の修復の普遍的局面である。
【０００３】
組織修復および組織再生のプロセスは複雑であり、そして多くのレベルで調節および組織化されている。非常に頻繁に、個々の因子（例えば、サイトカイン、レセプター、ホルモンなど）は、このプロセスにおいて本質的な役割を果たし、そして種々の形態の治療についての潜在的な治療様式として試験されている。しかし、この調節の複雑な性質に起因して、単一の因子もしくはレセプターなど、またはさらには因子もしくはレセプターの単純な組合せは、利益を提供するには不充分であることが証明されている。従って、哺乳動物組織の修復および再生の複雑なプロセスに関与する種々の分子のアレイを提供する必要性が当該分野に存在する。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
（発明の詳細な説明）
発明を述べる前に、本明細書中以下で用いられる特定の用語の定義を述べることがその理解に有用であり得る。
【０００５】
用語「刺激」は、本明細書中で使用される場合、細胞表面部分の連結によって誘導される一次応答をいう。例えば、レセプターに関しては、このような刺激は、レセプターとその後のシグナル伝達事象との連結を必要とする。Ｔ細胞の刺激に関して、このような刺激は、１つの実施形態で、続いてシグナル伝達事象を誘導する、Ｔ細胞表面部分の連結（例えば、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体の結合）をいう。さらに、刺激事象は、細胞を活性化し得、そして分子の発現または分泌をアップレギュレートまたはダウンレギュレートし得る（例えば、腫瘍増殖因子β（ＴＧＦ−β）のダウンレギュレーション）。従って、細胞表面部分の連結は、直接的なシグナル伝達事象の不存在下でさえ、細胞骨格構造の再組織化をもたらし得るか、または細胞表面部分の合体においては、これらの各々は、その後の細胞応答を増強、改変、もしくは変更するに役立ち得る。
【０００６】
用語「活性化」は、本明細書中で使用される場合、測定可能な生化学的変化または形態学的変化、表現型的変化、および／または機能的変化を誘導するに充分な細胞表面部分の連結後の細胞の状態をいう。Ｔ細胞の関係においては、このような活性化は、細胞増殖を誘導するに充分に刺激されたＴ細胞の状態であり得る。Ｔ細胞の活性化はまた、サイトカイン産生および／または分泌、ならびに調節機能能力または細胞溶解エフェクター機能能力を誘導し得る。他の細胞の関係では、この用語は、特定の物理化学的プロセスのアップレギュレーションまたはダウンレギュレーションのいずれかを意味する。
【０００７】
用語「標的細胞」は、本明細書中で使用される場合、細胞表面部分の連結によって刺激されることが意図される任意の細胞をいう。
【０００８】
「抗体」は、本明細書中で使用される場合、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体（ｍＡｂ）の両方；霊長類化（例えば、ヒト化）；マウス；マウス−ヒト；マウス−霊長類；およびキメラを包含し；そしてインタクトな分子、そのフラグメント（例えば、ｓｃＦｖフラグメント、Ｆｖフラグメント、Ｆｄフラグメント、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメントおよびＦ（ａｂ）’２フラグメント）、またはインタクトな分子および／もしくはフラグメントのマルチマーもしくは凝集体であり得；そして天然に存在し得るかまたは例えば、免疫、合成もしくは遺伝子操作によって産生され得；「抗体フラグメント」は、本明細書中で使用される場合、抗体に由来するかまたは抗体に関連するフラグメントであって、抗原に結合し、そしていくつかの実施形態では、例えば、ガラクトース残基の組込みによって、クリアランスおよび取込みを促進する構造的特徴を示すように誘導体化され得る、フラグメントをいう。これとしては、例えば、Ｆ（ａｂ）、Ｆ（ａｂ）’２、ｓｃＦｖ、軽鎖可変領域（ＶＬ）、重鎖可変領域（ＶＨ）、およびこれらの組合せが挙げられる。
【０００９】
用語「タンパク質」は、本明細書中で使用される場合、タンパク質、糖タンパク質および他の細胞由来の改変タンパク質、ポリペプチドおよびペプチドを包含し；そしてインタクトな分子、そのフラグメント、またはインタクトな分子および／もしくはフラグメントのマルチマーもしくは凝集物であり得；そして天然に存在し得るか、または例えば、合成（化学的合成および／または酵素的合成を包含する）または遺伝子操作によって産生され得る。
【００１０】
用語「因子」、「リガンド」、または「細胞表面部分を結合する因子」は、本明細書中で使用される場合、規定の細胞集団に結合する分子をいう。この因子は、任意の細胞表面部分（例えば、レセプター、抗原決定基、または標的細胞集団上に存在する他の結合部位）を結合し得る。この因子は、タンパク質、ペプチド、抗体およびその抗体フラグメント、融合タンパク質、合成分子、有機分子（例えば、低分子）などであり得る。本明細書では、そしてＴ細胞刺激に関して、抗体は、このような因子の原型の例として用いられる。
【００１１】
用語「細胞表面部分」は、本明細書中で使用される場合、細胞表面レセプター、抗原決定基、または標的細胞集団上に存在する任意の他の結合部位を言及し得る。
【００１２】
用語「細胞表面部分を結合する因子」および「細胞表面部分」は、本明細書中で使用される場合、一般に、比較的高親和性（約１０６Ｍ−１の親和性定数Ｋａ）の特異的結合を示す分子の相補的／抗相補的（ａｎｔｉ−ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ）セットとしてみなされるべきである。
【００１３】
「補助刺激シグナル」は、本明細書中で使用される場合、一次シグナル（例えば、ＴＣＲ／ＣＤ３連結）との組合せで、Ｔ細胞の増殖および／または活性化をもたらすシグナルをいう。
【００１４】
「分離」は、本明細書中で使用される場合、（例えば、濾過、親和性、浮遊密度、または磁気誘引によって）１つの成分を別の成分から実質的に精製する任意の手段を包含する。
【００１５】
「表面」は、本明細書中で使用される場合、因子をそこに付着させ得る任意の表面をいい、そして金属、ガラス、プラスチック、コポリマー、コロイド、脂質、細胞表面などを包含するがこれらに限定されない。因子が結合したままであり得るかまたは因子がそこに付着したままであり得る、本質的に任意の表面。本明細書中で用いられる表面の原型の例は、粒子（例えば、ビーズ）である。
【００１６】
「改善する」は、本明細書中で使用される場合、より良くする；改善することであると定義される（Ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｈｅｒｉｔａｇｅ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ、第３版、Ｈｏｕｇｈｔｏｎ  Ｍｉｆｆｌｉｎ  Ｃｏｍｐａｎｙ、２０００）。
【００１７】
「粒子」は、本明細書中で使用される場合、コロイド状粒子、ミクロスフェア、ナノ粒子、ビーズなどを包含し得る。種々の実施形態では、市販の表面（例えば、ビーズまたは他の粒子）が有用である（例えば、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ，Ｇｅｒｍａｎｙ）；Ｓｅｐｈａｒｏｓｅビーズ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｆｉｎｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｓｗｅｄｅｎ）；ＤＹＮＡＢＥＡＤＳＴＭ（Ｄｙｎａｌ  Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）；ＰＵＲＡＢＥＡＤＳＴＭ（Ｐｒｏｍｅｔｉｃ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、磁気ビーズ（Ｉｍｍｕｎｉｃｏｎ，Ｈｕｎｔｉｎｇｄｏｎ  Ｖａｌｌｅｙ，ＰＡ製）、ミクロスフェア（Ｂａｎｇｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｆｉｓｈｅｒｓ，ＩＮ製））。
【００１８】
「磁気粒子」は、本明細書中で使用される場合、磁界に応答して局在する、上記の通りの粒子をいう。
【００１９】
「抗原」は、本明細書中で使用される場合、以下の任意の分子をいう：１）その全体またはそのフラグメントのいずれかにおいて特異的に認識され得、そしてｍＡｂまたはその誘導体の「イディオタイプ」部分（抗原結合領域）によって結合され得る分子；２）ＭＨＣによって結合され得、次いでＭＨＣ提示に関してその同族Ｔ細胞抗原レセプターに特異的に係合し得るペプチド配列を含む分子。
【００２０】
用語「動物」または「哺乳動物」は、本明細書中で使用される場合、ヒトを含む全ての哺乳動物を包含する。好ましくは、本発明の動物は、ヒト被験体である。
【００２１】
用語「曝露する」は、本明細書中で使用される場合、すぐ近接したまたは直接接触した状況または状態にすることをいう。
【００２２】
用語「増殖」は、本明細書中で使用される場合、新たな細胞を産生することによって、増えるまたは繁殖することを意味する。
【００２３】
「創傷部位」は、本明細書中で使用される場合、外科的手順、感染、外傷的傷害、または疾患状態（梗塞を形成した心筋層、虚血心筋層、腐食した骨、変性した軟骨（ｃａｒｔａｌａｇｅｎｏｕｓ）組織、変性した神経組織、熱傷、または移植部位を含むがこれらに限定されない）によって誘導されるかまたはこれらから生じるかのいずれかの組織損傷由来の組織傷害から生じる、宿主中の任意の位置として定義される。
【００２４】
用語「神経栄養因子」は、本明細書中で使用される場合、神経組織の生長または増殖を刺激し得る化合物をいう。
【００２５】
創傷治癒に関して、改善された臨床結果とは、より迅速な創傷閉鎖速度、より少ない創傷収縮および／またはより少ない瘢痕形成を言及し得る。
【００２６】
閉塞した血管をバイパスするための新生血管形成に関して、「治療有効量」は、遮断された血管を通常通過する血液の少なくとも一部を輸送し得る新たな血管の形成をもたらす量である。
【００２７】
（Ｔ細胞組成物）
Ｔ細胞は、その生物学および機能が独特である。Ｔ細胞は、これらの細胞または組織の分化／脱分化／成熟／組織の組織化および修復活性を促進または調節し得る特異的な様式で他の細胞／組織と相互作用し得るおびただしい数の重要な分子をその表面に発現して分泌する。特に、種々の活性化状態の（従って、異なる群の表面分子または分泌分子を発現する）Ｔ細胞は、組織の発達、分化または再組織化、および種々の医学的状態を改善し得る修復をもたらし得る。
【００２８】
Ｔ細胞（特に、活性化Ｔ細胞）は、哺乳動物組織の修復および再生の複雑なプロセスに関与する潜在的分子のうちの多くを保有し、そしてこのプロセスに関与する他の細胞型の調節／制御を介して組織の生長および／または再構築を提供するに必要な、複雑かつ調節されるおびただしい数の分子を提供するという、当該分野における必要性を満たす。
【００２９】
一般に、本発明の活性化Ｔ細胞は、活性化を誘導する、細胞表面部分の連結によって生成される。活性化Ｔ細胞は、例えば、米国特許出願第          号（「Ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ  Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｅｌｌｓ」との発明の名称、２００２年４月２６日出願）および米国特許出願第０８／２５３，６９４号；同第０８／４３５，８１６号；同第０８／５９２，７１１号；同第０９／１８３，０５５号；同第０９／３５０，２０２号；および同第０９／２５２，１５０号、ならびに特許第６，３５２，６９４号；同第５，８５８，３５８号および同第５，８８３，２２３号（これらの全体は本明細書中に参考として援用される）に記載されるように、Ｔ細胞集団を活性化し、そして補助分子を結合するリガンドでＴ細胞表面の補助分子を刺激することによって、作製される。
【００３０】
