(57)【要約】酵母の育成培養液に致死量に達しない量の過酸化物を添加し、酵母細胞に起こる損傷の尺度として波長２５６ナノメートルにおける培養液の吸光度の変化を観測し、そして予め定められた吸光度の値に達した時点で過酸化物を含む酵母培養液から水溶性の酵母エキスを精製することを含む、酵母培養液エキスを供給するプロセス。得られる生成物は、乾燥重量ｍｇ当り少なくとも１．５呼吸単位を有し、そしてＳＤＳスラブゲル電気泳動によって定量される分子量が１５、２５及び５５ｋＤの産生物を、生酵母細胞誘導体に比較して有意に増加した量で含有する。この生成物は、化粧品として許容される担体と組み合わせて皮膚の局所塗布に好適な組成物を提供することができる。
2004519208.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
水溶性酵母エキスを製造する方法であって：
酵母細胞の育成培養液を供給し；
育成培養液に致死量にまで達しない量の過酸化物を添加し；
過酸化物を含む培養液の、波長２５６ナノメートルにおける吸光度を観測し；そして、
波長２５６ナノメートルでの所望の吸光度に到達した時点で、過酸化物を含む培養液から可溶性酵母エキスを分離する；
ことを特徴とする方法。
【請求項２】
過酸化物が過酸化水素であり、過酸化物の致死量にまで達しない量が育成培養液の約０．１重量％から約２．０重量％であることを特徴とする、請求項１記載の方法。
【請求項３】
過酸化物の致死量にまで達しない量が育成培養液の約０．７重量％であることを特徴とする、請求項３記載の方法。
【請求項４】
精製工程が、過酸化物を含む培養液の水不溶性成分を水溶性の酵母エキスから分離することを含むことを特徴とする、請求項１記載の方法。
【請求項５】
分離がろ過又は遠心分離によって行われることを特徴とする、請求項４記載の方法。
【請求項６】
水溶性酵母エキスを製造する方法であって：
酵母細胞の育成培養液を供給し；
育成培養液に過酸化物を添加し；
育成培養液に紫外線を照射し；
過酸化物を含む培養液の、波長２５６ナノメートルにおける吸光度を観測し；そして、
波長２５６ナノメートルでの所望の吸光度に到達した時点で、過酸化物を含む培養液から可溶性酵母エキスを精製する；
ことを特徴とし、添加される過酸化物の量及び紫外線照射の量が相俟って培養液に対して致死量にまで達しない量である上記方法。
【請求項７】
致死量にまで達しない量の過酸化物で処理された酵母培養液から誘導されることを特徴とする水溶性酵母エキスであって、該水溶性酵母エキスが乾燥重量ｍｇ当り少なくとも１．５呼吸単位を有する上記水溶性酵母エキス。
【請求項８】
請求項９記載の水溶性酵母エキス及び皮膚への適用のための化粧品として許容される賦形剤を含むことを特徴とする、皮膚の局所処理のための組成物。
【請求項９】
致死量に達しない量の過酸化物で処理された酵母培養液から誘導され得ることを特徴とする水溶性酵母エキスであって、該水溶性酵母エキスが乾燥重量ｍｇ当り少なくとも１．５呼吸単位を有する上記水溶性酵母エキス。
【請求項１０】
ＳＤＳスラブゲル電気泳動により定量される分子量が１５、２５及び５５ｋＤの産生物を、生酵母細胞誘導体に比較して有意に増加した量で含有することを特徴とする、請求項９記載の水溶性酵母エキス。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の背景
発明の分野
本発明は、従来技術による酵母エキスの細胞刺激効果を維持すると同時に、これに加えて光保護効果を付与する、化粧品技術に使用するための改善された酵母エキスに関する。
【０００２】
従来技術の記載
