(57)【要約】生体の身体の所定選択部位から得た試料を電気化学分析し、ＤＶＡまたＲＮＡの損傷で生じたヌクレオチド切除物質の遊離レベルの上昇度から生体の健康状態を検出する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体の身体の所定選択部位から得た試料を電気化学的に分析して、ＤＮＡまたはＲＮＡの損傷で生じたヌクレオチド切除物質の遊離レベルの上昇度から生体の健康状態を検出する方法。
【請求項２】
ヌクレオチド切除物質が８ＯＨ２’ｄＧ、Ｏ６ＭＧ、２’ｄＧ、７ＭＧ、８ＮＧ、８ＯＨＧ、８ＯＨ２’ｄＡ、８ＯＨＡ、５ＯＨ２’ｄＣｙ、５ＯＨＵ、３ＮＴおよび３ＣＩＴから成る群の中から選択される請求項１に記載の方法。
【請求項３】
試料が便からなり、調べる健康状態が結腸癌である請求項１に記載の方法。
【請求項４】
試料が唾液からなり、調べる健康状態が食道癌または咽喉癌である請求項１に記載の方法。
【請求項５】
試料が尿からなり、調べる健康状態が膀胱癌または精巣癌である請求項１に記載の方法。
【請求項６】
試料が痰からなり、調べる健康状態が肺癌である請求項１に記載の方法。
【請求項７】
試料が頚膣部洗浄液、子宮頚管スワブまたはブラシ試料からなり、調べる健康状態が子宮頚癌である請求項１に記載の方法。
【請求項８】
チラミンを分析する段階を含み、チラミンに対する８ＯＨ２’ｄＧのモル比を比較する請求項７に記載の方法。
【請求項９】
試料が痰からなり、調べる健康状態が咽頭癌または鼻癌である請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
試料が葉状の尿細管上皮（ｕｒｉｔｈｅｌｉａｌ）細胞からなり、調べる健康状態が膀胱癌、精巣癌または前立腺癌である請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
試料が誘導痰、歯槽または気管支の洗浄試料からなり、調べる健康状態が肺癌または気管支癌である請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
試料が誘導痰、標準ＰＡＰスミアの頚管スワブまたはブラシ試料からなり、調べる健康状態が肺癌または気管支癌である請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
下記段階：
（１）  試料採取部位から得た細胞物質および細胞外物質中の正規化（ノーマライゼーション）候補化合物のレベルを測定し、
（２）  試料採取部位に固有な化合物または代謝作用で増幅された化合物を選択し、
（３）  選択した化合物の中で細胞物質よりも細胞外物質で多くなる化合物を選択する、
から成ることを特徴とする、生体のＤＮＡまたはＲＮＡ損傷で生じるヌクレオチド切除物質を測定する試料の量および獲得変数のための正規化（ノーマライゼーション）化合物を決定する方法。
【請求項１４】
細胞外物質が唾で、正規化化合物が４ヒドロキシフェニル乳酸である、食道癌または咽喉癌を検出するための請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
細胞外物質が痰、歯槽または気管支洗浄試料からなり、正規化化合物が４ヒドロキシフェニル乳酸である、肺癌または気管支癌を検出するための請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
細胞外物質が子宮頚部洗浄液、子宮頚管内スワブまたはブラシ試料からなり、正規化化合物がチラミンであり、診断基準がチラミンに対する８ＯＨ２’ｄＧ−８の比率である、子宮頚癌を検出するための請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
ヌクレオチド切除物質が８ＯＨ２’ｄＧ、Ｏ６ＭＧ、２’ｄＧ、７ＭＧ、８ＮＧ、８ＯＨＧ、８ＯＨ２’ｄＡ、８ＯＨＡ、５ＯＨ２’ｄＣｙ、５ＯＨＵ、３ＮＴおよび３ＣＩＴから成る群の中から選択される請求項１３に記載の方法。
【請求項１８】
クロロチロシンを感染のマーカーとして同時に決定することによって８ＯＨ１’ｄＧと８ＯＨ２’ｄＧホスフェートのレベルの診断特異性を改良する方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の分野】
本発明は診断方法、特にＤＮＡまたはＲＮＡ損傷（ダメッジ）を検出および同定する診断方法に関するものである。
本発明は子宮頚癌（ｃｅｒｖｉｃａｌ ｃａｎｃｅｒ）の検出に特に有用で、以下、この用途に関して説明するが、以下で詳細に説明するように、本発明はその他の用途、例えばその他の癌、その他の疾患の検出にも有用であり、さらには、放射線、金属、煙、溶剤等の環境汚染への曝露に起因する健康状態の異常の検出にも有用である。
【０００２】
【従来の技術】
