(57)【要約】有機体の混合集団に由来する遺伝子ライブラリを、所定の生体分子の生物活性に関して、スクリーニングする方法を提示する。有機体の混合試料は、例えば環境からの培養集団又は未培養集団にすることが可能である。更に、有機体の分離物又は濃縮集団をスクリーニングする方法が提示され、分離物は、例えば、有機体の特定の種、属、科、又は綱の、空間的、時間的、又は階層的な集団を含む。新しい生体分子又は生物活性を形成するために、所定の生体分子又は生物活性を含む同定されたクローンには、更に変化を与えることが可能であり、或いは、クローンに含まれるＤＮＡに、変化を与えることが可能である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
所定の生物活性又は生体分子を取得する方法であって、
ａ）特定の生物活性又は生体分子に関して、細胞の混合集団からの核酸により生成されたクローンのライブラリをスクリーニングするステップと、
ｂ）特定の生物活性又は生体分子を有するクローンに含まれる核酸配列に変化を与えるステップと、
ｃ）ステップｂ）からの生物活性又は生体分子を特定の生物活性又は生体分子と比較するステップにして、生物活性又は生体分子の相違が配列変化の影響を示し、これにより所定の生物活性又は生体分子を提供するステップと、
を備える方法。
【請求項２】
生体分子が、核酸配列である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
核酸配列が、ＤＮＡ又はＲＮＡ配列である、請求項２記載の方法。
【請求項４】
核酸配列が、
クローンに含まれる核酸を、検出可能な分子を含む少なくとも一つのオリゴヌクレオチドプローブ及び所定の核酸配列の少なくとも一部に接触させるステップと、
少なくとも一つのオリゴヌクレオチドプローブに対する補体を含む核酸配列を、検出可能な分子からの検出可能な信号を検出するアナライザにより同定するステップと、
によってスクリーニングされる、請求項２記載の方法。
【請求項５】
検出可能な分子が、発色又は蛍光基質である、請求項４記載の方法。
【請求項６】
検出可能な信号が、蛍光である、請求項４記載の方法。
【請求項７】
蛍光基質が、ウンベリフェロン又はその誘導体又は類似体、レゾルフィン又はその誘導体又は類似体、フルオレセイン又はその誘導体又は類似体、或いはローダミン又はその誘導体又は類似体である、請求項５記載の方法。
【請求項８】
検出可能な分子が、所定のポリヌクレオチド又はその断片を符号化する配列を有する、検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドである、請求項４記載の方法。
【請求項９】
検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドが、蛍光分子によって標識される、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
スクリーニングが、所定の配列又は所定の核酸配列を側面に置く配列を実質的に補完し、検出可能な分子を有するプライマを使用した、所定の核酸配列のＰＣＲ増幅によるものである、請求項２記載の方法。
【請求項１１】
スクリーニングが、所定の核酸配列を実質的に補完するオリゴヌクレオチドのハイブリッド形成によるものである、請求項２記載の方法。
【請求項１２】
変化を与えた所定の核酸配列を、変化を与えていないステップ（ｃ）の核酸配列と比較し、これによりヌクレオチド配列の変化を特定するステップを更に含む、請求項２記載の方法。
【請求項１３】
比較が、配列比較アルゴリズムを使用して実行される、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
生物活性が、ポリペプチドによって提供される、請求項１記載の方法。
【請求項１５】
生物活性が、酵素活性である、請求項１記載の方法。
【請求項１６】
酵素活性が、リパーゼと、エステラーゼと、プロテアーゼと、グリコシダーゼと、グリコシルトランスフェラーゼと、ホスファターゼと、キナーゼと、モノ及びジオキシゲナーゼと、ハロペルオキシダーゼと、リグニンペロキシダーゼと、ジアリルプロパンペロキシダーゼと、エポキシドヒドロラーゼと、ニトリルヒドラターゼと、ニトリラーゼと、トランスアミナーゼと、アミダーゼと、アシラーゼとによって構成されるグループから選択された酵素によって提供される、請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
ライブラリが、発現ライブラリである、請求項１記載の方法。
【請求項１８】
ライブラリが、環境試料から取得されたＤＮＡを含む、請求項１記載の方法。
【請求項１９】
ライブラリが、極限環境微生物から取得されたＤＮＡを含む、請求項１記載の方法。
【請求項２０】
極限環境微生物が、好熱性有機体である、請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
極限環境微生物が、超好熱性有機体と、冷温性有機体と、好塩性有機体と、低温菌と、好アルカリ性有機体と、好酸性有機体とによって構成されるグループから選択される、請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
スクリーニングするステップが、クローンを、検出可能な分子により標識された基質に接触させるステップを含み、基質とクローンに含まれる生物活性又は生体分子との相互作用が検出可能な信号を生成する、請求項１７記載の方法。
【請求項２３】
基質が、生物活性基質である、請求項２２記載の方法。
【請求項２４】
生物活性基質が、Ｃ１２ＦＤＣＧを含む、請求項２２記載の方法。
【請求項２５】
基質が、ＤＮＡ結合部分にリンクする第一のテストタンパク質と、転写活性部分にリンクする第二のテストタンパク質とを含み、ＤＮＡ結合部分にリンクする第一のテストタンパク質と転写活性部分にリンクする第二のテストタンパク質との相互作用の調節により、検出可能なタンパク質の発現に変化が生じる、請求項２２記載の方法。
【請求項２６】
スクリーニングが、核酸の発現によるものである、請求項２２記載の方法。
【請求項２７】
ステップ（ｄ）の前に、特定の生物活性又は生体分子を含むクローンから核酸を取得するステップを更に含む、請求項１記載の方法。
【請求項２８】
クローンに含まれる核酸を取得するステップが、クローンを、相補的核酸又はその断片に接触させるステップを含み、これにより、相補的核酸によるクローン核酸のハイブリッド形成と、その分離とを可能にする、請求項２７記載の方法。
【請求項２９】
相補的核酸又はその断片が、固相結合ハイブリッド形成プローブを含む、請求項２８記載の方法。
【請求項３０】
核酸配列に、エラープローンＰＣＲと、シャッフリングと、オリゴヌクレオチド指定突然変異生成と、アセンブリＰＣＲと、セクシャルＰＣＲ突然変異生成と、ｉｎ  ｖｉｖｏ突然変異生成と、カセット式突然変異生成と、再帰的アンサンブル突然変異生成と、指数アンサンブル突然変異生成と、部位特異的突然変異生成と、ライゲーション再構成と、ＧＳＳＭと、その任意の組み合わせとによって構成されるグループから選択された方法で変化を与える、請求項１記載の方法。
【請求項３１】
核酸配列に、エラープローンＰＣＲで変化を与える、請求項１記載の方法。
【請求項３２】
核酸配列に、シャッフリングで変化を与える、請求項１記載の方法。
【請求項３３】
核酸配列に、オリゴヌクレオチド指定突然変異生成で変化を与える、請求項１記載の方法。
【請求項３４】
核酸配列に、アセンブリＰＣＲで変化を与える、請求項１記載の方法。
【請求項３５】
核酸配列に、セクシャルＰＣＲ突然変異生成で変化を与える、請求項１記載の方法。
【請求項３６】
核酸配列に、ｉｎ  ｖｉｖｏ突然変異生成で変化を与える、請求項１記載の方法。
【請求項３７】
核酸配列に、カセット式突然変異生成で変化を与える、請求項１記載の方法。
【請求項３８】
核酸配列に、再帰的アンサンブル突然変異生成で変化を与える、請求項１記載の方法。
【請求項３９】
核酸配列に、指数アンサンブル突然変異生成で変化を与える、請求項１記載の方法。
【請求項４０】
核酸配列に、部位特異的突然変異生成で変化を与える、請求項１記載の方法。
【請求項４１】
核酸に変化を与えるステップの前に、更なる特定のタンパク質又は酵素活性に対して、ステップ（ｃ）のクローンをスクリーニングするステップを含む、請求項１記載の方法。
【請求項４２】
ライブラリが、原核細胞において生成される、請求項１記載の方法。
【請求項４３】
ライブラリが、ストレプトミセス種において生成される、請求項１記載の方法。
【請求項４４】
ストレプトミセスが、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｖｅｎｅｚｕｅｌａｅである、請求項４３記載の方法。
【請求項４５】
原核細胞が、グラム陰性である、請求項４２記載の方法。
【請求項４６】
原核細胞が、バシラス種である、請求項４２記載の方法。
【請求項４７】
原核細胞が、シュードモナス種である、請求項４２記載の方法。
【請求項４８】
ライブラリが、ライブラリのクローンを、生物活性基質に接触させること、或いはこれによりカプセル化することによりスクリーニングされ、クローンによって生成される生物活性又は生体分子が、クローンに接触させる前の基質における接触後と比較した相違によって検出される、請求項１記載の方法。
【請求項４９】
ライブラリが、ライブラリをスクリーニングするステップの前に平均化される、請求項１記載の方法。
【請求項５０】
生物活性又は生体分子が、遺伝子群又はその断片である、請求項１記載の方法。
【請求項５１】
生物活性又は生体分子が、代謝経路にあるポリペプチドである、請求項１記載の方法。
【請求項５２】
所定の生物活性又は生体分子を同定する方法であって、
ａ）特定の生物活性又は生体分子に関して、複数の分離物から取得されたプール済み核酸により生成されたクローンのライブラリをスクリーニングするステップと、
ｂ）特定の生物活性又は生体分子を含むクローンを同定するステップと、
を備える方法。
【請求項５３】
所定の生物活性又は生体分子を同定する方法であって、
ａ）特定の生物活性又は生体分子に関して、複数の分離物から取得されたプール済み核酸により生成されたクローンのライブラリをスクリーニングするステップと、
ｂ）特定の生物活性又は生体分子を有するクローンに含まれる核酸配列に変化を与えるステップと、
ｃ）ｂ）からの生物活性又は生体分子を特定の生物活性又は生体分子と比較し、これにおいて、生物活性又は生体分子の相違が少なくとも一つの配列変化を導入したことの影響を示し、これにより所定の生物活性又は生体分子を提供するステップと、
を備える方法。
【請求項５４】
所定の生物活性又は生体分子を同定する方法であって、
ａ）特定の生物活性又は生体分子に関して、複数の分離物のそれぞれから取得した核酸により生成された個別の遺伝子ライブラリをプールすることから生成されたクローンのライブラリをスクリーニングするステップと、
ｂ）特定の生物活性又は生体分子を含むクローンを同定するステップと、
を備える方法。
【請求項５５】
所定の生物活性又は生体分子を同定する方法であって、
ａ）特定の生物活性又は生体分子に関してライブラリをスクリーニングするステップにして、前記ライブラリが、複数の分離物のそれぞれから取得した核酸により生成された個別の遺伝子ライブラリをプールすることから生成されるステップと、
ｂ）特定の生物活性又は生体分子を有するクローンに含まれる核酸配列に変化を与えるステップと、
ｃ）ステップｃ）からの生物活性又は生体分子を特定の生物活性又は生体分子と比較するステップにして、生物活性又は生体分子の相違が少なくとも一つの配列変化を導入したことの影響を示し、これにより所定の生物活性又は生体分子を提供するステップと、
を備える方法。
【請求項５６】
所定の生物活性又は生体分子を同定する方法であって、
（ａ）特定の生物活性又は生体分子に関して、有機体の濃縮集団からの核酸により生成されたクローンのライブラリをスクリーニングするステップと、
（ｂ）特定の生物活性又は生体分子を含むクローンを同定するステップと、
を備える方法。
【請求項５７】
所定の生物活性又は生体分子を同定する方法であって、
（ａ）特定の生物活性又は生体分子に関して、有機体の濃縮集団からの核酸により生成されたクローンのライブラリをスクリーニングするステップと、
（ｂ）特定の生物活性又は生体分子を有するクローンに含まれる核酸配列に変化を与えるステップと、
（ｃ）ステップｂ）からの生物活性又は生体分子を特定の生物活性又は生体分子と比較するステップにして、生物活性又は生体分子の相違が少なくとも一つの配列変化を導入したことの影響を示し、これにより所定の生物活性又は生体分子を提供するステップと、
を備える方法。
【請求項５８】
所定の生物活性又は生体分子を同定する方法であって、
（ａ）有機体の混合集団からの核酸を、検出可能な分子を含む少なくとも一つのオリゴヌクレオチドプローブ及び所定の分子を符号化する核酸配列の少なくとも一部と共に、相補配列の相互作用が可能となるような条件下で且つ相補配列の相互作用が可能となるような時間に渡って、培養するステップと、
（ｂ）検出可能な分子を検出するアナライザを使用して、オリゴヌクレオチドプローブに対する補体を有する核酸配列を同定するステップと、
（ｃ）同定した核酸配列からライブラリを生成するステップと、
（ｄ）特定の生物活性又は生体分子に関してライブラリをスクリーニングするステップと、
（ｅ）特定の生物活性又は生体分子を有するクローンに含まれる核酸配列に変化を与えるステップと、
（ｆ）ステップ（ｅ）からの生物活性又は生体分子を特定の生物活性又は生体分子と比較するステップにして、生物活性又は生体分子の相違が少なくとも一つの配列変化を導入したことの影響を示し、これにより所定の生物活性又は生体分子を提供するステップと、
を備える方法。
【請求項５９】
所定の生物活性又は生体分子を同定する方法であって、
（ａ）有機体の混合集団から取得した核酸を、検出可能な分子を含む少なくとも一つのオリゴヌクレオチドプローブ及び所定の分子を符号化する核酸配列の少なくとも一部と共に、相補配列の相互作用が可能となるような条件下で且つ相補配列の相互作用が可能となるような時間に渡って、微環境において共同カプセル化するステップと、
（ｂ）検出可能な分子を検出するアナライザにより、カプセル化核酸を分離することで、所定の分子を符号化するオリゴヌクレオチドプローブに対する補体を含むカプセル化核酸を同定するステップと、
（ｃ）分離されたカプセル化核酸からライブラリを生成するステップと、
（ｄ）特定の生物活性又は生体分子に関してライブラリをスクリーニングするステップと、
（ｅ）特定の生物活性又は生体分子を有するクローンに含まれる核酸配列に変化を与えるステップと、
（ｆ）ステップ（ｅ）からの生物活性又は生体分子を特定の生物活性又は生体分子と比較するステップにして、生物活性又は生体分子の相違が少なくとも一つの配列変化を導入したことの影響を示し、これにより所定の生物活性又は生体分子を提供するステップと、
を備える方法。
【請求項６０】
所定の生物活性又は生体分子を同定する方法であって、
（ａ）有機体の混合集団の分離物から取得された核酸を、検出可能なマーカを含む少なくとも一つのオリゴヌクレオチドプローブ及び所定の生物活性を有する分子を符号化するポリヌクレオチド配列の少なくとも一部と共に、相補配列の相互作用が可能となるような条件下で且つ相補配列の相互作用が可能となるような時間に渡って、微環境において共同カプセル化するステップと、
（ｂ）検出可能なマーカを検出するアナライザにより、カプセル化核酸を分離することで、所定の分子を符号化するオリゴヌクレオチドプローブに対する補体を含むカプセル化核酸を同定するステップと、
（ｃ）分離されたカプセル化核酸からライブラリを生成するステップと、
（ｄ）特定の生物活性又は生体分子に関してライブラリをスクリーニングするステップと、
（ｅ）特定の生物活性又は生体分子を有するクローンに含まれる核酸配列に変化を与えるステップと、
（ｆ）ステップ（ｅ）からの生物活性又は生体分子を特定の生物活性又は生体分子と比較するステップにして、生物活性又は生体分子の相違が少なくとも一つの配列変化を導入したことの影響を示し、これにより所定の生物活性又は生体分子を提供するステップと、
を備える方法。
【請求項６１】
所定の生物活性又は生体分子を同定する方法であって、
（ａ）有機体の混合集団の一つ以上の分離物から取得された核酸を、検出可能なマーカを含む少なくとも一つのオリゴヌクレオチドプローブ及び所定の生物活性を有する分子を符号化するポリヌクレオチド配列の少なくとも一部と共に、相補配列の相互作用が可能となるような条件下で且つ相補配列の相互作用が可能となるような時間に渡って、微環境において共同カプセル化するステップと、
（ｂ）検出可能なマーカを検出するアナライザによりカプセル化核酸を分離することで、所定の分子を符号化するオリゴヌクレオチドプローブに対する補体を含むカプセル化核酸を同定するステップと、
（ｃ）分離されたカプセル化核酸からライブラリを生成するステップと、
（ｄ）特定の生物活性又は生体分子に関してライブラリをスクリーニングするステップと、
（ｅ）特定の生物活性又は生体分子を有するクローンに含まれる核酸配列に変化を与えるステップと、
（ｆ）ステップ（ｅ）からの生物活性又は生体分子を特定の生物活性又は生体分子と比較するステップにして、生物活性又は生体分子の相違が少なくとも一つの配列変化を導入したことの影響を示し、これにより所定の生物活性又は生体分子を提供するステップと、
を備える方法。
【請求項６２】
所定の生物活性又は生体分子を同定する方法であって、
（ａ）有機体の混合集団の分離物の混合物から取得された核酸を、検出可能なマーカを含む少なくとも一つのオリゴヌクレオチドプローブ及び所定の生物活性を有する分子を符号化するポリヌクレオチド配列の少なくとも一部と共に、相補配列の相互作用が可能となるような条件下で且つ相補配列の相互作用が可能となるような時間に渡って、微環境において共同カプセル化するステップと、
（ｂ）検出可能なマーカを検出するアナライザによりカプセル化核酸を分離することで、所定の分子を符号化するオリゴヌクレオチドプローブに対する補体を含むカプセル化核酸を同定するステップと、
（ｃ）分離されたカプセル化核酸からライブラリを生成するステップと、
（ｄ）特定の生物活性又は生体分子に関してライブラリをスクリーニングするステップと、
（ｅ）特定の生物活性又は生体分子を有するクローンに含まれる核酸配列に変化を与えるステップと、
（ｆ）ステップ（ｅ）からの生物活性又は生体分子を特定の生物活性又は生体分子と比較するステップにして、生物活性又は生体分子の相違が少なくとも一つの配列変化を導入したことの影響を示し、これにより所定の生物活性又は生体分子を提供するステップと、
を備える方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の分野】
本発明は、生物活性分子のスクリーニング及び同定に関し、特に、生物活性分子又は生物活性について、二つ以上の有機体から分離した核酸から生成される遺伝子ライブラリの作成及びスクリーニングに関する。
【０００２】
【背景】
現在使用されている生物活性化合物の大部分は、土壌微生物に由来する。土壌その他の複雑な生態学的コミュニティに住む多くの微生物は、存続及び繁殖する能力を高める様々な化合物を生成する。こうした化合物は、一般に、有機体の成長にとって不可欠ではないと考えられており、中間代謝に関与する遺伝子の助けを借りて合成される。他の有機体の成長又は生存に影響を与えるこうした二次代謝産物は、「生物活性」化合物として知られており、微生物及び非顕微的微生物の両方にとって、化学的な防衛備蓄の主要構成要素としての役割を果たす。人間は、こうした化合物を活用し、抗生物質、抗感染薬、及び広範な原核細胞及び真核細胞の病原体に対抗する活性を伴うその他の生物活性化合物として使用してきた（バーンズら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ．， ９１， １９９４）。
【０００３】
多数の利用可能な生物活性化合物が存在するように見えるが、現代の生物医学は、最大の課題の一つとして、抗生物質耐性病原体の増殖に直面している。世代時間の短さと、遺伝情報を容易に交換できる能力とにより、病原微生物は、急速に進化し、事実上、あらゆるクラスの複合抗生物質に対抗する抵抗メカニズムを広めている。例えば、ヒト病原体Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ及びＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓの毒性の強い菌株は、現在、単一の抗生物質バンコマイシンでのみ治療可能であり、この化合物に対する耐性を発生させる上で必要となるのは、耐性のあるＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ種から単一の遺伝子ｖａｎＡを転写することのみである（ベイトソンら、Ｓｙｓｔｅｍ． Ａｐｐｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．， １２， １９８９）。新しい抗菌性化合物に関する重大な必要性を、酵素阻害剤、免疫抑制剤、及び抗癌剤の需要の増加と重ね合わせると、製薬会社が、生物活性化合物に関する微生物試料のスクリーニングを強化してきた理由は、容易に明らかとなる。
【０００４】
新しい生物活性化合物に関して微生物をスクリーニングするために現在使用されているアプローチは、この分野が開始されて以来、概ね変化していない。バクテリアの新しい分離物、特に土壌環境からのグラム陽性菌株を収集し、その代謝産物を薬理活性についてテストする。
【０００５】
先導化合物のソースとして未だ利用されていない生物学的多様性が、なお膨大に存在する。しかしながら、先導化合物をスクリーニング及び生成するために現在利用可能な方法は、こうした探究が不十分なリソースに効率的に適用することができない。例えば、海洋細菌種の少なくとも９９％は実験室の培地上で生き残れないと推定されており、市販の発酵設備はこうした種が成長する条件で使用するのに適していないため、こうした有機体は、スクリーニング又は再供給のために培養するのが困難又は不可能である。薬物生成有機体の再収集、成長、株の改良、培地の改良、及び拡大生産は、先導化合物の合成及び開発において問題を発生させる場合が多い。更に、一部の化合物を合成するために特定の有機体を相互作用させる必要性により、発見の過程でこれらを使用することが極めて困難になる。未だ使用されていない化合物のソースの遺伝資源及び化学的多様性を利用する新しい方法を、薬物の発見において使用することは、非常に有益である。
【０００６】
現代の生物学の中核となるのは、核酸ゲノムに遺伝情報が存在すること、及びこうしたゲノムにおいて具体化される情報（つまり遺伝子型）が細胞機能を方向付けることである。これは、有機体のゲノム内の様々な遺伝子の発現と、こうした遺伝子の発現の調節とを通じて発生する。細胞又は有機体内の遺伝子の発現は、その細胞又は有機体の物理的特性（つまり表現型）を定める。これは、遺伝子のタンパク質への翻訳を通じて達成される。環境試料から取得したタンパク質の生物活性を決定することで、環境におけるタンパク質の役割に関する有益な情報を提供できる。加えて、こうした情報は、生物学、診断学、治療学、及び産業用途の組成の発展に役立つ。
【０００７】
したがって、本発明は、この未使用の生物学的多様性にアクセスし、組み換えＤＮＡ技術を利用して、所定の配列及び活性を迅速にスクリーニングする方法を提供する。本発明は、自然化合物を迅速にスクリーニングする能力に関連する利点と、有機体の遺伝物質を扱う作業に提供される柔軟性及び再現性とを組み合わせるものである。
【０００８】
【発明の概要】
本発明は、所定の生物活性又は生体分子に関する試料の迅速なスクリーニングを提供する。試料は、広範なソースから導くことが可能であり、例えば、環境ライブラリと、二つ以上の有機体を含む試料（有機体の混合集団等）と、培養不可能な有機体からの試料と、深海の噴出孔と、その他とを含む。本明細書で説明するように、こうした試料は、生物学と、治療学と、産業用途とにおいて有用な未使用の分子の豊富なソースを提供し、これらは、本発明以前には、特徴付け及び特定のために困難で時間のかかる方法を要したものであり、或いは、同定又は特徴付けが不可能だったものである。
【０００９】
本発明の一実施形態において、本発明は、特定の生物活性又は生体分子に関して、細胞の混合集団からの核酸により生成されたクローンのライブラリをスクリーニングするステップと、特定の生物活性又は生体分子を有するクローンに含まれる核酸配列に変化を与えるステップと、変化を与えた生物活性又は生体分子を特定の生物活性又は生体分子と比較し、この比較において、生物活性又は生体分子の相違が配列変化の影響を示し、これにより所定の生物活性又は生体分子が提供されるステップとにより、所定の生物活性又は生体分子を取得する方法を提供する。
【００１０】
別の実施形態において、本発明は、特定の生物活性又は生体分子に関して、複数の分離物から取得したプール核酸により生成されたクローンのライブラリをスクリーニングするステップと、特定の生物活性又は生体分子を含むクローンを同定するステップとにより、所定の生物活性又は生体分子を同定する方法を提供する。
【００１１】
更に別の実施形態において、本発明は、所定の生物活性又は生体分子を同定する方法を提供する。この方法は、特定の生物活性又は生体分子に関して、複数の分離物から取得したプール核酸により生成されたクローンのライブラリをスクリーニングするステップと、特定の生物活性又は生体分子を有するクローンに含まれる核酸配列に変化を与えるステップと、変化を与えた生物活性又は生体分子を特定の生物活性又は生体分子と比較し、この比較において、生物活性又は生体分子の相違が少なくとも一つの配列変化を導入したことの影響を示し、これにより所定の生物活性又は生体分子が提供されるステップとを含む。
【００１２】
別の実施形態において、本発明は、所定の生物活性又は生体分子を同定する方法を提供し、この方法は、特定の生物活性又は生体分子に関して、複数の分離物のそれぞれから取得された核酸により生成された個別の遺伝子ライブラリをプールすることで生成されたクローンのライブラリをスクリーニングするステップと、特定の生物活性又は生体分子を含むクローンを同定するステップとを含む。
【００１３】
別の実施形態において、本発明は、特定の生物活性又は生体分子に関して、ライブラリをスクリーニングし、このライブラリが複数の分離物のそれぞれから取得された核酸により生成された個別の遺伝子ライブラリをプールすることで生成されるステップと、特定の生物活性又は生体分子を有するクローンに含まれる核酸配列に変化を与えるステップと、変化を与えた生物活性又は生体分子を特定の生物活性又は生体分子と比較し、この比較において、生物活性又は生体分子の相違が少なくとも一つの配列変化を導入したことの影響を示し、これにより所定の生物活性又は生体分子が提供されるステップとにより、所定の生物活性又は生体分子を同定する方法を提供する。
【００１４】
更に別の実施形態において、本発明は、所定の生物活性又は生体分子を同定する方法を提供し、これは、特定の生物活性及び生体分子に関して、有機体の濃縮集団からの核酸により生成されたクローンのライブラリをスクリーニングするステップと、特定の生物活性又は生体分子を含むクローンを同定するステップとを含む。
【００１５】
更に別の実施形態において、本発明は、特定の生物活性又は生体分子に関して、有機体の濃縮集団からの核酸により生成されたクローンのライブラリをスクリーニングするステップと、特定の生物活性又は生体分子を有するクローンを含む核酸配列に変化を与えるステップと、変化を与えた生物活性又は生体分子を特定の生物活性又は生体分子と比較し、この比較において、生物活性又は生体分子の相違が少なくとも一つの配列変化を導入したことの影響を示し、これにより所定の生物活性又は生体分子が提供されるステップとにより、所定の生物活性又は生体分子を同定する方法を提供する。
【００１６】
別の実施形態において、本発明は、所定の生物活性又は生体分子を同定する方法を提供する。所定の生物活性又は生体分子は、有機体の混合集団からの核酸を、検出可能な分子を有する少なくとも一つのオリゴヌクレオチドプローブ及び所定の分子を符号化する核酸配列の少なくとも一部と共に、相補配列の相互作用が可能な条件下で培養するステップと、検出可能な分子を検出するアナライザを使用して、オリゴヌクレオチドプローブに対する補体を有する核酸配列を同定するステップとによって同定される。その後、同定された核酸配列からライブラリが生成され、このライブラリは、特定の生物活性又は生体分子に関してスクリーニングされる。特定の生物活性又は生体分子を有するクローンに含まれる核酸配列には変化を与え、変化を与えた生物活性又は生体分子を特定の生物活性又は生体分子と比較し、この比較において、生物活性又は生体分子の相違が少なくとも一つの配列変化を導入したことの影響を示し、これにより所定の生物活性又は生体分子が提供される。
【００１７】
別の実施形態において、本発明は、微環境において、有機体の混合集団から取得された核酸を、検出可能な分子を有する少なくとも一つのオリゴヌクレオチドプローブ及び所定の分子を符号化する核酸配列の少なくとも一部と共に、相補配列の相互作用が可能となるような条件下で、このような時間に渡って、共同カプセル化するステップと、検出可能な分子を検出するアナライザによりカプセル化核酸を分離することで、所定の分子を符号化するオリゴヌクレオチドプローブに対する補体を含むカプセル化核酸を同定するステップと、分離されたカプセル化核酸からライブラリを生成するステップと、このライブラリを特定の生物活性又は生体分子に関してスクリーニングするステップと、特定の生物活性又は生体分子を有するクローンに含まれる核酸配列に変化を与えるステップと、変化を与えた生物活性又は生体分子を特定の生物活性又は生体分子と比較し、この比較において、生物活性又は生体分子の相違が少なくとも一つの配列変化を導入したことの影響を示し、これにより所定の生物活性又は生体分子が提供されるステップとにより、所定の生物活性又は生体分子を同定する方法を提供する。
【００１８】
更に別の実施形態において、本発明は、微環境において、有機体の混合集団の分離物から取得された核酸を、検出可能なマーカを有する少なくとも一つのオリゴヌクレオチドプローブ及び所定の生物活性を有する分子を符号化するポリヌクレオチド配列の少なくとも一部と共に、相補配列の相互作用が可能となるような条件下で、このような時間に渡って、共同カプセル化するステップと、検出可能なマーカを検出するアナライザによりカプセル化核酸を分離することで、所定の分子を符号化するオリゴヌクレオチドプローブに対する補体を含むカプセル化核酸を同定するステップと、分離されたカプセル化核酸からライブラリを生成するステップと、このライブラリを特定の生物活性又は生体分子に関してスクリーニングするステップと、特定の生物活性又は生体分子を有するクローンに含まれる核酸配列に変化を与えるステップと、変化を与えた生物活性又は生体分子を特定の生物活性又は生体分子と比較し、この比較において、生物活性又は生体分子の相違が少なくとも一つの配列変化を導入したことの影響を示し、これにより所定の生物活性又は生体分子が提供されるステップとを含む方法を提供する。
【００１９】
別の実施形態において、本発明は、微環境において、有機体の混合集団の一つ以上の分離物から取得された核酸を、検出可能なマーカを有する少なくとも一つのオリゴヌクレオチドプローブ及び所定の生物活性を有する分子を符号化するポリヌクレオチド配列の少なくとも一部と共に、相補配列の相互作用が可能となるような条件下で、このような時間に渡って、共同カプセル化するステップと、検出可能なマーカを検出するアナライザによりカプセル化核酸を分離することで、所定の分子を符号化するオリゴヌクレオチドプローブに対する補体を含むカプセル化核酸を同定するステップと、分離されたカプセル化核酸からライブラリを生成するステップと、このライブラリを特定の生物活性又は生体分子に関してスクリーニングするステップと、特定の生物活性又は生体分子を有するクローンに含まれる核酸配列に変化を与えるステップと、変化を与えた生物活性又は生体分子を特定の生物活性又は生体分子と比較し、この比較において、生物活性又は生体分子の相違が少なくとも一つの配列変化を導入したことの影響を示し、これにより所定の生物活性又は生体分子が提供されるステップとにより、所定の生物活性又は生体分子を取得する方法を提供する。
【００２０】
更に別の実施形態において、本発明は、所定の生物活性又は生体分子を同定する方法を提供する。この方法は、微環境において、有機体の混合集団の分離物の混合物から取得された核酸を、検出可能なマーカを有する少なくとも一つのオリゴヌクレオチドプローブ及び所定の生物活性を有する分子を符号化するポリヌクレオチド配列の少なくとも一部と共に、相補配列の相互作用が可能となるような条件下で、このような時間に渡って、共同カプセル化するステップと、検出可能なマーカを検出するアナライザによりカプセル化核酸を分離することで、所定の分子を符号化するオリゴヌクレオチドプローブに対する補体を含むカプセル化核酸を同定するステップと、分離されたカプセル化核酸からライブラリを生成するステップと、このライブラリを特定の生物活性又は生体分子に関してスクリーニングするステップと、特定の生物活性又は生体分子を有するクローンに含まれる核酸配列に変化を与えるステップと、変化を与えた生物活性又は生体分子を特定の生物活性又は生体分子と比較し、この比較において、生物活性又は生体分子の相違が少なくとも一つの配列変化を導入したことの影響を示し、これにより所定の生物活性又は生体分子が提供されるステップとを含む。
【００２１】
本発明の前記その他の態様は、本明細書の教示から、当業者には明らかであろう。
【００２２】
本発明は、例えば、環境試料或いは有機体の非培養集団又は有機体の培養集団からの有機体の混合集団等、二つ以上の有機体に由来するライブラリの迅速なスクリーニングを提供する。
【００２３】
一実施形態において、遺伝子ライブラリは、有機体の混合集団から核酸を取得するステップと、複数のクローンを形質転換して遺伝子ライブラリを生成するために、この核酸を適切なベクタにクローニングするステップとにより生成される。したがって、遺伝子ライブラリは、混合集団の有機体内に存在する遺伝子又は遺伝子断片を含む。遺伝子ライブラリは、発現ライブラリにすることが可能であり、この場合、このライブラリは、望ましい活性を有する発現ポリペプチドに関してスクリーニングすることができる。代わりに、遺伝子ライブラリは、例えば、ＰＣＲ又はハイブリッド形成スクリーニングにより、所定の配列に関してスクリーニングすることが可能である。
【００２４】
一実施形態においては、有機体の混合集団を含む試料の分離物からの核酸がプールされ、プールされた核酸は、遺伝子ライブラリの生成に使用される。
【００２５】
「分離物」とは、二つ以上の有機体を有する試料から或いは有機体の混合集団から、有機体の特定の種、属、科、目、又は綱が、取得されたこと或いは引き出されたことを意味する。こうした分離集団からの核酸は、その後、遺伝子ライブラリの生成に使用できる。分離物は、二つ以上の有機体又は有機体の混合集団を含む試料から、選択的にフィルタリング又は培養することで取得できる。例えば、バクテリアの分離物は、サイズに基づいて有機体を排除するフィルタで試料をフィルタリングすること、或いは有機体の特定の集団の選択的成長又は選択的阻害が可能な培地上で試料を培養することにより取得できる。
【００２６】
「濃縮集団」とは、集団全体に対して、有機体の特定の種、属、科、目、又は綱に属する有機体のパーセンテージが増加している有機体集団である。例えば、選択的成長又は阻害培地により、有機体の全体的な数を増やすことができる。集団内の有機体の合計数に対して、原核生物を濃縮することができる。同様に、混合集団内の小集団の成長を阻害又は促進する選択的培地上で混合集団を成長させることにより、有機体の特定の種、属、科、目、又は綱を濃縮することができる。
【００２７】
別の実施形態において、有機体の混合集団からの複数（例えば、二つ以上）の分離物からの核酸は、複数のクローンを含む複数の遺伝子ライブラリを生成するのに使用され、この少なくとも二つの分離物からの遺伝子ライブラリは、その後、「プール済み分離物ライブラリ」を取得するためにプールされる。
【００２８】
遺伝子ライブラリが生成された後、クローンは、所定の生物活性（例えば、酵素活性、二次メッセンジャ活性、結合活性、転写活性、その他）又は生体分子（例えば、核酸配列、ペプチド、ポリペプチド、脂質又はその他の小分子、その他）を検出するためにスクリーニングされる。こうしたスクリーニング手法は、例えば、クローン、クローン集団、又は核酸配列の集団を、所定の生物活性又は生体分子との相互作用時に検出可能な信号を提供する検出可能な分子を有する基質又は複数の基質に接触させることを含む。この基質は、酵素基質、生物活性分子、オリゴヌクレオチド、及びその他にすることができる。
【００２９】
一実施形態においては、遺伝子ライブラリが生成され、クローンは、所定の発色又は蛍光基質又は複数の基質に晒されるか、或いは、所定の配列に対応する配列を有する標識プローブ（検出可能分子を有するオリゴヌクレオチド等）とハイブリッド形成され、検出可能な信号（蛍光発光等）により、陽性のクローンが同定される。
【００３０】
一実施形態においては、有機体の混合集団から生成された発現ライブラリが、所定の活性に関してスクリーニングされる。具体的には、発現ライブラリが生成され、クローンは、所定の基質又は複数の基質に晒され、陽性のクローンが同定及び分離される。本発明では、細胞が生き残る必要はない。細胞は、検出される分子を生成するのに十分な長さだけ生存する必要があり、その後は、発現生体分子（酵素等）が活性状態を維持する限り、生存細胞又は非生存細胞のどちらであってもよい。
【００３１】
