(57)【要約】本発明は、限定されるものではないが、アテローム性動脈硬化症、再灌流傷、高血圧症、再狭窄、動脈炎症、また内皮細胞障害を含めた循環器疾患の診断用および治療用の方法に関する。詳細には、本発明は、正常または非循環器疾患の状態におけるおよび／または循環器疾患状態に関与する操作に応じたそれらの発現に対する循環器疾患状態における１０２１８遺伝子の示差発現を同定する。本発明は、様々な循環器疾患の診断評価および予後について、およびかかる疾患の素因を示す対象の同定のための方法を記載する。また、本発明は、循環器疾患を変調できる化合物を同定する方法を提供する。また、本発明は、循環器疾患の治療剤としての化合物の同定および治療上の使用のための方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
循環器疾患と関連する核酸分子を同定する方法であって、
ａ）核酸分子を含む試料と、配列番号：１の少なくとも２５個の連続ヌクレオチドを含むハイブリダイゼーション・プローブとを接触させ；次いで
ｂ）該プローブにハイブリダイズする該試料中の核酸分子の存在を検出し、それにより、循環器疾患と関連する核酸分子を同定することを含むことを特徴とする該方法。
【請求項２】
該ハイブリダイゼーション・プローブが検出可能に標識されることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３】
核酸分子を含む該試料が、該ハイブリダイゼーション・プローブと接触するのに先立って、アガロースゲル電気泳動およびサザンブロットに付されることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項４】
核酸分子を含む該試料が、該ハイブリダイゼーション・プローブと接触するのに先立って、アガロースゲル電気泳動およびノーザンブロットに付されることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項５】
該検出がインサイチュ・ハイブリダイゼーションによることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項６】
循環器疾患と関連する核酸を同定する方法であって、
ａ）核酸分子を含む試料と、第１および第２の増幅プライマーとを接触させ、ここに、該第１のプライマーは、配列番号：１の少なくとも２５個の連続ヌクレオチドを含み、かつ該第２のプライマーは、配列番号：１の相補体からの少なくとも２５個の連続ヌクレオチドを含み；
ｂ）核酸増幅を可能とする条件下にて該試料をインキュベートし；次いで
ｃ）増幅された該試料中の核酸分子の存在を検出し、それにより、循環器疾患と関連する核酸分子を同定することを含むことを特徴とする該方法。
【請求項７】
核酸分子を含む該試料が該インキュベーション工程後にアガロースゲル電気泳動に付されることを特徴とする請求項６記載の方法。
【請求項８】
該試料中のｍＲＮＡを検出するために用いることを特徴とする請求項1または６のいずれか１記載の方法。
【請求項９】
該試料中のゲノムＤＮＡを検出するために用いることを特徴とする請求項1または６のいずれか１記載の方法。
【請求項１０】
循環器疾患と関連するポリペプチドを同定する方法であって、
ａ）ポリペプチドを含む試料と、１０２１８結合物質とを接触させ；次いで、
ｂ）該１０２１８結合物質に結合する該試料中のポリペプチドの存在を検出し、それにより、循環器疾患と関連するポリペプチドを同定することを含むことを特徴とする該方法。
【請求項１１】
該結合物質が抗体であることを特徴とする請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
該結合物質が検出可能に標識されることを特徴とする請求項１０記載の方法。
【請求項１３】
循環器疾患を有するか、または循環器疾患を発生するリスクを持つ対象を同定する方法であって、
ａ）該対象から得られた核酸分子を含む試料と、配列番号：１の少なくとも２５個の連続ヌクレオチドを含むハイブリダイゼーション・プローブとを接触させ；次いで
ｂ）該プローブにハイブリダイズする該試料中の核酸分子の存在を検出し、それにより、循環器疾患を有するか、または循環器疾患を発生するリスクを持つ対象を同定することを含むことを特徴とする該方法。
【請求項１４】
該ハイブリダイゼーション・プローブが検出可能に標識されることを特徴とする請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
核酸分子を含む該試料が、該ハイブリダイゼーション・プローブと接触するのに先立って、アガロースゲル電気泳動およびサザンブロットに付されることを特徴とする請求項１３記載の方法。
【請求項１６】
核酸分子を含む該試料が、該ハイブリダイゼーション・プローブと接触させるのに先立って、アガロースゲル電気泳動およびノーザンブロットに付されることを特徴とする請求項１３記載の方法。
【請求項１７】
該検出がインサイチュ・ハイブリダイゼーションによることを特徴とする請求項１３記載の方法。
【請求項１８】
循環器疾患を有するか、または循環器疾患を発生するリスクを持つ対象を同定する方法であって、
ａ）該対象から得られた核酸分子を含む試料と、第１および第２の増幅プライマーとを接触させ、ここに、該第１のプライマーは、配列番号：１の少なくとも２５個の連続ヌクレオチドを含み、かつ該第２のプライマーは、配列番号：１の相補体からの少なくとも２５個の連続ヌクレオチドを含み；
ｂ）核酸増幅を可能とする条件下にて該試料をインキュベートし；次いで
ｃ）増幅された該試料中の核酸分子の存在を検出し、それにより、循環器疾患を有するか、または循環器疾患を発生するリスクを持つ対象を同定することを含むことを特徴とする該方法。
【請求項１９】
核酸分子を含む該試料が、該インキュベーション工程後にアガロースゲル電気泳動に付されることを特徴とする請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
該試料中のｍＲＮＡを検出するために用いられることを特徴とする請求項１３または１８のいずれか１記載の方法。
【請求項２１】
該試料中のゲノムＤＮＡを検出するために用いられることを特徴とする請求項１３または１８のいずれか１記載の方法。
【請求項２２】
循環器疾患を有するか、または循環器疾患を発生するリスクを持つ対象を同定する方法であって、
ａ）該対象から得られたポリペプチドを含む試料と、１０２１８結合物質とを接触させ；次いで
ｂ）該１０２１８結合物質に結合する該試料中のポリペプチドの存在を検出し、それにより、循環器疾患を有するか、または循環器疾患を発生するリスクを持つ対象を同定することを含むことを特徴とする該方法。
【請求項２３】
該結合物質が抗体であることを特徴とする請求項２２記載の方法。
【請求項２４】
該結合物質が検出可能に標識されることを特徴とする請求項２２記載の方法。
【請求項２５】
異常な１０２１８核酸発現または１０２１８ポリペプチド活性により特徴付けられた循環器疾患を治療できる化合物を同定する方法であって、１０２１８核酸発現または１０２１８ポリペプチド活性を変調するための化合物の能力をアッセイし、それにより、異常な１０２１８核酸発現または１０２１８ポリペプチド活性により特徴付けられた循環器疾患を治療できる化合物を同定することを含むことを特徴とする該方法。
【請求項２６】
障害が、アテローム性動脈硬化症であることを特徴とする請求項２５記載の方法。
【請求項２７】
異常な１０２１８ポリペプチド活性または異常な１０２１８核酸発現により特徴付けられた循環器疾患を有する対象を治療する方法であって、対象に１０２１８モジュレーターを投与し、それにより、循環器疾患を有する該対象を治療することを含むことを特徴とする該方法。
【請求項２８】
障害が、異常な血管新生と関連する障害であることを特徴とする請求項２７記載の方法。
【請求項２９】
障害が、アテローム性動脈硬化症であることを特徴とする請求項２７記載の方法。
【請求項３０】
該１０２１８モジュレーターが、医薬上許容される処方で投与されることを特徴とする請求項２７記載の方法。
【請求項３１】
該１０２１８モジュレーターが、遺伝子療法ベクターを用いて投与されることを特徴とする請求項２７記載の方法。
【請求項３２】
１０２１８モジュレーターが、１０２１８ポリペプチド活性を変調できることを特徴とする請求項２７記載の方法。
【請求項３３】
１０２１８モジュレーターが、抗１０２１８抗体であることを特徴とする請求項３２記載の方法。
【請求項３４】
１０２１８モジュレーターが、配列番号：２のアミノ酸配列またはその断片を含む１０２１８ポリペプチドであることを特徴とする請求項３２記載の方法。
【請求項３５】
１０２１８モジュレーターが、配列番号：２のアミノ酸配列に少なくとも９０パーセント同一性であるアミノ酸配列を含む１０２１８ポリペプチドであり、ここに、該パーセント同一性は、アミノ酸配列を比較するＡＬＩＧＮプログラム、ＰＡＭ１２０ウェイト残基表（weight residue table）、１２のギャップ長ペナルティーおよび４のギャップペナルティーを用いて計算されることを特徴とする請求項３２記載の方法。
【請求項３６】
１０２１８モジュレーターが、配列番号：２のアミノ酸配列よりなるポリペプチドの単離された天然に発生する対立変異体であり、ここに、ポリペプチドは、配列番号：１よりなる核酸分子の相補体に４×ＳＳＣ、６５〜７０℃にてハイブリダイズさせ、続いて１×ＳＳＣ中で６５〜７０℃にて１回以上洗浄した核酸分子によりコードされることを特徴とする請求項３２記載の方法。
【請求項３７】
１０２１８モジュレーターが、１０２１８核酸発現を変調できることを特徴とする請求項２７記載の方法。
【請求項３８】
１０２１８モジュレーターが、アンチセンス１０２１８核酸分子であることを特徴とする請求項３７記載の方法。
【請求項３９】
１０２１８モジュレーターがリボザイムであることを特徴とする請求項３７記載の方法。
【請求項４０】
１０２１８モジュレーターが、配列番号：１のヌクレオチド配列またはその断片を含むことを特徴とする請求項３７記載の方法。
【請求項４１】
１０２１８モジュレーターが、配列番号：２のアミノ酸配列に少なくとも９０パーセント同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸分子を含み、ここに、該パーセント同一性は、アミノ酸配列を比較するＡＬＩＧＮプログラム、ＰＡＭ１２０ウェイト残基表（weight residue table）、１２のギャップ長ペナルティーおよび４のギャップペナルティーを用いて計算されることを特徴とする請求項３７記載の方法。
【請求項４２】
１０２１８モジュレーターが、配列番号：２のアミノ酸配列を含むポリペプチドの天然に発生する対立変異体をコードする核酸分子を含み、ここに、核酸分子は、配列番号：１よりなる核酸分子の相補体に４×ＳＳＣ、６５〜７０℃にてハイブリダイズし、続いて１×ＳＳＣ中で６５〜７０℃にて１回以上洗浄することを特徴とする請求項３７記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
関連出願
本出願は２００２年４月１０日付けで出願された米国特許出願シリアル番号０９／８３３,０８２の優先権を主張し、ここに出典明示してその内容を本明細書の一部とみなす。
【０００２】
発明の背景
循環器疾患は先進国の全体にわたる主要な健康リスクである。最も一般な循環器疾患であるアテローム性動脈硬化症は、心臓発作、卒中および末梢血管疾患の主要原因であり、その結果、重大な障害および四肢喪失を生じ、それにより、米国内の死亡の主要原因である。
【０００３】
アテローム性動脈硬化症は、（例えば、Ross（１９９３） Nature ３６２：８０１−８０９に記載された）多数の細胞タイプおよび分子的因子を含む複雑な疾病である。通常の環境下にて、動脈壁の内皮および平滑筋細胞（ＳＭＣ）への損傷に対する保護応答であるそのプロセスは、炎症に先行し、それに伴った線維脂肪性および繊維の病変、またはプラークの形成から成る。アテローム性動脈硬化症の進行した病変は、関係する動脈を閉塞し、多数の異なる形態の損傷に対する過剰な炎症−線維増殖性の応答から生じ得る。血管内皮の傷または機能障害は、多数の疾患の共通した特徴であり、それは個体をアテローム性動脈硬化性循環器疾患の発生を促進させる。例えば、剪断応力は、分岐点および不規則構造のごとき、混乱した血流が発生する循環系領域のアテローム斑の頻繁な発生を担うと考えられる。
【０００４】
血液由来の単球が血管の内皮層に付着し、内皮下の空間へ通り抜けて移る場合に、アテローム斑の形成において第１の観察可能な事象が生じる。同時に、隣接した内皮細胞は酸化低密度リポ蛋白質（ＬＤＬ）を生成する。次いで、これらの酸化ＬＤＬは、それらの表面上で発現したスカベンジャー受容体を介して単球によって大量に処理される。本来のＬＤＬ（ｎＬＤＬ）がｎＬＤＬの特定の受容体によって処理される調節経路とは対照的に、取込みのスカベンジャー経路は単球によって調節されない。
【０００５】
これらの脂質充填（lipid-filled）単球は、泡沫細胞と呼ばれ、それらは脂肪線条の主要成分である。泡沫細胞ならびにそれらを囲む内皮細胞および平滑筋細胞間の相互作用は、平滑筋細胞増殖および移動に結局導くことができる慢性局所炎症の状態および線維性斑の形成に導く。
【０００６】
かかるプラークは、全体的または部分的に、心臓発作または卒中に導く血管を介する血流を遮断しかねない。また、プラークは、動脈壁を弱め得る結果、動脈瘤を生じる。さらに、プラークにより惹起された血管閉塞が血流を制限する結果、虚血を生じる。虚血は、不適切な灌流のための器官の組織中の酸素供給の不足によって特徴付けられる疾患である。かかる不適切な灌流は、アテローム性動脈硬化もしくは再狭窄の病変、貧血または脳卒中を含む多数の自然な原因を有し得る。また、バイパス手術中の血流の中断のごとき多数の医学的介在は、例えば、虚血に導く。心血管の患部組織により時々惹起されるのに加えて、虚血は虚血性心疾患においてのごとく心血管組織に時々影響しかねない。虚血はいずれの器官でも生じ得るが、しかしながら、それは酸素供給の不足を受けている。
【０００７】
Ｐ２Ｘ受容体は、細胞外のアデノシン５’−三リン酸（ＡＴＰ）の結合により活性化されるリガンド作動型膜イオンチャネルのファミリーである。７種の異なるＰ２Ｘ受容体サブユニットｃＤＮＡが同定されている（Ｐ２Ｘ１、Ｐ２Ｘ２、Ｐ２Ｘ３、Ｐ２Ｘ４、Ｐ２Ｘ５、Ｐ２Ｘ６およびＰ２Ｘ７）（MacKenzieら （１９９９） Ann. N.Y. Acad. Sci. ８６８：７１６-７２９）。それらは、１０個のシステイン残基が保存されている大きな細胞外ループを持つ２つの膜貫通領域；および細胞内のＮ末端およびＣ末端により特徴付けられる（Burnstock （２０００） British Journal of Anesthesia ８４：４７６-８８０）。Ｐ２Ｘ受容体は、膀胱および動脈の平滑筋、腎臓、膵臓、肺、心臓の心筋細胞、感覚および交感神経節、脳ならびに脊髄を含めた哺乳動物の種々の組織で広範囲に分布し、また、各サブタイプは、異なる組織中で優先的に発現されるようである（Yamamoto,ら （２０００） Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. ２７９：H２８５-H２９２）。
【０００８】
ヒトのＰ２Ｘ４遺伝子は脳からクローニングされ、異種起源の細胞系で発現される場合に機能的なホモマーのＡＴＰ−活性化チャネルを形成する（Garcia-Guzmanら （１９９７） Molecular Pharmacology ５１：１０９-１１８）。この受容体は、ヒト内皮細胞中で発現されることが判明し、それは内皮細胞中のＡＴＰ誘導Ｃａ２＋流入に関与している（Yamamotoら （２０００） Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. ２７９：H２８５-H２９２）。
【０００９】
カルシウム濃度はアテローム性動脈硬化症を含めた循環器疾患において役割を果たす。カルシウムチャネル・ブロッカー（ＣＣＢ）を用いて高血圧を有効に変調してきている。ＣＣＢを用いて、アテローム斑の主な成因のうちの１つである動脈壁のカルシウム沈着を回避できることも仮定されている（Perez （２０００） J. Hum. Hypertens. １４ Suppl １：S９６-９）。また、細胞内カルシウムレベルは、後期血小板凝集および止血プラグ（hemostaic plug）形成と関連付けられ、それはアテローム性動脈硬化症の病因に含まれてきた（Covicら （２０００） Biochemistry ３９：５４５８-５４６７）。また、最近の研究はカルシウムシグナリングに対する遊離基の役割に集中している。血管のカルシウムシグナリングは、虚血に関連する疾病状態のオキシダント・ストレスによって変化する（Lounsburyら （２０００） Free Radical. Biol. Med. ２８：１３６２）。細胞外カルシウムは、単球細胞に対する直接的および間接的な作用によりｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏにて固有の免疫応答を変調できるイオン性ケモキネシス剤（ionic chemokinetic agent）として機能することが示されている。従って、カルシウム沈着は、損傷、感染およびアテローム性動脈硬化症の部位での慢性炎症性変化の結果および／または原因の双方であり得る（Olszakら、（２０００） J. Clin. Invest. １０５：１２９９−３０５）。
【００１０】
発明の要約
本発明は、限定されるものではないが、アテローム性動脈硬化症を含めた、循環器疾患の診断および治療のための方法および組成物を提供する。本発明は、少なくとも部分的に、Ｐ２Ｘ４遺伝子（本明細書中で「１０２１８」という）が、高度なアテローム性動脈硬化性剤、例えば、インターフェロンガンマ（ＩＦＮγ）およびＣＤ４０Ｌにより刺激されたマクロファージ中、およびアテローム性動脈硬化症の動物モデルにおける非病変血管および野生型動物における通常の血管に比較してアテローム性動脈硬化病変中で示差発現されるという発見に基づいている。さらに、１０２１８は高度に血管新生された器官および血管で発現される。結果的に、本発明は、限定されるものではないが、アテローム性動脈硬化症を含めた循環器疾患の診断および治療のための方法を提供する。
【００１１】
１つの態様において、本発明は、異常な１０２１８の核酸発現もしくは活性を変調する化合物または薬剤の能力をアッセイすることにより、異常な１０２１８核酸発現もしくは１０２１８ポリペプチド活性により特徴付けられる循環器疾患、例えば、アテローム性動脈硬化症を治療できる化合物を同定する方法を提供する。一つの具体例において、同定された化合物は１０２１８発現もしくは活性を阻害する。
【００１２】
もう一つの態様において、本発明は、循環器疾患、例えば、アテローム性動脈硬化症に罹っている対象を同定する方法を提供し、それはその対象から生物学的試料を得、次いで、異常または正常でない１０２１８発現もしくは活性を該試料中で検出し、それにより、循環器疾患に罹っている対象を同定することを含むことを特徴とする。
【００１３】
さらにもう一つの具体例において、本発明は、循環器疾患、例えば、アテローム性動脈硬化症を有するか、または循環器疾患を発生するリスクを持つ対象を同定する方法を提供し、それは対象から得られた核酸分子を含有する試料と、配列番号：１の少なくとも２５個の連続するヌクレオチドを含むハイブリダイゼーション・プローブとを接触させ、次いで、そのプローブにハイブリダイズする試料中の核酸分子の存在を検出することを含むことを特徴とする。一つの具体例において、そのハイブリダイゼーション・プローブは、検出可能に標識される。もう一つの具体例において、試料は、ハイブリダイゼーション・プローブと接触するのに先立ち、アガロースゲル電気泳動およびサザンブロットに付される。さらにもう一つの具体例において、試料は、ハイブリダイゼーション・プローブと接触するのに先立ち、アガロースゲル電気泳動およびノーザンブロットに付される。さらなる具体例において、その検出はインサイチュ・ハイブリダイゼーションによる。
【００１４】
さらにもう一つの態様において、本発明は、１０２８１モジュレーター、例えば、小分子、１０２８１に特異的な抗体、１０２８１ポリペプチド、１０２８１ポリペプチドの断片、１０２８１核酸分子、１０２８１核酸分子の断片、アンチセンス１０２８１核酸分子およびリボザイムを対象に投与することにより異常な１０２８１ポリペプチド活性または異常な１０２８１核酸発現により特徴付けられる循環器疾患、例えば、アテローム性動脈硬化症を有する対象を治療する方法を提供する。一つの具体例において、１０２８１モジュレーターは医薬上許容される処方で投与できる。さらなる具体例において、１０２８１モジュレーターは、遺伝子療法ベクターを用いて投与される。もう一つの具体例において、１０２８１ポリペプチドは、配列番号：２のアミノ酸配列もしくはその断片または配列番号：２のアミノ酸配列に少なくとも９０パーセント同一であるアミノ酸配列を含み、そのパーセント同一性は、アミノ酸配列を比較するＡＬＩＧＮプログラム、ＰＡＭ１２０ウェイト残基表（weight residue table）、１２のギャップ長ペナルティーおよび４のギャップペナルティーを用いて計算される。さらにもう一つの具体例において、１０２８１ポリペプチドは、配列番号：２のアミノ酸配列よりなるポリペプチドの単離された天然に発生する対立変異体であり、ここに、そのポリペプチドは、配列番号：１よりなる核酸分子の相補体に６×ＳＳＣ、４５℃にてハイブリダイズさせ、続いて０.２×ＳＳＣ、０.１％ ＳＤＳ中で６５℃にて１回以上洗浄した核酸分子によりコードされる。さらにもう一つの具体例において、その１０２８１核酸分子は、配列番号：１のヌクレオチド配列、またはその断片を含む。
【００１５】
本発明の他の要旨および利点は、以下の詳細な記載および特許請求の範囲から明らかとなるであろう。
【００１６】
発明の詳細な説明
本発明は、限定されるものではないが、アテローム性動脈硬化症、虚血／再灌流傷害、高血圧症、再狭窄、動脈炎症および内皮細胞障害を含めた循環器疾患の診断および治療のための方法および組成物を提供する。本明細書に用いた「治療」とは、疾患もしくは障害、疾患もしくは障害の症状または疾患もしくは障害の素因を治癒する、治す、治癒する、緩和する、軽減する、変更する、治療する、寛解する、改善するもしくは影響させる目的で、疾患もしくは障害、疾患もしくは障害の症状または疾患もしくは障害の素因を持つ患者への治療剤の適用もしくは投与、または患者から単離された組織もしくは細胞系への治療剤の適用もしくは投与と定義される。治療剤には、限定されるものではないが、本明細書に記載した小分子、ペプチド、抗体、リボザイムおよびアンチセンスオリゴヌクレオチドが含まれる。
【００１７】
本発明は、少なくとも部分的に、Ｐ２Ｘ４核酸および蛋白質分子（本明細書中で、「１０２１８」核酸および蛋白質分子という）が、通常もしくは循環器疾患でない状態、ならびに高度にアテローム発生性のサイトカイニン、例えば、インターフェロンガンマ（ＩＦＮγ）およびＣＤ４０Ｌで刺激されたマクロファージ中でのそれらの発現に対し、循環器疾患において示差発現するという発見に基づいている。また、１０２１８核酸および蛋白質分子は、高度に血管新生された器官、例えば、心臓、腎臓、肝臓、骨格筋および血管、例えば、動脈および静脈中で発現される。本発明の方法により同定された１０２８１モジュレーターを用いて、限定されるものではないが、アテローム性動脈硬化症を含めた循環器疾患を変調する（例えば、阻害する、治療するもしくは予防する）または診断することができる。
【００１８】
本明細書に用いた「示差発現（differential expression）」には、遺伝子の一時的および／または組織発現パターン中の定量的ならびに定性的な差を含む。かくして、示差発現した遺伝子は、正常−対−循環器疾患状態（例えば、アテローム性動脈硬化症についての動物モデルのごとき実験的循環器疾患システム）におけるその発現を活性化または不活性化させることができる。発現が正常−対−循環器疾患または正常−対−実験的状態において異なる程度は、標準的な特徴付け技術、例えば、定量的ＰＣＲ、ノーザン分析、減法ハイブリダイゼーション（subtractive hybridization）を介して視覚化されるのに十分に大きいことだけが必要である。示差発現した遺伝子の発現パターンは、予後的もしくは診断的な循環器疾患、例えば、アテローム性動脈硬化症の評価の一部分として用いることができるか、あるいは循環器疾患、例えば、アテローム性動脈硬化症の治療に有用である化合物を同定する方法に用いることができる。加えて、循環器疾患に関与する示差発現した遺伝子は、標的遺伝子発現もしくは標的遺伝子産物活性のレベルの変調が、循環器疾患、例えば、アテローム性動脈硬化症を改善するように作用できるような標的遺伝子を表し得る。標的遺伝子発現もしくは標的遺伝子産物の活性を変調する化合物は、循環器疾患の治療に用いることができる。本明細書に記載された１０２１８遺伝子は、循環器疾患、例えば、アテローム性動脈硬化症に関して示差発現でき、および／またはそれらの産物は、循環器疾患に重要な遺伝子産物と相互作用できるので、その遺伝子もさらなる心血管系細胞プロセスに関与し得る。
【００１９】
本発明の方法に用いた１０２１８分子は、細胞外のアデノシン５’−三リン酸（ＡＴＰ）の結合により活性化されるリガンド作動型（ligand-gated）膜イオンチャネルである。それらは、内皮細胞中のＡＴＰ誘導Ｃａ２＋流入に関与する。（Yamamotoら （２０００） Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. ２７９：H２８５-H２９２）。カルシウム濃度は、限定されるものではないが、アテローム性動脈硬化症を含めた循環器疾患に関与すると仮定されている。例えば、カルシウムは、アテローム斑の主成分であり、高血圧にも関係する（Perez （２０００） J. Hum. Hypertens. １４ Suppl １：S９６-９）。また、カルシウムは、後期血小板凝集および形成に関与し（Covicら （２０００） Biochemistry ３９：５４５８-５４６７）、カルシウム沈着は、アテローム性動脈硬化部位での慢性炎症変化の結果および／または原因の双方であり得る（Olszakら （２０００） J. Clin. Invest. １０５：１２９９-３０５）。従って、循環器疾患状態および高度にアテローム発生性サイトカインで刺激したマクロファージ中の１０２１８分子の示差発現、ならびに血管および動脈中のそれらの発現を与えると、その１０２１８分子の変調は、循環器疾患、および特に、アテローム性動脈硬化症を変調、例えば、阻害、治療または予防することができる。
【００２０】