女性の子宮頚癌を検出するための現在の標準的テストはいわゆる「ＰＡＰスミア（Ｓｍｅａｒ）」である。しかし、このＰＡＰスミアテストは顕微鏡下で検査技師が細胞形態を観察して行うため、検査技師の疲労および／または検査技師の主観で信頼性が損なわれることがある。経験豊かな検査技師でもスライドの判定を誤ることがある。偽陽性が「コール」されたり、スライドが「不確実」のコールをされた時には医師は患者の安全性についての判断を誤って子宮摘出（子宮除去）や子宮全摘出（子宮および卵巣の除去）を決断することがある。この場合には、患者は身体のバランスを保つために所定投与量のホルモン補充薬を一生涯服用しなければならない。もちろん「前癌状態」を発見できないことの方が患者には酷な結果をもたらすであろう。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の主目的は、従来技術の上記およびそれ以外の欠点を無くすことにある。
本発明の他の目的は、ＤＮＡまたはＲＮＡ損傷マーカーを同定することによって病気の状態を検出、診断し、さらには、環境条件への露出に起因する健康状態を検出、診断する分析方法を提供する。
本発明のさらに別の目的は、信頼性のある完全に客観的な癌の検出、分析方法を提供することにある。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
前記およびその他の目的を達成するために、本発明はＤＮＡまたはＲＮＡの損傷で生じるヌクレオチド切除物質（ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｅｘｃｉｓｉｏｎ ｐｒｏｄｕｃｔ）、例えば、身体の所定選択部位から得た生体試料中の８ＯＨ２’ｄＧ−８ヒドロキシ２’デオキシグアノシン；Ｏ６ＭＧ−Ｏ−６−メチルグアニン；２’ｄＧ−２’デオキシグアノシン；７ＭＧ−７−メチルグアニン；８ＮＧ−８−ニトログアニン；８ＯＨＧ−８−ヒドロキシグアニン；８ＯＨ２’ｄＡ−８−ヒドロキシ−２−デオキシアデノシン；８ＯＨＡ−８−ヒドロキシアデニン；５ＯＨ２’ｄＣｙ−５−ヒドロキシ２’デオキシシチジン；５ＯＨＵ−５−ヒドロキシウラシル；３ＮＴ−３−ニトロチロシン；または３ＣＩＴ−３−クロロチロシンの遊離レベルを測定して、癌、その他の疾病、および／または、健康状態を検出、分析する方法を提供する。
【０００５】
本発明は、身体の特定の部位はインシチュー生化学環境（ｉｎ−ｓｉｔｕ ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔｓ、自然位での生化学環境）下では８ＯＨ２’ｄＧのようなヌクレオチド切除物質、その他のヌクレオチド切除物質に対して半孤立（ｓｅｍｉ−ｉｓｏｌａｔｅｄ）しているということ、この半孤立した環境下では遊離８ＯＨ２’ｄＧ、その他のヌクレオチド切除物質の遊離レベルはＤＮＡまたはＲＮＡの損傷・修復メカニズムの複合欠陥を増幅させるという仮定に基づいている。具体的には、癌細胞または前癌細胞中でのＤＮＡの損傷、修復率の増加は身体の所定部位の細胞外基質中の８ＯＨ２’ｄＧの蓄積となって表れる。具体例でいうと、子宮癌の場合には、頚膣部の洗浄サンプリング法で実現される（アセス可能な）インシチュー生化学環境下では子宮頚部は半孤立しているということがわかっている。従って、子宮癌を決定する客観的な分析方法が提供される。
【０００６】
【実施の態様】
以下の説明では頚膣部洗浄液またはＰＡＰスミアスワッブ試料中の８ヒドロキシ２’デオキシグアノシン（８ＯＨ２’ｄＧ）の電気化学分析結果を用いる。この分析は下記文献に記載の電気化学分析システムを用い、一般的分析方法に従って実施する。
【特許文献１】国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ９８／２２２７５号
【非特許文献１】「Ａ Ｃａｒｂｏｎ Ｃｏｌｕｍｎ Ｂａｓｅｄ ＬＣＥＣ Ａｐｐｒｏａｃｈ ｔｏ Ｒｏｕｔｉｎｅ ８−Ｈｙｄｒｏｘｙ−２’−Ｄｏｘｙｇｕａｎｏｓｉｎ Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｓ ｉｎ Ｕｒｉｎｅ ａｎｄ Ｏｔｈｅｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍａｔｒｉｃｅｓ」（Ｂｏｇｄａｎｏｖ ＭＢ， ｅｔ ａ． Ｆｒｅｅ Ｒａｄ． Ｃｉｏｌ． Ｍｅｄ． ２７， １２２７−１２４８， １９９９）
【０００７】
ヒドロキシル・ラジカルのＤＮＡ損傷と修復およびヒドロキシル化付加物（アダクト）８ＯＨ２’ｄＧの分泌に関する従来の仮説は、ヒドロキシル・ラジカルがＤＮＡと反応してその８位でデオキシグアノシンをヒドロキシル化させるというものである。損傷した断片は８Ｏｈｇｕａのように糖分解で切除されるか、８ＯＨ２’ｄＧ５’モノホスフェートのようにエンドヌクレアーゼで切除される。このモノホスフェートは次に脱ホスホリル化され、細胞から８ＯＨ２’ｄＧを迅速に排出する。細胞外基質中へ排出された８ＯＨ２’ｄＧは主として腎臓を経て尿中へ排出され、体外へ素早く除去される。また、８ＯｈｇｕａはＲＮＡへの攻撃および糖分解によっても生じる。
【０００８】
上記技術を用いて実施された研究によって、下記のような上記仮説の基本的要素が確認されている：
【０００９】
１．細胞外基質内の８ＯＨ２’ｄＧの透析分析：ラットおよびマウスの脳および筋肉中にプローブを設置し、産生・排出速度を測定し、細胞材料内の遊離レベルと比較することで細胞からの排出が迅速であることが確認される。同様に、約１００人のＡＬＳ患者と対照被験者でのＣＳＦ、血漿および尿レベルの比較（約１：１０：２０００）から、体外への排除速度が速いことが確認される。唾液または汗対尿のレベル研究および肝臓透析患者の血漿レベルが非常に高くなることを示す研究から、尿の排出が主要な除去方法であることが確認される。
