(57)【要約】Ｂリンパ球刺激因子（ＢＬｙＳ）タンパク質またはＢＬｙＳ様ポリペプチドと結合する、特定のアミノ酸配列を含んでなる結合性ポリペプチドを開示する。かかる結合性ポリペプチドは、血液、組織サンプル、馴らし培地などの溶液または混合物中に含まれるＢＬｙＳタンパク質またはＢＬｙＳ様ポリペプチドを検出または単離する本発明の方法において使用される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
次のアミノ酸配列：Ａｓｐ−Ｘａａ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ （配列番号４４６）（式中、ＸａａはＰｒｏ， Ｓｅｒ， Ｔｈｒ， Ｐｈｅ， Ｌｅｕ， Ｔｙｒ， ＣｙｓまたはＡｌａである）を含んでなるＢリンパ球刺激因子（ＢＬｙＳ）結合性ポリペプチド。
【請求項２】
ＸａａがＰｒｏまたはＳｅｒである、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
前記ポリペプチドが次のアミノ酸配列：
Ｘｌ−Ｘ２−Ａｓｐ−Ｘ４−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｘ７−Ｌｅｕ−Ｘ９−Ｘｌ０ （配列番号４４８）
（式中、
Ｘ１はＴｒｐ， Ｇｌｕ， Ｌｙｓ， Ｃｙｓ， Ｌｅｕ， Ａｌａ， Ａｒｇ， ＧｌｙまたはＳｅｒであり；
Ｘ２はＴｙｒ， Ｐｈｅ， Ｇｌｕ， ＣｙｓまたはＡｓｎであり；
Ｘ４はＰｒｏ， Ｓｅｒ， Ｔｈｒ， Ｐｈｅ， Ｌｅｕ， Ｔｙｒ， ＣｙｓまたはＡｌａであり；
Ｘ７はＬｙｓ， Ａｓｎ， Ｇｌｎ， ＧｌｙまたはＡｒｇであり；
Ｘ９はＴｒｐ， Ｓｅｒ， Ｔｈｒ， Ａｒｇ， Ｃｙｓ， ＴｙｒまたはＬｙｓであり；
Ｘ１０はＬｅｕ， Ｐｈｅ， Ｖａｌ， ＩｌｅまたはＨｉｓである）
を含んでなる、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項４】
前記ポリペプチドが次のアミノ酸配列：
Ｔｒｐ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ （配列番号４３６）
を含んでなる、請求項３に記載のポリペプチド。
【請求項５】
前記ポリペプチドが次のアミノ酸配列：
Ａｌａ−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ａｓｐ−Ｘ６−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｘ９−Ｌｅｕ−Ｘｌｌ−Ｘｌ２−Ｘｌ３−Ｘｌ４ （配列番号４４７）
（式中、
Ｘ２はＡｒｇ以外の任意のアミノ酸であり；
Ｘ３はＴｒｐ， Ｇｌｕ， Ｌｙｓ， Ｃｙｓ， Ｌｅｕ， Ａｌａ， Ａｒｇ， ＧｌｙまたはＳｅｒであり；
Ｘ４はＴｙｒ， Ｐｈｅ， Ｇｌｕ， ＣｙｓまたはＡｓｎであり；
Ｘ６はＰｒｏ， Ｓｅｒ， Ｔｈｒ， Ｐｈｅ， Ｌｅｕ， Ｔｙｒ， ＣｙｓまたはＡｌａであり；
Ｘ９はＬｙｓ， Ａｓｎ， Ｇｌｎ， ＧｌｙまたはＡｒｇであり；
ＸｌｌはＴｒｐ， Ｓｅｒ， Ｔｈｒ， Ａｒｇ， Ｃｙｓ， ＴｙｒまたはＬｙｓであり；
Ｘｌ２はＬｅｕ， Ｐｈｅ， Ｖａｌ， ＩｌｅまたはＨｉｓであり；
Ｘ１３はＰｒｏ， Ｌｅｕ， Ｈｉｓ， Ｓｅｒ， Ａｒｇ， Ａｓｎ， Ｇｌｎ， Ｔｈｒ， Ｖａｌ， Ａｌａ， Ｃｙｓ， Ｉｌｅ， ＰｈｅまたはＴｙｒであり；
Ｘ１４はＡｓｐ， Ｇｌｕ， Ａｓｎ， Ｖａｌ， Ｈｉｓ， Ｇｌｎ， Ａｒｇ， Ｇｌｙ， Ｓｅｒ， Ｔｙｒ， Ａｌａ， Ｃｙｓ， Ｌｙｓ， Ｉｌｅ， ＴｈｒまたはＬｅｕである）
を含んでなる、請求項３に記載のポリペプチド。
【請求項６】
表１４に示した配列番号１８６〜４３５からなる群より選択されるアミノ酸配列を含んでなる、請求項３に記載のポリペプチド。
【請求項７】
表１５に示した配列番号４３７〜４４４からなる群より選択されるアミノ酸配列を含んでなる、請求項３に記載のポリペプチド。
【請求項８】
下記のアミノ酸配列：
Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ−Ｔｒｐ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ （配列番号４５０）；
Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｃｙｓ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｈｉｓ−Ｃｙｓ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｇｌｙ （配列番号４５１）；
Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−Ｈｉｓ−Ｍｅｔ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−Ｖａｌ−Ｃｙｓ−Ｖａｌ−Ｈｉｓ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｐｒｏ （配列番号４５２）；
Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｃｙｓ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｈｉｓ−Ｐｈｅ−Ｃｙｓ−Ｍｅｔ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ （配列番号４５３）；
Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ （配列番号４５４）；
Ｔｒｐ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｔｒｐ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ （配列番号４５５）；
Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｔｒｐ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ （配列番号１８６）；
Ｔｒｐ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ （配列番号４５６）；
Ｔｒｐ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ （配列番号４５７）；
Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｔｒｐ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ （配列番号１８９） ；
Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｔｒｐ−Ｐｈｅ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ （配列番号３０９）；
Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｔｒｐ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ （配列番号４５８）；
Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｔｒｐ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｔｒｐ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ （配列番号３５３）；
Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｔｒｐ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ （配列番号３２７）；
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含んでなる、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項９】
下記の式のうちの１つに従うアミノ酸配列を含んでなるＢＬｙＳ結合性ポリペプチド：
（Ｈ） Ｃｙｓ−Ｘ２−Ｐｈｅ−Ｘ４−Ｔｒｐ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ （配列番号８）
（式中、
Ｘ２はＰｈｅ， ＴｒｐまたはＴｙｒであり；
Ｘ４はＰｒｏまたはＴｙｒである）；
（Ｉ） Ｃｙｓ−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｃｙｓ （配列番号９）
（式中、
Ｘ２はＡｓｐ， Ｉｌｅ， ＬｅｕまたはＴｙｒであり；
Ｘ３はＡｒｇ， Ａｓｐ， Ｇｌｕ， Ｈｉｓ， Ｉｌｅ， Ｌｅｕ， Ｌｙｓ， Ｐｈｅ， Ｐｒｏ， ＴｙｒまたはＶａｌであり；
Ｘ４はＨｉｓ， Ｌｅｕ， ＬｙｓまたはＰｈｅであり；
Ｘ５はＬｅｕ， ＰｒｏまたはＴｈｒであり；
Ｘ６はＡｒｇ， Ａｓｎ， Ｇｌｙ， Ｈｉｓ， Ｉｌｅ， Ｌｙｓ， ＭｅｔまたはＴｒｐであり；
Ｘ７はＡｌａ， Ａｓｎ， Ｇｌｎ， Ｇｌｕ， Ｇｌｙ， Ｈｉｓ， Ｉｌｅ， Ｌｅｕ， Ｍｅｔ， Ｐｈｅ， Ｓｅｒ， Ｔｒｐ， ＴｙｒまたはＶａｌである）；
（Ｊ） Ｃｙｓ−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｃｙｓ （配列番号１０）
（式中、
Ｘ２はＡｓｎ， Ａｓｐ， Ｐｒｏ， ＳｅｒまたはＴｈｒであり；
Ｘ３はＡｒｇ， Ａｓｐ， Ｉｌｅ， Ｌｅｕ， Ｍｅｔ， ＰｒｏまたはＶａｌであり；
Ｘ４はＡｌａ， Ｉｌｅ， Ｌｅｕ， Ｐｒｏ， ＴｈｒまたはＶａｌであり；
Ｘ５はＡｓｎ， Ｈｉｓ， Ｉｌｅ， Ｌｅｕ， Ｌｙｓ， ＰｈｅまたはＴｈｒであり；
Ｘ６はＡｓｎ， Ｇｌｕ， Ｇｌｙ， Ｈｉｓ， Ｌｅｕ， Ｌｙｓ， Ｍｅｔ， ＰｒｏまたはＴｈｒであり；
Ｘ７はＡｒｇ， Ａｓｎ， Ａｓｐ， Ｇｌｎ， Ｇｌｕ， Ｇｌｙ， Ｉｌｅ， Ｌｙｓ， Ｍｅｔ， Ｐｒｏ， ＳｅｒまたはＴｒｐであり；
Ｘ８はＡｒｇ， Ｇｌｕ， Ｇｌｙ， Ｌｙｓ， Ｐｈｅ， Ｓｅｒ， ＴｒｐまたはＴｙｒである）；
（Ｋ） Ｃｙｓ−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−Ｃｙｓ （配列番号１１）
（式中、
Ｘ２はＡｓｐ， Ｇｌｎ， Ｈｉｓ， Ｉｌｅ， Ｌｅｕ， Ｌｙｓ， Ｍｅｔ， ＰｈｅまたはＴｈｒであり；
Ｘ３はＨｉｓ， Ｉｌｅ， Ｌｅｕ， Ｍｅｔ， Ｐｈｅ， Ｐｒｏ， ＴｒｐまたはＴｙｒであり；
Ｘ４はＡｓｐ， Ｈｉｓ， ＬｅｕまたはＳｅｒであり；
Ｘ５はＡｌａ， Ａｒｇ， Ａｓｐ， Ｇｌｕ， Ｌｅｕ， Ｐｈｅ， ＰｒｏまたはＴｈｒであり；
Ｘ６はＡｌａ， Ａｒｇ， ＡｓｎまたはＬｅｕであり；
Ｘ７はＩｌｅ， Ｌｅｕ， Ｍｅｔ， Ｐｒｏ， ＳｅｒまたはＴｈｒであり；
Ｘ８はＡｌａ， Ａｒｇ， Ａｓｎ， Ｇｌｙ， Ｈｉｓ， Ｌｙｓ， ＳｅｒまたはＴｙｒであり；
Ｘ９はＡｌａ， Ａｒｇ， Ａｓｎ， Ｇｌｎ， Ｌｅｕ， Ｍｅｔ， Ｓｅｒ， Ｔｒｐ， ＴｙｒまたはＶａｌである）；
（Ｌ） Ｃｙｓ−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０−Ｘ１１−Ｃｙｓ （配列番号１２）
（式中、
Ｘ２はＡｒｇ， Ａｓｎ， Ｇｌｎ， Ｇｌｕ， Ｈｉｓ， Ｌｅｕ， Ｐｈｅ， Ｐｒｏ， Ｔｒｐ， ＴｙｒまたはＶａｌであり；
Ｘ３はＡｒｇ， Ａｓｐ， Ｇｌｎ， Ｇｌｙ， Ｉｌｅ， Ｌｙｓ， Ｐｈｅ， Ｔｈｒ， ＴｒｐまたはＴｙｒであり；
Ｘ４はＡｌａ， Ａｒｇ， Ａｓｐ， Ｇｌｕ， Ｇｌｙ， Ｌｅｕ， ＳｅｒまたはＴｙｒであり；
Ｘ５はＡｓｐ， Ｇｌｎ， Ｇｌｕ， Ｌｅｕ， Ｍｅｔ， Ｐｈｅ， Ｐｒｏ， ＳｅｒまたはＴｙｒであり；
Ｘ６はＡｓｐ， Ｌｅｕ， Ｐｒｏ， ＴｈｒまたはＶａｌであり；
Ｘ７はＡｒｇ， Ｇｌｎ， Ｈｉｓ， Ｉｌｅ， Ｌｅｕ， Ｌｙｓ， Ｍｅｔ， Ｐｈｅ， Ｔｈｒ， ＴｒｐまたはＴｙｒであり；
Ｘ８はＡｌａ， Ａｒｇ， Ａｓｎ， Ｇｌｎ， Ｇｌｕ， Ｈｉｓ， Ｌｅｕ， Ｌｙｓ， ＭｅｔまたはＴｈｒであり；
Ｘ９はＡｌａ， Ａｓｎ， Ｇｌｎ， Ｇｌｙ， Ｌｅｕ， Ｌｙｓ， Ｐｈｅ， Ｐｒｏ， Ｔｈｒ， ＴｒｐまたはＴｙｒであり；
Ｘｌ０はＡｌａ， Ａｒｇ， Ｇｌｎ， Ｈｉｓ， Ｌｙｓ， Ｍｅｔ， Ｐｈｅ， Ｐｒｏ， Ｔｈｒ， ＴｒｐまたはＴｙｒであり；
Ｘ１１はＡｒｇ， Ｇｌｎ， Ｇｌｕ， Ｇｌｙ， Ｈｉｓ， Ｌｅｕ， Ｍｅｔ， Ｐｈｅ， Ｐｒｏ， Ｓｅｒ， Ｔｈｒ， ＴｙｒまたはＶａｌである）。
【請求項１０】
（ａ） 前記ポリペプチドが式： Ｃｙｓ−Ｘ２−Ｐｈｅ−Ｘ４−Ｔｒｐ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ （配列番号８） のアミノ酸配列を含んでなり、下記のアミノ酸位置が独立して次のように選択される： Ｘ２がＴｙｒ； Ｘ４がＰｒｏ； またはそのような選択の組合せである；
（ｂ） 前記ポリペプチドが式： Ｃｙｓ−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｃｙｓ （配列番号９） のアミノ酸配列を含んでなり、下記のアミノ酸位置が独立して次のように選択される： Ｘ２がＡｓｐまたはＬｅｕ； Ｘ３がＧｌｕまたはＬｅｕ； Ｘ４がＨｉｓまたはＬｅｕ； Ｘ５がＴｈｒまたはＰｒｏ； Ｘ６がＬｙｓ； またはそのような選択の組合せである；
（ｃ） 前記ポリペプチドが式： Ｃｙｓ−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｃｙｓ （配列番号１０） のアミノ酸配列を含んでなり、下記のアミノ酸位置が独立して次のように選択される： Ｘ２がＡｓｐ； Ｘ３がＩｌｅ； Ｘ４がＶａｌまたはＬｅｕ； Ｘ５がＴｈｒ； Ｘ６がＬｅｕ； Ｘ８がＳｅｒ； またはそのような選択の組合せである；
（ｄ） 前記ポリペプチドが式： Ｃｙｓ−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−Ｃｙｓ （配列番号１１） のアミノ酸配列を含んでなり、下記のアミノ酸位置が独立して次のように選択される： Ｘ４がＡｓｐ； Ｘ５がＧｌｕまたはＰｒｏ； Ｘ６がＬｅｕ； Ｘ７がＴｈｒ； またはそのような選択の組合せである；
（ｅ） 前記ポリペプチドが式： Ｃｙｓ−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−Ｘｌ０−Ｘｌｌ−Ｃｙｓ （配列番号１２） のアミノ酸配列を含んでなり、下記のアミノ酸位置が独立して次のように選択される： Ｘ２がＴｒｐ， ＴｙｒまたはＶａｌ； Ｘ３がＡｓｐ； Ｘ４がＡｓｐ； Ｘ５がＬｅｕ； Ｘ６がＬｅｕまたはＴｈｒ； Ｘ７がＬｙｓまたはＴｈｒ； Ｘ８がＡｒｇまたはＬｅｕ； Ｘ９がＴｈｒまたはＴｒｐ； Ｘ１０がＭｅｔまたはＰｈｅ； Ｘ１１がＶａｌ； またはそのような選択の組合せである；
請求項９に記載のポリペプチド。
【請求項１１】
下記の式のアミノ酸配列を含んでなるＢＬｙＳ結合性ポリペプチド：
（Ａ） Ｘｌ−Ｘ２−Ｘ３−Ｃｙｓ−Ｘ５−Ｐｈｅ−Ｘ７−Ｔｒｐ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−Ｘｌｌ−Ｘ１２−Ｘ１３ （配列番号１）
（式中、
Ｘ１はＡｌａ， Ａｓｎ， ＬｙｓまたはＳｅｒであり；
Ｘ２はＡｌａ， Ｇｌｕ， Ｍｅｔ， ＳｅｒまたはＶａｌであり；
Ｘ３はＡｌａ， Ａｓｎ， ＬｙｓまたはＰｒｏであり；
Ｘ５はＰｈｅ， ＴｒｐまたはＴｙｒであり；
Ｘ７はＰｒｏまたはＴｙｒであり；
Ｘ１１はＡｌａ， Ｇｌｎ， Ｈｉｓ， ＰｈｅまたはＶａｌであり；
Ｘ１２はＡｓｎ， Ｇｌｎ， Ｇｌｙ， Ｈｉｓ， ＳｅｒまたはＶａｌであり；
Ｘ１３はＡｌａ， Ａｓｎ， Ｇｌｙ， Ｉｌｅ， ＰｒｏまたはＳｅｒである）；
（Ｂ） Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｃｙｓ−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０−Ｃｙｓ−Ｘ１２−Ｘ１３−Ｘ１４ （配列番号２）
（式中、
Ｘ１はＡｌａ， Ａｓｐ， Ｇｌｎ， Ｇｌｕ， Ｇｌｙ， Ｈｉｓ， Ｉｌｅ， Ｌｅｕ， Ｌｙｓ， Ｍｅｔ， Ｐｈｅ， Ｐｒｏ， Ｓｅｒ， Ｔｈｒ， Ｔｒｐ， Ｔｙｒ， Ｖａｌであるか、または存在せず；
Ｘ２はＡｌａ， Ａｓｎ， Ａｓｐ， Ｇｌｎ， Ｇｌｙ， Ｈｉｓ， Ｉｌｅ， Ｌｅｕ， Ｌｙｓ， Ｍｅｔ， Ｐｈｅ， Ｐｒｏ， Ｓｅｒ， Ｔｈｒ， Ｔｒｐ， ＴｙｒまたはＶａｌであり；
Ｘ３はＡｌａ， Ａｒｇ， Ａｓｎ， Ａｓｐ， Ｇｌｎ， Ｇｌｕ， Ｇｌｙ， Ｈｉｓ， Ｉｌｅ， Ｌｅｕ， Ｌｙｓ， Ｍｅｔ， Ｐｈｅ， Ｐｒｏ， Ｓｅｒ， Ｔｒｐ， ＴｙｒまたはＶａｌであり；
Ｘ５はＡｓｐ， Ｉｌｅ， ＬｅｕまたはＴｙｒであり；
Ｘ６はＡｒｇ， Ａｓｐ， Ｇｌｕ， Ｈｉｓ， Ｉｌｅ， Ｌｅｕ， Ｌｙｓ， Ｐｈｅ， Ｐｒｏ， ＴｙｒまたはＶａｌであり；
Ｘ７はＨｉｓ， Ｌｅｕ， ＬｙｓまたはＰｈｅであり；
Ｘ８はＬｅｕ， ＰｒｏまたはＴｈｒであり；
Ｘ９はＡｒｇ， Ａｓｎ， Ｇｌｙ， Ｈｉｓ， Ｉｌｅ， Ｌｙｓ， ＭｅｔまたはＴｒｐであり；
Ｘ１０はＡｌａ， Ｇｌｎ， Ｇｌｕ， Ｇｌｙ， Ｈｉｓ， Ｉｌｅ， Ｌｅｕ， Ｍｅｔ， Ｐｈｅ， Ｓｅｒ， Ｔｒｐ， ＴｙｒまたはＶａｌであり；
Ｘｌ２はＡｓｐ， Ｇｌｎ， Ｇｌｕ， Ｇｌｙ， Ｉｌｅ， Ｌｅｕ， Ｌｙｓ， Ｐｈｅ， Ｓｅｒ， Ｔｒｐ， ＴｙｒまたはＶａｌであり；
Ｘ１３はＡｌａ， Ａｒｇ， Ａｓｎ， Ａｓｐ， Ｇｌｎ， Ｇｌｕ， Ｇｌｙ， Ｈｉｓ， Ｌｅｕ， Ｌｙｓ， Ｍｅｔ， Ｐｈｅ， Ｐｒｏ， Ｓｅｒ， Ｔｈｒ， Ｔｒｐ， ＴｙｒまたはＶａｌであり；
Ｘ１４はＡｌａ， Ａｒｇ， Ａｓｎ， Ａｓｐ， Ｇｌｎ， Ｇｌｕ， Ｇｌｙ， Ｈｉｓ， Ｉｌｅ， Ｌｅｕ， Ｌｙｓ， Ｐｈｅ， Ｐｒｏ， Ｔｒｐ， Ｔｙｒ， Ｖａｌであるか、または存在しない）；
（Ｃ） Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｃｙｓ−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０−Ｘ１１−Ｃｙｓ−Ｘ１３−Ｘ１４−Ｘ１５ （配列番号３）
（式中、
Ｘ１はＡｌａ， Ａｒｇ， Ａｓｎ， Ａｓｐ， Ｌｅｕ， Ｌｙｓ， Ｐｈｅ， Ｐｒｏ， ＳｅｒまたはＴｈｒであり；
Ｘ２はＡｓｎ， Ａｓｐ， Ｇｌｎ， Ｈｉｓ， Ｉｌｅ， Ｌｙｓ， Ｐｒｏ， ＴｈｒまたはＴｒｐであり；
Ｘ３はＡｌａ， Ａｒｇ， Ａｓｎ， Ｇｌｎ， Ｇｌｕ， Ｈｉｓ， Ｐｈｅ， ＰｒｏまたはＴｈｒであり；
Ｘ５はＡｓｎ， Ａｓｐ， Ｐｒｏ， ＳｅｒまたはＴｈｒであり；
Ｘ６はＡｒｇ， Ａｓｐ， Ｉｌｅ， Ｌｅｕ， Ｍｅｔ， ＰｒｏまたはＶａｌであり；
Ｘ７はＡｌａ， Ｉｌｅ， Ｌｅｕ， Ｐｒｏ， ＴｈｒまたはＶａｌであり；
Ｘ８はＡｓｎ， Ｈｉｓ， Ｉｌｅ， Ｌｅｕ， Ｌｙｓ， ＰｈｅまたはＴｈｒであり；
Ｘ９はＡｓｎ， Ｇｌｕ， Ｇｌｙ， Ｈｉｓ， Ｌｅｕ， Ｌｙｓ， Ｍｅｔ， ＰｒｏまたはＴｈｒであり；
Ｘ１０はＡｒｇ， Ａｓｎ， Ａｓｐ， Ｇｌｎ， Ｇｌｕ， Ｇｌｙ， Ｉｌｅ， Ｌｙｓ， Ｍｅｔ， Ｐｒｏ， ＳｅｒまたはＴｒｐであり；
Ｘ１１はＡｒｇ， Ｇｌｕ， Ｇｌｙ， Ｌｙｓ， Ｐｈｅ， Ｓｅｒ， ＴｒｐまたはＴｙｒであり；
Ｘ１３はＧｌｎ， Ｇｌｕ， Ｉｌｅ， Ｌｅｕ， Ｐｈｅ， Ｐｒｏ， Ｓｅｒ， ＴｙｒまたはＶａｌであり；
Ｘ１４はＡｓｎ， Ｇｌｙ， Ｉｌｅ， Ｐｈｅ， Ｐｒｏ， Ｔｈｒ， ＴｒｐまたはＴｙｒであり；
Ｘ１５はＡｓｎ， Ａｓｐ， Ｇｌｕ， Ｌｅｕ， Ｌｙｓ， Ｍｅｔ， ＰｒｏまたはＴｈｒである）；
（Ｄ） Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｃｙｓ−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０−Ｘ１１−Ｘ１２−Ｃｙｓ−Ｘ１４−Ｘ１５−Ｘ１６ （配列番号４）
（式中、
Ｘ１はＡｓｎ， Ａｓｐ， Ｈｉｓ， Ｌｅｕ， Ｐｈｅ， Ｐｒｏ， Ｓｅｒ， Ｔｙｒであるか、または存在せず；
Ｘ２はＡｒｇ， Ａｓｎ， Ａｓｐ， Ｈｉｓ， Ｐｈｅ， ＳｅｒまたはＴｒｐであり；
Ｘ３はＡｓｎ， Ａｓｐ， Ｌｅｕ， Ｐｒｏ， ＳｅｒまたはＶａｌであり；
Ｘ５はＡｓｐ， Ｇｌｎ， Ｈｉｓ， Ｉｌｅ， Ｌｅｕ， Ｌｙｓ， Ｍｅｔ， ＰｈｅまたはＴｈｒであり；
Ｘ６はＨｉｓ， Ｉｌｅ， Ｌｅｕ， Ｍｅｔ， Ｐｈｅ， Ｐｒｏ， ＴｒｐまたはＴｙｒであり；
Ｘ７はＡｓｐ， Ｈｉｓ， ＬｅｕまたはＳｅｒであり；
Ｘ８はＡｌａ， Ａｒｇ， Ａｓｐ， Ｇｌｕ， Ｌｅｕ， Ｐｈｅ， ＰｒｏまたはＴｈｒであり；
Ｘ９はＡｌａ， Ａｒｇ， ＡｓｎまたはＬｅｕであり；
Ｘｌ０はＩｌｅ， Ｌｅｕ， Ｍｅｔ， Ｐｒｏ， ＳｅｒまたはＴｈｒであり；
Ｘ１１はＡｌａ， Ａｒｇ， Ａｓｎ， Ｇｌｙ， Ｈｉｓ， Ｌｙｓ， ＳｅｒまたはＴｙｒであり；
Ｘ１２はＡｌａ， Ａｒｇ， Ａｓｎ， Ｇｌｎ， Ｌｅｕ， Ｍｅｔ， Ｓｅｒ， Ｔｒｐ， ＴｙｒまたはＶａｌであり；
Ｘ１４はＡｓｐ， Ｇｌｙ， Ｌｅｕ， Ｐｈｅ， ＴｙｒまたはＶａｌであり；
Ｘ１５はＡｓｎ， Ｈｉｓ， Ｌｅｕ， ＰｒｏまたはＴｙｒであり；
Ｘ１６はＡｓｎ， Ａｓｐ， Ｈｉｓ， Ｐｈｅ， ＳｅｒまたはＴｙｒである）；
（Ｅ） Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｃｙｓ−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０−Ｘ１１−Ｘ１２−Ｘ１３−Ｘ１４−Ｃｙｓ−Ｘ１６−Ｘ１７−Ｘ１８ （配列番号５）
（式中、
Ｘ１はＡｒｇ， Ａｓｐ， Ｇｌｙ， Ｈｉｓ， Ｌｅｕ， Ｐｈｅ， Ｐｒｏ， Ｓｅｒ， Ｔｒｐ， Ｔｙｒであるか、または存在せず；
Ｘ２はＡｌａ， Ａｒｇ， Ａｓｎ， Ａｓｐ， Ｇｌｙ， Ｐｒｏ， Ｓｅｒであるか、または存在せず；
Ｘ３はＡｒｇ， Ａｓｎ， Ｇｌｎ， Ｇｌｕ， Ｇｌｙ， Ｌｙｓ， Ｍｅｔ， Ｐｒｏ， ＴｒｐまたはＶａｌであり；
Ｘ５はＡｒｇ， Ａｓｎ， Ｇｌｎ， Ｇｌｕ， Ｈｉｓ， Ｌｅｕ， Ｐｈｅ， Ｐｒｏ， Ｔｒｐ， ＴｙｒまたはＶａｌであり；
Ｘ６はＡｒｇ， Ａｓｐ， Ｇｌｎ， Ｇｌｙ， Ｉｌｅ， Ｌｙｓ， Ｐｈｅ， Ｔｈｒ， ＴｒｐまたはＴｙｒであり；
Ｘ７はＡｌａ， Ａｒｇ， Ａｓｐ， Ｇｌｕ， Ｇｌｙ， Ｌｅｕ， ＳｅｒまたはＴｙｒであり；
Ｘ８はＡｓｐ， Ｇｌｎ， Ｇｌｕ， Ｌｅｕ， Ｍｅｔ， Ｐｈｅ， Ｐｒｏ， ＳｅｒまたはＴｙｒであり；
Ｘ９はＡｓｐ， Ｌｅｕ， Ｐｒｏ， ＴｈｒまたはＶａｌであり；
Ｘ１０はＡｒｇ， Ｇｌｎ， Ｈｉｓ， Ｉｌｅ， Ｌｅｕ， Ｌｙｓ， Ｍｅｔ， Ｐｈｅ， Ｔｈｒ， ＴｒｐまたはＴｙｒであり；
Ｘ１１はＡｌａ， Ａｒｇ， Ａｓｎ， Ｇｌｎ， Ｇｌｕ， Ｈｉｓ， Ｌｅｕ， Ｌｙｓ， ＭｅｔまたはＴｈｒであり；
Ｘ１２はＡｌａ， Ａｓｎ， Ｇｌｎ， Ｇｌｙ， Ｌｅｕ， Ｌｙｓ， Ｐｈｅ， Ｐｒｏ， Ｔｈｒ， ＴｒｐまたはＴｙｒであり；
Ｘ１３はＡｌａ， Ａｒｇ， Ｇｌｎ， Ｈｉｓ， Ｌｙｓ， Ｍｅｔ， Ｐｈｅ， Ｐｒｏ， Ｔｈｒ， ＴｒｐまたはＴｙｒであり；
Ｘ１４はＡｒｇ， Ｇｌｎ， Ｇｌｕ， Ｇｌｙ， Ｈｉｓ， Ｌｅｕ， Ｍｅｔ， Ｐｈｅ， Ｐｒｏ， Ｓｅｒ， Ｔｈｒ， ＴｙｒまたはＶａｌであり；
Ｘ１６はＡｒｇ， Ａｓｐ， Ｇｌｙ， Ｈｉｓ， Ｌｙｓ， Ｍｅｔ， Ｐｈｅ， Ｐｒｏ， ＳｅｒまたはＴｒｐであり；
Ｘ１７はＡｒｇ， Ａｓｎ， Ａｓｐ， Ｇｌｙ， Ｈｉｓ， Ｐｈｅ， Ｐｒｏ， Ｓｅｒ， ＴｒｐまたはＴｙｒであり；
Ｘｌ８はＡｌａ， Ａｒｇ， Ａｓｎ， Ａｓｐ， Ｈｉｓ， Ｌｅｕ， ＰｈｅまたはＴｒｐである）；
（Ｆ） Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０−Ｘ１１−Ｘ１２ （配列番号６）
（式中、
Ｘ１はＡｌａ， Ａｒｇ， Ｇｌｙ， Ｈｉｓ， Ｌｅｕ， Ｌｙｓ， Ｍｅｔ， Ｐｈｅ， Ｔｒｐ， ＴｙｒまたはＶａｌであり；
Ｘ２はＡｌａ， Ａｒｇ， Ｇｌｎ， Ｈｉｓ， Ｉｌｅ， Ｌｅｕ， Ｐｈｅ， Ｔｈｒ， ＴｒｐまたはＴｙｒであり；
Ｘ３はＡｌａ， Ａｓｐ， Ｌｙｓ， Ｐｈｅ， Ｔｈｒ， ＴｒｐまたはＴｙｒであり；
Ｘ４はＡｒｇ， Ａｓｐ， Ｇｌｎ， Ｌｙｓ， Ｍｅｔ， Ｐｈｅ， Ｐｒｏ， Ｓｅｒ， ＴｙｒまたはＶａｌであり；
Ｘ５はＡｓｐ， Ｌｅｕ， Ｌｙｓ， Ｐｈｅ， Ｐｒｏ， ＳｅｒまたはＶａｌであり；
Ｘ６はＨｉｓ， Ｉｌｅ， Ｌｅｕ， Ｐｒｏ， ＳｅｒまたはＴｈｒであり；
Ｘ７はＡｒｇ， Ｇｌｙ， Ｈｉｓ， Ｌｅｕ， Ｌｙｓ， ＭｅｔまたはＴｈｒであり；
Ｘ８はＡｌａ， Ａｒｇ， Ａｓｎ， Ｉｌｅ， Ｌｅｕ， Ｌｙｓ， ＭｅｔまたはＴｈｒであり；
Ｘ９はＡｌａ， Ａｓｎ， Ａｒｇ， Ａｓｐ， Ｇｌｕ， Ｇｌｙ， Ｈｉｓ， Ｌｅｕ， Ｍｅｔ， Ｓｅｒ， Ｔｒｐ， ＴｙｒまたはＶａｌであり；
Ｘ１０はＩｌｅ， Ｌｅｕ， Ｐｈｅ， Ｓｅｒ， Ｔｈｒ， Ｔｒｐ， ＴｙｒまたはＶａｌであり；
ＸｌｌはＡｌａ， Ａｒｇ， Ｇｌｙ， Ｈｉｓ， Ｉｌｅ， Ｌｅｕ， Ｌｙｓ， Ｐｒｏ， Ｓｅｒ， Ｔｈｒ， Ｔｒｐ， ＴｙｒまたはＶａｌであり；
Ｘ１２はＡｒｇ， Ａｓｐ， Ｈｉｓ， Ｌｅｕ， Ｌｙｓ， Ｍｅｔ， Ｐｈｅ， Ｐｒｏ， Ｓｅｒ， Ｔｒｐ， ＴｙｒまたはＶａｌである）；
（Ｇ） Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０−Ｘ１１−Ｘ１２−Ｘ１３ （配列番号７）
（式中、
Ｘ１はＡｓｐ， Ｇｌｎ， Ｇｌｕ， Ｇｌｙ， Ｈｉｓ， Ｌｙｓ， ＭｅｔまたはＴｒｐであり；
Ｘ２はＡｒｇ， Ｇｌｎ， Ｈｉｓ， Ｉｌｅ， ＬｅｕまたはＰｒｏであり；
Ｘ３はＡｓｐ， Ｇｌｙ， Ｉｌｅ， Ｌｙｓ， Ｔｈｒ， ＴｙｒまたはＶａｌであり；
Ｘ４はＡｓｎ， Ａｓｐ， Ｇｌｎ， Ｇｌｕ， Ｍｅｔ， Ｐｒｏ， ＳｅｒまたはＴｙｒであり；
Ｘ５はＡｓｎ， Ａｓｐ， Ｈｉｓ， Ｉｌｅ， Ｌｅｕ， Ｍｅｔ， Ｐｒｏ， ＴｈｒまたはＶａｌであり；
Ｘ６はＡｓｐ， Ｇｌｕ， Ｈｉｓ， Ｌｅｕ， Ｌｙｓ， ＰｒｏまたはＶａｌであり；
Ｘ７はＡｒｇ， Ａｓｎ， Ｇｌｎ， Ｈｉｓ， Ｉｌｅ， Ｌｅｕ， Ｍｅｔ， ＰｒｏまたはＴｈｒであり；
Ｘ８はＧｌｎ， Ｇｌｙ， Ｈｉｓ， Ｌｅｕ， Ｍｅｔ， ＳｅｒまたはＴｈｒであり；
Ｘ９はＡｓｎ， Ｇｌｎ， Ｇｌｙ， Ｈｉｓ， Ｌｅｕ， Ｌｙｓ， ＳｅｒまたはＴｈｒであり；
Ｘ１０はＡｌａ， Ｇｌｙ， Ｉｌｅ， Ｌｅｕ， Ｌｙｓ， ＭｅｔまたはＰｈｅであり；
Ｘ１１はＡｌａ， Ｇｌｕ， Ｈｉｓ， Ｉｌｅ， Ｌｅｕ， Ｍｅｔ， Ｓｅｒ， Ｔｈｒ， Ｔｒｐ， ＴｙｒまたはＶａｌであり；
Ｘ１２はＡｒｇ， Ｇｌｎ， Ｇｌｕ， Ｇｌｙ， Ｈｉｓ， Ｉｌｅ， Ｌｙｓ， ＴｙｒまたはＶａｌであり；
Ｘ１３はＡｒｇ， Ａｓｎ， Ｇｌｕ， Ｈｉｓ， Ｉｌｅ， Ｓｅｒ， Ｔｈｒ， ＴｒｐまたはＶａｌである）。
【請求項１２】
（ａ） 前記ポリペプチドが式：
Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｃｙｓ−Ｘ５−Ｐｈｅ−Ｘ７−Ｔｒｐ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−Ｘ１１−Ｘ１２−Ｘ１３ （配列番号１） のアミノ酸配列を含んでなり、下記のアミノ酸位置が独立して次のように選択される： Ｘ３がＬｙｓ； Ｘ５がＴｙｒ； Ｘ７がＰｒｏ； Ｘ１１がＡｌａ， Ｇｌｎ， Ｈｉｓ， ＰｈｅまたはＶａｌ； Ｘ１２がＡｓｎ， Ｇｌｎ， Ｇｌｙ， Ｈｉｓ， ＳｅｒまたはＶａｌ； Ｘ１３がＡｌａ， Ａｓｎ， Ｇｌｙ， Ｉｌｅ， ＰｒｏまたはＳｅｒ； またはそのような選択の組合せである；
（ｂ） 前記ポリペプチドが式：
Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｃｙｓ−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０−Ｃｙｓ−Ｘ１２−Ｘ１３−Ｘ１４ （配列番号２） のアミノ酸配列を含んでなり、下記のアミノ酸位置が独立して次のように選択される： Ｘ３がＡｓｐ； Ｘ５がＡｓｐまたはＬｅｕ； Ｘ６がＧｌｕまたはＬｅｕ； Ｘ７がＨｉｓまたはＬｅｕ； Ｘ８がＴｈｒまたはＰｒｏ； Ｘ９がＬｙｓ； またはそのような選択の組合せである；
（ｃ） 前記ポリペプチドが式：
Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｃｙｓ−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０−Ｘ１１−Ｃｙｓ−Ｘ１３−Ｘ１４−Ｘ１５ （配列番号３） のアミノ酸配列を含んでなり、下記のアミノ酸位置が独立して次のように選択される： Ｘ３がＡｌａ； Ｘ５がＡｓｐ； Ｘ６がＩｌｅ； Ｘ７がＶａｌまたはＬｅｕ； Ｘ８がＴｈｒ； Ｘ９がＬｅｕ； Ｘ１１がＳｅｒ； Ｘｌ３がＶａｌ； Ｘ１５がＧｌｕまたはＰｒｏ； またはそのような選択の組合せである；
（ｄ） 前記ポリペプチドが式：
Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｃｙｓ−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０−Ｘ１１−Ｘ１２−Ｃｙｓ−Ｘ１４−Ｘ１５−Ｘ１６ （配列番号４） のアミノ酸配列を含んでなり、下記のアミノ酸位置が独立して次のように選択される： Ｘ１がＳｅｒ； Ｘ２がＡｒｇ； Ｘ３がＡｓｎまたはＡｓｐ； Ｘ７がＡｓｐ； Ｘ８がＧｌｕまたはＰｒｏ； Ｘ９がＬｅｕ； Ｘ１０がＴｈｒ； Ｘ１４がＬｅｕ； Ｘ１５がＨｉｓ， ＬｅｕまたはＰｒｏ； Ｘ１６がＡｓｐまたはＳｅｒ； またはそのような選択の組合せである；
（ｅ） 前記ポリペプチドが式：
Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｃｙｓ−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０−Ｘ１１−Ｘ１２−Ｘ１３−Ｘ１４−Ｃｙｓ−Ｘ１６−Ｘ１７−Ｘ１８ （配列番号５） のアミノ酸配列を含んでなり、下記のアミノ酸位置が独立して次のように選択される： Ｘ１がＡｒｇ； Ｘ２がＡｓｎ， Ａｓｐ， ＧｌｙまたはＰｒｏ； Ｘ３がＧｌｙまたはＭｅｔ； Ｘ５がＴｒｐ， ＴｙｒまたはＶａｌ； Ｘ６がＡｓｐ； Ｘ７がＡｓｐ； Ｘ８がＬｅｕ； Ｘ９がＬｅｕまたはＴｈｒ； Ｘｌ０がＬｙｓまたはＴｈｒ； Ｘ１１がＡｒｇまたはＬｅｕ； Ｘ１２がＴｈｒまたはＴｒｐ； Ｘ１３がＭｅｔまたはＰｈｅ； Ｘ１４がＶａｌ； Ｘ１６がＭｅｔ； Ｘｌ７がＡｒｇ， ＨｉｓまたはＴｙｒ； Ｘ１８がＡｓｎまたはＨｉｓ； またはそのような選択の組合せである；
（ｆ） 前記ポリペプチドが式：
Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０−Ｘ１１−Ｘ１２ （配列番号６） のアミノ酸配列を含んでなり、下記のアミノ酸位置が独立して次のように選択される： Ｘ１がＧｌｙ， ＴｙｒまたはＶａｌ； Ｘ２がＨｉｓまたはＴｙｒ； Ｘ３がＡｓｐまたはＴｙｒ； Ｘ４がＡｓｐまたはＧｌｎ ； Ｘ５がＬｅｕまたはＳｅｒ； Ｘ６がＬｅｕまたはＴｈｒ； Ｘ７がＬｙｓまたはＴｈｒ； Ｘ８がＬｅｕまたはＬｙｓ； Ｘ９がＭｅｔまたはＳｅｒ； Ｘｌ０がＴｈｒまたはＬｅｕ； Ｘ１１がＰｒｏまたはＴｈｒ； Ｘ１２がＡｒｇまたはＰｒｏ； またはそのような選択の組合せである；
（ｇ） 前記ポリペプチドが式：
Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０−Ｘ１１−Ｘ１２−Ｘ１３ （配列番号７） のアミノ酸配列を含んでなり、下記のアミノ酸位置が独立して次のように選択される： Ｘ１がＧｌｕまたはＬｙｓ； Ｘ２がＨｉｓまたはＰｒｏ； Ｘ３がＴｙｒ； Ｘ４がＡｓｐまたはＧｌｎ； Ｘ５がＡｓｎまたはＴｈｒ； Ｘ６がＡｓｐまたはＰｒｏ； Ｘ７がＩｌｅまたはＰｒｏ； Ｘ８がＬｅｕまたはＴｈｒ； Ｘ９がＬｙｓ； Ｘｌ０がＧｌｙまたはＭｅｔ； Ｘ１１がＡｌａまたはＴｈｒ； Ｘ１２がＡｒｇまたはＨｉｓ； Ｘ１３がＨｉｓ； またはそのような選択の組合せである；
請求項１１に記載のＢＬｙＳ結合性ポリペプチド。
【請求項１３】
表１〜８に示した配列番号２０〜１６２からなる群より選択されるアミノ酸配列を含んでなる、請求項１１に記載のＢＬｙＳ結合性ポリペプチド。
【請求項１４】
下記のアミノ酸配列：
ＡＧＫＥＰＣＹＦＹＷＥＣＡＶＳＧＰＧＰＥＧＧＧＫ （配列番号１６３）
ＡＧＶＰＦＣＤＬＬＴＫＨＣＦＥＡＧＰＧＰＥＧＧＧＫ （配列番号１６４）
ＧＳＳＲＬＣＨＭＤＥＬＴＨＶＣＶＨＦＡＰＰＧＰＥＧＧＧＫ （配列番号１６５）
ＧＤＧＧＮＣＹＴＤＳＬＴＫＬＨＦＣＭＧＤＥＰＧＰＥＧＧＧＫ （配列番号１６６）
ＧＹＤＶＬＴＫＬＹＦＶＰＧＧＰＧＰＥＧＧＧＫ （配列番号１６７）
ＷＴＤＳＬＴＧＬＷＦＰＤＧＧＰＧＰＥＧＧＧＫ （配列番号１６８）
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含んでなる、請求項１１に記載のＢＬｙＳ結合性ポリペプチド。
【請求項１５】
アミノ酸配列： Ａｓｐ−Ｘａａ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ （配列番号４４６）（式中、ＸａａはＰｒｏ， Ｓｅｒ， Ｔｈｒ， Ｐｈｅ， Ｌｅｕ， Ｔｙｒ， ＣｙｓまたはＡｌａである）を含んでなるＢＬｙＳ結合性ポリペプチドをコードする外因性ＤＮＡを発現する組換えバクテリオファージ。
【請求項１６】
ＸａａがＰｒｏまたはＳｅｒである、請求項１５に記載のバクテリオファージ。
【請求項１７】
前記ポリペプチドが下記のアミノ酸配列：
Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ−Ｔｒｐ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ （配列番号４５０）；
Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｃｙｓ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｈｉｓ−Ｃｙｓ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｇｌｙ （配列番号４５１）；
Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−Ｈｉｓ−Ｍｅｔ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−Ｖａｌ−Ｃｙｓ−Ｖａｌ−Ｈｉｓ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｐｒｏ （配列番号４５２）；
Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｃｙｓ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｈｉｓ−Ｐｈｅ−Ｃｙｓ−Ｍｅｔ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ （配列番号４５３）；
Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ （配列番号４５４）；
Ｔｒｐ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｔｒｐ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ （配列番号４５５）；
Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｔｒｐ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ （配列番号１８６）；
Ｔｒｐ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ （配列番号４５６）；
Ｔｒｐ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ （配列番号４５７）；
Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｔｒｐ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ （配列番号１８９） ；
Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｔｒｐ−Ｐｈｅ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ （配列番号３０９）；
Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｔｒｐ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ （配列番号４５８）；
Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｔｒｐ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｔｒｐ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ （配列番号３５３）；
Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｔｒｐ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ （配列番号３２７）；
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含んでなる、請求項１５に記載のバクテリオファージ。
【請求項１８】
前記ポリペプチドが次のアミノ酸配列：
Ｘ１−Ｘ２−Ａｓｐ−Ｘ４−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｘ７−Ｌｅｕ−Ｘ９−Ｘ１０ （配列番号４４８）
（式中、
Ｘ１はＴｒｐ， Ｇｌｕ， Ｌｙｓ， Ｃｙｓ， Ｌｅｕ， Ａｌａ， Ａｒｇ， ＧｌｙまたはＳｅｒであり；
Ｘ２はＴｙｒ， Ｐｈｅ， Ｇｌｕ， ＣｙｓまたはＡｓｎであり；
Ｘ４はＰｒｏ， Ｓｅｒ， Ｔｈｒ， Ｐｈｅ， Ｌｅｕ， Ｔｙｒ， ＣｙｓまたはＡｌａであり；
Ｘ７はＬｙｓ， Ａｓｎ， Ｇｌｎ， ＧｌｙまたはＡｒｇであり；
Ｘ９はＴｒｐ， Ｓｅｒ， Ｔｈｒ， Ａｒｇ， Ｃｙｓ， ＴｙｒまたはＬｙｓであり；
Ｘ１０はＬｅｕ， Ｐｈｅ， Ｖａｌ， ＩｌｅまたはＨｉｓである）
を含んでなる、請求項１５に記載のバクテリオファージ。
【請求項１９】
前記ポリペプチドが次のアミノ酸配列：
Ｔｒｐ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ （配列番号４３６）
を含んでなる、請求項１８に記載のバクテリオファージ。
【請求項２０】
前記ポリペプチドが次のアミノ酸配列：
Ａｌａ−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ａｓｐ−Ｘ６−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｘ９−Ｌｅｕ−Ｘｌｌ−Ｘｌ２−Ｘｌ３−Ｘｌ４ （配列番号４４７）
（式中、
Ｘ２はＡｒｇ以外の任意のアミノ酸であり；
Ｘ３はＴｒｐ， Ｇｌｕ， Ｌｙｓ， Ｃｙｓ， Ｌｅｕ， Ａｌａ， Ａｒｇ， ＧｌｙまたはＳｅｒであり；
Ｘ４はＴｙｒ， Ｐｈｅ， Ｇｌｕ， ＣｙｓまたはＡｓｎであり；
Ｘ６はＰｒｏ， Ｓｅｒ， Ｔｈｒ， Ｐｈｅ， Ｌｅｕ， Ｔｙｒ， ＣｙｓまたはＡｌａであり；
Ｘ９はＬｙｓ， Ａｓｎ， Ｇｌｎ， ＧｌｙまたはＡｒｇであり；
ＸｌｌはＴｒｐ， Ｓｅｒ， Ｔｈｒ， Ａｒｇ， Ｃｙｓ， ＴｙｒまたはＬｙｓであり；
Ｘｌ２はＬｅｕ， Ｐｈｅ， Ｖａｌ， ＩｌｅまたはＨｉｓであり；
Ｘ１３はＰｒｏ， Ｌｅｕ， Ｈｉｓ， Ｓｅｒ， Ａｒｇ， Ａｓｎ， Ｇｌｎ， Ｔｈｒ， Ｖａｌ， Ａｌａ， Ｃｙｓ， Ｉｌｅ， ＰｈｅまたはＴｙｒであり；
Ｘ１４はＡｓｐ， Ｇｌｕ， Ａｓｎ， Ｖａｌ， Ｈｉｓ， Ｇｌｎ， Ａｒｇ， Ｇｌｙ， Ｓｅｒ， Ｔｙｒ， Ａｌａ， Ｃｙｓ， Ｌｙｓ， Ｉｌｅ， ＴｈｒまたはＬｅｕである）
を含んでなる、請求項１８に記載のバクテリオファージ。
【請求項２１】
前記ポリペプチドが表１４に示した配列番号１８６〜４３５からなる群より選択されるアミノ酸配列を含んでなる、請求項１８に記載のバクテリオファージ。
【請求項２２】
下記の式のアミノ酸配列を含んでなるＢＬｙＳ結合性ポリペプチドをコードする外因性ＤＮＡを発現する組換えバクテリオファージ：
（Ａ） Ｘｌ−Ｘ２−Ｘ３−Ｃｙｓ−Ｘ５−Ｐｈｅ−Ｘ７−Ｔｒｐ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−Ｘｌｌ−Ｘ１２−Ｘ１３ （配列番号１）
（式中、
Ｘ１はＡｌａ， Ａｓｎ， ＬｙｓまたはＳｅｒであり；
Ｘ２はＡｌａ， Ｇｌｕ， Ｍｅｔ， ＳｅｒまたはＶａｌであり；
Ｘ３はＡｌａ， Ａｓｎ， ＬｙｓまたはＰｒｏであり；
Ｘ５はＰｈｅ， ＴｒｐまたはＴｙｒであり；
Ｘ７はＰｒｏまたはＴｙｒであり；
Ｘ１１はＡｌａ， Ｇｌｎ， Ｈｉｓ， ＰｈｅまたはＶａｌであり；
Ｘ１２はＡｓｎ， Ｇｌｎ， Ｇｌｙ， Ｈｉｓ， ＳｅｒまたはＶａｌであり；
Ｘ１３はＡｌａ， Ａｓｎ， Ｇｌｙ， Ｉｌｅ， ＰｒｏまたはＳｅｒである）；
（Ｂ） Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｃｙｓ−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０−Ｃｙｓ−Ｘ１２−Ｘ１３−Ｘ１４ （配列番号２）
（式中、
Ｘ１はＡｌａ， Ａｓｐ， Ｇｌｎ， Ｇｌｕ， Ｇｌｙ， Ｈｉｓ， Ｉｌｅ， Ｌｅｕ， Ｌｙｓ， Ｍｅｔ， Ｐｈｅ， Ｐｒｏ， Ｓｅｒ， Ｔｈｒ， Ｔｒｐ， Ｔｙｒ， Ｖａｌであるか、または存在せず；
Ｘ２はＡｌａ， Ａｓｎ， Ａｓｐ， Ｇｌｎ， Ｇｌｙ， Ｈｉｓ， Ｉｌｅ， Ｌｅｕ， Ｌｙｓ， Ｍｅｔ， Ｐｈｅ， Ｐｒｏ， Ｓｅｒ， Ｔｈｒ， Ｔｒｐ， ＴｙｒまたはＶａｌであり；
