(57)【要約】組み換えウイルスのゲノム又はアンチゲノム内にて変位される遺伝子の位置を有す、組換え呼吸器系合胞体ウイルス（ＨＲＳＶ）が，ヒト及び他の哺乳動物において、感染性を有し且つ弱毒化される。遺伝子の変位した（ｓｈｉｆｔ）ＲＳＶが、組換えゲノム又はアンチゲノム内にて遺伝子又はゲノム分節を挿入、欠失、又は再配列することにより構成され、そして抗ＲＳＶ免疫応答を誘発するためのワクチンを生成する際にも有益である。更に提供されるものは、単離されたポリヌクレオチド分子、及びベクターを組み込みした組換えＲＳＶゲノム又はアンチゲノムであり、この場合前記遺伝子又は遺伝子分節が、ＲＳＶ遺伝子地図中の野生型遺伝子の位置と比較してゲノム又はアンチゲノム内による有意的にプロモータへ隣接か、又はプロモータへ遠位な位置に変位される。この方法において遺伝子位置を変位することは、位置を変位させる性質又は変位の程度により、遺伝子発現の選択的な増大又は減少を提供する。１例において、ＲＳＶ糖タンパク質が、１又は複数の糖タンパク質コードする遺伝子を有意的にプロモータ隣接位置に変位させることにより上限調節される。遺伝子位置を変位したＲＳＶを生成するための関心のある遺伝子には、ＮＳ１、ＮＳ２、Ｎ、ＳＨ、Ｍ２（ＯＲＦ１）、Ｍ２（ＯＲＦ２）、Ｌ、Ｆ又はＧ遺伝子、又は遺伝の一部又は遺伝子外領域であるゲノム分節が含まれる。望ましい表現型及び構造的効果を得るために、種々の付加的な突然変異、及びヌクレオチドの修飾が、本発明の遺伝子位置を変位したＲＳＶ内にて提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
主要な ヌクレオキャプシド（Ｎ）タンパク質、ヌクレオキャプシドリン酸タンパク質（Ｐ）、大型ポリメラーゼタンパク質（Ｌ），ＲＮＡポリメラーゼ伸長因子、及び一部又は完全な組換えＲＳＶゲノムまたはアンチゲノムを含んで成り、前記一部又は完全な組換えＲＳＶゲノムまたはアンチゲノムが、野生型ＲＳＶゲノム又はアンチゲノム内の前記ＲＳＶ遺伝子又はゲノム分節の位置に対してプロモータへ有意的に隣接するか、又はプロモータへ遠位の位置に、位置的に変位される前記組換え型ゲノム又はアンチゲノム内に、１又は複数の変位されたＲＳＶ遺伝子又はゲノム分節を有する、単離された感染性呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）。
【請求項２】
前記一部又は完全な組換え型ＲＳＶゲノム又はアンチゲノム内の１又は複数の置換ポリヌクレオチドの欠失又は挿入により、前記１又は複数の変位された遺伝子又はゲノム分節を、プロモータへ有意的に隣接する位置、又はプロモータへ遠位の位置に変位される請求項１記載の単離された感染性組換えＲＳＶ。
【請求項３】
前記置換ポリヌクレオチドが、ゲノム又はアンチゲノムの非コード領域（ＮＣＲ）に挿入されるか、又は別々の遺伝子単位（ＧＵ）として存在する１５０ヌクレオチド（ｎｔｓ）と４０００ヌクレオチド間の長さの１又は複数のポリヌクレオチド挿入部を含んで成り、前記ポリヌクレオチド挿入部が、完全なオープンリーデングフレーム（ＯＲＦ）を欠損し、そして前記組換え型ＲＳＶにおける弱毒化表現型を特定する請求項２記載の単離された感染性組換えＲＳＶ。
【請求項４】
前記ポリヌクレオチド挿入部が、１又は複数のＲＳＶ遺伝子又はゲノム分節を含んで成る請求項３記載の単離された感染性組換えＲＳＶ。
【請求項５】
前記置換ポリヌクレオチドが、ＲＳＶのＮＳ１、ＮＳ２、Ｎ、Ｐ、Ｍ、Ｍ２（ＯＲＦ１）、Ｍ２（ＯＲＦ２）、Ｌ、Ｆ及びＧ遺伝子及びゲノム分節から選択される１又は複数のＲＳＶ遺伝子又はゲノム分節、及び前記ＲＳＶゲノムの先導部、尾部及び遺伝子間領域、及びその分節を含んで成る請求項２記載の単離された感染性組換えＲＳＶ。
【請求項６】
前記置換ポリヌクレオチドが、ＲＳＶのＮＳ１、ＮＳ２、Ｎ、Ｐ、Ｍ、ＳＨ、Ｍ２（ＯＲＦ１）、Ｍ２（ＯＲＦ２）、Ｌ、Ｆ及びＧ遺伝子又はゲノム分節から選択される１又は複数のウシＲＳＶ（ＢＲＳＶ）又はヒトＲＳＶ（ＨＲＳＶ）遺伝子又はゲノム分節、及び前記ＲＳＶゲノム及びその分節の先導部、尾部及び遺伝子間領域を含んで成る請求項２記載の単離された感染性組換えＲＳＶ。
【請求項７】
野生型ＲＳＶゲノム又はアンチゲノム内の前記ＲＳＶ遺伝子又はゲノム分節の位置に対してプロモータへ有意的に隣接する位置に、前記組換えゲノム又はアンチゲノム内の前記１又は複数の変位されたＲＳＶ遺伝子又はゲノム分節を位置的に変位させる組換えＲＳＶゲノム又はアンチゲノムを形成するために、前記置換ポリヌクレオチドを欠失させる請求項６記載の単離された感染性組換えＲＳＶ。
【請求項８】
組換えＲＳＶゲノム又はアンチゲノムを形成するために欠失された前記置換ポリヌクレオチドが、１又は複数のＲＳＶのＮＳ１、ＮＳ２、ＳＨ、Ｍ２（ＯＲＦ２）、又はＧ遺伝子又はそのゲノム分節を含んで成る請求項７記載の単離された感染性組換えＲＳＶ。
【請求項９】
ＲＳＶのＮＳ１遺伝子を含む置換ポリヌクレオチドが、組換えＲＳＶゲノム又はアンチゲノムを形成するために欠失される請求項８記載の単離された感染性組換えＲＳＶ。
【請求項１０】
ＲＳＶのＮＳ２遺伝子を含む置換ポリヌクレオチドが、組換えＲＳＶゲノム又はアンチゲノムを形成するために欠失される請求項８記載の単離された感染性組換えＲＳＶ。
【請求項１１】
ＲＳＶのＳＨ遺伝子を含む置換ポリヌクレオチドが、組換えＲＳＶゲノム又はアンチゲノムを形成するために欠失される請求項８記載の単離された感染性組換えＲＳＶ。
【請求項１２】
ＲＳＶのＭ２（ＯＲＦ２）を含む置換ポリヌクレオチドが、組換えＲＳＶゲノム又はアンチゲノムを形成するために欠失される請求項８記載の単離された感染性組換えＲＳＶ。
【請求項１３】
ＲＳＶのＧ遺伝子を含む置換ポリヌクレオチドが、組換えＲＳＶゲノム又はアンチゲノムを形成するために欠失される請求項８記載の単離された感染性組換えＲＳＶ。
【請求項１４】
ＲＳＶのＦ及びＧ遺伝子の両方が、組換えＲＳＶゲノム又はアンチゲノムを形成するために欠失される請求項８記載の単離された感染性組換えＲＳＶ。
【請求項１５】
ＲＳＶのＮＳ１及びＮＳ２遺伝子の両方が、組換えＲＳＶゲノム又はアンチゲノムを形成するために欠失される請求項８記載の単離された感染性組換えＲＳＶ。
【請求項１６】
ＲＳＶのＳＨ及びＮＳ２遺伝子の両方が組換えＲＳＶゲノム又はアンチゲノムを形成するために欠失される請求項８記載の単離された感染性組換えＲＳＶ。
【請求項１７】
ＲＳＶのＳＨ，ＮＳ１及びＮＳ２遺伝子が全て組換えＲＳＶゲノム又はアンチゲノムを形成するために欠失される請求項８記載の単離された感染性組換えＲＳＶ。
【請求項１８】
ＲＳＶオープンリーデングフレームの開始又は終了点、又はＲＳＶゲノムの３’先導部、又は５’尾部において、前記置換ポリヌクレオチドが、非翻訳配列内の１又は複数の欠失を含んで成る請求項７記載の単離された感染性組換えＲＳＶ。
【請求項１９】
前記置換ポリヌクレオチドが、１部遺伝子の欠失を含んで成る請求項１８記載の単離された感染性組換えＲＳＶ。
【請求項２０】
前記遺伝子の１部欠失が、ＳＨ遺伝子の１部欠失である請求項１９記載の単離された感染性組換えＲＳＶ。
【請求項２１】
前記ＳＨ遺伝子の１部欠失が、ＳＨ下流の非翻訳領域内の欠失を含んで成る請求項２０記載の単離された感染性組換えＲＳＶ。
【請求項２２】
組換えＲＳＶアンチゲノムの位置４４９９−４６１０における１１２ヌクレオチドの欠失を有するＲＳＶ６１２０である請求項２１記載の単離された感染性組換えＲＳＶ。
【請求項２３】
前記置換ポリヌクレオチドが、ＲＳＶ遺伝子下流の非翻訳配列の１又は複数の領域から選択される請求項７記載の単離された感染性組換えＲＳＶ。
【請求項２４】
前記下流の非翻訳配列が、ＮＳ１（位置５１９−５６３）より、ＮＳ２（位置１００３−１０８６）、Ｐ（位置３０７３−３２３０）、Ｍ（位置４０３３−４１９７）、Ｆ（位置７３８７−７５３９）及び／又はＭ２（位置８４３３−８４９０）遺伝子である請求項２３記載の単離された感染性組換えＲＳＶ。
【請求項２５】
前記置換ポリヌクレオチドが、ＲＳＶ遺伝子上流の非翻訳配列の１又は複数の領域から選択される請求項７記載の単離された感染性組換えＲＳＶ。
【請求項２６】
前記１又は複数の上流の非翻訳配列が、ＮＳ１（位置５５−９６）、ＮＳ２（位置６０６−６２４）、及び／又はＳＨ（位置４２３１−４３００）である請求項２５記載の単離された感染性組換えＲＳＶ。
【請求項２７】
前記置換ポリヌクレオチドが、ＲＳＶのＧ遺伝子の４６８３から４６８５のヌクレオチドの欠失を含んで成る請求項７記載の単離された感染性組換えＲＳＶ。
【請求項２８】
前記置換ポリヌクレオチドが、１又は複数のＲＳＶ遺伝子間配列から選択される請求項７記載の単離された感染性組換えＲＳＶ。
【請求項２９】
前記置換ポリヌクレオチドが、ＲＳＶの５’尾部領域内のヌクレオチドから選択される請求項７記載の単離された感染性組換えＲＳＶ。
【請求項３０】
Ｌ遺伝子のすぐ後に続く５’尾部領域の部分では、完全な５’ゲノム末端を残して、７５ヌクレオチド、１００ヌクレオチド、１２５ヌクレオチド又はそれ以上のサイズを減少させる請求項２９記載の単離された感染性組換えＲＳＶ。
【請求項３１】
前記置換ポリヌクレオチドが、ＲＳＶの３’の先導部領域内のポリヌクレオチドから選択される請求項７記載の単離された感染性組換えＲＳＶ。
【請求項３２】
３’先導部から最初の１１ヌクレオチド内に配置されたウイルスプロモータの中核部分を除く３’尾部領域の１部分が、欠失される請求項３１記載の単離された感染性組換えＲＳＶ。
【請求項３３】
ＲＳＶのＮＳ１，ＮＳ２＜ＳＨ，Ｆ及び／又はＭ２遺伝子を１又は任意の組み合わせから１部又は完全な欠失が、ゲノム長１−８０６間のヌクレオチドにおいて調節可能な減少を得ることのできる請求項７記載の単離された感染性組換えＲＳＶ。
【請求項３４】
１又は任意に組み合わせたＲＳＶ  遺伝子間領域を１部又は完全に欠失した遺伝子が、ゲノム長１−１９８間のヌクレオチドにおいて、調節可能な減少を得ることのできる請求項７記載の単離された感染性組換えＲＳＶ。
【請求項３５】
１又は任意に組み合わせたＲＳＶ  遺伝子間領域の１部又は完全に欠失した遺伝子が、ゲノム長１−１９８間のヌクレオチドにおいて、調節可能な減少を得ることのできる請求項７記載の単離された感染性組換えＲＳＶ。
【請求項３６】
前記置換ポリヌクレオチドが、野生型ＲＳＶゲノム又はアンチゲノム内の前記ＲＳＶ遺伝子又はゲノム分節の位置に対してプロモータへ有意的に隣接する位置に、又はプロモータへ遠位な位置に、前記組換えゲノム又はアンチゲノム内の前記１又は複数の変位されたＲＳＶ遺伝子又はゲノム分節を位置的に変位させる組換えＲＳＶゲノム又はアンチゲノム内にて、付加、置換、又は再配列される請求項６記載の単離された感染性組換えＲＳＶ。
【請求項３７】
組換えＲＳＶゲノム又はアンチゲノム内にて付加、置換、又は再配列された前記置換ポリヌクレオチドが、１つ又は複数のＲＳＶのＮＳ１、ＮＳ２、ＳＨ、Ｍ２（ＯＲＦ２）、Ｆ、及び／又はＧ遺伝子又はそのゲノム分節を含んで成る請求項３６記載の単離された感染性組換えＲＳＶ。
【請求項３８】
前記置換ポリヌクレオチドが、１又は複数のＲＳＶ糖タンパク質又は免疫原ドメイン又はそのエピトープをコードする１又は複数のＲＳＶ遺伝子又はゲノム分節を含んで成る請求項３６記載の単離された感染性組換えＲＳＶ。
【請求項３９】
前記置換ポリヌクレオチドが、ＲＳＶのＦ、Ｇ及び／又はＳＨ糖タンパク質、又は免疫遺伝子ドメイン又はそのエピトープをコードする遺伝子又はゲノム分節から選択される請求項３８記載の単離された感染性組換えＲＳＶ。
【請求項４０】
ＲＳＶのＦ、Ｇ及びＳＨの１又は複数のＲＳＶ糖タンパク質遺伝子又はゲノム分節が、前記１又は複数のＲＳＶ糖タンパク質遺伝子の野生型遺伝子順位の位置と比較してプロモータへ有意的に隣接する位置に、前記組換えＲＳＶゲノム又はアンチゲノム内に付加、置換、又は再配列される請求項１記載の単離された感染性組換えＲＳＶ。
【請求項４１】
前記ＲＳＶ糖タンパク質遺伝子Ｇが、Ｇの野生型遺伝子配列の位置と比較してプロモータへ有意的に隣接する遺伝子順位の位置に、前記組換え型ＲＳＶゲノム又はアンチゲノム内にて再配列される請求項４０記載の単離された感染性組換えＲＳＶ。
【請求項４２】
前記ＲＳＶ糖タンパク質遺伝子Ｇを、ＲＳＶゲノム又はアンチゲノム内遺伝子順位の位置１に変位する請求項４１記載の単離された感染性組換えＲＳＶ。
【請求項４３】
前記ＲＳＶ糖タンパク質遺伝子Ｆが、Ｆの野生型遺伝子順位の位置と比較してプロモータへ有意的に隣接する遺伝子順位の位置に、前記組換え型ＲＳＶゲノム又はアンチゲノム内にて再配列される請求項４０記載の単離された感染性組換えＲＳＶ。
【請求項４４】
前記ＲＳＶ糖タンパク質遺伝子Ｆを、前記組換え型ＲＳＶゲノム又はアンチゲノム内遺伝子順位の位置１に変位する請求項４３記載の単離された感染性組換えＲＳＶ。
【請求項４５】
前記ＲＳＶ糖タンパク質遺伝子Ｇ及びＦが、Ｇ及びＦの野生型遺伝子順位の位置と比較してプロモータへ有意的に隣接する遺伝子順位の位置に、前記組換え型ＲＳＶゲノム又はアンチゲノム内にて再配列される請求項４０記載の単離された感染性組換えＲＳＶ。
【請求項４６】
前記ＲＳＶ糖タンパク質遺伝子Ｇを、前記組換え型ＲＳＶゲノム又はアンチゲノム内遺伝子順位の位置１に，そして前記ＲＳＶ糖タンパク質遺伝子Ｆを、その遺伝子順位の位置２に変位する請求項４５記載の単離された感染性組換えＲＳＶ。
【請求項４７】
組換えＲＳＶゲノム又はアンチゲノムにおいて、１又は複数のＲＳＶのＮＳ１，ＮＳ２，ＳＨ，Ｍ２（ＯＲＦ２）又はＧ遺伝子又はそのゲノム分節が、欠失される請求項４０記載の単離された感染性組換えＲＳＶ。
【請求項４８】
ＲＳＶのＮＳ１遺伝子を含む置換ポリヌクレオチドが、組換えＲＳＶゲノム又はアンチゲノムを形成するために欠失される請求項４０記載の単離された感染性組換えＲＳＶ。
【請求項４９】
ＲＳＶのＮＳ２遺伝子を含む置換ポリヌクレオチドが、組換えＲＳＶゲノム又はアンチゲノムを形成するために欠失される請求項４０記載の単離された感染性組換えＲＳＶ。
【請求項５０】
ＲＳＶのＳＨ遺伝子を含む置換ポリヌクレオチドが、組換えＲＳＶゲノム又はアンチゲノムを形成するために欠失される請求項４０記載の単離された感染性組換えＲＳＶ。
【請求項５１】
前記ＲＳＶ糖タンパク質遺伝子Ｇが、Ｇの野生型遺伝子順位の位置と比較してプロモータへ有意的に隣接する遺伝子順位の位置に前記組換え型ＲＳＶゲノム又はアンチゲノム内に，再配列される請求項５０記載の単離された感染性組換えＲＳＶ。
【請求項５２】
前記ＲＳＶ糖タンパク質遺伝子Ｇが、前記組換え型ＲＳＶゲノム又はアンチゲノム内に，遺伝子順位の位置１に変位される請求項５１記載の単離された感染性組換えＲＳＶ。
【請求項５３】
Ｇ１／ΔＳＨである請求項５２記載の単離された感染性組換えＲＳＶ。
【請求項５４】
前記ＲＳＶ糖タンパク質遺伝子Ｆが、Ｆの野生型遺伝子順位の位置と比較してプロモータへ有意的に隣接する遺伝子順位の位置に対して、前記組換え型ＲＳＶゲノム又はアンチゲノム内にて再配列される請求項５０記載の単離された感染性組換えＲＳＶ。
【請求項５５】
前記ＲＳＶ糖タンパク質遺伝子Ｆが、前記組換え型ＲＳＶゲノム又はアンチゲノム内にて遺伝子順位の位置１に変位される請求項５４記載の単離された感染性組換えＲＳＶ。
【請求項５６】
Ｆ１／ΔＳＨである請求項５５記載の単離された感染性組換えＲＳＶ。
【請求項５７】
前記ＲＳＶ糖タンパク質遺伝子Ｇ及びＦの両方が、Ｇ及びＦの野生型遺伝子順位の位置と比較してプロモータへ有意的に隣接する遺伝子順位の位置に前記組換え型ＲＳＶゲノム又はアンチゲノム内にて、再配列される請求項５０記載の単離された感染性組換えＲＳＶ。
【請求項５８】
前記組換え型ＲＳＶゲノム又はアンチゲノム内にて、前記ＲＳＶ糖タンパク質遺伝子Ｇが、遺伝子順位の位置１に、且つ前記ＲＳＶ糖タンパク質遺伝子Ｆが、遺伝子順位の位置２に変位される請求項５７記載の単離された感染性組換えＲＳＶ。
【請求項５９】
Ｇ１Ｆ２／ΔＳＨである請求項５８記載の単離された感染性組換えＲＳＶ。
【請求項６０】
前記ＲＳＶのＳＨ及びＮＳ２遺伝子の両方が、前記組換え型ＲＳＶゲノム又はアンチゲノムを形成するために欠失される、請求項４０記載の単離された感染性組換えＲＳＶ。
【請求項６１】
前記ＲＳＶ糖タンパク質遺伝子Ｇ及びＦの両方が、Ｇ及びＦの野生型遺伝子順位の位置と比較してプロモータへ有意的に隣接する遺伝子順位の位置に前記組換え型ＲＳＶゲノム又はアンチゲノム内にて、再配列される請求項６０記載の単離された感染性組換えＲＳＶ。
【請求項６２】
前記組換え型ＲＳＶゲノム又はアンチゲノム内にて、前記ＲＳＶ糖タンパク質遺伝子Ｇが、遺伝子順位の位置１に、且つ前記ＲＳＶ糖タンパク質遺伝子Ｆが、遺伝子順位の位置２に変位される請求項６１記載の単離された感染性組換えＲＳＶ。
【請求項６３】
Ｇ１Ｆ２／ΔＮＳ２ΔＳＨである請求項６２記載の単離された感染性組換えＲＳＶ。
【請求項６４】
ＲＳＶのＳＨ，ＳＨ，ＮＳ１及びＮＳ２遺伝子が、前記組換え型ＲＳＶゲノム又はアンチゲノムを形成するために全て欠失される、請求項４０記載の単離された感染性組換えＲＳＶ。
【請求項６５】
前記ＲＳＶ糖タンパク質遺伝子Ｇ及びＦの両方が、Ｇ及びＦの野生型遺伝子順位の位置と比較してプロモータへ有意的に隣接する遺伝子順位の位置に前記組換え型ＲＳＶゲノム又はアンチゲノム内にて、再配列される請求項６４記載の単離された感染性組換えＲＳＶ。
【請求項６６】
前記組換え型ＲＳＶゲノム又はアンチゲノム内にて、前記ＲＳＶ糖タンパク質遺伝子Ｇが、遺伝子順位の位置１に、そして前記ＲＳＶ糖タンパク質遺伝子Ｆが、遺伝子順位の位置２に変位される請求項６５記載の単離された感染性組換えＲＳＶ。
【請求項６７】
Ｇ１Ｆ２／ΔＮＳ２ΔＮＳ２ΔＳＨである請求項６６記載の単離された感染性組換えＲＳＶ。
【請求項６８】
ヒト−子牛キメラＲＳＶゲノム又はアンチゲノムを形成するために、１又は複数の不均一遺伝子又は相違するＲＳＶからのゲノム分節により結合された一部又は完全なヒトＲＳＶ（ＨＲＳＶ）、又は牛ＲＳＶ（ＢＲＳＶ）を背景とするゲノム又はアンチゲノムを含んで成る請求項１記載の単離された感染性組換えＲＳＶ。
【請求項６９】
一部又は完全なＨＲＳＶ、又はＢＲＳＶを背景とするゲノム又はアンチゲノム内の同等の遺伝子又はゲノム分節に野生型遺伝子順位の位置と比較してプロモータへ有意的に隣接する位置か、又はプロモータへ遠位の位置に、不均一遺伝子又はゲノム分節が付加されるか、又は置換される請求項６８記載の単離された感染性組換えＲＳＶ。
【請求項７０】
一部ウシＲＳＶを背景とするゲノム又はアンチゲノムにおいて、野生型遺伝子の７と８の位置にそれぞれ欠失される同等のＧ及びＦ糖タンパク質遺伝子に置き換えるために、ヒトＲＳＶ糖タンパク質遺伝子ＧとＦの両方が、遺伝子順位の位置１と２にそれぞれ置換される請求項６９記載の単離された感染性組換えＲＳＶ。
【請求項７１】
ｒＢＲＳＶ／Ａ２−Ｇ１Ｆ２である請求項７０記載の単離された感染性組換えＲＳＶ。
【請求項７２】
ＮＳ１，ＮＳ２，Ｆ，Ｇ，ＳＨ及びＭから選択される１又は複数のヒトＲＳＶの非構造的、及び／又はエンベロープ関連遺伝子が、一部又は完全なウシＲＳＶ背景のゲノム又はアンチゲノム内に付加、又は置換される請求項６９記載の単離された感染性組換えＲＳＶ。
【請求項７３】
Ｆ，Ｇ，ＳＨ及びＭから選択される１又は複数のヒトＲＳＶエンベロープ関連遺伝子が、Ｆ，Ｇ，ＳＨ及びＭから選択される１又は複数のヒトＲＳＶエンベロープ関連遺伝子が欠失される一部ウシＲＳＶを背景とするゲノム又はアンチゲノム内にて、付加、又は置換される請求項６９記載の単離された感染性組換えＲＳＶ。
【請求項７４】
ヒトＲＳＶエンベロープ関連遺伝子Ｆ，Ｇ及びＭが、エンベロープ関連遺伝子Ｆ，Ｇ及びＭの全てが欠失される、１部ウシＲＳＶを背景とするゲノム又はアンチゲノム内に、付加される請求項７３記載の単離された感染性組換えＲＳＶ。
【請求項７５】
ｒＢＲＳＶ／Ａ２−ＭＧＦである請求項７４記載の単離された感染性組換えＲＳＶ。
【請求項７６】
ヒトＲＳＶ糖タンパク質遺伝子ＧとＦの両方が、一部ウシＲＳＶを背景としたゲノム又はアンチゲノムにおいて、それぞれ野生型の位置７と８にて欠失される同等のＧ及びＦ糖タンパク質遺伝子を置き換えるために、遺伝子順位の位置３と４にそれぞれ置換される請求項６９記載の単離された感染性組換えＲＳＶ。
【請求項７７】
ｒＢＲＳＶ／Ａ２−Ｇ３Ｆ４である請求項７６記載の単離された感染性組換えＲＳＶ。
【請求項７８】
ヒトＲＳＶ糖タンパク質遺伝子ＧとＦの両方が、野生型の位置７と８にてそれぞれ欠失された同等のＧ及びＦ糖タンパク質遺伝子を置き換えるために、遺伝子順位の位置１と２にてそれぞれ置換され、そして前記ＲＳＶ遺伝子ＮＳ１及びＮＳ２が、一部ウシＲＳＶを背景としたゲノム又はアンチゲノムおいて、これらウシの同等の遺伝子として、置換される請求項６９記載の単離された感染性組換えＲＳＶ。
【請求項７９】
ｒＢＲＳＶ／Ａ２−Ｇ１Ｆ２ＮＳ３ＮＳ４である請求項７８記載の単離された感染性組換えＲＳＶ。
【請求項８０】
ＲＳＶのＭ２（ＯＲＦ１）を、組換えウイルスの転写を上限調節するために、組換えＲＳＶゲノム又はアンチゲノム内においてプロモータへ有意的に隣接する位置に変位する請求項１記載の単離された感染性組換えＲＳＶ。
【請求項８１】
組み込みゲノム又はアンチゲノムが、１パネルの変異ヒトＲＳＶ菌株内に存在する変異体の弱毒化する少なくとも１つ及び全部の補体を組み込み、前記パネルが、ｃｐｔｓ ＲＳＶ ２４８（ＡＴＣＣ ＶＲ２４５０），ｃｐｔｓ ＲＳＶ ２４８／４０４（ＡＴＣＣ ＶＲ２４５４），ｃｐｔｓ ＲＳＶ ２４８／９５５（ＡＴＣＣ ＶＲ２４５３），ｃｐｔｓ ＲＳＶ ５３０（ＡＴＣＣ ＶＲ２４５２），ｃｐｔｓ ＲＳＶ ５３０／１００９（ＡＴＣＣ ＶＲ２４５１），ｃｐｔｓ ＲＳＶ ５３０／１０３０（ＡＴＣＣ ＶＲ２４５５），ＲＳＶ Ｂ−１ ｃｐ５２／２Ｂ５（ＡＴＣＣ ＶＲ２５４２），及びＲＳＶ Ｂ−１ ｃｐ−２３（ＡＴＣＣ ＶＲ２５７９）を含んで成る請求項１記載の単離された感染性組換えＲＳＶ。
【請求項８２】
前記組換えゲノム又はアンチゲノムが、異なる変異体ＲＳＶ菌株から採用された弱毒変異体を組み込む請求項８１記載の単離された感染性組換えＲＳＶ。
【請求項８３】
前記組換えゲノム又はアンチゲノムが、ＲＳＶのＮ遺伝子のＶａｌ２６７、ＲＳＶのＦ遺伝子のＧｌｕ２１８及び／又はＴｈｒ５２３、ＲＳＶ ポリメラーゼ遺伝子ＬのＡｓｎ４３、Ｃｙｓ３１９、Ｐｈｅ５２１、Ｇｌｎ８３１、Ｍｅｔ１１６９、Ｔｙｒ１３２１及び／又はＨｉｓ１６９０にてアミノ酸の置換、び遺伝子Ｍ２遺伝子の開始配列におけるヌクレオチド置換を特定する弱毒化変異体の少なくとも１つ、又は最大限として十分な補体を組み込む請求項１記載の単離された感染性組換えＲＳＶ。
【請求項８４】
組換えゲノム又はアンチゲノムが、少なくとも２の弱毒化変異体を組み込む請求項８３記載の単離された感染性組換えＲＳＶ。
【請求項８５】
組換えゲノム又はアンチゲノムが、変異体に特異性のあるコドンにおける複数のヌクレオチドの変化によって安定化する少なくとも１つの弱毒化変異体を含んで成る請求項８３記載の単離された感染性組換えＲＳＶ。
【請求項８６】
さらに組換えゲノム又はアンチゲノムが、弱毒性、温度感受性、低温適応性、プラークサイズ、宿主の範囲制限（ｈｏｓｔ−ｒａｎｇ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ）を特徴とする増殖の変化、又は免疫原性の変化から選択される表現型の変化を特定するヌクレオチド修飾を含んで成る請求項１記載の単離された感染性組換えＲＳＶ。
【請求項８７】
ヌクレオチドの修飾が、組換えウイルスのＳＨ、ＮＳ１、ＮＳ２、Ｍ２ＯＲＦ２、又はＧ遺伝子を変化させる請求項８６記載の単離された感染性組換えＲＳＶ。
【請求項８８】
遺伝子のオープンリーデングフレームにおける１又は複数のコドンを導入することによって、組換えウイルスのＳＨ、ＮＳ１、ＮＳ２、Ｍ２のＯＲＦ２、又はＧ遺伝子が、全体的、又は１部が欠失された、又は前記遺伝子の発現が除去される請求項８７記載の単離された感染性組換えＲＳＶ。
【請求項８９】
前記遺伝子修飾が、組換えＲＳＶゲノム又はアンチゲノム内の選択された遺伝子のシス作用調節配列におけるヌクレオチドの欠失、挿入、置換、追加、又は再配列を含んで成る請求項８６記載の単離された感染性組換えＲＳＶ。
【請求項９０】
ＮＳ１又はＮＳ２遺伝子の遺伝子末端（ＧＥ）シグナルが修飾される請求項８９記載の単離された感染性組換えＲＳＶ。
【請求項９１】
ヌクレオチドの修飾は、ＲＳＶゲノム又はアンチゲノム内の翻訳開始部位の挿入、欠失、又は再配列を含んで成る請求項８９記載の単離された感染性組換えＲＳＶ。
【請求項９２】
ＲＳＶ Ｇ糖タンパク質の選択された形状の転写開始部位が除去される請求項９１記載の単離された感染性組換えＲＳＶ。
【請求項９３】
哺乳動物の宿主内の前記病原体に対する保護としての免疫応答を惹起することのできる、サイトカイン、Ｔ−ヘルパーエピトープ、制限酵素部位マーカ、又は微生物病原体のタンパク質から選択される非ＲＳＶ分子をコードするために、組換えゲノム又はアンチゲノムが修飾される請求項１記載の単離された感染性組換えＲＳＶ。
【請求項９４】
パラインフルエンザウイルス（ＰＩＶ）から１又は複数の遺伝子、及び／又はゲノム分節を組み込む請求項９３記載の単離された感染性組換えＲＳＶ。
【請求項９５】
前記組換えゲノム又はアンチゲノムが、ＨＮ又はＦ糖タンパク質、又はＰＩＶ１，ＰＩＶ２又はＰＩＶ３のＨＮ又はＦのエクトドメイン又は免疫原エピトープをコードする請求項９４記載の単離された感染性組換えＲＳＶ。
【請求項９６】
ウイルスである請求項１記載の単離された感染性組換えＲＳＶ。
【請求項９７】
サブウイルス粒子である請求項１記載の単離された感染性組換えＲＳＶ。
【請求項９８】
前記置換ポリヌクレオチドが、組換えＲＳＶゲノム又はアンチゲノム内に追加されるか、又はその非コード領域から欠失される請求項２記載の単離された感染性組換えＲＳＶ。
【請求項９９】
組換えゲノム又はアンチゲノムが、ヒトＲＳＶのサブクループＡとサブグループＢの一方又は両方から抗原決定基を組み込む請求項１記載の単離された感染性組換えＲＳＶ。
【請求項１００】
生理学的に受け入れ可能な担体により結合された請求項１記載の組換えＲＳＶの免疫学的に十分な量を個体に投与することを含めてＲＳＶに対する保護を誘発するための個体の免疫系を刺激するための方法。
【請求項１０１】
前記組換えＲＳＶが、１０３から１０６ＰＦＵの用量にて投与される請求項１００記載の方法。
【請求項１０２】
前記組換えＲＳＶが、気道上部に投与される請求項１００記載の方法。
【請求項１０３】
前記組換えＲＳＶが、噴霧（ｓｐｒａｙ）、小滴、エアロゾルにより投与される請求項１００記載の方法。
【請求項１０４】
前記組換えＲＳＶが、ＲＳＶに対する抗体として血清陰性の個体に、あるいはＲＳＶに対する胎盤通過に必要な母性への抗体を所有するために投与される請求項１００記載の方法。
【請求項１０５】
前記組換えＲＳＶが、ヒトＲＳＶ ＡかＲＳＶ Ｂのいずれかに免疫応答を誘発する請求項１００記載の方法。
【請求項１０６】
前記組換えＲＳＶが、ヒトＲＳＶ ＡとＲＳＶ Ｂの両方に免疫応答を誘発する請求項１００記載の方法。
【請求項１０７】
前記組換えＲＳＶが、ヒトＲＳＶ ＡかＲＳＶ Ｂのいずれかに免疫応答を誘発し、そしてヒトＲＳＶ ＡかあるいはＲＳＶ Ｂに免疫応答を誘発できる第２の弱毒化ＲＳＶの免疫学的に十分な量により、併用投与されることにより、免疫応答が、ヒトＲＳＶ ＡとＲＳＶ Ｂの両方に対して誘発される請求項１００記載の方法。
【請求項１０８】
前記組換えＲＳＶ及び第２の弱毒化ＲＳＶが、混合して同時に投与される請求項１０７記載の方法。
【請求項１０９】
生理的に受け入れ可能な担体において、請求項１の組換えＲＳＶの免疫学的に十分な量を含むＲＳＶに対する免疫応答を誘発する免疫原組成物。
【請求項１１０】
１０３から１０６ＰＦＵの容量にて形成される請求項１０９記載の方法。
【請求項１１１】
前記組換えＲＳＶが、噴霧（ｓｐｒａｙ）、小滴、エアロゾルにより気道上部に投与するために処方される請求項１０９記載の免疫原組成物。
【請求項１１２】
前記組換えＲＳＶが、ヒトＲＳＶ ＡかＲＳＶ Ｂのいずれかに、又はヒトＲＳＶ ＡとＲＳＶ Ｂの両方に対して免疫応答を誘発する請求項１０９記載の免疫原組成物。
【請求項１１３】
前記組換えゲノム又はアンチゲノムが、１又は複数の異種病原体の１又は複数の抗原決定基をコードする１又は複数の異種遺伝子又はゲノム分節により結合した１部又は完全なＲＳＶベクターゲノム又はアンチゲノムを含んで成る請求項１記載の単離された感染性組換えＲＳＶ。
【請求項１１４】
前記１又は複数の異種病原体が、異種ＲＳＶであり、そして前記異種遺伝子又はゲノム文節が、１又は複数のＲＳＶのＮＳ１、ＮＳ２、Ｎ、Ｐ、ＳＨ、Ｍ２（ＯＲＦ１）、Ｍ２（ＯＲＦ２）、Ｌ、Ｆ又はＧタンパク質又はその断片をコードする請求項１１３記載の単離された感染性組換えＲＳＶ。
【請求項１１５】
前記ベクターゲノム又はアンチゲノムが、１部又は完全なＲＳＶ Ａゲノム又はアンチゲノムであり、そして抗原決定基をコードする異種遺伝子又はゲノム分節が、ＲＳＶ Ｂサブグループウイルスのものである請求項１１３記載の単離された感染性組換えＲＳＶ。
【請求項１１６】
キメラゲノム又はアンチゲノムが、弱毒化を特定するＢＲＳＶの１又は複数の遺伝子又はゲノム分節を組み込む請求項１１３記載の単離された感染性組換えＲＳＶ。
【請求項１１７】
１又は複数のＨＮ及び／又はＦ糖タンパク質、又抗原ドメイン、断片又はそのエピトープをコードする前記１又は複数のＨＰＩＶ１，ＨＰＩＶ２又はＨＰＩＶ３遺伝子、又はゲノム文節が、１部又は完全なＨＲＳＶベクターのゲノム又はアンチゲノム内に付加されるか、又は組み込まれている請求項１１３記載の単離された感染性組換えＲＳＶ。
【請求項１１８】
前記ベクターゲノム又はアンチゲノムが、１部又は完全なＢＲＳＶゲノム又はアンチゲノムであり、そして抗原決定基をコードする異種遺伝子又はゲノム分節が１又は複数のＨＲＳＶ（ｓ）からである請求項１１３記載の単離された感染性組換えＲＳＶ。
【請求項１１９】
前記１部又は完全なＢＲＳＶゲノム又はアンチゲノムが、Ｆ，Ｇ及びＳＨから選択される１又は複数のＨＲＳＶ糖タンパク質遺伝子をコードする遺伝子又はゲノム分節（ｓｅｇｍｅｎｔ）、あるいは細胞形質ドメイン、貫通膜ドメイン、エクトドメイン、又は免疫原エピトープ部位をコードするＨＲＳＶのＦ，Ｇ及び／又はＳＨの１又は複数のゲノムセグメントを組み込む請求項１１８記載の単離された感染性組換えＲＳＶ。
【請求項１２０】
前記ベクターゲノム又はアンチゲノムが、１部又は完全なＨＲＳＶ又はＢＲＳＶゲノムまたはアンチゲノムであり、そして前記異種病原体が、麻疹ウイルス（ｍｅａｓｌｅｓ ｖｉｒｕｓ），サブグループＡ及びサブグループＢの呼吸器合胞ウイルス、ムンプスウイルス（ｍｕｍｐｓ），ヒト乳頭腫ウイルス、１型と２型のヒト免疫不全ウイルス、単純ヘルペスウイルス、サイトメガロウイルス、ラビーウイルス、エプステン・バーウイルス（Ｅｐｓｔｅｉｎ Ｂａｒｒ Ｖｉｒｕｓ）、フィロウイルス（ｆｉｌｏｖｉｒｕｓｅｓ），ブンヤウイルス（ｂｕｎｙａｖｉｒｕｓｅｓ）、フラビウイルス（ｆｌａｖｉｖｉｒｕｓｅｓ）、アルファウイルス（ａｌｐｈａｖｉｒｕｓｅｓ）、及びインフルエンザウイルスから選択される請求項１１３記載の単離された感染性組換えＲＳＶ。
【請求項１２１】
前記１又は複数の異種抗原決定基が、麻疹ウイルス（ｍｅａｓｌｅｓ ｖｉｒｕｓ）ＨＡ及びＦタンパク質、サブグループＡ又はサブグループＢの呼吸器合胞ウイルスＦ，Ｇ，ＳＨ及びＭ２タンパク質、ムンプスウイルス（ｍｕｍｐｓ）ＮＨ及びＦタンパク質、ヒト乳頭腫ウイルスＬ１タンパク質、１型と２型のヒト免疫不全ウイルスのｇｐ１６０タンパク質、単純ヘルペスウイルス及びサイトメガロウイルスのｇＢ，ｇＣ，ｇＤ，ｇＥ，ｇＧ，ｇＨ，ｇＩ，ｇＪ，ｇＫ，ｇＬ，及びｇＭタンパク質、ラビーウイルスＧタンパク質、エプステン・バーウイルス（Ｅｐｓｔｅｉｎ Ｂａｒｒ Ｖｉｒｕｓ）のｇｐ３５０タンパク質、フィロウイルス（ｆｉｌｏｖｉｒｕｓｅｓ）Ｇタンパク質、ブンヤウイルス（ｂｕｎｙａｖｉｒｕｓｅｓ）Ｇタンパク質、フラビウイルス（ｆｌａｖｉｖｉｒｕｓｅｓ）のＥ及びＮＳ１タンパク質、及びアルファウイルス（ａｌｐｈａｖｉｒｕｓｅｓ）Ｅタンパク質、及び抗原ドメイン、断片及びそのエピトープから選択される請求項１２０記載の単離された感染性組換えＲＳＶ。
【請求項１２２】
前記異種病原体が、麻疹ウイルス（ｍｅａｓｌｅｓ ｖｉｒｕｓ）であり、そして異種抗原決定基が、麻疹ウイルス（ｍｅａｓｌｅｓ ｖｉｒｕｓ）ＨＡ及びＦタンパク質及び抗原ドメイン、断片及びそのエピトープから選択される請求項１２１記載の単離された感染性組換えＲＳＶ。
【請求項１２３】
前記麻疹ウイルス（ｍｅａｓｌｅｓ ｖｉｒｕｓ）ＨＡ遺伝子のオープンリーデングフレーム（ＯＲＦ）を含む転写単位が、ＨＲＳＶベクターゲノム又はアンチゲノム内に付加されるか、又は組み込まれている請求項１２１記載の単離された感染性組換えＲＳＶ。
【請求項１２４】
野生型ＲＳＶゲノムまたはアンチゲノム内に前記ＲＳＶ遺伝子又はゲノムセグメントの位置に対してプロモータへ有意的に隣接する位置又はプロモータへ遠位な位置に、位置的に変位される前記組換えゲノム又はアンチゲノム内の１又は複数の変位されたＲＳＶ遺伝子又はゲノムを有する組換えＲＳＶガノム又はアンチゲノムを含む単離されたポリヌクレオチド分子。
【請求項１２５】
前記１又は複数の転座遺伝子又はゲノム分節が、前記１部又は完全な組み換えＲＳＶゲノム又はアンチゲノム内により１又は複数の置換ポリヌクレオチドの挿入又は欠失により有意的にプロモータへ隣接する位置に変位される請求項１２４記載の単離されたポリヌクレオチド分子。
【請求項１２６】
前記置換ポリヌクレオチドが、ゲノム又はアンチゲノムの非コード領域（ＮＣＲ）に、又は別々の遺伝子単位（ＧＵ）として挿入される長さが１５０ヌクレオチド（ｎｔｓ）と４，０００ヌクレオチドの間の１又は複数のポリヌクレオチドの挿入を含み、前記ポリヌクレオチドの挿入には、完全なオープンリーデングフレーム（ＯＲＦ）を欠損し、前記組換えＲＳＶの弱毒化表現型を特定する請求項１２５記載の単離されたポリヌクレオチド分子。
【請求項１２７】
前記ポリヌクレオチドの挿入体は、１又は複数のＲＳＶ遺伝子又はゲノム分節を含んで成る請求項１２６記載の単離されたポリヌクレオチド分子。
【請求項１２８】
前記置換ポリヌクレオチドが、ＲＳＶのＮＳ１、ＮＳ２、Ｎ、Ｐ、Ｍ、ＳＨ、Ｍ２（ＯＲＦ１）、Ｍ２（ＯＲＦ２）、Ｌ、Ｆ、及びＧ遺伝子又はゲノム分節あるいは、ＲＳＶゲノム又はその分節の先導部、尾部及び遺伝子間領域から選択される１又は複数のウシＲＳＶ（ＢＲＳＶ）又はヒトＲＳＶ（ＨＲＳＶ）遺伝子又はゲノム分節を含んで成る請求項１２７記載の単離されたポリヌクレオチド分子。
【請求項１２９】
野生型ＲＳＶゲノム又はアンチゲノム内にて前記ＲＳＶ遺伝子又はゲノム分節の位置に対して有意的なプロモータ隣接位置に、前記組換えゲノム又はアンチゲノム内の前記１又は複数の変位されたＲＳＶ遺伝子又はゲノム分節を位置的に変位させる組換えＲＳＶゲノム又はアンチゲノムを形成するために、前記置換ポリヌクレオチドが欠失される請求項１２８記載の単離されたポリヌクレオチド分子。
【請求項１３０】
組換えＲＳＶゲノム又はアンチゲノムを形成するために欠失される前記置換ポリヌクレオチドが、１又は複数のＲＳＶのＮＳ１，ＮＳ２，ＳＨ，Ｍ２（ＯＲＦ２）、又はＧ遺伝子又はそのゲノム分節を含んで成る請求項１２９記載の単離されたポリヌクレオチド分子。
【請求項１３１】
ＲＳＶのＮＳ１遺伝子を含む前記置換ポリヌクレオチドが、組換えＲＳＶゲノム又はアンチゲノムを形成するために欠失される請求項１３０記載の単離されたポリヌクレオチド分子。
【請求項１３２】
ＲＳＶのＮＳ２遺伝子を含む前記置換ポリヌクレオチドが、組換えＲＳＶゲノム又はアンチゲノムを形成するために欠失される請求項１３０記載の単離されたポリヌクレオチド分子。
【請求項１３３】
ＲＳＶのＳＨ遺伝子を含む前記置換ポリヌクレオチドが、組換えＲＳＶゲノム又はアンチゲノムを形成するために欠失される請求項１３０記載の単離されたポリヌクレオチド分子。
【請求項１３４】
ＲＳＶのＭ２（ＯＲＦ２）遺伝子を含む前記置換ポリヌクレオチドが、組換えＲＳＶゲノム又はアンチゲノムを形成するために欠失される請求項１３０記載の単離されたポリヌクレオチド分子。
【請求項１３５】
ＲＳＶのＧ遺伝子を含む前記置換ポリヌクレオチドが、組換えＲＳＶゲノム又はアンチゲノムを形成するために欠失される請求項１３０記載の単離されたポリヌクレオチド分子。
【請求項１３６】
ＲＳＶのＦ及びＧ遺伝子が、組換えＲＳＶゲノム又はアンチゲノムを形成するために共に欠失される請求項１３０記載の単離されたポリヌクレオチド分子。
【請求項１３７】
ＲＳＶのＮＳ１及びＮＳ２遺伝子が、組換えＲＳＶゲノム又はアンチゲノムを形成するために共に欠失される請求項１３０記載の単離されたポリヌクレオチド分子。
【請求項１３８】
ＲＳＶのＳＨ及びＮＳ２遺伝子が、組換えＲＳＶゲノム又はアンチゲノムを形成するために共に欠失される請求項１３０記載の単離されたポリヌクレオチド分子。
【請求項１３９】
ＲＳＶのＳＨ，ＮＳ１及びＮＳ２遺伝子が、組換えＲＳＶゲノム又はアンチゲノムを形成するために全て欠失される請求項１３０記載の単離されたポリヌクレオチド分子。
【請求項１４０】
野生型ＲＳＶゲノム又はアンチゲノム内にて前記ＲＳＶ遺伝子又はゲノム分節の位置に対して有意的なプロモータ隣接位置に、又はプロモータへ遠位な位置に、前記組換えゲノム又はアンチゲノム内の前記１又は複数の変位されたＲＳＶ遺伝子又はゲノム分節を位置的に変位させる組換えＲＳＶゲノム又はアンチゲノム内にて、前記置換ポリヌクレオチドが付加、置換、再配列される請求項１２８記載の単離されたポリヌクレオチド分子。
【請求項１４１】
組換えＲＳＶゲノム又はアンチゲノム内にて付加、置換、又は再配列される前記置換ポリヌクレオチドが、１又は複数のＲＳＶのＮＳ１，ＮＳ２，ＳＨ，Ｍ２（ＯＲＦ２）、Ｆ及び／又はＧ遺伝子又はそのゲノム分節を含んで成る請求項１４０記載の単離されたポリヌクレオチド分子。
【請求項１４２】
前記置換ポリヌクレオチドが、１又は複数のＲＳＶの糖タンパク質又は免疫原ドメイン又はそのエピトープをコードする１又は複数のＲＳＶ遺伝子又はゲノム分節を含んで成る請求項１４０記載の単離されたポリヌクレオチド分子。
【請求項１４３】
前記置換ポリヌクレオチドが、ＲＳＶのＦ，Ｇ及び／又はＳＨの糖タンパク質、又は免疫原ドメイン又はそのエピトープをコードする遺伝子又はゲノム分節から選択される請求項１４１記載の単離されたポリヌクレオチド分子。
【請求項１４４】
Ｆ，Ｇ及びＳＨから選択される１又は複数のＲＳＶ糖タンパク質遺伝子が、前記１又は複数のＲＳＶ糖タンパク質遺伝子における野生型遺伝子順位の位置と比較して有意的にプロモータへ隣接する位置に、前記組換えＲＳＶゲノム又はアンチゲノム内にて付加、置換又は再配列される請求項１４３記載の単離されたポリヌクレオチド分子。
【請求項１４５】
前記ＲＳＶ糖タンパク質遺伝子Ｇが、Ｇの野生型遺伝子配列の位置と比較してプロモータへ有意的に隣接する遺伝子配列の位置に対して、前記組換えＲＳＶゲノム又はアンチゲノム内にて再配列される請求項１４４記載の単離されたポリヌクレオチド分子。
【請求項１４６】
前記ＲＳＶ糖タンパク質遺伝子Ｇが、前記組換えＲＳＶゲノム又はアンチゲノム内にて遺伝子順位の位置１に変位される請求項１４５記載の単離されたポリヌクレオチド分子。
【請求項１４７】
前記糖タンパク質遺伝子Ｆが、Ｆの野生型遺伝子配列の位置と比較してプロモータへ有意的に隣接する遺伝子配列の位置に対して、前記組換えＲＳＶゲノム又はアンチゲノム内にて再配列される請求項１４４記載の単離されたポリヌクレオチド分子。
【請求項１４８】
前記ＲＳＶ糖タンパク質遺伝子Ｆが、前記組換えＲＳＶゲノム又はアンチゲノム内にて遺伝子順位の位置１に変位される請求項１４７記載の単離されたポリヌクレオチド分子。
【請求項１４９】
前記糖タンパク質遺伝子Ｇ及びＦが共に、Ｇ及びＦの野生型遺伝子配列の位置と比較してプロモータへ有意的に隣接する遺伝子配列の位置に対して、前記組換えＲＳＶゲノム又はアンチゲノム内にて再配列される請求項１４４記載の単離されたポリヌクレオチド分子。
【請求項１５０】
前記ＲＳＶ糖タンパク質遺伝子Ｇが、前記組換えＲＳＶゲノム又はアンチゲノム内にて遺伝子順位の位置１に変位され，前記ＲＳＶ糖タンパク質遺伝子Ｆが、前記組換えＲＳＶゲノム又はアンチゲノム内にて遺伝子順位の位置２に変位される請求項１４９記載の単離されたポリヌクレオチド分子。
【請求項１５１】
１又は複数のＲＳＶのＮＳ１、ＮＳ２、ＳＨ、Ｍ２（ＯＲＦ２）、又はＧ遺伝子又はそのゲノム分節が、組換えＲＳＶゲノム又はアンチゲノムにおいて欠失される請求項１４４記載の単離されたポリヌクレオチド分子。
【請求項１５２】
ＲＳＶのＮＳ１遺伝子を含む置換ポリヌクレオチドが、組換えＲＳＶゲノム又はアンチゲノムを形成するために欠失される請求項１４４記載の単離されたポリヌクレオチド分子。
【請求項１５３】
ＲＳＶのＮＳ２遺伝子を含む置換ポリヌクレオチドが、組換えＲＳＶゲノム又はアンチゲノムを形成するために欠失される請求項１４４記載の単離されたポリヌクレオチド分子。
【請求項１５４】
ＲＳＶのＳＨ遺伝子を含む置換ポリヌクレオチドが、組換えＲＳＶゲノム又はアンチゲノムを形成するために欠失される請求項１４４記載の単離されたポリヌクレオチド分子。
【請求項１５５】
前記ＲＳＶ糖タンパク質遺伝子Ｇが、Ｇの野生型遺伝子配列の位置と比較してプロモータへ有意的に隣接する遺伝子配列の位置に対して、前記組換えＲＳＶゲノム又はアンチゲノム内にて再配列される請求項１５４記載の単離されたポリヌクレオチド分子。
【請求項１５６】
前記ＲＳＶ糖タンパク質遺伝子Ｇが、前記組換えＲＳＶゲノム又はアンチゲノム内にて遺伝子順位の位置１に変位される請求項１５５記載の単離されたポリヌクレオチド分子。
【請求項１５７】
前記ＲＳＶ糖タンパク質遺伝子Ｆが、Ｆの野生型遺伝子配列の位置と比較してプロモータへ有意的に隣接する遺伝子配列の位置に対して、前記組換えＲＳＶゲノム又はアンチゲノム内にて再配列される請求項１５４記載の単離されたポリヌクレオチド分子。
【請求項１５８】
前記ＲＳＶ糖タンパク質遺伝子Ｆが、前記組換えＲＳＶゲノム又はアンチゲノム内にて遺伝子順位の位置１に変位される請求項１５７記載の単離されたポリヌクレオチド分子。
【請求項１５９】
Ｆ１／ΔＳＨである請求項１５８記載の単離されたポリヌクレオチド分子。
【請求項１６０】
前記糖タンパク質遺伝子Ｇ及びＦが共に、Ｇ及びＦの野生型遺伝子配列の位置と比較してプロモータへ有意的に隣接する遺伝子配列の位置に対して、前記組換えＲＳＶゲノム又はアンチゲノム内にて再配列される請求項１５４記載の単離されたポリヌクレオチド分子。
【請求項１６１】
前記ＲＳＶ糖タンパク質遺伝子Ｇが、前記組換えＲＳＶゲノム又はアンチゲノム内の遺伝子順位の位置１に変位され，前記ＲＳＶ糖タンパク質遺伝子Ｆが、前記組換えＲＳＶゲノム又はアンチゲノム内の遺伝子順位の位置２に変位される請求項１６０記載の単離されたポリヌクレオチド分子。
【請求項１６２】
ＲＳＶのＳＨ及びＮＳ２遺伝子の両方が、組換えＲＳＶゲノム又はアンチゲノムを形成するために欠失される請求項１４４記載の単離されたポリヌクレオチド分子。
【請求項１６３】
前記糖タンパク質遺伝子Ｇ及びＦが共に、Ｇ及びＦの野生型遺伝子配列の位置と比較してプロモータへ有意的に隣接する遺伝子配列の位置に対して、前記組換えＲＳＶゲノム又はアンチゲノム内にて再配列される請求項１６２記載の単離されたポリヌクレオチド分子。
【請求項１６４】
前記ＲＳＶ糖タンパク質遺伝子Ｇが、前記組換えＲＳＶゲノム又はアンチゲノム内の遺伝子順位の位置１に変位され，前記ＲＳＶ糖タンパク質遺伝子Ｆが、前記組換えＲＳＶゲノム又はアンチゲノム内の遺伝子順位の位置２に変位される請求項１６３記載の単離されたポリヌクレオチド分子。
【請求項１６５】
ＲＳＶのＳＨ，ＮＳ１及びＮＳ２遺伝子が、組換えＲＳＶゲノム又はアンチゲノムを形成するために全て欠失される請求項１６４記載の単離されたポリヌクレオチド分子。
【請求項１６６】
前記糖タンパク質遺伝子Ｇ及びＦが共に、Ｇ及びＦの野生型遺伝子配列の位置と比較してプロモータへ有意的に隣接する遺伝子配列の位置に対して、前記組換えＲＳＶゲノム又はアンチゲノム内にて再配列される請求項１６５記載の単離されたポリヌクレオチド分子。
【請求項１６７】
前記ＲＳＶ糖タンパク質遺伝子Ｇが、前記組換えＲＳＶゲノム又はアンチゲノム内の遺伝子順位の位置１に変位され，前記ＲＳＶ糖タンパク質遺伝子Ｆが、前記組換えＲＳＶゲノム又はアンチゲノム内の遺伝子順位の位置２に変位される請求項１６６記載の単離されたポリヌクレオチド分子。
【請求項１６８】
前記組換えゲノム又はアンチゲノムが、ヒト−ウシ・キメラゲノム又はアンチゲノムを形成するために、異なるＲＳＶから１又は複数の異種遺伝子及び／又はゲノム分節と結合する１部又は完全なヒト又はウシＲＳＶを背景とするゲノム又はアンチゲノムを含んで成る請求項１２４記載の単離されたポリヌクレオチド分子。
【請求項１６９】
１部ウシＲＳＶを背景とするゲノム又はアンチゲノムにおけるＦ及びＧの糖タンパク質遺伝子の一方又は両方の等価物に置き換えるため、ヒトＲＳＶ糖タンパク質遺伝子Ｆ及びＧの一方又は両方が，置換される請求項１６８記載の単離されたポリヌクレオチド分子。
【請求項１７０】
１部ウシＲＳＶを背景とするゲノム又はアンチゲノムにおける同等のＦ及びＧの糖タンパク質遺伝子に置き換えるため、ヒトＲＳＶ糖タンパク質遺伝子Ｆ及びＧが共に置換される請求項１６９記載の単離されたポリヌクレオチド分子。
【請求項１７１】
１部又は完全なウシＲＳＶを背景とするゲノム又はアンチゲノム内に同等の遺伝子又はゲノム分節の野生型遺伝子配列の位置と比較してプロモータへ有意的に隣接する位置にて、Ｆ，Ｇ及びＳＨから選択される１又は複数のヒトＲＳＶ糖タンパク質遺伝子が、付加又は置換される請求項１６８記載の単離されたポリヌクレオチド分子。
【請求項１７２】
１部ウシＲＳＶを背景とするゲノム又はアンチゲノムにおいて、野生型位置７及び８にそれぞれ欠失される同等のＧ及びＦ糖タンパク質遺伝子を置き換えるために、ヒトＲＳＶ糖タンパク質遺伝子Ｇ及びＦが共に置換される請求項１７１記載の単離されたポリヌクレオチド分子。
【請求項１７３】
遺伝子の安定性を増大するため、又は組み換えウイルスの培養において弱毒化、反応の誘発性、又は増殖を変化させるために１部又は完全なウシを背景とするゲノム又はアンチゲノム内により、１又は複数の付加的な異種遺伝子又はゲノム文節のヒトのＲＳＶから付加又は又は置換によって、組換えゲノム又はアンチゲノムが、さらに修飾される請求項１２４記載の単離されたポリヌクレオチド分子。
【請求項１７４】
組み換えゲノム又はアンチゲノムが、ヒトＲＳＶのサブグループＡとサブグループＢの両方から抗原決定基を組み込む請求項１２４記載の単離されたポリヌクレオチド分子。
【請求項１７５】
組み換えゲノム又はアンチゲノムが、１又は複数の弱毒化する変異化を組み込むことによりさらに修飾される請求項１２４記載の単離されたポリヌクレオチド分子。
【請求項１７６】
組み換えゲノム又はアンチゲノムが、増殖の特徴、弱毒化、温度感受性、低温適応性、プラークの大きさ、宿主範囲の制限の変化、又は免疫原性の変化から選択される表現型の変化を特定するヌクレオチド修飾を組み込むことによりさらに修飾される請求項１２４記載の単離されたポリヌクレオチド分子。
【請求項１７７】
ＳＨ、Ｓ１、ＮＳ２、Ｍ２ＯＲＦ２又はＧ遺伝子が修飾される請求項１７６記載の単離されたポリヌクレオチド分子。
【請求項１７８】
上記ＳＨ、ＮＳ１、ＮＳ２、Ｍ２ＯＲＦ２又はＧ遺伝子が、一部又は全体において欠失され、上記遺伝子の発現が、遺伝子のオープンリーデングフレームの１又は複数の停止コドンを導入することにより除去される請求項１７７記載の単離されたポリヌクレオチド分子。
【請求項１７９】
ヌクレオチドの修飾が、組み換えゲノム又はアンチゲノム内の選択されるＲＳＶ遺伝子のシス作用調節配列におけるヌクレオチドの欠失、挿入、付加又は再配列を含んで成る請求項１７６記載の単離されたポリヌクレオチド分子。
【請求項１８０】
前記置換ポリヌクレオチドが、ＲＳＶのオープンリーデングフレームの開始部又は終了部における、又は遺伝子間領域に、又はＲＳＶゲノムの３’先導部又は５’尾部おける非翻訳配列内にて１又は複数の欠失を含んで成る請求項１２４記載の単離されたポリヌクレオチド分子。
【請求項１８１】
前記置換ポリヌクレオチドが、完全か、１部欠失した遺伝子を含んで成る請求項１８０記載の単離されたポリヌクレオチド分子。
【請求項１８２】
一部欠失した前記遺伝子が、一部欠失したＳＨ遺伝子である請求項１８１記載の単離されたポリヌクレオチド分子。
【請求項１８３】
前記ＳＨ遺伝子の１部欠失が、ＳＨ下流の非翻訳領域内を欠失することを含んで成る請求項１８２記載の単離されたポリヌクレオチド分子。
【請求項１８４】
組換えＲＳＶアンチゲノムにおける位置４４９９−４６１０の１１２ヌクレオチドを欠失したＲＳＶ６１２０である請求項１８３記載の単離されたポリヌクレオチド分子。
【請求項１８５】
前記置換ヌクレオチドが、ＲＳＶ遺伝子下流の非翻訳配列の１又は複数の領域から選択される請求項１２４記載の単離されたポリヌクレオチド分子。
【請求項１８６】
前記下流の非翻訳配列は、ＮＳ１（位置５１９−５６３）、ＮＳ２（位置１００３−１０８６）、Ｐ（位置３０７３−３２３０）、Ｍ（位置４０３３−４１９７）、Ｆ（位置７３８７−７５３９）、及び／又はＭ２（位置８４３３−８４９０）遺伝子からである請求項１８５記載の単離されたポリヌクレオチド分子。
【請求項１８７】
前記置換ヌクレオチドが，ＲＳＶ遺伝子上流の非翻訳配列の１又は複数の領域から選択される請求項１２４記載の単離されたポリヌクレオチド分子。
【請求項１８８】
前記１又は複数の上流の非翻訳配列は、ＮＳ１（位置５５−９６）、ＮＳ２（位置６０６−６２４）、及び／又はＳＨ（位置４２３１−４３００）遺伝子からである請求項１８７記載の単離されたポリヌクレオチド分子。
【請求項１８９】
前記置換ヌクレオチドが，ＲＳＶのＧ遺伝子のヌクレオチド４６８３から４６８５の欠失を含んで成る請求項１２４記載の単離されたポリヌクレオチド分子。
【請求項１９０】
前記置換ヌクレオチドが、１又は複数のＲＳＶ遺伝子間配列から選択される請求項１２４記載の単離されたポリヌクレオチド分子。
【請求項１９１】
前記置換ヌクレオチドが、ＳＶ５’尾部領域内のヌクレオチソから選択される請求項１２４記載の単離されたポリヌクレオチド分子。
【請求項１９２】
Ｌ遺伝子のすぐ後に続く５’尾部領域部分を、無傷な５’ゲノム末端を残して、サイズが７５ヌクレオチド、１００ヌクレオチド、１２５ヌクレオチド，又はそれ以上減少させる請求項１９１記載の単離されたポリヌクレオチド分子。
【請求項１９３】
前記置換ヌクレオチドが，ＲＳＶ３’先導部領域内のヌクレオチソから選択される請求項１２４記載の単離されたポリヌクレオチド分子。
【請求項１９４】
３’先導部領域の最初の１１ヌクレオチドに配置されるウイルスプロモータの中核部分を除いて３’尾部領域部を欠失する請求項１９１記載の単離されたポリヌクレオチド分子。
【請求項１９５】
ＲＳＶのＮＳ１，ＮＳ２，ＳＨ，Ｆ及び／又はＭ２遺伝子の１又は任意の組み合わせから１部又は完全な欠失により、１−８０６間のヌクレオチドのゲノム長に調整可能な減少を得ることのできる請求項１２４記載の単離されたポリヌクレオチド分子。
【請求項１９６】
ＲＳＶの遺伝子間領域の１又は任意の組み合わせから１部又は完全な欠失により、１−１９８間のヌクレオチドのゲノム長に調整可能な減少を得ることのできる請求項１２４記載の単離されたポリヌクレオチド分子。
【請求項１９７】
ＲＳＶの遺伝子間領域の１又は任意の組み合わせから１部又は完全な欠失により、１−１９８間のヌクレオチドのゲノム長に調整可能な減少を得ることのできる請求項１２４記載の単離されたポリヌクレオチド分子。
【請求項１９８】
前記ＲＳＶをコードする１又は複数の単離されたポリヌクレオチド分子から感染性弱毒化組換えＲＳＶ粒子を製造するための方法であって、野生型ＲＳＶゲノム又はアンチゲノム内の前記ＲＳＶ遺伝子又はゲノム分節，位置に対してプロモータへ有意的に隣接するか、又はプロモータへ遠位な位置に位置的に変位される前記組換えゲノム又はアンチゲノム内の１又は複数の変位されたＲＳＶ遺伝子又はゲノム、あるいはゲノム分節を有する組換えＲＳＶゲノム又はアンチゲノム、及びＲＳＶのＮ，Ｐ，Ｌ及びＲＮＡポリメラーゼ伸長因子タンパク質を含む発現ベクターを、細胞又は細胞の無い溶離産物中にて発現させることを含んでいる感染性弱毒化組換えＲＳＶ粒子を製造するための方法。
【請求項１９９】
組換えＲＳＶゲノム又はアンチゲノム、及びＲＳＶのＮ，Ｐ，Ｌ及びＲＮＡポリメラーゼ伸長因子タンパク質が、１又は複数の異なる発現ベクターにより発現される請求項１９８記載の方法。
【請求項２００】
ヒト−ウシキメラＲＳＶゲノム又はアンチゲノムを形成するために、ＲＳＶのＮＳ１、ＮＳ２、Ｍ、Ｇ、及び／又はＦの異種遺伝子及び／又はゲノム分節から選択されるヒトＲＳＶの複数の異種遺伝子及び／又はゲノム分節と組み合わされる主要なヌクレオキャプシド（Ｎ）タンパク質、ヌクレオキャプシドリン酸タンパク質（Ｐ）、大型ポリメラーゼタンパク質（Ｌ）、ＲＮＡポリメラーゼ伸長因子、及び１部又は完全なウシＲＳＶを背景とするゲノム又はアンチゲノムを含んでいる単離された感染性キメラ呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）。