２．個人の尿の８ＯＨ２’ｄＧレベルを日毎、週毎、月毎および年毎に周期的に研究した結果から、ＤＮＡの損傷・修復速度は極めて一定しており、各個人に特有であることが示される。同様に、値の一致が明らかに高い兄弟姉妹および両親の研究から、ＤＮＡの損傷率は遺伝的要因によって大きく影響されるということが分かる。
【００１０】
しかし、他の研究では、診断手段としてＤＮＡ損傷マーカーを使用する上で問題となるＤＮＡの損傷・修復の単純化モデルに以下のような基本的問題点が指摘されている。
１．ヒドロキシル・ラジカルの産生増加がＤＮＡ損傷を増加させるという単純なモデルは不完全で、サリチル酸スピントラッピングにより検定される全身のヒドロキシル・ラジカルの産生率の比較から、健常者、ＡＬＳ患者および遊離ドライヒ運動失調症（ＦＡ）患者で尿または血漿の８ＯＨ２’ｄＧレベルに全く相関関係が無いことが示されている。また、ＣＳＦ血漿または尿中の８ＯＨ２’ｄＧレベルは２５〜３０％増加するが、ＦＡまたはＡＬＳ患者の全身ヒドロキシル・ラジカル産生率が上昇したグループはなかった。
砒素またはｏ−トルイジンまたはアニリンに暴露した人の尿の８ＯＨ２’ｄＧレベルは大きく増加するが、これらの物質はヒドロキシル・ラジカルの産生増加に直接的な役割を果たしていない。
これらの研究から、ＤＮＡ損傷率を増加させるのに大きな役割を果たしているのはヒドロキシル・ラジカルの産生よりも外因性または内因性の付加物（アダクト）により誘発されるＤＮＡの構造変化またはＤＮＡ近接亜細胞構造の変化の方であることが示唆される。本発明者が実施した研究でもアスコルベートまたはトコフェロール等の単純な抗酸化剤は８ＯＨ２’ｄＧレベルに全く影響しないことが示されたことからも上記の考えが裏付けられる。
【００１１】
２．Ｃ． Ｅｌｅｇａｎｓ培地で行ったＤＮＡ損傷率の測定値と癌診断との関係では、生殖腺細胞の迅速な複製段階中に８ＯＨ２’ｄＧの多量の産生が見られた。同様な実験で、複製中に毒素（３ニトロプロピオン酸、３ＮＰ）がＤＮＡ損傷率を増加させることが分かった。暴露後に毒素を除去しても損傷率は高水準で維持され、このことは高い損傷が開始されると、損傷を止めても残るような生化学的状態またはフィードバックが生じることを示している。
【００１２】
３．また、ＤＮＡ中に残る８ＯＨ２’ｄＧレベル（ＤＮＡを抽出および加水分解して測定）は８ＯＨ２’ｄＧの排出率にほんのわずかな低い相関関係しかないことがヒト対照群、ＡＬＳ患者、ＦＡ患者およびＣ．Ｅｌｅｇａｎｓ培地で観察された。このことは損傷および修復は同時にアップレギュレートされ、排出されたＤＮＡ損傷物質の遊離レベルの測定で疾患に関連したＤＮＡ損傷プロセスのより強い指針が得られることを示している。
【００１３】
４．損傷、修復率が高い状況下では、従来の８ＯＨ２’ｄＧホスフェートの切除、８ＯＨ２’ｄＧの脱ホスフォリル化および８ＯＨ２’ｄＧの排出という順序は保たれない。Ｃ．Ｅｌｅｇａｎｓ、３ＮＰで損傷したＣ．Ｅｌｅｇａｎｓおよび子宮癌細胞（下記説明を参照）での急速な細胞複製では８ＯＨ２’ｄＧホスフェートが直接排出される。
【００１４】
５．損傷に固有な部位をサンプルすることが非常に重要である。喫煙に関連する尿中の８ＯＨ２’ｄＧレベルの増加研究では、約２００人の喫煙者対約３００人の対照非喫煙者コホートで統計的に有意な増加は１１％だけであった。しかし、喫煙者対非喫煙者の咽頭のスワブから得た細胞外基質中の８ＯＨ２’ｄＧの遊離レベルはチロシン、４−ヒドロキシフェニル乳酸の細胞代謝物に対して正規化したときにファクターが３ｘ〜４ｘだけ上昇する。
【００１５】
これらの研究および観察と癌の診断との関係は以下のようである：
１．細胞が大規模な異常複製を始めると、有糸分裂中のＤＮＡ構造の変化によって遊離ラジカルの損傷を受け易くなり、切除された損傷物質レベルが上昇すると共にこの物質の種類が変化する。
２．生理的輸送および排出から半孤立した試料部位は、患部細胞周囲の細胞外基質を反映し、残りの損傷物質に対して修復物質のレベルが大きく上昇する。
３．修復物質レベルは、遊離ラジカル損傷によってあまり影響されない代謝プロセスから細胞外基質へ排出される他の細胞代謝物に対して正規化することができる。
本発明の特徴および目的の理解を助けるために、以下、添付図面を参照して本発明をさらに詳細に説明する。
【００１６】
【実施例】
頚膣洗浄液試料を入手後すぐに遠心分離し、剥離細胞と細胞外基質を含む上澄みとに分離した。ＰＡＰスミアのスワブを規定の生理食塩水中でボルテックス分離し、遠心分離して剥離細胞と細胞外基質とに分離した。
国際特許第ＰＣＴ／ＵＮ９８／２２２７５号の教示に従って上記のＢｏｇｄａｎｏｒ達による電極調製、試料濃縮プロトコルを用いて上澄み中の８ＯＨ２’ｄＧを分析した。Ｂｏｇｄａｎｏｒ達によるＤＮＡ加水分解プロトコルの最終段階に続いて、アルカリ性ホスファターゼを用いて上澄みの部分標本を処理して８ＯＨ２’ｄＧホスフェートを分析し、処理されたアルカリ性ホスフォターゼと処理されていない部分試料の差から８ＯＨ２’ｄＧホスフェートのレベルを決定した。Ｂｏｇｄａｎｏｒ達のプロトコルに続いて、国際特許第ＰＣＴ／ＵＮ９８／２２２７５号の教示に従って上澄みの部分標本をクロロチロシン測定した。
