(57)【要約】【解決手段】本発明はビフィドバクテリウム由来の新規なプラスミド、これを利用した組換え発現ベクターおよび形質転換方法に関するものであり、配列番号１で表示される塩基配列を有するプラスミドｐＭＧ１と、前記プラスミドｐＭＧ１を含む菌株ビフィドバクテリウムロンガムＭＧ１（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ ＭＧ１）と、大腸菌およびビフィドバクテリウムで相互複製されて配列番号２で表示される塩基配列を有するＭｏｂ遺伝子、配列番号３で表示される塩基配列を有するＲｅｐ遺伝子および選別遺伝子を含むシャトルベクターに関するものである。本発明のシャトルベクターおよびプロモーターを利用すれば目的遺伝子を発現時に別の精製過程が必要ないし、ビフィドバクテリウム内で発現された目的遺伝子を直ちに食品に添加することができて食品添加物または経口用ワクチンの製造に使われることができる長所がある。また、このようなシャトルベクター開発を通じてビフィドバクテリウムを利用したプロバイオティックスの潜在力と可能性を画期的に高めることができる。
2004519236.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１で表示される塩基配列を有するプラスミドｐＭＧ１。
【請求項２】
請求項１のプラスミドを含む菌株ビフィドバクテリウムロンガムＭＧ１（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ ＭＧ１）（寄託番号ＫＣＣＭ−１０２５４）。
【請求項３】
大腸菌およびビフィドバクテリウムで相互複製されて配列番号２で表示される塩基配列を有するＭｏｂ遺伝子、配列番号３で表示される塩基配列を有するＲｅｐ遺伝子および選別遺伝子を含むシャトルベクター。
【請求項４】
前記シャトルベクターは第１項のプラスミドｐＭＧ１と大腸菌由来の形質転換用ベクターを利用して製造されることを特徴とする請求項３に記載のシャトルベクター。
【請求項５】
前記大腸菌由来の形質転換用ベクターがｐＥＫ１０４、ｐＵＣ１９およびｐＢＲ３２２でなされた群から選択されるいずれか一つであることを特徴とする請求項４に記載のシャトルベクター。
【請求項６】
請求項１のプラスミドｐＭＧ１とｐＥＫ１０４を利用して製造されたシャトルベクターｐＢＥＳ２。
【請求項７】
選別遺伝子はアンピシリン（ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ）抵抗性遺伝子、カナマイシン（ｋａｎａｍｙｃｉｎ）抵抗性遺伝子およびクロラムフェニコ−ルアセチルトランスフェラーゼ（ｃｈｌｏｒａｍｐｈｅｎｉｃｏｌ ａｃｅｔｙｌ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）遺伝子でなされた群から選択される一つ以上であることを特徴とする請求項３に記載のシャトルベクター。
【請求項８】
請求項３のシャトルベクターに目的蛋白質をコーディングする目的遺伝子を挿入した組換えベクター。
【請求項９】
前記目的遺伝子はアミラーゼ遺伝子、ワクチン遺伝子、坑癌遺伝子および多様な生理活性を示すことができる遺伝子でなされた群から選択されるいずれか一つであることを特徴とする請求項８に記載の組換えベクター。
【請求項１０】
請求項８のシャトルベクターに目的遺伝子でアミラーゼ遺伝子を挿入した組換えベクターｐＹＢａｍｙ５９。
【請求項１１】
請求項８の組換えベクターに形質転換された形質転換体。
【請求項１２】
請求項１０の組換えベクターｐＹＢａｍｙ５９に形質転換されたビフィドバクテリウムロンガムＭＧ１（寄託番号ＫＣＣＭ−１０２５５）。
【請求項１３】
ビフィドバクテリウム由来のプラスミドと大腸菌由来のプラスミドを利用してビフィドバクテリウムと大腸菌で相互複製されるシャトルベクターを製造する段階と、
前記シャトルベクターに目的蛋白質をコーディングする目的遺伝子を結合させて組換えベクターを製造する段階とを有し、
前記製造された組換えベクターに形質転換させるための宿主細胞として前記シャトルベクターの製造に利用されたビフィドバクテリウムを利用することを特徴とする形質転換方法。
【請求項１４】
