(57)【要約】本発明は、生物活性化合物を迅速に同定するのに有用なペプチドライブラリを提供する。本発明はさらに、細胞増殖に影響を及ぼすペプチドを含むペプチドと、細胞タンパク質の生成を増強しまたは阻害するペプチドを提供する。本発明のペプチドの多くは、組換え技法によって大量に生成することができ、培地に配合して所望の効果を培養細胞および組織にもたらすことができる。本発明のライブラリのいくつかと、それらの中で同定されたペプチドは、コンカテマーをベースとした組換え発現方法に特に有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０、配列番号：１１、配列番号：１２、配列番号：１３、配列番号：１４、配列番号：１５、配列番号：１６、配列番号：１７、配列番号：１８、配列番号：１９、配列番号：２０、配列番号：２１、配列番号：２２、配列番号：２３、配列番号：２４、配列番号：２５、配列番号：２６、配列番号：２７、配列番号：２８、配列番号：２９、配列番号：３０、配列番号：３１、配列番号：３２、配列番号：３３、配列番号：３４、配列番号：３５、配列番号：３６、配列番号：３７、配列番号：３８、配列番号：３９、配列番号：４０、配列番号：４１、配列番号：４２、配列番号：４３、配列番号：４４、配列番号：４５、配列番号：４６、配列番号：４７、配列番号：４８、配列番号：４９、配列番号：５０、配列番号：５１、配列番号：５２、配列番号：５３、配列番号：５４、配列番号：５５、配列番号：５６、配列番号：５７、配列番号：５８、配列番号：５９、配列番号：６０、配列番号：６１、配列番号：６２、配列番号：６３、配列番号：６４、配列番号：６５、配列番号：６６、配列番号：６７、配列番号：６８、配列番号：６９、配列番号：７０、配列番号：７１、配列番号：７２、配列番号：７３、配列番号：７４、配列番号：７５、配列番号：７６、配列番号：７７、配列番号：７８、配列番号：７９、配列番号：８０、配列番号：８１、配列番号：８２、配列番号：８３、配列番号：８４、配列番号：８５、配列番号：８６、配列番号：８７、配列番号：８８、配列番号：８９、配列番号：９０、配列番号：９１、配列番号：９２、配列番号：９３および配列番号：９４
からなる群から選択されることを特徴とするペプチド。
【請求項２】
ペプチドをコードする組換え核酸配列の発現によって生成されることを特徴とする請求項１に記載のペプチド。
【請求項３】
組換え核酸配列の発現が、ペプチドモノマーを放出するように化学的手段または酵素手段によって切断可能なペプチドのコンカテマーを生成することを特徴とする請求項２に記載のペプチド。
【請求項４】
請求項１に記載のペプチドを含むことを特徴とする細胞または組織培地。
【請求項５】
化学的に合成されたペプチドを含むペプチドライブラリであって、ペプチドのそれぞれが、ポリペプチドの酵素作用による切断または化学的な切断に関連したＮ−末端またはＣ−末端アミノ酸と、１つまたは複数の追加のアミノ酸を含むことを特徴とするライブラリ。
【請求項６】
追加のアミノ酸の少なくとも１つが、アミノ酸に化学的に関係する基を表すことを特徴とする請求項５に記載のライブラリ。
【請求項７】
ペプチドのＣ−末端アミノ酸が、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｒ、Ｙ、およびＷからなる群から選択されることを特徴とする請求項５に記載のライブラリ。
【請求項８】
ペプチドのＮ−末端アミノ酸が、Ａ、Ｄ、Ｆ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｓ、Ｖ、Ｙ、およびＷからなる群から選択されることを特徴とする請求項５に記載のライブラリ。
【請求項９】
Ｎ−末端またはＣ−末端アミノ酸に隣接するアミノ酸がスペーサアミノ酸であることを特徴とする請求項５に記載のライブラリ。
【請求項１０】
スペーサアミノ酸がＡであることを特徴とする請求項９に記載のライブラリ。
【請求項１１】
テトラペプチド、ペンタペプチド、またはヘキサペプチドを含むことを特徴とする請求項５に記載のライブラリ。
【請求項１２】
請求項５に記載のライブラリから選択されることを特徴とするペプチド。
【請求項１３】
ペプチドをコードする組換え核酸配列の発現によって生成されることを特徴とする請求項１２に記載のペプチド。
【請求項１４】
発現が、ペプチドモノマーを放出するように酵素手段または化学的手段によって切断可能なペプチドのコンカテマーを生成することを特徴とする請求項１３に記載のペプチド。
【請求項１５】
請求項５に記載のペプチドライブラリから選択されたペプチドを含むことを特徴とする細胞または組織培地。
【請求項１６】
ペプチドが、
配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０、配列番号：１１、配列番号：１２、配列番号：１３、配列番号：１４、配列番号：１５、配列番号：１６、配列番号：１７、配列番号：１８、配列番号：１９、配列番号：２０、配列番号：２１、配列番号：２２、配列番号：２３、配列番号：２５、配列番号：２６、配列番号：２７、配列番号：２８、配列番号：２９、配列番号：３０、配列番号：３１、配列番号：３２、配列番号：３３、配列番号：３４、配列番号：３５、配列番号：３６、配列番号：３７、配列番号：３８、配列番号：３９、配列番号：４０、配列番号：４１、配列番号：４２、配列番号：４３、配列番号：４４、配列番号：４５、配列番号：４６、配列番号：４７、配列番号：４８、配列番号：４９、配列番号：５０、配列番号：５２、配列番号：５４、配列番号：５５、配列番号：５６、配列番号：５７、配列番号：５９、配列番号：６０、配列番号：６２、配列番号：６３、配列番号：６４、配列番号：６５、配列番号：６６、配列番号：６７、配列番号：６８、配列番号：６９、配列番号：７０、配列番号：７１、配列番号：７２、配列番号：７３、配列番号：７６、配列番号：７７、配列番号：７８、配列番号：７９、配列番号：８０、配列番号：８１、配列番号：８２、配列番号：８３、配列番号：８４、配列番号：８５、配列番号：８６、配列番号：８７、配列番号：８８、配列番号：８９、配列番号：９０、配列番号：９１、配列番号：９２および配列番号：９３