適切な正規化剤（ｎｏｒｍａｌｉｚｅｒｓ）および試料完全性のマーカーは下記文献に記載の方法で調製、分析した頚膣洗浄液、ＰＡＰスミア試料、赤血球・白血球の形質細胞試料、頬細胞試料および誘発唾液試料から得られる上澄みと細胞抽出物から決定した。
【００１７】
【非特許文献１】Ｋｒｉｓｔａｌ達、「Ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｍａｊｏｒｉｔｙ ｏｆ Ｌｏｗ−Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｗｅｉｇｈｔ Ｒｅｄｏｘ−Ａｃｔｉｖｅ Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ ｆｒｏｍ Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ」， Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２６３， １８−２５（１９９８年）
これらの調製物からは一般に６００のピークを有するレドックス（酸化還元）活性化合物が単離される。各種試料を相互または基準混合物と比較して下記特徴を有するピークすなわち未知化合物を探す。
【００１８】
１．そのピークは頚膣洗浄液またはＰＡＰスミア試料に固有のもので、他の細胞質または生体物質混在物の混在によって影響されない。
２．そのピークは細胞抽出物中ではなく、上澄み中に存在し、相対濃度が細胞抽出物より実質的に高く、８ＯＨ２’ｄＧと同じような高い細胞からの切除率を示す。
次に、頚膣洗浄液およびＰＡＰスミア試料のパターンを尿および血液試料と比較して、血中で大幅に上昇した化合物、例えばグルタチオン、尿中では尿酸のレベルを求める。これらの化合物のレベルは汚染を示し、８ＯＨ２’ｄＧレベルに対する影響が確立される。
診断基準１と２を満たすパターン中の１６のピークからチラミンが同定された。診断基準を満たすそれ以外の１５のピークは現在未知の構造であるが、正規化（ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ）候補でもある。頚膣洗浄液およびＰＡＰスミア試料の細胞物質および上澄み中の尿酸およびグルタチオンのレベルから約１０００ｎｇ／ｍｌの尿酸および約５０，０００ｎｇ／ｍｌのグルタチオン（これより少ないと８ＯＨ２’ｄＧに対する影響はない）が確定された。
【００１９】
［表１］は各種細胞型の公知化合物に対して比較した典型例を示している。カーボンカラムスイッチ機器（ｃａｒｂｏｎ ｃｏｌｕｍｎ ｓｗｉｔｃｈｉｎｇ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ）とアレー機器（ａｒｒａｙ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ）とを組み合わせ、カーボンカラムスイッチ機器の第１分析カラムの出力に８チャンネル直列センサ（８ ｃｈａｎｎｅｌ ｓｅｒｉｅｓ ｓｅｎｓｏｒ）を設置し、カーボンカラムスイッチ機器の第２分析カラムの出力に２つ目の８チャンネル直列センサを設置した。こうすることによって第１分析カラムの出力で尿酸、グルタチオンおよびチラミンを定量でき、それと同時に第２分析カラムでカーボンカラムのトラップ、干渉物の除去、８ＯＨ２’ｄＧおよびクロロチロシンの検出をすることができる。
【００２０】
［図４］および［図５］は一般的なＰＡＰスミア試料中の８ＯＨ２’ｄＧとＯ６ＭＧの応答を示す。これらの図から全試料で８ＯＨ２’ｄＧが検出され、Ｏ６ＭＧはいくつかの試料だけで検出されることが分かる。
［図６］は細胞および上澄みの調製物から観察されたＣＥＡＳパターンを示す。これらのパターンを相互に比較し、尿、血漿、全血および頬側細胞の同様なパターンと比較して正規化化合物および試料の品質の指標を求めた。
［表Ｉ］は種々の疾病を有する５１人の患者から得た５１の頚膣洗浄液試料と２つの一般的なＰＡＰスミア試料に対して行った分析プロトコルの結果とコンセプトを示している。
【００２１】
［表ＩＩ］は８ＯＨ２’ｄＧとＯ６ＭＧのデータとこれに対するチラミン分割剤（ｄｉｖｉｓｏｒ）および試料の重量またはタンパクから推定される重量によってランク付けされた診断カテゴリー分類を表している。ＣＶＬおよびＰＡＰのスミア試料は別々にランク付けしている。膣部スワブ対頚部スワブに関する初期の研究から、膣部のチラミンレベルが高いことが分かっている。従って、診断基準を満たすが化学的に同定されていない他のピークが複数あるので、チラミンが最適な正規化剤（ｎｏｒｍａｌｉｚｅｒ）であるとはいえない。
［表ＩＩＩ］は、頚部、尿および血漿中の８ＯＨ２’ｄＧの遊離レベルおよびＤＮＡレベルの関係に関する一次データを表す。このデータには解釈に影響するのデータ品質に限界がある。少量試料（２ｍｇ未満）の精度は単に＋／−２２０−３０％である。また、貯蔵履歴は完全に記録しておらず、新しい基質の研究に関しても不確定性があるが、いくつかの観察結果を示した。
【００２２】
【表１】
2004524510.tif 000002
【００２３】
【表２】
2004524510.tif 000003
【００２４】
【表３】
2004524510.tif 000004