Ｔ細胞は、末梢血単核細胞、骨髄、胸腺、組織生検、腫瘍、リンパ節組織、腸関連リンパ組織、粘膜関連リンパ組織、脾臓組織、または任意の他のリンパ組織、および腫瘍を包含する、多数の供給源から入手され得る。Ｔ細胞は、Ｔ細胞株から、そして自己供給源または同種異系供給源から入手され得る。Ｔ細胞はまた、異種供給源（例えば、マウス、ラット、非ヒト霊長類、およびブタ）から入手され得る。
【００３１】
好ましくは、個体の循環している血液由来の細胞は、アフェレーシスまたは白血球搬出によって入手される。アフェレーシス産物は代表的に、リンパ球（Ｔ細胞、単球、顆粒球、Ｂ細胞、他の有核白血球、赤血球、および血小板を包含する）を含む。１つの実施形態では、アフェレーシスまたは白血球搬出によって収集される細胞は洗浄されて、血漿画分が除去され得、そして細胞が、その後の処理工程のために適切な緩衝液または培地中に配置され得る。本発明の１つの実施形態では、細胞は、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄される。代替の実施形態では、洗浄溶液は、カルシウムを欠き、そしてマグネシウムを欠き得るか、または全てではないにしろ多くの二価のカチオンを欠き得る。当業者が容易に認識するように、洗浄工程は、当業者に公知の方法によって（例えば、半自動化「フロースルー」遠心分離機（例えば、Ｃｏｂｅ  ２９９１細胞プロセッサー、Ｂａｘｔｅｒ）を製造業者の指示書に従って用いることによって）達成され得る。洗浄後、細胞は、種々の生体適合性緩衝液（例えば、Ｃａ＋＋／Ｍｇ＋＋を含まないＰＢＳ）中に再懸濁され得る。あるいは、アフェレーシスサンプルのうちの望ましくない成分は除去され得、そして細胞は培養培地中に直接的に再懸濁され得る。
【００３２】
別の実施形態では、Ｔ細胞は、赤血球を溶解し、上記に記載されたように単球を単離および保存することによって、または例えば、ＰＥＲＣＯＬＬＴＭ勾配を通した遠心分離によって、末梢血リンパ球から単離される。Ｔ細胞の特定のサブ集団（例えば、ＣＤ２８＋、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋、ＣＤ４５ＲＡ＋、およびＣＤ４５ＲＯ＋のＴ細胞）は、ポジティブ選択技術またはネガティブ選択技術によってさらに単離され得る。例えば、ＣＤ３＋、ＣＤ２８＋のＴ細胞は、ＣＤ３／ＣＤ２８結合体化磁気ビーズ（例えば、ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標）Ｍ−４５０  ＣＤ３／ＣＤ２８  Ｔ  Ｃｅｌｌ  Ｅｘｐａｎｄｅｒ）を用いてポジティブ選択され得る。本発明の１つの局面では、ネガティブ選択によるＴ細胞集団の富化は、ネガティブ選択される細胞に独特の表面マーカーに対する抗体の組合せを用いて達成され得る。好ましい方法は、ネガティブ選択される細胞上に存在する細胞表面マーカーに対するモノクローナル抗体のカクテルを用いる、ネガティブ磁気免疫接着またはフローサイトメトリーを介した、細胞選別および／または細胞選択である。例えば、ネガティブ選択によってＣＤ４＋細胞を富化するためには、モノクローナル抗体カクテルは代表的に、ＣＤ１４に対する抗体、ＣＤ２０に対する抗体、ＣＤ１１ｂに対する抗体、ＣＤ１６に対する抗体、ＨＬＡ−ＤＲに対する抗体、およびＣＤ８に対する抗体を含む。
【００３３】
従って、１つの実施形態では、本発明は、貪食作用性単球（これはその後、磁気分離によって除去される）によって飲み込まれるに充分なサイズの磁気粒子を用いる。特定の実施形態では、磁気粒子は、市販のビーズ（例えば、Ｄｙｎａｌ  ＡＳによって商品名ＤｙｎａｂｅａｄｓＴＭで製造されるビーズ）である。これに関して例示的なＤｙｎａｂｅａｄｓＴＭは、Ｍ−２８０、Ｍ−４５０、およびＭ−５００である。１つの局面では、他の非特異的細胞は、常磁性粒子を「無関係な」タンパク質（例えば、血清タンパク質または抗体）でコーティングすることによって除去され得る。無関係なタンパク質および抗体としては、増加させるべきＴ細胞を特異的に標的化しない、タンパク質および抗体またはそれらのフラグメントが挙げられる。特定の実施形態では、無関係のビーズとしては、ヒツジ抗マウス抗体でコーティングしたビーズ、ヤギ抗マウス抗体でコーティングしたビーズ、およびヒト血清アルブミンでコーティングしたビーズが挙げられる。
【００３４】
刺激のためのＴ細胞を調製する別の方法は、洗浄工程後に細胞を凍結することである。これは、単球除去工程を必要としない。理論に束縛されないことを望むが、凍結およびその後の融解工程は、細胞集団中の顆粒球、およびある程度までの単球を除去することによって、より均一な産物を提供する。血漿および血小板を除去する洗浄工程の後、細胞は、凍結溶液中に懸濁され得る。多くの凍結溶液およびパラメーターが当該分野で公知であり、この状況で有用であるが、１つの方法は、２０％  ＤＭＳＯおよび８％ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を含有するＰＢＳ、または他の適切な細胞凍結培地を用いることを含む。次いで、これは、ＤＭＳＯおよびＨＳＡの最終濃度がそれぞれ１０％および４％であるように、培地で１：１希釈される。次いで、細胞は、１分間あたり１°の割合で−８０℃まで凍結され、そして液体窒素保存タンクの蒸気相において保存される。制御された凍結の他の方法、ならびに−２０℃または液体窒素中での制御されていない急速凍結の他の方法がまた用いられ得る。
【００３５】
本発明の活性化Ｔ細胞は、活性化を誘導する、細胞表面部分の連結によって作製される。活性化Ｔ細胞は、例えば、米国特許出願第          号（「Ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ  Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｅｌｌｓ」との発明の名称、２００２年４月２６日出願）、特許出願第０８／２５３，６９４号、同第０８／４３５，８１６号、同第０８／５９２，７１１号、同第０９／１８３，０５５号、同第０９／３５０，２０２号、および同第０９／２５２，１５０号、ならびに特許第６，３５２，６９４号；同第５，８５８，３５８号および同第５，８８３，２２３号（それらの全体が本明細書中に参考として援用される）に記載されるように、Ｔ細胞集団を活性化し、そして補助分子を結合するリガンドでＴ細胞の表面上の補助分子を刺激することによって、作製される。
【００３６】
一般に、Ｔ細胞活性化は、細胞表面部分の連結によって（例えば、Ｔ細胞レセプター（ＴＣＲ）／ＣＤ３複合体またはＣＤ２表面タンパク質を刺激することによって）達成され得る。多数の抗ヒトＣＤ３モノクローナル抗体が市販されている。例は、以下である：クローンＢＣ３（ＸＲ−ＣＤ３；Ｆｒｅｄ  Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｅｒ，Ｓｅａｔｔｌｅ，ＷＡ）、ＯＫＴ３（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから得られるハイブリドーマ細胞から調製される）、およびモノクローナル抗体Ｇ１９−４。同様に、刺激形態の抗ＣＤ２抗体が公知であり、利用可能である。抗ＣＤ２抗体を用いたＣＤ２を通した刺激は代表的に、少なくとも２つの異なる抗ＣＤ２抗体の組合せを用いて達成される。記載された抗ＣＤ２抗体の刺激性組合せは、以下を含む：Ｔ１１．１抗体またはＴ１１．２抗体と組合せたＴ１１．３抗体（Ｍｅｕｅｒら，Ｃｅｌｌ  ３６：８９７−９０６，１９８４）および９−１抗体（Ｙａｎｇら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３７：１０９７−１１００，１９８６）と組合せた９．６抗体（これは、Ｔ１１．１と同じエピトープを認識する）の組合せ。上記の抗体のうちのいずれかと同じエピトープに結合する他の抗体もまた用いられ得る。さらなる抗体、または抗体の組合せは、標準的な技術によって調製および同定され得る。刺激はまた、抗原、ペプチド、タンパク質、ペプチド−ＭＨＣテトラマー（Ａｌｔｍａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９９６年１０月４日；２７４（５２８４）：９４６を参照のこと）、スーパー抗原（例えば、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｎ  Ａ（ＳＥＡ）、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｎ  Ｂ（ＳＥＢ）、トキシックショック症候群毒素１（ＴＳＳＴ−１））、エンドトキシンとの接触を通して、または種々のマイトジェン（フィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）、ホルボールミリステートアセテート（ＰＭＡ）およびイオノマイシン、リポ多糖（ＬＰＳ）、Ｔ細胞マイトジェン、ならびにＩＬ−２を含むがこれらに限定されない）を通して達成され得る。
【００３７】
Ｔ細胞集団をさらに活性化するために、Ｔ細胞の表面上の補助刺激分子または補助分子（例えば、ＣＤ２８）を、この補助分子を結合するリガンドで刺激する。従って、当業者は、任意の因子（ＣＤ２８分子に架橋し得る、抗ＣＤ２８抗体もしくはそのフラグメント、またはＣＤ２８に関する天然のリガンドを含む）を用いてＴ細胞を刺激し得ることを認識する。本発明に関して有用な、例示的な抗ＣＤ２８抗体またはそのフラグメントとしては、モノクローナル抗体９．３（ＩｇＧ２ａ）（Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ，Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，ＮＪ）、モノクローナル抗体ＫＯＬＴ−２（ＩｇＧ１）、１５Ｅ８（ＩｇＧ１）、２４８．２３．２（ＩｇＭ）、クローンＢ−Ｔ３（ＸＲ−ＣＤ２８；Ｄｉａｃｌｏｎｅ，Ｂｅｓａｎｃ，ｏｎ，Ｆｒａｎｃｅ）およびＥＸ５．３Ｄ１０（ＩｇＧ２ａ）（ＡＴＣＣ  ＨＢ１１３７３）が挙げられる。例示的な天然のリガンドとしては、Ｂ７ファミリーのタンパク質（例えば、Ｂ７−１（ＣＤ８０）およびＢ７−２（ＣＤ８６））が挙げられる（Ｆｒｅｅｄｍａｎら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３７：３２６０−３２６７，１９８７；Ｆｒｅｅｍａｎら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４３：２７１４−２７２２，１９８９；Ｆｒｅｅｍａｎら，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７４：６２５−６３１，１９９１；Ｆｒｅｅｍａｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６２：９０９−９１１，１９９３；Ａｚｕｍａら，Ｎａｔｕｒｅ  ３６６：７６−７９，１９９３；Ｆｒｅｅｍａｎら，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７８：２１８５−２１９２，１９９３）。
【００３８】
さらに、天然のリガンドの結合ホモログはまた、ネイティブであろうと化学的技術または組換え技術によって合成されたのであろうと、本発明に従って用いられ得る。他の因子としては、天然のリガンドおよび合成リガンドが挙げられ得る。因子としては、他の抗体もしくはそのフラグメント、ペプチド、ポリペプチド、増殖因子、サイトカイン、ケモカイン、糖ペプチド、可溶性レセプター、ステロイド、ホルモン、マイトジェン（例えば、ＰＨＡ）、または他のスーパー抗原が挙げられ得るがこれらに限定されない。
【００３９】