Ｘ３はＡｌａ， Ａｒｇ， Ａｓｎ， Ａｓｐ， Ｇｌｎ， Ｇｌｕ， Ｇｌｙ， Ｈｉｓ， Ｉｌｅ， Ｌｅｕ， Ｌｙｓ， Ｍｅｔ， Ｐｈｅ， Ｐｒｏ， Ｓｅｒ， Ｔｒｐ， ＴｙｒまたはＶａｌであり；
Ｘ５はＡｓｐ， Ｉｌｅ， ＬｅｕまたはＴｙｒであり；
Ｘ６はＡｒｇ， Ａｓｐ， Ｇｌｕ， Ｈｉｓ， Ｉｌｅ， Ｌｅｕ， Ｌｙｓ， Ｐｈｅ， Ｐｒｏ， ＴｙｒまたはＶａｌであり；
Ｘ７はＨｉｓ， Ｌｅｕ， ＬｙｓまたはＰｈｅであり；
Ｘ８はＬｅｕ， ＰｒｏまたはＴｈｒであり；
Ｘ９はＡｒｇ， Ａｓｎ， Ｇｌｙ， Ｈｉｓ， Ｉｌｅ， Ｌｙｓ， ＭｅｔまたはＴｒｐであり；
Ｘ１０はＡｌａ， Ｇｌｎ， Ｇｌｕ， Ｇｌｙ， Ｈｉｓ， Ｉｌｅ， Ｌｅｕ， Ｍｅｔ， Ｐｈｅ， Ｓｅｒ， Ｔｒｐ， ＴｙｒまたはＶａｌであり；
Ｘｌ２はＡｓｐ， Ｇｌｎ， Ｇｌｕ， Ｇｌｙ， Ｉｌｅ， Ｌｅｕ， Ｌｙｓ， Ｐｈｅ， Ｓｅｒ， Ｔｒｐ， ＴｙｒまたはＶａｌであり；
Ｘ１３はＡｌａ， Ａｒｇ， Ａｓｎ， Ａｓｐ， Ｇｌｎ， Ｇｌｕ， Ｇｌｙ， Ｈｉｓ， Ｌｅｕ， Ｌｙｓ， Ｍｅｔ， Ｐｈｅ， Ｐｒｏ， Ｓｅｒ， Ｔｈｒ， Ｔｒｐ， ＴｙｒまたはＶａｌであり；
Ｘ１４はＡｌａ， Ａｒｇ， Ａｓｎ， Ａｓｐ， Ｇｌｎ， Ｇｌｕ， Ｇｌｙ， Ｈｉｓ， Ｉｌｅ， Ｌｅｕ， Ｌｙｓ， Ｐｈｅ， Ｐｒｏ， Ｔｒｐ， Ｔｙｒ， Ｖａｌであるか、または存在しない）；
（Ｃ） Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｃｙｓ−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０−Ｘ１１−Ｃｙｓ−Ｘ１３−Ｘ１４−Ｘ１５ （配列番号３）
（式中、
Ｘ１はＡｌａ， Ａｒｇ， Ａｓｎ， Ａｓｐ， Ｌｅｕ， Ｌｙｓ， Ｐｈｅ， Ｐｒｏ， ＳｅｒまたはＴｈｒであり；
Ｘ２はＡｓｎ， Ａｓｐ， Ｇｌｎ， Ｈｉｓ， Ｉｌｅ， Ｌｙｓ， Ｐｒｏ， ＴｈｒまたはＴｒｐであり；
Ｘ３はＡｌａ， Ａｒｇ， Ａｓｎ， Ｇｌｎ， Ｇｌｕ， Ｈｉｓ， Ｐｈｅ， ＰｒｏまたはＴｈｒであり；
Ｘ５はＡｓｎ， Ａｓｐ， Ｐｒｏ， ＳｅｒまたはＴｈｒであり；
Ｘ６はＡｒｇ， Ａｓｐ， Ｉｌｅ， Ｌｅｕ， Ｍｅｔ， ＰｒｏまたはＶａｌであり；
Ｘ７はＡｌａ， Ｉｌｅ， Ｌｅｕ， Ｐｒｏ， ＴｈｒまたはＶａｌであり；
Ｘ８はＡｓｎ， Ｈｉｓ， Ｉｌｅ， Ｌｅｕ， Ｌｙｓ， ＰｈｅまたはＴｈｒであり；
Ｘ９はＡｓｎ， Ｇｌｕ， Ｇｌｙ， Ｈｉｓ， Ｌｅｕ， Ｌｙｓ， Ｍｅｔ， ＰｒｏまたはＴｈｒであり；
Ｘ１０はＡｒｇ， Ａｓｎ， Ａｓｐ， Ｇｌｎ， Ｇｌｕ， Ｇｌｙ， Ｉｌｅ， Ｌｙｓ， Ｍｅｔ， Ｐｒｏ， ＳｅｒまたはＴｒｐであり；
Ｘ１１はＡｒｇ， Ｇｌｕ， Ｇｌｙ， Ｌｙｓ， Ｐｈｅ， Ｓｅｒ， ＴｒｐまたはＴｙｒであり；
Ｘ１３はＧｌｎ， Ｇｌｕ， Ｉｌｅ， Ｌｅｕ， Ｐｈｅ， Ｐｒｏ， Ｓｅｒ， ＴｙｒまたはＶａｌであり；
Ｘ１４はＡｓｎ， Ｇｌｙ， Ｉｌｅ， Ｐｈｅ， Ｐｒｏ， Ｔｈｒ， ＴｒｐまたはＴｙｒであり；
Ｘ１５はＡｓｎ， Ａｓｐ， Ｇｌｕ， Ｌｅｕ， Ｌｙｓ， Ｍｅｔ， ＰｒｏまたはＴｈｒである）；
（Ｄ） Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｃｙｓ−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０−Ｘ１１−Ｘ１２−Ｃｙｓ−Ｘ１４−Ｘ１５−Ｘ１６ （配列番号４）
（式中、
Ｘ１はＡｓｎ， Ａｓｐ， Ｈｉｓ， Ｌｅｕ， Ｐｈｅ， Ｐｒｏ， Ｓｅｒ， Ｔｙｒであるか、または存在せず；
Ｘ２はＡｒｇ， Ａｓｎ， Ａｓｐ， Ｈｉｓ， Ｐｈｅ， ＳｅｒまたはＴｒｐであり；
Ｘ３はＡｓｎ， Ａｓｐ， Ｌｅｕ， Ｐｒｏ， ＳｅｒまたはＶａｌであり；
Ｘ５はＡｓｐ， Ｇｌｎ， Ｈｉｓ， Ｉｌｅ， Ｌｅｕ， Ｌｙｓ， Ｍｅｔ， ＰｈｅまたはＴｈｒであり；
Ｘ６はＨｉｓ， Ｉｌｅ， Ｌｅｕ， Ｍｅｔ， Ｐｈｅ， Ｐｒｏ， ＴｒｐまたはＴｙｒであり；
Ｘ７はＡｓｐ， Ｈｉｓ， ＬｅｕまたはＳｅｒであり；
Ｘ８はＡｌａ， Ａｒｇ， Ａｓｐ， Ｇｌｕ， Ｌｅｕ， Ｐｈｅ， ＰｒｏまたはＴｈｒであり；
Ｘ９はＡｌａ， Ａｒｇ， ＡｓｎまたはＬｅｕであり；
Ｘｌ０はＩｌｅ， Ｌｅｕ， Ｍｅｔ， Ｐｒｏ， ＳｅｒまたはＴｈｒであり；
Ｘ１１はＡｌａ， Ａｒｇ， Ａｓｎ， Ｇｌｙ， Ｈｉｓ， Ｌｙｓ， ＳｅｒまたはＴｙｒであり；
Ｘ１２はＡｌａ， Ａｒｇ， Ａｓｎ， Ｇｌｎ， Ｌｅｕ， Ｍｅｔ， Ｓｅｒ， Ｔｒｐ， ＴｙｒまたはＶａｌであり；
Ｘ１４はＡｓｐ， Ｇｌｙ， Ｌｅｕ， Ｐｈｅ， ＴｙｒまたはＶａｌであり；
Ｘ１５はＡｓｎ， Ｈｉｓ， Ｌｅｕ， ＰｒｏまたはＴｙｒであり；
Ｘ１６はＡｓｎ， Ａｓｐ， Ｈｉｓ， Ｐｈｅ， ＳｅｒまたはＴｙｒである）；
（Ｅ） Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｃｙｓ−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０−Ｘ１１−Ｘ１２−Ｘ１３−Ｘ１４−Ｃｙｓ−Ｘ１６−Ｘ１７−Ｘ１８ （配列番号５）
（式中、
Ｘ１はＡｒｇ， Ａｓｐ， Ｇｌｙ， Ｈｉｓ， Ｌｅｕ， Ｐｈｅ， Ｐｒｏ， Ｓｅｒ， Ｔｒｐ， Ｔｙｒであるか、または存在せず；
Ｘ２はＡｌａ， Ａｒｇ， Ａｓｎ， Ａｓｐ， Ｇｌｙ， Ｐｒｏ， Ｓｅｒであるか、または存在せず；
Ｘ３はＡｒｇ， Ａｓｎ， Ｇｌｎ， Ｇｌｕ， Ｇｌｙ， Ｌｙｓ， Ｍｅｔ， Ｐｒｏ， ＴｒｐまたはＶａｌであり；
Ｘ５はＡｒｇ， Ａｓｎ， Ｇｌｎ， Ｇｌｕ， Ｈｉｓ， Ｌｅｕ， Ｐｈｅ， Ｐｒｏ， Ｔｒｐ， ＴｙｒまたはＶａｌであり；
Ｘ６はＡｒｇ， Ａｓｐ， Ｇｌｎ， Ｇｌｙ， Ｉｌｅ， Ｌｙｓ， Ｐｈｅ， Ｔｈｒ， ＴｒｐまたはＴｙｒであり；
Ｘ７はＡｌａ， Ａｒｇ， Ａｓｐ， Ｇｌｕ， Ｇｌｙ， Ｌｅｕ， ＳｅｒまたはＴｙｒであり；
Ｘ８はＡｓｐ， Ｇｌｎ， Ｇｌｕ， Ｌｅｕ， Ｍｅｔ， Ｐｈｅ， Ｐｒｏ， ＳｅｒまたはＴｙｒであり；
Ｘ９はＡｓｐ， Ｌｅｕ， Ｐｒｏ， ＴｈｒまたはＶａｌであり；
Ｘ１０はＡｒｇ， Ｇｌｎ， Ｈｉｓ， Ｉｌｅ， Ｌｅｕ， Ｌｙｓ， Ｍｅｔ， Ｐｈｅ， Ｔｈｒ， ＴｒｐまたはＴｙｒであり；
Ｘ１１はＡｌａ， Ａｒｇ， Ａｓｎ， Ｇｌｎ， Ｇｌｕ， Ｈｉｓ， Ｌｅｕ， Ｌｙｓ， ＭｅｔまたはＴｈｒであり；
Ｘ１２はＡｌａ， Ａｓｎ， Ｇｌｎ， Ｇｌｙ， Ｌｅｕ， Ｌｙｓ， Ｐｈｅ， Ｐｒｏ， Ｔｈｒ， ＴｒｐまたはＴｙｒであり；
Ｘ１３はＡｌａ， Ａｒｇ， Ｇｌｎ， Ｈｉｓ， Ｌｙｓ， Ｍｅｔ， Ｐｈｅ， Ｐｒｏ， Ｔｈｒ， ＴｒｐまたはＴｙｒであり；
Ｘ１４はＡｒｇ， Ｇｌｎ， Ｇｌｕ， Ｇｌｙ， Ｈｉｓ， Ｌｅｕ， Ｍｅｔ， Ｐｈｅ， Ｐｒｏ， Ｓｅｒ， Ｔｈｒ， ＴｙｒまたはＶａｌであり；
Ｘ１６はＡｒｇ， Ａｓｐ， Ｇｌｙ， Ｈｉｓ， Ｌｙｓ， Ｍｅｔ， Ｐｈｅ， Ｐｒｏ， ＳｅｒまたはＴｒｐであり；
Ｘ１７はＡｒｇ， Ａｓｎ， Ａｓｐ， Ｇｌｙ， Ｈｉｓ， Ｐｈｅ， Ｐｒｏ， Ｓｅｒ， ＴｒｐまたはＴｙｒであり；
Ｘｌ８はＡｌａ， Ａｒｇ， Ａｓｎ， Ａｓｐ， Ｈｉｓ， Ｌｅｕ， ＰｈｅまたはＴｒｐである）；
（Ｆ） Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０−Ｘ１１−Ｘ１２ （配列番号６）
（式中、
Ｘ１はＡｌａ， Ａｒｇ， Ｇｌｙ， Ｈｉｓ， Ｌｅｕ， Ｌｙｓ， Ｍｅｔ， Ｐｈｅ， Ｔｒｐ， ＴｙｒまたはＶａｌであり；
Ｘ２はＡｌａ， Ａｒｇ， Ｇｌｎ， Ｈｉｓ， Ｉｌｅ， Ｌｅｕ， Ｐｈｅ， Ｔｈｒ， ＴｒｐまたはＴｙｒであり；
Ｘ３はＡｌａ， Ａｓｐ， Ｌｙｓ， Ｐｈｅ， Ｔｈｒ， ＴｒｐまたはＴｙｒであり；
Ｘ４はＡｒｇ， Ａｓｐ， Ｇｌｎ， Ｌｙｓ， Ｍｅｔ， Ｐｈｅ， Ｐｒｏ， Ｓｅｒ， ＴｙｒまたはＶａｌであり；
Ｘ５はＡｓｐ， Ｌｅｕ， Ｌｙｓ， Ｐｈｅ， Ｐｒｏ， ＳｅｒまたはＶａｌであり；
Ｘ６はＨｉｓ， Ｉｌｅ， Ｌｅｕ， Ｐｒｏ， ＳｅｒまたはＴｈｒであり；
Ｘ７はＡｒｇ， Ｇｌｙ， Ｈｉｓ， Ｌｅｕ， Ｌｙｓ， ＭｅｔまたはＴｈｒであり；
Ｘ８はＡｌａ， Ａｒｇ， Ａｓｎ， Ｉｌｅ， Ｌｅｕ， Ｌｙｓ， ＭｅｔまたはＴｈｒであり；
Ｘ９はＡｌａ， Ａｓｎ， Ａｒｇ， Ａｓｐ， Ｇｌｕ， Ｇｌｙ， Ｈｉｓ， Ｌｅｕ， Ｍｅｔ， Ｓｅｒ， Ｔｒｐ， ＴｙｒまたはＶａｌであり；
Ｘ１０はＩｌｅ， Ｌｅｕ， Ｐｈｅ， Ｓｅｒ， Ｔｈｒ， Ｔｒｐ， ＴｙｒまたはＶａｌであり；
ＸｌｌはＡｌａ， Ａｒｇ， Ｇｌｙ， Ｈｉｓ， Ｉｌｅ， Ｌｅｕ， Ｌｙｓ， Ｐｒｏ， Ｓｅｒ， Ｔｈｒ， Ｔｒｐ， ＴｙｒまたはＶａｌであり；
Ｘ１２はＡｒｇ， Ａｓｐ， Ｈｉｓ， Ｌｅｕ， Ｌｙｓ， Ｍｅｔ， Ｐｈｅ， Ｐｒｏ， Ｓｅｒ， Ｔｒｐ， ＴｙｒまたはＶａｌである）； または
（Ｇ） Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０−Ｘ１１−Ｘ１２−Ｘ１３ （配列番号７）
（式中、
Ｘ１はＡｓｐ， Ｇｌｎ， Ｇｌｕ， Ｇｌｙ， Ｈｉｓ， Ｌｙｓ， ＭｅｔまたはＴｒｐであり；
Ｘ２はＡｒｇ， Ｇｌｎ， Ｈｉｓ， Ｉｌｅ， ＬｅｕまたはＰｒｏであり；
Ｘ３はＡｓｐ， Ｇｌｙ， Ｉｌｅ， Ｌｙｓ， Ｔｈｒ， ＴｙｒまたはＶａｌであり；
Ｘ４はＡｓｎ， Ａｓｐ， Ｇｌｎ， Ｇｌｕ， Ｍｅｔ， Ｐｒｏ， ＳｅｒまたはＴｙｒであり；
Ｘ５はＡｓｎ， Ａｓｐ， Ｈｉｓ， Ｉｌｅ， Ｌｅｕ， Ｍｅｔ， Ｐｒｏ， ＴｈｒまたはＶａｌであり；
Ｘ６はＡｓｐ， Ｇｌｕ， Ｈｉｓ， Ｌｅｕ， Ｌｙｓ， ＰｒｏまたはＶａｌであり；
Ｘ７はＡｒｇ， Ａｓｎ， Ｇｌｎ， Ｈｉｓ， Ｉｌｅ， Ｌｅｕ， Ｍｅｔ， ＰｒｏまたはＴｈｒであり；
Ｘ８はＧｌｎ， Ｇｌｙ， Ｈｉｓ， Ｌｅｕ， Ｍｅｔ， ＳｅｒまたはＴｈｒであり；
Ｘ９はＡｓｎ， Ｇｌｎ， Ｇｌｙ， Ｈｉｓ， Ｌｅｕ， Ｌｙｓ， ＳｅｒまたはＴｈｒであり；
Ｘ１０はＡｌａ， Ｇｌｙ， Ｉｌｅ， Ｌｅｕ， Ｌｙｓ， ＭｅｔまたはＰｈｅであり；
Ｘ１１はＡｌａ， Ｇｌｕ， Ｈｉｓ， Ｉｌｅ， Ｌｅｕ， Ｍｅｔ， Ｓｅｒ， Ｔｈｒ， Ｔｒｐ， ＴｙｒまたはＶａｌであり；
Ｘ１２はＡｒｇ， Ｇｌｎ， Ｇｌｕ， Ｇｌｙ， Ｈｉｓ， Ｉｌｅ， Ｌｙｓ， ＴｙｒまたはＶａｌであり；
Ｘ１３はＡｒｇ， Ａｓｎ， Ｇｌｕ， Ｈｉｓ， Ｉｌｅ， Ｓｅｒ， Ｔｈｒ， ＴｒｐまたはＶａｌである）。
【請求項２３】
（ａ） 前記ポリペプチドが式：
Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｃｙｓ−Ｘ５−Ｐｈｅ−Ｘ７−Ｔｒｐ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−Ｘ１１−Ｘ１２−Ｘ１３ （配列番号１） のアミノ酸配列を含んでなり、下記のアミノ酸位置が独立して次のように選択される： Ｘ３がＬｙｓ； Ｘ５がＴｙｒ； Ｘ７がＰｒｏ； Ｘ１１がＡｌａ， Ｇｌｎ， Ｈｉｓ， ＰｈｅまたはＶａｌ； Ｘ１２がＡｓｎ， Ｇｌｎ， Ｇｌｙ， Ｈｉｓ， ＳｅｒまたはＶａｌ； Ｘ１３がＡｌａ， Ａｓｎ， Ｇｌｙ， Ｉｌｅ， ＰｒｏまたはＳｅｒ； またはそのような選択の組合せである；
（ｂ） 前記ポリペプチドが式：
Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｃｙｓ−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０−Ｃｙｓ−Ｘ１２−Ｘ１３−Ｘ１４ （配列番号２） のアミノ酸配列を含んでなり、下記のアミノ酸位置が独立して次のように選択される： Ｘ３がＡｓｐ； Ｘ５がＡｓｐまたはＬｅｕ； Ｘ６がＧｌｕまたはＬｅｕ； Ｘ７がＨｉｓまたはＬｅｕ； Ｘ８がＴｈｒまたはＰｒｏ； Ｘ９がＬｙｓ； またはそのような選択の組合せである；
（ｃ） 前記ポリペプチドが式：
Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｃｙｓ−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０−Ｘ１１−Ｃｙｓ−Ｘ１３−Ｘ１４−Ｘ１５ （配列番号３） のアミノ酸配列を含んでなり、下記のアミノ酸位置が独立して次のように選択される： Ｘ３がＡｌａ； Ｘ５がＡｓｐ； Ｘ６がＩｌｅ； Ｘ７がＶａｌまたはＬｅｕ； Ｘ８がＴｈｒ； Ｘ９がＬｅｕ； Ｘ１１がＳｅｒ； Ｘｌ３がＶａｌ； Ｘ１５がＧｌｕまたはＰｒｏ； またはそのような選択の組合せである；
（ｄ） 前記ポリペプチドが式：
Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｃｙｓ−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０−Ｘ１１−Ｘ１２−Ｃｙｓ−Ｘ１４−Ｘ１５−Ｘ１６ （配列番号４） のアミノ酸配列を含んでなり、下記のアミノ酸位置が独立して次のように選択される： Ｘ１がＳｅｒ； Ｘ２がＡｒｇ； Ｘ３がＡｓｎまたはＡｓｐ； Ｘ７がＡｓｐ； Ｘ８がＧｌｕまたはＰｒｏ； Ｘ９がＬｅｕ； Ｘ１０がＴｈｒ； Ｘ１４がＬｅｕ； Ｘ１５がＨｉｓ， ＬｅｕまたはＰｒｏ； Ｘ１６がＡｓｐまたはＳｅｒ； またはそのような選択の組合せである；
（ｅ） 前記ポリペプチドが式：
Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｃｙｓ−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０−Ｘ１１−Ｘ１２−Ｘ１３−Ｘ１４−Ｃｙｓ−Ｘ１６−Ｘ１７−Ｘ１８ （配列番号５） のアミノ酸配列を含んでなり、下記のアミノ酸位置が独立して次のように選択される： Ｘ１がＡｒｇ； Ｘ２がＡｓｎ， Ａｓｐ， ＧｌｙまたはＰｒｏ； Ｘ３がＧｌｙまたはＭｅｔ； Ｘ５がＴｒｐ， ＴｙｒまたはＶａｌ； Ｘ６がＡｓｐ； Ｘ７がＡｓｐ； Ｘ８がＬｅｕ； Ｘ９がＬｅｕまたはＴｈｒ； Ｘｌ０がＬｙｓまたはＴｈｒ； Ｘ１１がＡｒｇまたはＬｅｕ； Ｘ１２がＴｈｒまたはＴｒｐ； Ｘ１３がＭｅｔまたはＰｈｅ； Ｘ１４がＶａｌ； Ｘ１６がＭｅｔ； Ｘｌ７がＡｒｇ， ＨｉｓまたはＴｙｒ； Ｘ１８がＡｓｎまたはＨｉｓ； またはそのような選択の組合せである；
（ｆ） 前記ポリペプチドが式：
Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０−Ｘ１１−Ｘ１２ （配列番号６） のアミノ酸配列を含んでなり、下記のアミノ酸位置が独立して次のように選択される： Ｘ１がＧｌｙ， ＴｙｒまたはＶａｌ； Ｘ２がＨｉｓまたはＴｙｒ； Ｘ３がＡｓｐまたはＴｙｒ； Ｘ４がＡｓｐまたはＧｌｎ ； Ｘ５がＬｅｕまたはＳｅｒ； Ｘ６がＬｅｕまたはＴｈｒ； Ｘ７がＬｙｓまたはＴｈｒ； Ｘ８がＬｅｕまたはＬｙｓ； Ｘ９がＭｅｔまたはＳｅｒ； Ｘｌ０がＴｈｒまたはＬｅｕ； Ｘ１１がＰｒｏまたはＴｈｒ； Ｘ１２がＡｒｇまたはＰｒｏ； またはそのような選択の組合せである；
（ｇ） 前記ポリペプチドが式：
Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０−Ｘ１１−Ｘ１２−Ｘ１３ （配列番号７） のアミノ酸配列を含んでなり、下記のアミノ酸位置が独立して次のように選択される： Ｘ１がＧｌｕまたはＬｙｓ； Ｘ２がＨｉｓまたはＰｒｏ； Ｘ３がＴｙｒ； Ｘ４がＡｓｐまたはＧｌｎ； Ｘ５がＡｓｎまたはＴｈｒ； Ｘ６がＡｓｐまたはＰｒｏ； Ｘ７がＩｌｅまたはＰｒｏ； Ｘ８がＬｅｕまたはＴｈｒ； Ｘ９がＬｙｓ； Ｘｌ０がＧｌｙまたはＭｅｔ； Ｘ１１がＡｌａまたはＴｈｒ； Ｘ１２がＡｒｇまたはＨｉｓ； Ｘ１３がＨｉｓ； またはそのような選択の組合せである；
請求項２２に記載の組換えバクテリオファージ。
【請求項２４】
ＢＬｙＳまたはＢＬｙＳ様ポリペプチドを含むと予想される溶液中のＢＬｙＳまたはＢＬｙＳ様ポリペプチドを検出する方法であって、
（ａ） 該溶液に請求項１、９または１１に記載のポリペプチドを接触させること、
（ｂ） 該ポリペプチドとＢＬｙＳまたはＢＬｙＳ様ポリペプチドとの間に結合が起こっているか否かを調べること、
を含んでなる上記方法。
【請求項２５】
ＢＬｙＳまたはＢＬｙＳ様ポリペプチドを精製する方法であって、
（ａ） 固相支持体に請求項１、９または１１に記載のポリペプチドを固定化すること、
（ｂ） ＢＬｙＳまたはＢＬｙＳ様ポリペプチドを含む溶液を該支持体と接触させること、
（ｃ） 該溶液を該支持体から分離すること、
を含んでなる上記方法。
【請求項２６】
（ａ） クロマトグラフマトリックス材料、および、そこに固定化された、（ｂ） 請求項１、９または１１に記載のＢＬｙＳ結合性ポリペプチドを含むＢＬｙＳ結合性分子、を含んでなるＢＬｙＳ分離媒体。
【請求項２７】
（ａ） クロマトグラフマトリックス材料、および、そこに固定化された、（ｂ） 表１〜８および１４に示した配列番号２０〜１６２および１８６〜４３５からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むＢＬｙＳ結合性ポリペプチドを含むＢＬｙＳ結合性分子、を含んでなる、請求項２６に記載のＢＬｙＳ分離媒体。
【請求項２８】
ＢＬｙＳまたはＢＬｙＳ様ポリペプチドを、それを含有する溶液から分離する方法であって、
（ａ） 該溶液を請求項２６に記載の分離媒体と接触させること、
（ｂ） 結合してない物質を除くこと、
（ｃ） 結合したＢＬｙＳまたはＢＬｙＳ様ポリペプチドを該分離媒体から溶出すること、
を含んでなる上記方法。
【請求項２９】
アミノ酸配列： Ａｓｐ−Ｘａａ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ （配列番号４４６） （式中、ＸａａはＰｒｏ， Ｓｅｒ， Ｔｈｒ， Ｐｈｅ， Ｌｅｕ， Ｔｙｒ， ＣｙｓまたはＡｌａである）を含んでなるＢＬｙＳ結合性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項３０】
ＸａａがＰｒｏまたはＳｅｒである、請求項２９に記載のポリヌクレオチド。
【請求項３１】
前記ポリペプチドが次のアミノ酸配列：
Ｘｌ−Ｘ２−Ａｓｐ−Ｘ４−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｘ７−Ｌｅｕ−Ｘ９−Ｘｌ０ （配列番号４４８）
（式中、
Ｘ１はＴｒｐ， Ｇｌｕ， Ｌｙｓ， Ｃｙｓ， Ｌｅｕ， Ａｌａ， Ａｒｇ， ＧｌｙまたはＳｅｒであり；
Ｘ２はＴｙｒ， Ｐｈｅ， Ｇｌｕ， ＣｙｓまたはＡｓｎであり；
Ｘ４はＰｒｏ， Ｓｅｒ， Ｔｈｒ， Ｐｈｅ， Ｌｅｕ， Ｔｙｒ， ＣｙｓまたはＡｌａであり；
Ｘ７はＬｙｓ， Ａｓｎ， Ｇｌｎ， ＧｌｙまたはＡｒｇであり；
Ｘ９はＴｒｐ， Ｓｅｒ， Ｔｈｒ， Ａｒｇ， Ｃｙｓ， ＴｙｒまたはＬｙｓであり；
Ｘ１０はＬｅｕ， Ｐｈｅ， Ｖａｌ， ＩｌｅまたはＨｉｓである）
を含んでなる、請求項２９に記載のポリヌクレオチド。
【請求項３２】
前記ポリペプチドが次のアミノ酸配列：
Ｔｒｐ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ （配列番号４３６） を含んでなる、請求項３１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項３３】
前記ポリペプチドが次のアミノ酸配列：
Ａｌａ−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ａｓｐ−Ｘ６−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｘ９−Ｌｅｕ−Ｘｌｌ−Ｘｌ２−Ｘｌ３−Ｘｌ４ （配列番号４４７）
（式中、
Ｘ２はＡｒｇ以外の任意のアミノ酸であり；
Ｘ３はＴｒｐ， Ｇｌｕ， Ｌｙｓ， Ｃｙｓ， Ｌｅｕ， Ａｌａ， Ａｒｇ， ＧｌｙまたはＳｅｒであり；
Ｘ４はＴｙｒ， Ｐｈｅ， Ｇｌｕ， ＣｙｓまたはＡｓｎであり；
Ｘ６はＰｒｏ， Ｓｅｒ， Ｔｈｒ， Ｐｈｅ， Ｌｅｕ， Ｔｙｒ， ＣｙｓまたはＡｌａであり；
Ｘ９はＬｙｓ， Ａｓｎ， Ｇｌｎ， ＧｌｙまたはＡｒｇであり；
ＸｌｌはＴｒｐ， Ｓｅｒ， Ｔｈｒ， Ａｒｇ， Ｃｙｓ， ＴｙｒまたはＬｙｓであり；
Ｘｌ２はＬｅｕ， Ｐｈｅ， Ｖａｌ， ＩｌｅまたはＨｉｓであり；
Ｘ１３はＰｒｏ， Ｌｅｕ， Ｈｉｓ， Ｓｅｒ， Ａｒｇ， Ａｓｎ， Ｇｌｎ， Ｔｈｒ， Ｖａｌ， Ａｌａ， Ｃｙｓ， Ｉｌｅ， ＰｈｅまたはＴｙｒであり；
Ｘ１４はＡｓｐ， Ｇｌｕ， Ａｓｎ， Ｖａｌ， Ｈｉｓ， Ｇｌｎ， Ａｒｇ， Ｇｌｙ， Ｓｅｒ， Ｔｙｒ， Ａｌａ， Ｃｙｓ， Ｌｙｓ， Ｉｌｅ， ＴｈｒまたはＬｅｕである）
を含んでなる、請求項３１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項３４】
表１４に示した配列番号１８６〜４３５からなる群より選択されるアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドをコードする、請求項３１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項３５】
下記の式のＢＬｙＳ結合性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド：
（Ａ） Ｘｌ−Ｘ２−Ｘ３−Ｃｙｓ−Ｘ５−Ｐｈｅ−Ｘ７−Ｔｒｐ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−Ｘｌｌ−Ｘ１２−Ｘ１３ （配列番号１）
（式中、
Ｘ１はＡｌａ， Ａｓｎ， ＬｙｓまたはＳｅｒであり；
Ｘ２はＡｌａ， Ｇｌｕ， Ｍｅｔ， ＳｅｒまたはＶａｌであり；
Ｘ３はＡｌａ， Ａｓｎ， ＬｙｓまたはＰｒｏであり；
Ｘ５はＰｈｅ， ＴｒｐまたはＴｙｒであり；
Ｘ７はＰｒｏまたはＴｙｒであり；
Ｘ１１はＡｌａ， Ｇｌｎ， Ｈｉｓ， ＰｈｅまたはＶａｌであり；
Ｘ１２はＡｓｎ， Ｇｌｎ， Ｇｌｙ， Ｈｉｓ， ＳｅｒまたはＶａｌであり；
Ｘ１３はＡｌａ， Ａｓｎ， Ｇｌｙ， Ｉｌｅ， ＰｒｏまたはＳｅｒである）；
（Ｂ） Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｃｙｓ−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０−Ｃｙｓ−Ｘ１２−Ｘ１３−Ｘ１４ （配列番号２）
（式中、
Ｘ１はＡｌａ， Ａｓｐ， Ｇｌｎ， Ｇｌｕ， Ｇｌｙ， Ｈｉｓ， Ｉｌｅ， Ｌｅｕ， Ｌｙｓ， Ｍｅｔ， Ｐｈｅ， Ｐｒｏ， Ｓｅｒ， Ｔｈｒ， Ｔｒｐ， Ｔｙｒ， Ｖａｌであるか、または存在せず；
Ｘ２はＡｌａ， Ａｓｎ， Ａｓｐ， Ｇｌｎ， Ｇｌｙ， Ｈｉｓ， Ｉｌｅ， Ｌｅｕ， Ｌｙｓ， Ｍｅｔ， Ｐｈｅ， Ｐｒｏ， Ｓｅｒ， Ｔｈｒ， Ｔｒｐ， ＴｙｒまたはＶａｌであり；
Ｘ３はＡｌａ， Ａｒｇ， Ａｓｎ， Ａｓｐ， Ｇｌｎ， Ｇｌｕ， Ｇｌｙ， Ｈｉｓ， Ｉｌｅ， Ｌｅｕ， Ｌｙｓ， Ｍｅｔ， Ｐｈｅ， Ｐｒｏ， Ｓｅｒ， Ｔｒｐ， ＴｙｒまたはＶａｌであり；
Ｘ５はＡｓｐ， Ｉｌｅ， ＬｅｕまたはＴｙｒであり；
Ｘ６はＡｒｇ， Ａｓｐ， Ｇｌｕ， Ｈｉｓ， Ｉｌｅ， Ｌｅｕ， Ｌｙｓ， Ｐｈｅ， Ｐｒｏ， ＴｙｒまたはＶａｌであり；
Ｘ７はＨｉｓ， Ｌｅｕ， ＬｙｓまたはＰｈｅであり；
Ｘ８はＬｅｕ， ＰｒｏまたはＴｈｒであり；
Ｘ９はＡｒｇ， Ａｓｎ， Ｇｌｙ， Ｈｉｓ， Ｉｌｅ， Ｌｙｓ， ＭｅｔまたはＴｒｐであり；
Ｘ１０はＡｌａ， Ｇｌｎ， Ｇｌｕ， Ｇｌｙ， Ｈｉｓ， Ｉｌｅ， Ｌｅｕ， Ｍｅｔ， Ｐｈｅ， Ｓｅｒ， Ｔｒｐ， ＴｙｒまたはＶａｌであり；
Ｘｌ２はＡｓｐ， Ｇｌｎ， Ｇｌｕ， Ｇｌｙ， Ｉｌｅ， Ｌｅｕ， Ｌｙｓ， Ｐｈｅ， Ｓｅｒ， Ｔｒｐ， ＴｙｒまたはＶａｌであり；
Ｘ１３はＡｌａ， Ａｒｇ， Ａｓｎ， Ａｓｐ， Ｇｌｎ， Ｇｌｕ， Ｇｌｙ， Ｈｉｓ， Ｌｅｕ， Ｌｙｓ， Ｍｅｔ， Ｐｈｅ， Ｐｒｏ， Ｓｅｒ， Ｔｈｒ， Ｔｒｐ， ＴｙｒまたはＶａｌであり；
Ｘ１４はＡｌａ， Ａｒｇ， Ａｓｎ， Ａｓｐ， Ｇｌｎ， Ｇｌｕ， Ｇｌｙ， Ｈｉｓ， Ｉｌｅ， Ｌｅｕ， Ｌｙｓ， Ｐｈｅ， Ｐｒｏ， Ｔｒｐ， Ｔｙｒ， Ｖａｌであるか、または存在しない）；
（Ｃ） Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｃｙｓ−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０−Ｘ１１−Ｃｙｓ−Ｘ１３−Ｘ１４−Ｘ１５ （配列番号３）
（式中、
Ｘ１はＡｌａ， Ａｒｇ， Ａｓｎ， Ａｓｐ， Ｌｅｕ， Ｌｙｓ， Ｐｈｅ， Ｐｒｏ， ＳｅｒまたはＴｈｒであり；
Ｘ２はＡｓｎ， Ａｓｐ， Ｇｌｎ， Ｈｉｓ， Ｉｌｅ， Ｌｙｓ， Ｐｒｏ， ＴｈｒまたはＴｒｐであり；
Ｘ３はＡｌａ， Ａｒｇ， Ａｓｎ， Ｇｌｎ， Ｇｌｕ， Ｈｉｓ， Ｐｈｅ， ＰｒｏまたはＴｈｒであり；
Ｘ５はＡｓｎ， Ａｓｐ， Ｐｒｏ， ＳｅｒまたはＴｈｒであり；
Ｘ６はＡｒｇ， Ａｓｐ， Ｉｌｅ， Ｌｅｕ， Ｍｅｔ， ＰｒｏまたはＶａｌであり；
Ｘ７はＡｌａ， Ｉｌｅ， Ｌｅｕ， Ｐｒｏ， ＴｈｒまたはＶａｌであり；
Ｘ８はＡｓｎ， Ｈｉｓ， Ｉｌｅ， Ｌｅｕ， Ｌｙｓ， ＰｈｅまたはＴｈｒであり；
Ｘ９はＡｓｎ， Ｇｌｕ， Ｇｌｙ， Ｈｉｓ， Ｌｅｕ， Ｌｙｓ， Ｍｅｔ， ＰｒｏまたはＴｈｒであり；
Ｘ１０はＡｒｇ， Ａｓｎ， Ａｓｐ， Ｇｌｎ， Ｇｌｕ， Ｇｌｙ， Ｉｌｅ， Ｌｙｓ， Ｍｅｔ， Ｐｒｏ， ＳｅｒまたはＴｒｐであり；
Ｘ１１はＡｒｇ， Ｇｌｕ， Ｇｌｙ， Ｌｙｓ， Ｐｈｅ， Ｓｅｒ， ＴｒｐまたはＴｙｒであり；
Ｘ１３はＧｌｎ， Ｇｌｕ， Ｉｌｅ， Ｌｅｕ， Ｐｈｅ， Ｐｒｏ， Ｓｅｒ， ＴｙｒまたはＶａｌであり；
Ｘ１４はＡｓｎ， Ｇｌｙ， Ｉｌｅ， Ｐｈｅ， Ｐｒｏ， Ｔｈｒ， ＴｒｐまたはＴｙｒであり；
Ｘ１５はＡｓｎ， Ａｓｐ， Ｇｌｕ， Ｌｅｕ， Ｌｙｓ， Ｍｅｔ， ＰｒｏまたはＴｈｒである）；
（Ｄ） Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｃｙｓ−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０−Ｘ１１−Ｘ１２−Ｃｙｓ−Ｘ１４−Ｘ１５−Ｘ１６ （配列番号４）
（式中、
Ｘ１はＡｓｎ， Ａｓｐ， Ｈｉｓ， Ｌｅｕ， Ｐｈｅ， Ｐｒｏ， Ｓｅｒ， Ｔｙｒであるか、または存在せず；
Ｘ２はＡｒｇ， Ａｓｎ， Ａｓｐ， Ｈｉｓ， Ｐｈｅ， ＳｅｒまたはＴｒｐであり；
Ｘ３はＡｓｎ， Ａｓｐ， Ｌｅｕ， Ｐｒｏ， ＳｅｒまたはＶａｌであり；
Ｘ５はＡｓｐ， Ｇｌｎ， Ｈｉｓ， Ｉｌｅ， Ｌｅｕ， Ｌｙｓ， Ｍｅｔ， ＰｈｅまたはＴｈｒであり；
Ｘ６はＨｉｓ， Ｉｌｅ， Ｌｅｕ， Ｍｅｔ， Ｐｈｅ， Ｐｒｏ， ＴｒｐまたはＴｙｒであり；
Ｘ７はＡｓｐ， Ｈｉｓ， ＬｅｕまたはＳｅｒであり；
Ｘ８はＡｌａ， Ａｒｇ， Ａｓｐ， Ｇｌｕ， Ｌｅｕ， Ｐｈｅ， ＰｒｏまたはＴｈｒであり；
Ｘ９はＡｌａ， Ａｒｇ， ＡｓｎまたはＬｅｕであり；
Ｘｌ０はＩｌｅ， Ｌｅｕ， Ｍｅｔ， Ｐｒｏ， ＳｅｒまたはＴｈｒであり；
Ｘ１１はＡｌａ， Ａｒｇ， Ａｓｎ， Ｇｌｙ， Ｈｉｓ， Ｌｙｓ， ＳｅｒまたはＴｙｒであり；
Ｘ１２はＡｌａ， Ａｒｇ， Ａｓｎ， Ｇｌｎ， Ｌｅｕ， Ｍｅｔ， Ｓｅｒ， Ｔｒｐ， ＴｙｒまたはＶａｌであり；
Ｘ１４はＡｓｐ， Ｇｌｙ， Ｌｅｕ， Ｐｈｅ， ＴｙｒまたはＶａｌであり；
Ｘ１５はＡｓｎ， Ｈｉｓ， Ｌｅｕ， ＰｒｏまたはＴｙｒであり；
Ｘ１６はＡｓｎ， Ａｓｐ， Ｈｉｓ， Ｐｈｅ， ＳｅｒまたはＴｙｒである）；
（Ｅ） Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｃｙｓ−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０−Ｘ１１−Ｘ１２−Ｘ１３−Ｘ１４−Ｃｙｓ−Ｘ１６−Ｘ１７−Ｘ１８ （配列番号５）
（式中、
Ｘ１はＡｒｇ， Ａｓｐ， Ｇｌｙ， Ｈｉｓ， Ｌｅｕ， Ｐｈｅ， Ｐｒｏ， Ｓｅｒ， Ｔｒｐ， Ｔｙｒであるか、または存在せず；
Ｘ２はＡｌａ， Ａｒｇ， Ａｓｎ， Ａｓｐ， Ｇｌｙ， Ｐｒｏ， Ｓｅｒであるか、または存在せず；
Ｘ３はＡｒｇ， Ａｓｎ， Ｇｌｎ， Ｇｌｕ， Ｇｌｙ， Ｌｙｓ， Ｍｅｔ， Ｐｒｏ， ＴｒｐまたはＶａｌであり；
Ｘ５はＡｒｇ， Ａｓｎ， Ｇｌｎ， Ｇｌｕ， Ｈｉｓ， Ｌｅｕ， Ｐｈｅ， Ｐｒｏ， Ｔｒｐ， ＴｙｒまたはＶａｌであり；
Ｘ６はＡｒｇ， Ａｓｐ， Ｇｌｎ， Ｇｌｙ， Ｉｌｅ， Ｌｙｓ， Ｐｈｅ， Ｔｈｒ， ＴｒｐまたはＴｙｒであり；
Ｘ７はＡｌａ， Ａｒｇ， Ａｓｐ， Ｇｌｕ， Ｇｌｙ， Ｌｅｕ， ＳｅｒまたはＴｙｒであり；
Ｘ８はＡｓｐ， Ｇｌｎ， Ｇｌｕ， Ｌｅｕ， Ｍｅｔ， Ｐｈｅ， Ｐｒｏ， ＳｅｒまたはＴｙｒであり；
Ｘ９はＡｓｐ， Ｌｅｕ， Ｐｒｏ， ＴｈｒまたはＶａｌであり；
Ｘ１０はＡｒｇ， Ｇｌｎ， Ｈｉｓ， Ｉｌｅ， Ｌｅｕ， Ｌｙｓ， Ｍｅｔ， Ｐｈｅ， Ｔｈｒ， ＴｒｐまたはＴｙｒであり；
Ｘ１１はＡｌａ， Ａｒｇ， Ａｓｎ， Ｇｌｎ， Ｇｌｕ， Ｈｉｓ， Ｌｅｕ， Ｌｙｓ， ＭｅｔまたはＴｈｒであり；
Ｘ１２はＡｌａ， Ａｓｎ， Ｇｌｎ， Ｇｌｙ， Ｌｅｕ， Ｌｙｓ， Ｐｈｅ， Ｐｒｏ， Ｔｈｒ， ＴｒｐまたはＴｙｒであり；
Ｘ１３はＡｌａ， Ａｒｇ， Ｇｌｎ， Ｈｉｓ， Ｌｙｓ， Ｍｅｔ， Ｐｈｅ， Ｐｒｏ， Ｔｈｒ， ＴｒｐまたはＴｙｒであり；
Ｘ１４はＡｒｇ， Ｇｌｎ， Ｇｌｕ， Ｇｌｙ， Ｈｉｓ， Ｌｅｕ， Ｍｅｔ， Ｐｈｅ， Ｐｒｏ， Ｓｅｒ， Ｔｈｒ， ＴｙｒまたはＶａｌであり；
Ｘ１６はＡｒｇ， Ａｓｐ， Ｇｌｙ， Ｈｉｓ， Ｌｙｓ， Ｍｅｔ， Ｐｈｅ， Ｐｒｏ， ＳｅｒまたはＴｒｐであり；
Ｘ１７はＡｒｇ， Ａｓｎ， Ａｓｐ， Ｇｌｙ， Ｈｉｓ， Ｐｈｅ， Ｐｒｏ， Ｓｅｒ， ＴｒｐまたはＴｙｒであり；
Ｘｌ８はＡｌａ， Ａｒｇ， Ａｓｎ， Ａｓｐ， Ｈｉｓ， Ｌｅｕ， ＰｈｅまたはＴｒｐである）；
（Ｆ） Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０−Ｘ１１−Ｘ１２ （配列番号６）
（式中、
Ｘ１はＡｌａ， Ａｒｇ， Ｇｌｙ， Ｈｉｓ， Ｌｅｕ， Ｌｙｓ， Ｍｅｔ， Ｐｈｅ， Ｔｒｐ， ＴｙｒまたはＶａｌであり；
Ｘ２はＡｌａ， Ａｒｇ， Ｇｌｎ， Ｈｉｓ， Ｉｌｅ， Ｌｅｕ， Ｐｈｅ， Ｔｈｒ， ＴｒｐまたはＴｙｒであり；
Ｘ３はＡｌａ， Ａｓｐ， Ｌｙｓ， Ｐｈｅ， Ｔｈｒ， ＴｒｐまたはＴｙｒであり；
Ｘ４はＡｒｇ， Ａｓｐ， Ｇｌｎ， Ｌｙｓ， Ｍｅｔ， Ｐｈｅ， Ｐｒｏ， Ｓｅｒ， ＴｙｒまたはＶａｌであり；
Ｘ５はＡｓｐ， Ｌｅｕ， Ｌｙｓ， Ｐｈｅ， Ｐｒｏ， ＳｅｒまたはＶａｌであり；
Ｘ６はＨｉｓ， Ｉｌｅ， Ｌｅｕ， Ｐｒｏ， ＳｅｒまたはＴｈｒであり；
Ｘ７はＡｒｇ， Ｇｌｙ， Ｈｉｓ， Ｌｅｕ， Ｌｙｓ， ＭｅｔまたはＴｈｒであり；
Ｘ８はＡｌａ， Ａｒｇ， Ａｓｎ， Ｉｌｅ， Ｌｅｕ， Ｌｙｓ， ＭｅｔまたはＴｈｒであり；
Ｘ９はＡｌａ， Ａｓｎ， Ａｒｇ， Ａｓｐ， Ｇｌｕ， Ｇｌｙ， Ｈｉｓ， Ｌｅｕ， Ｍｅｔ， Ｓｅｒ， Ｔｒｐ， ＴｙｒまたはＶａｌであり；
Ｘ１０はＩｌｅ， Ｌｅｕ， Ｐｈｅ， Ｓｅｒ， Ｔｈｒ， Ｔｒｐ， ＴｙｒまたはＶａｌであり；
ＸｌｌはＡｌａ， Ａｒｇ， Ｇｌｙ， Ｈｉｓ， Ｉｌｅ， Ｌｅｕ， Ｌｙｓ， Ｐｒｏ， Ｓｅｒ， Ｔｈｒ， Ｔｒｐ， ＴｙｒまたはＶａｌであり；
Ｘ１２はＡｒｇ， Ａｓｐ， Ｈｉｓ， Ｌｅｕ， Ｌｙｓ， Ｍｅｔ， Ｐｈｅ， Ｐｒｏ， Ｓｅｒ， Ｔｒｐ， ＴｙｒまたはＶａｌである）；
（Ｇ） Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０−Ｘ１１−Ｘ１２−Ｘ１３ （配列番号７）
（式中、
Ｘ１はＡｓｐ， Ｇｌｎ， Ｇｌｕ， Ｇｌｙ， Ｈｉｓ， Ｌｙｓ， ＭｅｔまたはＴｒｐであり；
Ｘ２はＡｒｇ， Ｇｌｎ， Ｈｉｓ， Ｉｌｅ， ＬｅｕまたはＰｒｏであり；
Ｘ３はＡｓｐ， Ｇｌｙ， Ｉｌｅ， Ｌｙｓ， Ｔｈｒ， ＴｙｒまたはＶａｌであり；
Ｘ４はＡｓｎ， Ａｓｐ， Ｇｌｎ， Ｇｌｕ， Ｍｅｔ， Ｐｒｏ， ＳｅｒまたはＴｙｒであり；
Ｘ５はＡｓｎ， Ａｓｐ， Ｈｉｓ， Ｉｌｅ， Ｌｅｕ， Ｍｅｔ， Ｐｒｏ， ＴｈｒまたはＶａｌであり；
Ｘ６はＡｓｐ， Ｇｌｕ， Ｈｉｓ， Ｌｅｕ， Ｌｙｓ， ＰｒｏまたはＶａｌであり；
Ｘ７はＡｒｇ， Ａｓｎ， Ｇｌｎ， Ｈｉｓ， Ｉｌｅ， Ｌｅｕ， Ｍｅｔ， ＰｒｏまたはＴｈｒであり；
Ｘ８はＧｌｎ， Ｇｌｙ， Ｈｉｓ， Ｌｅｕ， Ｍｅｔ， ＳｅｒまたはＴｈｒであり；
Ｘ９はＡｓｎ， Ｇｌｎ， Ｇｌｙ， Ｈｉｓ， Ｌｅｕ， Ｌｙｓ， ＳｅｒまたはＴｈｒであり；
Ｘ１０はＡｌａ， Ｇｌｙ， Ｉｌｅ， Ｌｅｕ， Ｌｙｓ， ＭｅｔまたはＰｈｅであり；
Ｘ１１はＡｌａ， Ｇｌｕ， Ｈｉｓ， Ｉｌｅ， Ｌｅｕ， Ｍｅｔ， Ｓｅｒ， Ｔｈｒ， Ｔｒｐ， ＴｙｒまたはＶａｌであり；
Ｘ１２はＡｒｇ， Ｇｌｎ， Ｇｌｕ， Ｇｌｙ， Ｈｉｓ， Ｉｌｅ， Ｌｙｓ， ＴｙｒまたはＶａｌであり；
Ｘ１３はＡｒｇ， Ａｓｎ， Ｇｌｕ， Ｈｉｓ， Ｉｌｅ， Ｓｅｒ， Ｔｈｒ， ＴｒｐまたはＶａｌである）。
【請求項３６】
ＢＬｙＳ標的のための結合性分子を同定する方法であって、請求項１、９または１１に記載のＢＬｙＳ結合性ポリペプチドを利用してＢＬｙＳまたはＢＬｙＳ様ポリペプチドとの複合体を形成させ、該複合体を１種以上の潜在的ＢＬｙＳ標的結合性分子と接触させ、該１種以上の潜在的ＢＬｙＳ標的結合性分子がＢＬｙＳ結合性ポリペプチドと競合して該ＢＬｙＳまたはＢＬｙＳ様ポリペプチドとの複合体を形成するか否かを判定する、各ステップを含んでなる上記方法。
【請求項３７】
少なくとも１０３のポリペプチドの集団から構成され、該集団のポリペプチドが次のアミノ酸配列：
Ａｌａ−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ａｓｐ−Ｘ６−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｘ９−Ｌｅｕ−Ｘ１１−Ｘ１２−Ｘ１３−Ｘ１４ （配列番号４４９）
（式中、
Ｘ２は任意のアミノ酸であり；
Ｘ３は任意のアミノ酸であり；
Ｘ４は任意のアミノ酸であり；
Ｘ６は任意のアミノ酸であり；
Ｘ９は任意のアミノ酸であり；
Ｘ１１は任意のアミノ酸であり；
Ｘ１２は任意のアミノ酸であり；
Ｘ１３は任意のアミノ酸であり；
Ｘ１４は任意のアミノ酸である）
を含んでなる、ＢＬｙＳ親和性成熟ライブラリー。
【請求項３８】
次の配列：
ＧＣＴ ＮＮＮ ＮＮＮ ＮＮＮ ＧＡＴ ＮＮＮ ＣＴＴ ＡＣＴ ＮＮＮ ＣＴＣ ＮＮＮ ＮＮＮ ＮＮＮ ＮＮＮ （配列番号１８５）
を含んでなる、多様なＢＬｙＳ結合性ポリペプチドをコードするＤＮＡ鋳型。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の利用分野
本発明は、Ｂリンパ球刺激因子タンパク質（ＢＬｙＳ）と結合するポリペプチドに関する。そのようなポリペプチドは、例えば、ＢＬｙＳの検出、単離および／または精製に使用することができる。本発明はまた、これらのＢＬｙＳ結合性ポリペプチドをコードする核酸分子、これらの核酸を含有するベクターおよび宿主細胞、ならびに該ポリペプチドの産生方法に関する。
【０００２】
発明の背景
Ｂリンパ球刺激因子（ＢＬｙＳ）は腫瘍壊死因子（「ＴＮＦ」）スーパーファミリーのメンバーであり、ｉｎ ｖｉｖｏでもｉｎ ｖｉｔｒｏでもＢ細胞の増殖と分化を誘導する（Ｍｏｏｒｅら， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２８５：２６０−２６３ （１９９９））。ＢＬｙＳは、その単球特異的な遺伝子およびタンパク質発現パターンならびにＢリンパ球へのその特異的受容体分布および生物学的活性により、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ２７Ｌ（ＣＤ７０）などの他のＢ細胞増殖・分化因子と区別される。ＢＬｙＳ発現はナチュラルキラー（「ＮＫ」）細胞、Ｔ細胞またはＢ細胞上には検出されず、骨髄由来の細胞に限られる。休止している単球でのＢＬｙＳの発現はインターフェロンγ（ＩＦＮγ）によりアップレギュレートされる。ＢＬｙＳをコードする遺伝子は染色体１３ｑ３４にすでにマップされている。
【０００３】
ＢＬｙＳは２８５アミノ酸からなるタイプＩＩ膜結合型ポリペプチドおよび１５２アミノ酸からなる可溶性ポリペプチドとして発現される（Ｍｏｏｒｅら， １９９９， 前掲）。膜結合型のＢＬｙＳはアミノ酸残基４７および７３間にわたる推定上の膜貫通ドメインをもつ。可溶型のＢＬｙＳのＮＨ２末端は膜結合型のＢＬｙＳのＡｌａ１３４で始まる。可溶型と膜結合型のどちらのタンパク質もホモ三量体を形成している。可溶性の組換えＢＬｙＳは、マウス脾性Ｂ細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ増殖を誘導し、かつこれらの細胞上の細胞表面受容体と結合することが見出されている（Ｍｏｏｒｅら， １９９９， 前掲）。可溶性ＢＬｙＳをマウスに投与すると、ＣＤ４５Ｒｄｕｌｌ、Ｌｙ６Ｄｂｒｉｇｈｔ（ＴｈＢとしても知られる）Ｂ細胞の割合が増加し、また、血清ＩｇＭおよびＩｇＡレベルも増加することがわかった（Ｍｏｏｒｅら， １９９９， 前掲）。こうして、ＢＬｙＳはその受容体分布においても生物学的活性においてもＢ細胞向性を示す。
【０００４】
その発現パターンと生物学的活性に基づき、ＢＬｙＳはＢ細胞と単球または分化したその子孫との間のシグナル交換に関与していると提案された。ＢＬｙＳ受容体およびリガンドの制限された発現パターンからは、ＢＬｙＳは、Ｔ細胞依存的抗原活性化におけるＣＤ４０およびＣＤ４０Ｌと同様の様式で、Ｔ細胞非依存的応答の調節因子として機能しうることが示唆される。
【０００５】
したがって、ＢＬｙＳと特異的に結合する分子は、ＢＬｙＳサイトカインの研究において、商業量および医学的に純粋な量でのＢＬｙＳの製造・精製において、また、新しい治療薬と診断薬の開発において、様々な用途を見出すであろう。
【０００６】
発明の概要
本発明は、Ｂリンパ球刺激因子タンパク質（ＢＬｙＳ）および／またはＢＬｙＳ様ポリペプチドと特異的に結合する新規なポリペプチドおよびポリペプチドのファミリーを提供する。特に、本発明は、ヒトＢＬｙＳ（配列番号１７３および／または１７４）またはヒト単球上に発現されるＢＬｙＳ；マウスＢＬｙＳ（配列番号１７５および／または１７６）またはマウス単球上に発現されるＢＬｙＳ；ラットＢＬｙＳ（配列番号１７７、１７８、１７９および／または１８０に示される可溶型、あるいは、例えばラット単球の表面にある、膜結合型のいずれか）；またはサルＢＬｙＳ（例えば、配列番号１８１および／または１８２のサルＢＬｙＳポリペプチド、可溶型のサルＢＬｙＳ、またはサル単球上に発現されるＢＬｙＳ）、好ましくはヒトＢＬｙＳ、のポリペプチドもしくはポリペプチド断片と特異的に結合するポリペプチドを包含する。
【０００７】
特定の好ましい実施形態において、本発明のＢＬｙＳ結合性ポリペプチドは高い親和性でもってＢＬｙＳおよび／またはＢＬｙＳ様ポリペプチドと結合する。他の実施形態では、本発明のＢＬｙＳ結合性ポリペプチドはＢＬｙＳおよび／またはＢＬｙＳ様ポリペプチドと可逆的に結合する。さらに別の実施形態では、本発明のＢＬｙＳ結合性ポリペプチドはＢＬｙＳおよび／またはＢＬｙＳ様ポリペプチドと不可逆的に結合する。
【０００８】
本発明に従う特定のポリペプチドに含まれるシステイン残基はジスルフィド結合を形成すると考えられ、このジスルフィド結合のため、これらのシステイン残基を含むポリペプチドは非還元条件下で安定したループ構造を形成するだろう。本発明の特に好適なＢＬｙＳ結合性ポリペプチドは、ＢＬｙＳまたはＢＬｙＳ様ポリペプチドと結合する安定したループ構造やその他の構造を形成するアミノ酸配列を含むポリペプチド分子である。
【０００９】
特定の実施形態において、本発明は、配列番号１〜１２、２０〜１７２、および１８６〜４４４（好ましくは、上記した、また、表１〜８、１４、１５ならびに下記の実施例２、５、６に記載する配列番号１６３〜１７２または４３６〜４４４）からなる群より選択されるアミノ酸配列を含んでなる、あるいは、からなるＢＬｙＳ結合性ポリペプチドに関する。ここに記載する単離されたＢＬｙＳ結合性ポリペプチドの配列の解析は、テトラペプチドＡｓｐ−Ｘａａ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ （配列番号４４６）を含むポリペプチドについての強い選択を示し、それゆえに、最も広範な形態において、本発明は、ポリペプチドＡｓｐ−Ｘａａ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ （配列番号４４６） （式中、ＸａａはＰｒｏ， Ｓｅｒ， Ｔｈｒ， Ｐｈｅ， Ｌｅｕ， Ｔｙｒ， ＣｙｓまたはＡｌａであり、好ましくは、ＰｒｏまたはＳｅｒである）を含んでなる、ＢＬｙＳと結合可能なポリペプチドに関する。
【００１０】
表１〜８に示した特定のＢＬｙＳ結合性ポリペプチドに基づいて、７つのコンセンサス配列（配列番号１〜７）が決定された。特定の実施形態では、本発明のＢＬｙＳ結合性ポリペプチドはこれらの配列を１つ以上含んでなる。そのような好適なＢＬｙＳ結合性ポリペプチドには、不変のＣｙｓ残基間で環状構造またはループ構造を形成する可能性があり、下記のＡ〜Ｅ（配列番号１〜５）から選択されるアミノ酸配列を含んでなる、あるいは、からなるポリペプチドが含まれる：
（Ａ） Ｘｌ−Ｘ２−Ｘ３−Ｃｙｓ−Ｘ５−Ｐｈｅ−Ｘ７−Ｔｒｐ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−Ｘｌｌ−Ｘ１２−Ｘ１３ （配列番号１）
（式中、
Ｘ１はＡｌａ， Ａｓｎ， ＬｙｓまたはＳｅｒであり；
Ｘ２はＡｌａ， Ｇｌｕ， Ｍｅｔ， ＳｅｒまたはＶａｌであり；
Ｘ３はＡｌａ， Ａｓｎ， ＬｙｓまたはＰｒｏ（好ましくは、Ｌｙｓ）であり；
Ｘ５はＰｈｅ， ＴｒｐまたはＴｙｒ（好ましくは、Ｔｙｒ）であり；
Ｘ７はＰｒｏまたはＴｙｒ（好ましくは、Ｐｒｏ）であり；
Ｘ１１はＡｌａ， Ｇｌｎ， Ｈｉｓ， ＰｈｅまたはＶａｌであり；
Ｘ１２はＡｓｎ， Ｇｌｎ， Ｇｌｙ， Ｈｉｓ， ＳｅｒまたはＶａｌであり；
Ｘ１３はＡｌａ， Ａｓｎ， Ｇｌｙ， Ｉｌｅ， ＰｒｏまたはＳｅｒである）；
ただし、該ポリペプチドはＢＬｙＳおよび／またはＢＬｙＳ様ポリペプチドと結合する；
【００１１】