配列番号４で表示される塩基配列を有するビフィドバクテリウムＧＥ６５（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ． ＧＥ６５）のプロモーター。
【請求項１５】
配列番号５で表示される塩基配列を有するビフィドバクテリウムＧＥ６５のプロモーター。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ビフィドバクテリウム由来の新規なプラスミド、これを利用した組換え発現ベクターおよび形質転換方法に関するものであり、配列番号１で表示される塩基配列を有するプラスミドｐＭＧ１と、前記プラスミドｐＭＧ１を含む菌株ビフィドバクテリウムロンガムＭＧ１（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ ＭＧ１）と、大腸菌およびビフィドバクテリウムで相互複製されて配列番号２で表示される塩基配列を有するＭｏｂ遺伝子、配列番号３で表示される塩基配列を有するＲｅｐ遺伝子および選別遺伝子を含むシャトルベクターに関するものである。
【０００２】
【従来の技術および課題】
人間の腸内にはいろいろな種類の微生物が繁殖しながら腸内の細菌叢を形成している。このような腸内の細菌叢の組成と活性は人間または動物の健康だけでなく栄養、生体機能、薬物の効率、癌化、老化、免疫反応、感染に対する抵抗性および身体に対する他のストレスにも広範囲に影響を及ぼす。腸内の細菌叢は５００ケ以上のお互い異なる細菌種を含んでおり、胃および上部の小腸には相対的に少ない数の細菌が存在し、細菌数は大腸にいくほど増加する。前述したように、腸内の細菌叢は人間の健康に明確な影響を与えており、腸内の細菌叢のうち特にビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）が最も重要なものとして知られている。このような事実はビフィドバクテリウムが出生以後に一生の間、人の大腸内に棲息することを観察することによって分かり、また、牛乳を飲む乳児より母乳を飲む乳児の方がビフィドバクテリウムの数がより多くて下痢疾患にかかる危険が低いこととして現れた。このようなビフィドバクテリウムの数は年を取ると急激に減少することがわかった。
【０００３】
一方、腸内の菌叢の分布状況は、年齢、人種、生活環境、食べ物の成分等の各種要因により変化している。特に、腸内の菌叢は一般的に食べ物の種類により大きい影響を受けて、健康で長生きする長寿者あるいは成人病の発病率が低い人々は、腸内の乳酸菌が他の人に比べてより多く存在すると報告されている。したがって、整腸効果を高揚させるための食べ物の重要性が認識されており、乳酸菌の摂取を通した整腸効果を得るために最近はヨーグルトを含む従来の乳製品に乳酸菌を添加した商品を開発する研究が活発化している。
【０００４】
このように最近、健康に対する関心が高まり、乳酸菌を健康食品および医薬品等に使用しようという多くの試みがなされてきたし、実際に多様な乳酸菌の食品および乳酸菌の医薬品が開発された。韓国で使われている乳酸菌らはすべて外国で開発されたものであり、韓国人の腸内に存在する菌株等とはその特性に差がある。また、韓国人の腸内のみに存在する乳酸菌はいままで開発されたどの乳酸菌より韓国人にさらに適合して高い生理活性を示すことができるものと予想される。したがって、韓国人に有用な韓国型の乳酸菌を分離して韓国人に適合した新しい乳酸菌食品および医薬品などを開発しようという試みがなされるようになった。
【０００５】
ビフィドバクテリウムはグラム陽性（Ｇｒａｍ ｐｏｓｉｔｉｖｅ）菌でＹ形状またはＶ形状であり、運動性がない嫌気性菌であり、胞子を形成しない発効菌である。伝統的にビフィドバクテリウムは乳酸菌に属するものとして分類されてきた。ビフィドバクテリウムの発効の主要産物はアセテートおよびラクテートであり、これらは３：２の割合で生産され、ＤＮＡのＧＣ含有率は５５〜６４％である。ビフィドバクテリウムは宿主菌に特異的であるものとして知られており、人においてはビフィダム（Ｂ． ｂｉｆｉｄｕｍ）、ロンガム（Ｂ． ｌｏｎｇｕｍ）、ブレベ菌（Ｂ． ｂｒｅｖｅ）、インファンティス菌（Ｂ． ｉｎｆａｎｔｉｓ）およびアドレスセンティス菌（Ｂ． ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓ）が発見されており、前記５種類の菌株はプロバイオティック（ｐｒｏｂｉｏｔｉｃｓ）として使われている。プロバイオティックとは人間や動物に生きている微生物を粉末または発効産物の形態で投与したとき、腸内微生物の望ましい均衡およびそれらの生理特性を増進させて宿主に有益な効果を示す微生物食品の強化剤を意味する（Ｆｕｌｌｅｒ， Ｒ．， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、６６：３６５−３７８、１９８９）。
