(57)【要約】本発明は、標的化された抗微生物作用をもたらす組成物が見出されたことに基づくものである。具体的には、前記組成物は、標的微生物を認識するターゲティング成分と、抗微生物活性を有する抗微生物ペプチド成分とを含有する。また、本発明は、本発明により提供される組成物を使用することによる、例えば粘膜表面上の、微生物感染の治療方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ターゲティング成分と抗微生物ペプチド成分とを含んでなる、微生物を処置するための組成物であって、ターゲティング成分が抗微生物ペプチド成分に結合しており、かつ標的微生物を認識するものであり、該組成物が標的微生物に対して抗微生物作用を及ぼす、ことを特徴とする組成物。
【請求項２】
ターゲティング成分がペプチドである、請求項1記載の組成物。
【請求項３】
ターゲティング成分がペプチドリンカーを介して抗微生物ペプチド成分に結合している、請求項2記載の組成物。
【請求項４】
ターゲティング成分がミニ抗体である、請求項1記載の組成物。
【請求項５】
ターゲティング成分が、scFv、ミニ抗体、ジミニ抗体、テトラミニ抗体、(scFv)2、二重特異性抗体、sc二重特異性抗体、三重特異性抗体、四重特異性抗体およびタンデム二重特異性抗体よりなる群から選ばれる、請求項1記載の組成物。
【請求項６】
ターゲティング成分が抗体の可変領域の全部または一部を含む、請求項1記載の組成物。
【請求項７】
前記抗体がS. mutansに特異的なモノクローナル抗体である、請求項6記載の組成物。
【請求項８】
前記抗体がSWLA1、SWLA2およびSWLA3よりなる群から選ばれる、請求項7記載の組成物。
【請求項９】
ターゲティング成分が抗体の軽鎖の可変領域と重鎖の可変領域を含む、請求項1記載の組成物。
【請求項１０】
ターゲティング成分が定常ドメインをさらに含む、請求項9記載の組成物。
【請求項１１】
定常ドメインがペプチドリンカーにより重鎖の可変領域に結合している、請求項10記載の組成物。
【請求項１２】
前記組成物が二量体を含み、該二量体の各単量体が、ターゲティング成分と抗微生物ペプチド成分とを含有する融合ポリペプチドを含む、請求項10記載の組成物。
【請求項１３】
ターゲティング成分が標的微生物の受容体に対するリガンドである、請求項1記載の組成物。
【請求項１４】
抗微生物ペプチド成分が、アレクソマイシン、アンドロピン、アピデシン、バクテリオシン、βプリーツシートバクテリオシン、バクテネシン、ブフォリン、カテリシジン、αらせん状クラバニン、セクロピン、ドデカペプチド、デフェンシン、βデフェンシン、αデフェンシン、ゲグリン、ヒスタチン、インドリシジン、マガイニン、ニシン、プロテグリン、ラナレキシンおよびタキプレシンよりなる群から選ばれるペプチドを含む、請求項1記載の組成物。
【請求項１５】
抗微生物ペプチド成分がヒスタチン5を含む、請求項1記載の組成物。
【請求項１６】
抗微生物ペプチド成分が配列番号2に示すアミノ酸配列を含むペプチドを含む、請求項1記載の組成物。
【請求項１７】
抗微生物ペプチド成分がdhvar1を含む、請求項1記載の組成物。
【請求項１８】
抗微生物ペプチド成分が、配列番号6に示すアミノ酸配列を含むペプチドを含む、請求項1記載の組成物。
【請求項１９】
抗微生物ペプチド成分がプロテグリンPG-1を含む、請求項1記載の組成物。
【請求項２０】
抗微生物ペプチド成分が、配列番号15に示すアミノ酸配列を含むペプチドを含む、請求項1記載の組成物。
【請求項２１】
抗微生物ペプチド成分がノビスピリンG10を含む、請求項1記載の組成物。
【請求項２２】
抗微生物ペプチド成分が、配列番号17に示すアミノ酸配列を含むペプチドを含む、請求項1記載の組成物。
【請求項２３】
標的微生物が細菌、リケッチア、真菌、酵母、原生動物および寄生生物よりなる群から選ばれる、請求項1記載の組成物。
【請求項２４】
標的微生物がう蝕原性生物である、請求項1記載の組成物。
【請求項２５】
標的微生物がストレプトコッカス・ミュータンス（Streptococcus mutans）である、請求項1記載の組成物。
【請求項２６】
抗微生物ペプチド成分がヒスタチン5、dhvar1、プロテグリンPG-1およびノビスピリンG10よりなる群から選ばれるペプチドを含む、請求項25記載の組成物。
【請求項２７】
標的微生物が大腸菌（Escherichia coli）、志賀赤痢菌（Shigella dysenteriae）、ネズミチフス菌（Salmonella typhimurium）、肺炎連鎖球菌（Streptococcus pneumoniae）、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）および緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）よりなる群から選ばれる、請求項1記載の組成物。
【請求項２８】
抗微生物ペプチド成分がブフォリン、セクロピン、インドリシジンおよびニシンよりなる群から選ばれるペプチドを含む、請求項27記載の組成物。
【請求項２９】
標的微生物が大腸菌（Escherichia coli）、志賀赤痢菌（Shigella dysenteriae）、ネズミチフス菌（Salmonella typhimurium）、肺炎連鎖球菌（Streptococcus pneumoniae）、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）、緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）、カンジダ・アルビカンス（Candida albicans）、クリプトコックス・ネオフォルマンス（Cryptococcus neoformans）、カンジダ・クルセイ（Candida krusei）およびヘリコバクター・ピロリ（Helicobacter pylori）よりなる群から選ばれる、請求項1記載の組成物。
【請求項３０】
抗微生物ペプチド成分がマガイニンおよびラナレキシンよりなる群から選ばれるペプチドを含む、請求項29記載の組成物。
【請求項３１】
標的微生物が単純ヘルペスウイルスであり、抗微生物ペプチド成分がマガイニンのペプチドを含む、請求項1記載の組成物。
【請求項３２】
標的微生物がストレプトコッカス・ミュータンス（Streptococcus mutans）、淋菌（Neisseria gonorrhoeae）、クラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）およびヘモフィルス・デュクレー（Haemophilius ducreyi）よりなる群から選ばれ、抗微生物ペプチド成分がプロテグリンのペプチドを含む、請求項1記載の組成物。
【請求項３３】
標的微生物がカンピロバクター・ジェジュニ（Camphylobacter jejuni）、モラクセラ・カタラーリス（Moraxella catarrhalis）およびインフルエンザ菌（Haemophilus influenzae）よりなる群から選ばれ、抗微生物ペプチド成分がアレクソマイシンのペプチドを含む、請求項1記載の組成物。
【請求項３４】
標的微生物が肺炎連鎖球菌（Streptococcus pneumoniae）であり、抗微生物ペプチド成分がデフェンシン、αデフェンシンおよびβプリーツシートデフェンシンよりなる群から選ばれる、請求項1記載の組成物。
【請求項３５】
標的微生物感染を治療するための方法であって、かかる治療が必要な被験者に、有効量の請求項1記載の組成物を投与することを含んでなる方法。
【請求項３６】
標的微生物感染が粘膜表面上におけるものである、請求項35記載の方法。
【請求項３７】
粘膜表面が口、膣、胃腸管および食道よりなる群から選ばれる、請求項36記載の方法。