【請求項２０１】
ヒトのＮＳ１とＮＳ２遺伝子の両方を、ウシの同等なＮＳ１及びＮＳ２遺伝子にて置換する請求項２００記載の単離された感染性ＲＳＶ。
【請求項２０２】
ｒＢＲＳＶ／Ａ２−ＮＳ１＋２である請求項２０１記載の単離された感染性ＲＳＶ。
【請求項２０３】
ヒトＮＳ１，ＮＳ２，Ｇ，及びＦ遺伝子を、ウシの同等なＮＳ１，ＮＳ２，Ｇ，及びＦ遺伝子にて置換する請求項２００記載の単離された感染性ＲＳＶ。
【請求項２０４】
ｒＢＲＳＶ／Ａ２−ＮＳ１＋２ＧＦである請求項２０３記載の単離された感染性ＲＳＶ。
【請求項２０５】
ヒトＭ、ＳＨ、Ｇ及びＦ遺伝子を、ウシの同等なＭ、ＳＨ、Ｇ及びＦ遺伝子に置換する請求項２００記載の単離された感染性ＲＳＶ。
【請求項２０６】
ｒＢＲＳＶ／Ａ２−ＭＳＨＧＦである請求項２０３記載の単離された感染性ＲＳＶ。
【請求項２０７】
ヒト−ウシ・キメラＲＳＶゲノム又はアンチゲノムを形成するために、ＲＳＶのＮＳ１、ＮＳ２、Ｍ、ＳＨ、Ｇ、及び／又はＦ遺伝子の異種遺伝子及び／又はゲノム分節から選択される複数の異種遺伝子及び／又はゲノム分節と組み合わされた一部又は完全なウシＲＳＶを背景とするゲノム又はアンチゲノムを含む組替えＲＳＶゲノム又はアンチゲノムを含んでいる単離されたポリヌクレオチド分子。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の背景
ヒト呼吸器系合胞体ウイルス（ＨＲＳＶ）は、世界中に重篤な小児気道疾患を起こしている主たるウイルス因子（Ｃｏｌｌｉｎｓ，ら、Ｆｉｅｌｄｓ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２：１３１３−１３５２，１９９６）である。ＲＳＶが、１歳未満の乳児の肺炎や細気管支炎の原因として他のあらゆる微生物病原を越えている。事実上全ての子供が、２歳までに感染し、再感染が年長の子供、及び大人として若年者が、再感染をかなり高い頻度で起っている（Ｃｈａｎｏｃｋ ｅｔ ａｌ．、ｉｎ Ｖｉｒａｌ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｈｕｍａｎｓ、３ｒｄ ｅｄ．、Ａ．Ｓ．Ｅｖａｎｓ、ｅｄ．、Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ、Ｎ．Ｙ．、１９８９）。気道疾患が原因の小児入院患者の５名のうち２名以上は、ＲＳＶが原因となっており、ＲＳＶは米国だけでも１０万人の入院患者が発生し、年間４，５００人の死亡者を出している（Ｈｅｉｌｍａｎ、Ｊ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ １６１：４０２−６、１９９０）。さらに幼若にて重篤な気道疾患の感染に罹ると、喘息を発症するか又は喘息を悪化させたりすることを実証している（Ｓｉｇｕｒｓ、ｅｔ ａｌ．、Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ ９５：５００−５、１９９５）。
【０００２】
ヒトＲＳＶは、通常小児患者集団の状況下にて考えられるが、さらに加齢者における重篤な疾患に対する重要な薬剤としても認識される（Ｆａｌｓｅｙら、Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１７２：３８９−３９４，１９９５）。ヒトＲＳＶが、ヒト骨髄移植のレシュペントなど、ある種の免疫不全の個体において、生命の脅威となる疾患を引き起こす（Ｆｏｕｉｌｌａｒｄ、ｅｔ ａｌ．、Ｂｏｎｅ Ｍａｒｒｏｗ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ ９：９７−１００、１９９２）。
【０００３】
ヒトＲＳＶを治療として、１つの化学的治療剤であるリバビリンが、利用することができる。しかしながら、その効果やその使用性は、論議されるところである。さらに、少ないドナーＩｇＧ（Ｇｒｏｏｔｈｕｉｓ ｅｔ ａｌ．、Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ３２９：１５２４−３０，１９９３）、又は人に向けたＲＳＶ−特異的モノクローナル抗体を組み合わされたＲＳＶ介在産生物が認可された。これらは、高リスクな個体に受動的（ｐａｓｓｉｖｅ）な免疫保護剤として投与される。これらの産生物は有益であるが、コストが高く、長期にわたり効果がないなど、他の要因により、広範囲な使用を適切でなくしている。別の欠点としては、血液−骨によりウイルスを移植する可能性、調製及び保存が難しく、コストがかかることを含む。さらに、感染疾患、及びウイルスを資源となる疾患を管理する履歴が、ワクチンの重要性な中核となることを示している。
【０００４】
ＲＳＶに対して有効なワクチン剤を開発するために数十年にわたる研究にもかかわらず、ＲＳＶ感染に関係する厳しい罹病率及び有意的な死亡を防止するための安全で有効なワクチンが、全く実現されなかった。有効なワクチンが開発されないことは、小さい幼児達が、血清、及びＲＳＶ抗原に応答して分泌する抗体が減少していたという事実において、ある部分に関係している。したがって、これらの個体が、ＲＳＶのより重篤な感染にかかると、免疫性が累積しウイルスのより深刻な衝撃い対して、年齢を経た子供達及び成人を保護するものと見える。
【０００５】
ＲＳＶ感染における免疫性の機構が、最近中心的な課題となっている。分泌性の抗体が、上部気道を保護する際最も重要であると見られ、そのことから高レベルな血清抗体が、低部気道におけるＲＳＶの感染に対する抵抗性に主要な役割を有すると見られる。誘発される別の有効なアームとして、ＲＳＶ−特異的な細胞毒性Ｔ細胞が、ＲＳＶの感染を解決する際にも重要である。しかしながら、ウイルスの攻撃に対する抵抗性を増大させるために、後者のエフェクターを、前の免疫化により論議できるが、その効果としての有効性が短で。Ｆ及びＧの表面Ｇタンパク質が、ＲＳＶの２の主要な保護抗原であり、そしてＲＳＶを中和する抗体を誘発、及び攻撃に対して長期に抵抗するために示されたわずか２のＲＳＶタンパク質である（Ｃｏｌｌｉｎｓ ｅｔ ａｌ．、Ｆｉｅｌｄｓ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、Ｆｉｅｌｄｓ ｅｔ ａｌ．、ｅｄｓ．、２：１３１３−１３５２、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、１９９６；Ｃｏｎｎｏｒｓ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６５（３）：１６３−７、１９９１）。第３のＲＳＶ表面タンパク質、ＳＨが、ＲＳＶを中和する抗体、又はＲＳＶの攻撃に有意的に抵抗を誘発しなかった。
【０００６】
ＲＳＶ生ワクチンを開発する上で障害となるのは、これは、部分的に弱毒化されたウイルスの遺伝的な不安定性、細胞培養におけるＲＳＶの比較的貧弱な増殖、及びウイルス粒子の不安定性により、弱毒化と免疫原性の間に適切なバランスを実現することが、困難である。加えて、自然感染により誘発される免疫性が、後の感染に対して十分に保護するわけではない。多くの因子が、気道の管腔表面へのウイルス感染を制限する免疫系の相対的な非効率性、局所粘膜免疫が短期寿命であるという性質、迅速にて、拡張性のあるウイルスの複製、免疫性が未成熟による幼児の免疫応答性の減少、胎盤経由で誘導される母体の血清抗体による免疫抑制、及びＧタンパク質の高度なグリコシル化などウイルスの幾つかの性質を含めて、これにおそらく関与している。さらに下記のように、ヒトＲＳＶが、抗原のサブグループＡ及びＢとして存在し、一方のサブグループに対する免疫性が、もう一方のサブグループに対する効果を減少させる。
【０００７】
ＲＳＶに、生存中複数回にわたり再感染するが、通常再感染が、前回の感染により誘発される保護免疫性により、その重篤度が低減され、従って免疫学的予防が可能である。生の弱毒化ＲＳＶワクチンが、免疫性を与える軽度な免疫となる感染を開始するために、鼻から投与されることになる。これは、非経口経路と比較して、簡単で安全であるという利点がある。さらに、局部気道の免疫性を直接的な刺激を提供し、ＲＳＶに対する抵抗性に主要な役割を果たす。さらに、この方法は、幼若期に典型的に見られるＲＳＶ特異的母体から血清抗体の免疫抑制効果を阻止している。また、ＲＳＶ抗原の非経口投与が、時に免疫病理学的合併症を併発することがあるが（Ｍｕｒｐｈｙ ｅｔ ａｌ．、Ｖａｃｃｉｎｅ ８（５）：４９７−５０２、１９９０）、これは生のウイルスでは観察されていない。
【０００８】
ホルマリンによる不活化ウイルスワクチンを、１９６０年代の半ばにＲＳＶに対して試験したが、ＲＳＶ感染又は疾病に対して保護することができず、実際にウイルスによる後の感染時に症状をさらに悪くした（Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．、Ａｍ．Ｊ．Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ．８９：４２２−４３４、１９６９、Ｃｈｉｎ ｅｔ ａｌ．、Ａｍ Ｊ．Ｅｐｄｅｍｉｏｌ．８９：４４９−４６３、１９６９、Ｋａｐｉｋｉａｎ ｅｔ ａｌ．、Ａｍ．Ｊ．Ｅｐｄｅｍｉｏｌ．８９：４０５−４２１、１９６９）。
【０００９】
最近では、ＲＳＶに対するワクチンの開発は、弱毒化したＲＳＶ変異体に焦点が当てられている。Ｆｒｌｅｄｅｗａｌｄ ｅｔ ａｌ．、（Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｍｅｄ．Ａｓｓｏｃ．２０４：６９０−６９４、１９６８）が、ワクチンの候補になるように、充分弱毒化されると見られるＲＳＶの低温継代培養の変異体（ｃｐＲＳＶ）について報告している。この変異体が、その野生型親ウイルスと比較して、２６℃にて増殖効率がわずかに高いことを示したが、その複製体は、温度感受性も、有意的な低温適応性もなかった。しかしながら、この低温継代培養された変異体が、成人に対して弱毒化される。ＣｐＲＳＶ変異体が、以前にＲＳＶに感染したことがある乳児及び子供（すなわち、血清反応陽性の個体）に対して満足できる弱毒化、及び免疫原性があるが、血清反応陰性の乳児の上部気道に対しては低レベルの発病力を保持していた。
【００１０】
同様に、Ｇｈａｒｐｕｒｅ ｅｔ ａｌ．、（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．３：４１４−４２１、１９６９）が、ワクチン候補として期待できる温度感受性ＲＳＶ（ｔｓＲＳＶ）変異体の分離について報告している。
一つ変異体、ｔｓ−１が、研究室内でまたボランティアを募って広範囲にわたり評価された。この変異体は、成人のボランティアに無症候性の感染を形成し、そして免疫化４５日後に野生型ウイルスによる攻撃に対する抵抗力を付与した。
【００１１】
さらに、血清反応陽性の乳児及び子供を、無症候性の感染を経験させたが、血清反応陰性の乳児は鼻炎の兆候、及び他の軽い症状を呈した。さらに、ｔｓ表現型の不安定性が検出された。１部又は完全な温度感受性を喪失しているウイルスが、ワクチン接種者から回収できる少集団のウイルスを示しているが、これは軽い鼻炎以外の疾病兆候とは関連性がなかった。
【００１２】
ある種の低温継代及び温度感受性のＲＳＶ菌株は、弱毒化が不十分で、何人かのワクチン接種者、特に血清反応陰性の乳児において、疾病の軽い症状を引き起こすが、一方ではＲＳＶ菌株が、過度に弱毒化され、保護免疫応答を惹起するために、十分に複製することができないことが、上記の研究及び他の研究によって示した（Ｗｒｉｇｈｔ ｅｔ ａｌ．、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ，、３７：３９７−４００、１９８２）。さらに、候補ワクチンの変異体の遺伝的な不安定性が、その温度感受性表現型を喪失することになり、さらには有効なＲＳＶワクチンの開発を妨げる結果となっている。（Ｈｏｄｅｓ ｅｔ ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．１４５：１１５８−１１６４、１９７４；ＭｃＩｎｔｏｓｈ ｅｔ ａｌ．、Ｐｅｄｉａｔｒ．Ｒｅｓ．８：６８９−６９６、１９７４；ａｎｄ Ｂｅｌｓｈｅ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｖｉｒｏｌ．３：１０１−１１０、１９７８）を一般論として参照。
【００１３】
選択肢として生の弱毒化ＲＳＶワクチンに対し、さらに研究者が、精製されたＲＳＶエンベロープ糖タンパク質を使って、サブユニットワクチン候補を試験した。この糖タンパク質が、コットンラットの肺内にＲＳウイルス感染に対する抵抗性を誘発（Ｗａｌｓｈ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１５５：ｌ１９８− −１２０４、１９８７）したが、前記抗体が、極めて弱い中和作用を有し、精製されたサブユニットワクチンによるげっ歯類の免疫化が、疾病を相乗作用する結果となった（Ｍｕｒｐｈｙ ｅｔ ａｌ．、Ｖａｃｃｉｎｅ ８：４９７−５０２、１９９０）。
【００１４】
さらにＦ及びＧエンベロープ糖タンパク質を発現する組換え型種痘ウイルスワクチンを調査した。これらの組換え型が、真正ウイルス相当体から区別できないＲＳＶ糖タンパク質を発現し、種痘ＲＳＶのＦ及びＧ組換え型により皮内に感染したゲッ歯類から、ウイルスの感染性を中和した高レベルの特異的抗体を生成した。実際に種痘Ｆ組換え型によるコットンラットの感染には、下部気道においてＲＳＶの複製対するほぼ完全な抵抗性、そして上部気道において有意的な抵抗性を刺激した（Ｏｌｍｓｔｅｄ ｅｔ ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８３：７４６２−７４６６、１９８６）。しかしながら、種痘Ｆ及びＧ組換え型によるチンパンジーの免疫化により提供されるものが、上部気道へＲＳＶの攻撃に対してほとんど保護されなく（Ｃｏｌｌｉｎｓ ｅｔ ａｌ．、Ｖａｃｃｉｎｅ ８：１６４−１６８、１９９０）、下部気道へ継続して保護することができない（Ｃｒｏｗｅ ｅｔ ａｌ．、Ｖａｃｃｉｎｅ １１：１３９５−１４０４、１９９３）。
【００１５】
有効なＲＳＶワクチンの開発のため種々の努力にもかかわらず、認可されるワクチンとして、まだＲＳＶに対して全く承認されていない。先に取られたアプローチが実現されなかったことから、ＲＳＶ開発を目指し新しい戦略の必要性を、特に、変動可能な、弱毒化されたＲＳＶ組換え型において新しい表現型の特質を生み出す遺伝子的な変化を組み込むための組換えＲＳＶを操作する方法の必要性が、強調される。しかしながら、ＲＳＶのゲノムＲＮＡ及び他の非分節性ネガティブセンスＲＮＡウイルスを操作することは、これまで困難であるとされてきた。この点に関する主要な障害には、これらウイルスの裸ゲノムＲＮＡの非感染性、組織培養における貧弱なウイルス増殖、長期に渡る複製サイクル、ビリオンの不安定さ、複合ゲノム、遺伝子産物の治療不応性組織が含まれる。
【００１６】
組換えＤＮＡの技術により、感染を起こす非分節性負鎖ＲＮＡウイルスをｃＤＮＡから回復すること、新規なワクチン候補を構成するためにウイルスクローンを遺伝子的に操作すること、さらにその弱毒化及び表現型安定性のこれらレベルを迅速に評価することが可能となった（Ｃｏｎｚｅｌｍａｎｎ、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７７：３８１−８９、１９９６；Ｐａｌｅｓｅ ｅｔ ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９３：１１３５４−５８、１９９６以下を参照のこと）。この状況において、組換えレスキュウとしは、ウイルスの必須タンパク質の存在下、ｃＤＮＡがコードされるアンチゲノムＲＮＡから、感染性の呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）、パラインフルエンザウイルス（ＰＩＶ）、狂犬病ウイルス（ＲａＶ）、水泡性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、麻疹ウイルス（ＭｅＶ）、牛疫及びセンダイウイルス（ＳｅＶ）などに関しより報告されてきた（たとえばＧａｒｃｉｎ ｅｔ ａｌ．、ＥＭＢ０ Ｊ．１４：６０８７−６０９４、１９９５、Ｌａｗｓｏｎ ｅｔ ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９２：４４７７−８１、１９９５、Ｒａｄｅｃｋｅ ｅｔ ａｌ．、ＥＭＢＯ Ｊ．１４：５７７３−５７８４、１９９５；Ｓｃｈｎｅｌｌ ｅｔ ａｌ．、ＥＭＢＯ Ｊ．１３：４１９５−２０３、１９９４，Ｗｈｅｌａｎ ｅｔ ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９２：８３８８−９２、１９９５、Ｈｏｆｆｍａｎ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１：４２７２−４２７７、１９９７、Ｐｅｃｔｅｒｓ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７３：５００１−５００９、１９９９、Ｋａｔｏ ｅｔ ａｌ．、Ｇｅｎｅｓ ｔｏ Ｃｅｌｌｓ １：５６９−５７９、１９９６、Ｒｏｂｅｒｔｓ ｅｔ ａｌ．、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２４７（１）、１−６，１９９８、Ｂａｒｏｎ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１：１２６５−１２７１、１９９７、国際公開番号Ｗ０９７／０６２７０、１９９５年９月２７日に提出された米国特許仮出願番号６０／００７，０８３、１９９６年９月２７日に提出された米国特許出願番号０８／７２０，１３２、１９９６年７月１５日に提出された米国特許仮出願番号６０／０２１，７７３、１９９７年５月９日に提出された米国特許仮出願番号６０／０４６，１４１、１９９７年５月２３日に提出された米国特許仮出願番号６０／０４７，６３４、１９９９年１１月３０日に発行された米国特許番号５，９９３，８２４（国際公開番号Ｗ０９８／０２５３０に対応する）、Ｃｏｌｌｉｎｓｅ．により１９９９年４月１３日に提出された米国特許出願番号０９／２９１，８９４、Ｍｕｒｐｈｙｅ ｅｔａｌ．により１９９９年４月１３日に提出された米国特許仮出願番号６０／１２９，００６、Ｃｏｌｌｉｎｓ ｅｔ ａｌ．、Ｐｒｏｃ Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９２：１１５６３−ｌ１５６７、１９９５、Ｂｕｋｒｅｙｅｖ、ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７０：６６３４−４１、１９９６、Ｊｕｈａｓｚ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１（８）：５８１４−５８１９、１９９７、Ｄｕｒｂｉｎ ｅｔ ａｌ．、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２３５：３２３−３３２、１９９７、Ｈｅ ｅｔ ａｌ．、Ｖｉｒｌｏｇｙ ２３７：２４９−２６０、１９９７、Ｂａｒｏｎｅ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１：１２６５−１２７１、１９９７、Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ ｅｔ ａｌ．、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２４７（２）：２３２−９、１９９８ａ、Ｂｕｃｈｈｏｌｚ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７３：２５１−９、１９９９、Ｗｈｉｔｅｈｅａｄｅ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２（５）：４４６７−４４７１、１９９８ｂ、Ｊｉｎ ｅｔ ａｌ．、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２５１：２０６−２１４、１９９８、ａｎｄ Ｗｈｉｔｅｈｅａｄｅ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７３（４）：３４３８−３４４２、１９９９、ａｎｄ Ｂｕｋｒｅｙｅｖ、ｅｔ ａｌ．、Ｐｒｏｃ Ｎａｔ Ａｃａｄ Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９６：２３６７−７２、１９９９、を参照、各々が、あらゆる目的のためその全体を引例として本明細書に組み込まれている）。
【００１７】
前記開発により、現在、ｃＤＮＡから感染性ＲＳＶを回収させ、新規なワクチン候補を構成するために、ＲＳＶクローンに種々の遺伝子操作を設計し、順次実行することが可能となった。以後他の所望の表現型特性における、弱毒化及び表現型の安定性のレベルが評価され、調整することができる。従って残っている問題点は、広範囲なワクチンを使用するために有用な感染性を弱毒化したＲＳＶクローンを構成するために、単独の遺伝子操作又は他の型の遺伝子操作と組み合わせて用いることのできる遺伝子操作の広範囲にて、多様なメニューを開発することである。このような状況において、安全で有効なワクチンを遺伝子操作することで、ＲＳＶに帰する健康上深刻な問題を取り除くことができる付加的ツール及び方法に対する技術において、差し迫った必要性が依然として存在する。驚いたことに、本発明は、感染性の弱毒化されたＲＳＶワクチン候補を構成するために追加ツールを提供することによって、この必要性を満たすものである。
【００１８】
発明の要約
本発明は、組換えＲＳＶゲノム又はアンチゲノム内の１又は複数の遺伝子又はゲノム分節を相対的な遺伝子順位又は離れた位置に変位させることにより修飾される組換え呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶｓ）を提供することであり、すなわちヒト又は他の哺乳動物に感染性、弱毒化、及び免疫原性がある組換えワクチンウイルスを生成するためである。本発明の組換えＲＳＶｓが、主要ヌクレオキャプシド（Ｎ）タンパク質、ヌクレオキャプシドリン酸タンパク質（Ｐ）、大型のポリメラーゼタンパク質（Ｌ）、ＲＮＡポリメラーゼ伸長因子、及び組換えゲノム又はアンチゲノム内の１又は複数の変位されたＲＳＶ遺伝子又はゲノム分節を有する１部又は完全な組換えＲＳＶゲノム又はアンチゲノムを、典型的に含んでいる。本発明のある観点においては、組換えＲＳＶが、１部又は完全な組換えＲＳＶゲノム又はアンチゲノム内の１つ又は複数の置換ポリヌクレオチドを挿入、欠失、又は再配列することによりプロモータへ有意的に隣接する又はプロモータへ遠位の位置に変位可能な１又は複数の位置的に変位される遺伝子又はゲノム分節を特徴とする。置換ポリヌクレオチドが、組換えＲＳＶゲノム又はアンチゲノムの非コード領域（ＮＣＲ）に挿入又は再配置できるか、あるいは別々の遺伝子単位（ＧＵ）として、組換えＲＳＶゲノム又はアンチゲノムに組み込むことができる。
【００１９】
本発明の実施例では、単離された感染性組換えＲＳＶが、ＲＳＶのＮＳｌ、ＮＳ２、Ｎ、Ｐ、Ｍ、ＳＨ、Ｍ２（ＯＲＦｌ）、Ｍ２（ＯＲＦ２）、Ｌ、Ｆ及びＧ遺伝子及びゲノム分節から選択される１又は複数のＲＳＶ遺伝子又はゲノム分節、及び上記ＲＳＶゲノム及びその分節の先導部、尾部及び遺伝子間領域から選択可能な１又は複数の置換ポリヌクレオチドを追加、欠失、又は再配列することにより構成される。
【００２０】
より詳細な例において、組換えＲＳＶゲノム又はアンチゲノム内の、ポリヌクレオチド挿入要素、欠失又は再配列要素が、ＲＳＶのＮＳ１、ＮＳ２、Ｎ、Ｐ、Ｍ、ＳＨ、Ｍ２（ＯＲＦ１）、Ｍ２（ＯＲＦ２）、Ｌ、Ｆ及びＧ遺伝子又はゲノム分節から選択される１又は複数のウシＲＳＶ（ＢＲＳＶ）又はヒトＲＳＶ（ＨＲＳＶ）遺伝子又はゲノム分節、及び上記ＲＳＶゲノム又はその分節の先導部、尾部及び遺伝子間領域から選択される。
【００２１】
本発明の幾つかの観点において、置換ポリヌクレオチドが、組換えＲＳＶゲノム又はアンチゲノムが形成するために欠失される。置換ポリヌクレオチドをこの方法にて欠失すると、野生型ＲＳＶ（たとえばＨＲＳＶ Ａ２又はＢＲＳＶカンサス菌株）ゲノム又はアンチゲノム内の変位された遺伝子又はゲノム分節の位置に対して、プロモータへ有意的に隣接する位置に、組換えＲＳＶゲノム又はアンチゲノム内の１又は複数の「変位」ＲＳＶ遺伝子又はゲノム分節の位置的な変位を起こす。組換えＲＳＶゲノム又はアンチゲノムを形成するためにこの方法にて欠失することのできる典型的な置換ポリヌクレオチドが、１又は複数のＲＳＶのＮＳ１、ＮＳ２、ＳＨ、Ｍ２（ＯＲＦ２）、又はＧ遺伝子又はそのゲノム分節から選択することができる。
【００２２】
本発明のさらに詳細な例において、ＲＳＶのＮＳ１遺伝子を含む置換ポリヌクレオチドを、組換えＲＳＶゲノム又はアンチゲノムを形成するために欠失する。他の選択肢として、ＲＳＶのＮＳ２遺伝子を含む置換ポリヌクレオチドを、組換えＲＳＶゲノム又はアンチゲノムを形成するために欠失することができる。他の選択肢として、ＲＳＶのＳＨ遺伝子を含む置換ポリヌクレオチドを、組換えＲＳＶゲノム又はアンチゲノムを形成するために欠失することができる。他の選択肢として、ＲＳＶのＭ２（ＯＲＦ）を含む置換ポリヌクレオチドを、組換えＲＳＶゲノム又はアンチゲノムを形成するために欠失することができる。他の選択肢として、ＲＳＶのＧ遺伝子を含む置換ポリヌクレオチドを、組換えＲＳＶゲノム又はアンチゲノムを形成するために欠失することができる。
【００２３】
さらに追加的な例において、ＲＳＶ遺伝子又はゲノム分節から成る複数の置換ポリヌクレオチドを、欠失することができる。例えば、ＲＳＶのＦ及びＧ遺伝子の双方を組換えＲＳＶゲノム又はアンチゲノムを形成するために欠失することができる。他の選択肢として、ＲＳＶのＮＳ１及びＮＳ２遺伝子を、組換えＲＳＶゲノム又はアンチゲノムを形成するために、双方を欠失することができる。他の選択肢として、ＲＳＶのＳＨ及びＮＳ２遺伝子を、組換えＲＳＶゲノム又はアンチゲノムを形成するために、双方を欠失することができる。他の選択肢として、ＲＳＶのＳＨ、ＮＳ１及びＮＳ２遺伝子を、組換えＲＳＶゲノム又はアンチゲノムを形成するために、全部欠失することができる。
【００２４】
本発明の異なる例において、１又は複数の変位されたＲＳＶ遺伝子又はゲノム分節を位置的に変位させるために、組換えＲＳＶゲノム又はアンチゲノム内にて、上記１又は複数の置換ヌクレオチドが、付加、置換、又は再配列される、単離された感染性組換えＲＳＶが提供される。
【００２５】
これらの修飾のうち、遺伝子及びゲノム分節を挿入及び再配列により、相当する（たとえばウシ又はヒト）野生型ＲＳＶゲノム又はアンチゲノム内にて、各対象の（挿入又は再配列された） 遺伝子又はゲノム分節のそれぞれの位置に対してプロモータへ有意的に隣接する、又はプロモータへ遠位な位置に対象遺伝子又はゲノム分節を導入又は再配列することができる。組換えＲＳＶゲノム又はアンチゲノム内に、付加、置換、又は再配列される置換ポリヌクレオチドが、１又は複数のＲＳＶのＮＳｌ、ＮＳ２、ＳＨ、Ｍ２（ＯＲＦ２）、Ｆ、および／またはＧ遺伝子、又はそのゲノム分節から選択することができる。
【００２６】
さらに詳細な例において、置換ポリヌクレオチドが、１又は複数のＲＳＶ糖タンパク質又はその免疫原性ドメインまたはＲＳＶ糖タンパク質のエピトープをコードした、１又は複数のＲＳＶ遺伝子又はゲノム分節を含む組換えＲＳＶゲノム又はアンチゲノム内にて、挿入又は再配列するために選択される。典型的な例において、これらの置換ポリヌクレオチドが、そのＲＳＶのＦ、Ｇ、及び／又はＳＨ糖タンパク質又は免疫原性領域またはエピトープから選択される。例えば、Ｆ、Ｇ及びＳＨから選択された１又は複数のＲＳＶ糖タンパク質遺伝子が、その遺伝子の野生型遺伝子順位の位置と比較してプロモータへ有意的に隣接する又はプロモータ遠位である位置に、組換えＲＳＶゲノム又はアンチゲノム内にて、付加、置換、又は再配列することができる。
【００２７】
典型的な例において、ＲＳＶ糖タンパク質遺伝子Ｇが、組換えＲＳＶゲノム又はアンチゲノム内にて、野生型遺伝子順位のＧの位置と比較して、よりプロモータへ隣接している遺伝子順位の位置に再配列される。より詳細な観点において、ＲＳＶ糖タンパク質遺伝子Ｇが、前記組換えＲＳＶゲノム又はアンチゲノム内の遺伝子順位位置１に変位される。他の典型的な例において、ＲＳＶ糖タンパク質遺伝子Ｆが、組換えＲＳＶゲノム又はアンチゲノム内に、よりプロモータへ隣接する位置に、例えば、組換えＲＳＶゲノム又はアンチゲノム内の遺伝子順位位置１にＦ遺伝子を変位させることにより、再配列される。さらに別の典型的な例においては、ＲＳＶ糖タンパク質遺伝子Ｇ及びＦの双方が、組換えＲＳＶゲノム又はアンチゲノム内にて、それぞれの野生型遺伝子順位の位置と比較してよりプロモータへ隣接する遺伝子順位位置に再配列される。さらに詳細な観点において、ＲＳＶ糖タンパク質遺伝子Ｇが、遺伝子順位位置１に変位され、そしてＲＳＶ糖タンパク質遺伝子Ｆが、遺伝子順位位置２に変位される。
【００２８】
糖タンパク質の遺伝子変位を特徴とするさらに追加的な構成において、組み換えＲＳＶが、Ｆ、Ｇ及びＳＨから選択される１又は複数のＲＳＶ糖タンパク質遺伝子、又はそれらのゲノム分節を有し、組換えＲＳＶゲノム又はアンチゲノム内にて付加、置換、又は再配列されるが、前記１又は複数のＲＳＶのＮＳｌ、ＮＳ２、ＳＨ、Ｍ２（ＯＲＦ２）、又はＧ遺伝子、あるいはそのゲノム分節が欠失されるよう、生成される。従って、ＲＳＶのＦ、Ｇ、又はＳＨの遺伝子又はゲノム分節は、ＲＳＶのＮＳｌ遺伝子を含む置換ポリヌクレオチドが、組換えＲＳＶゲノム又はアンチゲノムを形成するために欠失されるという背景において、付加、置換、又は再配列することができる。他の選択肢として、ＲＳＶのＦ、Ｇ、又はＳＨの遺伝子又はゲノム分節は、ＲＳＶのＮＳ２遺伝子を含む置換ポリヌクレオチドが、組換えＲＳＶゲノム又はアンチゲノムを形成するために欠失されるという背景において、付加、置換、又は再配列することができる。他の選択肢として、ＲＳＶのＦ、Ｇ、又はＳＨの遺伝子又はゲノム分節は、ＲＳＶのＳＨ遺伝子を含む置換ポリヌクレオチドが、組換えＲＳＶゲノム又はアンチゲノムを形成するために欠失されるという背景において、付加、置換、又は再配列することができる。
【００２９】
下記の一例において、ＲＳＶ糖タンパク質遺伝子Ｇが、野生型遺伝子Ｇの順位位置と比較して、よりプロモータへ隣接する遺伝子順位位置にＳＨ遺伝子を欠失する組換えＲＳＶゲノム又はアンチゲノム内にて、再配列される。さらに詳細な観点において、組換えワクチン候補Ｇ１／△ＳＨに例示されるように、ＲＳＶ糖タンパク質遺伝子Ｇが、組換えＲＳＶゲノム又はアンチゲノム内にて、遺伝子順位位置１に変位される。また別の例において、ＲＳＶ糖タンパク質遺伝子Ｆが、よりプロモータへ隣接する位置にＳＨ遺伝子を欠失する組換えＲＳＶゲノム又はアンチゲノム内にて再配列される。さらに詳細な観点において、組換えＦ１△ＳＨにより例示されるように、Ｆ遺伝子が、遺伝子順位位置１に変位される。さらに別の例では、ＲＳＶ糖タンパク質遺伝子Ｇ及びＦの双方が、△ＳＨ組換えＲＳＶゲノム又はアンチゲノム内にて、Ｇ及びＦの野生型遺伝子の順位位置と比較して、よりプロモータへ隣接する遺伝子順位の位置に再配列される。さらに詳細なる観点において、組換えＧｌＦ２／△ＳＨにより例示されるように、組換えＲＳＶゲノム又はアンチゲノム内にて、ＲＳＶ糖タンパク質遺伝子Ｇが、遺伝子順位位置１に変位され、そしてＲＳＶ糖タンパク質遺伝子Ｆが、遺伝子順位位置１に変位される。
【００３０】
さらに別の例における、遺伝子位置が変位されるＲＳＶが、Ｆ、Ｇ及びＳＨから選択された糖タンパク質遺伝子の変位を特徴として提供される。この例は、ＲＳＶのＮＳ１，ＮＳ２，ＳＨ，Ｍ２（ＯＲＦ２）、及びＧ遺伝子から選択される複数の遺伝子又はゲノム分節、あるいは欠失されるゲノム分節を有する、組換えＲＳＶゲノム又はアンチゲノム内にて生成される、変位を特徴とする糖タンパク質を提供する。一例において、ＲＳＶのＳＨ及びＮＳ２遺伝子が、組換えＲＳＶゲノム又はアンチゲノムを形成するために共に欠失され、そしてＲＳＶ糖タンパク質遺伝子Ｇ及びＦの１つ又は双方が、組換えＲＳＶゲノム内にて、プロモータへ有意的に隣接する遺伝子順位の位置に再配列される。さらに詳細な観点において、組換えＧｌＦ２／△ＮＳ２△ＳＨに例示されるように、Ｇが遺伝子順位位置１に、Ｆは遺伝子順位位置２に変位される。また別の例において、組換えワクチン候補ＧｌＦ２／△ＮＳ２△ＮＳ２△ＳＨに例示されるように、ＲＳＶのＳＨ、ＮＳ１及びＮＳ２遺伝子の全てが、組換えＲＳＶゲノム又はアンチゲノム又を形成するために欠失され、またＲＳＶ糖タンパク質遺伝子Ｇ及びＦの１つ又は双方が、組換えＲＳＶゲノム又はアンチゲノム内にて、プロモータへ有意的に隣接する遺伝子順位の位置に再配列される。本発明のまた別の観点において、遺伝子位置を変位されたＲＳＶが、ヒト−ウシのキメラＲＳＶと組み合わされるか、あるいはその中に組み込まれている。これらの観点にて、組換えゲノム又はアンチゲノムが、異なるＲＳＶからヒト−ウシのキメラＲＳＶゲノム又はアンチゲノムに対し、１又は複数の異種遺伝子、又はゲノム分節と組み合わされた１部又は完全なヒトＲＳＶ（ＨＲＳＶ）又はウシＲＳＶ（ＢＲＳＶ）を背景とするゲノム又はアンチゲノムを含んでいる。相違するＨＲＳＶ又はＢＲＳＶの異種遺伝子またはゲノム分節が、１部又は完全なＨＲＳＶ又はＢＲＳＶを背景としたゲノム又はアンチゲノム内の同等のゲノム又はアンチゲノム分節の野生型遺伝子順位の位置と比較してプロモータへ有意的に隣接するか、プロモータへ遠位の位置にて、付加又は置換することができる。本明細書に提供される例において、組換えウイルスｒＢＲＳＶ／Ａ２−ＧｌＦ２により例示されるように、ヒトＲＳＶ糖タンパク質遺伝子Ｇ及びＦが共に、１部ウシＲＳＶを背景とするゲノム又はアンチゲノムにおいて、野生型の位置７及び８のそれぞれに欠失される同等のＧ及びＦ糖タンパク質遺伝子を置き換えるために、遺伝子順位位置１及び２にて置換される。他の例において、Ｆ、Ｇ、ＳＨ、及びＭから選択される１又は複数のヒトＲＳＶエンベロープ関連遺伝子が、１部又は完全なウシＲＳＶを背景とするゲノム又はアンチゲノム内にて付加又は置換される。より詳細な観点において、Ｆ、Ｇ、ＳＨ、及びＭから選択される１又は複数のヒトＲＳＶエンベロープ関連遺伝子は、Ｆ、Ｇ、ＳＨ、及びＭから選択される１又は複数のヒトＲＳＶエンベロープ関連遺伝子が欠失される１部ウシＲＳＶを背景とするゲノム又はアンチゲノム内にて、付加又は置換される。
【００３１】
下記の一例において、組換えウイルスｒＢＲＳＶ／Ａ２−ＭＧＦにより例示されるように、ヒトＲＳＶエンベロープ関連遺伝子Ｆ、Ｇ、及びＭは、エンベロープ関連遺伝子Ｆ，Ｇ，ＳＨ，Ｍのすべてが欠失される１部ウシＲＳＶを背景とするゲノム又はアンチゲノム内にて付加される。
【００３２】
本発明の別の選択肢としての例において、単離された感染性組換えＲＳＶが、提供される。この感染性組換えＲＳＶは、ＲＳＶのＭ２（ＯＲＦｌ）が、組換えＲＳＶゲノム又はアンチゲノム内にて、よりプロモータへ隣接する位置に変位する。この遺伝子変位により、組換えウイルスの変位が上限に調節される。本発明のまた別の観点において、弱毒化された遺伝子位置を変位したＲＳＶが生成される。この弱毒化遺伝子位置を変位したＲＳＶでは、組換えゲノム又はアンチゲノムが、１又は複数の弱毒化変異を導入することにより、さらに修飾される。結果として生成されるウイルス又はサブウイルス粒子「たんぱく質などウイスルを構成する組成粒子のこと」において弱毒化する表現型が特定される。これらの弱毒化変異が新規に生成し、適切に設計した変異生成方法により弱毒化作用を試験することができ、あるいは、弱毒化変異が、既存の生物学的に誘導される変異体ＲＳＶ内で同定され、次に本発明の遺伝子位置が変位されたＲＳＶに組み込まれている場合がある。
【００３３】
本発明の組換えＲＳＶに導入される遺伝子位置の変化と組み合わせて、キメラウイルスの弱毒化を増大、又は低下させる付加的な変異化を導入することにより、弱毒化表現型を調節することが好ましいことが良くある。
【００３４】
従って、候補のワクチン菌株を、少なくとも１つ、好ましくは二つ以上の異種の変異体（例えば、既知の生物学的に得られた変異ＲＳＶ菌株のパネルから同定される変異）を組み込むことにより、さらに弱毒化することが可能である。典型的なヒト変異体ＲＳＶ菌株は、低温継代培養及び／又は温度感受性（ｔｓ）の変異体で、例えば、以下の名称を有する変異体である：「ｃｐｔｓ ＲＳＶ ２４８（ＡＴＣＣ ＶＲ ２４５０）、ｃｐｔｓ ＲＳＶ ２４８／４０４（ＡＴＣＣ ＶＲ ２４５４）、ｃｐｔｓ ＲＳＶ ２４８／９５５（ＡＴＣＣ ＶＲ２４５３）、ｃｐｔｓ ＲＳＶ ５３０（ＡＴＣＣ ＶＲ２４５２）、ｃｐｔｓ ＲＳＶ ５３０／１００９（ＡＴＣＣ ＶＲ２４５１）、ｃｐｔｓ ＲＳＶ ５３０／１０３０（ＡＴＣＣ ＶＲ２４５５）、ＲＳＶ Ｂ−１ ｃｐ５２／２Ｂ５（ＡＴＣＣ ＶＲ２５４２）、及びＲＳＶ Ｂ−１ ｃｐ−２３（ＡＴＣＣ ＶＲ２５７９）」（各々の変異体が、ブタペスト条約の条件下、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）ｏｆ １０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ、Ｍａｎａｓｓａｓ、Ｖｉｒｇｉｎｉａ ２０１１０−２２０９、Ｕ．Ｓ．Ａ．に保管されて、上記同定の登録番号が付与される）。この生物学的に誘導される変異体の例示パネルから、多数の弱毒化変異体の「メニュー」が提供され、これら各弱毒化変異体が、ワクチンを使用するめ、組換え体のヒト−ウシキメラＲＳＶにおける弱毒化の程度を較正するために、パネル内により別の変異体と組み合わせることができる。
【００３５】
またさらなる変異化では、例えば、小プラーク（ｓｐ）、低温適応型（ｃａ）又はホスト範囲制限（ｈｒ）変異菌株において同定される非ｔｓ及び非ｃｐの弱毒化する変異株を有するＲＳＶから誘導される。本出願書に引例として組み入れられる米国特許仮出願番号６０／１２９，００６（ＭｕＩｐｈｙ ｅｔ ａｌ．，Ａｐｒｉｌ１３、１９９９）に記載されているように、変異体を、ヒトかウシのいずれかのアンチゲノム配列に組み込まれ，入れられてよく、ヒト−ウシ、又は他のＲＳＶ変異体において同定された弱即化による変異体を、異種ＲＳＶレシピエントゲノムにおける相当する、相同部位に対して変異化部位をマッピングし、さらに変異体遺伝子型に対するレシピエントにおける天然の配列を （同一又は保存型変異化により）に変異化することによって、異種ＲＳＶレシピエント（例えば、それぞれウシ又はヒトのＲＳＶ）に移入することができる。
【００３６】
従って、本発明のさらに詳細な例において、遺伝子位置を変位したＲＳＶが提供される。この遺伝子位置を変位したＲＳＶでは、組換えゲノム又はアンチゲノムが、ヒトＲＳＶ菌株のパネル内で起こる弱毒化変異の少なくとも１つ、最大で全ての相補体で組み込まれている。当該パネルは、ｃｐｔｓ ＲＳＶ ２４８（ＡＴＣＣ ＶＲ ２４５０），ｃｐｔｓ ＲＳＶ ２４８／４０４（ＡＴＣＣ ＶＲ２４５４），ｃｐｔｓ ＲＳＶ ２４８／９５５（ＡＴＣＣ ＶＲ２４５３），ｃｐｔｓ ＲＳＶ ５３０（ＡＴＣＣ ＶＲ２４５２），ｃｐｔｓ ＲＳＶ ５３０／１００９（ＡＴＣＣ ＶＲ２４５１），ｃｐｔｓ ＲＳＶ ５３０／１０３０（ＡＴＣＣ ＶＲ２４５５），ＲＳＶ Ｂ−１ｃｐ５２／２Ｂ５（ＡＴＣＣ ＶＲ２５４２），ａｎｄ ＲＳＶ Ｂ−ｌ ｃｐ−２３（ＡＴＣＣ ＶＲ２５７９）から構成される。幾つかの例において、組換えゲノム又はアンチゲノムが、異種変異ＲＳＶ菌株から採られた弱毒化変異体を組み込んでいる。
【００３７】
ワクチンを使用するために設計、選択され、遺伝子位置を変位したＲＳＶが、臨床的に広範囲に使用するために適切な程度の弱毒化を実現するため、少なくとも２、時には３、またはそれ以上の弱毒化変異体を有することが良くある。一例として少なくとも１つの弱毒化変異体が、ＲＳＶポリメラーゼ遺伝子Ｌに生成し（ドナー遺伝子又はレシピエント遺伝子のいずれかにおいて）、温度感受性（ｔｓ）表現型を含むかどうかに関わらず、弱毒化表現型を特定するポリメラーゼタンパク質におけるアミノ酸の変化を特定する１又は複数のヌクレオチド置換体を含んでいる。本発明の遺伝子位置を変位したＲＳＶは、Ｌ遺伝子を加えて、任意の付加ＲＳＶ遺伝子、例えば、Ｍ２遺伝子における弱毒化変異体を組み込むことができる。しかしながらこの状況において好ましいヒト−ウシキメラＲＳＶが、大型ポリメラーゼ遺伝子Ｌにおける１又は複数のヌクレオチド置換体を組み込み、その結果、ＲＳＶポリメラーゼ遺伝子Ｌにあるアミノ酸Ａｓｎ４３、Ｃｙｓ３１９、Ｐｈｅ５２１、Ｇｌｎ８３１、Ｍｅｔ１１６９、Ｔｙｒ１３２１及び／又はＨｉｓ１６９０にて、アミノ酸が変化して、例示のような変化、すなわちＡｓｎ４３に対してＩｌｅ、Ｐｈｅ５２１に対してＬｅｕ、Ｇｌｎ８３１に対してＬｅｕ、Ｍｅｔ１１６９に対してＶａｌ、及びＴｙｒ１３２１に対してＡｓｎなどに変化する。他の選択肢としてアミノ酸の変化、特に同定された変異体残基に対して保守的な変化が、もちろんこれらの位置にて、同定される同様の効果を得るために、変異置換体作成することができる。本発明のヒト−ウシキメラＲＳＶに組み込むために所望の付加的変異体が、ＲＳＶのＮ遺伝子におけるＶａ１２６７、ＲＳＶのＦ遺伝子におけるＧｌｕｅ２１８及び／又はＴｈｒ５２３、及び遺伝子Ｍ２の遺伝子開始配列におけるヌクレオチドの置換を特定する弱毒化変異体を含んでいる。
【００３８】
これらの最大十分、又は十分である相補性変異体を含む、本明細書に同定される１又は複数の弱毒化変異体における任意の組み合わせ体を、ワクチンレシュペントの選択された集団、又は広範囲な集団に使用するため適切に弱毒化された組み換えウイルスを生成するために、ヒト−ウシキメラＲＳＶに組み込むことも可能である。
【００３９】
他のより詳細な本発明の例において、組換えゲノム又はアンチゲノムが、ＲＳＶのＮ遺伝子においてＶａ１２６７、ＲＳＶのＦ遺伝子においてＧｌｕ２１８及び／又はＴｈｒ５２３、ＲＳＶのポリメラーゼ遺伝子ＬにおけるＡｓｎ４３、Ｃｙｓ３１９、Ｐｈｅ５２１、Ｇｌｎ８３１、Ｍｅｔｌ１６９、Ｔｙｒ１３２１及び／又はＨｉｓ１６９０、及び遺伝子Ｍ２の遺伝子開始配列におけるヌクレオチド置換体にてアミノ酸の置換を特定する弱毒する変異体の相補体を少なくとも１又は最大で十分に組み込んでいる、遺伝子位置を変位したＲＳＶが提供される。
【００４０】
ある観点において、組換えゲノム又はアンチゲノムは、これらの弱毒化変異の、少なくとも２、一般的には３、４又は５、時には全部の相補体を組み込んでいる。多くの場合、少なくとも１つの弱毒化する変異体を、この変異化を特定するコドンの複数のヌクレオチド変化により安定化することがよくある。
【００４１】
本発明のヒト−ウシキメラＲＳＶに組み込むための弱毒化変異体が、供与又はレシピエントＲＳＶ遺伝子のコード部分、又はｃｉｓ調節配列など非コード領域にて選択ことができる。例示的な非コード変異体が、Ｍ２遺伝子開始配列におけるヌクレオチド７６０５（組換え配列におけるヌクレオチド７６０６）にて、単一又は複数の塩基置換によって例示されるように、遺伝子開始配列の単一又は複数の塩基の変化が含まれる。
【００４２】
本発明による感染性ＲＳＶが、いかなるタイプの異種任意のＲＳＶウイルス又はＲＳＶ様ウイルス、例えば、ヒト、ウシ、マウス（マウスの肺炎ウイルス）、又は鳥（シチメンチョウ鼻気管炎ウイルス）肺炎ウイルスから、又は別のエンベロープウイルス、たとえばパラインフルエンザウイルス（ＰＩＶ）からのも、異種性のコード又は非コードヌクレオチド配列を組み込むことができる。例示的な異種配列は、異なるヒトＲＳＶ菌株からの配列と組み合わせたヒトＲＳＶ菌株からのＲＳＶ配列、又はウシＲＳＶ菌株からの配列と組み合わせたヒトＲＳＶ菌株からのＲＳＶ配列を含んでいる。
【００４３】
本発明の遺伝子位置が変異されたＲＳＶが、２またはそれ以上の野生型、又は変異体ＲＳＶ菌株、たとえばｃｐｔｓ ＲＳＶ２４８、ｃｐｔｓ ２４８／４０４、ｃｐｔｓ ２４８／９５５、ｃｐｔｓ ＲＳＶ５３０、ｃｐｔｓ ５５３０／１００９、又はｃｐｔｓ ５３０／１０３０から選択される変異ＲＳＶ菌株から配列を組み込むことができる。
【００４４】
選択肢として、キメラＲＳＶは、２又はそれ以上の野生型又は変異化ＲＳＶのサブグループ、例えばヒトＲＳＶサブグループＡとサブグループＢ配列を組み合わせた配列を組み込こむことができる。
【００４５】
さらにまた別の観点において、１又は複数のヒトＲＳＶコード又は非コードポリヌクレオチドが、新規な弱毒化されたワクチン菌株を生成するために、単独か、又は１又は複数の選択された弱毒化変異体、例えばｃｐ及び／又はｔｓ変異体と組み合わせて異種ＲＳＶ又は非ＲＳＶウイルスから同等の配列により置換される。
【００４６】
本発明による遺伝子位置を変位したＲＳＶのｃＤＮＡｓ、ベクター、及びウイルス粒子内に組み込まれた変異が、個別、に導入することも、又は全長ＲＳＶのｃＤＮＡを組み合わせて導入することができ、そして導入された変異体を含む表現型のレスキューウイルスを、容易に決定することができる。
【００４７】
典型的な例として、野生型ＲＳＶに対する、弱毒化され生物学的に誘導されるウイルスによって示されるアミノ酸の変化、例えば、ｃｐＲＳＶ又はｔｓＲＳＶにより示される変化が、所望の弱毒化レベルを生成するために、遺伝子位置を変位したＲＳＶ内で組み合わせて、組み込まれる。
【００４８】
遺伝子位置を変位したＲＳＶが、複数のＲＳＶ菌株又はグループ（例えばヒトＲＳＶ Ａ及びＲＳＶ Ｂサブグループの双方）を含む異なる病原体、ＨＰＩＶ３、ＨＰＩＶ２及びＨＰＩＶ１を含むヒトパラインフルエンザウイルス（ＨＰＩＶ）、麻疹ウイルス及び他の病原（例えば、以下を参照：米国特許仮出願番号６０／１７０，１９５、米国特許出願番号０９／４５８，８１３、及び米国特許出願番号０９／４５９，０６２、各文献を引例として本明細書に組み入れられる）から抗原決定基組み込むための「ベクター」として、容易に設計することができる。様々な例において、組換えゲノム又はアンチゲノムが、１又は複数の異種病原体の１又は複数の抗原決定基をコードする異種遺伝子又はゲノム分節により組み合わされた、１部又は完全なＲＳＶ「ベクターゲノム又はアンチゲノム」を含んでいる。異種病原が、異種ＲＳＶ（すなわち、異種菌株又はサブグループのＲＳＶ）にて可能であり、そして異種遺伝子又はゲノム分節が、ＲＳＶのＮＳ１、ＮＳ２、Ｎ、Ｐ、Ｍ、ＳＨ、Ｍ２（ＯＲＦ１）、Ｍ２（ＯＲＦ２）、Ｌ、Ｆ又はＧタンパク質又はその断片（例えば、免疫原性領域又はエピトープ）をコードすることができる。例えば、ベクターゲノム又はアンチゲノムが、１部又は完全なＲＳＶ Ａゲノム又はアンチゲノムであってよく、そして異種遺伝子又はゲノム分節が、ＲＳＶ Ｂサブグループウイルスの抗原決定基をコ一ド化することができる。
【００４９】
これに代わる例では、遺伝子位置を変位したＲＳＶベクターゲノム又はアンチゲノムが、１部又は完全なＢＲＳＶゲノム又はアンチゲノムであり、そして抗原決定基をコードする異種遺伝子又はゲノム分節が、１又は複数のＨＲＳＶである。
【００５０】
例えば、１部又は完全なＢＲＳＶゲノム又はアンチゲノムが、Ｆ、Ｇ及びＳＨから選択される１又は複数のＨＲＶの糖タンパク質遺伝子をコードする１又は複数の遺伝子又はゲノム分節、又は細胞質ドメイン、膜間ドメイン、細胞外ドメインまたはＨＲＳＶのＦ、Ｇ、及び／又はＳＨの免疫原性エピトープ部分をコードする１又は複数のゲノム分節を組み込むことができる。上記のように、異種抗原決定基を伝達するためベクターとして設計した遺伝子位置を変位したＲＳＶが、ヒトパラインフルエンザウイルス（ＨＰＩＶ）など非ＲＳＶ病原の１又は複数の抗原決定基を組み込むことができる。典型的な１例として、１又は複数のＨＮ及び／又はＦ糖タンパク質又は抗原ドメイン、その断片、又はエピトープをコードする１又は複数のＨＰＩＶ１、ＨＰＩＶ２、又はＨＰＩＶ３遺伝子又はゲノム分節が、１部又は完全なＨＲＳＶベクターゲノム又はアンチゲノムに付加されるか、又はそれに組み込まれる。さらに詳細な実施例では、ＨＰＩＶ１、ＨＰＩＶ２、又はＨＰＩＶ３のＨＮ又はＦ遺伝子のオープンリーデングフレーム（ＯＲＦ）を含む転写単位が、組換えベクターゲノム又はアンチゲノムに付加されるか、又はそれに組み込まれる。選択肢としてさらに別の例において、ベクターゲノム又はアンチゲノムが、１部又は完全なＨＲＳＶ又はＢＲＳＶゲノム又はアンチゲノムを含み、そして異種病原体が、麻疹ウイルス、サブグループＡ及びサブグループＢ呼吸器系合胞体ウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、ヒト乳頭腫ウイルス、タイプ１及びタイプ２の免疫不全ウイルス、単純性庖疹ウイルス、サイトメガロウイルス、狂犬病ウイルス、エプスタインーバーウイルス、フィロウイルス、ブニヤウイルス、フラビウイルス、アルファウイルス及びインフルエンザウイルスから選択される。候補病原の典型的なリストにより、基づいて特定した異種性抗原決定基を、以下の病原、すなわち、麻疹ウイルスＨＡ及びＦタンパク質、サブグループＡ及びサブグループＢ呼吸器系胞体ウイルスＦ、Ｇ、ＳＨ及びＭ２タンパク質、流行性耳下腺炎ウイルスＨＮ及びＦタンパク質、ヒト乳頭腫ウイルスＬ１タンパク質、タイプ１及びタイプ２の免疫不全ウイルスｇｐ１６０タンパク質、単純性庖疹ウイルス及びサイトメガロウイルスｇＢ、ｇＣ、ｇＤ、ｇＥ、ｇＧ、ｇＨ、ｇＩ、ｇＪ、ｇＫ、ｇＬ、及びｇＭタンパク質、狂犬病ウイルスＧタンパク質、エプスタインーバーウイルスｇｐ３５０タンパク質、フィロウイルスＧタンパク質、ブニヤウイルスＧタンパク質、フラビウイルスＥ及びＮＳ１タンパク質、及びアルファウイルスＥタンパク質、及びそれらの抗原ドメイン、断片及びエピトープなどから選択することができる。１例として、異種病原が、麻疹ウイルスであり、異種性抗原決定基は、麻疹ウイルスＨＡ及びＦタンパク質及びそれらの抗原ドメイン、その断片及びエピトープから選択される。こうしたキメラ構造を実現するために、麻疹ウイルスＨＡ遺伝子のオープンリーデングフレーム（ＯＲＦ）を含む転写単位が、ＨＲＳＶベクターゲノム又はアンチゲノムに、付加されるか又はそれに組み込まれる。
【００５１】
従って本発明は、弱毒化された感染性ウイルス、又はサブウイルス粒子を生成するために、遺伝子位置を変位したＲＳＶゲノム又はアンチゲノムに選択的に組み合わせて導入される複数の表現型特異的変異体を組み込むことのできる遺伝子位置を変位したＲＳＶクローン、ポリヌクレオチド発現構成体（ベクターとも呼ばれている）及び粒子を提供する。
【００５２】
一定の表現型評価と結び付けられた本方法は、弱毒化、温度感受性、変更された免疫原性、低温適応性、小型プラーク、ホスト範囲制限などの所望の特徴を有する、遺伝子位置が変位されたＲＳＶを提供する。従って、同定された変異体が、「メニュー」にまとめられ、そして選択されたレベルの弱毒化、免疫原性、及び安定性に対して、ワクチンウイルスを較正するように種々組み合わせて導入される。
【００５３】
さらに本発明の追加的な観点において、弱毒化する変異化を伴うか、又は伴わない遺伝子位置を変位したＲＳＶが、所望の表現型、構成的、又は機能的な変化を形成するために、ヌクレオチドの修飾を有するように構成される。一般的に、選択されたヌクレオチドの修飾が、表現型変化、例えば増殖特性、弱毒化、温度感受性、低温適応性、プラークのサイズ、ホスト範囲の制限、又は免疫原性等の変化を特定することになる。この状況における構造の変化には、操作及び同定を容易にするために、ｃＤＮＡｓをコードするＲＳＶの制限部位を導入又は除去することを含んでいる。
【００５４】
幾つかの例において、遺伝子位置を変位したＲＳＶ内のヌクレオチドの変化には、遺伝子の欠失、あるいはその発現を除去することによるウイルス遺伝子の修飾を含んでいる。この状況における変異に向けた標的遺伝子が、結合（Ｇ）タンパク質、融合（Ｆ）タンパク質、小型疎水性（ＳＨ）、ＲＮＡ結合タンパク質（Ｎ）、リンタンパク質（Ｐ）、大型ポリメラーゼタンパク質（Ｌ）、転写伸長因子（Ｍ２０ＲＦ１）、ＲＮＡ制御因子Ｍ２−２００ＲＦ２、基質（Ｍ）タンパク質、及び２種の非構成タンパク質、ＮＳ１及びＮＳ２を含んでいる。これらのタンパク質の各々が、新規のキメラＲＳＶ組換えを作製するために、全部又はその一部を、単独か、あるいは所望の他の修飾と組み合わせて、全体的か１部において、選択的に欠失、置換、又は再配列することができる。
【００５５】
本発明の１の観点において、ＳＨ、ＮＳ１、ＮＳ２、Ｇ又はＭ２−２遺伝子が、遺伝子位置を変位したＲＳＶにおいて修飾される。
【００５６】