【００２５】
【表４】
2004524510.tif 000005
【００２６】
結果
８ＯＨ２’ｄＧの遊離レベル（ｐｇ／ｍｌ）は１．６１（ノーマル）、２．４２（前駆細胞の症例）、１０．８〜１７．４（異形成症ｄｙｓｐｌａｓｉａの症例）および６３５．５（子宮癌の症例）であった。全タンパク、アミノ酸または細胞数の各種測定値で稀釈に関する補正値から、細胞外の子宮頚部環境内の初期濃度は８０〜１１０，０００ｐｇ／ｍｌすなわちノーマル血漿レベル１０ｐｇ／ｍｌの１０００倍であることが分かる。このことは、子宮頚部が生化学的に孤立した部位にあるという仮説が支持される。剥離細胞のＤＮＡ中の８ＯＨ２’ｄＧ／２’ｄＧの比はノーマルに対する異形成症および癌の症例で２．１倍および４．８倍だけ上昇した。このことはＤＮＡ損傷および修復の増幅作用は子宮頚部環境内の細胞外基質中で大きくなるという仮説を支持している。
【００２７】
さらに、子宮頚部内ではＤＮＡ損傷および修復が２０〜１００倍速い速度で進行するという直感的で確実性の低い仮説に合っている。癌患者には高い値が見られるが、尿レベルと子宮頚部レベルとの間の相互関係（ｒ＝０．４３１）が弱いことも一貫している。子宮頚部の反復試料の場合、個人値が一貫している。尿の８ＯＨ２’ｄＧ値は各個人に固有のもので、子宮頚部でも同じことがいえる。
頚膣洗浄液試料中のタンパク値からの細胞外基質量の推定値とＰＡＰスミア試料の実際の重量とを基礎にした８ＯＨ２’ｄＧの絶対レベルは約２００〜８００ｐｇ／ｍｌ、すなわち血漿（２）中に見られる１０ｐｇ／ｍｌのレベルの約２０〜８０倍である。このことは、子宮頚部がＤＮＡ損傷物質の輸送および排出に関して半孤立したインシチュー（ｉｎ−ｓｉｔｕ）部位であるという仮説および必要な診断条件を支持している。
ＤＮＡ内にＤＮＡ損傷物質が統計的に有意ではないが非常にわずかに増加することは、損傷および修復の両方がアップ制御（ｕｐ ｒｅｇｕｌａｔｅｄ）されるということ、そして、細胞外基質では作用が大きくなるという仮説を支持している。
【００２８】
補正していない８ＯＨ２’ｄＧ濃度は対照群より癌患者および癌の危険性のある患者で統計的に高くなるが、試料の稀釈度と細胞外基質の獲得因子を反映する正規化剤（ｎｏｒｍａｌｉｚｅｒ）としてチラミンを用いることはデータの分散を圧縮するのに有効である。
チラミン正規化８ＯＨ２’ｄＧレベルは、全ての対照群の試料および不定異型扁平上皮細胞（Ａｂｎｏｒｍａｌ Ｓｑｕａｎｏｕｓ Ｃｅｌｌｓ ｏｆ Ｕｎｃｅｒｔａｉｎ Ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ， ＡＳＣＵＳ）の２つの症例の所見で、全て１．６ｐｇ８ＯＨ２’ｄＧ／ｎｇチラミンのレベル以下であった。子宮頚部癌が同定された全被験者および癌の疑いが高い２人の被験者は約１６０００ｐｇ８ＯＨ２’ｄＧ／ｎｇチラミンである。前癌状態および危険因子が中程度の患者は対照群と癌群との中間の８ＯＨ２’ｄＧ／チラミン比を有し、今後大きくなるであろう初期癌の危険度の上昇が予測される。
全ての癌症例と有意危険因子および初期前癌インジケータを有する症例の３件で、全８ＯＨ２’ｄＧのかなりの部分が測定可能な８ＯＨ２’ｄＧホスフェートであった。
クロロチロシンは７つの症例で見られ、ＥＳＡ０５１の症例では初期癌の病変と同時またはその代わりに重大な感染レベルを示している。
【００２９】
本発明は、最低でも１０００倍のファクターで対照群から子宮頚癌の被験者を分離でき、異常または前癌細胞または病変の各種危険度および所見の中間値を与える指標８ＯＨ２’ｄＧ／チラミンを与える。
８ＯＨ２’ｄＧの一部がホスフェートとして排出される固有なマーカーは全ての癌の被験者で見られ、このマーカーは８ＯＨ２’ｄＧ／チラミン比の値が高い患者での初期癌の危険度因子および傷害因子の第１の指標となる。これと同時に炎症および感染のマーカーを測定することができるので、危険因子と癌性病変の進行とを識別する追加の診断をすることができる。
【００３０】
子宮頚部洗浄液の上澄み中の大部分の酸化可能な化合物に分析プロトコルを適用していくつかの稀釈正規化化合物の候補を同定した。チラミン（ＴＹＲＡ）は魅力的な正規化剤であると思える。チラミンはその他の細胞物質（頬側細胞、リンパ球、歯槽および咽頭洗浄液、脳および筋透析物）に比べて子宮頚部の細胞代謝物が特異的に多い物質であり、細胞外基質へ迅速に排出され、上記方法で８ＯＨ２’ｄＧと一緒に決定することができる。６件のテスト症例での８ＯＨ２’ｄＧ×１０００／ＴＹＲＡのモル比は１．４８（通常の症例）、７．３４（前駆細胞の症例）、１９．３〜２２．５（異形成症の症例ｎ＝３）および１７９５６（子宮癌の症例）であった。
従って、血漿中または子宮頚部部位の局所でのｃｏＱ１０レベルの上昇と８ＯＨ２’ｄＧレベルの減少は相関していることは明らかである。従って、ｃｏＱ１０と一緒に８ＯＨ２’ｄＧの遊離レベルおよびＤＮＡレベルの両方を測定する分析計画によって酸化損傷率による変化とｃｏＱ１０レベルに関連する修復率の変化とを区別する基準が得られる。
【００３１】