（Ｂ） Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｃｙｓ−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０−Ｃｙｓ−Ｘ１２−Ｘ１３−Ｘ１４ （配列番号２）
（式中、
Ｘ１はＡｌａ， Ａｓｐ， Ｇｌｎ， Ｇｌｕ， Ｇｌｙ， Ｈｉｓ， Ｉｌｅ， Ｌｅｕ， Ｌｙｓ， Ｍｅｔ， Ｐｈｅ， Ｐｒｏ， Ｓｅｒ， Ｔｈｒ， Ｔｒｐ， Ｔｙｒ， Ｖａｌであるか、または存在せず；
Ｘ２はＡｌａ， Ａｓｎ， Ａｓｐ， Ｇｌｎ， Ｇｌｙ， Ｈｉｓ， Ｉｌｅ， Ｌｅｕ， Ｌｙｓ， Ｍｅｔ， Ｐｈｅ， Ｐｒｏ， Ｓｅｒ， Ｔｈｒ， Ｔｒｐ， ＴｙｒまたはＶａｌであり；
Ｘ３はＡｌａ， Ａｒｇ， Ａｓｎ， Ａｓｐ， Ｇｌｎ， Ｇｌｕ， Ｇｌｙ， Ｈｉｓ， Ｉｌｅ， Ｌｅｕ， Ｌｙｓ， Ｍｅｔ， Ｐｈｅ， Ｐｒｏ， Ｓｅｒ， Ｔｒｐ， ＴｙｒまたはＶａｌ（好ましくは、Ａｓｐ）であり；
Ｘ５はＡｓｐ， Ｉｌｅ， ＬｅｕまたはＴｙｒ（好ましくは、ＡｓｐまたはＬｅｕ）であり；
Ｘ６はＡｒｇ， Ａｓｐ， Ｇｌｕ， Ｈｉｓ， Ｉｌｅ， Ｌｅｕ， Ｌｙｓ， Ｐｈｅ， Ｐｒｏ， ＴｙｒまたはＶａｌ（好ましくは、ＧｌｕまたはＬｅｕ）であり；
Ｘ７はＨｉｓ， Ｌｅｕ， ＬｙｓまたはＰｈｅ（好ましくは、ＨｉｓまたはＬｅｕ）であり；
Ｘ８はＬｅｕ， ＰｒｏまたはＴｈｒ（好ましくは、ＴｈｒまたはＰｒｏ）であり；
Ｘ９はＡｒｇ， Ａｓｎ， Ｇｌｙ， Ｈｉｓ， Ｉｌｅ， Ｌｙｓ， ＭｅｔまたはＴｒｐ（好ましくは、Ｌｙｓ）であり；
Ｘ１０はＡｌａ， Ｇｌｎ， Ｇｌｕ， Ｇｌｙ， Ｈｉｓ， Ｉｌｅ， Ｌｅｕ， Ｍｅｔ， Ｐｈｅ， Ｓｅｒ， Ｔｒｐ， ＴｙｒまたはＶａｌであり；
Ｘｌ２はＡｓｐ， Ｇｌｎ， Ｇｌｕ， Ｇｌｙ， Ｉｌｅ， Ｌｅｕ， Ｌｙｓ， Ｐｈｅ， Ｓｅｒ， Ｔｒｐ， ＴｙｒまたはＶａｌであり；
Ｘ１３はＡｌａ， Ａｒｇ， Ａｓｎ， Ａｓｐ， Ｇｌｎ， Ｇｌｕ， Ｇｌｙ， Ｈｉｓ， Ｌｅｕ， Ｌｙｓ， Ｍｅｔ， Ｐｈｅ， Ｐｒｏ， Ｓｅｒ， Ｔｈｒ， Ｔｒｐ， ＴｙｒまたはＶａｌであり；
Ｘ１４はＡｌａ， Ａｒｇ， Ａｓｎ， Ａｓｐ， Ｇｌｎ， Ｇｌｕ， Ｇｌｙ， Ｈｉｓ， Ｉｌｅ， Ｌｅｕ， Ｌｙｓ， Ｐｈｅ， Ｐｒｏ， Ｔｒｐ， Ｔｙｒ， Ｖａｌであるか、または存在しない）；
ただし、該ポリペプチドはＢＬｙＳおよび／またはＢＬｙＳ様ポリペプチドと結合する；
【００１２】
（Ｃ） Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｃｙｓ−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０−Ｘ１１−Ｃｙｓ−Ｘ１３−Ｘ１４−Ｘ１５ （配列番号３）
（式中、
Ｘ１はＡｌａ， Ａｒｇ， Ａｓｎ， Ａｓｐ， Ｌｅｕ， Ｌｙｓ， Ｐｈｅ， Ｐｒｏ， ＳｅｒまたはＴｈｒであり；
Ｘ２はＡｓｎ， Ａｓｐ， Ｇｌｎ， Ｈｉｓ， Ｉｌｅ， Ｌｙｓ， Ｐｒｏ， ＴｈｒまたはＴｒｐであり；
Ｘ３はＡｌａ， Ａｒｇ， Ａｓｎ， Ｇｌｎ， Ｇｌｕ， Ｈｉｓ， Ｐｈｅ， ＰｒｏまたはＴｈｒ（好ましくは、Ａｌａ）であり；
Ｘ５はＡｓｎ， Ａｓｐ， Ｐｒｏ， ＳｅｒまたはＴｈｒ（好ましくは、Ａｓｐ）であり；
Ｘ６はＡｒｇ， Ａｓｐ， Ｉｌｅ， Ｌｅｕ， Ｍｅｔ， ＰｒｏまたはＶａｌ（好ましくは、Ｉｌｅ）であり；
Ｘ７はＡｌａ， Ｉｌｅ， Ｌｅｕ， Ｐｒｏ， ＴｈｒまたはＶａｌ（好ましくは、ＶａｌまたはＬｅｕ）であり；
Ｘ８はＡｓｎ， Ｈｉｓ， Ｉｌｅ， Ｌｅｕ， Ｌｙｓ， ＰｈｅまたはＴｈｒ（好ましくは、Ｔｈｒ）であり；
Ｘ９はＡｓｎ， Ｇｌｕ， Ｇｌｙ， Ｈｉｓ， Ｌｅｕ， Ｌｙｓ， Ｍｅｔ， ＰｒｏまたはＴｈｒ（好ましくは、Ｌｅｕ）であり；
Ｘ１０はＡｒｇ， Ａｓｎ， Ａｓｐ， Ｇｌｎ， Ｇｌｕ， Ｇｌｙ， Ｉｌｅ， Ｌｙｓ， Ｍｅｔ， Ｐｒｏ， ＳｅｒまたはＴｒｐであり；
Ｘ１１はＡｒｇ， Ｇｌｕ， Ｇｌｙ， Ｌｙｓ， Ｐｈｅ， Ｓｅｒ， ＴｒｐまたはＴｙｒ（好ましくは、Ｓｅｒ）であり；
Ｘ１３はＧｌｎ， Ｇｌｕ， Ｉｌｅ， Ｌｅｕ， Ｐｈｅ， Ｐｒｏ， Ｓｅｒ， ＴｙｒまたはＶａｌ（好ましくは、Ｖａｌ）であり；
Ｘ１４はＡｓｎ， Ｇｌｙ， Ｉｌｅ， Ｐｈｅ， Ｐｒｏ， Ｔｈｒ， ＴｒｐまたはＴｙｒであり；
Ｘ１５はＡｓｎ， Ａｓｐ， Ｇｌｕ， Ｌｅｕ， Ｌｙｓ， Ｍｅｔ， ＰｒｏまたはＴｈｒ（好ましくは、ＧｌｕまたはＰｒｏ）である）；
ただし、該ポリペプチドはＢＬｙＳおよび／またはＢＬｙＳ様ポリペプチドと結合する；
【００１３】
（Ｄ） Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｃｙｓ−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０−Ｘ１１−Ｘ１２−Ｃｙｓ−Ｘ１４−Ｘ１５−Ｘ１６ （配列番号４）
（式中、
Ｘ１はＡｓｎ， Ａｓｐ， Ｈｉｓ， Ｌｅｕ， Ｐｈｅ， Ｐｒｏ， Ｓｅｒ， Ｔｙｒであるか、または存在せず（好ましくは、Ｓｅｒ）；
Ｘ２はＡｒｇ， Ａｓｎ， Ａｓｐ， Ｈｉｓ， Ｐｈｅ， ＳｅｒまたはＴｒｐ（好ましくは、Ａｒｇ）であり；
Ｘ３はＡｓｎ， Ａｓｐ， Ｌｅｕ， Ｐｒｏ， ＳｅｒまたはＶａｌ（好ましくは、ＡｓｎまたはＡｓｐ）であり；
Ｘ５はＡｓｐ， Ｇｌｎ， Ｈｉｓ， Ｉｌｅ， Ｌｅｕ， Ｌｙｓ， Ｍｅｔ， ＰｈｅまたはＴｈｒであり；
Ｘ６はＨｉｓ， Ｉｌｅ， Ｌｅｕ， Ｍｅｔ， Ｐｈｅ， Ｐｒｏ， ＴｒｐまたはＴｙｒであり；
Ｘ７はＡｓｐ， Ｈｉｓ， ＬｅｕまたはＳｅｒ（好ましくは、Ａｓｐ）であり；
Ｘ８はＡｌａ， Ａｒｇ， Ａｓｐ， Ｇｌｕ， Ｌｅｕ， Ｐｈｅ， ＰｒｏまたはＴｈｒ（好ましくは、ＧｌｕまたはＰｒｏ）であり；
Ｘ９はＡｌａ， Ａｒｇ， ＡｓｎまたはＬｅｕ（好ましくは、Ｌｅｕ）であり；
Ｘｌ０はＩｌｅ， Ｌｅｕ， Ｍｅｔ， Ｐｒｏ， ＳｅｒまたはＴｈｒ（好ましくは、Ｔｈｒ）であり；
Ｘ１１はＡｌａ， Ａｒｇ， Ａｓｎ， Ｇｌｙ， Ｈｉｓ， Ｌｙｓ， ＳｅｒまたはＴｙｒであり；
Ｘ１２はＡｌａ， Ａｒｇ， Ａｓｎ， Ｇｌｎ， Ｌｅｕ， Ｍｅｔ， Ｓｅｒ， Ｔｒｐ， ＴｙｒまたはＶａｌであり；
Ｘ１４はＡｓｐ， Ｇｌｙ， Ｌｅｕ， Ｐｈｅ， ＴｙｒまたはＶａｌ（好ましくは、Ｌｅｕ）であり；
Ｘ１５はＡｓｎ， Ｈｉｓ， Ｌｅｕ， ＰｒｏまたはＴｙｒ（好ましくは、Ｈｉｓ、ＬｅｕまたはＰｒｏ）であり；
Ｘ１６はＡｓｎ， Ａｓｐ， Ｈｉｓ， Ｐｈｅ， ＳｅｒまたはＴｙｒ（好ましくは、ＡｓｐまたはＳｅｒ）である）；
ただし、該ポリペプチドはＢＬｙＳおよび／またはＢＬｙＳ様ポリペプチドと結合する；
【００１４】
（Ｅ） Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｃｙｓ−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０−Ｘ１１−Ｘ１２−Ｘ１３−Ｘ１４−Ｃｙｓ−Ｘ１６−Ｘ１７−Ｘ１８ （配列番号５）
（式中、
Ｘ１はＡｒｇ， Ａｓｐ， Ｇｌｙ， Ｈｉｓ， Ｌｅｕ， Ｐｈｅ， Ｐｒｏ， Ｓｅｒ， Ｔｒｐ， Ｔｙｒであるか、または存在せず（好ましくは、Ａｒｇ）；
Ｘ２はＡｌａ， Ａｒｇ， Ａｓｎ， Ａｓｐ， Ｇｌｙ， Ｐｒｏ， Ｓｅｒであるか、または存在せず（好ましくは、Ａｓｎ、Ａｓｐ、ＧｌｙまたはＰｒｏ）；
Ｘ３はＡｒｇ， Ａｓｎ， Ｇｌｎ， Ｇｌｕ， Ｇｌｙ， Ｌｙｓ， Ｍｅｔ， Ｐｒｏ， ＴｒｐまたはＶａｌ（好ましくは、ＧｌｙまたはＭｅｔ）であり；
Ｘ５はＡｒｇ， Ａｓｎ， Ｇｌｎ， Ｇｌｕ， Ｈｉｓ， Ｌｅｕ， Ｐｈｅ， Ｐｒｏ， Ｔｒｐ， ＴｙｒまたはＶａｌ（好ましくは、Ｔｒｐ、ＴｙｒまたはＶａｌ）であり；
Ｘ６はＡｒｇ， Ａｓｐ， Ｇｌｎ， Ｇｌｙ， Ｉｌｅ， Ｌｙｓ， Ｐｈｅ， Ｔｈｒ， ＴｒｐまたはＴｙｒ（好ましくは、Ａｓｐ）であり；
Ｘ７はＡｌａ， Ａｒｇ， Ａｓｐ， Ｇｌｕ， Ｇｌｙ， Ｌｅｕ， ＳｅｒまたはＴｙｒ（好ましくは、Ａｓｐ）であり；
Ｘ８はＡｓｐ， Ｇｌｎ， Ｇｌｕ， Ｌｅｕ， Ｍｅｔ， Ｐｈｅ， Ｐｒｏ， ＳｅｒまたはＴｙｒ（好ましくは、Ｌｅｕ）であり；
Ｘ９はＡｓｐ， Ｌｅｕ， Ｐｒｏ， ＴｈｒまたはＶａｌ（好ましくは、ＬｅｕまたはＴｈｒ）であり；
Ｘ１０はＡｒｇ， Ｇｌｎ， Ｈｉｓ， Ｉｌｅ， Ｌｅｕ， Ｌｙｓ， Ｍｅｔ， Ｐｈｅ， Ｔｈｒ， ＴｒｐまたはＴｙｒ（好ましくは、ＬｙｓまたはＴｈｒ）であり；
Ｘ１１はＡｌａ， Ａｒｇ， Ａｓｎ， Ｇｌｎ， Ｇｌｕ， Ｈｉｓ， Ｌｅｕ， Ｌｙｓ， ＭｅｔまたはＴｈｒ（好ましくは、ＡｒｇまたはＬｅｕ）であり；
Ｘ１２はＡｌａ， Ａｓｎ， Ｇｌｎ， Ｇｌｙ， Ｌｅｕ， Ｌｙｓ， Ｐｈｅ， Ｐｒｏ， Ｔｈｒ， ＴｒｐまたはＴｙｒ（好ましくは、ＴｈｒまたはＴｒｐ）であり；
Ｘ１３はＡｌａ， Ａｒｇ， Ｇｌｎ， Ｈｉｓ， Ｌｙｓ， Ｍｅｔ， Ｐｈｅ， Ｐｒｏ， Ｔｈｒ， ＴｒｐまたはＴｙｒ（好ましくは、ＭｅｔまたはＰｈｅ）であり；
Ｘ１４はＡｒｇ， Ｇｌｎ， Ｇｌｕ， Ｇｌｙ， Ｈｉｓ， Ｌｅｕ， Ｍｅｔ， Ｐｈｅ， Ｐｒｏ， Ｓｅｒ， Ｔｈｒ， ＴｙｒまたはＶａｌ（好ましくは、Ｖａｌ）であり；
Ｘ１６はＡｒｇ， Ａｓｐ， Ｇｌｙ， Ｈｉｓ， Ｌｙｓ， Ｍｅｔ， Ｐｈｅ， Ｐｒｏ， ＳｅｒまたはＴｒｐ（好ましくは、Ｍｅｔ）であり；
Ｘ１７はＡｒｇ， Ａｓｎ， Ａｓｐ， Ｇｌｙ， Ｈｉｓ， Ｐｈｅ， Ｐｒｏ， Ｓｅｒ， ＴｒｐまたはＴｙｒ（好ましくは、Ａｒｇ、ＨｉｓまたはＴｙｒ）であり；
Ｘｌ８はＡｌａ， Ａｒｇ， Ａｓｎ， Ａｓｐ， Ｈｉｓ， Ｌｅｕ， ＰｈｅまたはＴｒｐ（好ましくは、ＨｉｓまたはＡｓｎ）である）；
ただし、該ポリペプチドはＢＬｙＳおよび／またはＢＬｙＳ様ポリペプチドと結合する。
【００１５】
さらなる好適な実施形態には、下記のＦおよびＧ（配列番号６および７）から選択されるアミノ酸配列を含んでなる、あるいは、からなる線状ポリペプチドが含まれる：
（Ｆ） Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０−Ｘ１１−Ｘ１２ （配列番号６）
（式中、
Ｘ１はＡｌａ， Ａｒｇ， Ｇｌｙ， Ｈｉｓ， Ｌｅｕ， Ｌｙｓ， Ｍｅｔ， Ｐｈｅ， Ｔｒｐ， ＴｙｒまたはＶａｌ（好ましくは、Ｇｌｙ、ＴｙｒまたはＶａｌ）であり；
Ｘ２はＡｌａ， Ａｒｇ， Ｇｌｎ， Ｈｉｓ， Ｉｌｅ， Ｌｅｕ， Ｐｈｅ， Ｔｈｒ， ＴｒｐまたはＴｙｒ（好ましくは、ＨｉｓまたはＴｙｒ）であり；
Ｘ３はＡｌａ， Ａｓｐ， Ｌｙｓ， Ｐｈｅ， Ｔｈｒ， ＴｒｐまたはＴｙｒ（好ましくは、ＡｓｐまたはＴｙｒ）であり；
Ｘ４はＡｒｇ， Ａｓｐ， Ｇｌｎ， Ｌｙｓ， Ｍｅｔ， Ｐｈｅ， Ｐｒｏ， Ｓｅｒ， ＴｙｒまたはＶａｌ（好ましくは、ＡｓｐまたはＧｌｎ）であり；
Ｘ５はＡｓｐ， Ｌｅｕ， Ｌｙｓ， Ｐｈｅ， Ｐｒｏ， ＳｅｒまたはＶａｌ（好ましくは、ＬｅｕまたはＳｅｒ）であり；
Ｘ６はＨｉｓ， Ｉｌｅ， Ｌｅｕ， Ｐｒｏ， ＳｅｒまたはＴｈｒ（好ましくは、ＬｅｕまたはＴｈｒ）であり；
Ｘ７はＡｒｇ， Ｇｌｙ， Ｈｉｓ， Ｌｅｕ， Ｌｙｓ， ＭｅｔまたはＴｈｒ（好ましくは、ＬｙｓまたはＴｈｒ）であり；
Ｘ８はＡｌａ， Ａｒｇ， Ａｓｎ， Ｉｌｅ， Ｌｅｕ， Ｌｙｓ， ＭｅｔまたはＴｈｒ（好ましくは、ＬｅｕまたはＬｙｓ）であり；
Ｘ９はＡｌａ， Ａｓｎ， Ａｒｇ， Ａｓｐ， Ｇｌｕ， Ｇｌｙ， Ｈｉｓ， Ｌｅｕ， Ｍｅｔ， Ｓｅｒ， Ｔｒｐ， ＴｙｒまたはＶａｌ（好ましくは、ＭｅｔまたはＳｅｒ）であり；
Ｘ１０はＩｌｅ， Ｌｅｕ， Ｐｈｅ， Ｓｅｒ， Ｔｈｒ， Ｔｒｐ， ＴｙｒまたはＶａｌ（好ましくは、ＴｈｒまたはＬｅｕ）であり；
ＸｌｌはＡｌａ， Ａｒｇ， Ｇｌｙ， Ｈｉｓ， Ｉｌｅ， Ｌｅｕ， Ｌｙｓ， Ｐｒｏ， Ｓｅｒ， Ｔｈｒ， Ｔｒｐ， ＴｙｒまたはＶａｌ（好ましくは、ＰｒｏまたはＴｈｒ）であり；
Ｘ１２はＡｒｇ， Ａｓｐ， Ｈｉｓ， Ｌｅｕ， Ｌｙｓ， Ｍｅｔ， Ｐｈｅ， Ｐｒｏ， Ｓｅｒ， Ｔｒｐ， ＴｙｒまたはＶａｌ（好ましくは、ＡｒｇまたはＰｒｏ）である）；
ただし、該ポリペプチドはＢＬｙＳおよび／またはＢＬｙＳ様ポリペプチドと結合する；
【００１６】
（Ｇ） Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０−Ｘ１１−Ｘ１２−Ｘ１３ （配列番号７）
（式中、
Ｘ１はＡｓｐ， Ｇｌｎ， Ｇｌｕ， Ｇｌｙ， Ｈｉｓ， Ｌｙｓ， ＭｅｔまたはＴｒｐ（好ましくは、ＧｌｕまたはＬｙｓ）であり；
Ｘ２はＡｒｇ， Ｇｌｎ， Ｈｉｓ， Ｉｌｅ， ＬｅｕまたはＰｒｏ（好ましくは、ＨｉｓまたはＰｒｏ）であり；
Ｘ３はＡｓｐ， Ｇｌｙ， Ｉｌｅ， Ｌｙｓ， Ｔｈｒ， ＴｙｒまたはＶａｌ（好ましくは、Ｔｙｒ）であり；
Ｘ４はＡｓｎ， Ａｓｐ， Ｇｌｎ， Ｇｌｕ， Ｍｅｔ， Ｐｒｏ， ＳｅｒまたはＴｙｒ（好ましくは、ＡｓｐまたはＧｌｎ）であり；
Ｘ５はＡｓｎ， Ａｓｐ， Ｈｉｓ， Ｉｌｅ， Ｌｅｕ， Ｍｅｔ， Ｐｒｏ， ＴｈｒまたはＶａｌ（好ましくは、ＡｓｎまたはＴｈｒ）であり；
Ｘ６はＡｓｐ， Ｇｌｕ， Ｈｉｓ， Ｌｅｕ， Ｌｙｓ， ＰｒｏまたはＶａｌ（好ましくは、ＡｓｐまたはＰｒｏ）であり；
Ｘ７はＡｒｇ， Ａｓｎ， Ｇｌｎ， Ｈｉｓ， Ｉｌｅ， Ｌｅｕ， Ｍｅｔ， ＰｒｏまたはＴｈｒ（好ましくは、ＩｌｅまたはＰｒｏ）であり；
Ｘ８はＧｌｎ， Ｇｌｙ， Ｈｉｓ， Ｌｅｕ， Ｍｅｔ， ＳｅｒまたはＴｈｒ（好ましくは、ＬｅｕまたはＴｈｒ）であり；
Ｘ９はＡｓｎ， Ｇｌｎ， Ｇｌｙ， Ｈｉｓ， Ｌｅｕ， Ｌｙｓ， ＳｅｒまたはＴｈｒ（好ましくは、Ｌｙｓ）であり；
Ｘ１０はＡｌａ， Ｇｌｙ， Ｉｌｅ， Ｌｅｕ， Ｌｙｓ， ＭｅｔまたはＰｈｅ（好ましくは、ＧｌｙまたはＭｅｔ）であり；
Ｘ１１はＡｌａ， Ｇｌｕ， Ｈｉｓ， Ｉｌｅ， Ｌｅｕ， Ｍｅｔ， Ｓｅｒ， Ｔｈｒ， Ｔｒｐ， ＴｙｒまたはＶａｌ（好ましくは、ＡｌａまたはＴｈｒ）であり；
Ｘ１２はＡｒｇ， Ｇｌｎ， Ｇｌｕ， Ｇｌｙ， Ｈｉｓ， Ｉｌｅ， Ｌｙｓ， ＴｙｒまたはＶａｌ（好ましくは、ＡｒｇまたはＨｉｓ）であり；
Ｘ１３はＡｒｇ， Ａｓｎ， Ｇｌｕ， Ｈｉｓ， Ｉｌｅ， Ｓｅｒ， Ｔｈｒ， ＴｒｐまたはＶａｌ（好ましくは、Ｈｉｓ）である）；
ただし、該ポリペプチドはＢＬｙＳおよび／またはＢＬｙＳ様ポリペプチドと結合する。
【００１７】
前記ポリペプチドはＮ−末端とＣ−末端のいずれか一方または両方に追加のアミノ酸が結合されていてもよい。
【００１８】
ループ構造を形成する可能性があるポリペプチドを含むライブラリー（すなわち、ＴＮ６、ＴＮ７、ＴＮ８、ＴＮ９、ＴＮ１０およびＴＮ１２と称するライブラリー）の分離物からの配列情報および結合データを検討すると、ループ構造を形成しうる一連のＢＬｙＳ結合性ポリペプチドが同定される。特定の実施形態において、本発明のＢＬｙＳ結合性ポリペプチドは下記のＨ〜Ｌ（配列番号８〜１２）から選択されるアミノ酸配列を含んでなる、あるいは、からなる：
（Ｈ） Ｃｙｓ−Ｘ２−Ｐｈｅ−Ｘ４−Ｔｒｐ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ （配列番号８）
（式中、
Ｘ２はＰｈｅ， ＴｒｐまたはＴｙｒ（好ましくは、Ｔｙｒ）であり；
Ｘ４はＰｒｏまたはＴｙｒ（好ましくは、Ｐｒｏ）である）；
【００１９】
（Ｉ） Ｃｙｓ−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｃｙｓ （配列番号９）
（式中、
Ｘ２はＡｓｐ， Ｉｌｅ， ＬｅｕまたはＴｙｒ（好ましくは、ＡｓｐまたはＬｅｕ）であり；
Ｘ３はＡｒｇ， Ａｓｐ， Ｇｌｕ， Ｈｉｓ， Ｉｌｅ， Ｌｅｕ， Ｌｙｓ， Ｐｈｅ， Ｐｒｏ， ＴｙｒまたはＶａｌ（好ましくは、ＧｌｕまたはＬｅｕ）であり；
Ｘ４はＨｉｓ， Ｌｅｕ， ＬｙｓまたはＰｈｅ（好ましくは、ＨｉｓまたはＬｅｕ）であり；
Ｘ５はＬｅｕ， ＰｒｏまたはＴｈｒ（好ましくは、ＴｈｒまたはＰｒｏ）であり；
Ｘ６はＡｒｇ， Ａｓｎ， Ｇｌｙ， Ｈｉｓ， Ｉｌｅ， Ｌｙｓ， ＭｅｔまたはＴｒｐ（好ましくは、Ｌｙｓ）であり；
Ｘ７はＡｌａ， Ａｓｎ， Ｇｌｎ， Ｇｌｕ， Ｇｌｙ， Ｈｉｓ， Ｉｌｅ， Ｌｅｕ， Ｍｅｔ， Ｐｈｅ， Ｓｅｒ， Ｔｒｐ， ＴｙｒまたはＶａｌである）；
【００２０】
（Ｊ） Ｃｙｓ−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｃｙｓ （配列番号１０）
（式中、
Ｘ２はＡｓｎ， Ａｓｐ， Ｐｒｏ， ＳｅｒまたはＴｈｒ（好ましくは、Ａｓｐ）であり；
Ｘ３はＡｒｇ， Ａｓｐ， Ｉｌｅ， Ｌｅｕ， Ｍｅｔ， ＰｒｏまたはＶａｌ（好ましくは、Ｉｌｅ）であり；
Ｘ４はＡｌａ， Ｉｌｅ， Ｌｅｕ， Ｐｒｏ， ＴｈｒまたはＶａｌ（好ましくは、ＶａｌまたはＬｅｕ）であり；
Ｘ５はＡｓｎ， Ｈｉｓ， Ｉｌｅ， Ｌｅｕ， Ｌｙｓ， ＰｈｅまたはＴｈｒ（好ましくは、Ｔｈｒ）であり；
Ｘ６はＡｓｎ， Ｇｌｕ， Ｇｌｙ， Ｈｉｓ， Ｌｅｕ， Ｌｙｓ， Ｍｅｔ， ＰｒｏまたはＴｈｒ（好ましくは、Ｌｅｕ）であり；
Ｘ７はＡｒｇ， Ａｓｎ， Ａｓｐ， Ｇｌｎ， Ｇｌｕ， Ｇｌｙ， Ｉｌｅ， Ｌｙｓ， Ｍｅｔ， Ｐｒｏ， ＳｅｒまたはＴｒｐであり；
Ｘ８はＡｒｇ， Ｇｌｕ， Ｇｌｙ， Ｌｙｓ， Ｐｈｅ， Ｓｅｒ， ＴｒｐまたはＴｙｒ（好ましくは、Ｓｅｒ）である）；
【００２１】
（Ｋ） Ｃｙｓ−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−Ｃｙｓ （配列番号１１）
（式中、
Ｘ２はＡｓｐ， Ｇｌｎ， Ｈｉｓ， Ｉｌｅ， Ｌｅｕ， Ｌｙｓ， Ｍｅｔ， ＰｈｅまたはＴｈｒであり；
Ｘ３はＨｉｓ， Ｉｌｅ， Ｌｅｕ， Ｍｅｔ， Ｐｈｅ， Ｐｒｏ， ＴｒｐまたはＴｙｒであり；
Ｘ４はＡｓｐ， Ｈｉｓ， ＬｅｕまたはＳｅｒ（好ましくは、Ａｓｐ）であり；
Ｘ５はＡｌａ， Ａｒｇ， Ａｓｐ， Ｇｌｕ， Ｌｅｕ， Ｐｈｅ， ＰｒｏまたはＴｈｒ（好ましくは、ＧｌｕまたはＰｒｏ）であり；
Ｘ６はＡｌａ， Ａｒｇ， ＡｓｎまたはＬｅｕ（好ましくは、Ｌｅｕ）であり；
Ｘ７はＩｌｅ， Ｌｅｕ， Ｍｅｔ， Ｐｒｏ， ＳｅｒまたはＴｈｒ（好ましくは、Ｔｈｒ）であり；
Ｘ８はＡｌａ， Ａｒｇ， Ａｓｎ， Ｇｌｙ， Ｈｉｓ， Ｌｙｓ， ＳｅｒまたはＴｙｒであり；
Ｘ９はＡｌａ， Ａｒｇ， Ａｓｎ， Ｇｌｎ， Ｌｅｕ， Ｍｅｔ， Ｓｅｒ， Ｔｒｐ， ＴｙｒまたはＶａｌである）；
【００２２】
（Ｌ） Ｃｙｓ−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０−Ｘ１１−Ｃｙｓ （配列番号１２）
（式中、
Ｘ２はＡｒｇ， Ａｓｎ， Ｇｌｎ， Ｇｌｕ， Ｈｉｓ， Ｌｅｕ， Ｐｈｅ， Ｐｒｏ， Ｔｒｐ， ＴｙｒまたはＶａｌ（好ましくは、Ｔｒｐ、ＴｙｒまたはＶａｌ）であり；
Ｘ３はＡｒｇ， Ａｓｐ， Ｇｌｎ， Ｇｌｙ， Ｉｌｅ， Ｌｙｓ， Ｐｈｅ， Ｔｈｒ， ＴｒｐまたはＴｙｒ（好ましくは、Ａｓｐ）であり；
Ｘ４はＡｌａ， Ａｒｇ， Ａｓｐ， Ｇｌｕ， Ｇｌｙ， Ｌｅｕ， ＳｅｒまたはＴｙｒ（好ましくは、Ａｓｐ）であり；
Ｘ５はＡｓｐ， Ｇｌｎ， Ｇｌｕ， Ｌｅｕ， Ｍｅｔ， Ｐｈｅ， Ｐｒｏ， ＳｅｒまたはＴｙｒ（好ましくは、Ｌｅｕ）であり；
Ｘ６はＡｓｐ， Ｌｅｕ， Ｐｒｏ， ＴｈｒまたはＶａｌ（好ましくは、ＬｅｕまたはＴｈｒ）であり；
Ｘ７はＡｒｇ， Ｇｌｎ， Ｈｉｓ， Ｉｌｅ， Ｌｅｕ， Ｌｙｓ， Ｍｅｔ， Ｐｈｅ， Ｔｈｒ， ＴｒｐまたはＴｙｒ（好ましくは、ＬｙｓまたはＴｈｒ）であり；
Ｘ８はＡｌａ， Ａｒｇ， Ａｓｎ， Ｇｌｎ， Ｇｌｕ， Ｈｉｓ， Ｌｅｕ， Ｌｙｓ， ＭｅｔまたはＴｈｒ（好ましくは、ＡｒｇまたはＬｅｕ）であり；
Ｘ９はＡｌａ， Ａｓｎ， Ｇｌｎ， Ｇｌｙ， Ｌｅｕ， Ｌｙｓ， Ｐｈｅ， Ｐｒｏ， Ｔｈｒ， ＴｒｐまたはＴｙｒ（好ましくは、ＴｈｒまたはＴｒｐ）であり；
Ｘｌ０はＡｌａ， Ａｒｇ， Ｇｌｎ， Ｈｉｓ， Ｌｙｓ， Ｍｅｔ， Ｐｈｅ， Ｐｒｏ， Ｔｈｒ， ＴｒｐまたはＴｙｒ（好ましくは、ＭｅｔまたはＰｈｅ）であり；
Ｘ１１はＡｒｇ， Ｇｌｎ， Ｇｌｕ， Ｇｌｙ， Ｈｉｓ， Ｌｅｕ， Ｍｅｔ， Ｐｈｅ， Ｐｒｏ， Ｓｅｒ， Ｔｈｒ， ＴｙｒまたはＶａｌ（好ましくは、Ｖａｌ）である）；
ただし、前記ポリペプチドはＢＬｙＳおよび／またはＢＬｙＳ様ポリペプチドと結合する。
【００２３】
本発明のさらに好適な実施形態において、ＢＬｙＳ結合性ポリペプチドは下記のアミノ酸配列Ｍ（配列番号４４７）を含んでなる：
（Ｍ） Ａｌａ−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ａｓｐ−Ｘ６−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｘ９−Ｌｅｕ−Ｘｌｌ−Ｘｌ２−Ｘｌ３−Ｘｌ４ （配列番号４４７）
（式中、
Ｘ２はＡｓｎ， Ｓｅｒ， Ｔｙｒ， Ａｓｐ， Ｐｈｅ， Ｉｌｅ， Ｇｌｎ， Ｈｉｓ， Ｐｒｏ， Ｌｙｓ， Ｌｅｕ， Ｍｅｔ， Ｔｈｒ， Ｖａｌ， Ｇｌｕ， Ａｌａ， Ｇｌｙ， ＣｙｓまたはＴｒｐ（すなわち、Ａｒｇ以外の任意のアミノ酸；好ましくは、Ａｓｎ）であり；
Ｘ３はＴｒｐ， Ｇｌｕ， Ｌｙｓ， Ｃｙｓ， Ｌｅｕ， Ａｌａ， Ａｒｇ， ＧｌｙまたはＳｅｒ（好ましくは、Ｔｒｐ）であり；
Ｘ４はＴｙｒ， Ｐｈｅ， Ｇｌｕ， ＣｙｓまたはＡｓｎ（好ましくは、Ｔｙｒ）であり；
Ｘ６はＰｒｏ， Ｓｅｒ， Ｔｈｒ， Ｐｈｅ， Ｌｅｕ， Ｔｙｒ， ＣｙｓまたはＡｌａ（好ましくは、ＰｒｏまたはＳｅｒ）であり；
Ｘ９はＬｙｓ， Ａｓｎ， Ｇｌｎ， ＧｌｙまたはＡｒｇ（好ましくは、Ｌｙｓ）であり；
ＸｌｌはＴｒｐ， Ｓｅｒ， Ｔｈｒ， Ａｒｇ， Ｃｙｓ， ＴｙｒまたはＬｙｓ（好ましくは、Ｔｒｐ）であり；
Ｘｌ２はＬｅｕ， Ｐｈｅ， Ｖａｌ， ＩｌｅまたはＨｉｓ（好ましくは、Ｌｅｕ）であり；
Ｘ１３はＰｒｏ， Ｌｅｕ， Ｈｉｓ， Ｓｅｒ， Ａｒｇ， Ａｓｎ， Ｇｌｎ， Ｔｈｒ， Ｖａｌ， Ａｌａ， Ｃｙｓ， Ｉｌｅ， ＰｈｅまたはＴｙｒ（すなわち、Ａｓｐ， Ｇｌｕ， Ｇｌｙ， Ｌｙｓ， ＭｅｔまたはＴｒｐではない；好ましくは、Ｐｒｏ）であり；
Ｘ１４はＡｓｐ， Ｇｌｕ， Ａｓｎ， Ｖａｌ， Ｈｉｓ， Ｇｌｎ， Ａｒｇ， Ｇｌｙ， Ｓｅｒ， Ｔｙｒ， Ａｌａ， Ｃｙｓ， Ｌｙｓ， Ｉｌｅ， ＴｈｒまたはＬｅｕ（すなわち、Ｐｈｅ， Ｍｅｔ， ＰｒｏまたはＴｒｐではない；好ましくは、Ａｓｐ， ＶａｌまたはＧｌｕ）である）。
【００２４】
好適な実施形態は下記の式Ｎのコア配列を含んでなるポリペプチドである：
（Ｎ） Ｘ１−Ｘ２−Ａｓｐ−Ｘ４−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｘ７−Ｌｅｕ−Ｘ９−Ｘ１０ （配列番号４４８）
（式中、
Ｘ１はＴｒｐ， Ｇｌｕ， Ｌｙｓ， Ｃｙｓ， Ｌｅｕ， Ａｌａ， Ａｒｇ， ＧｌｙまたはＳｅｒ（好ましくは、Ｔｒｐ）であり；
Ｘ２はＴｙｒ， Ｐｈｅ， Ｇｌｕ， ＣｙｓまたはＡｓｎ（好ましくは、Ｔｙｒ）であり；
Ｘ４はＰｒｏ， Ｓｅｒ， Ｔｈｒ， Ｐｈｅ， Ｌｅｕ， Ｔｙｒ， ＣｙｓまたはＡｌａ（好ましくは、ＰｒｏまたはＳｅｒ）であり；
Ｘ７はＬｙｓ， Ａｓｎ， Ｇｌｎ， ＧｌｙまたはＡｒｇ（好ましくは、Ｌｙｓ）であり；
Ｘ９はＴｒｐ， Ｓｅｒ， Ｔｈｒ， Ａｒｇ， Ｃｙｓ， ＴｙｒまたはＬｙｓ（好ましくは、Ｔｒｐ）であり；
Ｘ１０はＬｅｕ， Ｐｈｅ， Ｖａｌ， ＩｌｅまたはＨｉｓ（好ましくは、Ｌｅｕ）である）。
【００２５】
本発明に従う特に好適なＢＬｙＳ結合性ポリペプチドは、次のコアペプチド：
Ｔｒｐ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ （配列番号４３６）
を含んでなる。
【００２６】
上記のＢＬｙＳ結合性ポリペプチドは、Ｎ−およびＣ−末端のいずれか一方または両方に追加のアミノ酸が結合されていてもよい。
【００２７】
本発明のさらなる実施形態は、少なくとも１０３のポリペプチド、好ましくは、少なくとも１０６のポリペプチド、より好ましくは、少なくとも１０９またはそれ以上のポリペプチドの集団から構成され、該集団のポリペプチドが次のアミノ酸配列：
Ａｌａ−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ａｓｐ−Ｘ６−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｘ９−Ｌｅｕ−Ｘ１１−Ｘ１２−Ｘ１３−Ｘ１４ （配列番号４４９）
（式中、
Ｘ２は任意のアミノ酸であり；
Ｘ３は任意のアミノ酸であり；
Ｘ４は任意のアミノ酸であり；
Ｘ６は任意のアミノ酸であり；
Ｘ９は任意のアミノ酸であり；
Ｘ１１は任意のアミノ酸であり；
Ｘ１２は任意のアミノ酸であり；
Ｘ１３は任意のアミノ酸であり；
Ｘ１４は任意のアミノ酸である）
を含んでなる、ＢＬｙＳ親和性成熟ライブラリーに関する。
【００２８】
好適なＢＬｙＳ親和性成熟ライブラリーは、可変アミノ酸位置（すなわち、配列番号４４９における２、３、４、６、９、１１、１２、１３および１４位）が無作為に多様化されるのではなく、不均化的に所定の単一アミノ酸となるように作製される。そのようなライブラリーは、次のＤＮＡ鋳型：
ＧＣＴ ＮＮＮ ＮＮＮ ＮＮＮ ＧＡＴ ＮＮＮ ＣＴＴ ＡＣＴ ＮＮＮ ＣＴＣ ＮＮＮ ＮＮＮ ＮＮＮ ＮＮＮ （配列番号１８５）
（式中、それぞれの可変塩基（Ｎ）はＡ、Ｃ、ＧまたはＴであるが、それぞれの場合に１つの塩基は所与の塩基位置で約１１倍多く存在しうる）
に適合する多様なポリヌクレオチドの発現により作製することができる。そのような１つのＤＮＡ鋳型は、以下の実施例６で述べるが、ＤＮＡ配列のヌクレオチドが下記の割合となるように作製される。
【００２９】
2004532604.tif 000002
【００３０】
また、本発明のＢＬｙＳ結合性ポリペプチドは、アミノ末端（Ｎ−末端）キャッピング基または官能基（例えば、アセチル基）をもっていてもよく、こうした基は、例えば、望ましくない反応からアミノ末端アミノ基をブロックしたり、ＢＬｙＳ結合性ポリペプチドを別の分子、マトリックス、樹脂もしくは固相支持体に連結させるのに有用である。本発明のＢＬｙＳ結合性ポリペプチドはまた、カルボキシ末端（Ｃ−末端）キャッピング基または官能基（例えば、アミド基）をもっていてもよく、こうした基は、例えば、望ましくない反応からＣ−末端カルボキシル基をブロックしたり、該結合性ポリペプチドを別の分子、マトリックス、樹脂もしくは固相支持体にコンジュゲートさせるのに有用な官能基を提供する。好ましくは、Ｎ−および／またはＣ−末端のキャッピング基はポリペプチドリンカー分子である。本発明のＢＬｙＳ結合性ポリペプチドを固相支持体またはクロマトグラフィーマトリックス材料に固定するのに有用な、特に好適なＣ−末端リンカー分子は、次のアミノ酸配列 Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ （配列番号１３） を含んでなる。もう一つの有用なＣ−末端リンカー、例えば、ペプチドをフルオレセイン化するためのリンカーは、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓである（表１５参照）。
【００３１】
本発明はさらに、ＢＬｙＳおよび／またはＢＬｙＳ様ポリペプチドと結合する能力を保持しながら、例えば分子の安定性を高めるまたは減ずるように、改変されているＢＬｙＳ結合性ポリペプチドを包含する。本発明の改変されたＢＬｙＳ結合性ポリペプチドの例は、２つのシステイン残基のうち一方が非天然アミノ酸で置換されているポリペプチドである。この非天然アミノ酸は、残りのシステイン側鎖と縮合して安定なチオエーテル橋を形成することができ、その結果、環状のＢＬｙＳ結合性ポリペプチドが生成する。このような合成ペプチドの環状チオエーテル分子は、例えば、ＰＣＴ国際公開ＷＯ ９７／４６２５１（参照により本明細書に組み入れるものとする）に記載されるような、当分野で公知の技法を用いてルーチンに製造することができる。
【００３２】
別の実施形態において、本発明は、マトリックス、樹脂または固相支持体に結合された、連結された、あるいは、付着された本発明のＢＬｙＳ結合性ポリペプチドを提供する。ポリペプチドをマトリックス、樹脂または固相支持体に結合、連結または付着させるための技法は当分野で周知である。これらの物質に適するマトリックス、樹脂または固相支持体は、ＢＬｙＳ結合性ポリペプチドが普通に結合、連結または付着するものであれば、当分野で知られたどのような組成のものであってもよく、例えば、クロマトグラフィー用の樹脂やマトリックス（例えば、ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ−４ＦＦアガロースビーズ）、プラスチック製マイクロタイタープレートのウェルの壁面や底面（例えば、固相酵素免疫検定法（ＥＬＩＳＡ）で用いるもの）、またはシリカを基材としたバイオチップなどがあり、これらに限らない。本発明の結合性ポリペプチドを固定するための固相支持体として有用な材料には、ポリアクリルアミド、アガロース、シリカ、ニトロセルロース、紙、プラスチック、ナイロン、金属、およびこれらの組合せが含まれるが、これらに限るものではない。本発明のＢＬｙＳ結合性ポリペプチドは、当分野で公知の技法を用いて、非共有結合あるいは共有結合によってマトリックス、樹脂または固相支持体に固定させることができる。好ましくは、本発明のＢＬｙＳ結合性ポリペプチドを、ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ−４ＦＦアガロースのようなクロマトグラフィー材料に固定させる。より一層好適な実施形態では、本発明のＢＬｙＳ結合性ポリペプチドを、リンカー分子によってクロマトグラフィー材料に連結させる。本発明に従う好適なリンカー分子は次のアミノ酸配列 Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ （配列番号１３） を含むポリペプチドである。最も好ましくは、本発明のアフィニティークロマトグラフィー材料は、アミノ酸配列 Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ （配列番号１３） を有するポリペプチドリンカー分子によりクロマトグラフィー材料に連結された、配列番号１６３〜１７２からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むＢＬｙＳ結合性ポリペプチドを含んでなる。マトリックス、樹脂または他の固相支持体に結合、連結または付着させた本発明のＢＬｙＳ結合性ポリペプチドは、ＢＬｙＳおよび／またはＢＬｙＳ様ポリペプチドを検出、単離および精製する方法で用いられ、特に、アフィニティークロマトグラフィーによってＢＬｙＳおよび／またはＢＬｙＳ様ポリペプチドを精製するのに有用である。
【００３３】
特定の好ましい実施形態では、本発明のＢＬｙＳ結合性ポリペプチドまたは該結合性ポリペプチドを展示するファージは、天然の可溶性三量体の形をしたＢＬｙＳタンパク質と不可逆的に結合する。
【００３４】
特定の好ましい実施形態では、本発明のＢＬｙＳ結合性ポリペプチドまたは該結合性ポリペプチドを展示するファージは、天然の可溶性三量体の形をしたＢＬｙＳタンパク質と可逆的に結合する。
【００３５】
さらなる実施形態において、本発明は、本発明のＢＬｙＳ結合性ポリペプチドをコードする単離された核酸（好ましくは、ＤＮＡ）を含んでなる組成物を包含する。特定の実施形態では、本発明の核酸分子は、配列番号１〜１２、２０〜１７２、および１８６〜４４４に示されるような本発明のＢＬｙＳ結合性ポリペプチドをコードする。付加的な実施形態では、本発明の核酸分子は、配列番号１〜１２、２０〜１７２、および１８６〜４４４のアミノ酸配列を含むポリペプチドの変異体または断片をコードする。さらに付加的な実施形態では、本発明の核酸分子はＢＬｙＳ結合性ポリペプチドをコードし、該核酸の相補鎖は、表１〜８および１４ならびに実施例２、５および６に記載されるポリペプチド（配列番号１〜１２、２０〜１７２、および１８６〜４４４）をコードするポリヌクレオチド配列と、ストリンジェントな条件下（例えば、６ｘ塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）中約４５℃でのフィルター結合ＤＮＡへのハイブリダイゼーションと、その後の０．２ｘＳＳＣ／０．１％ ＳＤＳ中約５０〜６５℃での１回以上の洗浄）、高度にストリンジェントな条件下（例えば、６ｘＳＳＣ中約４５℃でのフィルター結合核酸へのハイブリダイゼーションと、その後の０．１ｘＳＳＣ／０．２％ ＳＤＳ中約６８℃での１回以上の洗浄）、または、当業者に公知のその他のストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ， Ｆ．Ｍ．ら編， １９８９， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌ．Ｉ， Ｇｒｅｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ， Ｉｎｃ．およびＪｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ｐｐ． ６．３．１−６．３．６および２．１０．３を参照のこと）。
【００３６】
本発明はまた、本発明のＢＬｙＳ結合性ポリペプチド（ならびにその断片および変異体）をコードする単離された核酸分子を含む組換えベクター、該組換えベクターを含む宿主細胞、ならびに該ベクターおよび宿主細胞を作製する方法に関する。本発明はさらに、該組換えベクターを使用して、ＢＬｙＳ結合性ポリペプチドを組換え法により生産することを提供する。
【００３７】
本発明のＢＬｙＳ結合性ポリペプチド、核酸、形質転換宿主細胞、ならびに、遺伝子操作したウイルスおよびファージ（例えば、組換えファージ）は、ＢＬｙＳの検出、単離および精製を含むがこれらに限らない用途を有する。
【００３８】
本発明の別の実施形態では、ＢＬｙＳ結合性ポリペプチドをファージ表面に展示する組換えバクテリオファージも提供される。そのようなファージは当分野で公知の技法を用いてルーチンに作製することができ、例えば、スクリーニング試薬やＢＬｙＳを検出するための試薬として有用である。
【００３９】
別の実施形態において、本発明のＢＬｙＳ結合性ポリペプチドは溶液中のＢＬｙＳまたはＢＬｙＳ様ポリペプチドを検出または単離するために使用される。この種の溶液としては、ＢＬｙＳまたはＢＬｙＳ様ポリペプチドを水やバッファー溶液に懸濁または溶解したもの、ならびに、個体に由来する体液および／または細胞、生物学的液体、生体組織、体細胞、細胞系、組織培養物、またはＢＬｙＳもしくはＢＬｙＳ様ポリペプチドを含みうる他の供給源（例えば、細胞培養基、細胞抽出物、組織ホモジェネートなど）が含まれるが、これらに限定されない。生物学的液体としては、血清、血漿、リンパ液、血液、血液画分、尿、滑液、脊髄液、唾液および粘液が挙げられ、これらに限らない。
【００４０】
別の実施形態において、本発明は、溶液中に含まれるＢＬｙＳタンパク質および／またはＢＬｙＳ様ポリペプチドを検出する方法を提供し、この方法は、該溶液を本発明のＢＬｙＳ結合性ポリペプチドと接触させ、ＢＬｙＳ結合性ポリペプチドへのＢＬｙＳまたはＢＬｙＳ様ポリペプチドの結合を検出することを含んでなる。ＢＬｙＳ結合性ポリペプチドは遊離であっても固定されていてもよい。好ましくは、ＢＬｙＳ結合性ポリペプチドは固相表面、クロマトグラフィー材料またはプラスチック製マイクロタイターアッセイプレートのウェルに固定されたポリペプチドである。
【００４１】
本発明の別の実施形態は、ＢＬｙＳタンパク質および／またはＢＬｙＳ様ポリペプチドを、それを含む溶液から単離する方法であり、この方法は、
（ａ）  該溶液をＢＬｙＳ結合性ポリペプチドと、ＢＬｙＳ結合性ポリペプチドへのＢＬｙＳおよび／またはＢＬｙＳ様ポリペプチドの結合を可能にする条件下で接触させること、
（ｂ）   ＢＬｙＳ結合性ポリペプチド（およびそれに結合されたＢＬｙＳおよび／またはＢＬｙＳ様ポリペプチド）を該溶液の残部から分離すること、
を含んでなる。
【００４２】
本発明のさらなる実施形態は、ＢＬｙＳタンパク質および／またはＢＬｙＳ様ポリペプチドを、それを含む溶液から単離する方法であり、この方法は、
（ａ）  該溶液をＢＬｙＳ結合性ポリペプチドと、ＢＬｙＳ結合性ポリペプチドへのＢＬｙＳおよび／またはＢＬｙＳ様ポリペプチドの結合を可能にする条件下で接触させること、
（ｂ）   ＢＬｙＳ結合性ポリペプチドとＢＬｙＳおよび／またはＢＬｙＳ様ポリペプチドとから形成された複合体を、該溶液の他の成分から分離すること、
（ｃ）  ＢＬｙＳ結合性ポリペプチドをＢＬｙＳおよび／またはＢＬｙＳ様ポリペプチドから解離させること、
（ｄ）  解離させたＢＬｙＳおよび／またはＢＬｙＳ様ポリペプチドを回収すること、
を含んでなる。
【００４３】
別の実施形態において、本発明は、ＢＬｙＳおよび／またはＢＬｙＳ様ポリペプチドを検出または単離する方法で使用するための、本発明の結合性ポリペプチドを含んでなるキットを提供する。
【００４４】
定義
本発明を明確に理解しやすくするために、以下の用語を定義する：
「組換え」という用語は、非天然に改変されたまたは操作された核酸、外因性核酸でトランスフェクトされた宿主細胞、あるいは、単離された核酸（通常はＤＮＡ）の操作または宿主細胞の形質転換もしくはトランスフェクションにより、非天然に発現されるポリペプチド分子を説明するために用いられる。「組換え」は、特に、遺伝子工学的手法を用いてｉｎ ｖｉｔｒｏで構築されている核酸分子を包含する用語であり、そして分子、構築物、ベクター、細胞、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドを説明するための形容詞としての用語「組換え」の使用は、特に、天然に存在するそのような分子、構築物、ベクター、細胞、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドを除外するものである。
【００４５】
「バクテリオファージ」という用語は、核酸コアと、いくつかの異なるタンパク質分子の集合により構成された防御シェルとを含む細菌ウイルスとして定義される。「バクテリオファージ」と「ファージ」は同義語であり、本明細書では相互交換可能に用いられる。
【００４６】
本明細書では「親和性リガンド」という用語が時々用いられるが、この用語は本発明のＢＬｙＳ結合性ポリペプチドと同義である。
【００４７】
本明細書で用いる「ＢＬｙＳタンパク質」とは、膜結合型（例えば、配列番号１７３）と可溶型（例えば、配列番号１７４）の両者を含むものとする。ＢＬｙＳタンパク質は単量体、二量体、三量体または多量体であってよい。好ましくは、ＢＬｙＳタンパク質はホモ三量体である。
【００４８】
本明細書で用いる「ＢＬｙＳ様タンパク質」とは、天然ＢＬｙＳ、組換え全長ＢＬｙＳ、ならびに、その断片および変異体、例えば、改変されたもしくはトランケートされた天然ＢＬｙＳまたは組換え全長ＢＬｙＳを包含し、これらのＢＬｙＳおよびＢＬｙＳ様タンパク質はＢＬｙＳ機能活性を保持するものである。本発明の組成物によって特異的に結合され得るＢＬｙＳまたはＢＬｙＳ断片としては、限定するものではないが、ヒトＢＬｙＳ（配列番号１７３および／または１７４）またはヒト単球上に発現されるＢＬｙＳ；マウスＢＬｙＳ（配列番号１７５および／または１７６）またはマウス単球上に発現されるＢＬｙＳ；ラットＢＬｙＳ（配列番号１７７、１７８および／または１８０に示される可溶型と、例えばラット単球の表面上の、膜結合型）；またはサルＢＬｙＳ（例えば、配列番号１８１および／または１８２のサルＢＬｙＳポリペプチド、可溶型のサルＢＬｙＳ、またはサル単球上に発現されるＢＬｙＳ）、あるいは、それらの断片を挙げることができる。好ましくは、本発明の組成物はヒトＢＬｙＳ（配列番号１７３および／または１７４）またはその断片と結合するものである。ＢＬｙＳおよびＢＬｙＳ様ポリペプチドは、以下の活性を含むがこれらに限らない天然または全長ＢＬｙＳの機能活性を少なくとも１つ保持する：ＢＬｙＳ受容体（例えば、ＴＡＣＩ （ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＡＣ５１７９０）およびＢＣＭＡ （ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＰ ００１１８３））への結合、Ｂ細胞増殖の刺激、Ｂ細胞による免疫グロブリン分泌の刺激、ＢＬｙＳ受容体シグナル伝達カスケードの刺激、および／または、抗ＢＬｙＳ抗体もしくは他のＢＬｙＳ結合性ポリペプチドとの結合。ＢＬｙＳまたはＢＬｙＳ様ポリペプチドの機能活性を調べるために用いられるアッセイは、当業者が容易に決めることができる（例えば、Ｍｏｏｒｅら， １９９９，前掲に開示されたアッセイを参照のこと）。「ＢＬｙＳ様ポリペプチド」には、ＢＬｙＳの全部または一部が他のポリペプチドに融合または結合されている融合ポリペプチドも含まれる。融合ポリペプチドであるＢＬｙＳ様ポリペプチドは、ＢＬｙＳの少なくとも１つの機能活性、好ましくは、Ｂリンパ球を刺激する能力（例えば、Ｍｏｏｒｅら， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２８５：２６０−２６３ （１９９９）を参照のこと）、ＢＬｙＳ受容体（例えば、ＴＡＣＩまたはＢＣＭＡ）と結合する能力、および／または、抗ＢＬｙＳ抗体もしくは他のＢＬｙＳ結合性ポリペプチドによって結合される能力を保持する。ＢＬｙＳ融合ポリペプチドは、ＢＬｙＳの遺伝子もしくは他のポリヌクレオチドコード配列またはその断片を、他のタンパク質またはポリペプチドのコード配列と、リーディングフレームを合わせて連結させる（再結合させる）組換えＤＮＡ法により作製することができる。その後、得られる組換えＤＮＡ分子を各種のプラスミドまたはファージ発現ベクター（適切な真核または原核宿主細胞における融合タンパク質分子の発現を可能にするもの）のいずれかに挿入する。ＢＬｙＳ融合ポリペプチドは合成法でも半合成法でも調製することができる。
【００４９】
「ＢＬｙＳ標的」または「ＢＬｙＳ標的タンパク質」という用語が本明細書において用いられることがあるが、この用語はＢＬｙＳおよび／またはＢＬｙＳ様ポリペプチドを包含する。したがって、本発明のＢＬｙＳ結合性ポリペプチドは「ＢＬｙＳ標的タンパク質」と結合し、そのため「ＢＬｙＳ標的タンパク質」との結合、その検出、除去および／または精製に使用することができる。
【００５０】
本明細書中で用いる「結合性ポリペプチド」とは、別の分子、ポリペプチド、ペプチド擬似体または形質転換体と結合して複合体を形成することができるあらゆるポリペプチドを指す。
【００５１】
