(57)【要約】本発明は、標的核酸中の遺伝子バリエーションを検出するため、生物学的サンプル中の特定の核酸の存在または不存在を検出するため、１本鎖核酸プローブを調製するため、および標的ｃＤＮＡ分子またはｃＤＮＡ集団中のプレｍＲＮＡディファレンシャルスプライシングを検出するための、化合物、キットおよび方法に関する。これは、この標的核酸の遺伝子バリエーションを含むか、特定の核酸に関連する独特の配列を有するか、目的の核酸に相補的であるか、またはエキソン−エキソン連結部を含むかのいずれかである１本鎖核酸フラグメントの増幅においてニック形成を利用する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
方法であって、該方法は、以下：
（ａ）部分的または完全に２本鎖のテンプレート核酸分子を、ニック形成剤（ＮＡ）と接触させる工程であって、該テンプレートは、該ＮＡによって認識され得るニック形成剤認識配列（ＮＡＲＳ）を含む、工程；
（ｂ）該テンプレートが、該ＮＡによってニック形成され得るニック形成部位（ＮＳ）を含まない場合、該テンプレートを伸長して該ＮＳを提供する工程；
（ｃ）該テンプレートまたはその該伸長産物に該ＮＳにてニック形成する工程；
（ｄ）工程（ｃ）のニック形成された産物を該ＮＳの３’末端から伸長する工程；ならびに
（ｅ）工程（ｃ）および工程（ｄ）を繰返し、それにより、１本鎖核酸フラグメントを増幅する工程
を包含する、方法。
【請求項２】
（ｅ）の前記１本鎖核酸フラグメントが、２５以下のヌクレオチドを有する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
工程（ｃ）が、ｅｘｏ−Ｖｅｎｔ、ｅｘｏ−Ｄｅｅｐ  Ｖｅｎｔ、ｅｘｏ−Ｂｓｔ、ｅｘｏ−Ｐｆｕ、ｅｘｏ−Ｂｃａ、Ｔａｑ、ＤＮＡポリメラーゼＩのＫｌｅｎｏｗフラグメント、Ｔ５  ＤＮＡポリメラーゼ、φ２９  ＤＮＡポリメラーゼ、ファージＭ２  ＤＮＡポリメラーゼ、ファージφＰＲＤ１  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ、ＰＲＤ１  ＤＮＡポリメラーゼ、９°ＮｍＴＭＤＮＡポリメラーゼ、およびＴ４  ＤＮＡポリメラーゼからなる群より選択されるＤＮＡポリメラーゼの存在下で行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
工程（ｂ）、工程（ｃ）、工程（ｄ）および工程（ｅ）が、同一の等温条件下で行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記ＮＡが、ニック形成エンドヌクレアーゼ（ＮＥ）である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記テンプレート核酸分子が、固体支持体に固定されている、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記テンプレート核酸が、前記ＮＳの３’側に位置しかつこの分子の該ＮＳと同じ鎖に遺伝子バリエーションをさらに含み、その結果、該遺伝子バリエーションが、前記増幅された１本鎖核酸フラグメントに取り込まれる、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記テンプレート核酸が、以下：
（ｉ）第１オリゴヌクレオチドプライマー（ＯＤＮＰ）、第２ＯＤＮＰ、および遺伝子バリエーションを含む標的核酸の混合物を形成する工程であって、ここで
（ａ）該標的核酸が、第１鎖および第２鎖を有する２本鎖核酸である場合、
該第１ＯＤＮＰは、ニック形成エンドヌクレアーゼ認識配列（ＮＥＲＳ）のセンス鎖のヌクレオチド配列、および該遺伝子バリエーションの相補体の３’側に位置する該標的核酸の第１鎖のヌクレオチド配列に対して少なくとも実質的に相補的なヌクレオチド配列を含み、そして
該第２ＯＤＮＰは、該遺伝子バリエーションの３’側に位置する該標的核酸の第２鎖のヌクレオチド配列に対して少なくとも実質的に相補的なヌクレオチド配列を含み、そして必要に応じて、制限エンドヌクレアーゼ認識配列（ＲＥＲＳ）の１つの鎖の配列を含むか、
または
（ｂ）該標的核酸が１本鎖核酸である場合、
該第１ＯＤＮＰは、ニック形成エンドヌクレアーゼ認識配列（ＮＥＲＳ）のセンス配列の配列、および該遺伝子バリエーションの５’側に位置する該標的核酸に対して少なくとも実質的に同一であるヌクレオチド配列を含み、そして
該第２ＯＤＮＰは、該遺伝子バリエーションの３’側に位置する該標的核酸のヌクレオチド配列に対して少なくとも実質的に相補的なヌクレオチド配列を含み、そして必要に応じて、制限エンドヌクレアーゼ認識配列（ＲＥＲＳ）の１つの鎖の配列を含む、工程；
（ｉｉ）該第１ＯＤＮＰおよび該第２ＯＤＮＰを伸長して、該ＮＥＲＳおよび該ＲＥＲＳの両方を有するフラグメントを生成する工程；ならびに
（ｉｉｉ）必要に応じて、工程（ｉｉ）の伸長産物を、該ＲＥＲＳを認識する制限エンドヌクレアーゼを用いて切断する工程
を含む方法によって形成される、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記テンプレート核酸が、以下：
（ｉ）第１ＯＤＮＰ、第２ＯＤＮＰ、および遺伝子バリエーションを含む標的核酸の混合物を形成する工程であって、ここで
（ａ）該標的核酸が、第１鎖および第２鎖を有する２本鎖核酸である場合、
該第１ＯＤＮＰは、第１制限エンドヌクレアーゼ認識配列（ＲＥＲＳ）の１つの鎖のヌクレオチド配列、および該遺伝子バリエーションの相補体の３’側に位置する該標的核酸の第１鎖のヌクレオチド配列に対して少なくとも実質的に相補的なヌクレオチド配列を含み、そして
該第２ＯＤＮＰは、第２ＲＥＲＳの１つの鎖の配列、および該遺伝子バリエーションの３’側に位置する該標的核酸の該第２鎖のヌクレオチド配列に対して少なくとも実質的に相補的なヌクレオチド配列を含むか、
または
（ｂ）該標的核酸が１本鎖核酸である場合、
該第１ＯＤＮＰは、第１制限エンドヌクレアーゼ認識配列（ＲＥＲＳ）の１つの鎖の配列、および該遺伝子バリエーションの５’側に位置する該標的核酸の核酸配列に対して少なくとも実質的に相補的なヌクレオチド配列を含み、そして
該第２ＯＤＮＰは、第２ＲＥＲＳの１つの鎖の配列、および該遺伝子バリエーションの３’側に位置する該標的核酸のヌクレオチド配列に対して少なくとも実質的に相補的なヌクレオチド配列を含む、工程；
（ｉｉ）デオキシリボヌクレオシド三リン酸および少なくとも１つの改変デオキシリボヌクレオシド三リン酸の存在下で該第１ＯＤＮＰおよび該第２ＯＤＮＰを伸長して、該第１ＲＥＲＳおよび該第２ＲＥＲＳの両方を有するフラグメントを生成する、工程
を包含する方法によって形成される、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記テンプレート核酸が、以下：
（ｉ）第１ＯＤＮＰ、第２ＯＤＮＰ、および遺伝子バリエーションを含む標的核酸の混合物を形成する工程であって、ここで
（ａ）該標的核酸が、第１鎖および第２鎖を有する２本鎖核酸分子である場合、
該第１ＯＤＮＰは、遺伝子バリエーションの相補体の３’側に位置する該標的核酸の第１鎖のヌクレオチド配列に対して少なくとも実質的に相補的なヌクレオチド配列を含み、そして
該第２ＯＤＮＰは、該遺伝子バリエーションの３’側に位置する該標的核酸の該第２鎖のヌクレオチド配列に対して少なくとも実質的に相補的なヌクレオチド配列を含むか、
または
（ｂ）該標的核酸が１本鎖核酸である場合、
該第１ＯＤＮＰは、該遺伝子バリエーションの５’側に位置する該標的核酸のヌクレオチド配列に対して少なくとも実質的に同一であるヌクレオチド配列を含み、そして
該第２ＯＤＮＰは、該遺伝子バリエーションの３’側に位置する該標的核酸のヌクレオチド配列に対して少なくとも実質的に相補的なヌクレオチド配列を含み；
該第１ＯＤＮＰおよび該第２ＯＤＮＰは各々、ＮＥＲＳのセンス鎖の配列をさらに含む、工程；
（ｉｉ）該第１ＯＤＮＰおよび該第２ＯＤＮＰを伸長して、２つのＮＥＲＳを有するフラグメントを生成する工程；
を包含する方法によって形成される、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記テンプレート核酸分子が、該鎖中に前記ＮＳを含む５’突出部または該鎖中に該ＮＳを含まない３’突出部のいずれかをさらに含み、ここで、突出部が、標的核酸に対して少なくとも実質的に相補的な核酸配列を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
さらに以下：
（ｉ）前記標的核酸が生物学的サンプル中に存在するならば、前記テンプレート核酸の突出部にハイブリダイズする条件下にて、該テンプレート核酸を、該生物学的サンプル中の核酸分子と混合する工程であって、ここで、該生物学的サンプルが、該標的核酸を含み得る、工程；および
（ｉｉ）工程（ａ）を行う前に、ハイブリダイズしていないテンプレート核酸を工程（ｉ）の該混合物から除去する工程；および
（ｉｉｉ）該ハイブリダイズしたテンプレート核酸をＮＡと合わせる工程
を包含する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記２本鎖テンプレート核酸分子が、ＩＩｓ型制限エンドヌクレアーゼ認識配列（ＴＲＥＲＳ）をさらに含み、そして核酸アダプターを２本鎖標的核酸に連結することによって提供され、その結果、前記増幅された１本鎖核酸分子が、該標的核酸の一部分を含み、該核酸アダプターが、ＩＩｓ型制限エンドヌクレアーゼ認識配列（ＴＲＥＲＳ）および該ＮＡＲＳを含み、ここで、前記ＮＳを含まない鎖において、該ＴＲＥＲＳを認識するＩＩｓ型制限エンドヌクレアーゼの切断部位は、前記２本鎖標的核酸フラグメント内および該ＮＳに対応する位置の５’側の両方に位置する、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記テンプレート核酸が、上流エキソン（エキソンＡ）と前記ＮＳの３’側に位置する下流エキソン（エキソンＢ）との間に連結部をさらに含み、その結果、該連結部の両方の側で該連結部に隣接するヌクレオチドが、前記増幅された１本鎖核酸フラグメントに取り込まれる、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記テンプレート核酸が、以下：
（ｉ）第１オリゴヌクレオチドプライマー（ＯＤＮＰ）、第２ＯＤＮＰ、およびｃＤＮＡの混合物を形成する工程であって、ここで
該第１ＯＤＮＰは、アンチセンス鎖中のエキソンＡの５’末端付近のエキソンＡの該アンチセンス鎖の一部分に対して少なくとも実質的に相補的な配列を含み、
該第２ＯＤＮＰは、センス鎖中のエキソンＢの５’末端付近のエキソンＢの該センス鎖の一部分に対して少なくとも実質的に相補的な配列を含み、そして
該第１ＯＤＮＰおよび該第２ＯＤＮＰのうちの少なくとも一方は、ニック形成剤認識配列（ＮＡＲＳ）のセンス鎖の配列をさらに含む、工程；ならびに
（ｉｉ）該第１ＯＤＮＰおよび該第２ＯＤＮＰを伸長して、該第１ＯＤＮＰおよび該第２ＯＤＮＰを含むテンプレート核酸を提供する、工程
を包含する方法によって形成される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
１本鎖核酸分子を増幅するための方法であって、該方法は、以下：
（Ａ）混合物を形成する工程であって、該混合物は以下：
（ｉ）標的核酸；
（ｉｉ）オリゴヌクレオチドプライマーであって、該オリゴヌクレオチドプライマーは、
（ａ）２本鎖ニック形成剤認識配列の外側にニックを形成するニック形成剤によって認識され得る該認識配列のセンス鎖の配列を含み、そして
（ｂ）該標的核酸に対して少なくとも実質的に相補的である、オリゴヌクレオチドプライマー
を含む、工程；ならびに
（Ｂ）該ニック形成剤の存在下でテンプレートとして該標的核酸の一部分を用いて１本鎖核酸分子を増幅する工程
を包含する、方法。
【請求項１７】
前記２本鎖ニック形成剤認識配列が、Ｎ．ＢｓｔＮＢＩによって認識され得る、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記２本鎖ニック形成剤認識配列のセンス鎖の配列におけるヌクレオチドが、前記オリゴヌクレオチドプライマーが、該標的核酸にアニールした場合、該標的核酸の別のヌクレオチドと通常の塩基対を形成しない、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
前記オリゴヌクレオチドプライマーが、前記標的核酸にアニーリングする場合、前記２本鎖ニック形成剤認識配列のセンス鎖の配列中の２以上のヌクレオチドは、前記標的核酸のヌクレオチドと通常の塩基対合を形成しない、請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
方法であって、該方法は、以下：
（Ａ）混合物を形成する工程であって、該混合物は以下
（ｉ）標的核酸；
（ｉｉ）オリゴヌクレオチドプライマーであって、該オリゴヌクレオチドプライマーは、
（ａ）ＮＡＲＳの外側にニックを形成するニック形成剤（ＮＡ）によって認識され得る該ＮＡＲＳのセンス鎖の配列を含み、そして
（ｂ）該標的核酸の第１領域に対して少なくとも実質的に相補的である、オリゴヌクレオチドプライマー；および
（ｉｉｉ）部分的に２本鎖の核酸であって、該部分的に２本鎖の核酸は、
（ａ）２本鎖ＩＩｓ型制限エンドヌクレアーゼ認識配列、および
（ｂ）該第１領域の５’側に位置する該標的核酸の第２領域に対して少なくとも実質的に相補的である３’突出部を含む、部分的に２本鎖の核酸；
を含み、該形成は、該オリゴヌクレオチドプライマーと該標的の該第１領域との間でのハイブリダイゼーション、および該部分的に２本鎖の核酸の該３’突出部と該標的の該第２領域との間でのハイブリダイゼーションを可能にする条件下で行われる、工程；
（Ｂ）該オリゴヌクレオチドプライマー、および該第２領域において、該部分的に２本鎖の核酸に対してハイブリダイズした該標的核酸を消化する、工程；
（Ｃ）該ニック形成剤の存在下で、工程（Ｂ）において消化された標的核酸の一部分をテンプレートとして用いて、１本鎖核酸分子を増幅する、工程
を包含する、方法。
【請求項２１】
標的核酸中の規定の位置における遺伝子バリエーションを同定するための方法であって、該方法は、以下：
（ａ）該規定の位置に該遺伝子バリエーションを含む、該標的核酸の一部分を含み、かつ該遺伝子バリエーションの５’側に位置するニック形成部位（ＮＳ）をさらに含む、部分的または完全に２本鎖のテンプレート核酸を提供する工程；
（ｂ）ＤＮＡポリメラーゼ、および該ＮＳにおいてニックを形成するニック形成剤（ＮＡ）の存在下で、該遺伝子バリエーションを含み、かつその５’末端が該ＮＳにあった、１本鎖核酸フラグメントを増幅する工程；および
（ｃ）該１本鎖核酸フラグメントを特徴付けし、それにより該遺伝子バリエーションを同定する工程
を包含する、方法。
【請求項２２】
前記遺伝子バリエーションが、単一ヌクレオチド多型である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記１本鎖核酸フラグメントが、２５以下のヌクレオチドを含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
前記標的核酸が、ゲノム核酸またはｃＤＮＡである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２５】
前記ＮＡが、ニック形成エンドヌクレアーゼ（ＮＥ）である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２６】
工程（ｂ）が、等温条件下で行われる、請求項２１に記載の方法。
【請求項２７】
前記増幅された１本鎖核酸フラグメントが、１７以下のヌクレオチドを含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２８】
工程（ｃ）の前記特徴付け工程が、質量分析法、液体クロマトグラフィー、蛍光偏光、および電気泳動からなる群より選択される技術の使用によって少なくとも部分的に行われる、請求項２１に記載の方法。
【請求項２９】
請求項２１に記載の、標的核酸中の規定の位置における遺伝子バリエーションを同定するための方法であって、該方法は、以下：
（ａ）第１オリゴヌクレオチドプライマー（ＯＤＮＰ）、第２ＯＤＮＰおよび該標的核酸の混合物を形成する工程であって、ここで
（ｉ）該標的核酸が、第１鎖および第２鎖を有する２本鎖核酸である場合、
該第１ＯＤＮＰは、該遺伝子バリエーションの相補体の３’側に位置する該標的核酸の第１鎖のヌクレオチド配列に対して少なくとも実質的に相補的なヌクレオチド配列を含み、そして
該第２ＯＤＮＰは、該遺伝子バリエーションの３’に位置する該標的核酸の第２鎖のヌクレオチド配列に対して少なくとも実質的に相補的なヌクレオチド配列を含むか、
または
（ｉｉ）該標的核酸が１本鎖核酸である場合、
該第１ＯＤＮＰは、該遺伝子バリエーションの５’側に位置する該標的核酸のヌクレオチド配列に対して少なくとも実質的に同一であるヌクレオチド配列を含み、そして
該第２ＯＤＮＰは、該遺伝子バリエーションの３’側に位置する該標的核酸のヌクレオチド配列に対して少なくとも実質的に相補的なヌクレオチド配列を含み、
該第１ＯＤＮＰおよび該第２ＯＤＮＰは各々、ニック形成エンドヌクレアーゼ認識配列（ＮＥＲＳ）のセンス鎖のヌクレオチド配列をさらに含む、工程；
（ｂ）該第１ＯＤＮＰおよび該第２ＯＤＮＰを伸長して、２つのＮＥＲＳを含む伸長産物を生成する工程；
（ｃ）該ＮＥＲＳを認識する１以上のニック形成エンドヌクレアーゼ（ＮＥ）の存在下で、工程（ｂ）の伸長産物の１つの鎖をテンプレートとして用いて、１本鎖核酸フラグメントを増幅する工程；ならびに
（ｄ）工程（ｃ）の１本鎖フラグメントを特徴付けし、それにより該遺伝子バリエーションを同定する工程
を包含する、方法。
【請求項３０】
核酸集団中の、第１核酸分子の数の、第２核酸分子の数に対する比を決定するための方法であって、ここで、該第１核酸分子の配列と該第２核酸分子の配列とが、規定の位置を除いて同一であり、該方法は、以下：
（ａ）第１オリゴヌクレオチドプライマー（ＯＤＮＰ）、第２ＯＤＮＰおよび該核酸集団を混合する工程であって、ここで
（ｉ）該第１核酸および該第２核酸が２本鎖であって、各々、第１鎖および第２鎖を含む場合、
ａ）該第１ＯＤＮＰは、該規定の位置の３’側に位置する、該第１核酸の該第１鎖の核酸配列に対して少なくとも実質的に相補的なヌクレオチド配列を含み、そして
ｂ）該第２ＯＤＮＰは、該規定の位置の３’側に位置する、該第１核酸の該第２鎖の核酸配列に対して少なくとも実質的に相補的なヌクレオチド配列を含むか、
または
（ｉｉ）該第１核酸および該第２核酸が、１本鎖である場合、
ａ）該第１ＯＤＮＰは、該規定の位置の５’側に位置する、該第１核酸の核酸配列に対して少なくとも実質的に同一なヌクレオチド配列を含み、そして
ｂ）該第２ＯＤＮＰは、該規定の位置の３’側に位置する該第１核酸の核酸配列に対して少なくとも実質的に相補的なヌクレオチド配列を含み；そして
該第１ＯＤＮＰおよび該第２ＯＤＮＰのうちの少なくとも一方が、ニック形成剤認識配列（ＮＡＲＳ）のセンス鎖の配列をさらに含む、工程；
（ｂ）該第１ＯＤＮＰおよび該第２ＯＤＮＰを伸長して、該第１ＯＤＮＰおよび該第２ＯＤＮＰによって取り囲まれたフラグメントを生成する、工程；
（ｃ）ＤＮＡポリメラーゼおよび該ＮＡＲＳを認識するニック形成剤（ＮＡ）の存在下で１本鎖核酸フラグメントを増幅する、工程；ならびに
（ｄ）該第１核酸に由来する工程（ｃ）の該１本鎖核酸フラグメントの数の、該第２核酸に由来する工程（ｃ）の該１本鎖核酸フラグメントの数に対する比を決定する、工程
を包含する、方法。
【請求項３１】
前記第１ＯＤＮＰまたは前記第２ＯＤＮＰが、ＲＥＲＳの１つの鎖の配列を含むが、ＮＥＲＳのセンス鎖の配列を含まず；そして工程（ｂ）によって生成されるフラグメントが、半改変ＲＥＲＳを含まない、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
工程（ｂ）の前記増幅されたフラグメントが、工程（ｃ）を行う前に、該ＲＥＲＳを認識するＲＥによって消化される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
工程（ｃ）の前記増幅産物は、３５以下のヌクレオチドを含む１本鎖核酸フラグメントである、請求項３０に記載の方法。
【請求項３４】
サンプル中の標的核酸の存在または不存在を決定するための方法であって、該方法は、以下：
（ａ）該サンプルの該核酸分子と、部分的に２本鎖のオリゴヌクレオチドプローブとを混合して、該標的核酸に対する該プローブのハイブリダイゼーションを可能にする工程であって、該プローブは、以下：
（ｉ）ニック形成剤（ＮＡ）によって切断されてニック形成部位（ＮＳ）を生成し得るニック形成剤認識配列（ＮＡＲＳ）、および
（ｉｉ）該鎖またはその伸長産物のいずれかが該ＮＳを含む、該鎖中の５’突出部、または
該鎖もその伸長産物のいずれも該ＮＳを含まない、該鎖中の３’突出部
を含み、
ここで、該突出部は、標的核酸に対して少なくとも実質的に相補的な核酸配列を含む、工程；
（ｂ）ハイブリダイズしていないプローブを、該ハイブリダイズしていないプローブから分離する工程；
（ｃ）該ＮＡ、ＤＮＡポリメラーゼ、および該ハイブリダイズしたプローブの存在下で増幅反応を行って、増幅産物を提供する工程；ならびに
（ｄ）工程（ｃ）の該増幅産物の存在または不存在を検出し、それにより、該サンプル中の該標的核酸の存在または不存在を決定する工程
を包含する、方法。
【請求項３５】
前記標的核酸が、細菌、ウイルス、真菌および寄生生物からなる群より選択されるメンバーに由来する核酸分子である、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記ＮＡがＮ．ＢｓｔＮＢ  Ｉである、請求項３４に記載の方法。
【請求項３７】
工程（ｃ）が、等温条件で行われる、請求項３４に記載の方法。
【請求項３８】
工程（ｃ）が、標識されたデオキシヌクレオシド三リン酸の存在下で行われ、そして該標識されたデオキシヌクレオシド三リン酸が、放射性標識、酵素、蛍光色素、ジゴキシゲニン、およびビオチンからなる群より選択される標識に連結しているデオキシヌクレオシド三リン酸である、請求項３４に記載の方法。
【請求項３９】
前記増幅産物が、存在する場合、３５以下のヌクレオチドを含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項４０】
前記サンプルの前記核酸分子が、固体支持体に固定されている、請求項３４に記載の方法。
【請求項４１】
工程（ｃ）の前記増幅産物が、工程（ｄ）において検出される前に固体支持体に固定される、請求項３４に記載の方法。
【請求項４２】
サンプル中の標的核酸の存在または不存在を決定するための方法であって、該方法は、以下：
（Ａ）混合物を形成する工程であって、該混合物は以下：
（ｉ）該サンプルの該核酸分子；
（ｉｉ）１本鎖核酸プローブであって、該プローブは、３’から５’へと、以下：
（ａ）該標的核酸に対して少なくとも実質的に相補的である第１配列、
（ｂ）ニック形成剤認識配列（ＮＡＲＳ）のアンチセンス鎖の配列、および
（ｃ）第２配列、
を含む、プローブ；
（ｉｉｉ）該ＮＡＲＳを認識するニック形成エンドヌクレアーゼ（ＮＡ）、ＤＮＡポリメラーゼ、および１以上のデオキシヌクレオシド三リン酸
を含む、工程；
（Ｂ）該標的核酸が該サンプル中に存在するならば、該１本鎖核酸プローブをテンプレートとして用いて１本鎖核酸フラグメントが増幅される条件に、該混合物を維持する工程であって、該１本鎖核酸フラグメントが、多くとも２５ヌクレオチド長である、工程；ならびに
（Ｃ）工程（Ｂ）において増幅された該１本鎖核酸フラグメントの存在または不存在を
検出して、該サンプル中の該標的核酸の存在または不存在を決定する工程
を包含する、方法。
【請求項４３】
サンプル中の標的核酸の存在または不存在を決定するための方法であって、該方法は、以下：
（Ａ）混合物を形成する工程であって、該混合物は以下：
（ｉ）該サンプルの該核酸分子；
（ｉｉ）１本鎖核酸プローブであって、該プローブは、３’から５’へと、以下：
（ａ）該標的核酸に対して少なくとも実質的に相補的である配列、および
（ｂ）ニック形成剤認識配列（ＮＡＲＳ）のセンス鎖の配列、
（ｉｉｉ）第１ＮＡＲＳを認識するニック形成エンドヌクレアーゼ（ＮＡ）、ＤＮＡポリメラーゼ、および１以上のデオキシヌクレオシド三リン酸；
を含む、工程；
（Ｂ）該標的核酸が該サンプル中に存在するならば、該標的核酸に対して少なくとも実質的に相補的である１本鎖核酸フラグメントが増幅される条件に、該混合物を維持する工程であって、ここで、該１本鎖核酸フラグメントが、多くとも２５ヌクレオチド長である、工程；ならびに
（Ｃ）工程（Ｂ）において増幅された該１本鎖核酸フラグメントの存在または不存在を検出して、該サンプル中での該標的核酸の存在または不存在を決定する工程
を包含する、方法。
【請求項４４】
サンプル中の、ニック形成剤認識配列（ＮＡＲＳ）を含む標的核酸の存在または不存在を決定するための方法であって、該方法は、以下：
（Ａ）混合物を形成する工程であって、該混合物は以下：
（ｉ）該サンプルの該核酸分子、
（ｉｉ）該ＮＡＲＳを認識するニック形成剤（ＮＡ）、ＤＮＡポリメラーゼ、および１以上のデオキシヌクレオシド三リン酸
を含む、工程；
（Ｂ）該標的核酸が、該サンプル中に存在するならば、該標的核酸の一部分をテンプレートとして用いて１本鎖核酸フラグメントが増幅される条件に、該混合物を維持する、工程；ならびに
（Ｃ）工程（Ｂ）において増幅された該１本鎖核酸フラグメントの存在または不存在を検出して、該サンプル中の該標的核酸の存在または不存在を決定する、工程
を包含する、方法。
【請求項４５】
サンプル中の、ニック形成剤認識配列（ＮＡＲＳ）を含む標的核酸の存在または不存在を決定するための方法であって、該方法は、以下：
（Ａ）混合物を形成する工程であって、該混合物は以下：
（ｉ）該サンプルの該核酸分子、
（ｉｉ）該標的核酸の１つの鎖に対して実質的に同一であって、該ＮＡＲＳのアンチセンス鎖の配列を含む、１本鎖核酸プローブ、
（ｉｉｉ）該ＮＡＲＳを認識するニック形成剤（ＮＡ）、ＤＮＡポリメラーゼ、および１以上のデオキシヌクレオシド三リン酸
を含む、工程；
（Ｂ）該標的核酸が該サンプル中に存在するならば、該プローブの一部分をテンプレートとして用いて１本鎖核酸フラグメントが増幅される条件に、該混合物を維持する、工程；ならびに
（Ｃ）工程（Ｂ）の該１本鎖核酸フラグメントの存在または不存在を検出して、該サンプル中の該標的核酸の存在または不存在を決定する、工程
を包含する、方法。
【請求項４６】
工程（Ｂ）の前記１本鎖核酸フラグメントが、多くとも２５ヌクレオチド長である、請求項４２〜４５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４７】
前記サンプルの前記核酸分子が固定されている、請求項４２〜４６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４８】
前記１本鎖核酸プローブが、固体支持体に固定されている、請求項４２〜４６のいずれかに記載の方法。
【請求項４９】
前記ＮＡＲＳが、ミスマッチ塩基対を含む、請求項１または３４のいずれかに記載の方法。
【請求項５０】
ｃＤＮＡ分子中の遺伝子の上流エキソン（エキソンＡ）と下流エキソン（エキソンＢ）との間の連結部の存在または不存在を検出するための方法であって、該方法は、以下：
（ａ）第１オリゴヌクレオチドプライマー（ＯＤＮＰ）、第２ＯＤＮＰ、および該ｃＤＮＡを混合する工程であって、ここで
該第１ＯＤＮＰは、エキソンＡのアンチセンス鎖の一部分に対して少なくとも実質的に相補的な配列を、該アンチセンス鎖中のエキソンＡの５’末端付近に含み、
該第２ＯＤＮＰは、エキソンＢのセンス鎖の一部分に対して少なくとも実質的に相補的な配列を、該センス鎖中のエキソンＢの５’末端付近に含み、そして
該第１ＯＤＮＰおよび該第２ＯＤＮＰのうちの少なくとも一方は、ニック形成剤認識配列（ＮＡＲＳ）のセンス鎖の配列をさらに含む、工程；
（ｂ）エキソンＡおよびエキソンＢの両方が該ｃＤＮＡ中に存在するならば、該第１ＯＤＮＰおよび該第２ＯＤＮＰによって取り囲まれたフラグメントが生成される条件下で、伸長反応を行う、工程；
（ｃ）ＤＮＡポリメラーゼ、および該ＮＡＲＳを認識するニック形成剤（ＮＡ）の存在下で増幅反応を行う、工程；ならびに
（ｄ）工程（ｃ）の増幅産物が存在するならば、該増幅産物を特徴付けして、それにより、エキソンＡとエキソンＢとの間の該連結部の存在または不存在を決定する、工程
を包含する、方法。
【請求項５１】
前記第１ＯＤＮＰおよび前記第２ＯＤＮＰの両方が、ＮＡＲＳのセンス鎖の配列を含む、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記ＮＥＲＳが、Ｎ．ＢｓｔＮＢ  Ｉによって認識され得る、請求項５０に記載の方法。
【請求項５３】
前記第１ＯＤＮＰまたは前記第２ＯＤＮＰが、ＮＥＲＳのセンス鎖の配列を含まないが、ＲＥＲＳの１つの鎖の配列を含み；工程（ｂ）によって生成されるフラグメントが、半改変されたＲＥＲＳを含まない、請求項５０に記載の方法。
【請求項５４】
工程（ｃ）が、等温条件下で行われる、請求項５０に記載の方法。
【請求項５５】
存在する場合、前記増幅産物が、３５以下のヌクレオチドを含む１本鎖核酸フラグメントである、請求項５０に記載の方法。
【請求項５６】
ｃＤＮＡ分子中の遺伝子の上流エキソン（エキソンＡ）と下流エキソン（エキソンＢ）との間の連結部の存在または不存在を検出するためのオリゴヌクレオチドプライマー（ＯＤＮＰ）対であって、該ＯＤＮＰ対は、以下：
（ａ）アンチセンス鎖のエキソンＡの一部分に対して少なくとも実質的に相補的な配列
を該アンチセンス鎖中のエキソンＡの５’末端付近に含む、第１ＯＤＮＰ、および
エキソンＢのセンス鎖の一部分に対して少なくとも実質的に相補的な配列を該センス鎖中のエキソンＢの５’末端付近に含む、第２ＯＤＮＰ；
を含み、
ここで、該第１ＯＤＮＰおよび該第２ＯＤＮＰのうちの少なくとも一方は、ニック形成剤認識配列（ＮＡＲＳ）のセンス鎖の配列をさらに含む、ＯＤＮＰ対。
【請求項５７】
前記ＮＡＲＳが、ニック形成エンドヌクレアーゼ認識配列（ＮＥＲＳ）である、請求項５６に記載のＯＤＮＰ対。
【請求項５８】
前記第１ＯＤＮＰおよび前記第２ＯＤＮＰの両方が、ＮＡＲＳのセンス鎖の配列を含む、請求項５６に記載のＯＤＮＰ対。
【請求項５９】
前記ＮＡＲＳがＮＥＲＳである、請求項５８に記載のＯＤＮＰ対。
【請求項６０】
前記第１ＯＤＮＰが、ＮＥＲＳのセンス鎖の配列を含み、そして前記第２ＯＤＮＰが、ＲＥＲＳの１つの鎖の配列を含む、請求項５６に記載のＯＤＮＰ対。
【請求項６１】
前記第１ＯＤＮＰが、ＲＥＲＳの１つの鎖の配列を含み、そして前記第２ＯＤＮＰが、ＮＥＲＳのセンス鎖の配列を含む、請求項５６に記載のＯＤＮＰ対。
【請求項６２】
前記第２ＯＤＮＰが、少なくとも１２ヌクレオチド長である、請求項５６に記載のＯＤＮＰ対。
【請求項６３】
１本鎖ｃＤＮＡ分子を合成するためのテンプレート核酸分子を作製する方法であって、該方法は、以下：
ａ．２本鎖ｃＤＮＡ分子を提供する工程；および
ｂ．該２本鎖ｃＤＮＡ分子と、ニック形成剤認識配列（ＮＡＲＳ）を含む核酸アダプターとを連結する工程であって、その結果、該ＮＡＲＳを認識するニック形成剤（ＮＡ）およびＤＮＡポリメラーゼの存在下で、該連結産物をテンプレートとして用いて増幅される１本鎖核酸分子は、該２本鎖ｃＤＮＡ分子の１つの鎖の少なくとも一部分を含む、工程
を包含する、方法。
【請求項６４】
前記部分が、少なくとも８ヌクレオチド長である、請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
前記部分が、少なくとも１２ヌクレオチド長である、請求項６３に記載の方法。
【請求項６６】
前記前記２本鎖ｃＤＮＡ分子または前記核酸アダプターのいずれかが、該２本鎖ｃＤＮＡ分子と該核酸アダプターとの間での連結に関与しない末端を介して固定されている、請求項６３に記載の方法。
【請求項６７】
前記ＮＡが、ニック形成エンドヌクレアーゼ（ＮＥ）である、請求項６３に記載の方法。
【請求項６８】
ｃＤＮＡライブラリーを作製するための方法であって、該方法は、以下：
ａ．生物学的サンプルから単離されたｍＲＮＡ分子を提供する工程；
ｂ．該ｍＲＮＡをテンプレートとして用いて２本鎖ｃＤＮＡ分子を調製する工程；および
ｃ．該２本鎖ｃＤＮＡ分子と、ニック形成剤認識配列（ＮＡＲＳ）を含む核酸アダプターとを連結する工程であって、その結果、該ＮＡＲＳを認識するニック形成剤およびＤＮＡポリメラーゼの存在下で、該連結産物をテンプレートとして用いて増幅される１本鎖核酸分子が、該２本鎖ｃＤＮＡ分子の１つの鎖の少なくとも一部分を含む、工程
を包含する、方法。
【請求項６９】
前記部分が、少なくとも８ヌクレオチド長である、請求項６８に記載の方法。
【請求項７０】
標的核酸中の規定の位置における単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）を同定するための方法であって、該方法は、以下：
（ａ）該規定の位置に該ＳＮＰを含む、該標的核酸の一部分を含み、かつ遺伝子バリエーションに対して５’側に位置するニック形成部位（ＮＳ）をさらに含む、部分的または完全に２本鎖のテンプレート核酸を提供する工程；
（ｂ）ＤＮＡポリメラーゼおよび該ＮＳにてニックを形成するニック形成エンドヌクレアーゼ（ＮＥ）の存在下で、そして等温条件下で、１７以下のヌクレオチドを含み、そしてその５’末端が該ＮＳにあった該遺伝子バリエーションを含む１本鎖核酸フラグメントを増幅する工程；ならびに
（ｃ）該１本鎖核酸フラグメントを、液体クロマトグラフィーおよび／または質量分析法を少なくとも部分的に用いて特徴付けし、それにより、該ＳＮＰを同定する工程
を包含する、方法。
【請求項７１】
前記ＮＥが、Ｎ．ＢｓｔＮＢ  Ｉである、請求項７０に記載の方法。
【請求項７２】
工程（ｂ）が、５０℃〜７０℃で行われる、請求項７０に記載の方法。
【請求項７３】
哺乳動物被験体由来の生物学的サンプル中の標的核酸の存在または不存在を決定するための方法であって、該方法は、以下：
（ａ）該サンプルの該核酸分子を、部分的に２本鎖のオリゴヌクレオチドプローブと混合して、該標的核酸に対する該プローブのハイブリダイゼーションを可能にする工程であって、該プローブは、以下：
（ｉ）ニック形成エンドヌクレアーゼ（ＮＥ）によって切断されてニック形成部位（ＮＳ）を生成し得るニック形成エンドヌクレアーゼ認識配列（ＮＥＲＳ）、および
（ｉｉ）該鎖もしくはその伸長産物のいずれかが、該ＮＳを含む、該鎖中の５’突出部、または
該鎖もその伸長産物のいずれも該ＮＳを含まない、該鎖中の３’突出部
を含み、
ここで、該突出部は、標的核酸に対して少なくとも実質的に相補的な核酸配列を含む、工程、
（ｂ）ハイブリダイズしていないプローブを、工程（ａ）の該混合物から除去する工程；
（ｃ）該ＮＥおよびＤＮＡポリメラーゼの存在下で等温条件条件下にて増幅反応を行って、１７以下のヌクレオチドを含む増幅産物を提供する工程；ならびに
（ｄ）工程（ｃ）の該増幅産物の存在または不存在を、液体クロマトグラフィーおよび／または質量分析法を少なくとも部分的に用いて検出し、それにより、該サンプル中の該標的核酸の存在または不存在を決定する工程
を包含する、方法。
【請求項７４】
工程（ｃ）の前記増幅産物が、１２以下のヌクレオチドを含む、請求項７３に記載の方法。
【請求項７５】
各々が第１鎖および第２鎖を有する標的核酸中の規定の位置での遺伝子バリエーションの多重同定のための方法であって、該方法は、以下：
（ａ）各標的核酸について、
（ｉ）第１オリゴヌクレオチドプライマー（ＯＤＮＰ）、第２ＯＤＮＰ、および該標的核酸の混合物を形成する工程であって、ここで
ａ）該標的核酸が、第１鎖および第２鎖を有する２本鎖核酸である場合、
該第１ＯＤＮＰは、ニック形成エンドヌクレアーゼ認識配列（ＮＥＲＳ）のセンス鎖の配列、および該遺伝子バリエーションの相補体の３’側に位置する、該標的核酸の該第１鎖のヌクレオチド配列に対して少なくとも実質的に相補的なヌクレオチド配列を含み、そして
該第２ＯＤＮＰは、制限エンドヌクレアーゼ認識配列（ＲＥＲＳ）の１つの鎖の任意の配列、および該遺伝子バリエーションの３’側に位置する、該標的核酸の該第２鎖のヌクレオチド配列に対して少なくとも実質的に相補的なヌクレオチド配列を含むか、
または
ｂ）該標的核酸が１本鎖核酸である場合、
該第１ＯＤＮＰは、ＮＥＲＳのセンス鎖の配列、および該遺伝子バリエーションの５’側に位置する、該標的核酸のヌクレオチド配列に対して少なくとも実質的に同一なヌクレオチド配列を含み、そして
該第２ＯＤＮＰは、ＲＥＲＳの１つの鎖の任意の配列、および該遺伝子バリエーションの３’側に位置する、該標的核酸のヌクレオチド配列に対して少なくとも実質的に相補的なヌクレオチド配列を含む、工程；
（ｉｉ）該第１ＯＤＮＰおよび該第２ＯＤＮＰを伸長して、該第１ＯＤＮＰおよび該第２ＯＤＮＰによって取り囲まれたフラグメントを生成する工程であって、ここで、該伸長反応は、各標的核酸について個々に、または１より多くの標的核酸について一緒にのいずれかで行われ得る、工程；
（ｂ）必要に応じて、該伸長産物を、該ＲＥＲＳを認識するＲＥによって切断する工程；
（ｃ）１本鎖核酸フラグメントを、該ＮＥＲＳを認識するニック形成エンドヌクレアーゼの存在下で、工程（ｂ）の各伸長産物または工程（ｃ）の各消化産物の１つの鎖をテンプレートとして用いて増幅する工程；ならびに
（ｄ）該１本鎖フラグメントを特徴付けし、それにより、該遺伝子バリエーションを同定する工程
を包含する、方法。
【請求項７６】
前記標的核酸が２本鎖である場合の、前記標的核酸の第１鎖に対して少なくとも実質的に相補的な、前記第１ＯＤＮＰの前記ヌクレオチド配列、または、該標的核酸が１本鎖であるある場合の、該標的核酸に対して少なくとも実質的に同一な該第１ＯＤＮＰの該ヌクレオチド配列が、少なくとも１２ヌクレオチド長である、請求項７５に記載の方法。
【請求項７７】
前記標的核酸が２本鎖である場合の、該標的核酸の第２鎖に対して少なくとも実質的に相補的な、前記第２ＯＤＮＰの前記ヌクレオチド配列、または、該標的核酸が２本鎖である場合の、該標的核酸に対して少なくとも実質的に相補的な該第２ＯＤＮＰの該ヌクレオチド配列が、少なくとも１２ヌクレオチド長である、請求項７５に記載の方法。
【請求項７８】
前記ＲＥＲＳが、中断された制限エンドヌクレアーゼによって認識され得る、請求項７５に記載の方法。
【請求項７９】
前記ＮＥＲＳが、５’ＧＡＧＴＣ３’である、請求項７５に記載の方法。
【請求項８０】
工程（ｃ）が、等温条件下で行われる、請求項７５に記載の方法。
【請求項８１】
工程（ｃ）の前記１本鎖核酸フラグメントが、１７以下のヌクレオチドを含む、請求項７５に記載の方法。
【請求項８２】
工程（ａ）（ｉｉ）の少なくとも２つの伸長反応の産物を、工程（ｃ）を行う前に合わせる工程をさらに包含する、請求項７５に記載の方法。
【請求項８３】
前記遺伝子バリエーションのうちの少なくとも１つが、単一ヌクレオチド多型である、請求項７５に記載の方法。
【請求項８４】
標的核酸中の規定の位置での遺伝子バリエーションを同定するためのキットであって、該キットは、以下：
（ａ）該標的核酸が、第１鎖および第２鎖を有する２本鎖核酸である場合、
（ｉ）ニック形成エンドヌクレアーゼ認識配列（ＮＥＲＳ）のセンス鎖の配列、および該遺伝子バリエーションの相補体の３’側に位置する、該標的核酸の該第１鎖のヌクレオチド配列に対して少なくとも実質的に相補的なヌクレオチド配列を含む、第１オリゴヌクレオチドプライマー（ＯＤＮＰ）、ならびに
（ｉｉ）制限エンドヌクレアーゼ認識配列（ＲＥＲＳ）の１つの鎖の任意の配列、および該遺伝子バリエーションの３’側に位置する、該標的核酸の該第２鎖のヌクレオチド配列に対して少なくとも実質的に相補的なヌクレオチド配列を含む、第２ＯＤＮＰ
を含むか；
または、
（ｂ）該標的核酸が１本鎖核酸である場合、
（ｉ）ＮＥＲＳのセンス鎖の配列、および該遺伝子バリエーションの５’側に位置する、該標的核酸のヌクレオチド配列に対して少なくとも実質的に同一のヌクレオチド配列を含む、該第１ＯＤＮＰ、ならびに
（ｉｉ）ＲＥＲＳの１つの鎖の任意の配列、および該遺伝子バリエーションの３’側に位置する、該標的核酸のヌクレオチド配列に対して少なくとも実質的に相補的なヌクレオチド配列を含む、該第２ＯＤＮＰ
を含む、キット。
【請求項８５】
前記第１ＯＤＮＰおよび前記第２ＯＤＮＰをプライマーとして、そして前記標的核酸をテンプレートとして用いて増幅された２本鎖核酸分子において、一方の鎖における前記ＮＥＲＳを認識するニック形成エンドヌクレアーゼ（ＮＥ）によって生成されるニック形成部位（ＮＳ）と、他方の鎖における前記ＲＥＲＳを認識する制限エンドヌクレアーゼ（ＲＥ）によって生成される切断部位に対応する位置との間の距離が、３５ヌクレオチド以下である、請求項８４に記載のキット。
【請求項８６】
一方の鎖における前記ＮＳと、他方の鎖における前記ＲＥの前記切断部位に対応する位置との間の距離が、２５ヌクレオチド以下である、請求項８４に記載のキット。
【請求項８７】
部分的に２本鎖のオリゴヌクレオチドプローブであって、該オリゴヌクレオチドプローブは、以下：
（ａ）ニック形成剤（ＮＡ）によって切断されてニック形成部位（ＮＳ）を生成し得る、ニック形成剤認識配列（ＮＡＲＳ）；
（ｂ）該ＮＳを含む鎖中の５’突出部、または該ＮＳを含まない鎖中の３’突出部のいずれかであって、ここで、各突出部は、標的核酸に対して少なくとも実質的に相補的な核酸配列を含む、突出部；ならびに
（ｃ）該鎖もその伸長産物も該ＮＳを含まない鎖中の配列であって、該配列は、該ＮＳに対応する位置の５’側に位置し、該配列は、該突出部が少なくとも実質的に相補的である標的核酸と唯一関連する、配列、
を含む、オリゴヌクレオチドプローブ。
【請求項８８】
前記標的核酸が、変性した２本鎖核酸のうちの１つの鎖である、請求項８７に記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
【請求項８９】
前記２本鎖核酸が、ゲノム核酸またはｃＤＮＡである、請求項８７に記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
【請求項９０】
前記２本鎖領域が、１２〜２０ヌクレオチド長である、請求項８７に記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
【請求項９１】
前記５’突出部または前記３’突出部が、８〜２０ヌクレオチド長である、請求項８７に記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
【請求項９２】
オリゴヌクレオチドプライマー（ＯＤＮＰ）対であって、該対は、第１ＯＤＮＰおよび第２ＯＤＮＰを含み、ここで、
（ａ）該第１ＯＤＮＰは、規定の位置の３’側に位置する、１本鎖標的核酸のヌクレオチド配列に対して少なくとも実質的に相補的であるヌクレオチド配列を含み；
（ｂ）該第２ＯＤＮＰは、規定の位置での該ヌクレオチドの少なくとも実質的に相補的なヌクレオチドの３’側の位置にて、該標的核酸の相補体のヌクレオチド配列に対して少なくとも実質的に相補的であるヌクレオチド配列を含み；
（ｃ）該第１ＯＤＮＰおよび該第２ＯＤＮＰは、それぞれ、中断された制限エンドヌクレアーゼ認識配列（ＩＲＥＲＳ）の第１鎖の第１定常認識配列（ＣＲＳ）および第２鎖の第２ＣＲＳをさらに含むが、完全ＩＲＥＲＳは含まず、該完全ＩＲＥＲＳは、該第１鎖および該第２鎖を有する２本鎖核酸であって、かつ可変認識配列（ＶＲＳ）によって連結される該第１ＣＲＳおよび該第２ＣＲＳを含み、そして
（ｄ）該第１ＯＤＮＰまたは該第２ＯＤＮＰのいずれかは、該第１ＣＲＳまたは該第２ＣＲＳの５’側に位置するＮＥＲＳをさらに含む、オリゴヌクレオチドプライマー対。
【請求項９３】
核酸集団中の、第１核酸分子の数の、第２核酸分子の数に対する比を決定するための方法であって、ここで、該第１核酸分子の配列と該第２核酸分子の配列とが、規定の位置を除いて同一であり、該方法は、以下：
（ａ）第１オリゴヌクレオチドプライマー（ＯＤＮＰ）、第２ＯＤＮＰおよび該核酸集団を混合する工程であって、ここで
（ｉ）該第１核酸および該第２核酸が２本鎖であって、各々、第１鎖および第２鎖を有する場合、
ａ）該第１ＯＤＮＰは、該規定の位置の３’側に位置する、該第１核酸の該第１鎖の核酸配列に対して少なくとも実質的に相補的なヌクレオチド配列を含み、そして
ｂ）該第２ＯＤＮＰは、該規定の位置の３’側に位置する、該第１核酸の該第２鎖の核酸配列に対して少なくとも実質的に相補的なヌクレオチド配列を含むか、
または
（ｉｉ）該第１核酸および該第２核酸が、１本鎖である場合、
ａ）該第１ＯＤＮＰは、該規定の位置の５’側に位置する、該第１核酸の核酸配列に対して少なくとも実質的に同一なヌクレオチド配列を含み、そして
ｂ）該第２ＯＤＮＰは、該規定の位置の３’側に位置する該第１核酸の核酸配列に対して少なくとも実質的に相補的なヌクレオチド配列を含み；そして
該第１ＯＤＮＰおよび該第２ＯＤＮＰのうちの少なくとも一方が、ニック形成エンドヌクレアーゼ認識配列（ＮＥＲＳ）のセンス鎖の配列をさらに含む、工程；
（ｂ）該第１ＯＤＮＰおよび該第２ＯＤＮＰを伸長して、該第１ＯＤＮＰおよび該第２ＯＤＮＰによって取り囲まれたフラグメントを生成する工程；
（ｃ）ＤＮＡポリメラーゼおよび該ＮＥＲＳを認識するニック形成エンドヌクレアーゼ（ＮＥ）の存在下で、等温条件下にて、１本鎖核酸フラグメントを増幅する工程であって
、ここで、該１本鎖核酸フラグメントが各々、１７以下のヌクレオチドを含む、工程；ならびに
（ｄ）液体クロマトグラフィーおよび／または質量分析法を少なくとも部分的に用いて、該第１核酸に由来する工程（ｃ）の該１本鎖核酸フラグメントの数の、該第２核酸に由来する工程（ｃ）の該１本鎖核酸フラグメントの数に対する比を決定する、工程
を包含する、方法。
【請求項９４】
核酸集団中の規定の位置における遺伝子バリエーションを用いて、標的核酸分子の対立遺伝子頻度を決定するための方法であって、該方法は、以下：
（ａ）第１オリゴヌクレオチドプライマー（ＯＤＮＰ）、第２ＯＤＮＰおよび該核酸集団を混合する工程であって、ここで
（ｉ）該標的核酸が２本鎖であって、第１鎖および第２鎖を含む場合、
ａ）該第１ＯＤＮＰは、該規定の位置の３’側に位置する、該標的核酸の該第１鎖の核酸配列に対して少なくとも実質的に相補的なヌクレオチド配列を含み、そして
ｂ）該第２ＯＤＮＰは、該規定の位置の３’側に位置する、該標的核酸の該第２鎖の核酸配列に対して少なくとも実質的に相補的なヌクレオチド配列を含むか、
または
（ｉｉ）該標的核酸が、１本鎖である場合、
ａ）該第１ＯＤＮＰは、該規定の位置の５’側に位置する、該標的核酸の核酸配列に対して少なくとも実質的に同一なヌクレオチド配列を含み、そして
ｂ）該第２ＯＤＮＰは、該規定の位置の３’側に位置する該標的核酸の核酸配列に対して少なくとも実質的に相補的なヌクレオチド配列を含み；そして
該第１ＯＤＮＰおよび該第２ＯＤＮＰのうちの少なくとも一方が、ニック形成エンドヌクレアーゼ認識配列（ＮＥＲＳ）のセンス鎖の配列をさらに含む、工程；
（ｂ）該第１ＯＤＮＰおよび該第２ＯＤＮＰを伸長して、該第１ＯＤＮＰおよび該第２ＯＤＮＰによって取り囲まれたフラグメントを生成する工程；
（ｃ）ＤＮＡポリメラーゼおよび該ＮＥＲＳを認識するニック形成エンドヌクレアーゼ（ＮＥ）の存在下で、等温条件にて、１本鎖核酸フラグメントを増幅する工程であって、ここで、該１本鎖核酸フラグメントは各々、１７以下のヌクレオチドを含む、工程；ならびに
（ｄ）液体クロマトグラフィーおよび質量分析法を少なくとも部分的に用いて、該遺伝子バリエーション以外は産物Ａの部分と同一である、工程（ｃ）の該１本鎖核酸フラグメントの全てにおける、該標的核酸の該遺伝子バリエーションを含む、工程（ｃ）の１本鎖核酸フラグメント（産物Ａ）の百分率を決定し、それにより、該標的核酸の該対立遺伝子頻度を決定する工程
を包含する、方法。
【請求項９５】
核酸アダプターであって、該核酸アダプターは、以下：
（ａ）必要に応じたＩＩｓ型制限エンドヌクレアーゼ認識配列（ＴＲＥＲＳ）；および
（ｂ）ニック形成剤認識配列（ＮＡＲＳ）
を含み、
ここで、該アダプターが、該ＮＡＲＳを認識するニック形成剤（ＮＡ）の該ニック形成部位（ＮＳ）を含まない該鎖において該ＮＡＲＳの５’側に該標的核酸フラグメントが位置するように２本鎖標的核酸フラグメントに連結される場合、該ＴＲＥＲＳが存在するならば、該鎖中の該ＴＲＥＲＳを認識するＩＩｓ型制限エンドヌクレアーゼの該切断部位は、
（ｉ）該２本鎖標的核酸フラグメント内、および
（ｉｉ）該ＮＳに対応する位置の５’側
の両方である位置に位置する、
核酸アダプター。
【請求項９６】
前記ＮＡが、ニック形成エンドヌクレアーゼ（ＮＥ）である、請求項９５に記載の核酸アダプター。
【請求項９７】
前記ＮＳを含む前記鎖において、前記ＴＲＥＲＳが、前記ＮＡＲＳの５’に位置する、請求項９５に記載の核酸アダプター。
【請求項９８】
前記ＮＳを含む前記鎖において、前記ＴＲＥＲＳが、前記ＮＡＲＳの３’に位置する、請求項９５に記載の核酸アダプター。
【請求項９９】
前記ＴＲＥＲＳが、Ｂｐｍ  ＩまたはＭｍｅ  Ｉによって認識され得る、請求項９５に記載の核酸アダプター。
【請求項１００】
前記アダプターが、前記標的核酸フラグメントと連結するための３’突出部を有する、請求項９５に記載の核酸アダプター。
【請求項１０１】
前記アダプターが、前記標的核酸フラグメントと連結するための５’突出部を有する、請求項９５に記載の核酸アダプター。
【請求項１０２】
前記アダプターが、前記標的核酸フラグメントと連結するための平滑末端を有する、請求項９５に記載の核酸アダプター。
【請求項１０３】
核酸アダプターであって、該核酸アダプターは、以下：
（ａ）ＩＩｓ型制限エンドヌクレアーゼ認識配列（ＴＲＥＲＳ）；および
（ｂ）ニック形成剤認識配列（ＮＡＲＳ）
を含み、
ここで、該アダプターが、該ＮＡＲＳを認識するニック形成剤（ＮＡ）の該ニック形成部位（ＮＳ）を含まない該鎖において該標的核酸フラグメントが該ＮＡＲＳの５’側に位置するように２本鎖標的核酸フラグメントに連結される場合、該鎖中の該ＴＲＥＲＳを認識するＩＩｓ型制限エンドヌクレアーゼの該切断部位は、
（ｉ）該２本鎖標的核酸フラグメント内、および
（ｉｉ）該ＮＳに対応する位置の５’側
の両方である位置に位置する、
核酸アダプター。
【請求項１０４】
１本鎖ｃＤＮＡ分子を合成するためのテンプレート核酸分子であって、該テンプレート核酸分子は、以下：
（ａ）２本鎖ｃＤＮＡ分子またはそのフラグメント；および
（ｂ）ニック形成剤認識配列（ＮＡＲＳ）を認識するニック形成剤（ＮＡ）およびＤＮＡポリメラーゼの存在下で、連結産物をテンプレートとして用いて増幅された該１本鎖ｃＤＮＡ分子が、該２本鎖ｃＤＮＡまたはそのフラグメントの１つの鎖の少なくとも一部分を含むように、該２本鎖ｃＤＮＡ分子またはそのフラグメントに連結された該ＮＡＲＳを含み、該部分が、少なくとも８ヌクレオチド長である、核酸アダプター
を含む、テンプレート核酸分子。
【請求項１０５】
前記テンプレート核酸分子の少なくとも１つの鎖が、該２本鎖ｃＤＮＡ分子と該核酸アダプターとの間の、連結に関与していない、前記２本鎖ｃＤＮＡ分子または前記核酸アダプターのいずれかの末端を介して固体支持体へと固定されている、請求項１０４に記載のテンプレート核酸分子。
【請求項１０６】
リンカー分子が、固相と前記テンプレート核酸分子の前記末端との間に存在する、請求項１０４に記載のテンプレート核酸分子。
【請求項１０７】
前記リンカーが、制限エンドヌクレアーゼ認識配列（ＲＥＲＳ）の１つの鎖の配列を含む、請求項１０６に記載のテンプレート核酸分子。
【請求項１０８】
方法であって、該方法が、以下：
（ａ）２本鎖核酸を提供する工程であって、該２本鎖核酸が、以下
（ｉ）必要に応じたＩＩｓ型制限エンドヌクレアーゼ認識配列（ＴＲＥＲＳ）、
（ｉｉ）ニック形成剤認識配列（ＮＡＲＳ）、および
（ｉｉｉ）標的核酸フラグメント、
を含み、
ここで、該ＮＡＲＳを認識するニック形成剤（ＮＡ）のニック形成部位（ＮＳ）を含まない鎖において、
（１）該標的核酸フラグメントは、該ＮＡＲＳの５’側に位置し、そして
（２）該ＴＲＥＲＳが存在する場合、該ＴＲＥＲＳを認識するＩＩｓ型制限エンドヌクレアーゼの切断部位が、該標的核酸フラグメント内であって、該ＮＳに対応する位置の５’側でもある位置に位置する、工程；
（ｂ）該２本鎖核酸を、該ＴＲＥＲＳを認識するＩＩｓ型制限エンドヌクレアーゼを用いて、必要に応じて切断する工程；ならびに
（ｃ）該ＮＡＲＳを認識するＮＡの存在下で、１本鎖核酸フラグメントを増幅する工程を包含する、方法。
【請求項１０９】
方法であって、該方法は、以下：
（ａ）２本鎖核酸を提供する工程であって、該２本鎖核酸は、以下：
（ｉ）ＩＩｓ型制限エンドヌクレアーゼ認識配列（ＴＲＥＲＳ）、
（ｉｉ）ニック形成エンドヌクレアーゼ認識配列（ＮＥＲＳ）、および
（ｉｉｉ）標的核酸フラグメント
を含み、
ここで、該ＮＥＲＳを認識するニック形成エンドヌクレアーゼ（ＮＥ）の該ニック形成部位（ＮＳ）を含まない鎖において、
（１）該標的核酸フラグメントは、該ＮＥＲＳの５’側に位置する、工程、および
（２）該ＴＲＥＲＳを認識するＩＩｓ型制限エンドヌクレアーゼの該切断部位は、該標的核酸フラグメント内であって、該ＮＳに対応する位置の５’側でもある位置に位置する、
標的核酸フラグメント
を提供する、工程；
（ｂ）該２本鎖核酸を、該ＴＲＥＲＳを認識するＩＩｓ型制限エンドヌクレアーゼで切断する工程で切断する工程；ならびに
（ｃ）該ＮＡＲＳを認識するＮＡの存在下で等温条件にて、１本鎖核酸フラグメントを増幅する工程であって、ここで、該１本鎖核酸フラグメントは、２５以下のヌクレオチドを含む、工程
を包含する、方法。
【請求項１１０】
複数の１本鎖核酸プローブを作製するための方法であって、該方法は、以下：
（ａ）２本鎖核酸を提供する工程であって、該２本鎖は各々、以下：
（ｉ）必要に応じたＩＩｓ型制限エンドヌクレアーゼ認識配列（ＴＲＥＲＳ）、
（ｉｉ）ニック形成剤認識配列（ＮＡＲＳ）、および
（ｉｉｉ）標的核酸フラグメントを含み、
ここで、該ＮＡＲＳを認識するニック形成剤（ＮＡ）のニック形成部位（ＮＳ）を含まない鎖において、
（１）該標的核酸フラグメントは、該ＮＡＲＳの５’側に位置し、そして
（２）該ＴＲＥＲＳが存在する場合、該ＴＲＥＲＳを認識するＩＩｓ型制限エンドヌクレアーゼの切断部位が、該標的核酸フラグメント内であって、該ＮＳに対応する位置の５’側でもある位置に位置する、工程；
（ｂ）該２本鎖核酸を、該ＴＲＥＲＳを認識するＩＩｓ型制限エンドヌクレアーゼを用いて、必要に応じて切断する工程；ならびに
（ｃ）該ＮＡＲＳを認識するＮＡの存在下で、１本鎖核酸フラグメントを増幅する工程を包含する、方法。
【請求項１１１】
複数の１本鎖核酸プローブを作製するための方法であって、該方法は、以下：
（ａ）２本鎖核酸を提供する工程であって、該２本鎖核酸は各々は、以下：
（ｉ）ＩＩｓ型制限エンドヌクレアーゼ認識配列（ＴＲＥＲＳ）、
（ｉｉ）ニック形成エンドヌクレアーゼ認識配列（ＮＥＲＳ）、および
（ｉｉｉ）標的核酸フラグメント
を含み、
ここで、該ＮＥＲＳを認識するニック形成エンドヌクレアーゼ（ＮＥ）の該ニック形成部位（ＮＳ）を含まない鎖において、
（１）該標的核酸フラグメントは、該ＮＥＲＳの５’側に位置する、工程、および
（２）該ＴＲＥＲＳが存在する場合、該ＴＲＥＲＳを認識するＩＩｓ型制限エンドヌクレアーゼの該切断部位は、該標的核酸フラグメント内であって、該ＮＳに対応する位置の５’側でもある位置に位置する、
標的核酸フラグメント
を含む、工程；
（ｂ）該２本鎖核酸を、該ＴＲＥＲＳを認識するＩＩｓ型制限エンドヌクレアーゼで切断する工程で切断する工程；ならびに
（ｃ）該ＮＥＲＳを認識するＮＥの存在下で等温条件にて、１本鎖核酸フラグメントを増幅する工程であって、ここで、該１本鎖核酸フラグメントは、各々、２５以下のヌクレオチドを含む、工程
を包含する、方法。
【請求項１１２】
ｃＤＮＡ分子中の遺伝子の上流エキソン（エキソンＡ）と下流エキソン（エキソンＢ）との間の連結部の存在または不存在を検出するための方法であって、該方法は、以下：
（ａ）第１オリゴヌクレオチドプライマー（ＯＤＮＰ）、第２ＯＤＮＰ、および該ｃＤＮＡを混合する工程であって、ここで
該第１ＯＤＮＰは、エキソンＡのアンチセンス鎖の一部分に対して少なくとも実質的に相補的な配列を、該アンチセンス鎖中のエキソンＡの５’末端付近に含み、
該第２ＯＤＮＰは、エキソンＢのセンス鎖の一部分に対して少なくとも実質的に相補的な配列を、該センス鎖中のエキソンＢの５’末端付近に含み、そして
該第１ＯＤＮＰおよび該第２ＯＤＮＰのうちの少なくとも一方は、ニック形成エンドヌクレアーゼ認識配列（ＮＥＲＳ）のセンス鎖の配列をさらに含む、工程；
（ｂ）エキソンＡおよびエキソンＢの両方が該ｃＤＮＡ中に存在するならば、該第１ＯＤＮＰおよび該第２ＯＤＮＰによって取り囲まれたフラグメントが生成される条件下で、伸長反応を行う工程；
（ｃ）ＤＮＡポリメラーゼ、および該ＮＥＲＳを認識するニック形成エンドヌクレアーゼ（ＮＥ）の存在下で、等温条件にて増幅反応を行う工程；ならびに
（ｄ）工程（ｃ）の増幅産物が存在するならば、液体クロマトグラフィーおよび／または質量分析法を少なくとも部分的に用いて、該増幅産物を特徴付けして、それにより、エキソンＡとエキソンＢとの間の該連結部の存在または不存在を決定する工程
を包含する、方法。
【請求項１１３】
ｃＤＮＡ分子またはｃＤＮＡ集団において、ｎ個のエキソンを含む遺伝子の任意の２つのエキソンの間の各潜在的連結部の存在または不存在を検出するための方法であって、ここで、ｎは２以上の整数であり、エキソンＡは最も上流のエキソンであり、そしてエキソンＮは最も下流のエキソンであり；該方法は、以下：
（ａ）第１セットのオリゴヌクレオチドプライマー（ＯＤＮＰ）、第２セットのＯＤＮＰ、および該ｃＤＮＡ分子または該ｃＤＮＡ集団を混合する工程であって、ここで、
該第１セットのＯＤＮＰは、エキソンＡを除く該エキソンのうちの１つにそれぞれ対応するｎ−１個のＯＤＮＰを含み、該ＯＤＮＰの各々は、対応するエキソンのセンス鎖の一部分に対して少なくとも実質的に相補的な配列を、該鎖中の該エキソンの５’末端近傍に含み、
該第２セットのＯＤＮＰは、エキソンＮ以外は該エキソンのうちの１つにそれぞれ対応するｎ−１個のＯＤＮＰを含み、該ＯＤＮＰの各々は、対応するエキソンのアンチセンス鎖の一部分に対して少なくとも実質的に相補的な配列を、該鎖中の該エキソンの５’末端付近に含み、そして
少なくとも１つのＯＤＮＰセットの該ＯＤＮＰの各々は、ニック形成剤認識配列（ＮＡＲＳ）のセンス鎖の配列をさらに含む、工程；
（ｂ）該第１ＯＤＮＰセット由来の１つのＯＤＮＰと、該第２ＯＤＮＰセット由来の別のＯＤＮＰとによって取り囲まれたフラグメントを増幅する工程；
（ｃ）ＤＮＡポリメラーゼ、および該ＮＡＲＳを認識するニック形成剤（ＮＡ）の存在下で増幅反応を行う工程；ならびに
（ｄ）工程（ｃ）の増幅産物の存在または不存在を検出し、それにより、各潜在的連結部の存在または不存在を決定する工程
を包含する、方法。
【請求項１１４】
ｃＤＮＡ分子またはｃＤＮＡ集団において、ｎ個のエキソンを含む遺伝子の各２つのエキソンの間の連結部の存在または不存在を検出するための方法であって、ここで、ｎは２以上の整数であり、エキソンＡは最も上流のエキソンであり、そしてエキソンＮは最も下流のエキソンであり；該方法は、以下：
（ａ）第１セットのオリゴヌクレオチドプライマー（ＯＤＮＰ）、第２セットのＯＤＮＰ、および該ｃＤＮＡ分子または該ｃＤＮＡ集団を混合する工程であって、ここで、
該第１セットのＯＤＮＰは、エキソンＡを除く該エキソンのうちの１つにそれぞれ対応するｎ−１個のＯＤＮＰを含み、該ＯＤＮＰの各々は、対応するエキソンのセンス鎖の一部分に対して少なくとも実質的に相補的な配列を、該鎖中の該エキソンの５’末端近傍に含み、
該第２セットのＯＤＮＰは、エキソンＮ以外は該エキソンのうちの１つにそれぞれ対応するｎ−１個のＯＤＮＰを含み、該ＯＤＮＰの各々は、対応するエキソンのアンチセンス鎖の一部分に対して少なくとも実質的に相補的な配列を、該鎖中の該エキソンの５’末端付近に含み、そして
少なくとも１つのＯＤＮＰセットの該ＯＤＮＰの各々は、ニック形成エンドヌクレアーゼ認識配列（ＮＥＲＳ）のセンス鎖の配列をさらに含む、工程；
（ｂ）該第１ＯＤＮＰセット由来の１つのＯＤＮＰと、該第２ＯＤＮＰセット由来の別のＯＤＮＰとによって取り囲まれたフラグメントを増幅する工程；
（ｃ）ＤＮＡポリメラーゼ、および該ＮＥＲＳを認識するニック形成エンドヌクレアーゼ（ＮＥ）の存在下で、等温条件にて、増幅反応を行う工程；ならびに
（ｄ）液体クロマトグラフィーおよび／または質量分析法を少なくとも部分的に用いて、工程（ｃ）の増幅産物の存在または不存在を検出し、それにより、各潜在的連結部の存在または不存在を決定する工程
を包含する、方法。
【請求項１１５】
ｃＤＮＡ集団中の遺伝子の選択的スプライシングを決定するための方法であって、該方法は、以下：
（ａ）請求項１１４に記載の方法に従って該遺伝子の任意の２つのエキソンの間の各潜在的連結部の存在または不存在を決定する工程；および
（ｂ）該遺伝子の少なくとも１つエキソンについて、該エキソンの少なくとも１つ末端にて、１より多くの連結部が存在するならば、該ｃＤＮＡ集団中の該遺伝子の選択的スプライシングの存在を示す工程
を包含する、方法。
【請求項１１６】
第１鎖および第２鎖を有する標的核酸中の規定の位置での遺伝子バリエーションを同定するためのキットであって、該キットは、以下：
（Ａ）第１オリゴヌクレオチドプライマー（ＯＤＮＰ）および第２オリゴヌクレオチドプライマー（ＯＤＮＰ）であって、ここで、
（１）該標的核酸が、第１鎖および第２鎖を有する２本鎖核酸である場合、
（ａ）該第１ＯＤＮＰは、該遺伝子バリエーションの相補体の３’側に位置する該標的核酸の該第１鎖のヌクレオチド配列に対して少なくとも実質的に相補的なヌクレオチド配列を含み、そして
（ｂ）該第２ＯＤＮＰは、該遺伝子バリエーションの３’側に位置する該標的核酸の該第２鎖のヌクレオチド配列に対して少なくとも実質的に相補的なヌクレオチド配列を含むか；
または
該標的核酸が、１本鎖核酸である場合、
（ａ）該第１ＯＤＮＰは、該遺伝子バリエーションの５’側に位置する該標的核酸のヌクレオチド配列に対して少なくとも実質的に同一なヌクレオチド配列を含み、そして
（ｂ）該第２ＯＤＮＰは、該遺伝子バリエーションの３’側に位置する該標的核酸のヌクレオチド配列に対して少なくとも実質的に相補的なヌクレオチド配列を含み；
（２）ここで、該第１ＯＤＮＰおよび該第２ＯＤＮＰは各々、ニック形成エンドヌクレアーゼ認識配列（ＮＥＲＳ）のセンス鎖の配列をさらに含み；そして
（３）ここで、一方の鎖中の該ＮＥＲＳを認識するニック形成エンドヌクレアーゼによって産生されるニック形成部位（ＮＳ）と、他方の鎖中の該ＮＥによって産生されるＮＳに対応する位置との間の距離が、２５ヌクレオチド以下である、第１ＯＤＮＰおよび第２ＯＤＮＰ；
（Ｂ）該ニック形成エンドヌクレアーゼ認識配列を認識するニック形成エンドヌクレアーゼ；
（Ｃ）ＤＮＡポリメラーゼ；
（Ｄ）液体クロマトグラフィーカラム；
（Ｅ）水、および有機酸または無機酸と錯化した２級アミンまたは３級アミンのアンモニウム塩を含む、緩衝液Ａ；
（Ｆ）緩衝液Ａおよび有機溶媒を含む、緩衝液Ｂ；ならびに
（Ｇ）鎖置換促進剤
を備える、キット。
【請求項１１７】
方法であって、該方法は、以下：
（ａ）ニック形成剤認識配列（ＮＡＲＳ）を含む、部分的または完全に２本鎖のテンプレート核酸分子、該ＮＡＲＳを認識するニック形成剤（ＮＡ）、ＤＮＡポリメラーゼ、および１以上のデオキシリボヌクレオシド三リン酸の混合物を形成する工程；
（ｂ）工程（ａ）の該混合物を、１本鎖核酸フラグメントの増幅を可能にする条件下で維持する工程
を包含し、ここで、該１本鎖核酸フラグメントは、該ＤＮＡポリメラーゼまたは該鎖置換促進剤の任意の鎖置換活性の不存在下で、該テンプレート核酸から解離し得る、方法。
【請求項１１８】
方法であって、該方法は、以下：
（ａ）部分的または完全に２本鎖のテンプレート核酸を、ニック形成剤（ＮＡ）と接触させる工程であって、該テンプレートは、ニック形成剤認識配列（ＮＡＲＳ）を含む、工程；
（ｂ）該テンプレートが、該ＮＡによってニック形成可能なニック形成部位（ＮＳ）を含まないならば、該テンプレートを伸長して、該ＮＳを提供する工程；
（ｃ）該テンプレートまたはその伸長産物を該ＮＳにてニック形成して、該ＮＳにて新たな３’末端を含む、ニック形成された産物、および該ＮＳにて新たな５’末端を含む、ニック形成された産物を提供する工程であって；ここで、該ＮＳにて該新たな３’末端を含む、ニック形成された産物と、該ＮＡＲＳのアンチセンス鎖の配列を含む、該テンプレートまたはその伸長産物の鎖との間で形成された二重鎖の融解温度は、該ＮＳにて該新たな３’末端を含む、該ニック形成された産物と、該テンプレートまたはその伸長産物の同じ鎖との間で形成された二重鎖の融解温度よりも高い、工程；
（ｄ）該ＮＳにて該新たな３’末端を含む、工程（ｃ）の該ニック形成された産物を伸長する工程；
（ｅ）工程（ｃ）および工程（ｄ）を繰り返して、１本鎖核酸フラグメントを増幅する工程
を包含する、方法。
【請求項１１９】
前記ＮＡＲＳが、少なくとも１つのミスマッチ塩基対を含む、請求項６３、請求項７３、請求項１１７、または請求項１１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２０】
前記ＮＡＲＳが、少なくとも１つのミスマッチ塩基対を含む、請求項８７に記載のプローブ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の背景）
（技術分野）
本発明は、分子生物学の分野に関し、より詳細には、核酸に関与する、方法および組成物に関し、さらにより詳細には、ニック形成剤を用いて核酸フラグメントを増幅するための、方法および組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
（関連技術の説明）
ヒトゲノムプロジェクトによって達成された８０，０００〜１００，０００のヒト遺伝子の各々の、染色体マッピングおよび核酸配列決定は、遺伝疾患の原因のヌクレオチド遺伝子座の同定に対する包括的アプローチについての機会を提供する。１５０〜２００の一般的遺伝疾患の多く、および約６００〜８００のより稀な遺伝疾患は、１以上の欠損遺伝子に関連している。これらのうち、２００を超えるヒト疾患は、しばしば、単一アミノ酸残基の変化をもたらす、単一の遺伝子における欠損によって引き起こされることが公知である（Ｏｌｓｅｎ，「Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ａｎ  Ｉｎｄｕｓｔｒｙ  Ｃｏｍｅｓ  ｏｆ  Ａｇｅ」（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９８６））。
【０００３】
体細胞において生じる変異は、この変異が、細胞分裂制御に関与する遺伝子に影響を与える場合、疾患を誘発し得、例えば、腫瘍形成となり得る。生殖細胞系列においては、多くの遺伝子における機能喪失（ｌｏｓｓ−ｏｆ−ｆｕｎｃｔｉｏｎ）変異は、検出可能な表現型をヒトにおいて生じ得る。１つの配偶子から子孫中の配偶子までの、この生殖細胞系列中の細胞世代の数は、男性生殖細胞系列において、女性生殖細胞系列においてよりも、約２０倍多くあり得る。女性において、卵は、第２減数分裂後に形成され、そして４０歳まで持続する。それゆえ、異なる種類の生殖細胞系列変異および染色体異常の発生数は、起源である親に依存する。
【０００４】
大多数の変異（生殖細胞系列変異または体細胞変異）は、生物に対してほとんどコンセンサスがない。なぜなら、ゲノムの大部分（約９４％）は、コード機能を欠くようであるからである。遺伝暗号の縮重、そしてこのアミノ酸置換がタンパク質の機能に対してわずかにしか影響を与えないかもしれないことの両方に起因して、エキソン領域内でさえ、変異に対する何らかの耐性が存在する（例えば、Ｓｔｒｏｎｇら，Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ３２５：１５９７（１９９１）を参照のこと）。大きなＤＮＡセグメント中の変異を検出するためのますます効率的な方法の開発に伴って、変異の機能的コンセンサス（例えば、臨床表現型）を予測する必要性は、より重要になっている。
【０００５】
分子遺伝子技術は、遺伝疾患および悪性疾患における染色体異常の診断において、顕著な程度までは用いられていない；細胞遺伝学は、これらの重要な遺伝子機構を調査するために好ましい技術のままである。１コピーの変異した腫瘍サプレッサー遺伝子を有する個体では、残りの正常対立遺伝子は、１０３〜１０４あたり１細胞において、第２コピーの変異体対立遺伝子によって置換され得る。この置換を引き起こす機構としては、染色体不分離、有糸分裂組換え、および遺伝子変換が挙げられる。対照的に、残りの遺伝子コピーの機能を破壊する独立変異は、１０６あたり１つの細胞において生じると見積もられる。
【０００６】
高感度の変異検出技術は、変異スクリーニングについての驚くべき可能性を提供する。例えば、分析は、受精卵の着床前にさえ実施され得る（Ｈｏｌｄｉｎｇら，Ｌａｎｃｅｔ  ３：５３２（１９８９））。ますます効率的な遺伝子試験もまた、健康検査に関連した、気道または膀胱から剥離した細胞における発癌変異についてのスクリーニングを許容し得る（Ｓｉｄｒａｎｓｋｙら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５２：７０６，１９９１）。あるいは、未知の遺伝子が遺伝子疾患を引き起こす場合、ＤＮＡ配列改変体をモニタリングするための方法は、遺伝子連鎖分析を介して疾患の遺伝を研究するために有用である。個々の遺伝子における変異の検出のためのこれらの独特の適用にもかかわらず、このような適用を達成するための既存の方法論は、技術的挑戦および経済的挑戦を提起し続ける。いくつかの異なるアプローチが探求されているが、幅広いスケールの適用について充分に効率的でかつ費用対効果に優れたものはない。
【０００７】
規定のヌクレオチド遺伝子座における変異を検出するための従来方法は、「読み出す」のが困難である、制限されたセットの遺伝子マーカーを用いた、家族における、時間のかかる連鎖分析を含む。このような方法としては、例えば、ＤＮＡマーカーハプロタイプ分類（ｈａｐｌｏｔｙｐｉｎｇ）（影響を受けた遺伝子を有する染色体を同定する）、ならびに主な再配置（例えば、大きな欠失、重複、トランスロケーションおよび１塩基対変異）を検出するための方法が挙げられる。これらの方法としては、走査、スクリーニングおよび蛍光共鳴エネルギー輸送（ＦＲＥＴ）に基づく技術が挙げられる（Ｃｏｔｔｏｎ，「Ｍｕｔａｔｉｏｎ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ」（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９９７）を参照のこと）。
【０００８】
少量の変異を検出する高感度アッセイは、標的配列を増幅するためにＰＣＲに頼る。しかし、これらのアッセイは、ＰＣＲ試薬に関連した高コストが欠点である。さらに、変異を含む増幅された核酸フラグメントを検出および／または特徴付けするための現行方法は、遺伝子バリエーションの高度の多重同定を可能にするほど充分には開発されていない。
【０００９】
遺伝子変異を検出するための既存の方法論における欠点に部分的に起因して、標的核酸内の規定のヌクレオチド遺伝子座における変異を検出するための迅速かつ高感度の方法についての、まだ対処されていない必要性が存在する。本発明は、とりわけ、増大した速度および便利さ、ならびに低減したコストを提示する、標的核酸中の規定のヌクレオチド遺伝子座における変異の検出のための方法を提供することによって、この必要性および他の関連する必要性を満たす。本明細書中以下でよ詳細に開示するように、本発明による方法は、遺伝子バリエーションを規定の位置に含む核酸フラグメントを、ニック形成剤を用いて増幅することに基づく。さらに、本発明はまた、生物学的サンプル中の特定の核酸の存在または不存在を検出するための方法および組成物；１本鎖核酸プローブを調製するための方法および組成物；ならびにｍＲＮＡ分子またはｃＤＮＡ分子中の２つのエキソンの間の連結部の存在または不存在を検出するための方法および組成物を提供する。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
（発明の要旨）
１つの局面では、本発明は、以下を包含する方法を提供する：（ａ）テンプレート核酸分子を、ニック形成剤（ＮＡ）と接触させる工程であって、ここで、このテンプレート核酸分子（「テンプレート」）が、このＮＡによって認識され得るニック形成剤認識配列（ＮＡＲＳ）を含む、工程。１つの実施形態では、このテンプレートは、部分的に２本鎖であり、１つの実施形態では、このＮＡＲＳは、このテンプレートの１本鎖部分内にあり、一方、別の実施形態では、このＮＡＲＳは、このテンプレートの２本鎖部分内にある。別の実施形態では、このテンプレートは、完全に２本鎖である。（ｂ）このテンプレートが、このＮＡによってニック形成され得るニック形成部位（ＮＳ）を含まないならば、この方法は、このテンプレートの伸長産物を形成するように、このテンプレートの１つの鎖を伸長させる工程を提供し、ここで、この伸長産物は、このＮＡによってニック形成可能なＮＳを含む。（ｃ）このテンプレートまたはその伸長産物をこのＮＳにおいてニック形成する工程。これは、このＮＳにおいて３’末端および５’末端を提供する。次に記載するように、このニック形成部位にて５’末端を有する複数コピーの核酸フラグメントは、以下の工程によって調製される。（ｄ）工程（ｃ）のこのニック形成された産物を、このＮＳにおいて３’末端から伸長させる工程。（ｅ）工程（ｃ）および工程（ｄ）を繰返し、それにより、１本鎖核酸フラグメントを増幅する工程。本発明の種々の実施形態では、この１本鎖核酸フラグメントは、５０以下、または４５以下、または４０以下、または３５以下、または３０以下、または２５以下、または２４以下、または２３以下、または２２以下、または２１以下、または２０以下、または１９以下、または１８以下、または１７以下、または１６以下、または１５以下、または１４以下、または１３以下、または１２以下、または１１以下、または１０以下、または９以下、または８以下、または７以下、または６以下、または５以下、または４以下、または３以下、または２以下、または１の、ヌクレオチドを有する。一般に、５０以下、４５以下などのヌクレオチドを有する１本鎖核酸フラグメントの形成は、５０より多い、４５より多いなどのヌクレオチドを有するフラグメントを形成することと比較して、少なくとも以下の理由について有利である：フラグメント形成の割合および効率がより大きく、より小さいフラグメントが、いくつかの特徴付け方法（例えば、質量分析法および液体クロマトグラフィー）によって、より高レベルの識別まで、より容易に特徴付けされ、そして伸長工程は、鎖置換活性を必ずしも有さないＤＮＡポリメラーゼを用いて実施され得る。
【００１１】
以下の基準は、本発明のこの方法をさらに記載するために用いられ得る、さらなる基準の例示である。本明細書中に開示されるとおりの任意の１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つなどの基準（以下の基準を含む）は、本発明のこの方法を記載する際に合わされ得る。２つの基準（ＡおよびＢ）が互いに矛盾する場合、これらは、別の方法で合わされ得る。すなわち、この方法は、基準Ａまたは基準Ｂを含むと記載され得る。これらの基準としては、以下が挙げられる：ＮＡは、ニック形成エンドヌクレアーゼ（ＮＥ）である；ＮＡは、制限エンドヌクレアーゼ（ＲＥ）である；工程（ｃ）は、以下に列挙するＤＮＡポリメラーゼから選択されるＤＮＡポリメラーゼの存在下で行われ、ここで、潜在的ＤＮＡポリメラーゼのリストは、以下のＤＮＡポリメラーゼのうちの任意の２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つなどを含むように減らされ得る：ｅｘｏ−Ｖｅｎｔ、ｅｘｏ−Ｄｅｅｐ  Ｖｅｎｔ、ｅｘｏ−Ｂｓｔ、ｅｘｏ−Ｐｆｕ、ｅｘｏ−Ｂｃａ、Ｔａｑ、ＤＮＡポリメラーゼＩのＫｌｅｎｏｗフラグメント、Ｔ５  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｈｉ２９  ＤＮＡポリメラーゼ、ファージＭ２  ＤＮＡポリメラーゼ、ファージｐｈｉＰＲＤ１  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ、ＰＲＤ１  ＤＮＡポリメラーゼ、９°ＮｍＴＭＤＮＡポリメラーゼ、およびＴ４  ＤＮＡポリメラーゼ。例えば、工程（ｃ）は、ｅｘｏ−Ｂｓｔポリメラーゼ、ｅｘｏ−Ｂｃａポリメラーゼ、９°ＮｍＴＭＤＮＡポリメラーゼ、またはｅｘｏ−Ｖｅｎｔポリメラーゼからなる群より選択されるＤＮＡポリメラーゼの存在下で行われ得る；工程（ｂ）、工程（ｃ）、工程（ｄ）および工程（ｅ）のうちの２以上、好ましくは３つまたは４つ、そしてさらにより好ましくは４つ全てが、同一の等温条件下で行われる；この方法は、工程（ｅ）の増幅された１本鎖核酸フラグメントを特徴付ける工程を包含する；この方法は、工程（ｅ）の増幅された１本鎖核酸フラグメントを、発光分光学、蛍光分光学、質量分析法、液体クロマトグラフィー、蛍光偏光、電子衝突イオン化、ゲル電気泳動、およびキャピラリー電気泳動から選択される１以上の方法によって、特徴付ける工程を包含する。例えば、この方法は、工程（ｅ）の増幅された１本鎖核酸フラグメントを、質量分析法によって、すなわち、質量分析法のみによって、または質量分析法を含む方法によって特徴付ける工程を包含する；テンプレート核酸は、ＮＳの３’側に位置しかつＮＳを含むテンプレートの同じ鎖に位置する遺伝子バリエーションを有し、その結果、この遺伝子バリエーションは、増幅される１本鎖核酸フラグメントに取り込まれる；テンプレート核酸は、以下の工程（ｉ）および工程（ｉｉ）を含む方法によって形成され得、そしてさらに工程（ｉｉｉ）を含み得る：（ｉ）第１オリゴヌクレオチドプライマー（ＯＤＮＰ）、第２ＯＤＮＰ、および標的核酸を含む混合物を形成する工程であって、ここで、この標的核酸は、調査中の遺伝子バリエーションを含み、ここで、（ａ）標的核酸が、第１鎖および第２鎖を有する２本鎖核酸である場合、この第１ＯＤＮＰは、ニック形成エンドヌクレアーゼ認識配列（ＮＥＲＳ）のセンス鎖のヌクレオチド配列、および遺伝子バリエーションの相補体の３’側に位置する標的核酸の第１鎖のヌクレオチド配列に対して少なくとも実質的に相補的なヌクレオチド配列を含み、そしてこの第２ＯＤＮＰは、遺伝子バリエーションの３’側に位置する標的核酸の第２鎖のヌクレオチド配列に対して少なくとも実質的に相補的なヌクレオチド配列を含み、そして必要に応じて制限エンドヌクレアーゼ認識配列（ＲＥＲＳ）の１つの鎖の配列を含むが、（ｂ）この標的核酸が、１本鎖核酸である場合、この第１ＯＤＮＰは、ニック形成エンドヌクレアーゼ認識配列（ＮＥＲＳ）のセンス配列の配列、および遺伝子バリエーションの５’側に位置する標的核酸に対して少なくとも実質的に同一のヌクレオチド配列を含み、そしてこの第２ＯＤＮＰは、遺伝子バリエーションの３’側に位置する標的核酸のヌクレオチド配列に対して少なくとも実質的に相補的なヌクレオチド配列を含み、そして必要に応じて、制限エンドヌクレアーゼ認識配列（ＲＥＲＳ）の１つの鎖の配列を含む。（ｉｉ）第１ＯＤＮＰおよび第２ＯＤＮＰを伸長して、ＮＥＲＳおよびＲＥＲＳの両方を有するフラグメントを生成する工程。この方法は、必要に応じて、（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）の伸長産物を、このＲＥＲＳを認識する制限エンドヌクレアーゼを用いて切断する工程を包含する；このテンプレート核酸は、以下の通りの、以下の工程（ｉ）および工程（ｉｉ）を含む方法によって形成され得る：（ｉ）第１ＯＤＮＰ、第２ＯＤＮＰ、および遺伝子バリエーションを含む標的核酸を含む混合物を形成する工程であって、ここで、（ａ）この標的核酸が、第１鎖および第２鎖を有する２本鎖核酸である場合、この第１ＯＤＮＰは、第１制限エンドヌクレアーゼ認識配列（ＲＥＲＳ）の１つの鎖のヌクレオチド配列、およびこの遺伝子バリエーションの相補体の３’側に位置するこの標的核酸の第１鎖のヌクレオチド配列に対して少なくとも実質的に相補的なヌクレオチド配列を含み、そしてこの第２ＯＤＮＰは、第２ＲＥＲＳの１つの鎖の配列、およびこの遺伝子バリエーションに対して３’側に位置する標的核酸の第２鎖のヌクレオチド配列に対して少なくとも実質的に相補的なヌクレオチド配列を含むが、（ｂ）この標的核酸が１本鎖核酸である場合、この第１ＯＤＮＰは、第１制限エンドヌクレアーゼ認識配列（ＲＥＲＳ）の１つの鎖の配列、およびこの遺伝子バリエーションの５’側に位置する標的核酸の核酸配列に対して少なくとも実質的に相補的なヌクレオチド配列を含み、そしてこの第２ＯＤＮＰは、第２ＲＥＲＳの１つの鎖の配列、およびこの遺伝子バリエーションの５’側に位置する標的核酸のヌクレオチド配列に対して少なくとも実質的に相補的なヌクレオチド配列を含む。（ｉｉ）この第１ＯＤＮＰおよびこの第２ＯＤＮＰを、デオキシリボヌクレオシド三リン酸および少なくとも１つの改変デオキシリボヌクレオシド三リン酸の存在下で伸長して、この第１ＲＥＲＳおよびこの第２ＲＥＲＳの両方を有するフラグメントを生成する工程；このテンプレート核酸は、以下のとおりの（ｉ）および（ｉｉ）を含む方法によって形成される：（ｉ）第１ＯＤＮＰ、第２ＯＤＮＰ、および遺伝子バリエーションを含む標的核酸を含む混合物を形成する工程であって、ここで、（ａ）この標的核酸が、第１鎖および第２鎖を有する２本鎖核酸分子である場合、この第１ＯＤＮＰは、この遺伝子バリエーションの相補体の３’側に位置するこの標的核酸の第１鎖のヌクレオチド配列に対して少なくとも実質的に相補的なヌクレオチド配列を含み、そしてこの第２ＯＤＮＰは、この遺伝子バリエーションの３’側に位置するこの標的核酸の第２鎖のヌクレオチド配列に対して少なくとも実質的に相補的なヌクレオチド配列を含むが、（ｂ）この標的核酸が１本鎖核酸である場合、この第１ＯＤＮＰは、この遺伝子バリエーションの５’側に位置するこの標的核酸のヌクレオチド配列に対して少なくとも実質的に同一のヌクレオチド配列を含み、そしてこの第２ＯＤＮＰは、この遺伝子バリエーションの３’側に位置する標的核酸のヌクレオチド配列に対して少なくとも実質的に相補的なヌクレオチド配列を含み；ここで、どちらの場合も、この第１ＯＤＮＰおよびこの第２ＯＤＮＰは各々、ＮＥＲＳのセンス鎖の配列をさらに含む、工程。（ｉｉ）この第１ＯＤＮＰおよびこの第２ＯＤＮＰを伸長して、２つのＮＥＲＳを有するフラグメントを生成する工程；このテンプレート核酸分子は、この鎖中にこのＮＳを含む５’突出部をさらに含み、ここで、この突出部は、標的核酸に対して少なくとも実質的に相補的な核酸配列を含む；このテンプレート核酸分子は、この鎖中に、このＮＳを含まない３’突出部をさらに含み、ここで、この突出部は、標的核酸に対して少なくとも実質的に相補的な核酸配列を含む；このテンプレートが突出部を含む場合、本発明は、以下のさらなる工程（ｉ）、工程（ｉｉ）、および工程（ｉｉｉ）を行うことを必要に応じて提供する：（ｉ）このテンプレート核酸を、生物学的サンプル中の核酸分子と、この生物学的サンプル中に存在する場合にこの標的核酸が、このテンプレート核酸の突出部にハイブリダイスする条件下で、混合する工程であって、ここで、この生物学的サンプルは、この標的核酸を含み得る。（ｉｉ）ハイブリダイズしていないテンプレート核酸を、工程（ａ）を行う前に、工程（ｉ）の混合物から除去する工程。（ｉｉｉ）このハイブリダイズしたテンプレート核酸をＮＡと合わせる工程；この２本鎖テンプレート核酸分子は、ＩＩｓ型制限エンドヌクレアーゼ認識配列（ＴＲＥＲＳ）を含み；この２本鎖テンプレート核酸分子は、核酸アダプターを、２本鎖標的核酸に対して、以下であるような様式で連結することによって提供される：（ｉ）本発明の方法によって形成された、増幅された１本鎖核酸分子が、この標的核酸の一部分を含み、（ｉｉ）この核酸アダプターは、ＩＩｓ型制限エンドヌクレアーゼ認識配列（ＴＲＥＲＳ）を含み、（ｉｉｉ）この核酸アダプターは、このテンプレートのこのＮＳを含む鎖に連結しないこのアダプターの鎖中にＮＡＲＳを含み、（ｉｖ）このＴＲＥＲＳを認識するＩＩｓ型制限エンドヌクレアーゼの切断部位は、（ａ）この２本鎖標的核酸フラグメント内でかつ（ｂ）このＮＳに対応する位置の５’側に位置し；このテンプレート核酸は、上流エキソン（エキソンＡ）と下流エキソン（エキソンＢ）との間に、このＮＳの３’側に位置する連結部を含み、その結果、この連結部の両側でこの連結部に隣接するヌクレオチドは、その増幅される１本鎖核酸フラグメント中に取り込まれ；このテンプレート核酸は、以下のとおりの（ｉ）および（ｉｉ）を含む方法によって形成される：（ｉ）第１オリゴヌクレオチドプライマー（ＯＤＮＰ）、第２ＯＤＮＰ、およびｃＤＮＡを混合する工程であって、ここで、この第１ＯＤＮＰは、アンチセンス鎖中のエキソンＡの５’末端付近のエキソンＡのアンチセンス鎖の一部分に対して少なくとも実質的に相補的な配列を含み、この第２ＯＤＮＰは、センス鎖中のエキソンＢの５’末端付近のエキソンＢのセンス鎖の一部分に対して少なくとも実質的に相補的な配列を含み、そしてこの第１ＯＤＮＰおよびこの第２ＯＤＮＰのうちの少なくとも一方は、ニック形成剤認識配列（ＮＡＲＳ）のセンス鎖の配列をさらに含む、工程。（ｉｉ）この第１ＯＤＮＰおよびこの第２ＯＤＮＰを伸長して、この第１ＯＤＮＰおよびこの第２ＯＤＮＰを含むテンプレート核酸を提供する工程；ときどき、工程（ｅ）の前に、このテンプレート核酸は、固体支持体に固定化され得、ここで、１つの実施形態では、このニック形成部位を含まない核酸鎖は、必要に応じてこの鎖の３’末端で、または必要に応じてこの鎖の５’末端で、固体支持体に結合され、一方、別の実施形態では、このＮＳでのニック形成の際に形成される３’末端を含む、この核酸フラグメントの５’末端が、固体支持体に結合され、一方、なお別の実施形態では、このＮＳでのニック形成の際に形成される５’末端を含む、この核酸フラグメントの３’末端は、固体支持体に結合される；例えば、ｃＤＮＡを用いてこのテンプレート核酸を調製する場合、このｃＤＮＡ分子は、固体支持体に結合され得る；別の例として、標的核酸を用いてこのテンプレート核酸を調製する場合、この標的核酸は、固体支持体に結合され得る。関連の実施形態では、本発明は、ｃＤＮＡ分子中の遺伝子の上流エキソンＡ（エキソンＡ）と下流エキソン（エキソンＢ）との間の連結部の存在または不存在を検出するために有用であるキットを提供し、ここで、このキットは、本明細書中に記載されるとおりの検出のための方法において機能する、少なくとも１対のＯＤＮＰを備える。さらに、これらのキットは、以下の成分／条件のうちの１以上をさらに備え得るか、またはこれらを備えるとさらに特徴付けられ得る：このＮＡＲＳを認識するニック形成剤（ＮＡ）；制限エンドヌクレアーゼ（ＲＥ）；このＲＥについての緩衝液；ニック形成エンドヌクレアーゼ（ＮＥ）；このＮＥについての緩衝液；Ｎ．ＢｓｔＮＢ  Ｉ；この第１ＯＤＮＰはＮＥＲＳを含み、そしてこの第２ＯＤＮＰはＲＥＲＳを含む；この第１ＯＤＮＰはＲＥＲＳを含み、そしてこの第２ＯＤＮＰはＮＥＲＳを含む；このＲＥＲＳは、ＩＩｓ型制限エンドヌクレアーゼによって認識され得る；ＩＩｓ型制限エンドヌクレアーゼ；このＩＩｓ型制限エンドヌクレアーゼについての緩衝液；Ｂｐｍ  Ｉとして公知のＩＩｓ型制限エンドヌクレアーゼ；このＮＥＲＳを認識するＮＥ；ＤＮＡポリメラーゼ；このＤＮＡポリメラーゼについての緩衝液；ｅｘｏ−Ｂｓｔポリメラーゼ、ｅｘｏ−Ｂｃａポリメラーゼ、９°ＮｍＴＭＤＮＡポリメラーゼ、およびｅｘｏ−Ｖｅｎｔポリメラーゼのうちの１以上；このキットを用いるための指示書；液体クロマトグラフィーカラム；水、および有機酸または無機酸と錯化した２級アミンまたは３級アミンのアンモニウム塩を含む、緩衝液Ａ；緩衝液Ａおよび有機溶媒を含む、緩衝液Ｂ；アンモニウム塩（ここで、アミン成分は、トリエチルアミン、ジアリルアミン、ジイソプロピルアミン、Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−シクロヘキシルアミン、Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−イソプロピルアミン、およびＮ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−ブチルアミンからなる群より選択される）；有機酸と錯化した２級アミンまたは３級アミンであって、この有機酸は、酢酸、プロピオン酸、およびそれらのハロゲン化版から選択される、２級アミンまたは３級アミン；メタノール；アセトニトリル；逆相クロマトグラフィーカラム；トレハロース；デオキシリボヌクレオシド三リン酸；改変デオキシヌクレオシド三リン酸；オリゴヌクレオチド標準；ならびに／またはこのＯＤＮＰ対を設計または注文する際に用いるソフトウェアのためのアクセスコード。
【００１２】