からなる群から選択されることを特徴とする請求項１５に記載の培地。
【請求項１７】
化学的に確定された培地、血清を含まない培地、または加水分解物を含まない培地であることを特徴とする請求項１５に記載の培地。
【請求項１８】
約０．１〜２５ｍＭのペプチドを含むことを特徴とする請求項１５に記載の培地。
【請求項１９】
異なる生物活性を有する少なくとも２つのペプチドを含むことを特徴とする請求項１５に記載の培地。
【請求項２０】
細胞増殖または細胞タンパク質の生成を増強しまたは阻害するための方法であって、請求項５に記載のペプチドライブラリから選択されたペプチドの存在下で細胞または組織を培養することを含むことを特徴とする方法。
【請求項２１】
ペプチドが、
配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０、配列番号：１１、配列番号：１２、配列番号：１３、配列番号：１４、配列番号：１５、配列番号：１６、配列番号：１７、配列番号：１８、配列番号：１９、配列番号：２０、配列番号：２１、配列番号：２２、配列番号：２３、配列番号：２５、配列番号：２６、配列番号：２７、配列番号：２８、配列番号：２９、配列番号：３０、配列番号：３１、配列番号：３２、配列番号：３３、配列番号：３４、配列番号：３５、配列番号：３６、配列番号：３７、配列番号：３８、配列番号：３９、配列番号：４０、配列番号：４１、配列番号：４２、配列番号：４３、配列番号：４４、配列番号：４５、配列番号：４６、配列番号：４７、配列番号：４８、配列番号：４９、配列番号：５０、配列番号：５２、配列番号：５４、配列番号：５５、配列番号：５６、配列番号：５７、配列番号：５９、配列番号：６０、配列番号：６２、配列番号：６３、配列番号：６４、配列番号：６５、配列番号：６６、配列番号：６７、配列番号：６８、配列番号：６９、配列番号：７０、配列番号：７１、配列番号：７２、配列番号：７３、配列番号：７６、配列番号：７７、配列番号：７８、配列番号：７９、配列番号：８０、配列番号：８１、配列番号：８２、配列番号：８３、配列番号：８４、配列番号：８５、配列番号：８６、配列番号：８７、配列番号：８８、配列番号：８９、配列番号：９０、配列番号：９１、配列番号：９２および配列番号：９３
からなる群から選択されることを特徴とする請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
ウェルシュ菌（Ｃ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）の増殖が増強されまたは阻害されることを特徴とする請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
β−トキシンの生成が増強されまたは阻害されることを特徴とする請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
細胞が、約０．１〜２５ｍＭのペプチドの存在下で培養されることを特徴とする請求項２０に記載の方法。
【請求項２５】
細胞が、約１．０〜１２ｍＭのペプチドの存在下で培養されることを特徴とする請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
請求項５に記載のペプチドタイブラリから選択されるペプチドを生成するための方法であって、ペプチドのコンカテマーをコードする組換え核酸配列を発現すること、および発現したコンカテマーの酵素作用による切断または化学的な切断によってペプチドモノマーを放出することを含むことを特徴とする方法。
【請求項２７】
ペプチドが、
配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０、配列番号：１１、配列番号：１２、配列番号：１３、配列番号：１４、配列番号：１５、配列番号：１６、配列番号：１７、配列番号：１８、配列番号：１９、配列番号：２０、配列番号：２１、配列番号：２２、配列番号：２３、配列番号：２５、配列番号：２６、配列番号：２７、配列番号：２８、配列番号：２９、配列番号：３０、配列番号：３１、配列番号：３２、配列番号：３３、配列番号：３４、配列番号：３５、配列番号：３６、配列番号：３７、配列番号：３８、配列番号：３９、配列番号：４０、配列番号：４１、配列番号：４２、配列番号：４３、配列番号：４４、配列番号：４５、配列番号：４６、配列番号：４７、配列番号：４８、配列番号：４９、配列番号：５０、配列番号：５２、配列番号：５４、配列番号：５５、配列番号：５６、配列番号：５７、配列番号：５９、配列番号：６０、配列番号：６２、配列番号：６３、配列番号：６４、配列番号：６５、配列番号：６６、配列番号：６７、配列番号：６８、配列番号：６９、配列番号：７０、配列番号：７１、配列番号：７２、配列番号：７３、配列番号：７６、配列番号：７７、配列番号：７８、配列番号：７９、配列番号：８０、配列番号：８１、配列番号：８２、配列番号：８３、配列番号：８４、配列番号：８５、配列番号：８６、配列番号：８７、配列番号：８８、配列番号：８９、配列番号：９０、配列番号：９１、配列番号：９２および配列番号：９３
からなる群から選択されることを特徴とする請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
ペプチドモノマーが、ペプシン、パパイン、キモトリプシン、トリプシン、臭化シアン、Ｖ８プロテアーゼ、サーモリシン、カテプシンＧ、エンドプロテイナーゼＬｙｓ−Ｃ、エンドプロテイナーゼＡｓｐ−Ｎ、プロテイナーゼＫ、またはプロリンエンドペプチダーゼでコンカテマーを切断することによって放出されることを特徴とする請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