例えば、これらの各遺伝子が、増殖、弱毒化、免疫原性、又は他の所望の表現型特徴を改良するために、得られた組換えＲＳＶクローンの表現型を変更するように（たとえば停止コドンの導入により）、欠失されるか、又はその発現が削除される。例えば、組換えゲノム又はアンチゲノムにおけるＳＨ遺伝子を欠失させることにより、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける増殖及び／又はｉｎ ｖｉｖｏにおける弱毒化を増強するなどの新規な表現型の特徴を有するＲＳＶを、作製することができる。これに関連した観点において、ＳＨ遺伝子の欠失、又はＮＳ１、ＮＳ２、Ｇ又はＭ２−２遺伝子の欠失など、他に選択された非必須遺伝子又はゲノム分節の欠失が、遺伝子位置を変位したＲＳＶ内に、単独か又は弱毒化された表現型を特定する、例えば生物学的に導入される弱毒化ＲＳＶ変異体から直接適応される（又は、例えば変異化を特定するコドンにおける複数のヌクレオチドの変化を導入することにより、修飾した形状）点変異にて、１又は複数の異なる変異体と組み合わせて構成される。例えば、ＳＨ、ＮＳ１、ＮＳ２、Ｇ又はＭ２−２遺伝子が、ウイルスの収率の増大、弱毒化の強化、異なる変異体の有効な組み合わせにより、弱毒化された表現型から免疫性及び復帰に対する遺伝子抵抗性を改良させた遺伝子位置を変位したＲＳＶを生成するために、ｃｐｔｓ ２４８／４０４、ｃｐｔｓ ５３０／１００９、ｃｐｔｓ ５３０／１０３０、から適応される１又は複数のｃｐ及び／又はｔｓ変異体、又は別に選択された変異体ＲＳＶ菌株と組み合わせて欠失することができる。
【００５７】
これに代わるヌクレオチド修飾には、遺伝子位置を変位したＲＳＶにある選択された遺伝子のため、シス作用調節配列を欠失、挿入、付加、又は再配列することを含むことができる。一例では、１つのＲＳＶ遺伝子のシス作用調節配列を、異種調節配列に対応して変化して、それが、異なるＲＳＶにおける同じ遺伝子の相当するシス作用調節配列か、あるいは異なるＲＳＶ遺伝子のシス作用調節配列にて可能である。例えば、遺伝子終了シグナルが、同一ＲＳＶ菌株にある異種の遺伝子の遺伝子終了シグナルヘ変換又は置換することにより、修飾することができる。他の例において、ヌクレオチドの修飾が、例えば、タンパク質の選択される形状としてそれぞれの翻訳開始部位を除去するため、キメラゲノム又はアンチゲノム内の翻訳開始部位を挿入、欠失、置換、又は再配列することを含んでいる。一例では、ＲＳＶのＧタンパク質の分泌される形状として翻訳開始部位を、Ｇタンパク質のこの型の発現を修飾するために除去し、それにより所望のｉｎ  ｖｉｖｏにおける効果を創り出す。
【００５８】
加えて、多様な他の遺伝子化修飾が、遺伝子位置を変位したＲＳＶゲノム又はアンチゲノムにおいて、単独又は生物学的に誘導される変異体ＲＳＶから適応される１又は複数の弱毒化変異体と共に生成することができる。例えば、非ＲＳＶ資資源からの遺伝子又はゲノム分節が、１部、又は全体を挿入することができる。非翻訳遺伝子配列を、例えば、外来配列を挿入するための容量を増加させるために、除去することができる。さらにまた別の観点において、遺伝子位置を変位したＲＳＶゲノム又はアンチゲノムをコードするポリヌクレオチド分子又はベクターを、非ＲＳＶ配列をコードするため、例えば、サイトカイン、Ｔ−ヘルパーエピトープ、制限部位マーカ、又は意図されたホストに保護免疫反応を惹起できる微生物病原（例えば、ウイルス、バクテリア、又は菌類）のタンパク質を修飾することができる。遺伝子位置を変位したＲＳＶアンチゲノムにおける差異又は付加的な修飾を、種々の遺伝子間領域（例えば、Ｇ遺伝子とＦ遺伝子の間にある固有のユニークなＳｔｕＩ部位）又は他の領域への挿入など、操作を容易にするために行うことができる。
【００５９】
点変異体、部位特異的ヌクレオチドの変化、及び遺伝子又はゲノム分節全体に関与する変化を形成するために、ヌクレオチドの挿入、采配列，欠失、又は置換を含む遺伝子位置を変位したＲＳＶゲノム又はアンチゲノム内の前記修飾の全てが、１部か完全なＲＳＶゲノム又はアンチゲノムのいずれかに、又はキメラＲＳＶのゲノム又はアンチゲノムを背景として異種ドーナ遺伝子又はゲノム分節、あるいはレシペント内により行うことが出来る。それぞれの場合、これらの変更が、弱毒化、温度感受性、低温適応性、小プラークサイズ、ホスト範囲の制限、遺伝子発現の変更又は免疫原性エピトープの変化となる表現型変化など、もたらされる組換えＲＳＶ内の１又は複数の表現型変化を特定することが好ましい。
【００６０】
本発明のまた別の観点において、組成物（例えば、ＲＳＶをコードするｃＤＮＡを組み込む単離されたポリヌクレオチド及びベクター）及び方法が、単離された感染性遺伝子位置を変位したＲＳＶを生成するために提供される。これらの組成物及び方法を用いて、単離された感染性遺伝子位置を変位したＲＳＶ粒子又はサブウイルス粒子が、ヌクレオキャプシド（Ｎ）タンパク質、ヌクレオキャプシドリンタンパク質（Ｐ）、大型（Ｌ）ポリメラーゼタンパク質、及びＲＮＡポリメラーゼ伸長因子により同時発現される組換えＲＳＶゲノム又はアンチゲノムから生成される。本発明の関連する観点において、組成物及び方法が、感染性の弱毒化されたワクチンウイルスを生成するために、組換え遺伝子位置を変位したＲＳＶに導入するための提供される。
【００６１】
一例において、遺伝子位置を変位したＲＳＶゲノム又はアンチゲノムをコードする単離されたポリヌクレオチド分子を含んでいる、発現ベクターが提供される。さらに提供されるものは、この発現ベクターは、Ｎ、Ｐ、Ｌ及びＲＮＡポリアミラーゼ伸長因子タンパク質をコードする１又は複数の単離されたポリヌクレオチド分子を含んでいる同一又は異なる発現ベクターである。またこれらのタンパク質が、ゲノム又はアンチゲノムｃＤＮＡから直接発現することができる。上記ベクターが、好ましくは、細胞の又は細胞のない溶離物において、発現又は同時に発現させ、それにより、感染性遺伝子位置を変位したＲＳＶ粒子又はサブウイルス粒子を生成することが好ましい。
【００６２】
ＲＳＶゲノムまたはアンチゲノム、又はＮ、Ｐ、Ｌ及びＲＮＡポリメラーゼ伸長因子（好ましくは、ＲＳＶのＭ２（ＯＲＦ１）の生成物）タンパク質が、同一又は異種の発現ベクターにより、同時発現されてよい。ある場合においては、Ｎ、Ｐ、Ｌ及びＲＮＡポリメラーゼ伸長因子タンパク質が、それぞれ異なった発現ベクター上にコードされる。遺伝子位置を変位したＲＳＶゲノム又はアンチゲノムをコードしているポリヌクレオチド分子が、操作により、感染性ウイルスから生成されるウイルス粒子を生成できるようにするため、これらの調節配列に加えられる。本発明のこれに代わる観点において、遺伝子位置を変位したＲＳＶゲノム又はアンチゲノムは、複数のヒトＲＳＶ菌株又はサブグループ（ＡとＢ）、及び他の非ヒト（例えばマウスの）ＲＳＶ配列からの配列を含むことが可能である。またこれに代わる観点において、遺伝子位置を変位したＲＳＶゲノム又はアンチゲノムは、非ＲＳＶ配列を組み込むことが可能である。非ＲＳＶ配列の例としては、ヌクレオチド又はポリヌクレオチドの操作で加わったヒト及びウシＲＳＶからの配列を含むポリヌクレオチドがある。そのヌクレオチド又はポリヌクレオチドが、ＰＩＶの点変異、タンパク質、タンパク質ドメイン又は免疫原性エピトープ選択肢として別の陰性二本鎖ｍｍＡウイルスをコードしている。
【００６３】
上記の遺伝子位置を変位したＲＳＶ生成のための方法及び組成により、感染性ウイルス又はサブウイルス粒子、あるいはその誘導体を生成する。感染性ウイルスは真正ＲＳＶウイルス粒子と比較され、同様に感染性がある。感染性ウイルスが、新鮮な細胞を直接感染させる。感染性サブウイルス粒子が、一般的にウイルス粒子の組成物であり、適切な状況下で感染を起こすものである。例えば、ゲノム又はアンチゲノムＲＮＡ及びＮ、Ｐ、Ｌ及びＭ２（ＯＲＦｌ）タンパク質を含むヌクレオキャプシドは、細胞の細胞質に導入されれば感染を起こすことができるサブウイルス粒子の一例である。本発明にて提供されるサブウイルス粒子は、１又は複数のタンパク質、タンパク質分節、又は感染性に必須ではない他のウイルス組成物などを持たないウイルス粒子を含む。
【００６４】
他の例において、本発明は、上記のように遺伝子位置を変位したＲＳＶゲノム又はアンチゲノムをコードする、単離されたポリヌクレオチド分子を含む発現ベクター、及びＲＳＶのＮ、Ｐ、Ｌ及びＲＮＡポリアミラーゼ伸長因子タンパク質をコードする、１又は複数の単離されたポリヌクレオチド分子を含む発現ベクター（同一又は異種のベクター）を含んでいる細胞又は細胞のない溶解質を提供する。さらにこれらのタンパク質が、１又は複数のゲノム又はアンチゲノムｃＤＮＡから発現することができる。発現により、ゲノム又はアンチゲノム及びＮ、Ｐ、Ｌ及びＲＮＡポリアミラーゼ伸長因子タンパク質が、感染性遺伝子位置を変位したＲＳＶウイルス又はサブウイルスの粒子を作製するために、組み合わされる。
【００６５】
本発明の弱毒化された遺伝子位置を変位したＲＳＶが、感染したヒトのホストに保護免疫反応を惹起することができ、さらに免疫処置を受けたホストに重篤な気道疾病による受け入れ不可能な症状を起こさないように、充分に弱毒化される。弱毒化されたウイルス又はサブウイルス粒子が、培養から単離された、又は部分的にまたは完全に精製された細胞培養上清に存在することが可能である。
このウイルスはまた、凍結乾燥してよく、保管又はホストヘの接種のためには必要に応じて、他の多様な組成物と混合してよい。
【００６６】
本発明はさらに、生理的に許容できる担体及び／又はアジュバント、及び単離された弱毒化遺伝子位置変位ＲＳＶを含む新規なワクチンを提供している。一例において、ワクチンが、上記のように、少なくとも１、好ましくは２又はそれ以上の弱毒化する変異体又は他のヌクレオチド修飾を有する、遺伝子位置が変位されたＲＳＶ１個から成る。このワクチンは、弱毒化されたウイルスの１０３から１０６ＰＦＵの用量にて処方することができる。このワクチンが、単一のＲＳＶ菌株又は抗原サブグループ例えばＡ又はＢ、又は複数のＲＳＶ菌株あるいはサブグループに対して免疫反応を惹起する弱毒化された遺伝子位置を変位したＲＳＶを含むことができる。この点に関して、本発明の遺伝子位置を変位したＲＳＶは、単一特異性の免疫反応又は多特異性の免疫反応を、複数のＲＳＶ菌株又はサブグループに対して、個別に惹起することができる。遺伝子位置を変位したＲＳＶが、一つ又は複数のＲＳＶ菌株又はサブグループに対するより効果的に保護するためを異なる免疫原性特質を有するた他のＲＳＶｓと、ワクチン処方において組み合わせることができる。
【００６７】
関連する観点において、本発明は、哺乳動物の対象動物における１又は複数の菌株またはサブグループに対する免疫反応を惹起するために、個体の免疫系を刺激するための方法を提供する。この方法は、生理的に許容できる担体及び／又はアジュバントに、弱毒化され、遺伝子位置が変位されたＲＳＶを免疫学的に充分な量により処方して投与することを含む。１例において、免疫原性組成物が、上記のように所望の表現型を特定する少なくとも１つの、好ましくは２又はそれ以上の弱毒化する変異体、又は他のヌクレオチドの修飾を有する、遺伝子位置が変位されたＲＳＶから成るワクチンである。このワクチンは、弱毒化されたウイルスを１０３から１０６ＰＦＵの用量にて処方することができる。このワクチンが、単一のＲＳＶ菌株又は抗原サブグループ、例えば、ＡまたはＢに対して、又は複数のＲＳＶ菌株又はサブグループに対して、免疫反応を惹起する弱毒化された遺伝子位置を変位したＲＳＶを含んでいる。この状況において、この遺伝子位置が変位されたＲＳＶは、複数のＲＳＶ菌株又はサブグループに対して、単一特異性の免疫反応又は多特異性の免疫反応を惹起することができる。選択肢として、異なる免疫原性の特徴を有する遺伝子位置が変位されたＲＳＶは、単一のＲＳＶ菌株に対し、又は複数のＲＳＶ菌株、あるいはサブグループに対してより効果的に保護されるように、配合治療プロトコルによりワクチン混合物にて組み合せることができるか、又は個別に投与することができる。好ましくは、この免疫原性組成物は、上気道に、例えば、噴霧、液滴、又はエアゾルとして投与されるのがよい。多くの場合、この組成物が、ＲＳＶに対する抗体血清反応陰性のヒト、又は胎盤経由にて獲得された母体からのＲＳＶに対する抗体を有しているヒトに、投与されることになる。
【００６８】
特定の実施例の説明
本発明は、ヒト及び他の哺乳動物における感染性、及び弱毒化されたワクチンを作成するために、組換えゲノム又はアンチゲノム内に１又は複数の遺伝子の遺伝子順位又は空間的位置を、変位させることにより修飾された組換え呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶｓ）を提供する。一般的に、組換えＲＳＶゲノム又はアンチゲノムが、上記ゲノム内に第２の「置換ポリヌクレオチド」を導入、欠失、又は再配列を介して１又は複数の「変位」遺伝子又はゲノム分節を直接的に又は間接的に再配置することにより修飾され、その結果、プロモータへ隣接するか、またはプロモータへ遠位の位置に対象の「変位」遺伝子又はゲノム分節を位置的に変位させることになる。この状況における遺伝子又はゲノム分節の位置を変位することが、遺伝子変位を導入する前に、親ＲＳＶゲノム又はアンチゲノムの対象遺伝子又はゲノム分節の位置に対して、例えば、遺伝子を変位する前に、本明細書に記載のように、野生型ＲＳＶゲノム又はアンチゲノム（例えば、ＨＲＳＶ Ａ２又はＢＲＳＶカンザス菌株）における、又は親組換えＲＳＶゲノム又はアンチゲノムにおける対象遺伝子又はゲノム分節の位置に対して決定される。
【００６９】
本発明のある観点において、遺伝子位置を変位したＲＳＶは、１部又は完全な組換えＲＳＶゲノム又はアンチゲノム内にて、１又は複数の置換ポリヌクレオチドを挿入、欠失、又は再配列することにより、プロモータ隣接又はプロモータ遠位に変位された１又は複数の変位された遺伝子又はゲノム分節を有することを特徴としている。置換ポリヌクレオチドが、相違した、又は「異種」ＲＳＶからの遺伝子又はゲノム分節（例えば、異なるＲＳＶのゲノム又はアンチゲノムに挿入される異種遺伝子又はゲノム分節の場合において）を含む、ＲＳＶ遺伝子又はゲノム分節を含むことができる。選択肢として、置換ポリヌクレオチドが、パラインフルエンザ（ＰＩＶ）又は麻疹ウイルスのような非ＲＳＶ病原ウイルスを含む、非ＲＳＶ資源からのものであってもよい。置換ポリヌクレオチドが、糖タンパク質の免疫原性領域又はエピトープのようなタンパク質又はタンパク質の一部をコードしてよく、又は置換ポリヌクレオチドが、非コード及びナンセンスポリヌクレオチド配列を含む、不完全又は損傷されたコード配列を表わすものであってもよい。
【００７０】
本発明のある観点において、組換えＲＳＶは、１部又は完全な組換えＲＳＶゲノム又はアンチゲノム内にて、１又は複数の置換ポリヌクレオチドを挿入、欠失、又は再配列することにより、プロモータ隣接又はプロモータ遠位の位置に、変位された１又は複数の変位された遺伝子又はゲノム分節を有することを特徴とする。ある観点において、置換ポリヌクレオチドが、ＲＳＶゲノム又はゲノム分節である。他の観点において、置換ポリヌクレオチドが、完全なオープンリーデングフレーム（ＯＲＦ）に欠けている。さらに詳細な実施例では、置換ポリヌクレオチドが、１５０個から４，０００個のヌクレオチド（ｎｔｓ）の長さを有するポリヌクレオチドが組み込まれる。置換ポリヌクレオチドが、組換えゲノム又はアンチゲノムの非コード領域（ＮＣＲ）に、挿入又は再配列されてよく、また、組換えＲＳＶゲノム又はアンチゲノムに、別個の遺伝子ユニット（ＧＵ）として、組み込むことができる。
【００７１】
本発明の組換えＲＳＶ内の遺伝子位置の変位は、一般的に、ゲノム又はアンチゲノム「プロモータ」に関連して決定される。ＲＳＶプロモータが、ポリメラーゼ開始部位を含み、これはポリメラーゼにより認識される保守された配列要素である。プロモータは、およそ３０の３’末端ヌクレオチド内の、ゲノム又はアンチゲノムの３’末端に位置している。ＲＳＶゲノムの場合、プロモータが、転写と複製の双方を指示している。しかし、転写シグナルに欠け自然状態にて複製のみ制御するアンチゲノム「プロモータ」は、既知の転写シグナルを挿入することにより、転写を指示するように修飾することができる。本発明を説明するために、このように、ＲＳＶプロモータはゲノム又はアンチゲノムの３’末端に存在すると解釈され、それに故、本明細書にて使われている「プロモータ隣接」及び「プロモータ遠位」という用語が、代替的に、それぞれゲノム又はアンチゲノムの３’末端に向かう方向又は離れる方向を意味する。
【００７２】
このように、本発明により提供されるのは、単離されたポリヌクレオチド分子、ベクター（発現の構成）、及び組換えＲＳＶゲノム又はアンチゲノムを組み込んでいる組換えウイルスであり、この中で１又は複数のゲノム又はゲノム分節が、組換えゲノム又はアンチゲノム内にて、親又は野生型のＲＳＶ遺伝子地図における遺伝子部位に比して、よりプロモータ隣接及びプロモータ遠位の位置に変位される。この方法にて遺伝子の位置を変位させることにより、位置的な変位の性質及び程度によって、１又は複数の位置的に「変位」された遺伝子の発現を、望み通りに増加させたり又は減少させたりすることができる。一例では、ＲＳＶ糖タンパク質が、１又は複数の糖タンパク質コードする遺伝子をよりプロモータ隣接の部位に変位させることにより、アップレギュレートされる。遺伝子位置を変位したＲＳＶを作製するための操作対象の遺伝子は、ＮＳ１、ＮＳ２、Ｎ、Ｐ、Ｍ、ＳＨ、Ｍ２（Ｏｍｍ１）、Ｍ２（ＯＲＦ２）、Ｌ、Ｆ又はＧ遺伝子のどれでもよく、また遺伝子の一部又は遺伝子外であるゲノム分節でもよい。望みの表現型及び構造的上の効果を得るために、本発明の遺伝子位置を変位したＲＳＶ内にて、多様な他の変異及びヌクレオチド修飾が提供される。
【００７３】
ヒト−ウシＲＳＶの組換え構成により、哺乳動物、とくにヒトに感染性を有し、臨床使用目的の免疫原性組成物を生成する上で有用であるウイルス粒子又はサブウイルス粒子が得られる。本発明ではまた、弱毒化された遺伝子位置を変位したＲＳＶ及びＲＳＶ感染の予防法及び治療のための新しい方法及び組成物をも提供している。本発明による遺伝子位置を変位したＲＳＶ及び免疫原性組成物は、特異性をもつＲＳＶサブグループ又は菌株に対して免疫反応を惹起するか、選択肢として、ＲＳＶサブグループ又は菌株に対して複数の多特異性反応を惹起することが可能である。本発明の遺伝子位置を変位したＲＳＶは、このように、ヒト及び他の哺乳動物に感染性を持ち且つ弱毒化される。関係する観点において、本発明は、様々な組成物に有用な弱毒化された遺伝子位置を変位したＲＳＶを設計し作製するための新しい方法を提供し、その結果、ＲＳＶ感染に脆弱であるホストにおいてＲＳＶに対し必要な免疫反応を生成している。本発明のこれらの観点に含まれるのは、新しい分離ポリヌクレオチド分子、ベクター、及び遺伝子位置を変位したＲＳＶゲノム又はアンチゲノムから成るそのような分子を組み込んでいる感染細胞である。本発明による遺伝子位置を変位したＲＳＶは、特異性を有するＲＳＶサブグループ又は菌株に対して免疫反応を、又は複数のＲＳＶサブグループ又は菌株に対して複数の多特異性反応を、惹起することができる。さらにまた、関心の持たれている異種の病原に対する望みの免疫反応を生成するために、他の病原の抗原決定基を組み込むためのベクターとして、弱毒化された遺伝子位置を変位したＲＳＶを設計し作製するための別の組成物又は方法が提供される。また、本発明では、ＲＳＶ及び他の病原により引き起こされる感染及び疾病の予防及び治療のために、遺伝子位置を変位したＲＳＶを挿入する方法又は組成物が提供される。
【００７４】
本発明は、結果的に、近年、感染性の組換えＲＳＶをｃＤＮＡから生成する方法が出現し改良されてきたことに基づく、継続した発見の流れを補うものである。この業績に基づいて、ＲＳＶ遺伝子発現及び複製におけるＲＮＡ及びタンパク質構造の働きを直接研究することが今や可能となった。これらの研究は、以下に説明、報告がされる：１９９５年９月２７日に提出された米国特許仮出願番号６０／００７，０８３、１９９６年９月２７日に提出された米国特許出願番号０８／７２０，１３２、１９９６年７月１５日米国特許仮出願番号６０／０２１，７７３、１９９７年５月９日に提出された米国特許仮出願番号６０／０４６，１４１、１９９７年５月２３日に提出された米国特許仮出願番号６０／０４７，６３４、１９９９年１１月３０日に発行された米国特許番号５，９９３，８２４（国際公開番号Ｗ０９８／０２５３０に対応する）、Ｃｏｎｉｎｓｅｔａｌ．により１９９９年４月１３日に提出された米国特許出願番号０９／２９１，８９４、Ｍｕｒｐｈｙｅｔａｌ．により４月１３日に提出された米国特許仮出願番号６０／１２９，００６、Ｃｒｏｗｅ ｅｔ ａｌ．、Ｖａｃｃｍｅ １２：６９１−６９９，１９９４；ａｎｄ Ｃｒｏｗｅ ｅｔ ａｌ．、Ｖａｃｃｉｎｅ １２：７８３−７９０、１９９４；Ｃｏｌｌｉｎｓ、ｅｔ ａｌ．、Ｐｒｏｃ Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９２：ｌ１５６３−１１５６７、１９９５；Ｂｕｋｒｅｙｅｖ、ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ ７０：６６３４−４１，１９９６、Ｊｕｈａｓｚ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１（８）：５８１４−５８１９，１９９７、Ｄｕｒｂｉｎ ｅｔ ａｌ．、Ｖｉｒｏｌｏｒｙ ２３５：３２３−３３２，１９９７；Ｋａｒｒｏｎ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１７６：１４２８−１４３６、１９９７、Ｈｅ ｅｔ ａｌ．、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２３７：２４９−２６０、１９９７；Ｂａｒｏｎ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１：１２６５−１２７１、１９９７；Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ ｅｔ ａｌ．、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２４７（２）：２３２−９、１９９８ａ；Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２（５）：４４６７−４４７１、１９９８ｂ；Ｊｉｎ ｅｔ ａｌ．、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２５１：２０６−２１４、１９９８；Ｂｕｋｒｅｙｅｖ，ｅｔ ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９６：２３６７−２３７２、１９９９；Ｂｅｒｍｉｎｇｈａｍ ａｎｄ Ｃｏｌｌｉｎｓ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９６：ｌ１２５９−１１２６４、１９９９ Ｊｕｈａｓｚ ｅｔ ａｌ．、Ｖａｃｃｉｎｅ １７：１４１６−１４２４、１９９９；Ｊｕｈａｓｚ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７３：５１７６−５１８０、１９９９；Ｔｅｎｇ ａｎｄ Ｃｏｌｌｉｎｓ、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７３：４６６−７３、１９９９；Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７３：９７７３−９７８０、１９９９；Ｗｈｌｔｅｈｅａｄ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７３：８７１−８７７、１９９９；ａｎｄ Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７３：３４３８−３４４２、１９９９；Ｊｉｎ ｅｔ ａｌ．、Ｖｉｒｏｌｏｒｙ ２７３：２１０−８、２０００、Ｊｉｎ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．���ｏｒｏｌ．７４：７４−８２、２０００；Ｔｅｎｇ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７４：９３１７−２１、２０００（上記各文献を引例として本明細書に組み込まれている）。
【００７５】
本発明の遺伝子位置を変位したＲＳＶに関連して、上記の本書に組み込まれた多数の開示は、天然に生成するＲＳＶにおける遺伝子配列の修飾に焦点を当てている。例えば、ＮＳ１、ＮＳ２、ＳＨ及びＧ遺伝子の各々は、感染性ＲＳＶ組換え体において個別に首尾良く欠失されており、それにより、下流遺伝子の部位をウイルスプロモータへ関連して変位させている。本発明の他の組換え体においては、ＮＳ１及びＮＳ２遺伝子の両方が欠失され、プロモータ隣接方向へ残りの遺伝子を、組換えＲＳＶゲノム又はアンチゲノム内にて、変位させている。
【００７６】
例えば、ＮＳ１及びＮＳ２遺伝子の両方が欠失される場合、Ｎを部位３から部位１へ変位させ、Ｐを部位４から部位２へ変位させるというようにする。本発明のこれに代わる実施例での他のＲＳＶ遺伝子のどれを欠失しても、同様に（プロモータへ関連して）さらに下流に部位するそれらの遺伝子の部位を変位することになる。例えば、ＳＨは野生型ウイルスの部位６に存在し、そのを欠失しても部位５にあるＭに（上流にある遺伝子のどれにも）影響を及ぼさないが、Ｇがプロモータへ関連して部位７から６に変位することになる。遺伝子の欠失は、稀ではあるが、生物学的に得られる変異ウイルスにおいても起こり得るということを特筆しておく（Ｋａｒｒｏｎ ｅｔ ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９４：１３９６１−１３９６６、１９９７、引例により本明細書に組み込まれている）。「上流」及び「下流」は、それぞれ、プロモータ隣接及びプロモータ遠位方向を、意味していることに注意されたい（プロモータはネガティブセンスゲノムｍｍＡの３’先導部末端に存在する）。
【００７７】
本発明の遺伝子位置を変位したＲＳＶによって、遺伝子配列変位の修飾（すなわち、１又は複数の遺伝子を、組換えウイルスゲノム内にて、よりプロモータ隣接又はプロモータ遠位の場所へ部位的に修飾すること）を行うと、変化した生物学的特性を有するウイルスが生成される。例えば、ＮＳｌ、ＮＳ２、ＳＨ、Ｇ、ＮＳ１及びＮＳ２を全て欠いているＲＳＶ、又はＳＨ及びＧを共に欠いているＲＳＶは、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて及びｉｎ ｖｉｖｏにおいて、又はその両方にて、弱毒化されることが示される。おそらく、この表現型は、主として特異性を有するウイルスタンパク質の発現に起因するものであったと考えられる。しかしながら、改造された遺伝子地図はまた、おそらく観察された表現型に寄与したと思われる。この効果は、ＳＨ欠失ウイルスにより、よく記載されている。ＳＨ欠失ウイルスは、ある細胞種の野生型に比べてより効果的に増殖したが、その原因には、おそらくその遺伝子欠失により転写、複製、又はその双方の効率が高まったこと、さらに欠失によって起こった遺伝子順位及びゲノムサイズが変化したことが考えられる。ＮＳ１及び／又はＮＳ２が欠失されたＲＳＶのような、他のウイルスでは、おそらく遺伝子配列の変化に起因する増殖の変化が、ＲＳＶタンパク質の発現が喪失されたために、より優性な表現型によって不明確にされる傾向であった。
【００７８】
さらにまた別の変化が導入され、ＲＳＶの遺伝子配列を変え、弱毒化生ワクチンとしてのその特質を改良させ、好結果を産んでいる。本発明の有効性を論証する特定な例においては、ＲＳＶＧ及びＦ遺伝子が、個別にそして直列に、それらの野生型の遺伝子配列に比して、よりプロモータ隣接の部位へ変位される。これら二つのタンパク質は、通常、ＲＳＶ遺伝子順位（ＮＳ１−ＮＳ２−Ｎ−Ｐ−Ｍ−ＳＨ−Ｇ−Ｆ−Ｍ２−Ｌ）における部位７（Ｇ）及び８（Ｆ）を占める。発見が好結果を産む可能性を高めるために、Ｇ及びＦに関するこの配列操作が、ＳＨ遺伝子が欠失されたＲＳＶバージョン（例えば、以下を参照：ｗｈｉｔｅｈｅａｄ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ． ７３：３４３８−４２（１９９９）、引例として本明細書に組み込まれている）で行なわれた。このウイルスはより大型のプラークをｉｎ  ｖｉｔｒｏにて生成するため、これによりウイルスの回収が促進される（Ｂｕｋｒｅｙｅｖ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１：８９７３−８２，１９９７、引例として本明細書に組み込まれている）。Ｇ及びＦが、その後、個別に部位１へ、又は同時に各々部位１及び２へ、変位された。
【００７９】
Ｇ又はＦが部位１へ変位された組換えＲＳＶ、又はＧ及びＦがそれぞれ部位１及び２へ変位された組換えＲＳＶは、予想外に容易に回収された。この結果は、単一ＶＳＶ糖タンパク質遺伝子の位置を２つ変位するだけで、ウイルス増殖は大きく阻害されたという水泡性口炎ウイルス（ＶＳＶ）に関する以前の研究と著しく異なっていた（Ｂａｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７３：４７０５−４７１２，１９９９， 引例として本明細書に組み込まれている）。ＲＳＶの複製が非効率的であり、ＲＳＶが複雑な遺伝子順位を有しており、さらに糖タンパク質遺伝子の動きには多数の部位変化が関連していたことから考えると、これらの変更ウイルスを回収する能力は予想外であった。実に、再配列されたＲＳＶは少なくとも、野生型遺伝子順位を有するた直近の親と同等に増殖した。これはＲＳＶにとっては特に重要である。なぜなら、上記のように、野生型ウイルスの細胞培養の増殖は非効率的であり、この増殖効率が加γ伽複製においてはさらに下がることを考えれば、ワクチン作成は実行不可能となるからである。このように、ＮＳｌ−ＮＳ２−Ｎ−Ｐ−Ｍタンパク質の全てが、増殖の健全性を著しく損なうことなく、プロモータへ関連して一つまたは二っだけ部位を置き換えることが可能であるというのは驚くべきことである。加えて、Ｇ糖タンパク質の発現を検査してみると、その親ウイルスの発現の数倍にまで発現が高まっていることがわかった。これにより、Ｇ及び／又はＦを第１部位に含むワクチンウイルスは、これらの感染保護抗原を他のウイルスタンパク質に比べてより高いモル量にて発現し、その結果、望まれるワクチン特質を有するウイルスであることが示された。
【００８０】
同様に二っの高度に弱毒化されたＲＳＶワクチン候補について広範囲に及ぶ遺伝子配列の修飾が成された。これらのＲＳＶワクチン候補は、先に引用される文献により詳しく述べられているように、ＮＳ２遺伝子が自然状態にて欠失されたか、又はＮＳ１及びＮＳ２遺伝子の両方が欠失されたものである。これらの二つのワクチン候補において、Ｇ及びＦ糖タンパク質が、共にそれぞれ部位１及び２へ変位され、Ｇ、Ｆ及びＳＨ糖タンパク質がそれらの本来の下流部位から欠失された。このように、回収されたウイルスであるＧｌＦ２△ＮＳ２△ＳＨ及びＧｌＦ２／△ＮＳ１△ＮＳ２△ＳＨは、Ｇ及びＦ遺伝子の変位に加えて、二っ又は三っの遺伝子がそれぞれ欠失される。行った変化の程度を分かりやすく示すために、遺伝子順位を、野生型ＲＳＶ（ＮＳ１−ＮＳ２−Ｎ−Ｐ−Ｍ−ＳＨ−Ｇ−Ｆ−Ｍ２−Ｌ）とＧｌＦ２／△ＮＳ２△ＳＨウイルス（Ｇ−Ｆ−ＮＳ１−Ｎ−Ｐ−Ｍ−Ｍ２−Ｌ）又は△ＮＳｌ△ＮＳ２△ＳＨ（Ｇ−Ｆ−Ｎ−Ｐ−Ｍ−Ｍ２−Ｌ）間にて、比較することができる。この比較により、殆ど又は全部の遺伝子の部位が、プロモータへ関連して変更されたことがわかる。しかし、これらの高度に弱毒化された誘導体は、細胞培養にて増殖する能力を保持した。
【００８１】
さらにまた別の変化を導入し、ヒト−ウシキメラＲＳＶにおけるＲＳＶの遺伝子配列を変更し、弱毒化生ワクチンとしてその特性を改良し、好結果を出している（以下を参照のこと：Ｂｕｃｈｏｌｚ ｅｔ ａｌ．により２０００年６月２３日に提出された米国特許出願番号０９／６０２，２１２、２００１年１月１８日にＷ０  ０１／０４３３５として公表されたそれに対応する特許協力条約申請書、及び１９９９年７月９日提出のその優先仮出願である米国特許出願番号６０／１４３，１３２。各々本書に文献として挿入される）。下記の例に記載されているように、Ｇ及びＦ遺伝子が組換えウシＲＳＶ（ｒＢＲＳＶ）背景内に置換されるところの、感染性組換えヒト−ウシキメラＲＳＶ（ｒＢＲＳＶ／ＨＲＳＶ）が、順調に構成され回収される。作製されたヒト−ウシキメラは、ＨＲＳＶからの二つの遺伝子、すなわちＧとＦ、及びＢＲＳＶからの８つの遺伝子、すなわちＮＳ１、ＮＳ２、Ｎ、Ｐ、Ｍ、ＳＨ、Ｍ２、Ｌを含む。この基本的な置換糖タンパク質の構成に加えて、ＨＲＳＶＧ及びＦ遺伝子が、ｒＢＲＳＶ骨格内のよりプロモータ隣接の部位へ（すなわち、ＲＳＶゲノムにおけるＦ及びＧ遺伝子の野生型の部位遺伝子配列部位に比べて）変位される。具体的には、Ｆ及びＧ遺伝子が、プロモータへ関連したそれらの通常の場所、すなわち遺伝子部位７及び８から、それぞれ部位１及び２へ変位していることである。作製されたキメラ組換えウイルスであるｒＢＲＳＶ／Ａ２−ＧｌＦ２は、免疫蛍光法により検査されたところによると、Ｆ及びＧタンパク質発現のレベルが、ｗｔＨＲＳＶの発現と非常に類似している。この結果、Ｇ及びＦ糖タンパク質の発現が強まったのは、それらの遺伝子のプロモータ隣接への変位が原因であると解釈される。このｒＢＲＳＶ／Ａ２−ＧｌＦ２ウイルスは、その遺伝子背景にあるＢＲＳＶ遺伝子と同一の配列を有しているのでホスト範囲の制限が強いこの表現型をおそらく共有すると思われる。この状況において、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるこの二つの保護抗原の増強された発現が、このウイルスの免疫原性を高め、極めて望ましいワクチン特性を生成することになる。
【００８２】
ＲＳＶは、モノネガウイルス目（Ｍｏｎｏｎｅｇａｖｉｒａｌｅｓ）の非分節型マイナス鎖のＲＮＡウイルスである。モノネガウイルス目は、４つの科を含む巨大で多様な目を構成している。すなわち、水泡性口炎ウイルス（ＶＳＶ）及び狂犬病ウイルスに代表されるラブドウイルス科（ｒｈａｂｄｏｖｉｒｉｄａｅ）、ボルナ病ウイルスに代表されるボルナウイルス科（Ｂｏｒｎａｖｉｒｉｄａｅ）、マルブルグウイルス及びエボラウイルスに代表されるフィロウイルス科（Ｆｉｌｏｖｉｒｒｄａｅ）、及びパラミクソウウイルス科（Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）などである。この最後の科はさらに、仙台、はしか、流行性耳下腺炎及びパラインフルエンザを含むパラミクソウウイルス亜科、及び呼吸器系胞体ウイルスを含むニューモウイルス亜科（Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）の二っの亜科に分けられる。
【００８３】
モノネガウイルス目ウイルスのゲノムは、線状に整列配置された５（ＶＳＶ）から１１（ＲＳＶ）の遺伝子を含む単一のＲＮＡである。モノネーガクイルースβウイルスのゲノムは、タンパク質を直接コードせず（故に「ネガティブセンス」）、それぞれが１又は複数のタンパク質をコードする補体ポジティブセンスｍＲＮＡｓを、コードする。一般的に、遺伝子は、短い遺伝子開始シグナルにて始まり、短い遺伝子終了シグナルで終る。これらのシグナルは、通常、８個から１２個のヌクレオチドから成り、通常、あるウイルスの遺伝子間において高度に保存されており、関連ウイルス間においてはその保存性は下がる。
【００８４】
ＲＳＶの場合、ゲノムは１５．２ｋｂ以上の長さがあり、１１個の同定されたタンパク質をコードする１０個の別のｍＲＮＡｓに転写される。具体的には、ＲＳＶの遺伝子配列は３’−ＮＳｌ−ＮＳ２−Ｎ−Ｐ−Ｍ−ＳＨ−Ｇ−Ｆ−Ｍ２−Ｌ−５’であり、Ｍ２のｍＲＮＡは重なっているＯＲＦｓからＭ２−１及びＭ２−２という二つのタンパク質をコードする。ＲＳＶの遺伝子開始及び遺伝子終了シグナルは、ＲＮＡ複製とプロモータ機能に関与する配列と共に、あらゆる進行中の研究により同定され、分析される（Ｂｕｋｒｅｙｅｖ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７０：６６３４−６６４１、１９９６、Ｃｏｌｌｉｎ ｅｔ ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：９６６３−９６６７、１９９１、Ｍｉｎｎｋ ｅｔ ａｌ．、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １８５：６１５−６２４、１９９１、Ｇｒｏｓｆｅｌｄ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６９：５６７７−５６８６、１９９５、Ｈａｒｄｙ ａｎｄ Ｗｅｒｔｚ、Ｊ．Ｖｉｒｏ１．７２：５２０−５２６、１９９８；Ｈａｒｄｙ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７３：１７０−１７６、１９９９、Ｋｕｏ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７０：６１４３−６１５０、１９９６、Ｋｕｏ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７０：６８９２−６９０１、１９９６、Ｓａｍａｌ ａｎｄ Ｃｏｌｌｌｉｎｓ、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７０：５０７５−５０８２、１９９６、Ｋｕｏ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１：４９４４−４９５３、１９９７、Ｆｅａｍｓ ａｎｄ Ｃｏｌｌｉｎｓ、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７３：３８８−３９７、１９９９、 各文献を引例として本明細書に組み込まれている）。
【００８５】
モノネガウイルス目ウイルスのゲノムの３’末端は、ポリメラーゼのエントリーを司るプロモータを含んでいる（Ｌａｍｂ ａｎｄ Ｋｏｌａｋｏｆｓｋｙ、Ｆｉｅｌｄｓ Ｖｉｒｏｌｏｒｙ、１：１１７７−１２０４、１９９６、ａｎｄ Ｗａｇｎｅｒ ａｎｄ Ｒｏｓｅ、Ｆｉｅｌｄｓ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１１２１−１１３６、１９９６、各文献を引例として本明細書に組み込まれている）。このプロモータは、ゲノムの３’末端にある遺伝子外先導部領域に、完全に又は部分的に含まれている。ポリメラーゼはその後、遺伝子開始及び遺伝子終了シグナルに導かれて、線形に、終了したり再開したりしながら、３’側から５ノ側のゲノムを、転写する。各々の遺伝子の遺伝子開始シグナルは、対応するｍＲＮＡの合成の開始を司り、遺伝子終了シグナルは対応するｍＲＮＡのポリアデニル化、終了及び放出を司る。ポリメラーゼはその後も、テンプレートに結合されたままにて、次の下流遺伝子開始シグナルにて再開始する。このプロセスが繰り返され、３’側から５’側に順次遺伝子を転写される（Ｌａｍｂ ａｎｄ Ｋｏｌａｋｏｆｓｋｙ，Ｆｉｅｌｄｓ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，ｌ：ｌ１７７−１２０４，１９９６；ａｎｄ Ｗａｇｎｅｒ ａｎｄ Ｒｏｓｅ、Ｆｉｅｌｄｓ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、１１２１−１１３６、１９９６；Ａｂｒａｈａｍ ａｎｄ Ｂａｎｅｒｊｅｅ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７３：１５０４−１５０８、１９７６；Ｂａｌｌ ａｎｄ Ｗｈｌｔｅ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７３：４４２−４４６、１９７６；Ｂａｌｌ、Ｊ．Ｖｉｒｏ１．２１：４１１−４１４、１９７７；Ｂａｎｅｒｊｅｅ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏ１．３４：１−８、１９７７；Ｉｖｅｒｓｏｎ ａｎｄ Ｒｏｓｅ、Ｃｅｌｌ ２３：４７７−４８４、１９８１；Ｉｖｅｒｓｏｎ ａｎｄ Ｒｏｓｅ、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．４４：３５６−３６５、１９８２；Ｂａｎｒｊｅｅ ｅｔ ａｌ．、Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ．５１：４７−７０、１９９１；引例により本明細書に組み込まれている）。
上に列挙されるＲＳＶタンパク質の４つは、ヌクレオキャプシドノポリメラーゼタンパク質、すなわち主要ヌクレオキャプシドＮタンパク質、リンタンパク質Ｐ、及びポリメラーゼタンパク質Ｌ、及び抗転写終結タンパク質Ｍ２−１である。３つは、表面糖タンパク質、すなわち結合Ｇタンパク質、貫通及びシンシチウム形成を行う融合性Ｆタンパク質、機能の不明な小型の疎水性ＳＨタンパク質である。基質Ｍタンパク質は、ウイルス粒子形成に関与する内部ウイルス粒子タンパク質である。機能不明な非構造的な二つのタンパク質ＮＳ１及びＮＳ２がある。最後に、Ｍ２ｍＲＮＡに第２のオープンリーデングフレーム（ＯＲＦ）があり、これはＲＮＡ制御因子であるＭ２−２をコードする。
【００８６】
Ｇ及びＦタンパク質は、主要な中和及び保護抗原である（Ｃｏｌｌｉｎｓ、ｅｔ ａｌ、Ｆｉｅｌｄｓ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２：１３１３−１３５２、１９９６；Ｃｏｎｎｏｒｓ、ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６６：１２７７−８１、１９９２）。ＲＳＶによる再感染への抵抗力は、大部分は、これらのタンパク質に対して特異性を有する血清及び粘膜抗体により仲介される。ＲＳＶ特異性細胞傷害性丁細胞もまた、ＲＳＶ感染により誘発され、多数の異種のタンパク質に対して制御されることが可能だが、このエフェクターは再感染に対する長期にわたる抵抗力の重要要因になるとは現在のところ報告されていない。しかしながら、ＣＤ８＋及びＣＤ４＋細胞は双方とも、免疫反応を制御する上で重要である可能性があり、双方ともウイルス病因に関与しているとなる（Ｊｏｈｎｓｏｎ、ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．２８：７１−８０、１９９８；Ｓｈｋｉａｔｋｈａｃｈｏｒｎ ａｎｄ Ｂｒａｃｉａｌｅ、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８６：４２１−３２、１９９７）。このように、Ｆ及びＧは、最も重要な抗原決定基であるが、他のタンパク質もまた免疫系において重要な役割を果たしている可能性がある。
【００８７】
ＲＳＶ単離株は、モノクローナル抗体の活性により、二つの抗原サブグループＡ及びＢに分けることができる（Ａｎｄｅｒｓｏｎ、ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１５１：６２６−３３、１９８５、Ｍｕｆｓｏｎ、ｅｔ ａｌ、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．６６：２１１１−２４、１９８５）。これらの二つのサブグループは、ゲノム間にて差異を呈するが、Ｇタンパク質の外領域において最も大きい多様性を示す。Ｇタンパク質の外領域では、アミノ酸配列の多様性の割合が５０％を越えることがあり、単一特異性ポリクローナル抗血清の活性に基づく抗原の多様性が９５％になる（Ｊｏｈｎｓｏｎ、ｅｔ ａｌ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４：５６２５−９、１９８７；Ｊｏｈｎｓｏｎ、ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６１：３１６３−６、１９８７）。Ｆタンパク質は、アミノ酸配列にて約１０％の多様性があり、抗原的にはＲＳＶＡ及びＢサブグループ間にて５０％の多様性がある（Ｊｏｈｎｓｏｎ、ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６１：３１６３−６、１９８７、Ｊｏｈｎｓｏｎ ａｎｄ Ｃｏｌｌｉｎｓ、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．６９：２６２３−８、１９８８）。このように、双方のサブグループは、ワクチンの代表例となるとなる。
【００８８】
ＲＳＶ及び他のモノネガウイルス目は、徐々に遺伝子の転写効率を減少させるため、その結果、最もプロモータ隣接のにある遺伝子が最も効果的に転写され、その後に並ぶ遺伝子の転写効率は徐々に下がると報告される（Ｌａｍｂ ａｎｄ Ｋｏｌａｋｏｆｓｋｙ、Ｆｉｅｌｄｓ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、１：１１７７−１２０４、１９９６；Ｗａｇｎｅｒ ａｎｄ Ｒｏｓｅ、 Ｆｉｅｌｄｓ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、１１２１−１１３６、１９９６；Ａｂｒａｈａｍ ａｎｄ Ｂａｎｅ１ｒｊｅｅ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７３：１５０４−１５０８、１９７６、Ｂａｌｌ ａｎｄ Ｗｈｉｔｅ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７３：４４２−４４６、１９７６、ａｌｌ、Ｊ．Ｖｉｒｏ１．２１：４１１−４１４、１９７７；Ｂａｎｅｒｊｅｅ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．、３４：１−８、１９７７、Ｉｖｅｒｓｏｎ ａｎｄ Ｒｏｓｅ、Ｃｅｌｌ ２３：４７７−４８４、１９８１、Ｉｖｅｒｓｏｎ ａｎｄ Ｒｏｓｅ、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．４４：３５６−３６５、１９８２、Ｂａｎｅｒｊｅｅ ｅｔ ａｌ．、Ｐｈａｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ．５１：４７−７０、１９９１、各々引例として本明細書に組み込まれている）。
【００８９】
この遺伝子発現の減少傾向は、これまでも報告されており、ＲＳＶの特徴の一っである（Ｃｏｌｌｉｎｓ ａｎｄ Ｗｅｒｔｚ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８０：３２０８−３２１２、１９８３；Ｃｏｌｌｉｎｓ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｖｉｒｏ１．４９；５７２−５７８、１９８４，Ｄｌｃｋｅｎｓ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｖｉｒｏ１．５２：３６４−３６９、１９８４、各々引例として本明細書に組み込まれている）。この減少傾向は、部分的には、配列の転写中に起こるポリメラーゼの「減少」が原因であると考えられている。モノネガウイルス目のウイルスの中で最も単純であるラブドウイルスＶＳＶについての研究によると、減少は主として遺伝子間領域にて起こるという（Ｉｖｅｒｓｏｎ ａｎｄ Ｒｏｓｅ、Ｃｅｌｌ ２３：４７７−１５４８４、１９８１、Ｉｖｅｒｓｏｎ ａｎｄ Ｒｏｓｅ、Ｊ．Ｖｉｒｏ１．４４：３５６−３６５、１９８２、各々引例として本明細書に組み込まれている）。しかし、大型ＬｍＲＮＡの量が極端に低いため、遺伝子内の減少もその結果して当然であるとも言える。
【００９０】
モノネガウイルス目のウイルスについて報告される遺伝子転写の減少傾向は、感染細胞内の多様なウイルスｍＲＮＡｓの相対的モル率を決定する主要な因子であると考えられている。この現象は、言い換えると、ウイルスのタンパク質の相対的モル率を決定する主要な因子であると考えられている。モノネガウイルス目のウイルスはどれもみな、次の５つのタンパク質に対応するものをコードする遺伝子を有している。すなわち、ＲＮＡ結合ヌクレオキャプシドタンパク質Ｎ、リンタンパク質Ｐ、内部ウイルス粒子基質タンパク質Ｍ、結合タンパク質Ｇ、ＨＡ、又はＨＮ、及び大型ポリメラーゼタンパク質Ｌなどである。さらに、これらは、必ず３’→５’に向かってＮ−Ｐ−Ｍ−Ｇ−Ｌの順になっている。
【００９１】
これから解釈できることは、このゲノム構成は、モノネガウイルス目のウイルス共通の二一ズが、Ｎ及びＰタンパク質の量が多く、Ｌの量が少なく、さらにＭ及びＧの量が中程度であることを反映している。選択肢として、モノネガウイルス目のウイルス内の相同性組換え体の欠落は、結果的に、ウイルスにとって必ずしも最適ではない先祖の遺伝子配列の保持につながることが示唆される（Ｂａｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７３：４７０５−４７１２，１９９９、引例として本明細書に組み込まれている）。抑制遺伝子の順位及び転写の極性が、モノネガウイルス目のウイルスの遺伝子発現の制御における重要な因子として提案される。しかしながら、他の二次的な因子もまた、１又は複数のモノネガウイルスにおけるタンパク質の発現の相対的レベルに影響を及ぼすと考えられている。二次的因子には、シス作用性ＲＮＡシグナルの効率における差異、多様なｍＲＮＡｓの翻訳の効率における差異、及びタンパク質の処理及び安定性における差異などが含まれる。
【００９２】
単純な原型モノネガウイルスＶＳＶは、５つの遺伝子を有している（Ｗａｇｎｅｒ ａｎｄ Ｒｏｓｅ、Ｆｉｅｌｄｓ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、１１２１−１１３６、１９９６、Ｓｃｈｕｂｅｒｔｅｔａｌ、 Ｊ．Ｖｉｒｏ１．５１：５０５−５１４、１９８４、各々引例として本明細書に組み込まれている）。しかしながら、他のモノネガウイルスは、１１（ＲＳＶ）又は１２（ネズミの肺炎ウイルス）もの遺伝子を有している（Ｂａｒｒ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｖｉｒｏ１．、６８：５３３０−５３３４、１９９４、本書に文献として挿入される）。これらには、パラミクソウイルス及びニューモウイルスの全てに見られる融合性Ｆ遺伝子などのタンパク質、パラミクソウイルスの一部に見られるＣ，Ｄ及びＶ遺伝子、さらにニューモウイルスの殆どに見られるＮＳ１、ＮＳ２、ＳＨ及びＭ２遺伝子が含まれる。また、ＶＳＶとＲＳＶに共通である可能性がある５つのタンパク質（Ｎ、Ｐ、Ｍ、Ｇ及びＬ）についても、Ｌに対してのみ明瞭な配列関連性があり、その関連性は低い（Ｐｏｃｈ ｅｔ ａｌ．、Ｅｍｂｏ．Ｊ．８：３８６７−３６７４，１９８９、Ｓｔｅｃ ｅｔ ａｌ．、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １８３：２７３−２８７、１９９１、各々引例として本明細書に組み込まれている）。
【００９３】
遺伝子生成物の整列及び構造におけるこの広範囲に渡る差異、さらにトランス作用性とシス作用性組成物の構造及び機能における差異を考慮すれば、１つのモノネガウイルス、例えばＶＳＶの特徴及び特質は、直接他のモノネガウイルス、例えばＲＳＶに当てはめることはできない。この不確実は、ＲＳＶポリメラーゼが３つではなく４つのタンパク質から成り、余分な１つはＭ２−１抗転写終結因子であり、ＶＳＶにはそれに対応するタンパク質がないという研究成果により例示される（Ｈａｒｄｙ ａｎｄ Ｗｅｒｔｚ、Ｊ．Ｖｉｒｏ１．７２：５２０−５２６，１９９８；Ｈａｒｄｙ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｖｉｒｏ１．７３：１７０−１７６，１９９９，Ｃｏｌｌｉｎｓ ｅｔ ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９３：８１−８５、１９９６；Ｆｅａｒｎｓ ａｎｄ Ｃｏｌｌｉｎｓ、Ｊ．Ｖｉｒｏ１．７３：５８５２−５８６４、１９９９、各々引例として本明細書に組み込まれている）。これが、組換えＲＳＶの効率的な回収に非常に重要であることが論証される。（Ｃｏｌｌｉｎｓ ｅｔ ａｌ．、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２５９：２５１−２５５，１９９９；引例として本明細書に組み込まれている）。加えて、ＲＳＶのＲＮＡの合成は、少なくとも二つのタンパク質ＮＳｌ及びＭ２−２によりさらに制御されており、この二つのタンパク質は、ＶＳＶ内にこれらに対応する物質を有するていない（Ｂｅｒｍｉｎｇｈａｍ ａｎｄ Ｃｏｌｌｉｎｓ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９６：１１２５９−６４、１９９９；Ｗｈｌｔｅｈｅａｄ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｖｉｒｏ１．７３：３４３８−３４４２、１９９９；Ａｔｒｅｙａ ｅｔ ａｌ、Ｊ．Ｖｉｒｏ１．７２：１４５２−６１、１９９８、Ｊｉｎ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｖｉｒｏ１．７４：７４−８２；２０００；各々引例として本明細書に組み込まれている）。
