(57)【要約】【解決手段】ｐ５３タンパク質特異的Ｔ細胞応答を媒介するマウスα／β−Ｔ細胞受容体のポリペプチド、または機能的変異体またはその部分、または、これをコードする核酸、機能的変異体またはその部分。【効果】ｐ５３タンパク質発現細胞が遺伝子を誘発するＴ細胞によって認識され、サイトカインが発現され、腫瘍あるいは白血病細胞の溶解および／またはアポトーシスが誘導されるというものである。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１〜配列番号５によるｐ５３タンパク質特異的Ｔ細胞応答を媒介するマウスα／β−Ｔ細胞受容体のポリペプチド、または機能的変異体またはその部分、または、これをコードする核酸、機能的変異体またはその部分。
【請求項２】
請求項１に記載されているポリペプチド含む融合タンパク質、または機能的変異体またはその部分、またはこれをコードする核酸、機能的変異体またはその部分。
【請求項３】
ＣＤ３および／またはＣＤ８、ＣＤ１６またはその部分のζ−領域、特にヒトＣＤ３および／またはＣＤ８、ＣＤ１６またはその部分のζ−領域を含むことを特徴とする請求項２に記載されている前記融合タンパク質。
【請求項４】
可動リンカー、特に、前記アミノ酸配列（ＧＧＧＧＳ）３のリンカーを更に含む請求項２または３に記載されている前記融合タンパク質。
【請求項５】
キメラの、少なくとも部分的にヒト化融合タンパク質であることを特徴とする、請求項２に記載されている前記融合タンパク質。
【請求項６】
一本鎖または二本鎖Ｔ細胞受容体であることを特徴とする、請求項２〜５のうちの１つに記載されている前記融合タンパク質。
【請求項７】
前記タンパク質ｐ５３の前記アミノ酸２６４−２７２に対して特異的な抗体の抗原認識配列、または、ｐ５３  ２６４−２７２とＨＬＡ−Ａ２の複合体の抗原認識配列を含むＴ細胞受容体のα−またはβ−鎖。
【請求項８】
前記ポリペプチドが合成により作成されたことを特徴とする、請求１〜７のうちの１つに記載されている前記ポリペプチド。
【請求項９】
ＤＮＡまたはＲＮＡであり、好適には、特に、少なくとも８個のヌクレオチドの長さを有する二本鎖ＤＮＡであり、好適には、少なくとも１８個のヌクレオチドを有する二本鎖ＤＮＡであり、特に少なくとも２４個のヌクレオチドを有する二本鎖ＤＮＡであることを特徴とする請求項１または２に記載されている前記核酸。
【請求項１０】
前記核酸の前記配列には、少なくとも１つのイントロンおよび／または１つのポリＡ配列が含まれることを特徴とする、請求項１、２または９のうちの１つに記載されている前記核酸。
【請求項１１】
その相補的な「アンチセンス」配列の形態である、請求項１、２、９または１０のうちの１つに記載されている前記核酸。
【請求項１２】
前記核酸が合成により作成されることを特徴とする請求項１、２または９〜１１のうちの１つに記載されている前記核酸。
【請求項１３】
請求項１、２または９〜１２のうちの１つに記載されている核酸を含む、好適には、プラスミド、シャトルベクター、ファージミド、コスミド、発現ベクター、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、または粒子、および／または遺伝子治療において活性なベクターの形態のベクター。
【請求項１４】
請求項１３に記載されている、ベクターによりトランスフェクションされた、または、粒子により感染、または形質導入された宿主細胞。
【請求項１５】
Ｔ細胞または、Ｔ前駆体細胞または幹細胞であることを特徴とする請求項１４に記載されている前記宿主細胞。
【請求項１６】
その表面上に、請求項１〜８のうちの１つにより、ポリペプチドまたは融合タンパク質を発現させることを特徴とする、請求１４または１５に記載されている前記宿主細胞。
【請求項１７】
ｐ５３提示腫瘍細胞またはその部分が、前記提示されたポリペプチドまたは融合タンパク質が特異的である前記ｐ５３タンパク質特異的抗原を前記腫瘍が提示する場合には、前記腫瘍細胞またはその部分だけが溶解される条件下で請求項１６に記載されている宿主細胞と組み合わせることを特徴とするｐ５３タンパク質特異的抗原の同定のためのプロセス。
【請求項１８】
ｐ５３タンパク質と関連している諸疾患の診断、治療および／または治療のモニタリングおよび／または薬理学的に活性な物質の同定のための、請求項１〜１２のうちの１つに記載されており、抗体産生生物が、請求項１〜８のうちの１つに記載されている少なくとも６個のアミノ酸を有する、好適には、少なくとも８個のアミノ酸を有する、特に、少なくとも１２個のアミノ酸を有するポリペプチドまたはその機能的等価物、またはその部分、または、これをコードする核酸を伴うポリペプチド、またはその機能的な等価物、またはその部分により、免疫化されることを特徴とするポリペプチド、融合タンパク質または核酸に対して定方向に方向付けられている抗体、好適には、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体を作成するためのプロセス。
【請求項１９】
請求項１〜８のうちの１つに記載されているポリペプチドに対して定方向に方向付けられることを特徴とする、請求項１８に記載されているとおりに作成された抗体。
【請求項２０】
前記タンパク質ｐ５３の前記アミノ酸２６４−２７２に対して特異的なＴ細胞受容体の前記α−またはβ−鎖の前記抗原認識配列、またはｐ５３  ２６４−２７２とＨＬＡ−Ａ２の複合体の前記抗原認識配列から成ることを特徴とする組換え抗体。
【請求項２１】
前出の請求項のうちの１つに記載されている少なくとも１つの核酸、少なくとも１つのポリペプチド、少なくとも１つの宿主細胞、または、少なくとも１つの抗体が、適当な添加剤と賦形剤と一緒に組み合わせられることを特徴とする、ｐ５３タンパク質と関連している諸疾患の治療用薬物の生産のためのプロセス。
【請求項２２】
適当な添加剤と賦形剤と一緒にして適切なものとなる場合は、前出の請求項のうちの１つに記載されている少なくとも１個の核酸、少なくとも１個のポリヌクレオチド、少なくとも１個の宿主細胞、または、少なくとも１個の抗体を含むことを特徴とする、ｐ５３タンパク質に関連している諸疾患の前記治療のための薬物。
【請求項２３】
ｐ５３タンパク質と関連している諸疾患の前記治療のための、請求項２２に記載されている薬物の使用法。
【請求項２４】
前出の請求項のうちの１つに記載されている、少なくとも１個の核酸、少なくとも１個のポリペプチド、または少なくとも１個の抗体は、適当な添加剤と賦形剤と一緒に組み合わされることを特徴とする、ｐ５３タンパク質と関連している諸疾患と関係がある機能的相互作用因子の発見用テストの創出のためのプロセス。
【請求項２５】
適当な添加剤と賦形剤と一緒にして適切なものである場合は、前出の請求項のうちの１つに記載されている少なくとも１個の核酸、少なくとも１個のポリペプチド、または少なくとも１個の抗体を含むことを特徴とする、ｐ５３タンパク質と関連している諸疾患と関係がある機能的相互作用因子の前記同定のためのテスト。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ｐ５３特異的Ｔ細胞応答を媒介するマウスα／β−Ｔ細胞受容体のポリペプチドと、これらポリペプチドをコードする核酸と、前記ｐ５３タンパク質と関連している疾患の治療、診断および／または予防におけるそれらの使用法に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｔリンパ球（ＣＴＬ）による抗原認識は、効果的な免疫反応の発生と調節にとっては非常に重要である。その特徴的なＴ細胞系統マーカーはＴ細胞抗原受容体（ＴＣＲ）である。Ｔ細胞抗原受容体（ＴＣＲ）には、定義されている２つのタイプがある。すなわち、１つは、2つのジスルフィド結合ポリペプチド（αおよびβ）のヘテロ二量体であり、もう１つは、確かに構造的に類似しているが、しかし、γ−およびδ−ポリペプチドから成るものである。両方の受容体とも、５つのポリペプチドのセット、そのＣＤ３複合体と関連しており、したがって一緒になって、前記Ｔ細胞抗原受容体複合体（ＴＣＲ−ＣＤ３複合体）を形成する。α／β−Ｔ細胞抗原受容体（α／β−ＴＣＲ）は全てのＴ細胞の９５％を超えるものにおいてＴ細胞抗原受容体が発現されるため、機能的にもっとも重要なものである。
【０００３】
α／β−Ｔ細胞は、2つの異なる重複する集団にさらに細かく分けることができる。すなわち、ＣＤ４マーカーを担体し、また、主に前記免疫反応（ＴＨ）を補助するサブグループと、ＣＤ８マーカーを担体し、また、主として、細胞傷害性（ＴＣ）のものであるサブグループである。ＣＤ８＋Ｔ細胞はＭＨＣ（Ｍａｊｏｒ  Ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ  Ｃｏｍｐｌｅｘ；主要組織適合複合体あるいは主要組織適合性抗原）クラスＩ分子と関連している抗原を認識する。こうした抗原は、中でも、腫瘍特異的あるいは腫瘍関連ペプチド抗原でありうる。前記ペプチド抗原の認識後は、前記関与している細胞は標的細胞を溶解する、および／またはこうした標的細胞のアポトーシスを誘導する、またはサイトカイン（例えば、ＩＬ−２，ＩＦＮ−γ）を放出する前記Ｔ細胞により破壊される。
【０００４】
ＭＨＣクラスＩ分子の文脈の中で、腫瘍細胞の表面上に存在としている前記腫瘍関連ペプチド抗原（ＴＡＡ）の中でも、「普遍的な」ＴＡＡは、特に興味の対象となっている。こうした腫瘍関連ペプチド抗原（ＴＡＡ）は、正常細胞では弱く発現され、また、腫瘍細胞では過剰発現される、細胞質タンパク質から主に誘導される。こうしたタンパク質には、中でも、全てのヒト悪性腫瘍疾病のおよそ５０％で、その発現が増加し、特に、固形腫瘍の数において増加しており、また、プロテアソーム媒介減成およびその後のＭＨＣクラスＩ分子関連提示による発現率が増加している前記「ｐ５３」タンパク質が含まれている。
【０００５】
前記ｐ５３タンパク質のオリゴペプチドは、ＭＨＣクラスＩ分子の文脈においては前記細胞表面に対して提示され、また、ＣＤ８陽性Ｔ細胞に対して魅力的な標的構造を提示することができる。
【０００６】
悪性腫瘍の治療のための免疫治療方法を開発する1つのアプローチは、タンパク質特異的Ｔ細胞抗原受容体（ＴＣＲ）の同定である。こうしたＴ細胞抗原受容体（ＴＣＲ）は、ある一定の条件下では、Ｔ細胞がある種の腫瘍の緩解ならびに根絶をもたらすという目的を携え、一般的には抗原特異性を有し、また、特に腫瘍の反応性を備えた前記Ｔ細胞を供給することが可能である。
【０００７】
