(57)【要約】本発明は、ヒトを含む動物において記憶を増強するための方法及び組成物であって、有効量の異型プロテインキナーゼＣ、例えば、プロテインキナーゼＭζ（ＰＫＭζ）またはプロテインキナーゼＣイオタ／ラムダを投与することによる方法及び組成物を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
動物において記憶を増強する方法であって、治療上有効な量の異型ＰＫＣを投与することを含む方法。
【請求項２】
前記異型ＰＫＣを、約０．１から約１０ナノモル濃度の範囲の、脳における前記異型ＰＫＣの最終濃度を生じる量で投与する請求項１の方法。
【請求項３】
動物においてシナプス伝達を増強する方法であって、治療上有効な量の異型ＰＫＣを投与することを含む方法。
【請求項４】
動物において記憶を維持する方法であって、治療上有効な量の異型ＰＫＣを投与することを含む方法。
【請求項５】
動物において脳の損傷を治療する方法であって、治療上有効な量の異型ＰＫＣを投与することを含む方法。
【請求項６】
動物において脊髄の損傷を治療する方法であって、治療上有効な量の異型ＰＫＣを投与することを含む方法。
【請求項７】
前記異型ＰＫＣがＰＫＭζである請求項１、３、４、５または６のいずれか１項の方法。
【請求項８】
前記異型ＰＫＣがＰＫＣイオタ／ラムダである請求項１、３、４、５または６のいずれか１項の方法。
【請求項９】
異型ＰＫＣ及び薬学的に許容し得る担体を含む医薬組成物。
【請求項１０】
前記異型ＰＫＣがＰＫＭζまたはＰＫＣイオタ／ラムダである請求項９の組成物。
【請求項１１】
外傷性ストレス障害、恐怖症、痛み症候群またはてんかんを患う動物において記憶喪失を生じるか、またはシナプス伝達を減少させる方法であって、治療上有効な量のＰＫＭζ阻害剤を投与することを含む方法。
【請求項１２】
前記ＰＫＭζ阻害剤がケレリトリンである請求項１１の方法。
【請求項１３】
前記ＰＫＭζ阻害剤がミリストイル化ゼータ阻害偽基質ペプチドである請求項８の方法。
【請求項１４】
前記阻害剤がＰＫＭζの優性陰性もしくは変更形態、またはＰＫＭζのアンチセンス・バージョンである請求項１２の方法。
【請求項１５】
前記動物がヒトである請求項１、３−６及び１１のいずれか１項の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、ヒトを含む動物において記憶を増強させるための方法を提供する。また、本発明は、有効量の、プロテインキナーゼＭゼータ（ＰＫＭζ）を含む異型キナーゼＣを投与することで脳または脊髄損傷を治療するための方法も指向する。さらに、本発明は、有効量のＰＫＭζ阻害剤を投与することで記憶喪失を誘導する方法を提供する。
【０００２】
（発明の背景）
記憶の生理学的基礎の一般的な実用的仮説は、挙動の持続的変化にシナプス強度の長期の変更が介在するというものである（Ｋａｎｄｅｌら（１９８２）Ｓｃｉｅｎｃｅ２１８：４３３−４４３；Ｂｌｉｓｓら（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ３６１：３１−３９）。これらの変化の分子機構は複雑であり、多くの信号伝達経路が関与する。しかしながら、全体的には、これらの機構は２つの機能的に異なる相に分けられる：長期間の変更を開始する誘導、及びそれらの変更を持続させる維持（Ｍａｌｉｎｏｗら（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ３３５：８２０−８２４；Ｓｃｈｗａｒｔｚ，Ｊ．Ｈ．（１９９３）ＰＮＡＳ９０：８３１０−８３１３；Ｓｃｈｗａｒｔｚら（１９８７）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１０：４５９−４７６）。
【０００３】
これらの信号伝達経路を検査する多くの研究が、シナプス伝達の長期間の増加、長期間の増強（ＬＴＰ）を生じるシナプスの高周波数求心性刺激に対する応答の研究から生じている（Ｂｌｉｓｓら（１９９３），前出；Ｂｌｉｓｓら（１９７３）Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２３２：３３１−３５６；Ｎｉｃｏｌｌら（１９８８）１：９７−１０３）。ＬＴＰに関与する大多数の信号伝達分子は誘導のみに影響を及ぼし、維持には影響を及ぼさない。例外は、ＬＴＰ誘導の遮断及びその維持を逆転させることが可能であるプロテインキナーゼ、特には、プロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）の触媒ドメインを阻害する作用物質である（Ｎｉｓｈｉｚｕｋａ，Ｙ（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ３３４：６６１−６６５；Ｓｃｈｗａｒｔｚ，Ｊ．Ｈ．（１９９３）前出；Ｓｃｈｗａｒｔｚら（１９８７）前出）。
【０００４】