【００９４】
ＶＳＶ遺伝子の発現及び制御に関する多くの重要な特徴も、多くの他のモノネガウイルス、特にＲＳＶには、なんらの関連性もないように思われる。これらのＶＳＶ遺伝子の発現及び制御に関する特徴には、次のようなものがある。すなわし、ＶＳＶ遺伝子の発現を補完的に制御している末端基の関与（Ｗｅｒｔｚ ｅｔ ａｌ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：８５８７−８５９１、１９９４；Ｗｈｅｌａｎ ａｎｄ Ｗｅｒｔｚ、Ｊ．Ｖｉｒｏ１．７３：２９７−３０６、１９９９、Ｐｅｅｐｌｅｓ ａｎｄ Ｃｏｌｌｉｎｓ、Ｊ．Ｖｉｒｏ１．７４：１４６−１５５、２０００、各々引例として本明細書に組み込まれている）、直接遺伝子発現に関与する高度に保存されたＶＳＶの遺伝子間領域（ＲＳＶの遺伝子間領域はこうではないが（Ｂａｒｒ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１：１７９４−１８０１、１９９７、引例として本明細書に組み込まれている）（Ｋｕｏ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７０：６１４３−６１５０、１９９６、引例として本明細書に組み込まれている）、他のモノネガウイルスグループには見られないＶＳＶゲノム・パッケージング・シグナル（Ｗｈｅｌａｎ ａｎｄ Ｗｅｒｔｚ、Ｊ．Ｖｉｒｏ１．７３：３０７−３１５、１９９９、引例として本明細書に組み込まれている）、及びＮタンパク質によるＶＳＶ遺伝子の発現及び複製の制御（Ｗａｇｎｅｒ ａｎｄ Ｒｏｓｅ、Ｆｉｅｌｄｓ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、１１２１−１１３６、１９９６、Ｆｅａｍｓ ｅｔ ａｌ．、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２３６：１８８−２０１、１９９７、引例として本明細書に組み込まれている）。これらの特徴は、ＲＳＶには起こらないようであり（Ｐｅｅｐｌｅｓ ａｎｄ Ｃｏｌｌｉｎｓ、Ｊ．Ｖｉｒｏ１．７４：１４６−１５５、２０００、引例として本明細書に組み込まれている）、一方対照的に、ＲＳＶには、ＶＳＶでは起こらない遺伝子の発現及び制御に関する重要な特徴がある。その特徴には次のようなものがある。すなわち、シス作用性の機能的要素を欠く多様な遺伝子間配列（Ｋｕｏ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７０：６１４３−６１５０、１９９６、引例として本明細書に組み込まれている）、部位特異性の弱毒を伝達する遺伝子の重なり１箇所（Ｆｅａｍｓ ａｎｄ Ｃｏｌｌｉｎｓ、Ｊ．Ｖｉｒｏ１．７３：３８８−３９７、１９９９、Ｃｏｌｌｉｎｓ ｅｔ ａｌ．、ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４：５１３４−５１３８、１９８７、引例として本明細書に組み込まれている）、及びＬ遺伝子の発現に非常に重要であるポリメラーゼのバックトラッキング・メカ必要性ムの存在（Ｆｅａｍｓ ａｎｄ Ｃｏｌｌｉｎｓ、Ｊ．Ｖｉｒｏ１．７３：５３８８−５３９７、１９９９、引例として本明細書に組み込まれている）などである。特に、配列の転写を調節する抗転写終結因子の存在（Ｆｅａｍｓ ａｎｄ Ｃｏｌｌｉｎｓ、Ｊ．Ｖｉｒｏ１．７３：５８５２−５８６４、１９９９、引例として本明細書に組み込まれている）、特異性を有する制御タンパク質、部位特異性の弱毒化、さらに転写の遺伝子結合特異性のモジュレーション（Ｈａｒｄｙ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｖｉｒｏ１．７３：１７０−１７６、１９９９、引例として本明細書に組み込まれている）は、ＶＳ��での状況と全く対照的である。
【００９５】
本発明のある実施例では、遺伝子位置の変位が、ＲＳＶのＮＳ１、ＮＳ２、ＳＨ及び／又はＧ遺伝子の１又は複数の欠失により行なわれており、それらの欠失が、個別に上記の文献に記載される。これらに代わる遺伝子又はゲノム分節の欠失が、上記に同定されるＲＳＶ遺伝子又はゲノム分節のどれを使っても構成することができ、残りのＲＳＶ遺伝子の遺伝子部位を修飾することができる。より詳細な例では、ＮＳ１及びＮＳ２遺伝子を対で欠失する上記の文献に例示されるように、複数の遺伝子又はゲノム分節が欠失される（Ｂｕｋｒｅｙｅｖ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｖｉｒｏ１．７１：８９７３−８９８２、１９９７、Ｔｅｎｇ ａｎｄ Ｃｏｌｌｉｎｓ、Ｊ．Ｖｉｒｏ１．７３：４６６−４７３、１９９９、Ｗｈｌｔｅｈｅａｄ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｖｉｒｏ１．７３：３４３８−３４４２、１９９９、文献として挿入される）。
【００９６】
組換えＲＳＶゲノム又はアンチゲノム内にて、１又は複数の遺伝子またはゲノム分節を欠失することが、全ての下流の遺伝子をプロモータへ隣接する位置に変位させるという効果を有する（例えば、下流の遺伝子をその位置にて１又は複数のプロモータへ隣接する方向へ変位させることにより）。例えば、ＲＳＶのＮＳ１及びＮＳ２遺伝子が、ゲノム地図において第１及び第２の遺伝子であり、それらを同等に欠失させることにより、残りの遺伝子全ての位置を修飾する。
【００９７】
このように、ＮＳｌ及びＮＳ２を共に欠失する場合、Ｎは部位３から部位１へＰは部位４から部位２へというように変位される。選択肢として、この遺伝子配列内の他のどの遺伝子を欠失しても、それよりさらに下流にある遺伝子の部位 （プロモータを基準として）にのみ影響を及ぼす。例えば、ＳＨが、野生型ウイルスにおいて部位６を占めているが、それを欠失しても部位５にあるＭ（又は他のどの上流遺伝子にも）には影響を及ぼさないが、Ｇをプロモータ基準として部位７から６へ変位させる。遺伝子欠失はまた、稀ではあるが、生物学的に得られるウイルスにも起こり得ることを特筆しておく。例えば、細胞培養にて大規模に継代培養したサブグループＢＲＳＶが、自然発生的にＳＨ及びＧ遺伝子を欠失している（Ｋａｒｒｏｎ ｅｔ ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９４：１３９６１−１３９６６、１９９７；引例として本明細書に組み込まれている）。「上流」及び「下流」とは、それぞれ、プロモータへ隣接及びプロモータへ遠位の方向を意味していることに留意されたい（プロモータは、ネガティブセンス・ゲノムＲＮＡの３’先導部末端にある）。
【００９８】
本発明において有用な遺伝子の再配列における第２の例が、遺伝子順位を修飾するために、又はプロモータを基準とした遺伝子部位の変位を組換えゲノム又はアンチゲノムに導入するめに、遺伝子、ゲノム分節又は異種性ポリヌクレオチド配列を、組換えＲＳＶゲノム又はアンチゲノムに、挿入することに関連している（例えば以下を参照。Ｂｕｋｒｅｙｅｖ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｖｉｒｏ１．７０：６６３４−６６４１、１９９６；Ｂｕｋｒｅｙｅｖ ｅｔ ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９６：２３６７−２３７２、１９９９、Ｍｏｎｙａ ｅｔ ａｌ．、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．４２５：１０５−１１１、１９９８、Ｓｉｎｇｈ ａｎｄ Ｂｉｌｌｅｔｅｒ、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．８０：１０１−１０６、１９９９、引例として本明細書に組み込まれている）。
【００９９】
組み込まれた遺伝子の各々が、全て下流の遺伝子を、プロモータを基準として、１箇所だけ置き換える。これら及び他の置換ポリヌクレオチドが、組換えゲノム又はアンチゲノムを非コード領域（ＮＣＲ）に、挿入又は再配列することも、又は組換えゲノム又はアンチゲノムに、別個の遺伝子ユニット（ＧＵ）として、挿入することもある。本明細書に用いられているように、「ＲＳＶ遺伝子」という用語は、通常上流末端にて、１ヌクレオチド遺伝子開始（ＧＳ）シグナルを開始、下流末端で１２から１３、１ヌクレオチド遺伝子終了（ＧＥ）シグナルで終了する一般的にｍＲＮＡをコードするＲＳＶゲノムの一部を意味する。本発明にて使用する１０個の遺伝子が、ＲＳＶとして知られているので、すなわちＮＳ１、ＮＳ２、Ｎ、Ｐ、Ｍ、ＳＨ、Ｇ、Ｆ、Ｍ２及びＬである。「遺伝子」という用語はまた、本明細書にては「翻訳オープンリーデングフレーム（ＯＲＦ）」のことを指すのにも使われている。ＯＲＦが、重要なＲＳＶタンパク質１個をコードする翻訳オープンリーデングフレームとして、より詳しく定義される。重要なタンパク質のうち、現在、ＮＳ１、ＮＳ２、Ｎ、Ｐ、Ｍ、ＳＨ、Ｇ、Ｆ、Ｍ２−１（又はＭ２（ＯＲＦｌ））、Ｍ２−２（又はＭ２（ＯＲＦ２））、及びＬの１１個が認識されている。このように、「遺伝子」という用語は、サブゲノムＲＮＡをコードするゲノムＲＮＡ配列、及びＯＲＦを意味し、これらは同じことを意味する（後者の用語は特に、異なったタンパク質をコードする二つの重なり合う０ＲＦが１つのｍＲＮＡにあるＲＳＶのＭ２遺伝子の場合にあてはまる）。（Ｃｏｌｌｉｎｓ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７１：１３０１５−３０２０、１９９０、Ｂｅｒｍｉｎｇｈａｍ ａｎｄ Ｃｏｌｌｉｎｓ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９６：１１２５９−１１２６４、１９９９、Ａｈｍａｄｉａｎ ｅｔ ａｌ．、ＥＭＢＯ Ｊ．１９：２６８１−２６８９、２０００、Ｊｉｎ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７４：７４−８２、２０００（各々引例として本明細書に組み込まれている）。「遺伝子」という用語がプロモータの位置を基準として遺伝子の位置を決定する状況により使われる場合は、この用語は通常厳密には転写遺伝子開始及び遺伝子終了シグナルモチーフにより区切られるｍＲＮＡコード配列を指す（Ｃｏｌｌｉｎｓ ｅｔ ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８３：４５９４−４５９８、１９８６、Ｋｕｏ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｖｉｒｏ１．７０：６８９２−６９０１、１９９６、各々引例として本明細書に組み込まれている）。
【０１００】
「ゲノム分節」という用語は、あらゆる長さのＲＳＶゲノムからの連続性ヌクレオチドを指し、ゲノム分節が、ＯＲＦ、遺伝子、または遺伝子外領域の組み合わせの一部であってよい。
【０１０１】
本発明の遺伝子位置を変位したＲＳＶ内にて挿入部、置換部、欠失要素、又は再配列要素に使用するために選択される遺伝子及びゲノム分節には、ＮＳ１、ＮＳ２、Ｎ、Ｐ、Ｍ、ＳＨ、Ｍ２（ＯＲＦｌ）、Ｍ２（ＯＲＦ２）、Ｌ、ＦまたはＧタンパク質又はそれらのタンパク質をコードする遺伝子又はゲノム分節が含まれる。遺伝子外先導部又は尾部領域にような、制御領域もまた、考慮対象になり得る。本発明の好ましい例では、キメラＲＳＶはＲＳＶのＦ、ＧまたはＳＨ糖タンパク質をコードする１又は複数の異種遺伝子を組み込んでいる。選択肢として、組換えＲＳＶは、ＲＳＶのＦ、ＧまたはＳＨ糖タンパク質の細胞質ドメイン、膜間ドメイン、外部ドメイン又は免疫原性エピトープをコードするゲノム分節を組み込むこともできる。これらの免疫原性タンパク質、ドメイン及びエピトープが、新しい免疫反応を免疫化するホストに生成するため、遺伝子位置を変位したＲＳＶにおいて、特に有用である。特に、Ｇ及びＦタンパク質、及びそれらに含まれるドメインとエピトープが、主要な中和及び感染保護抗原を提供し得る。さらに、例えば、流行性耳下腺炎及びＲＳＶウイルスに見出されるＳＨタンパク質のような、非ＲＳＶタンパクをコードする遺伝子及びゲノム分節を、本発明の遺伝子位置を変位したＲＳＶに組み込むことが可能である。遺伝子外３’先導部または５’尾部領域、遺伝子開始領域、遺伝子終了領域、遺伝子間領域、又は３’または５’非コード領域のような、制御領域もまた、異種性（異種のＲＳＶ菌株またはサブグループ、又はＰＩＶ、麻疹、流行性耳下腺炎などの非ＲＳＶ資源からするもの）置換又は付加として有用である。
【０１０２】
例えば、ヒトＲＳＶサブグループ又は菌株からする１又は複数の遺伝子又はゲノム分節を、ウシレシピエントゲノム又はアンチゲノムに付加又は置換またはその内にて付加又は置換することにより、１又は複数の特異性を有するヒトＲＳＶサブグループ又は菌株を含むヒト供与ウイルスを対象とする、免疫反応を生成する能力を有する組換えキメラサブウイルス粒子えお生成し、一方でウシ骨格が、弱毒化された表現型を与え、このキメラが、ワクチン開発に有用な候補となる。そのような一例では、感染しやすいホストが、抗ヒトＲＳＶ免疫反応を惹起する弱毒化され、そして感染性を有するヒト−ウシキメラを作製するために、１又は複数のヒトＲＳＶ糖タンパク質遺伝子Ｆ、ＳＨ、及び／又はＧが、１部又は完全なウシゲノム又はアンチゲノムに付加又は置換、あるいはその内にて付加又は置換される。他の「キメラ」実施例では、遺伝子位置を変位したＲＳＶが、例えば、ＲＳＶサブグループＡ及びＢからするＦ又はＧタンパク質らの免疫原性部分のような、複数のヒトＲＳＶ菌株からする免疫原性タンパク質、タンパク質ドメイン、又はエピトープをコードする異種性の遺伝子又はゲノム分節を組み込んでいる。さらに別のこれに代わる例では、遺伝子位置を変位したＲＳＶゲノム又はアンチゲノムが、ヒト及びウシ双方の糖タンパク質ドメイン又は免疫原性エピトープを有する組換えウイルス又はサブウイルス粒子内にて、キメラ糖タンパク質をコードしている。例えば、ヒトＲＳＶのＦ、ＳＨ又はＧ糖タンパク質から糖タンパク質外ドメインをコードする異種性ゲノム分節、背景のウシゲノム又はアンチゲノム内にて対応するウシＦ、ＳＨ又はＧ糖タンパク質細胞質ドメイン及び内部ドメインをコードするゲノム分節に組み合わせることもできる。
【０１０３】
本発明の方法によると、ヒトウシキメラＲＳＶが、異種性遺伝子又はゲノム分節を、それらに対応する遺伝子又はゲノム分節と、部分的ＲＳＶ背景ゲノム又はアンチゲノムにおいて、置換することにより、構成することができる。選択肢として、異種性遺伝子又はゲノム分節を、完全な（別の遺伝子又はゲノム分節が欠失される場合は、部分的な）ＲＳＶ背景ゲノム又はアンチゲノムと組み合わせ、過量の遺伝子又はゲノム分節として付加することができる。例えば、ＲＳＶサブグループＡ及びＢのそれぞれから１つ、合計二つのヒトＲＳＶ Ｇ又はＦ遺伝子又はゲノム分節を、含めることができる。
【０１０４】
多くの場合、置換遺伝子又はゲノム分節（異種性の遺伝子又はゲノム分節を含めて）が、１部又は完全なＲＳＶゲノム又はアンチゲノム内の遺伝子間部位にて付加される。選択肢として、遺伝子又はゲノム分節が、そのゲノムの他の非コード領域内に配置してもよい。例えば、５’側又は３’側の非コード領域内、又はヌクレオチドの非コードが、１部又は完全なゲノム又はアンチゲノム内にて起こる他の部位などである。一観点においては、非コード制御領域が、効率のよい複製に必要なシス作用性シグナル、転写、及び翻訳を含み、従がって置換遺伝子又はゲノム分節を本発明に開示されるように導入することにより、これらの機能の修飾を行う目的部位にもなっている。本発明のさらに詳細な観点において、弱毒化変異が、シス作用性制御領域に、例えば以下を生成するために導入される。
【０１０５】
すなわち、（１）組織特異性の弱毒化（Ｇｒｏｍｅｌｅｒ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｖｉｒｏ１．７３：９５８−６４、１９９９；ｚｌｍｍｅｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｖｉｒｏ１．７１：４１４５−９，１９９７）、（２）インターフェロンに対する高い感受性（ｚｌｍｍｅｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｖｉｒｏ１．７１：４１４５−９、１９９７）、（３）温度感受性（Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ ｅｔ ａｌ．、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２４７：２３２−９、１９９８）、（４）複製のレベルにおける一般的制限（Ｍｅｎ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｖｉｒｏ１．７０：３９３０−７、１９９６；Ｍｕｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：５１７７−５１８１、１９９１）、及び／又は（５）複製のホスト特異性制限（Ｃａｈｏｕｒ ｅｔ ａｌ．、Ｖｉｒｏｌｏｒｙ ２０７：６８−７６、１９９５）などである。これらの弱毒化変異は、あらゆる方法にて達成でき、例えば、点変異、関連ウイルス間の配列交換、又は欠失により、本発明の弱毒化遺伝子変位されたＲＳＶを作成できる。
【０１０６】
本発明のこれらに代わる他の実施例では、遺伝子位置を変位したＲＳＶが提供されており、この遺伝子位置を変位したＲＳＶでは、複数の遺伝子又はゲノム分節を欠失、挿入、置換、又は再配列することにより、組換えＲＳＶが修飾される。ある例では、選択された「遺伝子の組み込み」を、組換えＲＳＶゲノム又はアンチゲノムヘ、その内にて又はそこから、これらの手段の１つを用いて、連係して変位する。個別に又は連係して変位される遺伝子群が選択される可能性のあるＲＳＶ遺伝子群には、ＲＳＶのＮ、Ｐ、ＮＳ１、ＮＳ２、Ｍ２−１及びＭ遺伝子が含まれ、これらが、弱毒化された遺伝子位置の変位誘導体を生成するために、ヒト又はウシＲＳＶゲノム又はアンチゲノム内にて、単独、又は任意の組み合わせにより変位することができる。さらに詳細な観点において、ヒト又はウシＲＳＶのＮ及びＰ遺伝子の双方が、連係されて欠失、挿入、置換、又は再配列される（例えば、ＨＲＳＶゲノム又はアンチゲノムにおける、ウシＲＳＶからの対応Ｎ及びＰ遺伝子による、連係した欠失又は置換により）。この配列された遺伝子の変位が、ＲＳＶゲノムに存在するある種の遺伝子間の機能的な協調性により促進される。この協調性が、ゲノム内の隣接する遺伝子の対にしばしば起こるものである。このように、他の前記に代わる実施例では、ＮＳ１及びＮＳ２遺伝子の双方が、例えば、ウシＲＳＶからＮＳｌ及びＮＳ２遺伝子によるヒトＲＳＶの置換などにより、連係して変位する。さらにまた別の例では、ＲＳＶのＭ２−１、Ｍ２−２及びＬ遺伝子の２またはそれ以上連係して変位する。ホスト範囲制限が高レベルであることが望まれる本発明のある種のワクチン候補については、ヒトＲＳＶのＮ、Ｐ、ＮＳ１、ＮＳ２、Ｍ２−１及びＭ遺伝子のそれぞれが、ウシＲＳＶからの対応遺伝子Ｎ、Ｐ、ＮＳ１、ＮＳ２、Ｍ２−１及びＭにより置き換えられている。
【０１０７】
ヒト−ウシキメラＲＳＶ内の連係された遺伝子の変位がまた、ウシ背景ゲノム又はアンチゲノム内へのヒト抗原遺伝子の導入に通じている。幾つかの例では、Ｆ、Ｇ、ＳＨ、及びＭから選択された１又は複数のヒトＲＳＶエンベロープ関連遺伝子を、部分的な又は完全なウシＲＳＶ背景ゲノム又はアンチゲノム内にて、付加、又は置換する。例えば、Ｆ、Ｇ、ＳＨ、及びＭから選択された１又は複数のヒトＲＳＶエンベロープ関連遺伝子を、１部又は完全なウシＲＳＶ背景ゲノム又はアンチゲノム内にて、付加、又は置換させることもあり、その中でＦ、Ｇ、ＳＨ、及びＭから選択された１又は複数のエンベロープ関連遺伝子を欠失する。さらに詳細な観点において、ヒトＲＳＶエンベロープ関連遺伝子Ｆ、Ｇ、及びＭとして定義される遺伝子セットからする１又は複数の遺伝子が、エンベロープ関連遺伝子Ｆ、Ｇ、ＳＨ、及びＭを欠失する部分的なウシＲＳＶ背景ゲノム又はアンチゲノム内にて付加される。下記の例に記載されているこれらの特徴を有する典型的なヒトウシキメラＲＳＶは、ｒＢＲＳＶ／Ａ２−ＭＧＦである。
【０１０８】
本発明の他の観点において、ＲＳＶワクチン候補へ異種性ヌクレオチド配列を組み込むことが、候補ワクチン組換え体の弱毒化レベルを調整するために、個別に行なわれている（例えば、上気道用に）。このように、外来タンパク質の発現を司り、同時に動物のホストにおけるウイルスを弱毒化するヌクレオチド配列をｒＲＳＶへ挿入することが可能であり、また、ヌクレオチド挿入を別個に用いて候補ワクチンウイルスを弱毒化することが可能である。本発明のこれらの観点を達成する一般的なツールと方法は、例えば、以下の文献に提供される。
【０１０９】
すなわち、仮出願番号６０／１７０，１９５、米国特許出願番号０９／４５８，８１３、及び米国特許出願番号０９／４５９，０６２（各々本書に文献として挿入される）。したがって、本発明の典型的な例では、選択されたＲＳＶ遺伝子間結合間にはしかＨＡＯＲＦを組み込むことにより、ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるウイルス複製を制限している。本発明のこれらの観点において、選択された遺伝子の挿入量は、比較的多い（約１９００ｎｔｓ以上）。この状況において、挿入のサイズにより、結果として作製される組換えウイルスの弱毒化のレベルを特定し選択できる。例えば、単一の遺伝子単位（ＧＵｓ）として導入され、重要なＯＲＦを欠失するように特に設計するなど、異種性のウイルスからする様々な長さの置換配列が、ゲノムの長さを増加させたため（すなわち、付加ｍＲＮＡの発現と比較して）、選択可能な弱毒化効果を呈する。類似したサイズを組み込むことが下流の非コード領域（ＮＣＲ）に導入されるよう他の構成も本発明では有用である。
【０１１０】
遺伝子挿入による弱毒化への効果を左右する法則を定義するため、多様な長さの遺伝子ユニットを、野生型ＲＳＶ骨格に組み込みし、遺伝子単位の長さの弱毒化への効果を調べることができる。重要なＯＲＦを含まないように設計された遺伝子単位を組み込むことにより、その遺伝子の発現タンパク質の効果の影響を受けずに、遺伝子単位長の効果だけを評価することができる。これらの異種性配列が、ＨＮとＬ遺伝子の間の、１６８ｎｔから３９１８ｎｔのサイズを有する追加遺伝子ユニットとして、ＰＩＶ骨格に挿入された。さらに、制御ｃＤＮＡ構成及びウイルスを生成し、その中で同様のサイズの挿入がＰＩＶのＨＮ遺伝子の３’非コード領域に置かれ、そして余分な遺伝子の付加が行なわれなかった。これらのウイルスを、ゲノム全長の増加及び遺伝子数の増加の、弱毒化への効果を測るために作製した。追加遺伝子単位の組み込みにより、挿入部位から下流の遺伝子の転写が低下すると考えられており、この転写の低下は発現タンパク質の全体の量的存在度及び発現率の双方に影響すると考えられる。本明細書に記載されているように、約３０００ｎｔｓの長さを越える遺伝子挿入又は拡張により、ハムスターの上気道及び下気道に感染する野生型ウイルスが弱毒化された。約２０００ｎｔｓの長さを有する遺伝子挿入により、同上気道に感染するｒＨＰＩＶ３ｃｐ４５Ｌワクチン候補がさらに弱毒化された。
【０１１１】
ＲＳＶへ類似した遺伝子を挿入することが、このように候補ワクチンウイルスを弱毒化すること、及び第２のウイルスに対して感染保護効果を誘発することの二重の効果がある。ある遺伝子の３’非コード領域における遺伝子拡張は、付加タンパク質を発現することはできないが、遺伝子拡張内、及び遺伝子拡張自体の弱毒化を起こすこともできる。本発明のこれらの方法において、遺伝子挿入長は、弱毒化の決定因子である。
【０１１２】
本発明にて使用される遺伝子再配列の別の例では、かなり長いポリヌクレオチド（例えば、１００個を超えるヌクレオチド）を導入することも、欠失することもせずに、天然にて生成する１又は複数の遺伝子の部位を、天然にて生成する他の遺伝子に関連して変更することを含んでいる。例えば、ヒト又はヒト−ウシキメラＲＳＶのＦ及びＧ遺伝子が、組換えＲＳＶゲノム又はアンチゲノムの長さを大幅に変更することなく、それら天然の遺伝子配列部位から、プロモータへ有意に隣接へ、それらの遺伝子の組換えゲノム又はアンチゲノムヘ、切除及び再挿入することにより変位することができる。
【０１１３】
遺伝子部位及び／又は遺伝子順位におけるこれらの修飾により、一般的に、修飾された生物学的特質を有するたウイルスを生成する。例えば、１又は複数の選択された遺伝子（例えば、ＮＳ１、ＮＳ２、ＳＨ、又はＧ，ＮＳ１とＮＳ２を共に、及びＳＨとＧを共に）を欠損する本発明の組換えＲＳＶが、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、又はｉｎ  ｖｉｖｏにて、あるいはその両方にて弱毒化することができる。この表現型が、主としてたぶん特異性を有するウイルスタンパク質の発現を喪失することが、原因にて起こると考えられるが、さらに修飾された遺伝子地図によりこの表現型が起こるとも考えられる。このことが、ＳＨ遺伝子を欠失したウイルスにて観察した結果により裏付けられる。このＳＨ遺伝子欠失ウイルスを、ある細胞種の野生型に比べより効果的に増殖したが、それはおそらくこの遺伝子欠失及び欠失の結果として起こる遺伝子配列の変化及びおそらくゲノムサイズの変化に起因する転写、複製、又はその双方の効率の増大によると考えられる。ｃＤＮＡから感染性ＲＳＶを生成する能力を利用して、ｃＤＮＡ中間体を通して感染性ウイルスに所定の変更を導入する方法が提供される。
【０１１４】
この方法は、野生型の組換えＲＳＶ菌株Ａ２の一連の感染性弱毒化誘導体を生成するために使われてきた。これらの誘導体には、例えば、シス作用性ＲＮＡシグナルにおける１又は複数のヌクレオチド置換、及び／又は１又は複数のウイルスタンパク質におけるアミノ酸置換、及び／または１又は複数の遺伝子の欠失、又はその発現の除去を含む、弱毒化変異が含まれている（Ｂｕｋｒｅｙｅｖ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｖｉｒｏ１．７１：１８９７３−８９８２、１９９７；Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｖｉｒｏ１．７２：４４６７−４４７１、１９９８、Ｗｈｌｔｅｈｅａｄ ｅｔ ａｌ．、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２４７：２３２−２３９、１９９８；Ｂｅｒｍｉｎｇｈａｍ ａｎｄ Ｃｏｌｌｉｎｓ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９６：１１２５９−１１２６４、１９９９；Ｊｕｈａｓｚ ｅｔ ａｌ．、Ｖａｃｃｉｎｅ １７：１４１６−１４２４、１９９９、Ｊｕｈａｓｚ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｖｉｒｏ１．７３：５１７６−５１８０、１９９９、Ｔｅｎｇ ａｎｄ Ｃｏｌｌｉｎｓ、Ｊ．Ｖｉｒｏ１．７３：４６６−４７３、１９９９；Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７３：８７１−８７７、１９９９，Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｖｉｒｏ１．７３：３４３８−３４４２、１９９９；Ｃｏｌｌｉｎｓ ｅｔ ａｌ．、Ａｄｖ．Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓ．５４：４２３−４５１、１９９９；１９９９年７月９日に提出された米国特許出願番号６０／１４３，０９７、米国特許出願番号０９／６１１，８２９及びＷ００１／０４３２１として公開されたその対応特許協力条約出願書、各々引例として本明細書に組み込まれている）。
【０１１５】
菌株Ａ２が、抗原サブグループＡを代表するものであり、効果的なワクチンＲＳＶもまたもう１つの抗原サブグループＢを代表するものである。Ｇ及びＦ糖タンパク質が、主要な抗原決定基であり、そして主な感染保護ＲＳＶ抗体である（Ｃｏｎｎｏｒｓ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｖｉｒｏ１．６５：１６３４−１６３７、１９９１，Ｍｕｌｐｈｙ ｅｔ ａｌ．、Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３２：１３−３６、１９９４；Ｃｏｌｌｉｎｓ ｅｔ ａｌ．、Ｆｉｅｌｄｓ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２：１３１３−１３５２、１９９６，ａｎｄ Ｃｒｏｗｅ ｅｔ ａｌ．、Ｎｅｗ Ｇｅｎｅｒａｔｌｏｎ Ｖａｃｃｉｎｅｓ、７１１−７２５、１９９７、各々引例として本明細書に組み込まれている）。
【０１１６】
従って、組換えＡ２のＧ及びＦ遺伝子が、抗原サブグループＢのＢｌ菌株からそれらに対応する遺伝子と置き換えられた（Ｗｈｌｔｅｈｅａｄ ｅｔ ａｌ．、 Ｊ．Ｖｉｒｏ１．７３：９７７３−９７８０、１９９９、本明細書の引例として組み込まれて）。これは、野生型により弱毒化された菌株Ａ２骨格を使って行なわれた。組換えウイルスが得られ、この「キメラ化」が、ウイルス複製を殆ど妨げなかった。このことにより、ワクチンウイルス作製の迅速な方法が示された。具体的には、弱毒化された菌株Ａ２骨格を使って、サブグループＢの抗原決定基を発現することである（特許出願中）。このように、適切に弱毒化されたサブグループＡ遺伝子位置を変位したＲＳＶワクチンウイルスが臨床検査により同定されると、その骨格を修飾して、同等のサブグループＢワクチンを迅速な方法を使って生成することができ、これらの二つのウイルスを混合して２価のワクチンを作製することができる。
【０１１７】
上記の文献に示されるように、本発明で有用なＲＳＶが、余分な遺伝子つまり過剰の遺伝子として、あらゆるゲノム部位の１箇所に、好ましくは遺伝子間領域に、配置された付加外来遺伝子を発現し得る。この概念が、過剰遺伝子としてのサブグループＢのＧ糖タンパク質を発現した組換え菌株Ａ２ウイルスを作製するために利用された。このように、単一のウイルスが、二つのサブグループの抗原決定基を発現した。本明細書に組み込まれたさらに別の例には、付加遺伝子としてのインターフェロンガンマの発現が関連しており、この例は、免疫原性を減少させることなく弱毒化させることができ、さらにＴヘルパーリンパ球サブセット２の刺激の相対的レベルを下げる方法を提供し、これがＲＳＶに対する免疫病原性反応を仲介するとされる（例えば以下を参照：１９９９年７月１３日に提出された米国仮出願番号６０／１４３，４２５、米国特許出願番号０９／６１４，２８５及びＷ０ ０１／０４２７１として公開された特許協力条約出願書、各々引例として本明細書に組み込まれている）。
【０１１８】
本発明の上記に代わる例では、遺伝子部位の変位を組み込んだ生のウイルスワクチンを弱毒化した異なった基盤が提供される。これは、弱毒化が部分的にホスト範囲の効果に基づいている。この点において、簡略な開示例が、ＨＲＳＶ／ＢＲＳＶ間に、ゲノム分節、全部の遺伝子、複数の遺伝子を導入することにより、弱毒化キメラＲＳＶを提供している。ＨＲＳＶとＢＲＳＶ間のホスト範囲の違う例示として、ＢＲＳＶの増殖がチンパンジーにおいて微かに認められるか認識できない程度であるのに比べて、ＨＲＳＶではチンパンジーにおいて高度に自由な増殖を見せていることを挙げている。チンパンジーが、ヒトにおけるＲＳＶ感染及び免疫抗原活性について広く利用されるモデルであり、ヒトに類似したウイルス複製及び疾病を呈する。下記に示すように、チンパンジーにおいて観察されるキメラＲＳＶのホスト範囲の違いが、細胞培養において観察されたホスト範囲の違いと相関関係があり、便利な予備アッセイ法を提供する結果となった。
【０１１９】
本発明のキメラヒト−ウシＲＳＶにて観察されたホスト範囲の効果は、一般的にＨＲＳＶ／ＢＲＳＶ間にて観察されるヌクレオチド及びアミノ酸配列の差異に関連している。例えば、次に挙げるタンパク質の各々についてＨＲＳＶ／ＢＲＳＶ間のアミノ酸の相同性の割合が、次のようになっている。すなわち、ＮＳｌ（６９％）、ＮＳ２（８４％）、Ｎ（９３％）、Ｐ（８１％）、Ｍ（８９％）、ＳＨ（３８％）、Ｇ（３０％）、Ｆ（８１％）、Ｍ２−１ （８０％）、Ｌ（７７％）である。ＨＲＳＶ／ＢＲＳＶ間における遺伝子の多様性が著しいため（例えば、ＨＲＳＶのＮ遺伝子をＢＲＳＶのＮ遺伝子と置き換えると、およそ２６のアミノ酸の差異が関与してくる）、本発明のキメラウシーヒトＲＳＶは、特に有用なワクチン候補である。下記に例示されるように、ＢＲＳＶＧ及びＦ糖タンパク質をＨＲＳＶの対応糖タンパク質に置換すると、チンパンジーにおける複製について組換えＢＲＳＶの許容度が高まる。アミノ酸又はヌクレオチドに複数め差異を有する複数の遺伝子及びゲノム分節を関与させることにより、表現型の復帰に非常に安定性を示す広範な弱毒化の基盤が提供できる。この弱毒化モードが、個々において変異する表現型の復帰により、かなり又は完全な病原性毒性の再獲得が得られる、１つ又は幾つかの点変異により弱毒化されたＨＲＳＶウイルスと極めて対照的である。これに加えて、ＨＲＳＶにおける既知の弱毒化点変異が、一般的に温度感受性の表現型を生成する。これは、温度感受性の表現型が、抗変ＨＲＳＶを抗変異原物質に暴露した後に修飾された子孫を同定する、第１のスクリーニングとして特に使用されるからである。温度感受性に関わる弱毒化の問題の１つは、このウイルスの下気道における複製が過度に制限されるが、上気道においては弱毒化が不十分であり得ることである。これが、下気道においては温度が高い（制限性が高い）が、上気道においては温度が低い（制限性が低い）という、気道の温度勾配があるためである。上気道において複製する弱毒化ウイルスの能力が、欝血、鼻炎、発熱、中耳炎などの併発症を結果として起こす可能性がある。このように、温度感受性の変異のみにより達成された弱毒化は、理想的でないかもしれない。対照的に、本発明の遺伝子位置を変位したＲＳＶにみられるホスト範囲変異は、殆どの場合、温度感受性を持たない。従って、この新しい弱毒化方法は、次の性質を呈する。つまり（ｉ）遺伝子的にも表現型的にもより安定している、（ｉｉ）他の生きたワクチンアプローチに比べて、上気道における残留毒力に関与する可能性が低いことである。
【０１２０】
ＢＲＳＶ／ＨＲＳＶ間における配列の多様性は、先に述べたＨＲＳＶ Ａ／Ｂサブグループ間における多様性の約二倍である。このように、Ｆタンパク質が、ＢＲＳＶ／ＨＲＳＶ間においてアミノ酸多様性が約２０％で、Ｇタンパク質が７０％の多様性を有している（Ｌｅｒｃｈ、ｅｔ ａｌ、Ｊ．Ｖｉｒｏ１．６４：５５５９−６９、１９９０；Ｌｅｒｃｈ、ｅｔ ａｌ．、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １８１：１１８−３１、１９９１、Ｍａｌｌｉｐｅｄｄｉ ａｎｄ Ｓａｍａｌ、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７４：２００１−４、１９９３；Ｍａｌｌｉｐｅｄｄｉ ａｎｄ Ｓａｍａｌ、Ｖｅｔ．Ｍｉｃｒｏｂｌｏｌ．３６：３５９−６７，１９９３、Ｓａｍａｌ ｅｔ ａｌ．、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １８０：４５３−４５６、１９９１；Ｓａｍａｌ ａｎｄ ｚａｍｏｒａ、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７２：１７１７−１７２０、１９９１、Ｚａｍｏｒａ ａｎｄ Ｓａｍａｌ、Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓ．２４：１１５−１２１、１９９２；ｉｂｉｄ、ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７３：７３７−７４１、１９９２、Ｍａｌｌｉｐｅｄｄｉ ａｎｄ Ｓａｍａｌ、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７３：２４４１−２４４４、１９９２、Ｐａｓｔｅｙ ａｎｄ Ｓａｍａｌ、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７６：１９３−１９７、１９９５、Ｗａｌｒａｖｅｎｓ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７１：３００９−３０１４、１９９０、Ｙｕｎｎｕｓ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７９：２２３１−２２３８、１９９８、各々引例として本明細書に組み込まれている）。
【０１２１】
本明細書に挿入される先の文献では、組換えＢＲＳＶが修飾され、Ｇ及びＦ ＢＲＳＶ遺伝子が、そのヒトＲＳＶの対応する遺伝子と置き換えられた。その結果として作製されたキメラＢＲＳＶ／ＨＲＳＶウイルスが、ＢＲＳＶの骨格にヒトＲＳＶの抗原決定基を持ち、チンパンジーにおいてそのＢＲＳＶ親と比較して有意に効率的に複製したが、高い弱毒化程度を維持した。これにより、Ｇ及びＦ遺伝子がＢＲＳＶのホスト範囲制限の一因であったことがわかるが、１又は複数の遺伝子もまたこのホスト範囲制限を特定したことがわかる。これは、上記に記載されているような遺伝子部位変化を特徴とし、さらにヒトＲＳＶＧ及びＦ抗原決定基を含む最適なＢＲＳＶ／ＨＲＳＶキメラウイルス構成の開始点になる。
【０１２２】
このＢＲＳＶ／ＨＲＳＶキメラウイルスにおいては、結果として生成される組換えＲＳＶは、ホスト範囲制限の特質を与える１又は複数のＢＲＳＶ遺伝子の存在により弱毒化される（Ｂｕｃｈｈｏｌｚ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．１１８７−１１９９、２０００、１９９９年７月９日に提出された米国国特許出願番号６０／１４３，１３２、各々引例として本明細書に組み込まれている）。
【０１２３】
ｃＤＮＡから組換えＲＳＶを作製するため、及び本発明の付加的観点として本明細書に開示される変異化及びヌクレオチドの修飾を全範囲にわたり作成および試験するため、物質及び方法に関する詳細なる記載が、例えば、１９９５年９月２７日に提出された米国特許仮出願番号６０／００７，０８３、１９９６年９月２７日に提出された米国特許出願番号０８／２０，１３２、１９９６年７月１５日に提出された米国特許仮出願番号６０／０２１，７７３及び現在米国特許番号５，９９３，８２４として発行される米国特許出願番号０８／８９２，４０３、１９９７年５月９日に提出された米国特許仮出願番号６０／０４６，１４１、１９９７年５月２３日に提出された米国特許仮出願番号６０／０４７，６３４、１９９９年１１月３０日に提出された米国特許番号５，９９３，８２４（国際公開番号Ｗ０ ９８／０２５３０に対応する）、Ｃｏｌｌｉｎｓｅｔａｌ．により１９９９年４月１３日に提出された米国特許出願番号０９／２９１，８９４及びその対応特許協力条約出願Ｗ０ ００／６１７３７、Ｍｕｒｐｈｙ ｅｔ ａｌ．により１９９９年４月１３日に提出された米国特許仮出願番号６０／１２９，００６、Ｃｒｏｗｅ ｅｔ ａｌ．、Ｖａｃｃｉｎｅ １２：６９１−６９９、１９９４、ａｎｄ Ｃｒｏｗｅ ｅｔ ａｌ．、Ｖａｃｃｉｎｅ １２：７８３−７９０、１９９４；Ｃｏｌｌｉｎｓ，ｅｔ ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９２：ｌ１５６３−１１５６７、１９９５；Ｂｕｋｒｅｙｅｖ，ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ． ７０：６６３４−４１、１９９６，Ｊｕｈａｓｚ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１（８）：５８１４−５８１９、１９９７；Ｄｕｒｂｉｎ ｅｔ ａｌ．、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２３５：３２３−３３２，１９９７；Ｋａｒｒｏｎ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１７６：１４２８−１４３６、１９９７；Ｈｅ ｅｔ ａｌ．、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２３７：２４９−２６０、１９９７；Ｂａｒｏｎ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１：１２６５−１２７１、１９９７；Ｗｈｌｔｅｈｅａｄ ｅｔ ａｌ．、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２４７（２）：２３２−９，１９９８ａ；Ｗｈｌｔｅｈｅａｄ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２（５）：４４６７−４４７１、１９９８ｂ；Ｊｉｎ ｅｔ ａｌ．、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ２５１：２０６−２１４、１９９８；Ｂｕｋｒｅｙｅｖ、ｅｔ ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９６：２３６７−２３７２、１９９９；Ｂｅｒｍｉｎｇｈａｍ ａｎｄ Ｃｏｌｌｉｎｓ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９６：１１２５９−１１２６４、１９９９ Ｊｕｈａｓｚ ｅｔ ａｌ．、Ｖａｃｃｉｎｅ １７：１４１６−１４２４、１９９９；Ｊｕｈａｓｚ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７３：５１７６−５１８０、１９９９；Ｔｅｎｇ ａｎｄ Ｃｏｌｌｉｎｓ、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７３：４６６−４７３、１９９９，Ｗｈｌｔｅｈｅａｄ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７３：９７７３−９７８０、１９９９，Ｗｈｌｔｅｈｅａｄ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７３：８７１−８７７、１９９９；ａｎｄ Ｗｈｌｔｅｈｅａｄ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７３：３４３８−３４４２、１９９９．、に示されている。
【０１２４】
ｃＤＮＡから組換えＲＳＶを作製する典型的な方法は、ＲＳＶアンチゲノムＲＮＡ及びＲＳＶのＮ、Ｐ、Ｍ２−１とＬタンパク質の細胞内同時発現（通常、組織培養細胞に同時トランスフェクションされたプラスミドにからする）に関するものである。これが、結果としてｃＤＮＡから感染性ウイルスを生産させる増殖的な感染の開始点となり、このウイルスが組換えウイルスと呼ばれる。一旦生成されると、組換えＲＳＶを、生物学的に得られるウイルスと同様に容易に増殖し、組換えウイルスとその生物学的に得られた対応ウイルスが、前者が１又は複数の導入された変化をマーカとして含まない限り区別することができない。
【０１２５】
さらに詳細な観点において、上記の引用文献には、本発明で有用な、弱毒化された変異菌株（例：温度感受性（ｔｓ）、低温継代培養（ｃｐ）、低温適応性（ｃａ）、小型プラーク（ｓｐ）、及びホスト範囲制限（ｈｒ）の変異菌株）を得るための変異誘発やＲＳＶの単離及び特徴付けの方法及び手順、及び弱毒化された表現型を特定する遺伝子変化を同定する方法及び手順が記載されている。これらの方法と関連して、上記の文献は、ヒトＲＳＶＡ及びＢサブグループをはじめとする、生物学的に得られたヒトＲＳＶ及び組換えにより生成された弱毒化ヒトＲＳＶの複製、免疫原性、遺伝子の安定性及び感染保護効率を、マウス及び霊長類のモデル系を含む容認されたモデル系を用いて、決定する手順について詳細に記している。加えて、これらの文献は、１価及び２価のワクチンを含む免疫学的組成物を、ＲＳＶ感染の予防及び治療のために、開発し検査する一般的方法について説明している。感染性のＲＳＶをｃＤＮＡから生成する能力により、前もって決定された変化を感染性ウイルスにｃＤＮＡ中間体を用いて導入する方法が提供される。
【０１２６】
この方法は、広範囲の感染性弱毒化ＲＳＶの誘導体を生成するとして記載されている。その例は、ウイルスのタンパク質における１又は複数のアミノ酸置換、遺伝子発現の除去、及び／又は望みの効果をウイルスの表現型に生成するシス作用性ＲＮＡシグナルにおける１又は複数のヌクレオチド置換を含む組換えワクチン候補である（参照例Ｂｕｋｒｅｙｅｖ ｅｔ ａＩ．、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１：８９７３−８９８２、１９９７、Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：４４６７−４４７１、１９９８、ｈｌｔｅｈｅａｄ ｅｔ ａｌ．、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２４７：２３２−２３９、１９９８、Ｂｅｍｉｎｇｈａｍ ａｎｄ Ｃｏｌｌｉｎｓ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９６：１１２５９−１１２６４、１９９９、Ｊｕｈａｓｚ ｅｔ ａｌ．、Ｖａｃｃｉｎｅ  １７：１４１６−１４２４、１９９９、Ｊｕｈａｓｚ  ｅｔ  ａｌ．、 Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７３：５１７６−５１８０、１９９９、Ｔｅｎｇ ａｎｄ Ｃｏｌｌｉｎｓ、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７３：４６６−４７３、１９９９；Ｗｈｌｔｅｈｅａｄ ｅｔ ａｌ．、 Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７３：８７１−８７７、１９９９、Ｗｈｌｔｅｈｅａｄ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７３：３４３８−３４４２、１９９９、ａｎｄ Ｃｏｌｌｉｎｓ ｅｔ ａｌ．、Ａｄｖ．Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓ．５４：４２３−４５１、１９９９、各々引例として本明細書に組み込まれている）。
【０１２７】
上記の指導の模範例は、生物学的に得られたＲＳＶ変異により同定された表現型特異性の変異体を組み入れるように修飾された感染性組換えＲＳＶを構成及び評価する方法である。生物学的に得られたＲＳＶ変異体の例には、以下の名称を有する生物学的に得られた変異から組換えＲＳＶにより識別されるｃｐ及びｔｓ変異体であるｃｐｔｓ ＲＳＶ ２４８（ＡＴＣＣ ＶＲ２４５０），ｃｐｔｓ ＲＳＶ ２４８／４０４（ＡＴＣＣ ＶＲ２４５４），ｃｐｔｓ ＲＳＶ ２４８／９５５（ＡＴＣＣ ＶＲ２４５３），ｃｐｔｓ ＲＳＶ ５３０（ＡＴＣＣ ＶＲ２４５２），ｃｐｔｓ ＲＳＶ ５３０／１００９（ＡＴＣＣ ＶＲ２４５１），ｃｐｔｓ ＲＳＶ ５３０／１０３０（ＡＴＣＣ ＶＲ２４５５），ＲＳＶ Ｂ−１ ｃｐ５２／２Ｂ５（ＡＴＣＣ ＶＲ２５４２），ａｎｄ ＲＳＶ Ｂ−１ ｃｐ−３（ＡＴＣＣ ＶＲ２５７９）がある。これらの方法が、本発明の組換え遺伝子位置を変位したＲＳＶの構成するために容易に改造される。このようにして得られた組換えＲＳＶが、同一の又は異種の生物学的に得られたＲＳＶ変異からする二つ以上のｔｓ変異体（例えば、２４８／４０４、２４８／９５５、５３０／１００９、又は５３０／１０３０の生物学的変異の１つ以上）を、組み入れることができる。後者の状況では、増強弱毒化組換え体は、二つ、三つ以上の生物学的変異からする弱毒化変異体を組み合わせ（例えば、ＲＳＶ変異５３０／１００９／４０４、２４８／４０４／ｌ００９、２４８／４０４／１０３０、又は２４８／４０４／１００９／１０３０変異にからする弱毒化変異の組み合わせ）を有することもある。典型的な例においては、１又は複数の弱毒化変異が、ＲＳＶポリメラーゼ遺伝子内のアミノ酸Ａｓｎ４３、Ｐｈｅ５２１、Ｇｌｎ８３１、Ｍｅｔ１１６９、又はＴｙｒ１３２１における温度感受性を置換、及び遺伝子Ｍ２の遺伝子開始配列における温度感受性のヌクレオチド置換を特定している。好ましくは、これらの変異体が、同一の又は保存型の変化を、生物学的に得られる変異ＲＳＶにより同定される次の変化と共に有する。例えば、Ｌポリメラーゼ遺伝子により同定される次の置換に関連した保存型の変化、Ａｓｎ４３に対してＩｌｅ、Ｐｈｅ５２１に対してＬｅｕ、Ｇｌｎ８３１に対してＬｅｕ、Ｍｅｔ１１６９に対してＶａｌ、及びＴｙｒ１３２１に対してＡｓｎなどである。
【０１２８】
本発明の遺伝子位置を変位したＲＳＶに組み込むことのできる付加的な変異体が、例えば、異種性ＲＳＶ又は関連性の薄い負鎖ＲＮＡウイルス内により同定される弱毒化などの変異体である。特に、単一のネガチブ菌株のＲＮＡウイルスにて同定される弱毒化変異又は他の望まれる変異体が、ヒト又はウシＲＳＶゲノム又はアンチゲノム内の対応する部位に、遺伝子位置を変位したＲＳＶ内により、又は遺伝子位置を変位したＲＳＶ構成手段として、「変位」（例えば、コピー）されてよい。簡単に言えば、異種性一本負鎖ＲＮＡウイルスにおいて望まれる変異体が、ＲＳＶレシピエントに（例えば、それぞれ、ウシ又はヒトＲＳＶに）変位される。これは、異種性ウイルスにおける変異のマッピングが関与し、そうすることにより、配列の並びでヒト又はウシＲＳＶにおける対応部位を同定し、（同一変異又は保存型変異により）ＲＳＶレシピエントにおける本来の配列を変異遺伝子型に変異させる。（以下を参照のこと：ＭｕｒＰｈｙｅｔａｌ．により１９９９年４月１３日に提出された米国特許仮出願番号６０／１２９，００６、引例として本明細書に組み込まれている）。この開示が導くように、キメラゲノム又はアンチゲノムを、異種性変異ウイルスにより同定された変化に保存的に対応する変異体の対象部位にて、その変化をコードするように修飾するのが好ましい。例えば、アミノ酸置換が変異ウイルスにおける変異部位を対応する野生型配列に比較してマークする場合、類似した置換が組換えウイルスにおける対応残基に設計されるべきである。好ましくは、置換が、同一の又は保存型のアミノ酸を、変異ウイルスタンパク質内に存在する残基に関与させるのが望ましい。しかし、本来のアミノ酸残基を変異部位にて、変異タンパク質における置換残基に関連して非保存型に修飾することもできる（例えば、他のあらゆるアミノ酸を用いて、野生型残基の機能を途絶し損なうことにより）。典型的な変異が同定され本発明の遺伝子位置を変位したＲＳＶに変位される負鎖ＲＮＡウイルス群には、他のＲＳＶｓ（例えば、マウスのＲＳＶ）、ＰＩＶ、センダイウイルス（ＳｅＶ）、ニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）、シミアンウイルス５（ＳＶ５）、麻疹ウイルス（ＭｅＶ）、牛疫ウイルス、イヌジステンバーウイルス（ＣＤＶ）、狂犬病ウイルス（ＲａＶ）及び水泡性口炎ウイルス（ＶＳＶ）がある。ＲＳＶＬタンパク質の部位５２１でのフェニルアラニンのアミノ酸置換（ＨＰＩＶ３Ｌタンパク質の位置４５６でのフェニルアラニンの置換に対応する）を含むがそれに限定されない、様々な典型的な変異が開示される。欠失又は挿入でマークされる場合は、これらを、欠失又は挿入されたタンパク質断片のサイズ及びアミノ酸配列がいかに異なろうとも、組換えウイルスヘの対応欠失又は挿入として、導入することができる。