Ｗｅｉｊｔｅｎｓら（「１つのレトロウイルスベクターシステムである「ＳＴＩＴＣＨ」、すなわち、適正化された一本鎖抗体との組合せにより、キメラ受容体遺伝子構造では、ヒトＴリンパ球における効果的な遺伝子形質導入および発現が可能となる」、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ５：１９９５−１２０３、１９９８）は、活性化Ｔリンパ球の中に遺伝子の形質導入のためのレトロウイルスベクターシステムを記載している。このシステムは、Ｔ細胞の膜の中にある抗体をベースとしたキメラ受容体の発現をもたらすために使用される。これらＴ細胞はその後、例えば、腎癌細胞に対して用いることができる。タンパク質の発現および、そのように成功裡に行われるベクター移入は、ＦＡＣＳ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｃｅｌｌ  Ｓｏｒｔｅｒ；蛍光標示式細胞分取器）分析という手段により判定され、一方、細胞傷害性アッセイは、成功裡に行われた発現および前記キメラ受容体の機能に関する証拠を提供する。同様に、Ｅｓｈｈａｒら（「免疫グロブリンおよびＴ細胞受容体の抗体結合ドメインおよびγあるいはζサブユニットから成るキメラ一本鎖による細胞傷害性リンパ球の特異的活性化と標的化」、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：７２０−７２４，１９９３）は、Ｔ細胞抗原受容体（ＴＣＲ）の定常領域を有する1つの抗体の可変領域から成る、キメラをベースにしている免疫療法における腫瘍特異的リンパ球の作成とその使用法を記載している。これらキメラ遺伝子は、細胞溶解性Ｔ細胞ハイブリドーマの表面上で発現することが可能であったし、また、それにより、前記抗原と接触した後に、インターロイキン−２の分泌をもたらしたのである。
【０００８】
Ｃｌａｙら（「ヒト末梢血リンパ球に対する腫瘍抗原反応性Ｔ細胞抗原受容体（ＴＣＲ）の効率的な移入は抗腫瘍反応性をもたらす」，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１６３：５０７−５１３，１９９９）は、ＭＡＲＴ−１（２５−３５）特異的Ｔ細胞抗原受容体（ＴＣＲ）のα−ＴＣＲおよびβ−ＴＣＲ鎖の遺伝子の分離と、ヒト末梢血リンパ球（ＰＢＬ）におけるその発現を記載している。さまざまなメラノーマ細胞系統の溶解が記載されている。
【０００９】
Ｄaｒｃｙら（「エキソビボ遺伝子工学的に処理されたＴリンパ球（ＣＴＬ）による大腸がんの再定方向パーフォリン依存性溶解」、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６４：３７０５−３７１２，２０００）は、ｓｃＦｖ抗ＣＥＡ受容体形質導入Ｔリンパ球（ＣＴＬ）と、パーフォリンと、γ−インターフェロン（ＩＦＮ）を使用して、大腸がんのための免疫治療手順を記載している。キメラ特異的受容体構築は、レトロウイルスベクターという手段により、初代マウスＴリンパ球の中に形質導入される。こうした細胞は、大腸がん細胞系統とともに前もって接種されたマウス（養子Ｔ細胞移入として知られているもの）の中に注入された。
【００１０】
Ｔｈｅｏｂａｌｄら（「全身性腫瘍抗原としてｐ５３を標的化」、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９２：１１９９３−１１９９７，１９９５）からは、ｐ５３野生型配列由来ペプチド注入後のｐ５３特異的細胞傷害性Ｔ細胞の作成が公知のものとなっている。これらのＴ細胞系統という手段により、ヒト腫瘍細胞の選択｛培地｝を溶解することが結果的に可能となった。ｐ５３に対して定方向に方向付けられた前記溶解Ｔ細胞の特異的Ｔ細胞抗原受容体（ＴＣＲ）の遺伝子の分離は記載されていない。国際公開第ＷＯ９７／３２６０３号は腫瘍組織に対して定方向に方向付けられた特異的Ｔ細胞抗原受容体（ＴＣＲ）を発現させる、組換えＴリンパ球の作成のためのプロセスを一般的に記載している。このプロセスの中で、ＨＬＡトランスジェニックマウス（この事例では、ＨＬＡ−Ａ２．１）が、その表面上で特異的Ｔ細胞抗原受容体（ＴＣＲ）を発現させる細胞傷害性Ｔリンパ球の産生をこのようにもたらすために、腫瘍関連抗原により免疫化される。腫瘍関連抗原としては、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ、Ｒａｓ、ｐ５３、チロシナーゼ、ＭＡＲＴ、ｇｐ１００、ＭＡＧＥ、ＢＡＧＥ、ＭＵＣ−１などのさまざまな遺伝子のペプチドが記載されている。前記Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ特異的Ｔリンパ球から、相当する非ヒトＴ細胞抗原受容体（ＴＣＲ）の前記α−およびβ−鎖の少なくとも１つの可変領域を含むヌクレオチド配列が分離され、また、さまざまな遺伝子（中でも「ヒト化」）Ｔ細胞抗原受容体（ＴＣＲ）構築物において使用されている。このように、国際公開第ＷＯ９７／３２６０３号は、ＣＤ３、ＣＤ８あるいはＣＤ１６の前記ζ領域とともにＴ細胞抗原受容体（ＴＣＲ）の可変領域の融合タンパク質、ならびに、アミノ酸配列（ＧＧＧＧＳ）３の可動リンカーの使用法も記載している。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
しかしながら、ｐ５３のアミノ酸２６４−２７２の前記オリゴヌクレオチドに対して特異的に定方向に方向付けられたＴ細胞抗原受容体（ＴＣＲ）およびその使用法は、上述されている公表物によっては、また、他の文献の中では、言及も示唆もされてはいない。
【００１２】
したがって、本発明は、前記ｐ５３タンパク質に対して定方向に効果的に方向付けられている１つの新規なＴ細胞抗原受容体（ＴＣＲ）の前記鎖（α−ＴＣＲおよびβ−ＴＣＲ）の前記マウス遺伝子を有用にするという目的に基づいている。これらにより、ｐ５３タンパク質発現細胞は、前記遺伝子を供給されたＴ細胞により認識され、サイトカインが分泌され、また、Ｔ細胞導入溶解および／または腫瘍あるいは白血病細胞のアポトーシスがもたらされる。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明により、この目的は、配列番号１から配列番号５によるｐ５３タンパク質特異的Ｔ細胞応答を媒介する前記マウスα／βＴ細胞抗原受容体（ＴＣＲ）の前記ポリペプチド、あるいは機能的変異体あるいはその部分あるいはそれらをコードする核酸、機能的変異体あるいはその部分、特に置換、欠損、挿入、付加、転化および／または、１つあるいはそれ以上のアミノ酸あるいはそれらをコードする核酸の１つ化学的あるいは物理的修飾によって達成される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
シングル−Ａ２．１トランスジェニックマウス（（［Ａ２．１ｘＣ５７ＢＬ／６］ｘＣ５７ＢＬ／６）Ｆ１）から、ＨＬＡ−Ａ２．１−制限されていて、また、前記ｐ５３タンパク質の前記アミノ酸２６４−２７２の前記ペプチドに対して定方向に方向付けられている、ｐ５３タンパク質特異的Ｔ細胞応答を媒介する前記マウスαあるいはβ−Ｔ細胞抗原受容体（ＴＣＲ）鎖の遺伝子が分離された。このＴ細胞受容体（ＴＣＲ）のポリペプチドは未知であった。前記遺伝子はヒト末梢血リンパ球（ＰＢＬ）の中に野生型（ＷＴ）として、レトロウイルスにより挿入され、また、前記ＨＬＡ−制限抗原認識が、５１クロム放出試験におけるさまざまな細胞系統のＴ細胞抗原受容体（ＴＣＲ）媒介細胞傷害性溶解という手段により機能的に検討された。本発明の前記「定常」β−Ｔ細胞抗原受容体（ＴＣＲ）鎖に加えて、代替的ｍＲＮＡ成熟のために生み出されたβ−Ｔ細胞抗原受容体（β−ＴＣＲ）鎖変異体（ＢｅｈｌｋｅとＬｏｈ「マウスＴ細胞受容体β鎖転写（体）の代替的スプライシング」、Ｎａｔｕｒｅ  ３２２：３７９−３８２，１９８６の中に記載されている）を分離することが可能となった。得られた前記Ｔ細胞集団は、ナノモル濃度でペプチドを認識し、また、ｐ５３トランスフェクタント（形質移入体）およびさまざまなＡ２．１陽性悪性腫瘍細胞を効果的に破壊することが可能となった。本発明による前記ｐ５３特異的Ｔ細胞抗原受容体（ＴＣＲ）は、例えば、指標などの診断用に、および／または例えば、ｐ５３タンパク質と結びついている諸疾患の変調などの治療、あるいは完全に新規な治療上のアプローチが本発明から結果的に生じているなどといった薬学的に活性な物質同定用の適当な以前から公知の材料に含められることはない。
【００１５】
Ｌｉｕら（「ジャーカットＴ細胞において発現したＨＬＡ  Ａ*０２０１制限マウスＴ細胞受容体によるヒトｐ５３過剰発現腫瘍細胞の標的化」、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６０：６９３−７０１，２０００）は、注入したペプチドをベースにしたｐ５３特異的Ｔ細胞抗原受容体（ＴＣＲ）の作成を記載している。得られたＴ細胞はがんの免疫療法に適当なものであると説明している。しかしながら、Ｌｉｕらにより記載されている前記Ｔ細胞抗原受容体（ＴＣＲ）は、ｐ５３のアミノ酸１４９−１５７のペプチドに対して定方向に方向付けられている。前記Ｔ細胞抗原受容体（ＴＣＲ）により認識される前記腫瘍関連ペプチド抗原（ＴＡＡ）エピトープは、治療行為および副作用にとっては非常に重要なものであるため、さらに効果的な、また、ｐ５３のその他のペプチド／エピトープに対して定方向に方向付けられている現在までのところ未知のＴ細胞抗原受容体（ＴＣＲ）の存在は、ますます驚くべきものとなっている。
【００１６】
本発明のもう１つのさらなる形態は、本発明による前記ポリペプチド、あるいは機能的変異体あるいはその部分、あるいはこれらポリペプチドをコードする核酸、機能的変異体あるいはその部分を含む１つの融合タンパク質に関する。
【００１７】
前記融合タンパク質は、ＣＤ３あるいはＣＤ８あるいはＣＤ１６あるいはその部分の前記ζ領域、特に、ヒトＣＤ３あるいはＣＤ８あるいはＣＤ１６あるいはその部分の前記ζ領域を含むことにより特徴付けることができる。可動リンカー（Ｗｈｉｔｌｏｗら「凝集の減少およびタンパク質分解安定性の向上を伴う一本鎖Ｆｖ用の１つの改善されたリンカー」、Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇｉｎ．６（８）：９８９−９９５，１９９３）、特に、アミノ酸配列（ＧＧＧＧＳ）３のリンカーを含む本発明による１つの融合タンパク質が好適である。特に、本発明による前記融合タンパク質は、前記ＣＤ３複合体の前記ζ鎖あるいは前記ζ鎖あるいはその部分のＩＴＡＭモチーフ（Ｉｍｍｕｎｏｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｔｙｒｏｓｉｎｅ−ｂａｓｅｄ  Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  Ｍｏｔｉｆ；免疫受容体チロシンをベースにした活性化モチーフ）、特に、ヒトＣＤ３あるいはその部分の前記ζ鎖から成ることが可能である。前記融合タンパク質は、さらに、それが、ＣＤ８α、あるいはＣＤ８α、あるいはその部分のＬｃｋ結合モチーフ、特にヒトＣＤ８αのものから成ることにより特徴付けることができる。