これら２つの相は、信号伝達経路を阻害する薬理学的作用物質の適用のタイミングによって経験的に区別することができる。作用物質が強縮性求心性刺激の前に適用され、かつ長期間の変化の形成を妨げるとき、それらは誘導を遮断する。それらが強縮の後に適用され、かつ確立されている増強を逆転させる場合、それらは維持に影響を及ぼす。
【０００５】
シナプス伝達の長期間の変化を維持するに違いない機構を特徴付けるのに幾つかの原理が提唱されている。第１に、第２メッセンジャーが活性化されるときにシナプス伝達を一時的に増強させるプロテインキナーゼ、例えば、ＰＫＣは、第２メッセンジャーとは無関係のキナーゼを恒常的に活性化させることによってそれらの作用を拡張させることができる（Ｓｃｈｗａｒｔｚら（１９８７）前出；Ｋｌａｎｎら（１９９１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：２４２５３−２４２５６）。
【０００６】
第２に、シナプス可塑性の長期形態は、シナプスの増強を生じる重要な新規合成分子が同定されてはいないものの、新たなタンパク質の合成に依存するものと考えられる。Ｓｔａｎｔｏｎら（１９８４）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．４：３０８０−３０８８；Ｆｒｅｙら（１９８８）Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．４５２：５７−６５；Ｏｔａｎｉら（１９８９）Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２８：５１９−５２６；Ａｂｅｌら（１９９８）Ｓｃｉｅｎｃｅ２７９：３３８−３４１。新たなタンパク質の合成に対する同様の要求が長期間の記憶について観察されている。Ｄａｖｉｓら（１９８４） Ｐｓｙｃｈｏｌ  Ｂｕｌｌ．９６：５１８−５５９；Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｒ．Ｆ．Ｓｃｉｅｎｃｅ２３３：９４１−９４７；Ｍｏｎｔａｒｏｌａら（１９８６）Ｓｃｉｅｎｃｅ２３４：１２４９−１２５４。
【０００７】
通常考えられる独立した機構の特性の一方、ＰＫＣの一方のイソ型がこれらの特徴の両方を有することが決定されている：これはＬＴＰの間、恒常的に活性の酵素として持続的に増加し、かつ新たなタンパク質の合成によって産生される。Ｓａｃｋｔｏｒら（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）９０：８３４２−８３４６。ＰＣＫのこの新たに記述される形態はＰＫＣζイソ型の独立の触媒ドメインであるＰＫＭζであり、これはＰＫＣζの自己抑制調節ドメインを欠き、自律的に活性である。Ｓｃｈｗａｒｔｚ，Ｊ．Ｈ．（１９９３） 前出；Ｓａｃｋｔｏｒら（１９９３）前出。
【０００８】
ＰＫＭは、通常、酵素の調節及び触媒ドメインを分離する、ＰＫＣの制限タンパク分解によって生じるものと考えられる。これは高周波数強縮の後の早期に生じ得る。しかしながら、近年の証拠は、ζの触媒ドメインのみをコードする能特異的ｍＲＮＡからも長期間持続するＰＫＭζが誘導され得ることを示す。Ａｎｄｒｅａら（１９９５）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３１０：８３５−８４３；Ｐｏｗｅｌｌら（１９９４）Ｃｅｌｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｄｉｆｆｅｒ．５：１４３−１４９。
【０００９】
ＰＫＣは、１９７７年にＮｉｓｈｉｚｕｋａによって最初に発見された多機能プロテインキナーゼの１ファミリーである。Ｔａｋａｉら（１９７７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５２：７６０３−７６０９；Ｉｎｏｕｅら（１９７７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５２：７６１０−７６１６。ＰＫＣはヒンジ領域によって分離される２つのドメインからなる：自己抑制偽基質配列及び第２メッセンジャー／脂質結合部位を含むアミノ末端調節ドメイン並びにカルボキシ末端触媒キナーゼドメイン。ＰＫＣは、調節ドメインと触媒ドメインとの相互作用によって細胞基質内に不活性状態で保持される。脂質第２メッセンジャー（または、幾つかのイソ型については、Ｃａ２＋）が増加するとき、ＰＫＣは細胞基質から膜（または細胞骨格）コンパートメントに移行してその立体配座に変化が生じ、これが調節ドメインを触媒ドメインからはずし、自己抑制が解除され、かつ酵素を活性化する。ＰＫＣの１０種類の異なる形態が３つの群：在来（α、βＩ、βＩＩ、γ）、新規（または新、δ、ε、η、θ）、及び異型（ζ、ι／λ）に分割され、これらの各々は第２メッセンジャーの異なるセットによって活性化される。（ＰＫＤまたはＰＫＣμはＣａＭキナーゼに近い触媒ドメインを有するＰＫＣ関連分子である）。在来ＰＫＣはＣａ２＋及びジアシルグリセロール（ＤＡＧ）によって活性化される；新規はＤＡＧによっては活性化されるが、Ｃａ２＋によっては活性化されない；並びに異型はＤＡＧまたはＣａ２＋のいずれによっても活性化されないが、アラキドン酸、ホスホイノシチド３−ＯＨキナーゼ産生物、及びセラミドを含む代替脂質−第２メッセンジャーによって活性化する。