さらに多様なタイプの変異体もまた、上記の文献に記載されており、弱毒化及び免疫原性を較正し、他の有利な構造的及び／又は表現型的な効果を提供するために、本発明の組換え遺伝子位置を変位したＲＳＶに容易に作製され得る。例えば、制限部位マーカが、ｃＤＮＡ構成及び操作を促進するために、ルーチンとして、遺伝子位置の変位ゲノム又はアンチゲノム内に導入される。本書の文献には、また迅速な方法の発明にて有用な点又は部位特異性変異の他に、広範囲のヌクレオチド修飾が記載されている。例えば、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ｃｈｌｏｒａｍｐｈｅｎｉｃｏｌ ａｃｅｔｙｌ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（ＣＡＴ）又はルシフェラーゼ遺伝子のような、追加の外来遺伝子を発現する組換えＲＳＶを生成する方法及び組成物が開示される。そのような組換え体は、一般的に、挿入遺伝子に関連して増殖が鈍る。この弱毒化が、挿入遺伝子の長さと共に高まる。組換えＲＳＶへの外来遺伝子の挿入は複製のレベルを下げ、その挿入はｉｎ ｖｉｔｒｏの継代培養中は安定しているという研究結果により、ワクチンに使用するためにＲＳＶを弱毒化する効果的な方法がもうひとつ提供できる。類似又は改良された効果が、こうした他の選択遺伝子（例えば、インターフェロン−γ、インターロイキン２、インターロイキン４及びＧＭ−ＣＳＦなどのサイトカイン）の組み込みにより達成される。
【０１２９】
本発明の方法では、追加の遺伝子又はゲノム分節を、遺伝子位置を変位したＲＳＶゲノム又はアンチゲノム内に又はそれに隣接して組み込むこともできる。これらの遺伝子が、レシピエント遺伝子の共通の制御下にあってよく、又は転写シグナルの独立したセットの制御下にあってもよい。ターゲット遺伝子には、上記に同定されるＲＳＶ遺伝子、さらに非ＲＳＶ遺伝子が含まれる。タゲット非ＲＳＶ遺伝子は、サイトカイン（例えば、ＩＬ−２からＩＬ−１８まで、特に、ＩＬ−２、ＩＬ−６及びＩＬ−１２、ＩＬ−１８など）、γインターフェロン、及びＴヘルパー細胞エピトープを多く含むタンパク質をコードする遺伝子が含まれる。さらにこれらの付加的なタンパク質を、別個のタンパク質として、又はＳＨのようなＲＳＶタンパク質の第２のコピーから作製されたキメラとして発現することができる。これにより、ＲＳＶに対する免疫反応を量的にも質的にも修飾及び改良する能力が提供される。
【０１３０】
ゲノム長を増やすと、部分的には挿入物の長さに依るが、結果として作成されるＲＳＶの弱毒化に繋がる。さらに、非ＲＳＶ遺伝子からの遺伝子位置を変位したＲＳＶに組み込まれる特定タンパク質（例えばサイトカイン）の発現が、そのタンパク質の作用により、ウイルスの弱毒化に繋がる。感染性、そして弱毒化されたウイルスの表現型及びＲＳＶトランスフェクション細胞から高レベルのサイトカイン発現を生む典型的なサイトカインには、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、ＩＬ−４、ＧＭ−ＣＳＦ、及びγ一インターフェロンが含まれる。サイトカイン遺伝子を本発明の部位変位されたＲＳＶへ導入することにより、結果として、細胞性又は体液性の免疫反応の増大を含む別の効果を生ずる。
【０１３１】
本発明の遺伝子位置を変位したＲＳＶ内にてのウイルス遺伝子又はゲノム分節の全体の変更を伴う欠失、挿入、置換及び他の変異が、非常に安定したワクチン候補を産み、これらのワクチン候補が、免疫抑制された個体に特に重要である。これらの変更の多くは結果として作製されたワクチン菌株の弱毒化を結果としてもたらし、一方他の変更が別のタイプの必要な表現型変更を特定する。例えば、アクセサリー（つまり、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて必須でない）遺伝子が、ホストの免疫性に特異的に干渉するタンパク質をコードする優れた候補である（以下参照例Ｋａｔｏ ｅｔ ａｌ．、ＥＭＢＯＪ．Ｊ．１６：５７８−８７、１９９７、本書に文献として組み入れられる）。キメラワクチンウイルスにおいてそのような遺伝子を除去すると、毒力及び病因及び／又は免疫原性を下げると考えられている。
【０１３２】
組換え遺伝子位置を変位したＲＳＶに組み込まれるものとして、上記文献に記載されるさらにまた別の独立したヌクレオチド修飾には、選択されたＲＳＶ遺伝子の１部又は完全な欠失又は除去が含まれる。このように、ＲＳＶのＮＳ１、ＮＳ２、Ｎ、Ｐ、Ｍ、Ｇ、Ｆ、ＳＨ、Ｍ２（ＯＲＦ１）、Ｍ２（Ｏｍｍ２）及び／又はＬ遺伝子のオープンリーデングフレーム及び／又はシス作用性制御配列の１部又は完全な欠失を含めて、ＲＳＶ遺伝子又はゲノム分節を欠失することもできる。一例では、ＳＨ ｍＲＮＡとタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を除去することによりＳＨ遺伝子の発現が除去された組換えＲＳＶが作製される。ＳＨ遺伝子を欠失することにより、回収可能な感染性のＲＳＶだけでなく、感染性ウイルス及びプラークの双方の産出量に基づいて、組織培養の増殖がかなり改良されたＲＳＶも得られた。
【０１３３】
ＳＨ欠失により特定されたこの組織培養における改良された増殖が、例えば培養におけるＲＳＶの産生量が乏しいという問題を克服することにより、遺伝子位置を変位したＲＳＶワクチンを開発する有用なツールを提供している。さらに、これらの欠失が、遺伝的復帰に対して高度に安定しており、それから得られるＲＳＶクローンをワクチン剤として特に有用なものとしている。ＳＨが取り除かれたＲＳＶ組換え体はまた、マウスの上気道に部位特異性の弱毒化を呈し、これはワクチン開発にとって新しい利点となる。ウイルスワクチンとして評価対象となった現行のＲＳＶ菌株（例えば、ｃｐ変異）が、組織培養において著しく修飾された増殖を呈さない。これらはホスト範囲関連の変異であり、チンパンジー及びヒトの気道での複製を、下気道での複製の約ｌ００倍制限する。またべつの典型的な種の変異体であるｔｓ変異が、上気道から下気道へ向かう体温の上昇勾配のために、好んで下気道におけるウイルス複製を制限する。これらのｃｐ及びｔｓ変異と対照的に、ＳＨが取り除かれたＲＳＶ組換え体が、上気道における強力な制限を呈する特異な表現型群を有する。上気道での複製を制限することが、主に鼻で呼吸する脆弱な年齢集団に安全にワクチンを投与するため必須であるため、極めて幼若な乳児に使用するワクチンとして、このワクチンが特に望ましい。さらにいかなる年齢集団においても、上気道での複製が押えらることにより、中耳炎の罹患率が下がる。これらの利点に加えて、例えば約４００ｎｔ及びｍＲＮＡ全体を除去することを伴うＳＨ欠失変異体の性質は、復帰に対する高度に不応性を呈する変異のタイプを表わしている。同時に遺伝子位置の変位を指図する（例えば、Ｆ及びＧ糖タンパク質遺伝子発現を上限調節する）ための「置換ポリヌクレオチド」としてＳＨ欠失の効用を、下記の例に詳細に明らかにする。
【０１３４】
ＳＨ遺伝子修飾の状況においてさらに記載されていることが、有用なＲＳＶ組換えワクチンを生成するため付加的なツールおよび方法を提供するために、ヒト及びウシのＲＳＶｓ、及び他のニューモウイルスを含む異種のＲＳＶｓでのＳＨ遺伝子を比較することである。例えば、２ＲＳＶ抗原サブグループＡ及びＢが、ある種のＳＨドメインにおける比較的高度の保存性を呈している。そのような２つのドメインでは、ＲＳＶ Ａ及びＢのＮ末端領域及び膜貫通ドメインが、アミノ酸レベルで８４％の相同性を示すが、推定Ｃ末端外部ドメインはもっと多様性がある（約５０％の同一性）。ＲＳＶサブグループＢ菌株２つ（８／６０及び１８５３７）のＳＨ遺伝子を比較すると、アミノ酸の差異が１つだけあった（Ａｎｄｅｒｓｏｎｅｔａｌ．，上述）。ヒト−ウシＲＳＶ間のＳＨタンパク質が、約４０％同一で、以下に示す主要な構造的特徴を共有している。すなわち、（ｉ）保存された残基の非対称な分布、（ｉｉ）非常に類似した疎水性の特質、（ｉｉｉ）１部位が疎水性領域のそれぞれの側にある２つのＮ連鎖糖鎖形成部位の存在、（ｉｖ）各々のＳＨタンパク質の中心疎水領域にあるカルボキシ末端側の単一システイン残基（Ａｎｄｅｒｓｏｎｅｔａｌ．，上記）である。これらの及び他の配列間の類似点及び相違点を評価することにより、感染性の遺伝子位置を変位したＲＳＶクローン内での置換及び挿入の対象となる異種性配列を選択することが可能となる。これは、例えば、多特異性の免疫原性効果又は／加えて弱毒化のような望ましい効果を有するワクチンを作成するためである。
【０１３５】
本発明の上記に代わる実施例では、望ましい表現型の変化を得るために、部分的な遺伝子欠失又は他の限定されたヌクレオチド欠失を、組換えＲＳＶに設計する。一例では、ＲＳＶゲノム長が、ＳＨ遺伝子の下流非コード領域から配列を欠失することにより短縮される。このな典型的な部分的遺伝子欠失が、Ｇ−Ｆ遺伝子間領域にあるＸｍａＩ部位を含むアンチゲノムｃＤＮＡのバージョンを使って構成されたが、この変化自体が、コードされたウイルスに影響を及ぼすと考えられていなかった。ＲＳＶ／６１２０という名称が与えられたこのコードされたウイルスが、ＳＨ ＯＲＦの最後の３コドン及び終了コドンにおいてサイレント・ヌクレオチドを有しており、またＳＨ下流の非翻訳領域（組換えアンチゲノム内の部位４４９９から４６１０まで）から１１２個のヌクレオチドが欠失される。この欠失により、遺伝子終了「（Ｂｕｋｒｅｙｅｖ，ｅｔ ａｌ．），Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７０：６６３４−４１、１９９６、文献として本書に組み込まれている」がそのまま残る。これらの点変異及び１１２−ｎｔの欠失には、いかなるウイルスタンパク質のコードされたアミノ酸も修飾されず、いかな既知のウイルスＲＮＡシグナルをさえぎることも、コードされたｍＲＮＡｓの数が変わることもなし、６１２０ウイルスを、複数ステップの増殖の効率についてその全長対応ウイルスであるＤ５３と一緒に分析し、増殖性において、１．５倍から２倍の係数分、Ｄ５３ウイルスのそれより高いピーク力価を示した。このように、１１２−ｎｔと非コード配列を有するＳＨ遺伝子の小規模で部分的な欠失が、ｉｎ ｖｉｖｏにおける増殖効率を著しく上昇させた。
他の部分的遺伝子の欠失及び小規模なヌクレオチドの欠失を、容易に本発明の組換えＲＳＶに、以下におけるヌクレオチド欠失を含むウイルス表現型を修飾するために設計することができる。すなわち、（１）シス作用性ＲＮＡシグナルから離れた多様なＯＲＦｓの最初及び／又は最後にある非翻訳配列、（２）遺伝子間領域、及び（３）プロモータ活性に必須でない３’先導部及び５’尾部の領域である。欠失又は挿入に適した非翻訳遺伝子配列の例には、ＮＳ１、ＮＳ２、Ｐ、Ｍ、Ｆ、及びＭ２遺伝子下流の非翻訳領域にて次の領域が含まれる。すなわち、配列部位５１９−５６３、１００３−１０８６、３０７３−３２３０、４０３３−４１９７、７３８７−７５３９及び８４３３−８４９０であり、それぞれ組換えアンチゲノムに沿って番号が付けられている。また、さらに別の例では、ｎｔ５５−９６、ｎｔ６０６−６２４、ｎｔ４２３１−４３００もまた、ＮＳｌ、ＮＳ２及びＳＨ遺伝子の上流非翻訳領域からそれぞれ欠失することができる。これらの配列の１又は複数の１部又は完全な欠失が、本明細書の従って行なうことができる。本明細書の教示により、選択された欠失により特定される利益をもたらす表現型の変化が、容易にスクリーニングされ得る候補を提供するものである。ＲＳＶゲノム内のさらに別の非翻訳領域もまた有用である。遺伝子開始及び遺伝子終了シグナルが、重要な位置に関して地図付け、および特徴付けられているため（Ｋｕｏ，ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１：４９４−４９５３、１９９７、Ｈａｒｍｏｎ、ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７５：３６−４４、２００１、各々引例として本明細書に組み込まれている）、１つ又は少量（例えば３−１０，１０−２０，２０−４５）ｎｔに関与する欠失又は修飾を、考慮することができる。ある場合には、特異な新しい利点が得られる可能性がある。例えば、Ｇ遺伝子においては、４６８３から４６８５を欠失（遺伝子開始シグナルの１ｎｔ及び非翻訳配列の２ｎｔを含む）することにより、ｍＲＮＡの第１のＡＵＧを除去し、これにより重要なＯＲＦを開始しないが、ＧＯＲＦを開始する次のＡＵＧからのリボソームを方向転換させると考えられている。さらにこの欠失により、ＧＳシグナルを回復し、Ｇ ＯＲＦの翻訳開始部位が保持される。このように、修飾の非翻訳部位を、ゲノムの知識に基づいて選択することができ、無作為に選択され、本発明の方法により迅速に検査することができる。
【０１３６】
遺伝子間配列については、ミニゲノムに関する研究により、遺伝子間領域を、転写及びＲＮＡ複製に影響を及ぼすことなく、単一ｎｔに減じるか又は全く欠失する可能があることを示している。Ａ２菌株の遺伝子間領域は、凝集状態にいける別の２０７ｎｔを表している（組換えアンチゲノムのＮＳ２−Ｎ遺伝子間領域が、その生物学的対応領域より１ｎｔ長く設計した、参照例：Ｃｏｌｌｉｎｓ、ｅｔ ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、５２：１１５６３−１１５６７、１９９５、本書に文献として組み入れられる）。
【０１３７】
ＲＳＶの５’尾部領域は１５５ｎｔの長さで、殆どのモノネガウイルスのその対応領域より１００ｎｔ長く、ＲＳＶ先導部領域より１１１ｎｔ長い。ミニゲノムに関する研究によると、この配列の多くは必須ではなく、修飾の候補であるということが示唆される（Ｋｕｏ，ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７０：６８９２−９０１、１９９６、本明細書に引例として組み込まれる）。例えば、Ｌ遺伝子のすぐ後に続く尾部領域が、７５ｎｔ、１００ｎｔ、１２５ｎｔ以上のサイズに下げることが可能で、５’ゲノム末端（これはアンチゲノムプロモータを含めて３宋端コードする）をそのまま残すことができる。同様に、４４−ｎｔ先導部領域を修飾することができる。例えば、３’先導部末端にある最初の１１ｎｔが、ウイルスプロモータのコアを形成するため、先導部領域の残りの領域にある配列が、欠失されるか又は修飾される。
【０１３８】
本発明のある例においては、ＮＳ１、ＮＳ２、ＳＨ、Ｆ及びＭ２遺伝子について上記の非翻訳配列の１又は複数の（１部又は完全に）欠失することにより、結果として、８０６ｎｔまでのゲノム長（簡易例に記載されている１１２−ｎｔの欠失に比べて、７倍を超える長さ）における調整可能な減少に繋がることになる。最初の９遺伝子間の遺伝子間領域の１又は複数を１部又は完全に欠失すると（それぞれｌｎｔの最低長まで）、さらに１９８ｎｔまでの調整可能な欠失が得られる。尾部領域及び／又は先導部から部分的な又は完全な欠失を行うと、５０、７５、１００、以上のｎｔまでの更なる欠失を生む。このように例えば、非翻訳遺伝子配列の８０６ｎｔを、遺伝子間領域の１９８ｎｔと尾部の１００ｎｔと組み合わせると、凝集状態で１１０４ｎｔが得られ、これはここに記載されている１１２−ｎｔの欠失に比べて約１０倍の大きさの欠失となる（ＲＳＶゲノムの７％以上を占める）。
【０１３９】
上記の文献に記載されている別の例では、ＮＳ２遺伝子の発現が停止コドンを翻訳オープンリーデングフレーム（ＯＲＦ）に導入することにより除去される。感染性ウイルスの放出率が、このＮＳ２ノックアウトウイルスについて、野生型に比べて減少した。加えて、変異体と野生型間にてプラークを比較してみると、ＮＳ２ノックアウトのプラークのサイズが著しく減少ことがわかった。この種の変異体が、このように、増殖可能な組換え遺伝子位置の変位をＲＳＶに組み込み、修飾表現型を（この場合は、低ウイルス増殖率及びｉｎ ｖｉｔｒｏにおける小プラークサイズも）作製することができる。これらの方法と他のノックアウト方法及び変異体が、従ってｉｎ ｖｉｔｒｏにおける小プラークサイズとｉｎ ｖｉｖｏにおける弱毒化の間の既知の相関関係に基づいて、さらに別の組換えＲＳＶワクチン剤を提供するとなる。また、ＮＳ２遺伝子を完全に取り除くことにより除去しても、類似した表現型を有するウイルスを作製することができた。
【０１４０】
欠失して好結果を生んだ他のＲＳＶ遺伝子が、ＮＳ１及びＭ２−２遺伝子である。前者はそれぞれのタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を取り除くことにより、後者はフレーム変位を導入することにより又は翻訳開始部位を導入し停止コドンを導入することにより欠失した。興味をそそるのが、回収されたＮＳ１除去ウイルスは、ＮＳ２欠失ウルスのサイズほど小さくはないが、組織培養にてサイズの小さいプラークを形成することである。ＮＳｌ除去ウイルスが、低い効率であっても、増殖するとい事実により、ＮＳｌタンパク質がアクセサリータンパク質であること、つまりウイルス増殖に必要でないタンパク質であることがわかる。ＮＳｌ除去ウイルスのプラークサイズが、翻訳停止コドンをコード配列に導入することによりＮＳ２タンパク質の発現が、除去されたＮＳ２ノックアウトウイルスのそれに類似していた。小プラーク表現型が、通常、弱毒化変異と関連している。この種の変異は、このように独立して、増殖可能な組換えＲＳＶ内に組み込み、修飾表現型を作製することができる。これらの方法と他のノックアウト方法及び変異体が、従って、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける小プラークサイズとｉｎ ｖｉｖｏにおける弱毒化間の既知の相関関係に基づいて、さらに別の組換えＲＳＶワクチン剤を提供するとなる。ＮＳ２ノックアウト変異体が、ナイーブなチンパンジーの上気道にて適度に弱毒化された表現型を、また高度に弱毒化された表現型を下気道にて示した。この変異体はまた、チンパンジーにおいて著しく減じられた疾病症状を惹起し、その上野生型ウイルスによる攻撃に対する顕著な抵抗力を刺激した（Ｗｈｌｔｅｈｅａｄ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７３：３４３８−３４４２、１９９９、引例として本明細書に組み込まれている）。
【０１４１】
文献に記載されており、本発明にて有用である、さらに別の方法及び組成物には、キメラゲノム又はアンチゲノム内のシス作用性制御配列を修飾する遺伝子位置を変位したＲＳＶの別の異なったヌクレオチド修飾を伴うものである。例えば、ＲＳＶＧ糖タンパク質の分泌型に対る翻訳開始部位が、Ｇ糖タンパク質のこの型の発現を粉砕するために、欠失さることが可能である。
【０１４２】
ＲＳＶＧタンパク質は、二つの型に合成される。すなわち固定タイプＩＩ細胞膜内タンパク質、及び全ての細胞膜アンカーを決失して分泌されるＮ末端切除型である（Ｈｅｎｄｒｌｃｋｓ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６２：２２２８−２２３３、１９８８）。これらの２の型は、２つの異なった開始部位における翻訳開始により得られると報告される。すなわち、長い方の型は、Ｇ ＯＲＦの第１のＡＵＧで開始し、もう１つの型はコドン４８にあるＯＲＦの第２のＡＵＧにて開始タンパク質分解により、さらに処理される（Ｒｏｂｅｒｔｓ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６８：４５３８−４５４６、１９９４）。この第２の開始部位は高度に保存型で、現在までのところ、ヒト−ウシ、ヒツジのＲＳＶにおける全ての菌株に存在する。
【０１４３】
可溶性のＧタンパク質が中和抗体をだますおとりとして作用することによりホスト免疫を軽減するということが示唆される。また、可溶性Ｇが、Ｔｈ２表現型に偏った反応を優先的に刺激すると暗に示されており、これは同様にそれに続いてＲＳＶに暴露されると同時に、免疫病理が強化することと関連しているように思われる。ＲＳＶワクチンウイルスに関して言えば、抗原トラッピング及び免疫システムのバランスが崩れた刺激を最小限にすることが、大変望ましいことから、Ｇタンパク質の分泌型の発現を除去することが望ましいとなる。これを、組換えウイルスにて既に達成している。このように、この変異体が、ウイルスを直接弱毒化することよりむしろ、組換えウイルスにより惹起されたホスト免疫反応を質的及び／又は量的に修飾する上で特に有用である。
【０１４４】
文献にはまた、典型的な遺伝子（例えばＮＳ１及びＮＳ２）のシス作用性転写シグナルを変更することによる組換えＲＳＶの表現型の修飾が記載されている。これらのヌクレオチド修飾の結果は、例えば、リードスルーｍＲＮＡｓのレベルを下げ、下流遺伝子のタンパク質を増加させるためにシス作用性要素を変更して遺伝子発現を修飾したことと一致している。結果として作製される組換えウイルスが、好ましくは、高い増殖反応速度及び大型のプラークサイズを呈するものがよい。シス作用性制御配列に対する典型的な修飾には、ＲＳＶ遺伝子に関連する遺伝子終了（ＧＥ）及び遺伝子開始（ＧＳ）シグナルヘの修飾が含まれる。この状況において、典型的な変化には、ＮＳｌ及びＮＳ２遺伝子のＧＥシグナルの変更が含まれ、変更によりこれらのシグナルが、ＲＳＶのＮ遺伝子の天然の状態にて形成されるＧＥシグナルと同一になる。結果として作製される組換えウイルスが、高い増殖反応速度及び大型のプラークサイズを呈し、従って、遺伝子位置を変位したＲＳＶワクチン候補の表現型を有益に修飾するための新たな手段を提供する。
【０１４５】
上記の文献により提供される方法及び組成物を使用し、例えば、ＲＳＶＡ又はＢワクチン又は２価のＲＳＶ／ＶＢワクチンを生成するために、ＲＳＶサブグループＡ及びＢの双方の配列からなる弱毒化された遺伝子位置を変位したＲＳＶワクチンウイルスを作製することが、また可能になる（参照例：米国特許出願番号．０９／２９１，８９４、ｆｉｌｅｄ ｂｙ Ｃｏｌｌｉｎｓ ｅｔ ａｌ．、ｏｎ Ａｐｒｉ１１３、１９９９、引例として本明細書に組み込まれている）。この状況で本発明をさらに改良する過程にて、キメラＲＳＶ Ａ／Ｂウイルスに組み込まれていた挿入された特定な弱毒化変異には、以下が含まれている。すなわち、（ｉ）５つのｃｐ変異体のうち３つ、すなわちＮ（Ｖ２６７１）における変異及びＬ（Ｃ３１９Ｙ及びＨ１６９０Ｙ）における２の変異、ただしＦにおける２の変異は含まない（これらはＢｌＦ遺伝子の置換により取り除かれているため）、（ｉｉ）２４８（Ｑ８３１Ｌ）、１０３０（Ｙ１３２１Ｎ）、及び任意に、弱毒化された菌株Ａ２ウイルスにて同定された４０４−Ｌ（Ｄｌ１８３Ｅ）変異、（ｉｉｉ）Ｍ２遺伝子の遺伝子開始シグナルにおける部位９での単一ヌクレオチド置換、（ｉｖ）ＳＨ遺伝子の欠失などである。ＲＳＶＡ及び／又はＲＳＶＢ遺伝子、あるいはゲノム分節を有する遺伝子位置を変位したＲＳＶにおける他の即座に利用できる変異には、ＮＳ１、ＮＳ、Ｇ、又はＭ２−２遺伝子の欠失、及び５３０と１００９変異の単独、又は組合わせを含んでいるが、それらに限定されるものではない。
【０１４６】
本発明の他の詳細な観点において、遺伝子位置の変位ＲＳは、他のＲＳＶｓ及び非ＲＳＶウイルス及び非ウイルス病原を含む異種性の病原に対する感染保護抗体「ベクター」として利用される。これらの観点においては、遺伝子位置を変位したＲＳＶゲノム又はアンチゲノムが、１又は複数の相同性病原の１又は複数の抗原決定基をコードする１又は複数の相同性遺伝子又はゲノム分節と組み合わされる。それらは、１部又は完全なＲＳＶの「ベクターゲノム又はアンチゲノム」から成り立っている（参照例：米国特許仮出願番号６０／１７０，１９５、米国特許出願番号０９／４５８，８１３、及び米国特許出願番号０９／４５９，０６２、各々本書に文献として挿入される）。この状況における異種性病原は、異種性ＲＳＶ（例えば、異種のＲＳＶ菌株又はサブグループ）にて、異種性遺伝子又はゲノム分節は、上記で同定されたＲＳＶタンパク質の１、又は複数の、及びそれらのタンパク質ドメイン、断片、及び免疫原性領域又はエピトープをコードするように選択されることができる。このように構成されたＲＳＶベクターワクチンは、多特異性の免疫反応を惹起するため、併用投与されるか、又は相応する投与プロトコルにより他のワクチン剤と共に投与されてよい。
【０１４７】
他の病原のベクターとして設計した遺伝子位置を変位したＲＳＶは、部分的な又は完全なＨＲＳＶゲノム、又はアンチゲノムであるベクターゲノム又はアンチゲノムから構成されることもある。このベクターゲノムは、１又は複数の異種性ＲＳＶ（ｓ）の抗原決定基をコードする１又は複数の異種性遺伝子又はゲノム分節と組み合わされるか、又はそれらを組み込むように修飾される。異種性ＲＳＶには、ＨＲＳＶＡ又はＨＲＳＶＢからの異種性ＨＲＳＶｓが含まれる。上記に代わる観点においては、ベクターゲノムあるいはアンチゲノムは部分的な又は完全なＨＲＳＶゲノム又はアンチゲノムであり、抗原決定基をコードしている異種性遺伝子又はゲノム分節は１又は複数の非ＲＳＶ病原である。このベクターゲノム又はアンチゲノムは、弱毒化を特定するＢＲＳＶの１又は複数の遺伝子又はゲノム分節をさらに組み込むことが可能である。選択肢として、このベクターウイルスは、１又は複数のＨＲＳＶ遺伝子又はゲノム分節を組み込んでいる、１部又は完全なＢＲＳＶ背景ゲノム又はアンチゲノムから構成されることもある。ここで、遺伝子位置を変位したＲＳＶベクターウイルスは、非ＲＳＶ病原の抗原決定基を１個コードする１又は複数のドナー遺伝子又はゲノム分節を含むように修飾される。
【０１４８】
このように、本発明のある詳細な観点において、遺伝子位置を変位したＲＳＶが、ある範囲の非ＲＳＶ病原のベクターとして、提供される（参照例：米国特許仮出願番号６０／１７０，１９５、米国特許出願番号０９／４５８，８１３、及び米国特許出願番号０９／４５９，０６２、各々引例として本明細書に組み込まれている）。本発明のこれらの観点で使用されるベクターゲノム又はアンチゲノムは、それぞれ異種性のＨＲＳＶまたはＢＲＳＶ遺伝子又はゲノム分節を組み込んでいる部分的な又は完全なＢＲＳＶまたはＨＲＳＶゲノム又はアンチゲノムから構成され、異種性の病原は、麻疹ウイルス、サブグループＡ及びＢ呼吸器系胞体ウイルス、ＨＰＩＶ１、ＨＰＩＶ２、ＨＰＩＶ３、流行性耳下腺炎、ヒト乳頭腫ウイルス、タイプ１及びタイプ２ヒト免疫不全ウイルス、単純性庖疹ウイルス、サイトメガロウイルス、狂犬病ウイルス、エプスタインーバーウイルス，フィロウイルス、ブニヤウイルス、フラビウイルス、アルファウイルス及びインフルエンザウイルスから選択されることもある。
【０１４９】
例えば、本発明の遺伝子位置を変位したＲＳＶを構成するためのＨＲＳＶ又はＢＲＳＶのベクターゲノム又はアンチゲノムは、麻疹ウイルスＨＡ及びＦタンパク質、又はその抗原ドメイン、断片及びエピトープから選択された異種性抗原決定基を挿入することもある。典型的な実施例では、麻疹ウイルスＨＡ遺伝子のオープンリーデングフレーム（ＯＲＦ）から構成される転写ユニットが、ＢＲＳＶ又はＨＲＳＶ３ベクターゲノム又はアンチゲノム内に、付加又は挿入される。選択肢として、本発明の遺伝子位置を変位したＲＳＶは、例えば、ＨＰＩＶ１、ＨＰＩＶ２、またはＨＰＩＶ３のＨＮ、又はＦ糖タンパク質またはその免疫原性ドメインまたはエピトープをコードする１又は複数の遺伝子又はゲノム分節を挿入することにより、異種性の抗原決定基をパラインフルエンザウイルス（ＰＩＶ）から挿入するベクターとして使用することもできる。
【０１５０】
異種性の免疫原性タンパク質、ドメイン及びエピトープの遺伝子位置を変位したＲＳＶ内に導入することが、免疫化されたホストに新しい免疫反応を生成する上で、特に有用である。例えば、ドナーＲＳＶサブグループ又は菌株からの免疫原性の遺伝子又はゲノム分節を、異種のＲＳＶサブグループ又は菌株のレシピエントゲノム又はアンチゲノム内にて、付加又は置換することに関連している。一般的に、シス作用性制御因子及び遺伝子間配列のような、非コードヌクレオチドは、ドナー遺伝子コード領域と共に変位される必要がない。このように、ある特定な遺伝子のコード配列（例えば、部分的な又は完全なオープンリーデングフレーム（ＯＲＦ））を、部分的な又は完全な背景ゲノム又はアンチゲノムに、付加又は置換しすることができる。この付加又は置換は、ドナー配列に比較して対応する遺伝子又は異種遺伝子の異種プロモータ（例えば、背景ゲノム又はアンチゲノムに存在しているプロモータ）の制御下にて行なわれる。多様なまた別のゲノム又はアンチゲノムが、新しい有用な特質を有する遺伝子位置を変位したＲＳＶを発現するために、キメラゲノム又はアンチゲノム内に含めることができる有用なドナーポリヌクレオチドを提供している。例えば、異種性のゲノム分節は、ヒト又はウシＲＳＶからの選択された糖タンパク質細胞質尾部領域、膜間ドメイン、又は外部ドメイン、エピトープ部位又は領域、結合部位又は結合部位を含む領域、活性部位又は活性部位を含む領域等の一部又は全部をコードすることができる。これらの及び他のゲノム分節を、完全な背景ゲノム又はアンチゲノムに付加し、又はそこで対応ゲノム分節に置換し、新しいキメラＲＳＶ組換え体を作製することができる。ある組換え体が、キメラタンパク質、例えば、別のＲＳＶの外ドメインに融合されたＲＳＶの細胞質の尾部及び／又は膜間ドメインを有するタンパク質を発現する。
【０１５１】
本発明の遺伝子位置を変位したＲＳＶにて使用される遺伝子及びゲノム分節は、サイズ及び配列が多様な代替のポリヌクレオチドの集団を含んでいる。この点で有用なゲノム分節は、タンパク質の小規模な機能的ドメイン（例えば、エピトープ部位）をコードするゲノム分節の場合で、約１５−３５ヌクレオチドの範囲であり、大規模なドメイン又はタンパク質領域をコードするゲノム分節の場合で、約５０、７５、１００、２００−５００、及び５００−１，５００以上のヌクレオチドの範囲である。対応遺伝子及びゲノム分節の選択は、対象となる対応物間のゲノムにおける配列同一性又は直線性の相関性による。この状況において、選択されたヒト又はウシのポリヌクレオチド「基準配列」は、ドナー又はレシピエントゲノム又はアンチゲノムに存在する配列又はその一部として定義される。この基準配列は、配列をその対応する異種性配列と比較する場合の、理論的根拠の基盤を与えるための定義された配列として使われる。例えば基準配列は、ｃＤＮＡまたは遺伝子、又は完全なｃＤＮＡまたは遺伝子配列の一分節として定義されてよい。一般的に、対応する遺伝子及びゲノム分節を定義することに使われる基準配列は、少なくとも２０ヌクレオチドの長さで、しばしば少なくとも２５ヌクレオチドの長さで、さらに多くの場合少なくとも５０ヌクレオチドの長さである。２のポリヌクレオチドが、それぞれ（１）これら２のポリヌクレオチドの間にて類似している配列（すなわち、完全なポリヌクレオチド配列の一部）から成り、また（２）さらにこれら２のポリヌクレオチドの間で異なっている配列から成っている。そこで、２又はそれ以上のポリヌクレオチド間の比較は、一般的に、配列類似性の局所領域を同定及び比較する「比較ウィンドウ」の２のポリヌクレオチドの配列を比較することにより行なわれる。「比較ウィンドウ」は、本明細書にて使われているように、少なくとも２０の隣接ヌクレオチド部位の概念的分節を表わす。この概念的分節では、ポリヌクレオチドの配列が、少なくとも２０ヌクレオチドの基準配列に比較される。さらに、「比較ウィンドウ」内のポリヌクレオチド配列の部分が、これら２の配列を最適に整列させるために、基準配列（付加も欠失も含まない）に比べて２０パーセント以下の付加又は欠失（すなわち、間隙）から構成される。比較ウィンドウを整列させる最適な配列は、以下により行なわれる。つまり、局部相同性アルゴリズム（Ｓｍｌｔｈ ＆ Ｗａｔｅｒｍａｎ、Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２、１９８１）、相同性整列アルゴリズム（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ＆ Ｗｕｎｓｃｈ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３、１９７０）、類似性方法の探索（ｐｅａｒｓｏｎ ＆ Ｌｉｐｍａｎ、ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：２４４４、１９８８）（各々引例として本明細書に組み込まれている）、これらのアルゴリズムのコンピューター化して実行（ＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、ａｎｄ ＴＦＡＳＴＡ ｉｎ ｔｈｅ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ Ｒｅｌｅａｓｅ７．０，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ、５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ、引例とし��本明細書に組み込まれている）、又はあらゆる方法により生成された調査及び最高の整列（つまり、比較ウィンドウにより、配列類似性が最高のパーセンテージなった場合）である。「配列同一性」という用語は、２のポリヌクレオチド配列が、比較のウィンドウにより同一である（すなわち、ヌクレオチドを比較して）ということを意味する。「配列同一性のパーセンテージ」は、最適に整列された２の配列を比較ウィンドウで比較することにより計算され、同一の核酸塩基（例えば、Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、Ｕ、又は１）が双方の配列に起こる部位の数を判断し、一致する部位の数を算出し、その一致する部位数をウィンドウの総数（すなわち、ウィンドウのサイズ）で除し、その商に１００を乗じて配列同一性のパーセンテージを算出する。
【０１５２】
例えば、２つの異なるヒトＲＳＶｓ、又はウシ及びヒトのＲＳＶのような対応する残基部位が、異なっているか、同一であるか、又は保存型アミノ酸置換が異なっているなどの可能性がある。保存型アミノ酸置換とは、類似した側鎖を有する残基の互換性を意味する。例えば、脂肪族側鎖を有するアミノ酸の保存型１群として、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、及びイソロイシンであり、脂肪族側鎖を有するアミノ酸の１群が、セリン及びトレオニンであり、アミド含有側鎖を有するアミノ酸のグループは、アスパラギン及びグルタミンであり、芳香性側鎖を有するアミノ酸の１群が、フェニルアラニン、チロシン、及びトリプトファンであり、基本側鎖を有するアミノ酸の１群が、リジン、アルギニン、及びヒスチジンであり、硫黄含有側鎖を有するアミノ酸の１群が、システイン及びメチオニンである。好ましい保存型アミノ酸１群が、バリン−ロイシン−イソロイシン、フェニルアラニン−チロシン、リシン−アルギニン、アラニン−バリン、及びアルパラギン−グルタミンである。２０個の従来型アミノ酸の立体異性体（例：Ｄアミノ酸）、α，α２置換型アミノ酸のような非天然アミノ酸、Ｎアルキルアミノ酸、乳酸、及び他の非従来型アミノ酸もまた、本発明のポリペプチドの構成要素として適切である。非従来型アミノ酸の例として、４ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタメート、ε−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルリジン、ε−Ｎ−アセチルリジン、Ｏ−ホスホセリン、Ｎ−アセチルセリン、Ｎ−ホルミルメチオニン、３−メチルヒスチジン、５−ヒドロキシリジン、ω−Ｎ−メチルアルギニン、及び他のアミノ酸とイミノ酸類（４−ヒドキシプロリンなど）が挙げられる。さらに、アミノ酸は、グルコシル化、リン酸化等により、修飾されてよい。
【０１５３】
本発明は、多様な組換え体である遺伝子位置を変位したＲＳＶウイルス及びサブウイルス粒子を構成するためにｃＤＮＡに基づく方法を用いている。これらの組換えＲＳＶは、弱毒化及び免疫原性について、ワクチン剤としての使用に適した改良された特徴を呈する。遺伝子位置を変位したＲＳＶに挿入される望ましい表現型変化には、次のものが含まれるがそれらに限定するものではない。すなわち、培養における又は選択されたホスト環境における弱毒化、弱毒化表現型からの復帰に対する抵抗力、改良された免疫原性特徴（例：引き出された反応の改良性又は削減により決定される）、選択されたウイルス生成物の転写及び／又は翻訳の上限調節又は下限調節などである。本発明の好適な観点において、弱毒化された遺伝子位置を変位したＲＳＶが生成されており、そのＲＳＶでは、キメラゲノム又はアンチゲノムが、弱毒化表現型を特定する、１又は複数の弱毒化変異体を導入することにより、さらに修飾される。これらの変異体が、新規に生成されその弱毒化効果が上記の文献に記載されている、合理的設計の変異誘発策に従って試験される。選択肢として、弱毒化変異体が、生物学的に得られた変異ＲＳＶにて同定され、本来の遺伝子位置を変位したＲＳＶに挿入される。
【０１５４】
遺伝子位置を変位したＲＳＶワクチン菌株に挿入される生物学的に得られるＲＳＶ内の弱毒化変異体を、天然に生成することもあるが、よく知られた変異誘発操作により野生型ＲＳＶ菌株に導入することができる。例えば、不完全に弱毒化された親ＲＳＶ菌株は、ここに概要としてまた以下の文献（ＵＳＳＮ Ｕ．Ｓ．ＰａｔｅｎｔＮｏ．５，９２２、３２６、ｉｓｓｕｅｄ Ｊｕｌｙ １３、１９９９、引例として本明細書に組み込まれている）に詳説されるように、以下の三っの方法によって、生成することができる。すなわち、化学的変異原性物質が付加された細胞培養におけるウイルス増殖中の化学的変異誘発、増殖制限変異を作製するために最適以下の温度での継代培養にさらされたウイルスの選択、細胞培養により小型のプラーク（ｓｐ）を生成する変異誘発されたウイルスの選択である。
【０１５５】
「生物学的に得られたＲＳＶ」とは、組換え手段により生成されていないＲＳＶを指す。そのため、生物学的に得られたＲＳＶには、天然で生成する全てのサブグループ及び菌株のＲＳＶが含まれ、その例としては、野生型ゲノム配列を有する天然にて生成するＲＳＶ、及び参照野生型ＲＳＶ配列からのゲノム変異を有するＲＳＶ（例：弱毒化を起こす表現型を特定する変異を有するＲＳＶ）がある。同様に、生物学的に得られたＲＳＶには、親ＲＳＶ菌株から得られたＲＳＶ変異が含まれ、とりわけ、人工的変異誘発及び選択操作により得られたものが含まれる。
【０１５６】
充分に弱毒化されたＲＳＶを生物学的に得られた菌株から生成するには、不完全に又は部分的に弱毒化された親菌株に、よく知られたＲＳＶサブグループＡにおけるＡ２菌株のｔｓ−１又はｔｓ−ｌＮＧ又はｃｐＲＳＶ変異、又はその誘導体又はサブクローンのような変異が適宜導入される。これらの及び他の部分的に弱毒化された菌株を利用して、その菌株をより一層弱毒化する（例えば、ワクチンによる感染保護を与えるに充分な免疫原性を保持する一方で、哺乳動物のホストにおける複製制限レベルを望ましいレベルまで下げる）さらにまた別の変異を生成することができる。
【０１５７】
サブグループＡ又はＢウイルスの部分的に弱毒化された変異は、以下のよく知られた方法により、生成することができる。これらの方法は、野生型ウイルスを容認された細胞基質でクローニングし、その低温継代培養変異体を生成する、対象ウイルスを化学的変異誘発法にさらしｔｓ変異体を得る、又は小型プラーク表現型又は類似表現型をもつ変異を選択する（参照例：Ｍｕｒｐｈｙ ｅｔ ａｌ．による国際公開番号Ｗ０９３  ２１３１０、引例として本明細書に組み込まれている）などである。サブグループＢのウイルスについては、典型的な部分的に弱毒化された親ウイルスはｃｐ２３であり、これはサブグループＢのＢ１菌株の変異である。
【０１５８】
あらゆる既知の先端技術を組み合わせて、本項に記載されているようなさらなる展開に有用である非弱毒化サブグループＡ又はＢ菌株から、部分的に弱毒化された変異を作製することができる。また、弱毒化された表現型を特定する変異を、個別に、又は不完全に弱毒化されたサブグループＡ又はＢと組み合わせて導入し、望ましいレベルの弱毒化及びワクチン接種を受けるヒトに対し免疫原性を与える、複数の定義された弱毒化変異ワクチンウイルスを生成することができる。
【０１５９】
上記のように、充分に弱毒化された生物学的に得られるＲＳＶ変異の作製は、いくつかの既知の方法により、達成することができる。そのような操作の１つは、部分的に弱毒化されたウイルスを、暫時低下する弱毒化を起こす温度で、細胞培養の継代にさらす方法に関連している。例えば、野生型ウイルスが通常約３４−３７℃で培養されるのに対して、部分的に弱毒化された変異体が、細胞培養（例えば、初代ウシ肝臓細胞）の継代で最適以下の温度、例えば２０−２６℃で生成される。このように、ｃｐ変異又は他の部分的に弱毒化された菌株（例えば、ｔｓ−１又はｓｐＲＳＶ）が、低温でＭＲＣ−５又はベロ細胞の継代により、２０−２４℃、好ましくは２０−２２℃の温度で、効率のよい増殖をするように順応される。低温継代培養時に変異ＲＳＶを選択することにより、部分的に弱毒化された親に比較して、誘導体菌株のいかなる残留毒力をも大幅に減じる。
【０１６０】
選択肢として、特定の変異が、生物学的に得られたＲＳＶに、部分的に弱毒化された親ウイルスを化学的変異誘導法に暴露することにより、導入されてよい。化学的変異誘導法の例としては、ｔｓ変異を導入する方法があり、すでにｔｓであるウイルスの場合は、弱毒化を高めるために及び／又は弱毒化誘導体のｔｓ表現型の安定性を高めるために、充分なだけｔｓ変異を付加する。ｔｓ変異をＲＳＶへ導入する手段には、５フルオロウリジン又は５フルオロウラシルのような抗変異原物質の存在の下で、約１０−３から１０−５Ｍ、好ましくは１０−４Ｍの濃度で、そのウイルスを複製すること、以下の文献（Ｇｈａｐｕｒｅ ｅｔ ａｌ、 Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．３：４１４−４２１、１９６９ ａｎｄ Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｖｉｒｏｌ．３：９１−１００、１９７８）に記載されている操作に従って、ウイルスをニトロソグアニジンに１００μｇ／ｋｍ１の濃度でさらすこと、又は特定のｔｓ変異の遺伝子的導入が含まれる。他の化学的変異誘導方法も、用いられてよい。この目的について特に有望な標的が、ポリメラーゼ（Ｌ）遺伝子であることがわかったが、弱毒化は、どんなＲＳＶ遺伝子にもあるｔｓ変異の結果として発生することが可能である。
【０１６１】
本発明で使用される典型的な弱毒化ＲＳＶ複製時の温度感受性のレベルは、許容温度での複製と制限温度数力所での複製を比較することにより決定される。ウイルスの複製が、許容温度時に比較して１／１００以下に減じられる時の最低温度を、遮断温度と呼ぶ。実験動物やヒトでは、複製とＲＳＶの毒力は、変異の遮断温度と相関関係を示す。３９℃の遮断温度での変異の複製は適度に制限されるのに対し、変異は３８℃の遮断温度ではより低い効率で複製し、疾病の症状は主として上気道に制限される。３５℃から３７℃の遮断温度を有するウイルスは、通常、チンパンジーにおいては完全に弱毒化され、ヒトにおいてはかなり弱毒化される。このように、ｔｓ変異である、生物学的に得られる弱毒化変異及び本発明の遺伝子位置を変位したＲＳＶは、約３５℃から３９℃、及び好ましくは３５℃から３８℃の範囲の遮断温度を有する。ｔｓ変異を部分的に弱毒化された菌株へ導入することにより、本発明のワクチン組成物で有用である複数の弱毒化されたウイルスが得られる。
【０１６２】
鼻腔内投与用の候補ワクチンとしての多くの弱毒化ＲＳＶ菌株が、低温継代培養中に、既に弱毒化されたウイルスに複数の変異を導入する化学的変異誘発を繰り返して行うことにより開発された（例Ｃｏｎｎｏｒｓ  ｅｔ  ａｌ．、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２０８：４７８−４８４、１９９５、Ｃｒｏｗｅ ｅｔ ａｌ．、Ｖａｃｃｉｎｅ １２：６９１−６９９、１９９４；ａｎｄ Ｃｒｏｗｅｅｔａｌ、Ｖａｃｃｉｎｅ １２：２７８３−７９０、１９９４、引例として本明細書に組み込まれている）。げっ歯類、チンパンジー、成人及び乳幼児での評価により、これらの候補ワクチン菌株のいくつかは遺伝子的に比較的安定しており、免疫原性が高く、充分に弱毒化される可能性がある。これら弱毒化ウイルスのいくつかのヌクレオチド配列を分析することにより、高められた弱毒化のレベルは、特異性を有するヌクレオチドとアミノ酸の置換に関連していることがわかった。上記の文献には、また、変異を個別に又はあらゆる組み合わせで、感染性ＲＳＶクローンのゲノム又はアンチゲノムに導入することにより、ルーチンとしてどのように、サイレントな偶発的変異と表現型の差異を引き起こす変異とを区別するかが開示される。このプロセスを、親及び誘導体の表現型特徴を評価することと共に行うことにより、弱毒化、温度感受性、低温適応性、小型のプラークサイズ、ホスト範囲制限など、好ましい特徴を引き起こす変異を同定することができる。
【０１６３】
このように同定された変異体を、「メニュー」に編集し、単独又は様々な組み合わせにて導入して、遺伝子位置を変位したＲＳＶワクチンウイルスを、弱毒化、免疫原性、弱毒化表現型の復帰遺伝的抵抗力等に対する適切なレベルに、較正する。好ましくは、本発明のキメラＲＳＶが、そのようなメニューから同定された少なくとも１または複数の、好ましくは２又はそれ以上の弱毒化した変異体を組み込むことにより弱毒化される。このメニューを、生物学的に得られた変異ＲＳＶ菌株のパネル内の既知の変異グループとして定義することができる。この変異ＲＳＶ菌株の典型的なパネルは、低温継代培養（ｃｐ）及び／又は温度感受性（ｔｓ）であり、その例は、以下の名称が与えられているＲＳＶ変異パネルである。すなわちｃｐｔｓ ＲＳＶ ２４８（ＡＴＣＣ ＶＲ２４５０）、ｃｐｔｓ ＲＳＶ ２４８／４０４（ＡＴＣＣ ＶＲ２４５４）、ｃｐｔｓ ＲＳＶ ２４８／９５５（ＡＴＣＣ ＶＲ２４５３）、ｃｐｔｓ ＲＳＶ ５３０（ＡＴＣＣ ＶＲ２４５２）、ｃｐｔｓ ＲＳＶ ５３０／１００９（ＡＴＣＣ ＶＲ２４５１）、ｃｐｔｓ ＲＳＶ ５３０／１０３０（ＡＴＣＣ ＶＲ２４５５）、ＲＳＶＢ−１ ｃｐ５２／２Ｂ５（ＡＴＣＣ ＶＲ２５４２）、及びＲＳＶＢ−ｌ ｃｐ−２３（ＡＴＣＣ ＶＲ２５７９）（各々の変異体は、ＢｕｄａｐｅｓｔＴｒｅａｔｙの条件の下Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）（１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ、Ｍａｎａｓｓａｓ、Ｖｉｒｇｉｎｉａ ２０１１０−２２０９、Ｕ．Ｓ．Ａ．）に保管されており、上記の同定登録番号を付与される）などである。
【０１６４】
こうした生物学的に得られた変異の典型的なパネルから、多くの弱毒化変異体が提供されており、ワクチンの使用ために組換え遺伝子位置を変位したＲＳＶの弱毒化のレベルを較正するために、その各々をパネル内における他のいずれの変異体とも組み合わすことができる。さらに別の変異体、例えば小型プラーク（ｓｐ）、低温適応（ｃａ）、又はホスト範囲制限（ｈｒ）変異菌株において同定された非ｔｓ及び非ｃｐ弱毒化変異を有するＲＳＶからも得ることができる。弱毒化変異体を、ドナーのコード部分およびレシピエントＲＳＶ遺伝子、又はシス制御配列のような非コード領域内で選択することができる。例えば、弱毒化変異には、遺伝子開始配列における単一又は複数の塩基変化が含まれることもあり、これが、ヌクレオチド７６０５でのＭ２遺伝子開始配列における単一又は複数の塩基置換により例示される。
【０１６５】
ワクチンに使用するために設計され、選択された遺伝子位置を変位したＲＳＶが、広範囲な臨床使用目的に充分なレベルの弱毒化を達成するために、多くの場合少なくとも２、時には３又はそれ以上の弱毒化変異体を有している。一例において、少なくとも１つの弱毒化変異体がＲＳＶポリメラーゼ遺伝子（ドナー又はレシピエント遺伝子のどちらか）において発生し、その変異体が、温度感受性（ｔｓ）表現型を特定するポリメラーゼタンパク質におけるアミノ酸変化を特定するヌクレオチド置換に関連している。この状況における典型的な遺伝子位置を変位したＲＳＶが、大型のポリメラーゼ遺伝子Ｌに１又は複数のヌクレオチド置換を組み込んでおり、その結果、アミノ酸部位Ａｓｎ４３、Ｐｈｅ５２１、Ｇｌｎ８３１、Ｍｅｔ１１６９、又はＴｙｒ１３２１でアミノ酸が変化しており、その変化として、Ｐｈｅ５２１ではＬｅｕ、Ｇｌｎ８３１ではＬｅｕ、Ｍｅｔ１１６９ではＶａｌ、及びＴｙｒ１３２１ではＡｓｎが例示される。上記に代わるものとして、又は上記に加えて、本発明の遺伝子位置を変位したＲＳＶが、ｔｓ変異を異種のＲＳＶ遺伝子、例えば、Ｍ２遺伝子に挿入することもできる。好ましくは、２またはそれ以上のヌクレオチドの変化が、弱毒化変異体を特定するコドン、例えば、ｔｓ変異を特定するコドンに組み込まれ、その結果、弱毒化表現型からの復帰の可能性が低下する。
【０１６６】
本発明の方法により、生物学的に得られた変異ＲＳＶ菌株のパネルに表示される少なくとも１つ及び最大限の弱毒化変異を挿入する遺伝子位置を変位したＲＳＶを、容易に構成し、特徴付けることができる。このように、変異体が、以下に表示された変異体の選択されるパネルから、いかなる組み合わせも組み立てることができる。すなわち、ｃｐｔｓ  ＲＳＶ  ２４８（ＡＴＣＣ  ＶＲ２４５０）、ｃｐｔｓ  ＲＳＶ  ２４８／４０４（ＡＴＣＣ  ＶＲ２４５４）、ｃｐｔｓ  ＲＳＶ  ２４８／９５５（ＡＴＣＣ  ＶＲ２４５３）、ｃｐｔｓ  ＲＳＶ  ５３０（ＡＴＣＣ  ＶＲ２４５２）、ｃｐｔｓ  ＲＳＶ  ５３０／１００９（ＡＴＣＣ  ＶＲ２４５１）、ｃｐｔｓ  ＲＳＶ  ５３０／１０３０（ＡＴＣＣ  ＶＲ２４５５）、ＲＳＶＢ−１  ｃｐ５２／２Ｂ５（ＡＴＣＣ  ＶＲ２５４２）、及びＲＳＶＢ−１ｃｐ−２３（ＡＴＣＣ  ＶＲ２５７９）などである。この方法で、組換えワクチン候補の弱毒化を、血清反応陰性の乳幼児を含めて、１又は複数の患者タイプに対して、精密に較正することができる。
【０１６７】
より詳細な実施例では、ワクチン用遺伝子位置を変位したＲＳＶが、温度感受性、及び／又はＲＳＶポリメラーゼ遺伝子ＬにおけるＡｓｎ４３、Ｐｈｅ５２１、Ｇｌｎ８３１、Ｍｅｔｌ１６９又はＴｙｒ１３２１での弱毒化アミノ酸の置換、又は遺伝子Ｍ２遺伝子の開始配列における温度感受性ヌクレオチドの置換を特定する、少なくとも１つ及び最大限の弱毒化変異体を挿入している。上記に代わるものとして、又は上記に付け加えて、本発明の遺伝子位置を変位したＲＳＶが、低温継代培養弱毒化ＲＳＶから、１つ及び最大限の弱毒化変異を組み込むことができる。例えば、ＲＳＶのＮ遺伝子におけるＶａ１２６７、ＲＳＶのＦ遺伝子におけるＧｌｕ２１８又はＴｈｒ５２３、ＲＳＶポリメラーゼ遺伝子Ｌにおけるｃｙｓ３１９又はＨｉｓ１６９０でのアミノ酸置換を特定する１又は複数の変異体などである。
【０１６８】
他の詳細な実施例では、本発明の遺伝子位置を変位したＲＳＶが、以下から選択された弱毒化変異体を組み込むようにさらに修飾する。すなわち、（ｉ）ＲＳＶポリメラーゼ遺伝子Ｌにおける温度感受性のアミノ酸置換（Ｇｌｎ８３１からＬｅｕ、及びＴｙｒ１３２１からＡｓｎ）を特定する変異のパネル、（ｉｉ）遺伝子Ｍ２の遺伝子開始配列における温度感受性のヌクレオチド置換、（ｉｉｉ）アミノ酸配列置換、すなわち、ＲＳＶのＮ遺伝子におけるＩｌｅ、ＲＳＶポリメラーゼ遺伝子ＬにおけるＣｙｓ３１９Ｔｙｒ及びＨｉｓ１６９０Ｔｙｒ、を特定する低温継代培養ＲＳＶから採取された変異対の弱毒化のパネル、（ｉｖ）ＲＳＶのＳＨ、ＮＳ１、ＮＳ２、Ｇ及びＭ２−２遺伝子の１又は複数の欠失又は除去などである。好ましくは、遺伝子位置を変位したＲＳＶのこれらの例及び他の例は、生物学的に得られた変異ＲＳＶから採取された少なくとも２の弱毒化変異を組み込んでおり、これらの変異体を、同一又は異種の生物学的に得られた変異ＲＳＶ菌株から得ることができる。また、好ましくは、これらの典型的な変異体が、変異を特定するコドン内の複数のヌクレオチド変化によって安定化される、１又は複数の弱毒化変異体を有している。
【０１６９】
上記の説明に従って、ｃＤＮＡから感染性のＲＳＶを作製できることが、遺伝子位置を変位したＲＳＶ内に特定的に遺伝子操作による変化を導入することができる。特に、感染性の組換えＲＳＶは、特定の変異（例えば、ｔｓ、ｃａ、ａｔｔ及び他の表現型を特定する変異）を、生物学的に得られた弱毒化ＲＳＶ菌株で、同定するために用いられている。望ましい変異が、このように同定され、組換え遺伝子位置を変位したＲＳＶワクチン菌株に導入された。ｃＤＮＡからウイルスを作製する能力により、これらの変異を、ルーチンとして、個別に又はあらゆる組み合わせで、全長のｃＤＮＡクローンに組み込むことができ、それにより、導入された変異を含むレスキュー組換えウイルスの表現型を容易に決定する。
【０１７０】
望ましい表現型（例えば、ｃｐ又はｔｓ表現型）と関連している特定な生物学的に得られた変異体を同定し、感染性キメラＲＳＶクローンに組み込むことにより、本発明は他の部位特異性な修飾を、同定された変異箇所で、又は極めて接近した中にて提供する。生物学的に得られたＲＳＶで生成されたほとんどの弱毒化変異体が単一ヌクレオチドの変化であるため、他の「部位特異性」の変異もまた、組換え技術により生物学的に得られたＲＳＶ又は組換えＲＳＶに組み込むことができる。本発明で利用されるように、部位特異性の変異には、１−３個から５−１０個まで、又はそれ以上の修飾ヌクレオチドの挿入、置換、欠失又は再配列が含まれる（例：野生型ＲＳＶから、選択された変異、ＲＳＶ菌株の配列から、又は化学的変異誘発方法に暴露された親組換えＲＳＶＣクローンからの修飾）。そのような部位特異性の変異は、選択され、生物学的に得られた変異体に、又はその領域に、組み込むことができる。選択肢として、変異は、ＲＳＶクローン内のあらゆる他の状況で（例：例えば、タンパク質活性部位、結合部位、免疫原性エピトープ等をコードするシス作用性制御配列又はヌクレオチド配列又はその近くにて）、導入することができる。