【請求項３８】
標的微生物感染が口内におけるS. mutans感染である、請求項35記載の方法。
【請求項３９】
かかる治療が必要な被験者に、有効量の請求項5記載の組成物を投与することを含む、請求項38記載の方法。
【請求項４０】
かかる治療が必要な被験者に、有効量の請求項6記載の組成物を投与することを含む、請求項38記載の方法。
【請求項４１】
かかる治療が必要な被験者に、有効量の請求項8記載の組成物を投与することを含む、請求項38記載の方法。
【請求項４２】
かかる治療が必要な被験者に、有効量の請求項12記載の組成物を投与することを含む、請求項38記載の方法。
【請求項４３】
標的微生物感染が膣内におけるカンジダ・アルビカンス（Candida albicans）感染である、請求項37記載の方法。
【請求項４４】
標的微生物感染がヘリコバクター・ピロリ（Helicobacter pylori）感染、カンピロバクター・ジェジュニ（Campylobacter jerjuni）感染、コレラ菌（Vibrio cholerae）感染、サルモネラ感染、赤痢菌感染および大腸菌感染よりなる群から選ばれる胃腸管における感染である、請求項37記載の方法。
【請求項４５】
標的微生物感染がポルフィロモナス・ジンジバリス（porphyromonas gingivalis）、アクチノミセス属（Actinomyces）、ベイヨネラ属（Veillonella）、スピロヘータおよびグラム陰性菌叢の感染よりなる群から選ばれる口腔感染である、請求項37記載の方法。
【請求項４６】
標的微生物感染が胃腸管または食道におけるクロストリジウム・ディフィシレ（Clostridium difficile）感染である、請求項37記載の方法。
【請求項４７】
ターゲティング成分、抗微生物ペプチド成分、フェロモンα因子、インテインおよびキチン結合ドメインをコードする配列を含有する発現構築物を使用することを含んでなる、請求項1記載の組成物の製造方法。
【請求項４８】
ターゲティング成分、抗微生物ペプチド成分、フェロモンα因子、インテインおよびキチン結合ドメインをコードする配列を含有する発現構築物を使用することを含んでなる、請求項2記載の組成物の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、全般的には、抗微生物治療の分野に関し、より詳しくは、キメラ構築物による標的抗微生物治療に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
米国疾病対策センター（The Centers for Disease Control）は、1億を超える年間抗生物質処方のうちの半数は不必要であると推定している。その結果、多くの場合、抗生物質に対する絶えざる曝露および抗生物質の不適切な使用のため、微生物が順応してしまい抗生物質に対して耐性となる。米国における薬剤耐性感染症の治療の年間コストは約50億ドルになると見積もられている。抗微生物剤耐性細菌、真菌、酵母および寄生生物のこのような絶えざる出現は、病原性微生物を死滅させうる他の物質を鋭意開発するよう促している。さらに、多くの微生物病原体は、最適な健康状態にとって重要である無害な共生細菌と共存しているため、ターゲットに特異的な抗微生物剤が緊急に必要とされている。
【０００３】
最近の研究により、ヒト、他の哺乳動物、昆虫および他の生物において、あるクラスの天然に存在する抗微生物ペプチドが明らかになっている。抗生物質または抗微生物ペプチドによる治療の欠点は、それらが広域スペクトルの生物を殺したりその増殖を抑制したりすることである。人体は数万の様々な細菌の住みかであり、そのうちの多くは最適な健康状態に不可欠である。抗生物質の使い過ぎは、人体の正常な生態系を著しく破壊し、細菌、酵母、ウイルスおよび寄生生物の感染に対してヒトを感受性にする。こうした影響は、抗微生物ペプチドの投与においても認められる。例えば、ヒスタチン（histatin）は、う蝕を引き起こすグラム陽性細菌だけでなく、口腔内の無害な共生グラム陽性細菌をも殺すことが示されており、したがって、ヒスタチンの全身投与は、実際には、アクチノバシラス属菌（Actinobacillus sp）またはフゾバクテリウム属菌（Fusobacterium sp）のようなグラム陰性細菌（それらの多くは歯周病を引き起こしうる）の増殖を刺激することにより、望ましからざる影響を及ぼす。したがって、ヒスタチン自体は歯科疾患の予防に有用ではない。
【０００４】
抗微生物ペプチドの投与のもう1つの欠点は、これらの正に荷電したペプチドはまた、真核細胞膜に浸透してそれを破壊することがあるため、高濃度では宿主細胞を損傷しうることである。
【０００５】
薬理活性物質の送達をターゲティングするためのこれまで努力は、主に、薬理活性物質とターゲティング成分との間の非特異的化学反応に基づくものであった。例えば、Shihら（米国特許第5,057,313号）は、治療用または診断用成分を高分子担体上にローディングし、ついで該担体をターゲティング抗体にコンジュゲートさせることにより、薬物、毒素およびキレート化剤の送達を生物の特定部位へターゲティングすることに言及している。Hansen（米国特許第5,851,527号）は、同様の発明を特許請求している。
【０００６】
このアプローチの欠点は、ターゲティングに使用する抗体分子上の不明の部位への薬学的試薬の非特異的結合がその治療剤の送達を妨げうることである。Rodwellらの米国特許第4,671,958号を参照されたい。さらに、コンジュゲーション中の非特異的反応によるターゲティング抗体の化学修飾が抗体自体を実質的に変化させて、それによりターゲットへのその結合を損ないうる。化学結合は非常に非効率的であり、その結果は不均一となり、この技術を実際に使用することを非常に困難なものとする。
【０００７】
最近になって、疾患治療用の融合タンパク質を製造するための組換え技術の使用が多数報告されるようになった。総説としては、PenichetおよびMorrison, J. Immunological Methods, 248:91-101 (2001)を参照されたい。Penichetらは、腫瘍細胞に特異的に結合する免疫学的成分と顕著な抗腫瘍活性を惹起することができるサイトカインとを含む遺伝子工学的に作製されたタンパク質構築物を使用して、悪性疾患を治療する試みを述べている。Pastanらの米国特許第5,981,726号およびFell, Jr.らの米国特許第5,645,835号を参照されたい。
【０００８】
しかし、現在のところ、ターゲット特異的分子を使用してヒトまたは動物の罹患領域に抗微生物剤を向かわせる報告は皆無である。微生物および微生物媒介疾患、特に、免疫系により賦与される通常の抗微生物メカニズムによっては容易に対処できない粘膜表面の微生物疾患の治療に有用な方法および組成物を提供することが、当技術分野において必要とされている。
【発明の開示】
【０００９】
発明の概要
本発明は、抗微生物ペプチドに連結されたターゲティング成分により、所望の標的微生物に抗微生物ペプチドを特異的に向かわせることができる、という知見に基づいている。したがって、本発明は、標的微生物に対して抗微生物作用を及ぼす組成物を提供する。本発明はまた、本発明により提供される組成物を使用することによる、例えば粘膜表面上の、微生物感染の治療方法を提供する。
【００１０】
1つの実施形態において、本発明は、微生物の処置に有用な組成物を提供する。該組成物は、ターゲティング成分と抗微生物ペプチド成分とを含んでなり、該ターゲティング成分は抗微生物ペプチド成分に結合しており、かつ標的微生物を認識するものであり、そして該組成物は標的微生物に対して抗微生物作用を及ぼすものである。
【００１１】