【００１０】
ＰＫＣを永久に活性化するための第２の機構は、これもＮｉｓｈｉｚｕｋａによって発見されたものであるが、調節ドメインを触媒ドメインから永久に分離する、カルパインまたはそれらのプロテアーゼによるヒンジ領域での開裂である。この独立に活性のキナーゼドメインはＰＫＭと呼ばれる。（この要求はＭｇ２＋−ＡＴＰにおけるＭｇ２＋に対するものであることが判明したが、「Ｍ」はＭｇ２＋を表す）。ＰＫＭの形成は持続的に活性のキナーゼを生じ、ＰＫＣが活性化される典型的な方法ではない。安定なＰＫＭの形成は１つのイソ型ζに対してのみ、脳内だけで内生的に生じる。Ｎａｉｋら（出版のために投稿済）。近年、神経的に分化した細胞株においてもＰＫＭζが報告されている。Ｏｅｈｒｌｅｉｎら（１９９８）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏ７７：３２３−３３７。他のイソ型の安定なＰＫＭ形態は病理学的状態においてのみ観察されている：乳癌腫瘍細胞（Ｂａｘｔｅｒら（１９９２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：１９１０−１９１７）及び心臓虚血（Ｕｒｔｈａｌｅｒら（１９９７）Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｒｅｓ．３５：６０−６７）におけるＰＫＭδ並びにアポトーシスにおけるＰＫＭδ（Ｅｍｏｔｏら（１９９６）Ｂｌｏｏｄ９７：１９９０−１９９６；Ｄｅｎｎｉｎｇら（１９９８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：２９９９５−３０００２）。
【００１１】
プロテインキナーゼＭゼータ（ＰＫＭζ）は、記憶の形成及び維持における基本的な役割を有するプロテインキナーゼＣの一形態である。ＰＫＭζは最も広範に研究されている生理学的記憶モデル、シナプスの長期間の増強（ＬＴＰ）において重要な分子である（Ｓａｃｋｔｏｒら，（１９９３）前出；Ｏｓｔｅｎら，（１９９６）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１６（８）：２４４４−２４５１；Ｈｒａｂｅｔｏｂａ  ａｎｄ  Ｓａｃｋｔｏｒ，（１９９６）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１６ （１７）：４３２４−５３３３）。
【００１２】
（発明の要約）
本発明は、記憶を増強し、並びに脳及び脊髄の損傷を治療するための方法であって、治療上有効な量の１種類以上の異型プロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）、例えば、ＰＫＭζまたはＰＫＣイオタ／ラムダを投与することによる方法を提供する。
【００１３】
一側面において、本発明は、動物においてシナプス伝達を増強する方法であって、治療上有効な量の１種類以上の異型ＰＫＣ、例えば、ＰＫＭζまたはＰＫＣイオタ／ラムダを投与することを含む方法を提供する。
【００１４】
別の側面において、本発明は、動物において記憶を維持する方法であって、治療上有効な量の１種類以上の異型ＰＫＣ、例えば、ＰＫＭζまたはＰＫＣイオタ／ラムダを投与することを含む方法を提供する。
【００１５】
さらに別の側面において、本発明は、シナプス伝達を増強し、または記憶を維持するための方法であって、ＰＫＭζのヒト（または動物）配列をコードするＤＮＡを投与することを含む方法を提供する。さらに別の側面において、本発明は、記憶喪失を引き起こすまたはシナプス伝達を減少させるための方法であって、治療上有効な量のＰＫＭζ阻害剤を投与することを含む方法を提供する。シナプス伝達を減少させるための使用には、例えば、急性もしくは慢性の痛みの治療、薬物もしくはアルコール中毒の治療、及びてんかんの治療が含まれる。
【００１６】
さらにまた別の側面において、本発明は、記憶喪失またはシナプス伝達の減少を生成するための方法であって、治療上有効な量の優性陰性ＰＫＭζ阻害剤、優性陰性ＰＫＭζのヒト（もしくは動物）配列をコードするＤＮＡ、またはＰＫＭζのアンチセンスを投与することを含む方法を提供する。
【００１７】
別の側面において、本発明は、動物において記憶喪失を引き起こさせる方法であって、治療上有効な量のＰＫＭζ阻害剤またはＰＫＣイオタ／ラムダ阻害剤を投与することを含む方法を提供する。
【００１８】
さらに別の側面において、本発明は、ＰＫＭζ及び薬学的に許容し得る担体を含む医薬組成物を提供する。
【００１９】
さらに別の側面において、本発明は、ＰＫＣイオタ／ラムダ及び薬学的に許容し得る担体を含む医薬組成物を提供する。
【００２０】
（発明の詳細な説明）