本明細書に用いた「循環器疾患」または「循環器障害」には、循環器系、例えば、心臓もしくは血管に影響する疾患または障害が含まれる。循環器疾患には、アテローム性動脈硬化症、虚血再灌流傷害、再狭窄、動脈炎症、血管壁再構築、心室再構築、急速心室ペーシング（rapid venticular pacing）、冠動脈微小塞栓症、頻脈、徐脈、圧力過負荷、大動脈屈曲（aortic bending）、冠動脈結紮（coronary artery ligation）、血管心臓病、心房性細動、ＱＴ延長症候群、うっ血性心不全、洞房結節機能障害、狭心症、心不全、高血圧症、心房性細動、心房粗動、拡張型心筋症、特発性心筋症、心筋梗塞、冠動脈疾患、冠動脈スパスム、虚血性疾患、不整脈および心血管発達障害（例えば、動静脈奇形、動脈静脈フィステル、レイノー症候群、神経性胸郭出口症候群、灼熱痛／反射自律神経性ジストロフィー、血管腫、動脈瘤、海綿状様血管腫、大動脈弁狭窄症、心房中隔欠損症、房室管（atrioventicular canal）、大動脈縮窄症、エープシュタイン奇形（ebsteins anomaly）、左心室発育不全症候群、大動脈弓障害、僧帽弁逸脱症候群、動脈管、卵円口開存、部分的肺静脈還流異常、心室中隔欠損を伴う肺動脈閉鎖症、心室中隔欠損を伴わない肺動脈閉鎖症、胎児循環の持続、肺動脈弁狭窄、単心室、全肺静脈還流異常、大血管転位症、三尖弁閉鎖症、総動脈幹、心室中隔欠損症）のごとき障害が含まれる。好ましい具体例において、循環器疾患はアテローム性動脈硬化症である。また、循環器の疾患または障害は内皮細胞障害を含む。
【００２１】
本明細書に用いた「内皮細胞障害」には、異常、未制御または望まれない内皮細胞活性、例えば、増殖、移動、脈管形成もしくは血管新生；または脈管形成と関連する細胞表面付着分子または遺伝子、例えば、ＴＩＥ−２、ＦＬＴおよびＦＬＫの異常な発現によって特徴付けられる障害が含まれる。内皮細胞障害には、腫瘍形成、腫瘍転移、乾癬、糖尿病網膜症、子宮内膜症、グレーヴス病、虚血性疾病（例えば、アテローム性動脈硬化症）および慢性炎症性疾患（例えば、慢性関節リウマチ）が含まれる。
【００２２】
本明細書に交換可能に用いた「１０２１８活性」、「１０２１８の生物学的活性」または「１０２１８の機能的活性」には、標準的な技術に従いｉｎ ｖｉｖｏもしくはｉｎ ｖｉｔｒｏで決定された、１０２１８応答性細胞もしくは組織、例えば、内皮細胞もしくは血管組織、または１０２１８蛋白質基質に対する１０２１８蛋白質、ポリペプチドもしくは核酸分子により発揮された活性が含まれる。１０２１８活性は、１０２１８標的分子との会合のごとく直接的な活性であり得る。本明細書に用いた「基質」、「標的分子」もしくは「結合パートナー」は、１０２１８媒介機能、例えば、カルシウム濃度の変調が達成されるような、１０２１８蛋白質が自然に、例えば、ＡＴＰに結合もしくは相互作用する分子である。１０２１８標的分子は、非１０２１８分子または１０２１８蛋白質もしくはポリペプチドで有り得る。かかる標的分子の例には、細胞内もしくは細胞外のカルシウム濃度、例えば、ＡＴＰ結合により変調されたカルシウム流入の変調に関与する経路における１０２１８蛋白質の同一シグナリング経路における蛋白質、例えば、（活性の促進剤および阻害剤を含めた）１０２１８蛋白質の上流または下流で機能し得る蛋白質が含まれる。あるいは、１０２１８活性は、１０２１８標的分子との１０２１８蛋白質の相互作用により媒介された細胞シグナリング活性のごとき、間接的活性である。１０２１８の生物学的活性は、本明細書に記載されている。例えば、その１０２１８蛋白質は、１以上の以下の活性を持つことができる：１）それらはＡＴＰに結合する；２）それらはカルシウムに結合する；３）それらは、細胞、例えば、内皮細胞中で細胞間カルシウム流入を変調する；４）それらは、細胞の移動、例えば、単球、血小板移動を変調する；およびそれらはアテローム性動脈硬化性の病変形成を変調する。
【００２３】
本発明の種々の態様は、以下のサブセクションにさらに詳細に記載される。
【００２４】
１．スクリーニングアッセイ：
本発明は、１０２１８蛋白質に結合するか、例えば、１０２１８発現もしくは１０２１８活性に対して促進または阻害効果を有するか、あるいは例えば、１０２１８基質の発現もしくは活性に促進または阻害効果を有するモジュレーター、すなわち、候補またはテスト化合物もしくは剤（例えば、ペプチド、ペプチドミメティクス、小分子（有機もしくは無機）または他の薬物）を同定する方法（本明細書で「スクリーニングアッセイ」ともいう）を提供する。本発明に記載されたアッセイ方法を用いて同定された化合物は、循環器疾患、例えば、アテローム性動脈硬化症に有用で有り得る。
【００２５】
これらのアッセイ方法は、１０２１８蛋白質に結合する、１０２１８蛋白質と相互作用する他の細胞内もしくは細胞外蛋白質に結合する、および他の細胞内もしくは細胞外蛋白質との１０２１８蛋白質の相互作用と干渉する化合物を同定するように設計される。例えば、膜貫通受容体タイプ蛋白質である１０２１８の蛋白質の場合には、かかる手法は、かかる受容体についてのリガンドを同定できる。１０２１８蛋白質リガンドは、例えば、循環器疾患、例えば、アテローム性動脈硬化症、虚血／再灌流、高血圧症、再狭窄、動脈炎症、内皮細胞障害を改善するために用いることができる。かかる化合物には、限定されるものではないが、ペプチド、抗体、または小さな有機化合物もしくは無機化合物が含まれる。また、かかる化合物は、他の細胞の蛋白質を含み得る。
【００２６】
本明細書に記載されたもののようなアッセイ方法により同定された化合物は、例えば、循環器疾患、例えば、アテローム性動脈硬化症の改善のために有用であり得る。循環器疾患状態が、細胞または組織中の１０２１８遺伝子発現および/または１０２１８蛋白質の全体的な低レベルに起因する場合には、その１０２１８蛋白質と相互作用する化合物は、結合した１０２１８蛋白質の活性を強調するか、または増幅する化合物を含む。かかる化合物は、１０２１８蛋白質活性のレベルの有効な増加をもたらし、かくして、症状を改善するであろう。
【００２７】
他の場合において、１０２１８遺伝子内の突然変異は、異常なタイプまたは過剰量の１０２１８蛋白質を作成させ、それは循環器疾患に導く有害な効果を有する。同様に、生理的条件は、循環器疾患に導く１０２１８の遺伝子発現の過度の増加を引き起こしかねない。そのような場合には、１０２１８の蛋白質に結合する化合物が同定でき、それは１０２１８の蛋白質の活性を抑制する。このセクションに記載されたもののごとき手法により同定された化合物の有効性をテストするためのアッセイ方法は本明細書に記載されている。
【００２８】
１つの具体例において、本発明は、１０２１８の蛋白質もしくはポリペプチドの基質またはその生物学的に活性な部分である候補化合物またはテスト化合物をスクリーニングするためのアッセイ方法を提供する。もう一つの具体例において、本発明は、１０２１８の蛋白質もしくはポリペプチドまたはその生物学的に活性な部分に結合するか、またはそれらの活性を変調する候補化合物またはテスト化合物をスクリーニングするためのアッセイ方法を提供する。本発明のテスト化合物は、生物学的ライブラリー；空間的にアドレス可能なパラレルな固相または溶液相ライブラリー；ディコンボリューション（deconvolution）を必要とする合成ライブラリー法；「ワン−ビーズ・ワン−化合物（one-bead one-compound）」ライブラリー法；およびアフィニティークロマトグラフィー選択を用いる合成ライブラリー法を含めた当該技術分野において知られたコンビナトリアル・ライブラリー法における多数のアプローチのいずれかを用いて得ることができる。生物学的ライブラリーアプローチはペプチドライブラリーに限定されるが、他の４つのアプローチはペプチド、非ペプチドオリゴマーまたは小分子ライブラリーの化合物に適用できる（Lam, K. S. （１９９７） Anticancer Drug Des. １２：１４５）。
【００２９】
分子ライブラリーの合成についての方法の例は、当該技術分野において、例えば、DeWittら （１９９３） Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. ９０：６９０９；Erbら （１９９４） Proc. Natl. Acad. Sci. USA ９１：１１４２２；Zuckermannら （１９９４）. J. Med. Chem. ３７：２６７８；Choら （１９９３） Science ２６１：１３０３；Carrellら （１９９４） Angew. Chem. Int. Ed. Engl. ３３：２０５９；Carellら （１９９４） Angew. Chem. Int. Ed. Engl. ３３：２０６１；およびGallopら （１９９４） J. Med. Chem. ３７：１２３３に見出すことができる。
【００３０】
化合物のライブラリーは、溶液中（例えば、Houghten （１９９２） Biotechniques １３：４１２-４２１）またはビーズ上（Lam （１９９１） Nature ３５４：８２-８４）、チップ（Fodor （１９９３） Nature ３６４：５５５-５５６）、細菌（Ladner 米国特許第５,２２３,４０９号）、胞子（Ladner 米国特許'４０９号）、プラスミド（Cullら （１９９２） Proc Natl Acad Sci USA ８９：１８６５-１８６９）またはファージ（ScottおよびSmith （１９９０） Science ２４９：３８６-３９０）；（Devlin （１９９０） Science ２４９：４０４-４０６）；（Cwirlaら （１９９０） Proc. Natl. Acad. Sci. ８７：６３７８-６３８２）；（Felici （１９９１） J. Mol. Biol. ２２２：３０１-３１０）；（Ladner 前記）に存在し得る。
【００３１】
一つの具体例において、アッセイ方法は、１０２１８蛋白質またはその生物学的に活性な部分を発現する細胞をテスト化合物と接触させ、１０２１８の活性を変調する化合物の能力を決定する細胞ベースのアッセイである。１０２１８の活性を変調するテスト化合物の能力の決定は、例えば、細胞内のカルシウム、ＩＰ３、ｃＡＭＰ、またはジアシルグリセロール濃度、細胞内蛋白質の燐酸化プロフィール、細胞増殖および／または移動、例えば、細胞表面付着分子の遺伝子発現、脈管形成と関連する遺伝子、または１０２１８調節転写因子の活性をモニターすることにより達成できる。細胞は、哺乳動物起源、例えば、内皮細胞であり得る。１つの具体例において、１０２１８の受容体ドメインと相互作用する化合物をリガンドとして機能する、すなわち、１０２１８受容体に結合し、かつシグナルの形質導入経路を変調するそれらの能力につきスクリーニングすることができる。１０２１８リガンドの同定およびリガンド受容体複合体の活性の測定は、この相互作用のモジュレーター（例えば、アンタゴニスト）の同定に導く。かかるモジュレーターは、循環器疾患の治療において有用であり得る。
【００３２】
また、基質に結合する１０２１８を変調するか、または１０２１８に結合するテスト化合物の能力を決定できる。基質に結合している１０２１８基質を変調するテスト化合物の能力の決定は、例えば、１０２１８基質の１０２１８への結合が、複合体中の標識された１０２１８基質を検出することにより決定できるような、同位体元素もしくは酵素的標識での１０２１８基質をカップリングすることにより達成することができる。また、１０２１８は、複合体中の１０２１８基質に結合する１０２１８を変調するテスト化合物の能力をモニターする放射性同位元素または酵素ラベルとカップリングできる。１０２１８を結合するテスト化合物の能力の決定は、例えば、化合物の１０２１８への結合が複合体中の標識した１０２１８化合物を検出することにより決定できるように放射性同位元素または酵素ラベルとカップリングすることによって達成できる。例えば、化合物（例えば、１０２１８リガンドまたは基質）は直接的または間接的に、１２５Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃまたは３Ｈで標識でき、その放射性同位元素は、放射線放出の直接的なカウントまたはシンチレーションカウントにより検出できる。さらに、例えば、化合物は、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼまたはルシフェラーゼ、および適当な基質の生成物への変換の決定により標識できる酵素標識で酵素的に標識できる。
【００３３】
（例えば、結合）カルシウムと会合する１０２１８受容体の能力を変調するテスト化合物の能力は、例えば、Liu L. （１９９９） Cell Signal. １１（５）：３１７-２４およびKawai T.ら （１９９９） Oncogene １８（２３）：３４７１-８０（ここに出典明示してその内容を本明細書の一部とみなす）に記載されたアッセイを用いてテストできる。
【００３４】
また、いずれの相互作用の標識もない１０２１８と相互作用する化合物（例えば、１０２１８リガンドまたは基質）の能力を決定することは本発明の範囲内にある。例えば、マイクロフィジオメーター（microphysiometer）を用いて、化合物もしくは１０２１８のいずれの標識もなくして１０２１８との化合物の相互作用を検出できる（McConnell, H. M.ら （１９９２） Science ２５７：１９０６-１９１２）。本明細書に用いた「マイクロフィジオメーター」（例えば、サイトセンサー（Cytosensor）は。光アドレス可能電位差センサー（light-addressable potentiometric sensor）（ＬＡＰＳ）を用いて細胞がその環境を酸性化する割合を測定する分析装置である。この酸性化割合における変化は、化合物および１０２１８間の相互作用の指標として用いることができる。
【００３５】
もう一つの具体例において、アッセイ方法は、細胞ベースのアッセイ方法であり、それは１０２１８標的分子（例えば、１０２１８基質）を発現しているテスト化合物とテスト化合物とを接触させ、次いで、１０２１８標的分子の活性を変調する（例えば、刺激するまたは阻害する）テスト化合物の能力を決定することを含む。１０２１８標的分子を変調するテスト化合物の能力の決定は、例えば、１０２１８標的分子と結合または相互作用する１０２１８蛋白質の能力を決定することにより達成できる。
【００３６】
１０２１８標的分子に結合またはそれと相互作用する１０２１８蛋白質または生物学的に活性な断片の能力の決定は、直接的結合を決定する前記の方法のうちの一つにより達成できる。好ましい具体例において、１０２１８標的分子と結合または相互作用する１０２１８の能力の決定は、標的分子の活性を測定することにより達成できる。例えば、標的分子の活性は、その標的の細胞のセカンド・メッセンジャー（すなわち、細胞内Ｃａ２＋、ジアシルグリセロール、ＩＰ３、ｃＡＭＰ）の誘導を検出することにより決定できるか、レポーター遺伝子（検出可能なマーカー、例えば、ルシフェラーゼをコードする核酸に作動可能に連結する標的応答性調節エレメントを含む）の誘導を検出するか、または標的調節細胞応答（例えば、遺伝子発現）を検出することによって決定できる。
【００３７】
さらにもう一つの具体例において、本発明のアッセイ方法は、無細胞アッセイ方法であって、ここに、１０２１８蛋白質またはその生物学的に活性な部分をテスト化合物と接触させ、１０２１８蛋白質またはその生物学的に活性な部分に結合する能力を決定する。１０２１８蛋白質の好ましい生物学的に活性な部分は、非−１０２１８分子との相互作用において沈殿する断片、例えば、高い表面確率スコア（high surface probalility scores）を持つ断片を含む。１０２１８へのテスト化合物の結合は、前記のごとく直接的または間接的に決定できる。好ましい具体例において、そのアッセイ方法は、１０２１８蛋白質またはその生物学的に活性な部分と１０２１８に結合する公知の化合物とを接触させて、アッセイ混合物を形成し、そのアッセイ混合物とテスト化合物とを接触させ、１０２１８蛋白質と相互作用するテスト化合物の能力を決定し、ここに、１０２１８蛋白質と相互作用するテスト化合物の能力の測定は、公知の化合物に比較した１０２１８またはその生物学的に活性な部分に優先的に結合するテスト化合物の能力を測定することを含む。１０２１８と公知の標的蛋白質との相互作用を変調する化合物は、１０２１８蛋白質の活性、特に、変異体１０２１８蛋白質を調節するのに有用であろう。
【００３８】
もう一つの具体例において、アッセイは無細胞アッセイ方法であり、ここに、１０２１８蛋白質またはその生物学的に活性な部分をテスト化合物と接触させ、その１０２１８蛋白質またはその生物学的に活性な部分の活性を変調する（例えば、促進するか、または阻害する）テスト化合物の能力を決定する。１０２１８蛋白質の活性を変調するテスト化合物の能力の決定は、例えば、直接的結合を測定するための前記の方法のうちの一つにより１０２１８標的分子に結合する１０２１８蛋白質の能力を決定することにより達成できる。また、１０２１８標的分子に結合する１０２１８蛋白質の能力の決定は、リアルタイムのＢｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ Ａｎａｌｙｓｉｓ（ＢＩＡ）のごとき技術を用いて達成できる（Sjolander, S.およびUrbaniczky, C. （１９９１） Anal. Chem. ６３：２３３８-２３４５およびSzaboら （１９９５） Curr. Opin. Struct. Biol. ５：６９９-７０５）。本明細書に用いた「ＢＩＡ」は、いずれの反応体（例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ）を標識することなくリアルタイムに生物特異的な相互作用を研究する技術である。表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）の最適な現象における変化は、生物学的分子間のリアルタイム反応の指標として用いることができる。
【００３９】
もう一つの具体例において、１０２１８の活性を変調するテスト化合物の能力の決定は、さらに１０２１８標的分子の下流のエフェクターの活性を変調する１０２１８蛋白質の能力を決定することにより達成できる。例えば、適当な標的に対するエフェクターの活性を決定できるか、または適当な標的へのエフェクターの結合が、従前に記載されるごとく決定できる。
【００４０】
さらにもう一つの具体例において、その無細胞アッセイ方法は、１０２１８蛋白質またはその生物学的に活性な部分と１０２１８蛋白質に結合する公知化合物とを接触させ、アッセイ混合物を形成し、そのアッセイ混合物とテスト化合物とを接触させ、次いで、１０２１８蛋白質と相互作用するテスト化合物の能力を決定し、ここに、１０２１８蛋白質と相互作用するテスト化合物の能力の決定は、１０２１８標的分子に優位に結合するか、または１０２１８標的分子の活性を変調する１０２１８蛋白質の能力を決定することを含む。
【００４１】
本発明の前記アッセイ方法の１を超える具体例において、１０２１８もしくはその標的分子のいずれかを固定化して、その蛋白質の一方または双方の未複合形態から複合化した形態の分離を促進する、ならびにアッセイ方法の自動化を提供することが望ましいであろう。１０２１８蛋白質へのテスト化合物の結合または候補化合物の存在および不存在下の１０２１８蛋白質の標的分子との相互作用は、反応体を含有するのに適当ないずれの容器についても達成できる。かかる容器の例には、蛋白質の一方または双方がマトリックスに結合するのを可能とするドメインを添加する融合蛋白質を提供できる。例えば、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ／１０２１８融合蛋白質またはグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ／標的融合蛋白質がグルタチオンセファロースビーズ（Sigma Chemical, St. Loui, MO）、またはグルタチオン誘導体化マイクロタイタープレートに吸着でき、次いで、テスト化合物またはテスト化合物および非吸着標的蛋白質もしくは１０２１８蛋白質のいずれかと組み合わせ、次いで、混合物を複合体形成の助けとなる条件下でインキュベートする。インキュベーション後に、例えば、前記のごとく、ビーズもしくはマイクロタイタープレートウェルを洗浄して、いずれの未結合成分も除去し、マトリックスをビーズの場合には固定化し、複合体は直接的または間接的に決定する。別法として、その複合体はマトリックスから分離でき、１０２１８結合または活性のレベルは標準的な技術を用いて決定できる。
【００４２】
また、マトリックス上の蛋白質の固定化の他の技術は、本発明のスクリーニングアッセイに用いることができる。例えば、１０２１８蛋白質または１０２１８標的分子のいずれもビオチンおよびストレプトアビジンのコンジュゲーションを利用して固定化できる。ビオチン化１０２１８蛋白質または標的分子は、当該技術分野において知られた手法を用いてビオチン−ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミド）（例えば、ビオチン化キット、Pierce Chemicals, Rockford, IL）から調製でき、ストレプトアビジンコートした９６ウェルプレート（Pierce Chemical）のウェル中で固定化できる。別法として、１０２１８蛋白質または標的分子と反応性であるが、１０２１８蛋白質のその標的分子への結合に干渉しない抗体をプレートのウェルに誘導体化でき、未結合標的または１０２１８蛋白質を抗体コンジュゲーションによりそのウエル中に捕捉できる。かかる複合体を検出する方法は、ＧＳＴ−固定化複合体につき前記されたものに加えて、かかる複合体を検出する方法は、１０２１８蛋白質または標的分子と反応性の抗体を用いる複合体の免疫検出法、ならびに１０２１８蛋白質または標的分子と関連する酵素活性を検出することに依拠する酵素リンクアッセイ方法が含まれる。
【００４３】
もう一つの具体例において、１０２１８発現のモジュレーターは、細胞が候補化合物と接触し、細胞中の１０２１８ｍＲＮＡまたは蛋白質の発現を決定する。候補化合物の存在下の１０２１８ｍＲＮＡもしくは蛋白質の発現レベルは、候補化合物の不存在下の１０２１８ｍＲＮＡまたは蛋白質の発現レベルに比較される。次いで、候補化合物は、この比較に基づき１０２１８発現のモジュレーターと同定できる。例えば、１０２１８ｍＲＮＡもしくは蛋白質の発現がその不存在下より候補化合物の存在下で大きい（統計学的に有意に大きい）場合、その候補化合物は、１０２１８ｍＲＮＡもしくは蛋白質発現の促進剤と同定される。あるいは、１０２１８ｍＲＮＡまたは蛋白質の発現はその不存在下より候補化合物の存在下で小さい（統計学的に有意に小さい）場合、その候補化合物は、１０２１８ｍＲＮＡもしくは蛋白質発現の阻害剤と同定される。細胞中の１０２１８ｍＲＮＡまたは蛋白質発現のレベルは、１０２１８ｍＲＮＡまたは蛋白質を検出するための本明細書に記載の方法により決定できる。
【００４４】
本明細書のさらにもう一つの態様において、１０２１８蛋白質を２つのハイブリッドアッセイまたは３つのハイブリッドアッセイにおいて、「バイト蛋白質（bait protein）」として用いることができ（例えば、米国特許特許第５,２８３,３１７号；Zervosら （１９９３） Cell ７２：２２３-２３２；Maduraら （１９９３） J. Biol. Chem. ２６８：１２０４６-１２０５４；Bartelら （１９９３） Biotechniques １４：９２０-９２４；Iwabuchiら （１９９３） Oncogene ８：１６９３-１６９６；およびBrent W０９４／１０３００参照）、他の蛋白質を同定でき、それは１０２１８（「１０２１８結合蛋白質」または「１０２１８−ｂｐ」）に結合するかそれと干渉し、１０２１８活性に関与する。また、かかる１０２１８結合蛋白質は１０２１８蛋白質または１０２１８標的により、例えば、１０２１８媒介シグナリング経路の下流エレメントとしてのシグナルの伝播に関与するようである。あるいは、かかる１０２１８結合蛋白質は１０２１８阻害剤のようである。
【００４５】
その２つのハイブリッド系は、大部分の転写因子のモジュラー性質に基づき、それは分離できるＤＮＡ−結合および活性ドメインよりなる。略言すると、そのアッセイ方法は、２つの異なるＤＮＡ構築体を利用する。一つの構築体において、１０２１８蛋白質をコードする遺伝子は公知の転写因子（例えば、ＧＡＬ−４）のＤＮＡ結合ドメインをコードする遺伝子に融合する。他の構築体において、ＤＮＡ配列のライブラリーからの未同定蛋白質（「プレイ（prey）」または「試料」）をコードするＤＮＡ配列は、公知の転写因子の活性化ドメインをコードする遺伝子に融合される。その「バイト」および「プレイ」蛋白質がｉｎ ｖｉｖｏにて相互作用し、１０２１８依存性複合体を形成できるならば、そのＤＮＡ結合蛋白質および転写因子の活性化ドメインは密接な接近に至らせる。この接近は、転写因子に応答性の転写調節部位に作動可能に連結したレポーター遺伝子（例えば、Ｌａｃｚ）の転写を可能とする。そのレポーター遺伝子の発現を検出でき、機能的転写因子を含む細胞コロニーを単離し、それを用いて、１０２１８蛋白質と相互作用する蛋白質をコードするクローン化遺伝子を得ることができる。
【００４６】
もう一つの態様において、本発明は、本明細書に記載した２以上のアッセイ方法の組み合わせに関する。例えば、変調剤（modulating agent）は、細胞ベースまたは無細胞のアッセイ方法を用いて同定でき、１０２１８蛋白質の活性を変調するその剤の能力はｉｎ ｖｉｖｏ、例えば、本明細書に記載のごとき循環器疾患、例えば、アテローム性動脈硬化症についての動物モデルのごとき動物において確認できる。
【００４７】
本発明は、さらに、前記のスクリーニングアッセイ方法により同定された新規な剤に関する。従って、適当な動物モデルにおける本明細書に記載のごとき同定された剤をさらに用いることは本発明の範囲内にある。例えば、本明細書に記載のごとく同定された剤（例えば、１０２１８変調剤、アンチセンス１０２１８核酸分子、１０２１８特異的抗体または１０２１８結合パートナー）は、かかる剤での処置の効力、毒性もしくは副作用を決定する動物モデルにおいて用いることができる。あるいは、本明細書に記載のごとく同定された剤は、かかる剤の作用機序を決定する動物モデルにおいて用いることができる。さらに、本発明は、本明細書に記載のごとき処置についての前記のスクリーニングアッセイ方法により同定された新規な剤の使用に関する。
【００４８】
限定されるものではないが、前記のアッセイ系において同定されるもののような化合物を含めたいずれの化合物も循環器疾患症状を改善する能力につきテストすることができる。循環器疾患系を改善するかかる能力を示す化合物の同定のための細胞ベースおよび動物モデルベースのアッセイが本明細書に記載されている。
【００４９】
一つの態様において、本明細書に記載のごとき細胞ベースの系を用いて、循環器疾患症状を改善するように作用できる化合物を同定できる。例えば、かかる細胞系は、曝露さらら細胞中で循環器疾患症状のかかる改善を得るのに十分な濃度にて、および十分な時間循環器疾患症状を改善する能力を示す候補の化合物に曝露できる。曝露後、細胞を評価して、１以上の循環器疾患細胞表現型が、より通常またはより野生型の非−循環器疾患表現型と似るように変更されたかを決定する。循環器疾患状態と関係する細胞表現型には、異常な増殖および移動、脈管形成、細胞外マトリックス成分の沈着、細胞内脂質の蓄積ならびに成長因子、サイトカイニンおよび他の炎症伝達物質の発現が含まれる。