もう1つの実施形態において、上記組成物は、ターゲティング成分と抗微生物ペプチド成分とを含んでなり、該ターゲティング成分はペプチド（例えば、ポリペプチドまたは小ペプチド）であって、該抗微生物ペプチド成分にインフレームで融合されている。そのような組成物は、発現系（例えば、細菌、酵母または真核細胞発現系）を使用して組換え的に製造することが可能であり、化学的または物理的結合に関連した問題に対処する必要がない。
【００１２】
もう1つの実施形態において、本発明は、標的微生物による感染を治療するための方法を提供する。該方法は、かかる治療が必要な被験者に、有効量の本発明の組成物を投与することを含んでなる。
【００１３】
好ましい実施形態の説明
本発明は、全般的には、組成物、例えば、ターゲティング成分と抗微生物ペプチド成分とを含むキメラ構築物、を使用した標的抗微生物作用に関する。本発明はまた、本発明により提供される組成物を使用する微生物感染症の治療方法を提供する。
【００１４】
本発明においては、ターゲティング成分は、標的微生物を認識してそれに結合する、どのような適当な構造体であってもよい。例えば、ターゲティング成分は、標的微生物（例えば、標的微生物の鞭毛および線毛、表面露出タンパク質、脂質および多糖のような細胞表面付属器）と特異的に相互作用するポリペプチド、ペプチド、小分子、リガンド、受容体、抗体、タンパク質またはそれらの一部でありうる。
【００１５】
1つの実施形態においては、本発明のターゲティング成分は、標的微生物のエピトープまたは抗原を特異的に認識するモノクローナル抗体、またはモノクローナル抗体の種々の形態である。そのようなエピトープまたは抗原は、通常、種特異的であり、標的微生物の表面上に位置する。ターゲティング成分中のモノクローナル抗体またはその種々の形態は抗微生物ペプチド成分をその標的部位に導くことができる。さらに、かかる抗体は、抗微生物ペプチド成分によりもたらされる作用に加えて、抗微生物作用をも提供しうる。なぜなら、そのようなモノクローナル抗体は免疫系の関与を招き、抗体関連免疫応答、例えば体液性免疫応答を惹起しうるからである。
【００１６】
微生物に特異的なモノクローナル抗体は、当業者に容易に利用可能な任意の方法を用いて製造することができる。例えば、米国特許第6,231,857号（それを参照により本明細書に組み入れることとする）に記載されているとおり、3つのモノクローナル抗体、すなわち、SWLA1、SWLA2およびSWLA3がS. mutansに対して産生されている。また、ターゲティング成分として使用される非ヒト動物由来のモノクローナル抗体は、その免疫原性を減少させかつヒトの抗微生物免疫応答を惹起するその能力を増強しうる当技術分野で利用可能な手段によりヒト化することができる。
【００１７】
モノクローナル抗体の種々の形態には、scFv、ミニ抗体（minibody）、ジミニ抗体（Di-miniantibody）、テトラミニ抗体（Tetra-miniantibody）、(scFv)2、二重特異性抗体、sc二重特異性抗体、三重特異性抗体（Triabody）、四重特異性抗体（Tetrabody）およびタンデム二重特異性抗体（Tandem diabody）が含まれるが、これらに限定されるものではない。scFvは、通常、軽鎖と重鎖の可変領域を含有する一本鎖からなる。ミニ抗体は、通常、軽鎖と重鎖の可変領域を含み、例えば、重鎖定常領域（例えば、第3定常ドメインであるCH3ドメインの約20アミノ酸）に直接的に又はリンカー（例えば、約10〜25アミノ酸）を介して間接的に結合されたscFvを含む。ミニ抗体は、そのコード配列を任意の適当な細胞系（例えば、Sp2/0細胞）内で発現させることにより容易に製造することができる。容易に製造される形態のミニ抗体は、通常、定常領域（例えば、CH3ドメイン）とシステイン含有リンカーとによりジスルフィド結合二量体を形成している。種々の形態のモノクローナル抗体が、参照により本明細書に組み入れるLittleら, Immunology Today, 21:364-370 (2000)に記載されている。
【００１８】
あるいは、本発明のターゲティング成分は、標的微生物を特異的に認識し又はそれに結合しうる1以上の可変領域の全部または一部と、所望により、二量体化にとって十分な定常領域の一部とを含みうる。例えば、重鎖の可変領域は抗原に結合しうる3つの相補性決定領域（CDR）を有する。当業者であれば、特定のモノクローナル抗体が抗原またはエピトープに結合するのに必要な最小の可変領域を容易に評価することが可能である。
【００１９】
本発明のもう1つの実施形態においては、ターゲティング成分は、ペプチドまたは小分子ライブラリーをスクリーニングすることにより同定されたペプチドでありうる。例えば、標的微生物またはその所望の抗原もしくはエピトープに対してファージディスプレイペプチドライブラリーをスクリーニングすることが可能である。そのようなスクリーニングにより同定されたペプチドはどれも、標的微生物に対するターゲティング成分として使用することができる。
【００２０】
本発明のターゲティング成分は、標的微生物を特異的に認識するリガンド、受容体またはそれらの断片でありうる。例えば、ストレプトコッカス・ミュータンス（Streptococcus mutans）の表面上の不溶性グルカンと特異的に結合しうるストレプトコッカス・ミュータンス（Streptococcus mutans）のグルカン結合タンパク質が挙げられる。
【００２１】
本発明の組成物は、同じ又は異なる標的微生物を標的としうる1以上のターゲティング成分を含有しうる。1つの実施形態においては、本発明の組成物は、同じ標的微生物の異なる部位または構造体を標的としうる1以上のターゲティング成分を含有する。そのような組成物は、該組成物への標的微生物の耐性が起こらないようにするのに有用である。
【００２２】
本発明によれば、本発明の組成物の抗微生物ペプチド成分は1以上の抗微生物ペプチドを含む。一般に、本発明の組成物には、公知の又は今後発見される抗微生物ペプチドを使用することができる。抗微生物ペプチドは種々のクラスのペプチドであり、例えば、もともと植物または動物から単離されたペプチドである。動物においては、抗微生物ペプチドは、通常、好中球および上皮細胞をはじめとする種々の細胞内で発現される。ヒトを含む哺乳動物においては、抗微生物ペプチドは、通常、舌、気管および上部腸の表面上で見出される。
【００２３】
天然に存在する抗微生物ペプチドは、一般には、100個未満のアミノ酸を含有する両親媒性分子である。これらのペプチドの多くは、一般には、実効正電荷を有し（すなわち、カチオン性であり）、ほとんどがらせん構造を形成している。これらのペプチドの抗微生物効力は、それらが微生物の膜に浸透してそれを破壊することにより微生物を殺したりその増殖を抑制する能力にある、と一般に考えられている。
【００２４】