Ｔ細胞に関する一次刺激シグナルおよび補助刺激シグナルは、異なるプロトコルによって提供され得る。例えば、各シグナルを提供する因子は、溶液中に存在し得るかまたは表面に結合され得る。表面に結合された場合、この因子は、同じ表面（すなわち、「シス」構成で）または別の表面（すなわち、「トランス」構成で）へと結合され得る。あるいは、一方の因子は、表面に結合され得、そして他方の因子は溶液中に存在し得る。１つの実施形態では、補助刺激シグナルを提供する因子は、細胞表面へと結合され、そして一次活性化シグナルを提供する因子は、溶液中に存在するかまたは表面へと結合される。特定の実施形態では、両方の因子は、溶液中に存在し得る。別の実施形態では、これらの因子は、可溶性形態であり得、次いで、表面（例えば、これらの因子に結合するＦＣレセプターまたは抗体または他の結合因子を発現する細胞）へと架橋され得る。好ましい実施形態では、これらの２つの因子は、同じビーズ（すなわち、「シス」）または別個のビーズ（すなわち、「トランス」）のいずれかでビーズに固定化される。例として、一次活性化シグナルを提供する因子は抗ＣＤ３抗体であり、そして補助刺激シグナルを提供する因子は抗ＣＤ２８抗体である；そして両方の因子は、同じビーズへと等しいモル量で同時固定化される。１つの実施形態では、ＣＤ４＋Ｔ細胞増大およびＴ細胞生長のためにビーズへと結合された１：１の比の各抗体が用いられる。本発明の特定の局面では、ビーズに結合されたある比の抗ＣＤ３：ＣＤ２８抗体が、Ｔ細胞増大における増加が、１：１の比を用いて観察される増大と比較して観察されるように用いられる。１つの特定の実施形態では、１：１の比を用いて観察される増大と比較して約０．５倍〜約３倍の増加が観察される。１つの実施形態では、ビーズに結合したＣＤ３：ＣＤ２８抗体の比は、１００：１〜１：１００、およびそれらの間の全ての整数値の範囲にわたる。本発明の１つの局面では、抗ＣＤ３抗体よりも多くの抗ＣＤ２８抗体が、粒子に結合している。すなわち、ＣＤ３：ＣＤ２８の比は１未満である。本発明の特定の実施形態では、ビーズに結合した抗ＣＤ２８抗体：ビーズに結合した抗ＣＤ３抗体の比は、２：１よりも大きい。１つの特定の実施形態では、１：１００のＣＤ３：ＣＤ２８の比でビーズに結合した抗体が用いられる。別の実施形態では、１：７５のＣＤ３：ＣＤ２８の比でビーズに結合した抗体が用いられる。さらなる実施形態では、１：５０のＣＤ３：ＣＤ２８の比でビーズに結合した抗体が用いられる。別の実施形態では、１：３０のＣＤ３：ＣＤ２８の比でビーズに結合した抗体が用いられる。１つの好ましい実施形態では、１：１０のＣＤ３：ＣＤ２８の比でビーズに結合した抗体が用いられる。別の実施形態では、１：３のＣＤ３：ＣＤ２８の比でビーズに結合した抗体が用いられる。なお別の実施形態では、３：１のＣＤ３：ＣＤ２８の比でビーズに結合した抗体が用いられる。
【００４０】
１：５００〜５００：１および中間の任意の整数値の比の粒子：細胞を用いて、Ｔ細胞または他の標的細胞を刺激し得る。当業者が容易に認識し得るように、粒子：細胞の比は、標的細胞と比較した粒子サイズに依存し得る。例えば、小さなサイズのビーズは、いくつかの細胞にしか結合できず、一方、より大きなビーズは多くを結合し得る。特定の実施形態では、細胞：粒子の比は、１：１００〜１００：１および中間の任意の整数値にわたり得、そしてさらなる実施形態では、この比は、１：９〜９：１および中間の任意の整数値を含み、また、Ｔ細胞を刺激するために用いられ得る。抗ＣＤ３結合および抗ＣＤ２８結合ビーズ粒子：Ｔ細胞刺激をもたらすＴ細胞の比は、上記のように変動し得るが、しかし特定の好ましい値としては、少なくとも１：５、１：４、１：３、１：２、１：１、２：１、３：１、４：１〜６：１が挙げられ、１つの好ましい比は少なくとも２１：１のビーズ粒子：Ｔ細胞である。１つの実施形態では、１：１以下の粒子：細胞の比が用いられる。さらなる実施形態では、粒子：細胞の比は、刺激日に依存して変動し得る。例えば、１つの実施形態では、粒子：細胞の比は、１日目に１：１〜１０：１であり、そしてさらなる粒子が、（添加日の細胞数に基づいて）１：１〜１：１０の最終的な比で、その後１０日目まで、毎日または１日おきにこの細胞に添加される。１つの特定の実施形態では、粒子：細胞の比は、刺激１日目に１：１であり、そして刺激３日目および５日目に１：５に調整される。別の実施形態では、粒子は、１日目の最終比１：１に基づいて、そして刺激３日目および５日目の１：５に基づいて、毎日または１日おきに添加される。別の実施形態では、粒子：細胞の比は、刺激１日目に２：１であり、そして刺激３日目および５日目に１：１０に調整される。別の実施形態では、粒子は、１日目の１：１の最終比に基づいて、そして刺激３日目および５日目の１：１０に基づいて、毎日または１日おきに添加される。当業者は、種々の他の比は、本発明における使用のために適切であり得ることを認識する。特に、比は、粒子サイズならびに細胞のサイズおよび種類に依存して変動する。
【００４１】
特定の方法論を用いて、約１２日間〜約１４日間の期間の後、Ｔ細胞を刺激から分離することによって、最初の活性化および刺激後のＴ細胞集団の長期刺激を維持することが有利であり得る。Ｔ細胞の増殖速度は、例えば、Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｃｏｕｎｔｅｒを用いてＴ細胞のサイズを調べることによってか、またはＴ細胞の容積を測定することによって、周期的に（例えば、毎日）モニタリングされる。これに関して、休止Ｔ細胞は、約６．８ミクロンの平均直径を有し、そして刺激リガンドの存在下での最初の活性化および刺激によって、このＴ細胞の平均直径は、４日目までに１２ミクロンを越えるまで増大し、そして約６日目までに減少し始める。平均Ｔ細胞直径が約８ミクロンまで減少した場合、Ｔ細胞は再活性化および再刺激されて、Ｔ細胞のさらなる増殖が誘導され得る。あるいは、Ｔ細胞の増殖速度およびＴ細胞の再刺激のための時間は、活性化Ｔ細胞上で誘導された細胞表面分子（例えば、ＣＤ１５４、ＣＤ５４、ＣＤ２５、ＣＤ１３７、ＣＤ１３４、Ｂ７−１、Ｂ７−２）の存在についてアッセイすることによってモニタリングされ得る。
【００４２】
ＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞の集団の長期刺激を誘導するために、刺激因子（例えば、抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体（例えば、Ｂ−Ｔ３、ＸＲ−ＣＤ２８（Ｄｉａｃｌｏｎｅ、Ｂｅｓａｎｃ，ｏｎ、Ｆｒａｎｃｅ）またはモノクローナル抗体ＥＳ５．２Ｄ８）を用いてＴ細胞を何回か再活性化および再刺激して、数が元々のＴ細胞集団の約１０倍〜約１，０００倍に増大したＣＤ４＋細胞またはＣＤ８＋細胞の集団を生成することが必要であり得る。例えば、本発明の１つの実施形態では、Ｔ細胞は、本明細書中に記載される通りに２〜３回刺激される。さらなる実施形態えは、Ｔ細胞は、本明細書中に記載される通りに４回または５回刺激される。
【００４３】
別の実施形態では、刺激因子（例えば、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８（すなわち、ＣＤ３×ＣＤ２８）コーティングビーズ）に曝露する時間は、所望のＴ細胞表現型を得るために改変または調整され得る。ＣＤ８＋細胞傷害性またはサプレッサーＴ細胞（Ｔｃ）とは対照的に、より大きなヘルパーＴ細胞（ＴＨ）（代表的には、ＣＤ４＋）の集団を所望し得る。なぜなら、ＴＨ細胞の増大は、所望の組織修復および／または組織再生を誘導し得るからである。ＣＤ４＋Ｔ細胞は、例えば、重要な免疫調節分子（例えば、ＧＭ−ＣＳＦ、ＣＤ４０Ｌ、およびＩＬ−２）を発現する。ＣＤ４媒介ヘルプが好ましい場合、例えば、本明細書中に記載される、ＣＤ４：ＣＤ８比を保存または増強する方法が、顕著に有益な方法であり得る。本発明の１つの局面では、ＧＭ−ＣＳＦまたはＩＬ−２（これらの全てはＣＤ４＋Ｔ細胞によって主に発現される）を発現する、注入した細胞の数を増加させることが有益であり得る。あるいは、ＣＤ４−ヘルプがそれほど必要とされず、そして増大した数のＣＤ８＋Ｔ細胞が望ましい状況では、本明細書中に記載されるＴ細胞活性化アプローチもまた、例えば、刺激および／または培養の前にＣＤ８＋細胞について予め選択することによって利用され得る。このような状況は、増大したレベルのＩＦＮ−γが好ましい場合に存在し得る。さらに、他の適用では、ＴＨ２型細胞に対してＴＨ１型細胞の集団を利用すること（またはその逆）またはそれらからの上清を利用することが所望され得る。
【００４４】
異なるＴ細胞集団の単離を達成するために、活性化を誘導する細胞表面部分の連結の回数を、変化させ得るかまたはパルス適用し得る。例えば、増大（ｅｘｐａｎｓｉｏｎ）の回数を変化させて、目的とする特定の表現型を獲得し得、および／または異なる型の刺激因子を使用し得る（例えば、抗体もしくはそのフラグメント、ペプチド、ポリペプチド、ＭＨＣ／ペプチドテトラマー、増殖因子、サイトカイン、ケモカイン、糖ペプチド、可溶性レセプター、ステロイド、ホルモン、マイトジェン（例えば、ＰＨＡ）、または他のスーパー抗原）。種々の表現型マーカーの発現は、経時的に変化し；従って、特定の時点または刺激因子を選択して、Ｔ細胞の特定の集団を獲得し得る。従って、刺激される細胞型に依存して、刺激および／または増大の回数は、４週間以下、２週間以下、１０日間以下、または８日間以下であり得る（４週間以下は、４週間から１日間（２４時間）までのすべての時間範囲を含む）。いくつかの実施形態では、刺激および増大は、６日間以下、４日間以下、２日間以下にわたって実施され得、そして他の実施形態では、２４時間以下ほどに短い間、そして好ましくは、４〜６時間以下ほどに短い間にわたって実施され得る（これらの範囲は、間に挟まれたあらゆる整数値を含む）。Ｔ細胞の刺激をより短期間実施する場合、Ｔ細胞の集団は劇的には数を増大させないかもしれないが、その集団は、より頑健かつ健康な活性化Ｔ細胞を提供し、この活性化Ｔ細胞は、インビボで増殖を継続し得、そして天然のエフェクターＴ細胞プールにより密接に類似し得る。
【００４５】
種々の刺激時間および刺激因子に曝露されたＴ細胞は、異なる特徴を示し得る。例えば、代表的な血液またはアフェレーシスされた（ａｐｈｅｒｅｓｅｄ）末梢血単核細胞の生成物は、細胞傷害性Ｔ細胞集団またはサプレッサＴ細胞集団（ＴＣ、ＣＤ８＋）よりも優れたヘルパーＴ細胞集団（ＴＨ、ＣＤ４＋）を有する。ＣＤ３レセプターおよびＣＤ２８レセプターを刺激することによるＴ細胞のエキソビボ増大は、約８〜９日目以前には、主にＴＨ細胞からなるＴ細胞の集団を生成するが、約８〜９日目より後には、Ｔ細胞の集団は、漸増的により多くのＴＣ細胞集団を含む。従って、処置の目的に依存して、主にＴＨ細胞を含むＴ細胞集団を被験体に注入することまたは適用することが、有益であり得る。
【００４６】
さらに、ＣＤ４マーカーおよびＣＤ８マーカーに加えて、他の表現型マーカーが、細胞増大プロセス過程の間に、顕著ではあるが大部分において再現可能なように、変化する。従って、このような再現可能性は、特定の目的のために（例えば、新脈管形成とは対照的に、骨再生のために）、活性化Ｔ細胞生成物を仕立てる能力を付与する。
【００４７】
１つのこのような例において、時間と共に再現可能に変化するものでとりわけ重要な表現型マーカーは、高親和性ＩＬ−２レセプター（ＣＤ２５）、ＣＤ４０リガンド（ＣＤ１５４）およびＣＤ４５ＲＯ（ＴＣＲとの優先的結合によって、ＴＣＲの抗原結合に対する感受性を増大し得る分子）である。当業者が容易に理解するように、このような分子は、種々の理由のために重要である。例えば、ＣＤ２５は、迅速なＴ細胞分裂を可能にするオートクラインループの重要な部分を構成する。ＣＤ１５４は、抗原提示樹状細胞の成熟の刺激；抗体産生に関してのＢ細胞の活性化；ＴＨ細胞増殖の調節；ＴＣ細胞分化の増大；ＴＨ細胞および抗原提示細胞の両方のサイトカイン分泌の調節；ならびにＣＤ８０、ＣＤ８６およびＣＤ１５４を含む同時刺激リガンドの発現の刺激、において重要な役割を果たすことが示されている。
【００４８】
