(57)【要約】本発明は，キナーゼポリペプチド，キナーゼポリペプチドをコードするヌクレオチド配列，ならびに，種々のキナーゼ関連疾病および状態の診断および治療に有用な種々の産物および方法に関する。バイオインフォマティクス戦略を用いて，ＰＴＫおよびＳＴＫの哺乳動物メンバーが同定され，その蛋白質構造が予測された。
2004504009.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
キナーゼポリペプチドをコードする，単離され，濃縮され，または精製された核酸分子であって，
（ａ）配列番号１３，配列番号１４，配列番号１５，配列番号１６，配列番号１７，配列番号１８，配列番号１９，配列番号２０，配列番号２１，配列番号２２，配列番号２３，および配列番号２４に記載されるアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする；
（ｂ）（ａ）のヌクレオチド配列の相補体である；
（ｃ）ストリンジェントな条件下で（ａ）のヌクレオチド分子にハイブリダイズし，かつ天然に生ずるキナーゼポリペプチドをコードする；
（ｄ）配列番号１３，配列番号１４，配列番号１５，配列番号１６，配列番号１７，配列番号１８，配列番号１９，配列番号２０，配列番号２１，配列番号２２，配列番号２３，および配列番号２４に記載されるアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列であって，ただし，Ｎ末端ドメイン，Ｃ末端触媒ドメイン，触媒ドメイン，Ｃ末端ドメイン，コイルドコイル構造領域，プロリンリッチ領域，スペーサー領域およびＣ末端テールの全部ではないが１またはそれ以上を欠失しているアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする；または
（ｅ）（ｄ）のヌクレオチド配列の相補体である
のヌクレオチド配列を含むことを特徴とする核酸分子。
【請求項２】
宿主細胞において転写を開始させるのに有効なベクターまたはプロモーターをさらに含む，請求項１記載の核酸分子。
【請求項３】
前記核酸分子が，哺乳動物から単離され，濃縮され，または精製されたものである，請求項１記載の核酸分子。
【請求項４】
前記哺乳動物がヒトである，請求項３記載の核酸分子。
【請求項５】
試料においてキナーゼポリペプチドをコードする核酸を検出するために用いられ，前記キナーゼポリペプチドが，配列番号１３，配列番号１４，配列番号１５，配列番号１６，配列番号１７，配列番号１８，配列番号１９，配列番号２０，配列番号２１，配列番号２２，配列番号２３，および配列番号２４に記載されるアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するキナーゼポリペプチドからなる群より選択されることを特徴とする，請求項１記載の核酸プローブ。
【請求項６】
配列番号１３，配列番号１４，配列番号１５，配列番号１６，配列番号１７，配列番号１８，配列番号１９，配列番号２０，配列番号２１，配列番号２２，配列番号２３，および配列番号２４に記載されるアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するキナーゼポリペプチドをコードする請求項１記載の核酸分子を含む組換え細胞。
【請求項７】
単離され，濃縮され，または精製されたキナーゼポリペプチドであって，前記ポリペプチドは，
（ａ）それぞれ，配列番号１３，配列番号１４，配列番号１５，配列番号１６，配列番号１７，配列番号１８，配列番号１９，配列番号２０，配列番号２１，配列番号２２，配列番号２３，および配列番号２４に記載されるアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列；
（ｂ）それぞれ配列番号１３，配列番号１４，配列番号１５，配列番号１６，配列番号１７，配列番号１８，配列番号１９，配列番号２０，配列番号２１，配列番号２２，配列番号２３，および配列番号２４に記載されるアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列であって，ただし，Ｎ末端ドメイン，Ｃ末端触媒ドメイン，触媒ドメイン，Ｃ末端ドメイン，コイルドコイル構造領域，プロリンリッチ領域，スペーサー領域，およびＣ末端テールからなる群より選択されるドメインの全部ではないが１またはそれ以上を欠失しているアミノ酸配列，
を有するアミノ酸配列を含むことを特徴とするポリペプチド。
【請求項８】
前記ポリペプチドが哺乳動物から単離され，精製され，または濃縮されたものである，請求項７記載のキナーゼポリペプチド。
【請求項９】
前記哺乳動物がヒトである，請求項８記載のキナーゼポリペプチド。
【請求項１０】
キナーゼポリペプチドまたは前記ポリペプチドのドメインに対する特異的結合親和性を有する抗体または抗体フラグメントであって，前記ポリペプチドは，配列番号１３，配列番号１４，配列番号１５，配列番号１６，配列番号１７，配列番号１８，配列番号１９，配列番号２０，配列番号２１，配列番号２２，配列番号２３，および配列番号２４に記載されるアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するキナーゼポリペプチドであることを特徴とする抗体または抗体フラグメント。
【請求項１１】
配列番号１３，配列番号１４，配列番号１５，配列番号１６，配列番号１７，配列番号１８，配列番号１９，配列番号２０，配列番号２１，配列番号２２，配列番号２３，および配列番号２４に記載されるアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するキナーゼポリペプチドに対する特異的結合親和性を有する抗体を産生するハイブリドーマ。
【請求項１２】
請求項７または８記載のポリペプチドに結合する抗体および負対照抗体を含むキット。
【請求項１３】
キナーゼポリペプチドの活性を調節する物質を同定する方法であって，
（ａ）配列番号１３，配列番号１４，配列番号１５，配列番号１６，配列番号１７，配列番号１８，配列番号１９，配列番号２０，配列番号２１，配列番号２２，配列番号２３，および配列番号２４に記載されるアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するキナーゼポリペプチドを試験物質と接触させ；
（ｂ）前記ポリペプチドの活性を測定し；そして
（ｃ）前記物質が前記ポリペプチドの活性を調節するか否かを判定する
の各工程を含む方法。
【請求項１４】
細胞においてキナーゼポリペプチドの活性を調節する物質を同定する方法であって，
（ａ）配列番号１３，配列番号１４，配列番号１５，配列番号１６，配列番号１７，配列番号１８，配列番号１９，配列番号２０，配列番号２１，配列番号２２，配列番号２３，および配列番号２４に記載されるアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するキナーゼポリペプチドを発現させ；
（ｂ）試験物質を前記細胞に加え；そして
（ｃ）細胞表現型または前記ポリペプチドと天然の結合パートナーとの間の相互作用の変化をモニターする
の各工程を含む方法。
【請求項１５】
治療を必要とする患者に，配列番号１３，配列番号１４，配列番号１５，配列番号１６，配列番号１７，配列番号１８，配列番号１９，配列番号２０，配列番号２１，配列番号２２，配列番号２３，および配列番号２４に記載されるアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する，キナーゼの活性を調節する物質を投与することにより，疾病または疾患を治療する方法。
【請求項１６】
前記疾病または疾患が，癌，免疫関連疾病および疾患，心臓血管疾病，脳またはニューロン関連疾病，および代謝性疾患からなる群より選択される，請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
前記疾病または疾患が，組織の癌；血液起源の癌；中枢神経系の疾病；末梢神経系の疾病；アルツハイマー病；パーキンソン病；多発性硬化症；筋萎縮性側索硬化症；ウイルス感染；プリオンにより引き起こされる感染；細菌により引き起こされる感染；真菌により引き起こされる感染；および眼性疾病からなる群より選択される，請求項１５記載の方法。
【請求項１８】
前記疾病または疾患が，片頭痛；痛み；性的機能不全；気分障害；注意障害；認識障害；低血圧症；高血圧症；精神病性疾患；神経学的疾患；運動異常症；代謝性疾患；および臓器移植拒絶からなる群より選択される，請求項１５記載の方法。
【請求項１９】
前記物質がインビトロでキナーゼ活性を調節する，請求項１５記載の方法。
【請求項２０】
前記物質がキナーゼ阻害剤である，請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
疾病または疾患の診断道具として試料中でキナーゼポリペプチドを検出する方法であって，
（ａ）前記試料を，配列番号１３，配列番号１４，配列番号１５，配列番号１６，配列番号１７，配列番号１８，配列番号１９，配列番号２０，配列番号２１，配列番号２２，配列番号２３，および配列番号２４に記載されるアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するキナーゼポリペプチドの核酸標的領域にハイブリダイゼーションアッセイ条件下でハイブリダイズする核酸プローブと接触させ，前記プローブは，前記ポリペプチド，そのフラグメント，または前記配列およびフラグメントの相補体をコードする核酸配列を含み；そして
（ｂ）前記疾病の指標として，プローブ：標的領域ハイブリッドの存在または量を検出する
の各工程を含む方法。
【請求項２２】
前記疾病または疾患が，癌，免疫関連疾病および疾患，心臓血管疾病，脳またはニューロン関連疾病，および代謝性疾患からなる群より選択される，請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
前記疾病または疾患が，組織の癌；血液起源の癌；中枢神経系の疾病；末梢神経系の疾病；アルツハイマー病；パーキンソン病；多発性硬化症；筋萎縮性側索硬化症；ウイルス感染；プリオンにより引き起こされる感染；細菌により引き起こされる感染；真菌により引き起こされる感染；および眼性疾病からなる群より選択される，請求項２１記載の方法。
【請求項２４】
前記疾病または疾患が，片頭痛，痛み；性的機能不全；気分障害；注意障害；認識障害；低血圧症；高血圧症；精神病性疾患；神経学的疾患；運動異常症；代謝性疾患；および臓器移植拒絶からなる群より選択される，請求項２１記載の方法。
【請求項２５】
疾病または疾患の診断道具として試料中のキナーゼポリペプチドを検出する方法であって，
（ａ）試料中の前記キナーゼポリペプチドをコードする核酸標的領域を，前記キナーゼポリペプチド，またはその１またはそれ以上のフラグメントをコードする対照核酸標的領域と比較し，ここで，前記キナーゼポリペプチドは，配列番号１３，配列番号１４，配列番号１５，配列番号１６，配列番号１７，配列番号１８，配列番号１９，配列番号２０，配列番号２１，配列番号２２，配列番号２３，および配列番号２４に記載されるアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列，またはその１またはそれ以上のフラグメントを有しており；そして
（ｂ）前記疾病または疾患の指標として前記標的領域と前記対照標的領域との間の配列または量の相違を検出する，
の各工程を含む方法。
【請求項２６】
前記疾病または疾患が，癌，免疫関連疾病および疾患，心臓血管疾病，脳またはニューロン関連疾病，および代謝性疾患からなる群より選択される，請求項２５記載の方法。
【請求項２７】
前記疾病または疾患が，組織の癌；血液起源の癌；中枢神経系の疾病；末梢神経系の疾病；アルツハイマー病；パーキンソン病；多発性硬化症；筋萎縮性側索硬化症；ウイルス感染；プリオンにより引き起こされる感染；細菌により引き起こされる感染；真菌により引き起こされる感染；および眼性疾病からなる群より選択される，請求項２５記載の方法。
【請求項２８】
前記疾病または疾患が，片頭痛，痛み；性的機能不全；気分障害；注意障害；認識障害；低血圧症；高血圧症；精神病性疾患；神経学的疾患；運動異常症；代謝性疾患；および臓器移植拒絶からなる群より選択される，請求項２５記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は，米国特許仮出願６０／１８７，１５０，および６０／１９３，４０４，および６０／２４７，１０３に基づく優先権を主張する。これらはすべてその全体を本明細書の一部としてここに引用する。
【０００２】
発明の分野
本発明は，キナーゼポリペプチド，キナーゼポリペプチドをコードするヌクレオチド配列，ならびに種々のキナーゼ関連疾病および状態の診断および治療に有用な種々の産物および方法に関する。
【０００３】
発明の背景
以下の本発明の背景の記述は，本発明の理解を助けるために提供されるものであり，本発明に対する先行技術であるかまたはそれを記載すると認めるものではない。
【０００４】
細胞シグナル伝達は，各種の細胞プロセスを制御する外部刺激を細胞内部にリレーするための基本的メカニズムである。シグナル伝達の重要な生物化学メカニズムの一つは蛋白質の可逆的リン酸化であり，これは，成熟蛋白質の構造と機能を変化させることによりその活性を制御することができる。
【０００５】
蛋白質リン酸化は，細胞のシグナル伝達において中枢的役割を果たす。このタイプの翻訳後修飾により制御される生物学的機能には以下のものがある：細胞分裂；分化および死（アポトーシス）；細胞遊走性および細胞骨格構造；ＤＮＡ複製，転写，スプライシングおよび翻訳の制御；小胞体およびゴルジ装置から膜および細胞外空間への蛋白質輸送事象；蛋白質の核内輸送および核外輸送；代謝反応の制御等。異常な蛋白質リン酸化は，多くの疾病，例えば癌，ならびに免疫性，神経性および代謝性疾患の病因に関連していることが広く認められている。
【０００６】
本明細書の全体を通して，キナーゼについては以下の略号を用いる：
ＡＳＫ　アポトーシスシグナル制御キナーゼ
ＣａＭＫ　Ｃａ２＋／カルモジュリン依存性蛋白質キナーゼ
ＣＣＲＫ　細胞サイクル関連キナーゼ
ＣＤＫ　サイクリン依存性キナーゼ
ＣＫ　カゼインキナーゼ
ＤＡＰＫ　死関連蛋白質キナーゼ
ＤＭ　筋緊張性ジストロフィーキナーゼ
Ｄｙｒｋ　二重特異性チロシンリン酸化制御キナーゼ
ＧＡＫ　サイクリンＧ関連キナーゼ
ＧＲＫ　Ｇ−蛋白質共役レセプター
ＧｕＣ　グアニル酸シクラーゼ
ＨＩＰＫ　ホメオドメイン相互作用蛋白質キナーゼ
ＩＲＡＫ　インターロイキン−１レセプター関連キナーゼ
ＭＡＰＫ　有糸分裂促進物質活性化蛋白質キナーゼ
ＭＡＳＴ　微小管関連ＳＴＫ
ＭＬＣＫ　ミオシン軽鎖キナーゼ
ＭＬＫ　ミックスライニージキナーゼ
ＮＩＭＡ　ＮｉｍＡ関連蛋白質キナーゼ
ＰＫＡ　ｃＡＭＰ依存性蛋白質キナーゼ
ＲＳＫ　リボゾーム蛋白質Ｓ６キナーゼ
ＲＴＫ　レセプターチロシンキナーゼ
ＳＧＫ　血清およびグルココルチコイド制御キナーゼ
ＳＴＫ　セリントレオニンキナーゼ
ＵＬＫ　ＵＮＣ−５１様キナーゼ
【０００７】
真核生物において最もよく特徴決定されている蛋白質キナーゼは，最も一般的なリン酸アクセプターアミノ酸残基である，セリン，トレオニンおよびチロシン残基のヒドロキシル置換基上で蛋白質をリン酸化する。また，ヒスチジンにおけるリン酸化が細菌において見いだされている。
【０００８】
リン酸基の存在は，蛋白質の機能を多くの方法により調節する。一般的なメカニズムには，酵素の活性化または不活性化につながる触媒特性（ＶｍａｘおよびＫｍ）の変化が含まれる。
【０００９】
２番目に広く認識されているメカニズムには，蛋白質−蛋白質相互作用の促進が関与する。この例は，リガンド活性化ＥＧＦレセプターチロシンキナーゼのチロシン自己リン酸化である。この事象により，レセプターのＣ末端細胞内ドメイン上のホスホチロシン残基がアダプター分子Ｇｒｂ２のＳＨ２モチーフに高親和性結合することが誘発される。次に，Ｇｒｂ２は，そのＳＨ３モチーフを介して第２のアダプター分子，例えばＳＨＣに結合する。この３成分系複合体の形成は，ＥＧＦの生物学的効果を担うシグナリング事象を活性化する。最近，セリンおよびトレオニンのリン酸化事象はまた，ホスホセリンおよびホスホトレオニンが広範な種類の蛋白質に存在するＷＷモチーフに高親和性結合することにより媒介される蛋白質−蛋白質相互作用事象を通してその生物学的機能を作用させることが認識されている（Ｌｕ，Ｐ．Ｊ．ｅｔ　ａｌ．（１９９９）Ｓｃｉｅｎｃｅ　２８３：１３２５−１３２８）。
【００１０】
蛋白質リン酸化の３番目に重要な結果は，基質の細胞内局在の変化である。例としては，広範な種類の蛋白質の核内輸送および核外輸送事象が蛋白質リン酸化により制御されている（Ｄｒｉｅｒ　Ｅ．Ａ．ｅｔ　ａｌ．（１９９９）Ｇｅｎｅｓ　Ｄｅｖ　１３：５５６−５６８）。
【００１１】
蛋白質キナーゼは，真核生物蛋白質の最も大きなファミリーの１つであり，数百種類のメンバーが知られている。これらの蛋白質は，２５０−３００アミノ酸のドメインを共有し，これは，さらに共通の触媒コア構造を含む１２個の別々のサブドメインに分割することができる。最近，これらの保存された蛋白質モチーフをＰＣＲに基づく方法およびバイオインフォマティクス法を用いて利用して，既知のキナーゼが著しく拡大した。蛋白質キナーゼの触媒ドメインの配列の多重アラインメントおよび続くパルシモニー分析により，これらを関連するキナーゼのサブファミリーに分割することができる。
【００１２】
キナーゼは，セリンおよびトレオニンのリン酸化に特異的なものと，チロシンのリン酸化に特異的なものとの２グループに大別される。”二重特異性”キナーゼと称されるあるキナーゼは，チロシンならびにセリン／トレオニン残基をリン酸化することができる。
【００１３】
蛋白質キナーゼはまた，細胞中のその位置によっても特徴づけることができる。ある種のキナーゼは，外部環境，例えばリガンドの結合に応答してその触媒的活性を直接変化させることができる，貫膜レセプタータイプ蛋白質である。またあるものは，貫膜ドメインを有しない非レセプタータイプ蛋白質である。これらは細胞膜の内表面から核までの種々の細胞コンパートメントにおいて見いだされる。
【００１４】
多くのキナーゼは制御カスケードに関与しており，ここで，その基質には活性がそのリン酸化状態により制御される他のキナーゼが含まれる。最終的に，いくつかの下流エフェクターの活性が，そのような経路の活性化から生ずるリン酸化により調節される。最近ＰＣＲに基づくクローニング戦略を用いてこれらのキナーゼの保存蛋白質モチーフが探究され，既知のキナーゼが著しく拡大した。
【００１５】
蛋白質キナーゼの触媒ドメイン中の配列の多重アラインメントおよび続くパルシモニー分析により，関連するキナーゼをサブファミリーの区別しうる枝，例えば，チロシンキナーゼ（ＰＴＫ），二重特異性キナーゼ，およびセリン／トレオニンキナーゼ（ＳＴＫ）に分類することができる。後者のサブファミリーには，サイクリックヌクレオチド依存性キナーゼ，カルシウム／カルモジュリンキナーゼ，サイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ），ＭＡＰ−キナーゼ，セリン−トレオニンキナーゼレセプター，およびあまり明確にされていないいくつかのサブファミリーが含まれる。
【００１６】
蛋白質キナーゼは，いくつかの主要なグループに分類することができる：ＡＧＣ，ＣＡＭＫ，カゼインキナーゼ１，ＣＭＧＣ，ＳＴＥ，チロシンキナーゼ，および非典型的キナーゼ（Ｐｌｏｗｍａｎ，ＧＤ　ｅｔ　ａｌ．，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｆ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＵＳＡ，Ｖｏｌ．９６，Ｉｓｓｕｅ　２４，１３６０３−１３６１０，Ｎｏｖｅｍｂｅｒ　２３，１９９９；ｗｗｗ．ｋｉｎａｓｅ．ｃｏｍも参照）。さらに，小さいがなお区別しうる多くのファミリー，例えば，虫特異的または真菌特異的キナーゼに関連するファミリー，およびいくつかのより小さいファミリーを表す”その他”と称されるファミリーがある。各グループ中には，より密接に関連するキナーゼのいくつかの区別しうるファミリーがある。さらに，”非典型的”ファミリーは，その触媒ドメインが一般的キナーゼと一次配列ホモロジーをほとんどまたは全く有しない蛋白質キナーゼを表し，これにはＡ６キナーゼおよびＰＩ３キナーゼが含まれる。
【００１７】
ＡＧＣグループ
ＡＧＣキナーゼは，ＡｒｇおよびＬｙｓの近傍に見いだされる残基をリン酸化する塩基性アミノ酸指向性酵素である。このグループの例は，Ｇ蛋白質共役レセプターキナーゼ（ＧＲＫ），サイクリックヌクレオチド依存性キナーゼ（ＰＫＡ，ＰＫＣ，ＰＫＧ），ＮＤＲまたはＤＢＦ２キナーゼ，リボソームＳ６キナーゼ，ＡＫＴキナーゼ，筋緊張性ジストロフィーキナーゼ（ＤＭＰＫ），ＭＡＰＫ相互作用キナーゼ（ＭＮＫ），ＭＡＳＴキナーゼ，および元々線虫においてのみ同定されているＭｏ３Ｃ１１．１＿ｃｅファミリーである。
【００１８】
ＧＲＫは，ヘテロ三量体グアニン蛋白質共役レセプター（ＧＰＣＲ）からのシグナリングを制御する。ＧＰＣＲにおける変異は，多くのヒト疾病を引き起こす。これには，色素性網膜炎，定常的夜盲症，色盲，過度甲状腺腺腫，家族性性的早熟，家族性低カルシウム尿性高カルシウム血症および新生児重症上皮小体機能亢進症が含まれる（ＯＭＩＭ，ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｏｍｉｍ／）。ＧＲＫによるＧＰＣＲの制御は，これらの疾病におけるＧＲＫの関与を間接的に示唆する。
【００１９】
ｃＡＭＰ依存性蛋白質キナーゼ（ＰＫＡ）は２つの触媒（Ｃ）および２つの制御（Ｒ）サブユニットからなるヘテロ四量体から構成される。ここで，Ｒサブユニットは第２メッセンジャーｃＡＭＰに結合し，このことにより活性なＣサブユニットが複合体から解離する。これらのキナーゼの多くは第２メッセンジャー，例えばｃＡＭＰに応答して，ホルモンおよび神経伝達物質に対する広範な細胞性応答が生ずる。
【００２０】
ＡＫＴはホスファチジルイノシトール３−キナーゼ（ＰＩ３−Ｋ）により制御される哺乳動物プロトオンコプロテインであり，細胞生存シグナルとして機能して，アポトーシスから細胞を保護するようである。インスリンレセプター，ＲＡＳ，ＰＩ３−Ｋ，およびＰＤＫ１はすべてＡＫＴの上流アクチベータとして作用するが，脂質ホスファターゼＰＴＥＮは，ＰＩ３−Ｋ／ＡＫＴ経路の負のレギュレータとして機能する。ＡＫＴ媒介性細胞生存の下流の標的には，プロアポトーシス因子ＢＡＤおよびカスパーゼ９，およびフォークヘッドファミリー中の転写因子，例えば虫のＤＡＦ−１６が含まれる。ＡＫＴはまたインスリンシグナリングにおける必須のメディエータであり，これは部分的には，これがＧＳＫ−３を別の下流標的として使用するためである。
【００２１】
Ｓ６キナーゼは，有糸分裂促進性応答に関与する広範な種類の細胞プロセス，例えば，蛋白質合成，特定のｍＲＮＡ種の翻訳，およびＧ１期からＳ期への細胞サイクル進行を制御する。遺伝子は染色体領域１７ｑ２３に位置しており，乳癌において増幅される（Ｃｏｕｃｈ，　ｅｔ　ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．１９９９Ａｐｒ　１；５９（７）：１４０８−１１）。
【００２２】
ＣＡＭＫグループ
ＣＡＭＫキナーゼもまた塩基性アミノ酸指向性キナーゼである。これには，Ｃａ２＋／カルモジュリン制御およびＡＭＰ依存性蛋白質キナーゼ（ＡＭＰＫ），ミオシン軽鎖キナーゼ（ＭＬＣＫ），ＭＡＰキナーゼ活性化蛋白質キナーゼ（ＭＡＰＫＡＰＫ），チェックポイント２キナーゼ（ＣＨＫ２），死関連蛋白質キナーゼ（ＤＡＰＫ），ホスホリラーゼキナーゼ（ＰＨＫ），ＲａｃおよびＲｈｏ結合トリオキナーゼ，ＣＡＭＫの”ユニーク”ファミリー，およびＥＭＫ関連蛋白質キナーゼが含まれる。
【００２３】
ＳＴＫのＥＭＫファミリーは，細胞極性，微小管安定性および癌の制御に関与している。ＥＭＫファミリーの１つのメンバーであるＣ−ＴＡＫ１は，Ｃｄｃ２５Ｃを活性化し，次にこれがＣｄｃ２を脱リン酸化することにより，有糸分裂に入ることを制御することが報告されている。ＥＭＫファミリーには，転移腫瘍において過剰発現することが示されているＭＡＫＶも含まれる（Ｄｏｋｌ．Ａｋａｄ．Ｎａｕｋ　３５４（４），５５４−５５６（１９９７））。
【００２４】
チロシン蛋白質キナーゼグループ（ＴＫ）
チロシンキナーゼグループは，細胞質（例えばｓｒｃ）ならびに貫膜レセプターチロシンキナーゼ（例えばＥＧＦレセプター）の両方を含む。これらのキナーゼは，細胞増殖，分化およびアポトーシスを媒介するシグナル伝達プロセスにおいて中枢的な役割を果たす。
【００２５】
カゼインキナーゼ１グループ（ＣＫ１）
ＣＫ１ファミリーは，蛋白質キナーゼファミリーの遠い枝である。蛋白質キナーゼサブドメインＶＩＩＩおよびＩＸの顕著な特徴を同定することは困難である。１またはそれ以上の形が哺乳動物組織および細胞株に偏在的に分布している。ＣＫ１キナーゼは，細胞質，核，膜結合，および細胞骨格に付随して見いだされる。スプライシング変種はその細胞内分布が異なる。
【００２６】
”その他”グループ
いくつかのファミリーは，”その他”と名付けられる無関係なキナーゼのグループにクラスター化される。これには，ＣＨＫ１；伸長２因子キナーゼ（ＥＩＦＫ）；ＭＡＰＫの上流に順番に存在する３種類のキナーゼを表す酵母ステライルファミリーキナーゼ（ＳＴＥ）のホモログ；カルシウム−カルモジュリンキナーゼキナーゼ（ＣＡＭＫＫ）；二重特異性チロシンキナーゼ（ＤＹＲＫ）；ＩｋＢキナーゼ（ＩＫＫ）；インテグリンレセプターキナーゼ（ＩＲＡＫ）；エンドリボヌクレアーゼ付随キナーゼ（ＩＲＥ）；ミックスライニージキナーゼ（ＭＬＫ）；ＬＩＭ−ドメイン含有キナーゼ（ＬＩＭＫ）；ＭＯＳ；ＰＩＭ；レセプター相互作用キナーゼ（ＲＩＰ）；ＳＲ−蛋白質特異的キナーゼ（ＳＲＰＫ）；ＲＡＦ；セリン−トレオニンキナーゼレセプター（ＳＴＫＲ）；ＴＡＫ１；精巣特異的キナーゼ（ＴＳＫ）；タウズレッド関連キナーゼ（ＴＳＬ）；ＵＮＣ５１−関連キナーゼ（ＵＮＣ）；ＶＲＫ；ＷＥＥ；有糸分裂キナーゼ（ＢＵＢ１，ＡＵＲＯＲＡ，ＰＬＫ，およびＮＩＭＡ／ＮＥＫ）；虫に対する密接なホモログであるいくつかのファミリー（Ｃ２６Ｃ２．１，ＹＱ０９，ＺＣ５８１．９，ＹＦＬ０３３ｃ，Ｃ２４Ａ１．３）；ショウジョウバエ（ＳＬＯＢ），または酵母（ＹＤＯＤ＿ｓｐ，ＹＧＲ２６２＿ｓｃ）キナーゼ；および”ユニーク”，すなわち，いずれの明確なファミリーにもクラスター化されないものが含まれる。追加のファミリーはあまり明確にされておらず，下等真核生物，例えば酵母または虫において最初に同定された（ＹＮＬ０２０，ＹＰＬ２３６，ＹＱ０９，ＹＷＹ３，ＳＣＹ１，Ｃ０１Ｈ６．９，Ｃ２６Ｃ２．１）。
【００２７】
ＲＩＰ２は腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）レセプター複合体に付随するセリン−トレオニンキナーゼであり，哺乳動物細胞においてＮＦ−カッパＢの活性化および細胞死に関与することが示唆されている。最近，ＲＩＰ２がＭＡＰＫ経路を活性化することが示された（Ｎａｖａｓ，　ｅｔ　ａｌ．，Ｊ　Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９９　Ｎｏｖ１９；２７４（４７）：３３６８４−３３６９０）。ＲＩＰ２は，Ｅｌｋｌ転写因子の活性化を誘導することにより，ＡＰ−１および血清応答要素に制御される発現を活性化する。ＲＩＰ２は，ＥＲＫ２をインビボおよびインビトロで直接リン酸化し，活性化する。次にＲＩＰ２はＲａｓ活性化Ｒａｆｌとの相互作用により活性化される。これらの結果は，キナーゼシグナリング経路の統合された性質を強調する。
【００２８】
タウズレッド（ＴＳＬ）キナーゼは最初に植物Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｔｈａｌｉａｎａで同定された。ＴＳＬは適切な花の発達に必須のセリン／トレオニンキナーゼをコードする。ヒトタウズレッド様キナーゼ（Ｔｌｋｓ）は，細胞−サイクルにより制御される酵素であり，Ｓ期の間に最大の活性を示す。この制御された活性は，Ｔｌｋ機能が進行中のＤＮＡ複製と連鎖していることを示唆する（Ｓｉｌｌｊｅ，　ｅｔ　ａｌ．，ＥＭＢＯ　Ｊ　１９９９　Ｏｃｔ１５；１８（２０）：５６９１−５７０２）。
【００２９】
非典型的蛋白質キナーゼグループ
蛋白質キナーゼ活性を有する，真核生物蛋白質キナーゼとは構造的に無関係のようであるいくつかの蛋白質が存在する。これらには，Ｄｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍミオシン重鎖キナーゼＡ（ＭＨＣＫＡ），Ｐｈｙｓａｒｕｍ　ｐｏｌｙｃｅｐｈａｌｕｍアクチンフラグミンキナーゼ，ヒトＡ６ＰＴＫ，ヒトＢＣＲ，ミトコンドリアピルビン酸デヒドロゲナーゼおよび分枝鎖脂肪酸デヒドロゲナーゼキナーゼ，および原核生物”ヒスチジン”蛋白質キナーゼファミリーが含まれる。粘菌，虫，およびヒトｅＥＦ−２キナーゼホモログは，すべて蛋白質キナーゼ活性を有することが示されているが，予測ＧｘＧｘｘＧＡＴＰ結合モチーフの存在を除き，一般的蛋白質キナーゼとはほとんど似ていない。
【００３０】
いわゆるヒスチジンキナーゼは原核生物において多く存在し，Ｅ．ｃｏｌｉでは２０を越える類似物が存在し，酵母，糸状菌，および植物においても同定されている。これらのキナーゼは，外部刺激に応答して，２成分システムの一部として作用して，標的蛋白質中のアスパラギン酸のリン酸化を通してＤＮＡ複製，細胞分裂および分化を制御する。これまで，後生動物においては”ヒスチジン”キナーゼは同定されていないが，ミトコンドリアピルビン酸デヒドロゲナーゼ（ＰＤＫ）および分枝鎖アルファケト酸デヒドロゲナーゼキナーゼ（ＢＣＫＤキナーゼ）は配列において関連している。ＰＤＫおよびＢＣＫＤキナーゼは解糖，クエン酸サイクル，および蛋白質栄養不良における蛋白質合成の制御に関与する非典型的蛋白質キナーゼのユニークファミリーである。これらは構造的には”ヒスチジン”キナーゼのＧボックス領域を含むＣ末端部分のみを保存している。ＢＣＫＤキナーゼは，ＢＣＫＤ複合体のＥｌａサブユニットをＳｅｒ−２９３でリン酸化し，これを機能的な蛋白質キナーゼとする。真の”ヒスチジン”キナーゼはまだヒトでは同定されていないが，これらはＰＤＫを含む。
【００３１】
いくつかの他の蛋白質は，蛋白質キナーゼ様ホモロジーを含み，これには，レセプターグアニリルシクラーゼ，ジアシルグリセロールキナーゼ，コリン／エタノールアミンキナーゼ，およびＹＬＫ１関連抗生物質耐性キナーゼが含まれる。これらのファミリーのそれぞれは，我々の低スコアＥ値でのプロファイル検索により認識されたが，先験的に蛋白質キナーゼとして機能するとは予測されなかった短いモチーフを含む。それよりも，類似性は，蛋白質進化のモジュール的性質および多様なリン酸転移酵素におけるＡＴＰ結合の根本的な役割を単に反映しているのかもしれない。しかし，ＹＬＫ１ファミリーの細菌ホモログに関する最近の２つの報告は，アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ（ＡＰＨ）が構造的および機能的に蛋白質キナーゼに関連することを示唆する。カナマイシン，ゲンタマイシンまたはアミカシンなどのアミノグリコシドに耐性の細菌から４０を越えるＡＰＨが同定されている。１つのよく特徴決定されたＡＰＨの結晶構造は，ｃＡＭＰ依存性蛋白質キナーゼ（ＰＫＡ）の触媒ドメインの２葉構造と４０％を越える構造的同一性を共有し，５本鎖のアンチパラレルベータシートから構成されるＮ末端ローブおよびすべての蛋白質キナーゼにおいて見いだされるいくつかの不変セグメントを含むＣ末端ローブのコアを含むことを明らかにする。ＡＰＨは通常はベータ鎖１と２との間のループに存在するＧｘＧｘｘＧを欠失しているが，ほとんどの蛋白質キナーゼに存在する１２個の厳密に保存された残基の７個，例えばキナーゼサブドメインＶＩＢ中のＨＧＤｘｘｘＮの特徴的配列を含む。さらに，ＡＰＨはまた蛋白質−セリン／トレオニンキナーゼ活性を示すことが明らかにされており，このことは，他のＹＬＫ関連分子が実際に機能的な蛋白質キナーゼであることを示唆する。
【００３２】
真核生物脂質キナーゼ（ＰＩ３Ｋ，ＰＩ４Ｋ，およびＰＩＰＫ）もまた，蛋白質キナーゼと類似するいくつかの短いモチーフを含むが，それ以外は最小限の一次配列類似性しか共有しない。しかし，ここでもまた，ＰＩＰＫＩＩ−ベータの構造分析は，一般の蛋白質キナーゼと著しく類似した保存されたＡＴＰ結合コアを明確にする。これらの酵素すべての間で３つの残基が保存されており，これには（ＰＫＡ配列に対して），ＡＴＰのガンマリン酸に結合するＬｙｓ−７２，ＨＲＤＬＫモチーフの一部であるＡｓｐ−１６６および保存されたＭｇ＋＋またはＭｎ＋＋結合ＤＦＧモチーフからのＡｓｐ−１８４が含まれる。虫ゲノムは１２個のホスファチジルイノシトールキナーゼを含み，これには，３個のＰＩ３−キナーゼ，２個のＰＩ４−キナーゼ，３個のＰＩＰ５−キナーゼ，および４個のＰＩ３−キナーゼ関連キナーゼが含まれる。後者のグループは４個の哺乳動物メンバー（ＤＮＡ−ＰＫ，ＦＲＡＰ／ＴＯＲ，ＡＴＭ，およびＡＴＲ）を有し，これは，ＤＮＡ障害に応答したゲノム一体性の維持に関与し，真の蛋白質キナーゼ活性を示すことが示されており，このため他のＰＩ−キナーゼも蛋白質キナーゼとして作用する可能性が高い。これらが真の蛋白質キナーゼ活性を有するか否かにかかわらず，ＰＩ３−キナーゼは，多くの成長因子レセプターの下流での関与およびＡＫＴ蛋白質キナーゼにより媒介される細胞生存応答の上流アクチベータとしての関与により明らかなように，蛋白質キナーゼシグナリングに密接に関連している。
【００３３】
発明の概要
本発明は，部分的には，ゲノム配列決定から同定されたヒト蛋白質キナーゼおよび蛋白質キナーゼ様酵素に関する。
【００３４】
チロシンおよびセリン／トレオニンキナーゼ（ＰＴＫおよびＳＴＫ）が同定され，本発明の一部としてその蛋白質配列が予測された。バイオインフォマティクス戦略を用いてこれらのファミリーの哺乳動物メンバーが同定された。これらのキナーゼの部分配列または完全配列が，その分類，予測されたまたは推定された蛋白質構造とともに本明細書に記載される。
【００３５】
本発明の１つの観点は，配列番号１，配列番号２，配列番号３，配列番号４，配列番号５，配列番号６，配列番号７，配列番号８，配列番号９，配列番号１０，配列番号１１，および配列番号１２に記載されるアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するキナーゼポリペプチドをコードする，同定された，単離された，濃縮されたまたは精製された核酸分子を特徴とする。
【００３６】
核酸に関して”同定された”との用語は，これまでに知られていない新規蛋白質キナーゼの一部をコードすると予測されることに基づいて，ゲノム，ＥＳＴ，またはｃＤＮＡ配列データベースから配列が選択されたことを意味する。
【００３７】
核酸に関して”単離された”とは，互いに結合した１０個（好ましくは２１個，より好ましくは３９個，最も好ましくは７５個）またはそれ以上のヌクレオチドのポリマーを意味し，天然起源から単離された，またはセンス鎖または相補的なアンチセンス鎖として合成されるＤＮＡおよびＲＮＡが含まれる。本発明のある態様においては，より長い核酸が好ましく，例えば，３００，６００，９００，１２００，１５００，またはそれ以上のヌクレオチドのもの，および／または配列番号１，配列番号２，配列番号３，配列番号４，配列番号５，配列番号６，配列番号７，配列番号８，配列番号９，配列番号１０，配列番号１１，および配列番号１２に記載される配列からなる群より選択される配列と，少なくとも５０％，６０％，７５％，８０％，８５％，９０％，９５％または９９％の同一性を有するものが好ましい。
【００３８】
本発明の単離された核酸は，これが自然には純粋なまたは分離された状態で見いだされないという点において独特である。”単離された”との用語の使用は，天然に生ずる配列がその通常の細胞環境（すなわち染色体）から除かれていることを表す。すなわち，配列は，無細胞溶液中にあってもよく，または異なる細胞環境に置かれていてもよい。この用語は，この配列が存在する唯一のヌクレオチド鎖であることを意味するものではなく，天然にこれに付随する非ヌクレオチド物質を本質的に含まず（少なくとも約９０−９５％純粋），したがって，単離された染色体とは区別されることを意味する。
【００３９】
核酸に関連して，”濃縮された”との用語の使用は，特定のＤＮＡまたはＲＮＡ配列が，目的とする細胞または溶液中に存在する総ＤＮＡまたはＲＮＡ中で，正常または疾病細胞，またはこの配列が由来する細胞におけるより有意に高い割合（２−５倍）を占めることを意味する。これは，存在する他のＤＮＡまたはＲＮＡの量の優先的減少，または特定のＤＮＡまたはＲＮＡ配列の量の優先的増加，またはこれらの２つの組み合わせにより，人が生じさせることができる。しかし，濃縮されたとは，他のＤＮＡまたはＲＮＡ配列が存在しないことを意味するものではなく，単に，目的とする配列の相対的な量が有意に増加されていることを意味することに注意すべきである。”有意に”との用語は，増加のレベルがそのような増加を作成した人にとって有用であることを示すために用いられ，一般に，他の核酸に比べて少なくとも約２倍，より好ましくは少なくとも５−１０倍，またはそれ以上増加していることを意味する。またこの用語は，他の起源からのＤＮＡまたはＲＮＡが存在しないことを意味するものではない。他の起源のＤＮＡは，例えば，酵母または細菌ゲノム，またはクローニングベクター，例えばｐＵＣ１９からのＤＮＡでありうる。この用語は，１つのｍＲＮＡのレベルが他の種のｍＲＮＡと比較して自然に増加している天然に生ずる事象，例えばウイルス感染または腫瘍タイプの成長から区別される。すなわち，この用語は，人が介在して所望の核酸の比率を上昇させる状況のみをカバーする。
【００４０】
ある目的のためには，ヌクレオチド配列が精製された形であることも有利である。核酸に関して，”精製された”との用語は，絶対的純度（例えば均一な調製物）を要求するものではない。むしろ，これは配列が天然の環境におけるより比較的純粋であることを示す（天然のレベルと比較して，このレベルは，例えばｍｇ／ｍＬで少なくとも２−５倍高い）。ｃＤＮＡライブラリから単離された個々のクローンは，電気泳動的に均一にまで精製することができる。これらのクローンから得られた本発明のＤＮＡ分子は，総ＤＮＡからまたは総ＲＮＡから直接得ることができる。ｃＤＮＡクローンは天然に生じず，好ましくは部分的に精製した天然に生ずる物質（メッセンジャーＲＮＡ）の操作により得る。ｍＲＮＡからのｃＤＮＡライブラリの構築は，合成物質（ｃＤＮＡ）の作成を含み，純粋な個々のｃＤＮＡクローンは，ｃＤＮＡライブラリを有する細胞のクローン選択により合成ライブラリから単離することができる。すなわち，ｍＲＮＡからｃＤＮＡライブラリを構築し，個々のｃＤＮＡクローンを単離することを含む工程により，天然のメッセンジャーのおよそ１０６倍の精製が得られる。すなわち，少なくとも１桁，好ましくは２または３桁，より好ましくは４または５桁の精製が明示的に企図される。
【００４１】
”キナーゼポリペプチド”とは，配列番号１３，配列番号１４，配列番号１５，配列番号１６，配列番号１７，配列番号１８，配列番号１９，配列番号２０，配列番号２１，配列番号２２，配列番号２３，および配列番号２４に記載されるアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチド中の，３２個（好ましくは４０，より好ましくは４５，最も好ましくは５５個）またはそれ以上の連続するアミノ酸を意味する。ある観点においては，１００，２００，３００，４００，４５０，５００，５５０，６００，７００，８００，９００個またはそれ以上のアミノ酸のポリペプチドが好ましい。キナーゼポリペプチドは，ポリペプチドの機能的活性が保持される限り，完全長核酸配列または完全長核酸配列の任意の部分（例えば，本明細書において定義される”フラグメント”），例えば，触媒ドメイン（本明細書において定義される）またはその一部によりコードされることができる。当業者は，キナーゼまたはキナーゼ様活性，例えば本明細書において定義される触媒的活性を示すこれらの触媒ドメインまたはその一部を選択することができるであろう。遺伝コードの縮重のため，多数の異なる核酸配列が同じアミノ酸配列をコードしうることは当該技術分野においてよく知られている。同じく，アミノ酸の保存的変更を行って，元の機能を保持している蛋白質またはポリペプチドを得ることができることも，当該技術分野においてよく知られている。そのような置換には，アミノ酸を類似の物理化学的特性を有する残基で置き換えること，例えば，１つの脂肪族残基（Ｉｌｅ，Ｖａｌ，ＬｅｕまたはＡｌａ）を別のもので，または塩基性残基ＬｙｓとＡｒｇ，酸性残基ＧｌｕとＡｓｐ，アミド残基ＧｌｎとＡｓｎ，ヒドロキシル残基ＳｅｒとＴｙｒ，または芳香族残基ＰｈｅとＴｙｒとの間で置き換えることが含まれる。蛋白質全体に対して，あったとしてもわずかの影響しか与えないアミノ酸の交換を作成することに関するさらなる情報は，Ｂｏｗｉｅ　ｅｔ　ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９０，２４７，１３０６−１３１０に見いだすことができる（図面および表を含めその全体を本明細書の一部としてここに引用する）。すべての場合において，すべての順列が本明細書の開示によりカバーされることが意図される。
【００４２】
本発明のキナーゼペプチドのアミノ酸配列は，配列番号１３，配列番号１４，配列番号１５，配列番号１６，配列番号１７，配列番号１８，配列番号１９，配列番号２０，配列番号２１，配列番号２２，配列番号２３，および配列番号２４に記載されるアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列，または対応する完全長アミノ酸配列，またはそのフラグメントを有する配列に実質的に類似するであろう。
【００４３】
配列番号１３，配列番号１４，配列番号１５，配列番号１６，配列番号１７，配列番号１８，配列番号１９，配列番号２０，配列番号２１，配列番号２２，配列番号２３，および配列番号２４に記載される配列からなる群より選択される配列と実質的に類似する配列は，好ましくは配列と少なくとも９０％の同一性（より好ましくは少なくとも９５％，最も好ましくは９９−１００％）を有するであろう。
【００４４】
”同一性”とは，その類似性または関係の尺度である配列の性質を意味する。同一性は，同一である残基の数を，既知の配列または既知の配列のドメイン中の残基の総数で割り，１００を乗ずることにより測定する。”ギャップ”とは，アミノ酸の付加または欠失により生じたアラインメント中の空間である。すなわち，完全に同一の配列の２つのコピーは１００％の同一性を有するが，より低い程度に保存され，欠失，付加または置換を含む配列はより低い程度の同一性を有するであろう。当業者は，標準的なパラメータを用いて配列の同一性を決定するためのいくつかのコンピュータプログラム，例えば，Ｇａｐｐｅｄ　ＢＬＡＳＴまたはＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔ　ａｌ．（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２），ＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔ　ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０），およびスミス−ウォーターマン（Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ）（Ｓｍｉｔｈ，ｅｔ　ａｌ．（１９８１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１４７：１９５−１９７）が利用可能であることを認識するであろう。好ましくは，これらのプログラムのデフォルト設定を用いるが，当業者は，これらの設定を変更することが必要であるか否かを認識しており，どのようにして変更するを理解している。
【００４５】
”類似性”は，同一の残基の数と保存的に置換された残基の数（Ｂｏｗｉｅ，　ｅｔ　ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９９，２４７，１３０６−１３１０を参照（図面および表を含め，その全体を本明細書の一部としてここに引用する）との合計を残基とギャップの総数で割り，１００を乗ずることにより測定することができる。
【００４６】
好ましい態様においては，本発明は，以下のヌクレオチド配列を含むキナーゼポリペプチドをコードする，単離された，濃縮されたまたは精製された核酸分子を特徴とする：
（ａ）配列番号１３，配列番号１４，配列番号１５，配列番号１６，配列番号１７，配列番号１８，配列番号１９，配列番号２０，配列番号２１，配列番号２２，配列番号２３，および配列番号２４に記載されるアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする；
（ｂ）（ａ）のヌクレオチド配列の相補体である；
（ｃ）（ａ）のヌクレオチド分子に高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズし，かつ天然に生ずるキナーゼポリペプチドをコードする；
（ｄ）配列番号１３，配列番号１４，配列番号１５，配列番号１６，配列番号１７，配列番号１８，配列番号１９，配列番号２０，配列番号２１，配列番号２２，配列番号２３，および配列番号２４に記載されるアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列であって，ただしＮ末端ドメイン，触媒ドメイン，Ｃ末端触媒ドメイン，Ｃ末端ドメイン，コイルドコイル構造領域，プロリンリッチ領域，スペーサー領域，およびＣ末端テールからなる群より選択されるドメインの全部ではないが１またはそれ以上を欠失しているアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする；および
（ｅ）（ｄ）のヌクレオチド配列の相補体である。
【００４７】
”相補体”との用語は，互いに多くの望ましい相互作用を形成しうる２つのヌクレオチドを表す。例えば，アデニンはチミンと２つの水素結合を形成することができるため，チミンに相補的である。同様に，グアニンとシトシンは３つの水素結合を形成することができるため，相補的である。あるヌクレオチド配列は，第１の配列のすべてのヌクレオチドが第２の配列のすべてのヌクレオチドと相補的である場合，他のヌクレオチド配列の相補体である。
【００４８】
所望の特異性および選択性に応じて，種々の低いまたは高いストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件を用いることができる。これらの条件は，当業者にはよく知られている。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下では，高度に相補的な核酸配列のみがハイブリダイズする。好ましくは，そのような条件は，２０個の連続するヌクレオチド中に１または２個より多いミスマッチを有する核酸のハイブリダイゼーションを防止し，より好ましくは，そのような条件は，５０個の連続するヌクレオチド中に１または２個より多いミスマッチを有する核酸のハイブリダイゼーションを防止し，最も好ましくは，そのような条件は，１００個の連続するヌクレオチド中に１または２個より多いミスマッチを有する核酸のハイブリダイゼーションを防止する。場合によっては，この条件は，全長配列中に５個のミスマッチを有する核酸のハイブリダイゼーションを防止する。
【００４９】
ストリンジェントなハイブリダイゼーションアッセイ条件とは，少なくとも以下の程度にストリンジェントなハイブリダイゼーションアッセイ条件を意味する：５０％ホルムアミド，５ＸＳＳＣ，５０ｍＭ　ＮａＨ２ＰＯ４，ｐＨ６．８，０．５％ＳＤＳ，０．１ｍｇ／ｍＬ超音波処理サケ精子ＤＮＡ，および５Ｘデンハルト溶液中で４２℃で一夜のハイブリダイゼーション；２ＸＳＳＣ，０．１％ＳＤＳで４５℃での洗浄；および０．２ＸＳＳＣ，０．１％ＳＤＳで４５℃での洗浄。いくつかの最もストリンジェントなハイブリダイゼーションアッセイ条件においては，２回目の洗浄は，０．１ＸＳＳＣで７０℃までの温度で行うことができる（Ｂｅｒｇｅｒ　ｅｔ　ａｌ（１９８７）Ｇｕｉｄｅ　ｔｏ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，ｐｇ４２１（図面および表を含めその全体を本明細書の一部としてここに引用する）。しかし，他の用途は，これらの条件の組の間に入る条件の使用を必要とするかもしれない。所望のハイブリダイゼーションを達成するのに必要な条件を決定する方法は当業者にはよく知られており，いくつかの因子，例えば，限定されないが，ハイブリダイズすべき配列および試験すべき試料に基づく。低いストリンジェンシーの洗浄条件は，しばしば洗浄工程の間により低い温度，例えば，６５℃，６０℃，５５℃，５０℃，または４２℃を用いる。
【００５０】
”ドメイン”との用語は，特定の機能を含むポリペプチドの領域を表す。例えば，シグナル伝達蛋白質のＮ末端またはＣ末端ドメインは，例えば，限定されないが，シグナル伝達分子を細胞の異なる領域に局在させる分子に結合し，特定の細胞シグナルを伝播するのに直接関与する他のシグナリング分子に結合する，等の機能を提供することができる。あるドメインは蛋白質の残部と別々に発現させてそれ自身で機能することができるが，他のドメインはその機能を保持するためには無傷の蛋白質の一部のままでなければならない。後者は蛋白質の機能的領域とも称され，これもまたドメインと関連する。
【００５１】
”Ｎ末端ドメイン”との用語は，蛋白質キナーゼの開始メチオニンと触媒的ドメインとの間に位置する触媒外領域を表す。Ｎ末端ドメインは，蛋白質配列を非重複蛋白質データベースに対してスミス−ウォーターマンアラインメントを行い，触媒的ドメインのＮ末端境界を規定することにより同定することができる。Ｎ末端ドメインは，その長さに応じて，キナーゼ機能において制御的役割を果たすかまたは果たさない。Ｎ末端ドメインが制御的役割を果たすことが知られている蛋白質キナーゼの例はＰＡＫ６５であり，これはＣｄｃ４２およびｒａｃ結合に用いられるＣＲＩＢモチーフを含む（Ｂｕｒｂｅｌｏ，Ｐ．Ｄ．ｅｔ　ａｌ．（１９９５）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０，２９０７１−２９０７４）。
【００５２】
”触媒ドメイン”との用語は，典型的に２５−３００アミノ酸の長さであり，高エネルギーリン酸ドナー分子，例えばＡＴＰまたはＧＴＰからそれ自身へ（自己リン酸化）または他の蛋白質へ（外因性リン酸化）のリン酸転移反応を担う，蛋白質キナーゼの領域を表す。蛋白質キナーゼの触媒ドメインは，適切なポリペプチドの折り畳みおよび触媒作用を担う高度に保存されたアミノ酸残基を含む１２個のサブドメインから構成されている。触媒ドメインは，蛋白質配列を非重複蛋白質データベースに対してスミス−ウォーターマンアラインメントを行うことにより同定することができる。
【００５３】
本明細書において用いる場合，”触媒活性”との用語は，キナーゼ触媒ドメインが基質をリン酸化する速度を規定する。触媒活性は，例えば，リン酸化された生成物に変換される基質の量を時間の関数として決定することにより測定することができる。触媒活性は，時間を一定にして定められた時間の後にリン酸化された基質の濃度を決定することにより，本発明の方法により測定することができる。基質のリン酸化は，蛋白質キナーゼの活性部位において生ずる。活性部位は，通常は，基質が蛋白質キナーゼに結合し，リン酸化される空洞である。
【００５４】
本明細書において用いる場合，”基質”との用語は，本発明のキナーゼによりリン酸化される分子を表す。キナーゼは，セリン／トレオニンまたはチロシンアミノ酸で基質をリン酸化する。分子は別の蛋白質またはポリペプチドであってもよい。
【００５５】
”Ｃ末端ドメイン”との用語は，蛋白質キナーゼの触媒ドメインまたは最後の（Ｃ末端に最も近い位置の）機能的ドメインとカルボキシ末端アミノ酸残基との間に位置する領域を表す。”機能的”ドメインとは，他の蛋白質に対するアミノ酸配列ホモロジーから，または特定の構造的コンフォメーションを与えるであろうアミノ酸配列の存在（例えばＮ末端ドメイン）により，制御的または触媒的役割を果たすであろう，ポリペプチドの任意の領域を意味する。Ｃ末端ドメインは，非重複蛋白質データベースに対して蛋白質配列のスミス−ウォーターマンアラインメントを用いて，触媒ドメインまたは任意の機能的なＣ末端の触媒外ドメインのＣ末端境界を規定することにより同定することができる。その長さおよびアミノ酸組成に依存して，Ｃ末端ドメインは，キナーゼ機能において制御的機能を果たすかもしれないし果たさないかもしれない。そのＣ末端ドメインが制御的役割を果たすかもしれない蛋白質キナーゼの例はＰＡＫ３であり，これはそのＣ末端近くにヘテロ三量体Ｇｂサブユニット結合部位を含む（Ｌｅｅｕｗ，Ｔ．　ｅｔ　ａｌ．（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ，３９１，１９１−１９５）。本発明のいくつかのキナーゼについては，Ｃ末端ドメインはまた触媒ドメインを含むかもしれない（上述）。
【００５６】
本明細書において用いる場合，”Ｃ末端テール”との用語は，ホモロジーにより，その最も近いホモログのＣ末端アミノ酸を越えて伸長または突出している蛋白質キナーゼのＣ末端ドメインを表す。Ｃ末端テールは，蛋白質配列を非重複蛋白質データベースに対してスミス−ウォーターマン配列アラインメントを用いることにより，またはＤＮＡＳｔａｒプログラムＭｅｇａｌｉｇｎを用いる相同な配列の多重配列アラインメントにより，同定することができる。Ｃ末端テールは，その長さに依存して，キナーゼ機能において制御的役割を果たすかもしれないし果たさないかもしれない。
【００５７】
本明細書において用いる場合，”コイルドコイル構造領域”との用語は，コンピュータアルゴリズム，例えばＣＯＩＬＳ（Ｌｕｐａｓ，Ａ．（１９９６）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　２６６：５１３−５２５）により推定してコイルドコイル構造をとる可能性が高いポリペプチド配列を表す。コイルドコイルは，平行な２または３個の両親媒性α−ヘリックスから形成される。コイルドコイルは，他のポリペプチドのコイルドコイルドメインと結合してホモ二量体またはヘテロ二量体を生ずることができる（Ｌｕｐａｓ，Ａ．（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ　２５２：１１６２−１１６４）。コイルドコイル依存性オリゴマー化は，蛋白質機能，例えばセリン／トレオニンキナーゼの触媒活性に必要であることが示されている（Ｒｏｅ，Ｊ．ｅｔ　ａｌ．（１９９７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：５８３８−５８４５）。
【００５８】
本明細書において用いる場合，”プロリンリッチ領域”との用語は，蛋白質キナーゼの，所定のアミノ酸長さにわたるプロリン含量が蛋白質において見いだされるこのアミノ酸の平均含量より高い（すなわち，＞１０％）領域を表す。プロリンリッチ領域は，アミノ酸配列を目で調べることにより容易に識別され，標準的なコンピュータ配列分析プログラム，例えばＤＮＡＳｔａｒプログラムＥｄｉｔＳｅｑにより定量することができる。プロリンリッチ領域は，制御的な蛋白質−蛋白質相互作用に関与することが示されている。これらの相互作用の中で，本発明に最も関連性が深いものには，ある種の蛋白質キナーゼ（例えばヒトＰＡＫ１）およびアダプター分子ＮｃｋのＳＨ３ドメインに見いだされる”ＰｘｘＰ”プロリンリッチモチーフが関与する（Ｇａｌｉｓｔｅｏ，Ｍ．Ｌ．ｅｔ　ａｌ．（１９９６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：２０９９７−２１０００）。”ＰｘｘＰ”プロリンリッチモチーフが関与する他の制御的相互作用にはＷＷドメインがある（Ｓｕｄｏｌ，Ｍ．（１９９６）Ｐｒｏｇ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．６５：１１３−１３２）。
【００５９】
本明細書において用いる場合，”スペーサー領域”との用語は，予測される機能的ドメインの間に位置する蛋白質キナーゼの領域を表す。スペーサー領域は，データベース中の任意のアミノ酸配列に対する検出可能なホモロジーを有しない。これは，非重複蛋白質データベースに対して蛋白質配列のスミスウォーターマンアラインメントを用いて，これを挟む機能的ドメインのＣおよびＮ末端境界を規定することにより同定することができる。スペーサー領域は，蛋白質キナーゼ機能において基本的な機能を果たすかもしれず果たさないかもしれない。スペーサー領域のキナーゼ機能における制御的役割の先例は，ｓｒｃキナーゼスペーサーのドメイン間相互作用における役割により提供される（Ｘｕ，Ｗ．ｅｔ　ａｌ（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ　３８５：５９５−６０２）。
【００６０】
本明細書において用いる場合，”挿入物”との用語は，蛋白質キナーゼの密接なホモロジーを有しない一部を表す。挿入物は，エクソンの選択的スプライシングの産物であるかもしれないしそうではないかもしれない。挿入物は，蛋白質配列の非重複蛋白質データベースに対するスミス−ウォーターマン配列アラインメントを用いて，またはＤＮＡＳｔａｒプログラムＭｅｇａｌｉｇｎを用いる相同な配列の多重配列アラインメントにより，同定することができる。挿入物は，蛋白質−蛋白質相互作用のための新規なインターフェースを提示することにより，またはそのような相互作用を妨害することにより，機能的役割を果たすかもしれない。
【００６１】
”シグナル伝達経路”との用語は，細胞外シグナルを細胞膜を通して伝播し，細胞内シグナルとなる分子を表す。このシグナルは，次に細胞性応答を刺激することができる。シグナル伝達プロセスに関与するポリペプチド分子は，典型的にはレセプターおよび非レセプター蛋白質チロシンキナーゼ，レセプターおよび非レセプター蛋白質ホスファターゼ，ＳＲＣホモロジー２および３ドメイン，ホスホチロシン結合蛋白質（ＳＲＣホモロジー２（ＳＨ２）およびホスホチロシン結合（ＰＴＢおよびＰＨ）ドメイン含有蛋白質），プロリンリッチ結合蛋白質（ＳＨ３ドメイン含有蛋白質），ＧＴＰａｓｅ，ホスホジエステラーゼ，ホスホリパーゼ，プロリルイソメラーゼ，プロテアーゼ，Ｃａ２＋結合蛋白質，ｃＡＭＰ結合蛋白質，グアニルシクラーゼ，アデニリルシクラーゼ，ＮＯ生成蛋白質，ヌクレオチド交換因子および転写因子である。
【００６２】
別の好ましい態様においては，本発明は，キナーゼポリペプチドをコードし，宿主細胞において転写を開始するのに有効なベクターまたはプロモーターをさらに含む，単離された，濃縮されたまたは精製された核酸分子を特徴とする。本発明はまた，組換え核酸を特徴とし，これは好ましくは細胞または生物内にある。組換え核酸は，配列番号１，配列番号２，配列番号３，配列番号４，配列番号５，配列番号６，配列番号７，配列番号８，配列番号９，配列番号１０，配列番号１１，および配列番号１２に記載される配列からなる群より選択される配列，またはその機能的誘導体，および宿主細胞において転写を開始させるのに有効なベクターまたはプロモーターを含むことができる。あるいは，組換え核酸は，細胞において機能的な転写開始領域，キナーゼポリペプチドをコードするＲＮＡ配列に相補的な配列および細胞において機能的な転写終止領域を含んでいてもよい。特定のベクターおよび宿主細胞の組み合わせは本明細書において議論される。