本発明は変形することができる。例えば、チロシン代謝産物ゲンチシン酸のレベルに対して正規化された８ＯＨ２’ｄＧおよび８ＯＨ２’ｄホスフェートの所定時間内での産生量すなわち総産生量（一般に、通常糞便中には約０．１ｐｇ／ｇｍ以上はない）の存在およびそのレベルを調べる便試料の分析結果を結腸または下行結腸癌の診断に用いることができる。唾液を分析して８ＯＨ２’ｄＧレベルの増加を調べることによって食道癌または咽喉癌の早期テストを実施できる。尿または精液を分析して８ＯＨ２’ｄＧレベルの増加を調べて膀胱癌または精巣癌の早期テストを実施できる。咽頭または鼻のスワブ、歯槽または気管支の洗浄試料を用いて４−ヒドロキシフェニル乳酸レベルに対して正規化した８ＯＨ２’ｄＧを分析することで咽頭癌、鼻癌、歯槽癌または肺癌を診断することができる。定期培養中の葉状の尿細管上皮（ｕｒｉｔｈｅｌｉａｌ）細胞の細胞数または重量に対して正規化された８ＯＨ２’ｄＧレベルの分析を膀胱癌または前立腺癌の診断に用いることができる。月経血の８ＯＨ２’ｄＧに関する分析を卵巣癌の早期検出に用いることができる。痰の８ＯＨ２’ｄＧレベルの上昇度を分析して肺癌の早期テストを実施できる。咽頭スワブの分析で咽頭癌または食道癌の早期テストを実施できる。
【００３２】
８ＯＨ２’ｄＧの遊離レベルの測定値は生体内の疾病状況または環境による傷害に起因するＤＮＡ損傷率および修復率の複合作用を表すものと思われる。しかし、この理論に限定されるものではない。全身での８ＯＨ２’ｄＧの産生率（速度）に関しては基本的に下記のことがいえる：
（ａ）疾病または環境的傷害が無い場合、各個人で長期間一定であり、
（ｂ）遺伝性であり、
（ｃ）全身でのヒドロキシルラジカルの産生率とは無関連であり、
（ｄ）ＤＮＡ付加物（例えばピレン、トルイジン、砒素等）に起因すると推定される環境傷害で増加し、
（ｅ）多くの神経変性疾病で増加し、
（ｆ）スポット尿と２４時間尿とで同様に検定され、
（ｇ）抗酸化剤のトコフェロールとアスコルビン酸塩に影響されず、
（ｈ）食事の影響を受けず、胃内部で（ＨＣｌ、グリコラーゼによって）８ＯＨ２’ｄＧＧｕａに転化しない。
【００３３】
細胞および全身からの排出速度は非常に速いものと考えられる。一般に尿から排泄されるが、唾液や汗からも排出される。その速度を考えると、血漿、尿、唾液、白血球内のＤＮＡ損傷レベルの間には一定の相関関係がある。一般に、８ＯＨ２’ｄＧの全身産生量の約３０％は脳からのものである。
この相関関係を用いて特定器官の関与を決定することができる。例えば、Ｃ．Ｅｌｅｇａｎｓ培養では有糸分裂中に多量の産生が急速に生じる。また、単離したミトコンドリア調整物は呼吸器内に８ＯＨ２’ｄＧを産生する。各付加物（アダクト）間の関連性は急速有糸分裂、安定細胞培養およびミトコンドリア培養で異なる。ＤＮＡレベルは産生速度と非常に弱い相関関係しかない。
【００３４】
生理的または輸送で孤立した貯蔵部は物質を濃縮し、ＤＮＡの損傷および修復の影響を拡大する。例えば、喫煙者の尿レベルでは１１％の増加が測定されたものが、咽頭のスワブ試料では４００％の増加が測定されたことがある。
従って、ＤＮＡ損傷率は主として（ａ）ＤＮＡ構造の変化を引き起こす因子（有糸分裂、内因性および外因性の付加物、転写）と、（ｂ）ＤＮＡに近い亜細胞構造（脂質二分子膜、核、細胞質）内での遊離ラジカルの産生量の増加とに影響されるものと思われる。損傷と切除物質の特性はミトコントドリアと核のＤＮＡで異なり、損傷機構によって異なる。これらの知見は子宮頚癌に関するものであるが、下記のように肺癌、下部腸／大腸癌、前立腺癌、膀胱癌等についても同様に一般化できると思われる：
【００３５】
１．  子宮頚部および子宮頚部の細胞外基質は排出された細胞質代謝物の輸送に関しては半孤立した生理的部位である。
２．  ＤＮＡ損傷と修復の複合プロセスの産生物質８ＯＨ２’ｄＧは子宮頚部の細胞外基質中で濃縮され、ＤＮＡ中に残る損傷物質レベルより損傷・修復プロセスの影響を増幅し、より強く反映する。
３．  試料稀釈および獲得効果を制御するための相関マーカーまたは正規化マーカーは、（ａ）遊離ラジカルの作用に影響を受けず、（ｂ）細胞から迅速に排出され且つ（ｃ）子宮頚部細胞の代謝に固有または独特な代謝物の中から選択することができる。
４．  ＤＮＡ損傷／修復物質の産生率は、子宮頚部の細胞が（ａ）急速な分裂を受け、（ｂ）感染または炎症によって増加した遊離ラジカル傷害に局所的に暴露され、（ｃ）内因性プロセス（代謝シフト）または外因性プロセス（バクテリアまたはウイルスの感染および／または環境毒物）によってレベルが増加したＤＮＡ構造修正付加物に暴露されたときに上昇する。
５．  ＤＮＡ損傷率を上昇させる因子群は癌危険因子であり、細胞外基質中のＤＮＡ損傷および修復物質８ＯＨ２’ｄＧレベルの上昇を反映する。
【００３６】
６．  ＤＮＡ損傷の各機構のおおきさは互いに異なり、迅速な細胞分裂が優先する。癌の場合のＤＮＡ損傷率および細胞外８ＯＨ２’ｄＧレベルはＡＳＣＵＳの症例または異形成症、その他の危険因子を有する症例よりも有意に高い。
７．  ＤＮＡ損傷の各機構の相対レベルは互いに異なり、癌細胞はエンドヌクレアーゼで切除した８ＯＨ２’ｄＧの大部分をホスフェートまたはモノホスフェートとして排出し、グリコラーゼ切除で損傷した塩基をより高い割合で切除し、細胞外基質中の８ＯＨ２’ｄＧｕａのレベルが高くなる。また、癌細胞は高レベルの５−オキソシチジンと低レベルの８−ニトログアニンとを多く排出する。