異なる生物活性を有する複数のペプチドが単一のコンカテマーとして発現されることを特徴とする請求項２６に記載の方法。
【請求項３０】
ａ）「Ｘ」が、化学的に関係するアミノ酸の基を表すアミノ酸を示すＸＸＡＬライブラリと、
ｂ）「Ｘ」が、化学的に関係するアミノ酸の基を表すアミノ酸を示すＸＸＸＬライブラリと、
ｃ）「Ｚ」が任意のアミノ酸を表すＺＺＡＬライブラリと、
ｄ）「Ｚ」が任意のアミノ酸を表すＺＺＺＬライブラリと、
ｅ）単一のアミノ酸配列が、アミノ酸配列の全ての順列を表すライブラリと
からなる群から選択されることを特徴とするペプチドライブラリ。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、培養中の細胞に影響を及ぼすペプチドと、そのようなペプチドを発見し製造する方法に関する。詳細には本発明は、培養中の細胞の増殖に影響を及ぼすペプチドと、細胞タンパク質の生成に影響を及ぼすペプチドに関する。
【０００２】
（発明の背景）
組織およびタンパク質の加水分解物は、１８００年代後半から細胞培地のペプチド源として日常的に使用されてきた。これらは、細菌学において現在使用されている最も一般的な、不定の培地成分であり、哺乳動物の培養でしばしば血清の代わりに使用される（Ｓ．  ＳａｈａおよびＡ．  Ｓｅｎ、１９８９、Ａｃｔａ  Ｖｉｒｏｌ．３３：３３８〜３４３）。しかし、加水分解物および血清は、その組成が漠然として変動しやすく、また血清はＢＳＥなどの病原体のすみかとなる場合があるので、培地にとって最適なペプチド源ではない。
【０００３】
ペプチドは、その構成成分であるアミノ酸に比べ、一般に好ましい栄養素であることが認識されている。増殖または幾つかのその他の生物活性に影響を与える確定されたペプチドを同定するための手段として、細胞培養でどの特定のペプチドが利用されているかを決定しようとしていくつかの手法がとられてきた。一般に実施されているのは、培養中に消費された化合物を同定するために、使用済みの培地を分析することである。この手法では、単離し、調べることができる単一の化合物が得られることはほとんどない。使用済みの培地による手法は、細胞に影響を及ぼし、培地から除去されない化合物（例えばシグナル伝達化合物）を同定することができない。代替の手法では、特定のタンパク質を消化し、ＨＰＬＣ精製されたペプチド断片を再び培地に加えてその効果を評価する。この手法では、全タンパク質の消化物または組織の消化物よりも良く機能するペプチドを同定することができるが、分析可能なペプチドの数が限られている。例えば、ミクロコッカス−カゼオリチカス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｓｅｏｌｙｔｉｃｕｓ）の中性プロテアーゼによって加水分解されたカゼイン（Ｍ．  Ｊ．  ＤｅｓｍａｚｅａｕｄおよびＪ．  Ｈ．  Ｈｅｒｍｉｅｒ、１９７２、Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ２８：１９０〜１９８）と、グルカゴンのパパイン消化物（Ｍ．  Ｊ．  ＤｅｓｍａｚｅａｕｄおよびＪ．  Ｈ．  Ｈｅｒｍｉｅｒ、１９７３、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ  ５５：６７９〜６８４）は、高温性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）の増殖を高めることが報告されている。この場合、刺激性ペプチドを単離し、特徴付けた。トリプシンで消化されたκ−カゼインはビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属の増殖を増大させることもわかっているが（Ｍ．  ＰｏｃｈおよびＡ．  Ｂｅｚｋｏｒｏｖａｉｎｙ、１９９１、Ｊ．  Ａｇｒｉｃ．  Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ．、３９：７３〜７７）、この結果をもたらす特定のペプチドは同定されなかった。Ａｚｕｍａ他（１９８４、Ａｇｒｉｃ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ４８：２１５９〜２１６２）およびＢｅｚｋｏｒｏｖａｉｎｙ他（１９７９、Ａｍ．  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｎｕｔｒ．  ３２：１４２８〜１４３２）は、酵素で消化されたヒトカゼイン由来のグリコポリペプチドがビフィズス菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｉｆｉｄｕｓ）の増殖を促進させることを報告した。また、ヒトβ−カゼインのトリプシン断片は、ＢＡＬＢ／ｃ３Ｔ３細胞でＤＮＡ合成を刺激することも報告されている（Ｎ．  Ａｚｕｍａ他、１９８９、Ａｇｒｉｃ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ５３：２６３１〜２６４３）。そのような２つのトリプシン断片の配列は決定されている。これらの従来技術の方法は時間がかかり、わずかな改善をもたらす２〜３のペプチドしか同定されなかった。このような成果は、主に、その調製に使用される出発物質および消化剤による制約を受ける、原材料によって制限される。
【０００４】