本発明は、記憶を増強し、かつ脳及び脊髄の損傷を治療するための方法及び組成物であって、治療上有効な量の１種類以上の異型ＰＫＣを投与することによる方法及び組成物を提供する。好ましい実施形態において、異型ＰＫＣはＰＫＭζである。別の好ましい実施形態において、異型ＰＫＣはＰＫＣイオタ／ラムダである。本発明によると、ＰＫＭζがＬＴＰの長期間の維持に必要かつ十分であることが決定されている。さらに、本教示によると、ＰＫＭζの機能が脳内に記憶を保存して統一することであることが決定されている。
【００２１】
本発明によると、異型ＰＫＣとして知られるクラスの化合物のメンバー、例えば、プロテインキナーゼＭゼータ（ＰＫＭζ）及びＰＫＣイオタ／ラムダが、脊椎動物において、長期記憶の機構であるシナプス強度の長期間の変化を維持または統一することが見出されている。本発明は、長期間の増強（ＬＴＰ）の研究で、増強されたシナプス伝達の維持におけるＰＫＭζの役割を解明する。逆に、ＰＫＭζの阻害は記憶喪失を生じることができ、これは外傷性ストレス障害、恐怖症及び急性もしくは慢性の痛みの治療において有用であり得る。
【００２２】
記憶を増強することが提唱されている他の作用物質は、本質的に、長期増強（ＬＴＰ）様プロセスの誘導を（コーヒーのように）刺激するか、またはそれを増強するように設計された作用物質（例えば、ｃＡＭＰを増加させる薬物）である。ＰＫＭζは、その機能が脊椎動物において記憶を維持することである最初の分子である。本発明によると、ＰＫＭζをニューロンに注射した場合、それはシナプス伝達を持続的に増強する。
【００２３】
本発明の一実施形態は、動物において脳の損傷を治療する方法であって、治療上有効な量の１種類以上の異型ＰＫＣ、例えば、ＰＫＭζまたはＰＫＭζメッセージをコードするＤＮＡを投与することを含む方法を目的とする。治療上有効な量によって意味されるのは、妥当な医学的判断の範囲内で、治療しようとする状態を有意に肯定的に変更するのに十分な多さではあるが、深刻な副作用を回避するのに十分な少なさである（合理的な利益／危険の比である）異型ＰＫＣの量である。例えば、治療上有効な量のＰＫＭζは治療する特定の傷害、治療を受ける患者の年齢及び身体的状態、その傷害の重篤性、治療の持続期間、併用治療の性質並びに用いられる具体的なＰＫＭζで変化する。
【００２４】
別の実施形態において、本発明は、動物において脊髄の損傷を治療する方法であって、治療上有効な量の１種類上の異型ＰＫＣ、例えば、ＰＫＭζを投与することを含む方法を目的とする。
【００２５】
さらに別の実施形態において、本発明は、動物においてシナプス伝達を増強する方法であって、治療上有効な量の１種類以上の異型ＰＫＣ、例えば、ＰＫＭζを投与することを含む方法を目的とする。
【００２６】
また、本発明は、動物において記憶喪失を誘導する方法であって、治療上有効な量のＰＫＭζ阻害剤を投与することによる方法も目的とする。好ましい実施形態において、ＰＫＭζ阻害剤はケレリトリン、ミリストイル化ゼータ阻害偽基質（ＭＺＩＰ）ペプチド（ｍｙｒ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−ＯＨ）、またはＰＫＭζの優性陰性形態、例えば、ＰＫＭζ−Ｋ２８１Ｗ、またはＰＫＭζ ｍＲＮＡに対するアンチセンスである。ＭＺＩＰはＰＫＭζに対して１０−１００ｎＭ、ＰＫＣガンマに対して１０，０００ｎＭのＩＣ５０を有し、したがって、ケレリトリンよりも特異的な阻害剤である（図５を参照）。本発明が目的とする選択的記憶喪失の誘導の候補は、好ましくは、例えば外傷後ストレス障害及び恐怖症を患う、ヒトである。
【００２７】
また、本発明は、脳または脊髄の選択された領域においてシナプス伝達を減少させる方法であって、治療上有効な量のＰＫＭζ阻害剤を投与することによる方法も目的とする。本発明が目的とするシナプス伝達の減少の候補は、好ましくは、例えば痛みの傷害、薬物もしくはアルコール中毒、またはてんかんにおけるような過剰のニューロン活性を患う、ヒトである。
【００２８】
本発明のさらに別の実施形態は、１種類以上の異型ＰＫＣ、例えば、ＰＫＭζを含む医薬組成物を目的とする。
【００２９】
ＰＫＭζを含む医薬組成物の活性成分またはＰＫＭζをコードする核酸は、例えば記憶の増強並びに脳及び脊髄の損傷の治療において、有効な治療活性を示すように意図される。したがって、ＰＫＭζを含む治療用組成物の活性成分は特定の疾患に依存する治療量で投与される。例えば、投与によって達成されるべき脳または脊髄中のＰＫＭζの最終濃度は約１ナノモル濃度であり得る。投与方式は最適の治療応答をもたらすように調整することができる。例えば、幾つかの分割用量を毎日投与することができ、または治療状況の緊急性によって指示される通りに用量を比例的に減少させることができる。脳または脊髄への１種類以上の異型ＰＫＣ、例えば、ＰＫＭζの投与は頭蓋内またはくも膜下腔内、すなわち、くも膜下腔内ポンプまたはレポジトリによるものであり得る。投与経路に依存して、ＰＫＭζを含む活性成分は、その成分を酸及びその成分を不活性化し得る他の天然条件から保護する材料で被覆することを要求されることがある。
【００３０】