【０１７１】
部位特異性のＲＳＶ変異体が、通常、望ましい弱毒化表現型を保持するが、それに加えて弱毒化に関係ない修飾された表現型の特徴（例えば、改良された又は拡大された免疫原性、及び／又は増殖）をも呈することもある。望ましい部位特異性の変異体には、付加的な安定化ヌクレオチド変異を、弱毒化変異体を特定するコドンに組み入れるように設計した組換えＲＳＶが含まれる。可能な場合は、２又はそれ以上のヌクレオチド置換が、弱毒化アミノ酸変化を親変異体又は組換えＲＳＶクローンにおいて特定するコドンによって導入され、その結果、弱毒化表現型からの復帰に対して遺伝子的抵抗力を有するた生物学的に得られるＲＳＶ又は組換えＲＳＶを作製する。他の実施例では、部位特異性のヌクレオチド置換、付加、欠失又は再配列が、上流（Ｎ末端方向）又は下流（Ｃ末端方向）に導入される（例：既存のシス作用性制御因子の構成、又は除去を目的とした、ターゲットヌクレオチド部位から５｀又は３’の方向へ、１−３または５−１０，あるいは１５ヌクレオチド分以上離れた位置）。
【０１７２】
単一及び複数の点変異及び部位特異性の変異体に加えて、本発明で開示される遺伝子位置を変位したＲＳＶへの変化には、全部の遺伝子又はゲノム分節の欠失、挿入、置換又は再配列が含まれる。これらの変異体が、ドナー又はレシピエントゲノム又はアンチゲノムにある少数の塩基（例えば５１５−３０個の塩基から、３５−５０個の塩基まで、又はそれ以上）、ヌクレオチドの大型ブロック（例えば、５０−１００、１００−３００、３００−５００、５００−１，０００個の塩基）、又はほとんど完全な又は完全な遺伝子（例えば、１，０００−１，５００個のヌクレオチド、１，５００−２，５００個のヌクレオチド、２，５００−５，０００ヌクレオチド、ヌクレオチド５，００−６，５０００個以上）を、変化の特徴に応じて修飾する。これは、すなわち、少数の塩基が、免疫原性エピトープを挿入又は除去するように変更されるか、又は小型のゲノム分節を変化するように変更されるが、塩基の大型ブロックは遺伝子や大型ブロックが付加、置換、欠失又は再配列された場合に関与してくる。
【０１７３】
本発明の上記に代わる観点において、ｃＤＮＡ発現ゲノム又はアンチゲノムから作成された感染性遺伝子位置を変位したＲＳＶが、ＲＳＶ又はＲＳＶ様の菌株のどれでもよく（ヒト−ウシ、マウス等）、又はニューモウイルスのどれでもよい（マウス鶏ニューモウイルスの肺炎ウイルス、以前はシチメンチョウ鼻気管炎ウイルスと呼ばれていた）。感染保護免疫反応を発生させるためには、ＲＳＶ菌株が、免疫化される対象に対して内因性である菌株（ヒトを免疫化するために使われるヒトＲＳＶなど）であってよい。しかしながら、内因性ＲＳＶのゲノム又はアンチゲノムを、異種の菌株資源と組み合わせ（例：異種のＲＳＶ種、サブグループ、又は菌株から、又はＲＳＶ選択肢としてＰＩＶのような別の呼吸系病原からの、遺伝子又はゲノム分節を組み合わせ）からのＲＳＶ遺伝子又はゲノム分節を発現するように修飾することができる。
【０１７４】
上記の定義された変異体の感染性遺伝子位置を変位したＲＳＶクローンヘの導入は、様々な既知方法により、達成できる。ＤＮＡに関連した「感染性のクローン」というのは、ｃＤＮＡ又はその生成物（合成又は非合成）であり、それらを、感染性ウイルス又はサブウイルス粒子のゲノムを生成するテンプレートとしての機能を果たすことができるゲノム又はアンチゲノムＲＮＡへ転写することができる。このように、定義された変異体を、従来の技術（例：部位指定変異誘発）により、ゲノム又はアンチゲノムのｃＤＮＡコピーに導入することができる。アンチゲノム又はゲノムｃＤＮＡの副断片を使って、本発明に記載されているように、完全なアンチゲノム又はゲノムｃＤＮＡを組み立てることには、それぞれの領域が別個に操作され（小さいｃＤＮＡｓが大きいｃＤＮＡｓより、操作しやすい）、容易に完全なｃＤＮＡに組み込まれるという利点がある。このように、アンチゲノム又はゲノムｃＤＮＡ、又はそのいかなる副断片も、オリゴヌクレオチド指令型変異誘発方法のテンプレートとして使用できる。これは、１本鎖ファージミド型の中間体を通して実行することができるが、これは、Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社（Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、ＣＡ）のＭｕｔａ−ｇｅｎｅ（商標）キットを用いて、又はＳｔｒａｔａｇｅｎｅ社（Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）のＣｈａｍｅｌｅｏｎ変異誘発キットのような二本鎖プラスミドを直接テンプレートとして用いたり、又は目的の変異を含むオリゴヌクレオチド・プライマー又はテンプレートのどちらかを用いたポリメラーゼ連鎖反応を利用する。
【０１７５】
変異させた副断片を、完全なアンチゲノム又はゲノムｃＤＮＡに組み立てることができる。他の変異誘発技術が知られており、ＲＳＶアンチゲノム又はゲノムｃＤＮＡに目的の変異体を作製するために利用できる。変異は、単一ヌクレオチドの変化から、１又は複数の遺伝子又はゲノム領域を含む大型のｃＤＮＡ切片の置き換えに至るまで多様である。
【０１７６】
このように、説明に役立つ一例では、Ｂｉｏ−Ｒａｄ社から入手できるＭｕｔａ−ｇｅｎｅプラスミドｉｎ ｖｉｔｒｏにおける変異誘導キットを用いて変異体が導入される。要するに、ＲＳＶゲノム又はアンチゲノムの一部をコードするｃＤＮＡが、プラスミドｐＴＺ１８Ｕにクローニングされ、ＣＪ２３６細胞を転換するために使われる（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）。ファージミド製剤は、製造会社の推奨方法に従って調製される。オリゴヌクレオチドが、修飾ヌクレオチドをゲノム又はアンチゲノムの望ましい部位に導入することにより、変異誘発用に設計される。遺伝子的に修飾されたゲノム又はアンチゲノムの断片を含むプラスミドは、その後増殖され、変異された切片が、全長ゲノム又はアンチゲノムクローンに、再導入される。
【０１７７】
本発明はまた、１又は複数の単離されたポリヌクレオチド（例えば、１又は複数のｃＤＮＡｓ）から、感染性遺伝子位置を変位したＲＳＶを作製する方法を提供する。本発明によると、ＲＳＶゲノム又はアンチゲノムをコードするｃＤＮＡが、感染ＲＳＶを形成するために必要なウイルスタンパク質と、細胞内又はｉｎ  ｖｉｔｒｏに同時発現させるために構成される。「ＲＳＶアンチゲノム」とは、子孫ＲＳＶゲノムを合成するテンプレートとして機能する単離されたポジティブ・センスのポリヌクレオチド分子を指す。好ましくは、複製中間体ＲＮＡ又はアンチゲノムに対応する、ＲＳＶゲノムのポジティブ・センスバージョンであるｃＤＮＡが、構成される。この目的は、転写及び複製されるヌクレオキャプシド（すなわち、Ｎ、Ｐ、Ｌ及びＭ２（ＯＲＦ１）タンパク質をコードする配列）の生成に必要なタンパク質をコードする、相補配列のポジディブ・センス転写物とハイブリダイズする可能性を最小限に留めることである。ＲＳＶのミニゲノムシステムでは、ゲノム又はアンチゲノムが、ＲＳＶにより補完されていても又はプラスミドにより補完されていても、同等にレスキューにおいて活性であり、これにより、ゲノム又はアンチゲノムのどちらかが使用されることがわかり、その選択は方法論又は他の理由によって行われる。
【０１７８】
天然のＲＳＶゲノムは、一般的に、ネガティブ・センス・ポリヌクレオチド分子から構成されており、これは、相補的なウイルスｍＲＮＡｓを通して、以下の１１種のウイルスタンパク質をコードする。すなわち、非構造的種であるＮＳ１及びＮＳ２、Ｎ、Ｐ、基質（Ｍ）、小型疎水性（ＳＨ）、糖タンパク質（Ｇ）、融合（Ｆ）、Ｍ２（ＯＲＦ１）、Ｍ２（ＯＲＦ２）、及びＬなどである。これは、以下に詳しく説明されており（Ｍｉｎｋ ｅｔ ａｌ．、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １８５：６１５−６２４、１９９１、Ｓｔｅｃ ｅｔ ａｌ、ｉｒｏｌｏｇｙ １８３：２７３−２８７、９９１、ａｎｄ Ｃｏｎｎｏｒｓ ｅｔ ａｌ．、Ｖｌｒｏｌ．２０８：４７８−４８４、９９５、Ｃｏｌｌｉｎｓ ｅｔ ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９３：８１−８５、１９９６）、各々引例として本明細書に組み込まれている。本発明の目的にとって、本発明で必要とする組換えＲＳＶのゲノム又はアンチゲノムは、単にウイルス又はサブウイルス粒子がそれにより感染性としてコードされるのに必要な、それらの遺伝子とそのタンパク質を含んでいることである。
【０１７９】
さらに、遺伝子又はその部分を、１又は複数のポリヌクレオチド分子により、提供することができる。すなわち、遺伝子が、別個のヌクレオチド分子からの相補性又はそれに類似したものにより提供され、ｃＤＮＡのゲノム又はアンチゲノムから直接発現されることができる。
「組換えＲＳＶ」は、組換え発現システムから直接的に又は間接的に得られた、又はそれから作製されたウイルス又はサブウイルス粒子から増殖された、ＲＳＶ又はＲＳＶ様のウイルス又はサブウイルス粒子を指す。組換え発現システムは、組換え発現ベクターを利用している。
【０１８０】
このベクターは、操作上連結した転写ユニットを含み、この転写ユニットが、集合体を含み、この集合体が少なくとも遺伝子的要素又はＲＳＶ遺伝子発現において制御役割を有する要素群を含んでいる。これらの要素の例には、プロモ一ター、ＲＳＶＲＮＡの転写される構造的又はコード配列、及び適切な転写開始及び終了配列がある。
【０１８１】
ｃＤＮＡ発現ゲノム又はアンチゲノムから感染性ＲＳＶを作製するには、ゲノム又はアンチゲノムが、それらのＲＳＶタンパク質と同時に発現される。これらのタンパク質は、（ｉ）ＲＮＡ複製ができるヌクレオキャプシドを生成するために必要であり、また、（ｉｉ）子孫のヌクレオキャプシドをＲＮＡ複製及び転写ができるようにするために必要である。ゲノムヌクレオキャプシドによる転写により、他のＲＳＶタンパク質が提供され、増殖感染が開始される。選択肢として、増殖感染に必要なさらに別のＲＳＶタンパク質が、同時発現により供給される。
【０１８２】
ＲＳＶアンチゲノムが、本発明で使用するために、ＲＳＶのｍＲＮＡの逆転写されたコピー又はゲノムＲＮＡのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ；例えば以下に記載されている：米国特許番号４，６８３，１９５及び４，６８３，２０２，及びＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ Ａ Ｇｕｌｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｌｏｎｓ、Ｉｎｎｉｓ ｅｔ ａｌ．、ｅｄｓ．、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、１９９０、本明細書に引例として組み込まれている）を用いて、凝集状態で完全なアンチゲノムであるクローニングされたｃＤＮＡ分節を、組み立てることにより構成される。例えば、アンチゲノムの左側の末端を含むｃＤＮＡｓが、適切なプロモータ（例えば、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼプロモータ）及びＳＨ遺伝子に相補する先導部領域に広がり、プラスミド（例えば、ｐＢＲ３２２）又は多様な利用可能なコスミド、ファージ、又はＤＮＡウイルスベクターのような適切な発現ベクター内で組み立てられる。このベクターが、変異誘発法及び／または組み立てを促進するように設計されたユニークな制限部位を含む合成ポリリンカーを組み入れることにより修飾される。例えば、本発明で記載されているプラスミドベクターが、ＰｓｔＩ−ＥｃｏＲ１断片を、都合のよい制限酵素部位を含む合成ＤＮＡと置き換えることにより、ｐＢＲ３２２から得られる。ｐＢＲ３２２をベクターとして使用することにより、ＲＳＶ配列におけるヌクレオチド３７１６−３７３２が安定化された。そのベクターを使用しない場合は、ヌクレオチド欠失又は挿入が起こった。人工的な重複及び挿入を避けるためにプラスミドの増殖を、細菌性の菌株ＤｈｌＯＢにて行った。そうしない場合は、ｎｔ４４９９の近隣で人工的な重複及び挿入が起こった。調製を簡単にするため、Ｇ、Ｆ及びＭ２遺伝子を、別個のベクターにて組み立てられることができ、これはＬ及び尾部配列についても同様である。アンチゲノムプラスミドの右側末端（例えば、Ｌ及び尾部配列）が、必要に応じて付加の配列（例えば、側面に配置するリボザイム及びタンデムＴ７転写ターミネーター）を含んでよい。リボザイムはハンマーヘッド型（例Ｇｒｏｓｆｅｌｄ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６９：５６７７−５６８６、１９９５）（このタイプは単一の非ウイルスヌクレオチドを含む３’末端を生成する）であってよく、又は肝炎デルタウイルスのリボザイム（Ｐｅｒｒｏｔｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３５０：４３４−４３６，１９９１）（非ＲＳＶヌクレオチドの無い３’末端を生成する）のような他のいかなる適したリボザイムであってよい。中間の分節１個（例えば、Ｇ−Ｍ２切片）が、リ一ダ−ＳＨプラスミド（これは同様にＬ一尾部リボザイムーターミネーター切片のレシピエントである）の適切な制限部位に挿入され、完全なアンチゲノムを作成する。本発明で記載されている実例では、先導部末端が、最適な活性を産むための３つの転写Ｇ残基を含むＴ７  ＲＮＡポリメラーゼのプロモータと接するように、構成された。転写により、これら３つの非ウイルスのＧが、アンチゲノムの５，末端に供与される。これら３つの非ウイルスのＧ残基を、省略して、非ウイルスのヌクレオチドの無い５’末端を作製するため���欠失することができる。ほぼ正しい３’末端を生成するには、尾部末端が、ハンマーヘッド・リボザイムに隣接するように構成された。これにより、分割直後に単一の３’−リン酸化Ｕ残基を、コードされたＲＮＡの３’末端に寄与する。
本発明のある実施例においては、ＲＳＶヌクレオチドを転写及び複製するために必要なタンパク質をコードする相補配列が、１又は複数のヘルパーウイルスにより提供される。そのようなヘルパーウイルスが、野生型でも変異型であってもよい。好ましくは、このヘルパーウイルスを、表現型において、ＲＳＶのｃＤＮＡによりコードされたウイルスと区別することができる。例えば、ヘルパーウイルスには免疫学的に反応するがＲＳＶｃＤＮＡによりコードされたウイルスには反応しないモノクローナル抗体を提供することが望ましい。そのような抗体が、中和抗体であり得る。ある実施例においては、このような抗体を使って、ヘルパーウイルス背景を中和し、組換えウイルスの同定及び回収を促進することが可能であり、又はアフィニティー・クロマトグラフィーでヘルパーウイルスを組換えウイルスと分離することが可能である。そのような抗体で組換えＲＳＶを非反応性に又は抵抗力を有するように変える変異を、ＲＳＶｃＤＮＡに導入することができる。
【０１８３】
様々なヌクレオチド挿入及び欠失を、遺伝子位置を変位したＲＳＶゲノム又はアンチゲノム内にて、適切に弱毒化されたクローンを生成するために行なうことが可能である。野生ヒトＲＳＶのゲノムのヌクレオチド長（１５，２２２個のヌクレオチド）は、６の倍数で、パラミクソウイルス及び麻疹ウイルス属のウイルスが、一般的に、ゲノム又はミニゲノムは、そのヌクレオチド長が６の倍数である時のみ、効率よく複製するという「６の規則」に従っている（キャプシド形成ＮＰタンパク質を基準にしたヌクレオチド残基の正確な間隔を推測するために必要であると考えられている）。残基を１個づつ増やしてＲＳＶゲノム長を修飾しても、複製の効率にはなんの影響も及ぼさず、継代培養後の異種のミニゲノム変異数種について配列分析をしたところ、埋め合わせとなる変化がなくても、長さの違いは維持されることがわかった。このように、ＲＳＶは、ゲノム長が６の倍数でなければならないという厳格な要件を持たず、ヌクレオチド挿入及び欠失を、ＲＳＶゲノム又はアンチゲノム内にて、本発明の組換えＲＳＶの複製を損なうことなく行うことができる。
【０１８４】
遺伝子位置を変位したＲＳＶゲノム又はアンチゲノムをコードするｃＤＮＡを構成する別な手段で、上記に代わるものには、サブユニットｃＤＮＡ組成物の数を１つ又は２つまで減らすように改良したＰＣＲ条件を利用した逆転写ＰＣＲが含まれる（例えば以下に記載されているＣｈｅｎｇｅｔａｌ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：５６９５−５６９９、１９９４、Ｓａｍａｌ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７０：５０７５−５０８２、１９９６、各々引例として本明細書に組み込まれている）。他の実施例では、異種のプロモータ（例：Ｔ３、ＳＰ６）又は異種のリボザイム（例：肝炎デルタウイルスのリボザイム）を利用することができる。大型ゲノム又はアンチゲノムの収容を改良するために、異種のＤＮＡベクター（例えば、コスミド）を増殖に利用できるＲＮＡ複製に必要であるＮ、Ｐ及びＬタンパク質は、開始後の前進的転写用のＭ２（ＯＲＦ１）タンパク質のようなＲＮＡポリメラーゼ伸長因子を要する。このように、負鎖ＲＮＡウイルス用のＭ２（ＯＲＦ１）又は実質的に同等の転写伸長因子が、感染性ＲＳＶの増殖に必要であり、増殖性感染時にヌクレオチドを機能させるために必要な要素である。
【０１８５】
Ｍ２（ＯＲＦ１）タンパク質の必要性は、転写伸長因子としてのその役割と一致している。ポジテブ鎖のＲＮＡウイルスに向けたＲＮＡポリメラーゼ伸長因子タンパク質の発現の必要性は、本発明の特徴の１つである。Ｍ２（ＯＲＦｌ）は、完全なＭ２遺伝子の発現により供給され、その発現はキメラゲノム又はアンチゲノムによるか、又はそれらとの同時発現によって行なわれる。尤も、この型では、第２のＯＲＦ２が発現され、ＲＮＡ複製に抑制効果を有する。従って、完全なＭ２遺伝子を使って感染性ウイルスの増殖を行う場合には、Ｍ２（ＯＲＦ１）の発現を充分に許容し、Ｍ２（ＯＲＦ２）がＲＮＡ複製を抑制しないような程度の転写伸長因子の活性をもたらすように、２のＯＲＦｓの活性にバランスが取れている必要がある。選択肢として、ＯＲＦ１タンパク質は、ＯＲＦ２を欠くように設計したｃＤＮＡ、又は欠損ＯＲＦ２をコードするｃＤＮＡから提供される。ウイルス増殖の効率は、例えば、エンベロープ成分をコードするタンパク質（すなわち、ＳＨ、Ｍ、Ｇ、Ｆタンパク質）などの、付加的なウイルスタンパク質遺伝子の同時発現により、改良されることもある。
Ｍ２（ＯＲＦ２）に関するこれらの結果に基づいて、本発明のまた別の典型的な実施例が提供される。この例においては、Ｍ２（ＯＲＦ２）の変異体を挿入する遺伝子位置を変位したＲＳＶが構成されており（Ｃｏｌｌｉｎｓ ａｎｄ Ｗｅｒｔｚ、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．５４：６５−７１、１９８５、ｏｌｌｉｎｓ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７１：３０１５−３０２０、１９９０、Ｃｏｌｌｉｎｓ ｅｔ ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９３：８１−８５、１９９６、各々引例として本明細書に組み込まれている）、新しいＲＳＶワクチン候補を作成している（以下を参照のこと：アメリカ合衆国特許仮出願認識５番号．６０／１４３，０９７、ｆｉｌｅｄ ｂｙ Ｃｏｌｌｉｎｓ ｅｔ ａｌ．ｏｎ Ｊｕｌｙ ９，１９９９、引例として本明細書に組み込まれている）。ある観点においては、組換えゲノム又はアンチゲノムを修飾することにより、Ｍ２０ＲＦ２の発現が減じられるか、除去され、その結果、Ｍ２０ＲＦ２内にフレーム変位変異又は１又は複数の終止コドンを挿入し、「ノックアウト」ウイルスクローンを得ることになる。選択肢として、Ｍ２０ＲＦ２を、全部又は１部欠失しＭ２−２タンパク質を部分的に又は全く機能しないものとするか、又はその発現を完全に途絶させ、Ｍ２０ＲＦ２「欠失変異」キメラＲＳＶを作製する。選択肢として、Ｍ２−２ＯＲＦが、Ｍ２−２遺伝子の自然状態の遺伝子配列部位に比べて、よりプロモータへ隣接又はプロモータ遠位に変位し、Ｍ２−２０ＲＦの発現を上限調節又は下限調節する。
【０１８６】
さらに別の実施例では、Ｍ２−２０ＲＦがゲノム又はアンチゲノム内に、遺伝子開始及び遺伝子終了シグナルを有する個別の遺伝子として挿入され、この修飾の結果、Ｍ２−２０ＲＦが上限調節される。Ｍ２０ＲＦ２の変異を挿入する本発明の遺伝子位置を変位したＲＳＶが、ワクチン開発に大変望ましい表現型を有している。組換えゲノム又はアンチゲノムにおける上記の修飾は、結果として作製されたウイルス又はサブウイルス粒子において１又は複数の望ましい表現型を特定している。以下のような特徴が１つ以上同定されたワクチン候補が、このようにして生成される。すなわち、（ｉ）ｍＲＮＡ転写における変化、（ｉｉ）ウイルスタンパク質発現のレベルにおける変化、（ｉｉｉ）ゲノム又はアンチゲノムＲＮＡ複製における変化、（ｉｖ）ウイルス増殖の特徴における変化、（ｖ）ウイルスプラークのサイズにおける変化、及び／又は（ｖｉ）細胞病原性における変更などである。
【０１８７】
Ｍ２０ＲＦ２欠失又はノックアウト変異を挿入する典型的なＲＳＶ組換え体では、望ましい表現型の変化として、対応する野生型又は変異体の親ＲＳＶ菌株の増殖に比べて、ウイルス増殖における弱毒化過程が含まれている。
【０１８８】
より詳細な観点において、細胞培養におけるウイルス増殖が、Ｍ２０ＲＦ２における変異のため、約１０倍以上弱毒化される。ウイルス増殖の増殖反応速度もまた、ワクチン開発に役に立っように修飾されたことが示される。
本発明には、Ｍ２−ＯＲＦ２の欠失及びノックアウト変異ＲＳＶも含まれている。これらは、対応する野生型又は変異体親ＲＳＶ菌株に比べて、ウイルスｍＲＮＡ合成の増殖反応速度が遅い。このような遅い転写増殖反応速度にもかかわらず、これらの新しいワクチン侯補は、親ウイルスに比べて、蓄積ｍＲＮＡ合成が向上している。これらの表現型の変化が、一般的に、野生型又は他の親ＲＳＶ菌株に感染した細胞におけるタンパク質の蓄積に比べて、感染細胞におけるウイルスタンパク質の蓄積を向上している。同時に、ウイルスＲＮＡ複製は、正常なＭ２０ＲＦ２の機能を有する親ＲＳＶ菌株の複製に比べ、Ｍ２０ ＲＮＡ遺伝子位置を変位したＲＳＶにおいて減少し、それによってゲノム又はアンチゲノムＲＮＡの蓄積を減少する。
【０１８９】
本発明の好ましい観点において、キメラＭ２０ＲＦ２欠失及び「ノックアウト」ＲＳＶを設計し、非減少又はより一般的には向上したウイルス抗原を発現し、一方では、弱毒化された表現型を呈している。このように、免疫原性上の可能性が、非減少又は向上したｍＲＮＡ転写及び抗原発現により、保たれ、その上、異種性の遺伝子又はゲノム分節を挿入したこと、及びそれに付随して起こったＲＮＡ複製の減少、及びＭ２−ＯＲＦ２の欠失及びノックアウト変異に起因するウイルス増殖を通して、弱毒化が達成された。表現型形質のこの新しいセットは、ワクチン開発に非常に望ましい。Ｍ２０ＲＦ２欠失及びノックアウト遺伝子位置を変位したＲＳＶで見られる他の有用な表現型変化には、対応する野生型又は変異体親ＲＳＶ菌株に比べて、大型プラーク表現型及び修飾された細胞病原性が含まれている。
【０１９０】
遺伝子位置を変位したＲＳＶゲノム又はアンチゲノムをコードする単離されたポリヌクレオチド（例えばｃＤＮＡ）及びＮ、Ｐ、Ｌ及びＭ２（ＯＲＦ１）タンパク質（個別に、又はシスで、又はアンチゲノム又はゲノムｃＤＮＡから発現された状態で）が、トランスフェクション、エレクトロポレーション、機械的挿入、形質導入又は類似法により、増殖性ＲＳＶ感染をサポートすることができる細胞（例えば、ＨＥｐ−２、ＦＲｈＬ−ＤＢＳ２、ＭＲＣ、及びベロ細胞）に挿入される。単離されたポリヌクレオチドのトランスフェクションは、例えば以下の方法により、培養細胞に導入されることもある。すなわち、カルシウムリン酸介在トランスフェクション（Ｗｉｇｌｅｒ ｅｔ ａｌ．、Ｃｅｌｌ １４：７２５、１９７８、Ｃｏｒｓａｒｏ ａｎｄ Ｐｅａｒｓｏｎ、Ｓｏｍａｔｉｃ Ｃｅｌｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ７：６０３、１９８１、Ｇｒａｈａｍ ａｎｄ Ｖａｎ ｄｅｒ Ｅｂ，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ５２：４５６、９７３）、エレクトロポレーション（Ｎｅｕｍａｎｎ ｅｔ ａｌ、ＥＭＢＯ Ｊ．１：８４１−８４５、１９８２）、ＤＥＡＥデキストラン媒介トランスフェクション（Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．、（ｅｄ）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ、Ｉｎｃ．、ＮＹ，１９８７）カチオン脂質媒介トランスフェクシヨン（Ｈａｗｌｅｙ−Ｎｅｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｆｏｃｕｓ １５：７３−７９．１９９３）、又は市販されるトランスフェクションキット（例えば、Ｉｎｆｅｃｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社のＬｉｐｏｆｅｃｔ ＡＣＥ（商標））（上記の各々の文献は本書に挿入される）などである。
【０１９１】
Ｎ、Ｐ、Ｌ及びＭ２（ＯＲＦ１）タンパク質は、１又は複数のｃＤＮＡｓ及び発現ベクターによりコードされる。この発現ベクターは、ゲノム又はアンチゲノムまたその多様な組換え体をコードするものと同一である場合も別な場合もある。さらにまた別のタンパク質を必要に応じて加えてもよく、これらのタンパク質は、それ自身のベクターにより、又はＮ、Ｐ、Ｌ、又はＭ２（ＯＲＦ１）タンパク質及び／又は完全なゲノム又はアンチゲノムをコードするベクターにより、コードすることができる。トランスフェクションされたプラスミドからのゲノム又はアンチゲノム及びタンパク質の発現は、例えば、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼのプロモータの制御下にある各々のｃＤＮＡにより達成され、その結果、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを発現するワクチンウイルスＭＶＡ菌株組換え体）の発現システムと共に、感染、トランスフェクション又は形質導入により供給される（Ｗｙａｔｔ  ｅｔ  ａｌ．、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、２１０：２０２−２０５、１９９５、引例として本明細書に組み込まれている）。ウイルスタンパク質及び／又はＴ７  ＲＮＡポリメラーゼは、転換された哺乳動物の細胞から提供されるか、選択肢として前もって形成されたｍＲＮＡ又はタンパク質のトランスフェクションにより提供される。
【０１９２】
選択肢として、アンチゲノム又はゲノムは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ（細胞なし）で結合転写翻訳反応、続いて細胞へのトランスフェクションにより、合成が可能である。選択肢として、アンチゲノム又はゲノムＲＮＡを、ｉｎ ｖｉｔｒｏで合成され、ＲＳＶタンパク質を発現する細胞にトランスフェクションすることが可能である。
【０１９３】
本発明により候補になるワクチンウイルスを選択するには、既知の方法に従って、生存能力、弱毒化及び免疫原性の判断基準が決定される。本発明のワクチンにおいて最も望ましいウイルスは、生存能力を維持し、安定した弱毒化表現型を有し、免疫化されたホストにおいて複製を呈し（低レベルであっても）、さらに野生型ウイルスによる二次感染により引き起こされる重篤な疾病に対し、感染保護を与えるに充分な免疫反応を効果的に惹起するものでなければならない。明らかに、これまでに知られ報告されたＲＳウイルス変異体が、これらの判断基準をすべて満たしてはいない。実は、既知の弱毒化ＲＳＶについて報告された結果に基づいた予想に反して、本発明のウイルスが、以前の研究における変異に比べて生（なま）であり適切に弱毒化されるのみならず、以前の研究における変異に比べてｉｎ  ｖｉｖｏで遺伝子的により安定しており、その結果、感染保護免疫反応を刺激し、ある事例においては複数の修飾によりもたらされた感染保護を拡大する（例えば、異種のウイルス菌株又はサブグループに対する感染保護又は異種の免疫基盤による感染保護を誘発するなど）能力を保持した（異種の免疫基盤例には、分泌及び血清免疫グロブリン、細胞性免疫性などが含まれる）。本発明が開示される以前は、ｉｎ  ｖｉｖｏ複製後のｔｓ表現型の遺伝子的不安定さは、ｔｓウイルスにとって一般的であった（Ｍｕｌｐｈｙ ｅｔ ａｌ．、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．３７：２３５−２４２、１９８２）。
【０１９４】
遺伝子位置を変位したＲＳＶをワクチンに使用する及び他のために増殖するには、ＲＳＶ増殖を許容する多数の細胞ラインが利用できる。ＲＳＶが、あらゆるヒト及び動物細胞にて増殖する。ワクチンに使用する弱毒化ＲＳウイルスを増殖するための好ましい細胞ラインには、ＤＢＳ−ＦＲｈＬ−２、ＭＲＣ−５、及びベロ細胞が含まれる。高いウイルス産生物が、通常、ベロ細胞のような上皮細胞にて達成される。細胞は、一般的に、Ｏ．ＯＯｌから１．０以上の範囲の感染多重度で、ウイルスにより免疫化されており、さらに、ウイルスの複製を許容する条件下で培養される（例えば、３０−３７℃で３−５日間、又はウイルスが適切な力価に達するまで）。ウイルスが、細胞培養から取り除かれ、細胞性要素から、既知の清澄化方法、例えば遠心分離法により分離され、さらにこの分野での常法を用いて、記載されているように精製される。
【０１９５】
弱毒化され、又は本発明で記載されているように修飾された遺伝子位置を変位したＲＳＶが、あらゆる既知の一般的に受け入れられたｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏモデルを使って、適切な弱毒化、表現型復帰への抵抗力、及びワクチンに使用するためにの免疫原性を試験することができる。ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイでは、修飾されたウイルス（例えば、幾重にも弱毒化された生物学的に得られたＲＳＶ又は組換えＲＳＶ）を、ウイルス複製の温度感受性（すなわち、ｔｓ表現型）及び小型プラーク表現型について試験する。修飾されたウイルスを、さらにＲＳＶ感染の動物モデルにて試験する。あらゆる動物モデルが、以下の文献で説明及び要約される（Ｍｅｉｇｎｉｅｒ ｅｔ ａｌ．、ｅｄｓ．、Ａｎｉｍａｌ Ｍｏｄｅｌｓ ｏｆ Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ Ｓｙｎｃｙｔｉａｌ Ｖｉｒｕｓ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ、Ｍｅｒｉｅｕｘ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ、１９９１、引例として本明細書に組み込まれている）。ＲＳＶ感染コットンラットのモデルが、以下の文献に説明されており（Ｕ．Ｓ．４，８００，０７８ ａｎｄ Ｐｒｉｎｃｅ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ Ｒｅｓ．３：１９３−２０６，１９８５、引例として本明細書に組み込まれている）、これは、ヒト及び非ヒトの霊長類における弱毒化と効用を予測するものである。さらに、チンパンジーを用いたＲＳＶ感染の霊長類モデルは、以下の文献に詳細に記載されているように、ヒトにおける弱毒化と効用を予測するものである（Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｖｉｒｏｌ．３：９１−１００、１９７８、Ｗｒｉｇｈｔ ｅｔ ａｌ、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．３７：３９７−４００、１９８２、Ｃｒｏｗｅ ｅｔ ａｌ．、Ｖａｃｃｉｎｅ １１：１３９５−１４０４，１９９３，各々引例として本明細書に組み込まれている）。
【０１９６】
ＲＳＶワクチン候補の弱毒化と及び感染力を評価するげっ歯類及びチンパンジーを含むＲＳＶモデルシステムが、分野に広く受け入れられており、それから得られたデータが、ＲＳＶ感染及び弱毒化との間に高い相関関係を示している。マウス及びコットンラットのモデルが、候補のＲＳＶウイルスがチンパンジーにおいて不適切な増殖を呈する事例において、例えば、ＲＳＶサブグループＢウイルスの事例において、特に有用である。
【０１９７】
上記の説明及び下記の例に従って、本発明はまた、ワクチン用の単離された感染性の遺伝子位置転位ＲＳＶを提供する。ワクチンの一組成物である弱毒化されたキメラウイルスが、単離され一般的に精製された型に属する。「単離された」という用語は、感染された個体の鼻咽喉のような、野生型ウイルスの天然の環境以外に属するＲＳＶを指す。もっと一般的に言えば、「単離された」という用語は、細胞培養又は他の人工的な媒体（ウイルスが増殖され制御された設定で特徴付けがされるもの）の組成物としての弱毒化されたウイルスを含む意味がある。例えば、本発明の弱毒化ＲＳＶは、感染された細胞培養により生成され、細胞培養から単離され、安定剤に加えられる。
【０１９８】
本発明のＲＳＶワクチンが、本明細書に記載されているように、活性成分として、免疫原性的に効果的な量のＲＳＶを含んでいる。生物学的に得られたＲＳＶ又は組換えＲＳＶが、直接ワクチン製剤に使用され、選択肢として凍結乾燥もできる。凍結乾燥されたウイルスは、一般的に約４℃で保存される。使用時には、凍結乾燥されたウイルスは、下記により詳細に記載されているように、安定化剤溶液（例えば、生理食塩水又はＳＰＧ、Ｍｇ＋＋及びＨＥＰＥＳからなる溶液）にて、アジュバント（抗原性補強剤）ともに、又はなしにて調製される。生物学的に得られたウイルス又は組換えウイルスが、生理的に受け入れられる担体及び／又はアジュバントと共に、ホストに導入されてよい。有用な担体は分野でよく知られているが、例えば、水、緩衝水、０．４％の生理食塩水、２００．３％のグリシン、ヒアルロン酸等が含まれる。結果として生成される水溶液が、そのままパッケージに詰められことも、又は凍結乾燥することもできる。上記に記載されているように、凍結乾燥調剤は、投与する前に消毒液と混合する。
【０１９９】
組成物は、生理的状態に近づけるために必要に応じて、薬剤学的に受け入れられている補助剤を含んでいても構わない。補助剤の例としては、ｐＨ調整剤及び緩衝剤、張性（浸透圧）調整剤、湿潤剤等があり、その例には、酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、ラウリル酸ソルビタン、オレイン酸トリエタノールアミン等がある。受け入れられているアジュバントには、不完全Ｆｒｅｕｄアジュバント、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、またはミョウバンが含まれ、これらは分野でよく知られた物質である。好ましいアジュバントにはまた、Ｓｔｉｍｕｌｏｎ（商標）ＱＳ−２１（Ａｑｕｉｌａ Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．、ＦｒａｍｉｎｇｈａＲＮＡ）、ＭＰＬ（商標）（３−０−ｄｅａｃｙｌａｔｅｄ ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌ ｌｉｐｉｄ Ａ、Ｃｏｒｉｘａ、Ｈａｍｉｌｔｏｎ、ＭＴ）、及びインターロイキンー１２（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）が含まれている。
【０２００】
本発明で記載されているように、エアロゾル、液滴、経口、局所又は他の経路で、遺伝子部位転位ＲＳＶワクチン組成物で免疫化を施した直後、ホストの免疫系は、１又は複数のＲＳＶウイルスタンパク質（Ｆ及び／又はＧ糖タンパク質）に特異性を有する抗体を生成することにより、ワクチンに反応する。免疫化の結果、ホストは、特に下気道で、ＲＳＶ感染性に対し少なくとも部分的に又は完全に免疫力ができるか、又は軽いまたは重篤なＲＳＶ疾病の発病に対し抵抗力ができる。
【０２０１】
本発明の遺伝子の位置を変位したＲＳＶワクチンが、単一のＲＳＶ菌株又は抗原サブグループ（例えば、Ａ及びＢ）、又は複数のＲＳＶ菌株またはサブグループに対する免疫反応を惹起する弱毒化されたウイルスを含む。この状況において、遺伝子位置を変位したＲＳＶが、単一特異性の免疫反応又は多特異性の免疫反応を、複数のＲＳＶ菌株またはサブグループに対して惹起する。選択肢として、異種の免疫原性を特徴付けする遺伝子位置を変位したＲＳＶを、ワクチン混合物と混合し、相応する治療プロトコルで別個に投与し、１個のＲＳＶ菌株に対して、又は複数のＲＳＶ菌株又はサブグループに対して、より効果的な感染保護を惹起することもできる。
【０２０２】
ワクチンが投与されるホストは、ＲＳＶ又は密接に関連したウイルスによる感染に罹りやすい哺乳動物で、接種しているウイルスの抗原に対する感染保護免疫反応を生成することができる哺乳動物であってよい。このように、適したホストには、ヒト、ヒト以外の霊長類、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウサギ目、げっ歯類等が含まれる。これに応じて、本発明は、多様なヒトおよび獣医学的用法のためにワクチンを作成する方法を提供する。
【０２０３】
本発明の弱毒化遺伝子部位転位ＲＳＶを含むワクチン組成物は、感染しやすい又はＲＳＶ感染のリスクがある患者に、「免疫学的に効果のある投与量」（個体のＲＳＶに対する免疫反応能力を誘発又は向上させるに充分な量）にて投与される。ヒトの被験者の場合、本発明の弱毒化ウイルスが、以下の文献に記載されているように、確立されたヒトＲＳＶワクチンプロトコルに従って、投与され（Ｗｒｉｇｈｔ ｅｔ ａｌ、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．３７：３９７−４００、１９８２，Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．、Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ ５２：５６−６３、１９７３、ａｎｄ Ｗｒｉｇｈｔ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｐｅｄｉａｔｒ．８８：９３１−９３６、１９７６）、これらはそれぞれ引例として本明細書に組み込まれている。要約すれば、成人及び子供は、鼻腔内経由で液滴により、免疫学的に効果のあるＲＳＶワクチン投与量を以って（通常、生理的に受け入れられる希釈剤又は担体０．５ｍｌの量を以って）、免疫化される。この方法には、非複製ワクチンの非経口的経路の免疫化に比べて、簡単で安全であるという利点がある。この方法はまた、局部の気道の免疫を直接刺激し、このことはＲＳＶに対する抵抗力において主要な役割を果たすものである。さらに、このモデルのワクチンは、乳児によく見られるＲＳＶ特異性を有する母親からの血清抗体の免疫抑制効果を効果的に無視する。また、ＲＳＶ抗原の非経口的投与は時に、免疫病理学的な併発症を起こすことがあるが、これは生ウイスルに関しては未だ観察されていない。
【０２０４】
全ての患者において、遺伝子部位転位ＲＳＶワクチンの正確な投与量、タイミング及び投与回数っが、患者の健康状態、体重、投与方法、製剤の性質等に基づいて決定される。投与量は、一般的に、患者１人につき約１０３から１０６プラーク形成ユニット（ＰＦＵ）以上のウイルス量であり、より一般的には、患者２０１人につき約１０４から１０５（ＰＦＵ）のウイルスの範囲である。いずれにしても、ワクチン製剤は、本発明の弱毒化されたＲＳＶが、アンチＲＳＶ免疫反応を刺激又は誘発するために充分な量を提供する必要があり、これは、補体結合、プラーク中和、及び／又は酵素免疫測定法等により決定される。この点で、患者は、上気道の疾病の兆候及び症状がないかどうか、モニターされる。チンパンジーヘの投与に見られるように、ワクチンの弱毒化ウイルスは、接種を受けた個体の鼻咽喉で、野生型ウイルスに比べて約１／１０以下の低いレベルで、また不完全に弱毒化されたＲＳＶのレベルと比較して約１／１０以下の低いレベルで増殖する。
【０２０５】
新生児及び乳児においては、充分なレベルの免疫性を惹起するには、複数回の投与が必要となる。投与は、生後一ヶ月以内に開始するべきであり、幼児期には、生後２ヶ月、６ヶ月、１年及び２年という間隔をおいて、天然（野生型）のＲＳＶ感染に対する感染保護の充分なレベルを保つために必要に応じて、行うべきである。同様に、繰り返して重篤なＲＳＶ感染に罹りやすい成人（例えば、医療勤務者、保育所勤務者、乳幼児のいる家庭、高齢者、心肺性機能の脆弱な者）は、感染保護免疫反応を確立及び／又は維持するために複数回の免疫化が必要となる。誘発された免疫のレベルは、中和分泌及び血清抗体によりモニターすることが可能であり、感染保護の望ましいレベルを維持するために必要に応じて、投与量を調整し、免疫化を繰り返すことができる。
【０２０６】
さらに、様々なワクチンウイルスが、多様な被接種患者グループヘ投与できると示唆される。例えば、サイトカイン選択肢として別の細胞エピトープが多く含まれるタンパク質を発現するように作製された遺伝子位置を変位したＲＳＶ菌株は、乳児よりも成人に特に好適である。本発明により作製されたＲＳＶワクチンは、ＲＳＶの別のサブグループ又は菌株の抗原を発現するＲＳＶワクチンと混合して、複数のＲＳＶサブグループ又は菌株に対する感染保護をもたらすことができる。選択肢として、ワクチンウイルスは、本発明に記載されているように、１個のＲＳＶクローンに作製された複数のＲＳＶ菌株又はサブグループの感染保護エピトープを、挿入することが可能である。
【０２０７】
一般的に、ワクチンウイルスを使用する場合、混合剤で同時に投与されるが、個別に投与されることもある。例えば、２のＲＳＶサブグループのＦ糖タンパク質はアミノ酸配列において差異が１０％しかないことから、この類似性は交差保護免疫反応の基盤となる。このことは、ＲＳＶまたはＦ抗体で免疫された動物又は、異種性の菌株で攻撃された動物において観察される。
【０２０８】
このように、１個の菌株による免疫化により、同一又は異種のサブグループに対する感染保護がもたらされる。しかしながら、最適な感染保護には、おそらく双方のサブグループに対して免疫化を行うことが必要である。
【０２０９】
本発明の遺伝子部位転位ＲＳＶワクチンが、患者が以前に野生型ＲＳＶに感染している場合に、例えば、肺炎及び細気管支炎のような重篤な下気道疾病に対する感染保護をもたらす免疫反応の生成を惹起する。自然状態で存在するウイルスは、感染を起こすことができるが（特に上気道に）、免疫化の結果として鼻炎の可能性が大きく減じられ、さらに野生型ウイルスによる次回の感染に対する抵抗力を増強する可能性が出る。ワクチン投与後、検出できるレベルのホスト産生血清及び分泌抗体が見られ、これは異種性（同一のサブグループからの）の野生型ウイルスを、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏにて中和することができる。
【０２１０】
多くの場合、ホスト抗体もまた、異種の非ワクチンサブグループの野生型ウイルスを、中和する。本発明の好ましい遺伝子位置を変位したＲＳＶは、自然状態でヒトに存在する野生型ウイルスに比較して、非常に著しい毒性力の減少を呈している。遺伝子部位転位ウイルスは、充分に弱毒化されるので、感染の症状はほとんどの免疫化された患者では起こらない。ある事例においては、弱毒化されたウイルスは、免疫化されていない患者に伝播する能力は依然としてあるが、その毒性力は充分に無効化されるので、免疫化された又は偶発的なホストでの重篤な下気道感染は起こらない。
【０２１１】
遺伝子部位転位ＲＳＶワクチンウイルスの弱毒化のレベルは、例えば、免疫化された患者の気道に存在するウイルスの量を測り、その量を野生型ＲＳＶ又はワクチン菌株候補として評価された他のＲＳＶにより生成された量と比較することにより、決定することができる。例えば、本発明の弱毒化されたキメラウイルスは、野生型ウイルスの複製レベルに比べて（例えば、１／１０倍から１／１０００倍低い）、チンパンジーのような罹患しやすいホストの上気道での複製を非常に制限する。また、弱毒化されたＲＳＶワクチン菌株のチンパンジーの上気道での複製レベルが、ＲＳＶのＡ２ｔｓ−１変異体のそれより低くなければならないが、これは血清反応陰性のヒト乳児にて不完全に弱毒化されるとして先に示された。上気道でのウイルスの複製と関連している鼻漏の発病をさらに減少させるためには、理想的なワクチン候補ウイルスが、上気道及び下気道の両方にての複製を制限するものでなけれならない。
【０２１２】
しかしながら、本発明の弱毒化ウイルスは、免疫化された患者に感染保護を与えるように、ヒトにおいて充分な感染性及び免疫原性を持たねばならない。
【０２１３】
感染したホストの鼻咽喉におけるＲＳウイルスのレベルを決定する方法は、上記の文献でよく知られている。検体は、検査法による組織培養又はその他により定量化された鼻咽喉分泌及びウイルスからの吸引又は洗浄により得られる。次はその参照例である。すなわち（Ｂｅｌｓｈｅ ｅｔ ａｌ、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １：１５７−１６２、１９７７；Ｆｎｅｄｅｗａｌｄ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｍｅｄ．Ａｓｓｏｃ．２０４：６９０−６９４、１９６８、ＧｈａＩｐｕｒｅ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｖｉｒｏｉ．３：４１４−４２１、１９６９ ａｎｄ Ｗｒｇｈｔ ｅｔ ａｌ．、Ａｒｃｈ．Ｇｅｓ．Ｖｉｒｕｓｆｏｒｓｃｈ．４１：２３８−２４７、１９７３（各々引例として本明細書に組み込まれている）など。ウイルスが、チンパンジーのようなホスト動物の鼻咽喉にて、簡易に測定することができる。
【０２１４】
ある場合においては、本発明の遺伝子位置を変位したＲＳＶワクチンを、他の病因、特に、他の小児期ウイルスに対する感染保護反応を誘発するワクチンと組み合わせることが望ましいとなる。例えば、本発明の遺伝子位置を変位したＲＳＶワクチンは、以下に記載されているように（Ｃｌｅｍｅｎｔｓ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２９：１１７５−１１８２，１９９１、引例として本明細書に組み込まれている）、パラインフルエンザウイルスワクチンと同時に投与することができる。本発明のまた別の観点において、キメラＲＳＶを、ＰＩＶのような他の気道病原の感染保護抗体用ベクターとして、用いることが可能である。これは、本発明で記載されているように、それらの感染保護抗体をコードする配列を、感染性組換えＲＳＶを生成するのに使用される遺伝子部位転位ＲＳＶゲノム又はアンチゲノムに組み入れることにより達成される。
【０２１５】
本発明のさらにまた別の観点において、遺伝子部位転位ＲＳＶが、気道一過性の遺伝子療法用のベクターとして用いられている。この実施例によると、遺伝子位置を変位したＲＳＶゲノム又はアンチゲノムを、目的の遺伝子生成物をコードすることができる配列を組み込んでいる。この目的の遺伝子生成物は、ＲＳＶの発現を制御するプロモータと同一の又は異種のプロモータの制御下にある。
【０２１６】
組換えＲＳＶゲノム又はアンチゲノムをＮ、Ｐ、Ｌ及びＭ２（ＯＲＦｌ）タンパク質と同時発現することにより、また目的の遺伝子生成物をコードする配列を含むことにより、作製された感染性ＲＳＶが患者に投与される。これは、完全に感染性である（すなわち、培養細胞を感染させ感染性の子孫を増殖する能力があるということ）組換えＲＳＶとおそらく関与しており、選択肢として、例えば、Ｇ、Ｆ及びＳＨ表面糖タンパク質遺伝子の１又は複数が欠損し、安定した又は一過性の発現によりトランス部位でこれらのタンパク質の１又は複数を提供する細胞において増殖する組換えＲＳＶであってよい。そのような事例では、作製された組換えウイルスは、効果的な感染を起こす能力はあるが、感染性の粒子を作製する上では非常に非効率的となる。発現された細胞表面糖タンパク質がないことにより、感染細胞を除去する上でホスト免疫システムの効率が下がる。これらの特徴により、外来遺伝子の発現の耐性及び安全性が上がる。
【０２１７】
遺伝子療法に関しては、投与は、一般的に、治療を受けている患者の気道へのエアゾル、噴霧、又は他の局所散布による。遺伝子部位置を変位したＲＳＶは、希望の遺伝子生成物の治療又は予防レベルの発現を結果として起こすに充分な量で投与される。この方法で投与される代表的な遺伝子生成物の例には、例えば、一過性の発現に特に適しているものをコードする遺伝子生成物がある。その例としては、インターロイキン−２、インターロイキン−４、γインターフェロン、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、エリスロポエチン、及び他のサイトカイン、グルコセレブロシダーゼ、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ、嚢胞性線維性膜貫通調節因子（ＣＦＴＲ）、ヒポキサンチン・グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴ）、細胞毒、腫瘍抑制遺伝子、アンチセンスＲＮＡｓ、及びワクチン抗原がある。以下の例は、分かりやすく説明するために提示されており、これに限定するわけではない。
【０２１８】
実施例１
Ｇ及びＦ遺伝子が、単独又は組み合わせて、プロモータ隣接した位置に再配列されるている組換えＲＳＶの構成
本実施例は、感染性ＲＳＶの遺伝子配列の再配列を記録したものである。この感染性ＲＳＶにおいては、Ｇ及び／又はＦ遺伝子により例示される抗原決定基をコードする１又は複数の遺伝子又はゲノム分節が、プロモータへ有意的に隣接する位置に変位される。下記の一例では、Ｇ及び／又はＦ遺伝子が、その野生型遺伝子順位の位置から、組換えＲＳＶゲノム又はアンチゲノムにおける再配列位置１及び２を占めるように、共に変位される。先に記載されているように、この操作は、ＳＨ遺伝子が欠失されたＲＳＶアンチゲノムＲＮＡ（ＲＳＶ△ＳＨ）のクローン作製ｃＤＮＡで行なわれた（参照例Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ ｅｔ ａｌ．， Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７３：３４３８−３４４２，１９９９，引例として本明細書に組み込まれている）。ＳＨ遺伝子が欠失された野生ＲＳＶ型は、完全な野生型ＲＳＶと同等又はそれより多少良くｉｎ ｖｉｔｒｏで増殖し、マウスの上気道で及びチンパンジーの上気道及び下気道で多少弱毒化される（Ｂｕｋｒｅｙｅｖ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１：８９７３−８９８２、１９９７、Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７３：３４３８−３４４２、１９９９、引例として本明細書に組み込まれている）。その免疫原性及び感染保護効用は、野生型ウイルスのものと大変近い。このように、ＲＳＶ△ＳＨウイルスは野生型ウイルスに比べて、多少弱毒化されるが、それ以外は類似した特質を有する。このＲＳＶ△ＳＨウイルスが、これらの研究における親ウイルスである。ＳＨ欠損ウイルスのこれらの特徴は、一般のＲＳＶ欠失変異の遺伝子的安定性と共にこの背景を、遺伝子配列変位されたＲＳＶを作製するための親組換え体として特に有用なものとし、変異誘導体の回収と操作を促進している。
【０２１９】