８．  ８ＯＨ２’ｄＧ、８ＯＨ２’ｄＧホスフェート、８ＯＨ２’ｄＧｕａ、８ニトログアニンおよび５オキソシチジンの絶対レベルおよび相対レベルは、ＰＡＰスミアの細胞学的結果とは無関係に癌の有無と、危険因子のレベルを示す特性となる。
９．  ＤＮＡ損傷物質の絶対レベルおよび相対レベルは前癌状態にある細胞を早期に示すことができる。
１０．  他の遊離ラジカル損傷物質のマーカーを同時を用いることによって、他の危険因子に起因する損傷の種類と範囲をＤＮＡ損傷率と区別することができる。特に、クロロチロシンは炎症または感染の作用の指標の役目をし、ニトロチロシンはペルオキシニトライトＤＮＡ損傷作用の正規化剤の役目をする。
【００３７】
以上のことから下記の１、２のことが分かる：
１．  タンパク質で正規化した頚膣洗浄液試料中または重量で正規化された対照群から得たＰＡＰスミア試料中の８ＯＨ２’ｄＧレベルは、細胞外基質１ｍｌ当たり約２５０〜５００ｐｇすなわち血漿の２５〜５０倍である。これは筋肉、脳、肝臓等の遊離細胞外レベル（約１〜３ｐｇ／ｍｌ）とは逆である。従って、子宮頚部は代謝物の輸送に関して半孤立していることが分かる。細胞外基質の８ＯＨ２’ｄＧレベルが対照群の１００倍高い癌の症例では、剥離した細胞からのＤＮＡレベルは３５％しか上昇せず、この違いは統計的に有意ではない。すなわち、半孤立部位中の物質濃度がＤＮＡ損傷率の影響を大きくする。
２．  パターン発生法を用いたＣＶＬ、ＰＡＰスミア、頬側細胞および歯槽洗浄液試料と、血漿、赤血球細胞、尿から得た細胞抽出物と細胞外基質との比較から下記の事実が観察された：
ＣＶＬおよびＰＡＰスミアの試料では、２３の候補ピークが細胞外基質で１０倍以上濃縮されており、他の全てのタイプよりもＣＶＬ／ＰＡＰのスミア試料で高く、独特なものは３つであった。チラミンは遊離ラジカルのプロセスにほとんど影響されないものの１つとして同定され、試料獲得正規化剤（ｓａｍｐｌｅ ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎ ｎｏｒｍａｌｉｚｅｒ）として選択された。操作上でも、本発明の研究は試料品質の指標（インジケータ）として許容されるレベルのものを提供する（例えば、尿の汚染での尿酸、血液封入でのグルタチオン）。
【００３８】
３．  ８ＯＨ２’ｄＧ／チラミン比は損傷率が癌および各種の危険因子（例えばＨＰＶ感染、他のＳＴＤ、複数パートナー、ｈｉｓｕｉｔｉｓｍ、ホルモン異常および膣頸管検査で発見される種々の不定症状）とともに高くなるということを示していると思える。
４．  一般に、ＤＮＡ損傷率は危険因子と同じ方向に上昇する。
５．  たとえ上記の仮定が全て間違っていたとしても、癌コホート群の子宮頚部の局所的ＤＮＡ損傷率は、対照群または癌の危険性のあるコホート群の損傷率よりはるかに高い。従って、癌の生検スクリーニングテストを続ける。
【００３９】
６．  癌の症例では８ＯＨ２’ｄＧホスフェートが常に見られる。従って、ＤＮＡ損傷率およびその他の危険因子が高い被験者は、実際に癌であるにもかかわらず、従来法では検出できる段階まで進んでいないだけであると思われる。８ＯＨ２’ｄＧｕａ／８ＯＨ２’ｄＧの比は２人の癌患者で８人の対照群の２０倍高い。この比と絶対レベルとをベースにしたアルゴリズムによって２０，０００のファクターのカテゴリーに分類することができる。
【００４０】
本発明は種々変形、変更することができる。例えば、カーボンカラムスイッチ式液体クロマトグラフィー電気化学検出（ＬＣＥＣ）装置を用い、上記方法を用いて酸化ＤＮＡ切除の主産生物質の８−ヒドロキシ−２’−デオキシグアノシン（８ＯＨ２’ｄＧ）と、咽頭スワブ、誘導痰、気管支および歯槽洗浄液中の試料正規化化合物の遊離レベルを検定（アッセー）することができる。予備的研究では、喫煙者の痰および咽頭スワブ中で３倍の８ＯＨ２’ｄＧの増加が示されている。８ＯＨ２’ｄＧの絶対レベルは血漿中より１０〜３０倍高い。このことは気道が半孤立した生理的輸送限定部位で、ここでＤＮＡの損傷および修復プロセスが拡大するという最初の仮説を支持している。癌患者群は半孤立した生理的部位である子宮頚部で対照群より８ＯＨ２’ｄＧが２，０００〜１０，０００倍高いので、呼吸障害に対する生化学的診断テストまたは危険性検定テストが提供される。
【００４１】
仮説をまとめると下記の通りになるが、下記の理論に限定されるものではない：
１．気道は半孤立した生理学的輸送限定部位で、この部位ではＤＮＡ障害の修復作用が拡大される。
２．ＤＮＡ損傷が増加すると修復がアップレギュレート（ｕｐ ｒｅｇｕｌａｔｅｄ）されて、気道の細胞外基質中の修復物質の遊離レベルが上昇する。従って、ＤＮＡ中の遊離レベル以上に疾病の危険性または有無を示すことができる。
３．ＤＮＡおよびＲＳの損傷物質のレベルおよび種類は、ＤＮＡリガンド形成プロセス、反応種物質の増加、炎症／感染および急速な細胞有糸分裂、壊死および細胞消失によって異なり、従って、診断または危険のアセス方法として使える。
【００４２】