ごく最近、ペプチド合成技術の開発によって、培地強化用の多数の化合物を個々の確定された配列としてまたはペプチドライブラリの様々な配列の混合物として調製し、スクリーニングすることが、少なくともうまく行われるようになった。これらの配列の多くは、従来からの明確にされていない材料中に存在しないか、または検出されないと考えられる。ライブラリの手法により、細胞培養中の望ましい生物学的作用を得るためにより多くのペプチド配列をスクリーニングする機会が与えられたが、これらの主な方法には多くの欠点がある。化合物を個々にアッセイにかけることは、ランダムに生成された配列を含有する何百万ものサンプルをスクリーニングすることを意味する。実際問題として、徹底的にライブラリの合成およびスクリーニングを行うことは、しばしば非常に費用がかかり時間もかかる。コンビナトリアル手法では、溶解度の制約および競合する化合物から生じる可能性があるマスキング効果が原因で、カクテル中の各化合物の発現量が不十分（低濃度）であるために、潜在的リード化合物を見失うという危険が伴う。ライブラリの中でスクリーニングしなければならない配列の数を減少させるために、当業者は、ライブラリの合成中、ある特定の残基位置を「固定」した。すなわち配列中のある位置に存在するある残基をランダムに付加するが、他の位置にある残基は確定されている。そのような合成ペプチドライブラリは、米国特許第５，５５６，７６２号に記載されている。さらに、Ｇｅｙｓｅｎ（ＷＯ  ８６／００９９１）は、確定されたアミノ酸残基と確定されていないアミノ酸残基の組合せであるペプチド配列を含むライブラリについて記述している。Ｆｕｒｋａ他（１９８８、１４ｔｈ  Ｉｎｔ．Ｃｏｎｇ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｖｏｌ．５、Ａｂｓｔ．ＦＲ：０１３）は、Ｎ−およびＣ−末端残基が固定され、３つの残基のうちいずれか１つが各位置で両者の間に生じるテトラペプチドの比較的簡単な混合物を開示している。Ｆｏｄｏｒ他（１９９１、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５１：７６７〜７７３）は、フォトマスクを使用してスライドの定められた領域に結合させた所定のアミノ酸を使用する、スライド上での固相ペプチド合成について教示している。このようにして、確定されたＣ−末端を有する１０２４個の異なるペプチドのアレイを合成した。これらの技法の全ては、何百万ものペプチドを個々にスクリーニングすることを回避してライブラリ中の所与の配列の量を増加させ、それによって生物学的に活性なペプチドのスクリーニングおよび同定を簡単にしようとするものである。
【０００５】
固定位置（すなわち限定された多様性）ライブラリにより、スクリーニングしなければならない配列の数が減少するが、スクリーニングに利用可能な種々の配列の数も制限され、したがって所望の性質を有する配列を同定する可能性が小さくなる。上記論じた文献では、一般に、多様性が限定されたライブラリのものと同様の性質を有すると考えられる追加の配列を同定するために、利用可能な配列の数を「再び広げよう」とする試みがなされていなかった。最近、より限定された配列ライブラリで同定された化合物の性質に関する情報を使用して、初めに同定された化合物と構造が類似している化合物のより多様なライブラリが作成されている。これらの追加の化合物は、初めのライブラリに存在しないものであるが、当初のリード化合物と同様の生物活性を示す可能性がある。この手法は、しばしば標的ライブラリの合理的設計と呼ばれる。例えばＳ．  Ｃｈｏ他、１９９８、Ｊ．  Ｃｈｅｍ．  Ｉｎｆ．  Ｃｏｍｐｕｔ．  Ｓｃｉ．  ３８：２５９〜２６８を参照されたい。
【０００６】
培地に適用する場合、所望の強化を行う化合物の同定だけでは不十分である。培地を最適化するプロセス全体に影響を与えるには、リード化合物を急速に増大させて、典型的な培地最適化サイクルに影響を与えることになる時間枠で利用可能にしなければならない。さらに、この化合物を初めに増大させるのに使用される方法は、利益に見合ったコストで化合物を与えることが可能な計画された商用製造プロセスに適合しなければならない。理想的な発見プロセスでは、初期のライブラリ設計を好ましい製造プロセスと結びつけ、それによって、製造することも可能な同様のパフォーマンス特性を有する化合物を見出すことを意図した一連の後続のライブラリが避けられると考えられる。既存の固定ライブラリ設計は、この要求に応えるものではない。実際に、製造態様は偶然にまかせている。
【０００７】
したがって当技術分野では、所望の生物学的作用をもたらすために培地に添加することが可能な、十分に特徴付けられた生物活性を有する、化学的に確定されたペプチドが必要とされている。そのようなペプチドは、培地中の未確定の成分の数および量を減少させ、動物由来の成分の必要性を小さくし、培地のコンシステンシーおよび品質管理を改善し、細胞培養性能を精密に制御し調節するための手段を提供する。本発明は、これらの要求に応えるペプチドを選択し同定するためにペプチドライブラリの手法を使用し、特に、細胞増殖に影響を与え（プラスにまたはマイナスに）あるいは細胞タンパク質の生成を高めまたは妨げるペプチドの発見と製造を結びつけるプロセスを使用する。
【０００８】
（発明の概要）
本発明は、培養中の細胞の性質に影響を及ぼす生物活性化合物を迅速に同定するのに有用なペプチドライブラリを提供する。本発明はさらに、これらのライブラリで同定された、細胞増殖増強ペプチド、細胞増殖阻害ペプチド、および細胞タンパク質の生成、特にウェルシュ菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）によるβ−トキシンの生成を増強しまたは阻害するペプチドを含めたペプチドを提供する。所望の生物活性を有するペプチドの配列が同定されたら、それを大量に生成することができ（例えば化学合成や組換えＤＮＡの発現によって）、培地に配合して所望の効果を培養細胞にもたらすことができる。本発明のライブラリとそこで同定されたペプチドは、ある大規模で経済的な組換え生成法に、特に有用である。
【０００９】
（発明の詳細な説明）