特定の実施形態において、本発明は、環境試料からの新しい又は望ましい生物活性を符号化する遺伝子のダイレクトクローニングを、新しい分子、例えば、酵素を迅速に発見するために設計された高スループットスクリーニングシステムに組み合わせるアプローチを提供する。このアプローチは、Ｅ．ｃｏｌｉその他の適切な宿主細胞内で増殖させることが可能なクローニングベクタ内に保管された多数の自然発生微生物の集団ゲノムを表すことが可能な環境「発現ライブラリ」の構築に基づく。クローンＤＮＡは、環境試料から、或いは環境試料の分離物から、直接、最初に抽出することができるため、このライブラリは、純培養で成長させることが可能な原核生物の小部分に限定されない。加えて、こうした試料に存在する環境ＤＮＡを平均化することで、試料内に存在するすべての種からのＤＮＡを更に均等に表現させることが可能になる。平均化手法（下で説明する）は、試料内の支配的な種と比較して表現が数桁少ない場合がある試料の微量成分から、興味深い遺伝子を発見する効率を劇的に増加させる。平均化は、前記のあらゆる実施形態において、試料又は（複数の）基質からの核酸の取得に続いて行うことができる。
【００３２】
別の実施形態において、本発明は、膨大な数のクローンを評価し、有用な酵素、及びその他の生体分子（リガンド等）を符号化する細胞を同定及び回収することが可能なスクリーニング用の高スループットキャピラリアレイシステムを提供する。特に、本明細書で説明するキャピラリアレイに基づく手法は、望ましい生物活性を有するタンパク質、或いは望ましい結合親和性を有するその他のリガンドのスクリーニング、同定、及び回収に使用することができる。例えば、望ましい結合事象の発生時に検出可能な信号を発する適切な基質又はその他のマーカを使用することで、結合検定を実施できる。
【００３３】
加えて、蛍光活性細胞選別法を使用して、所定の活性又は配列を有するクローンをスクリーニング及び分離することができる。これまでは、真核及び原核細胞株及び細胞培養プロセスの分析を中心とした研究において、ＦＡＣＳ装置が利用されてきた。ＦＡＣＳは、更に、研究する真核生物及び原核生物の両方における異質なタンパク質の生成、例えば、識別的遺伝子発現その他をモニタするためにも利用されてきた。ＦＡＣＳシステムの検出及び計数機能は、こうした例において応用されてきた。しかしながら、ＦＡＣＳは、これまで、原核生物における生物活性をスクリーニング及び回収する発見プロセスには利用されてこなかった。更に、本発明では、望ましい核酸（組み換えクローン）を生きた細胞又は死んだ細胞から取得できるため、以前に説明した技術のように、細胞が生き残る必要はない。細胞が生存する必要があるのは、検出する化合物を生成するのに十分な長さだけであり、その後は、発現生体分子が活性状態を維持する限り、生存細胞又は非生存細胞のどちらであってもよい。本発明は、更に、Ｅ．ｃｏｌｉ発現組み換え酵素の検出及び選別と、符号化する核酸の回収に関連することになる問題を解決する。加えて、本発明は、その実施形態に、生体物質に関連する蛍光波長を検出できる任意の装置を含み、こうした装置は、本明細書において、蛍光アナライザ（一例としてＦＡＣＳ装置）として定義される。
【００３４】
また、有機体の混合集団、分離物、又は濃縮集団から核酸配列を同定することが望ましい。この実施形態では、遺伝子産物を発現させる必要がない。所定の核酸配列は、クローン、デバイス（遺伝子チップ等）、フィルタ、又は核酸試料を、検出可能な分子によって標識されたプローブに接触させることで同定又は「バイオパニング」することができる。プローブは、通常、所定の核酸配列と実質的に同一の配列を有する。或いは、プローブは、所定のポリペプチドを符号化する断片長又は全長核酸配列となる。プローブ及び核酸は、プローブと実質的な相補配列とのハイブリッド形成が可能になる条件下で、このような時間に渡って、培養される。ハイブリッド形成の緊縮性は、例えば、プローブの長さ及びＧＣ含量に応じて変化する。こうした要因は、経験的に定めることができる（例えば、サンブルックら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ−−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， ＮＹ， １９８９、及びＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｍ・オースベル他編（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ， Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ， ＩｎｃとＪｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃとの合弁事業、最新の補足）を参照）。ハイブリッド形成後、相補配列は、ＰＣＲ増幅すること、ハイブリッド形成手法（例えば、プローブ及び核酸混合物をフィルムに晒すこと）により同定すること、或いはチップを使用して核酸を検出することが可能である。
【００３５】
本発明以前、複雑な遺伝子ライブラリ又は環境発現ライブラリの評価は、速度が制限されていた。本発明により、例えば、数千種類の有機体又はそのサブセット及び分離物からのゲノム配列を含む、複雑な環境ライブラリの迅速なスクリーニングが可能になる。本発明の利点は、例えば、複雑な環境試料をスクリーニングする点に見て取ることができる。複雑な試料のスクリーニングでは、これまで、労働集約的方法を使用して、数百万のクローンをスクリーニングし、ゲノムの多様性をカバーする必要があった。本発明は、こうした膨大な数のクローンを評価することが可能となる極めて高スループットなスクリーニング方法を意味する。開示する方法により、所定の望ましい核酸配列、生物学的活性、又は生体分子に関して、毎時約三千万乃至約二億のクローンを任意にスクリーニングすることが可能となる。これにより、クローン発現の新しい生物活性又は生体分子に関して、環境ライブラリを完全にスクリーニングすることが可能となる。
【００３６】
所定の配列又は生物活性（例えば、所定の酵素）を同定した後、所定の生物活性を符号化する配列又はポリヌクレオチドを発展させること、変異させること、或いは誘導することでアミノ酸配列を修飾し、例えば、耐熱性、特異性、又は活性の増加といった修飾活性を提供することができる。
【００３７】
「アミノ酸」は、中心炭素原子（α−炭素原子）が水素原子と、カルボン酸基（この中の炭素原子を本明細書では「カルボキシル炭素原子」と呼ぶ）と、アミノ基（この中の窒素原子を本明細書では「アミノ窒素原子」と呼ぶ）と、側鎖基Ｒとに連結した構造を有する分子である。ペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質に組み込まれる時、アミノ酸は、一つのアミノ酸を他のものに連結させる脱水反応において、そのアミノ酸のカルボキシル基で一つ以上の原子を失う。その結果、タンパク質に組み込まれる時、アミノ酸は、「アミノ酸残基」と呼ばれることになる。
【００３８】
「タンパク質」又は「ポリペプチド」は、ペプチド結合を介して連結した二つ以上の個別のアミノ酸（自然発生であるかどうかを問わない）による任意のポリマを指し、一つのアミノ酸（又はアミノ酸残基）のα−炭素原子と結合するカルボン酸基のカルボキシル炭素原子が、隣接するアミノ酸のα−炭素原子と結合するアミノ基のアミノ窒素原子と共有結合する時に発生する。「タンパク質」という用語は、「ポリペプチド」及び「ペプチド」という用語（本明細書では交換可能なものとして使用される場合がある）を、その意味の中に含むと理解される。加えて、多数のポリペプチドサブユニット（例えば、ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩ、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ）又はその他の構成要素（例えば、テロメラーゼにおいて発生するようなＲＮＡ分子）を含むタンパク質も、本明細書で使用する「タンパク質」の意味に含まれると理解される。同様に、タンパク質及びポリペプチドの断片も、本発明の範囲に入り、本明細書では「タンパク質」と呼ばれる場合がある。
【００３９】
一定のタンパク質の特定のアミノ酸配列（つまり、アミノ末端乃至カルボキシ末端を書く時のポリペプチドの「一次構造」）は、ｍＲＮＡの符号化部分のヌクレオチド配列によって決定され、これは次に、遺伝情報、通常はゲノムＤＮＡ（ミトコンドリア又は葉緑体ＤＮＡ等の細胞小器官ＤＮＡを含む）によって指定される。したがって、遺伝子の配列を決定することは、対応するポリペプチドの一次構造、更に詳しくは、その遺伝子又はポリヌクレオチド配列によって符号化されるポリペプチド又はタンパク質の役割又は活性を予測するのに役立つ。
【００４０】
「分離された」又は「精製された」という用語は、核酸配列又はポリペプチド配列を指す時、それぞれ、「人間の手によって」自然状態から変更されたことを意味し、つまり、それが自然に発生する場合、オリジナルの環境から変化させたこと、又は移転させたこと、或いはその両方を行ったことになる。例えば、自然状態にある現存動物、生物学的試料、又は環境試料の中に自然に存在する自然発生ポリヌクレオチド又はポリペプチドは、「分離」又は「精製」されていないが、自然状態の共存物質から切り離した同じポリヌクレオチド又はポリペプチドは、本明細書で使用する用語として「分離」又は「精製」されている。こうしたポリヌクレオチドは、培養株又は完全な有機体の宿主細胞に導入した時も、自然発生の形態又は環境とは異なるため、本明細書で使用される用語では、依然として分離されていることになる。同様に、ポリヌクレオチド及びポリペプチドは、培地組成（例えば、細胞又は組成物にポリヌクレオチド又はポリペプチドを導入するための溶液、或いは化学又は酵素反応のための溶液）等の組成物において発生する場合がある。
【００４１】
「ポリヌクレオチド」又は「核酸配列」は、ヌクレオチドの重合形態を指す。また、ポリヌクレオチドは、由来する有機体の自然発生ゲノムにおいて直に連続する符号化配列（５’末端に一つ及び３’末端に一つ）のいずれとも直に連続しない配列を指す。そのため、この用語は、例えば、ベクタ内、自己複製プラスミド又はウイルス内、或いは原核生物又は真核生物のゲノムＤＮＡ内に組み込まれた組み換えＤＮＡ、若しくは他の配列から独立した別個の分子（ｃＤＮＡ等）として存在する組み換えＤＮＡを含む。本発明のヌクレオチドは、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、又はいずれかのヌクレオチドの修飾形態にすることができる。ポリヌクレオチドは、本明細書での使用において、特に、一本鎖及び二本鎖ＤＮＡと、一本鎖及び二本鎖領域の混合物であるＤＮＡと、一本鎖及び二本鎖ＲＮＡと、一本鎖及び二本鎖領域の混合物であるＲＮＡと、一本鎖、又は更に一般的には、二本鎖、或いは一本鎖及び二本鎖領域の混合物である場合があるＤＮＡ及びＲＮＡを含むハイブリッド分子とを指す。
【００４２】
加えて、ポリヌクレオチドは、本明細書での使用において、ＲＮＡ又はＤＮＡ或いはＲＮＡ及びＤＮＡの両方を含む三本鎖領域を指す。こうした領域の鎖は、同じ分子からのもの、又は異なる分子からのものである場合がある。この領域は、一つ以上の分子のすべてを含むことができるが、更に一般的には、いくつかの分子の一領域のみを含む。三重螺旋領域の分子の一つは、オリゴヌクレオチドである場合が多い。ポリヌクレオチドという用語は、ゲノムＤＮＡ又はＲＮＡ（有機体に応じて変化、つまりウイルスのＲＮＡゲノム）の他、ゲノムＤＮＡにより符号化されるｍＲＮＡ、及びｃＤＮＡを包含する。
【００４３】
上で述べたように、現在、生物学及び化学産業において、生物学的又は化学的プロセスを最適に実施することが可能な分子（酵素等）の必要性が存在する。例えば、従来及び新興の化学、製薬、繊維、食品及び試料、及び潜在市場において利用される分子及び化合物は、厳しい経済及び環境基準を満たす必要がある。ポリマ、製薬、天然産物、及び農薬の合成は、有害な副産物を生み出し、低品質又は非効率的な触媒作用が問題となる高価なプロセスにより妨げられる場合が多い。例えば、酵素は、こうした触媒作用における問題を克服可能な注目すべき多数の利点を有し、単一の官能基に作用し、単一の分子上の類似する官能基を識別し、光学異性体を識別する。更に、酵素は、生物分解可能であり、反応混合物において非常に小さなモル分率で機能する。その化学特異性、領域特異性、及び立体特異性から、酵素は、望ましい選択的形質転換を適切に達成する独自の機会を提供する。酵素は、特に単一段階の反応において、化学的に複製することが極めて困難である場合が多い。保護基の必要性の排除、選択性、単一の反応槽で多段階形質転換を実施する能力は、付随する環境的負担の減少と共に、化学及び製薬産業における酵素の需要増加をもたらしてきた。酵素系プロセスは、徐々に、従来型の多くの化学的方法に取って代わっている。現在、更に広範な産業での使用が制限されている主な原因は、商業的に利用可能な酵素が比較的少数なためである。これまでに説明されている３０００を超える非ＤＮＡ増幅酵素活性のうち、今のところ商業的に利用可能なものは、３００までの酵素（ＤＮＡ増幅酵素を除く）のみである。
【００４４】
技術的用途での酵素の使用では、更に、要求の厳しい産業条件下での性能が求められる。これには、現在知られている酵素の備蓄が進化的に選択されない環境内又は基質上での活性が含まれる。しかしながら、自然環境は、例えば、極端な温度及びｐＨを含め、極限条件を提供する。多数の有機体は、こうした極限状態に耐えることが可能となるようにポリペプチドを選択すること等により、こうした条件に適応している。
【００４５】
酵素は、温度、ｐＨ、及び塩濃度の条件の下、生物の環境内で非常に特異的な機能を果たす選択的な圧力により進化してきた。これまで同定された非ＤＮＡ修飾酵素活性の大部分は、中温性の有機体から分離されており、これは、利用可能な系統発生的多様性の非常に小さな部分を表すものである。生体触媒の動的な分野は、極限環境で繁栄する微生物から分離された酵素の助けを借りて、新たな次元に入っている。例えば、こうした酵素は、陸上の温泉及び深海の熱水噴出孔での１００℃を超える温度、極海での０℃を下回る温度、死海の飽和塩環境、石炭埋蔵地及び地熱による硫黄分の多い湧水でのゼロに近いｐＨ値、或いは下水スラッジでの１１より大きなｐＨ値で機能する必要がある。例えば、有機体、ポリヌクレオチド、又はポリペプチド（酵素等）を含む極限条件から取得された環境試料は、生体触媒の新しい分野を開く。所定のポリペプチドを符号化するポリヌクレオチドを迅速にスクリーニングすることで、本発明は、生物学、治療学、及び産業用途の酵素を発展させる物質のソースだけでなく、特定の活性、特異性、又は条件のために修飾する分子又はポリペプチドを開発する目的で、例えば、定方向進化及び突然変異生成によって更に処理する新しい物質を提供する。
【００４６】
産業で使用する新しい酵素の必要性に加え、新たな活性を有する生物活性化合物の必要性は、劇的に増加している。この需要は、主に、現在利用可能な抗生物質に対する抵抗力がある多数の病原生物における明確かつ増大する傾向と結びついた世界的な人口統計の変化から生じたものである。例えば、年少人口の高い新興国家において、抗菌薬の需要が急増した一方で、米国等、人口の高齢化が進む国では、癌、糖尿病、関節炎、及びその他の衰弱状態に対する薬品のレパートリを増やす必要がある。感染病による死亡率は、１９８０年から１９９２年の間に５８％増加しており、抗生物質耐性菌の出現により、米国だけで年間３００憶ドルを超える医療コストが追加されたと推定されている（アダムスら、Ｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｎｅｗｓ， １９９５、アマンら、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ， ５９， １９９５）。この傾向への反応として、製薬会社は、独自の活性又は特異性を有する化合物に関して、細菌の多様性のスクリーニングを大幅に増加させた。したがって、本発明は、ポリヌクレオチド及び関連配列に固有の情報を、例えば、様々な微生物の消化管等の環境に存在する感染性微生物等から、取得及び同定するために使用することができる。
【００４７】
環境試料において新しい酵素を同定することは、こうした問題に対する解決策の一つである。所定の活性を有するポリペプチドと、所定のポリペプチドを符号化するポリヌクレオチドとを迅速に同定することで、本発明は、生物学、診断学、治療学、及び産業用途の組成の発展に役立つ方法、組成、及びソースを提供する。
【００４８】
本発明の方法及び組成は、環境試料内に存在する薬品の先導化合物の同定を提供する。本発明の方法は、新薬のための環境を掘り下げる能力、或いは異なる微生物中に含まれる関連する薬物を同定する能力を提供する。先導化合物（薬品候補）には、いくつかの共通するソースが存在し、これには、環境を掘り下げた結果として同定又は開発されたヌクレオチド、ペプチド、又はその他の重合分子のような、天然産物の集合と、合成化学物質の集合と、合成組み合わせ化学物質ライブラリとが含まれる。こうしたソースのそれぞれは、利点と欠点とを有する。こうした候補をスクリーニングするプログラムが成功するかどうかは、主に、プログラムに入れる化合物の数によって左右され、製薬会社は、先導化合物の探究において、スクリーニングした膨大な数の合成物質及び自然化合物を時代遅れにする必要がある。残念なことに、過去に発見された化合物に対する新化合物の割合は、時間と共に減少している。新しい先導化合物の発見率は、製薬会社の最善の努力にもかかわらず、需要に追随していない。潜在的な薬品候補の新しいソースにアクセスする強い必要性が存在している。したがって、本発明は、新しい薬品化合物を含む環境試料を同定し、特徴づけるための迅速で効率的な方法を提供する。
【００４９】
現在使用されている生物活性化合物の大部分は、土壌微生物に由来する。こうした化合物は、一般に、微生物の成長にとって不可欠なものではないと考えられており、中間代謝に関与する遺伝子の助けを借りて合成されるため、「二次代謝産物」と呼ばれている。他の有機体の成長又は生存に影響する二次代謝物は、「生物活性」化合物として知られており、微生物及び非顕微的微生物の両方にとって、化学的な防衛備蓄の主要構成要素としての役割を果たす。微生物起源の約６，０００の生物活性化合物が特徴づけられており、その６０％より多くは、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属のグラム陽性土壌バクテリアによって生成される（バーンズら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ．， ９１， １９９４）。このうち、少なくとも７０種類は、現在、生物医学及び農業の用途で使用されている。生物活性化合物の最大のクラスであるポリケチドは、広範な抗生物質、免疫抑制剤、及び抗癌剤を含み、合計すると、売上高は年間５０億ドルとなる。
【００５０】
本発明は、既知又は未知の機能を有するポリペプチドを符号化する核酸配列を同定する方法を提供する。例えば、微生物ゲノムにおける多様性の多くは、微生物のゲノムにある遺伝子群の再配列によって生じる。こうした遺伝子群は、種を越えて存在する場合があり、或いは他の有機体に系統的に関連する場合がある。
【００５１】
例えば、バクテリア及び多くの真核生物は、生産物が関連プロセスに関与する調節遺伝子のための協調メカニズムを有する。こうした遺伝子は、単一の染色体上で集合し、「遺伝子群」と呼ばれる構造をなし、クラスタ全体の転写を開始する単一のプロモータを含む単一の調節配列の制御下で、共に転写される。遺伝子群と、プロモータと、調節において機能する補助配列とは、全体として「オペロン」と呼ばれ、２０個以上の遺伝子を含むことが可能であり、通常は二乃至六個の遺伝子を含む。したがって、遺伝子群は、通常はその機能に関して、同一であるか、或いは関連性のある、隣接する遺伝子のグループである。
【００５２】
一部の遺伝子ファミリは、同一の構成要素で構成される。群化する遺伝子は必ずしも同一である必要はないが、群化は、遺伝子間の同一性を維持するための必要条件である。遺伝子群は、隣接する関連遺伝子に対する複製が生成される極端なものから、数百の同一遺伝子がタンデム配列で存在するケースまでの幅がある。特定の遺伝子の反復に意味を見出せない場合もある。この主要な例は、一部の種における発現複製インスリン遺伝子であり、他の哺乳類種においては単一のインスリン遺伝子で十分である。
【００５３】
更に、遺伝子群は、継続的な再編成を経験するため、例えば、バクテリアその他の原核生物ソースから、遺伝子群の異種ライブラリを形成する能力は、例えば、膨大な数の有効活性を有するポリケチドの合成を引き起こすポリケチド合成酵素等の酵素を特に含む、新しいタンパク質のソースを決定する上で価値がある。例えば、ポリケチドは、生物活性の極めて豊富なソースとなる分子であり、抗生物質（テトラサイクリン及びエリスロマイシン等）と、抗癌剤（ダウノマイシン）と、免疫抑制剤（ＦＫ５０６及びラパマイシン）と、獣医用製品（モネンシン）とを含む。多くのポリケチド（ポリケチド合成酵素によって生成される）は、治療剤として価値がある。ポリケチド合成酵素は、長さと機能及び還化のパターンとが異なる多様な炭素鎖の生合成を触媒する多機能酵素である。ポリケチド合成酵素遺伝子は、遺伝子群に分類され、ポリケチド合成酵素の少なくとも一つのタイプ（タイプＩと指定される）は、大きなサイズの遺伝子及び酵素を有し、遺伝子操作と、こうした遺伝子／タンパク質のｉｎ  ｖｉｔｒｏ研究とは複雑なものになる。遺伝子群の（複数の）生産物である他のタイプのタンパク質も考えられ、これには、例えば、抗生物質、抗ウイルス薬、抗腫瘍剤、及びインスリン等の調節タンパク質が含まれる。
【００５４】
研究用の新しいポリケチドを生成するために、ポリケチド及びポストポリケチド生合成遺伝子のライブラリから望ましい成分を選択し組み合わせる能力は、魅力あるものといえる。本発明の（複数の）方法は、これを可能にするものであり、（特にＦ因子系ベクタを使用する時に）大きな挿入を含むクローンを備える遺伝子バンクの生成が可能となり、これが遺伝子群のクローニングを容易にするため、新しいポリケチド合成酵素その他の遺伝子群のクローニングを容易にする。
【００５５】
例えば、遺伝子群は、連結した遺伝子群からの検出可能なタンパク質又はタンパク質関連配列活性の生成を制御及び調節可能な発現調節配列を含むベクタに連結することができる。外部性の核酸の導入に関して非常に大きな容量を有するベクタの使用は、こうした遺伝子群での使用に特に適しており、本明細書では、一例として、Ｅ．ｃｏｌｉのＦ因子（又は稔性因子）を含めて説明される。このＥ．ｃｏｌｉのＦ因子は、接合中の自分自身の高頻度伝達に影響するプラスミドであり、混合微生物試料からの遺伝子群等、大きな核酸断片を完成させ、安定した繁殖を行う上で理想的である。
【００５６】
こうした試料（微生物の混合集団等）又はその分離物から分離又は引き出された核酸は、ポリヌクレオチドのスクリーニングの前に、ベクタ又はプラスミドに挿入することができる。こうしたベクタ又はプラスミドは、通常、プロモータ、エンハンサ、及びその他を含め、発現調節配列を含むものである。
【００５７】
したがって、本発明は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、所定の活性、つまり所定の酵素活性及び生物活性を有する分子を符号化するポリヌクレオチドに関して、微生物濃縮試料の混合集団又はその分離物をクローニング及びスクリーニングする新しいシステムを提供する。本発明の（複数の）方法によって、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、新しい生物活性分子、特に、未培養又は培養試料に由来する新しい生物活性分子をクローニング及び発見することが可能となる。本発明の（複数の）方法を使用して、大きなサイズの遺伝子群、遺伝子、及び遺伝子断片を、クローニング、配列、及びスクリーニングすることができる。以前の方策とは異なり、本発明の（複数の）方法では、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、幅広い環境試料から、ポリヌクレオチドと、こうしたポリヌクレオチドによって符号化されたポリペプチドとを、クローニング、スクリーニング、及び同定することができる。
【００５８】
本発明では、複雑な環境試料、その濃縮試料、又はその分離物から、ポリヌクレオチド配列をスクリーニング及び同定することができる。遺伝子ライブラリは、試料が核酸配列を含む限り、無細胞試料から生成することが可能であり、或いは、細胞、細胞物資、又はウイルス粒子を含む試料から生成できる。ライブラリを作成可能な有機体は、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉａ及びＡｒｃｈａｅｂａｃｔｅｒｉａ等の原核微生物と、菌類、藻類、及び原生動物等の下等真核微生物とを含む他、植物、植物の胞子、及び花粉の混合集団を含む。こうした有機体は、培養有機体又は環境試料から取得した未培養有機体にすることが可能であり、好熱性有機体、超好熱性有機体、冷温性有機体、及び低温菌等の極限環境微生物を含む。
【００５９】
ＤＮＡライブラリを生成するのに使用する核酸のソースは、環境試料から取得することが可能であり、これには、その一部として、北極及び南極の氷、海域、及び永久凍土層のソースと、火山起源の物質と、熱帯の土壌又は植物のソースからの物質と、哺乳類及び無脊椎動物を含む様々な有機体の糞とから取得した微生物試料の他、無機物及び腐敗物その他から取得した微生物試料が含まれる。遺伝子ライブラリを生成するのに使用する核酸は、例えば、試料の濃縮小集団又は分離物から取得することができる。別の実施形態では、複数の分離物からのＤＮＡをプールし、ライブラリを生成するための核酸のソースを形成することができる。代わりに、この核酸は、複数の分離物と、複数の遺伝子ライブラリを収録するために複数の分離物から生成された複数の遺伝子ライブラリとから取得することが可能である。二つ以上の遺伝子ライブラリをプールすること又は組み合わせることで、プール分離ライブラリを取得することができる。したがって、例えば、核酸は、培養有機体又は未培養有機体から回収することが可能であり、適切な遺伝子ライブラリ（組み換え発現ライブラリ等）を生成し、所定の特定の生体分子の同一性（ポリヌクレオチド配列等）をその後決定するのに使用すること、或いは所定の生物活性（酵素又は生物学的活性等）に関してスクリーニングすることができる。
【００６０】
以下では、培養及び未培養有機体の両方と、濃縮集団と、有機体の混合集団及びその分離物とからライブラリを生成するための一般的な手順の概要を説明しており、このライブラリは、調査、配列、又はスクリーニングを行って、確認、要望、又は予測される生物学的活性（酵素活性等）を有する核酸配列を、ここから選択することが可能であり、選択された核酸配列は、更に進化、突然変異生成、又は誘導することが可能である。
【００６１】
環境試料とは、本明細書での使用において、有機体又はポリヌクレオチド或いはその組み合わせを含む任意の試料である。したがって、環境試料は、（上で説明したような）任意の数のソースから取得することが可能であり、これには、例えば、昆虫の糞、温泉、土壌、及びその他が含まれる。精製又は未精製形態である核酸の任意のソースは、出発物質として利用することができる。したがって、核酸は、有機体によって汚染された任意のソースから、或いは細胞を含む任意の試料から、取得することができる。環境試料は、任意の哺乳類生物の血液、尿、脊髄液、組織、膣スワブ、便、羊水、又は頬部口腔洗浄液といった任意の生体試料からの抽出物にすることができる。非哺乳類（例えば無脊椎）生物に関して、試料は、その生物の組織試料、唾液試料、糞便試料、又は消化管内の物質にすることができる。環境試料は、更に、極限環境から取得された試料を含み、こうした環境には、例えば、高温の硫黄だまり、火道、及び凍結したツンドラが含まれる。試料は、様々なソースから得ることができる。例えば、園芸及び農業試験において、試料は、植物、肥料、土壌、液体、又はその他の園芸及び農業生産物にすることが可能であり、食品試験において、試料は、生鮮食品又は加工食品（例えば、特殊調製粉乳、海産物、生鮮農産物、及び包装食品）にすることが可能であり、環境試験において、試料は、液体、土壌、汚水処理、汚泥、及び有機体又はポリヌクレオチドを含むと判断又は推測される環境内の他の任意の試料にすることが可能である。
【００６２】
試料は、有機体の混合集団を含む物質の混合物、例えば、血液、土壌、又は汚泥である場合、細胞を開き、核酸の鎖を露出又は分離するのに有効である適切な試薬によって処理することができる。必須ではないものの、この溶解及び核酸変性ステップにより、クローニング、増幅、又は配列は、更に迅速に発生することになる。更に、望ましい場合は、特定の集団又は望ましい分離物（例えば、有機体の特定の種、属、又は科の分離物）を精製又は濃縮し、これにより不純物の少ない試料を取得するために、混合集団を分析の前に培養することができる。しかしながら、これは必須ではない。例えば、試料内の有機体を培養することは、微小液滴内の有機体を培養するステップと、培養した微小液滴を、セルソータにより、マルチウェル組織培養プレートの個々のウェルに分離するステップとを含む場合がある。代わりに、試料は、有機体の特定の小集団の成長を阻害又は促進するように設計された任意の数の選択的培地組成で培養することができる。
【００６３】
分離物が有機体の混合集団を含む試料に由来する場合、核酸は、下で説明するような分離物から取得することができる。この分離物から取得される核酸は、遺伝子ライブラリの生成に使用することが可能であり、或いは、代わりに、試料の他の分離断片と共にプールすることが可能で、この場合は、プールされた核酸が遺伝子ライブラリの生成に使用される。この分離物は、核酸の抽出前に培養することが可能であり、或いは、未培養にすることができる。有機体の特定の集団を分離する方法は、混合集団において行われる。
【００６４】
したがって、試料は、例えば、有機体（昆虫の消化管に存在する微生物等）の多様な混合集団からの核酸を含む。核酸は、ＤＮＡ及びＲＮＡを分離する任意の数の方法を使用して試料から分離される。こうした核酸分離方法は、この技術において一般的に実施されている。核酸がＲＮＡである場合、このＲＮＡは、この技術で知られているプライマを使用して、ＤＮＡに逆転写することができる。このＤＮＡがゲノムＤＮＡである場合、このＤＮＡは、例えば２５ゲージ針を使用して、剪断することができる。
【００６５】
核酸は、適切なベクタでクローニングすることができる。使用されるベクタは、この技術で知られている任意の数の方法においてＤＮＡの発現、増幅、又は操作のいずれを行うかによって決定することになる（例えば、高スループット配列ベクタを開示する米国特許第６，０２２，７１６号を参照）。クローニング手法は、この技術で知られており、不要な説明を行わなくとも、当業者が構築可能である。ベクタの選択は、更に、本発明の方法において利用されるポリヌクレオチド配列及び宿主細胞のサイズによって変化することになる。したがって、本発明で使用されるベクタは、プラスミド、ファージ、コスミド、ファージミド、ウイルス（例えば、レトロウイルス、パラインフルエンザウイルス、ヘルペスウイルス、レオウイルス、パラミクソウイルス、及びその他）、又はこの選択部分（例えば、コートタンパク質、スパイク糖タンパク質、カプシドタンパク質）にすることができる。例えば、コスミド及びファージミドは、通常、分析又は修飾される特定の核酸配列が大きい場合に使用され、これは、こうしたベクタが大きなポリヌクレオチドを安定して増殖させることができるためである。
【００６６】
クローン核酸配列を含むベクタは、次に、ベクタ（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ宿主上のファージ）により適切な宿主細胞をプレーティング（つまり、クローン増幅）又はトランスフェクションすることで、増幅できる。クローン核酸配列は、適切な有機体を形質転換することで、スクリーニング（例えば、発現スクリーニング、ＰＣＲスクリーニング、ハイブリッド形成スクリーニング、又はその他）のためのライブラリを作成するのに使用できる。この技術で知られている宿主は、こうした形質転換に役立つ条件下での接種により、核酸配列を含むベクタを人為的に導入することで形質転換される。二本鎖環状又は線状核酸による形質転換が可能であり、一本鎖環状又は線状核酸配列により形質転換されることもある。形質転換又はトランスフォーメーションとは、新しいＤＮＡ（細胞にとって外部性のＤＮＡ等）の組み込みに続いて、細胞内で誘発される永続的又は一時的な遺伝子の変化を意味する。細胞が哺乳類細胞である場合、永続的な遺伝子の変化は、通常、細胞のゲノムにＤＮＡを導入することで達成される。形質転換細胞又は宿主細胞とは、一般に、宿主有機体に通常存在しないＤＮＡ分子を、組み換えＤＮＡ手法を用いて導入された（或いは、その祖先に導入された）細胞（例えば、原核又は真核）を指す。
【００６７】
本発明において使用される特定のタイプのベクタは、Ｆ因子起点の複製を含む。Ｅ．ｃｏｌｉのＦ因子（又は稔性因子）は、接合中の自分自身の高頻度伝達と、バクテリア染色体自体の低頻度伝達とに影響するプラスミドである。特定の実施形態では、「フォスミド」又はバクテリア人工染色体（ＢＡＣ）ベクタと呼ばれるクローニングベクタが使用される。これらは、ＤＮＡの大きなセグメントを安定して統合することが可能なＥ．ｃｏｌｉのＦ因子に由来するものである。混合未培養環境試料からのＤＮＡと統合する時、これにより、安定した環境遺伝子ライブラリの形態で、大きなゲノム断片を達成することが可能となる。
【００６８】
混合集団又は試料に由来する核酸は、様々な手順によってベクタに挿入することができる。一般に、核酸配列は、この技術で知られている手順により、適切な（複数の）制限エンドヌクレアーゼ部位に挿入される。こうした手順その他は、当業者の範囲に入ると思われる。代表的なクローニングのシナリオにおいては、適切なヌクレアーゼ（マングビーンヌクレアーゼ等）で「平滑化」したＤＮＡを、例えば、ＥｃｏＲ  Ｉメチラーゼによりメチル化し、ＥｃｏＲ  ＩリンカＧＧＡＡＴＴＣＣ（ＳＥＱ  ＩＤ番号１）に連結させることが含まれる場合がある。このリンカは、その後、ＥｃｏＲ  Ｉ制限エンドヌクレアーゼにより消化され、ＤＮＡのサイズは（例えば、ショ糖勾配を使用して）断片化される。結果として生じるサイズ断片化ＤＮＡは、次に、配列、スクリーニング、又は発現のため、適切なベクタに連結される（例えば、λベクタ、及びｉｎ  ｖｉｔｒｏ  λパッケージング抽出を使用したパッケージ化）。
【００６９】
組み換えＤＮＡによる宿主細胞の形質転換は、当業者に広く知られている従来の手法により実行できる。宿主がＥ．ｃｏｌｉ等の原核である場合、ＤＮＡを取り込むことが可能なコンピテント細胞は、指数増殖期の後で回収し、その後、この技術で広く知られる手順により、ＣａＣｌ２方法で処理した細胞から作成できる。代わりに、ＭｇＣｌ２又はＲｂＣｌを使用することができる。形質転換は、宿主細胞のプロトプラストを形成した後で、或いはエレクトロポレーションにより、実行することもできる。
【００７０】
宿主が真核である時、ＤＮＡによるトランスフェクション又は形質転換の方法には、リン酸カルシウム共沈法、マイクロインジェクション等の従来の機械的手順、エレクトロポレーション、リポソームに包まれたプラスミドの挿入、又はウイルスベクタが含まれ、この技術で知られている他の方法を使用することもできる。真核細胞は、更に、単純ヘルペスチミジンキナーゼ遺伝子等、選択可能なマーカを符号化した第二の異種ＤＮＡ分子によりコトランスフェクションすることが可能である。別の方法では、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）又はウシ乳頭腫ウイルス等の真核ウイルスベクタを使用し、真核細胞を一時的に感染又は形質転換させ、タンパク質を発現させる（Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ Ｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， グルツマン編、１９８２）。この真核細胞は、イースト菌（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ等）、昆虫の細胞（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ種等）、或いは人間の細胞を含む哺乳類細胞にすることができる。
【００７１】
真核系、及び哺乳類発現系により、発現哺乳類タンパク質の翻訳後修飾が可能になる。一次転写、グリコシル化、リン酸化、又は遺伝子産物の分泌を処理する細胞機械を有する真核細胞を使用するべきである。こうした細胞株は、その一部として、ＣＨＯ、ＶＥＲＯ、ＢＨＫ、ＨｅＬａ、ＣＯＳ、ＭＤＣＫ、Ｊｕｒｋａｔ、ＨＥＫ−２９３、及びＷＩ３８を含むことができる。
【００７２】
一実施形態において、上で説明したものを含め、任意の数の方法を使用して、クローンのライブラリが作成された後、クローンは、例えば、栄養豊富なブロス又はこの技術で知られる他の成長培地等の液体培地で再懸濁される。通常、培地は、素早くピペットで取ることが可能な液体培地である。その後、ライブラリの少なくとも一つのクローンを含む一つ以上の培地タイプを、個別に、或いは混合物として共に、キャピラリアレイのキャピラリに（すべて、又はその一部を）導入する。
【００７３】
別の実施形態において、ライブラリは、最初に、キャピラリデバイス又は他のスクリーニング手法に導入又は送出する前に、バイオパニングされる。こうしたバイオパニング方法は、所定の配列又は活性に関して、ライブラリを濃縮する。バイオパニングする方法の例については、下で説明する。
【００７４】