本発明の組織修復および組織再生において重要なサイトカイン、細胞表面レセプターおよび他の因子の生成は、しばしば非常に早く開始して、エキソビボ増大プロセスにおいて増加する。従って、サイトカインおよび他の因子は、Ｔ細胞の活性化および機能の媒介ならびに細胞分化の調節のために重要であることが公知であるので、このような因子は、治療的Ｔ細胞生成物の開発に重要である可能性が高い。この点に関して重要な分子としては、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＴＮＦ−αおよびＩＦＮ−γ、トランスホーミング増殖因子（ＴＧＦ）、ＴＧＦ−β、ニューロロイキン（ホスホグルコースイソメラーゼ）、神経成長因子、ＮＦ−κＢ転写因子、およびＣＤ４０が挙げられるが、これらに限定されない。従って、最初の数日間の増大の間にＴ細胞集団を獲得し、そしてこれらの細胞を被験体に注入することによるか、またはこれらの細胞もしくはそれに由来する上清を直接的に傷害部位に適用することによって、インビボでＴ細胞のさらなる活性化および増大が起こり、そして／または組織の修復および再生が起こるという治療効果を生じ得る。
【００４９】
先に考察したサイトカインおよびマーカーに加えて、Ｔ細胞の活性化および標的細胞の免疫媒介性調節の媒介のために重要であることが公知の接着分子の発現もまた、エキソビボでの増大プロセスの過程の間に、劇的ではあるが再現可能なように変化する。例えば、ＣＤ６２Ｌは、リンパ系組織へのＴ細胞のホーミングおよび炎症部位へのＴ細胞の輸送のために重要である。ＣＤ６２Ｌのダウンレギュレーションは、活性化後早期に生じるので、Ｔ細胞はより短期間の間に増大し得る。逆に、培養期間が長くなるにつれて、より高いレベルのＣＤ６２Ｌを有し、従って、他の好ましい条件下でこれらの部位に対して活性化Ｔ細胞を標的化するより高い能力を有するＴ細胞集団が生成される。発現が経時的に変化するポリペプチドの別の例はＣＤ４９ｄであり、これは、リンパ球を血液から炎症部位の組織間隙へと輸送する際に関与する接着分子である。ＣＤ４９ｄリガンドのＣＤ４９ｄへの結合はまた、Ｔ細胞が、ＶＣＡＭ−１またはフィブロネクチンリガンドによる結合を通して、活性化および増殖のための同時刺激シグナルを受け取ることを可能にする。Ｔ細胞−ＡＰＣおよびＴ細胞−Ｔ細胞の相互作用ならびに炎症部位へのホーミングに関与する接着分子ＣＤ５４の発現もまた、増大過程の間に変化する。従って、Ｔ細胞は、目的のマーカープロフィールと一致して選択された期間にわたり刺激され得、その後に収集され得、そして注入され得る。活性化Ｔ細胞由来の上清を含む組成物もまた注入され得る。活性化Ｔ細胞またはそれに由来する上清はまた、直接的に傷害部位に適用され得る。従って、Ｔ細胞集団は、処置される適応症のために最も治療効果を与えると考えられるマーカーを発現するように仕立てられ得る。
【００５０】
種々の実施形態において、当業者は、細胞からの刺激シグナルの除去が、使用される表面の型に依存することを理解する。例えば、常磁性ビーズを使用する場合、磁気分離が、実行可能な選択肢である。分離技術は、常磁性ビーズの製造業者による指示書（例えば、ＤＹＮＡＬ  Ｉｎｃ．，Ｏｓｌｏ，Ｎｏｒｗａｙ）により、詳細に記載されている。さらに、表面が、細胞から分離されるに十分に大きなビーズである場合には、濾過が使用され得る。さらに、種々の輸液フィルターが市販されている（２０ミクロンおよび８０ミクロンの輸液フィルター（Ｂａｘｔｅｒ）が挙げられる）。従って、ビーズがフィルターのメッシュサイズよりも大きい限り、このような濾過が非常に効率的である。関連の実施形態では、ビーズはフィルターを通過し得るが、細胞は残存し得ることにより、分離が可能となる。
【００５１】
本明細書中に記載された方法において使用される抗体は、公的な供給源（例えば、ＡＴＣＣ）から容易に入手され得るが、Ｔ細胞補助分子およびＣＤ３複合体に対する抗体は、標準的な技術によって生成され得る。本発明の方法において使用する抗体の生成のための方法論は、当該分野で周知である。
【００５２】
本発明の１つの局面では、Ｔ細胞は、当該分野で公知の多数の任意の方法を使用して、遺伝的に改変され得る。Ｔ細胞は、当業者に公知の多数のＲＮＡ発現ベクターまたはＤＮＡ発現ベクターを使用してトランスフェクトされ得る。遺伝的改変は、当該分野で公知の多数の任意の技術（例えば、エレクトロポレーション（例えば、Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ  ＩＩ，ＢｉｏＲａｄ，Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＣＡを使用する）、種々のカチオン性脂質（ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥＴＭ，Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、またはＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ．Ｎ．Ｙ．に記載されるリン酸カルシウムトランスフェクションのような他の技術）を使用する、ＲＮＡトランスフェクションまたはＤＮＡトランスフェクションを含み得る。例えば、５００μｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭ中の５〜５０μｇのＲＮＡまたはＤＮＡを、１０〜１００μｇの濃度でカチオン性脂質と混合し得、そして室温で２０〜３０分間インキュベートし得る。他の適切な脂質としては、ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮＴＭ、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥＴＭが挙げられる。次いで、得られた核酸−脂質複合体を、約２ｍｌの総容量の（例えば、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ中の）１〜３×１０６細胞、好ましくは、２×１０６細胞の抗原提示細胞に添加し、そして３７℃で２〜４時間にわたりインキュベートする。Ｔ細胞はまた、以下に記載されるようなウイルス形質導入方法論を使用して、形質導入され得る。
【００５３】
あるいは、Ｔ細胞は、レトロウイルス形質導入技術を使用して、遺伝的に改変され得る。本発明の１つの局面では、レトロウイルスベクターは、両栄養性レトロウイルスベクターであり得、好ましくは、長末端反復配列（ＬＴＲ）を有する点で特徴付けられるベクター（例えば、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭｏＭＬＶ）、骨髄増殖性肉腫ウイルス（ＭＰＳＶ）、マウス胚幹細胞ウイルス（ＭＥＳＶ）、マウス幹細胞ウイルス（ＭＳＣＶ）、脾フォーカス形成ウイルス（ＳＦＦＶ）またはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）に由来するレトロウイルスベクター）であり得る。大半のレトロウイルスベクターは、マウスレトロウイルス由来である。しかし、本発明に従う用途に適用可能なレトロウイルスは、任意の鳥類細胞供給源または哺乳動物細胞供給源に由来し得る。これらのレトロウイルスは、好ましくは、両栄養性（これは、それらが、ヒトを含む数種の宿主細胞に感染し得ることを意味する）である。１つの実施形態では、発現される遺伝子を、レトロウイルスのｇａｇ、ｐｏｌおよび／またはｅｎｖ配列と置換する。多数の例示的なレトロウイルス系が記載されている（例えば、米国特許第５，２１９，７４０号；同第６，２０７，４５３号；同第５，２１９，７４０号；ＭｉｌｌｅｒおよびＲｏｓｍａｎ（１９８９）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ７：９８０−９９０；Ｍｉｌｌｅｒ，Ａ．Ｄ．（１９９０）Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １：５−１４；Ｓｃａｒｐａら（１９９１）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １８０：８４９−８５２；Ｂｕｒｎｓら（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：８０３３−８０３７；ならびにＢｏｒｉｓ−ＬａｗｒｉｅおよびＴｅｍｉｎ（１９９３）Ｃｕｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．Ｄｅｖｅｌｏｐ．３：１０２−１０９）。
【００５４】
（組織修復および組織再生におけるＴ細胞組成物の使用）
本発明の活性化Ｔ細胞は、多くの異なる細胞、組織および器官を含み得る、損傷を受けた組織または処置の必要な組織部位に、汎用的に適用され得る。活性化Ｔ細胞は、損傷を受けた組織部位へと「標的化」される。本発明は、ヒト医療において、種々の広範な損傷を受けた組織の修復に適用可能である。これらとしては、腐食骨、変性軟骨組織、虚血性心筋層、損傷を受けた内皮細胞、変性または他の損傷を受けた神経、熱傷部位、外科手術後の部位、および器官／組織の移植部位の修復および／または再生が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５５】
例えば、本発明の活性化Ｔ細胞またはそれに由来する上清を使用することにより、この細胞により生成されるかまたはそれに由来する上清中に存在するサイトカイン増殖因子および／または他の分子が、細胞表面シグナル伝達レセプターの結合を通して、組織部位で他の細胞に影響を及ぼし、それにより、創傷治癒、組織修復または再構築のプロセスに通常関連する生理学的事象のカスケードを刺激および増幅する。例えば、創傷治癒の速度が増大し、より迅速な再上皮化および組織修復が導かれる。最終的な結果は、組織修復および組織再生の増強である。本発明の細胞および／または上清を使用して、傷害部位または組織再生の必要がある部位への、他の細胞（例えば、間葉幹細胞、骨髄由来の血管芽細胞、神経幹細胞、または組織修復に関与する任意の様式の前駆細胞（単球が挙げられるが、これに限定されない））を補充し得る。本発明の活性化Ｔ細胞またはそれに由来する上清は、所望される結果に依存して、インビトロまたはインビボのいずれかで投与され得る。
【００５６】
本発明の活性化Ｔ細胞またはそれに由来する上清はまた、疾患プロセスをブロックすることにより天然の組織治癒を起こさせることが目的である場合、または遺伝的に欠損性のタンパク質機能を置換することが目的である場合に有用である。
【００５７】
損傷を受けた組織は、外科手術手順、感染、外傷的傷害、または疾患状態（梗塞心筋層、虚血性心筋層、腐食骨、変性軟骨（ｃａｒｔａｌａｇｅｎｏｕｓ）組織、変性神経組織、熱傷または移植部位が挙げられるが、これらに限定されない）によって誘導されるか、またはそれらから生じるかのいずれかである組織損傷に由来する組織傷害から生じ得る。本発明の活性化Ｔ細胞またはそれに由来する上清は、種々の技術を使用して患者に移入され得る。例えば、細胞および／またはそれに由来する上清を含む組成物は、治療的な移植物、注射として、または適切な処方物の局所的適用を介するかのいずれかで、医師によって創傷部位に直接的に移入され得る。さらに、活性化Ｔ細胞またはそれに由来する上清は、局所的に投与され得るか、または遠位の疾患組織を処置するために正常な組織部位に外科手術的に配置され得る。
【００５８】
創傷治癒のプロセスは、出血、血餅形成、損傷を受けた組織の除去と同時に起こる血餅の溶解、および最初の修復材料としての肉芽組織の沈着を含む協調的な一連の事象である。肉芽組織は、線維芽細胞および毛細血管の混合物である。創傷治癒プロセスは、内皮細胞、幹細胞、マクロファージ、および線維芽細胞を含む多様な細胞集団を含む。創傷修復に関与する調節因子は、全身性のホルモン、サイトカイン、増殖因子、細胞外マトリクスタンパク質、ならびに増殖および分化を調節する他のタンパク質を含むことが公知である。
【００５９】
（骨修復および骨再生におけるＴ細胞組成物の使用）
骨は、骨折後に再生する実質的な能力を有する。複雑だが順序付けられた骨折修復順序は、ホメオスタシス、血餅溶解、肉芽組織の内生成、仮骨形成、および最適な構造への仮骨再構築（Ａ．Ｗ．Ｈａｍ．Ｊ  Ｂｏｎｅ  Ｊｏｉｎｔ  Ｓｕｒｇ．１２：８２７−８４４，１９３０）を含む。このプロセスにおいて関与する細胞としては、血小板、炎症細胞、繊維芽細胞、内皮細胞、血管周囲細胞、破骨細胞および骨原性前駆細胞が挙げられる。
【００６０】