本発明の抗微生物ペプチドの抗微生物活性には、抗細菌、抗ウイルスまたは抗真菌活性が含まれるが、これらに限定されるものではない。例えば、1つのよく知られたクラスの抗微生物ペプチドは、抗真菌および抗細菌活性を有することが示されているタキプレシン（tachyplesin）である。アンドロピン（andropin）、アピデシン（apidaecin）、バクテンシン（bactencin）、クラバニン（clavanin）、ドデカペプチド（dodecappeptide）、デフェンシンおよびインドリシジン（indolicidin）は、抗細菌活性を有する抗微生物ペプチドである。ブフォリン（buforin）、ニシンおよびセクロピン（cecropin）ペプチドは、大腸菌（Escherichia coli）、志賀赤痢菌（Shigella disenteriae）、ネズミチフス菌（Salmonella typhimurium）、肺炎連鎖球菌（Streptococcus pneumoniae）、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）および緑膿菌（Pseudomonas aeroginosa）に対して抗微生物作用を及ぼすことが証明されている。マガイニンおよびラナレキシン（ranalexin）ペプチドは、同じ生物に対して抗微生物作用を有し、さらには、カンジダ・アルビカンス（Candida albicans）、クリプトコックス・ネオフォルマンス（Cryptococcus neoformans）、カンジダ・クルセイ（Candida krusei）およびヘリコバクター・ピロリ（Helicobacter pylori）に対してもそのような作用を有することが実証されている。マガイニンは単純ヘルペスウイルスに対する抗微生物作用も有することが示されている。アレクソマイシン（alexomycin）ペプチドは、カンピロバクター・ジェジュニ（Camphylobacter jejuni）、モラクセラ・カタラーリス（Moraxella catarrhalis）およびインフルエンザ菌（Haemophilus inflluenzae）に対する抗微生物作用を有することが示されており、αデフェンシンおよびβプリーツシートデフェンシンペプチドは肺炎連鎖球菌（Streptococcus pneumoneae）に対して抗微生物作用を及ぼすことが明らかにされている。
【００２５】
ヒスタチンペプチドおよびそれらの誘導体は、ストレプトコッカス・ミュータンス（Streptococcus mutans）を含む種々の生物に対して抗真菌および抗細菌活性を有するもう1つのクラスの抗微生物ペプチドである（MacKay, B.J.ら, Infect. Immun. 44:695-701 (1984); Xuら, J. Dent. Res. 69:239 (1990)）。
【００２６】
1つの実施形態においては、本発明の抗微生物ペプチド成分は、ヒスタチンペプチドおよびそれらの誘導体のクラスに由来する1以上の抗微生物ペプチドを含有する。例えば、本発明の抗微生物ペプチド成分は、1以上のヒスタチン誘導体、例えば、配列番号2に示すアミノ酸配列を有するヒスタチン5、または配列番号6に示すアミノ酸配列を有するdhvar 1を含有する。
【００２７】
もう1つの実施形態においては、本発明の抗微生物ペプチド成分は、プロテグリン（protegrin）およびそれらの誘導体のクラスに由来する1以上の抗微生物ペプチドを含有する。例えば、本発明の抗微生物ペプチド成分は、配列番号15に示すアミノ酸配列RGGRLCYCRRRFCVCVGRを有するプロテグリンPG-1を含有する。プロテグリンペプチドは、肺炎連鎖球菌（Streptococcus pneumoneae）、淋菌（Neisseria gonorrhoeae）、クラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）およびインフルエンザ菌（Haemophilus inflluenzae）に対して抗微生物作用を有することが示されている。プロテグリンペプチドは、米国特許第5693486号、第5708145号、第5804558号、第5994306号および第6159936号（それらのすべてを参照により本明細書に組み入れることとする）に記載されている。
【００２８】
さらにもう1つの実施形態においては、本発明の抗微生物ペプチド成分は、Sawaiら, “Impact of Single-Residue Mutations on the Structure and Function of Ovispirin/Novispirin Antimicrobial Peptides.” Protein Engineering (印刷中)に記載されているノビスピリン（novispirin）およびその誘導体のクラスに由来する1以上の抗微生物ペプチドを含有する。例えば、本発明の抗微生物ペプチド成分は、う蝕原性微生物、例えばストレプトコッカス・ミュータンス（Streptococcus mutans）を処置するための、配列番号17に示すアミノ酸配列KNLRRIIRKGIHIIKKYGを有するノビスピリンG10を含有する。
【００２９】
さらにもう1つの実施形態においては、抗微生物ペプチド成分は、アレクソマイシン（alexomycin）、アンドロピン（andropin）、アピデシン（apidaecin）、バクテリオシン、βプリーツシートバクテリオシン、バクテネシン、ブフォリン（buforin）、カテリシジン（cathelicidin）、αらせん状クラバニン（clavanin）、セクロピン（cecropin）、ドデカペプチド、デフェンシン、βデフェンシン、αデフェンシン、ゲグリン（gaegurin）、ヒスタチン、インドリシジン（indolicidin）、マガイニン、ニシン、プロテグリン（protegrin）、ラナレキシン（ranalexin）、タキプレシン（tachyplesin）およびそれらの誘導体を含む（それらに限定されるものではない）1以上の抗微生物ペプチドを含有する。
【００３０】
本発明の抗微生物ペプチド成分は、同じ又は異なる抗微生物ペプチドでありうる1以上の抗微生物ペプチドを含みうる。また、本発明の抗微生物ペプチドは、例えば、その抗微生物効力、その細胞送達、該組成物構造体の残部とのその適合性、または製造の際の該組成物の取り扱いを改善するために修飾されうる。
【００３１】
本発明のターゲティング成分と抗微生物ペプチド成分とは、当業者に公知の種々の手段により結合させることができる。例えば、ターゲティング成分と抗微生物ペプチド成分とを共有結合させるか、またはペプチドリンカーにより連結させ、そのようにして形成された組成物を分子クローニングにより構築し、そして細菌、酵母または真核細胞発現系において1つのポリペプチド単位として過剰発現させたり、または精製したりすることが可能である。本発明のターゲティング成分と抗微生物ペプチド成分とを連結するためには、任意のペプチドリンカーを使用することができる。1つの実施形態においては、ペプチドリンカーは、ターゲティング成分または抗微生物ペプチド成分の活性を妨げたり抑制したりしないものである。もう1つの実施形態においては、ペプチドリンカーは、約10〜60アミノ酸、約15〜25アミノ酸または約15アミノ酸である。
【００３２】
抗微生物ペプチドは、ターゲティング成分のいずれか一方または両方の末端でターゲティング成分に連結させることができる。1つの実施形態においては、ターゲティング成分は、N末端、C末端または両方の末端で1以上の抗微生物ペプチドとインフレームで融合させることができるペプチドまたはポリペプチドである。
【００３３】
本発明の組成物は、当業者に公知のどのような適当な手段により製造してもよい。例えば、抗微生物ペプチド成分をコードするヌクレオチド配列に直接的に、またはペプチドリンカーをコードするヌクレオチド配列を介して連結された、ターゲティング成分をコードするヌクレオチド配列を、適当な発現系、例えば、商業的に入手可能な細菌発現系、酵母発現系または真核細胞発現系において発現させることができる。通常、細菌発現系内での発現には、自己触媒性タンパク質、例えばインテインおよびキチン結合ドメイン（CBD）を精製目的で使用する。酵母発現系内での発現の場合には、精製過程での発現産物の取り扱いを容易にするために、通常、コード配列のN末端にフェロモンα因子を融合させ、コード配列のC末端にミオシン-hisタグを融合させる。
【００３４】
本発明の1つの実施形態においては、商業的に入手可能な酵母発現系を改変する。例えば、細菌発現系に用いられるタンパク質を酵母発現のために用いる。例えば、本発明の組成物をコードする配列を、フェロモンα因子をコードする配列ならびにインテインおよびCBDをコードする配列に融合させ、酵母発現系内で発現させる。
【００３５】
本発明の組成物は、任意の標的微生物を処置するために使用することができる。例えば、本発明の標的微生物は、任意の細菌、リケッチア、真菌、酵母、原生動物または寄生生物でありうる。1つの実施形態においては、標的微生物は、う蝕原性生物、例えばストレプトコッカス・ミュータンス（Streptococcus mutans）である。