【００６３】
”ベクター”との用語は，細胞にトランスフェクトすることができ，細胞ゲノム中でまたはそれとは独立に複製しうる一本鎖または二本鎖の環状核酸分子を表す。環状二本鎖核酸分子は，制限酵素で処理することにより切断し，したがって直鎖状にすることができる。核酸ベクターの分類，制限酵素，および制限酵素により切断されるヌクレオチド配列の知識は，当業者には容易に入手可能である。キナーゼをコードする核酸分子は，ベクターを制限酵素で切断し，２つの断片を一緒にライゲーションすることにより，ベクター中に挿入することができる。
【００６４】
”トランスフェクトする”との用語は，核酸ベクターまたは他の核酸分子を細胞性生物中に挿入する多数の方法を規定する。これらの方法には，種々の手法が含まれ，例えば，細胞を高濃度の塩，電界，界面活性剤，またはＤＭＳＯで処理することにより，細胞の外膜または壁を目的の核酸分子に対して透過性にすること，または種々のウイルス伝達戦略を用いることが含まれる。
【００６５】
本明細書において用いる場合，”プロモーター”との用語は，遺伝子配列の発現に必要な核酸配列を表す。プロモーター領域は生物によって様々であるが，種々の生物について当業者によく知られている。例えば，原核生物においては，プロモーター領域は，プロモーター（ＲＮＡ転写の開始を指示する）ならびに，ＲＮＡに転写されたときに合成の開始を合図するＤＮＡ配列の両方を含む。そのような領域は，通常は転写および翻訳の開始に関与する５’非コーディング配列，例えばＴＡＴＡボックス，キャッピング配列，ＣＡＡＴ配列等を含む。
【００６６】
好ましい態様においては，単離された核酸は，配列番号１，配列番号２，配列番号３，配列番号４，配列番号５，配列番号６，配列番号７，配列番号８，配列番号９，配列番号１０，配列番号１１，および配列番号１２に記載される配列からなる群より選択される核酸配列を含むか，本質的にそれからなるか，それからなり，かつ，配列番号１３，配列番号１４，配列番号１５，配列番号１６，配列番号１７，配列番号１８，配列番号１９，配列番号２０，配列番号２１，配列番号２２，配列番号２３，および配列番号２４に記載されるアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列，その機能的誘導体，または配列番号１３，配列番号１４，配列番号１５，配列番号１６，配列番号１７，配列番号１８，配列番号１９，配列番号２０，配列番号２１，配列番号２２，配列番号２３，および配列番号２４に記載されるアミノ酸配列からなる群より選択される少なくとも３５，４０，４５，５０，６０，７５，１００，２００，または３００個の連続するアミノ酸をコードする。核酸は，ｃＤＮＡクローニングにより，またはサブトラクティブハイブリダイゼーションにより，天然の起源から単離することができる。天然の起源は哺乳動物であることができ，好ましくはヒト，好ましくは血液，精液または組織であり，核酸はトリエステル法によりまたは自動化ＤＮＡ合成機を用いることにより合成してもよい。
【００６７】
”哺乳動物”とは，好ましくはマウス，ラット，ウサギ，モルモット，ヒツジ，およびヤギ等の生物を表し，より好ましくはネコ，イヌ，有尾サル，および無尾サルを表し，最も好ましくはヒトを表す。
【００６８】
さらに別の好ましい態様においては，核酸は，例えば，追加のポリペプチドの同定およびクローニングを容易にするためのハイブリダイゼーションプローブを設計するのに，追加のポリペプチドのクローニングを容易にするためのＰＣＲプローブを設計するのに，ポリペプチド領域に対する抗体を得るために，およびアンチセンスオリゴヌクレオチドを設計するのに有用な，保存されたまたは独特の領域である。
【００６９】
”保存された核酸領域”とは，キナーゼポリペプチドをコードする２つまたはそれ以上の核酸に存在する領域を意味し，特定の核酸配列は低いストリンジェンシー条件下でこの領域にハイブリダイズすることができる。キナーゼポリペプチドをコードする核酸のスクリーニングに適した低ストリンジェンシー条件の例は，Ｗａｈｌ　ｅｔ　ａｌ．Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍ．１５２：３９９−４０７（１９８７）およびＷａｈｌ　ｅｔ　ａｌ．Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍ．１５２：４１５−４２３（１９８７）（図面および表を含めその全体を本明細書の一部としてここに引用する）に提供される。好ましくは，保存領域は，２０ヌクレオチド中５個以下で異なり，より好ましくは２０ヌクレオチド中２個，最も好ましくは２０ヌクレオチド中１個が異なる。
【００７０】
”独特の核酸領域”とは，キナーゼポリペプチドをコードする核酸中に存在し，天然に生ずる任意の他のポリペプチドをコードする配列中には存在しない配列を意味する。そのような領域は，好ましくは３２個（好ましくは４０個，より好ましくは４５個，最も好ましくは５５個）またはそれ以上の連続するアミノ酸，例えば，配列番号１３，配列番号１４，配列番号１５，配列番号１６，配列番号１７，配列番号１８，配列番号１９，配列番号２０，配列番号２１，配列番号２２，配列番号２３，および配列番号２４に記載されるアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列をコードする。特に，独特の核酸領域は，好ましくは哺乳動物起源のものである。
【００７１】
本発明の別の観点は，試料において，配列番号１３，配列番号１４，配列番号１５，配列番号１６，配列番号１７，配列番号１８，配列番号１９，配列番号２０，配列番号２１，配列番号２２，配列番号２３，および配列番号２４に記載されるアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するキナーゼポリペプチドをコードする核酸を検出するための核酸プローブを特徴とする。核酸プローブは，配列番号１，配列番号２，配列番号３，配列番号４，配列番号５，配列番号６，配列番号７，配列番号８，配列番号９，配列番号１０，配列番号１１，および配列番号１２，またはその機能的誘導体に記載される配列からなる群より選択される配列にハイブリダイズするであろうヌクレオチド塩基配列を含む。
【００７２】
好ましい態様においては，核酸プローブは，少なくとも１２，３２，７５，９０，１０５，１２０，１５０，２００，２５０，３００または３５０個の連続するアミノ酸をコードする核酸にハイブリダイズし，ここで，核酸配列は，配列番号１，配列番号２，配列番号３，配列番号４，配列番号５，配列番号６，配列番号７，配列番号８，配列番号９，配列番号１０，配列番号１１，および配列番号１２，またはその機能的誘導体からなる群より選択される。
【００７３】
プローブを使用する方法には，ハイブリダイゼーションが生ずるような条件下で試料を核酸プローブと接触させ，キナーゼＲＮＡに結合したプローブの存在または量を検出することにより，試料中のキナーゼＲＮＡの存在または量を検出することが含まれる。プローブとキナーゼポリペプチドをコードする核酸配列との間に形成される核酸デュープレックスを，検出された核酸の配列の同定において用いることができる（Ｎｅｌｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ．，Ｎｏｎｉｓｏｔｏｐｉｃ　ＤＮＡ　Ｐｒｏｂｅ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ，Ｋｒｉｃｋａ，ｅｄ．，ｐ．２７５，１９９２（図面および表を含めその全体を本明細書の一部としてここに引用する）。そのような方法を実施するためのキットは，その中に核酸プローブが置かれている容器手段を含むように構築することができる。
【００７４】
プローブを使用する方法には，これらのプローブを用いて，例えば当該技術分野において知られる技術を用いて予測キナーゼのそれぞれの完全長クローンを見いだすことも含まれる。これらのクローンは，コードされるキナーゼの触媒的活性を阻害し，癌，免疫関連疾病および疾患，心臓血管疾病，脳またはニューロン関連疾病，および代謝性疾患の治療において潜在的有用性を有する小分子化合物をスクリーニングするのに有用であろう。より詳細には，疾患には，組織，血液，または造血細胞起源の癌，特に乳，結腸，肺，前立腺，子宮頚部，脳，卵巣，膀胱，または腎臓が関与する癌；中枢神経または末梢神経系疾病および状態，例えば，片頭痛，痛み，性的機能不全，気分障害，注意障害，認識障害，低血圧症，および高血圧症；精神病性および神経学的疾患，例えば不安，精神分裂病，躁うつ病，せん妄，痴呆，重症の精神遅滞および運動異常症，例えばハンチントン病またはツレット症候群；神経変性性疾病，例えばアルツハイマー病，パーキンソン病，多発性硬化症，および筋萎縮性側索硬化症；ＨＩＶ１，ＨＩＶ−２または他のウイルスまたはプリオン体または真菌または細菌生物により引き起こされるウイルスまたは非ウイルス感染；代謝性疾患，例えば糖尿病および肥満およびこれに関連する症候群，特に，心臓血管疾患，例えば再灌流再狭窄，冠状動脈血栓症，凝固疾患，制御されない細胞成長疾患，アテローム性動脈硬化症；眼性疾病，例えば緑内障，網膜症，および黄斑変性；炎症性疾患，例えば慢性関節リウマチ，慢性炎症性腸疾病，慢性炎症性骨盤疾病，多発性硬化症，ぜん息，変形性関節症，乾癬，アテローム性動脈硬化症，鼻炎，自己免疫，および臓器移植拒絶が含まれる。
【００７５】
別の観点においては，本発明は，配列番号１３，配列番号１４，配列番号１５，配列番号１６，配列番号１７，配列番号１８，配列番号１９，配列番号２０，配列番号２１，配列番号２２，配列番号２３，および配列番号２４に記載されるアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するキナーゼポリペプチドをコードする核酸分子を含む組換え細胞または組織を記述する。そのような細胞においては，核酸は遺伝的制御要素の制御下にあってもよく，または外来性プロモーターを含む外来性制御要素の制御下にあってもよい。”外来性”とは，通常はキナーゼポリペプチドのコーディング配列とインビボで転写的にカップリングしていないプロモーターを意味する。
【００７６】
ポリペプチドは，好ましくは，配列番号１３，配列番号１４，配列番号１５，配列番号１６，配列番号１７，配列番号１８，配列番号１９，配列番号２０，配列番号２１，配列番号２２，配列番号２３，および配列番号２４に記載されるアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列によりコードされる蛋白質のフラグメントである。”フラグメント”とは，キナーゼポリペプチド中に存在するアミノ酸配列を意味する。好ましくは，そのような配列は，配列番号１３，配列番号１４，配列番号１５，配列番号１６，配列番号１７，配列番号１８，配列番号１９，配列番号２０，配列番号２１，配列番号２２，配列番号２３，および配列番号２４に記載されるアミノ酸配列からなる群より選択される配列の，少なくとも３２，４５，５０，６０，１００，２００，または３００個の連続するアミノ酸を含む。
【００７７】
別の観点においては，本発明は，配列番号１３，配列番号１４，配列番号１５，配列番号１６，配列番号１７，配列番号１８，配列番号１９，配列番号２０，配列番号２１，配列番号２２，配列番号２３，および配列番号２４に記載されるアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する，単離された，濃縮されたまたは精製されたキナーゼポリペプチドを特徴とする。
【００７８】
ポリペプチドに関して”単離された”とは，互いに結合した６個（好ましくは１２個，より好ましくは１８個，最も好ましくは２５，３２，４０，または５０個）またはそれ以上のアミノ酸のポリマーを意味し，天然起源から単離されたポリペプチドまたは合成されたポリペプチドが含まれる。ある種の観点においては，より長いポリペプチド，例えば，配列番号１３，配列番号１４，配列番号１５，配列番号１６，配列番号１７，配列番号１８，配列番号１９，配列番号２０，配列番号２１，配列番号２２，配列番号２３，および配列番号２４に記載されるアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む，１００，２００，３００，４００，４５０，５００，５５０，６００，７００，８００，９００個またはそれ以上の連続するアミノ酸を含むものが好ましい。
【００７９】
本発明の単離されたポリペプチドは，天然には純粋なまたは分離された形で見いだされない点において独特である。”単離された”との用語の使用は，天然に生ずる配列がその正常な細胞性環境から除かれていることを示す。すなわち，配列は，無細胞溶液中にあってもよく，異なる細胞性環境に置かれていてもよい。この用語は，その配列が存在する唯一のアミノ酸鎖であることを意味するものではなく，配列が天然にこれに付随する非アミノ酸物質を本質的に含まない（少なくとも約９０−９５％純粋）ことを意味する。
【００８０】
ポリペプチドに関して使用する場合，”濃縮された”との用語は，特定のアミノ酸配列が，正常または疾病細胞におけるより，または配列が由来する細胞におけるより，目的とする細胞または溶液中に存在する総アミノ酸配列の有意に高い割合（２−５倍）を占めることを意味する。これは，存在する他のアミノ酸配列の量の優先的減少により，または目的とする特定のアミノ酸配列の量の優先的増加により，またはこれら２つの組み合わせにより，人が生じさせることができる。しかし，濃縮されたとは，他のアミノ酸配列が存在しないことを意味するものではなく，単に目的とする配列の相対的な量が有意に増加していることを意味することに注意すべきである。本明細書において”有意”にとの用語は，増加のレベルがそのような増加を作成した人にとって有用であることを示し，一般に，他のアミノ酸配列と比較して少なくとも約２倍，より好ましくは少なくとも５−１０倍，またはそれより多い増加を意味する。この用語はまた，他の起源からのアミノ酸配列が存在しないことを意味するものではない。アミノ酸配列の他の起源は，例えば，酵母または細菌のゲノム，またはクローニングベクター，例えばｐＵＣ１９によりコードされるアミノ酸配列を含みうる。この用語は，人が介在して所望のアミノ酸配列の比率を増加させる状況のみをカバーすることを意味する。
【００８１】
ある目的のためには，アミノ酸配列が精製された形であることも有利である。ポリペプチドに関して”精製された”との用語は絶対的純度（例えば均一調製物）を要求するものではなく，この用語は配列が天然の環境におけるより比較的純粋であることを示す。天然のレベルと比較して，このレベルは少なくとも２−５倍高くあるべきである（例えばｍｇ／ｍＬで）。少なくとも１桁の精製，好ましくは２または３桁，より好ましくは４または５桁の精製が明示的に意図される。物質は，好ましくは機能的に有意なレベルで夾雑物を含まず，例えば，９０％，９５％，または９９％純粋である。
【００８２】
好ましい態様においては，キナーゼポリペプチドは，配列番号１３，配列番号１４，配列番号１５，配列番号１６，配列番号１７，配列番号１８，配列番号１９，配列番号２０，配列番号２１，配列番号２２，配列番号２３，および配列番号２４に記載されるアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列によりコードされる蛋白質のフラグメントである。好ましくは，キナーゼポリペプチドは，配列番号１３，配列番号１４，配列番号１５，配列番号１６，配列番号１７，配列番号１８，配列番号１９，配列番号２０，配列番号２１，配列番号２２，配列番号２３，および配列番号２４に記載されるアミノ酸配列，またはその機能的誘導体からなる群より選択される配列の，少なくとも３２，４５，５０，６０，１００，２００，または３００個の連続するアミノ酸を含む。
【００８３】
好ましい態様においては，キナーゼポリペプチドは，（ａ）配列番号１３，配列番号１４，配列番号１５，配列番号１６，配列番号１７，配列番号１８，配列番号１９，配列番号２０，配列番号２１，配列番号２２，配列番号２３，および配列番号２４に記載されるアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列であって，ただし，Ｃ末端触媒ドメイン，Ｎ末端ドメイン，触媒ドメイン，Ｃ末端ドメイン，コイルドコイル構造領域，プロリンリッチ領域，スペーサー領域，およびＣ末端テールからなる群より選択されるドメインの１またはそれ以上が欠失している配列；
を有するアミノ酸配列を含む。
【００８４】
ポリペプチドは，当該技術分野においてよく知られる方法により，天然の起源から単離することができる。天然の起源は哺乳動物であることができ，好ましくはヒトであり，好ましくは，血液，精液，または組織であり，またはポリペプチドは自動化ポリペプチド合成機を用いて合成してもよい。
【００８５】
ある態様においては，本発明は，（ａ）配列番号１３，配列番号１４，配列番号１５，配列番号１６，配列番号１７，配列番号１８，配列番号１９，配列番号２０，配列番号２１，配列番号２２，配列番号２３，および配列番号２４に記載されるアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する組換えキナーゼポリペプチドを含む。”組換えキナーゼポリペプチド”とは，その存在位置（例えば，天然に見いだされる物とは異なる細胞または組織に存在），純度または構造において天然に生ずるポリペプチドと区別されるように，組換えＤＮＡ技術により製造されるポリペプチドを意味する。一般に，そのような組換えポリペプチドは，天然に通常観察される量とは異なる量で細胞中に存在するであろう。
【００８６】
宿主細胞中で発現させるべきポリペプチドは，異種蛋白質からの領域を含む融合蛋白質であってもよい。そのような領域を含むことにより，例えば，分泌させ，安定性を改良し，またはポリペプチドの精製を容易にすることができる。例えば，適当なシグナルペプチドをコードする配列を発現ベクター中に組み込むことができる。シグナルペプチド（分泌リーダー）のＤＮＡ配列を，ポリペプチドがシグナルペプチドを含む融合蛋白質として翻訳されるように，ポリヌクレオチド配列にインフレームで融合させることができる。意図する宿主細胞において機能的であるシグナルペプチドは，ポリペプチドの細胞外分泌を促進する。好ましくは，シグナル配列はポリペプチドが細胞から分泌される際にポリペプチドから切断される。すなわち，キナーゼポリペプチドのＮ末端が運搬ペプチドに融合されている好ましい融合蛋白質を作成することができる。
【００８７】
１つの態様においては，ポリペプチドは，ポリペプチドの精製を容易にするために用いられる異種領域を含む融合蛋白質を含む。そのような機能のために用いられる入手可能なペプチドの多くは，融合蛋白質が結合パートナーに選択的に結合することを可能とする。好ましい結合パートナーには，プロテインＡのＩｇＧ結合ドメインの１またはそれ以上が含まれ，融合蛋白質は，ＩｇＧ結合セファロース等のアフィニティークロマトグラフィーにより容易に均一にまで精製される。あるいは，多くのベクターは，標的蛋白質のＮ末端またはＣ末端で発現されることができるヒスチジン残基のストレッチを有するという利点を有しており，したがって，金属キレート化クロマトグラフィーにより目的とする蛋白質を回収することができる。蛋白質加水分解酵素，例えばエンテロキナーゼ，ファクターＸプロコラゲナーゼまたはトロンビンの認識部位をコードするヌクレオチド配列をキナーゼポリペプチドの配列のすぐ上流に配置すると，融合蛋白質を切断して成熟キナーゼポリペプチドを得ることができる。融合蛋白質結合パートナーのさらなる例には，限定されないが，酵母Ｉ−因子，ｓｆ９昆虫細胞におけるミツバチメラチンリーダー，６−Ｈｉｓタグ，チオレドキシンタグ，ヘマグルチニンタグ，ＧＳＴタグ，およびＯｍｐＡシグナル配列タグが含まれる。当業者には理解されるように，ペプチドを認識しこれに結合する結合パートナーは，任意のイオン，分子または化合物であることができ，例えば金属イオン（例えば金属アフィニティーカラム），抗体，またはそのフラグメント，およびペプチドに結合する任意の蛋白質またはペプチド，例えばＦＬＡＧタグが含まれる。
【００８８】
別の観点においては，本発明は，キナーゼポリペプチドまたはキナーゼポリペプチドドメインまたはフラグメントに対して特異的結合親和性を有する抗体（例えば，モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体）を特徴とし，ここで，ポリペプチドは，配列番号１３，配列番号１４，配列番号１５，配列番号１６，配列番号１７，配列番号１８，配列番号１９，配列番号２０，配列番号２１，配列番号２２，配列番号２３，および配列番号２４に記載されるアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する群から選択される。”特異的結合親和性”とは，抗体が，特定の条件下において，他のポリペプチドに結合するより高い親和性をもって標的キナーゼポリペプチドに結合することを意味する。抗体または抗体フラグメントは，他のポリペプチドに結合しうる領域を含むポリペプチドである。”特異的結合親和性”との用語は，特定の条件下で，他のポリペプチドに結合するより高い親和性をもってキナーゼポリペプチドに結合する抗体を記述する。抗体を用いて，キナーゼポリペプチドの内因性起源を同定して，細胞サイクル制御をモニターすることができ，または，キナーゼポリペプチドの細胞中の免疫局在化に用いることができる。
【００８９】
”ポリクローナル”との用語は，抗原またはその抗原性機能的誘導体で免疫した動物の血清から誘導される抗体分子の異成分集団である抗体を表す。ポリクローナル抗体の製造のためには，種々の宿主動物に抗原を注射することにより免疫することができる。宿主の種により，種々のアジュバントを用いて免疫学的応答を増加させることができる。
【００９０】
”モノクローナル抗体”は，特定の抗原に対する抗体の実質的に均一な集団である。モノクローナル抗体は，培養連続細胞株による抗体分子の生成を与える任意の技術により得ることができる。モノクローナル抗体は，当業者に知られる方法により得ることができる（Ｋｏｈｌｅｒ　ｅｔ　ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ　２５６：４９５−４９７，１９７５，および米国特許４，３７６，１１０（これらの両方は，図面または表を含めその全体を本明細書の一部としてここに引用する））。
【００９１】
”抗体フラグメント”との用語は，特定の分子に対して特異的結合親和性を表示する抗体の一部，しばしば超可変領域および周囲の重鎖および軽鎖の一部を表す。超可変領域は，抗体のポリペプチド標的に物理的に結合する部分である。
【００９２】
本発明のキナーゼポリペプチドに対して特異的結合親和性を有する抗体または抗体フラグメントは，試料をキナーゼ−抗体免疫複合体の形成に適した条件下で抗体で探索し，キナーゼポリペプチドに結合した抗体の存在および／または量を検出することにより，試料中のキナーゼポリペプチドの存在および／または量を検出する方法において用いることができる。そのような方法を実施するための診断キットは，キナーゼに特異的な抗体または抗体フラグメント，ならびに抗体の結合パートナーまたは抗体それ自体のコンジュゲートを含むように構築することができる。
【００９３】
本発明のキナーゼポリペプチドに対して特異的結合親和性を有する抗体または抗体フラグメントは，原核生物または真核生物から単離，濃縮，または精製することができる。当業者に知られる日常的な方法により，原核生物および真核生物の両方において，抗体または抗体フラグメントを製造することができる。ポリペプチド分子である抗体の精製，濃縮および単離は，上に記載される。
【００９４】
本発明のキナーゼポリペプチドに対して特異的結合親和性を有する抗体は，免疫複合体が形成するような条件下で試料を抗体と接触させ，キナーゼポリペプチドに結合した抗体の存在および／または量を検出することにより，試料中のキナーゼポリペプチドの存在および／または量を検出するための方法において用いることができる。そのような方法を実施するための診断キットは，抗体を含む第１の容器および抗体の結合パートナーおよび標識（例えば放射性同位体）を含む第２の容器を含むように構築することができる。診断キットはまた，ＦＤＡに認可された使用の通知およびその指針を含んでいてもよい。
【００９５】
別の観点においては，本発明は，キナーゼポリペプチドまたはキナーゼポリペプチドドメインに対して特異的結合親和性を有する抗体を産生するハイブリドーマを特徴とし，ここで，ポリペプチドは，配列番号１３，配列番号１４，配列番号１５，配列番号１６，配列番号１７，配列番号１８，配列番号１９，配列番号２０，配列番号２１，配列番号２２，配列番号２３，および配列番号２４に記載されるアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する群から選択される。”ハイブリドーマ”とは，抗体，例えば本発明のキナーゼに対する抗体を分泌しうる不死化細胞株を意味する。好ましい態様においては，キナーゼに対する抗体は，本発明のキナーゼポリペプチドに特異的に結合することができるアミノ酸の配列を含む。
【００９６】
別の観点においては，本発明はまた，上述したいずれかの核酸分子によりコードされるポリペプチドに結合する抗体，および負対照抗体を含むキットに関する。
【００９７】
”負対照抗体”との用語は，特異的結合親和性を有する抗体と類似の起源に由来するが，本発明のポリペプチドに対して結合親和性を示さない抗体を表す。
【００９８】
別の観点においては，本発明は，（ａ）配列番号１３，配列番号１４，配列番号１５，配列番号１６，配列番号１７，配列番号１８，配列番号１９，配列番号２０，配列番号２１，配列番号２２，配列番号２３，および配列番号２４に記載されるアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する群から選択されるキナーゼポリペプチドに結合することができるキナーゼポリペプチド結合剤を特徴とする。結合剤は，好ましくは，本発明のキナーゼポリペプチド上に存在するエピトープを認識する精製された抗体である。他の結合剤には，キナーゼポリペプチドに結合する分子およびキナーゼポリペプチドに結合する類似の分子が含まれる。そのような結合剤は，キナーゼ結合パートナー活性を測定するアッセイ，例えばＰＤＧＦＲ活性を測定するアッセイを用いて同定することができる。
【００９９】
本発明はまた，本発明のキナーゼポリペプチドまたは同等の配列を含むヒト細胞をスクリーニングする方法を特徴とする。該方法は，当該技術分野において日常的かつ標準的な技術，例えば本発明のキナーゼの同定のために本明細書において記載される技術（例えば，クローニング，サザンまたはノザンブロット分析，インシトゥーハイブリダイゼーション，ＰＣＲ増幅等）を用いて，ヒト細胞において新規ポリペプチドを同定することを含む。
【０１００】
別の観点においては，本発明は，キナーゼ活性を調節する物質を同定する方法を特徴とする。該方法は，（ａ）配列番号１３，配列番号１４，配列番号１５，配列番号１６，配列番号１７，配列番号１８，配列番号１９，配列番号２０，配列番号２１，配列番号２２，配列番号２３，および配列番号２４に記載されるアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する群から選択されるキナーゼポリペプチドを試験物質と接触させ；（ｂ）前記ポリペプチドの活性を測定し；そして（ｃ）前記物質が前記ポリペプチドの活性を調節するか否かを判定する，の各工程を含む。当業者は，本発明のキナーゼポリペプチド，例えば，触媒ドメインまたはその一部等の完全長配列の一部が，キナーゼ活性を調節する物質を同定するのに有用であることを理解するであろう。機能的活性（例えば，本明細書において定義される触媒的活性）を有するキナーゼポリペプチドは，キナーゼ活性を調節する物質を同定するのに有用である。
【０１０１】
”調節する”との用語は，化合物が本発明のキナーゼの機能を変化させる能力を表す。調節剤は，好ましくは，キナーゼに暴露される化合物の濃度に依存して本発明のキナーゼの活性を活性化するかまたは阻害する。
【０１０２】
”調節する”との用語はまた，キナーゼと天然の結合パートナーとの間に複合体が形成される確率を増加または減少させることにより，本発明のキナーゼの機能を変更することを表す。調節剤は，好ましくは，キナーゼと天然の結合パートナーとの間にそのような複合体が形成される確率を増加させ，より好ましくは，キナーゼに暴露される化合物の濃度に依存してキナーゼと天然の結合パートナーとの間に複合体が形成される確率を増加または減少させ，最も好ましくは，キナーゼと天然の結合パートナーとの間に複合体が形成される確率を減少させる。
【０１０３】
”活性化する”との用語は，キナーゼの細胞活性を増加させることを表す。阻害するとの用語は，キナーゼの細胞活性を減少させることを表す。キナーゼ活性は，好ましくは，天然の結合パートナーとの相互作用である。
【０１０４】
”複合体”との用語は，互いに結合した少なくとも２つの分子の集合を表す。シグナル伝達複合体は，しばしば，互いに結合した少なくとも２つの蛋白質分子を含む。例えば，蛋白質チロシンレセプター蛋白質キナーゼ，ＧＲＢ２，ＳＯＳ，ＲＡＦ，およびＲＡＳは，有糸分裂促進リガンドに応答して，集合してシグナル伝達複合体を形成する。
【０１０５】
”天然の結合パートナー”との用語は，細胞中でキナーゼに結合するポリペプチド，脂質，小分子，または核酸を表す。キナーゼと天然の結合パートナーとの間の相互作用の変化は，相互作用が形成される確率の増加または減少，またはキナーゼ／天然の結合パートナー複合体の濃度の増加または減少として現れることができる。
【０１０６】
本明細書において用いる場合，”接触させる”との用語は，試験化合物を含む溶液を，本発明の方法の細胞を浸している液体培地と混合することを表す。化合物を含む溶液はまた，該方法の細胞内への試験化合物の取り込みを容易にする他の成分，例えばジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含んでいてもよい。試験化合物を含む溶液は，輸送装置，例えば，ピペットに基づく装置またはシリンジに基づく装置を用いて，細胞を浸している培地に加えることができる。
【０１０７】
別の観点においては，本発明は，細胞においてキナーゼ活性を調節する物質を同定する方法を特徴とする。該方法は，（ａ）細胞においてキナーゼポリペプチドを発現させ，ここで，前記ポリペプチドは，配列番号１３，配列番号１４，配列番号１５，配列番号１６，配列番号１７，配列番号１８，配列番号１９，配列番号２０，配列番号２１，配列番号２２，配列番号２３，および配列番号２４に記載されるアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する群から選択され；（ｂ）試験物質を前記細胞に加え；そして（ｃ）細胞表現型または前記ポリペプチドと天然の結合パートナーとの間の相互作用の変化をモニターする，の各工程を含む。当業者は，本発明のキナーゼポリペプチド，例えば，触媒ドメインまたはその一部等の完全長配列の一部がキナーゼ活性を調節する物質を同定するのに有用であることを理解するであろう。機能的活性（例えば，本明細書に定義される触媒的活性）を有するキナーゼポリペプチドは，キナーゼ活性を調節する物質を同定するのに有用である。
【０１０８】
本明細書において用いる場合，”発現”との用語は，細胞中でキナーゼ遺伝子を含む核酸ベクターから本発明のキナーゼが産生されることを表す。本明細書に記載されるように，核酸ベクターを，当該技術分野においてよく知られる手法を用いて細胞中にトランスフェクトする。
【０１０９】
本発明の別の観点は，本発明のキナーゼポリペプチドに結合する化合物を同定する方法に関する。該方法は，キナーゼポリペプチドを化合物と接触させ，化合物がキナーゼポリペプチドに結合するか否かを判定することを含む。結合は，当業者によく知られる結合アッセイ，例えば，限定されないが，ゲルシフトアッセイ，ウエスタンブロット，放射性標識競合アッセイ，ファージに基づく発現クローニング，クロマトグラフィーによる共分画，共沈澱，架橋，相互作用トラップ／ツーハイブリッド分析，サウスウエスタン分析，ＥＬＩＳＡ等により判定することができる。このようなアッセイは，例えば，Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，１９９９，Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，ＮＹ（その全体を本明細書の一部としてここに引用する）に記載されている。スクリーニングすべき化合物には，限定されないが，細胞外，細胞内，生物学的または化学的起源の化合物が含まれる。
【０１１０】
本発明の方法はまた，標識，例えば放射性標識（例えば１２５Ｉ，３５Ｓ，３２Ｐ，３３Ｐ，３Ｈ），蛍光標識，化学発光標識，酵素標識および免疫学的標識に結合した化合物を包含する。そのような試験において用いるキナーゼポリペプチドは，溶液中で遊離であってもよく，固体支持体に結合していてもよく，細胞表面上に存在してもよく，細胞内に存在してもよく，または細胞の一部に付随していてもよい。当業者は，例えば，キナーゼポリペプチドと試験化合物との間の複合体の形成を測定することができる。あるいは，当業者は，試験化合物により引き起こされる，キナーゼポリペプチドとその基質との間の複合体形成の減少を調べることができる。
【０１１１】
他のアッセイを用いて，酵素活性を調べることができる。これには，限定されないが，測光法，放射線法，ＨＰＬＣ，電気化学的方法等が含まれ，これは，例えば，Ｅｎｚｙｍｅ　Ａｓｓａｙｓ：Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ，ｅｄｓ．Ｒ．Ｅｉｓｅｎｔｈａｌ　ａｎｄ　Ｍ．Ｊ．Ｄａｎｓｏｎ，１９９２，Ｏｘｆｏｒｄ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｐｒｅｓｓ（その全体を本明細書の一部としてここに引用する）に記載されている。
【０１１２】
本発明の別の観点は，キナーゼポリペプチドを化合物と接触させ，化合物がキナーゼポリペプチドの活性を調節するか否かを判定することを含む，キナーゼポリペプチドの活性を調節する（すなわち，増加または減少させる）化合物を同定する方法に関する。本明細書に記載されるように，本発明のキナーゼポリペプチドには，完全長配列の一部，例えば本明細書において定義される触媒ドメインが含まれる。場合によっては，本発明のキナーゼポリペプチドは，全触媒ドメインより小さいが，なおキナーゼまたはキナーゼ様活性を示す。これらの化合物もまた，”蛋白質キナーゼの調節剤”と称される。試験化合物の存在下における活性を，試験化合物の非存在下における活性に対して測定する。試験化合物を含む試料の活性が試験化合物を含まない試料の活性より高い場合，その化合物は活性を増加させたのであろう。同様に，試験化合物を含む試料の活性が試験化合物を含まない試料の活性より低い場合，その化合物は活性を阻害したのであろう。
【０１１３】
本発明は，種々の薬剤スクリーニング手法の任意のものにおいてキナーゼポリペプチドを用いて化合物をスクリーニングするのに特に有用である。スクリーニングすべき化合物には，限定されないが，細胞外，細胞内，生物学的または化学的起源のものが含まれる。そのような試験において用いるキナーゼポリペプチドは，任意の形状であることができ，好ましくは，溶液中で遊離しているか，固体支持体に結合しているか，細胞表面上に存在するか，または細胞内に存在する。当業者は，例えば，キナーゼポリペプチドと試験化合物の間の複合体の形成を測定することができる。あるいは，当業者は，試験化合物により引き起こされる，キナーゼポリペプチドとその基質との間の複合体形成の減少を調べることができる。
【０１１４】
本発明のキナーゼポリペプチドの活性は，例えば，化学的に合成されたペプチドリガンドに結合するかまたはそれにより活性化される能力を調べることにより決定することができる。あるいは，キナーゼポリペプチドの活性は，カルシウム等の金属イオン，ホルモン，ケモカイン，神経ペプチド，神経伝達物質，ヌクレオチド，脂質，臭気物質，および光子に結合する能力を調べることによりアッセイすることができる。すなわち，キナーゼポリペプチドの活性の調節剤は，キナーゼの機能，例えばキナーゼの結合特性またはシグナル伝達等の活性または膜局在を変化させるであろう。
【０１１５】
本発明の方法の種々の態様においては，アッセイは，酵母成長アッセイ，エクオリンアッセイ，ルシフェラーゼアッセイ，有糸分裂促進アッセイ，ＭＡＰキナーゼ活性アッセイ，ならびに当該技術分野において一般に知られている結合または機能に基づくキナーゼ活性の他のアッセイの形をとることができる。これらの態様のいくつかにおいては，本発明は，レセプターおよび非レセプター蛋白質チロシンキナーゼ，レセプターおよび非レセプター蛋白質ホスファターゼ，ＳＲＣホモロジー２および３ドメインを含有するポリペプチド，ホスホチロシン結合蛋白質（ＳＲＣホモロジー２（ＳＨ２）およびホスホチロシン結合（ＰＴＢおよびＰＨ）ドメイン含有蛋白質），プロリンリッチ結合蛋白質（ＳＨ３ドメイン含有蛋白質），ＧＴＰａｓｅｓ，ホスホジエステラーゼ，ホスホリパーゼ，プロリルイソメラーゼ，プロテアーゼ，Ｃａ２＋結合蛋白質，ｃＡＭＰ結合蛋白質，グアニルシクラーゼ，アデニリルシクラーゼ，ＮＯ生成蛋白質，ヌクレオチド交換因子，および転写因子の任意のものを含む。本発明にしたがうキナーゼの生物学的活性には，限定されないが，天然のまたは合成のリガンドの結合，ならびに当該技術分野において知られるキナーゼの機能的活性のいずれかが含まれる。キナーゼ活性の非限定的例には，キナーゼ結合相互作用および／またはシグナル伝達に及ぼす影響を含む種々の形の貫膜シグナリングが含まれる。
【０１１６】
本発明の調節剤は，種々の化学構造を示し，これは一般に，天然のキナーゼリガンドの模倣体，およびキナーゼのペプチドおよび非ペプチドアロステリックエフェクターに分類することができる。本発明は適切な調節剤の起源を限定するものではなく，これは，天然起源，例えば植物，動物または無機抽出物，または非天然起源，例えば小分子ライブラリ（コンビナトリアル化学方法により構築したライブラリを含む）およびペプチドライブラリから得ることができる。
【０１１７】
キナーゼをコードするｃＤＮＡを薬剤発見プログラムにおいて用いることはよく知られている。ハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）において１日に数千種類の未知の化合物を試験することができるアッセイが詳細に記載されている。文献は，薬剤発見のためにＨＴＳ結合アッセイにおいて放射性標識リガンドを使用する例を多数記載している（Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｒｅｖｉｅｗｓ，１９９１，１１，１４７−１８４を参照；総説については，Ｓｗｅｅｔｎａｍ，　ｅｔ　ａｌ．，Ｊ．Ｎａｔｕｒａｌ　Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，１９９３，５６，４４１−４５５）。結合アッセイＨＴＳのためには，組換えレセプターが好ましい。これは特異性がより高く（より高い相対純度），大量のレセプター材料を生成する能力を提供し，広範な種類のフォーマットで用いることができるためである（Ｈｏｄｇｓｏｎ，Ｂｉｏｌ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９９２，１０，９７３−９８０を参照；その全体を本明細書の一部としてここに引用する）。
【０１１８】
組換えレセプターの機能的発現には種々の異種システムが利用可能であり，当業者にはよく知られている。そのようなシステムには，細菌（Ｓｔｒｏｓｂｅｒｇ，　ｅｔ　ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ　ｉｎ　Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１９９２，１３，９５−９８），酵母（Ｐａｕｓｃｈ，Ｔｒｅｎｄｓ　ｉｎ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９９７，１５，４８７−４９４），何種類かの昆虫細胞（Ｖａｎｄｅｎ　Ｂｒｏｅｃｋ，Ｉｎｔ．Ｒｅｖ．Ｃｙｔｏｌｏｇｙ，１９９６，１６４，１８９−２６８），両生類細胞（Ｊａｙａｗｉｃｋｒｅｍｅ　ｅｔ　ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｏｐｉｎｉｏｎ　ｉｎ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９９７，８，６２９−６３４）およびいくつかの哺乳動物細胞株（ＣＨＯ，ＨＥＫ２９３，ＣＯＳ等；Ｇｅｒｈａｒｄｔ，　ｅｔ　ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，１９９７，３３４，１−２３を参照）が含まれる。これらの例は他の可能な細胞発現システム，例えば線虫から得られる細胞株を使用することを排除するものではない（ＰＣＴ出願ＷＯ９８／３７１７７）。
【０１１９】
発現されたキナーゼを，その規定されたリガンド（この場合にはこれを活性化する対応するペプチド）とともにＨＴＳ結合アッセイにおいて用いることができる。同定されたペプチドは，適当な放射性同位体，例えば，限定されないが，１２５Ｉ，３Ｈ，３５Ｓまたは３２Ｐで，当業者によく知られる方法により標識する。あるいは，ペプチドは，適当な蛍光誘導体を用いてよく知られる方法により標識してもよい（Ｂａｉｎｄｕｒ，　ｅｔ　ａｌ．，Ｄｒｕｇ　Ｄｅｖ．Ｒｅｓ．，１９９４，３３，３７３−３９８；Ｒｏｇｅｒｓ，Ｄｒｕｇ　Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ　Ｔｏｄａｙ，１９９７，２，１５６−１６０）。組換え蛋白質を発現する細胞株から作成した膜調節物において，レセプターに特異的に結合する放射活性リガンドは，いくつかの標準的な方法の１つ，例えば，レセプター−リガンド複合体を濾過して結合したリガンドを未結合リガンドから分離する方法において，ＨＴＳアッセイにより検出することができる（Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｍｅｄ．Ｒｅｓ．Ｒｅｖ．，１９９１，１１，１４７−１８４．；Ｓｗｅｅｔｎａｍ，　ｅｔ　ａｌ．，Ｊ．Ｎａｔｕｒａｌ　Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，１９９３，５６，４４１−４５５）。別の方法としては，シンチレーション近接アッセイ（ＳＰＡ）またはそのような分離を必要としないフラッシュプレート（ＦｌａｓｈＰｌａｔｅ）フォーマットが挙げられる（Ｎａｋａｙａｍａ，Ｃｕｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ　Ｄｒｕｇ　Ｄｉｓｃ．Ｄｅｖ．，１９９８，１，８５−９１　Ｂｏｓｓｅ，　ｅｔ　ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ，１９９８，３，２８５−２９２）。蛍光リガンドの結合は，例えば，蛍光エネルギー転移（ＦＲＥＴ），結合したリガンドの直接分光蛍光分析，または蛍光分極等の種々の方法により検出することができる（Ｒｏｇｅｒｓ，Ｄｒｕｇ　Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ　Ｔｏｄａｙ，１９９７，２，１５６−１６０；Ｈｉｌｌ，Ｃｕｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ　Ｄｒｕｇ　Ｄｉｓｃ．Ｄｅｖ．，１９９８，１，９２−９７）。
【０１２０】
キナーゼおよび異種キナーゼポリペプチドの機能的発現に必要な天然の結合パートナーは，宿主細胞の天然の構成物であってもよく，またはよく知られる組換え技術により導入してもよい。キナーゼポリペプチドは無傷であってもよく，キメラであってもよい。キナーゼ活性化により他の天然蛋白質が刺激または阻害され，これらの事象を測定可能な応答に結びつけることができる。
【０１２１】
そのような生物学的応答の例には，限定されないが，以下のものが含まれる：特別に遺伝子工学処理した酵母細胞において制限栄養の非存在下で生存する能力（Ｐａｕｓｃｈ，Ｔｒｅｎｄｓ　ｉｎ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９９７，１５，４８７−４９４）；蛍光色素により測定される細胞内Ｃａ２＋濃度の変化（Ｍｕｒｐｈｙ，　ｅｔ　ａｌ．，Ｃｕｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ　Ｄｒｕｇ　Ｄｉｓｃ．Ｄｅｖ．，１９９８，１，１９２−１９９）。蛍光の変化を用いてリガンド誘導性の膜電位または細胞内ｐＨの変化をモニターすることもできる。このような目的のためにＨＴＳに適した自動化システムが記載されている（Ｓｃｈｒｏｅｄｅｒ，　ｅｔ　ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ，１９９６，１，７５−８０）。共通のセカンドを測定するためのアッセイもまた利用可能であるが，これらは一般的にはＨＴＳには好ましくない。
【０１２２】
本発明は，キナーゼポリペプチドに結合するリガンドの阻害剤をスクリーニングし同定する多数のアッセイを企図する。１つの例においては，キナーゼポリペプチドを固定化し，候補調節剤，例えば阻害剤化合物の存在下および非存在下において，結合パートナーとの相互作用を評価することができる。別の例においては，キナーゼポリペプチドとその結合パートナーとの間の相互作用は，溶液アッセイにおいて，候補阻害剤化合物の存在下および非存在下の両方で評価することができる。いずれのアッセイにおいても，阻害剤はキナーゼポリペプチドとその天然の結合パートナーとの間の結合を減少させる化合物として同定される。別の企図されるアッセイには，ＰＣＴ国際公開ＷＯ９５／２０６５２（１９９５年８月３日公開；図面および表を含め本明細書の一部としてここに引用する）に記載されるような，トランスフォームしたまたはトランスフェクトした宿主細胞におけるポジティブシグナルの検出により蛋白質／蛋白質相互作用の阻害剤を同定する，ジハイブリッドアッセイの変種が含まれる。
【０１２３】
本発明により企図される調節剤の候補には，潜在的活性化剤または潜在的阻害剤のいずれかのライブラリから選択される化合物が含まれる。小分子調節剤の同定に用いられる多くの多様なライブラリが存在し，これには，例えば，（１）化学ライブラリ，（２）天然産物ライブラリ，および（３）ランダムペプチド，オリゴヌクレオチドまたは有機分子から構成されるコンビナトリアルライブラリが含まれる。化学ライブラリはランダムな化学構造から構成され，その一部は既知の化合物の類似体または他の薬剤発見スクリーニングにおいて”ヒット”または”リード”として同定された化合物の類似体であるが，別のものは天然産物から誘導され，さらに別のものは，無指向性有機合成化学から生ずる。天然産物ライブラリは，（１）土壌，植物または海洋生物からの培養液の発酵および抽出，または（２）植物または海洋生物の抽出，によりスクリーニング用の混合物を作成するために用いられる，微生物，動物，植物，または海洋生物の収集物である。天然産物ライブラリには，ポリケタイド，非リボソームペプチド，およびそれらの変種（天然に生じない）が含まれる。総説については，Ｓｃｉｅｎｃｅ　２８２：６３−６８（１９９８）を参照。コンビナトリアルライブラリは，混合物としての多数のペプチド，オリゴヌクレオチド，または有機化合物から構成される。これらのライブラリは，伝統的自動化合成法，ＰＣＲ，クローニング，または私有の合成法により比較的容易に製造することができる。特に興味深いものは非ペプチドコンビナトリアルライブラリである。さらに興味深い他のライブラリには，ペプチド，蛋白質，ペプチド模倣物，多重平行合成収集物，リコンビナトリアル，およびポリペプチドライブラリが含まれる。コンビナトリアルケミストリおよびこれから作成されるライブラリの総説については，Ｍｙｅｒｓ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．８：７０１−７０７（１９９７）を参照。本明細書に記載される，種々のライブラリを用いる調節剤の同定により，候補物質である”ヒット”（または”リード”）を改変して，”ヒット”が活性を調節する能力を最適化することができる。
【０１２４】
本発明により企図される他の候補阻害剤を設計することができ，これには溶解型の結合パートナー，ならびにキメラ，または融合蛋白質等の結合パートナーが含まれる。本明細書において用いる場合，”結合パートナー”は，上述したような天然の結合パートナーならびにキメラポリペプチド，天然のリガンド以外のペプチド調節剤，抗体，抗体フラグメント，および同定されたキナーゼ遺伝子の発現産物に免疫特異的な抗体ドメインを含む改変型化合物を広く包含する。
【０１２５】
キナーゼポリペプチドの特異的ペプチドリガンドを同定するために他のアッセイを用いることができ，これには，試験リガンドの標的蛋白質への直接結合の測定により標的蛋白質のリガンドを同定するアッセイ，ならびにイオンスプレー質量分析計／ＨＰＬＣ方法または他の物理学的および分析的方法を用いてアフィニティー限外濾過により標的蛋白質のリガンドを同定するアッセイが含まれる。あるいは，そのような結合相互作用は，Ｆｉｅｌｄｓ　ｅｔ　ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３４０：２４５−２４６（１９８９），およびＦｉｅｌｄｓ　ｅｔ　ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ　ｉｎ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１０：２８６−２９２（１９９４）（いずれも本明細書の一部としてここに引用する）に記載される酵母ツーハイブリッド系を用いて間接的に評価することができる。ツーハイブリッド系は２つの蛋白質またはポリペプチドの間の相互作用を検出するための遺伝子アッセイである。これを用いて，目的とする既知の蛋白質に結合する蛋白質を同定し，相互作用に重要なドメインまたは残基を線引きすることができる。この方法論の変形が，ＤＮＡ結合蛋白質をコードする遺伝子のクローニング，蛋白質に結合するペプチドの同定，および薬剤のスクリーニング用に開発されている。ツーハイブリッド系は，１対の相互作用する蛋白質が転写活性化ドメインをレポーター遺伝子の上流活性化配列（ＵＡＳ）に結合するＤＮＡ結合ドメインの近くに配置させる能力を利用しており，一般に酵母において行われる。アッセイにおいては，（１）第１の蛋白質に融合されたＤＮＡ結合ドメイン，および（２）第２の蛋白質に融合された活性化ドメイン，をコードする２つのハイブリッド遺伝子を構築することが必要である。ＤＮＡ結合ドメインは，第１のハイブリッド蛋白質をレポーター遺伝子のＵＡＳにターゲティングする。しかし，ほとんどの蛋白質は活性化ドメインを有していないため，このＤＮＡ結合ハイブリッド蛋白質はレポーター遺伝子の転写を活性化しない。活性化ドメインを含む第２のハイブリッド蛋白質は，ＵＡＳに結合しないため，それ自身ではレポーター遺伝子の発現を活性化しない。しかし，両方のハイブリッド蛋白質が存在する場合には，第１の蛋白質と第２の蛋白質との非共有結合的相互作用が活性化ドメインをＵＡＳにつなぎ，レポーター遺伝子の転写を活性化させる。例えば，第１の蛋白質が，他の蛋白質または核酸と相互作用することが知られているキナーゼ遺伝子産物，またはそのフラグメントである場合，このアッセイを用いて結合相互作用を妨害する薬剤を検出することができる。異なる試験薬剤を系に添加してレポーター遺伝子の発現をモニターする。阻害剤が存在すると，レポーターシグナルが発生しない。
【０１２６】
キナーゼポリペプチド遺伝子産物の機能が未知であり，遺伝子産物に結合するリガンドが知られていない場合においても，酵母ツーハイブリッドアッセイを用いて遺伝子産物に結合する蛋白質を同定することができる。キナーゼポリペプチドまたはそのフラグメントに結合する蛋白質を同定するアッセイにおいては，キナーゼポリペプチド（またはフラグメント）およびＵＡＳ結合ドメイン（すなわち，第１の蛋白質）の両方をコードする融合ポリヌクレオチドを用いることができる。さらに，それぞれが活性化ドメインに融合された異なる第２の蛋白質をコードする多数のハイブリッド遺伝子を製造し，このアッセイにおいてスクリーニングすることができる。典型的には，第２の蛋白質は総ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ融合ライブラリの１またはそれ以上のメンバーによりコードされ，ここで，それぞれの第２の蛋白質のコーディング領域は活性化ドメインに融合されている。この系は広範な種類の蛋白質に適用することができ，第２の結合蛋白質の種類または機能を知ることすら必要ではない。この系は非常に感度が高く，他の方法では明らかにされない相互作用を検出することができる。過渡的相互作用であっても，転写を誘発して安定なｍＲＮＡを生成し，これは繰り返し翻訳されてレポーター蛋白質を生成することができる。
【０１２７】
他のアッセイを用いて，標的蛋白質に結合する薬剤を検索してもよい。試験リガンドの標的蛋白質への直接結合を同定する１つのそのようなスクリーニング方法が，米国特許５，５８５，２７７（本明細書の一部としてここに引用する）に議論されている。この方法は，蛋白質は一般に折り畳まれた状態と折り畳まれていない状態の混合物として存在し，２つの状態の間で継続的に交替しているという原理に基づく。試験リガンドが折り畳まれた形の標的蛋白質に結合する場合（すなわち，試験リガンドが標的蛋白質のリガンドである場合），リガンドに結合した標的蛋白質分子は折り畳まれた状態のままである。すなわち，折り畳まれた標的蛋白質は，標的蛋白質に結合する試験リガンドの存在下で，リガンドの非存在下におけるよりも多く存在する。リガンドの標的蛋白質への結合は，折り畳まれた状態と折り畳まれていない状態の標的蛋白質とを区別する任意の方法により検出することができる。このアッセイを行うためには，標的蛋白質の機能がわかっている必要はない。この方法により事実上すべての薬剤，例えば，限定されないが，金属，ポリペプチド，蛋白質，脂質，多糖類，ポリヌクレオチドおよび小有機分子を試験リガンドとして評価することができる。
【０１２８】
標的蛋白質のリガンドを同定する別の方法は，Ｗｉｅｂｏｌｄｔ　ｅｔ　ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，６９：１６８３−１６９１（１９９７）（本明細書の一部としてここに引用する）に記載されている。この手法は，１回に溶液相中の２０−３０種類の薬剤のコンビナトリアルライブラリを標的蛋白質に対する結合についてスクリーニングする。簡単な膜洗浄により標的蛋白質に結合する薬剤を他のライブラリ成分から分離する。次にフィルター上に保持された特定の選択された分子を標的蛋白質から遊離させ，ＨＰＬＣおよび気体補助エレクトロスプレー（イオンスプレー）イオン化質量分析により分析する。この方法は，標的蛋白質に対して最も高い親和性を有するライブラリ成分を選択し，特に小分子ライブラリについて有用である。
【０１２９】
本発明の好ましい態様においては，キナーゼ活性を調節する化合物をスクリーニングする方法は，試験化合物をキナーゼポリペプチドと接触させ，化合物とキナーゼポリペプチドとの間の複合体の存在についてアッセイすることを含む。そのようなアッセイにおいては，典型的にはリガンドを標識する。適当にインキュベートした後，遊離のリガンドを結合した形のリガンドから分離する。遊離のまたは複合体を形成していない標識の量は，特定の化合物がキナーゼポリペプチドに結合する能力の尺度である。
【０１３０】
本発明の別の態様においては，キナーゼポリペプチドに対して適切な結合親和性を有する化合物のハイスループットスクリーニングを用いる。簡単には，多数の様々な小ペプチド試験化合物を固体支持体上で合成する。ペプチド試験化合物をキナーゼポリペプチドと接触させ，洗浄する。次に，結合したキナーゼポリペプチドを当該技術分野においてよく知られる方法により検出する。本発明の精製ポリペプチドはまた，上述した薬剤スクリーニング手法において用いるために，直接プレート上にコーティングすることができる。さらに，非中和抗体を用いて蛋白質を捕獲し，これを固体支持体上に固定化することができる。
【０１３１】
本発明の別の態様は，本発明のポリペプチドに結合しうる中和抗体がポリペプチドに対する結合について試験化合物と特異的に競合する，競合スクリーニングアッセイを用いることを含む。このようにして，抗体を用いて，キナーゼポリペプチドと１またはそれ以上の抗原性決定基を共有するペプチドの存在を検出することができる。放射性標識した競合結合実験は，Ａ．Ｈ．Ｌｉｎ　ｅｔ　ａｌ．Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ　Ａｇｅｎｔｓ　ａｎｄ　Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ，１９９７，ｖｏｌ．４１，ｎｏ．１０．ｐｐ．２１２７−２１３１に記載されており，この開示はその全体を本明細書の一部としてここに引用する。
【０１３２】
別の観点においては，本発明は，治療を必要とする患者に，配列番号１３，配列番号１４，配列番号１５，配列番号１６，配列番号１７，配列番号１８，配列番号１９，配列番号２０，配列番号２１，配列番号２２，配列番号２３，および配列番号２４に記載されるアミノ酸配列からなる群より選択されるキナーゼポリペプチド，ならびに，その完全長ポリペプチド，または機能的活性（本明細書において記載される）を保持するこれらの配列のいずれかの一部の活性を調節する物質を投与することにより疾病を治療する方法を提供する。好ましくは疾病は，癌，免疫関連疾病および疾患，心臓血管疾病，脳またはニューロン関連疾病，および代謝性疾患からなる群より選択される。より詳細には，これらの疾病には，組織，血液，または造血細胞起源の癌，特に，乳，結腸，肺，前立腺，子宮頚部，脳，卵巣，膀胱，または腎臓が関与する癌；中枢神経または末梢神経系疾病および状態，例えば，片頭痛，痛み，性的機能不全，気分障害，注意障害，認識障害，低血圧症，および高血圧症；精神病性および神経学的疾患，例えば，不安，精神分裂病，躁うつ病，せん妄，痴呆，重症の精神遅滞および運動異常症，例えば，ハンチントン病またはツレット症候群；神経変性性疾病，例えば，アルツハイマー病，パーキンソン病，多発性硬化症，および筋萎縮性側方硬化症；ＨＩＶ−１，ＨＩＶ−２または他のウイルスまたはプリオン体または真菌または細菌生物により引き起こされるウイルスまたは非ウイルス感染；代謝性疾患，例えば糖尿病および肥満，およびこれらに関連する症候群，特に，心臓血管疾患，例えば，再灌流再狭窄，冠状動脈血栓症，凝固疾患，制御されない細胞成長疾患，アテローム性動脈硬化症；眼性疾病，例えば緑内障，網膜症，および黄斑変性；炎症性疾患，例えば，慢性関節リウマチ，慢性炎症性腸疾病，慢性炎症性骨盤疾病，多発性硬化症，ぜん息，変形性関節症，乾癬，アテローム性動脈硬化症，鼻炎，自己免疫，および臓器移植拒絶が含まれる。
【０１３３】