【００１８】
本発明による前記融合タンパク質は、さらに、部分的にキメラあるいは完全にヒト化されたαおよび／またはβ−Ｔ細胞抗原受容体（ＴＣＲ）鎖でありうる。本発明のさらに１つのアスペクトは、一本鎖Ｔ細胞抗原受容体（ＴＣＲ）である１つの融合タンパク質に関する。本発明による１つの融合タンパク質は、可動リンカー、特に、前記アミノ酸配列（ＧＧＧＧＳ）３のリンカーを含むものが好適である。本発明による前記融合タンパク質は、しかしながら、また、それがα／β−Ｔ細胞抗原受容体（ＴＣＲ）であることにより特徴付けることもできる。
【００１９】
本発明の１つのさらなる主題は、ｐ５３タンパク質に結び付けられる諸疾患の診断および／または治療用の、あるいは例えば、本発明による１つの核酸が使用されている１つの適当な宿主細胞における薬学的に活性な物質の同定用の１つの融合タンパク質の作成のための１つのプロセスである。
【００２０】
上述されている本発明による前記ポリペプチドを含む融合タンパク質が作成され、ここでは、前記融合タンパク質自体がすでに、本発明の１つのポリペプチドの機能を有しているか、あるいは、前記特定機能は前記融合部分の除去後にはじめて機能的に活性なものとなる。これらには特に、外来アミノ酸を約１〜２００、好適には、約１〜１５０、特に約１〜１００、特に１〜５０という割合で有する融合タンパク質が含まれる。こうしたペプチド配列の実施例は、例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のガラクトシダーゼから誘導することができる原核生物のペプチド配列である。さらに、例えば、バクテリオファージＭ１３などのウイルスのペプチド配列もまた、当業者には公知のものである「ファージ提示」プロセス用の融合タンパク質をこのように産生するために、使用することもできる。
【００２１】
本発明による前記タンパク質の精製に関しては、１つのさらなるポリペプチド（「タグ」）を付加することができる。本発明によるタンパク質タグは、顕著な程度まで複合体を溶離することなく適当な緩衝液による緊縮洗浄によって、マトリックス上で例えば、高親和性吸収を可能にし、また、その後には、制御されたやり方で吸収された複合体の溶離を可能とする。当業者には公知のものである前記タンパク質タグの実施例は、（Ｈｉｓ）６タグ、Ｍｙｃタグ、ＦＬＡＧタグ、Ｓｔｒｅｐタグ、ＳｔｒｅｐタグＩＩ、ヘマグルチニンタグ、グルタチオントランスフェラーゼ（ＧＳＴ）タグ、親和性キチン結合タグを有するインテイン、あるいはマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）タグである。これらタンパク質タグは、Ｎ−，Ｃ−末端側および／またはその内側に位置することが可能である。細胞から分離された自然なポリペプチドの他に、本発明による全てのポリペプチドあるいはその部分は、無細胞状態下で、例えば、合成により、あるいはインビトロ翻訳により作成することが出来た。このように、例えば、伝統的な合成の助けを得て、ポリペプチド全体あるいはその部分は合成することができる（メリフィールド法）。本発明による前記ポリペプチドの部分（Parts）は、本発明による前記ポリペプチドのさらなる機能的変異体をこのように得るために適当な遺伝子発現バンクを検索することができるという助けを得て、特に、抗血清の入手には適当なものとなる。
【００２２】
本発明はまた、前記ｐ５３ペプチド抗原（ＡＡ  ２６４−２７２）に対する特異性を有し、好適には、ＨＬＡ−Ａ２．１の文脈において提示される抗体の誘導体であるポリペプチドに関する。
【００２３】
本発明はさらに、配列番号：１から配列番号：５までの前記ポリペプチド配列、あるいは機能的変異体あるいはその部分による、レトロインバースペプチド、あるいは擬似ペプチドから成る。前記−ＣＯ−ＮＨ−ペプチド結合の代わりに、これらペプチドは−ＮＨ−ＣＯ結合を有する。
【００２４】
本発明の目的は、さらに、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ（ペプチド核酸）あるいはｐ−ＮＡ（ピラノシル核酸）である本発明による１つの核酸によって達成され、好適には、１つのＤＮＡは特に、少なくとも８個のヌクレオチドの長さを有する1本の二本鎖ＤＮＡであり、好適には、少なくとも１２個のヌクレオチドを有し、特に、少なくとも２４個のヌクレオチドを有する二本鎖ＤＮＡである。前記核酸は、前記核酸の前記配列が、少なくとも１つのイントロンおよび／または1つのポリＡ配列を有することにより特徴付けることができる。それはまた、そのアンチセンス配列という形態で存在することができる。
【００２５】
関与している前記遺伝子の発現に関しては、一般的には、１本の二本鎖ＤＮＡが好適なものであり、前記ポリペプチドをコードする前記ＤＮＡ領域が特に好ましいものである。この領域は、ＡＴＧに対して同じ読み枠内にある、Ｋｏｚａｋ共通配列（Ｋｏｚａｋ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１５：８１２５−４８，１９８７）中にある第１開始コドン（ＡＴＧ）から次の停止コドン（ＴＡＧ，ＴＧＡ  ｂｚｗ．ＴＡＡ）によりはじまる。本発明による前記核酸配列のさらなる1つの使用法は、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＺｈｅｎｇとＫｅｍｅｎｙ，Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１００：３８０−３８２，１９９５；ＮｅｌｌｅｎとＬｉｃｈｔｅｎｓｔｅｉｎ，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．１８：４１９−２３，１９９３）および／またはリボザイム（Ａｍａｒｚｇｕｉｏｕｉら、Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．５４：１１７５−２０２，１９９８；Ｖａｉｓｈら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２６：５２３７−４２，１９９８；Ｐｅｒｓｉｄｉｓ，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１５：９２１−２、１９９７；ＣｏｕｔｕｒｅとＳｔｉｎｃｈｃｏｍｂ、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ．１２：５１０−５，１９９６）の構築である。「アンチセンス」オリゴヌクレオチドを使用して、本発明による前記核酸の安定性を減少させる、および／または本発明による前記核酸の翻訳を阻害することが可能である。このように、例えば、インビボおよびインビトロの両方で細胞における相当する遺伝子の発現を減少させることは可能である。したがって、オリゴヌクレオチドは１つの治療法として適当なものになりうる。この方策は、特に、前記「アンチセンス」オリゴヌクレオチドがリポソームにより複合化される場合には（Ｓｍｙｔｈら、Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．１０８：５２３−６，１９９７；Ｗｈｉｔｅら、Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．１１２：６９９−７０５，１９９９；Ｗｈｉｔｅら、Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．１１２：８８７−９２，１９９９）、例えば、皮膚、すなわち、表皮および真皮細胞に対して適当なものである。プローブとして、あるいは「アンチセンス」オリゴヌクレオチドとして使用する場合には、一本鎖ＤＮＡあるいはＲＮＡが好ましい。
【００２６】
細胞から分離された天然核酸のほかに、本発明による全ての核酸あるいはその部分もまた、合成により作成することができる。さらに、本発明を実施するために、合成により作成された核酸を使用することができる。このように、本発明による前記核酸は、例えば、ホスホトリエステル法（例えば、ＵｈｌｍａｎｎとＰｅｙｍａｎ，Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ９０：５４３−５８４，１９９０を参照）による、遺伝子コード、を利用する配列番号：１〜配列番号：５に記載されている前記タンパク質配列の助けを得て、化学的に合成することができる。
【００２７】
オリゴヌクレオチドは、概して、エンドヌクレアーゼあるいはエキソヌクレアーゼにより、特に、前記細胞内に発生するＤＮアーゼおよびＲＮアーゼにより、急速に減成される。したがって、減成に対してそれを安定化させるために、前記核酸を修飾することが利得的なことであり、そのため、前記核酸の高濃度は、長い期間にわたって、前記細胞中に維持される（Ｂｅｉｇｅｌｍａｎら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２３：３９８９−９４，１９９５；Ｄｕｄｙｃｚ，ＷＯ９５／１１９１０，１９９５；Ｍａｃａｄａｍら、ＷＯ９８／３７２４０，１９９８；Ｒｅｅｓｅら、ＷＯ９７／２９１１６，１９９７）。典型的には、こうした安定化は、1つあるいはそれ以上のインターヌクレオチドリン酸基の導入により、あるいは、1つあるいはそれ以上の非リンインターヌクレオチドの導入により得ることができる。
【００２８】
適当な修飾インターヌクレオチドは、ＵｈｌｍａｎｎとＰｅｙｍａｎｎの中で概要されている（Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．９０：５４４，１９９０）（Ｂｅｉｇｅｌｍａｎら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２３：３９８９−９４，１９９５；Ｄｕｄｙｃｚ，ＷＯ９５／１１９１０，１９９５；Ｍａｃａｄａｍら、ＷＯ９８／３７２４０，１９９８；Ｒｅｅｓｅら、ＷＯ９７／２９１１６，１９９７）。修飾インターヌクレオチドリン酸ラジカルおよび／または本発明による使用法の1つの中で採用することができる核酸における非リンエステル結合には、例えば、メチルホスホネート、ホスホロチオエート、ホスホルアミデート、ホスホロジチオエート、リン酸エステルが含まれるが、一方、非リンインターヌクレオチドアナログには、例えば、シロキサンブリッジ、炭酸ブリッジ、カルボキシ−メチルエステル、アセトアミデートブリッジ、および／またはチオブリッジが含まれる。この修飾により、本発明による前記使用法の1つにおいて採用することができる製薬的組成の安定性が改善されることもまた企図されている。