一実施形態において、ライブラリは、ライブラリ又はクローン内に存在するポリヌクレオチド配列に基づいて、所定の配列又は活性を含むクローンに関してスクリーニング又は選別することができる。したがって、本発明は、望ましい生物学的活性又は生物学的配列に関して、有機体をスクリーニングするのに有効で、更に、定方向進化、分子生物学、バイオテクノロジ、及び産業用途において使用可能な所定の配列の取得を支援する方法及び組成を提供する。
【００７５】
したがって、本発明は、試料中に存在する核酸配列をスクリーニング及び同定することで、試料中の配列を迅速にスクリーニング、濃縮、及び又は同定する方法を提供する。そのため、本発明は、診断学、治療学、又は産業用途の分子を発展させるのに使用できる利用可能な配列のレパートリを増やす。したがって、本発明の方法は、望ましい生物学的活性を有するタンパク質又はポリペプチドを符号化する新しい核酸配列を同定することができる。
【００７６】
遺伝子ライブラリ（発現ライブラリ等）が生成された後、発現スクリーニングの前に、こうしたライブラリを「バイオパニング」する追加ステップを含めることができる。この「バイオパニング」手順は、クローンのライブラリにおいて配列相同性に関するスクリーニングを行うことで、指定された生物学的活性を有するクローンを同定するプロセスを指す。
【００７７】
ライブラリ内の所定のターゲット配列と選択的に相互作用させるために使用するプローブ配列は、既知の生物活性に関する全長コーディング領域配列又は部分コーディング領域配列にすることができる。ライブラリは、既知の生物活性を符号化する配列又は望ましい生物活性を有する配列の少なくとも一部を含むプローブの混合物を使用して、プローブすることができる。こうした複数のプローブ又はプローブライブラリは、好ましくは、一本鎖である。一実施形態において、ライブラリは、好ましくは、一本鎖の形態に転換される。特に適切なプローブは、スクリーニングされる指定の生物活性に類似する活性、或いは同一の活性を有する生物活性を符号化するＤＮＡに由来するものである。プローブは、ＰＣＲ増幅に使用することが可能であり、したがって、ターゲット配列を選択することができる。代わりに、プローブ配列は、実質的な相同性又は望ましい相同性を備える配列を同定するのに使用できるハイブリッド形成プローブとして使用することができる。
【００７８】
別の実施形態において、ＦＡＣＳ系装置を利用して、ｉｎ  ｖｉｖｏバイオパニングを実行することができる。遺伝子ライブラリ又は発現ライブラリは、転写ＲＮＡを安定化する要素を含むベクタにより構築される。例えば、ＲＮＡの転写領域を側面に置くように設計されたヘアピンのような二次構造を発生させる配列を含めることは、安定性を強化するのに役立ち、そのため、細胞内での半減期を増加させる。バイオパニングプロセスにおいて使用されるプローブ分子は、ターゲット配列との相互作用時に検出可能な信号を提供する（例えば、プローブがターゲット分子と結合した時のみ蛍光を発する）検出可能な分子によって標識されたオリゴヌクレオチドによって構成される。例えば、ハワード・Ｍ・シャピロＭ．Ｄ．の”Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ”， １９９５， Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ， Ｉｎｃ．において説明されているもの等、この技術で知られている様々な染料又は染色剤を使用して、オリゴヌクレオチドを「標識」するために、核酸にインタカレート又は関連付けすることができる。こうしたプローブは、いくつかの形質転換方法の一つを使用して、ライブラリの組み換え細胞に導入される。プローブ分子は、転写されたターゲットｍＲＮＡ又はＤＮＡと相互作用又はハイブリッド形成し、ＤＮＡ／ＲＮＡヘテロ二本鎖分子又はＤＮＡ／ＲＮＡ二本鎖分子を発生させる。プローブのターゲットとの結合により、スクリーニングプロセス中に、ＦＡＣＳ装置又はその他によって検出及び選別される検出可能な信号（蛍光信号等）が生じることになる。
【００７９】
プローブＤＮＡは、少なくとも約１０塩基、好ましくは、少なくとも１５塩基にするべきである。一実施形態においては、経路の一部分のコーディング領域全体を、プローブとして利用することができる。プローブがｉｎ  ｖｉｔｒｏ系においてターゲットＤＮＡとハイブリッド形成する場合、少なくとも一つのＤＮＡプローブを使用することでターゲットＤＮＡが分離されるハイブリッド形成の条件は、配列同一性が少なくとも約５０％となるハイブリッド形成の緊縮性を提供するように設計され、更に詳しくは、配列同一性が少なくとも約７０％となる緊縮性を提供する。
【００８０】
対象となる可能性のあるターゲットＤＮＡを分離するために微生物ＤＮＡライブラリをプローブするハイブリッド形成手法は、この技術において広く知られており、本明細書での使用には、文献において説明されている任意のものが適切であり、これには例えば、チップ単位の検定法、膜単位の検定法、及びその他が含まれる。
【００８１】
結果として生じる形質転換クローンのライブラリは、その後、所定の活性を示すクローンに関して、更にスクリーニングすることができる。クローンは、活性化合物の発現のために、代替宿主へ輸送することが可能であり、或いは、本明細書で説明する方法を使用してスクリーニングすることができる。
【００８２】
上で説明したｉｎ  ｖｉｔｒｏバイオパニングの代替方法は、例えば、ゲル微小液滴等のカプセル化手法であり、これは多数のクローンを一つの場所に局所化し、ＦＡＣＳ装置でスクリーニングするために利用することができる。クローンは、その後、再度ＦＡＣＳ装置でスクリーニングし、陽性である個々のクローンを同定するために、個別のクローンに分割することができる。このようなＦＡＣＳ装置を使用するスクリーニングは、１９９７年６月１６日に出願された特許出願番号第０８／８７６，２７６号において十分に説明されている。したがって、例えば、クローン混合物が望ましい活性を有する場合は、個々のクローンを回収し、ＦＡＣＳ装置を利用して再スクリーニングし、こうしたクローンの中から、指定された望ましい活性を有するものを決定することができる。
【００８３】
本発明では、様々なタイプのカプセル化方法及び化合物又はポリマを使用することができる。例えば、高温のアガロースを利用して、高温で安定した微小液滴を作成することが可能であり、これにより、熱安定生物活性に関してスクリーニングする時、すべての背景活性を除去するために利用される熱殺菌ステップの後、安定した細胞のカプセル化を得ることができる。カプセル化は、ビード、高温アガロース、ゲル微小液滴、ゴースト赤血球細胞又はマクロファージ等の細胞、リポソーム、又は分子をカプセル化及び局所化する他の任意の手段で行うことができる。
【００８４】
例えば、リポソームを作成する方法が説明されており（例えば、米国特許第５，６５３，９９６号、第５，３９３，５３０号、及び第５，６５１，９８１号）、様々な分子をカプセル化するためのリポソームの使用方法も説明されている（例えば、米国特許第５，５９５，７５６号、第５，６０５，７０３号、第５，６２７，１５９号、第５，６５２，２２５号、第５，５６７，４３３号、第４，２３５，８７１号、及び第５，２２７，１７０号）。エンドサイトーシス中のタンパク質、ウイルス、バクテリア、及びＤＮＡの包括についても、同様に説明されている（例えば、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４， ４１８−４３５ （１９８２）を参照）。膜の低浸透圧溶解又は絶縁破壊中に包括される物質のｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏでのキャリアとして利用される赤血球についても説明されている（Ｔｈｅｉｒ， Ｇ． Ｍ． （１９８３） Ｊ． Ｐｈａｒｍ． Ｔｈｅｒにおいて検討されている）。これらの手法は、本発明において、スクリーニングのために微環境で試料をカプセル化するのに役立つ。
【００８５】
「微環境」とは、本発明での使用において、本発明の方法に必要な相互作用を促進するのに適した環境を提供する任意の分子環境を指す。分子の相互作用を促進するのに適した環境は、例えば、リポソームを含む。リポソームは、リン脂質と、糖脂質と、ステロイドと、アルキルリン酸塩等の長鎖アルキルエステルと、レシチン等の脂肪酸エステルと、脂肪族アミンと、その他とを含む様々な脂質から作成することができる。脂肪質の混合物は、中性ステロイド、荷電両親媒性物質、及びリン脂質といった組み合わせで利用することができる。リン脂質の説明例には、レシチンと、スフィンゴミエリンと、ジパルミトイルホスファチジルコリンとが含まれる。代表的なステロイドには、コレステロールと、コレスタノールと、ラノステロールとが含まれる。代表的な荷電両親媒性物質化合物は、一般に、１２乃至３０の炭素原子を含む。これは、モノアルキル又はジアルキルリン酸エステル、又はアルキルアミンであり、例えば、ジセチルリン酸塩、ステアリルアミン、ヘキサデシルアミン、ジラウリルリン酸塩、及びその他である。
【００８６】
更に、上で説明した実施形態の一部又は全部を組み合わせ、発現ライブラリの生成前に平均化ステップを実行し、その後、発現ライブラリを生成し、次に、このように生成された発現ライブラリをバイオパニングし、その後、バイオパニングされた発現ライブラリを高スループット細胞選別及びスクリーニング機器を使用してスクリーニングすることが可能である。したがって、様々な選択肢が存在し、これには、（ｉ）ライブラリを生成し、その後、スクリーニングすること、（ｉｉ）ターゲットＤＮＡを平均化し、ライブラリを生成し、その後、スクリーニングすること、（ｉｉ）平均化し、ライブラリを生成し、バイオパニングし、スクリーニングすること、或いは（ｉｖ）ライブラリを生成し、バイオパニングし、スクリーニングすることが含まれる。ライブラリを生成するために使用する核酸は、例えば、環境試料と、有機体の混合集団（培養又は未培養等）と、その濃縮集団と、その分離物とから取得することができる。加えて、スクリーニング手法は、例えば、ハイブリッド形成スクリーニングと、ＰＣＲスクリーニングと、発現スクリーニングと、その他とを含む。
【００８７】
ゲル微小液滴技術は、フローサイトメトリ分析で利用可能な信号を増幅することと、バイオテクノロジに関する菌株改良プログラムで微生物菌株のスクリーニングを可能にすることとにおいて、意義を有してきた。ウィットルプら（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏ． Ｂｉｏｅｎｇ． （１９９３） ４２：３５１−３５６）は、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｗａｍｏｒｉグルコアミラーゼの分泌増進に関して、１０６を超えるイースト菌の迅速な量的スクリーニングを可能にする微小カプセル化選択方法を開発した。この方法は、高分泌突然変異体に関して４００倍のシングルパス濃縮を提供する。
【００８８】
ゲル微小液滴又は他の関連技術は、本発明において、組み換えライブラリの高スループットスクリーニングにおいて、局所化、選別、及び信号の増幅を行うのに使用することができる。核酸を微小液滴から回収できるため、スクリーニング中の細胞の生存可能性は、問題ではなく、或いは重要ではない。
【００８９】
所定の配列を含むクローンに関してライブラリを濃縮できる任意の数のバイオパニング手法に続いて、濃縮クローンは、ブイヨンその他の成長培地等の液体培地に懸濁される。したがって、濃縮クローンは、試料（例えば、有機体の混合集団、その分離物、及びその他）に由来する核酸配列が組み込まれたベクタを含む構造物により形質転換された複数の宿主細胞を含む。クローンのサブセットと、検出可能な分子を有する一つ以上の基質（酵素基質等）とを含む液体培地は、その後、個別に、或いは混合物として共に、濃縮クローンに導入又は接触させる（キャピラリアレイのキャピラリ内等）。基質と、望ましい酵素活性を有する酵素を発現するクローンとの相互作用（反応を含む）により、生産物又は検出可能な信号が生成され、これは、少なくとも一つの信号生成クローンを含む一つ以上のクローン又はキャピラリを同定するために、空間的に検出することができる。この信号生成クローン又は信号生成クローンに含まれる核酸は、その後、任意の数の手法を使用して回収することができる。
【００９０】
「基質」とは、本明細書での使用において、例えば、生物活性又は生体分子（例えば、酵素、及びその特定の酵素活性）を検出するための基質を含む。こうした基質は、この技術において広く知られている。例えば、様々な酵素、及びこうした酵素に固有の適切な基質は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ， Ｈａｎｄｂｏｏｋ Ｏｆ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｂｅｓ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ（オレゴン州ユージーン所在のＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ）において提示されており、その開示内容は出典を明記することにより本願明細書の一部とする。基質は、関連する検出可能な分子を有することが可能であり、これには、例えば、発色又は蛍光分子が含まれる。本発明で使用するのに適した基質は、望ましい活性を有する一定の酵素、或いはこうした酵素を符号化する一定のクローンとの相互作用（例えば、反応）時に、光学的に検出可能な信号を生成する任意の基質である。
【００９１】
当業者は、例えば、望ましい酵素活性に基づいて、適切な基質を選択できる。望ましい酵素／酵素活性の例には、本明細書で列挙するものが含まれる。望ましい酵素活性には、更に、光学信号基質が存在する酵素経路内の酵素のグループを含むことができる。この一例は、一連のカロチノイド合成酵素である。
【００９２】
基質は、特に、グルコシダーゼ、プロテアーゼ、ホスファターゼ、及びモノオキシゲナーゼについて知られており及び又は市販されている。検出可能な（光学等の）信号基質を備えるプロテアーゼには、セリンプロテアーゼ――トリプシン及びキモトリプシンが含まれる。グルコシダーゼには、マンノシダーゼ、アミログルコシダーゼ、セルラーゼ、ノイラミニダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、及びアルファアミラーゼが含まれる。
【００９３】
望ましい活性が、多数の基質を有する他の生体分子又は酵素のものと同じクラスである時、その活性は、既知の基質の反応混液を使用して、検査することができる。例えば、基質は、約２０種類の市販のエステラーゼについて知られており、こうした既知の基質の組み合わせは、光学的ではないとしても、検出可能な信号生成を提供する。
【００９４】
光学信号基質は、発色基質、蛍光基質、生物発光又は化学発光基質、或いは、蛍光共鳴エネルギ移動（ＦＲＥＴ）基質にすることができる。検出可能な種は、基質の分割、或いは、検出可能な変化を被るように、分割又は他の基質／生体分子の相互作用によって影響される二次的分子から生じるものにすることができる。検出可能な検定形式の無数の例は、イムノアッセイ、クロモジェニックアッセイ、及び標識プローブ法を使用する診断技術から知られている。
【００９５】
一実施形態において、光学信号基質は、生物発光又は化学発光基質にすることができる。いくつかの酵素に関する化学発光基質は、Ｔｒｏｐｉｘ（マサチューセッツ州ベッドフォード）から入手できる。既知の化学発光基質を有する酵素には、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、β−グルコロニダーゼ、及びβ−グルコシダーゼが含まれる。
【００９６】
別の実施形態においては、発色基質を、特に、加水分解酵素といった特定の酵素に関して使用することができる。例えば、この光学信号基質は、酵素的に切断され、発色産物を発生させるインドリル誘導体にすることができる。発色基質が使用される場合、光学的に検出可能な信号は、光吸収度（吸収度の変化を含む）である。この実施形態においては、分光光度計又はその他を使用した吸収度測定によって、信号を検出することができる。
【００９７】
別の実施形態においては、蛍光基質が使用され、光学的に検出可能な信号は、蛍光となる。蛍光基質は、検出性を高める高感度と、代わりの検出モードとを提供する。水酸基及びアミノ置換クマリンは、蛍光基質の作成に利用される蛍光物質として最も広く使用されている。通常のクマリン系蛍光基質は、７−ヒドロキシクマリンで、一般にウンベリフェロン（Ｕｍｂ）として知られている。ウンベリフェロンの誘導体及び類似体も使用される。フルオレセイン（ＦＤＧ又はＣ１２−ＦＤＧ等）及びローダミンの誘導体及び類似体系基質も使用される。レゾルフィン（例えば、レゾルフィンβ−Ｄ−ガラクトピラノシド又はレゾルフィンβ−Ｄ−グルクロニド）は、本発明において特に有用である。レゾルフィン系基質は、例えば、グリコシダーゼ、ヒドロラーゼ、及びデアルキラーゼに関するスクリーニングにおいて有用である。前記の基質（アルキル化誘導体等）の脂肪親和性誘導体は、一般に、細胞に容易に取り込まれ、細胞の脂質領域と結びつく傾向を有することがあるため、特定の実施形態において有用な場合がある。フルオレセイン及びレゾルフィンは、相対的に水に溶解しにくい（つまり、脂肪親和性の）製品を形成するアルキル化誘導体として市販されている。例えば、蛍光画像化は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ（オレゴン州ユージーン）が基質として製造するＣ１２−レゾルフィンガラクトシドを使用して実行することができる。
【００９８】
使用する特定の蛍光基質は、スクリーニングする酵素活性に基づいて選択することができる。以下に例を挙げる。
【００９９】
リパーゼ／エステラーゼ。リパーゼ又はエステラーゼ活性を有する酵素に関してスクリーニングする時は、フルオレセインのアシル化誘導体が使用される。蛍光物質は、この誘導体から加水分解され、信号を生成する。
【０１００】
プロテアーゼ。プロテアーゼ活性を有する酵素は、エステラーゼと同じ方法でスクリーニングされ、エステルの代わりにアミド結合が切断される。現在、１００種類を大きく上回るプロテアーゼ基質を、アシル化蛍光物質の切断部位において利用することができる。
【０１０１】
モノオキシゲナーゼ（デアルキラーゼ）。モノオキシゲナーゼ基質として適するいくつかのクマリン誘導体が市販されている。通常、こうした基質では、この化合物のエチル基のヒドロキシ化により、レゾルフィン蛍光物質の放出が生じる。
【０１０２】
通常、基質は、細胞に入り、分析を行うのに十分な期間に渡って、細胞内での存在を維持することができる（例えば、基質は、細胞に入ると、検出可能な反応を生成するのに十分な期間に渡って、スクリーニングされる酵素と反応する前に再び「漏出」することはない）。細胞内での基質の保持は、様々な手法によって強化することができる。一方法において、この基質化合物は、疎水性（例えばアルキル）の尾部を追加することで、構造的に修飾される。別の実施形態では、ＤＭＳＯ又はグリセロール等の溶媒を使用し、細胞の外部を覆うことができる。更に、この基質は、細胞からの基質の漏出を遅らせることが観察された換算温度で、細胞に与えることができる。しかしながら、基質の細胞への侵入は、例えば、酵素又はポリペプチドが分泌され、溶解細胞試料その他の中に存在する場合、或いは、基質が細胞に対して外的に作用できる場合（細胞外受容体リガンド複合体等）、必須ではない。
【０１０３】
光学信号基質は、一部の実施形態において、ＦＲＥＴ基質にすることができる。ＦＲＥＴは、蛍光物質の近接性と相対的な角度方向とをモニタすることが可能な分光学的方法である。ＦＲＥＴを使用して基質又は生産物の濃度を測定する蛍光インジケータシステムは、発光及び励起スペクトルを有する二つの蛍光部分を含み、一方を「ドナー」蛍光部分とし、他方を「アクセプタ」蛍光部分とする。二つの蛍光部分は、アクセプタ蛍光部分の励起スペクトルが励起された部分（ドナー蛍光部分）の発光スペクトルと重複するように選択される。ドナー部分は、ドナー部分の励起スペクトル内の適切な強度の光によって励起され、吸収エネルギを蛍光として放出する。アクセプタ蛍光タンパク質部分が励起状態のドナー部分を抑制するように配置される時、蛍光エネルギは、アクセプタ部分に転送され、アクセプタ部分は第二のフォトンを放出することができる。ドナー及びアクセプタ部分の放出スペクトルは、最低限の重複を有するため、二つの放出を識別することが可能である。したがって、アクセプタがドナーよりも長い波長で蛍光を発する時には、最終的な定常状態の結果として、ドナーの放出は抑制され、ドナーの吸収極大で励起された時に、アクセプタが放出を行うようになる。
【０１０４】
検出可能又は光学的信号は、例えば、蛍光偏向、時間分解蛍光、又はＦＲＥＴを含む蛍光を検出する蛍光光度計（又は同様のもの）を使用して測定可能である。一般に、第一の波長を有する励起源からの励起放射は、試料を励起する励起放射を発生させる。これに応じて、試料中の蛍光化合物は、励起波長とは異なる波長を有する放射を発する。蛍光物質に関する検定を行う方法は、この技術で広く知られており、例えば、ラコビッツ（Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ， １９８３）及びハーマン（”Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ｅｎｅｒｇｙ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ，” ｉｎ： Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ ｏｆ Ｌｉｖｉｎｇ Ｃｅｌｌｓ ｉｎ Ｃｕｌｔｕｒｅ， Ｐａｒｔ Ｂ， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ， ｖｏｌ． ３０， ｅｄ． Ｔａｙｌｏｒ ＆ Ｗａｎｇ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， １９８９， ｐｐ． ２１９−２４３）により説明されている。蛍光検出手法の例については、下で更に詳細に説明する。
【０１０５】
加えて、レポータ遺伝子を使用して遺伝子発現を測定することについて、いくつかの方法が、文献で説明されている。ノランらは、哺乳類細胞でのβ−ガラクトシダーゼ発現を分析する手法について説明している。この手法では、フルオレセイン−ジ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＦＤＧ）をβ−ガラクトシダーゼに関する基質として利用し、これは、加水分解時に、蛍光発光により検出可能な生産物であるフルオレセインを放出する（ノランら，１９９１年）。他の蛍光基質も開発されており、例えば、５−ドデカノイルアミノフルオレセインジ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（Ｃ１２−ＦＤＧ）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）は、生理的培養条件下で、殆どの細胞膜を容易に横断可能な脂肪親和性フルオレセイン誘導体である点において、ＦＤＧと異なっている。
【０１０６】
上で述べたβ−ガラクトシダーゼ検定は、例えば、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓといった超好熱性古細菌から分離される組み換えβ−Ｄ−ガラクトシダーゼを発現する、単一のＥ．ｃｏｌｉ細胞をスクリーニングするのに利用することができる。他のレポータ遺伝子も、基質として有用である場合があり、β−グルコロニダーゼ、アルカリホスフォターゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、及びルシフェラーゼに関して知られている。
【０１０７】
ライブラリは、例えば、特定の酵素活性に関してスクリーニングすることができる。例えば、スクリーニングする酵素活性は、オキシドレダクターゼと、トランスフェラーゼと、ヒドロラーゼと、リアーゼと、イソメラーゼと、リガーゼとである６種類のＩＵＢクラスの一つ以上にすることができる。ＩＵＢクラスの一つ以上に関して陽性であると判断された組み換え酵素は、その後、更に具体的な酵素活性に関して再スクリーニングすることができる。
【０１０８】
代わりに、ライブラリは、更に特化した酵素活性に関してスクリーニングすることができる。例えば、ライブラリは、ヒドロラーゼ活性に関して全般的にスクリーニングする代わりに、更に特化した活性、つまり、ヒドロラーゼが作用する結合のタイプに関してスクリーニングすることができる。したがって、例えば、ライブラリは、（ａ）アミド（ペプチド結合）、つまりプロテアーゼと、（ｂ）エステル結合、つまりエステラーゼ及びリパーゼと、（ｃ）アセタール、つまりグリコシダーゼ及びその他とのような一つ以上の特定の化学的官能性に作用するようなヒドロラーゼを確認するためにスクリーニングすることができる。
【０１０９】
上の態様の一つに関して説明したように、本発明は、微生物に由来する選択されたＤＮＡを含むクローンの活性スクリーニングに関するプロセスを提供し、この方法は：
所定の生体分子又は所定の生物活性に関しライブラリをスクリーニングし、このライブラリが複数のクローンを含み、このクローンが有機体の混合集団、その濃縮集団、又はその分離物から核酸（ゲノムＤＮＡ等）を回収することで作成されるステップと、所定の生体分子又は生物活性に関してスクリーニングするクローンを生成するために宿主を核酸により形質転換するステップとである。
【０１１０】
別の実施形態においては、活性に基づくスクリーニングの前に、濃縮ステップを使用することができる。この濃縮ステップは、例えば、バイオパニング法にすることができる。こうした「バイオパニング」の手順は、２０００年４月２５日に発行された米国特許第６，０５４，００２号において説明及び例証されており、その開示内容は出典を明記することにより本願明細書の一部とする。
【０１１１】
別の実施形態においては、ポリヌクレオチドがクローンに含まれ、このクローンは、有機体の混合集団の核酸配列から作成され、この核酸配列は、有機体の混合集団の遺伝子ライブラリを作成するために使用される。この遺伝子ライブラリは、望ましい活性を有する生物活性を符号化したＤＮＡ配列の全部又は一部である検出可能な分子を有する少なくとも一つの核酸配列によりライブラリを含む宿主細胞をトランスフェクションし、例えば、蛍光系の分析により、望ましい配列を含むライブラリクローンを分離することで、所定の配列に関してスクリーニングされる。
【０１１２】
本発明は、多くのタイプの生物活性に関してスクリーニングを行う能力を提供する。例えば、研究用の新しいポリケチドを生成するために、ポリケチド及びポストポリケチド生合成遺伝子のライブラリから、望ましい成分を選択し組み合わせる能力は、魅力あるものといえる。本発明の複数の方法は、これを可能にするものであり、（特に、Ｆ因子系ベクタ等、大きな挿入を受け入れることが可能なベクタを使用する時に）大きな挿入を含むクローンを備える遺伝子ライブラリの生成が可能となり、これが遺伝子群のクローニングを容易にするため、新しいポリケチド合成酵素と、商業的に関連する二次代謝産物を符号化するその他の関連経路又は遺伝子とのクローニングを容易にする。
【０１１３】
上で説明したバイオパニングのアプローチは、一定のプローブ配列と相同的な配列を運ぶクローンで濃縮されたライブラリを作成するために使用できる。このアプローチを使用することで、４０ｋｂｐまでの挿入と共にクローンを含むライブラリは、パニングの各ラウンド後、約１，０００倍に濃縮することができる。これにより、一ラウンドのバイオパニング濃縮後にスクリーニングされるクローンの数を減らすことができる。このアプローチは、例えば、ポリケチド配列等、所定の生物活性に関連する所定の配列を運ぶクローンに関して濃縮されたライブラリを作成するために適用できる。
【０１１４】
高密度フィルタ又はバイオパニングを使用するハイブリッド形成スクリーニングは、保全された遺伝子を含む経路の相同物を検出する上で効率的なアプローチであることが証明されている。しかしながら、既知の対応物が存在しない可能性のある新しい生物活性分子を発見するためには、別のアプローチが必要になる。本発明の別のアプローチでは、小分子のリング構造又は「バックボーン」の発現に関して、Ｅ．ｃｏｌｉ内でスクリーニングを行う。こうした多環構造を符号化する遺伝子はＥ．ｃｏｌｉ内で発現する場合が多いため、小分子バックボーンは、不活性形態であるとしても、生成することが可能である。生物活性は、構造を修飾又は「デコレート」して活性形態にすることができる必要なグリコシル化及びメチル化遺伝子を発現する適切な宿主に分子又は経路を転送した時点で与えられる。したがって、組み換えによりＥ．ｃｏｌｉ内で発現した不活性リング化合物は、クローンを同定し、次に、ストレプトミセスのように代謝的に豊かな宿主へ輸送し、その後、生物活性分子を生成するために検出される。高スループットロボットシステムの使用により、マイクロタイターディッシュの多重アレイにおいて膨大な数のクローンをスクリーニングすることが可能となる。
【０１１５】
こうした構造を運ぶクローンを検出及び濃縮するアプローチの一つでは、キャピラリスクリーニング法又はＦＡＣＳスクリーニングを使用し、１９９７年６月１６日に出願された米国出願番号第０８／８７６，２７６号において、手順が説明及び例証されている。多環リング化合物は、通常、紫外線光によって励起される時、特徴的な蛍光スペクトルを有する。したがって、こうした構造を発現するクローンは、十分な感度の検出方法を使用して背景から識別することができる。例えば、高スループットＦＡＣＳスクリーニングは、Ｅ．ｃｏｌｉライブラリの小分子バックボーンに関するスクリーニングに利用することができる。市販のＦＡＣＳ装置は、ＵＶ活性分子に関して、毎秒１００，０００クローンまでをスクリーニングする能力を有する。こうしたクローンは、更にＦＡＣＳスクリーニングで選別することが可能であり、或いは、定在のプラスミドを抽出し、活性スクリーニングのためにストレプトミセスへ輸送することができる。
【０１１６】
代替のスクリーニングアプローチにおいては、ストレプトミセス宿主への輸送後、候補クローンからの有機抽出物を、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ又はＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｖｉｓｉａｅ等のテスト有機体に対する感受性スクリーニングにより、生物活性に関してテストすることができる。
【０１１７】
本発明によって提供される上で述べたスクリーニング法の代替方法は、「混合抽出」スクリーニングと呼ばれるアプローチである。「混合抽出」スクリーニングのアプローチは、ストレプトミセス等の代謝的に豊かな宿主において多環バックボーンが発現される時、活性を与えるために補助遺伝子が必要であるという事実と、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで生物活性化合物を生成するために、酵素を抽出し、Ｅ．ｃｏｌｉクローンから抽出されたバックボーンと組み合わせることが可能であるという事実を利用する。様々な成長段階で、ストレプトミセス菌株等の代謝的に豊かな宿主からの酵素抽出標本は、Ｅ．ｃｏｌｉライブラリからの有機抽出物のプールと結合され、その後、生物活性に関して評価される。
【０１１８】
Ｅ．ｃｏｌｉクローンにおける活性を検出する別のアプローチでは、生物活性化合物を異なる形態へ変換できる遺伝子に関してスクリーニングが行われる。例えば、最近では、低価値のダウノマイシンを価値の高いドキソルビシンに変換することが可能な組み換え酵素が発見されている。同様の酵素経路は、ペニシリンをセファロスポリンに変換するために探求されている。
【０１１９】
キャピラリスクリーニングは、例えば、ストレプトミセス等の代謝的に豊かな宿主におけるＵＶ蛍光分子の発現を検出するために使用することができる。組み換えオキシテトラサイクリンは、Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓ  ＴＫ２４において非相同的に生成される時、診断的な赤色蛍光を維持する。本発明の方法及びシステムによって同定可能な経路のクローンは、したがって、高スループット方式で、多環の分子に関してスクリーニングできる。
【０１２０】
組み換え生物活性化合物は、「ツーハイブリッド」システムを使用して、ｉｎ  ｖｉｖｏでスクリーニングすることが可能であり、これは、転写因子とその活性物質との間、或いはレセプタとその同族ターゲットとの間にあるような、タンパク質−タンパク質又はその他の相互作用のエンハンサ及びインヒビタを検出することができる。この実施形態では、小分子経路とＧＦＰレポータ構成物との両方が、共発現する。ＧＦＰ発現において変化したクローンは、その後、同定することが可能であり、このクローンは特徴付けのために分離される
指摘したように、薬品を発見する一般的なアプローチには、疾病ターゲット（疾病の発生に関与する高分子）を治療活性に関してテストされる潜在的薬品候補に晒すスクリーニング検定が伴う。他のアプローチでは、バクテリア又は腫瘍細胞株等、代表的な疾病の原因物質である完全な細胞又は有機体を、スクリーニングの目的で潜在的候補に晒す。こうした任意のアプローチは、本発明で利用することができる。
【０１２１】
本発明では、更に、異種発現と、上で簡単に説明した様々なスクリーニングアプローチを使用した所定の生物活性化合物に関する下流でのスクリーニングとのために、未培養試料に由来するクローン経路を、代謝的に豊かな宿主に転送することが可能となる。
【０１２２】
遺伝子ライブラリからの異なる発現クローンをそれぞれ含む生存又は非生存細胞をスクリーニングし、陽性のクローンを回収した後、この技術で広く知られる手法を利用して、陽性クローンからＤＮＡを分離することができる。このＤＮＡは、その後、この技術で知られている任意の様々な増幅手法を利用して、ｉｎ  ｖｉｖｏ又はｉｎ  ｖｉｔｒｏのいずれかで増幅することができる。ｉｎ  ｖｉｖｏ増幅は、（複数の）クローン又は（複数の）サブクローンを生存に適した宿主へと転換し、続いて宿主を成長させることを含む。ｉｎ  ｖｉｖｏ増幅は、ポリメラーゼ連鎖反応等の手法を使用して実行できる。増幅後、同定された配列は、「進化」させること、或いは配列決定することが可能である。
【０１２３】
本発明が提供する利点の一つは、変更した配列、活性、又は特異性を有する符号化された変異体を生成及び選択するために、同定された生体分子又は生物活性を操作する能力である。
【０１２４】
スクリーニングが実行された生体分子又は生物活性を有すると判断されたクローンには、定方向突然変異生成を施し、望ましい特性を有する新しい生体分子又は生物活性を開発すること、或いは、熱又は有機溶媒に対する安定性等、自然状態（野生型の活性等）では欠如しているか又は顕著ではない特に望ましい特性を有する修飾生体分子又は生物活性を開発することができる。定方向突然変異生成に関する任意の既知の手法を、本発明に適用することができる。例えば、本発明による使用において特に好適な突然変異生成手法は、下で説明するものを含む。
【０１２５】
代わりに、本明細書で説明するように取得、同定、又はクローニングされた生体分子（例えば、ペプチド、タンパク質、又はポリヌクレオチド配列）又は生物活性（例えば、酵素活性）に変化を与えることが望ましい場合がある。こうした変化は、例えば、ポリペプチドの活性と、特異性と、親和性と、機能と、その他とを増加又は減少させるために、生体分子又は生物活性を修飾することができる。ＤＮＡシャッフリングは、実質的に相同だが同一ではない配列の間での組み換えを示すものであり、一部の実施形態において、ＤＮＡシャッフリングは、ｃｅｒ／ｌｏｘ及び又はｆｌｐ／ｆｒｔ系を介するような、非相同組み換えを介した乗り換えを伴う場合がある（例えば、出典を明記することによりその開示内容を本願明細書の一部とする１９９７年８月１７日にジェイ・ショート博士に対して発行され、Ｄｉｖｅｒｓａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎに譲渡された米国特許第５，９３９，２５０号を参照）。ポリヌクレオチド又はポリペプチド配列をシャッフリングすること、突然変異させること、或いはこれらに変化を与えることに関する様々な方法については、下で説明する。
【０１２６】
核酸シャッフリングは、ポリヌクレオチド又は（複数の）ポリヌクレオチドを生成するために、短い又は小さいポリヌクレオチドのプールをｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏで相同組み換えする方法である。関連する核酸配列又はポリヌクレオチドの混合物に、ランダムなポリヌクレオチドを提供するセクシャルＰＣＲを施し、組み換えハイブリッド核酸分子又はポリヌクレオチドのライブラリ又は混合集団を生成するために、これを再構成する。カセット式突然変異生成とは対照的に、シャッフリング及びエラープローンＰＣＲのみで、配列のプールを盲目的に（プライマ以外の配列情報なしに）突然変異させることができる。
【０１２７】
反復選択に関してエラープローンＰＣＲのみと比較した本発明の突然変異生成シャッフリングの利点は、次のように説明することで最も理解できる。ＤＮＡシャッフリングについて、（セクシャルＰＣＲではなく）エラープローンＰＣＲと比較して考える。選択又はプールされた配列の最初のライブラリは、様々な起源の関連配列で構成される可能性があり、或いは、単一の遺伝子の任意のタイプの突然変異生成（シャッフリングを含む）に由来する可能性がある。選択された配列の集合は、活性選択の第一のラウンド後に取得される。シャッフリングにより、例えば、すべての関連配列の自由な組み合わせでの関連付けが可能になる。
【０１２８】