【００５０】
加えて、本明細書に記載されたもののような動物ベースの循環器疾患系を用いて、循環器疾患症状を改善できる化合物を同定できる。かかる動物モデルは、循環器疾患を治療するのに有効で有り得る薬物、医薬、治療および介在の同定用のテスト基質として用いることができる。例えば、動物モデルは、曝露された動物における循環器疾患症状のかかる改善を得るのに十分な濃度で、かつ十分な時間循環器疾患症状を改善する能力を示す候補の化合物に曝露できる。その曝露に対する動物の応答は、循環器疾患と関連する疾患の反転を評価することにより、例えば、処置前後にアテローム性動脈硬化プラーク数をカウントするおよび／またはそれらのサイズを測定することによりモニターできる。
【００５１】
その介在に関して、循環器疾患症状のいずれかの態様を反転するいずれの処置も、ヒト循環器疾患治療介在についての候補物と考えられるであろう。テスト剤の用量は、用量−応答曲線を導出することにより決定できる。
【００５２】
加えて、遺伝子発現パターンを利用して、循環器疾患症状を改善する化合物の能力を評価できる。例えば、１以上の遺伝子の発現パターンは、次いで、かかる評価に用いることができる「遺伝子発現プロフィール」または「転写プロフィール」の一部分を形成できる。本明細書に用いた「遺伝子発現プロフィール」または「転写プロフィール」には、所与のセットの条件下の所与の組織または細胞タイプについて得たｍＲＮＡ発現のパターンが含まれる。かかる条件は、本明細書に記載されたいずれの対照または実験条件、例えば、マクロファージのアテローム発生サイトカイン刺激を含めた、限定されるものではないが、アテローム性動脈硬化症、虚血／再灌流、高血圧症、再狭窄および動脈炎症が含まれる。遺伝子発現プロフィールは、例えば、差異表示方法、ノーザン分析および／またはＲＴ−ＰＣＲを利用することにより生成できる。一つの具体例において、１０２１８遺伝子配列は、かかる遺伝子発現プロフィールの生成および確証についてのプローブおよび／またはＰＣＲプライマーとして用いることができる。
【００５３】
遺伝子発現プロフィールは、細胞ベースおよび／または動物ベースのモデル系内の循環器疾患または通常のいずれかの公知の状態につき特徴付けできる。引き続いて、これらの公知の遺伝子発現プロフィールを比較して、テスト化合物がかかる遺伝子発現プロフィールを変調するにちがいないという効果を解明し、そのプロフィールがより望ましいプロフィールのものにより密接に類似するのを可能とする。
【００５４】
例えば、化合物の投与は、循環器疾患モデル系の遺伝子発現プロフィールがその対照系により密接に類似するであろう。あるいは、化合物の投与は、対照系の遺伝子発現プロフィールを循環器疾患状態を模倣しはじめるようにさせることができる。かかる化合物は、例えば、注目する化合物をさらに特徴付けするのに用いることができるか、またはさらなる動物モデルの作成に用いることができる。
【００５５】
ＩＩ.  細胞−および動物−ベースのモデル系
本明細書に記載されるのは、循環器疾患についてのモデルとして作用する細胞−および動物−ベースのモデル系である。これらの系は、様々な適用に用いることができる。例えば、細胞−および動物−ベースのモデル系を用いて、循環器疾患と関連する示差発現遺伝子、例えば、１０２１８をさらに特徴付けできる。加えて、細胞−および動物−ベースのモデル系は、後記の循環器疾患症状を改善できる化合物を同定するように設計されたスクリーニング戦略の一部分として用いることもできる。かくして、細胞−および動物−ベースのモデル系を用いて、循環器疾患を治療するのに有効であろう薬物、医薬、治療および介在を同定できる。さらに、かかる動物モデルを用いて、動物対象におけるＬＤ５０およびＥＤ５０を決定でき、かかるデータを用いて、潜在的な循環器疾患治療のｉｎ ｖｉｖｏ効力を決定できる。
【００５６】
Ａ．動物ベースの系
循環器疾患の動物ベースの系は、限定されるものではないが、非組換えおよび設計されたトランスジェニック動物を含むことができる。
【００５７】
循環器疾患についての非組換え動物モデルには、例えば、遺伝モデルを含むことができる。かかる遺伝子循環器疾患モデルには、例えば、ＡｐｏＢまたはＡｐｏＲ欠損ブタ（Rapaczら,１９８６,Science ２３４：１５７３−１５７７）、およびＷａｔａｎａｂｅ遺伝性高脂血症（ＷＨＨＬ）ウサギ（Kita, １９８７, Proc. Natl. Acad. Sci USA ８４：５９２８−５９３１）を含み得る。循環器疾患および脈管形成におけるトランスジェニックマウスモデルは、Carmeliet,P.およびCollen,D.（２０００） J. Pathol. １９０：３８７−４０５に概説されている。
【００５８】
アテローム性動脈硬化症の非組み換え非遺伝の動物モデルは、例えば、動物がＬＤＬの食事補充を介する化学的外傷、またはバルーンカテーテル血管形成を介する機械的外傷のいずれかに曝露されたブタ、ウサギまたはラットのモデルを含むことができる。また、循環器疾患の動物モデルには、（例えば、Schwarz, ERら （２０００） J. Am. Coll. Cardiol. ３５：１３２３-１３３０に記載されている）ラット心筋梗塞モデルおよび（例えば、Operschall, Cら （２０００） J. Appl. Physiol. ８８：１４３８-１４４５に記載されている）ウサギにおける慢性（chromic）心虚血モデルが含まれる。
【００５９】
加えて、循環器疾患症状を示す動物モデルは、例えば、当業者によく知られたトランスジェニック動物についての手法と組み合わせて前記の１０２１８遺伝子配列を用いて設計できる。例えば、１０２１８遺伝子配列は、注目する動物のゲノムに導入し、動物において過剰発現でき、内因性１０２１８遺伝子配列が存在するならば、それらは過剰発現できるか、あるいはマウスにおけるＡｐｏＥの破損につき記載されるごとく低発現または不活性な１０２１８遺伝子発現のために崩壊し得る（Plumpら, １９９２, Cell ７１： ３４３-３５３）。
【００６０】
また、本発明の宿主細胞を用いて、非ヒトトランスジェニック動物を生成できる。例えば、１つの具体例において、本発明の宿主細胞は、１０２１８コード配列を導入した受精卵の卵母細胞または胚性幹細胞である。次いで、かかる宿主細胞を用いて、外来性１０２１８配列をそれらのゲノムに導入した非ヒトトランスジェニック動物を創製できるか、または内因性１０２１８配列を変更した同族の組換え動物を創製できる。かかる動物は、１０２１８の機能および／または活性を研究するのに、および１０２１８活性のモジュレーターを同定および／または評価するのに有用である。本明細書に用いた「トランスジェニック動物」は、非ヒト動物、好ましくは、哺乳動物、より好ましくは、ラットまたはマウスのごとき齧歯類であり、ここに、その動物の１以上の細胞には導入遺伝子が含まれる。トランスジェニック動物の他の例には、非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ウシ、ヤギ、ニワトリ、両生動物等が含まれる。導入遺伝子は、トランスジェニック動物が発生する細胞のゲノムへ組み込まれ、成熟動物のゲノムに保持され、それによって、そのトランスジェニック動物の１以上の細胞タイプにおいてコードされた遺伝子産物の発現を指令する外来性ＤＮＡである。本明細書に用いた「同族の組換え動物」は、非ヒト動物、好ましくは、哺乳動物、より好ましくは、マウスであり、ここに、内因性１０２１８遺伝子は、動物の発生に先立ち、動物の細胞、例えば、動物の胚細胞へ導入された内因性遺伝子および外来性ＤＮＡ分子間の同族組換えにより変更される。
【００６１】
本発明方法に用いたトランスジェニック動物は、例えば、微量注入、レトロウイルス感染により受精卵卵母細胞の雄性前核へ１０２１８をコードする核酸を導入し、次いで、卵母細胞が偽妊娠雌性育成動物中で発生するのを可能とすることにより創製できる。配列番号：１または３の１０２１８ｃＤＮＡ配列は、非ヒト動物のゲノムに導入遺伝子として導入できる。あるいは、マウスまたはラット１０２１８遺伝子のごときヒト１０２１８遺伝子の非ヒトホモログは、導入遺伝子として用いることができる。あるいは、他の１０２１８ファミリーメンバーのごとき１０２１８遺伝子ホモログは、配列番号１または３の１０２１８ｃＤＮＡ配列へのハイブリダイゼーションに基づき単離し、導入遺伝子として用いることができる。また、イントロン配列およびポリアデニル化シグナルは、導入遺伝子に含むことができ、その導入遺伝子の発現の効率を増大できる。組織特異的な調節配列（群）は、１０２１８導入遺伝子に作動可能に連結させて、特定の細胞に１０２１８蛋白質の発現を指令できる。胚の操作および顕微鏡下注射を介するトランスジェニック動物、特に、マウスのごとき動物の作成方法は、当該技術分野において通常となってきており、例えば、Lederらによる米国特許第４,７３６,８６６号および第４,８７０,００９号、Wagnerらによる米国特許第４,８７３,１９１号ならびにHogan, B., Manipulating the Mouse Embryo, （Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., １９８６）に記載されている。同様の方法は、他のトランスジェニック動物の作製に用いられる。トランスジェニック創始動物は、そのゲノム中の１０２１８導入遺伝子の存在および／または動物の組織または細胞中の１０２１８ｍＲＮＡの発現に基づき同定できる。次いで、トランスジェニック創始動物を用いて、その導入遺伝子を運ぶさらなる動物を繁殖できる。さらに、１０２１８蛋白質をコードする導入遺伝子を運ぶトランスジェニック動物をさらに他の導入遺伝子を運ぶ他のトランスジェニック動物に交配させることができる。
【００６２】
同族組換え動物を創製するために、少なくとも部分的な１０２１８遺伝子を含有するベクターを調製し、その中への欠失、付加もしくは置換を導入して、それによりその１０２１８遺伝子を変化させる、例えば、機能的に混乱させる。１０２１８遺伝子は、ヒト遺伝子（例えば、配列番号：１または３のｃＤＮＡ）であり得、しかし、より好ましくは、ヒト１０２１８遺伝子（例えば、配列番号：１ま３のヌクレオチド配列でストリンジェントなハイブリダイゼーションにより単離されたｃＤＮＡ）のヒトホモログである。例えば、ラット１０２１８遺伝子を用いて、マウスゲノム中の内因性１０２１８遺伝子を変更するのに適当な相同性の組換え核酸分子、例えば、ベクターを構築できる。好ましい具体例において、相同性の組換え核酸分子を、相同性組換えに際して、内因性１０２１８遺伝子が機能的に崩壊するように設計されている（すなわち、もはや機能的蛋白質をコードせず；「ノックアウト」ベクターともいう）。あるいは、その相同性の組換え核酸分子は、相同性組換えに際して、内因性１０２１８遺伝子を突然変異させるかまたは変更するか、あるいは依然として機能性蛋白質をコードする（例えば、上流調節領域を変更でき、それにより、内因性１０２１８蛋白質の発現を変更できる）。相同性組換え核酸分子において、１０２１８遺伝子の変更された部分は、１０２１８遺伝子のさらなる核酸配列によりその５’および３’末端にて近接して、相同性組換えが、相同性組換え核酸分子および細胞、例えば、胚性幹細胞中の外来性１０２１８遺伝子間に生じるのを可能とする。さらに近接している１０２１８核酸配列は、内因性遺伝子で成功した相同性組換えに十分な長さのものである。典型的には、数キロベースの近接しているＤＮＡ（５’および３’末端の双方）は、相同性組換え核酸分子中に含めれる（例えば、相同性組換えベクターにつきThomas, K. R.およびCapecchi, M. R. （１９８７） Cell ５１：５０３参照）。相同性組み換え核酸分子は、（例えば、エレクトロポレーションにより）細胞、例えば、胚幹細胞系に導入され、次いで、導入された１０２１８遺伝子が内因性１０２１８遺伝子と相同的に組み換えられた細胞を選択する（例えば、Li, E.ら （１９９２） Cell ６９：９１５参照）。次いで、その選択された細胞を動物（例えば、マウス）の未分化胚芽細胞に注入して、凝集キメラを形成できる（例えば、Bradley, A. in Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells： A Practical Approach, E. J. Robertson編（IRL, Oxford, １９８７） pp. １１３-１５２参照）。次いで、キメラ胚は適当な偽妊娠雌性育成動物に埋め込み、その胚を出産にもってくる。それらの生殖細胞中の相同性に組換えたＤＮＡを宿している子孫を用いて、動物の全細胞が、導入遺伝子の生殖系列の伝達により相同的に組換えられたＤＮＡを含む動物を繁殖できる。相同性の組換え核酸分子、例えば、ベクターを構築する方法、または相同性組換え動物はさらにBradley, A. （１９９１） Current Opinion in Biotechnology ２：８２３-８２９およびLe MouellecらによるＰＣＴ国際公開番号：ＷＯ９０／１１３５４；SmithiesらによるＷＯ９１／０１１４０；ZijlstraらによるＷＯ９２／０９６８；およびBernsらによるＷＯ９３／０４１６９に記載されている。
【００６３】
もう一つの具体例において、本発明方法に用いるトランスジェニック非ヒト動物が作製でき、それはその導入遺伝子の発現の調節を可能とする選択された系を含む。かかる系の一例は、バクテリオファージＰＩのｃｒｅ／ｌｏｘＰレコンビナーゼ系である。ｃｒｅ／ｌｏｘＰレコンビナーゼ系の記載につき、例えば、Laksoら （１９９２） Proc. Natl. Acad. Sci. USA ８９：６２３２-６２３６を参照されたし。レコンビナーゼ系のもう一つの例は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＦＬＰレコンビナーゼ系である（O'Gormanら （１９９１） Science ２５１：１３５１-１３５５。ｃｒｅ／ｌｏｘＰレコンビナーゼ系を導入遺伝子の発現を調節するのに用いるならば、Ｃｒｅレンコンビナーゼおよび選択された蛋白質の双方をコードする導入遺伝子を含む動物が必要である。かかる動物は、例えば、一方が選択された蛋白質をコードする導入遺伝子を含み、他方がレコンビナーゼをコードする導入遺伝子を含む２匹のトランスジェニック動物を交尾させることにより「２重の」トランスジェニック動物の構築を通して供することができる。
【００６４】
また、本明細書に記載された非ヒトトランスジェニック動物のクローンは、Wilmut, Iら（１９９７） Nature ３８５：８１０−８１３およびＰＣＴ国際公開番号ＷＯ  ９７／０７６６８およびＷＯ  ９７／０７６６９に記載された方法に従い作製できる。要約すると、トランスジェニック動物からの細胞、例えば、体細胞を単離および導入して、成長サイクルを出て、Ｇ０相に入ることができる。次いで、静止細胞を、例えば、電気パルスの使用を通じて、静止細胞が単離された同一種の動物からの核を取り除いた卵母細胞に融合できる。次いで、その再構築された卵母細胞は、それが桑実胚または未分化胚芽細胞に発生し、次いで、偽妊娠雌性育成動物に移行するように培養される。子孫媒介（borne）のこの雌性育成動物は、細胞、例えば、体細胞が単離された動物のクローンであろう。
【００６５】
容易に検出可能なレベルにて（１０２１８エピトープに対して指向された抗体を用いて免疫細胞化学的に検出した）１０２１８ｍＲＮＡまたは１０２１８蛋白質を発現する１０２１８トランスジェニック動物をさらに評価して、特徴的な循環器疾患上場を示すそれらの動物を同定するであろう。かかる循環器疾患症状には、例えば、脂肪条痕および／または循環器疾患プラークの流行およびサイズの増加が含まれる。
【００６６】
加えて、トランスジェニック動物内の特定の細胞タイプ（例えば、内皮細胞）は、循環器疾患の細胞表現特性につき分析およびアッセイできる。内皮細胞の場合において、かかる表現型には、限定されるものではないが、細胞増殖、移動、脈管形成、プロ炎症成長因子およびサイトカインの産生、および炎症細胞への付着が含まれる。単球の場合には、かかる表現型には、限定されるものではないが、ＬＤＬ取り込み、内皮細胞への付着、移動、泡沫細胞形成、脂肪線条形成および泡沫細胞特異的産物の産生の速度における増加を含み得る。細胞表現型は、循環器疾患症状を示す動物における特定の細胞タイプの公知の発現プロフィールに比較した循環器疾患に関連する遺伝子発現の特定の細胞タイプのパターンを含み得る。
【００６７】
Ｂ．細胞ベースの系
１０２１８蛋白質をコードする１０２１８遺伝子配列を含み発現し、さらに、循環器疾患と関連する細胞表現型を示す細胞を用いて、抗循環器疾患活性を呈する化合物を同定できる。かかる細胞は、Ｕ９３７（ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ−１５９３）、ＴＨＰ−１（ＡＴＣＣ＃ＴＩＢ−２０２）およびＰ３８８Ｄ１（ＡＴＣＣ＃ＴＩＢ−６３）のごとき非組換え単球系；ヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）、ヒト微小血管内皮細胞（ＨＭＶＥＣ）およびウシ大動脈内皮細胞（ＢＡＥＣ）のごとき内皮細胞；ならびにＨｅＬａ細胞およびＣＯＳ細胞、例えば、ＣＯＳ−７（ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ−１６５１）のごとき一般的な哺乳動物細胞系を含み得る。さらに、かかる細胞は、組換えトランスジェニック細胞系を含み得る。例えば、前記の本発明の循環器疾患動物モデルを用いて、循環器疾患に関与する１以上の細胞タイプを含む細胞系を生成でき、それをこの障害の細胞培養モデルとして用いることができる。本発明の循環器疾患トランスジェニック動物から誘導された一次培養物は利用できるが、連続細胞系の生成が好ましい。トランスジェニック動物からの連続細胞系を誘導するために用いることができる手法の例につき、Smallら, （１９８５） Mol. Cell Biol. ５：６４２-６４８を参照されたし。
【００６８】
あるいは、循環器疾患に関与することが知られている細胞タイプの細胞は、細胞内の１０２１８遺伝子発現の量を増加または減少できる配列でトランスフェクトできる。例えば、１０２１８遺伝子配列は、注目する細胞のゲノムに導入し、その細胞において過剰発現でき、内因性１０２１８遺伝子配列が存在するならば、それらは過剰発現できるか、あるいは低発現または不活性な１０２１８遺伝子発現のために崩壊し得る。
【００６９】
１０２１８遺伝子を過剰発現するために、１０２１８のコード部分を注目する細胞タイプ、例えば、内皮細胞中の遺伝子発現を駆動できる通常の配列に連結できる。かかる調節領域は当業者によく知られ、過度の実験の不存在下で利用できる。標的遺伝子を発現する組換え方法は前記されている。
【００７０】
内因性１０２１８遺伝子配列の低発現については、注目する細胞タイプのゲノムに再導入する場合にその内因性１０２１８対立遺伝子は不活性化されるであろうようにかかる配列を単離および設計されるであろう。好ましくは、その設計された１０２１８配列を、内因性１０２１８配列が細胞ゲノムへの設計された１０２１８配列の組込みに際して崩壊するように遺伝子ターゲティングを介して導入される。１０２１８遺伝子での宿主細胞のトランスフェクションは前記に言及されている。
【００７１】
化合物で処理するか、または１０２１８遺伝子でトランスフェクトした細胞を循環器疾患に関連する表現型につき評価できる。単球の場合、かかる表現型は、限定されるものではないが、ＬＤＬ取り込み、内皮細胞への付着、移動、泡沫細胞形成、脂肪線条形成およびｂＦＧＦ、ＩＧＦ−Ｉ、ＶＥＧＦ、ＩＬ−１、Ｍ−ＣＳＦ、ＴＧＦβ、ＴＧＦα、ＴＮＦα、ＨＢ−ＥＧＦ、ＰＤＧＦ、ＩＦＮ−γおよびＧＭ−ＣＳＦのごとき成長因子の泡沫細胞による産生の速度における増加を含む。移動速度（transmigration rate）は、例えば、内皮細胞を横切り、内皮下空間のコラーゲン層に移動する単球数を定量することにより、Navabら（１９８８）J. Clin. Invest. ８２：１８５３−１８６３のｉｎ ｖｉｔｒｏ系を用いることにより測定できる。
【００７２】
同様に、内皮細胞は、テスト化合物で処理できるか、または一般的に設計された１０２１８遺伝子でトランスフェクトできる。次いで、その内皮細胞は、限定されるものではないが、細胞形態学、細胞増殖、細胞移動、および単核細胞吸着における変化を含めた循環器疾患と関連する表現型；または付着分子（例えば、ＩＣＡＭ、ＶＣＡＭ、Ｅ−セレクチン）、成長因子およびサイトカイニン（例えば、ＰＤＧＦ、ＩＬ−１β、ＴＮＦα、ＭＣＦ）および脈管形成に関与する蛋白質（例えば、ＦＬＫ、ＦＬＴ）のごとき循環器疾患に関与する他の蛋白質の産生に対する効果につき評価できる。
【００７３】
１０２１８核酸のトランスフェクションは、標準的な手法（例えば、Ausubel（１９８９）前記に記載）を用いて達成できる。トランスフェクトされた細胞は、組換え１０２１８遺伝子配列の存在、１０２１８ｍＲＮＡの発現および蓄積、および組換え１０２１８蛋白質産生の存在につき評価されるであろう。１０２１８遺伝子発現における減少が所望である場合には、標準的な手法を用いて、内因性１０２１８遺伝子発現および／または１０２１８蛋白質産生における減少が達成されたことを示すことができる。
【００７４】
循環器疾患および脈管形成の研究における細胞モデルには、Ｍａｔｒｉｇｅｌに対する内皮細胞分化のモデル（Baatout, S.ら （１９９６） Rom. J. Intern. Med. ３４：２６３-２６９；Benelli, Rら （１９９９） Int. J. Biol. Markers １４：２４３-２４６）、脈管形態形成の胚幹細胞モデル（Doetschman, T.ら （１９９３） Hypertension ２２：６１８-６２９）、生理学的ゲル中の微小血管断片の培養（Hoying, JBら （１９９６） In Vitro Cell Dev. Biol. Anim. ３２： ４０９-４１９；米国特許第５,９７６,７８２号）、ならびに成長因子およびサイトカイン（例えば、ＩＬ−１β、ＰＤＧＦ、ＴＮＦα、ＶＥＧＦ）、ホモシステインおよびＬＤＬを含めたアテローム発生および脈管形成での内皮細胞および平滑筋細胞の処理を含む。ｉｎ ｖｉｔｒｏ脈管形成モデルは、例えば、Black, AFら （１９９９） Cell Biol. Toxicol. １５：８１-９０に記載されている。
【００７５】
ＩＩＩ．予測医薬：
また、本発明は、診断アッセイ方法、予後アッセイ方法、および臨床試験のモニタリングを予後（予測）目的で用いて、それにより個人を予防的に処理する予測医薬の分野に関する。従って、本発明の一つの態様は、生物学的試料（例えば、血液、血清、細胞、例えば、内皮細胞または組織、例えば、脈管組織）との関連において、１０２１８蛋白質および／または核酸発現ならびに１０２１８活性を決定し、それにより個人が循環器疾患に苦しむかを決定する診断アッセイ方法に関する。また、本発明は、個人が循環器疾患を発生するリスクを持つかを決定するための予後（予測）アッセイ方法のために提供される。例えば、１０２１８遺伝子中の突然変異は生物学的試料においてアッセイできる。かかるアッセイ方法は、予後または予測目的に用いて、それにより、循環器疾患、例えば、アテローム性動脈硬化症に先立ち個人を予防的に処置できる。
【００７６】
本発明のもう一つの態様は、臨床試験における１０２１８の発現または活性に対する１０２１８モジュレーター（例えば、抗１０２１８抗体または１０２１８リボザイム）の影響のモニタリングに関する。
【００７７】
これらおよび他の剤は、以下のセクションにさらに詳細に記載されている。
【００７８】
Ａ．循環器疾患についての診断アッセイ方法
対象が循環器疾患で苦しむかを決定するために、生物学的試料を対象から得、次いで、生物学的試料を生物学的試料における１０２１８蛋白質、または１０２１８蛋白質をコードする核酸（例えば、ｍＲＮＡもしくはゲノムＤＮＡ）を検出できる化合物または剤と接触できる。１０２１８ｍＲＮＡもしくはゲノムＤＮＡを検出するための好ましい剤は、１０２１８ｍＲＮＡもしくはゲノムＤＮＡにハイブリダイズできる標識された核酸プローブである。その核酸プローブは、蛋白質、配列番号：１に記載された１０２１８核酸、または長さが少なくとも１５、２０、２５、３０、２５、４０、４５、５０、１００、２５０または５００ヌクレオチドで、かつ１０２１８ｍＲＮＡもしくはゲノムＤＮＡにストリンジェントな条件下で特にハイブリダイズするのに十分なオリゴヌクレオチドのごときその一部分で有り得る。本発明の診断アッセイ方法における使用に適当な他のプローブは本明細書に記載されている。
【００７９】
試料中の１０２１８蛋白質を検出するための好ましい剤は、１０２１８蛋白質に結合できる抗体、好ましくは、検出可能な標識を持つ抗体である。抗体は、ポリクローナル、またはより好ましくは、モノクローナルで有り得る。無傷の抗体、またはその断片（例えば、ＦａｂもしくはＦ（ａｂ’）２）を用いることができる。プローブもしくは抗体に関する「標識された」なる用語は、検出可能な物質をそのプローブもしくは抗体にカップリングすることによるそのプローブもしくは抗体の直接的な標識、ならびに直接的に標識されたもう一つの試薬との反応性によるそのプローブもしくは抗体の間接的な標識を含むことを意図する。間接的標識の例は、ビオチンでの蛍光的に標識した２次抗体およびＤＮＡプローブの末端標識を用いて１次抗体の検出を含む。
【００８０】
「生物学的試料」なる用語は、対象から単離された組織、細胞および生物学的流体ならびに対象内に存在する組織、細胞および流体を含むことを意図する。すなわち、本発明の検出方法を用いて、ｉｎ ｖｉｔｒｏならびにｉｎ ｖｉｖｏにて生物学的試料中の１０２１８ｍＲＮＡ、蛋白質、ゲノムＤＮＡを検出できる。例えば、１０２１８ｍＲＮＡの検出のためのｉｎ ｖｉｔｒｏ手法は、ノーザンハイブリダイゼーションおよびインサイツハイブリダイゼーションを含む。１０２１８蛋白質の検出のためのｉｎ ｖｉｔｒｏ手法は、酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、ウェスタンブロット、免疫沈殿法および免疫蛍光法を含む。１０２１８ゲノムＤＮＡの検出用のｉｎ ｖｉｔｒｏ手法は、サザンブロットハイブリダイゼーションを含む。さらに、１０２１８ゲノムＤＮＡの検出用のｉｎ ｖｉｖｏ手法は、対象への標識した抗１０２１８抗体の導入を含む。例えば、抗体は、対象における存在および位置が標準的な画像手法により検出できる放射性マーカーで標識できる。
【００８１】
もう一つの具体例において、本方法は、対照の対象からの対照生物学的試料を得、生物学的試料中の１０２１８蛋白質、ｍＲＮＡもしくはゲノムＤＮＡを検出するように対照試料と１０２１８蛋白質、ｍＲＮＡもしくはゲノムＤＮＡを検出できる化合物または剤とを接触させ、次いで、対照試料中の１０２１８蛋白質、ｍＲＮＡもしくはゲノムＤＮＡの存在と、テスト試料中の１０２１８蛋白質、ｍＲＮＡもしくはゲノムＤＮＡの存在とを比較することを含む。