【００２９】
本発明のさらなる１つの形態は、ベクター、好適には、プラスミドの形態にあるもの、シャトルベクター、ファージミド、コスミド、発現ベクター、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター（Ｍｉｌｌｅｒら、「遺伝子移入と発現のための改善レトロウイルスベクター」、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ第７巻、第９号、９８０ページ、１９８９）、および／または本発明による核酸を含む、遺伝子治療活性を有するベクターに関する。
【００３０】
このように、本発明による前記核酸は、ベクター、好適には、発現ベクター、あるいは遺伝子治療において活性となるベクターの中に含めることができる。好適には、前記遺伝子治療において活性となるベクターには、本発明による前記核酸に機能的に結合されるＴ細胞特異的調節塩基配列が含まれる。前記発現ベクターは原核細胞あるいは真核細胞発現ベクターでありうる。原核細胞発現ベクターの実施例は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）における発現に関しては、例えば、ベクターｐＧＥＭあるいはｐＵＣ誘導体であり、また、酵母菌（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  Ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）における発現に対する真核細胞発現ベクターに関しては、例えば、ベクターｐ４２６Ｍｅｔ２５あるいはｐ４２６ＧＡＬ１（Ｍｕｍｂｅｒｇら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２２：５７６７−５７６８，１９９４）であり、挿入細胞における発現に関しては、例えば、ＥＰ−Ｂ１−０  １２７  ８３９あるいはＥＰ−Ｂ１−０  ５４９  ７２１に開示されているようなバキュロウイルスベクターであり、また、哺乳動物細胞における発現に関しては、例えば、これらは全て一般的には入手可能である、ベクターＲｃ／ＣＭＶおよびＲｃ／ＲＳＶあるいはＳＶ４０ベクターである。
【００３１】
一般的には、前記発現ベクターにはまた、例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）における発現用のｔｒｐプロモーター（例えば、ＥＰ−Ｂ１−０  １５４  １３３を参照）、酵母菌における発現用のＭｅｔ  ２５、ＧＡＬ  １、あるいはＡＤＨ２プロモーター（Ｒｕｓｓｅｌら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５８：２６７４−２６８２，１９８３；Ｍｕｍｂｅｒｇ，同上）、昆虫細胞における発現用のバキュロウイルスポリヘドリンプロモーター（例えば、１３．ＥＰ−Ｂ１−０  １２７  ８３９）などのそれぞれの宿主細胞に適しているプロモーターが含まれる。哺乳動物細胞における発現に関しては、適当なプロモーターは、例えば、真核細胞における構成的で、調節可能な組織特異的、細胞サイクル特異的あるいは代謝的に特異的な発現を可能にするものである。本発明による調節可能なエレメントは、プロモーター、アクチベーター配列、エンハンサー、サイレンサーおよび／またはレプレッサー配列である。真核細胞における構成的発現を可能にする適当な調節可能なエレメントの実施例は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩあるいはウイルスプロモーター、ＣＭＶエンハンサー、ＣＭＶプロモーター、ＳＶ４０プロモーターあるいは例えば、ＭＭＴＶ（マウス乳腺腫瘍ウイルス；Ｌｅｅら、Ｎａｔｕｒｅ，２１４：２２８−２３２，１９８１）のＬＴＲプロモーター、またさらには、例えば、ＨＢＶ，ＨＣＶ，ＨＳＶ，ＨＰＶ，ＥＢＶ，ＨＴＬＶあるいはＨＩＶに由来するウイルスプロモーターおよびアクチベーター配列により認識されるプロモーターである。前記真核細胞における調節可能な発現を可能にする調節可能なエレメントの実施例は、適切なレプレッサーと組み合わせたテトラサイクリンオペレーターである（Ｇｏｓｓｅｎら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．５：５１６−２０，１９９４）。
【００３２】
真核細胞におけるＴ細胞特異的発現を可能にする調節可能なエレメントの実施例は、これら細胞型においてのみ発現されるタンパク質をコードする遺伝子のプロモーターあるいはエンハンサーのプロモーターあるいはアクチベーター-配列である。
【００３３】
真核細胞における細胞サイクル特異的発現を可能にする調節可能なエレメントの実施例は、以下の遺伝子のプロモーターである。すなわち、ｃｄｃ２５，サイクリンＡ，サイクリンＥ，ｃｄｃ２，Ｅ２Ｆ，Ｂ−ｍｙｂあるいはＤＨＦＲ（ＺｗｉｃｋｅｒとＭuｌｌｅｒ，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ．１３：３−６，１９９７）。真核細胞における代謝的に特異的な発現を可能にする調節可能なエレメントの実施例は、低酸素症により、グルコース欠乏症により、リン酸濃度により、あるいは熱ショックにより調節されるプロモーターである。
【００３４】
本発明による前記ベクターは、好適にはＴ細胞である宿主細胞のトランスフェクションのために使用することができる。特に好ましいものは、それが、その表面上で本発明によるポリペプチドあるいは融合タンパク質を発現するということにより特徴付けられる宿主細胞である。
【００３５】
本発明による前記核酸の導入、また、したがって、トランスフェクション、形質転換あるいは感染による真核細胞あるいは原核細胞における前記ポリペプチドの発現を可能にするためには、前記核酸は、プラスミドとして、ウイルスあるいは非ウイルスベクターの一部分として、提供することができる。このケースにおける適当なウイルスベクターは特に、レトロウイルス、バキュロウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、およびヘルペスウイルスである。このケースにおける適当な非ウイルスキャリアは、特に、ビロソーム、リポソーム、カチオン脂質、あるいはポリリジン抱合型ＤＮＡである。
【００３６】
遺伝子治療において活性となるベクターの実施例は、ウイルスベクター、例えば、アデノウイルスベクターあるいはレトロウイルスベクターである（Ｌｉｎｄｅｍａｎｎら、Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．３：４６６−７６，１９９７；Ｓｐｒｉｎｇｅｒら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．２：５４９−５８，１９９８）。
【００３７】
インビボにて本発明によるポリペプチドを発現させるための1つの好適なメカニズムは、特にレトロウイルス粒子の助けを得たウイルス遺伝子移入である。これらは、適切な標的細胞、好ましくは、形質導入による本発明による遺伝子あるいはポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を有する患者のエキソビボのＴリンパ球を提供するために好適に利用される。前記標的細胞はその後に、デノボ挿入特異性を用いて、腫瘍殺傷性および／または免疫調節エフェクター機能を模倣するために、養子細胞移入の意味でその患者に再注入することができる。最近、このように、非常に良好な遺伝子治療結果が、順応性免疫システム（Ｃａｖａｚｚａｎａ−Ｃａｌｖｏら、２０００）のさまざまなエフェクター細胞への分化にとっては必要不可欠である、小児において発生するγ鎖遺伝子の非機能的変異体の類似していて無傷の導入遺伝子を血液学的前駆体細胞にレトロウイルスにより供給された新生児における免疫不適格性により特徴付けられるＳＣＩＤ−Ｘ１疾患の治療において達成されている。
【００３８】
さらに、インビボにて遺伝子移入を一方では、感染粒子の好適に定位的な注入により、他方では、ウイルス産生細胞の直接的な投与により実施するという可能性を挙げることができる（Ｏｌｄｆｉｅｌｄら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎ．Ｔｈｅｒ．４：３９−６９，１９９３）。
【００３９】
遺伝子の移入のために多くの場合に採用された前記ウイルスベクターは、主に、現在の最新技術による、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルスおよびアデノ関連ウイルスベクターである。これらは、少なくとも前記ウイルス構造タンパク質コード遺伝子が移入されるべき構築物によって置換される、天然ウイルス由来のサイクリックヌクレオチド配列である。
【００４０】
レトロウイルスベクターシステムは、安定しているが、しかし、宿主ゲノムの中への定位方向には方向付けられていない組込みにより導入遺伝子の長続きする発現のために必要不可欠なものを作り出す。若年世代のベクターは、まったく関連性のないわけではなく、また、潜在的には免疫原性タンパク質を所持しており、加えて、そこには、前記ベクターに対するレシピエントの以前に存在していた免疫性はない。レトロウイルスには、宿主細胞膜およびウイルスタンパク質の部分（Parts）から成る脂質被膜の中にパッケージされているＲＮＡゲノムが含まれている。ウイルス遺伝子の発現に関しては、前記ＲＮＡゲノムは逆転写され、また、その酵素インテグラーゼにより前記標的細胞ＤＮＡの中に組み込まれる。これにより、その後に、前記感染細胞により転写し、また、翻訳することができ、それによって、ウイルス構成物が組み合わさってレトロウイルスを生じるという結果をもちらした。ＲＮＡはもっぱらその後に、前記新たに形成されたウイルスの中に挿入される。レトロウイルスの前記ゲノムは３つの必要不可欠の遺伝子を有する。すなわち、ウイルス構造タンパク質をコードするｇａｇ、「グループ特異的抗原」、逆転写酵素やインテグラーゼなどの酵素用のｐｏｌ、また、宿主特異的受容体の結合を司っている被膜タンパク質（「エンベロープ」）用のｅｎｖである。複製形質転換受容性ウイルスの産生が、ｇａｇ／ｐｏｌコード遺伝子を付加的に備え、また、これらを「トランス形に」発現させ、また、したがって複製形質転換受容性（例えば、ｇａｇ／ｐｏｌ欠失）トランスジェニックウイルス粒子の形成を補完する、「パッキング細胞系統」におけるトランスフェクション後に生じる。1つの代替物は、必要不可欠なウイルス遺伝子のコトランスフェクションであり、パッケージングシグナルを担体する導入遺伝子を含む前記ベクターのみである。
【００４１】