対照群、種々の危険因子を有する患者、気道障害を有する患者から成るコホートから得た咽頭スワブ、誘導唾液、歯槽洗浄液試料、尿、血漿および赤血球中の８ＯＨ２’ｄＧおよび試料正規化剤候補を、公知方法を用いてアッセイ（検定）することによって各種の試料タイプの間の相関関係と８ＯＨ２’ｄＧおよび試料正規化剤候補に対する各種診断カテゴリーの部分的相関関係を決定することができる。逆にいえば、各種マーカー：８−ヒドロキシグアニン、８−ヒドロキシグアノシン（グリコラーゼ切除およびＲＮＡ損傷マーカー）；７−メチルグアニン（ＤＮＡメチル化マーカー）；３−ニトロチロシンおよび８−ニトログアニン（末梢およびＤＮＡ反応性窒素マーカー）および３−クロロチロシン（感染または炎症マーカー）の相関関係とプロセス関連反応とを評価することができる。
本発明はさらに、血漿およびＣＳＦ中のＮメチルおよびＮ、Ｎジメチルセロトニン（ＮＭ５ＨＴＮＮＭ５Ｈ）および７メチルグアニン（７ＭＧ）の同時メチル化の上昇と、ヒトの脳卒中および虚血における酸化ＤＮＡ損傷マーカー：８−ヒドロキシ２’デオキシグアニシンの減少との強力な証拠を提供する。特に、本発明の分析方法を用いることによって、酸化ＤＮＡ損傷マーカー：８−ヒドロキシ２’デオキシグアニシン（８ＯＨ２’ｄＧ）のＣＮＳ生成量の減少と、脳卒中患者のコホートのメチル化化合物の生成量の増加と、動物の脳卒中モデルの８ＯＨ２’ｄＧレベルの同様な減少とが分かる。従って、脳卒中とそれに関連する疾病におけるＤＮＡとその他の細胞構造に対するメチル化および酸化の遊離ラジカル損傷の生化学的メカニズムを開明し、脳卒中管理に対する生化学的関係を確定することによって、臨床で利用可能な試料および動物モデルでのメカニズム研究に関連する試料のメチル化、活性酸素および窒素種（ＲＯＳ、ＲＮＳ）マーカーの迅速な単一アッセー法が提供される。これによって脳卒中での薬理学的処置の臨床的管理および評価ができる。
【００４３】
上記のプリン特定カーボンカラムスイッチ法を用いた予備的研究では、複数の神経変性疾病（ＮＤＤ）のＤＮＡヒドロキシラジカル損傷マーカー：８−ヒドロキシ−２’−デオキシグアノシンの増加が示された。例えば、筋萎縮性側索硬化症等では疾病と共に漸進的増加が見られた。すなわち、本発明のカーボンカラムスイッチＬＣＥＣ法を用いた予備的研究では、ＲＯＳＤＮＡ損傷マーカー：８−ヒドロキシ−２’−デオキシグアノシン（８ＯＨ２’ｄＧ）がパーキンソン病（ＰＤ）（尿、血漿およびＣＳＦ）、アルツハイマー病（ＡＤ）（血漿および尿）、ハンチントン舞踏病（ＨＤ）（尿）、遊離ドライヒ運動失調症（ＦＡ）（尿、血漿）で増加し、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）（尿、血漿およびＣＳＦ）では増加し且つ時間の経過と共に漸進的するが筋疾患ではそうではないことが示される。８ＯＨ２’ｄＧを決定するクロマトグラムパターンから得られる２次的証拠は神経変性疾病（ＮＤＤ）のカテゴリーでの尿、血漿およびＣＳＦ中の未確認プリン付加物の違いを示している。以上をまとめた仮説は下記の通りであるが、上記の場合と同様に下記の理論に限定されるものではない：
【００４４】
１．メチル化／ＲＯＳ／ＲＮＳ／ＲＣＬＳのプロセスで生じるＤＮＡ損傷物質は対照群とＮＤＤ群とで異なる。
２．ＤＮＡとの内因性／外因性化合物の配位子はＤＮＡ損傷を増加させる役目をする。
３．切除、修復プロセスは対照群とＮＤＤ群とで異なる。
４．ＤＮＡに対するＲＳの攻撃部位は対照群とＮＤＤ群とで異なる。
既に述べた通り、他のＤＮＡおよびＲＮＡ損傷マーカーおよび遊離ラジカルマーカーを種々の健康障害の有無または危険性を示す指標としてアッセーすることができる。
下記の［表ＩＶ］は、所定検体の近似レベルを確定するために定めたＤＮＡ損傷マーカーおよび遊離ラジカルマーカーの予備的開発条件を示したものである。尿、血漿および子宮頚部の細胞外基質の値が対照群の試料群に対して与えられている。全ての手続きの基本的感度は１０〜５０ｐｇ／ｍｌ（カラムでは５００〜２５００ｆｇ）である。
【００４５】
【表５】
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【００４６】
本発明は子宮頚癌および前癌のスクリーニングと、その他の各種癌、心臓疾患および各種変性疾患を含む健康状態を早期検出するための客観的で再現性のあるテストを提供する。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の好ましい実施例での試料の単離、分析システムの概念図。
【図２】本発明の好ましい実施例で有用な試料調製カラムの好ましい実施例の詳細側部断面図。
【図３】本発明の好ましい実施例で有用な電気化学電池として制御される単離および／または試験カラムの側部断面図。
【図４】本発明の好ましい実施例の頚膣洗浄試料中の８ＯＨ２’ｄＧの電気化学的分析の時間−電流量を示すグラフ。
【図５】本発明の好ましい実施例の頚膣洗浄試料中のＯ６ＭＧの電気化学的分析の時間−電流量を示すグラフ。
【図６】本発明によるＰＡＰスミア試料のクーロン電極アレーシステムのパターン図。
【図１】
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【図２】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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2004524510.tif 000049
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