【０００６】
いままで乳酸菌であるラクトバシラス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）およびラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）では多くのベクターシステムが開発されたし、遺伝子の改良による商品化が近い将来に実現できることとして展望されている。腸内への定着性がさらに優秀なものとして知らされたビフィドバクテリウムのベクターシステムの開発はまだ初歩段階にある。いままでビフィドバクテリウムの菌種類でプラスミドに対する研究はつぎの通りである。
【０００７】
まず、はじめには人から分離された菌のうちからロンガム（Ｂ． ｌｏｎｇｕｍ）のみにプラスミドが存在すると報告され、前記菌株から分離したプラスミドを大腸菌由来の形質転換用のベクターと連結したシャトルベクターが開発された。また、グラボサム（Ｂ． ｇｌｏｂｏｓｕｍ）、アステロイデス（Ｂ． ａｓｔｅｒｏｉｄｅｓ）、インディクム（Ｂ． ｉｎｄｉｃｕｍ）等にもプラスミドが存在するものとして報告されたし、前記プラスミドは電気泳動パターンまたはサザン混成化（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）などを通じて相同性によってグループに分けられた。また、他の菌株であるブレベ菌（Ｂ． ｂｒｅｖｅ）にもプラスミドが存在すると報告された場合がある（Ｓｇｏｒｂａｔｉ， Ｂ． ｅｔ ａｌ， Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａ．， ６：１６９−１７３、１９８３；Ｔａｎｎｏｃｋ，Ｇ． Ｗ． ｅｔ ａｌ．， Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２８：１２２５−１２２８、１９９０）。
【０００８】
ビフィドバクテリウムのプラスミドを利用したベクター開発は１９９０年代に入って報告され始めた。ロンガム（Ｂ． ｌｏｎｇｕｍ）Ｂ２５７７の１．９ｋｂのプラスミドｐＭＢ１を大腸菌ベクターにクローニングして制限酵素の地図が作成された。１９９４年にはｐＭＢ１を基本ベクターとして大腸菌とロンガム（Ｂ． ｌｏｎｇｕｍ）で相互複製されるシャトルベクターのｐＲＭ２が開発されたし、電気穿孔法（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）によりロンガム（Ｂ． ｌｏｎｇｕｍ）を形質転換（ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）するのに成功した。また、最近では前記ｐＭＢ１の全体の塩基配列が明るみに出た（Ｍａｔｅｕｚｚｉ， Ｄ．， ｅｔ ａｌ．， Ｌｅｔｔｅｒｓｉｎ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１１：２２０−２２３、１９９０；Ｍｉｓｓｉｃｈｉ， Ｒ．， ｅｔ ａｌ， Ｐｌａｓｍｉｄ，３２：２０８−２１１，１９９４；Ａｒｇｎａｍｉ、Ａ． ｅｔ ａｌ．， Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、１４２：１０９−１１４、１９９６）。ビフィドバクテリウムは厚い多層の細胞壁といろいろな種類のペプチドグリカン（ｐｅｐｔｉｄｏｇｌｙｃａｎ）、多糖類（ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）、リポタイコ酸（ｌｉｐｏｔｅｉｃｈｏｉｃ ａｃｉｄ）および蛋白質により構成された細胞壁を有しており、このような細胞壁の特性は外部ＤＮＡ分子を受け入れるのに障壁になってきた。ビフィドバクテリウムを形質転換させるために学問的または産業的な次元で多様な試みがなされたが成功したことがまれであるし、ロンガム（Ｂ． ｌｏｎｇｕｍ）を電気穿孔法により利用して低い効率であっても形質転換体を製造した研究が報告されたことがある（Ｍｉｓｓｉｃｈ， Ｒ． ｅｔ ａｌ．， Ｐｌａｓｍｉｄ，３２：２０８−２１１、１９９４）。