他の局面では、本発明は、標的核酸中の規定の位置における遺伝子バリエーションを同定するための方法を提供し、ここで、この遺伝子バリエーションは、例えば、単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）であり得る。例えば、１つの実施形態では、この方法は、以下を包含する：（ａ）この標的核酸の一部または全てを含む、特に、この遺伝子バリエーションをこの標的核酸の規定の位置に含むヌクレオチド配列を含むテンプレート核酸（「テンプレート」）を提供する工程。このテンプレートは、ニック形成剤（ＮＡ）のニック形成部位（ＮＳ）をさらに包含し、ここで、このＮＳは、この遺伝子バリエーションの５’側に位置する。このテンプレートは、部分的または完全に２本鎖であり得る。（ｂ）ＤＮＡポリメラーゼ、およびこのＮＳにてニックを形成するＮＡの存在下で、この遺伝子バリエーションを含むヌクレオチド配列を有する１本鎖核酸フラグメントを増幅する工程。この１本鎖核酸フラグメントは、このＮＳで生じたニック形成によって形成された５’末端を有する。（ｃ）この１本鎖核酸フラグメントを特徴付けし、それにより、この遺伝子バリエーションを同定する工程。別の実施形態では、標的核酸中の規定の位置における遺伝子バリエーションを同定するための本発明の方法は、ここで、この遺伝子バリエーションが、例えば、ＳＮＰであり得、以下を包含する：（ａ）第１オリゴヌクレオチドプライマー（ＯＤＮＰ）、第２ＯＤＮＰ、およびこの標的核酸を含む混合物を形成する工程であって、ここで（ｉ）この標的核酸が、第１鎖および第２鎖を有する２本鎖核酸である場合、この第１ＯＤＮＰは、ニック形成エンドヌクレアーゼ認識配列（ＮＥＲＳ）のセンス鎖のヌクレオチド配列、およびこの遺伝子バリエーションの相補体の３’側に位置する、この標的核酸のこの第１鎖のヌクレオチド配列に対して少なくとも実質的に相補的なヌクレオチド配列を含み、そしてこの第２ＯＤＮＰは、この遺伝子バリエーションの３’側に位置する、この標的核酸のこの第２鎖のヌクレオチド配列に対して少なくとも実質的に相補的なヌクレオチド配列を含み、そして必要に応じて、制限エンドヌクレアーゼ認識配列（ＲＥＲＳ）の１つの鎖の配列を含むが、（ｉｉ）この標的核酸が１本鎖核酸である場合、この第１ＯＤＮＰは、ＮＥＲＳのセンス鎖のヌクレオチド配列、およびこの遺伝子バリエーションの５’側に位置する、該標的核酸のヌクレオチド配列に対して少なくとも実質的に同一のヌクレオチド配列を含み、そしてこの第２ＯＤＮＰは、この遺伝子バリエーションの３’側に位置する、この標的核酸のヌクレオチド配列に対して少なくとも実質的に相補的なヌクレオチド配列を含み、そして必要に応じて、ＲＥＲＳを含む。（ｂ）この第１ＯＤＮＰおよびこの第２ＯＤＮＰを伸長して、この第１ＯＤＮＰおよびこの第２ＯＤＮＰを含む伸長産物を生成する工程。（ｃ）工程（ｂ）のこの伸長産物を、このＲＥＲＳを認識する制限エンドヌクレアーゼを用いて必要に応じて消化して、消化産物を生成する工程。（ｄ）このＮＥＲＳを認識するニック形成エンドヌクレアーゼ（ＮＥ）の存在下で、工程（ｂ）のこの伸長産物の１つの鎖または工程（ｃ）の消化産物をテンプレートとして用いて、１本鎖核酸フラグメントを増幅する工程。（ｅ）工程（ｄ）のこの１本鎖フラグメントを特徴付けし、それにより、この標的核酸中のこの遺伝子バリエーションを同定する工程。さらなる例として、本発明は、標的核酸中の規定の位置での遺伝子バリエーションを同定するための方法を提供し、ここで、この遺伝子バリエーションは、例えば、ＳＰＮであり得、ここで、この方法は、以下を包含する：（ａ）第１ＯＤＮＰ、第２ＯＤＮＰ、およびこの標的核酸を含む混合物を形成する工程であって、ここで、（ｉ）この標的核酸が、第１鎖および第２鎖を有する２本鎖核酸である場合、この第１ＯＤＮＰは、第１制限エンドヌクレアーゼ認識配列（ＲＥＲＳ）の１つの鎖のヌクレオチド配列、およびこの遺伝子バリエーションの相補体の３’側に位置するこの標的核酸の第１鎖のヌクレオチド配列に対して少なくとも実質的に相補的なヌクレオチド配列を含み、そしてこの第２ＯＤＮＰは、第２ＲＥＲＳの１つの鎖のヌクレオチド配列、およびこの遺伝子バリエーションの相補鎖の３’側に位置するこの標的核酸の第２鎖のヌクレオチド配列に対して少なくとも実質的に相補的なヌクレオチド配列を含むが、（ｉｉ）この標的核酸が１本鎖核酸である場合、この第１ＯＤＮＰは、第１ＲＥＲＳの１つの鎖のヌクレオチド配列、およびこの遺伝子バリエーションの５’側に位置するこの標的核酸のヌクレオチド配列に対して少なくとも実質的に同一のヌクレオチド配列を含み、そしてこの第２ＯＤＮＰは、第２ＲＥＲＳの１つの鎖の配列、およびこの遺伝子バリエーションの３’側に位置する標的核酸のヌクレオチド配列に対して少なくとも実質的に相補的なヌクレオチド配列を含む。（ｂ）デオキシリボヌクレオシド三リン酸および少なくとも１つの改変デオキシリボヌクレオシド三リン酸の存在下で、この第１ＯＤＮＰおよびこの第２ＯＤＮＰを伸長して、この第１ＲＥＲＳおよびこの第２ＲＥＲＳの両方を含む伸長産物を生成する工程。（ｃ）この第１ＲＥＲＳおよびこの第２ＲＥＲＳを認識する制限エンドヌクレアーゼ（ＲＥ）の存在下で、工程（ｂ）の伸長産物の１つの鎖をテンプレートとして用いて１本鎖核酸フラグメントを増幅する工程であって、ここで、この１本鎖核酸フラグメントは、３５ヌクレオチド長以下である、工程。（ｄ）工程（ｃ）のこの１本鎖フラグメントを特徴付けし、それにより、この遺伝子バリエーションを同定する工程。標的核酸中の規定の位置での遺伝子バリエーションを同定するための方法に関し、ここで、遺伝子バリエーションが、例えば、ＳＮＰであり得る、本発明の別の局面では、この方法は、以下を包含する：（ａ）第１オリゴヌクレオチドプライマー（ＯＤＮＰ）、第２ＯＤＮＰおよびこの標的核酸を含む混合物を形成する工程であって、ここで、（ｉ）この標的核酸は、第１鎖および第２鎖を有する２本鎖核酸である場合、この第１ＯＤＮＰは、この遺伝子バリエーションの相補鎖の３’側に位置するこの標的核酸の第１鎖のヌクレオチド配列に対して少なくとも実質的に相補的なヌクレオチド配列と含み、そしてこの第２ＯＤＮＰは、この遺伝子バリエーションの３’側に位置するこの標的核酸の第２鎖のヌクレオチド配列に対して少なくとも実質的に相補的なヌクレオチド配列を含むが、（ｉｉ）この標的核酸が１本鎖核酸である場合、この第１ＯＤＮＰは、この遺伝子バリエーションの５’側に位置するこの標的核酸のヌクレオチド配列に対して少なくとも実質的に同一であるヌクレオチド配列を含み、そしてこの第２ＯＤＮＰは、この遺伝子バリエーションの３’側に位置する標的核酸のヌクレオチド配列に対して少なくとも実質的に相補的なヌクレオチド配列を含み、ここで、この第１ＯＤＮＰおよびこの第２ＯＤＮＰは各々、ニック形成エンドヌクレアーゼ認識配列（ＮＥＲＳ）のセンス鎖のヌクレオチド配列をさらに含む。（ｂ）この第１ＯＤＮＰおよびこの第２ＯＤＮＰを伸長して、２つのＮＥＲＳを含む伸長産物を生成する工程。（ｃ）このＮＥＲＳを認識する１以上のニック形成エンドヌクレアーゼ（ＮＥ）の存在下で、工程（ｂ）のこの伸長産物の１つの鎖をテンプレートとして用いて、１本鎖核酸フラグメントを増幅する工程。（ｄ）工程（ｃ）のこの１本鎖フラグメントを特徴付けし、それにより、この遺伝子バリエーションを同定する工程。関連する局面では、本発明は、１本鎖標的核酸中の規定の位置での遺伝子バリエーションを同定するための方法を提供し、ここで、この方法は、以下を包含する：（ａ）第１オリゴヌクレオチドプライマー（ＯＤＮＰ）、第２ＯＤＮＰ、およびこの標的核酸の混合物を形成する工程であって、ここで、この第１ＯＤＮＰは、この規定の位置の３’側に位置するこの標的核酸のヌクレオチド配列に対して少なくとも実質的に相補的であるヌクレオチド配列を含み、この第２ＯＤＮＰは、この規定の位置にて、このヌクレオチドのこの少なくとも実質的に相補的なヌクレオチドの３’側に位置するこの標的核酸の相補体のヌクレオチド配列に対して少なくとも実質的に相補的であるヌクレオチド配列を含み、この第１ＯＤＮＰおよびこの第２ＯＤＮＰは、それぞれ、中断された制限エンドヌクレアーゼ認識配列（ＩＲＥＲＳ）の第１鎖の第１定常認識配列（ＣＲＳ）および第２鎖の第２ＣＲＳをさらに含むが、完全ＩＲＥＲＳを含まず、この完全ＩＲＥＲＳは、この第１鎖およびこの第２鎖を有しかつ可変認識配列（ＶＲＳ）によって連結されたこの第１ＣＲＳおよびこの第２ＣＲＳを含む２本鎖核酸であり、そしてこの第１ＯＤＮＰまたはこの第２ＯＤＮＰのいずれかは、この第１ＣＲＳまたはこの第２ＣＲＳの５’側に位置するＮＥＲＳをさらに含む、工程。（ｂ）この第１ＯＤＮＰおよびこの第２ＯＤＮＰを伸長して、このＮＥＲＳおよびこの完全ＩＲＥＲＳを有するフラグメントを生成する工程であって、ここで、この遺伝子バリエーションは、このＶＲＳ内に存在する、工程。（ｃ）このＮＥＲＳを認識するニック形成エンドヌクレアーゼ（ＮＥ）の存在下で、工程（ｂ）のこの伸長産物の１つの鎖をテンプレートとして用いて、１本鎖核酸フラグメントを増幅する工程。（ｄ）この１本鎖フラグメントを特徴付けし、それにより、この遺伝子バリエーションを同定する工程。ＣＲＳ、ＶＲＳ、およびＩＲＥＲＳを必要とするこの方法をさらに記載する際に、以下の基準のうちの１以上が利用され得、ここで、以下の基準のうちの任意の２以上が合わされ得、そしてこれらの基準は、本明細書中に記載される基準の例示にすぎない：この１本鎖標的核酸は、変性した２本鎖核酸のうちの１つの鎖である；この２本鎖核酸は、ゲノム核酸である；この２本鎖ＤＮＡは、ｃＤＮＡである；この標的核酸に対して少なくとも実質的に相補的なこの第１ＯＤＮＰのこのヌクレオチド配列は、少なくとも１２ヌクレオチド長である；この標的核酸の相補体に対して少なくとも実質的に相補的なこの第２ＯＤＮＰのこのヌクレオチド配列は、少なくとも１２ヌクレオチド長である；この第１ＯＤＮＰは、１５〜８５ヌクレオチド長である；この第２ＯＤＮＰは、１５〜８５ヌクレオチド長である；この第１ＯＤＮＰは、この第１ＣＲＳの３’末端で、この標的核酸に対して少なくとも実質的に相補的な１以上のヌクレオチドをさらに含む；この第２ＯＤＮＰは、この第２ＣＲＳの３’末端で、この標的核酸に対して少なくとも実質的に相補的な１以上のヌクレオチドをさらに含む；工程（ａ）〜工程（ｄ）の全ては、単一の容器において行われる；このＩＲＥＲＳは、Ｂｓｌ  Ｉ、Ｍｗｏ  ＩおよびＸｃｍ  Ｉからなる群より選択される制限エンドヌクレアーゼによって認識され得る；このＮＥＲＳは、Ｎ．ＢｓｔＮＢ  Ｉによって認識され得る；工程（ｄ）は、質量分析法、液体クロマトグラフィー、蛍光偏光、電子衝突イオン化、ゲル電気泳動およびキャピラリー電気泳動からなる群より選択される技術の使用によって少なくとも部分的に行われる。
【００１３】
規定の位置における遺伝子バリエーションを同定するこれらの方法（この遺伝子バリエーションがＳＮＰである方法を含む）の各々は、以下の基準のうちの１以上によって、本発明に従ってさらに記載され得、ここで、以下の基準のうちの任意の２以上は、この方法のいずれかを記載する際に組み合わされ得、そしてここで、これらの基準は、本明細書中に示されるとおりの他の基準をまた用いて、本発明による標的核酸中の規定の位置における遺伝子バリエーションを同定する方法をさらに記載し得るので、例示に過ぎない：この遺伝子バリエーションは、単一ヌクレオチド多型である（ＳＮＰ）；この遺伝子バリエーションは、疾患に関連する；この遺伝子バリエーションは、ヒトの遺伝子疾患に関連する；この遺伝子バリエーションは、病原性微生物の薬物耐性に関連する；この標的核酸は、ゲノム核酸である；この標的核酸は、ｃＤＮＡである；この標的核酸は、病原性ウイルスのゲノムに由来する；この標的核酸は、病原性細菌のゲノムに由来する；この標的核酸は、病原性細菌のエピソームに由来する；このＮＡは、ニック形成エンドヌクレアーゼ（ＮＥ）である；このＮＡは、Ｎ．ＢｓｔＮＢ  Ｉである；増幅は、等温条件下で行われる；増幅は、５０℃〜７０℃の温度範囲内で行われる；増幅は、６０℃で行われる；増幅は、５５±５℃で行われる；増幅は、６０±５℃で行われる；増幅は、６５℃±５℃で行われる；増幅は、７０℃±５℃で行われる；増幅は、最高温度と最低温度との間の温度で行われ、ここで、この最高温度は、この最低温度から２０℃以内である；増幅は、最高温度と最低温度との間の温度で行われ、ここで、この最高温度は、この最低温度から１５℃以内である；増幅は、最高温度と最低温度との間の温度で行われ、ここで、この最高温度は、この最低温度から１０℃以内である；増幅は、最高温度と最低温度との間の温度で行われ、ここで、この最高温度は、この最低温度から５℃以内である；増幅は、ＤＮＡポリメラーゼの存在下で行われ、ここで、このＤＮＡポリメラーゼは、ｅｘｏ−Ｖｅｎｔ、ｅｘｏ−Ｄｅｅｐ  Ｖｅｎｔ、ｅｘｏ−Ｂｓｔ、ｅｘｏ−Ｐｆｕ、ｅｘｏ−Ｂｃａ、Ｔａｑ、ＤＮＡポリメラーゼＩのＫｌｅｎｏｗフラグメント、Ｔ５  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｈｉ２９  ＤＮＡポリメラーゼ、ファージＭ２  ＤＮＡポリメラーゼ、ファージｐｈｉＰＲＤ１  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ、ＰＲＤ１  ＤＮＡポリメラーゼ、９°ＮｍＴＭＤＮＡポリメラーゼ、およびＴ４  ＤＮＡポリメラーゼのうちのいずれかであり、ここで、これらのＤＮＡポリメラーゼのうちの任意の２以上は、増幅に用いられ得るＤＮＡポリメラーゼを示す群を形成し得る（例えば、このＤＮＡポリメラーゼは、ｅｘｏ−Ｂｓｔポリメラーゼ、ｅｘｏ−Ｂｃａポリメラーゼ、９°ＮｍＴＭＤＮＡポリメラーゼ、およびｅｘｏ−Ｖｅｎｔポリメラーゼからなる群より選択される）；この１本鎖核酸フラグメントは、質量分析法、液体クロマトグラフィー、蛍光偏光、および電気泳動からなる群より選択される１以上の技術によって特徴付けられ、例えば、この１本鎖核酸フラグメントは、液体クロマトグラフィーを含む１以上の技術によって特徴付けられるか、または別の例として、この１本鎖��酸フラグメントは、質量分析法を含む１以上の技術によって特徴付けられるか、またはなお別の例として、この１本鎖核酸フラグメントは、液体クロマトグラフィーおよび質量分析法の両方を含む１以上の技術によって特徴付けられる；この方法が、本発明の種々の実施形態において、プライマー（すなわち、ＯＤＮＰ）を用いることを含む場合、この方法において用いられる各ＯＤＮＰは、独立して、少なくとも８ヌクレオチド長、または少なくとも９ヌクレオチド長、または少なくとも１０ヌクレオチド長、または少なくとも１１ヌクレオチド長、または少なくとも１２ヌクレオチド長、または少なくとも１３ヌクレオチド長、または少なくとも１４ヌクレオチド長、または少なくとも１５ヌクレオチド長、または少なくとも１６ヌクレオチド長、または少なくとも１７ヌクレオチド長、または少なくとも１８ヌクレオチド長、または少なくとも１９ヌクレオチド長、または少なくとも２０ヌクレオチド長である；本発明の方法が、プライマー（すなわち、ＯＤＮＰ）を用いることを含む場合、本発明の種々の実施形態において、この方法において用いられる各ＯＤＮＰは、独立して、５０ヌクレオチド長以下、または４５ヌクレオチド長以下、または４０ヌクレオチド長以下、または３５ヌクレオチド長以下、または３０ヌクレオチド長以下、または２９ヌクレオチド長以下、または２８ヌクレオチド長以下、または２７ヌクレオチド長以下、または２６ヌクレオチド長以下、または２５ヌクレオチド長以下、または２４ヌクレオチド長以下、または２３ヌクレオチド長以下、または２２ヌクレオチド長以下、または２１ヌクレオチド長以下、または２０ヌクレオチド長以下、または１９ヌクレオチド長以下、または１８ヌクレオチド長以下である；この方法が、標的核酸中のヌクレオチド配列に対して少なくとも実質的に相補的なヌクレオチド配列を含むプライマーを用いることを含む場合、本発明の種々の実施形態において、このプライマー中のこのヌクレオチド配列は、独立して、各プライマーにおいて、少なくとも４ヌクレオチド長、少なくとも５ヌクレオチド長、少なくとも６ヌクレオチド長、少なくとも７ヌクレオチド長、少なくとも８ヌクレオチド長、または少なくとも９ヌクレオチド長、または少なくとも１０ヌクレオチド長、または少なくとも１１ヌクレオチド長、または少なくとも１２ヌクレオチド長、または少なくとも１３ヌクレオチド長、または少なくとも１４ヌクレオチド長、または少なくとも１５ヌクレオチド長、または少なくとも１６ヌクレオチド長、または少なくとも１７ヌクレオチド長、または少なくとも１８ヌクレオチド長、または少なくとも１９ヌクレオチド長、または少なくとも２０ヌクレオチド長であり；本発明の方法が、標的核酸中のヌクレオチド配列に対して少なくとも実質的に相補的なヌクレオチド配列を含むプライマーを用いることを含む場合、本発明の種々の実施形態において、このプライマー中のこのヌクレオチド配列は、独立して、各プライマー中で、２０ヌクレオチド長以下、または１９ヌクレオチド長以下、または１８ヌクレオチド長以下、または１７ヌクレオチド長以下、または１６ヌクレオチド長以下、または１５ヌクレオチド長以下、または１４ヌクレ��チド長以下、または１３ヌクレオチド長以下、または１２ヌクレオチド長以下、または１１ヌクレオチド長以下、または１０ヌクレオチド長以下、または９ヌクレオチド長以下、または８ヌクレオチド長以下、または７ヌクレオチド長以下、または６ヌクレオチド長以下、または５ヌクレオチド長以下である；本発明の方法が、ＲＥＲＳを含む核酸分子の使用を伴う場合、１つの実施形態では、このＲＥＲＳは、ＩＩ型制限エンドヌクレアーゼによって認識され得る；本発明の方法が、ＲＥＲＳを含む核酸分子の使用を伴う場合、１つの実施形態では、このＲＥＲＳは、ＩＩｓ型制限エンドヌクレアーゼによって認識され得る；本発明の方法が、ＲＥＲＳを含む核酸分子の使用を伴う場合、１つの実施形態では、このＲＥＲＳは、Ｂｐｍ  Ｉによって認識され得る；本発明の方法が、１以上のＲＥＲＳを含む核酸分子の使用を伴うか、またはこの方法が、各々がＲＥＲＳを含む２以上の分子の使用を伴う場合、種々の実施形態において、このＲＥＲＳは、Ａｖａ  Ｉ、Ｂｓｌ  Ｉ、ＢｓｍＡ  Ｉ、ＢｓｏＢ  Ｉ、Ｂｓｒ  Ｉ、ＢｓｔＮ  Ｉ、ＢｓｔＯ  Ｉ、Ｆｎｕ４Ｈ  Ｉ、Ｈｉｎｃ  ＩＩ、Ｈｉｎｄ  ＩＩ、およびＮｃｉ  Ｉから選択されるＲＥによって認識され得、ここで、これらのＲＥの任意の２以上から群が形成され得る；本発明の方法が、ＲＥＲＳを含む核酸分子の使用を伴う場合、１つの実施形態では、このＲＥＲＳは、中断された制限エンドヌクレアーゼによって認識され得る；方法が、２つのＲＥＲＳを含む場合、１つの実施形態では、この第１ＲＥＲＳのヌクレオチド配列は、この第２ＲＥＲＳとは同一でなく、一方、別の実施形態では、この第１ＲＥＲＳのヌクレオチド配列は、この第２ＲＥＲＳと同一である；本発明の方法が、ＮＥＲＳを含む核酸分子の使用を伴う場合、１つの実施形態では、このＮＥＲＳは、ヌクレオチド配列５’ＧＡＧＴＣ３’を有するセンス鎖を有する；本発明の方法が、核酸分子を伸長する工程を伴う場合、１つの実施形態では、この伸長は、ポリメラーゼ連鎖反応によって行われる；この方法は、２本鎖である標的核酸を利用する；この方法は、１本鎖である標的核酸を利用する；この方法が、伸長産物を制限エンドヌクレアーゼで消化する、必要に応じた工程を包含する場合、本発明の１つの実施形態では、この方法は、伸長産物を制限エンドヌクレアーゼで消化する工程を包含し、一方、別の実施形態では、この方法は、伸長産物を制限エンドヌクレアーゼで消化する工程を省略する；この１本鎖核酸フラグメントを特徴付けして、この遺伝子バリエーションについての情報を得る前のいつかの時点で、このテンプレート核酸は、固体支持体に固定化され得、ここで、１つの実施形態では、このニック形成部位を含まない核酸鎖は、（必要に応じてこの鎖の３’末端で、または必要に応じてこの鎖の５’末端で）固体支持体に結合され、一方、別の実施形態では、このＮＳにてニック形成の際に形成された３’末端を含む核酸フラグメントの５’末端は、固体支持体に結合され、一方、なお別の実施形態では、このＮＳのニック形成の際に形成された５’末端を含む核酸フラグメントの３’末端は、固体支持体に結合される；いくつかの例では、標的核酸ならびに第１ＯＤＮＰおよび��２ＯＤＮＰを用いてこのテンプレートが形成され、ここで、このテンプレートは、増幅プロセスに供されて、１本鎖核酸フラグメントを提供し、そしてこれらの例では、この標的核酸、またはこの第１ＯＤＮＰ、またはこの第２ＯＤＮＰは、固体支持体に固定化され得、ここで、このテンプレートを形成するために伸長される、この第１ＯＤＮＰまたはこの第２ＯＤＮＰの末端は、好ましくは、この固体支持体に連結したＯＤＮＰの末端ではなく、そしてここでこの標的核酸は、非特異的に（すなわち、末端でなく、より好ましくは３’末端でもなく）、またはこの標的核酸の５’末端でのいずれかで固定化され得る。
【００１４】
上記で言及したとおり、本発明は、標的核酸中の規定の位置における遺伝子バリエーションを同定するための方法を提供し、ここで、この遺伝子バリエーションは、単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）であり得る。例えば、１つの局面では、本発明は、標的核酸中の規定の位置におけるＳＮＰを同定するための方法を提供し、ここで、この方法は、以下を包含する：（ａ）規定の位置にこのＳＮＰを含む、この標的核酸の一部分を含み、そしてこの遺伝子バリエーションの５’側（すなわち、このＳＮＰの５’側）に位置するニック形成部位（ＮＳ）をさらに含む、部分的または完全に２本鎖のテンプレート核酸を提供する工程。（ｂ）ＤＮＡポリメラーゼ、およびこのＮＳにおいてニックを形成するニック形成エンドヌクレアーゼ（ＮＥ）の存在下で、等温条件下にて、この遺伝子バリエーション（すなわち、ＳＮＰ）を含み、１７以下のヌクレオチドを含み、かつその５’末端がこのＮＳにあった、１本鎖核酸フラグメントを増幅する工程。（ｃ）少なくとも液体クロマトグラフィーおよび／または質量分析法を用いて、この１本鎖核酸フラグメントを特徴付け、それにより、このＳＮＰを同定する工程。別の例として、別の局面では、本発明は、標的核酸中の規定の位置におけるＳＮＰを同定するための方法を提供し、ここで、この方法は、以下を包含する：（ａ）第１オリゴヌクレオチドプライマー（ＯＤＮＰ）、第２ＯＤＮＰ、およびこの標的核酸を含む混合物を形成する工程であって、ここで、（ｉ）この標的核酸が、第１鎖および第２鎖を有する２本鎖核酸である場合、第１ＯＤＮＰは、ニック形成エンドヌクレアーゼ認識配列（ＮＥＲＳ）のセンス鎖のヌクレオチド配列、およびこのＳＮＰの相補体の３’側に位置するこの標的核酸の第１鎖のヌクレオチド配列に対して少なくとも実質的に相補的なヌクレオチド配列を含み、そして第２ＯＤＮＰは、このＳＮＰの３’側に位置するこの標的核酸の第２鎖のヌクレオチド配列に対して少なくとも実質的に相補的なヌクレオチド配列を含み、そしてさらに、制限エンドヌクレアーゼ認識配列（ＲＥＲＳ）の１つの鎖の配列を含むが、（ｉｉ）この標的核酸が１本鎖核酸である場合、この第１ＯＤＮＰは、ＮＥＲＳのセンス鎖のヌクレオチド配列、およびこのＳＮＰの相補体の５’側に位置する該標的核酸のヌクレオチド配列に対して少なくとも実質的に同一のヌクレオチド配列を含み、そしてこの第２ＯＤＮＰは、このＳＮＰの３’側に位置するこの標的核酸のヌクレオチド配列に対して少なくとも実質的に相補的なヌクレオチド配列を含み、そしてさらにＲＥＲＳを含む、工程。（ｂ）この第１ＯＤＮＰおよびこの第２ＯＤＮＰを伸長して、この第１ＯＤＮＰおよびこの第２ＯＤＮＰを含む伸長産物を生成する工程。（ｃ）工程（ｂ）のこの伸長産物を、このＲＥＲＳを認識する制限エンドヌクレアーゼ（ＲＥ）で消化して、消化産物を生成する工程。（ｄ）このＮＥＲＳを認識するニック形成エンドヌクレアーゼ（ＮＥ）の存在下で、等温条件下にて、工程（ｂ）のこの伸長産物または工程（ｃ）のこの消化産物の１つの鎖をテンプレートとして用いて、１７以下のヌクレオチドを含む１本鎖核酸フラグメントを増幅する工程。（ｅ）液体クロマトグラフィーおよび／または質量分析法を少なくとも部分的に用いて、工程（ｄ）のこの１本鎖フラグメントを特徴付けし、それにより、この標的核酸中のこのＳＮＰを同定する工程。本発明はまた、標的核酸中の規定の位置での単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）を同定するための方法を提供し、ここで、この方法は、以下を包含する：（ａ）第１ＯＤＮＰ、第２ＯＤＮＰ、およびこの標的核酸を含む混合物を形成する工程であって、ここで、（ｉ）この標的核酸が、第１鎖および第２鎖を有する２本鎖核酸である場合、この第１ＯＤＮＰは、第１制限エンドヌクレアーゼ認識配列（ＲＥＲＳ）の１つの鎖のヌクレオチド配列、およびこのＳＮＰの相補体の３’側に位置するこの標的核酸の第１鎖のヌクレオチド配列に対して少なくとも実質的に相補的なヌクレオチド配列を含み、そしてこの第２ＯＤＮＰは、第２ＲＥＲＳの１つの鎖のヌクレオチド配列、およびこのＳＮＰの３’側に位置するこの標的核酸の第２鎖のヌクレオチド配列に対して少なくとも実質的に相補的なヌクレオチド配列を含むが、（ｉｉ）この標的核酸が、１本鎖核酸である場合、この第１ＯＤＮＰは、第１ＲＥＲＳの１つの鎖のヌクレオチド配列、およびこのＳＮＰの相補体の５’側に位置するこの標的核酸のヌクレオチド配列に対して少なくとも実質的に同一のヌクレオチド配列を含み、そしてこの第２ＯＤＮＰは、第２ＲＥＲＳの１つの鎖の配列、およびこのＳＮＰの３’側に位置するこの標的核酸のヌクレオチド配列に対して少なくとも実質的に相補的なヌクレオチド配列を含む、工程。（ｂ）デオキシリボヌクレオシド三リン酸および少なくとも１つの改変デオキシリボヌクレオシド三リン酸の存在下でこの第１ＯＤＮＰおよびこの第２ＯＤＮＰを伸長して、この第１ＲＥＲＳおよびこの第２ＲＥＲＳの両方を有する伸長産物を生成する工程。（ｃ）この第１ＲＥＲＳおよびこの第２ＲＥＲＳを認識する制限エンドヌクレアーゼ（ＲＥ）の存在下で、等温条件下にて、工程（ｂ）のこの伸長産物の１つの鎖をテンプレートとして用いて、１７以下のヌクレオチドを含む１本鎖核酸フラグメントを増幅する工程。（ｄ）液体クロマトグラフィーおよび／または質量分析法を少なくとも部分的に用いて、工程（ｃ）のこの１本鎖フラグメントを特徴付けし、それにより、このＳＮＰを同定する工程。本発明はまた、標的核酸中の規定の位置でのＳＮＰを同定するための方法を提供し、ここで、この方法は、以下を包含する：（ａ）第１オリゴヌクレオチドプライマー（ＯＤＮＰ）、第２ＯＤＮＰおよびこの標的核酸を含む混合物を形成する工程であって、ここで、（ｉ）この標的核酸が、第１鎖および第２鎖を有する２本鎖核酸である場合、この第１ＯＤＮＰは、このＳＮＰの相補体の３’側に位置するこの標的核酸の第１鎖のヌクレオチド配列に対して少なくとも実質的に相補的なヌクレオチド配列を含み、そしてこの第２ＯＤＮＰは、このＳＮＰの３’に位置するこの標的核酸の第２鎖のヌクレオチド配列に対して少なくとも実質的に相補的なヌクレオチド配列を含むが、（ｉｉ）この標的核酸が、１本鎖核酸である場合、この第１ＯＤＮＰは、このＳＮＰの５’側に位置するこの標的核酸のヌクレオチド配列に対して少なくとも実質的に同一であるヌクレオチド配列を含み、そしてこの第２ＯＤＮＰは、このＳＮＰの３’側に位置する標的核酸のヌクレオチド配列に対して少なくとも実質的に相補的なヌクレオチド配列を含み、ここで、この第１ＯＤＮＰおよび第２ＯＤＮＰは各々、同じニック形成エンドヌクレアーゼ認識配列（ＮＥＲＳ）のセンス配列のヌクレオチド配列をさらに含む、工程。（ｂ）この第１ＯＤＮＰおよびこの第２ＯＤＮＰを伸長して、２つのＮＥＲＳを有する伸長産物を生成する工程。（ｃ）このＮＥＲＳを認識するニック形成エンドヌクレアーゼ（ＮＥ）の存在下で、等温条件下にて、工程（ｂ）のこの伸長産物の１つの鎖をテンプレートとして用いて、１７以下のヌクレオチドを含む１本鎖核酸フラグメントを増幅する工程。（ｄ）液体クロマトグラフィーおよび／または質量分析法を少なくとも部分的に用いて、工程（ｃ）の１本鎖フラグメントを特徴付けし、それにより、このＳＮＰを同定する工程。なお別の局面では、本発明は、１本鎖標的核酸中の規定の位置での単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）を同定するための方法を提供し、ここで、この方法は、以下を包含する：（ａ）第１オリゴヌクレオチドプライマー（ＯＤＮＰ）、第２ＯＤＮＰ、およびこの標的核酸を含む混合物を形成する工程であって、ここで、この第１ＯＤＮＰは、この規定の位置の３’側に位置するこの標的核酸のヌクレオチド配列に対して少なくとも実質的に相補的なヌクレオチド配列を含み、この第２ＯＤＮＰは、この規定の位置のこのヌクレオチドのこの少なくとも実質的に相補的なヌクレオチドの３’側に位置するこの標的核酸の相補体のヌクレオチド配列に対して少なくとも実質的に相補的であるヌクレオチド配列を含み、この第１ＯＤＮＰおよびこの第２ＯＤＮＰは、それぞれ、中断された制限エンドヌクレアーゼ認識配列（ＩＲＥＲＳ）の第１鎖の第１定常認識配列（ＣＲＳ）および第２鎖の第２ＣＲＳをさらに含むが、完全ＩＲＥＲＳは含まず、この完全ＩＲＥＲＳは、この第１鎖およびこの第２鎖を有する２本鎖核酸であって、かつ可変認識配列（ＶＲＳ）によって連結されるこの第１ＣＲＳおよびこの第２ＣＲＳを含む２本鎖核酸であり、そしてこの第１ＯＤＮＰまたはこの第２ＯＤＮＰのいずれかは、この第１ＣＲＳまたはこの第２ＣＲＳの５’側に位置するＮＥＲＳをさらに含む、工程。（ｂ）この第１ＯＤＮＰおよびこの第２ＯＤＮＰを伸長して、このＮＥＲＳおよびこの完全ＩＲＥＲＳを有するフラグメントを生成する工程であって、ここで、このＳＮＰは、このＶＲＳ内にある。（ｃ）このＮＥＲＳを認識するニック形成エンドヌクレアーゼ（ＮＥ）の存在下で、等温条件下にて、工程（ｂ）のこの伸長産物の１つの鎖をテンプレートとして用いて、１本鎖核酸フラグメントを増幅する工程であって、ここで、この１本鎖フラグメントは、１７以下のヌクレオチドを含む、工程。（ｄ）液体クロマトグラフィーおよび／または質量分析法を少なくとも部分的に用いて、工程（ｃ）のこの１本鎖フラグメントを特徴付けし、それにより、このＳＮＰを同定する工程。
【００１５】
標的核酸中の規定の位置での遺伝子バリエーション（例えば、ＳＮＰ）を同定するための方法を行うための便利な手段として、本発明は、種々のキットを提供する。１つの局面では、この標的核酸が２本鎖である（すなわち、第１鎖および第２鎖を有する）場合に特に有用である本発明のキットは、以下を備える：（ｉ）ニック形成エンドヌクレアーゼ認識配列（ＮＥＲＳ）のセンス鎖のヌクレオチド配列を含み、そしてまたこの遺伝子バリエーションの相補体の３’側に位置する、この標的核酸のこの第１鎖に存在するヌクレオチド配列に対して少なくとも実質的に相補的なヌクレオチド配列を含む、第１オリゴヌクレオチドプライマー（ＯＤＮＰ）。（ｉｉ）この遺伝子バリエーションに対して３’側に位置する、この標的核酸のこの第２鎖のヌクレオチド配列に対して少なくとも実質的に相補的なヌクレオチド配列を含む、第２ＯＤＮＰ。この第２ＯＤＮＰは、また、制限エンドヌクレアーゼ認識配列（ＲＥＲＳ）の１つの鎖のヌクレオチド配列を必要に応じて含み得る。別の局面では、この標的核酸が１本鎖である場合に特に有用である本発明のキットは、以下を備える：（ｉ）ＮＥＲＳのセンス鎖のヌクレオチド配列と同一のヌクレオチド配列を含み、そしてこの遺伝子バリエーションの５’側に位置するこの標的核酸に存在するヌクレオチド配列に対して少なくとも実質的に同一であるヌクレオチド配列をさらに含む、第１ＯＤＮＰ。（ｉｉ）この遺伝子バリエーションの３’側に位置するこの標的核酸のヌクレオチド配列に対して少なくとも実質的に相補的なヌクレオチド配列を含む、第２ＯＤＮＰ。この第２ＯＤＮＰは、ＲＥＲＳの１つの鎖中に存在するヌクレオチド配列を必要に応じて含み得る。なお別の局面では、本発明は、標的核酸が、第１鎖および第２鎖を有する２本鎖核酸である場合に特に有用である、この標的核酸中の規定の位置での遺伝子バリエーションを同定するためのキットを提供し、ここで、このキットは、以下を備える：（ｉ）この遺伝子バリエーションの相補体の３’側に位置する、この標的核酸のこの第１鎖のヌクレオチド配列に対して少なくとも実質的に相補的なヌクレオチド配列を含む、第１ＯＤＮＰ。（ｉｉ）この遺伝子バリエーションに対して３’側に位置する、この標的核酸のこの第２鎖のヌクレオチド配列に対して少なくとも実質的に相補的なヌクレオチド配列を含む、第２ＯＤＮＰ。このキットでは、この第１ＯＤＮＰおよびこの第２ＯＤＮＰは各々、ニック形成エンドヌクレアーゼ認識配列（ＮＥＲＳ）のセンス鎖の配列をさらに含む。なお別の局面では、本発明は、この標的核酸が１本鎖である場合に特に有用である、標的核酸中の規定の位置での遺伝子バリエーションを同定するためのキットを提供し、ここで、このキットは、以下を備える：（ｉ）この遺伝子バリエーションの５’側に位置するこの標的核酸中のヌクレオチド配列に対して少なくとも実質的に同一であるヌクレオチド配列を含む、第１ＯＤＮＰ。（ｉｉ）この遺伝子バリエーションに対して３’側の位置にて、この標的核酸中に存在するヌクレオチド配列に対して少なくとも実質的に相補的なヌクレオチド配列を含む、第２ＯＤＮＰ。このキットでは、この第１ＯＤＮＰおよびこの第２ＯＤＮＰ各々、ニック形成エンドヌクレアーゼ認識配列（ＮＥＲＳ）のセンス鎖の配列をさらに含む。本発明はまた、第１鎖および第２鎖を有する標的核酸中の規定の位置での遺伝子バリエーションを同定するためのキットを提供し、このキットは、以下を備える：第１オリゴヌクレオチドプライマー（ＯＤＮＰ）および第２オリゴヌクレオチドプライマー（ＯＤＮＰ）であって、ここで、（ａ）この第１ＯＤＮＰは、この遺伝子バリエーションの相補体の３’側に位置するこの標的核酸のこの第１鎖のヌクレオチド配列に対して少なくとも実質的に相補的なヌクレオチド配列を含み、（ｂ）この第２ＯＤＮＰは、この遺伝子バリエーションの３’側に位置するこの標的核酸の第２鎖のヌクレオチド配列に対して少なくとも実質的に相補的なヌクレオチド配列を含み、（ｃ）この第１ＯＤＮＰおよびこの第２ＯＤＮＰは各々、ニック形成エンドヌクレアーゼ認識配列（ＮＥＲＳ）のセンス鎖の配列をさらに含み；そして（ｄ）一方の鎖におけるこのＮＥＲＳを認識するニック形成エンドヌクレアーゼによって生成されるニック形成部位（ＮＳ）と、他方の鎖においてＮＥによって生成される、ＮＳに対応する位置との間の距離は、２５ヌクレオチド以下である。本発明はまた、１本鎖標的核酸中の規定の位置での遺伝子バリエーションを同定するためのキットを提供し、このキットは、以下を備える：第１オリゴヌクレオチドプライマー（ＯＤＮＰ）および第２オリゴヌクレオチドプライマー（ＯＤＮＰ）であって、ここで、（ａ）この第１ＯＤＮＰは、この遺伝子バリエーションの５’側に位置するこの標的核酸のヌクレオチド配列に対して少なくとも実質的に同一のヌクレオチド配列を含み、（ｂ）この第２ＯＤＮＰは、この遺伝子バリエーションの３’側に位置する標的核酸のヌクレオチド配列に対して少なくとも実質的に相補的なヌクレオチド配列を含み、（ｃ）この第１ＯＤＮＰおよびこの第２ＯＤＮＰは各々、ニック形成エンドヌクレアーゼ認識配列（ＮＥＲＳ）のセンス鎖の配列をさらに含み、そして（ｄ）一方の鎖におけるこのＮＥＲＳを認識するニック形成エンドヌクレアーゼによって生成されるニック形成部位（ＮＳ）と、他方の鎖におけるＮＥによって生成されるＮＳに対応する位置との間の距離は、２５ヌクレオチド以下である。
【００１６】
必要に応じて、標的核酸中の規定の位置での遺伝子バリエーション（例えば、ＳＮＰ）を同定するためのこれらのキットにおいて、以下の基準および／または成分が存在し得、ここで、任意の２つの基準および／または成分は、キットまたはその内容物を記載する際に組み合わされ得る：この第１ＯＤＮＰおよびこの第２ＯＤＮＰをプライマーとして、そしてこの標的核酸をテンプレートとして用いて、本発明の方法に従って増幅される２本鎖核酸分子において、一方の鎖中のこのＮＥＲＳを認識するニック形成エンドヌクレアーゼ（ＮＥ）によって生成されるニック形成部位（ＮＳ）と、他方の鎖におけるこのＲＥＲＳを認識する制限エンドヌクレアーゼ（ＲＥ）によって生成される切断部位に対応する位置との間の距離は、４０ヌクレオチド以下、または３９ヌクレオチド以下、または３８ヌクレオチド以下、または３７ヌクレオチド以下、または３６ヌクレオチド以下、または３５ヌクレオチド以下、または３４ヌクレオチド以下、または３３ヌクレオチド以下、または３２ヌクレオチド以下、または３１ヌクレオチド以下、または３０ヌクレオチド以下、または２９ヌクレオチド以下、または２８ヌクレオチド以下、または２７ヌクレオチド以下、または２６ヌクレオチド以下、または２５ヌクレオチド以下、または２４ヌクレオチド以下、または２３ヌクレオチド以下、または２２ヌクレオチド以下、または２１ヌクレオチド以下、または２０ヌクレオチド以下、または１９ヌクレオチド以下、または１８ヌクレオチド以下、または１７ヌクレオチド以下、または１６ヌクレオチド以下、または１５ヌクレオチド以下、または１４ヌクレオチド以下、または１３ヌクレオチド以下、または１２ヌクレオチド以下、または１１ヌクレオチド以下、または１０ヌクレオチド以下、または９ヌクレオチド以下、または８ヌクレオチド以下、または７ヌクレオチド以下、または６ヌクレオチド以下、または５ヌクレオチド以下である；この第１ＯＤＮＰおよびこの第２ＯＤＮＰをプライマーとして、そしてこの標的核酸をテンプレートとして用いて増幅される２本鎖核酸分子において、一方の鎖におけるこのＮＥＲＳを認識するニック形成エンドヌクレアーゼ（ＮＥ）によって生成されるニック形成部位（ＮＳ）と、他方の鎖におけるこのＮＥによって生成されるＮＳに対応する位置との間の距離は、４０ヌクレオチド以下、または３９ヌクレオチド以下、または３８ヌクレオチド以下、または３７ヌクレオチド以下、または３６ヌクレオチド以下、または３５ヌクレオチド以下、または３４ヌクレオチド以下、または３３ヌクレオチド以下、または３２ヌクレオチド以下、または３１ヌクレオチド以下、または３０ヌクレオチド以下、または２９ヌクレオチド以下、または２８ヌクレオチド以下、または２７ヌクレオチド以下、または２６ヌクレオチド以下、または２５ヌクレオチド以下、または２４ヌクレオチド以下、または２３ヌクレオチド以下、または２２ヌクレオチド以下、または２１ヌクレオチド以下、または２０ヌクレオチド以下、または１９ヌクレオチド以下、または１８ヌクレオチド以下、または１７ヌクレオチド以下、または１６ヌクレオチド以下、または１５ヌクレオチド以下、または１４ヌクレオチド以下、または１３ヌクレオチド以下、または１２ヌクレオチド以下、または１１ヌクレオチド以下、または１０ヌクレオチド以下、または９ヌクレオチド以下、または８ヌクレオチド以下、または７ヌクレオチド以下、または６ヌクレオチド以下、または５ヌクレオチド以下である；このＮＥＲＳは、配列５’ＧＡＧＴＣ３’を有する；Ｎ．ＢｓｔＮＢ  Ｉ；Ｎ．ＢｓｔＮＢ  Ｉについての緩衝液；このＲＥＲＳを認識する制限エンドヌクレアーゼ（ＲＥ）；このＲＥについての緩衝液；ＤＮＡポリメラーゼ；ｅｘｏ−Ｂｓｔポリメラーゼ、ｅｘｏ−Ｂｃａポリメラーゼ、９°ＮｍＴＭＤＮＡポリメラーゼ、およびｅｘｏ−Ｖｅｎｔポリメラーゼから選択されるＤＮＡポリメラーゼ；このＤＮＡポリメラーゼについての緩衝液；このＮＥおよびこのＤＮＡポリメラーゼの両方についての緩衝液；このキットを使用することについての指示書；液体クロマトグラフィーカラム；逆相液体クロマトグラフィーカラム；水、および有機酸または無機酸と錯化した２級アミンまたは３級アミンのアンモニウム塩を含む、緩衝液Ａ、ここで、このアンモニウム塩のアミン成分は、トリエチルアミン、ジアリルアミン、ジイソプロピルアミン、Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−シクロヘキシルアミン、Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−イソプロピルアミン、およびＮ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−ブチルアミンからなる群より必要に応じて選択され、ここで、この２級アミンまたは３級アミンは、有機酸と必要に応じて錯化しており、そしてこの有機酸は、酢酸、プロピオン酸、およびそれらのハロゲン化版から必要に応じて選択される；緩衝液Ａおよび有機溶媒を含む、緩衝液Ｂであって、ここで、この有機溶媒は、メタノールおよびアセトニトリルから必要に応じて選択される；デオキシリボヌクレオシド三リン酸；改変デオキシリボヌクレオシド三リン酸；コントロールテンプレート核酸分子およびコントロールＯＤＮＰ対；トレハロース；オリゴヌクレオチド標準；ならびに／またはこのＯＤＮＰ対を設計または注文する際に有用なソフトウェアについてのアクセスコード。例えば、キットは、このＲＥＲＳを認識するＲＥおよびこのＲＥについての緩衝液、このＮＥＲＳを認識するＮＥおよびこのＮＥについての緩衝液、ならびにＤＮＡポリメラーゼおよびこのＤＮＡポリメラーゼについての緩衝液をさらに備え得る。
【００１７】
標的核酸における規定された位置の遺伝子バリエーションを同定するための方法を提供することに加えて、本発明は、（多重）標的核酸における規定された位置の（多重）遺伝子バリエーションの多重同定のための方法を提供する。従って、単一のサンプルは、各々が遺伝子バリエーションを有する２以上の核酸を含み得る。プライマーの適切な選択によって、サンプルが、多重潜在的遺伝子バリエーションを含む、特定の遺伝子バリエーションを有する核酸の存在または不存在、あるいは核酸の特定のサンプルを有する特定の遺伝子バリエーションの存在が、分析され得る。例えば、１つの局面において、本発明は、標的核酸における規定された位置の遺伝子バリエーションの多重同定のための方法を提供し、ここで、この方法は、以下の工程を包含する：（ａ）調査下の標的核酸における各々の遺伝子バリエーションに対して、（ｉ）第１のオリゴヌクレオチドプライマー（ＯＤＮＰ）、第２のＯＤＮＰ、および標的核酸を含む混合物を形成する工程であって、ここで、ａ）調査下の標的核酸が、第１の鎖および第２の鎖を有する二本鎖核酸である場合に、第１のＯＤＮＰは、ニック形成エンドヌクレアーゼ認識配列（ＮＥＲＳ）のセンス鎖の配列、および遺伝子バリエーションの補体に対して３’側に位置する標的核酸の第１の鎖のヌクレオチド配列に対して少なくとも実質的に相補的であるヌクレオチド配列を含み、そして第２のＯＤＮＰは、制限エンドヌクレアーゼ認識配列（ＲＥＲＳ）の１本の鎖の任意の配列、および遺伝子バリエーションに対して３’側に位置する標的核酸の第２の鎖のヌクレオチド配列に対して少なくとも実質的に相補的であるヌクレオチド配列を含み、一方、ｂ）調査下の標的核酸が、一本鎖核酸である場合に、第１のＯＤＮＰは、ＮＥＲＳのセンス鎖の配列、および遺伝子バリエーションに対して５’側に位置する標的核酸のヌクレオチド配列に対して少なくとも実質的に同一であるヌクレオチド配列を含み、そして第２のＯＤＮＰは、ＲＥＲＳの１本の鎖の任意の配列、および遺伝子バリエーションに対して３’側に位置する標的核酸のヌクレオチド配列に対して少なくとも実質的に相補的であるヌクレオチド配列を含む、工程；（ｉｉ）第１のＯＤＮＰおよび第２のＯＤＮＰによって囲まれたフラグメントを生成するために、第１のＯＤＮＰおよび第２のＯＤＮＰを伸長させる工程であって、ここで、伸長反応は、各標的核酸に対して別個にか、または１より多い標的核酸に対して共同してのいずれかで実施され得る。（ｂ）必要に応じて、すなわち、この工程は、伸長生成物を、ためにＲＥＲＳを認識するＲＥによって切断して消化生成物を提供する、本発明の方法に従って実施され得るか、または実施され得ない。（ｃ）工程（ａ）（ｉｉ）の各伸長生成物の１本の鎖またはＮＥＲＳを認識するニック形成エンドヌクレアーゼの存在下におけるテンプレートとして工程（ｃ）の各消化生成物を使用して、一本鎖核酸フラグメントを増幅する工程。（ｄ）増幅された一本鎖フラグメントを特徴付けし、それによって遺伝子バリエーションを同定する工程。１つの関連する局面において、本発明は、標的核酸における規定された位置での単一のヌクレオチド多型の多重同定のための方法を提供し、ここで、この方法は、以下の工程を含む：（ａ）各標的核酸に対して、（ｉ）第１のオリゴヌクレオチドプライマー（ＯＤＮＰ）、第２のＯＤＮＰ、および標的核酸を含む混合物を形成する工程であって、ここで、ａ）標的核酸が、第１の鎖および第２の鎖を有する二本鎖核酸である場合に、第１のＯＤＮＰは、ニック形成エンドヌクレアーゼ認識配列（ＮＥＲＳ）のセンス鎖の配列、およびＳＮＰの補体に対して３’側に位置する標的核酸の第１の鎖のヌクレオチド配列に対して少なくとも実質的に相補的であるヌクレオチド配列を含み、そして第２のＯＤＮＰは、制限エンドヌクレアーゼ認識配列（ＲＥＲＳ）の１本の鎖の配列、およびＳＮＰに対して３’側に位置する標的核酸の第２の鎖のヌクレオチド配列に対して少なくとも実質的に相補的であるヌクレオチド配列を含むか、または、ｂ）標的核酸が、一本鎖核酸である場合、第１のＯＤＮＰは、ＮＥＲＳのセンス鎖の配列、およびＳＮＰに対して５’側に位置する標的核酸のヌクレオチド配列に対して少なくとも実質的に同一であるヌクレオチド配列を含み、そして第２のＯＤＮＰは、ＲＥＲＳの１本の鎖の配列、およびＳＮＰに対して３’側に位置する標的核酸のヌクレオチド配列に対して少なくとも実質的に相補的であるヌクレオチド配列を含む；（ｉｉ）第１のＯＤＮＰおよび第２のＯＤＮＰによって囲まれたフラグメントを生成するために、第１のＯＤＮＰおよび第２のＯＤＮＰを伸長させる工程であって、ここで、伸長反応は、各標的核酸に対して別個にか、または１より多い標的核酸に対して共同してのいずれかで実施され得る。（ｂ）伸長生成物をＲＥＲＳを認識するＲＥによって切断して、消化生成物を提供する工程。（ｃ）工程（ａ）（ｉｉ）の各伸長生成物の１本の鎖またはＮＥＲＳを認識するニック形成エンドヌクレアーゼの存在下でテンプレートとしての工程（ｃ）の各消化生成物を使用して、好ましくは、等温状態で、一本鎖核酸フラグメントを増幅する工程であって、ここで、一本鎖核酸フラグメントの各々は、好ましくは、１７個以下のヌクレオチドを含む。（ｄ）少なくとも部分的に液体クロマトグラフィーおよび／または質量分析法を使用して一本鎖フラグメントを特性付けし、それによって遺伝子バリエーションを同定する工程。
【００１８】
１つの関連する局面において、本発明は、標的核酸における規定された位置での遺伝子バリエーションの多重同定のための方法を提供し、ここで、この方法は、以下の工程を包含する：（ａ）各標的核酸について、（ｉ）第１のオリゴヌクレオチドプライマー（ＯＤＮＰ）、第２のＯＤＮＰ、および標的核酸を含む混合物を形成する工程であって、ここで、ａ）標的核酸が、第１の鎖および第２の鎖を有する二本鎖核酸である場合には、第１のＯＤＮＰは、遺伝子バリエーションの補体に対して３’側に位置する標的核酸の第１の鎖のヌクレオチド配列に対して少なくとも実質的に相補的であるヌクレオチド配列を含み、そして第２のＯＤＮＰは、遺伝子バリエーションに対して３’側に位置する標的核酸の第２の鎖のヌクレオチド配列に対して少なくとも実質的に相補的であるヌクレオチド配列を含むが、ｂ）標的核酸が、一本鎖核酸である場合には、第１のＯＤＮＰは、遺伝子バリエーションに対して５’側に位置する標的核酸のヌクレオチド配列に対して少なくとも実質的に同一であるヌクレオチド配列を含み、そして第２のＯＤＮＰは、遺伝子バリエーションに対して３’側に位置する標的核酸のヌクレオチド配列に対して少なくとも実質的に相補的であるヌクレオチド配列を含み、ここで、いずれかの事象において、第１のＯＤＮＰおよび第２のＯＤＮＰの各々は、ニック形成エンドヌクレアーゼ認識配列（ＮＥＲＳ）のセンス鎖の配列をさらに含み、（ｉｉ）２つのＮＥＲＳを有するフラグメントを生成するために、第１のＯＤＮＰおよび第２のＯＤＮＰを伸長させる工程であって、ここで、伸長反応は、各標的核酸に対して別個にか、または１より多い標的核酸に対して共同してのいずれかで実施され得る。（ｂ）ＮＥＲＳを認識するニック形成エンドヌクレアーゼ（ＮＥ）の存在下におけるテンプレートとして、各伸長生成物の１本の鎖を使用して、一本鎖核酸フラグメントを増幅する工程。（ｃ）工程（ｂ）の一本鎖フラグメントを特徴付けし、それによって遺伝子バリエーションを同定する工程。１つの関連する局面において、本発明は、標的核酸における規定された位置の単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）の多重同定のための方法を提供し、ここで、この方法は、以下の工程を包含する：（ａ）各標的核酸に対して、（ｉ）第１のオリゴヌクレオチドプライマー（ＯＤＮＰ）、第２のＯＤＮＰ、および標的核酸を含む混合物を形成する工程であって、ここで、ａ）標的核酸が、第１の鎖および第２の鎖を有する二本鎖核酸である場合に、第１のＯＤＮＰは、ＳＮＰの補体に対して３’に位置する標的核酸の第１の鎖のヌクレオチド配列に対して少なくとも実質的に相補的であるヌクレオチド配列を含み、そして第２のＯＤＮＰは、ＳＮＰに対して３’に位置する標的核酸の第２の鎖のヌクレオチド配列に対して少なくとも実質的に相補的であるヌクレオチド配列を含むが、ｂ）標的核酸が、一本鎖核酸である場合には、次いで、第１のＯＤＮＰは、ＳＮＰに対して５’に位置する標的核酸のヌクレオチド配列に対して少なくとも実質的に同一であるヌクレオチド配列を含み、そして第２のＯＤＮＰは、ＳＮＰに対して３’に位置する標的核酸のヌクレオチド配列に対して少なくとも実質的に相補的であるヌクレオチド配列を含み、ここで、いずれかの事象において、第１のＯＤＮＰおよび第２のＯＤＮＰの各々は、同じニック形成エンドヌクレアーゼ認識配列（ＮＥＲＳ）のセンス鎖の配列をさらに含み、そして（ｉｉ）２つのＮＥＲＳを有するフラグメントを生成するために、第１のＯＤＮＰおよび第２のＯＤＮＰを伸長させる工程であって、ここで、伸長反応は、各標的核酸に対して別個にか、または１より多い標的核酸に対して共同してのいずれかで実施され得る。（ｂ）ＮＥＲＳを認識するニック形成エンドヌクレアーゼ（ＮＥ）の存在下におけるテンプレートとしての各伸長生成物の１本の鎖を使用して、等温状態下で、一本鎖核酸フラグメントを増幅する工程であって、ここで、好ましくは、一本鎖核酸フラグメントは、多くとも１７個のヌクレオチドを各々含む。（ｃ）少なくとも一部液体クロマトグラフィーおよび／または質量分析法を使用して、工程（ｂ）の一本鎖フラグメントを特徴付けし、それによって遺伝子バリエーションを同定する工程。
【００１９】
（複数の）標的核酸中の規定された位置における（複数の）遺伝子バリエーションの多重同定のための方法において、１つ以上のさらなる基準を使用して、（これらのさらなる基準が本明細書中に開示される場合）この方法を記載し得、そしてこれらの基準は、（これらの基準の任意の１つ以上が本発明の方法を記載する際に利用され得る場合）標的核酸における規定される位置における遺伝子バリエーション（例えば、ＳＮＰ）の同定に関する本発明の方法に関連して上記される基準を含む。例えば、（複数の）標的核酸における規定された位置における（複数の）遺伝子バリエーションの多重同定のための本発明の方法を記載するために使用され得る、この基準のうちのいくつかとしては、以下が挙げられる：遺伝子バリエーションの少なくとも１つがＳＮＰである；遺伝子バリエーションの少なくとも１つが疾患（例えば、ヒトの遺伝性疾患）に関連する；遺伝子バリエーションの少なくとも１つが病原性微生物の薬物耐性に関連する；標的核酸の少なくとも１つが、ゲノム核酸である；標的核酸の少なくとも１つがｃＤＮＡである；標的核酸の少なくとも１つが病原性ウイルスのゲノムに由来する；標的核酸の少なくとも１つが病原性細菌のゲノムに由来する；標的核酸の少なくとも１つが、病原性細菌のエピソームに由来する；標的核酸が二本鎖である場合に標的核酸の第１の鎖に対して少なくとも実質的に相補的であるか、または標的核酸が一本鎖である場合に標的核酸に対して同一である、第１ＯＤＮＰのヌクレオチド配列が、少なくとも８ヌクレオチド長、もしくは少なくとも９ヌクレオチド長もしくは少なくとも１０ヌクレオチド長、もしくは少なくとも１１ヌクレオチド長、もしくは少なくとも１２ヌクレオチド長、もしくは少なくとも１３ヌクレオチド長、もしくは少なくとも１４ヌクレオチド長、もしくは少なくとも１５ヌクレオチド長である；標的核酸が二本鎖である場合に標的核酸の第２鎖に対してか、または標的核酸が二本鎖である場合にこの標的核酸に対して少なくとも実質的に相補的である、第２ＯＤＮＰのヌクレオチド配列が、少なくとも８ヌクレオチド長、もしくは少なくとも９ヌクレオチド長もしくは少なくとも１０ヌクレオチド長、もしくは少なくとも１１ヌクレオチド長、もしくは少なくとも１２ヌクレオチド長、もしくは少なくとも１３ヌクレオチド長、もしくは少なくとも１４ヌクレオチド長、もしくは少なくとも１５ヌクレオチド長である；ＲＥＲＳが、ＩＩ型制限エンドヌクレアーゼにより認識可能である；ＲＥＲＳが、ＩＩｓ型制限エンドヌクレアーゼにより認識可能である；ＲＥＲＳが、Ｂｐｍ  Ｉにより認識可能である；ＲＥＲＳが、分断された制限エンドヌクレアーゼにより認識可能である；ＮＥＲＳが、５’ＧＡＧＴＣ３’である；伸長がポリメラーゼ連鎖反応により行われる；増幅が、ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、ｅｘｏ−Ｂｓｔポリメラーゼ、ｅｘｏ−Ｂｃａポリメラーゼ、９°ＮｍＴＭ  ＤＮＡポリメラーゼまたはｅｘｏ−Ｖｅｎｔポリメラーゼ）の存在下で行われる；増幅が、等温条件下で行われる；工程（ｃ）の一本鎖核酸フラグメントが、２０以下、もしくは１９以下、もしくは１８以下、もしくは１７以下、もしくは１６以下、もしくは１５以下、もしくは１４以下、もしくは１３以下、もしくは１２以下、もしくは１１以下、もしくは１０以下のヌクレオチドを含む；特徴づけが、質量分析法、液体クロマトグラフィー、蛍光偏光、電子イオン化、ゲル電気泳動、およびキャピラリー電気泳動から選択される１つ以上の技術を含む特徴づけが、質量分析を含む１つ以上の方法によって行われる；この方法が、工程（ｃ）を行う前に、工程（ａ）（ｉｉ）の少なくとも２つの伸長反応の産物を合わせる工程をさらに包含する；工程（ｃ）を行う前に、工程（ａ）（ｉｉ）の各伸長反応の産物を合わせる工程；この方法が、消化産物を提供するようにＲＥＲＳを認識するＲＥを用いて伸長産物を切断する工程を包含する；この方法が、ＲＥＲＳを認識するＲＥを用いて伸長産物を切断する工程を省略して、その結果消化産物が形成されない。
【００２０】
関連する実施形態の別の組において、本発明は、標的核酸中の位置における遺伝子バリエーションの多重同定のための方法において使用され得るキットを提供する。これらの実施形態の１つにおいて、このキットは、調査中の標的核酸の各々について、以下を含む：（ａ）標的核酸が、第１鎖および第２鎖を有する二本鎖核酸である場合、このキットは、（ｉ）ニック形成エンドヌクレアーゼ認識配列（ＮＥＲＳ）のセンス鎖の配列、および遺伝子バリエーションの補体に対して３’に位置する標的核酸の第１鎖のヌクレオチド配列に対して少なくとも実質的に相補的なヌクレオチド配列を含む、第１オリゴヌクレオチドプライマー（ＯＤＮＰ）、ならびに（ｉｉ）任意の配列を含む、すなわち、制限エンドヌクレアーゼ認識配列（ＲＥＲＳ）の１つの鎖の（すなわち同一な）ヌクレオチド配列を必要に応じて含み、かつ遺伝子バリエーションに対して３’に位置する標的核酸の第２鎖のヌクレオチド配列に対して少なくとも実質的に相補的なヌクレオチド配列を有する、第２ＯＤＮＰ、を含み；そして（ｂ）標的核酸の１つ以上が一本鎖である場合、各一本鎖標的核酸について、このキットは、（ｉ）ＮＥＲＳのセンス鎖の配列および遺伝子バリエーションに対して５’に位置する標的核酸のヌクレオチド配列に対して少なくとも実質的に同一なヌクレオチド配列を含む、第１ＯＤＮＰ、ならびに（ｉｉ）ＲＥＲＳの１つの鎖に同一なヌクレオチド配列を必要に応じて含み、そして遺伝子バリエーションに対して３’に位置する標的核酸のヌクレオチド配列に対して少なくとも実質的に相補的なヌクレオチド配列を必ず含む、第２ＯＤＮＰ、を含む。関連する局面において、本発明は、標的核酸中の規定された位置における遺伝子バリエーションの多重同定のための方法において有用なキットを提供し、この場合、このキットは、調査中の各標的核酸について、以下を含む：（ａ）特定の標的核酸が、第１の鎖および第２の鎖を有する二本鎖核酸である場合、この型の標的核酸の各々について、このキットは、（ｉ）遺伝子バリエーションの補体に対して３’に位置する標的核酸の第１の鎖のヌクレオチド配列に対して少なくとも実質的に相補的なヌクレオチド配列を含む、第１ＯＤＮＰ、ならびに（ｉｉ）遺伝子バリエーションに対して３’に位置する標的核酸の第２の鎖のヌクレオチド配列に対して少なくとも実質的に相補的なヌクレオチド配列を含む第２ＯＤＮＰ、を有する；しかし、（ｂ）一本鎖核酸である調査中の標的核酸の各々については、このキットは、（ｉ）遺伝子バリエーションに対して５’に位置する標的核酸のヌクレオチド配列に対して少なくとも実質的に同一なヌクレオチド配列を含む第１ＯＤＮＰ、ならびに（ｉｉ）遺伝子バリエーションに対して３’に位置する標的核酸のヌクレオチド配列に対して少なくとも実質的に相補的なヌクレオチド配列を含む、第２ＯＤＮＰ、を含み、ここで第１ＯＤＮＰおよび第２ＯＤＮＰの各組は、ニック形成エンドヌクレアーゼ認識配列（ＮＥＲＳ）のセンス鎖をさらに含む。
【００２１】
標的核酸内の位置における遺伝子変異の多重同定のための方法において特に有用である本発明のキットにおいて、以下の基準のうちの１つ以上が、キットを説明する際に使用され得、ここで、これらの基準は、任意の組合せで組み合わされ得、そしてこのキットは、本明細書中に記載される遺伝子変異の多重同定のための方法において使用されるように設計され、そしてこれらの基準は、非限定的であり、すなわち、他の基準は、本明細書中の他の箇所に現れ得る：核酸分子に存在するＮＥＲＳは、配列５’ＧＡＧＴＣ３’を有し；Ｎ．ＢｓｔＮＢ  Ｉは、キット内に存在し；このキットは、Ｎ．ＢｓｔＮＢ  Ｉのための緩衝液を含み；このキットは、ＲＥＲＳを認識する制限エンドヌクレアーゼ（ＲＥ）を含み；このキットは、ＲＥのための緩衝液を含み；このキットは、ＤＮＡポリメラーゼを含み；このキットは、ｅｘｏ−Ｂｓｔポリメラーゼ、ｅｘｏ−Ｂｃａポリメラーゼ、９ｏＮｍＴＭＤＮＡポリメラーゼ、またはｅｘｏ−Ｖｅｎｔポリメラーゼのうちの１つ以上を含み；このキットは、ＤＮＡポリメラーゼのための緩衝液を含み；このキットは、ニック形成エンドヌクレアーゼおよびＤＮＡポリメラーゼの両方に適切な緩衝液を含み；このキットは、ＮＥに適切な緩衝液およびＤＮＡポリメラーゼのための異なる緩衝液；このキットを使用するための説明書；液体クロマトグラフィーカラム；逆相液体クロマトグラフィーカラム；水および有機酸または無機酸と複合体化した第２級アミンまたは第３級アミンのアンモニウム塩を含む緩衝液Ａ（ここで、アンモニウム塩のアミン成分は、必要に応じて、トリエチルアミン、ジアリルアミン、ジイソプロピルアミン、Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−シクロヘキシルアミン、Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−イソプロピルアミン、およびＮ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−ブチリルアミンからなる群より選択され、ここで、第２級アミンまたは第３級アミンは、必要に応じて、有機酸と複合体化され、ここで、有機酸は、必要に応じて、酢酸、プロピオン酸、およびそれらのハロゲン化版から選択される）；緩衝液Ａおよび有機溶媒を含む緩衝液Ｂ（ここで、有機溶媒は、必要に応じて、メタノールおよびアセトニトリルから選択される）；デオキシリボヌクレオシド三リン酸；改変デオキシリボヌクレオシド三リン酸；コントロールテンプレート核酸分子およびコントロールＯＤＮＰ対；トレハロース；オリゴヌクレオチド標準；および／またはＯＤＮＰ対を設計または注文する際に有用なソフトウェアのためのアクセスコードを含む。例えば、キットは、ＲＥＲＳを認識するＲＥおよびＲＥのための緩衝液、ＮＥＲＳを認識するＮＥおよびＮＥのための緩衝液、およびＤＮＡポリメラーゼおよびＤＮＡポリメラーゼのための緩衝液をさらに含み得る。
【００２２】
別の局面では、本発明はサンプル中の標的核酸の存在または非存在を決定するための方法を提供する。これらの方法は、診断の状態において特に有用であり、ここで、特定のサンプル（例えば、患者由来のサンプル）が特定の標的核酸（例えば、疾患の原因となる生物に共通して見いだされる核酸）を含むか否かを決定することが所望される。１つの実施形態では、この方法は、以下（ａ）〜（ｄ）を包含する：（ａ）部分的に２本鎖となったオリゴヌクレオチドプローブとサンプル中に存在する核酸分子を混合する工程。この核酸分子およびプローブは、サンプル中に存在し得る標的核酸に対するこのプローブのハイブリダイゼーションを可能にする条件下で混合される。このプローブは、以下の（ｉ）〜（ｉｉ）のいずれかを有するものとして特徴付けられる：（ｉ）ニック形成剤（ＮＡ）によって認識可能であるニック形成剤認識配列（ＮＡＲＳ）（ここで、このニック形成剤はニック形成部位（ＮＳ）で切断する）および（ｉｉ）ＮＳを含むかまたはＮＳを含むように伸長され得る鎖における５’突出部、あるいはＮＳを含まないかまたはＮＳを含むように伸長され得ない鎖における３’突出部のいずれか（ここで、いずれかの場合において、この突出部は標的核酸に存在するヌクレオチド配列に少なくとも実質的に相補的なヌクレオチド配列を含む）。（ｂ）工程（ａ）の混合物からハイブリダイズしていないプローブを取り除く工程。（ｃ）ＮＡおよびＤＮＡポリメラーゼの存在下で増幅反応を実施して、増幅産物を提供する工程であって、ここで、この増幅反応は、好ましくは、標的核酸にハイブリダイズしたプローブにおいて実施される、工程。（ｄ）工程（ｃ）の増幅産物の存在または非存在を検出する工程であって、それによって、サンプル中の標的核酸の存在または非存在を決定する工程。生物学的サンプル中における標的核酸の存在または非存在を決定するための方法に関する関連局面において、この方法は、以下の（ａ）〜（ｃ）を包含する：（ａ）部分的に２本鎖となったオリゴヌクレオチドプローブとこのサンプルの核酸分子を混合して、その標的核酸に対するプローブのハイブリダイゼーションを可能にするための工程であって、ここで、このプローブは、以下の（ｉ）〜（ｉｉ）のいずれかを含む：（ｉ）ニック形成エンドヌクレアーゼ（ＮＥ）によって認識され得るニック形成エンドヌクレアーゼ認識配列（ＮＥＲＳ）（ここで、ＮＥＲＳの認識の後において、このＮＥは、ニック形成部位（ＮＳ）と称される位置で二本鎖核酸においてニックを生じる）、および（ｉｉ）ＮＳを含むプローブの鎖または伸長されるかつ伸長するときにＮＳを含むプローブの鎖における５’突出部、あるいはＮＳを含まない鎖かつＮＳを形成するように伸長しない鎖における３’突出部（ここで、この突出部（５’または３’）は標的核酸に少なくとも実質的に相補的なヌクレオチド配列を含む）、工程。（ｂ）工程（ａ）の混合物からハイブリダイズしていないプローブを取り除く工程（ｃ）ＮＥおよびＤＮＡポリメラーゼの存在下で、好ましくは等温度条件下で増幅反応を実施して、増幅産物を提供する工程（ここで、この増幅産物は、好ましくは１７以下のヌクレオチドを含む）（ｄ）好ましくは、少なくとも部分的に液体クロマトグラフィーおよび／または質量分析法を使用して工程（ｃ）の増幅産物の存在または非存在を検出する工程（ここで、この検出工程は。標的核酸がそのサンプル中に存在したか否かを決定することを可能にする）。関連する局面では、本発明は、サンプル中の標的核酸の存在または非存在を決定するための方法を提供し、ここで、この方法は、以下（Ａ）〜（Ｃ）を包含する（Ａ）以下の（ｉ）〜（ｉｉｉ）を含む混合物を形成する工程：（ｉ）目的のサンプル由来の核酸分子（ここで、これらの核酸分子は、標的核酸を含んでも含まなくともよい）；（ｉｉ）（ａ）標的核酸に存在するヌクレオチド配列に少なくとも実質的に相補的な第１のヌクレオチド配列、（ｂ）ニック形成剤認識配列（ＮＡＲＳ）のアンチセンス鎖のヌクレオチド配列、および（ｃ）第２の配列を、３’から５’へと含む１本鎖核酸プローブ、（ｉｉｉ）ＮＡＲＳを認識する、ニック形成エンドヌクレアーゼ（ＮＡ）、ＤＮＡポリメラーゼ、および１以上のデオキシヌクレオシド三リン酸。（Ｂ）標的核酸サンプル中に存在する場合にテンプレートとして１本鎖核酸プローブを使用して１本鎖核酸フラグメントを増幅する条件下で工程（Ａ）の混合物を維持する工程。１つの実施形態では、この１本鎖核酸フラグメントは、長くて、２５ヌクレオチド長である。（Ｃ）工程（Ｂ）において増幅される１本鎖核酸フラグメントの存在または非存在を検出して、サンプル中の標的核酸の存在または非存在を決定する工程。関連する実施形態において、本発明は、サンプル中の標的核酸の存在または非存在を決定するための方法を提供し、ここで、この方法は、以下の（Ａ）〜（Ｃ）を包含する：（Ａ）（ｉ）そのサンプル由来の核酸分子；（ｉｉ）（ａ）研究中の標的核酸に存在するヌクレオチド配列に少なくとも実質的に相補的なヌクレオチド配列および（ｂ）ニック形成剤認識配列（ＮＡＲＳ）のセンス鎖のヌクレオチドを３’から５’へ含む１本鎖核酸フラグメント；ならびに（ｉｉｉ）第１のＮＡＲＳを認識するニック形成エンドヌクレアーゼ（ＮＡ）、ＤＮＡポリメラーゼ、および１以上のデオキシヌクレオシド三リン酸を含む混合物を形成する工程。（Ｂ）標的核酸がサンプル中に存在する場合に標的核酸に少なくとも実質的に相補的な１本鎖核酸フラグメントの増幅を可能にする条件下で混合物を維持する工程。１つの実施形態において、この１本鎖核酸フラグメントは、長くとも２５ヌクレオチド長である。（Ｃ）サンプル中の標的核酸の存在または非存在を決定するために、工程（Ｂ）において増幅された１本鎖核酸フラグメントの存在または非存在を検出する工程。関連する局面では、本発明はまた、サンプル中の標的核酸の存在または非存在を決定するための方法を提供する（ここで、この標的核酸は、ニック形成剤認識配列（ＮＡＲＳ）を含む）。この方法は、以下の（Ａ）〜（Ｃ）を包含する：（Ａ）（ｉ）サンプルの核酸分子、ならびに（ｉｉ）ＮＡＲＳ，ＤＮＡポリメラーゼ、および１以上のデオキシヌクレオシド三リン酸を認識するニック形成剤（ＮＡ）を含む混合物を形成する工程。（Ｂ）サンプル中に標的核酸が存在する場合にテンプレートとして標的核酸の一部分を使用して１本鎖核酸のフラグメントの増幅を可能にする条件下で（Ａ）の混合物を維持する工程（Ｃ）サンプル中の標的核酸の存在または非存在を決定するために工程（Ｂ）で増幅した１本鎖核酸フラグメントの存在または非存在を検出する工程。関連する局面では、本発明は、標的核酸の存在または非存在を決定するための方法を提供し、ここで、この標的は、第１のニック形成剤認識配列（ＮＡＲＳ）のヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列を有する。この方法は、以下の（Ａ）〜（Ｃ）を包含する：（Ａ）（ｉ）サンプルの核酸分子、（ｉｉ）標的核酸のうちの１つの鎖に実質的に同一であり、そしてＮＡＲＳのアンチセンス鎖と同一のヌクレオチド配列であるヌクレオチド配列を含む１本鎖プローブおよび（ｉｉｉ）ＮＡＲＳ、ＤＮＡポリメラーゼ、および１以上のデオキシヌクレオシド三リン酸を認識するニック形成剤（ＮＡ）を含む混合物を形成する工程。（Ｂ）標的配列がサンプル中に存在する事象においてテンプレートとしてプローブの一部分を使用して１本鎖核酸フラグメントの増幅を可能にする条件下でこの混合物を維持する工程。（Ｃ）サンプル中の標的核酸の存在または非存在を決定するために、工程（Ｂ）の一本鎖核酸フラグメントの存在または非存在を検出する工程。関連する方法において、本発明は、サンプル中の標的核酸の存在または非存在を決定するための方法を提供する。この方法は、以下の（Ａ）〜（Ｃ）を包含する：（Ａ）第１のオリゴヌクレオチドプライマー（ＯＤＮＰ）、第２のＯＤＮＰおよびサンプルの核酸分子を含む混合物を形成する工程（ここで、（ｉ）標的核酸が第１の鎖および第２の鎖を有する２本鎖核酸であり得る場合に、この第１のＯＤＮＰは、第１の制限エンドヌクレアーゼ認識配列（ＲＥＲＳ）のセンス鎖のヌクレオチド配列およびその標的核酸の第１の鎖の第１の部分に少なくとも実質的に相補的なヌクレオチド配列を含み、そして、第２のＯＤＮＰは、その標的核酸の第２の鎖の第２の部分に対して少なくとも実質的に相補的なヌクレオチド配列を含み、かつ、第２のＲＥＲＳのセンス鎖の配列を含み、この第２の部分は、その標的核酸の第２の鎖における第１の部分の相補体に対して３’に位置付けられるが、しかし、（ｉｉ）この標的核酸が一本鎖核酸であり得、この第１のＯＤＮＰが第１のＲＥＥＳのセンス鎖のヌクレオチド配列およびその標的核酸の第１の部分に少なくとも実質的に同一なヌクレオチド配列を含み、第２のＯＤＮＰは、その標的核酸の第２の部分に少なくとも実質的に相補的なヌクレオチド配列を含み、かつ第２のＲＥＲＳのセンス鎖の配列を含み、この第２の部分は標的核酸における第１の部分に対して５’側に位置付けられる。（Ｂ）サンプル中に標的核酸が存在する場合に、（ｉ）第１のＯＤＮＰおよび第２のＯＤＮＰを伸長して第１のＲＥＲＳおよび第２のＲＥＲＳの両方を含む伸長産物を生じ；そして（ｉｉ）第１のＲＥＲＳおよび第２のＲＥＲＳを認識する１以上の制限エンドヌクレアーゼ（ＲＥ）の存在下で、工程（Ｂ）（ｉ）の伸長産物のうちの１つの鎖をテンプレートとして使用して１本鎖核酸フラグメントを増幅する条件下に、（Ａ）の混合物を供する工程。１つの実施形態では、１本鎖核酸フラグメントは、長くて２５ヌクレオチド長である。（Ｃ）工程（Ｂ）で増幅した１本鎖核酸フラグメントの存在または非存在を検出してサンプル中の標的核酸の存在または非存在を決定する工程。必要に応じて、この第１のＲＥＲＳは、第２のＲＥＲＳに同一である。関連の局面において、本発明は、サンプル中の標的核酸の存在または非存在を決定するための方法を提供する。この方法は、以下の（Ａ）〜（Ｃ）を包含する：（Ａ）第１のオリゴヌクレオチドプライマー（ＯＤＮＰ）、第２のＯＤＮＰ、およびサンプルの核酸分子を含む混合物を形成する工程であって、ここで、（ｉ）その標的核酸が、第１の鎖および第２の鎖を有する２本鎖核酸である場合に、第１のＯＤＮＰが、第１のニック形成エンドヌクレアーゼ認識配列（ＮＥＲＳ）のセンス鎖に存在するヌクレオチド配列およびその標的核酸の第１の鎖の第１の部分に少なくとも実質的に相補的なヌクレオチド配列を含み、かつ第２のＯＤＮＰは、標的核酸の第２の鎖の第２の部分に少なくとも実質的に相補的なヌクレオチド配列を含みそして第２のＮＥＲＳのセンス鎖のヌクレオチド配列をさらに含み、ここで、この第２の部分は、標的核酸の第２の鎖における第１の部分の相補体に対して３’側に位置付けられるか、または（ｉｉ）標的核酸が１本鎖核酸である場合に、第１のＯＤＮＰは、第１のＮＥＲＳのセンス鎖のヌクレオチド配列およびその標的核酸の第１の部分に少なくとも実質的に同一であるヌクレオチド配列を含むが、その一方で、第２のＯＤＮＰは、その標的核酸の第２の部分に少なくとも実質的に相補的なヌクレオチド配列を含み、そして、第１のＮＥＲＳのセンス鎖の配列をさらに含み、ここで、この第２の部分は、標的核酸における第１の部分に対して５’側に位置付けられる。
（Ｂ）標的配列がサンプル中に存在する場合に、（ｉ）第１のＯＤＮＰおよび第２のＯＤＮＰを伸長して第１のＮＥＲＳおよび第２のＮＥＲＳの両方を含む伸長産物を生じ；かつ（ｉｉ）第１のＮＥＲＳおよび第２のＮＥＲＳを認識する１以上のニック形成エンドヌクレアーゼ（ＮＥ）の存在下でテンプレートとして工程（Ｂ）（ｉ）の伸長産物のうちの１つの鎖を使用して１本鎖フラグメントを増幅するような条件下に、混合物を供する工程。１つの実施形態において、１本鎖核酸フラグメントは、長くて２５ヌクレオチド長である。（Ｃ）サンプル中の標的核酸の存在または非存在を決定するために工程（Ｂ）において増幅した１本鎖核酸フラグメントの存在または非存在を検出する工程。１つの実施形態では、この第１のＮＥＲＳおよび第２のＮＥＲＳは同一である。別の関連する局面において、本発明は、サンプル中の標的核酸の存在または非存在を決定するための方法を提供し、ここで、この方法は、以下の（Ａ）〜（Ｄ）を包含する：（Ａ）（ｉ）サンプル由来の核酸分子、および（ｉｉ）標的核酸の５’末端または５’末端近くに位置付けられる標的核酸の一部分に対して少なくとも実質的に相補的なヌクレオチド配列、およびニック形成剤認識配列（ＮＡＲＳ）のアンチセンス鎖の配列を３’から５’に含む１本鎖核酸プローブを含む混合物を形成する工程。（Ｂ）存在する場合に、その標的に対してハイブリダイズしていないプローブ分子から、標的にハイブリダイズしたプローブ分子を分離する工程（Ｃ）存在する場合には、標的にハイブリダイズしたプローブ分子およびＮＡＲＳを認識するニック形成剤（ＮＡ）の存在下で増幅反応を実施する工程。（Ｄ）工程（Ｃ）においてテンプレートして１本鎖核酸プローブを使用して増幅された１本鎖フラグメントの存在または非存在を検出して、それによって、サンプル中の標的核酸の存在または非存在を決定する工程。サンプル中の標的核酸の存在または非存在を決定するための方法に関する本発明のさらに別の関連する局面において、本発明は、以下（Ａ）〜（Ｄ）を包含する方法を提供する：（Ａ）（ｉ）サンプル中の核酸分子、（ｉｉ）５’末端を介して固体支持体に固定された一本鎖核酸プローブ（ここで、このプローブは、３’から５’方向へと、以下を含む：（ａ）標的の３’またはその付近に位置付けられた標的の一部分に少なくとも実質的に相補的なヌクレオチド配列および（ｂ）ニック形成剤認識配列のセンス鎖の配列）。（Ｂ）固体支持体との接触にから、プローブとハイブリダイズしないサンプルの核酸分子を取り除く工程。（Ｃ）工程（Ｂ）の固体支持体に対して固定されたプローブおよびニック形成剤認識配列を認識するニック形成剤の存在下で増幅反応を実施する工程。（Ｄ）サンプル中の標的核酸の存在または非存在を決定するために、テンプレートとして標的核酸の一部を使用して工程（Ｃ）において増幅された１本鎖核酸フラグメントの存在または非存在を検出する工程。
【００２３】
サンプル中の標的核酸の存在または非存在を決定することに関する本発明の種々の実施形態では、１つ以上の以下の判断基準が、実施形態を記載するために使用され得、ここでは任意の２つ、３つ、４つなどの判断基準が、実施形態を記載するために組み合わせられ得、そしてここでこれらの実施形態は、本明細書中の他の箇所に記載される他の実施形態に付け加えられる：工程（ｄ）が、発光分光学、蛍光分光学、質量分析法、液体クロマトグラフィー、蛍光分極、ゲル電気泳動およびキャピラリー電気泳動からなる群より選択される技術によって少なくとも一部実施され、ここで特徴付けが、これらの技術の１つ、２つ、３つまたはそれより多くによって実施され得、ならびに／またはこの特徴付けが、適切であり得るかおよび／もしくは容易に利用可能であり得る他の任意の特徴付け技術に加えて、これらの技術の１つ、２つ、３つまたはそれより多くによって実施され得る；サンプル中の標的核酸が、すべて一本鎖である；サンプル中の標的核酸が、すべて二本鎖である；サンプル中の標的核酸が、一本鎖標的核酸と二本鎖標的核酸との混合物である；標的核酸を含む生物学的サンプルまたは標的核酸が由来する生物学的サンプルが、哺乳動物（例えば、ヒト、ウシ、ウマ、イヌ、ヒツジ、シカ、ブタ）由来であるか、またはさもなくば、患者から由来するように記載されているものであり得る；標的核酸が、細菌および／またはウイルスおよび／または真菌および／または寄生生物からなる群より選択される宿主に由来する核酸分子である；ＮＡが、Ｎ．ＢｓｔＮＢ  Ｉであり、増幅が、ＤＮＡポリメラーゼの存在下において実施され、ここで以下が例示的な適切なＤＮＡポリメラーゼであり、そして以下のＤＮＡポリメラーゼの任意の２つ以上は組み合わされて、本発明に使用されるＤＮＡポリメラーゼが選択され得る群を形成し得る：ｅｘｏ−Ｖｅｎｔ、ｅｘｏ−Ｄｅｅｐ  Ｖｅｎｔ、ｅｘｏ−Ｂｓｔ、ｅｘｏ−Ｐｆｕ、ｅｘｏ−Ｂｃａ、Ｔａｑ、ＤＮＡポリメラーゼＩのＫｌｅｎｏｗフラグメント、Ｔ５  ＤＮＡポリメラーゼ、φ２９  ＤＮＡポリメラーゼ、ファージＭ２  ＤＮＡポリメラーゼ、ファージφＰＲＤ１  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ、ＰＲＤ  １  ＤＮＡポリメラーゼ、９°ＮｍＴＭ  ＤＮＡポリメラーゼ、およびＴ４  ＤＮＡポリメラーゼ；例えば、ポリメラーゼは、ｅｘｏ−Ｂｓｔポリメラーゼ、ｅｘｏ−Ｂｃａポリメラーゼ、９°ＮｍＴＭＤＮＡポリメラーゼ、またはｅｘｏ−Ｖｅｎｔポリメラーゼからなる群より選択され得る；増幅は、等温条件下で実施される；増幅は、標識化デオキシヌクレオシド三リン酸の存在下において実施される；増幅は標識化デオキシヌクレオシド三リン酸の存在下において実施され、ここでこの標識化デオキシヌクレオシド三リン酸は、標識に連結されたデオキシヌクレオシド三リン酸であり、ここでこの標識は、放射性標識および／または酵素および／または蛍光色素および／またはジゴキシゲニンおよび／またはビオチンであり得、ここでこれらは例示的な標識である；増幅産物が形成されたか否かを検出する工程、そして増幅産物が形成された場合には、次いでさらに、増幅産物のいくらかまたはすべてのヌクレオチド配列を検出する工程が、発光分��学、蛍光分光学、質量分析法、液体クロマトグラフィー、蛍光分極、ゲル電気泳動およびキャピラリー電気泳動を含む１つ以上の技術によって少なくとも一部達成され、例えば、分析は、発光分光学、蛍光分光学、または質量分析法によって実施され得る；増幅産物が、存在するならば、３以下、または４以下、または５以下、または６以下、または７以下、または８以下、または９以下、または１０以下、または１１以下、または１２以下、または１３以下、または１４以下、または１５以下、または１６以下、または１７以下、または１８以下、または１９以下、または２０以下、または２１以下、または２２以下、または２３以下、または２４以下、または２５以下、または２６以下、または２７以下、または２８以下、または２９以下、または３０以下、または３１以下、または３２以下、または３３以下、または３４以下、または３５以下、または３６以下、または３７以下、または３８以下、または３９以下、または４０以下、または４１以下、または４２以下、または４３以下、または４４以下、または４５以下、または４６以下、または４７以下、または４８以下、または４９以下、または５０以下のヌクレオチドを含む；サンプル中に存在する核酸分子が、固体支持体に固定される；増幅産物が、検出前に固体基材に固定される；一本鎖核酸プローブが、固体支持体に固定される。
【００２４】
特定の標的核酸が、サンプル中に存在するかまたは存在しないかを決定するための方法を実施するための手段として、本発明は、種々のキットを提供する。種々の実施形態において、このキットは、以下の構成要素の１つ以上を含み、ここで本発明に従うキットを記載するにおいて、これらの構成要素の任意の２つ以上は組み合わされ得る：サンプル中における標的核酸の存在または非存在を決定することに関する前述の方法において記載されたような部分的に二本鎖のオリゴヌクレオチドプローブ；２つの一本鎖オリゴヌクレオチドであって、これらはその互いとのアニーリングに際して、サンプル中における標的核酸の存在または非存在を決定することに関する前述の方法において記載されたような二本鎖オリゴヌクレオチドプローブを生成する、２つの一本鎖オリゴヌクレオチド；ＮＡＲＳがＮ．ＢｓｔＮＢ  Ｉによって認識されるキット；Ｎ．ＢｓｔＮＢ  Ｉを含むキット；Ｎ．ＢｓｔＮＢ  Ｉについての緩衝液；ＮＡＲＳを認識するＮＡ；ＤＮＡポリメラーゼ；ＤＮＡポリメラーゼについての緩衝液；ＮＥおよびＤＮＡポリメラーゼの両方に適切な緩衝液；ＮＥに適切な緩衝液およびＤＮＡポリメラーゼに適切な異なる緩衝液；ｅｘｏ−Ｂｓｔポリメラーゼ、ｅｘｏ−Ｂｃａポリメラーゼ、９°ＮｍＴＭＤＮＡポリメラーゼ、およびｅｘｏ−Ｖｅｎｔポリメラーゼのうちの少なくとも１つ；標識化デオキシヌクレオシド三リン酸（これは例えば、放射性標識に連結されたデオキシヌクレオシド三リン酸、または酵素に連結されたデオキシヌクレオシド三リン酸、または蛍光色素に連結されたデオキシヌクレオシド三リン酸、またはジゴキシゲニンに連結されたデオキシヌクレオシド三リン酸、またはビオチンに連結されたデオキシヌクレオシド三リン酸であり得る）；キットの使用についての指示書；液体クロマトグラフィーカラム；逆相液体クロマトグラフィーカラム；水と、有機酸または無機酸と錯化された二級アミンまたは三級アミンのアンモニウム塩とを含む緩衝液Ａであって、ここでこのアンモニウム塩のアミン成分は、必要に応じて、トリエチルアミン、ジアリルアミン、ジイソピロピルアミン、Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−シクロヘキシルアミン、Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−イソピロピルアミン、およびＮ，Ｎ−ジメチルＮ−ブチルアミンからなる群より選択され、ここでこの二級アミンまたは三級アミンは、必要に応じて、有機酸と錯化され、この有機酸は必要に応じて、酢酸、プロピオン酸、およびそれらのハロゲン化バージョンから選択される、緩衝液Ａ；緩衝液Ａと有機溶媒とを含む緩衝液Ｂであって、ここでこの有機溶媒は必要に応じて、メタノールおよびアセトニトリルから選択される、緩衝液Ｂ；デオキシリボヌクレオシド三リン酸；改変されたデオキシリボヌクレオシド三リン酸；コントロールテンプレート核酸分子およびコントロールＯＤＮＰ対；トレハロース；オリゴヌクレオチド標準；プローブの設計また注文において有用なソフトウェアについてのアクセスコード；核酸分子に結合可能な化学物質層でコーティングされたピン、または例えば、ポリ（エチレンイミン）層でコーティングされたピン、またはＰＤＡＤＭＡＣ（すなわち、ポリジアリルジメチルアンモニウムクロリド）でコーテ���ングされたピン；および／またはトレハロース。
【００２５】
本発明はまた、生物学的サンプル中における複数の標的核酸の存在または非存在の多重決定を提供する。１つの実施形態において、この方法は、以下の工程を包含する：（ａ）生物学的サンプル由来の核酸分子と、部分的に二本鎖のオリゴヌクレオチドプローブとを混合して、そのサンプル中に存在し得るすべての標的核酸に対する上記プローブのハイブリダイゼーションを可能にする工程であって、ここで各プローブは、以下を含む：（１）ＮＡによって認識可能なニック形成剤認識配列（ＮＡＲＳ）であって、ここでＮＡＲＳの認識後にこのＮＡは、ニック形成部位（ＮＳ）と称される位置において、核酸の二本鎖部分にニックを形成する、ＮＡＲＳ；（２）ＮＳを含むかもしくはＮＳを形成するように伸長する鎖における５’突出部か、またはＮＳを含まずかつＮＳを形成するようには本発明の方法に従って伸長されない鎖における３’突出部のいずれかであって、ここでこの突出部（５’または３’のいずれか）は、目的の標的核酸に対して少なくとも実質的に相補的であるヌクレオチド配列を含む、５’突出部または３’突出部；ならびに（３）配列であって、この配列は、ＮＳを含まずかつＮＳを形成するようには本発明の方法に従って伸長されない鎖に位置づけられ、この配列は、ＮＳに対応する位置に対して５’側に位置づけられ、ここでこの配列は、上記の突出部が少なくとも実質的に相補的である標的核酸に対して独特に対応する、配列。（３）の配列は、特定の標的核酸について独特なシグナルを有効に提供し、その結果、このシグナルの検出により、（３）の配列によって「コード」される特定の標的核酸の存在が示される。（ｂ）工程（ａ）の混合物から、ハイブリダイズされていないプローブを除去する工程。（ｃ）ＮＡおよびＤＮＡポリメラーゼの存在下で増幅反応を実施する工程。（ｄ）工程（ｃ）の増幅産物の存在または非存在を検出して、生物学的サンプル中における増幅産物の配列に対応する標的核酸の存在を決定する工程。別の関連する局面では、本発明は、生物学的サンプル中における標的核酸の存在または非存在の多重決定の方法を提供し、ここでこの方法は、以下の工程を包含する：（ａ）生物学的サンプルの核酸分子と、部分的に二本鎖のオリゴヌクレオチドプローブとを、標的核酸に対する上記プローブのハイブリダイゼーションを可能にする条件下で混合する工程であって、ここで各プローブは、以下を含む：（１）ニック形成エンドヌクレアーゼ（ＮＥ）によって認識可能なニック形成エンドヌクレアーゼ認識配列（ＮＥＲＳ）であって、ここでＮＥは、ＮＥＲＳ付近に位置づけられるニック形成部位（ＮＳ）と称される位置において、二本鎖核酸分子にニックを形成し得る、ＮＥＲＳ；（２）ＮＳを含まずかつＮＳを含むようには本発明の方法に従って伸長されない鎖における５’突出部か、またはＮＳを含まずかつＮＳを形成するようには本発明の方法に従って伸長されない鎖における３’突出部のいずれかであって、ここでこの突出部（５’突出部または３’突出部のいずれであっても）は、目的の標的核酸に対して少なくとも実質的に相補的であるヌクレオチド配列を含む、５’突出部または３’突出部；ならびに（３）ヌクレオチド配列であって、これは、ＮＳを含まずかつＮＳを形成するようには本発明の方法によって伸長されない鎖に位置づけられ、ここでこの配列は、ＮＳに対応する位置に対して５’側に位置づけられ、そしてこの配列は、上記の突出部が少なくとも実質的に相補的である標的核酸に対して独特に対応する、ヌクレオチド配列。（３）の配列は、特定の標的核酸について独特なシグナルを有効に提供し、その結果、このシグナルの検出により、（３）の配列によって「コード」される特定の核酸の存在が示される。（ｂ）工程（ａ）の混合物から、ハイブリダイズされていないプローブを除去する工程。（ｃ）ＮＥおよびＤＮＡポリメラーゼの存在下において、好ましくは等温条件下で、増幅反応を実施して、増幅産物を提供する工程。種々の実施形態において、この増幅産物は各々、１７以下、１６以下、１５以下、１４以下、１３以下、または１２以下のヌクレオチドを含む。（ｄ）工程（ｃ）の増幅産物の存在または非存在を検出して、生物学的サンプル中における増幅産物の配列に対応する標的核酸の存在を決定する工程。必要に応じて、この検出する工程は、少なくとも部分的に、液体クロマトグラフィーおよび／または質量分析法の使用を必要とする。
【００２６】
生物学的サンプル中における標的核酸の存在または非存在の多重決定に関する本発明の方法をさらに記載するにおいて、１つ以上のさらなる判断基準が利用され得る。部分的に、サンプル中における標的核酸の存在または非存在を決定することに関する本発明の方法と関連して上記で示された判断基準はまた、任意の組み合わせにおいて使用されて、生物学的サンプル中における標的核酸の存在または非存在の多重決定に関する本発明の方法をさらに特徴付け得る。例えば、サンプルは、患者由来であり得る。生物学的サンプル中における標的核酸の存在または非存在の多重決定をさらに特徴付けるために適切な他の判断基準は、本明細書中の他の箇所に見られ得る。また、この方法は、固体支持体に固定された核酸分子を利用して実施され得る。例えば、プローブが、アレイ様式で固体支持体の独特な位置に固定され得る。あるいは、プローブは、固体支持体に無差別的に固定され得る。いずれの事象においても、標的核酸を含むサンプルは、固定されたプローブと接触される。あるいは、標的核酸が固体支持体に固定され得、次いで、プローブがその支持体に添加され得、その結果、そのプローブは、固定された標的と接触する。
【００２７】
本発明はまた、生物学的サンプル中における数種の標的核酸の存在または非存在の多重決定について本明細書中に記載される方法において利用され得るキットを提供する。これらのキットは、非多重方法（すなわち、１つの生物学的サンプル中において１つの標的核酸の存在または非存在を決定するための方法）において有用なキットについて先に記載された構成要素のいずれかまたはすべてを含み得る。多重方法のために特に有用なキットは、単純に、複数の標的の存在について試験するために、より多くのプローブまたはより多くの一本鎖オリゴヌクレオチド（この一本鎖オリゴヌクレオチドからプローブが調製される）を含み得る。また、キットが複数のプローブ（またはプローブ成分）を含む場合、この複数のプローブまたはその成分は、異なる標的に応答して独特なシグナルを提供するように設計される。１つの局面において、このキットは、２つの異なるプローブ（またはプローブ成分）を含むが、他の局面では、このキットは、３個、または４個、または５個、または６個、または７個、または８個、または９個、または１０個、または１１個、または１２個、または１３個、または１４個、または１５個、または１６個、または１７個、または１８個、または１９個、または２０個、または２２個、または２４個、または２６個、または２８個、または３０個、または３５個、または４０個、または４５個、または５０個、または５５個、または６０個、または６５個、または７０個、または７５個、または８０個、または８５個、または９０個、または９５個、または１００個の異なるプローブまたはプローブ成分を含む。このキットは、固定されたプローブ（例えば、固体表面にわたって独特な位置に固定されたプローブ、または固体表面にわたって無差別的に固定されたプローブ）を含み得る。
【００２８】
核酸が、本発明の方法または組成物またはキットに従って固体支持体に固定される場合、適切な固体支持体としては、全体または一部分が、ケイ素、ガラス、紙、セラミック、金属、メタロイド、およびプラスチックから形成される材料が挙げられる。１つの実施形態において、固体支持体は、核酸分子に結合する化学物質層でコーティングされる。適切な化学物質層は、ポリ（エチレンイミン）から形成される。別の適切な化学物質層は、ＰＤＡＤＭＡＣ（すなわち、ポリジアリルジメチルアンモニウムクロリド）から形成される。