【００８２】
Ｂ．循環器疾患についての予後アッセイ方法
本発明は、異常な１０２１８核酸発現または活性と関連する循環器疾患を有する、またはその発生のリスクを持つ対象の同定方法に関する。
【００８３】
本明細書に用いた「異常な」は、野生型１０２１８発現または活性から逸脱する１０２１８発現または活性を含む。異常な発現または活性には、発現または活性の増大もしくは低下、ならびに発現の野生型発生パターンまたは発現の細胞下パターンに従わない発現または活性を含む。例えば、異常な１０２１８発現または活性は、１０２１８遺伝子における突然変異が、１０２１８遺伝子を低発現または過剰発現させる場合、およびかかる突然変異の結果、非機能性１０２１８蛋白質または野生型様式で機能しない蛋白質、例えば、１０２１８基質と相互作用しない蛋白質、または非１０２１８基質と相互作用するものを生じる状態を含む。
【００８４】
前記の診断アッセイ方法または以下のアッセイ方法のごとき本明細書に記載されたアッセイ方法を用いて、例えば、限定されるものではないが、アテローム性動脈硬化症、虚血／再灌流傷害、高血圧症、再狭窄、動脈炎症および内皮細胞障害を含めた循環器疾患を有するか、またはそれを発生するリスクを持つ対象を同定できる。生物学的試料を対象から得、遺伝子変化の存在または不存在につきテストできる。例えば、かかる遺伝子変化は、少なくとも１つの１）１０２１８遺伝子からの１以上のヌクレオチドの欠失、２）１０２１８遺伝子からの１以上のヌクレオチドの付加、３）１０２１８遺伝子の１以上の置換、４）１０２１８遺伝子の染色体再構成、５）１０２１８遺伝子のメッセンジャーＲＮＡのレベルにおける変化、６）ゲノムＤＮＡのメチル化のごとき１０２１８遺伝子の異常修飾、７）１０２１８遺伝子のメッセンジャーＲＮＡ転写の非野生型スプライシングパターンの存在、８）１０２１８−蛋白質の非野生型レベル、９）１０２１８遺伝子の対立遺伝子の損失、および１０）１０２１８遺伝子の不適当な翻訳後修飾の存在を確認することにより検出できる。
【００８５】
本明細書に記載のごとく、１０２１８遺伝子における遺伝子変化を検出するために用いることができる多数の当該技術分野に知られたアッセイ方法が存在する。例えば、１０２１８遺伝子中の遺伝子変化は、ａｎｃｈｏｒ ＰＣＲまたはＲＡＣＥ ＰＣＲのごときポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）（例えば、米国特許第４,６８３,１９５号および第４,６８３,２０２号参照）における、あるいは、連結鎖（ligation chain）反応（ＬＣＲ）（例えば、Landegranら （１９８８） Science ２４１：１０７７-１０８０；およびNakazawaら （１９９４） Proc. Natl. Acad. Sci. USA ９１：３６０-３６４参照）におけるプローブ／プライマーを用いて検出でき、その後者は、１０２１８遺伝子における点突然変異を検出するのに特に有用で有り得る（Abravayaら （１９９５） Nucleic Acids Res. ２３：６７５-６８２参照）。本方法は、対象から生物学的試料を採取し、該試料から核酸（例えば、ゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡまたは両者）を単離し、（存在するならば）１０２１８遺伝子のハイブリダイゼーションおよび増幅を生じるような条件下にて、その核酸試料と１０２１８遺伝子に特にハイブリダイズする１以上のプライマーとを接触させ、次いで、増幅産物の存在または不存在を検出するか、または増幅産物のサイズを検出すし、次いで、その長さを対照試料に比較することを含む。ＰＣＲおよび／またはＬＣＲは本明細書に記載された突然変異を検出するのに用いたいずれの手法と組み合わせても予備的増幅工程として用いることが望ましいであろうと予測される。
【００８６】
別法の増幅方法には：自己持続配列複製（self sustained sequence replication）（Guatelli, J. C.ら （１９９０） Proc. Natl. Acad. Sci. USA ８７：１８７４-１８７８）、転写増幅系（Kwoh, D. Y.ら （１９８９） Proc. Natl. Acad. Sci. USA ８６：１１７３-１１７７）、Ｑ−ベータレプリカーゼ（Lizardi, P. M.ら （１９８８） Bio-Technology ６：１１９７）、またはいずれかの他の核酸増幅方法に続いての当業者によく知られた手法を用いて増幅された分子の検出が含まれる。これらの検出スキームはかかる分子が非常に少数で存在するならば核酸分子の検出につき特に有用である。
【００８７】
別法の具体例において、生物学的試料からの１０２１８遺伝子中の突然変異は、制限酵素切断パターンにおける変化により同定できる。例えば、試料および対照ＤＮＡを単離し、増幅し、１以上の制限エンドヌクレアーゼで消化し、次いで、断片長サイズをゲル電気泳動法により決定し、次いで、比較する。試料および対照ＤＮＡ間の断片長サイズの差は、試料ＤＮＡ中の突然変異を示す。さらに、配列特異的なリボザイムの使用を用いて、リボザイム切断部位の発生または喪失による特異的な突然変異の存在につき記録できる。
【００８８】
他の具体例において、１０２１８中の遺伝子突然変異は、誘導された生物学的試料および対照核酸、例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡを数百または数千のオリゴヌクレオチドプローブを含有する高密度アレイにハイブリダイズすることにより同定できる（Cronin, M. T.ら （１９９６） Human Mutation ７：２４４-２５５；Kozal, M. J.ら （１９９６） Nature Medicine ２：７５３-７５９）。例えば、１０２１８中の遺伝子突然変異は、Cronin, M. T.ら （１９９６） 前記に記載された光生成ＤＮＡプローブを含む２次元アレイで同定できる。略言すると、プローブの第１のハイブリダイゼーションアッセイを用いて、試料および対照中のＤＮＡの長いストレッチを通して走査して、配列が重なり合っているプローブの直線アレイを作成することによりその配列間のベース変化を同定できる。この工程は、点突然変異の同定を可能とする。この工程に続いて、検出された全ての変異体または突然変異に相補的な小さな特殊化されたプローブアレイを用いて特定の突然変異の特長付けを可能とする第２のハイブリダイゼーションアレイある。各々の突然変異アレイは、パラレルなプローブセット、野生型遺伝子に相補的なものおよびその突然変異体遺伝子に相補的な他のものよりなる。
【００８９】
さらにもう一つの具体例において、当該技術分野において知られた様々なシーケンシング反応のいずれを用いても、生物学的試料中の１０２１８遺伝子を直接的に配列決定でき、生物学的試料中の１０２１８の配列を対応する野生型（対照）配列と比較することにより突然変異を検出できる。シーケンシング反応の例には、MaxamおよびGilbert （１９７７） Proc. Natl. Acad. Sci. USA ７４：５６０）またはSanger （１９７７） Proc. Natl. Acad. Sci. USA ７４：５４６３により開発された手法に基づくものが含まれる。また、質量分析による配列決定（例えば、ＰＣＴ国際公開番号ＷＯ９４／１６１０１；Cohenら （１９９６） Adv. Chromatogr. ３６：１２７-１６２；およびGriffinら （１９９３） Appl. Biochem. Biotechnol. ３８：１４７-１５９参照）を含めた、診断アッセイ方法（Naeve, C. W. （１９９５） Biotechniques １９：４４８-５３）を行う場合に様々な自動シーケンシング手順のいずれも利用できると考えられる。
【００９０】
１０２１８遺伝子中の突然変異を検出する他の方法には、切断剤（cleavage agent）からの保護を用いて、ＲＮＡ／ＲＮＡまたはＲＮＡ／ＤＮＡヘテロ二本鎖中のミスマッチ塩基を検出する方法（Myersら （１９８５） Science ２３０：１２４２）を含む。一般的には、「ミスマッチ切断」の技術は、野生型１０２１８配列を含む（標識された）ＲＮＡまたはＤＮＡと組織試料から得られた潜在的な突然変異体ＲＮＡまたはＤＮＡとをハイブリダイズすることにより形成されたヘテロ二本鎖により開始される。二本鎖は、対照および試料の鎖間の塩基対ミスマッチのために存在するであろう二本鎖の一本鎖領域を切断する剤で処理する。例えば、ＲＮＡ／ＤＮＡ二本鎖は、ＲＮアーゼで処理して、ＤＮＡ／ＤＮＡハイブリッドはＳ１ヌクレアーゼで処理してミスマッチ領域を酵素的に消化できる。他の具体例において、ＤＮＡ／ＤＮＡまたはＲＮＡ／ＤＮＡ二本鎖のいずれもミスマッチ領域を消化するためにヒドロキシルアミンもしくは四酸化オスミウムで、またはピペリジンで処理できる。次いで、そのミスマッチ領域の消化後、得られた物質を変性ポリアクリルアミドゲル上でサイズにより分離して、突然変異の部位を決定する。例えば、Cottonら （１９８８） Proc. Natl Acad Sci USA ８５：４３９７およびSaleebaら （１９９２） Methods Enzymol. ２１７：２８６-２９５を参照されたし。好ましい具体例において、対照ＤＮＡまたはＲＮＡを検出のために標識できる。
【００９１】
さらにもう一つの具体例において、ミスマッチ切断反応は、細胞試料から得た１０２１８ｃＤＮＡ中の点突然変異を検出およびマッピングするための規定システムにおける二本鎖ＤＮＡ中のミスマッチ塩基対を認識する（いわゆる「ＤＮＡミスマッチ対」酵素）１以上の蛋白質を使用する。例えば、Ｅ．ｃｏｌｉのｍｕｔＹ酵素はＧ／ＡミスマッチにてＡを切断し、ＨｅＬａ細胞からのチミジンＤＮＡグリコシラーゼは、Ｇ／ＴミスマッチにてＴを切断する（Hsuら （１９９４） Carcinogenesis １５：１６５７-１６６２）。例示的な具体例により、１０２１８配列、例えば、野生型１０２１８配列に基づくプローブは、テスト細胞からのｃＤＮＡまたは他のＤＮＡ産物にハイブリダイズする。二本鎖をＤＮＡミスマッチ修復酵素で処理し、もし存在するならば、切断産物を電気泳動プロトコール等から検出できる。例えば、米国特許第５,４５９,０３９号を参照されたし。
【００９２】
他の具体例において、電気泳動移動度の変化を用いて、１０２１８遺伝子における変化を同定するであろう。例えば、一本鎖立体配座多形（ＳＳＣＰ）を用いて、突然変異体および野生型の核酸間の電気泳動移動度の差を検出できる（Oritaら （１９８９） Proc Natl. Acad. Sci USA： ８６：２７６６；また、Cotton （１９９３） Mutat. Res. ２８５：１２５-１４４およびHayashi （１９９２） Genet. Anal. Tech. Appl. ９：７３-７９参照）。試料および対照１０２１８核酸の一本鎖ＤＮＡ断片を変性し、復元させるであろう。一本鎖核酸の２次構造は、配列により変化し、電気泳動移動度における得られた変化は、単一塩基変化でさえ検出できる。このアッセイ方法の感度は、（ＤＮＡよりむしろ）ＲＮＡを用いて増大でき、ここに、２次構造は、配列の変化により敏感である。好ましい具体例において、その主題方法を利用して、電気泳動移動度における変化に基づく二本鎖へテロ二本鎖分子を分離する（Keenら （１９９１） Trends Genet ７：５）。
【００９３】
さらにもう一つの具体例において、変性剤の勾配を含むポリアクリルアミドゲル中の突然変異または野生型断片の移動は、変性勾配ゲル電気泳動法（ＤＧＧＥ）（Myersら （１９８５） Nature ３１３：４９５）を用いることによりアッセイされる。ＤＧＧＥを分析方法として用いる場合、ＤＮＡを修飾して、例えば、ＰＣＲによる約４０ｂｐの高融解ＧＣ豊富なＤＮＡのＧＣクランプを添加することにより完全に変性しないことを確かめる。さらなる具体例において、温度勾配を変性勾配に代えて用いて、対照および試料のＤＮＡの移動度における差を同定する（RosenbaumおよびReissner （１９８７） Biophys Chem ２６５：１２７５３）。
【００９４】
点突然変異を検出する他の手法の例には、限定されるものではないが、選択的オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション、選択的増幅または選択的プライマー伸長が含まれる。例えば、オリゴヌクレオチドプライマーは、公知の突然変異が中心に位置され、次いで、完全なマッチが見出される場合にのみハイブリダイゼーションを可能とする条件下で標的ＤＮＡにハイブリダイズできる（Saikiら （１９８６） Nature ３２４：１６３）；Saikiら （１９８９） Proc. Natl Acad. Sci USA ８６：６２３０）。かかる対立遺伝子特異的なオリゴヌクレオチドを、ＰＣＲ増幅した標的ＤＮＡ、またはそのオリゴヌクレオチドがハイブリダイズしている膜に付着し、標識された標的ＤＮＡとハイブリダイズする場合の多数の異なる突然変異にハイブリダイズする。
【００９５】
あるいは、選択的ＰＣＲ増幅に依存する対立遺伝子特異的な増幅技術を本発明と組み合わせて用いることができる。特異的増幅用のプライマーとして用いたオリゴヌクレオチドは、その分子の中央において（その結果、増幅が異なるハイブリダイゼーションに依存する）（Gibbsら （１９８９） Nucleic Acids Res. １７：２４３７-２４４８）、あるいは適当な条件下で、ミスマッチがポリメラーゼ伸長を防止または減少できる一つのプライマーの極度な３’端にて注目する突然変異を運ぶ（Prossner （１９９３） Tibtech １１：２３８）。加えて、突然変異の領域に新規な制限部位を導入して、切断ペースの検出を創製することが望ましい（Gaspariniら （１９９２） Mol. Cell Probes ６：１）。ある種の具体例において、増幅は増幅用のＴａｑリガーゼを用いて行うこともできると予測される（Barany （１９９１） Proc. Natl. Acad. Sci USA ８８：１８９）。このような場合には、核酸連結は、５’配列の３’端にて完全なマッチが存在する場合のみ生じ、それは、増幅の存在または不存在を探索することにより特定の部位にて公知の突然変異の存在を検出するのを可能とする。
【００９６】
さらに、本明細書に記載された予後アッセイ方法を用いて、対象に１０２１８モジュレーター（例えば、アゴニスト、アンタゴニスト、ペプチドミメティック、蛋白質、ペプチド、核酸または小分子）を投与できるかを決定して、循環器疾患、例えば、アテローム性動脈硬化症を効果的に治療できる。
【００９７】
Ｃ．臨床試験中の効果のモニタリング
本発明は、対象における循環器疾患、例えば、アテローム性動脈硬化症の治療における１０２１８モジュレーター（例えば、本明細書に記載された１０２１８モジュレーター）の有効性を決定する方法を提供する。例えば、１０２１８遺伝子発現、蛋白質レベルの増加、または１０２１８の上昇調節における１０２１８モジュレーターの有効性は、１０２１８遺伝子発現、蛋白質レベルまたは１０２１８活性の低下を示している対象の臨床試験においてモニターできる。あるいは、１０２１８遺伝子発現、蛋白質レベルの低下、または１０２１８の下降調節における１０２１８モジュレーターの有効性は、１０２１８遺伝子発現、蛋白質レベルまたは１０２１８活性の増加を示している対象の臨床試験においてモニターできる。かかる臨床試験において、１０２１８遺伝子、および好ましくは、例えば、アテローム性動脈硬化症に関連する他の遺伝子の発現または活性は、特定の細胞、例えば、血管内皮細胞の表現型の「読出し（read out）」またはマーカーとして用いることができる。
【００９８】
例えば、および限定されるものではないが、（例えば、本明細書に記載されたスクリーニングアッセイにおいて同定された）１０２１８活性を変調する剤での処置により細胞中で変調される１０２１８を含めた遺伝子が同定される。かくして、例えば、臨床試験において循環器疾患に罹っている対象に対する１０２１８活性を変調する剤の効果を試験するために、細胞を単離し、ＲＮＡを調整し、１０２１８および循環器疾患に関連する他の遺伝子の発現レベルを分析できる。遺伝子発現（例えば、遺伝子発現パターン）のレベルは、本明細書に記載のごときノーザンブロットまたはＲＴ−ＰＣＲにより、あるいは別法として、産生された蛋白質の量を測定することにより、本明細書に記載された方法の一つにより、あるいは１０２１８または他の遺伝子の活性レベルを測定することにより定量できる。このようして、遺伝子発現パターンは、１０２１８活性を変調する剤に対する細胞の生理学的応答を示すマーカーとして機能できる。この応答状態は、１０２１８活性を変調する剤での個体の処置前、および処置中の種々のポイントにて測定できる。
【００９９】
好ましい具体例において、本発明は、１０２１８活性を変調する剤で対象の治療の有効性をモニターする方法を提供し、それは、（ｉ）剤の投与に先立ち、対象から投与前試料を得；（ｉｉ）該投与前試料中の１０２１８蛋白質、ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡの発現レベルを検出し；（ｉｉｉ）対象からの１以上の投与後試料群を得；（ｉｖ）該投与後試料中の１０２１８蛋白質、ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡの発現または活性のレベルを検出し；（ｖ）投与前試料中の１０２１８蛋白質、ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡの発現または活性のレベルと、投与後試料（群）中の１０２１８蛋白質、ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡとを比較し；次いで、（ｖｉ）結果的に、対象に対する該剤の投与を変更することを含む。例えば、剤の投与の増加は、１０２１８の発現または活性を検出されたより高レベルまで増加させる、すなわち、剤の有効性を増加させることが望ましい。あるいは、剤の投与の減少は、１０２１８の発現または活性を検出されたより低レベルまで減少させる、すなわち、剤の有効性を減少させることが望ましい。かかる具体例において、１０２１８発現または活性は、観察できる表現型応答の不存在下でさえ、剤の有効性の指標として用いることができる。
【０１００】
ＩＶ．循環器疾患に罹っている対象の治療方法：
本発明は、アテローム性動脈硬化症、虚血／再灌流傷、高血圧症、再狭窄、動脈炎症、また内皮細胞障害のごとき循環器疾患のリスクを持つ（または感受性の）対象、例えば、ヒトを治療するための予防および治療方法の双方を提供する。治療の予防および治療方法の双方に関して、かかる治療は、ファーマコゲノミックスの分野から得られた知識に基づき特に調整または変調できる。本明細書に用いた「ファーマコゲノミックス」とは、臨床開発中および市場における薬物に対する遺伝子配列決定、統計遺伝学および遺伝子発現分析のごときゲノミクス技術の適用をいう。より詳細には、その用語は、患者の遺伝子が薬物に対する彼または彼女の応答（例えば、患者の「薬物応答表現型」または「薬物応答遺伝子型」）を決定する方法の試験をいう。
【０１０１】
かくして、本発明のもう一つの態様は、個体の薬物応答遺伝子型により本発明の１０２１８分子または１０２１８モジュレーターのいずれかでの対象の予防または治療上の処理を調整する方法を提供する。ファーマコゲノミックスは、臨床医または内科医が治療から最も利益を受けるであろう患者に対する予防または治療上の処置を標的とし、中毒薬物に関連する副作用を受けるであろう患者の処置を回避するのを可能とする。
【０１０２】
Ａ．予防方法
１つの態様において、本発明は、１０２１８発現または１０２１８活性、例えば、カルシウム流入、細胞移動の変調、またはアテローム性動脈硬化病変の形成を変調する剤を対象に投与することにより、対象における循環器疾患を防止する方法を提供する。循環器疾患、例えば、アテローム性動脈硬化症のリスクを持つ対象は、例えば、本明細書に記載された診断または予後アッセイ方法のいずれかまたはその組合せにより同定できる。予防剤の投与は、異常な１０２１８発現または活性に特徴的な症状の顕在化に先立ち生じ、その結果、循環器疾患が防止されるか、あるいはその進行が遅延される。１０２１８倒錯（aberrancy）のタイプに依存して、例えば、１０２１８、１０２１８アゴニストまたは１０２１８アンタゴニストは対象を治療するのに用いることができる。適当な剤は、本明細書に記載されたスクリーニングアッセイ方法に基づいて決定できる。
【０１０３】
Ｂ．治療方法
本明細書に記載されるのは、循環器疾患症状を改善できる方法および組成物である。ある種の循環器疾患は、少なくとも部分的に、過剰レベルの遺伝子産物により、または異常もしく過剰な活性を示す遺伝子産物の存在により引き起こされる。従って、かかる遺伝子産物のレベルおよび／または活性における低下は、循環器疾患症状の改善を引き起こすであろう。遺伝子発現レベルまたは蛋白質の活性の低下についての手法を後記する。
【０１０４】
あるいは、ある種の他の循環器疾患は、少なくとも部分的に、遺伝子発現のレベルの不存在もしくは低下、または蛋白質活性のレベルにおける低下により引き起こされる。結果的に、遺伝子発現のレベルおよび／またはかかる蛋白質の活性における増加は、循環器疾患症状の改善を引き起こすであろう。
【０１０５】
いくらかの場合において、疾患状態における遺伝子の上昇調節は、疾患状態に対する応答においてその遺伝子産物についての保護的役割を反映する。かかる遺伝子発現の増強または遺伝子産物の活性は、それが機能する保護的効果を強化するであろう。いくらかの循環器疾患状態は、かかる保護遺伝子の異常に低レベルの活性に誘因し得る。また、これらの場合において、遺伝子発現のレベルおよび／またはかかる遺伝子産物の活性における増加は、循環器疾患症状の改善を引き起こすであろう。標的遺伝子発現レベルまたは標的遺伝子産物活性レベルにつういての手法を本明細書中に記載する。
【０１０６】
従って、本発明のもう一つの態様は、治療目的のための１０２１８発現または活性を変調する方法に関する。従って、例示的な具体例において、本発明の変調方法は、細胞と、１０２１８または細胞（例えば、内皮細胞または卵巣細胞）と関連する１０２１８蛋白質活性の１以上の活性を変調する剤とを接触させることを含む。１０２１８蛋白質活性を変調する剤は、核酸または蛋白質、１０２１８蛋白質の天然に発生する標的分子（例えば、１０２１８リガンドもしくは基質）、１０２１８抗体、１０２１８アゴニストまたはアンタゴニスト、１０２１８アゴニストまたはアンタゴニストのペプチドミミック、あるいは他の小分子のごとき本明細書中に記載された剤であり得る。一の具体例において、その剤は、１以上の１０２１８活性を刺激する。かかる刺激剤の例には、活性１０２１８蛋白質、および細胞へ誘導された１０２１８をコードする核酸分子が含まれる。かかる阻害剤の例には、アンチセンス１０２１８核酸分子、抗１０２１８抗体および１０２１８阻害剤が含まれる。これらの変調方法は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ（例えば、剤での細胞の培養）、あるいはｉｎ ｖｉｖｏ（例えば、対象への剤の投与）にて行うことができる。それ自体、本発明は、１０２１８蛋白質または核酸分子の異常かまたは望まない発現または活性により特徴付けられる疾患または障害に苦しむ個体を治療する方法を提供する。１の具体例において、その方法は、剤（例えば、本明細書に記載されたスクリーニングアッセイ方法により同定された剤）、または１０２１８発現または活性を変調する（例えば、上昇調節まもしくは下降調節する）剤の組合せを含む。もう一つの具体例において、その方法は、１０２１８蛋白質または核酸分子を治療剤として投与し、低下した、異常なまたは望まれない１０２１８発現もしくは活性につき補う。
【０１０７】
１０２１８活性の刺激は、１０２１８が異常に下降調節される、および／または１０２１８活性の増加が有利な効果を有するようである状態において望ましい。同様に、１０２１８活性の阻害は、１０２１８が異常に上昇調節される、および／または１０２１８活性の低下が有利な効果を有するようである状態において望ましい。
【０１０８】
（ｉ）標的遺伝子の発現、合成または活性を阻害する方法
前記のごとく、循環器障害に関与する遺伝子は、遺伝子活性レベルの増加を介してかかる障害を惹起し得る。いくらかの場合、かかる上昇調節は、その疾患状態に対して原因となるまたは悪化させる効果を有し得る。様々な手法を用いて、かかる遺伝子および／または蛋白質の発現、合成または活性を阻害できる。
【０１０９】
例えば、阻害活性を示す前記のアッセイ方法を介して同定されたものごとき化合物は、循環器疾患症状を改善するために本発明により用いることができる。かかる分子には、限定されるものではないが、有機小分子、ペプチド、抗体等が含まれる。
【０１１０】
例えば、１０２１８蛋白質についての内因性リガンドと競合する化合物が投与できる。リガンド結合１０２１８蛋白質の量における得られた低下は、内皮細胞生理学を変調するであろう。この目的に特に有用であり得る化合物には、例えば、Ｉｇ−テールの（Ig-tailed）融合蛋白のごとき可溶化融合蛋白質を含めた、例えば、１０２１８蛋白質の１以上の細胞外ドメイン、その一部分および／またはアナログを含むペプチドのごとき可溶化蛋白質またはペプチドが含まれる。（Ｉｇ−テールの融合蛋白の産生の言及につき、米国特許第５,１１６,９６４号参照。）あるいは、１０２１８受容体部位に結合するが、その蛋白質を活性化しないリガンドアナログまたは抗体のごとき化合物（例えば、受容体−リガンドアンタゴニスト）は、１０２１８蛋白質活性を阻害するのに有効であり得る。
【０１１１】
さらに、１０２１８遺伝子の発現を阻害するアンチセンスおよびリボザイム分子も本発明に従って用いて、異常な１０２１８遺伝子活性を阻害できる。さらにまた、３重らせん分子を異常な１０２１８遺伝子活性を阻害するのに利用できる。
【０１１２】
本発明方法に用いたアンチセンス核酸分子は、それらが１０２１８蛋白質をコードする細胞ｍＲＮＡおよび／またはゲノムＤＮＡとハイブリダイズまたは結合して、それにより、例えば、転写および／または翻訳を阻害することにより蛋白質の発現を阻害するように、典型的には、対象に投与するか、ｉｎ ｓｉｔｕで生成される。ハイブリダイゼーションは、通常のヌクレオチド相補性によりなされて安定な二本鎖を形成できるか、あるいは、例えば、ＤＮＡ二本鎖に結合するアンチセンス核酸分子の場合には、二本らせん体の主要な溝中の特異的な相互作用を通してできる。本発明のアンチセンス核酸分子の投与経路の例には、組織部位での直接的な注射が含まれる。あるいは、アンチセンス核酸分子を修飾して、標的選択細胞に修飾でき、次いで、全身投与できる。例えば、全身投与では、アンチセンス分子を、例えば、アンチセンス核酸分子を細胞表面受容体または抗原に結合するペプチドまたは抗体に連結することにより、それらが選択された細胞表面上で発現した受容体または抗原に特異的に結合させるように修飾できる。また、アンチセンス核酸分子は、本明細書に記載されたベクターを用いて細胞に送達できる。そのアンチセンス分子の十分な細胞内濃度を達成するために、アンチセンス核酸分子が強力なｐｏｌ ＩＩまたはｐｏｌ ＩＩＩプロモーターの制御下にあるベクター構築物が好ましい。