この方法は、逆連鎖反応である点において、エラープローンＰＣＲとは異なる。エラープローンＰＣＲにおいては、ポリメラーゼ開始部位の数と、分子の数とは、指数関数的に増加する。しかしながら、ポリメラーゼ開始部位の配列と、分子の配列とは、本質的に同じ状態を維持する。対照的に、核酸の再構成、或いはランダムなポリヌクレオチドのシャッフリングでは、開始部位の数と、ランダムなポリヌクレオチドの数（サイズではない）とは、経時的に減少する。プラスミド全体に由来するポリヌクレオチドに関して、理論的な終点は、単一の大きなコンカテマ分子である。
【０１２９】
乗り換えは相同の領域で発生するため、組み換えは、主に、同じ配列ファミリの構成要素間で発生する。これにより、著しく不適合な配列（例えば、異なる活性又は特異性を有する）の組み合わせは阻止される。配列の多数のファミリを、同じ反応内でシャッフリングできると考えられる。更に、シャッフリングでは、一般に、相対順序が保護される。
【０１３０】
シャッフルされるものは、まれに、多数の最善の分子（例えば、最高の活性又は特異性）を含むことになり、こうしたまれなものは、その優れた活性又は特異性に基づいて選択することができる。
【０１３１】
１００種類のポリペプチド配列のプールは、１０３種類の方法で並べ替えることができる。こうした多数の並べ替えは、ＤＮＡ配列の単一のライブラリでは表現できない。したがって、望ましい配列の長さ及び配列多様性に応じて、多数のサイクルのＤＮＡシャッフリング及び選択が必要になる場合があると考えられる。エラープローンＰＣＲは、対照的に、選択された配列をすべて同じ相対的な方向性で維持し、遙かに小さな突然変異体の群れを生成する。
【０１３２】
本発明の方法で使用することが可能な鋳型ポリヌクレオチドは、ＤＮＡ又はＲＮＡにすることができる。これは、遺伝子、或いは、組み換え又は再構成する短い又は小さいポリヌクレオチドのサイズに応じて、様々な長さにすることができる。好ましくは、鋳型ポリヌクレオチドは、５０ｂｐ乃至５０ｋｂである。所定のタンパク質を符号化する核酸を含むベクタ全体を、本発明の方法において使用することができると考えられ、実際に、使用に成功している。
【０１３３】
鋳型ポリヌクレオチドは、ＰＣＲ反応（米国特許第４，６８３，２０２号及び第４，６８３，１９５号）或いはその他の増幅又はクローニング方法を使用した増幅により取得することができる。しかしながら、ＰＣＲ産物のプールを行う前に、ＰＣＲ産物から遊離プライマを除去することで、セクシャルＰＣＲは、更に効率的な結果を提供できる。セクシャルＰＣＲの前に、オリジナルのプールからプライマを十分に除去しなかった場合は、乗り換えクローンの頻度が低くなる可能性がある。
【０１３４】
鋳型ポリヌクレオチドは、二本鎖である場合が多い。結果として生じる一本鎖ポリヌクレオチドが互いに相補的であり、したがって、ハイブリッド形成により二本鎖分子を形成できる状態を確保するために、二本鎖核酸分子が推奨される。
【０１３５】
鋳型ポリヌクレオチドとの同一性領域と、鋳型テンプレートとの異種領域とを有する一本鎖又は二本鎖核酸ポリヌクレオチドを、このステップで鋳型ポリヌクレオチドに追加できると考えられる。更に、二種類の関連するポリヌクレオチド鋳型を、このステップで混合できると考えられる。
【０１３６】
二本鎖ポリヌクレオチド鋳型と、追加した任意の二本鎖又は一本鎖ポリヌクレオチドとは、約５ｂｐ乃至５ｋｂ以上の混合物を提供するための緩慢化又は停止を含むセクシャルＰＣＲを受ける。好ましくは、ランダムなポリヌクレオチドのサイズは、約１０ｂｐ乃至１０００ｂｐであり、更に好ましくは、ポリヌクレオチドのサイズは、約２０ｂｐ乃至５００ｂｐである。
【０１３７】
代わりに、多数のニックを有する二本鎖核酸を、本発明の方法において使用できると考えられる。ニックとは、二本鎖核酸の一本の鎖における切れ目である。こうしたニック間の距離は、好ましくは、５ｂｐ乃至５ｋｂであり、更に好ましくは、１０ｂｐ乃至１０００ｂｐである。これにより、例えば、ランダムプライマから生じたポリヌクレオチドと共に含まれる短い又は小さいポリヌクレオチドを生成する自給エリアを提供できる。
【０１３８】
任意の特定の一ポリヌクレオチドの濃度は、重量で、ポリヌクレオチド合計の１％を上回ることはなく、更に好ましくは、任意の特定の一核酸配列の濃度は、重量で、核酸合計の０．１％を上回ることはない。
【０１３９】
混合物における種類の異なる特定のポリヌクレオチドの数は、少なくとも約１００であり、好ましくは、少なくとも約５００であり、更に好ましくは、少なくとも約１０００である。
【０１４０】
このステップでは、合成又は自然発生である一本鎖又は二本鎖ポリヌクレオチドを、ポリヌクレオチドの混合物の異種性を高めるために、ランダムな二本鎖の短い又は小さいポリヌクレオチドに追加することができる。
【０１４１】
更に、二本鎖のランダムに切れたポリヌクレオチドの集団は、このステップにおいて、セクシャルＰＣＲプロセスからのポリヌクレオチドと混合すること又は組み合わせることが可能であり、随意的に一回以上のセクシャルＰＣＲサイクルを施すことができると考えられる。
【０１４２】
鋳型ポリヌクレオチドへの突然変異体の挿入が望ましい場合、鋳型ポリヌクレオチドとの同一性領域と、鋳型ポリヌクレオチドとの異種領域とを有する一本鎖又は二本鎖ポリヌクレオチドを、核酸合計と比較して２０倍超過する重量で追加することが可能であり、更に好ましくは、一本鎖ポリヌクレオチドを、核酸合計と比較して１０倍超過する重量で追加することができる。
【０１４３】
種類は異なるが関連する鋳型ポリヌクレオチドの混合物が望ましい場合は、鋳型のそれぞれからのポリヌクレオチドの集団を、約１：１００を下回る比率で、更に好ましくは、約１：４０を下回る比率で、組み合わせることができる。例えば、中立突然変異（選択されている表現型特性において、実体のない変更が生じる突然変異）を排除するために、突然変異したポリヌクレオチドの集団による野生型ポリヌクレオチドの戻し交配が必要になる場合がある。こうした例において、ランダムに提供されるセクシャルＰＣＲサイクルのハイブリッドポリヌクレオチドに追加することが可能なランダムに提供される野生型ポリヌクレオチドの比率は、約１：１乃至約１００：１であり、更に好ましくは、１：１乃至４０：１である。
【０１４４】
ランダムなポリヌクレオチドの混合集団は、変性させて一本鎖ポリヌクレオチドを形成し、その後、再アニーリングする。他の一本鎖ポリヌクレオチドとの相同性領域を有する一本鎖ポリヌクレオチドのみを、再アニーリングすることになる。
【０１４５】
ランダムなポリヌクレオチドは、加熱により変性させることができる。二本鎖核酸を完全に変性させるために必要な条件は、当業者が判断できる。好ましくは、この温度は、８０℃乃至１００℃であり、更に好ましくは、この温度は、９０℃乃至９６℃である。ポリヌクレオチドを変性させるために使用できる他の方法は、圧力及びｐＨを含む。
【０１４６】
このポリヌクレオチドは、冷却により再アニーリングすることができる。好ましくは、この温度は、２０℃乃至７５℃であり、更に好ましくは、この温度は、４０℃乃至６５℃である。相同性の四連続塩基のみの平均に基づいて、高頻度の乗り換えが必要な場合は、低いアニーリング温度を使用して、組み換えを強制できるが、このプロセスは更に難しくなる。発生する再生の度合いは、一本鎖ポリヌクレオチドの集団における相同性の度合いに応じて変化する。
【０１４７】
再生は、ポリエチレングリコール（「ＰＥＧ」）又は塩を追加することで、加速できる。塩濃度は、好ましくは、０ｍＭ乃至２００ｍＭであり、更に好ましくは、塩濃度は、１０ｍＭ乃至１００ｍＭである。この塩は、ＫＣｌ又はＮａＣｌにすることができる。ＰＥＧの濃度は、好ましくは０％乃至２０％であり、更に好ましくは、５％乃至１０％である。
【０１４８】
アニーリングしたポリヌクレオチドは、次に、核酸ポリメラーゼ及びｄＮＴＰ（つまり、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、及びｄＴＴＰ）が存在する状態で培養される。核酸ポリメラーゼは、クレノウフラグメント、Ｔａｑポリメラーゼ、或いは、この技術で知られている他の任意のＤＮＡポリメラーゼにすることができる。
【０１４９】
この組み立てに使用されるアプローチは、更に乗り換えを発生させる最低限の相同性の度合いに応じて変化する。同一のエリアが大きい場合は、Ｔａｑポリメラーゼを、４５乃至６５℃のアニーリング温度で使用することができる。同一のエリアが小さい場合は、クレノウポリメラーゼを、２０乃至３０℃のアニーリング温度で使用することができる。当業者は、アニーリングの温度を変化させて、達成する乗り換えの数を増やすことができる。
【０１５０】
ポリメラーゼは、アニーリングの前に、アニーリングと同時に、或いはアニーリング後に、ランダムなポリヌクレオチドに追加することができる。
【０１５１】
変性と、再生と、ポリメラーゼが存在する状態での培養とのサイクルは、本明細書において、核酸のシャッフリング又は再構成と呼ばれる。このサイクルは、望ましい回数に渡って繰り返される。好ましくは、このサイクルは、２乃至５０回繰り返され、更に好ましくは、このシーケンスは、１０乃至４０回繰り返される。
【０１５２】
結果として生じた核酸は、約５０ｂｐ乃至約１００ｋｂの大きな二本鎖ポリヌクレオチドであり、好ましくは、この大きなポリヌクレオチドは、５００ｂｐ乃至５０ｋｂである。
【０１５３】
この大きなポリヌクレオチドは、鋳型ポリヌクレオチドと同じサイズを有するポリヌクレオチドの多数のコピーを、タンデム状態で含むことができる。このコンカテマポリヌクレオチドは、その後、鋳型ポリヌクレオチドの単一のコピーへと変性させる。結果として、鋳型ポリヌクレオチドとほぼ同じサイズのポリヌクレオチドの集団が生じる。この集団は、同一のエリアと異種のエリアとを有する一本鎖又は二本鎖ポリヌクレオチドをシャッフリング前の鋳型ポリヌクレオチドに追加した混合集団となる。こうしたポリヌクレオチドは、その後、バクテリアの形質転換に使用される適切なベクタ及びライゲーション混合物でクローニングされる。
【０１５４】
単一のポリヌクレオチドは、コンカテマの消化によってではなく、ＰＣＲを含む様々な方法によってクローニング前に単一のポリヌクレオチドを増幅することによって、大きなコンカテマポリヌクレオチドから取得できると考えられる（米国特許第４，６８３，１９５号及び第４，６８３，２０２号）。
【０１５５】
クローニングに使用されるベクタは、望ましいサイズのポリヌクレオチドを受け入れるのであれば、決定的な要素にはならない。特定のポリヌクレオチドの発現が望ましい場合、このクローニング用運搬体は、ポリヌクレオチドの挿入部位の隣に転写及び翻訳信号を更に含み、宿主細胞におけるポリヌクレオチドの発現を可能にする。
【０１５６】
結果として生じたバクテリア集団は、ランダムな突然変異を有する多数の組み換えポリヌクレオチドを含む。この混合集団は、望ましい組み換えポリヌクレオチドを同定するためにテストできる。選択の方法は、望ましいポリヌクレオチドに応じて変化する。
【０１５７】
例えば、本明細書で説明した方法により同定したポリヌクレオチドが第一の結合親和性を有するタンパク質を符号化する場合、後に突然変異させた（例えば、シャッフリングした）配列は、リガンドに対する結合効率が増加していることが望ましい。こうしたケースにおいて、集団又はライブラリ内のポリヌクレオチドのそれぞれの部分によって発現したタンパク質は、この技術で知られている方法（パニング、アフィニティクロマトグラフィ等）により、リガンドと結合する能力についてテストすることができる。薬物耐性が増加したタンパク質を符号化するポリヌクレオチドが望ましい場合、集団又はライブラリ内のポリヌクレオチドのそれぞれの部分によって発現したタンパク質は、宿主有機体に薬物耐性を与える能力についてテストすることができる。当業者は、望ましいタンパク質の知識を与えられた場合、タンパク質に望ましい特性を与えるポリヌクレオチドを同定するために集団を容易にテストすることができる。
【０１５８】
当業者は、タンパク質の断片をファージ表面の融合タンパク質として発現させるファージディスプレイシステムを使用することができると考えられる（ウィスコンシン州ミルウォーキのＰｈａｒｍａｃｉａ）。組み換えＤＮＡ分子は、ファージＤＮＡにおいて、融合タンパク質の転写が生じる部位でクローニングされ、融合タンパク質の一部は、組み換えＤＮＡ分子によって符号化される。組み換え核酸分子を含むファージは、細胞内で複製及び転写される。融合タンパク質のリーダ配列は、ファージ粒子の先端への融合タンパク質の運搬を命令する。したがって、組み換えＤＮＡ分子によって部分的に符号化された融合タンパク質は、上で説明した方法による検出及び選択のために、ファージ粒子上でディスプレイされる。
【０１５９】
更に、第一の集団の小集団からのポリペプチドにより、多数のサイクルの核酸シャッフリングを実行できると考えられ、この小集団は、望ましい組み換えタンパク質を符号化するＤＮＡを含む。これにより、更に高い結合親和性又は酵素活性を有するタンパク質を達成することができる。
【０１６０】
更に、小集団からの任意のサイレント突然変異を除去するために、野生型ポリヌクレオチドと、核酸シャッフリングの第一又はその後のラウンドからの核酸の小集団との混合物により、多数のサイクルの核酸シャッフリングを実行できると考えられる。
【０１６１】
精製形態である核酸の任意のソースを、開始する核酸として利用できる。したがって、このプロセスは、メッセンジャＲＮＡを含むＤＮＡ又はＲＮＡを利用することが可能であり、このＤＮＡ又はＤＮＡは一本鎖又は二本鎖にすることができる。加えて、それぞれの一本鎖を含むＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドを利用することができる。核酸配列は、突然変異させる核酸配列のサイズに応じて、様々な長さにすることができる。好ましくは、特定の核酸配列は、５０乃至５０，０００塩基対である。所定のタンパク質を符号化する核酸を含むベクタ全体を、本発明の方法で使用できると考えられる。
【０１６２】
任意の特定の核酸配列を使用して、本プロセスによってハイブリッドの集団を生成することができる。必要となるのは、存在している或いは本プロセスで利用可能な、特定の核酸配列のハイブリッド配列の小さな集団のみである。
【０１６３】
突然変異を有する特定の核酸配列の集団は、多数の種類の方法によって形成することができる。突然変異は、エラープローンＰＣＲによって形成することができる。エラープローンＰＣＲは、低忠実度の重合条件を使用して、長い配列全体で低レベルの点突然変異をランダムに導入する。代わりに、突然変異は、オリゴヌクレオチド指定突然変異生成によって、鋳型ポリヌクレオチドに導入することができる。オリゴヌクレオチド指定突然変異生成では、ポリヌクレオチドの短い配列を、制限酵素消化を使用してポリヌクレオチドから除去し、様々な塩基をオリジナルの配列から変化させた合成ポリヌクレオチドに置き換える。このポリヌクレオチド配列は、化学的突然変異生成によって変更することもできる。化学的突然変異原は、例えば、亜硫酸水素ナトリウム、亜硝酸、ヒドロキシルアミン、ヒドラジン、又は蟻酸を含む。ヌクレオチド前駆体の類似体であるその他の作用因子は、ニトロソグアニジン、５−ブロモウラシル、２−アミノプリン、又はアクリジンを含む。一般に、こうした作用因子は、ヌクレオチド前駆体の位置でＰＣＲ反応に追加し、これにより、配列を突然変異させる。プロフラビン、アクリフラビン、キナクリン、及びその他といった挿入剤を使用することもできる。ポリヌクレオチド配列のランダムな突然変異生成は、Ｘ線又は紫外線の照射によって達成することもできる。一般に、このように突然変異生成したプラスミドのポリヌクレオチドは、Ｅ．ｃｏｌｉに導入し、ハイブリッドプラスミドのプール又はライブラリとして増殖させる。
【０１６４】
代わりに、特定の核酸の小さな混合集団は、同じ遺伝子の様々な対立遺伝子、或いは様々な関連する種からの同じ遺伝子（つまり同族遺伝子）で構成される点において、自然状態で発見することができる。代わりに、これらは、例えば、免疫グロブリン遺伝子といった一つの種の中で発見される関連ＤＮＡ配列にすることができる。
【０１６５】
特定の核酸配列の混合集団が生成された後、ポリヌクレオチドは、この技術で広く知られる手法を利用して、直接使用すること、或いは、適切なクローニングベクタに挿入することが可能である。
【０１６６】
ベクタの選択は、本発明の方法において利用するポリヌクレオチド配列及び宿主細胞のサイズに応じて変化する。本発明の鋳型は、プラスミド、ファージ、コスミド、ファージミド、ウイルス（例えば、レトロウイルス、パラインフルエンザウイルス、ヘルペスウイルス、レオウイルス、パラミクソウイルス、及びその他）、又はその選択部分（例えば、コートタンパク質、スパイク糖タンパク質、カプシドタンパク質）にすることができる。例えば、コスミド及びファージミドは、突然変異させる特定の核酸配列が大きい場合に好適であり、これは、こうしたベクタが大きなポリヌクレオチドを安定して増殖させることができるためである。
【０１６７】
特定の核酸配列の混合集団は、ベクタでクローニングする場合には、クローン的に増幅することができる。有用性は、発現ポリペプチドをスクリーニングすることで容易に判断できる。
【０１６８】
本発明のＤＮＡシャッフリング法は、未知の配列のプールで盲目的に実行することができる。（再構成する配列と相同の末端を有する）再構成混合物のオリゴヌクレオチドに追加することで、任意の配列混合物を、任意の特定の位置で、別の配列混合物に組み込むことができる。したがって、合成オリゴヌクレオチド、ＰＣＲポリヌクレオチド、或いは更に、完全な遺伝子の混合物を、別の配列ライブラリに、定義した位置で混合することができる。一つの配列（混合物）の挿入は、鋳型の別の部分における配列の挿入から独立している。したがって、組み換えの度合いと、必要な相同性と、ライブラリの多様性とは、再構成されるＤＮＡの長さと共に、独立して同時に変化させることができる。
【０１６９】
シャッフリングでは、多様性の領域を分離する相同性領域の存在が必要となる。足場状タンパク質構造は、シャッフリングに特に適している場合がある。保全された足場は、自己会合により全体的な折り畳みを決定し、同時に、特定の結合を仲介する比較的制限のないループを示す。こうした足場の例は、この技術で広く知られている免疫グロブリンβ−バレル及び四本ヘリックスバンドルである。このシャッフリングは、突然変異させた配列の様々な組み合わせでの結合により、足場状タンパク質を作成するために使用できる。
【０１７０】
一部の標準的な遺伝交配と同等のものを、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのシャッフリングにより実行することもできる。例えば、「分子的戻し交配」は、所定の突然変異を選択する間に、ハイブリッドの核酸を野生型の核酸に繰り返し混合することで実行できる。従来の品種改良と同様に、このアプローチは、様々なソースからの表現型を選択した背景に組み合わせるために使用することができる。これは、例えば、選択していない特徴（免疫原性等）に影響する中立突然変異の除去にとって有用である。したがって、これは、強化された生物学的活性に、タンパク質内のどの突然変異が関与しており、どれが関与していないかを判断するのに有用である場合があり、この利点はエラープローン突然変異生成又はカセット式突然変異生成法では達成できないものである。
【０１７１】
大きな機能遺伝子は、小さくランダムなポリヌクレオチドの混合物から、正確に組み立てることができる。この反応は、極めて断片化した化石のＤＮＡからの遺伝子の再構成に使用することができる。加えて、化石からのランダムな核酸配列は、関連する種の類似遺伝子からのポリヌクレオチドに組み合わせることができる。
【０１７２】
更に、本発明の方法は、様々な研究及び診断用途で必要とされるような、単一の細胞からの完全なゲノムのｉｎ  ｖｉｔｒｏ増幅に使用することができると考えられる。ＰＣＲによるＤＮＡ増幅は、通常、約４０ｋｂの配列を含む。ＰＣＲによるＥ．ｃｏｌｉ（５，０００ｋｂ）等の完全なゲノムの増幅では、１２５の４０ｋｂポリヌクレオチドを発生させる約２５０のプライマが必要となる。一方、セクシャルＰＣＲサイクルによるゲノムのポリヌクレオチドのランダム生産と、これに続く小さなポリヌクレオチドのゲル精製とでは、可能性のある多数のプライマが提供される。このランダムな小さいポリヌクレオチドの混合物を、ＰＣＲ反応におけるプライマとして、単独で、或いは、鋳型として完全なゲノムと共に、使用した場合には、ゲノムの多くのコピーを含む単一のコンカテマを理論上の終点とする逆連鎖反応が生じる。
【０１７３】
ランダムなヌクレオチドのみを使用した時には、コピー数の１００倍の増幅と、５０ｋｂを上回る平均ポリヌクレオチドのサイズとが得られる。大きなコンカテマは、多くの小さなポリヌクレオチドの重複によって生成されると考えられる。合成プライマを使用して得られる特定のＰＣＲ産物の品質は、未増幅ＤＮＡから得られる産物と区別できない。このアプローチは、ゲノムのマッピングに有用であると予想される。
【０１７４】
シャッフリングされるポリヌクレオチドは、実施者の判断により、ランダム又は非ランダムなポリヌクレオチドとして生成することができる。更に、本発明は、広範なポリヌクレオチドのサイズ及びタイプに適用可能なシャッフリングの方法を提供し、これには、大きなポリヌクレオチドの再構成において基礎単位として使用されるポリヌクレオチドモノマを生成するステップが含まれる。例えば、この基礎単位は、遺伝子の断片にすることが可能であり、或いは、遺伝子全体又は遺伝子経路、又はその任意の組み合わせを含むことができる。
【０１７５】
ｉｎ  ｖｉｖｏシャッフリングの実施形態において、特定の核酸配列の混合集団は、少なくとも二種類の核酸配列が各宿主細胞に存在するような条件下で、バクテリア細胞又は真核細胞に導入される。このポリヌクレオチドは、様々な方法で宿主細胞に導入することができる。宿主細胞は、例えば、塩化カルシウムによる処理等、この技術で知られている方法を使用して、小さなポリヌクレオチドにより形質転換することができる。ポリヌクレオチドがファージゲノムに挿入される場合、宿主細胞は、特定の核酸配列を有する組み換えファージゲノムによりトランスフェクションすることができる。代わりに、この核酸配列は、エレクトロポレーション、トランスフェクション、リポフェクション、バイオリスティクス、接合、及びその他を使用して、宿主細胞に導入することができる。
【０１７６】
一般に、この実施形態において、特定の核酸配列は、この配列を宿主細胞内で安定して複製できるベクタ内に存在することになる。加えて、ベクタは、ベクタを有する宿主細胞を選択できるように、マーカ遺伝子を符号化することになると考えられる。これにより、突然変異させた特定の核酸配列を、宿主細胞への導入後に回収できる状態が確保される。しかしながら、特定の核酸配列の混合集団全体が、ベクタ配列上に存在する必要はないと考えられる。むしろ、宿主細胞へのポリヌクレオチドの導入後、各宿主細胞が、内部に少なくとも一つの特定の核酸配列が存在する一つのベクタを含む状態を確保するために、ベクタでクローニングする必要があるのは、十分な数の配列のみである。更に、特定の核酸配列の集団のサブセットをベクタでクローニングするのではなく、このサブセットが、既に宿主細胞に安定して統合されている可能性があると考えられる。
【０１７７】
同一性領域を有する二つのポリヌクレオチドが宿主細胞に挿入される時、二つのポリヌクレオチド間で相同的組み換えが発生することが分かっている。突然変異させた二つの特定の核酸配列間でのこうした組み換えにより、一部の状況では、二重又は三重ハイブリッドの生成が生じることになる。
【０１７８】
更に、突然変異させた特定の核酸配列の一部が線状核酸分子上に存在する場合、組み換えの頻度が増加することが分かっている。そのため、一実施形態において、特定の核酸配列の一部は、線状ポリヌクレオチド上に存在する。
【０１７９】
形質変換後、宿主細胞の形質転換体は、望ましい品質を有する突然変異させた特定の核酸配列を含む宿主細胞の形質転換体を同定するために、選択の対象とされる。例えば、特定の薬物に対する耐性の増加が望ましい場合、形質転換された宿主細胞には、濃度を高めた特定の薬物の影響を与えることが可能であり、増加した薬物耐性を与えることができる突然変異タンパク質を生成した形質変換体が選択されることになる。特定のタンパク質がレセプタと結合する能力を高めることが望ましい場合、形質転換体からタンパク質の発現を誘導することが可能であり、結果として生じたタンパク質を、この技術で知られている方法によって、リガンド結合検定において評価し、リガンドに対する結合の強化を示す突然変異集団のサブセットを同定する。代わりに、タンパク質を別のシステムで発現させ、適切な処理を確保することができる。
【０１８０】
望ましい特徴を有する第一の組み換え済みの特定の核酸配列のサブセット（娘配列）は、同定された後、第二のラウンドの組み換えを受ける。組み換えの第二のサイクルでは、組み換え済みの特定の核酸配列は、オリジナルである突然変異させた特定の核酸配列（親配列）と混合することが可能であり、このサイクルは、上で説明したように繰り返される。この方法では、強化された特徴を有する、或いは強化された特徴を有するプロテインを符号化する、第二の組み換え済みの特定の核酸配列のセットを同定することができる。このサイクルは、望ましい回数に渡って繰り返すことができる。
【０１８１】
更に、第二の又はその後の組み換えサイクルにおいて、戻し交配を実行させることができると考えられる。分子的戻し交配は、少なくとも一つの野生型核酸配列と突然変異させた核酸配列とが形質変換後の同じ宿主細胞に存在するように、望ましい特定の核酸配列を多数の野生型配列と混合することで実行できる。野生型の特定の核酸配列との組み換えにより、免疫原性等の選択していない特徴に影響するが、選択した特徴に影響しない可能性がある中立突然変異が除去されることになる。
【０１８２】
本発明の別の実施形態においては、宿主細胞への導入前にＰＣＲ増幅を緩慢化又は停止することで、第一のラウンド中に、特定の核酸配列のサブセットを、小さなポリヌクレオチドとして生成することができると考えられる。ポリヌクレオチドのサイズは、他の配列と相同的に組み換えできるように、他の配列とのいくつかの同一性領域を含むのに十分な大きさでなければならない。ポリヌクレオチドのサイズは、０．０３ｋｂ乃至１００ｋｂの範囲となり、更に好ましくは、０．２ｋｂ乃至１０ｋｂとなる。更に、後に続くラウンドにおいて、以前のラウンドから選択された配列以外の特定の核酸配列のすべては、宿主細胞に導入する前にＰＣＲポリヌクレオチドを生成するために利用することができる。
【０１８３】
短いポリヌクレオチド配列は、一本鎖又は二本鎖にすることができる。核酸の鎖を分離するのに適した反応条件は、この技術で広く知られている。
【０１８４】
このプロセスのステップは、無制限に繰り返すことが可能であり、達成できる可能性があるハイブリッドの数によってのみ制限される。
【０１８５】
そのため、突然変異させた鋳型核酸の最初のプール又は集団は、Ｅ．ｃｏｌｉ等、バクテリア内での複製が可能なベクタでクローニングされる。Ｅ．ｃｏｌｉでの自律複製が可能である限り、特定のベクタが不可欠になることはない。一実施形態において、このベクタは、ベクタと結びつく突然変異させた特定の核酸によって符号化される任意のタンパク質の発現及び生成を可能にするように設計される。更に、好ましくは、このベクタは、選択可能なマーカを符号化する遺伝子を含む。
【０１８６】
突然変異させた核酸配列のプールを含むベクタの集団は、Ｅ．ｃｏｌｉ宿主細胞に導入される。ベクタの核酸配列は、形質転換、トランスフェクション、或いはファージの場合の感染によって導入することができる。バクテリアを形質転換するのに使用されるベクタの濃度は、多数のベクタが各細胞に導入されるようなものにする。細胞内に入った後、相同的組み換えの効率は、相同的組み換えが様々なベクタ間で発生するようなものにする。この結果、オリジナルの親突然変異配列とは異なる突然変異の組み合わせを有するハイブリッド（娘）が生成される。宿主細胞は、その後、ベクタに存在するマーカ遺伝子に関して、クローン的に複製され、選択される。プラスミドを有する細胞のみが、選択の対象として成長することになる。ベクタを含む宿主細胞は、その後、好ましい突然変異の存在に関してテストされる。
【０１８７】
望ましい特徴を与える特定の娘突然変異核酸が同定された後、この核酸は、既にベクタと結びついた状態或いはベクタから離れた状態のいずれかで、分離される。この核酸は、その後、第一の又は親である核酸の集団と混合され、このサイクルが繰り返される。
【０１８８】
親である突然変異させた特定の核酸の集団は、ポリヌクレオチドとして、或いは同じベクタでクローニングされ、既に娘核酸を含む宿主細胞に導入される。細胞内では組み換えの発生が可能となり、次世代の組み換え体、又は孫娘が、上で説明した方法によって選択される。このサイクルは、望ましい特徴を有する核酸又はペプチドが得られるまで、何度も繰り返すことができる。その後のサイクルにおいて、ハイブリッドに追加する突然変異させた配列の集団は、親ハイブリッド又は任意の配列世代に由来するものでよい。
【０１８９】
代替の実施形態において、本発明は、任意の中立突然変異を排除するために、取得された組み換え済みの特定の核酸の「分子的」戻し交配を実施する方法を提供する。中立突然変異は、核酸又はペプチドに望ましい特性を与えない突然変異である。しかしながら、こうした突然変異は、核酸又はペプチドに望ましくない特徴を与える。したがって、こうした中立突然変異を排除することが望ましい。本発明の方法は、これを行う手段を提供する。
【０１９０】
この実施形態においては、実施形態の方法によって、望ましい特徴を有するハイブリッド核酸が取得された後で、核酸、核酸を有するベクタ、或いは、ベクタ及び核酸を含む宿主細胞が、分離される。
【０１９１】
この核酸又はベクタは、その後、野生型核酸が大幅に超過した宿主細胞に導入される。ハイブリッドの核酸と、野生型配列の核酸とは、組み換えが可能となる。結果として生じた組み換え体は、ハイブリッド核酸と同様に選択の対象となる。望ましい特徴を保持している組み換え体のみが、選択されることになる。望ましい特徴を提供しない任意のサイレント突然変異は、野生型ＤＮＡとの組み換えを通じて失われることになる。このサイクルは、すべてのサイレント突然変異が排除されるまで、何度も繰り返すことができる。
【０１９２】
別の実施形態において、本発明は、子孫ポリヌクレオチド（例えば、発現させてポリペプチド又は遺伝子経路を生成できるキメラ子孫ヌクレオチド）を形成するために、少なくとも二つのポリヌクレオチドを、シャッフリング、組み立て、再構成、組み換え、及び又は鎖状化する方法を提供する。特定の実施形態において、二本鎖ポリヌクレオチド（例えば、ハイブリッド形成のパートナとして、互いにハイブリッド形成した二本の一本鎖配列）を、エクソヌクレアーゼにより処理し、二本の鎖の一方からヌクレオチドを遊離させ、残りの鎖をオリジナルのパートナから離れた状態にし、望ましい場合には、残りの鎖を使用して、別のパートナとのハイブリッド形成を達成できるようにする。
【０１９３】
特定の態様において、（ポリヌクレオチド又は非ポリヌクレオチド配列の一部にすること、或いは、これに結合させることが可能な）二本鎖ポリヌクレオチド末端は、エクソヌクレアーゼ活性のソースにより影響を受ける。３’エクソヌクレアーゼ活性を有する酵素と、５’エクソヌクレアーゼ活性を有する酵素と、３’エクソヌクレアーゼ活性及び５’エクソヌクレアーゼ活性の両方を有する酵素と、その任意の組み合わせとを、本発明において使用することができる。エクソヌクレアーゼは、線状二本鎖ポリヌクレオチドの一方又は両方の末端から、或いは三つ以上の末端を有する分岐ポリヌクレオチドの一つ乃至全部の末端から、ヌクレオチドを遊離させるのに使用することができる。
【０１９４】
対照的に、非酵素的ステップを使用して、ポリヌクレオチド基礎単位のシャッフリング、組み立て、再構成、組み換え、及び又は鎖状化を行うことが可能であり、これは、作業中の二本鎖ポリヌクレオチドのセットを溶解して単一のポリヌクレオチド鎖にできるように、（例えば、温度、ｐＨ、及び又は塩度条件を変化させることで）作業中の試料に変性（又は「溶解」）条件を与えることを含む。シャッフリングに関しては、単一のポリヌクレオチド鎖を、異なるハイブリッド形成パートナとのアニーリングに、ある程度まで関与させることが望ましい（つまり、単に、変性ステップ前の元のパートナとの間の排他的な再アニーリングに戻すのではない）。しかしながら、反応槽に元のハイブリッド形成パートナが存在するため、一本鎖ポリヌクレオチドと元のパートナとの再アニーリングによるオリジナルの二本鎖ヌクレオチドの再形成は不可能にならず、場合によっては、これに有利に働くこともある。
【０１９５】
二本鎖ポリペプチド基礎単位に変性を施し、その後アニーリングすることを含む非酵素的シャッフリングステップとは対照的に、本発明は、更に、エクソヌクレアーゼに基づくアプローチを提供し、これは変性を必要とせず、逆に、変性条件を回避し、二本鎖ポリヌクレオチド基質をアニーリング（つまり、非変性）条件で維持することが、エクソヌクレアーゼ（例えば、エクソヌクレアーゼＩＩＩ及びレッドアルファ遺伝子産物）の活動にとっての必要条件となる。更に対照的に、他の一本鎖ポリヌクレオチド配列とのハイブリッド形成が可能な一本鎖ポリヌクレオチド配列の生成は、ハイブリッド形成パートナの一つにおける、共有開裂、及びこれによる配列の破壊の結果である。例えば、エクソヌクレアーゼＩＩＩ酵素は、一つのハイブリッド形成鎖の３’末端ヌクレオチドを酵素的に遊離させる（そのポリヌクレオチド鎖において共有加水分解を達成する）ために使用可能であり、これは、残りの一本鎖が新しいパートナとハイブリッド形成するのを助ける（元のパートナが共有開裂を施されたため）。
【０１９６】
特に理解される点として、より最適な速度、及び又はより高い特異活性、及び又はより少ない不必要な活性を有する酵素を、直前に開示したアプローチのために特別に発見すること、最適化すること（例えば、定方向進化により作成）、又は発見と最適化との両方を行うことができる。実際に、本発明は、こうしたデザイナ酵素の発見及び又は開発を促進する場合があると予想される。
【０１９７】
更に、理解される点として、必要に応じて、二本鎖ポリヌクレオチドの末端を保護すること、或いは、エクソヌクレアーゼの望ましい酵素活動の影響を受けやすくすることが可能である。例えば、３’オーバハングを有する二本鎖ポリヌクレオチド末端は、エクソヌクレアーゼＩＩＩのエクソヌクレアーゼ活動の影響を受けない。しかしながら、様々な手段により、エクソヌクレアーゼＩＩＩのエクソヌクレアーゼ活動の影響を受けやすくすることが可能であり、例えば、ポリメラーゼによる処理で平滑化すること、開裂させ平滑末端又は５’オーバハングを提供すること、別の二本鎖ポリヌクレオチドに結び付け（連結又はハイブリッド形成させ）平滑末端又は５’オーバハングを提供すること、一本鎖ポリヌクレオチドとハイブリッド形成させ平滑末端又は５’オーバハングを提供すること、或いは、様々な手段のいずれかによって修飾することが可能である。
【０１９８】
一態様によれば、エクソヌクレアーゼは、線状二本鎖ポリヌクレオチドの一方又は両方の末端に作用することが可能で、完了、完了近く、又は部分的な完了へと進むことができる。エクソヌクレアーゼ活動が完了へと進むことができる時、その結果として、各５’オーバハングの長さは、ポリヌクレオチドの中央領域に向かって、「ランデブーポイント」（ポリヌクレオチドの中央点近くのどこかになる場合がある）と考えられるものの方向へ、長く延びることになる。最終的には、これにより、それぞれオリジナルの二本鎖ポリヌクレオチドの約半分の長さの（分離することが可能な）一本鎖ポリヌクレオチドが生成される。
【０１９９】
したがって、エクソヌクレアーゼが仲介するアプローチは、ポリヌクレオチド基礎単位のシャッフリングと、組み立て及び又は再構成と、組み換えと、鎖状化とを行うのに有用である。このポリヌクレオチド基礎単位は、長さ十塩基まで、又は長さ数十塩基、又は長さ数百塩基、又は長さ数千塩基、又は長さ数万塩基、又は長さ数十万塩基、又は長さ数百万塩基、又は更に長いものにすることができる。
【０２００】
エクソヌクレアーゼの基質は、二本鎖ポリヌクレアーゼに断片化を施すことで生成できる。断片化は、機械的手段（例えば、剪断、音波処理、及びその他）と、酵素的手段（例えば、制限酵素の使用）と、その任意の組み合わせとによって達成できる。大きなポリヌクレオチドの断片は、ポリメラーゼ仲介合成によって生成することもできる。
【０２０１】
エクソヌクレアーゼ活性を有する酵素の追加的な例は、レッドアルファ及びヘビ毒ホスホジエステラーゼを含む。レッドアルファ（ｒｅｄα）遺伝子産物（λ−エクソヌクレアーゼとも呼ばれる）は、バクテリオファージλ起源である。レッドアルファ遺伝子産物は、５’−リン酸末端から前進的に作用し、二重螺旋ＤＮＡからモノヌクレオチドを遊離させる（タカハシ及びコバヤシ，１９９０）。ヘビ毒ホスホジエステラーゼ（ラスコースキ，１９８０）は、スーパーコイルＤＮＡを急速に開くことができる。
【０２０２】
一態様において、本発明は、合成ライゲーション再構成（ＳＬＲ）と呼ばれる非確率的方法を提供し、これは、確率的なシャッフリングに幾分関連するが、ただし、核酸基礎単位をランダムにシャッフリング、又は鎖状化、又はキメラ化するのではなく、非確率的に組み立てる
ＳＬＲ法は、シャッフリングするポリヌクレオチド間における高レベルの相同性の存在に依存しない。本発明は、１０１００種類を超えるキメラを含む子孫分子のライブラリ（又はセット）を非確率的に生成するために使用することができる。おそらく、ＳＬＲは、１０１０００種類を超える子孫キメラを含むライブラリを生成するために使用することさえ可能である。
【０２０３】
したがって、一態様において、本発明は、計画的に選択した全体的な組み立て順序を有する完成済みキメラ核酸分子のセットを生成する非確率的方法を提供し、この方法は、実用的で相互互換性があり連結可能な末端を有する複数の特定の核酸基礎単位を、計画的に生成することと、計画した全体的な組み立て順序が達成されるように、こうした核酸基礎単位を組み立てることとを含む。