一方では、こうした遺伝子の分離は、さまざまな株から得られたｅｎｖ読み枠とのｇａｌ／ｐｏｌ読み枠の任意の組合せを可能にし、それによって、修飾された宿主向性を有するプソイドタイプが生じ、一方、パッケージング細胞内にある複製形質転換受容性ウイルスの形成を、それによって劇的に減少させることができる。本ケースにおいて使用される「テナガザル白血病ウイルス」（ＧＡＬＶ）由来の被膜タンパク質は、ヒト細胞を形質導入することができ、また、両向性宿主範囲（Ｍｉｌｌｅｒら、１９９１）を備えた前記パッケージ細胞系統ＰＧ１３において確立される。付加的には、その安全性は、相同的組換えの防止、またしたがって、複製−形質転換受容性粒子の産生のための非必須ウイルス配列の選択的な欠失により増大される。
【００４２】
新規な、非ウイルスベクターは、例えば、リポソームトランスフェクションにより宿主細胞の中に挿入される自律的な自己組込みＤＮＡ配列、トランスポゾンで構成され、また、哺乳動物細胞におけるヒト導入遺伝子の発現に対して初めて成功裡に用いられた（Ｙａｎｔら、２０００）。
【００４３】
遺伝子治療において活性なベクターはまた、それによって特に皮膚細胞の非常に高いトランスフェクション効率を達成することができるので、リポソームによる本発明の前記核酸を複合化することにより得ることができる（ＡｌｅｘａｎｄｅｒとＡｋｈｕｒｓｔ，Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．４：２２７９−８５，１９９５）。リポフェクションは、リポソーム懸濁液の超音波処理により、カチオン脂質からの小さな単層小胞を作成することから成る。そのＤＮＡは前記リポソーム表面にイオン的に結合され、また、正の正味電荷が残り、また、プラスミドＤＮＡは前記リポソームにより１００％複合化されるというそういった割合で結合される。Ｆｅｌｇｎｅｒら（１９８７、同上）により用いられた脂質混合物ＤＯＴＭＡ（１，２−ジオレイルオクス  プロピル−３−トリメチルアンモニウムブロマイド）およびＤＰＯＥ（ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン）に加えて、数え切れないほどの数の新しい脂質組成がその後、合成され、また、さまざまな細胞系統をトランスフェクトするその効率に関して測定された（Ｂｅｈｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：６９８２−６９８６，１９８９；Ｆｅｌｇｎｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：２５５０−２５５６１，１９９４；ＧａｏとＨｕａｎｇ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １１８９：１９５−２０３，１９９１）。前記新しい脂質組成の実施例は、ＤＯＴＡＰ  Ｎ−［１−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムエチルスリフェートあるいはＤＯＧＳ（ＴＲＡＳＦＥＣＴＡＭ；ジオクタデシル−アミドグリシルスペルミン）である。前記細胞への核酸の移入を増加させる賦形剤は、例えば、前記細胞の核の中に前記核酸の移送を可能にするＤＮＡあるいは合成ペプチドＤＮＡ分子に結合されるタンパク質あるいはペプチドでありうる（Ｓｃｈｗａｒｔｚら、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ６：２８２，１９９９；Ｂｒａｎｄeｎら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．１７：７８４，１９９９）。賦形剤にはまた、前記細胞の細胞質の中へ核酸の放出を可能にする分子（Ｋｉｅｈｌｅｒら、Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．８：２１３，１９９７）あるいは、例えば、リポソーム（ＵｈｌｍａｎｎとＰｅｙｍａｎｎ，１９９０，同上）が含まれる。遺伝子治療ベクターのもう１つの特に好適な形態は、本発明の前記核酸を、金粒子に適用することにより、また、「遺伝子銃」の助けを借りて、これらを組織の中に打ち込むことにより、好適には皮膚あるいは細胞の中に打ち込むことにより、得ることができる（Ｗａｎｇら、Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．１１２：７７５−８１，１９９９）。
【００４４】
本発明の前記核酸の遺伝子治療適用に関しては、前記ポリペプチドをコードする前記核酸の一部分が、イントロン配列、好適には、プロモーターと前記ポリペプチドの開始コドンとの間の配列、および／またはポリＡ配列、特に、天然に生じるポリＡ配列、あるいはＳＶ４０ウイルスポリＡ配列、特に前記遺伝子の３’末端にある配列を含む1つあるいはそれ以上の非コード配列を含む場合にも利得的である。これによってｍＲＮＡの安定性を達成することができるということが意図されているからである（Ｊａｃｋｓｏｎ，Ｃｅｌｌ  ７４：９−１４，１９９３；Ｐａｌｍｉｔｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：４７８−４８２，１９９１）。
【００４５】
本発明のさらなる１つの目的は、宿主細胞であって、特に、本発明のベクターあるいは本発明の別の遺伝子構築物を使用して形質転換されるＴ細胞である。宿主細胞は、原核細胞あるいは真核細胞のいずれでもありうるものであり、原核細胞の宿主細胞の実施例は大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、真核細胞の実施例は、酵母菌（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）あるいは昆虫細胞である。
【００４６】
１つの特に好適な形質転換宿主細胞は、それが本発明の遺伝子構築物あるいは本発明の発現カセットから成るトランスジェニックＴ前駆体細胞あるいは幹細胞である。宿主細胞および／または幹細胞の形質転換のためのプロセスは、当業者には周知のものであり、また、それらには、例えば、電気穿孔（エレクトロポレーション）法、マイクロインジェクション法、あるいは形質導入法が含まれる。特に好適な１つの形質転換宿主細胞は、本発明の遺伝子構築物を使用して取り出した後にトランスフェクションされる、あるいは形質転換される患者自身のＴ細胞である。本発明の宿主細胞は、前記患者から１つあるいはそれ以上の細胞、好適には、Ｔ細胞、特に、本発明による宿主細胞をこのように得るために、本発明の１つあるいはそれ以上の遺伝子構築物を使用してエキソビボにてトランスフェクションされるあるいは形質導入されるＣＤ８’Ｔ細胞を取り出すことにより、特に得ることができる。エキソビボにて生じた特異的Ｔ細胞はその後に引き続いて、前記患者に再移植することができる。そのプロセスはしたがって、ｓｃＦｖ抗ＣＥＡ受容体、パーフォリン、およびγ−ＩＦＮにより形質導入されたＴリンパ球（ＣＴＬ）を使用してＤａｒｃｙら（「エキソビボにて遺伝子工学的に処理されたＴリンパ球（ＣＴＬ）による大腸がんの再定方向パーフォリン依存性溶解」、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４：３７０５−３７１２，２０００）の中に記載されているプロセスに類似している。
【００４７】
ｐ５３タンパク質特異的抗原の同定用の本発明によるさらなる好適な１つのプロセスは、ｐ５３提示腫瘍細胞あるいはその部分が、発現されたポリペプチドあるいは融合タンパク質がそれに対して特異的であるｐ５３タンパク質特異的抗原を前記腫瘍が提示している場合は、前記腫瘍細胞あるいはその部分が単に溶解される条件下で本発明による宿主細胞との組合されるということにより特徴付けられる。
【００４８】
本発明のさらなる１つの形態は、抗体の作成のための１つのプロセスであって、好適には、ｐ５３タンパク質に関連している諸疾患の診断および／または治療、あるいは、薬学的に活性な物質の同定のためのポリクローナルあるいはモノクローナル抗体の作成のための1つのプロセスであって、抗体産生組織が、本発明による１つのポリペプチド、あるいはその機能的な等価物、あるいは少なくとも６個のアミノ酸を有する、好適には、少なくとも８個のアミノ酸を有する、特に少なくとも１２個のアミノ酸を有するるあるいは本発明による核酸を伴うその一部分により免疫化されることにより特徴付けられる1つのプロセスに関する。
【００４９】
前記プロセスは、例えば、不完全なフロイントのアジュバントおよび／または水酸化アルミニウムゲル（例えば、Ｄｉａｍｏｎｄら、Ｔｈｅ  Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，１３４４−１３４９，１９８１を参照）の存在下で適切である場合は、本発明の前記ポリペプチドあるいは上述のその一部分、あるいはこれ（これら）をコードする核酸により、哺乳動物、例えば、ウサギを免疫化することにより当業者には一般的に公知のものである諸方法により実施される。免疫学的反応に関わる前記動物の中に形成される前記ポリクローナル抗体は、その後、例えば、カラムクロマトグラフィーという手段により、一般的に知られている諸方法によりその血液から容易に分離し、また、精製することができる。モノクローナル抗体は、例えば、ＷｉｎｔｅｒとＭｉｌｓｔｅｉｎの公知のものである方法（Ｎａｔｕｒｅ  ３４９：２９３−２９９，１９９１）  により、作成することができる。
【００５０】
本発明のさらなる１つの目的とするものは、例えば、ウシ血清アルブミンなどの適当なキャリアに結合させることにより、前記ポリペプチドの上述の部分をそれ自体免疫原性とするか、あるいは免疫原性とすることができるか、あるいはその免疫原性において増加させることができるかのいずれかである場合は、本発明による１つのポリペプチドに対して定方向に方向付けられ、また、本発明による前記ポリペプチドと特異的に反応する、ｐ５３タンパク質と関連している諸疾患の診断、予後および治療最適化のための、あるいは薬理学的に活性である物質の同定のための１つの抗体である。この抗体は、ポリクローナルあるいはモノクローナル抗体のいずれかが好ましい。抗体という用語は、本発明によると、遺伝子工学的により作成されたという意味としても理解されており、また、任意に修飾された抗体、あるいは、例えば、キメラ抗体、ヒト化抗体、多機能抗体、両特異的抗体あるいはオリゴ特異的抗体、一本鎖抗体、Ｆ（ａｂ）あるいはＦ（ａｂ）２断片（例えば、ＥＰ−Ｂ１−０  ３６８  ６８４，米国特許第４，８１６，５６７号、米国特許第４，８１６，３９７号、国際公開第ＷＯ８８／０１６４９号、国際公開第ＷＯ９３０６２１３号、国際公開第ＷＯ９８／２４８８４号を参照）などのその抗原結合部分として理解される。本発明による前記抗体は、ｐ５３タンパク質に関連している諸疾患の診断、治療モニタリング、および／または治療用に、あるいは、薬理学的に活性である物質の同定用に使用することができる。