【０１１３】
さらにもう一つの具体例において、本発明方法に用いたアンチセンス核酸分子はα−アノマー核酸分子である。α−アノマー核酸分子は、相補的ＲＮＡと特定の二本鎖ハイブリッドを形成し、ここに、通常のβユニットにとは反対に、その鎖は交互にパラレルに走っている（Gaultierら （１９８７） Nucleic Acids. Res. １５：６６２５-６６４１）。また、アンチセンス核酸分子は、２’−ｏ−メチルリボヌクレオチド（Inoueら （１９８７）Nucleic Acids Res. １５：６１３１-６１４８）またはキメラＲＮＡ−ＤＮＡアナログを含む（Inoueら （１９８７） FEBS Lett. ２１５：３２７-３３０）。
【０１１４】
さらにもう一つの具体例において、本発明方法に用いたアンチ核酸分子はリボザイムである。リボザイムは、リボヌクレアーゼ活性を持つ触媒ＲＮＡであり、それはそれらが相補的領域を有するｍＲＮＡのごとき一本鎖核酸を切断できる。かくして、リボザイムは（例えば、（HaselhoffおよびGerlach （１９８８） Nature ３３４：５８５-５９１に記載された）ハンマーヘッドリボザイムを用いて、１０２１８ｍＲＮＡ転写物を触媒的に切断でき、それによって、１０２１８ｍＲＮＡの翻訳を阻害する。１０２１８コード核酸に対する特異性を有するリボザイムを本明細書に開示された１０２１８ｃＤＮＡの核酸配列（すなわち、配列番号：１または３）に基づき設計できる。例えば、テトラヒメナＬ−１９  ＩＶＳ  ＲＮＡの誘導体を構築でき、ここに、活性部位の核酸配列は１０２１８コード部位ｍＲＮＡにおいて切断されるヌクレオチド配列に相補的である（例えば、Cechら米国特許第４,９８７,０７１号；およびCechら 米国特許第５,１１６,７４２号参照）。あるいは、１０２１８ｍＲＮＡを用いて、ＲＮＡ分子のプールから特異的なリボヌクレアーゼ活性を有する触媒ＲＮＡを選択できる（例えば、Bartel, D.およびSzostak, J. W. （１９９３） Science ２６１：１４１１-１４１８参照）。
【０１１５】
また、１０２１８遺伝子発現は、１０２１８の調節領域に相補的な核酸配列を標的とすることにより阻害して、標的細胞中の１０２１８遺伝子の転写を防止する３重らせん構造を形成できる（例えば、Helene, C. （１９９１） Anticancer Drug Des. ６（６）：５６９-８４；Helene, C.ら （１９９２） Ann. N.Y. Acad. Sci. ６６０：２７-３６；およびMaher, L. J. （１９９２） Bioassays １４（１２）：８０７-１５参照）。
【０１１６】
また、１０２１８に特異的であり、かつその活性を干渉する抗体を用いて、１０２１８蛋白質機能を変調または阻害できる。かかる抗体は、１０２１８蛋白質自体または一部分の蛋白質に対応するペプチドに対して、本明細書に記載した標準的手順を用いて生成できる。かかる抗体には、限定されるものではないが、ポリクローナル、モノクローナル、Ｆａｂ断片、一本鎖抗体またはキメラ抗体が含まれる。
【０１１７】
標的遺伝子蛋白質が細胞内にあり、抗体が用いられる場合には、内在化抗体が好ましいであろう。リポフェクチンリポソームを用いて、ヒトエピトープに結合する抗体またはＦａｂ領域の断片を細胞へ送達できる。抗体の断片を用いる場合、標的蛋白質結合ドメインに結合する最小の阻害断片が好ましい。例えば、標的遺伝子蛋白質に結合する抗体の可変領域のドメインに対応するアミノ酸配列を有するペプチドを用いることができる。かかるペプチドは、当該技術分野においてよく知られた方法（例えば、Creighton （１９８３）, 前記；およびSambrookら （１９８９） 前記に記載されている）を用いて化学合成できるか、または組換えＤＮＡ技術を介して産生できる。また、細胞内標的遺伝子エピトープに結合する一本鎖中和抗体を投与できる。かかる一本鎖抗体は、例えば、Marascoら （１９９３） Proc. Natl. Acad. Sci. USA ９０：７８８９-７８９３）に記載されたもののごとき手法を利用して、例えば、標的細胞集団内で一本鎖抗体をコードする核酸配列を発現することによって投与できる。
【０１１８】
いくらかの場合、その標的遺伝子蛋白質は細胞外にあるか、１０２１８蛋白質のごとき膜貫通蛋白質であろう。１０２１８蛋白質の１以上の細胞内ドメインに特異的であり、例えば、その活性を干渉する抗体は、循環器疾患を治療するのに特に有用である。かかる抗体は、それらが血流から直接的に標的ドメインにアクセスできるので、特に有効である。ペプチド投与に適用される後記のいずれの投与手法を利用して、それらの作用部位に阻害標的遺伝子抗体を有効に投与できる。
【０１１９】
（ｉｉ）標的遺伝子活性を回復または増強する方法
循環器疾患を惹起する遺伝子は、循環器疾患状態内で低発現できる。あるいは、循環器疾患症状の発生に導き、かかる遺伝子の蛋白質生成物の活性を低下できる。遺伝子発現のかかる下降調節または蛋白質活性の低下は、疾患状態に対する原因または悪化の効果を有し得る。
【０１２０】
いくらかの場合において、疾患状態において上昇調節される遺伝子は、保護効果を発揮し得る。種々の手法を用いて、循環器疾患状態に応答する保護効果を発揮する遺伝子および／または蛋白質の発現、合成あるいは活性を増加できる。
【０１２１】
本セクションに記載されるのは、１０２１８活性のレベルが循環器疾患症状が改善されるレベルまで増加できる方法である。１０２１８活性のレベルは、例えば、１０２１８遺伝子発現のレベルの増加、または存在する活性１０２１８蛋白質のレベルの増加のいずれかにより、増加できる。
【０１２２】
例えば、循環器疾患症状を改善するのに十分なレベルでの１０２１８蛋白質をかかる症状を示す患者へ投与できる。後記のいずれの手法もかかる投与に用いることができる。当業者ならば、後記のもののごとき手法を利用して有効な、非毒性用量の１０２１８蛋白質の濃度を測定する方法を容易に知るであろう。
【０１２３】
加えて、１０２１８蛋白質をコードするＲＮＡは、循環器疾患症状を改善するような１０２１８のレベルを生成するのに十分な濃度にて、循環器疾患症状を示す患者に直接的に投与できる。例えば、リボゾーム投与のごとき化合物の細胞内投与を達成する後記のいずれの手法も、かかるＲＮＡ分子の投与に用いることができる。ＲＮＡ分子は、例えば、本明細書に記載のもののごとき組換え手法をにより生成できる。
【０１２４】
さらに、対象は、遺伝子組換え治療により治療できる。１０２１８機能を持つ通常の１０２１８蛋白質の産生を指令する１コピー以上の１０２１８遺伝子またはその一部分を、限定されるものではないが、リポソームのごとき細胞へＤＮＡを導入する蛋白質の分子に加えて、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、およびレトロウイルスベクターを含むベクターを用いて細胞へ挿入できる。加えて、前記のものごとき手法は、ヒト細胞への１０２１８遺伝子配列の導入につき用いることができる。
【０１２５】
次いで、１０２１８を発現する遺伝子配列を含む細胞、好ましくは、自己細胞を循環器疾患症状の回旋を可能とする位置の対象に導入または再導入できる。かかる細胞置換手法は、例えば、遺伝子産物が分泌された細胞外遺伝子産物である場合に好ましいであろう。
【０１２６】
Ｃ．医薬組成物
本発明のもう一つの態様は、循環器疾患、例えば、アテローム性動脈硬化症に罹っている対象を治療する方法に関する。これらの方法は、１０２１８発現または活性を変調する剤（例えば、本明細書に記載されたスクリーニングアッセイ方法により同定された剤）またはかかる剤の組合せを対象に投与することを含む。もう一つの具体例において、本方法は、治療剤として１０２１８蛋白質または核酸を対象に投与して、低下した、異常なまたは望まれない１０２１８発現または活性を補うことを含む。
【０１２７】
１０２１８活性の刺激は、１０２１８が異常に下降調節されているおよび／または１０２１８活性の増加が有利な効果を有するようである状態において望ましい。同様に、１０２１８活性の阻害は、１０２１８が異常に上昇調節されているおよび／または１０２１８活性の低下が有利な効果を有するようである状態において望ましい。
【０１２８】
１０２１８活性を変調する剤は、かかる投与に適当な医薬組成物を用いて対象に投与できる。かかる組成物は、典型的には、剤（例えば、核酸分子、蛋白質または抗体）および医薬上許容される担体を含む。本明細書に用いた「医薬上許容される担体」なる語は、いずれかのおよび全ての溶媒、分散媒体、コーティング剤、抗菌剤および抗真菌剤、等張性および吸収遅延剤等を含むことを意図する。医薬上活性な物質についてのかかる媒体および剤の使用は、当該技術分野においてよく知られている。通常の媒体または剤が活性化合物と不適合である範囲を除いて、組成物中のその使用が考えられる。補助的な活性化合物はその組成物に組込むことができる。
【０１２９】
本発明の治療方法に用いた医薬組成物は、その意図された投与経路で適合するように処方される。投与経路の例には、非経口、例えば、静脈内、皮内、皮下、経口（例えば、吸入）、経皮的（局所）、経粘膜および直腸投与が含まれる。非経口、皮内または皮下適用に用いる液剤および懸濁剤には、以下の成分：注射用蒸留水、食塩水、不揮発性油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の合成溶剤のごとき無菌の希釈剤；ベンジルアルコールまたはメチルパラベンのごとき抗菌剤；アスコルビン酸または亜硫酸ナトリウムのごとき酸化防止剤；エチレンジアミン四酢酸のごときキレート剤；酢酸塩、クエン酸塩またはリン酸塩のごとき緩衝剤、および塩化ナトリウムまたはできブドウ糖のごとき張力調整用の剤を含むことができる。ｐＨは、塩酸または水酸化ナトリウムのごとき酸または塩基で調整できる。非経口製剤は、ガラスまたはプラスチックで作成されたアンプル、ディスポーザブル注射器または複数回投与バイアルに入れることができる。
【０１３０】
注射可能な使用に適する医薬組成物は、無菌液剤（水溶性の場合）または分散剤、無菌の注射可能な液剤または分散剤の即時調製用の粉末が含まれる。静脈内投与では、適当な担体には、生理食塩水、細菌発育阻止水、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ ＥＬＴＭ（ＢＡＳＦ、Parsippany、NJ）またはリン酸緩衝液（ＰＢＳ）が含まれる。すべての場合において、組成物は無菌なければならず、容易なシリンジ可能性（syringability）が存在するという程度まで流動性であるべきである。それは、製造および貯蔵の条件下で安定すべきであり、細菌および真菌のごとき微生物の汚染作用に対して保護されなければならない。その担体は、例えば、水、エタノール、多価アルコール（例えば、グリセリン、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコール等）およびその適当な混合物を含めた溶媒または分散媒体であり得る。適当な流動性は、例えば、レシチンのごときコーティング剤の使用、分散剤の場合における必要な粒子サイズの維持、および界面活性剤の使用により維持できる。微生物の作用の予防は、様々な抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサール等）により達成できる。多くの場合、組成物中の等張剤、例えば、糖、マンニトールのごとき多価アルコール、ソルビトールおよび塩化ナトリウムを含むことは望ましいであろう。注射可能な組成物の延長された吸収は、組成物中に吸収を遅延させる剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウム、ゼラチンを含めることにより引き起こすことができる。
【０１３１】
無菌の注射可能な溶液は、必要な前記に列挙される成分の１つまたは組合せで適当な溶媒中の必要量で１０２１８活性（例えば、１０２１８蛋白質の断片または抗１０２１８抗体）を変調する剤を組み込み、必要ならば、濾過滅菌することにより調製できる。一般には、分散剤は、基本的な分散媒体を含む無菌ビヒクルおよび前記に列記されたものから必要とされる他の成分を活性化合物に組込むことにより調製される。無菌注射可能溶液の調製用の無菌粉末の場合、好ましい調製法は真空乾燥および凍結乾燥であり、それは従前の滅菌濾過溶液から有効成分＋いずれかの付加的な所望の成分の粉末を与える。
【０１３２】
経口組成物は、一般的には、不活性希釈剤または食用担体を含む。それらは、ゼラチンカプセルに入れことができるか、または錠剤に圧縮できる。経口治療投与の目的のために、有効成分を賦形剤と組合せ、錠剤、トローチ剤またはカプセル剤の形態に用いることができる。また、経口組成物は、口腔洗浄剤としての使用のための流体担体を用いて調製でき、ここに、その流体担体中の化合物は経口的に適用し、グチュグチュし、吐き出すか、または飲み込む。医薬上適合する結合剤、および／または補助材料はその組成物の一部として含むことができる。錠剤、錠剤、カプセル剤、トローチ剤等は、以下の成分または同様の性質の化合物のいずれかを含むことができる：微結晶性セルロース、トラガカントゴムまたはゼラチンのごとき結合剤；デンプンまたはラクトースのごとき賦形剤、アルギン酸、Ｐｒｉｍｏｇｅｌまたはコーンスターチのごとき崩壊剤；ステアリン酸マグネシウムまたはＳｔｅｒｏｔｅｓのごとき滑沢剤；コロイド状二酸化ケイ素のごとき流動促進剤（glidant）；スクロースまたはサッカリンのごとき甘味剤；あるいはペパーミント、サリチル酸メチルまたはオレンジの香味料のごとき香味剤。
【０１３３】
吸入による投与では、化合物は、適切な高圧ガス、例えば、二酸化炭素のごとき気体を含む加圧容器またはディスペンサーからのエアゾール噴霧の形態、またはネブライザーの形態で送達される。
【０１３４】
また、全身投与は、経粘膜または経皮的な手段によりなすことができる。経粘膜または経皮的な投与では、浸透するべきバリアーに適当な浸透剤が処方中で用いられる。かかる浸透剤は当該技術分野において一般的に知られており、例えば、経粘膜投与につき、洗浄剤、胆汁酸塩およびフシジン酸誘導体を含む。経粘膜投与は、鼻内噴霧または坐薬の使用を通じて達成できる。経皮投与では、活性化合物は、当該技術分野において一般的に知られているような軟膏、サルブ（salve）、ゲル剤またはクリームに処方される。
【０１３５】
また、１０２１８活性を変調する剤は、直腸送達用の坐剤（例えば、カカオ脂および他のグリセリドのごとき通常の坐剤基剤）または停留浣腸剤の形態中で調製できる。
【０１３６】
１つの具体例において、１０２１８活性を変調する剤は、埋込剤およびマイクロカプセル化された送達システムを含めた放出制御製剤のごとき体内からの急速な消失に対して化合物を保護するであろう担体で調製される。エチレン酢酸ビニル、ポリ無水物（polyanhydride）、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステルおよびポリ乳酸のごとき生物分解性の生物学的適合のポリマーを用いることができる。かかる処方の調製方法は当業者にあきらかであろう。また、その材料もＡｌｚａ社およびＮｏｖａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ社から商業的に得ることができる。（ウイルス抗原に対する単クローン抗体を持つ感染した細胞へ標的とされるリポゾームを含めた）リポソーム懸濁剤は、医薬上許容される担体として用いることができる。これらは、当業者に知られた方法、例えば、米国特許第４,５２２,８１１号に従い調製できる。
【０１３７】
投与の容易さおよび投薬の均一性についての投与単位における経口または非経口の組成物を処方することは特に有利である。本明細書に用いた投与単位形態は、治療されるべき対象についての単一投薬として適当な物理的に区別される単位をいい；各単位は、必要とされる医薬担体と関連する所望の治療効果を生成するように計算された予め決定された量の活性化合物を含む。本発明の投薬単位形態の規格は１０２１８活性を変調する剤のユニークな特定、達成されるべき特定の治療効果、および対象の治療用の剤のごとき調剤技術に特有の制限により指示され、それらに直接的に依存する。
【０１３８】
かかる剤の毒性および治療効果は、例えば、ＬＤ５０（５０％の集団の致死用量）およびＥＤ５０（５０％の集団の治療上の有効用量）を決定するための細胞培養または実験動物における標準的な手順により決定できる。毒性および治療効果の用量比は治療指数であり、それは比ＬＤ５０／ＥＤ５０として表すことができる。大きな治療指数を示す薬剤が好ましい。有毒な副作用を示す薬剤を用いることができるが、未感染細胞に対して潜在的な損傷を最小化し、それにより副作用を低下するために罹患組織部位にかかる剤を標的とする送達システムを設計するように注意が払われるべきである。
【０１３９】
細胞培養アッセイおよび動物試験から得られたデータはをヒトにおける使用のための用量範囲を形成するのに用いることができる。かかる１０２１８変調剤の用量は、好ましくは、ほどんどまたは全く毒性を持たないＥＤ５０を含む循環濃度の範囲内にある。その用量は、使用した用量形態および利用した投与経路に依存してこの範囲内で変化し得る。本発明の治療方法において用いたいずれの薬剤についても、治療上の有効用量は細胞培養アッセイから最初に見積ることができる。用量は、動物モデルにおいて処方して、細胞培養において決定されたＩＣ５０（すなわち、症状の半−最大阻害を達成するテスト化合物の濃度）を含む循環血漿濃度範囲を達成できる。かかる情報をもいいて、より正確に、ヒトにおける有用な用量を決定できる。血漿中のレベルは、例えば、高速液体クロマトグラフィーにより測定できる。
【０１４０】
本明細書に記載のごとき蛋白質またはポリペプチドの治療上の有効用量（すなわち、有効用量）は、０.００１ないし３０ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは、約０.０１ないし２５ｍｇ／ｋｇ体重、より好ましくは、約０.１ないし２０ｍｇ／ｋｇ体重、およびさらにより好ましくは、約１ないし１０ｍｇ／ｋｇ、２ないし９ｍｇ／ｋｇ、３ないし８ｍｇ／ｋｇ、４ないし７ｍｇ／ｋｇ、または５ないし６ｍｇ／ｋｇ体重の範囲である。当業者は、限定されるものではないが、疾患または障害の重篤度、従前の処置、対象の一般的健康および／または年齢および存在する他の疾患を含めたある種の因子が対象を有効に治療するのに必要な用量に影響し得ることを理解するであろう。さらに、治療上有効量の蛋白質、ポリペプチドまたは抗体での対象の処置は、単回処置を含むことができ、または好ましくは、一連の処置を含むことができる。
【０１４１】
好ましい例において、対象は、約０.１ないし２０ｍｇ／ｋｇ体重の間の範囲内の抗体、蛋白質またはポリペプチドで、約１ないし１０週間、好ましくは、２ないし８週間、より好ましくは、約３ないし７週間、およびさらにより好ましくは約４、５または６週間の間１週間に１回治療される。また、治療に用いた有効用量の抗体、蛋白質またはポリペプチドを特定の治療のコースにわたり増加または減少させることもできると理解されるであろう。用量の変化は、本明細書に記載された診断アッセイ方法の結果から生じ、明らかとなり得る。
【０１４２】
本発明は、発現または活性を変調する剤を含む。剤は、例えば、小分子であり得る。例えば、かかる小分子には、限定されるものではないが、ペプチド、ペプチドミミック、アミノ酸、アミノ酸アナログ、ポリヌクレオチド、ポリヌクレオチドアナログ、ヌクレオチド、ヌクレオチドアナログ、モル当り約１０,０００グラム未満の分子量を有する有機または無機化合物（例えば、ヘテロ有機および有機金属化合物を含む）、モル当り約５,０００グラム未満の分子量を有する有機または無機化合物、およびかかる化合物の塩、エステルおよび他の医薬上許容される形態が含まれる。適当な用量の小分子剤は通常の技量を有する内科医、獣医または研究者の知識内の多数の因子に依存すると理解される。小分子の用量は、例えば、治療されるべき対象または試料の同定、サイズおよび条件に依存して、さらに、適用可能ならば、組成物が投与される経路に依存して、および実践者が小分子が本発明の核酸またはポリペプチドに関して有することを望む効果に依存して変化する。例示的な用量には、対象または試料重量のキログラム当りの小分子のミリグラムまたはマイクログラム量（例えば、キログラム当り約１マイクログラムないしキログラム当り約５００ミリグラム、キログラム当り約１マイクログラムないしキログラム当り約５００ミリグラム、キログラム当り約１マイクログラムないしキログラム当り約５０ミリグラム）を含む。さらに、小分子の適当な用量は変調されるべき発現または活性に関して小分子の効力に依存すると理解される。かかる適当な用量は、本明細書に記載されたアッセイ方法を用いて決定できる。１以上のこれらの小分子が本発明のポリペプチドまたは核酸の発現または活性を変調するために動物（例えば、ヒト）に投与される場合、内科医、獣医または研究者は、例えば、最初は比較的低用量を処方し、引き続いて適当な応答がえられるまで用量を増加できる。加えて、いずれかの特定の動物対象についての特定の用量レベルは使用された特定の化合物の活性、対象の年齢、体重、一般的健康、性別および食事、投与時間、投与経路、排泄速度、いずれかの薬物組合せ、および変調されるべき発現または活性の程度を含めた様々な因子に依存するであろうと理解される。
【０１４３】
さらに、抗体（またはその断片）は、細胞毒素、治療剤または放射活性金属イオンのごとき治療部位にコンジュゲートできる。細胞毒素または細胞毒性剤は、細胞に有害であるいずれの薬剤も含む。例には、タキソール、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、エチジウムブロマイド、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド（tenoposide）、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン（colchicin）、アドリアマイシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン（dihydroxy anthracin dione）、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１−デヒドロテストステロン、糖質コルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロールおよびプロマイシンならびにそのアナログまたはホモログを含む。治療剤には、限定されるものではないが、代謝拮抗剤（例えば、メトトレキサート、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、シタラビン、５−フルオロウラシル  デカルバジン（decarbazine））、アルキル化剤（例えば、メクロレタミン、チオエパ（thioepa）クロラムブチル、メルファラン、カルムスチン（ＢＳＮＵ）およびロムスチン（ＣＣＮＵ）、シクロソスファミド（cyclothosphamide）、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンＣおよびシス−ジクロロジアミン白金（ＩＩ）（ＤＤＰ）シスプラチン）、アントラサイクリン（例えば、ダウノルビシン（以前はダウノマイシン）およびドキソルビン）、抗生物質（例えば、ダクチノマイシン（以前はアクチノマイシン）、ブレオマイシン、ミトラマイシンおよびアントラマイシン（anthramycin）（ＡＭＣ））、ならびに細胞分裂抑制剤（例えば、ビンクリスチンおよびビンブラスチン）が含まれる。
【０１４４】
本発明のコンジュゲートは、所与の生物学的応答を変調するために用いることができ、薬物部分は古典的な化学治療剤に限定されるごとく構築されない。例えば、薬部位は所望の生物学的活性を所有する蛋白質またはポリペプチドであり得る。かかる蛋白質は、例えば、アブリン、リシンＡ、シュードモナス菌体外毒素またはジフテリア毒素のごとき毒素；腫瘍壊死因子、アルファ−インターフェロン、ベータ−インターフェロン、神経成長因子、血小板由来増殖因子、組織プラスミノゲン活性剤のごとき蛋白質；または、例えば、リンホカイン、インターロイキン−１（「ＩＬ−１」）、インターロイキン−２（「ＩＬ−２」）、インターロイキン−６（「ＩＬ−６」）、顆粒球マクロファージマクロファージコロニー刺激因子（「ＧＭ−ＣＳＦ」）、顆粒球コロニー刺激因子（「Ｇ−ＣＳＦ」）または他の成長因子のごとき生物学的応答調節物質を含むことができる。
【０１４５】
抗体へのかかる治療の部位をコンジュゲートさせるための手法はよく知られている。例えば、Arnonら, 「Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy」, Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeldら （編）, pp. ２４３-５６ （Alan R. Liss, Inc. １９８５）；Hellstromら, 「Antibodies For Drug Delivery」, Controlled Drug Delivery （第２版）, Robinsonら （編）, pp. ６２３-５３ （Marcel Dekker, Inc. １９８７）；Thorpe, 「Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy： A Review」, Monoclonal Antibodies '８４： Biological And Clinical Applications, Pincheraら （編）, pp. ４７５-５０６ （１９８５）；「Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy」, Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwinら編, pp. ３０３-１６ （Academic Press １９８５）およびThorpeら, 「The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates」, Immunol. Rev., ６２：１１９-５８ （１９８２）参照。あるいは、抗体は、第２の抗体にコンジュゲートして、Segalの米国特許第４,６７６,９８０号により記載されるごとく抗体へテロコンジュゲートを形成できる。
【０１４６】