【００３６】
もう1つの実施形態においては、本発明の標的微生物には、大腸菌（Escherichia coli）、カンピロバクター・ジェジュニ（Camphylobacter jejuni）、カンジダ・アルビカンス（Candida albicans）、カンジダ・クルセイ（Candida krusei）、クラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）、クロストリジウム・ディフィシレ（Clostridium difficile）、クリプトコックス・ネオフォルマンス（Cryptococcus neoformans）、インフルエンザ菌（Haemophilus inflluenzae）、ヘリコバクター・ピロリ（Helicobacter pylori）、モラクセラ・カタラーリス（Moraxella catarrhalis）、淋菌（Neisseria gonorrhoeae）、緑膿菌（Pseudomonas aeroginosa）、ネズミチフス菌（Salmonella typhimurium）、志賀赤痢菌（Shigella disenteriae）、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）および肺炎連鎖球菌（Streptococcus pneumoniae）が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００３７】
本発明のもう1つの特徴によれば、本発明の組成物は、標的微生物に対する抗微生物作用をもたらし、標的微生物感染を治療するために使用することができる。抗微生物作用としては、標的微生物の増殖抑制または殺滅、あるいは標的微生物のいずれかの生物学的機能の阻害が挙げられる。
【００３８】
一般に、本発明の組成物は、宿主の任意の部位（例えば、任意の組織）における標的微生物感染を治療するために使用することができる。1つの実施形態においては、粘膜表面上の標的微生物感染を治療するために、本発明の組成物を使用する。粘膜表面には、通常、広域スペクトルの微生物が生息しており、全微生物集団の平衡を乱す可能性が最も低く（例えば、病原性微生物に特異的であり）かつ非病原性微生物集団には最小の作用を及ぼす治療が好ましい。例えば、ヒトの口内には酵母および細菌を含む多種多様な微生物が存在する。多くの細菌は、他の病原微生物の侵入および定着（例えば、酵母感染）を妨げるために健全かつ正常な微生物叢を維持するのに不可欠な無害の共生細菌である。本発明の組成物の投与は、う蝕原性生物、例えばストレプトコッカス・ミュータンス（Streptococcus mutans）を特異的な標的とし、非標的微生物には最小限の影響を及ぼすにすぎず、したがって、非標的微生物には、望ましくない作用を及ぼさないであろう。
【００３９】
動物およびヒトの体内の多くの部位は粘膜表面を有し、標的抗微生物作用をもたらすよう本発明の組成物で治療することが可能である。例えば、口、膣、胃腸（GI）管、食道および気管はすべて、その粘膜表面上に微生物感染を有しうる。
【００４０】
特に、S. mutans感染は一般には口内で見出され、う蝕を引き起こす。ポルフィロモナス・ジンジバリス（Porphyromonas gingivalis）、種々のアクチノミセス属細菌（Actinomyces）種、ベイヨネラ属（Veillonella）、スピロヘータおよびグラム陰性細菌叢（黒色色素バクテロイデスを含む）は、一般には、歯周病を引き起こす歯肉および周辺結合組織の感染症に関連している。肺炎連鎖球菌（Streptococcus pneumoniae）、型別不能のインフルエンザ菌（Haemophilus inflluenzae）またはモラクセラ・カタラーリス（Moraxella catarrhalis）感染は、一般には、小児の上部呼吸器感染の合併症としての急性中耳炎（AOM）および中耳炎滲出液（OME）において見出される。
【００４１】
ヘリコバクター・ピロリ（H. pylori）細菌は、胃粘膜層で見出されるか、胃の上皮層に付着しており、十二指腸潰瘍の90％以上および胃潰瘍の80％までの原因となる。他のGI管感染には、カンピロバクター細菌感染（主に、下痢に関連したカンピロバクター・ジェジュニ（Camphylobacter jejuni））、コレラ菌（Vibrio cholerae）血清群により引き起こされるコレラ、ネズミチフス菌（S. Typhimurium）および腸炎菌（S. Enteritidis）のようなサルモネラ菌により引き起こされるサルモネラ症、赤痢菌属（Shigella）、例えば志賀赤痢菌（Shigella disenteriae）により引き起こされる細菌性赤痢、ならびに毒素原性大腸菌（ETEC）により引き起こされる旅行者下痢症が含まれるが、これらに限定されるものではない。クロストリジウム・ディフィシレ（Clostridium difficile）感染も、胃腸管または食道でよく見られる。
【００４２】
酵母またはカンジダ（Candida）感染症（カンジダ症）は、典型的には、経口的（口咽頭カンジダまたはOPC）または経膣的（外陰膣カンジダまたはVVC）に生じる。カンジダ症は、皮膚および粘膜表面上（例えば、口および膣）に既に存在するカンジダ菌株（最も一般的にはカンジダ・アルビカンス（Candida albicans））を無制限に増殖させる局所環境の変化により引き起こされる。淋病、クラミジア、梅毒およびトリコモナス症は、性行為感染症、例えば骨盤炎症性疾患を引き起こす生殖管内の感染症である。
【００４３】
本発明の組成物は種々の粘膜表面（例えば、前記の粘膜表面）に投与することが可能であり、各組成物は感染の1以上の特異的微生物（例えば、前記の微生物）に対応するターゲティング成分を含有する。
【００４４】
標的微生物感染の治療に有用な本発明の組成物は、単独で又は適当な医薬担体と組合せて又は他の治療剤と組合せて投与することができる。投与する組成物の有効量は、場合に応じて決定することができる。通常、必要な投与量は、ターゲティング成分に連結しないで投与される抗微生物ペプチドについて必要とされる投与量より少ない（例えば、10-1少ない）。通常考慮すべき要因としては、年齢、体重、病状の段階、他の病態、治療の持続期間、および初期治療への応答が挙げられる。
【００４５】
典型的には、該組成物は、局所用または注射用に溶液または懸濁液として製造される。しかし、注射前に液体ビヒクルに溶解または懸濁するのに適した固体形態を製造することも可能である。また、該組成物は、当技術分野における公知方法に従い腸溶コーティング錠またはゲルカプセル剤に製剤化することも可能である。
【００４６】
本発明の組成物は、治療すべき病態または損傷に応じた医学的に許容される任意の方法で投与することができる。可能な投与経路には、非経口経路（例えば、血管内、静脈内、硬膜内など）による注射、および経口的、鼻腔内、眼内、直腸内、局所的または肺内経路（例えば、吸入によるもの）が含まれる。また、該組成物は、組織表面に直接的に適用することができる。デポー注射または腐食性インプラントのような手段による持続放出、pH依存性放出、または他の特定の化学的もしくは環境的条件に媒介される放出投与も、本発明に特に含まれる。
【００４７】
1つの実施形態においては、本発明の組成物は、う蝕原性生物の感染、例えば、う蝕に関連したS. mutans感染を治療または予防するために使用され、食品への添加物として、または口腔環境（特に、う蝕に感受性である口腔環境）と直接接触する製品として製造される。例えば、う蝕を治療または予防するために、本発明の1以上の組成物を、乳児用調合乳、洗口剤、トローチ、ゲル、歯科用バーニッシュ、練り歯磨き、爪楊枝、歯ブラシ、または他の歯洗浄装置、局所送達装置、例えば持続放出ポリマーまたはマイクロカプセル、任意の種類の口腔洗浄液（機械的に送達されるものも口内リンス剤も含む）、おしゃぶり、およびいずれかの食品、例えばチューインガム、キャンディー、飲料、パン、クッキーおよびミルク（これらに限定されるものではない）中に配合することが可能である。