好ましい態様においては，本発明は，治療を必要とする患者に，配列番号１３，配列番号１４，配列番号１５，配列番号１６，配列番号１７，配列番号１８，配列番号１９，配列番号２０，配列番号２１，配列番号２２，配列番号２３，および配列番号２４に記載されるアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するキナーゼポリペプチド，ならびにその完全長ポリペプチド，または機能的活性（本明細書において記載される）を保持するこれらの配列のいずれかの一部の活性を調節する物質を投与することにより，疾病または疾患を治療または予防する方法を提供する。好ましくは，疾病は，癌，免疫関連疾病および疾患，心臓血管疾病，脳またはニューロン関連疾病，および代謝性疾患からなる群より選択される。より詳細には，これらの疾病には，組織，血液，または造血細胞起源の癌，特に，乳，結腸，肺，前立腺，子宮頚部，脳，卵巣，膀胱，または腎臓が関与する癌；中枢神経または末梢神経系疾病および状態，例えば，片頭痛，痛み，性的機能不全，気分障害，注意障害，認識障害，低血圧症，および高血圧症；精神病性および神経学的疾患，例えば，不安，精神分裂病；躁うつ病，せん妄，痴呆，重症の精神遅滞および運動異常症，例えば，ハンチントン病，またはツレット症候群；神経変性性疾病，例えばアルツハイマー病，パーキンソン病，多発性硬化症，および筋萎縮性側方硬化症；ＨＩＶ−１，ＨＩＶ−２または他のウイルスまたはプリオン体または真菌または細菌生物により引き起こされるウイルスまたは非ウイルス感染；代謝性疾患，例えば，糖尿病および肥満，およびこれらに関連する症候群，特に，心臓血管疾患，例えば，再灌流再狭窄，冠状動脈血栓症，凝固疾患，制御されない細胞成長疾患，アテローム性動脈硬化症；眼性疾病，例えば，緑内障，網膜症，および黄斑変性；炎症性疾患，例えば，慢性関節リウマチ，慢性炎症性腸疾病，慢性炎症性骨盤疾病，多発性硬化症，ぜん息，変形性関節症，乾癬，アテローム性動脈硬化症，鼻炎，自己免疫，および臓器移植拒絶が含まれる。
【０１３４】
本発明はまた，治療を必要とする患者に，配列番号１３，配列番号１４，配列番号１５，配列番号１６，配列番号１７，配列番号１８，配列番号１９，配列番号２０，配列番号２１，配列番号２２，配列番号２３，および配列番号２４に記載されるアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するキナーゼポリペプチド，ならびにその全長ポリペプチド，または機能的活性（本明細書に記載される）を保持するこれらの配列のいずれかの一部の活性を調節する物質を投与することにより，疾病または疾患を治療または予防する方法を特徴とする。好ましくは，疾病は，癌，免疫関連疾病および疾患，心臓血管疾病，脳またはニューロン関連疾病，および代謝性疾患からなる群より選択される。より詳細には，これらの疾病には，組織，血液，または造血細胞起源の癌，特に乳，結腸，肺，前立腺，子宮頚部，脳，卵巣，膀胱，または腎臓が関与する癌；中枢神経または末梢神経系疾病および状態，例えば，片頭痛，痛み，性的機能不全，気分障害，注意障害，認識障害，低血圧症，および高血圧症；精神病性および神経学的疾患，例えば不安，精神分裂病，躁うつ病，せん妄，痴呆，重症の精神遅滞および運動異常症，例えばハンチントン病またはツレット症候群；神経変性性疾病，例えばアルツハイマー病，パーキンソン病，多発性硬化症，および筋萎縮性側方硬化症；ＨＩＶ−１，ＨＩＶ−２または他のウイルスまたはプリオン体または真菌または細菌生物により引き起こされるウイルスまたは非ウイルス感染；代謝性疾患，例えば糖尿病および肥満およびこれらに関連する症候群，特に，心臓血管疾患，例えば再灌流再狭窄，冠状動脈血栓症，凝固疾患，制御されない細胞成長疾患，アテローム性動脈硬化症；眼性疾病，例えば緑内障，網膜症，および黄斑変性；炎症性疾患，例えば慢性関節リウマチ，慢性炎症性腸疾病，慢性炎症性骨盤疾病，多発性硬化症，ぜん息，変形性関節症，乾癬，アテローム性動脈硬化症，鼻炎，自己免疫，および臓器移植拒絶が含まれる。
【０１３５】
本発明はまた，配列番号１３，配列番号１４，配列番号１５，配列番号１６，配列番号１７，配列番号１８，配列番号１９，配列番号２０，配列番号２１，配列番号２２，配列番号２３，および配列番号２４に記載される配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するキナーゼポリペプチド，ならびにその完全長ポリペプチド，または機能的活性（本明細書に記載される）を保持するこれらの配列の一部の活性を調節する物質を投与することにより，疾病または疾患を治療または予防する方法を特徴とする。好ましくは，疾病は，免疫関連疾病および疾患，心臓血管疾病，および癌からなる群より選択される。より好ましくは，これらの疾病には，組織，血液，または造血細胞起源の癌，特に乳，結腸，肺，前立腺，子宮頚部，脳，卵巣，膀胱，または腎臓が関与する癌；中枢神経または末梢神経系疾病および状態，例えば，片頭痛，痛み，性的機能不全，気分障害，注意障害，認識障害，低血圧症，および高血圧症；精神病性および神経学的疾患，例えば，不安，精神分裂病，躁うつ病，せん妄，痴呆，重症の精神遅滞および運動異常症，例えば，ハンチントン病またはツレット症候群；神経変性性疾病，例えばアルツハイマー病，パーキンソン病，多発性硬化症，および筋萎縮性側方硬化症；ＨＩＶ−１，ＨＩＶ−２又は他のウイルスまたはプリオン体または真菌または細菌生物により引き起こされるウイルスまたは非ウイルス感染；代謝性疾患，例えば糖尿病および肥満およびこれらに関連する症候群，特に，心臓血管疾患，例えば再灌流再狭窄，冠状動脈血栓症，凝固疾患，制御されない細胞成長疾患，アテローム性動脈硬化症；眼性疾病，例えば緑内障，網膜症，および黄斑変性；炎症性疾患，例えば慢性関節リウマチ，慢性炎症性腸疾病，慢性炎症性骨盤疾病，多発性硬化症，ぜん息，変形性関節症，乾癬，アテローム性動脈硬化症，鼻炎，自己免疫，および臓器移植拒絶が含まれる。最も好ましくは，免疫関連疾病および疾患は，慢性関節リウマチ，慢性炎症性腸疾病，慢性炎症性骨盤疾病，多発性硬化症，ぜん息，変形性関節症，乾癬，アテローム性動脈硬化症，鼻炎，自己免疫，および臓器移植からなる群より選択される。
【０１３６】
キナーゼ関連疾患または疾病の治療に有用な物質は，好ましくは，問題とする疾病または疾患の治療に対応する活性についての１またはそれ以上のインビトロアッセイにおいて陽性の結果を示す（そのようなアッセイの例は，以下のＶＩ節における参照文献および本明細書の実施例７において提供される）。望ましい活性についてスクリーニングすることができる物質の例は，以下のＶＩ節に提供され参照される。キナーゼの活性を調節する物質は，好ましくは，限定されないが，アンチセンスオリゴヌクレオチドおよび以下のＶＩ節および実施例７において参照される方法およびスクリーニングにより決定されるような蛋白質キナーゼの阻害剤を含む。
【０１３７】
”予防する”との用語は，生物が異常な状態に罹患するかこれを発達させる可能性を減少させることを表す。
【０１３８】
”治療する”との用語は，生物において治療効果を有し，異常な状態を少なくとも部分的に緩和するかまたは排除することを表す。
【０１３９】
”治療効果”との用語は，異常な状態を引き起こすかまたはこれに寄与する阻害または活性化率を表す。治療効果は，異常な状態の１またはそれ以上の症状をある程度緩和する。異常な状態の治療に関して，治療効果は，以下の１またはそれ以上を表すことができる：（ａ）細胞の増殖，成長，および／または分化の増加；（ｂ）細胞死の阻害（すなわち，遅延または停止）；（ｃ）変性の阻害；（ｄ）異常な状態に伴う１またはそれ以上の症状のある程度の緩和；および（ｅ）影響を受けた細胞の集団の機能の増強。異常な状態に対して有効性を示す化合物は，本明細書に記載されるようにして同定することができる。
【０１４０】
”異常な状態”との用語は，生物の細胞または組織における，その生物における正常な機能からはずれた機能を表す。異常な状態は，細胞増殖，細胞分化，または細胞生存に関連しうる。
【０１４１】
異常な細胞増殖状態には，癌，例えば繊維性およびメサンギウム疾患，異常な新脈管形成および脈管形成，創傷治癒，乾癬，真性糖尿病，および炎症が含まれる。
【０１４２】
異常な分化状態には，限定されないが，神経変性性疾患，遅い創傷治癒速度，および遅い組織移植治癒速度が含まれる。
【０１４３】
異常な細胞生存状態は，プログラムされた細胞死（アポトーシス）経路が活性化されているかまたは排除されている状態に関連する。多くの蛋白質キナーゼがアポトーシス経路に関連している。蛋白質キナーゼのいずれかの機能の異常は，細胞の不死または未成熟細胞死につながりうる。
【０１４４】
シグナル伝達プロセスにおけるキナーゼポリペプチドの機能に関連して，”異常な”との用語は，生物において過剰発現または過小発現されているか，その触媒活性が野生型蛋白質キナーゼ活性より低いかまたは高いように変異しているか，天然の結合パートナーともはや相互作用できないように変異しているか，別の蛋白質キナーゼまたは蛋白質ホスファターゼによりもはや修飾されないか，または天然の結合パートナーともはや相互作用しない，キナーゼを表す。
【０１４５】
”投与する”との用語は，化合物を生物の細胞または組織内に取り込ませる方法に関連する。異常な状態は，生物の細胞または組織が生物中または生物外に存在する場合，予防または治療することができる。生物の外に存在する細胞は，細胞培養皿中で維持または成長させることができる。生物中に含まれる細胞については，当該技術分野には化合物を投与する多くの手法が存在し，例えば，限定されないが，経口，非経口，経皮，注入およびエアロゾル外用が含まれる。生物外の細胞については，当該技術分野には化合物を投与する多数の手法が存在し，例えば，限定されないが，細胞マイクロインジェクション手法，トランスフォーメーション手法，および担体手法が含まれる。
【０１４６】
異常な状態はまた，シグナル伝達経路に異常を有する一群の細胞を有する生物に化合物を投与することにより，予防または治療することができる。次に，化合物の投与が生物機能に及ぼす影響をモニターすることができる。生物は，好ましくはマウス，ラット，ウサギ，モルモット，またはヤギであり，より好ましくは有尾サルまたは無尾サルであり，最も好ましくはヒトである。
【０１４７】
別の観点においては，本発明は，疾病または疾患の診断道具として，試料中でキナーゼポリペプチドを検出する方法を特徴とする。該方法は，（ａ）試料を，ハイブリダイゼーションアッセイ条件下で，配列番号１３，配列番号１４，配列番号１５，配列番号１６，配列番号１７，配列番号１８，配列番号１９，配列番号２０，配列番号２１，配列番号２２，配列番号２３，および配列番号２４に記載されるアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するキナーゼポリペプチドの核酸標的領域にハイブリダイズする核酸プローブと接触させ，ここで，前記プローブは，ポリペプチド，そのフラグメントをコードする核酸配列，および配列およびフラグメントの相補体を含み；そして（ｂ）プローブ：標的領域ハイブリッドの存在または量を疾病の指標として検出する，
の各工程を含む。
【０１４８】
本発明の好ましい態様においては，疾病または疾患は，慢性関節リウマチ，動脈硬化症，自己免疫疾患，臓器移植，心筋梗塞，心筋症，発作，腎不全，酸化的ストレス関連神経変性性疾患，および癌からなる群より選択される。
【０１４９】
キナーゼ”標的領域”とは，配列番号１，配列番号２，配列番号３，配列番号４，配列番号５，配列番号６，配列番号７，配列番号８，配列番号９，配列番号１０，配列番号１１，および配列番号１２に記載される配列からなる群より選択されるヌクレオチド塩基配列，または対応する完全長配列，核酸プローブが特異的にハイブリダイズするであろうその機能的誘導体，またはそのフラグメントである。特異的なハイブリダイゼーションとは，他の核酸の存在下において，プローブが本発明のキナーゼの標的領域にのみ検出可能なようにハイブリダイズすることを示す。推定標的領域は，当該技術分野においてよく知られる，データベース中の最も近い関連配列のアラインメントおよび比較からなる方法により同定することができる。
【０１５０】
好ましい態様においては，核酸プローブは，配列番号１３，配列番号１４，配列番号１５，配列番号１６，配列番号１７，配列番号１８，配列番号１９，配列番号２０，配列番号２１，配列番号２２，配列番号２３，および配列番号２４に記載されるアミノ酸配列，または対応する完全長アミノ酸配列，本明細書に記載されるような機能的活性を保持するこれらの配列の任意のものの一部またはそれらの機能的誘導体からなる群より選択される配列の，少なくとも６，１２，７５，９０，１０５，１２０，１５０，２００，２５０，３００または３５０個の連続するアミノ酸をコードするキナーゼ標的領域にハイブリダイズする。ハイブリダイゼーション条件は，他の核酸分子の存在下でキナーゼ遺伝子とのみハイブリダイゼーションが生ずるような条件であるべきである。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下では，高度に相補的な核酸配列のみがハイブリダイズする。好ましくは，そのような条件は，２０個の連続するヌクレオチド中に１または２個より多いミスマッチを有する核酸のハイブリダイゼーションを防止する。そのような条件は上で定義される。
【０１５１】
試料中のキナーゼ遺伝子の検出により診断することができる疾病には，キナーゼ核酸（ＤＮＡおよび／またはＲＮＡ）が正常細胞と比較して増幅されている疾病が含まれる。”増幅”とは，正常細胞と比較して，細胞中でキナーゼＤＮＡまたはＲＮＡの数が増加していることを意味する。正常細胞においては，キナーゼは典型的には１コピーの遺伝子として見いだされる。選択された疾病においては，キナーゼ遺伝子の染色体位置が増幅されて，遺伝子の多数のコピーまたは増幅が生ずる。遺伝子増幅は，そのようなキナーゼＲＮＡを増幅させることができ，またはキナーゼＲＮＡはキナーゼＤＮＡの増幅なしに増幅することができる。
【０１５２】
ＲＮＡに関する場合，”増幅”は，細胞においてキナーゼＲＮＡが検出可能なように存在することでありうる。ある正常細胞においては，ＲＮＡの基底発現がないためである。他の正常細胞においては，キナーゼの発現の基底レベルが存在し，したがってこれらの場合には増幅は基底レベルと比較して少なくとも１−２倍，好ましくはそれより多い，検出可能な存在の増加を示すキナーゼＲＮＡの増加である。
【０１５３】
試料中のキナーゼ核酸の検出により診断することができる疾病には，好ましくは癌が含まれる。本発明の核酸探索方法に適した試験試料には，例えば，細胞または細胞の核酸抽出物，または体液が含まれる。上述の方法において用いられる試料は，アッセイフォーマット，検出方法，およびアッセイする組織，細胞または抽出物の性質により様々でありうる。細胞の核酸抽出物を調製する方法は当該技術分野においてよく知られており，用いる方法に適合した試料を得るために容易に適合させることができる。
【０１５４】
本発明はまた，疾病または疾患の診断道具として，試料中のキナーゼポリペプチドを検出する方法を特徴とする。該方法は，（ａ）試料中のキナーゼポリペプチドをコードする核酸標的領域を，キナーゼポリペプチド，またはその１またはそれ以上フラグメントをコードする対照核酸標的領域と比較し，ここで，キナーゼポリペプチドは，配列番号１３，配列番号１４，配列番号１５，配列番号１６，配列番号１７，配列番号１８，配列番号１９，配列番号２０，配列番号２１，配列番号２２，配列番号２３，および配列番号２４に記載される配列，またはその１またはそれ以上フラグメントからなる群より選択されるアミノ酸配列を有しており；そして（ｂ）標的領域と対照標的領域との間の配列または量の相違を疾病または疾患の指標として検出することを含む。好ましくは，疾病は，癌，免疫関連疾病および疾患，心臓血管疾病，脳またはニューロン関連疾病，および代謝性疾患からなる群より選択される。より詳細には，これらの疾病には，組織，血液，または造血細胞起源の癌，特に乳，結腸，肺，前立腺，子宮頚部，脳，卵巣，膀胱，または腎臓が関与する癌；中枢神経または末梢神経系疾病および状態，例えば，片頭痛，痛み，性的機能不全，気分障害，注意障害，認識障害，低血圧症，および高血圧症；精神病性および神経学的疾患，例えば，不安，精神分裂病，躁うつ病，せん妄，痴呆，重症の精神遅滞および運動異常症，例えば，ハンチントン病またはツレット症候群；神経変性性疾病，例えば，アルツハイマー病，パーキンソン病，多発性硬化症，および筋萎縮性側方硬化症；ＨＩＶ−１，ＨＩＶ−２または他のウイルスまたはプリオン体または真菌または細菌生物により引き起こされるウイルスまたは非ウイルス感染；代謝性疾患，例えば糖尿病および肥満，およびこれらに関連する症候群，特に，心臓血管疾患，例えば，再灌流再狭窄，冠状動脈血栓症，凝固疾患，制御されない細胞成長疾患，アテローム性動脈硬化症；眼性疾病，例えば，緑内障，網膜症，および黄斑変性；炎症性疾患，例えば，慢性関節リウマチ，慢性炎症性腸疾病，慢性炎症性骨盤疾病，多発性硬化症，ぜん息，変形性関節症，乾癬，アテローム性動脈硬化症，鼻炎，自己免疫，および臓器移植拒絶が含まれる。
【０１５５】
本明細書において用いる場合，”比較する”との用語は，試料から単離された核酸標的領域と対照核酸標的領域との間の不一致を同定することを表す。不一致は，ヌクレオチド配列における，例えば挿入，欠失，または点突然変異であってもよく，または所定のヌクレオチド配列の量におけるものであってもよい。配列におけるこれらの不一致を判定する方法は当業者にはよく知られている。”対照”核酸標的領域とは，正常細胞，例えば，先に記載したような疾病を有しない細胞において見いだされる配列または配列の量を表す。
【０１５６】
上述した本発明の概要は限定的なものではなく，本発明の他の特徴および利点は，以下の本発明の詳細な説明および特許請求の範囲から明らかであろう。
【０１５７】
図面の簡単な説明
図１Ａ−１Ｌは，ヒト蛋白質キナーゼのヌクレオチド配列（配列番号１，配列番号２，配列番号３，配列番号４，配列番号５，配列番号６，配列番号７，配列番号８，配列番号９，配列番号１０，配列番号１１，および配列番号１２）を５’から３’の方向で示す。
【０１５８】
図２Ａ−２Ｄは，配列番号１−１２によりコードされるヒト蛋白質キナーゼのアミノ酸配列（配列番号１３，配列番号１４，配列番号１５，配列番号１６，配列番号１７，配列番号１８，配列番号１９，配列番号２０，配列番号２１，配列番号２２，配列番号２３，および配列番号２４）を翻訳の方向で示す。いくつかの配列はコーディング領域中で推定終止コドンをコードしており，これは’ｘ’で示される。
【０１５９】
発明の詳細な説明
本発明は，とりわけ，ゲノムデータベースにおいて同定された蛋白質キナーゼおよびキナーゼ様遺伝子，ならびにそれらのフラグメントを提供する。本発明は，部分的には，キナーゼまたはキナーゼ様活性を有するポリペプチドをコードすることができる核酸分子を提供する。以下の表１−８を参照すると，本発明の遺伝子をより理解することができる。本発明はさらに，多数の異なる態様，例えば以下に記載される態様を提供する。
【０１６０】
核酸
マップされた遺伝子の染色体の位置と癌における関与が示唆されているアンプリコンとの関連づけは，文献検索（ＰｕｂＭｅｄ，ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｅｎｔｒｅｚ／ｑｕｅｒｙ．ｆｃｇｉ），ＯＭＩＭ検索（Ｏｎｌｉｎｅ　Ｍｅｎｄｅｌｉａｎ　Ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ　ｉｎ　Ｍａｎ，ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｏｍｉｍ／ｓｅａｒｃｈｏｍｉｍ．ｈｔｍｌ）およびＫｎｕｕｔｉｌａらにより維持されている癌アンプリコンの包括的データベース（Ｋｎｕｕｔｉｌａ，　ｅｔ　ａｌ．，ＤＮＡ　ｃｏｐｙ　ｎｕｍｂｅｒ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ　ｉｎ　ｈｕｍａｎ　ｎｅｏｐｌａｓｍｓ．Ｒｅｖｉｅｗ　ｏｆ　ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ　ｇｅｎｏｍｉｃ　ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ　ｓｔｕｄｉｅｓ．Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１５２：１１０７−１１２３，１９９８．ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｈｅｌｓｉｎｋｉ．ｆｉ／〜ｌｇ１＿ｗｗｗ／ＣＭＧ．ｈｔｍｌ）に基づく。マップされた遺伝子の多くについて，Ｋｎｕｕｔｉｌａからの細胞遺伝学的領域が示されており，続いて，増幅が報告されている事例の数および調べた事例の総数が示されている。すなわち，ＳＧＫ１８７については，登録物”非小細胞肺癌（１２ｑ２４．１−２４．３；２／５０）”は，染色体位置が位置１２ｑ２４．１−２４．３において非小細胞肺癌と関連づけられており，これはＳＧＫ０８７の位置を包含し，調べた５０例の試料中の２例で増幅が認められたことを意味する。
【０１６１】
一塩基多型については，ＮＣＢＩで維持されているｄｂＳＮＰ（一塩基多型のデータベース）（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＳＮＰ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ）においてＳＮＰが記録されている場合に，受託番号（例えば，ＳＧＫ１３７についてはｓｓ２０１４９６３）が与えられる。ＳＮＰについての受託番号を用いて，このサイトから完全ＳＮＰ含有配列を引き出すことができる。ｄｂＳＮＰ受託番号を有しない候補ＳＮＰｓは，本明細書の配列のｃＤＮＡおよびゲノムデータベースに対するＢｌａｓｔｎ出力を調べることにより同定した。これは，例えば，表６および７に示され，実施例１において記載される。
【０１６２】
核酸プローブ，キナーゼを検出するための方法およびキット
本発明はさらに，核酸プローブおよびその用途を提供する。本発明の核酸プローブを用いて，通常のハイブリダイゼーション方法により適当な染色体またはｃＤＮＡライブラリを探索して，本発明の他の核酸分子を得ることができる。染色体ＤＮＡまたはｃＤＮＡライブラリは，当該技術分野において認識されている方法にしたがって，適当な細胞から調製することができる（”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ”，第２版．Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ，＆Ｍａｎｉａｔｉｓ，ｅｄｓ．，１９８９を参照）。
【０１６３】
別の方法においては，目的とするポリペプチドのアミノ酸配列のＮ末端，およびＣ末端部分に対応するヌクレオチド配列を有する核酸プローブを得るために化学合成を行うことができる。合成した核酸プローブを，ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）においてプライマーとして使用して，認識されているＰＣＲ手法にしたがって，本質的にＰＣＲ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，”Ａ　Ｇｕｉｄｅ　ｔｏ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ａｎｄ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ”，Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ，Ｍｉｃｈａｅｌ，ｅｔ　ａｌ．，ｅｄｓ．，１９９０にしたがって，適当な染色体またはｃＤＮＡライブラリを用いて，本発明のフラグメントを得ることができる。
【０１６４】
当業者は，本明細書に開示される配列に基づいて，当該技術分野において知られるコンピュータアラインメントおよび配列分析の方法を用いて，そのようなプローブを容易に設計することができる（”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ”，１９８９，上掲）。本発明のハイブリダイゼーションプローブは，標準的な標識技術，例えば放射性標識，酵素標識，蛍光標識，ビオチン−アビジン標識，化学発光等を用いる技術により，標識することができる。ハイブリダイゼーション後，プローブは既知の方法を用いて可視化することができる。
【０１６５】
本発明の核酸プローブはＲＮＡならびにＤＮＡプローブを含み，そのようなプローブは，例えば当該技術分野において知られる技術を用いて生成される。核酸プローブは，固体支持体上に固定化してもよい。そのような固体支持体の例としては，限定されないが，プラスチック，例えばポリカーボネート，複合炭水化物，例えばアガロースおよびセファロース，およびアクリル樹脂，例えばポリアクリルアミドおよびラテックスビーズが含まれる。核酸プローブをそのような固体支持体に結合させる技術は当該技術分野においてよく知られている。
【０１６６】
本発明の核酸探索方法に適した試験試料には，例えば，細胞または細胞の核酸抽出物，または体液が含まれる。上述の方法において用いられる試料は，アッセイフォーマット，検出方法，およびアッセイすべき組織，細胞，または抽出物の性質により様々であろう。細胞の核酸抽出物を調製する方法は当該技術分野においてよく知られており，用いる方法に適合する試料を得るために容易に適合させることができる。
【０１６７】
試料中で本発明の核酸の存在を検出する１つの方法は，（ａ）前記試料をハイブリダイゼーションが生ずるような条件下で上述の核酸プローブと接触させ，そして（ｂ）前記核酸分子に結合した前記プローブの存在を検出する，ことを含む。当業者は，当該技術分野において知られる技術にしたがって，上述のように核酸プローブを選択するであろう。試験すべき試料には，限定されないが，ヒト組織のＲＮＡ試料が含まれる。
【０１６８】
試料中で本発明の核酸の存在を検出するためのキットは，その中に上述の核酸プローブが置かれている少なくとも１つの容器手段を含む。キットはさらに，以下の１またはそれ以上を含む他の容器を含んでいてもよい：洗浄試薬および結合した核酸プローブの存在を検出することができる試薬。検出試薬の例としては，限定されないが，放射性標識プローブ，酵素標識プローブ（西洋ワサビペルオキシダーゼ，アルカリホスファターゼ），および親和性標識プローブ（ビオチン，アビジン，またはストレプトアビジン）が挙げられる。好ましくは，キットはさらに使用の指針を含む。
【０１６９】
詳細には，コンパートメント化されたキットには，試薬が別々の容器に入れられている任意のキットが含まれる。そのような容器には，小ガラス容器，プラスチック容器またはプラスチックまたは紙のストリップが含まれる。そのような容器は，試料および試薬が互いに夾雑しないように，かつ各容器の薬剤または溶液を定量的様式で１つのコンパートメントから別のコンパートメントに加えることができるように，１つのコンパートメントから別のコンパートメントに試薬を効率よく移すことができるものである。そのような容器には，試験試料を入れる容器，アッセイにおいて用いるプローブまたはプライマーを含有する容器，洗浄試薬（例えばリン酸緩衝化食塩水，Ｔｒｉｓ緩衝液等）を含有する容器，およびハイブリダイズしたプローブ，結合した抗体，増幅産物等を検出するために用いられる試薬を含有する容器が含まれる。当業者は，本発明において記載される核酸プローブを，当該技術分野においてよく知られる確立されたキットフォーマットの１つに容易に組み込むことができることを容易に認識するであろう。
【０１７０】
本発明にしたがうポリペプチドの分類
本発明の多数の蛋白質キナーゼについて，これが属する蛋白質クラスおよびファミリーの分類，非触媒的蛋白質モチーフの概要，ならびに染色体位置が提供される。この情報は，各蛋白質についての機能，制御および／または治療的有用性を決定するのに有用である。染色体領域の増幅を種々の癌と関連づけることができる。本明細書において議論されるアンプリコンについては，情報源はＫｎｕｕｔｉｌａ，　ｅｔ　ａｌ（Ｋｎｕｕｔｉｌａ　Ｓ，Ｂｊｏｒｋｑｖｉｓｔ　Ａ−Ｍ，Ａｕｔｉｏ　Ｋ，Ｔａｒｋｋａｎｅｎ　Ｍ，Ｗｏｌｆ　Ｍ，Ｍｏｎｎｉ　Ｏ，Ｓｚｙｍａｎｓｋａ　Ｊ，Ｌａｒｒａｍｅｎｄｙ　ＭＬ，Ｔａｐｐｅｒ　Ｊ，Ｐｅｒｅ　Ｈ，Ｅｌ−Ｒｉｆａｉ　Ｗ，Ｈｅｍｍｅｒ　Ｓ，Ｗａｓｅｎｉｕｓ　Ｖ−Ｍ，Ｖｉｄｇｒｅｎ　Ｖ＆Ｚｈｕ　Ｙ：ＤＮＡ　ｃｏｐｙ　ｎｕｍｂｅｒ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ　ｉｎ　ｈｕｍａｎ　ｎｅｏｐｌａｓｍｓ．Ｒｅｖｉｅｗ　ｏｆ　ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ　ｇｅｎｏｍｉｃ　ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ　ｓｔｕｄｉｅｓ．Ａｍ　Ｊ　Ｐａｔｈｏｌ　１５２：１１０７−１１２３，１９９８．ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｈｅｌｓｉｎｋｉ．ｆｉ／〜ｌｇｌ＿ｗｗｗ／ＣＭＧ．ｈｔｍｌ）であった。
【０１７１】
キナーゼ分類および蛋白質ドメインは，しばしば，経路，細胞での役割，または上流または下流の制御のメカニズムを反映する。また，疾病関連性遺伝子は，しばしば関連する遺伝子のファミリーにおいて生ずる。例えば，キナーゼファミリーの１つのメンバーがオンコジンまたは腫瘍サプレッサーとして機能する場合，または，免疫，神経，心臓血管，または代謝性疾患において破壊されていることが見いだされている場合，しばしば他のファミリーメンバーは関連する役割を果たすであろう。
【０１７２】
発現分析は，キナーゼを，腫瘍において転写的にアップレギュレートされているもののグループ，および特定の腫瘍タイプ（例えば黒色腫または前立腺）に限定されているもののグループに系統化する。この分析はまた，細胞サイクル依存性様式で制御されており，したがって細胞サイクルチェックポイントの維持，進行，または有糸分裂に入り，進行し，出ること，および所管ＤＮＡ修復に関与していると考えられる遺伝子，または細胞増殖およびゲノム安定性に関与している遺伝子を同定する。また，発現データにより，内皮起源または他の組織において発現しており，新脈管形成における役割が示唆され，したがって，脈管形成を構成要素とする疾病，例えば，癌，子宮内膜症，網膜症および変性，および種々の虚血性または血管性の病状の管理の標的としての意味を有する遺伝子を同定することができる。細胞生存における蛋白質の役割はまた，外部ストレス，例えば酸化的障害，低酸素症，シスプラチン等の薬剤，または放射線照射にさらされている細胞における限定された発現に基づいても示唆される。発現が腫瘍の侵入領域に限定されている場合，または発現が局所または原発性腫瘍と比較して遠位の転移においてのみ見られる場合，または遺伝子が侵入，移動または運動の培養細胞モデルの間にアップレギュレートされる場合，転移に付随する遺伝子が示唆される。
【０１７３】
染色体位置により，腫瘍アンプリコンまたは腫瘍サプレッサー遺伝子座についての候補標的を同定することができる。有力な腫瘍アンプリコンの概要は文献から入手可能であり，隣接する領域に位置するキナーゼ遺伝子の増幅されたコピーを含むことを実験的に確認すべき腫瘍タイプを同定することができる。
【０１７４】
本明細書に記載されるように，本発明のポリペプチドは，いくつかの異なるグループに分類することができる。これらの異なるグループの生物学的および化学的意味に関連する顕著な特徴は，以下により一般的に記載される。
【０１７５】
本発明のポリペプチドのより詳細な特性決定，例えば潜在的な生物学的および化学的意味は，例えば実施例２および５に提供される。
【０１７６】
キナーゼ活性を示すポリペプチドの分類
以下の情報については，例えば表１および２も参照されたい。
【０１７７】
ＡＧＣグループ
ファミリーメンバーは，蛋白質キナーゼのＡＧＣグループに属すると記述される。蛋白質キナーゼのＡＧＣグループには，その主要なプロトタイプとして，蛋白質キナーゼＣ（ＰＫＣ），ｃＡＭＰ依存性蛋白質キナーゼ（ＰＫＡ），Ｇ蛋白質共役レセプターキナーゼ（ＡＲＫおよびロドプシンキナーゼ（ＧＲＫ１））ならびにｐ７０Ｓ６ＫおよびＡＫＴが含まれる。
【０１７８】
新規なＡＧＣグループの蛋白質キナーゼの潜在的な生物学的および臨床的関連性は実施例６に記載される。新規なＡＧＣグループのキナーゼには，配列番号１３が含まれる。
【０１７９】
ＣＡＭＫグループ
ファミリーメンバーは，蛋白質キナーゼのＣＡＭＫグループに属すると記述される。蛋白質キナーゼのＣＡＭＫグループには，その主要なプロトタイプとして，カルモジュリン依存性蛋白質キナーゼ，伸長因子−２キナーゼ，ホスホリラーゼキナーゼおよびＳｎｆｌおよび蛋白質キナーゼのｃＡＭＰ依存性ファミリーが含まれる。
【０１８０】
新規なＣＡＭＫグループの蛋白質キナーゼの潜在的な生物学的および臨床的関連性は実施例６に記載される。新規なＣＡＭＫグループの蛋白質キナーゼには配列番号１４が含まれる。
【０１８１】
カゼインキナーゼグループ
ファミリーメンバーは，蛋白質キナーゼのカゼインキナーゼ（ＣＫＩ）グループに属すると記述される。蛋白質キナーゼのカゼインキナーゼ（ＣＫ）グループには，その主要なプロトタイプとして，カゼインキナーゼＩ（ＣＫＩ）およびカゼインキナーゼＩＩ（ＣＫＩＩ）が含まれる。ＣＫＩおよびＣＫＩＩはいずれも偏在しており，構成的に活性であり，セカンドメッセンジャー非依存的キナーゼであり，多くのアイソフォームで存在する高度に保存された酵素である。ＣＫＩは小胞輸送，ＤＮＡ修復，細胞サイクル進行および細胞質分裂において機能する（Ｃｅｌｌ　Ｓｉｇｎａｌ　１９９８，Ｎｏｖ；１０（１０）：６９９−７１１）。ＣＫ２は，非神経細胞において細胞サイクル進行において機能する。ＣＫ２はまた，正常および疾病状態の哺乳動物神経系における多数のシグナリング経路に関与することが示唆されている（Ｐｒｏｇ　Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ　２０００　Ｆｅｂ；６０（３）：２１１−４６）。蛋白質キナーゼの新規カゼインキナーゼグループの潜在的な生物学的および臨床的関連性は実施例６に記載される。新規カゼインキナーゼ蛋白質キナーゼには配列番号１５が含まれる。
【０１８２】
”その他”グループ
ファミリーメンバーは，蛋白質キナーゼの”その他”グループに属すると記述される。蛋白質キナーゼのこのグループ中には，隠れマルコフモデル分析により同定される認識しうる触媒的モチーフを有するが，触媒領域にわたるそのアミノ酸配列ホモロジーに基づいて他の蛋白質キナーゼとともにクラスター化されないメンバーが含まれる。
【０１８３】
”その他”グループに属する新規蛋白質キナーゼの潜在的な生物学的および臨床的関連性は実施例６に記載される。新規な”その他”蛋白質キナーゼには，配列番号１６，配列番号１７，配列番号１８，配列番号１９，および配列番号２０が含まれる。
【０１８４】
ＴＫグループ
ファミリーメンバーは，蛋白質キナーゼのチロシンキナーゼ（ＴＫ）グループに属すると記述される。蛋白質キナーゼのＴＫグループには，その主要なプロトタイプとして蛋白質キナーゼの細胞質およびレセプターファミリーが含まれる。このグループの蛋白質には，配列番号２１および配列番号２２が含まれる。
【０１８５】
キナーゼ様活性を示すポリペプチドの分類
新規メンバーはまた，蛋白質キナーゼの蛋白質キナーゼ（ＰＫ）様スーパーファミリーに属すると記述される。キナーゼのＰＫ様スーパーファミリーは，非蛋白質性の基質（すなわち，代謝産物，脂質）をリン酸化する酵素，例えばアミノ酸キナーゼ（例えばコリンキナーゼ），ヌクレオチド（例えばグアニル酸キナーゼ）および脂質キナーゼ（例えばホスホイノシチドキナーゼ）を含み，以下の実施例および表に記載される。
【０１８６】
本明細書においては２つの遺伝子，ＳＧＫ１１９（配列番号１１，配列番号２３をコード）およびＳＧＫ３８７（配列番号１２，配列番号２４をコード）がＰＫ様である（すなわちＰＫドメインを有しない）。表３においては，本明細書に記載される他の遺伝子についての蛋白質キナーゼドメイン境界を示すカラムにおいて，これらの遺伝子は”ＰＫ様”というエントリーを有し，これはこれらの遺伝子が内包的蛋白質キナーゼドメインを有しないことを示す。これらの触媒ドメイン，すなわちＳＧＫ１１９（配列番号１１）についてはグアニルシクラーゼドメインおよびＳＧＫ３８７（配列番号１２）についてはホスホイノシチドキナーゼドメインの境界は，”追加ドメイン”のカラムに示される。以下の段落は，これらの非キナーゼドメインを同定するのに用いた隠れマルコフプロファイルを記載する。
【０１８７】
蛋白質キナーゼＣ末端ドメイン（ＰＦ００４３３）は約４９アミノ酸の長さである。これは２１のメンバーから構成され，蛋白質キナーゼＣファミリーメンバーであることが見いだされている。
【０１８８】
アルマジロ／ベータ−カテニン様反復（ＰＦ００５１４）は約４１アミノ酸の長さである。これは腺腫様結腸ポリポシス（ＡＰＣ）腫瘍サプレッサーおよびベータカテニンを含む２５６のメンバーから構成される。
【０１８９】
ロイシンリッチ反復（ＰＦ００５６０）は約２３アミノ酸の長さである。これは多様な機能および細胞内局在を有する多数の蛋白質を含む２５８７個のメンバーから構成される。ロイシンリッチ反復を有する蛋白質は，典型的には蛋白質−蛋白質相互作用に関与する。リボヌクレアーゼ阻害剤はロイシンリッチ反復を含む蛋白質の一例である。これは，膵臓リボヌクレアーゼスーパーファミリーのリボヌクレアーゼに強く結合しこれを阻害する細胞質蛋白質である。リボヌクレアーゼ阻害剤は，ＲＮＡの制御および新脈管形成において役割を果たすことが示されている。
【０１９０】
ＴＢＣドメイン（ＰＦ００５６６）は約２３３アミノ酸の長さである。これはＴｂｃ−１，ｔｒｅ−２オンコジンおよび酵母の有糸分裂のレギュレータであるＢＵＢ２およびｃｄｃ１６等の蛋白質を含む１１個のメンバーから構成される。Ｔｂｃ１は核蛋白質であり，その組織発現は細胞特異的かつ期特異的である。Ｔｂｃ１は種々の組織の細胞サイクルおよび分化において役割を果たすかもしれない。
【０１９１】
ローダネース様ドメイン（ＰＦ００５８１）は約１１１アミノ酸の長さである。これは４９個のメンバーから構成される。ローダネースはチオサルフェートのスルファン原子をシアニドに移動させてサルファイトおよびチオシアネートを形成する反応を触媒する。ローダネースは脊椎動物に見いだされ，ここでは，これは鉄−イオウ複合体の形成およびシアニド無毒化に関与するミトコンドリア酵素である。ローダネースに密接に関連する他の細菌蛋白質には，ｒｈｄＡ（Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ　ｖｉｎｅｌａｎｄｉｉ），ｓｓｅＡ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ），およびｃｙｓＡ（Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ　ｅｒｙｔｈｒａｅａ）が含まれる。
【０１９２】
エフィリンレセプターリガンド結合ドメイン（ＰＦ０１４０４）は約１７２アミノ酸の長さである。これはエフィリンとして知られる細胞膜アンカーリガンドのグループに結合するＥｐｈレセプターを含む１５個のメンバーから構成される。Ｅｐｈレセプターはレセプターチロシンキナーゼの最大のサブファミリーを形成し，主として発達中のおよび成人の神経系において発現される。Ｅｐｈレセプターはまた，接触媒介性軸索誘導，軸索束形成および細胞遊走において重要な役割を果たすことが示されている。
【０１９３】
フィブロネクチンタイプＩＩＩドメイン（ＰＦ０００４１）は約８６アミノ酸の長さである。これは典型的には接着機能に関与するレセプタースーパーグループ，およびリンホカイン，造血成長因子および成長ホルモン関連分子の多数のレセプターを含む１０８個のメンバーから構成される。
【０１９４】
ＳＡＭドメイン（ステライルアルファモチーフ）（ＰＦ００５３６）は約６４アミノ酸の長さである。これは４０個のＥＰＨ関連レセプターチロシンキナーゼ（ＲＰＴＫ），ショウジョウバエ双尾−Ｃ，Ｌｏｌｉｇｏ　ｆｏｒｂｅｓｉからのｐ５３，およびジアシルグリセロールキナーゼアイソフォームデルタを含む１０８個のメンバーから構成される。ＳＡＭドメインは，多くの発生プロセスの制御に関与する，進化的に保存されている蛋白質結合ドメインである。ＥＰＨ関連ＲＰＴＫは，細胞−細胞により開始される，ＳＨ２含有蛋白質のホスホチロシンへの結合を介するシグナル伝達を媒介しているようである，保存されたチロシンを含む。
【０１９５】
アンキリンドメイン（ＰＦ０００２３）は約３３アミノ酸の長さである。これは例えば，構造蛋白質のアンキリンファミリー，ＣＤＫ阻害剤，例えばｐ１９ＩＮＫ４ｄ，および他のシグナリング蛋白質，例えば核因子ＮＦ−カッパ−ｂのｐ５０サブユニットおよびＢｃｌ３（ｂ細胞リンパ腫３によりコードされる蛋白質）を含む２２２０個のメンバーから構成される。アンキリン反復は一般にベータ，アルファ，アルファ，ベータの順の二次構造から構成される。反復は会合して高次構造を形成する。
【０１９６】
アデニル酸およびグアニル酸シクラーゼ触媒ドメイン（ＰＦ００２１１）は約１６１アミノ酸の長さである。これはＧＣ−ＡおよびＧＣ−Ｂを含むナトリウム利尿ペプチド（ＡＮＦ）のレセプターを含む２４個のメンバーから構成される。細胞質および膜蛋白質の両方がアデニル酸およびグアニル酸シクラーゼ触媒ドメインを含むことが見いだされている。
【０１９７】
ホスファチジルイノシトール３−および４−キナーゼ（ＰＦ００４５４）は約２０８アミノ酸の長さである。これはＰＩ３キナーゼおよびＰＩ４キナーゼを含む３３個のメンバーから構成され，これらはイノシトール環のそれぞれ３−および４−ヒドロキシル基のホスホイノシチドのリン酸化に関与する。このリン酸化は細胞シグナリングのセカンドメッセンジャーの形成に関与すると考えられている。
【０１９８】
ＦＡＴＣドメイン（ＦＲＡＰ，ＡＴＭ，ＴＲＲＡＰ　Ｃ末端）（ＰＦ０２２６０）は約３２アミノ酸の長さである。これはＰＩＫ関連キナーゼを含む１５のメンバーから構成される。
【０１９９】
本発明にしたがう治療方法
診断：
本発明は，疾病または疾患の診断道具として，試料中のポリペプチドを検出する方法を提供する。該方法は，（ａ）試料を，ハイブリダイゼーションアッセイ条件下で，配列番号１３，配列番号１４，配列番号１５，配列番号１６，配列番号１７，配列番号１８，配列番号１９，配列番号２０，配列番号２１，配列番号２２，配列番号２３，および配列番号２４からなる群より選択されるポリペプチドの核酸標的領域にハイブリダイズする核酸プローブと接触させ，前記プローブは，ポリペプチド，そのフラグメント，および配列およびフラグメントの相補体をコードする核酸配列を含み；そして（ｂ）プローブ：標的領域ハイブリッドの存在または量を疾病の指標として検出する，の各工程を含む。
【０２００】
本発明の好ましい態様においては，疾病または疾患は，慢性関節リウマチ，アテローム性動脈硬化症，自己免疫疾患，臓器移植，心筋梗塞，心筋症，発作，腎不全，酸化的ストレス関連神経変性性疾患，代謝性疾患，例えば糖尿病，生殖疾患，例えば不妊症，および癌からなる群より選択される。
【０２０１】
ハイブリダイゼーション条件は，他の核酸分子の存在下においてその遺伝子とのみハイブリダイゼーションが生ずるような条件であるべきである。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下では，高度に相補的な核酸配列のみがハイブリダイズする。好ましくは，そのような条件は，２０個の連続するヌクレオチド中に１または２個のミスマッチを有する核酸のハイブリダイゼーションを防止する。そのような条件は上で定義される。
【０２０２】
試料中の遺伝子の検出により診断することができる疾病には，核酸（ＤＮＡおよび／またはＲＮＡ）が正常細胞と比較して増幅されている疾病が含まれる。”増幅”とは，正常細胞と比較して，細胞中でＤＮＡまたはＲＮＡの数が増加していることを意味する。
【０２０３】
ＲＮＡに関する場合，”増幅”は，細胞においてＲＮＡが検出可能なように存在することでありうる。ある正常細胞においては，ＲＮＡの基底発現がないためである。他の正常細胞においては，発現の基底レベルが存在し，したがってこれらの場合には増幅は基底レベルと比較して少なくとも１−２倍，好ましくはそれより多い検出である。
【０２０４】
試料中の核酸の検出により診断することができる疾病には，好ましくは，癌が含まれる。本発明の核酸探索方法に適した試験試料には，例えば，細胞または細胞の核酸抽出物，または体液が含まれる。上述の方法において用いられる試料は，アッセイフォーマット，検出方法，およびアッセイする組織，細胞または抽出物の性質により様々でありうる。細胞の核酸抽出物を調製する方法は，当該技術分野においてよく知られており，用いる方法に適合した試料を得るために容易に適合させることができる。
【０２０５】
抗体，ハイブリドーマ，キナーゼの検出のための使用方法およびキット
本発明は，本発明のキナーゼに結合親和性を有する抗体に関する。ポリペプチドは，配列番号１３，配列番号１４，配列番号１５，配列番号１６，配列番号１７，配列番号１８，配列番号１９，配列番号２０，配列番号２１，配列番号２２，配列番号２３，および配列番号２４に記載されるアミノ酸配列，またはその機能的誘導体，またはその少なくとも９個の連続するアミノ酸（好ましくは，その少なくとも２０，３０，３５，または４０個の連続するアミノ酸）からなる群より選択されるアミノ酸配列を有することができる。
【０２０６】
本発明はまた，本発明のキナーゼに対して特異的結合親和性を有する抗体に関する。そのような抗体は，本発明のキナーゼに対するその結合親和性を他のポリペプチドに対する結合親和性と比較することにより単離することができる。本発明のキナーゼに選択的に結合する抗体を，本発明のキナーゼと他のポリペプチドとを区別することを必要とする方法において用いるために選択することができる。そのような方法には，限定されないが，他のポリペプチドを含む組織におけるキナーゼ発現の変化の分析が含まれる。
【０２０７】
本発明のキナーゼは，種々の手順および方法，例えば抗体の生成，医薬組成物の同定，およびＤＮＡ／蛋白質相互作用の研究において用いることができる。
【０２０８】
本発明のキナーゼは，抗体またはハイブリドーマを生成するために用いることができる。当業者は，抗体が望まれる場合，そのようなペプチドを本明細書に記載されるように生成し，免疫原として用いることができることを認識するであろう。本発明の抗体には，モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体，ならびにこれらの抗体のフラグメント，およびヒト化型が含まれる。本発明の抗体のヒト化型は，キメラ化またはＣＤＲグラフティング等の当該技術分野において知られる手法の１つを用いて生成することができる。
【０２０９】
本発明はまた，上述のモノクローナル抗体またはその結合フラグメントを産生するハイブリドーマに関する。ハイブリドーマは，特定のモノクローナル抗体を分泌することができる不死化細胞株である。
【０２１０】
一般に，モノクローナル抗体およびハイブリドーマを製造する手法は当該技術分野においてよく知られている（Ｃａｍｐｂｅｌｌ，”Ｍｏｎｏｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｙ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　ｉｎ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ａｎｄ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ”，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，Ｔｈｅ　Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ，１９８４；Ｓｔ．Ｇｒｏｔｈ　ｅｔ　ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ　３５：１−２１，１９８０）。抗体を生成することが知られている任意の動物（マウス，ウサギ等）を，選択されたポリペプチドで免疫することができる。免疫の方法は当該技術分野においてよく知られている。そのような方法には，ポリペプチドの皮下または腹膜内注射が含まれる。当業者は，免疫に用いるポリペプチドの量は，免疫する動物，ポリペプチドの抗原性，および注入部位により様々であることを認識するであろう。
【０２１１】
ポリペプチドは，ペプチドの抗原性を増加させるために，修飾するかまたはアジュバント中で投与することができる。ポリペプチドの抗原性を増加させる方法は当該技術分野においてよく知られている。そのような方法には，抗原を異種蛋白質（例えばグロブリンまたはβ−ガラクトシダーゼ）とカップリングさせるか，または免疫の間にアジュバントを含めることが含まれる。
【０２１２】
モノクローナル抗体については，免疫した動物から脾臓細胞を切除し，ミエローマ細胞，例えばＳＰ２／０−Ａｇｌ４ミエローマ細胞と融合させ，モノクローナル抗体産生ハイブリドーマ細胞とさせる。当該技術分野においてよく知られる多数の方法の任意のものを用いて，所望の特性を有する抗体を産生するハイブリドーマ細胞を同定することができる。これらには，ハイブリドーマをＥＬＩＳＡアッセイ，ウエスタンブロット分析，またはラジオイムノアッセイを用いてスクリーニングすることが含まれる（Ｌｕｔｚ　ｅｔ　ａｌ．，Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ　Ｒｅｓ．１７５：１０９−１２４，１９８８）。所望の抗体を分泌するハイブリドーマをクローニングし，当該技術分野において知られる方法を用いてクラスおよびサブクラスを決定する（Ｃａｍｐｂｅｌｌ，”Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｙ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　ｉｎ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ａｎｄ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ”，上掲，１９８４）。
【０２１３】
ポリクローナル抗体については，免疫した動物から抗体を含有する抗血清を単離し，上述の方法の１つを用いて所望の特異性を有する抗体の存在についてスクリーニングする。上述の抗体は，検出可能なように標識することができる。抗体は，放射性同位体，アフィニティー標識（例えばビオチン，アビジン等），酵素標識（例えば西洋ワサビペルオキシダーゼ，アルカリホスファターゼ等），蛍光標識（例えばＦＩＴＣまたはローダミン等），常磁性原子等を用いて，検出可能なように標識することができる。そのような標識を行う方法は当該技術分野においてよく知られている。例えば，Ｓｔｅｍｂｅｒｇｅｒ　ｅｔ　ａｌ．，Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．１８：３１５，１９７０；Ｂａｙｅｒ　ｅｔ　ａｌ．Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍ．６２：３０８，１９７９；Ｅｎｇｖａｌ　ｅｔ　ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０９：１２９，１９７２；Ｇｏｄｉｎｇ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．１３：２１５，１９７６を参照。本発明の標識された抗体は，インビトロ，インビボ，およびインシトゥーアッセイに用いて，特定のペプチドを発現する細胞または組織を同定することができる。
【０２１４】
上述の抗体は，固体支持体上に固定化してもよい。そのような固体支持体の例には，プラスチック，例えばポリカーボネート，複合炭水化物，例えばアガロースおよびセファロース，アクリル樹脂，例えばポリアクリルアミドおよびラテックスビーズが含まれる。抗体をそのような固体支持体にカップリングさせる技術は当該技術分野においてよく知られている（Ｗｅｉｒ　ｅｔ　ａｌ．，”Ｈａｎｄｂｏｏｋ　ｏｆ　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ”４ｔｈＥｄ．，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ，Ｃｈａｐｔｅｒ　１０，１９８６；Ｊａｃｏｂｙ　ｅｔ　ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍ．３４，Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．，１９７４）。本発明の固定化された抗体は，インビトロ，インビボ，およびインシトゥーアッセイに，ならびに免疫クロマトグラフィーに用いることができる。
【０２１５】
さらに，当業者は，合理的に設計された抗ペプチドペプチドを生成するために，現在利用可能な方法，並びに抗体に関して本明細書に記載される技術，方法およびキットを容易に適合させて，特定のペプチド配列に結合しうるペプチドを容易に生成することができる（Ｈｕｒｂｙ　ｅｔ　ａｌ．，”Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ　Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ　Ｐｅｐｔｉｄｅｓ”，Ｉｎ　Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ　Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，Ａ　Ｕｓｅｒ’ｓ　Ｇｕｉｄｅ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ，ＮＹ，ｐｐ．２８９−３０７，１９９２；Ｋａｓｐｃｚａｋ　ｅｔ　ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　２８：９２３０−９２３８，１９８９）。
【０２１６】
抗ペプチドペプチドは，本発明のキナーゼのペプチド配列中に見いだされる塩基性アミノ酸残基を，疎水性および非荷電極性基を維持しながら酸性残基で置き換えることにより生成することができる。例えば，リジン，アルギニン，および／またはヒスチジン残基をアスパラギン酸またはグルタミン酸で置き換え，およびグルタミン酸残基をリジン，アルギニンまたはヒスチジンで置き換える。
【０２１７】
本発明はまた，試料中においてキナーゼポリペプチドを検出する方法を包含する。該方法は，（ａ）試料を，免疫複合体が形成するような条件下で上述の抗体と接触させ，そして（ｂ）ポリペプチドに結合した前記抗体の存在を検出する，ことを含む。詳細には，該方法は，試験試料を１またはそれ以上の本発明の抗体とインキュベートし，抗体が試験試料に結合するか否かをアッセイすることを含む。試料中で本発明のキナーゼのレベルが正常なレベルと比較して変化していることは疾病を示すかもしれない。
【０２１８】
抗体を試験試料とインキュベートする条件は様々である。インキュベーション条件は，アッセイにおいて用いられるフォーマット，用いられる検出方法，およびアッセイにおいて用いられる抗体のタイプおよび性質によって異なる。当業者は，慣用的に入手可能な免疫学的アッセイフォーマット（例えばラジオイムノアッセイ，酵素結合イムノソルベントアッセイ，拡散に基づくオクタロニー，またはロケット免疫蛍光アッセイ）の任意のものを，本発明の抗体を用いるために容易に適合させることができることを認識するであろう。そのようなアッセイの例は，Ｃｈａｒｄ（”Ａｎ　Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ｔｏ　Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓｙ　ａｎｄ　Ｒｅｌａｔｅｄ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ”，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，Ｔｈｅ　Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ，１９８６），Ｂｕｌｌｏｃｋ　ｅｔ　ａｌ．（”Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　ｉｎ　Ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ”，Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ，Ｏｒｌａｎｄｏ，ＦＬＶｏｌ．１，１９８２；Ｖｏｌ．２，１９８３；Ｖｏｌ．３，１９８５），Ｔｉｊｓｓｅｎ（”Ｐｒａｃｔｉｃｅ　ａｎｄ　Ｔｈｅｏｒｙ　ｏｆ　Ｅｎｚｙｍｅ　Ｉｍｍｕｎｏａｓｓｙｓ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　ｉｎ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ａｎｄ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ”，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，Ｔｈｅ　Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ，１９８５）に見いだすことができる。
【０２１９】
本発明の免疫学的アッセイ試験試料には，細胞，蛋白質または細胞の膜抽出物，または体液，例えば血液，血清，血漿または尿が含まれる。上述の方法において用いられる試験試料は，アッセイフォーマット，検出方法の性質およびアッセイすべき試料として用いられる組織，細胞または抽出物により様々であろう。蛋白質抽出物または細胞の膜抽出物を製造する方法は当該技術分野においてよく知られており，用いるシステムにより試験しうる試料を得るために容易に適合させることができる。
【０２２０】
キットは，先に記載した検出方法を実施するために必要な全ての試薬を含む。キットは，（ｉ）上述の抗体を含む第１の容器手段，および（ｉｉ）抗体の結合パートナーと標識を含むコンジュゲートを含む第２の容器手段を含むことができる。別の好ましい態様においては，キットは以下の１またはそれ以上を含む１またはそれ以上の他の容器をさらに含む：洗浄試薬および結合した抗体の存在を検出しうる試薬。
【０２２１】
検出試薬の例には，限定されないが，標識二次抗体が含まれ，あるいは，一次抗体が標識されている場合には，標識された抗体と反応しうる発色団，酵素，または抗体結合試薬が含まれる。コンパートメント化キットは核酸プローブキットについて上述したようなものでもよい。当業者は，本発明に記載される抗体を，当該技術分野においてよく知られる確立されたキットフォーマットの１つに容易に取り込ませることができることを容易に認識するであろう。
【０２２２】
キナーゼと相互作用することができる化合物の単離
本発明はまた，本発明の蛋白質キナーゼに結合しうる化合物を検出する方法に関する。該方法は，化合物を本発明のキナーゼとともにインキュベートし，キナーゼに結合した化合物の存在を検出することを含む。化合物は，複雑な混合物，例えば，血清，体液，または細胞抽出物中に存在していてもよい。
【０２２３】
本発明はまた，キナーゼの活性またはキナーゼの結合パートナーの活性のアゴニストまたはアンタゴニストを検出する方法に関する。該方法は，本発明のキナーゼを産生する細胞を化合物の存在下でインキュベートし，キナーゼ活性またはキナーゼ結合パートナーの活性のレベルの変化を検出することを含む。このようにして同定される化合物は，化合物の存在を示す活性の変化を生ずるであろう。化合物は，複雑な混合物，例えば，血清，体液，または細胞抽出物中に存在していてもよい。いったん化合物が同定されれば，当該技術分野においてよく知られる技術を用いてこれを単離することができる。