本発明方法に用いた核酸分子はベクターに挿入し、遺伝子療法ベクターとして用いることができる。遺伝子療法ベクターは、例えば、静脈注射、局所投与（米国特許第５,３２８,４７０号参照）により、または定位固定注入（例えば、Chenら （１９９４） Proc. Natl. Acad. Sci. USA ９１：３０５４-３０５７参照）により対象に送達できる。遺伝子療法ベクターの医薬製剤は、許容される希釈剤中に遺伝子療法ベクターを含むか、または遺伝子送達ビヒクルが埋め込まれている徐放性マトリックスを含むことができる。あるいは、完全な遺伝子送達ベクターを組換え細胞、例えば、レトロウイルスベクターから無傷で生成できる場合、医薬製剤は遺伝子送達システムを生成する１個以上の細胞を含むことができる。
【０１４７】
Ｄ．  ファーマコゲノミックス
本発明の治療方法と共に、ファーマコゲノミックス（すなわち、対象の遺伝子型およびその対象の外来化合物または薬物に対する応答の間の関係の試験）を考え得る。治療学における代謝の差は、薬理学的に活性な薬物の用量および血中濃度間の関係を変更することにより、重篤な毒性または治療の失敗に導き得る。かくして、内科医または臨床医は、１０２１８活性を変調する薬剤を投与するかを決定し、ならびに１０２１８活性を変調する薬剤での治療の用量および／または治療投与法を調整する関連するファーマコゲノミックス研究で得られた知識を適用することを考えてもよい。
【０１４８】
ファーマコゲノミックスは、影響さえた人における薬物性質の変更および異常な作用のために薬物に対する応答において臨床的に有意な遺伝学的な変化を扱う。例えば、Eichelbaum, M.ら （１９９６） Clin. Exp.Phannacol. Physiol. ２３（１０-１１）：９８３-９８５およびLinder, M. W.ら （１９９７） Clin. Chem. ４３（２）：２５４-２６６参照。一般的には、２つのタイプの薬理遺伝学的条件が区別できる。遺伝条件は薬物が体内で作用する方法を変更する（薬物作用の変更）単一因子として伝達させるか、または遺伝条件が体が薬物に対して作用する方法を変更する（薬物代謝の変更）単一因子として伝達された。これらの薬理遺伝学的条件は、まれな遺伝子欠陥として、または天然に発生する多形として発生することができる。例えば、グルコース−６−リン酸塩アミノペプチダーゼ欠乏（Ｇ６ＰＤ）は、主な臨床的合併症がオキシダント薬物（抗マラリア剤、スルホンアミド、鎮痛剤、ニトロフラン）の摂取およびソラマメの消費後に溶血性である共通した遺伝酵素病である。
【０１４９】
「ゲノム−広範囲会合」として知られている薬物反応を予測する遺伝子を同定するための１つのファーマコゲノミックスアプローチは、主として、既に公知の遺伝子関連マーカーよりなるヒトゲノムの高解像度地図（例えば、ヒトゲノム上の６０，０００〜１００，０００の多形または可変部位よりなる「両対立形質の」遺伝子マーカー地図、各々が２つの変異体を有する）に依拠する。かかる高解像度遺伝子地図は、特定の観察された薬物応答または副作用と関連するマーカーを同定するための第ＩＩ／ＩＩＩ相の薬物試験において参加した統計的にかなりの数の各々の患者のゲノムの地図と比較できる。あるいは、かかる高解像度地図は、ヒトゲノム中の数千万個の公知の単一ヌクレオチド多形（ＳＮＰ）の組合せから作成できる。本明細書に用いた「ＳＮＰ」は、ＤＮＡの伸長における単一のヌクレオチド塩基において発生する共通の変化である。例えば、ＳＮＰが、１０００塩基のＤＮＡ毎に１回発生し得る。ＳＮＰは疾病プロセスに関与でき、しかしながら、大部分は疾患関連ではないであろう。かかるＳＮＰの発生に基づく遺伝地図を与えられると、個体は、それらの個々のゲノムにおける特定のパターンのＳＮＰに依存する遺伝的カテゴリーに分類できる。かかる方法において、治療投与法は、かかる遺伝学的に類似する個体の間で共通であり得る試験に配慮しつつ、遺伝学的に同様の個体の群に調整できる。
【０１５０】
あるいは、「候補遺伝子アプローチ」と呼ばれる方法を利用して、薬物応答を予測する遺伝子を同定できる。この方法によれば、薬物標的をコードする遺伝子が知られている（例えば、本発明方法に用いられた１０２１８蛋白質）場合、その遺伝子の共通の全ての変異体はその集団においてかなり容易に同定でき、その遺伝子−対−もう一つの一つのバージョンが特定の薬物応答と関連するかを同定できる。
【０１５１】
例示的な具体例として、薬物代謝酵素をの活性は、薬物作用の強度および持続の双方の主要な決定因子である。薬物代謝酵素（例えば、Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ２（ＮＡＴ ２）およびチトクロームＰ４５０酵素ＣＹＰ２Ｄ６およびＣＹＰ２Ｃ１９）の遺伝子多形の発見は、標準および安全用量の薬物の摂取後、いくらかの患者が予測された薬物効果を得ず、または過度の薬物応答および重篤な毒性を示を示す理由に関して説明を提供した。これらの多形は、集団中の２つの表現型、広範囲代謝者（ＥＭ）および不全代謝者（ＰＭ）における集団中の２つの表現型で発現される。ＰＭの普及は異なる集団間で異なる。例えば、ＣＹＰ２Ｄ６をコードする遺伝子は高度に多形であり、いくつかの当然変異は、ＰＭにおいて同定され、そのすべては機能的ＣＹＰ２Ｄ６の不存在に導く。標準用量を受ける場合に、ＣＹＰ２Ｄ６およびＣＹＰ２Ｃ１９の不全代謝者は、全く頻繁に、過剰な薬物応答および副作用を経験する。代謝物質が活性な治療部位であるならば、そのＣＹＰ２Ｄ６で形成されて代謝体モルヒネにより媒介されたコデインの鎮痛効果につき示されるように、ＰＭは治療応答を示さない。他の極端は、標準的用量に応答しない超急速代謝者と呼ばれる。最近、超急速代謝の分子的基礎が、ＣＹＰ２Ｄ６遺伝子増幅のためであると同定された。
【０１５２】
あるいは、「遺伝子発現プロファイリング」と呼ばれる方法を利用して、薬物応答を予測できる。例えば、薬物（例えば、本発明方法に用いた１０２１８分子または１０２１８モジュレーター）を投薬された動物の遺伝子発現は、毒性と関連する遺伝経路が作動するかどうかの表示を与えることができる。
【０１５３】
前記の２つ以上のファーマコゲノミックスアプローチのから生成された情報を用いて、対象の予防または治療上の処置のための適当な投与計画および治療投与法を決定できる。この知識は、投与または薬物選択に適用される場合、副作用または治療上の失敗を回避でき、かくして、１０２１８活性を変調する薬剤で、循環器疾患、例えば、アテローム性動脈硬化症に罹っている対象を治療する場合の治療または予防上の効力を増強できる。
【０１５４】
Ｖ．  本発明方法に用いた組換え発現ベクターおよび宿主細胞
本発明方法（例えば、本明細書に記載されたスクリーニングアッセイ方法）は、１０２１８蛋白質（あるいはそれの一部分）をコードする核酸を含めたベクター、好ましくは、発現ベクターの使用を含む。本明細書に用いた「ベクター」なる用語は、それが連結されるもう一つの核酸を輸送できる核酸分子をいう。１つのタイプのベクターは、さらなるＤＮＡセグメントが連結できる円形の二本鎖ＤＮＡループをいう「プラスミド」である。もう一つのタイプのベクターは、ウイルスベクターであり、ここに、さらなるＤＮＡセグメントをウイルスゲノムに連結できる。ある種のベクターは、それらが導入される宿主細胞に自律増殖できる（例えば、細菌ベクターは、細菌の複製開始点およびエピゾーム哺乳動物ベクターを有する）。他のベクター（例えば、非エピゾーム哺乳動物ベクター）は、宿主細胞中への導入に際して宿主細胞のゲノムへ組込まれ、それによって、宿主ゲノムと共に複製される。さらに、ある種のベクターは、それらが効果的に連結した遺伝子の発現を指令できる。かかるベクターは、本明細書中では「発現ベクター」という。一般には、組換えＤＮＡ手法において利用できる発現ベクターは、しばしばプラスミドの形態である。本明細書のおいて、「プラスミド」および「ベクター」は互換的に用いることができ、プラスミドが最も共通して用いて形態のベクターである。しかしながら、本発明は、等価な機能を発揮するウイルスのベクター（例えば、応答の不完全なレトロウイルス、アデノウイルスとアデノ関連性ウイルス）のごときかかる他の形態の発現ベクターを含むことを意図する。
【０１５５】
本発明方法に用いられるべき組換え発現ベクターは、宿主細胞中の核酸の発現に適する形態における本発明の核酸を含み、それは、組換えの発現ベクターが、発現されるべき核酸配列に作動可能に連結した発現に用いられるべき宿細胞に基づき選択された１以上の通常の配列を含むことを意味する。組換え発現ベクター内の、「作動可能に連結した」ヌクレオチド配列は、注目するヌクレオチド配列が、（例えば、インビトロ転写／翻訳系におけるか、またはベクターが宿主細胞へ導入される場合の宿主細胞における）ヌクレオチド配列の発現を可能とする方法で、調節配列（群）に連結することを意味することを意図する。「調節配列」なる用語は、プロモーター、エンハンサーおよび他の発現制御要素（例えば、ポリアデニル化シグナリング）を含むことを意図する。かかる調節配列は、例えば、Goeddel （１９９０） Methods Enzymol. １８５：３-７に記載されている。調節配列は、多くのタイプの宿主細胞中のヌクレオチド配列の構成的発現を指令するもの、およびある種の宿主細胞（例えば、組織特異的な調節配列）中にだけヌクレオチド配列の発現を指令するものを含む。発現ベクターの設計は、トランスフォームされるべき宿主細胞の選択、所望の蛋白質の発現レベル等のごとき因子に依存し得ることは当業者によって十分に認識されるであろう。本発明の発現ベクターは宿主細胞に導入し、それによって、本明細書に記載のごとき核酸によりコードされる融合蛋白質またはペプチドを含めた蛋白質またはペプチド（例えば、１０２１８蛋白質、１０２１８蛋白質の突然変異体形態、融合蛋白質等）を生成できる。
【０１５６】
本発明方法に用いた組換え発現ベクターは、原核生物または真核細胞中の１０２１８蛋白質の発現のために設計できる。例えば、１０２１８蛋白質は、Ｅ．ｃｏｌｉのごとき細菌細胞、昆虫細胞（バキュロウイルス発現ベクターを用いる）、酵母細胞または哺乳動物細胞中で発現できる。適当な宿主細胞はさらにGoeddel （１９９０） 前記に言及されている。あるいは、組換え発現ベクターは、例えば、Ｔ７プロモーター調節配列およびＴ７Ｔ７ポリメラーゼを用いて、ｉｎ ｖｉｔｒｏにて転写および翻訳できる。
【０１５７】
原核生物における蛋白質の発現は、融合または非融合の蛋白質のいずれかの発現を指令する構成的または誘導可能なプロモーターを含むベクターでＥ．ｃｏｌｉ中で最もしばしば行なわれる。融合ベクターは、通常、組換え蛋白質のアミノ末端にその中でコード化された蛋白質に多くのアミノ酸を付加する。かかる融合ベクターは典型的には３つの目的：１）組換え蛋白質の発現の増加；２）組換え蛋白質の溶解度の増加；および３）アフィニティー精製におけるリガンドとして作用させることによる組換え蛋白質の精製の援助に役立つ。しばしば、融合発現ベクターにおいて、蛋白質切断部位を融合部位および組換え蛋白質の結合部位にて導入し、融合部位からの組換え蛋白質の分離を可能とし、引き続いて、融合蛋白質を精製する。かかる酵素およびそれらの同系統の認識配列は、Ｘａ因子、トロンビンおよびエンテロキナーゼを含む。典型的な融合発現ベクターは、標的組換え蛋白質に、各々、グルタチオンＳ転移酵素（ＧＳＴ）、マルトースＥ結合蛋白質または蛋白質Ａを融合させたｐＧＥＸ（Pharmacia Biotech Inc; Smith, D. B. およびJohnson, K. S.（１９８８）Gene ６７：３１−４０）、ｐＭＡＬ（New England Biolabs, Beverly, Mass.）およびｐＲＩＴ５（Pharmacia, Piscataway, N.J.）を含む。
【０１５８】
精製された融合蛋白質は、１０２１８活性アッセイ方法（例えば、後記に詳述される直接的アッセイ方法または競合アッセイ方法）において、または１０２１８蛋白質に特異的な抗体を精製するために利用できる。好ましい具体例において、本発明のレトロウイルス発現ベクター中で発現した１０２１８融合蛋白質を利用して、骨髄細胞を感染でき、それは引き続いて照射された被移植者へ移植される。次いで、十分な時間が通過した（例えば、６週間）後、対象被移植者の病理学を検査する。
【０１５９】
他の具体例において、本発明の核酸は哺乳動物の発現ベクターを用いて、哺乳動物細胞中で発現する。哺乳動物発現ベクターの例は、ｐＣＤＭ８（Seed, B. （１９８７） Nature ３２９：８４０）およびｐＭＴ２ＰＣ（Kaufmanら （１９８７） EMBO J. ６：１８７-１９５）を含む。哺乳動物細胞中で用いた場合、発現ベクターの制御機能は、しばしば、ウイルス調節要素により供される。例えば、一般的に用いたプロモーターは、ポリオーマウイルス、アデノウイルス２、サイトメガロウイルスおよびシミアンウイルス（Simian Viros）４０から由来する。他の原核生物・真核細胞の双方に適する発現システムについては、１６および１７ of Sambrook, J.ら, Molecular Cloning： A Laboratory Manual. 第２版, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., １９８９の第１６および１８章を参照されたし。
【０１６０】
もう一つの具体例において、組換え哺乳動物発現ベクターは、特定の細胞タイプ（例えば、組織特異的な調節要素は核酸を発現するために用いる）中で核酸の発現を優先的に指令できる。
【０１６１】
本発明方法は、アンチセンス配向で発現ベクターにクローニングされた本発明のＤＮＡ分子を含む組換え発現ベクターをさらに用いることができる。すなわち、ＤＮＡ分子は、１０２１８ｍＲＮＡにアンチセンスであるＲＮＡ分子の（ＤＮＡ分子の転写による）発現を可能とする方法で調節配列に作動可能に連結される。アンチセンス配向でクローニングされた核酸に作動可能に連結した調節配列を選択でき、それは、様々な細胞タイプ中のアンチセンスＲＮＡ分子の連続的な発現を指令し、例えば、ウイルスのプロモーター、エンハンサー、または調節配列を選択でき、それはアンチセンスＲＮＡの構成的な組織特異的または細胞特異的な発現を指令する。アンチセンスの発現ベクターは、組換えのプラスミド、ファージミドまたは弱毒化ウイルスの形態であり得、ここに、アンチセンス核酸は、高効率調節領域の制御下で産生され、その活性はベクターが導入された細胞タイプにより決定できる。アンチセンス遺伝子を用いる遺伝子発現の調節の言及については、Weintraub, H.ら, Antisense RNA as a molecular tool for genetic analysis, Reviews-Trends in Genetics, Vol. １（１） １９８６を参照されたし。
【０１６２】
本発明のもう一つの態様は、本発明の１０２１８核酸分子（例えば、組換え発現ベクター内の１０２１８核酸分子または宿主細胞のゲノムの特定の部位へそれが同族に再結合するのを可能とする配列を含む１０２１８核酸分子）が導入された宿主細胞の使用に関する。「宿主細胞」および「組換え宿主細胞」なる用語は、本明細書中で交換可能に用いられる。かかる用語は、特定の対象細胞だけでなくかかる細胞の子孫または潜在的な子孫もいうと理解される。ある種の修飾が突然変異または環境上の影響のいずれかにより後続世代に発生し得るために、かかる子孫は、実際には親細胞と同一ではないかもしれないが、本明細書に用いた用語の範囲内で依然として含まれている。
【０１６３】
宿主細胞はいずれかの原核生物または真核細胞であり得る。例えば、１０２１８蛋白質は、Ｅ．ｃｏｌｉのごとき細菌細胞、昆虫細胞、酵母または（チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）またはＣＯＳ細胞のごとき）哺乳動物細胞中で発現できる。他の適当な宿主細胞は当業者に知られている。
【０１６４】
ベクターＤＮＡは従来の形質転換またはトランスフェクション手法によって原核生物または真核細胞へ導入することができる。本明細書に用いた「形質転換」および「トランスフェクション」なる用語は、リン酸カルシウムまたは塩化カリウム共析出、ＤＥＡＥデキストラン媒介トランスフェクション、リポフェクションまたはエレクトロポレーションを含めた宿主細胞への外来核酸（例えば、ＤＮＡ）を導入する様々な技術認識された手法をいうことを意図する。宿主細胞を形質転換または感染させるのに適する方法は、Sambrookら （Molecular Cloning： A Laboratory Manual. 第２版, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., １９８９）および他の実験手引書に見出すことができる。
【０１６５】
培養における原核生物または真核生物の宿主細胞のごとき本発明方法に用いた宿主細胞は、１０２１８蛋白質を産生する（すなわち、発現する）のに用いることができる。従って、本発明は、本発明の宿主細胞を用いて、１０２１８蛋白質を産生する方法をさらに提供する。１つの具体例において、本方法は、１０２１８蛋白質が生成されるような適当な媒体中で（１０２１８蛋白質をコードする組換え発現ベクターが導入された）本発明の宿主細胞を培養することを含む。もう一つの具体例において、本方法は、さらに、媒体または宿主細胞から１０２１８蛋白質を単離することを含む。
【０１６６】
ＶＩ．  本発明方法に用いた単離核酸分子
単離されたヒト１０２１８  ｃＤＮＡ（本明細書中でＰ２Ｘ４ともいう）のコード配列およびヒト１０２１８ポリペプチドの予測されたアミノ酸配列は、各々、配列番号：１および２に示されている。また、１０２１８アミノ酸配列は、Garcia-Guzmanら （１９９７） Molecular Phannacolgy ５１：１０９ （ここに出典明示してその内容を本明細書の一部とみなす）に記載されている。また、１０２１８ヌクレオチド配列は、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＭ−００２５６０（配列番号：１）およびＹ０７６８４（ここに出典明示してその内容を本明細書の一部とみなす）に記載されている。
【０１６７】
本発明方法は、１０２１８蛋白質またはその生物学的に活性な部分をコードする単離核酸分子、ならびに１０２１８核酸分子の増幅または突然変異用のＰＣＲプライマーとして用いる１０２１８をコードする核酸分子（例えば、１０２１８ｍＲＮＡ）および断片を同定するためのハイブリダイゼーション・プローブとして用いるのに十分な核酸断片の使用を含む。本明細書に用いた「核酸分子」なる用語は、ＤＮＡ分子（例えば、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）およびＲＮＡ分子（例えば、ｍＲＮＡ）、ならびにヌクレオチドアナログを用いて生成されたＤＮＡまたはＲＮＡのアナログを含むことを意図する。核酸分子は、一本鎖または二本鎖であり得るが、好ましくは二本鎖ＤＮＡである。
【０１６８】
本発明方法に用いる核酸分子、例えば、配列番号：１のヌクレオチド配列を有する核酸分子またはその一部分は、標準的分子生物学手法、および本明細書に供される配列情報を用いて単離できる。ハイブリダイゼーション・プローブとして配列番号：１の核酸配列のすべてまたは一部分を用いると、１０２１８核酸分子は標準的ハイブリダイゼーションおよびクローニング手法（例えば、Sambrook, J., Fritsh, E. F.,およびManiatis, T. Molecular Cloning： A Laboratory Manual. 第２版, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., １９８９）を用いて単離できる。
【０１６９】
さらに、配列番号：１の全てまたは一部分を含む核酸分子を配列番号：１の配列に基づいて設計された合成オリゴヌクレオチドプライマーを用いるポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）により単離できる。
【０１７０】
本発明方法に用いた核酸は、標準ＰＣＲ増幅手法により、鋳型および適当なオリゴヌクレオチドプライマーとしてｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、あるいはゲノムＤＮＡを用いて増幅できる。さらに、１０２１８ヌクレオチド配列に対応するオリゴヌクレオチドを標準合成手法、例えば、自動ＤＮＡシンセサイザーを用いて調製できる。
【０１７１】
好ましい具体例において、本発明方法に用いた単離核酸分子は、配列番号：１に示されるヌクレオチド配列、配列番号：１に示されるヌクレオチド配列の相補体またはこれらのヌクレオチド配列のうちのいずれかの一部分を含む。配列番号：１に示されたヌクレオチド配列に相補的である核酸分子は、配列番号：１に示されたヌクレオチド配列にハイブリダイズでき、それにより安定な二本鎖を形成できる配列番号：１に示されたヌクレオチドに十分に相補的であるものである。
【０１７２】
さらにもう一つの好ましい具体例において、本発明方法に用いた単離核酸分子は配列番号：１で示された全長のヌクレオチド配列またはこのヌクレオチド配列のいずれかの一部分に同一の少なくとも約５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％あるいはそれを超えるヌクレオチドハイブリダイズを含む。
【０１７３】
さらに、本発明方法に用いた核酸分子は、配列番号：１の核酸配列の一部分だけ、例えば、プローブまたはプライマーとして用いることができる断片、または１０２１８蛋白質の一部分、例えば、１０２１８蛋白質の生物学的に活性な部分をコードする断片を含むことができる。プローブ／プライマーは、典型的には、配列番号：１のアンチセンスの配列番号：１のセンス配列あるいは配列番号：１の天然に発生する対立変異体または突然変異体の少なくとも約１２または１５、好ましくは、約２０または２５、より好ましくは、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５または７５個の連続ヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列の領域を含む。１つの具体例において、本発明方法に用いた核酸分子は、長さが１００を越える、１００−２００、２００−３００、３００−４００、４００−５００、５００−６００、６００−７００、７００−８００、８００−９００、９００−１０００、１０００−１１００、１１００−１２００、１２００−１３００またはそれを超え、かつ配列番号：１の核酸分子にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む。
【０１７４】
本明細書に用いた「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」なる用語は、相互にかなり同一または相同性であるヌクレオチド配列が相互にハイブリダイズしたままとなるハイブリダイゼーションおよび洗浄についての条件を記載することを意図する。好ましくは、その条件は、相互に少なくとも約７０％、より好ましくは、少なくとも約８０％、さらにより好ましくは少なくとも約８５または９０％同一の配列が、相互にハイブリダイズしたままとなるようなものである。かかるストリンジェントな条件は、当業者に知られており、それはCurrent Protocols in Molecular Biology, Ausubelら編, John Wiley & Sons, Inc. （１９９５）, セクション２, ４および６に見出すことができる。さらなるストリンジェントな条件は、Molecular Cloning： A Laboratory Manual, Sambrookら, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y. （１９８９）,第７, ９および１１章に見出すことができる。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の好ましい非限定の例は、約６５〜７０℃での４×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）中のハイブリダイゼーション（または約４２〜５０℃での４×ＳＳＣ＋５０％ホルムアルデヒド中のハイブリダイゼーション）に続いて、約６５〜７０℃での１×ＳＳＣで１回以上の洗浄を含む。高度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の好ましい非限定の例は、約６５〜７０℃での１×ＳＳＣ中のハイブリダイゼーション（または約４２〜５０℃での１×ＳＳＣ＋５０％ホルムアルデヒド中のハイブリダイゼーション）に続いて、約６５〜７０℃での０.３×ＳＳＣで１回以上の洗浄を含む。低下したストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の好ましい非限定の例は、約５０〜６０℃での４×ＳＳＣ中のハイブリダイゼーション（または別法として約４０〜４５℃での６×ＳＳＣ＋５０％ホルムアルデヒド中のハイブリダイゼーション）に続いて、約５０〜６０℃での２×ＳＳＣで１回以上の洗浄を含む。また、例えば、６５〜７０℃または４２〜５０℃での前記の値の中間の範囲は、本発明により含めれることを意図する。ＳＳＰＥ（１×ＳＳＰＥは、０.１５Ｍ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４および１.２５ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７.４である）は、ハイブリダイゼーションおよび洗浄緩衝液中のＳＳＣ（１×ＳＳＣは０.１５Ｍ  ＮａＣｌおよび１５ｍＭクエン酸水素ナトリウムである）に代えて用いることができ；ハイブリダイゼーションが完了した後、洗浄を各々１５分間行う。長さが５０塩基対未満であると予想されるハイブリッドのハイブリダイゼーション温度は、ハイブリッドの融解温度（Ｔｍ）の５〜１０℃低くすべきであり、Ｔｍは以下の式により決定される。長さが１８塩基対未満のハイブリッドでは、Ｔｍ（℃）＝２（Ａ＋Ｔ塩基の＃）＋４（Ｇ＋Ｃ塩基の＃）。長さが１８および４９塩基対の間のハイブリッドでは、Ｔｍ（℃）＝８１.５＋１６.６（ｌｏｇ１０［Ｎａ＋］＋０.４１（％Ｇ＋Ｃ）−（６００／Ｎ）［式中、Nはそのハイブリッド中の塩基数であり、［Ｎａ＋］はハイブリダイゼーション緩衝液中のナトリウムイオン濃度である（１×ＳＳＣでは［Ｎａ＋］＝０.１６５Ｍ）］。また、当業者により、さらなる試薬をハイブリダイゼーションおよび／または洗浄緩衝液に添加して、限定されるものではないが、ブロッキング剤（例えば、ＢＳＡまたはサケまたはニシン精液キャリアーＤＮＡ）、洗浄剤（例えば、ＳＤＳ）、キレート剤（例えば、ＥＤＴＡ）、フィコール（Ficoll）、ＰＶＰ等を含む膜、例えば、ニトロセルロースまたはナイロン膜に対する核酸分子の非特異的ハイブリダイゼーションを低下させることは認識されるであろう。ナイロン膜を用いる場合、特に、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件のさらなる好ましい非限定の例は、約６５°の０.２５−０.５Ｍ  ＮａＨ２ＰＯ４、７％ＳＤＳに続いて、約６５°の０.０２Ｍ  ＮａＨ２ＰＯ４、１％ＳＤＳにて１回以上の洗浄であり、ChurchおよびGilbert （1984） Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:1991-1995参照されたし（または、別法として、０.２ＳＳＣ、１％ＳＤＳである）。