ペプチドを合成する従来の技法を使用して、多様性が限定されたペプチドライブラリを構築し、その後、ある所望の特徴を示す生物活性ペプチドについてスクリーニングを行った。当初の目的は、細胞増殖（すなわち細胞の数）を増大させることによってまたは細胞１個あたり生成されるトキシンの量を増大させることによってウェルシュ菌（Ｃ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）により生成されるβ−トキシンの量を増大させるため、培地中に含めることができるペプチドを同定することであった。最初の候補のライブラリは、いくつかの設計基準に基づいていた。まず、プロテオースペプトンは、ウェルシュ菌の培養に好ましい加水分解物であることが知られている。プロテオースペプトンはペプシンを使用して製造され、したがってロイシンは、加水分解物のペプチドの中でより一般的なＣ−末端の１つと考えられる。それに応じてテトラペプチドライブラリを構築したが、このときＣ−末端（ペプチドの第４の位置）としてロイシンを用い、第３の位置でスペーサとしてアラニン（単純なアミノ酸）を用いて構築した。以下に示す、選択された１０個のアミノ酸基の代表例は、それぞれが関連するアミノ酸の基を表しているが、これらはペプチドの残りの最初の２つの位置で挿入するために選択した。代表的なアミノ酸基の選択は、一般に、そのアミノ酸を使用することによってペプチドの合成が容易になることに基づいている。
【００１０】
【表１】
2004519417.tif 000002
【００１１】
最初の２つの位置のそれぞれで、これら１０個のアミノ酸への置換を行い、１００個の異なる４量体配列からなる多様性が限定されたライブラリにした。このライブラリはＸＸＡＬライブラリと呼ばれ、ここで「Ｘ」は、クラスタ群を表すよう選択されたアミノ酸を示す。
【００１２】
ペプチドライブラリ用のペプチドは、固相ペプチド合成（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ、１９６５）におけるＡｔｈｅｒｔｏｎおよびＳｈｅｐｐａｒｄ（１９８９）のＦＭＯＣ化学法など、当技術分野で知られている任意の適切な方法によって合成することができる。Ｂｏｃ化学法も、様々な異なる固体支持体上での合成、「ティーバッグ（ｔｅａ−ｂａｇ）」合成（Ｈｏｕｇｈｔｅｎ）、スプリット・アンド・ディバイド・コンビナトリアル法（ｓｐｌｉｔ  ａｎｄ  ｄｉｖｉｄｅ  ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  ｍｅｔｈｏｄ）と同様に使用することができる。ペプチド合成のための液相法も使用することができる。ライブラリペプチドは、Ｃ−末端の修飾（例えばアミドやエステル）、Ｎ−末端の修飾（例えばアセチル）、および天然に生じないアミノ酸の修飾（例えばノルロイシン）を含んでよく、そのような修飾がペプチド活性に及ぼす影響が評価される。
【００１３】
培養中の細胞増殖にプラスにもマイナスにも影響を及ぼすライブラリのペプチドを同定するには、このライブラリを増殖アッセイでスクリーニングする。選択した細胞を、まずペプチドが補われていない適切な培地で増殖させ、次いでライブラリペプチドのそれぞれを補った培地で継代培養する。スクリーニング培地は、選択した細胞タイプに合わせた複合培地でよいが、このスクリーニング培地は、培地中に存在する明らかにされていない材料に妨げられずにペプチドの影響を評価できるように、確定された培地であることが好ましい。ペプチドのスクリーニングの前に、細胞増殖のため基本培地を最適にすることも好ましいが、最適化されていない培地を使用することもできる。本発明では、アミノ酸に富みかつ必要なビタミン、金属、および簡単な炭素源を含有する基本培地において、ペプチドが存在しまたは存在しない状態でのウェルシュ菌の増殖を評価した。しかし、その他の細胞タイプの増殖スクリーニングに適切な培地の選択は、決まりきった作業であり当業者の範囲内である。適切なインキュベーション時間が過ぎた後、各ペプチドを補った培養の増殖を、補っていない培地での増殖と比較する。増殖の程度は、光学密度（ＯＤ６００）、ＣＯ２生成、Ｏ２消費、ＡＴＰ、蛍光、生物発光、培養皿上での手動または自動コロニー計数、および電場のインピーダンスを含めた通常使用される方法のいずれかを使用して評価することができる。スクリーニングは、標準的な培養またはマイクロタイタープレートフォーマットで行うことができる。
【００１４】
細胞生成物の生成にプラスまたはマイナスの影響を及ぼすライブラリのペプチドを同定することが望まれる場合、そのライブラリを、細胞生成物の検出に適切なアッセイでスクリーニングする。この場合も、まず選択した細胞を、ペプチドが補っていない適切な培地で増殖させ、次いでライブラリペプチドのそれぞれが補った培地で継代培養する。スクリーニング培地は、選択した細胞タイプに合わせた複合培地でよいが、このスクリーニング培地は、培地中に存在する明らかにされていない材料に妨げられずにペプチドの影響を評価できるように、確定された培地であることが好ましい。ペプチドのスクリーニングの前に、タンパク質発現のために基本培地を最適にすることも好ましいが、最適化されていない培地を使用することもできる。本発明の特定の目的は、ウェルシュ菌によるβ−トキシンの生成に影響を及ぼすペプチドを同定することである。この場合、細胞から分泌されたβ−トキシンを、２つのマウス抗β−トキシンモノクローナル抗体を使用してサンドイッチＥＬＩＳＡアッセイで定量し、その後、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）に結合されたヤギ抗マウスＩｇＧ２Ａで定量した。トキシンは、培養物を連続希釈して定量し、ペプチドが添加されていない培養物（基本培地培養物）によって生成されたトキシンと比較した。吸光度を４９２ｎｍで読み取り、Ｂ５０値（Ａ４９２シグナルが最大シグナルの５０％である希釈度）を計算し、２つの培養物の平均を得た。全総トキシン生成値を得るため、Ｂ５０値の逆数にＯＤ６００を掛けた。細胞１個あたりのトキシンは、トキシン／ＯＤとして表した。このようなＥＬＩＳＡアッセイフォーマットは、モノクローナル抗体またはその他の特定のバインダまたはリガンドを利用することができまたは発生させることができるその他の細胞生成物の検出に、容易に適合される。β−トキシンまたはその他の対象となる生成物を定量するには、ここに述べたサンドイッチＥＬＩＳＡアッセイに加えてその他の免疫アッセイフォーマットを使用することができる。これらのアッセイには、放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）、直接ＥＬＩＳＡ、その他の指示酵素を使用するＥＬＩＳＡ、蛍光レポーター分子を使用するＥＬＩＳＡ、および表面プラズモン共鳴検出を使用するようなフロースルーアッセイが含まれる。さらに、本発明では、β−トキシンに関するＥＬＩＳＡの結果をバイオアッセイで確認した。これは、免疫アッセイによって検出されたβ−トキシンのいかなる増加も機能性トキシンを表すことを確認するために行った。ペプチドが補った培養物からの上澄みを希釈し、各希釈液の０．２ｍＬをマウスに接種した。補っていない培地は、陰性対照としての役割をした。注射の２４時間後に死亡率を記録し、５０％の死亡率をもたらす最大希釈度を、生成されるβ−トキシンの量の尺度として使用した。