本発明はさらに、ｐ５３タンパク質に関連している諸疾患の治療に対する薬物の産生のための１つのプロセスに関し、上述の請求項の１つに記載されている少なくとも１つの核酸、少なくとも１つのポリペプチド、少なくとも１つの宿主細胞、あるいは少なくとも１つの抗体が、適当な添加剤、および賦形剤と一緒に組み合わせられるということにより特徴付けられる１つのプロセスに関する。
【００５１】
本発明はさらに、適当な添加剤および賦形剤と一緒して適切なものである場合は、本発明による少なくとも１つの核酸、少なくとも１つのポリペプチドあるいは少なくとも１つの抗体を含むｐ５３タンパク質に関連している諸疾患の治療のためのこのプロセスにより作成される１つの薬物に関する。本発明はさらに、ｐ５３タンパク質に関連している諸疾患の治療のためのこの薬物の使用法に関する。
【００５２】
ｐ５３タンパク質に関連している諸疾患の前記治療は、例えば、本発明による前記薬物を含む注入あるいは注射という手段により、通常のやり方で実施することができる。本発明による前記薬物の投与は、さらに、リポソーム複合体あるいは金粒子複合体という形態で任意に実施することができる。しかしながら、本発明による前記薬物という手段による治療はまた、例えば、錠剤あるいはカプセルといった経口投与形態により、例えば、鼻あるいは口腔といった粘膜を経て、あるいは、皮膚の下に移植されたデポジトリ（保管）という形態で、実施することもできる。経皮的な治療システムは、例えば、ＥＰ  ０  ９４４  ３９８  Ａ１，ＥＰ  ０  ９１６  ３３６  Ａ１，ＥＰ  0  ８８９  ７２３  Ａ１，あるいは、ＥＰ  ０  ８５２  ４９３  Ａｌから公知のものである。本発明による前記（ポリ）ペプチドとその誘導体はまた、ｐ５３．２６４−２７２−特異的細胞傷害性Ｔリンパ球の誘導、産生および拡大を達成するために、また、関わっている患者の腫瘍および白血病細胞を破壊するために標的化されるやり方で、ｐ５３と関連している諸疾患、特に腫瘍に罹患している患者を免疫適格性にするために用いることもできる。こうした諸疾患には、例えば、固形腫瘍、リンパ血行性産生新生物、悪性血液学的疾患あるいは骨髄芽球クリーゼが含まれる。
【００５３】
治療の特に好適なタイプでは、１つあるいはそれ以上の細胞、好適にはＴ細胞、特にＣＤ８＋Ｔ細胞が患者から採取され、それがその後、本発明による１つあるいはそれ以上の遺伝子構築物によりエキソビボにてトランスフェクションされるか、あるいは形質導入される。エキソビボにて生じた特異的Ｔ細胞はその後引き続いて、前記患者に再注入あるいは移植することができる。そのプロセスはしたがって、ｓｃＦｖ抗ＣＥＡ受容体、パーフォリン、およびγ−ＩＦＮにより形質導入されたＴリンパ球（ＣＴＬ）を使用してＤａｒｃｙら（「エキソビボにて遺伝子工学的に処理されたＴリンパ球（ＣＴＬ）による大腸がんの再定方向パーフォリン依存性溶解」、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４：３７０５−３７１２，２０００）の中に記載されている免疫学的治療プロセスに類似している。
【００５４】
本発明のさらなる１つの形態は、本発明による少なくとも１つの核酸、少なくとも１つのポリペプチド、あるいは少なくとも１つの抗体が適当な添加剤および賦形剤と一緒に組み合わせることにより特徴付けられる、ｐ５３タンパク質関連諸疾患に関連している機能的相互作用因子発見用テストの創出のための１つのプロセスに関する。
【００５５】
本発明の意味の範囲内では「機能的相互作用因子」という用語は、適当な条件下で適当な添加剤および賦形剤と一緒にして適切である場合は、本発明による前記核酸、ポリペプチド、あるいは抗体と相互作用することができる全てのそうした分子、化合物および／または組成物および物質混合物を意味するものとして理解されるべきものである。可能な相互作用因子は簡単な有機化学あるいは無機化学分子あるいは化合物であるが、しかしまた、ペプチド、タンパク質、あるいはそれらの複合体も含めることができる。それらの相互作用のため、前記機能的相互作用因子は、インビボ、あるいはインビトロの前記核酸、ポリペプチド、あるいは抗体の機能に影響を及ぼすことができ、あるいは、その代わりになるものとして、本発明による前記核酸、ポリペプチド、あるいは抗体に単に結合することができ、あるいは、それらと、共有結合、あるいは非共有結合のやり方の他の相互作用を開始することができる。
【００５６】
本発明はさらに、適当な添加剤および賦形剤と一緒にして適切なものである場合は、本発明による少なくとも１つの核酸、少なくとも１つのポリペプチド、少なくとも１つの抗体を含むＰ５３タンパク質と関連している諸疾患に関連している機能的相互作用因子の同定のための、本発明により創出されるテストから成る。多くの場合は、インビトロの前記細胞の病理学的挙動は、したがって、模倣することができ、また、前記細胞の正常挙動を回復させ、また、治療上の潜在能力を所持している物質は探し求めることができる。さらに、このテストシステムは本発明の前記ポリペプチドと機能的相互作用因子との間の相互作用を阻害する物質のスクリーニング用に使用することができる。
【００５７】
本発明の目的の１つはまた、本発明による核酸、あるいは本発明によるポリペプチドを含むｐ５３タンパク質と関連している諸疾患の例えば、診断および治療といった適応症に対する薬物であって、また、適当な添加剤あるいは賦形剤と一緒にして適切なものである場合に、本発明の核酸あるいは本発明のポリペプチドが、製薬的に受け入れ可能なキャリアにより製剤化される、ｐ５３タンパク質と関連している諸疾患の治療のためのそうした薬物の産生のためのプロセスである。
【００５８】
実現可能な治療法および／または予防薬は、活性化合物として、（ａ）本発明による前記ＴＣＲポリペプチドおよび／またはその誘導体および／または（ｂ）本発明による核酸および／または（ｃ）ｐ５３．２６４−２７２に対して特異的に定方向に方向付けられているＴＣＲを含む、インビトロあるいはエキソビボにて産生されるＴリンパ球を含む、特に、ワクチン、組換え粒子あるいは注射あるいは注入溶液である。
【００５９】
ヒトにおける遺伝子治療適用に関しては、裸の形態で、あるいは上述されている遺伝子治療において活性であるベクターの１つの形態で、あるいは、リポソームあるいは金粒子により複合化された形態で、本発明による前記核酸を含む、薬物および／または組換え粒子は特に適当なものである。前記製薬上のキャリアは、好適には、ｐＨ約６．０〜８．０、好適には、ｐＨ約６．８〜７．８、特にｐＨ約７．４、および／または約２００〜４００ｍｏｓｍｏｌ／Ｌの浸透圧、好適には、約２９０〜３１０ｍｏｓｍｏｌ／Ｌの浸透圧を有する例えば、生理学的緩衝溶液である。さらに、前記製薬上のキャリアには、例えば、ヌクレアーゼ阻害剤、好適には、ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）などの錯化剤、および／または、当業者には公知のものであるその他の賦形剤といった適当な安定剤を含めることができる。
【００６０】
本発明のさらなる１つの目的は、本発明による核酸を適当なやり方で発現させるということにより特徴付けられる、ｐ５３タンバク質と関連している諸疾患の診断および／または治療あるいは適当な宿主細胞において薬理学的に活性な物質の同定用ポリペプチド作成のためのプロセスに関する。
【００６１】
前記ポリペプチドは、例えば、熟練した技術を有する同業者には一般的に公知のものである前記諸方法により、すでに上述されているように、適当な発現システムにおいて、本発明の前記核酸の発現により、このように作成される。適当な宿主細胞とは、例えば、全て一般的に入手可能なものである、例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＤＨＳ、ＨＢ１０１、あるいはＢＬ２１、酵母菌株Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、昆虫細胞系統、例えば、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ由来のもの、あるいは動物細胞ＣＯＳ、Ｖｅｒｏ、２９３、ＨａＣａＴ、Ｈｅｌａである。
【００６２】
治療モニタリングのための本発明による１つの診断法には、上記に非常に詳細に説明されている、本発明による前記ポリペプチド、あるいはその免疫学的に活性な部分が含まれる。例えば、ニトロセルローズあるいはナイロンで出来ている固相に好適に結合している前記ポリペプチドあるいはその部分は、例えば、自己免疫抗体あるいは腫瘍および白血病細胞と反応することが可能であるようにするために、調査すべき例えば、血液である体液とインビトロにて接触させることができる。前記抗体−抗原複合体は、その後に、例えば、標識化された抗体ヒトＩｇＧあるいは抗ヒトＩｇＭ抗体の助けを借りて、検出することができる。前記標識は、着色反応を触媒する、例えば、酵素、例えば、ペロオキシダーゼ、あるいは別の適当な標識である。自己抗体の存在およびその分量はこのように、前記着色反応という手段により容易にまた素早く検出することができる。
【００６３】
治療モニタリングのためのもう１つの診断法には、本発明による抗体自体が含まれる。こうした抗体の助けを借りて、例えば、組織サンプルは、ｐ５３タンパク質と関連している諸疾患をそれによって診断するために、また、治療のための徴候をそれによって得るために、増大した量の中に前記関与しているポリペプチドが存在しているかどうかを調べることができる。この場合は、本発明による前記抗体は、例えば、すでに上記に説明されているように、酵素により標識化される。前記特異的抗体−抗原複合体はそれによって、容易に、また、同様に素早く、酵素による着色反応という手段により検出することができる。
【００６４】
本発明によるさらなる１つの診断法は、プローブ、好適には、ＤＮＡプローブ、および／またはプライマーから成る。これにより、適当なプローブの助けを借りて、例えば、適当な遺伝子バンクから分離することによって、本発明による前記核酸を得るというさらなる可能性が開かれる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ．Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ニューヨーク、第８章８．１ページ〜８．８１ページ、第９章９．４７ページ〜９．５８ページ、および第１０章１０．１ページ〜１０．６７ページ）。
【００６５】