【００４８】
以下の実施例は本発明を例示するものであり、いずれの様式、形状または形態においても、明示的または暗示的に本発明を限定するものではない。それらは、使用可能なものの代表であるが、それらの代わりに、当業者に公知の他の手順、方法または技術を用いることも可能である。
【実施例１】
【００４９】
S. mutansに対する活性を有するヒスタチン5およびdhvar 1/SWLA3キメラ抗体融合タンパク質の構築および発現
a．抗体に基づく融合タンパク質のための発現ベクターの構築
IgG1発現ベクター内に最終的にクローニングされ、標的化された抗微生物融合タンパク質の発現をもたらす構築物は、以下の方法に従い構築した（図1を参照されたい）。この構築物は、逐次的PCRおよび制限酵素技術を用いて構築した。該融合タンパク質の認識配列は、ハイブリドーマATCC HB 12558により産生されたSWLA3の重鎖配列に由来するものであった。Shiによる米国特許第6,231,857号（その開示を参照により本明細書に組み入れることとする）、ならびに米国特許出願第09/378,577号および第09/881,823号を参照されたい。ヒスタチン5またはdhvar 1をコードする配列を、SWLA3の重鎖の可変領域の上流に挿入した。ヒスタチン5およびdhvar 1に使用するアミノ酸配列を以下に示す：
ヒスタチン5 (配列番号2) DSHAKRHHGY KRKFHEKHHS HRGY
dhvar 1 (配列番号6) KRLFKELKFS LRKY
起源シグナルペプチドをヒスタチン5またはdhvar 1の上流に付加し、また、該抗体の重鎖の可変領域（VH）から該融合タンパク質が分離されるようにグリシン／セリンリンカー（配列番号3）を付加した。ヒスタチン5/SWLA3 VHの核酸配列およびコード化アミノ酸配列に関しては図3を、それぞれのdhvar 1/SWLA3 VHの配列に関しては図4を参照されたい。以下の方法に従って該構築物を完成させるために逐次的PCR反応を用いた（使用したプライマーの核酸配列に関しては、図2を参照されたい）。
【００５０】
1．第1 PCR反応においては、プライマーセット986+452（ヒスタチン5）または989+452（dhvar1）と共に、SWLA3のVHを担持するプラスミドを鋳型として使用した。この反応は、VHの5'末端において元の遺伝子中のシグナルペプチドをリンカーペプチドで置換し、3'末端に制限部位を挿入した。この反応の産物を単離し、第2 PCR反応における鋳型として使用した。
【００５１】
2．第2 PCR反応においてプライマーセット987+452（ヒスタチン5）または990+452（dhvar1）を使用することにより、リンカーペプチドの上流に抗微生物ペプチドを付加した。3'末端の制限部位は維持した。この反応から得られた産物を単離し、第3 PCR反応における鋳型として使用した。
【００５２】
3．プライマーセット988+452（ヒスタチン5）または991+452（dhvar1）を使用して、抗微生物ペプチドの上流にシグナルペプチドおよび制限部位を付加した。3'部位の制限部位は維持した。第3 PCRからの産物を単離した。
【００５３】
4．ついで、第3 PCR反応から単離した産物をTOPO Cloning KitによりInvitrogenのPCR2.1ベクター内にクローニングし、配列決定した。
【００５４】
5．2つのクローンの配列を確認した後、該インサートをNheI/EcoRV断片としてIgG1 PCR発現ベクター（pAH 4604）内に移した。
【００５５】
6．ヒスタチン5およびdhvar 1抗体融合タンパク質用の最終的な発現ベクターを、それぞれ、pAH 5993およびpAH 5994と命名した。
【００５６】
用いたPCR条件は以下のとおりであった：
1．94℃で40秒間の変性
2．60℃で40秒間のアニーリング
3．72℃で40秒間の伸長
4．30サイクルの増幅
5．72℃で10分間の最終伸長。
【００５７】
図3は、VH SWLA3とのヒスタチン5融合体をコードする核酸配列およびコード化アミノ酸配列（配列番号1および4）を示し、図4は、VH SWLA3とのdhvar 1融合体をコードする核酸配列およびコード化アミノ酸配列（配列番号5および7）を示す。それらの図においては、太字の配列は対応する抗微生物ペプチドを表し、下線付きの配列はグリシン／セリンリンカーを表し、各配列中の単一の下線付き太字塩基はサイレント点突然変異を表す。Shiらの米国特許出願第09/881,823号に開示されている元の配列では、該塩基はグアニンである。
【００５８】
SWLA3からの軽鎖の可変領域（VL）を、5940 pAGと称されるヒトκ発現ベクター内に、Shiらの米国特許出願第09/881,823号に記載されている方法に従いクローニングした。簡潔に説明すると、
（i）該発現ベクターから、および正しいVLを含有するプラスミドから、DNAを調製した。軽鎖および重鎖の定常領域を発現するベクターに関する詳細な情報に関しては、Current Protocols in Immunology, Section 2.12.1 (1994)を参照されたい。
【００５９】
（ii）該発現ベクターを適当な制限酵素で消化した。ついで消化物をアガロースゲル上で電気泳動して、適当なサイズの断片を単離した。
【００６０】
（iii）クローニングされたVL領域を含有するプラスミドも消化し、VL領域を含有する適当なDNA断片をアガロースゲルから単離した。
【００６１】
（iv）ついでVL領域と発現ベクターとを一緒に混合し、T4 DNAリガーゼを加え、該反応混合物を16℃で一晩インキュベートした。
【００６２】
（v）コンピテント細胞をVL連結混合物でトランスフェクトし、正しい連結配列を発現するクローンを選択した。制限マッピングを用いて、正しい構造を確認した。
【００６３】
b．真核細胞のトランスフェクション
各発現ベクターpAH 5993（ヒスタチン5）またはpAH 5994（dhvar 1）および5940 pAGからの10μgのDNAをBSPC1（Stratagene, PvuIアイソシゾマー）消化により線状化し、1×107個の骨髄腫細胞（SP2/0またはP3X63.Ag8.653）をエレクトロポレーションによりコトランスフェクトした。トランスフェクションの前に、該細胞を冷PBSで洗浄し、ついで0.9mlの同じ冷バッファーに再懸濁させ、0.4cmの電極間隙のエレクトロポレーションキュベット内に配置した。エレクトロポレーションには、960μFおよび200Vを使用した。ついで、ショックを与えた細胞を、10％ 子ウシ血清を含有するIMDM培地（Gibco, NY）中にて氷上でインキュベートした。
【００６４】
トランスフェクト細胞を10000個／ウェルの濃度で96ウェルプレートにプレーティングした。ヒスチジノールまたはミコフェノール酸のような選択用薬剤を含む選択培地を使用して、発現ベクターを含有する細胞を選択した。12日後、増殖しているクローンからの上清を抗体産生に関して試験した。
【００６５】
c．ヒスタチン5およびdhvar 1/SWLA3キメラ抗体融合タンパク質の分析
ELISAアッセイを用いて、融合IgG抗体を分泌するトランスフェクトーマを同定した。100μlの5μg/ml ヤギ抗ヒトIgGを96ウェルELISAプレートの各ウェルに加え、一晩インキュベートした。該プレートをPBSで数回洗浄し、3％ BSAでブロッキングした。前記の増殖しているクローンからの上清を、ヤギ抗ヒトIg抗体との反応性に関してアッセイするために、室温で2時間にわたり該プレートに加えた。ついでプレートを洗浄し、1％ BSAで1:104に希釈されたアルカリホスファターゼ標識抗ヒトκ抗体を37℃で1時間にわたり加えた。プレートをPBSで洗浄し、ジエタノールアミンバッファー（9.6% ジエタノールアミン、0.24mM MgCl2、pH 9.8）中のp-ニトロフェニルホスフェートを加えた。OD405での発色は、H2L2を産生する細胞を示すものであった。