例えば、ＰＫＭζは補助剤またはリポソーム中にある状態で投与することができる。ここで意図される補助剤には、レゾシノール、非イオン性表面活性剤、例えば、ポリオキシエチレンオレイルエーテル及びｎ−ヘキサデシルポリエチレンエーテルが含まれる。リポソームには、通常のリポソームの他に、水中油中水Ｐ４０エマルジョンが含まれる。
【００３１】
通常の保存及び使用条件下で、本発明の調製品は微生物の成長を防止する保存剤を含む。
【００３２】
注射用の使用に適する薬学形態には無菌の水溶液（水溶性の場合）もしくは水性分散液及び無菌の注射用溶液もしくは分散液を即席に調製するための無菌粉末が含まれる。すべての場合において、その形態は無菌でなければならず、かつ容易に注射可能である程度まで流動性でなければならない。それは製造及び保存の条件下で安定でなければならず、かつ細菌及び真菌のような微生物の汚染作用に対して保護されていなければならない。担体は溶媒または分散媒であり得、これには、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコール等）、それらの適切な混合物及び植物油が含まれる。適正な流動性は、例えば、レシチンのようなコーティングを用いることにより、分散液の場合に要求される粒子径を維持することにより、及び表面活性剤を用いることによって維持することができる。微生物の作用の防止は、様々な抗菌剤及び抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサール等によって達成することができる。多くの場合において、等張剤、例えば、糖または塩化ナトリウムを含めることが好ましい。注射用組成物の吸収の長期化は、その組成物において、吸収を遅延させる作用物質、例えば、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンを用いることによって達成することができる。
【００３３】
無菌注射用溶液は、上に列挙される様々な他の成分を必要に応じて含む、適切な溶媒に必要とされる量の活性化合物を組み込み、次いで濾過滅菌することによって調製される。一般には、分散液は、基本分散媒及び上に列挙されるものからの必要とされる他の成分を含む無菌ビヒクルに様々な無菌活性成分を組み込むことによって調製される。無菌注射用溶液を調製するための無菌粉末の場合、好ましい調製方法は真空乾燥及び凍結乾燥技術であり、これは活性成分に加えてさらなる所望の成分の粉末を予め無菌濾過したそれらの溶液から生じる。
【００３４】
投与の容易さ及び投与量の均一性のため、組成物を投与単位形態で処方することが特に有利である。ここで用いられる投与単位形態は、治療しようとする哺乳動物被検体に対する単位投与量として適する物理的に分離した単位を指す；各々の単位は、所望の治療効果を生じるように算出された、予め決定された量の活性物質を必要とされる医薬担体と共に含む。本発明の新規投与単位形態の仕様は、（ａ）活性物質の独自の特徴及び達成しようとする特定の治療効果、並びに（ｂ）身体の健康がここに詳細に開示されるように損なわれている状態を有する生活被検体において損傷を治療するための活性物質のような配合の技術に固有の制限によって指示され、かつそれらに直接依存する。
【００３５】
主要活性成分は、好都合で有効な投与のため、有効量で、適切な薬学的に許容し得る担体と共に前に開示されるもののような投与単位形態に配合される。投与単位形態は、例えば脳または脊髄においてＰＫＭζの約０．１から約１０ナノモル濃度を、例えば達成させることができる。
【００３６】
ここで用いられる場合、「薬学的に許容し得る担体」はあらゆるすべての溶媒、分散媒、コーティング、抗菌及び抗真菌剤、等張剤及び吸収遅延剤等を含むことができる。薬学的に活性の物質へのこのような媒体の使用は当該技術分野において公知である。あらゆる通常の媒体または作用物質が活性成分と不適合である限りを除いて、治療用組成物におけるそれらの使用が意図される。補足的な活性成分を組成物に組み込むこともできる。
【００３７】
異型ＰＫＣ、例えば、ＰＫＭζの投与はＰＫＭζの代替形態もしくは誘導体またはその活性、安定性、もしくは神経系への到達性を強化する薬物を含むこともできる。適用可能なＰＫＭζ賦活薬の同定は、（図４において測定されるような）インビトロでの薬物もしくはＰＫＭζのリン酸化の効果または図２のようにニューロンに注射されたときのシナプス伝達に対するＰＫＭζの効果を試験することにより、容易に試験またはスクリーニングされる。
【００３８】
脳または脊髄へのＰＫＭζＤＮＡの投与は遺伝子移行技術によるものであってもよい。このような技術には、これらに限定されるものではないが、ウイルス、リポソーム、並びにＤＮＡもしくはＲＮＡの代替形態もしくは誘導体が含まれる。
【００３９】
ＰＫＭζ活性の阻害剤の投与には、薬物、例えば、ケレリトリン、ミリストイル化ゼータ阻害偽基質ペプチド及び、優性陰性効果により内在性ＰＫＭζの活性もしくは有効性を阻害する、ＰＫＭζの代替形態が含まれる。このような優性陰性作用物質には、これらに限定されるものではないが、ＰＫＭζの不活性形態または部分が含まれる。ＰＫＭζの機能の阻害には、ＰＫＭζの配列のアンチセンスを投与することによって内在性ＰＫＭζのレベルを減少させることも含まれ得る。