【０２２４】
ポリペプチド活性の調節：
本発明はさらに，治療を必要とする患者に，配列番号１３，配列番号１４，配列番号１５，配列番号１６，配列番号１７，配列番号１８，配列番号１９，配列番号２０，配列番号２１，配列番号２２，配列番号２３，および配列番号２４からなる群より選択されるポリペプチドの活性を調節する物質を投与することにより，疾病または異常な状態を治療する方法を提供する。好ましくは，疾病は，慢性関節リウマチ，アテローム性動脈硬化症，自己免疫疾患，臓器移植，心筋梗塞，心筋症，発作，腎不全，酸化的ストレス関連神経変性性疾患，代謝性および生殖疾患，および癌からなる群より選択される。
【０２２５】
疾患または疾病の治療に有用な物質は，好ましくは，問題とする疾病または疾患の治療に対応する活性についての１またはそれ以上のインビトロアッセイにおいて陽性の結果を示す。ポリペプチドの活性を調節する物質は，好ましくは，限定されないが，アンチセンスオリゴヌクレオチドおよび蛋白質キナーゼの阻害剤を含む。
【０２２６】
”予防する”との用語は，生物が異常な状態に罹患するかこれを発達させる可能性を減少させることを表す。
【０２２７】
”治療する”との用語は，生物において治療効果を有し，異常な状態を少なくとも部分的に緩和するかまたは排除することを表す。
【０２２８】
”治療効果”との用語は，異常な状態を引き起こすかまたはこれに寄与する阻害または活性化率を表す。治療効果は，異常な状態の１またはそれ以上の症状をある程度緩和する。異常な状態の治療に関して，治療効果は，以下の１またはそれ以上を表すことができる：（ａ）細胞の増殖，成長，および／または分化の増加；（ｂ）細胞死の阻害（すなわち，遅延または停止）；（ｃ）変性の阻害；（ｄ）異常な状態に伴う１またはそれ以上の症状のある程度の緩和；および（ｅ）影響を受けた細胞の集団の機能の増強。異常な状態に対して有効性を示す化合物は，本明細書に記載されるようにして同定することができる。
【０２２９】
”異常な状態”との用語は，生物の細胞または組織における，その生物における正常な機能からはずれた機能を表す。異常な状態は，細胞増殖，細胞分化，または細胞生存に関連しうる。異常な状態にはまた，変則的な細胞サイクル進行，すなわち有糸分裂および減数分裂を通る正常な細胞サイクル進行が変則的であることが含まれる。
【０２３０】
異常な細胞増殖状態には，癌，例えば繊維性およびメサンギウム疾患，異常な新脈管形成および脈管形成，創傷治癒，乾癬，真性糖尿病，および炎症が含まれる。
【０２３１】
異常な分化状態には，限定されないが，神経変性性疾患，遅い創傷治癒速度，および遅い組織移植治癒速度が含まれる。
【０２３２】
異常な細胞生存状態は，プログラムされた細胞死（アポトーシス）経路が活性化されているかまたは排除されている状態に関連する。多くの蛋白質キナーゼがアポトーシス経路に関連している。蛋白質キナーゼのいずれかの機能の異常は，細胞の不死または未成熟細胞死につながりうる。
【０２３３】
シグナル伝達プロセスにおけるキナーゼの機能に関連して，”異常な”との用語は，生物において過剰発現または過小発現されているか，その触媒活性が野生型蛋白質キナーゼ活性より低いかまたは高いように変異しているか，天然の結合パートナーともはや相互作用できないように変異しているか，別の蛋白質キナーゼまたは蛋白質ホスファターゼによりもはや修飾されないか，または天然の結合パートナーともはや相互作用しない，キナーゼを表す。
【０２３４】
”投与する”との用語は，化合物を生物の細胞または組織内に取り込ませる方法に関連する。異常な状態は，生物の細胞または組織が生物中または生物外に存在する場合，予防または治療することができる。生物の外に存在する細胞は，細胞培養皿中で維持または成長させることができる。生物中に含まれる細胞については，当該技術分野には化合物を投与する多くの手法が存在し，例えば，限定されないが，経口，非経口，経皮，注入およびエアロゾル外用が含まれる。生物外の細胞については，当該技術分野には化合物を投与する多数の手法が存在し，例えば，限定されないが，細胞マイクロインジェクション手法，トランスフォーメーション手法，および担体手法が含まれる。
【０２３５】
異常な状態はまた，シグナル伝達経路に異常を有する一群の細胞を有する生物に化合物を投与することにより，予防または治療することができる。次に，化合物の投与が生物機能に及ぼす影響をモニターすることができる。生物は，好ましくはマウス，ラット，ウサギ，モルモット，またはヤギであり，より好ましくは有尾サルまたは無尾サルであり，最も好ましくはヒトである。
【０２３６】
本発明はまた，哺乳動物においてキナーゼに関連する活性をアゴナイズ（促進）するかまたはアンタゴナイズする方法を含む。該方法は，前記哺乳動物に，配列番号１３，配列番号１４，配列番号１５，配列番号１６，配列番号１７，配列番号１８，配列番号１９，配列番号２０，配列番号２１，配列番号２２，配列番号２３，および配列番号２４からなる群より選択されるポリペプチドに対するアゴニストまたはアンタゴニストを前記アゴニズムまたはアンタゴニズムを生ずるのに十分な量で投与することを含む。キナーゼに関連する機能をアゴナイズまたはアンタゴナイズするのに十分な量のアゴニストまたはアンタゴニストを哺乳動物に投与することを含む，哺乳動物において，本発明のキナーゼの１つの活性のアゴニストまたはアンタゴニストを用いて疾病を治療する方法もまた本発明に含まれる。
【０２３７】
疾病の新規な治療を発見することをめざして，生物医学研究者および化学者は，蛋白質キナーゼの機能を阻害する分子を設計し，合成し，試験してきた。いくつかの小さい有機分子は蛋白質キナーゼの機能を調節する化合物の一群を形成する。蛋白質キナーゼの機能を阻害することが報告されている分子の例としては，限定されないが，ビス単環式，二環式または複素環式アリール化合物（ＰＣＴ　ＷＯ９２／２０６４２，１９９２年１１月２６日公開，Ｍａｇｕｉｒｅ　ｅｔ　ａｌ．），ビニレン−アザインドール誘導体（ＰＣＴ　ＷＯ９４／１４８０８，１９９４年７月７日公開，Ｂａｌｌｉｎａｒｉ　ｅｔ　ａｌ．），１−シクロプロピル−４−ピリジル−キノロン類（米国特許５，３３０，９９２），スチリル化合物（米国特許５，２１７，９９９），スチリル置換ピリジル化合物（米国特許５，３０２，６０６），ある種のキナゾリン誘導体（欧州特許出願０５６６２６６Ａ１），セレオインドール類およびセレニド類（ＰＣＴ　ＷＯ９４／０３４２７，１９９４年２月１７日公開，Ｄｅｎｎｙ　ｅｔ　ａｌ．），三環式ポリヒドロキシ化合物（ＰＣＴ　ＷＯ９２／２１６６０，１９９２年１２月１０日公開，Ｄｏｗ），およびベンジルホスホン酸化合物（ＰＣＴ　ＷＯ９１／１５４９５，１９９１年１０月１７日公開，Ｄｏｗ　ｅｔ　ａｌ）が挙げられる（これらはすべて，図面を含め本明細書の一部としてここに引用する）。
【０２３８】
細胞膜を横切ることができ，酸加水分解に耐性の化合物は，患者に経口投与された後に高度に生物利用性となることができるため，治療剤として利点を有する可能性がある。しかし，これらの蛋白質キナーゼ阻害剤の多くは，蛋白質キナーゼの機能を弱くしか阻害しない。さらに，多くは種々の蛋白質キナーゼを阻害し，したがって，疾病の治療剤として多くの副作用を引き起こすであろう。
【０２３９】
しかし，ある種のインドリノン化合物は，酸耐性であり膜透過性である有機分子の一群を形成する。ＷＯ９６／２２９７６（１９９６年８月１日公開，Ｂａｌｌｉｎａｒｉ　ｅｔ　ａｌ．）は，オキシインドール環に融合したテトラリン，ナフタレン，キノリン，およびインドール置換基を有する水溶性インドリノン化合物を記載する。これらの二環式置換基は，さらに，ヒドロキシル化アルキル，リン酸，およびエーテル成分等の極性成分で置換されている。”Ｉｎｄｏｌｉｎｏｎｅ　Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ　Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ　ａｎｄ　Ｒｅｌａｔｅｄ　Ｐｒｏｄｕｃｔｓ　ａｎｄ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｄｅｓｅａｓｅｓ”と題するＴａｎｇ　ｅｔ　ａｌ．の米国特許出願０８／７０２，２３２（１９９６年８月２３日出願；Ｌｙｏｎ＆Ｌｙｏｎ　Ｄｏｃｋｅｔ　Ｎｏ．２２１／１８７）および”Ｂｅｎｚｙｌｉｄｅｎｅ−Ｚ−Ｉｎｄｏｌｉｎｅ　Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｄｅｓｅａｓｅｓ”と題するＴａｎｇ　ｅｔ　ａｌの米国特許出願０８／４８５，３２３（１９９５年６月７日出願；Ｌｙｏｎ＆Ｌｙｏｎ　Ｄｏｃｋｅｔ　Ｎｏ．２２３／２９８），国際公開ＷＯ９６／４０１１６（１９９６年１２月１９日公開，Ｔａｎｇ　ｅｔ　ａｌ），および国際公開ＷＯ９６／２２９７６（１９９６年８月１日公開，Ｂａｌｌｉｎａｒｉ　ｅｔ　ａｌ）（これらはすべて，図面および表を含めその全体を本明細書の一部としてここに引用する）は，オキシインドール環に融合した他の二環式成分ならびに単環式成分を有するインドリノン化合物のインドリノン化学ライブラリを記載する。”Ｉｎｄｏｌｉｎｏｎｅ　Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ　Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ　ａｎｄ　Ｒｅｌａｔｅｄ　Ｐｒｏｄｕｃｔｓ　ａｎｄ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｄｅｓｅａｓｅｓ”と題するＴａｎｇ　ｅｔ　ａｌ．の出願０８／７０２，２３２（１９９６年８月２３日出願；Ｌｙｏｎ＆Ｌｙｏｎ　Ｄｏｃｋｅｔ　Ｎｏ．２２１／１８７），”Ｂｅｎｚｙｌｉｄｅｎｅ−Ｚ−Ｉｎｄｏｌｉｎｅ　Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｄｅｓｅａｓｅｓ”と題するＴａｎｇ　ｅｔ　ａｌ．の０８／４８５，３２３（１９９５年６月７日出願；Ｌｙｏｎ＆Ｌｙｏｎ　Ｄｏｃｋｅｔ　Ｎｏ．２２３／２９８），およびＷＯ９６／２２９７６（１９９６年８月１日公開，Ｂａｌｌｉｎａｒｉ　ｅｔ　ａｌ．）は，インドリノンの合成方法，細胞におけるインドリノン化合物の生物学的活性を試験する方法およびインドリノン誘導体の阻害パターンを教示する。
【０２４０】
キナーゼ活性を調節することができる物質の他の例には，限定されないが，チロホスチン，キナゾリン，キノキソリン，およびキノリンが含まれる。上述のキナゾリン，チロホスチン，キノリン，およびキノキソリンには，よく知られる化合物，例えば文献に記載される化合物が含まれる。例えば，キナゾリン類を記載する代表的刊行物には，Ｂａｒｋｅｒ　ｅｔ　ａｌ．，欧州特許公開０５２０７２２Ａ１；Ｊｏｎｅｓ　ｅｔ　ａｌ．，米国特許．４，４４７，６０８；Ｋａｂｂｅ　ｅｔ　ａｌ．，米国特許．４，７５７，０７２；Ｋａｕｌ　ａｎｄ　Ｖｏｕｇｉｏｕｋａｓ，米国特許５，３１６，５５３；Ｋｒｅｉｇｈｂａｕｍ　ａｎｄ　Ｃｏｍｅｒ，米国特許４，３４３，９４０；Ｐｅｇｇ　ａｎｄ　Ｗａｒｄｌｅｗｏｒｔｈ，欧州特許公開０５６２７３４Ａ１；Ｂａｒｋｅｒ　ｅｔ　ａｌ．，（１９９１）Ｐｒｏｃ．ｏｆ　Ａｍ．Ａｓｓｏｃ．ｆｏｒ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　３２，３２７；Ｂｅｒｔｉｎｏ，Ｊ．Ｒ．，（１９７９）Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　３，２９３−３０４；Ｂｅｒｔｉｎｏ，Ｊ．Ｒ．，（１９７９）Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　９（２　ｐａｒｔ１），２９３−３０４；Ｃｕｒｔｉｎ　ｅｔ　ａｌ．，（１９８６）Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ　５３，３６１−３６８；Ｆｅｒｎａｎｄｅｓ　ｅｔ　ａｌ．，（１９８３）Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　４３，１１１７−１１２３；Ｆｅｒｒｉｓ　ｅｔ　ａｌ．Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．４４（２），１７３−１７８；Ｆｒｙｅｔ　ａｌ．，（１９９４）Ｓｃｉｅｎｃｅ２６５，１０９３−１０９５；Ｊａｃｋｍａｎｅｔ　ａｌ．，（１９８１）Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　５１，５５７９−５５８６；Ｊｏｎｅｓ　ｅｔ　ａｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２９（６），１１１４−１１１８；Ｌｅｅ　ａｎｄ　Ｓｋｉｂｏ，（１９８７）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　２６（２３），７３５５−７３６２；Ｌｅｍｕｓ　ｅｔ　ａｌ．，（１９８９）Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．５４，３５１１−３５１８；Ｌｅｙ　ａｎｄ　Ｓｅｎｇ，（１９７５）Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　１９７５，４１５−５２２；Ｍａｘｗｅｌｌ　ｅｔ　ａｌ．，（１９９１）Ｍａｇｎｅｔｉｃ　Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ　ｉｎ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ　１７，１８９−１９６；Ｍｉｎｉ　ｅｔ　ａｌ．，（１９８５）Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　４５，３２５−３３０；Ｐｈｉｌｌｉｐｓ　ａｎｄ　Ｃａｓｔｌｅ，Ｊ．（１９８０）Ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｉｃ　Ｃｈｅｍ．１７（１９），１４８９−１５９６；Ｒｅｅｃｅ　ｅｔ　ａｌ．，（１９７７）Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ４７（１１），２９９６−２９９９；Ｓｃｕｌｌｅｒ　ｅｔ　ａｌ．，（１９８６）Ｃａｎｃｅｒ　Ｉｍｍｕｎｏｌ．ａｎｄ　Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．２３，Ａ６５；Ｓｉｋｏｒａ　ｅｔ　ａｌ．，（１９８４）Ｃａｎｃｅｒ　Ｌｅｔｔｅｒｓ　２３，２８９−２９５；Ｓｉｋｏｒａ　ｅｔ　ａｌ．，（１９８８）Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍ．１７２，３４４−３５５（これらすべては，図面を含めその全体を本明細書の一部としてここに引用する）が含まれる。
【０２４１】
キノキサリン類は，Ｋａｕｌ　ａｎｄ　Ｖｏｕｇｉｏｕｋａｓ，米国特許５，３１６，５５３（図面を含めその全体を本明細書の一部としてここに引用する）に記載される。
【０２４２】
キノリン類は，Ｄｏｌｌｅ　ｅｔ　ａｌ．，（１９９４）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３７，２６２７−２６２９；ＭａＧｕｉｒｅ，Ｊ．（１９９４）Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３７，２１２９−２１３１；Ｂｕｒｋｅ　ｅｔ　ａｌ．，（１９９３）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３６，４２５−４３２，およびＢｕｒｋｅ　ｅｔ　ａｌ．（１９９２）Ｂｉｏ　Ｏｒｇａｎｉｃ　Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔｅｒｓ　２，１７７１−１７７４（これらすべては，図面を含めその全体を本明細書の一部としてここに引用する）に記載される。
【０２４３】
チロホスチン類は，Ａｌｉｅｎ　ｅｔ　ａｌ．，（１９９３）Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９１，１４１−１５６；Ａｎａｆｉ　ｅｔ　ａｌ．．（１９９３）Ｂｌｏｏｄ　８２：１２，３５２４−３５２９；Ｂａｋｅｒ　ｅｔ　ａｌ．，（１９９２）Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｓｃｉ．１０２，５４３−５５５；Ｂｉｌｄｅｒ　ｅｔ　ａｌ．，（１９９１）Ａｍｅｒ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｓｏｃ．ｐｐ．６３６３−６１４３：Ｃ７２１−Ｃ７３０；Ｂｒｕｎｔｏｎｅｔ　ａｌ．，（１９９２）Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ　ｏｆ　Ａｍｅｒ．Ａｓｓｏｃ．Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｓｃｈ．３３，５５８；Ｂｒｙｃｋａｅｒｔ　ｅｔ　ａｌ．，（１９９２）Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　１９９，２５５−２６１；Ｄｏｎｇ　ｅｔ　ａｌ．，（１９９３）Ｊ．Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　５３，５３−６０；Ｄｏｎｇ　ｅｔ　ａｌ．，（１９９３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１（５），２７１７−２７２４；Ｇａｚｉｔ　ｅｔ　ａｌ．．（１９８９）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３２，２３４４−２３５２；Ｇａｚｉｔ　ｅｔ　ａｌ．，（１９９３）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３６，３５５６−３５６４；Ｋａｕｒ　ｅｔ　ａｌ．，（１９９４）Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ　Ｄｒｕｇｓ　５，２１３−２２２；Ｋｉｎｇ　ｅｔ　ａｌ．，（１９９１）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２７５，４１３−４１８；Ｋｕｏ　ｅｔ　ａｌ．，（１９９３）Ｃａｎｃｅｒ　Ｌｅｔｔｅｒｓ　７４，１９７−２０２；Ｌｅｖｉｔｚｋｉ，Ａ．，（１９９２）Ｔｈｅ　ＦＡＳＥＢ　Ｊ．６，３２７５−３２８２；Ｌｙａｌｌ　ｅｔ　ａｌ．．（１９８９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４，１４５０３−１４５０９；Ｐｅｔｅｒｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ．，（１９９３）Ｔｈｅ　Ｐｒｏｓｔａｔｅ　２２，３３５−３４５；Ｐｉｌｌｅｍｅｒｅｔ　ａｌ．，（１９９２）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ　５０，８０−８５；Ｐｏｓｎｅｒ　ｅｔ　ａｌ．，（１９９３）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ　４５，６７３−６８３；Ｒｅｎｄｕ　ｅｔ　ａｌ．，（１９９２）Ｂｉｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ　４４（５），８８１−８８８；Ｓａｕｒｏ　ａｎｄ　Ｔｈｏｍａｓ，（１９９３）Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ　５３，３７１−３７６；Ｓａｕｒｏ　ａｎｄ　Ｔｈｏｍａｓ，（１９９３）Ｊ．Ｐｈａｒｍ．ａｎｄ　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ　２６７（３），１１９−１１２５；Ｗｏｌｂｒｉｎｇ　ｅｔ　ａｌ．，（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９（３６），２２４７０−２２４７２；およびＹｏｎｅｄａ　ｅｔ　ａｌ．，（１９９１）Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ５１，４４３０−４４３５；（これらはすべて，図面を含めその全体を本明細書の一部としてここに引用する）に記載される。
【０２４４】
調節剤として用いることができる他の化合物には，オキシインドリノン，例えば，米国特許出願０８／７０２，２３２（１９９６年８月２３日出願，図面を含め本明細書の一部としてここに引用する）に記載されるものが含まれる。
【０２４５】
組換えＤＮＡ技術
キナーゼ核酸分子を含むＤＮＡ構築物およびこれらの構築物を含む細胞：
本発明はまた，宿主細胞において転写を開始するのに有効なプロモーターおよび上述の核酸分子を５’から３’方向に含む組換えＤＮＡ分子に関する。さらに，本発明は，ベクターおよび上述の核酸分子を含む組換えＤＮＡ分子に関する。本発明はまた，細胞において機能的な転写領域，上述のポリペプチドに対応するアミノ酸配列をコードするＲＮＡ配列に相補的な配列，および前記細胞において機能的な転写終止領域を含む核酸分子に関する。上述の分子は，単離されたおよび／または精製されたＤＮＡ分子でありうる。
【０２４６】
本発明はまた，上述の核酸分子を含み，したがってポリペプチドを発現しうる細胞または生物に関する。ポリペプチドは，そのポリペプチドを発現するよう変更されている細胞から精製することができる。細胞が，細胞が通常は産生しないかまたは細胞が通常はより低いレベルで産生する蛋白質を産生するように遺伝子操作により作成されている場合，細胞は”所望のポリペプチドを発現するよう変更されている”と言われる。当業者は，ゲノム，ｃＤＮＡ，または合成配列のいずれかを真核生物または原核生物細胞のいずれかに導入して発現させるための方法を容易に適用することができる。
【０２４７】
核酸分子，例えばＤＮＡは，これが転写および翻訳制御情報を含むヌクレオチド配列を含み，かつそのような配列がポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に”動作可能なように連結されている”場合，ポリペプチドを”発現しうる”と言われる。動作可能な連結とは，制御ＤＮＡ配列および発現が求められているＤＮＡ配列が，遺伝子配列の発現を可能とするような様式で接続されているような連結である。遺伝子配列の発現に必要な制御領域の詳細な性質は生物によって異なるであろうが，これは一般にプロモーター領域を含む。原核生物においては，プロモーター領域は，プロモーター（ＲＮＡ転写の開始を指示する）ならびにＲＮＡに転写されたときに合成の開始を合図するであろうＤＮＡ配列の両方を含む。そのような領域は，通常は転写および翻訳の開始に関与する５’−非コーディング配列，例えばＴＡＴＡボックス，キャッピング配列，ＣＡＡＴ配列等を含むであろう。
【０２４８】
所望の場合には，本発明のキナーゼをコードする配列の３’側の非コーディング領域を上述の方法により得ることができる。この領域は，その転写終止制御配列，例えば終止およびポリアデニル化のために保持することができる。すなわち，本発明のキナーゼをコードするＤＮＡ配列に天然に隣接している３’領域を保持することにより，転写終止シグナルを提供することができる。発現宿主細胞において転写終止シグナルが十分に機能性でない場合には，宿主細胞において機能的な３’領域で置き換えることができる。
【０２４９】
２つのＤＮＡ配列（例えば，プロモーター領域配列および本発明のキナーゼをコードする配列）は，２つのＤＮＡ配列の連結の性質が，（１）フレームシフト変異を導入しない，（２）プロモーター領域配列が本発明のキナーゼをコードする遺伝子配列の転写を指示する能力を妨害しない，または（３）本発明のキナーゼの遺伝子配列がプロモーター領域配列により転写されることを妨害しない場合，動作可能なように連結されていると言われる。すなわち，プロモーター領域は，プロモーターがそのＤＮＡ配列の転写を行うことができる場合，ＤＮＡ配列に動作可能なように連結されているであろう。すなわち，本発明のキナーゼをコードする遺伝子を発現させるためには，適当な宿主により認識される転写および翻訳シグナルが必要である。
【０２５０】
本発明は，本発明のキナーゼ（またはその機能的誘導体）をコードする遺伝子を原核生物または真核生物細胞のいずれかにおいて発現させることを包含する。原核生物宿主は，一般に，組換え蛋白質の製造において非常に有効でありかつ便利であり，したがって，本発明のキナーゼのための１つの好ましい発現システムである。原核生物は，しばしばＥ．ｃｏｌｉの種々の株により代表される。しかし，他の細菌株等の他の微生物株もまた用いることができる。
【０２５１】
原核生物系においては，宿主と適合性のある種に由来する複製部位および制御配列を含むプラスミドベクターを用いることができる。適当なプラスミドベクターの例には，ｐＢＲ３２２，ｐＵＣ１１８，ｐＵＣ１１９等が含まれ，適当なファージまたはバクテリオファージベクターの例には，λｇｔｌ０，λｇｔ１１等が含まれ，適当なウイルスベクターの例には，ｐＭＡＭ−ｎｅｏ，ｐＫＲＣ等が含まれる。好ましくは，本発明の選択されたベクターは，選択された宿主細胞において複製する能力を有する。
【０２５２】
認められている原核生物宿主には，細菌，例えばＥ．ｃｏｌｉ，Ｂａｃｉｌｌｕｓ，Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ，Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ，Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ，Ｓｅｒｒａｔｉａ等が含まれる。しかし，そのような条件下においては，ポリペプチドはグリコシル化されない。原核生物宿主は発現プラスミド中のレプリコンおよび制御配列と適合性でなければならない。
【０２５３】
本発明のキナーゼ（またはその機能的誘導体）を原核生物細胞において発現させるためには，本発明のキナーゼをコードする配列が，機能的原核生物プロモーターと動作可能なように連結されていることが必要である。そのようなプロモーターは，構成的であってもよく，より好ましくは制御可能（すなわち，誘導可能または抑制解除可能）である。構成的プロモーターの例には，バクテリオファージλのｉｎｔプロモーター，ｐＢＲ３２２のβ−ラクタマーゼ遺伝子配列のｂｌａプロモーター，およびｐＰＲ３２５のクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子配列のｃａｔプロモーター等が含まれる。誘導可能な原核生物プロモーターの例には，バクテリオファージλの主要右および左プロモーター（ＰＬおよびＰＲ），Ｅ．ｃｏｌｉのｔｒｐ，ｒｅｃＡ，ｌａｃＺ，ｌａｃＩ，およびｇａｌプロモーター，α−アミラーゼ（Ｕｌｍａｎｅｎ　ｅｔ　ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６２：１７６−１８２，１９８５）およびＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓのσ−２８−特異的プロモーター（Ｇｉｌｍａｎ　ｅｔ　ａｌ．．Ｇｅｎｅ　Ｓｅｑｅｕｃｎｅ　３２：１１−２０，１９８４），Ｂａｃｉｌｌｕｓのバクテリオファージのプロモーター（Ｇｒｙｃｚａｎ，Ｔｈｅ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｂａｃｉｌｌｉ，Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，ＮＹ，１９８２），およびＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓプロモーター（Ｗａｒｄ　ｅｔ　ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２０３：４６８−４７８，１９８６）が含まれる。原核生物プロモーターは，Ｇｌｉｃｋ（Ｉｎｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｔ．１：２７７−２８２，１９８７），Ｃｅｎａｔｉｅｍｐｏ（Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ　６８：５０５−５１６，１９８６），およびＧｏｔｔｅｓｍａｎ（Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．１８：４１５−４４２，１９８４）により概説されている。
【０２５４】
原核生物細胞における適切な発現には，遺伝子コーディング配列の上流にリボソーム結合部位の存在が必要である。そのようなリボソーム結合部位は，例えば，Ｇｏｌｄ　ｅｔ　ａｌ．（Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３５：３６５−４０４，１９８１）に記載されている。制御配列，発現ベクター，トランスフォーメーション方法等の選択は，遺伝子を発現させるために用いられる宿主細胞のタイプに依存する。本明細書において用いる場合，”細胞”，”細胞株”および”細胞培養”は互換的に用いることができ，そのような名称はすべて子孫を含む。すなわち，”トランスフォーマント”または”トランスフォームした細胞”との語句は，継代の数にかかわらず，初代対象細胞およびここから誘導された培養物を含む。また，意図的なまたは偶然の変異のために，すべての子孫がＤＮＡ含有物において精密に同一ではないかもしれないことが理解される。しかし，定義されるように，変異体子孫は元々のトランスフォームした細胞と同じ機能性を有する。
【０２５５】
本発明の発現システムにおいて用いることができる宿主細胞は，目的とするキナーゼの発現において用いるのに適当である限り，特に限定されない。適当な宿主はしばしば真核生物細胞を含むことができる。好ましい真核生物宿主には，例えば，酵母，真菌，昆虫細胞，哺乳動物細胞（インビボまたは組織培養のいずれか）が含まれる。宿主として有用でありうる哺乳動物細胞には，ＨｅＬａ細胞，線維芽細胞由来の細胞，例えばＶＥＲＯまたはＣＨＯ−Ｋ１，またはリンパ球由来の細胞，およびこれらの誘導体が含まれる。好ましい哺乳動物宿主細胞には，ＳＰ２／０およびＪ５５８Ｌ，ならびに神経芽細胞腫細胞株，例えばＩＭＲ３３２が含まれ，これらは正しい翻訳後プロセシングのよりすぐれた能力を提供することができる。
【０２５６】
さらに，植物細胞もまた宿主として利用可能であり，植物細胞と適合しうる制御配列，例えばカリフラワーモザイクウイルス３５Ｓおよび１９Ｓ，およびノパリンシンターゼプロモーターおよびポリアデニル化シグナル配列が利用可能である。他の好ましい宿主は昆虫細胞，例えば，Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ　ｌａｒｖａｅである。昆虫細胞を宿主として用いる場合，Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａアルコールデヒドロゲナーゼプロモーターを用いることができる（Ｒｕｂｉｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ　２４０：１４５３−１４５９，１９８８）。あるいは，バキュロウイルスベクターを，昆虫細胞において本発明のキナーゼを大量に発現するよう遺伝子工学処理することができる（Ｊａｓｎｙ，Ｓｃｉｅｎｃｅ　２３８：１６５３，１９８７；Ｍｉｌｌｅｒ　ｅｔ　ａｌ．，Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｖｏｌ．８，Ｐｌｅｎｕｍ，Ｓｅｔｌｏｗ　ｅｔ　ａｌ．，ｅｄｓ．，ｐｐ．２７７−２９７，１９８６）。
【０２５７】
酵母がグルコースの豊富な培地中で成長するときに大量に産生される解糖系酵素をコードする活発に発現されている配列からのプロモーターおよび終止要素を組み込んだ一連の酵母発現システムの任意のものを用いることができる。既知の解糖系遺伝子配列はまた，非常に効率的な転写制御シグナルを提供することができる。酵母は，翻訳後修飾を行うこともできる点において，実質的な利点を与える。強いプロモーター配列および高コピー数プラスミドを用いる多くの組換えＤＮＡ戦略が存在し，これを酵母において所望の蛋白質を製造するために用いることができる。酵母はクローン化された哺乳動物遺伝子のリーダー配列を認識して，リーダー配列を有するペプチド（すなわちプレペプチド）を分泌する。哺乳動物宿主における本発明のキナーゼの発現にはいくつかの可能なベクター系が利用可能である。
【０２５８】
宿主の性質に応じて，広範な種類の転写および翻訳制御配列を用いることができる。転写および翻訳制御シグナルは，制御シグナルが高レベルの発現を有する特定の遺伝子配列に関連しているウイルス起源，例えばアデノウイルス，ウシパピローマウイルス，サイトメガロウイルス，サルウイルス等から誘導することができる。あるいは，哺乳動物発現産物，例えばアクチン，コラーゲン，ミオシンなどからのプロモーターを用いることができる。転写開始制御シグナルは，遺伝子配列の発現を調節することができるように，抑制または活性化を可能とするものを選択することができる。興味深いものは，温度を変化させることにより発現を抑制または開始することができるように温度感受性であるか，化学物質（例えば代謝産物）制御を行うことができる制御シグナルである。
【０２５９】
本発明のキナーゼの真核生物宿主における発現には，真核生物制御領域を使用することが必要である。そのような領域は，一般に，ＲＮＡ合成の開始を指示するのに十分なプロモーター領域を含む。好ましい真核生物プロモーターには，例えば，マウスメタロチオネインＩ遺伝子配列のプロモーター（Ｈａｍｅｒ　ｅｔ　ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎ．１：２７３−２８８，１９８２）；ヘルペスウイルスのＴＫプロモーター（ＭｃＫｎｉｇｈｔ，Ｃｅｌｌ　３１：３５５−３６５，１９８２）；ＳＶ４０初期プロモーター（Ｂｅｎｏｉｓｔ　ｅｔ　ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ）２９０：３０４−３１，１９８１）；および酵母ｇａｌ４遺伝子配列プロモーター（Ｊｏｈｎｓｔｏｎ　ｅｔ　ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）７９：６９７１−６９７５，１９８２；Ｓｉｌｖｅｒ　ｅｔ　ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）８１：５９５１−５９５５，１９８４）が含まれる。
【０２６０】
真核生物ｍＲＮＡの翻訳は，最初のメチオニンをコードするコドンから開始される。この理由のため，真核生物プロモーターと，本発明のキナーゼ（またはその機能的誘導体）をコードするＤＮＡ配列との間の連結には，メチオニンをコードしうる介在コドン（すなわちＡＵＧ）が含まれないことを確実にすることが好ましい。そのようなコドンの存在は，融合蛋白質（ＡＵＧコドンが本発明のキナーゼのコーディング配列と同じリーディングフレームにある場合）またはフレームシフト変異（ＡＵＧコドンが本発明のキナーゼのコーディング配列と同じリーディングフレームにない場合）の形成のいずれかをもたらす。
【０２６１】
本発明のキナーゼをコードする核酸分子および動作可能なように連結されたプロモーターは，レシピエントである原核生物または真核生物細胞中に，非複製ＤＮＡまたはＲＮＡ分子のいずれかとして導入することができ，これは，直線状分子またはより好ましくは閉環状分子のいずれでもよい。そのような分子は自己複製することができないため，遺伝子の発現は導入された配列の過渡的発現により生ずる。あるいは，導入されたＤＮＡ配列が宿主染色体中にインテグレートされることにより永久発現が得られる。
【０２６２】
所望の遺伝子配列を宿主細胞染色体中にインテグレートしうるベクターを用いることができる。導入されたＤＮＡをその染色体中に安定にインテグレートしている細胞は，発現ベクターを含有する宿主細胞の選択を可能とする１またはそれ以上のマーカーを導入することにより選択することができる。マーカーは，栄養要求性宿主に対する栄養，殺生物剤耐性（例えば抗生物質，または重金属，例えば銅）等を提供することができる。選択マーカー遺伝子配列は，発現させるべきＤＮＡ遺伝子配列に直接連結してもよく，または同じ細胞にコトランスフェクションにより導入してもよい。ｍＲＮＡの最適な合成には追加の要素も必要であろう。これらの要素には，スプライシングシグナル，ならびに転写プロモーター，エンハンサー，および終止シグナルが含まれる。そのような要素を組み込んだｃＤＮＡ発現ベクターには，Ｏｋａｙａｍａ（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３：２８０−２８９，１９８３）により記載されるものが含まれる。
【０２６３】
導入された核酸分子は，レシピエント宿主中で自己複製可能なプラスミドまたはウイルスベクター中に取り込ませることができる。この目的のために広範な種類のベクターの任意のものを用いることができる。特定のプラスミドまたはウイルスベクターの選択において重要な因子には，ベクターを含むレシピエント細胞を認識しベクターを含まないレシピエント細胞から選択することの容易性；特定の宿主において所望されるベクターのコピー数；およびベクターを異なる種の宿主細胞間で”シャトル”しうることが望ましいか否かが含まれる。
【０２６４】
好ましい原核生物ベクターには，Ｅ．ｃｏｌｉ中で複製しうるプラスミド（例えば，ｐＢＲ３２２，ＣｏｌＥｌ，ｐＳＣ１０１，ｐＡＣＹＣ１８４，ΣＶＸ；”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ”，１９８９，上掲）などのプラスミドが含まれる。Ｂａｃｉｌｌｕｓプラスミドには，ｐＣ１９４，ｐＣ２２１，ｐＴ１２７等が含まれる（Ｇｒｙｃｚａｎ，Ｔｈｅ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｂａｃｉｌｌｉ，Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ，ｐｐ．３０７−３２９，１９８２）。適当なＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓプラスミドには，ｐ１Ｊ１０１（Ｋｅｎｄａｌｌ　ｅｔ　ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６９：４１７７−４１８３，１９８７），およびＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓバクテリオファージ，例えばΦＣ３１（Ｃｈａｔｅｒ　ｅｔ　ａｌ．，Ｓｉｘｔｈ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍｏｎ　Ａｃｔｉｎｏｍｙｃ　ｅｔ　ａｌｅｓ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｋａｄｅｍｉａｉ　Ｋａｉｄｏ，Ｂｕｄａｐｅｓｔ，Ｈｕｎｇａｒｙ，ｐｐ．４５−５４，１９８６）が含まれる。ＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓプラスミドはＪｏｈｎ　ｅｔ　ａｌ．（Ｒｅｖ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．８：６９３−７０４，１９８６），およびＩｚａｋｉ（Ｊｐｎ．Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．３３：７２９−７４２，１９７８）により概説されている。
【０２６５】
好ましい真核生物プラスミドには，例えば，ＢＰＶ，ワクチニア，ＳＶ４０，２−ミクロンサークル等，またはそれらの誘導体が含まれる。そのようなプラスミドは当該技術分野においてよく知られている（Ｂｏｔｓｔｅｉｎ　ｅｔ　ａｌ．，Ｍｉａｍｉ　Ｗｎｔｒ．Ｓｙｍｐ．１９：２６５−２７４，１９８２；Ｂｒｏａｃｈ，”Ｔｈｅ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｙｅａｓｔ　Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ：Ｌｉｆｅ　Ｃｙｃｌｅ　ａｎｄ　Ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ”，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，ｐ．４４５−４７０，１９８１；Ｂｒｏａｃｈ，Ｃｅｌｌ　２８：２０３−２０４，１９８２；Ｂｏｌｌｏｎ　ｅｔ　ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｈｅｍａｔｏｌ．Ｏｎｃｏｌ．１０：３９−４８，１９８０；Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ　Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ　Ｔｒｅａｔｉｓｅ，Ｖｏｌ．３，Ｇｅｎｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ，ｐｐ．５６３−６０８，１９８０）。
【０２６６】
構築物を含有するベクターまたは核酸分子を発現用に用意した後，ＤＮＡ構築物は，種々の適当な手段，すなわち，トランスフォーメーション，トランスフェクション，コンジュゲーション，プロトプラスト融合，エレクトロポレーション，粒子銃技術，リン酸カルシウム沈澱，直接マイクロインジェクション等により，適当な宿主細胞中に導入することができる。ベクターを導入した後，レシピエント細胞を，ベクター含有細胞の成長を選択する選択培地中で成長させる。クローニングされた遺伝子の発現により，本発明のキナーゼまたはそのフラグメントが産生される。これは，トランスフォームした細胞中でそのまま起こるか，またはこれらの細胞を分化させるよう誘導した後に起こる（例えば，ブロモデオキシウラシルを神経芽細胞腫等に投与することにより）。本発明のペプチドを形成するために，種々のインキュベーション条件を用いることができる。最も好ましい条件は，生理学的条件を模倣した条件である。
【０２６７】
トランスジェニック動物：
本発明に関連するトランスジェニック動物の製造には，種々の方法が利用可能である。ＤＮＡを受精可能卵の前核に注入した後，雄前核と雌前核を融合させるか，またはＤＮＡを胚性細胞（例えば，２細胞胚の核）の核に注入した後，細胞分裂を開始させることができる（Ｂｒｉｎｓｔｅｒ　ｅｔ　ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８２：４４３８−４４４２，１９８５）。本発明の無機イオンレセプターヌクレオチド配列を有するよう改変したウイルス，特にレトロウイルスを胚に感染させることができる。
【０２６８】
胚の内部細胞塊から誘導され培養中で安定化させた多能性幹細胞を，培養中で操作して本発明のヌクレオチド配列を取り込ませることができる。トランスジェニック動物は，そのような細胞を胚盤胞中に移植し，これを仮母に移植し，分娩させることにより製造することができる。トランスジェニック実験に適当な動物は，標準的な商業的供給源，例えばＣｈａｒｌｅｓ　Ｒｉｖｅｒ（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ），Ｔａｃｏｎｉｃ（Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ，ＮＹ），Ｈａｒｌａｎ　Ｓｐｒａｇｕｅ　Ｄａｗｌｅｙ（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）等から入手することができる。
【０２６９】
齧歯類胚を操作する方法およびＤＮＡを接合子の前核に注入する方法は，当業者によく知られている（Ｈｏｇａｎ　ｅｔ　ａｌ．，上掲）。魚，両生類卵および鳥類のためのマイクロインジェクション法は，Ｈｏｕｄｅｂｉｎｅ　ａｎｄ　Ｃｈｏｕｒｒｏｕｔ（Ｅｘｐｅｒｉｅｎｔｉａ　４７：８９７−９０５，１９９１）に詳述されている。ＤＮＡを動物の組織中に導入する他の方法は，米国特許，４，９４５，０５０（Ｓａｎｄｆｏｒｄ　ｅｔ　ａｌ．，１９９０年７月３０日）に記載されている。
【０２７０】
一例にすぎないが，トランスジェニックマウスを製造するためには，雌マウスを過剰排卵誘発する。雌を雄といっしょに置き，交配した雌をＣＯ２窒息または頚部脱臼により殺し，切除した卵管から胚を回収する。まわりの丘細胞を除去する。次に，前核胚を洗浄し，注入時まで保存する。ランダムな周期の成人雌を精管切除雄と対にする。レシピエント雌はドナー雌と同じ時に交配させる。次に胚を外科的に移す。トランスジェニックラットを製造する方法はマウスの場合と類似する方法である（Ｈａｍｍｅｒ　ｅｔ　ａｌ．，Ｃｅｌｌ　６３：１０９９−１１１２，１９９０）。
【０２７１】
胚性幹（ＥＳ）細胞を培養し，次にエレクトロポレーション，リン酸カルシウム／ＤＮＡ沈澱および直接注入等の方法を用いてＤＮＡをＥＳ細胞中に導入することによりトランスジェニック動物を製造する方法もまた当業者によく知られている（Ｔｅｒａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａｓ　ａｎｄ　Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ　Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌ，Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｅ．Ｊ．Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ，ｅｄ．，ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ，１９８７）。
【０２７２】
ランダム遺伝子インテグレーションを含む場合には，本発明の配列を含むクローンを耐性をコードする遺伝子とともにコトランスフェクトすることができる。あるいは，ネオマイシン耐性をコードする遺伝子を，本発明の配列に物理的に連結させることができる。所望のクローンのトランスフェクションおよび単離は，当業者によく知られるいくつかの方法のいずれかを用いて実施することができる（Ｅ．Ｊ．Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ，上掲）。
【０２７３】
ＥＳ細胞中に導入されたＤＮＡ分子はまた，相同組換えのプロセスにより染色体中にインテグレートされることができる（Ｃａｐｅｃｃｈｉ，Ｓｃｉｅｎｃｅ　２４４：１２８８−１２９２，１９８９）。組換え事象のポジティブ選択（すなわち，ｎｅｏ耐性）および二重ポジティブ−ネガティブ選択（すなわち，ｎｅｏ耐性およびガンシクロビル耐性）の方法，および続くＰＣＲによる所望のクローンの同定は，Ｃａｐｅｃｃｈｉ，上掲およびＪｏｙｎｅｒ　ｅｔ　ａｌ．（Ｎａｔｕｒｅ　３３８：１５３−１５６，１９８９）に記載されており，これらの教示は，図面を含めその全体を本明細書の一部としてここに引用する。この方法の最後の段階は，標的とするＥＳ細胞を胚盤胞中に注入し，胚盤胞を擬妊娠雌に移すことである。得られるキメラ動物を繁殖させ，子孫をサザンブロッティングにより分析して，トランスジンを有する個体を同定する。非齧歯類哺乳動物および他の動物の製造方法は別の者により議論されている（Ｈｏｕｄｅｂｉｎｅ　ａｎｄ　Ｃｈｏｕｒｒｏｕｔ，上掲；Ｐｕｒｓｅｌ　ｅｔ　ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ　２４４：１２８１−１２８８，１９８９；ａｎｄ　Ｓｉｍｍｓ　ｅｔ　ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　６：１７９−１８３，１９８８）。
【０２７４】
すなわち，本発明は，本発明のキナーゼをコードするトランスジンまたはキナーゼの発現に影響する遺伝子を含有するトランスジェニックの非ヒト哺乳動物を提供する。そのようなトランスジェニックの非ヒト哺乳動物は，キナーゼの導入の効果を研究するため，またはキナーゼの発現を制御（すなわち，追加の遺伝子，アンチセンス核酸，またはリボザイムの導入により）するためのインビボ試験系として特に有用である。
【０２７５】
”トランスジェニック動物”とは，細胞中に人工的に挿入されたＤＮＡを含む細胞を有する動物である。該ＤＮＡは，その細胞から発生した動物のゲノムの一部となる。好ましいトランスジェニック動物は，霊長類，マウス，ラット，ウシ，ブタ，ウマ，ヤギ，ヒツジ，イヌおよびネコである。トランスジェニックＤＮＡは，ヒトキナーゼをコードすることができる。動物における自然の発現は，レセプターの発現を減少させるのに有効な量のアンチセンスＲＮＡまたはＤＮＡを与えることにより減少させることができる。
【０２７６】
遺伝子治療：
本発明のキナーゼまたはその遺伝子配列は，遺伝子治療においても有用である（総説としてＭｉｌｌｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ　３５７：４５５−４６０，１９９２）。Ｍｉｌｌｅｒは，進歩により，ポジティブな初期の結果を示したヒト遺伝子治療に対する実用的なアプローチが得られたと述べている。遺伝子治療の基本的な科学はＭｕｌｌｉｇａｎ（Ｓｃｉｅｎｃｅ　２６０：９２６−９３１，１９９３）に記載されている。
【０２７７】
１つの好ましい態様においては，蛋白質キナーゼのコーディング配列を含む発現ベクターを細胞に挿入し，細胞をインビトロで成長させ，次にこれを大量に患者に注入する。別の好ましい態様においては，選択されたプロモーター（例えば，強いプロモーター）を含むＤＮＡセグメントを，本発明のキナーゼをコードする内因性遺伝子を含む細胞中に，プロモーターセグメントが内因性キナーゼ遺伝子の発現を増強する様式で移送する（例えば，プロモーターセグメントをこれが内因性キナーゼ遺伝子に直接連結するように細胞内に移送する）。
【０２７８】
遺伝子治療は，腫瘍を標的とするキナーゼｃＤＮＡを含むアデノウイルスの使用を含むことができる。全身キナーゼは，遺伝子工学処理した細胞の移植，そのようなキナーゼをコードするウイルスの注入，または裸のキナーゼＤＮＡの適当な組織への注入により増加する。
【０２７９】
そのような複合体の活性を調節するために，標的細胞集団を，蛋白質複合体の１またはそれ以上の変更された形の成分を導入することにより改変することができる。例えば，標的細胞中における複合体成分の活性を減少させるか阻害することにより，そのような状態につながる異常なシグナル伝達事象を減少させ，阻害し，または逆転させることができる。蛋白質複合体の他の成分と相互作用する能力を保持しているが，シグナル伝達において機能することができない成分の欠失またはミスセンス変異体を用いて，異常な，有害なシグナル伝達事象を阻害することができる。
【０２８０】
ウイルス，例えばレトロウイルス，ワクチニアウイルス，アデノウイルス，アデノ随伴ウイルス，ヘルペスウイルス，いくつかのＲＮＡウイルス，またはウシパピローマウイルスに由来する発現ベクターを用いて，本発明の組換えキナーゼをコードするヌクレオチド配列（例えばｃＤＮＡ）を標的細胞集団（例えば腫瘍細胞）に輸送することができる。当業者によく知られる方法を用いて，コーディング配列を含む組換えウイルスベクターを構築することができる（Ｍａｎｉａｔｉｓ　ｅｔ　ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎ．Ｙ．，１９８９；Ａｕｓｕｂｅｌ　ｅｔ　ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ　ａｎｄ　Ｗｉｌｅｙ　Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎ．Ｙ．，１９８９）。あるいは，蛋白質配列をコードする組換え核酸分子を裸のＤＮＡとしてまたは再構築系，例えば標的細胞への輸送のためのリポソームまたは他の脂質系において用いることができる（例えば，Ｆｅｌｇｎｅｒ　ｅｔ　ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ　３３７：３８７−８，１９８９）。ヒト遺伝子治療において用いるための，プラスミドＤＮＡを細胞内に直接輸送するいくつかの他の方法が存在し，これはプラスミドＤＮＡを蛋白質に複合体化させることによりＤＮＡを細胞上のレセプターにターゲティングすることを含む（Ｍｉｌｌｅｒ，上掲）。
【０２８１】
最も簡単な形においては，遺伝子輸送は，単にマイクロインジェクション工程により細胞の核内に最小量のＤＮＡを注入することにより行うことができる（Ｃａｐｅｃｃｈｉ，Ｃｅｌｌ　２２：４７９−８８，１９８０）。組換え遺伝子は，いったん細胞内に導入されると，転写および翻訳に関する細胞の正常なメカニズムにより認識されることができ，遺伝子産物が発現される。より多数の細胞にＤＮＡを導入するための他の方法も試みられている。これらの方法には，ＤＮＡをリン酸カルシウムで沈澱させピノサイトーシスにより細胞中に取り込ませるトランスフェクション（Ｃｈｅｎ　ｅｔ　ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ．７：２７４５−５２，１９８７）；細胞を高圧パルスに暴露して膜に穴をあけるエレクトロポレーション（Ｃｈｕ　ｅｔ　ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．１５：１３１１−２６，１９８７）；ＤＮＡを親油性ベヒクル中に封入し，これを標的細胞と融合させるリポフェクチン／リポソーム融合（Ｆｅｌｇｎｅｒ　ｅｔ　ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．８４：７４１３−７４１７，１９８７）；および小さい発射体に結合させたＤＮＡを用いる粒子衝撃（Ｙａｎｇ　ｅｔ　ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８７：９５６８−９５７２，１９９０）が含まれる。ＤＮＡを細胞内に導入する他の方法は，ＤＮＡを化学的に修飾した蛋白質にカップリングさせることである。
【０２８２】
また，アデノウイルス蛋白質がエンドソームを不安定化させ，ＤＮＡの細胞への取り込みを促進しうることが示されている。アデノウイルスをＤＮＡ複合体を含む溶液と混合するか，または蛋白質架橋試薬を用いてアデノウイルスに共有結合したポリリジンにＤＮＡを結合させることにより，組換え遺伝子の取り込みおよび発現が実質的に改良される（Ｃｕｒｉｅｌ　ｅｔ　ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．６：２４７−５２，１９９２）。
【０２８３】
本明細書において用いる場合，”遺伝子輸送”とは，外来核酸分子を細胞中に導入する工程を意味する。遺伝子輸送は，一般に，遺伝子によりコードされる特定の産物の発現を可能とするために行われる。産物には，蛋白質，ポリペプチド，アンチセンスＤＮＡまたはＲＮＡ，または酵素的に活性なＲＮＡが含まれる。遺伝子輸送は，培養細胞中で，または動物への直接投与により行うことができる。一般に，遺伝子輸送には，核酸を非特異的レセプター媒介性相互作用により標的細胞と接触させ，核酸を膜を通してまたはエンドサイトーシスにより細胞内に取り込ませ，核酸を原形質膜またはエンドソームから細胞質内に放出させる工程が含まれる。さらに，発現には，核酸が細胞の核に移動し，転写のための適当な核因子に結合することが必要である。
【０２８４】
本明細書において用いる場合，”遺伝子治療”とは，遺伝子輸送の１つの形であり，本明細書において用いられる遺伝子輸送の定義の中に含まれ，特にインビボでまたはインビトロで細胞から治療用産物を発現させるための遺伝子治療を表す。遺伝子輸送は，細胞でエクスビボで行い，次に患者に移植することにより，または，核酸または核酸蛋白質複合体を患者に直接投与することにより，行うことができる。
【０２８５】
別の好ましい態様においては，キナーゼポリペプチドをコードする核酸配列を有するベクターが提供され，ここで，核酸配列は特定の組織においてのみ発現される。組織特異的遺伝子発現を行う方法は，国際公開ＷＯ９３／０９２３６（１９９２年１１月３日出願，１９９３年５月１３日公開）に記載される。
【０２８６】
上述したすべてのベクターにおいて，本発明のさらに別の観点は，ベクターに含まれる核酸配列が，核酸の配列の一部または全てについて，上で定義したような付加，欠失または修飾を含んでいてもよいことである。
【０２８７】
別の好ましい態様においては，遺伝子置換の方法が記載される。本明細書において用いる場合，”遺伝子置換”とは，インビボで発現しうる核酸配列を動物に供給し，このことによりその動物に欠失しているかまたは不完全な内因性遺伝子の機能を提供することを意味する。
【０２８８】
医薬処方および投与経路
本明細書に記載される化合物は，それ自体で，または医薬組成物中でヒト患者に投与することができる。医薬組成物では，組み合わせ療法におけるように，化合物が他の活性成分と混合されているか，または適当な担体または賦形剤と混合されている。本発明の化合物の処方および投与の手法は”Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ，”ＭａｃｋＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇＣｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡの最新版に見いだすことができる。
【０２８９】
投与経路：
投与の適当な経路には，例えば，経口，直腸，経粘膜，または腸投与；非経口輸送，例えば筋肉内，皮下，静脈内，骨髄内注入，ならびに鞘内，直接心室内，腹膜内，鼻腔内，または眼内注射が含まれる。
【０２９０】
あるいは，化合物を全身ではなく局所的に投与してもよく，これには，例えば，化合物を，しばしばデポ製剤または徐放製剤として直接固体腫瘍に注射することが含まれる。
【０２９１】
さらに，薬物はターゲティングされたドラッグデリバリーシステムにおいて，例えば腫瘍特異的抗体により被覆されたリポソーム中で投与してもよい。リポソームは腫瘍にターゲティングされ，選択的に取り込まれるであろう。
【０２９２】
組成物／処方：
本発明の医薬組成物は，当該技術分野においてよく知られる方法，例えば，限定されないが，慣用の混合，溶解，顆粒化，糖衣作成，研和，乳化，カプセル封入，捕捉，または凍結乾燥により製造することができる。
【０２９３】
すなわち，本発明にしたがって使用するための医薬組成物は，活性化合物を薬剤として使用することができる製品に加工することを容易にする賦形剤および補助剤を含む，１またはそれ以上の生理学的に許容しうる担体を用いて，慣用の方法で製剤することができる。適切な処方は，選択される投与経路に依存する。
【０２９４】
注射用には，本発明の薬剤を水性溶液，好ましくはハンクス溶液，リンゲル溶液，または生理的食塩緩衝液等の生理学的に適合性の緩衝液中で処方することができる。経粘膜投与用には，浸透すべき障壁に適した浸透剤が処方に用いられる。そのような浸透剤は当該技術分野において一般に知られている。