老化のプロセスには、生理的な生命活動の鈍化が伴う。中でも、ストレスを慢性的、日常的に受けた場合に止血環境を維持する生体能力の減少が真っ先に現れる。老化は一部には、種々の内的、外的な要因、天然及び人工の要因による細胞及び組織の損傷の結果として起こる。我々の体はこれらの損傷を認知し、それらの修復を誘発し、ある場合には生じた異常たんぱく質を劣化させるように、遺伝学的に進化してきた。老化の進行の影響は我々の皮膚にはっきりと出てくる。
【０００３】
酵母は、その作用が個々のヒト細胞の作用によく似ていることから、生化学研究の主要な支えとなっている。酵母は、そのゲノムが完全に解読されているため、細胞の防御機構を研究するには理想的な道具である。医薬及び化粧品の種々の有効成分を製造するために、酵母の産生能力が商業的に利用されてきた。化粧品産業では、酵母を利用する原動力の一つに、倫理上、規制上又は安全上の懸念から動物由来の有効成分を排除する動きがあった。
【０００４】
細胞が損傷を受けることにより細胞の防御反応が誘発される。熱、紫外線照射、汚染物質又は他の不利な状況に曝されると、刺激を受けて防御用の遺伝子産生物が発生する。これらの防御用遺伝子産生物は、不利な状況に曝された時に細胞呼吸作用、細胞増殖作用又は細胞生存力を高めることができる。
【０００５】
Ｇｅｏｒｇｅ  Ｓｐｅｒｔｉは、酵母細胞が熱、紫外線照射、Ｘ線又は化学的損傷によって刺激されて、後に「熱ショックタンパク質」と名付けられたストレス起因の防御因子を生成し得ることを発見した。これらの熱ショックタンパク質（Ｈｓｐ）は「ストレス応答タンパク質」と呼ぶ方がより適切かも知れない。酵母、ネズミ（ラット）、ハツカネズミ（マウス）、雛鳥及び種々の細菌の細胞は全て、損傷を受けた際に細胞修復を刺激することができるストレス因子を、他の種由来の培養細胞中に作り出すことがＳｐｅｒｔｉの研究によって明らかになった。米国特許第２，２３９，３４５号を参照。熱ショックタンパク質は、ストレスによって損傷を受けた細胞機能を代行するか、又は一般にタンパク質の折りたたみを変更することによって本来の構造を保護する分子シャペロンの役目をする。
【０００６】
特定の波長（２８６ナノメートル）の紫外光に曝露された生きた酵母培養液は、生酵母細胞誘導体（Ｌｉｖｅ  Ｙｅａｓｔ  Ｃｅｌｌ  Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ，ＬＹＣＤ）と呼ばれる単離体を生成する。ＬＹＣＤは医薬及び化粧品産業で幅広く利用されている。Ｗｈｉｔｅｈａｌｌ  Ｌａｂｓは、同社の痔疾患用製剤の中で創傷治癒剤としてＬＹＣＤを使用している。傷が熱的又は機械的な損傷による場合、ＬＹＣＤはヒトの創傷治癒速度を速めることが明らかにされている。Ｇｏｏｄｓｏｎらの「皮膚呼吸因子による創傷治癒のある側面の増大（Ａｕｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｏｍｅ  ａｓｐｅｃｔｓ  ｏｆ  ｗｏｕｎｄ  ｈｅａｌｉｎｇ  ｂｙ  “ｓｋｉｎ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｆａｃｔｏｒ”）」，Ｊ．Ｓｕｒｇ．Ｒｅｓ．（１９７６）２１，１２５〜１２９頁を参照。創傷治癒の速度はコラーゲン合成の増加に関係しており、これは繊維芽細胞の盛んな呼吸作用に関係していると考えられている。
【０００７】
繊維芽細胞の活性を促進するＬＹＣＤの能力によって、ＬＹＣＤは化粧品に盛んに使用されている。皮膚を湿潤化し又はその外観を改善するのにＬＹＣＤを使用することに関連して、幾つかの米国特許がある。例えば、米国特許第５，６４３，５８７号、第５，６７６，９５６号又は第５，７７６，４４１号を参照。コラーゲン及びエラスチン合成を増加させることにより、ＬＹＣＤが皮膚に潤いを与える内部湿潤剤の役目をすると考えられる。ＬＹＣＤを化粧品に適用すると、細胞による酸素取り込みが増加し、修復を刺激し、翻って目に見える老化の兆候を鈍化させる。ＬＹＣＤはストレスで損傷を受けたタンパク質の分解を開始することによって、細胞内及び体内にそれが蓄積することを防止することができる。