骨修復を刺激するために設計された技術は、骨折を処置する際に貴重なツールである。骨折した骨のかなりの部分は、創傷治癒をもたらす天然の機構を可能にする、ギブス包帯によって依然として処置されている。近年、骨折処置において進展（改善されたデバイス、刺激するための新たなプロセスの開発、または補完を含む）があったものの、創傷治癒機構は、この領域において有意な進展を示す。
【００６１】
本発明の活性化されたＴ細胞およびそれに由来する上清を使用して、骨折修復を促進し得る。この技術の他の局面は、「弱い骨」を有する患者（例えば、骨粗しょう症のような疾患において）を処置するために；未知の理由で生じ得る貧弱な治癒（例えば、繊維性の偽関節）を改善するために；移植物の統合および人工関節の機能を改善するために；アキレス腱のような他の骨格組織の治癒を刺激するために、および大きな欠損を修復するためのアジュバントとして、細胞または上清の移入の使用を含む。
【００６２】
トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）はまた、細胞増殖、遺伝子発現、およびマトリクスタンパク質合成をもたらすことによって組織治癒を調節する際に重要な役割を有することが示されている（Ｒｏｂｅｒｔｓ＆Ｓｐｏｒｎ，１９８９，Ｍ．Ｂ．Ｓｐｏｒｎ  ａｎｄ  Ａ．Ｂ．Ｒｏｂｅｒｔｓ編，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，９５（Ｐａｒｔ１））。例えば、ＴＧＦ−β１およびＴＧＦ−β２は、軟骨形成および骨形成の両方を開始し得る（Ｊｏｙｃｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１１０：１９５−２００７，１９９０；Ｉｚｕｍｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎ．Ｒｅｓ．７：１１５−１１，１９９２；Ｊｉｎｇｕｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ．Ｏｒｔｈｏｐ．Ｒｅｓ．８．３６４−３７１，１９９２）。よって、この因子を産生する本発明の活性化されたＴ細胞は、骨折後の新たな骨形成に影響を及ぼすために本発明の実施において使用され得る。
【００６３】
本発明の１つの実施形態において、本発明の活性化されたＴ細胞は、骨折部位に外科的に移植される。このような外科的手順手術は、骨折部位に活性化されたＴ細胞の調製物を直接注射すること、複雑骨折の外科的修復、または関節鏡検査外科を含み得る。活性化されたＴ細胞またはそれに由来する上清が骨折修復に使用される場合、哺乳動物修復細胞は、自然に移動して、骨損傷部位で増殖する。
【００６４】
本発明をまた使用して、柔組織（例えば、靭帯、腱、軟骨および皮膚）の増殖または再生を刺激し得る。外傷性の傷害に起因する骨格結合組織損傷は、活性化されたＴ細胞またはそれに由来する上清を使用して処置され得る。活性化されたＴ細胞によって産生される種々の因子は、柔組織修復を促進し得る。これらとしては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：細胞外マトリクスタンパク質をコードする遺伝子の発現を刺激するＴＧＦ−βスーパーファミリーのメンバー（例えば、ＴＧＦ−β自身）、および他のサイトカイン（例えば、ＥＧＦおよびＰＤＧＦ）。このプロセスにおいて重要であり得る活性化されたＴ細胞によって産生される他の因子の例としては、以下が挙げられる：（ａ）インターロイキン、ケモカイン、インターフェロン、コロニー刺激因子；（ｂ）細胞接着分子のファミリー；（ｃ）核トランス作用タンパク質（例えば、転写因子）。
【００６５】
本発明の活性化されたＴ細胞またはそれに由来する上清は、宿主哺乳動物において結合組織創傷の領域に置かれ得る。この活性化されたＴ細胞またはそれに由来する上清は、結合組織損傷の領域に直接注射され得る。あるいは、外科的技術（例えば、関節鏡検査手術）を使用して、結合組織創傷の領域にその活性化されたＴ細胞またはそれに由来する上清を送達し得る。
【００６６】
本発明の１つの局面において、活性化されたＴ細胞またはそれに由来する上清を使用して、骨細胞またはその前駆体のインビトロ培養において骨再生を刺激し得る。活性化されたＴ細胞またはそれに由来する上清と共存培養は、骨細胞の成熟、分化、機能改善、および／または移植潜在性の増強を導き得る。さらに、本発明の活性化されたＴ細胞またはそれに由来する上清と種々の細胞型とのインビトロでの共存培養は、非Ｔ細胞系統の細胞の機能変更を導き得る。次いで、共存培養の結果として変更された細胞は、組織修復および／または組織再生における使用のために哺乳動物に投与され得る。
【００６７】
活性化されたＴ細胞および／またはそれに由来する上清はまた、骨転移の修復に使用され得る。カルシウム代謝およびリン酸代謝において不整を含むいくつかの病理学的状態が存在する。このような状態は、パジェット病および骨粗しょう症を含む骨関連疾患、ならびに骨転移における骨溶解を含む。骨転移は、頻繁に生じる多くの悪性疾患における主要な問題を示す。骨吸収により生じる高カルシウム血症は、悪性疾患の一般的かつ非常に重要な合併症であり、重篤な痛みおよび特発性骨折のような窮迫した症状を引き起こし、そして代謝性昏睡および死を導き得る。さらに、新生物の細胞誘導性骨溶解は、骨腫瘍の局在および増殖増強を決定し得る（Ｇ．Ｒ．Ｍｕｎｄｙ，Ｂｏｎｅ，８，ｓｕｐｐ．１，Ｓ９−５  １６（１９８７）；およびＣａｌｃｉｕｍ  ｉｎ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｒ．Ｐ．Ｒｕｂｉｎ，Ｇ．Ｂ．Ｗｅｉｓｓ，ａｎｄ  Ｊ．Ｗ．Ｐｕｔｎｅｙ，Ｊｒ編．Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．（１９８５）を参照のこと）。他の病理学的状態は、慢性関節リウマチおよび変形性関節症のような体内におけるカルシウム沈着およびリン酸沈着を異常に生じるかまたはこれらから異常に生じる。本発明の活性化されたＴ細胞組成物またはそれに由来する上清は、所望の活性を促進にすることが公知である化合物と組合わせて（例えば、オステオプロテグリン（ｏｓｔｅｏｐｒｏｔｅｇｒｉｎ）またはビスホスホネートの使用）、このような障害の治療に使用され得る。ビスホスホネートは、骨の種々の代謝性疾患における使用のために開発されたクラスの薬物であり、その標的は、過度の骨再吸収ならびに不適切な石灰化および骨形成である（Ｍ．Ｄ．Ｆｒａｎｃｉｓ  ａｎｄ  Ｒ．Ｒ．Ｍａｒｔｏｄａｍ，「Ｔｈｅ  Ｒｏｌｅ  ｏｆ  Ｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅｓ  ｉｎ  Ｌｉｖｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ」  Ｒ．Ｌ．Ｈｉｌｄｅｒｂｒａｎｄ編，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，Ｆｌａ．，１９８３，ｐｐ．５５−９６；およびＨ．Ｆｌｅｉｓｃｈ，Ｂｏｎｅ，１９８７，８，Ｓｕｐｐ．１，Ｓ２３−Ｓ２８）。
【００６８】
（新脈管形成におけるＴ細胞組成物の使用）
本発明をまた使用して、血管の形成および広がり、すなわち、それぞれ脈管形成および新脈管形成を調節し得る。これらの両方の生理学的プロセスは、創傷治癒および組織再生における重要な役割を担う。
【００６９】
第一に、創傷の部位において、コラーゲン、マトリクスおよび血管が沈着され、そして組織修復の間創傷強度を提供する。新たな血管の形成は、血管内皮細胞の増殖、移動および浸潤を含み、そして、種々のポリペプチド増殖因子によって調節されることが知られている。内皮細胞増殖促進活性を有するいくつかのポリペプチドが同定されており、このポリペプチドとしては、酸性繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）および塩基性繊維芽細胞増殖因子、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）および胎盤由来増殖因子（ＰＤＧＦ）が挙げられる。
【００７０】
血管の形成および広がりを刺激するために、これらの増殖因子の発現を促進する因子（例えば、ＴＧＦ−β（しかし、これに限定されない））を発現する活性化したＴ細胞は、血管系においてかまたは所望の創傷治癒／新脈管形成の部位で宿主に投与され得る。いくつかの例において、この活性化したＴ細胞は、組織傷害を介する創傷治癒プロセスを誘導するために必要であり得る。
【００７１】
本発明の活性化されたＴ細胞またはそれに由来する上清をまた使用して、心筋細胞、内皮細胞またはこれらの細胞の前駆体のインビトロ培養物での新脈管形成を刺激し得る。これらの細胞の共存培養は、これらの細胞の成熟、分化、機能改善、および／または移植可能性の増強を導き得る。さらに、本発明のこれらの細胞と種々の細胞型とのインビトロでの共存培養は、非Ｔ細胞系統の細胞の機能変更を導き得る。
【００７２】
脈管形成因子（新脈管形成調節に特有である、哺乳動物での生理学的変化を誘導する分子（例えば、血管内皮増殖因子）を含む）はまた、本発明の組成物と組合わせて使用され得る。特徴的な調節の例としては、腫瘍増殖の調節（促進または抑制）、組織修復および組織再構築が挙げられる。多価リガンドに組み込まれる場合に腫瘍増殖を調節するペプチドが、脈管形成性であるとみなされる。血管発生または内皮細胞表現型の発現に関与する細胞性プロセスを調節する分子もまた、脈管形成性因子の定義に含まれる。例としては、内皮細胞増殖、内皮細胞生存、内皮細胞移動、内皮細胞への結合が挙げられる。
【００７３】
新脈管形成を評価するために有用なインビトロアッセイは、Ｔｏｌｓｍａ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１２２：４９７（１９９３）およびＶｏｇｅｌ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５３：７４（１９９３）（それらの全体が本明細書中に参考として援用される）に記載される。米国特許第６，２２５，１１８号（その全体が本明細書中に援用される）に記載されるインビトロアッセイもまた使用され得る。簡単には、その中に記載されるのは、二重培養を使用しさらなる増殖因子を必要としない適切な細胞シグナリング機構に依存する、新脈管形成についてのインビトロアッセイである。新脈管形成の刺激および阻害の両方は、この技術を使用して実証され得る。
【００７４】
（神経再生におけるＴ細胞組成物の使用）
本発明の別の局面において、活性化されたＴ細胞またはそれに由来する上清を使用して、神経増殖を刺激する。この局面について、本明細書中に記載される組成物は、培養中の神経細胞に直接適用され得るか、またはインビボ投与に適切な組成物中に提供され得る。本発明の好ましい１つの局面において、この組成物は、エキソビボでの神経再生に有用である。
【００７５】
代替の実施形態に従って、軸索伸長を刺激する方法は、神経栄養因子で患者または培養中のエキソビボ神経細胞を処置する、さらなる工程を包含する。この実施形態は、患者に投与されるべき場合、単一投薬形態または別々の複数投薬形態において本発明の組成物および神経栄養因子を投与する工程を包含する。別々の投薬形態が使用される場合、これらは、同時に、連続してまたは互いに約５時間未満に投与され得る。
【００７６】
本発明の方法および組成物を使用して、広範な種々の疾患または身体的外傷によって生じる神経損傷を処置し得る。これらとしては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：アルツハイマー病、パーキンソン病、ＡＬＳ、多発性硬化症、発作および発作に関連する虚血、ニューロパシー（ｎｅｕｒａｌ  ｐａｒｏｐａｔｈｙ）、他の神経変性疾患、運動ニューロン疾患、座骨挫傷、末梢ニューロパシー（特に、糖尿病に関連するニューロパシー）、脊髄傷害および顔面神経挫傷。
【００７７】