【０２９５】
経口投与のためには，化合物を当該技術分野においてよく知られる薬学的に許容しうる担体と混合することにより化合物を容易に処方することができる。そのような担体は，本発明の化合物を，治療すべき患者による経口摂取のための錠剤，丸薬，糖衣剤，カプセル，液体，ゲル，シロップ，スラリー，懸濁液等として処方することを可能とする。適当な担体には，特に，ラクトース，ショ糖，マンニトール，またはソルビトール等の糖類；トウモロコシデンプン，小麦デンプン，米デンプン，およびジャガイモデンプン等のセルロース製品，ゼラチン，トラガカントゴム，メチルセルロース，ヒドロキシプロピルメチルセルロース，カルボキシメチルセルロースナトリウム，および／またはポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）等の増量剤などの賦形剤が含まれる。所望の場合には，架橋されたポリビニルピロリドン，寒天，またはアルギン酸またはその塩，例えばアルギン酸ナトリウム等の崩壊剤を加えてもよい。
【０２９６】
糖衣剤のコアは，適当なコーティングとともに供給される。この目的のためには，濃縮された糖溶液を用いることができる。これは，アラビアゴム，タルク，ポリビニルピロリドン，カルボポールゲル，ポリエチレングリコール，および／または二酸化チタン，ラッカー溶液，および適当な有機溶媒または溶媒混合物を任意に含むことができる。識別のため，あるいは活性化合物の用量の異なる組合せを特徴づけるため，染料または色素を錠剤または糖衣剤コーティングに添加してもよい。
【０２９７】
経口で使用することができる医薬製剤は，ゼラチンから作成されるプッシュフィットカプセル，ならびにゼラチンおよびグリセロール，ソルビトール等の可塑剤から作成される密封軟カプセルを含む。プッシュフィットカプセルは，活性成分を，ラクトース等の増量剤，デンプン等の結合剤，および／またはタルクおよびステアリン酸マグネシウム等の潤滑剤，さらに任意に安定剤との混合物中に含むことができる。軟カプセルにおいては，活性化合物は脂肪油，流動パラフィン，または液体ポリエチレングリコール等の適当な液体中に溶解または懸濁することができる。さらに安定剤を添加してもよい。経口投与用のすべての処方は，そのような投与に適当な用量で調製すべきである。
【０２９８】
口内投与のためには，組成物は，慣用的な方法で錠剤またはトローチ剤の形にすることができる。
【０２９９】
吸入による投与用には，本発明に従って用いられる化合物は，噴射剤，例えば，ジクロロジフルオロメタン，トリクロロフルオロメタン，ジクロロテトラフルオロエタン，二酸化炭素または他の適当な気体を用いて，加圧されたパックまたはネブライザーからエアーゾルスプレイの形状で便利に輸送される。加圧されたエアーゾルの場合，用量単位は計量された量を送達するべく備えられたバルブにより調節することができる。例えば吸入器または注入器において使用するためのゼラチン製のカプセルおよびカートリッジは，化合物の粉末混合物と，ラクトースまたはデンプン等の適当な粉末基剤とを含むよう処方することができる。
【０３００】
化合物は，例えばボーラス注射または連続注入による非経口投与用に処方することができる。注射用の処方は，単位用量にて，例えばアンプルにて，あるいは添加された保存料と共に多用量容器中で提供することができる。組成物は油性または水性のベヒクル中で，懸濁液，溶液，または乳濁液等の形状をとることができ，懸濁剤，安定剤および／または分散剤等の製剤物質を含んでいてもよい。
【０３０１】
非経口投与用の薬剤処方は，水溶性の形態の活性化合物の水性溶液を含む。さらに，活性化合物の懸濁液は，適当な油性の注入用懸濁液として調製することができる。適切な親油性溶媒またはベヒクルには，ゴマ油等の脂肪油，オレイン酸エチルまたはトリグリセリド等の合成脂肪酸エステル，またはリポソーム等を含む。水性の注射用懸濁液は，カルボキシメチルセルロースナトリウム，ソルビトール，またはデキストラン等の，懸濁液の粘度を増加させる物質を含んでいてもよい。任意に，懸濁液はまた，高度に濃縮された溶液の調製を可能にする，当該化合物の溶解性を増加させる適当な安定剤または薬剤を含んでいてもよい。
【０３０２】
あるいは，活性成分は粉体の形態であって，使用前に適当なベヒクル，例えば発熱物質を含まない滅菌水を用いて構成することができる。
【０３０３】
化合物はまた，例えばカカオバターまたは他のグリセリド等の慣用の坐剤基剤を用いて，坐剤または停留浣腸等の直腸用組成物に処方することができる。
【０３０４】
上述した処方に加えて，化合物はまたデポ製剤として処方することができる。そのような長時間作用性の処方は，埋込み（例えば皮下または筋肉内への）によるか，または筋肉内注射により投与することができる。すなわち，例えば，化合物は，適当な高分子性または疎水性物質と共に（例えば許容される油剤中の乳濁液として），イオン交換樹脂と共に，溶けにくい塩等の溶けにくい誘導体として，処方することができる。
【０３０５】
本発明の疎水性化合物のための薬学的担体は，ベンジルアルコール，非極性界面活性剤，水混和性有機ポリマーおよび水性相を含む共溶媒系であってもよい。共溶媒系はＶＰＤ共溶媒系であってもよい。ＶＰＤは，３％（ｗ／ｖ）ベンジルアルコール，８％（ｗ／ｖ）非極性界面活性剤ポリソルベート８０，および６５％（ｗ／ｖ）ポリエチレングリコール３００を純粋エタノール中に作成した溶液である。ＶＰＤ共溶媒系（ＶＰＤ：Ｄ５Ｗ）は，ＶＰＤを５％デキストロースの水溶液中に１：１で希釈したものである。この共溶媒系は疎水性化合物をよく溶解し，それ自体，全身投与に際して低い毒性を示す。本来，共溶媒系の比率は，その溶解性および毒性特性を破壊することなく相当変化させることができる。さらに，共溶媒成分の同一性も変化させることができる。例えば，他の低毒性非極性界面活性剤をポリソルベート８０の代わりに用いることができ，ポリエチレングリコールの分画サイズは様々でありうる。他の生体適合性ポリマー，例えばポリビニルピロリドンをポリエチレングリコールの代わりに用いることができ，他の糖または多糖類をデキストロースの代わりに用いることができる。
【０３０６】
あるいは，疎水的医薬化合物のための他の輸送系を用いてもよい。リポソームおよび乳剤は，疎水的薬剤のための輸送用ベヒクルまたは担体の例としてよく知られている。さらに，ある種の有機溶媒，例えばジメチルスルホキシドもまた用いることができるが，しばしば毒性がより高くなる。さらに，化合物は，持続放出系，例えば治療薬剤を含む固体疎水性ポリマーの準透過性マトリックスを用いて輸送することができる。種々の持続放出材料が当業者にはよく知られている。持続放出カプセルはその化学的性質に応じて，数週間から１００日を越える期間，化合物を放出する。治療薬剤の化学的性質および生物学的安定性に応じて，さらに別の蛋白質安定化戦略を用いてもよい。
【０３０７】
医薬組成物はまた，適当な固体またはゲル相の担体または賦形剤を含んでいてもよい。そのような担体または賦形剤の例には，限定されないが，炭酸カルシウム，リン酸カルシウム，種々の糖，澱粉，セルロース誘導体，ゼラチン，およびポリエチレングリコール等の高分子が含まれる。
【０３０８】
本発明のチロシンまたはセリン／トレオニンキナーゼ調節化合物の多くは，薬学的に適合性のカウンターイオンとの塩として提供される。薬学的に適合性の塩は，多くの酸，例えば，限定されないが，塩酸，硫酸，酢酸，乳酸，酒石酸，リンゴ酸，クエン酸等を用いて形成することができる。塩は，水性または他のプロトン性溶媒において，対応する遊離塩基の形よりもより溶解性である傾向にある。
【０３０９】
適切な投与計画：
本発明において使用するのに適した医薬組成物には，活性成分がその意図される目的を達成するのに有効な量で含まれている組成物が含まれる。より詳細には，治療上有効量とは，疾病の症状を予防，緩和または改善するのに，または治療している被験者の生存を長くするのに有効な化合物の量を意味する。本発明の化合物の治療上有効量の決定は，特に本明細書に提供される詳細な開示に鑑みて，十分に当業者の能力の範囲内である。
【０３１０】
患者に投与すべき化合物の投与量および生物に化合物を投与するモードを決定する方法は，米国特許出願０８／７０２，２８２（１９９６年８月２３日出願）および国際出願ＷＯ９６／２２９７６（１９９６年８月１日公開）（この両方について，図面および表を含めその全体を本明細書の一部としてここに引用する）に開示されている。当業者は，そのような記載が本発明に適用可能であり，容易に適合させることができることを理解するであろう。
【０３１１】
適切な投与量は，種々の因子，例えば，治療する疾病のタイプ，用いられる特定の組成物および患者のサイズおよび生理学的状態に依存する。本明細書に記載される化合物についての治療上有効量は，最初は培養細胞および動物モデルから見積もることができる。例えば，容量は，動物モデルにおいて，培養細胞アッセイにおいて決定されたＩＣ５０を最初に考慮した循環濃度範囲を達成する用量を処方することができる。動物モデルのデータを用いて，ヒトにおける有用な用量をより正確に決定することができる。
【０３１２】
本発明の方法において用いられる任意の化合物について，治療上有効な用量は，最初は細胞培養アッセイから見積もることができる。例えば，動物モデルにおいて，培養細胞において決定されたＩＣ５０（すなわちチロシンまたはセリン／トレオニンキナーゼ活性の最大阻害の半分を達成する試験化合物の濃度）を含む循環濃度範囲を達成するような用量を処方することができる。そのような情報は，ヒトまたは他の被験体における有用な用量のさらに正確な決定のために用いることができる。
【０３１３】
本明細書に記載される化合物の毒性および治療有効性は，培養細胞または実験動物における標準的な薬理学的方法，例えばＬＤ５０（集団の５０％に致死的な用量）およびＥＤ５０（集団の５０％に治療上有効な用量）を決定することにより，決定することができる。毒性と治療上有効性の用量の比は治療指数であり，ＬＤ５０とＥＤ５０の比率として表すことができる。高い治療指数を示す化合物が好ましい。これらの培養細胞アッセイおよび動物研究から得られるデータは，ヒトにおいて用いるための範囲の投与量を処方するために用いることができる。このような化合物の投与量は，好ましくは，ＥＤ５０を含み毒性がほとんどまたは全くない循環濃度の範囲内にある。投与量は，用いる投与形態および用いる投与経路により，この範囲内で様々でありうる。正確な処方，投与経路，および投与量は，個々の医師が，患者の状態を考慮して選択することができる（例えば，Ｆｉｎｇｌ　ｅｔ　ａｌ．１９７５，”Ｔｈｅ　Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｂａｓｉｓ　ｏｆ　Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ”，Ｃｈ．１，ｐ．１を参照）。
【０３１４】
別の例においては，毒性研究は，血液細胞組成を測定することにより実施することもできる。例えば，以下のようにして，適当な動物モデルにおいて毒性研究を行うことができる１）化合物をマウスに投与し（未処置対照マウスも用いなければならない）；２）各処置群の１匹のマウスの尾部静脈から定期的に血液試料を採取し；そして３）試料を，赤血球および白血球数，血液細胞組成物，およびリンパ球対多形核細胞のパーセントについて分析する。各用量計画および対照からの結果の比較は，毒性が存在するか否かを示す。
【０３１５】
各毒性研究の終わりに動物を犠牲にすることにより（好ましくは，ｔｈｅ　Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ　ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ　Ｒｅｐｏｒｔ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ａｓｓｏｃ．Ｐａｎｅｌ　ｏｎ　Ｅｕｔｈａｎａｓｉａ，Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ａｓｓｏｃ．／２０２：２２９−２４９，１９９３にしたがって），さらなる研究を実施することができる。次に，各処置群の代表的動物を，肉眼剖検により転移の直接証拠，異常な不健康，または毒性について調べることができる。組織の肉眼異常を記録し，組織を組織学的に調べる。体重または血液成分の減少を引き起こす化合物，および主要な臓器に有害な影響を有する化合物はあまり好ましくない。一般に，有害な影響が大きければ大きいほど，化合物はより好ましくない。
【０３１６】
癌の治療においては，疎水性薬剤の予測される１日用量は１−５００ｍｇ／日，好ましくは，１−２５０ｍｇ／日，最も好ましくは，１−５０ｍｇ／日の範囲である。薬剤は，活性成分の血漿レベルが治療の有効性を維持するのに十分であるかぎり，より少ない頻度で投与することができる。
【０３１７】
血漿レベルは薬剤の有効性を反映するはずである。一般に，化合物が強力であればあるほど，有効性を達成するのに必要な血漿レベルは低い。
【０３１８】
薬剤および代謝産物の血漿半減期および血漿，腫瘍，および主要な臓器における生物学的分布を決定して，疾患を阻害するのに最も適当な薬剤の選択を容易にすることができる。そのような測定を実施することができる。例えば，薬剤で処置した動物の血漿についてＨＰＬＣ分析を行い，Ｘ線，ＣＡＴスキャン，およびＭＲＩ等の検出方法を用いて放射性標識した化合物の位置を決定することができる。スクリーニングアッセイにおいて強力な阻害活性を示すが，不十分な薬物動力学的特性を有する化合物は，化学構造の変更および再試験により最適化することができる。この点に関しては，優れた薬物動力学的特性を示す化合物をモデルとして用いることができる。
【０３１９】
投与量および間隔は，個々に，活性成分がキナーゼ調節効果を維持するのに十分な血漿レベル，すなわち最小有効濃度（ＭＥＣ）を与えるよう調節することができる。ＭＥＣは，各化合物について異なるが，インビトロのデータ，例えば，限定されないが，本明細書に記載されるアッセイを用いて，キナーゼの５０−９０％の阻害を達成するのに必要な濃度から見積もることができる。ＭＥＣを達成するのに必要な投与量は，個々の特性および投与経路に依存するであろう。しかし，血漿濃度はＨＰＬＣアッセイまたはバイオアッセイを用いて決定することができる。
【０３２０】
投与間隔もまた，ＭＥＣ値を用いて決定することができる。化合物は，１０−９０％の時間，好ましくは３０−９０％の時間，最も好ましくは５０−９０％の時間，ＭＥＣより高い血漿レベルを維持する投与計画を用いて投与すべきである。
【０３２１】
局所投与または選択的取り込みの場合には，薬剤の有効な局所濃度は血漿濃度とは関係ないであろう。
【０３２２】
投与される特定の組成物の量は，もちろん，治療中の患者，患者の体重，苦痛の激しさ，投与方法，および担当医師の判断に依存するであろう。
【０３２３】
包装：
組成物は，所望の場合には，活性成分を含む１またはそれ以上の単位用量形を含んでいてもよいパックまたはディスペンサー装置中で提供することができる。パックは，例えば，ブリスターパックなどの金属またはプラスチック箔を含むことができる。パックまたはディスペンサー装置には，投与の指示が添付されていてもよい。パックまたはディスペンサー装置はまた，薬剤の製造，使用，または販売を規制する政府機関によって規定された形式の，容器に付随した注意書が添付されていてもよく，その注意書はヒトまたは獣医学的投与用のポリヌクレオチドの形状の当該機関による承認を反映するものである。そのような注意書は，例えば米国食品医薬品局により処方箋調剤薬として承認されたラベルによるものか，または承認された製品に差込まれたものでもよい。適合した薬学的担体中に処方された，本発明の化合物を含む組成物もまた製造され，適当な容器内に配置され，さらに指示された条件による処置のためにラベルを付すことができる。ラベル上に示される適切な状態としては，腫瘍の治療，新脈管形成の阻害，線維症，糖尿病等の治療が挙げられる。
【０３２４】
機能的誘導体
本発明はまた，本発明のポリペプチドまたは核酸の機能的誘導体を提供する。”機能的誘導体”は，本発明のポリペプチドまたは核酸の”化学的誘導体”，”フラグメント”または”変種”を意味し，これらの用語は以下に定義される。機能的誘導体は，蛋白質の機能の少なくとも一部，例えば蛋白質に特異的な抗体との反応性，非触媒ドメインにより媒介される酵素活性または結合活性を保持しており，これにより本発明にしたがう有用性を有する。遺伝コードの縮重のため，多くの異なる核酸配列が同じアミノ酸配列をコードすることができることは当該技術分野においてよく知られている。同じく，アミノ酸を保存的に変更して，元の機能性的を保持する蛋白質またはポリペプチドを得ることができることも当該技術分野においてよく知られている。いずれの場合においても，すべての順列が本明細書の開示によりカバーされることが意図される。
【０３２５】
本明細書に記載される単離された核酸分子の機能的等価物も本発明の範囲内に含まれる。遺伝コードの縮重のため，あるコドンを同じアミノ酸を規定する他のコドンで置き換え，同じ蛋白質を生じさせることができる。既知のアミノ酸は，メチオニンおよびトリプトファンを除き，２以上のコドンによりコードすることができるため，核酸配列は実質的に様々でありうる。すなわち，本発明の遺伝子の一部または全部を合成して，配列番号１，配列番号２，配列番号３，配列番号４，配列番号５，配列番号６，配列番号７，配列番号８，配列番号９，配列番号１０，配列番号１１，および配列番号１２に記載される配列からなる群より選択される核酸配列と有意に異なる核酸配列を得ることができる。しかし，これによりコードされるアミノ酸配列は保存される。
【０３２６】
さらに，核酸配列は，配列番号１，配列番号２，配列番号３，配列番号４，配列番号５，配列番号６，配列番号７，配列番号８，配列番号９，配列番号１０，配列番号１１，および配列番号１２に記載される配列，またはその誘導体からなる群より選択される核酸の式またはその誘導体の５’−末端および／または３’−末端で少なくとも１つのヌクレオチドを付加，欠失または置換することにより得られるヌクレオチド配列を含んでいてもよい。その付加，欠失または置換が，ヌクレオチド配列によりコードされる，配列番号１３，配列番号１４，配列番号１５，配列番号１６，配列番号１７，配列番号１８，配列番号１９，配列番号２０，配列番号２１，配列番号２２，配列番号２３，および配列番号２４に記載される配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を変更しない限り，任意のヌクレオチドまたはポリヌクレオチドをこのように用いることができる。例えば，本発明は，本発明の核酸配列またはその誘導体の５’−末端に開始コドンとしてＡＴＧを付加することにより，または本発明のヌクレオチド配列またはその誘導体の３’−末端に終止コドンとしてＴＴＡ，ＴＡＧまたはＴＧＡを付加することにより得られる任意の核酸配列を含むことを意図する。さらに，本発明の核酸分子は，必要に応じて，これらの５’−末端および／または３’−末端に付加された制限エンドヌクレアーゼ認識部位を有することができる。
【０３２７】
所定の核酸配列のそのような機能的変更により，これに融合した外来核酸配列によりコードされる異種蛋白質の分泌および／またはプロセシングが促進される機会が与えられる。したがって，遺伝コードにより許容される本発明のキナーゼ遺伝子およびそのフラグメントのヌクレオチド配列のすべての変種は本発明に含まれる。
【０３２８】
さらに，コドンを削除するかまたは１またはそれ以上のコドンを縮重コドン以外のコドンと置換して，構造的に改変されているが，未改変核酸分子により産生されるポリペプチドと実質的に同じ有用性または活性を有するポリペプチドを製造することが可能である。当該技術分野において認識されているように，２つのポリペプチドは機能的に同等であり，これらの核酸分子の間の相違が遺伝コードの縮重に関連しない場合であっても，これらの製造を生じさせる２つの核酸分子も機能的に同等である。
【０３２９】
複合体の”化学的誘導体”は，通常は蛋白質の一部ではない追加の化学的成分を含む。蛋白質またはペプチドの共有結合修飾は，本発明の範囲内に含まれる。そのような修飾は，以下に記載するように，ペプチドの標的アミノ酸残基を選択された側鎖または末端残基と反応しうる有機誘導化剤と反応させることにより，分子中に導入することができる。
【０３３０】
システイン残基は，最も一般的にはアルファ−ハロアセテート（および対応するアミン），例えばクロロ酢酸またはクロロアセトアミドと反応させて，カルボキシメチルまたはカルボキシアミドメチル誘導体を得る。システイン残基は，ブロモトリフルオロアセトン，クロロアセチルホスフェート，Ｎ−アルキルマレイミド，３−ニトロ−２−ピリジルジスルフィド，メチル２−ピリジルジスルフィド，ｐ−クロロ水銀ベンゾエート，２−クロロ水銀−４−ニトロフェノール，またはクロロ７−ニトロベンゾ−２−オキサ−１，３−ジアゾールと反応させることにより誘導化する。
【０３３１】
ヒスチジン残基は，ｐＨ５．５−７．０でジエチルプロカーボネートと反応させることにより誘導化することができる。これは，この薬剤がヒスチジンの側鎖に比較的特異的であるためである。臭化パラブロモフェナシルもまた有用である。反応は，好ましくは，０．１Ｍカコジル酸ナトリウム中でｐＨ６．０で行う。
【０３３２】
リジンおよびアミノ末端残基はコハク酸または他のカルボン酸無水物と反応させる。これらの薬剤による誘導化は，リジン残基の電荷を逆転させる効果を有する。１級アミン含有残基を誘導化するための他の適当な試薬には，イミドエステル，例えば，メチルピコリンイミデート；ピリドキサールホスフェート；ピリドキサール；クロロホウ化水素；トリニトロベンゼンスルホン酸；Ｏ−メチルイソウレア；２，４−ペンタンジオン；およびトランスアミナーゼに触媒されるグリオキシレートとの反応が含まれる。
【０３３３】
アルギニン残基は慣用的な試薬の１つまたはいくつかと反応させることにより修飾する。これには，例えば，フェニルグリオキサール，２，３−ブタンジオン，１，２−シクロヘキサンジオン，およびニンヒドリンがある。アルギニン残基の誘導化には，グアニジン官能基の高いｐＫａのため，反応をアルカリ条件中で行うことが必要である。さらに，これらの試薬はリジンの基ならびにアルギニンアルファアミノ基とも反応することができる。
【０３３４】
チロシン残基は，芳香族性ジアゾニウム化合物またはテトラニトロメタンと反応させることにより光学的標識を導入するための修飾のよく知られる標的である。最も一般的には，Ｎ−アセチルイミダゾールおよびテトラニトロメタンを用いて，それぞれＯ−アセチルチロシル種および３−ニトロ誘導体を生成する。
【０３３５】
カルボキシル側鎖（アスパラギン酸およびグルタミン酸）は，カルボジイミド（Ｒ’−Ｎ−Ｃ−Ｎ−Ｒ’），例えば１−シクロヘキシル−３−（２−モルホリニル（４−エチル）カルボジイミドまたは１−エチル−３−（４−アゾニア−４，４−ジメチルペンチル）カルボジイミドと反応させることにより，選択的に修飾する。さらに，アスパラギン酸およびグルタミン酸残基は，アンモニウムイオンと反応させることにより，アスパラギンおよびグルタミン残基に変換する。
【０３３６】
グルタミンおよびアスパラギン残基は，しばしば脱アミド化して，対応するグルタミン酸およびアスパラギン酸残基に変換する。あるいは，これらの残基をより穏和な酸性条件下で脱アミド化する。これらの残基のいずれの形も本発明の範囲内である。
【０３３７】
二官能性薬剤による誘導化は，例えば，蛋白質の成分ペプチドを互いに，または複合体中の他の蛋白質と，または水不溶性支持体マトリクスと，または他の高分子担体と架橋するのに有用である。一般に用いられる架橋薬剤としては，例えば，１，１−ビス（ジアゾアセチル）−２−フェニルエタン，グルタルアルデヒド，Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル，例えば，４−アジドサリチル酸のエステル，ホモ二官能性イミドエステル（３，３’−ジチオビス（スクシンイミジルプロピオネート）等のジスクシンイミジルエステルを含む），および二官能性マレイミド，例えばビス−Ｎ−マレイミド−１，８−オクタンが挙げられる。メチル−３−［ｐ−アジドフェニル）ジチオールプロピオイミデート等の誘導化薬剤により，光の存在下で架橋を形成しうる光活性化可能な中間体が得られる。あるいは，反応性の水不溶性マトリクス，例えば臭化シアン活性化炭水化物および米国特許３，９６９，２８７；３，６９１，０１６；４，１９５，１２８；４，２４７，６４２；４，２２９，５３７；および４，３３０，４４０に記載される反応性基質を蛋白質固定化のために用いることができる。
【０３３８】
他の修飾としては，プロリンおよびリジンのヒドロキシル化，セリンまたはトレオニン残基のヒドロキシル基のリン酸化，リジン，アルギニン，およびヒスチジン側鎖のアルファアミノ基のメチル化（Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｔ．Ｅ．，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ　ａｎｄ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ＆Ｃｏ．，Ｓａｎ　Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ｐｐ．７９−８６（１９８３）），Ｎ末端アミンのアセチル化，および場合によりＣ末端カルボキシル基のアミド化が挙げられる。
【０３３９】
そのような誘導化された成分は，安定性，溶解性，吸収，生物学的半減期等を改良することができる。あるいは，これらの成分は，蛋白質複合体の望ましくない副作用を排除するかまたは緩和することができる。そのような効果を媒介しうる成分は，例えば，Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ　ｅｄ．，Ｍａｃｋ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ（１９９０）に開示されている。
【０３４０】
”フラグメント”との用語は，これが由来する全長ポリペプチドより短い長さを有する蛋白質または複合体のアミノ酸配列に由来するポリペプチドを示すものとして用いられる。そのようなフラグメントは，例えば，全長蛋白質の蛋白質分解性切断により製造することができる。好ましくは，フラグメントは，蛋白質をコードするＤＮＡ配列を適当に改変して，Ｃ末端，Ｎ末端，および／または天然配列中の１またはそれ以上の部位において１またはそれ以上のアミノ酸を除去することにより，組換えにより得る。蛋白質のフラグメントは，本明細書に記載されるように，シグナル伝達を調節するように作用する物質のスクリーニングに有用である。そのようなフラグメントは，天然の複合体の１またはそれ以上の特徴的部分を保持しているであろうことが理解される。そのような保持される特徴の例としては，触媒的活性；基質特異性；無傷の細胞中における他の分子との相互作用；制御機能；または天然の複合体またはそのエピトープに対する抗体との結合が挙げられる。
【０３４１】
本発明の範囲内に入ることが意図される別の機能的誘導体は，天然のポリペプチドに対して，１またはそれ以上のアミノ酸を欠失しているか，追加のまたは置換されたアミノ酸を含む”変種”ポリペプチドである。変種は，蛋白質のＤＮＡコーディング配列を適当に改変して，Ｃ末端，Ｎ末端，および／または天然配列中の１またはそれ以上の部位において１またはそれ以上のアミノ酸のためのコドンを付加，除去，および／または改変することにより，天然に生ずる複合体成分から誘導することができる。追加，置換および／または追加アミノ酸を有するそのような変種は，上述するように，天然の蛋白質の１またはそれ以上の特徴的部分を保持していることが理解される。
【０３４２】
アミノ酸残基が除去，挿入および／または置換されている蛋白質の機能的誘導体は，当業者によく知られる標準的な手法を用いて製造することができる。例えば，機能的誘導体の改変された成分は，改変されたコード配列を生成するように，ＤＮＡコード配列中のヌクレオチドを修飾する部位特異的突然変異手法（Ａｄｅｌｍａｎ　ｅｔ　ａｌ．，１９８３，ＤＮＡ　２：１８３に例示されている）を用いて，その後上述したような手法を用いてこの組換えＤＮＡを原核生物または真核生物宿主細胞中で発現させることにより，製造することができる。あるいは，アミノ酸が削除，挿入および／または置換されている蛋白質は，当該技術分野においてよく知られる方法を用いて，直接化学合成により便利に製造することができる。蛋白質の機能的誘導体は，典型的には天然の蛋白質と同じ質の生物学的活性を示す。
【０３４３】
表およびその記載
表１は，各遺伝子の名前，各遺伝子の分類，配列中のオープンリーディングフレームの位置，および対応するペプチドの長さを表す。データは，左から右に，以下のものを表す：”遺伝子名”，”ＩＤ＃ｎａ”，”ＩＤ＃ａａ”，”ＦＬ／Ｃａｔ”，”スーパーファミリー”，”グループ”，”ファミリー”，”ＮＡ長さ”，”ＯＲＦ開始”，”ＯＲＦ終了”，”ＯＲＦ長さ”，および”ＡＡ長さ”。”遺伝子名”は，キナーゼまたはキナーゼ様酵素をコードする配列に与えられた名前を表す。各遺伝子は，”ＳＧＫ”名称およびその後の番号により表される。ＳＧＫ名は，通常は，１つの連続配列（”コンティグ”）に構築された多数の重複配列を表す。”ＩＤ＃ｎａ”および”ＩＤ＃ａａ”は，本明細書において各核酸およびアミノ酸配列に与えられた同定番号を表す。”ＦＬ／Ｃａｔ”は，遺伝子の長さを表し，ＦＬは全長を，”Ｃａｔ”は触媒ドメインのみが示されていることを表す。このカラム中の”Ｐａｒｔｉａｌ”とは，配列が部分的蛋白質キナーゼ触媒ドメインをコードすることを示す。”スーパーファミリー”とは，遺伝子が蛋白質キナーゼまたは蛋白質−キナーゼ様であるか否かを識別する。”グループ”および”ファミリー”は，配列ホモロジーにより定義され，先に確立されている系統発生分析に基づく蛋白質キナーゼの分類を表す［Ｈａｒｄｉｅ，Ｇ．ａｎｄ　ＨａｎｋｓＳ．Ｔｈｅ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｋｉｎａｓｅ　Ｂｏｏｋ，Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ（１９９５）およびＨｕｎｔｅｒ　Ｔ．ａｎｄ　Ｐｌｏｗｍａｎ，Ｇ．Ｔｒｅｎｄｓ　ｉｎ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１９７７）２２：１８−２２およびＰｌｏｗｍａｎ　Ｇ．Ｄ．　ｅｔ　ａｌ．（１９９９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９６：１３６０３−１３６１０）］。”ＮＡ長さ”は，対応する核酸配列の長さをヌクレオチドで表す。”ＯＲＦ開始”は，オープンリーディングフレームの開始ヌクレオチドを表す。”ＯＲＦ終了”は，オープンリーディングフレームの終止コドンを除く最後のヌクレオチドを表す。”ＯＲＦ長さ”は，オープンリーディングフレームの長さ（終止コドンを除く）をヌクレオチドで表す。”ＡＡ長さ”は，対応するヌクレオチド配列においてコードされるペプチドの長さをアミノ酸で表す。
【０３４４】
表１−オープンリーディングフレーム
【表１】
2004504009.tif 000003
【０３４５】
表２は，本明細書に記載される遺伝子の以下の特徴を示す：染色体位置，一塩基多型（ＳＮＰｓ），ｄｂＥＳＴにおける表示，および反復領域。示されるデータは，左から右に，以下のとおりである：”遺伝子名”，”ＩＤ＃ｎａ”，”ＩＤ＃ａａ”，”ＦＬ／Ｃａｔ”，”スーパーファミリー”，”グループ”，”ファミリー”，”染色体”，”ＳＮＰｓ”，”ｄｂＥＳＴ＿ヒット”，および”反復”。最初の７つのカラム（すなわち，”遺伝子名”，”ＩＤ＃ｎａ”，”ＩＤ＃ａａ”，”ＦＬ／Ｃａｔ”，”スーパーファミリー”，”グループ”，”ファミリー”）の内容は，表１について上述したとおりである。”染色体”は，遺伝子の細胞遺伝学的位置を表す。”ＳＮＰｓ”カラムの情報は，候補一塩基多型（ＳＮＰｓ）の核酸位置および縮重性を示す。例えば，ＳＧＫ３０７について，”ＳＮＰｓ”カラムは”２４６０＝Ｒ（ａａｇａｇａｇｔｔｔａｃａＲ）ｓｓ１９２８２７５”を含み，これは，位置２６４０においてＡおよびＧの両方の例が存在することを示す（Ｒ＝ＧまたはＡ）。ＳＮＰの前の配列およびｄｂＳＮＰからの受託番号もまた示される。”ｄｂＥＳＴヒット”は，対応する遺伝子に対して少なくとも１００ｂｐの１００％同一性を含む，ＥＳＴの公共のデータベース（ｄｂＥＳＴ，ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｄｂＥＳＴ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ）中の登録物の受託番号を示す。これらのＥＳＴはｄｂＥＳＴのｂｌａｓｔｎにより同定した。”反復”は，複雑性が低く，いくつかの別々の遺伝子中に存在する約２０ｂｐの長さの短い配列の位置に関する情報を含む。これらの反復は，ＮＣＢＩ（ｎｒｎａ）の非重複核酸データベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＳＮＰ／ｓｎｐｂｌａｓｔＢｙＣｈｒ．ｈｔｍｌ）に対するＤＮＡ配列のｂｌａｓｔｎにより同定した。この反復カラムに含まれるためには，配列は典型的にはその長さにわたり１００％同一性を有し，典型的には少なくとも５つの異なる遺伝子中に存在する。
【０３４６】
表２−ＣＨＲ，ＳＮＰｓ，ｄｂＥＳＴ，反復
【表２】
2004504009.tif 000004
【０３４７】
【表３】
2004504009.tif 000005
【０３４８】
表３は，キナーゼ触媒ドメインおよび他の蛋白質ドメインの程度および境界を示す。カラムの標題は以下のとおりである：”遺伝子名”，”ＩＤ＃ｎａ”，”ＩＤ＃ａａ”，”ＦＬ／Ｃａｔ”，”ＰＫプロファイル開始”，”ＰＫプロファイル終了”，”蛋白質キナーゼ開始”，”蛋白質キナーゼ終了”，”プロファイル”，および”追加ドメイン”。最初の４つのカラム（すなわち，”遺伝子名”，”ＩＤ＃ｎａ”，”ＩＤ＃ａａ”，”ＦＬ／Ｃａｔ”）の内容は表１について上述したとおりである。”プロファイル開始”，”プロファイル終了”，”キナーゼ開始”および”キナーゼ終了”は，隠れマルコフモデルを用いて得た触媒的範囲の境界を規定するデータを表す。プロファイルは完全蛋白質キナーゼ触媒ドメインに対応する２６１アミノ酸の長さを有する。プロファイルが全長触媒ドメインを認識する蛋白質は，”プロファイル開始”が１であり，”プロファイル終了”が２６１である。部分的触媒ドメインを有する遺伝子は，”プロファイル開始”が１より大きく（キナーゼドメインの最初が欠失していることを示す），および／または”プロファイル終了”が２６１より小さい（キナーゼドメインのＣ末端が欠失していることを示す）。全体の蛋白質中の触媒ドメインの境界は，”キナーゼ開始”および”キナーゼ終了”のカラムで示される。”プロファイル”は，完全（Ｇｌｏｂａｌ）であるかまたは”Ｓｍｉｔｈ　Ｗａｔｅｒｍａｎ”（部分的）であることを示す。キナーゼ触媒ドメインの多重配列アラインメントから出発して，２つの隠れマルコフモデルを構築した。その一方は，触媒ドメインに対する部分的マッチを可能とする；これは”ローカル”ＨＭＭであり，配列マッチングにおけるスミス・ウォーターマンアラインメントと類似する。他方の”完全”モデルは，完全触媒ドメインに対するマッチのみを可能とする；これは”グローバル”ＨＭＭであり，配列マッチングにおけるＮｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈアラインメントと類似する。スミス・ウォーターマンのローカルモデルはより特異的であり，キナーゼ触媒ドメインに対するフラグメント的なマッチを可能とする。一方，グローバルな”完全”モデルはより感度が高く，遠隔のホモログ同定を可能とする。”追加ドメイン”の欄には，蛋白質配列中の蛋白質キナーゼドメインとは別のドメインの名前および位置が示される。これらのドメインは，ＰＦＡＭ（ｈｔｔｐ：／／ｐｆａｍ．ｗｕｓｔｌ．ｅｄｕｈｍｍｓｅａｒｃｈ．ｓｈｔｍｌ）モデルを用いて同定した。触媒外ドメインは，Ｐｆａｍを用いてアミノ酸配列の隠れマルコフ検索を行うことにより同定した。これは，多くの共通蛋白質ドメインをカバーする多重配列アラインメントおよび隠れマルコフモデルの大きな集積物である。Ｐｆａｍのバージョン５．５（２０００年９月）は，２４７８種類の蛋白質ファミリーのアラインメントおよびモデルを含む（ｈｔｔｐ：／／ｐｆａｍ．ｗｕｓｔｌ．ｅｄｕ／ｆａｑ．ｓｈｔｍｌ）。ＰＦＡＭアラインメントはｈｔｔｐ：／／ｐｆａｍ．ｗｕｓｔｌ．ｅｄｕ／ｈｍｍｓｅａｒｃｈ．ｓｈｔｍｌからダウンロードし，ＨＭＭ検索はＴｉｍｅｌｏｇｉｃコンピュータ（Ｔｉｍｅ　Ｌｏｇｉｃ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｉｎｃｌｉｎｅ　Ｖｉｌｌａｇｅ，ＮＶ）で現場で行った。プロファイルを構築するのに用いたＰＦＡＭ受託番号，アミノ酸の長さおよび蛋白質の数は以下に示される。
【０３４９】
表３−蛋白質キナーゼドメイン，他のドメイン
【表４】
2004504009.tif 000006
【０３５０】
表４は，非重複蛋白質配列のＮＣＢＩデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｅｎｔｒｅｚ／ｐｒｏｔｅｉｎ．ｈｔｍｌ）に対するアミノ酸配列のスミス・ウォーターマン類似性検索（マトリックス：Ｐａｍｌ００；ギャップオープン／イクステンションペナルティー１２／２）の結果を示す。カラム標題は以下のとおりである：”遺伝子名”，”ＩＤ＃ｎａ”，”ＩＤ＃ａａ”，”ＦＬ／Ｃａｔ”，”スーパーファミリー”，”グループ”，”ファミリー”，”Ｐスコア”，”ａａ長さ”，”ａａＩＤマッチ”，”％同一性”，”％類似性”，”ＡＣＣ＃ｎｒａａマッチ”，および”説明”．最初の７つのカラム（すなわち，”遺伝子名”，”ＩＤ＃ｎａ”，”ＩＤ＃ａａ”，”ＦＬ／Ｃａｔ”，”スーパーファミリー”，”グループ”，および”ファミリー”）の内容は表１について上述したとおりである。”Ｐスコア”はスミス・ウォーターマン確率スコアを表す。この数値はアラインメントが偶然により生ずるおよその確率を表す。すなわち，非常に低い数値，例えば２．１０Ｅ−６４は，クエリーとデータベース標的との間に非常に顕著なマッチがあることを示す。”ａａ長さ”は，蛋白質の長さをアミノ酸で表す。”ａａＩＤマッチ”は，アラインメント中で同一であるアミノ酸の数を示す。”％同一性”は，アラインメントした領域にわたって同一であるヌクレオチドのパーセントを示す。”％類似性”は，アラインメント全体にわたって類似するアミノ酸のパーセントを示す。”ＡＣＣ＃ｎｒａａマッチ”は，非重複蛋白質のＮＣＢＩデータベース中で最も類似する蛋白質の受託番号を示す。”説明”は，非重複蛋白質ＮＣＢＩデータベース中で最も類似する蛋白質の名前を含む。ベストヒットがあまり情報を与えない場合には，２番目のスミス・ウォーターマンヒットが示されている（エントリーは第２のエントリーについて右に並べて示されている）。
【０３５１】
表４−スミス・ウォーターマン
【表５】
2004504009.tif 000007
【０３５２】
【表６】
2004504009.tif 000008
【０３５３】
表５は，本明細書に記載されるキナーゼの３種類についての４８個のヒトｃＤＮＡ起源のＰＣＲスクリーニングの結果を示す。プラスの記号（＋）は，アガロースゲル上に標的キナーゼについて予測されるサイズのバンドが存在することを示す。負の記号（−）は，予測されるサイズのＰＣＲ産物が存在しないことを示す。この表に示される遺伝子は，ＳＧＫ２６９（配列番号５）；ＳＧＫ３０７（配列番号１０）；およびＳＧＫ３８７（配列番号１２）である。表５のカラムは次のとおりである：”組織名”，”ＲＮＡ起源”（”Ｃｌｏｎｔｅｃｈ”：Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃより；”Ｓｕｇｅｎ”：社内の起源；”ＮＣＩ”：ヒト腫瘍細胞株から社内で誘導），”腫瘍タイプ”（腫瘍が由来する組織），”種”，および”腫瘍の説明”。
【０３５４】
表５−ＰＣＲ発現分析
【表７】
2004504009.tif 000009
【０３５５】
【表８】
2004504009.tif 000010
【０３５６】
実施例
以下の実施例は限定ではなく，本発明の種々の観点および特徴の代表的なものにすぎない。以下の実施例は，本発明にしたがう核酸分子，ならびにこれによりコードされるポリペプチドの単離および特徴付けを示す。
【０３５７】
実施例１：蛋白質キナーゼをコードするゲノムフラグメントの同定および特徴づけ
材料および方法
新規キナーゼは，Ｃｅｌｅｒａヒトゲノム配列データベースから，および公共のＨｕｍａｎ　Ｇｅｎｏｍｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　ｐｒｏｊｅｃｔ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）から，７０の哺乳動物および酵母キナーゼ触媒ドメイン配列で構築した隠れマルコフモデル（ＨＭＭＲ）を用いて同定した。これらの配列は，２つの配列が５０％以上の配列同一性を有しないようにキナーゼの広範な収集物から選択した。ゲノムデータベース登録物は，６つのオープンリーディングフレームに翻訳し，ＨＭＭＲ２．１のＦｉｅｌｄプログラム可能アレイ（ＦＰＧＡ）加速版を有するＴｉｍｅｌｏｇｉｃ　Ｄｅｃｙｐｈｅｒボックスを用いて，モデルに対してこれらを検索した。ＨＭＭＲプロファイルに対してアラインメントした，予測された蛋白質配列をコードするＤＮＡ配列を，元のゲノムデータベースから抽出した。次に，核酸配列をＰａｎｇｅａ　Ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇツールを用いてクラスター化し，反復登録物を排除した。次に推定蛋白質キナーゼ配列を一連のクエリーおよびフィルターを通して順番に走らせて，新規蛋白質キナーゼ配列を同定した。特に，ＨＭＭＲで同定された配列は，ＢＬＡＳＴＮおよびＢＬＡＳＴＸを用いて，既知のヒト蛋白質キナーゼおよびすべてのその後の新規蛋白質キナーゼ配列をそれが同定されるにつれて含有するヌクレオチドおよびアミノ酸レポジトリに対して検索した。出力はスプレッドシートで表示して，手動検査で既知の遺伝子を排除することを容易にした。２つのモデル，すなわち，”完全”モデルおよび”部分”またはスミス・ウォーターマンモデルを開発した。部分モデルを用いて準触媒的キナーゼドメインを同定し，完全モデルを用いて完全触媒ドメインを同定した。次に選択したヒットをＢＬＡＳＴＮを用いて公共ｎｒｎａおよびＥＳＴデータベースに対してクエリーを行い，これらが実際にユニークであることを確認した。場合によっては，新規遺伝子は，先に同定されている齧歯類または脊椎動物蛋白質キナーゼのオルトログであると判定された。
【０３５８】
仮出願において出願された配列の多くは全コーディング配列を含んでいなかった。部分ＤＮＡ配列の延長による全長オープンリーディングフレームの包含は，いくつかの方法により行った。表６に示されるｃＤＮＡデータベースを繰り返しｂｌａｓｔｎ検索して，ゲノム配列を延長したｃＤＮＡを見いだした。”ＬｉｆｅＧｏｌｄ”データベースはＩｎｃｙｔｅ　Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，Ｉｎｃ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｎｃｙｔｅ．ｃｏｍ／）から入手した。ＮＣＢＩデータベースはＮａｔｉｏｎａｌ　Ｃｅｎｔｅｒ　ｆｏｒ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）から入手した。すべてのｂｌａｓｔｎ検索は，ｂｌｏｓｕｍ６２マトリクスを用いて，ヌクレオチドミスマッチについてのペナルティー３，およびヌクレオチドマッチのリウォード１を用いて行った。ギャップ付きｂｌａｓｔアルゴリズムは以下に記載されている（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓｔｅｐｈｅｎ　Ｆ．，Ｔｈｏｍａｓ　Ｌ．Ｍａｄｄｅｎ，Ａｌｅｊａｎｄｒｏ　Ａ．Ｓｃｈａｆｆｅｒ，Ｊｉｎｇｈｕｉ　Ｚｈａｎｇ，Ｚｈｅｎｇ　Ｚｈａｎｇ，　Ｗｅｂｂ　Ｍｉｌｌｅｒ，　ａｎｄ　Ｄａｖｉｄ　Ｊ．　Ｌｉｐｍａｎ　（１９９７），”Ｇａｐｐｅｄ　ＢＬＡＳＴ　ａｎｄ　ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ：ａ　ｎｅｗ　ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｄａｔａｂａｓｅ　ｓｅａｒｃｈ　ｐｒｏｇｒａｍｓ”，Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２）。
【０３５９】
部分ＤＮＡ配列の伸長による全長オープンリーディングフレームの包含はまた，ゲノムデータベースの検索の繰り返しにより行った。第１の方法は，スミス−ウォーターマンアルゴリズムを用いて，最も近いホモログまたはオルトログを部分配列に対して蛋白質−蛋白質検索を行った。標的データベースは，Ｇｅｎｅｓｃａｎ［Ｃｈｒｉｓ　Ｂｕｒｇｅ　ａｎｄ　Ｓａｍ　Ｋａｒｌｉｎ，”Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｃｏｍｐｌｅｔｅ　Ｇｅｎｅ　Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ　ｉｎ　Ｈｕｍａｎ　Ｇｅｎｏｍｉｃ　ＤＮＡ”，ＪＭＢ（１９９７），２６８（１）：７８−９４）］およびヒトゲノムプロジェクト（ＨＧＰ）ならびにＣｅｌｅｒａから得られた全ヒトゲノム配列のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）予測からなる。検索したゲノムデータベースの完全なセットは以下の表７に示される。潜在的な伸長をコードするゲノム配列は，ＮＣＢＩ非重複データベースに対するｂｌａｓｔｐ分析を行ってヒットの新規性を確認することによりさらに評価した。伸長するゲノム配列は，ＤＮＡＳｔａｒのＳｅｑｍａｎプログラムを用いて潜在的イントロンを削除した後にｃＤＮＡ配列中に組み込んだ。スミス−ウォーターマン検索について用いたデフォルトのパラメータは以下のとおりである。マトリクス：ＰＡＭ１００；ギャップオープニングペナルティー：１２；ギャップ伸長ペナルティー：２．Ｇｅｎｅｓｃａｎ予測は，Ｇｅｎｅｓｃａｎプログラムを，Ｃｈｒｉｓ　Ｂｕｒｇｅ　ａｎｄ　Ｓａｍ　Ｋａｒｌｉｎ（”Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｃｏｍｐｌｅｔｅ　Ｇｅｎｅ　Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ　ｉｎ　Ｈｕｍａｎ　Ｇｅｎｏｍｉｃ　ＤＮＡ”，ＪＭＢ（１９９７）２６８（１）：７８−９４）に詳細が記載されるように用いて行った。ゲノムＤＮＡからのＯＲＦの予測は，標準的な６フレーム翻訳を用いて行った。
【０３６０】
ゲノム配列からＤＮＡ伸長を規定する別の方法は，Ｇｅｎｅｓｃａｎプログラムを用いてゲノムデータベースを繰り返し検索してエクソンスプライシングを予測した［Ｂｕｒｇｅ　ａｎｄ　Ｋａｒｌｉｎ，ＪＭＢ（１９９７），２６８（１）：７８−９４）］。次にこれらの予測された遺伝子を，関連するキナーゼに対するホモロジーに基づいてこれらが部分遺伝子の”本物の”伸長であるかを見ることにより評価した。
【０３６１】
別の方法は，Ｇｅｎｅｗｉｓｅプログラム（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ／Ｓｏｆｔｗａｒｅ／Ｗｉｓｅ２／）を使用して，最も近いオルトログ／ホモログに対するホモロジーに基づいて潜在的ＯＲＦを予測することを含む。Ｇｅｎｅｗｉｓｅは，２つの入力，すなわち相同の蛋白質と目的とする遺伝子を含むゲノムＤＮＡを必要とする。ゲノムＤＮＡはＣｅｌｅｒａおよびヒトゲノムプロジェクトのデータベースのｂｌａｓｔｎ検索により同定した。オルトログは，ＮＣＢＩ非重複蛋白質データベース（ＮＲＡＡ）のｂｌａｓｔｐ検索により同定した。Ｇｅｎｅｗｉｓｅは，蛋白質配列をゲノムＤＮＡ配列と比較し，イントロンおよびフレームシフトエラーを得ることができる。
【０３６２】
表６−ｃＤＮＡに基づく配列延長に用いたデータベース
【表９】
2004504009.tif 000011
【０３６３】
表７−ゲノムに基づく配列延長に用いたデータベース
【表１０】
2004504009.tif 000012
【０３６４】
結果
仮出願において遺伝子を延長するのに用いた配列情報源を以下に示す。Ｇｅｎｅｗｉｓｅを用いて延長した遺伝子については，蛋白質オルトログおよびゲノムＤＮＡの受託番号が記載されている（Ｇｅｎｅｗｉｓｅはゲノム配列から標的遺伝子のコーディング配列を組み立てるためにオルトログを用いる）。オルトログのアミノ酸配列は，蛋白質のＮＣＢＩ非重複データベースから得た（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｅｎｔｒｅｚ／ｐｒｏｔｅｉｎ．ｈｔｍｌ）。ゲノムＤＮＡは２つの起源，すなわち，ＣｅｌｅｒａおよびＮＣＢＩ−ＮＲＮＡからのものであり，これは以下に示される。ｃＤＮＡ起源もまた以下に示される。Ｇｅｎｓｃａｎ予測の入力としてすべてのゲノム配列を用いてスプライシング部位を予測した［Ｂｕｒｇｅ　ａｎｄ　Ｋａｒｌｉｎ，ＪＭＢ（１９９７）２６８（１）：７８−９４）］．略号：ＨＧＰ：ヒトゲノムプロジェクト；ＮＣＢＩ，Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｅｎｔｅｒｆｏｒ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ．
【０３６５】
ＳＧＫ２１６（配列番号１，配列番号１３をコード）
Ｇｅｎｅｗｉｓｅオルトログ：Ｓ１２９０６．
ゲノムＤＮＡ起源：Ｃｅｌｅｒａ：１６００００１１７９４３１９６，１６００００１１７４５５５５２；ヒトゲノムプロジェクト：ＡＣ０５３４８１，ｇｉ｜８０９９９２０
注：ＨＧＰフェーズ１コンティグｇｉ｜８０９９９２０は２６個の順番になっていない断片である。ヒトおよびラットＳ６キナーゼを用いるＴｂｌａｓｔｎにより，コンティグを部分的に並べることができ，ラット（ｇｉ｜ｌ２５６９６）およびヒト（ｇｉ｜４５０６７３７）遺伝子を用いてこの記録されたコンティグに対してｇｅｎｅｗｉｓｅを走らせた。ヒト遺伝子に関して１２ＡＡの多型が見られ，このうち２つは停止であった。Ｃｅｌｅｒａの個々の読みとの比較により，停止の近傍の配列を補正することができた。選択的スプライシング型：公共ＥＳＴｓｇｉ｜９８６８７３１およびｇｉ｜９８６８６９５に見いだされるように，１つのスプライシング型においては配列ＫＲＮＡＡＳＬＧＡＧＧＰＧＤＡＧＥＶが欠失しているかもしれない。
【０３６６】
ＳＧＫ２３７（配列番号２，配列番号１４をコード）
Ｇｅｎｅｗｉｓｅオルトログ：Ｐ４１９５１およびＮＰ＿００９４１０．
ゲノムＤＮＡ起源：Ｃｅｌｅｒａ：１８１０００００１０５８６１９；ヒトゲノムプロジェクト：ＡＣ０２４９３６．
注：元のＨＭＭヒットをＣｅｌｅｒａ＿Ａｓｍ５ｇに対してｂｌａｓｔを行い，元のＨＭＭヒットをゲノムコンティグ１８１０００００１０５８６１９とアライメントさせ，そのうちの２００ｋｂをｇｅｎｅｗｉｓｅ／ｇｅｎｓｃａｎ／ｓｙｍ４予測に用いた。ＧｅｎｅｗｉｓｅはＹＬＫ３＿ＣＡＥＬをモデルとして走らせ，結果により元の配列予測を延長した。ｇｅｎｅｗｉｓｅ予測はＮＣＢＩ非重複に対するＢｌａｓｔｘにより裏付け，ＹＬＫ３＿ＣＡＥＬに対するホモロジーを確認した。ＮＣＢＩＥＳＴＡＡＡ５０７３５．１はｇｅｎｅｗｉｓｅ予測を５’方向に延長したが，ＹＬＫ３＿ＣＡＥＬに対するホモロジーは保持された。５’ＥＳＴウォーキングによってはさらなる延長はできなかった。元の２００ｋｂのゲノム配列の５’側のゲノム配列の９２ｋｂをＹＬＫ３＿ＣＡＥＬをモデルとしてｇｅｎｅｗｉｓｅ予測を用いて走らせた。このｇｅｎｅｗｉｓｅ予測は，ＯＲＦを５’方向に１１ＡＡ延長した。ｇｅｎｅｗｉｓｅによってはさらなる５’の延長は予測されず，さらなるＥＳＴヒットも見いだされなかった。Ｇｅｎｓｃａｎはゲノム配列のこの９２ｋｂのストレッチ中に５個のＣＤＳを予測した。ＣＤＳ１は炭酸水素ナトリウムコトランスポーター３の遺伝子を含み，ＳＧＫ２３７の５’境界を規定する。ＣＤＳ５はいくつかのエクソンを予測する。ＣＤＳ５は組み立てたときにＹＬＫ３＿ＣＡＥＬのＡＡ１２５（ＳＧＫ２３７のＡＡ４２）を通してＹＬＫ３＿ＣＡＥＬに対するホモロジーを有する。ＣＤＳ５はまたＥＳＴＡＡＡ５０７３５．１と重複しており，このコンティグを用いて予測を延長した。すべてのＥＳＴ配列は，Ｃｅｌｅｒａ＿Ａｓｍ５ｇおよびＨＧＰデータベースに対するｂｌａｓｔに用いる前に補正した。ＩｎｃｙｔｅＥＳＴ４５８９７２．１は予測を３’方向に延長したが，ＹＬＫ３＿ＣＡＥＬに対するホモロジーは維持された。ＧｅｎｓｃａｎＣＤＳ３は９個のエクソンを予測し，そのうち５個はＩｎｃｙｔｅＥＳＴ４５８９７２．１とアライメントし，このことは延長を裏付ける。ＩｎｃｙｔｅＥＳＴ４５８９７２．１のＥＳＴデータベースに対するＢｌａｓｔｎからは他のＥＳＴはヒットしなかった。すべてのＥＳＴ配列は，ＣｅｌｅｒａＡｓｍ５ｇおよびＨＧＰデータベースに対してｂｌａｓｔを行う前に補正した。
【０３６７】
ＳＧＫ２４８（配列番号３，配列番号１５をコード）
Ｇｅｎｅｗｉｓｅオルトログ：Ｑ６２７６１．
ゲノムＤＮＡ起源：Ｃｅｌｅｒａ：９００００６４０２４６６２３；ヒトゲノムプロジェクト：ＡＣ０６２０２３
この遺伝子は，ヒト精巣ｃＤＮＡライブラリから全長遺伝子としてクローニングされ，完全に配列決定された。遺伝子は整列遺伝子のデータベースをＢＬＡＳＴＮで検索することにより同定された。本明細書に記載される配列はこの物理学的試薬を表す。
【０３６８】
ＳＧＫ２２３（配列番号４，配列番号１６をコード）
Ｇｅｎｅｗｉｓｅオルトログ：ＡＡＦ４６１８８およびＮＰ＿０１５１１５．
ゲノムＤＮＡ起源：Ｃｅｌｅｒａ：３０１４５７０１３；ヒトゲノムプロジェクト：ＡＣ０６８３５３，ｇｉ｜ｌ０４３７１８１，ｇｉ｜９０８２３３２およびｇｉ｜８５１６０１７．
元のＨＭＭヒットをＨＧＰデータ（これに対しては長いＣｅｌｅｒａ組立物は存在しない）に対してｂｌａｓｔを行い，コンティグｇｉ｜９０８２３３２およびｇｉ｜８５１６０１７を用いた。ｇｉ｜１０４３７１８１を用いてＧｅｎｅｗｉｓｅを走らせ，その結果を重複ＥＳＴｓを用いて繰り返し延長して，ゲノム配列からのオープンリーディングフレームの長い延長を得た。用いたＥＳＴｓは以下のとおりである：Ｉｎｃｙｔｅ２３２６７５．１，２０８７７９．１および公共ＥＳＴｓｇｉ｜６７０１８０６，ｇｉ｜１２０６６４４３。ＨＧＰデータベースに対するＢｌａｓｔに用いる前にＥＳＴ配列を補正した。ほとんどの蛋白質は複雑性が低く，多くの他の蛋白質に対して２０％の同一性を有するが，ＥＳＴデータベースとの比較は，マウス，ラット，ブタおよびウシＥＳＴｓが遺伝子のほとんどをカバーする高い類似性を有することを示す。
【０３６９】
ＳＧＫ２６９（配列番号５，配列番号１７をコード）
Ｇｅｎｅｗｉｓｅオルトログ：ＡＡＦ４６１８８およびＮＰ＿０１０１８２．
ゲノムＤＮＡ起源：Ｃｅｌｅｒａ：９００００６４１９３６１６９；ヒトゲノムプロジェクト：ＡＣ０１６６９３
ｃＤＮＡ起源：Ｉｎｃｙｔｅ：３１２９１６．１，７３９４５９０Ｈ１，０４８８７８．１；ｄｂＥＳＴＶ８７１０８
【０３７０】
ＳＧＫ２５８（配列番号６，配列番号１８をコード）
Ｇｅｎｅｗｉｓｅオルトログ：Ｔ３３４７５，ＡＡＦ５５７９３およびＡＡＤ１８１０９．
ゲノムＤＮＡ起源：Ｃｅｌｅｒａ：１８１００００００８５３０４６；ヒトゲノムプロジェクト：ＡＣ０１９２５４，ＡＣ０２０５７８
ｃＤＮＡ起源：Ｉｎｃｙｔｅ７４８３３３７ＣＢ１．
【０３７１】
ＳＧＫ３８２（配列番号７，配列番号１９をコード）
Ｇｅｎｅｗｉｓｅオルトログ：ＡＡＦ４５９９５およびＮＰ＿０１３７１４．
ゲノムＤＮＡ起源：Ｃｅｌｅｒａ：９２０００００３６４７４１５；ヒトゲノムプロジェクト：ＡＰ００１８２０
注：ホモログｇｉ｜７２９０５４３およびｇｉ｜７４９６９２５を用いるＧｅｎｓｃａｎおよびｇｅｎｅｗｉｓｅを実施した。コンティグ９２０００００３６４７４１５。ｇｅｎｅｗｉｓｅの結果を延長し，重複ｃＤＮＡｇｉ｜６８４１２５３およびＥＳＴｓ，例えばｇｉ｜９３４２９０３，ｇｉ｜９１４４９１９，ｇｉ｜７１１３５９３を用いて補正した。ゲノム配列と比較することによりＥＳＴ配列を補正した。
【０３７２】
ＳＧＫ４２４（配列番号８，配列番号２０をコード）
Ｇｅｎｅｗｉｓｅオルトログ：Ｑ９１０４８およびＡＡＤ４２８５６．
ゲノムＤＮＡ起源：Ｃｅｌｅｒａ：９２０００００４０１８２６１；ヒトゲノムプロジェクト：ＡＣ００２３９８
最終的な配列は，上述したゲノム配列を用いるＧｅｎｅｓｃａｎ予測から得た。
【０３７３】
ＳＧＫ２５１（配列番号９，配列番号２１をコード）
Ｇｅｎｅｗｉｓｅオルトログ：ＮＰ＿０３１９６４．
ゲノムＤＮＡ起源：Ｃｅｌｅｒａ：９００００６４２８６１５１２；ヒトゲノムプロジェクト：Ｕ９００９３
この遺伝子はいくつかのゲノムコンティグをカバーする。マウスオルトログＥＰＨＡ６ｇｉ｜６６７９６６１遺伝子を用いて，ゲノムのマッチングフラグメントを見いだし，これは以下のコンティグ中に見いだされた：９００００６４２８６１５１２，１８１０００００１００６２０２，１８１０００００１００６２０２，ＡＣ０２３８３７．１２およびＡＣ０２１１５６．４。マウスホモログｇｉ｜６６７９６６１を用いてＧｅｎｅｗｉｓｅを走らせ，別個のｇｅｎｅｗｉｓｅフラグメントをマウスに対するホモロジーに基づいて一緒につなぎ合わせた。ＥＳＴデータベースに対するＢｌａｓｔによりｇｉ｜５３９５５７３からの３’ＵＴＲを得た。この配列をゲノムとの比較により補正し，ｉｎｃｙｔｅＥＳＴ１１３５８７９．１からＮ末端を延長して，これもゲノム配列を用いて補正した。Ｃｅｌｅｒａの読み３９００００２５４２１７５１は，オープンリーディングフレームおよびマウスｃＤＮＡとのホモロジーを保ちながら，上流に続いた。
【０３７４】
ＳＧＫ３０７（配列番号１０，配列番号２２をコード）
Ｇｅｎｅｗｉｓｅオルトログ：Ｑ９１９８７．
ゲノムＤＮＡ起源：Ｃｅｌｅｒａ：１８１０００００１８７１１０６；ヒトゲノムプロジェクト：ＡＣ０１１１９５
この遺伝子はヒト精巣ライブラリから全長遺伝子としてクローニングされた。クローンは精巣ｃＤＮＡライブラリからのプラスミドのアレイを表すデータベースのＢＬＡＳＴＮのより同定した。本明細書における配列は，この物理学的試薬の配列である。
【０３７５】
ＳＧＫ１１９（配列番号１１，配列番号２３をコード）
Ｇｅｎｅｗｉｓｅオルトログ：Ｐ５１８３９．
ゲノムＤＮＡ起源：Ｃｅｌｅｒａ：９００００６２８２５１７６４；ヒトゲノムプロジェクト：ＡＰ００１１８９
元のＨＭＭヒットをＣｅｌｅｒａＡｓｍ５ｇに対してｂｌａｓｔを行い，元のＨＭＭヒットをゲノムコンティグ９００００６２８２５１７６４とアラインメントさせた。そのうちの２００ｋｂをｇｅｎｅｗｉｓｅ／ｇｅｎｓｃａｎ／ｓｙｍ４予測に用いた。ＣＹＧＸ＿ｒをモデルとしてＧｅｎｅｗｉｓｅを走らせ，その結果，元の配列予測は８３１ＡＡまで延長された。ｇｅｎｅｗｉｓｅ予測をＮＣＢＩ非重複に対するＢｌａｓｔｘにより裏付けて，ＣＹＧＸ＿ｒに対するホモロジーを確認した。Ｇｅｎｓｃａｎ予測はＳＧＫ２４９をさらに延長することができなかった。ＧｅｎｅｗｉｓｅおよびＧｅｎｓｃａｎ予測を全ＥＳＴおよびｃＤＮＡデータベースに対してｂｌａｓｔｎを行った。いくつかのヒットが見いだされた（ＬＧｔｅｍｐｌａｔｅｓＪＡＮ２００１：ＡＡＣ４２０５７／ＬＧｃｏｍｐｓｅｑＪＡＮ２００１：７６１２３５Ｔ６および７６１２３５Ｈ１／ＣｅｌｅｒａＯＲＦ：ｈＣＴ１６４１２９４／ＮＣＢＩ＿Ｈｕｍａｎ＿ＥＳＴ：ｇｉ：１１５９８３３１）。