【００４０】
以下の実施例は、いかなる意味においても本発明を限定することなく、本発明をさらに説明する役目を果たす。
【００４１】
（実施例１）
シナプス伝達に対するＰＫＭζの増加の効果
ＰＫＭζの細胞内灌流
バキュロウイルス／Ｓｆ９発現系からほぼ均一に精製したＰＫＭζを全細胞記録ペプチドによりＣＡ１錐体細胞内に灌流した（図１Ａ−１Ｂ）。ＰＫＭζの濃度は約０．８ｎＭ ＰＫＭζであり、活性は０．０３ピコモル／分／μｌであった。ＡＭＰＡ／カイニン酸応答を分離するため、細胞体で記録した細胞をＩＰＳＣ逆転電位（〜−７０）で電位固定し、Ｃｓ−グルコネート・ベースの電極溶液を用いた（ＧＡＢＡＢ効果を遮断するため）。刺激は放射状に１０秒ごとであり、入力抵抗を監視したがこの実験を通して変化しなかった。５−１０分にわたってＡＭＰＡ／カイニン酸ＥＰＳＣの〜６０％の増加があり、その後安定化した。対照的に、不活性化ＰＫＭζには効果がなかった。同様の全細胞技術によってＣＡ１錐体細胞におけるシナプス応答を増強することが報告される自己活性化チオリン酸化ＣａＭ−キナーゼＩＩとの比較において、ＡＭＰＡ／カイニン酸電流の増強に関するこの知見は、ＰＫＭゼータがＣａＭ−キナーゼＩＩよりも２００から１０００倍強力であることを示した。
【００４２】
電気生理学的記録
実施例２に説明されるようにＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットから海馬スライスを調製した。ＮａｒａｓｈｉｇｅＰＰ−８３垂直プーラーで外径１５ｍｍのホウケイ酸ガラス（Ｗｏｒｌｄ  Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｓａｒａｓｏｔａ，ＦＬ）からパッチ電極を引いた（２段階）。記録ピペットは２−５ＭΩのチップ抵抗を有し、（ｍＭで）：Ｃｓ−グルコン酸もしくはＫ−グルコン酸、１３０−；ＭｇＣｌ２、２；ＣａＣｌ２、２；ＥＧＴＡ、１０；ＨＥＰＥＳ、１０；Ｎａ−ＡＴＰ、２；ＣｓＯＨもしくはＫＯＨのいずれかで７．２５に調整したｐＨを有する。この混合物はＧＡＢＡＡ受容体介在応答のランダウンを低下させることが報告されていた。スローＧＡＢＡＢ ＩＰＳＣを含むカリウム電流を遮断するのにセシウムを用いた。Ｎａ２＋電流を遮断して脱分極保持電位での細胞スパイク放電を防止するため、電極溶液はＱＸ−３１４（１０ｍＭ）を含んでいた。全細胞記録はＣＡ１錐体細胞から盲パッチ技術を用いて得た。モニタ電極抵抗に簡単な電位差（−１０ｍＶ、１０ｍｓ）を適用しながら、記録ピペットを組織を通して徐々に前進させた。ひとたび電極の電流応答に偏向が検出されたら（これは標的細胞体の膜との接触を示す）、僅かな陰圧を印加して＞１ＧΩの細胞−電極シールを形成した。
【００４３】
膜の突破はさらなる吸引または電流パルスのいずれかで達成された。膜の破壊に続いて、正式記録の前に２分の安定化時間を許容した。電位差（−１０ｍＶ）を適用してアクセス抵抗及び入力キャパシタンスを監視した。Ａｘｏｃｌａｍｐ  ２Ａ増幅器（Ａｘｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  ＣｉｔｙＣＡ）を用いて電位固定の下で信号を記録した。保持電圧からの−１０ｍＶの電位差に対する電流応答から静止入力抵抗を測定した（通常、細胞内溶液で静止膜電位、６０ｍＶ）。＞１００ＭΩの静止入力抵抗及び＜２０ＭΩのアクセス抵抗が観察された場合にのみ細胞を研究に受け入れた。
【００４４】
記録の過程で細胞のアクセス抵抗が有意に増加した場合（＞２０％）、データを廃棄した。ＩＢＭ互換Ｐｅｎｔｉｕｍ−ＩＩマイクロコンピュータでのｐＣＬＡＭＰソフトウェア（Ａｘｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を用いる後の分析のため、データ信号を１４ビットＰＣＭインターフェース（ＶＲ−１０Ｂ  Ｄｉｇｉｔａｌ  Ｄａｔａ  Ｒｅｃｏｒｄｅｒ，Ｉｎｓｔｒｕｔｅｃｋ  Ｃｏｒｐ．  Ｅｌｅｍｅｎｔ，ＮＹ）によって９４ｋＨｚでデジタル化し、ＶＨＳテープに保存した。
【００４５】
シナプスでの現象は、記録電極側方に放射層状に配置された双極被覆タングステン電極での細胞外刺激によって誘起した。陰極ショック（２−１０Ｖ；持続期間２００μｓ）はデジタル的に制御された刺激分離ユニット（Ｗｏｒｌｄ  Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）によって低周波数（０．１Ｈｚ）で送出した。他に注記されない限り、薬物は浴内で送達した。
【００４６】
（実施例２）