【００１５】
細胞増殖に影響を及ぼすいくつかのペプチドを、ＸＸＡＬライブラリの最初のスクリーニングで同定した。ＧＥＡＬ（配列番号１）はウェルシュ菌の増殖を約４０％増大させ、一方ＫＬＡＬ（配列番号２）は実質的に増殖を阻害した。配列番号２は増殖に対する阻害作用が大きいので、段階ＩＩの培養は１ＯＤ、すなわち段階ＩＩＩでの試験に進むための最小要件に到達しなかった。配列番号１と配列番号２の構成成分であるアミノ酸では、基本培地のみと比べた場合に増殖に著しい差が生じなかった。ＥＫＡＬ（配列番号３）も、未処理の形態（増殖が２倍向上）と精製された形態（増殖が３．５倍向上）の両方で増殖を著しく増大させた。ＥＳＡＬ（配列番号４）も、未処理の形態と精製された形態の両方で増殖を著しく増大させることがわかった。未処理の形態と精製された形態の両方で同様の結果が観察されたという事実は、ペプチドの処理中に入り込んだ少量の化学物質ではなくてペプチドそのものが影響を及ぼすことを示している。
【００１６】
ＸＸＡＬライブラリのペプチドに応答するトキシン生成を、１５時間増殖および２点ＥＬＩＳＡ値を使用して評価した。このライブラリの１００ペプチドのうち７５のペプチドについて、トキシンのデータを収集し、４量体１個あたりのレプリケートの数は１〜１４に及んだ。総トキシン比は、試験ペプチドを含有する培地に関して得られた総トキシンを、基本培地の総トキシンの値で割った商として計算した。ＶＮＡＬ（配列番号８）、ＳＮＡＬ（配列番号７）、ＤＫＡＬ（配列番号１４）、およびＮＤＡＬ（配列番号５）は、総トキシン比を増大させたことがわかった。ＬＳＡＬ（配列番号１５）は増殖に効果がなかったが、トキシン生成を著しく阻害した。
【００１７】
ＸＸＡＬにより多様性が限定されたライブラリを、選択した細胞タイプの増殖に最も良く機能する加水分解物のペプチドで認められる主要なＣ−末端に基づいて合理的に設計した。この概念は、様々な細胞に影響を及ぼすペプチドに関してスクリーニングされるその他のライブラリの設計にまで広げることができる。以下の表は、示した酵素または化学試薬により調製された加水分解物の存在下での培養を好む細胞の増殖に影響を及ぼす化合物に関してスクリーニングされるライブラリを構築するのに好ましい、ペプチドのＣ−および／またはＮ−末端を示す。
【００１８】
【表２】
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【００１９】
このように確定した、酵素または化学的な切断によって生成された多くのペプチド末端は当技術分野で知られており、本発明のライブラリおよびペプチドの生成に適合させることができる。当技術分野で知られているように、列挙された酵素のいくつか（例えばトリプシンやキモトリプシン、エンドプロテイナーゼＬｙｓ−Ｃ、リシルエンドプロテイナーゼ、Ｖ８プロテアーゼ）は、示されるアミノ酸にプロリンが付随する場合に阻害されることに留意されたい。
【００２０】
あるいは、クラスタ群を表す「Ｘ」アミノ酸を、テトラペプチドの全ての非Ｃ−末端位置に配置することによって（例えばＸＸＸＬライブラリ）、より多様性があってより大きいライブラリを構築することができる。あるいは、特定の群の全てのアミノ酸（群を表す単一のアミノ酸だけではなく）を、テトラペプチドの位置１および２に、または全ての非Ｃ−末端位置に配置することができる。可能なアミノ酸残基のいずれか１つを表すのに文字Ｚを使用する場合、そのようなライブラリは、例えばＺＺＡＬやＺＺＺＬと記述されると考えられる。上述のように、Ｃ−末端アミノ酸は、タンパク質の既知の酵素切断または化学的切断に関連付けられた残基のいずれかでよい。これらの概念は、５個以上のアミノ酸を含むペプチドのライブラリ、およびその他の酵素または化学物質による切断から得られる末端を含むペプチドのライブラリにもさらに広げることができ、スクリーニングのためにより大きくより多様性に富むペプチドライブラリさえも提供する。ライブラリはＸＸＡＬからＺＺＡＬまで発展するので、以下のペプチド、すなわちＮＤＡＬ（配列番号５）、ＮＮＡＬ（配列番号６）、ＳＮＡＬ（配列番号７）、およびＶＮＡＬ（配列番号８）は、細胞増殖を著しく増大させることがわかった。対照的に、ペプチドＫＫＡＬ（配列番号９）は細胞増殖を阻害した。
【００２１】
ペプチドＥＫＡＬ（配列番号３）およびＤＫＡＬ（配列番号１４）は、これら初めの２つのライブラリ設計の組合せによる生成物である。初めのＸＸＡＬライブラリに見出されるリードを使用して、アミノ酸基（Ｅ）の１メンバを同じ基（Ｄ）の別のメンバで単に置換することによりＺＺＡＬスペース中のリードを同定し、それによって、スクリーニングにかかる労力を軽減させた。Ｃ−末端はロイシンに固定されているので、どの化合物も、経済的なコンカテマー法によって急速に増大させることができた。
【００２２】