「ＢＬｙＳ結合性ポリペプチド」はＢＬｙＳ標的タンパク質と結合しうる本発明の分子である。本発明のＢＬｙＳ結合性ポリペプチドの非限定的な例として、本明細書に記載のアミノ酸配列（配列番号１〜１２、２０〜１７２および１８６〜４４４参照）を有するポリペプチドが挙げられる。「ＢＬｙＳ結合性ポリペプチド」という用語はまた、本明細書に記載の特定のアミノ酸配列（配列番号１〜１２、２０〜１７２および１８６〜４４４参照）を有するポリペプチドのＢＬｙＳ結合性断片および変異体（誘導体を含む）をも包含する。本明細書に記載するアミノ酸配列の「変異体」とは、ＢＬｙＳと結合するが、本明細書で特定されるＢＬｙＳ結合性ポリペプチドと同一のまたは類似したアミノ酸配列を必ずしも含まないポリペプチドを意味する。本明細書で特定されるＢＬｙＳ結合性ポリペプチドの変異体である本発明のＢＬｙＳ結合性ポリペプチドは、下記の要件の少なくとも１つを満たすものである：（ａ）  本明細書に開示するＢＬｙＳ結合性ポリペプチド配列のアミノ酸配列（配列番号１〜１２、２０〜１７２および１８６〜４４４）に対して少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含んでなる、あるいは、からなるポリペプチド、（ｂ）  ヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチドであって、該ヌクレオチド配列の相補配列が、ストリンジェントな条件下で、本明細書に開示するＢＬｙＳ結合性ポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列（例えば、配列番号１〜１２、２０〜１７２および１８６〜４４４のアミノ酸配列をコードする核酸配列）とハイブリダイズするもの、および／または、本明細書に開示するＢＬｙＳ結合性ポリペプチド配列の、少なくとも５個のアミノ酸残基、少なくとも１０個のアミノ酸残基、少なくとも１５個のアミノ酸残基、もしくは少なくとも２０個のアミノ酸残基からなる断片。本発明のＢＬｙＳ結合性ポリペプチドはまた、様々な用途のために改変されているポリペプチドを包含するが、ただし、そのような改変がＢＬｙＳ標的と結合する能力を排除しないことを条件とする。考えられる改変の具体的な例としては、Ｃ−末端またはＮ−末端アミノ酸の置換、あるいは、ＢＬｙＳ結合剤をクロマトグラフィー材料または他の固相支持体に結合させるためのペプチド鎖の伸長などがあり、これらに限らない。その他の考えられる置換として、通常はジスルフィド結合を形成している一対のシステイン残基の一方または両方を、反応性側鎖をもつ非天然のアミノ酸で置換することがあり、かかる置換は、これらのアミノ酸位置に以前のジスルフィド結合よりも安定した結合を形成することを目的としている。そのような改変型の結合性ポリペプチドもすべて、その改変型ポリペプチドがＢＬｙＳおよび／またはＢＬｙＳ様ポリペプチドと結合する能力を保持する限り、本発明のＢＬｙＳ結合性ポリペプチドと見なされ、溶液中に含まれるＢＬｙ��またはＢＬｙＳ様ポリペプチドを検出したり、該溶液から該ポリペプチドを単離・精製するなど、本明細書に記載の種々の方法において使用することができる。本発明のＢＬｙＳ結合性ポリペプチドには、本明細書に開示する特定のＢＬｙＳ結合性ポリペプチド配列（例えば、配列番号１〜１２、２０〜１７２および１８６〜４４４）の変異体も含まれ、かかる変異体は、これらのポリペプチド配列の一つに対応するアミノ酸配列を有するが、そのポリペプチド配列がＢＬｙＳと結合する分子を提供する置換、付加または欠失により改変されている。したがって、ＢＬｙＳ結合性ポリペプチドには、一次アミノ酸配列として、特定のＢＬｙＳ結合性ポリペプチド配列の全部または一部を含むポリペプチドが含まれ、例えば、該配列内の残基が機能的に等しいアミノ酸残基で置換されていて、結果的に機能的に活性のあるペプチドをもたらす改変配列などである。例えば、該配列内の１個以上のアミノ酸残基を同様の極性をもつ別のアミノ酸残基（機能的同等物として作用して、結果的にサイレント変化をもたらす）で置換することができる。該配列内のアミノ酸の保存的置換は、そのアミノ酸が属するクラスの他のメンバーから選択しうる。例えば、無極性（疎水性）アミノ酸としては、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、およびメチオニンがある。極性中性アミノ酸としては、グリシン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、およびグルタミンがある。正に荷電した（塩基性）アミノ酸としては、アルギニン、リシン、およびヒスチジンがある。負に荷電した（酸性）アミノ酸としては、アスパラギン酸とグルタミン酸がある。そのようなＢＬｙＳ結合性ポリペプチドは、化学的ペプチド合成により、あるいは、ＢＬｙＳ結合性ポリペプチドをコードするが突然変異を起こしている核酸からの組換え生産により調製することができる。当分野で公知の突然変異誘発法はどれも使用することができ、例えば、化学的突然変異誘発法、ｉｎ ｖｉｔｒｏ部位特異的突然変異誘発法（Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎら， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２５３：６５５１ （１９７８））、ＴＡＢ．ＲＴＭ．リンカー（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）の使用などがあるが、これらに限らない。
【００５２】
本明細書で採用され、理解されるように、２つのアミノ酸配列もしくは２つの核酸配列の相同性パーセントまたは同一性パーセントは、ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌ （Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８７：２２６４−２２６８ （１９９０））のアルゴリズムをＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌ （Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ９０：５８７３−５８７７ （１９９３））に記載のように改変したものを用いて決定される。そのようなアルゴリズムはＡｌｔｓｃｈｕｌら（Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， ２１５：４０３−４１０ （１９９０））のＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラムに組み込まれる。ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索をＮＢＬＡＳＴプログラムにより実行すると、本明細書に開示する核酸分子に相同なヌクレオチド配列が得られる。ＢＬＡＳＴタンパク質検索をＸＢＬＡＳＴプログラムにより実行すると、基準ポリペプチドに相同なアミノ酸配列が得られる。比較のためにギャップを入れたアラインメントを得るためには、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， ２５：３３８９−３４０２ （１９９７））に記載されるとおりにＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴを利用する。ＢＬＡＳＴおよびＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴプログラムを使用する場合は、それぞれのプログラム（例えば、ＸＢＬＡＳＴおよびＮＢＬＡＳＴ）のデフォルトパラメーターを用いる。を参照のこと。あるいはまた、２つのアミノ酸配列もしくは２つの核酸配列の同一性パーセントは、いったん配列同士を最適な比較のためにアラインメントしてから（例えば、第２のアミノ酸または核酸配列との最適なアラインメントのために第１のアミノ酸または核酸配列の配列中にギャップを導入してから）決定することができる。その後、対応するアミノ酸位置もしくはヌクレオチド位置のアミノ酸残基またはヌクレオチドを比較する。第１の配列中の１つの位置が第２の配列の対応する位置と同じアミノ酸残基またはヌクレオチドで占められている場合、それらの分子はその位置において同一である。２つの配列間の同一性パーセントはそれらの配列によって共有される同一位置の数の関数である（すなわち、同一性％＝重複する同一位置の数／位置の総数×１００％）。ある実施形態においては、２つの配列が同じ長さである。
【００５３】
本明細書で用いる「ポリペプチド」とは、２個以上のアミノ酸残基がペプチド結合によって連結されている直鎖、分岐鎖、または環状（例えば、ループ構造を含む）のポリマーを指す。「ポリペプチド」という用語は、アミノ酸残基のどのような特定の上限にも限定されない。かくして、本明細書に開示するアミノ酸配列を含んでなる本発明のＢＬｙＳ親和性リガンドは、適切には「ＢＬｙＳ結合性ポリペプチド」と呼ばれる。なぜなら、かかる結合性ポリペプチドは、たとえそのような分子がペプチド結合に関与してもしなくてもよいアミノ酸以外の付加的な成分または基（例えば、Ｎ−末端および／またはＣ−末端のキャッピング基または官能基）を１個以上含むものであろうと、ペプチド結合により一緒に保持されるアミノ酸残基を２個以上含むからである。本発明のポリペプチドは１価、２価、３価または多価であってよく、配列番号１〜１２、２０〜１７２、および１８６〜４４４のアミノ酸配列を有するＢＬｙＳ結合性ポリペプチドおよび／またはその断片もしくは変異体を１本以上含んでいてもよい。本明細書で用いる「ペプチド」という用語は「ポリペプチド」と同じ意味を有する。
【００５４】
「供給流」：  本発明のＢＬｙＳ結合性ポリペプチドが結合するＢＬｙＳおよびＢＬｙＳ様ポリペプチドは当分野で公知の方法により調製することができ、かかる方法として、限定するものではないが、化学合成；形質転換宿主細胞による生産；天然に存在する細胞または組換えにより形質転換された細菌、酵母、真菌、昆虫細胞、植物細胞および哺乳動物細胞による培地への分泌；遺伝子操作生物（例えば、トランスジェニック哺乳動物）による生産；および非遺伝子操作生物による生産がある。ＢＬｙＳまたはＢＬｙＳ様ポリペプチドを生産された状態のままで含むか、またはそれが生産溶液中に存在することがわかっている溶液、サンプルまたは混合物を「供給流」と呼ぶことがある。
【００５５】
「結合する」という用語は、結合性ポリペプチドが所与の標的を認識してそれと結合するという、標準的手法による測定を意味する。そのような標準的手法として、限定するものではないが、アフィニティークロマトグラフィー、平衡透析、ゲル濾過、固相酵素免疫検定法（ＥＬＩＳＡ）、ＦＡＣＳ分析、および、直接結合測定または他の結合物質との競合アッセイのいずれかによる、結合から生じる分光学的変化（例えば、蛍光異方性を用いる）のモニタリングなどがある。
【００５６】
「特異性」とは、他の標的に比して、ある標的に対してより高い結合親和性を有する本発明の結合性ポリペプチドを指す。かくして、「ＢＬｙＳ標的タンパク質特異性」という用語は、ＢＬｙＳ標的タンパク質ではない別の分子と比べて、ＢＬｙＳ標的タンパク質に対してより高い親和性を有する分子を指す。
【００５７】
その他の用語は以下の本文中で必要に応じて定義される。
【００５８】
詳細な説明
本発明はＢＬｙＳのための新規な結合性分子を提供する。そのような結合性分子は、組織中、または溶液もしくは系中に含まれるＢＬｙＳまたはＢＬｙＳ様ポリペプチドの効率的な検出および単離を可能にする。本明細書に開示するＢＬｙＳ結合性ポリペプチドは、ＢＬｙＳ標的を固定化するためにも使用され、また、ＢＬｙＳ標的タンパク質を含む溶液または系からそれを分離する手段を提供する。本発明の好適な結合性分子は高い親和性（すなわち、低濃度で作用）でもってＢＬｙＳと結合する。
【００５９】
ＢＬｙＳ結合性ポリペプチド
本発明は、Ｂリンパ球刺激因子タンパク質（ＢＬｙＳ）および／またはＢＬｙＳ様ポリペプチドと特異的に結合する新規なポリペプチドならびにポリペプチドのファミリーを提供する。特に、本発明は、ヒトＢＬｙＳ（配列番号１７３および／または１７４）またはヒト単球上に発現されるＢＬｙＳ；マウスＢＬｙＳ（配列番号１７５および／または１７６）またはマウス単球上に発現されるＢＬｙＳ；ラットＢＬｙＳ（配列番号１７７、１７８、１７９および／または１８０に示される可溶型、あるいは、例えばラット単球の表面にある、膜結合型のいずれか）；またはサルＢＬｙＳ（例えば、配列番号１８１および／または１８２のサルＢＬｙＳポリペプチド、可溶型のサルＢＬｙＳ、またはサル単球上に発現されるＢＬｙＳ）、好ましくはヒトＢＬｙＳ、のポリペプチドもしくはポリペプチド断片と特異的に結合するポリペプチドを包含する。
【００６０】
特定の好ましい実施形態において、本発明のＢＬｙＳ結合性ポリペプチドは高い親和性でもってＢＬｙＳおよび／またはＢＬｙＳ様ポリペプチドと結合する。他の実施形態では、本発明のＢＬｙＳ結合性ポリペプチドはＢＬｙＳおよび／またはＢＬｙＳ様ポリペプチドと可逆的に結合する。さらに別の実施形態では、本発明のＢＬｙＳ結合性ポリペプチドはＢＬｙＳおよび／またはＢＬｙＳ様ポリペプチドと不可逆的に結合する。
【００６１】
ポリペプチドに含まれるシステイン残基はジスルフィド結合を形成すると考えられ、このジスルフィド結合のため、これらのシステイン残基を含むポリペプチドは非還元条件下で安定したループ構造を形成するだろう。本発明の特に好適なＢＬｙＳ結合性ポリペプチドは、ＢＬｙＳまたはＢＬｙＳ様ポリペプチドと結合する安定したループ構造やその他の構造を形成するアミノ酸配列を含むポリペプチド分子である。
【００６２】
特定の実施形態において、本発明は、配列番号１〜１２、２０〜１７２、および１８６〜４４４（好ましくは、上記した、また、表１〜８、１４、１５ならびに下記の実施例２、５、６に記載する配列番号１６３〜１７２または４３６〜４４４）からなる群より選択されるアミノ酸配列を含んでなる、あるいは、からなるＢＬｙＳ結合性ポリペプチドに関する。ここに記載する単離されたＢＬｙＳ結合性ポリペプチドの配列の解析は、テトラペプチドＡｓｐ−Ｘａａ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ （配列番号４４６）を含むポリペプチドについての強い選択を示し、それゆえに、最も広範な形態において、本発明は、ポリペプチドＡｓｐ−Ｘａａ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ （配列番号４４６） （式中、ＸａａはＰｒｏ， Ｓｅｒ， Ｔｈｒ， Ｐｈｅ， Ｌｅｕ， Ｔｙｒ， ＣｙｓまたはＡｌａであり、好ましくは、ＰｒｏまたはＳｅｒである）を含んでなる、ＢＬｙＳと結合可能なポリペプチドに関する。
【００６３】
表１〜８に示した特定のＢＬｙＳ結合性ポリペプチドに基づいて、７つのコンセンサス配列（配列番号１〜７）が決定された。特定の実施形態では、本発明のＢＬｙＳ結合性ポリペプチドはこれらの配列を１つ以上含んでなる。そのような好適なＢＬｙＳ結合性ポリペプチドには、不変のＣｙｓ残基間で環状構造またはループ構造を形成する可能性があり、下記のＡ〜Ｅ（配列番号１〜５）から選択されるアミノ酸配列を含んでなる、あるいは、からなるポリペプチドが含まれる：
（Ａ） Ｘｌ−Ｘ２−Ｘ３−Ｃｙｓ−Ｘ５−Ｐｈｅ−Ｘ７−Ｔｒｐ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−Ｘｌｌ−Ｘ１２−Ｘ１３ （配列番号１）
（式中、
Ｘ１はＡｌａ， Ａｓｎ， ＬｙｓまたはＳｅｒであり；
Ｘ２はＡｌａ， Ｇｌｕ， Ｍｅｔ， ＳｅｒまたはＶａｌであり；
Ｘ３はＡｌａ， Ａｓｎ， ＬｙｓまたはＰｒｏ（好ましくは、Ｌｙｓ）であり；
Ｘ５はＰｈｅ， ＴｒｐまたはＴｙｒ（好ましくは、Ｔｙｒ）であり；
Ｘ７はＰｒｏまたはＴｙｒ（好ましくは、Ｐｒｏ）であり；
Ｘ１１はＡｌａ， Ｇｌｎ， Ｈｉｓ， ＰｈｅまたはＶａｌであり；
Ｘ１２はＡｓｎ， Ｇｌｎ， Ｇｌｙ， Ｈｉｓ， ＳｅｒまたはＶａｌであり；
Ｘ１３はＡｌａ， Ａｓｎ， Ｇｌｙ， Ｉｌｅ， ＰｒｏまたはＳｅｒである）；
ただし、該ポリペプチドはＢＬｙＳおよび／またはＢＬｙＳ様ポリペプチドと結合する；
【００６４】
（Ｂ） Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｃｙｓ−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０−Ｃｙｓ−Ｘ１２−Ｘ１３−Ｘ１４ （配列番号２）
（式中、
Ｘ１はＡｌａ， Ａｓｐ， Ｇｌｎ， Ｇｌｕ， Ｇｌｙ， Ｈｉｓ， Ｉｌｅ， Ｌｅｕ， Ｌｙｓ， Ｍｅｔ， Ｐｈｅ， Ｐｒｏ， Ｓｅｒ， Ｔｈｒ， Ｔｒｐ， Ｔｙｒ， Ｖａｌであるか、または存在せず；
Ｘ２はＡｌａ， Ａｓｎ， Ａｓｐ， Ｇｌｎ， Ｇｌｙ， Ｈｉｓ， Ｉｌｅ， Ｌｅｕ， Ｌｙｓ， Ｍｅｔ， Ｐｈｅ， Ｐｒｏ， Ｓｅｒ， Ｔｈｒ， Ｔｒｐ， ＴｙｒまたはＶａｌであり；
Ｘ３はＡｌａ， Ａｒｇ， Ａｓｎ， Ａｓｐ， Ｇｌｎ， Ｇｌｕ， Ｇｌｙ， Ｈｉｓ， Ｉｌｅ， Ｌｅｕ， Ｌｙｓ， Ｍｅｔ， Ｐｈｅ， Ｐｒｏ， Ｓｅｒ， Ｔｒｐ， ＴｙｒまたはＶａｌ（好ましくは、Ａｓｐ）であり；
Ｘ５はＡｓｐ， Ｉｌｅ， ＬｅｕまたはＴｙｒ（好ましくは、ＡｓｐまたはＬｅｕ）であり；
Ｘ６はＡｒｇ， Ａｓｐ， Ｇｌｕ， Ｈｉｓ， Ｉｌｅ， Ｌｅｕ， Ｌｙｓ， Ｐｈｅ， Ｐｒｏ， ＴｙｒまたはＶａｌ（好ましくは、ＧｌｕまたはＬｅｕ）であり；
Ｘ７はＨｉｓ， Ｌｅｕ， ＬｙｓまたはＰｈｅ（好ましくは、ＨｉｓまたはＬｅｕ）であり；
Ｘ８はＬｅｕ， ＰｒｏまたはＴｈｒ（好ましくは、ＴｈｒまたはＰｒｏ）であり；
Ｘ９はＡｒｇ， Ａｓｎ， Ｇｌｙ， Ｈｉｓ， Ｉｌｅ， Ｌｙｓ， ＭｅｔまたはＴｒｐ（好ましくは、Ｌｙｓ）であり；
Ｘ１０はＡｌａ， Ｇｌｎ， Ｇｌｕ， Ｇｌｙ， Ｈｉｓ， Ｉｌｅ， Ｌｅｕ， Ｍｅｔ， Ｐｈｅ， Ｓｅｒ， Ｔｒｐ， ＴｙｒまたはＶａｌであり；
Ｘｌ２はＡｓｐ， Ｇｌｎ， Ｇｌｕ， Ｇｌｙ， Ｉｌｅ， Ｌｅｕ， Ｌｙｓ， Ｐｈｅ， Ｓｅｒ， Ｔｒｐ， ＴｙｒまたはＶａｌであり；
Ｘ１３はＡｌａ， Ａｒｇ， Ａｓｎ， Ａｓｐ， Ｇｌｎ， Ｇｌｕ， Ｇｌｙ， Ｈｉｓ， Ｌｅｕ， Ｌｙｓ， Ｍｅｔ， Ｐｈｅ， Ｐｒｏ， Ｓｅｒ， Ｔｈｒ， Ｔｒｐ， ＴｙｒまたはＶａｌであり；
Ｘ１４はＡｌａ， Ａｒｇ， Ａｓｎ， Ａｓｐ， Ｇｌｎ， Ｇｌｕ， Ｇｌｙ， Ｈｉｓ， Ｉｌｅ， Ｌｅｕ， Ｌｙｓ， Ｐｈｅ， Ｐｒｏ， Ｔｒｐ， Ｔｙｒ， Ｖａｌであるか、または存在しない）；
ただし、該ポリペプチドはＢＬｙＳおよび／またはＢＬｙＳ様ポリペプチドと結合する；
【００６５】
（Ｃ） Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｃｙｓ−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０−Ｘ１１−Ｃｙｓ−Ｘ１３−Ｘ１４−Ｘ１５ （配列番号３）
（式中、
Ｘ１はＡｌａ， Ａｒｇ， Ａｓｎ， Ａｓｐ， Ｌｅｕ， Ｌｙｓ， Ｐｈｅ， Ｐｒｏ， ＳｅｒまたはＴｈｒであり；
Ｘ２はＡｓｎ， Ａｓｐ， Ｇｌｎ， Ｈｉｓ， Ｉｌｅ， Ｌｙｓ， Ｐｒｏ， ＴｈｒまたはＴｒｐであり；
Ｘ３はＡｌａ， Ａｒｇ， Ａｓｎ， Ｇｌｎ， Ｇｌｕ， Ｈｉｓ， Ｐｈｅ， ＰｒｏまたはＴｈｒ（好ましくは、Ａｌａ）であり；
Ｘ５はＡｓｎ， Ａｓｐ， Ｐｒｏ， ＳｅｒまたはＴｈｒ（好ましくは、Ａｓｐ）であり；
Ｘ６はＡｒｇ， Ａｓｐ， Ｉｌｅ， Ｌｅｕ， Ｍｅｔ， ＰｒｏまたはＶａｌ（好ましくは、Ｉｌｅ）であり；
Ｘ７はＡｌａ， Ｉｌｅ， Ｌｅｕ， Ｐｒｏ， ＴｈｒまたはＶａｌ（好ましくは、ＶａｌまたはＬｅｕ）であり；
Ｘ８はＡｓｎ， Ｈｉｓ， Ｉｌｅ， Ｌｅｕ， Ｌｙｓ， ＰｈｅまたはＴｈｒ（好ましくは、Ｔｈｒ）であり；
Ｘ９はＡｓｎ， Ｇｌｕ， Ｇｌｙ， Ｈｉｓ， Ｌｅｕ， Ｌｙｓ， Ｍｅｔ， ＰｒｏまたはＴｈｒ（好ましくは、Ｌｅｕ）であり；
Ｘ１０はＡｒｇ， Ａｓｎ， Ａｓｐ， Ｇｌｎ， Ｇｌｕ， Ｇｌｙ， Ｉｌｅ， Ｌｙｓ， Ｍｅｔ， Ｐｒｏ， ＳｅｒまたはＴｒｐであり；
Ｘ１１はＡｒｇ， Ｇｌｕ， Ｇｌｙ， Ｌｙｓ， Ｐｈｅ， Ｓｅｒ， ＴｒｐまたはＴｙｒ（好ましくは、Ｓｅｒ）であり；
Ｘ１３はＧｌｎ， Ｇｌｕ， Ｉｌｅ， Ｌｅｕ， Ｐｈｅ， Ｐｒｏ， Ｓｅｒ， ＴｙｒまたはＶａｌ（好ましくは、Ｖａｌ）であり；
Ｘ１４はＡｓｎ， Ｇｌｙ， Ｉｌｅ， Ｐｈｅ， Ｐｒｏ， Ｔｈｒ， ＴｒｐまたはＴｙｒであり；
Ｘ１５はＡｓｎ， Ａｓｐ， Ｇｌｕ， Ｌｅｕ， Ｌｙｓ， Ｍｅｔ， ＰｒｏまたはＴｈｒ（好ましくは、ＧｌｕまたはＰｒｏ）である）；
ただし、該ポリペプチドはＢＬｙＳおよび／またはＢＬｙＳ様ポリペプチドと結合する；
【００６６】
（Ｄ） Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｃｙｓ−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０−Ｘ１１−Ｘ１２−Ｃｙｓ−Ｘ１４−Ｘ１５−Ｘ１６ （配列番号４）
（式中、
Ｘ１はＡｓｎ， Ａｓｐ， Ｈｉｓ， Ｌｅｕ， Ｐｈｅ， Ｐｒｏ， Ｓｅｒ， Ｔｙｒであるか、または存在せず（好ましくは、Ｓｅｒ）；
Ｘ２はＡｒｇ， Ａｓｎ， Ａｓｐ， Ｈｉｓ， Ｐｈｅ， ＳｅｒまたはＴｒｐ（好ましくは、Ａｒｇ）であり；
Ｘ３はＡｓｎ， Ａｓｐ， Ｌｅｕ， Ｐｒｏ， ＳｅｒまたはＶａｌ（好ましくは、ＡｓｎまたはＡｓｐ）であり；
Ｘ５はＡｓｐ， Ｇｌｎ， Ｈｉｓ， Ｉｌｅ， Ｌｅｕ， Ｌｙｓ， Ｍｅｔ， ＰｈｅまたはＴｈｒであり；
Ｘ６はＨｉｓ， Ｉｌｅ， Ｌｅｕ， Ｍｅｔ， Ｐｈｅ， Ｐｒｏ， ＴｒｐまたはＴｙｒであり；
Ｘ７はＡｓｐ， Ｈｉｓ， ＬｅｕまたはＳｅｒ（好ましくは、Ａｓｐ）であり；
Ｘ８はＡｌａ， Ａｒｇ， Ａｓｐ， Ｇｌｕ， Ｌｅｕ， Ｐｈｅ， ＰｒｏまたはＴｈｒ（好ましくは、ＧｌｕまたはＰｒｏ）であり；
Ｘ９はＡｌａ， Ａｒｇ， ＡｓｎまたはＬｅｕ（好ましくは、Ｌｅｕ）であり；
Ｘｌ０はＩｌｅ， Ｌｅｕ， Ｍｅｔ， Ｐｒｏ， ＳｅｒまたはＴｈｒ（好ましくは、Ｔｈｒ）であり；
Ｘ１１はＡｌａ， Ａｒｇ， Ａｓｎ， Ｇｌｙ， Ｈｉｓ， Ｌｙｓ， ＳｅｒまたはＴｙｒであり；
Ｘ１２はＡｌａ， Ａｒｇ， Ａｓｎ， Ｇｌｎ， Ｌｅｕ， Ｍｅｔ， Ｓｅｒ， Ｔｒｐ， ＴｙｒまたはＶａｌであり；
Ｘ１４はＡｓｐ， Ｇｌｙ， Ｌｅｕ， Ｐｈｅ， ＴｙｒまたはＶａｌ（好ましくは、Ｌｅｕ）であり；
Ｘ１５はＡｓｎ， Ｈｉｓ， Ｌｅｕ， ＰｒｏまたはＴｙｒ（好ましくは、Ｈｉｓ、ＬｅｕまたはＰｒｏ）であり；
Ｘ１６はＡｓｎ， Ａｓｐ， Ｈｉｓ， Ｐｈｅ， ＳｅｒまたはＴｙｒ（好ましくは、ＡｓｐまたはＳｅｒ）である）；
ただし、該ポリペプチドはＢＬｙＳおよび／またはＢＬｙＳ様ポリペプチドと結合する；
【００６７】
（Ｅ） Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｃｙｓ−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０−Ｘ１１−Ｘ１２−Ｘ１３−Ｘ１４−Ｃｙｓ−Ｘ１６−Ｘ１７−Ｘ１８ （配列番号５）
（式中、
Ｘ１はＡｒｇ， Ａｓｐ， Ｇｌｙ， Ｈｉｓ， Ｌｅｕ， Ｐｈｅ， Ｐｒｏ， Ｓｅｒ， Ｔｒｐ， Ｔｙｒであるか、または存在せず（好ましくは、Ａｒｇ）；
Ｘ２はＡｌａ， Ａｒｇ， Ａｓｎ， Ａｓｐ， Ｇｌｙ， Ｐｒｏ， Ｓｅｒであるか、または存在せず（好ましくは、Ａｓｎ、Ａｓｐ、ＧｌｙまたはＰｒｏ）；
Ｘ３はＡｒｇ， Ａｓｎ， Ｇｌｎ， Ｇｌｕ， Ｇｌｙ， Ｌｙｓ， Ｍｅｔ， Ｐｒｏ， ＴｒｐまたはＶａｌ（好ましくは、ＧｌｙまたはＭｅｔ）であり；
Ｘ５はＡｒｇ， Ａｓｎ， Ｇｌｎ， Ｇｌｕ， Ｈｉｓ， Ｌｅｕ， Ｐｈｅ， Ｐｒｏ， Ｔｒｐ， ＴｙｒまたはＶａｌ（好ましくは、Ｔｒｐ、ＴｙｒまたはＶａｌ）であり；
Ｘ６はＡｒｇ， Ａｓｐ， Ｇｌｎ， Ｇｌｙ， Ｉｌｅ， Ｌｙｓ， Ｐｈｅ， Ｔｈｒ， ＴｒｐまたはＴｙｒ（好ましくは、Ａｓｐ）であり；
Ｘ７はＡｌａ， Ａｒｇ， Ａｓｐ， Ｇｌｕ， Ｇｌｙ， Ｌｅｕ， ＳｅｒまたはＴｙｒ（好ましくは、Ａｓｐ）であり；
Ｘ８はＡｓｐ， Ｇｌｎ， Ｇｌｕ， Ｌｅｕ， Ｍｅｔ， Ｐｈｅ， Ｐｒｏ， ＳｅｒまたはＴｙｒ（好ましくは、Ｌｅｕ）であり；
Ｘ９はＡｓｐ， Ｌｅｕ， Ｐｒｏ， ＴｈｒまたはＶａｌ（好ましくは、ＬｅｕまたはＴｈｒ）であり；
Ｘ１０はＡｒｇ， Ｇｌｎ， Ｈｉｓ， Ｉｌｅ， Ｌｅｕ， Ｌｙｓ， Ｍｅｔ， Ｐｈｅ， Ｔｈｒ， ＴｒｐまたはＴｙｒ（好ましくは、ＬｙｓまたはＴｈｒ）であり；
Ｘ１１はＡｌａ， Ａｒｇ， Ａｓｎ， Ｇｌｎ， Ｇｌｕ， Ｈｉｓ， Ｌｅｕ， Ｌｙｓ， ＭｅｔまたはＴｈｒ（好ましくは、ＡｒｇまたはＬｅｕ）であり；
Ｘ１２はＡｌａ， Ａｓｎ， Ｇｌｎ， Ｇｌｙ， Ｌｅｕ， Ｌｙｓ， Ｐｈｅ， Ｐｒｏ， Ｔｈｒ， ＴｒｐまたはＴｙｒ（好ましくは、ＴｈｒまたはＴｒｐ）であり；
Ｘ１３はＡｌａ， Ａｒｇ， Ｇｌｎ， Ｈｉｓ， Ｌｙｓ， Ｍｅｔ， Ｐｈｅ， Ｐｒｏ， Ｔｈｒ， ＴｒｐまたはＴｙｒ（好ましくは、ＭｅｔまたはＰｈｅ）であり；
Ｘ１４はＡｒｇ， Ｇｌｎ， Ｇｌｕ， Ｇｌｙ， Ｈｉｓ， Ｌｅｕ， Ｍｅｔ， Ｐｈｅ， Ｐｒｏ， Ｓｅｒ， Ｔｈｒ， ＴｙｒまたはＶａｌ（好ましくは、Ｖａｌ）であり；
Ｘ１６はＡｒｇ， Ａｓｐ， Ｇｌｙ， Ｈｉｓ， Ｌｙｓ， Ｍｅｔ， Ｐｈｅ， Ｐｒｏ， ＳｅｒまたはＴｒｐ（好ましくは、Ｍｅｔ）であり；
Ｘ１７はＡｒｇ， Ａｓｎ， Ａｓｐ， Ｇｌｙ， Ｈｉｓ， Ｐｈｅ， Ｐｒｏ， Ｓｅｒ， ＴｒｐまたはＴｙｒ（好ましくは、Ａｒｇ、ＨｉｓまたはＴｙｒ）であり；
Ｘｌ８はＡｌａ， Ａｒｇ， Ａｓｎ， Ａｓｐ， Ｈｉｓ， Ｌｅｕ， ＰｈｅまたはＴｒｐ（好ましくは、ＨｉｓまたはＡｓｎ）である）；
ただし、該ポリペプチドはＢＬｙＳおよび／またはＢＬｙＳ様ポリペプチドと結合する。
【００６８】
さらなる好適な実施形態には、下記のＦおよびＧ（配列番号６および７）から選択されるアミノ酸配列を含んでなる、あるいは、からなる線状ポリペプチドが含まれる：
（Ｆ） Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０−Ｘ１１−Ｘ１２ （配列番号６）
（式中、
Ｘ１はＡｌａ， Ａｒｇ， Ｇｌｙ， Ｈｉｓ， Ｌｅｕ， Ｌｙｓ， Ｍｅｔ， Ｐｈｅ， Ｔｒｐ， ＴｙｒまたはＶａｌ（好ましくは、Ｇｌｙ、ＴｙｒまたはＶａｌ）であり；
Ｘ２はＡｌａ， Ａｒｇ， Ｇｌｎ， Ｈｉｓ， Ｉｌｅ， Ｌｅｕ， Ｐｈｅ， Ｔｈｒ， ＴｒｐまたはＴｙｒ（好ましくは、ＨｉｓまたはＴｙｒ）であり；
Ｘ３はＡｌａ， Ａｓｐ， Ｌｙｓ， Ｐｈｅ， Ｔｈｒ， ＴｒｐまたはＴｙｒ（好ましくは、ＡｓｐまたはＴｙｒ）であり；
Ｘ４はＡｒｇ， Ａｓｐ， Ｇｌｎ， Ｌｙｓ， Ｍｅｔ， Ｐｈｅ， Ｐｒｏ， Ｓｅｒ， ＴｙｒまたはＶａｌ（好ましくは、ＡｓｐまたはＧｌｎ）であり；
Ｘ５はＡｓｐ， Ｌｅｕ， Ｌｙｓ， Ｐｈｅ， Ｐｒｏ， ＳｅｒまたはＶａｌ（好ましくは、ＬｅｕまたはＳｅｒ）であり；
Ｘ６はＨｉｓ， Ｉｌｅ， Ｌｅｕ， Ｐｒｏ， ＳｅｒまたはＴｈｒ（好ましくは、ＬｅｕまたはＴｈｒ）であり；
Ｘ７はＡｒｇ， Ｇｌｙ， Ｈｉｓ， Ｌｅｕ， Ｌｙｓ， ＭｅｔまたはＴｈｒ（好ましくは、ＬｙｓまたはＴｈｒ）であり；
Ｘ８はＡｌａ， Ａｒｇ， Ａｓｎ， Ｉｌｅ， Ｌｅｕ， Ｌｙｓ， ＭｅｔまたはＴｈｒ（好ましくは、ＬｅｕまたはＬｙｓ）であり；
Ｘ９はＡｌａ， Ａｓｎ， Ａｒｇ， Ａｓｐ， Ｇｌｕ， Ｇｌｙ， Ｈｉｓ， Ｌｅｕ， Ｍｅｔ， Ｓｅｒ， Ｔｒｐ， ＴｙｒまたはＶａｌ（好ましくは、ＭｅｔまたはＳｅｒ）であり；
Ｘ１０はＩｌｅ， Ｌｅｕ， Ｐｈｅ， Ｓｅｒ， Ｔｈｒ， Ｔｒｐ， ＴｙｒまたはＶａｌ（好ましくは、ＴｈｒまたはＬｅｕ）であり；
ＸｌｌはＡｌａ， Ａｒｇ， Ｇｌｙ， Ｈｉｓ， Ｉｌｅ， Ｌｅｕ， Ｌｙｓ， Ｐｒｏ， Ｓｅｒ， Ｔｈｒ， Ｔｒｐ， ＴｙｒまたはＶａｌ（好ましくは、ＰｒｏまたはＴｈｒ）であり；
Ｘ１２はＡｒｇ， Ａｓｐ， Ｈｉｓ， Ｌｅｕ， Ｌｙｓ， Ｍｅｔ， Ｐｈｅ， Ｐｒｏ， Ｓｅｒ， Ｔｒｐ， ＴｙｒまたはＶａｌ（好ましくは、ＡｒｇまたはＰｒｏ）である）；
ただし、該ポリペプチドはＢＬｙＳおよび／またはＢＬｙＳ様ポリペプチドと結合する；
【００６９】
（Ｇ） Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０−Ｘ１１−Ｘ１２−Ｘ１３ （配列番号７）
（式中、
Ｘ１はＡｓｐ， Ｇｌｎ， Ｇｌｕ， Ｇｌｙ， Ｈｉｓ， Ｌｙｓ， ＭｅｔまたはＴｒｐ（好ましくは、ＧｌｕまたはＬｙｓ）であり；
Ｘ２はＡｒｇ， Ｇｌｎ， Ｈｉｓ， Ｉｌｅ， ＬｅｕまたはＰｒｏ（好ましくは、ＨｉｓまたはＰｒｏ）であり；
Ｘ３はＡｓｐ， Ｇｌｙ， Ｉｌｅ， Ｌｙｓ， Ｔｈｒ， ＴｙｒまたはＶａｌ（好ましくは、Ｔｙｒ）であり；
Ｘ４はＡｓｎ， Ａｓｐ， Ｇｌｎ， Ｇｌｕ， Ｍｅｔ， Ｐｒｏ， ＳｅｒまたはＴｙｒ（好ましくは、ＡｓｐまたはＧｌｎ）であり；
Ｘ５はＡｓｎ， Ａｓｐ， Ｈｉｓ， Ｉｌｅ， Ｌｅｕ， Ｍｅｔ， Ｐｒｏ， ＴｈｒまたはＶａｌ（好ましくは、ＡｓｎまたはＴｈｒ）であり；
Ｘ６はＡｓｐ， Ｇｌｕ， Ｈｉｓ， Ｌｅｕ， Ｌｙｓ， ＰｒｏまたはＶａｌ（好ましくは、ＡｓｐまたはＰｒｏ）であり；
Ｘ７はＡｒｇ， Ａｓｎ， Ｇｌｎ， Ｈｉｓ， Ｉｌｅ， Ｌｅｕ， Ｍｅｔ， ＰｒｏまたはＴｈｒ（好ましくは、ＩｌｅまたはＰｒｏ）であり；
Ｘ８はＧｌｎ， Ｇｌｙ， Ｈｉｓ， Ｌｅｕ， Ｍｅｔ， ＳｅｒまたはＴｈｒ（好ましくは、ＬｅｕまたはＴｈｒ）であり；
Ｘ９はＡｓｎ， Ｇｌｎ， Ｇｌｙ， Ｈｉｓ， Ｌｅｕ， Ｌｙｓ， ＳｅｒまたはＴｈｒ（好ましくは、Ｌｙｓ）であり；
Ｘ１０はＡｌａ， Ｇｌｙ， Ｉｌｅ， Ｌｅｕ， Ｌｙｓ， ＭｅｔまたはＰｈｅ（好ましくは、ＧｌｙまたはＭｅｔ）であり；
Ｘ１１はＡｌａ， Ｇｌｕ， Ｈｉｓ， Ｉｌｅ， Ｌｅｕ， Ｍｅｔ， Ｓｅｒ， Ｔｈｒ， Ｔｒｐ， ＴｙｒまたはＶａｌ（好ましくは、ＡｌａまたはＴｈｒ）であり；
Ｘ１２はＡｒｇ， Ｇｌｎ， Ｇｌｕ， Ｇｌｙ， Ｈｉｓ， Ｉｌｅ， Ｌｙｓ， ＴｙｒまたはＶａｌ（好ましくは、ＡｒｇまたはＨｉｓ）であり；
Ｘ１３はＡｒｇ， Ａｓｎ， Ｇｌｕ， Ｈｉｓ， Ｉｌｅ， Ｓｅｒ， Ｔｈｒ， ＴｒｐまたはＶａｌ（好ましくは、Ｈｉｓ）である）；
ただし、該ポリペプチドはＢＬｙＳおよび／またはＢＬｙＳ様ポリペプチドと結合する。
【００７０】
前記ポリペプチドはＮ−末端とＣ−末端のいずれか一方または両方に追加のアミノ酸が結合されていてもよい。
【００７１】
ループ構造を形成する可能性があるポリペプチドを含むライブラリー（すなわち、ＴＮ６、ＴＮ７、ＴＮ８、ＴＮ９、ＴＮ１０およびＴＮ１２と称するライブラリー）の分離物からの配列情報および結合データを検討すると、ループ構造を形成しうる一連のＢＬｙＳ結合性ポリペプチドが同定される。特定の実施形態において、本発明のＢＬｙＳ結合性ポリペプチドは下記のＨ〜Ｌ（配列番号８〜１２）から選択されるアミノ酸配列を含んでなる、あるいは、からなる：
（Ｈ） Ｃｙｓ−Ｘ２−Ｐｈｅ−Ｘ４−Ｔｒｐ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ （配列番号８）
（式中、
Ｘ２はＰｈｅ， ＴｒｐまたはＴｙｒ（好ましくは、Ｔｙｒ）であり；
Ｘ４はＰｒｏまたはＴｙｒ（好ましくは、Ｐｒｏ）である）；
【００７２】
（Ｉ） Ｃｙｓ−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｃｙｓ （配列番号９）
（式中、
Ｘ２はＡｓｐ， Ｉｌｅ， ＬｅｕまたはＴｙｒ（好ましくは、ＡｓｐまたはＬｅｕ）であり；
Ｘ３はＡｒｇ， Ａｓｐ， Ｇｌｕ， Ｈｉｓ， Ｉｌｅ， Ｌｅｕ， Ｌｙｓ， Ｐｈｅ， Ｐｒｏ， ＴｙｒまたはＶａｌ（好ましくは、ＧｌｕまたはＬｅｕ）であり；
Ｘ４はＨｉｓ， Ｌｅｕ， ＬｙｓまたはＰｈｅ（好ましくは、ＨｉｓまたはＬｅｕ）であり；
Ｘ５はＬｅｕ， ＰｒｏまたはＴｈｒ（好ましくは、ＴｈｒまたはＰｒｏ）であり；
Ｘ６はＡｒｇ， Ａｓｎ， Ｇｌｙ， Ｈｉｓ， Ｉｌｅ， Ｌｙｓ， ＭｅｔまたはＴｒｐ（好ましくは、Ｌｙｓ）であり；
Ｘ７はＡｌａ， Ａｓｎ， Ｇｌｎ， Ｇｌｕ， Ｇｌｙ， Ｈｉｓ， Ｉｌｅ， Ｌｅｕ， Ｍｅｔ， Ｐｈｅ， Ｓｅｒ， Ｔｒｐ， ＴｙｒまたはＶａｌである）；
【００７３】
（Ｊ） Ｃｙｓ−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｃｙｓ （配列番号１０）
（式中、
Ｘ２はＡｓｎ， Ａｓｐ， Ｐｒｏ， ＳｅｒまたはＴｈｒ（好ましくは、Ａｓｐ）であり；
Ｘ３はＡｒｇ， Ａｓｐ， Ｉｌｅ， Ｌｅｕ， Ｍｅｔ， ＰｒｏまたはＶａｌ（好ましくは、Ｉｌｅ）であり；
Ｘ４はＡｌａ， Ｉｌｅ， Ｌｅｕ， Ｐｒｏ， ＴｈｒまたはＶａｌ（好ましくは、ＶａｌまたはＬｅｕ）であり；
Ｘ５はＡｓｎ， Ｈｉｓ， Ｉｌｅ， Ｌｅｕ， Ｌｙｓ， ＰｈｅまたはＴｈｒ（好ましくは、Ｔｈｒ）であり；
Ｘ６はＡｓｎ， Ｇｌｕ， Ｇｌｙ， Ｈｉｓ， Ｌｅｕ， Ｌｙｓ， Ｍｅｔ， ＰｒｏまたはＴｈｒ（好ましくは、Ｌｅｕ）であり；
Ｘ７はＡｒｇ， Ａｓｎ， Ａｓｐ， Ｇｌｎ， Ｇｌｕ， Ｇｌｙ， Ｉｌｅ， Ｌｙｓ， Ｍｅｔ， Ｐｒｏ， ＳｅｒまたはＴｒｐであり；
Ｘ８はＡｒｇ， Ｇｌｕ， Ｇｌｙ， Ｌｙｓ， Ｐｈｅ， Ｓｅｒ， ＴｒｐまたはＴｙｒ（好ましくは、Ｓｅｒ）である）；
【００７４】
（Ｋ） Ｃｙｓ−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−Ｃｙｓ （配列番号１１）
（式中、
Ｘ２はＡｓｐ， Ｇｌｎ， Ｈｉｓ， Ｉｌｅ， Ｌｅｕ， Ｌｙｓ， Ｍｅｔ， ＰｈｅまたはＴｈｒであり；
Ｘ３はＨｉｓ， Ｉｌｅ， Ｌｅｕ， Ｍｅｔ， Ｐｈｅ， Ｐｒｏ， ＴｒｐまたはＴｙｒであり；
Ｘ４はＡｓｐ， Ｈｉｓ， ＬｅｕまたはＳｅｒ（好ましくは、Ａｓｐ）であり；
Ｘ５はＡｌａ， Ａｒｇ， Ａｓｐ， Ｇｌｕ， Ｌｅｕ， Ｐｈｅ， ＰｒｏまたはＴｈｒ（好ましくは、ＧｌｕまたはＰｒｏ）であり；
Ｘ６はＡｌａ， Ａｒｇ， ＡｓｎまたはＬｅｕ（好ましくは、Ｌｅｕ）であり；
Ｘ７はＩｌｅ， Ｌｅｕ， Ｍｅｔ， Ｐｒｏ， ＳｅｒまたはＴｈｒ（好ましくは、Ｔｈｒ）であり；
Ｘ８はＡｌａ， Ａｒｇ， Ａｓｎ， Ｇｌｙ， Ｈｉｓ， Ｌｙｓ， ＳｅｒまたはＴｙｒであり；
Ｘ９はＡｌａ， Ａｒｇ， Ａｓｎ， Ｇｌｎ， Ｌｅｕ， Ｍｅｔ， Ｓｅｒ， Ｔｒｐ， ＴｙｒまたはＶａｌである）；
【００７５】
（Ｌ） Ｃｙｓ−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０−Ｘ１１−Ｃｙｓ （配列番号１２）
（式中、
Ｘ２はＡｒｇ， Ａｓｎ， Ｇｌｎ， Ｇｌｕ， Ｈｉｓ， Ｌｅｕ， Ｐｈｅ， Ｐｒｏ， Ｔｒｐ， ＴｙｒまたはＶａｌ（好ましくは、Ｔｒｐ、ＴｙｒまたはＶａｌ）であり；
Ｘ３はＡｒｇ， Ａｓｐ， Ｇｌｎ， Ｇｌｙ， Ｉｌｅ， Ｌｙｓ， Ｐｈｅ， Ｔｈｒ， ＴｒｐまたはＴｙｒ（好ましくは、Ａｓｐ）であり；
Ｘ４はＡｌａ， Ａｒｇ， Ａｓｐ， Ｇｌｕ， Ｇｌｙ， Ｌｅｕ， ＳｅｒまたはＴｙｒ（好ましくは、Ａｓｐ）であり；
Ｘ５はＡｓｐ， Ｇｌｎ， Ｇｌｕ， Ｌｅｕ， Ｍｅｔ， Ｐｈｅ， Ｐｒｏ， ＳｅｒまたはＴｙｒ（好ましくは、Ｌｅｕ）であり；
Ｘ６はＡｓｐ， Ｌｅｕ， Ｐｒｏ， ＴｈｒまたはＶａｌ（好ましくは、ＬｅｕまたはＴｈｒ）であり；
Ｘ７はＡｒｇ， Ｇｌｎ， Ｈｉｓ， Ｉｌｅ， Ｌｅｕ， Ｌｙｓ， Ｍｅｔ， Ｐｈｅ， Ｔｈｒ， ＴｒｐまたはＴｙｒ（好ましくは、ＬｙｓまたはＴｈｒ）であり；
Ｘ８はＡｌａ， Ａｒｇ， Ａｓｎ， Ｇｌｎ， Ｇｌｕ， Ｈｉｓ， Ｌｅｕ， Ｌｙｓ， ＭｅｔまたはＴｈｒ（好ましくは、ＡｒｇまたはＬｅｕ）であり；
Ｘ９はＡｌａ， Ａｓｎ， Ｇｌｎ， Ｇｌｙ， Ｌｅｕ， Ｌｙｓ， Ｐｈｅ， Ｐｒｏ， Ｔｈｒ， ＴｒｐまたはＴｙｒ（好ましくは、ＴｈｒまたはＴｒｐ）であり；
Ｘｌ０はＡｌａ， Ａｒｇ， Ｇｌｎ， Ｈｉｓ， Ｌｙｓ， Ｍｅｔ， Ｐｈｅ， Ｐｒｏ， Ｔｈｒ， ＴｒｐまたはＴｙｒ（好ましくは、ＭｅｔまたはＰｈｅ）であり；
Ｘ１１はＡｒｇ， Ｇｌｎ， Ｇｌｕ， Ｇｌｙ， Ｈｉｓ， Ｌｅｕ， Ｍｅｔ， Ｐｈｅ， Ｐｒｏ， Ｓｅｒ， Ｔｈｒ， ＴｙｒまたはＶａｌ（好ましくは、Ｖａｌ）である）；
ただし、前記ポリペプチドはＢＬｙＳおよび／またはＢＬｙＳ様ポリペプチドと結合する。
【００７６】
本発明のさらに好適な実施形態において、ＢＬｙＳ結合性ポリペプチドは下記のアミノ酸配列Ｍ（配列番号４４７）を含んでなる：
（Ｍ） Ａｌａ−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ａｓｐ−Ｘ６−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｘ９−Ｌｅｕ−Ｘｌｌ−Ｘｌ２−Ｘｌ３−Ｘｌ４ （配列番号４４７）（式中、
Ｘ２はＡｓｎ， Ｓｅｒ， Ｔｙｒ， Ａｓｐ， Ｐｈｅ， Ｉｌｅ， Ｇｌｎ， Ｈｉｓ， Ｐｒｏ， Ｌｙｓ， Ｌｅｕ， Ｍｅｔ， Ｔｈｒ， Ｖａｌ， Ｇｌｕ， Ａｌａ， Ｇｌｙ， ＣｙｓまたはＴｒｐ（すなわち、Ａｒｇ以外の任意のアミノ酸；好ましくは、Ａｓｎ）であり；
Ｘ３はＴｒｐ， Ｇｌｕ， Ｌｙｓ， Ｃｙｓ， Ｌｅｕ， Ａｌａ， Ａｒｇ， ＧｌｙまたはＳｅｒ（好ましくは、Ｔｒｐ）であり；
Ｘ４はＴｙｒ， Ｐｈｅ， Ｇｌｕ， ＣｙｓまたはＡｓｎ（好ましくは、Ｔｙｒ）であり；
Ｘ６はＰｒｏ， Ｓｅｒ， Ｔｈｒ， Ｐｈｅ， Ｌｅｕ， Ｔｙｒ， ＣｙｓまたはＡｌａ（好ましくは、ＰｒｏまたはＳｅｒ）であり；
Ｘ９はＬｙｓ， Ａｓｎ， Ｇｌｎ， ＧｌｙまたはＡｒｇ（好ましくは、Ｌｙｓ）であり；
ＸｌｌはＴｒｐ， Ｓｅｒ， Ｔｈｒ， Ａｒｇ， Ｃｙｓ， ＴｙｒまたはＬｙｓ（好ましくは、Ｔｒｐ）であり；
Ｘｌ２はＬｅｕ， Ｐｈｅ， Ｖａｌ， ＩｌｅまたはＨｉｓ（好ましくは、Ｌｅｕ）であり；
Ｘ１３はＰｒｏ， Ｌｅｕ， Ｈｉｓ， Ｓｅｒ， Ａｒｇ， Ａｓｎ， Ｇｌｎ， Ｔｈｒ， Ｖａｌ， Ａｌａ， Ｃｙｓ， Ｉｌｅ， ＰｈｅまたはＴｙｒ（すなわち、Ａｓｐ， Ｇｌｕ， Ｇｌｙ， Ｌｙｓ， ＭｅｔまたはＴｒｐではない；好ましくは、Ｐｒｏ）であり；
Ｘ１４はＡｓｐ， Ｇｌｕ， Ａｓｎ， Ｖａｌ， Ｈｉｓ， Ｇｌｎ， Ａｒｇ， Ｇｌｙ， Ｓｅｒ， Ｔｙｒ， Ａｌａ， Ｃｙｓ， Ｌｙｓ， Ｉｌｅ， ＴｈｒまたはＬｅｕ（すなわち、Ｐｈｅ， Ｍｅｔ， ＰｒｏまたはＴｒｐではない；好ましくは、Ａｓｐ， ＶａｌまたはＧｌｕ）である）。
【００７７】
好適な実施形態は下記の式Ｎのコア配列を含んでなるポリペプチドである：
（Ｎ） Ｘ１−Ｘ２−Ａｓｐ−Ｘ４−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｘ７−Ｌｅｕ−Ｘ９−Ｘ１０ （配列番号４４８）
（式中、
Ｘ１はＴｒｐ， Ｇｌｕ， Ｌｙｓ， Ｃｙｓ， Ｌｅｕ， Ａｌａ， Ａｒｇ， ＧｌｙまたはＳｅｒ（好ましくは、Ｔｒｐ）であり；
Ｘ２はＴｙｒ， Ｐｈｅ， Ｇｌｕ， ＣｙｓまたはＡｓｎ（好ましくは、Ｔｙｒ）であり；
Ｘ４はＰｒｏ， Ｓｅｒ， Ｔｈｒ， Ｐｈｅ， Ｌｅｕ， Ｔｙｒ， ＣｙｓまたはＡｌａ（好ましくは、ＰｒｏまたはＳｅｒ）であり；
Ｘ７はＬｙｓ， Ａｓｎ， Ｇｌｎ， ＧｌｙまたはＡｒｇ（好ましくは、Ｌｙｓ）であり；
Ｘ９はＴｒｐ， Ｓｅｒ， Ｔｈｒ， Ａｒｇ， Ｃｙｓ， ＴｙｒまたはＬｙｓ（好ましくは、Ｔｒｐ）であり；
Ｘ１０はＬｅｕ， Ｐｈｅ， Ｖａｌ， ＩｌｅまたはＨｉｓ（好ましくは、Ｌｅｕ）である）。
【００７８】
本発明に従う特に好適なＢＬｙＳ結合性ポリペプチドは、次のコアペプチド：
Ｔｒｐ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ （配列番号４３６）
を含んでなる。
【００７９】
上記のＢＬｙＳ結合性ポリペプチドは、Ｎ−およびＣ−末端のいずれか一方または両方に追加のアミノ酸が結合されていてもよい。
【００８０】
また、本発明のＢＬｙＳ結合性ポリペプチドは、アミノ末端（Ｎ−末端）キャッピング基または官能基（例えば、アセチル基）をもっていてもよく、こうした基は、例えば、望ましくない反応からアミノ末端アミノ基をブロックしたり、ＢＬｙＳ結合性ポリペプチドを別の分子、マトリックス、樹脂もしくは固相支持体に連結させたりするのに有用である。本発明のＢＬｙＳ結合性ポリペプチドはまた、カルボキシ末端（Ｃ−末端）キャッピング基または官能基（例えば、アミド基）をもっていてもよく、こうした基は、例えば、望ましくない反応からＣ−末端カルボキシル基をブロックしたり、該結合性ポリペプチドを別の分子、マトリックス、樹脂もしくは固相支持体にコンジュゲートさせたりするのに有用な官能基を提供する。好ましくは、Ｎ−および／またはＣ−末端のキャッピング基はポリペプチドリンカー分子である。本発明のＢＬｙＳ結合性ポリペプチドを固相支持体またはクロマトグラフマトリックス材料に固定するのに有用な、特に好適なＣ−末端リンカー分子は、次のアミノ酸配列 Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ （配列番号１３） を含んでなる。もう一つの有用なＣ−末端リンカー、例えば、ペプチドをフルオレセイン化するためのリンカーは、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓである（表１５参照）。
【００８１】
本発明はさらに、ＢＬｙＳおよび／またはＢＬｙＳ様ポリペプチドと結合する能力を保持しながら、例えば分子の安定性を高めるまたは減ずるように、改変されているＢＬｙＳ結合性ポリペプチドを包含する。本発明の改変されたＢＬｙＳ結合性ポリペプチドの例は、２つのシステイン残基のうち一方が非天然アミノ酸で置換されているポリペプチドである。この非天然アミノ酸は、残りのシステイン側鎖と縮合して安定なチオエーテル橋を形成することができ、その結果、環状のＢＬｙＳ結合性ポリペプチドが生成する。このような合成ペプチドの環状チオエーテル分子は、例えば、ＰＣＴ国際公開ＷＯ ９７／４６２５１（参照により本明細書に組み入れるものとする）に記載されるような、当分野で公知の技法を用いてルーチンに製造することができる。
【００８２】