【００２９】
別の局面において、本発明は、核酸分子の集団中における、第２核酸分子の数に対する第１核酸分子の数の比率を決定する方法を提供し、ここでこの第１核酸分子および第２核酸分子のヌクレオチド配列は、規定された位置を除いて同一である。この方法は、以下の工程を包含する：（ａ）第１オリゴヌクレオチドプライマー（ＯＤＮＰ）と、第２のＯＤＮＰと、核酸集団とを混合する工程であって、ここで（ｉ）上記第１核酸および上記第２核酸が二本鎖であって、各々が第１鎖および第２鎖を有する場合、（ａ）第１のＯＤＮＰは、第１核酸分子の第１鎖に存在する核酸配列に対して少なくとも実質的に相補的なヌクレオチド配列を含み、ここでこの配列は、規定された位置に対して３’側に位置づけられ、そして（ｂ）第２のＯＤＮＰは、第１核酸の第２鎖に存在する核酸配列に対して少なくとも実質的に相補的なヌクレオチド配列を含み、このヌクレオチド配列もまた、規定された位置に対して３’側に位置づけられ、しかし、（ｉｉ）上記第１核酸および上記第２核酸が一本鎖である場合、（ａ）第１のＯＤＮＰは、第１核酸に存在する核酸配列に対して少なくとも実質的に相補的なヌクレオチド配列を含み、ここでこの配列は、規定された位置に対して５’側に位置づけられ、そして（ｂ）第２のＯＤＮＰは、第１核酸に存在する核酸配列に対して少なくとも実質的に相補的なヌクレオチド配列を含み、この配列は、規定された位置に対して３’側に位置づけられる、工程。さらに、第１のＯＤＮＰおよび第２のＯＤＮＰのうちの少なくとも１つは、ニック形成剤認識配列（ＮＡＲＳ）のセンス鎖のヌクレオチド配列をさらに含む。（ｂ）第１のＯＤＮＰおよび第２のＯＤＮＰを伸長して、この第１のＯＤＮＰと第２のＯＤＮＰとを含むフラグメントを生成する工程。（ｃ）ＤＮＡポリメラーゼと、ＮＡＲＳを認識するニック形成剤（ＮＡ）との存在下において、一本鎖核酸フラグメントを増幅する工程。（ｄ）上記の第２核酸に由来する一本鎖核酸フラグメントの数に対する、上記第１核酸に由来する工程（ｃ）の一本鎖核酸フラグメントの数の比率を決定する工程。本発明はまた、核酸集団中における、第２核酸分子の数に対する第１核酸分子の数の比率を決定する方法を提供し、ここでこの第１核酸分子のヌクレオチド配列と第２核酸分子のヌクレオチド配列とは、規定された位置を除いて同一であり、ここでこの方法は、以下の工程を包含する：（ａ）第１のＯＤＮＰと、第２のＯＤＮＰと、核酸集団とを混合する工程であって、ここで（ｉ）上記第１核酸および上記第２核酸が二本鎖である（すなわち、各々が第１鎖および第２鎖を有する）場合、（ａ）第１のＯＤＮＰは、第１核酸分子の第１鎖のヌクレオチド配列に対して少なくとも実質的に相補的なヌクレオチド配列を含み、ここでこのヌクレオチド配列は、規定された位置に対して３’側に位置づけられ、そして（ｂ）第２のＯＤＮＰは、第１核酸の第２鎖のヌクレオチド配列に対して少なくとも実質的に相補的なヌクレオチド配列を含み、このヌクレオチド配列は、規定された位置に対して３’側に位置づけられ、しかし、（ｉｉ）上記第１核酸および上記第２核酸が各々一本鎖である場合、（ａ）第１のＯＤＮＰは、第１核酸に存在する核酸配列に対して少なくとも実質的に相補的なヌクレオチド配列を含み、ここでこのヌクレオチド配列は、第１核酸中の規定された位置に対して５’側に位置づけられ、そして（ｂ）第２のＯＤＮＰは、第１核酸中の規定された位置に対して３’側に位置づけられる、第１核酸に存在するヌクレオチド配列に対して少なくとも実質的に相補的なヌクレオチド配列を含む、工程。さらに、第１のＯＤＮＰおよび第２のＯＤＮＰのうちの少なくとも１つは、ニック形成エンドヌクレアーゼ認識配列（ＮＥＲＳ）のセンス鎖のヌクレオチド配列をさらに含む。（ｂ）第１のＯＤＮＰおよび第２のＯＤＮＰを伸長して、この第１のＯＤＮＰと第２のＯＤＮＰとを含むフラグメントを生成する工程。（ｃ）ＤＮＡポリメラーゼと、ＮＥＲＳを認識するニック形成エンドヌクレアーゼ（ＮＥ）との存在下において、好ましくは等温条件下で、一本鎖核酸フラグメントを増幅する工程。種々の実施形態において、この一本鎖核酸フラグメントは各々、２０以下、または１８以下、または１７以下、または１６以下、または１５以下、または１４以下、または１３以下、または１２以下、または１１以下、または１０以下などのヌクレオチドを含む。（ｄ）上記の第２核酸分子に由来した数に対する、上記第１核酸分子に由来した工程（ｃ）の一本鎖核酸フラグメントの数の比率を決定する工程。この決定は、例えば、液体クロマトグラフィーおよび質量分析法の一方または両方を使用して行われ得る。関連する方法において、本発明は、規定された位置において遺伝子バリエーションを有する標的核酸分子の対立遺伝子頻度の決定を提供し、ここでこの標的核酸分子は、核酸集団中に存在する。この方法は、以下の工程を包含する：（ａ）第１オリゴヌクレオチドプライマー（ＯＤＮＰ）と、第２のＯＤＮＰと、核酸集団とを混合する工程であって、ここで（ｉ）標的核酸が二本鎖であり、その結果その標的核酸が第１鎖および第２鎖を有する場合、（ａ）第１のＯＤＮＰは、標的核酸の第１鎖に存在するヌクレオチド配列に対して少なくとも実質的に相補的なヌクレオチド配列を含み、ここでこのヌクレオチド配列は、標的核酸中の規定された位置に対して３’側に位置づけられ、そして（ｂ）第２のＯＤＮＰは、標的核酸の第２鎖のヌクレオチド配列に対して少なくとも実質的に相補的なヌクレオチド配列を含み、ここでこのヌクレオチド配列は、標的核酸中の規定された位置に対して３’側に位置づけられ、しかし、（ｉｉ）上記標的核酸が一本鎖である場合、（ａ）第１のＯＤＮＰは、標的核酸中に存在するヌクレオチド配列に対して少なくとも実質的に同一なヌクレオチド配列を含み、ここでこのヌクレオチド配列は、標的核酸中の規定された位置に対して５’側に位置づけられ、そして（ｂ）第２のＯＤＮＰは、標的核酸中に存在するヌクレオチド配列に対して少なくとも実質的に相補的なヌクレオチド配列を含み、ここでこのヌクレオチド配列は、標的核酸中の規定された位置に対して３’側に位置づけられ、そして上記標的核酸が一本鎖であるか二本鎖であるかにかかわらず、上記第１のＯＤＮＰおよび第２のＯＤＮＰのうちの少なくとも１つは、ニック形成剤認識配列（ＮＡＲＳ）のセンス鎖の配列をさらに含む、工程。（ｂ）第１のＯＤＮＰおよび第２のＯＤＮＰを伸長して、この第１のＯＤＮＰと第２のＯＤＮＰとを含むフラグメントを生成する工程。（ｃ）ＤＮＡポリメラーゼと、ＮＡＲＳを認識するニック形成剤（ＮＡ）との存在下において、一本鎖核酸フラグメントを増幅する工程。（ｄ）サンプル中に存在する標的核酸分子の総数に対する、遺伝子バリエーションを有する標的核酸分子の対立遺伝子頻度を決定する工程。この決定は、標的核酸（生成物Ａ）中に必要に応じて存在する遺伝子バリエーションを含む工程（ｃ）において形成される一本酸核酸フラグメントの、（試験される遺伝子バリエーション以外）生成物Ａと同一である工程（ｃ）のすべての一本鎖核酸フラグメントに対するパーセンテージを決定し、それにより標的核酸の対立遺伝子頻度を決定することによって行われ得る。関連の実施形態において、本発明は、規定された位置において遺伝子バリエーションを有する標的核酸分子の対立遺伝子頻度を決定するための方法を提供し、ここでこの標的核酸は、核酸集団に含まれる。この方法は、以下の工程を包含する：（ａ）第１オリゴヌクレオチドプライマー（ＯＤＮＰ）と、第２のＯＤＮＰと、核酸分子の集団とを混合する工程であって、この核酸分子の集団のうちのいくつかが標的核酸であり、ここで（ｉ）標的核酸が二本鎖であって、第１鎖および第２鎖を有する場合、（ａ）第１のＯＤＮＰは、規定された位置に対して３’側の位置において、標的核酸の第１鎖に存在するヌクレオチド配列に対して少なくとも実質的に相補的なヌクレオチド配列を含み、そして（ｂ）第２のＯＤＮＰは、標的核酸の第２鎖に存在するヌクレオチド配列に対して少なくとも実質的に相補的なヌクレオチド配列を含み、ここでこのヌクレオチド配列は、規定された位置に対して３’側に位置づけられ、または、（ｉｉ）上記標的核酸が一本鎖である場合、（ａ）第１のＯＤＮＰは、標的核酸中に存在するヌクレオチド配列に対して少なくとも実質的に同一なヌクレオチド配列を含み、ここでこのヌクレオチド配列は、規定された位置に対して５’側に位置づけられ、そして（ｂ）第２のＯＤＮＰは、標的核酸中に存在するヌクレオチド配列に対して少なくとも実質的に相補的なヌクレオチド配列を含み、そして標的核酸中の規定された位置に対して３’側に位置づけられる、工程。さらに、上記第１のＯＤＮＰおよび第２のＯＤＮＰのうちの少なくとも１つは、ニック形成エンドヌクレアーゼ認識配列（ＮＥＲＳ）のセンス鎖のヌクレオチド配列をさらに含む。（ｂ）第１のＯＤＮＰおよび第２のＯＤＮＰを伸長して、この第１のＯＤＮＰと第２のＯＤＮＰとを含むフラグメントを生成する工程。（ｃ）ＤＮＡポリメラーゼと、ＮＥＲＳを認識するニック形成エンドヌクレアーゼ（ＮＥ）との存在下において、好ましくは等温条件下で、一本鎖核酸フラグメントを増幅する工程。１つの実施形態において、この一本鎖核酸フラグメントは各々、２０以下、または１９以下、または１８以下、または１７以下、または１６以下、または１５以下、または１４以下、または１３以下、または１２以下、または１１以下、または１０以下などのヌクレオチドを含む。（ｄ）目的の標的核酸中における遺伝子バリエーションの対立遺伝子頻度を決定する工程。この決定は、例えば、標的核酸（生成物Ａ）中に必要に応じて存在する遺伝子バリエーションを含む工程（ｃ）の一本酸核酸フラグメントの、遺伝子バリエーション以外は生成物Ａの部分と同一である工程（ｃ）のすべての一本鎖核酸フラグメントに対するパーセンテージを決定することによって、行われ得る。このような決定は、液体クロマトグラフィーおよび質量分析法の一方または両方を使用して行われ得、ここでこれらの技術は、単なる例示に過ぎない。
【００３０】
関連の実施形態において、本発明の方法は、（ｉ）核酸分子の集団中に存在する第１の核酸分子の数の、核酸分子の集団中に存在する第２の核酸分子の数に対する比率を決定すること、および（ｉｉ）核酸分子の集団中の遺伝子バリエーションを有する標的核酸分子の対立遺伝子頻度を決定することに関し、各々は、目的とする１つより多い核酸分子に対して同時に実施され得る（すなわち、この方法は、多重決定を介して実施され得る）。例えば、１つの局面では、本発明は、規定された位置において遺伝子バリエーションを各々有する標的核酸分子の対立遺伝子頻度を多重に決定する方法を提供し、ここでこれらの標的核酸分子は、核酸集団中に存在し、ここでこの方法は、以下の工程を包含する：（ａ）核酸集団とＯＤＮＰ対とを混合する工程であって、ここで各対は、目的の標的核酸のうちの１つに対応し、かつ第１のＯＤＮＰと第２のＯＤＮＰとを含み、ここで（ｉ）研究下にある標的核酸が二本鎖であり、その結果、その標的核酸が第１鎖および第２鎖を有する場合、（ａ）第１のＯＤＮＰは、標的核酸の第１鎖に存在するヌクレオチド配列に対して少なくとも実質的に相補的なヌクレオチド配列を含み、ここでこのヌクレオチド配列は、規定された位置に対して３’側の位置に位置づけられ、そして（ｂ）第２のＯＤＮＰは、標的核酸の第２鎖に存在するヌクレオチド配列に対して少なくとも実質的に相補的なヌクレオチド配列を含み、ここでこのヌクレオチド配列は、標的核酸中の規定された位置に対して３’側に位置づけられ、または、（ｉｉ）研究下にある標的核酸が一本鎖である場合、（ａ）第１のＯＤＮＰは、標的核酸中に存在するヌクレオチド配列に対して少なくとも実質的に同一でありかつ標的核酸内の規定された位置に対して５’側に位置づけられるヌクレオチド配列を含み、そして（ｂ）第２のＯＤＮＰは、標的核酸中に存在するヌクレオチド配列に対して少なくとも実質的に相補的でありかつ標的核酸内の規定された位置に対して３’側に位置づけられるヌクレオチド配列を含む、工程。さらに、上記第１のＯＤＮＰおよび第２のＯＤＮＰのうちの少なくとも１つは、ニック形成剤認識配列（ＮＡＲＳ）のセンス鎖のヌクレオチド配列をさらに含む。（ｂ）各ＯＤＮＰ対の第１のＯＤＮＰおよび第２のＯＤＮＰを伸長して、この第１のＯＤＮＰと第２のＯＤＮＰとを含むフラグメントを生成する工程。（ｃ）ＤＮＡポリメラーゼと、ＮＡＲＳを認識するニック形成剤（ＮＡ）との存在下において、テンプレートとして工程（ｂ）の伸長産物を使用して、一本鎖核酸フラグメントを増幅する工程。（ｄ）各標的核酸について、標的核酸（生成物Ａ）中の遺伝子バリエーションを含む工程（ｃ）の一本酸核酸フラグメントの、遺伝子バリエーション以外は生成物Ａの部分と同一である工程（ｃ）のすべての一本鎖核酸フラグメントに対するパーセンテージを決定し、それにより、標的核酸の対立遺伝子頻度を決定する、工程。
【００３１】
関連の局面において、本発明は、規定された位置において遺伝子バリエーションを有する標的核酸分子の対立遺伝子頻度を多重に決定するための方法を提供し、ここでこれらの標的核酸分子は、核酸の集団中に存在し、そしてここでこの方法は、以下の工程を包含する：（ａ）核酸集団とＯＤＮＰ対とを混合する工程であって、ここでこのＯＤＮＰの各対は、標的核酸のうちの１つに対応し、かつ第１のＯＤＮＰと第２のＯＤＮＰとを含み、ここで（ｉ）研究下にある標的核酸が二本鎖である（その結果、その標的核酸が第１鎖および第２鎖を有する）場合、（ａ）第１のＯＤＮＰは、標的核酸の第１鎖に存在するヌクレオチド配列に対して少なくとも実質的に相補的なヌクレオチド配列を含み、ここでこのヌクレオチド配列は、規定された位置に対して３’側に位置づけられ、そして（ｂ）第２のＯＤＮＰは、標的核酸の第２鎖に存在するヌクレオチド配列に対して少なくとも実質的に相補的なヌクレオチド配列を含み、ここでこのヌクレオチド配列は、規定された位置に対して３’側に位置づけられ、または、（ｉｉ）研究下にある標的核酸が一本鎖である場合、（ａ）第１のＯＤＮＰは、規定された位置に対して５’側に位置づけられる、標的核酸のヌクレオチド配列に対して少なくとも実質的に同一であるヌクレオチド配列を含み、そして（ｂ）第２のＯＤＮＰは、標的核酸のヌクレオチド配列に対して少なくとも実質的に相補的であるヌクレオチド配列を含み、ここでこのヌクレオチド配列は、規定された位置に対して３’側に位置づけられる、工程。さらに、上記第１のＯＤＮＰおよび第２のＯＤＮＰのうちの少なくとも１つは、ニック形成エンドヌクレアーゼ認識配列（ＮＥＲＳ）のセンス鎖のヌクレオチド配列をさらに含む。（ｂ）各ＯＤＮＰ対の第１のＯＤＮＰおよび第２のＯＤＮＰを伸長して、この第１のＯＤＮＰと第２のＯＤＮＰとを含むフラグメントを生成する工程。（ｃ）ＤＮＡポリメラーゼと、ＮＥＲＳを認識するニック形成エンドヌクレアーゼ（ＮＥ）との存在下において、テンプレートとして工程（ｂ）の伸長産物を使用して、好ましくは等温条件下で、一本鎖核酸フラグメントを増幅する工程。必要に応じて、この一本鎖核酸フラグメントは各々、２０以下、または１９以下、または１８以下、または１７以下、または１６以下、または１５以下、または１４以下、または１３以下、または１２以下、または１１以下、または１０以下などのヌクレオチドを含む。（ｄ）各標的核酸について、標的核酸（生成物Ａ）中に必要に応じて存在する遺伝子バリエーションを含む工程（ｃ）の一本酸核酸フラグメントの、遺伝子バリエーション以外は生成物Ａの部分と同一である工程（ｃ）のすべての一本鎖核酸フラグメントに対するパーセンテージを決定し、それにより、標的核酸の対立遺伝子頻度を決定する、工程。
【００３２】
（ｉ）核酸分子の集団中に存在する第１の核酸分子の数の、核酸分子の集団中に存在する第２の核酸分子の数に対する比率を決定すること、および（ｉｉ）核酸分子の集団中の遺伝子バリエーションを有する標的核酸分子の対立遺伝子頻度を決定することに関する本発明のこれらの方法では、１つ以上の以下の判断基準が、本方法を記載するために使用され得、ここでは任意の２つ、３つ、４つ、５つなどの判断基準が、本方法を記載するために組み合わせられ得、そしてここで、本発明の方法を記載するにおいて、任意の１つ、２つ、３つ、４つなどの以下の判断基準は、本明細書中に記載される任意の他の判断基準と組み合わせられ得る：増幅工程によって形成され、そして対立遺伝子頻度の測定を行うためまたは上記のような比率を決定するために必要とされる情報を含む一本鎖核酸フラグメントが、少なくとも１、または少なくとも２、または少なくとも３、または少なくとも４、または少なくとも５、または少なくとも６、または少なくとも７、または少なくとも８、または少なくとも９、または少なくとも１０、または少なくとも１１、または少なくとも１２、または少なくとも１３、または少なくとも１４、または少なくとも１５、または少なくとも１６、または少なくとも１７、または少なくとも１８、または少なくとも１９、または少なくとも２０を含む；増幅工程によって形成される一本鎖核酸フラグメントが、３以下、または４以下、または５以下、または６以下、または７以下、または８以下、または９以下、または１０以下、または１１以下、または１２以下、または１３以下、または１４以下、または１５以下、または１６以下、または１７以下、または１８以下、または１９以下、または２０以下、または２１以下、または２２以下、または２３以下、または２４以下、または２５以下、または２６以下、または２７以下、または２８以下、または２９以下、または３０以下、または３１以下、または３２以下、または３３以下、または３４以下、または３５以下、または３６以下、または３７以下、または３８以下、または３９以下、または４０以下、または４１以下、または４２以下、または４３以下、または４４以下、または４５以下、または４６以下、または４７以下、または４８以下、または４９以下、または５０以下のヌクレオチドを有する；その方法において利用されるＮＡＲＳが、制限エンドヌクレアーゼ認識配列（ＲＥＲＳ）である；伸長反応が、少なくとも１つの改変されたデオキシヌクレオシド三リン酸の存在下において実施される；その方法において使用されるＮＡＲＳが、ニック形成エンドヌクレアーゼ認識配列（ＮＥＲＳ）である；第１のＯＤＮＰおよび第２のＯＤＮＰが両方とも、ＮＡＲＳのセンス鎖の配列を含む；ＮＡＲＳが、Ｎ．ＢｓｔＮＢ  Ｉによって認識可能なＮＥＲＳである；第１のＯＤＮＰが、ＲＥＲＳの一方の鎖のヌクレオチド配列を含むが、ＮＥＲＳのセンス鎖のヌクレオチド配列を含まない；第２のＯＤＮＰが、ＲＥＲＳの一方の鎖のヌクレオチド配列を含むが、ＮＥＲＳのセンス鎖のヌクレオチド配列を含まない；伸長工程によって生成されるフラグメントが、半改変ＲＥＲＳを含まない；ＲＥＲＳが、ＩＩｓ型制限エンドヌクレアーゼによって���識可能である；工程（ｂ）のフラグメントが、工程（ｃ）を実施する前に、ＲＥＲＳを認識するＲＥによって消化される；規定された位置におけるヌクレオチドが、疾患と関連する；核酸の集団が、哺乳動物（例えば、ヒト、またはイヌ、またはネコ、またはブタ、またはウマ、またはウサギ）から採取され、ＤＮＡポリメラーゼが、ｅｘｏ−Ｖｅｎｔ、ｅｘｏ−Ｄｅｅｐ  Ｖｅｎｔ、ｅｘｏ−Ｂｓｔ、ｅｘｏ−Ｐｆｕ、ｅｘｏ−Ｂｃａ、Ｔａｑ、ＤＮＡポリメラーゼＩのＫｌｅｎｏｗフラグメント、Ｔ５  ＤＮＡポリメラーゼ、φ２９  ＤＮＡポリメラーゼ、ファージＭ２  ＤＮＡポリメラーゼ、ファージφＰＲＤ１  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ、ＰＲＤ  １  ＤＮＡポリメラーゼ、９°ＮｍＴＭ  ＤＮＡポリメラーゼ、およびＴ４  ＤＮＡポリメラーゼのうちのいずれか１つであり、ここで挙げられたＤＮＡポリメラーゼの任意の２つ以上は組み合わせられて、本発明において使用される可能なＤＮＡポリメラーゼを示す群を形成し、例えば、ＤＮＡポリメラーゼは、ｅｘｏ−Ｂｓｔポリメラーゼ、ｅｘｏ−Ｂｃａポリメラーゼ、９°ＮｍＴＭＤＮＡポリメラーゼ、またはｅｘｏ−Ｖｅｎｔポリメラーゼである；伸長反応が、ポリメラーゼ連鎖反応によって実施される；増幅が、等温条件下で実施される；増幅が、５０℃〜７０℃の温度範囲内で実施される；増幅が６０℃で実施される；増幅が、５５±５℃で実施される；増幅が、６０±５℃で実施される；増幅が、６５±５℃で実施される；増幅が、７０±５℃で実施される；増幅が、最高温度と最低温度との間で実施され、ここでこの最高温度は、最低温度から２０℃の範囲内である；増幅が、最高温度と最低温度との間で実施され、ここでこの最高温度は、最低温度から１５℃の範囲内である；増幅が、最高温度と最低温度との間で実施され、ここでこの最高温度は、最低温度から１０℃の範囲内である；増幅が、最高温度と最低温度との間で実施され、ここでこの最高温度は、最低温度から５℃の範囲内である；本発明の種々の実施形態において、本方法に使用されるＯＤＮＰは、独立して、少なくとも８ヌクレオチド長、または少なくとも９ヌクレオチド長、または少なくとも１０ヌクレオチド長、または少なくとも１１ヌクレオチド長、または少なくとも１２ヌクレオチド長、または少なくとも１３ヌクレオチド長、または少なくとも１４ヌクレオチド長、または少なくとも１５ヌクレオチド長、または少なくとも１６ヌクレオチド長、または少なくとも１７ヌクレオチド長、または少なくとも１８ヌクレオチド長、または少なくとも１９ヌクレオチド長、または少なくとも２０ヌクレオチド長である；本方法に使用される各ＯＤＮＰは、独立して、そして必要に応じて、５０ヌクレオチド長以下、または４５ヌクレオチド長以下、または４０ヌクレオチド長以下、または３５ヌクレオチド長以下、または３０ヌクレオチド長以下、または２９ヌクレオチド長以下、または２８ヌクレオチド長以下、または２７ヌクレオチド長以下、または２６ヌクレオチド長以下、または２５ヌクレオチド長以下、または２４ヌクレオチド長以下、または２３ヌクレオチド長以下、または２２ヌクレオチド長以下、または２１ヌクレオチド長以下、または２０ヌクレオチド長以下、または１９ヌクレオチド長以下、または１８ヌクレオチド長以下である；本方法が、標的核酸中のヌクレオチド配列に対して少なくとも実質的に相補的なヌクレオチド配列を含むプライマーを使用する工程を包含する場合、本発明の種々の実施形態において、そのプライマーにおけるこのヌクレオチド配列は、各プライマーにおいて独立して、少なくとも４ヌクレオチド長、少なくとも５ヌクレオチド長、少なくとも６ヌクレオチド長、少なくとも７ヌクレオチド長、少なくとも８ヌクレオチド長、または少なくとも９ヌクレオチド長、または少なくとも１０ヌクレオチド長、または少なくとも１１ヌクレオチド長、または少なくとも１２ヌクレオチド長、または少なくとも１３ヌクレオチド長、または少なくとも１４ヌクレオチド長、または少なくとも１５ヌクレオチド長、または少なくとも１６ヌクレオチド長、または少なくとも１７ヌクレオチド長、または少なくとも１８ヌクレオチド長、または少なくとも１９ヌクレオチド長、または少なくとも２０ヌクレオチド長である；本発明の方法が、標的核酸中のヌクレオチド配列に対して少なくとも実質的に相補的なヌクレオチド配列を含むプライマーを使用する工程を包含する場合、本発明の種々の実施形態において、そのプライマーにおけるこのヌクレオチド配列は、各プライマーにおいて独立して、２０ヌクレオチド長以下、または１９ヌクレオチド長以下、または１８ヌクレオチド長以下、または１７ヌクレオチド長以下、または１６ヌクレオチド長以下、または１５ヌクレオチド長以下、または１４ヌクレオチド長以下、または１３ヌクレオチド長以下、または１２ヌクレオチド長以下、または１１ヌクレオチド長以下、または１０ヌクレオチド長以下、または９ヌクレオチド長以下、または８ヌクレオチド長以下、または７ヌクレオチド長以下、または６ヌクレオチド長以下、または５ヌクレオチド長以下である；所望の情報を得るために増幅産物に対して実施される測定は、以下の分析方法の１つ、または任意の２つ、または任意の３つ、またはそれより多くを含み、ここでさらなる分析方法もまた、特定の状況（例えば、機器の性能）に依存して利用され得る：発光分光学、蛍光分光学、質量分析法、液体クロマトグラフィー、蛍光分極、ゲル電気泳動、およびキャピラリー電気泳動（例えば、測定は、少なくとも部分的に、質量分析法によって実施され得るか、または測定は、少なくとも部分的に、液体クロマトグラフィーによって実施され得、測定は、質量分析法および液体クロマトグラフィーの両方を含む分析方法によって実施され得る）。
【００３３】
別の局面において、本発明は、ｃＤＮＡ分子において遺伝子の上流エキソン（エキソンＡ）と下流エキソン（エキソンＢ）との間の連結部の存在または非存在を検出する方法を提供し、ここでこの方法は、以下の工程を包含する：（ａ）第１のＯＤＮＰ、第２のＯＤＮＰ、およびｃＤＮＡを混合する工程。この第１のＯＤＮＰは、エキソンＡのアンチセンス鎖において５’末端付近にあるエキソンＡのアンチセンス鎖の一部分に対して少なくとも実質的に相補的なヌクレオチド配列を含む。第２のＯＤＮＰは、エキソンＢのセンス鎖において５’末端付近にあるエキソンＢのセンス鎖の一部分に対して少なくとも実質的に相補的なヌクレオチド配列を含む。さらに、第１のＯＤＮＰおよび第２のＯＤＮＰのうちの少なくとも一方は、ニック形成剤認識配列（ＮＡＲＳ）のセンス鎖のヌクレオチド配列をさらに含む。（ｂ）エキソンＡおよびエキソンＢの両方がｃＤＮＡ中に存在する場合に、第１のＯＤＮＰおよび第２のＯＤＮＰによって包囲されるフラグメントを生成する反応条件下で、伸長反応を実施する工程。（ｃ）ＤＮＡポリメラーゼと、ＮＡＲＳを認識するニック形成剤（ＮＡ）の存在下において、増幅反応を実施する工程。（ｄ）工程（ｃ）の増幅産物を特徴づけることにより、エキソンＡとエキソンＢとの間における連結部の存在または非存在を決定する工程。関連の局面において、本発明は、ｃＤＮＡ分子において遺伝子の上流エキソン（エキソンＡ）と下流エキソン（エキソンＢ）との間の連結部の存在または非存在を検出する方法を提供し、ここでこの方法は、以下の工程を包含する：（ａ）第１のＯＤＮＰ、第２のＯＤＮＰ、およびｃＤＮＡを混合する工程。この第１のＯＤＮＰは、エキソンＡのアンチセンス鎖の５’末端付近にあるエキソンＡのアンチセンス鎖の一部分に対して少なくとも実質的に相補的なヌクレオチド配列を含む。第２のＯＤＮＰは、エキソンＢのセンス鎖の５’末端付近にあるエキソンＢのセンス鎖の一部分に対して少なくとも実質的に相補的な配列を含むヌクレオチド配列を有する。さらに、第１のＯＤＮＰおよび第２のＯＤＮＰのうちの少なくとも一方は、ニック形成エンドヌクレアーゼ認識配列（ＮＥＲＳ）のセンス鎖のヌクレオチド配列をさらに含む。（ｂ）エキソンＡおよびエキソンＢの両方がｃＤＮＡ中に存在する場合に、第１のＯＤＮＰおよび第２のＯＤＮＰによって包囲されるフラグメントを生成する反応条件下で、伸長反応を実施する工程。（ｃ）ＤＮＡポリメラーゼと、ＮＥＲＳを認識するニック形成エンドヌクレアーゼ（ＮＥ）の存在下において、好ましくは、等温条件下で、増幅反応を実施する工程。（ｄ）工程（ｃ）の増幅産物を特徴づけることにより、エキソンＡとエキソンＢとの間における連結部の存在または非存在を決定する工程。この特徴づけは、少なくとも部分的に、液体クロマトグラフィーおよび／または質量分析法を使用して実施され得る。これらの方法の任意の実施形態において、１つ以上の以下の判断基準が本方法を記載するために使用され得る；
ＮＡＲＳが、制限エンドヌクレアーゼ認識配列（ＲＥＲＳ）であり、そして伸長反応が、少なくとも１つの改変デオキシリボヌクレオシド三リン酸の存在下で実施される；ＮＡＲＳがニック形成エンドヌクレアーゼ認識配列（ＮＥＲＳ）である；第１のＯＤＮＰおよび第２のＯＤＮＰが両方とも、ＮＡＲＳのセンス鎖のヌクレオチド配列を含む；ＮＡＲＳがＲＥＲＳであり、そして伸長反応が、少なくとも１つの改変デオキシリボヌクレオシド三リン酸の存在下で実施される；ＮＡＲＳがＮＥＲＳである；ＮＡＲＳが、Ｎ．ＢｓｔＮＢ  Ｉによって認識可能である；第１のＯＤＮＰが、ＮＥＲＳのセンス鎖のヌクレオチド配列を含まないが、ＲＥＲＳの一方の鎖のヌクレオチド配列を含む；第２のＯＤＮＰが、ＮＥＲＳのセンス鎖のヌクレオチド配列を含まないが、ＲＥＲＳの一方の鎖のヌクレオチド配列を含む；伸長反応によって生成されるフラグメントが、半改変ＲＥＲＳを含まない；ＲＥＲＳが、ＩＩｓ型制限エンドヌクレアーゼ（ＲＥ）によって認識可能である；工程（ｂ）の伸長産物が、工程（ｃ）を実施する前に、ＲＥＲＳを認識するＲＥによって消化される；遺伝子が、疾患に関連している；遺伝子が、ヒト疾患に関連している；ＤＮＡポリメラーゼが、ｅｘｏ−Ｖｅｎｔ、ｅｘｏ−Ｄｅｅｐ  Ｖｅｎｔ、ｅｘｏ−Ｂｓｔ、ｅｘｏ−Ｐｆｕ、ｅｘｏ−Ｂｃａ、Ｔａｑ、ＤＮＡポリメラーゼＩのＫｌｅｎｏｗフラグメント、Ｔ５  ＤＮＡポリメラーゼ、φ２９  ＤＮＡポリメラーゼ、ファージＭ２  ＤＮＡポリメラーゼ、ファージφＰＲＤ１  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ、ＰＲＤ１  ＤＮＡポリメラーゼ、９°ＮｍＴＭＤＮＡポリメラーゼ、またはＴ４  ＤＮＡポリメラーゼであり、ここでこれらのＤＮＡポリメラーゼのうちの任意の２つ以上は、一緒になって群形成されて、本発明の方法において使用されるＤＮＡポリメラーゼが選択される群を形成し得る（例えば、ＤＮＡポリメラーゼは、ｅｘｏ−Ｂｓｔポリメラーゼ、ｅｘｏ−Ｂｃａポリメラーゼ、９°ＮｍＴＭＤＮＡポリメラーゼまたはｅｘｏ−Ｖｅｎｔポリメラーゼである）；
伸長反応が、ポリメラーゼ連鎖反応によって実施される；増幅が、等温条件下で実施される；増幅産物が、存在する場合には、３５ヌクレオチド以下、または１７ヌクレオチド以下、または１２ヌクレオチド以下を含む一本鎖核酸フラグメントである；特徴付ける工程が、少なくとも一部、発光分光学、蛍光分光学、質量分析法、液体クロマトグラフィー、蛍光分極、ゲル電気泳動、およびキャピラリー電気泳動から選択される分析技術によって達成される（例えば、特徴付けが、少なくとも部分的に、質量分析法によって実施され得る）。
【００３４】
別の局面において、本発明は、ｃＤＮＡ分子中またはｃＤＮＡ集団中において、ｎ個のエキソンを含む遺伝子の２個毎のエキソンの間における連結部の存在または非存在を検出する方法を提供し、ここでｎは、２以上の整数であり、エキソンＡはその遺伝子に存在するエキソンの中で最も上流のエキソンであり、そしてエキソンＮは、その遺伝子に存在するエキソンの中で最も下流のエキソンであり、ここでこの方法は以下の工程を包含する：（ａ）オリゴヌクレオチドプライマー（ＯＤＮＰ）の第１セットと、ＯＤＮＰの第２セットと、ｃＤＮＡ分子またはｃＤＮＡ集団とを混合する工程。ＯＤＮＰの第１セットは、ｎ−１個のＯＤＮＰを含み、このセットの各メンバーは、その遺伝子のｎ個のエキソン（エキソンＡを除く）のうちの１つに対応し、そしてさらに、各ＯＤＮＰは、そのエキソンのセンス鎖における５’末端付近にある対応するエキソンのセンス鎖の一部分に対して少なくとも実質的に相補的なヌクレオチド配列を含む。ＯＤＮＰの第２セットは、各エキソン（エキソンＮを除く）に対応するｎ−１個のＯＤＮＰを含み、ここで各ＯＤＮＰは、そのエキソンのアンチセンス鎖における５’末端付近にある対応するエキソンのアンチセンス鎖の一部分に対して少なくとも実質的に相補的なヌクレオチド配列を含む。本発明の第１の実施形態では、ＯＤＮＰの第１セットのメンバーである各ＯＤＮＰ、または本発明の第２の実施形態では、ＯＤＮＰの第２セットのメンバーである各ＯＤＮＰ、または本発明の第３の実施形態では、ＯＤＮＰの第１セットまたは第２セットのいずれかのメンバーである各ＯＤＮＰはさらに、ニック形成剤認識配列（ＮＡＲＳ）のセンス鎖のヌクレオチド配列を含む。（ｂ）第１のＯＤＮＰセット由来の１つのＯＤＮＰおよび第２のＯＤＮＰセット由来の別のＯＤＮＰを含むフラグメントを増幅する工程。（ｃ）ＤＮＡポリメラーゼと、ＮＡＲＳを認識するニック形成剤（ＮＡ）との存在下において、増幅反応を実施する工程。（ｄ）工程（ｃ）由来の増幅産物の存在または非存在を検出することにより、各々の潜在的な連結部の存在または非存在を決定する工程。
【００３５】
関連の局面において、本発明は、ｃＤＮＡ分子中またはｃＤＮＡ集団中において、ｎ個のエキソンを含む遺伝子の２個毎のエキソンの間における連結部の存在または非存在を検出する方法を提供し、ここでｎは、２以上の整数であり、エキソンＡはその遺伝子のエキソンの中で最も上流のエキソンであり、そしてエキソンＮは、その遺伝子のエキソンの中で最も下流のエキソンであり、ここでこの方法は以下の工程を包含する：（ａ）オリゴヌクレオチドプライマー（ＯＤＮＰ）の第１セットと、ＯＤＮＰの第２セットと、ｃＤＮＡ分子またはｃＤＮＡ集団とを混合する工程。ＯＤＮＰの第１セットは、ｎ−１個のＯＤＮＰを含み、このセットの各メンバーは、エキソンＡを除くエキソンのうちの独特な１つに対応し、そして各ＯＤＮＰは、そのエキソンのセンス鎖における５’末端付近にある対応するエキソンのセンス鎖の一部分に対して少なくとも実質的に相補的なヌクレオチド配列を含む。ＯＤＮＰの第２セットは、ｎ−１個のＯＤＮＰを含み、このセットの各メンバーは、エキソンＮを除くエキソンのうちの独特な１つに対応し、そして各ＯＤＮＰはさらに、そのエキソンのアンチセンス鎖における５’末端付近にある対応するエキソンのアンチセンス鎖の一部分に対して少なくとも実質的に相補的なヌクレオチド配列を含む。さらに、本発明の第１の実施形態では、ＯＤＮＰの第１セットのメンバーである各ＯＤＮＰ、または本発明の第２の実施形態では、ＯＤＮＰの第２セットのメンバーである各ＯＤＮＰ、または本発明の第３の実施形態では、ＯＤＮＰの第１セットまたは第２セットのいずれかのメンバーである各ＯＤＮＰはさらに、ニック形成エンドヌクレアーゼ認識配列（ＮＥＲＳ）のセンス鎖のヌクレオチド配列を含む。（ｂ）第１のＯＤＮＰセット由来の１つのＯＤＮＰおよび第２のＯＤＮＰセット由来の別のＯＤＮＰによって包囲されるフラグメントを増幅する工程。（ｃ）ＤＮＡポリメラーゼと、ＮＥＲＳを認識するニック形成エンドヌクレアーゼ（ＮＥ）との存在下において、好ましくは等温条件下で、増幅反応を実施する工程。（ｄ）工程（ｃ）の増幅産物の存在または非存在を検出する工程。１つの実施形態において、この検出は、液体クロマトグラフィーおよび／または質量分析法によって実施される。この検出は、引き続いて、研究下にある潜在的な連結部の各々の存在または非存在の決定を可能にする。
１つの実施形態では、工程（ｃ）の増幅産物は、存在する場合には、１７以下のヌクレオチドを含む。本発明の種々の実施形態において、１つ以上の以下の判断基準が、本実施形態を記載するにおいて使用され得る：ＮＡＲＳが、制限エンドヌクレアーゼ認識配列（ＲＥＲＳ）であり、そして工程（ｂ）が、少なくとも１つの改変デオキシリボヌクレオシド三リン酸の存在下で実施される；ＮＡＲＳがニック形成エンドヌクレアーゼ認識配列（ＮＥＲＳ）である；第１セットのＯＤＮＰおよび第２セットのＯＤＮＰが両方とも、ＮＡＲＳのセンス鎖のヌクレオチド配列を含む；ＮＡＲＳがＲＥＲＳであり、そして工程（ｂ）が、少なくとも１つの改変デオキシリボヌクレオシド三リン酸の存在下で実施される；ＮＡＲＳがＮＥＲＳである；ＮＥＲＳが、Ｎ．ＢｓｔＮＢ  Ｉによって認識可能である；第１セットにおけるＯＤＮＰまたは第２セットにおけるＯＤＮＰが、ＲＥＲＳの一方の鎖の配列を含むが、ＮＥＲＳのセンス鎖の配列を含まない；工程（ｂ）によって生成されるフラグメントが、半改変ＲＥＲＳを含まない；ＲＥＲＳが、ＩＩｓ型制限エンドヌクレアーゼ（ＲＥ）によって認識可能である；工程（ｂ）の増幅フラグメントが、工程（ｃ）を実施する前に、ＲＥＲＳを認識するＲＥによって消化される；遺伝子が、疾患に関連している；遺伝子が、ヒト疾患に関連している；工程（ｂ）が、ポリメラーゼ連鎖反応によって実施される；工程（ｃ）が、等温条件下で実施される；工程（ｃ）の増幅産物が、存在する場合には、３５ヌクレオチド以下を含む一本鎖核酸フラグメント；１７ヌクレオチド以下を含む一本鎖核酸フラグメント；１２ヌクレオチド以下を含む一本鎖核酸フラグメントである；工程（ｄ）が、少なくとも一部、発光分光学、蛍光分光学、質量分析法、液体クロマトグラフィー、蛍光分極、ゲル電気泳動、およびキャピラリー電気泳動から選択される技術によって実施される；工程（ｄ）が、少なくとも部分的に、質量分析法によって実施される。
【００３６】
本発明は、他の局面において、ｃＤＮＡ集団中において遺伝子の選択的スプライシングを検出するための方法を提供する。１つの実施形態において、この方法は、以下の工程を包含する：（ａ）本明細書中に記載される本発明の方法に従って、遺伝子のなかの任意の２つのエキソンの間における潜在的な連結部の各々の存在または非存在を決定する工程。（ｂ）その遺伝子の少なくとも１つのエキソンについて、そのエキソンの少なくとも１つの末端に１つより多い連結部が存在する場合に、そのｃＤＮＡ集団中において遺伝子の選択的スプライシングが存在することを示す工程。関連の実施形態において、本方法は、ｃＤＮＡ集団中における遺伝子の選択的スプライシングの多重検出を提供し、ここでこの方法は、各遺伝子について、以下の工程を包含する：（ａ）本明細書中に記載される本発明の方法に従う方法に従って、遺伝子のなかの任意の２つのエキソンの間における潜在的な連結部の各々の存在または非存在を決定する工程。（ｂ）その遺伝子の少なくとも１つのエキソンについて、そのエキソンの少なくとも１つの末端に１つより多い連結部が存在する場合に、そのｃＤＮＡ集団中において遺伝子の選択的スプライシングが存在することを示す工程。関連の実施形態において、本発明は、２つの生物学的サンプルの間において遺伝子の選択的スプライシングを検出するための方法を提供し、ここでこの方法は、以下の工程を包含する：（ａ）各生物学的サンプルについて、本発明に従う方法を実施することによって、遺伝子のなかの任意の２つのエキソンの間における潜在的な連結部の各々の存在または非存在を決定する工程。（ｂ）少なくとも１つの連結部が、その生物学的サンプルのうちの一方に存在するが、他方の生物学的サンプル中には存在しない場合に、その２つの生物学的サンプルの間において遺伝子の選択的スプライシングが存在することを示す工程。関連の実施形態において、本発明は、２つの生物学的サンプルの間における遺伝子の選択的スプライシングの多重検出のための方法を提供し、ここでこの方法は、各遺伝子について、以下の工程を包含する：（ａ）各生物学的サンプルについて、本明細書中に記載されるような本発明の方法に従って、遺伝子のなかの任意の２つのエキソンの間における潜在的な連結部の各々の存在または非存在を決定する工程。（ｂ）少なくとも１つの連結部が、その生物学的サンプルのうちの一方に存在するが、他方の生物学的サンプル中には存在しない場合に、その２つの生物学的サンプルの間において遺伝子の選択的スプライシングが存在することを示す工程。関連の実施形態において、本発明は、ｃＤＮＡ分子において遺伝子の上流エキソン（エキソンＡ）と下流エキソン（エキソンＢ）との間における連結部の存在または非存在を検出するためのオリゴヌクレオチドプライマー（ＯＤＮＰ）を提供し、ここで：（ａ）第１のＯＤＮＰは、エキソンＡのアンチセンス鎖において５’末端付近にあるエキソンＡのアンチセンス鎖の一部分に対して少なくとも実質的に相補的なヌクレオチド配列を含む。
第２のＯＤＮＰは、エキソンＢのセンス鎖において５’末端付近にあるエキソンＢのセンス鎖の一部分に対して少なくとも実質的に相補的なヌクレオチド配列を含む。さらに、第１のＯＤＮＰおよび第２のＯＤＮＰのうちの少なくとも一方は、ニック形成剤認識配列（ＮＡＲＳ）のセンス鎖のヌクレオチド配列をさらに含む。本発明のこのＯＤＮＰ対の種々の実施形態では、以下の判断基準が、この対を記載するために使用され得、ここでこの以下の判断基準の任意の２つ以上は、必要に応じて本明細書中の他の箇所に記載される他の判断基準と、組み合わせられ得る：ＮＡＲＳが、制限エンドヌクレアーゼ認識配列（ＲＥＲＳ）である；ＮＡＲＳがニック形成エンドヌクレアーゼ認識配列（ＮＥＲＳ）である；第１のＯＤＮＰおよび第２のＯＤＮＰが両方とも、ＮＡＲＳのセンス鎖のヌクレオチド配列を含む；ＮＡＲＳがＲＥＲＳである；ＮＡＲＳがＮＥＲＳである；ＮＥＲＳが、Ｎ．ＢｓｔＮＢ  Ｉによって認識可能である；第１のＯＤＮＰが、ＮＥＲＳのセンス鎖のヌクレオチド配列を含み、そして第２のＯＤＮＰが、ＲＥＲＳの一方の鎖（１つの実施形態ではセンス鎖、別の実施形態ではアンチセンス鎖）のヌクレオチド配列を含む；第１のＯＤＮＰが、ＲＥＲＳの一方の鎖のヌクレオチド配列を含み、そして第２のＯＤＮＰが、ＮＥＲＳのセンス鎖のヌクレオチド配列を含む；ＲＥＲＳが、ＩＩｓ型制限エンドヌクレアーゼ（ＲＥ）によって認識可能である；遺伝子が疾患に関連している；第１のＯＤＮＰが、少なくとも１２ヌクレオチド長である：第２のＯＤＮＰが、少なくとも１２ヌクレオチド長である。
【００３７】
別の局面では、本発明は、一本鎖ｃＤＮＡ分子を合成するために有用なテンプレート核酸分子を作製する方法を提供し、ここでこの方法は、以下の工程を包含する：（ａ）二本鎖ｃＤＮＡ分子を提供する工程。（ｂ）その二本鎖ｃＤＮＡ分子を、ニック形成剤認識配列（ＮＡＲＳ）を含む核酸アダプターと連結する工程であって、その結果、ＮＡＲＳを認識するニック形成剤（ＮＡ）とＤＮＡポリメラーゼとの存在下において、テンプレートとしてその連結産物を使用して増幅される一本鎖核酸分子は、その二本鎖ｃＤＮＡ分子の一方の鎖の少なくとも一部分を含む、工程。別の局面では、本発明は、ｃＤＮＡライブラリーを作製する方法を提供し、ここでこの方法は、以下の工程を包含する：（ａ）生物学的サンプルから単離されたｍＲＮＡ分子を提供する工程。（ｂ）テンプレートとしてその単離されたｍＲＮＡを使用して、二本鎖ｃＤＮＡ分子を調製する工程。
（ｃ）その二本鎖ｃＤＮＡ分子を、ニック形成剤認識配列（ＮＡＲＳ）を含む核酸アダプターに連結する工程であって、その結果、（ｉ）ＮＡＲＳを認識するニック形成剤と（ｉｉ）ＤＮＡポリメラーゼとの存在下において、テンプレートとしてその連結産物を使用して増幅される一本鎖核酸分子は、その二本鎖ｃＤＮＡ分子の一方の鎖の少なくとも一部分を含む、工程。任意の実施形態において、本発明のこれらの方法は、１つ以上の以下の判断基準によってさらに特徴付けられ得、ここでこれらの判断基準の任意の２つ以上は、本発明のこの方法を特徴付けるにおいて組み合わせられ得、そしてここでこれらの判断基準は、非排他的である：その部分が、少なくとも４０ヌクレオチド長、または少なくとも３８ヌクレオチド長、または少なくとも３６ヌクレオチド長、または少なくとも３４ヌクレオチド長、または少なくとも３２ヌクレオチド長、または少なくとも３０ヌクレオチド長、または少なくとも２８ヌクレオチド長、または少なくとも２６ヌクレオチド長、または少なくとも２４ヌクレオチド長、または少なくとも２２ヌクレオチド長、または少なくとも２０ヌクレオチド長、または少なくとも１９ヌクレオチド長、または少なくとも１８ヌクレオチド長、または少なくとも１７ヌクレオチド長、または少なくとも１６ヌクレオチド長、または少なくとも１５ヌクレオチド長、または少なくとも１４ヌクレオチド長、または少なくとも１３ヌクレオチド長、または少なくとも１２ヌクレオチド長、または少なくとも１１ヌクレオチド長、または少なくとも１０ヌクレオチド長、または少なくとも９ヌクレオチド長、または少なくとも８ヌクレオチド長、または少なくとも７ヌクレオチド長、または少なくとも６ヌクレオチド長、または少なくとも５ヌクレオチド長、または少なくとも４ヌクレオチド長である；その部分が、１００ヌクレオチド長以下である、または９０ヌクレオチド長以下である、または８０ヌクレオチド長以下である、または７０ヌクレオチド長以下である、または６０ヌクレオチド長以下である、または５０ヌクレオチド長以下である、または４０ヌクレオチド長以下である、または３８ヌクレオチド長以下である、または３６ヌクレオチド長以下である、または３４ヌクレオチド長以下である、または３２ヌクレオチド長以下である、または３０ヌクレオチド長以下である、または２８ヌクレオチド長以下である、または２６ヌクレオチド長以下である、または２４ヌクレオチド長以下である、または２２ヌクレオチド長以下である、または２０ヌクレオチド長以下である、または１８ヌクレオチド長以下である、または１７ヌクレオチド長以下である、または１６ヌクレオチド長以下である、または１５ヌクレオチド長以下である、または１４ヌクレオチド長以下である、または１３ヌクレオチド長以下である、または１２ヌクレオチド長以下である、または１１ヌクレオチド長以下である、または１０ヌクレオチド長以下である、または９ヌクレオチド長以下である、または８ヌクレオチド長以下である、または７ヌクレオチド長以下である、または６ヌクレオチド長以下である、または５ヌクレオチド長以下である；二本鎖ｃＤＮＡ分子が、その二本鎖ｃＤＮＡ分子と核酸アダプターとの間の連結に関与しない末端を介して固定される；核酸アダプターが、二本鎖ｃＤＮＡ分子とその核酸アダプターとの間の連結に関与しない末端を介して固定される；ＮＡが、ニック形成エンドヌクレアーゼ（ＮＥ）である；ＮＡが、Ｎ．ＢｓｔＮＢ  Ｉである；ＮＡＲＳが、半改変制限エンドヌクレアーゼ認識配列である；アダプターが関与する場合、二本鎖ｃＤＮＡ分子または核酸アダプターのいずれかが、その二本鎖ｃＤＮＡ分子とその核酸アダプターとの間の連結に関与しない固定化材料の末端を介して固定される。
【００３８】
別の局面において、本発明は、以下の工程を包含する方法を提供する：（ａ）以下（ｉ）必要に応じて存在する配列として、ＩＩｓ型制限エンドヌクレアーゼ認識配列（ＴＲＥＲＳ）と、（ｉｉ）ニック形成剤認識配列（ＮＡＲＳ）と、（ｉｉｉ）標的核酸のフラグメントとを含む、二本鎖核酸分子を提供する工程。この二本鎖核酸分子において、特に、ＮＡＲＳを認識するニック形成剤（ＮＡ）のニック形成部位（ＮＳ）を含まない鎖において、（１）標的核酸フラグメントは、ＮＡＲＳに対して５’側に位置付けられ、そして（２）ＴＲＥＲＳが存在する場合には、そのＴＲＥＲＳを認識するＩＩｓ型制限エンドヌクレアーゼの切断部位は、標的核酸フラグメントの内部でありかつＮＳに対応する位置に対して５’側である位置に位置付けられる。（ｂ）任意の工程として、ＴＲＥＲＳを認識するＩＩｓ型制限エンドヌクレアーゼで、その二本鎖核酸を切断する工程。（ｃ）ＮＡＲＳを認識するＮＡの存在下において、一本鎖核酸フラグメントを増幅する工程。関連の局面において、本発明は、以下の工程を包含する方法を提供する：（ａ）以下（ｉ）ＩＩｓ型制限エンドヌクレアーゼ認識配列（ＴＲＥＲＳ）と、（ｉｉ）ニック形成エンドヌクレアーゼ認識配列（ＮＥＲＳ）と、（ｉｉｉ）標的核酸のフラグメントとを含む、二本鎖核酸分子を提供する工程。
この二本鎖核酸分子において、特に、ＮＥＲＳを認識するニック形成エンドヌクレアーゼ（ＮＥ）のニック形成部位（ＮＳ）を含まない鎖において、（１）標的核酸フラグメントは、ＮＥＲＳに対して５’側に位置付けられ、そして（２）ＴＲＥＲＳを認識するＩＩｓ型制限エンドヌクレアーゼの切断部位は、標的核酸フラグメントの内部でありかつＮＳに対応する位置に対して５’側である位置に位置付けられる。（ｂ）ＴＲＥＲＳを認識するＩＩｓ型制限エンドヌクレアーゼで、その二本鎖核酸を切断する工程。（ｃ）ＮＡＲＳを認識するＮＡの存在下において、好ましくは等温条件下で、一本鎖核酸フラグメントを増幅する工程。１つの実施形態において、この一本鎖核酸フラグメントは、１７以下のヌクレオチドを含む。別の局面では、本発明は、複数の一本鎖核酸プローブを作製する方法を提供し、ここでこの方法は、以下の工程を包含する：（ａ）二本鎖核酸分子を提供する工程であって、ここで各二本鎖核酸分子は、以下：（ｉ）ＩＩｓ型制限エンドヌクレアーゼ認識配列（ＴＲＥＲＳ）（このＴＲＥＲＳは、この二本鎖核酸分子の任意要素である）と、（ｉｉ）ニック形成剤認識配列（ＮＡＲＳ）と、（ｉｉｉ）標的核酸のフラグメントとを含む、工程。さらに、ＮＡＲＳを認識するニック形成剤（ＮＡ）のニック形成部位（ＮＳ）を含まない鎖において、（１）標的核酸フラグメントは、ＮＡＲＳに対して５’側に位置付けられ、そして（２）ＴＲＥＲＳが存在する場合には、そのＴＲＥＲＳを認識するＩＩｓ型制限エンドヌクレアーゼの切断部位は、標的核酸フラグメントの内部でありかつＮＳに対応する位置に対して５’側である位置に位置付けられる。（ｂ）本方法は、ＴＲＥＲＳを認識するＩＩｓ型制限エンドヌクレアーゼで、その二本鎖核酸を切断する任意の工程を包含する。（ｃ）ＮＡＲＳを認識するＮＡの存在下において、一本鎖核酸フラグメントを増幅する工程。関連の局面において、本発明は、複数の一本鎖核酸プローブを作製する方法を提供し、ここでこの方法は、以下の工程を包含する：（ａ）複数の二本鎖核酸分子を提供する工程であって、ここで各二本鎖核酸分子は、以下：（ｉ）ＩＩｓ型制限エンドヌクレアーゼ認識配列（ＴＲＥＲＳ）と、（ｉｉ）ニック形成エンドヌクレアーゼ認識配列（ＮＥＲＳ）と、（ｉｉｉ）標的核酸のフラグメントとを含む、工程。この二本鎖核酸分子において、特に、ＮＥＲＳを認識するニック形成エンドヌクレアーゼ（ＮＥ）のニック形成部位（ＮＳ）を含まない鎖において、（１）標的核酸フラグメントは、ＮＥＲＳに対して５’側に位置付けられ、そして（２）ＴＲＥＲＳを認識するＩＩｓ型制限エンドヌクレアーゼの切断部位は、標的核酸フラグメントの内部でありかつＮＳに対応する位置に対して５’側である位置に位置付けられる。（ｂ）ＴＲＥＲＳを認識するＩＩｓ型制限エンドヌクレアーゼで、その二本鎖核酸を切断する工程。（ｃ）ＮＥＲＳを認識するＮＥの存在下において、好ましくは等温条件下で、一本鎖核酸フラグメントを増幅する工程。必要に応じて、この一本鎖核酸フラグメントは各々、２５以下のヌクレオチド、または１７以下のヌクレオチドを含む。本発明のこれらの方法はさらに、１つ以上の以下の判断基準によって記載され得、ここでこの以下の判断基準の任意の２つ以上は、本発明のこれらの方法を記載するにおいて組み合わせられ得る：ＮＡが、ニック形成エンドヌクレアーゼ（ＮＥ）である；ＮＡが、Ｎ．ＢｓｔＮＢ  Ｉである；ＮＡＲＳが、半改変制限エンドヌクレアーゼ認識配列である；ＮＡＲＳが、ＡｖａＩ、ＢｓｌＩ、ＢｓｍＡＩ、ＢｓｏＢＩ、ＢｓｒＩ、ＢｓｔＮＩ、ＢｓｔＯＩ、Ｆｎｕ４ＨＩ、ＨｉｎｃＩＩ、ＨｉｎｄＩＩおよびＮｃｉＩからなる群より選択される制限エンドヌクレアーゼ（ＲＥ）によって認識可能である；ＴＲＥＲＳが、ＢｐｍＩまたはＭｍｅＩによって認識可能である；二本鎖核酸分子を提供する工程が、少なくとも一部、本明細書に記載されるようなアダプター分子を連結する工程、およびＮＡＲＳを、二本鎖標的核酸フラグメントに組み込む工程によって実施され、ここで必要に応じて、この二本鎖核酸フラグメントは、アダプターに連結される前に、制限エンドヌクレアーゼ（ＲＥ）によって切断され、そしてここでまた必要に応じて、この二本鎖標的核酸フラグメントはｃＤＮＡフラグメントであり、ここでこのｃＤＮＡフラグメントは必要に応じて、固体支持体に固定され得、そしてここでこの固定されたｃＤＮＡは、必要に応じて、以下：（ｉ）固定されたオリゴヌクレオチドプライマーを使用して、生物学的サンプルからｍＲＮＡを単離する工程、および（ｉｉ）テンプレートとしてそのｍＲＮＡを使用して二本鎖ｃＤＮＡを合成する工程、を包含する方法によって生成され得る；増幅する工程が、ＤＮＡポリメラーゼの存在下において実施され、ここでこのＤＮＡポリメラーゼは、以下：ｅｘｏ−Ｖｅｎｔ、ｅｘｏ−Ｄｅｅｐ  Ｖｅｎｔ、ｅｘｏ−Ｂｓｔ、ｅｘｏ−Ｐｆｕ、ｅｘｏ−Ｂｃａ、Ｔａｑ、ＤＮＡポリメラーゼＩのＫｌｅｎｏｗフラグメント、Ｔ５  ＤＮＡポリメラーゼ、φ２９  ＤＮＡポリメラーゼ、ファージＭ２  ＤＮＡポリメラーゼ、ファージφＰＲＤ１  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ、ＰＲＤ１  ＤＮＡポリメラーゼ、９°ＮｍＴＭＤＮＡポリメラーゼ、またはＴ４  ＤＮＡポリメラーゼのうちの１つ、またはそれらのうちの２つ以上からなる任意の群である（例えば、ポリメラーゼは、ｅｘｏ−Ｂｓｔポリメラーゼ、ｅｘｏ−Ｂｃａポリメラーゼ、９°ＮｍＴＭＤＮＡポリメラーゼまたはｅｘｏ−Ｖｅｎｔポリメラーゼである）；増幅が、等温条件下で実施される；増幅される一本鎖核酸フラグメントが、２５以下のヌクレオチドを含む；一本鎖核酸フラグメントが、１５〜５０ヌクレオチド長である；一本鎖核酸フラグメントが、５１〜２０，０００ヌクレオチド長である。
【００３９】
別の局面において、本発明は、一本鎖核酸分子を増幅する方法を提供し、ここでこの方法は、以下の工程を包含する：（Ａ）以下：（ｉ）標的核酸と；（ｉｉ）オリゴヌクレオチドプライマーであって、（ａ）二本鎖ニック形成剤認識配列の外側に位置付けられるニック形成部位（ＮＳ）にニックを形成するニック形成剤（ＮＡ）によって認識可能な、二本鎖ニック形成剤認識配列（ＮＡＲＳ）のセンス鎖のヌクレオチド配列を含み、かつ（ｂ）標的核酸に対して少なくとも実質的に相補的なヌクレオチド配列を含む、オリゴヌクレオチドプライマー、とを含む混合物を形成する工程。（Ｂ）ニック形成剤の存在下において、テンプレートとして標的核酸の一部分を使用して、一本鎖核酸分子を増幅する工程。必要に応じて、この二本鎖ニック形成剤認識配列は、Ｎ．ＢｓｔＮＢ  Ｉによって認識可能である。必要に応じて、この二本鎖ニック形成剤認識配列のセンス鎖のヌクレオチド配列内にある１つのヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドプライマーが標的核酸とアニールする場合に、標的核酸の別のヌクレオチドと従来の塩基対を形成しない。必要に応じて、この二本鎖ニック形成剤認識配列のセンス鎖のヌクレオチド配列内にある２つ以上のヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドプライマーが標的核酸とアニールする場合に、標的核酸のヌクレオチドと従来の塩基対を形成しない。必要に応じて、標的核酸は、固定される。必要に応じて、オリゴヌクレオチドプライマーは、その５’末端で固定される。
【００４０】
別の局面において、本発明は、以下の工程を包含する方法を提供する：（Ａ）以下：（ｉ）標的核酸と、（ｉｉ）オリゴヌクレオチドプライマーであって、（ａ）認識配列の外側にニックを形成するニック形成剤によって認識可能なＮＡＲＳのセンス鎖のヌクレオチド配列を含み、かつ（ｂ）標的核酸の第１領域に対して少なくとも実質的に相補的である、オリゴヌクレオチドプライマーと、（ｉｉｉ）部分的に二本鎖の核酸であって、以下（ａ）二本鎖ＩＩｓ型制限エンドヌクレアーゼ認識配列を含み、かつ（ｂ）上記第１領域に対して５’側に位置付けられる標的核酸の第２領域に対して少なくとも実質的に相補的な３’突出部を含む、部分的に二本鎖の核酸、とを含む混合物を形成する工程。これらの構成要素は、オリゴヌクレオチドプライマーと標的の第１領域との間、および部分的に二本鎖の核酸の３’突出部と標的の第２領域との間でハイブリダイゼーションを可能にする条件下で組み合わされる。（Ｂ）オリゴヌクレオチドプライマーにハイブリダイズした、そして第２領域においては部分的に二本鎖の核酸にハイブリダイズした、標的核酸を消化する工程。（Ｃ）ニック形成剤の存在下において、テンプレートとして工程（Ｂ）において消化された標的核酸の一部分を使用して、一本鎖核酸分子を増幅する工程。関連の実施形態において、本発明は、以下の工程を包含する方法を提供する：（Ａ）以下：（ｉ）標的核酸と、（ｉｉ）オリゴヌクレオチドプライマーであって、（ａ）認識配列の外側にニックを形成するニック形成剤によって認識可能なＮＡＲＳのセンス鎖のヌクレオチド配列を含み、かつ（ｂ）標的核酸の第１領域に対して少なくとも実質的に相補的である、オリゴヌクレオチドプライマーと、（ｉｉｉ）一本鎖核酸分子であって、（１）第１領域に対して５’側に位置付けられる標的核酸の第２領域に対して少なくとも実質的に相補的である、一本鎖核酸分子、とを含む混合物を形成する工程。これらの構成要素は、オリゴヌクレオチドプライマーと標的の第１領域との間、および一本鎖核酸分子と標的の第２領域との間でハイブリダイゼーションを可能にする条件下で組み合わされる。（Ｂ）ニック形成剤およびＤＮＡポリメラーゼの存在下において、テンプレートとして標的核酸の一部分を使用して、一本鎖核酸分子を増幅する工程。好ましくは、このＤＮＡポリメラーゼは、鎖置換活性を有さず、その結果、事実上、この一本鎖核酸分子は、ＤＮＡポリメラーゼによるさらなる伸長反応をブロックする。本発明のこの局面に従って、好ましくは等温条件下において、好ましくは、標的核酸分子の長さに基づいて生成され得る全長よりも短い長さの、複数の一本鎖核酸分子が生成される。１つの実施形態では、１つのミスマッチ塩基対がＮＡＲＳ中に存在し、一方で別の実施形態では、２つのミスマッチ塩基対がＮＡＲＳ中に存在し、一方で別の実施形態では、ＮＡＲＳを形成するすべての塩基対がミスマッチであり、一方で別の実施形態では、ＮＡＲＳを形成する塩基対（ここでｎ個の塩基対が、ＮＡＲＳを形成する）のうちのｎ−１個がミスマッチである。別の実施形態では、ＮＡＲＳ中にマッチしないヌクレオチドが存在する。別の実施形態では、ＮＡＲＳのセンス配列を形成するすべてのヌクレオチドがマッチしない。
【００４１】
別の局面では、本発明は、以下を包含する方法を提供する：（ａ）以下（ｉ）ニック形成剤認識配列（ＮＡＲＳ）を含む部分的または完全に二本鎖のテンプレート核酸分子と、（ｉｉ）ＮＡＲＳを認識するニック形成剤（ＮＡ）と、（ｉｉｉ）ＤＮＡポリメラーゼと、（ｉｉｉ）１つ以上のデオキシリボヌクレオシド三リン酸との混合物を形成する工程。（ｂ）一本鎖核酸フラグメントの増幅を可能にする条件下で、工程（ａ）の混合物を維持する工程であって、ここでこの条件下で、一本鎖核酸フラグメントは、ＤＮＡポリメラーゼのいかなる鎖置換活性も鎖置換促進因子のいかなる鎖置換活性も存在しない状況下において、テンプレート核酸から同時に解離し得る、工程。関連の局面において、本発明は、以下の工程を包含する方法を提供する：（ａ）部分的または完全に二本鎖のテンプレート核酸を、ニック形成剤（ＮＡ）と接触させる工程であって、ここでこのテンプレートは、ニック形成剤認識配列（ＮＡＲＳ）を含む、工程。（ｂ）上記テンプレートが、ＮＡによってニック形成可能なニック形成部位（ＮＳ）を含まない場合、そのテンプレートを伸長して、ＮＳを提供する工程。（ｃ）ＮＳにおいてテンプレートまたはその伸長産物にニック形成して、ＮＳにおいて新たな３’末端を含むニック形成産物およびＮＳにおいて新たな５’末端を含むニック形成産物を提供する工程であって；ここで、ＮＳにおいて新たな５’末端を含むニック形成産物と、ＮＡＲＳのアンチセンス鎖の配列を含むテンプレートまたはその伸長産物の鎖との間で形成される二重鎖の融解温度は、ＮＳにおいて新たな３’末端を含むニック形成産物と、テンプレートまたはその伸長産物の同じ鎖との間で形成される二重鎖の融解温度よりも高い、工程。（ｄ）ＮＳにおいて新たな３’末端を含む工程（ｃ）のニック形成産物を伸長する工程。（ｅ）工程（ｃ）および（ｄ）を繰り返して、一本鎖核酸フラグメントを増幅する工程。必要に応じて、ニック形成、伸長および／または増幅は、等温条件下で実施される。必要に応じて、工程（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）および（ｅ）を実施する温度は、ＮＳにおいて新たな５’末端を含むニック形成産物と、ＮＡＲＳのアンチセンス鎖の配列を含むテンプレートまたはその伸長産物の鎖との間で形成される二重鎖の融解温度と、ＮＳにおいて新たな３’末端を含むニック形成産物と、テンプレートまたはその伸長産物の同じ鎖との間で形成される二重鎖の融解温度との間である。
【００４２】
一本鎖核酸フラグメントが、本発明の任意の方法における増幅工程によって形成される場合、そして特に（必然的ではないが）、この一本鎖核酸フラグメントが、目的の情報を含む（例えば、特定の位置に特定のヌクレオチドを有するか、または特定のヌクレオチド配列を有し、ここでこの情報により決定が下される）場合、本発明の方法の種々の実施形態において、この一本鎖核酸フラグメントは、少なくとも１ヌクレオチド、または少なくとも２ヌクレオチド、または少なくとも３ヌクレオチド、または少なくとも４ヌクレオチド、または少なくとも５ヌクレオチド、または少なくとも６ヌクレオチド、または少なくとも７ヌクレオチド、または少なくとも８ヌクレオチド、または少なくとも９ヌクレオチド、または少なくとも１０ヌクレオチド、または少なくとも１１ヌクレオチド、または少なくとも１２ヌクレオチド、または少なくとも１３ヌクレオチド、または少なくとも１４ヌクレオチド、または少なくとも１５ヌクレオチド、または少なくとも１６ヌクレオチド、または少なくとも１７ヌクレオチド、または少なくとも１８ヌクレオチド、または少なくとも１９ヌクレオチド、または少なくとも２０ヌクレオチドを有する。
さらに、本発明の増幅工程によって形成される一本鎖核酸フラグメントは、３以下のヌクレオチド、または４以下のヌクレオチド、または５以下のヌクレオチド、または６以下のヌクレオチド、または７以下のヌクレオチド、または８以下のヌクレオチド、または９以下のヌクレオチド、または１０以下のヌクレオチド、または１１以下のヌクレオチド、または１２以下のヌクレオチド、または１３以下のヌクレオチド、または１４以下のヌクレオチド、または１５以下のヌクレオチド、または１６以下のヌクレオチド、または１７以下のヌクレオチド、または１８以下のヌクレオチド、または１９以下のヌクレオチド、または２０以下のヌクレオチド、または２１以下のヌクレオチド、または２２以下のヌクレオチド、または２３以下のヌクレオチド、または２４以下のヌクレオチド、または２５以下のヌクレオチド、または２６以下のヌクレオチド、または２７以下のヌクレオチド、または２８以下のヌクレオチド、または２９以下のヌクレオチド、または３０以下のヌクレオチド、または３１以下のヌクレオチド、または３２以下のヌクレオチド、または３３以下のヌクレオチド、または３４以下のヌクレオチド、または３５以下のヌクレオチド、または３６以下のヌクレオチド、または３７以下のヌクレオチド、または３８以下のヌクレオチド、または３９以下のヌクレオチド、または４０以下のヌクレオチド、または４１以下のヌクレオチド、または４２以下のヌクレオチド、または４３以下のヌクレオチド、または４４以下のヌクレオチド、または４５以下のヌクレオチド、または４６以下のヌクレオチド、または４７以下のヌクレオチド、または４８以下のヌクレオチド、または４９以下のヌクレオチド、または５０以下のヌクレオチドを含むものとして特徴付けられ得る。
【００４３】
消化産物が、本発明の任意の方法において形成される場合、種々の実施形態において、この消化産物は、少なくとも８ヌクレオチド、または少なくとも１０ヌクレオチド、または少なくとも１２ヌクレオチド、または少なくとも１４ヌクレオチド、または少なくとも１６ヌクレオチド、または少なくとも１８ヌクレオチド、または少なくとも２０ヌクレオチド、または少なくとも２２ヌクレオチド、または少なくとも２４ヌクレオチド、または少なくとも２６ヌクレオチド、または少なくとも２８ヌクレオチド、または少なくとも３０ヌクレオチド、または少なくとも３２ヌクレオチド、または少なくとも３４ヌクレオチド、または少なくとも３６ヌクレオチド、または少なくとも３８ヌクレオチド、または少なくとも４０ヌクレオチド、または少なくとも４２ヌクレオチド、または少なくとも４４ヌクレオチド、または少なくとも４６ヌクレオチド、または少なくとも４８ヌクレオチド、または少なくとも５０ヌクレオチド、または少なくとも５２ヌクレオチド、または少なくとも５４ヌクレオチド、または少なくとも５６ヌクレオチド、または少なくとも５８ヌクレオチド、または少なくとも６０ヌクレオチド、または少なくとも６２ヌクレオチド、または少なくとも６４ヌクレオチド、または少なくとも６６ヌクレオチド、または少なくとも６８ヌクレオチド、または少なくとも７０ヌクレオチド、または少なくとも７２ヌクレオチド、または少なくとも７４ヌクレオチド、または少なくとも７６ヌクレオチド、または少なくとも７８ヌクレオチド、または少なくとも８０ヌクレオチド、または少なくとも８２ヌクレオチド、または少なくとも８４ヌクレオチド、または少なくとも８６ヌクレオチド、または少なくとも８８ヌクレオチド、または少なくとも９０ヌクレオチド、または少なくとも９２ヌクレオチド、または少なくとも９４ヌクレオチド、または少なくとも９６ヌクレオチド、または少なくとも９８ヌクレオチド、または少なくとも１００ヌクレオチドを有し；
消化産物が形成される場合、種々の実施形態において、その消化産物は、２００以下のヌクレオチド、または１８０以下のヌクレオチド、または１６０以下のヌクレオチド、または１４０以下のヌクレオチド、または１２０以下のヌクレオチド、または１１０以下のヌクレオチド、または１００以下のヌクレオチド、または９０以下のヌクレオチド、または８０以下のヌクレオチド、または７０以下のヌクレオチド、または６０以下のヌクレオチド、または５０以下のヌクレオチド、または４０以下のヌクレオチド、または３８以下のヌクレオチド、または３６以下のヌクレオチド、または３４以下のヌクレオチド、または３２以下のヌクレオチド、または３０以下のヌクレオチド、または２８以下のヌクレオチド、または２６以下のヌクレオチド、または２４以下のヌクレオチド、または２２以下のヌクレオチド、または２０以下のヌクレオチド、または１８以下のヌクレオチド、または１６以下のヌクレオチド、または１４以下のヌクレオチド、または１２以下のヌクレオチド、または１０以下のヌクレオチドを有する。
【００４４】
ＮＡＲＳを含む本発明の任意の方法または化合物または組成物において、このＮＡＲＳは、１つの（すなわち、１つまたはそれより多くの）ミスマッチヌクレオチドを含み得る。換言すると、ＮＡＲＳを形成する１つ以上のヌクレオチド塩基対は、従来のワトソン−クリック塩基対形成の法則に従ってハイブリダイズし得ない。しかし、ミスマッチヌクレオチドがＮＡＲＳに存在する場合、ＮＡＲＳのセンス鎖を形成する少なくともすべてのヌクレオチドが存在する。
【００４５】
本発明の任意の方法が改変デオキシリボヌクレオシド三リン酸の使用を伴う場合、１つの実施形態において、この改変デオキシリボヌクレオシド三リン酸は、α−チオデオキシリボヌクレオシド三リン酸である。
【００４６】
ＤＮＡポリメラーゼが本発明の任意の方法において利用される場合、このＤＮＡポリメラーゼは、ｅｘｏ−Ｖｅｎｔ、ｅｘｏ−Ｄｅｅｐ  Ｖｅｎｔ、ｅｘｏ−Ｂｓｔ、ｅｘｏ−Ｐｆｕ、ｅｘｏ−Ｂｃａ、Ｔａｑ、ＤＮＡポリメラーゼＩのＫｌｅｎｏｗフラグメント、Ｔ５  ＤＮＡポリメラーゼ、φ２９  ＤＮＡポリメラーゼ、ファージＭ２  ＤＮＡポリメラーゼ、ファージφＰＲＤ１  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ、ＰＲＤ１  ＤＮＡポリメラーゼ、９°ＮｍＴＭＤＮＡポリメラーゼ、およびＴ４  ＤＮＡポリメラーゼのうちの任意の１つ以上であり、ここで適切なＤＮＡポリメラーゼの群が、これらの列挙されたポリメラーゼのうちの任意の２つ、または任意の３つ、または任意の４つなどを組み合わせることによって形成され得、例えば、ＤＮＡポリメラーゼは、ｅｘｏ−Ｂｓｔポリメラーゼ、ｅｘｏ−Ｂｃａポリメラーゼ、９°ＮｍＴＭＤＮＡポリメラーゼまたはｅｘｏ−Ｖｅｎｔポリメラーゼからなる群より選択され得る。
【００４７】
上記にまとめられ、そして本明細書中において非常に詳細に記載される方法、キットおよび組成物に加えて、本発明はまた、本発明の方法およびキットにおいて有用であるかまたは本発明の方法およびキットによって生成され得る、以下の化合物、組成物およびキットを提供する。
【００４８】
部分的に二本鎖のオリゴヌクレオチドプローブであって、これは、以下：（ａ）ニック形成剤（ＮＡ）によって認識可能なニック形成剤認識配列（ＮＡＲＳ）であって、ここでこのＮＡは、ニック形成部位（ＮＳ）においてプローブまたはその伸長産物のいずれかにニック形成する、ＮＡＲＳ、（ｂ）以下（ｉ）ＮＳを含む鎖における５’突出部であってここでこの突出部は、標的核酸におけるヌクレオチド配列に対して少なくとも実質的に相補的なヌクレオチド配列を含む、５’突出部、または（ｉｉ）ＮＳを含まない鎖における３’突出部であって、ここでこの突出部は、標的核酸におけるヌクレオチド配列に対して少なくとも実質的に相補的なヌクレオチド配列を含む、３’突出部のいずれか；ならびに（ｃ）ＮＳを含まずＮＳを含むように伸長もし得ないプローブの鎖におけるヌクレオチド配列であって、ここでこのヌクレオチド配列は、ＮＳに対応する位置に対して５’側に位置づけられ、そしてこのヌクレオチド配列は、上記の突出部が少なくとも実質的に相補的な標的核酸に対して独特に関連付けられる、ヌクレオチド配列、を含む。このプローブは特に、連続的に、標的核酸を含む問題の試験サンプルを、プローブと合わせ；サンプル由来の核酸にハイブリダイズしなかったプローブを、サンプル由来の核酸に対してハイブリダイズしたプローブから分離し；次いで、サンプル由来の核酸に対してハイブリダイズしたプローブを、ニック形成剤およびポリメラーゼで処理して、サンプル由来の核酸に独特に関連するヌクレオチド配列を含む一本鎖核酸フラグメントを増幅し；
そして少なくとも、配列がサンプル由来の核酸の存在に独特に関連付けられる配列である限りにおいて、増幅された核酸フラグメントを特徴付けて、そのヌクレオチド配列を決定する、という方法において有用である。例えば、標的またはプローブは、固定され得、次いで、固定されていない標的（プローブが固定されている場合）または固定されていないプローブ（標的が固定されている場合）が、固定された材料と合わせられ、次いで、固定されていないあらゆるものまたは固定されたものにハイブリダイズしていないあらゆるものが洗い流され、次いで、固定された材料は、本発明に従って繰り返しニック形成および伸長に供されて、増幅された一本鎖核酸フラグメントを提供し、次いで、増幅された一本鎖フラグメントが、標的に対して独特に関連付けられるプローブ中に存在するヌクレオチド配列の相補体を少なくとも同定するために特徴付けられ、次いで、目的の標的（すなわち、プローブが「独特に相関する」ように設計された標的）がサンプル中に存在したか否かに関して決定が下される。本質的に、標的核酸に独特に関連付けられるプローブ中のヌクレオチド配列は有効に、特定の標的核酸に対して特異的なシグナルとなる。１つの局面において、本発明は、化合物を提供し、ここで標的核酸はプローブに対してハイブリダイズされる。別の局面では、本発明は、化合物を提供し、ここで標的核酸は固体支持体に固定され、そしてまたプローブにハイブリダイズされる。別の局面では、本発明は、プローブを提供し、このプローブは固体支持体に固定される。別の局面では、本発明は、プローブを提供し、このプローブは固体支持体に固定され、そして標的核酸がプローブにハイブリダイズされる。本発明の種々のさらなる実施形態では、１つ以上の以下の判断基準が、上記プローブおよび／または上記プローブと標的とのハイブリダイゼーション産物を記載するにおいて使用され得る：標的核酸が、変性された二本鎖核酸の一方の鎖であり、ここでこの二本鎖核酸は、例えば、ゲノム核酸であり得るかおよび／またはｃＤＮＡであり得る；標的核酸が、病原性ウイルスのゲノム由来である；標的核酸が、病原性細菌のゲノム由来である；標的核酸が、病原性細菌のエピソーム由来である；プローブの二本鎖領域が、１０〜２２ヌクレオチド長、または１１〜２１ヌクレオチド長、または１２〜２０ヌクレオチド長、または１３〜１９ヌクレオチド長、または８〜２５ヌクレオチド長、または８〜３０ヌクレオチド長、または８〜３５ヌクレオチド長、または１０〜２５ヌクレオチド長、または１０〜３０ヌクレオチド長、または１０〜３５ヌクレオチド長である；プローブが、ＮＳを含まない鎖において３’突出部を有する；プローブが、ＮＳを含む鎖において５’突出部を有する；５’突出部または３’突出部が、５〜２５ヌクレオチド長、または６〜２２ヌクレオチド長、または８〜２０ヌクレオチド長、または１０〜１８ヌクレオチド長である；プローブが、２００未満のヌクレオチドを含む；プローブが、１５０未満のヌクレオチドを含む；プローブが、１００未満のヌクレオチドを含む；プローブが、９０未満のヌクレオチド、または８０未満のヌクレオチド、または７０未満のヌクレオチド、または６０未満のヌクレオチド、または５０未満のヌクレオチドを含む；プローブが、少なくとも２０ヌクレオチド、または少なくとも２１ヌクレオチド、または少なくとも２２ヌクレオチド、または少なくとも２３ヌクレオチド、または少なくとも２４ヌクレオチド、または少なくとも２５ヌクレオチド、または少なくとも２６ヌクレオチド、または少なくとも２７ヌクレオチド、または少なくとも２８ヌクレオチド、または少なくとも２９ヌクレオチド、または少なくとも３０ヌクレオチドを含む；ＮＳが、ニック形成エンドヌクレアーゼによってニック形成可能である；
ＮＳが、Ｎ．ＢｓｔＮＢ  Ｉによってニック形成可能である；本発明はまた、上記の複数の独特なプローブを含む組成物を提供し、ここでプローブは独特である（すなわち、任意の他のプローブが特定の標的核酸と関連付けられるというものとは異なる様式で標的核酸と独特に関連付けられるというプローブの特徴（ｃ）に従う配列をそれが有するという点により、組成物中のすべての他のプローブとは異なる）か、さもなくば、このプローブは、標的核酸に特独に関連付けられる配列を有し、ここでその組成物中の他のプローブはまた、その特定の標的核酸と関連付けられない。１つの局面において、この複数のプローブは、アレイ様式で組織化され、例えば、複数のものが、固体支持体の異なる規定位置においてその固体支持体に固定される。
【００４９】
オリゴヌクレオチドプライマー（ＯＤＮＰ）の対、またはＯＤＮＰの対を含むキットもしくは組成物であって、この対は、第１のＯＤＮＰおよび第２のＯＤＮＰによって規定され、ここで（ａ）第１のＯＤＮＰは、少なくとも一部、一本鎖標的核酸中の規定された位置に対して３’側に位置づけられるヌクレオチド配列に対して少なくとも実質的に相補的なヌクレオチド配列によって形成され、（ｂ）第２のＯＤＮＰは、少なくとも一部、標的核酸の相補体中に存在するヌクレオチド配列に対して少なくとも実質的に相補的なヌクレオチド配列によって形成され、ここで相補体中に存在するこのヌクレオチド配列は、上記の規定された位置の相補体に対して３’側の位置に位置づけられ；（ｃ）第１のＯＤＮＰおよび第２のＯＤＮＰはさらに、それぞれ、断続制限エンドヌクレアーゼ認識配列（ＩＲＥＲＳ）の第１鎖の第１の定常認識配列（ＣＲＳ）および第２鎖の第２のＣＲＳを含むが、完全なＩＲＥＲＳを含まず、ここでこの完全なＩＲＥＲＳは、第１鎖および第２鎖から形成される二本鎖核酸配列であり、ここでこの第１のＣＲＳおよび第２のＣＲＳは、可変認識配列（ＶＲＳ）によって連結され；そして（ｄ）第１のＯＤＮＰおよび第２のＯＤＮＰのいずれかはさらに、第１のＣＲＳまたは第２のＣＲＳに対して５’側に位置づけられるＮＥＲＳを含む。以下の判断基準が、本明細書中に記載され得るような他の判断基準に加えて、ＯＤＮＰ単独、または組成物もしくはキットにおいて存在するようなＯＤＮＰを記載するためにさらに利用され得、ここでこれらの判断基準の任意の２つ以上は、ＯＤＮＰを記載するにおいて組み合わせられ得る：標的核酸に対して少なくとも実質的に相補的な第１のＯＤＮＰのヌクレオチド配列は、少なくとも８ヌクレオチド長、または９ヌクレオチド長、または１０ヌクレオチド長、または１１ヌクレオチド長、または１２ヌクレオチド長、または１３ヌクレオチド長、または１４ヌクレオチド長、または１５ヌクレオチド長、または１６ヌクレオチド長、または１７ヌクレオチド長、または１８ヌクレオチド長、または１９ヌクレオチド長、または２０ヌクレオチド長である；標的核酸の相補体に対して少なくとも実質的に相補的な第２のＯＤＮＰのヌクレオチド配列は、少なくとも８ヌクレオチド長、または９ヌクレオチド長、または１０ヌクレオチド長、または１１ヌクレオチド長、または１２ヌクレオチド長、または１３ヌクレオチド長、または１４ヌクレオチド長、または１５ヌクレオチド長、または１６ヌクレオチド長、または１７ヌクレオチド長、または１８ヌクレオチド長、または１９ヌクレオチド長、または２０ヌクレオチド長である；第１のＯＤＮＰは、１５〜８５ヌクレオチド長、または１６〜７０ヌクレオチド長、または１７〜６０ヌクレオチド長、または１８〜５０ヌクレオチド長、または１８〜４０ヌクレオチド長、または２０〜３０ヌクレオチド長、または１５〜３０ヌクレオチド長、または１５〜４０ヌクレオチド長、または１５〜５０ヌクレオチド長である；第２のＯＤＮＰは、１５〜８５ヌクレオチド長、または１６〜７０ヌクレオチド長、または１７〜６０ヌクレオチド長、または１８〜５０ヌクレオチド長、または１８〜４０ヌクレオチド長、または２０〜３０ヌクレオチド長、または１５〜３０ヌクレオチド長、または１５〜４０ヌクレオチド長、または１５〜５０ヌクレオチド長である；第１のＯＤＮＰは、１つ以上のヌクレオチドを含み、これらの１つ以上のヌクレオチドは共に、第１のＣＲＳの３’末端における標的核酸中に存在するヌクレオチドに対して少なくとも実質的に相補的である；第２のＯＤＮＰは、１つ以上のヌクレオチドを含み、これらの１つ以上のヌクレオチド配列は共に、第２のＣＲＳの３’末端における標的核酸中に存在するヌクレオチドに対して少なくとも実質的に相補的である；一本鎖標的核酸が、二本鎖核酸の一方の鎖であり；ここで、この二本鎖核酸は、例えば、ゲノム核酸であり得るかおよび／またはｃＤＮＡであり得る；標的核酸が、病原性ウイルスのゲノム由来であり得る；標的核酸が、病原性細菌のゲノム由来であり得る；標的核酸が、病原性細菌のエピソーム由来であり得る。組成物はさらに、標的核酸および／または標的核酸の相補体を含み得る。この組成物またはキットはさらに、以下のうちの１つ以上を含み得る：ＩＲＥＲＳを認識する制限エンドヌクレアーゼ；ＢｓｌＩ；ＮＥＲＳを認識するニック形成エンドヌクレアーゼ（ＮＥ）；Ｎ．ＢｓｔＮＢ  Ｉ；ＤＮＡポリメラーゼ；ＯＤＮＰでのアッセイを実行するために適切な緩衝液；およびそのキットの使用についての指示書。例えば、本発明は、遺伝子型決定のキットを提供し、このキットは、ＮＥＲＳを認識するＮＥ、ＩＲＥＲＳを認識するＲＥ、ＤＮＡポリメラーゼ、およびそのキットの使用についての指示書と共に、まさに記載された通りのプライマー対を備える。
【００５０】
ニック形成剤認識配列（ＮＡＲＳ）を含む、核酸アダプター。本発明は、アダプター、このアダプターを含むキット、このアダプターを使用する方法、およびこのアダプターを含む組成物を提供する。本発明の種々の実施形態では、以下の判断基準を使用して、このアダプターをさらに特徴付け得、ここでこの判断基準の任意の２つ以上は組み合わせられ得、ここでこれらの判断基準は、単なる例示に過ぎず、そして本明細書中の他の箇所に示される任意の判断基準を補う：これは、ＮＡＲＳのセンス配列およびアンチセンス配列の両方を含む；これは、二本鎖ニック形成部位（ＮＳ）を含み、ここで一方の鎖のみが、ＮＡＲＳを認識するニック形成剤によって切断される；これは、２００未満のヌクレオチド、または１７５未満のヌクレオチド、または１５０未満のヌクレオチド、または１２５未満のヌクレオチド、または１００未満のヌクレオチド、または９０未満のヌクレオチド、または８０未満のヌクレオチド、または７０未満のヌクレオチド、または６５未満のヌクレオチド、または６０未満のヌクレオチド、または５５未満のヌクレオチド、または５０未満のヌクレオチド、または４５未満のヌクレオチド、または４０未満のヌクレオチド、または３５未満のヌクレオチド、または３０未満のヌクレオチド、または２５未満のヌクレオチド、または２０未満のヌクレオチドを含む；これは、１０より多くのヌクレオチド、または１５より多くのヌクレオチド、または２０より多くのヌクレオチド、または２５より多くのヌクレオチド、または３０より多くのヌクレオチド、または３５より多くのヌクレオチド、または４０より多くのヌクレオチド、または４５より多くのヌクレオチド、または５０より多くのヌクレオチドを含む；これは、標的核酸との連結のための３’突出部を含む；これは、標的核酸との連結のための５’突出部を含む；これは、標的核酸との連結のための平滑末端を含む；これは、固体支持体に固定される；これは、アダプターの３’末端を通して、固体支持体に固定される；これは、アダプターの５’末端を通して、固体支持体に固定される；ＮＡＲＳが、ニック形成エンドヌクレアーゼによって認識される；ＮＡＲＳが、Ｎ．ＢｓｔＮＢ  Ｉによって認識される；ＮＡＲＳが、半改変制限エンドヌクレアーゼ認識配列である；ＮＡＲＳが、ＡｖａＩ、ＢｓｌＩ、ＢｓｍＡＩ、ＢｓｏＢＩ、ＢｓｒＩ、ＢｓｔＮＩ、ＢｓｔＯＩ、Ｆｎｕ４ＨＩ、ＨｉｎｃＩＩ、ＨｉｎｄＩＩおよびＮｃｉＩからなる群より選択される制限エンドヌクレアーゼ（ＲＥ）によって認識可能である；アダプターが、二本鎖標的核酸フラグメントに連結する場合に、標的核酸の鎖が、ＮＳを含まないアダプターの鎖に位置づけられるＮＡＲＳの部分に対して５’側に位置づけられるように、アダプターが設計される；これが、ＩＩｓ型制限エンドヌクレアーゼ認識配列（ＴＲＥＲＳ）を含む；これが、ＩＩｓ型制限エンドヌクレアーゼ認識配列（ＴＲＥＲＳ）を含み、そしてＴＲＥＲＳを認識するＩＩｓ型制限エンドヌクレアーゼの切断部位が、（ｉ）二本鎖標的核酸フラグメントの内部でありかつ（ｉｉ）ＮＡによって切断されるＮＳに対応する位置に対して５’側に、位置づけられる；これが、ＩＩｓ型制限エンドヌク���アーゼ認識配列（ＴＲＥＲＳ）を含み、そしてＴＲＥＲＳは、ＮＳを含む鎖内において測定される場合に、ＮＡＲＳに対して５’側の両方に位置づけられる；これが、ＩＩｓ型制限エンドヌクレアーゼ認識配列（ＴＲＥＲＳ）を含み、そしてＴＲＥＲＳは、ＮＳを含む鎖内において測定される場合に、ＮＡＲＳに対して３’側に位置づけられる；これが、ＢｐｍＩによって認識可能なＩＩｓ型制限エンドヌクレアーゼ認識配列（ＴＲＥＲＳ）を含む；これが、ＭｍｅＩによって認識可能なＩＩｓ型制限エンドヌクレアーゼ認識配列（ＴＲＥＲＳ）を含む。
本発明はまた、アダプターを含む組成物およびキットを提供する。この組成物およびキットは、例えば、本明細書中に記載されるようなオリゴヌクレオチドプローブを合成するにおいて有用であり得る。アダプターに加えて、この組成物およびキットの任意の成分は、以下の１つ以上を含む；ＮＡＲＳを認識するニック形成剤；ＮＡＲＳを認識するニック形成エンドヌクレアーゼ（ＮＥ）；ＮＥについての緩衝液；ＴＲＥＲＳを認識するＩＩｓ型制限エンドヌクレアーゼ；ＩＩｓ型制限エンドヌクレアーゼについての緩衝液；ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、ｅｘｏ−Ｂｓｔポリメラーゼ、ｅｘｏ−Ｂｃａポリメラーゼ、９°ＮｍＴＭＤＮＡポリメラーゼおよび／またはｅｘｏ−Ｖｅｎｔポリメラーゼから選択されるＤＮＡポリメラーゼ）；ＤＮＡポリメラーゼについての緩衝液；アダプターを標的核酸に連結し得るリガーゼ；ＤＮＡリガーゼについての緩衝液；キットの使用についての指示書；ポリ（ｄＴ）オリゴヌクレオチドを含む、固体支持体に固定されたプライマー；逆転写酵素；鎖置換促進因子（例えば、トレハロース）。本発明はまた、アダプターと二本鎖標的核酸とを含む組成物を提供する。必要に応じて、この二本鎖標的核酸フラグメントは、ｃＤＮＡフラグメントである。必要に応じて、二本鎖標的核酸は、固体支持体に固定される。必要に応じて、この組成物はさらに、リガーゼおよび／またはポリメラーゼおよび／または制限エンドヌクレアーゼおよび／またはニック形成エンドヌクレアーゼを含む。例えば、本発明は、核酸アダプターを提供し、この核酸アダプターは、以下：（ａ）ＩＩｓ型制限エンドヌクレアーゼ認識配列（ＴＲＥＲＳ）と；（ｂ）ニック形成剤認識配列（ＮＡＲＳ）とを含み、ここでこのアダプターが、ＮＡＲＳを認識するニック形成剤（ＮＡ）のニック形成部位（ＮＳ）を含まない鎖において、標的核酸フラグメントがＮＡＲＳに対して５’側に位置づけられるように、二本鎖標的核酸フラグメントに連結される場合、この鎖においてＴＲＥＲＳを認識するＩＩｓ型制限エンドヌクレアーゼの切断部位は、ＴＲＥＲＳが存在する場合には、（ｉ）二本鎖標的核酸フラグメントの内部でありかつ（ｉｉ）ＮＳに対応する位置に対して５’側の両方に、位置づけられる。
【００５１】
テンプレート核酸分子であって、このテンプレート核酸分子は、一本鎖ｃＤＮＡ分子を合成するために使用され得る。このテンプレート核酸分子は、以下：（ａ）二本鎖ｃＤＮＡ分子またはそのフラグメント由来であるとして特徴付けられ得る部分；および（ｂ）核酸アダプター由来であるとして特徴付けられ得る部分、を含み、ここでこの（ａ）の部分は、この（ｂ）の部分に連結される。核酸アダプターの部分（ｂ）は、ニック形成剤認識配列（ＮＡＲＳ）を含む。（ｉ）テンプレート核酸分子と、（ｉｉ）ＮＡＲＳを認識するニック形成剤（ＮＡ）と、（ｉｉｉ）ＤＮＡポリメラーゼとの組み合わせの存在下において、一本鎖分子が増幅され、ここで一本鎖分子の少なくとも一部分は、二本鎖ｃＤＮＡの一方の鎖のヌクレオチド配列の少なくとも一部分に対して同一であるヌクレオチド配列を有する。好ましくは、この部分は、少なくとも６ヌクレオチド長、または少なくとも７ヌクレオチド長、または少なくとも８ヌクレオチド長、または少なくとも９ヌクレオチド長、または少なくとも１０ヌクレオチド長、または少なくとも１１ヌクレオチド長、または少なくとも１２ヌクレオチド長、または少なくとも１３ヌクレオチド長、または少なくとも１４ヌクレオチド長、または少なくとも１５ヌクレオチド長、または少なくとも１６ヌクレオチド長、または少なくとも１７ヌクレオチド長、または少なくとも１８ヌクレオチド長、または少なくとも１９ヌクレオチド長、または少なくとも２０ヌクレオチド長である。以下の判断基準が、単独でまたは任意の組み合わせにおいて、本発明のテンプレート核酸分子をさらに特徴付けるために使用され得る：ＮＡＲＳを認識するＮＡが、ニック形成エンドヌクレアーゼ（ＮＥ）である；ＮＡＲＳを認識するＮＡが、Ｎ．ＢｓｔＮＢ  Ｉである；ＮＡＲＳが、半改変制限エンドヌクレアーゼ認識配列である。必要に応じて、テンプレート核酸分子の少なくとも一方の鎖は、固体支持体に固定される。この固定は、例えば、二本鎖ｃＤＮＡ分子と核酸アダプターとの間に存在せず、そしてそれらの間に存在したことは無く、そしてそれらの間の連結に関与しない、二本鎖ｃＤＮＡ分子または核酸アダプターのいずれかの末端を介し得る。必要に応じて、リンカー分子が、固体支持体と、固体支持体に固定されたテンプレート核酸分子の末端との間に存在し得る。必要に応じて、リンカー部分が、固体支持体と、固体支持体に最も近く固定されたテンプレート核酸分子の末端との間に存在し得、ここでこのリンカーは、制限エンドヌクレアーゼ認識配列（ＲＥＲＳ）の一方の鎖の配列を含む。複数のこれらのテンプレート核酸分子が、ｃＤＮＡライブラリーを形成するために使用され得る。１つの実施形態では、ライブラリーを形成する複数のテンプレート核酸分子の各々が、固体支持体に固定される。必要に応じて、このライブラリーにおいて、ＮＡＲＳを認識するＮＡは、ニック形成エンドヌクレアーゼ（ＮＥ）（例えば、Ｎ．ＢｓｔＮＢ  Ｉ）である。あるいは、既に言及されたように、ＮＡＲＳは、半改変制限エンドヌクレアーゼ認識配列であり得る。
【００５２】
本発明のこれらおよび関連の局面および実施形態を、以下により詳細に記載する。
【００５３】
（発明の詳細な説明）
本発明は、一本鎖核酸フラグメントを増幅するための方法、組成物およびキットを提供し、ここでこの増幅方法は、例えば、遺伝子バリエーションの同定；オリゴヌクレオチドプローブの調製；および生物学的サンプル中の核酸の存在もしくは非存在、またはｃＤＮＡおよびｍＲＮＡ中のエキソン間の接合部の検出において有用である。この増幅は、（ａ）ニック形成剤認識配列（ＮＡＲＳ）を含むテンプレート二本鎖核酸および（ｂ）ＮＡＲＳを認識するニック形成剤（ＮＡ）を含むニック形成部位（ＮＳ）を組み合わせることにより行われる。次いで、二本鎖核酸テンプレートは、ニック形成剤によりＮＳにおいてニック形成し、それによりＮＳにおける３’末端を生成する。５’→３’エキソヌクレアーゼ欠損ＤＮＡポリメラーゼの存在下において、ＮＳの３’末端は伸長され、下流の一本鎖ＤＮＡフラグメント（すなわち、ＮＳに存在していた５’末端を有する一本鎖ＤＮＡフラグメント）を置き換える。次いで、この伸長産物は、ニック形成剤によりニック形成され、そしてこのようにして形成されたＮＳにおける３’末端は、再びＤＮＡポリメラーゼにより伸長されて、別の伸長産物を形成する。このニック形成伸長プロセスは、複数回繰り返されて、ＮＳにおいてニック形成剤により生成された５’末端を有する一本鎖ＤＮＡフラグメントの増幅を生じる。
【００５４】
種々の局面において、本発明は、種々の有用な適用において上記の増幅方法を使用する。この適用としては、標的核酸における遺伝子バリエーション、オリゴヌクレオチドプローブの調製、および生物学的サンプル中の特定の核酸、またはｃＤＮＡもしくはｍＲＮＡの分子もしくは集団における特定のエキソン−エキソン接合体の存在または非存在の検出が挙げられる。このような適用は、多くの分野で有用であり、これらの分野としては、遺伝性疾患、腫瘍もしくは病原体の診断のための遺伝子分析、疾患の素因の同定、法医学、親子鑑定、植物栽培もしくは動物の優良体（ｓｕｐｅｒｉｏｒ）飼育プログラムの作成およびモニタリング、細胞機能および／もしくは疾患マーカー遺伝子の発現プロファイリング、ならびに植物もしくは動物において感染性疾患を引き起こすかおよび／もしくは食物安全性に関連する感染性生物の同定および／または特徴づけが挙げられる。
【００５５】
（Ａ．取り決め／定義）
本発明のより詳細な説明を提供する前に、以下のように、本明細書中で使用される場合のいくつかの取り決めおよび用語を規定することは、本発明の理解により有用であり得る。さらなる定義は、本発明の記載の全体にわたって提供される。
【００５６】