方法：海馬スライスの調製。ハロタンで麻酔した後、横断４５０μｍスライスを３−４週齢Ｓｐｒａｑｕｅ−ＤａｗｌｅｙラットからＭｃＩｌｗａｉｎ組織チョッパーで調製した。解剖の間、４℃の解剖生理食塩水（１２５ｍＭ ＮａＣｌ、２．５ｍＭ ＫＣｌ、１．２５ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、２６ｍＭ ＮａＨＣＯ３、１１ｍＭグルコース、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２及び０．５ｍＭＣａＣｌ２、ｐＨ７．４、９５％Ｏ２／５％ＣＯ２で平衡化）で複数回洗浄することで海馬を低温に保った。解剖生理食塩水中、３２℃で１時間インキュベートするため、スライスをインターフェース・チャンバ（Ｆｉｎｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｔｏｏｌｓ）に移した。その後、二価イオン濃度を１．２ｍＭ ＭｇＣｌ２及び１．７ｍＭ ＣａＣｌ２に変化させた（生理食塩水）。
【００４７】
ＰＫＭζの細胞内灌流
ＣＡ１錐体ニューロンにおいて誘起されたＥＰＳＣに対するＰＫＭζの効果及びケレリトリンの効果の分析
全細胞ピペット内にキナーゼを含め、かつ全時間にわたってＥＰＳＣ振幅を測定することにより、興奮性シナプス電流に対するＰＫＭζ細胞注入の効果を評価した。様々な濃度のＰＫＭζ（０．１、１、１０ｎＭ）を含むＣｓ−グルコン酸ベースの電極溶液を用いて、海馬ＣＡ１錐体細胞の細胞体におけるシナプスの現象を記録した。ＩＰＳＣ逆電位（Ｅｉｐｓｃ、〜−７０ｍＶ）で電位固定した細胞を用いて、放射層状に適用した低周波数（０．１Ｈｚ）電気刺激により分離された集合ＥＰＳＣを誘起した。刺激強度は、高速ＥＰＳＣ（すなわち、ＡＭＰＡ／カイニン酸介在）を選択的に誘起するため中程度レベル（〜５Ｖ）に設定し、実験を通して一定に保持した。対照データは全細胞記録が確立された直後（すなわち、標的細胞内へのＰＫＭζの拡散前）のＥＰＳＣ振幅及び持続時間の測定、並びに煮沸によって変性されているか、または複数回の凍結／解凍によって不活性化されているキナーゼを用いる並行実験からなるものであった。灌流されたＰＫＭζの活性は、各実験についてのイン・ビトロでのリン酸化アッセイによって決定した。
【００４８】
ピークＥＰＳＣの大きさ及び持続時間に対する細胞内ＰＫＭζの効果を評価するためＥＰＳＣを継続的に監視した。周期的に電流−電位記録を取ってＰＥＳＣ逆電位（ＥＥＰＳＣ）の定常性をチェックし、実験を通して細胞の入力抵抗を監視した。非ＮＭＤＡ受容体アンタゴニストＣＮＱＸ（１０μＭ）の適用をスライスに適用し、ＥＩＰＳＣで中程度の刺激強度を用いて誘発したＥＰＳＣに非ＮＭＤＡ受容体のみが介在していることを確認した。
【００４９】
ひとたび効果が観察されて安定だと思われたら、競合性ＰＫＣ触媒ドメイン阻害剤ケレリトリンを浴に添加し、ＰＫＭζのリン酸化を防止することによる効果の逆転を試みた。その後、薬物を洗い流した。３ｎＭ  ＰＫＭζを用いるケレリトリンでの実験の一例が図２Ａ−２Ｂに示されている。
【００５０】
（実施例３）
Ｓｆ９細胞からのバキュロウイルス発現ＰＫＭζの精製：スポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）（Ｓｆ９）細胞を、５μｇ／ｍｌゲンタマイシンを含むＳＦ−９００ＩＩＳＦＭ昆虫細胞培養培地（Ｇｉｂｃｏ）において成長させた。ＰＫＭζを発現させるため、１０×１０８細胞の健常対数期Ｓｆ−９培養物を回転させ、１２５ｍｌの培地に再懸濁させ、２５ｍｌのバキュロウイルス−ζウイルス・ストック（Ｓｙｌｖｉａ  Ｓｔａｂｌｅの贈り物）に感染させた。室温での０．５時間のインキュベーションの後、追加の培地を細胞に添加し、次にそれを１×１０６細胞／ｍｌの密度で接種した。３日後、細胞を回転させ、ＰＢＳで洗浄した後、６５ｍｌの均質化バッファ中でホモジナイズした。ＤＥＡＥ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ及びＳｕｐｅｒｄｅｘ７５（標品グレード、Ｐｈａｒｍａｃｉａ）カラムを用いる２工程精製を行い、バキュロウイルス発現ＰＫＭζを精製した。全細胞実験の各々と同じ日にＰＫＭζの活性をアッセイした。バキュロウイルスの銀染色、調製品の純度を示す組換え的に発現したＰＫＭζ。（図３を参照）
（実施例４）
ＰＫＭζの阻害剤としてのケレリトリンの特異性
様々なプロテインキナーゼによる外来性基質のリン酸化の薬物ケレリトリンによる阻害は、ケレリトリンがＰＫＭζの活性の阻害剤として１０倍を上回る選択性であることを示した。（図４を参照）
（実施例５）
ヒトＰＫＭζのセンス、アンチセンス、及びアミノ酸配列
公開された発現配列タグから得られるヒト配列を、ＰＫＭζの読み取り枠を含むものと同定されたラット配列（Ｏｎｏら、１９８８）との類似性によって得た。神経系におけるＰＫＭζの濃度を高めるため、そのＰＫＭζ配列を遺伝子移行技術に用いる。ＰＫＭζの優性陰性阻害剤を、ＡＴＰ結合部位において配列を変更もしくは欠失させることによって、またはそのタンパク質の選択的ドメイン、例えば、カルボキシ末端ドメインを付加することによって得る。
【００５１】
優性陰性ＰＫＭζを、ＡＴＰ結合部位の除去もしくは変更によって（有印）、及びカルボキシ末端ドメインの付加（有印）によって得た。アンチセンスは、アンチセンス配列のすべてまたは一部をＰＫＭζに付加することによって達成した。（図６を参照）