【０００８】
酸素は「危険な友人」であるということがしばしば議論されている。酸化は内因性及び外因性の両面で、老化の主な仕組みの一つである。酵母は過酸化水素及び超酸化物アニオンに対応する明白な転写性賦活物質を含有し、より高度な真核生物と同一の酸化性ストレスに対する戦闘機構を有する。Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１３９，５０１〜５０７頁。最近の研究で、致死量に達しない量の過酸化水素によって刺激される１００種以上のタンパク質が同定されている。Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９９８）２７３（３４）２２８０〜２２８９頁。
【０００９】
発明の概要
このように、活性酸素種及び／又は紫外光に起因する細胞損傷に対する新たな保護を付与すると同時に、従来技術と同一又はそれ以上の細胞刺激効果を与える、化粧品用の酵母細胞エキスを提供することが本発明の目的である。
【００１０】
細胞を刺激し、活性酸素種及び／又は紫外光に起因する細胞損傷に対して保護するという性質を有する化粧品組成物を提供することが本発明の更なる目的である。
【００１１】
細胞を刺激し、活性酸素種及び／又は紫外光に起因する細胞損傷に対して保護するという性質を有する酵母細胞エキスを調製する方法を提供することが、本発明の更に別の目的である。
【００１２】
これらの目的は、酵母の育成培養液に致死量に達しない量の過酸化物を添加し、酵母細胞に生じる損傷の尺度として、波長２５６ナノメートルでの培養液の吸光度の変化を観測し、そして予め定めた吸光度値に達した時点で過酸化物を含む酵母培養液から水溶性の酵母エキスを精製するプロセス及びこのプロセスから得られる生成物によって達成される。得られる生成物は乾燥重量ｍｇ当り少なくとも１．５呼吸単位を有し、そしてＳＤＳスラブゲル電気泳動により定量される分子量が１５、２５及び５５ｋＤの産生物を、生酵母細胞誘導体に比較して有意に増加した量で含有する。この生成物は、化粧品として許容される担体と組み合わせて皮膚の局所塗布に好適な組成物を提供することができる。
【００１３】
本明細書で使用される「呼吸単位」は、ワールブルグ検圧計で測定した場合、ネズミの腹部組織１ｍｇの酸素消費量を１時間に１％の割合で増加させるＰＴＹＥの量として定義される。
【００１４】
本明細書で使用される「化粧品として許容される担体」は、ローション、クリーム、化粧水又はスキンケア用マスクでの使用が知られる担体類、口紅、コンシーラー、ファンデーション又は粉おしろいのような装飾製品での使用が知られる担体類及びトニック、ジェル及びローションのような整髪調合品での使用が知られる担体類を含む。本発明の酵母エキスはいずれの化粧品配合においてもＬＹＣＤに代えて使用することができる。
【００１５】
本明細書で使用される「致死量に達しない量（亜致死量）」は生存細胞の９０％未満の殺傷率をもたらす量を意味する。過酸化物の最小有効濃度は、２５６ナノメートルの波長を有する光に対する培養液の吸光度の測定し得る増加をもたらす濃度である。
【００１６】
本明細書で使用される「過酸化物」は過酸化物基を含有するいずれの化合物をも意味する。更に、本発明の一つの実施態様では、過酸化物に代わって酸化ストレスをもたらす非過酸化物の化合物を使用する。酸化ストレスは反応性酸素種に起因する酸化による損傷効果である。酸化ストレスをもたらす非過酸化物の化合物の例には、超酸化物アニオン、ヒドロキシルラジカル及び酸化窒素が含まれる。