用語「３’」および「５’」は、核酸の一本鎖内の特定の部位の位置を記載するために、本明細書中で使用される。核酸内の位置が、参照ヌクレオチドもしくは参照ヌクレオチド配列「に対して３’」または参照ヌクレオチドもしくは参照ヌクレオチド配列「の３’」である場合、これは、その位置が参照ヌクレオチドもしくは参照ヌクレオチド配列の３’末端と核酸の参照ヌクレオチド鎖の３’ヒドロキシルとの間に位置することを意味する。同様に、核酸内の位置が、参照ヌクレオチドもしくは参照ヌクレオチド配列「に対して５’」または参照ヌクレオチドもしくは参照ヌクレオチド配列「の５’」である場合、これは、参照ヌクレオチドもしくは参照ヌクレオチド配列の５’末端と核酸の参照ヌクレオチド鎖の５’リン酸との間に位置することを意味する。さらに、ヌクレオチド配列が、参照ヌクレオチドもしくは参照ヌクレオチド配列「に対してすぐ３’」または参照ヌクレオチドもしくは参照ヌクレオチド配列「のすぐ３’」である場合、これは、このヌクレオチド配列が、参照ヌクレオチドもしくは参照ヌクレオチド配列の３’末端にすぐ隣接することを意味する。同様に、ヌクレオチド配列が、参照ヌクレオチドもしくは参照ヌクレオチド配列「に対してすぐ５’」または参照ヌクレオチドもしくは参照ヌクレオチド配列「のすぐ５’」である場合、これは、このヌクレオチド配列が、参照ヌクレオチドもしくは参照ヌクレオチド配列の５’末端にすぐ隣接することを意味する。
【００５７】
本明細書中で使用される場合、「ニック形成」は、二本鎖の核酸分子または部分的に二本鎖の核酸分子の二本鎖の部分の、ニック形成を行う酵素によって認識されるヌクレオチド配列に対する特定の位置での一方の鎖のみの切断をいう。核酸がニック形成される特定の位置は、「ニック形成部位」（ＮＳ）といわれる。
【００５８】
「ニック形成剤」（ＮＡ）は、完全にまたは部分的に二本鎖の核酸分子の特定のヌクレオチド配列を認識し、そしてこの認識配列に対して特定の位置で核酸分子のただ１つの鎖を切断する酵素である。ニック形成剤としては、二本鎖の（または部分的に二本鎖の）核酸分子が、半改変された認識／切断配列を含む場合、ニック形成エンドヌクレアーゼ（例えば、Ｎ．ＢｓｔＮＢ  Ｉ）および制限エンドヌクレアーゼ（例えば、Ｈｉｎｃ  ＩＩ）が挙げられるがこれらに限定されず、この半改変された認識／切断配列において、一本の鎖は、制限エンドヌクレアーゼによるその鎖（すなわち、誘導体化されたヌクレオチドを含む鎖）の切断を阻止する少なくとも１つの誘導体化されたヌクレオチドを含む。
【００５９】
本明細書中で使用される場合、「ニック形成エンドヌクレアーゼ」（ＮＥ）は、完全にまたは部分的に二本鎖の核酸分子のヌクレオチド配列を認識し、そして認識配列に対して特定の位置で核酸分子のただ１つの鎖を切断するエンドヌクレアーゼをいう。少なくとも１つの誘導体化されたヌクレオチドを含むことによって改変され、完全にまたは部分的に二本鎖の核酸分子の誘導体化されたヌクレオチド含有鎖の切断を阻止する、その認識配列を必要とする、制限エンドヌクレアーゼ（ＲＥ）と違って、ＮＥは、代表的に、ネイティブなヌクレオチドのみを含むヌクレオチド配列を認識し、そしてこのヌクレオチド配列を含む完全にまたは部分的に二本鎖の核酸分子の１つの鎖のみを切断する。
【００６０】
本明細書中で使用される場合、「ネイティブなヌクレオチド」は、アデニル酸、グアニル酸、シチジル酸、チミジル酸またはウリジル酸をいう。「誘導体化されたヌクレオチド」は、ネイティブなヌクレオチドではないヌクレオチドをいう。
【００６１】
ＮＡが認識する完全にまたは部分的に二本鎖の核酸分子のヌクレオチド配列は、「ニック形成剤認識配列」（ＮＡＲＳ）といわれる。同様に、ＮＥが認識する完全にまたは部分的に二本鎖の核酸分子のヌクレオチド配列は、「ニック形成エンドヌクレアーゼ認識配列」（ＮＥＲＳ）といわれる。ＲＥが認識する特定の配列は、「制限エンドヌクレアーゼ認識配列」（ＲＥＲＳ）といわれる。本明細書中で使用される場合、「半改変されたＲＥＲＳ」は、１つの鎖の認識配列が、少なくとも１つの誘導体化されたヌクレオチド（例えば、α−チオデオキシヌクレオチド）を含み、これは、ＲＥＲＳを認識するＲＥによる鎖（すなわち、認識配列内の誘導体化されたヌクレオチドを含む鎖）の切断を阻止する二本鎖ＲＥＲＳをいう。
【００６２】
特定の実施形態において、ＮＡＲＳは、１つの鎖の配列の各ヌクレオチドが、もう１つの鎖の対応する位置のヌクレオチドに対して相補的である二本鎖ヌクレオチド配列である。このような実施形態において、ＮＡＲＳを認識するＮＡによってニック形成可能なＮＳを含む鎖におけるＮＡＲＳの配列は、「ＮＡＲＳのセンス鎖の配列」または「二本鎖ＮＡＲＳのセンス鎖の配列」といわれ、一方、ＮＳを含まない鎖におけるＮＡＲＳ配列は、「ＮＡＲＳのアンチセンス鎖の配列」または「二本鎖ＮＡＲＳのアンチセンス鎖の配列」といわれる。
【００６３】
同様に、ＮＥＲＳが、１つの鎖がもう１つの鎖に厳密に相補的である二本鎖ヌクレオチド配列である実施形態において、ＮＥＲＳを認識するＮＥによってニック形成可能なＮＳを含む鎖に位置するＮＥＲＳの配列は、「ＮＥＲＳのセンス鎖の配列」または「二本鎖Ｎ
ＥＲＳのセンス鎖の配列」といわれ、一方、ＮＳを含まない鎖に位置するＮＥＲＳの配列は、「ＮＥＲＳのアンチセンス鎖の配列」または「二本鎖ＮＥＲＳのアンチセンス鎖の配列」といわれる。例えば、例示的なニック形成エンドヌクレアーゼ（Ｎ．ＢｓｔＮＢ  Ｉ）の認識配列およびニック形成部位は、以下に示され、切断部位を示すために「▼」を用い、そして任意のヌクレオチドを示すためにＮを用いる：
【００６４】
【化１Ａ】
2004535815.tif 000002
Ｎ．ＢｓｔＮＢ  Ｉ認識配列のセンス鎖の配列は、５’−ＧＡＧＴＣ−３’であるのに対して、アンチセンス鎖の配列は、５’−ＧＡＣＴＣ−３’である。
【００６５】
同様に、半改変されたＲＥＲＳを認識するＲＥによってニック形成可能なＮＳを含む鎖（すなわち、いずれの誘導体化されたヌクレオチドも含まない鎖）に位置する半改変されたＲＥＲＳの配列は、「半改変されたＲＥＲＳのセンス鎖の配列」といわれ、半改変されたＲＥＲＳを含む核酸の「半改変されたＲＥＲＳのセンス鎖」に位置し、一方、ＮＳを含まない鎖（すなわち、誘導体化されたヌクレオチドを含む鎖）における半改変されたＲＥＲＳの配列は、「半改変されたＲＥＲＳのアンチセンス鎖の配列」といわれ、半改変されたＲＥＲＳを含む核酸の「半改変されたＲＥＲＳのアンチセンス鎖」に位置する。
【００６６】
特定の他の実施形態において、ＮＡＲＳは、１つ以上のヌクレオチドミスマッチを有する最大限に部分的に二本鎖のヌクレオチド配列であるが、上記されるような二本鎖のＮＡＲＳのインタクトなセンス配列を含む。本明細書中で使用される慣例に従って、ＮＡＲＳを記載する文脈において、２つの核酸分子が、互いにアニールし、ハイブリダイズされた産物を形成し、このハイブリダイズされた産物がＮＡＲＳを含み、そしてハイブリダイズされた産物のＮＡＲＳ内に少なくとも１つのミスマッチ塩基対が存在する場合、このＮＡＲＳは、単に部分的に二本鎖であると考えられる。このようなＮＡＲＳは、特定のニック形成剤（例えば、Ｎ．ＢｓｔＮＢ  Ｉ）によって認識され得、このニック形成剤は、これらのニック形成活性に対して二重鎖認識配列のただ１つの鎖を必要とする。例えば、Ｎ．ＢｓｔＮＢ  ＩのＮＡＲＳは、特定の実施形態において、以下のようなインタクトなセンス鎖を含み得：
５’−ＧＡＧＴＣ−３’
３’−ＮＮＮＮＮ−５’
ここで、Ｎは、任意のヌクレオチドを示し、１つの位置のＮは、他の位置のＮと同一であってもそうでなくてもよいが、この認識配列の中に少なくとも１つのミスマッチ塩基対が存在する。この状況において、ＮＡＲＳは、少なくとも１つのミスマッチヌクレオチドを有するとして特徴付けられる。
【００６７】
特定の他の実施形態において、ＮＡＲＳは、１つ以上の一致していないヌクレオチドを有する部分的なまたは完全な一本鎖ヌクレオチド配列であるが、上記されるように、二本鎖ＮＡＲＳのインタクトなセンス鎖を含む。本明細書中で使用される慣例に従って、ＮＡＲＳを記載する文脈において、２つの核酸分子（すなわち、第１および第２の鎖）が、互いにアニールし、ハイブリダイズされた産物を形成し、このハイブリダイズされた産物が、ＮＡによって認識される第１の鎖内のヌクレオチド配列を含み（すなわち、ハイブリダイズされた産物は、ＮＡＲＳを含む）、そしてＮＡによって認識される配列中の少なくとも１つのヌクレオチドが、ハイブリダイズされた産物が形成される場合に、第２の鎖中のヌクレオチドに対応しない（すなわち、それと向かい合わない）場合、このハイブリダイズされた産物のＮＡＲＳ内に少なくとも１つの一致しないヌクレオチドが存在し、そしてこのＮＡＲＳが部分的または完全に一本鎖であると考えられる。このようなＮＡＲＳは、特定のニック形成剤（例えば、Ｎ．ＢｓｔＮＢ  Ｉ）によって認識され得、このニック形成剤は、これらのニック形成活性のために、二本鎖認識配列のただ１つの鎖を必要とする。例えば、Ｎ．ＢｓｔＮＢ  ＩのＮＡＲＳは、特定の実施形態において、以下のようなインタクトなセンス鎖を含み得：
５’−ＧＡＧＴＣ−３’
３’−Ｎ０−４−５’
（ここで、「Ｎ」は、任意のヌクレオチドを示し、０−４は、ヌクレオチド「Ｎ」の数を示し、１つの位置での「Ｎ」は、別の位置での「Ｎ」と同じであってもそうでなくてもよい）、この鎖は、Ｎ．ＢｓｔＮＢ  Ｉの二本鎖認識配列のセンス鎖を含む。この例において、相補鎖中の対応するヌクレオチドが存在しないという点において、Ｇ、Ａ、Ｇ、ＴまたはＣの少なくとも１つは、一致しない。この状況は、例えば、ハイブリダイズされた産物中に「ループ」が存在し、特に、センス配列がループ内に完全にまたは部分的に存在する場合、生じる。
【００６８】
増幅された一本鎖核酸フラグメントは、本発明のいくつかの局面において、一本鎖核酸フラグメント（すなわち、多くても、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、または１００ヌクレオチド長）である。このようなフラグメントの短い長さは、以下に詳細に記載されるように、種々の技術（質量分析および液体クロマトグラフィーを含む）により検出および／または特徴づけを容易にする。しかし、いくつかの局面の特定の実施形態において（例えば、一本鎖核酸プローブの作製）、増幅された一本鎖核酸フラグメントは、比較的長くなり得、例えば５１〜１０００ヌクレオチド長であり得る。
【００６９】
二本鎖核酸の他方の鎖（第２鎖）中のある位置（すなわち、規定された位置）「二対応する」位置に位置する、二本鎖核酸の一方の鎖（第１鎖）におけるヌクレオチドとは、第１鎖および第２鎖が、二本鎖核酸を形成するように互いにハイブリダイズする場合、第２鎖中の規定された位置におけるヌクレオチドに水素結合し、かつその規定された一におけるヌクレオチドに相補的である、第１鎖中のヌクレオチドをいう。同様に、二本鎖核酸の他方の鎖（第２鎖）内のニック形成部位「に対応する」、二本鎖核酸の一方の鎖（第１鎖）中の位置とは、ニック形成部位の周囲の第２鎖における２つのヌクレオチドに相補的な、第１鎖中の２つのヌクレオチドの間の位置をいう。
【００７０】
（Ｂ．遺伝子バリエーションの検出）
一局面において、本発明は、標的核酸中の遺伝子バリエーションを検出するための方法、化合物およびキットを提供する。
【００７１】
（１．遺伝子バリエーションを検出するための方法）
本発明は、標的核酸内の規定された位置における遺伝子バリエーションを検出するための方法を提供する。この方法は、（ａ）標的核酸のフラグメントおよび遺伝子バリエーションに対して５’側に位置するニック形成部位（ＮＳ）を含む二本鎖テンプレート核酸を提供する工程；（ｂ）ＤＮＡポリメラーゼおよびＮＳにおいてニック形成するニック形成剤の存在下で、遺伝子バリエーションを含み、かつその５’末端がＮＳにある一本鎖フラグメントを増幅する工程；ならびに（ｃ）この一本鎖フラグメントを特徴づけし、それにより遺伝子バリエーションを同定する工程、を包含する。一実施形態において、この一本鎖フラグメントは、ニック形成エンドヌクレアーゼの存在下で増幅される。別の実施形態において、このフラグメントは、制限エンドヌクレアーゼの存在下で増幅される。
【００７２】
ニック形成エンドヌクレアーゼを使用する方法に関して、二本鎖テンプレート核酸は、最初に第１オリゴヌクレオチドプライマー（ＯＤＮＰ）、第２ＯＤＮＰ、および規定された位置に遺伝子バリエーションを含む標的核酸の混合物を形成することにより提供され得る。標的核酸が二本鎖である場合、図１に示したように、この第１ＯＤＮＰは、ＮＥＲＳのセンス鎖のヌクレオチド配列、および遺伝子バリエーションの相補体に対して３’側に位置する標的核酸の１つの鎖のヌクレオチド配列に対して少なくとも実質的に相補的なヌクレオチド配列を含む。第２ＯＤＮＰは、標的核酸の他の鎖に位置する遺伝子バリエーションに対して３’のヌクレオチド配列に対して少なくとも実質的に相補的なヌクレオチド配列を含み、そして必要に応じて、制限エンドヌクレアーゼ認識配列（ＲＥＲＳ）の１つの鎖のヌクレオチド配列を含む。
【００７３】
標的核酸が一本鎖である場合、この第１ＯＤＮＰは、ＮＥＲＳのセンス鎖のヌクレオチド配列、および遺伝子バリエーションに対して５’側に位置する標的核酸に対して少なくとも実質的に同一なヌクレオチド配列を含むが、第２ＯＤＮＰは、遺伝子バリエーションに対して３’側に位置する標的核酸のヌクレオチド配列に対して少なくとも実質的に相補的なヌクレオチド配列を含み、そして必要に応じて、ＲＥＲＳの１つの鎖のヌクレオチド配列を含む。
【００７４】
テンプレートとして標的核酸を使用する第１ＯＤＮＰおよ第２ＯＤＮＰの伸長は、ＮＥＲＳを有し、必要に応じて、遺伝子バリエーションがＮＥＲＳとＲＥＲＳとの間に位置するＲＥＲＳを有する伸長産物を生成する。この伸長産物は、所望の二本鎖テンプレート核酸であり、これは、標的核酸のフラグメントおよび遺伝子バリエーションに対して５’側に位置するＮＳを含む。この伸長産物は、ＲＥＲＳを含む場合、次いでＲＥＲＳを認識する制限エンドヌクレアーゼで切断され得、そしてＮＥＲＳを認識するＮＥの存在下で一本鎖核酸分子を増幅するためのテンプレートとして使用され得る。そうでなければ、この伸長産物は、一本鎖核酸分子を増幅するためのテンプレートとして直接使用され得る。この方法の例示的プロセスは、図１に図示され、代表的なＲＥＲＳとしてＴＲＥＲＳ（ＩＩ型制限エンドヌクレアーゼ認識配列）を使用する。
【００７５】
あるいは、図２に示されるように、二本鎖テンプレート核酸は、最初に、第１オリゴヌクレオチドプライマー（ＯＤＮＰ）、第２ＯＤＮＰ、および規定された位置に遺伝子バリエーションを含む二本鎖標的核酸の混合物を形成することにより提供され得る。この第１ＯＤＮＰは、ＮＥＲＳのセンス鎖のヌクレオチド配列、および遺伝子バリエーションの相補体に対して５’側に位置する標的核酸の１つの鎖のヌクレオチド配列に少なくとも実質的に相補的なヌクレオチド配列を含む。第２ＯＤＮＰは、上記のＲＥＲＳの代わりにＮＥＲＳのセンス鎖の配列を含む。テンプレートとして標的核酸を使用するこの第１ＯＤＮＰおよび第２ＯＤＮＰの伸長は、２つのＮＥＲＳを有する伸長産物を生成する。この伸長産物は、標的核酸のフラグメントおよび遺伝子バリエーションに対して５’側に位置するＮＳを含む所望の二本鎖テンプレート核酸である。次いで、この伸長産物は、ＮＥＲＳを認識するＮＥを使用することにより、遺伝子バリエーションを含みかつその５’末端がＮＳにある一本鎖核酸フラグメントを増幅するためのテンプレートとして使用され得る。
【００７６】
二本鎖核酸にニック形成するための制限エンドヌクレアーゼを使用する方法に関して、この二本鎖テンプレート核酸は、最初に、第１ＯＤＮＰ、第２ＯＤＮＰ、および二本鎖標的核酸（図５）の混合物を形成することにより提供され得る。この標的核酸が二本鎖である場合、この第１ＯＤＮＰは、第１制限エンドヌクレアーゼ認識配列（ＲＥＲＳ）の１つの鎖の配列、および遺伝子バリエーションの相補体に対して３’側に位置する標的核酸の１つの鎖のヌクレオチド配列に対して少なくとも実質的に相補的なヌクレオチド配列を含み、一方、第２ＯＤＮＰは、第２ＲＥＲＳの１つの鎖の配列、および規定された位置に対して３’側に位置する標的核酸の第２の鎖のヌクレオチド配列に対して相補的であるヌク
レオチド配列を含む。標的核酸が一本鎖である場合、第１ＯＤＮＰは、第１ＲＥＲＳの１つの鎖の配列、および遺伝子バリエーションの相補体に対して５’側に位置する標的核酸配列のヌクレオチド配列に少なくとも実質的に同一なヌクレオチド配列を含み、一方、第２ＯＤＮＰは、第２ＲＥＲＳの１つの鎖の配列、および遺伝子バリエーションに対して３’側に位置する標的核酸のヌクレオチド配列に対して少なくとも実質的に相補的なヌクレオチド配列を含む。デオキシリボヌクレオシド三リン酸および少なくとも１つの改変されたデオキシリボヌクレオシド三リン酸の存在下での第１ＯＤＮＰおよび第２ＯＤＮＰの伸長は、第１半改変ＲＥＲＳおよび第２半改変ＲＥＲＳの両方を有するフラグメントを生成する。このような伸長産物は、第１ＲＥＲＳおよび第２ＲＥＲＳを認識するＲＥの存在下で一本鎖核酸分子を増幅するためのテンプレートとして使用され得る。特定の実施形態において、この第１ＲＥＲＳは、第２ＲＥＲＳと同じである。従って、この伸長産物は、第１ＲＥＲＳおよび第２ＲＥＲＳの両方を認識するＲＥの存在下で増幅され得る。
【００７７】
上記の実施形態の全てにおいて、一本鎖核酸分子の増幅は、ニック形成剤に加えてＤＮＡポリメラーゼの存在下で行われる。この増幅された一本鎖核酸分子は、標的核酸の遺伝子バリエーションを含み、次いで特徴づけされる。この標的核酸の遺伝子バリエーションは、それにより同定される。
【００７８】
（ａ．標的核酸）
遺伝子バリエーションの同定に関連する本発明の標的核酸は、参照として野生型核酸配列を使用する遺伝子バリエーションを含み得、そしてプライマー伸長反応として作用し得る（すなわち、オリゴヌクレオチドプライマーと塩基対合し得る）任意の核酸分子である。
【００７９】
用語「核酸」とは、一般的に、リボ核酸またはそのアナログの単位を組み込んだ任意の分子、好ましくはポリマー分子をいう。標的核酸は、一本鎖または二本鎖のいずれでもあり得る。一本鎖標的核酸は、変性二本鎖ＤＮＡの１つの鎖であり得る。あるいは、これは、いずれの二本鎖ＤＮＡにも由来しない一本鎖核酸であり得る。一局面において、この標的核酸は、ＤＮＡである。別の局面において、この標的はＲＮＡである。適切な核酸分子はＤＮＡであり、これらとしては、ゲノムＤＮＡ、リボソームＤＮＡおよびｃＤＮＡが挙げられる。他の適切な核酸分子はＲＮＡであり、これらとしては、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡおよびｔＲＮＡが挙げられる。核酸分子は、ゲノムＤＮＡ中として天然に存在に存在し得るか、または合成であり得る（すなわち、人の作業に基づいて調製される）か、またはこれら２つの組み合わせであり得る。
【００８０】
一局面において、この標的核酸は、天然に存在する核酸であるか、または天然に存在する核酸に由来する。天然に存在する標的核酸は、生物学的サンプルから得られる。好ましい生物学的サンプルとしては、１つ以上の哺乳動物組織、好ましくはヒト組織（例えば、血液、血漿／血清、毛髪、皮膚、リンパ節、脾臓、肝臓など）および／または細胞もしくは細胞株が挙げられる。生物学的サンプルは、１つ以上のヒト組織および／または細胞を含み得る。哺乳動物組織および／またはヒト組織および／または細胞は、１つ以上の腫瘍組織および／または細胞をさらに含み得る。
【００８１】
生物学的サンプルから核酸の集団を単離する方法論は、本発明の技術分野の当業者に周知でありかつ容易に利用可能である。例示的な技術は、例えば、以下の研究室用研究マニュアルに記載される：Ｓａｍｂｒｏｏｋら、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ」（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，第３版、２００１）およびＡｕｓｕｂｅｌら、「Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」（１９９９）（本明細書中にその全体が参考として援用される）。核酸単離キットもまた、多数の企業から市販されており、そして単離プロセスを単純化しかつ加速するために使用され得る。
【００８２】
合成標的核酸は、ヒトの介入により産生される。この時点で、多くの企業は、事業として製造しており、そして本発明において標的核酸分子として有用であり得る合成核酸を販売している。これらの企業はまた、本発明において有用であるプライマーを調製し得るかまたは調製する。例えば、以下を参照のこと：Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  Ｂｉｏｎｅｘｕｓ（ｗｗｗ，ｂｉｏｎｅｘｕｓ．ｎｅｔ）；Ｃｏｍｍｏｎｗｅａｌｔｈ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＶＡ；ｗｗｗ．ｃｂｉ−ｂｉｏｔｅｃｈ．ｃｏｍ）；Ｇｅｍｉｎｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ（Ａｌａｃｈｕａ，Ｆｌｏｒｉｄａ；ｗｗｗ．ｇｅｍｉｎｉｂｉｏ．ｃｏｍ）；ＩＮＴＥＲＡＣＴＩＶＡ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅ  ＧｍｂＨ（Ｕｌｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ；ｗｗｗ．ｉｎｔｅｒａｃｔｉｖａ．ｄｅ）；Ｍｉｃｒｏｓｙｎｔｈ（Ｂａｌｇａｃｈ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ；ｗｗｗ．ｍｉｃｒｏｓｙｎｔｈ．ｃｈ）；Ｍｉｄｌａｎｄ  Ｃｅｒｔｉｆｉｅｄ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｍｉｄｌａｎｄ，ＴＸ；ｗｗｗ．ｍｃｒｃ．ｃｏｍ）；Ｏｌｉｇｏｓ  Ｅｔｃ．（Ｗｉｌｓｏｎｖｉｌｌｅ，ＯＲ；ｗｗｗ．ｏｌｉｇｏｓｅｔｃ．ｃｏｍ）；Ｏｐｅｒｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．（Ａｌａｍｅｄａ，ＣＡ；ｗｗｗ．ｏｐｅｒｏｎ．ｃｏｍ）；Ｓｃａｎｄａｎａｖｉａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ＡＢ（Ｋｏｐｉｎｇ，Ｓｗｅｄｅｎ；ｗｗｗ．ｓｇｓ．ｄｎａ）；Ｓｉｇｍａ−Ｇｅｎｏｓｙｓ（Ｔｈｅ  Ｗｏｏｄｌａｎｄｓ，Ｔｅｘａｓ；ｗｗｗ．ｇｅｎｏｓｙｓ．ｃｏｍ）；Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ；ｗｗｗ．ｓｙｎｔｈｅｔｉｃｇｅｎｅｔｉｃｓ．ｃｏｍ，Ｅｐｏｃｈ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｂｏｔｈｅｌｌ，ＷＡ；ｗｗｗ．ｅｐｏｃｈｂｉｏ．ｃｏｍ）；など。
【００８３】
合成核酸標的は、増幅反応を使用して調製され得る。この増幅反応は、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）であり得る。
【００８４】
合成核酸標的は、組換えＤＮＡ手段を使用して１つ以上の原核生物または真核生物（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、酵母、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａまたは哺乳動物組織培養細胞株）における産生により調製され得る。
【００８５】
この標的核酸分子は、ヌクレオチドに存在する天然の塩基（すなわち、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）、およびｍＲＮＡの場合にはウラシル（Ｕ））の１つ以上を含み得るか、代表的に含む。さらに、および特に核酸が合成分子である場合、この標的核酸は、「非天然」ヌクレオチドを含み得る。非天然ヌクレオチドは、プライマー伸長反応のためのテンプレートとして作用する能力を核酸に失わせることなくヌクレオチド鎖中の１つ以上の天然のヌクレオチドと置換され得る化学的部分である。この置換は、塩基置換に加えて、糖置換および／またはリン酸置換のいずれかを含み得る。
【００８６】
このような部分は、当該分野で非常に良く知られており、そして多数の名前で知られており、これらとしては、例えば、以下が挙げられる：無塩基ヌクレオチド（これは、一般的に認識されるアデニン、グアニン、シトシン、ウラシルまたはチミンのようなヌクレオチド塩基を含まない）（例えば、Ｔａｋｅｓｈｉｔａら、「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ａｂａｓｉｃ  ｓｉｔｅｓ」、Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ｖｏｌ．２６２，ｐｐ．１０１７１−１０１７９  １９８７；Ｉｙｅｒら、「Ａｂａｓｉｃ  ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅｓ：ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ａｓ  ａｎｔｉ  ＨＩＶ−１  ａｇｅｎｔｓ」、Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，ｖｏｌ．１８，ｐｐ．２８５５−２８５９  １９９０を参照のこと）；および米国特許第６，１１７，６５７号）；塩基またはヌクレオチドアナログ（例えば、Ｍａら、「Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ＲＮＡ  Ｍｉｎｉｄｕｐｌｅｘｅｓ  ｖｉａ  ａ  Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｌｉｎｋｅｒ  Ａｐｐｒｏａｃｈ．２．Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｏｖａｌｅｎｔｌｙ  Ｃｌｏｓｅｄ，Ｄｏｕｂｌｅ−Ｓｔｒａｎｄｅｄ  Ｃｙｃｌｉｃ  ＨＩＶ−１  ＴＡＲ  ＲＮＡ  Ａｎａｌｏｇｓ  ｗｉｔｈ  Ｈｉｇｈ  Ｔａｔ−Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ」、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２１：２５８５（１９９３）を参照のこと）。いくつかの塩基は、以下として知られる：普遍的（ｕｎｉｖｅｒｓａｌ）ミスマッチ塩基アナログ（例えば、無塩基３−ニトロピロール）；コンバーチド（ｃｏｎｖｅｒｔｉｄｅ）（例えば、Ｈｏｏｐｓら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：４８６６−４８７１（１９９７）を参照のこと）；改変ヌクレオチド（例えば、Ｍｉｌｌｉｃａｎら、「Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  ｓｔｕｄｉｅｓ  ｏｆ  ｓｈｏｒｔ  ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｗｉｔｈ  ｎｏｖｅｌ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ：Ａ  ｐｏｓｓｉｂｌｅ  ａｐｐｒｏａｃｈ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｐｒｏｂｌｅｍ  ｏｆ  ｍｉｘｅｄ  ｂａｓｅ  ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １２：７４３５−７４５３（１９８４）を参照のこと）；ヌクレオチドミメティック；核酸関連化合物；スペーサー（例えば、Ｎｉｅｌｓｅｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５４：１４９７−１５００（１９９１）を参照のこと）；および特異性スペーサー（例えば、ＰＣＴ国際公開番号ＷＯ９８／１３５２７を参照のこと）。
【００８７】
非天然ヌクレオチドのさらなる例は、以下に記載される：Ｊａｓｃｈｋｅら，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．３４：３０１（１９９３）；ＳｅｅｌａおよびＫａｉｓｅｒ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １５：３１１３（１９９０）およびＮｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １８：６３５３（１９９０）；Ｕｓｍａｎら，ＰＣＴ国際特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９３／００８３３；Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，ＰＣＴ国際特許出願番号ＰＣＴ／ＥＰ９１／０１８１１；Ｓｐｒｏａｔら，米国特許第５，３３４，７１１号、およびＢｕｈｒおよびＭａｔｔｅｕｃｃｉ，ＰＣＴ国際公開番号ＷＯ  ９１／０６５５６；Ａｕｇｕｓｔｙｎｓ，Ｋ．Ａ．ら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１９９１，１９，２５８７−２  ５９３）；ならびに米国特許第５，９５９，０９９号および同第５，８４０，８７６号。
【００８８】
標的核酸分子、および／または本発明の方法において使用されるプライマー分子が、非天然ヌクレオチドを含む場合、塩基対ミスマッチが標的とプライマーとの間で生じる。用語「塩基対ミスマッチ」とは、オリゴヌクレオチド二重鎖の反対の鎖における対応するヌクレオチドに対して標準的なワトソン−クリックモデルに従ってハイブリダイズしない部分とのヌクレオチドの置換により、従来の塩基対（例えば、Ｇ：Ｃ、Ａ：ＴおよびＡ：Ｕ）間の水素結合を摂動する、全ての単一および複数のヌクレオチド置換をいう。このような塩基対ミスマッチとしては、例えば、Ｇ：Ｇ、Ｇ：Ｔ、Ｇ：Ａ、Ｇ：Ｕ、Ｃ：Ｃ、Ｃ：Ａ、Ｃ：Ｔ，Ｃ：Ｕ、Ｔ：Ｔ、Ｔ：Ｕ、Ｕ：ＵおよびＡ：Ａが挙げられる。完全に塩基対合した二重鎖の通常の水素結合を摂動する単一または複数のヌクレオチド欠失または挿入もまた、塩基対ミスマッチの定義内に含まれる。さらに、塩基対ミスマッチは、塩基対中の両方のヌクレオチドが、塩基間の通常の水素結合を破壊する共有結合改変（例えば、塩基のメチル化）を受けた場合に生じる。塩基対ミスマッチはまた、核酸二重鎖のヘリシティおよび／または塩基のスタッキングを変更することにより水素結合を摂動する非共有結合改変（例えば、インターカレート剤（例えば、臭化エチジウムなど）の取り込みから生じるもの）を含む。
【００８９】
核酸またはそのアナログを含むことに加えて、標的はまた、未知の正体（例えば、潜在的遺伝子バリエーション）の１以上の天然の塩基を含む。本発明は、未知のヌクレオチドの正体が既知になり、よってその遺伝子バリエーションが同定されることによる組成物および方法を提供する。未知の正体の塩基は、「ヌクレオチド座」（または「所定の位置（ｌｏｃａｔｉｏｎ）」、または「所定の位置（ｐｏｓｉｔｉｏｎ）」）に存在し、標的核酸上に正確な位置を有する１以上のヌクレオチドを包含する特定のヌクレオチドまたは領域をいう。
【００９０】
特定の実施形態において、その標的核酸は、固体支持体に固定化される。核酸分子が直接結合され得るかまたは間接的に結合され得る、任意の支持体が使用され得る。このような支持体としては、ニトロセルロース、ナイロン、ガラスおよび金属が挙げられる。標的核酸は、最初に精製も単離もされることなく、固体支持体に固定化され得る。あるいは、標的核酸は、標的核酸を含むサンプルから精製され得、次いで、固体支持体に固定化され得る。組織プリンティングおよびポリ（エチレンイミン）のような、核酸分子を固体支持体に固定化するための方法は、当該分野で周知である。
【００９１】
用語「多型」および「遺伝子バリエーション」とは、本明細書中で使用される場合、集団における小さな領域（すなわち、長さが１〜いくつか（例えば、２、３、４、５、６、７または８）ヌクレオチド）中の２以上の遺伝子的に決定された別の配列または対立遺伝子の存在をいう。選択された集団中の最も頻繁に存在する対立遺伝子形態は、野生型形態といわれる。他の対立遺伝子形態は、改変体形態と称される。二倍体生物は、対立遺伝子形態についてホモ接合性またはヘテロ接合性であり得る。
【００９２】
遺伝子改変体は、遺伝子発現に対する影響（発現レベルおよび発現産物（すなわちコードされたポリペプチド）を含む）があってもなくてもよい。遺伝子発現に影響を及ぼす遺伝子改変体はまた、「変異」ともいわれ、点変異、フレームシフト変異、調節性変異、ナンセンス変異、およびミスセンス変異が挙げられる。「点変異」とは、野生型塩基（例えば、Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＴ）が、核酸サンプル内の所定のヌクレオチド座にて他の標準的塩基のうちの１つで置換されている変異をいう。これは、塩基置換または塩基欠失により生じ得る。「フレームシフト変異」は、小さな欠失または挿入により引き起こされ、続いて、遺伝子のリーディングフレームをシフトさせ、従って、新規のペプチドが形成される。「調節性変異」とは、正確な遺伝子発現（例えば、生成物の量、タンパク質の局在、発現のタイミング）に影響を及ぼす非コード領域（例えば、イントロン）、コード領域に対して５’または３’側に位置する領域中の変異をいう。「ナンセンス変異」は、ペプチド伸長の成熟前終結（短縮化ペプチド）を引き起こす「終止コドン」として読まれる、トリプレトコドン（ここで変異が生じる）において生じる単一ヌクレオチド変化をいう。「ミスセンス変異」は、異なるアミノ酸に交換される、１つのアミノ酸を生じる変異である。このような変異は、ペプチドの折りたたみ（三次元構造）および／またはマルチマータンパク質における他のペプチドとのその適切な会合の変化を生じ得る。
【００９３】
本発明の１つの局面において、遺伝子バリエーションは、「単一ヌクレオチド多型」（ＳＮＰ）であり、これは、任意の単一のヌクレオチド配列バリエーション、好ましくは、生物の集団に共通し、メンデルの様式にて遺伝するバリエーションをいう。代表的には、ＳＮＰは、２つの可能な塩基のうちのいずれかであり、ＳＮＰ部位の第３および第４のヌクレオチドの正体を見いだす可能性はない。
【００９４】
遺伝子バリエーションは、疾患もしくは障害と関連し得るか、または疾患もしくは障害を引き起こし得る。本明細書中で使用される場合、用語「と関連する（した）」とは、遺伝子バリエーションの出現と、宿主における疾患もしくは障害の存在との間のポジティブな相関の存在をいう。このような疾患もしくは障害は、ヒトの遺伝疾患または遺伝障害であり得、これらとしては、膀胱癌種、結腸直腸腫瘍、鎌状赤血球貧血、サラセミア、α１−アンチトリプシン欠損、レッシュ−ナイハン症候群、嚢胞性線維症／ムコビシドーシス、デュシェンヌ／ベッカー筋ジストロフィー、アルツハイマー病、Ｘ染色体依存性精神薄弱、およびハンチントン舞踏病、フェニルケトン尿症、ガラクトース血症、ウィルソン病、血色素症、重症複合免疫不全、α−１−アンチトリプシン欠損、白皮症、アルカプトン尿症、リソソーム蓄積症、エーラス−ダンロス症候群、血友病、グルコース−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼ障害、無ガンマグロブリン血症、尿崩症、ウィスコット−アルドリッチ症候群、ファブリーズ病、脆弱Ｘ染色体症候群、家族性高コレステロール血症、多発性嚢胞腎、遺伝性球状赤血球症、メルファラン症候群、フォンウィルブランド病、神経線維腫症、結節硬化症、遺伝性出血性毛細血管拡張症、家族性結腸ポリープ症、エーラス−ダンロス症候群、筋ジストロフィー、骨形成不全症、急性間歇性ポルフィリン症、およびフォンヒッペル−リンダウ病が挙げられるが、これらに限定されない。
【００９５】
標的核酸は、以下に記載されるＯＤＮＰと合わせる前に、増幅され得る。核酸を増幅するための任意の既知の方法が使用され得る。例示的な方法としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：Ｑβレプリカーゼの使用、鎖置換増幅（Ｗａｌｋｅｒら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｒｅｓｅａｒｃｈ  ２０：１６９１−６，１９９５）、転写媒介性増幅（Ｋｗｏｈら、ＰＣＴ国際特許出願ＷＯ８８／１０３１５）、ＲＡＣＥ（Ｆｒｏｈｍａｎ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．２１８：３４０−５６，１９９３）、片側ＰＣＲ（ｏｎｅ−ｓｉｄｅｄ  ＰＣＲ）（Ｏｈａｒａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ．８６：５６７３−７，１９８９）、およびギャップ−ＬＣＲ（Ａｂｒａｖａｙａら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２３：６７５−８２，１９９５）。これらの引用された学術文献およびＰＣＴ国際特許出願は、それらの全体が、本明細書中に参考として援用される。
【００９６】
（ｂ．二本鎖テンプレート核酸の作製）
上記のように、標的核酸に由来する遺伝子バリエーションを含む一本鎖核酸分子は、ニック形成剤（例えば、ＮＥまたはＲＥ）およびＤＮＡポリメラーゼの存在下で増幅され得る。ニック形成剤としてＮＥを使用して一本鎖核酸分子を増幅するために、増幅のためのテンプレート核酸は、ＮＥＲＳ（ときおり、第１ＮＥＲＳといわれる）を含まなければならない。さらに、テンプレート核酸はまた、ＲＥＲＳまたは第２ＮＥＲＳを含み得る。ＲＥＲＳまたは第２ＲＥＲＳの存在は、第１ＮＥＲＳの存在に加えて、第１ＮＥＲＳに結合するＮＥにより生成されるニック形成部位に対応する部位近辺にある、ＮＳを含まないテンプレートの鎖中の切断を可能にする。このような切断は、テンプレートから増幅される一本鎖核酸分子を比較的短くすることを可能にし、それにより、一本鎖核酸分子に組み込まれる遺伝子バリエーションの特徴付けを容易にする。ニック形成剤としてＲＥを使用する一本鎖核酸分子の増幅のために、増幅のためのテンプレート核酸は、半改変ＲＥＲＳを含まなければならず、さらなるＲＥＲＳを含み得る。２つの半改変ＲＥＲＳが存在する場合、これらは、同じであっても同じでなくてもよい。２つのＮＥＲＳを含むテンプレートと同様に、第２の半改変ＲＥＲＳの存在はまた、増幅された一本鎖核酸分子を配列核的短くすることを可能にする。
【００９７】
（ｉ．オリゴヌクレオチドプライマー（ＯＤＮＰ）の設計）
本発明のテンプレート核酸は、特別に設計されたＯＤＮＰを使用して、遺伝子バリエーションを含む標的核酸のフラグメントを増幅することによって提供され得る。用語「オリゴヌクレオチド」（ＯＤＮ）とは、従来の自動化核酸（例えば、ＤＮＡ）合成機によって合成により得られる核酸フラグメント（代表的には、ＤＮＡまたはＲＮＡ）をいう。オリゴヌクレオチドは、用語ポリヌクレオチドと同義的に使用される。用語「オリゴヌクレオチドプライマー」（ＯＤＮＰ）とは、ハイブリダイゼーション反応、伸長反応、および／または増幅反応において使用される２以上のヌクレオチドを有する任意のポリマーをいう。ＯＤＮＰは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、またはいずれかのアナログから構成され得る。ハイブリダイゼーション反応、伸長反応、および増幅反応について本明細書中で使用されるように、ＯＤＮＰは、一般に、長さが８〜２００塩基である。より好ましくは、ＯＤＮＰは、長さが１２〜５０塩基であり、なおより好ましくは、ＯＤＮＰは、長さが１８〜３２塩基である。
【００９８】
１つの局面において、ＮＥＲＳを含み、必要に応じて、ＲＥＲＳを含むテンプレート核酸を生成するために有用なＯＤＮＰ対（「第１のＯＤＮＰ対」といわれる）を提供する。ここで、遺伝子バリエーションは、ＮＥＲＳと、必要に応じて存在するＲＥＲＳとの間に位置する。便宜上、二本鎖標的核酸は、ＯＤＮＰ対の以下の説明において使用される。第１のＯＤＮＰ対のうちの一方のＯＤＮＰ（「第１のＯＤＮＰ」といわれる）は、以下を含む：（１）ＮＥＲＳのセンス鎖の配列および（２）遺伝子バリエーションの相補的ヌクレオチドを含む標的核酸の鎖のヌクレオチド配列に少なくとも実質的に相補的なヌクレオチド配列。第１のＯＤＮＰの一部が相補的な標的のヌクレオチド配列は、遺伝子バリエーションの相補的ヌクレオチドに対して３’側に位置する。このような設計は、第１のＯＤＮＰの伸長産物に遺伝子バリエーションを組み込むことを可能にする。句「少なくとも実質的に相補的」は、ＯＤＮＰの一部と、ＯＤＮＰを標的に特異的にアニールさせ、伸長／増幅のためのプライマーとして機能させるに十分な標的核酸との間の相補性の程度をいう。好ましい実施形態において、相補性は、正確である。標的と相補的なＯＤＮＰの配列は、ＮＥＲＳに結合のセンス鎖の配列に対して３’側または５’側のいずれかに位置し得る。配列は、好ましくは、標的に少なくとも実質的に相補的なＮＥＲＳのセンス鎖の配列に対して５’側および３’側の両方に位置する。ＮＥＲＳのセンス鎖の配列に対して３’側に位置する実質的にまたは正確に相補的な配列の存在は、予め規定された位置でのテンプレートへのプライマーのアニーリングを容易にし、伸長／増幅効率を増大させる。ＮＥＲＳのセンス鎖の配列に対して５’側に位置する実質的にまたは正確に相補的な配列の存在は、首尾よく、効率的なアニーリングおよび伸長に必要なＮＥＲＳのセンス鎖の配列に対して３’側に位置するヌクレオチドの数を減少させ、また、以下に詳細に記載されるように、その後に増幅される一本鎖核酸分子の長さを短くする。ＯＤＮＰのＮＥＲＳのセンス鎖の完全な配列は、標的の対応領域に相補的であっても相補的でなくてもよい。１つの局面において、ＯＤＮＰのＮＥＲＳのセンス鎖の完全配列は、標的の対応する領域に正確に相補的ではない。一般に、ＯＤＮＰは、標的核酸に正確に相補的である、少なくとも６個、好ましくは８個、より好ましくは１０個、最も好ましくは１２個、１４個、または１６個のヌクレオチドを含む。
【００９９】
第１のＯＤＮＰ対の他方のＯＤＮＰ（「第２のＯＤＮＰ」といわれる）は、以下を含む：（１）遺伝子バリエーションを含む標的核酸の鎖のヌクレオチド配列に少なくとも実質的に相補的なヌクレオチド配列；および必要に応じて、（２）ＲＥＲＳの一方の鎖の配列。標的の一部が少なくとも実質的に相補的なＯＤＮＰのヌクレオチド配列は、遺伝子バリエーションに対して３’側に位置するように設計される。このような設計は、第２のＯＤＮＰの伸長産物に遺伝子バリエーションの相補体を組み込むことを可能にする。第１のＯＤＮＰと同様に、第２のＯＤＮＰのアニーリング部分と、標的の対応する部分との間の相補性は、正確である必要はないが、第２のＯＤＮＰが、所望の位置で標的に特異的にアニーリングし、伸長／増幅のためのプライマーとして機能すること可能にするに十分でなければならない。標的に少なくとも実質的に相補的な第２のＯＤＮＰの配列は、ＲＥＲＳが存在する場合に、ＲＥＲＳの一方の鎖の配列に対して３’側または５’側のいずれかに位置し得る。好ましくは、配列は、標的に少なくとも実質的に相補的なＲＥＲＳの配列に対して３’側および５’側の両方に位置する。第２のＯＤＮＰのＲＥＲＳの配列は、標的の対応する領域に相補的であっても相補的でなくてもよく、代表的には、標的の対応する領域に正確に相補的ではない。一般に、第２のＯＤＮＰは、標的核酸に正確に相補的である、少なくとも６個、好ましくは８個、より好ましくは１０個、最も好ましくは、１２個、１４個または１６個のヌクレオチドを含む。
【０１００】
第１のＯＤＮＰ対は、二本鎖である標的核酸と関連して上記に記載されているが、当業者は、本明細書中で提供されるガイダンスとともに、標的核酸が一本鎖である状況のために、このＯＤＮＰ対ならびに他のＯＤＮＰ対（すなわち、第２のＯＤＮＰ対および以下に記載の第３のＯＤＮＰ対）を容易に設計し得る。簡潔には、標的核酸分子が一本鎖である場合、一方の第１のＯＤＮＰは、ＮＥＲＳのセンス鎖のヌクレオチド配列および遺伝子バリエーションに対して５’側に位置する標的核酸のヌクレオチド配列に少なくとも実質的に同一のヌクレオチド配列を含むが、第２のＯＤＮＰは、遺伝子バリエーションに対して５’側に位置する標的核酸のヌクレオチド配列に少なくとも実質的に相補的なヌクレオチド配列を含み、ＲＥＲＳの一方の鎖の配列を必要に応じて含む。句「少なくとも実質的に同一」とは、ＯＤＮＰのヌクレオチド配列の一部と、ＯＤＮＰが標的核酸の対応する部分に正確に相補的な配列を含む核酸に特異的にアニールし、テンプレートとしての核酸とともに伸長／増幅のためのプライマーとして機能することを可能にするに十分な標的核酸の対応する部分との間の同一性の程度をいう。特定の好ましい実施形態において、第１のＯＤＮＰのヌクレオチド配列の一部は、標的核酸の一部と正確に同一である。
【０１０１】
別の局面において、本発明は、１つまたは２つのＮＥＲＳを含むテンプレート核酸を生成するために有用なＯＤＮＰ対（「第２のＯＤＮＰ対」といわれる）を提供する。ここで、標的に由来する遺伝子バリエーションは、第２のＮＥＲＳが存在する場合に、２つのＮＥＲＳ間に位置する。第２のＯＤＮＰ対のうちの第１のＯＤＮＰは、上記の第１のＯＤＮＰ対の第１のＯＤＮＰと同一である。第２のＯＤＮＰ対の第２のＯＤＮＰは、第１のＯＤＮＰ対の第２のＯＤＮＰにおけるＲＥＲＳの一方の鎖の配列が、第２のＯＤＮＰ対の第２のＯＤＮＰにおけるＮＥＲＳのセンス鎖の配列と置換されることを除いて、第１のＯＤＮＰ対の第２のＯＤＮＰと同一である。
【０１０２】
なお別の局面において、本発明は、１つまたは２つの半改変ＲＥＲＳを含むテンプレート核酸を生成するために有用なＯＤＮＰ対（「第３のＯＤＮＰ対」といわれる）を提供し、遺伝子バリエーションが、第２の半改変ＲＥＲＳが存在する場合に、２つの半改変ＲＥＲＳの間に存在する。第３のＯＤＮＰ対の第１のＯＤＮＰは、第１のＯＤＮＰ対の第１のＯＤＮＰにおけるＮＥＲＳのセンス鎖の配列が、半改変ＲＥＲＳのセンス鎖と置換されることを除いて、第１のＯＤＮＰ対の第１のＯＤＮＰと同じである。第３のＯＤＮＰ対の第２のＯＤＮＰは、第１のＯＤＮＰ対の第２のＯＤＮＰにおけるＲＥＲＳの一方の鎖の配列が、第３のＯＤＮＰ対の第２のＯＤＮＰにおける半改変ＲＥＲＳのセンス鎖の配列と置換され得ることを除いて、第１のＯＤＮＰ対の第２のＯＤＮＰと同じである。第１のＯＤＮＰにおける半改変ＲＥＲＳのセンス鎖の配列は、第３のＯＤＮＰ対の第２のＯＤＮＰにおける半改変ＲＥＲＳのセンス鎖の配列と同じであってもなくてもよい。好ましくは、これらは同じである。
【０１０３】
さらなる局面において、本発明は、所定の位置において同定される遺伝子バリエーションを含む一本鎖核酸の一部を生成するために有用なＯＤＮＰ対（「第４のＯＤＮＰ対といわれる」）を提供する（図３）。便宜上、一本鎖標的核酸は、ＯＤＮＰ対の以下の説明において使用される。しかし、標的核酸が本明細書中で提供されるガイダンスを使用して二本鎖であるＯＤＮＰ対を設計することは、当業者の技術範囲内である。
【０１０４】
第４のＯＤＮＰ対のうちの一方のプライマー（「第１のＯＤＮＰ」）は、所定の位置に対して３’側の位置（標的核酸の第１の領域）にある標的核酸のヌクレオチド配列に少なくとも実質的に相補的なヌクレオチド配列を含むのに対して、第４のＯＤＮＰ対のうちの他方のプライマー（第２のＯＤＮＰ）は、所定の位置にあるヌクレオチドの相補的ヌクレオチドに対して３’側の位置（「相補体の第１の領域」）にある標的核酸の相補体のヌクレオチド配列に少なくとも実質的に相補的なヌクレオチド配列を含む。ＯＤＮＰと、それらの対応する標的核酸またはそれらの相補体との間の相補性は、正確である必要はないが、ＯＤＮＰが、標的核酸またはその相補体をテンプレートとして使用する、伸長および／または増幅のためのプライマーとして機能し得るように、標的核酸またはその相補体と選択的にハイブリダイズするに十分でなければならない。一般に、各ＯＤＮＰは、標的核酸またはその相補体に正確に相補的である、少なくとも６個、好ましくは８個、より好ましくは１０個、最も好ましくは１２個、１４個、または１６個のヌクレオチドを含む。第４のＯＤＮＰ対の各ＯＤＮＰは、標的の相補体における標的位置または相補的位置の所定の位置に対して３’側の位置にて標的核酸またはその相補体にハイブリダイズするので、第４のＯＤＮＰ対から得られた伸長および／または増幅産物は、規定された位置にて同定されるヌクレオチドまたはその相補体を組み込む。
【０１０５】
本発明の第４のＯＤＮＰ対における各ＯＤＮＰは、中断された制限エンドヌクレアーゼ認識配列（ＩＲＥＲＳ）の一方の鎖の部分的配列をさらに含むが、上記の核酸配列に対して３’側に、好ましくは、上記の核酸配列（すなわち、標的核酸またはその相補体に相補的な配列）に対してすぐ３’側に位置するＩＲＥＲＳのその鎖の完全な配列を含まない。以下により詳細に記載されるように、完全なＩＲＥＲＳは、第１の不変認識配列（ｃｏｎｓｔａｎｔ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）（ＣＲＳ）および可変性認識配列（ＶＲＳ）と連結される第２のＣＲＳを含む二本鎖ヌクレオチド配列である（図４）。一般に、第１のＯＤＮＰおよび第２のＯＤＮＰは、それぞれ、ＩＲＥＲＳの第１鎖の第１のＣＲＳおよびＩＲＥＲＳの第２鎖の第２のＣＲＳを含む。さらに、第１のＯＤＮＰおよび第２のＯＤＮＰは、（１）第４のＯＤＮＰ対をプライマーとして用いて伸長産物および／または増幅産物、ならびにテンプレートとしての標的核酸が完全なＩＲＥＲＳを含み、そして（２）同定される核酸がＶＲＳ内に組み込まれるように間隔を空けられる。言い換えると、第１のＣＲＳと第２のＣＲＳとの間のヌクレオチド数は、ＶＲＳ中のヌクレオチドの正確な数であり、その結果、第４のＯＤＮＰ対からの伸長産物および／または増幅産物が、完全なＩＲＥＲＳを認識するＲＥにより消化され得る。各ＯＤＮＰ中の部分的なＩＲＥＲＳは、標的核酸に相補的であっても相補的でなくてもよい。
【０１０６】
好ましい実施形態において、第４のＯＤＮＰ対の各ＯＤＮＰは、ＣＲＳに対して３’側、好ましくは、ＣＲＳの３’末端にて標的核酸またはその相補体（それぞれ、「標的核酸の第２の領域」および「相補体の第２の領域」）に相補的な１つ以上のヌクレオチドをさらに含む。このようなヌクレオチドは、ＶＲＳの一部である（図３および４）。標的核酸またはその相補体の第１の領域と第２の領域との間のヌクレオチド数は、より大きくてもより小さくてもいいが、好ましくは、標的核酸またはその相補体に対して相補的な対応する第１の領域と第２の領域との間に位置するＯＤＮＰのヌクレオチド数に等しい。さらに、１つの局面において、第１のＯＤＮＰは、ＩＲＥＲＳの第１鎖の第１のＣＲＳに対して５’側の位置にＮＥＲＳのセンス鎖の配列をさらに含む。あるいは、第２のＯＤＮＰは、ＩＲＥＲＳの第２鎖の第２のＣＲＳに対して５’側の位置にＮＥＲＳのセンス鎖の配列をさらに含む。このようなＮＥＲＳの存在は、下記のように、ＮＥＲＳを認識するＮＥおよびＩＲＥＲＳを認識するＲＥを使用して、ＯＤＮＰからの伸長産物／増幅産物の消化の際に短い一本鎖オリゴヌクレオチドの生成を可能にする。
【０１０７】
配列特異的プライマーを設計するための一般的技術は、周知である。例えば、このような技術は、ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ（Ｂｒｕｃｅ  Ａ．  Ｗｈｉｔｅ編），１９９３；ＰＣＲ  Ｐｒｉｍｅｒ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｃａｒｌ  Ｗ．ＤｉｅｆｆｅｎｂａｃｈおよびＧａｂｒｉｅｌａ  Ｓ．Ｄｖｅｋｓｌｅｒ編），１９９５；ＭｃＰｈｅｒｓｏｎらによるＰＣＲ（Ｂａｓｉｃｓ：Ｆｒｏｍ  Ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ  ｔｏ  Ｂｅｎｃｈ）；ＰＣＲ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ：Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｆｏｒ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ（Ｍｉｃｈａｅｌ  Ａ．Ｉｎｎｉｓ編），１９９９：ＮｅｗｔｏｎおよびＧｒａｈａｍによるＰＣＲ：Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  Ｓｅｒｉｅｓ，１９９７；ＧｅｌｆａｎｄらによるＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，１９９０；Ｍｉｃｈａｅｌ  Ａ．ＩｎｉｓによるＰＣＲ  Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ；ＧｒｉｆｆｉｎおよびＧｒｉｆｆｉｎによるＰＣＲ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ：Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎｓ，１９９４；ならびにＰＣＲ：Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｑｕｅｓ（Ｊ．Ｆ．Ｂｕｒｋｅ編）のような書籍に記載される。さらに、プライマーを設計するためのソフトウェアプログラムもまた、市販されており、Ｐｒｉｍｅｒ  Ｍａｓｔｅｒ（ＰｒｏｕｔｓｋｉおよびＨｏｌｍｅｓ、「Ｐｒｉｍｅｒ  Ｍａｓｔｅｒ：Ａ  ｎｅｗ  ｐｒｏｇｒａｍ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ＰＣＲ  ｐｒｉｍｅｒｓ」，Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．１２：２５３−５，１９９６を参照のこと）およびＯＬＩＧＯ  Ｐｒｉｍｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｉｎｓｉｇｈｔｓ，Ｉｎｃ．（Ｃａｓｃａｄｅ，ＣＯ，ＵＳＡ）製）が挙げられる。上記の参考書籍はおよびソフトウェアプログラムの説明は、その全体が本明細書中に参考として援用される。
【０１０８】
本発明に従うＯＤＮＰは、米国特許第６，１６６，１９８号、同第６，０４３，３５３号、同第６，０４０，４３９号および同第５，９４５，５２４号（それらの全体が本明細書中に参考として援用される）に開示される方法のようにオリゴヌクレオチド合成についての当該分野で公知の任意の方法によって合成され得る。例えば、固相オリゴヌクレオチド合成は、樹脂に結合される発生期オリゴヌクレオチドに５’ブロックされたヌクレオチドに連続して連結し、続いて、リン酸ジエステル結合を形成するために酸化および脱ブロック化することによって行われ得る。次いで、本発明のＯＤＮＰは、単離され得る。用語「単離される（た）」とは、本明細書中で使用される場合、所望でない夾雑物を実質的に含まない分子（例えば、他の配列を有する分子）をいう。
【０１０９】
（ｉｉ．オリゴヌクレオチドプライマーの固定化）
特定の実施形態において、本発明のＯＤＮＰは、固定化され得る。一般に、ＯＤＮＰは、以下の２つの方法において基材に固定化され得る：（１）基材上に直接ＯＤＮＰを合成すること（しばしば、インサイチュ合成といわれる）、または（２）ＯＤＮＰを別々に合成し、次いで、これらを基材に位置づけまたは結合させること（ときおり、「合成後結合」といわれる）。インサイチュ合成について、主な技術は、フォトリソグラフィーである。簡潔には、この技術は、固体支持体の表面を、例えば、連結エレメントを通じて基材に結合される酸素原子を保護する感光性基で改変することを包含する。保護化ヒドロキシル基のこのアレイは、フォトリソグラフィーマスクを通じて照射され、照射された領域において反応性ヒドロキシル基を生成する。同じ感光性基で５’−ヒドロキシルにて保護された３’−Ｏ−ホスホルアミダイト活性化デオキシヌクレオシドは、次いで、表面に提示され、カップリングが、照射された領域のヒドロキシル基を通じて発生する。さらなる化学的反応の後に、基材はすすがれ、その表面は、第２のマスクを通じて照射されて、さらなるヒドロキシル基がカップリングのために曝される。第２の５’保護し、３’−Ｏ−ホスホルアミダイト活性化したデオキシヌクレオシドは、表面に提示される。選択的光脱保護およびカップリングサイクルは、所望のセットの生成物が得られるまで反復される。アレイ製作におけるフォトリソグラフィーの使用についての詳細な記載は、以下の特許または公開特許出願において見いだされ得る：米国特許第５，１４３，８５４号；同第５，４２４，１８６号；同第５，８５６，１０１号；同第５，５９３，８３９号；同第５，９０８，９２６号；同第５，７３７，２５７号；および公開ＰＣＴ特許出願番号ＷＯ９９／４０１０５；ＷＯ９９／６０１５６；ＷＯ００／３５９３１。
【０１１０】
合成後付着アプローチは、予め存在するオリゴヌクレオチドを基材に付着するための方法を必要とする。１つの方法は、ビオチン−ストレプトアビジン相互作用を用いる。簡単に述べれば、ビオチンとストレプトアビジンとが、共有結合ではないが、強度において共有結合に等価であると考えられ得る非常に強い相互作用を形成することが周知である。あるいは、予め合成されたオリゴヌクレオチドを、基材に共有結合し得る。例えば、カルボジイミドは、３つの異なるアプローチで一般に用いられ、ＤＮＡを固体支持体に結合する。１つのアプローチでは、支持体は、次に、カルボジイミドおよびカルボキシ改変オリゴヌクレオチドで処理されるヒドラジド基でコートされる。あるいは、複数のカルボン酸基をもつ基材は、アミノ改変オリゴヌクレオチドおよびカルボジイミドで処理され得る。エポキシドを基礎にした化学もまた、アミン改変オリゴヌクレオチドと用いられる。予め存在するオリゴヌクレオチドを基材に付着するための方法の詳細な記載は、以下の参考文献中に見出され得る：米国特許第６，０３０，７８２号；同第５，７６０，１３０号；同第５，９１９，６２６号；公開されたＰＣＴ特許出願番号ＷＯ００／４０５９３；Ｓｔｉｍｐｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９２：６３７９〜６３８３（１９９５）；Ｂｅａｔｔｉｅら、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．４１：７００〜７０６（１９９５）；Ｌａｍｔｕｒｅら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２２：２１２１〜２１２５（１９９４）；Ｃｈｒｉｓｅｙら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２４：３０３１〜３０３９（１９９６）；およびＨｏｌｍｓｔｒｏｍら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２０９：２７８〜２８３（１９９３）。
【０１１１】
主要な合成後付着技法は、インクジェットおよび機械的スポットを含む。インクジェットは、インクジェットプリンティング工業に由来するディスペンサを用いてオリゴヌクレオチドを散布することを含む。このオリゴヌクレオチドは、供給源プレートからプリントヘッド中に上に引き抜かれ、そして次に基材の上の位置に移動される。次いで、オリゴヌクレオチドは、小オリフィスを通じて押され、プリントヘッドから基材の表面上に小滴の射出を引き起こす。アレイ製作においてインクジェットを用いる詳細な記載は、以下の特許中に見出され得る：米国特許第５，７００，６３７号；第６，０５４，２７０号；第５，６５８，８０２号；同５，９５８，３４２号；同６，１３６，９６２号および同第６，００１，３０９号。
【０１１２】
機械的スポットは、剛直性のピンの使用を含む。ピンは、オリゴヌクレオチド溶液中に浸漬され、それによって小容量の溶液をピンの先端上に移す。ピン先端を基材に触れさせてスポットを残し、その直径は、ピン、オリゴヌクレオチド溶液、および基材の表面エネルギーによって決定される。機械的スポットは、一回のオリゴヌクレオチドローディグで複数のアレイをスポットするために用いられ得る。アレイ製作において機械的スポットを用いる詳細な記載は、以下の特許および公開された特許出願中に見出され得る：米国特許第６，０５４，２７０号；同第６，０４０，１９３号；同第５，４２９，８０７号；同第５，８０７，５２２号；同第６，１１０，４２６号；同第６，０６３，３３９号；および同第６，１０１，９４６号；ならびに公開されたＰＣＴ特許出願番号ＷＯ９９／３６７６０；同９９／０５３０８；同００／０１８５９；および００／０１７９８。
【０１１３】
当業者は、上記に記載した技法の他に、他の方法もまた、基材にＯＤＮＰを固定することにおいて用いられ得ることを認識する。このような方法の記載は、制限されないで、以下の特許または公開された特許出願中に見出され得る：米国特許第５，６７７，１９５号；同第６，０３０，７８２号；同第５，７６０，１３０号；および同第５，９１９，６２６号；ならびに公開されたＰＣＴ特許出願番号ＷＯ９８／０１２２１；ＷＯ９９／４１００７；ＷＯ９９／４２８１３；ＷＯ９９／４３６８８；ＷＯ９９／６３３８５；ＷＯ００／４０５９３；ＷＯ９９／１９３４１；およびＷＯ００／０７０２２。この節（すなわち、ＯＤＮＰの固定化）において上記で引用されたこれらの特許および特許出願、ならびに全ての参考文献（特許、特許出願および学術文献を含む）は、それらの全体が本明細書中に参考として援用される。
【０１１４】
（ｉｉｉ．ハイブリダイゼーション）
本発明の方法、キットおよび組成物は、標的核酸にハイブリダイズされるＯＤＮＰを含み得る。ここで、そのＯＤＮＰは、標的核酸内の規定のヌクレオチド座の生成および／または増幅を容易にする。従って、ＯＤＮＰおよび標的核酸は、好ましくは、ハイブリダイゼーションおよび／または増幅を可能にする塩基対合条件下であわされる。適切な核酸ハイブリダイゼーションおよび／または増幅条件の選択は、当業者の技術範囲内であり、例えば、以下の実験研究マニュアルを参照することによって補助され得る：Ｓａｍｂｒｏｏｋら、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ」（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９）およびＡｕｓｕｂｅｌら、「Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」（１９９９）（それらの全体が、本明細書中に参考として援用される）。
【０１１５】
想定される適用に依存して、当業者は、標的配列に対するＯＤＮＰの選択性の所望の程度を達成するために、ハイブリダイゼーションの条件を変化させ得る。高い選択性を必要とする適用については、ハイブリッドを形成するために比較的ストリンジェントな条件が使用され得る（例えば、低い塩および／または高い温度条件（例えば、約５０℃〜約７０℃の温度にて約０．０２Ｍ〜約０．１５Ｍの塩））。このような選択的条件は、ＯＤＮＰと標的核酸との間の大きなミスマッチを比較的受け入れない。
【０１１６】
あるいは、ＯＤＮＰのハイブリダイゼーションは、例えば、６０℃にて１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．３）；５０ｍＭ  ＫＣｌ；１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２のような中程度にストリンジェントな条件下で達成され得る。この条件は、標的核酸とのヌクレオチドミスマッチを含むＯＤＮＰのハイブリダイゼーションを可能にする。別のハイブリダイゼーション条件の設計は、当業者の経験の範囲内である。
【０１１７】
（ｉｖ．核酸伸長／増幅）
規定の位置に遺伝子変異を含む標的核酸の一部、および認識配列の種々の組合せ（例えば、ＮＥＲＳおよびＲＥＲＳ（ＩＲＥＲＳを含む）、２つのＮＥＲＳまたは２つの半改変ＲＥＲＳ）の両方を含むテンプレート核酸を得るために、一対のプライマーを、標的核酸にハイブリダイズし、そしてＯＤＮＰ対の各プライマーを、当該分野で公知の種々の方法論（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）および改変リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ））を使用して伸長される。一般的に、上記ＯＤＮＰ対からの伸長反応の少なくとも３回の実施は、実施される必要がある。簡単に述べると、伸長の第１の実施は、酵素認識配列（ＥＲＳ）（「第１のＥＲＳ」）（例えば、半改変ＲＥＲＳ、ＮＥＲＳ）のセンス鎖の配列を有する第１プライマーが、標的核酸の遺伝子改変を、第１伸長産物内に組み込むことである。次いで、第２プライマー（別のＥＲＳ（「第２のＥＲＳ」）（これは、第１のＥＲＳと同じであっても同じでなくてもよい）の１つの鎖の追加配列を必要に応じて有する）が、第１の伸長産物にハイブリダイズし、そしてテンプレートとしてこの第１の伸長産物を使用して伸長して、それによって、遺伝子変異の相補体および第１のＥＲＳの相補体を第２の伸長産物に組み込む。次いで、伸長されていない第１のプライマーが、第２の伸長産物にハイブリダイズし、そして、テンプレートとしてこの第２の伸長産物を使用して伸長して、それによって、第２の伸長産物と組み合わせて、遺伝子変異およびその相補体、ならびに２つの完全ＥＲＳを含む二本鎖核酸フラグメントを形成する。
【０１１８】
伸長反応の３つの実施が標的核酸の遺伝子変異および２つのＥＲＳを含むフラグメントを産生するのに十分であるが、好ましくは、３回より多くの伸長反応を、テンプレートを増幅するために実施する。当業者は、伸長の引き続く実施において、第１のプライマーが、ハイブリダイズし得、そして標的核酸、第２の伸長産物、および第３の伸長産物の相補体のいずれかをテンプレートして使用して伸長し得ることを理解する。同様に、伸長の引き続く実施において、第２のプライマーは、第１の伸長産物または第３の伸長産物のいずれかにハイブリダイズして、テンプレートしてこの第１の伸長産物または第３の伸長産物のいずれかを使用して伸長し得る。しかし、第３の伸長産物およびその相補体が標的核酸、第１の伸長産物および第２の伸長産物のいずれよりも短いので、これらは、第１のＯＤＮＰまたは第２のＯＤＮＰのいずれかからの引き続く伸長反応に好ましいテンプレートである。これは、テンプレートとして短いフラグメントを用いた伸長の効率が、テンプレートとして大きなフラグメントを用いた伸長の効率よりも高いからである。伸長反応の数の増加とともに、遺伝子変異および第１のＥＲＳの両方ならびに必要に応じて第２のＥＲＳを含む二本鎖フラグメントが、反応混合物中の他の分子よりも迅速に蓄積する。このような蓄積は、テンプレートとして上記テンプレート核酸を使用して増幅される一本鎖核酸の引き続く特徴付けの感度を増加する。
【０１１９】
伸長／増幅反応は、当該分野で公知の任意の方法によって実施され得る。例えば、米国特許第４，６８３，１９５号、同第４，６８３，２０２号、および同第４，８００，１５９号に記載されるＰＣＲ法が使用され得る。他のＰＣＲ法がまた、本、例えば、Ｇｅｌｆａｎｄら，「ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ」（１９９０）；Ｂｕｒｋｅ（編），「ＰＣＲ：Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ」；およびＭｃＰｈｅｒｓｏｎら、「ＰＣＲ（Ｂａｓｉｃ：Ｆｒｏｍ  Ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ  ｔｏ  Ｂｅｎｃｈ）」に記載されるように使用され得る。上記参考文献のそれぞれが、本明細書中において、その全体が参考として援用される。簡単に述べると、ＰＣＲにおいて、標的核酸配列の反対の相補鎖における領域に対して相補的である２つのＯＤＮＰが調製される。過剰なデオキシリボヌクレオオシド三リン酸が、ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｔａｑポリメラーゼまたはｐｆｕポリメラーゼ）とともに反応混合物に添加される。標的核酸配列がサンプル中に存在する場合、ＯＤＮＰが、標的に結合し、そしてポリメラーゼによって、ＯＤＮＰが、ヌクレオチドを添加することによって、標的核酸配列に沿って伸長される。反応混合物の温度を上昇および下降させることによって、伸長されたＯＤＮＰは、標的から解離して、反応生成物を形成し、過剰のＯＤＮＰが、標的および反応生成物に結合し、そしてプロセスが繰り返される。
【０１２０】
本発明に従う例示的なＰＣＲ条件としては、以下が挙げられ得るが、これに限定されない：１００μｌのＰＣＲ反応は、１００ｎｇの標的核酸；各々０．５μＭの第１のＯＤＮＰおよび第２のＯＤＮＰ；１０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８．３）；５０ｍＭ  ＫＣｌ；１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２；２００μＭの各ｄＮＴＰ；４単位のＴａｑＴＭ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ；Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）、および８８０ｎｇのＴａｑＳｔａｒｔＴＭＡｎｔｉｂｏｄｙ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）を含む。例示的な熱サイクル条件は、以下のようであり得る：９４℃で５分間の最初の変性；９４℃で３０秒間、６０℃で３０秒間、７２℃で１分間の４５サイクル；７２℃で５分間の最終伸長。例示的な核酸ポリメラーゼは、当該分野において容易に入手可能な熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、ＴａｑＴＭ、ＶｅｎｔＴＭまたはＰＦＵＴＭのような）のうちの１つを含み得る。意図される特定の適用に依存して、欠損性３’〜５’エキソヌクレアーゼ活性を有する核酸ポリメラーゼのうちの１つを使用することが好ましくあり得る。
【０１２１】
同定されるべきヌクレオチドを含むフラグメントを作製および／または増幅するための代替方法は、本明細書中においてギャップ−ＬＣＲとして呼ばれる改変リガーゼ連鎖反応による（Ａｂｒａｖａｙａら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２３：６７５−６８２（１９９５））。簡単に述べると、標的核酸の存在下において、各々の対のセットが、標的核酸中の目的のヌクレオチド（のいずれかの側）の５’側および３’側に配置される、標的またはその相補体に結合する。ポリメラーゼおよびリガーゼの存在において、各対の２つのＯＤＮＰ間のギャップは、満たされ、そしてそれぞれの対のＯＤＮＰは、１つの単位を形成するために連結される。熱サイクリングによって、ＰＣＲにおけるように、結合した連結された単位は、標的から解離し、次いで、過剰なＯＤＮＰ対の連結に対する「標的配列」として役立つ。従って、ＬＣＲは、反応を駆動するための核酸ポリメラーゼ酵素と核酸リガーゼ酵素の両方を使用する。例示的な核酸ポリメラーゼとしては、当該分野において容易に入手可能な熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、ＴａｑＴＭ、ＶｅｎｔＴＭまたはＰＦＵＴＭのような）のうちの１つが挙げられ得る。例示的な核酸リガーゼは、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ、あるいは熱安定性Ｔｓｃ  ＤＮＡリガーゼまたは熱安定性Ｐｆｕ  ＤＮＡリガーゼを含み得る。米国特許第４，８８３，７５０号（その全体が、本明細書中において参考として援用される）は、ＯＤＮＰ対を標的配列に結合するためのＬＣＲに類似の代替の増幅方法を記載する。
【０１２２】
例示的なギャップ−ＬＣＲ条件は、以下を含み得るが、これらに限定されない：５０μｌ  ＬＣＲ反応は、５００ｎｇ  ＤＮＡを含み；５０ｍＭ  ＥＰＰＳ（ｐＨ７．８）、３０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２０ｍＭ  Ｋ＋、１０μＭ  ＮＡＤ、１〜１０μＭのヌクレオチドを満たすギャップ、３０ｎＭの各オリゴヌクレオチドプライマー、１Ｕ  Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｆｌａｖｕｓ  ＤＮＡポリメラーゼ（３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を欠く）（ＭＢＲ、Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ、ＷＩ）、および５０００ＵのＴ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＤＮＡリガーゼ（Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を含む緩衝液を含む。サイクリング条件は、８５℃での３０秒間のインキュベーション、および６０℃で３０秒間のインキュベーションを２５サイクルからなり得、そして標準のＰＣＲ機械（例えば、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  ９６００サーモサイクラー）で実施され得る。
【０１２３】
２つのＲＥＲＳを含むテンプレート核酸が両方の鎖で切断されることを妨げるために、第３のＯＤＮＰ対からの伸長／増幅が、改変デオキシリボヌクレオシド三リン酸（例えば、α−チオデオキシリボヌクレオシド三リン酸）の存在下で実施され得る。ＲＥＲＳの１つの鎖への改変デオキシリボヌクレオチドの組み込みは、改変鎖においてＲＥＲＳを認識するＲＥによる切断を遮断する。結果として、ＯＤＮＰ対の一部であるＲＥＲＳのセンス鎖のみが切断され得る。
【０１２４】
ＲＥＲＳを含む２つのＤＮＡ鎖のうちの１つの切断の阻害に寄与する任意の改変デオキシリボヌクレオシド三リン酸が、本発明において使用され得る。例示的な改変デオキシリボヌクレオシド三リン酸としては、限定しないが、以下が挙げられる：２’−デオキシシチジン  ５’−Ｏ−（１−チオ三リン酸）［すなわち、ｄＣＴＰ（αＳ）］、２’−デオキシグアノシン  ５’−Ｏ−（１−チオ三リン酸）、チミジン−５’−Ｏ−（１−チオ三リン酸）、２’−デオキシシチジン  ５’−Ｏ−（１−チオ三リン酸）、２’−デオキシウリジン  ５’−三リン酸、５−メチルデオキシチジン  ５’−三リン酸、および７−デアザ−２’−デオキシグアノシン  ５’三リン酸。
【０１２５】
特定の実施形態において、１つより多くの改変デオキシリボヌクレオシド三リン酸が使用され得る。いくつかの他の実施形態において、特定の適切なヌクレオチドの合成後改変は、改変デオキシリボヌクレオシド三リン酸の使用に対する代替を提供する。
【０１２６】
標的核酸がＲＮＡ分子（例えば、ｍＲＮＡ）であるいくつかの実施形態において、テンプレートとしてＲＮＡ分子を使用するＤＮＡポリメラーゼ（例えば、逆転写酵素）が必要とされ得る。ＤＮＡポリメラーゼによって合成される一本鎖ＤＮＡ分子は、ＤＮＡ分子をテンプレートとして使用するＤＮＡポリメラーゼの存在下で二本鎖ＤＮＡ分子を合成および／または増幅するためのテンプレートとしてさらに使用され得る。
【０１２７】
本発明はまた、規定の位置における標的核酸における遺伝子変異の多重決定のために使用され得る。このような適用において、複数標的核酸およびこれらの標的核酸に対して特異的なＯＤＮＰ対が、増幅条件下で一緒に組み合わされ得る。この組合せは、増幅に必要とされる試薬およびＤＮＡポリメラーゼと関連する費用を低下させる。得られる増幅産物は、引き続いて、一本鎖核酸分子の増幅のためのテンプレートとして使用され、従って、
テンプレートの増幅が、一般的に、広範である必要はない。なぜなら、一本鎖核酸分子の第２の増幅が、引き続く検出方法によって検出されるサンプルの量を増加するからである。
【０１２８】
いくつかの実施形態において、本発明のテンプレート核酸は、以下に詳細に記載される一本鎖核酸分子の増幅において使用されるＤＮＡポリメラーゼと同じＤＮＡポリメラーゼを使用して得られ得る。
【０１２９】
（ｖ．制限エンドヌクレアーゼおよび消化条件）
上記のような増幅されたテンプレート核酸が、ＲＥＲＳを含む（半改変ＲＥＲＳを含まない）場合、ＲＥＲＳを認識するＲＥによって代表的に消化される。用語「制限エンドヌクレアーゼ」（ＲＥ）とは、独特の二本鎖核酸配列を認識し、そして二本鎖核酸における切断を作製し、平滑末端二本鎖末端または５’突出部もしくは３’突出部のいずれかを有する一本鎖末端のいずれかを生じるヌクレアーゼのクラスをいう。ＲＥは、通常、３つの型に分類される：Ｉ型、ＩＩ型およびＩＩＩ型。これらのうち、ＩＩ型が分子生物学操作において最も一般的に使用される。本発明において使用され得るＲＥとしては、任意のＩＩ型ＲＥ、例えば、（１）４、５、または６ヌクレオチド長である特定の配列を認識し、そして二回対称性を示すＩＩ型ＲＥの大部分（例えば、ＥｃｏＲ  Ｉ、ＢａｍＨ  Ｉ）、（２）ＩＩｓ型ＲＥ（ＴＳＲＥ）、および（３）中断された（ｉｎｔｅｒｒｕｐｔｅｄ）ＲＥ（ＩＲＥ）が挙げられる。「ＩＩｓ型制限エンドヌクレアーゼ」は、その認識配列の外側を切断するＩＩ型制限エンドヌクレアーゼである。例示的なＴＳＲＥとしては、Ｆｏｋ  Ｉ、ＢｓｇＩおよびＢｐｍＩが挙げられるが、これらに限定されない。「中断された制限エンドヌクレアーゼ」は、中断された制限エンドヌクレアーゼ認識配列（ＩＲＥＲＳ）を認識するＩＩ型制限エンドヌクレアーゼである。ＩＲＥＲＳは、「第１の一定の認識配列（ＣＲＳ）」、「第２のＣＲＳ」および「可変認識配列（ＶＲＳ）」（第１のＣＲＳおよび第２のＣＲＳを連結する）から構成される制限エンドヌクレアーゼ認識配列として規定される（図４）。ＩＲＥＲの三つの成分全てが、二本鎖である。本発明に従って、「第１のＣＲＳ」は、１つの側においてＩＲＥＲＳのＶＲＥにすぐ隣接するＩＲＥＲＳの一定の（可変でない）ヌクレオチドを含むＩＲＥＲＳの領域として規定され、ここで、「第２のＣＲＳ」は、他の側におけるＩＲＥＲＳのＶＲＥにすぐ隣接するＩＲＥＲＳの一定の（可変でない）ヌクレオチドを含むＩＲＥＲＳの領域として規定される。本発明に従って、「ＶＲＥ」は、第１のＣＲＳと第２のＣＲＳとの間に配置される１つ以上の可変ヌクレオチドのストレッチとして規定される。例示的なＩＲＥとしては、Ｂｓｌ  Ｉ、ＥｃｏＮ  Ｉ、Ｄｒａ  ＩＩＩおよびＤｄｅ  Ｉが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１３０】
本発明に有用なＲＥは、種々の会社、例えば、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ  Ｉｎｃ．（Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ；ｗｗｗ．ｎｅｂ．ｃｏｍ）；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ；ｗｗｗ．ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ．ｃｏｍ），Ｐｒｏｍｅｇａ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ：ｗｗｗ．ｐｒｏｍｅｇａ．ｃｏｍ），およびＣｌｏｎｔｅｃｈ  （Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ；ｗｗｗ．ｃｌｏｎｔｅｃｈ．ｃｏｍ）から購入され得る。市販でない制限酵素は、当該分野で入手可能な教示に基づいて単離および／または精製され得る。例えば、以下の論文は、本発明に適切ないくつかの市販でない制限酵素の単離および／または精製を記載し、そして本明細書中において、その全体が参考として援用される：制限酵素ＡｐａＢ  Ｉについて、Ｇｒｏｎｅｓ  ａｎｄ  Ｔｕｒｎａ，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １１６２：３２３−３２５（１９９３），Ｇｒｏｎｅｓ  ａｎｄ  Ｔｕｒｎａ，Ｂｉｏｌｏｇｉａ（Ｂｒａｔｉｓｌ）４６：１１０３−１１０８（１９９１）；ＥｃｏＨ  Ｉについて，Ｇｌａｔｍａｎら，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｍｉｋｒｏｂｉｏｌ．Ｖｉｒｕｓｏｌ．３：３２（１９９０）；Ｆｍｕ  Ｉについて，Ｒｅｂｅｎｔｉｓｈら、Ｂｉｏｔｅｋｈｎｏｌｏｇｉｙａ  ３：１５−１６（１９９４）；ＨｐｙＢ  ＩＩについて，ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．１７９：１７５−１８０（１９９９）；Ｓｓｅ８６４７  Ｉについて，Ｎｏｍｕｒａら，欧州特許出願番号０６９８６６３  Ａｌ，Ｉｓｈｉｎｏら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２３：７４２−７４４（１９９５）；Ｕｎｂ  Ｉについて，Ｋａｗａｌｅｃら，Ａｃｔａ  Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｐｏｌ．４４：８４９−８５２（１９９７）；ＶｐａＫ１ｌＡ  Ｉについて，ＭｉｙａｈａｒａらＪ．Ｆｏｏｄ．Ｈｙｇ．Ｓｃｉ．  Ｊａｐａｎ  ３５：６０５−６０９（１９９４）。
【０１３１】
本発明に従って使用される制限エンドヌクレアーゼの保存および使用についての条件の記載は、当該分野において容易に入手可能であり、例えば、上記Ｓａｍｂｒｏｏｋら、および上記Ａｕｓｕｂｅｌらのような実験室マニュアルに見出される。簡単に述べると、反応に添加されるＲＥの単位の数は、核酸基質の種々の切断速度に従って計算および調節され得る。制限エンドヌクレアーゼの１単位は、５０μｌの反応物中の１μｇの基質の核酸を６０分で消化する。一般的に、フラグメント（例えば、アンプリコン）は、１単位／μｇより多くが完全に切断されることが必要であり得る。制限酵素緩衝液は、代表的に、反応物中で１×濃度で使用される。いくつかの制限エンドヌクレアーゼは、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（通常、最適な活性のために１００μｇ／ｍｌの最終濃度で使用される）を必要とする。最適な活性のためにウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を必要としない制限エンドヌクレアーゼは、ＢＳＡが反応物に存在する場合、有害に影響しない。
【０１３２】
推奨される保存緩衝液中において−２０℃で保存される場合、大部分の制限エンドヌクレアーゼは、安定である。−２０℃より上の温度への暴露は、可能な限り最小化されるべきである。全ての制限エンドヌクレアーゼは、冷凍庫に保存されない場合、氷上で維持されるべきである。酵素は、いつも、反応物に添加される最後の成分であるべきである。
【０１３３】
大部分の制限エンドヌクレアーゼについての推奨されるインキュベーション温度は、約３７℃である。好熱性細菌から単離された制限エンドヌクレアーゼは、より高いインキュベーション温度（代表的には、５０℃〜６５℃の範囲）を必要とする。インキュベーション時間は、過剰の制限エンドヌクレアーゼが反応物に添加される場合、しばしば短くされ得る。より長いインキュベーション時間は、しばしば、より少ない単位の制限エンドヌクレアーゼを用いて完了へと反応を進行させるために使用される。
【０１３４】
２つのＲＥが同時に使用される場合、インキュベーション温度および反応緩衝液を含む反応条件は、両方の酵素に適切であるように最適化される必要がある。しかし、２つの異なるＲＥの両方に適切な消化条件が見出され得ない場合、１つのＲＥを用いる消化が、他のＲＥを用いる消化の前に実施され得る。二重消化がＮＥおよびＲＥを使用して実施される場合において、本発明のプライマー対（例えば、第４のＯＤＮＰ対）を使用して伸長／増幅産物から得られる生成物は、２つの二重鎖オリゴヌクレオチドおよび一本鎖オリゴヌクレオチドである（例えば、図３を参照のこと）。
【０１３５】
（ｃ．一本鎖核酸の増幅）
本発明に従って、ＮＡＲＳ、ＮＳ、およびＮＳに対して３’側の遺伝子変異を含むテンプレート核酸は、遺伝子変異またはその相補体を含む一本鎖核酸を増幅するためのテンプレートとして使用される。増幅は、テンプレートを繰り返しニック形成し、次いで、ニック形成部位から伸長してテンプレートを作製することによって実施される。従って、テンプレート核酸は、最初に、テンプレートのＮＡＲＳを認識するＮＡによってニック形成され、それによって、ＮＳにおいて３’末端を作製する。次いで、鎖置換能力を有するが、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を欠くＤＮＡポリメラーゼを使用して、ＮＳにおいて３’末端からニック形成されたテンプレートを伸長し、従って、下流の一本鎖核酸を置換する。この伸長は、ＮＡに対する新たなニック形成部位を作製する。ニック形成伸長プロセスの繰り返しは、ＮＡによって作製されるＮＳにおける５’末端を有する一本鎖核酸を増幅する。遺伝子変異がテンプレート中のＮＳに対して３’側に配置されるので、遺伝子変異は、増幅された一本鎖核酸に組み込まれる。従って、増幅された一本鎖核酸の引き続く特徴付けによって、標的核酸を起源とする遺伝子変異の同定が可能になる。
【０１３６】
本発明の特定の実施形態において、例えば、テンプレート核酸がＮＥＲＳのセンス鎖の配列およびＲＥＲＳの１つの鎖の配列の両方を含む場合（例えば、図１を参照のこと）、ＲＥＲＳを認識するＲＥによって消化された後に、テンプレート核酸のニック形成は、テンプレート核酸の残りの部分から容易に解離する短い核酸フラグメントを生じる。これらの実施形態において、鎖置換能力を有さず、そして／または５’〜３’エキソヌクレアーゼ欠損でないＤＮＡポリメラーゼは、短い一本鎖核酸フラグメントを増幅するために使用され得る。このようなＤＮＡポリメラーゼはまた、テンプレート核酸が互いに十分に密接な２つのＮＡＲＳ（例えば、２つのＮＥＲＳまたは２つの半改変ＲＥＲＳまたは１つの半改変ＲＥＲＳを伴う１つのＮＥＲＳ）を含み、その結果、（１）２つのＮＡＲＳを認識するＮＡによってテンプレート核酸の最初のニック形成が、ニック形成反応条件下で互いから解離する２つの部分的二本鎖核酸フラグメントを生じ、そして（２）ニック形成されたテンプレート核酸の伸長生成物の引き続くニック形成が、伸長生成物の他の部分から容易に解離する短い核酸フラグメントを生じる（例えば、図２および５を参照のこと）場合に、使用され得る。ＤＮＡポリメラーゼの鎖置換活性が、一本鎖核酸フラグメントを増幅するために必要とされないこれらの実施形態において、増幅は、テンプレートとして、消化されたかまたはニック形成されたテンプレート核酸の一本鎖部分を使用して実施され、これは、一本鎖核酸フラグメントの増幅のためのテンプレートが二本鎖である従来の鎖置換増幅とは異なる。
【０１３７】
（ｉ．テンプレート核酸のニック形成）
本発明のテンプレート核酸は、テンプレート核酸中にニック形成剤認識配列（ＮＡＲＳ）を認識する任意のニック形成剤によってニック形成され得る。好ましくは、ニック形成剤は、二本鎖核酸の特定の配列を認識し、核酸の１つの鎖のみを切断する酵素である。このような酵素は、半改変認識配列を認識するネイティブヌクレオチドまたは制限エンドヌクレアーゼからなる特定の配列を認識するニック形成エンドヌクレアーゼであり得る。
【０１３８】
ニック形成エンドヌクレアーゼは、その認識配列と重複するニック形成部位を有しても、有さなくてもよい。その認識配列の外側にニック形成する例示的なＮＥは、Ｎ．ＢｓｔＮＢ  Ｉであり、これは、５’−ＧＡＧＴＣ−３’から構成される独特の核酸配列を認識するが、認識配列の３’末端を超えて４ヌクレオチドにニック形成する。認識配列およびＮ．ＢｓｔＮＢ  Ｉのニック形成部位は、切断部位を示すために、
【０１３９】
【化１】
2004535815.tif 000003
を用いて以下に示され、ここで文字Ｎは、任意のヌクレオチドを示す：
【０１４０】
【化２】
2004535815.tif 000004
Ｎ．ＢｓｔＮＢ  Ｉは、米国特許第６，１９１，２６７号に記載されるように調製および単離され得る。このニック形成エンドヌクレアーゼを使用するための緩衝液および条件はまた、’２６７特許に記載される。その認識配列の外側にニック形成するさらなる例示的なＮＥは、Ｎ．ＡｌｗＩであり、これは、以下の二本鎖認識配列を認識する：
【０１４１】
【化３】
2004535815.tif 000005
Ｎ．ＡｌｗＩのニック形成部位はまた、記号
【０１４２】
【化４】
2004535815.tif 000006
によって示される。両方のＮＥがＮｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ（ＮＥＢ）から入手可能である。Ｎ．ＡｌｗＩはまた、Ｘｕら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９８：１２９９０−５，２００１）に記載されるようなＩＩｓ型ＲＥ  ＡｌｗＩを変異させることによって調製され得る。
【０１４３】
ＮＥＲＳ内でニック形成する例示的なＮＥとしては、Ｎ．ＢｂｖＣＩ−ａおよびＮ．ＢｂｖＣＩ−ｂが挙げられる。２つのＮＥおよびＮＳについての認識配列（記号
【０１４４】
【化５】
2004535815.tif 000007
によって示される）は、以下のように示される：