別の実施形態において、本発明は、マトリックス、樹脂または固相支持体に結合された、連結された、あるいは、付着された本発明のＢＬｙＳ結合性ポリペプチドを提供する。ポリペプチドをマトリックス、樹脂または固相支持体に結合、連結または付着させるための技法は当分野で周知である。これらの物質に適するマトリックス、樹脂または固相支持体は、ＢＬｙＳ結合性ポリペプチドが普通に結合、連結または付着するものであれば、当分野で知られたどのような組成のものであってもよく、例えば、クロマトグラフィー用の樹脂やマトリックス（例えば、ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ−４ＦＦアガロースビーズ）、プラスチック製マイクロタイタープレートのウェルの壁面や底面（例えば、固相酵素免疫検定法（ＥＬＩＳＡ）で用いるもの）、またはシリカを基材としたバイオチップなどがあり、これらに限らない。本発明の結合性ポリペプチドを固定するための固相支持体として有用な材料には、ポリアクリルアミド、アガロース、シリカ、ニトロセルロース、紙、プラスチック、ナイロン、金属、およびこれらの組合せが含まれるが、これらに限るものではない。本発明のＢＬｙＳ結合性ポリペプチドは、当分野で公知の技法を用いて、非共有結合あるいは共有結合によってマトリックス、樹脂または固相支持体に固定させることができる。好ましくは、本発明のＢＬｙＳ結合性ポリペプチドを、ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ−４ＦＦアガロースのようなクロマトグラフィー材料に固定させる。より一層好適な実施形態では、本発明のＢＬｙＳ結合性ポリペプチドを、リンカー分子によってクロマトグラフィー材料に連結させる。本発明に従う好適なリンカー分子は次のアミノ酸配列 Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ （配列番号１３） を含むポリペプチドである。最も好ましくは、本発明のアフィニティークロマトグラフィー材料は、アミノ酸配列 Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ （配列番号１３） を有するポリペプチドリンカー分子によりクロマトグラフィー材料に連結された、配列番号１６３〜１７２からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むＢＬｙＳ結合性ポリペプチドを含んでなる。マトリックス、樹脂または他の固相支持体に結合、連結または付着させた本発明のＢＬｙＳ結合性ポリペプチドは、ＢＬｙＳおよび／またはＢＬｙＳ様ポリペプチドを検出、単離および精製する方法で用いられ、特に、アフィニティークロマトグラフィーによってＢＬｙＳおよび／またはＢＬｙＳ様ポリペプチドを精製するのに有用である。
【００８３】
特定の好ましい実施形態では、本発明のＢＬｙＳ結合性ポリペプチドまたは該結合性ポリペプチドを展示するファージは、天然の可溶性三量体の形をしたＢＬｙＳタンパク質と不可逆的に結合する。
【００８４】
特定の好ましい実施形態では、本発明のＢＬｙＳ結合性ポリペプチドまたは該結合性ポリペプチドを展示するファージは、天然の可溶性三量体の形をしたＢＬｙＳタンパク質と可逆的に結合する。
【００８５】
本発明のＢＬｙＳ結合性ポリペプチドは高い親和性でもってＢＬｙＳ標的タンパク質と結合する。特定の実施形態では、本発明のＢＬｙＳ結合性ポリペプチドは、５×１０−２Ｍ、１０−２Ｍ、５×１０−３Ｍ、１０−３Ｍ、５×１０−４Ｍ、１０−４Ｍ、５×１０−５Ｍ、または１０−５Ｍ以下の解離定数つまりＫＤでＢＬｙＳ標的タンパク質と結合する。より好ましくは、本発明のＢＬｙＳ結合性ポリペプチドは、５×１０−９Ｍ、１０−９Ｍ、５×１０−１０Ｍ、１０−１０Ｍ、５×１０−１１Ｍ、１０−１１Ｍ、５×１０−１２Ｍ、１０−１２Ｍ、５×１０−１３Ｍ、１０−１３Ｍ、５×１０−１４Ｍ、１０−１４Ｍ、５×１０−１５Ｍ、または１０−１５Ｍより小さいかまたはそれに等しい解離定数つまりＫＤでＢＬｙＳ標的タンパク質と結合する。
【００８６】
特定の好ましい実施形態においては、本発明のＢＬｙＳ結合性ポリペプチドはＢＬｙＳおよび／またはＢＬｙＳ様ポリペプチドと可逆的に結合して、特定の放出条件下で、結合したＢＬｙＳタンパク質を活性形態（好ましくは、天然の可溶性三量体の形態）で放出する。特定の実施形態では、本発明のＢＬｙＳ結合性ポリペプチドは、１０−１０ｓ−１、５×１０−９ｓ−１、１０−９ｓ−１、５×１０−８ｓ−１、１０−８ｓ−１、５×１０−７ｓ−１、１０−７ｓ−１、５×１０−６ｓ−１、１０−６ｓ−１、５×１０−５ｓ−１、１０−５ｓ−１、５×１０−４ｓ−１、１０−４ｓ−１、５×１０−３ｓ−１、１０−３ｓ−１、５×１０−２ｓ−１、１０−２ｓ−１、５×１０−１ｓ−１、または１０−１ｓ−１より大きいかまたはそれに等しいオフ速度（ｏｆｆ−ｒａｔｅ）つまりｋｏｆｆでＢＬｙＳ標的タンパク質と結合する。
【００８７】
ＫＤおよびオフ速度を決定するための結合実験はいくつかの条件下で行うことができ、例えば、限定するものではないが、［ｐＨ６．０， ０．０１％ Ｔｗｅｅｎ ２０］、［ｐＨ６．０， ０．１％ ゼラチン］、［ｐＨ５．０， ０．０１％ Ｔｗｅｅｎ ２０］、［ｐＨ９．０， ０．１％ Ｔｗｅｅｎ ２０］、［ｐＨ６．０， １５％エチレングリコール， ０．０１％ Ｔｗｅｅｎ ２０］、［ｐＨ５．０， １５％エチレングリコール， ０．０１％ Ｔｗｅｅｎ ２０］、および ［ｐＨ９．０， １５％エチレングリコール， ０．０１％ Ｔｗｅｅｎ ２０］などである。これらの溶液を調製するためのバッファーは当業者によって容易に決定することができ、最終溶液の所望ｐＨに大きく依存する。低ｐＨ溶液（＜ｐＨ５．５）は、例えば、クエン酸バッファー、グリシン−ＨＣｌバッファー、またはコハク酸バッファー中に調製する。高ｐＨ溶液は、例えば、トリス−ＨＣｌ、リン酸バッファー、または重炭酸ナトリウムバッファー中に調製する。例えば、最適なｐＨおよび／または塩濃度を測定することを目的としてＫＤおよびオフ速度を決定するために、いくつかの条件を用いてもよい。
【００８８】
特定の実施形態において、本発明のＢＬｙＳ結合性ポリペプチドは、好ましくは天然の可溶性三量体の形をした、ＢＬｙＳおよび／またはＢＬｙＳ様ポリペプチドと可逆的に結合する。
【００８９】
好適な実施形態では、本発明のＢＬｙＳ結合性ポリペプチドは、天然の可溶性三量体形態のＢＬｙＳとのみ可逆的に結合する。
【００９０】
特定の実施形態において、本発明のＢＬｙＳ結合性ポリペプチドは、好ましくは天然の可溶性三量体の形をした、ＢＬｙＳおよび／またはＢＬｙＳ様ポリペプチドと不可逆的に結合する。
【００９１】
好適な実施形態では、本発明のＢＬｙＳ結合性ポリペプチドは、天然の可溶性三量体形態のＢＬｙＳとのみ不可逆的に結合する。
【００９２】
いくつかのスクリーニングまたはアッセイ法では、単離されたＢＬｙＳ結合性ポリペプチドを使う代わりに、特定のＢＬｙＳ結合性ポリペプチドを展示する組換えバクテリオファージを使用することが可能で、より便利である。そのような方法には、ファージに基づくＥＬＩＳＡプロトコルおよび結合性ポリペプチドを展示するファージのクロマトグラフィー材料への固定化が含まれる。かかるスクリーニングアッセイおよび手順は当分野でルーチンであり、本発明の組換えバクテリオファージを使用する方法に容易に適合させることができる。
【００９３】
本発明はまた、ＢＬｙＳとの結合について、本明細書に開示するＢＬｙＳ結合性ポリペプチド（例えば、配列番号１６３〜１６８のアミノ酸配列を有するポリペプチド）の結合を競合的に阻害するＢＬｙＳ結合性ポリペプチドを包含する。競合的阻害は当分野で公知のどのような方法で測定してもよく、例えば、本明細書に記載する競合結合アッセイを用いる。好ましい実施形態において、該ポリペプチドは、本明細書に開示するＢＬｙＳ結合性ポリペプチド（例えば、配列番号１６３〜１６８のアミノ酸配列を有するポリペプチド）のＢＬｙＳへの結合を、少なくとも９５％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７５％、少なくとも７０％、少なくとも６０％、または少なくとも５０％だけ競合的に阻害する。より好ましい実施形態では、ＢＬｙＳ結合性ポリペプチドは、本明細書に開示するＢＬｙＳ結合性ポリペプチド（例えば、配列番号１６３〜１６８のアミノ酸配列を有するポリペプチド）の天然の可溶性三量体形態のＢＬｙＳへの結合を、少なくとも９５％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７５％、少なくとも７０％、少なくとも６０％、または少なくとも５０％だけ競合的に阻害する。
【００９４】
さらなる実施形態において、本発明は、本発明のＢＬｙＳ結合性ポリペプチドをコードする単離された核酸（好ましくは、ＤＮＡ）を含む組成物を包含する。特定の実施形態では、本発明の核酸分子は配列番号１〜１２、２０〜１７２、および１８６〜４４４に示された本発明のＢＬｙＳ結合性ポリペプチドをコードする。さらなる実施形態では、本発明の核酸分子は配列番号１〜１２、２０〜１７２、および１８６〜４４４のアミノ酸配列を有するポリペプチドのポリペプチド変異体または断片をコードする。さらに追加の実施形態では、本発明の核酸分子は、ＢＬｙＳ結合性ポリペプチドをコードし、該核酸の相補鎖が表１〜８ならびに実施例２および５に記載されるポリペプチド（配列番号１〜１２、２０〜１７２、および１８６〜４４４）をコードするポリヌクレオチド配列と、ストリンジェントな条件下（例えば、６ｘ塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）中約４５℃でのフィルター結合ＤＮＡへのハイブリダイゼーションと、その後の０．２ｘＳＳＣ／０．１％ ＳＤＳ中約５０〜６５℃での１回以上の洗浄）、高度にストリンジェントな条件下（例えば、６ｘＳＳＣ中約４５℃でのフィルター結合核酸へのハイブリダイゼーションと、その後の０．１ｘＳＳＣ／０．２％ ＳＤＳ中約６８℃での１回以上の洗浄）、または、当業者に公知のその他のストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ， Ｆ．Ｍ．ら編， １９８９， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌ．Ｉ， Ｇｒｅｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ， Ｉｎｃ．およびＪｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ｐｐ． ６．３．１−６．３．６および２．１０．３を参照のこと）。
【００９５】
本発明はまた、本発明のＢＬｙＳ結合性ポリペプチド（ならびにその断片および変異体）をコードする単離された核酸分子を含む組換えベクター、該組換えベクターを含む宿主細胞、ならびに該ベクターおよび宿主細胞を作製する方法に関する。本発明はさらに、該組換えベクターを使用して、ＢＬｙＳ結合性ポリペプチドを組換え法により生産することを提供する。
【００９６】
本発明のＢＬｙＳ結合性ポリペプチド、核酸、形質転換宿主細胞、ならびに、遺伝子操作したウイルスおよびファージ（例えば、組換えファージ）は、ＢＬｙＳの検出、単離および精製を含むがこれらに限らない用途を有する。
【００９７】
本発明の別の実施形態では、ＢＬｙＳ結合性ポリペプチドをファージ表面に展示する組換えバクテリオファージも提供される。そのようなファージは当分野で公知の技法を用いてルーチンに作製することができ、例えば、スクリーニング試薬やＢＬｙＳを検出するための試薬として有用である。
【００９８】
ＢＬｙＳ結合性ポリペプチドの生産と修飾
本発明のＢＬｙＳ結合性ポリペプチドは当業界で公知の化学合成法、半合成法、および組換えＤＮＡ法で生産することができる。
【００９９】
特定の実施形態においては、本発明のＢＬｙＳ結合性ポリペプチドは当業界で公知の化学的もしくは半合成的方法によって生産される（Ｋｅｌｌｅｙら， 「遺伝子工学の原理と方法（Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ）」中， Ｓｅｔｌｏｗ， Ｊ．Ｋ．編，（Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ， ＮＹ．， １９９０）， 第１２巻， ｐｐ．１−１９； Ｓｔｅｗａｒｔら， 「固相ペプチド合成（Ｓｏｌｉｄ−Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）」 Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ Ｃｏ．， Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ， １９８９を参照のこと）。これらの方法の１つの利点は、非天然アミノ酸残基をＢＬｙＳ結合性ポリペプチドの配列内に組み入れることができることである。
【０１００】
好ましい実施形態においては、本発明のＢＬｙＳ結合性ポリペプチドは化学的に合成される（例えば、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ， Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ．， ８５：２１４９（１９６３）； Ｈｏｕｇｈｔｅｎ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８２：５１３２（１９８５）を参照のこと）。例えば、固相法でポリペプチドを合成し、樹脂から切り離し、分取高速液体クロマトグラフィーで精製することができる（例えばＣｒｅｉｇｈｔｏｎ， 「タンパク質：構造と分子的性質（Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ）」（Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．， Ｎ．Ｙ．， １９８３）， ｐｐ．５０−６０を参照のこと）。またＢＬｙＳ結合性ポリペプチドはペプチド合成機を用いて合成することもできる。合成ポリペプチドの組成はアミノ酸分析もしくは配列決定分析で確認することができる（例えば、エドマン分解法：Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ， 「タンパク質：構造と分子的性質（Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ）」（Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．， Ｎ．Ｙ．， １９８３）， ｐｐ．３４−４９を参照のこと）。さらに、所望により、本発明のＢＬｙＳ結合性ポリペプチドは非古典的アミノ酸もしくは化学的アミノ酸類似体を含むものとすることができ、それは化学合成の際に本発明のＢＬｙＳ結合性ポリペプチド中に置換もしくは付加として慣例的に導入することができる。非古典的アミノ酸としては、限定はされないが、通常のアミノ酸のＤ−異性体、２，４−ジアミノ酪酸、α−アミノイソ酪酸、４−アミノ酪酸（４Ａｂｕ）、２−アミノ酪酸（Ａｂｕ）、６−アミノヘキサン酸（ε−Ａｈｘ）、２−アミノイソ酪酸（Ａｉｂ）、３−アミノプロピオン酸、オルニチン、ノルロイシン、ノルバリン、ヒドロキシプロリン、サルコシン、シトルリン、ホモシトルリン、システイン酸、ｔ−ブチルグリシン、ｔ−ブチルアラニン、フェニルグリシン、シクロヘキシルアラニン、β−アラニン（ｂＡｌａ）、フルオロアミノ酸、デザイナー（ｄｅｓｉｇｎｅｒ）アミノ酸、例えばβ−メチルアミノ酸、Ｃα−メチルアミノ酸、Ｎα−メチルアミノ酸、および一般のアミノ酸類似体が挙げられる。さらに、そのようなアミノ酸はＤ体（右旋性）もしくはＬ体（左旋性）とすることができる。
【０１０１】
固相ペプチド合成は推定上のポリペプチドのカルボキシ（Ｃ）末端で保護アミノ酸を適切な樹脂へカップリングさせることによって開始され、その樹脂はＣ末端アミノ酸のカルボキシル基と反応して後に容易に切断される結合を形成するもので、例えばクロロメチル樹脂、ブロモメチル樹脂などのハロメチル樹脂、ヒドロキシメチル樹脂、アミノメチル樹脂、ベンズヒドリルアミン樹脂またはｔ−アルキルオキシカルボニルヒドラジド樹脂が挙げられる。α−アミノ保護基を、例えば塩化メチレン中のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）で除去し、中和を例えばＴＥＡで行った後、合成の次のサイクルへ進めることができる。次いで残存するα−アミノ酸および、必要に応じて側鎖が保護されたアミノ酸を順次所望の順番で縮合によってカップリングさせて樹脂に連結された中間化合物を得る。あるいは、伸長しつつある固相のポリペプチド鎖に付加する前に、いくつかのアミノ酸を互いにカップリングさせてオリゴペプチドを形成させておくことができる。
【０１０２】
２つのアミノ酸間の、または１つのアミノ酸とペプチドとの間、またはペプチドとペプチドとの間の縮合は当業界で公知の縮合方法に従って行うことができ、そのような方法としては、限定はされないが、アジド法、混合酸無水物法、ＤＣＣ（ジシクロヘキシルカルボジイミド）法、活性型エステル法（ｐ−ニトロフェニルエステル法、ＢＯＰ［ベンゾトリアゾール−１−イル−オキシ−トリス（ジメチルアミノ）ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート］法、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミドエステル法）、ならびにウッドワード（Ｗｏｏｄｗａｒｄ）試薬 Ｋ法が挙げられる。
【０１０３】
ペプチドの化学合成に通常行われる方法は、適切な保護基もしくはキャッピング基を用いて種々のアミノ酸残基の反応性側鎖基をその部位で保護もしくはキャッピング（ブロッキング）し、それはそのポリペプチド鎖が完全に組み立てられた後に最終的に除去される。また通常行われる方法は、アミノ酸もしくは断片のα−アミノ基を、その本体がそのカルボキシル基の位置で反応する間、保護もしくはキャッピングし、その後にα−アミノ保護基を選択的に除去してその位置で引き続き反応が起こるようにすることである。従って、合成の間に中間化合物が生産され、それにはペプチド鎖中に各アミノ酸残基が所望の配列で並べられて含まれ、様々なそれらの残基は側鎖保護基もしくはキャッピング基を有している。次いで、アミノ酸側鎖上のこれらの保護基もしくはキャッピング基は、精製後に所望の産物が生産されるように、実質的に同時に除去される。
【０１０４】
アミノ酸中に見出されるα−およびε−アミノ側鎖基のための典型的な保護基、キャッピング基、もしくはブロッキング基としては例えば、ベンジルオキシカルボニル（Ｚ）、イソニコチニルオキシカルボニル（ｉＮＯＣ）、Ｏ−クロロベンジルオキシカルボニル［Ｚ（ＮＯ２）］、ｐ−メトキシベンジルオキシカルボニル［Ｚ（ＯＭｅ）］、ｔ−ブトキシカルボニル（Ｂｏｃ）、ｔ−アミイオキシカルボニル（ｔ−ａｍｙｉｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ：Ａｏｃ）、イソボルニルオキシカルボニル、アダマチルオキシカルボニル、２−（４−ビフェニル）−２−プロピルオキシカルボニル（Ｂｐｏｃ）、９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）、メチルスルホニルエトキシカルボニル（Ｍｓｃ）、トリフルオロアセチル、フタリル、ホルミル、２−ニトロフェニルスルフェニル（ＮＰＳ）、ジフェニルホスフィノチオイル（Ｐｐｔ）、ジメチルオホスフィノチオイル（Ｍｐｔ）などが挙げられる。
【０１０５】
アミノ酸のカルボキシル基のための保護基、キャッピング基、もしくはブロッキング基としては例えば、ベンジルエステル（ＯＢｚｌ）、シクロヘキシルエステル（Ｃｈｘ）、４−ニトロベンジルエステル（ＯＮｂ）、ｔ−ブチルエステル（Ｏｂｕｔ）、４−ピリジルメチルエステル（ＯＰｉｃ）などが挙げられる。また、必要に応じて特定のアミノ酸、例えばアルギニン、システイン、およびセリンなどの側鎖基が適切な保護基で保護されていることが通常は望ましい。例えば、アルギニンのグアニジノ基は、ニトロ、ｐ−トルエンスルホニル、ベンジルオキシカルボニル、アダマンチルオキシカルボニル、ｐ−メトキシベンゼンスルホニル、４−メトキシ−２，６−ジメチルベンゼンスルホニル（Ｍｄｓ）、１，３，５−トリメチルフェニルスルホニル（Ｍｔｓ）などで保護することができる。システインのチオール基は、ｐ−メトキシベンジル、トリフェニルメチル、アセチルアミノメチルエチルカルバモイル、４−メチルベンジル、２，４，６−トリメチルベンジル（Ｔｍｂ）などで保護することができ、セリンのヒドロキシル基はベンジル、ｔ−ブチル、アセチル、テトラヒドロピラニルなどで保護することができる。
【０１０６】
所望のアミノ酸配列が完成した後、中間体ポリペプチドは樹脂支持体から試薬、例えば液状ＨＦおよび１種以上のチオ−含有スカベンジャーなどを用いた処理によって除去されるが、このような試薬は樹脂および残存している側鎖保護基のすべてからペプチド分子を切り離す。ＨＦで切断した後、そのタンパク質配列をエーテルで洗い、多量の希酢酸中に移し、ｐＨを水酸化アンモニウムで約８．０に調整し攪拌する。ｐＨを調整すると該ポリペプチドは所望のコンホメーション配置を取る。
【０１０７】
例示としてであって限定するものではないが、本発明のポリペプチドは下記のとおりに化学的に合成し精製することができる：ペプチドはＲａｉｎｉｎ Ｓｙｍｐｈｏｎｙ Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒを用いてＮ−α−９−フルオレニルメチルオキシカルボニル、すなわちＦｍｏｃ固相ペプチド合成化学を利用することによって合成することができる。１個のアミノ酸をペプチド−樹脂伸長鎖へとカップリングさせるために用いられる標準的なサイクルには、一般的に：（１）ペプチド−樹脂をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）で３０秒間、３回洗い；（２）アミノ末端上のＦｍｏｃ保護基をＤＭＦ中の２０％のピペリジンで２回、各１５分間洗うことで脱保護することによって除去し、そのプロセスの間にペプチド−樹脂間の定着が起こることを防止するために１０秒間に１秒間、反応容器に窒素をバブリング（ｂｕｂｂｌｉｎｇ）させて、混合を行う；（３）ペプチド−樹脂をＤＭＦで３０秒間、３回洗う；（４）ペプチド−樹脂へのアミノ酸のカップリングを、適切なアミノ酸のＦｍｏｃ誘導体の２５０ｍＭ溶液と活性化剤混合物の等量を添加することによって行うが、その活性化剤混合物は４００ｍＭ Ｎ−メチルモルホリンと２５０ｍＭ （２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−４））−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）をＤＭＦ中に含むものからなる；（５）その溶液を４５分間混合させる；および（６）ペプチド−樹脂をＤＭＦで３０秒間、３回洗うことが含まれる。所望のペプチドを生産するためにこのサイクルを必要に応じて適切なアミノ酸を順番に用いて繰り返すことができる。このサイクルプログラムの例外としては、アミノ酸のカップリングがそれらの疎水性性質のために困難であることが予測される場合、もしくは合成の間にヘリックス形成に関与することが予測される場合である。それらの場合には、上述のサイクルは対象のアミノ酸を「二重カップリング（ｄｏｕｂｌｅ ｃｏｕｐｌｅ）」させるため、最初の４５分間のカップリングステップの完了直後に２回目のステップ４を繰り返すという改変を加えることができる。さらに、ペプチド合成の初回カップリングステップにおいて、より効率的なカップリングを行う目的で、初回のＤＭＦでの洗浄での混合時間を延長して３０秒間３回の洗浄の替わりに１５分間を３回の洗浄を行って樹脂を膨潤させることができる。
【０１０８】
ペプチド合成後、ペプチドは樹脂から下記の方法で切り離すことができる：（１）ペプチド−樹脂をＤＭＦで３０秒間３回洗う；（２）アミノ末端上のＦｍｏｃ保護基をＤＭＦ中の２０％のピペリジンで２回、各１５分間洗うことによって除去する；（３）ペプチド−樹脂をＤＭＦで３０秒間、３回洗う；ならびに（４）９５％のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、２．４％の水、２．４％のフェノール、および０．２％のトリイソプロピルシランからなる切断用カクテルをペプチド−樹脂と２時間混合し、次いで、切断用カクテル中のペプチドを樹脂からろ過して取り、２倍量のエチルエーテルを添加して溶液からペプチドを沈殿させる。具体的には、ペプチドを単離するためにエーテル−ペプチド溶液を−２０℃で２０分間置き、次いで６，０００ ｘ Ｇで５分間遠心分離してペプチドをペレットとし、そのペプチドをエチルエーテルで３回洗って残存している切断カクテルの成分を除去することができる。最終的なペプチド産物を、０．１％のＴＦＡからなる一次溶媒および８０％のアセトニトリルと０．１％のＴＦＡからなる溶出バッファーを用いて逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）で精製することができる。次いで精製したペプチドは凍結乾燥して粉末とすることができる。
【０１０９】
他の特定の実施形態においては、本明細書に記載のＢＬｙＳ結合性ポリペプチドの分枝バージョン（ｖｅｒｓｉｏｎ）が提供され、それは例えば、ＢＬｙＳ結合性ポリペプチド配列内の１個以上のアミノ酸を、１つ以上のアミノ酸とペプチド結合を形成することのできる遊離の側鎖を有するアミノ酸もしくはアミノ酸類似体と置換することによって提供される（従って「分枝」を形成することができる）。
【０１１０】
分枝したペプチドは、天然のもしくは合成のいずれのアミノ酸を、ペプチド鎖中の天然のもしくは合成のいずれのアミノ酸と、共有結合で連結させるための当業界で公知のいかなる方法でも調製することができ、そのペプチド鎖は、ペプチド鎖に共有結合で結合させようとするアミノ酸上のアミノ基もしくはカルボキシル基と反応することのできる側鎖基を有する。とりわけ、遊離のアミノ側鎖基を有するアミノ酸、例えば限定はされないが、ジアミノ酪酸、リシン、アルギニン、オルニチン、ジアミノプロピオン酸、およびシトルリンなどをペプチド中に組み入れて、あるアミノ酸がこれらのアミノ酸とともに、例えば、その残基の遊離のアミノ側鎖基とペプチド結合を形成することによって、分枝を形成させることができる。あるいは、遊離のカルボキシル側鎖基を有するアミノ酸、例えば限定はされないが、グルタミン酸、アスパラギン酸、およびホモシトルリンなどをペプチド中に組み入れて、あるアミノ酸がこれらのアミノ酸とともに、例えば、その残基の遊離のカルボキシル側鎖基とペプチド結合を形成することによって、分枝を形成させることができる。分枝を形成するアミノ酸はペプチド鎖中のあるアミノ酸の側鎖基といかなるタイプの共有結合でも連結することもでき、そのような結合としては、限定はされないが、ペプチド結合、エステル結合、およびジスルフィド結合が挙げられる。特定の１実施形態においては、上述のものなどの分枝点を形成することのできるアミノ酸は、ＢＬｙＳ結合性ポリペプチド配列を含んでいるペプチド内部のＢＬｙＳ結合性ポリペプチドの残基と置換される。
【０１１１】
分枝したペプチドは当業界で公知のいかなる方法によっても調製することができる。例えば、限定はしないが、分枝ペプチドは下記のとおり調製することができる：（１）ペプチド鎖の主鎖から分枝するアミノ酸はＮα−ｔ−ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）で保護されたアミノ酸のペンタフルオロフェニル（Ｏｐｆｐ）エステルとして購入することができ、この分枝アミノ酸が付着されることとなる主鎖内の残基はＮ−Ｆｍｏｃ−α−γ−ジアミノ酪酸とすることができる；（２）Ｂｏｃで保護されたアミノ酸のジアミノ酪酸とのカップリングは、各前駆体５ｇをＤＭＦ １５０ｍＬならびにピリジン２．２５ｍＬおよびジメチルアミノピリジン５０ｍｇ含有のフラスコ中に添加し、その溶液を２４時間混合することによって行われる；（３）次いでそのペプチドをカップリング反応物１５０ｍＬから抽出することができるが、その抽出は反応物をジクロロメタン（ｄｉｃｈｌｏｒｍｅｔｈａｎｅ；ＤＣＭ）４００ｍＬおよび０．１２Ｎ ＨＣｌ ２００ｍＬと１Ｌの分液漏斗中で混合し、相の分離を起こさせ、底部の水相を保存し、上部の層を０．１２Ｎ ＨＣｌ ２００ｍＬでさらに２回再抽出して行う；（４）ペプチドを含有している溶液に硫酸マグネシウム２〜５ｇを添加して脱水し、硫酸マグネシウムをろ過して除き、残留溶液を蒸発させて容量を約２〜５ｍＬとすることができる；（５）次いでそのジペプチドに酢酸エチルおよび次に２倍量のヘキサンを添加して沈殿させ、次いでろ過して集め、冷ヘキサンで２回洗う；および（６）その結果得られたろ液を凍結乾燥して所望のジペプチドの軽粉末形態を得ることができる。この方法で調製された分枝ペプチドは分枝の位置のアミノ酸がジアミノ酪酸で置換されているだろう。ジアミノ酪酸以外のアミノ酸もしくはアミノ酸類似体での置換を含む分岐ペプチドは、上述の方法と類似の方法で、Ｎ−Ｆｍｏｃをカップリングした形態のアミノ酸もしくはアミノ酸類似体を用いて調製することができる。
【０１１２】
好ましい１実施形態においては、本発明のＢＬｙＳ結合性ポリペプチドは環状ペプチドである。環状化は、例えば、限定はされないが、２個のシステイン残基間のジスルフィド結合を介して、もしくはアミド連鎖を介して行うことができる。例えば、限定はされないが、ジスルフィド架橋の形成は（１）精製したペプチドを０．０１Ｍ 酢酸アンモニウム， ｐＨ７．５中に０．１〜０．５ｍｇ／ｍＬの濃度で溶解し；（２）この溶解したペプチドに０．０１Ｍ フェリシアン化カリウムを溶液の色が淡黄色となるまで滴下添加し、その溶液を２４時間混合する；（３）環状ペプチドを濃縮して溶液５〜１０ｍＬとし、逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）でそのペプチドを再精製し、最後にそのペプチドを凍結乾燥することによって達成できる。該ペプチドが２つの適切な位置のシステイン残基を含有していないような特定の１実施形態においては、システイン残基を、アミノ末端および／もしくはカルボキシ末端および／または内部に、その環状化しようとするペプチドが、その残基がジスルフィド架橋を形成しうる間隔となるように２個のシステイン残基を含有するように導入することができる。あるいは、環状ペプチドは、例えば限定はされないが、下記のプロトコールを用いてアミド連鎖を生成して得ることができる：アリルで保護されたアミノ酸、例えばアスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、もしくはグルタミンなどを第１のアミノ酸としてペプチド中に組み込み、次いで残りのアミノ酸をカップリングする。アリル保護基はペプチド−樹脂を、５％の酢酸および２．５％のＮ−メチルモルホリンを含有するクロロホルム溶液中でテトラキストリフェニルホスフィンパラジウム（０）溶液と２時間混合することによって除去することができる。ペプチド−樹脂を、ＤＭＦ中の０．５％のＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）および０．５％のナトリウムジエチルジチオカバメートで３回洗うことができる。ペプチド鎖上のアミノ末端のＦｍｏｃ基は、ＤＭＦ中の２０％のピペリジンで２回、各１５分インキュベートして除去し、ＤＭＦで３回、各３０秒間洗うことができる。活性化剤混合物、ＤＭＦ中のＮ−メチルモルホリンおよびＨＢＴＵをカラム上に置き、遊離のアミノ末端を、アリル基の除去によって生じたカルボキシル基とカップリングさせてペプチドを環状化することができる。そのペプチドを樹脂から上述の化学的ペプチド合成の一般的説明で述べたとおり切断し、そのペプチドを逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）で精製することができる。環状化しようとするペプチドがアリルで保護されたアミノ酸を含有していないような特定の１実施形態においては、アリルで保護されたアミノ酸を、そのペプチドの配列中のアミノ末端、カルボキシ末端、またはペプチド内部に、そのペプチドが環状化されうるように、導入することができる。
【０１１３】
さらに、ある特定の実施形態においては、本発明のＢＬｙＳ結合性ポリペプチドがアミノ末端（Ｎ末端）および／もしくはカルボキシ末端（Ｃ末端）キャッピング基を有するかもしくは保持したものとして生産されることが好ましく、そのキャッピング基は使用中にＮ末端もしくはＣ末端のアミノ酸を望ましくない化学反応から保護することができるか、または結合性ポリペプチドをさらにコンジュゲーションもしくは操作することを可能にすることができ、例えばその結合性ポリペプチドをクロマトグラフ用の支持体樹脂もしくはマトリックスとコンジュゲートさせる、またはその結合性ポリペプチドと樹脂もしくは支持体とをつなぐために別のペプチドにコンジュゲートさせることができる。そのようなＮ末端基およびＣ末端基はまた、結合性ポリペプチドを標識する、もしくはタグを付するために用いることができ、それによって結合している複合体を検出する、もしくは結合性ポリペプチドの位置（ＢＬｙＳ標的タンパク質に結合しているのか、またはしていないのか）を、例えば分離方法の何らかの時点で、示すことができる。従って、検出もしくは分離法で用いるための最終形態で合成された本発明のＢＬｙＳ結合性ポリペプチドはＮ末端および／もしくはＣ末端キャッピング基を含有し得る。本発明の結合性ポリペプチド中に存在しうるもしくは保持しうる特に好ましいＮ末端キャッピング基は、アセチル基（Ａｃ）である。本発明の結合性ポリペプチド中に存在しうるもしくは保持しうる、特に好ましいＣ末端キャッピング基は、アミド基である。さらに好ましい１実施形態においては、本発明のＢＬｙＳ結合性ポリペプチドはＮ末端キャッピング基としてアセチル基を有し、かつＣ末端キャッピング基としてアミド基を有するものである。
【０１１４】
本発明のＢＬｙＳ結合性ポリペプチドはまた、ペプチド合成を業務としている企業（例えば、ＢＡＣＨＥＭ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ， Ｉｎｃ．， Ｋｉｎｇ ｏｆ Ｐｒｕｓｓｉａ， ＰＡ； Ｑｕａｌｉｔｙ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ， Ｉｎｃ．， Ｈｏｐｋｉｎｔｏｎ， ＭＡ）によって商業的に調製されたものとすることができる。
【０１１５】
本発明のＢＬｙＳ結合性ポリペプチドをコードする核酸配列は当業界で周知の技法を用いて生産および単離することができる。１例では、本発明のＢＬｙＳ結合性ポリペプチドをコードする核酸は、ＢＬｙＳ結合性ポリペプチドのアミノ酸配列についての知識に基づいて化学的に合成される（好ましくはその配列はそのポリペプチドが発現されることとなる宿主系に最適なコドンとしたものである）。別の１例では、ＢＬｙＳ結合性ポリペプチドをコードする核酸は、発現ライブラリー（例えば、ファージディスプレイライブラリー）をスクリーニングしてＢＬｙＳ結合性ポリペプチドを発現しているファージを同定し、その同定したライブラリーのメンバーからＢＬｙＳ結合性ポリペプチドコード核酸配列を単離（例えば、そのポリペプチドコード配列にフランキングするプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応法を介して）することによって得られる。
【０１１６】
本発明はまた、本発明のＢＬｙＳ結合性ポリペプチドをコードする核酸配列を含んでいるベクター、その組換えベクターで遺伝子操作された、もしくは別の手段で本発明のポリペプチドを生産するように操作された宿主細胞、およびＢＬｙＳ結合性ポリペプチドもしくはその断片の組換えによる、または化学的もしくは合成技法による生産にも関する。
【０１１７】
従って、本発明では、ＢＬｙＳ結合性ポリペプチドはまた、組換え発現技法によっても得ることができる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら， １９８９， 「分子クローニング、実験室マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」， 第２版、Ｇｌｏｖｅｒ， Ｄ．Ｍ．（編）， （Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎ．Ｙ．， １９８９）；「ＤＮＡクローニング：実際的なアプローチ（ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ）」（ＭＲＬ Ｐｒｅｓｓ， Ｌｔｄ．， Ｏｘｆｏｒｄ， Ｕ．Ｋ．， １９８５）， 第Ｉ，ＩＩ巻を参照のこと）。
【０１１８】
組換えＢＬｙＳ結合性ポリペプチドを生産させるために、ＢＬｙＳ結合性ポリペプチドをコードする核酸配列はプロモーターと機能しうる形で連結され、その配列からＢＬｙＳ結合性ポリペプチドが生産されることとなる。例えば、ベクターを細胞中に導入することができ、その細胞中でそのベクターもしくはその一部分が発現され、ＢＬｙＳ結合性ポリペプチドが生産される。好ましい１実施形態においては、ＲＮＡポリメラーゼの供給源がＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼであれば該核酸はＤＮＡであるが、またポリメラーゼの供給源がＲＮＡ依存性ＲＮＡ ポリメラーゼであれば、または逆転写酵素が細胞中に存在しているかもしくは提供されて、ＤＮＡをＲＮＡから生産する場合には、該核酸をＲＮＡとすることができる。そのようなベクターは、それが所望のＲＮＡを生産することとなるように転写されうるものである限りは、エピソームに留まることができ、または染色体に組み込まれたようにすることができる。そのようなベクターは当業界において標準的な組換えＤＮＡ技術法によって構築することができる。ベクターとしては、バクテリオファージ、プラスミド、ウイルス、レトロウイルス、または当業界で公知のその他のものとすることができ、それらは細菌、真菌、植物、昆虫もしくは哺乳動物の細胞中での複製および発現に用いられる。レトロウイルスベクターは複製能のあるもの、もしくは複製が欠失しているものとすることができる。後者の場合には、ウイルスの増殖は通常は補足性を有する宿主細胞中でのみ起こるだろう。ベクター構築物の宿主細胞中への導入は当業界で公知の技法によって行うことができ、そのようなものとしては、限定はされないが、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン介在トランスフェクション、陽イオン性脂質介在トランスフェクション、電気穿孔法、形質導入、感染またはその他の方法が挙げられる。そのような方法は、例えば、Ｄａｖｉｓら，「分子生物学の基礎的方法（Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）」（１９８６）などの多数の標準的な実験室マニュアルに述べられている。
【０１１９】
通常は、組換え発現ベクターには複製起点、および宿主細胞の形質転換を可能とする、例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のアンピシリン耐性遺伝子およびＳ．セレビシアエ（Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のＴＲＰ１遺伝子などの選択マーカー、ならびに下流の構造配列の転写を指令する高度に発現される遺伝子由来のプロモーターが含まれるだろう。そのようなプロモーターは、数ある中で解糖系酵素、例えば、３−ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）、ａ因子、酸性ホスファターゼ、もしくは熱ショックタンパク質をコードするオペロン由来のものとすることができる。異種の構造配列は適切な相で翻訳開始および終結配列、および好ましくは、翻訳されたタンパク質の細胞周辺腔もしくは細胞外培地への分泌を指令することのできるリーダー配列を有する形でアセンブルされる。任意で、その異種配列は、所望の特性を備えた、Ｎ末端の同定ペプチドを含む融合タンパク質をコードすることができ、その所望の特性とは、例えば、発現された組換え産物の安定化もしくは精製の単純化である。
【０１２０】
１実施形態においては、本発明のＢＬｙＳ結合性ポリペプチドをコードする核酸は、適切な異種の調節エレメント（例えば、プロモーターもしくはエンハンサー）、例えば、少数の例を挙げると、λファージＰＬプロモーター、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のｌａｃ、ｔｒｐ、ｐｈｏＡ、およびｔａｃプロモーター、ＳＶ４０初期および後期プロモーター、ならびにレトロウイルスのＬＴＲのプロモーターなどと、機能しうる形で連結されている。その他の適切なプロモーターも当業者であればわかるであろう。
【０１２１】
示したとおり、発現ベクターには好ましくは少なくとも１種の選択マーカーが含まれるだろう。そのようなマーカーとしては、真核細胞の培養ではジヒドロ葉酸レダクターゼ、Ｇ４１８、もしくはネオマイシン耐性、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）およびその他の細菌の培養ではテトラサイクリン、カナマイシン、もしくはアンピシリン耐性遺伝子が挙げられる。適切な宿主の代表的な例としては、限定はされないが、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、およびネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）細胞；酵母細胞（例えば、サッカロミセス・セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、もしくはピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）（ＡＴＣＣ寄託番号２０１１７８））などの真菌細胞；ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）Ｓ２およびスポドプテラ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ）Ｓｆ９細胞などの昆虫細胞；ＣＨＯ、ＣＯＳ、２９３、ＮＳＯ、およびＢｏｗｅｓ黒色腫細胞などの動物細胞；ならびに植物細胞が挙げられる。上述の宿主細胞用として適切な培地および培養条件は当業界で公知である。
【０１２２】