【００１７】
好ましい態様の詳細な説明
酸化ストレスの効果に対する本発明者らの関心から、本発明者らは酵母培養液中に致死量に達しない量のＨ２Ｏ２を導入した。酵母培養液は、次いで波長２５６ナノメートルにおける分光測光による吸光度の測定によって観察される。この吸光度は「損傷」の結果としての細胞内のヌクレオチド組成物の変化を示す。吸光度が、ｍｇ当り１．５呼吸単位を有する最終エキスに相当する値を超えた時点で酵母培養液を採取する。次いで、処理された酵母から水溶性の画分を遠心分離によって分離し、濃縮し、その生物学的活性を評価する。これはＬＹＣＤを製造するのに使用されるプロセスに類似している。この新しいエキスは「過酸化物で処理された酵母エキス（Ｐｅｒｏｘｉｄｅ  Ｔｒｅａｔｅｄ  Ｙｅａｓｔ  Ｅｘｔｒａｃｔ，ＰＴＹＥ）」と呼ばれる。
【００１８】
ＰＴＹＥは、ｐＨ及び波長２５６ナノメートルにおける分光測光による吸光度によって定量される呼吸単位に関しては、ＬＹＣＤに類似の性質を示す。ＰＴＹＥの製造において酵母を刺激するのに使用されたＨ２Ｏ２の酸化ストレスのために、抗酸化剤活性の新たなスペクトルが明白である。ＰＴＹＥは細胞の呼吸を増加させ、酸化ストレス及び紫外線照射に対する抵抗力を高める。興味あることに、ＰＴＹＥはＬＹＣＤが反応しないビウレット検定に正方向に反応する。
【００１９】
本発明者らは、単離されたヒトの繊維芽細胞に対するＰＴＹＥとＬＹＣＤの効果を比較した。繊維芽細胞を調製し曝気した。次いで試験溶液を添加し、酸素消費速度の差異を使用して呼吸単位を計算した。この解析のために、ＬＹＣＤの試料は２５％水溶液で供され、ＰＴＹＥも２５％水溶液で供された。解析結果を図１に示す。酵母培養液に加えられた障害の機構に拘わらず呼吸単位のレベルは一定であるということを確認したので、本発明者らは他の性質について相違がないか研究を続けた。
【００２０】
異なった損傷が他の遺伝子産生物の生成を招くかも知れないと考え、試料中のタンパク質のプールの分子量分布を測定するために、ＬＹＣＤ及びＰＴＹＥの試料をＳＤＳスラブゲル電気泳動にかけた。試料をＳＤＳ沸騰緩衝液を用いて重量で５ｍｇ／ｍｌまで希釈し、試験管を沸騰水浴に５分間浸して確実に溶解した。図２は実際のゲル電気泳動を示し、図３及び図４は分子量対銀染色濃度の関係を示す。１５及び２５ｋＤの間のバンド及び５５ｋＤでのバンドに明らかな減少が見られる。ＰＴＹＥ試料に存在せずに、ＬＹＣＤ試料に存在するバンドはないようである。
【００２１】
３１．５ｍＪ／ｃｍ２のＵＶＡ／ＵＶＢ照射を受けたヒトの皮膚相当品（ＭａｔＴｅｃ  Ｃｏｒｐ．，Ａｓｈｌａｎｄ，ＭＡ）を使用して、プロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）合成量を測定した。保護されずに照射された組織では、約９０，０００ｐｇ／ｍｌのＰＧＥ２が発生した。比較として、ＬＹＣＤ（０．７％ｗ／ｗ活性）で処理され照射された組織は平均７９，１３９ｐｇ／ｍｌのＰＧＥ２を発生させた。ＰＴＹＥ（０．７％ｗ／ｗ活性）はＰＧＥ２を平均５４，４９０ｐｇ／ｍｌまで減少させる。図５を参照。この有意な保護効果は、Ｈ２Ｏ２処理によって誘発された１種以上の未だ解明されていない遺伝子産生物が、ＵＶＡ／ＵＶＢにより誘起された細胞損傷に対し保護作用をもたらすことを示しているようである。
【００２２】
過酸化物で損傷を受けた酵母培養液が、細胞の酸素取り込みを刺激する能力に関してＬＹＣＤと同等である産生物を生成することは明らかである。この同等性は、ＰＴＹＥがＬＹＣＤと同じく化粧品として望ましい効果を生み出すことができることを示唆している。更に、過酸化物は、未だ同定されてはいないがストレス応答因子と思えるいくつかの可溶性保護因子の生成を誘導する。