アンチゲノムｃＤＮＡが操作され、組換えウイルスが、上記手順及び方法を利用して回収された（更なる参照例Ｃｏｌｌｉｎｓ ｅｔ ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９２：１１５６３−ｌ１５６７、１９９５、Ｂｕｋｒｅｙｅｖ ｅｔ ａｌ．、 Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７０：６６３４−６６４１、１９９６、Ｂｕｋｒｅｙｅｖ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１：８９７３−８９８２、１９９７、Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：４４６７−４４７１、１９９８、Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ ｅｔ ａｌ．、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２４７：２３２−２３９、１９９８、Ｂｅｒｍｉｎｇｈａｍ ａｎｄ ａｎｄ Ｃｏｌｌｉｎｓ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９６：１１２５９−１１２６４、１９９９、Ｃｏｌｌｉｎｓ ｅｔ ａｌ．、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２５９：２５１−２５５、１９９９；Ｂｕｋｒｅｙｅｖ ｅｔ ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９６：２３６７−２３７２、１９９９、Ｊｕｈａｓｚ ｅｔ ａｌ．、Ｖａｃｃｉｎｅ１７：１４１６−１４２４、１９９９；Ｊｕｈａｓｚ ｅｔ ａｌ．、 Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７３：５１７６−５１８０、１９９９；Ｔｅｎｇ ａｎｄ Ｃｏｌｌｉｎｓ、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７３：４６６−４７３、１９９９、Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７３：９７７３−９７８０、１９９９、Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７３：８７１−８７７、１９９９、Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７３：３４３８−３４４２、１９９９、米国特許出願番号５，９９３，８２４、各々引例として本明細書に組み込まれている）。
【０２２０】
このアンチゲノムｃＤＮＡを、３つのサブクローンとして操作した。第１のサブクローンＤ５１／△ＳＨが、先導部領域からＭ遺伝子の下流末端におけるゲノム、Ｔ７プロモータと左側末端を含む。第２のサブクローンｐＵＣ１９−ＧＦＭ２が、ゲノムの中心部にからするＧ、Ｆ及びＭ２遺伝子を含む。第三のサブクローンＤ３９は、Ｌ遺伝子、その後にゲノムの右側末端からの尾部が続き、さらにその後に自己開裂リボソーム配列及びタンデムＴ７転写ターミネーターを含む。
【０２２１】
変異誘発プライマーによるＰＣＲ法を使って、Ｇ及びＦ遺伝子を別個に又は同時に単一のＧ−Ｆ ｃＤＮＡとして含んでいるｃＤＮＡｓの末端を、増幅及び修飾した（図１）。挿入用にＧ遺伝子だけのｃＤＮＡを作製するために、ＰＣＲ法を使って、完全な組換えＲＳＶアンチゲノム配列（ＧＯＲＦを開始するＡＴＧからＧ遺伝子終了シグナルの下流末端に及ぶ）のヌクレオチド４６９２−５５９６を増幅した。ＰＣＲ法プライマーを、Ｇ遺伝子終了シグナルの直後に、Ｇ−Ｆ遺伝子間（ＩＧ）領域の最初の６つのヌクレオチドを付加し、その後にＮＳ１遺伝子の１０−ヌクレオチドＧＳシグナルのコピーが続くように設計した（図１）。ＰＣＲ法プライマーはまた、ＢｌｐＩ部位を増幅したｃＤＮＡの両方の末端に付加するように設計した。挿入用にＦ遺伝子だけのｃＤＮＡを作製するために、ＰＣＲ法を使って、完全なアンチゲノム配列（ＦＯＲＦを開始するＡＴＧからＦ遺伝子終了シグナルの下流末端に及ぶ）のヌクレオチド５６６２−７５５１を増幅した。ＰＣＲ法プライマーは、Ｆ遺伝子終了シグナルの直後に、Ｆ−Ｍ２１Ｇの最初の６ヌクレオチドを付加し、その後に１０ヌクレオチドＮＳ１遺伝子開始シグナルのコピーが続くように設計した。ＰＣＲ法プライマーは、ＢｌｐＩ部位をｃＤＮＡの両方の末端に配置した。
【０２２２】
挿入用にＧ及びＦ遺伝子を含むｃＤＮＡを作製するために、ＰＣＲ法を使って、完全なアンチゲノム配列（ＧＯＲＦのＡＴＧからＦ遺伝子終了シグナルの下流末端に及ぶ）のヌクレオチド４６９２−７５５１を増幅した（図１）。ＰＣＲ法プライマーは、Ｆ遺伝子終了シグナルの直後に、Ｆ−Ｍ２１Ｇの最初の６ヌクレオチドを付加し、その後にＮＳｌ遺伝子開始シグナルのコピーが続くように設計した。ＰＣＲ法プライマーはまた、ＢｌｐＩ部位をｃＤＮＡの両方の末端に付加するように設計した。全てのｃＤＮＡｓは、全体の配列が決定され構造が確認された。
【０２２３】
Ｇ、Ｆ、又はＧ−Ｆ ｃＤＮＡの挿入用にプロモータ隣接部位を作製するため、ＮＳｌ遺伝子の上流非コード領域が、アンチゲノム位置９２（ＧからＣ、ポジティブセンス）及び９７（ＡからＣ）におけるヌクレオチド置換により修飾され、それにより助１部位が作られた（図１）。この操作は、ＲＳＶアンチゲノムＲＮＡの最初の４１９のヌクレオチドを含むＢｓｔＢＩ−ＭｆｅＩサブクローンで行なわれた。ヌクレオチド置換は、ＰＣＲ法により、完全なプラスミド上で導入された（Ｂｙｒａｐｐａ ｅｔ ａｌ．、Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５：４０４−４０７、１９９５、引例として本明細書に組み込まれている）。修飾されたＢｓｔＢＩ−ＭｆｅＩ断片は、Ｄ５１／△ＳＨに再挿入され、このサブクローンは同様に、上記のように構成されたＧ、Ｆ、及びＧ−Ｆ ｂｌｐＩのｃＤＮＡ断片のレシピエントとして機能した。ＢｌｐＩは、非対称７量体識別配列を有するため、断片は正しい配向にのみ挿入することが可能である。
【０２２４】
Ｇ、Ｆ、又はＧ−Ｆ ｃＤＮＡ遺伝子がプロモータ隣接する位置に配列された場合、それに対応する遺伝子はその通常の下流位置から欠失され、その結果各々の組換えゲノムがＧ及びＦの単一のコピーを組み込んだ（図１）。Ｇ遺伝子のみを欠失するには、ＰＣＲ法がｐＵＣ１９−Ｇ−Ｆ−Ｍ２で行なわれ、ＳｔｕＩ−ＨｐａＩ断片（ヌクレオチド５６１１−６４１９、ｔｈｅ Ｇ−ＦＩＧからＦ遺伝子の中ほどに及ぶ）が増幅された。さらに、このＰＣＲ法は配列：ＴＴＡＡＴＴＡＡＡＡＡＣＡＴＡＴＴＡＴＣＡＣＡＡＡ（配列ＩＤ番号：３）を、ｃＤＮＡの上流末端に付加した。この配列は、ＰａｃＩ部位（先頭８文字）を含み、これはアンチゲノムｃＤＮＡではＳＨ遺伝子終了シグナル内に位置している。この切片は、その後、ＰａｃＩ−Ｈｐａｌ断片として、修飾されていないｐＵＣ１９−ＧＦＭ２のＰａｃＩ−ＨｐａＩウィンドウに導入することができ、それによってＧ遺伝子を欠失した。ＰＣＲ法に暴露したこのｃＤＮＡ断片の配列を、ジデキシヌクレオチド配列決定により確認した。
【０２２５】
又は、Ｆ遺伝子のみを欠失するには、ＰＣＲ法がｐＵＣ１９−ＧＦＭ２で行なわれ、ヌクレオチド部４６１８にあるＰａｃＩ部位からヌクレオチド５５９６にあるＧ遺伝子終了シグナルまで及ぶ断片を増幅した。さらにこのＰＣＲ法は、配列ＣＡＣＡＡＴＴＧＣＡＴＧＣ（配列ＩＤ番号４）を、ｃＤＮＡの下流末端に付加した。この配列は、Ｆ−Ｍ２１Ｇ配列の上流部分を含み、その後に組換えＲＳＶアンチゲノムのＦ−Ｍ２１ＧにあるＳｐｈＩ部位（後部６文字）が続く。このｃＤＮＡをＰａｃＩ−ＳｐａＩ断片として、修飾されていないｐＵＣ１９−ＧＦＭ２のＰａｃＩ−ＳｐａＩウィンドウにクローンすると、その結果、Ｆ遺伝子が欠失された。ＰＣＲ法に暴露されたｃＤＮＡ断片の配列を、ジデキシヌクレオチド配列決定により確認した。
【０２２６】
Ｇ及びＦ遺伝子を双方とも（ＳｐｈＩ−ＢａｍＨＩ断片）欠失するために、ＢｙｒａｐＰａの方法によるＰＣＲ法（Ｂｙｒａｐｐａ ｅｔ ａｌ．、Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，５：４０４−４０７（１９９５）を使って、ＴＴＡＡＴＴＡＡＡＡＡＣＡＣＡＡＴＴ（配列ＩＤ番号：５）の配列がｃＤＮＡの上流末端に付加されたｐＵＣ−ＧＦＭ２（Ｆ−Ｍ２１ＧからＭ２／Ｌ重複部分まで及ぶ）のヌクレオチド７５５９−８５０６が増幅された。その結果として作製されるｃＤＮＡ挿入には、ＰａｃＩ 部位（先導部８文字）及びＳｐｈＩ部位のすぐ隣にあるＦ−Ｍ２１Ｇ配列の上流部分が含まれるが、Ｇ及びＦ遺伝子を欠いている。ＰＣＲ法に暴露されていたｃＤＮＡ断片の配列は、ジデキシヌクレオチド配列決定により確認された。
完全なアンチゲノムｃＤＮＡｓは、次いで、上述のように組み立てられる（さらなる参照例Ｃｏｌｌｉｎｓ ｅｔ ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９２：１１５６３−１１５６７、１９９５、Ｂｕｋｒｅｙｅｖ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７０：６６３４−６６４１、１９９６；Ｂｕｋｒｅｙｅｖ ｅｔ ａＩ．、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１：８９７３−８９８２、９９７、Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：４４６７−４４７１、１９９８、Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ ｅｔ ａｌ．、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２４７：２３２−２３９、９９８、ｅｒｍｇｈａｍ ａｎｄ Ｃｏｌｌｉｎｓ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９６：ｌ１２５９−１１２６４、１９９９、Ｃｏｌｌｉｎｓ ｅｔ ａｌ．、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２５９：２５１−２５５、１９９９、Ｂｕｋｒｅｙｅｖ ｅｔ ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９６：２３６７−２３７２、１９９９、Ｊｕｈａｓｚ ｅｔ ａｌ、Ｖａｃｃｉｎｅ １７：１４１６−１４２４、１９９９、Ｊｕｈａｓｚ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７３：５１７６−５１８０、１９９９、Ｔｅｎｇ ａｎｄ Ｃｏｌｌｉｎｓ、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７３：４６６−４７３、１９９９、Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７３：９７７３−９７８０、１９９９；Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７３：８７１−８７７、１９９９、Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７３：３４３８−３４４２、１９９９、及び米国特許出願番号５，９９３，８２４４、各々引例として本明細書に組み込まれている）。この組み立てにより、Ｂｌｐ／△ＳＨ、Ｇ１／△ＳＨ、Ｆ１／△ＳＨ、及びＧｌＦ２／ΔＳＨアンチゲノムｃＤＮＡｓをコードするｃＤＮＡｓが生成された。
【０２２７】
これらのｃＤＮＡｓは、別々にＮ、Ｐ、Ｍ２−１及びＬサポートプラスミドと共にＨＥｐ−２細胞にトランスフェクションされ、３２℃でインキュベートされた（参照例Ｃｏｌｌｉｎｓ ｅｔ ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９２：１１５６３−１１５６７、１９９５、Ｃｏｌｌｉｎｓ ｅｔ ａｌ．、Ｖｉｏｌｏｇｙ ２５９：２５１−２５５、１９９９、米国特許出願番号５，９９３，８２４、各々引例として本明細書に組み込まれている）。トランスフェクションされた上澄物が３日後に新鮮な細胞に継代培養にかけられ、３日から７日の間隔で採取して、３７℃にてＨＥｐ−２細胞の連続的な継代培養にかけた。間隔を短くすることが、Ｆ１／△ＳＨ及びＧｌＦ２／△ＳＨウイルスにより感染された単一層に必要であった。なぜならばこれらの単一層は迅速な胞体形成及びそれに続く細胞破壊を呈したからである。これは、Ｆ遺伝子タンパク質における修飾のため、膜融合Ｆタンパク質の発現が高められることを反映していると解釈される。図２に示すように、それぞれの採取された上澄液の培養液分取を、瞬間冷凍し、後に重複して滴定にかけた。これらの結果により、ＧｌＦ２／△ＳＨ及びＦ１／△ＳＨウイルスの回収及び増幅は、Ｂｌｐ／△ＳＨ又はＧ１／△ＳＨウイルスのそれを上回ることがわかった。同じ知見がまたＳＨ欠損ウイルス及び野生型ウイルスについて確認した。
【０２２８】
総ＲＮＡは組換えウイルスのそれぞれを、感染された細胞から単離し、適切なゲノム分節のＲＴ−ＰＣＲ法が行なわれた。それにより、作製されたゲノム構造が設計及び構成された通りであることを確認した。加えてノーザンブロット法により、適切なサブゲノムｍＲＮＡｓの発現を確認した。
【０２２９】
その後、次のウイルスの増殖反応速度及びｉｎ ｖｉｔｒｏにて抗原増殖を比較した、すなわち野生型ＲＳＶ（ＳＨ遺伝子を含むもの）、ＳＨ欠損（ＳＨ遺伝子が欠失されるがＮＳ１非コード領域にＢｌｐＩ部位を含まないもの）、Ｂｌｐ／△ＳＨ、Ｇ１／△ＳＨ、及びＧｌＦ２／ΔＳＨなどである。ＨＥｐ−２細胞及びベロ細胞の複製単一層培養は、一細胞あたり０．１のプラーク形成ユニット（ＰＦＵ）のＭＯＩで、１時間（−１から０時間）の吸着期間にて感染した。これらの単一層をその後、３回洗浄し３７℃にてインキュベートした。ウイルス当り２の複製単一層を１２時間の間隔にて、吸着直後（ｔ＝０時間）に採取した。培養液の上澄物を瞬間冷凍し、後に放出された感染性ウイルスを定量化するプラークアッセイ法による分析に備えた（図３Ａ）。これにより、これらのウイルスが、ベロ（図３Ａ、上方パネル）及びＨＥｐ−２（図３Ａ、下方パネル）細胞において感染性のウイルスを増殖させるその能力において、同等であることがわかった。
【０２３０】
同一の実験において、各々の時刻からベロ細胞単一層（図３Ａ、上方パネル）を採取し、ウェスタンブロット法により分析し、Ｇタンパク質の発現を特徴付けた（図４）。各々の時刻からの総感染細胞の検体を、性質を変容させるポリアクリルアミドゲルにて電気泳動させ、ニトロセルロースに変位させて、さらにＧタンパク質のあるペプチドに特異性を有する抗血清とインキュベートすることにより分析した。結合した抗体を、市販の化学発光キットを用いて、検索し定量した。抗体が、Ｇタンパク質のこの２の主な細胞関連型（すなわち大型の９０ｋＤａ完全成熟型及び小型の５０ｋＤａ不完全グリコシル化型）に結合した。この比較により、感染性の粒子の増殖が、全てのウイルスにて類似しているが（図３Ａ，上方パネル）、細胞関連型Ｇタンパク質の量は、Ｇ１／△ＳＨまたはＧｌＦ２／△ＳＨウイルスに感染した細胞においてかなり多いこと（図１０４）が判明した。露光フィルムのデンシトメトリーによるゲルバンドの定量化により、Ｇ１／△ＳＨ及びＧｌＦ２／△ＳＨウイルスが、Ｂｌｐ／△ＳＨウイルスに比べて、それぞれ６倍から４倍多いＧタンパク質を発現していたことがわかった。
【０２３１】
上記のように、Ｆｌ／△ＳＨ又はＧｌＦ２／△ＳＨウイルスにより感染された細胞単一層が、合胞体形成を含む細胞変性効果を急速に開始した。これは、Ｆタンパク質の発現が高められたことを反映されると解釈された。この高められた細胞変性効果が、このウイルスをワクチンとして用いることに否定しない。というもの、ワクチンウイルスによるｉｎ  ｖｉｖｏでの感染が、これらの散在する細胞の細胞変性の開始が、より急速であるか否かにかかわらず、死んで置換される少量の上皮細胞しか含まないためである。しかしながら、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの細胞病原性の速度が遅ければ、より高いウイルスの力価が達成することができる。これらの因子の解明することが、遺伝子配列変位されたＲＳＶをより高度に弱毒化された背景に構成することにより達成される。この状況において、遺伝子変位はＲＳＶの増殖を妨げなかったが、Ｇタンパク質の総発現を数倍高めたということは特筆に価する。
【０２３２】
更なる研究において、遺伝子配列変位ウイルスのＨＥｐ−２、及びベロ細胞単一層における複製能力を、感染多重度が３．０に設定された実験と比較した（図３Ｂ）。これは、２の個別実験にて行なわれ類似した結果が得られた。
【０２３３】
これらの実験の１つから提供されるデータを、図３Ｂに示す。この単一サイクルの増殖アッセイでは、プロモータへ隣接する位置にＧ及び／又はＦを含む３つのウイルスＧ１／△ＳＨ、Ｆ１／△ＳＨ、及びＧｌＦ２／△ＳＨのそれぞれが、対照ウイルスＢｌｐ／ΔＳＨに比較してより効率的に複製された。さらに、差異は、ＨＥｐ−２細胞よりベロ細胞において大きかった。例として、ＨＥｐ−２細胞におけるＢｌｐ／△ＳＨ対照ウイルスの６．８Ｘ１０６ＰＦＵ／ｍｌに比較して、Ｇｌ／△ＳＨウイルスの力価は感染２４ｈ後７．２×１０６ＰＦＵ／ｍｌであり、その差は０．４１ｏｇ１０であった。それに対して、ベロ細胞におけるぞれぞれの価は、Ｇｌ／△ＳＨウイルスで６．６×１０６ＰＦＵ／ｍｌ、Ｂｌｐ／△ＳＨ対照ウイルスで５．６×１０６ＰＦＵ／ｍｌであり、その差は１．０１ｏｇ１０であった。他の遺伝子変位ウイルスの各値はまた、対照ウイルスの力価を越える値を有していた。このように、この例のように、Ｇ及び／又はＦ遺伝子をプロモータ隣接へ変位することより、ＨＥｐ−２及びベロ細胞におけるウイルス産出量が増加され、その最大産出量は、大規模なウイルス増殖に有用な細胞ラインであるベロ細胞においてｌＯ倍であった。
【０２３４】
さらに遺伝子変位組換えウイルスを、ＢＡＬＢ／ｃマウスの上気道及び下気道における複製能力について検査した（表１）。１グループ１８匹のマウスのそれぞれを、１匹につき１０６ＰＦＵのＧ１／△ＳＨ、Ｆ１／△ＳＨ、ＧｌＦ２／△ＳＨ、又は対照ウイルスＢｌｐ／△ＳＨにて感染させた。各々のグループから６匹を、感染後３、４及び５日後に屠殺し、その鼻甲介及び肺が採取し、プラークアッセイ法により分析し、それぞれ上気道及び下気道におけるウイルス力価を測定した。表１に示されるように、Ｂｌｐ／△ＳＨ及びＦｌ／△ＳＨウイルスの複製レベルが、ほとんど識別し難い。このように、後者のウイルスはｉｎ  ｖｉｔｒｏでいくらか効率的に複製したが、ｉｎ  ｖｉｖｏでの複製は変わらなかった。複製又は毒性力が高まらなかったことにより、遺伝子変位ウイルスの修飾が、弱毒化変異の付加により簡素化された。ＧｌＦ２／△ＳＨウイルスの複製が、「野生型」Ｂｌｐ／△ＳＨ対照ウイルスの複製に比べてかろうじて低く、Ｇ１／△ＳＨウイルスの複製もまた、特に感染の初期において低かった。例えば、３日目には、Ｇ１／△ＳＨウイルスが、上気道及び下気道の双方において、Ｂｌｐ／△ＳＨ対照ウイルスに比べ０．７１ｏｇ１０低かった。
【０２３５】
表１．  Ｇ及び／又はＦ遺伝子をプロモータ隣接に含む組換えＲＳＶのマウス
の上気道及び下気道における複製
【０２３６】
【表１】
2004515218.tif 000002
【０２３７】
１．  １群１８匹のＢＡＬＢ／Ｃマウスに、鼻腔内経由で、１匹あたり１０６ＰＦＵの表示されたウイルスが接種された（０日目）。３、４、及び５日目に、１グループにつき６匹のマウスを屠殺し、その鼻の鼻介骨及び肺を採取して、ウイルス力価をプラークアッセイ法により決定した。平均力価を、表示された標準誤差と共に示す。
【０２３８】
このように、１又は複数の遺伝子をプロモータ隣接する位置に変位又はＲＳＶ遺伝子一般を再配列することにより、ウイルスをｉｎ  ｖｉｖｏで複製するために、多少弱毒化することができる。これは、弱毒化の有用な方法のメニューに加えることができるので、弱毒化ワクチン菌株を設計する上での価値がある。さらに、異種のクラス又は型の弱毒化を起こす変異（例：温度感受性点変異、非温度感受性点変異、遺伝子欠失等）を含めることが重要である。様々な型の変異は、様々な様式でウイルスの表現型に影響を及ぼし、単一のワクチンウイルスにおける複数の型の変異が存在することにより、安定性が高まる。遺伝子変位による弱毒化が、この状況においてさらに新しい有用な弱毒化変異のクラスとなる。本発明の遺伝子変位はある程度の弱毒化をもたらすことができるという知見により、ワクチン菌株の弱毒化表現型をきめ細かく調整する有用な新規ツールが提供される。
【０２３９】
本発明のある種の有用な弱毒化変異は、「条件で左右される」種であり、この種では弱毒化が特定の条件下において（例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで）最小で、他の条件下において（例えば、ｉｎ  ｖｉｖｏで）は最大である。ｉｎ  ｖｉｔｒｏで最小限又は作用しない弱毒化表現型は、ワクチンウイルスの増殖を効率よくさせるが、これは細胞培養で増殖が悪いＲＳＶ及び他のウイルスの事例において特に重要である。勿論、本明細書に記載されているように、ワクチンウイルスの疾病及び副作用を減らすためには、弱毒化表現型はｉｎ  ｖｉｖｏで作用しなければならない。
【０２４０】
本明細書に示されるＧｌ／△ＳＨ組換え体が、遺伝子変位の結果生成される特に望ましい特質の組み合わせを例示している。特に、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのその増殖が実際１０倍まで増幅され、一方ｉｎ  ｖｉｖｏでのその複製は多少減じられた。これにより、上記のように、ワクチン増殖の効果及び抗原発現が改良るという利点がもたらされた。
【０２４１】
ｉｎ  ｖｉｖｏでの遺伝子配列変位ウイルスの免疫原性を、ＢＡＬＢ／ｃマウスについて研究した。１グループ６匹のマウスを、前記記載されているように、別々のウイルスにより感染させ、血清検体を接種の１日前及び、接種の２８日及び５６日後に採取した（表２）。血清検体を、ＩｇＧ専用の糖タンパク質特異的酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）により分析した（表２）。Ｇタンパク質特異性ＩｇＧの分析により、Ｆ１／ΔＳＨ及びＧｌＦ２／ΔＳＨウイルスに対する反応が、２０Ｂｌｐ／ΔＳＨ対照ウイルスのそれと非常に類似しているということがわかった。それと反対に、Ｇ１／△ＳＨウイルス対するＧ特異性の反応が、多少（最高で４倍まで）下がった。これは、少なくとも部分的には、表１に記載されているように、このウイルスの複製が、下がったことによると考えられる。Ｆ特異性の反応により、Ｆｌ／△ＳＨ及びＧｌＦ２／△ＳＨウイルスが、抗原レベルにおいてＧｌ／△ＳＨ及びＢｌｐ／△ＳＨウイルスと比較して、２．５から４倍の緩和な上昇を呈したということが判明した。この知見は、Ｆ遺伝子をよりプロモータ隣接に変位させることにより、結果としてｉｎ  ｖｉｖｏでの抗原発現及び免疫原性を増幅するという解釈と一致している。さらに、これらの結果により、遺伝子変位が、免疫化を起こすウイルスの全体の複製が変わらないという条件下において、ｉｎ  ｖｉｖｏでの免疫原性を増大することができることが判明した。これは、野生型親ウイルスと比較して、特異的的により高い免疫原性を有するＲＳＶワクチンを作成する特定の方法を提供するために非常に望ましい結果である。マウスモデルと使ってウイルスの生物学的特質を同定及び特徴付けることができ、さらに本明細書に示すように新しい望ましい特質を明らかにすることができるということに留意されたい。
【０２４２】
表２．   プロモータへ隣接する位置にＧ及び／又はＦ遺伝子を含む組み換えＲＳＶにより感染した後のマウスにて、糖タンパク質特異的酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、又は血清抗原反応による測定
【０２４３】
【表２】
2004515218.tif 000003
【０２４４】
１．  １群につき６匹のＢＡＬＢ  Ｃマウスに、接種材料０．１ｍｌ（１０６ＰＦＵのウイルス）が鼻腔内接種された（０日目）。
【０２４５】
２．  表示されるように、血清検体が接種の１日前（接種前）、２８日目、及び５６日目に採取され、ＲＳＶＧ又はＦタンパク質と比較して、ＩｇＧ抗原専用の糖タンパク質特異的酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）により、分析された。平均力価は、表示された標準誤差と共に示される。
実施例ＩＩ
ＧおよぴＦ遺伝子を高度に弱毒化された背景においてプロモータへ隣接した変位位置に組み込んだ組換えＲＳＶ
先に記載されている遺伝子が変位された変異体は、ＳＨ遺伝子が欠失された遺伝子的背景とする状況下にて導入された。野生型ウイルスにおいて、この欠失が、細胞培養における増殖を多少改良し、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて適度な弱毒化を呈する（Ｂｕｋｒｅｙｅｖ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１：８９７３−８９８２、１９９７、Ｗｈｌｔｅｈｅａｄ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７３：３４３８−３４４２、１９９９、引例として本明細書に組み込まれている）。しかしながら、ＲＳＶに未罹患の乳児及び幼児に投与するために安全なＲＳＶワクチンウイルスは、△ＳＨ欠損のみにより提供される弱毒化より、高い弱毒化が必要である。従って、本実施例は、本発明の遺伝子が変位された変異体が、高度に弱毒化された背景にうまく回収できることを、実証するために提供される。
【０２４６】
本発明のこの観点を例示するために２の背景が選択された。一方では、ＳＨ及びＮＳ２遺伝子の双方を欠損している背景、もう一方では、ＳＨ、ＮＳ１及びＮＳ２遺伝子を欠損している背景である。上記の文献に記載されているように、△ＮＳ２及び△ＮＳｌの欠失は、それだけで、それぞれ高度に弱毒化を呈する（参照例Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７３：３４３８−３４４２，１９９９）。ワクチン増殖条件下において、野生型のウイルスの産生量が、△ＮＳ２ウイルスの産生量と同等になるが、Ｉｎ ｖｉｔｒｏでは、どちらかの変異を含むウイルスの増殖を、遅延及び減少する。チンパンジーにおいては、△ＮＳ２及び△ＮＳ１ウイルスが、それぞれ複製及び疾病に対し高度に弱毒化されており、ＲＳＶの攻撃に対して高度の免疫原性及び感染保護性を呈する。各々の変異体のみが、組換えワクチンウイルスにおけるそれ自体か他の変異体との組み合わせるかのいずれかを含められる優れた侯補である。△ＮＳｌ及び△ＮＳ２変異は共に、△ＮＳ２ウイルスに比較して、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいてさらにより高度に弱毒化されたウイルスを生成する。本実施例においては、これらの欠失を有するさらなる組換え体が構成され、さらに遺伝子配列変位変異をサポートする能力を検査した。
【０２４７】
Ｇ及びＦ遺伝子を、ＮＳ２及びＳＨ遺伝子を欠失したアンチゲノムの１位及び２位に変位した（ＧｌＦ２  △ＮＳ２△ＳＨ）（図５、パネルＡ）、又はＮＳｌ、ＮＳ２及びＳＨ遺伝子を欠失したアンチゲノムの１位及び２位へ変位した（ＧｌＦ２／△ＮＳ１△ＮＳ２△ＳＨ）（図５、パネルＢ）、アンチゲノムｃＤＮＡｓが構成された。これらのアンチゲノムｃＤＮＡｓを、上記の実施例１に記載されているように、組換えウイルスを回収するために使用した。双方の事例において、組換えウイルスを、容易にｉｎ ｖｉｔｒｏにて回収及び増殖した。このように、本実施例は、Ｇ及びＦ遺伝子がプロモータへ隣接する位置に変位された複数の変異体を含む遺伝子配列を変位したＲＳＶが、容易に作製及び回収されることを例示する。これら及び他の遺伝子配列を変位したＲＳＶが、本発明に記載されている方法により適切なワクチン候補を選択するために、複製及び抗原発現のレベル、さらにｉｎ  ｖｉｖｏにて増殖、免疫原性及び感染保護効果について分析した。
【０２４８】
上記の実施例において、弱毒化生ワクチンとしての特性を改良するために、ワクチンＲＳＶの遺伝子配列に典型的な変化が行われた。特に、Ｇ及びＦ遺伝子が、単独で又は共に、プロモータへ隣接する位置に変位した。これらのタンパク質が、通常、ＲＳＶ遺伝子配列（ＮＳｌ−ＮＳ２−Ｎ−Ｐ−Ｍ−ＳＨ−Ｇ−Ｆ−Ｍ２−Ｌ）において、位置７（Ｇ）及び８（Ｆ）を占める。回収について好結果の可能性を高めるために、ＳＨ遺伝子が欠失されたＲＳＶバージョンにて、遺伝子操作を行った。
【０２４９】
Ｇ及びＦ遺伝子の双方をその後、個別に位置１へ又は位置１及び２へそれぞれ共に変位させた。意外なことに、Ｇ及びＦ遺伝子が位置１へ変位された組換えＲＳＶ、又はＧ及びＦ遺伝子が位置１及び２へそれぞれ共に変位されたＲＳＶが、容易に回収された。この結果は、単一のＶＳＶ糖タンパク質遺伝子を２位置だけ変位させることにより、ウイルス増殖が著しく妨げられたというＶＳＶに関する以前の研究と大いに異なる。ＲＳＶが非効率的に複製し、ＲＳＶが複雑な遺伝子配列を持ち、糖タンパク質遺伝子の変位には多くの位置変化が含まれるという理由から、これらの修飾されたウイルスを回収する能力はまた意外であった。実際、再配列されたＲＳＶが、少なくとも野生型の遺伝子配列を有するその直接の親と同等に増殖する。上記のように野生型ウイルスの細胞培養での増殖が非効率で、ｉｎ ｖｉｔｒｏ複製においてさらに効率が低下することによりワクチン処方が実現不可能になるという理由から、これはＲＳＶには特に重要である。
【０２５０】
ＮＳｌ−ＮＳ２−Ｎ−Ｐ−Ｍタンパク質の全てが、増殖の健全性を損なわずに、プロモータを基準として１又は２位置だけ動かすことができるということは、驚くべきことである。加えて、Ｇ糖タンパク質の発現を調べてみると、その親ウイルスの発現と比較して、数倍高まっていることがわかった。これにより、Ｇ及び／又はＦ遺伝子を最初の位置に含むワクチンウイルスが、他のウイルスタンパク質と比較して、これらの感染保護抗原の分子量が多いということを示し、従ってこのワクチンウイルスは大変望ましいワクチン特性を有するウイルスとなる。
【０２５１】
さらに、遺伝子配列の修飾が、以前の研究により作製された２つの高度に弱毒化されたワクチン候補について行なわれた。これらのワクチン候補は、上記のようにＮＳ２遺伝子を単独にて欠失したもの、及びＮＳｌ及びＮＳ２遺伝子の両方を欠失したものである。これらの２つのワクチン候補において、Ｇ及びＦ糖タンパク質を共に位置１及び２へそれぞれ変位させ、Ｇ、Ｆ及びＳＨ糖タンパク質をその元の下流位置から欠失させた。このように、回収されたウイルスＧｌＦ２△ＮＳ２△ＳＨ及びＧｌＦ２／△ＮＳｌ△ＮＳ２△ＳＨが、Ｇ及びＦ遺伝子の変位に加えて、２つ及び３つの遺伝子がそれぞれ欠失していた。行なわれた変化の程度を分かりやすく示すために、野生型ＲＳＶの遺伝子配列（ＮＳ１−ＮＳ２−Ｎ−Ｐ−Ｍ−ＳＨ−Ｇ−Ｆ−Ｍ２−Ｌ）とＧｌＦ２／△ＮＳ２△ＳＨの遺伝子配列（Ｇ−Ｆ−ＮＳ１−Ｎ−Ｐ−Ｍ−Ｍ２−Ｌ）又は△ＮＳ１△ＮＳ２△ＳＨの遺伝子配列（Ｇ−Ｆ−Ｎ−Ｐ−Ｍ−Ｍ２−Ｌ）を比較することができる。これにより、ほとんど又は全ての遺伝子の位置が、プロモータを基準として、変更されることがわかった。しかしながら、これらの高度に弱毒化された誘導体は細胞培養で増殖する能力を保持した。これは、これらの誘導体が候補ワクチンウイルスの開発に明らかな有用性を有することを示している。
【０２５２】
実施例ＩＩＩ
プロモータへ隣接して変位された位置にＨＲＳＶのＧ及びＦ遺伝子を含むキメラＢＲＳＶ／ＨＲＳＶの構成
本実施例は、ＨＲＳＶＧ及びＦ遺伝子が組換えウシＲＳＶ（ｒＢＲＳＶ）を背景に置換される感染性ｒＢＲＳＶ／ＨＲＳＶキメラの構成について説明している。その結果作製されたヒト−ウシキメラが、ＨＲＳＶからの２の遺伝子（すなわち、Ｇ及びＦ）、ＢＲＳＶからの８つの遺伝子（すなわち、ＮＳ１、ＮＳ２、Ｎ、Ｐ、Ｍ、ＳＨ、Ｍ２及びＬ）を含む。ヒトＧ及びＦ遺伝子がウシＲＳＶ背景（ｒＢＲＳＶ／Ａ２と名称が与えられている）に対応する野生型の位置にて置換されるヒト−ウシＲＳＶ構成を説明する、より詳細な情報を以下に提示する。すなわち、Ｂｕｃｈｏｌｚｅｔａｌ．により２０００年６月２３日提出された米国特許出願番号０９／６０２，２１２、２００１年１月１８日にＷＯ Ｏｌ／０４３３５として公開されるその対応特許協力条約出願、及びその１９９９年７月９日に提出された優先権仮出願による米国出願識番号６０／１４３，１３２；各々引例として本明細書に組み込まれている。
【０２５３】
ｒＢＲＳＶ／Ａ２の基本的置換糖タンパク質構成に加えて、本実施例ではＨＲＳＶＧ及びＦ遺伝子が、ＢＲＳＶゲノムのＦ及びＧ遺伝子の野生型遺伝子配列に比して、ｒＢＲＳＶ骨格におけるよりプロモータ隣接に変位された。より具体的には、Ｆ及びＧ遺伝子を、プロモータを基準としてその通常の位置から、すなわち、７位及び８位からそれぞれ１位及び２位へ変位させた。この目的を達成するために、ユニークなＭｏｔＩ、ＳａｌＩ及びＸｈｏＩ部位を６７、４，６７３及び７，４７１位においてそれぞれ作製するためにヌクレオチド置換を行い、完全な感染性ｒＢＲＳＶを構成した（図６、パネルＡ）（更なる参照例ＢｕｃｈｈｏＩｚ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７３：２５１−２５９、１９９９、Ｂｕｃｈｈｏｌｚ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ、７４：１１８７−１１９９、２０００、引例として本明細書に組み込まれている）。ＮｏｔＩ部位が、ＢＲＳＶのＮＳ１遺伝子の上流非翻訳領域に含まれており、ＳａｌＩ及びＸｈｏＩ部位が、遺伝子間領域にある。ＳａｌＩ及びＸｈｏＩ部位を有するｒＢＲＳＶアンチゲノムｃＤＮＡの消化により、ＢＲＳＶのＧ及びＦ遺伝子を完全に切除して、結合された適合性のある相補末端が作製された（図６、パネルＢ）。この結果、Ｇ及びＦ遺伝子を欠損し、以下の配列を有する６４ヌクレオチドＳＨ−Ｍ２遺伝子間領域を含むｒＢＲＳＶアンチゲノムｃＤＮＡを作製した。
ＴＴＡＡＡＣＴＴＡＡＡＡＡＴＧＧＴＴＴＡＴＧｔｃｇａＧＧＡＡＴＡＡＡＡＴＣＧＡＴＴＡＡＣＡＡＣＣＡＡＴＣＡＴＴＣＡＡＡＡＡＧＡＴ（配列ＩＤ番号：６）（本来の開裂したＳａｌＩ及びＸｈｏＩ部位のテトラヌクレオチド相補末端を小文字にて表示）。比較のため、自然状態で発生するＢＲＳＶのＦ−Ｍ２遺伝子間配列は、５５ヌクレオチドの長さである。
【０２５４】
ＨＲＳＶのＧ及びＦ遺伝子を含むｃＤＮＡは、ｃＤＮＡ末端を修飾するために使用される変異プライマーを用いて、ＰＣＲ法により作成される。具体的には、ＰＣＲ法を使って、完全なＨＲＳＶアンチゲノムｃＤＮＡ（ＧＯＲＦのＡＴＧからＦ遺伝子終了シグナルの末端まで及ぶ）のヌクレオチド４６９２−７５５１が増幅され、プライマーが、Ｆ遺伝子終了シグナルの直後に、Ｆ−Ｍ２１Ｇの最初の６ヌクレオチドを付加し、その後にＮＳ１遺伝子開始シグナルのコピーが続くように設計した。このＰＣＲプライマーはまた、ＢｌｐＩ部位及びＭｏｒＩ部位を、ｃＤＮＡの両末端に付加するように設計した。ｐＣＲ法に暴露されたｃＤＮＡ断片を、ジデキシヌクレオチド配列決定により確認した。このｃＤＮＡは、その後、ＮｏｔＩ断片として、上記のようにＧ及びＦ遺伝子を欠損するｒＢＲＳＶアンチゲノムｃＤＮＡのユニークなＮｏｔＩ部位に挿入された。正しい組換え体が制限断片マッピングにより同定され、ｒＢＲＳＶ／Ａ２−ＧｌＦ２と名称が与えられた。コードされたゲノムＲＮＡの構造は、図６パネルＣに示される。図にあるように、このｃＤＮＡでは、Ｇ及びＦ遺伝子が、プロモータを基準として７位及び８位から、位置１及び２へ変位される。
【０２５５】
ｒＢＲＳＶ／Ａ２−ＧｌＦ２のアンチゲノムＲＮＡをコードするプラスミドは、Ｎ、Ｐ、Ｍ２−１及びＬサポートタンパク質をコードするプラスミドと共に、ＢＳＲＴ７／５細胞に、トランスフェクションされた。その結果、上記のようにＴ７  ＲＮＡポリメラーゼを安定して発現し（更なる参照例Ｂｕｃｈｈｏｌｚ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７３：２５１−２５９、１９９９、Ｂｕｃｈｈｏｌｚ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７４：１１８７−１１９９、２０００、各々引例として本明細書に組み込まれている）、感染性のウイルスを回収した。回収されたｒＢＲＳＶ  Ａ２−ＧｌＦ２ウイルスを、ヒトＨＥｐ−２細胞及びウシＭＤＢＫ細胞における多サイクル増殖の効率について、ｒＢＲＳＶ、ｒＨＲＳＶ（ｒＡ２とも呼ばれている）及びｒＢＲＳＶ／Ａ２と比較した。上記のように（さらなる参照例Ｂｕｃｈｈｏｌｚ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７４：１１８７−１１９９、２０００、引例として本明細書に組み込まれている）、ｒＨＲＳＶはＨＥｐ−２細胞においてｒＢＲＳＶに比べてより効率的に増殖し、ｒＢＲＳＶ／Ａ２ウイルスが、各々親の増殖効率における中間の効率にて増殖する。図７に示されるように、ｒＢＲＳＶ／Ａ２−ＧｌＦ２の複製効率が、ｒＢＲＳＶ／Ａ２の効率と区別できなかった。このように期待に反して、Ｇ及びＦ遺伝子の位置における変更により、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの増殖効率は下がらなかった。この新しい結果により、ＲＳＶワクチンウイルスの効率的な増殖が可能となった。
【０２５６】
免疫蛍光法が、ｗｔＨＲＳＶ又はキメラウイルスであるｒＢＲＳＶ／Ａ２またはｒＢＲＳＶ／Ａ２−ＧｌＦ２により感染されたＨＥｐ−２細胞について行なわれた。これは、ＨＲＳＶＧ又はＦタンパク質に特異性を有するモノクロナール抗体（それぞれ０２１／０１Ｇ及び４４Ｆ）を用いて行なわれた（Ｌｏｐｅｚｅｔａｌ、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：６９２２−６９２８、１９９８、ｅｌｅｒｏ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７８：２４１１−２４１８、１９９７、各々引例として本明細書に組み込まれている）。染色が、それぞれのモノクロナール抗体について別個に行なわれた。このアッセイが、半定量的測定でしかないが、先にこのアッセイによりｗｔｒＢＲＳＶとｒＢＲＳＶ／Ａ２が確実に区別できるということが確認される（後者はｒＢＲＳＶ骨格における通常のゲノム位置にＨＲＳＶのＧ及びＦ遺伝子を有する）。特に、ｗｔＨＲＳＶは非常に強力で広範な免疫蛍光パターンを与え、それに対してｒＢＲＳＶ／Ａ２は弱く拡散した広範囲でないパターンを与える（Ｂｕｃｈｈｏｌｚ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７４：１１８７−１１９９、２０００、引例として本明細書に組み込まれている）。ｒＢＲＳＶ／Ａ２−ＧｌＦ２について行なわれた同等のアッセイによると（図８）、このプロモータへ変位したキメラの免疫蛍光パターンが、ｗｔＨＲＳＶと非常に類似していることがわかった。この結果は、Ｇ及びＦ糖タンパク質の発現の増大と一致している。同時に、ｒＢＲＳＶ／Ａ２−ＧｌＦ２の細胞の変性効果が、ｗｔＨＲＳＶに比べて下がっており、ｒＢＲＳＶ／Ａ２のそれに大変類似していた（Ｂｕｃｈｈｏｌｚ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７４：１１８７−１１９９、２０００、引例として本明細書に組み込まれている）。具体的には、ｒＢＲＳＶ／Ａ２及びｒＢＲＳＶ／Ａ２−ＧｌＦ２が、胞体の数及びサイズの減少を誘発した。
このように、本実施例は、ｒＢＲＳＶ／Ａ２ヒト−ウシキメラＲＳＶウイルスの修飾を記録している。この修飾ウイルスには、ＨＲＳＶの主要な感染保護抗原に対する遺伝子、すなわち、Ｇ及びＦタンパク質が、霊長類の気道で複製されるために強力に弱毒化されるＢＲＳＶの背景に含んでいる。ｒＢＲＳＶ／Ａ２ウイルスが、強力なホスト範囲制限の表現型を有し、そのためこのウイルスは霊長類において強く弱毒化される。本遺伝子配列変位ｒＢＲＳＶ／Ａ２−ＧｌＦ２ウイルスが、その遺伝子的背景においてＢＲＳＶ遺伝子と同一の型を有しているため、この強力なホスト範囲制限の表現型を共有している可能性があり、それによりこの２つの主な感染保護抗原の発現が高まる。これら２つの主要な感染保護抗原のｉｎ  ｖｉｖｏにおける発現が高まれば、さらにこのウイルスの免疫原性も高まると予測される。このように、本実施例は、ｒＢＲＳＶ／Ａ２ウイルスを、ＨＲＳＶ遺伝子をプロモータ隣接する位置に変位させることによって修飾及び改良した。この規模の位置変位、すなわち、プロモータに対して野生型の位置７及び８から新しい位置１及び２へ変位されたことが、これまでに記載されなかった。
【０２５７】
実施例１Ｖ
ＨＲＳＶから誘導されるエンベロープ関連Ｍ、Ｇ及びＦタンパク質を伴うキメラＢＲＳＶ／ＨＲＳＶの構成
本実施例は、ヒト−ウシキメラ背景内にて作製されるさらにまた別の遺伝子配列が変位されたＲＳＶを例示している。この遺伝子配列が変位されたＲＳＶでは、上記のように、ｒＢＲＳＶ／Ａ２キメラ（ＨＲＳＶＧ及びＦ感染保護抗原遺伝子をＢＲＳＶホスト範囲弱毒化背景において有する）に似たアンチゲノムキメラウイルスの修飾を含む。ＢＲＳＶ及びＨＲＳＶは双方とも、４つのエンベロープ関連のタンパク質、すなわち主な保護抗原であるＧ及びＦ糖タンパク質、中和されるように見られない未知の機能の小型疎水性ＳＨタンパク質又はＨＲＶに対する保護抗原（Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７３：３４３８−３４４２、１９９９、Ｃｏｎｎｏｒｓ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６５：１６３４−１６３７、１９９１、各々引例として本明細書に組み込まれている）、及び感染保護抗原ではないがビリオンを組み立てる際重要であるグリコシル化されていない内部基質（Ｍ）タンパク質（Ｔｅｎｇ ａｎｄ Ｃｏｌｌｉｎｓ、 Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：５７０７−１６、１９９８、引例として本明細書に組み込まれている）を有している。
【０２５８】
この実施例では、このキメラウイルスが、４つのエンベロープ関連のタンパク質、すなわちＢＲＳＶＭ、ＳＨ、Ｇ及びＦを全て欠失した、そして３つＨＲＳＶのエンベロープ関連タンパク質遺伝子、すなわち、Ｍ、Ｇ及びＦを、それらの位置に挿入した、ＢＲＳＶ／ＨＲＳＶキメラウイルスを構成した。これにより、Ｆ及びＧ糖タンパク質遺伝子が、プロモータへ隣接する位置に、ＳＨ遺伝子の長さに対応する一遺伝子の距離だけ変位させることができる。
【０２５９】
上記のｒＢＲＳＶ／Ａ２構成（さらなる参照例Ｂｕｃｈｈｏｌｚ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７４：１１８７−１１９９、２０００、引例として本明細書に組み込まれている）には、ＰとＭ遺伝子の間の領域に、ユニークなＭｌｕＩ部位を位置３２０４に含むように修飾した（図９、パネルＡ；Ｐ−ＭＩＧ）。これは、５ヌクレオチド置換の導入を含むものであった。ヌクレオチド配列位置番号は、完全なｒＢＲＳＶアンチゲノムに対応している（Ｂｕｃｈｈｏｌｚ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７３：２５１−２５９，１９９９，Ｂｕｃｈｈｏｌｚ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７４：１１８７−１１９９、２０００、ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ ＡＦ０９２９４２ ｏｒ ｃｏｍｐｌｅｔｅｒ ＨＲＳＶ ａｎｔｉｇｅｎｏｍｅ ｉｎ Ｃｏｌｌｉｎｓ ｅｔ ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９２：１１５６３−１１５６７、１９９５、各々引例として本明細書に組み込まれている）、ＨＲＳＶ配列を表わす配列位置番号には、下線が引かれている。ＭｌｕＩ−ＳａｌＩ断片が、切除され、Ｍ遺伝子を有するＭｌｕＩ−ＳａｌＩ断片と置き換えられた。
【０２６０】
図９、パネルＢでは、ＨＲＳＶＭ遺伝子を含んだｃＤＮＡを、ＰＣＲ法によりｃＤＮＡｓの両末端に変化を導入したプライマーを用いて、増幅及び修飾した。具体的には、ＭｃＤＮＡを修飾し、その結果その上流末端にＭｌｕＩ部位を含み、その後順に、Ｐ−Ｍ遺伝子間領域の最後のヌクレオチド（これは、ＨＲＳＶ及びＢＲＳＶにおいて同じ）、完全なＨＲＳＶＭ遺伝子、ＢＲＳＶのＳＨ−Ｇ遺伝子間領域における最初の４つのヌクレオチド、さらにＳａｌＩ部位が続いた。このｃＤＮＡの全配列が正しいことを確認した。この配列では、ＭｌｕＩとＳａｌＩとが共に消化され、ｒＢＲＳＶアンチゲノムのＭｌｕＩ−ＳａｌＩウィンドウにクローンされた。この結果ｒＢＲＳＶ／Ａ２−ＭＧＦを作製した。図９、パネルＣに示されるように、このキメラを、６つのＢＲＳＶ遺伝子、すなわち、ＮＳｌ、ＮＳ２、Ｎ、Ｐ、Ｍ２及びＬ、及び３つのエンベロープ関連タンパク質遺伝子、すなわち、Ｍ、Ｇ及びＦを含んでいた。
【０２６１】
このアンチゲノムプラスミドが、上に詳しく記載されているように、Ｎ、Ｐ、Ｍ２−１及びＬサポートタンパク質をコードするプラスミドと共にＢＳＲＴ７／５細胞に、トランスフェクションされ、それにより、Ｔ７／ＲＮＡポリメラーゼを安定して発現し（Ｂｕｃｈｈｏｌｚ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７３：２５１−２５９、１９９９，Ｂｕｃｈｈｏｌｚ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７４：１１８７−１１９９、２０００、各々引例として本明細書に組み込まれている）、さらに感染性のウイルスが回収された。このように、本実施例は、Ｇ及びＦ遺伝子のプロモータへ隣接して変位することにより生ずる遺伝子欠失を含む遺伝子配列を変位したＲＳＶが、容易に作製及び回収されることができることを例示している。この及び他の遺伝子配列を変位したＲＳＶが、本発明に記載されている方法に従って適切なワクチンを選択するために、複製及び抗原の発現、さらにｉｎ  ｖｉｖｏでの増殖、免疫原性及び感染保護効力について分析される。
【０２６２】
実施例Ｖ
ＢＲＳＶ骨格内に置換されたＨＲＳＶの非構造的及び／又はエンベロープ関連タンパク質を含む追加的ＢＲＳＶ／ＨＲＳＶキメラウイルスの構成及び回収ＢＲＳＶ
ＨＲＳＶ骨格に置換されたＨＲＳＶの非構造的なＮＳ１及びＮＳ２及び／又はエンベロープ関連のＭ、ＳＨ、Ｇ及び／又はＦ遺伝子を含む、付加的なＢＲＳＶ／ＨＲＳＶキメラウイルスが構成された。これらのキメラウイルスのほとんどが、ＨＲＳＶからのＧ及びＦ遺伝子を含んでいるが、これは、これらが主な保護抗原をコードするものであり、効果的なＨＲＳＶワクチンにとって重要であることから、所望の特質である。
【０２６３】
典型的なウイルス内で、ＢＲＳＶのＮＳ１及びＮＳ２遺伝子を、それに対応するＨＲＳＶ遺伝子に置換した。ＮＳ１及びＮＳ２が、近年１型インターフェロン媒介抗ウイルス形状の拮抗体であることが判明しており（Ｓｃｈｌｅｎｄｅｒ、ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７４：８２３４−４２、２０００、引例として本明細書に組み込まれている）、これらの遺伝子の置換を行うことにより、増殖特質及びワクチンウイルスの毒性力を修飾する道がもたらされた。これは、インターフェロン拮抗体が、ホスト特異性である傾向があるという、一般的知見による（Ｙｏｕｎｇ，ｅｔ ａｌ．、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、２６９：３８３−９０、２０００；Ｄｉｄｃｏｃｋ、ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、７３：３１２５−３３、１９９９、Ｄｉｄｃｏｃｋ、ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、７３：９９２８−３３，１９９９，各々引例として本明細書に組み込まれている）。このように、ＢＲＳＶ特異性を有するＮＳ１及びＮＳ２遺伝子をワクチンウイルスに含めることが、ウシ細胞においてその増殖を改良することになるが、霊長類の細胞における及びヒトワクチンにおける増殖に関して、弱毒化を起こす変異になる。
【０２６４】
逆に、ＨＲＳＶ特異性を有するＮＳｌ及びＮＳ２遺伝子が、ヒト細胞におけるワクチンウイルスの増殖を改良する道を提供する。これにより、ワクチンウイルスの増殖特質及び反応誘発性を操作する新しい方法が提供される。また別のウイルスでは、ＨＲＳＶ特異性を有する細胞膜関連遺伝子、すなわち、Ｍ、ＳＨ、Ｇ及びＦの完全な型が、ＢＲＳＶ骨格に配置された。
【０２６５】
このウイルス粒子のあらゆるタンパク質が、遺伝子発現時、ゲノム複製時、及びビリオン増殖時に、あらゆる形で相互に作用すると考えられているから、多様な組換え体を作製する能力により、ワクチン候補に関する豊富な情報資源が提供される。
【０２６６】
最後に、さらに別の典型的なウイルスパネルには、遺伝子配列を変化させずに置換された遺伝子の例、置換されたウイルスの遺伝子配列が修飾されていた他の例、さらにＢＲＳＶ骨格に関して他の例では配列を変化させたことに反して、置換された遺伝子は、配列を変化させなかった例が含まれていた。このように、このパネルによりｃＤＮＡからのウイルスを、多様なキメラウイルスを作製するために、さらに修飾された望ましい生物学的特質を有する増殖可能なウイルスを回収するために、操作する能力を測る厳しい検査が提供された。
【０２６７】
ｒＢＲＳＶ骨格のＮＳ１及びＮＳ２遺伝子を、取り除き、ＨＲＳＶのＮＳ１及びＮＳ２遺伝子及び置換されたＢＲＳＶ／ＨＲＳＶキメラウイルスが、構成され、ｒＢＲＳＶ／Ａ２−ＮＳｌ＋２と呼ばれるウイルスを作製した（図１０、上から２つ目の構成図）。この構成の骨格が、ユニークなＮｏｔｌ、Ｋｐｎｌ、Ｓａｌｌ及びＸｈｏｌ部位（図ｌＯ、最上の構成に図解される）を含むように修飾されたｒＢＲＳＶアンチゲノムｃＤＮＡであった（先に詳しく記載されている）（Ｂｕｃｈｈｏｌｚ，ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、７３：２５１−９、１９９９、Ｂｕｃｈｈｏｌｚ，ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、７４：１１８７−１１９９、２０００、各々引例として本明細書に組み込まれている）。ＨＲＳＶのＮＳ１及びＮＳ２コード配列を、ＰＣＲ法により、完全なＨＲＳＶアンチゲノム配列の７５からｌ０３６に及び、ＨＲＳＶのＮＳ１ ＯＲＦ、ＮＳ１／ＮＳ２遺伝子間結合、及びＮＳ２ ０ＲＦを含む単一断片として増幅させた。この断片の上流末端はまた、Ｎｏｔｌ部位をＨＲＳＶ配列の直前に付加しており、さらにＢｌｐｌ部位をＨＲＳＶ位置９１にあるＮＳ１０ＲＦの非翻訳配列上流に付加している。ｐＣＲｃＤＮＡの下流末端には、Ｋｐｎｌ部位が含まれており、その直前にＨＲＳＶ配列があった。
【０２６８】
このＰＣＲ生成物をクローンして、その配列が確認された。それが、Ｎｏｔｌ−Ｋｐｎｌ断片として対応するｒＢＲＳＶ骨格のウィンドウに挿入された。
【０２６９】
ＲＢＲＳＶにおける以下４つの遺伝子ＮＳ１、ＮＳ２、Ｇ及びＦを、そのＨＲＳＶ対応遺伝子に置換し、さらに別のＢＲＳＶ／ＨＲＳＶキメラウイルスを作製した。このウイルスは、ｒＢＲＳＶ／Ａ２−ＮＳ１＋２ＧＦと名称が与えられている（図１０、上から３つ目の構成）。この構成が、ｒＢＲＳＶ／Ａ２−ＮＳ１＋２及び先に説明されたｒＢＲＳＶ／Ａ２からの断片を組み合わせることにより作製され（参照：図７及び８；米国特許出願番号０９／６０２，２１２、Ｂｕｃｈｈｏｌｚ、ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７４：１１８７−１１９９、２０００、各々引例として本明細書に組み込まれている）、本明細書においては任意にｒＢＲＳＶ／Ａ２−ＧＦと称す。具体的には、双方の構成がともに、先導部領域のプラスミド配列上流にＸｍａｌ部位、及び図１０に図解されるＫｐｎｌ部位を有する。
【０２７０】
ｒＢＲＳＶ／Ａ２−ＮＳ１＋２のＸｍａＩ−Ｋｐｎｌ断片を、ｒＢＲＳＶ／Ａ２−ＧＦプラスミドの対応するウィンドウに変位した。ｒＢＲＳＶの次の４遺伝子Ｍ、ＳＨ、Ｇ及びＦそ、そのＨＲＳＶ対応遺伝子に置換し、また別のＢＲＳＶ／ＨＲＳＶキメラウイルスを作製した。このウイルスは、ｒＢＲＳＶ／Ａ２−ＭＳＨＧＦと名称が与えられている（図１０、上から４つ目の構成）。これには、Ｐ−Ｍ遺伝子間領域にＭｌｕＩ部位を加えたｒＢＲＳＶ骨格が含まれていた（図９参照）。このように、図９に示されるように、挿入ＨＲＳＶ配列が、その上流及び下流境界として、Ｍｌｕｌ及びＸｈｏｌ位置を有していた。Ｍｌｕｌ及びＸｈｏｌ部位に囲まれているＨＲＳＶのＭ−ＳＨ−Ｇ−Ｆ配列を有するこのＨＲＳＶ挿入が、ＰＣＲ法により作製され、その結果として作製される生成物がクローンされ、その配列が確認された。Ｍｌｕｌ−Ｘｈｏｌ断片を、その後、ｒＢＲＳＶ骨格の対応ウィンドウにクローンした。