宿主細胞は、哺乳動物細胞（例えば、ヒト由来細胞）などの高等真核細胞、もしくは酵母細胞などの下等真核細胞とすることができ、または、宿主細胞は細菌細胞などの原核細胞とすることができる。宿主株は、挿入された本発明のＢＬｙＳポリペプチドをコードする核酸配列の発現をモジュレートする、または所望の特定な様式でＢＬｙＳ結合性ポリペプチドを修飾およびプロセシングするものを選択することができる。特定のプロモーターからの発現は特定の誘導物質の存在によって増強することができる；このようにして遺伝子操作されたポリペプチドの発現を制御することができる。さらに、種々の宿主細胞はタンパク質の翻訳および翻訳後のプロセシングならびに改変（例えば、リン酸化、切断）のための特性と特定の機構を有している。発現された外来タンパク質の所望の改変とプロセシングを確保するために適切な細胞系を選択することができる。宿主細胞内での発現のための適切なベクターとプロモーターの選択は周知の方法であり、発現ベクターの構築、そのベクターの宿主内への導入、宿主内での発現のために必要な技法は当業界では慣例的な技術である。
【０１２３】
細菌での使用に有用な発現ベクターは、所望のタンパク質をコードする構造的ＤＮＡ配列と適切な翻訳開始および終結シグナルとを機能しうるリーディング相中に、機能的プロモーターと共に挿入することによって構築される。そのベクターは好ましくは、ベクターの維持を確実にし、および、所望により宿主内での増幅を提供するために、１種以上の表現型選択マーカーおよび１個の複製起点を含んでなるだろう。形質転換のための適切な原核生物宿主としては、他のものも選択することができるが、大腸菌、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、ネズミチフス菌、ならびにシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、ストレプトミセスおよびブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）属内の様々な種が挙げられる。非限定的な例ではあるが、代表的なものとして、細菌での使用に有用な発現ベクターは、周知のクローニングベクターであるｐＢＲ３２２（ＡＴＣＣ ３７０１７）の遺伝子エレメントを含んでなる市販のプラスミド由来の選択マーカーと細菌性の複製起点を含んでなるものとすることができる。そのような市販のベクターとしては、例えば、ｐＫＫ２２３−３（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｆｉｎｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ， Ｕｐｐｓａｌａ， Ｓｗｅｄｅｎ）、およびＧＥＭ１（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｂｉｏｔｅｃ， Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩ， ＵＳＡ）が挙げられる。これらのｐＢＲ３２２「骨格」セクションは適切なプロモーターおよび発現されるべき構造配列と組み合わされる。ベクターの中で細菌で使用するために好ましいものとしては、ｐＨＥ４−５（ＡＴＣＣ寄託番号２０９３１１）およびそれの変異体、ｐＱＥ７０、ｐＱＥ６０、およびｐＱＥ−９（これらはＱＩＡＧＥＮ Ｉｎｃ．から入手できる）；ｐＢＳベクター、Ｐｈａｇｅｓｃｒｉｐｔベクター、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクター、ｐＮＨ８Ａ、ｐＮＨ１６ａ、ｐＮＨ１８Ａ、ｐＮＨ４６Ａ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅから入手できる）；およびｐｔｒｃ９９ａ、ｐＫＫ２２３−３、ｐＫＫ２３３−３、ｐＤＲ５４０、ｐＲＩＴ５（これらはＰｈａｒｍａｃｉａから入手できる）がある。酵母系で用いるために好ましい発現ベクターとしては、限定はされないが、ｐＹＥＳ２、ｐＹＤ１、ｐＴＥＦ１／Ｚｅｏ、ｐＹＥＳ２／ＧＳ、ｐＰＩＣＺ、ｐＧＡＰＺ、ｐＧＡＰＺα、ｐＰＩＣ９、ｐＰＩＣ３．５、ｐＨＩＬ−Ｄ２、ｐＨＩＬ−Ｓ１、ｐＰＩＣ３．５Ｋ、ｐＰＩＣ９Ｋ、およびＰＡＯ８１５（これらはすべてＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｃａｒｌｓｂａｄ， ＣＡから入手できる）が挙げられる。好ましい真核生物ベクターとしては、ｐＷＬＮＥＯ、ｐＳＶ２ＣＡＴ、ｐＯＧ４４、ｐＸＴ１、およびｐＳＧ（これらはＳｔｒａｔａｇｅｎｅから入手できる）；ｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧ、およびｐＳＶＬ（Ｐｈａｒｍａｃｉａから入手できる）がある。その他の適切なベクターについては、当業者であれば容易にわかるであろう。
【０１２４】
適切な宿主株を形質転換し、その宿主株を適切な細胞密度まで増殖させた後、適切な手段（例えば、温度シフトもしくは化学的誘導）で選択プロモーターを誘導させ、細胞をさらなる期間培養する。細胞を、典型的には遠心分離して回収し、物理的もしくは化学的手段で破壊し、その結果得られる粗抽出物をさらに精製するために保持する。
【０１２５】
タンパク質の発現に用いる微生物細胞は、都合のよい任意の方法で破壊することができ、そのような方法としては、凍結−融解サイクル、超音波処理、機械的破壊または細胞溶解剤の使用が含まれ、そのような方法は当業者に周知である。
【０１２６】
１実施形態においては、酵母のピキア・パストリスが真核生物系でのＢＬｙＳ結合性ポリペプチドの発現に用いられる。ピキア・パストリスはメチロトローフ酵母でメタノールを唯一の炭素源として代謝することができる。メタノール代謝経路の主要ステップは、Ｏ２を用いたメタノールからホルムアルデヒドへの酸化である。この反応はアルコールオキシダーゼという酵素によって触媒される。メタノールを唯一の炭素源として代謝するために、ピキア・パストリスは高レベルのアルコールオキシダーゼを生成しなければならないが、それは部分的には、アルコールオキシダーゼのＯ２に対する親和性が比較的低いことによるものである。その結果、主な炭素源としてメタノールに依存している増殖培地中では、２つのアルコールオキシダーゼ遺伝子（ＡＯＸ１）のうちの一方のプロモーター領域が非常に活性である。メタノールの存在下でＡＯＸ１遺伝子から生産されたアルコールオキシダーゼはピキア・パストリス中の可溶性タンパク質の総量の約３０％まで含む。Ｅｌｌｉｓら， Ｍｏｌｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ．， ５：１１１１−２１（１９８５）； Ｋｏｕｔｚら， Ｙｅａｓｔ， ５：１６７−７７（１９８９）； Ｔｓｃｈｏｐｐら， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， １５：３８５９−７６（１９８７）を参照のこと。このように、例えば本発明のＢＬｙＳ結合性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドなどの異種コード配列は、ＡＯＸ１調節配列のすべてもしくは一部分の転写調節下で、メタノールの存在下で培養させたピキア酵母中で極めて高いレベルで発現される。
【０１２７】
１例においては、本明細書に示すとおり、プラスミドベクターｐＰＩＣ９Ｋが本発明のＢＬｙＳ結合性ポリペプチドをコードするＤＮＡのピキア酵母系内での発現に用いられ、本質的には、「ピキアプロトコール：分子生物学における方法（Ｐｉｃｈｉａ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）」， Ｄ．Ｒ．ＨｉｇｇｉｎｓとＪ．Ｃｒｅｇｇ編（Ｔｈｅ Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ， Ｔｏｔｏｗａ， Ｎ．Ｊ．， １９９８）に述べられているとおりである。この発現ベクターは多重クローニング部位の上流に位置するピキア・パストリスアルカリホスファターゼ（ＰＨＯ）分泌シグナルペプチド（すなわち、リーダー）に連結された強力なＡＯＸ１プロモーターによって、本発明のＢＬｙＳ結合性ポリペプチドの発現と分泌を可能にする。
【０１２８】
当業者であれば容易に理解されるとおり、提示された発現構築物が、必要に応じてインフレームのＡＵＧを含む転写、翻訳、分泌（所望により）などのための適切な位置にあるシグナルを提供するものである限りは、ｐＰＩＣ９Ｋの替わりにｐＹＥＳ２、ｐＹＤ１、ｐＴＥＦ１／Ｚｅｏ、ｐＹＥＳ２／ＧＳ、ｐＰＩＣＺ、ｐＧＡＰＺ、ｐＧＡＰＺα、ｐＰＩＣ９、ｐＰＩＣ３．５、ｐＨＩＬ−Ｄ２、ｐＨＩＬ−Ｓ１、ｐＰＩＣ３．５Ｋ、およびＰＡＯ８１５など、他の多数の酵母ベクターを用いることができる。
【０１２９】
１実施形態においては、例えば、本発明のＢＬｙＳ結合性ポリペプチドをコードする核酸などの異種コード配列の高レベルの発現は、本発明の異種核酸配列を発現ベクター、例えばｐＧＡＰＺもしくはｐＧＡＰＺαなどへクローニングし、メタノール不在下で酵母培養物を増殖させることによって行うことができる。
【０１３０】
本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡの高等真核生物による転写は、そのベクター中にエンハンサー配列を挿入することによって増加される。エンハンサーは、プロモーターに作用して転写を増加させる通常は約１０〜３００ｂｐのＤＮＡのシス作用性エレメントである。例としては、複製起点の１００ｂｐ〜２７０ｂｐ後期側にあるＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側にあるポリオーマエンハンサー、およびアデノウイルスエンハンサーが挙げられる。
【０１３１】
組換えタンパク質を発現するために種々の哺乳動物細胞培養系も用いることができる。哺乳動物発現系の例としては、サルの腎臓線維芽細胞のＣＯＳ−７系（これはＧｌｕｚｍａｎ（Ｃｅｌｌ， ２３：１７５（１９８１））によって記載されている）ならびに適合性ベクターを発現することのできるその他の細胞系、例えば、Ｃ１２７、３Ｔ３、ＣＨＯ、２９３、ＮＳＯ、ＨｅＬａ、およびＢＨＫ細胞系が挙げられる。哺乳動物発現ベクターは、複製起点、適切なプロモーターおよびエンハンサー、ならびにまたリボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライス供与部位および受容部位、転写終結配列、および５’フランキング非転写配列で任意に必要なものをも含むだろう。ＳＶ４０スプライス由来のＤＮＡ配列、およびポリアデニル化部位は必要とされる非転写遺伝子エレメントを提供するために用いることができる。
【０１３２】
本明細書に記載の宿主細胞は、従来の方法で該組換え配列によってコードされる遺伝子産物を生産させるために用いることができる。あるいは、無細胞翻訳系も本発明のＤＮＡ構築物由来のＲＮＡを用いて本発明のポリペプチドを生産させるために用いることができる。
【０１３３】
本発明のポリペプチドは、改変された形態、例えば融合タンパク質（ペプチド結合を介して異種タンパク質配列（異なるタンパク質の）と連結されたポリペプチドを含んでなる）などで発現もしくは合成することができ、そのようなポリペプチドには、分泌シグナルのみならず、さらなる異種機能的領域をも含むことができる。そのような融合タンパク質は、本発明のポリヌクレオチドと所望のアミノ酸配列をコードする所望の核酸配列とを当業界で公知の方法によって適切なリーディングフレーム中でお互いに連結し、当業界で公知の方法によってその融合タンパク質産物を発現させることによって作製することができる。あるいは、そのような融合タンパク質はタンパク質合成技法、例えばペプチド合成機を用いて作製することができる。このように、例えば、追加のアミノ酸からなる領域、特に荷電したアミノ酸をポリペプチドのＮ末端に付加して、精製中の、またはその後の取り扱いと保管中の、宿主細胞における安定性と持続性を改善することができる。また、ペプチド部分をそのポリペプチドに付加して精製を容易にすることができる。そのような領域はそのポリペプチドの最終調製の前に除去することができる。特にポリペプチドにペプチド部分を付加して分泌もしくは排出を生じさせること、安定性を改善すること、ならびに精製を容易にすることは、当業界ではよく知られた、慣例的な技法である。特にヘキサヒスチジンポリペプチドについては言及しておくが、これは特に例えばｐＱＥベクター（ＱＩＡＧＥＮ， Ｉｎｃ．， ９２５９ Ｅｔｏｎ Ａｖｅｎｕｅ， Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ， ＣＡ， ９１３１１）で提供されるタグが例としてあげられるが、多数のものが市販されている。Ｇｅｎｔｚら， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ，８６：８２１−８２４（１９８９）に記載されているとおり、例えば、ヘキサヒスチジンは、融合タンパク質の都合のよい精製を提供する。精製に有用なその他のペプチドタグとしては、限定はされないが、インフルエンザヘマグルチニンタンパク質由来のエピトープに対応するヘマグルチニン「ＨＡ」タグ（Ｗｉｌｓｏｎら， Ｃｅｌｌ， ３７：７６７（１９８４））、および「フラッグ（ｆｌａｇ）」タグ（ＤＹＫＤＤＤＤＫ（配列番号１８３），Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ， Ｌａ Ｊｏｌｌａ， ＣＡ）が挙げられる。
【０１３４】
１実施形態においては、本発明のＢＬｙＳ結合性ポリペプチドをコードする核酸をｐｅｌＢ ペクチン酸リアーゼシグナル配列と融合させてグラム陰性細菌中でのそのようなポリペプチドの発現と精製の効率を向上させることができる。米国特許第５，５７６，１９５号および第５，８４６，８１８号を参照すればよく、これらの内容は本明細書にその全体を参照により組み入れる。
【０１３５】
本発明のポリペプチドには、化学合成法の産物、組換え技法で原核生物もしくは真核生物宿主から生産された産物が含まれ、そのような宿主としては例えば、細菌、酵母、高等植物、昆虫、および哺乳動物細胞が挙げられる。組換え生産法に用いる宿主の如何によって、本発明のポリペプチドは糖鎖が付加されるか、もしくは付加されない場合がある。さらに、本発明のポリペプチドには場合によって宿主が介在するプロセスの結果として、開始修飾メチオニン残基も含まれうる。
【０１３６】
本発明は合成もしくは翻訳中もしくはその後に、例えば糖鎖付加、アセチル化、ベンジル化、リン酸化、アミド化、ＰＥＧ化、ホルミル化、既知の保護基／ブロッキング基による誘導体化、タンパク質分解切断、抗体分子との連結、水酸化、ヨウ素化、メチル化、ミリストイル化、酸化、ＰＥＧ化、タンパク質分解プロセシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、ユビキチン化などによって修飾されるＢＬｙＳ結合性ポリペプチドを包含する。（例えば、Ｃｒｅｉｇｔｏｎ， 「タンパク質：構造と分子的性質（Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ： Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ）」， 第２版 （Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ． Ｎ．Ｙ．， １９９２）； 「翻訳後のタンパク質の共有結合による修飾（Ｐｏｓｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｖａｌｅｎｔ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ）」， Ｊｏｈｎｓｏｎ編（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９８３）， ｐｐ．１−１２； Ｓｅｉｆｔｅｒら， Ｍｅｔｈ． Ｅｎｚｙｍｏｌ．， １８２：６２６−６４６（１９９０）； Ｒａｔｔａｎら， Ａｎｎ． ＮＹ Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．， ６６３：４８−６２（１９９２）を参照のこと）。特定の実施形態においては、該ペプチドはＮ末端でアセチル化され、および／またはＣ末端でアミド化されたものである。
【０１３７】
さらに別の実施形態においては、相互作用する能力のある、例えばポリペプチド中の２個のシステイン残基などの残基を２個以上含有する本発明のＢＬｙＳ結合性ポリペプチドは、酸化条件下、またはこれらの残基の相互作用を促進するその他の条件下（例えば、ジスルフィド架橋形成）で処理することができる。
【０１３８】
さらに、本発明に包含されるＢＬｙＳ結合性ポリペプチドの修飾には、例えば、既知の技法で行われる非常に多数の化学的修飾のいずれのものも含まれ、そのようなものとしては限定はされないが、臭化シアンでの特異的な化学的切断、トリプシン、キモトリプシン、パパイン、Ｖ８プロテアーゼ、ＮａＢＨ４、アセチル化、ホルミル化、酸化、還元、ツニカマイシンの存在下での代謝的合成などが挙げられる。
【０１３９】
本発明に包含される翻訳後／合成後の修飾としてはさらに、例えば、Ｎ結合型もしくはＯ結合型炭化水素鎖、Ｎ末端もしくはＣ末端のプロセシング、アミノ酸骨格への化学的部分の付加、Ｎ結合型もしくはＯ結合型炭化水素鎖の化学的修飾、および原核生物宿主細胞での発現の結果としてのＮ末端メチオニン残基の付加もしくは欠失が挙げられる。
【０１４０】
本発明によって提供されるものとしてはまた、さらに別の利点、例えば親和性の増加、オフ速度（ｏｆｆ−ｒａｔｅ）、溶解性、安定性、およびｉｎ ｖｉｖｏもしくはｉｎ ｖｉｔｒｏでのポリペプチドの循環時間の低減、または免疫原性の低減などをもたらすことができる本発明のＢＬｙＳ結合性ポリペプチドの化学修飾された誘導体がある（米国特許第４，１７９，３３７号を参照のこと）。誘導体化のための化学的部分は、ポリエチレングリコール、エチレングリコール／プロピレングリコールコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコールなどの水溶性ポリマーから選択することができる。該ポリペプチドは分子内のランダムな位置で、または分子内のあらかじめ定めた位置で修飾することができ、付加される化学的部分を１、２、３個もしくはそれ以上含むことができる。
【０１４１】
該ポリマーはどのような分子量でもよく、分枝したものもしくは分枝していないものとすることができる。ポリエチレングリコールについては、取り扱いと製造の容易性から好ましい分子量は約１ｋＤａ〜約１００ｋＤａである（「約」という用語はポリエチレングリコールの調製において、示した分子量よりも重い分子がいくらかあり、軽い分子がいくらかあるだろうことを示している）。所望の治療プロファイルの如何によって（例えば、所望の徐放性の持続時間、もしあるとすれば生物学的活性に及ぼす影響、取り扱いの容易性、抗原性の程度もしくは欠如、およびその他のポリエチレングリコールの治療用タンパク質もしくは類似体に及ぼす既知の影響）、他のサイズを用いることができる。例えば、ポリエチレングリコールの平均分子量は、約２００、５００、１０００、１５００、２０００、２５００、３０００、３５００、４０００、４５００、５０００、５５００、６０００、６５００、７０００、７５００、８０００、８５００、９０００、９５００、１０，０００、１０，５００、１１，０００、１１，５００、１２，０００、１２，５００、１３，０００、１３，５００、１４，０００、１４，５００、１５，０００、１５，５００、１６，０００、１６，５００、１７，０００、１７，５００、１８，０００、１８，５００、１９，０００、１９，５００、２０，０００、２５，０００、３０，０００、３５，０００、４０，０００、５０，０００、５５，０００、６０，０００、６５，０００、７０，０００、７５，０００、８０，０００、８５，０００、９０，０００、９５，０００、もしくは１００，０００ｋＤａであってよい。
【０１４２】
上述のとおり、該ポリエチレングリコールは分枝構造を有するものとすることができる。分枝ポリエチレングリコールについては、例えば、米国特許第５，６４３，５７５号； Ｍｏｒｐｕｒｇｏら， Ａｐｐｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．， ５６：５９−７２（１９９６）； Ｖｏｒｏｂｊｅｖら， Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ， １８：２７４５−２７５０（１９９９）； およびＣａｌｉｃｅｔｉら， Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ． Ｃｈｅｍ．， １０：６３８−６４６（１９９９）に述べられており、これらの各々の開示は本明細書に参照により組み入れる。
【０１４３】
該ポリエチレングリコール分子（もしくはその他の化学的部分）は該ポリペプチドの機能的ドメインに及ぼす影響を考慮してＢＬｙＳ結合性ポリペプチドへ付着させなければならない。当業者が利用しうる付着方法は多数あり、例えば、ＥＰ ０ ４０１ ３８４（ＰＥＧをＧ−ＣＳＦにカップリングさせるもの）が挙げられるが（本明細書に参照により組み入れる）、Ｍａｌｉｋら， Ｅｘｐ． Ｈｅｍａｔｏｌ．， ２０：１０２８−１０３５（１９９２）（トレシルクロリド（ｔｒｅｓｙｌ ｃｈｌｏｒｉｄｅ）を用いたＧＭ−ＣＳＦのＰＥＧ化について報告したもの）をも参照のこと。例えば、ポリエチレングリコールは、反応基、例えば遊離のアミノ基もしくはカルボキシル基を介してアミノ酸残基と共有結合で結合することができる。反応基はそれに対して活性化ポリエチレングリコール分子が結合しうるものである。遊離のアミノ基を有するアミノ酸残基としては、例えば、リシン残基およびＮ末端アミノ酸残基が挙げられうる；遊離のカルボキシル基を有するアミノ酸残基としては、アスパラギン酸残基、グルタミン酸残基、およびＣ末端アミノ酸残基が挙げられうる。スルフヒドリル基もポリエチレングリコール分子を付着させるための反応基として用いることができる。好ましい１実施形態においては、ポリエチレングリコール分子は、例えばＮ末端もしくはリシン側鎖のアミノ基への付着などで、アミノ基に付着される。
【０１４４】
上記で示唆したとおり、ポリエチレングリコールは、多数あるアミノ酸残基のいずれかとの連結を介してポリペプチドに付着させることができる。例えば、ポリエチレングリコールは、リシン、ヒスチジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、もしくはシステイン残基への共有結合を介してポリペプチドと連結することができる。ポリエチレングリコールを、該ポリペプチドの特定のアミノ酸残基（例えば、リシン、ヒスチジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、もしくはシステイン）と、または該ポリペプチドの２つ以上のタイプのアミノ酸残基（例えば、リシン、ヒスチジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、システイン、およびそれらの組み合わせ）に付着させるためには１種以上の反応化学を利用することができる。
【０１４５】
Ｎ末端で化学修飾されたタンパク質が特に所望される場合もある。説明としてポリエチレングリコールを用いると、種々のポリエチレングリコール分子（分子量、分枝などによって）、反応混合物中のポリエチレングリコール分子のポリペプチド分子に対する比率、行おうとするＰＥＧ化反応のタイプ、および選択されたＮ末端ＰＥＧ化ポリペプチドを得るための方法から選択することができる。Ｎ末端ＰＥＧ化調製物を得るための方法（すなわち、必要に応じてこの部分を他のモノＰＥＧ化部分から分離すること）は、ＰＥＧ化ポリペプチド分子の集団からＮ末端がＰＥＧ化された物質を精製することによるものでありうる。タンパク質の選択的Ｎ末端修飾は、ある特定のタンパク質の誘導体化に利用しうる第一級アミノ基の種々のタイプの反応性に差があること（リシン対Ｎ末端）を利用した還元的アルキル化によって行うことができる。適切な反応条件下では実質的にＮ末端でのタンパク質の選択的な誘導体化がカルボニル基を含んでいるポリマーを用いて行える。
【０１４６】
上述のとおり、本発明のポリペプチドのＰＥＧ化はかなり多数の手段によって達成できる。例えば、ポリエチレングリコールはタンパク質に直接的、もしくは介在リンカーによってのいずれかで付着させることができる。ポリエチレングリコールをタンパク質にリンカーなしで付着させるシステムは、Ｄｅｌｇａｄｏら， Ｃｒｉｔ． Ｒｅｖ． Ｔｈｅｒａ． Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓ．， ９：２４９−３０４（１９９２）； Ｆｒａｎｃｉｓら， Ｉｎｔｅｒｎ． Ｊ． ｏｆ Ｈｅｍａｔｏｌ．， ６８：１−１８（１９９８）； 米国特許第４，００２，５３１号； 米国特許第５，３４９，０５２号； ＷＯ ９５／０６０５８； およびＷＯ ９８／３２４６６に述べられており、これらの各々の開示は本明細書に参照により組み入れる。
【０１４７】
介在リンカーなしにポリペプチドのアミノ酸残基へポリエチレングリコールを直接的に付着させるシステムの１つは、トレシル化（ｔｒｅｓｙｌａｔｅｄ）ＭＰＥＧを用いるものであるが、それはトレシルクロリド（ＣｌＳＯ２ＣＨ２ＣＦ３）を用いてモノメトキシポリエチレングリコール（ＭＰＥＧ）を修飾することによって生産される。タンパク質をトレシル化ＭＰＥＧと反応させると、ポリエチレングリコールはポリペプチドのアミン基へ直接的に付着される。このように、本発明は、本発明のポリペプチドを２，２，２−トリフルオロエタンスルホニル基を有するポリエチレングリコール分子と反応させることによって生産されるポリペプチド−ポリエチレングリコールコンジュゲートを含んでいる。
【０１４８】
またポリエチレングリコールはポリペプチドに多数の様々な介在リンカーを用いて付着させることもできる。例えば、米国特許第５，６１２，４６０号（これはその開示の全体を本明細書中に参照により組み入れる）は、ポリエチレングリコールをポリペプチドに連結するためのウレタンリンカーについて開示している。またポリエチレングリコールがポリペプチドにリンカーによって付着されているポリペプチド−ポリエチレングリコールコンジュゲートは、ポリペプチドとＭＰＥＧ−スクシニミジルスクシネート、１，１’−カルボニルジイミダゾールで活性化したＭＰＥＧ、ＭＰＥＧ−２，４，５−トリクロロフェニルカーボネート、ＭＰＥＧ−ｐ−ニトロフェノールカーボネート、および種々のＭＰＥＧ−スクシネート誘導体などの化合物との反応によって生産することもできる。その他の多数のポリエチレングリコール誘導体、およびポリエチレングリコールをポリペプチドに付着させる反応化学は、ＷＯ ９８／３２４６６に述べられており、その開示全体は本明細書中に参照により組み入れる。本明細書に記載の反応化学を用いて生産したＰＥＧ化ＢＬｙＳ結合性ポリペプチド産物は本発明の範囲内に含まれる。
【０１４９】
また本発明の各ポリペプチドに付着されるポリエチレングリコール部分の数（すなわち、置換の程度）は変えることができる。例えば、本発明のＰＥＧ化ポリペプチドは、平均して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１５、１７、２０個もしくはそれ以上のポリエチレングリコール分子と連結することができる。同様にして、置換の程度の平均も例えば、ポリペプチド１分子あたりポリエチレングリコール部分１〜３、２〜４、３〜５、４〜６、５〜７、６〜８、７〜９、８〜１０、９〜１１、１０〜１２、１１〜１３、１２〜１４、１３〜１５、１４〜１６、１５〜１７、１６〜１８、１７〜１９、もしくは１８〜２０個などの範囲内にありうる。置換の程度を測定するための方法は、例えば、Ｄｅｌｇａｄｏら， Ｃｒｉｔ． Ｒｅｖ． Ｔｈｅｒａ． Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓ．， ９：２４９−３０４（１９９２）で論じられている。
【０１５０】
ＢＬｙＳ結合性ポリペプチド多量体、コンジュゲート、および融合物
本発明は多価のＢＬｙＳ結合性ポリペプチドを包含する。ＢＬｙＳ結合性ポリペプチドは単量体、二量体、三量体、もしくはより高次な多量体とすることができる。好ましい１実施形態においては、多価のＢＬｙＳ結合性ポリペプチドはホモ三量体である。別の好ましい１実施形態においては、ホモ三量体のＢＬｙＳ結合性ポリペプチドは単一のホモ三量体ＢＬｙＳと結合する。
【０１５１】
別の好ましい１実施形態においては、単量体もしくは多量体のＢＬｙＳ結合性ポリペプチドは別のポリペプチドもしくはその他の化合物とコンジュゲートする。例えば、ＢＬｙＳ結合性ポリペプチドは放射性化合物、もしくはその他の毒性化合物とコンジュゲートさせて、ＢＬｙＳを発現している細胞を標的として破壊させることができる。
【０１５２】
本発明はまた、１個以上のＢＬｙＳ結合性ポリペプチドと１個以上の非ＢＬｙＳ結合性ポリペプチドもしくはその他の化学的部分とを含んでなるヘテロ多量体をも包含する。そのようなヘテロ多量体は、単量体、二量体、三量体、四量体、五量体、もしくはより高次の多量体とすることができる。ヘテロＢＬｙＳ結合性多量体はＢＬｙＳを発現している細胞、および異種の非ＢＬｙＳ結合性ポリペプチドもしくはその他の化学的部分に対する受容体を、標的とし、結合し、阻害し、および／もしくは応答を活性化するために用いることができる。そのような活性化される応答としては例えば、アポトーシス、もしくはその他の生物学的および化学的に介在された形態の細胞の破壊が挙げられうる。またヘテロＢＬｙＳ結合性多量体を用いて、ＢＬｙＳを発現している細胞を標的として所望の分子もしくは化合物をその細胞に導入することができる。例えば、ヘテロＢＬｙＳ結合性多量体は、放射性化合物もしくはその他の毒性化合物とコンジュゲートさせてＢＬｙＳを発現している細胞を死滅させることができる。別の１例として、ヘテロＢＬｙＳ結合性およびアデノウイルス結合性多量体は、ＢＬｙＳを発現している細胞を特異的に標的としてアデノウイルスが介在する遺伝子治療をその細胞中に導入するために用いうる。
【０１５３】
ＢＬｙＳ結合性ポリペプチド多量体は当業界で公知の方法を用いてホモ多量体およびヘテロ多量体として融合もしくはコンジュゲートすることができる。好ましい１実施形態においては、ＢＬｙＳ結合性ポリペプチドはホモ多量体として連結され、それの１個もしくは複数のリンカーは各ＢＬｙＳ結合性ポリペプチドが同時に個々のＢＬｙＳ分子と結合しうるのに十分な長さと柔軟性を与えている。別の好ましい１実施形態においては、ＢＬｙＳ結合性ポリペプチドはヘテロ多量体として連結され、それの１個もしくは複数のリンカーは各ＢＬｙＳ結合性ポリペプチドが同時に個々のＢＬｙＳ分子と結合しうるのに十分な長さと柔軟性を与え、異種のポリペプチドもしくは化学的部分は同時にそれの標的と結合することができる。適切なリンカー分子の多数の例については当業界で公知である。（例えば、Ｔｏｄｏｒｏｖｓｋａら， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ， ２４８（１−２）：４７−６６（２００１）； Ｍｅｈｖａｒ， Ｊ． Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌｅａｓｅ， ６９（１）：１−２５（２０００）； Ｆｒａｎｃｉｓら， Ｉｎｔ． Ｊ． Ｈｅｍａｔｏｌ．， ６８（１）：１−１８（１９９８）を参照のこと）。特定の実施形態においては、該リンカーは次のものからなる群から選択されるメンバーである：（ａ）ペプチドリンカー；（ｂ）グルタメートリンカー；および（ｃ）ポリエチレングリコールリンカー。本発明の方法に従って用いられるリンカーの長さは当業界で公知の技法を用いて慣例的に測定することができる。特定の実施形態においては、リンカーは５〜６０オングストロームの長さである。他の実施形態においては、リンカーは１０〜５０、１０〜４０、１０〜３０、もしくは１０〜２０オングストロームの長さである。さらに別の実施形態においては、リンカーは約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、もしくは１００オングストロームの長さである。この文脈で「約」とは、列挙した長さおよび／もしくはそれより数オングストローム（５、４、３、２、もしくは１オングストローム）長いもしくは短い長さのものを含んでいる。他の実施形態においては、リンカーは少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、もしくは１００オングストロームの長さである。
【０１５４】
好ましい１実施形態においては、ＢＬｙＳ結合性ポリペプチドはヒト血清アルブミン（ＨＡ）と融合させることができる。例えば、米国特許出願第０９／８３３，２４５号、２００１年４月１２日出願、を参照すればよく、これは本明細書に参照により組み入れる。１実施形態においては、該アルブミン融合タンパク質はＮ末端部分としてＨＡ、およびＣ末端部分としてＢＬｙＳ結合性ポリペプチドを含んでなるものである。別の１実施形態においては、該アルブミン融合タンパク質はＣ末端部分としてＨＡ、およびＮ末端部分としてＢＬｙＳ結合性ポリペプチドを含んでなるものである。
【０１５５】
他の実施形態においては、該アルブミン融合タンパク質はアルブミンのＮ末端およびＣ末端の双方に融合させたＢＬｙＳ結合性ポリペプチドを有している。好ましい１実施形態においては、Ｎ末端およびＣ末端に融合させたＢＬｙＳ結合性ポリペプチドが同一のＢＬｙＳ結合性ポリペプチドである。別の好ましい１実施形態においては、Ｎ末端およびＣ末端で融合させたＢＬｙＳ結合性ポリペプチドは異なるＢＬｙＳ結合性ポリペプチドである。別の好ましい１実施形態においては、それぞれＢＬｙＳ結合性ポリペプチドはＨＡのＮ末端もしくはＣ末端のいずれかに融合され、異なる（非ＢＬｙＳ結合性）ポリペプチドがＣ末端もしくはＮ末端のいずれかに融合されている。
【０１５６】
ＢＬｙＳ結合性ポリペプチドがＨＡのＮ末端および／もしくはＣ末端に融合されているアルブミン融合タンパク質に加えて、また本発明のＢＬｙＳ結合性ポリペプチド／アルブミン融合タンパク質はＢＬｙＳ結合性ポリペプチドをＨＡの１つもしくは複数の内部領域に挿入することによって生産することもできる。例えば、ＨＡ分子のタンパク質の配列内には、α−ヘリックスの末端部から開始部までの間に多数のループもしくはターンが存在しており、それはジスルフィド結合によって安定化されている（米国特許出願第０９／８３３，２４５号の図９〜１１を参照のこと）。ＨＡの結晶構造から決定されたループ（米国特許出願第０９／８３３，２４５号の図１３）（ＰＤＢ識別名 １ＡＯ６、１ＢＪ５、１ＢＫＥ、１ＢＭ０、１Ｅ７Ｅ〜１Ｅ７Ｉ、および１ＵＯＲ）は、その大部分が分子の本体の外へと延ばす。これらのループは、治療的活性を有するペプチド（特に機能的であるために二次構造が必要なもの）もしくは治療用タンパク質の挿入もしくは内部の融合に有用であり、本質的には特定の生物学的活性を有するアルブミン分子が生成される。
【０１５７】
その内部に本発明の結合性ポリペプチドが挿入されて本発明のアルブミン融合タンパク質を生成しうるヒトアルブミン構造中のループとしては次のものが挙げられる：Ｖａｌ５４−Ａｓｎ６１、Ｔｈｒ７６−Ａｓｐ８９、Ａｌａ９２−Ｇｌｕ１００、Ｇｌｎ１７０−Ａｌａ１７６、Ｈｉｓ２４７−Ｇｌｕ２５２、Ｇｌｕ２６６−Ｇｌｕ２７７、Ｇｌｕ２８０−Ｈｉｓ２８８、Ａｌａ３６２−Ｇｌｕ３６８、Ｌｙｓ４３９−Ｐｒｏ４４７、Ｖａｌ４６２−Ｌｙｓ４７５、Ｔｈｒ４７８−Ｐｒｏ４８６、およびＬｙｓ５６０−Ｔｈｒ５６６。より好ましい実施形態においては、本発明のポリペプチドは、成熟ヒト血清アルブミン（配列番号４４５）のＶａｌ５４−Ａｓｎ６１、Ｇｌｎ１７０−Ａｌａ１７６、および／もしくはＬｙｓ５６０−Ｔｈｒ５６６ループ中に挿入される。
【０１５８】
特定の実施形態においては、本発明のＢＬｙＳ結合性ポリペプチドは、放射性金属イオン（そのようなイオンとしては限定はされないが１１１Ｉｎ、１７７Ｌｕ、９０Ｙ、１６６Ｈｏ、および１５３Ｓｍが挙げられる）をポリペプチドとコンジュゲートさせるために有用な大環状キレート化剤に付着される。好ましい１実施形態においては、本発明のＢＬｙＳ結合性ポリペプチドに付着した大環状キレート化剤と会合した放射性金属イオンは１１１Ｉｎである。別の好ましい１実施形態においては、本発明のＢＬｙＳ結合性ポリペプチドに付着した大環状キレート化剤と会合した放射性金属イオンは９０Ｙである。特定の実施形態においては、大環状キレート化剤は、１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’−四酢酸（ＤＯＴＡ）である。他の特定の実施形態においては、ＤＯＴＡが１個のリンカー分子を介して本発明のＢＬｙＳ結合性ポリペプチドに付着している。ＤＯＴＡをポリペプチドとコンジュゲートさせるために有用なリンカー分子の例は当業界では一般的に知られている−例えば、ＤｅＮａｒｄｏら， Ｃｌｉｎ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．， ４（１０）：２４８３−９０（１９９８）； Ｐｅｔｅｒｓｏｎら， Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ． Ｃｈｅｍ．， １０（４）：５５３−７（１９９９）； およびＺｉｍｍｅｒｍａｎら， Ｎｕｃｌ． Ｍｅｄ． Ｂｉｏｌ．， ２６（８）：９４３−５０（１９９９）を参照されたい。これらはそれらの全体を本明細書中に参照により組み入れる。さらに、米国特許第５，６５２，３６１号および第５，７５６，０６５号は、抗体にコンジュゲートさせることのできるキレート化剤、およびそのキレート化剤の作製法と使用法について開示しているものであるが、これらはそれらの全体を本明細書中に参照により組み入れる。米国特許第５，６５２，３６１号および第５，７５６，０６５号はキレート化剤を抗体とコンジュゲートさせることに焦点を当ててはいるが、当業者であれば、キレート化剤を他のポリペプチドとコンジュゲートさせるためにそれらに開示されている方法を適用することは容易にできるであろう。
【０１５９】
本発明のＢＬｙＳ結合性ポリペプチドは既知の方法によって回収し精製することができるが、そのような方法としては、限定はされないが、硫酸アンモニウムもしくはエタノール沈殿、酸抽出、陰イオンもしくは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、およびレクチンクロマトグラフィーが挙げられる。最も好ましいのは、高速液体クロマトグラフィー（「ＨＰＬＣ」）を精製に用いることである。
【０１６０】
ＢＬｙＳ結合性ポリペプチドは検出可能な標識を用いて修飾することもでき、そのような標識としては限定はされないが、ＢＬｙＳ標的の検出と単離のための、酵素、補欠分子族、蛍光物質、発光物質、生物発光物質、放射性物質、陽電子放射金属、非放射性常磁性金属イオン、および親和性標識が挙げられる。検出可能な物質は、本発明のポリペプチドと直接的に、もしくは当業界で公知の技法を用いて中間物（例えば当業界で公知のリンカーなど）を介して間接的に、カップリングもしくはコンジュゲートさせることができる。適切な酵素の例としては、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、もしくはアセチルコリンエステラーゼが挙げられ；適切な補欠分子族複合体の例としては、ストレプトアビジン／ビオチン、およびアビジン／ビオチンが挙げられ；適切な蛍光物質の例としては、ビオチン、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロリド、もしくはフィコエリトリンが挙げられ；発光物質の例としてはルミノールが挙げられ；生物発光物質の例としては、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、およびエクオリンが挙げられ；適切な放射性物質の例としては、放射性金属イオン、例えば、２１３Ｂｉなどのα放射体、またはその他の放射性同位元素、例えばヨウ素（１３１Ｉ、１２５Ｉ、１２３Ｉ、１２１Ｉ）、炭素（１４Ｃ）、硫黄（３５Ｓ）、トリチウム（３Ｈ）、インジウム（１１５ｍＩｎ、１１３ｍＩｎ、１１２Ｉｎ、１１１Ｉｎ）、およびテクネチウム（９９Ｔｃ、９９ｍＴｃ）、タリウム（２０１Ｔｉ）、ガリウム（６８Ｇａ、６７Ｇａ）、パラジウム（１０３Ｐｄ）、モリブデン（９９Ｍｏ）、キセノン（１３３Ｘｅ）、フッ素（１８Ｆ）、１５３Ｓｍ、１７７Ｌｕ、１５９Ｇｄ、１４９Ｐｍ、１４０Ｌａ、１７５Ｙｂ、１６６Ｈｏ、９０Ｙ、４７Ｓｃ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１４２Ｐｒ、１０５Ｒｈ、９７Ｒｕ、６８Ｇｅ、５７Ｃｏ、６５Ｚｎ、８５Ｓｒ、３２Ｐ、１５３Ｇｄ、１６９Ｙｂ、５１Ｃｒ、５４Ｍｎ、７５Ｓｅ、１１３Ｓｎ、および１１７Ｔｉｎなどが挙げられる。
【０１６１】
特定の１実施形態においては、本発明のＢＬｙＳ結合性ポリペプチドはビオチンで標識される。
【０１６２】
本発明の結合性ポリペプチドと組換えバクテリオファージの使用
本明細書に記載のＢＬｙＳ結合性ポリペプチドは、溶液中のＢＬｙＳ標的タンパク質の検出、単離、もしくは除去に特に有用である。そのような溶液は、ＢＬｙＳおよび／もしくはＢＬｙＳ様ポリペプチドを水もしくは水性バッファー中に含む単純な分散液もしくは溶液とすることができ、または、例えば血液およびその他の体液、組織ホモジネート、細胞抽出物、もしくは生検サンプルなどのより複雑な溶液、およびＢＬｙＳもしくはＢＬｙＳ様ポリペプチドを含有する細胞培養培地とすることができる。体液としては、限定はされないが、血清、血漿、リンパ液、血液、血液の画分、尿、滑液、髄液、唾液、および粘液が挙げられる。
【０１６３】
１実施形態においては、本発明は溶液中のＢＬｙＳタンパク質および／もしくはＢＬｙＳ様ポリペプチドを検出するための方法を提供し、その方法は、溶液を本発明のＢＬｙＳ結合性ポリペプチドと接触させ、ＢＬｙＳ結合性ポリペプチドに対するＢＬｙＳもしくはＢＬｙＳ様ポリペプチドの結合を検出することを含んでなるものである。ＢＬｙＳ結合性ポリペプチドは遊離の状態とすることができ、または固定化された状態とすることもできる。好ましくは、ＢＬｙＳ結合性ポリペプチドは固体表面もしくはクロマトグラフ材料、またはプラスチックのマイクロタイターアッセイディッシュのウエル上に固定化されたポリペプチドである。
【０１６４】
本発明の別の１実施形態は、ＢＬｙＳタンパク質および／もしくはＢＬｙＳ様ポリペプチドを、それを含有する溶液から単離する方法であり、その方法は：
（ａ） その溶液を、ＢＬｙＳおよび／もしくはＢＬｙＳ様ポリペプチドがＢＬｙＳ結合性ポリペプチドと結合しうる条件下でＢＬｙＳ結合性ポリペプチドと接触させ、
（ｂ） ＢＬｙＳおよび／もしくはＢＬｙＳ様ポリペプチドを回収する、ことを含んでなる。
【０１６５】
本発明のさらに別の１実施形態は、ＢＬｙＳタンパク質および／もしくはＢＬｙＳ様ポリペプチドを、それを含有する溶液から単離する方法であり、その方法は：
（ａ） その溶液を、ＢＬｙＳおよび／もしくはＢＬｙＳ様ポリペプチドがＢＬｙＳ結合性ポリペプチドと結合しうる条件下でＢＬｙＳ結合性ポリペプチドと接触させ、