多くの神経栄養因子が、当該分野において同定されており、そしてこれらの因子のいずれもが、本発明の活性化されたＴ細胞またはそれに由来する上清の組成物と組合わせて使用され得る。これらの神経栄養因子としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：神経成長因子（ＮＧＦ）、インスリン増殖因子（ＩＧＦ−１）およびその活性な短縮型誘導体（例えば、ｇＩＧＦ−１）、酸性繊維芽細胞増殖因子および塩基性繊維芽細胞増殖因子（それぞれ、ａＦＧＦおよびｂＦＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、グリア細胞株由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、ニューロトロフィン−３（ＮＴ−３）およびニューロトロフィン４／５（ＮＴ−４／５）。本発明の組成物中における１つの好ましい神経栄養因子は、ＮＧＦである。
【００７８】
神経再生および神経修復に関する本発明の有効性は、米国特許第５，５４７，９６３号（その全体が本明細書中に援用される）に記載される方法を使用して測定され得る。簡単には、ヒト筋肉フラグメント（その繊維鞘が除去されている）は、小片に切断され、そして１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）ならびに１％の即時使用可能な（ｒｅａｄｙ−ｔｏ−ｕｓｅ）抗生物質および抗真菌剤の溶液（ベンジルペニシリン酸ナトリウム、ストレプトマイシン、ファンギゾン（ＧＩＢＣＯ））を含む１９９培地から構成される馴化培地中で一晩インキュベートされる。これらのフラグメントは、４倍容の馴化培地および１倍容のヒト血漿から構成される滋養性の凝塊中で維持される。次いで、外植片は、ゼラチンコートペトリ皿に移され、加湿され、そして３７℃で１時間のインキュベーションによって支持体上に固定化され、そしてＦ１４培地（ＧＩＢＣＯ）（１０％  ＦＣＳ、２ｍＭ  グルタミン、１０μｇ／ｍｌ（．ｍｕ．ｇ／ｍｌ）インスリン、１０ｎｇ／ｍｌ  ＦＧＦおよび１０ｎｇ／ｍｌ  ＥＧＦを含む）が添加される。多くのサテライト筋肉細胞（成体における筋線維の前駆体）は、移植体外に移動する。これらの細胞は、増殖し始め、そして培養１週間後に合体し始める。筋管へのサテライト細胞の合体前に、外植片を除去する。実験に必要な量を得るために、合体相の直前に細胞をトリプシンで処理し、そして継代培養する。
【００７９】
細胞を、最終的に播種する（２０．０００／ｃｍ２）。筋管の形成後、１３日齢のラット胚由来の脊髄外植片を、筋細胞層上に固定化し、２５％  １９９培地、６７．５％  ＭＥＭ培地（ＧＩＢＣＯ）、５％  ＦＣＳ、１０μｇ／ｍｌ（．ｍｕ．ｇ／ｍｌ）インスリンおよび１％抗生物質溶液中で共存培養する。この培養培地を、週に２回一新する。試験化合物を、この培養培地中に溶解する。
【００８０】
標準条件下で、４つの外植片中１つのみが、筋線維との機能的な接触を達成し得る。よって、これらの実験条件は、軸索およびシナプス形成の実証に最適である。
【００８１】
本発明の活性化Ｔ細胞またはこの活性化Ｔ細胞からの上清の効果は、以下のパラメーターを測定することにより決定される：
１）  軸索の長さ
２）  軸索の長さは、接眼ミクロメーターを備える位相差顕微鏡（最終拡大率２００×）を用いて決定する。軸索の長さは、外植片の中心から、これらの線状の延長部の湾曲を考慮せずに測定される。分枝部の長さもまた決定される。軸索の全体の長さは、少なくとも１５個の外植片において決定される。
【００８２】
３）  １外植片あたりの軸索の数
４）  各外植片から出現する軸索の数は、分枝部を考慮せずに決定される。
【００８３】
５）  神経筋接合部の数
６）  コリン作用性レセプター凝集物の計数
７）  培養物は、１２５Ｉ−α−ブンガロトキシンの存在下で１時間インキュベートされ、２．５％グルタルアルデヒドで固定され、乾燥され、そして流動性の写真撮影用エマルジョンに浸漬される。オートラジオグラムは、１０日間の露光の後に現像される。培養物は、顕微鏡（倍率２００×）下で試験され、明確に異なるレセプター凝集物により単離された筋繊維を選択する（これらの繊維は、一般に、顕微鏡の視野の直径よりも大きく、そしてこの視野の長さが、長さ単位とされる）。少なくとも６０個の繊維が研究される。値は、補正率で乗算した凝集物の数の平均であり、そしてｍｍで表される。
【００８４】
８）  アセチルコリンエステラーゼ−リッチのシナプスゾーンの数
９）  アセチルコリンエステラーゼは、ＫｏｂａｙａｓｈｉおよびＡｓｋａｎａｓ（Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、第７巻、３１３１−３１４１，１９８７）により改変されたＫａｒｎｏｖｓｋｙおよびＲｏｏｔｓの技術により示される。アセチルコリンエステラーゼ−リッチのシナプスゾーンは、レセプター凝集物について上記される技術に従って計数される。
【００８５】
１０）  神経支配されたゾーンの表面
１１）  外植片の周りの神経支配された筋肉細胞領域の表面の合計。このパラメーターは、運動ニューロンにより覆われた領域に対応し、この領域内部の神経支配されていないゾーンまたは他の細胞型の存在は考慮しない。
【００８６】
１２）  神経支配された筋繊維により覆われた実際の表面。この領域は、コリン作用性レセプター凝集物のオートラジオグラフ検出か、またはアセチルコリンエステラーゼ染色のいずれかにより決定され、そして画像分析器を用いてデジタル化した後定量される。このパラメーターは、神経支配された筋繊維の数の見積もりを与える。
【００８７】
（粘膜炎（Ｍｕｃｏｓｉｔｉｓ）に対するＴ細胞組成物の使用）
悪性腫瘍の処置のための化学療法または放射線療法を受けている患者は、殆ど常に、これらの治療に起因する穏やかな副作用または重篤な副作用に直面している。癌患者が直面する共通の副作用の１つは、粘膜の潰瘍性粘膜炎粘膜炎の誘導である。この粘膜炎は、口腔において特に顕著である。この副作用は、貧血または免疫抑制のような副作用のように生命を脅かすものではないが、それにもかかわらず、頻繁に、多くの癌患者における治療の継続において用量制限因子となる。潰瘍性粘膜炎は、口腔における治癒の遅い開放性潰瘍の形成により特徴付けられ、患者に対して多くの疼痛および不快感を引き起こす。食べること、飲むこと、および飲み込むことが、困難でかつ痛みをともなうようになり、そして、さらに、唾液腺が、頻繁に、この不快感の倍加をもたらす。口における開放性潰瘍の存在は、頻繁に、これらの治療に起因して、頻繁に、免疫学的に抑制されるこれらの患者において、細菌、ウイルス、および真菌起源の日和見感染を導く。これら経口感染は、生命を脅かす全身性感染に広がることを避けるために、慎重にモニターされなければならない。
【００８８】
今のところ、治療の中止か、または待期的介入および支持的介入のいずれかを除いて、このような粘膜炎に対する処置は存在しない。現在用いられる待期処置のいくつかとしては、感染の機会を減少させる抗生物質の使用、抗ヒスタミン剤の使用、および抗炎症剤の使用、ならびに疼痛低減医薬の使用が挙げられる。これらの処置の全ては、癌治療の中止の場合、受容不可能であるか、または粘膜炎の罹患を軽減することに、一部のみが成功している。
【００８９】
本発明の1つの局面において、活性化Ｔ細胞またはこの活性化Ｔ細胞由来の上清は、粘膜炎の処置に使用される。この局面について、本明細書中に記載される組成物は、粘膜炎の部位に直接塗布され得るか、またはインビボでの投与に適切な薬学的組成物中で提供され得る。別の局面では、活性化Ｔ細胞またはこの活性化Ｔ細胞由来の上清は、粘膜炎の発症を阻害するために用いられ得る。本発明の活性化Ｔ細胞は、化学治療の前、化学治療と組合わせて、または化学治療の後に、投与され得る。
【００９０】
（悪液質に対するＴ細胞の使用）
悪液質は、悪性腫瘍、結核、糖尿病、血液疾患、内分泌障害、ＡＩＤＳなどと関係し、基本的な症状として、体重の進行性の減少、貧血、水腫、および食欲不振に関与する（「Ｊ．Ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ  ａｎｄ  Ｅｎｔｅｒａｌ  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ，１２，２８６−２９８，１９８８」および「Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，８５，２８９−２９１，１９８８」）。
【００９１】
悪液質に対して、例えば、非経口栄養療法または経腸栄養療法、および内分泌療法が、今日まで試みられてきたが、満足のいく治療様式は、今のところ確立されていない。特に、悪液質が、悪性腫瘍により引き起こされる場合、悪液質の進行は、抗癌化学療法に対する患者の許容性を低下させ、その結果、この処置は、深刻な妨げにあう。他方で、悪液質に対する待期栄養性支持は、むしろ、悪性腫瘍を悪化させて、患者の生存期間を短くする。悪液質は、頻繁に、悪性腫瘍により誘導される一方で、抗腫瘍薬物の投与は、抗腫瘍効果を引き起こし得るが、抗腫瘍医薬の副作用が悪液質の緩解を阻止するように重なって起きるということは、例外というよりはむしろ常例である。これらの状況下で、悪液質症状（例えば、体重の減少）の進行を緩和または阻止する、治療用薬物の必要性が存在する。
【００９２】
本発明の１つの局面では、活性化Ｔ細胞またはこの活性化Ｔ細胞に由来する上清は、悪液質の処置に用いられる。この局面について、本明細書中に記載される組成物は、インビボ投与に適切な薬学的組成物中で提供され得る。別の局面では、活性化Ｔ細胞またはこの活性化Ｔ細胞に由来する上清は、悪液質の発症を阻害するために用いられ得る。本発明の活性化Ｔ細胞は、化学療法の前、化学療法と組合わせて、または化学療法の後に投与され得る。本発明の活性化Ｔ細胞は、当該分野で利用可能な悪液質に対する他の処置と組合わせて投与され得る。
【００９３】
（遺伝子発見におけるＴ細胞組成物の使用）
本明細書中に記載される、活性化Ｔ細胞および／またはこの活性化Ｔ細胞に由来する上清のインビトロ共培養はまた、遺伝子発見に適用可能であり得る。例えば、活性化Ｔ細胞および／またはこの活性化Ｔ細胞に由来する上清の、神経細胞、心筋細胞（ｃａｒｉｏｍｙｏｃｙｔｅｓ）、内皮細胞、骨細胞、および／またはこれらの細胞の前駆体との共培養は、標的細胞における変化した遺伝子発現を導き得る。次いで、目的の細胞が、多数の免疫選択方法のような当業者に公知の種々の技術を用いて単離され得る。このような技術は、例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．に記載される。次いで、この様式で単離された細胞は、遺伝子ライブラリーの作製に用いられ得る。ＤＮＡまたはｃＤＮＡライブラリー構築技術は、当業者に周知である。特注のライブラリーもまた、種々の企業（例えば、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ））により商業的に作成され得る。次いで、これらのライブラリーは、例えば、ＰＣＲおよび直接スクリーニングによって、スクリーニングされて、活性化Ｔ細胞またはこの活性化Ｔ細胞に由来する上清の結果として活性化された、組織修復および組織再生のプロセスに関与する公知の遺伝子および／または固有の遺伝子を同定し得る。
【００９４】
（処方物／薬学的組成物）
本発明は、活性化Ｔ細胞、および／または活性化Ｔ細胞もしくはこの活性化Ｔ細胞に由来する上清と共に培養した後に改変された細胞、ならびに薬学的に受容可能なキャリアを含む薬学的組成物をさらに提供する。本発明の組成物は、単独か、あるいは希釈剤および／またはＩＬ−２もしくは他のサイトカインまたは他の細胞集団のような他の成分と組合わせた薬学的組成物としてかのいずれかで投与され得る。簡単には、本発明の薬学的組成物は、１つ以上の薬学的に受容可能なキャリアまたは生理学的に受容可能なキャリア、希釈剤、または賦形剤と組合わせた、本明細書中に記載されるような標的細胞集団を含み得る。このような組成物は、中性の緩衝化生理食塩水、リン酸緩衝化生理食塩水などのような緩衝液；グルコース、マンノース、ショ糖またはデキストラン、マンニトールのような糖質；タンパク質；ポリペプチドまたはグリシンのようなアミノ酸；抗酸化剤；エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）またはグルタチオンのようなキレート剤；アジュバント（例えば、水酸化アルミニウム）；および保存剤を含み得る。本発明の組成物は、特定の局面において、静脈内投与のために処方される。