【０２７１】
Ｇ及びＦ遺伝子がそのＨＲＳＶ対応遺伝子と置き換えられ、それらの置換対応遺伝子がｒＢＲＳＶ骨格にある第３位及び第４位に配列されたまた別のＢＲＳＶ／ＨＲＳＶキメラウイルスが作製された。このウイルスは、ｒＢＲＳＶ／Ａ２−Ｇ３Ｆ４と名称が与えられた（図１０、上から５つ目の構成）。この構成には、ＰＣＲ法が使用され、ＨＲＳＶＧ及びＦＯＲＦｓを増幅した。このＰＣＲプライマーは、上流末端Ｇに次の特徴を付加するように設計した：Ｋｐｎｌ部位１０１個、ＢＲＳＶ遺伝子末端シグナル（５’−ＡＧＴＴＡＴＴＴＡＡＡＡＡ）及び３ｎｔ遺伝子間配列（ＣＡＴ）、この後にＨＲＳＶＧ及びＦ遺伝子が続いた。この増幅された断片の下流末端が、ＨＲＳＶのＦ遺伝子の下流非翻訳領域、ＨＲＳＶアンチゲノム位置７４２０で終了し、この後に付加されたＫｐｎＩ部位が続いた。ＰＣＲ産生物をクローン化し、その配列を確認した。ＨＲＳＶＧ及びＦ配列を有するＫｐｎＩ断片を、その後、ｒＢＲＳＶｃＤＮＡ（図６、パネルＢに示されるように、Ｇ及びＦ遺伝子を欠損する）のＫｐｎＩ部位にクローン化した。正しい配向の挿入を含む組換え体を、制限分析により同定した。
【０２７２】
次の遺伝子（ＮＳ１、ＮＳ２、Ｇ及びＦ）を、ｒＢＲＳＶ骨格におけるプロモータ隣接のＧ及びＦ遺伝子にて置換し、そして別のＢＲＳＶ／ＨＲＳＶキメラウイルスを作製した。この構成は、Ｈｅｘ、又はｒＢＲＳＶ／Ａ２−ＧｌＦ２ＮＳ３ＮＳ４と名称が与えられている（図１０、最下の構成）。このキメラが、ｒＢＲＳＶ／Ａ２−ＮＳｌ＋２を修飾して、ＢＲＳＶＧ及びＦ遺伝子をそのＨＲＳＶ対応遺伝子により、第１及び第２の位置で置換して作製された。これは、ｒＢＲＳＶ／Ａ２−ＧｌＦ２の構成についての上記の説明と同じで方法ある（実施例ＩＩＩ、図６、パネルＢ）。具体的には、上記のように、ＢＲＳＶＧ及びＦ遺伝子を、ｒＢＲＳＶ／Ａ２−ＮＳｌ＋２アンチゲノムｃＤＮＡからＳａｌＩ及びＸｈｏＩ部位の消化により切除した（実施例ＩＩＩ）。
【０２７３】
次いで、上記のように（実施例ＩＩＩ、図６、パネルＢ）ＨＲＳＶＧ及びＦ遺伝子を含むＮｏｔＩ断片を、ｒＢＲＳＶ／Ａ２−ＮＳｌ＋２アンチゲノムｃＤＮＡのＮＳ１非コード領域にあるＨＲＳＶ配列の直前に位置する単数のＮｏｔＩ部位にクローンした。正しい配向の挿入を含む組換え体が、制限分析により同定された。
【０２７４】
上記に一覧に示されるウイルスが、それぞれ容易にｃＤＮＡから回収され、現在まで設計したウイルスにて回収不能であったものはない。新しいｒＢＲＳＶ／Ａ２−Ｇ３Ｆ４及びＨＥｘウイルスを、以前の研究で検査してｒＢＲＳＶ／Ａ２−ＧＦ及びｒＢＲＳＶ／Ａ２−ＧＦウイルスと、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける増殖の効率性について、比較された（先記のように、先の実施例では最後のウイルスをｒＢＲＳＶ／Ａ２と称したが、ここでは新しい構成と明確に比較できるように改名した）。ベロ細胞の単一層培養物を、感染多重度０．１にて感染させ３７℃にてインキュベートした。培養液分取を図１１に示される時刻において採取し、ウイルス毒性力を、プラークアッセイにより測定した。これらの条件下で、ＢＲＳＶがＨＲＳＶに比べて、やや低い効率で複製し、霊長類の細胞におけるそのホスト範囲制限特質を反映していた。図１１の最上パネルに示されるように、ｒＢＲＳＶ／Ａ２−Ｇ３Ｆ４が、他のキメラウイルス及びｒＢＲＳＶに比較して、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの増殖における改良傾向を呈した。実際、その増殖効率が、組換えＨＲＳＶ（ｒＡ２）に類似していた。このように、ｒＢＲＳＶウイルスの増殖が、ＢＲＳＶＧ及びＦ遺伝子をＨＲＳＶ対応遺伝子で置換することにより改良され（ｒＢＲＳＶ／Ａ２−ＧＦにあるように）、また、ＨＲＳＶ遺伝子をプロモータへ隣接して配列することによりさらに改良され（ｒＢＲＳＶ／Ａ２−ＧｌＦ２にあるように）、またＨＲＳＶＧ及びＦ遺伝子を位置３及び４に配置することにより、さらに再改良された（ｒＢＲＳＶ／Ａ２−Ｇ３Ｆ４にあるように）。これらの結果により、ウイルス遺伝子のからの順位を操作することにより、どのようにして体系的に本発明の特質を調整できるかを示している。
【０２７５】
ＨＥｘウイルスを、同様にして評価した（図１１、最下のパネル）。このウイルスの増殖がｒＢＲＳＶ及びｒＡ２の増殖の中間であることから、これらの４つの遺伝子の置換がｉｎ ｖｉｔｒｏでの複製の健全性を保持し、実際はそのｒＢＲＳＶ親の複製を凌いだことがわかった。ベロ細胞が１型インターフェロンに対する構造的遺伝子を欠損しているため、インターフェロン特異性の効果が評価できないということに留意されたい。これに反して、ベロ細胞が、大規模なワクチン増殖のための有用な基質であり、これらの細胞における効率の良い増殖が、ワクチンウイルスのために重要な特徴である。
【０２７６】
ｒＢＲＳＶ／ＨＲＳＶキメラウイルスのパネルが、ＨＥｐ−２及びＭＤＢＫ細胞におけるプラークサイズによる増殖効率についてさらに評価した。これらの細胞は、前者がヒトからであり、後者がウシからである（図１２、それぞれ、最上及び最下のパネル）。この比較にはまた、先に述べた実施例にて説明されたキメラウイルス、すなわち、ｒＢＲＳＶ／Ａ２−ＧＦ（先には、ｒＢＲＳＶ／Ａ２と呼ばれた）、ｒＢＲＳＶ／Ａ２−ＭＧＦ、及びｒＢＲＳＶ−ＧｌＦ２をも含む。ＨＥｐ−２細胞において、ｒＨＲＳＶはｒＢＲＳＶに比べてより大型のプラークを生成したが、これはホスト範囲の制限と一致する（図１２，最上パネル）。まずこの論議において、ＮＳ１及びＮＳ２遺伝子が、ＢＲＳＶからのままであるウイルスを考慮する。このグループでは、ｒＢＲＳＶ／Ａ２−Ｇ３Ｆ４、ｒＢＲＳＶ／Ａ２−ＧｌＦ２及びｒＢＲＳＶ／Ａ２−ＧＦウイルスが、ＨＲＳＶとＢＲＳＶの中間サイズのプラークを形成し、プラークサイズが、上記の順位にて減少した。これは、増殖反応速度データと完全に一致し、ＨＲＳＶＧ及びＦ遺伝子をｒＢＲＳＶ骨格に導入することにより、ＨＥｐ−２細胞におけるその増殖を改良し、これらの遺伝子の位置を修飾することによって、さらなる改良が得られるということを確認した。ｒＢＲＳＶ／Ａ２−ＭＧＦ及びｒＢＲＳＶ／Ａ２−ＭＳＨＧＦウイルスが、ｒＢＲＳＶのプラークより小型のプラークを形成した。この実施例により、これらのウイルスが回収及び操作可能であることがわかるが、それらの増殖特質の完全な特徴付けを決定するためには、さらにｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏにおいて特徴付けが必要である。
【０２７７】
ＮＳ１及びＮＳ２遺伝子がＨＲＳＶからであるこれらのウイルスのＨＥｐ−２細胞における増殖をまた検査した。具体的には、ＮＳｌ及びＮＳ２遺伝子のから資源以外は同一であるウイルスの対が比較された。それぞれの対にＨＲＳＶのＮＳｌ及びＮＳ２遺伝子を有するウイルスが、それぞれ対、すなわちｒＢＲＳＶ対ｒＢＲＳＶ／Ａ２−ＮＳ１＋２；ｒＢＲＳＶ／Ａ２−ＧＦ対ｒＢＲＳＶ／Ａ２−ＮＳｌ＋２ＧＦ；ｒＢＲＳＶ／Ａ２−ＧｌＦ２対Ｈｅｘである順序にして、これらの対が順次列挙される。各々の事例において、ＨＲＳＶからのＮＳｌ及びＮＳ２遺伝子があることにより、プラークサイズが大型化し、これによりホスト範囲制限の調整が示された。このことから、ＮＳ１及びＮＳ２遺伝子からの資源が、ＨＲＳＶワクチンの増殖特質を予期的に調整する方法としてどのように選択されるかを示している。この例では、２つの遺伝子が対として操作されたが、本明細書に記載されている知識に従って、単独で操作されることも当然可能である。
【０２７８】
ＭＤＢＫウシ細胞におけるこれらのウイルスの特徴が、図１２、最下のパネルに示される。これらの細胞におけるホスト範囲制限特質が、上記のＨＥｐ−２細胞における比較と比べて逆になっており、ＢＲＳＶがＨＲＳＶに比べてより大型のプラークを形成した。ｒＢＲＳＶ骨格にＨＲＳＶＧ及びＦ遺伝子があることにより、増殖に大きな影響はもたらされなかったが、ＨＲＳＶからのＮＳ１とＮＳ２遺伝子の存在により、ウイルスは弱毒化された。その理由は、これらのＨＲＳＶからのインターフェロン拮抗体のウシ細胞における作用の効率が低い可能性がる。ウシの細胞及びウシのホストが、これらの候補ＨＲＳＶワクチンの重要なターゲットではないため、ＭＤＢＫ細胞に関するこれらの知見は主として、これらのタンパク質の機能及び増殖に対する影響について、より明確に理解するためのものである。
【０２７９】
要約すれば、上記の例は、広範囲の望ましい増殖特質を呈する組換えＨＲＳＶワクチン候補のパネルが、どのようにして容易に作製され得るかを示している。本発明の方法にるワクチン候補の最適化を導く水準点が、選択された候補の臨床評価により提供される。以前の研究によると、ｒＢＲＳＶ及びそのｒＢＲＳＶ／Ａ２−ＧＦ誘導体は、後者のウイルスがｒＢＲＳＶの改良種であるにもかかわらず、チンパンジーにおいて過剰に弱毒化された（Ｂｕｃｈｈｏｌｚ，ｅｔ ａｌ．， Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７４：１１８７−１１９９，２０００、引例として本明細書に組み込まれている）。このように、本発明で得られた増殖に関して優良種と交配することによって得られたさらなる改良種が、ＲＳＶワクチン組換え体の最適化を目指す実質的進歩を表わすものである。
【０２８０】
実施例Ｖ１
ＨＲＳＶ又はＢＲＳＶからのＮＳｌ及びＮＳ２タンパク質を伴うＢＲＳＶ骨格にＮおよぴ／またはＰ遺伝子を置換することを含む付加的ＢＲＳＶ／ＨＲＳＶキメラウイルスの構成及び回収
ヒトパラインフルエンザ３型ウイルス（ＨＰＩＶ３）が、霊長類においてホスト範囲制限を呈するウシの対応ウイルス（ＢＰＩＶ３）を持ち、従って、ＨＰＩＶ３／ＢＰＩＶ３キメラウイルスに基づく弱毒化されたＨＰＩＶ３ワクチンを開発する基盤を提供している。１つの有望なキメラは、Ｎ ＯＲＦがそのＢＰＩＶ３対応物と置換されるＨＰＩＶ３骨格から成る。驚くべきことに、このキメラウイルスが、細胞培養にて効率的に複製し、霊長類において弱毒化表現型を呈する（Ｂａｉｌｌｙ，ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７４：３１８８−９５、２０００、引例として本明細書に組み込まれている）。
【０２８１】
本実施例では、個々のＢＲＳＶ遺伝子が、そのＨＲＳＶ対応遺伝子と置換可能であるか否かを判断するために研究が行なわれている。具体的には、Ｎ遺伝子及びＰ遺伝子を個別に置換した（図１３Ａ）。これら２つの遺伝子が同時に置換可能であるか否かを判断するために、さらに研究が行なわれた。最後に、遺伝子置換がまたＨＲＳＶのＮＳ１及びＮＳ２遺伝子を含む骨格でも行うことが可能であるか否かを判断するために、さらに研究が行なわれた（図１３Ｂ）。
【０２８２】
これらの置換は、ＢＲＳＶのＧ及びＦ遺伝子を有するｒＢＲＳＶ骨格で行なわれたことに留意されたい。最適なＨＲＳＶワクチンを作成するには、本書で上述してきた指導的内容に従って、これらの遺伝子をそのＨＲＳＶ対応遺伝子と置換し、自然状態での遺伝子順位の位置又は他の位置に挿入する。本発明には、そのような置換が容易に作製でき、実際にほとんどの場合において増殖特質を改良させることが可能であることが記載されている。
【０２８３】
ＢＲＳＶのＮコード配列がＨＲＳＶのそれと置換されたＢＲＳＶ／ＨＲＳＶキメラが、構成された。このキメラは、ｒＢＲＳＶ／Ａ２−Ｎと名称が与えられている（図１３Ａ）。この構成のために、Ｎ ＯＲＦ最後の３コドン内に位置する、ｎｔ２３０５−２３１０にあるｒＢＲＳＶのＮ遺伝子に、ＡａｔＩＩ部位が作製された。この置換は、アミノ酸レベルでは、サイレントであった。同一部位を、ＨＲＳＶアンチゲノムｃＤＮＡのＨＲＳＶのＮ ＯＲＦに作製した。さらに、このＨＲＳＶアンチゲノムｃＤＮＡを、ＮＳ２の下流非翻訳領域のアンチゲノムｎｔ１０３７−１０４２がＫｐｎ Ｉ部位に変更されるように、修飾した。Ｋｐｎ Ｉ−Ａａｔ ＩＩ ＨＲＳＶ断片を、Ｎ ＯＲＦのほとんどを変位させながらｒＢＲＳＶのその対応ウィンドウにクローンした。ＢＲＳＶとＨＲＳＶのＮ ＯＲＦの最終コドンが、同一のアミノ酸コード割当を有しているため、残りのＢＲＳＶのＮ ＯＲＦの数少ないｎｔが、完全なＨＲＳＶのＮタンパク質をコードするために影響している。
【０２８４】
ＢＲＳＶ Ｐ遺伝子がそのＨＲＳＶ対応遺伝子と置換されたＢＲＳＶ／ＨＲＳＶキメラが、構成された。このキメラは、ｒＢＲＳＶ／Ａ２−Ｐと名称が与えられている（図１３Ａ）。これには、上記のＡａｔ ＩＩ部位、さらに先に説明されたＭｌｕ Ｉ部位を用いた（図９参照）。このＨＲＳＶ断片を、ｒＢＲＳＶのその対応ウィンドウ変位させることにより、完全なＰ遺伝子を変位させた。上記のように、この断片に変位された少数のＮ ＯＲＦｎｔが、ＢＲＳＶ及びＨＲＳＶにおいて、同一のコード配分を有する。
【０２８５】
上記のＨＲＳＶのＮ及びＰ配列をｒＢＲＳＶに変位したＢＲＳＶ／ＨＲＳＶキメラが構成され、ｒＢＲＳＶ／Ａ２−ＮＰが作製された（図１３Ａ）。このキメラには、上記のＫｐｎＩ及びＭｌｕＩ部位を用いた。
【０２８６】
同一の変位が、ＨＲＳＶのＮＳ１及びＮＳ２遺伝子を含むｒＢＲＳＶ骨格（すなわち、上記の例で記載されているｒＢＲＳＶ／Ａ２−ＮＳ１＋２骨格）に導入された。この変位により、結果として、ｒＢＲＳＶ／Ａ２−ＮＳｌ＋２Ｎ、ｒＢＲＳＶ／Ａ２−ＮＳ１＋２Ｐ、及びｒＢＲＳＶ／Ａ２−ＮＳ１＋２ＮＰが作製された（図１３Ｂ）。上記の組換えウイルスを、ぞれぞれｃＤＮＡから容易に回収した。ｒＢＲＳＶ／Ａ２−Ｐウイルスを、ＭＤＢＫ細胞において野生型ｒＢＲＳＶと同等に複製したがｒＢＲＳＶ／Ａ２−Ｎの複製は約１０倍低く、さらにｒＢＲＳＶ／Ａ２−ＮＰウイルスの複製が、これら２つのウイルスの中間であった。このように、あらゆる増殖特質が得られた。
【０２８７】
上記の方法に従って、これらのウイルスが、ＨＲＳＶ Ｇ及びＦ遺伝子を有するように修飾することができる。加えて、同等の遺伝子置換をｒＨＲＳＶ骨格に導入することができる。すなわち、ＨＲＳＶのＮ及び／又はＰ遺伝子を、そのＢＲＳＶ対応遺伝子と置換することができる。ＮＳｌ及びＮＳ２遺伝子の置換の状況でこれらの置換を行う能力は、最適レベルのｉｎ  ｖｉｔｒｏワクチンの生成、及びワクチン接種を受ける患者における弱毒化と免疫原性を得ることに対しさらに柔軟性をもたらされる。
【０２８８】
上記の例に示されるように、遺伝子位置を，変位したＲＳＶにて変位される遺伝子を選択し、その結果、ＲＳＶ構造／機能に関して利用できる知識に基づいて、機能的にまた構造的に相互作用し易いようにできる。これらの遺伝子位置を変位したＲＳＶ内での変更及び他の修飾は、相互作用するタンパク質（例えば、Ｎ、Ｐヌクレオキャプシドタンパク質、Ｍ、ＳＨ、Ｆ及びＧエンベロープタンパク質、及びＭ２−１、Ｍ２−２及びＬポリメラーゼ組成物）はゲノムにおいて並列されるという事実により、さらに簡素化される。このように、本発明によるさらなる候補ワクチン菌株が、例えば、２又はそれ以上の並列された遺伝子を組み込むことにより得られる。このような並列遺伝子の例には、Ｎ及びＰから選択された遺伝子、Ｍ、ＳＨ、Ｆ及びＧエンベロープ遺伝子の２又はそれ以上、又はＭ２−１、Ｍ２−２及びＬ遺伝子の２又はそれ以上あり、これらを共に異種性の挿入又は置換の単位として、レシピエント又は背景のゲノム又はアンチゲノムに組み込むことができる。
【０２８９】
例えば、Ｍ及びＳＨ遺伝子を共に、ｒＢＲＳＶ／Ａ２において、そのＨＲＳＶ対応遺伝子と置換することができる。これにより、ウイルスのエンベロープタンパク質（Ｇ、Ｆ、ＳＨ及びＭ）が全てＨＲＳＶからで、内部タンパク質がＢＲＳＶからであるウイルスが作製される。この工程の後に、必要に応じて、また別のＢＲＳＶ遺伝子を、そのヒト対応遺伝子（例えば、ＮとＰの対、ＮＳｌとＮＳ２の対、及びＭ２−１、Ｍ２−２とＬのグループ）と置換してもよい。各々の遺伝子の対を並列させることにより、置換が簡素化される。また同時に、個々のＢＲＳＶ遺伝子をＨＲＳＶの挿入し、ＨＲＳＶのＧ及びＦ遺伝子抗原決定基をそのまま残すという逆のアプローチを取ることによっても、本発明の望ましいワクチンを作成することができる。例えば、ヒトＲＳＶのＮ、Ｐ、Ｍ２−１及びＭ遺伝子の１又はそれ以上は、個別にそのウシ対応遺伝子と置換することができる。回収された組換えウイルスを、その後本発明で例示されるように、弱毒化表現型にて、細胞培養、げっ歯類、及び非ヒト霊長類において評価した。このように本発明は、あらゆる対象における治療及び予防を目的とした弱毒化及び感染保護の望ましいレベルを有するヒトウシキメラＲＳＶワクチンウイルス侯補の同定法を提供している。
【０２９０】
実施例  ＶＩＩ
一部遺伝子を欠失したＲＳＶワクチンウイルスのｉｎ  ｖｉｔｒｏでの改良された複製
上記の説明によると、ＲＳＶのｉｎ ｖｉｔｒｏにおける複製の効率が、ゲノムのヌクレオチド長における変化の影響を受け易いということがわかっている。ヌクレオチド長の増幅に関しては、組換えＲＳＶの増殖表現型を調整するある型の修飾に、外来遺伝子をコードする付加的な遺伝子の挿入が含むことができる。例えば、細菌性クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、蛍光ルシフェラーゼ、マウスインターフェロンガンマ（ＩＦＮｇ）、マウスインターロイキン２（ＩＬ−２）、及びマウス穎粒球・マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）のコードする配列が、これまで個別にＧ−Ｆ遺伝子間領域に挿入されてきた。これらの挿入の各々に、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのウイルス増殖の効率を下げる効果が見られた。一事例においては、約０．７６ｋｂのＣＡＴ転写カセットを、Ｇ−Ｆ遺伝子間領域に挿入することにより、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのウイルス増殖が２０分の一に下がった。リンフォカインが、マウスからにてヒトからのＨＥｐ−２細胞にて活性を有するとは予測されていなかった。また、同等のサイズのあらゆる挿入に、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＲＳＶ増殖の効率を下げる同等の規模の効果が見られた。これらの研究で報告される抑制効果が、あらゆるコードされた外来タンパク質の発現に原因があるためはなく、配列を付加すること自体に原因がある可能性がある。
【０２９１】
１．７５ｋｂのルシフェラーゼカセットをこの同一の遺伝子間領域に挿入することにより、ウイルス複製に遥に強い抑制効果が得られた（５０分の一を越える減少）。これは、挿入が大きいほど、強い抑制効果が得られることを示唆している。一方では、この効果はまたゲノム内の挿入位置に依る可能性もあるという根拠もあった。例えば、０．８ｋｂの転写カセットをＮＳｌ遺伝子の非コード領域に挿入し、プロモータ隣接に配列すると、ウイルス増殖への抑制効果は非常に微弱であった（Ｈａｌｌａｋ、ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７４：１０５０８−１３、２０００、引例として本明細書に組み込まれている）。観察された効果が、ヌクレオチド長の増加に依るのか、選択肢として別のｍＲＮＡコードユニットの付加に依るのか、選択肢としてその双方に依るのかは、依然として定かではない。
【０２９２】
他の例においては、組換えＲＳＶのｎｔ長の増幅が、単一の遺伝子間領域で行われた。現在までに分析された自然状態で発生するＲＳＶ遺伝子間領域は、１から５６ｎｔの長さである。ＳＨ遺伝子を欠損する組換えウイルスでは、Ｍ−ＳＨ遺伝子間領域が最大限で１６０ｎｔ増幅され、増殖への抑制効果は微弱であった。
【０２９３】
さらにまた別の例では、ＲＳＶゲノムが減じられ、ウイルス表現型に望ましい効果をもたらしている。優れた実施例では、ＮＳｌ、ＮＳ２、ＳＨ、Ｇ及びＭ２−２の組みから１つまたはそれ以上の遺伝子が、単独で又はある種の組み合わせで、ウイルスの感染性を奪うことなく、欠失された。欠失により、結果としてそれぞれの欠失されたタンパク質の発現が喪失され、さらに殆どの場合において、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏでのウイルス増殖の効率が低下している。唯一の例外は、ＳＨ欠損ウイルスの増殖がｉｎ  ｖｉｔｒｏで低下せず、ある細胞ラインにおいて微弱ながら向上したということである。ＲＳＶ菌株Ａ２とＢ１の間に作製されたキメラウイルスの構成に関するまた別の例においては、ＧとＦ遺伝子間の遺伝子間領域が５２ｎｔから５ｎｔまで、短縮された（参照例Ｗｉｔｅｈｅａｄ，ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７３：９７７３−８０、１９９９、引例として本明細書に組み込まれている）。
【０２９４】
多くの先行文献が、遺伝子又は遺伝子間配列の欠失を含む組換えＲＳＶの作製について論じている（Ｂｅｒｍｉｎｇｈａｍ ａｎｄ Ｃｏｌｌｉｎｓ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、９６：１１２５９−６４、１９９９、Ｂｕｋｒｅｙｅｖ、ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、７１：８９７３−８２，１９９７、Ｊｉｎ、ｅｔ ａｌ．、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、２７３：２１０−８、２０００、Ｊｉｎ，ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７４：７４−８２、２０００、Ｔｅｎｇ ａｎｄ Ｃｏｌｌｉｎｓ、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７３：４６６−４７３、１９９９、Ｔｅｎｇ，ｅｔ ａｌ．、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、２０００，Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ、ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７３：３４３８−４２、１９９９、各々引例として本明細書に組み込まれている）。しかし、各々の事例において、欠失がオープンリーデングフレーム又は他の重要なゲノム特徴の修飾を伴っているため、ウイルス表現型に対するヌクレオチド欠失の効果が不確かなものとなった。
【０２９５】
本実施例では、ＳＨ遺伝子の下流非コード領域から配列を除去することによりＲＳＶゲノム長を減じることの効果が例示されている。この典型的な部分的な遺伝子欠失（図１４に略図で示される）が、ＸｍａＩ部位をＧ−Ｆ遺伝子間領域に含むアンチゲノムｃＤＮＡのバージョンを使って構成されたが、その変化自体がコードされたウイルスの影響を及ぼすと予測されていなかった。
【０２９６】
ＳＨ ＯＲＦの末端からＳＨ遺伝子終了シグナルまで及ぶ１４１−ｂｐＸｈｏＩ−ＰａｃＩウィンドウが、次の２のヌクレオチドから形成された合成ＤＮＡと置換された。すなわち、ＴｃＧＡＧＴｔＡＡｔＡＣｔＴｇａＴＡＡＡＧＴＡＧＴＴＡＡＴ（配列ＩＤ番号：７）及びＴＡＡＣＴＡＣＴＴＴＡｔｃＡａＧＴａＴＴａＡｃ（配列ＩＤ番号：８）（ｘｈｏＩ及びＰａｃＩ制限部位の部分は太字で、ＳＨオープンリーデングフレーム及び終止コドンのヌクレオチドは下線で、またサイレントヌクレオチド変化は小文字で、表示される）。ＲＳＶ／６１２０と名称が与えられたコードされたウイルスには、ＳＨ ＯＲＦの最後の３コドン及び終止コドンにサイレントヌクレオチド置換があり、さらにＳＨ下流非翻訳領域から１１２のヌクレオチドが欠失されるが（組換えアンチゲノム内の位置４４９９−４６１０）、遺伝子終了シグナルはそのまま残った（Ｂｕｋｒｅｙｅｖ、ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７０：６６３４−４１、１９９６、引例として本明細書に組み込まれている）（図１４）。これらの点変異及び１１２−ｎｔ欠失により、いかなるウイルスタンパク質のコードされたアミノ酸も修飾されず、いかなる既知のウイルスＲＮＡシグナルも修飾されず、さらにコードされたｍＲＮＡｓの数も修飾されなかった。
【０２９７】
ＳＨ遺伝子の末端における非コード変更が行なわれたのは、この領域が細菌での増殖段階における不安定さに影響されやすいからである。実際、これらの変更は、結果として、細菌での安定性を著しく向上させた。この特質は、アンチゲノムプラスミドの操作及び増殖に重要である。このように、ＲＳＶ／６１２０は、コードされたタンパク質、ＲＮＡシグナル、又はコードされたｍＲＮＡｓ内の変更が引き起こす二次的及び三次的な効果を混同せずに、ゲノム配列を欠失する効果を調べる機会を提供している。ＳＨ ＯＲＦの最終いくつかのコドンに作製された５つの点変異が、コードウイルスの生物学的特質に影響を及ぼさないとなると予測される。これは、マーカとして組換えＲＳＶ及びヒトとウシのパラインフルエンザウイルス３型などのあらゆる遺伝子（生物学的な特質の著しい変化に関連していないもの）に導入された点変異の研究により証拠付けられている（Ｃｏｌｌｉｎｓ，ｅｔ ａｌ．、Ａｄｖ．Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓ．、５４：４２３−５１、１９９９、Ｓｃｈｍｉｄｔ、ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７４：８９２２−９、２０００、Ｓｃｈｍｉｄｔ、ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７５：４５９４−６０３、２００１、Ｓｋｌａｄｏｐｏｕｌｏｓ、ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：１７６２−８、１９９８、Ｓｋｌａｄｏｐｏｕｌｏｓ、ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７３：１３７４−８１、１９９９、Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ、ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：４４６７−４４７１、１９９８、Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ、ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７３：８７１−７、１９９９、各々引例として本明細書に組み込まれている）。
【０２９８】
６１２０ウイルスを、多段階の増殖の効率について、別個の感染事例３１０組において、その全長の対応ウイルスであるＤ５３と比較分析した（図１５Ａ、１５Ｂ及び１５Ｃ）。図に示されるように、６１２０ウイルスのピーク力価は、増殖において、Ｄ５３ウイルスのそれに比べて、１．５から２倍の率で高かった。このように、ＳＨ遺伝子に加えられた修飾、特に１１２−ｎｔヌクレオチドの欠失（ゲノム長の０．７％にあたる）が、結果として、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの増殖効率に実質的な向上をもたらした。Ｉｎ ｖｉｔｙｏでの増殖効率における向上が、いかなるものであっても、ＲＳＶワクチン作製には有利である。これは、ＲＳＶの特徴である比較的弱い増殖が、ワクチン開発にとって重要な問題であり、ワクチン作成上の困難となることが予測されるからである。
【０２９９】
本発明で記載されている特定の定義された修飾が、組換えワクチンウイルスの増殖及び他の表現型特徴を最適化するために、多様な状況に応用することができる一般的なツールとなる。本発明の知見に基づいて、ＲＳＶの１５．２ｋｂのゲノムが、部分的な遺伝子欠失又は他のヌクレオチド欠失による修飾のためのターゲット部位の多くの組み合わせ材料を提供している。一般的に、この点に関して選択される変化には、１１個のウイルスＯＲＦｓ及びその翻訳開始部位が含まれない（参照例Ｋｏｚａｋ、Ｇｅｎｅ、２３４：１８７−２０８、１９９９、引例として本明細書に組み込まれている）。ウイルスＯＲＦｓはゲノムの９０％以上を占めるから、部分的欠失修飾のためのターゲット部位の一般的な選択は、残りの部分、つまり非翻訳領域（非コード領域とも呼ばれる）にて行なわれる。加えて、この点に関するヌクレオチド欠失のためのターゲット部位が、通常、シス作用性複製及び翻訳シグナルを除外する。除外される部位には、それぞれの遺伝子を囲む１０−ｎｔ遺伝子開始及び１２−から１３−ｎｔ遺伝子終了シグナル（参照例：Ｃｏｌｌｉｎｓ、ｅｔ ａｌ．、Ｆｉｅｌｄｓ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、２：１３１３−１３５２、１９９６、引例として本明細書に組み込まれている）、さらにゲノムの３７末端にある１個の１１−ｎｔコアプロモータ、及びゲノムの５’末端にあるアンチゲノムプロモータの相補体がある。
【０３００】
本実施例は、予想に反して、ＲＳＶのｉｎ ｖｉｔｒｏにおける増殖効率が、非翻訳配列（例えば、ウイルスＯＲＦｓを囲む配列、又は遺伝子の間にある配列、又は遺伝子に続く配列、又は３’及び５遺伝子外領域にある配列）を変位させることにより、実質的に高められることができることを例示している。この実施例は、配列の欠失が小規模でも、ウイルス増殖を改良し得ることを例示している。Ｉｎ ｖｉｖｏでの増殖効率の改良は、大規模なワクチン開発及び病態的な症状生産を促進することから、これは非常に望ましい結果である。
【０３０１】
微生物の寄託に関する情報
以下に示す細胞及び細菌が、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ、Ｍａｎａｓｓａｓ、Ｖｉｒｇｉｎｉａ ２０１１０−２２０９に、ブタペスト条約に基づいて寄託されて、以下のように登録される。
【０３０２】
【表３】
2004515218.tif 000004
【０３０３】
理解を明確にするために、前記の本発明を、例示をもって詳細に記載してきたが、ある種の変化及び変更が、限定されない図示する方法により提示される添付の請求項の範囲内で実施できることが、当業者に対して明らかになろう。この状況において、あらゆる出版物、及び他の文献が、説明を省くため上記開示の範囲内にて引用される。これらの各文献が、あらゆる目的のためにその内容を引用として本明細書に組み込まれている。
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１  Ｇ遺伝子、又はＦ遺伝子、又はＧとＦ遺伝子双方の、ＲＳＶゲノム内のプロモータ隣接部位への変位を示している。略図の上部には、ＲＳＶゲノムから指定されたＢｌｐ／△ＳＨを示し、そのＳＨ遺伝子が、先に記載されたように欠失されており（Ｗｈｌｔｅｈｅａｄ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７３：３４３８−３４４２、１９９９、本明細書に引例として組み入れられている）、そしてＢｌｐＩ制限酵素部位がプロモータ隣接ＮＳ１遺伝子の上流の非コード領域に付加されていた。Ｍ遺伝子の遺伝子終了（ＧＥ）シグナルに星印を付け、先に記載の（Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７３：３４３８−３４４２、１９９９、引例として本明細書に組み入れられる）天然に生成するＳＨＧＥシグナルに同定するようにＳＨ遺伝子の欠失中に組み込まれている単一ヌクレオチドの変化を含むことを示している。略図における下方の２の囲み部分は、ゲノムＢｌｐ／△ＳＨの詳細な構成、及びゲノムＧｌ／△ＳＨ，Ｆ１／△ＳＨ及びＧｌＦ２／△ＳＨを生成するために、△ＳＨ／Ｂｌｐゲノムのプロモータ隣接末端に （左側の囲み）、及びＭ−Ｇ−Ｆ−Ｍ２領域に（右側の囲み）作成された修飾を示している。全ての操作は、ＲＳＶアンチゲノムＲＮＡのクローンｃＤＮＡ （Ｃｏｌｌｉｎｓ ｅｔ ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９２：１１５６３−１１５６７、１９９５、Ｃｏｌｌｉｎｓ ｅｔ ａｌ．、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２５９：２５１−２５５、１９９９、ａｎｄ Ｗｈｌｔｅｈｅａｄ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７３：３４３８−３４４２、１９９９、 引例として本明細書に組み入れ） を用いて行われ、そしてスクレオリドの位置が、野生型組換えＲＳＶ（ＳＨ遺伝子を含んでいる）（Ｃｏｌｌｉｎｓ ｅｔ．ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９２：１１５６３−１１５６７、１９９５、の完全なアンチゲノム配列に従ってコードが付される（ＳＨ遺伝子を含んでいる）（Ｃｏｌｌｉｎｓ ｅｔ．ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９２：１１５６３−１１５６７、１９９５、Ｍｕｒｐｈｙ ｅｔ ａｌ．、Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ 特許番号第５，９９３，８２４号、それぞれ引例として本明細書に組み入れられる）；それぞれ文献として本明細書に挿入される）の完全なアンチゲノム配列に従って数値付けされいる。なお「上流」及び「下流」とは、それぞれ、プロモータへ隣接、及びプロモータへ遠位な方向を示していることに留意されたい（前記プロモータが、ネガティブセンス・ゲノムＲＮＡの３’先導部であり、図１記載の左側末端部である）。
ゲノムＢｌｐ／△ＳＨ： ＲＳＶの上記ＳＨ欠失変異体 （Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７３：３４３８−３４４２、１９９９、引例として本明細書に組み入れられる）のヌクレオチド９２及び９７にて、Ｇ及びＡを（左側囲み部分の略図の上部において小文字により指示される）それぞれを、Ｃ及びＣ（太線の大文字）に変えることにより、ＮＳ１オープンリーデングフレーム（ＯＲＦ）のＡＴＧ翻訳開始コドン（斜体、太字）の前のＢｌｐＩ部位（下線付き）の１個のヌクレオチドを作製している。Ｂｌｐ／△ＳＨゲノムのＭ−Ｇ−Ｆ領域（右の囲み部分）が、ＳＨの欠失を示している（通常ＳＨ遺伝子がＭ遺伝子とＧ遺伝子の間にある）。
ゲノムＧ１／△ＳＨ：このゲノムは、プロモータ隣接し、ＢｌｐＩ部位に挿入されたＧ遺伝子を含む（左の囲み部分）。このＧのｃＤＮＡ挿入体が、以下のように構成され、すなわち、完全なＧのＯＲＦ及び下流のＧ非コード配列及びＧＥシグナル（ヌクレオチド４６９２から５５９６まで）を、後に６一ヌクレオチドＩＧ配列がこれらに続くように設計され（天然にて生成するＧ−ＦＩＧ配列の最初の６ヌクレオチド、ＣＡＴＡＴＴ（配列ＩＤ番号１）を表わしている）、続いてＮＳｌ遺伝子のＧＳシグナルにおけり１０ヌクレオチドのコピー（ボックス状に囲まれている）となるよう遺伝子操作される。このクローン化された配列が、ＢｌｐＩ部位にて側面に配置され、ゲノムＢｌｐ／△ＳＨのＢｌｐＩ部位にクローンされた。この操作により、ＧのＯＲＦを、ＲＳＶのＧＳ及びＧＥシグナルの制御下で、プロモータへ隣接した位置に配置した。同一のゲノムにおいて、Ｇ遺伝子が、Ｍ遺伝子とＦ遺伝子間の下流の位置から欠失され（欠失点は、大きな矢印により示される）、そしてＭとＦ遺伝子が、Ｇ−ＦＩＧ配列によりのみ分離された。
ゲノムＦ１／△ＳＨ：このゲノムは、プロモータ隣接位置に、ＢｌｐＩ部位に挿入されるＦ遺伝子を含む。このＦのｃＤＮＡ挿入体は、以下のように構成される、すなわち、完全なＦのＯＲＦ及び下流の非コード配列及びＧＥシグナル（ヌクレオチド５６６２から７５５１まで）を、６一ヌクレオチドのＩＧ配列（天然に形成するＦ−Ｍ２の１Ｇ配列の最初の６ヌクレオチド、ＣＡＣＡＡＴ（配列ＩＤ番号第２）を表わしている）、それに続きＮｓｌ遺伝子の１０ヌクレオチドのＧＳシグナルとなるように、遺伝子操作をする。このクローン化された配列を、ＢｌｐＩ部位にて側面に配列されて、ゲノムＢｌｐ／△ＳＨのＢｌｐＩ部位にクローン化された。この操作により、ＲＳＶのＧＳ及びＧＥシグナルの制御下で、プロモータ隣接位置にＦのＯＲＦを配置した。同一のゲノムにおいて、Ｆ遺伝子を、Ｇ遺伝子とＭ２遺伝子間の下流部位から欠失して（欠失点は、大きな矢印により示される）、そしてこれら２の遺伝子が、Ｆ−Ｍ２の１Ｇ配列によってのみ分離された。
ゲノムＧｌＦ２／△ＳＨ：このゲノムが、ＢｌｐＩ部位に１本鎖ｃＤＮＡとして挿入される第１及び第２のプロモータ隣接位置にそれぞれＧ及びＦ遺伝子を含んでいる。このＧ−ＦのｃＤＮＡの挿入には、完全なＧのＯＲＦ、その下流の非コード及びＧＥシグナル、Ｇ−ＦＩＧ配列、完全なＦ遺伝子、Ｆ−Ｍ２の１Ｇ配列の６ヌクレオチド（ＣＡＣＡＡＴ）（配列ＩＤ番号第２号）、及びＮＳｌのＧＳシグナル（上流から下流へ向かう順位で）を含むように構成される。このｃＤＮＡは、ＢｌｐＩ部位の側面に配列されて、ゲノムＢｌｐ／ΔＳＨのＢｌｐＩ部位にクローン化された。この操作により、プロモータへ対してそれぞれ位置１及び２へ、Ｇ及びＦ遺伝子を配置した。同一ゲノムにおいて、Ｇ及びＦ遺伝子を、Ｍ遺伝子とＭ２遺伝子問の下流の位置から欠失され（欠失点は、大きな矢印により示される）、そしてＭ及びＭ２遺伝子が、Ｆ−Ｍ２の１Ｇ配列によってのみ分離された。
【図２】
図２は、トランスフェクト中の感染性組換えイウルスの生成、及びｉｎ ｖｉｔｒｏにおける初期継代を示している。ＨＥｐ−２細胞を、記載のような（Ｍｕｌｐｈｙ ｅｔ ａｌ．、Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｐａｔｅｎｔ ５，９９３、８２４）、指示される個々のアンチゲノムプラスミド及びＮ、Ｐ、Ｌ及びＭ２−１のサポートプラスミドによりトランスフェクトした。培地の上澄物を３日後に採取して、３日から７日の間隔にて採取される培地の上澄物により、ＨＥｐ−２細胞において連続した非希釈継代にかけた。採取毎に試料を取り、瞬時冷凍しその後プラークアッセイ法により並行して分析した。これらのウイルスとしては、それぞれのｃＤＮＡｓと同じく明示した、すなわちＢｌｐ／△ＳＨ及びＧ１／△ＳＨ等が提供された。データは、Ｂｌｐ／△ＳＨ、Ｇ１／△ＳＨ、Ｆ１／△ＳＨ及びＧｌＦ２／△ＳＨとして示される。トランスフェクトは、３２℃であり、その後の継代培養を３７℃であった。
【図３Ａ】
図３Ａは、０．１の感染の入力多重度（ＭＯＩ）で感染後の、組換えｗｔＲＳＶ（ＳＨ遺伝子を含む）、及び△ＳＨ（ＢｌｐＩ部位を含まない）、Ｂｌｐ／△ＳＨ、Ｇｌ／△ＳＨ及びＧｌＦ２／△ＳＨ変異ウイルスのｉｎ ｖｉｔｒｏにおける複製を示す。ベロ細胞（上方パネル）又はＨＥｐ−２細胞（最下パネル）の複製培養体を、感染させそして３７℃にてインキュベートした。指示時刻にて、二重化した単一層を各ウイルスとして採集し、そして培地の上澄物を瞬間冷凍した。その後これらを、プラークアッセイ法により並行して分析した。
【図３Ｂ】
図３Ｂは、３．０のインプット感染多重度（ＭＯＩ）にて、Ｈｅｐ−２（最上）及びベロ細胞（最下）細胞単一層の感染後の、Ｂｌｐ／ＳＨ、Ｇｌ／ＳＨ、Ｆｌ／ＳＨ及びＧｌＦ２／ＳＨウイルスの単一工程の増殖を示している。複製細胞の単一層を感染し、３７℃にてインキュベートして、そして指示された時刻にて、二重化モノレイヤーを採集し、そして培地の上澄物を瞬間冷凍した。
【図４】
図４は、ベロ細胞のＢｌｐ／△ＳＨ、Ｇ１／△ＳＨ及びＧｌＦ２／△ＳＨウイルスによりＧタンパク質発現のウェスタンブロット分析法を示す。図３Ａの上面パネルにおける各時点からの細胞を採集し、そして総タンパク質をゲル電気泳動法及びウェスタンブロット分析法により分析した。ブロットが、Ｇタンパク質のペプチドに特異的なウサギ抗血清により、インキュベートすることにより作成した。次に結合した抗体を、化学的蛍光により可視化した。Ｇタンパク質を、二つの形状、すなわち９０ｋＤａの成熟形状及び５０ｋＤａの不完全グリコシル化した形状として変位する。
【図５】
図５は、Ｇ及びＦ遺伝子が部位１及び２に変位される弱毒化されたＲＳＶｓの構造を示す。パネルＡ： ＳＨ及びＮＳ２遺伝子が、記載のように （Ｔｅｎｇ ａｎｄ Ｃｏｌｌｉｎｓ、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７３：４６６−４７３、１９９９，Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７３：３４３８−３４４２、１９９９、例として本明細書に組み込まれている） 欠失され、そしてＧ及びＦ遺伝子を、図１の上記のように、位置１及び２にそれぞれ変位した組換えＲＳＶのＧｌＦ２ ／△ＮＳ２△ＳＨの構造。パネルＢ：ＳＨ、ＮＳ１及びＮＳ２遺伝子が欠失され、そしてＧ及びＦ遺伝子が、位置１及び２にそれぞれ変位した組換えＲＳＶのＧｌＦ２／△ＮＳ１△ＮＳ２△ＳＨの構造。
【図６】
図６は、ＢＲＳＶＧ及びＦ遺伝子が欠失され、ＨＲＳＶのＧ及びＦ遺伝子がプロモータ隣接に配置されたキメラｒＢＲＳＶ／ＨＲＳＶゲノムの構成を詳細に示す。ＢＲＳＶ遺伝子を暗色にて、ＨＲＳＶ遺伝子を明色にて示している。ヌクレオチド配列の位置数は、完全なｒＢＲＳＶアンチゲノムに対応しており（Ｂｕｃｈｈｏｌｚ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７３：２５１−２５９、１９９９；Ｂｕｃｈｈｏｌｚ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７４：１１８７−１１９９、２０００；ＧｅｎＢａｎｋ ｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ ＡＦ０９２９４２ ｏｒ ｃｏｍｐｌｅｔｅｒ ＨＲＳＶ ａｎｔｉｇｅｎｏｍｅ ｉｎ Ｃｏｌｌｉｎｓ ｅｔ ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９２：１１５６３−１１５６７、１９９５；各引例として本明細書に組み込まれている）、ＨＲＳＶを指している配列位置数には、下線が引かれている。図６のパネルＡは、ｒＢＲＳＶの構成には、前の操作にて付加されたＭｏｔＩ，ＳａｌＩ及びＸｈｏＩ部位を含むｒＢＲＳＶ構成の詳細である（Ｂｕｃｈｈｏｌｚ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７３：２５１−２５９、１９９９、Ｂｕｃｈｈｏｌｚ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７４：１１８７−１１９９，２０００）。図６のパネルＢは、ｒＢＲＳＶ／Ａ２−ＧｌＦ２を生成するためにｒＢＲＳＶに対する修飾を示している。ＢＲＳＶのＧ及びＦ遺伝子が、ＳａｌＩ及びＸｈｏＩによる消化により欠失され、そして得られた適合可能な付着末端を再結合する。Ｇ及びＦ遺伝子を含むヌクレオチド４６９２から７５５７までのＨＲＳＶのゲノムの領域を、ｃＤＮＡの各末端に組み込まれているように、所望の変化を含むプライマーを用いてＰＣＲによって増幅した。増幅されたＰＣＲ産物には、以下を（上流から下流の順位にて）、すなわちＮｏｔＩ部位、ＢｌｐＩ部位、完全なＨＲＳＶのＧ ＯＲＦ、その下流の非コード及びＧＥシグナル、ＨＲＳＶのＧ−ＦＩＧ配列、完全なＨＲＳＶのＦ遺伝子、ＨＲＳＶのＦ−Ｍ２１Ｇ配列からの６ヌクレオチド（ＣＡＣＡＡＴ）、ＮＳｌのＧＳシグナル、ＢｌｐＩ部位、及びＮｏｔＩ部位が含まれた。このｃＤＮＡを、ｒＢＲＳＶの位置６７にて、固有のＮｏｔｌ部位にクロー化された。図６のパネルＣは、ｒＢＲＳＶ／Ａ２−ＧｌＦ２のゲノムＲＮＡの構造を示している。
【図７】
図７は、ＨＥｐ−２ヒト（左側パネル）及びＭＤＢＫウシ（右側パネル）細胞のｒＢＲＳＶ、ｒＨＲＳＶ（ｒＡ２）、ｒＢＲＳＶ／Ａ２、及びｒＢＲＳＶ／Ａ２−ＧｌＦ２の多段サイクルによる増殖を表わしている。複製細胞の単一層を、０．１の感染多重度（ＭＯＩ）により示されるウイルスを用いて感染させ、３７℃にてインキュベートし、そして培地の滴量を指示時間にて採取し、瞬時冷凍して一７０℃にて保存し、その後に二重に滴定した。各々の値は、二つのウェルにおける平均力価の値である。
【図８】
図８は、ｒＢＲＳＶ／Ａ２−ＧｌＦ２、ｒＢＲＳＶ／Ａ２、又はｒＡ２により感染されたＨＥｐ−２細胞の間接的免疫蛍光法を示している。細胞を、０．１のＭＯＩにて感染し、３７℃にて９６時間インキュベートし、アセトンにより固定し、ＨＲＳＶのＧタンパク質に対して特異的なモノクーロナル抗体０２１／１Ｇ、又はＨＲＳＶのＦタンパク質に特異的なモノクーロナル抗体４４Ｆにより透過及び反応した。抗体の結合を、マウスＩｇＧに特異的なタグ付き抗体による反応によって可視化した。
【図９】
図９は、ＨＲＳＶのＭ、Ｇ及びＦ遺伝子を含むキメラｒＢＲＳＶ／ＨＲＳＶ構成を詳細に示す。ＢＲＳＶ遺伝子を暗色にて、ＨＲＳＶ遺伝子を明色にて示す。ＨＲＳＶ遺伝子を指す配列の位置数に、下線が引いてある。図９のパネルＡは、ユニークＭＺμ１部位を、ＰとＭ遺伝子間の遺伝子間領域（Ｐ−ＭＩＧ）内にて、位置３２０４にて固有のＭｌｕＩ部位を含むためのｒＢＲＳＶ／Ａ２の修飾を示している。ＩＧの配列が、元のヌクレオチドに当てられた位置を指示するため、小文字にて示される。下線付きの文字は、５ヌクレオチド置換により生成されるＭｌｕＩ部位を表わしている。ヌクレオチド配列の位置数は、完全なｒＢＲＳＶアンチゲノムに対応しており（Ｂｕｃｈｈｏｌｚ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７３：２５１−２５９、１９９９；Ｂｕｃｈｈｏｌｚ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７４：１１８７−１１９９、２０００；ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ ＡＦ０９２９４２ ｏｒ ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｒＨＲＳＶ ａｎｔｉｇｅｎｏｍｅ ｉｎ Ｃｏｌｌｉｎｓ ｅｔ ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９２：ｌ１５６３−ｌ１５６７、１９９５）； ＨＲＳＶ配列を表わす配列位置数には、下線が引かれている。図９のパネルＢは、ｒＢＲＳＶ／Ａ２−ＭＧＦを生成するためのｒＢＲＳＶ／Ａ２の修飾を示している。ＢＲＳＶのＭ及びＳＨ遺伝子を含むＭｌｕＩ−ＳａｌＩ断片が切除され、そしてＨＲＳＶのＭ遺伝子を含むＭｌｕＩ−ＳａｌＩ断片により置換された。ＨＲＳＶのＭ遺伝子を含むＭｌｕＩ−ＳａｌＩ断片が、ボックス状囲み内に示される。さらに、ＢＲＳＶのＰ遺伝子末端配列を含むＭｌｕＩ部位のすぐ上流の配列、及びＭ及びＧ遺伝子間の遺伝子間配列（Ｍ−ＧＩＧ）、ＨＲＳＶのＧ遺伝子開始シグナル、及びＧのＯＲＦを開始するＡＴＧ（太字、斜体字）を含むＳａｌＩ部位のすぐ下流の配列を示している。図９のパネルＣは、ｒＢＲＳＶ／Ａ２−ＭＧＦのゲノムの構造を示している。
【図１０】
図１０は、特異的なＢＲＳＶ遺伝子（暗色の長方形）を、そのＨＲＳＶ相当体（明色の長方形）と置換した、組換えＢＲＳＶ（ｒＢＲＳＶ、最上）及び５ ＢＲＳＶ／ＨＲＳＶキメラウイルスのゲノムの構造を示している。加えて、最下パネルにおいて、２のウイルスのＧ及びＦ遺伝子を、その通常の位置から、３と４又は１と２に変位する。ｒＢＲＳＶの概要図では、幾つかの制限部位が指示される。種々の構造に用いられる制限部位が示される、すなわち、Ｋｐｎｌ部位が自然に形成され、他の部位では必要に応じて導入された（Ｂｕｃｈｈｏｌｚ，ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７３：２５１−９、１９９９；Ｂｕｃｈｈｏｌｚ、ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７４：１１８７−１１９９、２０００，各々引例として本明細書に組み込まれている）。
【図１１】
図１１は、ｒＨＲＳＶ（ｒＡ２）及びｒＢＲＳＶの親ウイルス及び前に記載されたキメラウイルスｒＢＲＳＶ／Ａ２−ＧＦ（以前はｒＢＲＳＶ／Ａ２と呼ばれていた；Ｂｕｃｈｈｏｌｚ，２０００，ｓｕｐｒａ）及びｒＢＲＳＶ／Ａ２−ＧｌＦ２と比較して、ＢＲＳＶ／ＨＲＳＶキメラウイルスｒＢＲＳＶ／Ａ２−Ｇ３Ｆ４（最上パネル）及びＨｅｘ（最下パネル）の多サイクルによる増殖を表している。ベロ細胞の培養による単一層を、０．１のインプット感染多重度において感染させ、３７℃にてインキュベートした。培地上部にある試料を指示時刻にて採取し、ウイルスの力価が限界希釈法により決定した。ウェル当り連続１０倍のウイルス希釈液０．ｌｍｌに、１０４ＢＨＫ−２１細胞をＯ．１ｍｌ容量に加えた。４８時間後、細胞を８０％のアセトンにて固定し、ＢＲＳＶのＭタンパク質に対して特異的があり、ＨＲＳＶのＭタンパク質と交差反応性の抗体を用いる間接免疫蛍光法により分析され、感染された細胞の病巣を計数した（ｓｅｅ，Ｂｕｃｈｈｏｌｚ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７３：２５１−９、１９９９、を参照（引例として本明細書に組み込まれている））。
【図１２】
図１２は、ヒトＨＥｐ−２細胞（最上パネル）対ウシＭＤＢＫ細胞（最下）にて、指示ウイルスにより形成されるプラーク又は病巣のサイズを比較して、ＨＲＳＶ（ＨＥｐ−２細胞）又はＢＲＳＶ（ＭＤＢＫ細胞）と比較される百分率として表わしている。
【図１３】
図１３Ａ及び図１３Ｂは、Ｎ及び／又はＰ遺伝子が、それらのＨＲＳＶ相当体にて置換される組換えＢＲＳＶのゲノムの構造を示している。図１３Ａは、これらの置換がｒＢＲＳＶ骨格で行なわれたキメラを示しており、図１３Ｂは、その骨格がｒＢＲＳＶ／Ａ２−ＮＳｌ＋２ウイルスであるキメラを示している。
【図１４】
図１４は、ネガティブセンスＲＮＡとして、３’から５’側に描かれたＳＨ遺伝子における欠失を含む組換えｒＲＳＶ／６１２０ウイルスのゲノムＲＮＡの概要図であり、コードされた各ｍＲＮＡが長方形にて示される、そしてｍＲＮＡの非コードする遺伝子外及び遺伝子間領域が水平な線として示される。親ＲＳＶアンチゲノムｃＤＮＡは、上記のように（Ｃｏｌｌｉｎｓ，ｅｔ ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９２：１１５６３−１１５６７、１９９５），Ｇ−Ｆ遺伝子間領域のＸｍａＩ部位にさらなる修飾を有するている（Ｂｕｋｒｅｙｅｖ，ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７０：６６３４−６６４１、１９９６、引例として本明細書に組み込まれている）。このｃＤＮＡを、（ｉ）翻訳停止コドンを含むＳＨのＯＲＦ最後４つのコドン内に、５つの翻訳としてサイレントなヌクレオチド置換基を含み、そして（ｉｉ）ＳＨ遺伝子（囲み）の下流の非翻訳領域から完全なアンチゲノム配列の１１２ヌクレオチド（位置４４９９から４６１０まで）を欠失するために、修飾した。この構成において用いられるＸｈｏＩ及びＰａｃＩ部位は、斜字で示され、ラベルが付けられ、ＳＨ遺伝子−終了シグナルに下線か引かれて、ＳＨのコドンが、トリプレットとして示され、ヌクレオチド置換は小文字で示され、欠失される配列を、配列を示すボックスにより表される。
【図１５】
図１５Ａ−１５Ｂは、組換えｒＲＳＶ親Ｄ５３のその全長と比較した、ＳＨ遺伝子の欠失を含めｒＲＳＶ／６１２０の増殖反応速度を示している。ＨＥｐ−２細胞の３組の単一層培養物（Ｆｉｇ．１５Ａ，Ｆｉｇ．１５Ｂ及びＦｉｇ１５Ｃ）をの感染は、指定のウイルスを用いて０．Ｏ０５のインプット感染多重度にて、指示ウイルスにより感染させた。吸着期間の後、細胞を３７℃にてインキュベートした。１２時間の間隔にて、その培地を完全に採集して、滴量を後の滴定のために瞬時冷凍した。前記細胞を３回洗浄し、そして新鮮な培地を加えて、続けてインキュベートした。実験の最後に、試料をプラークアッセイ法により分析し、ウイルスの力価が決定した。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１５Ｃ】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004515218.tif 000192
【国際調査報告】
2004515218.tif 000193
2004515218.tif 000194
2004515218.tif 000195
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