（ｂ） ＢＬｙＳ結合性ポリペプチドとＢＬｙＳおよび／もしくはＢＬｙＳ様ポリペプチドとによって形成される複合体（単一もしくは複数）を溶液中の他の成分から分離する、ことを含んでなる。
【０１６６】
好ましくは、このような方法にはさらに次のステップをも含める：
（ｃ） ＢＬｙＳ結合性ポリペプチドをＢＬｙＳおよび／もしくはＢＬｙＳ様ポリペプチドから解離させ、そして
（ｄ） 解離したＢＬｙＳおよび／もしくはＢＬｙＳ様ポリペプチドを回収する。
【０１６７】
本発明はまた、ＢＬｙＳおよび／もしくはＢＬｙＳ様ポリペプチドを検出する方法、もしくは単離する方法で使用するための、本発明の結合性ポリペプチドを含むキットをも提供する。
【０１６８】
本発明に従えば、ＢＬｙＳ標的タンパク質の検出もしくは単離は、ＢＬｙＳ標的タンパク質を含有する溶液をＢＬｙＳ結合性ポリペプチドと接触させることを含んでなるものである。特定の適用の如何によって、ＢＬｙＳ結合性ポリペプチドは溶液中に遊離の状態とすることができ、または固相支持体もしくはクロマトグラフ材料上に固定化された状態とすることができる。ＢＬｙＳ標的タンパク質と結合性ポリペプチドとの間の結合が可能となるように十分な時間をかけ、溶液中もしくは混合物中の非結合性成分を除去もしくは洗い流す。次いで結合性ポリペプチドとＢＬｙＳ標的タンパク質との間の結合性複合体の形成の検出は、例えば結合性ポリペプチド上の標識（それは結合性複合体の１成分である）からのシグナルを検出することによって行うことができる。標識は標準的な方法によって検出しうるシグナルを生じるような標識であればいかなるものでもよく、そのようなものとしては、蛍光標識、放射性化合物、もしくは基質と反応して検出可能なシグナルを生ずる酵素などがある。そのような適切な標識については上述している。本発明のファージ結合性ポリペプチド、すなわちその表面にＢＬｙＳ結合性ポリペプチドを展示している組換えファージは、ＢＬｙＳおよび／もしくはＢＬｙＳ様ポリペプチドと複合体を形成することができ、その複合体は反応試験管中で沈殿物もしくは沈降物として検出でき、それは沈殿させた後もしくは遠心分離後に視覚的に検出しうる。あるいは、サンドイッチタイプのアッセイを用いることができ、そのアッセイではＢＬｙＳ結合性ポリペプチドは固相支持体上、例えばプラスチック管もしくはウエルなどの上に固定化されるか、またはアガロースビーズなどのクロマトグラフ支持体マトリックス上に固定化され、次いで、ＢＬｙＳ標的を含むと予想される溶液を固定化された結合性ポリペプチドと接触させ、非結合性物質もしくは成分を除去もしくは洗い流す。
【０１６９】
本発明の結合性ポリペプチドは、ＢＬｙＳおよび／もしくはＢＬｙＳ様ポリペプチドの検出および／もしくは単離をアフィニティークロマトグラフィー法で行うのに特に有用である。従来法のクロマトグラフィーのいずれでも利用することができる。好ましくは、本発明のＢＬｙＳ結合性ポリペプチドは例えばクロマトグラフィーカラムにパッキングするのに適した固相支持体上に固定される。次いで固定化されたＢＬｙＳ結合性ポリペプチド親和性リガンドを、結合性ポリペプチド／ＢＬｙＳ（もしくはＢＬｙＳ様ポリペプチド）複合体の形成に都合のよい条件下で、ローディングするか、もしくは供給流と接触させることができる。非結合性物質を洗い流すことができる。適切な洗浄条件の例は当業者であれば容易に定めることができ、そのような条件の例としては、限定はされないが、［ＰＢＳ／０．０１％のＴｗｅｅｎ ２０， ｐＨ７．２］および［１Ｍ ＮａＣｌ／１０ｍＭ Ｔｒｉｓ， ｐＨ７．５］が挙げられる。Ｔｒｉｓ洗浄バッファーがおそらく好ましいが、それはリン酸塩が５０％のエチレングリコール中で沈殿することができるからである。一般的には、限定するものではないが、洗浄バッファーはｐＨ７．０であり、任意で０．０〜１．５ＭのＮａＣｌを含んでいるが、より好ましくは１Ｍ ＮａＣｌを含む。さらに、洗浄バッファーは任意で緩和な界面活性剤、例えば、Ｔｗｅｅｎ ２０、Ｔｗｅｅｎ ８０、もしくはＮＰ−８０などを含有することができる。ＢＬｙＳもしくはＢＬｙＳ様ポリペプチドはＢＬｙＳ結合性ポリペプチドから、結合性複合体の解離に好都合な溶液条件を導入することによって溶出することができる。適切な溶出液は当業者であれば容易に定めることができ、そのような溶出液としては、限定はされないが、［５０％のエチレングリコール／１００ｍＭ ＮａＯＡｃ］が挙げられる。非限定的な例示としては、本発明の目的に有用な溶出バッファーは、４０〜６０％のエチレングリコール、好ましくは５０％のエチレングリコール；および５０〜１００ｍＭのＮａＯＡｃでｐＨ４〜ｐＨ７の範囲のもの、より好ましくはｐＨ４〜ｐＨ６、最も好ましくはｐＨ４．５〜ｐＨ５．５のものを含有する。好ましくは、ファーストフロー（ｆａｓｔ ｆｌｏｗ）アフィニティークロマトグラフィー技法を分子の結合のために用い、それから精製されたＢＬｙＳもしくはＢＬｙＳ様ポリペプチドを溶出する。
【０１７０】
あるいは、ＢＬｙＳ標的を含有する溶液とＢＬｙＳ結合性ポリペプチドとを混合し、次いでＢＬｙＳ標的と結合性ポリペプチドとの複合体を単離することによるバッチクロマトグラフィーを行うことができる。このタイプの分離を行うための多数の方法が知られている。例えば、結合性ポリペプチドをビーズなどの固相支持体上に固定化し、次いでろ過によって供給流からＢＬｙＳ標的とともに分離することができる。別の１例においては、ＢＬｙＳ結合性ポリペプチドはそれ自体の親和性タグ、例えばポリＨｉｓテイルもしくはストレプトアビジン結合領域などで修飾し、それを用いて、固定化した金属アフィニティークロマトグラフ樹脂もしくはストレプトアビジンをコーティングした基質を用いて複合体を形成させた後、結合性ポリペプチドを単離することができる。分離後は、ＢＬｙＳ標的を溶出条件下で結合性ポリペプチドから放出させ、精製された形態で回収することができる。
【０１７１】
ＢＬｙＳもしくはＢＬｙＳ様ポリペプチドを生産する方法により、通常供給流中のＢＬｙＳもしくはＢＬｙＳ様ポリペプチドが得られるが、供給流にはさらに不純物（ＢＬｙＳ標的との関係で）が含まれる。本発明の目的の１つは、ＢＬｙＳ結合性ポリペプチドおよびＢＬｙＳ結合性ポリペプチドを含んでなる調製物（アフィニティークロマトグラフィー媒体もしくは表面など）を生産することであり、これらによって供給流からのＢＬｙＳ標的タンパク質の迅速で高度に特異的な精製が可能となる。本明細書の方法で得られたＢＬｙＳ結合性ポリペプチドは、特定の供給流からＢＬｙＳ標的タンパク質を単離するために、当業界で公知の条件および技法を用いて、もしくは慣例的に改変して、容易に適合させることができる。ＢＬｙＳの別の代替生産方法を用いる場合には、同じレベルの精製を達成するために、異なる供給流を生産すること、ＢＬｙＳ結合性ポリペプチドおよび／もしくは条件の異なるセットが必要となる場合がある。ＢＬｙＳ結合性ポリペプチドおよび／もしくは条件の新たなセットは、本明細書に概説した方法に従って、もしくはそれを改変して、そうでなければ当業界で公知の方法によって、容易に得ることができる。
【０１７２】
キット
また本発明は、ＢＬｙＳの存在のスクリーニングおよび／または液体、例えば体液（例えば、血液、血清、もしくは滑液）中のＢＬｙＳ濃度の定量に有用でありうるアッセイキットをも対象としたものである。
【０１７３】
本発明の特定の１実施形態においては、アッセイキットは、本発明のＢＬｙＳ結合性ポリペプチドの１個以上の容器、および任意で、ＢＬｙＳ標的／ＢＬｙＳ結合性ポリペプチド相互作用の存在もしくはその不在を測定するための検出手段を含んでなるものを意図している。キットはさらに任意で、例えば対照もしくは標準として用いることのできるＢＬｙＳタンパク質を含んでいる。ＢＬｙＳ結合性ポリペプチドは、遊離の状態、または宿主細胞の表面もしくはバクテリオファージの表面上に発現させたものとすることができる。
【０１７４】
特定の１実施形態においては、ＢＬｙＳ結合性ポリペプチドもしくはＢＬｙＳタンパク質のいずれかが標識される。本明細書でさらに述べるとおり、本発明には様々な標識を用いることができ、そのような標識としては限定はされないが、従来の手段によって認識ユニットをビオチンへコンジュゲートさせることが挙げられる。あるいは、標識は、例えば、発蛍光団（ｆｌｕｏｒｏｇｅｎ）、酵素、エピトープ、色素原、もしくは放射性核種を含んでなるものとすることができる。好ましくは、ビオチンが共有結合でＢＬｙＳ結合性ポリペプチドもしくはＢＬｙＳタンパク質のいずれかにコンジュゲートされる。好ましくはＢＬｙＳ結合性ポリペプチドは固相支持体上に固定化される。その標識を検出するために用いる検出手段は、標識の性質の如何によって変わり、当業界で公知のいかなる手段でもよく、例えば、放射性核種を検出するためのフィルム；酵素の存在を検出するための検出可能なシグナルを生ずる酵素基質；エピトープの存在を検出するための抗体、その他が挙げられる。
【０１７５】
ＢＬｙＳ結合性分子をスクリーニングするための方法
本発明はまた、ＢＬｙＳと結合するポリペプチドおよび非ポリペプチドを同定するためのスクリーニング方法、およびそれによって同定されたＢＬｙＳ結合性分子をも包含する。
【０１７６】
この方法は下記のステップを含んでなる：
（ａ） ＢＬｙＳタンパク質もしくはＢＬｙＳ様タンパク質を複数の分子と接触させ；および
（ｂ） ＢＬｙＳタンパク質もしくはＢＬｙＳ様タンパク質と結合する分子を同定する。
【０１７７】
ＢＬｙＳタンパク質もしくはＢＬｙＳ様タンパク質を複数の分子と接触させるステップは多数の方法で行うことができる。たとえば、ＢＬｙＳタンパク質もしくはＢＬｙＳ様タンパク質を固相支持体上に固定化し、複数の分子を含有する溶液をその固定化したＢＬｙＳタンパク質もしくはＢＬｙＳ様タンパク質と接触させることが考えられうる。このような方法はアフィニティークロマトグラフィー法と同種のものであり、その方法では親和性マトリックスは固定化されたＢＬｙＳタンパク質もしくはＢＬｙＳ様ポリペプチドを含んでなるものである。ＢＬｙＳタンパク質もしくはＢＬｙＳ様ポリペプチドに対する選択的親和性を有する分子は親和性選択によって精製することができる。固相支持体の性質、ＢＬｙＳタンパク質もしくはＢＬｙＳ様ポリペプチドの固相支持体への付着のプロセス、溶媒、および親和性による単離もしくは選択の条件は、大部分は従来から用いられてきたものであり、当業者には周知である。
【０１７８】
あるいは、複数の種類のポリペプチドを、ポリペプチドのサブセットもしくは個々のポリペプチドを含んでなる実質的な分離画分へと分離することもできる。例えば、複数の種類のポリペプチドを、ゲル電気泳動、カラムクロマトグラフィー、もしくは当業者に公知のポリペプチドを分離するための類似の方法によって分離することができる。個々のポリペプチドはまた、形質転換した宿主細胞によってその外表面上もしくはその周辺で発現されるような方法（例えば、組換えファージ）で生産させることができる。次いで、個々の単離体をＢＬｙＳタンパク質もしくはＢＬｙＳ様ポリペプチドによって「プロービング」することができ、それは任意で発現に必要な誘導物質の存在下で行うことができ、それによってＢＬｙＳタンパク質もしくはＢＬｙＳ様タンパク質と個々のクローンとの間の選択的親和性相互作用が起こっていればそのことを測定できる。ＢＬｙＳタンパク質もしくはＢＬｙＳ様タンパク質を、個々のポリペプチドを含んでなる各画分と接触させる前に、さらに都合よく行うためにそのポリペプチドをまず固相支持体に移すことができる。そのような固相支持体は、単にニトロセルロースもしくはナイロン製のものなどのフィルター膜の一片でよい。このようなやり方で、陽性のクローンを発現ライブラリーの形質転換された宿主細胞の集合から同定することができ、それはＢＬｙＳタンパク質もしくはＢＬｙＳ様タンパク質に対して選択的親和性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ構築物を持ったものである。さらに、ＢＬｙＳタンパク質もしくはＢＬｙＳ様タンパク質に対して選択的親和性を有するポリペプチドのアミノ酸配列は従来の手段で直接的に決定することができ、または、該ポリペプチドをコードするＤＮＡのコード配列はより都合よく決定することができる場合が多い。次いで、その一次配列を対応するＤＮＡ配列から推定することができる。アミノ酸配列がそのポリペプチド自体から決定されるものである場合には、マイクロシークエンシング（ｍｉｃｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）技法を用いることができる。そのシークエンシング技法には、質量分析が含まれうる。
【０１７９】
特定の状況下では、選択的親和性相互作用の存在を測定もしくは検出しようと試みる前に、結合してないＢＬｙＳタンパク質もしくはＢＬｙＳ様タンパク質、あるいは結合してないポリペプチドを、ＢＬｙＳタンパク質もしくはＢＬｙＳ様タンパク質と複数の種類のポリペプチドとの混合物から洗い流すことが望ましいかもしれない。そのような洗浄ステップは、ＢＬｙＳタンパク質もしくはＢＬｙＳ様タンパク質または複数の種類のポリペプチドが固相支持体に結合している場合には特に望ましい場合がある。
【０１８０】
この方法で提供される複数の分子は、種々のライブラリー、例えば、ランダムもしくはコンビナトリアルペプチドもしくは非ペプチドライブラリーなどによって提供され、それらのライブラリーをＢＬｙＳと特異的に結合する分子についてスクリーニングすることができる。用いることができる当業界で公知の多数のライブラリーがあり、それらとしては例えば、化学合成ライブラリー、組換えライブラリー（例えば、ファージディスプレイライブラリー）、およびｉｎ ｖｉｔｒｏでの翻訳に基づくライブラリーが挙げられる。化学合成ライブラリーの例については、Ｆｏｄｏｒら， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２５１：７６７−７７３（１９９１）； Ｈｏｕｇｈｔｅｎら， Ｎａｔｕｒｅ， ３５４：８４−８６（１９９１）； Ｌａｍら， Ｎａｔｕｒｅ， ３５４：８２−８４（１９９１）； Ｍｅｄｙｎｓｋｉ， Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， １２：７０９−７１０（１９９４）； Ｇａｌｌｏｐら， Ｊ． Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ３７（９）：１２３３−１２５１（１９９４）； Ｏｈｌｍｅｙｅｒら， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ９０：１０９２２−１０９２６（１９９３）； Ｅｒｂら， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ９１：１１４２２−１１４２６ （１９９４）； Ｈｏｕｇｈｔｅｎら， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ， １３：４１２（１９９２）； Ｊａｙａｗｉｃｋｒｅｍｅら， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ９１：１６１４−１６１８（１９９４）； Ｓａｌｍｏｎら， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ９０：１１７０８−１１７１２（１９９３）； ＰＣＴ 公開第ＷＯ ９３／２０２４２号；ならびにＢｒｅｎｎｅｒおよびＬｅｒｎｅｒ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８９：５３８１−５３８３（１９９２）中に述べられている。
【０１８１】
ファージディスプレイライブラリーの例は、ＳｃｏｔｔおよびＳｍｉｔｈ， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２４９：３８６−３９０（１９９０）； Ｄｅｖｌｉｎら， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２４９：４０４−４０６（１９９０）； Ｃｈｒｉｓｔｉａｎら， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， ２２７：７１１−７１８（１９９２）； Ｌｅｎｓｔｒａ， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈ．， １５２：１４９−１５７（１９９２）； Ｋａｙら， Ｇｅｎｅ， １２８：５９−６５（１９９３）； およびＰＣＴ国際公開第ＷＯ ９４／１８３１８号（１９９４年８月１８日付）中に述べられている。
【０１８２】
ｉｎ ｖｉｔｒｏでの翻訳に基づくライブラリーとしては、限定はされないが、ＰＣＴ国際公開第ＷＯ ９１／０５０５８号（１９９１年４月１８日付）； およびＭａｔｔｈｅａｋｉｓら， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ９１：９０２２−９０２６（１９９４）中に述べられているものが挙げられる。
【０１８３】
非ペプチドライブラリーの例としては、ベンゾジアゼピンライブラリー（例えば、Ｂｕｎｉｎら， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ９１：４７０８−４７１２（１９９４）を参照のこと）を適応して用いることができる。またペプトイド（ｐｅｐｔｏｉｄ）ライブラリー（Ｓｉｍｏｎら， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８９：９３６７−９３７１（１９９２）を参照のこと）も用いることができる。用いうるライブラリーの別の例としては、ペプチド中のアミド官能基が過メチル化されて化学的に転換されたコンビナトリアルライブラリーを生成したものが挙げられ、それはＯｓｔｒｅｓｈら（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ９１：１１１３８−１１１４２（１９９４））によって述べられている。
【０１８４】
本発明に有用な非ペプチドライブラリーの多様性はきわめて大きい。例えば、ＥｃｋｅｒおよびＣｒｏｏｋｅは、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， １３：３５１−３６０（１９９５）で、種々のライブラリーの基本を成す化学種としてベンゾジアゼピン、ヒダントイン、ピペラジンジオン、ビフェニル、糖類似体、β−メルカプトケトン、アリール酢酸、アシルピペリシン、ベンゾピラン、クバン、キサンチン、アミンイミド、およびオキサゾロンを列挙している。
【０１８５】
非ペプチドライブラリーは、おおまかに２つのタイプ：修飾されたモノマーおよびオリゴマーに分類することができる。修飾されたモノマーライブラリーは、比較的単純な骨格構造をとり、それに様々な官能基が付加される。その骨格は既知の有用な薬理活性を有する分子であることが多い。例えば、骨格はベンゾジアゼピン構造とすることができる。
【０１８６】
非ペプチドオリゴマーライブラリーは、モノマーの配列によって異なる新しい分子形状を創出するように集められた、多数のモノマーを利用する。用いられたモノマー単位には、カルバメート、ピロリノンおよびモルホリノがある。ペプトイドはα炭素ではなくαミノ基に側鎖が結合しているペプチド様オリゴマーであるが、これが非ペプチドオリゴマーライブラリーのもう１つのバージョンの基本となる。第１の非ペプチドオリゴマーライブラリーは１種類のモノマーを利用しており、したがって反復主鎖を含有した。最近のライブラリーは２種類以上のモノマーを使用するため、それによってライブラリーにさらに柔軟性が与えられる。
【０１８７】
ライブラリーのスクリーニングは、よく知られた様々な方法のいずれかによって達成することができる。例えば、下記の参考文献を参照されたい（ペプチドライブラリーのスクリーニングを発表している）：ＰａｒｍｌｅｙおよびＳｍｉｔｈ， １９８９， Ａｄｖ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． Ｂｉｏｌ．， ２５１：２１５−２１８； ＳｃｏｔｔおよびＳｍｉｔｈ， １９９０， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２４９：３８６−３９０； Ｆｏｗｌｋｅｓら、１９９２， Ｂｉｏ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ， １３：４２２−４２７； Ｏｌｄｅｎｂｕｒｇら、１９９２， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８９：５３９３−５３９７； Ｙｕら、１９９４， Ｃｅｌｌ， ７６：９３３−９４５； Ｓｔａｕｄｔら、１９８８， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２４１：５７７−５８０； Ｂｏｃｋら、１９９２， Ｎａｔｕｒｅ， ３５５：５６４−５６６； Ｔｕｅｒｋら、１９９２， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８９：６９８８−６９９２； Ｅｌｌｉｎｇｔｏｎら、１９９２， Ｎａｔｕｒｅ， ３５５：８５０−８５２； 米国特許第５，０９６，８１５号、米国特許第５，２２５，４０９号および米国特許第５，１９８，３４６号、いずれもＬａｄｎｅｒら； ＲｅｂａｒおよびＰａｂｏ， １９９３， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２６３：６７１−６７３； およびＰＣＴ国際公開ＷＯ ９４／１８３１８。
【０１８８】
特定の実施形態において、ＢＬｙＳに結合する分子を同定するスクリーニングは、ライブラリーのメンバーを、固相に固定化されたＢＬｙＳタンパク質またはＢＬｙＳ様タンパク質と接触させることによって実施することができる。このようなスクリーニング法は、「パニング」法と称されるが、例えばＰａｒｍｌｅｙおよびＳｍｉｔｈ， １９８８， Ｇｅｎｅ， ７３：３０５−３１８； Ｆｏｗｌｋｅｓら、１９２２， Ｂｉｏ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ， １３：４２２−４２７； ＰＣＴ国際公開ＷＯ ９４／１８３１８；および本文に引用された参考文献に記載されている。
【０１８９】
別の実施形態では、酵母において相互作用タンパク質を選択する２ハイブリッド系（ＦｉｅｌｄｓおよびＳｏｎｇ， １９８９， Ｎａｔｕｒｅ， ３４０：２４５−２４６； Ｃｈｉｅｎら、１９９１， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８８：９５７８−９５８２）を用いて、ＢＬｙＳまたはＢＬｙＳ様タンパク質に特異的に結合する分子を同定することができる。
【０１９０】
ＢＬｙＳ標的タンパク質と結合する能力をもつ新しい結合成分を得るための別のスクリーニング法は、競合アッセイを用いるものであるが、このアッセイではＢＬｙＳ標的を本発明のＢＬｙＳ結合性ポリペプチド（好ましくは、標識したもの）に結合させた後、この複合体を１以上の試験成分と接触させる。本明細書に開示された既知のＢＬｙＳ結合性物質の存在下でＢＬｙＳ標的との結合について効果的に拮抗することができる試験成分が、良好な新ＢＬｙＳ結合成分となるであろう。
【０１９１】
ＢＬｙＳ標的タンパク質と特異的に結合するポリペプチドは、好都合なことに、あらゆるペプチドライブラリーから選択することができる。こうしたライブラリーには、ランダムペプチドライブラリー、コンビナトリアルペプチドライブラリー、またはバイアスをかけたペプチドライブラリーがある。本明細書で使用される「バイアスをかけた」（ｂｉａｓｅｄ）という用語は、ライブラリーを作製する方法を操作して、結果として得られる分子コレクション（この場合ペプチドであるが）の多様性を支配する１以上のパラメーターを制限することを意味する。
【０１９２】
したがって、真にランダムなペプチドライブラリーは、ペプチドの所定の位置に特定のアミノ酸を見いだす確率が２０種のアミノ酸すべてについて同じであるようなペプチドコレクションをもたらすと考えられる。しかしながら、例えばリシンが５アミノ酸ごとに存在すること、あるいはデカペプチドライブラリーの４、８および９位がアルギニンのみを含むように確定すること、を特定することによって、ライブラリーにバイアスを導入することができる。安定なループ構造を示すように設計されたライブラリーに関しては、ペプチド配列は２つの不変のシステイン残基を包含するように設計され、他のすべてのアミノ酸位置はシステイン残基を除く１以上のアミノ酸残基とすることができる（後述の実施例１を参照されたい）。明らかに、様々なタイプのバイアスを考慮することができ、本発明はどのような特定のバイアスにも限定されない。さらに、本発明は、例えばファージディスプレイペプチドライブラリー、およびＤＮＡ挿入断片を保持するラムダファージベクターを含んでなるＤＮＡ構築物を利用したライブラリーといった、特定のタイプのペプチドライブラリーを包含する。
【０１９３】
前述のように、ＢＬｙＳ結合性分子がポリペプチドである場合には、このポリペプチドは約６から６０個未満までのアミノ酸残基を有することができるが、約６から約１０個までのアミノ酸残基が望ましく、最も望ましいのは約６から約２２個までである。別の実施形態においては、ＢＬｙＳ結合性ポリペプチドは１５〜１００個の範囲のアミノ酸を有し、または２０〜５０個のアミノ酸を含有する。
【０１９４】
選択されたＢＬｙＳ結合性ポリペプチドは、上記のように化学合成または組換え発現によって調製することができる。
【０１９５】
本明細書に開示した特定のＢＬｙＳ結合性ポリペプチドは、特定のあらかじめ選択された結合特性を示すＢＬｙＳ結合性ポリペプチドを同定するファージディスプレイ法によって単離された。これらのＢＬｙＳ結合性ポリペプチドは、はじめに、９種のファージディスプレイライブラリー、すなわちファージ表面に外来組換えポリペプチドを発現するように形質転換された組換えバクテリオファージの集団、をスクリーニングすることによって単離された。ＢＬｙＳのような特定の標的に対する新規ポリペプチド結合部分を単離するために、例えばファージディスプレイ法を使用するといったペプチドライブラリーのスクリーニングは特に有利である。というのは、非常に数多く（例えば、５×１０９）の結合可能性のある化合物を試験することができ、好結果の結合性物質を短時間で単離することができるためである。
【０１９６】
可能性のある結合性ポリペプチドのファージライブラリーを作製し、ＢＬｙＳ結合性ポリペプチドであるそのライブラリーのメンバーを求めてスクリーニングするために、ライブラリーで展示されるポリペプチドの構造鋳型として機能する候補結合ドメインを選択する。ファージライブラリーはこのような鋳型すなわち「親結合ドメイン」のポリペプチド類似体からなっている。親結合ドメインは、天然に存在するポリペプチド分子または合成のタンパク質もしくはポリペプチド、またはタンパク質のポリペプチド領域もしくはドメインである。親結合ドメインは、親結合ドメインと標的タンパク質との既知の相互作用に関する知見に基づいて選択することができるが、これは絶対に重要というわけではない。実際、親結合ドメインが標的に対して親和性を有することは不可欠ではない。なぜならば、非常に多数のポリペプチド類似体（「ライブラリー」）をそこから生じさせることができる構造を提供することを、目的としているためである。このポリペプチド類似体の多様性は、ＢＬｙＳ標的タンパク質に関して望ましい結合・放出特性（および選択された何か他の特性）を示す１以上の結合性ポリペプチドを包含すると考えられる。
【０１９７】
親結合ドメインとして機能する正確なポリペプチドに関する知見、または親結合ドメインが属するタンパク質またはドメインのクラスに関する知見は、ＢＬｙＳ結合性タンパク質がＢＬｙＳ標的タンパク質と最適に結合する条件、ならびにＢＬｙＳ結合性ポリペプチドがＢＬｙＳ標的タンパク質を最適に放出する条件を決定するうえで有用であると考えられる。同様に、結合ドメインおよびＢＬｙＳ標的タンパク質間の既知の相互作用を考慮して、例えば結合および／または放出条件下で相互作用を助けるように、結合および／または放出条件を選択することができ、あるいは、そうした既知の相互作用を考慮することなく、選択することもできる。また、望ましい結合および／または放出条件を考慮に入れて親結合ドメインを選択することができるが、そうでない選択も可能である。ライブラリーの結合ドメイン類似体が、提案されたまたは所望の結合もしくは放出条件下で不安定ならば、有用な結合性ポリペプチドはまったく得られないことが理解されよう。
【０１９８】
親結合ドメインを選択するときに、最も重要な考慮すべき事項は、いかにしてその類似体ドメインをＢＬｙＳ標的タンパク質に提示するか、すなわち、どのような形でＢＬｙＳ標的とポリペプチド類似体を相互に接触させるか、である。好ましい実施形態においては、例えば、ポリペプチド類似体をコードする合成ＤＮＡを、Ｍ１３ファージのような微生物の表面に該ドメインを展示させる複製可能な遺伝子パッケージに挿入することによって、ポリペプチド類似体を生成することができる。これに用いられる方法は、Ｋａｙら、Ｐｈａｇｅ Ｄｉｓｐｌａｙ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ．； Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ １９９６）および米国特許第５，２２３，４０９号（Ｌａｄｎｅｒら）に記載され、参考として本明細書に含めるものとする。ファージディスプレイライブラリーを作製するために、構造化されていない直鎖状のペプチドではなく、親結合ドメインまたは鋳型として構造化されたポリペプチドを使用することが望ましい。タンパク質ドメインもしくはポリペプチド分子の表面残基の変異は通常、タンパク質の全体的な構造もしくは一般的な性質（例えば、大きさ、安定性および変性温度）にはほとんど影響がない；ところが同時に、表面残基の変異は分子の結合特性に大いに影響を及ぼす可能性がある。ポリペプチドセグメントがより強固に拘束されているほど、特定の標的と結合しにくくなる。しかしながら、結合しさえすれば、その結合はより強固で、より特異的となる可能性が高い。したがって、親ポリペプチドが構造性を有するような親結合ドメインを選択することが望ましく、ひいては、ライブラリーのポリペプチド類似体のために、ある程度堅固なフレームワーク内で拘束されている構造を選択することが望ましい。
【０１９９】
ドメイン類似体のライブラリーを作製するための鋳型または親ドメインとして使用されるタンパク質ドメインは、比較的小さなタンパク質またはポリペプチドからなるペプチド分子であることが望ましい。低分子量ポリペプチドは、高分子量タンパク質よりもいくつかの利点を提供する：第１に、結合部位当たりの質量が減少する。低分子量の非常に安定なタンパク質ドメイン、例えばＫｕｎｉｔｚドメイン（〜７キロダルトン、ｋＤａ）、Ｋａｚａｌドメイン（〜７ｋＤａ）、Ｃｕｃｕｒｂｉｄａ ｍａｘｉｍａトリプシンインヒビター（ＣＭＴＩ）ドメイン（〜３．５ｋＤａ）、およびエンドセリン（〜２ｋＤａ）は、抗体（１５０ｋＤａ）または一本鎖ｓｃＦｖ抗体（３０ｋＤａ）よりもはるかに高いグラム当たりの結合を示すと考えられる。第２に、非特異的結合に利用される分子表面が少ないため、非特異的結合が低下する。第３に、低分子量ポリペプチドは、もっと大きなタンパク質や抗体には実行不可能な方法で、独自の結合部位を有するように操作することができる。例えば、低分子量タンパク質およびポリペプチドは、クロマトグラフィーマトリックスへの連結に適した部位にだけリシンを有するように操作することができる。これは抗体には実行不可能である。第４に、拘束されたポリペプチドの構造は、あるフレームワークから別のフレームワークに移すときに（構造ドメインはそのままで）、その機能性を維持する可能性が高い。例えば、結合ドメイン構造は、ファージ上に展示されるような、ライブラリーでのディスプレイのために用いられるフレームワークから、該展示フレームワークから分離されたもしくはクロマトグラフィー基体に固定化された単離タンパク質へと移し変えできる可能性が高い。
【０２００】
特定の実施形態では、本発明のＢＬｙＳ結合性ポリペプチドは固定化される。本発明のＢＬｙＳ結合性ポリペプチド分子は、例えばクロマトグラフィーの支持体に固定化されて、有効なＢＬｙＳ分離またはアフィニティークロマトグラフィー媒体を形成する。固定化された本発明のＢＬｙＳ結合性ポリペプチドは、溶液からＢＬｙＳ標的タンパク質を検出、単離または除去するという用途があるが、それらに限定されない。例えば、マトリックス、樹脂、または支持体に固定化できるＢＬｙＳ結合性ポリペプチド分子を生成する１つの方法は、適当な結合ドメイン鋳型を選択することにより、クロマトグラフィー樹脂または基体にＢＬｙＳ結合性ポリペプチドを共有結合させてアフィニティー樹脂を形成するために利用できる１個以上のアミノ酸を有するＢＬｙＳ結合性ペプチド分子を生成させることを伴う。同様に、ペプチド分子のＮ−末端アミノ基またはＣ−末端カルボキシル基は、これを不活性にするキャッピング基、または支持体との結合を可能にする官能基を付加することによって修飾することができる。例えば、タンパク質ドメインのＣ−末端カルボキシル基は、アルデヒド官能性基体または他のアミン反応性基体と反応させるために、アミドまたはヒドラジド（−ＮＨ−ＮＨ２）基に変換することができる。この方法は好ましい。本発明のＢＬｙＳ結合性ポリペプチド分子をクロマトグラフィー材料に結合するために有用な、ＢＬｙＳ結合性ポリペプチドのもう１つの好ましい修飾は、アミノ酸配列Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ（配列番号１３）を含んでなる、もしくは同配列からなる、ポリペプチドリンカーである。
【０２０１】
本発明に含まれるＢＬｙＳ結合性ポリペプチドを得るためのスクリーニング法の非限定的な例では、ファージディスプレイライブラリーにおけるファージは、固相支持体上に固定化されたＢＬｙＳ標的タンパク質と接触させて、これと結合させることが可能である。非結合性ポリペプチドを展示するファージは、ＢＬｙＳ標的タンパク質と結合したファージから分離される。当技術分野で公知の様々な技法のいずれかを応用して、結合したファージを固定化ＢＬｙＳタンパク質から解離させて、さらにそのファージおよび／またはその核酸成分を回収し、かつ／または増幅することができる。こうした方法を用いて、集団の中でおよそ２千万に１つのＢＬｙＳ結合性ファージを同定することができる。１〜２千万またはそれ以上の可能性のある結合性ペプチド分子をそれぞれ展示するライブラリーは、高親和性ＢＬｙＳ結合性ポリペプチドを探しだすために迅速にスクリーニングされる。
【０２０２】
スクリーニングの回を重ねるごとに、有効な結合性ポリペプチドのみが残るまで集団の多様性が低下し、すなわちこのプロセスが収束する。一般的に、ファージディスプレイライブラリーは、いくつかの密接に関連した結合性ポリペプチド（１千万のうち、１０〜５０の異なる結合性ポリペプチド）を含有するものである。収束の兆候には、密接に関連した配列の増大した結合性（ファージ力価で測定）および回収が含まれる。結合性ポリペプチド分子の最初の１セットが同定された後、その配列情報を利用して、例えばＢＬｙＳの異なった型（例えばＢＬｙＳの膜型および可溶性型）とその断片の識別、または供給流におけるＢＬｙＳと、密接に関連した不純物との識別といった、さらに他に望ましい性質を有するメンバーに対してバイアスをかけた別のライブラリーを設計することができる。
【０２０３】
このような方法によって、多数の可能性のある結合性ポリペプチドをスクリーニングすることが可能になるばかりでなく、実際上、結合・溶出サイクルを反復し、特定の基準に合致したポリペプチド類似体を展示するファージをスクリーニングするための第２のバイアスをかけたライブラリーを構築することができる。上記の方法を用いて、バイアスのかかったポリペプチド類似体ライブラリーをスクリーニングし、スクリーニング条件下でＢＬｙＳ標的タンパク質に対して強固に結合する、すなわち高い親和性を有するメンバーを明らかにすることができる。
【０２０４】
本発明において、標的ＢＬｙＳタンパク質分子はビオチン化後、ストレプトアビジンをコートした磁性粒子に結合させた。異なる設計の９種のファージディスプレイライブラリーを、固定化ＢＬｙＳと結合する能力についてスクリーニングした。各ライブラリーは、Ｍ１３ファージが展示する、異なる長さと全体構造を有する多様性に富んだペプチドを特徴とした：ＴＮ６／６と称するライブラリー（２×１０８変異体）は、ヘキサマーループ構造を形成するために内部に２つの不変システインを有する、多様性に富んだ１２−ｍｅｒを展示した。ＴＮ７／４と称するライブラリー（２．３×１０９変異体）は、ヘプタマーループ構造を形成するために内部に２つの不変システインを有する、多様性に富んだ１３−ｍｅｒを展示した。ＴＮ８／９と称するライブラリー（５×１０９変異体）は、オクタマーループ構造を形成するために内部に２つの不変システインを有する、多様性に富んだ１４−ｍｅｒを展示した。ＴＮ９／４と称するライブラリー（３．２×１０９変異体）は、ノナマーループ構造を形成するために内部に２つの不変システインを有する、多様性に富んだ１６−ｍｅｒを展示した。ＴＮ１０／９と称するライブラリー（２．５×１０９変異体）は、デカマーループ構造を形成するために内部に２つの不変システインを有する、多様性に富んだ１６−ｍｅｒを展示した。ＴＮ１２／１と称するライブラリー（１．４×１０９変異体）は、ドデカマーループ構造を形成するために内部に２つの不変システインを有する、多様性に富んだ１８−ｍｅｒを展示した。約２×１０８の多様なアミノ酸配列を有するＳｕｂｓｔｒａｔｅ Ｐｈａｇｅ Ｌｉｂｒａｒｙ ＃２と称するライブラリーは、１３の連続したアミノ酸からなる展示ポリペプチド内に直鎖状のペプチド多様化領域を含むように設計され、その展示ペプチド設計では、システイン以外のあらゆるアミノ酸残基を各位置に存在させた。最後に、それぞれＰｈＤ ７およびＰｈＤ １２という２つの市販の直鎖状ファージディスプレイライブラリーもスクリーニングした（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）。ＰｈＤ ７ライブラリーは直鎖状ランダム配列７−ｍｅｒを展示し、ＰｈＤ １２ライブラリーはランダム配列１２−ｍｅｒを展示した。
【０２０５】
ＢＬｙＳ結合性ファージをＰｈＤ ７以外のすべてのファージから単離して集めた。
【０２０６】
ライブラリースクリーニングから単離した配列を分析した後、ＢＬｙＳ結合性ペプチドのいくつかのファミリーが規定された（上記コンセンサス配列Ａ−ＧおよびＨ−Ｌを参照されたい）。第１回スクリーニングから得たＢＬｙＳ結合性「ヒット」のアミノ酸配列を表１〜８（下記）に示す。
【０２０７】
ＢＬｙＳ標的に対してさらに一層高い親和性を有するＢＬｙＳ結合性ポリペプチドを得るために、ＰｈＤ １２ライブラリーの高親和性の多様な例を基をもとにして、特殊化したライブラリー、すなわちＢＬｙＳ親和性成熟ライブラリー、を作製した（実施例６参照）。このライブラリーは、ＢＬｙＳに高い親和性を示す可能性の高いポリペプチドが多く含まれる集団を与えるように設計された。このようなライブラリーからの選択は、可溶性ＢＬｙＳの可溶性溶離液または他のＢＬｙＳ結合性ポリペプチドとの長期の競合によって、ＢＬｙＳに対して最も高い親和性を有するポリペプチド以外のすべてを排除するように実施された。親和性成熟ライブラリーの４回のスクリーニングから、高親和性ＢＬｙＳ結合性ポリペプチドの大ファミリーが単離され、それらのアミノ酸配列を表１４（下記）に示す。
【０２０８】
本発明のＢＬｙＳ結合性ポリペプチド、およびそのようなポリペプチドを含んでなるファージは、上記のようにＢＬｙＳおよびＢＬｙＳ様ポリペプチドを検出し単離することを包含する用途を有するが、用途はこれに限定されない。
【０２０９】
本発明によるＢＬｙＳ結合性ポリペプチドの単離およびその使用は、下記でさらに説明される。下記の実施例に含まれる特定のパラメーターは、発明の実施を説明することを意図したものであり、決して本発明の範囲を限定するために提示されるのではない。
【０２１０】
実施例１：  ファージディスプレイライブラリーのスクリーニング
９６ウェルプレートと比べて結合能が優れているため、スクリーニング時に標的を提示するために、ストレプトアビジンをコートした磁性ビーズ（Ｄｙｎａｌ Ｍ−２８０）を選択した。ビーズのビオチン化抗体に対する結合能は、製造業者が記載するとおりビーズｍｇ当たり５〜１０μｇであった。本研究および次のスクリーニングのために、ビーズ１ｍｇあたり５μｇのビオチン化組換えＢＬｙＳ（Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ， Ｉｎｃ．より入手）が割り当てられた。このビオチン化ＢＬｙＳの量は、ビーズの飽和に関して、標的の１０倍過剰に相当する。未結合のＢＬｙＳを洗浄して除去した。Ｍａｂ １６Ｃ９（マウス抗ＢＬｙＳ、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ）一次抗体、および二次抗体としてヤギ抗マウスＨＲＰコンジュゲートを用いて検出することによって、結合したビオチン化ＢＬｙＳを確認した。関連性のないモノクローナル抗体（抗ＴＮＦα）を用いて、非特異的結合の対照とするため別の１セットのビーズを探査した。呈色試薬ＴＭＢを使用し、アッセイをＯＤ ６３０ ｎｍで読み取った。
【０２１１】
９種のライブラリー、ＴＮ６／６、ＴＮ７／４、ＴＮ８／９、ＴＮ９／４、ＴＮ１０／９、ＴＮ１２／１、Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ Ｐｈａｇｅ Ｌｉｂｒａｒｙ ＃２、ＰｈＤ７、およびＰｈＤ１２を、ＢＬｙＳ結合性物質を求めてスクリーニングした。これらのライブラリーの構成は下記の通りである：
ＴＮ６／６ファージディスプレイライブラリーは、Ｘａａ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｃｙｓ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｃｙｓ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｘａａ（配列番号１４）の構造を有するポリペプチド鋳型に基づいてループ構造を形成する可能性をもつ、多様性に富んだペプチドを展示する組換えＭ１３ファージから構成され、２．０×１０８のペプチド多様性を提供した。
【０２１２】