（実施例６）
ＰＫＭζがＬＴＰの間のシナプス伝達の増強に介在することを確認するため、ＰＫＭζの優性陰性阻害形態（ＰＫＭζ−Ｋ２８１Ｗ）をＣＡ１錐体細胞にシナプス後導入した、ＬＴＰに対するその効果を検査した。ＰＫＭζ−Ｋ２８１Ｗの触媒ドメインにおけるリジン２８１のトリプトファンへの突然変異は、ＡＴＰ結合を破壊することによってキナーゼ活性を消滅させた。２０ナノモル濃度の優性陰性阻害剤（図７Ａ）を全細胞記録ピペットに含め、−７５ｍＶに電位固定したＣＡ１錐体細胞内に１０分間拡散させてシナプスＡＭＰＡ応答を分離した。ＰＫＭζ−Ｋ２８１Ｗには、−４０ｍＶで１分及び１０分にサンプリングした、ＡＭＰＡ及びＮＭＤＡ受容体が介在するシナプス伝達に対する明らかな効果がなかった（図７Ｂ）。ＰＫＭζ−Ｋ２８１Ｗは細胞における持続的なシナプス増強を完全に除去したが、強縮後増強（ＰＴＰ）は除去しなかった（図７Ｃ、上のトレース、Ｄ、大グラフ）。強縮性刺激の２０分後、ＥＰＳＣは基線応答の１０１．６±１．９％であった（ｎ＝４）。スライスの電場応答における同時ＬＴＰが観察された（図７Ｃ、下のトレース、及びＤ、挿入グラフ）。
【００５２】
ＰＫＭζ−Ｋ２８１ＷはＭａｘＢａｃ２．０バキュロウイルス／Ｓｆ９系（Ｉｎｂｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を用いて発現させた。ＰＫＣζのアミノ酸１５８−５９２を含む挿入物（Ｄｒｉｅｒら（２０００）３０ｔｈ  Ａｎｎｕａｌ  Ｍｅｅｔｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  ＮｅｕｒｏＳｃｉｅｎｃｅ，ＮｅｗＯｒｌｅａｎｓ，ＬＡ，ｇｅｎｅｒｏｕｓ  ｇｉｆｔ  ｆｒｏｍ  Ｊｅｒｒｙ  Ｙｉｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ）を、バキュロウイルス移行ベクターｐＢｌｕｅＢａｃＨｉｓ２ＢのＥｃｏＲＩ部位とＳａｌｌ部位との間にサブクローン化した。その構築体を確認のために配列決定した後、直線化バキュロウイルスゲノムを有するＳｆ９細胞に同時形質移入した。組換えタンパク質をＳｆ９細胞において発現させ、Ｎｉ２＋カラム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｘｐｒｅｓｓ（商標）  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を用いて精製し、かつ銀染色（図７Ａ）及びウェスタンブロット（データは示さず）によって分析した。
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１Ａは、注射されたＰＫＭζに対する個々のＥＰＳＣ応答を示す。
図１Ｂは、ＥＰＳＣ振幅の時間経過を示す。
【図２】
図２Ａは、３ｎＭ ＰＫＭζでのＣＡ１錐体細胞の全細胞記録を示す。ＰＫＭζの導入でシナプス的に誘起されたＡＭＰＡ／カイニン酸応答の増加はケレリトリン（１μＭ）によって可逆であった。
図２Ｂは、ＥＰＳＣ振幅の時間経過を示す。
【図３】
図３は、精製した組換え発現ＰＫＭζの銀染色を示す。
【図４】
図４は、他のプロテインキナーゼと比した、ケレリトリンによるＰＫＭζの阻害の特異性を示す。ＰＫＣＡはミエリン基本タンパク質（ＭＢＰ）のＰＫＣアルファ・リン酸化である。ＰＫＣＥはＭＢＰのＰＫＣイプシロン・リン酸化である。ＰＫＭはＭＢＰのＰＫＭζリン酸化である。ＣＫＩＩはＳｙｎｔｉｄｅ（登録商標）（Ｃａｌｖｉｏｃｈｅｍ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）ペプチド基質のＣａ２＋−カルモジュリン依存性プロテインキナーゼＩＩリン酸化である。
【図５】
図５は、ミリストイル化ゼータ阻害偽基質ペプチド（１μＭ）がＬＴＰ維持を逆転させることを示す。
【図６】
図６は、ヒトＰＫＭζをコードする（ｃＤＮＡから誘導した）ＤＮＡ配列を示す。
【図７】
図７は、優勢陰性阻害剤ＰＫＭζ−Ｋ２８１Ｗ（２０ｎＭ）へのシナプス後露出がＬＴＰを妨害することを示す。（Ａ）全細胞記録ピペットに入れたバキュロウイルス／Ｓｆ９発現ＰＫＭζ−Ｋ２８１Ｗタンパク質の銀染色。ＰＫＭζ−Ｋ２８１Ｗは二重線として現れる。（Ｂ）ＰＫＭζ−Ｋ２８１Ｗの拡散後１及び１０分での−４０ｍＶへの脱分極はＡＭＰＡ及びＮＭＤＡ受容体が介在するシナプス応答に対して明白な効果を示さない。（Ｃ）上のトレース、ＰＫＭζ−Ｋ２８１Ｗへの露出の後に持続的な増強を示さない全細胞ＥＰＳＣ前及び後強直痙攣。下のトレース、同時記録電場電位はＬＴＰを示す。（Ｄ）ＰＫＭζ−Ｋ２８１Ｗを用いる全細胞記録の時間経過。強直痙攣はＰＴＰのみを示す。挿入、同時電場記録の時間経過はＬＴＰを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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