【０３７６】
ＳＧＫ３８７（配列番号１２，配列番号２４をコード）
Ｇｅｎｅｗｉｓｅオルトログ：ＡＡＦ４６２０７およびＡＡＤ４８７７３．
ゲノムＤＮＡ起源：Ｃｅｌｅｒａ：９００００６４１３０４２２７；ヒトゲノムプロジェクト：ＡＣ０２５２８９，ＡＣ０２６４７２
Ｇｅｎｅｗｉｓｅ予測を，ＡＢ００７８８１．１を用いて３’側に約７ｋｂ，公共ＥＳＴＢＦ３７１３１７を用いて５’側に約１５０ｂｐ延長した。ＥＳＴ配列は配列との比較により補正した。
【０３７７】
ＳＧＫ２１６，配列番号１（配列番号１３をコードする）は８４３ヌクレオチドの長さである。オープンリーディングフレームは位置１から開始し，位置８４３で終了し，８４３ヌクレオチドの長さのＯＲＦを与える。予測蛋白質は２８１アミノ酸の長さである。この配列は部分キナーゼ触媒ドメインである。これは次のように分類される（スーパーファミリー／グループ／ファミリー）：蛋白質キナーゼ，ＡＧＣ，Ｓ６Ｋ。この遺伝子は染色体位置１７ｑ２１．２−ｑ２２にマップされる。この染色体位置の増幅は以下のヒト疾病と関連づけられている：卵巣癌（位置１７ｑ２１−ｑｔｅｒ，頻度３／４７）；肝臓およびリンパ節転移（位置１７ｑ２１−ｑ２２，頻度３／１４）；乳癌腫（位置１７ｑ２２−ｑ２５，頻度８／１０１）（Ｋｎｕｕｔｉｌａ，ｅｔ　ａｌ．）。この遺伝子はマップされた候補一塩基多型を含まない。この遺伝子を表すＥＳＴはｄｂＥＳＴ中に見いだされなかった。この遺伝子はヌクレオチド位置２７１−２９１に反復配列を有する（配列：ｇａｃｃｔｇａａｇｃｃｇｇａｇａａｔａｔｃ）。
【０３７８】
ＳＧＫ２３７，配列番号２（配列番号１４をコードする）は２５６２ヌクレオチドの長さである。オープンリーディングフレームは位置１から開始し，位置２５６２で終了し，２５６２ヌクレオチドの長さのＯＲＦを与える。予測蛋白質は８５４アミノ酸の長さである。この配列は完全なキナーゼ触媒ドメインを含む。これは次のように分類される（スーパーファミリー／グループ／ファミリー）：蛋白質キナーゼ，ＣＡＭＫ，ＥＭＫ。この遺伝子は染色体位置３ｐ２４．２−ｐ２１．３にマップされる。この染色体位置はヒト疾病とは関連づけられていない。この遺伝子は２つの候補一塩基多型を含む：位置５２７（５２７＝Ｓ，ｔｇａｇｇａｃｃｃｔｇａｇａｃｃａＳ，ｄｂＳＮＰｓｓ７２７８０４）；および位置８２（８２＝Ｋ，ｔｔｃｃｔｔｇｃｔｔｃｃｔｔｇＫ，ｄｂＳＮＰｓｓ１８９１２１６）。位置５２７におけるＳＮＰはアミノ酸配列を変更する。ヌクレオチド５２７がＧであるとき，アミノ酸１７６はセリンである。ヌクレオチド５２７がＣであるとき，アミノ酸１７６はトレオニンである。位置８２におけるＳＮＰもまたアミノ酸配列を変更する。ヌクレオチド８２がＧであるとき，アミノ酸２８はグリシンである。ヌクレオチド８２がＴであるとき，アミノ酸２８はシステインである。これらの蛋白質配列の変更は，細胞内においてその活性に影響を及ぼす可能性がある。公共ドメイン（ｄｂＥＳＴ）におけるこの遺伝子のＥＳＴは次のとおりである：ＡＡ４３０２５０．１およびＡＩ１４９６４７．１。この遺伝子は上で定義した反復配列を含まない（多数遺伝子中で２１ｂｐを越える１００％マッチ）。
【０３７９】
ＳＧＫ２４８，配列番号３（配列番号１５をコードする）は１２６９ヌクレオチドの長さである。オープンリーディングフレームは位置１から開始し，位置１２６６で終了し，１２６６ヌクレオチドの長さのＯＲＦを与える。予測蛋白質は４２２アミノ酸の長さである。この配列は全長である（開始メチオニンから終止コドンまで）。これは次のように分類される（スーパーファミリー／グループ／ファミリー）：蛋白質キナーゼ，ＣＫＩ，ＣＫＩ。この遺伝子は染色体位置１５ｑ２１．３にマップされる。この染色体位置はヒト疾病と関連づけられていない。この遺伝子はマップされた候補一塩基多型を含まない。公共ドメイン（ｄｂＥＳＴ）におけるこの遺伝子のＥＳＴは次のとおりである：ＢＦ３０８８１０．１，ＢＥ７３２５２３．１，ＢＥ９００１１６．１。この遺伝子は上で定義した反復配列を含まない（多数遺伝子中で２１ｂｐを越える１００％マッチ）。いくつかのＣ末端スプライシング変種が存在する。
【０３８０】
ＳＧＫ２２３，配列番号４（配列番号１６をコードする）は，４１６９ヌクレオチドの長さである。オープンリーディングフレームは位置１から開始し，位置３７３２で終了し，３７３２ヌクレオチドの長さのＯＲＦを与える。予測蛋白質は１２４４アミノ酸の長さである。この配列は全長である（開始メチオニンから終止コドンまで）。これは次のように分類される（スーパーファミリー／グループ／ファミリー）：蛋白質キナーゼ，その他，ＡＵＲ。この遺伝子は染色体位置８ｐ２２−ｐ２３にマップされる。この染色体位置の増幅は胃癌腫と関連づけられている（位置８ｐ２２−ｐ２３，頻度３／５８）。（Ｋｎｕｕｔｉｌａ，ｅｔ　ａｌ．）。この遺伝子は２つの候補一塩基多型を含む：位置７３１（７３１＝Ｒ，ｇｃｃｃｃｃｇｇｃｃｃａｃｃｃｃｃＲ，ｄｂＳＮＰｓｓ１３７９４０７；および位置２７５７（２７５７＝Ｓ，ｇｃｃｔｇｃｃｃｔｇｃｃｃａｃａｃａＳ，ｄｂＳＮＰｓｓ１３７９４０６）。位置７３１のＳＮＰはアミノ酸配列を変更する。ヌクレオチド７３１がＡであるとき，アミノ酸２４４はグルタミンである。ヌクレオチド７３１がＧであるとき，アミノ酸２４４はアルギニンである。アルギニンは荷電しており，グルタミンは中性であるため，これは非保存的変更である。位置２７５７のＳＮＰもアミノ酸配列を変更する。ヌクレオチド２７５７がＣであるとき，アミノ酸９１９はヒスチジンである。ヌクレオチド２７５７がＧであるとき，アミノ酸９１９はグルタミンである。このアミノ酸配列の変化は細胞中の蛋白質機能を変更するかもしれない。公共ドメイン（ｄｂＥＳＴ）におけるこの遺伝子のＥＳＴは次のとおりである：ＢＦ８２０９２９．１，ＢＦ５２５６４７．１。この遺伝子は以下のヌクレオチド位置に反復配列を有する：３８５２−３８７４，（配列：ｔａａａａｔａｔａｔａａａｔａｔａｔａｔａｔａ）。
【０３８１】
ＳＧＫ２６９，配列番号５（配列番号１７をコードする）は５２４１ヌクレオチドの長さである。オープンリーディングフレームは位置１から開始し，位置５２３８で終了し，５２３８ヌクレオチドの長さのＯＲＦを与える。予測蛋白質は１７４６アミノ酸の長さである。この配列は全長である（開始メチオニンから終止コドンまで）。これは次のように分類される（スーパーファミリー／グループ／ファミリー）：蛋白質キナーゼ，その他，ＡＵＲ。この遺伝子は染色体位置１５ｑ２３にマップされる。この染色体位置の増幅は骨肉腫と関連づけられている（位置１５ｑ２３−ｑｔｅｒ，頻度１／３１）（Ｋｎｕｕｔｉｌａ，ｅｔ　ａｌ．）。この遺伝子はマップされた候補一塩基多型を含まない。公共ドメイン（ｄｂＥＳＴ）におけるこの遺伝子のＥＳＴは次のとおりである：ＡＷ８６００７１．１，ＡＷ８６２３２５．１，ＡＡ６５４７８５．１，およびＡＡ６７９２４０。この遺伝子は上で定義した反復配列を含まない（多数遺伝子中で２１ｂｐを越える１００％マッチ）。
【０３８２】
ＳＧＫ２５８，配列番号６（配列番号１８をコード）は６０４２ヌクレオチドの長さである。オープンリーディングフレームは位置１から開始し，位置６０４２で終了し，６０４２ヌクレオチドの長さのＯＲＦを与える。予測蛋白質は２０１４アミノ酸の長さである。この配列は全長である（開始メチオニンから終止コドンまで）。これは次のように分類される（スーパーファミリー／グループ／ファミリー）：蛋白質キナーゼ，その他，ＭＬＫ。この遺伝子は染色体１５にマップされる。この染色体位置は特定の疾病との関連性を割り当てるには不正確である。この遺伝子はマップされた候補一塩基多型を含まない。公共ドメイン（ｄｂＥＳＴ）におけるこの遺伝子のＥＳＴは次のとおりである：ＢＦ７９６０３０．１，ＢＦ３３３７７４．１，ＢＦ３３３８１２．１，およびＡＷ５０２９９５．１。この遺伝子は上で定義した反復配列を含まない（多数遺伝子中で２１ｂｐを越える１００％マッチ）。
【０３８３】
ＳＧＫ３８２，配列番号７（配列番号１９をコードする）は３９１５ヌクレオチドの長さである。オープンリーディングフレームは位置３５８から開始し，位置３０３６で終了し，２６７９ヌクレオチドの長さのＯＲＦを与える。予測蛋白質は８９３アミノ酸の長さである。この配列は全長である（開始メチオニンから終止コドンまで）。これは次のように分類される（スーパーファミリー／グループ／ファミリー）：蛋白質キナーゼ，その他，ユニーク。この遺伝子は染色体位置４ｑ２４にマップされる。この染色体位置は精巣癌と関連づけられている（位置１４ｑ１２−ｑｔｅｒ，頻度２／１１）（Ｋｎｕｕｔｉｌａ，ｅｔ　ａｌ．）。この遺伝子は次の位置に２つの候補一塩基多型を含む：位置３４８４（３４８４＝Ｒ，ａａｃｔｇａｇａａａｃｔａｔｔｃａｃａａｔｇｃＲ，ｄｂＳＮＰｓｓ１２５２；および位置３３３６（３３３６＝Ｗ，ａｃａａｇａｃａｇａｔｔｔａｇｃａｔｔＷ，ｄｂＳＮＰｓｓ１５１２７０２）。いずれのＳＮＰも遺伝子の３’非翻訳領域中にある。公共ドメイン（ｄｂＥＳＴ）におけるこの遺伝子のＥＳＴは次のとおりである：ＢＥ２７１２６７．１，ＢＥ５１３２８４．１，ＡＡ７０２１６０．１，ＡＩ８０８７６１．１。この遺伝子は以下のヌクレオチド位置に反復配列を有する：３５４０−３５５９，（配列ｇｔｇｔｇｔｇｔｇｔｇｔｇｔｇｔｇｔａｔ）。
【０３８４】
ＳＧＫ４２４，配列番号８（配列番号２０をコードする）は１６８３ヌクレオチドの長さである。オープンリーディングフレームは位置１から開始し，位置１６８０で終了し，１６８０ヌクレオチドの長さのＯＲＦを与える。予測蛋白質は５６０アミノ酸の長さである。この配列は全長である（開始メチオニンから終止コドンまで）。これは次のように分類される（スーパーファミリー／グループ／ファミリー）：蛋白質キナーゼ，その他，ユニーク。この遺伝子は染色体位置１９ｑ１２−ｑ１３．３にマップされる。この染色体位置の増幅は小細胞癌と関連づけられている（位置１９ｑ１３．１，頻度１０／３５）（Ｋｎｕｕｔｉｌａ，ｅｔ　ａｌ．）。この遺伝子はマップされた候補一塩基多型を含まない。公共ドメイン（ｄｂＥＳＴ）にはこの遺伝子のＥＳＴは見いだされなかった。この遺伝子は上で定義した反復配列を含まない（多数遺伝子中で２１ｂｐを越える１００％マッチ）。
【０３８５】
ＳＧＫ２５１，配列番号９（配列番号２１をコードする）は３９０３ヌクレオチドの長さである。オープンリーディングフレームは位置２８０から開始し，位置３３８７で終了し，３１０８ヌクレオチドの長さのＯＲＦを与える。予測蛋白質は１０３６アミノ酸の長さである。この配列は全長である（開始メチオニンから終止コドンまで）。これは次のように分類される（スーパーファミリー／グループ／ファミリー）：蛋白質キナーゼ，ＴＫ，ＲＴＫ−１１。この遺伝子は染色体１１にマップされる。この染色体位置は特定の疾病との関連性を割り当てるには不正確である。この遺伝子はマップされた候補一塩基多型を含まない。ｄｂＥＳＴにはこの遺伝子のＥＳＴは見いだされなかった。この遺伝子は以下のヌクレオチド位置に反復配列を有する：１５９−１８７；（配列：ｇｇａｇｇａｇｇａａｇａｇｇａｇｇａｇｇａｇｇａａｇａａｇ）。
【０３８６】
ＳＧＫ３０７，配列番号１０（配列番号２２をコードする）は４７３９ヌクレオチドの長さである。オープンリーディングフレームは位置１２３から開始し，位置４４０６で終了し，４２８４ヌクレオチドの長さのＯＲＦを与える。予測蛋白質は１４２８アミノ酸の長さである。この配列は全長である（開始メチオニンから終止コドンまで）。これは次のように分類される（スーパーファミリー／グループ／ファミリー）：蛋白質キナーゼ，ＴＫ，ユニーク。この遺伝子は染色体位置１７ｑ２１．２−ｑ２２にマップされる。この染色体位置の増幅は卵巣癌と関連づけられている（位置１７ｑ２１−ｑｔｅｒ，頻度３／４７）（Ｋｎｕｕｔｉｌａ，ｅｔ　ａｌ．）。この遺伝子は位置２４６０に候補一塩基多型を含む（２４６０＝Ｒ，ａｃｔｔｃａａｇａｇａｇｔｔｔａｃａＲ，ｄｂＳＮＰｓｓ１９２８２７５）。このＳＮＰは蛋白質のアミノ酸配列を変更する。ヌクレオチド２４６０がＡであるとき，アミノ酸７８０はアスパラギンである。ヌクレオチド２４６０がＧであるとき，アミノ酸７８０はアスパラギン酸である。このアミノ酸組成の非保存的変更は，コードされる蛋白質の機能を変更する可能性がある。公共ドメイン（ｄｂＥＳＴ）におけるこの遺伝子のＥＳＴは次のとおりである：ＡＬ０４０７３９．１，ＡＬ０４０７３８．１，ＡＩ０６６７３２．１。この遺伝子は上で定義した反復配列を含まない（多数遺伝子中で２１ｂｐを越える１００％マッチ）。
【０３８７】
ＳＧＫ１１９，配列番号１１（配列番号２３をコードする）は８１９ヌクレオチドの長さである。オープンリーディングフレームは位置１から開始し，位置８１９で終了し，８１９ヌクレオチドの長さのＯＲＦを与える。予測蛋白質は２７３アミノ酸の長さである。この配列は部分キナーゼ触媒ドメインである。これは次のように分類される（スーパーファミリー／グループ／ファミリー）：ＰＫ様，ＧＣｙｃ，ＧＣｙｃ。この遺伝子は染色体位置１１ｑ１４にマップされる。この染色体位置を含む増幅は膀胱癌腫と関連づけられている（位置１１ｑ１４−ｑ２２，頻度１／１６）（Ｋｎｕｕｔｉｌａ，ｅｔ　ａｌ．）。この遺伝子はマップされた候補一塩基多型を含まない。公共ドメイン（ｄｂＥＳＴ）中でこの遺伝子のＥＳＴが１つ同定された：ＢＦ５１３１５２．１。この遺伝子は上で定義した反復配列を含まない（多数遺伝子中で２１ｂｐを越える１００％マッチ）。
【０３８８】
ＳＧＫ３８７，配列番号１２（配列番号２４をコードする）は５７３６ヌクレオチドの長さである。オープンリーディングフレームは位置１から開始し，位置５７３３で終了し，５７３３ヌクレオチドの長さのＯＲＦを与える。予測蛋白質は１９１１アミノ酸の長さである。この配列は全長である（開始メチオニンから終止コドンまで）。これは次のように分類される（スーパーファミリー／グループ／ファミリー）：ＰＫ様，イノシトールキナーゼ，ＰＩ３Ｋ。この遺伝子は染色体１６にマップされる。この染色体位置は特定の疾病との関連性を割り当てるには不正確である。この遺伝子はマップされた候補一塩基多型を含まない。公共ドメイン（ｄｂＥＳＴ）におけるこの遺伝子のＥＳＴは次のとおりである：ＢＦ０８６８１１．１；ＢＥ６９４３５１．１；ＡＩ０５０７１７．１。この遺伝子は上で定義した反復配列を含まない（多数遺伝子中で２１ｂｐを越える１００％マッチ）。
【０３８９】
実施例２：本発明のポリペプチドの発現分析
発現分析
選択された遺伝子についての遺伝子発現パターンを，４８のヒト組織のＰＣＲスクリーニング（この手法では組織間の定量的発現レベルは得られないが，ＰＣＲにより検出可能なレベルで遺伝子を発現する組織ならびに遺伝子をそのようなレベルで発現しない組織を同定することができる）を用いて調べた。
【０３９０】
ＰＣＲスクリーニング：
ＰＣＲによるｄｓｃＤＮＡテンプレートからの発現源についてのスクリーニング
種々の起源からのｃＤＮＡのＰＣＲスクリーニングにより，目的とする遺伝子を発現する組織を同定することができる。我々は，４８種類の異なるヒトｃＤＮＡ起源を遺伝子発現についてスクリーニングした。遺伝子は以下のとおりである：ＳＧＫ２６９（配列番号５）；ＳＧＫ３０７（配列番号１０）；およびＳＧＫ３８７（配列番号１２）。表５の第１欄に示される４８種類の組織および細胞株は以下のとおりである：胎児肝臓，胸腺，膵臓，下垂体，胎盤，前立腺，唾液腺，骨格筋，小腸，脊髄，脾臓，胃−ｈ，甲状腺，気管，子宮，副腎，胎児脳，胎児腎臓，胎児肺，心臓，腎臓，肝臓，肺，リンパ節，心臓，ＨＰＡＥＣ，ＲＰＴＥＣ，ＨＭＥＣ，ＨＣＡＥＣ，４５８ｍｅｄｕｌｌｏＲＮＡ，Ａ５４９／ＡＴＣＣ，ＭＤＡ−ＭＢ−２３１，Ｈｓ５７８Ｔ，ＭＣＦ−７／ＡＤＲＲＥＳ，Ｍａｌｍｅ−３Ｍ，Ａ４９８，ＣＯＬＯ２０５，ＣＣＲＦ−ＣＥＭ，ＳＦ−５３９，ＳＦ−２９５，Ｕ２５１，ＳＮＢ−１９，ＯＶＣＡＲ−４，ＯＶＣＡＲ−３，ＴＣＧＰ，ＨＭＥＣ，ＨＯＰ−６２，ＮＣＩ−Ｈ５２２。
【０３９１】
ｄｓｃＤＮＡテンプレートの調製
ｄｓｃＤＮＡテンプレートは，組織アレイ遺伝子発現プロトコルの材料および方法に詳細に記載されるように作成した対称タグ付けリバーストランスクリプターゼのｓｓｃＤＮＡ産物のＰＣＲ増幅により調製した。増幅した組織起源は，表５に示される。増幅条件は以下のとおりであった：２００μｌのＰＣＲ反応につき，１００μｌのＰｒｅｍｉｘＴａＫａＲａＥｘＴａｑ，２０．０μｌのｐｗｏＤＮＡポリメラーゼ（１／１０希釈，以下のように作成：１μｌ　ｐｗｏ（５ユニット／μｌ），１μｌ　１０ｘＰＣＲ緩衝液（２０ｍＭＭｇＳＯ４，８μｌ水），４．０μｌのｓｓｃＤＮＡテンプレート（リバーストランスクリプターゼ生成物），８．０μｌの１０ｐｍｏｌｅｓ／μｌ（１０μＭ）プライマー（ＡＡＧＣＡＧＴＧＧＴＡＡＣＡＡＣＧＣＡＧＡＧＴ）（１．０μＭ最終濃度）および６８．０μｌのＨ２Ｏを加えた。反応は以下の方法にしたがって増幅した：高温で開始（９５℃，１分間），９５℃で１分間，２４サイクル，９５℃で２０秒間，６５℃で３０秒間，６８℃で６分間，６８℃で１０分間，１サイクルおよび以後４℃。ＰＣＲ反応の後，５−１０μｌの生成物を１ｋｂラダーサイズ標準とともにアガロースゲルに負荷して，生成物の収率と均一性を評価した。表中のプラスの記号（＋）は，予測サイズにＰＣＲ産物が存在することを示す。産物は切り出して配列を確認した。
【０３９２】
ｃＤＮＡ起源をスクリーニングするために用いたオリゴヌクレオチドおよびＰＣＲ産物のサイズは以下のとおりである：
ＳＧＫ２６９
５’ＣＡＧＧＴＧＴＧＴＣＴＧＣＴＧＣＴＣＴＴＡＣＡＧＣ
３’ＣＧＧＴＧＣＴＧＣＡＧＡＡＴＴＴＴＣＡＣＡＡＴＡＣ
サイズ：７１５ｂｐ
ＳＧＫ３０７
５’ＣＡＧＣＡＧＣＧＧＴＣＣＣＡＧＴＴＣＣＣＡＧ
３’ＧＴＡＡＧＣＡＧＡＡＡＴＡＡＡＣＴＣＣＣＡＡＣＡＡＣ
サイズ：５７０ｂｐ
ＳＧＫ３８７
５’ＧＣＧＣＣＴＧＣＴＧＣＧＧＴＴＧＣＴＣＧＴＧＡＡＧ
３’ＣＡＣＣＡＧＡＧＧＧＴＣＧＴＡＣＡＣＡＡＡＧＧＣＣ
サイズ：１．７１ｋｂ
【０３９３】
結果
ＳＧＫ２６９（配列番号５）は，ＰＣＲにより以下のヒト組織／細胞株から同定することに成功した：胸腺，膵臓，胎盤，前立腺，唾液腺，骨格筋，小腸，脊髄，脾臓，胃，気管，子宮，副腎，胎児脳，胎児腎臓，心臓，ＨＰＡＥＣ，ＨＭＥＣ，ＨＣＡＥＣ，４５８髄質ＲＮＡ，Ａ５４９／ＡＴＣＣ，ＭＤＡ−ＭＢ−２３１，Ｈｓ５７８Ｔ，ＭＣＦ−７／ＡＤＲ−ＲＥＳ，Ｍａｌｍｅ−３Ｍ，ＣＯＬＯ２０５，ＣＣＲＦ−ＣＥＭ，ＳＦ−５３９，ＳＦ−２９５，Ｕ２５１，ＳＮＢ−１９，ＯＶＣＡＲ−４，ＯＶＣＡＲ３，ＨＯＰ−６２。この遺伝子は腫瘍および正常組織において広く発現されている。
【０３９４】
ＳＧＫ３０７（配列番号１０）は，ＰＣＲにより以下のヒト組織／細胞株から同定することに成功した：唾液腺，リンパ節，ＣＣＲＦ−ＣＥＭ白血病細胞株。このパターンは，この遺伝子が造血機能または免疫機能において役割を有するかもしれないことを示唆する。
【０３９５】
ＳＧＫ３８７（配列番号１２）は，ＰＣＲにより以下のヒト腫瘍由来細胞株から同定することに成功した：ＭＣＦ−７／ＡＤＲ−ＲＥＳ，ＣＯＬＯ２０５，ＣＣＲＦＣＥＭ，ＳＦ−５３９，ＳＦ−２９５，Ｕ２５１，およびＳＮＢ−１９。発現は腫瘍由来細胞株に限定されており，このことは，この遺伝子がヒト癌において役割を果たすかもしれないことを示唆する。
【０３９６】
実施例３：蛋白質キナーゼの染色体位置
材料および方法
いくつかの情報源を用いて，本明細書に記載される遺伝子のそれぞれの染色体上の位置に関する情報を得た。最初に，これらのコンティグの細胞遺伝学マップ位置をそのＧｅｎｂａｎｋの記録の表題またはテキストから見いだすか，またはＮＣＢＩヒトゲノムマップビュワーにより調査した（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／Ｅｎｔｒｅｚ／ｈｕｍ＿ｓｒｃｈ？）。あるいは，ゲノムコンティグ（ＮＲＮＡに対するＢＬＡＳＴ　により同定）の受託番号を用いて，Ｅｎｔｒｅｚ　Ｇｅｎｏｍｅ　Ｂｒｏｗｓｅｒ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＰＭＧｉｆｓ／Ｇｅｎｏｍｅｓ／ＭａｐＶｉｅｗｅｒＨｅｌｐ．ｈｔｍｌ）をクエリーし，ＮＣＢＩデータから細胞遺伝学的位置を読んだ。また，細胞遺伝学的領域についての入手可能な文献の徹底的な検索は，Ｍｅｄｌｉｎｅ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＰｕｂＭｅｄ／ｍｅｄｌｉｎｅ．ｈｔｍｌ）を用いて行う。マップされた部位とヒト癌において見いだされる染色体異常との関連についての参考文献は，Ｋｎｕｕｔｉｌａ，ｅｔ　ａｌ．，Ａｍ　Ｊ　Ｐａｔｈｏｌ，１９９８，１５２：１１０７−１１２３に見いだすことができる。
【０３９７】
結果
マップされた遺伝子の染色体領域は表２に示され，上述の核酸の節で議論される。染色体位置は，多くのヒト疾病，例えば癌の遺伝的情報を追跡するｔｈｅ　Ｏｎｌｉｎｅ　Ｍｅｎｄｅｌｉａｎ　Ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ　ｉｎ　Ｍａｎデータベース（ＯＭＩＭ，ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｈｔｂｉｎ−ｐｏｓｔＯｍｉｍ）を用いてクロスチェックした。マップされた部位とヒト癌に見いだされる染色体異常との関連についての参考文献は，Ｋｎｕｕｔｉｌａ，　ｅｔ　ａｌ．，ＡｍＪ．Ｐａｔｈｏｌ，１９９８，１５２：１１０７−１１２３に見いだすことができる。マップされた位置についての第３の情報源は，マップされた位置とヒト疾病との関連性を記載する，公表された文献（ＮＣＢＩ，ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｅｎｔｒｅｚ／ｑｕｅｒｙ．ｆｃｇｉ）の検索であった。
【０３９８】
実施例４：一塩基多型（ＳＮＰｓ）候補
材料および方法
ヒトＤＮＡにおける最も一般的な変種は一塩基多型（ＳＮＰｓ）であり，これは，約１００−３００塩基に１回生ずる。ＳＮＰｓは大規模の関連遺伝学研究を容易にすると予測されているため，最近，ＳＮＰの発見および検出に多大な興味がもたれている。本明細書に記載される遺伝子の候補ＳＮＰｓは，核酸配列を公共のデータベースに記録されているＳＮＰｓを含む配列に対してｂｌａｓｔｎ検索することにより同定した（ｄｂＳＮＰ，ＮＣＢＩ，ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＳＮＰ／ｓｎｐｂｌａｓｔｐｒｅｔｔｙ．ｈｔｍｌ）。ＳＮＰ含有配列についてｄｂＳＮＰ受託番号が与えられている。ＳＮＰｓはまた，発現遺伝子（ｄｂＥＳＴ，ＮＲＮＡ）およびゲノム配列（すなわちＮＲＮＡ）のいくつかのデータベースを一塩基対ミスマッチについて比較することにより同定した。結果は，表１の”ＳＮＰｓ”のカラムに示される。これらは候補ＳＮＰｓである。ヒト集団におけるこれらの実際の頻度は決定していない。以下のコードはそれぞれのＤＮＡ配列を表す：
【０３９９】
Ｇ＝グアノシン
Ａ＝アデノシン
Ｔ＝チミジン
Ｃ＝シチジン
Ｒ＝ＧまたはＡ，（プリン）
Ｙ＝ＣまたはＴ，（ピリミジン）
Ｋ＝ＧまたはＴ，（ケト）
Ｗ＝ＡまたはＴ，（弱）（２つの水素結合）
Ｓ＝ＣまたはＧ，（強）（３つの水素結合）
Ｍ＝ＡまたはＣ，（アミノ）
Ｂ＝Ｃ，ＧまたはＴ（すなわち，Ａ以外）
Ｄ＝Ａ，ＧまたはＴ（すなわち，Ｃ以外）
Ｈ＝Ａ，ＣまたはＴ（すなわち，Ｇ以外）
Ｖ＝Ａ，ＣまたはＧ（すなわち，Ｔ以外）
Ｎ＝Ａ，Ｃ，ＧまたはＴ，（任意）
Ｘ＝Ａ，Ｃ，ＧまたはＴ
相補的ＤＮＡ鎖
ＧＡＴＣＲＹＷＳＫＭＢＶＤＨＮＸ
＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋
ＣＴＡＧＹＲＳＷＭＫＶＢＨＤＮＸ
例えば，２つのバージョンの遺伝子が存在し，一方は所定の位置に”Ｃ”を有し，他方は同じ位置に”Ｔ”を有する場合，その位置はＹと表され，これはＣまたはＴを意味する。ＳＮＰｓは，遺伝子に付随する遺伝性の特徴を同定するために重要であろう。
【０４００】
結果
ＳＮＰの同定の結果は，上述の核酸の節において説明される。
【０４０１】
実施例５：予測蛋白質
ＳＧＫ２１６（配列番号１）は，２８１アミノ酸の長さの蛋白質である配列番号１３をコードする。これは次のように分類される（スーパーファミリー／グループ／ファミリー）：蛋白質キナーゼ，ＡＧＣ，Ｓ６Ｋ。この蛋白質中のキナーゼドメインは，２６１アミノ酸の全長キナーゼドメインについてプロファイル位置１５からプロファイル位置２６１の隠れマルコフプロファイルとマッチする。コードされる蛋白質中のキナーゼ触媒領域の位置はアミノ酸４からアミノ酸２２４である。この蛋白質配列でアミノ酸配列の公共データベース（ＮＲＡＡ）のスミスウォーターマン検索を行ったところ以下の結果が得られた：Ｐスコア＝１．４０Ｅ−１０５；同一のアミノ酸の数＝２７１；パーセント同一性＝９６％；パーセント類似性＝９９％；ＮＲＡＡ中の最も類似する登録物の受託番号はＮＰ＿００３１５２．１である；ＮＲＡＡ中の最も類似する蛋白質の名前または説明および種は次のとおりである：リボソーム蛋白質Ｓ６キナーゼ，７０ｋＤ，ポリペプチド１；セリン／トレオニンキナーゼ１４アルファ［Ｈｏｍｏ　ｓａｐｉｅｎｓ］。この蛋白質中で同定されたキナーゼ触媒ドメイン以外のドメインは次のとおりである：蛋白質キナーゼＣ末端ドメイン，アミノ酸位置２２５−２７８。
【０４０２】
ＳＧＫ２３７（配列番号２）は，８５４アミノ酸の長さの蛋白質である配列番号１４をコードする。これは次のように分類される（スーパーファミリー／グループ／ファミリー）：蛋白質キナーゼ，ＣＡＭＫ，ＥＭＫ。この蛋白質中のキナーゼドメインは，２６１アミノ酸の全長キナーゼドメインについてプロファイル位置１からプロファイル位置２６１の隠れマルコフプロファイルとマッチする。コードされる蛋白質中のキナーゼ触媒領域の位置はアミノ酸３７０からアミノ酸６３６である。この蛋白質配列でアミノ酸配列の公共データベース（ＮＲＡＡ）のスミスウォーターマン検索を行ったところ以下の結果が得られた：Ｐスコア＝４．８０Ｅ−７１；同一のアミノ酸の数＝２２７；パーセント同一性＝４０％；パーセント類似性＝６１％；ＮＲＡＡ中の最も類似する登録物の受託番号はＰ４１９５１である；ＮＲＡＡ中の最も類似する蛋白質の名前または説明および種は次のとおりである：ＳＴＫＤ１０４４．３［Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ］。この蛋白質中で同定されたキナーゼ触媒ドメイン以外のドメインは次のとおりである：アルマジロ／ベータ−カテニン様反復（２）：アミノ酸７８−１１８＆１３１−１７１。
【０４０３】
ＳＧＫ２４８（配列番号３）は，４２２アミノ酸の長さの蛋白質である配列番号１５をコードする。これは次のように分類される（スーパーファミリー／グループ／ファミリー）：蛋白質キナーゼ，ＣＫＩ，ＣＫＩ。この蛋白質中のキナーゼドメインは，２６１アミノ酸の全長キナーゼドメインについてプロファイル位置１からプロファイル位置２６１の隠れマルコフプロファイルとマッチする。コードされる蛋白質中のキナーゼ触媒領域の位置はアミノ酸４４からアミノ酸２９９である。この蛋白質配列でアミノ酸配列の公共データベース（ＮＲＡＡ）のスミスウォーターマン検索を行ったところ以下の結果が得られた：Ｐスコア＝６．８０Ｅ−１９５；同一のアミノ酸の数＝４２２；パーセント同一性＝１００％；パーセント類似性＝１００％；ＮＲＡＡ中の最も類似する登録物の受託番号はＢＡＢ１７８３９．１である；ＮＲＡＡ中の最も類似する蛋白質の名前または説明および種は次のとおりである：カゼインキナーゼ１，ガンマ１［Ｈｏｍｏ　ｓａｐｉｅｎｓ］。
【０４０４】
ＳＧＫ２２３（配列番号４）は，１２４４アミノ酸の長さの蛋白質である配列番号１６をコードする。これは次のように分類される（スーパーファミリー／グループ／ファミリー）：蛋白質キナーゼ，その他，ＡＵＲ。この蛋白質中のキナーゼドメインは，２６１アミノ酸の全長キナーゼドメインについてプロファイル位置３４からプロファイル位置１３４の隠れマルコフプロファイルとマッチする。コードされる蛋白質中のキナーゼ触媒領域の位置はアミノ酸８５７からアミノ酸９９４である。この蛋白質配列でアミノ酸配列の公共データベース（ＮＲＡＡ）のスミスウォーターマン検索を行ったところ以下の結果が得られた：Ｐスコア＝３．４０Ｅ−４３；同一のアミノ酸の数＝１５９；パーセント同一性＝５０％；パーセント類似性＝６５％；ＮＲＡＡ中の最も類似する登録物の受託番号はＢＡＢ１５００６．１である；ＮＲＡＡ中の最も類似する蛋白質の名前または説明および種は次のとおりである：（ＡＫ０２４７９３）非命名蛋白質産物［Ｈｏｍｏ　ｓａｐｉｅｎｓ］。
【０４０５】
ＳＧＫ２６９（配列番号５）は，１７４６アミノ酸の長さの蛋白質である配列番号１７をコードする。これは次のように分類される（スーパーファミリー／グループ／ファミリー）：蛋白質キナーゼ，その他，ＡＵＲ。この蛋白質中のキナーゼドメインは，２６１アミノ酸の全長キナーゼドメインについてプロファイル位置１６９からプロファイル位置２６１の隠れマルコフプロファイルとマッチする。コードされる蛋白質中のキナーゼ触媒領域の位置はアミノ酸１５７７からアミノ酸１６６６である。この蛋白質配列でアミノ酸配列の公共データベース（ＮＲＡＡ）のスミスウォーターマン検索を行ったところ以下の結果が得られた：Ｐスコア＝１．６０Ｅ−１６６；同一のアミノ酸の数＝３２９；パーセント同一性＝１００％；パーセント類似性＝１００％；ＮＲＡＡ中の最も類似する登録物の受託番号はＢＡＢ１５００６．１である；ＮＲＡＡ中の最も類似する蛋白質の名前または説明および種は次のとおりである：（ＡＫ０２４７９３）非命名蛋白質産物［Ｈｏｍｏ　ｓａｐｉｅｎｓ］。
【０４０６】
ＳＧＫ２５８（配列番号６）は，２０１４アミノ酸の長さの蛋白質である配列番号１８をコードする。これは次のように分類される（スーパーファミリー／グループ／ファミリー）：蛋白質キナーゼ，その他，ＭＬＫ。この蛋白質中のキナーゼドメインは，２６１アミノ酸の全長キナーゼドメインについてプロファイル位置１からプロファイル位置２６１の隠れマルコフプロファイルとマッチする。コードされる蛋白質中のキナーゼ触媒領域の位置はアミノ酸１２８０からアミノ酸１５６３である。この蛋白質配列でアミノ酸配列の公共データベース（ＮＲＡＡ）のスミスウォーターマン検索を行ったところ以下の結果が得られた：Ｐスコア＝２．５０Ｅ−１０４；同一のアミノ酸の数＝２５３；パーセント同一性＝１００％；パーセント類似性＝１００％；ＮＲＡＡ中の最も類似する登録物の受託番号はＢＡＢ１５５４７．１である；ＮＲＡＡ中の最も類似する蛋白質の名前または説明および種は次のとおりである：（ＡＫ０２６７７２）非命名蛋白質産物［Ｈｏｍｏ　ｓａｐｉｅｎｓ］。この蛋白質中で同定されたキナーゼ触媒ドメイン以外のドメインは次のとおりである：ロイシンリッチ反復（１２）：２７８−３０１；３０２−３２３；３２９−３５１；３５２−３７３；３８０４０３；４０４−４２５；４５０−４７２；４７３−４９４；４９７−５１９；５７６−５９８；５９９−６２２；１２２２−１２４４。
【０４０７】
ＳＧＫ３８２（配列番号７）は，８９３アミノ酸の長さの蛋白質である配列番号１９をコードする。これは次のように分類される（スーパーファミリー／グループ／ファミリー）：蛋白質キナーゼ，その他，ユニーク。この蛋白質中のキナーゼドメインは，２６１アミノ酸の全長キナーゼドメインについてプロファイル位置１からプロファイル位置２６１の隠れマルコフプロファイルとマッチする。コードされる蛋白質中のキナーゼ触媒領域の位置はアミノ酸１８からアミノ酸２７３である。この蛋白質配列でアミノ酸配列の公共データベース（ＮＲＡＡ）のスミスウォーターマン検索を行ったところ以下の結果が得られた：Ｐスコア＝１．８０Ｅ−２００；同一のアミノ酸の数＝４８３；パーセント同一性＝９５％；パーセント類似性＝９５％；ＮＲＡＡ中の最も類似する登録物の受託番号はＡＡＦ２８９８０．１である；ＮＲＡＡ中の最も類似する蛋白質の名前または説明および種は次のとおりである：：ＨＳＰＣ３０２［Ｈｏｍｏ　ｓａｐｉｅｎｓ］。この蛋白質中で同定されたキナーゼ触媒ドメイン以外のドメインは次のとおりである：ＴＢＣドメイン，アミノ酸４６３−６７３；ローダナーゼ様ドメイン，アミノ酸７７６−８８３。ＴＢＣドメインがｒａｂ−１ＧＡＰｓに見いだされる（ＧＹＰ６＿ＹＥＡＳＴおよびＧＹＰ７＿ＹＥＡＳＴ，一般に小さい蛋白質であるが，１つの虫の蛋白質はこれと２つのキナーゼドメインを含む）。ローダナーゼドメインはローダナーゼおよびいくつかのホスファターゼおよびユビキチンＣ末端ヒドロラーゼに見いだされる。
【０４０８】
ＳＧＫ４２４（配列番号８）は，５６０アミノ酸の長さの蛋白質である配列番号２０をコードする。これは次のように分類される（スーパーファミリー／グループ／ファミリー）：蛋白質キナーゼ，その他，ユニーク。この蛋白質中のキナーゼドメインは，２６１アミノ酸の全長キナーゼドメインについてプロファイル位置１７３からプロファイル位置２６１の隠れマルコフプロファイルとマッチする。コードされる蛋白質中のキナーゼ触媒領域の位置はアミノ酸４２０からアミノ酸４９６である。この蛋白質配列でアミノ酸配列の公共データベース（ＮＲＡＡ）のスミスウォーターマン検索を行ったところ以下の結果が得られた：Ｐスコア＝０．９８８７６４；同一のアミノ酸の数＝２３；パーセント同一性＝３５％；パーセント類似性＝６０％；ＮＲＡＡ中の最も類似する登録物の受託番号はＮＰ＿００２８１２．１である；ＮＲＡＡ中の最も類似する蛋白質の名前または説明および種は次のとおりである：ＰＴＫ７蛋白質チロシンキナーゼ７［Ｈｏｍｏ　ｓａｐｉｅｎｓ］。
【０４０９】
ＳＧＫ２５１（配列番号９）は，１０３６アミノ酸の長さの蛋白質である配列番号２１をコードする。これは次のように分類される（スーパーファミリー／グループ／ファミリー）：蛋白質キナーゼ，ＴＫ，ＲＴＫ−１１。この蛋白質中のキナーゼドメインは，２６１アミノ酸の全長キナーゼドメインについてプロファイル位置１からプロファイル位置２６１の隠れマルコフプロファイルとマッチする。コードされる蛋白質中のキナーゼ触媒領域の位置はアミノ酸６３１からアミノ酸９３０である。この蛋白質配列でアミノ酸配列の公共データベース（ＮＲＡＡ）のスミスウォーターマン検索を行ったところ以下の結果が得られた：Ｐスコア＝０；同一のアミノ酸の数＝１００２；パーセント同一性＝９７％；パーセント類似性＝９９％；ＮＲＡＡ中の最も類似する登録物の受託番号はＮＰ＿０３１９６４．１である；ＮＲＡＡ中の最も類似する蛋白質の名前または説明および種は次のとおりである：ＥｐｈレセプターＡ６［Ｍｕｓ　ｍｕｓｃｕｌｕｓ］。この蛋白質中で同定されたキナーゼ触媒ドメイン以外のドメインは次のとおりである：エフィリンレセプターリガンド結合ドメイン，アミノ酸３４−２０７；フィブロネクチンタイプＩＩＩドメイン（２）：アミノ酸３３２−４２５＆４４０−５２７；ＳＡＭドメイン（ステライルアルファモチーフ），アミノ酸９５９−１０２３。
【０４１０】
ＳＧＫ３０７（配列番号１０）は，１４２８アミノ酸の長さの蛋白質である配列番号２２をコードする。これは次のように分類される（スーパーファミリー／グループ／ファミリー）：蛋白質キナーゼ，ＴＫ，ユニーク。この蛋白質中のキナーゼドメインは，２６１アミノ酸の全長キナーゼドメインについてプロファイル位置２９からプロファイル位置１２４の隠れマルコフプロファイルとマッチする。コードされる蛋白質中のキナーゼ触媒領域の位置はアミノ酸２６６からアミノ酸３６９である。この蛋白質配列でアミノ酸配列の公共データベース（ＮＲＡＡ）のスミスウォーターマン検索を行ったところ以下の結果が得られた：Ｐスコア＝０．０００１６１；同一のアミノ酸の数＝４９；パーセント同一性＝３１％；パーセント類似性＝５２％；ＮＲＡＡ中の最も類似する登録物の受託番号はＮＰ＿０５７０６２．１である；ＮＲＡＡ中の最も類似する蛋白質の名前または説明および種は次のとおりである：予測蛋白質−チロシンキナーゼ［Ｈｏｍｏ　ｓａｐｉｅｎｓ］。この蛋白質中で同定されたキナーゼ触媒ドメイン以外のドメインは次のとおりである：アンキリン（２），アミノ酸５５−８７＆８８−１２０。
【０４１１】
ＳＧＫ１１９（配列番号１１）は，２７３アミノ酸の長さの蛋白質である配列番号２３をコードする。これは次のように分類される（スーパーファミリー／グループ／ファミリー）：ＰＫ様，ＧＣｙｃ，ＧＣｙｃｌ。この蛋白質は蛋白質キナーゼファミリーに関連するが，実質的に異なる触媒領域を有する。この蛋白質配列でアミノ酸配列の公共データベース（ＮＲＡＡ）のスミスウォーターマン検索を行ったところ以下の結果が得られた：Ｐスコア＝２．３０Ｅ−１２６；同一のアミノ酸の数＝２１５；パーセント同一性＝７９％；パーセント類似性＝８８％；ＮＲＡＡ中の最も類似する登録物の受託番号はＰ５１８３９である；ＮＲＡＡ中の最も類似する蛋白質の名前または説明および種は次のとおりである：オルファクトリーグアニリルシクラーゼＧＣ−Ｄ［Ｒａｔｔｕｓ　ｎｏｒｖｉｅｇｉｃｕｓ］。ＰＦＡＭ検索によりこの蛋白質中で同定されたグアニル酸シクラーゼ触媒ドメインは，アミノ酸８９と２７３との間に位置する。
【０４１２】
ＳＧＫ３８７（配列番号１２）は，１９１１アミノ酸の長さの蛋白質である配列番号２４をコードする。これは次のように分類される（スーパーファミリー／グループ／ファミリー）：ＰＫ様，イノシトールキナーゼ，ＰＩ３Ｋ。この蛋白質は蛋白質キナーゼファミリーに関連するが，実質的に異なる触媒領域を有する。この蛋白質配列でアミノ酸配列の公共データベース（ＮＲＡＡ）のスミスウォーターマン検索を行ったところ以下の結果が得られた：Ｐスコア＝０；同一のアミノ酸の数＝１３０２；パーセント同一性＝１００％；パーセント類似性＝１００％；ＮＲＡＡ中の最も類似する登録物の受託番号はＢＡＡ２４８５１．１である；ＮＲＡＡ中の最も類似する蛋白質の名前または説明および種は次のとおりである：（ＡＢ００７８８１）ＫＩＡＡ０４２１［Ｈｏｍｏ　ｓａｐｉｅｎｓ］。ＰＦＡＭ検索により同定されたホスファチジルイノシトール３−および４−キナーゼドメインは，アミノ酸４０８−６７７に位置する。ＰＦＡＭ検索により同定されたＦＡＴＣドメインはアミノ酸１８７９と１９１１との間に位置する。
【０４１３】
実施例６：キナーゼ活性を示すポリペプチドの定義されたグループへの分類
ＡＧＣグループ
新規ＡＧＣグループ蛋白質キナーゼの潜在的な生物学的および臨床的関連性を以下に記載する。
【０４１４】
部分ＳＧＫ２１６（配列番号１３）は，ＡＧＣグループキナーゼのＳ６Ｋファミリーに属し，２８１アミノ酸領域にわたり，ヒトリボソーム蛋白質Ｓ６キナーゼ（ＮＰ＿００３１５２．１）に対して９６％同一である。ヒトリボソームＳ６蛋白質キナーゼのファミリーは，少なくとも８個のメンバーから構成される（ＲＳＫ１，ＲＳＫ２，ＲＳＫ３，ＲＳＫ４，ＭＳＫ１，ＭＳＫ２，ｐ７０Ｓ６Ｋおよびｐ７０Ｓ６Ｋｂ）。リボソーム蛋白質Ｓ６蛋白質キナーゼは重要な多面発現性の機能を果たし，そのうち特に，蛋白質生合成の間のｍＲＮＡ翻訳の制御が鍵となる役割である（Ｅｕｒ　Ｊ　Ｂｉｏｃｈｅｍ　２０００　Ｎｏｖ；２６７（２１）：６３２１−３０，Ｅｘｐ　Ｃｅｌ　ｌＲｅｓ．１９９９　Ｎｏｖ２５；２５３（１）：１００−９，Ｍｏｌ　Ｃｅｌｌ　Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ　１９９９　Ｍａｙ２５；１５１（１−２）：６５−７７）。ｐ７０Ｓ６によるＳ６リボソーム蛋白質のリン酸化はまた，細胞運動性（Ｉｍｍｕｎｏｌ　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ　２０００　Ａｕｇ；７８（４）：４４７−５１）および細胞成長（Ｐｒｏｇ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ　Ｒｅｓ　Ｍｏｌ　Ｂｉｏｌ　２０００；６５：１０１−２７）の制御における関与が示唆されており，したがって，腫瘍転移，免疫応答および組織修復において重要であるかもしれない。ＳＧＫ２１６は，Ｓ６キナーゼのファミリーの追加のメンバーであって，癌，炎症，ならびに他の疾病状態において潜在的役割を有するかもしれない。
【０４１５】
ＣＡＭＫグループ
新規ＣＡＭＫグループ蛋白質キナーゼの潜在的な生物学的および臨床的関連性を以下に記載する。部分ＳＧＫ２３７（配列番号１４）は，ＣＡＭＫキナーゼのＥＭＫファミリーに属し，８５４アミノ酸領域にわたり，Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓＳＴＫＹＬＫ３（Ｐ４１９５１）に対して４０％同一である。ＳＧＫ２３７およびＣ．ｅｌｅｇａｎｓＳＴＫＹＬＫ３は，その触媒外領域にわたり相当のホモロジーを有し，したがって，関連する生物学的機能を共有するオルトログ蛋白質であるかもしれない。Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓＳＴＫＹＬＫ３蛋白質の機能は不明である。ＳＧＫ２３７に次に近いマッチはヒトＮＩＭＡ（ｎｅｖｅｒ　ｉｎ　ｍｉｔｏｓｉｓ　ｇｅｎｅ　ａ）関連キナーゼ６（ＮＲＫ６）（ＮＰ＿０５５２１２．１）であり，２６１アミノ酸にわたり３５％のアミノ酸配列同一性を有する。ＳＧＫ２３７とＮＲＫ６との間のホモロジーは触媒領域に限られている。ＮＲＫ６（９ｑ３３．３−−＞ｑ３４．１１）の機能は不明である。ＮＲＫ６は，ＮＥＫ１，ＮＥＫ２およびＮＥＫ３とともに，互いに高い程度の触媒ドメイン配列ホモロジーを有し，糸状真菌Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｄｕｌａｎｓ由来のＮＩＭＡキナーゼに対して低いが有意な触媒ドメインホモロジーを有する蛋白質である。Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓにおける有糸分裂の制御におけるＮ１ＭＡの重要な役割はよく説明されている（Ｐｒｏｇ　Ｃｅｌｌ　Ｃｙｃｌｅ　Ｒｅｓ　１９９５；１：１８７−２０５，Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔ　Ｃｅｌｌ　Ｇｅｎｅｔ　１９９９；８７（３−４）：２７１−２）。
【０４１６】
ＳＧＫ２３７とｃ．ｅｌｅｇａｎｓＳＴＫＹＬＫ３との間のホモロジーは，これらの蛋白質触媒ドメイン境界を越えて伸びている。特に重要なものは，ヒト蛋白質における２つのアルマジロ／ベータ−カテニン様反復の存在であり，虫蛋白質におけるそのような反復の１つは触媒ドメインのすぐＮ末端側に位置する。アルマジロ／ベータ−カテニン様反復は，最初はショウジョウバエウイングレス蛋白質において特性決定され，多くの多様なシグナリング蛋白質において見いだされる。この反復は細胞間接触および細胞骨格内において生ずる蛋白質−蛋白質相互作用を担う（Ｉｎｔ　Ｒｅｖ　Ｃｙｔｏｌ　１９９９；１８６：１７９−２２４）。アルマジロ／ベータ−カテニン様オリゴデンドロメア化反復は，腺腫様結腸ポリポーシス（ＡＰＣ）腫瘍サプレッサー蛋白質の機能において鍵となる役割を果たす（Ｂｉｏｃｈｉｍ　Ｂｉｏｐｈｙｓ　Ａｃｔａ　１９９７　Ｊｕｎ７；１３３２（３）：Ｆ１２７−４７）。Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ　ＳＴＫＹＬＫ３蛋白質はまた，１２個のＥＧＦ様反復または触媒ドメインのＣ末端に存在するヒトＳＧＫ２３７には見いだされないＥＢモジュール（ＥＢＭ）ドメインを特徴とする。その機能が明らかではないＥＢＭドメインは，無脊椎動物ゲノムによりコードされる蛋白質にのみ存在すると予測されている。ＳＧＫ２３７は，細胞成長，分化および／またはアポトーシスに重要な細胞内および細胞間シグナリングにおいて役割を果たすかもしれない。
【０４１７】
カゼインキナーゼ（ＣＫ１）グループ
新規ＣＫ１グループ蛋白質キナーゼの潜在的な生物学的および臨床的関連性を以下に記載する。
【０４１８】
ＣＡＭＫグループキナーゼのＥＭＫファミリーに属する全長ＳＧＫ２４８（配列番号１５）は，ヒトカゼインキナーゼ１，ガンマ１（ＮＰ＿０７１３３１．１）と１００％一致する。ＳＧＫ２４８の３’領域において多様性を有するｃＤＮＡクローン（ＳＧＫ２４８Ｃ変種）の同定に基づけば，ＳＧＫ２４８のＣ末端における選択的スプライシングが存在するかもしれない。ＳＧＫ２４８のＣ末端は，ＳＬＲＴＶＴＡＥＨＹＤＶＮＮＳＡＩＷＨＲＧＲＧＴ（配列（ＡＧＣＣＴＴＡＧＧＡＣＴＧＴＴＡＣＡＧＣＴＧＡＧＣＡＴＴＡＴＧＡＴＧＴＴＡＡＣＡＡＣＴＣＡＧＣＣＡＴＣＴＧＧＣＡＣＡＧＧＧＧＡＡＧＡＧＧＣＡＣＣによりコードされる）である。ＳＧＫ２４８Ｃ変種のＣ末端はＥＩＦＶＤである（配列ＧＡＡＡＴＴＴＴＴＧＴＧＧＡＴによりコードされる）。Ｃ末端における選択的スプライシングにより，蛋白質機能の変更が生ずるかもしれない。
【０４１９】
”その他”グループ
その他グループに属する新規蛋白質キナーゼの潜在的な生物学的および臨床的関連性を以下に記載する。
【０４２０】
全長ＳＧＫ２２３（配列番号１６）およびＳＧＫ２６９（配列番号１７）は（その他）グループ蛋白質キナーゼのＡｕｒｏｒａファミリーに属する。ＳＧＫ２２３は仮想ヒト蛋白質（ＢＡＢ１５００６．１）に対して１２４４アミノ酸にわたり５０％のアミノ酸配列同一性を示す。ＳＧＫ２６９は，その全長（１７４６アミノ酸）の部分領域（３２９アミノ酸）にわたり，同じヒト仮想蛋白質（ＢＡＢ１５００６．１）に対して１００％のアミノ酸配列同一性を示す。ＳＧＫ２２３およびＳＧＫ２６９は，機能未知の１組のショウジョウバエ仮想蛋白質（ＣＧ４５２３およびＣＧ１０９６７）に対して，その触媒ドメインにわたり低いが有意なホモロジーを有する。ＳＧＫ２２３およびＳＧＫ２６９のキナーゼのＡｕｒｏｒａファミリーへの分類は，ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（ＮＰ＿０１５１１５．１）由来のＩｐ１１ｐに対する触媒的ホモロジーの短いストレッチに起因する。セリン／トレオニンキナーゼのＡｕｒｏｒａ／Ｉｐｌｌｐファミリーのメンバーには，Ａｕｒｏｒａ１（ＮＭ＿００４２１７，Ａｕｒｏｒａ２（ＡＦ００８５５１）およびＡｕｒｏｒａ３（ＡＦ０５９６８１）が含まれ，有糸分裂レギュレータとしての役割を有することが示されている（Ｔｒｅｎｄｓ　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ　１９９９　Ｎｏｖ；９（１１）：４５４−９）。
【０４２１】
全長ＳＧＫ２５８（配列番号１８）は（その他）グループ蛋白質キナーゼのミックスリニアージキナーゼ（ＭＬＫ）ファミリーに属する。ＳＧＫ２５８はその全長（２０１４アミノ酸）の部分領域（２５３アミノ酸）にわたり仮想ヒト蛋白質（ＢＡＢ１５５４７．１）に対して１００％のアミノ酸配列同一性を示す。ＳＧＫ２５８に次に近いマッチは，ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ　ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒＣＧ５４８３遺伝子産物（ＡＡＦ５５７９３．１）である（２０１４アミノ酸にわたり２９％）。Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ　ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ　ＣＧ５４８３遺伝子産物の機能は知られていない。ＳＧＫ２５８は蛋白質−蛋白質相互作用を担うかもしれない１２個のロイシンリッチ反復を特徴とする。
【０４２２】
全長ＳＧＫ３８２（配列番号１９）およびＳＧＫ４２４（配列番号２０）は，（その他）グループ蛋白質キナーゼのユニークファミリーに属する。ユニークファミリーメンバーは，その触媒領域にわたり，その他グループ中で見いだされる他のキナーゼに対して低い配列ホモロジーを有する。ＳＧＫ３８２（配列番号１９）は，ショウジョウバエＣＧ４０４１遺伝子産物（ＡＡＦ４５９９５．１）に対して８９３アミノ酸にわたり４４％のアミノ酸配列同一性を示す。この無脊椎動物蛋白質の機能は不明である。ＳＧＫ４２４は，５６０アミノ酸にわたり，ヒト結腸癌腫細胞において発現されている貫膜糖蛋白質レセプターチロシンキナーゼ（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ　１９９５　Ｎｏｖ１６；１１（１０）：２１７９−８４）であるヒトＰＴＫ７蛋白質チロシンキナーゼ７（ＮＰ＿００２８１２．１）に対して３５％のアミノ酸配列同一性を示す。ＳＧＫ４２４とヒトＰＴＫ７（２３アミノ酸）との間のマッチは長さが短いため，この配列比較に基づいてＳＧＫ４２４の潜在的機能に関して結論を引き出すことができない。
【０４２３】
ＴＫグループ
全長ＳＧＫ２５１（配列番号２１）はレセプターのエフィリンファミリーに関連する新規チロシンキナーゼである。ＳＧＫ２５１は，１０３６アミノ酸にわたり，ネズミＥｐｈレセプターＡ６（ＮＰ＿０３１９６４．１）に対して９７％のアミノ酸配列同一性を示し，したがって，齧歯類キナーゼのヒトオルトログであるようである。ＳＧＫ２５１は，エフィリンレセプター蛋白質に伴う規範的モチーフを特徴とし，これは，キナーゼドメインおよび潜在的貫膜ドメインに加えて，リガンド結合ドメイン，２つのフィブロネクチンタイプＩＩＩドメインおよびＳＡＭ（ステライルアルファモチーフ）ドメインを含む。エフィリンレセプター（Ｅｐｈ）およびそのリガンド（エフィリン）は，軸索ガイダンス，ニューロンを標的とする相互作用および神経系の他のシナプス機能において機能する。
【０４２４】
全長ＳＧＫ３０７（配列番号２２）は，チロシンキナーゼのユニークファミリーに属する新規チロシンキナーゼである。ユニークファミリーのメンバーはその触媒領域にわたってチロシンキナーゼグループ中に見いだされる他のキナーゼに対して低い配列ホモロジーを有する。ＳＧＫ３０７は，ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｔｈａｌｉａｎａからの仮想蛋白質である蛋白質キナーゼホモログＦ２４０１．１３に対して１４２８アミノ酸にわたり２８％のアミノ酸配列同一性を示す。ＳＧＫ３０７に次に近いホモログは，トップヒットに対して同様のホモロジーを示し，主として多様な生物からのチロシンキナーゼ，例えばＳｐｏｎｇｉｌｌａ　ｌａｃｕｓｔｒｉｓ（ＡＡＢ２２５７９．１）由来のｓｒｃ関連チロシンキナーゼ，ヒトｆｙｎ関連キナーゼ（ＮＰ＿００２０２２．１）およびＸｅｎｏｐｕｓ　ｌａｅｖｉｓ　ｃ−Ｓｒｃキナーゼ（ＡＡＣ０５８３５．１）を含む。１４２８アミノ酸の全長ＳＧＫ３０７蛋白質についての隠れマルコフプロファイル分析は，位置５５−８７および８８−１２０に２つのアンキリンドメインを，位置２９５−４９３にキナーゼドメインを予測した。アンキリン反復蛋白質−蛋白質相互作用の役割はよく説明されている（Ｊ　Ｃｅｌｌ　Ｓｃｉ　２０００　Ｊｕｎ；１１３（Ｐｔ１１）：１８５１−６）。ＳＧＫ３０７中の潜在的膜スパニング領域の分析（ｈｔｔｐ：／／ｐｓｏｒｔ．ｎｉｂｂ．ａｃ．ｌ／ｃｉ−ｂｉｎ／ｒｕｎｐｓｏｒｔ．ｐｌ）は，潜在的な核またはゴルジ装置貫膜ドメインを予測する。この予測と一致する疎水性領域（位置５９−６８）がｐｒｏｔｅａｎＤＮＡＳｔａｒプログラムを用いて観察される。ＳＧＫ３０７は細胞内オルガネラ，例えばゴルジ装置および／または核に付随するチロシンキナーゼとして機能するかもしれない。ＳＧＫ３０７はアンキリン反復によりおそらくゴルジ蛋白質，例えばタンキラーゼと相互作用してこれをリン酸化することを担うと考えられる。タンキラーゼは，ＧＬＵＴ４小胞に付随するＭＡＰＫ基質であり，インスリン分泌において重要であることが示されているアンキリン反復含有蛋白質である（Ｊ　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｍ　２０００　Ｄｅｃ８；２７５（４９）：３８４３７−４４）。
【０４２５】
実施例７：キナーゼ様活性を示すポリペプチドの，規定されたグループへの分類グアニル酸シクラーゼグループ
グアニル酸−シクラーゼグループキナーゼのグアニル酸−シクラーゼファミリーに属する部分ＳＧＫ１１９（配列番号２３）は，２７３アミノ酸領域にわたり，ラット嗅覚グアニリルシクラーゼｇｃ−ｄ（Ｐ５１８３９）に対して７９％同一である。ＳＧＫ１１９のアミノ酸配列の部分２７３アミノ酸の隠れマルコフプロファイル分析から，部分キナーゼ触媒ドメイン（位置１−１９），それに続く位置８９−２７３における完全アデニル酸／グアニル酸シクラーゼ触媒ドメインが予測された。二分割の触媒構造の存在は，多数のアデニル酸／グアニル酸シクラーゼの独特の特徴である。ＳＧＫ１１９は，嗅覚感覚ニューロンにおいて発現されている臭気物質レセプターグアニルシクラーゼの追加のメンバーであるかもしれない。多様なｃＤＮＡライブラリにおいてｃＤＮＡクローンがないことから判定される，ＳＧＫ１１９に伴うこの見かけ上非常に制限された発現パターンは，この可能性と一致する。グアニル酸シクラーゼの機能は嗅覚に限定されない。グアニル酸シクラーゼは，ｃＧＭＰの生成を担うことから，ｃＧＭＰ依存性蛋白質キナーゼ，ｃＧＭＰ制御性ホスホジエステラーゼ，およびサイクリックヌクレオチドゲート性イオンチャネルが関与するｃＧＭＰ依存性シグナリングカスケードの上流レギュレータとしての遍在的役割を果たす。血管平滑筋の運動性，腸内液体および電解質ホメオタシス，および網膜光伝達を含む病態生理学的プロセスにおけるグアニル酸シクラーゼの関与を示す証拠が増加しつつある（Ｐｈａｒｍａｃｏｌ　Ｒｅｖ　２０００　Ｓｅｐ；５２（３）：３７５−４１４）。ＳＧＫ１１９は，アデニル酸／グアニル酸シクラーゼの成長しつつあるファミリーの新規メンバーとして，これらの病態生理学的事象において役割をはたすかもしれない。さらに，外因性および内因性窒素酸化物はグアニル酸シクラーゼが関与するシグナリングカスケードを介して心筋機能，例えば収縮，弛緩および心拍数を刺激する（Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ　Ｒｅｓ　１９９９　Ｍａｒ；４１（３）：５１４−２３）。したがって，ＳＧＫ１１９は，心臓血管疾病において役割を果たすかもしれない。
【０４２６】
イノシトールキナーゼグループ
全長ＳＧＫ３８７（配列番号２４）は，イノシトールキナーゼグループのキナーゼのＰＩ３Ｋ（ホスファチジルイノシトールキナーゼ）ファミリーに属し，その全長（１９１１アミノ酸）の部分領域（１３０２アミノ酸）にわたり，ヒト蛋白質ＫＩＡＡ０４２１（ＢＡＡ２４８５１．１）に対して１００％同一である。ＳＧＫ３８７はまた，その全長にわたり，部分長蛋白質であるラムダ／イオタ蛋白質キナーゼＣ相互作用蛋白質（Ｕ３２５８１）とも同一である。ＳＧＫ３８７に次に近いマッチは，多様な種からの種々の蛋白質を含み，ＳＧＫ３８７に対するアライメントの長さにより，近いオルトログまたは近いホモログであるようである。これらには，ショウジョウバエ由来のＣＧ４５４９遺伝子産物（ＡＡＦ４６２０７．１），Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ　ｅｌｅｇａｎｓ由来のナンセンス媒介性ｍＲＮＡ減衰蛋白質ＳＭＧ−１（ＡＡＤ４８７７３．１），ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｔｈａｌｉａｎａ由来のＴＯＲ様蛋白質（ＡＡＧ４３４２２．１），Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来の変異型ｄｒｒｌ−１蛋白質（ＡＡＢ６６８８１．１）およびヒトＦＫ５０６結合蛋白質１２であるラパマイシン付随蛋白質１（ＦＲＡＰ）（ＮＰ＿００４９４９．１）が含まれる。
【０４２７】
ＳＧＫ３８７の全長１９１１アミノ酸の隠れマルコフモデル分析により，位置４０８−６７７の潜在的ホスファチジルイノシトール３−および４−キナーゼ触媒ドメインおよび位置１８７９−１９１１のＣ末端に向かうＦＡＴＣドメイン（ＦＲＡＰ，ＡＴＭ，ＴＲＲＡＰＣ末端）が明らかになった。ＳＧＫ３８７について予測されるドメイン構造は，ヒトＦＲＡＰ蛋白質において見いだされるものと一致し，中心の長いＦＡＴＣドメイン，およびＣ末端のホスファチジルイノシトールキナーゼドメイン，およびそのすぐ後の短いＦＡＴＣドメインを特徴とする。同様の構造は，このクラスのＰＩ３キナーゼの他のメンバー，例えばＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来のＴｅｌｌおよびＭｅｃｌおよびヒト毛細血管拡張性運動失調変異（ＡＴＭ）蛋白質にも見られる。酵母ＴｅｌｌおよびＭｅｃｌ，およびヒトＡＴＭは，テロメア長さの制御およびＤＮＡ損傷に対する細胞応答に関与する（Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ　２０００　Ｄｅｃ５；９７（２５）：１３７４９−５４）。
【０４２８】
家族性および散発性の癌におけるＡＴＭの役割はよく記述されている（Ｒｅｃｅｎｔ　Ｒｅｓｕｌｔｓ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ　１９９８；１５４：１５６−７３）。ＡＴＭ関連ＦＲＡＰ遺伝子を有する染色体座ｌｐ３６．２の欠失がヒト神経芽細胞腫において見いだされている（Ｈｕｍ　Ｇｅｎｅｔ　１９９７　Ａｐｒ；９９（４）：５４７−９）。酵母由来のＴｅｌｌおよびヒトＡＴＭおよびＦＲＡＰと同様に，ＳＧＫ３８７は，細胞サイクルチェックポイント蛋白質として役割を果たしているようである。ＳＧＫ３８７から生じた変異またはそのシグナリングメカニズムの破壊は，ヒト新生物と関連するかもしれない。ＳＧＫ３８７の癌に関連する潜在的な役割の裏付けとして，この遺伝子の発現レベルが正常な細胞起源と比較して腫瘍においてより高いことを示唆するＲＴ−ＰＣＲの証拠が本明細書に記載されている（表５）。
【０４２９】
実施例８：哺乳動物蛋白質キナーゼをコードするｃＤＮＡの単離
材料および方法
新規クローンの同定
総ＲＮＡは，原発性腫瘍，正常および腫瘍細胞株，正常ヒト組織，およびソートしたヒト造血細胞細胞からＣｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉおよびＳａｃｃｈｉ（Ｐ．Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ　ａｎｄ　Ｎ．Ｓａｃｃｈｉ，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１６２，１５６（１９８７））のグアニジン塩／フェノール抽出プロトコルを用いて単離する。これらのＲＮＡを用いて，Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ　Ｐｒｅ　Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍ（ＧＩＢＣＯ　ＢＲＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ；Ｇｅｒａｒｄ，ＧＦ　ｅｔ　ａｌ．（１９８９），ＦＯＣＵＳ　１１，６６）を用いて，製造元により推奨される条件で一本鎖ｃＤＮＡを生成する。典型的な反応においては，６０μｌの反応容量中で１０μｇの総ＲＮＡおよび１．５μｇのオリゴ（ｄＴ）１２−１８を用いる。生成物をＲＮａｓｅＨで処理し，Ｈ２Ｏで１００μｌに希釈する。続くＰＣＲ増幅のためには，１−４μｌのこのｓｓｃＤＮＡを各反応において用いる。
【０４３０】
縮重オリゴヌクレオチドは，Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　３９４８ＤＮＡ合成機で確立されたホスホルアミダイト化学を用いて合成し，エタノールで沈澱させ，精製せずにＰＣＲ用に用いる。これらのプライマーは，いくつかの蛋白質キナーゼの触媒ドメイン中の保存モチーフのセンスおよびアンチセンス鎖に由来する。縮重ヌクレオチド残基の表示は以下のとおりである：Ｎ＝Ａ，Ｃ，Ｇ，またはＴ；Ｒ＝ＡまたはＧ；Ｙ＝ＣまたはＴ；Ｈ＝Ａ，ＣまたはＴ，Ｇではない；Ｄ＝Ａ，ＧまたはＴ，Ｃではない；Ｓ＝ＣまたはＧ；およびＷ＝ＡまたはＴ。