【０１４５】
【化６】
2004535815.tif 000008
両方のＮＥがＮＥＢから入手可能である。
【０１４６】
さらに例示的なニック形成エンドヌクレアーゼとしては、制限しないが、Ｎ．ＢｓｔＳＥ  Ｉ（Ａｂｄｕｒａｓｈｉｔｏｖら，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（Ｍｏｓｋ）３０：１２６１−７，１９９６），操作されたＥｃｏＲ  Ｖ（Ｓｔａｈｌら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３：６１７５−８０，１９９６），操作されたＦｏｋ  Ｉ（Ｋｉｍら，Ｇｅｎｅ  ２０３：４３−４９，１９９７），Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ由来のエンドヌクレアーゼＶ（Ｈｕａｎｇら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．４０：８７３８−４８，２００１），Ｃｖｉ  Ｎｉｃｋａｓｅｓ（例えば、ＣｖｉＮＹ２Ａ，ＣｖｉＮＹＳＩ，Ｍｅｇａｂａｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｌｉｎｃｏｌｎ，Ｎｅｂｒａｓｋａ）（Ｚｈａｎｇら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２４０：３６６−７５，１９９８；Ｎｅｌｓｏｎら，Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．３７９：４２３−８，１９９８；Ｘｉａら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１６：９４７７−８７，１９８８），および操作されたＭｌｙ  Ｉ（すなわち，Ｎ．Ｍｌｙ  Ｉ）（Ｂｅｓｎｉｅｒ  ａｎｄ  Ｋｏｎｇ，ＥＭＢＯ  Ｒｅｐｏｒｔｓ  ２：７８２−６，２００１）。さらなるＮＥは、ＥｃｏＲ  Ｖ、ＡｌｗＩ，Ｆｏｋ  Ｉおよび／またはＭｌｙ  Ｉを操作するための方法に類似の方法を使用して、操作された他の制限エンドヌクレアーゼ（特に、ＩＩｓ型制限エンドヌクレアーゼ）によって得られ得る。
【０１４７】
本発明のテンプレート核酸のニック形成は、その半改変認識配列において二本鎖核酸をニック形成する任意の制限エンドヌクレアーゼによって実施され得る。「半改変認識配列」は、ＲＥの二本鎖認識配列であり、ここで、認識配列の一つの鎖が、少なくとも１つの誘導体化ヌクレオチド（例えば、α−チオデオキシヌクレオチド）を含み、これは、制限エンドヌクレアーゼによる１つの鎖（すなわち、誘導体化ヌクレオチドを含む鎖または誘導体化ヌクレオチドを含まないもう一方の鎖）の切断を妨げる。二本鎖半改変認識配列をニック形成する例示的なＲＥとしては、Ａｖａ  Ｉ、Ｂｓｌ  Ｉ、ＢｓｍＡ  Ｉ、ＢｓｏＢ  Ｉ、Ｂｓｒ  Ｉ、ＢｓｔＮ  Ｉ、ＢｓｔＯ  Ｉ、Ｆｎｕ４Ｈ  Ｉ、Ｈｉｎｃ  ＩＩ、Ｈｉｎｄ  ＩＩおよびＮｃｉ  Ｉが挙げられるが、これらに限定されない。半改変認識配列をニック形成するさらなるＲＥは、米国特許第５，６３１，１４７号（本明細書中において、その全体が参考として援用される）に記載される鎖保護アッセイによってスクリーニングされ得る。簡単に述べると、制限エンドヌクレアーゼ／切断部位を含む一本鎖テンプレートおよび認識／切断部位以外のテンプレートの一部に相補的なプライマーを合成する。次いで、テンプレートおよびプライマーを標識する（例えば、放射標識する）。プライマーおよびテンプレートをアニールし、そして改変ｄＮＴＰを、プライマーの伸長によって組み込み、半改変制限エンドヌクレアーゼ認識／切断部位を含む完全二本鎖分子を得る。次いで、この分子を、二本鎖切断に適切な条件下で制限エンドヌクレアーゼと合わせる。次いで、消化産物を変性電気泳動によって分析して、生成されるフラグメントのサイズによって、認識／切断部位がニック形成されたか、切断されたか、または切断されていないかを決定する。消化産物のサイズがまた、認識／切断部位の２つの鎖（すなわち、改変または未改変）のいずれが切断から保護されるかを決定するために使用される。
【０１４８】
半改変制限エンドヌクレアーゼ認識配列をニック形成するＲＥは、例えば、以下のような種々の会社から購入され得る：Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ  Ｉｎｃ．（Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ；ｗｗｗ．ｎｅｂ．ｃｏｍ）；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ；ｗｗｗ．ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ．ｃｏｍ），Ｐｒｏｍｅｇａ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ：ｗｗｗ．ｐｒｏｍｅｇａ．ｃｏｍ），およびＣｌｏｎｔｅｃｈ（Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ；ｗｗｗ．ｃｌｏｎｔｅｃｈ．ｃｏｍ）。市販でない制限酵素は、当該分野で入手可能な教示に基づいて単離および／精製され得る。テンプレート核酸をニック形成するための制限エンドヌクレアーゼを使用するための条件は、二本鎖核酸を切断するための条件と同じであっても、同じでなくてもよい。これらの条件は、当該分野で通常の技術を使用してＲＥのニック形成活性について最適化され得る（例えば、Ｗａｌｋｅｒ，ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ａｐｐｌ．３：１−６，１９９３を参照のこと；本明細書中でその全体が参考として援用される）。
【０１４９】
特定の実施形態において、ニック形成剤は、ＤＮＡ−ＲＮＡ二重鎖中のヌクレオチド配列を認識し得、そしてこの二重鎖の１つの鎖においてニック形成する。特定の他の実施形態において、ニック形成剤は、二本鎖ＲＮＡ中のヌクレオチド配列を認識し得、そしてＲＮＡの鎖においてニック形成する。
【０１５０】
（ｉｉ．伸長）
テンプレート核酸のニック形成は、ニック形成部位において３’末端を産生し、この部位から、テンプレートとしてニック形成されていない鎖を使用して、ＤＮＡポリメラーゼの存在下で伸長が実施され得る。ＤＮＡポリメラーゼが５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を欠き、鎖置換活性を有する場合、ニック形成部位におけるニック形成されたテンプレート核酸の伸長は、下流の一本鎖核酸フラグメントを置換する。このような置換は、一本鎖核酸フラグメントの蓄積、次いで増幅を可能にする。
【０１５１】
５’→３’エキソヌクレアーゼ欠損であるが、鎖置換活性を有する任意のＤＮＡポリメラーゼは、ニック形成されたテンプレート核酸から伸長され、引き続いてニック形成剤の連続的存在下において一本鎖核酸を増幅するために使用され得る。このようなＤＮＡポリメラーゼとしては、ｅｘｏ−Ｄｅｅｐ  Ｖｅｎｔ、ｅｘｏ−Ｂｓｔ、ｅｘｏ−Ｐｆｕ、およびｅｘｏ−Ｂｃａが挙げられるが、これらに限定されない。本発明において有用なさらなるＤＮＡポリメラーゼは、米国特許第５，６３１，１４７号（本明細書中において、その全体が参考として援用される）に記載される方法によってスクリーニングされ得るかまたは作製され得る。簡単に述べると、ポリメラーゼスクリーニング系は、二本鎖テンプレート中のニック形成部位において開始する下流鎖を置換する、ポリメラーゼの能力を試験する伸長アッセイである。これはまた、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性の存在または非存在について試験する。５’→３’エキソヌクレアーゼ活性は、当該分野において公知の慣用的な方法によって不活性化され得る（例えば、ＰＣＴ公開特許出願ＷＯ９２／０６２００）。ポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ活性を不活性化するための１つの方法は、ポリメラーゼに対する遺伝子をクローンし、エキソヌクレアーゼ活性を担うタンパク質ドメインをコードする遺伝子の一部分を同定し、そしてインビトロ変異によってそれを不活性化することである。あるいは、エキソヌクレアーゼ活性は、ポリメラーゼをプロテアーゼを用いて処理し、その後、所望の重合のみを示すフラグメントを単離し、そして活性を置換することによって、不活性化され得る。ＤＮＡポリメラーゼの鎖置換活性は、以下に記載のような鎖置換促進剤（ｆａｃｉｌｉｔａｔｏｒ）の存在によってさらに増強され得る。
【０１５２】
「鎖置換促進剤」は、ＤＮＡポリメラーゼによって触媒されるニック形成部位における３’末端からの核酸伸長の間、鎖置換を促進する任意の化合物または組成物である。本発明において有用な鎖置換促進剤としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ＢＭＲＦ１ポリメラーゼアクセサリーサブユニット（Ｔｓｕｒｕｍｉら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ６７：７６４８−５３，１９９３）、アデノウイルスＤＮＡ結合タンパク質（Ｚｉｊｄｅｒｖｅｌｄ  ａｎｄ  ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｖｌｉｅｔ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ６８：１１５８−６４，１９９４）、単純ヘルペスウイルスタンパク質ＩＣＰ８（Ｂｏｅｈｍｅｒ  ａｎｄ  Ｌｅｈｍａｎ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ６７：７１１−５，１９９３；Ｓｋａｌｉｔｅｒ  ａｎｄ  Ｌｅｈｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：１０６６５−９，１９９４）、一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質（Ｒｉｇｌｅｒ  ａｎｄ  Ｒｏｍａｎｏ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：８９１０−９，１９９５）、ファージＴ４遺伝子３２タンパク質（Ｖｉｌｌｅｍａｉｎ  ａｎｄ  Ｇｉｅｄｒｏｃ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｉｙ  ３５：１４３９５−４４０４，１９９６）、ウシ胸腺ヘリカーゼ（Ｓｉｅｇｅｌら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：１３６２９−３５，１９９２）およびトレハロース。
【０１５３】
さらに、上記のように、テンプレート核酸またはその消化産物のニック形成、またはニック形成剤によるニック形成されたテンプレート核酸の伸長産物の再ニック形成が、テンプレート核酸の残りの部分から容易に解離する短い一本鎖核酸フラグメントを生成する特定の実施形態において、鎖置換活性を有さず、そして／または５’〜３’エキソヌクレアーゼ欠損でないＤＮＡポリメラーゼがまた使用され得る。鎖置換活性を有さないＤＮＡポリメラーゼとしては、ｅｘｏ−Ｖｅｎｔ，Ｔａｑ、ＤＮＡポリメラーゼＩのＫｌｅｎｏｗフラグメント、Ｔ５  ＤＮＡポリメラーゼ、およびＰｈｉ２９  ＤＮＡポリメラーゼが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１５４】
短い一本鎖核酸フラグメントは、例えば、多くて、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０のヌクレオチドを含み得る。このような核酸フラグメントの長さの増加とともに、水素結合による、これらのフラグメントとテンプレート核酸の対応する相補鎖との間の相互作用は、それらが相補鎖から解離し得ないほど十分に強力であり得る。このような状況において、一本鎖核酸フラグメントの増幅は、鎖置換能力を有するＤＮＡポリメラーゼ、鎖置換促進剤の存在、または両方を必要する。テンプレート核酸の他の部分から容易に解離し得る増幅される一本鎖核酸フラグメントの最大長さはまた、ニック形成伸長反応条件に依存し得る。例えば、相補鎖から容易に解離し得る比較的高いニック形成伸長反応温度（例えば、５５℃）下で増幅される、一本鎖核酸フラグメントの最大長さは、比較的低い反応温度（例えば、３７℃または２２℃）下で増幅される長さより長い。
【０１５５】
本発明において有用なさらなる例示的なＤＮＡポリメラーゼとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ファージＭ２  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｍａｔｓｕｍｏｔｏら，Ｇｅｎｅ  ８４：２４７，１９８９）、ファージＰｈｉＰＲＤ１  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｊｕｎｇら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８４：８２８７，１９８７），Ｔ５  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｃｈａｔｔｅｒｊｅｅら，Ｇｅｎｅ  ９７：１３−１９，１９９１），Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ（Ｕ．Ｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ），ＰＲＤ１  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｚｈｕ  ａｎｄ  Ｉｔｏ，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．１２１９：２６７−７６，１９９４），９ｏＮｍＴＭＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）（Ｓｏｕｔｈｗｏｒｔｈら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９３：５２８１−５，１９９６；Ｒｏｄｒｉｑｕｅｚら，Ｊ．Ｍｏｌ．
Ｂｉｏｌ．３０２：４４７−６２，２０００），およびＴ４  ＤＮＡポリメラーゼホロ酵素（Ｋａｂｏｏｒｄ  ａｎｄ  Ｂｅｎｋｏｖｉｃ，Ｃｕｒｒ，Ｂｉｏｌ．５：１４９−５７，１９９５）。
【０１５６】
ニック形成剤がＲＮＡ−ＤＮＡ二重鎖のＤＮＡ鎖においてニック形成する特定の実施形態において、ＲＮＡ−依存性ＤＮＡポリメラーゼが使用され得る。ニック形成剤がＲＮＡ−ＤＮＡ二重鎖のＲＮＡ鎖においてニック形成する他の実施形態において、ＤＮＡプライマーから伸長するＤＮＡ−依存性ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、トリ骨髄芽球症ウイルス逆転写酵素（Ｐｒｏｍｅｇａ））が使用され得る。両方の場合において、標的ｍＲＮＡは、ｃＤＮＡに逆転写される必要はなく、そして標的ｍＲＮＡに少なくとも実質的に相補的なテンプレート核酸分子と直接的に混合され得る。
【０１５７】
（ｉｉｉ．一本鎖核酸の増幅）
ＤＮＡポリメラーゼによってニック形成部位の３’末端からのニック形成された核酸の伸長は、新たなニック形成部位を生成する。この新たなニック形成部位は、ＤＮＡポリメラーゼの存在下でニック形成剤によって再ニック形成され得、そして再伸長され得る。このようなニック形成伸長プロセスは、多くの回数繰り返され得、ニック形成部位の下流に一本鎖核酸フラグメントの増幅を生じる。
【０１５８】
好ましくは、ニック形成剤（例えば、ＮＥまたはＲＥ）およびＤＮＡポリメラーゼの両方が、ニック形成／伸長反応混合物中に存在し、そしてこの混合物が、ニック形成剤およびＤＮＡポリメラーゼの両方に対して適切であるように最適化される。例えば、Ｎ．ＢｓｔＮＢ  Ｉがニック形成剤であり、そしてｅｘｏ−Ｖｅｎｔが、ＤＮＡポリメラーゼである場合、ニック形成伸長緩衝液は、０．５×Ｎ．ＢｓｔＮＢ  Ｉ緩衝液および１×ＤＮＡポリメラーゼ緩衝液であり得る。例示的な１×Ｎ．ＢｓｔＮＢ  Ｉ緩衝液は、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１０  ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１５０ｍＭ  ＫＣｌ、および１ｍＭジチオトレイトール（２５℃でｐＨ  ７．５）であり得る。例示的な１×ＤＮＡポリメラーゼ緩衝液は、１０ｍＭ  ＫＣｌ、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（２５℃でｐＨ８．８）、１０ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４、２ｍＭ  ＭｇＳＯ４、および０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−ｌ００であり得る。
【０１５９】
また、好ましくは、本発明のニック形成条件および伸長反応は、等温条件下で実施される。本明細書中で使用される場合、「等温的」および「等温条件」とは、増幅の過程の間、反応の温度が、本質的に一定（すなわち、同じ温度で、または上側温度と下側温度との間の差が、２０℃以下である同じ狭い温度範囲内）に維持される１セットの反応条件をいう。本発明の増幅方法の利点は、上側温度と下側温度との間の温度をサイクルする必要がないことである。ニック形成反応および伸長反応の両方は、同じ温度または同じ狭い温度範囲内で行う。温度を維持するために使用される装置によって、反応混合物の温度が数℃変化し得る場合、このような揺らぎは、増幅反応において有害ではない。等温増幅のための例示的な温度としては、５０℃〜７０℃の間の任意の温度（すなわち、５１、５２、５３・・・６９）または５０℃〜７０℃、５５℃〜７０℃、６０℃〜７０℃、６５℃〜７０℃、５０℃〜５５℃、５０〜６０℃、５０℃〜６５℃の間の範囲の温度が挙げられるが、これらに限定されない。多くのＮＡおよびＤＮＡポリメラーゼが、上記例示的な温度において、または上記例示的な温度範囲内において活性である。例えば、Ｎ．ＢｓｔＮＢ  Ｉ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を使用するニック形成反応およびｅｘｏ−Ｂｓｔポリメラーゼ（ＢｉｏＲａｄ）を使用する伸長反応の両方は、約５５℃で実施され得る。約５０℃と７０℃との間で活性な他のポリメラーゼとしては、ｅｘｏ−Ｖｅｎｔ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）、ｅｘｏ−Ｄｅｅｐ  Ｖｅｎｔ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）、ｅｘｏ−Ｐｆｕ（Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅ）、ｅｘｏ−Ｂｃａ（Ｐａｎｖｅｒａ）およびＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｇｒａｄｅ  Ｔａｑ（Ｐｒｏｍｅｇａ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１６０】
上記のように、特定の好ましい実施形態において、ＮＡＲＳの１つの鎖の同一の配列が、テンプレート核酸を合成するためのＯＤＮＰ対の両方のメンバーにおいて存在する。これらの実施形態において、２つの相補的な一本鎖核酸フラグメントが、ＮＡＲＳおよびＤＮＡポリメラーゼを認識するＮＡの存在下で増幅される。以下に詳細に記載される方法によって増幅される両方の核酸フラグメントの検出は、本発明の方法の信頼性および／または正確性を増加する。
【０１６１】
上記のように、特定の実施形態において、増幅される一本鎖核酸は、比較的短く、ＤＮＡポリメラーゼの任意の鎖置換活性も、鎖置換促進剤も無しに、テンプレート核酸の他の部分から容易に解離し得る。増幅される一本鎖分子の短い長さは、有利であり得る。なぜなら、それは、増幅効率および速度を増加するからである。さらに、これは、鎖置換活性を有さないか、または５’→３’エキソヌクレアーゼ欠損でないＤＮＡポリメラーゼの使用を可能にする。これはまた、Ａ１が、質量分光測定分析のような特定の技術によって、最初の増幅プライマーとして使用されるＡ１分子の検出を容易にする。
【０１６２】
鎖置換活性も鎖置換促進剤も非存在下で、増幅される一本鎖核酸の解離は、増幅される一本鎖核酸とその相補鎖との間に形成される二重鎖の融解温度（Ｔｍ）が、ニック形成部位の３’末端を含むニック形成された生成物とその相補鎖との間に形成される二重鎖の融解温度よりも低く、そして増幅が上記２つの融解温度間にある温度で実施される、条件下で生じ得る。融解温度の計算は、当該分野において公知である。本発明について、核酸二重鎖融解温度は、Ｂａｌｄｉｎｏら，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１６８：７６１−７７７，１９８９の方法によって計算される。
【０１６３】
本発明はまた、規定の位置における標的核酸の遺伝子変異の多重決定のための方法を提供する。このような適用において、複数のテンプレート核酸が、ニック形成−伸長反応において一緒に合わされ得る。この組合せは、反応のための試薬、ニック形成剤およびＤＮＡポリメラーゼに関連する費用を低下させる。これはまた、増幅される一本鎖核酸分子についての引き続く検出／特徴付けのアッセイのスループットを増加する。
【０１６４】
（ｄ．増幅される一本鎖核酸フラグメントを特徴付けるための方法論）
上記のように、本発明は、標的核酸に由来する遺伝子変異を含む一本鎖核酸フラグメントが増幅される方法論を提供する。増幅される一本鎖核酸フラグメントの引き続く特徴付けによって、標的核酸における遺伝子変異の同一性を決定し得る。従って、本発明は、比較的大きな標的核酸から比較的小さな核酸フラグメントへ、遺伝子変異についての情報を移動する。この移動は、遺伝子変異の特徴付けを容易にする。なぜなら、小さな核酸フラグメントの直接的かつ完全な特徴付けが、しばしば、大きな核酸標的の適切な特徴付けよりも、より実施可能であるからである。
【０１６５】
本発明に従って、核酸フラグメント（すなわち、増幅された一本鎖核酸）の特徴付けは、直接的に、すなわち、フラグメントへのタグまたは標識の組み込みの必要性無しに、なされ得る。あるいは、いくつかの実施形態において、１つ以上の検出可能な標識を使用することが有利であり得る。両方の型の特徴付け方法が、以下により詳細に考察される。さらに、標的核酸を特徴付けるための方法に関して以下に記載される核酸フラグメントを特徴付けるための技術はまた、遺伝子変異を検出するための方法において使用され得る。
【０１６６】
（ｉ．直接的特徴付け）
本発明は、比較的大きな標的核酸から比較的小さな一本鎖核酸フラグメントへの目的のヌクレオチドについての情報（すなわち、遺伝子変異）を移動する。小さなフラグメントの直接的特徴付けは、多くの場合において、目的のヌクレオチドについての情報、特に、目的のヌクレオチドの同一性についての情報を提供する。例えば、小さな核酸フラグメントは、種々の質量分光測定方法論（本明細書中において以下に考察される）および紫外（ＵＶ）吸収によって、直接的検出に受け入れられる。
【０１６７】
本発明に従う多くの場合において、完全なヌクレオチド配列は、単一ヌクレオチドを除いて、それが形成される前でさえ、短い核酸フラグメントについて既知である。次いで、問題は、短い核酸フラグメント中の他の塩基を同時に検出する間に同時に作製される「ノイズ」よりも、目的のヌクレオチドを検出することになる。しかし、他のヌクレオチドの同一性が既知であり、そして検出方法におけるそれらのシグナルが既知である場合、このシグナルは、フラグメントについての全体のシグナルから減算され得、目的のヌクレオチドについての情報を残す。このアプローチは、基本的に、小さな核酸フラグメントを特徴付けるための質量分光法を使用する際に採用される。他の適切な方法（本明細書中において詳細に考察される）は、小さな核酸フラグメントの質量対電荷比を決定する工程、蛍光分極を測定する工程、および／またはフラグメントの紫外線（ＵＶ）吸収を定量化する工程を包含する。
【０１６８】
いくつかの場合において、小さな核酸フラグメントを特徴付けることは、一本鎖核酸フラグメントのサイズを単純に決定することを伴い、そしてこの情報から、当業者は、標的核酸が規定されたヌクレオチド遺伝子座に１つ以上の変異を含むか否かを推測し得る。一本鎖フラグメントの大きさが、当該分野において容易に入手可能な多くの方法によって決定され得ることが理解される。一本鎖核酸フラグメントのサイズおよび／または分子量を測定するための本明細書中に開示される例示的な方法としては、蛍光分極（ＦＰを含む蛍光）、質量分光法（ＭＳ）、紫外（ＵＶ）吸収、切断可能質量タグ、ＴａｑＭａｎ（均一）、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）、比色、ルミネセンス、および／または西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）に対する基質を使用する蛍光方法論、および／またはアルカリホスファターゼ（ＡＰ）、ならびに放射活性を使用する方法が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１６９】
本発明の特定の実施形態において、質量分光法（ＭＳ）は、標的核酸から目的のヌクレオチド遺伝子座を含む核酸フラグメント（好ましくは、短い核酸フラグメント）を特徴付けるために使用される。ＭＳは、検出の前の分画工程を排除することが望ましい適用において、特に有利であり得る。あるいは、ＭＳはまた、例えば、ＨＰＬＣおよびＤＨＰＬＣを含む液体クロマトグラフィー方法論のうちの１つのような本明細書中において以下に考察される分画方法論とともに使用され得る。代表的には、ＭＳ検出は、小さな核酸フラグメントに対するタグまたは標識の添加を必要としない。代わりに、核酸フラグメントは、質量分光計において適切に同定され、そして／または直接的に特徴付けられ得る。
【０１７０】
本明細書中において開示されるように、ＭＳは、１ヌクレオチドほどの少なさから数百ヌクレオチドほどの多さまでの小さな核酸フラグメントの検出のために特に適切であり得る。より好ましくは、ＭＳは、１〜５０ヌクレオチドのフラグメント、なおより好ましくは、１〜１７ヌクレオチドのフラグメントを同定および／または特徴付けるために使用される。
【０１７１】
感度は、少なくとも１ダルトンまでで達成され得る。核酸塩基における最小の質量差は、アデニンとチミジンとの間であり、この差は９ダルトンである。
【０１７２】
特に好ましいＭＳ方法論は、液体クロマトグラフィー−飛行時間型質量分析（ＬＣ−ＴＯＦ−ＭＳ）を使用する。ＬＣ−ＴＯＦ−ＭＳは、エレクトロスプレー（ＥＳ）または大気圧化学イオン化（ＡＰＣＩ）を用いる、大気圧イオン化（ＡＰＩ）分析のための直交加速度性飛時間型（ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ  ａｃｃｅｌｅｒａｔｉｏｎ  Ｔｉｍｅ−ｏｆ−Ｆｌｉｇｈｔ）（ＴＯＦ）ＭＳ検出器から構成される。ＬＣ−ＴＯＦ−ＭＳは、走査型四極子機器（ｓｃａｎｎｉｎｇ  ｑｕａｄｒｕｐｏｌｅ  ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ）と比べて、高質量分解能（５０００  ＦＷＨＭ）、高質量測定精度（５  ｐｐｍ以内）および非常に良好な感度（ピコモル量のＤＮＡポリマーを検出する能力）を提供する。ＴＯＦ機器は、一般的に、四極子よりも感度が高いが、より高価でもある。１つの実施形態において、固相抽出（ＳＰＥ）は、核酸フラグメントをＭＳ分析に供する前に、このフラグメントを精製するためにＬＣのかわりに使用され得る。
【０１７３】
現在の機器は、他の全てを受け入れず（ｒｅｊｅｃｔｉｎｇ）に１つの塊を連続して分析し得るので、ＬＣ−ＴＯＦ−ＭＳは、非常に効率的な負荷サイクル（ｄｕｔｙ  ｃｙｃｌｅ）を有する（これは、単一イオンモニタリング（ＳＩＭ）と称される）。ＬＣ−ＴＯＦ−ＭＳは、ＴＯＦ分析器内を通過するイオンの全てをサンプリングし、そして同時に試験する。この結果、高感度になり、１０倍と１００倍との間に感度を改善する定量的データを提供する。増大した分解能（５０００ＦＷＨＭ）および５ｐｐｍよりも良好な精度の質量測定は、９ａｍｕ（ダルトン）程度のヌクレオシド間の差異が正確に測定され得ることを意味する。ＴＯＦ質量分析器は、目的の全質量範囲にわたって同時に、全てのイオンの非常に高頻度のサンプリング（１０スペクトル／秒）を実行する。ＬＣ−ＴＯＦ−ＭＳの負荷サイクルは、高分解能スペクトルが迅速に連続して記録されることを可能にし、機器を非常に高効率な分離技術（例えば、狭小ボアＬＣ（ｎａｒｒｏｗ  ｂｏｒｅ  ＬＣ）、キャピラリークロマトグラフィーおよびキャピラリー通電クロマトグラフィー（ＣＥＣ））に適合可能にする。このイオンは、分析器内にパルスされ、任意の時点で存在するイオンの「スナップショット」を効率的にとる。
【０１７４】
ＥＳまたはＡＰＣＩの第一段階において、エアロゾル噴霧器は、サンプリングコーン（ｓａｍｐｌｉｎｇ  ｃｏｎｅ）を垂直に通過するように方向付けられ、この機器の中心軸から外される。イオンは、大きな液滴、不揮発性物質、粒子および交換可能なライナーで保護される排出ポート内に回収するために所望でない他の成分を残して、噴霧器からサンプリングコーン機器内に直交して抽出される。第２の直交性工程は、大気からサンプリングされたガス（およびイオン）の容積が従来のＡＰＩ供給源と比べて増加されることを可能にする。大気圧でのガスは、自由に広がる噴出を形成するため不完全真空内に機器を通してサンプリングされ、これは、周囲の減圧と比べて高性能な領域を示す。この噴出が従来のＡＰＩインターフェースの第２の開口部内に指向される場合、第２の開口部を通るガスの流れを増加させる。従って、ＭＳ−ＴＯＦにおいて適切な減圧を維持することは、このようなＬＣインターフェースにおいて、開口部の最大直径に制限を与える。イオンブロックの不完全真空におけるイオンは、ヘキサポールイオン架橋（ｈｅｘａｐｏｌｅ  ｉｏｎ  ｂｒｉｄｇｅ）中に静電的に抽出され、分析器にイオンを効率的に移送する。
【０１７５】
１つの局面において、ＴＯＦ質量分析器は、ＭＵＸ技術と連結され、単一ＬＣ−ＴＯＦ−ＭＳと平行して８つのＨＰＬＣカラムまで接続可能である。（Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ，Ｍａｎｃｈｅｓｔｅｒ  ＵＫ）。マルチプレックスエレクトロスプレー（ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｅｄ  ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ）（ＥＳＩ）インターフェースが、オンラインＬＣ−ＭＳのために使用され得、８つのＨＰＬＣカラムまたは平行して操作される液体引入口に至るまでに連続してサンプリングするために、インデックス付きのステッピングモーターを利用する。
【０１７６】
ＬＣ−ＴＯＦ−ＭＳの使用は、一般に、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦの使用よりも好ましい。なぜなら、ＬＣ−ＴＯＦ−ＭＳは、ポリマー分子量の分析用の定量的方法であるからである。ＬＣ−ＴＯＦ−ＭＳは、ポリマーを断片化せず、そしてマトリックス支援レーザーイオン化（ＭＡＬＤＩ）と比べて非常に穏やかなイオン化プロセスを使用する。全てのＭＡＬＤＩブラストが異なるので、このイオン化は定量的でない。しかしながら、ＬＣ−ＴＯＦ−ＭＳは、ポリマーについて異なるｍ／ｚ値を生じるが（実施例１および図７〜１７に開示されるように）、この特性は、バックグラウンドが減少するというさらなる利点を提供し、相補的な情報を提供する。
【０１７７】
１つの局面において、タンデムＭＳまたはＭＳ／ＭＳは、分子のイオンまたはフラグメントの構造決定に使用される。タンデムＭＳにおいて、目的のイオンは、第１分析器（ＭＳ−１）によって選択され、衝突セルにおいて不活性なガス原子と衝突され、そして衝突によって生成されたフラグメントは、第２分析器（ＭＳ−２）によって分離される。イオントラップおよびフーリエ変換実験において、これらの分析物は、１つの分析器において実施され、そして種々の事象は、空間ではなく時間において分離される。この情報は、ペプチド、小さなＤＮＡおよびＲＮＡのオリゴマーを配列決定するために使用され得る。
【０１７８】
１つの局面において、正確な質量測定（時折、「高分解能測定」と称される）は、サンプル分子のイオンまたはイオンフラグメントの元素組成決定のために使用される。本方法の基礎は、各元素が独特の質量欠損（ｍａｓｓ  ｄｅｆｅｃｔ）（整数の質量からの偏差）を有することである。測定値０は、内部較正（ＥＩまたはＣＩ様式）を用いて走査することによってか、またはピークマッチング（ＦＡＢ様式）によって実施される。元素組成は、測定された質量と、可能性のある多くの組成物の質量を比較することによって決定される。この方法は、８００Ｄａまでの質量を有するフラグメントについて非常に正確である。より多い質量、より高度な精度および／または予測された組成物についての知識が、明らかな元素組成を決定するために必要とされる。
【０１７９】
電子衝撃イオン化（Ｅｌ）は、熱に対して反応せず、相対的に低分子量である、相対的に揮発性のサンプルに対する質量分析において広く使用されている。このスペクトル（通常、多くのフラグメントイオンピークを含む）は、構造の特徴付けおよび同定にとって有用である。サンプルにおける少量の不純物は検出することが容易である。化学イオン化（ＣＩ）は、類似のサンプルにおいて適用される；分子イオンの存在量を増大させるために使用される。両方のイオン化方法について、分子量の範囲は５０〜８００Ｄａであり、従って、このフラグメントが明確に規定された範囲内である場合、これらのイオン化方法のいずれかは、本発明に従って使用され得る。稀な場合、高分子量のサンプルを分析することが可能である。低分解能での質量測定の正確さは、±０．１ダルトンであり、高分解能様式では、±５ｐｐｍである。
【０１８０】
高速原子衝撃イオン化（ＦＡＢ、すなわち、時折、液体第２イオン化ＭＳ、ＬＳＩＭＳと称される）は、ＥＩよりも柔軟なイオン化方法である。このスペクトルは、しばしば、イオン化にとって必要なマトリクス、数個のフラグメントからのピークおよびプロトン化サンプル分子または脱プロトン化サンプル分子についてのピークを含む。ＦＡＢは、感受性の不揮発性化合物の分子量を得るために使用される。この方法は、少量の不純物による抑制効果の傾向がある。この分子量の範囲は、１００〜４０００Ｄａである。正確な質量測定は、通常、ピークマッチングによってなされる。質量の精度は、ＥＩ、ＣＩにおいて得られるのと同程度であり、従って、これは、本明細書中に記載される方法によって調製されるフラグメントの特徴付けにおいて使用される、別の適切なイオン化方法である。
【０１８１】
マトリックス支援レーザーイオン化（ＭＡＬＤＩ）は、ペプチド、タンパク質、オリゴヌクレオチド、および小さな合成ポリマーのような生物学的供給源の他の化合物の分子量を決定するために使用されている。必要とされるサンプルの量は、非常に少ない（ｐモルまたはそれ以下）。この分析は、ｍ／ｚ３００，０００（まれな場合）の分子量までの線形様式（高質量、低分解能）、または１０，０００の分子量までの反射様式（低質量、高分解能）において実施され得る。この分析は、混入物に対して相対的に非感受性であり、従って、特徴付けがＭＳを含む場合、精製工程は特徴付けプロセスの一部分として一般的に必須ではない。しかし、特定の実施形態において、ＬＣまたはＳＰＥは、これらのフラグメントをＭＡＬＤＩに供する前に、一本鎖核酸フラグメントを分離または精製するために使用され得る。従来のＭＡＤＬＩの質量精度（０．１〜０．０１％）は、他の質量分析方法ほど高くない。しかし、ディレイドエクストラクションＴＯＦにおける最近の開発は、高い分解能および質量精度を可能にする。従って、ＭＡＬＤＩは、本発明の１つの局面において使用される。さらに、増幅された一本鎖核酸分子が、液体クロマトグラフィーを介して最初に精製または分離される実施例において、ＭＡＬＤＩは、質量分析の前に液体クロマトグラフィーの複数の画分をプーリングし得、従って高スループットを可能にする。
【０１８２】
エレクトロスプレー（ＥＳＩ）は、溶液中のサンプルから直接的に分子イオンを産生し得る。低分子量および高分子量の生体高分子（ペプチド、タンパク質、炭水化物、およびＤＮＡフラグメント）、ならびに脂質にとって使用可能である。ＭＡＬＤＩとは違って、パルスされる場合、ＥＳＩは、ＨＰＬＣまたはキャピラリー電気泳動と適合し得る連続したイオン化方法である。複数に荷電したイオンが通常生成される。ＥＳＩは、ＭＡＬＤＩに相補的であると考えられ得、そして本発明にしたがって使用され得る。サンプルは、溶解性、溶液中で安定、極性、および比較的清潔（不揮発性の緩衝液、界面活性剤、塩などを含まない）であり得る。
【０１８３】
電子捕捉（時折、陰イオン化学イオン化またはＮＩＣＩと称される）は、ハロゲン、ＮＯ２、ＣＮなどを含む分子を代用し、そして分析物が、高電子捕捉部分（例えば、フッ素原子またはニトロベンジル基）を含むように誘導されることを、通常必要とする。このような部分は、一般的に、単離後そして質量分析前に標的分析物に挿入される。ＮＩＣＩ分析の感度は、ＰＣＩ分析またはＥＩ分析よりも、一般的に２〜３桁良好である。小さなフラグメント化は、ＮＩＣＩの間に生じる。従って、電子補足は、核酸フラグメントが必要とされる化学団または原子団を有する場合、あるいはこのような団が以下に議論されるようなフラグメントに添加される場合に使用され得る。
【０１８４】
種々の質量分析は、イオン化されているサンプルを分析するために使用され得る。このような質量分析としては、時間飛行、四極子、磁場セクターおよびイオントラップ質量分析器が挙げられる。イオン化方法および質量分析器の種々の型の一般的な議論については、Ｓｉｕｚｄａｋ，Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９９６を参照のこと。
【０１８５】
（ｉｉ．間接的な特徴付け）
本発明のいくつかの実施形態において、短い一本鎖核酸フラグメントまたはその反応生成物（例えば、その短い核酸フラグメントの一部分または完全な相補鎖）に、１つ以上の検出可能な標識を添加することは利点であり得る。このような標識は、このフラグメントの特徴付けを促進し得、それによってフラグメント内の目的のヌクレオチドおよび／または一般的な改変の同定を促進し得る。
【０１８６】
表１および２は、例示的な標識および検出器をそれぞれまとめている。これらは、一般的に、小さな核酸フラグメントを検出する方法において使用するのに適切であり、そして本明細書中に記載される方法によって生成される核酸フラグメントを検出するために使用され得る。
【０１８７】
（表１）
（小さな核酸フラグメントを検出する方法における使用に適切な標識）
2004535815.tif 000009
（表２）
（小さな核酸フラグメントを検出する方法における使用に適切な検出器）
2004535815.tif 000010
これらのタグおよび標識のための検出器は、一般的および非一般的な機器において利用可能である。一般的な機器は、通常、９６ウェルまたは３８４ウェル形式のマイクロプレートを読み取り、そしてマルチカラー（４〜６の蛍光タグ）の読み取りが可能なプレートリーダーである。これらの機器は、時間分解蛍光（ＴＦＲ）または蛍光分極のようなより特異的な測定を実施するように特別注文されたバージョンにおいて見出される。ＰＡＧＥ配列決定のための検出器およびバンドルドキャピラリー機器（ｂｕｎｄｌｅｄ  ｃａｐｉｌｌａｒｙ  ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ）は、高度に専門的であり、一般的でない。一般的な質量分析器であるＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ、エレクトロスプレー−ＴＯＦおよびＡＰＣＩ−四極子（およびイオントラップ機器を含むそれらの組み合わせ）は、多能なオープン−エンド型機器（ｏｐｅｎｅｄ−ｅｎｄｅｄ  ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ）である。適切なソフトウェアパッケージは、コンビナトリアル化学適用のために開発され、そして本明細書中に記載されるようなフラグメントの検出における使用に容易に適合され得る。シンチレーションカウンターは、ラジオアイソトープを用いることを必要とするが、広範囲なアッセイ形式に適用され得る。
【０１８８】
以下は、例示的な間接的特徴付け方法を記載する。しかし、本発明は、これらの例示に限定されない。小さな核酸フラグメントを特徴付け、およびそれによる規定された領域でヌクレオチドの同定を決定するのに適切な、当該分野で公知の任意の技術が、本発明において使用され得る。
【０１８９】
（ａ）配列決定
本発明の１つの局面において、一本鎖核酸フラグメントは、完全なヌクレオチド配列分析を実施することによって特徴付けられる。多くの技術が、塩基配列情報を得るために核酸フラグメントにおいて塩基の各々を同定することは当該分野において公知である。例えば、２つの異なるＤＮＡ配列決定方法（１９７７年に開発され、そして他の名前もあるが、一般的に「サンガーの配列決定」および「マキサム−ギルバートの配列決定」として公知である）は、今日でも未だ広く使用され、そして当業者に周知である。例えば、Ｓａｎｇｅｒ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）７４：５４６３，１９７７）ならびにＭａｘａｍおよびＧｉｌｂｅｒｔ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）７４：５６０，１９７７）を参照のこと。両方の方法は、特定の位置から始まるより短いフラグメントの集団を生成し、そして配列決定されるべき核酸フラグメントにおいて見出される全ての塩基において終結する。より短い核酸フラグメントは、ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分離され、そしてＤＮＡ塩基（アデニン、シトシン、チミン、グアニン；それぞれＡ、Ｃ、Ｔ、Ｇとしても公知である）の順序は、ゲルのオートグラフィから読み取られる。これらの方法は、一般的に、相対的に長い一本鎖核酸フラグメントを用いてより成功する。
【０１９０】
自動化ＤＮＡ配列決定方法もまた使用され得る。このような方法は、長い核酸分子および短い核酸分子の両方の配列を使用するために広く市販されている。１つのアプローチにおいて、これらの方法は、放射標識された成分の代わりに蛍光標識されたプライマーまたはｄｄＮＴＰターミネータを使用する。ロボット構成成分は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術（線形増幅ストラテジーの開発を導く）を利用し得る。現在の市販の配列決定は、全て４つのジデオキシターミネータ反応が１つのレーン上で実施され得る。各ジデオキシターミネータ反応は、単独の蛍光プライマー（各塩基型：Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇについて１つの発蛍光団）によって示される。一つの鋳型ＤＮＡ（すなわち、ＤＮＡサンプル）のみが、１つのレーンあたりに示される。現在のゲルは、６４の異なるレーンにおいて６４サンプルまで同時に電気泳動し得る。異なるｄｄＮＴＰ−終結フラグメントは、光によるゲルレーンの照射によって検出され、その後、発蛍光団からの発光の検出が続く。各電気泳動工程は、約４〜６時間長である。各電気泳動分離は、約４００〜６００ヌクレオチド（ｎｔ）まで分解し、それゆえ、配列決定機あたり１時間あたり、約６０００ｎｔが配列決定され得る。
【０１９１】
Ｇｉｌｂｅｒｔは、自動化ＤＮＡ配列決定機を記載しており（ＥＰＡ，９２１０８６７８．２）、これは、オリゴマー合成機、膜上アレイ、ハイブリダイゼーションを検出する検出器およびセントラルコンピュータから構成される。合成機は、任意の予測された配列の複数のオリゴマーを合成および標識する。このオリゴマーは、膜上に固定されたＤＮＡをプローブするために使用される。この検出器は、ハイブリダイゼーションパターンを同定し、次いで配列を構築するセントラルコンピュータにこれらのパターンを送り、次いでオリゴマーの合成の次回ラウンドの配列を予測する。反復プロセスを通して、ＤＮＡ配列は、自動化様式において得られ得る。このアプローチは、本発明に従って短い核酸フラグメント（二重鎖またはより一般的に一本鎖のいずれか）を特徴付けるために使用され得る。
【０１９２】
核酸の単量構成物の研究に関する質量分析の使用もまた、記載されている（Ｈｉｇｎｉｔｅ，「Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ」、ＷａｌｌｅｒおよびＤｅｒｍｅｒ（編），Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，第１６章，５２７頁，１９７２）。まとめると、より長いオリゴマーについて、有意に早い成功が、１４塩基長までの保護された合成オリゴヌクレオチド、および４塩基長までの保護されていないオリゴヌクレオチドについてのプラズマ脱離によって得られた。タンパク質と同様に、オリゴヌクレオチドに対するＥＳＩ−ＭＳの適用が実証されている（Ｃｏｖｅｙら、Ｒａｐｉｄ  Ｃｏｍｍ．ｉｎ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃ．２：２４９−２５６，１９８８）。これらの種は、溶液においてイオン化され（酸性架橋ホスホジエステルおよび／または終末リン酸部分で荷電される）、そしてナトリウム添加物に加えて、ガス相の複数の荷電した分子アニオンを得る。核酸特徴付けのためのこれらのアプローチは、本発明に従って使用され得る。
【０１９３】
一般的な酵素ｄｄＮＴＰ技術による１００塩基未満の核酸の配列決定は、より長い核酸鋳型の配列決定よりも複雑であり、その結果、化学的分解が時折使用される。しかし、化学的分解方法は、約５０ｐｍｏｌの放射性３２Ｐ末端標識された物質、６つの化学的工程、電気泳動分離、およびフィルム暴露を必要とする。小さなオリゴヌクレオチド（＜１４ｎｔ）について、本発明に従って特徴付けされることが必要とされ得、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）およびフーリエ変換（ＦＴ）質量分析（ＭＳ）の組み合わせは、より早く、そしてより感受性であり、そして本発明にとって好ましい方法である。高度（１０５）な分解能で測定された複数の荷電したイオンの解離産物は、連続した骨格切断を示し、ピコモル以下の量のサンプルについて１分未満で完全な配列を提供する（Ｌｉｔｔｌｅら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１６：４８９３，１９９４）。分子量測定のために、ＥＳＩ／ＭＳは、より大きなフラグメントに伸長される（Ｐｏｔｉｅｒら、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２２：３８９５，１９９４）。ＥＳＩ／ＦＴＭＳは、１００マーほどの大きさのヌクレオチドにおける配列決定および点変異のための伝統的な方法に加えてさらに有益（ｖａｌｕａｂｌｅ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）であるようである。最近、スペクトルデータは、より感受性のＥＳＩ供給源を使用して３×１０−１３モルの５０マーをロードすることによって得られる（Ｖａｌａｓｋｏｖｉｃ，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．６８：２５９，１９９５）。
【０１９４】
核酸分子についての完全またはほぼ完全な塩基配列情報を得るための他の方法は、以下の参考文献に記載されている：Ｂｒｅｎｎｅｎら（Ｂｉｏｌ．Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，２１９頁，１９９０）；米国特許第５，４０３，７０８号；ＰＣＴ特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９４／０２９３８；およびＰＣＴ特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９４／１１９１８。これらの同定された特徴付け技術の各々は、本明細書中に記載されるように生成された一本鎖核酸フラグメントを特徴付けるために使用され得る。
【０１９５】
（ｂ）流体処理（ｆｌｕｉｄ  ｈａｎｄｌｉｎｇ）
本明細書中で使用される場合、用語「流体処理」は、マイクロタイタープレートベースであり、そして蛍光、蛍光分極、発光、放射能（シンチレーションカウンター）、または比色読み出しを使用するアッセイをいう。流体処理は、特徴付け方法が短い核酸フラグメントの改変を使用する場合（例えば、タグまたは標識が短い核酸フラグメントに取り込まれる場合）に、有用であり得る。これらのアッセイは、可溶性基質由来の可溶性比色生成物または不溶性比色生成物あるいは感受性発光生成物を生成し得る、西洋ワサビペルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼのような酵素の使用によって増幅され得る。これらのアッセイは、大きく動的な範囲（６〜８ｌｏｇ）を有し、強固になり得る。マイクロプレートを使用する流体処理は、十分なスケールであり、３８４ウェルプレートの使用によって部分的に縮小化されている。流体処理は、市販のロボット光学および読み取りシステム（例えば、蛍光光度計およびプレートリーダー）と特に互換性がある。このデータは、容易に記録されそして操作される。
【０１９６】
（ｉｉｉ．分画方法）
本発明に従って、小さな核酸フラグメントは、必要に応じて、検出の工程前に分画の工程を受け得る。この分画工程は、目的の小さなフラグメントから所望でない不純物を単に取り除き得、フラグメントの特徴付けをより簡便および／またはより正確にし得る。この型の分画工程は、精製と称され得る。あるいは、さらに、この分画は、別の方法（例えば、クロマトグラフィー）により核酸を分離し得、そしてこの検出技術は、（例えば、核酸がクロマトグラフィーカラムから溶出されるか否かを決定するために紫外線検出を使用して）核酸が特に時間および空間において存在するか、または存在しないかを、単に決定する。
【０１９７】
従って、使用した特定の検出方法に依存して、検出方法は、小さな核酸フラグメントの分画についての１つ以上の方法と連結するという利点があり得る。以下に議論されるように、このような分画方法としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：電気泳動（ポリアクリルアミドゲル電気泳動またはアガロースゲル電気泳動およびキャピラリー電気泳動を含む）、ならびに液体クロマトグラフィー（ＬＣ）（高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）および変性高圧液体クロマトグラフィー（ＤＨＰＬＣ）を含む）。
【０１９８】
（ａ）ゲル電気泳動
本明細書中に使用される場合、用語「電気泳動」は、一般的に、電場における核酸の移動に基づく分離技術をいう。負に荷電した核酸は、陽極方向に移動し、そして正に荷電した核酸は、陰極方向に移動する。荷電した種は、全ての電荷、サイズ、および形状に依存して異なる移動速度を有し、従って分離され得る。
【０１９９】
電気泳動装置は、高圧電源、電極、緩衝液、緩衝液の支持体（例えば、ポリアクリルアミドゲル、またはキャピラリーチューブ）からなる。オープンキャピラリーチューブは、多くの型のサンプルについて使用され、そして他のゲル支持体は、通常、生物学サンプル（例えば、タンパク質混合物または核酸フラグメント）について使用される。
【０２００】
核酸フラグメントについての最も強力な分離方法は、ＰＡＧＥであり、一般的にスラブゲル形式である。現在の技術の主な限定は、配列決定反応において生じる、核酸フラグメントのゲル電気泳動の実行に必要な比較的長い時間である。増加した大きさ（１０倍）は、超薄ゲルを利用するキャピラリー電気泳動の使用を用いて達成され得る。
【０２０１】
種々の形態のキャピラリー電気泳動（ＣＥ）（溶液のみ（ｆｒｅｅ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）、等速電気泳動、等電点電気泳動法、ＰＡＧＥおよびミセル動電学的「クロマトグラフィー」を含む）は、非常に小さいサンプル容積の複合混合物の、迅速な、高分解能分離について適切な技術である。固有の感度と質量分析の選択性を組み合わせ（ＣＥ−ＭＳ；以下を参照のこと）において、ＣＥは、生物分析のための強力な技術である。本明細書中に開示される方法において、これら２つの方法の接点は、現在の配列決定方法（ｃｕｒｒｅｎｔ  ｒａｔｅ  ｍｅｔｈｏｄ  ｏｆ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）より優れたＤＮＡ配列決定方法を提供する。
【０２０２】
代替的な実施形態によって、ＣＥは、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）流速と組み合わせて使用され得る。キャピラリーゾーン電気泳動（ＣＺＥ）およびキャピラリー等速電気泳動の両方と、ＥＳＩに基づく四極子質量分析との組み合わせが記載されている。（Ｏｌｉｖａｒｅｓら、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．５９．１２３０（１９８７）；Ｓｍｉｔｈら、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．６０：４３６（１９８８）；Ｌｏｏら、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．１７９：４０４（１９８９）；Ｅｄｍｏｎｄｓら、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａ．４７４：２１（１９８９）；Ｌｏｏら、Ｊ．Ｍｉｃｒｏｃｏｌｕｍｎ  Ｓｅｐ．１：２２３（１９８９）；Ｌｅｅら、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇ．４５８：３１３（１９８８）；Ｓｍｉｔｈら、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇ．４８０．２１１（１９８９）；Ｇｒｅｓｅら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１１：２８３５（１９８９）（これらの各々は、本明細書中に参考としてその全体が援用される））。小さな核酸は、良好な（フェムトモル）感度を有するＣＺＥ分析に容易に従い得る。
【０２０３】
ポリアクリルアミドゲル（例えば、上に議論されるような）は、ＣＥ方法に適合され得る。１メートルあたりの顕著なプレート数は、架橋されたポリアクリルアミドで達成される。（例えば、Ｃｏｈｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ  ８５：９６６０（１９８８）１メートルあたり１０＋７プレートを報告する、を参照のこと）。記載されるこのようなＣＥカラムは、核酸（特定のＤＮＡ）配列決定のために使用され得る。ＣＥ方法は、標準的な配列決定機におけるスラブゲル電気泳動より原則的に２５倍速い。例えば、１時間あたり約３００塩基が読み取られ得る。スラブゲル電気泳動の分離速度は、過剰な熱生成を伴わずにゲルに印加され得る電場の大きさによって限定される。従って、ＣＥのより速い速度は、より高い電界強度（ＣＥにおいて３００Ｖ／ｃｍ対スラブゲル電気泳動において１０Ｖ／ｃｍ）の使用によって達成される。キャピラリー形式は、アンペア数を減少させ、従って力および結果として熱を生成する。
【０２０４】
本発明の代替の実施形態において、複数のキャピラリーは、スループットを増加させるために平行して使用され得、そして高スループット配列決定と組み合わせて使用され得る。（Ｓｍｉｔｈら、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．１８：４４１７（１９９０）；Ｍａｔｈｉｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ  ３５９：１６７（１９９２）；Ｈｕａｎｇら、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．６４：９６７（１９９２）；Ｈｕａｎｇら、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．６４：２１４９（１９９２））。キャピラリー電気泳動の主要な不利点は、キャピラリー上にロードされ得るサンプルの限定された容積である。この限定は、キャピラリーをロードする前に大きなサンプル容積を濃縮することによって（検出において１０倍増加よりも大きな利点を伴って）、回避され得る。本発明の１つの局面において、小さな一本鎖核酸フラグメントは、特徴付けの前に予め濃縮される。
【０２０５】
ＣＥにおける前濃縮のための適切な方法は、サンプルスタッキングである。（Ｃｈｉｅｎら、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．６４：４８９Ａ（１９９２））。サンプルスタッキングは、サンプル緩衝液とキャピラリー緩衝液との間のマトリクスの差異（すなわち、ｐＨおよびイオン強度）に依存し、その結果、サンプルゾーンにわたる電場は、キャピラリー領域よりも高い。サンプルスタッキングにおいて、低濃度の緩衝液中の大容積のサンプルは、キャピラリーカラムの上部にて前濃縮が導入される。キャピラリーは同じ組成であるが、高濃度の緩衝液で満たされる。サンプルイオンがキャピラリー緩衝液およびより低い電場に達する場合、それらは濃縮ゾーン内にスタッキングされる。サンプルスタッキングは、１〜３桁の大きさまで増加した検出能力を有する。
【０２０６】
あるいは、前濃縮は、分析物のフリーゾーンＣＥ分離の前に、等速電気泳動（ＩＴＰ）に適用することによって達成され得る。ＩＴＰは、代表的にＣＥで用いる低ｎＬの注入容積とは対照的に、μｌの容積のサンプルがキャピラリー上にロードされることを可能にする電気泳動技術である。この技術は、より高い移動とより低い移動の２つの緩衝液（リーディング電気分解およびトレーリング電気分解）との間へのサンプルの挿入、続く分析物の挿入に依存する。この技術は、本来の濃縮技術であり、ここで、この分析物は、同じ速度で移動する純粋なゾーンで濃縮される。この技術は、代表的に上に開示されるスタッキング方法よりもあまり好ましくない。なぜなら、リーディング電気分解およびトレーリング電気分解のいくつかの選択が必要であり、そして分離プロセスの間、カチオン種またはアニオン種のみを分離し得るからである。
【０２０７】
核酸配列決定プロセスの中心は、核酸フラグメントを用いて達成され得る、顕著に選択的な電気泳動的分離である。分離は、単一ヌクレオチドのみによる配列決定で異なるフラグメントを用いて慣用的に達成される。この方法は、１０００ｂｐ長までのフラグメントの分離に適切である。
【０２０８】
さらなる利点は、切断可能なタグを用いる配列決定によって達成され得る。例えば、欧州特許出願番号０  ８６８  ５３５；０  ８４０  ８０４；および０  ８５０  ３２０、および米国特許第６，０２７，８９０号を参照のこと。切断可能なタグを用いる場合、核酸フラグメントがＰＡＧＥによって分離されるとき、スラブゲル形式を使用する必要は存在しない。多くのサンプルは組み合わされる（４〜２０００）ので、現在の色素プライマーまたは色素ターミネータの方法（すなわち、ＡＢＩ３７３配列決定機）を用いる場合のように平行してサンプルを泳動する必要はない。平行レーンで泳動する理由はないので、スラブゲルを使用する理由も存在しない。従って、電気泳動的分離方法についてチューブゲル形式を使用し得る。チューブゲル形式がスラブゲル形式のプレートにおいて使用される場合、顕著な利点が得られることが示されている。（Ｇｒｏｓｓｍａｎら、Ｇｅｎｅｔ．Ａｎａｌ．Ｔｅｃｈ．Ａｐｐｌ．９：９（１９９２））。これは、スラブゲルと比べてチューブ形式のジュール熱を分散させる能力が高いことに起因し、これは、より速い泳動時間（５０％まで）、および高分子量核酸フラグメント（１０００ｎｔより大きい）のより高い分解能を生じる。長い読み取りは、ゲノム配列決定において重要である。従って、配列決定における切断可能なタグの使用は、ユーザーが最も効率的でかつ感受性の核酸分離方法（最も高い分解能もまた有する）を使用することを可能にするというさらなる利点を有する。
【０２０９】
上で議論されるように、ＣＥは、核酸配列決定、特に、ＤＮＡ配列決定、法医学分析（ｆｏｒｅｎｓｉｃ  ａｎａｌｙｓｉｓ）、ＰＣＲ産物分析およびフラグメントサイズ処理の制限において強力な方法である。ＣＥは、慣用的なスラブＰＡＧＥよりも速い。なぜなら、より高いポテンシャル場を有するキャピラリーゲルが適用され得るからであるが、１つのゲルあたりたった１つのサンプルだけが処理され得るという欠点を有する。従って、本発明に従う代替的な実施形態によって、マイクロファブリケーション（ＭＦＤ）は、平行に複数のサンプルを分析する能力を有する、より速い分離時間のＣＥと組み合わせて使用される。
【０２１０】
ＭＦＤは、約１００μｍのレーン寸法を縮小化することによって電気泳動における情報密度の増加を可能にする。キャピラリーアレイの電流密度は、キャピラリー管の外側の直径に限定される。チャネルの微小製造（ｍｉｃｒｏｆａｂｒｉｃａｔｉｏｎ）は、アレイのより高い密度を提供する。微小製造はまた、ガラスファイバーを用いた可能でない物理的アセンブリを可能にし、そしてチップ上の他のデバイスに直接的にチャネルを結合する。ガスクロマトグラフおよび液体クロマトグラフは、シリコンチップ上で組みたてられるが、これらのデバイスは、広範に使用されない。（Ｔｅｒｒｙら、ＩＥＥＥ  Ｔｒａｎｓ．Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｄｅｖｉｃｅ  ＥＤ−２６：１８８０（１９７９）およびＭａｎｚら、Ｓｅｎｓ．Ａｃｔｕａｔｏｒｓ．Ｂ１：２４９（１９９０））。いくつかのグループは、ＭＦＤ上の蛍光色素およびアミノ酸を分離することを報告した（Ｍａｎｚら、Ｊ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  ５９３：２５３（１９９２）；Ｅｆｆｅｎｈａｕｓｅｒら、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．６５：２６３７（１９９３））。
【０２１１】
写真平版および化学的エッチングを使用して、ガラス基板上の多数の分離チャネルを作製し得る。このチャネルは、ヒドロキシエチルセルロース（ＨＥＣ）分離マトリックスで満たされる。ＤＮＡ制限フラグメントは、２分以下で分離され得る（Ｗｏｏｌｌｅｙら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９１：１１３４８（１９９４））。
【０２１２】
（ｂ）液体クロマトグラフィー（ＬＣ）
液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣおよびＤＨＰＬＣを含む）は、上記の検出方法論（例えば、蛍光偏光、質量分析および／または電子イオン化法）の１つと組み合せて使用され得る。あるいは、ＬＣ、ＨＰＬＣおよび／またはＤＨＰＬＣは、ＵＶ検出方法論と組み合せて使用され得る。使用される検出方法論に関係なく、液体クロマトグラフィーは、検出の前に不揮発性化合物の複合混合物の分離を提供する。本発明の特定の実施形態において、ＬＣは単独で、互いから小さい核酸分子を同定し、そして／または区別するために使用され得、従って、標的核酸中の目的のヌクレオチドの同定を可能にする（本明細書中に記載される標的核酸から調製された短い核酸フラグメントを特徴付けることに基づく）。
【０２１３】
著しく、２つの核酸分子は、同じ長さ（すなわち、同じ数のヌクレオチドを含む）であり得、そして１つのヌクレオチドの位置でそれらの配列においてのみ互いに異なり、そしてなおこれらの２つの分子は、本発明によって実行された液体クロマトグラフィー分析から得られた保持時間に基づいて、互いに区別し得る。同じ長さおよび同じヌクレオチド組成物であり、そしてヌクレオチドが整列されるオーダーにおいてのみ互いに異なる２つの核酸分子は、本発明に従って実行された液体クロマトグラフィー分析から得られた保持時間に基づいて互いと区別され得る。１つの例のように、核酸分子中の２つのヌクレオチドのオーダーは、種々の核酸分子を提供するように変換され得、そしてオリジナルの核酸分子および改変核酸分子は、液体クロマトグラフィー分析によって観察されるようなそれらの異なる保持時間によって区別され得る（例えば、実施例１の８マーＢおよび８マーＣを参照のこと）。２つの類似の核酸分子を区別するための保持時間を使用し得る重要な因子は、クロマトグラフィー分析の移動相の選択であり、従って、この主題は、以下に詳細に記載される。
【０２１４】
移動相は、２つの緩衝液（緩衝液Ａおよび緩衝液Ｂ）から形成される勾配である。すなわち、核酸分子は、カラムに適用された後、緩衝液Ａ（すなわち溶出緩衝液は大部分が緩衝液Ａである）は、分子を溶出するために使用される。クロマトグラフィーの過程の間、緩衝液Ｂは、緩衝液Ａにゆっくりと（増加）添加され、その結果、溶出緩衝液により、緩衝液Ｂに特異的な成分がゆっくり多くなる。緩衝液Ａは、（１つ以上の）アンモニウム塩の水溶液であるが、緩衝液Ｂは、（１つ以上の）アンモニウム塩の有機溶液である。本明細書中で言及される場合、水溶液は必然的に水を含むが、有機成分（例えば、有機溶媒）を含む不溶性成分もまた含み得る。本明細書中で言及される場合、有機溶液は、必然的に有機物質を含むが、代表的に、無機成分（例えば、溶媒としての水）を含む非有機成分を含み得る。緩衝液Ａおよび／または緩衝液Ｂに使用される水は、好ましくは、ＨＰＬＣ等級の水であり、水の純度は、当該分野で周知である。
【０２１５】
緩衝液Ａ中に存在するアンモニウム塩は、緩衝液Ａ中に存在するアンモニウム塩と同一である必要はないが、本発明の１つの局面において、緩衝液Ａおよび緩衝液Ｂは、同じアンモニウム塩を含む。緩衝液Ａまたは緩衝液Ｂのいずれかは、他方とは独立して、１種類を超えるアンモニウム塩を含み得るが、本発明の１つの局面において、緩衝液Ａおよび緩衝液Ｂは、各々、１種類のアンモニウム塩構造を含む。本発明の１つの局面において、緩衝液Ａおよび緩衝液Ｂの各々は、１種類のアンモニウム塩を含み、さらに、これら２種類の緩衝液は、同じアンモニウム塩を含む。
【０２１６】
緩衝液Ａについて言及すると、本発明の１つの局面において、水は、この緩衝液中に存在する唯一の溶媒である。本発明の他の局面において、水は、緩衝液Ａ中に存在する溶媒の総容積の少なくとも９９％、少なくとも９７％、少なくとも９５％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、または少なくとも８０％を構成する。緩衝液Ｂについて言及すると、本発明の１つの局面において、この緩衝液は、有機溶媒および水の両方を含む。代表的には、水は、必ず緩衝液Ｂ中に、この緩衝液にアンモニウム塩を溶解するために存在する。本発明の種々の局面において、有機溶媒は、緩衝液Ｂ中に存在する溶媒の総容積の７５％まで、６０％まで、４５％まで、３０％まで、または１５％までを構成し、水は、溶媒の残りの容積を与える。本発明の種々の局面において、緩衝液Ｂ中の有機溶媒：水の容積比は、５〜７５：９５〜２５、または１０〜５０：９０〜５０；または１５〜４０：８５〜６０；または２０〜３５：８０〜６５であり、有機溶媒および水の合計は、１００に等しい。
【０２１７】
有機溶媒に関して、これは、好ましくは、水と非常に混和性の溶媒である。好ましくは、この有機溶媒は、水および有機溶媒の総容積に基づいて、少なくとも約５容積％の程度まで水と混和性であり、種々の局面において、１０容積％、２０容積％、３０容積％、４０容積％、または５０容積％の程度まで混和性である（すなわち、水および有機溶媒の等容積が、均一な溶液を形成する）。本明細書中に言及されるように、溶媒は、少なくとも１つの炭素を含む限り、「有機（性）」である。この有機溶媒は、好ましくは、室温（周囲温度、標準的温度）にて、および部屋（周囲および標準的）圧力にて液体である。このような溶媒は、当該分野で周知である。１つの局面において、この有機溶媒は、室温においてアルコール（すなわち、有機液体）であり、次いで、少なくとも１つのヒドロキシル（ＯＨ）基を含む。例示的なアルコールとしては、メタノール、エタノール、エチレングリコール、イソ−プロパノール、ｎ−プロパノール、プロピレングリコール、およびグリセロールが挙げられるが、これらに限定されない。代表的には、アルコール中に存在する炭素原子数が増加するにつれて、アルコールは、水中にてあまり可溶性でなくなり、アルコールは、水との効率的な混和性を具体化するために、１つを超えるヒドロキシル基を含まなければならない。別の局面において、この有機溶媒は、アセトニトリルである。なお別の局面において、この有機溶媒は、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）である。
【０２１８】
アンモニウム塩に関して、これらは、プロトン酸（Ｈ−Ａ）と錯体化される、１級（ＲＮＨ２）、２級（Ｒ２ＮＨ）および３級（Ｒ３Ｎ）アミンから選択される。１つの局面において、このアンモニウム塩は、１級アミンを組み込み、別の局面において、このアンモニウム塩は、二級アミンを組み込み、なお別の局面において、このアンモニウム塩は、３級アミンを組み込む。別の局面において、このアンモニウム塩は、二級アミン塩および３級アミン塩から選択される。このアンモニウム塩は、緩衝液（これにアンモニウム塩が添加される）を形成する溶媒中に可溶性でなければならない。種々の局面において、このアンモニウム塩は、１，０００ｍＭまで、または８００ｍＭまで、または６００ｍＭまで、または４００ｍＭまで、または２００ｍＭまで、または１００ｍＭまでの濃度にて、水に可溶性であるべきである。特に、液体クロマトグラフィー分析が行われ、次に質量分析が行われる場合、液体クロマトグラフィーから得られる画分中のアンモニウム塩の量を最小化することは、望ましい。高濃度のアンモニウム塩は、特に、質量分析機が、エレクトロスプレーイオン化により作動する場合、質量分析機のイオン化効率を減少させ得る。アンモニウム塩は、代表的には、アンモニウム塩を形成するＲ基が、全体としてあまりにも疎水性でない限り、水溶性を示す。種々の局面において、このアンモニウム塩は、水溶液を提供するために選択され、ｐＨは、５．０〜９．０、または５．５〜８．５、または６．０〜８．０、または６．５〜７．５の範囲である。
【０２１９】
種々の局面において、Ｒ基は、アンモニウム分子内に存在する各々の存在とは独立して、および１級アンモニウム塩、２級アンモニウム塩、および３級アンモニウム塩の各々に関して、炭化水素（すなわち、このＲ基は、全体的に、水素および炭素から形成される）；１〜１０個の炭素を有する炭化水素；１〜６個の炭素を有する炭化水素；５〜８個の炭素を有する炭化水素であり；アルキル基およびシクロアルキル基から選択され；メチル、エチル、プロピル（その幾何異性体を含む）、ブチル（その幾何異性体を含む）、ペンチル（その幾何異性体を含む）、ヘキシル（その幾何異性体を含む）、シクロヘキシル、およびシクロペンチル（ｃｙｃｏｐｅｎｔｙｌ）（メチル置換シクロペンチルを含む）から選択され；１５〜２５０の原子量を有する有機基から選択され、炭素および水素以外の原子；１つの存在が置換されたハライド；および／または２つの存在が置換されたハライドを含んでも含まなくてもよく；ここでＲ基は、本発明に従って、２つの特徴が、相反しない限り、全ての組み合わせにおいてこれらの特徴のうちの任意の２つ以上を具現化し得る。本明細書中に言及されるように、アルキル基およびシクロアルキル（ｃｙｌｃｏａｌｋｙｌ）基は、不飽和（例えば、二重結合）を含み得るが、シクロアルキルは、芳香族環を含まない。にもかかわらず、１つの局面において、このＲ基は、フェニルおよびＣ１〜Ｃ６アルキル置換フェニルから選択される芳香族環である。別の局面において、このＲ基は、アリール置換（例えば、ベンジル）を有するアルキル基である。１つの局面において、そのアンモニウム塩は、５〜８個の炭素を有するアルキル基またはシクロアルキル基を有する２級アンモニウム塩または３級アンモニウム塩である。１つの局面において、このアンモニウム塩は、カチオン性（すなわち、プロトン化）形態のトリエチルアミン、ジアリルアミン、ジイソプロピルアミン、Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−シクロヘキシルアミン、またはＮ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−イソプロピルアミンを含む。１つの局面において、このアンモニウム塩は、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノブタンの塩形態である。別の局面において、このアンモニウム塩は、Ｎ，Ｎ−ジメチルシクロヘキシルアミンの塩形態である。別の局面において、このアンモニウム塩は、トリエチルアミンの塩形態である。
【０２２０】
アンモニウム塩のアミノ成分の選択は、液体クロマトグラフィー、次に質量分析を使用して、核酸分子により生成されるシグナルに対する影響を有し得る。例えば、ジメチルアミノブタンおよびジメチルシクロヘキシルアミンは、類似の応答を提供するが、トリエチルアミンは、液体クロマトグラフィー後の質量分析により見られる応答を、ジメチルアミノブタンと比較して、約２５％減少させる。
【０２２１】
１つの局面において、アンモニウム塩のプロトン酸は、アンモニウム基に対するアニオン性対イオンが、式Ｒａ−ＣＯＯ−を有するように、式Ｒａ−ＣＯＯＨである。種々の局面において、Ｒａは水素（すなわち、対イオンは、蟻酸から由来する）、メチル、エチル、プロピルであり、メチルおよびエチルから選択されるか、またはメチル、エチル、およびプロピル、ならびにそのモノハロゲン化バージョンおよびポリハロゲン化バージョンから選択される。別の局面において、アンモニウム塩を形成するために使用されるプロトン酸は、アニオンのカーボネートファミリーのプロトン化形態である（すなわち、炭酸水素（ＨＣＯ３）および／または炭酸（ＣＯ３）は、アンモニウム基に対するアニオン性対イオンである）。本発明の他の局面において、このプロトン酸は、無機酸（例えば、ＨＣｌおよびＨＢｒ）である。一般に、順に、アンモニウム塩のプロトン酸は、酢酸、蟻酸、炭酸（炭酸水素アニオンを提供するため）、または塩化水素である。
【０２２２】
本発明の１つの局面において、このアンモニウム基は、上記で規定されるＲ基を有する３級アンモニウム基であり、対イオンは、アセテート（ハロゲン化アセテートを含まない）、炭酸／炭酸水素であるか、またはアセテート（ハロゲン化アセテートを含まない）および炭酸／炭酸水素から選択される。対イオンがアセテートである場合、例示的なアンモニウム塩としては、酢酸トリエチルアミン、酢酸ジメチルブタミン、酢酸ジメチルイソプロピルアミン、酢酸ジメチルヘキシルアミン、酢酸ジメチルシクロヘキシルアミン、および酢酸ジイソプロピルアミン（ｄｉｓｏｐｒｏｐｙｌａｍｉｎｅ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２２３】
緩衝液Ａおよび緩衝液Ｂの選択のほかに、液体クロマトグラフィーが操作される条件は、同一の長さであるが、いくらか異なるヌクレオチド塩基配列の２つの核酸構造を分離または区別し得ることにおいて重要である。例えば、一般に、本発明の液体クロマトグラフィー分析は、室温（すなわち、約２５℃）または上昇した温度のいずれかにて行われる。代表的には、上昇した温度は、７５℃未満である。種々の局面において、クロマトグラフィーカラムは、クロマトグラフィーの間に以下の温度範囲内で維持される：２０℃〜８０℃、２５℃〜７０℃、２５℃〜６５℃、２５℃〜６０℃、３０℃〜８０℃、３０℃〜７０℃、３０℃〜６５℃、３０℃〜６０℃、３０℃〜５５℃、３０℃〜５０℃、または３０℃〜４５℃。上昇した温度が、代表的には所望される。なぜなら、このことは、ピークがより高く、より狭い、かつ／またはより卓越した分離を示すクロマトグラムを提供し得るからである。しかし、温度が約７０℃を超える場合、溶出液中の気泡形成が時折観察され、このことは、分離の損失を引き起こし得る。
【０２２４】
上記のように、溶出緩衝液のｐＨもまた、首尾よいクロマトグラフィー分析における重要な因子である。一般に、この溶出緩衝液は、上記のように、約５．０〜９．０の範囲のｐＨを維持する。代表的には、保持時間は、溶出緩衝液のｐＨが、このｐＨ範囲内に維持される限り、影響されない。
【０２２５】
クロマトグラフィーは、代表的に、圧力下で実施される。すなわち、圧力が、この溶出緩衝液を、カラムを通して押すために使用される。圧力が増大するにつれて、代表的には、このカラムを通る緩衝液の流速は増大する。約２００〜１６００バールの範囲の圧力、および約１０μＬ／分〜２０００μＬ／分の範囲の流速は、代表的に、カラムクロマトグラフィーを実施するために適切な条件である。
【０２２６】
液体クロマトグラフィーカラムの長さおよび定常相は、選択されるべき２つの他のパラメータである。代表的には、このカラムは、１０〜５００ｍｍの長さである。種々の局面において、このカラムは、１０、１８、２５、５０、１００、２５０または５００ｍｍの長さであり、そして小規模または大規模であり得る。この定常相は、逆相カラム（すなわち、固相を取り囲む疎水性相を有するカラム）を提供するように、選択される。適切な逆相カラムは、Ｖａｒｉａｎ  Ｉｎｃ．（Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、ＣＡ：ｗｗｗ．ｖａｒｉａｎｉｎｃ．ｃｏｍ）のＭＩＣＲＯＳＯＲＢＴＭＣ１８カラムである。このカラムは、モノマー性シリカカラムであり、５ミクロンの球状粒子、３００Åの細孔、Ｃ１８定常相、１２％の炭素充填を有し、そして末端がキャップされている。実質的に等価なカラムは、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｕ．Ｓ．Ａ．（Ｔｏｒｒａｎｃｅ、ＣＡ：ｗｗｗ．ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ．ｃｏｍ）製のＪＵＰＩＴＥＲＴＭＣ１８カラムである。類似のカラムは、Ｗａｔｅｒｓ（Ｍｉｌｆｏｒｄ、ＭＡ：ｗｗｗ．ｗａｔｅｒｓ．ｃｏｍ）のＸＴＥＲＲＡＴＭカラムであり、これは、１２０Åの細孔サイズ、および２．５ミクロン〜５ミクロンの粒子サイズを有する、ｐＨ安定性を拡大するための、シリカおよびポリマーから作製されたハイブリッド粒子を含む。完全にポリマー性の固体支持体を有するカラムもまた、使用され得る。本発明の１つの好ましい局面において、逆相カラムは、Ｃ１８定常相および少なくとも１２０Åの細孔サイズを有する。シリカカラムの末端キャップは、テーリングを最小にし、そしてピークの形状を改善するために所望され、従って、好ましいカラムは、この特徴を有する。カラムの炭素充填は、十分な保持時間を確実にするために重要であり（炭素充填は、ポリマー性カラムには適用されない）、そして好ましくは５〜２０％の範囲内である。粒子サイズは、代表的に、約２ミクロンから約１０ミクロンまで変化し、ここで、これらは、現在市販されるカラムについての代表的なサイズである。類似の粒子サイズは、一般に、改善されたクロマトグラフィーを生じる。従って、５μＭよりも小さいサイズの粒子が好ましい。カラム寸法は、重要ではないが、分析の規模および型に基づいて選択され得る。一般に、小さいサンプル（＜２５μＬまたは２５０μｇの分析物）の高速の高スループット分析について、小さいカラム（例えば、２．５μＭの粒子を有して、２５０μＬ／分の流速で４分間で完全に流れるのを可能にする、２．１×１５ｍｍ（直径×長さ）のＸＴＥＲＲＡＴＭカラム）が好ましい。より大きいサンプルサイズが注入される場合、より大きいカラムを使用することが好ましく、ここで、より大きいカラムは、約４．６ｍｍの直径および約２５０ｍｍの長さである。内径０．３ｍｍ〜４．６ｍｍおよび長さ１０ｍｍ〜２５０ｍｍの寸法を有するカラムは、多くの業者（例えば、Ｗａｔｅｒ）から入手可能であり、そして本発明における使用に適切である。代表的なＬＣＭＳカラムは、１ｍｍ×５０ｍｍである。流速は、カラムの寸法に依存し、そして０．３ｍｍのＩＤカラムについての数μＬ／分から、４．６ｍｍのＩＤカラムについての約１５００〜２０００μＬ／分まで、変動す���。
【０２２７】
上記説明のように、移動相は、好ましくは２つの異なる溶液（緩衝液ＡおよびＢ）を、漸増的に合わせることによって形成される。塩は、好ましくは、１ｍＭ〜２００ｍＭの濃度で、より好ましくは１ｍＭ〜１００ｍＭの濃度で、なおより好ましくは５ｍＭ〜５０ｍＭの濃度で、この合わされた溶液中に存在する。特に、液体クロマトグラフィー分析の跡に質量分析を行う場合、より低い塩濃度が好ましく、このような場合、約５ｍＭの塩濃度が好ましい。緩衝液Ｂは、好ましくは、緩衝液Ａ中に、１０〜９０％（容積／容積）の極性有機分子（例えば、アセトニトリル、メタノールまたはイソプロパノール）を含む。緩衝液Ａおよび／またはＢは、任意の成分を含み得、そして１つの局面において、１種の任意の成分が、緩衝液Ａ中にも緩衝液Ｂ中にも存在する。適切な任意の成分は、ＥＤＴＡであり、ここで、ＥＤＴＡは、これらの緩衝液中で約０．１ｍＭの濃度で使用され得る。
【０２２８】
例えば、本発明に従う液体クロマトグラフィーは、以下のように実施され得る。最初に、アセトニトリルまたは他の適切な溶媒の浅い勾配が、核酸分子を溶出し、そしてサンプルの清浄化を提供するために、使用され得る。例えば、アセトニトリルを使用する場合、この勾配は、５％または約５％で開始し得、そして２０％または約２０％まで増大し得、ここで、これらの％値は、溶出緩衝液としての、水中の有機溶媒の容積％をいう。メタノールは、アセトニトリルの代わりに使用され得るが、メタノールの使用は、５０％または７５％さえものメタノールまで、最終勾配組成を増大させることを必要とし得る。必要な溶媒の画分は、使用されるカラムに部分的に依存し、そしてまた、分析されている核酸分子の長さ範囲に依存する。一般に、強力な溶媒洗浄が、任意の大きい疎水性成分を溶出するために、泳動の終点においてカラムに適用される。好ましい実施形態において、勾配の分析部分は、５％アセトニトリルで開始し、そして約９０分間かけて１５％まで増大し、その後、このカラムに、数秒間だけ４５％アセトニトリルの「プラグ」を迅速に押す洗浄を行い、その後、５％アセトニトリルの開始条件に戻す。好ましい緩衝液系は、５ｍＭのＮ，Ｎ−ジメチルアミノブチル酢酸を組み込み、そしてｐＨ７で作動する。１ｍＭ〜５０ｍＭまでのアンモニウム塩の濃度は、質量分析器において等価な応答を有することが観察されている（例えば、この範囲内では、イオン抑制の証拠は存在しない）が、この範囲内でのアンモニウム塩濃度の変動は、核酸分子の保持時間に対して僅かな影響を有し得る。保持時間の変動は、ＬＣ泳動の間に、溶媒組成を調節することによって、補償され得る。上記のように、ｐＨ範囲は、可変的であり、ここで、ｐＨ６〜ｐＨ８の範囲が、結果における変化がほとんどないかまたは全くなしに、すなわち、核酸保持時間に対してほとんどまたは全く影響なしに、使用され得る。
【０２２９】
特定の他の実施形態において、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）が使用され得る。ＨＰＬＣは、溶液中に溶解した化合物の分離のためのクロマトグラフィー技術である。ＨＰＬＣ機器は、移動相、ポンプ、注入器、分離カラムおよび検出器からなる。化合物は、このカラムにサンプル混合物のアリコートを注入することによって、分離される。混合物中の異なる成分は、移動液体相と定常相との間の分配挙動の差異に起因して、異なる速度でカラムを通過する。これらのポンプは、振動を伴わずに、一定の高圧を提供し、そしてこの分離過程の間に溶媒の組成を変化させるように、プログラムされ得る。
【０２３０】
本発明の方法において有用な例示的な検出器としては、ＵＶ−ＶＩＳ吸収、または適切な波長での励起後の蛍光、質量分析器およびＩＲ分光器が挙げられる。蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチドは、半自動化配列分析、ミニ配列分析および遺伝子型決定において、放射性標識オリゴヌクレオチドを置換し得る（Ｓｍｉｔｈら、Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：６７４（１９８６））。
【０２３１】
本発明の１局面において、（短い）一本鎖核酸フラグメントは、核酸含有要素に適切な検出器と組み合わせて、本明細書中に記載されるようなクロマトグラフィーのみによって、特徴付けられる。別の局面において、この特徴付け工程は、分離されたフラグメントの質量分析と組み合わせて、上記のような核酸フラグメントを分離するためのクロマトグラフィーを伴う。
【０２３２】
化学的に結合したアルキル鎖を有する、非多孔性のＰＳ／ＤＶＢ粒子でのＩＰ−ＲＯ−ＨＰＬＣは、一本鎖核酸および二本鎖核酸の両方の分析において使用され得る（Ｈｕｂｅｒら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２１２−３５１（１９９３）；Ｈｕｂｅｒら、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２１．１０６１（１９９３）；Ｈｕｂｅｒら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １６：８９８（１９９３））。鎖の長さの関数として二本鎖ＤＮＡを通常は保持しない（なぜなら、ＡＴ塩基対は、正に荷電した定常相と、ＧＣ塩基対よりも強力に相互作用するからである）イオン交換クロマトグラフィーとは対照的に、ＩＰ−ＲＰ−ＨＰＬＣは、厳密にサイズ依存的な分離を可能にする。
【０２３３】
イオン対形成試薬として１００ｍＭの酢酸トリエチルアンモニウムを使用する方法が開発されており、その結果、ホスホジエステルオリゴヌクレオチドは、高速液体クロマトグラフィーによって、アルキル化非多孔性２．３μＭポリ（スチレン−ジビニルベンゼン）粒子で首尾よく分離され得る（Ｏｅｆｎｅｒら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２２３．３９（１９９４））。記載された技術は、５０〜２００ヌクレオチドのサイズ範囲内の長さ中、たった４〜８塩基対が異なるＰＣＲ産物の分離を可能にする。
【０２３４】
変性ＨＰＬＣ（ＤＨＰＬＣ）は、本明細書中に記載されるように生成された（短い）一本鎖核酸フラグメントを特徴付ける際に利用され得る定常相として、非多孔性Ｃ−１８カラムを使用する、イオン対逆相高速液体クロマトグラフィー（ＩＰ−ＲＰ−ＨＰＬＣ）である。このカラムは、ポリスチレン−ジビニルベンゼンコポリマーから構成される。この移動相は、酢酸トリエチルアンモニウム（ＴＥＡＡ）（定常相へのＤＮＡの結合を媒介する）およびカラムからのＤＮＡの引き続く分離を達成するための有機薬剤としてのアセトニトリル（ＡＣＮ）のイオン対形成剤から構成される。アセトニトリルの直線的勾配は、分離を可能にする。ＤＨＰＬＣは、二重鎖ＰＣＲ増幅ＤＮＡ中のミスマッチヌクレオチド間のヘテロ二重鎖形成の検出に基づいて、変異および多型を同定する。配列のバリエーションは、ヘテロ二重鎖のサイズおよび／または存在に基づいて、フラグメントの野生型ＤＮＡおよび変異体ＤＮＡの再アニーリングの間に、ヘテロ二重鎖およびホモ二重鎖の混合集団を生む（これは、ＤＨＰＬＣ技術の従来の用途である）。この混合集団が、部分的変性温度下でＨＰＬＣによって分析される場合、このヘテロ二重鎖は、融点の低下に起因して、ホモ二重鎖よりも早く、カラムから溶出する。分析は、異種接合性を決定するために個々のサンプルに対して実施され得るか、または個体間の配列バリエーションを同定するために、混合サンプルに対して実施され得る。
【０２３５】