【０２０４】
組み立てる核酸基礎単位の相互互換性がある連結可能な末端は、基礎単位を事前に定められた順序で結合させることができる場合に、このタイプの順序のある組み立てにとって「実用的」であるとされる。したがって、一態様において、核酸基礎単位を結合させることができる全体的な組み立て順序は、連結可能な末端の設計によって指定され、二つ以上の組み立てステップが使用される場合には、核酸基礎単位を結合させることができる全体的な組み立て順序は、更に、（複数の）組み立てステップの連続した順序によって指定される。本発明の一実施形態において、アニーリングされた基礎単位は、基礎単位の共有結合を達成するために、リガーゼ（例えば、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ）等の酵素によって処理される。
【０２０５】
別の実施形態において、核酸基礎単位の設計は、完成したキメラ核酸分子の子孫セットを生成する基盤の役割を果たす前駆核酸鋳型のセットの配列を分析することで取得される。したがって、こうした前駆核酸鋳型は、突然変異生成、つまりキメラ化又はシャッフリングされる核酸基礎単位の設計を支援する配列情報のソースとしての役割を果たす。
【０２０６】
一例証形態において、本発明は、関連する遺伝子のファミリと、関連する遺伝子の符号化ファミリとのキメラ化を提供する。特定の例証形態において、符号化された産物は、酵素である。本発明の態様による突然変異生成が可能な酵素のファミリの代表的なリストとして、挙げることが可能な酵素及びその機能は、リパーゼ／エステラーゼと、プロテアーゼと、グリコシダーゼ／グリコシルと、トランスフェラーゼと、ホスファターゼ／キナーゼと、モノ／ジオキシゲナーゼと、ハロペルオキシダーゼと、リグニンと、ペロキシダーゼ／ジアリルプロパンペロキシダーゼと、エポキシドヒドロラーゼと、ニトリルヒドラターゼ／ニトリラーゼと、トランスアミナーゼ、アミダーゼ／アシラーゼとである。こうした例証形態は、本発明の一部の特定の態様を例示するが、制限を表現すること、或いは開示する発明の範囲を制限することはない。
【０２０７】
したがって、本発明の一態様によれば、本発明の方法を使用して同定される複数の前駆核酸鋳型の配列は、一つ以上の境界点を選択するために整列させ、この境界点は、相同エリアに配置することが可能である。境界点は、生成する核酸基礎単位の境界を描くために使用することができる。したがって、前駆分子において同定及び選択される境界点は、子孫分子の組み立てにおいて、潜在的なキメラ化点としての役割を果たす。
【０２０８】
通常、境界点は、少なくとも二つの前駆鋳型が共有する相同エリア（少なくとも一つの相同ヌクレオチド塩基を含む）であるが、この境界点は、少なくとも半分の前駆鋳型と、少なくとも三分の二の前駆鋳型と、少なくとも四分の三の前駆鋳型と、好ましくは、ほとんどすべての前駆鋳型とが共有する相同エリアにすることができる。更に好ましくは、境界点は、すべての前駆鋳型が共有する相同エリアである。
【０２０９】
別の実施形態においては、網羅的なライブラリを生成するために、ライゲーション再構成プロセスが網羅的に実行される。言い換えると、核酸基礎単位の可能なすべての順序の組み合わせが、完成済みキメラ核酸分子のセット内で表現される。同時に、各組み合わせにおける組み立て順序（つまり、各完成済みキメラ核酸の５’乃至３配列における各基礎単位の組立の順序）は、計画的（又は非確率的）なものである。本発明の非確率的な性質から、不必要な副産物の可能性は、大幅に減少する。
【０２１０】
更に別の実施形態において、本発明では、ライゲーション再構成プロセスが、例えば、体系的にコンパートメント化されたライブラリを生成するために、体系的に実行され、このコンパートメントは、例えば、一つずつ等、体系的にスクリーニングできる。言い換えると、本発明では、特定の核酸基礎単位の選択的かつ賢明な使用を、連続した段階的な組み立て反応の選択的かつ賢明な使用と組み合わせ、子孫産物の特定のセットがいくつかの反応槽のそれぞれで作成される実験計画を達成できる。これにより、体系的な調査及びスクリーニング手順を実行することが可能となる。したがって、小さなグループ内で潜在的に非常に多数の子孫分子を体系的に調査することが可能となる。
【０２１１】
特に前駆分子間の相同性が低レベルである時、非常に柔軟でありながら網羅的で体系的でもある方法でキメラ化を実行する能力により、本発明は、多数の子孫分子を含むライブラリ（又はセット）の生成を提供する。このライゲーション再構成の発明の非確率的な性質から、生成される子孫分子は、好ましくは、計画的に選択された全体的な組み立て順序を有する完成済みキメラ核酸分子のライブラリの一部となる。特定の実施形態において、こうした生成済みライブラリは、１０３種類超乃至１０１０００種類超の子孫分子種を含む。
【０２１２】
一態様において、説明にしたがって生成された完成済みキメラ核酸分子のセットは、ポリペプチドを符号化するポリヌクレオチドを含む。一実施形態によれば、このポリヌクレオチドは、遺伝子であり、これは人工遺伝子にすることができる。別の実施形態によれば、このポリヌクレオチドは、遺伝子経路であり、これは人工遺伝子経路にすることができる。本発明では、本発明によって生成された一つ以上の人工遺伝子を、例えば、真核有機体（植物を含む）において機能する経路等の人工遺伝子経路に組み込むことが可能である。
【０２１３】
別の例証形態において、基礎単位が生成されることの合成的な性質から、ｉｎ  ｖｉｔｒｏプロセスにおいて（例えば、突然変異生成によって）、或いはｉｎ  ｖｉｖｏプロセスにおいて（例えば、宿主有機体の遺伝子スプライシング能力を利用して）、後で随意的に除去できるヌクレオチド（例えば、一つ以上のヌクレオチドで、コドン又はイントロン或いは調節配列等にすることができる）の設計及び導入が可能となる。多くの場合、こうしたヌクレオチドの導入は、境界点を形成する潜在的な利点に加え、他の多くの理由から望ましい場合もあると理解される。
【０２１４】
したがって、別の実施形態によれば、本発明では、核酸基礎単位を使用して、イントロンを導入することができる。したがって、本発明では、機能イントロンを、本発明の人工遺伝子に導入することができる。本発明では、更に、機能イントロンを、本発明の人工遺伝子経路に導入することができる。したがって、本発明は、一つの（又は複数の）人為的に導入した（複数の）イントロンを含む人工遺伝子であるキメラポリヌクレオチドの生成を提供する。
【０２１５】
したがって、本発明は、更に、一つの（又はそれ以上の）人為的に導入した（複数の）イントロンを含む人工遺伝子経路であるキメラポリヌクレオチドの生成を提供する。好ましくは、人為的に導入した（複数の）イントロンは、自然発生イントロンが遺伝子スプライシングにおいて機能を果たすのと同様の形で、一つ以上の宿主細胞において、遺伝子スプライシングに関して機能することができる。本発明は、組み換え及び又はスプライシングのために宿主有機体に導入する人工イントロン含有ポリヌクレオチドを生成するプロセスを提供する。
【０２１６】
本発明を使用して生成した人工遺伝子は、別の核酸による組み換えの基質としての役割を果たすこともできる。同様に、本発明を使用して生成した人工遺伝子経路は、更に、別の核酸による組み換えの基質としての役割を果たすこともできる。好適な事例において、この組み換えは、遺伝子を含む人工イントロンと組み換えパートナの役割を果たす核酸との間の相同エリアによって促進され、このエリアで発生する。特定の好適な事例において、この組み換えパートナは、本発明によって生成された核酸にすることが可能であり、これは人工遺伝子又は人工遺伝子経路を含む。組み換えは、人工遺伝子内の一つの（又はそれ以上の）人為的に導入された（複数の）イントロンに存在する相同エリアによって促進される場合があり、このエリアで発生する場合がある。
【０２１７】
本発明の合成ライゲーション再構成法は、複数の核酸基礎単位を利用し、そのそれぞれは、好ましくは、二つの連結可能末端を有する。各核酸基礎単位の二つの連結可能末端は、二つの平滑末端（つまり、それぞれがヌクレオチドのオーバハングを有しない）、又は、好ましくは、一つの平滑末端及び一つのオーバハング、又は、更に好ましくは、二つのオーバハングにすることができる。
【０２１８】
この目的でのオーバハングは、３’オーバハング又は５’オーバハングにすることができる。したがって、核酸基礎単位は、３’オーバハング、又は代わりに５’オーバハング、又は代わりに二つの３’オーバハング、又は代わりに二つの５’オーバハングを有することができる。完成済みキメラ核酸分子を形成するために核酸基礎単位が組み立てられる全体的順序は、ランダムではなく、目的のある実験計画によって決定される。
【０２１９】
好適な一実施形態によれば、核酸基礎単位は、二つの一本鎖核酸（一本鎖オリゴとも呼ばれる）の化学合成と、これらをアニーリングして二本鎖核酸基礎単位を形成できるように接触させるステップとによって生成される。
【０２２０】
二本鎖核酸基礎単位は、様々なサイズにすることができる。こうした基礎単位のサイズは、小さく又は大きくすることができる。基礎単位に好適なサイズは、１塩基対（任意のオーバハングを含まない）乃至１００，０００塩基対（任意のオーバハングを含まない）の範囲である。その他の好適なサイズ範囲も提供され、これは１ｂｐ乃至１０，０００ｂｐ（間の整数値をすべて含む）の下限値と、２ｂｐ乃至１００，０００ｂｐ（間の整数値をすべて含む）の上限値とを有する。
【０２２１】
図６は、酵素エクソヌクレアーゼＩＩＩの活性を示している。これは、ポリヌクレオチド基礎単位のシャッフリング、組み立て、再構成、組み換え、及び又は鎖状化に使用できる例示的な酵素である。アスタリスクは、酵素がポリヌクレオチド基質の３’方向から５’方向に向かって作用することを示している。図７は、エクソヌクレアーゼ仲介ポリヌクレオチド再構成における酵素エクソヌクレアーゼＩＩＩの例示的な応用を示している。更に、適切な宿主（エシェリキア、シュードモナス、ストレプトミセス、又はバシラス）を形質転換することと、発現スクリーニングで分析可能なクローン突然変異生成子孫核酸（及び好ましくは、こうした核酸によって発現されるポリペプチド）のライブラリを生成して更なる多様性を提供するために宿主の修復メカニズムを利用することとによるｉｎ  ｖｉｖｏ「修復」の併用を示している。
【０２２２】
図８は、多結合核酸鎖の生成を示している。このケースにおいて、生成された鎖は、親の鋳型と同じ長さだが、メチル化されていない。したがって、Ｄｐｎ  Ｉ処理を使用して、生成された鎖を選択することができる。表示されていないが、鋳型と生成産物とは、ベクタ（線状又は環状）の一部にすることができる。図９は、ヘテロメリック核酸複合体において、アニーリングした核酸鎖の未ハイブリッド形成一本鎖末端から、３’及び５’末端ヌクレオチドを遊離させ、短縮されているがハイブリッド形成された末端を残し、処理済み末端のポリメラーゼ系伸長及び又はリガーゼ仲介ライゲーションを促進する手段としてのエクソヌクレアーゼ処理の使用を示している。更に、適切な宿主（エシェリキア、シュードモナス、ストレプトミセス、又はバシラス）を形質転換することと、発現スクリーニングで分析可能なクローン突然変異生成子孫核酸（及び好ましくは、こうした核酸によって発現されるポリペプチド）のライブラリを生成して更なる多様性を提供するために宿主の修復メカニズムを利用することとによるｉｎ  ｖｉｖｏ「修復」の併用を示している。
【０２２３】
図１０は、一本のメチル化多結合核酸鎖をアニーリングし、いくつかの非メチル化単結合核酸鎖にする例における、エクソヌクレアーゼ仲介核酸再構成の使用を示す図である。アニーリングした核酸鎖は、ヘテロメリック核酸複合体を形成し、ヘテロメリック核酸複合体において複数のアニーリングした核酸鎖の未ハイブリッド形成一本鎖末端から、３’及び５’末端ヌクレオチドを遊離させ、短縮されているがハイブリッド形成された末端を残し、処理済み末端のポリメラーゼ系伸長及び又はリガーゼ仲介ライゲーションを促進する手段として、エクソヌクレアーゼ処理を受ける。その後、自然状態において非メチル化及びキメラである生成されたアニーリング済み単結合核酸鎖に対する選択に関して、Ｄｐｎ  Ｉによる処理が実用的となる。
【０２２４】
図１１は、複数のメチル化多結合核酸鎖をアニーリングし、いくつかの非メチル化単結合核酸鎖にする例における、エクソヌクレアーゼ仲介核酸再構成の使用を示している。アニーリングした核酸鎖は、ヘテロメリック核酸複合体を形成し、ヘテロメリック核酸複合体において複数のアニーリングした核酸鎖の未ハイブリッド形成一本鎖末端から、３’及び５’末端ヌクレオチドを遊離させ、短縮されているがハイブリッド形成された末端を残し、処理済み末端のポリメラーゼ系伸長及び又はリガーゼ仲介ライゲーションを促進する手段として、エクソヌクレアーゼ処理を受ける。その後、自然状態において非メチル化及びキメラである生成されたアニーリング済み単結合核酸鎖に対する選択に関して、Ｄｐｎ  Ｉによる処理が実用的となる。
【０２２５】
本発明において実用的である二本鎖核酸基礎単位を生成可能な多数の方法が存在し、これらは、この技術において知られており、当業者が容易に実行することができる。
【０２２６】
一実施形態によれば、二本鎖核酸基礎単位は、最初に二つの一本鎖核酸を生成することと、これらをアニーリングして二本鎖核酸基礎単位を生成できるようにすることとによって生成される。二本鎖核酸基礎単位の二つの鎖は、オーバハングを形成する任意のものを除き、すべてのヌクレオチドにおいて相補的にすることが可能であり、したがって、任意の（複数の）オーバハングを除き、ミスマッチを含まない。別の実施形態によれば、二本鎖核酸基礎単位の二つの鎖は、オーバハングを形成する任意のものを除き、すべてより少ない数のヌクレオチドにおいて相補的である。したがって、この実施形態によれば、二本鎖核酸基礎単位は、コドンの縮重を導入するのに使用することができる。好ましくは、コドンの縮重は、本明細書で説明する部位飽和突然変異生成を使用して導入され、これは一つ以上のＮ，Ｎ，Ｇ／Ｔカセットを使用し、或いは代わりに、一つ以上のＮ，Ｎ，Ｎカセットを使用する。
【０２２７】
図１は、本明細書で説明する部位飽和突然変異生成の好適な実施形態を示している。非確率的な部位飽和突然変異生成によって突然変異生成することが可能な核酸配列は、長さ１５乃至１００，０００塩基の任意のポリヌクレオチド（例えば、任意のコーディング領域及び任意の非コーディング領域）を含む。例えば、こうした核酸配列は、例として、プロモータ、エンハンサ、イントロン、遺伝子全体、ｃＤＮＡ、遺伝子セグメント、オペレータ、ポリヌクレオチド官能基、発現調節配列、発現配列タグ（ＥＳＴ）、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）、リプレッサ／トランス作用因子、複製の起源、又は遺伝子経路を含む。
【０２２８】
非確率的な不意飽和突然変異生成によって突然変異生成できる変異原性カセットは、長さ１乃至５００塩基の任意のポリヌクレオチドカセットを含む。部位飽和突然変異生成は、突然変異生成させるポリヌクレオチド配列内部に含まれるカセットの完全なセットを突然変異生成させることに関して実用的である。図１に示すように、カセットは、各ポリヌクレオチドに沿って様々な間隔（つまり、直に隣接、均等な間隔、又は不均等な間隔）にすることが可能であり、任意のサイズにすることができる。好適で非制限的な例証形態において、変異原性カセットのセットは、定められた長さの配列内の連続するコドンのセットである。代わりに、別の好適で非制限的な例において、変異原性カセットのセットは、整列した関連ポリヌクレオチドによって共有されないヌクレオチドカセットのセットである。
【０２２９】
変異原性カセットのセットに導入される突然変異のタイプは、ポリヌクレオチド部位飽和突然変異生成の各ラウンドで、同じタイプ又は異なるタイプにすることができる。（突然変異生成させる核酸配列内の）各変異原性カセットは、好ましくは、通常、対応するオリゴを使用することによって突然変異生成される（縮重オリゴによるものを含む）。本発明が提供する縮重突然変異の例は、以下を含む。
【０２３０】
全２０種類のアミノ酸に関するコドン（例えば、Ｎ，Ｎ，Ｎ、又はＮ，Ｎ，Ｇ／Ｔ、又はＮ，Ｎ，Ｇ／Ｃ）
親の鋳型のアミノ酸配列を変更しないすべての縮重コドン（つまり、親の鋳型に存在する同じアミノ酸に関するコドン）
選択されたアミノ酸グループ化体系＊にしたがった同じグループ内のアミノ酸に関する（すべての又は選択された）コドン
各アミノ酸グループ＊内の少なくとも一つのアミノ酸に関するコドン
１．芳香族（Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ）
２．脂肪族（Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ）
３．ＯＨ含有（Ｓｅｒ、Ｔｙｒ、Ｔｈｒ）
４．酸性（Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、Ｇｉｎ）
５．塩基性（Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ）
６．硫黄含有（Ｍｅｔ、Ｃｙｓ）
７．極性（Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｃｙｓ、Ａｓｎ、Ｇｉｎ、Ｔｙｒ）
８．無極性（Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｉ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｐｒｏ）
【０２３１】
図２は、この例において設計された核酸基礎単位の可能なすべての組み合わせを網羅的及び体系的に生成する能力における本発明の力を示している。特に、子孫キメラ細胞の大きなセット（又はライブラリ）を生成することができる。この方法は網羅的及び体系的に実行できるため、新しい境界点を選択することで繰り返し方法を適用することが可能であり、これに対応する新たに設計された核酸基礎単位により、以前に調査及び拒否された分子種を再生成及び再スクリーニングする負担が回避される。境界点の頻度を増やす上で有利となるように、コドンの揺らぎを使用できると理解される。言い換えると、特定の塩基は、コドン縮重のため、前駆コドン（変更されたコドン）によって符号化されるアミノ酸を変更することなく、核酸基礎単位において置換できる場合が多い。例示のように、境界点は、八つの前駆鋳型が整列した状態で選択される。その後、（順序のある結合の生成に関して実用的な）オーバハングを含む核酸基礎単位が設計及び合成される。この事例においては、１８の核酸基礎単位が、八つの前駆鋳型のそれぞれの配列に基づいて生成され、合計１４４の核酸基礎単位（又は二本鎖オリゴ）となる。その後、ライゲーション再構成手順を実行することで、８１８（又は１．８×１０１６超）のキメラ生成量を含む子孫分子のライブラリが生成されることになる。
【０２３２】
本発明のｉｎ  ｖｉｔｒｏ組み換え法は、特定のポリヌクレオチド又は配列の未知のハイブリッド又は対立遺伝子のプールに、盲目的に実行することができる。しかしながら、特定のポリヌクレオチドの実際のＤＮＡ又はＲＮＡ配列が分かっている必要がある。
【０２３３】
遺伝子の混合集団内での組み換えを使用するアプローチは、例えば、インターロイキンＩ、抗体、ｔＰＡ、及び成長ホルモンといった、任意の有用なタンパク質の生成に役立てることができる。このアプローチは、変更された特異性又は活性を有するタンパク質を生成するために使用することができる。このアプローチは、例えば、遺伝子のプロモータ領域、イントロン、エクソン、エンハンサ配列、３１非翻訳領域、又は５１非翻訳領域といった、ハイブリッド核酸配列の生成に役立てることもできる。したがって、このアプローチは、発現の速度が増加した遺伝子を生成するのに使用することができる。このアプローチは、反復性ＤＮＡ配列の研究において役立てることもできる。最後に、このアプローチは、リボザイム又はアプタマを突然変異させるのに役立てることができる。
【０２３４】
本発明は、ポリヌクレオチドの開始セットからポリヌクレオチドのサブセットを選択する方法を提供し、この方法は、各選択可能ポリヌクレオチドに関する選択（正の選択）、及び又は、これに対する選択（負の選択）を実行するために、作業中のポリヌクレオチドのどこかに存在する一つ以上の選択可能な特徴（又は選択マーカ）を識別する能力に基づいている。一態様において、提供される方法は末端選択と呼ばれ、この方法は、選択可能ポリヌクレオチドの末端領域に一部又は全部が位置する選択マーカの使用に基づいており、こうした選択マーカは、「末端選択マーカ」と呼ばれる場合がある。
【０２３５】
末端選択は、自然発生する配列の検出に基づくもの、又は実験的に導入した配列の検出に基づくもの（本明細書記載及び未記載の任意の突然変異生成によるものを含む）にすることが可能であり、或いは、同じポリヌクレオチド内であっても、これらの両方に基づくものにすることが可能である。末端選択マーカは、構造的な選択マーカ又は機能的な選択マーカ、或いは、構造的かつ機能的な選択マーカにすることができる。末端選択マーカは、ポリヌクレオチド配列、又はポリペプチド配列、又は任意の化学構造、或いは任意の生物学的又は生化学的タグを含むことが可能であり、放射能と、酵素活性と、蛍光と、任意の光学的特徴と、磁気特性（磁気ビーズの使用等）と、免疫反応性と、ハイブリッド形成との検出に基づく方法を使用して選択可能なマーカを含む。
【０２３６】
末端選択は、突然変異生成を実行する任意の方法と組み合わせて適用することができる。こうした突然変異生成法は、その一部として、本明細書で説明する方法を含む（前記及び後記）。こうした方法は、非制限的な例証として、本明細書において、又は当業者に、以下の用語のいずれかで呼ばれる場合がある任意の方法を含む：「飽和突然変異」、「シャッフリング」、「組み換え」、「再構成」、「エラープローンＰＣＲ」、「アセンブリＰＣＲ」、「セクシャルＰＣＲ」、「クロスオーバＰＣＲ」、「オリゴヌクレオチドプライマ指定突然変異生成」、「再帰的（及び又は指数）アンサンブル突然変異生成（アーキン及びユーバン，１９９２を参照）」、「カセット式突然変異生成」、「ｉｎ  ｖｉｖｏ突然変異生成」、及び「ｉｎ  ｖｉｔｒｏ突然変異生成」。更に、末端選択は、任意の突然変異生成及び又は増幅方法によって生成された分子に実行することが可能であり（アーノルド，１９９３、コールドウェル及びジョイス，１９９２、ステマ，１９９４等を参照）、この方法に続いて、望ましい子孫分子を（存在に関してスクリーニングを行うことを含め）選択することが望ましい。
【０２３７】
加えて、末端選択は、任意の突然変異生成法と関係のないポリヌクレオチドに適用することができる。一実施形態において、末端選択は、本明細書で定めるように、別のポリヌクレオチドとのライゲーションのステップ（ベクタとのライゲーションを含む）といったクローニングステップを促進するために使用できる。したがって、本発明は、望ましいポリヌクレオチドのライブラリ構築、選択、及び又は濃縮と、全般的なクローニングとを促進する手段としての末端選択を提供する。
【０２３８】
別の実施形態において、末端選択は、ポリヌクレオチドに関する（正の）選択に基づくものにすることが可能であり、代わりに、末端選択は、ポリヌクレオチドに対する（負の）選択に基づくものにすることが可能であり、更に代わりに、末端選択は、ポリヌクレオチドに関する（正の）選択と、これに対する（負の）選択との両方に基づくものにすることが可能である。末端選択は、他の選択及び又はスクリーニングの方法と共に、反復する形で実行することが可能であり、これにおいて、類似する又は類似しない選択及び又はスクリーニング方法及び突然変異生成又は定方向進化方法を任意の組み合わせにすることが可能であり、これらすべてを反復する形で、任意の順序、組み合わせ、及び順列において、実行することができる。更に、末端選択は、環状（例えば、プラスミド又は他の任意の環状ベクタ、或いは部分的に環状である他の任意のポリヌクレオチド）、及び又は分岐、及び又は任意の化学基又は部分による修飾又は置換状態のポリヌクレオチドを選択するために使用することもできる。
【０２３９】
非制限的な一態様において、線状ポリヌクレオチドの末端選択は、ポリヌクレオチドの端部又は末端（５’末端又は３’末端にすることが可能）或いはその近くに位置する少なくとも一つの末端選択マーカの存在に基づく一般的なアプローチを使用して実行される。特定の非制限的な一例証形態において、末端選択は、ポリヌクレオチド配列を認識する酵素によって認識される配列等を含む、末端又はその近くにある特定の配列の選択に基づく。ポリヌクレオチドの化学的修飾を認識及び触媒する酵素は、本明細書において、ポリヌクレオチド作用酵素と呼ばれる。好適な実施形態において、ポリヌクレオチド作用酵素は、ポリヌクレオチド切断活性を備える酵素と、ポリヌクレオチドメチル化活性を備える酵素と、ポリヌクレオチド連結活性を備える酵素と、複数の区別可能な酵素活性（例えば、ポリヌクレオチド切断活性及びポリヌクレオチド連結活性を排他的に含む）を備える酵素とによって、非排他的に例証される。
【０２４０】
関連するポリヌクレオチド作用酵素は、当業者が確認可能な（例えば、市販の）任意の酵素を含み、或いは、ポリヌクレオチドにおいてライゲーション適合末端、好ましくは付着末端を生成するのに役立つ、現在は利用できないが将来開発される可能性のあるものを含むと理解される。末端選択を施すポリヌクレオチドの内部に含まれない、或いは含まれることが予想されない、或いは含まれる可能性が低い（例えば、作業中のポリヌクレオチドに関する配列情報が不完全な場合）制限部位を使用することが好ましい場合がある。方法（例えば、突然変異生成法）は、不必要な内部制限部位を除去するのに使用することができると認識されている。更に、部分消化反応（つまり、部分的な完了へと進む消化反応）を使用して、末端領域の認識部位での消化を達成して、ポリヌクレオチド内部で発生し、同じ酵素によって認識される感受性のある制限部位を残しておくことが可能であると理解される。一態様において、部分消化が有用であるのは、認識配列が発生する位置及び環境に応じて、特定の酵素が同じ認識配列の優先的な切断を示すと理解されるためである。
【０２４１】
更に、保護方法を使用して、特定の制限部位（内部部位等）を、こうした部位の存在に反応して作業中のポリペプチドを切断する酵素による不必要な消化から、選択的に保護することが可能であり、こうした保護方法は、不必要な酵素活性を抑制するメチル化及び塩基置換（例えば、ＴをＵに置き換える）といった修飾を含む。
【０２４２】
本発明の別の実施形態において、有用な末端選択マーカは、特定のポリヌクレオチド配列を認識するポリヌクレオチド作用酵素によって認識される末端配列である。本発明の一態様において、有用なポリヌクレオチド作用酵素は、更に、標準的なＩＩ型制限酵素に加え、他の酵素を含む。この本発明の好適な態様によれば、有用なポリヌクレオチド作用酵素は、更に、ジャイレース（トポイソメラーゼ等）と、ヘリカーゼと、組み換え酵素と、リラクセーズと、これらに関連する任意の酵素とを含む。
【０２４３】
末端選択は、親の鋳型分子（突然変異生成を施されるもの等）を子孫分子（突然変異生成によって生成されたもの等）から識別及び分離するために使用することができると理解される。例えば、トポイソメラーゼＩ認識部位を欠いたプライマの第一のセットを使用して、（例えば、ポリメラーゼベースの増幅において）親分子の末端領域を修飾することができる。その後、異なるプライマの第二のセット（トポイソメラーゼＩ認識部位を有するもの等）を使用して、増幅した親分子から突然変異させた子孫分子を生成することができる（例えば、断続合成、鋳型切り替えポリメラーゼベース増幅、又は断続合成といった任意のポリヌクレオチドキメラ化方法を使用すること、或いは飽和突然変異を使用すること、或いは、突然変異生成された子孫分子にトポイソメラーゼＩ認識部位を導入する他の任意の方法を使用することによる）。トポイソメラーゼＩベースの末端選択の使用により、その後、望ましい子孫分子の識別だけでなく、選択的なトポイソメラーゼＩベースのライゲーションも促進される。
【０２４４】
トポイソメラーゼベースのニッキング及びライゲーションを使用する末端選択アプローチは、以前に利用可能だった選択方法に比べ、いくつかの利点を有すると理解される。要するに、このアプローチでは、方向クローニング（発現クローニングを含む）を達成することができる。
【０２４５】
図３は、（例えば、合成ライゲーション再構成による）ポリヌクレオチド再構成によって生成された望ましいポリヌクレオチドを選択する（例えば、全長分子の選択を行う）トポイソメラーゼ誘導選択ステップを使用した末端選択の応用を示す図である。図４は、末端選択技術の様々な態様を例示している。これには、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ再構成遺伝子における末端選択の方法が含まれ、この方法は以下のステップを含む：ａ）遺伝子特異プライマ鋳型を備える所定の遺伝子を増幅すること：染色体ＤＮＡ／λクローン／ゲノムクローン／任意のサブクローンＤＮＡ、ｂ）組み換えＰＣＲを実行すること：相同遺伝子からの混合ＰＣＲ産物に一般的なトポクローニングプライマを追加、ＰＣＲは、例えば、５分９４℃、８０×（３０秒９４℃、１０秒３７℃、１０秒７２℃）、ｃ）定方向発現クローニングを実行すること：再構成ＰＣＲ産物をゲル精製し、ワクシニアウイルスにトポイソメラーゼを結合させ（最適なモル比は、ＤＮＡ：酵素、１：５）、ベクタを追加し（挿入の二倍の量）、Ｅ．ｃｏｌｉを形質転換し、形質転換体をスクリーニングする。図５は、オリジナルの平滑末端ＤＮＡの定方向発現クローニングを達成する目的で、当初の平滑末端ＤＮＡに「付着末端」を導入するために、酵素Ｎ．ＢｓｔＮＢｌを使用して、「ｃ）定方向発現クローニングを実行すること」のステップが達成される、末端選択技術の特定の態様を例示している。
【０２４６】
本方法は、任意の開示方法と、その任意の組み合わせとによるｉｎ  ｖｉｔｒｏ及び又はｉｎ  ｖｉｖｏ組み換えによって、ペプチドディスプレイ法で選択されたポリヌクレオチド配列をシャッフリングするのに使用することが可能であり、これにおいて、関連するポリヌクレオチドは、表現型（既定のレセプタ（リガンド）に関する親和性等）に関してスクリーニングされたディスプレイペプチドを符号化する。
【０２４７】
生物薬剤学的薬品開発及び分子生物学において重要性が増す態様は、生物学的高分子と相互作用するペプチド又はペプチドミメティクスのプライマリアミノ酸配列を含むペプチド構造の同定である。既定の生物学的高分子（レセプタ等）との結合といった、望ましい構造又は機能特性を保有するペプチドを同定する一方法には、ペプチドのアミノ酸配列によって与えられる望ましい構造又は機能特性を保有する個別のライブラリ構成要素に関して、大きなライブラリ又はペプチドをスクリーニングすることが関与する。
【０２４８】
ペプチドライブラリを生成するためのダイレクト化学合成方法に加え、いくつかの組み換えＤＮＡ方法も報告されている。一タイプには、バクテリオファージ粒子又は細胞の表面でのペプチド配列、抗体、又は他のタンパク質のディスプレイが関与する。一般に、こうした方法では、各バクテリオファージ粒子又は細胞は、自然バクテリオファージ又は細胞タンパク質配列に加え、ディスプレイペプチドの単一の種をディスプレイする個別のライブラリ構成要素としての役割を果たす。各バクテリオファージ又は細胞は、特定のディスプレイペプチド配列を符号化するヌクレオチド配列情報を含み、したがって、ディスプレイペプチド配列は、分離したライブラリ構成要素の核酸配列を決定することで確認できる。
【０２４９】
広く知られているペプチドディスプレイ法には、通常はバクテリオファージコートタンパク質との融合として、糸状バクテリオファージの表面上でのペプチド配列の提示が関与する。このバクテリオファージライブラリは、固定化した既定の高分子または小分子（レセプタ等）により培養することが可能であり、固定化高分子と結合するペプチド配列を提示するバクテリオファージ粒子は、既定の高分子と結合するペプチド配列を提示しないものとは異なる形で区分できるようになる。固定化高分子と結合するバクテリオファージ粒子（つまり、ライブラリ構成要素）は、次に、回収及び複製し、その後のラウンドでの親和性濃縮及びファージ複製のために、選択したバクテリオファージ小集団を増幅することができる。数ラウンドの親和性濃縮及びファージ複製後、このように選択されたバクテリオファージライブラリ構成要素は、分離され、ディスプレイペプチド配列を符号化するヌクレオチド配列が決定され、これにより、既定の高分子（レセプタ等）と結合するペプチドの（複数の）配列が同定される。こうした方法については、ＰＣＴ特許公報ＷＯ９１／１７２７１、ＷＯ９１／１８９８０、ＷＯ９１／１９８１８、及びＷＯ９３／０８２７８において更に説明されている。
【０２５０】
本発明は、更に、ランダム、疑似ランダム、及び定義済みの配列枠組みペプチドライブラリと、所定のレセプタ分子又はエピトープ或いは望ましい形でペプチド又はＲＮＡを修飾する遺伝子産物に結合する有用な化合物（一本鎖抗体を含むペプチド等）を同定するために、こうしたライブラリを生成及びスクリーニングする方法とを提供する。ランダム、疑似ランダム、及び定義済みの配列枠組みペプチドは、ディスプレイペプチドが合成されたポリヌクレオチド鋳型に付着するディスプレイペプチド又はディスプレイ一本鎖抗体を含むペプチドライブラリ構成要素のライブラリから生成される。付着の形態は、選択した本発明の特定の実施形態に応じて変化させることが可能であり、ファージ粒子内でのカプセル化又は細胞内での取り込みを含むことができる。
【０２５１】
本発明の大きな利点は、所定のペプチドリガンド又は抗体を分離するために、予想されるリガンド構造に関する事前情報を必要としないことである。同定するペプチドは、生物学的活性を有することが可能であり、これは、選択されたレセプタ分子に関して少なくとも特定の結合親和性を含むことを意味し、また、他の化合物の結合をブロックする能力と、代謝経路を刺激又は抑制する能力と、信号又はメッセンジャとして作用する能力と、細胞活性を刺激又は抑制する能力と、その他とを更に含むことになる。
【０２５２】
本発明は、更に、本発明の方法によって同定され、既定のレセプタ（哺乳類タンパク質性レセプタ等、例えば、ペプチド性ホルモンレセプタ、細胞表面レセプタ、他の（複数の）タンパク質に結合してヘテロ二量体等の細胞内タンパク質複合体を形成する細胞内タンパク質、及びその他）又はエピトープ（固定化タンパク質、糖タンパク質、オリゴ糖、及びその他等）と結合するライブラリ構成要素に関して、発生期ペプチド（一本鎖抗体を含む）をディスプレイするポリソームのライブラリを親和性スクリーニングすることによって選択されたポリヌクレオチド配列のプールをシャッフリングする方法を提供する。
【０２５３】
こうした方法のいずれかによる第一の選択ラウンド（通常は、レセプタ（リガンド）との結合に関する親和性選択による）において選択されたポリヌクレオチド配列はプールされ、この（複数の）プールは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及び又はｉｎ  ｖｉｖｏ組み換えによってシャッフリングされ、組み換え済み選択ポリヌクレオチド配列の集団を含むシャッフル済みプールが生成される。組み換え済み選択ポリヌクレオチド配列には、少なくとも一回の事後選択ラウンドが施される。（複数の）事後選択ラウンドにおいて選択されたポリヌクレオチド配列は、直接、配列に使用することが可能であり、及び又は、一回以上の追加ラウンドでシャッフリング及び事後選択を施すことができる。選択した配列は、自然配列（つまり、結合に対する機能的影響に実体のないもの）を符号化するポリヌクレオチド配列によって戻し交配することも可能であり、例えば、免疫原性の少ない可能性があるネイティブに似た機能ペプチドを生成するために、選択した配列と実質的に同一な野生型又は自然発生配列によって戻し交配することが可能である。一般に、戻し交配中には、既定のレセプタ（リガンド）との結合特性を維持するために、事後選択が適用される。
【０２５４】
選択した配列のシャッフリングの前に、或いはこれと同時に、この配列は、突然変異生成させることができる。一実施形態において、選択済みライブラリ構成要素は、原核ベクタ（例えば、プラスミド、ファージミド、又はバクテリオファージ）においてクローニングされ、これにおいて、個別のライブラリ構成要素を表す個々のコロニ（又はプラーク）の集合が生成される。個別の選択済みライブラリ構成要素は、その後、選択済みライブラリ構成要素の配列に基づく配列多様性の中核を表すライブラリ構成要素の集合を生成するために、操作することができる（例えば、部位指定突然変異生成、カセット式突然変異生成、化学的突然変異生成、ＰＣＲ突然変異生成、及びその他）。個別の選択済みライブラリ構成要素又はプールの配列は、ランダム突然変異と、疑似ランダム突然変異と、定義中核突然変異（つまり、変異及び不変残基位置を含むこと、及び又はアミノ酸残基の定義されたサブセットから選択された残基を含む変異残基位置を含むこと）と、コドンベース突然変異と、その他とを組み込むために、セグメント的に、或いは個別の選択済みライブラリ構成要素配列の全長に渡って、操作することができる。突然変異生成した選択済みライブラリ構成要素は、その後、本明細書で開示するｉｎ  ｖｉｔｒｏ及び又はｉｎ  ｖｉｖｏ組み換えシャッフリングによってシャッフリングされる。
【０２５５】
本発明は、更に、本発明の複数の個別ライブラリ構成要素を含むペプチドライブラリを提供し、これにおいて、（１）前記複数内の各個別ライブラリ構成要素は、選択された配列のプールをシャッフリングすることで生成された配列を含み、（２）各個別ライブラリ構成要素は、前記複数内の他の個別ライブラリ構成要素の可変ペプチドセグメント配列又は一本鎖抗体セグメント配列から識別可能な、可変ペプチドセグメント配列又は一本鎖抗体セグメント配列を含む（ただし、一部のライブラリ構成要素は、不均等な増幅、確率的な可能性、又はその他のため、一ライブラリ当たり二つ以上のコピーに存在する場合がある）。