【００９５】
本発明の薬学的組成物は、処置（または予防）される疾患に適切な様式で投与され得る。投与の量および頻度は、患者の状態、ならびに患者の疾患の型および重篤度のような因子により決定されるが、適切な投薬量は、臨床試験により決定され得る。
【００９６】
「治療的有効量」が示される場合、投与されるべき本発明の組成物の正確な量は、患者の、年齢、体重、腫瘍のサイズ、感染または転移の程度、および状態における、個人差を考慮して、医師により決定され得る。代表的には、養子免疫治療研究において、活性化Ｔ細胞は、患者に対して約２×１０９〜２×１０１１個の細胞で投与される（例えば、米国特許第５，０５７，４２３号を参照のこと）。本発明のいくつかの局面において、特に、同種異系細胞または異種細胞の使用において、１０６／ｋｇ（１０６〜１０１１／患者）の範囲のより少ない数の細胞が、投与され得る。Ｔ細胞、または共培養後に変化した細胞組成物は、これらの範囲内での投薬量で複数回投与され得る。活性化Ｔ細胞は、治療を受けている患者に対して自系であってもよいし、異種であってもよい。
【００９７】
本発明の薬学的組成物の投与は、エアロゾル吸入、注射、経口摂取、輸注、移植（ｉｍｐｌａｎｔａｔｉｏｎ）または移植（ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ）によるものを含む、任意の都合の良い様式で実行され得る。本発明の組成物は、患者に対して、皮下投与、皮内投与、筋肉内投与、静脈内（ｉ．ｖ．）注入、または腹腔内投与され得る。本発明のＴ細胞組成物は、好ましくは、ｉ．ｖ．注射により投与される。活性化Ｔ細胞の組成物は、組織損傷の部位へと直接注入され得る。
【００９８】
さらに別の実施形態では、薬学的組成物は、制御放出系において送達され得る。１つの実施形態では、ポンプが用いられ得る（Ｌａｎｇｅｒ，１９９０，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：１５２７−１５３３；Ｓｅｆｔｏｎ  １９８７，ＣＲＣ  Ｃｒｉｔ．Ｒｅｆ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｅｎｇ．１４：２０１；Ｂｕｃｈｗａｌｄら、１９８０；Ｓｕｒｇｅｒｙ  ８８：５０７；Ｓａｕｄｅｋら、１９８９，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３２１：５７４を参照のこと）。別の実施形態では、ポリマー材料が用いられ得る（Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ，１９７４，ＬａｎｇｅｒおよびＷｉｓｅ（編），ＣＲＣ  Ｐｒｅｓ．Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，Ｆｌａ．；Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｂｉｏａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ，Ｄｒｕｇ  Ｐｒｏｄｕｃｔ  Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ，１９８４，ＳｍｏｌｅｎおよびＢａｌｌ（編）、Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；ＲａｎｇｅｒおよびＰｅｐｐａｓ，１９８３；Ｊ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｓｃｉ．Ｒｅｖ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．２３：６１を参照のこと；Ｌｅｖｙら、１９８５，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２８：１９０；Ｄｕｒｉｎｇら、１９８９，Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．２５：３５１；Ｈｏｗａｒｄら、１９８９，Ｊ。Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．７１：１０５もまた参照のこと）。さらに別の実施形態では、制御放出系は、治療標的の近位に位置づけられ得、従って、わずかな全身用量のみを必要とする（例えば、Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ，１９８４，ＬａｎｇｅｒおよびＷｉｓｅ（編）、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓ．，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，Ｆｌａ．，第２巻、１１５−１３８頁を参照のこと）。
【００９９】
本発明の組成物はまた、任意の数のマトリクスを用いて投与され得る。マトリクスは、組織工学の状況において長年利用されている（例えば、Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ  ｏｆ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（Ｌａｎｚａ，Ｌａｎｇｅｒ，およびＣｈｉｃｋ（編））１９９７を参照のこと）。本発明は、代表的には、Ｔ細胞の調節を介して、免疫系を支持、維持、または調節するための人工のリンパ球器官として作用する新しい状況においてこのようなマトリクスを利用する。従って、本発明は、組織工学における有用性を実証されたこれらのマトリクス組成物および処方物を利用し得る。従って、本発明の組成物、デバイスおよび方法において使用され得るマトリクスの型は、実際には制限がなく、そして生物学的マトリクスおよび合成マトリクスの両方を含み得る。１つの特定の例では、米国特許第５，９８０，８８９号；同第５，９１３，９９８号；同第５，９０２，７４５号；同第５，８４３，０６９号；５，７８７，９００号；または同第５，６２６，５６１号に示される組成物およびデバイスが、これらの特許がその全体において参考として援用されるように利用される。マトリクスは、哺乳動物宿主に投与される場合、生体適合性であるものに関係する共通の特徴を含む。マトリクスは、天然の材料および合成の材料の両方から形成され得る。これらのマトリクスは、持続的な構造または取出し可能な構造（例えば、インプラント）を、動物の身体に残すことが望ましい場合には、非生分解性あってもよいし、生分解性であってもよい。これらのマトリクスは、スポンジ、インプラント、チューブ、テルファパッド（ｔｅｌｆａ  ｐａｄ）、ファイバー、中空ファイバー、凍結乾燥成分、ゲル、粉末、多孔性組成物、またはナノ粒子の形態をとり得る。さらに、マトリクスは、播種される細胞または産生されるサイトカインまたは他の活性成分を持続性放出することを可能にするように設計され得る。特定の実施形態では、本発明のマトリクスは、可撓性でかつ弾性であり、そして無機塩、水性流体、および溶解した気体状の因子（酸素を含む）のような物質に対して透過性である、半個体骨格として記載され得る。
【０１００】
マトリクスは、生体適合性物質の例として、本明細書中で用いられる。しかし、本発明は、マトリクスに限定されず、そしてマトリクスが現れるどの場所においても、これらの用語は、細胞保持または細胞横断を可能にし、生体適合性であり、そして物質自体が半透膜であるような物質を通じて直接か、または特定の半透性物質と組合わせて使用されるかのいずれかで、巨大分子の横断を可能にし得る、デバイスおよび他の物質を含むように読まれるべきである。
【０１０１】
本明細書中に記載される、活性化Ｔ細胞および／またはこの活性化Ｔ細胞からの上清、ならびに／あるいは活性化Ｔ細胞またはこの活性化Ｔ細胞からの上清と共培養された細胞を含む組成物は、当業者に公知の処方方法を用いて、薬学的に受容可能な処方物として提供され得る。これらの処方は、標準的な経路により投与され得る。一般に、これらの組合わせは、局所経路、経皮経路、経口経路、直腸経路、または非経口（例えば、静脈内、皮下、または筋肉内）経路により投与され得る。さらに、こららの組み合わせは、組成物の持続性放出を可能にする生分解性ポリマーへと組み込まれ得、これらのポリマーは、送達が所望される場所（例えば、組織損傷の部位）の近傍に移植され得る。これらの生分解性ポリマーおよびそれらの使用は、例えば、Ｂｒｅｍら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．７４：４４１−４４６（１９９１）に詳細に記載される。
【０１０２】
その組成物の投薬量は、処置される条件、および他の臨床的要因（例えば、ヒトもしくは動物の体重および状態、その組成物の性質、ならびにその組成物の投与経路）に依存する。本発明は、ヒト用途および獣医学的用途の両方について適用を有することが理解されるべきである。
【０１０３】
その処方物としては、経口投与、直腸投与、眼内投与（硝子体内投与または眼房内投与を含む）、経鼻投与、局所投与（経頬投与および舌下投与を含む）、経膣投与または非経口投与（皮下投与、筋肉内投与、静脈内投与、皮内投与、気管内投与、および硬膜外投与を含む）に適した処方物が挙げられる。その処方物は、投薬形態で簡便に提示され得、そして従来の薬学的技術により調製され得る。そのような技術は、活性成分と薬学的キャリアまたは賦形剤を会合させる工程を包含する。一般に、その処方物は、活性成分を、液体キャリアもしくは微細分割した固体キャリアまたはその両方を、均一かつ密接して会合させること、そしてその後、必要な場合は産物を成形することによって、調製される。
【０１０４】
皮膚への局所投与に適切な処方物は、薬学的に受容可能なキャリア中で投与されるべき成分を含む、軟膏、クリーム、ゲル、およびペーストとして提示され得る。好ましい局所送達系は、投与されるべき成分を含む、経皮パッチである。
【０１０５】
直腸投与のための処方物は、例えば、ココアバターまたはサリチル酸塩を含む、適切な基剤を用いて坐剤として提示され得る。
【０１０６】
キャリアが固体である、経鼻投与に適切な処方物としては、例えば、２０ミクロン〜５００ミクロンの範囲の粒径を有する粗い粉末が挙げられ、この粉末は、嗅剤が投与される様式で、すなわち、鼻に近寄った粉末容器から鼻経路を通した迅速な吸入によって、投与される。キャリアが液体である、例えば、経鼻スプレーまたは経鼻ドロップとして投与するために適切な処方物としては、活性成分の水性溶液または油状溶液が挙げられる。
【０１０７】
経膣投与のために適切な処方物は、適切であることが当該分野で公知であるようなキャリアを活性成分に加えて含む、ペッサリー、タンポン、クリーン、ゲル、ペースト、泡状物、またはスプレー処方物として提示され得る。
【０１０８】
非経口投与に適切な処方物としては、抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤、およびその処方物を意図するレシピエントの血液と等張性にする溶質を含み得る、水性滅菌注射溶液および非水性滅菌注射溶液；ならびに懸濁剤および濃化剤を含み得る、水性滅菌懸濁物および非水性滅菌懸濁物が挙げられる。その処方物は、単用量容器または多用量容器（例えば、密封したアンプルおよびバイアル）中で提示され得、そして使用直前に滅菌液体キャリア（例えば、注射用蒸留水）の添加のみしか必要としない、凍結乾燥（凍結乾燥）状態で貯蔵され得る。即時注射溶液および即時注射懸濁物は、上記の種類の滅菌した粉末、顆粒、および錠剤から調製され得る。
【０１０９】
好ましい単位投薬処方物は、投与される成分の、本明細書中で上記したような１日量もしくは１日単位、１日部分量（ｄａｉｌｙ  ｓｕｂ−ｄｏｓｅ）、またはその適切な画分を含む、処方物である。