特定の適用において、異なるヌクレオチド組成を有する同じサイズのＤＮＡフラグメントを分離するために、非変性様式で、ＤＨＰＬＣカラムを使用することが好まれ得る。例えば、非変性様式は、例えば、６マーが、Ｃ→Ｔ単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）を含む場合（例えば、ここで、野生型の一本鎖ＤＮＡフラグメントは、ヌクレオチド配列５’−ＡＡＣＣＣＣ−３’を有し、一方で変異体一本鎖ＤＮＡフラグメントは、ヌクレオチド配列５’−ＡＡＴＣＣＣ−３’を有する）に、適用可能であり得る。１マー、２マー、３マー、４マー、５マー、６マー、７マー、８マー〜１６マーほどの短いフラグメントは、ＤＨＰＬＣ機器において、異なる移動度（保持時間）を示す。小さい核酸フラグメントのクロマトグラフィーを実施するための、非多孔性物質を使用する適用について代替的に、サイズ決めおよびＤＨＰＬＡ適用の両方としてのＨＰＬＣは、広範な細孔シリカベースの物質で実施される。多孔性物質は、半分離作業についての、高いサンプル能力の利点を有する。これは、Ｅｃｌｉｐｓｅ  ｄｓＤＮＡカラムとして、Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ（Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、ＣＡ）によって市販されている。
【０２３６】
（ｅ．対立遺伝子頻度決定）
増幅された一本鎖核酸フラグメントを検出および／または特徴づけするための多くの方法論もまた、増幅反応混合物中の特定の増幅一本鎖核酸フラグメントの量を測定するために使用され得る。例えば、増幅一本鎖核酸分子が、液体クロマトグラフィーによって、増幅反応混合物中の他の分子から、最初に分離され、次いで質量分析に供される場合、増幅一本鎖核酸分子の量は、核酸分子を含む画分の液体クロマトグラフィー、または核酸分子に対応する質量分析ピークのイオン電流測定のいずれかによって、定量され得る。
【０２３７】
このような方法論は、標的核酸の対立遺伝子改変体がまた、存在し得る核酸集団中の標的核酸の対立遺伝子頻度を決定するために使用され得る。「対立遺伝子改変体」とは、本明細書中で使用される場合、標的核酸の所定の位置を除いて、標的核酸と同一な配列を有する核酸分子をいう。所定の位置の標的核酸の配列と同じ所定の位置の標的核酸の対立遺伝子改変体の配列の両方は、「遺伝子バリエーション」と本明細書中でいわれ得る。「核酸集団中の標的核酸の対立遺伝子頻度」は、本明細書中で使用される場合、標的核酸が存在する核酸集団中の標的核酸およびその対立遺伝子改変体の総量の百分率をいう。なぜなら、上記の本発明のＯＤＮＰ対は、標的に存在する目的の遺伝子バリエーションの両側に位置する標的核酸の一部にアニールするように設計されているので、ＯＤＮＰ対をプライマーとして、および標的核酸を含む核酸集団をテンプレートとして使用する増幅は、標的核酸の遺伝子バリエーションを含む核酸フラグメント（「標的核酸に由来するテンプレート核酸フラグメント」といわれる）、および改変体が核酸集団中に存在する場合は、標的核酸の対立遺伝子改変体の遺伝子バリエーションを含む核酸フラグメント（「標的核酸の対立遺伝子改変体に由来するテンプレート核酸フラグメント」といわれる）を生成する。標的核酸およびその対立遺伝子改変体の配列は、所定の位置でのみ異なるので、標的核酸に由来するテンプレート核酸フラグメントおよび改変体に由来するテンプレート核酸フラグメントは、同じまたは類似の効率にて増幅される。同様に、標的核酸に由来するテンプレート核酸フラグメントおよび標的核酸の対立遺伝子改変体に由来するテンプレート核酸配列を、それぞれテンプレートとして使用する、標的核酸の遺伝子バリエーションを含む一本鎖核酸分子（「一本鎖標的」といわれる）、および標的核酸の対立遺伝子改変体の遺伝子バリエーションを含む一本鎖核酸分子（「一本鎖改変体」といわれる）の増幅は、同一のまたは類似の効率にて行われる。結論として、増幅された一本鎖核酸の合計（すなわち、一本鎖標的および一本鎖改変体の合計）内の一本鎖標的の百分率は、核酸集団中の標的核酸の対立遺伝子改変体頻度を反映する。
【０２３８】
本発明はまた、核酸集団中の複数の標的核酸の対立遺伝子頻度の多重決定のための方法を提供する。このような方法において、ＯＤＮＰ対は、各個々の標的核酸用に設計されて、標的核酸における所定の位置に遺伝子バリエーションを含むテンプレート核酸ならびに標的核酸の対立遺伝子改変体における（対応する）所定の位置にその配列を含むテンプレート核酸が調製される。次いで、全ての目的の標的核酸またはその消化産物（例えば、ＯＤＮＰ対のうちの一方のＯＤＮＰが、ＲＥＲＳを含む場合）のための増幅されたテンプレート核酸が、標的核酸の遺伝子バリエーションまたは標的核酸の対立遺伝子改変体の遺伝子バリエーションを含む一本鎖核酸フラグメントを増幅するためのテンプレートとして使用される。本発明の検出／特徴付け方法論（例えば、液体クロマトグラフィーおよび質量分析法）が、１つの標的核酸またはその対立遺伝子改変体に由来する増幅された一本鎖核酸と、別の標的核酸またはその対立遺伝子改変体に由来する増幅された一本鎖核酸との間を区別し得るので、複数の標的核酸分子の対立遺伝子頻度は、同時に決定され得る。
【０２３９】
（２．遺伝子バリエーションを同定するためのキット）
本発明はまた、遺伝子バリエーションを同定するためのキットを提供する。このようなキットは、一般に、ニック形成部位およびＮＳに対して３’側に位置する遺伝子バリエーションを含むテンプレート核酸を調製するために有用な上記のＯＤＮＰ対を含む。これらはまた、以下の成分のうちの少なくとも１つ、２つ、いくつか、または各々をさらに含み得る：（１）ＯＤＮＰ対のうちの少なくとも一方のプライマーにおけるニック形成剤認識配列（ＮＡＲＳ）を認識するニック形成剤（例えば、ＮＥまたはＲＥ）；（２）ニック形成剤（１）に適切な緩衝液；（３）そのＯＤＮＰのうちの少なくとも一方のプライマーに存在するＲＥＲＳを認識するＲＥ；（４）ＲＥ（３）に適切な緩衝液；（５）テンプレート核酸を作製する（すなわち、上記ＯＤＮＰ対の３’末端から伸長する）ために有用なＤＮＡポリメラーゼ；（６）ＤＮＡポリメラーゼ（５）に適切な緩衝液；（７）一本鎖核酸フラグメントを増幅するためのＤＮＡポリメラーゼ；（８）ＤＮＡポリメラーゼ（７）に適切な緩衝液；（９）ｄＮＴＰ；（１０）改変ｄＮＴＰ；（１１）テンプレート核酸を増幅するための制御テンプレートおよび／または制御オリゴヌクレオチドプライマー；（１２）クロマトグラフィーカラム；（１３）そのクロマトグラフィーカラムのための緩衝液Ａ；（１４）そのクロマトグラフィーカラムのための緩衝液Ｂ；（１５）水；（１６）鎖置換促進剤（例えば、１Ｍ  トレハロース）；（１７）マイクロタイタープレートまたはマイクロウェルプレート；（１８）液体クロマトグラフィーおよび／または質量分析法のためのオリゴヌクレオチド標準物質（例えば、６マー、７マー、８マー、１２マーおよび１６マー）；（１９）このキットを使用するための説明書小冊子；ならびに（２０）ＯＤＮＰ対を設計および／または注文するにあたって使用されるソフトウェアのためのアクセスコード。上記の成分の多くの詳細な説明は、上記に提供されている。
【０２４０】
例示的なニック形成剤は、ニック形成エンドヌクレアーゼＮ．ＢｓｔＮＢ  Ｉである。このニック形成エンドヌクレアーゼについての緩衝液は、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１５０ｍＭ  ＫＣｌ、１ｍＭジチオトレイトール（２５℃でｐＨ７．５）であり得る。Ｎ．ＢｓｔＮＢ  Ｉは、以下の保存緩衝液中に保存され得る：５０ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＤＴＴ、２００μｇ／ｍｌ  ＢＳＡ、および５０％グリセロール。
【０２４１】
例示的な５’→３’エキソヌクレアーゼ欠損ＤＮＡポリメラーゼは、ｅｘｏ−Ｖｅｎｔである。このポリメラーゼについての反応緩衝液は、１０ｍＭ  ＫＣｌ、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（２５℃でｐＨ８．８）、１０ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４、２ｍＭ  ＭｇＳＯ４、０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００であり得る。
【０２４２】
上記のように、緩衝液Ａは、水溶したアンモニウム塩を含み、ここで、この水は、好ましくは、ＨＰＬＣグレードの水であるべきである。このアンモニウム塩は、上記の１つ以上のアンモニウム塩のうちのいずれかであり得る。例えば、１つの局面において、このアンモニウム塩は、対イオンを伴うＮ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−ブチルアンモニウムであり、ここで、さらなる局面において、この対イオンは、アセテートである。好ましい実施形態において、このアンモニウム塩は、約１〜２００ｍＭ、好ましくは約１〜１００ｍＭ、好ましくは約５〜５０ｍＭ、より好ましくは約５ｍＭの濃度で水中に存在する。容器は、アンモニウム塩を１００ｍＭより高い濃度で保持し得るが、このような場合、この容器中の成分は、有効な緩衝液を形成するために、恐らく水で希釈される必要がある。このアンモニウム塩および水の溶液は、好ましくは約７．０〜７．５、そして代表的には、約７．２のｐＨを有し、そして本明細書中で、緩衝液Ａとして言及される。１つの局面において、この容器は、水中に溶解したアンモニア塩の溶液のみを保持する。
【０２４３】
また、上で検討したように、緩衝液Ｂは、アンモニウム塩、水、および有機溶媒を含む。１つの局面において、この成分は、緩衝液Ａおよび有機溶媒を含み、ここで、好ましくは、この混合物は、均一である（すなわち、この有機溶媒は、緩衝液Ａ中に溶解するかまたは混和性である）。１つの局面において、この有機溶媒は、アセトニトリルである。別の局面において、この有機溶媒は、メタノールである。種々の局面において、この有機溶媒は、容器中の成分の総容量に基づく容量％で、１５％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜３５％、３５％〜４０％、４０％〜４５％、４５％〜５０％または５０％〜５５％または５５％〜６０％または６５％〜７０％または７５％〜８０％を構成する。好ましい実施形態において、この有機溶媒は、２５％のアセトニトリルを構成する。別の好ましい実施形態において、この有機溶媒は、５０％のアセトニトリルを構成する。従って、好ましい成分は、７５容量％の緩衝液Ａおよび２５容量％のアセトニトリルの溶液であるが、一方で、別の好ましい成分は、５０容量％の緩衝液Ａおよび５０容量％のアセトニトリルの溶液である。
【０２４４】
好ましくは、クロマトグラフィーカラムは、逆相クロマトグラフィーカラムであり、より好ましくは、Ｃ１８逆相クロマトフラフィーカラムである。好ましいＣ１８逆相カラムは、以下の特徴のうち１つ、２つまたは全てを有し得る：少なくとも１２０Åのポアサイズ、２ミクロン〜１０ミクロンの粒子サイズ、および０．３ｍｍ〜４．６ｍｍの内径、および１０ｍｍ〜２５０ｍｍの長さ。
【０２４５】
（３．本発明の遺伝子バリエーションの同定方法のための適用）
本明細書において上で詳細に検討したように、本発明は、標的核酸中の遺伝子バリエーションを検出および／または同定するための方法を提供する。また、本明細書中において、例えば、変異および／遺伝子バリエーションを含む１つ以上の一本鎖フラグメントの大きさおよび／または分子量を検出するために、本発明の方法を用いて使用され得る種々の「読み出し」技術が提供される。本発明に従う方法は、規定されたヌクレオチドの遺伝子座でそのような変異を同定することまたは遺伝子バリエーションを測定することが所望または必要とされる広範な種々の用途において有用性を見出す。そのような適用としては、遺伝子に移入された疾患の遺伝子分析、腫瘍の診断、疾患疾病素質、法医学、親子鑑定、作物栽培または動物飼育における増強、細胞機能および／または疾患マーカー遺伝子の発現プロファイリング、ならびに植物もしくは動物における感染性疾患を引き起こし、そして／または食物の安全性に関連する感染性生物の同定および／もしくは特徴づけが挙げられるが、これらに限定されない。さらに、本発明の方法、組成物、およびキットは、当該分野において現在入手可能な従来の方法と比較して、費用が低いが、アッセイの特異性、感度およびスループットを非常に増加させるために使用され得る。本発明の特定の例示的な適用が以下に記載される。
【０２４６】
（ａ．発現プロファイリング）
ほとんどのｍＲＮＡが単一コピーの配列から転写される。ｃＤＮＡの別の特性は、これらが、ほとんどの遺伝子の染色体バージョン中に存在するイントロンに起因して、ゲノムのより長い領域を表すことである。この表現は、遺伝子毎に異なるが、多くの遺伝子が、単一のｃＤＮＡ中に表現される、ゲノムＤＮＡ中の１００ｋｂより多くをカバーするので、非常に有意であり得る。分子プロファイリングの１つの可能な使用は、別の種から作製されたクローンを見出すための１つの種由来のプローブの使用である。マウスのｍＲＮＡとヒトのｍＲＮＡとの間の配列の相違は、長い配列の特異的な交叉再会合を可能にするが、ほとんどの非常に保存された領域を除き、ＰＣＲプライマーの交叉ハイブリダイゼーションを妨げる。
【０２４７】
ＰＣＲベースおよびｃＲＮＡベースの増幅技術の開発に起因して、単一の細胞から調製されたｃＤＮＡプローブを用いる、発達中の神経系のような複雑な生物学的サンプルにおけるディフェレンシャルスクリーニングが、現在、可能である。複数のグループが、以前に、１０〜５０個の細胞から調製した少量（１ｎｇ以下）のポリ（Ａ）＋ＲＮＡからのｃＤＮＡライブラリの作製を報告した（Ｂｅｌｙａｖら、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１７：２９１９、１９８９）。これらのライブラリは、ｍＲＮＡの複雑性を十分に表現したが、これらのライブラリの平均のｃＤＮＡインサートのサイズは、非常に小さかった（２ｋｂ未満）。
【０２４８】
より最近には、方法論が組み合わされて、単一の細胞から、ＰＣＲベース（Ｌａｍｂｏｌｅｚら、Ｎｅｕｒｏｎ  ９：２４７、１９９２）およびｃＲＮＡベース（Ｖａｎ  Ｇｅｌｄｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：１６６３、１９９０）のプローブが作製された。電気的な記録の後、インサイチュでのｃＤＮＡ合成および増幅のために、パッチクランプマイクロ電極を用い単一細胞の細胞質含有物が吸引された。ＰＣＲが、単一のＰｕｒｋｉｎｊｅ細胞由来の選択的グルタミン酸レセプターｍＲＮＡおよび器官型小脳培養物の中の単一の膠由来のＧＦＡＰ  ｍＲＮＡのｃＤＮＡを増幅するために用いられた（Ｌａｍｂｏｌｅｚら、Ｎｅｕｒｏｎ  ９：２４７、１９９２）。ｃＲＮＡ増幅の場合、転写プロモーター配列が、ｃＤＮＡ合成のためのプライマー中に設計され、そして複合的アンチセンスｃＲＮＡが、バクテリオファージＲＮＡポリメラーゼを用いるインビトロでの転写により作製された。
【０２４９】
本発明の方法は、特定のｃＤＮＡ分子が、生物学的サンプル由来のｃＤＮＡ中に存在するか否か、および遺伝子バリエーションがｃＤＮＡ分子中に存在するか否かをさらに決定するために、有用である。
【０２５０】
（ｂ．法医学）
ＤＮＡ配列バリエーションのレベルでの個体の識別は、指紋、血液型、または身体的特徴のような従来の規格を超える多数の実用的な利点を与える。ほとんどの表現系マーカーと対照的に、ＤＮＡ分析は、親子鑑定において必要とされるような個体間の関連性の推定を容易に可能にする。遺伝子分析は、緊密に関連したドナー細胞とレシピエント細胞との間を識別する必要がある、骨髄移植において高度に有用であることが証明されている。２つの型のプローブが、現在、ＤＮＡブロットによるＤＮＡフィンガープリンティングのために使用されている。多型のミニサテライトＤＮＡプローブは、複数のＤＮＡ配列を識別し、これらの各々は、異なる個体において異なる形態で存在し、従って、個体間で複雑かつ非常に変化しやすいパターンを形成する。ＶＮＴＲプローブは、ゲノム中の単一の配列を識別するが、これらの配列は、識別されたフラグメントのサイズにより区別されるように、ヒト集団において３０までの異なる形態で存在し得る。関連しない個体が、複数のＶＮＴＲまたはミニサテライトプローブについて同一のハイブリダイゼーションパターンを有する可能性は、非常に低い。ＤＮＡブロットのために必要とされる組織より非常に少ない組織（１本の髪の毛でさえ）が、遺伝子マーカーのＰＣＲベースの分析のために十分なＤＮＡを提供する。また、少量のＤＮＡフラグメントが必要とされるのみであるので、部分的に分解された組織が分析のために用いられ得る。本発明の方法は、サンプルＤＮＡの多型を特徴づけるのに有用であり、従って、法医学的ＤＮＡ分析に有用である。例えば、サンプル中の２２の別個の遺伝子配列の分析（各々１つずつが、集団において２つの異なる形態で存在する）が、１０１０の異なる結果を生み出し、このことは、ヒトの個体の独特の識別を可能にする。
【０２５１】
（ｃ．腫瘍診断）
ウイルス性または細胞性の癌遺伝子の検出は、核酸診断の適用の別の重要な分野である。ウイルス性癌遺伝子（ｖ癌遺伝子）は、レトロウイルスにより伝播され、一方で、これらの細胞性の対応物（ｃ癌遺伝子）は、正常な細胞内にすでに存在する。しかし、細胞性癌遺伝子は、特定の改変（例えば、（膀胱癌および結腸直腸癌におけるｃ−Ｋ−ｒａｓ癌遺伝子におけるような）点変異）、小さな欠失、および小さな挿入により達成され得る。この活性化プロセスの各々は、さらなる分解プロセスと組み合わせて、増加した制御されていない細胞増殖を導く。さらに、点変異、小さい欠失または挿入はまた、いわゆる「劣性癌遺伝子」を不活性化し得、そしてそれにより（網膜芽細胞腫（Ｒｂ）遺伝子および骨肉腫におけるような）腫瘍の形成を導く。従って、本発明は、癌遺伝子を活性化するかまたは劣性癌遺伝子を不活性化する（これは、次いで、癌を引き起こす）点変異、小さい欠失、および小さい変異の検出または識別において有用である。
【０２５２】
（ｄ．移植分析）
移植された組織の拒絶反応が、特定のクラスの組織適合抗原（ＨＬＡ）によって決定的に制御される。これらは、抗原提示血液細胞（例えば、マクロファージ）の表面上で発現される。ＨＬＡと外来抗原との間の複合体は、細胞表面上の対応するＴ細胞レセプターを介してＴヘルパー細胞により認識される。ＨＬＡ、抗原、およびＴ細胞レセプターの間の相互作用は、複合体防御反応を引き起こし、これは、身体に対するカスケード様の免疫応答を導く。
【０２５３】
異種外来抗原の認識は、抗体反応に類似して、Ｔ細胞レセプターの抗原特異的可変領域により媒介される。従って、移植片の拒絶において、外来抗原に適合する特異的なＴ細胞レセプターを発現するＴ細胞は、Ｔ細胞プールから排除され得る。そのような分析は、高原特異的な可変ＤＮＡ配列の同定により可能であり、ここでこの配列は、ＰＣＲにより増幅され、従って選択的に増加される。特異的な増幅反応は、特異的なＴ細胞レセプターの、応答の単一の細胞に特異的な同定を可能にする。
【０２５４】
同様の分析が、若年性糖尿病、動脈硬化、多発性硬化症、慢性関節リウマチ、または脳脊髄炎のような自己免疫疾患の同定のために本明細書において実施される。
【０２５５】
従って、本発明は、種々の外来抗原の認識に関連する抗原特異的な可変領域をコードするＴ細胞レセプター遺伝子における遺伝子のバリエーションを決定するために有用である。
【０２５６】
（ｅ．ゲノム診断）
全ての新生児の４％が、遺伝的欠損を有して生まれる；たった１つの遺伝子の改変により引き起こされる記載された３，５００の遺伝子疾患のうち、原発性の分子の欠損は、それらのうち約４００についてのみ知られている。
【０２５７】
遺伝子疾患は、長い間、表現型分析（病歴（例えば、血液の欠損：サラセミア））、染色体分析（核型（例えば、ダウン症候群：２１トリソミー））または遺伝産物分析（改変タンパク質（例えば、フェニルケトン尿症：フェニルピルビン酸の増強されたレベルを生じる、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ酵素の欠損））により診断されてきた。核酸検出の法さらなる使用は、ゲノム診断の範囲を非常に増大させる。
【０２５８】
特定の遺伝子疾患の場合、２つの対立遺伝子のうちたった１つの改変が、疾患のために十分である（優性に伝播された単一遺伝子欠損）；多くの場合、両方の対立遺伝子は、改変されなくてはならない（劣性に伝播された単一遺伝子欠損）。第３の型の遺伝子欠損において、この疾患の発症は、遺伝子の改変によってだけでなく、食習慣（糖尿病または動脈硬化の場合）またはライフスタイル（癌の場合）のような要因によっても決定される。非常にしばしば、これらの疾患は、高齢者において生じる。精神分裂病、大うつ病または癲癇のような疾患は、また、この文脈において、言及されるべきである；これらの場合において、この疾患の発症が、環境要因および異なる染色体位置における複数の遺伝子の改変に依存するか否かは、調査中である。
【０２５９】
直接的および間接的なＤＮＡ分析を用いて、以下の一連の遺伝子疾患の診断が可能になっている：膀胱癌、結腸直腸癌、鎌状赤血球貧血、サラセミア、ａ１−抗トリプシン欠損、レッシュ−ナイハン症候群、嚢胞性線維症／ムコビシドーシス、デュシェーヌジストロフィー／ベッカー型筋ジストロフィー、アルツハイマー病、Ｘ染色体依存性精神遅滞、およハンティングトン舞踏病、フェニルケトン尿症、ガラクトース血症、ウィルソン病、ヘモクロマトーシス、重症複合型免疫不全、α１−抗トリプシン欠損、白皮症、アルカプトン尿症、リソソーム貯蔵病（ｌｙｓｏｓｏｍａｌ  ｓｔｏｒａｇｅ  ｄｉｓｅａｓｅ）、エーレルス−ダンロー症候群、血友病、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ障害、無ガンマグロブリン血症、潜伏性糖尿病、ヴィスコット−オールドリッチ症候群、ファブリー病、ぜい弱Ｘ症候群、家族性高コレステロール血症、多発性嚢胞腎疾患、遺伝性球状赤血球症、マルファン症候群、ヴォン・ヴィレブランド病、神経線維腫症、結節硬化症、遺伝性出血性毛細管拡張症、家族性結腸ポリープ症、エーレルス−ダンロー症候群、筋緊張性ジストロフィー、骨形成不全症、急性間欠性ポルフィリン症、およびフォン・ヒッペル−リンダウ症候群。本発明は、規定された位置での点変異、小さい欠損または小さい挿入により引き起こされる任意の遺伝子疾患の診断に有用である。
【０２６０】
（ｆ．感染症）
感染症の診断のための組換えＤＮＡ法の適用は、ウイルス感染について最も広範に調査されており、ここで、現在の方法は、厄介であり、結果が出るのが遅い。組織または培養細胞のインサイチュハイブリダイゼーションは、急性および慢性のヘルペス感染の可能性の診断をもたらした。培養細胞が、サイトメガロウイルスおよびエプスタイン−バーウイルスの検出のために用いられており、一方で、新しい組織およびホルマリン固定された組織が、浸潤性頸部癌におけるパピローマウイルスの検出のためおよびＨＩＶの検出において適切であることが報告されている。微生物性疾患の診断のための組換えＤＮＡ法の適用は、費用効果、速度および精度の要件を満たし得る場合、現在の微生物増殖法に取って代わる可能性を有する。組換えＤＮＡ手順が適用され始めている臨床的状況としては、トランスポゾンの存在によるペニシリン耐性Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅの同定、選好性増殖クラミジアの同定、食物中の微生物の同定；および集団にわたる感染の拡大を追跡する単純な手順が挙げられる。リーシュマニアおよびプラスモディウムのような寄生物に関連する疾患の世界規模の疫学的な試みが、組み換え法により既に満たされている。
【０２６１】
本発明は、感染症、特に薬物耐性遺伝子に関連する、遺伝子バリエーションの検出および／または測定のために有用である。従って、本発明は、感染症を引き起こす生物の特徴付けおよび分類を容易にし、そして結果として、これらの生物により引き起こされるそのような疾患の処置を容易にする。
【０２６２】
（ｇ．さらなる用途）
上記適用に加えて、本発明はまた、疾患感受性についての試験においても用いられ得る。特定の遺伝子のバリエーションは、直接的に疾患を引き起こさないが、これらは、疾患に関連する。言い換えれば、被験体によるこれらの遺伝子のバリエーションの保持は、被験体を、これらの疾患に対して感受性にする。本発明の方法を用いるそのような遺伝子バリエーションの検出は、特定の疾患の疑いのある被験体の識別および引き続く予防方法の実施を可能にする。
【０２６３】
本発明はまた、薬理ゲノム学にも適用可能である。例えば、それは、薬物耐性に関連する遺伝子（例えば、チトクロムＰ４５０遺伝子の種々の対立遺伝子）を検出または同定するために用いられ得る。
【０２６４】
さらに、本発明は、残留する疾患の検出または特徴付けのために有用な方法を提供する。言い換えれば、本発明の方法は、特定の処置（例えば、化学療法手術）の後の癌のような残留する変異体遺伝子型を検出または同定するために用いられ得る。それは、新性の変異体（例えば、病原性生物に薬物耐性を与える特定の遺伝子における遺伝子バリエーション）の同定においても有用であり得る。
【０２６５】
（Ｃ．生物学的サンプル中の核酸の検出）
種々の局面において、本発明は、生物学的サンプル中の標的核酸の存在または不存在を検出するための方法、化合物、組成物、およびキットを提供する。
【０２６６】
（１．標的核酸を検出するための方法）
本発明は、生物学的サンプル中の標的核酸の存在または不存在を検出するための方法を提供する。特定の実施形態において、これらの方法は、部分的に二本鎖の核酸プローブ（以下により詳細に記載される）を使用し、この核酸プローブは、以下：（１）標的核酸に対して少なくとも実質的に相補的な突出物、（２）ＮＡＲＳ、および（３）標的核酸に対して独特に相関をする配列を含む。標的核酸に対して「独特に相関する」配列とは、特定の目的の標的核酸に特異的な部分的に二本酸の核酸プローブ中にのみ存在するが、別の目的の標的核酸に特異的な部分的に二本鎖の核酸プローブ中には存在しない配列をいう。部分的に二本鎖の核酸プローブは、その突出物が標的核酸に対して少なくとも実質的に相補的である場合、目的の標的核酸に対して「特異的」である。特定の実施形態において、このプローブの突出物は、標的の一部に対して正確に相補的である。特定の実施形態において（例えば、ここで、下記のように、緊密に関連する核酸分子の検出が意図される）、目的の標的核酸は、互いに実質的に同一である種々の核酸分子を表す縮重配列を有する核酸であり得る。
【０２６７】
本発明によれば、上記のプローブは、存在する場合、生物学的サンプル中の標的核酸へのプローブのハイブリダイゼーションを可能にする条件下で、標的核酸を含み得る生物学的サンプルと組み合わせられる。ハイブリダイズしなかったプローブは、反応混合物から除去され、一方で、ハイブリダイズしたプローブは、ＮＡＲＳを認識するニック形成剤の存在下で一本鎖核酸を増幅するためのテンプレートとして用いられる。増幅された一本鎖核酸フラグメントが、標的核酸に独特に相関するプローブ中の配列と相補的である配列を有するので、この一本鎖核酸フラグメントの検出および／または特徴付けは、サンプル中の標的核酸の存在を示す。
【０２６８】
他の実施形態において、本発明は、ＮＡＲＳを含むテンプレート核酸を調製するために一本鎖核酸プローブまたは種々のＯＤＮＰ対を用いる。この一本鎖核酸プローブおよびＯＤＮＰ対は、標的核酸に対して特異的であり、そして標的核酸が生物学的サンプル中に存在する場合にのみ、テンプレート核酸を調製するために用いられ得る。次いで、テンプレート核酸は、ＮＡＲＳを認識するニック形成剤の存在下で一本鎖核酸を増幅するために用いられ得る。増幅された一本鎖核酸の検出および／または特徴付けは、サンプル中の標的核酸の存在を示す。
【０２６９】
上記方法は、サンプル中の複数の標的核酸の存在または不存在を検出するために多重化され得る。例えば、複数の部分的に二本鎖の核酸プローブが、サンプルと組み合わせられ得る。複数のプローブの各々は、ＮＳを含まない鎖内にヌクレオチド配列を有し、ここで、このヌクレオチド配列は、ＮＳに対応する位置に対して５’側に配置され、そして特定の標的核酸に対して独特に相関する。そのような配列は、（ｉ）ＮＡＲＳを認識するＮＡおよび（ｉｉ）ＤＮＡポリメラーゼの存在下での一本鎖核酸フラグメントの増幅のためのテンプレートとして用いられる。一本鎖核酸フラグメントの検出／特徴付けは、このプローブの一部が独特に対応する特定の標的核酸の存在を示す。
【０２７０】
（ａ．生物学的サンプルおよび標的核酸）
本発明の生物学的サンプルは、生物由来であり、そして目的の核酸（すなわち、標的核酸）を含み得る任意のサンプルを含む。これらは、血液サンプル、生検検体、組織外植物、器官培養物、または被験体または生物学的供給源由来の任意の他の組織または細胞調製物を得ることによって提供され得る。生物学的サンプルはまた、固体支持体上に作製された組織プリントを含む。被験体または生物学的供給源は、ヒトでも非ヒト動物でも、植物でも、初代細胞培養物でも、培養適合（ｃｕｌｔｕｒｅ  ａｄａｐｔｅｄ）細胞株でもよい。本発明の特定の好ましい実施形態において、被験体または生物学的供給源は、遺伝子疾患または病原体感染を有するか、またはそれらを有する危険性がある疑いがあり得る。他の好ましい実施形態において、被験体または生物学的供給源は、遺伝子疾患または病原体感染を有する患者であり得る。特定の他の実施形態において、被験体または生物学的供給源は、遺伝子疾患も病原体感染も有さないコントロール被験体であり得る。
【０２７１】
標的核酸は、生物学的サンプル中に存在する任意の核酸であり得る。これらは、ＤＮＡまたはＲＮＡ、一本鎖または二本鎖であり得る。特定の好ましい実施形態において、この標的核酸は、病原性生物（例えば、細菌、ウイルス、真菌、または寄生生物）由来である。例示的な病原性生物は、一本鎖核酸プローブ調製についての説明において、以下に提供される。標的核酸は、特定の種または亜種に共通するが、他の種または亜種において存在しない配列を有し得る。そのような標的核酸の検出は、生物学的サンプル中の種または亜種の存在を示し、そしてこれらの種または亜種の中の１つ特定の生物または複数の特定の生物についての第一のスクリーニングとして用いられ得る。この生物学的サンプルは、サンプル中の特定の生物の存在または不存在を決定するためにさらに特徴付けられ得る。他の好ましい実施形態において、標的核酸は、その発現が疾患と関連するｍＲＮＡである。
【０２７２】
特定の実施形態において、生物学的サンプルの核酸が、本発明の部分的二本鎖オリゴヌクレオチドプローブまたは一本鎖オリゴヌクレオチドプローブとハイブリダイズされる前に、固定される。標的核酸の固定によって、一本鎖核酸分子の増幅前に、ハイブリダイゼーション混合物からハイブリダイズしていないプローブを容易に取り除くことが可能になる。標的核酸の固定のための技術は、周知である。その固定は、当該分野で公知の任意の方法により達成され得る。例えば、生物学的サンプルが、そのサンプル中の細胞の形態学的完全性を維持するが細胞タンパク質を架橋も沈殿もしない固定剤を用いて徹底的に固定され得るので、核酸プローブおよび他の試薬の浸透が妨げられる。そのような固定により、標的核酸のインサイチュ検出が可能となる。あるいは、生物学的サンプルの核酸は、当該分野で公知の技術（例えば、組織プリント）を使用して、固体支持体（例えば、ニトロセルロース膜）に移され得る。特定の実施形態において、標的核酸は、まず、その生物学的サンプルから単離され得、その後、固体支持体に固定され得る。その固体支持体は、種々の材料（ケイ素、ガラス、紙、セラミック、金属（例えば、ステンレス鋼）、メタロイドおよびプラスチックが挙げられるが、これらに限定されない）から作製され得る。その固体支持体は、核酸分子に結合可能な化学物質層を用いてさらにコートされ得、その結果、このコーティングは、生物学的サンプルから単離された核酸分子と、コートされた固体支持体が接触した場合に、その化学物質層を介して、その生物学的サンプルから単離された核酸分子で固体支持体がさらにコートされる。核酸分子との結合のために適切な化学物質層を形成し得る例示的化学物質としては、ＰＡＤＭＡＣおよびポリ（エチレンイミン）（ＰＥＩ）が挙げられるが、これらに限定されない。適切な化学物質層でコートされた固体支持体のための方法は、公知である（例えば、米国特許第６，１５０，１０３号；米国特許出願番号０９／１２０，６８９号（現在特許化されている）（両方が、その全体が参考として本明細書中に援用される）を参照のこと）。
【０２７３】
特定の好ましい実施形態において、核酸との結合のために化学物質層でコートされた固体支持体は、ピン形態である。そのような固体支持体は、米国特許出願番号０９／３２３，６９５（現在係属中）（その全体が参考として本明細書中に援用される）に従って調製され得る。この型の固体支持体により、本明細書中に記載される診断法の自動化が可能になる。例えば、単一の生物学的サンプルから単離された核酸分子を保有する複数のピンが、マルチウェルプレートの個々のウェルに同時に配置され得、このマルチウェルプレートにおいて、各ウェルは、特定の標的核酸分子を検出するために特異的な部分的に二本鎖の核酸プローブまたは一本鎖核酸プローブ、および一本鎖核酸の増幅に必要な他の成分（例えば、ニック形成剤、ＤＮＡポリメラーゼ、およびｄＮＴＰ）を含む。その増幅反応が完了した際、ピンが、ウェルから取り除かれ得、そしてウェル中の増幅された一本鎖核酸分子が、並行して特徴付けられ得る。増幅された核酸分子のそのような特徴づけにより、生物学的サンプル中の特定の標的核酸の存在もしくは非存在の決定が可能になる。
【０２７４】
同様に、異なる生物学的サンプルから単離された核酸分子を保有する複数のピンが、マルチウェルプレートの個々のウェルに同時に配置され得、このマルチウェルプレートにおいて、各ウェルは、特定の標的核酸分子を検出するために特異的な部分的に二本鎖の同じ核酸プローブまたは同じ一本鎖核酸プローブ、および一本鎖核酸の増幅に必要な他の成分（例えば、ニック形成剤、ＤＮＡポリメラーゼ、およびｄＮＴＰ）を含む。その増幅反応が完了した際、ピンが、ウェルから取り除かれ得、そしてウェル中の増幅された一本鎖核酸分子が、並行して特徴付けられ得る。増幅された核酸分子のそのような特徴づけにより、種々の生物学的サンプル中の特定の標的核酸の存在もしくは非存在の決定が可能になる。
【０２７５】
（ｂ．テンプレート核酸を調製するための方法）
診断適用のために有用なテンプレート核酸分子は、種々のアプローチにより提供され得る。例えば、テンプレートは、一本鎖核酸プローブへのトリガー核酸のアニーリングにより得られ得、ここで、このトリガー核酸は、病原性生物に由来する核酸から誘導される。あるいは、テンプレートは、病原性生物に由来する二本鎖核酸分子から直接誘導され得る。テンプレートはまた、標的核酸に由来しかつ二本鎖核酸増幅のためのテンプレートとして機能するする突出を有する、部分的に二本鎖の核酸分子であり得るか、または標的核酸とハイブリダイズ可能であるが一本鎖核酸増幅のためのテンプレートとしては機能しない突出を有する、部分的に二本鎖の核酸分子であり得る。診断適用に関連するテンプレートを提供するためのこれらの手段および他の手段が、下記に記載される。
【０２７６】
（ｉ．テンプレート分子を提供するための第１の型の例示的方法）
一本鎖核酸プローブにトリガー核酸をアニーリングすることによりテンプレート核酸分子が提供される本発明の特定の実施形態において、そのトリガー核酸は、病原性生物に由来するＤＮＡ分子（例えば、ゲノムＤＮＡ分子）またはＲＮＡ分子（例えば、ｍＲＮＡ分子）のいずれかから誘導され得る。病原性生物に由来する核酸分子が一本鎖である場合、その核酸分子は、トリガー核酸として直接使用され得る。あるいは、その一本鎖核酸は、より短いフラグメントを生成するために切断され得、ここで、これらのフラグメントのうちの１つ以上が、トリガー核酸として使用され得る。病原性生物に由来する核酸分子が二本鎖である場合、その核酸分子は、変性され得そしてトリガー核酸として直接使用され得るか、または変性生成物が、より短い複数の一本鎖フラグメントを提供するために切断され得、ここで、これらのフラグメントのうちの１つ以上が、トリガー核酸として機能し得る。あるいは、この核酸は、まず、より短い二本鎖フラグメントを得るために切断され得、その後、そのより短いフラグメントが、１つ以上のトリガー核酸を提供するために変性され得る。
【０２７７】
一本鎖核酸プローブは、トリガー核酸と少なくとも実質的に相補的でなければならず、その結果、そのトリガー核酸が誘導される標的核酸が生物学的サンプル中に存在する場合に、その一本鎖核酸プローブがその標的にアニール可能となる。さらに、そのプローブは、ＮＡＲＳのうちの１本の鎖の配列を含み、その結果、トリガー核酸がプローブにアニールする場合に形成される二重鎖の伸長産物は、ニック形成剤認識配列を含む。
【０２７８】
テンプレート分子を調製するための第１の型の方法の例が、図３６に示される。この図において示されるように、二本鎖ゲノムＤＮＡが、まず、制限エンドヌクレアーゼにより切断され得る。消化生成物は、変性され得、消化生成物のうちの１つの１本の鎖は、核酸増幅反応を開始するためのトリガー核酸として使用され得る。
【０２７９】
（ｉｉ．テンプレート分子を提供するための第２の型の例示的方法）
トリガー核酸を一本鎖核酸プローブにアニールすることによりテンプレートが提供される本発明の特定の実施形態において、トリガー核酸は、ＮＡＲＳのセンス鎖の配列を含み得る。そのトリガー核酸は、病原性生物に由来する標的核酸（例えば、ゲノム核酸）から誘導され得る。テンプレート核酸が、その認識配列の外側にニック形成するニック形成エンドヌクレアーゼ（例えば、Ｎ．ＢｓｔＮＢ  Ｉ）により認識可能なＮＥＲＳを含む、特定の実施形態が、図３７に示される。この図により示されるように、ＮＥＲＳを含むゲノムＤＮＡまたはそのフラグメントが、変性され、そのゲノムＤＮＡの１本の鎖またはその鎖のフラグメントが、一本鎖核酸プローブにアニールする。このプローブは、ゲノムＤＮＡの、ＮＥＲＳのアンチセンス鎖の配列を含むもう一方の鎖の一部である。このプローブにトリガー核酸をアニーリングすると、増幅反応のためのテンプレート核酸が提供される。増幅反応混合物中のプローブ分子の数は、好ましくは、ＮＥＲＳのセンス鎖の配列を含むゲノムＤＮＡ鎖もしくはそのフラグメントの数よりも多い。
【０２８０】
トリガー核酸が標的核酸から誘導されかつＮＡＲＳのセンス鎖の配列を含む関連する実施形態において、一本鎖核酸プローブが、そのプローブの３’部分にてトリガー核酸と少なくとも実質的に相補的（５’部分においてはそうではない）であり得る。そのプローブの３’部分は、ＮＡＲＳのアンチセンス鎖の配列を含み、その結果、トリガー核酸にそのプローブをアニーリングすることにより形成されるテンプレート核酸は、二本鎖ＮＡＲＳを含む。ＮＡＲＳを認識するＮＡの存在下で、テンプレート分子がニック形成される。その後、ニック形成部位の３’末端が、テンプレート分子中のＮＡＲＳのアンチセンスの配列に対して５’側の領域をテンプレートとして使用して、伸長される。生じた増幅生成物は、トリガー核酸の一部ではなくＮＡＲＳのアンチセンス鎖の配列の５’側に位置するプローブ領域と相補的である、一本鎖核酸分子である。
【０２８１】
特定の実施形態において、その一本鎖核酸プローブは、固体支持体に固定され得る。あるいは、その一本鎖核酸プローブは、いかなる固体支持体にも結合されていないかもしれない。
【０２８２】
（ｉｉｉ．テンプレート分子を提供するための第３の型の例示的方法）
本発明の特定の実施形態において、テンプレート核酸は、ＮＡＲＳおよびＲＥＲＳの両方を含むゲノム核酸から直接誘導された、二本鎖核酸であり、ここで、ＮＡＲＳに対応するＮＳが、ＮＡＲＳ内に存在するか、またはＮＡＲＳとＲＥＲＳとの間に存在し、ＲＥＲＳは、ＮＡＲＳ付近に位置する。ＲＥＲＳは、ＲＥＲＳとＮＡＲＳとの間の距離が最大でも５００塩基対、４００塩基対、３００塩基対、２００塩基対、１００塩基対、５０塩基対、４０塩基対、３０塩基対、２０塩基対、１５塩基対、または１０塩基対である場合に、ＮＡＲＳ付近に位置する。その認識配列の外側にニック形成するニック形成エンドヌクレアーゼ（例えば、Ｎ．ＢｓｔＮＢ  Ｉ）により認識可能なＮＥＲＳを例示的ＮＡＲＳとして用いる実施形態が、図３８に示される。この図に示されるように、ゲノムＤＮＡが、そのゲノムＤＮＡ中のＲＥＲＳを認識する制限エンドヌクレアーゼにより消化され得る。ＮＥＲＳを含む消化産物は、テンプレート核酸として機能し得る。
【０２８３】
（ｉｖ．テンプレート分子を提供するための第４の型の例示的方法）
本発明の特定の実施形態において、テンプレート核酸は、種々のＯＤＮＰ対を使用して生成された、完全に二本鎖であるかまたは部分的に二本鎖である、核酸分子である。テンプレート分子を調製するためにＯＤＮＰ対を使用するための方法が、図３９〜４１とともに下記に記載されており、これらの方法は、図１、図２および図５における方法と類似する。
【０２８４】
１つの実施形態において、テンプレート核酸に対する前駆体は、二本鎖ＮＡＲＳおよびＲＥＲＳを含む。このＮＡＲＳおよびＲＥＲＳは、ＯＤＮＰ対を使用してその前駆体中に組込まれる。ＮＥの認識配列の外側にニック形成するＮＥ（例えば、Ｎ．ＢｓｔＮＢ  Ｉ）により認識可能なＮＥＲＳを例示的ＮＡＲＳとして用い、そしてＩＩ型制限エンドヌクレアーゼ配列（ＴＲＥＲＳ）を例示的ＲＥＲＳとして用いる実施形態が、図３９に示される。この図に示されるように、第１のＯＤＮＰは、ＮＥＲＳの一本の鎖の配列を含み、一方、第２のＯＤＮＰは、ＴＲＥＲＳの一本の鎖の配列を含む。これら２つのＯＤＮＰが標的核酸の一部を増幅するためのプライマーとして使用される場合、生じる増幅生成物（すなわち、テンプレート核酸に対する前駆体）は、二本鎖ＮＥＲＳおよび二本鎖ＴＲＥＲＳの両方を含む。ＴＲＥＲＳを認識するＩＩ型制限エンドヌクレアーゼの存在下で、増幅生成物は、二本鎖ＮＥＲＳを含むテンプレート核酸分子を生成するように消化される。
【０２８５】
別の実施形態において、テンプレート核酸に対する前駆体は、２つの二本鎖ＮＡＲＳを含む。この２つのＮＡＲＳは、２つのＯＤＮＰを使用して、テンプレートに対する前駆体中に組込まれる。その認識配列の外側にニック形成するニック形成エンドヌクレアーゼにより認識可能なＮＥＲＳを例示的ＮＡＲＳとして用いる実施形態が、図４０に示される。この図に示されるように、両方のＯＤＮＰは、ＮＥＲＳのセンス鎖の配列を含む。これら２つのＯＤＮＰが、標的核酸の一部を増幅するためのプライマーとして使用される場合、生じる増幅生成物は、２つのＮＥＲＳを含む。これらの２つのＮＥＲＳは、互いに同一であっても同一ではなくてもよいが、好ましくは、それらは同一である。ＮＥＲＳを認識するＮＥの存在下で、増幅生成物は、２回ニック形成され（各鎖に対して１回）、二本鎖ＮＥＲＳを各々含む２つのテンプレート核酸が生成される。
【０２８６】
なお別の実施形態において、テンプレート核酸に対する前駆体は、２つの半改変（ｈｅｍｉｍｏｄｉｆｉｅｄ）ＲＥＲＳを含む。この２つの半改変（ｈｅｍｉｍｏｄｉｆｉｅｄ）ＲＥＲＳが、２つのＯＤＮＰの使用により、前駆体に組込まれる。この実施形態は、図４１に示される。この図に示されるように、第１のＯＤＮＰおよび第２のＯＤＮＰの両方が、ＲＥＲＳの一本の鎖の配列を含む。これらの２つのＯＤＮＰが、改変デオキシヌクレオシド三リン酸の存在下で標的核酸の一部を増幅するためのプライマーとして使用される場合、生じる増幅生成物は、２つの半改変（ｈｅｍｉｍｏｄｉｆｉｅｄ）ＲＥＲＳを含む。これらの２つの半改変（ｈｅｍｉｍｏｄｉｆｉｅｄ）ＲＥＲＳは、互いに同一であっても、同一ではなくてもよい。半改変（ｈｅｍｉｍｏｄｉｆｉｅｄ）ＲＥＲＳを認識するＲＥの存在下で、上記増幅生成物は、半改変（ｈｅｍｉｍｏｄｉｆｉｅｄ）ＲＥＲＳの少なくとも１本の鎖の配列を各々が含む２つの部分的に二本鎖のテンプレート核酸分子を生成するようにニック形成される。
【０２８７】
（ｖ．テンプレート分子を提供するための第５の型の例示的方法）
本発明の他の実施形態において、部分的に二本鎖の核酸プローブが、テンプレート核酸分子として機能し得る。そのプローブは、（１）ニック形成部位（ＮＳ）を生じるようにニック形成剤により切断可能な、ニック形成剤認識配列（ＮＡＲＳ）；（２）鎖自体もしくはその伸長産物のいずれかがＮＳを含む、鎖中の５’突出、または鎖自体もその伸長産物もＮＳを含まない、鎖中の３’突出のいずれか（その突出は、標的核酸と少なくとも部分的に相補的なヌクレオチド配列を含む）；（３）鎖もその伸長産物もＮＳを含まない鎖中のヌクレオチド配列（そのヌクレオチド配列は、ＮＳに対応する位置の５’側に位置し、標的核酸と独特に相関する）を含む。その認識配列の外側にニック形成するニック形成エンドヌクレアーゼにより認識可能なＮＥＲＳを例示的ＮＡＲＳとしてテンプレート核酸が有する、例示的実施形態が、図６に示される。そのプローブは、生物学的サンプルと合わせられ、その生物学的サンプルは、存在する場合は、そのサンプル中の標的核酸へのプローブのハイブリダイゼーションを可能にする条件下で、標的核酸を含み得る。ハイブリダイズしていないプローブは取り除かれ、ハイブリダイズしたプローブは、ＮＡＲＳを認識するニック形成剤の存在下で一本鎖核酸を増幅する際のテンプレートとして使用される。増幅した一本鎖核酸フラグメントは、標的核酸と独特に相関するプローブ中の配列と相補的な配列を有するので、増幅した一本鎖核酸の検出および／または特徴づけは、サンプル中の標的核酸の存在を示す。
【０２８８】
ハイブリダイズしていないプローブの除去は、生物学的サンプルの核酸分子を固定することにより容易にされ得る。そのような固定は、上記のように当該分野で公知の任意の方法により実施され得る。特定の標的核酸分子と実質的に相補的な突出を有する部分的に二本鎖の核酸プローブがサンプルに適用される場合、そのプローブは、標的核酸がサンプル中に存在する場合に、そのプローブの突出を介して標的核酸にハイブリダイズする。その後、そのサンプルは洗浄されて、ハイブリダイズしていないいかなるプローブも除去される。ＤＮＡポリメラーゼと、プローブ中のＮＡＲＳを認識するニック形成剤との存在下で、一本鎖核酸分子が増幅される。しかし、標的核酸がサンプル中に存在しない場合、そのプローブは、サンプル中のどの核酸分子にもハイブリダイズ可能ではなく、従って、サンプルから洗浄して除去される。従って、洗浄された生物学的サンプルが、核酸増幅反応混合物（すなわち、プローブの部分をテンプレートとして使用する一本鎖核酸増幅のために必要な成分（例えば、プローブ中のＮＡＲＳを認識するＮＡ、およびＤＮＡポリメラーゼ）すべてを含む混合物）とともにインキュベートされる場合、そのプローブの上記部分と相補的な一本鎖核酸分子は増幅されない。従って、テンプレート分子は、特異的な固定配列にＮ１がハイブリダイズする場合にのみ形成される。
【０２８９】
標的核酸分子を固定することに加えて、標的核酸にアニールしたプローブ分子が、標的核酸と関係する官能基により、標的核酸にはアニールしなかったプローブ分子から分離され得る。例えば、標的核酸は、ビオチン分子を用いて標識され得、標的核酸にアニールしたプローブ分子は、標的と関連するビオチン分子を介して、標的核酸にアニールしなかったプローブ分子から分離され得る。例えば、標的核酸、および標的にアニールしたプローブは、固定したストレプトアビジンを用いて沈殿され得る。
【０２９０】
プローブのＮＡＲＳは、任意のニック形成剤の認識配列（ＮＥＲＳおよび半改変ＲＥＲＳが挙げられるが、これらに限定されない）であり得る。ＮＳは、ＮＡＲＳ中にあってもよいし、ＮＡＲＳの外側にあってもよい。特定の実施形態において、ＮＳは、プローブ中に存在しないかもしれないが、ＤＮＡポリメラーゼの存在下でプローブを伸長することにより生成され得る。好ましい実施形態において、ＮＡＲＳは、ニック形成エンドヌクレアーゼＮ．ＢｓｔＮＢ  Ｉにより認識可能である。
【０２９１】
プローブの二本鎖部分は、ハイブリダイズしていないプローブをサンプルから除去するための条件またはＮＡとＤＮＡポリメラーゼとの存在下で一本鎖核酸フラグメントを増幅するための条件下で、両方の鎖が互いにアニール可能であるに十分な長さでなければならない。この部分は、少なくとも８ヌクレオチド長、１０ヌクレオチド長、１２ヌクレオチド長、１５ヌクレオチド長、２０ヌクレオチド長であり得る。これは、対応するニック形成部位を含んでも含まなくてもよい。
【０２９２】
プローブの突出（ＮＳを含むかその伸長産物がＮＳを含む、鎖中の５’突出、またはもう一方の鎖中の３’突出のいずれか）もまた、その突出と標的核酸との間の特異的ハイブリダイゼーションを可能にするに十分な長さでなければならない。そのようなハイブリダイゼーションは、ハイブリダイズしていないプローブをサンプルから除去するための条件、またはその後、一本鎖核酸を増幅するための条件下で、解離してはならない。その突出は、少なくとも６ヌクレオチド長、８ヌクレオチド長、１０ヌクレオチド長、１２ヌクレオチド長、１４ヌクレオチド長、１６ヌクレオチド長、１８ヌクレオチド長、または２０ヌクレオチド長であり得る。
【０２９３】
そのプローブはまた、鎖自体またはその伸長産物のいずれもがＮＳを含まない鎖中のヌクレオチド配列を含まなければならず、ここで、このヌクレオチド配列は、ＮＳに対応する位置の５’側に位置する。この配列は、ニック形成剤とＤＮＡポリメラーゼとの存在下で、一本鎖核酸フラグメントの増幅のためのテンプレートとして使用される。この配列は、そのプローブの二本鎖部分または一本鎖部分中に存在し得る。複数のプローブが、目的の複数の標的核酸の存在または非存在を検出するために使用される場合、各プローブの上記配列は、各々が特定の標的核酸と独特に相関しうるように、互いに異ならなければならない。
【０２９４】
本発明のプローブは、当該分野で公知の適用可能な任意の方法を使用して、合成され得る。各鎖は、個々に合成され得、その後、部分的に二本鎖の核酸プローブを形成するようにアニールされ得る。
【０２９５】
特定の関連する実施形態において、テンプレート核酸が、生物学的サンプル由来の固定された標的核酸を一本鎖核酸プローブとハイブリダイズすることにより、形成される。ＮＡＲＳの外側にニックを形成するニック形成剤により認識可能なＮＡＲＳを使用するこれらの実施形態の例が、図４２に示される。この図に示されるように、生物学的サンプルの核酸が、その５’末端を介して固定される。その後、得られる固定された核酸は、一本鎖プローブでハイブリダイズされる。この一本鎖プローブは、３’から５’の方向に、生物学的サンプル中に存在すると疑われる標的核酸と少なくとも実質的に相補的な配列、およびＮＡＲＳのアンチセンス鎖の配列を含む。標的核酸が生物学的サンプル中に存在する場合、そのプローブ分子は、テンプレート分子を形成するように標的核酸にハイブリダイズする。そのテンプレート分子は、標的核酸が結合する固相を洗浄することによって、ハイブリダイズしていないプローブ分子から分離される。ＤＮＡポリメラーゼとＮＡＲＳを認識するニック形成剤との存在下で、テンプレート核酸が、一本鎖核酸分子を増幅するためのテンプレートとして使用される。しかし、標的核酸がサンプル中に存在しない場合、一本鎖プローブは、サンプル中のどの核酸分子ともハイブリダイズ可能ではなく、従って、固体支持体から洗い流される。結果として、固体支持体に結合するテンプレート核酸は何ら形成され得ず、テンプレート核酸の一部と相補的な一本鎖核酸分子も、何ら増幅され得ない。
【０２９６】
他の関連する実施形態において、生物学的サンプルに由来する標的核酸を、固定した一本鎖核酸プローブとハイブリダイズすることによって、テンプレート核酸が形成される。これらの実施形態の例は、標的核酸が固定されていないが、上記のような一本鎖核酸プローブが、その５’末端を介して固体支持体に固定されている場合である。標的核酸がサンプル中に存在する場合、プローブにサンプルの核酸をハイブリダイズすると、固体支持体が洗浄された場合に標的がその固体支持体に結合したままであることが可能になる。アンチセンス鎖がプローブ中に存在するニック形成剤認識配列を認識するニック形成剤と、ＤＮＡポリメラーゼとの存在下で、一本鎖核酸分子が、プローブ中の認識配列のアンチセンス鎖の配列の５’側に位置する配列をテンプレートとして使用して、増幅される。標的がサンプル中に存在しない場合、サンプルの核酸が、プローブが結合されている固体支持体から洗い流される。従って、プローブの一部をテンプレートとして使用して、いかなる一本鎖核酸分子も増幅されない。
【０２９７】
ＮＡＲＳの外側にニック形成するニック形成剤により認識可能なＮＡＲＳを使用する上記実施形態の別の例が、図４４に示される。この図に示されるように、一本鎖核酸プローブが、その５’末端を介して固体支持体に固定される。そのプローブは、５’から３’方向に、ＮＡＲＳのセンス鎖の配列と、標的核酸の３’部分と実質的に相補的な配列とを含む。そのプローブは、生物学的サンプル由来の核酸と混合される。その標的核酸がサンプル中に存在する場合、そのプローブ分子は、テンプレート分子を形成するように標的にハイブリダイズされる。そのプローブが結合される固体支持体が洗浄される場合、その標的は、プローブとのハイブリダイゼーションを介して固体支持体に結合されたままである。ＤＮＡポリメラーゼの存在下で、標的は、プローブをテンプレートとして使用して、その標的の３’末端から伸長する。標的の伸長産物とプローブの伸長産物との間に形成される二重鎖は、二本鎖ＮＡＲＳを含む。ＮＡＲＳを認識するニック形成剤とＤＮＡポリメラーゼとの存在下で、一本鎖核酸分子は、標的核酸の一部をテンプレートとして使用して増幅される。しかし、標的核酸がサンプル中に存在しない場合、そのプローブは、標的とハイブリダイズ可能ではない。従って、標的をテンプレートとして使用して、いかなる一本鎖核酸分子も増幅されない。
【０２９８】
上記の実施形態の別の例が、図４５に示される。この例において、固定された一本鎖核酸プローブが、標的核酸と実質的に相補的であるが、標的の３’部分と相補的である必要はない。そのプローブはまた、ニック形成剤認識配列のセンス鎖の配列を含む。標的が生物学的サンプル中に存在する場合、プローブがサンプル中の核酸と混合された場合に、そのプローブは、標的とハイブリダイズし得る。プローブが結合する固体支持体が洗浄された場合、標的は、そのプローブとその標的とのハイブリダイゼーションを介して固体支持体に結合されたままである。ＤＮＡポリメラーゼと、ＮＡＲＳを認識するニック形成剤の存在下で、ＮＡＲＳのセンス鎖の配列中の１つ以上のヌクレオチドが標的中のヌクレオチドと従来の塩基対を形成しないかもしれない場合でさえ、特定の環境において、一本鎖核酸が、標的の一部をテンプレートとして使用して増幅され得る。テンプレート核酸が二本鎖ＮＡＲＳを含まない場合に一本鎖核酸が増幅される環境についての詳細な説明が、一本鎖核酸分子を調製することに関連する節において下記に提供される。しかし、標的核酸がサンプル中に存在しない場合、そのプローブは、標的とハイブリダイズ可能ではない。従って、標的をテンプレートとして使用して、いかなる一本鎖核酸分子も増幅されない。
【０２９９】
（ｃ．特異性）
本発明の方法は、サンプル中の特定の病原性生物の存在もしくは非存在を検出するため、および密接に関連するいくつかの病原性生物の存在を検出するために、使用され得る。例えば、上記の第１の型および第２の型の例示的方法に関して、一本鎖核酸プローブがアニールするトリガー核酸の一部は、検出されるべき特定の病原性生物に特異的な標的核酸もしくはその一部から誘導され得る。あるいは、そのようなトリガー核酸の一部は、密接に関連するいくつかの病原性生物のうちで実質的に保存されているかまたは完全に保存されているが、より遠縁の他の病原性生物もしくは関連しない他の病原性生物には存在しない、標的核酸もしくはその一部から誘導され得る。
【０３００】
本明細書中で使用される場合、特定の病原性生物に「特異的な」標的核酸またはその一部は、特定の生物中に存在するが他のどの生物（その特定の生物と密接に関連する生物を含む）にも存在しない配列を有する、標的核酸もしくはその一部を指す。さらに、本明細書中で使用される場合、密接に関連するいくつかの病原性生物のうちで「実質的に保存されている」標的核酸中の領域とは、適切な条件下ではその密接に関連するいくつかの生物の各々における対応する領域とハイブリダイズ可能であるが、同一の条件下で、より遠縁の生物もしくは関連しない生物由来の標的核酸中の類似領域とはハイブリダイズ不可能である、核酸分子が存在する標的核酸中の領域を指す。また、本明細書中で使用される場合、密接に関連する病原性生物のうちで「完全に保存された」標的核酸中の領域とは、その密接に関連するいくつかの病原性生物の各々に由来する標的核酸中に同一の配列を有する領域を指す。
【０３０１】
同様に、上記の第４の型の例示的方法に関して、プライマー対を用いて増幅される標的核酸部分は、特定の病原性生物に特異的な領域であり得るか、または密接に関連するいくつかの病原性生物のうちで実質的に保存されているかもしくは完全に保存されているが遠縁の他の病原性生物もしくは関連しない病原性生物においては存在しない領域であり得る。さらに、標的核酸の増幅された部分は、密接に関連するいくつかの病原性生物のうちで、標的核酸における可変領域であり得る。本明細書中で使用される場合、標的核酸中の「可変」領域とは、密接に関連する生物由来の標的核酸のうちで５０％未満の配列同一性を有するが、密接に関連する同じ生物由来の標的核酸のうちで８０％を超える配列同一性を有する領域により各側面で囲まれている、領域を指す。本明細書中で使用される場合、２つの核酸の配列同一性パーセントは、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３〜１０，１９９０）のＢＬＡＳＴプログラムをそのデフォルトパラメータとともに使用して、決定される。これらのプログラムは、ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：５８７３〜７，１９９３）において改変されたＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌのアルゴリズム（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：２２６４〜８，１９９０）を実行する。ＢＬＡＳＴプログラムは、例えば、ウェッブサイトｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖにて入手可能である。
【０３０２】
同様に、上記の第５型の例示的方法について、部分的な２本鎖核酸プローブの突出は、病原体に対して特異的な標的核酸中の領域または種々の密接に関連する病原体の間で実質的にかまたは完全に保存される標的核酸中の領域に少なくとも実質的に相補的であり得る。突出が特定の生物由来の標的核酸またはその一部に完全に相補的であるが、１つ以上の密接に関連する生物由来の標的核酸またはその一部にも実質的に相補的である場合、当業者は、ハイブリダイゼーションストリンゲンシーを変更して、特定の生物の存在を検出し得るか、任意の１つの密接に関連する生物の存在を検出する。例えば、二本鎖核酸プローブは、高ストリンジェント条件下で生物学的サンプル由来の核酸とハイブリダイズされる場合、鋳型としてプローブ分子の一部を使用してハイブリダイズされたプローブの除去の後、核酸増幅は、生物学的サンプル中の特定の生物の存在を示し得る。言いかえると、プローブが中程度または低いストリンジェント条件下で、生物学的サンプル由来の核酸とハイブリダイズされる場合、核酸増幅（鋳型としてプローブ分子の一部を使用してハイブリダイズされたプローブ分子の除去の後）は、特定の生物および／または特定の生物に密接に関連する１つ以上の生物の存在を示し得る。ハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーを調節することは、当該分野で公知であり、そして詳細な議論が、例えば、ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，２００１に見出され得る。
【０３０３】
鋳型核酸が一本鎖核酸プローブにトリガー核酸をアニーリングすることによって提供される実施形態において、トリガー核酸またはその一部およびプローブ中のＮＡＲＳの一方の鎖の配列に対して３’側に位置するプローブ分子の一部は、互いに完全に相補的であるよりもむしろ実質的に相補的であり得る。例えば、トリガー核酸が、種々の密接に関連する病原体の間で実質的に保存される標的核酸の領域から誘導され、そして任意の種々の生物の存在が検出される必要がある場合、トリガー核酸に実質的に相補的なプローブ分子が使用され得る。このような環境において、プライマー伸長反応は、トリガー核酸がプローブ分子にアニーリングするのを防ぐか、またはトリガー核酸が鋳型としてプローブ分子の一部を使用して伸長されるのを防ぐにはあまりにもストリンジェントでない条件下で実行される必要がある。しかし、このような条件はまた、プローブ分子がトリガー核酸以外の核酸分子に非特異的なアニーリングするのを防ぐのに十分アストリンジェントである必要がある。核酸増幅に適切な条件は、トリガー核酸またはその一部が、プローブ分子の一部に実質的に相補的である場合、反応温度および／または反応緩衝液の組成または濃度を調節することによって、よい結果となり得る。一般的に、ハイブリダイゼーション反応に類似して、反応温度の上昇は、増幅反応のストリンジェンシーを増加する。
【０３０４】
本発明を使用して、ＲＮＡ標的配列またはＤＮＡ標的配列のいずれか、または両方の存在を検出し得る。ＤＮＡポリメラーゼは、鋳型としてＲＮＡまたはＤＮＡのいずれかを使用する能力を有するように選択され得る。ＲＮＡ標的配列検出について、生物学的サンプル（例えば、固定化細胞または組織）は、核酸プローブと直接的にハイブリダイズされ得る。代表的に、ＤＮＡ分子は、二本鎖としてサンプル中に存在するので、核酸プローブとハイブリダイズするのに利用可能でない。ＤＮＡ標的配列の検出について、生物学的サンプルを、始めにＲＮａｓａまたはＮａＯＨ（約０．１Ｍ）で処理し、潜在的なＲＮＡ標的配列を分解し得る。次いで、処理したサンプルを加熱し、得られた一本鎖が核酸プローブとハイブリダイズするのを可能にするように二本鎖標的核酸を変性し得る。加熱工程が、サンプルと核酸プローブとの間でのハイブリダイゼーションの前に、含まれる（ＲＮａｓｅ処理をしない）場合、ＤＮＡおよびＲＮＡ標的配列の両方は、プローブとのハイブリダイゼーションに利用可能であり、従って検出され得る。このようなハイブリダイゼーションは、本発明のほとんどの診断適用のために好ましい。なぜなら、これは標的配列にハイブリダイズするプローブの最大の数を与え、従って、増幅した一本鎖核酸分子の最良の収率を与えるからである。
【０３０５】
標的核酸が固体支持体に固定化される特定の実施形態において、標的核酸分子を固定化しているこの固体支持体を、初めにプローブとハイブリダイズする前の固体支持体へのプローブの非特異的な結合を阻止するようなブロッキング剤とインキュベートし得る。このようなブロッキング剤は、当該分野で公知であり、そして当業者に容易に利用可能である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出を参照のこと）。
【０３０６】
（ｄ．一本鎖核酸の増幅）
一本鎖核酸の増幅は、基本的に遺伝子変異検出方法についての上記の通りである。検出を容易にするために（以下により詳細に記載される）、標識化ジデオキシリボヌクレオシド三リン酸は、増幅に使用され得、次いで増幅した一本鎖核酸へ取り込まれ得る。核酸フラグメントへの取り込みのための適切な標識および続くフラグメントの検出のための方法は、当該分野で公知であり、そして例示的な標識は、遺伝子変異同定方法について上記される。特定の実施形態において、標識は、放射標識（例えば、３２Ｐ、３３Ｐ、１２５Ｉまたは３５Ｓ）、有色反応産物を生成し得る酵素（例えば、アルカリホスファターゼ）、蛍光標識（例えば、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ））、ビオチン、アビジン、ジゴキシゲニン、抗原、ハプテン、または蛍光色素であり得る。標識の存在はまた、標的核酸のインサイチュ検出を可能にする細胞内で、増幅した一本鎖核酸分子の保持を容易にし得る。
【０３０７】
上記のように、一本鎖核酸分子は、鋳型として鋳型核酸の一部を使用して増幅される。特定の実施形態において、増幅した一本鎖核酸は、比較的短くあり得、そして多くても２５ヌクレオチド、２０ヌクレオチド、１７ヌクレオチド、１５ヌクレオチド、１０ヌクレオチドまたは８ヌクレオチドを有する。このような短い長さは、一本鎖核酸プローブまたは鋳型分子を作製するのに使用されるＯＤＮＰを適切に設計することによって達成され得る。例えば、鋳型分子を提供する第２型について（図３７）、一本鎖核酸プローブは、ＮＡＲＳのアンチセンス鎖の配列に対して短い領域の５’側を有するように設計され得る。鋳型分子を提供する第４型について（図３９〜４１）、ＯＤＮＰ対は、プライマーが標的核酸にアニールする場合、互いに密接であるように設計され得る。鋳型核酸分子を提供する第５型について（図６）、部分的な二本鎖プローブは、ＮＡＲＳのアンチセンス鎖の配列に対して短い領域の５’側を有するように設計され得る。増幅された一本鎖核酸分子の短い長さは、有利であり得る。なぜなら、増幅効率および増幅割合が増加するからである。さらに、これは、位置置換活性を有さないＤＮＡポリメラーゼの使用を可能にする。これはまた、特定の技術（例えば、質量分光分析）による増幅した一本鎖核酸分子の検出を容易にする。
【０３０８】
（ｅ．増幅した一本鎖核酸分子の検出／特徴付け）
本発明の増幅した一本鎖核酸分子についての検出／特徴付け方法としては、短い核酸フラグメントを検出しそして／または特徴付けするのに適切である当該分野で公知の任意の方法が挙げられる。例示的な方法はまた、遺伝子変異同定方法について上記される。増幅した一本鎖核酸分子の検出は、インサイチュでまたは分子が生物学的サンプルから放出および／または除去された後に行なわれ得る。標的核酸由来の生物学的サンプルから単離され、引き続き固体支持体に固定化される特定の実施形態において、増幅した一本鎖核酸分子は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦのような技術によって検出される前に、別の固体支持体（「固体基板」とも呼ばれる）に転移され得る。このような手順は、容易に多重化され得、従って、多数の異なる生物学的サンプル由来の標的核酸から始まる増幅した一本鎖核酸分子のアレイを形成するために使用され得る。複数の増幅した一本鎖核酸分子を同時に検出および／または特徴付けし得る技術（例えば、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）の使用は、本発明の診断方法のスループットを増加する。
【０３０９】
上記のような、特定の実施形態において、増幅した一本鎖核酸分子は、標識化デオキシヌクレオチド三リン酸を取り込むことによって標識される。特定のこのような標識化分子（放射性同位体、蛍光部分および色素で標識された分子）は、ｘ線撮影、蛍光分光法または蛍光分光測定、および発光分光法または発光分光測定のような技術を使用して直接的に検出され得る。他の標識化分子（例えば、有色反応産物を生成し得る酵素、ビオチン、アビジン、ジゴキシゲン、抗原、ハプテンまたは蛍光色素）は、間接的に検出されなければならない可能性がある。例えば、アルカリホスファターゼは、基質（例えば、Ｖｅｃｔｏｒ  Ｒｅｄ／Ｖｅｃｔｏｒ  Ｂｌｕｅ（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｓ，ＣＡ）、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスフェート（ＢＣＩＰ）／ニトロブルーテトラゾリウム（ｔｅｔｒｚｏｌｉｕｍ）（ＮＢＴ）（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍ．Ｃｏ．，ＭＯ）またはＮｕｃｌｅａｒ  Ｆａｓｔ  Ｒｅｄ（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍ．Ｃｏ．））との反応によって検出され得る。ビオチン（または、アビジン）標識は、標識化アビジン（または標識化ビオチン）に結合することによって検出され得る。ジゴキシゲニン標識およびハプテン標識は、標識化抗ジゴキシゲニン抗体または標識化抗ハプテン抗体によって検出され得る。
【０３１０】
蛍光偏光（ＦＰ）はまた、一本鎖核酸分子の増幅を検出するために使用され得る。ＦＰは、蛍光分子が平面偏光によって励起される現象に依存し、タグ化分子が励起と発光との間で有意に回転しない場合、ＦＰは固定平面に偏光蛍光を発光する。しかし、分子が十分に小さく、そして回転し、そして空間に転がる場合、蛍光偏光は検出器によって完全に観察されない。
【０３１１】
分子の蛍光偏光は、分子の回転緩和時間（通常、６８．５°の角度で回転する時間）に比例し、この緩和時間は、溶液の性質（例えば、粘性）、温度および分析物または生体分子の分子容に関連する。従って、粘性および温度が一定に保たれる場合、蛍光偏光は、分子容に直接比例し、次いで、これは分子量に直接比例する。より大きなタグ化分子は、回転し、そして空間中にゆっくりと転がり、従って、蛍光偏光値は、得られ得る。対照的に、より小さい分子は、回転し、そして速く転がり、そして蛍光偏光は、測定され得ない。
【０３１２】
１つの局面において、本発明は、一本鎖オリゴヌクレオチドへの蛍光標識化ヌクレオチドの取り込みの際の、蛍光標識化ヌクレオシドを検出ために蛍光偏光を使用する。蛍光標識化ヌクレオチド三リン酸は小さく、そして溶液中で迅速に回転する。従って、小さい核酸フラグメントへの取込みがない場合、蛍光タグ化ヌクレオシド三リン酸は、蛍光偏光によって検出可能でない。核酸分子へ蛍光標識化ヌクレオシド三リン酸の取込む上記の一本鎖核酸分子の増幅は、、蛍光団の分子量を約２０倍増加する。分子量の増加の理由から、オリゴヌクレオチドの蛍光偏光は、検出され得、そして測定され得る。
【０３１３】
種々の蛍光色素またはプローブは、本発明に使用され得る。蛍光色素は、同定され、そしてそれらの吸収および蛍光発光の波長および強度によって最も直接的に定量される。発光スペクトル（蛍光およびリン光）は、吸収スペクトルよりもはるかに高感度であり、特異的である。他の光物理的特性（蛍光異方性のような）は、好ましくない。有用な強度パラメーターは、蛍光についての量子収量（ＱＹ）および吸収についてのモル吸光率（ε）である。ＱＹは、蛍光スペクトルプロフィール全体にわたる全光子発光の測定であり、そしてε値は、所定の波長（通常、プローブの吸収の最大値）で特定化される。狭い光学的バンド幅（＜２５ｎｍ）は、通常蛍光励起に（吸収を介して）使用されるが、蛍光検出バンド幅がより可変（最大感度についての完全なスペクトル〜最大分解能について狭いバンド（約２０ｎｍ）の範囲）である。プローブ分子あたりの蛍光強度は、εとＱＹとの積に比例する。本発明に使用するのに適切である商業的に重要なおよび例示的な蛍光色素は、フルオレセイン、テトラメチルローダミン、リサミン、Ｔｅｘａｓ  ＲｅｄおよびＢＯＤＩＰＹである。
【０３１４】
蛍光標識は、ＣＥおよびＨＰＬＣによって分離された小さい核酸フラグメントの検出のために、現在通常使用される。この目的のために使用され得る標識の１つのグループは、近赤外線（近ＩＲ）蛍光色素に基づくグループである。水溶液において、タグのこれらの型は、＞６８０ｎｍの最大吸収光、次いで近−ＩＲ波長の蛍光発光（蛍光の最大値は＞７００ｎｍである）を有する。検出にこの型の蛍光を使用する１つの利点は、この型の蛍光が生物学的サンプル中に存在し得る他の化合物に起因する相対的に小さい吸収または発光が存在するスペクトル領域に生じることである。これのことおよびほとんどの近ＩＲプローブは、市販されるレーザーで励起し得るという事実は、低いバックグラウンドシグナルを有するこのアプローチおよびａｔｔｏｍｏｌｅ範囲に及ぶ検出の限界を提供する。
【０３１５】
蛍光分光法の制限の１つは、自己蛍光の現象である。自己蛍光を避ける１つの方法は、発光するのに有意なより長い遅れ時間を有する蛍光色素を使用することである。これらの蛍光色素は、通常、ＯＤＮプローブまたはプライマーの５’末端で結合される発光金属キレートである。
【０３１６】
「天然の」核酸への時間分解（ｔｉｍｅ−ｒｅｓｏｌｖｅｄ）蛍光色素の取り込みを可能にするテルビウムデオキシリボヌクレオシド三リン酸が、利用可能である。これらのプローブは、大きなストークスシフト、狭い発光バンドおよび長い寿命の利点を有する。時間分解蛍光分光法は、構造生物学に特に有用であり、そして分子相互作用およびピコ秒〜ナノ秒の時間範囲に起こる運動をモニターするために使用される。時間分解蛍光分光法は、生体分子構造および生体分子動力学の中心となり始め、そして本発明に従う検出／特徴付け技術として使用され得る。
【０３１７】
本発明の小さい核酸フラグメントへ取り込まれ得、それによって小さい核酸に対する効果的な特徴付け手段をもたらすデオキシリボヌクレオシドアナログとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：フルオレセイン−１２−ｄＵＴＰ、クマリン−５−ｄＵＴＰ、テトラメチルローダミン−６−ｄＵＴＰ、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ（登録商標）−５−ｄＵＴＰ、ナフトフルオレセイン−５−ｄＵＴＰ、フルオレセインクロロトリアジニル−４−ｄＵＴＰ、ピレン−８−ｄＵＴＰ、ジエチルアミノクマリン−５−ｄＵＴＰ、シアニン３−ｄＵＴＰ、シアニン５−ｄＵＴＰ、クマリン−５−ｄＣＴＰ、フルオレセイン−１２−ｄＣＴＰ、テトラメチルローダミン−６−ｄＣＴＰ、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ（登録商標）−５−ｄＣＴＰ、リサミンＴＭ−５−ｄＣＴＰ、ナフトフルオレセイン−５−ｄＣＴＰ、フルオレセインクロロトリアジニル−４−ｄＣＴＰ、ピレン−８−ｄＣＴＰ、ジエチルアミノクマリン−５−ｄＣＴＰ、シアニン３−ｄＣＴＰ、シアニン５−ｄＣＴＰ、クマリン−５−ｄＡＴＰ、ジメチルアミノクマリン−５−ｄＡＴＰ、フルオレセイン−１２−ｄＡＴＰ、フルオレセインクロロトリアジニル−４−ｄＡＴＰ、リサミンＴＭ−５−ｄＡＴＰ、ナフトフルオレセイン−５−ｄＡＴＰ、ピレン−８−ｄＡＴＰ、テトラメチルローダミン−６−ｄＡＴＰ、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ（登録商標）−５−ｄＡＴＰ、シアニン３−ｄＡＴＰ、シアニン５−ｄＡＴＰ、クマリン−５−ｄＧＴＰ、フルオレセイン−１２−ｄＧＴＰ、テトラメチルローダミン−６−ｄＧＴＰ、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ（登録商標）−５−ｄＧＴＰおよびリサミンＴＭ−５−ｄＧＴＰ。
【０３１８】
リボヌクレオシドアナログとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：フルオレセイン−１２−ＵＴＰ、クマリン−５−ＵＴＰ、テトラメチルローダミン−６−ＵＴＰ、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ（登録商標）−５−ＵＴＰ、リサミンＴＭ−５−ＵＴＰ、ナフトフルオレセイン−５−ＵＴＰ、フルオレセインクロロトリアジニル−４−ＵＴＰ、ピレン−８−ＵＴＰ、シアニン３−ＵＴＰ、シアニン５−ＵＴＰ、クマリン−５−ＣＴＰ、フルオレセイン−１２−ＣＴＰ、テトラメチルローダミン−６−ＣＴＰ、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ（登録商標）−５−ＣＴＰ、リサミンＴＭ−５−ＣＴＰ、ナフトフルオレセイン−５−ＣＴＰ、フルオレセインクロロトリアジニル−４−ＣＴＰ、ピレン−８−ＣＴＰ、シアニン３−ＣＴＰ、シアニン５−ＣＴＰ、クマリン−５−ＡＴＰ、フルオレセイン−１２−ＡＴＰ、テトラメチルローダミン−６−ＡＴＰ、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ（登録商標）−５−ＡＴＰ、リサミンＴＭ−５−ＡＴＰ、クマリン−５−ＧＴＰ、フルオレセイン−１２−ＧＴＰ、テトラメチルローダミン−６−ＧＴＰ、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ（登録商標）−５−ＧＴＰおよびリサミンＴＭ−５−ＧＴＰ。
【０３１９】
デオキシアナログとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：フルオレセイン−１２−ｄｄＵＴＰ、ＦＡＭ−ｄｄＵＴＰ、ＲＯＸ−ｄｄＵＴＰ、Ｒ６Ｇ−ｄｄＵＴＰ、ＴＡＭＲＡ−ｄｄＵＴＰ、ＪＯＥ−ｄｄＵＴＰ、Ｒ１１０−ｄｄＵＴＰ、フルオレセイン−１２−ｄｄＣＴＰ、ＦＡＭ−ｄｄＣＴＰ、ＲＯＸ−ｄｄＣＴＰ、Ｒ６Ｇ−ｄｄＣＴＰ、ＴＡＭＲＡ−ｄｄＣＴＰ、ＪＯＥ−ｄｄＣＴＰ、Ｒ１１０−ｄｄＣＴＰ、フルオレセイン−１２−ｄｄＧＴＰ、ＦＡＭ−ｄｄＧＴＰ、ＲＯＸ−ｄｄＧＴＰ、Ｒ６Ｇ−ｄｄＧＴＰ、ＴＡＭＲＡ−ｄｄＧＴＰ、ＪＯＥ−ｄｄＧＴＰ、Ｒ１１０−ｄｄＧＴＰ、フルオレセイン−１２−ｄｄＡＴＰ、ＦＡＭ−ｄｄＡＴＰ、ＲＯＸ−ｄｄＡＴＰ、Ｒ６Ｇ−ｄｄＡＴＰ、ＴＡＭＲＡ−ｄｄＡＴＰ、ＪＯＥ−ｄｄＡＴＰおよびＲ１１０−ｄｄＡＴＰ。
【０３２０】
上記のアナログの全ては、３Ｈ、ジュウテリウム、３２Ｐ、１４Ｃ、３５Ｓおよび他の放射性同位体でさらに放射標識され得る。
【０３２１】
アナログはまた、非天然のヌクレオシドアナログであり得、これらとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：８−ブロモ−２’−デオキシアデノシン−ＴＴＰ、８−オキソ−２’−デオキシアデノシン、エテノ−２’−デオキシアデノシン−ＴＴＰ、エテノ−２’−デオキシアデノシン−ＴＴＰ、Ｎ６−メチル−２’デオキシアデノシン−ＴＴＰ、２，６−ジアミノプリン−２’−デオキシリボシド−ＴＴＰ、８−ブロモ−２’−デオキグアノシン−ＴＴＰ、７−デアザ−２’−デオキグアノシン−ＴＴＰ、２’−デオキシイソグアノシン−ＴＴＰ、オキソ−２’−デオキグアノシン−ＴＴＰ、Ｏ６−メチル−２’−デオキグアノシン−ＴＴＰ、Ｓ６−ＤＮＰ−２’−デオキシチオグアノシン−ＴＴＰ、３−ニトロピロール−２’−デオキシリボシド−ＴＴＰ、５−プロピニル−２’−デオキシウリジン−ＴＴＰ、５−フルオロ−２’−デオキシウリジン−ＴＴＰ、２’−デオキシウリジン−ＴＴＰ、５−ブロモ−２’−デオキシウリジン−ＴＴＰ、５−ヨード−２’−デオキシウリジン−ＴＴＰおよび４−トリアゾリル−２’−デオキシウリジン−ＴＴＰ。
【０３２２】
現在、偏光蛍光測定器および５０以上の蛍光偏光イムノアッセイ（ＦＰＩＡ）は、市販され、これらの多くは、生物学的流体中の治療剤、代謝産物および薬物乱用の測定のために臨床研究室で日常的に使用される（例えば、Ｃｈｅｃｏｖｉｃｈら、Ｎａｔｕｒｅ  ３７５：２５４−２５６（１９９５）；公開された誤りが、Ｎａｔｕｒｅ  ３７５：５２０（１９９５）に見られる（これらの両方は、全体が本明細書中で参考として援用される）を参照のこと）。
【０３２３】
本発明の１つの核酸プローブのみが、標的核酸が存在する生物学的サンプルにハイブリダイズするために使用される場合、増幅した一本鎖核酸分子単独の検出は、標的核酸の存在を示すのに十分であり得る。しかし、複数の核酸プローブが生物学的サンプル中の複数の標的核酸の存在または非存在を決定するために使用される場合、増幅した一本鎖核酸フラグメントは、通常、特徴付けすることが必要である。このような特徴付けは、各増幅した分子の同定、従ってその相関される標的核酸の同定を可能にする。上記のように、小さいヌクレオチドフラグメントを特徴付けするために適切な当該分野で公知の任意の技術は、増幅した核酸分子を特徴付けするために使用され得る。特定の好ましい実施形態において、これらの分子は、ＬＣ／ＭＳによって特徴付けされる。
【０３２４】
（２．標的核酸を検出するためのキット）
本発明はまた、生物学的サンプル中の標的核酸を検出するためのキットを提供する。このキットは、一般的に、上記のような部分的な二本鎖核酸プローブまたはアニーリングされる場合、部分的な二本鎖核酸プローブを生成する２つの一本鎖オリゴヌクレオチドを備える。キットはまた、少なくとも１個、２個、数個または以下の成分の各々をさらに備え得る：（１）プローブ中のＮＡＲＳを認識するニック形成剤（例えば、ＮＥまたはＲＥ）および／またはその緩衝液；一本鎖核酸フラグメントを増幅するためのＤＮＡポリメラーゼおよび／またはその緩衝液；（３）ｄＮＴＰ（ｄＮＴＰのいくらかが標識され得る）；（４）コントロール標的核酸およびコントロールプローブ；（４）ハイブリダイゼーション緩衝液；（５）ハイブリダイゼーションしていないプローブを取り除くための洗浄緩衝液；（６）液体クロマトグラフィーカラム；（７）クロマトグラフィーカラムのための緩衝液Ａ；（８）クロマトグラフィーカラムのための緩衝液Ｂ；（９）水；（１０）核酸に結合可能な化学物質で被膜された固体支持体（例えば、ＰＥＩコートステンレス鋼ピン）；（１１）微小管またはマイクロウェルプレート；（１２）鎖置換促進剤（ｓｔｒａｎｄ  ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ  ｆａｃｉｌｉｔａｔｏｒ）（例えば、１Ｍトレハロース）；および（１３）キットを使用するための指示冊子。遺伝子変異を検出するためのキットに共通した成分はまた、これらのキットに関する節において記載される。
【０３２５】
（３．本発明の標的核酸の検出方法の用途）
本明細書中の上記に詳細に議論されるように、本発明は、生物学的サンプル中の標的核酸を検出するための方法を提供する。これらの方法は、広範な用途における有用性を見出し、ここで生物学的サンプル中の標的核酸の存在または非存在を決定することが必要である。このような用途としては、限定されないが、以下が挙げられる：疾患の診断および疾患の素因、作物栽培および動物交配、細胞機能および／または疾患マーカー遺伝子の発現プロファイリング、ならびに植物または動物において感染性疾患を引き起こし、そして／または食品安全性に関する感染生物の同定および／または特徴付け。
【０３２６】
本発明は、目的の任意の標的核酸の存在をすばやく検出するのに有用である。特定の実施形態において、標的核酸は、病原体（例えば、感染性疾患を引き起こす生物）から誘導されるか、または由来する。このような病原体としては、バイオ脅威（ｂｉｏ−ｔｈｒｅａｔ）を課すもの（例えば、炭疽および天然痘）が挙げられる。さらに、本発明の方法は、特定の病原体の存在を検出するため、および様々な密接に関連する病原体の存在を検出するために使用され得る。本発明はまた、特定の抗生物質に耐性である生物を検出するのに使用され得る。例えば、本発明の方法、組成物またはキットを使用して、抗生物質または特定の組み合わせの抗生物質で処置された被験体中の特定の病原体を検出し得る。本発明をまた使用して、特定の性質（例えば、疾患の耐性または疾患の罹患率）に関する核酸の存在または非存在を検出し、そしてサンプルが得られた特定の被験体の特定の性質を有する可能性を予測し得る。
【０３２７】
さらに、本発明はまた、サンプル中の多数の標的核酸の存在または非存在の多重の決定のための方法を提供する。これらの方法は、サンプル（例えば、生検試料）を得ることが難しいか、サンプルの量が十分でないか、またはサンプルが得られた患者が、異なる障害または疾患に共通する症状を罹患する場合、特に役立つ。これらの方法は、当業者が、貴重なサンプルを使用して、種々の障害または疾患に関連する複数の核酸の存在または非存在を決定するのを可能にし、従って、患者の疾患の診断を容易にする。
【０３２８】
（Ｄ．一本鎖核酸プローブおよびｃＤＮＡライブラリーの調製）
別の局面において、本発明は、種々の核酸分析に有用な一本鎖核酸分子およびｃＤＮＡライブラリーを調製するための方法、化合物およびキットを提供する。これは、特定の実施形態において核酸アダプタを使用し、そして他の実施形態においてオリゴヌクレオチドプライマーを使用する。
【０３２９】
（１．核酸アダプタを使用して一本鎖核酸分子およびｃＤＮＡライブラリーを調製する方法）
本発明は、種々の核酸分析に有用な一本鎖核酸分子およびプローブを調製するための方法を提供する。特定の実施形態において、この方法は、ニック形成剤認識配列（ＮＡＲＳ）を含む核酸アダプタを使用する。核酸アダプタは、方向において二本鎖標的核酸フラグメントに結合し、その結果、ＮＡＲＳを認識するニック形成剤（ＮＡ）のニック形成部位（ＮＳ）を含まない鎖中で、標的核酸はＮＡＲＳに対して５’側に位置する。このような結合は、ＮＡＲＳおよびＤＮＡポリメラーゼを認識するＮＡの存在下で、一本鎖核酸プローブを合成ための鋳型としての標的核酸の鎖の使用を可能にする。特定の実施形態において、核酸アダプタは、ＩＩ型制限エンドヌクレアーゼ認識配列（ＴＲＥＲＳ）をさらに含む。ＴＲＥＲＳはアダプタ中に位置し、その結果、アダプタが、上記のような方向において二本鎖標的核酸フラグメントに結合される場合、ＮＳを含まない鎖中のＴＲＥＲＳを認識するＩＩ型制限エンドヌクレアーゼの切断部位は、二本鎖標的核酸フラグメントの内およびＮＳに対応する位置に対して５’側内の両方に位置する。二本鎖標的核酸がアダプタと連結し、得られた連結産物が、ＴＲＥＲＳを認識するＩＩ型制限エンドヌクレアーゼによって消化された後、アダプタ中のＴＲＥＲＳのこのような位置は、一本鎖核酸プローブを合成するための鋳型核酸としての標的核酸の一方の鎖の一部の使用を可能にする。ＴＲＥＲＳの存在は、相対的に短い一本鎖核酸プローブの作製を可能にする。
【０３３０】
上記の方法は、複数の一本鎖核酸プローブを調製するために多重化され得る。このような用途のために、本発明のアダプタ（以下に詳細に記載される）は、上記のような方向において複数の標的核酸に結合される。次いで、各標的核酸は、各標的核酸の一方の鎖に特異的にハイブリダイゼーションし得る一本鎖核酸プローブを合成するために鋳型として使用される。一本鎖核酸プローブの得られた混合物は、以下に詳細に記載れる種々の核酸分析に有用である。
【０３３１】
関連した局面において、本発明はまた、ｃＤＮＡライブラリーを調製しそして／または増幅するための方法を提供する。これらの方法についての一般的なスキームは、上記の一本鎖核酸プローブの多重調製に類似し、ここで、二本鎖標的核酸フラグメントは、二本鎖ｃＤＮＡ分子である。簡単には、生物学的サンプルから単離されたｍＲＮＡを使用して合成された二本鎖核酸分子は、ＮＡＲＳを含む核酸アダプタに連結し、その結果、アダプタ中のＮＡＲＳを認識するＮＡのＮＳを含まない鎖において、ｃＤＮＡはＮＡＲＳに対して５’側に位置する。組み合せで、連結産物は、生物学的サンプルからｍＲＮＡに特異的なｃＤＮＡライブラリーを形成する。このｃＤＮＡライブラリーは、アダプタ中のＮＡＲＳを認識するＮＡの存在下で、鋳型として二本鎖ｃＤＮＡ分子の一方の鎖を使用して、一本鎖ｃＤＮＡ分子を初めに増幅することによって増幅され得る。代表的に、アダプタは、ＴＲＥＲＳをさらに含まない。アダプタ中のＴＲＥＲＳの非存在は、鋳型として核酸アダプタに連結されたｃＤＮＡ分子の一方の鎖を使用して、相対的に長い一本鎖ｃＤＮＡ分子の増幅を可能にする。増幅した一本鎖核酸分子は、それらの相補的な鎖を合成するかまたは増幅するための鋳型としてさらに機能し得る。従って、二本鎖ｃＤＮＡ分子の両方の鎖の合成および／または増幅は、二本鎖ｃＤＮＡ分子が成分であるｃＤＮＡライブラリーを増幅する。
【０３３２】
ｃＤＮＡライブラリーのこのような増幅は、インビボでの核酸増幅を必要とする従来のｃＤＮＡライブラリー（例えば、λファージ中のｃＤＮＡライブラリー）の増幅と対照的にインビトロで実行され得る。さらに、元のｃＤＮＡライブラリー（特に、固体支持体に固定化される場合）は貯蔵され得、そしてライブラリー増幅の理論的な不正確な実行のための鋳型として使用され得る。ライブラリー増幅の各実行が、鋳型としてオリジナルのｃＤＮＡライブラリーを使用するので、本発明のｃＤＮＡライブラリーの増幅は、元のｃＤＮＡライブラリーが使い果たされる場合、鋳型として増幅したｃＤＮＡライブラリーを使用して調製されたｃＤＮＡライブラリー中のｃＤＮＡ含量の歪みを減少するかまたは削除する。このような歪みは、ライブラリー増幅の間、異なるｃＤＮＡクローンについての不等な有効性に起因し得る。さらに、本発明のｃＤＮＡライブラリーおよびこのようなライブラリーを増幅するための方法は、ｃＤＮＡライブラリーを構築するために必要な全ＲＮＡまたはｍＲＮＡの量を減少し、サンプルのスループットを増加しそしてユーザーの操作を減らす。
【０３３３】
（ａ．標的核酸およびｃＤＮＡ分子）
一本鎖核酸プローブを合成するためのテンプレートを提供するために有用な標的核酸は、目的の任意の核酸であり得る。これらとしては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ＲＮＡ、および人工的に合成された核酸。これらの人工的に合成された標的核酸以外の標的核酸は、それらの標的核酸が由来する生物から直接単離され得る。あるいは、これらの標的核酸は、核酸ライブラリーから調製され得るかまたは組換え核酸技術によって調製され得る。
【０３３４】