さらに、末端が固定されていない、多様性が最大のペンタペプチドライブラリを構築したが、このライブラリでは、アミノ酸配列の全ての順列を、単一のペンタペプチド配列によって表した。したがって、候補ペプチドの数を３２０万から４２，５０４に減少させることができた。次いでＣ、Ｒ、およびＷを含有する全ての配列を排除し、総セット数を２０，３４９に減少させた。これは、労力を非常に要する可能性がある合成であって新しいライブラリ手法の開発には必要ではない合成を回避するために行った。ライブラリ中の別のペプチドと同じ分子式を有する残りのどのペプチドも排除して、最終的に合計が１９，２４３の独自の構造が得られた。このライブラリのスクリーニングによって、以下の結果が得られた。ＦＥＦＶＧ（配列番号１６）は、総トキシン生成について試験されたペプチドの２番目に高い平均を有しており（８．７９）、その結果、複数回にわたって実験を繰り返した場合にも非常に高い再現性があることがわかった。配列番号１６についてさらに行われた統計的分析によれば、その総トキシン生成量の平均は、７よりも下の平均よりも統計的に著しく高いことが実証された。最適化された基本培地（加水分解物を含有しない、明らかにされた合成培地）では、配列番号１６は、最適化された基本培地のみの場合に比べて増殖を約４０％ほど増大させたが、その構成成分であるアミノ酸を培地（Ｆ、Ｅ、Ｖ、Ｇ）に添加すると、増殖は約１５％しか増大しなかった。配列番号１６は、２点ＥＬＩＳＡでの総トキシンが、最適化された基本培地のみの場合の総トキシン生成量よりも約２．２倍増大させたが、構成成分のアミノ酸を添加すると、その総トキシン生成量は基本培地のみの場合とほぼ同等になった。３．５％の加水分解物ブレンドを含有する商用培地では、配列番号１６は、細胞１個あたり生成されるトキシンの量が倍になるが、増殖を増大させないこともわかった。これが原因で、細胞の数をほとんどまたは全く増加させることなく培養によって生成される総トキシンをほぼ倍増させたのである。これは、追加の細胞集団を処理する必要なくトキシンを増加させることができるので、医薬品会社にとって特に望ましい。
【００２３】
総トキシン生成量の平均が最高である１０個の５量体は、ＦＳＬＬＥ（配列番号１７、８．８５５）、ＦＥＦＶＧ（配列番号１６、８．７８６６１１）、ＦＳＦＶＥ（配列番号１８、８．７２７）、ＮＥＹＬＹ（配列番号１９、８．６６５）、ＦＤＩＳＴ（配列番号２０、８．３９５）、ＮＬＴＥＬ（配列番号２１、８．３２１）、ＳＱＬＥＬ（配列番号２２、８．２８３７５）、ＥＴＬＮＬ（配列番号２３、８．２８）、ＮＱＬＥＶ（配列番号２４、７．８１）、およびＩＫＬＡＳ（配列番号２５、７．７４７５）であった。ＨＴＶＥＬ（配列番号２６）、ＱＮＤＶＹ（配列番号２７）、ＬＰＤＬＦ（配列番号２８）、ＤＴＨＨＩ（配列番号２９）、ＦＶＰＥＫ（配列番号３０）、ＧＹＰＥＶ（配列番号３１）、ＨＡＰＡＹ（配列番号３２）、ＳＮＧＩＹ（配列番号３３）、ＫＦＩＥＫ（配列番号３４）、ＭＨＡＰＰ（配列番号３５）、ＭＰＮＮＦ（配列番号３６）、ＰＥＬＭＥ（配列番号３７）、ＦＭＳＴＡ（配列番号３８）、ＶＮＶＱＡ（配列番号３９）、ＫＦＩＦＥ（配列番号４０）、ＰＬＦＥＱ（配列番号４１）、ＭＭＥＬＥ（配列番号４２）、ＡＬＦＨＥ（配列番号４３）、ＹＥＱＱＮ（配列番号４４）、ＧＧＭＰＧ（配列番号４５）、ＳＹＩＭＥ（配列番号４６）、およびＹＥＹＩＹ（配列番号４７）も細胞１個あたりのトキシンを平均以上に増加させ、これはＶＤＬＬＧ（配列番号４８）、ＤＭＬＱＴ（配列番号４９）、ＧＨＰＶＥ（配列番号５０）、ＮＥＧＬＧ（配列番号５１）、ＹＥＮＬＹ（配列番号５２）、ＫＰＬＤＶ（配列番号５３）、ＤＫＴＮＧ（配列番号５４）、ＥＫＡＬＥ（配列番号５５）、ＳＶＭＥＭ（配列番号５６）、ＬＡＤＴＦ（配列番号５７）、ＫＴＶＧＩ（配列番号５８）、ＥＳＬＱＭ（配列番号５９）、ＶＥＦＴＮ（配列番号６０）、ＥＬＳＰＨ（配列番号６１）、ＴＫＰＦＦ（配列番号６２）、ＬＳＦＩＥ（配列番号６３）、ＦＥＦＧＶ（配列番号６４）、ＧＤＹＶＳ（配列番号６５）、ＥＴＶＮＦ（配列番号６６）についても同様であった。ＶＨＶＹＱ（配列番号６７）およびＮＮＮＮＮ（配列番号６８）は、０．５％加水分解物培地で得られた平均を超えるトキシン生成量をもたらした。０．５％加水分解物培地でのＹＥＹＩＧ（配列番号６９）は、その総トキシン平均値が、３．５％加水分解物を単独で使用して得られた場合よりも２倍大きくなった。５量体ＡＧＫＡＨ（配列番号７０）、ＡＫＨＳＫ（配列番号７１）、ＡＴＮＫＫ（配列番号７２）、およびＡＤＰＫＤ（配列番号７３）も、増殖を著しく阻害した。
【００２４】
ＸＸＸＸライブラリスペースで同定されたペプチドも、ウェルシュ菌（Ｃ．  Ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）の増殖を阻害することがわかった。ＳＫＫＡ（配列番号１０）、ＫＧＬＫ（配列番号１１）、ＶＫＫＧ（配列番号１２）、およびＧＬＫＫ（配列番号１３）。
【００２５】
５量体ＦＥＦＶＧ（配列番号１６）を修飾して、６量体ＥＦＥＦＶＧ（配列番号７４）、ＮＦＥＦＶＧ（配列番号７５）、ＦＥＦＶＧＧ（配列番号７６）、ＦＥＦＶＧＥ（配列番号７７）、およびＦＥＦＶＧＹ（配列番号７８）を形成したが、これらの総トキシン値は、総トキシンの平均が３．８２である基本培地のみの場合に比べて６から９．７に及んでいた。
【００２６】
化学的に確定された培地での細胞増殖は、一般に、加水分解物をベースとした培地の場合よりも遅い。いくつかのペプチドは、化学的に確定された基本培地での増殖を、従来の加水分解物をベースとした培地での増殖に匹敵するほど十分に増大させることがわかった。これらのペプチドには、ＶＦＴＤＫ（配列番号：７９）、ＬＴＫＶＤ（配列番号：８０）、ＬＬＰＫＴ（配列番号：８１）、ＰＬＴＧＧ（配列番号：８２）、ＧＧＴＰＶ（配列番号：８３）、ＰＫＧＴＶ（配列番号：８４）、ＤＤＤＤＤ（配列番号：８５）、ＫＬＧＶＫ（配列番号：８６）、ＴＰＫＴＬ（配列番号：８７）、ＧＤＶＴＫ（配列番号：８８）、ＨＰＡＦＥ（配列番号：８９）、ＦＦＰＴＤ（配列番号：９０）、ＶＮＹＱＡ（配列番号：９１）およびＩＩＬＥＡ（配列番号：９２）が含まれ、これらは全て、その平均増殖値が４時間で４であった。化学的に確定されたスクリーニング培地単独では、４時間の増殖に関する平均は３．２ＯＤであった。ＥＳＡＬＤ（配列番号９３）も、基本培地上での増殖を増大させた。