【０２５６】
本発明は、更に、プロダクトバイプロセスを提供し、これにおいて、既定の結合特異性を有する（或いは、これを有するペプチドを符号化する）選択されたポリヌクレオチド配列は、以下のプロセスによって形成される：（１）既定のレセプタ（リガンド等）又はエピトープ（抗原高分子等）に対してディスプレイペプチド又はディスプレイ一本鎖抗体ライブラリをスクリーニングすること、及び選択ライブラリ構成要素のプールを生成するために、既定のレセプタ又はエピトープに結合するライブラリ構成要素を同定及び又は濃縮すること、（２）既定のエピトープと結合し、これによりライブラリから分離及び又は濃縮された選択ライブラリ構成要素（或いは、その増幅済み又はクローニング済みコピー）を、シャッフル済みライブラリを生成するために組み換えによりシャッフリングすること、及び（３）既定のレセプタ（リガンド等）又はエピトープ（抗原高分子等）に対してシャッフル済みライブラリをシャッフリングすること、及び選択シャッフル済みライブラリ構成要素のプールを生成するために、既定のレセプタ又はエピトープに結合するシャッフル済みライブラリ構成要素を同定及び又は濃縮すること。
【０２５７】
本方法は、任意の開示方法と、その任意の組み合わせとによるｉｎ  ｖｉｔｒｏ及び又はｉｎ  ｖｉｖｏ組み換えによって、抗体ディスプレイ法で選択されたポリヌクレオチド配列をシャッフリングするのに使用することが可能であり、これにおいて、関連するポリヌクレオチドは、表現型（既定の抗原（リガンド）と結合する親和性等）に関してスクリーニングされたディスプレイ抗体を符号化する。
【０２５８】
免疫グロブリン鎖に存在する可能性がある極めて多数の区別可能な可変領域によって表現される膨大な免疫学的レパートリを捕捉するために、様々な分子遺伝子アプローチが考案されてきた。自然発生の生殖細胞系免疫グロブリン重鎖座は、可変セグメント遺伝子の分離タンデム配列を含み、これは多様性セグメント遺伝子のタンデム配列の上流に位置し、これ自体は接合（ｉ）領域遺伝子のタンデム配列の上流に位置し、これは定常領域遺伝子の上流に位置する。Ｂリンパ球発生中、Ｖ−Ｄ−Ｊ再配列が発生し、これにおいて、融合Ｄセグメントを形成する再配列によって重鎖可変領域遺伝子（ＶＨ）が形成され、これに続いてＶセグメントの再配列によりＶ−Ｄ−Ｊ接合産物遺伝子が形成され、これは生産的に再配列された場合、重鎖の機能可変領域（ＶＨ）を符号化する。同様に、軽鎖座は、いくつかのＪセグメントの一つにより、いくつかのＶセグメントの一つを再配列し、軽鎖の可変領域（ＬＶ）を符号化する遺伝子を形成する。
【０２５９】
免疫グロブリンにおいて可能な可変領域の膨大なレパートリは、部分的には、Ｂ細胞の発生における再配列中にＶ及びｉセグメント（及び、重鎖座の場合、Ｄセグメント）を接合する無数の組み合わせ可能性に由来する。重鎖可変領域における追加的な配列多様性は、Ｖ−Ｄ−Ｊ接合中のＤセグメントの不均一な再配列、及びＮ領域の追加から発生する。更に、同定Ｂ細胞クローンの抗原選択では、重鎖及び軽鎖変異領域の一方又は両方において、非生殖細胞系突然変異を有する高い親和性変異体が選択され、この現象は「親和性突然変異」又は「親和性シャープニング」と呼ばれる。通常、こうした「親和性シャープニング」突然変異は、可変領域の特定のエリアに集まり、最も一般的には、相補性決定領域（ＣＤＲ）に集まる。
【０２６０】
抗原刺激β細胞の発生（つまり、免疫化）を通じて高親和性免疫グロブリンを生成及び同定することにおける多数の制約を克服するために、様々な原核発現系が開発されており、これは、特定の抗原に対する高親和性抗体をスクリーニング可能な組み合わせ抗体ライブラリを生成する目的で操作可能である。Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ及びバクテリオファージ系での抗体の発現における近年の進歩により（下記「代替ペプチドディスプレイ法」参照）、特徴付けたハイブリドーマからの抗体遺伝子をクローニングすること、或いは抗体遺伝子ライブラリ（例えば、Ｉｇ  ｃＤＮＡから）を使用したｄｅ  ｎｏｖｏ選択により、事実上任意の特異性を得られる可能性が高まった。
【０２６１】
抗体の組み合わせライブラリは、バクテリオファージプラークとして、或いはリソゲンのコロニとしてスクリーニング可能なバクテリオファージλ発現系において生成されている（ヒューズら，１９８９、ケイトン及びコプロウスキ，１９９０、マリナックスら，１９９０、ペルソンら，１９９１）。バクテリオファージ抗体ディスプレイライブラリ及びλファージ発現ライブラリの様々な実施形態が説明されている（カンら，１９９１、クラックソンら，１９９１、マッカファーティら，１９９０、バートンら，１９９１、フーゲンブームら，１９９１、チャンら，１９９１、ブライトリングら，１９９１、マークスら，１９９１，ｐ５８１、バーバスら，１９９２、ホーキンス及びウィンタ，１９９２、マークスら，１９９２，ｐ７７９、マークスら，１９９２，ｐ１６００７、及びローマンら，１９９１、ラーナら，１９９２、これらは全て出典を明記することによりその開示内容全体を本願明細書の一部とする）。通常、バクテリオファージ抗体ディスプレイライブラリは、固定化（例えば、親和性クロマトグラフィで反応性ファージを濃縮するためのクロマトグラフィ樹脂との共有結合による）及び又は標識付け（プラーク又はコロニリフトをスクリーニングすること）されたレセプタ（ポリペプチド、炭水化物、糖タンパク質、核酸等）によりスクリーニングされる。
【０２６２】
特定の有利な一アプローチは、いわゆる一本鎖可変断片（ｓｃｆｖ）ライブラリの使用であった（マークスら，１９９２，ｐ７７９、ウィンタ及びミルスタイン，１９９１、クラックソンら，１９９１、マークスら，１９９１，ｐ５８１、チョードリら，１９９０、チスウェルら，１９９２、マッカファーティら，１９９０、及びヒューストンら，１９９８）。バクテリオファージコートタンパク質でディスプレイされるｓｃｆｖライブラリの様々な実施形態が説明されている。
【０２６３】
１９８８年以来、一本鎖類似体及びその融合タンパク質は、抗体エンジニアリング法により、高い信頼性で生成されてきた。第一のステップは、通常、望ましい結合特性を備えたＶＨ及びＶＬドメインを符号化する遺伝子を取得することを含み、こうしたＶ遺伝子は、組み合わせＶ遺伝子ライブラリから選択された或いはＶ遺伝子合成により作成された特定のハイブリドーマ細胞株から分離することが可能である。一本鎖Ｆｖは、コンポーネントＶ遺伝子を、（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３））又は同等の（複数の）リンカペプチドのような適切に設計されたリンカペプチドを符号化するオリゴヌクレオチドに接続することで形成される。このリンカは、第一のＶ領域のＣ末端と第二のもののＮ末端とを架橋し、ＶＨ−リンカ−ＶＬ又はＶＬ−リンカ−ＶＨ’の順序にする。原則として、ｓｃｆｖ結合部位は、親抗体結合部位の親和性及び特異性の両方を忠実に複製することができる。
【０２６４】
したがって、ｓｃｆｖ断片は、フレキシブルなリンカペプチドによって単一のポリペプチド鎖にリンクするＶＨ及びＶＬドメインを含む。ｓｃｆｖ遺伝子が組み立てられた後、これらは、ファージミドでクローニングし、Ｍ１３ファージ（又は類似する糸状バクテリオファージ）の先端で、バクテリオファージＰＩＩＩ（遺伝子３）コートタンパク質を伴う融合タンパク質として発現させる。所定の抗体を発現するファージの濃縮は、集団のｓｃｆｖをディスプレイする組み換えファージを、既定のエピトープ（例えば、ターゲット抗原、レセプタ）との結合に関してパニングすることで達成される。
【０２６５】
ライブラリ構成要素のリンクしたポリヌクレオチドは、スクリーニング又は選択手順後にライブラリ構成要素を複製するための基盤を提供し、更に、ディスプレイペプチド配列或いはＶＨ又はＶＬアミノ酸配列の同一性をヌクレオチド配列によって決定するための基盤を提供する。（複数の）ディスプレイペプチド又は一本鎖抗体（ｓｃｆｖ等）、及び又はそのＶＨ及びＶＬドメイン又はそのＣＤＲは、適切な発現系においてクローニング及び発現が可能である。分離されたＶＨ及びＶＬドメインを符号化するポリヌクレオチドは、定常領域（ＣＨ及びＣＬ）を符号化するポリヌクレオチドに連結され、完全な抗体（例えば、キメラ又は完全ヒト）、抗体断片、及びその他を符号化するポリヌクレオチドを形成する場合が多い。分離されたＣＤＲを符号化するポリヌクレオチドは、適切な可変領域枠組み（及び、随意的に、定常領域）を符号化するポリヌクレオチドに移植され、完全な抗体（例えば、ヒト化又は完全ヒト）、抗体断片、及びその他を符号化するポリヌクレオチドを形成する場合が多い。抗体は、イミュノアフィニティクロマトグラフィによって、抗原の準備量を分離するのに使用できる。こうした抗体の他の様々な使用法には、疾病（腫瘍形成等）の診断及び又は段階付けと、例えば、腫瘍形成、自己免疫性疾患、ＡＩＤＳ、心疾患、感染症、及びその他といった疾病を治療するための治療的用途がある。
【０２６６】
ｓｃｆｖライブラリの組み合わせ多様性を増加させ、結合種（イディオタイプスペクトル）のレパートリを広げるために、様々な報告が報告されてきた。ＰＣＲの使用は、特定のハイブリドーマソースから、或いは非免疫化細胞からの遺伝子ライブラリとして、可変領域の迅速なクローニングを可能にし、組み合わせ可能なＶＨ及びＶＬカセットの取り合わせに組み合わせ多様性を提供する。更に、ＶＨ及びＶＬカセットは、ランダム、疑似ランダム、又は定義済み突然変異生成によって、それ自体を多様化することが可能である。通常、ＶＨ及びＶＬカセットは、相補性決定領域（ＣＤＲＳ）において、或いはその近くで、多様化され、これは第三のＣＤＲ、ＣＤＲ３である場合が多い。酵素的逆ＰＣＲ突然変異生成は、エラープローンＰＣＲ及び化学的突然変異生成と同様に（デンら，１９９４）、ｓｃｆｖ部位指定ハイブリッドの比較的大きなライブラリを構築するシンプルで信頼性の高い方法であることが示されている（ステマら，１９９３）。リーチマン（リーチマンら，１９９３）は、縮退オリゴヌクレオチドＰＣＲと、その後の結果として生じたｓｃｆｖハイブリッドのファージディスプレイとによる、部位指定ランダム化を使用した抗体ｓｃｆｖ断片の半合理的設計を示した。バルバス（バルバスら，１９９２）は、ヒト破傷風トキソイド結合Ｆａｂの合成ＣＤＲ領域において配列をランダム化することで、バイアスをかけた可変領域配列を使用することから生じる制限されたレパートリサイズの問題の回避を試みた。
【０２６７】
ＣＤＲランダム化は、重鎖ＣＤＲ３のみに関して約１×１０２０ＣＤＲと、重鎖ＣＤＲ１及びＣＤＲ２のほぼ同様の数の変異体と、軽鎖ＣＤＲ１乃至３変異体とを形成する可能性を有する。個別又は一緒に考えると、重鎖及び又は軽鎖のＣＤＲランダム化の組み合わせ可能性には、可能なすべての組み合わせを表現するクローンライブラリを生成するために、法外な数のバクテリオファージクローンを生成することが必要であり、組み合わせの大部分は非結合性である。こうした多数のプライマリ形質転換体の生成は、現在の形質転換技術及びバクテリオファージディスプレイシステムでは実現不可能である。例えば、バルバス（バルバスら，１９９２）は、５×１０７の形質転換体を生成したに過ぎず、これは完全にランダム化したＣＤＲのライブラリの潜在的な多様性のほんの僅かしか表現していない。
【０２６８】
こうした大きな制限にもかかわらず、ｓｃｆｖのバクテリオファージディスプレイは、既に、様々な役に立つ抗体及び抗体融合タンパク質を生み出している。二重特異性一本鎖抗体は、効率的な腫瘍細胞の溶解を仲介することが示されている（グルーバら，１９９４）。抗Ｒｅｖ  ｓｃｆｖの細胞内発現は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＨＩＶ−１ウイルスの複製を抑制することが示されており（デュアンら，１９９４）、抗ｐ２ｌｒａｒ  ｓｃｆｖの細胞内発現は、Ｘｅｎｏｐｕｓ卵母細胞の減数分裂成熟を抑制することが示されている（ビオッカら，１９９３）。ＨＩＶ感染を診断するのに使用できる組み換えｓｃｆｖについても報告されており、ｓｃｆｖの診断における重要性が実証されている（リリーら，１９９４）。毒素又は線維素溶解アクチベータタンパク質といった、ｓｃｆｖが第二のポリペプチドにリンクされる融合タンパク質についても報告されている（ホルボストら，１９９２、ニコラスら，１９９３）。
【０２６９】
幅広い抗体多様性を有し、潜在的な配列組み合わせの非常に僅かな部分のみをカバー可能な従来のＣＤＲ突然変異及びランダム化の多くの制限を克服するｓｃｆｖライブラリを生成することが可能であれば、治療及び診断用途に適したｓｃｆｖ抗体の数及び品質は、大いに向上する。これに取り組むためには、本発明のｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏシャッフリング法を使用して、選択されたディスプレイ抗体より得られた核酸から（通常はＰＣＲ増幅又はクローニングを介して）取得されたＣＤＲを組み換える。こうしたディスプレイ抗体は、細胞上、バクテリオファージ粒子上、ポリソーム上、或いは抗体が（複数の）符号化核酸に関連する任意の適切な抗体ディスプレイ系で、ディスプレイすることができる。変異として、ＣＤＲは、抗体生成細胞（例えば、ＷＯ９２／０３９１８、ＷＯ９３／１２２２７、及びＷＯ９４／２５５８５にあるような、免疫化した野生型マウス、ヒト、又はヒト抗体を形成できる遺伝子導入マウスからのプラズマ細胞／脾細胞）からのｍＲＮＡ（又はｃＤＮＡ）より最初に取得され、これは、これに由来するハイブリドーマを含む。
【０２７０】
こうした方法のいずれかによる第一の選択ラウンド（通常は、抗原（リガンド等）と結合するディスプレイ抗体に関する親和性選択による）において選択されたポリヌクレオチド配列は、プールされ、この（複数の）プールは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及び又はｉｎ  ｖｉｖｏ組み換え、特にＣＤＲのシャッフリング（通常は、他の重鎖ＣＤＲにより重鎖ＣＤＲをシャッフリングし、他の軽鎖ＣＤＲにより軽鎖ＣＤＲをシャッフリングする）により、シャッフリングされ、組み換え済み選択ポリヌクレオチド配列の集団を含むシャッフル済みプールが生成される。この組み換え済み選択ポリヌクレオチド配列は、ディスプレイ抗体として選択フォーマットにおいて発現させ、少なくとも一回の事後選択ランドを施す。（複数の）事後選択ラウンドにおいて選択されたポリヌクレオチドは、直接、配列決定することが可能であり、及び又は望ましい結合親和性が得られるまで、一回以上の追加ラウンドでシャッフリング及び事後選択を施すことができる。選択した配列は、中立抗体枠組み配列（つまり、抗原結合に対する機能的影響に実体のないもの）を符号化するポリヌクレオチド配列によって戻し交配することも可能であり、例えば、ヒトに似た配列抗体を生成するために、ヒト可変領域によって戻し交配することが可能である。一般に、戻し交配中には、既定の抗原との結合特性を維持するために、事後選択が適用される。
【０２７１】
代わりに、或いは記載の変異と組み合わせて、ターゲットエピトープの原子価を変化させて、選択されたｓｃｆｖライブラリ構成要素の平均結合親和性を制御することができる。ターゲットエピトープは、競争的エピトープを含めること、希釈すること、或いは当業者に知られる他の方法等によって、様々な濃度で表面又は基質に結合させることができる。既定のエピトープの高濃度（原子価）は、比較的低い親和性を有するｓｃｆｖライブラリ構成要素を濃縮するために使用可能であるのに対し、低濃度（原子価）は、高い親和性のｓｃｆｖライブラリ構成要素を優先的に濃縮することができる。
【０２７２】
多様な可変セグメントを生成するために、ペプチド配列のランダム、疑似ランダム、又は定義済みの配列中核セットを符号化する合成オリゴヌクレオチドの集合を、ライゲーションにより、既定の部位（ＣＤＲ等）に挿入することができる。同様に、（複数の）一本鎖抗体カセットの一つ以上のＣＤＲの配列多様性を、部位指定突然変異生成、ＣＤＲ置換、及びその他により（複数の）ＣＤＲを突然変異させることで伸長することができる。結果として生じたＤＮＡ分子は、シャッフリング前のクローニング及び増幅のための宿主において増殖させることが可能で、或いは、直接使用することが可能であり（つまり、宿主細胞での増殖時に発生する可能性のある多様性の損失を回避することができる）、選択されたライブラリ構成要素は、その後、シャッフリングされる。
【０２７３】
所定の様々なセグメントペプチド配列又は所定の一本鎖抗体を符号化するディスプレイペプチド／ポリヌクレオチド複合体（ライブラリ構成要素）は、親和性濃縮手法によりライブラリから選択される。これは、レセプタ等、所定のペプチド配列に特異的な高分子又はエピトープ、その他の高分子、或いはエピトープ種を固定化する手段によって達成される。親和性選択手順を繰り返すことで、望ましい配列を符号化するライブラリ構成要素の濃縮が提供され、これはその後、プーリング及びシャッフリング、配列、及び又は更なる増殖及び親和性濃縮のために分離することができる。
【０２７４】
望ましい特異性のないライブラリ構成要素は、洗浄により除去される。必要な洗浄の度合い及び強さは、各ペプチド配列又は所定の一本鎖抗体及び固定化した既定の高分子又はエピトープに関して決定される。結合培養及びその後の洗浄の条件を調整することで、回収される発生期ペプチド／ＤＮＡ複合体の結合特性に、ある程度の制御を及ぼすことができる。温度と、ｐＨと、イオン強度と、二価カチオン濃度と、洗浄の量及び持続時間とは、特定の範囲内の固定化高分子に関する親和性を示す発生期ペプチド／ＤＮＡ複合体に関して、選択することができる。通常、高親和性が予想される低い解離速度に基づく選択は、最も実際的なルートである場合が多い。これは、飽和量の自由な既定の高分子が存在する状態での継続的な培養、或いは、洗浄の量、回数、長さを増やすことによって実行できる。各ケースにおいて、解離した発生期ペプチド／ＤＮＡ又はペプチド／ＲＮＡ複合体の再結合は、防止され、時間が経過するにつれ、更に高い親和性の発生期ペプチド／ＤＮＡ又はペプチド／ＲＮＡ複合体が回収される。
【０２７５】
特別な特徴を有するペプチドを発見するために、結合及び洗浄手順の追加的な修正を適用することができる。一部のペプチドの親和性は、イオン強度又はカチオン濃度に応じて変化する。これは、ペプチドからタンパク質を除去するために穏やかな条件が必要とされる時、様々なタンパク質の親和性精製において使用されるペプチドにとって有用な特徴である。
【０２７６】
変異の一つには、多数の結合ターゲット（多数のエピトープ種、多数のレセプタ種）を使用し、様々な結合特異性を有する多数のｓｃｆｖに関して、ｓｃｆｖライブラリを同時にスクリーニングできるようにすることが含まれる。ｓｃｆｖライブラリのサイズは可能性のあるｓｃｆｖ配列の多様性を制限することが多いことから、通常は、可能な限り大きなサイズのｓｃｆｖライブラリを使用することが望ましい。多数の非常に大きなポリソームｓｃＦｖディスプレイライブラリを生成することに関する時間及び経済的な考慮事項は、極めて大きなものになる可能性がある。こうした大きな問題を回避するため、多数の既定のエピトープ種（レセプタ種）を、単一のライブラリにおいて共にスクリーニングすることが可能であり、或いは、多数のエピトープ種に対する連続的スクリーニングを使用することができる。変異の一つにおいて、別個のビード（又はビードのサブセット）上でそれぞれが符号化される多数のターゲットエピトープ種は、適切な結合条件下で、ポリソームディスプレイｓｃｆｖライブラリにより混合及び培養することができる。このビードの集合は、多数のエピトープ種を含み、その後、親和性選択により、ｓｃｆｖライブラリ構成要素を分離するのに使用することができる。一般に、その後の親和性スクリーニングラウンドは、ビードの同じ混合物、そのサブセット、或いは一つ又は二つの個別エピトープ種のみを含むビードを含むことができる。このアプローチは、効率的なスクリーニングを提供し、ラボラトリオートメーション、バッチ処理、及び高スループットスクリーニング方法に適合する。
【０２７７】
本発明においては、様々な手法を使用して、ペプチドライブラリ又は一本鎖抗体ライブラリを多様化すること、或いは、シャッフリングの前又はこれに付随して、パニングの初期のラウンドにおいて発見された可変領域修理のペプチドを多様化し、既定の高分子又はエピトープに対する十分な結合活性を得ることができる。アプローチの一つにおいては、陽性の選択ペプチド／ポリヌクレオチド複合体（親和性濃縮の初期のラウンドにおいて同定されたもの）を配列し、活性ペプチドの同一性を決定する。その後、一次オリゴヌクレオチド配列の僅かな変化を生成するために、各ステップに組み込まれた低レベルの全塩基を利用し、こうした活性ペプチド配列に基づいて、オリゴヌクレオチドが合成される。この（僅かに）縮退したオリゴヌクレオチドの混合物は、その後、様々なセグメント配列において、適切な位置でクローニングされる。この方法により、開始ペプチド配列の体系的で制御された変異が生じ、これはその後、シャッフリングすることができる。しかしながら、個々の陽性発生期ペプチド／ポリヌクレオチド複合体は、突然変異生成前に配列決定する必要があり、したがって、少数の回収複合体の多様性を伸長し、より高い親和性及び又はより高い結合特異性を有する変異体を選択するのに有用である。変異として、陽性の選択ペプチド／ポリヌクレオチド複合体（特に、可変領域配列のもの）の変異原性ＰＣＲ増幅において、その増幅産物は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及び又はｉｎ  ｖｉｖｏでシャッフリングされ、配列決定する前に、一回以上の追加ラウンドでのスクリーニングが実行される。同じ一般的なアプローチは、通常、シャッフリングの前又はこれに付随して、ＣＤＲ又は隣接した枠組み領域を多様化することで、多様性を伸長し、結合親和性／特異性を強化するために、一本鎖抗体において利用することが可能である。望ましい場合、シャッフリング反応には、含めることが可能な選択されたライブラリ構成要素によるｉｎ  ｖｉｔｒｏ組み換えが可能な変異原性オリゴヌクレオチドを加えることができる。したがって、合成オリゴヌクレオチド及びＰＣＲ生成ポリヌクレオチド（エラープローン又は忠実性の高い方法により合成されたもの）の混合物は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏシャッフリング混合物に追加することが可能であり、結果として生じたシャッフル済みライブラリ構成要素（シャッフラント）に組み込むことができる。
【０２７８】
本発明のシャッフリングにより、ＣＤＲ変異一本鎖抗体の膨大なライブラリを生成できる。こうした抗体を生成する一方法は、シャッフリングの前又はこれに付随して、一本鎖抗体及び又はＣＤＲランダム化に合成ＣＤＲを挿入することである。合成ＣＤＲカセットの配列は、ヒトＣＤＲの既知の配列データを参照することで選択され、以下のガイドラインにしたがって、実施者の判断において選択される：合成ＣＤＲは、既知のＣＤＲ配列に対して、少なくとも４０パーセントの位置的配列同一性を有し、好ましくは、既知のＣＤＲ配列に対して、少なくとも５０乃至７０パーセントの位置的配列同一性を有することになる。例えば、合成ＣＤＲ配列の集合は、カバット（カバットら，１９９１）において列挙される自然発生ヒトＣＤＲ配列に基づいてオリゴヌクレオチド配列の集合を合成することで生成可能であり、合成ＣＤＲ配列の（複数の）プールは、少なくとも一つの既知である自然発生ヒトＣＤＲ配列に対して、少なくとも４０パーセントの配列同一性を有するＣＤＲペプチド配列を符号化するために計算される。代わりに、自然発生ＣＤＲ配列の集合は、残基位置において頻繁に（つまり、既知のＣＤＲ配列の少なくとも５％において）使用されるアミノ酸が合成ＣＤＲで対応する（複数の）位置に組み込まれるようなコンセンサス配列を生成するために比較することができる。通常は、いくつか（例えば、３乃至約５０）の既知のＣＤＲ配列を比較し、既知のＣＤＲ間で観察される自然配列の変異を表にまとめ、観察された自然配列変異のすべて又は殆どの順列を包含するＣＤＲペプチド配列を符号化するオリゴヌクレオチドの集合を合成する。制限ではない例として、ヒトＶＨ  ＣＤＲ配列の集合がＴｙｒ、Ｖａｌ、Ｐｈｅ、又はＡｓｐのいずれかであるカルボキシ末端アミノ酸を有する場合、合成ＣＤＲオリゴヌクレオチド配列の（複数の）プールは、カルボキシ末端ＣＤＲ残基をこうしたアミノ酸のいずれかにすることが可能となるように設計される。一部の実施形態においては、ＣＤＲ配列の集合において残基位置で自然発生するもの以外の残基が組み込まれ、この場合は、同類アミノ酸置換が高い頻度で組み込まれ、既知の自然発生ＣＤＲ配列と比較して、五つまでの残基位置を変化させ、非同類アミノ酸置換を組み込むことができる。こうしたＣＤＲ配列は、一次ライブラリ構成要素（第一のラウンドのスクリーニング前）において使用することが可能であり、及び又は、選択されたライブラリ構成要素配列のｉｎ  ｖｉｔｒｏシャッフリング反応に加えるために使用することができる。こうした定義済み及び又は縮退配列のプールの構築は、当業者が容易に達成できるものである。
【０２７９】
合成ＣＤＲ配列の集合は、自然発生ＣＤＲ配列であることが知られていない少なくとも一つの構成要素を含む。重鎖ＣＤＲにおけるＮ領域添加に対応するランダム又は疑似ランダム配列の一部を含むかどうかは実施者の判断に含まれ、Ｎ領域配列は、Ｖ−Ｄ及びＤ−Ｊ接合において発生する１ヌクレオチド乃至約４ヌクレオチドの範囲である。合成重鎖ＣＤＲ配列の集合は、少なくとも約１００の一意的なＣＤＲ配列を含み、通常は少なくとも約１，０００の一意的なＣＤＲ配列を含み、好ましくは少なくとも約１０，０００の一意的なＣＤＲ配列を含み、高い頻度で５０，０００を超える一意的なＣＤＲ配列を含むが、しかしながら、通常は、約１×１０６以下の一意的なＣＤＲ配列が集合に含まれ、ただし、場合によっては、特に自然発生ヒトＣＤＲの同じ位置において同類アミノ酸置換が存在しない或いは希である（つまり０．１パーセント未満である）位置で、同類アミノ酸置換が可能である場合、１×１０７乃至１×１０８の一意的なＣＤＲ配列が存在する。一般に、ライブラリに含まれる一意的なＣＤＲ配列の数は、ライブラリにおける一次形質変換体の予想数の１０倍を上回るべきではない。こうした一本鎖抗体は、一般に、少なくとも１×１０ｍ−を結合し、好ましくは少なくとも約５×１０７Ｍ−１の親和性であり、更に好ましくは少なくとも約１×１０８Ｍ−１乃至１×１０９Ｍ−１以上の親和性であり、場合によっては１×１０１０Ｍ−１以上である。既定の抗原は、高い頻度で、ヒトタンパク質、例えば、ヒト細胞表面抗原（例えば、ＣＤ４、ＣＤ８、ＩＬ−２レセプタ、ＥＧＦレセプタ、ＰＤＧＦレセプタ）であり、その他のヒト生物学的高分子（例えば、トロンボモジュリン、プロテインＣ、糖鎖抗原、シアリルルイス抗原、Ｌセレクチン）、或いは、人間以外の疾病関連高分子（例えば、バクテリアＬＰＳ、ビリオンカプシドタンパク質、又はエンベロープ糖タンパク質）、及びその他である。
【０２８０】
望ましい特異性の高親和性一本鎖抗体は、様々な系においてエンジニアリング及び発現が可能である。例えば、ｓｃｆｖは、植物において生成されており（フィレクら，１９９３）、原核生物系において容易に作成できる（オーウェン及びヤング，１９９４、ジョンソン及びバード，１９９１）。更に、一本鎖抗体は、完全な抗体又はその様々な断片を構築する基盤として使用できる（ケトルバーロウら，１９９４）。配列を符号化する可変領域は、免疫原性を最小化するのが好ましいヒト治療用途に適したヒト配列抗体を符号化するために、（例えば、ＰＣＲ増幅又はサブクローニングにより）分離し、望ましいヒト定常領域を符号化する配列にスプライシングすることができる。結果として生じる（複数の）完全なヒト符号化配列を有する（複数の）ポリヌクレオチドは、（例えば、哺乳類細胞の発現ベクタからの）宿主細胞において発現させ、薬品製剤のために精製することができる。
【０２８１】
発現後、抗体と、個別の突然変異免疫グロブリン鎖と、突然変異抗体断片と、本発明のその他の免疫グロブリンポリペプチドとは、この技術の標準的な手順にしたがって精製することが可能であり、これには硫安沈殿、フラクションカラムクロマトグラフィ、ゲル電気永動、及びその他が含まれる（一般に、スコープス，１９８２を参照）。部分的に又は望ましい均質性まで、精製された後、このポリペプチドは、治療的に使用可能であり、或いは、検定手順の開発及び実行、免疫蛍光染色、及びその他で使用することができる（一般に、レフコビッツ及びパーニス，１９７９及び１９８１、レフコビッツ，１９９７を参照）。
【０２８２】
本発明の方法によって生成された抗体は、診断及び治療に使用することができる。制限ではなく例示として、これらは、癌、自己免疫疾患、又はウイルス感染の治療に使用することができる。癌の治療に関して、この抗体は、通常、ガン細胞上で優先的に発現する抗原と結合することになり、これには、ｅｒＢ−２、ＣＥＡ、ＣＤ３３、及び、当業者に広く知られる他の多くの抗原及び結合要素が含まれる。
【０２８３】
シャッフリングは、ツーハイブリッドスクリーニング系によって得られるライブラリ構成要素のプールを組み換えにより多様化し、既定のポリペプチド配列と結合するライブラリ構成要素を同定するために使用することもできる。選択されたライブラリ構成要素は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及び又はｉｎ  ｖｉｖｏ組み換えによりプール及びシャッフリングされる。シャッフリングされたプールは、その後、イーストツーハイブリッド系においてスクリーニングし、前記既定のポリペプチド配列（例えば、ＳＨ２ドメイン）と結合するライブラリ構成要素、或いは代替の既定のポリペプチド配列（例えば、別のタンパク質種からのＳＨ２ドメイン）と結合するライブラリ構成要素を選択することができる。
【０２８４】
既定のポリペプチド配列と結合するポリペプチド配列を同定するアプローチでは、既定のポリペプチド配列が融合タンパク質に存在するいわゆる「ツーハイブリッド」系が使用されてきた（シャンら，１９９１）。このアプローチは、転写活性因子、イーストＧａｌ４転写タンパク質の再構成（フィールズ及びソング，１９８９）を通じて、ｉｎ  ｖｉｖｏでタンパク質−タンパク質相互作用を同定する。通常、この方法は、ＤＮＡ結合及び転写活性化を引き起こす分離可能なドメイン構成されるイーストＧａｌ４タンパク質の特性に基づく。ツーハイブリッドタンパク質を符号化するポリヌクレオチドで、一方が既知のタンパク質のポリペプチド配列と融合するイーストＧａｌ４  ＤＮＡ結合ドメインで構成され、他方が第二のタンパク質のポリペプチド配列と融合するＧａｌ４活性化ドメインで構成されるものは、イースト宿主細胞で構築及び導入される。二つの融合タンパク質間の分子間結合は、Ｇａｌ４活性化ドメインを伴うＧａｌ４  ＤＮＡ結合ドメインを再構成し、これは、Ｇａｌ４結合部位と動作的にリンクするレセプタ遺伝子（例えば、ｌａｃＺ、ＨＩＳ３）の転写活性化につながる。通常、ツーハイブリッド法は、既知のタンパク質と相互作用する新しいポリペプチド配列を同定するために使用される（シルバ及びハント，１９９３、ダーフィら，１９９３、ヤンら，１９９２、ルバンら，１９９３、ハーディら，１９９２、バーテルら，１９９３、及びボイテクら，１９９３）。しかしながら、ツーハイブリッド法の変異は、第二の既知のタンパク質との結合に影響する既知のタンパク質の突然変異を同定するために使用されている（リー及びフィールズ，１９９３、ラロら，１９９３、ジャクソンら，１９９３、及びマドゥら，１９９３）。ツーハイブリッド系は、二つの既知のタンパク質の相互作用構造ドメイン（バードウェルら，１９９３、チャクラバーティら，１９９２、シュタウディンガら，１９９３、及びミルン及びウィーバ，１９９３）、或いは単一のタンパク質のオリゴメリゼーションを引き起こす領域（イワブチら，１９９３、ボガードら，１９９３）を同定するためにも使用されている。ツーハイブリッド系の変異は、タンパク質分解酵素のｉｎ  ｖｉｖｏ活性を研究するために使用されている（ダスマシャパトラら，１９９２）。代わりに、Ｅ．ｃｏｌｉ／ＢＣＣＰ双方向スクリーニング系（ジェルミノら，１９９３、グアレンテ，１９９３）は、相互作用タンパク質配列（つまり、上位のヘテロマルチマをヘテロ二量体化又は形成するタンパク質配列）を同定するために使用できる。ツーハイブリッド系によって選択された配列は、プール及びシャッフリングし、一回以上のその後のラウンドでのスクリーニングのためにツーハイブリッドシステムに導入し、既定の結合配列を含むハイブリッドと結合するポリペプチド配列を同定することができる。このように同定された配列は、比較を行い、（複数の）コンセンサス配列及びコンセンサス配列の中核を同定することができる。
【０２８５】
鋳型ＤＮＡの１マイクログラム試料は、ＴＴ二量体、特にプリン二量体を含む二量体を形成させるために、取得し、紫外線により処理する。紫外線による露光は、鋳型ＤＮＡ試料で遺伝子ごとにほんの僅かな光産物が生成されるように制限される。多数の試料を、紫外線により、時間の長さを変化させて処理し、紫外線露光による二量体の数が異なる鋳型ＤＮＡ試料を取得する。
【０２８６】
非プルーフリーディングポリメラーゼを利用するランダム初回免疫キット（例えば、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ＳｙｓｔｅｍｓのＰｒｉｍｅ−Ｉｔ  ＩＩ  Ｒａｎｄｏｍ  Ｐｒｉｍｅｒ  Ｌａｂｅｌｉｎｇキット）を利用し、紫外線によって（上記の通り）作成された鋳型のランダムな部位で初回免疫を行い、鋳型に沿って伸長することで、様々なサイズのポリヌクレオチドが生成される。Ｐｒｉｍｅ−Ｉｔ  ＩＩ  Ｒａｎｄｏｍ  Ｐｒｉｍｅｒ  Ｌａｂｅｌｉｎｇキットにおいて説明されるような初回免疫プロトコルは、プライマを伸長するのに利用することができる。紫外線露光によって形成される二量体は、非プルーフリーディングポリメラーゼによる伸長の障害物としての役割を果たす。したがって、ランダムなプライマによる伸長が終了した後には、ランダムなサイズのポリヌクレオチドのプールが存在する。
【０２８７】
本発明は、更に、通常は増幅及び又はクローニングされたポリヌクレオチドの形態である選択突然変異体ポリヌクレオチド配列（又は、選択ポリヌクレオチド配列の集団）を生成する方法に向けられており、これにより、（複数の）選択ポリヌクレオチド配列は、選択可能な少なくとも一つの望ましい表現型の特徴（例えば、ポリペプチドを符号化すること、リンクしたポリヌクレオチドの転写を促進すること、タンパク質を結合すること、及びその他）を保有する。既定の生物学的高分子（レセプタ等）との結合等、望ましい構造又は機能特性を保有するハイブリッドポリペプチドを同定する一方法は、ポリペプチドのアミノ酸配列によって与えられた望ましい構造又は機能特性を保有する個別のライブラリ構成要素に関して、ポリペプチドの大きなライブラリをスクリーニングすることを含む。
【０２８８】
一実施形態において、本発明は、親和性相互作用スクリーニング又は表現型スクリーニングに適したディスプレイポリペプチド又はディスプレイ抗体のライブラリを生成する方法を提供する。この方法は、（１）ディスプレイポリペプチド又はディスプレイ抗体及び前記ディスプレイポリペプチド又はディスプレイ抗体を符号化する関連ポリヌクレオチドを含む第一の複数の選択ライブラリ構成要素を取得すること、及び前記関連ポリヌクレオチド又はそのコピーを取得し、前記関連ポリヌクレオチドが実質的に同一である配列の領域を含み、突然変異を前記ポリヌクレオチド又はコピーに適切に導入することと、（２）このポリヌクレオチド又はコピーをプールすることと、（３）ランダムな又は特殊化した初回免疫及び合成プロセス或いは増幅プロセスを中断することで、小さい又は短いポリヌクレオチドを生成することと、（４）新たに合成されたポリヌクレオチドを相同的に組み換えるために、増幅、好ましくはＰＣＲ増幅、及び随意的な突然変異生成を実行することとを含む。
【０２８９】
本発明の目的は、以下を含む一連のステップにより、有用なハイブリッドポリペプチドを発現するハイブリッドポリヌクレオチドを生成するプロセスを提供することである。
【０２９０】
（ａ）増幅又は合成プロセスを阻害又は中断する手段により、ポリヌクレオチド増幅又は合成プロセスを中断し、様々な完了段階にあるポリヌクレオチドの複製による複数の小さい又は短いポリヌクレオチドを提供することで、ポリヌクレオチドを生成すること、
（ｂ）結果として生じた一本鎖又は二本鎖ポリヌクレオチドに一つ以上の一本鎖又は二本鎖オリゴヌクレオチドを追加し、前記追加オリゴヌクレオチドが、集団の一つ以上の一本鎖又は二本鎖ポリヌクレオチドとの異種構造エリアに同一性エリアを含むこと、
（ｃ）結果として生じた一本鎖又は二本鎖オリゴヌクレオチドを変性させ、随意的に、短い又は小さいポリヌクレオチドを様々な長さを有するポリヌクレオチドのプールに分離し、更に随意的に、少なくとも一つの前記ポリヌクレオチドプールに含まれる一つ以上のオリゴヌクレオチドを増幅するために前記ポリヌクレオチドにＰＣＲ手順を施すこと、
（ｄ）前記一本鎖ポリヌクレオチドのアニーリングが一本鎖ポリヌクレオチド間の同一性領域において生じ、突然変異による二本鎖ポリヌクレオチド鎖が形成される条件下で、複数の前記ポリヌクレオチド又は前記ポリヌクレオチドの少なくとも一つのプールを、ポリメラーゼにより培養すること、
（ｅ）ステップ（ｃ）及び（ｄ）を随意的に繰り返すこと、
（ｆ）前記ポリヌクレオチド鎖、又は複数の鎖から、少なくとも一つのハイブリッドポリペプチドを発現させること、
（ｇ）有用な活性に関して、前記少なくとも一つのハイブリッドポリペプチドをスクリーニングすること。
【０２９１】
本発明の一態様において、増幅又は合成プロセスを阻害又は中断する手段は、紫外線、ＤＮＡ付加物、及びＤＮＡ結合タンパク質の利用によるものである。
【０２９２】