【０１１０】
その成分（特に上記の成分）に加えて、本発明の処方物は、対象とする処方物の型に関して当該分野で従来的な他の薬剤を含み得、例えば、経口投与に適切な処方物は、矯味矯臭剤を含み得る。
【０１１１】
本発明の１つの実施形態において、本発明の細胞（活性化Ｔ細胞または活性化Ｔ細胞とともに以前に同時培養された細胞のいずれか）を含む組成物は、常磁性ビーズの使用および標的組織の内側または外側での磁力の適用（例えば、本明細書中にその全体が参考として援用される、米国特許第６，２０３，４８７号に記載される）を介して、所望の位置に標的化される。簡単に述べると、本発明の細胞（活性化Ｔ細胞または活性化Ｔ細胞とともに以前に同時培養された細胞のいずれか）は、適切な表面マーカーに結合体化された常磁性ビーズに、インビボでかもしくはインビトロでかまたはその２つの組み合わせのいずれかで曝露され、その細胞への常磁性粒子の結合が生じるようにされる。インビトロで実施される場合、常磁性粒子に結合した細胞と薬学的に受容可能な賦形剤とを含む組成物が、哺乳動物に投与される。磁石が、標的組織（すなわち、局所細胞送達が望ましい身体領域または選択された組織もしくは器官）に近接して配置され得る。その磁石は、身体表面に位置され得るか、または局所送達のための標的組織内側もしくは外側で外科的方法または経皮的方法を使用して身体表面の内部に送達される。細胞に結合した磁気粒子は、選択した組織中に直接注射することによって送達されるか、または遠隔部位に送達されそして標的部位に受動的に循環させられるか、または磁石もしくは標的化リガンドを用いて標的部位に能動的に送達される。
【０１１２】
本文中で参照されるすべての参考文献は、その全体が本明細書中で参考として援用される。さらに、本明細書中で使用される数値範囲すべては、その範囲内の整数値すべてを明示的を包含し、その範囲内の特定の数値の選択が、特定の用途に依存して企図される。さらに、以下の実施例が、例として提供される。この実施例は、限定としては提供されない。
【実施例】
【０１１３】
（実施例１）
（創傷治癒のための動物モデル）
表層（皮膚）創傷の動物モデルを、創傷の修復および治癒に対する本発明の組成物の効果を研究するために試験する。
【０１１４】
約２×２ｃｍの中間層皮膚創傷を、Ｓｔａｉａｎｏ−Ｃｏｉｃｏら、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ．７７（２）：３９６〜４０４（１９８６）により記載される方法に従って麻酔したブタの背中にわたって作製する。ブタモデルは、ブタの皮膚がヒトの皮膚に最も似ているので、このような研究において一般的に使用される。本発明の組成物を含む小量の溶液を、約１１個の創傷上に配置し、そして閉塞性接着包帯を使用してその創傷を覆う。プラシーボ溶液（生理食塩水、５０〜１００μｌ（．ｍｕ．ｌ）を、１１個の「鏡に映るような」同一の創傷の各々に配置し、これらの創傷もまた、閉塞性包帯で覆う。３日後、その動物に麻酔をし、屠殺し、そしてその動物が有したもとの皮膚創傷の２倍の大きさの完全厚皮膚サンプルを取り出す。受けた処置を盲目にするためにコード化したそれらのサンプルを、病理学者によって分析し、そして治癒パーセントについてスコア付けする。このスコア付け方法は、主に、創傷以来３日間の修復および治癒の間に生じた上皮形成（ケラチノサイトによる創傷被覆）の量を測定する。本発明の組成物で処置した１１個の創傷についての結果を、生理食塩水コントロールと比較して、治癒パーセントとして表す。高いパーセントほど、進んだ治癒を反映する。
【０１１５】
（実施例２）
（心筋虚血についての動物モデル）
本発明のＴ細胞またはそのＴ細胞由来の上清を使用する組織修復および再生に関する研究を首尾良く行うための重要な前提条件は、（ａ）心筋虚血状況における新脈管形成の機構に関する有用なデータを提供し得る臨床的心筋虚血に適用可能な動物モデルの構築；および（ｂ）本明細書中に記載の組成物の効果の正確な評価である。本明細書中にその全体が参考として援用される米国特許第６，１７４，８７１号に記載されるような、臨床的冠状動脈疾患を模倣する心筋虚血のブタモデルを、使用する。左回旋（ＬＣｘ）冠状動脈付近にアメロイド（ａｍｅｒｏｉｄ）収縮器を配置すると、（配置の７日間以内に）徐々に完全に閉鎖し、梗塞は最小である（左心室の１％、ＬＣｘ床の４±０．１％）（Ｒｏｔｈら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ８２：１７７８，１９９０；Ｒｏｔｈら、Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ２３５：Ｈ１２７９，１９８７；Ｗｈｉｔｅら、Ｃｉｒｃ  Ｒｅｓ  ７１：１４９０，１９９２、Ｈａｍｍｏｎｄら、Ｃａｒｄｉｏｌ  ２３：４７５、１９９４；およびＨａｍｍｏｎｄら、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  ９２：２６４４，１９９３）。副側血管の発生が原因で、閉塞した動脈により、以前に灌流した領域（虚血性領域と呼ばれる）において、心筋機能および血流は通常安静であるが、血流の保存は、心筋の酸素需要が増大する場合に、虚血を防ぐには不十分である。従って、ＬＣｘ床は、臨床的狭心症と類似して、偶発的虚血になりやすい。副側血管の発生および流れ−機能の関係は、アメロイド配置の２１日以内で安定であり、４ヶ月間変化しないままである（Ｒｏｔｈら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ８２：１７７８，１９９０；Ｒｏｔｈら、Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ２３５：Ｈ１２７９，１９８７；Ｗｈｉｔｅら、Ｃｉｒｃ  Ｒｅｓ  ７１：１４９０，１９９２）。動物が、給餌の間の心拍数の急激な増加、職員による妨害などに関連して、その日を通して危険な状態にあるその床における周期的虚血性機能不全を有することが、遠隔計測により実証されている（非公開データ）。従って、そのモデルは、安定しているが不十分な側副血管を供える床を有し、周期的虚血になりやすい。このモデルの別の異なる利点は、異常に灌流し機能する領域（ＬＣｘ床）に隣接する正常に灌流し機能する領域（ＬＡＤ床）が存在し、それにより、各動物内にコントロール床が提供されることである。
【０１１６】
心筋超音波造影心臓図検査を使用して、限局的心筋灌流を評価する。造影物質は、ガラクトースの微小凝集物から構成され、画像のエコー発生性（白さ）を増加させる。この微小凝集物は、血流と比例する様式で冠状動脈および心筋壁中に分散する（Ｓｋｙｂａら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ９０：１５１３〜１５２１，１９９４）。造影のピーク強度は、微小球により測定される心筋血流と密接に相関することが示されている（Ｓｋｙｂａら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ９０：１５１３〜１５２１，１９９４）。本発明で使用する超音波造影心臓図が、ＬＣｘ床を正確に同定すること、および心筋超音波造影心臓図検査を使用して、心筋血流を評価し得ることを実証するために、液圧カフ閉塞器を、アメロイドに近接する近位ＬＣｘ付近に配置した。
【０１１７】
動物を屠殺する場合、顕微鏡によって毛細血管成長を定量するために、心臓を灌流固定（グルタルアルデヒド、生理学的圧力、インサイチュ）する。ＰＣＲを使用して遺伝子導入を受けた動物からの心筋における脈管形成タンパク質のＤＮＡおよびｍＲＮＡを検出する。最後に、脈管形成タンパク質に対するポリクローナル抗体を用いて、本発明の組成物を投与した動物由来の細胞および心筋における脈管形成タンパク質の発現を試験する。
【０１１８】
治療的研究のためのストラテジーには、組成物の投与のタイミング、組成物の投与経路、および組成物の種類（例えば、活性化Ｔ細胞、そこからの上清、活性化Ｔ細胞と同時培養した細胞）が含まれる。心筋虚血のアメロイド（ａｍｅｒｏｉｄ）モデルにおいて、所望の組成物は、安定であるが、不十分な側副血管が発達した後に実施される。当業者は、ブタにおいて実証された結果が、ヒトにおける結果の予測となることを理解する。ブタは、ヒトの冠循環と非常に類似した天然の冠循環を有し、この冠循環には天然の冠側副血管が存在しない。
【０１１９】
（実施例３）
（活性化Ｔ細胞（ＸＣＥＬＬＥＲＡＴＥＴＭ）＋ＩＬ−２治療を受けた２人の患者における骨芽細胞病変および溶解性骨病変の修復）
３人の患者が、第Ｉ相の転移性腎細胞癌腫試験（ＸＴ００）に参加し、そして活性化Ｔ細胞（ＸＣＥＬＬＥＲＡＴＥＴＭ）＋ＩＬ−２治療での処置を受けた。第一の患者（患者＃００３）は、彼の頭蓋に骨芽細胞病変を有し、その病変はＸＣＥＬＬＥＲＡＴＥＴＭ＋ＩＬ−２治療での処置の後、完全に解決した（図１、円で囲った領域）。第二の患者（患者＃００４）は、彼の骨盤に７ｃｍの大きさの溶解性病変そして肋骨に第二の溶解性病変を有した。ＸＣＥＬＬＥＲＡＴＥＴＭ＋ＩＬ−２での処置の後、両方の骨病変は完全に治癒し、そして１０ヶ月の追跡訪問でも治癒されたままであった（図２、円で囲んだ領域）。
【０１２０】
（実施例４）
（活性化Ｔ細胞を用いる脈管形成のためのインビトロモデル）
Ｉｒｕｅｌａ−Ａｒｉｓｐｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：５０２６−５０３０，１９９１に記載される（これは、その全体が本明細書中に援用される）ような、脈管形成のインビトロモデルを使用する。要するに、ウシ大動脈およびラット血管内皮細胞（それぞれ、ＢＡＥＣおよびＲＶＥＣ）を、Ｓａｇｅ，Ｈ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２４：５４３３−５４４２，１９７９に記載されるように原則的に単離する。出芽（ｓｐｒｏｕｔｉｎｇ）表現型を発現するＢＡＥＣ由来のクローンおよび内皮帯（ｃｏｒｄ）を組織化するＲＶＥＣクローンを選択する。両方の種類の細胞を、ダルベッコの改変イーグル培地（１０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）の熱不活性化ＦＣＳを含む）中、３７℃で培養する。細胞は、ＢＡＥＣについて５〜１０継代目、そしてＲＶＥＣについて２５〜３０継代目を使用する。内皮帯の自然な形成は、一般的に、コンフルエントの１０〜１５日後に生じる。
【０１２１】
ＢＡＥＣを、２週間以内に帯から１２ウェルＣｏｓｔａｒプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）上にプレートした。１つの帯は、２つの交点（頂点）ポイント間の長さとして規定する。チューブの数を決定するために、１０個の顕微鏡視野（×１０対物レンズ、×１接眼レンズを使用）を、予め印をつけたプレートにおいて調べる。各実験のために、５つの複製培養物を数える（０日目）。次いで、培養物を無血清の培地で３回洗浄し、そして活性化Ｔ細胞またはそこからの上清とともにインキュベートする。使用したＴ細胞の数、および活性化に続いてＴ細胞が使用される日を最適化する。
【０１２２】
各実験のセットから、帯の平均数±ＳＥＭを、０日目および２日目に算出する。値はまた、各培養物における０日目の帯の数を１００％として、パーセンテージ（±ＳＥＭ）で表す。このデータを対応のあるサンプルｔ検定によって分析し、そしてその差異をＰが０．０２５以下である場合、有意とみなす。
【図面の簡単な説明】
【０１２３】
【図１】図１は、活性化Ｔ細胞（ＸＣＥＬＬＥＲＡＴＥＴＭ）処置での処置前および処置後の患者由来のＣＴスキャンである。
【図２】図２は、ＸＣＥＬＬＥＲＡＴＥＴＭ処置前ならびに処置３ヵ月後および４ヵ月後の患者由来のＣＴスキャンである。
【図１】
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【図２】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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