特定の好ましい実施形態において、これらの標的核酸は、生物学的流体、組織、食物および水道において見出されるような、病原性生物（例えば、病原性の細菌、ウイルス、カビ、寄生生物、および真菌）に関連する核酸および／またはそれらの特性を示す核酸である。一本鎖核酸プローブを合成するための標的核酸配列を提供し得る例示的な病原性細菌としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｓ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｄｙｓｅｎｔｅｒｅａ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（Ｄｉｐｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｅｔａｎｉ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｅｔａｎｉ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｙｐｈｏｓｕｓ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｏｓａ）、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｏｃｕｌｏｇｅｎｉｔａｌｉｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ、Ｈｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ、Ｈｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｐａｒａｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｉｔｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｒｏｇｅｎｅｓ、Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ、Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｏｍｍａ、Ｖｉｂｒｉｏ  ｆｅｔｕｓ、Ｖｉｂｒｉｏ  ｊｅｊｕｎｉ、Ｖｉｂｒｉｏ  Ｍｅｔｃｈｎｉｋｏｖｉｉ、およびＶｉｂｒｉｏ  ｎｉｇｅｒ。一本鎖核酸プローブを合成するための標的核酸配列を提供し得る例示的なウイルス（レトロウイルスを含む）としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：ＨＳＶ−Ｉウイルス、ＨＳＶ−ＩＩウイルス、ＨＩＶウイルス、ＣＭＶウイルス、麻疹ウイルス、ポリオウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、インフルエンザウイルスなど。これらの種の各々の特性を示す核酸配列は、当該分野で公知であり、本発明の方法における標的核酸配列として、全部または一部使用するのに適している。
【０３３５】
特定の他の好ましい実施形態において、標的核酸は、植物、動物またはヒトにおける疾患または障害に関連する核酸配列および／またはそれらの特性を示す核酸配列である。いくつかの他の実施形態において、この標的核酸は、目的の疾患または障害を有さない、正常な（または、コントロール）植物、動物またはヒト由来の核酸配列である。なお他の好ましい実施形態において、この標的核酸は、植物または動物において望ましい特性（例えば、疾患耐性および高収穫（ｈｉｇｈ  ｃｒｏｐ）または家畜収量（ｃａｔｔｌｅ  ｙｉｅｌｄ））に関連し、そして／またはそれらの特性を示す。
【０３３６】
いくつかの実施形態において、標的核酸は、目的の生物または生物学的サンプルから単離されるｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡである。さらに、このようなｃＤＮＡはまた、本発明の方法に従って、ｃＤＮＡを調製および／または増幅するために使用され得る。
【０３３７】
ｍＲＮＡとｃＤＮＡとの合成物を単離するための方法は、当該分野で周知である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出；Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１６２：１５６，１９８７を参照のこと）。このような方法は、一般に、細胞、組織またはサンプル溶解物、および抽出手順によるＲＮＡ回収を含む。これらの手順は、特に、カオトロピズム薬剤（例えば、グアニジニウムチオシアネート）で処理し、次いで溶媒（例えば、フェノールおよびクロロホルム）でＲＮＡ抽出することによって、なされ得る。これらは、総ＲＮＡ単離の間、市販のキット（例えば、ＵＳ７３７５０キット（Ａｍｅｒｓｈａｍ））を使用することによって、容易に実施され得る。ｍＲＮＡ分子は、このｍＲＮＡ分子のポリ（Ａ）テイル（ｔａｉｌ）に結合するオリゴ（ｄＴ）プライマーを使用して、総細胞ＲＮＡから精製され得る（Ｊａｃｏｂｓｏｎ，Ｍｅｔｈｏ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５２：２５４，１９８７（本明細書中で参考として援用される）を参照のこと）。この点に関して、ｍＲＮＡの調製は、市販のキット（例えば、ＵＳ７２７００キット（Ａｍｅｒｓｈａｒｎ））を使用して、行われ得る。あるいは、総細胞ＲＮＡからｍＲＮＡを精製するために、ランダムプライマー（すなわち、ランダム配列を有するプライマー）が使用され得る（Ｓｉｎｇｈら、Ｃｅｌｌ  ５２：４１５，１９８８；Ｖｉｎｓｏｎら、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．２：８０１，１９８８を参照のこと）。オリゴ（ｄＴ）プライマーまたはランダムプライマーのいずれかを固定化して、ｍＲＮＡの精製を容易にし得る。特定の他の実施形態において、ｍＲＮＡは、最初に総ＲＮＡを単離することなく、生物学的サンプルから直接単離され得る。
【０３３８】
次いで、単離／精製されたｍＲＮＡは、従来の分子生物学技術（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出を参照のこと）による逆転写によって第一鎖ｃＤＮＡを合成するためのテンプレートとして使用され得る。逆転写は、一般に、逆トランスクリプターゼおよびプライマーを使用して行われる。
【０３３９】
多数の逆トランスクリプターゼが、参考文献に記載されており、そして市販されている（例えば、１４８３１８８キット，Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）。例示的な逆トランスクリプターゼとしては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：鳥類ウイルスＡＭＶ（Ａｖｉａｎ  Ｍｙｅｌｏｂｌａｓｔｏｓｉｓ  Ｖｉｒｕｓ）由来の逆トランスクリプターゼ、マウス白血病ウイルスＭＭＬＶ由来の逆トランスクリプターゼ（Ｍｏｌｏｎｅｙ  Ｍｕｒｉｎｅ  Ｌｅｕｋｅｍｉａ  Ｖｉｒｕｓ）、Ｙｈｅｒｍｕｓ  ｆｌａｖｕｓおよびＴｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＨＢ−８由来の逆トランスクリプターゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ番号Ｍ１９４１およびＭ２１０１）。これらの酵素に適用する操作条件は、当業者に周知である。
【０３４０】
逆転写のために使用されるプライマーは、種々の型であり得る。このプライマーは、４〜１０ヌクレオチドを含むランダムオリゴヌクレオチド（好ましくは、ヘキサヌクレオチド）であり得る。この型のランダムプライマーの使用は、参考文献に記載されており、そのＲＮＡ分子内の種々の部位における逆転写のランダムな開始を可能にする。あるいは、４〜２０マー、好ましくは１５マーを含むポリ（ｄＴ）プライマーが使用され得る。特定の実施形態において、ｍＲＮＡを単離する際に使用されるプライマーがまた、ｃＤＮＡ合成において使用される。
【０３４１】
第二鎖ｃＤＮＡは、ＲＮａｓｅ  ＨおよびＤＮＡポリメラーゼを使用して合成され得る。あるいは、この第二鎖ｃＤＮＡは、アダプタ配列を第一鎖ｃＤＮＡ分子に最初にライゲーションし、そしてこの第一鎖ｃＤＮＡをテンプレートとして使用して、このアダプタ配列に相補的なプライマーを伸長させることによって、合成され得る。
【０３４２】
合成されたｃＤＮＡは、溶液中にあり得るか、または例えば、ｍＲＮＡを単離しそしてｃＤＮＡを合成するために、固定化プライマーを介して固体支持体に連結され得る。
【０３４３】
（ｂ．核酸アダプタ）
本発明は、一本鎖核酸プローブを合成し、そしてｃＤＮＡライブラリーを調製および／または増幅するのに有用な核酸アダプタを提供する。このアダプタは、ニック形成因子認識配列（ＮＡＲＳ）を含み、そしてニック形成部位（ＮＳ）を含んでいても含んでいなくてもよい。特定の実施形態において、このアダプタはさらに、ＩＩｓ型制限エンドヌクレアーゼ認識配列（ＴＲＥＲＳ）を含み、これは、ＮＡＲＳのいずれかの部位に位置され得る。ＴＲＥＲＳの存在は、同様に短いオリゴヌクレオチドのアレイを探索するのに特に有用な、相対的に短いオリゴヌクレオチドプローブ（例えば、１５〜５０ヌクレオチド長）の生成を可能にする。
【０３４４】
標的核酸の存在を検出するための核酸プローブとしてか、または第二鎖のｃＤＮＡを合成するための第一鎖ｃＤＮＡテンプレートとして使用され得る一本鎖核酸分子を増幅するために、本発明のアダプタは、ＮＳを含まないライゲーション産物の鎖において、標的核酸フラグメントがＮＡＲＳのアンチセンス鎖の配列に対して５’側に位置するような方向で、標的核酸（ｃＤＮＡ分子またはそのフラグメントを含む）にライゲーションされなければならない（例えば、図２９Ａ〜２９Ｄ（ここで、ＮＥＲＳは例示的なＮＡＲＳとして使用される）を参照のこと）。このような配置は、続けて増幅されたプローブが、標的核酸の一方の鎖の一部に相補的な配列を含むために、必要とされる。なぜなら、ＮＡによって作製されるＮＳにおいて、３’−ＯＨのみが伸長され得、得られた伸長産物は、さらに増幅され得るからである。従って、他の方向におけるアダプタと標的核酸とのライゲーション産物は、標的核酸とハイブリダイズし得る核酸プローブを増幅するためのテンプレートであり得ない（例えば、図２９Ｅ〜Ｈ（ここで、ＮＥＲＳは例示的なＮＡＲＳとして使用される）を参照のこと）。
【０３４５】
アダプタとＮＥＲＳとの間の方向性連結に加えて、ＴＲＥＲＳを認識する制限エンドヌクレアーゼ（ＲＥ）の切断部位はまた、以下の（１）と（２）との両方に位置することが必要である：（１）標的核酸内、および（２）ＮＳに対応する位置に対して５’側。ＴＲＥＲＳのこのような位置は、標的核酸の一部を含む、ＮＡ（これは、その５’オーバーハングに対応する凹状の３’末端を生じる）およびＲＥ（これは、５’オーバーハングを生じる）によって作製される５’オーバーハングを有する部分的に二本鎖の核酸分子の生成を可能にする。従って、この５’オーバーハングがＮＡおよびＤＮＡポリメラーゼの存在下で一本鎖核酸プローブを合成するためのテンプレートとして使用される場合、その合成されるプローブは、標的核酸の一部に相補的な配列を含む。
【０３４６】
特定の好ましい実施形態において、ＮＡＲＳは、ニック形成エンドヌクレアーゼ認識配列（ＮＥＲＳ）であり、この配列は、その認識配列（例えば、Ｎ．ＢｓｔＮＢ  Ｉ）の外側にニック形成するＮＥによって認識可能である。このような実施形態において、ＴＲＥＲＳからこのＴＲＥＲＳを認識するＲＥの切断部位までの方向（図２９Ａ〜２９Ｄにおいて、ＴＲＥＲＳの上下の矢印によって示される）、およびＮＥＲＳからこのＮＥＲＳを認識するＮＥのＮＳまでの方向（ＮＥＲＳの上下の矢印によって示される）は、上記２つの要件（図２９Ａおよび２９Ｃ）を満たすために、同じであることが必要である。
【０３４７】
本発明の核酸アダプタは、当該分野で公知の短い核酸フラグメントを作製する任意の方法によって、調製され得る。例えば、この核酸アダプタの各鎖は、個々に合成され得、その後、その相補鎖とアニーリングされ得る。特定の実施形態において、この核酸アダプタは、固体支持体に固定化される。
【０３４８】
（ｃ．アダプタと標的核酸との間のライゲーション）
上記のように、一本鎖核酸プローブを合成するためのテンプレートを作製するか、またはｃＤＮＡライブラリーを調製および／もしくは増幅するために、本発明の核酸アダプタは、標的核酸またはｃＤＮＡ分子またはそれらのフラグメントに方向性によって（すなわち、ＮＳを含まない、得られる核酸分子の鎖の方向で）連結される必要があり、その標的核酸フラグメントまたはｃＤＮＡ分子またはそれらのフラグメントは、ＮＡＲＳに対して５’側に位置される。
【０３４９】
核酸アダプタを、当該分野で公知の別の二本鎖核酸フラグメントに方向性によって連結させるための任意の方法が、本発明において使用され得る。例えば、標的核酸（ｃＤＮＡ分子またはそのフラグメントを含む）が固体支持体に固定化される場合、その標的核酸の一方端のみが、核酸アダプタと連結するのに利用可能である。標的核酸の利用可能な末端と、核酸アダプタの適切な末端（すなわち、鎖それ自体またはそのライゲーション産物のいずれかがＮＳを含むアダプタの鎖の３’末端）との間の方向性連結は、このアダプタが、標的にライゲーションさせるべき末端（平滑末端）を有し、かつ他の末端が３’オーバーハングまたは５’オーバーハングのいずれかを有するようにアダプタを設計することによって、達成され得る。他の末端における３’オーバーハングまたは５’オーバーハングの存在は、その末端が、標的核酸またはｃＤＮＡ分子またはそれらのフラグメントとライゲーションするのを防止する。
【０３５０】
特定の実施形態において、標的核酸は、プライマーを使用する核酸増幅によって提供される。このプライマーは、制限エンドヌクレアーゼ認識配列（ＲＥＲＳ）を含み得、この配列は、制限エンドヌクレアーゼでの消化の際に、突出末端を作製する。この突出末端は、核酸アダプタの適切な末端において目的によって設計される競合性突出末端にライゲーションされ得る。これらの適合性突出末端は、標的核酸と核酸アダプタとの間の方向性連結を可能にする。あるいは、この標的とアダプタとの間のライゲーションに関与する、標的核酸の末端と核酸アダプタの末端との両方が平滑にされ、一方、この標的の他端とアダプタの他端は突出しているが、互いに適合性ではない。これら２つの突出末端の間の不適合性は、これらの末端における標的とアダプタとの間のライゲーションを防止する。
【０３５１】
特定の好ましい実施形態において、一本鎖核酸プローブを合成するためまたはｃＤＮＡライブラリーを増幅するためのテンプレート核酸は、標的核酸（ｃＤＮＡ分子またはそのフラグメントを含む）の末端または核酸アダプタの末端のいずれかを介して、固定化され得る。このような固定化は、核酸増幅反応混合物の他の成分（増幅された核酸分子を含む）から、テンプレート核酸を容易に分離することを可能にする。従って、この固定化テンプレート核酸は、簡単に洗浄され得、将来の使用のために保存され得る。
【０３５２】
（ｄ．一本鎖核酸増幅）
一本鎖核酸増幅は、遺伝子バリエーションの検出方法について上記されたのと本質的に同じである。さらに、特定の実施形態において、増幅された一本鎖核酸分子が核酸プローブとして使用される場合、これらは、一般に、核酸分析における引き続く検出を容易にするために、標識される。核酸フラグメントに組み込むのに適切な標識、および引き続いてこのフラグメントを検出するための方法は、当該分野で公知である。遺伝子バリエーションの検出方法および標的核酸の検出方法についての、例示的な標識および検出方法は、上記されている。
【０３５３】
特定の実施形態において、増幅された一本鎖核酸は、相対的に短い（例えば、１５〜５０ヌクレオチド長）である。上記のように、このような短い核酸分子は、一般に、ＴＲＥＲＳを含む核酸アダプタを使用して、調製される。他の実施形態において、より長い一本鎖核酸分子（例えば、５１〜２０，０００ヌクレオチド長）が、生成される。このようなより長い一本鎖核酸分子の増幅のために、鎖置換促進因子（ｆａｃｉｌｉｔａｔｏｒ）（例えば、トレハロース）を使用して、ＤＮＡポリメラーゼの鎖置換能力を増強し得る。
【０３５４】
（２．オリゴヌクレオチドプライマーを用いる１本鎖核酸分子を調製する方法）
特定の実施形態において、本発明は、オリゴヌクレオチドプライマーを用いて一本鎖核酸分子を調製する方法を提供する。この方法は、特定のニック形成試薬について、二本鎖ニック形成試薬認識配列の両鎖ではなく、それらの二本鎖ニック形成試薬のセンス鎖のみが、それらのニック形成活性に必要であるという本発明の発見に基く。標的核酸が一本鎖である例示の方法が図４３に示されている。当業者は、本発明の方法はまた、二本鎖標的核酸の１つの鎖の一部分を増幅することにおいてもまた有用であることを認識する。
【０３５５】
図４３を参照して、オリゴヌクレオチドプライマーは、一本鎖標的核酸の一部分をテンプレートとして用いて一本鎖核酸分子を増幅するために用いられる。このプライマーは、５’から３’までに、３つの領域：領域Ａ、領域Ｂおよび領域Ｃを含む。領域Ｂは、二本鎖ニック形成試薬認識配列のセンス鎖の配列からなり、ここで、領域Ａおよび領域Ｃは、それぞれ、領域Ｂに対して直接５’および３’に位置している領域である。このオリゴヌクレオチドプライマーは、一本鎖核酸の増幅を可能にする条件下で、このオリゴヌクレオチドプライマーが標的にアニールし得、そしてＤＮＡポリメラーゼの存在下でその３’末端から伸びるように、標的核酸に少なくとも実質的に相補的である。得られる伸長産物は、たとえ、標的核酸中のヌクレオチドと従来の塩基対を形成しないオリゴヌクレオチドプライマーの領域Ｂ中に１つ以上のヌクレオチドが存在し得るとしても、二本鎖ニック形成試薬認識配列を認識するニック形成試薬の存在下でニック形成され得る。「従来の塩基対」は、完全または部分的に二本鎖である核酸の１つの鎖のヌクレオチドと、この核酸のその他の鎖上の別のヌクレオチドとの間の、標準のＷａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋモデル（例えば、Ｇ：Ｃ、Ａ：Ｔ、およびＡ：Ｕ）に従って形成される塩基対である。５’末端を含むニック形成された産物は、それが比較的短いか（例えば、１８ヌクレオチドより長くない）、またはニック形成部位で３’末端を含むニック形成された産物の伸長により置換される場合、この標的核酸から容易に解離し得る。ニック形成試薬がその認識部位配列の外側をニック形成するとき、伸長産物は、オリゴヌクレオチドプライマーの領域Ｂ（すなわち、ニック形成試薬認識配列のセンス鎖の配列）を保持し、従ってニック形成試薬により再ニック形成され得る。上記のニック形成−伸長サイクルは、複数回繰り返され得、ニック形成部位で５’末端を含む一本鎖核酸分子の増幅を生じる。
【０３５６】
領域Ｂと、標的核酸中のその対応する領域との間に１つ以上のミスマッチが存在する実施形態では、Ｂ領域を認識するニック形成試薬のニック形成活性は、領域Ｂと標的中のその対応する領域との間のミスマッチの数における増加とともに減少する。例えば、Ｎ．ＢｓｔＮＢ  Ｉは、その二本鎖認識配列を含む二本鎖をニック形成することに比べ、その二本鎖認識配列のセンス鎖の配列を含むが、その認識配列のセンス鎖とこの二本鎖の対向する鎖中のその対応する領域との間に１つのミスマッチを有する二本鎖をニック形成することで約半分の活性である。Ｎ．ＢｓｔＮＢ  Ｉのニック形成活性は、それが、その二本鎖認識配列のセンス鎖の配列を含むが、他の鎖中に、この認識配列のセンス鎖中の任意のヌクレオチドと従来の塩基対を形成する任意のヌクレオチドを有さない二本鎖をニック形成するとき、その最大レベルの約１０％〜２０％まで減少する。
【０３５７】
特定の実施形態では、その認識配列内をニック形成するニック形成試薬はまた、標的中のヌクレオチドと従来の塩基対を形成しない領域Ｂ中のヌクレオチド（単数または複数）が、領域Ｂ内のニック形成部位の５’に位置する場合に用いられ得る。オリゴヌクレオチドプライマーと標的との間に形成された二本鎖が領域Ｂ内でニック形成試薬によりニック形成された後、ニック形成部位で３’末端が伸長され得、領域Ｂを再生する。このような再生は、このニック形成−伸長サイクルの繰り返しを可能にする。さらに、領域Ｂと標的中の対応する領域との間のミスマッチ（単数または複数）とは、ニック形成部位の３’末端からの伸長に影響してはならない。一般に、ニック形成部位と、従来の塩基対を形成しない領域Ｂ中のヌクレオチド（単数または複数）との距離が大きいほど、ミスマッチ（単数または複数）が伸長に対してもつ悪影響は小さい。
【０３５８】
領域Ａは、標的核酸へのオリゴヌクレオチドプライマーのアニーリングを容易または可能にする。さらに、それは、ニック形成部位で３’末端を含むニック形成された産物が標的にアニールしたままにし、そしてＤＮＡポリメラーゼの存在下で３’末端から伸びることを容易または可能にする。特定の実施形態では、領域Ａは、多くても、長さが１００、７５、５０、２５、２０、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、または２ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、領域Ａ中に、標的核酸中のヌクレオチドと従来の塩基対を形成しない１つ以上のヌクレオチドが存在し得る。
【０３５９】
オリゴヌクレオチドプライマーは、領域Ｃを有してもよいが有さなくてもよい。特定の実施形態において、領域Ｃが存在する場合、それは、多くても、長さが１００、７５、５０、２５、２０、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、または１ヌクレオチドである。領域Ｃと標的核酸中のその対応する領域との間にはミスマッチが存在し得る。しかし、ミスマッチ（単数または複数）の存在は、オリゴヌクレオチドプライマーと標的との間で形成された二本鎖のニック形成、または二本鎖の伸長産物のニック形成をなお可能にする必要がある。さらに、ミスマッチ（単数または複数）の存在は、ニック形成部位で３’末端を含むニック形成された産物の伸長を、ＤＮＡポリメラーゼの存在下でその末端から伸びることをなお可能にする必要がある。領域Ｃが、領域Ｂを認識するニック形成試薬によりニック形成可能なニック形成部位を含む場合、一般に、領域Ｃの５’末端とニック形成部位との間のヌクレオチドは、標的中のヌクレオチドと従来の塩基対を形成する。
【０３６０】
特定の実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドプライマーは、好ましくはその５’末端で固定化される。プライマーが付着される固相と、プライマーの５’末端または３’末端との間には、リンカーが存在し得る。さらに、複数のオリゴヌクレオチドプライマーが単一の固相に固定化され得、オリゴヌクレオチドプライマーのアレイを生成する。複数のオリゴヌクレオチドプライマーは、別個の位置で同一の配列を有し得る。あるいは、これらのオリゴヌクレオチドは、アレイの別個の位置で異なる配列を有し得る。このようなアレイは、異なる配列をもつ複数の一本鎖核酸分子を増幅するために用いられ得る。特定の実施形態では、アレイの異なる位置で実施された増幅反応は、プレートのマイクロウェルにおけるように物理的に分離され、その結果、異なる位置の増幅産物は互いに混合されず、そして個々に特徴付けられ得る。
【０３６１】
本発明は、標的核酸として目的の任意の核酸を用い、一本鎖核酸を増幅するために有用である。この標的核酸は、核酸アダプターを用いて一本鎖核酸およびｃＤＮＡライブラリーを調製するためのセクションで上記に記載したものを含む。特定の実施形態では、サンプル中の標的核酸、およびその他の核酸は固定化されている。
【０３６２】
比較的短い一本鎖核酸を合成することが所望され得る特定の実施形態では、標的核酸は、最初に、酵素的切断、化学的切断、または機械的切断を受け得る。比較的短い一本鎖核酸としては、多くても２００、１５０、１００、７５、５０、４０、３０、２５、２０、１８、１６、１４、１２、１０、９、８、７、６、５、または４ヌクレオチドを有するものが挙げられる。酵素的切断は、例えば、この核酸分子を、標的核酸内の特異的配列を認識する制限エンドヌクレアーゼで消化することにより達成され得る。あるいは、酵素的切断は、標的核酸分子内の特異的配列を認識するニック形成試薬でこの核酸分子をニック形成することにより達成され得る。酵素的切断はまた、Ｓｚｙｂａｌｓｋｉ（米国特許第４，９３５，３５７号）に従うオリゴヌクレオチド特異的切断であり得る。化学的切断および機械的切断は、せん断のような、核酸分子を切断するために適切な当該分野で公知の任意の方法により達成され得る。切断産物は、二本鎖である場合、最初に変性され得、そして次に上記のようなオリゴヌクレオチドプライマーにアニールし得る。
【０３６３】
標的核酸の酵素的切断およびそれに続く標的の一部分に相補的である一本鎖核酸の増幅は図４６に示される。二本鎖ニック形成試薬認識配列のセンス鎖の配列を含むオリゴヌクレオチドプライマーは、一本鎖標的核酸の第１の領域にアニールし、その一方、部分的に二本鎖である核酸は、この第１の領域の５’に位置する標的核酸の第２の領域にアニールされる。二本鎖核酸分子は、二本鎖部分中にＩＩ型制限酵素認識配列（ＴＲＥＲＳ）の二本鎖認識配列、および標的核酸の第２の領域の部分に少なくとも実質的に、好ましくは正確に、相補的である３’オーバーハングを含む。ＩＩｓ型制限エンドヌクレアーゼは、その二本鎖認識配列の外側で核酸を切断するので、この部分的に二本鎖である核酸分子は、この部分的に二本鎖である核酸分子の３’オーバーハングと標的核酸の第２の領域との間に形成される二本鎖内で切断されるように設計され得る。このような切断は、テンプレートとして用いられるべき標的核酸のより短いフラグメントを生じ、一本鎖核酸フラグメントを増幅する。
【０３６４】
上記の実施形態は、標的核酸の任意の部分に正確に相補的である一本鎖核酸フラグメントを増幅するために用いられ得る。オリゴヌクレオチドプライマーの領域Ｂ中の１つ以上のヌクレオチドは、標的核酸のヌクレオチドと従来の塩基対を形成することは必要でないので、プライマーは、標的の任意の領域にアニールするように設計され得る。さらに、上記の実施形態を用いて任意の長さの一本鎖核酸分子を増幅し得る。上記で論議したように、標的核酸は、部分的に二本鎖の核酸分子の３’オーバーハングがアニールされる部分で切断され得る。この部分的に二本鎖の核酸分子の３’オーバーハングを設計することにより、この部分的に二本鎖の核酸分子のＴＲＥＲＳを認識するＩＩｓ型制限エンドヌクレアーゼによる標的核酸の切断部位は、標的の第１の領域から任意の距離であり得る。従って、領域Ｂを認識するニック形成試薬によりニック形成可能なニック形成部位に対応する位置と、ＩＩ型制限エンドヌクレアーゼの切断部位との間の標的の部分を用いて増幅された一本鎖核酸は、目的の任意の長さであり得る。
【０３６５】
特定の実施形態では、そのセンス鎖がオリゴヌクレオチドプライマーの領域Ｂ中に存在する二本鎖ニック形成試薬認識配列は、二本鎖ＴＲＥＲＳと同一であり得る。例えば、オリゴヌクレオチドプライマーの領域Ｂは、ニック形成エンドヌクレアーゼＮ．ＢｓｔＮＢ  Ｉにより認識可能な配列「５’−ＧＡＧＴＣ−３’」からなり得、その一方、この部分的に二本鎖の核酸分子中のＴＲＥＲＳは、ＩＩｓ型制限エンドヌクレアーゼＰｌｅＩおよびＭｌｙＩにより認識可能な
５’−ＧＡＧＴＣ−３’
３’−ＣＴＣＡＧ−５’であり得る。
【０３６６】
このような実施形態では、オリゴヌクレオチドプライマーの領域Ｂと標的核酸中の対応する領域との間にミスマッチ（単数または複数）が必要である。換言すれば、領域Ｂ中の１つ以上のヌクレオチドは、標的中のヌクレオチドと従来の塩基対を形成しない。ミスマッチの存在は、オリゴヌクレオチドプライマーと標的の第１の領域との間で形成される二本鎖の、ＴＲＥＲＳを認識するＩＩ型エンドヌクレアーゼによる切断を防ぐ。
【０３６７】
（３．一本鎖核酸分子を調製するためのキット）
本発明はまた、核酸分子を調製するため、またはｃＤＮＡライブラリーを調製および／または増幅するためのキットを提供する。このようなキットは、一般に、上記のような核酸アダプター、アニールするときこの核酸アダプターを生成する２つの一本鎖オリゴヌクレオチド、または上記のようなオリゴヌクレオチドプライマーを含む。それらは、以下の少なくとも１つ、２つ、いくつか、または各々をさらに含み得る：（１）核酸アダプター中のＮＡＲＳを認識するニック形成試薬（例えば、ＮＥまたはＲＥ）および／またはその緩衝液；（２）ＤＮＡポリメラーゼおよび／またはその緩衝液；（３）ｄＮＴＰ（ｄＮＴＰのいくつかは標識され得る）；（４）固体支持体に固定化されたポリ（ｄＴ）オリゴヌクレオチドプライマー；（５）逆転写酵素および／またはその緩衝液；（６）ＤＮＡリガーゼおよび／またはその緩衝液；（７）マイクロウェルプレートまたはチューブ；（８）鎖置換促進剤（例えば、１Ｍトレハロース）；（９）キットを用いる指示書。多くのこれら成分の詳細な記載は、上記および本発明のその他のキットの関連するセクションに提供されている。
【０３６８】
（４．一本鎖核酸分子およびｃＤＮＡライブラリーのための使用）
本明細書において上記で詳細に論議されるように、本発明は、一本鎖核酸分子を調製するため、ならびにｃＤＮＡライブラリーを調製および／または増幅するための方法ならびに組成物を提供する。これらの分子およびｃＤＮＡライブラリーは、広範な種類の適用において有用性を見出し、ここで、サンプル中の標的核酸の存在、または不在を決定する必要があり、そしてここで、２つの核酸集団を比較することが所望される。このような適用は、制限されずに、植物または動物において感染性疾患を引き起こすか、または食品安全性に関連する感染性生物の同定および／または特徴付け、ならびに、植物、動物またはヒトにおける疾患、または高穀物収率、増大した疾患耐性、および高栄養価のような植物または動物中の望ましい形質に関連する遺伝子の同定および／または特徴付けを含む。
【０３６９】
例えば、本発明の核酸分子またはプローブは、病原体（例えば、ウイルス、細菌、真菌、または寄生虫）に由来する核酸に特異的であり得、そしてそれ故、目的の生物学的サンプル中の病原体の存在、または不在を決定するために有用である。あるいは、それは、特定の形質（例えば、疾患耐性または感受性）と関連することが知られる遺伝子に特異的であり得、そしてそれ故、サンプルが得られた特定の被験体が特定の形質を有する可能性を予見するために有用である。
【０３７０】
さらに、本発明はまた、標的核酸が特定のｃＤＮＡ集団であるような、複数の核酸からまたはプローブを同時に調製するための方法を提供する。これらの分子またはプローブは、別のｃＤＮＡ集団を含む本発明に従って調製された発現アレイまたはｃＤＮＡライブラリーをハイブリダイズするために用いられ、両方のｃＤＮＡ集団に共通なｃＤＮＡ分子、および１つの集団には存在するが他の集団には存在しないｃＤＮＡ分子を決定し得る。このような決定は、１つのｃＤＮＡ集団が単離された１つの生物のみによって所有されるが、他のｃＤＮＡ集団が調製された他の生物によっては所有されない形質に関連する核酸分子の同定および／または特徴付けを支援する。
【０３７１】
（Ｅ．プレｍＲＮＡ選択的スプライシングの検出）
１つの局面では、本発明は、ｍＲＮＡの選択的（オルタナティブ）スプライシングの存在、または不在を検出するための方法、化合物およびキットを提供する。
【０３７２】
（１．プレｍＲＮＡ選択的スプライシングを検出する方法）
本発明は、ｍＲＮＡ分子またはｃＤＮＡ分子中の遺伝子の上流エキソン（「エキソンＡ」と称する）と下流エキソン（「エキソンＢ」と称する）との間の連結部の存在または不在を検出するための方法を提供する。この方法は、ＯＤＮＰ対を利用して一本鎖核酸フラグメントを増幅するためのテンプレート核酸を合成する。このＯＤＮＰ対は、以下の２つのＯＤＮＰから構成される：アンチセンス鎖中のエキソンＡの５’末端近傍にあるエキソンＡのアンチセンス鎖の一部分に相補的な配列を含む第１のＯＤＮＰ、およびセンス鎖中のエキソンＢの５’末端近傍にあるエキソンＢのセンス鎖の一部分に相補的な配列を含むＯＤＮＰ対の第２のＯＤＮＰ。さらに、このＯＤＮＰ対の少なくとも１つのＯＤＮＰは、ニック形成試薬認識配列（ＮＡＲＳ）のセンス鎖の配列をさらに含まなければならない。次いで、このＯＤＮＰ対は、ｃＤＮＡ中にエキソンＡおよびエキソンＢの両方が存在する場合に第１および第２のＯＤＮＰにより囲まれるフラグメントを生成する条件下で、標的ｃＤＮＡと組み合せられる。次に、伸長産物を、一本鎖核酸フラグメントを増幅するために、テンプレートとして、ＤＮＡポリメラーゼおよびＮＡＲＳを認識するニック形成試薬（ＮＡ）の存在下で用いる。次いで、増幅された核酸フラグメントを、エキソンＡとエキソンＢとの間の連結部の存在または不在を決定するために特徴付ける。
【０３７３】
本明細書で用いられるｃＤＮＡ分子の「センス鎖」は、ｍＲＮＡ中のヌクレオチド「Ｕ」がｃＤＮＡ分子ではヌクレオチド「Ｔ」により置換されることを除けば、このｃＤＮＡ分子が派生するｍＲＮＡ分子と同一の配列を有する鎖をいう。一方、ｃＤＮＡ分子の「アンチセンス鎖」は、ｃＤＮＡ分子が派生するｍＲＮＡ分子に相補的である鎖をいう。
【０３７４】
標的ｃＤＮＡ分子は、目的の遺伝子に由来するｃＤＮＡ分子をいう。換言すれば、それは、目的の遺伝子の転写から得られるｍＲＮＡ分子の逆転写の産物である。標的ｃＤＮＡ分子は、部分配列を有し得る（すなわち、部分ｍＲＮＡ分子から逆転写される）が、好ましくは、完全長配列である。
【０３７５】
本明細書で用いられる「エキソン」は、成熟ＲＮＡ産物中で提示される、中断された遺伝子の任意のセグメントである。「イントロン」は、転写されるが、そのいずれかの側で配列（エキソン）をともにスプライスすることにより転写物内から除かれるセグメントをいう。
【０３７６】
エキソン（エキソンＡ）は、エキソンＡのセンス鎖の配列がエキソンＢのセンス鎖の配列に対して５’にあるとき、同一遺伝子内で別のエキソン（エキソンＢ）に対し「上流」にある。エキソンＡおよびエキソンＢは、さらに、それぞれ、上流エキソンおよび下流エキソンと称され得る。
【０３７７】
第１のＯＤＮＰと第２のＯＤＮＰとにより取り囲まれる核酸フラグメントは、１つの鎖が第１のＯＤＮＰの配列、第２のＯＤＮＰの相補配列、および第１のＯＤＮＰと第２のＯＤＮＰの相補配列との間の配列からなり；その一方、他の鎖が、第１のＯＤＮＰの相補配列、第２のＯＤＮＰの配列、および第１のＯＤＮＰの相補配列と第２のＯＤＮＰの配列との間の配列からなる、二本鎖核酸フラグメントと称される。
【０３７８】
「選択的（オルタナティブ）スプライシング」とも称される「差次的（ｄｉｆｆｅｒｅｔｉａｌ）スプライシング」は、１つの遺伝子の同じ転写物からの、少なくとも２つの異なるｍＲＮＡ分子の生成である。例えば、転写物の特定のセグメントは、ｍＲＮＡ分子の１つに存在し得るが、他のｍＲＮＡ分子からスプライシング除去され得る。
【０３７９】
２つの特定のエキソン間の連結部を検出することに加えて、本発明はまた、ｃＤＮＡ分子またはｃＤＮＡ集団中の、遺伝子の任意の２つのエキソン間の可能な各々の連結部の存在または不在を検出する方法を提供する。この方法を記載する便宜上、遺伝子がｎ個のエキソンを含むと仮定し（ｎは２以上の整数である）、エキソンＡを最も上流のエキソン、そしてエキソンＮを最も下流のエキソンとする（図３１）。この方法は、一本鎖核酸フラグメントを増幅するためのテンプレート核酸分子を調製するために以下の２セットのＯＤＮＰを用いる：（１）エキソンＮを除くエキソンの１つにそれぞれ対応するｎ−１のＯＤＮＰを含むＯＤＮＰの第１のセットであって、ＯＤＮＰの各々が、そのセンス鎖中のその対応するエキソンの５’末端近傍の対応するエキソンのセンス鎖の一部分に相補的な配列を含むセット、および（２）エキソンＡを除くエキソンの１つにそれぞれ対応するｎ−１のＯＤＮＰを含むＯＤＮＰの第２のセットであって、ＯＤＮＰの各々が、そのアンチセンス鎖中のその対応するエキソンの５’末端近傍の対応するエキソンのアンチセンス鎖の一部分に相補的な配列を含むセット。さらに、少なくとも１つのＯＤＮＰセットのＯＤＮＰの各々は、ＮＡＲＳをさらに含む。
【０３８０】
本発明の方法では、ＯＤＮＰの上記の２つのセットは、特徴付けられるべき標的ｃＤＮＡ分子、または標的ｃＤＮＡ分子を含むｃＤＮＡ集団と組み合せられ、そして次に伸長されて第１のＯＤＮＰセットからの１つのＯＤＮＰと第２のＯＤＮＰセットからの別のＯＤＮＰとにより取り囲まれるフラグメントを生成する。得られる伸長産物は、次に、ＤＮＡポリメラーゼおよびＮＡＲＳを認識するニック形成試薬の存在下で、一本鎖核酸フラグメントを合成するためのテンプレートとして用いられる。増幅された一本鎖核酸フラグメントは、検出および／または特徴付けられ、それによって、各々の可能な連結部の存在または不在を決定する。
【０３８１】
ｃＤＮＡ集団中の遺伝子の、任意の２つのエキソン間の可能な連結部の各々の存在または不在の情報は、ｃＤＮＡ集団中の遺伝子の選択的スプライシングを検出することで有用である。エキソンの少なくとも１つの末端における、遺伝子の任意の１つのエキソンに関する１つ以上の型の連結部の存在は、遺伝子のｍＲＮＡが、そのエキソンのその末端において差次的にスプライスされたことを示す。
【０３８２】
さらに、同様の方法を用いて、２つの生物学的サンプル間の遺伝子の選択的スプライシングを検出し得る。各生物学的サンプルからの、ｃＤＮＡ分子またはｃＤＮＡ集団中の遺伝子の任意の２つのエキソン間の可能な連結部の各々の存在または不在が決定され得、そして次に比較され得る。これら２つの生物学的サンプル間の任意の特定のエキソン連結部の存在における任意の差異は、この遺伝子から転写されたｍＲＮＡが、２つのサンプル間で選択的スプライシングされたことを示す。
【０３８３】
さらに、当業者は、上記の方法が、ｃＤＮＡ集団中または２つの生物学的サンプル間の複数遺伝子の転写物の選択的スプラシングを検出するため、さらに複合され得ることを認識する。
【０３８４】
（ａ．生物学的サンプルおよびｃＤＮＡ分子またはｃＤＮＡ集団）
本発明の生物学的サンプルは、生物に由来し、しかも目的のｍＲＮＡ分子を含み得る任意のサンプルを含む。特に、この生物学的サンプルは、任意の細胞、器官、組織、生検材料などであり得る。目的であるのは、哺乳動物（特にヒト）、植物、細菌、および酵母、真菌細胞のような下等真核生物細胞由来のサンプルである。例示の生物学的サンプルは、制限されずに、癌生検、神経変性プラーク、神経変性兆候を示す大脳ゾーン生検、皮膚サンプル、血液細胞サンプル、結腸直腸生検などを含む。例示の細胞は、筋肉細胞、肝細胞、線維芽細胞、神経細胞、表皮細胞および真皮細胞、Ｂリンパ球、Ｔリンパ球、マスト細胞、単球、顆粒球およびマクロファージのような血液細胞を含む。
【０３８５】
上記のように、特定の実施形態では、ｃＤＮＡ分子または２つの異なる生物学的サンプルからの集団が比較され、これらサンプル間のｍＲＮＡの差次的スプイシングを検出する。このような比較のために、１つのサンプルは、遺伝子疾患または病原体感染を有すると疑われるか、または有するためのリスクにある被験体からであり、その一方、他のサンプルは、健常な対照被験体であり得る。あるいは、これら２つのサンプルは、同一の生物学的供給源由来であるが、異なる発生ステージ由来であり得る。特定の実施形態では、１つのサンプルは、所望の形質（例えば、疾患耐性）を所有する被験体からであり得、その一方、他は、同じ形質をもたない被験体からであり得る。他の実施形態では、１つのサンプルは、化学物質（例えば、薬物または毒性物質）で処置された被験体からであり、その一方、他は非処置の対照被験体からである。
【０３８６】
特徴付けられるべきｃＤＮＡ分子は、目的の任意のｍＲＮＡ分子由来であり得る。特定の好適な実施形態では、ｃＤＮＡに対応する遺伝子は、疾患または障害、特にヒト疾患または障害に関連する。他の好適な実施形態では、この遺伝子は、それが派生する生物の所望の形質に関連する。なお他の好適な被験体の発生に関与するいくつかの実施形態は、この遺伝子は、それが単離される生物の外部刺激（例えば、光、薬物、およびストレス処理）に対する応答を担う。
【０３８７】
特定の実施形態では、上記ｃＤＮＡ分子は、固体支持体に固定化される。ｃＤＮＡ分子を固定化するための方法は、当該分野で公知である。例えば、ｃＤＮＡ分子は、それらの合成の間に用いられる固定化プライマーにより固定化され得る。
【０３８８】
目的のｍＲＮＡ分子は単離され得、そして対応するｃＤＮＡは当該分野で公知の従来方法に従って合成され得る（一本鎖核酸プローブの調製のための上記の「標的核酸」セクションを参照のこと）。特徴付けられるべきｃＤＮＡ分子は、好ましくは完全長であるが、部分長さであり得る。完全長ｃＤＮＡ分子は、従来法を用い（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、上述を参照のこと）、プローブとしてこのｃＤＮＡ分子の一部分を用い、ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより単離され得る。あるいは、ＰＣＲに基づく方法（Ｗｉｌｆｉｎｇｅｒら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ２２：４８１〜４８６、１９９７）が、このようなスクリーニングのために使用され得る。
【０３８９】
（ｂ．二本鎖テンプレート核酸の作製）
上記のように、本発明は、ｃＤＮＡ分子またはｃＤＮＡ集団における遺伝子のエクソンの特定のエキソンの末端における選択的スプライシング、およびｃＤＮＡ分子またはｃＤＮＡ集団中の遺伝子毎の末端毎における選択的スプライシングの検出を含む、プレｍＲＮＡ選択的スプライシングを検出するための方法を提供する。さらに、本発明の方法は、ｃＤＮＡ集団中の目的の複合遺伝子の各々の特定の（またはすべての）エキソンの特定（またはすべての）末端における選択的スプライシングを同時に検出するために複合され得る。
【０３９０】
本発明の方法は、ＯＤＮＰ対または２つのＯＤＮＰセットを用い、特定のエキソン−エキソン連結部（単数または複数）に隣接する標的ｃＤＮＡ分子のヌクレオチド配列を含む二本鎖核酸フラグメント（単数または複数）を生成する（本明細書では「テンプレート核酸フラグメント（単数または複数）」と称する）。さらに、このテンプレート核酸フラグメントは、ＤＮＡポリメラーゼおよびＮＡＲＳを認識するＮＡの存在下で一本鎖核酸フラグメントの増幅を可能にするＮＡＲＳを含む。さらに、ＮＡＲＳを認識するＮＡのニック形成部位（ＮＳ）は、特定のエキソン−エキソン連結部の５’に位置し、その結果、増幅された一本鎖核酸フラグメントは、このエキソン−エキソン連結部に隣接するヌクレオチド配列を含む。次いで、この増幅された一本鎖核酸フラグメントが特徴付けられる。エキソン毎に特定の末端は、エキソン−イントロン連結の相同性に依存することにより割り当てられ得るので、当業者は、可能なエキソン−エキソン連結部に隣接する配列を推定し得る。増幅された一本鎖核酸フラグメントの特徴と特定のエキソン−エキソン連結部に隣接する推定された配列の特徴との間の比較は、特定のエキソン−エキソン連結部が標的ｃＤＮＡ分子、または標的ｃＤＮＡ集団中に存在するか否かの決定を可能にする。
【０３９１】
（ｉ．オリゴヌクレオチドプライマー（ＯＤＮＰ）の設計）
標的ｃＤＮＡの特定のエキソン−エキソン連結部を含む一本鎖核酸フラグメントを増幅するための本発明のテンプレート核酸は、最初に、特異的に設計されたＯＤＮＰを用いて標的ｃＤＮＡのフラグメントを増幅することにより提供され得る。従って、１つの局面では、本発明は、上記のテンプレート核酸を生成するために有用なＯＤＮＰ対を提供する。
【０３９２】
特定の実施形態では、このＯＤＮＰ対は、以下の２つのＯＤＮＰから構成される：（１）アンチセンス鎖中のエキソンＡの５’末端近傍にあるエキソンＡのアンチセンス鎖の一部分に相補的な配列を含む第１のＯＤＮＰ、および（２）センス鎖中のエキソンＢの５’末端近傍にあるエキソンＢのセンス鎖の一部分に相補的な配列を含むＯＤＮＰ対の第２のＯＤＮＰ。第１のＯＤＮＰとエキソンＡのアンチセンス鎖の一部分との間の相補性は、正確である必要はないが、ＯＤＮＰがエキソンＡのその一部分に特異的にアニールすることを可能にするに十分でなければならない。同様に、第２のＯＤＮＰとエキソンＢのセンス鎖の一部分との間の相補性は正確である必要はないが、ＯＤＮＰがエキソンＢのその一部分に特異的にアニールすることを可能にするに十分でなければならない。第１のＯＤＮＰとエキソンＡとの間および第２のＯＤＮＰとエキソンＢとの間のこのような相補性は、このような連結部がｃＤＮＡ中に存在する場合、エキソンＡとエキソンＢとの間の連結部に隣接する配列の増幅を可能にする。エキソンの鎖の一部分は、その部分がその鎖内でその末端から１００、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３５、３０、２５、２０、１５または１０ヌクレオチド内にある場合、このエキソンの末端の１つの近傍にある。ＯＤＮＰ対の２つのＯＤＮＰ間のこのような間隔の配置は、ＯＤＮＰ対により取り囲まれる比較的短いフラグメントの増幅を可能にする。
【０３９３】
ＯＤＮＰ対の各ＯＤＮＰとその対応するエキソンの１つの鎖との間の配列相同性の他に、第１のＯＤＮＰまたは第２のＯＤＮＰのいずれかは、ＮＡＲＳのセンス鎖の配列をさらに含まなければならない。特定の好適な実施形態では、第１のＯＤＮＰおよび第２のＯＤＮＰの両方がＮＡＲＳをさらに含む。ＮＡＲＳの存在は、以下に詳細に論議されるように、第１のＯＤＮＰと第２のＯＤＮＰにより取り囲まれる増幅された核酸フラグメントが、ＤＮＡポリメラーゼおよびＮＡＲＳを認識するＮＡの存在下で一本鎖核酸フラグメントを増幅するためのテンプレート核酸として機能することを可能にする。
【０３９４】
ＯＤＮＰ中にその１つの鎖が存在するＮＡＲＳは、種々のタイプであり得る。例えば、それは、制限エンドヌクレアーゼ認識配列（ＲＥＲＳ）であり得る。あるいは、それは、ニック形成エンドヌクレアーゼ認識配列（ＮＥＲＳ）であり得る。ＮＡＲＳがＲＥＲＳである場合、テンプレート核酸の増幅は、代表的には、改変されたデオキシリポヌクレオシド三リン酸の存在下で実施され、その結果、増幅されたテンプレートは、ネイティブなヌクレオチドからなるＲＥＲＳよりもむしろ半改変ＲＥＲＳを含む。半改変ＲＥＲＳの存在は、ＲＥＲＳを認識する制限エンドヌクレアーゼによるテンプレートの１つの鎖のみの切断を可能にする。ＮＡＲＳがＮＥＲＳであれば、ＯＤＮＰ中のＮＥＲＳのセンス鎖の配列は、ＮＥＲＳを認識するＮＥにより生成されるニック形成部位がエキソンＡとエキソンＢとの間の連結部の５’に位置するような方向にある必要がある。このような配置は、次に増幅された一本鎖核酸フラグメントが、以下に詳細に記載されるように、エキソンＡとエキソンＢとの間の連結部に隣接する配列を含むことを可能にする。ＯＤＮＰ対の１つのＯＤＮＰのみがＮＥＲＳのセンス鎖の配列を含むいくつかの実施形態では、ＮＥＲＳ配列を含まない他のＯＤＮＰは、ＲＥＲＳの１つの鎖の配列を含み得る。これらの実施形態では、テンプレート核酸の増幅は、任意の改変されたデオキシリポヌクレオシド三リン酸の不在下で実施され、その結果、増幅されたテンプレート核酸フラグメント中のＲＥＲＳは、半改変されていない。好ましくは、ＲＥＲＳは、ＩＩｓ型制限エンドヌクレアーゼにより認識可能である。このようなＲＥＲＳの存在は、次に一本鎖核酸フラグメントを合成するためのテンプレートとして用いられるべき比較的小さな核酸フラグメントの生成を可能にする。この比較的小さな核酸フラグメントの生成は、ＯＤＮＰ対の２つのＯＤＮＰにより取り囲まれた増幅テンプレート核酸フラグメントを、ＲＥＲＳを認識するＩＩｓ型制限エンドヌクレアーゼで消化することにより達成され得る。
【０３９５】
本発明はまた、ｃＤＮＡ分子またはｃＤＮＡ集団中の遺伝子の任意の２つのエキソン間の可能な連結部の各々の存在または不在を検出するために有用なＯＤＮＰセットを提供する。ＯＤＮＰセットを記載する便宜上、目的の遺伝子は、遺伝子がｎ個のエキソンを含むと仮定し、ここでｎは２以上の整数であり、最も上流のエキソンおよび最も下流のエキソンをそれぞれエキソンＡおよびエキソンＮとする。以下の２つのセットのＯＤＮＰが、特徴付けられるｃＤＮＡ分子またはｃＤＮＡ集団中に存在する遺伝子のすべてのエキソン−エキソン連結部をともに含むテンプレート核酸分子を調製するために有用である。：（１）エキソンＡを除くエキソンの１つにそれぞれ対応するｎ−１のＯＤＮＰを含むＯＤＮＰの第１のセットであって、ＯＤＮＰの各々が、センス鎖中の対応するエキソンの５’末端近傍の対応するエキソンのセンス鎖の一部分に相補的な配列を含むセット、および（２）エキソンＮを除くエキソンの１つにそれぞれ対応するｎ−１のＯＤＮＰを含むＯＤＮＰの第２のセットであって、ＯＤＮＰの各々が、アンチセンス鎖中のその対応するエキソンの５’末端近傍の対応するエキソンのアンチセンス鎖の一部分に相補的な配列を含むセット。第１のセットの各ＯＤＮＰと対応するエキソンのセンス鎖の一部分との間の相補性は、正確である必要はないが、各ＯＤＮＰが、対応するエキソンの相補的部分に特異的にアニールするのを可能にするのに十分でなければならない。同様に、第２のセットの各ＯＤＮＰと対応するエキソンのアンチセンス鎖の一部分との間の相補性は、正確である必要はないが、各ＯＤＮＰが、対応するエキソンの相補的部分に特異的にアニールするのを可能にするのに十分でなければならない。両方のセットの各ＯＤＮＰとその対応するエキソンとの間のこのような相補性は、特徴付けられるべきｃＤＮＡ分子またはｃＤＮＡ集団中に存在する遺伝子のすべてのエキソン−エキソン連結部に隣接する配列の増幅を可能にする。
【０３９６】
２つのＯＤＮＰセットの各ＯＤＮＰと対応するエキソンの１つの鎖との間の配列相補性の他に、第１のセットからの１つのＯＤＮＰと第２のセットからの別のＯＤＮＰをプライマーとして、そして目的の遺伝子に由来するｃＤＮＡ分子（単数または複数）をテンプレートとして用いて合成された各フラグメントは、制限されないで、ＮＥＲＳまたは半改変ＲＥＲＳを含むＮＡＲＳを含まなければならない。特定の好適な実施形態では、第１のセットの各ＯＤＮＰまたは第２のセットの各ＯＤＮＰのいずれかが、ＮＡＲＳのセンス鎖の配列を含む。いくつかの他の実施形態では、第１のセットと第２のセットの両方の各ＯＤＮＰがＮＡＲＳを含む。
【０３９７】
特定のエキソン−エキソン連結部の存在または不在を検出するために、１つの鎖がＯＤＮＰ対中に存在するＮＡＲＳと同様に、１つの鎖がＯＤＮＰセット中に存在するＮＡＲＳもまた、種々のタイプであり得る。例えば、それは、制限エンドヌクレアーゼ認識配列（ＲＥＲＳ）であり得る。あるいは、それは、ニック形成エンドヌクレアーゼ認識配列（ＮＥＲＳ）であり得る。ＮＡＲＳがＲＥＲＳである場合、テンプレート核酸の増幅は、代表的には、改変されたデオキシリボヌクレオシド三リン酸の存在下で実施され、その結果、増幅されたテンプレートは、ネイティブなヌクレオチドからなるＲＥＲＳよりもむしろ半改変ＲＥＲＳを含む。ＮＡＲＳがＮＥＲＳであれば、ＯＤＮＰ中のＮＥＲＳのセンス鎖の配列は、ＮＥＲＳを認識するニック形成エンドヌクレアーゼにより生成されるニック形成部位がエキソン−エキソン連結部の５’に位置するような方向にある必要がある。このような配置は、次に増幅された一本鎖核酸フラグメントが、エキソン−エキソン連結部に隣接する配列を含むことを可能にする。１つのＯＤＮＰセットのＯＤＮＰのみがＮＥＲＳのセンス鎖の配列を含むいくつかの実施形態では、ＮＥＲＳ配列を含まない他のセットのＯＤＮＰは、ＲＥＲＳの１つの鎖の配列を含み得る。これらの実施形態では、テンプレート核酸の増幅は、任意の改変されたデオキシリボヌクレオシド三リン酸の不在下で実施され、その結果、増幅されたテンプレート核酸フラグメント中のＲＥＲＳは、半改変されていない。好ましくは、ＲＥＲＳは、ＩＩｓ型制限エンドヌクレアーゼにより認識可能である。このようなＲＥＲＳの存在は、第１のセットからの１つのＯＤＮＰと第２のセットからの別のＯＤＮＰにより取り囲まれた増幅されたテンプレート核酸フラグメントを、ＲＥＲＳを認識するＩＩｓ型制限エンドヌクレアーゼで消化することによる、比較的小さな核酸フラグメントの生成を可能にする。生成された比較的小さな核酸フラグメントは、エキソン−エキソン連結部に隣接する配列を含む短い一本鎖核酸フラグメントを合成するためのテンプレートとして用いられ得る。この合成されたフラグメントの短い長さは、特定の分離および分析技法によるそれらの検出および／または特徴付けを容易にする。
【０３９８】
配列特異的プライマーを設計するための一般的技法は周知であり、そしてまた、本発明の遺伝子バリエーション検出方法について上記に記載されている。
【０３９９】
（ｉｉ．核酸のハイブリダイゼーション、伸長、増幅および消化）
上記のＯＤＮＰ対またはＯＤＮＰセットを、標的ｃＤＮＡ分子、または標的ｃＤＮＡ分子を含むｃＤＮＡ集団と、ＯＤＮＰの、ｃＤＮＡ分子（単数または複数）中のそれらの相補的配列との特異的アニーリングを可能にする条件下で合わせる。このような条件を決定し、そして提供することは、当業者の技術内である。例示の条件はまた、本発明の遺伝子バリエーション検出方法のハイブリダイゼーションのセクション中、および実施例中に提供されている。
【０４００】
アニーリングの後、当該分野で公知であり、そして本発明の遺伝子バリエーション検出方法の関連するセクションで記載される種々の方法を用いて、ＯＤＮＰは伸長され、２つのＯＤＮＰにより取り囲まれ、かつ標的ｃＤＮＡ分子の一部分を含むフラグメントを生成する。特定のエキソン−エキソン連結部（例えば、上流エキソンＡと下流エキソンＢとの間の連結部）の存在または不在を決定するために、標的ｃＤＮＡは、エキソンＡの一部分に相補的なＯＤＮＰ（「第１のＯＤＮＰ」と称する）およびエキソンＢの一部分に相補的なＯＤＮＰ（「第２のＯＤＮＰ」と称する）の両方からの伸長のために、エキソンＡおよびエキソンＢの両方を含まなければならない（図３０Ａおよび３０Ｂ）。エキソンＡとエキソンＢとの間の連結部が、標的ｃＤＮＡ分子中に存在する場合、エキソンＡとエキソンＢとの間の連結部を含む、第１のＯＤＮＰと第２のＯＤＮＰとにより取り囲まれる小フラグメントが増幅される（図３０Ａ）。エキソンＡとエキソンＢとの間の連結部が標的ｃＤＮＡにないが、エキソンＡとエキソンＢの両方が存在する（すなわち、エキソンＡとエキソンＢとの間にさらなるセグメントがある）場合、エキソンＡおよびエキソンＢの一部分に加え、さらなるセグメントを含む、第１のＯＤＮＰと第２のＯＤＮＰとにより取り囲まれたより大きなフラグメントが増幅される（図３０Ｂ）。
【０４０１】
標的ｃＤＮＡ分子、または標的ｃＤＮＡ分子を含むｃＤＮＡ集団中の目的遺伝子の任意の２つのエキソン間のすべての可能な連結部の存在または不在を決定するために、上記の２セットのＯＤＮＰを伸長して、種々のテンプレート核酸フラグメントを生成する。２セットのＯＤＮＰは、その鎖中の別のエキソンに連結され得るエキソン毎の５’末端近傍で標的ｃＤＮＡ分子の各鎖にアニールし得るＯＤＮＰをともに含むので、増幅されたテンプレート核酸フラグメントは、標的ｃＤＮＡ分子中のすべてのエキソン−エキソン連結部を含む。
【０４０２】
上記の観念は、図３１を参照することによりさらに説明され得る。図３１Ａは、エキソンＡを最も上流のエキソンとし、そしてエキソンＮを最も下流のエキソンとして、ｎ個のエキソンを含む、例示の目的遺伝子を示す。図３１Ｂおよび３１Ｃは、目的の遺伝子の同じ転写物の選択的スプライシングから生じる２つのｃＤＮＡ分子（「標的ｃＤＮＡＩ」および「標的ｃＤＮＡＩＩ」）を示す。特に、エキソンＢは標的ｃＤＮＡ  Ｉ中に存在するが、標的ｃＤＮＡ  ＩＩ中にはなく、この標的ｃＤＮＡ  ＩＩには、エキソンＡおよびエキソンＣは一緒に直接連結されている。上記のように目的の遺伝子に特異的に設計された２セットのＯＤＮＰを、標的ｃＤＮＡ  Ｉと、ＯＤＮＰがそれらの対応するエキソン中の相補的配列にアニールすることを可能にする条件下で合せたとき、第１のＯＤＮＰ（これは、アンチセンス鎖中のエキソンＡの５’末端近傍でエキソンＡのアンチセンス鎖にアニールする）と第２のＯＤＮＰ（これは、センス鎖中のエキソンＢの５’末端近傍でエキソンＢのセンス鎖にアニールする）（テンプレート１−２と称する）により、そして第３のＯＤＮＰ（これは、アンチセンス鎖中のエキソンＢの５’末端近傍でエキソンＢのアンチセンス鎖にアニールする）と第４のＯＤＮＰ（これは、センス鎖中のエキソンＣの５’末端近傍でエキソンＣのセンス鎖にアニールする）（テンプレート３−４と称する）により取り囲まれる核酸フラグメント、ならびに他のＯＤＮＰ対により取り囲まれたフラグメントが生成され得る。これらのフラグメントは、エキソン−エキソン連結部を含む標的ｃＤＮＡ  Ｉの一部分を含む。換言すれば、各フラグメントは、特定のエキソン−エキソン連結部に隣接する配列を含む。その一方、本発明による目的遺伝子のために特異的に設計された２セットのＯＤＮＰを標的ｃＤＮＡ  ＩＩと組み合せ、これらＯＤＮＰとそれらの対応するエキソン中の相補的配列との間のアニーリングを可能するとき、第１のＯＤＮＰと４つのＯＤＮＰ（「テンプレート１−４」と称する）により取り囲まれた核酸フラグメント、および他のＯＤＮＰ対により取り囲まれたフラグメントが増幅され得る。標的ｃＤＮＡ  ＩＩ中にはエキソンＢがないので、テンプレート１−２およびテンプレート３−４は生成され得ない。しかし、エキソンＡとエキソンＢとの間、またはエキソンＢとエキソンＣとの間には連結部がないので、テンプレート１−２またはテンプレート３−４の不在は、本発明の２セットのＯＤＮＰをプライマーとして用い、そして標的ｃＤＮＡ分子をテンプレートとして用いる増幅産物が、標的ｃＤＮＡ分子中に存在するすべてのエキソン−エキソン連結部を一緒に含むという観念には反しない。
【０４０３】
増幅反応混合物中の複数ＯＤＮＰの存在は、所定のプライマーから複数の産物を生じ得る。例えば、図３２Ｂにおいて、第２のＯＤＮＰでテンプレート１−２を増幅するほかに、第１のＯＤＮＰは、第１のＯＤＮＰセットからの他のＯＤＮＰ（例えば、第４のＯＤＮＰ）と対をなし得、より大きな核酸フラグメント（例えば、エキソンＡの一部分、完全長エキソンＢおよびエキソンＣの一部分を含むテンプレート１−Ｂ−２）を増幅する。しかし、より小さなフラグメントは、より大きなフラグメントより効率的に増幅されるので、テンプレート１−２分子は、増幅サイクルの増加につれて、他のより大きなテンプレート分子よりも早く蓄積する。
【０４０４】
上記のように、特定の実施形態では、１つの鎖が本発明のＯＤＮＰ中に存在するＮＡＲＳは、ＲＥＲＳである。特定の実施形態において、半改変されたＲＥＲＳを含むテンプレート核酸を得るために、ＯＤＮＰは、改変されたデオキシリボヌクレオチド三リン酸の存在下で伸長される。適切な改変デオキシリボヌクレオチド三リン酸、およびこれらの改変デオキシリボヌクレオチド三リン酸存在下での核酸フラグメントの増幅は、当該分野で公知であり、そしてまた本発明の遺伝子バリエーション検出方法についての関連するセクションに記載されている。
【０４０５】
また、上記で論議されたように、特定の他の実施形態では、１つのＯＤＮＰセットのＯＤＮＰの各々は、ＮＥＲＳのセンス鎖の配列を含み、その一方、他のＯＤＮＰセットのＯＤＮＰの各々は、ＲＥＲＳの１つの鎖の配列を含む。これら２セットのＯＤＮＰを、任意の改変されたデオキシリボヌクレオチド三リン酸の不在下で、エキソン−エキソン連結部に隣接する配列を含むテンプレート核酸フラグメントを合成するためのプライマーとして用いるとき、得られるテンプレート核酸は、ＮＥＲＳおよびＲＥＲＳの両方を含む。これらのテンプレート核酸は、ＲＥＲＳを認識し、そしてテンプレート核酸の両鎖で切断する制限エンドヌクレアーゼで消化され得る。このような消化は、より小さなテンプレート核酸を生成し、そしてその結果、より小さなテンプレート核酸を上記の増幅のテンプレートとして用いるとき、より短い一本鎖核酸フラグメントの増幅を可能にする。
【０４０６】
（ｃ．一本鎖核酸フラグメントの増幅および検出）
上記のテンプレート核酸を、テンプレートの合成に用いたＯＤＮＰ（単数または複数）中のＮＡＲＳを認識するニック形成試薬およびＤＮＡポリメラーゼの存在下で、一本鎖核酸フラグメントを増幅するためのテンプレートとして用いる。このような増幅は、本質的に、遺伝子バリエーション検出方法のための上記の記載のとおりである。得られる一本鎖核酸フラグメントは、次いで、標的ｃＤＮＡ分子中または標的ｃＤＮＡ分子を含むｃＤＮＡ集団中の特定のエキソン−エキソン連結部の存在または不在を決定するために特徴付けられる。
【０４０７】
上記のように、２つのＯＤＮＰセットを用いてテンプレート核酸を合成する実施形態では、合成されたテンプレート核酸の大部分は、１つのエキソン−エキソン連結部のみを含むが、いくつかのテンプレート核酸は、１つ以上のエキソン−エキソン連結部を含む（例えば、図３１Ｂ中のテンプレート１−Ｂ−２）。一本鎖核酸を増幅するための反応混合液中のこれらの比較的長いテンプレートの存在は、１つのエキソン−エキソン連結部のみを含むテンプレートを用いる反応混合液より、長い一本鎖核酸の増幅を生じ得る。特定の実施形態では、これらのより長い一本鎖核酸の増幅は、比較的長い一本鎖核酸分子の増幅を阻害または防ぐ条件下で増幅反応を実施することによりなくされ得るか、または低減され得る。例えば、鎖置換活性を欠くＤＮＡポリメラーゼを、短い一本鎖核酸分子のみを増幅するために用い得る。鎖置換活性の欠如は、ＤＮＡポリメラーゼが、ニック形成試薬により生成されたニック形成部位での３’末端から伸長することを防ぎ、ここで、ニック形成部位で５’末端を含むニック形成された鎖の一部分は、ニック形成されない鎖のその相補的配列に依然としてアニールしている。ニック形成部位で５’末端を含むニック形成された鎖の部分が、比較的短く（例えば、１７より少ないヌクレオチドを含む）、その結果、それが相補的鎖から容易に解離し得るときのみ、それは、ニック形成試薬の存在下で鎖置換活性をもたないＤＮＡポリメラーゼにより増幅され得る。
【０４０８】
１つのエキソン−エキソン連結部のみを含むテンプレート核酸から増幅された一本鎖核酸分子は、多くても、長さが約１００、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３５、３０、２５、２０、２５、１０、８、６、４、または２ヌクレオチドであり、そして小さな一本鎖核酸分子を検出または特徴付けるために適切な、当該分野で公知の任意の方法により、検出および／または特徴付けられ得る。例示の方法は、本発明の遺伝子バリエーション検出方法についての関連セクション、および標的核酸検出方法についての関連セクション中で上記に記載されている。増幅された一本鎖核酸フラグメントの特徴（例えば、質量スペクトル分析により得られる質量／荷電比）は、次いで、テンプレート核酸フラグメントを調製することで用いたＯＤＮＰの位置および組成を考慮し、そしてこれらＯＤＮＰが相補的である２つのエキソン間の連結部が存在すると仮定して推定された一本鎖核酸フラグメントの特徴と比較される。増幅核酸フラグメントと推定核酸フラグメントとの特徴が同一であれば、標的ｃＤＮＡ分子中に存在すると仮定された特定のエキソン−エキソン連結部が、実際に、この標的ｃＤＮＡ分子中に存在する。増幅され得る一本鎖核酸フラグメントの配列および特徴（例えば、質量／荷電比）の予測は、エキソン−エキソン連結部（「スプライシング連結部」とも称する）近傍のコンセンサス配列についての知識を基にする。この知識は、当業者が、エキソン−イントロン連結部をピンポイントで指摘し、そしてそれ故、２つのエキソン間のイントロンがスプライシングで切り出されるとき、エキソン−エキソン連結部の正確な位置を予測することを可能にする。
【０４０９】
（２．プレｍＲＮＡ差次的スプライシング検出のためのキット）
本発明はまた、プレｍＲＮＡ差次的スプライシングを検出するためのキットを提供する。このようなキットは、一般に、エキソン−エキソン連結部が標的ｃＤＮＡ分子中に存在する場合、この連結部に隣接する配列を含むテンプレート核酸を調製するために有用である上記のＯＤＮＰ対を含む。これらはまた、以下の成分の少なくとも１つ、２つ、いくつかまたは各々をさらに含み得る：（１）ＯＤＮＰ対の少なくとも１つのプライマー中のニック形成試薬認識配列を認識するニック形成試薬（例えば、ＮＥまたはＲＥ）；（２）ニック形成試薬（１）のための緩衝液；（３）ＯＤＮＰの少なくとも１つのプライマー中に存在するＲＥＲＳを認識するＲＥ；（４）ＲＥ（３）のための緩衝液；（５）テンプレート核酸を作製する（すなわち、上記ＯＤＮＰ対の３’末端から伸びる）ために有用なＤＮＡポリメラーゼ；（６）このＤＮＡポリメラーゼ（５）のための緩衝液；（７）一本鎖核酸フラグメントを増幅するためのＤＮＡポリメラーゼ；（８）このＤＮＡポリメラーゼ（７）のための緩衝液；（９）ｄＮＴＰ；（１０）改変ｄＮＴＰ；（１１）テンプレート核酸を増幅するためのコントロールテンプレートおよび／またはコントロールオリゴヌクレオチド；（１２）クロマトグラフィーカラム；（１３）クロマトグラフィーカラム用の緩衝液Ａ；（１４）クロマトグラフィーカラム用の緩衝液Ｂ；（１５）水；（１６）鎖置換促進剤（例えば、１Ｍトレハロース）；（１７）マイクロタイタープレートまたはマイクロウェルプレート；（１８）オリゴヌクレオチド標準（例えば、６マー、７マー、８マー、１２マーおよび１６マー）；（１９）キットを用いるための指示書；および（２０）ＯＤＮＰ対を設計および／または順序付けることで用いられるソフトウェアのアクセスコード。上記成分の多くの詳細な記載は上記に提供されている。
【０４１０】
（３．プレｍＲＮＡ差次的スプライシング検出方法の適用）
選択的プレｍＲＮＡスプライシングは、高等真核生物における遺伝子発現を調節するための重要な機構である。最近の推定により、ヒト遺伝子の約３０％の一次転写物は、正常な発生の間に、特異的空間的／時間的パターンでしばしば調節されている、選択的スプライシングを受けている。複雑な遺伝子では、選択的スプライシングは、単一の転写物から数ダースまたは数百でさえある異なるｍＲＮＡイソ形態を生成し得る（ＢｒｅｉｔｂａｒｔおよびＮａｄａｌ−Ｇｉｎａｒｄ、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５６：４６７〜９５、１９８７；ＭｉｓｓｌｅｒおよびＳｕｄｈｏｆ、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ  １４：２０〜６、１９９８；Ｇａｓｃａｒｄら、Ｂｌｏｏｄ  ９２：４４０４〜１４、１９９８）。多くの場合において、この選択的にスプライスされたエキソンは、触媒活性または結合相互作用のために機能的に重要であるタンパク質ドメインをコードし、得られるタンパク質は、異なる活性または競合する活性さえ示し得る。
【０４１１】
上記でより詳細に論議されるように、本発明は、ｃＤＮＡ分子またはｃＤＮＡ集団中の遺伝子の特定のエキソンの末端における、およびｃＤＮＡ分子またはｃＤＮＡ集団中の遺伝子のエキソン毎の末端毎における、選択的スプライシングの検出を含む、プレｍＲＮＡ選択的スプライシングを検出するための方法、組成物、およびキットを提供する。プレｍＲＮＡスプライシングの重要性に起因して、これらの方法は、疾患診断、疾病素質、および処置、穀類収穫および動物飼育、植物および動物の発生調節、薬物開発、および外部刺激（例えば、極限温度、毒および光）に対する生物の応答の操作のような、広範な種類の適用において有用性を見出す。
【０４１２】
例えば、本発明の方法は、病原状態に特有なプレｍＲＮＡスプライシングパターンを道程および／または特徴付けるために用いられ得る。多くの遺伝子において、異常プレｍＲＮＡスプライシングは、種々の疾患または障害、特に癌に関与している。小細胞肺癌腫において、網膜芽細胞腫タンパク質ファミリーに属するタンパク質ｐ１３０の遺伝子は、コンセンサススプライシング部位で変異している。この変異は、エキソン２の除去および未成熟停止コドンの存在に起因するタンパク質の合成の不在を生じる。同様に、特定の非小細胞肺癌では、サイクリン依存性キナーゼｃｄｋ４およびｃｄｋ６のインヒビターであるタンパク質ｐ１６１ＮＫ４Ａの遺伝子は、ドナースプライシング部位で変異している。この変異は、短縮型の短い半寿命タンパク質の産生を生じる。さらに、ビルムス腫瘍サプレッサー遺伝子であるＷＴ１は、選択的スプライシングにより生成されるいくつかのメッセンジャーＲＮＡに転写される。乳癌では、異なる改変体の相対比率が、健常組織と比較して改変され、それ故、診断ツールまたは腫瘍進行におけるＷＴ１の種々の機能的ドメインの重要性を理解することの見識を得る。細胞形質転換の間の異なるｍＲＮＡ形態およびタンパク質イソ形態間の比率に影響する類似の改変プロセスはまた、神経原繊維ＮＦ１で見出されている。さらに、頭部および頸部癌では、ｐ５３が不活性化される機構の１つが、コンセンサススプライシング部位における変異を含んでいた。さらに、ＩＲＦ−１腫瘍サプレッサー遺伝子転写物の改変されたスプライシングパターンは、この腫瘍サプレッサーの不活性化を生じ、そしてＩＲＦ−１  ｍＲＮＡにおけるエキソンスキッピングの加速は、脊髄形成異常症候群からの顕在白血病、急性骨髄性白血病、および脊髄形成異常症候群を含む多くの造血障害の指標である（米国特許第５，６４３，７２９号）。
【０４１３】
本発明の方法は、疾患（または障害）状態と関連することが知られるか、または疑われる遺伝子の転写物のスプライシングパターンを比較するため、およびその存在または不在が疾患（または障害）状態に特有であるエキソンを同定するため、または疾患（または障害）状態に特有の異なるスプライシング改変体間の比率における改変を同定するために用いられ得る。疾患（または障害）状態に不在であるエキソンの同定は、これらエキソンによりコードされるドメインが、健常細胞の正常機能に重要であること、しかも、このようなドメインを含むシグナル伝達経路が、治療目的のために回復され得ることを示す。その一方、疾患（または障害）状態に特有に存在するエキソンの同定は、診断ツールとして用いられ得、そしてそのコードされるドメインは、これらドメインにより媒介されるシグナル伝達と競合することが意図される低分子量化合物のスクリーニング標的として考慮され得る。さらに、これらドメインに対し特異的親和性をもつ抗体はまた、この疾患（または障害）状態の診断ツールとして用いられ得る。
【０４１４】
本発明はまた、生物発生において重要なプレｍＲＮＡ差次的スプライシングを同定および／または特徴付けるために用いられ得る。選択的スプライシングは、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａにおける性決定、ヒトにおける抗体応答、および他の組織または発生ステージ特異的プロセスにおいて主要な役割を演じている（Ｃｈａｂｏｔ、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ．１２：４７２〜８；Ｓｍｉｔｈら、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．２３：５２７〜７７、１９８９；Ｂｒｅｉｔｂａｒｔら、Ｃｅｌｌ  ４９：７９３〜８０３、１９８７）。従って、本発明の方法は、異なる発生ステージで発生調節に含まれることが知られるか、または疑われる遺伝子のプレｍＲＮＡスプライシングパターンを比較するために用いられ得る。この遺伝子における差次的スプライシングの存在の同定および／または特徴付けは、所望の形質（例えば、より大きな果実、より高いタンパク質または油含量種子、より高いミルク生産）を得るための対応する発生プロセスを調節することで指針を提供し得る。
【０４１５】
本発明の方法はまた、種々の外部刺激に対する生物の応答において重要なプレｍＲＮＡ差次的スプライシングを同定および／または特徴付けるために用いられ得る。非処置生物の特定の刺激（例えば、病原体の攻撃）に対する応答で役割を演じていることが知られるか、または疑われる遺伝子のプレｍＲＮＡスプライシングパターンは、この刺激を受けた生物のそれと比較され得る。刺激を受けた生物に特有のスプライシングパターンの同定および／または特徴付けは、この応答を増大するため（この応答が所望される場合）、または低減／なくす（この応答が所望されない場合）に、対応する応答プロセスを操作することで指針を提供し得る。
【０４１６】
以下の実施例は、制限ではなく、例示により提供される。
【実施例】
【０４１７】
（実施例１）
（エレクトロスプレー液体クロマトグラフィー／質量分析器によるオリゴヌクレオチドフラグメントの検出）
この実施例は、長さが４ヌクレオチド、６ヌクレオチド、８ヌクレオチドおよび１０ヌクレオチドの１本鎖オリゴヌクレオチド（ＯＤＮ）フラグメント（表３）の分子量を決定するための、エレクトロスプレー液体クロマトグラフィー／質量分析器（ＥＳ−ＬＣ／ＭＳ）の使用を開示する。
【０４１８】
オリゴヌクレオチド（ＯＤＮ）を、Ｍｉｄｌａｎｄ  ＴＸのＭｉｄｌａｎｄ  Ｃｅｒｔｉｆｉｅｄ試薬によって合成した。このＯＤＮを、０．０１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ中で０．５ｎｍ／μｌの濃度まで希釈し、ストック溶液を作製した。続いて、ＯＤＮの各ストック溶液を、純水中に１：１０希釈、１：１００希釈および１：１０００希釈した。各希釈物の５μｌを、エレクトロスプレー液体クロマトグラフィー／質量分析器、飛行時間（ＥＳ−ＬＣ／ＭＳ−ＴＯＦ）系（陰イオン全走査、コーン＝３５ボルト、１００℃のソース、２５０℃での脱溶媒和、Ｘｔｅｒｒａカラム（Ｃ８、２．１×５０ｍｍ）で、３００μｌ／分の流速で、直接、水、メタノール＋０．０５％  ＴＡＥ）中で均一に進行するに注入した。
【０４１９】
クロマトグラフィーを、以下の系を用いて実施した：２つのポンプ、カラムオーブン、ＵＶ検出器、デガッサー、攪拌器および自動注入器で構成されるＰｒｏＳｔａｒ  Ｈｅｌｉｘ  Ｓｙｓｔｅｍ（カタログ番号  Ｈｅｌｉｘｓｙｓ０１）。カラムは、５μＭの粒子サイズ、３００Åの細孔サイズのＣ１８が充填されている、４．６ｍｍ×５０ｍｍのＶａｒｉａｎ  Ｍｉｃｒｏｓｏｒｂ  ＭＶ（カタログ番号  Ｒ００８６２０３Ｆ５）である。カラムは、１００ｍＭ  酢酸トリエチルアミン（ＴＥＡＡ）および０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ中のアセトニトリルの勾配で、３０℃〜４０℃で実施した。以下のＨＰＬＣの方法を用いて、カラム上のフラグメント解離させた：緩衝液Ａは、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡと１００ｍＭ  ＴＥＡＡであり、緩衝液Ｂは、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡおよび２５％（Ｖ／Ｖ）アセトニトリルを含有する１００ｍＭ  ＴＥＡＡであり、０〜３分で２０％Ｂ〜２５％Ｂの勾配が存在し、３．０１〜４分で４５％Ｂまで上昇、４．０１〜４．５分で９５％Ｂまで上昇が存在し、４．５１分で１分間、２０％Ｂにて維持され、カラムを再平衡化する。このカラムを、カラムオーブンを４０℃に調節することによって、４０℃で実施した。流速は、１．５ｍｌ／分であった。１０μｌ容量あたり、約２００ｎｇのフラグメントが注入された。ＵＶ検出器で、カラムの溶出液を測定する。
【０４２０】
（表３）
（ＯＤＮおよび対応する配列および分子量）
【０４２１】
【化７】
2004535815.tif 000011
表３に記載されるＯＤＮの分子量を、ＥＳ−ＬＣ／ＭＳにより測定し、検出の下限を決定した。
【０４２２】
１１８１ダルトンの期待される分子量を有する４マーについて、１１８１．１０２〜１１８１．７の間の溶出したイオン電流の総量は、０．４１であった。図７は、１００％に標準化した１１８１．４のピークを有する４マーの１／１０希釈のクロマトグラムを示す。１１８１．４のピークは、質量／荷電（ｍ／ｚ）比＝１である、単一荷電種を示す。５９０．２の質量を有する二重荷電の４マーは、１１８１．４種の８０％の強度を示す。質量５９０．２は、単一荷電種のｍ／ｚ値であるｍ／ｚ値０．５を示す（すなわち、５９０．２種は、２つの荷電を有する）。また、ｎ＋０．５荷電およびｎ＋１荷電が、５９０．７および５９１．２で見られたことに留意のこと。このことは、ポリマー分子を用いたエレクトロスプレーイオン化に特徴的である。
【０４２３】
１／１００希釈での質量スペクトルは、期待される分子量１１８１．４および５９０．２のピークを有し、１／１０希釈と同様に見える。１２０３．５のピークは、４マーのＮａ＋付加物（＋２３ダルトン）である。６２１．２、６５９．２、８６８．３、９４８．３のピークは、フラグメント化生成物またはバックグランドのいずれかである（図８）。
【０４２４】
図９において、１／１０００希釈物は、ＥＳ−ＴＯＦの検出のほぼ下限であることを示している。１１８１．５および５９０．２のピークは、明らかにバックグランドを越えて可視的である。検出の下限が押し下げられる場合、より高い「バックグランド」がスペクトル中に見られる。
【０４２５】
１８１６ダルトンの期待される分子量を有する６マーについて、９０６．６〜９０７．５の間の溶出したイオン電流の総量は、０．３５であった（二重荷電種）。図１０Ａは、１００％に標準化した９０６．７のピークを有する６マー（これは、ｍ／ｚ＝０．５（質量／電荷＝０．５）の二重荷電種である）の１／１０希釈のクロマトグラムを示す。９０６．７の質量は、ｍ／ｚが０．５である、単一荷電種を示す（すなわち、９０６．７種は、２つの荷電を有する）。また、ｎ＋０．５荷電およびｎ＋１荷電が、９０７．３および９０７．８で見られることに留意のこと。このことは、ポリマー分子を用いたエレクトロスプレーイオン化に特徴的である。図１０Ｂの質量スペクトルは、期待される分子量１８１５．６のピークを示す。１８３７．５のピークは、６マーのＮａ＋付加物（＋２３ダルトン）である。図１１は、１００％に標準化した９０６．８のピークを有する６マーの１／１００希釈のクロマトグラムを示す。図１２では、１／１０００希釈が、ＥＳ−ＴＯＦの検出のほぼ下限であることを示している。９０６．８のピークは、明らかにバックグランドを越えて可視的である。検出の下限が押し下げられる場合、より高い「バックグランド」がスペクトル中に見られる。
【０４２６】
２４１８．６ダルトンの期待される分子量を有する８マーについて、１２０７．６０２〜１２１０．１の間の溶出したイオン電流の総量は、０．３７であった（二重荷電種）。図１３Ａおよび図１３Ｂは、１００％に標準化した１２０８．４のピークを有する８マーの１／１０希釈のクロマトグラムを示す（これは、ｍ／ｚ＝０．５（質量／電荷＝０．５）の二重荷電種である）。８０５．３の質量は、ｍ／ｚ値が０．３３である単一荷電種を示す（すなわち、８０５．３種は、３つの荷電を有する）。また、ｎ＋０．５荷電およびｎ＋１荷電が、８０５．９および８０６．３で見られたことに留意のこと。このことは、ポリマー化分子を用いたエレクトロスプレーイオン化に特徴的である。１／１００希釈（図１４）では、質量スペクトルは、期待される分子量１２０７．９（二重荷電）および８０４．９（三重荷電）のピークを示す。
【０４２７】
２９９６ダルトンの期待される分子量を有する１０マーについて、１４９６．１９９〜１５００．１８２の間の溶出したイオン電流の総量は、０．３７であった（二重荷電種）。図１５Ａおよび図１５Ｂは、１００％に標準化した１４９７．０のピークを有する１０マー（これは、ｍ／ｚ＝０．５（質量／電荷＝０．５）の二重荷電種である）の１／１０希釈のクロマトグラムを示す。１４９７．０の質量は、ｍ／ｚ値が０．５である、単一荷電種を示す（すなわち１４９７種は、２つの荷電を有する）。また、４つの荷電を有する種について、ｎ＋０．５荷電およびｎ＋１荷電が、７４８．５および７４９で見られることに留意のこと。このことは、ポリマー分子を用いたエレクトロスプレーイオン化に特徴的である。図１５Ｂは、期待される分子量２９９６のピークを有する質量スペクトル示す。３０１７．９のピークは、１０マーのＮａ＋付加物（＋２３ダルトン）である。図１６は、１００％に標準化した１４９７．１のピークを有する１０マーの１／１００希釈を示す。図１７では、１／１０００希釈が、ＥＳ−ＴＯＦの検出のほぼ下限であることが示される。１４９７．１のピーク（二重荷電種）は、三重荷電種（９９７．６）および４つの荷電を有する種（７４８）のように明らかにバックグランドを越えて可視的である。検出の下限が押し下げられる場合、より高い「バックグランド」がスペクトル中に見られる。
【０４２８】
検出の下限は、約２．５ピコモルの４マー、６マー、８マーまたは１０マーのいずれかであると算出された。エレクトロスプレー−ＴＯＦは、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦより大きな利点を有する。なぜならば、エレクトロスプレーの定量が可能だからである。このデータは、ＥＳ−ＴＯＦを用いて、１０マイクロリットルＰＣＲ反応の１／１００程度の少なさでも検出し得ることを示す。
【０４２９】
（実施例２）
（ＨＰＬＣを用いた単一のヌクレオチドによって異なるオリゴヌクレオチドフラグメントの分離および同定）
本実施例は、液体クロマトグラフィーによる短いＤＮＡフラグメントの分離および同定を記載する。ＵＶ吸収によってＤＮＡフラグメントを検出し、そして標準と比較したカラムにおける保持時間によって同定する。
【０４３０】
クロマトグラフィー系は、Ｖａｒｉａｎ製（Ｗａｌｎｕｔ  Ｃｒｅｅｋ，ＣＡ）および２つのポンプ、カラムオーブン、ＵＶ検出器、デガッサー、攪拌器および自動注入器で構成されるＰｒｏＳｔａｒ  Ｈｅｌｉｘ  Ｓｙｓｔｅｍ（カタログ番号  Ｈｅｌｉｘｓｙｓ０１）である。カラムは、５μＭの粒子サイズ、３００Åの細孔サイズのＣ１８が充填されている、４．６ｍｍ×５０ｍｍのＶａｒｉａｎ  Ｍｉｃｒｏｓｏｒｂ  ＭＶ（カタログ番号  Ｒ００８６２０３Ｆ５）である。カラムは、１００ｍＭ  酢酸トリエチルアミン（ＴＥＡＡ）および０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ中のアセトニトリルの勾配で、３０〜４０℃で実施した。勾配の型は、本文中に記載される。
【０４３１】
各々、特定の単一ヌクレオチド多型性を有する以下の遺伝子型決定フラグメントを試験し、続いて分離した。
【０４３２】
【化８】
2004535815.tif 000012
８マーおよび１０マーにおける多型に、下線を引いた。８マーＢおよび８マーＣは、８マーＡと単一の塩基のみ異なる。１０マーＢおよび１０マーＣは、１０マーＡと単一の塩基のみ異なる。
【０４３３】
以下のＨＰＬＣの方法を用いて、カラム上でフラグメント分離した：緩衝液Ａは、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡを含有する１００ｍＭ  ＴＥＡＡである、緩衝液Ｂは、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡおよび２５％（Ｖ／Ｖ）アセトニトリルを含有する１００ｍＭ  ＴＥＡＡであり、０〜３分で２０％Ｂ〜２５％Ｂの勾配が存在し、３．０１〜４分で４５％Ｂまで上昇、４．０１〜４．５分で９５％Ｂまでの上昇が存在し、４．５１分で１分間、２０％Ｂにて維持され、カラムを再平衡化する。このカラムを、カラムオーブンを４０℃に調節することによって、４０℃で実施した。流速は、１．５ｍｌ／分であった。注入量は、１０μｌであり、１０μｌ容量あたり、約２００ｎｇのフラグメントを注入した。４マー、６マー、８マーおよび１０マーの異なる組合せを注入し、クロマトグラフィーの動態を決定した。
【０４３４】
最初の結果を図１８に示す。図１８の追跡記録１において、４マー、６マー、８マーおよび１０マーで構成される８つの全てのフラグメントを単離した。単一の塩基しか違わないにもかかわらず、３種類の全ての８マーおよび３種類の全ての１０マーが分離された。フラグメントは、１本鎖である。追跡記録１における溶出のオーダーは（左から右へ）：４マー、６マー、８マーＢ、８マーＡ、１０マーＡ、８マーＢ、１０マーＢ、１０マーＣである。追跡記録２において、６マーおよび１０マーＣを同時に注入したところ、６マーおよび１０マーＣの溶出時間は、追跡記録１で見られたのと同じであった。追跡記録３において、３種類の１０マーを、同時に注入し、分離した。３種類の１０マーの溶出時間は、追跡記録１で見られたのと同じであった。追跡記録４において、３種類の８マーを、同時に注入し、分離した。３種類の８マーの溶出時間は、追跡記録１で見られたのと同じであった。追跡記録５は、８マーＡの単一のピークを表し、追跡記録６は、８マーＢの単一の追跡記録を示す。遺伝子型は、単一の塩基しか違わないフラグメントからであっても、クロマトグラフィーの間の保持時間から直接推測され得る。
【０４３５】
図１９Ａおよび図１９Ｂは、３種類の８マーのＨＰＬＣ分画および検出（図１９Ａ）ならびに３種類の８マーのＨＰＬＣ分画および検出（図１９Ｂ）を示す。図１９Ａにおいて、第１の８マーの位置２の「Ｔ」対立遺伝子を、第２の８マーの位置２の「Ｃ」対立遺伝子から識別し、そして第２の８マーの位置５の「Ｔ」対立遺伝子を、第３の８マーの位置５の「Ｃ」対立遺伝子から識別する。図１９Ｂにおいて、第３の１０マーの位置４の「Ｔ」対立遺伝子を、第２の１０マーの位置４の「Ｃ」対立遺伝子から識別し、そして第２の１０マーの位置１０の「Ｃ」対立遺伝子を、第１の１０マーの位置１０の「Ｔ」対立遺伝子から識別する。遺伝子型は、クロマトグラフィーの間の保持時間から、単一の塩基のみしか違わないフラグメントからであっても直接推定され得る。
【０４３６】
図２０Ａにおいて、１つの４マー（４マーＡ）、１つの６マー（６マーＡ）、３つの８マー（８マーＡ、８マーＢおよび８マーＣ）、３つの１０マー（１０マーＡ、１０マーＢおよび１０マーＣ）が分離される。図２０Ｂにおいて、２つの６マーは、２分〜３分の間での溶出が見られる。６マーは、６ヌクレオチドで分離されたフォワードＦｏｋＩ識別部位および逆方向ＦｏｋＩ識別部位を含む４１マーの２重ＦｏｋＩ消化によって生成される。
【０４３７】
（実施例３）
（液体クロマトグラフィーによる遺伝子型決定フラグメントの分離ＵＶ検出器および飛行時間質量分析器を用いた検出）
以下の例は、プライマーが、ＢｓｌＩおよびＮ．ＢｓｔＮＢＩ制限エンドヌクレアーゼ認識配列の一方または両方を含むヒトゲノムからの特定の配列の増幅を示す。生じたアンプリコンは、小オリゴヌクレオチドフラグメントを遊離させる二重切断部位を含み、このオリゴヌクレオチドフラグメントは、クロマトグラフィー工程に供され、そして質量  対電荷比によって識別される。
【０４３８】
５０μｌのＰＣＲ反応物は、２５ｎｇのゲノムＤＮＡ、各々０．５μＭの正方向プライマーおよび逆方向プライマー、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．３）、５０ｍＭ  ＫＣｌ、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、各々２００μＭのｄＮＴＰ、１単位のＤＮＡポリメラーゼ（ＭａｓｔｅｒＡｍｐＴＭ  Ｔａｑ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｆｒｏｍ  Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｍａｄｉｓｏｎ  ＷＩ製）またはＶｅｎｔ  ｅｘｏ−  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  （Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂａｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ  ＭＡ製）を含む。サーモサイクル条件は、以下のようである：９５℃で３分間（始めの変性）；９２℃で４０秒間、６０℃で３０秒間、７２℃で３０秒間を３０サイクル。ＡＭＪ  Ｒｅｓｅａｃｈ  ＰＴＣ−１００サーモサイクラー（ＭＪ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｗａｔｅｒｔｏｗｎ，ＭＡ）を、全てのＰＣＲ反応のために用いた。プライマーは、ＭＷＧ  Ｂｉｏｔｅｃｈ（Ｈｉｇｈ  Ｐｏｉｎｔ，ＮＣ）から購入した。
【０４３９】
サーモサイクルが完了した後、酵素混合物（Ｎ．ＢｓｔＮＢ  Ｉ、Ｂｓｔ  Ｉおよび１０×Ｎ．ＢｓｔＮＢ  Ｉ緩衝液（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ  Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）を含む）を調製した。この混合物を、各ウェルに添加し、１５０ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＤＴＴ（ｐＨ７．５）中に最終濃度で各々１単位の酵素を含ませた。この反応を、６０分を越える時間をかけて、５５℃にて行った。この反応物を、さらに操作することなく直接注入した。
【０４４０】