ＴＮ７／４ファージディスプレイライブラリーは、Ｘａａ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｃｙｓ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｃｙｓ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｘａａ（配列番号１５）の構造を有するポリペプチド鋳型に基づいてループ構造を形成する可能性をもつ、多様性に富んだペプチドを展示する組換えＭ１３ファージから構成され、２．３×１０９のペプチド多様性を提供した。
【０２１３】
ＴＮ８／９ファージディスプレイライブラリーは、Ｘａａ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｃｙｓ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｃｙｓ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｘａａ（配列番号１６）の構造を有するポリペプチド鋳型に基づいてループ構造を形成する可能性をもつ、多様性に富んだペプチドを展示する組換えＭ１３ファージから構成され、５×１０９のペプチド多様性を提供した。
【０２１４】
ＴＮ９／４ファージディスプレイライブラリーは、Ｘａａ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｃｙｓ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｃｙｓ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｘａａ（配列番号１７）の構造を有するポリペプチド鋳型に基づいてループ構造を形成する可能性をもつ、多様性に富んだペプチドを展示する組換えＭ１３ファージから構成され、３．２×１０９のペプチド多様性を提供した。
【０２１５】
ＴＮ１０／９ファージディスプレイライブラリーは、Ｘａａ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｃｙｓ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｃｙｓ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｘａａ（配列番号１８）の構造を有するポリペプチド鋳型に基づいてループ構造を形成する可能性をもつ、多様性に富んだペプチドを展示する組換えＭ１３ファージから構成され、２．５×１０９のペプチド多様性を提供した。
【０２１６】
ＴＮ１２／１ファージディスプレイライブラリーは、Ｘａａ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｃｙｓ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｃｙｓ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｘａａ（配列番号１９）の構造を有するポリペプチド鋳型に基づいてループ構造を形成する可能性をもつ、多様性に富んだペプチドを展示する組換えＭ１３ファージから構成され、１．４×１０９のペプチド多様性を提供した。
【０２１７】
Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ Ｐｈａｇｅ Ｌｉｂｒａｒｙ ＃２は、約８０アミノ酸からなるポリペプチド挿入断片を展示する組換えＭ１３ファージから構成されるが、このポリペプチドは２つのストレプトアビジン結合ドメイン、１３アミノ酸からなる直鎖状の多様性に富んだセグメント（Ｃｙｓ以外のすべてのアミノ酸を各位置に配置することが可能である）、およびＸａ因子切断部位を有し、これらはペプチドリンカーで連結された。このライブラリーは、２×１０８展示ポリペプチドの多様性を提供した。
【０２１８】
ライブラリーＰｈＤ７およびＰｈＤ１２は、ランダム化された直鎖状７−および１２−アミノ酸ペプチドを展示する組換えＭ１３ファージから構成されるが、これらは市販品をＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓから購入した。
【０２１９】
各回のスクリーニングの前に、５等分したストレプトアビジンビーズにライブラリーを添加して１０分間結合させておくことによって、ファージライブラリーまたはファージライブラリープールから、ストレプトアビジンビーズに結合可能なファージを枯渇させた。枯渇させたライブラリーをストレプトアビジン磁気ビーズ上のビオチン化ＢＬｙＳに添加し、室温で１時間結合させた。１回目のスクリーニングのために、最初からプールされていたＰｈＤ７およびＰｈＤ１２以外のすべてのライブラリーは、別々にしておいた。結合後、ビーズを７回洗浄し、結合しているファージをクエン酸緩衝溶液とともにｐＨ２．０で１０分間インキュベートして、溶出した。溶出されたファージを２ Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ ８．０で中和し、大腸菌ＸＬ−１ Ｂｌｕｅ ＭＲＦ’に感染させた。感染した細胞を大きな寒天平板に塗布し、当技術分野で公知の標準的なファージ技法を用いて、次回の出発材料を産生させた。スクリーニングの回ごとに、回収されたインプットの比率をそれぞれのライブラリー（ライブラリープール）について算出した。これは、回収されたファージ数を初発ファージ数で割ったものに等しい。インプットの回収率が全ファージの１×１０−２に達した後は、スクリーニングのそれ以上の回数を重ねなかった。２回目のスクリーニングのためのプールＡは、ＴＮ６／６、ＴＮ７／４およびＴＮ８／９の１回目のアウトプットの混合物である。２回目のためのプールＢは、ＴＮ９／４、ＴＮ１０／９およびＴＮ１２／１の１回目のアウトプットの混合物である。プールＡおよびプールＢについての２回目のスクリーニング後、インプットの回収率は１×１０−２と同等またはそれより大であったので、それ以上の回数を重ねなかった。Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ Ｐｈａｇｅ Ｌｉｂｒａｒｙ ＃２およびＰｈＤプールに関しては、３回目のスクリーニングが必要であった。
【０２２０】
スクリーニングの終わりに、それぞれのファージ分離株をランダムに選択して、ＥＬＩＳＡによってＢＬｙＳへの結合を調べた。同分離株をＤＮＡ配列解析に供し、展示されたペプチドのヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列を特定した。また、分離株は、ＣＨＯ上清およびＳｆ９上清（Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｉｎｃから提供された）の供給流中で組換えＢＬｙＳと結合する能力についても調べた。
【０２２１】
各分離株は、標準ＥＬＩＳＡ法によってＢＬｙＳとの結合について調べたが、この場合、結合ファージはモノクローナル抗ファージ抗体／ＨＰＲコンジュゲートを用いて検出した。ＴＮライブラリープールＡおよびプールＢから分離されたファージの約９０％が、ストレプトアビジン単独に対するバックグラウンド結合を超えて３×から１２×までの範囲のＢＬｙＳに対する結合シグナルを有していた。Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ Ｐｈａｇｅ Ｌｉｂｒａｒｙからのファージ分離株は、同様であるがやや低い結合シグナルを示した。
【０２２２】
可能性のあるプロセス供給流において、ＢＬｙＳ標的を認識するＢＬｙＳ結合性ポリペプチドの能力を評価するために、ファージの結合性を２つの供給流において測定した：ＢＬｙＳを加えたＣＨＯおよびＳｆ９上清。標準条件であるＰＢＳ＋ＴｗｅｅｎではなくＣＨＯ上清またはＳｆ９上清のいずれかにおいて、ファージをＢＬｙＳと結合させた。他のすべての洗浄ステップは標準ＥＬＩＳＡ条件と同様であった。ＰＢＳ＋Ｔｗｅｅｎ、ＣＨＯ上清、およびＳｆ９上清におけるＢＬｙＳ結合性ポリペプチドとＢＬｙＳとの結合は、すべての条件下で極めて類似していた。いくつかの単離されたＢＬｙＳ結合性ポリペプチドはＣＨＯ上清において最大５０％の結合低下を示した。Ｓｆ９上清においてＢＬｙＳと結合する単離されたＢＬｙＳ結合性ポリペプチドは、標準条件下での結合と有意な差はなかった。ＰｈＤおよびＳｕｂｓｔｒａｔｅ Ｐｈａｇｅ Ｌｉｂｒａｒｙで単離されたペプチドも、供給流において比較した。注目すべきことに、こうした単離ペプチドのいくつかは標準条件よりも供給流においてより高い結合を示した。
【０２２３】
展示されたペプチドのアミノ酸配列は、ファージ分離株のＤＮＡ挿入断片の配列決定から導かれた。ファージ分離株から得られた配列データはライブラリーごとにグループ分けし、類似性の程度によって分類された。ＢＬｙＳ結合性ファージ分離株のペプチドを下記の表１〜８に示す。これらのペプチドは、ファージディスプレイ融合／ペプチドをコードする遺伝子の様々な領域にわたるＤＮＡ配列の翻訳に相当する。
【０２２４】
【表１】
2004532604.tif 000003
【０２２５】
【表２】
2004532604.tif 000004
【０２２６】
【表３】
2004532604.tif 000005
【０２２７】
【表４】
2004532604.tif 000006
【０２２８】
【表５】
2004532604.tif 000007
【０２２９】
【表６】
2004532604.tif 000008
【０２３０】
【表７】
2004532604.tif 000009
【０２３１】
【表８】
2004532604.tif 000010
【０２３２】
いくつかの基準に基づいて、さらに特徴を明らかにするために少数のファージ分離株を選択したが、その基準とは、ＥＬＩＳＡシグナルの強さ（すなわち、１０分後にＯＤ６３０≧０．８）、同一の配列が発見される回数、および反復配列モチーフの存在である。選択されたファージ分離株の特徴の一部を下記に示す。分離株に何回も見いだされる配列モチーフに下線を付している。
【０２３３】
2004532604.tif 000011
【０２３４】
ＢＬｙＳ結合性ポリペプチドをＢＬｙＳ精製のための親和性リガンドとして利用できる、可能性のある溶出条件を見いだすために、様々な放出条件（下記参照）を調べた。放出研究のために、ストレプトアビジン上に固定化されたビオチン化ＢＬｙＳを含有するウェルに一定数のファージを加えた。ファージを結合させた後、それぞれのファージ分離株を次に、様々なバッファーを用いて５分間の洗浄を２回行うことによってウェルから「溶出」させた。ウェルを標準洗浄バッファーで洗浄し、結合したファージを標準的なファージＥＬＩＳＡで検出した。溶出条件は、低いｐＨでの放出を基にして選択されたが、これはスクリーニング時に用いられた機序であり、さらに別の溶出条件が、ＢＬｙＳ産物が少なくとも数時間は安定であることが分かっている条件に基づいて選択された。様々な溶出条件は、ＰＢＳ ｐＨ ７．０、クエン酸緩衝溶液ｐＨ ５．０、クエン酸緩衝溶液ｐＨ ３．０、クエン酸緩衝溶液ｐＨ ２．０、１Ｍ グアニジンｐＨ ７．０、および１Ｍ尿素ｐＨ７．０とした。ファージ分離株の一部の結合は標準条件下（ＰＢＳ ｐＨ ７．０）で減少した。これは、これらの実験がそれ以前のすべての実験で用いられた細菌の一晩培養上清ではなく濃縮されたファージ調製物で行われたために生じたのかもしれない。ファージの濃縮に使用されるポリエチレングリコールは、こうした分離株の結合を妨げると考えられている。このような放出研究のために選択されたファージ分離株の最初のシグナルは、ＯＤ６３０ｎｍが０．５以上であった。全体として、結合しているファージを放出させるために１Ｍ尿素ｐＨ７．０が最適のバッファーであると思われた。
【０２３５】
実施例２：  ＢＬｙＳ結合性ポリペプチドのＳｅｐｈａｒｏｓｅ−４ＦＦビーズへの固定化
上記の結果に基づいて、６種の展示ファージ配列を以後の研究のために選択した：
ＴＮ７−０１−Ａ０８（配列番号２７）、ＴＮ８−０１−Ｂ０７（配列番号３１）、ＴＮ１０−０１−Ｆ０５（配列番号７８）、ＴＮ１２−０１−Ｈ０５（配列番号８９）、ＰｈＤ−０２−Ｃ０４（配列番号１２８）、およびＰｈＤ−０２−Ｃ１２（配列番号１１０）。適当なＢＬｙＳ親和性リガンドを開発するために、同定された展示ペプチドは、わずかな修飾を加えて、製造供給メーカーに注文して合成された：
ファージディスプレイ鋳型の多様性に富んだ領域に対応する配列の最初のアミノ酸に遊離アミンが残されるのを避けるために、リーダーの２つのアミノ酸をそれぞれの結合性ペプチドのＮ末端に付加した；Ｎ−末端をアセチル化して、ペプチドが当該位置を介してクロマトグラフィーマトリックスに固定化されるのを防止した；Ｃ末端リンカーを付加した（すなわち、−ＰＧＰＥＧＧＧＫ；配列番号１３）；さらに、ペプチドに内在するすべてのリシンを次の基でブロックした：ｉｖＤｄｅ（すなわち、１−（４，４−ジメチル−２，６−ジオキソシクロヘキサ−１−イリデン）−３−メチルブチル−Ｌ−リシン）。この基は、合成し終わったペプチドでは完全な状態であるが、固定化もしくはフルオレセイン標識化後には除去される。別の修飾として、内部にリシンを有するペプチドはまた、Ｃ−末端ヒドラジド官能基を付して合成したが、これは活性化アルデヒドクロマトグラフィー媒体に固定化可能である。
【０２３６】
ペプチドをリガンド濃度２μｍｏｌ／ｍｌとなるようにＮＨＳ−活性化Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ−４ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗアガロース媒体（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に固定化した。媒体上のペプチドの実際のリガンド濃度は０．７６μｍｏｌ／ｍｌから１．９８μｍｏｌ／ｍｌの範囲であったが、これは固定化されたペプチドのアミノ酸分析によって定量された。１つを除くすべてのペプチドが１００ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４／１５０ｍＭ ＮａＣｌ／０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０、ｐＨ ７．５という水性条件で固定化された。溶解性の理由により、ペプチドＤＸ２１７（下記表９を参照されたい）は、３０％ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）／１００ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４／１５０ｍＭ ＮａＣｌ／０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０、ｐＨ ７．５中で固定化された。固定化反応は室温で２時間進行させ、次にｐＨ ７．５バッファーで短時間洗浄した。さらにＦａｓｔ Ｆｌｏｗ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ媒体を室温で一晩撹拌しておき、残存するＮＨＳエステルを加水分解した後、媒体を洗浄して未結合ペプチドをすべて除去した。２％ヒドラジン／ＤＭＦ溶液を用いてｉｖＤｄｅ−リシンを含有するリガンドを脱ブロックした。次に媒体を水性バッファーでさらに洗浄し、カラムに充填するまで４℃で保存した。表９は、合成ペプチドの配列および測定されたアガロ−ス媒体上のそれらの濃度を示す。
【０２３７】
【表９】
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【０２３８】
ＢＬｙＳ−リガンド親和性の定量（方法の概略）
合成ペプチドとＢＬｙＳ（溶液中、遊離）との間の解離定数を蛍光異方性（ＦＡ）によって測定した。この実験では、フルオレセイン標識ペプチドの濃度を一定に保ち、ＢＬｙＳタンパク質濃度を変化させた。観察される異方性の変化を非線形回帰によって下記の方程式に当てはめて、見かけのＫＤを得た。
【０２３９】
2004532604.tif 000013
式において：
ｒｏｂｓ ＝観察された異方性、ｒｆｒｅｅ ＝遊離ペプチドの異方性、ｒｂｏｕｎｄ ＝結合ペプチドの異方性、ＫＤ ＝解離定数、ＢＬｙＳ ＝全ＢＬｙＳ濃度、およびＰ ＝全フルオレセイン標識ペプチド濃度。
【０２４０】
ウェル当たり１０〜２０μｌの容量中に５０ｎＭフルオレセイン標識ペプチドおよび様々な濃度のＢＬｙＳを含有する結合反応を、３８４ウェルマイクロプレートで行った。反応は、Ｔｅｃａｎ Ｐｏｌａｒｉｏｎ 蛍光偏光プレートリーダーを用いてアッセイした。１００μＭ 非標識ペプチドの存在下および非存在下で、５０ｎＭフルオレセイン標識ペプチドおよび１〜２μＭ ＢＬｙＳを用いて、ペプチド間相互の競合に関する実験を行った。一次結合バッファー［１５ｍＭクエン酸ナトリウム、１２０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０１％ Ｔｗｅｅｎ ２０］を用いてｐＨ６．０で、さらに２００ｍＭ 炭酸水素ナトリウム、１２５ｍＭ 塩化ナトリウムを用いてｐＨ９．０で、ＫＤ測定値へのｐＨの影響を検討した。ＢＬｙＳ結合性ポリペプチドの解離定数を測定した他のバッファーには下記がある：［ｐＨ ６．０， ０．０１％ Ｔｗｅｅｎ］、［ｐＨ ６．０， ０．１％ゼラチン］、［ｐＨ ５．０， ０．０１％ Ｔｗｅｅｎ］、［ｐＨ ９．０， ０．１％ Ｔｗｅｅｎ］、［ｐＨ ６．０， １５％エチレングリコール、０．０１％ Ｔｗｅｅｎ］、［ｐＨ ５．０， １５％エチレングリコール、０．０１％ Ｔｗｅｅｎ］、および［ｐＨ ９．０， １５％エチレングリコール、０．０１％ Ｔｗｅｅｎ］。６種のペプチドのすべて（ＤＸ２１２、ＤＸ２１４、ＤＸ２１６、ＤＸ２１７、ＤＸ２１９、およびＤＸ２２１）がほぼ同等の親和性をもって溶液中のＢＬｙＳに結合した（ＫＤ ＝ ０．４〜３μＭ）。相互競合に関する実験は、すべてのペプチドが、ＢＬｙＳ結合性に対して互いに競合することを実証したが、これはすべてのペプチドがＢＬｙＳ上の同一部位に結合することを示唆する。
【０２４１】
実施例３：  固定化されたＢＬｙＳ結合性ポリペプチドのクロマトグラフィーによるスクリーニング
６種のアフィニティー媒体のクロマトグラフィー性能を評価するために逆相分析アッセイを用いた。
【０２４２】
６種のアフィニティー媒体（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ−４ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗに結合しているＢＬｙＳ結合性ポリペプチド）および対照カラム（加水分解ＮＨＳ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ−４ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ）を３×５０ ｍｍガラス製Ｏｍｎｉｆｉｔカラム（３５０μｌ）に充填した。すべてのカラムは、Ｗａｔｓｏｎ／Ｍａｒｌｏｗ １０１ ｒｕペリスタル型ポンプを用いて、２００μｌ／ｍｉｎ（１７０ｃｍ／ｈｒ）で試験した。このような構成装置は、制約なしに、数多くの洗浄、タンパク質および溶出の条件を使用することを可能にした。検出は、Ｗａｔｅｒｓ Ｍｉｌｌｅｎｎｉｕｍワークステーションに接続したＷａｔｅｒｓ ２４８７ ＵＶ／ＶＩＳ検出器を用いて、２１４ ｎｍおよび２８０ ｎｍで行った。
【０２４３】
ＰＢＳ／０．０１％Ｔｗｅｅｎ ２０， ｐＨ ７．２中３０μｇ／ｍｌの精製ＢＬｙＳを用いた初期スクリーニングでは、対照カラムの素通り画分で６５％の回収率を示した（合計で１ ｍｌ， ３０μｇ）。しかしながら、同様に実験した場合、すべてのカラムが溶液から定量的にＢＬｙＳを結合したが、タンパク質を放出しないことが直ちに判明した。そこで、考えられうる多数の溶出条件で試験し、ＢＬｙＳの放出を２１４ ｎｍおよび２８０ ｎｍでモニターした。ＵＶ吸収に基づいてＢＬｙＳの溶出が予想される画分を集め、確認のため逆相クロマトグラフィーで分析した。試験した条件を表１０（下記）に示す。
【０２４４】
【表１０】
2004532604.tif 000014
【０２４５】
ＤＸ２１４、ＤＸ２１６、ＤＸ２１７、ＤＸ２１９、およびＤＸ２２１アフィニティー媒体で作られたカラムは、ｐＨ ２のバッファー（３０ｍＭ Ｈ３ＰＯ４／１５０ｍＭ ＮａＣｌ， ｐＨ ２）の存在下でＢＬｙＳを放出するにすぎない。これらのカラムからの回収率は３０％から６５％であった。これに対して、ＤＸ２１２アフィニティー媒体は、５０％エチレングリコール、ｐＨ ４（５０％エチレングリコール／１００ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ ４）を用いた、または５０％エチレングリコール、ｐＨ ５（５０％エチレングリコール／１００ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ ５）を用いた溶出で、良好な回収率でＢＬｙＳを放出した。
【０２４６】
溶出条件がＢＬｙＳを天然の三量体型に維持することに有効であるかどうかを判定するために、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を用いて、天然のＢＬｙＳ、ならびにｐＨ２および５０％エチレングリコール／１００ ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ ５の両方に曝したＢＬｙＳをアッセイした。ｐＨ ２でのインキュベーション後のＢＬｙＳのＳＥＣ分析から、２つの新ピークの存在が明らかになったが、これらのサイズは見かけ上の多量体および単量体型に相当し、天然型の三量体の証拠はなかった。５０％エチレングリコール中でのインキュベーションの結果は、１６％の多量体であったが、そのほかは三量体を維持した。５０％エチレングリコール（ｐＨ ５．０）でＤＸ２１２カラムから溶出された物質に関するその後のＳＥＣの結果は、多量体を示さなかった。
【０２４７】
実施例４：  細胞培養上清からのＢＬｙＳの捕捉
細胞培養上清からＢＬｙＳを精製するＤＸ２１２、ＤＸ２１９、およびＤＸ２１４アフィニティーカラムの能力を調べた。ＣＨＯおよびＳｆ９細胞系由来の凍結融解細胞培養上清にＢＬｙＳを約４０μｇ／ｍｌスパイクした。およそ１００μｇのＢＬｙＳ（合計２．５ ｍｌ）を各カラムにローディングした。Ｓｆ９素通りサンプル中のＢＬｙＳレベルは逆相ＨＰＬＣアッセイで検出できなかった。溶出バッファー［５０％エチレングリコール、１００ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ ５．０］でＢＬｙＳを溶出した。この実験から得られたＢＬｙＳタンパク質の回収率は、２９．４％から完全回収までの範囲であり、純度は７６％から９６．５％の間であった。
【０２４８】
実施例５：  他のＢＬｙＳ結合性ペプチドの合成
ひとたび有望なＢＬｙＳ結合性ポリペプチドが単離されたならば、１個または数個のアミノ酸残基を置換させ、付加し、あるいはポリペプチドから欠失することによって、そのペプチドの改良を行うことができる。アミノ酸置換は保存的または非保存的とすることができる。保存的アミノ酸置換には、例えば、芳香族残基（例えば、フェニルアラニン、トリプトファンおよびチロシン）を相互に置換、疎水性残基（例えば、ロイシン、イソロイシンおよびバリン）を相互に置換、極性残基（例えばグルタミンおよびアスパラギン）を相互に置換、酸性残基（例えばアルギニン、リシンおよびヒスチジン）を相互に置換、および小残基（例えばアラニン、セリン、スレオニン、メチオニンおよびグリシン）を相互に置換することが挙げられる。さらに、非古典的アミノ酸、化学的アミノ酸類似体、または化学修飾した古典的アミノ酸を、置換または付加として本発明のＢＬｙＳ結合性ポリペプチドに導入することができる。非古典的アミノ酸には、通常のアミノ酸のＤ−異性体、２，４−ジアミノ酪酸（Ｄｂｕ）、４−アミノ酪酸（ｂＡｂｕ）、２−アミノ酪酸（Ａｂｕ）、６−アミノヘキサン酸（イプシロン−Ａｈｘ）、２−アミノイソ酪酸（Ａｉｂ）、３−アミノイソ酪酸（ｂＡｉｂ）、３−アミノプロパン酸（ｂＡｌａ）、オルニチン（Ｏｒｎ）、ノルロイシン（Ｎｌｅ）、ノルバリン（Ｎｖａ）、３−ヒドロキシプロリン（３Ｈｙｐ）、４−ヒドロキシプロリン（４Ｈｙｐ）、サルコシン（ＭｅＧｌｙ）、シトルリン、ホモシトルリン、システイン酸、ｔ−ブチルグリシン、ｔ−ブチルアラニン、フェニルグリシン、シクロヘキシルアラニン、フルオロアミノ酸、デザイナーアミノ酸（例えばβ−メチルアミノ酸、Ｃα−メチルアミノ酸、Ｎα−メチルアミノ酸）、および一般にアミノ酸類似体があるが、それに限定されない。一例として、ＤＸ２１２の配列を基にして４つの修飾ペプチドを設計した：
１．Ａｃ−ＡＧＫ（Ａｃ）ＥＰＣＹＦＹＷＥＣＡＶＳＧＰＧＰＥＧＧＧＫ（配列番号１６９）−−内部リシン側鎖のアセチル化；
２．Ａｃ−ＡＧＲＥＰＣＹＦＹＷＥＣＡＶＳＧＰＧＰＥＧＧＧＫ（配列番号１７０）−−アルギニン置換；
３．Ａｃ−ＡＧＱＥＰＣＹＦＹＷＥＣＡＶＳＧＰＧＰＥＧＧＧＫ（配列番号１７１）−−グルタミン置換；
４．Ａｃ−ＡＧＮｌｅＥＰＣＹＦＹＷＥＣＡＶＳＧＰＧＰＥＧＧＧＫ（配列番号１７２）−−ノルロイシン置換。
【０２４９】
実施例６：  ＢＬｙＳ結合性ポリペプチドの親和性成熟
高親和性のＢＬｙＳ結合性ポリペプチドを同定するために、１４残基のうち５カ所に一定のアミノ酸残基を有する１４−ｍｅｒ直鎖状ペプチド鋳型配列を中心として、ＢＬｙＳ親和性成熟ライブラリー（ＢＬｙＳ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ Ｌｉｂｒａｒｙ： ＢＡＭＬ）を設計した。不変の５残基のうち３残基は、拘束されたペプチドライブラリーおよび直鎖状ペプチドライブラリーの両方から単離された高度に保存されたＤｘＬＴテトラペプチドアミノ酸モチーフ（配列番号４４６）に相当する。この１４−ｍｅｒの設計は、残りの９位置のそれぞれでアミノ酸の変更を可能としたが、これらの位置のそれぞれで特定のアミノ酸が優先して選択された。新たに単離されたペプチドのＢＬｙＳに対する結合親和性の分析を、直接および間接ファージＥＬＩＳＡならびに蛍光異方性によって評価した。
【０２５０】
ＢＡＭＬは、１位（Ａｌａ）、５位（Ａｓｐ）、７位（Ｌｅｕ）、８位（Ｔｈｒ）および１０位（Ｌｅｕ）に確定された残基を有する１４−ｍｅｒ直鎖状（拘束されない）鋳型ペプチド配列に基づいて設計された。ＢＡＭＬ鋳型における３〜１４位のアミノ酸配列は、ＰｈＤ １２直鎖状ポリペプチドライブラリーから単離された結合性ポリペプチドに最もよく類似している（上記表７を参照されたい）。１位の残基（Ａｌａに確定）および２位の残基（可変）は、ＢＬｙＳ結合性配列の長さおよび提示を延長するために含められた。５〜８位は拘束されたペプチドライブラリーおよび直鎖状ペプチドライブラリーの両方から単離されたペプチドに見いだされるＤｘＬＴモチーフに相当する（上記表１〜８を参照されたい）。疎水性アミノ酸（Ｌ， Ｍ， Ｉ， ＡおよびＧ）がもとの単離ペプチドの８５％で１０位に見いだされたので、単離ペプチドの４２％に存在するＬｅｕ残基をＢＡＭＬ鋳型ペプチドのその位置に定めた。
【０２５１】
表１１は１４−ｍｅｒ  ＢＡＭＬ鋳型配列の設計を示す。
【０２５２】
【表１１】
2004532604.tif 000015
【０２５３】
表１１を参照すると、大文字は鋳型の１， ５， ７， ８，および１０位の特定された残基を示す。小文字は、その位置に望ましいアミノ酸を示すが、１４−ｍｅｒをコードする多様性に富んだＤＮＡ鋳型の設計は、これらの位置でいくつかの配列変化を可能にする。
【０２５４】
表１２はＢＡＭＬペプチドを生成させるために用いられる多様性に富んだＤＮＡ鋳型の設計を示す。
【０２５５】
【表１２】
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【０２５６】
表１２を参照すると、ＢＡＭＬ １４−ｍｅｒ鋳型において確定されているアミノ酸に対するヌクレオチドコード配列は大文字で示す。多様性に富んだＤＮＡ鋳型における「ｅ」、「ｊ」、「ｑ」および「ｚ」の文字は、それぞれ、各位置に対するインプットｄＮＴＰ中に存在するヌクレオシド塩基の特定の混合物を表す：
ｊ ＝ ７９％グアニン、７％シトシン、７％アデニン、７％チミン
ｑ ＝ ７％グアニン、７９％シトシン、７％アデニン、７％チミン
ｅ ＝ ７％グアニン、７％シトシン、７９％アデニン、７％チミン
ｚ ＝ ７％グアニン、７％シトシン、７％アデニン、７９％チミン
このＤＮＡ鋳型のコドンは、配列番号１８４に示す各位置で、コードされる変更可能なアミノ酸を望ましいアミノ酸に変えるように設計された（表１１、小文字）。ファージ分離株を後で配列決定すると、どの特定位置でも、望ましい残基が４４％から７０％の頻度で存在することが分かった。
【０２５７】
ＤＮＡ鋳型に適合する合成ＤＮＡ配列を大規模ＰＣＲで増幅した。増幅されたＤＮＡはＭ１３ファージ発現ベクター（ＭＡＮＰベクター、Ｄｙａｘ Ｃｏｒｐ．， Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ， ＭＡ）に挿入するために制限酵素で消化し、この挿入断片を有するベクターを用いてエレクトロポレーションによってＭ１３ファージを形質転換し、ＢＡＭＬを作製した。組換えファージを集め、ＰＥＧ沈澱によって精製し、力価を測定した。ＢＡＭＬにおいて１．６×１０９形質転換体から、全体で３．２×１０１３ＰＦＵが増幅された。
【０２５８】
ＢＡＭＬのスクリーニング
表１３に概略したように、元のＢＡＭＬライブラリーから始める２段階競合法を用いて、４回のスクリーニングを行い、最も親和性の高いＢＬｙＳ結合性ポリペプチドをＢＡＭＬから単離した。スクリーニングの前に、増幅したＢＡＭＬをＳｅｒａｄｙｎストレプトアビジン−コート磁気ビーズ（ＭＧ−ＳＡ， Ｓｅｒａｄｙｎ， Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ， ＩＮ）と接触させて、ビーズ結合性ファージおよびストレプトアビジン結合性ファージを除去した。
【０２５９】
ＢＡＭＬをスクリーニングするために、ファージを、２００μｌ ＰＢＳ， ｐＨ ７．４， Ｔｗｅｅｎ−２０（０．１％）中にビオチン化ＢＬｙＳ（ｂ−ＢＬｙＳ）を含む溶液中でインキュベートし、ファージ／ｂ−ＢＬｙＳ結合複合体を作製した。第１の競合ステップで、非標識ＢＬｙＳ（１〜２μＭ）を溶液中のファージ／ｂ−ＢＬｙＳ結合複合体混合物に添加し、１〜２０時間インキュベートした（表１３参照）。非標識ＢＬｙＳとインキュベートした後に溶液中に残存するファージ／ｂ−ＢＬｙＳ複合体を短時間（回転装置上で１０分）のＭＧ−ＳＡストレプトアビジンビーズ（５０μｌ）とのインキュベーションによって捕捉した。ストレプトアビジンビーズ上にファージ／ｂ−ＢＬｙＳ複合体を捕捉した後、結合していない画分を除去し、ビーズを１ｍｌ ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ ２０で１５〜２０回洗浄した後、第２の競合ステップを行った。１回目の競合ステップから得られたファージ／非標識ＢＬｙＳ複合体のみを集め、ビーズに捕捉されたファージ／ｂ−ＢＬｙＳ複合体とともに２回目のスクリーニングのためのインプットファージ画分として用いたが、その後の各回のスクリーニングにおいては、さらなるスクリーニングのために第１競合ステップの後、ビーズに結合したファージのみを集め、ファージ／非標識ＢＬｙＳ複合体は廃棄した。
【０２６０】
第２競合ステップに関しては、競合ペプチドは上記の初期スクリーニングでＰｈＤ １２ライブラリーから単離されたＢＬｙＳ結合性ポリペプチドに基づいたポリペプチド（ＤＸ２２１；配列番号１６８）とした。第１競合インキュベーションステップ後に集められた、ストレプトアビジンに結合しているファージ／ｂ−ＢＬｙＳ複合体を、３００μｌ ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ−２０（０．１％）中の５０μＭ ＤＸ２２１ ＢＬｙＳ結合性ポリペプチド（ＫＤ ＝ ３μＭ）の溶液で連続的に希釈した。ＤＸ２２１とともにファージ／ｂ−ＢＬｙＳ複合体の一連の短時間インキュベーション（１回のスクリーニング当たり３〜４、１時間）を行った後、一晩（Ｏ／Ｎ）（１、２および４回目）から３日間（３回目）の最後のインキュベーションを行った（表１３）。４回目の第２競合ステップでは、ＤＸ２２１とのインキュベーションの前に６７ｎＭ ＢＬｙＳとの１時間のインキュベーションを行った。４回目でＤＸ２２１競合ステップ後に残存するストレプトアビジンビーズに結合したファージ／ｂ−ＢＬｙＳ結合複合体をさらに分析するために集めた。
【０２６１】
【表１３】
2004532604.tif 000017
【０２６２】
ＥＬＩＳＡ分析
２、３および４回目の上記スクリーニングから得られた約４００のＢＡＭＬ分離株を直接および間接ファージＥＬＩＳＡアッセイによって分析した。
【０２６３】
間接ファージＥＬＩＳＡについては、Ｉｍｍｕｌｏｎ−２ＨＢプレート（Ｄｙｎｅｘ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｉｎｃ．， Ｃｈａｎｔｉｌｌｙ， ＶＡ）を、ＰＢＳで希釈した１μｇ／ｍｌ Ｉｍｍｕｎｏｐｕｒｅストレプトアビジン（Ｐｉｅｒｃｅ， Ｒｏｃｋｆｏｒｄ， ＩＬ）１００μｌでコートした。連続１０倍希釈したｂ−ＢＬｙＳ（０〜０．１μｇ／ｍｌ ＰＢＳ溶液）１００μｌをストレプトアビジンでコートしたウェルに固定化した（３７℃、１時間）。洗浄後、個々のファージプラークを感染させた大腸菌の１〜２５μｌの一晩培養物を適当なウェルに加え、１時間インキュベートし、続いてＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ−２０で１０回洗浄した。西洋ワサビペルオキシダーゼと結合した抗Ｍ１３抗体（ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ−２０中に１：１０，０００）をウェルに添加し（室温、３０分）、呈色試薬ＴＭＢを使用して、プレートをＯＤ６３０ｎｍで読み取った。
【０２６４】
固定化されたＢＬｙＳに結合している個々のファージ分離株は、配列を決定し、その配列を分析した。ＢＡＭＬ ＢＬｙＳ結合性１４−ｍｅｒ展示ペプチドのユニーク配列を表１４に示す。
【０２６５】
ペプチドの分析は、１つのモチーフ：Ｗ３ＹＤＰＬＴＫＬＷＬ１２（配列番号４３６）（下付添え字は１４−ｍｅｒ展示ペプチド配列におけるアミノ酸位置を示す）の前後に、有意な配列「崩壊」（ｃｏｌｌａｐｓｅ）を示す。この最も多数のコアモチーフは、元のＢＡＭＬ鋳型に由来する４つの確定された残基、すなわち５位のＡｓｐ（Ｄ）、７位のＬｅｕ（Ｌ）、８位のＴｈｒ（Ｔ）、および１０位のＬｅｕ（Ｌ）、を含む。さらに元のＢＡＭＬ鋳型配列に由来する６個の望ましい残基のうち５個がこのモチーフに含まれていた（表１１参照）。
【０２６６】
４回目の分離株の７３％（１９７のうち１４３）がこのコアモチーフ（配列番号４３６）を含んでいた。１０−ｍｅｒコアモチーフ内の単一残基の置換が４位（Ｙ→Ｆ）と１２位（Ｌ→Ｆ、Ｉ、またはＶ）に集中し、１２位の置換はＬｅｕに代わる疎水性残基であった。
【０２６７】
残りの変更可能な３カ所の残基について（すなわち２、１３および１４）、選択はそれほど厳密なものではなかったが、ある程度の優先性は明らかで、ライブラリーに組み込まれているか、選択の回を重ねても存続しているかのいずれかである。例えば、４回目の分離株において、５１％が２位にＡｓｎを含み、７７％が１３位にＰｒｏを含み、さらに３２％が１４位にＡｓｐを含んでいた。１４位におけるＶａｌ（２７％）またはＧｌｕ（１９％）の存在は、ＢＡＭＬの１４位でのこれらの理論的な割合（それぞれ４％）と比較して、４回目の分離株ではもっとも高度に選択されたものに入る。
【０２６８】
表１４の配列は、コア配列（配列番号４３６）からの相違の程度にしたがってグループ分けされている。
【０２６９】
【表１４】
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【０２７０】
ＢＡＭＬ分離株のＥＬＩＳＡシグナルのほとんどすべてが、初期スクリーニングで単離されたものより高かった（実施例１参照）。比較のために、ペプチド４５３−０１−Ｂ０７（配列番号３１）（ＫＤ ＝ ７００ｎＭ）を参照（陽性対照）として用いた。陰性対照のＭＡＥＸ（挿入断片を持たないＭ１３ファージ）は、試験したいかなる濃度でも、ｂ−ＢＬｙＳと結合しなかった。
【０２７１】
直接ファージＥＬＩＳＡに関しては、測定されたシグナルは、規定数のファージが様々な濃度のｂ−ＢＬｙＳと結合する能力を反映する。直接ファージＥＬＩＳＡアッセイによって試験したペプチドは、間接ファージＥＬＩＳＡアッセイで測定されたＢＬｙＳに対する高い親和性に基づいて選択された。このアッセイのために、Ｉｍｍｕｌｏｎ−２ＨＢプレートを０または１０００ｎｇの抗Ｆｄ抗体（Ｓｉｇｍａ， Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ）でコートした。洗浄（ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ−２０）後、ファージ希釈液を添加して有効な抗体を飽和させ、１時間インキュベートして、洗浄し、次に１００μｌのｂ−ＢＬｙＳ １０倍希釈液（０〜１μｇ／ｍｌ）とともに室温で１時間インキュベートした。ストレプトアビジン−ＨＲＰ（ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ−２０中に１：１０００；Ｅｎｄｏｇｅｎ， Ｗｏｂｕｒｎ， ＭＡ）をウェルに添加し、１時間インキュベートして、ＴＭＢで発色させ、ＯＤ ６３０ｎｍで読み取った。
【０２７２】
蛍光異方性によるＢＡＭＬペプチドのＫＤの測定
配列解析によって同定された１０−ｍｅｒコア構造モチーフもしくはそのモチーフの１カ所が変異した変異体を有するいくつかのペプチドを、短いＧｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓリンカー配列を伴って合成し、そのＣ末端リシンをフルオレセインで標識した。これらのペプチドを下記の表１５に示すが、これらは、ＢＬｙＳに関する解離定数を決定するために、固相合成法によって合成された。ＤＸ８１５およびＤＸ８７６ポリペプチドはＤＸ８１４（配列番号１８６）から２つのＮ末端アミノ酸の欠失、またはコアペプチド（３〜１２位）のＮ末端およびＣ末端の２つのアミノ酸の欠失によって誘導された。ＤＸ８１６、ＤＸ８１７、ＤＸ８１９およびＤＸ８２２は他のＢＡＭＬ単離物（それぞれ、配列番号１８９、３０９、３５３、３２７）に対応する。ＤＸ８１８は配列番号３４０の単離物に対応するが、ただし２位のＭｅｔがＡｓｎに置換されている。いくつかのＢＬｙＳ結合性ＢＡＭＬペプチドのＫＤを蛍光異方性によって測定したが、これは前述のように行った。−ＧＧＫリンカーを持たないＤＸ８２２の配列（配列番号３２７を参照）は、ＢＡＭＬ鋳型配列（表１１参照）に一致する。ＤＸ８２２に見いだされるＢＡＭＬコンセンサス配列は、初期スクリーニングで単離されたもっとも親和性の高い結合性ペプチドの１つ（４５３−０１−Ｂ０７、配列番号３１）と比較して、結果的にＢＬｙＳへの結合親和性を１０倍以上高めた。
【０２７３】
【表１５】
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【０２７４】
ＢＡＭＬ単離ペプチドの解析により、２位の配列保存（ＢＡＭＬ鋳型では可変、表１１参照）が失われたことが明らかになった。ＢＡＭＬ配列における１位と２位のＮ末端残基がＢＬｙＳとの結合に必要であるかどうかを調べるために、３〜１４残基のみを含むＤＸ８１４のトランケート型（ＤＸ８１５；表１５参照）を合成し、蛍光異方性によって分析した。ＤＸ８１５に関するＫＤはＤＸ８１４と区別がつかなかったので、１位と２位の残基はＢＬｙＳに対する高親和性結合に必要でないことが示唆された。さらに最小コア（残基１〜１０， ＤＸ８７６）までＤＸ８１４をトランケートすると、ＫＤは１７１ｎＭに増加したが、これは１４−ｍｅｒの１３位のＰｒｏおよび／または１４位のＡｓｐが高親和性ＢＬｙＳ結合性に寄与することを示す。その位置でのＤＸ８１６におけるＶａｌの置換はＫＤにほとんど影響しなかった（表１５参照）。ＢＬｙＳ結合性ポリペプチドＤＸ２２１（Ａｃ−ＷＴＤＳＬＴＧＬＷＦＰＤＧＧＰＧＰＥＧＧＧＫ； ＫＤ ＝ ３μＭ； 配列番号１６８）を、配列が最も近いＢＡＭＬペプチド（ＤＸ８１６、Ａｃ−ＡＮＷＹＤＰＬＴＫＬＷＦＰＤＧＧＫ； ＫＤ ＝ ６９ｎＭ； 配列番号４４３）と比較すると、４位（Ｔ→Ｙ）、６位（Ｓ→Ｐ）、および９位（Ｇ→Ｋ）の３カ所で相違が見られたが、このことはこれらの残基が結合親和性に寄与することを示す。
【０２７５】
合成されたＢＡＭＬペプチドは、一次分離株由来のペプチド（実施例１参照）よりも２桁低い、ナノモル値域のＫＤ値を示した。フェニルアラニン置換（Ｆ４→Ｙ４；Ｆ１２→Ｌ１２；表１７）は、もっとも多く見られるコア配列のマイナーな変異であるが、こうした変化は合成ペプチドの解離定数に有意な影響を与えることはできなかった。しかしながら、１１位の変化（Ｗ１１→Ｓ１１；ＤＸ８１８）は、結果として、親和性がＤＸ８１４と比べて約１０倍低下した。
【０２７６】
上の記述を受けて、あらゆる溶液中または溶液からのＢＬｙＳもしくはＢＬｙＳ様ポリペプチド（ＢＬｙＳ標的タンパク質）の検出または分離を可能にするアフィニティー結合性ポリペプチドにとって重要な特徴を正しく認識することができる。ある特定の溶液または供給流に適合した、本発明の結合性ポリペプチドに関する追加の実施形態および別法が、先の記述を研究することによって明らかとなるであろう。例えば、上記で検討されたＢＬｙＳ結合性ポリペプチドと結合しているスペーサーまたはリンカーはどれも、本発明のさらなるＢＬｙＳ結合性ポリペプチドを生成するために、除去または置換することが可能である。また、ｉｎ ｖｉｖｏ治療への応用に適した、非常に親和性の高いポリペプチドＢＬｙＳ標的結合物質は、例えば、ＢＡＭＬから単離されたペプチドの中から選択することにより、類似のポリペプチドを同様に厳密な条件下でＢＡＭＬもしくは他のペプチドライブラリーから選択することにより、または、上記のポリペプチド結合分子（例えば、ＢＬｙＳ結合性に寄与する重要な構造モチーフを有するもの）を設計することにより、調製することができる。このような実施形態および明白な別法はいずれも、上記の特許請求の範囲によって規定される本発明の範囲に含めるものとする。
【０２７７】
前記の文献はすべて、その全体を参考として本明細書に組み入れるものとする。
【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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