【００６６】
IgG定常領域を産生する上清に関して、S. mutansとの反応性を、Shiら, Hybridoma 17:365-371 (1998)に記載されているとおりに試験した。簡潔に説明すると、表1に記載の細菌株を、American Type Culture Collectionにより推奨されている種々の培地内で増殖させた。嫌気性細菌は80% N2、10% CO2および10% H2の雰囲気中、37℃で増殖させた。種々の口内細菌に対する抗体の特異性をELISAアッセイでアッセイした。細菌をPBSでOD600=0.5に希釈し、100μlの0.02mg/ml ポリ-L-リシンで4時間プレインキュベートされた96ウェルPVC ELISAプレートの2回反復ウェル（100μl）に加えた。これらの抗原コーティングプレートを、湿った箱の中で4℃で一晩インキュベートし、ついでPBSで3回洗浄し、PBS中の0.5％ ウシ胎児血清でブロッキングしてから、4℃で保存した。50μg/mlの100μlのキメラ抗体を抗原プレートの適当なウェルに加え、室温で1時間インキュベートし、PBS-0.05％ Tween 20で3回洗浄し、PBS-1％ ウシ胎児血清で1:103に希釈されたアルカリホスファターゼコンジュゲート多価ヤギ抗ヒトIgG抗体の添加により、結合抗体を検出した。炭酸バッファー（15mM Na2CO3、35mM NaH2CO3、10mM MgCl2、pH 9.6）中の1mg/ml p-ニトロフェニルホスフェートを基質として加えた後、15分後の発色をEIAリーダーで405nmで測定した。「+」はOD405＞1.0を意味し、「-」はOD405＜0.05を意味する。陰性対照は＜0.05である。結果を表1に示す。
【表１】
2004538283.tif 000002
【００６７】
融合タンパク質は、S. mutansに対する特異性および抗微生物効力の両方を示した。それらが誘導されるモノクローナル抗体と同様に、該融合タンパク質はS. mutansと特異的に結合する（表1を参照されたい）。それらもまた、細菌に対する抗細菌効力を有するが、ヒスタチン5のみより遥かに低い濃度で有効であった（表2を参照されたい）。
【表２】
2004538283.tif 000003
【００６８】
この観察から示唆されるとおり、認識配列は融合タンパク質とS. mutansとの間の特異的結合を引き起こし、これはヒスタミン5の濃度を細菌細胞表面において局所的に増加させる。融合タンパク質が抗細菌効力を示す濃度では、該融合タンパク質は他の細菌または宿主細胞に対して何の阻害作用も示さなかった（表2）。したがって、これらの結果は、本明細書に記載の基本的な構想が、他の感染および侵襲の治療のための、抗体に基づく融合タンパク質の作製に有用でありうることを示唆している。
【実施例２】
【００６９】
ミニ抗体と抗微生物ペプチドとを含有するキメラ構築物の構築および分析
a．ミニ抗体-ペプチド融合タンパク質の構築
ミニ抗体（minibody）は、頭部-尾部の様式で共有結合されたVL-VH-リンカー-Ch(1、2または3)を含む修飾抗体分子である（図5を参照されたい）。ミニ抗体-抗微生物ペプチド融合タンパク質を構築するためには、抗微生物ペプチドをポリグリシン-セリンリンカーペプチドを介してVLのN末端に連結する。ついでVLのC末端をVHのN末端に融合させ、ついでそれを、もう1つのペプチドリンカーを介して定常領域（Ch）のサブドメインに融合させる。定常領域由来のサブドメインを含めることにより、溶液中でのミニ抗体の効率的な二量体化が保証され、ミニ抗体の有効なコンホメーションが安定化されるであろう。抗微生物ペプチド、リンカーおよびミニ抗体の種々のドメインをコードするDNA断片を継ぎ合わせるためには、PCRおよび他のDNA操作技術を用いる。簡潔に説明すると、抗微生物ペプチド、リンカー、ミニ抗体の種々のドメインをコードする遺伝子を、対応ペプチドまたはドメインのコード領域に特異的なプライマーを使用するPCRにより合成する。プライマー内には制限酵素切断部位が組み込まれる。PCRの後、DNA断片を適当な制限酵素で消化し、T4 DNAリガーゼで連結する。異なる末端に異なる制限部位を組み入れることにより、DNA断片の正しい配向が保証される。全構築物を適当な発現ベクター内にクローニングし、適当な宿主内で発現させる。
【００７０】
b．抗S. mutansミニ抗体-プロテグリン融合タンパク質の構築
ミニ抗体を構築するための出発物質は、米国特許第6, 231,857号に記載の抗S. mutansモノクローナル抗体SWLA3である。抗微生物ペプチドは、米国特許第5693486号、第5708145号、第5804558号、第5994306号および第6159936号ならびにZhaoら, FEBS lett, 1994, 346 (2-3): 285-8に記載のプロテグリンである。
【００７１】
プロテグリン遺伝子断片の合成
プロテグリンのコード領域を、以下の配列を有するDNA断片として合成する：5'- AGG GGA GGT CGC CTG TGC TAT TGT AGG CGT AGG TTC TGC GTC TGT GTC GGA CGA GGA-3'（配列番号16）。以下の2つのプライマーを使用するPCRにより、該断片を増幅する:
プライマー1（フォワードプライマー）：5'- GGT GGT TGC TCT TCC AAC AGG GGA GGT CGC CTG TGC-3' (配列番号18)；下線付きの配列はSap I制限酵素切断部位である。
プライマー2（リバースプライマー）： 5'-CCG GAT CCT CGT CCG ACA CAG AC-3' (配列番号19)；下線付きの配列はBam HI制限部位である。
【００７２】
ポリSer-Glyリンカー領域の増幅
以下のプライマーを使用するSWLA3-ヒスタチン構築物からのPCRにより、ポリSer-GlyリンカーをコードするDNAを増幅する：
プライマー3（フォワード）：5'-GG GGA TCC GGT GGC GGT GGC TCG-3' (配列番号20)；下線付きの配列はBam HI制限部位である。
プライマー4（リバース）：5'-AAC ATC GAT AGA TCC GCC GCC ACC CG-3' (配列番号21)；下線付きの配列はCla I制限部位である。
【００７３】
SWLA3のVL領域をコードするDNA断片の作製
抗S. mutansモノクローナル抗体SWLA3と共に以下のプライマーを使用するPCRにより、VL領域をコードするDNA断片を増幅する：
プライマー5（フォワード）：5'-GG ATC GAT GTT GTG ATG ACC CAG-3' (配列番号22)；下線付きの配列はCla I制限部位である。
プライマー6（リバース）：GCGG GTC GAC CGA CTT ACG TTT CAG CTC CAG-3' (配列番号23)；下線付きの配列はSal I制限部位である。
【００７４】
SWLA3のVH領域をコードするDNA断片の作製
抗S. mutansモノクローナル抗体SWLA3と共に以下のプライマーを使用するPCRにより、VH領域をコードする遺伝子を増幅する：
プライマー7（フォワード）：5'-GCGG GTC GAC GTG AAG CTG GTG GAG TCT G-3' (配列番号24)；下線付きの配列はSal I制限部位である。
プライマー8（リバース）：5'-GGG TGT TGA GCT AGC TGA AGA GAC GGT GAC-3' (配列番号25)；下線付きの配列はNhe I制限部位である。