【０１７５】
好ましい具体例において、プローブは、それに結合する標識群をさらに含み、例えば、その標識群は同位体元素、蛍光化合物、酵素または酵素共同因子であり得る。かかるプローブは、対象からの細胞の試料中の１０２１８をコードする核酸のレベルを測定し、例えば、ｍＲＮＡレベルを検出するか、あるいはゲノム１０２１８遺伝子が突然変異していたかまたは欠失したかを決定することによるごとく、１０２１８蛋白質を誤って発現する細胞または組織を装置する診断用テストキットの一部分として用いることができる。
【０１７６】
本発明方法は、さらに、遺伝子コードの縮重により配列番号：１に示されるヌクレオチド配列と異なり、かくして、配列番号：１に示されるヌクレオチド配列によりコードされたものと同一の１０２１８蛋白質をコードする核酸分子の使用を含む。もう一つの具体例において、本発明方法に含まれる単離核酸分子は、配列番号：２に示されるアミノ酸配列が有する蛋白質をコードするヌクレオチド配列を持つ。
【０１７７】
本発明方法は、さらに、ヒト１０２１８の対立変異体、例えば、機能的および非機能的な対立変異体の使用を含む。機能的な対立変異体の形質転換は、１０２１８活性を維持するヒト１０２１８蛋白質の天然に発生しているアミノ酸配列変異体でる。機能的な対立変異体は、典型的には、配列番号：２の１以上のアミノ酸の保存的置換、またはその蛋白質の非常に重要ではない領域中の非常に重要ではない残基の置換、欠失もしくは挿入を含むであろう。非機能的な対立変異体は、１０２１８活性を有さないヒト１０２１８蛋白質の天然に発生しているアミノ酸配列変異体である。非機能的な対立変異体は、典型的には、配列番号：２のアミノ酸の非保存的な置換、欠もしくは挿入または早期の切断、あるいは蛋白質の非常に重要な残基または非常に重要な領域中の置換、欠失もしくは挿入を含むであろう。本発明方法は、さらに、ヒト１０２１８蛋白質の非ヒトのオルトログ（orthologue）を使用し得る。ヒト１０２１８蛋白質のオルトログは、非ヒト生物から単離され、同一の１０２１８活性を所有する蛋白質である。
【０１７８】
本発明方法は、さらに、突然変異が導入された配列番号：１のヌクレオチド配列
またはその一部分を含む核酸分子の使用を含む。その突然変異は、「必須でない」アミノ酸残基または「必須」アミノ酸残基にてアミノ酸置換に導き得る。「必須でない」アミノ酸残基は、生物学的活性を変化させることなく、１０２１８の野生型配列（例えば、配列番号：２の配列）から変化し得る残基であり、一方、「必須」アミノ酸残基は、生物学的活性につき必要である。例えば、本発明の１０２１８蛋白質またはそのＰ２Ｘファミリー（例えば、Ｐ２Ｘ１、Ｐ２Ｘ２、Ｐ２Ｘ３、Ｐ２Ｘ５、Ｐ２Ｘ６およびＰ２Ｘ７）の間で保存されているアミノ酸残基は、変化に影響を受けやすいようではない。
【０１７９】
突然変異は、部位特異的突然変異誘発およびＰＣＲ媒介突然変異生成のごとき標準手法により配列番号：１に導入できる。好ましくは、保存的なアミノ酸置換は、１以上の予測された必須でないアミノ酸残基で作成される。「保存的なアミノ酸置換」は、アミノ酸残基が同様の側鎖を有するアミノ酸残基で置換されるものである。同様のアミノ酸を有するアミノ酸残基のファミリーは当該技術分野において規定された。これらのファミリーは、塩基側鎖を持つアミノ酸（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を持つアミノ酸（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖を持つアミノ酸（例えば、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン）、非極性側を持つアミノ酸（例えば、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、ベータ−分岐側鎖を持つアミノ酸（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）および芳香族側鎖を持つアミノ酸（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を含む。かくして、１０２１８蛋白質における予測される必須ではないアミノ酸残基は、好ましくは、同一側鎖ファミリーからのもう一つのアミノ酸残基で置換される。あるいは、もう一つの具体例において、突然変異は、飽和突然変異生成によってのごとき１０２１８をコードする配列のすべてまたは一部分に沿ってランダムに導入でき、得られた突然変異体を１０２１８生物学的活性につきスクリーニングして、活性を保持する突然変異体を同定できる。配列番号：１の突然変異生成に続いて、コード化された蛋白質を組換えにて発現させ、蛋白質の活性を本明細書に記載されたアッセイ方法を用いて決定できる。
【０１８０】
本発明のもう一つの態様は、配列番号：１のヌクレオチド配列にアンチセンスである単離核酸分子の使用に関する。「アンチセンスの」核酸は、蛋白質をコード化する「センス」核酸に相補的である、例えば、二本鎖ｃＤＮＡ分子をコードする鎖に相補的であるか、またはｍＲＮＡ配列に相補的であるヌクレオチド配列を含む。従って、アンチセンス核酸は、センス核酸に水素結合できる。アンチセンス核酸は、全１０２１８コード鎖ｍまたはその一部分に相補的であり得る。１つの具体例において、アンチセンス核酸分子は、１０２１８をコードするヌクレオチド配列のコード鎖の「コード領域」にアンチセンスである。「コード領域」なる用語は、アミノ酸残基に翻訳されるコドンを持つヌクレオチド配列の領域をいう。もう一つの具体例において、アンチセンスの核酸分子は、１０２１８をコードするヌクレオチド配列のコード鎖の「非コード領域」にアンチセンスである。「非コード領域」なる用語は、アミノ酸に翻訳されないコード領域に近接する５’および３’配列をいう（５’および３’非翻訳領域ともいう）。
【０１８１】
本明細書に開示された１０２１８をコードするコード鎖配列を得ると、本発明のアンチセンスの核酸は、ＷａｔｓｏｎおよびＣｒｉｃｋ塩基対の規則により設計できる。アンチセンスの核酸分子は、１０２１８ｍＲＮＡのコードする全領域に相補的であり得るが、より好ましくは１０２１８ｍＲＮＡのコード領域または非コード領域の一部分だけにアンチセンスであるオリゴヌクレオチドである。例えば、アンチセンスのオリゴヌクレオチドは、例えば、長さが約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５または５０個のヌクレオチドであり得る。本発明のアンチセンスの核酸は、当該技術分野に知られた化学合成および酵素連結反応を用いて構築できる。例えば、アンチセンスの核酸（例えば、アンチセンスのオリゴヌクレオチド）は、天然に発生するヌクレオチドあるいは分子の生物学的安定性を増加させるかまたはアンチセンスおよびセンス核酸間に形成された二本鎖の物理的な安定性を増加させるように設計された種々の修飾されたヌクレオチドを用いて化学合成でき、例えば、ホスホロチオエート誘導体およびアクリジン置換されたヌクレオチドを用いることができる。アンチセンスの核酸を生成するために用いることができる修飾されたヌクレオチドの例には、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４−アセチルシトシン、５−（カルボキシヒドロキシルメチル）ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、ベータ−Ｄ−ガラクトシルクエソシン（galactosylqueosine）、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２,２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−アデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、ベータ−Ｄ−マンノシルキューオシン（mannosyl queosine）、５’−メトキシカルボキシメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸、ウィブトキシン（wybutoxosine）、プソイドウラシル、キューオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、５−メチル−２−チオウラシル、（３−（３−アミノ−３−Ｎ−２−カルボキシプロピル）ウラシル、（ａｃｐ３）ｗ、および２,６−ジアミノプリンが含まれる。あるいは、アンチセンスの核酸は、核酸がアンチセンス配向でサブクローニングされた発現ベクターを用いて生物学的に生成できる（すなわち、挿入された核酸から転写されたＲＮＡは、注目する標的核酸にアンチセンス配向であろう）。本発明方法に用いたアンチセンスの核酸分子は、さらにセクションＩＶに前記されている。
【０１８２】
さらにもう一つの具体例において、本発明方法に用いた１０２１８核酸分子は、塩基部位、糖部位またはリン酸骨格にて修飾して、例えば、分子の安定性、ハイブリダイゼーションまたは溶解性を改良できる。例えば、核酸分子のデオキシリボースリン酸骨格を修飾して、ペプチド核酸を生成できる（Hyrup B.ら （１９９６） Bioorganic & Medicinal Chemistry ４ （１）： ５-２３参照）。本明細書に用いた「ペプチド核酸」または「ＰＮＡ」なる用語は、デオキシリボース・リン酸骨格が偽ペプチド骨格および４種だけの天然のヌクレオベース（nucleobase）により置換される核酸ミミック、例えば、ＤＮＡミミックをいう。ＰＮＡの中性の骨格は、低イオン強度の条件下のＤＮＡおよびＲＮＡへの特定のハイブリダイゼーションを可能とすることが示された。ＰＮＡオリゴマーの合成は、Hyrup B.ら （１９９６） 前記；Perry-O'Keefeら （１９９６） Proc. Natl. Acad. Sci. ９３：１４６７０-６７５に記載のごとき標準的な固相ペプチド合成プロトコールを用いて行うことができる。
【０１８３】
１０２１８核酸分子のＰＮＡは、本明細書に記載された治療および診断上の適用に用いることができる。例えば、ＰＮＡは、例えば、転写または翻訳の停止（arrest）を誘導するか、または複製を阻害することにより遺伝子の配列特異的な修飾のためにアンチセンスまたは抗遺伝子剤として用いることができる。また、１０２１８核酸分子のＰＮＡは、（例えば、ＰＮＡ指令ＰＣＲクランピングによる）遺伝子中の単一塩基対突然変異の分析に用いることができ；他の酵素と組み合わせた場合に「人工制限酵素」として（例えば、Ｓ１ヌクレアーゼ（Hyrup B.ら （１９９６） 前記））；またはＤＮＡ配列決定またはハイブリダイゼーション用のプローブもしくはプライマーとして（Hyrup B.ら （１９９６） 前記；Perry-OKeefeら （１９９６） 前記）用いることができる。
【０１８４】
もう一つの具体例において、１０２１８ＰＮＡは、（例えば、それらの安定または細胞取込みを増強するために）ＰＮＡ−ＤＮＡキメラの形成によって、またはリポソームまたは当該技術分野において知られたドラッグデリバリーの他の手法の使用によって、ＰＮＡに疎水性または他の援助基を結合することによって修飾できる。例えば、ＰＮＡ−ＤＮＡの有利な特性を組み合わせる得る１０２１８核酸分子のＰＮＡ−ＤＮＡキメラを生成できる。かかるキメラはＤＮＡ認識酵素（例えば、ＲＮアーゼＨおよびＤＮＡポリメラーゼ）が、ＤＮＡ部分と相互作用するのを可能とし、一方、そのＰＮＡ部分は高い結合親和性および特異性を供するであろう。ＰＮＡ−ＤＮＡキメラは、塩基スタッキング、ヌクレオベース間の結合数、および配向（Hyrup B.ら （１９９６） 前記）に関して選択された適当な長さのリンカーを用いて連結できる。ＰＮＡ−ＤＮＡキメラの合成は、Hyrup B.ら （１９９６） 前記およびFinn P. J.ら （１９９６） Nucleic Acids Res. ２４ （１７）： ３３５７-６３に記載されたように行うことができる。例えば、ＤＮＡ鎖は、例えば、標準的なのホスホルアミダイト連結化学を用いて、固体支持体上で合成でき、修飾されたヌクレオシド・アナログ、例えば、５’−（４−メトキシトリチル）アミノ−５’−デオキシ−チミジンホスホルアミダイトは、PNAおよびＤＮＡの５’端間のごときで用いることができる（Mag, M.ら （１９８９） Nucleic Acid Res. １７： ５９７３-８８）。次いで、ＰＮＡモノマーは、段階的にカップリングさせて、５’ＰＮＡセグメントおよび３’ＤＮＡセグメントを持つキメラ分子を生成する（Finn P. J.ら （１９９６）前記）。あるいは、キメラ分子は、５’ＤＮＡセグメントおよび３’ＰＮＡセグメントで合成できる（Peterser, K.H.ら （１９７５） Bioorganic Med. Chem. Lett. ５： １１１９-１１１２４）。
【０１８５】
もう一つの具体例において、本発明方法に用いたオリゴヌクレオチドは、（例えば、ｉｎ ｖｉｖｏにて宿主細胞受容体を標的とする）ペプチド、または細胞膜（例えば、Letsingerら （１９８９） Proc. Natl. Acad. Sci. USA ８６：６５５３-６５５６；Lemaitreら （１９８７） Proc. Natl. Acad. Sci. USA ８４：６４８-６５２；ＰＣＴ公開番号ＷＯ８８／０９８１０参照）または血流−脳関門（例えば、ＰＣＴ公開番号W０８９／１０１３４）を横切る輸送を促す剤のごとき他の付加的な群を含む。加えて、オリゴヌクレオチドは、ハイブリダイゼーションが引金となる切断剤（例えば、Krolら （１９８８） Bio-Techniques ６：９５８-９７６参照）または挿入剤（例えば、Zon （１９８８） Pharm. Res. ５：５３９-５４９参照）で修飾できる。この目的のために、オリゴヌクレオチドは、他の分子（例えば、ペプチド、ハイブリダイゼーションの引金となる架橋剤、輸送剤またはハイブリダイゼーションの引金となる切断剤）にコンジュゲートできる。
【０１８６】
ＶＩＩ．  本発明方法に用いた単離された１０２１８蛋白質および抗１０２１８抗体
本発明方法は、単離された１０２１８蛋白質およびその生物学的に活性な部分、ならびに抗１０２１８抗体を生起するための免疫原として使用するのに適するポリペプチド断片の使用を含む。１つの具体例において、ネイティブな１０２１８蛋白質は、標準的蛋白質精製手法を用いる適当な精製スキームにより細胞または組織源から単離できる。もう一つの具体例において、１０２１８蛋白質は、組換えＤＮＡ手法によって産生される。組換えの発現の別法として、１０２１８蛋白質またはポリペプチドを標準的なペプチド合成手法を用いて化学合成できる。
【０１８７】
本明細書に用いた１０２１８蛋白質の「生物学的に活性な部分」は１０２１８活性を有する１０２１８蛋白質の断片を含む。１０２１８蛋白質の生物学的に活性な部分は、全長の１０２１８蛋白質よりも少ないアミノ酸を含み、１０２１８蛋白質の少なくとも1つの活性を示す１０２１８蛋白質のアミノ酸配列、例えば、配列番号：２に示されたアミノ酸配列に十分に同一かまたは由来するアミノ酸配列を含むペプチドを含む。典型的には、生物学的に活性な部分は、１０２１８蛋白質の少なくとも１つの活性を持つドメインまたはモチーフ（例えば、アポトーシス活性の調節に関与すると考えられている１０２１８蛋白質のＮ末端基領域）を含む。１０２１８蛋白質の生物学的に活性な部分は、例えば、あるポリペプチド、例えば、その長さが２５、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２５０、３００またはそれを超えるアミノの酸であり得る。１０２１８蛋白質の生物学的に活性な部分は、１０２１８活性を変調する薬剤の開発の標的として用いることができる。
【０１８８】
好ましい具体例において、本発明方法に用いた１０２１８蛋白質は、配列番号：２に示されるアミノ酸配列を持つ。他の具体例において、１０２１８蛋白質は、配列番号：２の蛋白質に実質的に同一であり、配列番号：２の蛋白質の機能的な活性を保持し、それはまだ前記のサブセクションＶにおいて詳細に記載された天然の対立遺伝子変異または突然変異生成のためにアミノ酸配列において異なる。従って、もう一つの具体例において、本明細書に用いた１０２１８蛋白質は、配列番号：２に少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超えて同一なアミノ酸配列を含む蛋白質である。
【０１８９】
２つのアミノ酸配列または２つの核酸配列のパーセント同一性を決定するために、その配列を、最適な比較目的のために整列させる（例えば、ギャップは最適な整列のために第１もしくは第２のアミノ酸または核酸配列のうちの一方または双方に導入できるにおいて導入でき、非同一配列は、比較目的のために無視できる）。好ましい具体例において、比較目的のために整列させた参照配列の長さは、少なくとも３０％、好ましくは少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも５０％、さらにより好ましくは少なくとも６０％およびさらにより好ましくは、７０％、８０％、または９０％の参照配列の長さである（例えば、５００個のアミノ酸残基を持つ配列番号：２の１０２１８アミノ酸配列に第２の配列を整列させる場合、少なくとも７５、好ましくは少なくとも１５０、より好ましくは少なくとも２２５、さらにより好ましくは、少なくとも３００およびさらにより好ましくは、少なくとも４００個、またはそれを超えるアミノ酸残基を整列させる）。次いで、対応するアミノ酸位置またはヌクレオチド位置でのアミノ酸残基またはヌクレオチドを比較する。第１の位置が第２の配列中の対応する位置としての同一アミノ酸残基またはヌクレオチドにより占有される場合、その分子は、その位置にて同一である（本明細書に用いたアミノ酸または核酸の「同一性」はアミノ酸または核酸「相同性」と等価である）。２つの配列間のパーセント同一性は、その２つの配列の最適な整列につき導入することが必要であるギャップ数、および各ギャップの長さを考慮して、配列により共有された同一位置の数の関数ある。
【０１９０】
２つの配列間の配列の比較およびパーセント同一性の決定は数学的アルゴリズムを用いて達成できる。好ましい具体例において、２つのアミノ酸配列間のパーセント同一性は、Ｂｌｏｓｕｍ６２マトリックスまたはＰＡＭ２５０マトリックスのいずれか、および１６、１４、１２、１０、８、６、または４のギャップ重さ付けおよび１、２、３、４、５または６の長さの重み付けを用いて、ＧＣＧソフトウェアパッケージ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｃｇ．ｃｏｍにて利用可能）中のＧＡＰプログラムに組込まれたＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ（J. Mol. Biol. ４８：４４４−４５３（１９７０）アルゴリズムを用いて決定される。さらにもう一つの好ましい具体例において、２つのヌクレオチド配列間のパーセント同一性は、ＮＷＳgapdna.ＣＭＰマトリックスおよび４０、５０、６０、７０または８０のギャップ重さ付けおよび１、２、３、４、５または６の長さの重み付けを用いて、ＧＣＧソフトウェアパッケージ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｃｇ．ｃｏｍにて利用可能）中のＧＡＰプログラムを用いて決定される。もう一つの具体例において、２つのアミノ酸またはヌクレオチド配列間のパーセント同一性は、ＰＡＭ１２０ウェイト残基表、１２のギャップ長ペナルティーおよび４のギャップペナルティーを用いて、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２.０または２.０Ｕ）に組込まれたＥ．ＭｅｙｅｒｓおよびＷ．Ｍｉｌｌｅｒ（Comput．Appl．Biosci．４：１１−１７（１９８８））のアルゴリズムを用いて決定される。
【０１９１】
また、本発明方法は、１０２１８キメラ蛋白質または融合蛋白質を用いることができる。本明細書に用いた１０２１８「キメラ蛋白質」または「融合蛋白質」は、非１０２１８ポリペプチドに作動可能に連結した１０２１８ポリペプチドを含む。「１０２１８ポリペプチド」とは、１０２１８分子に対応するアミノ酸配列を有するポリペプチドをいうが、一方、「非１０２１８ポリペプチド」とは、１０２１８蛋白質に実質的に同族でない蛋白質、例えば、１０２１８蛋白質とは異なりかつ同一または異なる生物から由来する蛋白質に対応するアミノ酸配列を持つポリペプチドをいう。１０２１８融合蛋白質内の１０２１８ポリペプチドは、１０２１８蛋白質の全てまたは一部分に対応する。好ましい具体例において、１０２１８融合蛋白質は、１０２１８蛋白質の少なくとも１つの生物学的に活性な部分を含む。もう一つの好ましい具体例において、１０２１８融合蛋白質は、１０２１８蛋白質の少なくとも２つの生物学的に活性な部分を含む。融合蛋白質内の「作動可能に連結された」なる用語は、１０２１８ポリペプチドおよび非１０２１８ポリペプチドが相互にイン−フレームで融合することを示すことを意図する。非１０２１８ポリペプチドは、１０２１８ポリペプチドのＮ末端基またはＣ末端に融合できる。
【０１９２】
例えば、１つの具体例において、融合蛋白質は、１０２１８配列がＧＳＴ配列のＣ末端に融合されるＧＳＴ−１０２１８融合蛋白質である。かかる融合蛋白質は、組換え１０２１８の精製を促すことができる。
【０１９３】
もう一つの具体例において、この融合蛋白質は、そのＮ末端基で非相同性シグナル配列を含む１０２１８蛋白質である。ある種の宿主細胞（例えば、哺乳動物宿主細胞）において、１０２１８の発現および／または分泌は、非相同性シグナル配列の使用を通じて増加させることができる。
【０１９４】
本発明方法に用いた１０２１８融合蛋白質は、医薬組成物に組込み、対象にｉｎ ｖｉｖｏにて投与できる。１０２１８融合蛋白質を用いて、１０２１８基質のバイオアべイラビリティに影響させることができる。１０２１８融合蛋白質の使用は、例えば、（ｉ）１０２１８蛋白質をコードする遺伝子の異常な修飾または突然変異；（ｉｉ）１０２１８遺伝子の誤った調節；および（ｉｉｉ）１０２１８蛋白質の異常な翻訳後修飾により惹起された障害の処置に治療上有用であり得る。
【０１９５】
さらに、本発明方法に用いた１０２１８融合蛋白質は、抗１０２１８抗体を対象において精製するための免疫原として、１０２１８リガンドを精製するために、および１０２１８と１０２１８基質との相互作用を阻害する分子を同定するスクリーニングアッセイ方法において用いることができる。
【０１９６】
好ましくは、本発明方法に用いた１０２１８キメラまたは融合蛋白質は、標準的な組換えＤＮＡ手法によって生成される。例えば、異なるポリペプチド配列をコードするＤＮＡ断片を、例えば、連結用の平滑末端またはねじれ末端（stagger-ended termini）、適当な末端のために供する制限酵素消化、必要に応じた付着端のフィリング−イン（filling-in）、望ましくない結合を回避するための適当なアルカリホスファターゼ処理、および酵素連結を用いることにより通常の手法に従いイン−フレームで共に連結される。もう一つの具体例において、融合遺伝子は、自動ＤＮＡシンセサイザーを含めた通常の手法により合成できる。あるいは、遺伝子断片のＰＣＲ増幅はアンカープライマーを用いて行うことができ、連続的な２個の遺伝子断片間の相補的なオーバーハング（overhang）を引き起こし、引き続いてアニーリングおよび再増幅して、キメラ遺伝子配列を生成できる（例えば、Current Protocols in Molecular Biology, eds. Ausubelら John Wiley & Sons： １９９２）。さらに、多数の発現ベクトルが商業上入手可能であり、それは既に融合部位（例えば、ＧＳＴポリペプチド）をコードしている。１０２１８コード核酸は、融合部位が１０２１８蛋白質にイン−フレームで連結するようにかかる発現ベクターにクローニングできる。
【０１９７】
また、本発明は、また、１０２１８アゴニスト（ミメティックス（mimetics））として、または１０２１８アンタゴニストとして機能する１０２１８蛋白質の変異体の使用に関する。１０２１８蛋白質の変異体は、突然変異生成、例えば、１０２１８蛋白質の区別される点突然変異または切断により生成できる。１０２１８蛋白質のアゴニストは、１０２１８蛋白質の天然に発生する形態の生物学的活性に同一またはサブセットを実質的に保持できる。１０２１８蛋白質のアンタゴニストは、例えば、１０２１８蛋白質の１０２１８媒介活性を競合的に変調して１０２１８蛋白質の天然に発生する形態の１以上の活性を阻害できる。かくして、特定の生物学の効果は、制限された機能の変異体での処置により誘発できる。１つの具体例において、天然に発生する形態の蛋白質の生物学的活性のサブセットを有する変異体での対象の処置は、その天然に発生する形態の１０２１８蛋白質での処置に対して対象におけるより少しの副作用を有する。
【０１９８】
１つの具体例において、１０２１８アゴニスト（ミメティックス）として、または１０２１８アンタゴニストとして機能するいずれかの１０２１８蛋白質の変異体は、１０２１８蛋白質アゴニストまたはアンタゴニスト活性につき、１０２１８蛋白質の突然変異体、例えば、切断突然変異体の組み合わせのライブラリーをスクリーニングすることにより同定できる。１つの具体例において、１０２１８変異体の変化に富んだライブラリーは、核酸レベルにて組み合わせ突然変異生成によって生成され、そのライブラリーは、変化に富んだ遺伝子ライブラリーによってコードされる。１０２１８変異体の変化に富んだライブラリーは、例えば、縮重セットの潜在的な１０２１８配列が個々のポリペプチドとして、または別法としてその中のそのセットの１０２１８配列を含有する一組の大きな融合蛋白質（例えば、ファージディスプレイ）として、発現できるように遺伝子配列に合成オリゴヌクレオチドの混合物を酵素的に連結することにより生成できる。縮重したオリゴヌクレオチド配列から潜在的な１０２１８変異体のライブラリーを生成するために用いることができる様々な方法が存在する。縮重した遺伝子配列の化学合成は自動ＤＮＡシンセサイザーで行うことができ、次いで、合成遺伝子は、適当な発現ベクトルに連結できる。縮重セットの遺伝子の使用は、所望のセットの潜在的１０２１８配列をコードする全配列のある混合物における規定を可能とする。縮重したオリゴヌクレオチドの合成方法は、当該技術分野において知られている（例えば、Narang, S.A. （１９８３） Tetrahedron ３９：３；Itakuraら （１９８４） Annu. Rev. Biochem. ５３：３２３；Itakuraら （１９８４） Science １９８：１０５６；Ikeら （１９８３） Nucleic Acid Res. １１：４７７参照）。
【０１９９】