適当なプローブは、例えば、約１００〜１０００個のヌクレオチドの長さを有する、好適には、約２００〜５００個のヌクレオチドの長さを有する、特に、約３００から４００個のヌクレオチドの長さを有するＤＮＡあるいはＲＮＡ断片であり、その配列を配列表の配列番号：１〜配列番号：５による前記ポリペプチドから誘導することができる。
【００６６】
代替的には、ポリメラーゼ連鎖反応用のプライマーとして適当なものである前記誘導核酸配列の助けを借りて、オリゴヌクレオチドを合成することができる。適当なプライマーは、約１０〜１００個のヌクレオチドの長さを有する、好適には、約１５〜５０個のヌクレオチドの長さを有する、特に、２０〜３０個のヌクレオチドの長さを有するＤＮＡ断片であり、例えば、その配列は、前記遺伝子コードによる相当するｃＤＮＡ配列の助けを借りて、配列表の配列番号：１〜配列番号：５による前記ポリペプチドから誘導することができる。
【００６７】
「コード核酸」という用語は、本発明による分離可能な生物学的に活性なポリペプチド又はプリカーサーをコードする１つのＤＮＡ配列に関する。前記ポリペプチドは、前記特異的な、例えば、酵素活性が保持されている限り、前記コード配列の完全長あるいはいずれかの部分の配列によりコードすることができる。
【００６８】
本発明の前記核酸の前記配列における小さな変化は、例えば、遺伝子コードの変性により、起こすことが可能であること、あるいは非翻訳配列は、その活性を顕著に変化させることなく、前記核酸の５’および／または３’末端で、付加することができることが知られている。本発明はしたがってまた、本発明による前記核酸の「機能的変異体」から成る。
【００６９】
「機能的変異体」という用語により、１つのＤＮＡ配列に対して相補的なものであって、特に高頻度可変性Ｖ（Ｄ）ＪＣ領域において、誘導基準配列あるいはその部分により、緊急条件下でハイブリダイズされ、また、本発明の相当するポリペプチドに対して類似しているあるいは同一の活性を有する全てのＤＮＡ配列が表わされる。
【００７０】
「緊縮ハイブリダイゼーション条件」という用語は、ハイブリダイゼーションが２．５ｘＳＳＣ緩衝液の中で６０℃にて起こり、その後に低緩衝液濃度の中で３７℃にていくつかの洗浄ステップが続き、安定したままの状態になっている、そうした条件を意味するものとして理解されるべきである。
【００７１】
本発明の意味の範囲内では、「機能的変異体」という用語は、本発明による前記ペプチドに機能的に関係しており、すなわち、前記ポリペプチドの構造的な特徴を有するポリペプチドを意味するものとして理解される。機能的な変異体の実施例は、マウス以外の、ヒトの組織を起源とし、あるいは、好適には、非ヒト哺乳動物、例えば、サル、ブタ、ラット、あるいはその他の鳥、例えば、ニワトリなどを起源とするものに相当するポリペプチドである。機能的変異体のその他の実施例は、さまざまな個人において、組織のさまざまな器官において、前記遺伝子の異なる対立遺伝子によりコードされるポリペプチドである。本発明の目的のため、機能的な変異体は、本発明の前記Ｔ細胞抗原受容体（ＴＣＲ）として、前記ｐ５３タンパク質の同一エピトープを認識する、特にポリペプチドである。さらなるもう１つの意味では、これらもまた、配列番号：１〜配列番号：５の１つによる前記アミノ酸配列を有する前記ポリペプチドに対して、および／または、前記ペプチド配列の助けを借りて誘導されたＤＮＡ配列に対して、配列相同性、特に、約７０％の配列同一性、好適には、約８０％、特に約９０％、さらに特に約９５％の配列同一性を有するポリペプチドを意味するものとして理解される。これらの中にはまた、約１〜６０個の、好適には、約１〜３０個の、特に、約１〜１５個の、特に約１〜５個のアミノ酸の範囲にある前記ポリペプチドの欠失、転化、付加、置換、挿入、化学的および／または物理的修飾、あるいはその一部分が含まれる。例えば、第１アミノ酸メチオニンは、有意に修飾されている前記ポリペプチドの前記機能がなくても、欠くことが可能である。
【００７２】
次に、本発明は、これによって制限されることなく、添付の実施例および符号により、図面を参照して説明する。前記符号などは、以下のとおりである。
【００７３】
図２は、作成された前記Ｔ細胞抗原受容体（ＴＣＲ）鎖の図である。可変セグメント（Ｖα／β）の命名法はＡｒｄｅｎら（Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ  ４２：５０１−５３０，１９９５）に従い、Ｊセグメントおよび定常ドメインの命名は、ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｉｍｇｔ．ｃｉｎｅｓ．ｆｒ：８１０４）に従った。この配列をベースにして、Ｔ細胞抗原受容体（ＴＣＲ）鎖Ｖα３、Ｖα１３、Ｖβ３、Ｖβ３Ｃβ０は増殖性のものであり、一方、Ｖβ１は組換え領域Ｖ−Ｄ−Ｊにおけるフレームシフトを有しており、その結果、Ｔ細胞抗原受容体（ＴＣＲ）β鎖ポリペプチドに対して増殖性のものではない。Ｃβ０は、代替的なスプライシングにより産生された挿入片である。切断型形態のみが作成され、また、したがって分化は不可能であったため、われわれは、いずれかのサブファミリーにＶβ１鎖の定常ドメインを割り当てることができなかった。
【００７４】
配列番号１は、「Ｖα３」を示す。すなわち、増殖性、機能的マウスα鎖（ｍｕｖα−ｍｕｃα）である。（図２を参照のこと）。
【００７５】
配列番号２は、「Ｖα１３」を示す。すなわち、増殖性マウスα鎖（ｍｕｖα−ｍｕｃα）である。（図２を参照のこと）。
【００７６】
配列番号３は、「Ｖβ１」を示す。すなわち、非増殖性、非機能的マウスβ鎖（ｍｕｖβ−ｍｕｃβ）である。（図２を参照のこと）。
【００７７】
配列番号４は、「Ｖβ３」を示す。すなわち、増殖性、機能的マウスβ鎖（ｍｕｖβ−ｍｕｃβ）である。（図２を参照のこと）。
【００７８】
配列番号５は、「Ｖβ３Ｃｂ０」を示す。すなわち、Ｃｂ１のＣｂ０上流挿入によるＶβ３のスプライシング変異体である。（図２を参照のこと）。
【００７９】
配列番号６は、プライマーＧＳＰ−１（ｒｅｖ＿Ｒ＿ａＳＰ１）を示す。
【００８０】
配列番号７は、プライマーＧＳＰ−２（ｒｅｖ＿Ｒ＿ａＳＰ２）を示す。
【００８１】
配列番号８は、プライマーＧＳＰ−３（ｒｅｖ＿Ａｓｃ＿ａＴＣＲ＿ｃｌ．２）を示す。
【００８２】
配列番号９は、プライマーＧＳＰ−４（ｒｅｖ＿Ａｓｃ＿ｂＴＣＲ＿ｃ２）を示す。
【００８３】
配列番号１０は、プライマーＧＳＰ−５（ｒｅｖ＿ｂＴＣＲ＿ｃ４）を示す。
【００８４】
配列番号１１は、プライマーＧＳＰ−６（ｒｅｖ＿Ａｓｃ＿ｂＴＣＲ＿ｃ６）を示す。
【００８５】
配列番号１２は、Ｖα３を示す。すなわち、前進プライマー（ｆｏｒ＿Ｖａ３−ＮｃｏＩ＿１）である。
【００８６】
配列番号１３は、Ｖβ３（Ｃβ０）を示す。すなわち、前進プライマー（ｆｏｒ＿Ｖｂ３−ＮｃｏＩ＿１）である。
【００８７】
配列番号１４は、Ｖα１３を示す。すなわち、逆転写プライマー（ｆｏｒ＿Ｖａ１３−ＮｃｏＩ＿１）である。
【実施例】
【００８８】
細胞基質ｍＲＮＡは、製造業者のプロトコルにより、商業的に入手可能なＱＩＡプレップミニプレップ（ＱＩＡＧＥＮ社、Ｈｉｌｄｅｎ市ドイツ連邦共和国）を用いて作成された。５’ＲＡＣＥ−ＰＣＲは、製造業者のプロトコルにより、商業的に入手可能なＲＡＣＥ  ＰＣＲキット（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社）を用いて実施された。前記ＲＡＣＥ−ＰＣＲプロトコル範囲内の逆転写に対する１つの代替物として、ディスプレイサーモ−ＲＴ（Ｄｉｓｐｌａｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社，米国カリフォルニア州Ｖｉｓｔａ市）を用いて実施された。ベクターｐＣＲ（登録商標）２．１−ＴＯＰＯ（登録商標）およびｐＣＲ（登録商標）ＸＬ−ＴＯＰＯ（登録商標）の中にクローン化して入れるために、製造業者のプロトコルにより、それに対応するキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、オランダ）が使用された。細胞傷害性アッセイは、Ｔｈｅｏｂａｌｄらの中に記載されている方法により実施された（「１つの一般的な腫瘍抗原としてｐ５３を標的とする」、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９２：１１９９３−１１９９７，１９９５）。
【００８９】
１．α−ＴＣＲ鎖のクローニング
ｐ５３．２６４−２７２特異的ＨＬＡ−Ａ２．１−制限マウスＣＴＬクローンから前記ｍＲＮＡを抽出した後、完全長α−ＴＣＲ鎖が、自己設計遺伝子特異的プライマー（配列番号：６〜配列番号：１４）という手段により、５’−ＲＡＣＥ−ＰＣＲ（Ｇｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ社、ドイツ）によって分離された。前記特異性は、２回目のＰＣＲ（入れ子状態ＰＣＲ）の前にアガロースゲルから前記ＤＮＡ中間体（およそ１１００ｂｐ）を作成することにより、増大させた。長さおよそ１０００ｂｐの産物は、その後、製造業者のインストラクションにより前記ｐＣＲ（登録商標）−ＸＬ−ＴＯＰＯ（登録商標）ベクターシステムの中にクローン化して入れられ、配列を決められた。
【００９０】
図１は、前記プライマーと前記α鎖のクローニングの定位を図式的に示す。前記ＴＣＲ−αの発現領域全体の増幅用の前記遺伝子特異的プライマーが、前記３’非発現領域（ＵＴＲ）において対形成するように選択された。停止コドン上で最終的には対合する前記遺伝子特異的プライマーＧＳＰ−３（配列番号：８）は、その５’突出末端を経由してＡｓｃＩ部位を人工的に導入する。前記遺伝子特異的プライマーの配列は公表されているマウスＴＣＲα鎖配列を比較し、また、適当な領域を選択することにより、決定された。
【００９１】
２．切断されたＴ細胞抗原受容体（ＴＣＲ）β鎖のクローン化
前記ＴＣＲβ鎖のクローン化は、前記α鎖に関しては実施されたが、前記β鎖の定常ドメインのさまざまな遺伝子が存在するため、前記発現領域の外側で対合するいずれかの遺伝子特異的プライマーを使用することはここでは可能なことではない。したがって、３’切断産物が精製されなければならす、前記５’−ＲＡＣＥ  ＰＣＲを再び利用し、また、前記産物は配列決定された。第１回目のＰＣＲの産物は、ゲル電気泳動法においては何らの明確なバンドを示すこともなかったが、にもかかわらず、前記ゲルから抽出され、また、前記入れ子状態ＰＣＲに供給された。結果的に生じるダブルバンドはその後に、前記ＴＯＰＯ（登録商標）ベクターシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）の中にクローン化されて入れられた。
【００９２】
３．Ｔ細胞抗原受容体（ＴＣＲ）鎖配列の分析