このクロマトグラフィー系は、２つのポンプ、排出ガス装置、カラムオーブン、ダイオードアレイ検出器、およびサーモスタットマイクロウェルプレート自動注入器（Ｖａｒｉａｎ  Ｉｎｃ．Ｗａｌｎｕｔ  Ｃｒｅｅｋ，ＣＡ）から構成されるＶａｒｉａｎ  Ｐｒｏｓｔａｒ  Ｈｅｌｉｘ  ｓｙｓｔｅｍである。カラムは、３μＭの粒子サイズ、３００Åの細孔サイズのＣ１８が充填されている、２．１ｍｍ×５０ｍｍのＶａｒｉａｎ  Ｍｉｃｒｏｓｏｒｂ  ＭＶ（Ｖａｒｉａｎ  Ｉｎｃ．Ｗａｌｎｕｔ  Ｃｒｅｅｋ，ＣＡ）である。カラムは、５ｍＭ  酢酸トリエチルアミン（ＴＥＡＡ）中のアセトニトリルの勾配で、３０℃で実施した。緩衝液Ａは、５ｍＭ  ＴＥＡＡであり、緩衝液Ｂは、５ｍＭ  ＴＥＡＡおよび２５％（Ｖ／Ｖ）アセトニトリルである。勾配を１０％Ｂで１分間維持することで開始し、次いで４分にわたり５０％Ｂに上昇させ、次いで９５％Ｂで３０秒間、そして最後に全実施時間が６分となる時間にわたり１０％Ｂに戻した。カラムの温度は、３０℃で一定に保った。流速は、０．４１６ｍｌ／分であった。注入容量は、１０μｌであった。質量分析器への流速は、２００μｌ／分であり、ＬＣ流の半分は、ティーを用いて廃棄物を分離した。質量分析器は、エレクトロスプレー入り口を備えたＭｉｃｒｏｍａｓｓ  ＬＣＴ  Ｔｉｍｅ−ｏｆ−Ｆｌｉｇｈｔ（Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ  Ｉｎｃ．Ｍａｎｃｈｅｓｔｅｒ  ＵＫ）である。このサンプルを、１秒の走査時間で、７００〜２３００ａｍｕの範囲の走査範囲によりエレクトロスプレーネガティブモードで用いた。装置のパラメータは：ＴＤＣ開始ボルト７００、ＴＤＣ停止ボルト５０、ＴＤＣ閾値０、ＴＤＣ獲得コントロール０、ＴＤＣエッジコントロール０、Ｌｔｅｆｆ  １１１７．５、Ｖｅｆｆ  ４６００。ソースパラメータ：脱溶媒気体  ８６２Ｌ／時間、キャピラリー  ３０００Ｖ、サンプルコーン  ２５Ｖ、ＲＦレンズ  ２００Ｖ、溶出コーン  ２Ｖ、脱溶媒温度  ２５０℃、ソース温度  １５０℃、ＲＦ  ＤＣ補正  １  ４Ｖ、ＲＤ  ＦＣ補正  ２  １Ｖ、開口部  ６Ｖ、加速  ２００Ｖ、集束  １０Ｖ、ステアリング  ０Ｖ、ＭＣＰ検出器  ２７００Ｖ、Ｐｕｓｈｅｒサイクル時間（手動）６０、イオンエネルギー  ４０Ｖ、管レンズ  ０Ｖ、グリッド  ２７４Ｖ、ＴＯＦ  ｆｌｉｇｈｔ  ｔｕｂｅ  ４６２０Ｖ、反射  １７９０Ｖ。
【０４４１】
特定の単一のヌクレオチド多型（Ｔ→欠失）を含むシトクローム２Ｄ６遺伝子を試験し、継続的に分離および識別した。ＳＮＰ周辺の遺伝子の部分的配列を、以下に示した。多型の位置は、イタリック体および太字を用い、１対の内部プライマー（以下に記載）を用いた増幅反応においてテンプレートとして機能する領域に下線を引いた。
【０４４２】
【化９】
2004535815.tif 000013
２つのプライマー対を、ＳＮＰを含むシトクローム２Ｄ６遺伝子の領域の増幅のために用いた。シトクローム２Ｄ６のみを増幅し、偽遺伝子を増幅しないように外部プライマーを設計した。部分的なＢｓｔ  Ｉ認識配列を有し、ＳＮＰを含むシトクローム２Ｄ６遺伝子の小領域を増幅するように内部プライマーを設計した。内部プライマーの１つはまた、５’に位置するＮ．ＢｓｔＮＢ  Ｉ認識配列〜Ｂｓｔ  Ｉ認識配列を含む。これら２つのプライマー対の配列および最終増幅産物の配列を、以下に示した。Ｂｓｔ  Ｉ認識配列を形成する塩基は、太字で目立たせ、そしてＮ．ＢｓｔＮＢ  Ｉ認識配列である塩基は、イタリックで示した。Ｂｓｔ  Ｉ認識配列および／またはＮ．ＢｓｔＮＢ  Ｉ認識配列のいくつかまたは全ての塩基は、テンプレート配列とミスマッチし得る。
【０４４３】
【化１０】
2004535815.tif 000014
次いで、最後の増幅産物を、Ｂｓｔ  ＩおよびＮ．ＢｓｔＮＢ  Ｉで設計し、１本鎖核酸フラグメント
【０４４４】
【化１１】
2004535815.tif 000015
の放出物を生じた。３’ＯＨおよび５’ＰＯ４を含むこの配列の質量は、４０３１．６ａｍｕである。
【０４４５】
図２１は、Ｎ．ＢｓｔＮＢ  ＩおよびＢｓｔ  Ｉで消化した後の、ＰＣＲ反応物の生成物のＵＶクロマトグラフィーを示す。大きなピークは、ＰＣＲ成分を含む最初の２分である。矢印は、Ｂｓｔ  ＩおよびＮ．ＢｓｔＮＢ  Ｉによって作製される１本鎖核酸フラグメントを指し示す。実施の最後の大きなピークは、過剰なプライマーおよび２本鎖生成物を含む。
【０４４６】
図２２Ａおよび図２２Ｂは、それぞれ、Ｎ．ＢｓｔＮＢ  ＩおよびＢｓｔ  Ｉ両方で消化した後、ＰＣＲ反応の産物の単一のイオンクロマトグラムおよび全イオンクロマトグラムである。単一のイオンクロマトグラムは、各々の記録された走査について、目的のイオンの強度（ノイズから選択的に引抜く）をプロットする。
【０４４７】
図２３は、Ｎ．ＢｓｔＮＢ  ＩおよびＢｓｔ  Ｉの二重消化で、２本鎖ＰＣＲ生成物から切り出された１本鎖オリゴヌクレオチドの質量スペクトルを示す。フラグメントの質量は、１３４２ａｍｕであり、算出した質量４０３１ａｍｕより、正確に１／３小さい。これは、フラグメントにおける複数の荷電状態の存在による。生体分子が、イオン化に際して多重荷電化することは一般的であり、一般的に、このアッセイによって生成されたフラグメントは、２つの電荷、３つの電荷または４つの電荷を保持する。期待される質量は、単一の式Ｍ／Ｚ−１（Ｍは、フラグメントの質量であり、Ｚは、電荷の数（１、２、３など）であり、イオン化の間のプロトンの損失のために１を引き、結果として負に荷電した分子を生じる）を使用して、予め算出され得る。この場合、荷電状態のみが三重荷電形態（これは、常にそのような場合である訳ではなく、１つの荷電状態、２つの荷電状態またはいくつかの荷電状態が、単一のオリゴヌクレオチドについて、同時に見られ得る）であり、従って、４０３１／３−１＝１３４２ａｍｕである。
【０４４８】
（実施例４）
（液体クロマトグラフィーによる遺伝子型フラグメントの分離、ならびに等温増幅を使用した、ＵＶ検出器および飛行時間型質量分析を用いた検出）
以下の実施例は、各々、Ｎ．ＢｓｔＮＢ  Ｉ認識配列を含むプライマー対を使用した、ヒトゲノム由来の特定の配列の増幅を記載する。得られたアンプリコンは、Ｎ．ＢｓｔＮＢ  Ｉを用いて切断する場合、各々が３’陥凹末端（ｒｅｃｅｓｓｅｄ  ｅｎｄ）を含む二本鎖核酸配列フラグメントを生成した。次いで、この３’陥凹末端を、５’→３’エキソヌクレアーゼ欠損性Ｂｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼを使用して埋めた。この埋め込まれたフラグメントを、次いで、Ｎ．ＢｓｔＮＢ  Ｉによって再びニック形成し、そして得られた３’陥凹末端を、再びＢｓｔポリメラーゼによって埋めた。このニック形成、それに続く３’陥凹末端充填のプロセスを繰り返し、その結果、２つの短い１本鎖核酸フラグメントを増幅した。次いで、このような短いフラグメントを、クロマトグラフィー分離に供し、そして質量対電荷の割合によって同定した。
【０４４９】
上記プライマー対を使用してＳＮＰを含むヒトゲノム配列を増幅するために、５０μｌのＰＣＲ反応混合物を、２５ｎｇゲノムＤＮＡ、０．５μＭの順方向プライマーおよび逆方向プライマーの各々、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．３）、５０ｍＭ  ＫＣｌ、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２００μＭの各ｄＮＴＰ、１単位のＤＮＡポリメラーゼ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｍａｄｉｓｏｎ  ＷＩからのＭａｓｔｅｒＡｍｐＴＭＴａｑ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、またはＮｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ、Ｂｅｖｅｒｌｙ  ＭＡのＶｅｎｔ  ｅｘｏ−Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）を含むように調製した。熱サイクル（ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｉｎｇ）を、以下の様に実施した：９５℃３分の開始変性；９２℃で４０秒、６０℃で３０秒、および７２℃で３０秒の３０サイクル。ＭＪ  ＲｅｓｅａｒｃｈのＰＴＣ−１００サーモサイクラー（ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒ）（ＭＪ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｗａｔｅｒｔｏｗｎ，ＭＡ）を、全てのＰＣＲ反応に使用した。プライマーは、ＭＷＧ  Ｂｉｏｔｅｃｈ（Ｈｉｇｈ  Ｐｏｉｎｔ，ＮＣ）から購入した。
【０４５０】
熱サイクルが完了した後、Ｎ．ＢｓｔＮＢ  Ｉ、Ｂｓｔポリメラーゼおよび１０×Ｎ．ＢｓｔＮＢ  Ｉ緩衝液（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ  Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）を含む酵素混合物を調製した。この混合物を、ＰＣＲ混合物に加え、その結果、各反応容器は、１５０ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＤＴＴ（ｐＨ７．５）中に、３０単位のＮ．ＢｓｔＮＢ  Ｉおよび２単位のＢｓｔポリメラーゼを有した。得られた３’陥凹末端のニック形成反応および充填反応を、６０℃で３０分間実行した。この反応物を、任意のさらなる操作なしに、直接投入（ｉｎｊｅｃｔ）した。この投入を、冷やしたメッキホルダー（ｐｌａｔｅｄ  ｈｏｌｄｅｒ）より、４℃で実施した。
【０４５１】
クロマトグラフィーシステムは、バイナリポンプ、脱気装置（ｄｅｇａｓｓｅｒ）、カラムオーブン、ダイオードアレイ検出器および恒温式マイクロウェルプレート自動インジェクターを備える、Ａｇｉｌｅｎｔ  １１００システム（Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ  ＣＡ）である。このカラムは、３００Åの孔径を有する３μＭ粒子サイズを詰めた、Ｃ１８（２．１ｍｍ×５０ｍｍ）を組み込んだ、Ｖａｒｉａｎ  Ｍｉｃｒｏｓｏｒｂ  ＭＶ（Ｖａｒｉａｎ  Ｉｎｃ．Ｗａｌｎｕｔ  Ｃｒｅｅｋ，ＣＡ）である。このカラムを、５ｍＭ  酢酸トリエチルアミン（ＴＥＡＡ）中のアセトニトリル勾配を用いて３０℃で流した。緩衝液Ａは５ｍＭ  ＴＥＡＡであり、緩衝液Ｂは５ｍＭ  ＴＥＡＡおよび２５％（Ｖ／Ｖ）アセトニトリルである。勾配は、１０％のＢの１分間のホールドで始まり、次いで５０％のＢまでの４分間にわたる傾斜、その後９５％のＢで３０秒間、そして最後に１０％のＢまで、総運用時間（ｔｏｔａｌ  ｒｕｎ  ｔｉｍｅ）６分間かけて戻る。カラム温度は、３０℃で一定に保った。流速は、０．４１６ｍｌ／分であった。投入量は、１０μｌだった。質量分析計への流動は２００μｌ／分であり、ＬＣ流動の半分を、Ｔ分岐（ｔｅｅ）を使用して廃液に導いた。質量分析計は、エレクトロスプレー入口を備えるＭｉｒｃｏｍａｓｓ  ＬＣＴ  Ｔｉｍｅ−ｏｆ−Ｆｌｉｇｈｔ（Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ  Ｉｎｃ．Ｍａｎｃｈｅｓｔｅｒ  ＵＫ）である。サンプルを、１秒の走査時間を使用して、７００〜２３００ａｍｕの走査範囲を用いて、エレクトロスプレー負モード（ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｍｏｄｅ）で流した。装置のパラメーターは、以下であった：ＴＤＣ開始電圧  ７００、ＴＤＣ停止電圧  ５０、ＴＤＣ閾値  ０、ＴＤＣゲイン制御  ０、ＴＤＣエッジ制御  ０、Ｌｔｅｆｆ  １１１７．５、Ｖｅｆｆ  ４６００。供給源パラメーターは、以下であった：脱溶媒和ガス  ８６２Ｌ／時間、キャピラリー  ３０００Ｖ、サンプルコーン  ２５Ｖ、ＲＦレンズ  ２００Ｖ、抽出コーン  ２Ｖ、脱溶媒和温度  ２５０℃、供給源温度  １５０℃、ＲＦ  ＤＣオフセット１  ４Ｖ、ＦＲ  ＤＣオフセット２  １Ｖ、アパーチャー  ６Ｖ、加速  ２００Ｖ、フォーカス  １０Ｖ、ステアリング  ０Ｖ、ＭＣＰ検出器  ２７００Ｖ、推進サイクル時間（手動）６０、イオンエネルギー  ４０Ｖ、チューブレンズ  ０Ｖ、グリッド２  ７４Ｖ、ＴＯＦ飛行チューブ  ４６２０Ｖ、リフレクトロン（Ｒｅｆｒｅｃｔｒｏｎ）１７９０Ｖ。
【０４５２】
非両対立遺伝子性ＳＮＰ（すなわち、Ｇ→ＣまたはＡ）を含むシトクロムＰ４５０  ２Ｄ６遺伝子を試験し、そしてこのＳＮＰを含むフラグメントを、首尾良く分離し、そして同定した。このフラグメントおよびＰＣＲ増幅産物を増幅するために使用されたプライマー対の配列を以下に示し、Ｎ．ＢｓｔＮＢ  Ｉ認識配列を構築する塩基を太字で強調し、そしてＳＮＰを「Ｎ」によって示し、これはＧ、ＣまたはＡのいずれかであり得る。
【０４５３】
【化１２】
2004535815.tif 000016
Ｎ．ＢｓｔＮＢ  Ｉの消化は、以下の２本鎖ＤＮＡフラグメントを生じ、各々は３’陥凹末端を有する：
【０４５４】
【化１３】
2004535815.tif 000017
Ｂｓｔポリメラーゼの存在下で、２つの２本鎖核酸フラグメントを増幅し、次いで解放する：
【０４５５】
【化１４】
2004535815.tif 000018
種々の単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）を含む、増幅した１本鎖配列の質量（３’ＯＨおよび５’ＰＯ４を含む）を、表４に示す。
【０４５６】
（表４）
（種々のＳＮＰを含む、増幅した１本鎖配列の質量）
【０４５７】
【化１５】
2004535815.tif 000019
２家族（２８個体）の遺伝子型決定からの結果を、表５に示し、これは、試験した全てのメンバーが、稀な変異型（ｖａｒｉａｎｔ）対立遺伝子についてホモ接合性であることを示す（すなわち、ＳＮＰ部位でのＡ）。
【０４５８】
（表５）
（２８個体の遺伝子型決定データ）
【０４５９】
【化１６】
2004535815.tif 000020
図２４および２５は、２個体の上側鎖および下側鎖についての、例示のＵＶクロマトグラム、および抽出（ｅｘｔｒａｃｔｅｄ）イオン電流を示す。１２６５および１２１６のＭ／Ｚ値は、表５に示されるＭ／Ｚ値よりも１ダルトン低い。なぜなら、質量分析計は、負モードで実施されるからである。
【０４６０】
図２６は、テンプレートなしのコントロールについての、ＵＶクロマトグラムおよび抽出イオン電流を示す。
【０４６１】
図２７は、上側フラグメントについての質量スペクトル（１２６５ａｍｕで、ｍ／ｚ＝３）および下側フラグメントについての質量スペクトル（１２１６ａｍｕで、ｍ／ｚ＝３）を示す。
【０４６２】
（実施例  ５）
（等温増幅アッセイおよび液体クロマトグラフィー／質量分析の分析を使用した、単一ヌクレオチド多型の測定）
この実施例は、Ｎ．ＢｓｔＮＢ  Ｉ認識配列のセンス鎖配列を各々が含むプライマー対を使用して、単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）を含むゲノムフラグメントの増幅を記載する。この得られたアンプリコンは、Ｎ．ＢｓｔＮＢ  Ｉで切断する場合、３’陥凹末端を各々が含む、二本鎖核酸フラグメントを生成した。次いで、この３’陥凹末端を、ｅｘｏ−Ｖｅｎｔポリメラーゼを使用して埋めた。次いで、埋め込まれたフラグメントを、Ｎ．ＢｓｔＮＢ  Ｉによって再度ニック形成し、そして得られた３’陥凹末端を、再びｅｘｏ−Ｖｅｎｔポリメラーゼによって埋めた。このニック形成、それに続く３’末端充填のプロセスを繰り返し、その結果、２つの短い１本鎖核酸フラグメントを増幅した。次いで、このような短いフラグメントを、クロマトグラフィー分離に供し、そして質量分析の分析を介して、質量対電荷の割合によって同定した。
【０４６３】
ＳＮＰを含むゲノム配列を増幅するために、以下の２つのプライマーを設計し、そしてＭＷＧ  Ｂｉｏｔｅｃｈ（Ｈｉｇｈ  Ｐｏｉｎｔ，ＮＣ）から購入した。ここで、Ｎ．ＢｓｔＮＢ  Ｉ認識配列のセンス鎖の配列は、下線を付される。
【０４６４】
【化１７】
2004535815.tif 000021
０．４μｍｏｌの上記の順方向プライマーおよび逆方向プライマーを、４℃で組み合わせたＰＣＲ混合物中で使用した。９６ウェルマイクロタイタープレート（Ｆｉｓｈｅｒ，Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ  ＭＯ）中の１ウェル当たり５０μｌの総反応量はまた、４００μＭ  ｄＮＴＰ、５ｎｇのゲノムＤＮＡ（Ｃｏｒｉｅｌｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ  ＭＤからのＣｏｒｉｅｌｌ  ＤＮＡ）、１×ＰＣＲ緩衝液（ＥｐｉＣｅｎｔｒｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ａｕｓｔｉｎ  ＴＸ）、１×エンハンサー溶液（ＥｐｉＣｅｎｔｅｒｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ａｕｓｔｉｎ  ＴＸ）および１単位のＴａｑポリメラーゼも含む。このプレートを、ポリプロピレンプレートシーラーを使用してシールし、次いで高温（９５℃）サーモサイクラー（ＭＷＧ，ＮＣ）に移した。次いで、このプレートを、３０サイクルにわたって７０℃で出発し６０℃で終結するタッチダウン手順として公知の、熱サイクル手順に供した。３０サイクルの終わりに、このプレートを４℃に処した。このＰＣＲプロセスは、６１ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドフラグメントを生成した。
【０４６５】
この増幅したオリゴヌクレオチドフラグメントを、ｅｘｏ−ＶｅｎｔポリメラーゼおよびＮ．ＢｓｔＮＢ  Ｉニック形成エンドヌクレアーゼの存在下で、２つの１本鎖核酸フラグメントを増幅するためのテンプレートとして使用した。以下の混合物を合せ、次いでこの混合物の１５μｌを、マクロウェルプレートの各ウェルに添加した。
【０４６６】
２５０μｌ    １０×Ｔｈｅｒｍｏｐｏｌ緩衝液（ＮＥＢ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）
１２５μｌ    １０×Ｎ．ＢｓｔＮＢ  Ｉ（ＮＥＢ）
１００μｌ    ２５ｍＭ  ｄＮＴＰ（ＮＥＢ）
１０００μｌ  １Ｍ  トレハロース（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）
２５０単位    Ｎ．ＢｓｔＮＢ  Ｉニック形成酵素（ＮＥＢ）
５０単位      ｅｘｏ−ＶｅｎｔＤＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢ）
１０２０μｌ  超純水
このプレートを４℃で再シールし、次いでこのプレートを、６０℃で１時間加熱した。
【０４６７】
この実施例において、ＳＮＰは、複対立遺伝子性であり、そしてＡからＴへの置換である。言い換えると、このＳＮＰについて、大量の対立遺伝子がＡであり、一方、稀な対立遺伝子がＴである。大量の対立遺伝子（すなわち、対立遺伝子Ａ）について、２本の増幅された１本鎖核酸フラグメントは、大文字で示される、ＳＮＰおよびその相補ヌクレオチドを有する以下に従うフラグメントである：
上側鎖：    ５’−ｇｇａｇａａａｃａｃＡｔｔｔｇ−３’
下側鎖：    ３’−ｃｃｔｃｔｔｔｇｔｇＴａａａｃ−５’。
同様に、稀な対立遺伝子（すなわち、対立遺伝子Ｔ）について、２本の増幅された１本鎖核酸フラグメントは、大文字で示されるＳＮＰおよびその相補ヌクレオチドを有する、以下に従うフラグメントである：
上側鎖：    ５’−ｇｇａｇａａａｃａｃＴｔｔｔｇ−３’
下側鎖：    ３’−ｃｃｔｃｔｔｔｇｔｇＡａａａｃ−５’。
上記の４つのフラグメントについての質量／電荷の計算は、負モードでのエレクトロスプレーを介した質量分析によって分析する場合、以下のとおりである。
【０４６８】
【化１８】
2004535815.tif 000022
１本鎖核酸増幅反応の完了の際、この反応混合物をＬＣ／ＭＳ（Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ  ＬＴＤ，Ｍａｎｃｈｅｓｔｅｒ  ＵＫおよびＢｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ，ＵＳＡ）にロードし、このＬＣ／ＭＳで、質量分析の分析を、負モードでのエレクトロスプレーを使用するＬＣＴ時間飛行によって行った。
【０４６９】
使用したクロマトグラフィーシステムは、バイナリポンプ、脱気装置、カラムオーブン、ダイオードアレイ検出器および恒温式マイクロウェルプレート自動インジェクターで構成される、Ａｇｉｌｅｎｔ  ＨＰＬＣ−１１００（Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ  ＣＡ）である。このカラムは、３００Åの孔径を有する３μＭ粒子サイズを詰めた、Ｃ１８（２．１ｍｍ×５０ｍｍ）を組み込んだ、Ｗａｔｅｒｓ  Ｘｔｅｒｒａ（Ｗａｔｅｒｓ  Ｉｎｃ．Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ）である。このカラムを、５ｍＭ  酢酸トリエチルアミン（ＴＥＡＡ）中のアセトニトリル勾配を用いて３０℃で流した。緩衝液Ａは５ｍＭ  ＴＥＡＡであり、一方、緩衝液Ｂは５ｍＭ  ＴＥＡＡおよび２５％（Ｖ／Ｖ）アセトニトリルである。勾配は、２０％のＢの３分間のホールドで始まり、次いで５０％のＢまでの３０秒間にわたる、その後８０％のＢで１．５分間、総運用時間６分間かけて、傾斜する。カラム温度は、３０℃で一定に保った。流速は、０．５ｍｌ／分であった。投入量は、１０μｌだった。質量分析計への流動は２００μｌ／分であり、ＬＣ流動の半分を、Ｔ分岐（ｔｅｅ）を使用して廃液に導いた。
【０４７０】
使用した質量分析計は、エレクトロスプレー入口を備えるＭｉｒｃｏｍａｓｓ  ＬＣＴ  Ｔｉｍｅ−ｏｆ−Ｆｌｉｇｈｔ（Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ  Ｉｎｃ．Ｍａｎｃｈｅｓｔｅｒ  ＵＫ）である。サンプルを、１秒の走査時間を使用して、７００〜２０００ａｍｕの走査範囲を用いて、エレクトロスプレー負モード（ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｍｏｄｅ）で流した。装置のパラメーターは、以下であった：ＴＤＣ開始電圧  ７００、ＴＤＣ停止電圧  ２００、ＴＤＣ閾値  ０、ＴＤＣゲイン制御  ０、ＴＤＣエッジ制御  ０、Ｌｔｅｆｆ  １１１８．３、Ｖｅｆｆ  ４６００。供給源パラメーター：脱溶媒和ガス  ８６２Ｌ／時間、キャピラリー  ３０００Ｖ、サンプルコーン  ３０Ｖ、ＲＦレンズ  ２５０Ｖ、抽出コーン  ３Ｖ、脱溶媒和温度  ３２５℃、供給源温度  １５０℃、ＲＦ  ＤＣオフセット１  ５Ｖ、ＦＲ  ＤＣオフセット２  ２Ｖ、アパーチャー  ０Ｖ、加速  ２００Ｖ、フォーカス  １Ｖ、ステアリング  ０Ｖ、ＭＣＰ検出器  ２７００Ｖ、推進サイクル時間（手動）６０、イオンエネルギー  ４０Ｖ、チューブレンズ  ４４Ｖ、グリッド２  ５０Ｖ、ＴＯＦ飛行チューブ  ４６２０Ｖ、およびリフレクトロン（Ｒｅｆｒｅｃｔｒｏｎ）１７８５Ｖ。
【０４７１】
切り出されそして分析される配列を、それぞれの予想される質量対電荷の割合と一緒に、大量の対立遺伝子および希少な対立遺伝子に対して付与した。全体的に、１４，０００より大きい質量対電荷の割合は、記録されなかった。
【０４７２】
以下の抽出イオン電流を、モニターした：
１５３４．６＋１１５０．７（Ｔ対立遺伝子の下側鎖に対して）
１５６４．３＋１１７３．２（Ｔ対立遺伝子の上側鎖に対して）
１５３１．６＋１１４８．５（Ａ対立遺伝子の下側鎖に対して）
１５６７．３＋１１７５．２（Ａ対立遺伝子の下側鎖に対して）。
【０４７３】
個体番号１（Ｃｏｒｉｅｌｌ由来ののサンプル番号１）についての結果を、図３２に示す。上側のパネルは、Ｔ対立遺伝子の下側鎖についての抽出イオン電流クロマトグラムを示す。第２のパネルは、Ｔ対立遺伝子の上側鎖についての抽出イオン電流クロマトグラムを示す。第３のパネルは、Ａ対立遺伝子の下側鎖についての抽出イオン電流クロマトグラムを示す。第４のパネルは、Ａ対立遺伝子の上側鎖についての抽出イオン電流クロマトグラムを示す。下側のパネルは、総イオン電流についてのクロマトグラムを示す。図３２に示されるとおり、Ｔ対立遺伝子またはＡ対立遺伝子の、上側鎖または下側鎖についてのイオン電流は、以下の通りであった：
１５３４．６＋１１５０．７（Ｔ対立遺伝子の下側鎖に対して）：０単位
１５６４．３＋１１７３．２（Ｔ対立遺伝子の上側鎖に対して）：０単位
１５３１．６＋１１４８．５（Ａ対立遺伝子の下側鎖に対して）：１７．２３単位
１５６７．３＋１１７５．２（Ａ対立遺伝子の上側鎖に対して）：１７．９９単位。
従って、個体番号１はＡ対立遺伝子についてホモ接合性である。
【０４７４】
個体番号２（Ｃｏｒｉｅｌｌ由来のサンプル番号１）についての結果を、図３３に示す。上側のパネルは、Ｔ対立遺伝子の下側鎖についての抽出イオン電流クロマトグラムを示す。第２のパネルは、Ｔ対立遺伝子の上側鎖についての抽出イオン電流クロマトグラムを示す。第３のパネルは、Ａ対立遺伝子の下側鎖についての抽出イオン電流クロマトグラムを示す。第４のパネルは、Ａ対立遺伝子の上側鎖についての抽出イオン電流クロマトグラムを示す。下側のパネルは、総イオン電流についてのクロマトグラムを示す。図３３に示されるとおり、Ｔ対立遺伝子またはＡ対立遺伝子の、上側鎖または下側鎖についてのイオン電流は、以下の通りであった：
１５３４．６＋１１５０．７（Ｔ対立遺伝子の下側鎖に対して）：３３．５６単位
１５６４．３＋１１７３．２（Ｔ対立遺伝子の上側鎖に対して）：３５．９８単位
１５３１．６＋１１４８．５（Ａ対立遺伝子の下側鎖に対して）：４４．８２単位
１５６７．３＋１１７５．２（Ａ対立遺伝子の上側鎖に対して）：５５．９５単位。
従って、個体番号２はＴ対立遺伝子およびＡ対立遺伝子について、ヘテロ接合性である。
【０４７５】
（実施例６）
（等温増幅アッセイおよび液体クロマトグラフィー／質量分析の分析を使用した、対立遺伝子の頻度の測定）
この実施例は、Ｎ．ＢｓｔＮＢ  Ｉ認識配列のセンス鎖配列を各々が含むプライマー対を使用して、プールされた複雑なサンプル中で単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）を含むゲノムフラグメントの増幅を記載する。この得られたアンプリコンの各々は、Ｎ．ＢｓｔＮＢ  Ｉで切断する場合、３’陥凹末端を各々が含む、二本鎖核酸フラグメントを生成した。次いで、この３’陥凹末端を、ｅｘｏ−Ｖｅｎｔポリメラーゼを使用して埋めた。次いで、埋め込まれたフラグメントを、Ｎ．ＢｓｔＮＢ  Ｉによって再度ニック形成し、そして得られた３’陥凹末端を、再びｅｘｏ−Ｖｅｎｔポリメラーゼによって埋めた。このニック形成、それに続く３’陥凹末端充填のプロセスを繰り返し、その結果、２つの短い１本鎖核酸フラグメントを増幅した。次いで、このような短いフラグメントを、クロマトグラフィー分離に供し、そして質量分析の分析を介して、質量対電荷の割合によって同定した。同じ対立遺伝子または異なる対立遺伝子を含むこれらの短いフラグメントの同定は、試験サンプル中の特定の対立遺伝子の頻度の計算を可能にする。
【０４７６】
ＳＮＰを含むゲノム配列を増幅するために、以下の２つのプライマーを設計し、そしてＭＷＧ  Ｂｉｏｔｅｃｈ（Ｈｉｇｈ  Ｐｏｉｎｔ，ＮＣ）から購入した。ここで、Ｎ．ＢｓｔＮＢ  Ｉ認識配列のセンス鎖の配列は、下線を付される。
【０４７７】
【化１９】
2004535815.tif 000023
この実施例において、ＳＮＰは両対立遺伝子性であり、そしてＡのＴへの置換である。言い換えると、このＳＮＰについては、大量の対立遺伝子はＡであり、一方、希少な対立遺伝子はＴである。
【０４７８】
Ｃｏｒｉｅｌｌ  Ｉｎｓｉｔｉｔｕｔｅ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ）から入手した、２００人の各々の異なる個体からの５ｎｇのゲノムＤＮＡを、１本の１．５ｍｌ遠心チューブに一緒にプールした。すべての２００人の個体は、Ａ対立遺伝子についてホモ接合性であった。プールしたＤＮＡサンプルに、Ｔ対立遺伝子についてホモ接合性であることを以前に決定した個体由来の、５ｎｇのＤＮＡを添加した。従って、このプールしたサンプルは、Ａ対立遺伝子についてホモ接合性である２００部のゲノムＤＮＡ、およびＴ対立遺伝子についてヘテロ接合性である１部のゲノムＤＮＡを含んだ。このサンプルを、ロトバップ（ｒｏｔｏｖａｐ）中で−２０℃で乾燥させ（ｄｅｓｓｉｃａｔｅ）、次いで１０μｌの０．０１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）中で再水和した。
【０４７９】
以下のＰＣＲ混合物を、４℃で組み合わせた。９６ウェルマイクロタイタープレート（Ｆｉｓｈｅｒ，Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ  ＭＯ）中の１ウェル当たり５０μｌの総反応量はまた、４００μＭ  ｄＮＴＰ、１００５ｎｇのゲノムＤＮＡ（Ｃｏｒｉｅｌｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ  ＭＤからのＣｏｒｉｅｌｌ  ＤＮＡ）、１×ＰＣＲ緩衝液（ＥｐｉＣｅｎｔｒｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ａｕｓｔｉｎ  ＴＸ）、１×エンハンサー溶液（ＥｐｉＣｅｎｔｅｒｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ａｕｓｔｉｎ  ＴＸ）および１単位のＴａｑポリメラーゼも含んだ。このプレートを、ポリプロピレンプレートシーラーを使用してシールた。プレート反応物を調製し、そして４℃でシールした。次いで高温（９５℃）サーモサイクラー（ＭＷＧ，ＮＣ）に移した。次いで、このプレートを、３０サイクルにわたって７０℃で出発し６０℃で終結するタッチダウン手順として公知の、熱サイクル手順に供した。
【０４８０】
この増幅したオリゴヌクレオチドフラグメントを、ｅｘｏ−Ｖｅｎｔポリメラーゼおよ
びＮ．ＢｓｔＮＢ  Ｉニック形成エンドヌクレアーゼの存在下で、２つの１本鎖核酸フラグメントを増幅するためのテンプレートとして使用した。以下の混合物を合せ、次いでこの混合物の１５μｌを、マクロタイタープレートの各ウェルに添加した。
【０４８１】
２５０μｌ    １０×Ｔｈｅｒｍｏｐｏｌ緩衝液（ＮＥＢ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）
１２５μｌ    １０×Ｎ．ＢｓｔＮＢ  Ｉ（ＮＥＢ）
１００μｌ    ２５ｍＭ  ｄＮＴＰ（ＮＥＢ）
１０００μｌ  １Ｍ  トレハロース（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）
２５０単位    Ｎ．ＢｓｔＮＢ  Ｉニック形成酵素（ＮＥＢ）
５０単位      ｅｘｏ−ＶｅｎｔＤＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢ）
１０２０μｌ  超純水
このプレートを４℃で再シールし、次いでこのプレートを、６０℃で１時間加熱した。
【０４８２】
大量の対立遺伝子（すなわち、対立遺伝子Ａ）について、２本の増幅された１本鎖核酸フラグメントは、大文字で示される、ＳＮＰおよびその相補ヌクレオチドを有する以下に従うフラグメントである：
上側鎖：    ５’−ｇｇａｇａａａｃａｃＡｔｔｔｇ−３’
下側鎖：    ３’−ｃｃｔｃｔｔｔｇｔｇＴａａａｃ−５’。
同様に、稀な対立遺伝子（すなわち、対立遺伝子Ｔ）について、２本の増幅された１本鎖核酸フラグメントは、大文字で示されるＳＮＰおよびその相補ヌクレオチドを有する、以下に従うフラグメントである：
上側鎖：    ５’−ｇｇａｇａａａｃａｃＴｔｔｔｇ−３’
下側鎖：    ３’−ｃｃｔｃｔｔｔｇｔｇＡａａａｃ−５’。
上記の４つのフラグメントについての質量／電荷の計算は、負モードでのエレクトロスプレーを介した質量分析によって分析する場合、以下のとおりである。
【０４８３】
【化２０】
2004535815.tif 000024
１本鎖核酸増幅反応の完了の際、この反応混合物をＬＣ／ＭＳ（Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ  ＬＴＤ，Ｍａｎｃｈｅｓｔｅｒ  ＵＫおよびＢｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ，ＵＳＡ）にロードし、このＬＣ／ＭＳで、質量分析の分析を、負モードでのエレクトロスプレーを使用するＬＣＴ飛行時間によって行った。
【０４８４】
使用したクロマトグラフィーシステムは、バイナリポンプ、脱気装置、カラムオーブン、ダイオードアレイ検出器および恒温式マイクロウェルプレート自動インジェクターで構成される、Ａｇｉｌｅｎｔ  ＨＰＬＣ−１１００（Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ  ＣＡ）である。このカラムは、３００Åの孔径を有する３μＭ粒子サイズを詰めた、Ｃ１８（２．１ｍｍ×５０ｍｍ）を組み込んだ、Ｗａｔｅｒｓ  Ｘｔｅｒｒａ（Ｗａｔｅｒｓ  Ｉｎｃ．Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ）である。このカラムを、５ｍＭ  酢酸トリエチルアミン（ＴＥＡＡ）中のアセトニトリル勾配を用いて３０℃で流した。緩衝液Ａは５ｍＭ  ＴＥＡＡであり、一方、緩衝液Ｂは５ｍＭ  ＴＥＡＡおよび２５％（Ｖ／Ｖ）アセトニトリルである。勾配は、２０％のＢの３分間のホールドで始まり、次いで５０％のＢまでの３０秒間にわたり傾斜し、その後８０％のＢで１．５分間、総運用時間６分間かけて傾斜する。カラム温度は、３０℃で一定に保った。流速は、０．５ｍｌ／分であった。投入量は、１０μｌであった。質量分析計への流動は２００μｌ／分であり、ＬＣ流動の半分を、Ｔ分岐（ｔｅｅ）を使用して廃液に導いた。
【０４８５】
使用した質量分析計は、エレクトロスプレー入口を備えるＭｉｒｃｏｍａｓｓ  ＬＣＴ  Ｔｉｍｅ−ｏｆ−Ｆｌｉｇｈｔ入口（Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ  Ｉｎｃ．Ｍａｎｃｈｅｓｔｅｒ  ＵＫ）である。サンプルを、１秒の走査時間を使用して、７００〜２０００ａｍｕの走査範囲を用いて、エレクトロスプレー負モード（ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｍｏｄｅ）で流した。装置のパラメーターは、以下であった：ＴＤＣ開始電圧  ７００、ＴＤＣ停止電圧  ２００、ＴＤＣ閾値  ０、ＴＤＣゲイン制御  ０、ＴＤＣエッジ制御  ０、Ｌｔｅｆｆ  １１１８．３、Ｖｅｆｆ  ４６００。供給源パラメーター：脱溶媒和ガス  ８６２Ｌ／時間、キャピラリー  ３０００Ｖ、サンプルコーン  ３０Ｖ、ＲＦレンズ  ２５０Ｖ、抽出コーン  ３Ｖ、脱溶媒和温度  ３２５℃、供給源温度  １５０℃、ＲＦ  ＤＣオフセット１  ５Ｖ、ＦＲ  ＤＣオフセット２  ２Ｖ、アパーチャー  ０Ｖ、加速  ２００Ｖ、フォーカス  １Ｖ、ステアリング  ０Ｖ、ＭＣＰ検出器  ２７００Ｖ、推進サイクル時間（手動）６０、イオンエネルギー  ４０Ｖ、チューブレンズ  ４４Ｖ、グリッド２  ５０Ｖ、ＴＯＦ飛行チューブ  ４６２０Ｖ、およびリフレクトロン（Ｒｅｆｒｅｃｔｒｏｎ）１７８５Ｖ。
【０４８６】
切り出されそして分析される配列を、それぞれの予想される質量対電荷の割合と一緒に、大量の対立遺伝子および希少な対立遺伝子に対して付与した。全体的に、１４，０００より大きい質量対電荷の割合は、記録されなかった。
【０４８７】
以下の抽出イオン電流を、モニターした：
１５３４．６＋１１５０．７（Ｔ対立遺伝子の下側鎖に対して）
１５６４．３＋１１７３．２（Ｔ対立遺伝子の上側鎖に対して）
１５３１．６＋１１４８．５（Ａ対立遺伝子の下側鎖に対して）
１５６７．３＋１１７５．２（Ａ対立遺伝子の上側鎖に対して）。
【０４８８】
プールされたサンプルについての結果を、図３４に示す。上側のパネルは、Ｔ対立遺伝子の下側鎖についての抽出イオン電流クロマトグラムを示す。第２のパネルは、Ｔ対立遺伝子の上側鎖についての抽出イオン電流クロマトグラムを示す。第３のパネルは、Ａ対立遺伝子の下側鎖についての抽出イオン電流クロマトグラムを示す。第４のパネルは、Ａ対立遺伝子の上側鎖についての抽出イオン電流クロマトグラムを示す。下側のパネルは、総イオン電流についてのクロマトグラムを示す。図３４に示されるとおり、Ｔ対立遺伝子およびＡ対立遺伝子の、上側鎖および下側鎖についてのイオン電流は、以下に示される：
１５３４．６＋１１５０．７（Ｔ対立遺伝子の下側鎖に対して）：１０．０単位
１５６４．３＋１１７３．２（Ｔ対立遺伝子の上側鎖に対して）：３．６単位
１５３１．６＋１１４８．５（Ａ対立遺伝子の下側鎖に対して）：１５１．９単位
１５６７．３＋１１７５．２（Ａ対立遺伝子の下側鎖に対して）：１６６．３単位。
【０４８９】
これらの結果は、Ｔ対立遺伝子について１３．６単位のシグナル（すなわち、Ｔ対立遺伝子の上側鎖および下側鎖からのシグナルの合計）が観察され、一方、Ａ対立遺伝子について３１８．２単位のシグナル（すなわち、Ａ対立遺伝子の上側鎖および下側鎖からのシグナルの合計）が観察されたことを示す。従って、このＤＮＡプール中のＴ対立遺伝子の頻度は、０．００４（すなわち、１３．６割る３１８．２）であるか、または２００部中１部である。
【０４９０】
図３５は、２．５分と５分との間の増幅オリゴヌクレオチドフラグメントについてのダイオードアレイトレース（ＵＶトレース）（上側パネル）、および総イオン電流（下側パネル）を示す。遺伝子型決定フラグメントは、ダイオードアレイトレースにおける３．８２分の集団保持時間、および総イオン電流クロマトグラムにおける３．９３分の集団保持時間を有する。
【０４９１】
（実施例７）
（固体支持体上でのｃＤＮＡ合成、およびニック形成剤およびＤＮＡポリメラーゼを使用する１本鎖核酸プローブの調製）
この実施例は、固体支持体上でのｃＤＮＡ合成およびそれに続く、ニック形成エンドヌクレアーゼおよびＤＮＡポリメラーゼの存在下で、テンプレートとして合成ｃＤＮＡを使用する、１本鎖核酸プローブの調製を記載する。この増幅スキームの設計は、現在のｃＤＮＡ依存性技術における以下の問題点を取り扱うことであった：必要とされる高い投入量のＲＮＡ、低い数のサンプルスループット、多くのユーザーの操作、有機性の抽出および沈殿、および低い適合性。
【０４９２】
（細胞刺激および総ＲＮＡ単離）
Ｊｕｒｋａｔ株ＪＲＴ３．５を、１０ｎｇ／ｍｌのホルボール−１２−ミリステート−１３酢酸（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）および１０ｎｇ／ｍｌのイオノマイシン（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）の存在下で、無血清ＲＰＭＩ培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）中で１×１０６細胞／ｍｌの細胞密度で６時間刺激した。細胞をペレット化し、１×ＰＢＳ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で洗浄し、再度ペレット化した。１０６細胞を含む各画分を、４Ｍグアニジンイソチオシアネート、１％  Ｎ−ラウリルサルコシン、および２５ｍＭ  クエン酸ナトリウム（ｐＨ７．１）（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ）を含む０．５ｍｌの緩衝液中で溶解させた。１／１０容量の２Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．２）（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を添加し、その後１容量の水飽和フェノール（Ａｍｒｅｓｃｏ．Ｓｏｌｏｎ，Ｏｈ）を添加した。混合後、１／４容量のクロロホルム：イソアミルアルコール（２９：１）（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を添加し、そしてこの溶液を激しく混合し、次いで氷上で１０分間インキュベートした。次いで、この溶解物を回転させ、水相を取り出し、そして等量のクロロホルム：イソアミルアルコールで抽出した。次いで、この水相をプールし、そしてＲＮＡを２容量のエタノール（Ｑｕａｎｔｕｍ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｒｐ．Ｔｕｓｃｏｌａ，ＩＬ）で沈殿させた。遠心分離後、エタノールをデカントし、そしてＲＮＡを簡単に風乾させ、次いで１ｍｇ／ｍｌおよび５ｍｇ／ｍｌの間の濃度に、ＲＮａｓｅ不含有水に再懸濁した。
【０４９３】
ｍＲＮＡを捕集するための供給源として、酸−グアニジニウム−フェノール抽出によって上記で調製された総ＲＮＡを使用することに加えて、細胞溶解およびハイブリダイゼーションのためにカオトロプ（ｃｈａｏｔｒｏｐｅ）（例えば、ＧｕＳＣＮまたはグアニジニウム塩酸）を使用する、同時溶解−ＲＮＡ捕集プロトコルもまた、最初に総ＲＮＡを単離せずに使用し得る。この代替アプローチは、標準的なＲＮＡ調製において、少量の細胞の溶解を可能にし、そして有機相抽出および連続のエタノール沈殿に関連した損失を避ける。
【０４９４】
（オリゴ（ｄＴ）−固体チップ（またはビーズ）の調製）
ｍＲＮＡを捕集するために、オリゴ（ｄＴ）を含む、ＡｓｃＩ認識配列を下線で示した以下のオリゴヌクレオチドを有する固体チップ（またはビーズ）を調製した：
【０４９５】
【化２１】
2004535815.tif 000025
上記オリゴヌクレオチドを、標準的なシアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノ−ホスホラミダイト（ＣＥＤホスホラミダイト）化学反応を使用する、市販の合成機で合成した。アミンのテールを、市販のＮ−モノメトキシトリチルアミノヘキサ−６−イルオキシ−ＣＥＤ−ホスホラミダイトを使用して、５’末端に組み込んだ。あるいは、オリゴヌクレオチドは、商業的に購入し得る（Ｍｉｄｌａｎｄ  Ｃｅｒｔｉｆｉｅｄ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ，Ｍｉｄｌａｎｄ，ＴＸ）。
【０４９６】
オリゴヌクレオチドのチップ（またはビーズ）を、以前に記載されるように調製した（Ｖａｎ  Ｎｅｓｓら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９：３３４５、１９９１）。このオリゴヌクレオチドのチップ（またはビーズ）は、チップ（またはビーズ）あたり、０．１〜１．２μｇの共有結合で固定したオリゴヌクレオチドを含んだ。
【０４９７】
（ポリアデニル化ｍＲＮＡの捕捉）
最初に混合物を６５〜７０℃に加熱し、高い塩のハイブリダイゼーション溶液を加え、次いでロータリーミキサーのような移動性プラットホームに置くことによって、ポリアデニル化ｍＲＮＡを、上記のビーズ上に捕捉させた。十分な混合を、連続的ボルテックス、円軌道振とう機、ロータリーロッカー、およびローテーターを取り付けたハイブリダイゼーションオーブンを含む種々の装置よって達成した。
【０４９８】
捕捉の持続時間は、投入したｍＲＮＡの量に依存する。周囲温度では、約２時間でビーズの９０％飽和を達成するのに、１０μｇの総ＲＮＡが十分であった。代表的な休眠細胞において、このことは、ビーズあたり、約１００ｎｇの結合したポリ（Ａ）＋ｍＲＮＡに対応する。同じ供給源からの４０μｇの総ＲＮＡは、３０分で同レベルの飽和をもたらした。別の組の実験において、飽和ヒトＴ細胞株をＲＮＡ供給源として使用し、そして飽和は、１０μｇの総投入ＲＮＡを使用する同じ捕捉条件下で、１時間で達した。マウス細胞株、ハムスター細胞株、およびヒト細胞株を含むいくつかのＲＮＡ供給源を捕捉し、そして全ては、１０μｇの総ＲＮＡあたり１〜２時間で、９０％捕捉のこの範囲内に至る傾向がある。
【０４９９】
１つの実験において、上記のように刺激したＪｕｒｋａｔ株ＪＲＴ３．５細胞から単離した１０μｇの細胞総ＲＮＡを、滅菌した１．５ｍｌ微量遠心チューブ（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中で、ポリ（ｄＴ）を含む、共有結合したオリゴヌクレオチドを有するビーズと混合し、ビーズを覆うのに十分なＲＮａｓｅ不含有水に希釈した。このＲＮＡおよびビーズを、６５℃で５分間インキュベートした。等量の２×ｍＲＮＡハイブリダイゼーション緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）、１Ｍ  ＮａＣｌ（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）および２０μｇ／ｍｌのアセチル化ＢＳＡ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）からなる）を各チューブに加え、そしてこれらチューブを、室温で２時間、穏やかに揺らした。上清を取り除き、次いでビーズを１×ｍＲＮＡハイブリダイゼーション緩衝液で３回洗浄した。
【０５００】
（第１鎖ｃＤＮＡ合成）
ポリ（Ａ）＋ｍＲＮＡの捕捉後、これらのビーズをハイブリダイゼーション緩衝液で３回洗浄して、非結合ＲＮＡを除去した。逆転写を、ＭＭＬＶ逆転写酵素（ＭＭＬＶ−ＲＴ）および最適化した緩衝系を使用して、３０μｌ容量中で、ハイブリダイゼーションオーブンローテーターの棚上で４２℃で１〜２時間、行った。捕捉工程に関しては、十分な第１鎖合成には、試薬の均一な混合が必要である。開始実験は、固体支持体あたり５０〜１００ｎｇのｃＤＮＡを生じた。この逆転写生成物を、固体支持体から切断された、標識二本鎖ｃＤＮＡのオートラジオグラフィーによって間接的にアッセイし、アガロースゲル電気泳動によってサイズを分けた。いくつかの実験において、複製したＲＮＡ種のサイズ範囲は、従来法に匹敵し、そしてしばしば従来法より良好であった。ｃＤＮＡのサイズ分布は、０．５Ｋｂ〜２０Ｋｂにわたり、平均が約２．０Ｋｂであった。
【０５０１】
１つの実験において、上記のように調製された、刺激したＪｕｒｋａｔ株ＪＲＴ３．５細胞からの捕捉したｍＲＮＡを、１×ＭＭＬＶ逆転写酵素緩衝液、１ｍＭ  ｄＮＴＰ混合物、２ｍＭ  ＤＴＴ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、２０単位のＲｎａｓｉｎ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）および１０μｇ／ｍｌのアセチル化ＢＳＡ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）からなる逆転写酵素混合物に懸濁し、続いて６００単位のＭＭＬＶ逆転写酵素（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を添加した。この反応物を、４２℃で２時間穏やかに揺らして、第１鎖ｃＤＮＡを合成した。
【０５０２】
第１鎖ｃＤＮＡの合成は、固体支持体ｃＤＮＡ方法論における、最初の分岐点である。残存するＲＮＡテンプレートを、ＲＮａｓｅＨで消化し得るか、ＮａＯＨ中で加水分解し得るか、または熱変性によって除去し得、一本鎖ＤＮＡを残し得る。次いで、この１本鎖ｃＤＮＡテンプレートを、オリゴヌクレオチド指向性の第２鎖ｃＤＮＡ合成、ＰＣＲ、ランダム開始（ｒａｎｄｏｍ−ｐｒｉｍｅｄ）プローブ生成、または標識オリゴヌクレオチドを使用する遺伝子発現研究のために、使用し得る。
【０５０３】
（第２鎖ｃＤＮＡ合成）
第１鎖ｃＤＮＡを合成すると、第２鎖ｃＤＮＡを、ＲＮａｓｅＨおよびＤＮＡポリメラーゼを使用して合成し得る。あるいは、アダプターをｃＤＮＡの第１鎖の３’末端上にライゲーションし、次いで、相補プライマーをアダプターにハイブリダイズし得る。続いて、第１鎖ｃＤＮＡをテンプレートとして使用して、第２鎖ｃＤＮＡを合成し得る。
【０５０４】
１つの実験において、逆転写後、ビーズを３回洗浄して反応物および酵素を取り除いた。第２鎖合成を、２５単位のＥ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡポリメラーゼＩにつき１単位のＲＮａｓｅＨを使用して、４０μｌ中で行った。この反応を、ロータリーロッカー上で６時間または一晩、室温でインキュベートした。続くライゲーション工程のために、第２鎖反応物を取り出しそしてＴ４ＤＮＡポリメラーゼおよびｄＮＴＰを添加することによって、不均一に伸長した末端を「平滑化（ｐｏｌｉｓｈ）」した。このインキュベーションを、ハイブリダイゼーションオーブン中でのローテーター上で３７℃で３０分間進めた。３２Ｐ標識化ｄＮＴＰの存在下での反応の進行、および第２鎖生成物のボイルにかまたは制限酵素ＡｓｃＩでの支持体からの切断のいずれかによって、生成物を直接的に可視化した。放射性標識化生成物を、ゲルに泳動し、そして視認化のためにフィルム上に置いた。１０μｇの総ＲＮＡの代表的な投入から、５０〜１２０ｎｇの二本鎖ｃＤＮＡの回収が可能であった。熱耐性ＤＮＡポリメラーゼをまた、逆転写反応後に、ＲＮａｓｅＨ活性を有する酵素（例えば、ＭＭＬＶ−ＲＴ）と共に使用し得る。第２鎖合成において、ＲＮａｓｅＨ／ＤＮＡｐｏｌＩをＴｔｈ  Ｉ  ＤＮＡポリメラーゼに対して比較した実験は、ＡｓｃＩ切断生成物の量にも、ＧＡＰＤＨおよびＩＬ−２のような選択的遺伝子ＰＣＲ増幅によって試験されたその生成物の含量のいずれにも、ほとんど差異を示さなかった。Ｔｔｈ  Ｉ  ＤＮＡポリメラーゼの使用は、室温で６時間のインキュベーションを、７０℃で１時間のインキュベーションに短縮する。Ｔｔｈ  Ｉ  ポリメラーゼはまた、Ｍｎ２＋の存在下で逆転写酵素活性を示したが、二価カチオンの存在下での高温でのＲＮＡ加水分解の可能性に起因して、インキュベーションを極短時間で維持する必要があった。高温でのＤＮＡポリマー化はまた、二次構造の領域を融解する利点を有し、このことは、高次構造のｍＲＮＡからのｃＤＮＡの合成に有益であり得る。
【０５０５】
別の実験において、次いで、刺激したＪｕｒｋａｔ株ＪＲＴ３．５由来のｍＲＮＡをテンプレートとして使用する第１鎖ｃＤＮＡ合成（上記のとおり）のために、１単位のＲＮａｓｅＨ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）を反応混合物に添加した。この反応を、さらに０．５時間継続させた。上清を取り除き、そして各ビーズを、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８）および１ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８）を含むＴＥ緩衝液（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中で３回洗浄した。残存するＲＮＡテンプレートを、０．０１％  ＳＤＳ（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を含むＴＥ緩衝液中で、ビーズをボイルすることによって除去した。
【０５０６】
第２鎖ｃＤＮＡ合成は、固体支持体ｃＤＮＡ技術における、第二の分岐点を表す。ここで、全長１本鎖ｃＤＮＡプローブ、ライブラリー生成、インビトロ転写および５’ＲＡＣＥのような工程を支援し得るｃＤＮＡに、アダプターをライゲーションする選択が、なされ得る。
【０５０７】
（スケールダウン）
標準的なｃＤＮＡライブラリー生成に関わる、多くの操作の間の物質の損失を最小にすることによって、投入ＲＮＡレベルを、１／１００〜１／１０にスケールダウンすることが可能であるべきである。概ね１００ｎｇの２本鎖ｃＤＮＡが１０μｇ（これは、市販のキットで必要とされる開始量の１／５０にも満たない）の総ＲＮＡから固体支持体上で合成され得ることを示した。上記のプロトコルを有意に変更することなく、上記のスケールを１／１０ほどに縮小することが可能であり得る。しかし、以下の縮小スケールは、ある種の増幅工程の並び換えを含むことが必要であるようである。１つのアプローチは、ｃＤＮＡ合成が、Ｎ．ＢｓｔＮＢ．Ｉ認識配列を含むアダプターを使用するアダプターのライゲーションで、続けられることである。得られたライゲーション生成物を、２本鎖ｃＤＮＡ分子の一方の鎖に同一である１本鎖核酸分子を合成するためのテンプレートとして使用し得、これを次いで、その相補鎖を合成するための、ｃＤＮＡプローブまたはテンプレートとして使用し、これによって２本鎖ｃＤＮＡ分子を生成し得る。
【０５０８】
（アダプターライゲーション）
固相ｃＤＮＡライブラリーの構築またはｃＤＮＡプローブの生成を促進するために、１０％のＰＥＧを含む緩衝液中で５〜１０：１のアダプター：ｃＤＮＡ末端のモル比で、３０μｌの容量中で、亜リン酸化（ｈｅｍｉ−ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｅ）アダプターを２本鎖ｃＤＮＡにライゲーションする。アダプター−ｃＤＮＡ混合物を、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼを用いて、ロータリーロッカー上で室温で一晩インキュベートした。次いで、固体支持体を３回洗浄して、余分なリンカーを取り除いた。ライゲーション後、アダプター上の５’ヒドロキシル基を、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼおよびＡＴＰを用いて、ハイブリダイゼーションオーブンの回転棚上で、３７℃で１時間、リン酸化した。この反応を、ビーズをＴＥ中で３回洗浄することによって停止させた。このｃＤＮＡを別の適用のために使用する場合、リン酸化工程は不要である。
【０５０９】
上記に考察されるように、特定の状況の下では、合成した２本鎖ｃＤＮＡを、Ｎ．ＢｓｔＮＢ．Ｉ認識配列を含むアダプターにライゲーションした。このようなライゲーション生成物をテンプレートとして使用して、１本鎖ｃＤＮＡプローブを調製し得るか、またはさらに２本鎖ｃＤＮＡ分子を作製し得る。
【０５１０】
（固体支持体上で合成されたｃＤＮＡをテンプレートとして使用する、ｃＤＮＡプローブ製造）
Ｎ．ＢｓｔＮＢ  Ｉアダプターを合成し、そして１０μｇの総ＲＮＡから生成した、ビーズ上の２本鎖ｃＤＮＡにライゲーションした。このビーズを、標準的なＣｅｔｕｓ  ＰＣＲチューブ（ＡＢＩ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）に入れ、そして６０℃で１時間インキュベートした。この結合した２本鎖ｃＤＮＡを続けてニック形成して、２本鎖ｃＤＮＡ分子の一方の鎖の多数のコピーを生成した。インキュベーション後、生成物を熱変性させ、そしてアガロースゲル上で泳動して、１本鎖ｃＤＮＡの長さの範囲を視認した。サイズは、およそ５００ｂｐから、２０Ｋｂより大きいものにわたり、これは、コントロール実験と平行して、標識され、ビーズから切断され、電気泳動によって分離され、そしてオートラジオグラフィーによって視認した、２本鎖ｃＤＮＡのサイズとうまく一致した。
【０５１１】
Ｎ．ＢｓｔＮＢ  Ｉ（ＮＥＢ製）についての反応緩衝液は、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１５０ｍＭ  ＫＣｌ、１ｍＭ  ジチオトレイトール（２５℃でｐＨ７．５）であった。ニック形成反応を、５５℃〜６０℃で実施した。ニック形成エンドヌクレアーゼは、８０℃で２０分間のインキュベーションによって、熱不活性化され得る。
【０５１２】
これらの実験において試験されたポリメラーゼは、ｅｘｏ−Ｖｅｎｔ、ｅｘｏ−Ｄｅｅｐ  ＶｅｎｔおよびＢｓｔ（ＮＥＢ）であった。これらのポリメラーゼについての反応緩衝液は、１×ＴｈｅｒｍｏＰｏｌ  Ｂｕｆｆｅｒ（１０ｍＭ  ＫＣｌ、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（２５℃でｐＨ８．８）、１０ｍＭ  （ＮＨ４）２ＳＯ４、２ｍＭ  ＭｇＳＯ４、０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、ｄＮＴＰ（４００μＭ）およびＤＮＡを含む）であった。ｅｘｏ−Ｖｅｎｔ  ＤＮＡポリメラーゼおよびｅｘｏ−Ｄｅｅｐ  Ｖｅｎｔ  ＤＮＡポリメラーゼは、７２℃〜８０℃で最大の活性であり、そして２，０００単位／ｍｌの濃度で供給される。
【０５１３】
増幅された１本鎖ｃＤＮＡが元々のｍＲＮＡ集団の代表であるかどうかを決定するために、ＰＣＲプライマーを、所定の細胞型において、高レベルで存在するか、低レベルで存在するか、または全く存在しないことが既知のいくつかの遺伝子について設計した。これらプライマーの設計は、全ての生成物がほぼ同じ長さ（４００〜６００ｂｐ）であり、かつｃＤＮＡの５’末端かまたはその付近に位置するような設計であり、その結果、第１鎖合成の良好なおおよその量が得られ得る。刺激したヒトＪｕｒｋａｔ  Ｔ細胞株をＲＮＡ供給源として使用した。以下の遺伝子を分析した：ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＧＭ−ＣＳＦ、ＧＡＰＤＨ、ｃ−ｆｏｓ、ＣＴＬＡ４、およびＷｅｒｎｅｒのヘリカーゼ。マウスグアニル酸キナーゼを、ネガティブコントロールとして使用した。上記遺伝子に特異的なプライマーを使用する、全てのＰＣＲ反応は、ＣＴＬＡ４またはマウスグアニル酸キナーゼに特異的なプライマーを使用すること除いて、予想されたサイズを有する生成物を生じた。ＩＬ−２についての生成物を、５０ｎｇの推定ＩＬ−２を３２Ｐ標識し、そしてこれを、刺激（ＰＭＡおよびイオノマイシン）したＪｕｒｋａｔ細胞および非刺激Ｊｕｒｋａｔ細胞の両方からの固定化ＲＮＡを含むブロットに対してハイブリダイズさせる、ノーザンブロットによって確認した。高ストリンジェンシーでの洗浄後、未刺激のＲＮＡはほぼシグナルを示さなかったが、一方刺激したサンプルは、ＩＬ−２メッセージについての予想サイズに一致する、強力なシグナルを示した。
【０５１４】
（実施例８）
（オリゴヌクレオチドの線形増幅）
この実施例は、テンプレート二重鎖からのオリゴヌクレオチドの線形増幅を例示する。このテンプレート二重鎖は、以下に示されるような、２本のオリゴヌクレオチドを互いにアニーリングすることによって形成される。Ｎ．ＢｓｔＮＢ  Ｉの認識配列を、以下に示す。
【０５１５】
【化２２】
2004535815.tif 000026
ＤＮＡポリメラーゼの存在下で、上記の二重鎖の陥凹を埋め込み、以下の伸長産物を生じる。
【０５１６】
【化２３】
2004535815.tif 000027
Ｎ．ＢｓｔＮＢ  Ｉの存在下で、上記の伸長産物にニック形成し、以下のニック形成生成物を生じる。
【０５１７】
【化２４】
2004535815.tif 000028
上記の伸長およびニック形成サイクルを、複数回反復して、フラグメント：５’−ａｇｔｔｃｃａｇｔｃｇｔａｔｇｇ−３’の増幅を生じ得る。このフラグメントを、液体クロマトグラフィーおよび質量分析器によって検出し得、そして特徴付け得る。これは、３の質量対電荷の割合を１６６３．１ダルトンで有し、そして４の質量対電荷の割合を１２４７．１ダルトンで有し、そして５の質量対電荷の割合を９９７．１ダルトンで有する。
【０５１８】
以下の反応物を、４℃で組み合わせた：
７４０μｌ    脱イオン化ヌクレアーゼ不含有水
１１０μｌ    １０×Ｎ．ＢｓｔＮＢ  Ｉ緩衝液（ＮＥＢ）
５５μｌ      １０×Ｎ．ＢｓｔＮＢ  Ｉ緩衝液（ＮＥＢ）
１μｌ        １ｐｍｏｌ／μｌ  ＮＢｂｔ１６  オリゴヌクレオチド
１μｌ        １ｐｍｏｌ／μｌ  ＩＴＡＴＯＰ  オリゴヌクレオチド
８０μｌ      ２０００単位／ｍｌ  Ｎ．ＢｓｔＮＢ  Ｉ（ＮＥＢ）
２４μｌ      ５０００単位／ｍｌ  ９°ＮｍＴＭ  ＤＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢ）
１６μｌ      ２５ｍＭ  ｄＮＴＰ（ＮＥＢ）。
【０５１９】
この反応混合物を、ＰＣＲチューブに、２０個の５０μｌアリコートに分けた。これらのチューブをＭＪサーモサイクラー上で６０℃に置き、そして示された時間、インキュベートした。次いで、これらのサンプルを、続く液体クロマトグラフィー質量分析に供した。
【０５２０】
カラム緩衝液は、以下のとおりであった：緩衝液Ａは、０．０５Ｍ  ジメチルブチルアミン酢酸（ｐＨ７．６）を含み、一方、緩衝液Ｂは、０．０５Ｍ  ジメチルブチルアミン酢酸（ｐＨ７．６）、５０％アセトニトリルを含む。
【０５２１】
アセトニトリルの浅い勾配を使用してオリゴヌクレオチドを溶出し、そしてサンプルを純粋にする。勾配の分析部分は、５％アセトニトリルで開始し、そして約９０秒間にわたって１５％に増加させ、その後、ほんの２、３秒間カラムに４５％アセトニトリルの「固まり（ｐｌｕｇ）」を即座に押し込む洗浄を行い、その後、５％アセトニトリルの開始状
態に戻した。
【０５２２】
使用したカラムは、ＧｕａｒｄカラムＸｔｅｒｒａ  ２．×２０ｍｍ、３．５ミクロンのＭＳＣ１８である。カラムの前、フリットは、フリットホルダ（Ｕｐｃｈｕｒｃｈ  Ａ７０１  Ｐｅｅｋ  Ｐｒｅｆｉｌｔｅｒ  Ｆｒｉｔ  ０．５ミクロンを備えるＵｐｃｈｕｒｃｈ  Ａ３５６フリットホルダ）中にある。
【０５２３】
液体クロマトグラフィーからの画分を、質量分析計（エレクトロスプレーの入り口を備えるＭｉｃｒｏＭａｓｓ  ＬＣＴ  Ｔｉｍｅ−ｏｆ−Ｆｌｉｇｈｔ，Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ  Ｉｎｃ．，Ｍａｎｃｈｅｓｔｅｒ  ＵＫ）に注入した。注入量は１０μｌであった。サンプルを、走査範囲８００〜２０００ａｍｕで、エレクトロスプレー負モードで流した。１２４７．１ダルトンでの相対質量単位の経時的結果を、以下の表に示す。
【０５２４】
【化２５】
2004535815.tif 000029
【０５２５】
【化２６】
2004535815.tif 000030
（実施例  ９）
（ニック形成剤認識配列中のミスマッチを含むテンプレート核酸を使用する核酸増幅）
以下のオリゴヌクレオチドを合成し、そしてＭＷＧ（ＭＷＧ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｉｎｃ．，Ｈｉｇｈ  Ｐｏｉｎｔ，ＮＣ）から得た。これらのオリゴヌクレオチドを、１００ｐｍｏｌ／μｌで、０．０１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌおよび０．００１Ｍ  ＥＤＴＡに入れた。Ｎ．ＢｓｔＮＢ  Ｉの２本鎖認識配列のセンス鎖の配列を、下線で示し、一方、Ｎ．ＢｓｔＮＢ  Ｉの２本鎖認識配列のアンチセンス鎖の対応位置でのヌクレオチドと異なるヌクレオチドを、斜体で示す。
【０５２６】
【化２７】
2004535815.tif 000031
【０５２７】
【化２８】
2004535815.tif 000032
以下の混合物を混ぜ合わせ、次いで２５μｌの混合物を、マイクロタイタープレートの各ウェルに加えた：
２５０μｌ    １０×Ｔｈｅｒｍｏｐｏｌ緩衝液（ＮＥＢ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）
１２５μｌ    １０×Ｎ．ＢｓｔＮＢ  Ｉ（ＮＥＢ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）
１００μｌ    ２５ｍＭ  ｄＮＴＰ（ＮＥＢ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）
１０００μｌ  １Ｍ  トレハロース（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）
２５０単位    Ｎ．ＢｓｔＮＢ  Ｉニック形成酵素（ＮＥＢ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）
５０単位      Ｖｅｎｔ  ｅｘｏ−ＤＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）
１０２０μｌ  超純水
次いで、２５μｌの、それぞれの二重鎖の各々を、マイクロタイタープレートに添加した。この二重鎖を、最初に２本のオリゴヌクレオチドプライマーを希釈し、そして以下の溶液に終濃度１ｐｍｏｌ／μｌにすることによって、形成した：１×Ｔｈｅｒｍｏｐｏｌ緩衝液（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）および０．５×Ｎ．ＢｓｔＮＢ  Ｉ緩衝液。この１×Ｔｈｅｒｍｏｐｏｌ緩衝液は、１０ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  （ＮＨ４）２ＳＯ４、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．８）、０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、２ｍＭ  ＭｇＳＯ４からなり、一方、１×Ｎ．ＢｓｔＮＢ  Ｉ緩衝液は、１５０ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１０ｍＭ  ＭｇＳＯ４、１０ｍＭ  １ｍＭ  ＤＴＴからなる。次いで、この混合物を、１分間１００℃に加熱し、次いで１０分間５０℃に保持し、二重鎖を形成させた。プレートを４℃で再度シールし、次いで１時間６０℃に加熱した。
【０５２８】
以下の二重鎖を試験した。
【０５２９】
【化２９】
2004535815.tif 000033
【０５３０】
【化３０】
2004535815.tif 000034
【０５３１】
【化３１】
2004535815.tif 000035
【０５３２】
【化３２】
2004535815.tif 000036
【０５３３】
【化３３】
2004535815.tif 000037
【０５３４】
【化３４】
2004535815.tif 000038
このプレートを、負モードでのエレクトロスプレーを使用する、ＬＣＴ時間飛行型であるＬＣ／ＭＳ（Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ  ＬＴＤ，Ｍａｎｃｈｅｓｔｅｒ  ＵＫおよびＢｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ，ＵＳＡ）にロードした。条件は、以下のとおりであった：
クロマトグラフィーシステムは、バイナリポンプ、脱気装置、カラムオーブン、ダイオードアレイ検出器および恒温式マイクロウェルプレート自動インジェクターで構成される、Ａｇｉｌｅｎｔ  ＨＰＬＣ−１１００（Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ  ＣＡ）であった。このカラムは、３００Åの孔径を有する３μＭ粒子サイズを詰めた、Ｃ１８（２．１ｍｍ×５０ｍｍ）を組み込んだ、Ｗａｔｅｒｓ  Ｘｔｅｒｒａ（Ｗａｔｅｒｓ  Ｉｎｃ．Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ）であった。このカラムを、５ｍＭ  酢酸トリエチルアミン（ＴＥＡＡ）中のアセトニトリル勾配を用いて３０℃で流した。緩衝液Ａは５ｍＭ  ＴＥＡＡであり、緩衝液Ｂは５ｍＭ  ＴＥＡＡおよび２５％（Ｖ／Ｖ）アセトニトリルである。勾配は、１０％のＢの１分間のホールドで始まり、次いで５０％のＢまで４分間傾斜し、その後９５％のＢで３０秒間傾斜し、最終的に、総運用時間６分間かけて戻った。カラム温度は、３０℃で一定に保った。流速は、０．４１６ｍｌ／分であった。投入量は、１０μｌだった。質量分析計への流動は２００μｌ／分であり、ＬＣ流動の半分を、Ｔ分岐（ｔｅｅ）を使用して廃液に導いた。質量分析計は、エレクトロスプレー入口を備えるＭｉｒｃｏｍａｓｓ  ＬＣＴ  Ｔｉｍｅ−ｏｆ−Ｆｌｉｇｈｔ（Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ  Ｉｎｃ．Ｍａｎｃｈｅｓｔｅｒ  ＵＫ）であった。サンプルを、１秒の走査時間を使用して、７００〜２３００ａｍｕの走査範囲を用いて、エレクトロスプレー負モード（ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｍｏｄｅ）で流した。装置のパラメーターは、以下であった：ＴＤＣ開始電圧  ７００、ＴＤＣ停止電圧  ５０、ＴＤＣ閾値  ０、ＴＤＣゲイン制御  ０、ＴＤＣエッジ制御  ０、Ｌｔｅｆｆ  １１１７．５、Ｖｅｆｆ  ４６００。供給源パラメーター：脱溶媒和ガス  ８６２Ｌ／時間、キャピラリー  ３０００Ｖ、サンプルコーン  ２５Ｖ、ＲＦレンズ  ２００Ｖ、抽出コーン  ２Ｖ、脱溶媒和温度  ２５０℃、供給源温度  １５０℃、ＲＦ  ＤＣオフセット１  ４Ｖ、ＦＲ  ＤＣオフセット２  １Ｖ、アパーチャー  ６Ｖ、加速  ２００Ｖ、フォーカス  １０Ｖ、ステアリング  ０Ｖ、ＭＣＰ検出器  ２７００Ｖ、推進サイクル時間（手動）６０、イオンエネルギー  ４０Ｖ、チューブレンズ  ０Ｖ、グリッド２  ７４Ｖ、ＴＯＦ飛行チューブ  ４６２０Ｖ、リフレクトロン１７９０Ｖ。
【０５３５】
以下の抽出イオン電流をモニターした：以下のフラグメント：
３’  ＧＧ  ＡＴＧ  ＣＴＧ  ＡＣＣ−５’
が以下の二重鎖ならびに上記に列挙した他の二重鎖から放出される、１１４４．７ダルトン±１１４４．７ダルトン周囲の１ダルトン：
【０５３６】
【化３５】
2004535815.tif 000039
これらの結果を、以下の表に示す。
【０５３７】
【化３６】
2004535815.tif 000040
【０５３８】
【化３７】
2004535815.tif 000041
本明細書中で参照され、そして／または出願データシートに列挙される、上記の全ての米国特許、米国特許出願公開、米国特許出願、外国の特許、外国の特許出願、ならびに非特許文献は、その全体が本明細書中で参考として援用される。
【０５３９】
前出より、本発明の特定の実施形態が例示の目的で本明細書中に記載されたが、種々の改変が、本発明の本質および範囲から逸脱することなくなされ得ることが理解される。従って、本発明は、添付の特許請求の範囲を除いて限定されない。
【図面の簡単な説明】
【０５４０】
【図１】図１は、ニック形成エンドヌクレアーゼ認識配列（ＮＥＲＳ）のセンス鎖の配列およびＩＩｓ型制限エンドヌクレアーゼ認識配列（ＴＲＥＲＳ）の１鎖の配列をそれぞれ含む、例示的なＯＤＮＰ対を使用して標的核酸中の所定の位置における遺伝子変異を同定するための本発明の方法における主要な工程の概略図である。
【図２】図２は、ＮＥＲＳのセンス鎖の配列をそれぞれ含む、例示的なＯＤＮＰ対を使用して標的核酸中の所定の位置で遺伝子変異を同定するための本発明の方法における主要な工程の概略図である。
【図３】図３は、ＯＤＮＰ対、例示的なＩＲＥＲＳとしてのＢｓＩ  Ｉ、および例示的なＮＥＲＳとしてのＮ．ＢｓｔＮＢ  Ｉを使用して標的核酸中の所定の位置でヌクレオチドを同定するための本発明の方法における主要な工程の概略図である。
【図４】図４は、断続的制限エンドヌクレアーゼ認識配列の主要な構成要素の概略図である。Ａ１Ａ２．．．Ａｍは、ｍ個のヌクレオチドからなる特異的ヌクレオチド配列であるが、Ａ’１Ａ’２．．．Ａ’ｍは、Ａ１Ａ２．．．Ａｍの相補配列である。Ａ１Ａ２．．．ＡｍおよびＡ’１Ａ’２．．．Ａ’ｍから構成される二本鎖フラグメントは、第１のＣＲＳを形成する。Ｎ１Ｎ２．．．Ｎｎは、ｎ個のヌクレオチドからなる可変ヌクレオチド配列であり、そのヌクレオチドのうちのいずれか１つは、４つの塩基（Ａ、Ｃ、Ｔ、またはＧ）のうちのいずれかを含み得る。Ｎ’１Ｎ’２．．．Ｎ’ｎは、Ｎ１Ｎ２．．．Ｎｎの相補体であり、Ｎ１Ｎ２．．．Ｎｎと組み合わさってＶＲＳを形成する。Ｃ１Ｃ２．．．Ｃｉは、ｉ個のヌクレオチドからなる特異的ヌクレオチド配列であるが、Ｃ’１Ｃ’２．．．Ｃ’ｉは、Ｃ１Ｃ２．．．Ｃｉの相補体である。Ｃ１Ｃ２．．．ＣｉおよびＣ’１Ｃ’２．．．Ｃ’ｉから構成される二本鎖フラグメントは、第２のＣＲＳを形成する。
【図５】図５は、ヘミ改変された（ｈｅｒｎｉｍｏｄｉｆｉｅｄ）ＲＥＲＳのセンス鎖の配列をそれぞれ含む例示的なＯＤＮＰ対を使用して標的核酸中の所定の位置で遺伝子改変を同定するための本発明の方法における主要な工程の概略図である。破線は、取りこまれた改変デオキシリボヌクレオチドを有している伸長／増幅産物を示す。
【図６】図６は、生物学的サンプル中における標的核酸の存在または非存在を検出するための本発明の方法における主要な工程の概略図である。
【図７】図７は、１：１０希釈した４マーのＯＤＮ（５’−ＡＣＧＡ−３’）の、エレクトロスプレー液体クロマトグラフィー／飛行時間型質量分析（ＥＳ−ＬＣ／ＭＳ−ＴＯＦ）から得られたクロマトグラムを示す。
【図８】図８は、１：１００希釈した４マーのＯＤＮ（５’−ＡＣＧＡ−３’）の（ＥＳ−ＬＣ／ＭＳ−ＴＯＦ）分析から得られたクロマトグラムを示す。
【図９】図９は、１：１０００希釈した４マーのＯＤＮ（５’−ＡＣＧＡ−３’）の（ＥＳ−ＬＣ／ＭＳ−ＴＯＦ）分析から得られたクロマトグラムを示す。
【図１０】図１０Ａおよび１０Ｂは、１：１０希釈した６マーのＯＤＮ（５’−ＡＣＧＡＴＧ−３’））の（ＥＳ−ＬＣ／ＭＳ−ＴＯＦ）分析から得られたクロマトグラムを示す。
【図１１】図１１は、１：１００希釈した６マーのＯＤＮ（５’−ＡＣＧＡＴＧ−３’））の（ＥＳ−ＬＣ／ＭＳ−ＴＯＦ）分析から得られたクロマトグラムを示す。
【図１２】図１２は、１：１０００希釈した６マーのＯＤＮ（５’−ＡＣＧＡＴＧ−３’））の（ＥＳ−ＬＣ／ＭＳ−ＴＯＦ）分析から得られたクロマトグラムを示す。
【図１３】図１３Ａおよび１３Ｂは、１：１０希釈した８マーのＯＤＮ（５’−ＡＣＧＡＴＧＣＡ−３’）の（ＥＳ−ＬＣ／ＭＳ−ＴＯＦ）分析から得られたクロマトグラムを示す。
【図１４】図１４は、１：１００希釈した８マーのＯＤＮ（５’−ＡＣＧＡＴＧＣＡ−３’）の（ＥＳ−ＬＣ／ＭＳ−ＴＯＦ）分析から得られたクロマトグラムを示す。
【図１５】図１５Ａおよび１５Ｂは、１：１０希釈した１０マーのＯＤＮ（５’−ＧＡＡＣＡＴＣＣＡＴ−３’）の（ＥＳ−ＬＣ／ＭＳ−ＴＯＦ）分析から得られたクロマトグラムを示す。
【図１６】図１６は、１：１００希釈した１０マーのＯＤＮ（５’−ＧＡＡＣＡＴＣＣＡＴ−３’）の（ＥＳ−ＬＣ／ＭＳ−ＴＯＦ）分析から得られたクロマトグラムを示す。
【図１７】図１７は、１：１０００希釈した１０マーのＯＤＮ（５’−ＧＡＡＣＡＴＣＣＡＴ−３’）の（ＥＳ−ＬＣ／ＭＳ−ＴＯＦ）分析から得られたクロマトグラムを示す。
【図１８】図１８は、４個、６個、８個および１０個のヌクレオチドのＯＤＮＰセットの高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）クロマトグラムを示す。
【図１９】図１９Ａおよび１９Ｂは、３種類の８マー（図１９Ａ）および３種類の１０マー（図１９Ｂ）のＨＰＬＣ分画および検出を示す。
【図２０】図２０Ａおよび２０Ｂは、１種類の４マー、１種類の６マー、３種類の８マー、および３種類の１０マーのＨＰＬＣ分離（図２０Ａ）ならびに２種類の６マーの溶出（図２０Ｂ）を示す。
【図２１】図２１は、Ｎ．ＢｓｔＮＢ  ＩおよびＢｓＩ  Ｉの両方で消化された後のＰＣＲ反応の産物のＵＶクロマトグラムである。矢印は、一本鎖核酸消化産物を示す。
【図２２】図２２Ａおよび２２Ｂは、それぞれ、Ｎ．ＢｓｔＮＢ  ＩおよびＢｓｌ  Ｉの２重消化後の、ＰＣＲ反応の産物の単一のイオンクロマトグラムおよび総イオンクロマトグラムを示す。
【図２３】図２３は、Ｎ．ＢｓｔＮＢ  ＩおよびＢｓｌ  Ｉの２重消化による二本鎖ＰＣＲ産物から切り出された一本鎖オリゴヌクレオチドの質量スペクトルを示す。
【図２４】図２４Ａおよび２４Ｂは、１つの個体のゲノムＤＮＡから増幅された配列５’−ＧＡＧＣＡＣＡＧＧＡＴＧ−３’（トップ鎖）および５’−ＣＡＴＣＣＴＧＴＧＣＴＣ−３’（ボトム鎖）についてのＵＶクロマトグラム（図２４Ａ）および取り出されたイオン電流チャート（図２４Ｂ）を示す。
【図２５】図２５Ａおよび２５Ｂは、別の個体のゲノムＤＮＡから増幅された配列５’−ＧＡＧＣＡＣＡＧＧＡＴＧ−３’（トップ鎖）および５’−ＣＡＴＣＣＴＧＴＧＣＴＣ−３’（ボトム鎖）についてのＵＶクロマトグラム（図２５Ａ）および取り出されたイオン電流チャート（図２５Ｂ）を示す。
【図２６】図２６Ａおよび２６Ｂは、テンプレートコントロールのないものについてのＵＶクロマトグラム（図２６Ａ）および取り出されたイオン電流チャート（図２６Ｂ）を示す。
【図２７】図２７Ａおよび２７Ｂは、トップフラグメント（ｍ／ｚ＝３  ＠１２６５ａｍｕ）についての質量スペクトル（図２７Ｂ）およびボトムフラグメント（ｍ／ｚ＝３  ＠１２１６ａｍｕ）についての質量スペクトル（図２７Ａ）を示す。
【図２８】図２８は、一本鎖核酸プローブを調製するための本発明の例示的な方法における主要な工程の概略図である。固定化されたポリ（ｄＴ）プローブを、ｍＲＮＡを単離し、ｃＤＮＡ合成のためのプライマーとして機能させるために使用する。次いで、合成されたｃＤＮＡを本発明の例示的なアダプターと連結する。このアダプターは、ニック形成エンドヌクレアーゼ制限配列（ＮＥＲＳ）およびＩＩｓ型制限エンドヌクレアーゼ制限配列（ＴＲＥＲＳ）を含む。次いで、連結された核酸フラグメントをＩＩｓ型制限エンドヌクレアーゼで消化し、そしてＤＮＡポリメラーゼおよび核酸アダプター中のＮＥＲＳを認識するニック形成エンドヌクレアーゼの存在下で短い一本鎖核酸プローブを合成するためのテンプレートとして使用する。
【図２９】図２９Ａ〜Ｈは、例示的なアダプターおよび標的核酸の連結産物の概略図である。この標的核酸は、破線で示される。ＴＲＥＲＳ（「ＩＩｓ型制限エンドヌクレアーゼ認識配列」の略語）の上または下の矢印は、ＴＲＥＲＳからＴＲＥＲＳを認識する制限エンドヌクレアーゼ（ＲＥ）の切断部位への方向を示す。同様に、ＮＥＲＳ（「ニック形成エンドヌクレアーゼ認識配列」の略語）の上または下の矢印は、ＮＥＲＳからＮＥＲＳを認識するニック形成エンドヌクレアーゼ（ＮＥ）のニック形成部位への方向を示す。
【図３０】図３０Ａおよび３０Ｂは、標的ｃＤＮＡ分子中の特定のエキソン−エキソン接合部（エキソンＡとエキソンＢの接合部）の存在を決定するための本発明の方法（図３０Ａ）または非存在を決定するための本発明の方法（図３０Ｂ）の主要な工程を示す。
【図３１】図３１Ａ〜Ｃは、目的の遺伝子由来のｃＤＮＡ中に全てのエキソン−エキソン接合部が存在するかまたは存在しないかを決定するための本発明の方法の主要な工程を示す。図３１Ａは、本発明の方法において有用である、目的の遺伝子および２つのＯＤＮＰセットの概略図である。破線は、示されない遺伝子の一部を示す。図３１Ｂは、標的ｃＤＮＡ分子（標的ｃＤＮＡ  Ｉ）および増幅されたテンプレート核酸フラグメントの概略図である。図３１Ｃは、別の標的ｃＤＮＡ（標的ｃＤＮＡ  ＩＩ）および増幅されたテンプレート核酸フラグメントの概略図である。
【図３２−１】図３２は、個体番号１（Ａ対立遺伝子に対してホモ接合性）由来の、２つの対立ＳＮＰ（ｂｉａｌｌｅｌｉｃ  ＳＮＰ）（すなわち、ＡまたはＴ）またはその相補ヌクレオチドを含む増幅された一本鎖フラグメントの質量スペクトル分析を示す。一番上のパネルは、Ｔ対立遺伝子の相補ヌクレオチドを含有するフラグメント（「Ｔ対立遺伝子のボトム鎖」と呼ばれる）についての、取り出されたイオン電流クロマトグラムを示す。第２のパネルは、Ｔ対立遺伝子を含むフラグメント（「Ｔ対立遺伝子の上部（ｕｐｐｅｒ）鎖」と呼ばれる）についての取り出されたイオン電流クロマトグラムを示す。第３のパネルは、Ａ対立遺伝子の相補ヌクレオチドを含むフラグメント（「Ａ対立遺伝子のボトム鎖」と呼ばれる）についての取り出されたイオン電流クロマトグラムを示す。第４のパネルは、Ａ対立遺伝子を含むフラグメント（「Ａ対立遺伝子のトップ鎖」と呼ばれる）についての取り出されたイオン電流クロマトグラムを示す。一番下のパネルは、総イオン電流についてのクロマトグラムを示す。
【図３２−２】図３２は、個体番号１（Ａ対立遺伝子に対してホモ接合性）由来の、２つの対立ＳＮＰ（ｂｉａｌｌｅｌｉｃ  ＳＮＰ）（すなわち、ＡまたはＴ）またはその相補ヌクレオチドを含む増幅された一本鎖フラグメントの質量スペクトル分析を示す。一番上のパネルは、Ｔ対立遺伝子の相補ヌクレオチドを含有するフラグメント（「Ｔ対立遺伝子のボトム鎖」と呼ばれる）についての、取り出されたイオン電流クロマトグラムを示す。第２のパネルは、Ｔ対立遺伝子を含むフラグメント（「Ｔ対立遺伝子の上部（ｕｐｐｅｒ）鎖」と呼ばれる）についての取り出されたイオン電流クロマトグラムを示す。第３のパネルは、Ａ対立遺伝子の相補ヌクレオチドを含むフラグメント（「Ａ対立遺伝子のボトム鎖」と呼ばれる）についての取り出されたイオン電流クロマトグラムを示す。第４のパネルは、Ａ対立遺伝子を含むフラグメント（「Ａ対立遺伝子のトップ鎖」と呼ばれる）についての取り出されたイオン電流クロマトグラムを示す。一番下のパネルは、総イオン電流についてのクロマトグラムを示す。
【図３３−１】図３３は、個体番号２（ＡおよびＴ対立遺伝子に対してホモ接合性）由来の、２つの対立ＳＮＰ（ｂｉａｌｌｅｌｉｃ  ＳＮＰ）（すなわち、ＡまたはＴ）またはその相補ヌクレオチドを含む増幅された一本鎖フラグメントの質量スペクトル分析を示す。一番上のパネルは、Ｔ対立遺伝子の相補ヌクレオチドを含有するフラグメント（「Ｔ対立遺伝子のボトム鎖」と呼ばれる）についての、取り出されたイオン電流クロマトグラムを示す。第２のパネルは、Ｔ対立遺伝子を含むフラグメント（「Ｔ対立遺伝子の上部鎖」と呼ばれる）についての取り出されたイオン電流クロマトグラムを示す。第３のパネルは、Ａ対立遺伝子の相補ヌクレオチドを含むフラグメント（「Ａ対立遺伝子のボトム鎖」と呼ばれる）についての取り出されたイオン電流クロマトグラムを示す。第４のパネルは、Ａ対立遺伝子を含むフラグメント（「Ａ対立遺伝子のトップ鎖」と呼ばれる）についての取り出されたイオン電流クロマトグラムを示す。一番下のパネルは、総イオン電流についてのクロマトグラムを示す。
【図３３−２】図３３は、個体番号２（ＡおよびＴ対立遺伝子に対してホモ接合性）由来の、２つの対立ＳＮＰ（ｂｉａｌｌｅｌｉｃ  ＳＮＰ）（すなわち、ＡまたはＴ）またはその相補ヌクレオチドを含む増幅された一本鎖フラグメントの質量スペクトル分析を示す。一番上のパネルは、Ｔ対立遺伝子の相補ヌクレオチドを含有するフラグメント（「Ｔ対立遺伝子のボトム鎖」と呼ばれる）についての、取り出されたイオン電流クロマトグラムを示す。第２のパネルは、Ｔ対立遺伝子を含むフラグメント（「Ｔ対立遺伝子の上部鎖」と呼ばれる）についての取り出されたイオン電流クロマトグラムを示す。第３のパネルは、Ａ対立遺伝子の相補ヌクレオチドを含むフラグメント（「Ａ対立遺伝子のボトム鎖」と呼ばれる）についての取り出されたイオン電流クロマトグラムを示す。第４のパネルは、Ａ対立遺伝子を含むフラグメント（「Ａ対立遺伝子のトップ鎖」と呼ばれる）についての取り出されたイオン電流クロマトグラムを示す。一番下のパネルは、総イオン電流についてのクロマトグラムを示す。
【図３４−１】図３４は、Ａ対立遺伝子に対してホモ接合性である２００の個体およびＴ対立遺伝子に対してホモ接合性である１つの個体からプールされたサンプル由来の、２つの対立ＳＮＰ（ｂｉａｌｌｅｌｉｃ  ＳＮＰ）（すなわち、ＡまたはＴ）またはその相補ヌクレオチドを含む増幅された一本鎖フラグメントの質量スペクトル分析を示す。一番上のパネルは、Ｔ対立遺伝子の相補ヌクレオチドを含有するフラグメント（「Ｔ対立遺伝子のボトム鎖」と呼ばれる）についての、取り出されたイオン電流クロマトグラムを示す。第２のパネルは、Ｔ対立遺伝子を含むフラグメント（「Ｔ対立遺伝子の上部鎖」と呼ばれる）についての取り出されたイオン電流クロマトグラムを示す。第３のパネルは、Ａ対立遺伝子の相補ヌクレオチドを含むフラグメント（「Ａ対立遺伝子のボトム鎖」と呼ばれる）についての取り出されたイオン電流クロマトグラムを示す。第４のパネルは、Ａ対立遺伝子を含むフラグメント（「Ａ対立遺伝子のトップ鎖」と呼ばれる）についての取り出されたイオン電流クロマトグラムを示す。一番下のパネルは、総イオン電流についてのクロマトグラムを示す。
【図３４−２】図３４は、Ａ対立遺伝子に対してホモ接合性である２００の個体およびＴ対立遺伝子に対してホモ接合性である１つの個体からプールされたサンプル由来の、２つの対立ＳＮＰ（ｂｉａｌｌｅｌｉｃ  ＳＮＰ）（すなわち、ＡまたはＴ）またはその相補ヌクレオチドを含む増幅された一本鎖フラグメントの質量スペクトル分析を示す。一番上のパネルは、Ｔ対立遺伝子の相補ヌクレオチド（「Ｔ対立遺伝子のボトム鎖」と呼ばれる）を含有するフラグメントについての、取り出されたイオン電流クロマトグラムを示す。Ｔ対立遺伝子を含むフラグメント（「Ｔ対立遺伝子の上部鎖」と呼ばれる）についての取り出されたイオン電流クロマトグラムを示す。第３のパネルは、Ａ対立遺伝子の相補ヌクレオチドを含むフラグメント（「Ａ対立遺伝子のボトム鎖」と呼ばれる）についての取り出されたイオン電流クロマトグラムを示す。第４のパネルは、Ａ対立遺伝子を含むフラグメント（「Ａ対立遺伝子のトップ鎖」と呼ばれる）についての取り出されたイオン電流クロマトグラムを示す。一番下のパネルは、総イオン電流についてのクロマトグラムを示す。
【図３５】図３５は、図３４の、２．５分と５分の間におけるフラグメントと同じ増幅オリゴヌクレオチドフラグメント（一番上のパネル）についてのダイオードアレイトレース（ＵＶトレース）および総イオン電流（下のパネル）を示す。
【図３６】図３６は、ゲノムＤＮＡ由来のトリガー核酸を一本鎖核酸プローブにアニーリングすることによってテンプレート核酸分子を調製して、その後一本鎖核酸分子の増幅をするための主要な工程の概略図を示す。
【図３７】図３７は、ゲノムＤＮＡからテンプレート核酸分子を調製し、その後一本鎖核酸分子を増幅するための主要な工程の概略図である。ゲノムＤＮＡは、ニック形成剤認識配列を含む。テンプレート分子は、ゲノムＤＮＡフラグメントの一方の鎖をゲノムＤＮＡフラグメントの他方の鎖の一部である一本鎖核酸プローブにアニーリングすることによって生成され、を得る。
【図３８】図３８は、ゲノムＤＮＡからテンプレート核酸分子を調製し、その後一本鎖核酸分子を増幅するための主要な工程の概略図である。ゲノムＤＮＡは、ニック形成剤認識配列および制限エンドヌクレアーゼ認識配列を含む。このゲノムＤＮＡは、ニック形成剤認識配列および制限エンドヌクレアーゼ認識配列を含む。その認識配列の外側にニック形成するニック形成エンドヌクレアーゼによって認識可能なニック形成エンドヌクレアーゼ認識配列は、例示的なニック形成剤認識配列として使用される。
【図３９】図３９は、２つのオリゴヌクレオチドプライマーを使用して標的核酸からテンプレート核酸分子を調製し、その後一本鎖核酸分子を増幅するための主要な工程の概略図である。一方のプライマーは、ＮＥＲＳのセンス鎖の配列を含むが、他方は、ＩＩｓ型制限エンドヌクレアーゼ認識配列（ＴＲＥＲＳ）の一方の鎖を含む。
【図４０】図４０は、２つのＯＤＮＰを使用してテンプレート核酸分子を調製し、その後一本鎖核酸分子を増幅するための主要な工程の概略図である。この例示的な実施形態において、両方のＯＤＮＰが、ＮＥＲＳのセンス鎖の配列を含む。
【図４１】図４１は、２つのＯＤＮＰを使用して例示的な実施形態におけるテンプレート核酸分子を調製し、その後一本鎖核酸分子を増幅するための主要な工程の概略図である。両方のＯＤＮＰは、ＲＥＲＳの１鎖の配列を含む。この増幅は、α−チオデオキシヌクレオシドトリホスフェート（これは、例示的な改変デオキシヌクレオシドトリホスフェートとして使用される）の存在下で実施される。
【図４２】図４２は、一本鎖核酸プローブ（これは、ＮＡＲＳのアンチセンス鎖の配列を含む）を使用して、固定化された標的核酸を検出するための方法の概略図である。
【図４３】図４３は、ニック形成剤認識配列のセンス鎖の配列を含むオリゴヌクレオチドプライマーを使用して、一本鎖核酸分子を増幅するための方法の概略図を示す。
【図４４】図４４は、ＮＡＲＳのセンス鎖の配列および標的核酸の３’部分に少なくとも実質的に相補的な配列を含む固定化された一本鎖核酸プローブを使用して、標的核酸の存在を検出するための方法の概略図を示す。
【図４５】図４５は、ＮＡＲＳのセンス鎖の配列を含み、標的核酸に対して少なくとも実質的に相補的な固定化された一本鎖核酸プローブを使用して標的核酸の存在を検出するための方法の概略図を示す。
【図４６】図４６は、ニック形成剤認識配列のセンス鎖の配列および二本鎖のＩＩｓ型制限エンドヌクレアーゼ認識配列（ＴＲＥＲＳ）を含む部分的な二本鎖核酸分子を含むオリゴヌクレオチドプライマーを使用して一本鎖核酸分子を増幅するための方法の概略図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２−１】
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【図３２−２】
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【図３３−１】
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【図３３−２】
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【図３４−１】
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【図３４−２】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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