本発明の一実施形態において、ＤＮＡ付加物、或いはＤＮＡ付加物を含むポリヌクレオチドは、更なる処理の前にＤＮＡ断片を含む溶液を加熱することを含むプロセス等により、ポリヌクレオチド又はポリヌクレオチドプールから除去される。
【０２９３】
別の実施形態においては、所定の生体分子又は生物活性を有するとして同定されたクローンも、例えば、ポリペプチド（酵素等）を符号化するＤＮＡ配列、或いは特定の活性を有するポリペプチド配列自体を同定するために配列決定することができる。したがって、本発明によれば、（ｉ）所定の生物活性を符号化するＤＮＡ（例えば、特定の酵素活性を有する酵素）と、（ｉｉ）生体分子（例えば、こうした活性を有するポリペプチド又は酵素（そのアミノ酸配列を含む））と、（ｉｉｉ）生成された組み換え生体分子又は生物活性とを分離及び同定することが可能である。
【０２９４】
ライブラリからの適切なクローン（例えば、１乃至１０００以上のクローン）は、本発明の方法によって同定され、例えば、高スループット配列手法を使用して配列決定される。配列決定の正確な方法は、本発明の限定要因にはならない。特定のクローンＤＮＡ配列の配列を同定するのに有用な任意の方法を使用することができる。一般に、配列決定は、ＤＮＡ複製の自然過程の適応である。そのため、鋳型（ベクタ等）及びプライマ配列が使用される。一般的な鋳型作成及び配列決定プロトコルの一つは、バクテリアコロニの自動採集により開始され、バクテリアコロニのそれぞれは、配列決定反応の鋳型として機能する別個のＤＮＡクローンを含む。選択したクローンは、培地に置き、一晩成長させる。ＤＮＡ鋳型は、その後、細胞から精製され、水に懸濁される。ＤＮＡの定量化後、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．のＰｒｉｓｍ  ３７７  ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ等のシークエンサを使用して、高スループット配列決定が実行される。結果として生じた配列データは、その後、データベース又は複数のデータベースの検索を含む、追加的な方法において使用することができる。
【０２９５】
特定のポリヌクレオチド配列によって符号化された活性の同定及び決定において本発明で使用する核酸配列及び又は推論アミノ酸配列を含む多数のソースデータベースを利用することができる。テストされる配列の全部又は代表的な部分（例えば、１００の個別のクローン）は、同時に又は個別に配列データベース（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ、ＰＦＡＭ、又はＰｒｏＤｏｍ）を検索するために使用される。こうした配列検索を実行する多数の様々な方法が、この技術において知られている。このデータベースは、特定の有機体又は有機体の集合に限定されている場合がある。例えば、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ、Ａｒａｂａｄｏｐｓｉｓ．ｓｐ、Ｍ．ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍ、Ｍ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、及びその他に関するデータベースが存在する。クローンの配列データは、その後、二つ以上の配列の相同性を測定するために設計されたアルゴリズムを使用して、データベース又は複数のデータベースの配列に合わせて並べられる。
【０２９６】
こうした配列アライメント方法は、例えば、ＢＬＡＳＴ（アルトシュルら，１９９０）、ＢＬＩＴＺ（ＭＰｓｒｃｈ）（スターロック及びコリンズ，１９９３）、及びＦＡＳＴＡ（パーソン及びリップマン，１９８８）を含む。プローブ配列（例えば、クローンからの配列データ）は、任意の長さにすることが可能であり、相同性閾値に基づいて、相同であると認識される。この閾値は、既定のものにすることができるが、これは必須ではない。この閾値は、特定のポリヌクレオチドの長さに基づいたものにすることができる。配列のアライメントには、多数の様々な手順を使用することができる。通常は、スミス−ウォーターマン又はニードルマン−ブンシュのアルゴリズムが使用される。しかしながら、説明したように、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ、ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴといったスピードの速い手順を使用することもできる。
【０２９７】
例えば、比較ウィンドウを並べる配列の適切なアライメントは、スミスの局所相同アルゴリズム（スミス及びウォーターマン，Ａｄｖ Ａｐｐｌ Ｍａｔｈ， １９８１、スミス及びウォーターマン，Ｊ Ｔｅｏｒ Ｂｉｏｌ， １９８１、スミス及びウォーターマン，Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ， １９８１、スミスら，Ｊ Ｍｏｌ Ｅｖｏｌ， １９８１）、ニードルマンの相同性アライメントアルゴリズム（ニードルマン及びブンシュ，１９７０）、ピアソンの類似性検索方法（ピアソン及びリップマン，１９８８）、こうしたアルゴリズムのコンピュータ実施（ウィスコンシン州マディソン、５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  ＧｒｏｕｐのＷｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ  Ｒｅｌｅａｓｅ７．０、或いはウィスコンシン州マディソン、ウィスコンシン大学、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  ＧｒｏｕｐのＳｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  ＰａｃｋａｇｅにおけるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、及びＴＦＡＳＴＡ）、或いは検査によって、実施することが可能であり、様々な方法によって生成された最善のアライメント（つまり、比較ウィンドウ全体で最大の相同性パーセンテージが生じるもの）が選択される。二つの配列（つまり、プローブ配列及びデータベース配列）の類似性は、その後、予測することができる。
【０２９８】
こうしたソフトウェアは、様々な欠失、置換、及びその他の修飾に相同性の度合いを割り当てることで、類似する配列を一致させる。二つ以上の核酸又はポリペプチド配列のコンテクストにおける「相同」及び「同一」という用語は、任意の数の配列比較アルゴリズムを使用して或いは手動アライメント及び目視検査により測定されたものとして、比較ウィンドウ又は指定領域全体において最大の対応性で比較し並べた時に同じである、或いは同じである特定のパーセンテージのアミノ酸残基又はヌクレオチドを有する、二つ以上の配列又は部分配列を指す。
【０２９９】
配列比較では、通常、一配列が基準配列の役割を果たし、テスト配列は、これと比較される。配列比較アルゴリズムを使用する時は、テスト及び基準配列をコンピュータに入れ、必要な場合は小配列座標を指定し、配列アルゴリズムプログラムパラメータを指定する。デフォルトのプログラムパラメータを使用することが可能であり、或いは、代替のパラメータを指定することができる。その後、配列比較アルゴリズムは、プログラムパラメータに基づいて、基準配列と比較したテスト配列の配列同一性のパーセントを計算する。
【０３００】
「比較ウィンドウ」は、本明細書での使用において、２０乃至６００、通常は約５０乃至約２００、更に通常は約１００乃至約１５０で構成されるグループから選択された連続位置の任意の一つの数のセグメントに対する基準を含み、この中で、二つの配列を適切に並べた後、配列を連続位置の同じ数の基準配列と比較することが可能である。
【０３０１】
有用なアルゴリズムの一例は、ＢＬＡＳＴ及びＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムであり、これは、それぞれ、アルトシュルら，Ｎｕｃ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２５：３３８９−３４０２（１９７７）及びアルトシュルら，Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２１５：４０３−４１０（１９９０）において説明されている。ＢＬＡＳＴ分析を実行するソフトウェアは、米国国立バイオテクノロジ情報センタ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｇｏｖ／）を通じて公的に入手することができる。このアルゴリズムは、問い合わせ配列において、長さＷの短い単語を同定することで、高スコア配列ペア（ＨＳＰ）を最初に同定することを含み、これは、データベース配列内の同じ長さの単語に合わせて並べた時、何らかの正の値の閾値スコアＴと一致するか、或いはこれを満たすものである。Ｔは、隣接単語スコア閾値（アルトシュルら、前掲）と呼ばれる。こうした最初の隣接単語のヒットは、これらを含む長いＨＳＰを見つけるために検索を開始する上で種の役割を果たす。単語のヒットは、累積アライメントスコアを増加させることができる限り、各配列に沿って、両方向で延長される。累積スコアは、ヌクレオチド配列に関して、パラメータＭ（一致する残基のペアに関する報酬スコアで、常に０より大きい）を使用して計算される。ＢＬＡＳＴアルゴリズムのパラメータＷ、Ｔ、及びＸは、アライメントの感度及び速度を決定する。ＢＬＡＳＴプログラム（ヌクレオチド配列に関する）は、デフォルトとして、単語の長さ（Ｗ）１１、期待値（Ｅ）１０、Ｍ＝５、Ｎ＝４、及び両方の鎖の比較を使用する。
【０３０２】
ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、二配列間の類似性の統計分析も実行する（カーリン＆アルトシュル，Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９０：５８７３（１９９３）等を参照）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムが提供する類似性の尺度の一つは、最小合計確率（Ｐ（Ｎ））であり、これは二つのヌクレオチド配列間での一致が偶然に発生する確率の表示を提供する。例えば、核酸は、基準核酸に対するテスト核酸の比較における最小合計確率が約０．２未満、更に好ましくは約０．０１未満、最も好ましくは約０．００１未満である場合、基準配列に類似するとみなされる。
【０３０３】
配列相同性とは、二つのポリヌクレオチド配列が比較のウィンドウ全体で（ヌクレオチドごとに比較して）相同であることを意味する。配列同一性又は相同性のパーセンテージは、比較のウィンドウ全体で適切にアライメントされた二配列を比較し、一致した位置の数を得るために両方の配列において同一の核酸塩基（例えば、Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、Ｕ、又はＩ）が発生する位置の数を決定し、一致した位置の数を比較ウィンドウ内の位置の合計数（つまりウィンドウサイズ）で割り、配列相同性のパーセンテージを得るために結果に１００を掛けることで計算される。こうした実質的な相同性は、ポリヌクレオチド配列の特徴を示し、これにおいて、ポリヌクレオチドは、少なくとも２５乃至５０ヌクレオチドの比較ウィンドウの基準配列と比較して、少なくとも６０％の配列相同性、通常は少なくとも７０％の相同性、多くの場合は８０乃至９０パーセントの配列相同性、最も一般的には少なくとも９９パーセントの配列相同性を含み、これにおいて、配列相同性のパーセンテージは、基準配列を、比較ウィンドウ全体で、合計して基準配列の２０パーセント以下の欠失又は追加を含む可能性があるポリヌクレオチド配列と比較することで計算される。
【０３０４】
十分な相同性を有する配列は、その後、例えば、種及び活性情報を含め、データベースに含まれる任意の注釈によって更に同定することが可能である。したがって、通常の環境試料では、複数の核酸配列が、取得され、クローニングされ、配列決定され、同定されたデータベースからの相同配列に対応することになる。この情報は、試料中に存在するポリヌクレオチドのプロフィールを提供し、これは、配列或いはその配列によってデータベース情報に基づいて符号化される任意のポリペプチドに関連する有機体及び活性を含むポリヌクレオチドに関連する一つ以上の機能を含む。本明細書において、「指紋」又は「プロフィール」とは、各試料が、試料のポリヌクレオチド特性のセットと、由来する環境とに関連することになる事実を指す。こうしたプロフィールは、試料中に存在する配列の量及びタイプと、ポリヌクレオチドによって符号化される潜在的な活性及びポリヌクレオチドが由来する有機体に関する情報とを含む場合がある。こうした固有のパターンは、各資料のプロフィール又は指紋となる。
【０３０５】
また、同一性又は活性が決定された時、或いは示唆される同一性又は活性がポリヌクレオチドに関連する時、特定のクローンポリヌクレオチド配列を発現させることが望ましい場合がある。こうした場合、望ましいクローンは、既に発現ベクタでクローニングされていない場合、調節制御要素（例えば、プロモータ又はエンハンサ）の下流で連結され、適切な宿主細胞でクローニングされる。発現ベクタは、本発明で使用される対応する宿主細胞と共に市販されている。
【０３０６】
使用可能な発現ベクタの代表的な例としては、ウイルス粒子と、バキュロウイルスと、ファージと、プラスミドと、ファージミドと、コスミドと、フォスミドと、バクテリア人工染色体と、ウイルス核酸（例えば、ワクシニア、アデノウイルス、ｆｏｕｌ  ｐｏｘウイルス、仮性狂犬病、及びＳＶ４０の派生物）と、Ｐ１ベース人工染色体と、イーストプラスミドと、イースト人工染色体と、所定の特定の宿主に特異的な他の任意のベクタ（バシラス、アスペルギルス、イースト、及びその他等）とを挙げることができる。したがって、例えば、ＤＮＡは、ポリペプチドを発現させる様々な発現ベクタの任意の一つに含まれる可能性がある。こうしたベクタは、染色体性、非染色体性、及び合成ＤＮＡ配列を含む。多数の適切なベクタが、当業者に知られており、市販されている。以下のベクタは、例として提示される。細菌性：ｐＱＥ７０、ｐＱＥ６０、ｐＱＥ−９（Ｑｕｉａｇｅｎ）、ｐｓｉＸ１７４、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＫＳ、ｐＮＨ８Ａ、ｐＮＨ１６ａ、ｐＮＨ１８Ａ、ｐＮＨ４６Ａ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＴＲＣ９９ａ、ｐＫＫ２２３−３、ｐＫＫ２３３−３、ｐＤＲ５４０、ｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、真核：ｐＷＬＮＥＯ、ｐＳＶ２ＣＡＴ、ｐＯＧ４４、ｐＸＴ１、ｐＳＧ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧ、ｐＳＶＬ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）。しかしながら、宿主内で複製及び生存可能である限り、他の任意のプラスミド又はベクタを使用することができる。
【０３０７】
発現ベクタ内の核酸配列は、ｍＲＮＡ合成を方向付けるために、適切な（複数の）発現制御配列に動作的にリンクされる。特定の指定バクテリアプロモータは、ｌａｃＩと、ｌａｃＺと、Ｔ３と、Ｔ７と、ｇｐｔと、ラムダＰＲと、ＰＬと、ｔｒｐとを含む。原核プロモータは、ＣＭＶ前初期と、ＨＳＶチミジンキナーゼと、初期及び後記ＳＶ４０と、レトロウイルスからのＬＴＲと、マウスメタロチオネイン−Ｉとを含む。適切なベクタ及びプロモータの選択は、十分に、この技術における通常の技能レベル内に含まれる。発現ベクタは、更に、翻訳開始のためのリボソーム結合部位と、転写ターミネータとを含む。ベクタは、更に、発現を増幅するための適切な配列を含む。プロモータ領域は、ＣＡＴ（クロラムフェニコールトランスフェラーゼ）ベクタ又は選択可能なマーカを有するその他のベクタを使用して、任意の望ましい遺伝子から選択することができる。
【０３０８】
加えて、発現ベクタは、真核細胞培養に関するジヒドロ葉酸還元酵素又はネオマイシン抵抗性、或いは、Ｅ．ｃｏｌｉにおけるテトラサイクリン又はアンピシリン抵抗性といった、形質転換させた宿主細胞の選択に関する表現型形質を提供するために、通常、一つ以上の選択可能なマーカ遺伝子を含む。
【０３０９】
上で説明したように選択、クローニング、及び配列決定される（複数の）核酸配列は、加えて、適切な宿主に導入し、望ましい生体分子又は生物活性に関してスクリーニングされるライブラリを準備することができる。選択核酸は、好ましくは、既に、適切な制御配列を含むベクタ内にあり、これにより、望ましい活性を検出するために、生体分子又は生物活性を符号化する選択核酸を発現させることが可能である。宿主細胞は、哺乳類細胞等の高等真核細胞、又はイースト菌等の下等真核細胞にすることが可能であり、或いは、宿主細胞は、バクテリア細胞等の原核細胞にすることができる。適切な宿主の選択は、本明細書の内容から当業者の範囲に入ると考えられる。
【０３１０】
また、試料中に存在する核酸配列又は分離された特定のクローンの増幅を実行することが望ましい場合がある。この実施形態において、核酸配列は、ＰＣＲ反応又は当業者に知られている同様の反応によって増幅される。こうした増幅反応を実行するために、市販の増幅キットを利用することができる。
【０３１１】
加えて、アライメントアルゴリズム及び検索可能なデータベースは、コンピュータハードウェア、ソフトウェア、又はその組み合わせにより実施することができる点を認識することが重要である。したがって、核酸又はポリペプチド配列の分離、処理、及び同定は、自動システムにおいて実施することができる。
【０３１２】
上で説明した配列ベースの手法に加え、マルチウェルプレートを使用して酵素活性を測定するための多数の伝統的な検定システムが存在している。例えば、既存のスクリーニング技術は、通常、二次元ウェル（例えば、９６、３８４、１５３６ウェル）に依存する。本発明は、更に、ウェルベースのスクリーニング手法に比べ多数の利点を有するキャピラリアレイベースのアプローチを提供し、こうした利点には、個別のウェルリザーバに流体（反応体等）を分配する流体ディスペンサの必要性の排除と、アレイ当たりのコスト減少（例えば、ガラスキャピラリは再使用可能）とが含まれる（例えば、出典を明記することによりその開示内容を本願明細書の一部とする１９９９年１１月２２日に出願された米国特許出願番号第０９／４４４，１２２号を参照）。
【０３１３】
したがって、本発明のキャピラリ、キャピラリアレイ、及びシステムは、ポリヌクレオチドを含む所定の活性又は生体分子に関してライブラリをスクリーニングするのに特に最適である。活性のスクリーニングは、個別の発現クローンに関して実行することが可能であり、或いは、発現クローンの混合物に関して、その混合物が一つ以上の指定された活性を有するかどうかを確認するために、最初に実行することができる。混合物が指定された活性を有する場合は、キャピラリアレイからの収集後、こうした活性に関して、或いは更に多くの指定された活性に関して、個別のクローンを再びスクリーニングすることができる。
【０３１４】
本明細書で使用されたあらゆる見出し及び小見出しは、読者の便宜を図るために提示されており、本発明の制限と解釈するべきではない。
【０３１５】
本明細書及び付記した請求項での使用において、単数形である原文の「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、コンテクストによる明確な指定がない限り、複数の指示物を含む。したがって、例えば、「クローン（ａ  ｃｌｏｎｅ）」についての論及は、複数のクローンを含み、「核酸配列（ｔｈｅ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）」についての論及は、一般に、一つ以上の核酸配列及び当業者に知られるその同等物についての論及を含み、その他も同様である。
【０３１６】
定義されていない限り、本明細書で使用されるあらゆる技術用語及び科学用語は、本発明が属する当業者が一般的に理解するものと同じ意味を有する。本発明の実施又はテストにおいては、本明細書で説明されているものと類似又は同等の任意の方法、デバイス、及び材料を使用することができるが、好適な方法、デバイス、及び材料が説明されている。
【０３１７】
本明細書で述べたすべての印刷物は、説明する発明と関連して使用される可能性がある出版物において説明されているデータベースと、タンパク質と、方法とを説明及び開示する目的で、出典を明記することによりその開示内容を本願明細書の一部とする。前記及び全文を通じて説明した出版物は、本願の出願日に先行する開示に関してのみ提示されている。本明細書のいかなる部分も、先行発明により発明者がこうした開示の日時を早める権利を有しないことを承認するものとして解釈されない。
【０３１８】
次に、本発明について、以下の非制限的な例を参照して更に詳細に説明する。
【０３１９】
実施例１
ＤＮＡ分離。ＤＮＡは、ＩｓｏＱｕｉｃｋ  Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅを製造者の指示（ワシントン州ボセルのＯｒｃａ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｃ．）に従って使用することで分離される。分離ＤＮＡは、実施例２（下記）に従って、随意的に平均化することができる。分離時、ＤＮＡは、２５ゲージダブルハブ針及び１ｃｃ注射器により約５００回、ＤＮＡを押し引きすることで剪断される。少量を、０．８％アガロースゲルに流し、ＤＮＡの大部分が望ましいサイズ範囲（約３乃至６ｋｂ）にある状態を確保する。
【０３２０】
ＤＮＡの平滑末端化。ＤＮＡは、４５μｌの１０×マングビーンバッファと、２．０μｌのマングビーンヌクレアーゼ（１０５０ｕ／μｌ）と、水とを混合し、最終体積を４０５μｌにすることで平滑末端化する。この混合物を、３７℃で１５分培養する。この混合物をフェノール／クロロホルム抽出し、その後、更にクロロホルム抽出する。氷温のエタノール１ｍｌを、最終抽出物に追加し、ＤＮＡを沈殿させる。ＤＮＡは、氷上で１０分間沈殿させる。ＤＮＡは、３０分間のマイクロ遠心分離機での遠心分離により取り出す。ペレットは、１ｍｌの７０％エタノールで洗浄し、マイクロ遠心分離機において再びペレットにする。遠心分離に続いて、ＤＮＡを乾燥させ、２６μｌのＴＥバッファで穏やかに再懸濁させる。
【０３２１】
ＤＮＡのメチル化。ＤＮＡは、４μｌの１０×ＥｃｏＲＩメチラーゼバッファと、０．５μｌのＳＡＭ（３２ｍＭ）と、５．０μｌのＥｃｏＲＩメチラーゼ（４０ｕ／μｌ）とを混合し、３７℃で１時間培養することでメチル化する。平滑末端を保証するために、メチル化反応に以下を追加することができる：５．０μｌの１００ｍＭ  ＭｇＣｌ２、８．０μｌのｄＮＴＰ混合物（ｄＧＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ、それぞれ２．５ｍＭ）、４．０μｌのクレノウ（５ｕ／μｌ）。この混合物は、その後、１２℃で３０分間培養される。
【０３２２】
３０分間の培養後、４５０μｌの１×ＳＴＥを追加する。この混合物を一度フェノール／クロロホルム抽出し、続いて、更にクロロホルム抽出する。氷温のエタノール１ｍｌを、最終抽出物に追加し、ＤＮＡを沈殿させる。ＤＮＡは、氷上で１０分間沈殿させる。ＤＮＡは、３０分間のマイクロ遠心分離機での遠心分離により取り出す。ペレットは、１ｍｌの７０％エタノールで洗浄し、マイクロ遠心分離機において再びペレットにし、１０分間乾燥させる。
【０３２３】
ライゲーション。ＤＮＡは、ＤＮＡを８μｌのＥｃｏＲＩアダプタ（ＳｔｒａｇｅｎｅのｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔより）と、１．０μｌの１０×ライゲーションバッファと、１．０μｌの１０ｍＭ  ｒＡＴＰと、１．０μｌのＴ４  ＤＮＡリガーゼ（４Ｗｕ／μｌ）とに穏やかに再懸濁し、４℃で二日間培養することでライゲーションさせる。このライゲーション反応は、３０分間７０℃で加熱することにより終了させる。
【０３２４】
アダプタのリン酸化。アダプタ末端は、ライゲーション反応に、１．０μｌの１０×ライゲーションバッファと、２．０μｌの１０ｍＭ  ｒＡＴＰと、６．０μｌのＨ２Ｏと、１．０μｌのポリヌクレオチドキナーゼ（ＰＮＫ）とを混合し、３７℃で３０分間培養することでメチル化される。３０分間の培養後、この反応に３０μｌのＨ２Ｏと、５ｍｌの１０×ＳＴＥとを追加し、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−５００スピンカラムにより試料をサイズ断片化する。プールした断片（１乃至３）を一度フェノール／クロロホルム抽出し、続いて、更にクロロホルム抽出する。ＤＮＡは、氷温のエタノールを追加することで、氷上で１０分間沈殿させる。沈殿物は、３０分間のマイクロ遠心分離機での遠心分離によりペレットにする。結果として生じたペレットは、１ｍｌの７０％エタノールで洗浄し、遠心分離機により再びペレットにし、１０分間乾燥させる。この試料は、１０．５μｌのＴＥバッファで再懸濁させる。この試料は平板培養されないが、２．５μｌのＤＮＡが使用され、水が使用されない点を除き、上で説明したようにラムダ腕部に直接連結される。
【０３２５】
スクロース勾配（２．２ｍｌ）サイズ断片化。ライゲーションは、試料を６５℃で１０分間加熱することで停止させる。試料を２．２ｍｌのショ糖勾配に入れ、４５０００ｒｐｍの小型超遠心分離機において２０℃で４時間遠心分離する（ブレーキを使用しない）。断片は、勾配管の底部に２０ゲージ針で穴を開け、ショ糖が針を通じて流れるようにすることで収集される。最初の２０液滴は、Ｆａｌｃｏｎ  ２０５９チューブで収集し、その後、１０種類の１液滴断片（１乃至１０で標識付け）を収集する。各液滴は、約６０μｌの体積である。各断片の５μｌを０．８％アガロースゲルに流し、サイズをチェックする。断片１乃至４（約１０乃至１．５ｋｂ）をプールし、別個のチューブにおいて、断片５乃至７（約５乃至０．５ｋｂ）をプールする。ＤＮＡを沈殿させるために氷温のエタノール１ｍｌを追加し、その後、氷上に１０分間置く。沈殿物は、３０分間のマイクロ遠心分離機での遠心分離によりペレットにする。ペレットを、７０％エタノールに再懸濁することで洗浄し、マイクロ遠心分離機において高速で１０分間遠心分離することで再びペレットにし、その後、乾燥させる。各ペレットは、次に、１０μｌのＴＥバッファに再懸濁させる。
【０３２６】
ラムダ腕部とのテストライゲーション。分析物は、０．５μｌの試料を基準（既知の濃度のＤＮＡ試料）と共にエチジウムブロマイドを含むアガロース上に置き、近似濃度を得ることで平板培養される。その後、紫外線を使用して、試料を観察し、推定濃度を基準と比較する。
【０３２７】
下の表１に示すように、以下のライゲーション反応（５μｌ反応）を準備し、４℃で一晩培養する。
【０３２８】
表１
2004524811.tif 000002
テストパッケージ及びプレート。ライゲーション反応は、製造業者のプロトコルに従ってパッケージする。パッケージング反応は、５００μｌのＳＭバッファにより停止させ、同じライゲーションに由来するパッケージングによりプールされる。各プール済み反応の１μｌを適切な宿主上で滴定する（ＯＤ６００＝１．０）（ＸＬ１−Ｂｌｕｅ  ＭＲＦ）。２００μｌの宿主（ＭｇＳＯ４内）を、Ｆａｌｃｏｎ  ２０５９チューブに追加し、１μｌのパッケージしたファージを接種し、３７℃で１５分間培養する。約３ｍｌの４８℃トップアガー（１５０μｌ  ＩＰＴＧ（０．５Ｍ）及び３００μｌ  Ｘ−ＧＡＬ（３５０ｍｇ／ｍｌ）を含む５０ｍｌストック）を追加し、１００ｍｍプレート上で平板培養する。プレートは、３７℃で一晩培養する。
【０３２９】
ライブラリの増幅（各ライブラリから５．０×１０５の組み換え）。約３．０ｍｌの宿主細胞（ＯＤ６００＝１．０）を、二本の５０ｍｌ円錐管に追加し、円錐管当たり２．５×１０５ｐｆｕのファージを接種し、その後、３７℃で２０分間培養する。トップアガーを各管に追加し、最終体積を４５ｍｌにする。各管は、五枚の１５０ｍｍプレートで平板培養する。プレートは、３７℃で６乃至８時間、或いはプラークがピンヘッドのサイズになるまで培養する。プレートにｍ８乃至１０ｍｌのＳＭバッファを被せ、４℃で一晩置く（可能な場合は穏やかに揺らす）。
【０３３０】
ファージの回収。ファージの懸濁は、ＳＭバッファを各プレートから５０ｍｌ円錐管に注ぐことで回収される。約３ｍｌのクロロホルムを追加し、強く振り、室温で１５分間培養する。この管を２０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、細胞残屑を取り除く、上澄みを無菌フラスコに注ぎ、５００μｌクロロホルムを追加し、４℃で保存する。
【０３３１】
滴定量増幅ライブラリ。回収したファージの連続希釈を行い（例えば、１０−５＝１ｍｌのＳＭバッファ内に１μｌの増幅ファージ、１０−６＝１ｍｌのＳＭバッファ１μｌの１０−３稀釈物、及びその他）、２００μｌの宿主（１０ｍＭ  ＭｇＳＯ４内）を二本の管に追加する。一方の管には、１０μｌの１０−６稀釈物（１０−５）を接種する。他方の管には、１μｌの１０−６稀釈物（１０−６）を接種し、３７℃で１５分間培養する。
【０３３２】
約３ｍｌの４８℃トップアガー（１５０μｌ  ＩＰＴＧ（０．５Ｍ）及び３７μｌ  Ｘ−ＧＡＬ（３５０ｍｇ／ｍｌ）を含む５０ｍｌストック）を各管に追加し、１００ｍｍプレートで平板培養する。プレートは、３７℃で一晩培養する。
【０３３３】
ＺＡＰ  ＩＩライブラリは、製造業者のプロトコル（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に従って、ｐＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴライブラリを形成するために切除される。
【０３３４】
ＤＮＡライブラリは、宿主細胞（Ｅ．ｃｏｌｉ等）で形質転換させ、クローンの発現ライブラリを生成することができる。
【０３３５】
実施例２
平均化
ライブラリ生成の前に、精製ＤＮＡは、平均化することができる。ＤＮＡは、以下のプロトコルに従って断片化される。ゲノムＤＮＡを含む試料は、塩化セシウム勾配で精製される。塩化セシウム（Ｒｆ＝１．３９８０）溶液は、０．２μｌフィルタで濾過し、１５ｍｌを３５ｍｌ  ＯｐｔｉＳｅａｌ管（Ｂｅｃｋｍａｎ）に入れる。ＤＮＡを追加し、完全に混合する。１０マイクログラムのビスベンズイミド（Ｓｉｇｍａ、Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３２５８）を追加し、完全に混合する。この管は、次に、濾過した塩化セシウム溶液で満たし、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｌ８−７０  ＵｌｔｒａｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅのＢｔｉ５０ロータにおいて、３３０００ｒｐｍで７２時間回転させる。遠心分離に続いて、シリンジポンプ及び精留塔（Ｂｒａｎｄｅｌ  Ｍｏｄｅｌ  １８６）を使用して、２８０ｎｍに設定したＩＳＣＯ  ＵＡ−５ＵＶ吸光度検出器に勾配を通す。環境試料に存在する有機体からのＤＮＡを表すピークが取得される。真正細菌の配列は、増幅のための以下のプライマを使用して、Ｅ．ｃｏｌｉのピークの１０倍稀釈からのｒＲＮＡを符号化するＤＮＡをＰＣＲ増幅することで検出できる。
【０３３６】
フォワードプライマ：５’−ＡＧＡＧＴＴＴＧＡＴＣＣＴＧＧＣＴＣＡＧ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）
リバースプライマ：５’−ＧＧＴＴＡＣＣＴＴＧＴＴＡＣＧＡＣＴＴ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）
回収されたＤＮＡは、３乃至６ｋｂの断片に剪断又は酵素的に消化される。ローンリンカプライマが連結され、ＤＮＡは、サイズ選択される。サイズ選択ＤＮＡは、必要な場合は、ＰＣＲによって増幅される。
【０３３７】
平均化は、その後、二本鎖ＤＮＡ試料をハイブリッド形成バッファ（０．１２Ｍ  ＮａＨ２ＰＯ４、ｐＨ６．８／０．８２Ｍ  ＮａＣｌ／１ｍＭ  ＥＤＴＡ／０．１％ＳＤＳ）において再懸濁することで達成される。この試料は、鉱油を被せ、１０分間沸騰させることで変性させる。この試料は、６８℃で１２乃至３６時間培養する。二本鎖ＤＮＡは、６０℃のヒドロキシアパタイトにおいて、標準のプロトコル（サンブルック，１９８９）に従って、一本鎖ＤＮＡから分離される。一本鎖ＤＮＡ断片は、脱塩し、ＰＣＲにより増幅する。このプロセスは、更に数ラウンド（五回まで又はそれ以上）繰り返される。
【０３３８】
実施例３
酵素活性検定
以下は、ヒドロラーゼ活性に関して、例１に従って準備された発現ライブラリをスクリーニングする代表的な手順である。
【０３３９】
例１において説明したように準備したライブラリのプレートは、各ウェルに２００μｌのＬＢ  Ａｍｐ／Ｍｅｔｈのグリセロールを含む単一プレートを多重接種するのに使用される。このステップは、Ｂｅｃｋｍａｎ  ＢＩＯＭＥＫ  ＲＴＭのＨｉｇｈ  Ｄｅｎｓｉｔｙ  Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｎｇ  Ｔｏｏｌ（ＨＤＲＴ）を使用して、１％漂白剤、水、イソプロパノール、各接種間の空気乾燥殺菌と共に実行される。この単一プレートは、二時間３７℃で成長させ、その後、各ウェルに２５０μｌのＬＢ  Ａｍｐ／Ｍｅｔｈのグリセロールを含む二枚の白色９６ウェルＤｙｎａｔｅｃｈマイクロタイタドータープレートを接種するのに使用される。オリジナルの単一プレートは、３７℃で１８時間培養し、その後、−８０℃で保管する。二枚の凝縮ドータープレートは、３７℃で同じく１８時間培養する。凝縮ドータープレートは、その後、７０℃で４５分間加熱して細胞を殺し、宿主Ｅ．ｃｏｌｉ酵素を不活性化する。ＤＭＳＯ内の５ｍｇ／ｍＬモルフォウレアフェニルアラニル−７−アミノ−４−トリフルオロメチルクマリン（ＭｕＰｈｅＡＦＣ、「基質」）のストック溶液は、０．６ｍｇ／ｍＬの界面活性ドデシルマルトシドを含む５０ｍＭ  ｐＨ７．５  Ｈｅｐｅｓバッファにより、６００μＭまで稀釈する。６００μＭのＭｕＰｈｅＡＦＣ溶液５０μｌを、白色凝縮プレートのウェルのそれぞれに、ＢＩＯＭＥＫを使用して、１００μｌ混合サイクルで追加し、基質の最終濃度を約１００μＭにする。蛍光値は、基質の追加直後
【０３４０】
【化】
2004524811.tif 000003
（ｔ＝０）にプレート読み出し蛍光光度計により記録する。このプレートは、７０℃で１００分間培養し、その後、周囲温度で更に１５分間冷却させる。蛍光値を、再度記録する（ｔ＝１００）。ｔ＝０の値をｔ＝１００の値から減算し、活性クローンが存在するかどうかを判断する。
【０３４１】
ＭｕＰｈｅＡＦＣ
このデータは、特定のウェル内のクローンの一つが基質を加水分解したかどうかを示すことになる。活性を備える個別のクローンを判定するために、ソースライブラリを解凍し、個別のクローンを使用して、ＬＢ  Ａｍｐ／Ｍｅｔｈのグリセロールを含む新しいプレートに単独で接種する。前記のように、このプレートは、３７℃で培養して細胞を成長させ、７０℃で加熱して宿主酵素を不活性化し、Ｂｉｏｍｅｋを使用して６００μＭのＭｕＰｈｅＡＦＣ５０μｌを追加する。
【０３４２】
基質の追加後、前記のように、ｔ＝０の蛍光値を記録し、プレートを７０℃で培養し、ｔ＝１００の値を記録する。これらのデータは、どのプレートに活性クローンがあるかを示す。
【０３４３】
基質に関する鏡像選択性の値、Ｅは、次の式に従って決定される。
【０３４４】
【数】
2004524811.tif 000004
この式で、ｅｅｐ＝加水分解産物の鏡像体過剰率であり、ｃ＝反応の変換パーセントである。ウォン及びホワイトサイズ，Ｅｎｚｙｍｅｓ ｉｎ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， １９９４， Ｅｌｓｅｖｉｅｒ， Ｔａｒｒｙｔｏｗｎ， Ｎ．Ｙ．， ｐｐ． ９−１２を参照せよ。
【０３４５】
鏡像体過剰率は、キラル高性能液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）又はキラルキャピラリ電気永動（ＣＥ）により決定される。検定は、以下のように実行される：２００μｌの適切なバッファを、９６ウェル白色マイクロタイタプレートの各ウェルに追加し、続いて５０μｌの部分又は完全精製酵素を追加し、５０μｌ基質を追加して、モニタされた蛍光の増加と時間とを、基質の５０％の消費又は反応の停止のいずれか早いほうが発生するまで比較する。
【０３４６】
実施例４
陽性酵素活性クローンの定方向突然変異生成
定方向突然変異生成は、野生型酵素より高い度合いの活性を示す新しい酵素を生成するために、二種類の酵素（アルカリホスファターゼ及びβ−グリコシダーゼ）で実行した。
【０３４７】
アルカリホスファターゼ
ＸＬ１−Ｒｅｄ株（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を、製造業者のプロトコルに従ってクジラの骨表面から分離した有機体である有機体ＯＣ９ａからのアルカリホスファターゼ遺伝子を符号化するゲノムクローン２７ａ３ａ（プラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ内）により形質転換させた。ＬＢ＋０．１ｍｇ／ｍｌアンピシリンの５ｍｌ培地を、２００μｌの形質転換体により接種し、この培地を３７℃で３０時間に渡って成長させた。その後、この培地でミニプレップを実行し、製造業者のプロトコルに従い、下で概要を説明する検定手順に従って、結果として生じたＤＮＡ２μｌをＸＬ−１  Ｂｌｕｅ細胞（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）で形質転換することで分離ＤＮＡをスクリーニングした。スクリーニング検定において、突然変異したＯＣ９ａホスファターゼは、発色までに１０分を要し、野生型酵素は、発色までに３０分を要した。