５つの異なるＴ細胞抗原受容体（ＴＣＲ）鎖コード配列が前記ＰＣＲ産物を配列決定することにより識別された。すなわち、
Ｖα３：生産的なＴＣＲα鎖であり、機能的である（配列番号：１）；
Ｖα１３：生産的なＴＣＲα鎖（配列番号：２）；
Ｖβ１：欠陥のある再配列（Ｖβ１−＞Ｄβ：フレームシフト）による非生産的β鎖であり、非機能的である（配列番号：３）；
Ｖβ３：生産的β鎖であり、機能的である（配列番号：４）；
Ｖβ３Ｃβ０：Ｖβ３の変異体を、Ｃβ１の上流にあるＣβ０挿入片により、スプライシングする（配列番号：５）。
【００９３】
４．レトロウイルスｐＢｕｌｌｅｔベクターシステムの中に生産的鎖をクローン化して入れる
前記５’領域において対合する、各鎖用に配列を取得したプライマーから誘導することが可能であった。これら配列は、ＰＣＲおよび出発コドンＡＴＧの周辺にあるＮｃｏＩ部位（ＣＣＡＴＧＧ）を経由して導入し、それによって、前記α鎖の場合には、前記第２塩基トリプレットを修飾し、また、そのように第２アミノ酸を修飾することが可能であるといったようなやり方で修飾された。
【００９４】
前記レトロウイルスｐＢｕｌｌｅｔベクターの中にクローン化して入れるために、第１ｍＲＮＡは再び逆転写された（ディスプレイサーモ−ＲＴ、２０ページを参照）が、しかしこの時には、前記ＲＮＡの前記ポリＡ尾部において対合した、１つのオリゴ−ｄＴプライマー（ディスプレイサーモ−ＲＴ、２０ページ参照）を使用することによるものであって、それによって、その後に行われたＰＣＲにおける鋳型として役立ったＲＮＡ全体の逆転写（一本鎖ｃＤＮＡ）を産生することとなった。
【００９５】
４．１  Ｖα３／１３のクローン化
前記ＴＣＲα鎖は、上述の逆転写および前記フランキングＮｃｏＩおよびＳａｌＩ部位が導入されたＰＣＲによりクローン化された。ｐＢｕｌｌｅｔおよび挿入片は、ＮｃｏＩおよびＳａｌＩにより加水分解され、前記挿入片（Ｖα３／Ｖα１３）は、標準的な諸方法により結合された。形質転換受容性細胞の形質変換後、陽性クローンを配列決定された。誤りのないＶα１３クローンがさらなる実験のために選択された。使用可能なクローンの収率は、Ｖα３に関しては低いため、また、停止コドンにおける誤りとは関係無く、それらの１つは受け入れ可能であったため、後者のクローンは再びサブクローン化されて、停止コドン、この場合はＢａｍＨＩ特異的なものである３’フランキング「部位」を再構築するために、ＮｃｏＩ交換クローニングを経由して、現存するプラスミドの中にサブクローン化された。
【００９６】
４．２  Ｖβ３のクローニング
前記β鎖（Ｖβ３）は、ＰＣＲ後に、そこからサブクローン化して前記ｐＢｕｌｌｅｔベクターの中に入れるように、ｐＣＲ（登録商標）ＸＬ−ＴＯＰＯ（登録商標）の中にもう一度コード核酸をクローニングすることよりクローン化された。この目的のために、１つの適当なクローンが選択され、また、ＡｓｃＩによる加水分解によって最初に線形化された。同様に、空のｐＢｕｌｌｅｔベクターはＸｈｏＩによる加水分解により線形化された。これには、その後に、「平滑末端化」末端にするように、ｄＮＴＰの存在下で、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼにより、両方の切断「粘着（スティッキー）」末端に充填することが行われた。その後、その加水分解において切断されなければならない内部ＮｃｏＩ部位を野生型Ｔ細胞抗原受容体（ＴＣＲ）が有するため、また、同時に、前記空のベクターがＮｃｏＩにより完全に加水分解されたため、前記Ｖβ３クローンの部分ＮｃｏＩ加水分解が実施された。前記ＮｃｏＩ完全長Ｖβ３平滑末端化および前記平滑末端化ｐＢｕｌｌｅｔ−空のＮｃｏＩ断片のゲル電気泳動と抽出を実施した後に、前記挿入片およびベクターが結合された。前記結合産物により形質転換された細菌クローンが配列決定された。
【００９７】
５．ヒトＰＢＭＣの形質導入
前記レトロウイルスｐＢｕｌｌｅｔベクターの中に挿入された完全長Ｔ細胞抗原受容体（ＴＣＲ）構築物を確立した後、これらプラスミドはまた、当業者であれば公知の諸方法により細菌培養培地において増殖され、作成された。前記細菌培養培地は、Ｃａ３（ＰＯ４）２−トランスフェクションを経て、構造タンパク質ｇａｇ，ｐｏｌおよびＧＡＬＶ−ｅｎｖをコードするプラスミドと組み合わせて、胚性腎細胞系統２９３Ｔの中にトランスフェクションされた。以下の組合せがトランスフェクションされた。すなわち、
１−ｐＢｕｌｌｅｔ＋ｐＨＩＴ６０＋ｐＣＯＬＴ−ＧａＬＶ
２−ｐＢｕｌｌｅｔ  ＡＶ０３＋ｐＢｕｌｌｅｔ  ＢＶ０３＋ｐＨＩＴ６０＋ｐＣＯＬＴ−ＧＡＬＶ
３−ｐＢｕｌｌｅｔ  ＡＶ１３＋ｐＢｕｌｌｅｔ  ＢＶ０３＋ｐＨＩＴ６０＋ｐＣＯＬＴ−ＧＡＬＶ  である。
【００９８】
この一過性トランスフェクション（導入選択マーカーはなしで）は、健常者ドナーのＯＫＴ−３（α−ｈｕ  ＣＤ３）活性化ＨＬＡ−Ａ２−陽性ＰＢＭＣとともに、ウイルス産生２９３Ｔ細胞（２５００ｒａｄで照射）を共培養することにより、前記ＰＢＭＣを感染させるために利用されたＧＡＬＶ擬似型レトロウイルス粒子の産生において、約２４時間後に結果が出た。形質導入の効率は、３日間の共培養と増殖後およそ一週間でフローサイトメトリーにより評価された。また、さらなる増殖の後、溶菌反応性を検定することが可能となった。
【００９９】
６．形質導入ＰＢＭＣのＦＡＣＳ分析
形質導入の効率は、前記フローサイトメトリー技術を使用することにより、前記Ｔ細胞抗原受容体（ＴＣＲ）鎖組合せＶα３Ｖβ３、Ｖα１３Ｖβ３を有する細胞、また、導入遺伝子を含んでいなかった前記ｐＢｕｌｌｅｔ発現ベクターによる細胞のみを測定することにより評価された。この目的のために、１０６個の細胞が抗ｍｕＴＣＲ  Ｖβ３抗体（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社、ドイツ連邦共和国ハイデルベルグ市）および抗ｈｕＣＤ３抗体の１μｇにより、製造業者のインストラクションにより室温で３０分間染色され、また、フローサイトメトリーにより測定された。図８および９は、Ｖα３Ｖβ３の組合せを有する前記細胞と、Ｖα１３Ｖβ３の組合せを有する細胞の両方とも、前記β鎖導入遺伝子の膜結合発現を示すＣＤ３およびｍｕＴＣＲＶβ３に関しては陽性に染色可能であった。対照的に、導入遺伝子のない陰性対照ｐＢｕｌｌｅｔは前記Ｖβ３表面導入遺伝子に関しては非陽性であった。
【０１００】
抗原特異性の再構成をフローサイトメトリーによりさらに測定するために、１０５個の細胞が、０．３７５μｇのＡ２−ｐ５３（２６４−２７２）−ＰＥ−四量体（氷上にて６０分間）および抗ｈｕＣＤ８−ＦＩＴＣ（氷上にて１５分間）により染色され、フローサイトメトリーにより測定された。先にＶα３Ｖβ３の組合せにより形質導入されたｍｕＴＣＲ  Ｖβ３陽性、ＦＡＣＳで分類されたＰＢＭＣの染色が、例として（図１０を参照）示されている。
【０１０１】
７．形質導入ＰＢＭＣの細胞溶解活性
レトロウイルス形質導入ヒトＰＢＭＣの溶解反応性は細胞傷害性アッセイにより評価された。前記形質導入ＰＢＭＣは、最初にペプチド負荷Ｔ２細胞を用いて、また、二番目に前記ｐ５３欠陥変異体Ｓａｏｓ−２およびそのｍｕｔ（１４３  Ｖ−＞Ａ）ｐ５３トランスフェクタントＳａｏｓ−２／１４３を用いて、標準的なクロム放出アッセイの中で検定された。前記ＨＬＡ−Ａ２．１表現型を有していた標的細胞は全て、ＮＫ細胞標的細胞として選択的に「コールドターゲット」として役立ったクロムのように標識化されていなかったＫ５６２細胞の２０倍過剰と付加的に混合され、また、したがって、腫瘍細胞の非特異的ＮＫ細胞媒介溶解を減少させた。エフェクター：標的細胞（Ｅ：Ｔ）という使用された比は３０であった。
【０１０２】
前記Ｖα３Ｖβ３組合せにより形質導入されたＰＢＭＣのｐ５３ポリペプチド特異的反応は検出することができる。さらに、内在的に処理され、また、ＨＬＡ−Ａ２．１の文脈の中で提示されるｐ５３誘導ペプチドは検出され（Ｓａｏｓ−２／１４３）、これは、ｐ５３過剰発現腫瘍細胞の溶解に対して、前もって必要不可欠なものとみなされる。前記陰性対照Ｓａｏｓ−２の溶解は、いずれのエフェクター細胞に対しても、提示することができなかった。以下の表１は、例として、さまざまな標的細胞に関して測定された溶解比を示している。さらに、悪性腫瘍細胞系統（図示せず）の溶解比を検出することが可能であった。表１中、数値は、％溶解比、比Ｅ：Ｔ＝３０：１におけるデータである。
【０１０３】
【表１】
2004535780.tif 000002
【図面の簡単な説明】
【０１０４】
【図１】完全長Ｔ細胞抗原受容体（ＴＣＲ）α鎖の作成に対するプライマー位置の図である。
【図２】作成された前記Ｔ細胞抗原受容体（ＴＣＲ）鎖の図である。
【図３】５’−ＲＡＣＥ  ＰＣＲにおける切断型Ｔ細胞抗原受容体（ＴＣＲ）β鎖の作成のためのプライマーの位置を示す。
【図４】野生型（Ｗｔ）マウス（ｍｕ）Ｔ細胞抗原受容体（ＴＣＲ）Ｖα３鎖を発現するためのウイルスベクターｐＢｕｌｌｅｔ  ＡＶ０３の図である。前記野生型Ｖα３鎖は、テキストの中で説明されているように、制限酵素切断部位ＮｃｏＩおよびＢａｍＨＩを経由してレトロウイルスベクターｐＢｕｌｌｅｔの中にクローン化されて入れられた。
【図５】上述されているように、制限酵素部位ＮｃｏＩおよびＳａｌＩを経由してクローン化された野生型（Ｗｔ）マウス（ｍｕ）Ｔ細胞抗原受容体（ＴＣＲ）Ｖα１３鎖の図である。
【図６】前記レトロウイルスｐＢｕｌｌｅｔベクターの中にクローン化されて入れられた機能的野生型（Ｗｔ）マウス（ｍｕ）Ｔ細胞抗原受容体（ＴＣＲ）Ｖβ３の図である。
【図７】空のｐＢｕｌｌｅｔベクターにより形質導入されたＰＢＭＣのフロー細胞数測定の結果を示す。導入遺伝子（Ｖβ３）は検出されなかった。
【図８】フロー細胞数測定により検出された、ヒトＰＢＭＣ上のマウス（ｍｕ）Ｔ細胞抗原受容体（ＴＣＲ）発現の再構成のためのマーカーとしての前記導入遺伝子Ｖβ３の発現図である。予想どうり、付加的にＣＤ３複合体を発現する細胞についてのみ、発現が示されている。
【図９】図８と同様に、組合せＶα１３Ｖβ３の発現図である。前記導入遺伝子Ｖβ３の検出により、ヒトＰＢＭＣ上のマウス（ｍｕ）Ｔ細胞抗原受容体（ＴＣＲ）の再構成が示唆される。
【図１０】Ｖα３Ｖβ３により形質導入されたヒトＰＢＭＣのフローサイトメトリーの図である。すなわち、ＨＬＡ−Ａ２．１−ｐ５３（２６４−２７２）−ＰＥ四量体の染色性が示されており、それは、前記ヒトＰＢＭＣ上のｐ５３（２６４−２７２）−特異的およびＨＬＡ−Ａ２．１−制限Ｔ細胞抗原受容体（ＴＣＲ）の発現を示している。
【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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