【００２７】
所望の性質を有することが明らかにされたペプチドは、様々な方法により、商用としてまたは研究に使用するのに十分な量で生成することができる。ペプチドは、当技術分野で知られるように、化学的にまたは酵素の作用によって合成することができるが、ペプチドは、このペプチドをコードする組換え核酸を発現させる方法を使用して生成することがより好ましい。組換え生成では、選択したペプチド配列を、まず対応する核酸配列、すなわちペプチドのアミノ酸配列をコードする核酸配列に変換する。これは、引き続き翻訳されてペプチドを生成するＲＮＡ配列でよく、または、次いで後続のｍＲＮＡの翻訳と共にＤＮＡ配列の転写を可能にするプロモーターの制御下で発現ベクターにクローニングされるＤＮＡ配列でよい。所望のペプチドまたはタンパク質配列の組換え生成を行うためのそのような多くの方法は当業者に周知であり、本発明のスキルを実行することなく本発明のペプチドの生成に適用することができる。ペプチドは、必要に応じ、やはり当業者に周知の物理的、化学的、および親和性を利用した分離の標準的な方法を使用して精製することができる。
【００２８】
従来からの培地加水分解物中で、酵素作用によりまたは化学的にタンパク質を切断することによって生成されたＣ−末端およびＮ−末端に対応するＣ−末端またはＮ−末端を含むことは、本発明のペプチドの多くにとって特に有利な特徴である。これは、当技術分野で知られているようなコンカテマー構造を使用して典型的には細菌または酵母で行われるペプチドの組換え生成を容易にする。コンカテマーは、コード配列の何百ものコピーを含有することができる。酵素作用によりまたは化学的に切断されるＣ−末端またはＮ−末端を有する本発明のペプチドをコード化するコンカテマー核酸構成物は、都合のよい切断部位によって分離されたペプチドアミノ酸配列の繰返しサブユニットを含むポリペプチドを生成する。適切な酵素または化学手段を使用した切断によって、ペプチドモノマーが放出される。この製造手法は、所望のペプチドの収量を増加させ、製造コストを低下させる。発現後の処理は、コンカテマー構造物のクローニングによって自動的に生成される切断部位により単純化される。例えば、ペプチドＮＤＡＬ（配列番号５）は、ＸＸＡＬライブラリ手法を使用して迅速に発見され、ペプシンまたはエンドペプチダーゼＮ−ＡＳＮを使用する後続の切断と共にコンカテマー法を使用して効率的に製造することができる。増殖阻害剤ＫＫＡＬ（配列番号９）も、コンカテマー法およびペプシンによる切断を使用して製造することができた。ＦＳＦＶＥ（配列番号１８）は、コンカテマーとして発現し、Ｖ８プロテアーゼを使用して発現の後にモノマーに切断することができた。さらなる例として、ＨＴＶＥＬ（配列番号２６）およびＱＮＤＶＹ（配列番号２７）は共に、培養上澄み中のβトキシンの蓄積を増大させる。これらのペプチドは、同じコンカテマーミニジーンから発現し、ペプシンによってペプチドへと切断され、また共に同じ属性を示すのでさらに分離することなく使用することができた。このような組合せのミニジーンも、１つのペプチドが別のペプチドとのバランスをとるために必要とされるとき、有用と考えられる。例えば、塩基性の配列と酸性の配列を交互にすることによって、全ミニジーン生成物を宿主細胞と共存させることができる。組合せミニジーンはまた、異なる属性を示す複数のペプチドを同じ培地に配合するのに望ましいときに、有用な生成ビヒクルとなる場合がある。この場合、全ての必要なペプチドを、個々のペプチドを分離する必要なく単一の生成プロセスで発現し、処理し、配合することができる。ＦＥＦＶＧ（配列番号１６）は、各ペプチドコード配列の間のナンセンス配列スペーサと共にコンカテマーとしてクローニングして、コンカテマーから遊離させることができる。例えば、ナンセンスペプチドＤＥＥＰ（配列番号９４）のコード配列は、培地強化ペプチドをコードする配列の両側に位置し、コンカテマーをエンドプロテアーゼＡｓｐ−Ｎ（アスパラギン酸の前で切断する）およびプロリンエンドペプチダーゼ（プロリンの後で切断する）で切断することができる。この手法は複数の試薬を必要とし、細胞培養と相容性がない場合、スペーサを所望のペプチドから分離することが必要と考えられる。ナンセンススペーサも、コンカテマーのペプチドコード配列間で���用され、切断可能な部位を生成し、他の状況では切断可能ではないペプチド配列での処理を容易にすることができる。
【００２９】
本発明のペプチドの好ましい使用は、所望の効果を細胞にもたらす細胞培地（原核生物および真核生物、脊椎動物および無脊椎動物由来の細胞および組織を培養するための培地を含む）中である。そのような効果には、増殖速度の増減、細胞生成物の生成の増減、または環境中の物質（例えばホルモン）に対する応答の増減を含めることができる。ペプチドが添加される基本培地は、化学的に確定された培地か、またはウシ胎児血清（ＦＣＳ）や酵母加水分解物など確定されていない成分を含有する複合培地でよい。化学的に確定され、または半分確定された培地が好ましいが、それは、本発明のペプチドが、確定されていない培地成分に起因する性能のばらつきを小さくしまたは無くす手段として、また医薬品を製造するのに使用する培地中の動物由来の成分を減少させまたはなくす手段として、最も有利に使用されるからである。
【００３０】
選択されたペプチドは、一般に、約０．１〜２５ｍＭの濃度で、より好ましくは約１．０ｍＭから１２ｍＭの濃度で培地に添加される。しかし、選択された培地での本発明のペプチドの適切な濃度を決定することは、当業者の範囲内である。培地に複数のペプチドを添加して、相乗効果をもたらすことができ（共に同じ効果を細胞にもたらす場合）、または複数の効果をもたらすことができる（各ペプチドが異なる効果を細胞にもたらす場合）。
【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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