【０３４８】
標準のアルカリホスファターゼスクリーニング検定
形質転換したＸＬ１  Ｂｌｕｅ細胞は、ＬＢ／ａｍｐプレートで平板培養した。結果として生じたコロニは、Ｄｕｒａｌｏｎ  ＵＶ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）又はＨＡＴＦ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）薄膜によりリフトし、クロロホルム蒸気内で３０秒間溶解させた。３０分間８５℃で培養し、細胞を熱で殺した。フィルタを、ＢＣＩＰバッファにおいて室温で構築し、最も早く発展したコロニ（「陽性物」）を選択し、この「陽性物」をＢＣＩＰプレート（ＢＣＩＰバッファ。２０ｍｍ  ＣＡＰＳ  ｐＨ９．０、１ｍｍ  ＭｇＣｌ２、０．０１ｍｍ  ＺｎＣｌ２、０．１ｍｇ／ｍｌ  ＢＣＩＰ）上で再び線条接種した。
【０３４９】
β−グリコシダーゼ
このプロトコルは、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ９Ｎ２  β−グリコシダーゼを突然変異生成させるために使用した。
【０３５０】
２マイクロリットルのｄＮＴＰ（１０ｍＭストック）と、１０マイクロリットルの１０×ＰＣＲバッファと、０．５マイクロリットルのベクタＤＮＡ−３１Ｇ１Ａ−１００ナノグラムと、２０マイクロリットルの３’プライマ（１００ｐｍｏｌ）と２０マイクロリットルの５’プライマ（１００ｐｍｏｌ）と、１６マイクロリットルのＭｎＣｌ  ４Ｈ２Ｏ（１．２５ｍＭストック）と、２４．５マイクロリットルのＨ２Ｏと、１マイクロリットルのＴａｑポリメラーゼ（５．０ユニット）とを、合計１００マイクロリットルとして培養することにより、ＰＣＲを実行した。ＰＣＲサイクルは、９５℃１５秒、５８℃３０秒、７２℃９０秒、２５サイクルである（７２℃乃至４℃の培養で１０分延長）。
【０３５１】
５マイクロリットルのＰＣＲ産物を、１％アガロースゲルに流し、反応をチェックした。ＱＩＡＱＵＩＣＫカラム（Ｑｉａｇｅｎ）で精製した。５０マイクロリットルのＨ２Ｏで再懸濁させた。
【０３５２】
２５マイクロリットルの精製ＰＣＲ産物と、１０マイクロリットルのＮＥＢバッファ＃２と、３マイクロリットルのＫｐｎ  Ｉ（１ＯＵ／マイクロリットル）と、３マイクロリットルのＥｃｏＲ１（２０Ｕ／マイクロリットル）と、５９マイクロリットルのＨ２Ｏとを、２時間３７℃で培養し、ＰＣＲ産物を消化させ、ＱＩＡＱＵＩＣＫカラム（Ｑｉａｇｅｎ）で精製した。３５マイクロリットルのＨ２Ｏで溶出させた。
【０３５３】
１０マイクロリットルの消化済みＰＣＲ産物と、５マイクロリットルのベクタ（ＥｃｏＲＩ／ＫｐｎＩによる切断、及びエビアルカリホスファターゼによるホスファターゼ処理済み）と、４マイクロリットルの５×ライゲーションバッファと、１マイクロリットルのＴ４  ＤＮＡリガーゼ（ＢＲＬ）とを一晩培養し、ＰＣＲ産物をベクタ内に連結させた。
【０３５４】
結果として生じたベクタは、エレクトロポレーションを使用して、Ｍ１５ｐＲＥＰ４細胞で形質転換させた。１００又は２００マイクロリットルの細胞を、ＬＢ  ａｍｐ  ｍｅｔｈ  ｋａｎプレート上で平板培養し、３７℃で一晩成長させた。
【０３５５】
β−ガラクトシダーゼの検定は、（１）Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  ＨＡＦＴ薄膜フィルタを使用してコロニリフトを実行し、（２）１５０ｍｍガラスペトリ皿において、クロロホルム蒸気でコロニを溶解させ、（３）１ｍｇ／ｍｌ  ＸＧＬＵを含むＺバッファを染み込ませたＷｈａｔｍａｎ  ３ＭＭ濾過紙１枚を含む１００ｍｍガラスペトリ皿にフィルタを移動させ（溶解コロニを有するフィルタをガラスペトリ皿に移動させた後、皿は室温に保つ）、（４）フィルタ薄膜上の青いスポットとして「陽性物」を観察すること（「陽性物」は早期に現れるスポット）により実行した。パスツールピペット（又はガラスキャピラリ管）を使用して、フィルタ薄膜上の青いスポットの中心を取った。小さなフィルタディスクを、２０μｌの水を含むエッペンドルフ管内に配置した。エッペンドルフ管を、７５℃で５分間培養し、続いて、渦動させて、プラスミドＤＮＡをフィルタから溶出させた。このＤＮＡを電気反応性Ｅ．ｃｏｌｉ細胞で形質転換させ、形質転換プレートでフィルタリフト検定を繰り返し、「陽性物」を同定した。形質転換プレートは、フィルタリフト後、３７℃の培養器に戻し、コロニを再生させた。３ｍｌのＬＢａｍｐ液に再精製した陽性物を接種し、３７℃で一晩培養した。こうした培地からプラスミドＤＮＡを分離し、プラスミド挿入の配列を決定した。このフィルタ検定では、１ｍｇの基質５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−ｏ−グルコピラノシド（ＸＧＬＵ）（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  Ｌｉｍｉｔｅｄ又はＳｉｇｍａ）を含むバッファＺ（下の配合表参照）を使用する。
【０３５６】
Ｚバッファ（Ｊ・Ｈ・ミラー（１９９２）、Ａ Ｓｈｏｒｔ Ｃｏｕｒｓｅ ｉｎ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ， ｐ．４４５を引用）１リットル当たり
Ｎａ２ＨＰＯ４−７Ｈ２Ｏ  １６．１ｇ
Ｎａ２ＨＰＯ４−４Ｈ２Ｏ  ５．５ｇ
ＫＣｌ                 ０．７５ｇ
Ｎａ２ＨＰＯ４−７Ｈ２Ｏ  ０．２４６ｇ
６−メルカプトエタノール  ２．７ｍｌ
ｐＨを７．０に調整
【０３５７】
実施例５
ピコプランクトンゲノムＤＮＡの安定した大きな挿入ＤＮＡライブラリの構築  細胞収集及びＤＮＡの準備。濃縮ピコプランクトン細胞を含むアガロースプラグは、オレゴン州ニューポート乃至ハワイ州ホノルルの海洋クルーズで採集した試料より準備した。海水（３０リットル）をニスキンボトルに収集し、１０μｍ  Ｎｉｔｅｘによりスクリーニングし、３０，０００ＭＷカットオフポリフルフォンフィルタを通じた中空糸濾過（Ａｍｉｃｏｎ  ＤＣ１０）により濃縮した。濃縮したバクテリアプランクトン細胞は、０．２２μｍ、４７ｍｍ  Ｄｕｒａｐｏｒｅフィルタで収集し、１ｍｌの２×ＳＴＥバッファ（１Ｍ  ＮａＣｌ、０．１Ｍ  ＥＤＴＡ、１０ｍＭトリス、ｐＨ８．０）に再懸濁し、最終濃度を１ｍｌ当たり約１×１０１０細胞とした。細胞懸濁液は、４０℃に冷却した一体積の１％溶融Ｓｅａｐｌａｑｕｅ  ＬＭＰアガロース（ＦＭＣ）と混合し、直後に１ｍｌ注射器に引き込んだ。この注射器は、パラフィルムで密封し、氷上に１０分間置いた。細胞含有アガロースプラグを、１０ｍｌの溶解バッファ（１０ｍＭトリス、ｐＨ８．０、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１Ｍ  ＥＤＴＡ、１％サルコシル、０．２％デオキシコール酸ナトリウム、１ｍｇ／ｍｌリゾチーム）に押し出し、３７℃で１時間培養した。このアガロースプラグは、その後、４０ｍｌのＥＳＰバッファ（１％サルコシル、１ｍｇ／ｍｌプロテイナーゼＫ、０．５Ｍ  ＥＤＴＡ中）に移動させ、５５℃で１６時間培養した。この溶液をデカントし、新鮮なＥＳＰバッファに取り替え、５５℃で更に一時間培養した。このアガロースプラグを、次に、５０ｍＭ  ＥＤＴＡ中に入れ、海洋クルーズの期間中、船上において４℃で保存した。
【０３５８】
オレゴン州沿岸で採集した試料から準備したアガロースプラグ一切片（７２μｌ）を、２ｍＬマイクロ遠心分離管において、１ｍＬのバッファＡ（１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭビストリスプロパン−ＨＣｌ、１００μｇ／ｍｌアセチル化ＢＳＡ、２５℃でｐＨ７．０）に対して、４℃で一晩透析した。この溶液を、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２及び１ｍＭ  ＤＴＴを含む２５０μｌの新鮮なバッファＡと取り替え、ロッキングプラットフォーム上において、室温で１時間培養した。次に、この溶液を、４ＵのＳａｕ３Ａ１（ＮＥＢ）を含む２５０μｌの同じバッファに変え、水槽内において３７℃で平衡化し、その後、３７℃の培養器内のロッキングプラットフォーム上で４５分間培養した。プラグは、１．５ｍｌマイクロ遠心分離管に移動させ、６８℃で３０分間培養し、酵素を不活性化し、アガロースを溶かした。Ｇｅｌａｓｅ及びＨＫ−ホスファターゼ（Ｅｐｉｃｅｎｔｕｒｅ）をそれぞれ使用し、製造業者の推奨に従って、アガロースを消化し、ＤＮＡを脱ホスホリル化した。タンパク質は、穏やかなフェノール／クロロホルム抽出により取り除き、ＤＮＡは、エタノール沈殿させ、ペレット化し、その後、７０％エタノールで洗浄した。この部分消化ＤＮＡを、無菌Ｈ２Ｏに再懸濁させ、ｐＦＯＳ１ベクタとのライゲーションのために濃度を２．５ｎｇ／μｌにした。
【０３５９】
いくつかのアガロースプラグからのＰＣＲ増幅の成果は、多量の古細菌ＤＮＡの存在を示した。オレゴンコースト沖、深さ２００ｍで採集した一試料から抽出したｒＲＮＡを使用する定量的ハイブリッド形成実験は、この集合のプランクトン古細菌が全ピコプランクトンのバイオマスの約４．７％を占めることを示した（この試料は、デロングら，Ｎａｔｕｒｅ， ３７１：６９５−６９８， １９９４のＴａｂｌｅ １の”ＰＡＣＩ”−２００ｍに対応する）。アガロースプラグ溶解物で実行された古細胞バイアス済みｒＤＮＡ  ＰＣＲ増幅の結果により、この試料における比較的多量の古細菌ＤＮＡの存在が確認された。このピコプランクトン試料から準備されたアガロースプラグを、その後のフォスミドライブラリ作成のために選択した。このサイトからの各１ｍｌアガロースプラグは、約７．５×１０５の細胞を含んでいたため、部分消化ＤＮＡの作成に使用された７２μｌスライスには、約５．４×１０５の細胞が存在した。
【０３６０】
ベクタ腕部は、説明の通り、ｐＦＯＳ１から作成した（キムら、Ｓｔａｂｌｅ ｐｒｏｐａｇａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｏｎｍｉｄ ｓｉｚｅｄ ｈｕｍａｎ ＤＮＡ ｉｎｓｅｒｔｓ ｉｎ ａｎ Ｆ ｆａｃｔｏｒ ｂａｓｅｄ ｖｅｃｔｏｒ， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， ２０：１０８３２−１０８３５， １９９２）。簡単に言うと、プラスミドを、ＡｓｔＩＩにより完全に消化し、ＨＫホスファターゼにより脱ホスホリル化し、その後、ＢａｍＨＩにより消化して二つの腕部を生成し、そのそれぞれが、３５乃至４５ｋｂｐの連結ＤＮＡをクローニング及びパッケージングするのに適切な方向性であるｃｏｓ部位を含む。部分消化ピコプランクトンＤＮＡは、それぞれ２５ｎｇのベクタ及び挿入物と１ＵのＴ４  ＤＮＡリガーゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ）とを含む１５μｌのライゲーション反応物において、ＰＦＯＳ１腕部に一晩で連結させた。この反応物４マイクロリットルに含まれる連結ＤＮＡは、Ｇｉｇａｐａｃｋ  ＸＬパッケージングシステム（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を使用してｉｎ  ｖｉｔｒｏでパッケージし、フォスミド粒子をＥ．ｃｏｌｉ株ＤＨ１０Ｂ（ＢＲＬ）にトランスフェクションし、この細胞をＬＢｃｍ１５プレート状に塗り広げた。結果として生じたフォスミドクローンを、７％グリセロールを補ったＬＢｃｍ１５を含む９６ウェルマイクロリットル皿に採取して入れた。約４０ｋｂのピコプランクトンＤＮＡ挿入物を含む組み換えフォスミドにより、３．５５２フォスミドクローンのライブラリが生じ、これは約１．４×１０８塩基対のクローンＤＮＡを含む。検査したすべてのクローンは、３８乃至４２ｋｂの範囲の挿入物を含んでいた。このライブラリは、その後の検定のために−８０℃で冷凍保存した。
【０３６１】
実施例６
紫外線誘導光産物を使用したランダムサイズポリヌクレオチドの生成
鋳型ＤＮＡの１マイクログラム試料は、ＴＴ二量体、特にプリン二量体を含む二量体を形成させるために、取得し、紫外線により処理する。紫外線による露光は、鋳型ＤＮＡ試料で遺伝子ごとにほんの僅かな光産物が生成されるように制限される。多数の試料を、紫外線により、時間の長さを変化させて処理し、紫外線露光による二量体の数が異なる鋳型ＤＮＡ試料を取得する。
【０３６２】
非プルーフリーディングポリメラーゼを利用するランダム初回免疫キット（例えば、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ＳｙｓｔｅｍｓのＰｒｉｍｅ−Ｉｔ  ＩＩ  Ｒａｎｄｏｍ  Ｐｒｉｍｅｒ  Ｌａｂｅｌｉｎｇキット）を利用し、紫外線によって（上記の通り）作成された鋳型のランダムな部位で初回免疫を行い、鋳型に沿って伸長することで、様々なサイズのポリヌクレオチドが生成される。Ｐｒｉｍｅ−Ｉｔ  ＩＩ  Ｒａｎｄｏｍ  Ｐｒｉｍｅｒ  Ｌａｂｅｌｉｎｇキットにおいて説明されるような初回免疫プロトコルは、プライマを伸長するのに利用することができる。紫外線露光によって形成される二量体は、非プルーフリーディングポリメラーゼによる伸長の障害物としての役割を果たす。したがって、ランダムなプライマによる伸長が終了した後には、ランダムなサイズのポリヌクレオチドのプールが存在する。
【０３６３】
実施例７
ランダムサイズのポリヌクレオチドの分離
例１に従って生成された所定のポリヌクレオチドは、１．５％アガロースゲル状でゲル分離される。１００乃至３００ｂｐの範囲のポリヌクレオチドを、ゲルから切り取り、三体積の６Ｍ  Ｎａｌをゲル切片に追加する。この混合物を、５０℃で１０分間培養し、１０μｌのグラスミルク（Ｂｉｏ  １０１）を追加する。この混合物を、一分間回転させ、上澄みをデカントする。ペレットを５００μｌのＣｏｌｕｍｎ  Ｗａｓｈで洗浄し（Ｃｏｌｕｍｎ  Ｗａｓｈは、５０％エタノール、１０ｍｌトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、及び２．５ｍＭ  ＥＤＴＡ）、１分間回転させ、その後、上澄みをデカントする。その後、洗浄、回転、及びデカントのステップを繰り返す。グラスミルクペレットを、２０μｌのＨ２Ｏに再懸濁し、一分間回転させる。ＤＮＡは、水相を維持する。
【０３６４】
実施例８
分離したランダムサイズの１００乃至３００ｂｐのポリヌクレオチドのシャッフリング
実施例２において取得された１００乃至３００ｂｐのポリヌクレオチドは、プライマを追加することなく、アニーリング混合物（０．２ｍＭの各ｄＮＴＰ、２．２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５０ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭトリスＨＣｌ、ｐＨ８．８，０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、０．３μ、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、合計体積５０μｌ）内で組み換える。以下のプログラムによるアニーリングステップに、ＳｔｒａｔａｇｅｎｅのＲｏｂｏｃｙｃｌｅｒを使用した：９５℃３０秒、［９５℃３０秒、５０乃至５０℃（好ましくは５８℃）３０秒、及び７２℃３０秒］を２５乃至５０サイクル、及び７２℃５分間。これにより、１００乃至３００ｂｐのポリヌクレオチドは、結合し、長い配列を有する二本鎖ポリヌクレオチドを発生させる。再構成した二本鎖ポリヌクレオチドを分離し、変性させて、一本鎖ポリヌクレオチドを形成した後、随意的にサイクリングを再び繰り返し、一部の試料では鋳型としての一本鎖とプライマＤＮＡとを利用し、その他の試料では一本鎖に加えてランダムなプライマを利用する。
【０３６５】
実施例９
シャッフル済みポリヌクレオチドからのポリヌクレオチドのスクリーニング
実施例３のポリヌクレオチドを分離し、ここからポリヌクレオチドを発現させる。実施例３のシャッフル済みポリヌクレオチドから取得したポリヌクレオチドは、オリジナルの鋳型から得られたポリペプチドの活性に関してスクリーニングし、活性レベルの制御を比較する。スクリーニング中に発見された関心のあるポリヌクレオチドをコーディングするシャッフル済みポリヌクレオチドは、更に、二次的な望ましい形質に関して比較される。関心の少ないスクリーン済みポリヌクレオチドに対応する一部のシャッフル済みポリヌクレオチドには、再びシャッフリングを施す。
【０３６６】
実施例１０
飽和突然変異生成による定方向進化
部位飽和突然変異生成：部位飽和突然変異生成を達成するために、デハロゲナーゼ酵素のすべての残基を、下のように、３２重縮退オリゴヌクレオチドプライマを使用した部位指定突然変異生成により、全２０種類のアミノ酸に変換した。
【０３６７】
１．  デハロゲナーゼ発現構造の培地を成長させ、プラスミドの作成を行った。
【０３６８】
プライマは、各コドンをランダム化させ、これらは共通の構造Ｘ２０ＮＮ（Ｇ／Ｔ）Ｘ２０を有し、このＸ２０は鋳型と結合する十分な相同性を備えた２０塩基配列を表し、ＮＮ（Ｇ／Ｔ）は全２０種類のアミノ酸を符号化する３２重縮退３塩基配列である。代替の態様において、本発明は、Ｎ，Ｎ，Ｇ／Ｔ又は同様なＮＮ（Ｇ／Ｔ）カセットに加え、全１９種類のアミノ酸置換を導入するのに実用的なコドンの任意のセットの使用を提供し、これは（その一部として）３２重縮退ＮＮ（Ｇ／Ｃ）カセット、６４重縮退ＮＮＮカセット、４８重ＮＮ（Ａ／Ｃ／Ｇ）カセット、４８重ＮＮ（Ａ／Ｇ／Ｔ）カセット、全１９アミノ酸置換を導入するのに実用的な１９コドンの任意の非縮退セット、及び全１９アミノ酸置換を導入するのに実用的な２０コドンの任意の非縮退セットを含む。更に別の代替の態様において、本発明は、２０種類のアミノ酸のサブセットがコドン位置のセットのそれぞれに導入されることを提供し、こうしたサブセットの例は、グループ化体系に基づくサブセットから選択された（複数の）アミノ酸を含むことが可能であり、このグループ化体系は、非制限的な例証として、以下の８種類のサブセットを有するグループ化体系にすることができる。
【０３６９】
・芳香族（Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ）
・脂肪族（Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ）
・ＯＨ含有（Ｓｅｒ、Ｔｙｒ、Ｔｈｒ）
・酸性（Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、Ｇｉｎ）
・塩基性（Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ）
・硫黄含有（Ｍｅｔ、Ｃｙｓ）
・極性（Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｃｙｓ、Ａｓｎ、Ｇｉｎ、Ｔｙｒ）
・無極性（Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｉ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｐｒｏ）
【０３７０】
２．  ５０ｎｇまでのプラスミド鋳型と、１２５ｎｇの各プライマと、１×ネイティブＰｆｕバッファと、２０ｕｍの各ｄＮＴＰと、２．５ＵネイティブＰｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼとを含む２５μｌの反応混合物を作成した。
【０３７１】
３．  Ｒｏｂｏ９６  Ｇｒａｄｉｅｎｔ  Ｃｙｃｌｅｒにおいて、次のように反応をサイクルさせた。
【０３７２】
９５℃１時間の初期変性
９５℃４５秒間、５３℃１分、７２℃１１分を２０サイクル
７２℃１０分の最終延長ステップ
４．  この反応混合物を、１０ＵのＤｐｎＩにより３７℃で１時間消化し、メチル化鋳型ＤＮＡを消化した。
【０３７３】
５．  ２ｕｌの反応混合物を使用して、５０ｕｌのＸＬ１−Ｂｌｕｅ  ＭＲＦ細胞を形質転換し、形質転換混合物全体を大きなＬＢ−Ａｍｐ−Ｍｅｔプレート上で平板培養し、２００乃至１０００のコロニを作成した。
【０３７４】
６．  個別のコロニを、ＬＢ−Ａｍｐ−ＩＰＴＧを含む９６ウェルマイクロタイタプレートのウェルに楊枝で入れ、一晩成長させた。
【０３７５】
７．  翌日、これらのプレートのクローンを検定した。
【０３７６】
スクリーニング：各位置の突然変異体の約２００クローンを、液体培地（３８４ウェルマイクロタイタプレート）で成長させ、次のようにスクリーニングした。
【０３７７】
１．  ３８４ウェルプレートにおいて一晩培養したものを、遠心分離し、培地を除去した。各ウェルに０．０６ｍＬ  １ｍＭトリス／ＳＯ４２−、ｐＨ７．８を追加した。
【０３７８】
２．  各親成長プレートからの二枚の検定プレートが、０．０２ｍＬ細胞懸濁で構成されるようにした。
【０３７９】
３．  一方の検定プレートを室温で配置し、他方を一定期間（最初は３０分間）に渡って高温にした（初期スクリーニングでは５５℃を使用）。
【０３８０】
４．  規定の時間後、０．０８ｍＬの室温の基質（１．５ｍＭ  ＮａＮ３及び０．１ｍＭブロモチモールブルーを含むＴＣＰ飽和１ｍＭトリス／ＳＯ４２−、ｐＨ７．８）を各ウェルに追加した。
【０３８１】
５．  ６２０ｎｍでの測定値を様々な時点で取り、各ウェルのプログレス曲線を生成した。
【０３８２】
６．  データを分析し、加熱した細胞と加熱していない細胞のキネティクスを比較した。各プレートは、１乃至２カラム（２４ウェル）の非突然変異２０Ｆ１２制御を含んでいた。
【０３８３】
７．  安定性が向上したと思われるウェルは、再び成長させ、同じ条件でテストした。
【０３８４】
この手順の後、九種類の単一部位突然変異が酵素に熱安定性の増加を与えたと思われた。この改善を本質的に引き起こした各位置での正確なアミノ酸の変化を判断するために、配列分析を実行した。簡単に言うと、この改善は、七つの部位では一種類のアミノ酸の変化、第八の部位では二種類のアミノ酸の変化それぞれ、第九の部位では三種類のアミノ酸の変化それぞれによって与えられた。その後、いくつかの突然変異を作成し、この突然変異はそれぞれ、これら九種類の有益な部位突然変異のうち複数を組み合わせて有し、そのうち二種類の突然変異は、単一ポイント突然変異のものを含め、他のすべての突然変異よりも優れていることが分かった。
【０３８５】
実施例１１
末端選択を使用したダイレクト発現クローニング
エステラーゼ遺伝子を、標準のＰＣＲ反応において、５’リン酸化プライマを使用して増幅した（１０ｎｇの鋳型、ＰＣＲ条件：３分９４℃、［１分９４℃、１分５０℃、１分３０秒６８℃］×３０、１０分６８℃）。
【０３８６】
フォワードプライマ＝９５１１ＴｏｐＦ（ＣＴＡＧＡＡＧＧＧＡＧＧＡＧＡＡＴＴＡＣＡＴＧＡＡＧＣＧＧＣＴＴＴＴＡＧＣＣＣ）
リバースプライマ＝９５１１ＴｏｐＲ（ＡＧＣＴＡＡＧＧＧＴＣＡＡＧＧＣＣＧＣＡＣＣＣＧＡＧＧ）
結果として生じたＰＣＲ産物（約１０００ｂｐ）は、ゲル精製及び定量化した。
【０３８７】
発現クローニングのベクタ、ｐＡＳＫ３（ドイツ、ゲッチンゲンのＩｎｓｔｉｔｕｔ  ｆｕｅｒ  Ｂｉｏａｎａｌｙｔｉｋ）は、Ｘｂａ  Ｉ及びＢｇｌ  ＩＩにより切断し、ＣＩＰにより脱ホスホリル化した。
【０３８８】
０．５ｐｍｏｌｅのＶａｃｃｉｎａ  Ｔｏｐｏｉｓｏｍｅｒａｓｅ（カリフォルニア州カールズバッドのＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、バッファＮＥＢ  Ｉ（マサチューセッツ州ベバリのＮｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）内の６０ｎｇ（約０．１ｐｍｏｌｅ）の精製ＰＣＲ産物に追加し、合計体積５μｌとし、５分間３７℃にした。このトポゲートしたＰＣＲ産物を、ベクタｐＡＳＫ３（５μｌ、ＮＥＢＩ内で約２００ｎｇ）でクローニングし、５分間室温にした。この混合物を、Ｈ２Ｏに対して３０分間透析した。ＤＨ１０Ｂ細胞（メリーランド州ゲーサーズバーグのＧｉｂｃｏ  ＢＲＬ）のエレクトロポレーションに、２μｌを使用した。
【０３８９】
効率性：実際のクローン数に基づき、この方法は、１μｇのベクタ当たり２×１０６クローンを生成可能である。
【０３９０】
実施例１２
デハロゲナーゼの熱安定性
本発明では、定方向進化によって生成される望ましい特性は、厳しい環境と考えられるものを含め、変化した環境に指定の時間に渡って晒された分子の改善された残基活性（例えば、酵素活性、免疫反応性、抗生物質活性、その他）により、限定的な形で例証される。こうした厳しい環境は、以下の任意の組み合わせ（反復性の有無を問わず、及び任意の順序又は順列）を含む場合がある：高温（動作する酵素の変性を引き起こす温度を含む）、低温、高塩度、低塩度、高ｐＨ、低ｐＨ、高圧、低圧、及び放射源への露出の変化（紫外線放射、可視光線、及び電磁スペクトル全体を含む）。
【０３９１】
本発明によれば、改善された前記活性等の望ましい特性は、厳しい環境（例えば、高温、低温、高ｐＨ、低ｐＨ、高塩度、低塩度、有機溶媒の存在の増加、有機溶媒の存在の減少、その他）で特定の期間維持した後の改善された活性（高い活性等）にすることが可能で、定方向進化ステップの適用に続くスクリーニング又は選択ステップに関する選択基準を含むことが可能であり、その一部として、末端選択ベースのステップ、エクソヌクレアーゼ処理ベースのステップ、部位飽和突然変異生成ベースのステップ、又は合成ライゲーション再構成ベースのステップ等がある。
【０３９２】
本発明の別の態様によれば、改善された前記活性等の望ましい特性は、厳しい環境（例えば、高温、低温、高ｐＨ、低ｐＨ、高塩度、低塩度、有機溶媒の存在の増加、有機溶媒の存在の減少、その他）に晒し、ここから移動させた後の改善された活性（高い活性等）にすることが可能で、定方向進化ステップの適用に続くスクリーニング又は選択ステップに関する選択基準を含むことが可能であり、その一部として、末端選択ベースのステップ、エクソヌクレアーゼ処理ベースのステップ、部位飽和突然変異生成ベースのステップ、又は合成ライゲーション再構成ベースのステップ等がある。
【０３９３】
好適な実施形態において、残基活性は、変性条件に晒された後、活性のある三次元形態（オリジナルの三次元形態、オリジナルの三次元形態に類似する三次元形態、或いはオリジナルの三次元形態とは異なる三次元形態を含む）を回復する分子の能力増加から生じる。こうした再び折り重なるための能力は、「変性の可逆性」又は「再生能力」又は「変性−再生の可逆性」と呼ばれる場合があり、本発明による選択パラメータである。
【０３９４】
次の例は、高温に晒された時に酵素が活性を再生及び又は維持する能力を進化させる定方向進化の適用を示している。デハロゲナーゼ酵素のすべての残基（３１６）は、３２重縮退オリゴヌクレオチドプライマを使用した部位指定突然変異生成により、全２０種類のアミノ酸に変換した。この突然変異は、既に比率を改善した変異体Ｄｈｌａ  ２０Ｆ１２に導入した。各位置の約２００クローンを、スクリーニングするために液体培地（３８４ウェルマイクロタイタプレート）で成長させた。スクリーニング手順は、次の通りである。
【０３９５】
１．  ３８４ウェルプレートにおいて一晩培養したものを、遠心分離し、培地を除去した。各ウェルに０．０６ｍＬ  １ｍＭトリス／ＳＯ４２−、ｐＨ７．８を追加した。
【０３９６】
２．  ロボットにより、各親成長プレートからの二枚の検定プレートが、０．０２ｍＬ細胞懸濁で構成されるようにした。
【０３９７】
３．  一方の検定プレートを室温で配置し、他方を一定期間（最初は３０分間）に渡って高温にした（初期スクリーニングでは５５℃を使用）。
【０３９８】
４．  規定の時間後、０．０８ｍＬの室温の基質（１．５ｍＭ  ＮａＮ３及び０．１ｍＭブロモチモールブルーを含むＴＣＰ飽和１ｍＭトリス／ＳＯ４２−、ｐＨ７．８）を各ウェルに追加した。ＴＣＰ＝トリクロロプロパン。
【０３９９】
５．  ６２０ｎｍでの測定値を様々な時点で取り、各ウェルのプログレス曲線を生成した。
【０４００】
６．  データを分析し、加熱した細胞と加熱していない細胞のキネティクスを比較した。各プレートは、１乃至２カラム（２４ウェル）の非突然変異２０Ｆ１２制御を含んでいた。
【０４０１】
７．  安定性が向上したと思われるウェルは、再び成長させ、同じ条件でテストした。
【０４０２】
この手順の後、九種類の単一部位突然変異がＤｈｌａ−２０Ｆ１２に熱安定性の増加を与えたと思われた。配列分析では、以下の変化が有益であることが明らかになった。
【０４０３】
Ｄ８９Ｇ
Ｆ９１Ｓ
Ｔ１５９Ｌ
Ｇ１８９Ｑ、Ｇ１８９Ｖ
Ｉ２２０Ｌ
Ｎ２３８Ｔ
Ｗ２５１Ｙ
Ｐ３０２Ａ、Ｐ３０２Ｌ、Ｐ３０２Ｓ、Ｐ３０２Ｋ
Ｐ３０２Ｒ／Ｓ３０６Ｒ
二つの部位（１８９及び３０２）のみが、二つ以上の置換を有した。リストの最初の五つは、（Ｇ１８９Ｑを使用して）単一の遺伝子へと結合された（この突然変異は「Ｄｈｌａ５」と呼ばれる）。Ｓ３０６Ｒを除くすべての変化は、Ｄｈｌａ８と呼ばれる別の変異体に組み込まれた。
【０４０４】
熱安定性は、酵素を一定期間高温（５５℃及び８０℃）で培養し、３０℃で活性検定することで評価した。初速度は、高温での時間と対比させてプロットした。酵素は、培養及び検定の両方で、５０ｍＭトリスＳＯ４、ｐＨ７．８に入れた。産物（Ｃｌ−）は、Ｆｅ（ＮＯ３）３及びＨｇＳＣＮを使用した標準的な方法で検出した。Ｄｈｌａ  ２０Ｆ１２を、事実上の野生型として使用した。見かけの半減期（Ｔ１／２）は、データを指数減衰関数に適合させることで計算した。
【０４０５】
５５℃でのＤｈｌａ５デハロゲナーゼの熱安定性。５０ｍＭトリスＳＯ４２−、ｐＨ７．８内の精製タンパク質を、５５℃で、様々な期間にわたって培養し、アリコートを取り出し、トリクロロプロパン（ＴＣＰ）加水分解に関して検定した。この検定は、５０ｍＭトリスＳＯ４２−、ｐＨ７．８において、３０℃で、１０ｍＭ  ＴＣＰにより実行した。産物（Ｃｌ−）の放出は、標準のＣｌ−検定により分析した。初速度（Ａ４５０／分）は、酵素プログレス曲線から導き、培養時間と対比させてプロットした。このデータは、指数減衰（Ｃ＊ｅｘｐ−ｋｔ）に適合し、ここでｔ１／２＝ｌｎ２／ｋである（図１３参照）。
【０４０６】
Ｄｈｌａ及び２０Ｆ１２の３０℃及び５５℃での酵素プログレス曲線（図１４参照）。この反応は、精製タンパク質を使用して、５０ｍＭトリスＳＯ４２−、ｐＨ７．８において、１０ｍＭ  ＴＣＰにより実行した。各検定において、等量のタンパク質を使用した。産物（Ｃｌ−）の濃度は、標準のＣｌ−検定を使用して、様々な時点で判定した。Ｄｈｌａ  ５は、３０℃及び５５℃の両方で、２０Ｆ１２と同じ特異活性を有すると思われるが、この酵素は、２０Ｆ１２が熱的に不活性となった後も、生成を継続する。
【０４０７】
８０℃でのＤｈｌａ５デハロゲナーゼの熱安定性。５０ｍＭトリスＳＯ４２−、ｐＨ７．８内の精製タンパク質を、８０℃で、様々な期間にわたって培養し、アリコートを取り出し、トリクロロプロパン（ＴＣＰ）加水分解に関して検定した。この検定は、５０ｍＭトリスＳＯ４２−、ｐＨ７．８において、３０℃で、１０ｍＭ  ＴＣＰにより実行した。産物（Ｃｌ−）の放出は、標準のＣｌ−検定により分析した。初速度（Ａ４５０／分）は、酵素プログレス曲線から導き、培養時間と対比させてプロットした。このデータは、指数減衰（Ｃ＊ｅｘｐ−ｋｔ）に適合し、ここでｔ１／２＝ｌｎ２／ｋである（図１５参照）。
【０４０８】
８０℃でのＤｈｌａ５及びＤｈｌａ８の熱安定性。５０ｍＭトリスＳＯ４２−、ｐＨ７．８内の精製タンパク質を、８０℃で、様々な期間にわたって培養し、アリコートを取り出し、トリクロロプロパン（ＴＣＰ）加水分解に関して検定した。この検定は、５０ｍＭトリスＳＯ４２−、ｐＨ７．８において、３０℃で、１０ｍＭ  ＴＣＰにより実行した。産物（Ｃｌ−）の放出は、標準のＣｌ−検定により分析した。初速度（Ａ４５０／分）は、酵素プログレス曲線から導き、相対速度を培養時間と対比させてプロットした。このデータは、指数減衰（Ｃ＊ｅｘｐ−ｋｔ）に適合し、ここでｔ１／２＝ｌｎ２／ｋであり、Ｄｈｌａ５及びＤｈｌａ８に関して、それぞれ１３及び１３８分の値を与えた（図１６参照）。
【０４０９】
こうしたデハロゲナーゼ変異体の示唆走査熱量測定は、図１７Ａ、Ｂ、及びＣに表示されている。このデータは、Ｐｅｒｋｉｎ  ＥｌｍｅｒのＰｙｒｉｓ  Ｉを使用し、走査速度１０℃／分で記録した。タンパク質濃度は、４０μｌにおいて１０ｍｇ／ｍｌである（合計０．４ｍｇのタンパク質）。バッファは、１０ｍＭ  ＮａＰｉ、ｐＨ７．５である。データから導かれた溶解温度は、６８℃（２０Ｆ１２）、７３℃（Ｄｈｌａ５）、及び７３℃（Ｄｈｌａ８）。このデータは、更に、２０Ｆ１２が不可逆変性を受けており、Ｄｈｌａ５が部分的に可逆であり、Ｄｈｌａ８が完全に可逆であることを示している（図１７参照）。
【０４１０】
５５℃での野生型（２０Ｆ１２）及び突然変異体（Ｄｈｌａ５）デハロゲナーゼの熱安定性。５０ｍＭトリスＳＯ４２−、ｐＨ７．８内の精製タンパク質を、５５℃で、様々な期間にわたって培養し、アリコートを取り出し、トリクロロプロパン（ＴＣＰ）加水分解に関して検定した。この検定は、５０ｍＭトリスＳＯ４２−、ｐＨ７．８において、３０℃で、１０ｍＭ  ＴＣＰにより実行した。産物（Ｃｌ−）の放出は、標準のＣｌ−検定により分析した。初速度（Ａ４５０／分）は、酵素プログレス曲線から導き、培養時間と対比させてプロットした。このデータは、指数減衰（Ｃ＊ｅｘｐ−ｋｔ）に適合し、ここでｔ１／２＝ｌｎ２／ｋである（図１２参照）。
【０４１１】
上述した教示を踏まえて、本発明の多数の修正及び変形が可能であり、そのため、特許請求の範囲内で、本発明は、詳述したもの以外の態様で実施することができる。以上、本発明をその特定の好適な実施形態に基づき詳細に説明してきたが、修正及び変形は、説明され且つ請求されている発明の趣旨及び範囲内に入るものと理解されよう。
【図面の簡単な説明】
【図１】部位飽和突然変異生成の好適な実施形態を示す図である。
【図２】合成ライゲーション再構成によるキメラ結合の網羅的なセットの生成を示す図である。
【図３Ａ及び図３Ｂ】（例えば、合成ライゲーション再構成による）ポリヌクレオチド再構成によって生成された望ましいポリヌクレオチドを選択する（例えば、全長分子の選択を行う）トポイソメラーゼ誘導選択ステップを使用した末端選択の応用を示す図である。
【図４】末端選択技術の様々な態様を示す図である。
【図５】オリジナルの平滑末端ＤＮＡの定方向発現クローニングを達成する目的で、当初の平滑末端ＤＮＡに「付着末端」を導入するために、酵素Ｎ．ＢｓｔＮＢｌを使用して、「ｃ）定方向発現クローニングを実行すること」のステップが達成される、末端選択技術の特定の態様を示す図である。
【図６】酵素エクソヌクレアーゼＩＩＩの活性を示す図である。アスタリスクは、この酵素がポリヌクレオチド基質の３’方向から５’方向に向けて働くことを示す。
【図７】エクソヌクレアーゼ仲介ポリヌクレオチド再構成における酵素エクソヌクレアーゼＩＩＩの例示的な応用を示す図である。
【図８】多結合核酸鎖の生成を示す図である。
【図９】ヘテロメリック核酸複合体において、アニーリングした核酸鎖の未ハイブリッド形成一本鎖末端から、３’及び５’末端ヌクレオチドを遊離させ、短縮されているがハイブリッド形成された末端を残し、処理済み末端のポリメラーゼベース伸長及び又はリガーゼ仲介ライゲーションを促進する手段としてのエクソヌクレアーゼ処理の使用を示す図である。
【図１０】一本のメチル化多結合核酸鎖をアニーリングし、いくつかの非メチル化単結合核酸鎖にする例における、エクソヌクレアーゼ仲介核酸再構成の使用を示す図である。
【図１１】複数のメチル化多結合核酸鎖をアニーリングし、いくつかの非メチル化単結合核酸鎖にする例における、エクソヌクレアーゼ仲介核酸再構成の使用を示す図である。
【図１２】５５℃での野生型（２０Ｆ１２）及び突然変異型（Ｄｈｌａ  ５）デハロゲナーゼの熱安定性のグラフを示す図である。
【図１３】５５℃でのＤｈｌａ  ５デハロゲナーゼの熱安定性のグラフを示す図である。
【図１４】３０℃及び５５℃でのＤｈｌａ  ５及び２０Ｆ１２の酵素プログレス曲線を示す図である。
【図１５】８０℃でのＤｈｌａ  ５デハロゲナーゼの熱安定性を示す図である。このデータは、ｔ１／２＝ｌｎ２／ｋである指数減衰（Ｃ＊ｅｘｐ−ｋｔ）に適合する。
【図１６】８０℃でのＤｈｌａ  ５及びＤｈｌａ  ８デハロゲナーゼの熱安定性を示す図である。このデータは、Ｄｈｌａ  ５及びＤｈｌａ  ８それぞれに関して、１３及び１３８分の値を与えたｔ１／２＝ｌｎ２／ｋである指数減衰（Ｃ＊ｅｘｐ−ｋｔ）に適合する。
【図１７】（図１７Ａ、図１７Ｂ、及び図１７Ｃ）三種類のデハロゲナーゼ変種の示差走査熱量測定を示す図である。このデータは、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｐｙｒｉｓ  １を使用して１０℃／分の走査速度で記録された。
【配列表】2004524811.tif 000005
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【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７Ａ】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004524811.tif 000191
【国際調査報告】
2004524811.tif 000192
2004524811.tif 000193
2004524811.tif 000194