加えて、１０２１８蛋白質をコードする断片のライブラリーを用いて、スクリーニングに続いて、１０２１８蛋白質の変異体の選択用の１０２１８断片の変化に富んだライブラリーを生成できる。１つの具体例において、配列断片をコードするライブラリーは、ニックイングが分子当り約１回だけ発生する条件下にて１０２１８のコード配列の二本鎖のＰＣＲ断片をヌクレアーゼで処理して、二本鎖ＤＮＡを変性させて、そのＤＮＡを復元して異なるニック生成物からセンス／アンチセンス対を含むことができる二本鎖ＤＮＡを形成し、Ｓ１ヌクレアーゼでの処理により再形成した二本鎖から一本鎖を取り出し、次いで、発現ベクターに得られた断片ライブラリーを連結することにより生成できる。この方法によって、１０２１８蛋白質の様々なサイズのＮ末端基、Ｃ末端および内部断片をコードする発現ライブラリーを誘導できる。
【０２００】
いくつかの手法が、点突然変異または切断によって作成された組合せライブラリーの遺伝子産物をスクリーニングするために、および選択された特性を有する遺伝子産物についてのｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするために当該技術分野において知られている。かかる手法は、１０２１８蛋白質の組合せの突然変異生成によって生成された遺伝子ライブラリーの迅速なスクリーニングに適用できる。大きな遺伝子をスクリーニングするための高処理量分析に敏感に反応する最も広範囲に用いられている手法は、典型的には、複製可能な発現ベクターに遺伝子ライブラリーをクローニングし、ベクターの得られたライブラリーで適当な細胞を形質転換し、所望の活性の検出がその生成物が検出される遺伝子をコードするベクターの単離を促す条件下で組合せ遺伝子を発現することを含む。ライブラリーの機能的な突然変異体の頻度を増強する新しい手法の繰返し全体突然変異生成（recursive ensemble mutagesis）（ＲＥＭ）を１０２１８変異体を同定するためのスクリーニングアッセイ方法と組み合わせて用いることができる（ArkinおよびYourvan （１９９２） Proc. Natl. Acad. Sci. USA ８９：７８１１-７８１５；Delgraveら （１９９３） Protein Engineering ６（３）：３２７-３３１）。
【０２０１】
本発明方法は、さらに抗１０２１８抗体の使用を含む。単離された１０２１８蛋白質、またはその一部分もしくは断片は、ポリクローナルのおよびモノクローナル抗体調製のための標準的手法を用いて、１０２１８を結合する抗体を生成するために免疫原として用いることができる。全長１０２１８蛋白質を用いることができるか、または別法として、１０２１８抗原ペプチド断片を免疫原として用いることができる。１０２１８抗原ペプチドは、配列番号：２に示されるアミノ酸配列の少なくとも８個のアミノ酸残基を含み、ペプチドに対して高めた抗体が１０２１８蛋白質との特定の免疫複合体を形成するような１０２１８のエピトープを含む。好ましくは、抗原ペプチドは少なくとも１０のアミノ酸残基、より好ましくは、少なくとも１５のアミノ酸残基、さらにより好ましくは少なくとも２０のアミノ酸残基、および最も好ましくは少なくとも３０のアミノ酸残基を含む。
【０２０２】
抗原ペプチドにより含まれる好ましいエピトープは、蛋白質の表面上に位置する１０２１８の領域、例えば、親水性領域、ならびに高抗原性を持つ領域である。
【０２０３】
１０２１８免疫原は、免疫原で適当な対象（例えば、ウサギ、ヤギ、マウスまたは他の哺乳動物）を免疫することにより抗体を調製するために典型的に用いることができる。適当な免疫原の調製は、例えば、組換え発現された１０２１８蛋白質または化学合成された１０２１８ポリペプチドを含むことができる。その調製は、さらにＦｒｅｕｎｄの完全または不完全アジュバントのごときアジュバントまたは類似する免疫刺激剤を含むことができる。免疫原１０２１８製剤での適当な対象の免疫は、ポリクローナルの抗１０２１８抗体応答を誘導する。
【０２０４】
本明細書に用いた「抗体」なる用語は、免疫グロブリン分子および免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分、すなわち、１０２１８のごとき抗原と特異的に結合する（免疫反応する）抗原結合部位を含む分子をいう。免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分の例は、ペプシンのごとき酵素で抗体を処理することにより生成できるＦ（ａｂ）およびＦ（ａｂ‘）２断片を含む。本発明は、１０２１８分子を結合するポリクローナルおよびモノクローナル抗体を提供する。本明細書に用いた「モノクローナル抗体」または「モノクローナル抗体組成物」なる用語は、１０２１８の特定のエピトープと免疫反応できる１種だけの抗原結合部位を含む抗体分子の集団をいう。かくして、モノクローナル抗体組成物は、典型的には、それが免疫反応する特定の１０２１８蛋白質に単一結合親和性を示す。
【０２０５】
ポリクローナル抗１０２１８抗体は、１０２１８免疫原で適当な対象を免疫にすることにより前記のごとく調製できる。免疫された対象における抗１０２１８抗体の力価は、固定化１０２１８を用いる酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）でのごとき標準的な手法により経時的にモニターできる。所望ならば、１０２１８に対して指向された抗体分子は、哺乳動物から（例えば、血液から）単離でき、次いで、さらにＩｇＧ画分を得るための蛋白質Ａクロマトグラフィーのごときよく知られた手法によって精製できる。免疫化後の適当な時間に、例えば、抗１０２１８抗体力価が最高である場合に、抗体を生成する細胞は、対象から得て、KohlerおよびMilstein （１９７５） Nature ２５６：４９５-４９７）により最初に記載されたハイブリドーマ手法（また、Brownら （１９８１） J. Immunol. １２７：５３９-４６；Brownら （１９８０） J. Biol. Chem. ２５５：４９８０-８３；Yehら （１９７６） Proc. Natl. Acad. Sci. USA ７６：２９２７-３１；およびYehら （１９８２） Int. J. Cancer ２９：２６９-７５参照）、より最近のヒトＢ細胞ハイブリドーマ手法（Kozborら （１９８３） Immunol Today ４：７２）、ＥＢＶ−ハイブリドーマ手法（Coleら （１９８５） Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. ７７-９６）またはトリオーマ（trioma）手法のごとき標準的手法によってモノクローナル抗体を調製するために用いることができる。モノクローナル抗体ハイブリドーマを生成するための技術はよく知られている（一般的にはKenneth, R. H. in Monoclonal Antibodies： A New Dimension In Biological Analyses, Plenum Publishing Corp., New York, N.Y. （１９８０）；Lerner, E. A. （１９８１） Yale J. Biol. Med. ５４：３８７-４０２；Gefter, M. L.ら （１９７７） Somatic Cell Genet. ３：２３１-３６参照）。略言すれば、不死化細胞系（典型的には骨髄腫）は、前記の１０２１８免疫原で免疫された哺乳動物からのリンパ細胞（典型的には脾細胞）に融合され、得られたハイブリドーマ細胞の培養上清をスクリーニングして、１０２１８を結合するモノクローナル抗体を生成するハイブリドーマを同定する。
【０２０６】
リンパ細胞および不死化細胞系を融合させるために用いられたいずれの多くのよく知られたプロトコールも、抗１０２１８モノクローナル抗体を生成する目的で適用できる（例えば、G. Galfreら （１９７７） Nature ２６６：５５０５２；Gefterら （１９７７） 前記；Lerner （１９８１） 前記；およびKenneth （１９８０） 前記参照）。さらに、通常の熟練者は、有用でもあるであろう捕縄に様々なかかる方法が存在することを認識するであろう。典型的には、不死化細胞系（例えば、骨髄腫細胞系）は、リンパ細胞と同一の哺乳動物種から由来する。例えば、マウスハイブリドーマは、本発明の免疫原製剤で免疫されたマウスからのリンパ細胞を不死化されたマウス細胞系と融合させることにより作成できる。好ましい不死化細胞系は、ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンを含む培養基（「ハット培養液」）に敏感なマウス骨髄腫細胞系である。多くの骨髄腫細胞系のいずれも、標準的手法、例えば、Ｐ３−ＮＳ１／１−Ａｇ４−１、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８.６５３またはＳｐ２／Ｏ−Ａｇ１４骨髄腫系）による融合パートナーとして用いることができる。これらの骨髄腫ラインはＡＴＣＣから入手可能である。典型的には、ＨＡＴに敏感なマウス骨髄腫細胞はポリエチレングリコール（「ＰＥＧ」）を用いて、マウス脾細胞に融合され、次いで、融合から得たハイブリドーマ細胞は、融合されず、非産生的に融合された骨髄腫細胞を殺す（それらが形質転換されないので、融合していない脾細胞は数日後に死滅する）ハット培養液を用いて選択される。本発明のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞は、例えば、標準的なＥＬＩＳＡアッセイを用いて、１０２１８を結合する抗体につきハイブリドーマ培養上清をスクリーニングすることにより検出される。
【０２０７】
モノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマの調製に代えて、単クローンの抗１０２１８抗体を、１０２１８で組換えの組合わせ免疫グロブリン発現ライブラリー（例えば、抗体ファージディスプレイ・ライブラリー）をスクリーニングすることにより同定および単離でき、それにより、１０２１８に結合する免疫グロブリンライブラリーメンバーを単離できる。ファージディスプレイ・ライブラリーを生成およびスクリーニングするためのキットは商業上入手可能である（例えば、ＰｈａｒｍａｃｉａのRecombinant Phage Antibody System、カタログ番号２７−９４００−０１）；およびＳｔｒａｔａｇｅｎｅ  ＳｕＪＺＡＰＴＭファージディスプレイ・キット（カタログ番号２４０６１２））。さらに、抗体ディスプレイ・ライブラリーを生成およびスクリーニングの使用に対して特に敏感に反応する方法および試薬の例を、例えば、Ladnerら 米国特許第５,２２３,４０９号；Kangら ＰＣＴ国際公開番号ＷＯ９２／１８６１９；Dowerら ＰＣＴ国際公開番号ＷＯ９１／１７２７１；WinterらＰＣＴ国際公開ＷＯ９２／２０７９１；Marklandら ＰＣＴ国際公開番号ＷＯ９２／１５６７９；Breitlingら ＰＣＴ国際公開ＷＯ９３／０１２８８；McCaffertyら ＰＣＴ国際公開番号ＷＯ９２／０１０４７；Garrardら ＰＣＴ国際公開番号ＷＯ９２／０９６９０；Ladnerら ＰＣＴ国際公開番号ＷＯ９０／０２８０９；Fuchsら （１９９１） Bio／Technology ９：１３７０-１３７２；Hayら （１９９２） Hum. Antibod. Hybridomas ３：８１-８５；Huse etal. （１９８９） Science ２４６：１２７５-１２８１；Griffithsら （１９９３） EMBO J １２：７２５-７３４；Hawkinsら （１９９２） J. Mol. Biol. ２２６：８８９-８９６；Clarksonら （１９９１） Nature ３５２：６２４-６２８；Gramら （１９９２） Proc. Natl. Acad. Sci. USA ８９：３５７６-３５８０；Garradら （１９９１） Bio／Technology ９：１３７３-１３７７；Hoogenboomら （１９９１） Nuc. Acid Res. １９：４１３３-４１３７；Barbasら （１９９１） Proc. Natl. Acad. Sci. USA ８８：７９７８-７９８２；およびMcCaffertyら （１９９０） Nature ３４８：５５２-５５４に見出すことができる。
【０２０８】
さらに、標準の組換えＤＮＡ手法を用いて作成できるヒトおよび非ヒト部分の双方を含むキメラおよびヒト化されたモノクローナル抗体のごとき組換え抗１０２１８抗体は、本発明方法の範囲内にある。かかるキメラおよびヒト化されたモノクローナル抗体は、例えば、Robinsonら 国際公開番号ＰＣＴ／ＵＳ８６／０２２６９；Akiraら 欧州特許出願第１８４,１８７；Taniguchi, M., 欧州特許出願第１７１,４９６；Morrisonら 欧州特許出願第１７３,４９４；Neubergerら ＰＣＴ国際公開番号ＷＯ８６／０１５３３；Cabillyら 米国特許第４,８１６,５６７；Cabillyら 欧州特許出願第１２５,０２３；Betterら （１９８８） Science ２４０：１０４１-１０４３；Liuら （１９８７） Proc. Natl. Acad. Sci. USA ８４：３４３９-３４４３；Liuら （１９８７） J. Immunol. １３９：３５２１-３５２６；Sunら （１９８７） Proc. Natl. Acad. Sci. USA ８４：２１４-２１８；Nishimuraら （１９８７） Canc. Res. ４７：９９９-１００５；Woodら （１９８５） Nature ３１４：４４６-４４９；Shawら （１９８８） J. Natl. Cancer Inst. ８０：１５５３-１５５９；Morrison, S. L. （１９８５） Science ２２９：１２０２-１２０７；Oi etal. （１９８６） BioTechniques ４：２１４；Winter 米国特許第５,２２５,５３９；Jonesら （１９８６） Nature ３２１：５５２-５２５；Verhoeyanら （１９８８） Science ２３９：１５３４；およびBeidlerら （１９８８） J. Immunol. １４１：４０５３-４０６０に記載された方法を用いて当該技術分野において知られた組換えＤＮＡ手法により生成できる。
【０２０９】
抗１０２１８抗体を用いて、１０２１８蛋白質の発現の発生量およびパターンを評価するために（例えば、細胞溶解物または細胞上清中の）１０２１８蛋白質を検出できる。抗１０２１８抗体を診断上用いて、臨床試験手順の一部として組織中の蛋白質レベルをモニターでき、例えば、所与の治療投与法の効力を決定できる。検出は、検出可能な物質に抗体をカップリングさせる（すなわち、物理的に連結させる）ことにより促すことができる。検出可能な物質の例には、種々の酵素、補欠分子族、蛍光性材料、発光材料、生物発光材料および放射性物質が含まれる。適当な酵素の例には、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼまたはアセチルコリンエステラーゼが含まれ；適当な補欠分子族複合体の例は、ストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチンを含み；適当な蛍光性材料の例はウンベリフェロン、フルオレセイン、イソチオシアン酸フルオレセイン、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、塩化ダンシルまたはフィコエリトリンを含み；発光材料の例はルミノールを含み；生物発光材料の例は、ルシフェラーゼ、ルシフェリンおよびエクオリンを含み、および適当な放射性物質の例は１２５Ｉ、１３１Ｉ、３５Ｓまたは３Ｈを含む。
【０２１０】
本発明は以下の例によってさらに図示されが、それは制限として解釈されるべきでない。本願出願を通して引用された全ての引用文献、特許および公開された特許出願、ならびに図および配列表をここに出典明示して本明細書の一部とみなす。
【０２１１】
実施例
実施例１：マクロファージ中のヒトＰ２Ｘ４（１０２１８）発現の分析
この実験は、非常にアテローム性動脈硬化状態に関与する生理学的条件を模倣するためにアテローム発生であると知られているインターフェロンガンマ（ＩＦＮγ）およびＣＤ４０Ｌ、サイトカイニンで刺激されたマクロファージ中の１０２１８発現を記載する。
【０２１２】
マクロファージをＩＦＮγおよびＣＤ４０Ｌで処理し、次いで、１０２１８ｍＲＮＡの発現を（実施例３に記載された）ＴａｑｍａｎＴＭ分析により評価した。
【０２１３】
ＩＦＮγで処理したマクロファージおよびＣＤ４０Ｌを処置後４時間および１８時間にて、１０２１８の発現の増加を示す（図１を参照）。このデータは、アテローム性動脈硬化病変の形成における１０２１８の役割を示す。
【０２１４】
実施例２：ＡｐｏＥノックアウト・マウスにおけるアテローム性動脈硬化病変中のヒトのＰ２Ｘ４（１０２１８）ｍＲＮＡ発現の分析
この実験は、病変発生の種々の段階でおよび正常な血管と比較してアテローム性動脈硬化病変における１０２１８の制御を検討するためのＡｐｏＥノックアウト・マウスの使用を記載する。
【０２１５】
ＡｐｏＥノックアウト・マウスを胚性幹細胞中の遺伝子ターゲティングにより創製して、ＡｐｏＥ遺伝子を崩壊させた。ＡｐｏＥ遺伝子の同型接合的不活性化の結果、それらの血清中のＡｐｏＥがけ欠いている動物を生じさせた。これらのマウスは５倍の正常血清血漿コレステロールおよび自然発生アテローム性動脈硬化病変を示す。これは、ＬＤＬ受容体への結合を欠くＡｐｏＥ遺伝子の変異体形態を有し、アテローム性動脈硬化症の早期発生のリスクを持ち、血漿トリグリセリドおよびコレステロール値を増加したヒトおける疾患に類似する。
【０２１６】
ＡｐｏＥノックアウト・マウスは、大動脈弓領域がアテローム性動脈硬化病変を形成する傾向にあるが、腹部大動脈は典型的にはかかる病変はない。５週齢にて、病変発生は最小であるが、１８週齡までに複雑な病変形成が観察され、それは３３週齡にて持続する。
【０２１７】
この実験では、Ｃ５７  ＡｐｏＥノックアウト動物において、８、１２、１７、２０、２２、２５および３０週齡にて１０２１８発現を評価した。病変のないおよび病変がある組織部分は、前記の各週齡にてＡｐｏＥノックアウト動物からの腹部の大動脈（病変のない）または大動脈弓（病変のある）のいずれかから分析した。野生型のマウスからの血管を対照として用いた。１０２１８は、病変のない血管に比較して病変のある血管において上昇調節され、１７、２０、２２、２５および３０週齡の正常な動物から得られた血管は、１０２１８発現およびアテローム性動脈硬化症の病因間の相関性を示す（図２を参照）。
【０２１８】
実施例３：ＴａｑＭａｎＴＭ分析を用いるヒトＰ２Ｘ４（１０２１８）ｍＲＮＡの生体内分布
この実施例は、ＴａｑＭａｎＴＭ手順を用いて決定されるごとく、様々な細胞および組織中のヒト１０２１８  ｍＲＮＡの生体内分布を記載する。ＴａｑＭａｎＴＭ手順は、ｍＲＮＡを検出するための定量的な逆転写ＰＣＲベースのアプローチである。ＲＴ−ＰＣＲ反応は、ＡｍｐｌｉＴａｑ ＧｏｌｄＴＭＤＮＡポリメラーゼの５’−ヌクレアーゼ活性を利用して、ＰＣＲ中にＴａｑＭａｎＴＭを切断する。略言すると、ｃＤＮＡは、注目する試料、例えば、心臓、腎臓、肝臓、骨格筋、様々な血管から生成され、ＰＣＲ増幅用の出発物質として用いた。５’および３’遺伝子特異的プライマーに加えて、（増幅されるべき領域に相補性である）遺伝子特異的なオリゴヌクレオチドプローブを反応において含む（すなわち、ＴａｑＭａｎＴＭプローブ）。ＴａｑＭａｎＴＭプローブは、そのプローブの５’端に共有結合した（ＦＡＭ（６−カルボキシフルオレセイン）、ＴＥＴ（６−カルボキシ−４,７,２’,７’−テトラクロロフルオレセイン）、ＪＯＥ（６−カルボキシ−４,５−ジクロロ−２,７−ジメトキシフルオレセイン）またはＶＩＣのごとき）蛍光レポーター色素、およびそのプローブの３’端にクエンチャー色素（ＴＡＭＲＡ（６−カルボキシ−Ｎ,Ｎ,Ｎ’,Ｎ’−テトラメチルローダミン）を含むオリゴヌクレオチドを含む。
【０２１９】
ＰＣＲ反応中に、プローブの切断は、リポーター色素およびクエンチャー色素を分離する結果、リポーターの蛍光が増加する。ＰＣＲ産物の蓄積は、リポーター色素の蛍光の増加をモニターすることにより直接的に検出する。プローブが無傷である場合、クエンチャー色素へのリポーター色素の接近の結果、リポーター蛍光が抑制される。ＰＣＲ中に、注目する標的が存在するならば、プローブは特に順方向および逆方向のプライマー部位間にアニーリングする。ＡｍｐｌｉＴａｑＴＭＧｏｌｄ ＤＮＡポリメラーゼの５’−３’ヌクレオチド鎖切断活性は、プローブが標的にハイブリダイズする場合にだけ、リポーターおよびとクエンチャー間のプローブを切断する。次いで、プローブ断片は標的から置換され、鎖の重合が継続する。プローブの３’端は、ＰＣＲ中にプローブの伸長を防止するためにブロックする。このプロセスは、すべてのサイクルにおいて発生し、産物の指数関数的な蓄積と干渉しない。ＲＮＡは、トリゾール方法を用いて調製でき、ＤＮアーゼで処理して、ゲノムＤＮＡを除去した。ｃＤＮＡを標準的手法を用いて合成した。制御遺伝子を検出できるＰＣＲ増幅のない試料における逆トランスクリプターゼの不存在下の模擬のｃＤＮＡ合成は、ゲノムＤＮＡ汚染の効率的な除去を確認する。
【０２２０】
ヒトの正常および腫瘍組織を含む相１.３.４パネルは、膵臓、静止および剪断ＨＵＶＥＣ、および脳中で最高の１０２１８発現を示した。また、１０２１９の発現は、腎臓、心臓、骨格筋および肝臓中で検出され、それらのすべてが血管の豊富な器官である。心血管のパネルは、大動脈平滑筋細胞（ＳＭＣ）、冠動脈ＳＭＣ、頚動脈、筋動脈、患部大動脈および正常な静脈を含めた様々なヒト血管中で発現を示した。最高の発現は、ＬＳＳ  ＨＵＶＥＣおよび静止ＨＵＶＥＣ中で検出した。これらの発現データは、様々な血管を横切っておよび高度に血管新生された器官中で１０２１８発現を示し、循環器疾患、例えば、アテローム性動脈硬化症の変調における１０２１８役割を示す。
【０２２１】
等価物
当業者は、本明細書に記載された発明の特定の具体例に対する多数の等価物を認識するか、または日常的な実験にすぎないものを用いて確かめることができるであろう。かかる等価物は、後記の請求項により含まれることを意図する。
【図面の簡単な説明】
【０２２２】
【図１】図１は、高度にアテローム発生性のサイトカインであるインターフェロンガンマ（ＩＦＮγ）またはＣＤ４０Ｌのいずれかで刺激したマクロファージ中の１０２８１発現を示すグラフである。結果は、１０２１８が非刺激細胞に比較して、ＩＦＮγおよびＣＤ４０Ｌの双方により刺激されたマクロファージ中で示差発現（例えば、上昇調節）されることを示す。
【図２】図２は、８、１２、１７、２０、２２、２５および３０週齢でのＡｐｏＥノックアウトマウスにおける大動脈の病変のないまたは腹部領域（ａｂｄｍ）および病変のあるまたは弓部領域（ａｒｃｈ）における１０２１８発現分析の結果を示すグラフである。結果は、１０２１８が病変のない血管（ａｂｄｍ）または正常な対照に比較して、病変のある血管（ａｒｃｈ）において示差発現（例えば、上昇調節）されることを示す。
【図１】
2004535788.tif 000002
【図２】
2004535788.tif 000003
【国際公開パンフレット】
2004535788.tif 000004
2004535788.tif 000005
2004535788.tif 000006
2004535788.tif 000007
2004535788.tif 000008
2004535788.tif 000009
2004535788.tif 000010
2004535788.tif 000011
2004535788.tif 000012
2004535788.tif 000013
2004535788.tif 000014
2004535788.tif 000015
2004535788.tif 000016
2004535788.tif 000017
2004535788.tif 000018
2004535788.tif 000019
2004535788.tif 000020
2004535788.tif 000021
2004535788.tif 000022
2004535788.tif 000023
2004535788.tif 000024
2004535788.tif 000025
2004535788.tif 000026
2004535788.tif 000027
2004535788.tif 000028
2004535788.tif 000029
2004535788.tif 000030
2004535788.tif 000031
2004535788.tif 000032
2004535788.tif 000033
2004535788.tif 000034
2004535788.tif 000035
2004535788.tif 000036
2004535788.tif 000037
2004535788.tif 000038
2004535788.tif 000039
2004535788.tif 000040
2004535788.tif 000041
2004535788.tif 000042
2004535788.tif 000043
2004535788.tif 000044
2004535788.tif 000045
2004535788.tif 000046
2004535788.tif 000047
2004535788.tif 000048
2004535788.tif 000049
2004535788.tif 000050
2004535788.tif 000051
2004535788.tif 000052
2004535788.tif 000053
2004535788.tif 000054
2004535788.tif 000055
2004535788.tif 000056
2004535788.tif 000057
2004535788.tif 000058
2004535788.tif 000059
2004535788.tif 000060
2004535788.tif 000061
2004535788.tif 000062
2004535788.tif 000063
2004535788.tif 000064
2004535788.tif 000065
2004535788.tif 000066
2004535788.tif 000067
2004535788.tif 000068
2004535788.tif 000069
2004535788.tif 000070
2004535788.tif 000071
2004535788.tif 000072
2004535788.tif 000073
2004535788.tif 000074
2004535788.tif 000075
2004535788.tif 000076
2004535788.tif 000077
2004535788.tif 000078
【国際調査報告】
2004535788.tif 000079
2004535788.tif 000080
2004535788.tif 000081
2004535788.tif 000082