【００７５】
VHとCH3との間のリンカーの合成
該リンカーのアミノ酸配列はLDPKSCERSHSCPPCGGGSGGGTS（配列番号26）とする。対応するDNA配列は5'-CTC GAC CCA AAG AGC TGC GAG CGG AGC CAC AGC TGC CCA CCG TGC GGG GGT GGG TCC GGC GGT GGC ACT AGT-3'（配列番号27）とする。この配列を化学合成し、以下のプライマーを使用するPCRにより増幅する：
プライマー9（フォワード）：5'-GTGG GCT AGC CTC GAC CCA AAG AGC TGC-3' (配列番号28)；下線付きの配列はNhe I制限部位である。
プライマー10（リバース）：5'-AGG TTC TCG GGG CTG CCC ACT AGT GCC ACC GCC GGA CC-3' (配列番号29)。
【００７６】
ヒトCH3断片の合成
ヒト化SWLA3モノクローナル抗体配列を含有するベクターを、PCRによりヒトCH3遺伝子断片を作製するための鋳型として使用する。PCR反応には、以下のプライマーを使用する：
プライマー11（フォワード）：5'-GGG CAG CCC CGA GAA CAA C-3' (配列番号30)。
プライマー12（リバース）：5'-GGT GGT CTG CAG TTT ACC CGG GGA CAG GGA GAG-3' (配列番号31)；下線付きの配列はPst I制限部位である。
【００７７】
ペプチド-ミニ抗体融合タンパク質遺伝子を作製するための断片の集合
プロテグリン、VL、VH、CH3およびリンカーをコードするDNA断片を、以下に図示するとおりに集合させる。
2004538283.tif 000004
この断片をSap IおよびPst Iで消化し、pTYB11中の同じ制限部位にクローニングする。
【実施例３】
【００７８】
表面結合ペプチドと抗微生物ペプチドとを含有するキメラ構築物の構築
抗体のほかに、いくつかの小ペプチドも、微生物または真核細胞の表面構造体に結合しうる。これらのペプチドは、「ドッキング成分」と称され、殺傷のために細胞膜内に挿入するための抗微生物ペプチド（殺傷成分）の柔軟性を高めることができる。これらのペプチドは、コンビナトリアルケミストリーにより作られた完全な人工物である。8〜12アミノ酸ペプチドのファージディスプレイライブラリーが商業的に入手可能である。本実験において、本発明者らは、標的生物（これは細菌、酵母または他の真菌でありうる）と特異的に結合しうるペプチドに関してこれらのライブラリーをスクリーニングした。ついで、これらのペプチドの1以上を、ペプチドリンカーを介して抗微生物ペプチドに融合させ、適当な宿主内で発現させる。
【００７９】
S. mutansおよびC. albicansに結合する特異的ペプチドに関するファージディスプレイライブラリーのスクリーニング
12アミノ酸ペプチドライブラリー（Ph.D-12）をNew England Biolabsから購入することが可能である。S. mutansをTH培地中37℃で嫌気的に一晩増殖させる。細胞を遠心沈降させ、PBSバッファーで洗浄する。108個のS. mutans細胞を、ファージディスプレイライブラリーからの1010 CFUと混合し、穏やかに振とうしながら室温で10分間インキュベートする。該混合物を微量遠心機で沈降させ、未結合ファージを含有する上清を新たなチューブに移し、更なるラウンドの結合のために108個の酵母細胞と混合する（この場合、S. mutansに結合しないファージ粒子を再利用し、酵母に結合するものを選択する。望む限りの多数の細菌標的について同じ方法を続ける）。結合後、細菌または酵母細胞をPBSで10回洗浄し、結合ファージを0.2Mグリシン+ 1mg/ml BSA（pH. 2.2）で溶出する。溶出液を1/6容量の1 M Tris.-HCl（pH 9.1）で中和し、大腸菌（E. coli）宿主株内で4.5時間増幅する。ファージをPEG沈殿により単離し、第1ラウンドに関して記載したとおりに第2ラウンドの結合のために使用する。細菌または酵母細胞に対して最高の結合親和性を有するペプチドを担うファージを濃縮するために、全工程を3〜4回繰返すことが可能である。これらのペプチドをコードするDNA配列は、これらの特異的ファージ粒子中に含有されるDNAを配列決定することにより入手することができる。ついで該DNA断片を、抗微生物ペプチドをコードする遺伝子と、PCR操作により融合させ、適当な発現ベクター内にクローニングする。
【実施例４】
【００８０】
酵母内でのミニ抗体の産生のための発現系の構築
酵母タンパク質発現系は商業的に入手可能である。そのような系では、関心のあるタンパク質をコードするアミノ酸配列が、N末端においてはフェロモンα因子に、C末端においてはミオシン-hisタグに融合される。そのような融合タンパク質は発現され、細胞外に分泌され、α因子切断部位においてプロセシングされる。ついで、生じたタンパク質を、hisタグに結合するニッケルカラムで精製する。この系の問題点は、関心のある融合タンパク質が、付加されたミオシン-his尾部を最終産物中のそのC末端に有することである。該タンパク質がミニ抗体である場合には、この付加された尾部は、それが哺乳動物に適用された際に問題を引き起こしうるであろう。
【００８１】
融合タンパク質が厳密にNまたはC末端において切り出されるのを可能にする細菌系も、商業的に入手可能である。この系では、自己触媒タンパク質インテインおよびキチン結合ドメインを精製用に使用する。この系は抗微生物ペプチドのみの産生には理想的かもしれないが、ミニ抗体の産生に要求される適切な修飾を欠いている。
【００８２】
融合タンパク質の厳密なプロセシングおよびミニ抗体成分の適切な修飾を可能にする新規ミニ抗体-ペプチド融合タンパク質産生系を酵母において作製するために、本発明者らはそれらの2つの系を組合せる。簡潔に説明すると、インテイン-CBD融合体をコードするDNA断片を細菌ベクターからPCR増幅し、酵母ベクターにα因子プロセシング部位の下流でクローニングする。ミニ抗体-ペプチド融合体をコードするDNA断片をインテインドメインに融合させ、インテイン-CBD-ミニ抗体融合体として発現させる。この融合複合体をα因子シグナルペプチドにより細胞外に分泌させ、キチンアフィニティーカラムにより細胞上清から精製する。ついで、還元条件下での自己切断により、ミニ抗体-ペプチド融合タンパク質をインテインから分離する。
【００８３】
本発明は、現時点で好ましい実施形態に関して記載されているが、本発明の精神から逸脱することなく種々の修飾を施しうると理解されるべきである。したがって、本発明は特許請求の範囲により限定されるに過ぎない。
【図面の簡単な説明】
【００８４】
【図１】抗体に基づく融合タンパク質の重鎖部分を組み立てるために用いる逐次的PCR反応の概要図を示す。
【図２】本発明の実施形態における逐次的PCR反応で使用するプライマーの配列（配列番号8〜14）を示す。
【図３】抗微生物ペプチドであるヒスタチン5、リンカーペプチド、およびSWLA3モノクローナル抗体由来の重鎖の可変領域をコードするヌクレオチド配列（配列番号1）を、そのアミノ酸配列（配列番号4）と共に示す。
【図４】抗微生物ペプチドであるdhvar 1、リンカーペプチド、およびSWLA3モノクローナル抗体由来の重鎖の可変領域をコードするヌクレオチド配列（配列番号5）を、そのアミノ酸配列（配列番号7）と共に示す。
【図５】ミニ抗体-抗微生物ペプチド融合タンパク質を作製するための概要図を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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