【０４３１】
ＰＣＲ反応は，多数の一本鎖ｃＤＮＡに適用される縮重プライマーを用いて行う。プライマーをそれぞれ最終濃度５μＭで，１０ｍＭ　ＴｒｉｓＨＣｌ，ｐＨ８．３，５０ｍＭ　ＫＣｌ，１．５ｍＭ　ＭｇＣｌ２，各２００μＭデオキシヌクレオシド三リン酸，０．００１％ゼラチン，１．５Ｕ　ＡｍｐｌｉＴａｑ　ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ／Ｃｅｔｕｓ），および１−４μｇのｃＤＮＡを含む混合物に加える。９５℃で３分間変性させた後，サイクルの条件は，９４℃で３０秒間，５０℃で１分間，および７２℃で１分４５秒間を３５サイクルである。３００−３５０ｂｐの間に移動したＰＣＲフラグメントをＧｅｎｅＣｌｅａｎキット（Ｂｉｏ１０１）を用いて２％アガロースゲルから単離し，製造元のプロトコルにしたがってｐＣＲＩＩベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ　Ｃｏｒｐ．Ｕ．Ｓ．Ａ．）中にＴ−Ａクローニングする。
【０４３２】
Ｑｉａｇｅｎカラムを用いるミニプラスミドＤＮＡ調製用にコロニーを選択し，サイクルシークエンシング染料ターミネータキットおよびＡｍｐｌｉＴａｑＤＮＡポリメラーゼ，ＦＳ（ＡＢＩ，Ｆｏｓｔｅｒ　Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を用いてプラスミドＤＮＡを配列決定する。配列決定反応生成物はＡＢＩ　Ｐｒｉｓｍ　３７７　ＤＮＡシークエンサーにかけ，ＢＬＡＳＴアラインメントアルゴリズム（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．　ｅｔ　ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−１０）を用いて分析する。
【０４３３】
追加のＰＣＲ戦略を用いて，正確なまたはほぼ正確なオリゴヌクレオチドプライマーを用いて種々のＰＣＲフラグメントまたはＥＳＴを接続する。ＰＣＲ条件は上述したとおりであるが，ただし，アニーリング温度は，式：Ｔｍ＝４（Ｇ＋Ｃ）＋２（Ａ＋Ｔ）を用いて各オリゴ対について計算する。
【０４３４】
ｃＤＮＡクローンの単離：
ヒトｃＤＮＡライブラリをキナーゼ関連遺伝子に対応するＰＣＲまたはＥＳＴフラグメントで探索する。プローブをランダムプライミングにより３２Ｐで標識し，ライブラリスクリーニングの標準的手法にしたがって，２ｘ１０６ｃｐｍ／ｍＬで用いる。プレハイブリダイゼーション（３時間）およびハイブリダイゼーション（一夜）は，５ＸＳＳＣ，５Ｘデンハルト溶液，２．５％硫酸デキストラン，５０ｍＭＮａ２ＰＯ４／ＮａＨＰＯ４，ｐＨ７．０，５０％ホルムアミド，１００ｍｇ／ｍＬ変性サケ精子ＤＮＡ中で４２℃で行う。ストリンジェントな洗浄は，６５℃で，０．１ＸＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳ中で行う。ＤＮＡ配列決定は，サイクルシークエンシング染料ターミネータキットを用い，ＡｍｐｌｉＴａｑＤＮＡポリメラーゼＦＳ（ＡＢＩ，Ｆｏｓｔｅｒ　Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を用いて両方の鎖について行う。配列決定反応生成物をＡＢＩ　Ｐｒｉｓｍ　３７７　ＤＮＡシークエンサーにかける。
【０４３５】
実施例９：哺乳動物蛋白質キナーゼの発現分析
材料および方法
ノザンブロット分析
ノザンブロットは，ヒト成人組織（例えば，胸腺，肺，十二指腸，結腸，精巣，脳，小脳，皮質，唾液腺，肝臓，膵臓，腎臓，脾臓，胃，子宮，前立腺，骨格筋，胎盤，乳腺，膀胱，リンパ節，脂肪組織），および２つのヒト胎児正常組織（胎児肝臓，胎児脳）からの６０種類のヒト腫瘍細胞株（例えば，ＨＯＰ−９２，ＥＫＶＸ，ＮＣＩ−Ｈ２３，ＮＣＩ−Ｈ２２６，ＮＣＩ−Ｈ３２２Ｍ，ＮＣＩ−Ｈ４６０，ＮＣＩ−Ｈ５２２，Ａ５４９，ＨＯＰ−６２，ＯＶＣＡＲ−３，ＯＶＣＡＲ−４，ＯＶＣＡＲ−５，ＯＶＣＡＲ−８，ＩＧＲＯＶ１，ＳＫ−ＯＶ−３，ＳＮＢ−１９，ＳＮＢ−７５，Ｕ２５１，ＳＦ−２６８，ＳＦ−２９５，ＳＦ−５３９，ＣＣＲＦ−ＣＥＭ，Ｋ−５６２，ＭＯＬＴ−４，ＨＬ−６０，ＲＰＭＩ８２２６，ＳＲ，ＤＵ−１４５，ＰＣ−３，ＨＴ−２９，ＨＣＣ−２９９８，ＨＣＴ−１１６，ＳＷ６２０，Ｃｏｌｏ２０５，ＨＴＣ１５，ＫＭ−１２，ＵＯ−３１，ＳＮ１２Ｃ，Ａ４９８，ＣａＫｉｌ，ＲＸＦ−３９３，ＡＣＨＮ，７８６−０，ＴＫ−１０，ＬＯＸＩＭＶＩ，Ｍａｌｍｅ−３Ｍ，ＳＫ−ＭＥＬ−２，ＳＫ−ＭＥＬ−５，ＳＫ−ＭＥＬ−２８，ＵＡＣＣ−６２，ＵＡＣＣ−２５７，Ｍ１４，ＭＣＦ−７，ＭＣＦ−７／ＡＤＲＲＥＳ，Ｈｓ５７８Ｔ，ＭＤＡ−ＭＢ−２３１，ＭＤＡ−ＭＢ−４３５，ＭＤＡ−Ｎ，ＢＴ−５４９，Ｔ４７Ｄ）から単離した１０μｇの総ＲＮＡを変性ホルムアルデヒド１．２％アガロースゲルに流し，ナイロン膜に移すことにより調製する。
【０４３６】
フィルターを，キナーゼ遺伝子のいくつかの挿入物から合成したランダムプライミング［α３２Ｐ］ｄＣＴＰ標識プローブでハイブリダイズさせる。ハイブリダイゼーションは，６ＸＳＳＣ，０．１％ＳＤＳ，１Ｘデンハルト溶液，１００μｇ／ｍＬの変性ニシン精子ＤＮＡ中で，１−２ｘ１０６ｃｐｍ／ｍＬの３２Ｐ標識ＤＮＡプローブで４２℃で一夜行う。フィルターを０．１ＸＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中で６５℃で洗浄し，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｄｙｎａｍｉｃｓホスファーイメージャーで露光する。
【０４３７】
定量的ＰＣＲ分析
種々の正常ヒト組織および細胞株からＲＮＡを単離する。一本鎖ｃＤＮＡは，１０μｇの上述した各ＲＮＡからＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ　Ｐｒｅａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍ（Ｇｉｂｃｏ　ＢＲＬ）を用いて合成する。次に，これらの一本鎖テンプレートを各クローンに特異的なプライマーとともに２５サイクルのＰＣＲ反応において用いる。反応生成物を２％アガロースゲルで電気泳動し，エチジウムブロマイドにより染色し，ＵＶ光ボックスで写真を撮る。各試料についてＳＴＫ特異的バンドの相対的強度を評価する。
【０４３８】
ＤＮＡアレイに基づく発現分析
プラスミドＤＮＡアレイブロットは，０．５μｇの各キナーゼの変性プラスミドをナイロン膜に付加することにより調製する。［γ３２Ｐ］ｄＣＴＰ標識一本鎖ＤＮＡプローブは，いくつかのヒト免疫組織起源または腫瘍細胞（例えば，胸腺，樹状細胞，肥満細胞，単球，Ｂ細胞（初代，Ｊｕｒｋａｔ，ＲＰＭＩ８２２６，ＳＲ），Ｔ細胞（ＣＤ８／ＣＤ４＋，ＴＨ１，ＴＨ２，ＣＥＭ，ＭＯＬＴ４），Ｋ５６２（巨核球）から単離された総ＲＮＡから合成する。ハイブリダイゼーションは，４２℃で１６時間，６ＸＳＳＣ，０．１％ＳＤＳ，１Ｘデンハルト溶液，１００μｇ／ｍＬ変性ニシン精子ＤＮＡ中で，１０６ｃｐｍ／ｍＬの［γ３２Ｐ］ｄＣＴＰ標識一本鎖プローブを用いて行う。フィルターを０．１ＸＳＳＣ／０．１％ＳＤＳで６５℃で洗浄し，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｄｙｎａｍｉｃｓホスファーイメージャーで定量的分析を行う。
【０４３９】
実施例１０：蛋白質キナーゼ遺伝子発現
ベクターの構築
材料および方法
発現ベクターの構築
ヒトｃＤＮＡのいくつかから発現構築物を作成する：ａ）ｐＣＤＮＡ発現ベクター中の完全長クローン；ｂ）ＧＳＴ発現カセットのＣ末端に融合させた新規キナーゼの触媒ドメインを含むＧＳＴ融合構築物；およびｃ）ｐＣＤＮＡベクター中に挿入されたキナーゼドメイン中の予測ＡＴＰ結合部位にＬｙｓからＡｌａ（ＫからＡ）変異を含む完全長クローン。
【０４４０】
キナーゼの”ＫからＡ”変異体は優性負の構築物として機能するかもしれず，これらの新規ＳＴＫの機能を解明するために用いられる。
【０４４１】
実施例１１：蛋白質キナーゼに対する特異的免疫試薬の作成
材料および方法
単離されたキナーゼポリペプチドに対応するＫＬＨ−またはＭＡＰ−コンジュゲート化合成ペプチドに対する特異的免疫試薬をウサギで生成させる。Ｃ末端ペプチドをグルタルアルデヒドでＫＬＨとコンジュゲートさせ，遊離Ｃ末端を残した。内部ペプチドは，ブロックされたＮ末端を用いてＭＡＰ−コンジュゲートさせた。追加の免疫試薬はまた，細菌で発現させた各新規ＰＴＫまたはＳＴＫの細胞質ドメインを含むＧＳＴ融合蛋白質でウサギを免疫することにより生成することができる。内因性起源について試験する前に，最初に，種々の免疫血清を，組換え蛋白質に対する反応性および選択性について試験する。
【０４４２】
ウエスタンブロット
ＳＤＳ　ＰＡＧＥ上の蛋白質をイモビロン膜に移す。洗浄緩衝液はＰＢＳＴ（標準的リン酸緩衝化食塩水，ｐＨ７．４＋０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）である。ブロッキングおよび抗体インキュベーション緩衝液はＰＢＳＴ＋５％ミルクである。抗体希釈は１：１０００から１：２０００の範囲である。
【０４４３】
実施例１２：蛋白質キナーゼの組換え発現および生物学的アッセイ
材料および方法
哺乳動物細胞におけるキナーゼの過渡的発現
キナーゼ構築物を含むｐｃＤＮＡ発現プラスミド（１０μｇＤＮＡ／１００ｍｍプレート）をリポフェクタミン（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）とともに２９３細胞中に導入する。７２時間後，細胞を０．５ｍＬの可溶化緩衝液（２０ｍＭＨＥＰＥＳ，ｐＨ７．３５，１５０ｍＭ　ＮａＣｌ，１０％グリセロール，１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００，１．５ｍＭ　ＭｇＣｌ２，１ｍＭ　ＥＧＴＡ，２ｍＭフッ化フェニルメチルスルホニル，１μｇ／ｍＬアプロチニン）中に回収する。試料アリコートを６％アクリルアミド／０．５％ビスアクリルアミドゲルのＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）で分離し，電気泳動的にニトロセルロースに移す。非特異的結合は，ブロットをＢｌｏｔｔｏ（５％ｗ／ｖ無脂乾燥ミルクおよび０．２％ｖ／ｖ　Ｎｏｎｉｄｅｔ　Ｐ−４０（Ｓｉｇｍａ）を含有するリン酸緩衝化食塩水）中でプレインキュベートすることによりブロックし，種々の抗ペプチドまたは抗ＧＳＴ融合蛋白質特異的抗血清を用いて組換え蛋白質を検出する。
【０４４４】
インビトロキナーゼアッセイ
キナーゼ発現構築物でトランスフェクトした３日後，１０ｃｍプレートの２９３細胞をＰＢＳで洗浄し，氷上でホスファターゼ阻害剤を含む２ｍＬのＰＢＳＴＤＳで溶解する（１０ｍＭ　ＮａＨＰＯ４，ｐＨ７．２５，１５０ｍＭ　ＮａＣｌ，１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００，０．５％デオキシコール酸，０．１％ＳＤＳ，０．２％アジ化ナトリウム，１ｍＭ　ＮａＦ，１ｍＭ　ＥＧＴＡ，４ｍＭオルトバナジン酸ナトリウム，１％アプロチニン，５μｇ／ｍＬロイペプチン）。細胞断片を遠心分離（１２０００ｘｇ，１５分間，４℃）により除去し，溶解物をプロテインＡセファロースの１：１スラリー５０μｌとともにそれぞれ１時間２回インキュベートすることにより前精製する。０．５ｍＬの精製上清を，１０μｌのプロテインＡ精製キナーゼ特異的抗血清（ＧＳＴ融合蛋白質または抗ペプチド抗血清から生成）プラス５０μｌのプロテインＡ−セファロースの１：１スラリーで，４℃で２時間インキュベートする。次にビーズをＰＢＳＴＤＳ中で２回，ＨＮＴＧ（２０ｍＭＨＥＰＥＳ，ｐＨ７．５／１５０ｍＭ　ＮａＣｌ，０，１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００，１０％グリセロール）中で２回洗浄する。
【０４４５】
セファロースビーズ上の免疫精製キナーゼを２０μｌのＨＮＴＧ＋３０ｍＭ　ＭｇＣｌ２，１０ｍＭ　ＭｎＣｌ２，および２０μＣｉ［α３２Ｐ］ＡＴＰ（３０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）中に再懸濁する。キナーゼ反応は室温で３０分間実施し，５０ｍＭ　ＥＤＴＡを補充したＨＮＴＧを加えることにより停止させる。試料をＨＮＴＧ中で６回洗浄し，ＳＤＳ試料緩衝液中で５分間煮沸し，６％ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび続くオートラジオグラフィーにより分析する。リン酸化アミノ酸の分析は，ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルから切り出した３２Ｐ−標識バンドの標準的２Ｄ法により行う。細菌で発現させたキナーゼのＧＳＴ融合構築物についても同様のアッセイを行う。
【０４４６】
実施例１３：サザンブロッティングによる遺伝子増幅の証明
材料および方法
ナイロン膜はＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍから購入する。変性溶液は，０．４ＭＮａＯＨおよび０．６Ｍ　ＮａＣｌを含む。中和溶液は，０．５ＭＴｒｉｓ−ＨＣＬ，ｐＨ７．５および１．５ＭＮａＣｌを含む。ハイブリダイゼーション溶液は，５０％ホルムアミド，６ＸＳＳＰＥ，２．５Ｘデンハルト溶液，０．２ｍｇ／ｍＬ変性サケＤＮＡ，０．１ｍｇ／ｍＬ酵母ｔＲＮＡ，および０．２％ドデシル硫酸ナトリウムを含む。制限酵素はＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍから購入する。放射性標識プローブは，ＳｔｒａｔａｇｅｎｅのＰｒｉｍｅ−ｉｔＩＩキットを用いて調製する。プローブテンプレートに用いるベータアクチンＤＮＡフラグメントはＣｌｏｎｔｅｃｈから購入する。
【０４４７】
種々の腫瘍細胞株（例えば，ＭＣＦ−７，ＭＤＡ−ＭＢ２３１，Ｃａｌｕ−６，Ａ５４９，ＨＣＴ−１５，ＨＴ−２９，Ｃｏｌｏ２０５，ＬＳ−１８０，ＤＬＤ−１，ＨＣＴ−１１６，ＰＣ３，ＣＡＰＡＮ−２，ＭＩＡ−ＰａＣａ−２，ＰＡＮＣ−１，ＡｓＰｃ−１，ＢｘＰＣ−３，ＯＶＣＡＲ−３，ＳＫＯＶ３，ＳＷ６２６およびＰＡ−１），および２つの正常細胞株から，ゲノムＤＮＡを単離する。
【０４４８】
各ゲノムＤＮＡ試料の１０μｇのアリコートをＥｃｏＲＩ制限酵素で消化し，別の１０μｇの試料をＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素で消化する。制限酵素消化したＤＮＡ試料を０．７％アガロースゲルに負荷し，電気泳動分離した後，標準的方法によりＤＮＡをナイロン膜にキャピラリー移動させる（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．　ｅｔ　ａｌ（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）。
【０４４９】
実施例１４：ファージディスプレイによる蛋白質−蛋白質相互作用の検出
材料および方法
ファージディスプレイは，所望のおとりに対する親和性に基づいて分子相互作用を単離する方法を提供する。ファージ被覆蛋白質への融合としてクローニングされたｃＤＮＡフラグメントは，ファージの表面にディスプレイされる。おとりと相互作用するファージをアフィニティー精製により濃縮し，個々のクローンからの挿入ＤＮＡを分析する。
【０４５０】
Ｔ７ファージディスプレイライブラリ
すべてのライブラリは，Ｔ７Ｓｅｌｅｃｔｌ−ｌｂベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）中で，製造元の指針にしたがって構築した。
【０４５１】
おとりの提示
おとりとして用いるべき蛋白質ドメインは，ＧＳＴへのＣ末端融合体として作成し，Ｅ．ｃｏｌｉで発現させる。ペプチドは化学的に合成し，長鎖スペーサービオチン試薬を用いてＮ末端でビオチン化する。
【０４５２】
選択
ＰａｎＭｉｘおよびＥ．ｃｏｌｉ阻害剤カクテル（ＳｉｇｍａＰ−８４６５）を補充した，新たに調製したライブラリ（１０１０−１０１２ｐｆｕ）のアリコートを，固定化したおとりとともに室温で１−２時間インキュベートする。未結合ファージを洗浄緩衝液でよく洗浄する（少なくとも４回）。３−４ラウンドの選択の後，結合したファージを１００μｌの１％ＳＤＳ中に溶出し，アガロースプレートに播種して，単一プラークを得る。
【０４５３】
挿入ＤＮＡの同定
個別のプラークを２５μｌの１０ｍＭＥＤＴＡ中に取り出し，７０℃で１０分間加熱することによりファージを破壊する。２μｌの破壊ファージを５０μｌのＰＣＲ反応混合物に加える。３５ラウンドの熱サイクル（９４℃，５０秒間；５０℃，１分間；７２℃，１分間）により挿入ＤＮＡを増幅する。
【０４５４】
緩衝液の組成
１０ｘＰａｎＭｉｘ
５％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００
１０％無脂乾燥乳（Ｃａｒｎａｔｉｏｎ）
１０ｍＭＥＧＴＡ
２５０ｍＭＮａＦ
２５０μｇ／ｍＬヘパリン（ｓｉｇｍａ）
２５０μｇ／ｍＬ，剪断し，沸騰させたサケ精子ＤＮＡ（ｓｉｇｍａ）
０．０５％アジ化ナトリウム
ＰＢＳ中で調製する。
【０４５５】
洗浄緩衝液
ＰＢＳ，以下のもので補充：
０．５％ＮＰ−４０
２５μｇ／ｍＬヘパリン
ＰＣＲ反応混合物
１．０ｍＬ　１０ｘＰＣＲ緩衝液（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ，１５ｍＭＭｇを含む）
各０．２ｍＬのｄＮＴＰｓ（１０ｍＭ保存液）
０．１ｍＬ　Ｔ７ＵＰプライマー（１５ｐｍｏｌ／Ｌ）ＧＧＡＧＣＴＧＴＣＧＴＡＴＴＣＣＡＧＴＣ
０．１ｍＬ　Ｔ７ＤＮプライマー（１５ｐｍｏｌ／Ｌ）ＡＡＣＣＣＣＴＣＡＡＧＡＣＣＣＧＴＴＴＡＧ
０．２ｍＬ　２５ｍＭＭｇＣｌ２またはＭｇＳＯ４，ＥＤＴＡ補償用
蒸留水で１０ｍＬとする
反応液５０μｌあたり１ユニットのＴａｑポリメラーゼを加える
ライブラリ：Ｔ７Ｓｅｌｅｃｔｌ−Ｈ４４１
【０４５６】
実施例１５：ＦＬＫ−１
ＥＬＩＳＡアッセイを実施して，ＦＬＫ−１レセプターのキナーゼ活性，より詳細にはＦＬＫ−１レセプター上のＴＫ活性の阻害または活性化を測定した。詳細には，以下のアッセイを実施して，Ｆｌｋ−１を発現するように遺伝子工学処理された細胞において，ＦＬＫ−１レセプターのキナーゼ活性を測定した。
【０４５７】
材料および方法
以下の試薬および供給物を用いた。
１．　Ｃｏｒｎｉｎｇ９６ウエルＥＬＩＳＡプレート（ＣｏｒｎｉｎｇカタログＮｏ．２５８０５−９６）；
２．　Ｃａｐｐｅｌヤギ抗ウサギＩｇＧ（カタログＮｏ．５５６４１）；
３．　ＰＢＳ（ＧｉｂｃｏカタログＮｏ．４５０−１３００ＥＢ）；
４．　ＴＢＳＷ緩衝液（５０ｍＭＴｒｉｓ（ｐＨ７．２），１５０ｍＭＮａＣｌおよび０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０）；
５．　エタノールアミン保存液（１０％エタノールアミン（ｐＨ７．０），４℃で保存）；
６．　ＨＮＴＧ緩衝液（２０ｍＭＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．５），１５０ｍＭＮａＣｌ，０．２％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００，および１０％グリセロール）；
７．　ＥＤＴＡ（０．５Ｍ（ｐＨ７．０）１００Ｘ保存液として）；
８．　オルトバナジウム酸ナトリウム（０．５Ｍ，１００Ｘ保存液として）；
９．　ピロリン酸ナトリウム（０．２Ｍ，１００Ｘ保存液として）；
１０．　ＮＵＮＣ９６ウエルＶ底ポリプロピレンプレート（Ａｐｐｌｉｅｄ　ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃカタログＮｏ．ＡＳ−７２０９２）；
１１．　ＮＩＨ３Ｔ３　Ｃ７＃３細胞（ＦＬＫ−１発現細胞）；
１２．　ＤＭＥＭ，１Ｘ高グルコースＬ−グルタミン含有（カタログＮｏ．１１９６５−０５０）；
１３．　ＦＢＳ，Ｇｉｂｃｏ（カタログＮｏ．１６０００−０２８）；
１４．　Ｌ−グルタミン，Ｇｉｂｃｏ（カタログＮｏ．２５０３０−０１６）；
１５．　ＶＥＧＦ，ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ，Ｉｎｃ．（カタログＮｏ．１００−２０）Ｍｉｌｌｉ−ＱｄＨ２Ｏ中１μｇ／１００μｌ保存液として保持し，−２０℃で保存；
１６．　アフィニティー精製抗ＦＬＫ−１抗血清；
１７．　ホスホチロシン特異的ＵＢ４０モノクローナル抗体（Ｆｅｎｄｌｅｙ，ｅｔ　ａｌ．，１９９０，Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　５０：１５５０−１５５８を参照）；
１８．　ＥＩＡ等級ヤギ抗マウスＩｇＧ−ＰＯＤ（ＢｉｏＲａｄカタログＮｏ．１７２−１０１１）；
１９．　２，２−アジノ−ビス（３−エチルベンズチアゾリン−６−硫酸（ＡＢＴＳ）溶液（１００ｍＭクエン酸（無水），２５０ｍＭＮａ２ＨＰＯ４（ｐＨ４．０），０．５ｍｇ／ｍｌＡＢＴＳ（ＳｉｇｍａカタログＮｏ．Ａ−１８８８）），溶液は，使用まで暗所で４℃で保存しなければならない；
２０．　Ｈ２Ｏ２（３０％溶液）（ＦｉｓｈｅｒカタログＮｏ．Ｈ３２５）；
２１．　ＡＢＴＳ／Ｈ２Ｏ２（１５ｍｌＡＢＴＳ溶液，２μｌＨ２Ｏ２）使用の５分間に調製，室温に保持；
２２．　０．２ＭＨＣｌ保存液，Ｈ２Ｏ中；
２３．　ジメチルスルホキシド（１００％）（ＳｉｇｍａカタログＮｏ．Ｄ−８４１８）；および
２４．　トリプシン−ＥＤＴＡ（Ｇｉｂｃｏ　ＢＲＬカタログＮｏ．２５２００−０４９）
【０４５８】
プロトコル
以下のプロトコルを用いてアッセイを実施した：
１．　Ｃｏｒｎｉｎｇ９６ウエルＥＬＩＳＡプレートを，ウエルあたり１．０μｇの，０．１ＭＮａ２ＣＯ３（ｐＨ９．６）中Ｃａｐｐｅｌ抗ウサギＩｇＧ抗体，でコーティングする。最終容量をウエルあたり１５０μｌとする。プレートを４℃で一夜コーティングする。プレートは，４℃で保存したとき，２週間まで保存することができる。
２．　細胞を適当な培養皿中で成長培地（ＤＭＥＭ，２．０ｍＭＬ−グルタミン，１０％ＦＢＳを補充）中で，コンフルエントとなるまで３７℃，５％ＣＯ２で成長させる。
３．　トリプシン処理により細胞を回収し，Ｃｏｒｎｉｎｇ２５８５０ポリスチレン９６ウエル丸底細胞プレートに，２００μｌの成長培地中２５，０００細胞／ウエルで播種する。
４．　細胞を３７℃，５％ＣＯ２で少なくとも１日成長させる。
５．　細胞をＤ−ＰＢＳ　１Ｘで洗浄する。
６．　２００μｌ／ウエルの飢餓培地（ＤＭＥＭ，２．０ｍＭ　ｌ−グルタミン，０．１％ＦＢＳ）を加える。３７℃，５％ＣＯ２で一夜インキュベートする。
７．　化合物をポリプロピレン９６ウエルプレート中で飢餓培地を用いて１：２０に希釈する。対照ウエルで使用するために，ジメチルスルホキシドを１：２０に希釈する。
８．　９６ウエル細胞培養プレートから飢餓培地を除去し，１６２μｌの新たに調製した飢餓培地を各ウエルに加える。
９．　１：２０に希釈された化合物希釈物１８μｌ（工程７より）を各ウエルに加え，１：２０ジメチルスルホキシド希釈物を対照ウエルに加え（＋／−ＶＥＧＦ），細胞刺激の後，１：２００の最終希釈とする。最終ジメチルスルホキシドは０．５％である。プレートを３７℃，５％ＣＯ２で２時間インキュベートする。
１０．　プレートを逆さにして液体を除去することにより，未結合抗体をＥＬＩＳＡプレートから除去する。ＴＢＳＷ＋０．５％エタノールアミン，ｐＨ７．０で３回洗浄する。プレートをペーパータオル上で軽くたたいて，過剰の液体および気泡を除去する。
１１．　ウエルあたり１５０μｌのＴＢＳＷ＋０．５％エタノールアミン，ｐＨ７．０でプレートをブロッキングする。プレートをマイクロタイタープレート振盪器で振盪しながら，３０分間インキュベートする。
１２．　プレートを工程１０で記載したように３回洗浄する。
１３．　０．５μｇ／ウエルのアフィニティー精製抗ＦＬＵ−１ポリクローナルウサギ抗血清を加える。ＴＢＳＷ＋０．５％エタノールアミンｐＨ７．０で最終容量を１５０μｌ／ウエルとする。プレートを振盪しながら３０分間インキュベートする。
１４．　細胞に１８０μｌの飢餓培地を加え，２０μｌ／ウエルの１０．０ｍＭオルトバナジウム酸ナトリウムおよび５００ｎｇ／ｍｌＶＥＧＦ（最終濃度；ウエルあたり１．０ｍＭオルトバナジウム酸ナトリウムおよび５０ｎｇ／ｍｌＶＥＧＦ）で３７℃，５％ＣＯ２で８分間細胞を刺激する。陰性対照ウエルには飢餓培地のみを加える。
１５．　８分後，培地を細胞から除去し，２００μｌ／ウエルのＰＢＳで１回洗浄しなければならない。
１６．　１５０μｌ／ウエルのＨＮＴＧ中で室温で５分間振盪しながら細胞を溶解させる。ＨＮＴＧ配合物はオルトバナジウム酸ナトリウム，ピロリン酸ナトリウムおよびＥＤＴＡを含む。
１７．　ＥＬＩＳＡプレートを工程１０に記載したように３回洗浄する。
１８．　細胞溶解物を細胞プレートからＥＬＩＳＡプレートに移し，振盪しながら２時間インキュベートする。細胞溶解物を移すには，ウエルを掻きながらピペットアップおよびダウンを行う。
１９．　プレートを工程１０に記載したように３回洗浄する。
２０．　ＥＬＩＳＡプレートを０．０２μｇ／ウエルのＴＢＳＷ＋０５％エタノールアミン中のＵＢ４０とともにインキュベートする。最終容量を１５０μｌ／ウエルとする。振盪しながら３０分間インキュベートする。
２１．　プレートを工程１０に記載したように３回洗浄する。
２２．　ＥＬＩＳＡプレートを，ＴＢＳＷ＋０．５％エタノールアミン，ｐＨ７．０中で１：１０，０００に希釈したＥＩＡ等級ヤギ抗マウスＩｇＧコンジュゲート西洋ワサビペルオキシダーゼとともにインキュベートする。最終容量を１５０μｌ／ウエルとする。振盪しながら３０分間インキュベートする。
２３．　工程１０で記載したようにプレートを洗浄する。
２４．　１００μｌのＡＢＴＳ／Ｈ２Ｏ２溶液をウエルに加える。振盪しながら１０分間インキュベートする。
２５．　１００μｌの０．２ＭＨＣｌを０．１ＭＨＣｌ最終濃度となるように加えて，発色反応を停止する。室温で１分間振盪する。ゆっくりした空気の流れで気泡を除去し，ＥＬＩＳＡプレートをＥＬＩＳＡプレートリーダーで４１０ｎｍで読む。
【０４５９】
実施例１６：ＨＥＲ−２　ＥＬＩＳＡ
アッセイ１：全細胞におけるＥＧＦレセプター−ＨＥＲ２キメラレセプターアッセイ
ＥＧＦＲ−ＮＩＨ３Ｔ３全細胞中のＨＥＲ２キナーゼ活性を以下に記載するようにして測定した。
【０４６０】
材料および試薬
以下の材料および試薬を用いてアッセイを実施した：
１．　ＥＧＦ：保存液濃度：１６．５ＩＬＭ；ＥＧＦ２０１，ＴＯＹＯＢＯ，Ｃｏ．，Ｌｔｄ．Ｊａｐａｎ
２．　０５−１０１（ＵＢＩ）（ＥＧＦＲ細胞外ドメインを認識するモノクローナル抗体）
３．　抗ホスホチロシン抗体（抗Ｐｔｙｒ）（ポリクローナル）（Ｆｅｎｄｌｅｙ，ｅｔ　ａｌ．，（上掲）を参照）
４．　検出抗体：ヤギ抗ウサギｌｇＧ西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲート，ＴＡＧＯ，Ｉｎｃ．，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ
５．　ＴＢＳＴ緩衝液：
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．２　　　５０ｍＭ
ＮａＣｌ　　　　　　　　　　　　　１５０ｍＭ
ＴｒｉｔｏｎＸ−１００　　　　　　０．１
６．　ＨＮＴＧ　５Ｘ保存液：
ＨＥＰＥＳ　　　　　　　　　　　　０．１Ｍ
ＮａＣｌ　　　　　　　　　　　　　０．７５Ｍ
グリセロール　　　　　　　　　　　５０％
ＴｒｉｔｏｎＸ−１００　　　　　　１．０％
７．　ＡＢＴＳ保存液：
クエン酸　　　　　　　　　　　　　１００ｍＭ
Ｎａ２ＨＰＯ４　　　　　　　　　　　２５０ｍＭ
ＨＣｌ（濃）　　　　　　　　　　　０．５ｍＭ
ＡＢＴＳ＊　　　　　　　　　　　　０．５ｍｇ／ｍｌ
＊（２，２’−アジノビス（３−エチルベンズチアゾリンスルホン酸））
溶液は使用するまで暗所で４℃で保存する。
８．　試薬保存液：
ＥＤＴＡ　１００ｍＭ　ｐＨ７．０
Ｎａ３ＶＯ４　０．５Ｍ
Ｎａ４（Ｐ２Ｏ７）　０．２Ｍ
【０４６１】
プロトコル
以下のプロトコルを用いた：
Ａ．ＥＬＩＳＡプレートのプレコート
１．　ＥＬＩＳＡプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ，９６ウエル，Ｃａｔ．＃２５８０５−９６）をウエルあたりＰＢＳ中０．５μｇの０５−１０１抗体で１００μｌの最終容量／ウエルでコーティングし，４℃で一夜保存する。コーティングしたプレートは４℃で保存した場合，１０日間まで良好である。
２．　使用の日，コーティング緩衝液を除去し，１００μｌのブロッキング緩衝液（ＰＢＳ中５％Ｃａｒｎａｔｉｏｎインスタント脱脂乾燥ミルク）で置き換える。プレートを室温で（約２３℃から２５℃）振盪しながら３０分間インキュベートする。使用の直前に，ブロッキング緩衝液を除去し，プレートをＴＢＳＴ緩衝液で４回洗浄する。
【０４６２】
Ｂ．細胞播種
１．　このアッセイには，ＥＧＦＲ細胞外ドメインおよび細胞内ＨＥＲ２キナーゼドメインを含有するキメラレセプターを過剰発現するＮＩＨ３Ｔ３細胞株を用いることができる。
２．　８０−９０％コンフルエントの培養皿を実験用に選択する。細胞をトリプシン処理し，１０％ウシ胎児血清を加えることにより反応を停止させる。細胞をＤＭＥＭ培地（１０％ＣＳ　ＤＭＥＭ培地）中に懸濁し，１５００ｒｐｍで室温で５分間１回遠心分離する。
３．　細胞を播種培地（ＤＭＥＭ，０．５％ウシ血清）に再懸濁し，トリパンブルーを用いて細胞を計数する。９０％より高い生存性が許容される。細胞をＤＭＥＭ培地（０．５％ウシ血清）中で，ウエルあたり１０，０００細胞の密度で，ウエルあたり１００μｌで，９６ウエルマイクロタイタープレートに播種する。播種した細胞を５％ＣＯ２中で３７℃で約４０時間インキュベートする。
【０４６３】
Ｃ．アッセイ方法
１．　播種した細胞を，倒立顕微鏡を用いてコンタミネーションについて検査する。薬剤保存液（ＤＭＳＯ中１０ｍｇ／ｍｌ）をＤＭＥＭ培地で１：１０に希釈し，次に５μｌを，最終薬剤希釈１：２００および最終ＤＭＳＯ濃度１％となるように，ＴＢＳＴウエルに移す。対照ウエルにはＤＭＳＯのみを加える。５％ＣＯ２中で３７℃で２時間インキュベートする。
２．　ＥＧＦリガンドの調製：保存液ＥＧＦを，１０μｌ希釈ＥＧＦ（１：１２希釈）を移したときに１００ｎＭの最終濃度が得られるように，ＤＭＥＭ中で希釈する。
３．　ウエルあたり１００μｌに十分なように新たにＨＮＴＧ＊を調製し，氷上に置く。
ＨＮＴＧ＊（１０ｍｌ）：
ＨＮＴＧ保存液　　　　　　　　　　　　２．０ｍｌ
ｍｉｌｌｉ−ＱＨ２Ｏ　　　　　　　　　　７．３ｍｌ
ＥＤＴＡ，１００ｍＭ，ｐＨ７．０　　　０．５ｍｌ
Ｎａ３ＶＯ４，０．５Ｍ　　　　　　　　　０．１ｍｌ
Ｎａ４（Ｐ２Ｏ７），０．２Ｍ　　　　　　　０．１ｍｌ
４．　薬剤とともに１２０分間インキュベーションした後，調製したＳＧＦリガンドを，ウエルあたり１０μｌ，最終濃度１００ｎＭとなるように細胞に加える。対照ウエルにはＤＭＥＭのみを加える。室温で５分間振盪しながらインキュベートする。
５．　薬剤，ＥＧＦ，およびＤＭＥＭを除去する。細胞をＰＢＳで２回洗浄する。ウエルあたり１００μｌのＨＮＴＧ＊を細胞に移す。氷上に５分間放置する。この間に，ブロッキング緩衝液を他のＥＬＩＳＡプレートから除去し，上述したようにＴＢＳＴで洗浄する。
６．　マイクロピペッターにぴったりと固定したピペットチップを用いて，細胞をプレートからはがし，ＨＮＴＧ＊溶解緩衝液を繰り返し吸引および分配することにより，細胞物質をホモジナイズする。コーティングし，ブロッキングし，洗浄したＥＬＩＳＡプレートに溶解物を移す。振盪しながら室温で１時間インキュベートする。
７．　溶解物を除去し，ＴＢＳＴで４回洗浄する。新たに希釈した抗Ｐｔｙｒ抗体をウエルあたり１００μｌでＥＬＩＳＡプレートに移す。抗Ｐｔｙｒ抗血清（ＴＢＳＴ中１：３０００希釈）の存在下で，振盪しながら室温で３０分間インキュベートする。
８．　抗Ｐｔｙｒ抗体を除去し，ＴＢＳＴで４回洗浄する。新たに希釈したＴＡＧＯ抗ウサギＩｇＧ抗体をＥＬＩＳＡプレートにウエルあたり１００μｌで移す。振盪しながら室温で３０分間インキュベートする（抗ウサギＩｇＧ抗体：ＴＢＳＴ中１：３０００希釈）。
９．　ＴＡＧＯ検出抗体を除去し，ＴＢＳＴで４回洗浄する。新たに調製したＡＢＴＳ／Ｈ２Ｏ２溶液をウエルあたり１００μｌでＥＬＩＳＡプレートに移す。振盪しながら室温で２０分間インキュベートする（ＡＢＴＳ／Ｈ２Ｏ２溶液：１０ｍｌＡＢＴＳ保存液中１．０μｌの３０％Ｈ２Ｏ２）。
１０．　５０μｌの５Ｎ　Ｈ２ＳＯ４を加えることにより反応を停止し（任意），４１０ｎｍでＯ．Ｄ．を測定する。
１１．　最大ホスホチロシンシグナルは，陰性対照の値を陽性対照の値から差し引くことにより決定する。次に，抽出物含有ウエルについて，陰性対照を差し引いた後にホスホチロシン含有量のパーセント阻害を計算する。
【０４６４】
実施例１７：ＰＤＧＦ−Ｒ　ＥＬＩＳＡ
すべての細胞培養培地，グルタミンおよびウシ胎児血清は，特に記載しないかぎり，Ｇｉｂｃｏ　Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｇｒａｎｄ　Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）から購入した。すべての細胞は，９０−９５％空気および５−１０％ＣＯ２の湿潤雰囲気下で３７℃で成長させた。すべての細胞株は，日常的に１週間に２回サブカルチャーし，Ｍｙｃｏｔｅｃｔ法（Ｇｉｂｃｏ）によりマイコプラズマがないことを確認した。
ＥＬＩＳＡアッセイのためには，細胞（Ｕ１２４２，Ｊｏｓｅｐｈ　Ｓｃｈｌｅｓｓｉｎｇｅｒ，ＮＹＵから入手）を成長培地（ＭＥＭ，１０％ＦＢＳ，ＮＥＡＡ，１ｍＭ　ＮａＰｙｒおよび２ｍＭＧＬＮ含有）で８０−９０％コンフルエントまで成長させ，９６ウエル組織培養プレートに０．５％血清中で，ウエルあたり２５，０００−３０，０００細胞を播種した。０．５％血清含有培地で一夜インキュベーションした後，細胞を無血清培地に移し，５％ＣＯ２，３７℃インキュベーター中で試験化合物で２時間処理した。次に細胞をリガンドで５−１０分間刺激し，ＨＮＴＧ（２０ｍＭＨｅｐｅｓ，１５０ｍＭＮａＣｌ，１０％グリセロール，５ｍＭＥＤＴＡ，５ｍＭＮａ３ＶＯ４，０．２％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００，および２ｍＭＮａＰｙｒ）で溶解した。細胞溶解物（ＰＢＳ中０．５ｍｇ／ウエル）をレセプター特異的抗体であらかじめ被覆し，ＴＢＳＴ（５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌｐＨ７．２，１５０ｍＭＮａＣｌおよび０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）中５％ミルクで室温で３０分間ブロッキングしたＥＬＩＳＡプレートに移した。溶解物を振盪しながら室温で１時間インキュベートした。プレートをＴＢＳＴで４回洗浄し，次にポリクローナル抗ホスホチロシン抗体とともに室温で３０分間インキュベートした。プレートをＴＢＳＴで４回すすぐことにより過剰の抗ホスホチロシン抗体を除去した。ＥＬＩＳＡプレートにヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体を室温で３０分間加え，次にＴＢＳＴでさらに４回すすいだ。ＡＢＴＳ（１００ｍＭクエン酸，２５０ｍＭＮａ２ＨＰＯ４および０．５ｍｇ／ｍＬ２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンズチアゾリン−６−硫酸）），およびＨ２Ｏ２（１．２ｍＬ３０％Ｈ２Ｏ２を１０ｍｌＡＢＴＳに加える）をＥＬＩＳＡプレートに加えて発色を開始させた。ＡＢＴＳ添加の約１５から３０分後，４１０ｎｍおよび６３０ｎｍの参照波長における吸光度を記録した。
【０４６５】
実施例１８：ＩＧＦ−ＩレセプターＥＬＩＳＡ
以下のプロトコルを用いて，ＩＧＦ−Ｉレセプター上のホスホチロシンレベルを測定することができ，これはＩＧＦ−Ｉレセプターチロシンキナーゼ活性を示す。
【０４６６】
材料および試薬
以下の材料および試薬を用いた：
１．　このアッセイにおいて用いる細胞株は，ＩＧＦ−１レセプターを過剰発現するように遺伝子工学処理された細胞株３Ｔ３／ＩＧＦ−１Ｒである。
２．　ＮＩＨ３Ｔ３／ＩＧＦ−１Ｒを，５％ＣＯ２，３７℃のインキュベーターで成長させる。成長培地はＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ（熱不活性化）＋２ｍＭＬ−グルタミンである。
３．　アフィニティー精製抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体１７−６９
４．　Ｄ−ＰＢＳ：
ＫＨ２ＰＯ４　　　　　　０．２０ｇ／ｌ
Ｋ２ＨＰＯ４　　　　　　２．１６ｇ／ｌ
ＫＣｌ　　　　　　　　０．２０ｇ／ｌ
ＮａＣｌ　　　　　　　８．００ｇ／ｌ（ｐＨ７．２）
５．　ブロッキング緩衝液：ＴＢＳＴプラス５％ミルク（Ｃａｒｎａｔｉｏｎインスタント脱脂乾燥ミルク）
６．　ＴＢＳＴ緩衝液：
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ　　　　　　５０ｍＭ
ＮａＣｌ　　　　　　　　　　１５０ｍＭ（ｐＨ７．２／ＨＣｌ　１０Ｎ）
ＴｒｉｔｏｎＸ−１００　　　０．１％
ＴＢＳ（１０Ｘ）の保存溶液を調製し，希釈の間に緩衝液にＴｒｉｔｏｎＸ−１００を加える。
７．　ＨＮＴＧ緩衝液：
ＨＥＰＥＳ　　　　　　　　　２０ｍＭ
ＮａＣｌ　　　　　　　　　　１５０ｍＭ（ｐＨ７．２／ＨＣｌ　１Ｎ）
グリセロール　　　　　　　　１０％
ＴｒｉｔｏｎＸ−１００　　　０．２％
保存溶液（５Ｘ）を調製し，４℃で保存する。
８．　ＥＤＴＡ／ＨＣｌ：０．５ＭｐＨ７．０（ＮａＯＨ），１００Ｘ保存液として
９．　Ｎａ３ＶＯ４：１００Ｘ保存液として０．５Ｍ，アリコートは−８０℃で保存する。
１０．　Ｎａ４Ｐ２Ｏ７：１００Ｘ保存液として０．２Ｍ
１１．　インスリン様成長因子−１，Ｐｒｏｍｅｇａ（Ｃａｔ＃Ｇ５１１１）
１２．ウサギポリクローナル抗ホスホチロシン抗血清
１３．　ヤギ抗ウサギＩｇＧ，ＰＯＤコンジュゲート（検出抗体），Ｔａｇｏ（Ｃａｔ．Ｎｏ．４５２０，ＬｏｔＮｏ．１８０２）：Ｔａｇｏ，Ｉｎｃ．，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ
１４．　ＡＢＴＳ（２，２’−アジノビス（３−エチルベンズチアゾリン硫酸））溶液：
クエン酸　　　　　　　　１００ｍＭ
Ｎａ２ＨＰＯ４　　　　　　２５０ｍＭ（ｐＨ４．０／１ＮＨＣｌ）
ＡＢＴＳ　　　　　　　　０．５ｍｇ／ｍｌ
ＡＢＴＳ溶液は暗所で４℃で保存しなければならない。溶液は緑色に変色したときは廃棄しなければならない。
１５．　過酸化水素：３０％溶液を暗所で４℃で保存する。
【０４６７】
プロトコル
以下のすべての工程は，特に記載しないかぎり，室温で実施する。すべてのＥＬＩＳＡプレート洗浄は，プレートを水道水で３回すすぎ，ＴＢＳＴで１回すすぐことにより実施する。プレートを軽くたたいてペーパータオルで乾燥させる。Ａ．細胞播種：
１．　組織培養皿（Ｃｏｒｎｉｎｇ２５０２０−１００）で８０−９０％コンフルエントまで成長させた細胞を，トリプシン−ＥＤＴＡ（０．２５％，０．５ｍｌ／Ｄ−１００，ＧＩＢＣＯ）で回収する。
２．　細胞を新鮮なＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ＋２ｍＭＬ−グルタミン中に再懸濁し，９６ウエル組織培養プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ，２５８０６−９６）に２０，０００細胞／ウエル（１００μｌ／ウエル）で移す。１日インキュベートし，次に培地を無血清培地（９０／μｌ）で置き換え，５％ＣＯ２，３７℃で一夜インキュベートする。
【０４６８】
Ｂ．ＥＬＩＳＡプレートコーティングおよびブロッキング：
１．　ＥＬＩＳＡプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ２５８０５−９６）を，１００μｌＰＢＳ中の抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体で０．５μｇ／ウエルで少なくとも２時間コーティングする。
２．　コーティング溶液を除去し，１００μｌのブロッキング緩衝液で置き換え，３０分間振盪する。ブロッキング緩衝液を除去し，溶解物を加える直前にプレートを洗浄する。
【０４６９】
Ｃ．アッセイ方法：
１．　薬剤は，無血清条件で試験する。
２．　薬剤保存液（１００％ＤＭＳＯ中）を９６ウエルポリプロピレンプレート中でＤＭＥＭで１：１０に希釈し，１０μｌ／ウエルのこの溶液を細胞に移して，最終薬剤希釈１：１００，最終ＤＭＳＯ濃度１．０％とする。細胞を５％ＣＯ２中で３７℃で２時間インキュベートする。
３．　新鮮な細胞溶解緩衝液（ＨＮＴＧ＊）を調製する。
ＨＮＴＧ　　　　　　　２ｍｌ
ＥＤＴＡ　　　　　　　０．１ｍｌ
Ｎａ３ＶＯ４　　　　　　０．１ｍｌ
Ｎａ４（Ｐ２Ｏ７）　　　０．１ｍｌ
Ｈ２Ｏ　　　　　　　　７．３ｍｌ
４．　薬剤を２時間インキュベートした後，１０μｌ／ウエルのＰＢＳ中２００ｎＭＩＧＦ−１リガンドを細胞に移し（最終濃度２０ｎＭ），５％ＣＯ２で３７℃で１０分間インキュベートする。
５．　培地を除去し，１００μｌ／ウエルのＨＮＴＧ＊を加え，１０分間振盪する。細胞を顕微鏡下で観察して，これらが適切に溶解したか否かを見る。
６．　１２チャネルピペットを用いて細胞をプレートから掻き取り，吸引と分配を繰り返すことにより溶解物をホモジナイズする。すべての溶解物を抗体コーティングＥＬＩＳＡプレートに移し，１時間振盪する。
７．　溶解物を除去し，プレートを洗浄し，抗ｐＴｙｒ（ＴＢＳＴ中１：３，０００）を１００μｌ／ウエルで移し，３０分間振盪する。
８．　抗ｐＴｙｒを除去し，プレートを洗浄し，ＴＡＧＯ（ＴＢＳＴ中１：３，０００）を１００μｌ／ウエルで移し，３０分間振盪する。
９．　検出抗体を除去し，プレートを洗浄し，新鮮なＡＢＴＳ／Ｈ２Ｏ２（１．２μｌＨ２Ｏ２を１０ｍｌＡＢＴＳに加える）を１００μｌ／ウエルでプレートに移して，発色を開始させる。
１０．　ＤｙｎａｔｅｃＭＲ５０００で参照波長６３０ｎｍで４１０ｎｍのＯＤを測定する。
【０４７０】
実施例１９：ＥＧＦレセプターＥＬＩＳＡ
ヒトＥＧＦ−Ｒを発現するよう遺伝子工学処理された細胞中のＥＧＦレセプターキナーゼ活性を以下に記載するように測定した。
材料および試薬
以下の材料および試薬を用いた：
１．　ＥＧＦリガンド：保存液濃度＝１６．５μＭ；ＥＧＦ２０１，ＴＯＹＯＢＯ，Ｃｏ．，Ｌｔｄ．Ｊａｐａｎ
２．　０５−１０１（ＵＢＩ）（ＥＧＦＲ細胞外ドメインを認識するモノクローナル抗体）
３．　抗ホスホチロシン抗体（抗Ｐｔｙｒ）（ポリクローナル）
４．　検出抗体：ヤギ抗ウサギｌｇＧ西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲート，ＴＡＧＯ，Ｉｎｃ．，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ
５．　ＴＢＳＴ緩衝液：
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７　　　　　５０ｍＭ
ＮａＣｌ　　　　　　　　　　　　　１５０ｍＭ
ＴｒｉｔｏｎＸ−１００　　　　　　０．１
６．　ＨＮＴＧ　５Ｘ保存液：
ＨＥＰＥＳ　　　　　　　　　　　　０．１Ｍ
ＮａＣｌ　　　　　　　　　　　０．７５Ｍ
グリセロール　　　　　　　　　　　５０
ＴｒｉｔｏｎＸ−１００　　　　　　１．０％
７．　ＡＢＴＳ保存液：
クエン酸　　　　　　　　　　　　　１００ｍＭ
ＮａＶＯ４　　　　　　　　　　　　２５０ｍＭ
ＨＣｌ（濃）　　　　　　　　　　　４．０ｐＨ
ＡＢＴＳ＊　　　　　　　　　　　　０．５ｍｇ／ｍｌ
溶液は使用するまで暗所で４℃で保存する。
８．　試薬保存液：
ＥＤＴＡ　１００ｍＭ　ｐＨ７．０
Ｎａ３ＶＯ４　０．５Ｍ
Ｎａ４（Ｐ２０７）　０．２Ｍ
【０４７１】
プロトコル
以下のプロトコルを用いた：
Ａ．ＥＬＩＳＡプレートのプレコート
１．　ＥＬＩＳＡプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ，９６ウエル，Ｃａｔ．＃２５８０５−９６）をウエルあたりＰＢＳ中０．５μｇ，１５０μｌ最終容量／ウエルの０５−１０１抗体でコーティングし，４℃で一夜保存する。コーティングしたプレートは４℃で保存した場合１０日間まで良好に使用しうる。
２．　使用の日，コーティング緩衝液を除去し，ブロッキング緩衝液（ＰＢＳ中５％Ｃａｒｎａｔｉｏｎインスタント脱脂乾燥ミルク）で置き換える。プレートを振盪しながら室温（約２３℃−２５℃）で３０分間インキュベートする。使用の直前に，ブロッキング緩衝液を除去し，プレートをＴＢＳＴ緩衝液で４回洗浄する。
【０４７２】
Ｂ．細胞播種
１．　このアッセイにはＮＩＨ３Ｔ３／Ｃ７細胞株（Ｈｏｎｅｇｇｅｒ，ｅｔ　ａｌ．，Ｃｅｌｌ５１：１９９−２０９，１９８７）を用いることができる。
２．　８０−９０％コンフルエントの皿を実験用に選択する。細胞をトリプシン処理し，１０％ＣＳ　ＤＭＥＭ培地を加えることにより反応を停止させる。細胞をＤＭＥＭ培地（１０％ＣＳ　ＤＭＥＭ培地）中に懸濁し，１０００ｒｐｍで室温で５分間，１回遠心分離する。
３．　細胞を播種培地（ＤＭＥＭ，０．５％ウシ血清）に再懸濁し，トリパンブルーを用いて細胞を計数する。９０％を越える生存率が許容範囲である。細胞を９６ウエルマイクロタイタープレート上で，ＤＭＥＭ培地（０．５％ウシ血清）中に，ウエルあたり１０，０００細胞の密度でウエルあたり１００μｌで播種する。播種した細胞を５％ＣＯ２，３７℃で約４０時間インキュベートする。
【０４７３】
Ｃ．アッセイ方法
１．　倒立顕微鏡を用いて，播種した細胞のコンタミネーションを調べる。試験化合物保存液（ＤＭＳＯ中１０ｍｇ／ｍｌ）をＤＭＥＭ培地中で１：１０に希釈し，次に５μｌを試験ウエルに移して，１：２００の最終薬剤希釈および１％の最終ＤＭＳＯ濃度とする。対照ウエルにはＤＭＳＯのみを加える。５％ＣＯ２，３７℃で１時間インキュベートする。
２．　ＥＧＦリガンドの調製：保存液ＥＧＦを，１０μｌの希釈ＥＧＦ（１：１２希釈）を移したときに２５ｎＭの最終濃度が得られるように，ＤＭＥＭ中で希釈する。
３．　ウエルあたり１００μｌに十分なように新鮮なＨＮＴＧ＊１０ｍｌを調製する。ＨＮＴＧ＊は以下のものを含む：ＨＮＴＧ保存液（２．０ｍｌ），ｍｉｌｌｉ−ＱＨ２Ｏ（７．３ｍｌ），ＥＤＴＡ，１００ｍＭ，ｐＨ７．０（０．５ｍｌ），Ｎａ３ＶＯ４０．５Ｍ（０．１ｍｌ）およびＮａ４（Ｐ２Ｏ７），０．２Ｍ（０．１ｍｌ）
４．　氷上に置く。
５．　薬剤とともに２時間インキュベーションした後，調製したＥＧＦリガンドを，ウエルあたり１０μｌで，２５ｎＭの最終濃度となるように細胞に加える。対照ウエルにはＤＭＥＭのみを加える。振盪しながら室温で５分間インキュベートする。
６．　試験化合物，ＥＧＦおよびＤＭＥＭを除去する。細胞をＰＢＳで２回洗浄する。ＨＮＴＧ＊をウエルあたり１００μｌで細胞に移す。氷上に５分間置く。その間に，他のＥＬＩＳＡプレートからブロッキング緩衝液を除去し，上述したようにＴＢＳＴで洗浄する。
７．　マイクロピペッターにぴったりと固定したピペットチップを用いて，細胞をプレートからはがし，ＨＮＴＧ＊溶解緩衝液を繰り返し吸引および分配することにより，細胞物質をホモジナイズする。コーティングし，ブロッキングし，洗浄したＥＬＩＳＡプレートに溶解物を移す。振盪しながら室温で１時間インキュベートする。
８．　溶解物を除去し，ＴＢＳＴで４回洗浄する。新たに希釈した抗Ｐｔｙｒ抗体をウエルあたり１００μｌでＥＬＩＳＡプレートに移す。抗Ｐｔｙｒ抗血清（ＴＢＳＴ中１：３０００希釈）の存在下で，振盪しながら室温で３０分間インキュベートする。
９．　抗Ｐｔｙｒ抗体を除去し，ＴＢＳＴで４回洗浄する。新たに希釈したＴＡＧＯ３０抗ウサギＩｇＧ抗体をＥＬＩＳＡプレートにウエルあたり１００μｌで移す。振盪しながら室温で３０分間インキュベートする（抗ウサギＩｇＧ抗体：ＴＢＳＴ中１：３０００希釈）。
１０．　検出抗体を除去し，ＴＢＳＴで４回洗浄する。新たに調製したＡＢＴＳ／Ｈ２Ｏ２溶液をウエルあたり１００μｌでＥＬＩＳＡプレートに移す。室温で２０分間インキュベートする（ＡＢＴＳ／Ｈ２Ｏ２溶液：１０ｍｌＡＢＴＳ保存液中１．２μｌの３０％Ｈ２Ｏ２）。
１１．　５０μｌの５ＮＨ２ＳＯ４を加えることにより反応を停止し（任意），４１０ｎｍでＯ．Ｄ．を測定する。
１２．　最大ホスホチロシンシグナルは，陰性対照の値を陽性対照の値から差し引くことにより決定する。次に，陰性対照を差し引いた後，抽出物含有ウエルについてのホスホチロシン含有量のパーセント阻害を計算する。
【０４７４】
実施例２０：Ｍｅｔ自己リン酸化アッセイ−ＥＬＩＳＡ
このアッセイは，Ｍｅｔレセプター上のＭｅｔ蛋白質チロシンキナーゼレベルを分析することにより，Ｍｅｔチロシンキナーゼ活性を決定する
材料および試薬
以下の材料および試薬を用いた：
１．　ＨＮＴＧ（５Ｘ保存溶液）：２３．８３ｇＨＥＰＥＳおよび４３．８３ｇＮａＣｌを約３５０ｍｌｄＨ２Ｏに溶解する。ＨＣｌまたはＮａＯＨでｐＨを７．２に調節し，５００ｍｌグリセロールおよび１０ｍｌＴｒｉｔｏｎＸ−１００を加え，混合し，ｄＨ２Ｏを加えて総容量を１Ｌとする。１Ｘ作業溶液１Ｌを作成するためには，２００ｍｌの５Ｘ保存溶液を８００ｍｌｄＨ２Ｏに加え，必要に応じてｐＨを調べて調節し，４℃で保存する。
２．　ＰＢＳ（ダルベッコリン酸緩衝化食塩水），Ｇｉｂｃｏ　Ｃａｔ．＃４５０−１３００ＥＢ（１Ｘ溶液）
３．　ブロッキング緩衝液：５００ｍｌｄＨ２Ｏ中に，１００ｇＢＳＡ，１２．１ｇＴｒｉｓ−ｐＨ７．５，５８．４４ｇＮａＣｌおよび１０ｍｌＴｗｅｅｎ−２０を加え，希釈して総容量１Ｌとする。
４．　キナーゼ緩衝液：５００ｍｌｄＨ２Ｏに，１２．１ｇＴＲＩＳ（ｐＨ７．２），５８．４ｇＮａＣｌ，４０．７ｇＭｇＣｌ２および１．９ｇＥＧＴＡを加え，ｄＨ２Ｏで総容量１Ｌとする。
５．　ＰＭＳＦ（フッ化フェニルメチルスルホニル），Ｓｉｇｍａ　Ｃａｔ．＃Ｐ−７６２６，４３５．５ｍｇに１００％エタノールを総容量２５ｍｌとなるように加え，ボルテックスする。
６．　ＡＴＰ（細菌起源），Ｓｉｇｍａ　Ｃａｔ．＃Ａ−７６９９，粉末を−２０℃で保存する；作業溶液を作成するためには，３．３１ｍｇを１ｍｌｄＨ２Ｏ中に溶解する。
７．　ＲＣ−２０Ｈ　ＨＲＰＯコンジュゲート化抗ホスホチロシン，Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　Ｃａｔ．＃Ｅ１２０Ｈ
８．　Ｐｉｅｒｃｅ　１−Ｓｔｅｐ（商標）Ｔｕｒｂｏ−ＴＭＢ−ＥＬＩＳＡ（３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン），Ｐｉｅｒｃｅ　Ｃａｔ．＃３４０２２
９．　Ｈ２ＳＯ４，濃硫酸１ｍｌ（１８Ｎ）を３５ｍｌｄＨ２Ｏに加える。
１０．　ＴＲＩＳ　ＨＣＬ，Ｆｉｓｃｈｅｒ　Ｃａｔ．＃ＢＰ１５２−５；材料１２１．１４ｇに６００ｍｌのＭｉｌｌｉＱ　Ｈ２Ｏを加え，ＨＣｌでｐＨを７．５（または７．２）に調節し，ＭｉｌｌｉＱ　Ｈ２Ｏで容量を１Ｌとする。
１１．　ＮａＣｌ，Ｆｉｓｃｈｅｒ　Ｃａｔ．＃Ｓ２７１−１０，５Ｍ溶液を作成する。
１２．　Ｔｗｅｅｎ−２０，Ｆｉｓｃｈｅｒ　Ｃａｔ．＃Ｓ３３７−５００
１３．　Ｎａ３ＶＯ４，Ｆｉｓｃｈｅｒ　Ｃａｔ．＃Ｓ４５４−５０，材料１．８ｇに８０ｍｌのＭｉｌｌｉＱ　Ｈ２Ｏを加え，ＨＣｌまたはＮａＯＨでｐＨを１０．０に調節し，電子レンジで沸騰させ，冷却し，ｐＨを調べ，ｐＨが１０．０で安定となるまでこの工程を繰り返し，ＭｉｌｌｉＱ　Ｈ２Ｏを加えて総容量１００ｍｌとし，１ｍｌアリコートを作成し，−８０℃で保存する。
１４．　ＭｇＣｌ２，Ｆｉｓｃｈｅｒ　Ｃａｔ．＃Ｍ３３−５００，１Ｍ溶液を作成する。
１５．　ＨＥＰＥＳ，Ｆｉｓｃｈｅｒ　Ｃａｔ．＃ＢＰ３１０−５００，２００ｍｌＭｉｌｌｉＱ　Ｈ２Ｏに，材料５９．６ｇを加え，ｐＨを７．５に調節し，総容量２５０ｍｌとし，濾過滅菌する。
１６．　アルブミン，ウシ（ＢＳＡ），Ｓｉｇｍａ　Ｃａｔ．＃Ａ−４５０３，材料３０ｇに滅菌蒸留水を加えて総容量３００ｍｌとし，４℃で保存する。
１７．　ＴＢＳＴ緩衝液：１Ｌの目盛り付きシリンダー中の約９００ｍｌのｄＨ２Ｏに６．０５７ｇＴＲＩＳおよび８．７６６ｇＮａＣｌを加え，溶解したとき，ＨＣｌでｐＨを７．２に調節し，１．０ｍｌＴｒｉｔｏｎＸ−１００を加え，ｄＨ２Ｏで総容量１Ｌとする。
１８．　ヤギアフィニティー精製抗体ウサギＩｇＧ（全分子），Ｃａｐｐｅｌ　Ｃａｔ．＃５５６４１
１９．　抗ｈ−Ｍｅｔ（Ｃ−２８）ウサギポリクローナルＩｇＧ抗体，Ｓａｎｔａ　Ｃｒｕｚ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃａｔ．＃ＳＣ−１６１
２０．　過渡的にトランスフェクションされたＥＧＦＲ／Ｍｅｔキメラ細胞（ＥＭＲ）（Ｋｏｍａｄａ，ｅｔ　ａｌ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，８：２３８１−２３９０（１９９３）
２１．　炭酸ナトリウム緩衝液，（Ｎａ２ＣＯ４，Ｆｉｓｃｈｅｒ　Ｃａｔ．＃Ｓ４９５）：材料１０．６ｇに８００ｍｌのＭｉｌｌｉＱ　Ｈ２Ｏを加え，溶解したとき，ＮａＯＨでｐＨを９．６に調節し，ＭｉｌｌｉＱ　Ｈ２Ｏで総容量１Ｌとし，濾過し，４℃で保存する。
【０４７５】
方法
以下の工程は，特に記載のない限り，全て室温で実施する。ＥＬＩＳＡプレート洗浄は全てＴＢＳＴで４回すすぐことにより行う。
Ａ．ＥＭＲ溶解
この方法は，レセプター捕捉の開始の前夜または直前に実施することができる。
１．　溶解物を３７℃の水浴中で渦巻き動作により最後の結晶が消失するまで急速に溶解する。
２．　細胞ペレットを１ｍＭＰＭＳＦを含有する１Ｘ　ＨＮＴＧ中で溶解する。
１５ｃｍ皿の細胞あたり３ｍｌのＨＮＴＧを用いる。計算したＨＮＴＧ容量の１／２を加え，管を１分間ボルテックスし，残量のＨＮＴＧを加え，さらに１分間ボルテックスする。
３．　管の釣り合いをとり，１０，０００ｘｇ，１０分間，４℃で遠心分離する。
４．　上清をプールし，アリコートを除去して蛋白質測定を行う。
５．　プールしたサンプルをドライアイス／エタノール浴中で急速凍結する。この工程は，溶解物を一夜保存するか蛋白質測定後に直ちに使用するかにかかわらず実施する。
６．　標準的ビシンコニン酸（ＢＣＡ）法を用いて蛋白質測定を実施する（ＢＣＡアッセイ試薬キット，Ｐｉｅｒｃｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃａｔ．＃２３２２５）。
【０４７６】
Ｂ．ＥＬＩＳＡ法
１．　Ｃｏｒｎｉｎｇ９６ウエルＥＬＩＳＡプレートを，総ウエル容量５０μｌ，ウエルあたり５μｇの炭酸塩緩衝液中のヤギ抗ウサギ抗体でコーティングする。４℃で一夜保存する。
２．　プレートを逆さにして液体を除去することにより，未結合ヤギ抗ウサギ抗体を除去する。
３．　１５０μｌのブロッキング緩衝液を各ウエルに加える。振盪しながら３０分間インキュベートする。
４．　ＴＢＳＴで４回洗浄する。プレートをペーパータオル上で軽くたたいて過剰の液体および気泡を除去する。
５．　ウエル総容量１００μｌに対して，ＴＢＳＴ中で希釈したウサギ抗Ｍｅｔ抗体をウエルあたり１μｇ加える。
６．　溶解物をＨＮＴＧで希釈する（９０μｇ溶解物／１００μｌ）。
７．　希釈した溶解物１００μｌを各ウエルに加える。６０分間振盪する。
８．　ＴＢＳＴで４回洗浄する。ペーパータオル上で軽くたたいて過剰の液体および気泡を除去する。
９．　ウエルあたり５０μｌの１Ｘ溶解物緩衝液を加える。
１０．　化合物／抽出物をポリプロピレン９６ウエルプレート中で１Ｘキナーゼ緩衝液中で１：１０に希釈する。
１１．　希釈した化合物５．５μｌをＥＬＩＳＡプレートウエルに移す。振盪しながら室温で２０分間インキュベートする。
１２．　ウエルあたり５．５μｌの６０μＭＡＴＰ溶液を加える。陰性対照にはＡＴＰを加えない。振盪しながら９０分間インキュベートする。
１３．　ＴＢＳＴで４回洗浄する。プレートをペーパータオル上で軽くたたいて過剰の液体および気泡を除去する。
１４．　ウエルあたり１００μｌのＲＣ２０（ブロッキング緩衝液中１：３０００希釈）を加える。振盪しながら３０分間インキュベートする。
１５．　ＴＢＳＴで４回洗浄する。プレートをペーパータオル上で軽くたたいて過剰の液体および気泡を除去する。
１６．　ウエルあたり１００μｌのＴｕｒｂｏ−ＴＭＢを加える。振盪しながら３０−６０分間インキュベートする。
１７．　ウエルあたり１００μｌの１ＭＨ２ＳＯ４を加えて反応を停止させる。
１８．　Ｄｙｎａｔｅｃｈ　ＭＲ７０００　ＥＬＩＳＡリーダーでアッセイを読む。試験フィルター＝４５０ｎｍ，参照フィルター＝４１０ｎｍ。
【０４７７】
実施例２１：生化学的ｓｒｃアッセイ−ＥＬＩＳＡ
このアッセイを用いて，ビオチニル化ペプチドのリン酸化を読出しとして測定することにより，ｓｒｃ蛋白質キナーゼ活性を決定する。
材料および試薬：
以下の材料および試薬を用いた：
１．　ｓｒｃでトランスフォームした酵母
２．　細胞溶解物：ｓｒｃを発現する酵母細胞をペレット化し，水で１回洗浄し，再びペレット化して，使用するまで−８０℃で保存する。
３．　Ｎ末端ビオチニル化ＥＥＥＹＥＥＹＥＥＥＹＥＥＥＹＥＥＥＹは，当業者に周知の標準的な方法により調製する。
４．　ＤＭＳＯ：Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ
５．　９６ウエルＥＬＩＳＡプレート：Ｃｏｒｎｉｎｇ９６ウエルＥａｓｙ　Ｗａｓｈ，改変平底プレート，Ｃｏｒｎｉｎｇ　Ｃａｔ．＃２５８０５−９６
６．　ＮＵＮＣ９６ウエルＶ−底ポリプロピレンプレート，化合物の希釈用：Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｃａｔ．＃Ａ−７２０９２
７．　Ｖｅｃａｓｔａｉｎ　ＥＬＩＴＥ　ＡＢＣ試薬：Ｖｅｃｔｏｒ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ
８．　抗ｓｒｃ（３２７）ｍａｂ：Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　Ｐｏｍｂｅを用いて組換えＳｒｃを発現させる（Ｓｕｐｅｒｔｉ−Ｆｕｒｇａ，ｅｔ　ａｌ．，ＥＭＢＯ　Ｊ．，１２：２６２５−２６３４；Ｓｕｐｅｒｔｉ−Ｆｕｒｇａ，ｅｔ　ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ　Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１４：６００−６０５）。Ｓ．Ｐｏｍｂｅ　ＳＰ２００株（ｈ−ｓ　ｌｅｕｌ．３２　ｕｒａ４　ａｄｅ２１０）を記載されたように増殖させ，酢酸リチウム法（Ｓｕｐｅｒｔｉ−Ｆｕｒｇａ，（上掲））によりｐＲＳＰ発現プラスミドでトランスフォームする。細胞は１μＭチアミンの存在下で増殖させてｎｍｔｌプロモーターの発現を抑制するか，またはチアミンの非存在下で増殖させて発現を誘導する。
９．　モノクローナル抗ホスホチロシン，ＵＢＩ０５−３２１（代わりにＵＢ４０を用いることができる）
１０．　Ｔｕｒｂｏ　ＴＭＢ−ＥＬＩＳＡペルオキシダーゼ基質：Ｐｉｅｒｃｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ
【０４７８】
緩衝溶液：
１．　ＰＢＳ（ダルベッコリン酸緩衝化食塩水）：ＧＩＢＣＯ　ＰＢＳ，ＧＩＢＣＯ　Ｃａｔ．＃４５０−１３００ＥＢ
２．　ブロッキング緩衝液：５％無脂乳（Ｃａｒｎａｔｉｏｎ），ＰＢＳ中
３．　炭酸塩緩衝液：Ｎａ２ＣＯ４，Ｆｉｓｃｈｅｒ，Ｃａｔ．＃Ｓ４９５，１００ｍＭ保存溶液を作成する。