【００２３】
ＰＴＹＥを製造する方法の別の実施態様では、酵母培養液（１００ｍｌの培養液当り１０ｍｇのサッカロミセス・セレビシエ酵母菌）が、制御された温度条件（３０±２℃）の下で十分にエアレーションを受けることによって、酵母エキスデキストロース培養液（ＹＥＤ）中で生存可能となる。生きている酵母細胞は次いで致死量に達しない量（０．４〜１４．７ｍＭ）のＨ２Ｏ２のような損傷プロセスを受ける。細胞は種々の保護物質を生成してＨ２Ｏ２の弱体化効果に対抗する。損傷プロセスは複合的な生化学的保護機構が完成するまで続けられ、数日も掛かることがある。発酵プロセスを通じて、培養液による波長２５６ナノメートルの光に対する吸光度を監視する。吸光度が必要とされる１．５呼吸単位／ｍｇに相当する値以上に増加したら、プロセスを停止する。最終エキスの１．５呼吸単位／ｍｇに相当する吸光度の値は、発酵条件のいずれの特定の組み合わせに対しても経験的に決定することができる。タンパク質分解酵素を使用して酵母細胞壁を破壊し発酵を停止する。不溶性の細胞壁物質の大半は遠心分離によって除去され、細胞の原形質が残る。次いで原形質誘導体を濃縮し、呼吸単位を用いて生物学的な活性を評価する。
【００２４】
超酸化物アニオン、ヒドロキシルラジカル及び酸化窒素を発生させることができる他の酸化性物質も、酵母培養液に酸化的ストレスを与えＰＴＹＥを製造するのに使用できる。損傷を引き起こすのに使用されるこれらの他の酸化性物質の量は状況により変化するが、存在するサッカロミセス・セレビシエ酵母菌の細胞の生存能力の９０％を超えて損傷することがない濃度で添加されなければならない。
【００２５】
本発明は特定の実施態様を通じて説明されているが、本発明はそれらの実施態様に限定されるものではなく、当業者には明白な諸変更及び前出の特許請求の範囲の全てを包含するものである。
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は、ＬＹＣＤ及び本発明の酵母エキスの同一量に対する呼吸単位の比較を示す。
【図２】
図２は染色ＳＤＳゲルの写真であり、この上でＬＹＣＤ及び本発明の酵母エキスの成分が分子量に応じて部分的に分離されている。
【図３】
図３は、図２の染色ＳＤＳゲルによるＬＹＣＤの分子量分布のグラフである。
【図４】
図４は、図２の染色ＳＤＳゲルによる本発明の酵母エキスの分子量分布のグラフである。
【図５】
図５は、ＬＹＣＤ及び本発明の酵母エキスの、照射を受けた組織内でのＰＧＥ２合成を抑制する能力の比較を示す。
【図１】
2004519208.tif 000003
【図３】
2004519208.tif 000004
【図４】
2004519208.tif 000005
【図５】
2004519208.tif 000006
【国際公開パンフレット】
2004519208.tif 000007
2004519208.tif 000008
2004519208.tif 000009
2004519208.tif 000010
2004519208.tif 000011
2004519208.tif 000012
2004519208.tif 000013
2004519208.tif 000014
2004519208.tif 000015
2004519208.tif 000016
2004519208.tif 000017
2004519208.tif 000018
2004519208.tif 000019
2004519208.tif 000020
2004519208.tif 000021
【国際調査報告】
2004519208.tif 000022
2004519208.tif 000023