４．　キナーゼ緩衝液：１．０ｍｌ（１Ｍ保存溶液から）ＭｇＣｌ２；０．２ｍｌ（１Ｍ保存溶液から）ＭｎＣｌ２；０．２ｍｌ（１Ｍ保存溶液から）ＤＴＴ；５．０ｍｌ（１Ｍ保存溶液から）ＨＥＰＥＳ；０．１ｍｌＴＸ−１００；ＭｉｌｌｉＱ　Ｈ２Ｏで総容量１０ｍｌとする。
５．　溶解緩衝液：５．０ＨＥＰＥＳ（１Ｍ保存溶液から）；２．７４ｍｌＮａＣｌ（５Ｍ保存溶液から）；１０ｍｌグリセロール；１．０ｍｌＴＸ−１００；０．４ｍｌＥＤＴＡ（１００ｍＭ保存溶液から）；１．０ｍｌＰＭＳＦ（１００ｍＭ保存溶液から）；０．１ｍｌＮａ３ＶＯ４（０．１Ｍ保存溶液から）；ＭｉｌｌｉＱ　Ｈ２Ｏで総容量１００ｍｌとする。
６．　ＡＴＰ：Ｓｉｇｍａ　Ｃａｔ．＃Ａ−７６９９，１０ｍＭ保存溶液（５．５１ｍｇ／ｍｌ）を作成する。
７．　ＴＲＩＳ−ＨＣｌ：Ｆｉｓｃｈｅｒ　Ｃａｔ．＃ＢＰ１５２−５，６００ｍｌのＭｉｌｌｉＱ　Ｈ２Ｏに１２１．１４ｇの物質を加え，ＨＣｌでｐＨを７．５に調節し，ＭｉｌｌｉＱ　Ｈ２Ｏで総容量１Ｌとする。
８．　ＮａＣｌ：Ｆｉｓｃｈｅｒ　Ｃａｔ．＃Ｓ２７１−１０，ＭｉｌｌｉＱ　Ｈ２Ｏで５Ｍ保存溶液を作成する。
９．　Ｎａ３ＶＯ４：Ｆｉｓｃｈｅｒ　Ｃａｔ．＃Ｓ４５４−５０；８０ｍｌのＭｉｌｌｉＱ　Ｈ２Ｏに，１．８ｇの物質を加える；ＨＣｌまたはＮａＯＨでｐＨを１０．０に調節する；電子レンジ中で沸騰させる；冷却する；ｐＨを調べ，加熱／冷却サイクルの後にｐＨが安定に維持されるまでｐＨ調節を繰り返す；ＭｉｌｌｉＱ　Ｈ２Ｏで総容量１００ｍｌとする；１ｍｌのアリコートを作成し，−８０℃で保存する。
１０．　ＭｇＣｌ２：Ｆｉｓｃｈｅｒ　Ｃａｔ．＃Ｍ３３−５００，ＭｉｌｌｉＱ　Ｈ２Ｏで１Ｍ保存溶液を作成する。
１１．　ＨＥＰＥＳ：Ｆｉｓｃｈｅｒ　Ｃａｔ．＃ＢＰ３１０−５００；２００ｍｌＭｉｌｌｉＱ　Ｈ２Ｏに，５９．６ｇの物質を加え，ｐＨを７．５に調節し，ＭｉｌｌｉＱ　Ｈ２Ｏで総容量２５０ｍｌとし，濾過滅菌する（１Ｍ保存溶液）。
１２．　ＴＢＳＴ緩衝液：ＴＢＳＴ緩衝液：９００ｍｌのｄＨ２Ｏに，６．０５７ｇＴＲＩＳおよび８．７６６ｇＮａＣｌを加える；ＨＣｌでｐＨを７．２に調節し，１．０ｍｌＴｒｉｔｏｎ−Ｘ１００を加える；ｄＨ２Ｏで総容量１Ｌとする。
１３．　ＭｎＣｌ２：Ｆｉｓｃｈｅｒ　Ｃａｔ．＃Ｍ８７−１００，ＭｉｌｌｉＱ　Ｈ２Ｏで１Ｍ保存溶液とする。
１４．　ＤＴＴ：Ｆｉｓｃｈｅｒ　Ｃａｔ．＃ＢＰ１７２−５
１５．　ＴＢＳ（ＴＲＩＳ緩衝化食塩水）：９００ｍｌのＭｉｌｌｉＱ　Ｈ２Ｏに，６．０５７ｇＴＲＩＳおよび８．７７７ｇＮａＣｌを加える；ＭｉｌｌｉＱ　Ｈ２Ｏで総容量を１Ｌとする。
１６．　キナーゼ反応混合物：アッセイプレート（１００ウエル）１枚あたりの量：１．０ｍｌキナーゼ緩衝液，２００μｇＧＳＴ−ζ，ＭｉｌｌｉＱ　Ｈ２Ｏで最終容量８．０ｍｌとする。
１７．　ビオチン標識ＥＥＥＹＥＥＹＥＥＥＹＥＥＥＹＥＥＥＹ：水中のペプチド保存溶液（１ｍＭ，２．９８ｍｇ／ｍｌ）を使用の直前に新たに作成する。
１８．　Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ　ＥＬＩＴＥ　ＡＢＣ試薬：１４ｍｌの作業用試薬を調製するためには，１滴の試薬Ａを１５ｍｌＴＢＳＴに加え，管を数回逆さにして混合する。次に１滴の試薬Ｂを加える。管を室温で環状振盪器に入れ，３０分間混合する。
【０４７９】
プロトコル
Ａ．ｓｒｃでコーティングしたＥＬＩＳＡプレートの調製
１．　ＥＬＩＳＡプレートを１００μｌの炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．６）中の０．５μｇ／ウエルの抗ｓｒｃモノクローナル抗体で，４℃で一夜コーティングする。
２．　ウエルをＰＢＳで１回洗浄する。
３．　プレートをＰＢＳ中５％ミルク０．１５ｍｌで，室温で３０分間ブロッキングする。
４．　プレートをＰＢＳで５回洗浄する。
５．　溶解緩衝液中で希釈した，ｓｒｃでトランスフォームした酵母の溶解物を１０μｇ／ウエルで加える（ウエルあたり総容量０．１ｍｌ）。（溶解物の量は，バッチにより異なるであろう）。プレートを室温で２０分間振盪する。
Ｂ．ホスホチロシン抗体でコーティングしたＥＬＩＳＡプレートの調製
１．　４Ｇ１０プレート：１００μｌＰＢＳ中の０．５μｇ／ウエルの４Ｇ１０で４℃で一夜コーティングし，１５０μｌのＰＢＳ中５％ミルクで室温で３０分間ブロッキングする。
Ｃ．キナーゼアッセイ法
１．　未結合蛋白質をプレートから除去し，プレートをＰＢＳで５回洗浄する。２．　ウエルあたり０．０８ｍｌのキナーゼ反応混合物（ウエルあたり１０μｌの１０Ｘキナーゼ緩衝液および１０μＭ（最終濃度）のビオチン−ＥＥＥＹＥＥＹＥＥＥＹＥＥＥＹＥＥＥＹ，水中に希釈）を加える。
３．　１０％ＤＭＳＯを含有する水中に希釈した１０μｌの化合物を加え，室温で１５分間プレインキュベートする。
４．　１０μｌ／ウエルの水中０．０５ｍＭＡＴＰ（最終５μＭＡＴＰ）を加えることにより，キナーゼ反応を開始させる。
５．　ＥＬＩＳＡプレートを室温で１５分間振盪する。
６．　ウエルあたり１０μｌの０．５ＭＥＤＴＡを加えることによりキナーゼ反応を停止させる。
７．　９０μｌの上清を，ブロッキングした４Ｇ１０コーティングＥＬＩＳＡプレートに移す。
８．　振盪しながら室温で３０分間インキュベートする。
９．　プレートをＴＢＳＴで５回洗浄する。
１０．　Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ　ＥＬＩＴＥ　ＡＢＣ試薬（１００μｌ／ウエル）とともに室温で３０分間インキュベートする。
１１．　ウエルをＴＢＳＴで５回洗浄する。
１２．　Ｔｕｒｂｏ　ＴＭＢで発色させる。
【０４８０】
実施例２２：生化学的ｌｃｋアッセイ−ＥＬＩＳＡ
このアッセイを用いて，ＧＳＴ−ζのリン酸化を読出しとして測定することにより，ｌｃｋ蛋白質キナーゼ活性を決定する。
材料および試薬：
以下の材料および試薬を用いた：
１．　ｌｃｋでトランスフォームした酵母：Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　Ｐｏｍｂｅを用いて組換えＬｃｋを発現させる（Ｓｕｐｅｒｔｉ−Ｆｕｒｇａ，ｅｔ　ａｌ．，ＥＭＢＯ　Ｊ，１２：２６２５−２６３４；Ｓｕｐｅｒｔｉ−Ｆｕｒｇａ，ｅｔ　ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ　Ｂｉｏｔｅｃｈ．，１４：６００−６０５）。Ｓ．Ｐｏｍｂｅ　ＳＰ２００株（ｈ−ｓ　ｌｅｕｌ．３２　ｕｒａ４　ａｄｅ２１０）を記載されたように増殖させ，ｐＲＳＰ発現プラスミドで酢酸リチウム法によりトランスフォームする（Ｓｕｐｅｒｔｉ−Ｆｕｒｇａ，（上掲））。細胞を１μＭチアミンの存在下で増殖させ，発現を誘導する。
２．　細胞溶解物：ｌｃｋを発現する酵母細胞をペレット化し，水で１回洗浄し，再ペレット化し，使用するまで−８０℃で凍結保存する。
３．　ＧＳＴ−ζ：細菌中で発現させるためのＧＳＴ−ζ融合蛋白質をコードするＤＮＡは，Ｈｏｗａｒｄ　Ｈｕｇｈｅｓ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，ｔｈｅ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，Ｓａｎ　ＦｒａｎｃｉｓｃｏのＡｒｔｈｕｒ　Ｗｅｉｓｓから入手する。トランスフォームした細菌を振盪しながら２５℃で一夜増殖させる。ＧＳＴ−ζは，グルタチオンアフィニティークロマトグラフィー（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ａｌａｍｅｄａ，ＣＡ）により精製する。
４．　ＤＭＳＯ：Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ
５．　９６ウエルＥＬＩＳＡプレート：Ｃｏｒｎｉｎｇ９６ウエルＥａｓｙ　Ｗａｓｈ，改変平底プレート，Ｃｏｒｎｉｎｇ　Ｃａｔ．＃２５８０５−９６
６．　ＮＵＮＣ９６ウエルＶ−底ポリプロピレンプレート，化合物希釈用：Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｃａｔ．＃ＡＳ−７２０９２
７．　精製ウサギ抗ＧＳＴ抗血清：Ａｍｒａｄ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ａｕｓｔｒａｌｉａ）Ｃａｔ．＃９０００１６０５
８．　ヤギ抗ウサギ−ＩｇＧ−ＨＲＰ：Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｃａｔ．＃Ｖ０１０３０１
９．　ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）：Ｊａｃｋｓｏｎ　Ｌａｂｓ　Ｃａｔ．＃５２１５−００５−００３
１０．　抗Ｌｃｋ（３Ａ５）モノクローナル抗体：Ｓａｎｔａ　Ｃｒｕｚ　ＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＣａｔ＃ｓｃ−４３３
１１．　抗ホスホチロシンモノクローナル抗体ＵＢＩ０５−３２１（代わりにＵＢ４０を用いてもよい）
【０４８１】
緩衝溶液：
１．　ＰＢＳ（ダルベッコリン酸緩衝化食塩水）１Ｘ溶液：ＧＩＢＣＯＰＢＳ，ＧＩＢＣＯ　Ｃａｔ．＃４５０−１３００ＥＢ
２．　ブロッキング緩衝液：１００ｇＢＳＡ，１２．１ｇＴＲＩＳ−ｐＨ７．５，５８．４４ｇＮａＣｌ，１０ｍｌＴｗｅｅｎ−２０，ＭｉｌｌｉＱ　Ｈ２Ｏで総容量１Ｌとする。
３．　炭酸緩衝液：Ｎａ２ＣＯ４，Ｆｉｓｃｈｅｒ，Ｃａｔ．＃Ｓ４９５；ＭｉｌｌｉＱ　Ｈ２Ｏで１００ｍＭ溶液とする。
４．　キナーゼ緩衝液：１．０ｍｌ（１Ｍ保存溶液より）ＭｇＣｌ２；０．２ｍｌ（１Ｍ保存溶液より）ＭｎＣｌ２；０．２ｍｌ（１Ｍ保存溶液より）ＤＴＴ；５．０ｍｌ（１Ｍ保存溶液より）ＨＥＰＥＳ；０．１ｍｌＴＸ−１００；ＭｉｌｌｉＱ　Ｈ２Ｏで総容量１０ｍｌとする。
５．　溶解緩衝液：５．０ＨＥＰＥＳ（１Ｍ保存溶液より）；２．７４ｍｌＮａＣｌ（５Ｍ保存溶液より）；１０ｍｌグリセロール；１．０ｍｌＴＸ−１００；０．４ｍｌＥＤＴＡ（１００ｍＭ保存溶液より）；１．０ｍｌＰＭＳＦ（１００ｍＭ保存溶液より）；０．１ｍｌＮａ３ＶＯ４（０．１Ｍ保存溶液より）；ＭｉｌｌｉＱ　Ｈ２Ｏで総容量１００ｍｌとする。
６．　ＡＴＰ：Ｓｉｇｍａ　Ｃａｔ．＃Ａ−７６９９，１０ｍＭ保存溶液（５．５１ｍｇ／ｍｌ）を作成する。
７．　ＴＲＩＳ−ＨＣｌ：Ｆｉｓｃｈｅｒ　Ｃａｔ．＃ＢＰ１５２−５，６００ｍｌのＭｉｌｌｉＱ　Ｈ２Ｏに，１２１．１４ｇの物質を加え，ＨＣｌでｐＨを７．５に調節し，ＭｉｌｌｉＱ　Ｈ２Ｏで総容量１Ｌとする。
８．　ＮａＣｌ：Ｆｉｓｃｈｅｒ　Ｃａｔ．＃Ｓ２７１−１０，ＭｉｌｌｉＱ　Ｈ２Ｏで５Ｍ保存溶液を作成する。
９．　Ｎａ３ＶＯ４：Ｆｉｓｃｈｅｒ　Ｃａｔ．＃Ｓ４５４−５０；８０ｍｌのＭｉｌｌｉＱ　Ｈ２Ｏに，１．８ｇの物質を加える；ＨＣｌまたはＮａＯＨでｐＨを１０．０に調節する；電子レンジ中で沸騰させる；冷却する；ｐＨを調べ，加熱／冷却サイクルの後にｐＨが安定となるまでｐＨ調節を繰り返す；ＭｉｌｌｉＱ　Ｈ２Ｏで総容量１００ｍｌとする；１ｍｌのアリコートを作成し，−８０℃で保存する。
１０．　ＭｇＣｌ２：Ｆｉｓｃｈｅｒ　Ｃａｔ．＃Ｍ３３−５００，ＭｉｌｌｉＱ　Ｈ２Ｏで１Ｍ保存溶液を作成する。
１１．　ＨＥＰＥＳ：Ｆｉｓｃｈｅｒ　Ｃａｔ．＃ＢＰ３１０−５００；２００ｍｌのＭｉｌｌｉＱ　Ｈ２Ｏに，５９．６ｇの物質を加え，ｐＨを７．５に調節し，ＭｉｌｌｉＱ　Ｈ２Ｏで総容量２５０ｍｌとし，濾過滅菌する（１Ｍ保存溶液）。
１２．　アルブミン，ウシ（ＢＳＡ），Ｓｉｇｍａ　Ｃａｔ．＃Ａ４５０３；１５０ｍｌのＭｉｌｌｉＱ　Ｈ２Ｏに，３０ｇの物質を加え，ＭｉｌｌｉＱ　Ｈ２Ｏで総容量３００ｍｌとし，０．２２μｍフィルターを通して濾過し，４℃で保存する。
１３．　ＴＢＳＴ緩衝液：９００ｍｌのｄＨ２Ｏに，６．０５７ｇＴＲＩＳおよび８．７６６ｇＮａＣｌを加える；ＨＣｌでｐＨを７．２に調節する；１．０ｍｌＴｒｉｔｏｎ−Ｘ１００を加える；ｄＨ２Ｏで総容量１Ｌとする。
１４．　ＭｎＣｌ２：Ｆｉｓｃｈｅｒ　Ｃａｔ．＃Ｍ８７−１００，ＭｉｌｌｉＱ　Ｈ２Ｏで１Ｍ保存溶液を作成する。
１５．　ＤＴＴ；Ｆｉｓｃｈｅｒ　Ｃａｔ．＃ＢＰ１７２−５
１６．　ＴＢＳ（ＴＲＩＳ緩衝化食塩水）：９００ｍｌのＭｉｌｌｉＱ　Ｈ２Ｏに，６．０５７ｇＴＲＩＳおよび８．７７７ｇＮａＣｌを加える；ＭｉｌｌｉＱ　Ｈ２Ｏで総容量１Ｌとする。
１７．　キナーゼ反応混合物：アッセイプレート（１００ウエル）１枚あたりの量：１．０ｍｌキナーゼ緩衝液，２００μｇＧＳＴ−ζ，ＭｉｌｌｉＱ　Ｈ２Ｏで最終容量８．０ｍｌとする。
【０４８２】
方法：
Ａ．ＬｃｋでコーティングしたＥＬＩＳＡプレートの調製
１．　１００μｌの炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．６）中のヤギ抗マウスＩｇＧ２．０μｇ／ウエルで，４℃で一夜コーティングする。
２．　ウエルをＰＢＳで１回洗浄する。
３．　プレートを０．１５ｍｌのブロッキング緩衝液で室温で３０分間ブロッキングする。
４．　プレートをＰＢＳで５回洗浄する。
５．　０．１ｍｌＰＢＳ中の抗ｌｃｋ（モノクローナル抗体３Ａ５）を０．５μｇ／ウエルで室温で１−２時間加える。
６．　プレートをＰＢＳで５回洗浄する。
７．　溶解緩衝液中に希釈した，ｌｃｋでトランスフォームした酵母の溶解物を２０μｇ／ウエルで加える（ウエルあたり総容量０．１ｍｌ）（溶解物の量はバッチによって異なる）。プレートを４℃で一夜振盪して活性の喪失を防止する。
Ｂ．ホスホチロシン抗体でコーティングしたＥＬＩＳＡプレートの調製
１．　ＵＢ４０プレート：１００μｌＰＢＳ中の１．０μｇ／ウエルＵＢ４０を４℃で一夜加え，１５０μｌのブロッキング緩衝液で少なくとも１時間ブロッキングする。
Ｃ．キナーゼアッセイ法
１．　未結合蛋白質をプレートから除去し，プレートをＰＢＳで５回洗浄する。
２．　ウエルあたり０．０８ｍｌのキナーゼ反応混合物（ウエルあたり，水で希釈した１０μｌの１０Ｘキナーゼ緩衝液および２μｇＧＳＴ−ζを含む）を加える。
３．　１０％ＤＭＳＯを含有する水中で希釈した化合物１０μｌを加え，室温で１５分間プレインキュベートする。
４．　水中０．１ｍＭＡＴＰ（最終濃度１０μＭＡＴＰ）を１０μｌ／ウエルで加えることによりキナーゼ反応を開始させる。
５．　ＥＬＩＳＡプレートを室温で６０分間振盪する。
６．　ウエルあたり１０μｌの０．５ＭＥＤＴＡを加えることによりキナーゼ反応を停止させる。
７．　９０μｌの上清を，上述のＢ節からのブロッキングした４Ｇ１０コーティングＥＬＩＳＡプレートに移す。
８．　振盪しながら室温で３０分間インキュベートする。
９．　プレートをＴＢＳＴで５回洗浄する。
１０．　１００μｌＴＢＳＴ中１：５０００に希釈したウサギ抗ＧＳＴ抗体とともに室温で３０分間インキュベートする。
１１．　ウエルをＴＢＳＴで５回洗浄する。
１２．　１００μｌのＴＢＳＴ中１：２０，０００に希釈したヤギ抗ウサギ−ＩｇＧ−ＨＲＰとともに室温で３０分間インキュベートする。
１３．　ウエルをＴＢＳＴで５回洗浄する。
１４．　ＴｕｒｂｏＴＭＢで発色させる。
【０４８３】
実施例２３：生化学的ｃ−ｋｉｔアッセイ−ＥＬＩＳＡ
Ａ．材料および試薬
１）ＨＮＴＧ：５Ｘ保存濃度：１００ｍＭ　ＨＥＰＥＳｐＨ７．２，７５０ｍＭ　ＮａＣｌ，５０％グリセロール，２．５％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００．
２）ＰＢＳ（ダルベッコリン酸緩衝化食塩水）：Ｇｉｂｃｏカタログ＃４５０−１３００ＥＢ
３）１Ｘブロッキング緩衝液：１０ｍＭ　ＴＲＩＳ−ｐＨ７．５，１％ＢＳＡ，１００ｍＭ　ＮａＣｌ，０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００
４）１Ｘキナーゼ緩衝液：２５ｍＭ　ＨＥＰＥＳ，１００ｍＭ　ＮａＣｌ，１０ｍＭ　ＭｇＣｌ２，６ｍＭ　ＭｎＣｌ２
５）ＰＭＳＦ保存溶液＝１００ｍＭ（Ｓｉｇｍａカタログ＃Ｐ−７６２６）
６）１０ｍＭＡＴＰ（細菌起源）ＳｉｇｍａＡ−７６９９，５ｇ．
７）ＵＢ４０抗ホスホチロシンｍＡｂ（Ｔｅｒｒａｎｃｅ，Ｓｕｇｅｎから入手可能）
８）ＨＲＰコンジュゲート化ヒツジ抗マウスＩｇＧ．（Ａｍｅｒｓｈａｍ　ＮＡ９３１）
９）ＡＢＴＳ（５Ｐｒｉｍｅ−３Ｐｒｉｍｅ７−５７９８４４）
１０）ＴＲＩＳＨＣＬ：Ｆｉｓｈｅｒ　ＢＰ１５２−５
１１）ＮａＣｌ：Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓ２７１−１０
１２）ＴｒｉｔｏｎＸ−１００：Ｆｉｓｈｅｒ　ＢＰ１５１−１００
１３）Ｎａ３ＶＯ４：Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓ４５４−５０
１４）ＭｇＣｌ２：Ｆｉｓｈｅｒ　Ｍ３３−５００
１５）ＭｎＣｌ２：Ｆｉｓｈｅｒ　Ｍ８７−５００
１６）ＨＥＰＥＳ：Ｆｉｓｈｅｒ　ＢＰ３１０−５００
１７）アルブミン，ウシ（ＢＳＡ）：ＳｉｇｍａＡ−８５５１
１８）ＴＢＳＴ緩衝液：５０ｍＭ　ＴｒｉｓｐＨ７．２，１５０ｍＭ　ＮａＣｌ，０．１％Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００
１９）ヤギアフィニティー精製抗体ラビットＩｇＧ（全分子）：Ｃａｐｐｅｌ　５５６４１．
２０）抗ｋｉｔ（Ｃ−２０）ウサギポリクローナルＩｇＧ抗体：Ｓａｎｔａ　Ｃｒｕｚｓｃ−１６８
２１）ｋｉｔ／ＣＨＯ細胞：ＧｙｒＢ／ｋｉｔを安定に発現するＣＨＯ細胞，１ｍｇ／ｍｌのＧ４１８を補充した標準的ＣＨＯ培地で成長させる
２２）インドリノン化合物：インドリノン化合物は，以下の出願に記載されるように合成した：ＰＣＴ／ＵＳ９９／０６４６８（１９９９年３月２６日出願，Ｆｏｎｇ，　ｅｔ　ａｌ．，表題”ＭＥＴＨＯＤＳ　ＯＦ　ＭＯＤＵＬＡＴＩＮＧ　ＴＹＲＯＳＩＮＥ　ＰＲＯＴＥＩＮ　ＫＩＮＡＳＥ”（Ｌｙｏｎ＆Ｌｙｏｎ書類番号２３１／２５０ＰＣＴ，図面を含めその全体を本明細書の一部としてここに引用する）。
【０４８４】
Ｂ．方法
以下の全ての工程は特に示さない限り室温で行う。すべてのＥＬＩＳＡプレート洗浄はＴＢＳＴで４回すすぐことにより行う。
ｋｉｔ細胞溶解
この方法は，レセプター捕捉の開始の１時間前に行う。
１）９５％以上コンフルエントの１５ｃｍ皿をＰＢＳで洗浄し，可能な限り吸引する。
２）１５ｃｍ皿１枚あたり１ｍＭＰＭＳＦを含む３ｍｌの１ｘＨＮＴＧで細胞を溶解する。細胞をプレートから掻き取り，５０ｍｌ遠心管に移す。
３）上清をプールし，氷上に１時間，時々ボルテックスしながら放置する。これを行わないと，バックグラウンドが増加する（約３倍高くなる）。
４）管を平衡させ，１０，０００ｘｇで１０分間，４℃で遠心分離する。蛋白質測定のためにアリコートを取り出す。
５）蛋白質測定用ＳＯＰにしたがって，ビシンコニン酸（ＢＣＡ）法を用いて蛋白質測定を行う
【０４８５】
ＥＬＩＳＡ法
１）Ｃｏｒｎｉｎｇ９６ウエルＥＬＩＳＡプレートをウエルあたり２μｇのＰＢＳ中のヤギ抗ウサギ抗体でウエル総容量１００μｌで被覆する。４℃で一夜保存する。
２）プレートを逆さにして液体を除去することにより未結合ヤギ抗ウサギ抗体を除去する。
３）１００μｌのブロッキング緩衝液を各ウエルに加える。室温で６０分間振盪する。
４）ＴＢＳＴで４回洗浄する。プレートをペーパータオル上で軽くたたいて過剰の液体および泡を除去する。
５）ウエルあたり０．２μｇのＴＢＳＴ中に希釈したウサギ抗−ｋｉｔ抗体を加え，ウエルの総容量を１００μｌとする。室温で６０分間振盪する。
６）溶解物をＨＮＴＧで希釈する（１８０μｇの溶解物／１００μｌ）。
７）１００μｌの希釈溶解物を各ウエルに加える。室温で６０分間振盪する。
８）ＴＢＳＴで４回洗浄する。プレートをペーパータオルの上で軽くたたいて過剰の液体および泡を除去する。
９）化合物／抽出物（または記載される他のもの）をポリプロピレン９６ウエルプレート中で１ｘキナーゼ緩衝液および５μｌのＡＴＰ中で希釈する。
１０）１００μｌの希釈薬剤をＥＬＩＳＡプレートのウエルに移す。振盪しながら室温で６０分間インキュベートする。
１１）１０μｌの０．５ＭＥＤＴＡを加えて反応を停止させる。この段階でプレートはある程度の時間安定である。
１２）ＴＢＳＴで４回洗浄する。プレートをペーパータオルの上で軽くたたいて過剰の液体および泡を除去する。
１３）ウエルあたり１００μｌのＵＢ４０（ＴＢＳＴ中１：２０００希釈）を加える。振盪しながら室温で６０分間インキュベートする。
１４）ＴＢＳＴで４回洗浄する。プレートをペーパータオルの上で軽くたたいて過剰の液体および泡を除去する。
１５）ウエルあたり１００μｌのヒツジ抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰ（ＴＢＳＴ中１：５０００希釈）を加える。振盪しながら室温で６０分間インキュベートする。
１６）ＴＢＳＴで４回洗浄する。プレートをペーパータオルの上で軽くたたいて過剰の液体および泡を除去する。
１７）ウエルあたり１００μｌのＡＢＴＳを加える。振盪しながら１５−３０分間インキュベートする。
１８）ＤｙｎａｔｅｃｈＭＲ７０００ＥＬＩＳＡリーダーでアッセイを読む。試験フィルター＝４１０ｎｍ，参照フィルター＝６３０ｎｍ。
【０４８６】
実施例２４：ＲＡＦのリン酸化機能を測定するアッセイ
以下のアッセイは，ＲＡＦにより触媒される，その標的蛋白質ＭＥＫならびにＭＥＫの標的であるＭＡＰＫのリン酸化の量を測定する。ＲＡＦ遺伝子配列は，Ｂｏｎｎｅｒら（１９８５，Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：１４００−１４０７）に記載されており，多くの遺伝子配列データバンクにおいて容易にアクセス可能である。核酸ベクターの構築および本発明のこの部分において用いられる細胞株は，Ｍｏｒｒｉｓｏｎら（１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８５：８８５５−８８５９）にすべて記載されている。
材料および試薬
１．　Ｓｆ９（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ　ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）細胞；ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ
２．　ＲＩＰＡ緩衝液：２０ｍＭＴｒｉｓ／ＨＣ１ｐＨ７．４，１３７ｍＭＮａＣｌ，１０％グリセロール，１ｍＭＰＭＳＦ，５ｍｇ／Ｌアプロテニン，０．５％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００；
３．　チオレドキシン−ＭＥＫ融合蛋白質（Ｔ−ＭＥＫ）：Ｔ−ＭＥＫ
発現およびアフィニティークロマトグラフィーによる精製は，製造元の方法に従って実施する。カタログ＃Ｋ３５０−０１およびＲ３５０−４０，ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎＣｏｒｐ．，Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ
４．　Ｈｉｓ−ＭＡＰＫ（ＥＲＫ２）；Ｈｉｓ−タグＭＡＰＫは，Ｈｉｓ−ＭＡＰＫをコードするｐＵＣ１８ベクターによりトランスフォームしたＸＬ１　Ｂｌｕｅ細胞中で発現させる。Ｈｉｓ−ＭＡＰＫはＮｉ−アフィニティークロマトグラフィーにより精製する。Ｃａｔ＃２７−４９４９−０１，Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ａｌａｍｅｄａ，ＣＡ，本明細書に記載されたとおり。
５．　ヤギ抗マウスＩｇＧ：Ｊａｃｋｓｏｎ　ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｗｅｓｔ　Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ．カタログ，＃５１５−００６−００８，Ｌｏｔ＃２８５６３
６．　ＲＡＦ−１蛋白質キナーゼ特異的抗体：ＵＲＰ２６５３，ＵＢＩ
７．　コーティング緩衝液：ＰＢＳ；リン酸緩衝化食塩水，ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ
８．　洗浄緩衝液：ＴＢＳＴ−５０ｍＭＴｒｉｓ／ＨＣＬｐＨ７．２，１５０ｍＭＮａＣｌ，０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００
９．　ブロッキング緩衝液：ＴＢＳＴ，０．１％エタノールアミンｐＨ７．４
１０．　ＤＭＳＯ，Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ
１１．　キナーゼ緩衝液（ＫＢ）：２０ｍＭＨＥＰＥＳ／ＨＣｌ（ｐＨ７．２），１５０ｍＭＮａＣｌ，０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００，１ｍＭＰＭＳＦ，５ｍｇ／Ｌアプロテニン，７５ｍＭオルトバナジウム酸ナトリウム，０．５ＭＭＤＴＴおよび１０ｍＭＭｇＣｌ２
１２．　ＡＴＰ混合物：ｌ００ｍＭＭｇＣｌ２，３００ｍＭＡＴＰ，１０ｍＣｉγ３３ＰＡＴＰ（ＤｕＰｏｎｔ−ＮＥＮ）／ｍＬ
１３　停止溶液：１％リン酸；Ｆｉｓｈｅｒ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ
１４．　Ｗａｌｌａｃリン酸セルロースフィルターマット；Ｗａｌｌａｃ，Ｔｕｒｋｕ，Ｆｉｎｎｌａｎｄ
１５．　フィルター洗浄溶液：１％リン酸，Ｆｉｓｈｅｒ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ
１６．　Ｔｏｍｔｅｃプレート回収機，Ｗａｌｌａｃ，Ｔｕｒｋｕ，Ｆｉｎｎｌａｎｄ
１７．　Ｗａｌｌａｃベータプレートリーダー＃１２０５，Ｗａｌｌａｃ，Ｔｕｒｋｕ，Ｆｉｎｎｌａｎｄ
１８．　化合物用に，ＮＵＮＣ９６ウエルＶ底ポリプロピレンプレート，Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃカタログ＃ＡＳ−７２０９２
【０４８７】
プロトコル
以下のすべての工程は，特に指示しないかぎり，室温で実施した。
１．　ＥＬＩＳＡプレートコーティング：ＥＬＩＳＡウエルを１００ｍｌのヤギ抗マウスアフィニティー精製抗血清（１ｍｇ／ｌ００ｍＬコーティング緩衝液）で４℃で一夜コーティングする。ＥＬＩＳＡプレートは，４℃で保存したとき，２週間使用することができる。
２．　プレートを逆さにして液体を除去する。１００ｍＬのブロッキング溶液を加え，３０分間インキュベートする。
３．　ブロッキング溶液を除去し，洗浄緩衝液で４回洗浄する。プレートをペーパータオル上で軽くたたいて過剰の液体を除去する。
４．　各ウエルに１ｍｇのＲＡＦ−１特異的抗体を加え，１時間インキュベートする。工程３に記載したように洗浄する。
５．　ＲＡＳ／ＲＡＦで感染させたＳｆ９細胞からの溶解物を解凍し，ＴＢＳＴで１０ｍｇ／１００ｍＬに希釈する。１０ｍｇの希釈溶解物をウエルに加え，１時間インキュベートする。インキュベーションの間，プレートを振盪する。陰性対照には溶解物を加えない。各ウイルスにつきＭＯＩ５で細胞を組換えバキュロウイルスで感染させた後，ＲＡＳ／ＲＡＦで感染させたＳｆ９昆虫細胞からの溶解物を調製し，４８時間後に回収する。細胞をＰＢＳで１回洗浄し，ＲＩＰＡ緩衝液中で溶解する。不溶物質を遠心分離（５分間，１００００ｘｇ）により除去する。溶解物のアリコートをドライアイス／エタノール中で凍結し，使用まで−８０℃で保存する。
６．　非結合物質を除去し，上に簡単に述べたように洗浄する（工程３）。
７．　ウエルあたり２ｍｇのＴ−ＭＥＫおよび２ｍｇのＨｉｓ−ＭＡＥＰＫを加え，キナーゼ緩衝液で容量を４０ｍＬに調節する。細胞抽出物からＴ−ＭＥＫおよびＭＡＰＫを精製する方法は，本明細書の実施例に記載される。
８．　化合物（保存溶液１０ｍｇ／ｍＬＤＭＳＯ）または抽出物をＴＢＳＴプラス１％ＤＭＳＯ中であらかじめ２０倍に希釈する。５ｍＬのあらかじめ希釈した化合物／抽出物を工程６に記載したウエルに加える。２０分間インキュベートする。対照には薬剤を加えない。
９．　５ｍＬＡＴＰミックスを加えることによりキナーゼ反応を開始する。インキュベーションの間，ＥＬＩＳＡプレート振盪器でプレートを振盪する。
１０．　６０分後，３０ｍＬの停止溶液を各ウエルに加えることによりキナーゼ反応を停止する。
１１．　ホスホセルロースマットおよびＥＬＩＳＡプレートをＴｏｍｔｅｃプレート回収機中に置く。フィルターを回収し，フィルター洗浄溶液で製造元の推奨にしたがってこれを洗浄する。フィルターマットを乾燥する。フィルターマットを密封し，ケース中に置く。ケースを放射活性検出装置に入れ，フィルターマット上の放射活性リンを定量する。
あるいは，アッセイプレートの個々のウエルからの４０ｍＬのアリコートを，ホスホセルロースフィルターマットの対応する位置に移すことができる。フィルターを風乾した後，フィルターをトレイ中に置く。トレイを穏やかにロックし，洗浄溶液を１５分間ごとに１時間交換する。フィルターマットを風乾する。フィルターマットを密封し，サンプル中の放射活性リンを測定するのに適当なケース中に入れる。ケースを検出装置に入れ，フィルターマット上の放射活性リンを定量する。
【０４８８】
実施例２５：ＣＤＫ２／サイクリンＡ−阻害アッセイ
このアッセイは，外部基質中のＣＤＫ２の蛋白質キナーゼ活性を測定する。
材料および試薬：
１．　緩衝液Ａ（８０ｍＭＴｒｉｓ（ｐＨ７．２），４０ｍＭＭｇＣｌ２）：４．８４ｇＴｒｉｓ（Ｆ．Ｗ．＝１２１．１ｇ／ｍｏｌ），４．０７ｇＭｇＣｌ２（Ｆ．Ｗ．＝２０３．３１ｇ／ｍｏｌ），５００ｍｌＨ２Ｏ中に溶解。ＨＣｌでｐＨを７．２に調節する。
２．　ヒストンＨ１溶液（０．４５ｍｇ／ｍｌヒストンＨ１および２０ｍＭＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．２）：１１．１１１ｍｌの２０ｍＭＨＥＰＥＳｐＨ７．２（４７７ｍｇＨＥＰＥＳ（Ｆ．Ｗ．＝２３８．３ｇ／ｍｏｌ））中の５ｍｇヒストンＨ１（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ），１００ｍｌｄｄＨ２Ｏ中に溶解する。１ｍｌアリコートとして−８０℃で保存する。
３．　ＡＴＰ溶液（６０μＭＡＴＰ，３００μｇ／ｍｌＢＳＡ，３ｍＭＤＴＴ）：１２０μｌの１０ｍＭＡＴＰ，６００μｌの１０ｍｇ／ｍｌＢＳＡで２０ｍｌとし，１ｍｌアリコートとして−８０℃で保存する。
４．　ＣＤＫ２溶液：ｃｄｋ２／サイクリンＡ，１０ｍＭＨＥＰＥＳ，ｐＨ７．２，２５ｍＭＮａＣｌ，０．５ｍＭＤＴＴ，１０％グリセロール中。９μｌアリコートとして−８０℃で保存する。
【０４８９】
アッセイの説明
１．　阻害剤の溶液を，ｄｄＨ２Ｏ／１５％ＤＭＳＯ（ｖ／ｖ）で所望の最終アッセイ濃度の３倍で調製する。
２．　２０μｌの阻害剤をポリプロピレンの９６ウエルプレートのウエルに加える（または陽性および陰性対照については２０μｌの１５％ＤＭＳＯ）。
３．　ヒストンＨ１溶液（１ｍｌ／プレート），ＡＴＰ溶液（１ｍｌ／プレートプラス陰性対照について１アリコート），およびＣＤＫ２溶液（９μｌ／プレート）を解凍する。ＣＤＫ２は使用まで氷上に保存する。ＣＤＫ２溶液を適当にアリコートに分けて，凍結解凍サイクルの繰り返しを避ける。
４．　９μｌＣＤＫ２溶液を２．１ｍｌ緩衝液Ａ（プレートあたり）で希釈し，混合し，２０μｌを各ウエルに加える。
５．　１ｍｌヒストンＨ１溶液を１ｍｌＡＴＰ溶液（プレートあたり）と混合して，１０ｍｌねじ蓋管に入れる。γ３３Ｐ　ＡＴＰを０．１５μＣｉ／２０μｌ（アッセイ中，０．１５μＣｉ／ウエル）の濃度となるよう加える。ＢＳＡの泡を避けるよう注意深く混合する。２０μｌを適当なウエルに加える。プレートをプレート振盪器上で混合する。陰性対照については，等量の２０ｍＭＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．２）とＡＴＰ溶液とを混合し，γ３３Ｐ　ＡＴＰを０．１５μＣｉ／２０μｌ溶液の濃度となるように加える。２０μｌを適当なウエルに加える。
６．　反応を６０分間進行させる。
７．　３５μｌの１０％ＴＣＡを各ウエルに加える。プレートをプレート振盪器上で混合する。
８．　４０μｌの各サンプルをＰ３０フィルターマットの升目上にスポットする。マットを乾燥させる（約１０−２０分間）。
９．　フィルターマットを２５０ｍｌの１％リン酸（ｄｄＨ２Ｏ　１ｌあたり１０ｍｌリン酸）で４Ｘ１０分間洗浄する。
１０．　フィルターマットをベータプレートリーダーで計数する。
【０４９０】
細胞／生物学的アッセイ
実施例２６：ＰＤＧＦ−誘導性ＢｒｄＵ取り込みアッセイ
材料および試薬：
１．　ＰＤＧＦ：ヒトＰＤＧＦ　Ｂ／Ｂ；１２７６−９５６，Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ
２．　ＢｒｄＵ標識試薬：１０ｍＭ，ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中，Ｃａｔ．Ｎｏ．１６４７２２９，Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ
３．　ＦｉｘＤｅｎａｔ：固定溶液（即使用可），Ｃａｔ．Ｎｏ．１６４７２２９，Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ
４．　抗ＢｒｄＵ−ＰＯＤ：ペルオキシダーゼとコンジュゲート化したマウスモノクローナル抗体，Ｃａｔ．Ｎｏ．１６４７２２９，Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ
５．　ＴＭＢ基質溶液：テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ），即使用可，Ｃａｔ．Ｎｏ．１６４７２２９，Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ
６．　ＰＢＳ洗浄溶液：１ＸＰＢＳ，ｐＨ７．４（Ｓｕｇｅｎ，Ｉｎｃ．，Ｒｅｄｗｏｏｄ　Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）
７．　アルブミン，ウシ（ＢＳＡ）：画分Ｖ粉末；Ａ−８５５１，Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ．，ＵＳＡ
８．ヒトＰＤＧＦ−Ｒを発現するよう遺伝子工学処理された３Ｔ３細胞株
【０４９１】
プロトコル
１．　細胞をＤＭＥＭ，１０％ＣＳ，２ｍＭＧｌｎ中で，９６ウエルプレートに８０００細胞／ウエルで播種する。細胞を５％ＣＯ２中で３７℃で一夜インキュベートする。
２．　２４時間後，細胞をＰＢＳで洗浄し，次に無血清培地（０％ＣＳ　ＤＭＥＭ，０．１％ＢＳＡ）中で２４時間血清飢餓とする。
３．　第３日に，リガンド（ＰＤＧＦ，３．８ｎＭ，ＤＭＥＭ，０．１％ＢＳＡ中で調製）および試験化合物を細胞に同時に加える。陰性対照ウエルには，無血清ＤＭＥＭおよび０．１％ＢＳＡのみを加える；陽性対照細胞には，リガンド（ＰＤＧＦ）を加えるが試験化合物を加えない。試験化合物は，９６ウエルプレート中で無血清ＤＭＥＭ中でリガンドとともに調製し，連続希釈して７種類の試験濃度とする。
４．　リガンド活性化の２０時間後，希釈ＢｒｄＵ標識試薬（ＤＭＥＭ，０．１％ＢＳＡ中１：１００）を加え，細胞をＢｒｄＵ（最終濃度＝１０μＭ）とともに１．５時間インキュベートする。
５．　標識試薬とともにインキュベーションした後，デカントし，逆さにしたプレートをペーパータオル上で軽くたたくことにより，培地を除去する。ＦｉｘＤｅｎａｔ溶液を加え（５０μｌ／ウエル），プレートをプレート振盪器上で室温で４５分間インキュベートする。
６．　デカントし，逆さにしたプレートをペーパータオル上で軽くたたくことにより，ＦｉｘＤｅｎａｔ溶液をよく除去する。ブロッキング溶液としてミルクを加え（ＰＢＳ中５％脱水ミルク，２００μｌ／ウエル），プレートをプレート振盪器上で室温で３０分間インキュベートする。
７．　デカントによりブロッキング溶液を除去し，ウエルをＰＢＳで１回洗浄する。抗ＢｒｄＵ−ＰＯＤ溶液（ＰＢＳ，１％ＢＳＡ中１：１００希釈）を加え（１００μｌ／ウエル），プレートをプレート振盪器上で室温で９０分間インキュベートする。
８．　デカントし，ウエルをＰＢＳで５回すすぐことにより抗体コンジュゲートをよく除去し，プレートを逆さにしてペーパータオル上で軽くたたくことにより乾燥させる。
９．　ＴＭＢ基質溶液を加え（１００μｌ／ウエル），プレート振盪器で室温で２０分間，発色が光度計による検出に十分となるまでインキュベートする。
１０．　サンプルの吸光度は，Ｄｙｎａｔｅｃｈ　ＥＬＩＳＡプレートリーダーで４１０ｎｍで測定する（参照波長として４９０ｎｍで読みとるフィルターを用いる”二波長”モード）。
【０４９２】
実施例２７：ＥＧＦ−誘導性ＢｒｄＵ取り込みアッセイ
材料および試薬
１．　ＥＧＦ：マウスＥＧＦ，２０１；Ｔｏｙｏｂｏ，Ｃｏ．，Ｌｔｄ．Ｊａｐａｎ
２．　ＢｒｄＵ標識試薬：１０ｍＭ，ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中，Ｃａｔ．Ｎｏ．１６４７２２９，Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ
３．　ＦｉｘＤｅｎａｔ：固定溶液（即使用可），Ｃａｔ．Ｎｏ．１６４７２２９，Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ
４．　抗ＢｒｄＵ−ＰＯＤ：ペルオキシダーゼとコンジュゲート化したマウスモノクローナル抗体，Ｃａｔ．Ｎｏ．１６４７２２９，Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ
５．　ＴＭＢ基質溶液：テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ），即使用可，Ｃａｔ．Ｎｏ．１６４７２２９，Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ
６．　ＰＢＳ洗浄溶液：１ＸＰＢＳ，ｐＨ７．４
７．　アルブミン，ウシ（ＢＳＡ）：画分Ｖ粉末；Ａ−８５５１，Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ．，ＵＳＡ
８．　ヒトＥＧＦ−Ｒを発現するよう遺伝子工学処理された３Ｔ３細胞株
【０４９３】
プロトコル
１．　細胞をＤＭＥＭ中１０％ＣＳ，２ｍＭＧｌｎで，９６ウエルプレート中で８０００細胞／ウエルで播種する。細胞を５％ＣＯ２中で３７℃で一夜インキュベートする。
２．　２４時間後，細胞をＰＢＳで洗浄し，次に無血清培地（０％ＣＳ　ＤＭＥＭ，０．１％ＢＳＡ）中で２４時間血清飢餓とする。
３．　第３日に，リガンド（ＥＧＦ，２ｎＭ，ＤＭＥＭ，０．１％ＢＳＡ中で調製）および試験化合物を細胞に同時に加える。陰性対照ウエルには０．１％ＢＳＡを含む無血清ＤＭＥＭのみを加える。陽性対照細胞には，リガンド（ＥＧＦ）を加えるが試験化合物を加えない。試験化合物は，９６ウエルプレート中で，無血清ＤＭＥＭ中でリガンドとともに調製し，連続希釈して７種類の試験濃度とする。
４．　リガンド活性化の２０時間後，希釈したＢｒｄＵ標識試薬（ＤＭＥＭ中１：１００，０．１％ＢＳＡ）を加え，細胞をＢｒｄＵ（最終濃度＝１０μＭ）とともに１．５時間インキュベートする。
５．　標識試薬とともにインキュベートした後，デカントして逆さにしたプレートをペーパータオル上で軽くたたくことにより培地を除去する。ＦｉｘＤｅｎａｔ溶液を加え（５０μｌ／ウエル），プレートをプレート振盪器で室温で４５分間インキュベートする。
６．　デカントして逆さにしたプレートをペーパータオル上で軽くたたくことによりＦｉｘＤｅｎａｔ溶液をよく除去する。ブロッキング溶液としてミルクを加え（ＰＢＳ中５％脱水ミルク，２００μｌ／ウエル），プレートをプレート振盪器で室温で３０分間インキュベートする。
７．　デカントによりブロッキング溶液を除去し，ウエルをＰＢＳで１回洗浄する。抗ＢｒｄＵ−ＰＯＤ溶液（ＰＢＳ中１：１００希釈，１％ＢＳＡ）を加え（１００μｌ／ウエル），プレートをプレート振盪器で室温で９０分間インキュベートする。
８．　デカントし，ウエルをＰＢＳで５回すすぐことにより抗体コンジュゲートをよく除去し，プレートを逆さにしてペーパータオル上で軽くたたくことにより乾燥させる。
９．　ＴＭＢ基質溶液を加え（１００μｌ／ウエル），プレート振盪器で室温で２０分間，発色が高度計検出に十分となるまでインキュベートする。
１０．　サンプルの吸光度は，Ｄｙｎａｔｅｃｈ　ＥＬＩＳＡプレートリーダーで，４１０ｎｍ（参照波長として４９０ｎｍを読むフィルターを用いる”二波長”モード”で）測定する。
【０４９４】
実施例２８：ＥＧＦ誘導性ＨＥＲ２推進ＢｒｄＵ取り込み
材料および試薬：
１．　ＥＧＦ：マウスＥＧＦ，２０１；Ｔｏｙｏｂｏ，Ｃｏ．，Ｌｔｄ．Ｊａｐａｎ
２．ＢｒｄＵ標識試薬：１０ｍＭ，ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中，Ｃａｔ．Ｎｏ．１６４７２２９，Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ
３．　ＦｉｘＤｅｎａｔ：固定溶液（即使用可），Ｃａｔ．Ｎｏ．１６４７２２９，Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ
４．　抗ＢｒｄＵ−ＰＯＤ：ペルオキシダーゼとコンジュゲート化したマウスモノクローナル抗体，Ｃａｔ．Ｎｏ．１６４７２２９，Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ
５．　ＴＭＢ基質溶液：テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ），即使用可，Ｃａｔ．Ｎｏ．１６４７２２９，Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ
６．　ＰＢＳ洗浄溶液：１ＸＰＢＳ，ｐＨ７．４，自社製。
７．　アルブミン，ウシ（ＢＳＡ）：画分Ｖ粉末；Ａ−８５５１，Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ．，ＵＳＡ
８．　ＥＧＦ−Ｒの細胞外ドメインおよびＨｅｒ２の細胞内ドメインを有するキメラレセプターを発現するよう遺伝子工学処理された３Ｔ３細胞株
【０４９５】
プロトコル：
１．　細胞をＤＭＥＭ，１０％ＣＳ，２ｍＭＧｌｎ中で９６−ウエルプレートに８０００細胞／ウエルで播種する。細胞を３７℃で５％ＣＯ２中で一夜インキュベートする。
２．　２４時間後，細胞をＰＢＳで洗浄し，次に無血清培地（０％ＣＳ　ＤＭＥＭ，０．１％ＢＳＡを含む）中で２４時間血清飢餓とする。
３．　第３日に，リガンド（ＥＧＦ＝２ｎＭ，０．１％ＢＳＡを含むＤＭＥＭ中で調製）および試験化合物を細胞に同時に加える。陰性対照ウエルには無血清ＤＭＥＭ，０．１％ＢＳＡのみを加える；陽性対照細胞にはリガンド（ＥＧＦ）を加えるが試験化合物は加えない。試験化合物は，無血清ＤＭＥＭ中でリガンドとともに９６ウエルプレート中で調製し，連続希釈して７種類の試験濃度とする。
４．　リガンド活性化の２０時間後，希釈ＢｒｄＵ標識試薬（ＤＭＥＭ中１：１００，０．１％ＢＳＡ）を加え，細胞をＢｒｄＵ（最終濃度＝１０μＭ）とともに１．５時間インキュベートする。
５．　標識試薬とともにインキュベートした後，デカントして逆さにしたプレートをペーパータオル上で軽くたたくことにより培地を除去する。ＦｉｘＤｅｎａｔ溶液を加え（５０μｌ／ウエル），プレートを室温でプレート振盪器で４５分間インキュベートする。
６．　デカントし，逆さにしたプレートをペーパータオル上で軽くたたくことにより，ＦｉｘＤｅｎａｔ溶液をよく除去する。ブロッキング溶液としてミルクを加え（ＰＢＳ中５％脱水ミルク，２００μｌ／ウエル），プレートをプレート振盪器上で室温で３０分間インキュベートする。
７．　デカントによりブロッキング溶液を除去し，ウエルをＰＢＳで１回洗浄する。抗ＢｒｄＵ−ＰＯＤ溶液（ＰＢＳ，１％ＢＳＡ中１：１００希釈）を加え（１００μｌ／ウエル），プレートをプレート振盪器上で９０分間室温でインキュベートする。
８．　デカントし，ウエルをＰＢＳで５回すすぐことにより抗体コンジュゲートをよく除去し，プレートを逆さにしてペーパータオル上で軽くたたくことにより乾燥させる。
９．　ＴＭＢ基質溶液を加え（１００μｌ／ウエル），プレート振盪器で室温で２０分間，発色が光度計検出に十分となるまでインキュベートする。
１０．　サンプルの吸光度を，Ｄｙｎａｔｅｃｈ　ＥＬＩＳＡプレートリーダーで，４１０ｎｍで（参照波長として４９０ｎｍで読むフィルターを用いる”二波長”モードで）測定する。
【０４９６】
実施例２９：ＩＧＦｌ−誘導性ＢｒｄＵ取り込みアッセイ
材料および試薬：
１．　ＩＧＦ１リガンド：ヒト，組換え；Ｇ５１１，Ｐｒｏｍｅｇａ　Ｃｏｒｐ，ＵＳＡ
２．　ＢｒｄＵ標識試薬：１０ｍＭ，ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中，Ｃａｔ．Ｎｏ．１６４７２２９，Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ
３．　ＦｉｘＤｅｎａｔ：固定溶液（即使用可），Ｃａｔ．Ｎｏ．１６４７２２９，Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ
４．　抗ＢｒｄＵ−ＰＯＤ：ペルオキシダーゼとコンジュゲート化したマウスモノクローナル抗体，Ｃａｔ．Ｎｏ．１６４７２２９，Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ
５．　ＴＭＢ基質溶液：テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ），即使用可，Ｃａｔ．Ｎｏ．１６４７２２９，Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ
６．　ＰＢＳ洗浄溶液：１ＸＰＢＳ，ｐＨ７．４
７．　アルブミン，ウシ（ＢＳＡ）：画分Ｖ粉末；Ａ−８５５１，Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ．，ＵＳＡ
８．　ヒトＩＧＦ−１レセプターを発現するよう遺伝子工学処理された３Ｔ３細胞株
【０４９７】
プロトコル：
１．　細胞をＤＭＥＭ，１０％ＣＳ，２ｍＭＧｌｎ中で９６−ウエルプレートに８０００細胞／ウエルで播種する。細胞を５％ＣＯ２中，３７℃で一夜インキュベートする。
２．　２４時間後，細胞をＰＢＳで洗浄し，次に無血清培地（０％ＣＳ　ＤＭＥＭ，０．１％ＢＳＡ）中で２４時間血清飢餓とする
３．　第３日に，リガンド（ＩＧＦ１＝３．３ｎＭ，０．１％ＢＳＡを含むＤＭＥＭ中で調製）および試験化合物を細胞に同時に加える。陰性対照ウエルには０．１％ＢＳＡを含む無血清ＤＭＥＭのみを加える。陽性対照細胞にはリガンド（ＩＧＦ１）を加えるが試験化合物を加えない。試験化合物は，９６ウエルプレートで無血清ＤＭＥＭ中でリガンドとともに調製し，連続希釈して７種類の試験濃度とする。
４．　リガンド活性化の１６時間後，希釈ＢｒｄＵ標識試薬（ＤＭＥＭ，０．１％ＢＳＡ中１：１００）を加え，細胞をＢｒｄＵ（最終濃度＝１０μＭ）とともに１．５時間インキュベートする。
５．　標識試薬とともにインキュベーションした後，デカントし，逆さにしたプレートをペーパータオル上で軽くたたくことにより培地を除去する。ＦｉｘＤｅｎａｔ溶液を加え（５０μｌ／ウエル），プレートをプレート振盪器上で室温で４５分間インキュベートする。
６．　デカントし，逆さにしたプレートをペーパータオル上で軽くたたくことによりＦｉｘＤｅｎａｔ溶液をよく除去する。ブロッキング溶液としてミルクを加え（ＰＢＳ中５％脱水ミルク，２００μｌ／ウエル），プレートをプレート振盪器上で室温で３０分間インキュベートする。
７．　ブロッキング溶液をデカントにより除去し，ウエルをＰＢＳで１回洗浄する。抗ＢｒｄＵ−ＰＯＤ溶液（ＰＢＳ，１％ＢＳＡ中１：１００希釈）を加え（１００μｌ／ウエル），プレートをプレート振盪器上で室温で９０分間インキュベートする。
８．　デカントし，ウエルをＰＢＳで５回すすぐことにより抗体コンジュゲートをよく除去し，プレートを逆さにしペーパータオル上で軽くたたくことにより乾燥する。
９．　ＴＭＢ基質溶液を加え（１００μｌ／ウエル），プレート振盪器上で室温で２０分間，発色が光度計検出に十分となるまでインキュベートする。
１０．　サンプルの吸光度は，Ｄｙｎａｔｅｃｈ　ＥＬＩＳＡプレートリーダーで，４１０ｎｍ（参照波長として４９０ｎｍで読むフィルターを用いる”二波長”モード）で測定する。
【０４９８】
実施例３０：ＨＵＶ−ＥＣ−Ｃアッセイ
また，以下のプロトコルを用いて，ＰＤＧＦ−Ｒ，ＦＧＦ−Ｒ，ＶＥＧＦ，ａＦＧＦまたはＦｌｋ−１／ＫＤＲ（これらはすべてＨＵＶ−ＥＣ細胞により天然に発現されている）に対する化合物の活性を測定することができる。
第０日
１．　ＨＵＶ−ＥＣ−Ｃ細胞（ヒト臍静脈内皮細胞，（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕｔｕｒｅ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ；カタログＮｏ．１７３０ＣＲＬ）を洗浄し，トリプシン処理する。ダルベッコリン酸緩衝化食塩水（Ｄ−ＰＢＳ；Ｇｉｂｃｏ　ＢＲＬ；カタログＮｏ．１４１９０−０２９から入手）で２回，約１ｍｌ／１０ｃｍ２組織培養フラスコで洗浄する。非酵素細胞解離溶液（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｍｐａｎｙ；カタログＮｏ．Ｃ−１５４４）中で０．０５％トリプシン−ＥＤＴＡでトリプシン処理する。０．０５％トリプシンは，０．２５％トリプシン／１ｍＭＥＤＴＡ（Ｇｉｂｃｏ；カタログＮｏ．２５２００−０４９）を細胞解離溶液中で希釈することにより作成する。約１ｍｌ／２５−３０ｃｍ２組織培養フラスコで３７℃で約５分間トリプシン処理する。細胞をフラスコからはがした後，等量のアッセイ培地を加え，５０ｍｌ滅菌遠心分離管（Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；カタログＮｏ．０５−５３９−６）に移す。
２．　５０ｍｌ滅菌遠心分離管中にアッセイ培地を加えることにより，細胞を約３５ｍｌのアッセイ培地で洗浄し，約２００ｇで１０分間遠心分離し，上清を吸引し，３５ｍｌのＤ−ＰＢＳに再懸濁する。Ｄ−ＰＢＳでさらに２回洗浄し，細胞を約１ｍｌ／組織培養フラスコ１５ｃｍ２のアッセイ培地に再懸濁する。アッセイ培地は，Ｆ１２Ｋ培地（Ｇｉｂｃｏ　ＢＲＬ；カタログＮｏ．２１１２７−０１４）＋０．５％熱不活性化ウシ胎児血清からなる。Ｃｏｕｌｔｅｒ　Ｃｏｕｎｔｅｒ（商標）（Ｃｏｕｌｔｅｒ　Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ，Ｉｎｃ．）で細胞を計数し，アッセイ培地を細胞に加えて０．８−１．０ｘ１０５細胞／ｍｌの濃度とする。
３．　細胞を９６ウエル平底プレートに１００μｌ／ウエルまたは０．８−１．０ｘ１０４細胞／ウエルで加える；３７℃，５％ＣＯ２で約２４時間インキュベートする。
【０４９９】
第１日
１．　試験化合物の２倍滴定を別々の９６ウエルプレート中に作成する。一般に，５０μＭから０μＭまで。上述の第０日，工程２と同じアッセイ培地を用いる。滴定は，９０μｌ／ウエルの試験化合物を２００μＭ（４Ｘ最終ウエル濃度）で特定のプレートカラムの最上のウエルに加えることにより行う。試験化合物保存液濃度は通常ＤＭＳＯ中２０ｍＭであるため，２００μＭの薬剤濃度は２％ＤＭＳＯを含む。
したがって，ＤＭＳＯ濃度を一定に保持しながら薬剤を希釈するために，アッセイ培地中（Ｆ１２Ｋ＋０．５％ウシ胎児血清）２％ＤＭＳＯとした希釈剤を，試験化合物滴定の希釈剤として用いる。この希釈物をカラム中の残りのウエルに６０μｌ／ウエルで加える。カラムの最上ウエル中の１２０μｌの２００μＭ試験化合物希釈物から６０μｌを採取し，カラムの第２のウエル中の６０μｌと混合する。このウエルから６０μｌを採取し，カラム中の第３のウエル中の６０μｌと混合し，２倍滴定が完了するまでこれを続ける。最後から２番目のウエルが混合されたとき，このウエル中の１２０μｌの６０μｌを採取し，これを廃棄する。最後のウエルには薬剤非含有対照として６０μｌのＤＭＳＯ／培地希釈物を加える。以下のアッセイの，滴定する試験化合物の三重のウエルに十分な９つのカラムを作成する：（１）ＶＥＧＦ（Ｐｅｐｒｏ　Ｔｅｃｈ　Ｉｎｃ．，から入手，カタログＮｏ．１００−２００，（２）内皮細胞成長因子（ＥＣＧＦ）（酸性線維芽細胞成長因子またはａＦＧＦとしても知られる）（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａから入手，カタログＮｏ．１４３９６００）；または（３）ヒトＰＤＧＦ　Ｂ／Ｂ（１２７６−９５６，Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）およびアッセイ培地対照。ＥＣＧＦはヘパリンナトリウムを有する調製物として得た。
２．　５０μｌ／ウエルの試験化合物希釈物を，第０日からのＨＵＶ−ＥＣ−Ｃ細胞０．８−１．０ｘ１０４細胞／１００μｌ／ウエルを含む９６ウエルアッセイプレートに移し，３７ｏＣ，５％ＣＯ２で約２時間インキュベートする。
３．　三重に，８０μｇ／ｍｌＶＥＧＦ，２０ｎｇ／ｍｌＥＣＧＦ，または各試験化合物の条件に対する培地対照を５０μｌ／ウエルで加える。試験化合物については，成長因子濃度は所望の最終濃度の４倍である。第０日，工程２からのアッセイ培地を用いて，成長因子の濃度を調節する。３７℃，５％ＣＯ２で約２４時間インキュベートする。各ウエルに５０μｌの試験化合物希釈物，５０μｌの成長因子または培地，および１００μｌの細胞を加え，総量２００μｌ／ウエルとする。すなわち，すべてをウエルに加えたとき，４倍濃度の試験化合物および成長因子は１倍となる。
【０５００】
第２日
１．　３Ｈ−チミジン（Ａｍｅｒｓｈａｍ；カタログＮｏ．ＴＲＫ−６８６）を１μＣｉ／ウエル（ＲＰＭＩ培地＋１０％熱不活性化ウシ胎児血清中で調製した１００μＣｉ／ｍｌ溶液を１０μｌ／ウエル）で加え，３７℃，５％ＣＯ２で約２４時間インキュベートする。ＲＰＭＩはＧｉｂｃｏ　ＢＲＬから入手する，カタログＮｏ．１１８７５−０５１
第３日
１．　プレートを−２０℃で一夜凍結する。
第４日
１．　プレートを融解し，９６ウエルプレート回収器（Ｔｏｍｔｅｃ　Ｈａｒｖｅｓｔｅｒ９６（登録商標））でフィルターマット（Ｗａｌｌａｃ；カタログＮｏ．１２０５−４０１）上に回収する；Ｗａｌｌａｃ　Ｂｅｔａｐｌａｔｅ（商標）液体シンチレーション計数機で計数する。
【０５０１】
結論
当業者は，本発明は，その目的を実施し，記載される結果および利点，ならびに本明細書に固有のものを得るのによく適合していることを容易に理解するであろう。本明細書に記載される分子複合体および方法，手順，処理，分子，特定の化合物は，現在のところ好ましい態様の代表的なものであり，例示的なものであって，本発明の範囲を限定することを意図するものではない。当業者は，本発明の範囲および精神から逸脱することなく，本明細書に開示される本発明に対して置換基の変更および改変をなすことができることを容易に理解するであろう。
【０５０２】
本明細書において言及されるすべての特許および刊行物は，本発明の属する技術分野の技術者のレベルを示す。すべての特許および刊行物は，それぞれの刊行物が特定的に個々に本明細書の一部としてここに引用されることと同じ程度に，本明細書の一部として引用される。
【０５０３】
本明細書に例示的に記載されている発明は，本明細書に特定的に開示されていない任意の要素または限定なしでも適切に実施することができる。すなわち，例えば，本明細書における各例において，”・・・を含む”，”・・・から本質的になる”および”・・・からなる”との用語は，他の２つのいずれかと置き換えることができる。本明細書において用いた用語および表現は，説明の用語として用いるものであり，限定ではない。そのような用語および表現の使用においては，示されかつ記載されている特徴またはその一部の等価物を排除することを意図するものではなく，特許請求の範囲に記載される本発明の範囲中で種々の変更が可能であることが理解される。すなわち，好ましい態様および任意の特徴により本発明を特定的に開示してきたが，当業者には本明細書に記載される概念の変更および変種が可能であり，そのような変更および変種も特許請求の範囲に定義される本発明の範囲内であると考えられることが理解されるべきである。
さらに，発明の特徴および局面がマーカッシュグループの用語で記載されている場合，当業者は，本発明が，マーカッシュグループのメンバーの個々のメンバーまたはサブグループに関してもまた記載されていることを認識するであろう。例えば，Ｘが，臭素，塩素およびヨウ素からなる群より選択されるとして記載されている場合，Ｘが臭素である特許請求の範囲およびＸが臭素および塩素である特許請求の範囲も完全に記載されている。
【０５０４】
遺伝コードの縮重の観点から，核酸の他の組み合わせもまた本明細書のペプチドおよび蛋白質をコードする。例えば，ＧＣＴ，ＧＣＣ，ＧＣＡ，ＧＣＧの４つの核酸配列はすべてアミノ酸アラニンをコードする。したがって，あるアミノ酸について平均で３つのコドンが存在し，１００アミノ酸の長さのポリペプチドは平均で３１００，もしくは５ｘ１０４７種類の核酸配列によりコードされるであろう。すなわち，日常的な方法を用いて過度の実験なしに，核酸配列を改変して第１の核酸配列によりコードされるものと同じポリペプチドをコードする第２の核酸配列を形成することができる。すなわち，特許請求の範囲に記載されるペプチドおよび蛋白質をコードするすべての可能な核酸もまた，コドン使用，特にヒトにおいて好ましいものを完全に考慮してこれらがすべて書き出されているように，本明細書に完全に記載されている。さらに，ポリペプチドの有意な活性が変更しない配列の領域内において，ポリペプチドのアミノ酸配列，またはそのようなポリペプチドをコードする対応する核酸配列の変更が生ずるよう設計しまたは選択することができる。例えば，ポリペプチドの活性部位と離れたβターン中で，アミノ酸変化を生じさせることができる。また，欠失（例えば活性部位に影響を与えないポリペプチドのセグメントまたはそのようなポリペプチドをコードする対応する核酸配列を除去する）および付加（例えば，活性部位の機能に影響を与えずに，ポリペプチド配列により多くのアミノ酸を付加する，例えばＧＳＴ融合蛋白質を形成する，または活性部位の機能に影響を与えずにそのようなポリペプチドをコードする対応する核酸配列に付加する）もまた本発明の範囲内である。ポリペプチドに対するそのような変更は，当業者が日常的な方法を用いて過度の実験なしに行うことができる。すなわち，本発明のペプチドまたは蛋白質の有意な活性に影響を与えないと容易に決定することができるすべての可能な核酸および／またはアミノ酸配列もまた本明細書に完全に記載されている。
【０５０５】
本明細書においては，本発明を広くかつ一般的に記載している。一般的開示に含まれるより狭い種および亜属のそれぞれのグループもまた本発明の一部を形成する。これには，除かれたものが具体的に記載されているか否かにかかわらず，属から任意の主題を除く「ただし・・・」またはネガティブ限定を含む発明の一般的記載が含まれる。
【０５０６】
他の態様は特許請求の範囲の範囲内である。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は，ヒト蛋白質キナーゼのヌクレオチド配列を５’から３’の方向で示す。
【図２】図２は，ヒト蛋白質キナーゼのアミノ酸配列を翻訳の方向で示す。
【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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