【０００９】
前記したようにして分離されたプラスミドｐＭＢ１を利用してシャトルベクターｐＮＣ７を製造したし、多様な種のビフィドバクテリウムに利用することができる形質転換方法を開発したし、その効率は菌によって１．０×１０１から１．２×１０５ＣＦＵ／μｇＤＮＡまで多様に現れた。前記形質転換方法においてアクティルライト（Ａｃｔｉｌｉｇｈｔ・Ｐ）を培地の糖源として使用したし、対数増殖期の初期に菌を回収してコンピテントセル（ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ ｃｅｌｌ）を製造したし、電気穿孔法の条件を１２．５ｋＶ／ｃｍ、１００Ω、２５μＦに調整して形質転換を遂行した。日本ではビフィドバクテリウムロンガム（Ｂ． ｌｏｎｇｕｍ）から分離された３．６ｋｂプラスミド（ｐＴＢ６、表１参考）を利用して大腸菌とビフィドバクテリウムで相互複製されるシャトルベクターを開発したことがある（Ｍａｔｓｕｍｍｕｒａ， Ｈ． ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｓｃｉ． Ｂｉｏｔｅｃｈ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， ６１（７）：１２１１−１２１２、１９９７）。
【００１０】
韓国では１９９４年に初めてビフィドバクテリウムでプラスミドを分離したし、サザン混成化（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）によっていくつかの相同グループに分類した（Ｈｙｕｎ−Ｓｅｏ ＪＵＮＧ等、韓国食品科学会の春季学術発表、１９９４；Ｊｕ−Ｈｕｎ ＬＥＥ等、韓国食品科学会の春季学術発表、１９９７）。これらのうち二つの菌株は各々エリスロマイシン（ｅｒｙｔｈｒｏｍｙｃｉｎ）およびテトラサイクリン（ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎ）に対して相対的に強い耐性を見せたし、プラスミドが消失されれば耐性も顕著に減少することを確認した。また、他の菌株であるビフィドバクテリウムロンガム（Ｂ． ｌｏｎｇｕｍ）ＫＪは二つの相互に異なるプラスミドであるｐＫＪ３６およびｐＫＪ５０（表１参照）を保有していた。これらを大腸菌由来の形質転換用のベクターにクローニングしてこれを基に二つのプラスミドに対する遺伝子地図を作成したし、全体の塩基配列を明らかにしてこれを比較分析した（Ｍｙｏｕｎｇ−Ｓｏｏ ＰＡＲＫ等、韓国産業微生物学会の秋季学術発表、１９９５、１９９６、１９９７）。その結果、二つのプラスミドは非常に類似の構造的特徴があり、グラム陽性およびグラム陰性の微生物等のプラスミドから発現されるＲｅｐ蛋白質およびＭｏｂ蛋白質とアミノ酸相同性を有するＯＲＦを含んでいることが分かった。前記それぞれのＯＲＦは翻訳／転（ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ／ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ）水準で発現されることが確認された。このような分析資料を基に大腸菌とビフィドバクテリウムとで相互複製されるシャトルベクターｐＢＫＪ５０Ｆ、ｐＢＫＪ５０ＲおよびｐＢＲｅｐＡを製造してビフィドバクテリウムを形質転換するのに使用した。
【００１１】
前述したビフィドバクテリウムのプラスミドを利用して開発されたベクターらはすべてが外来の抗生剤の耐性遺伝子を選別遺伝子（ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｍａｒｋｅｒ）として含有しており、これらを直接食品に使用できない短所がある。したがって、食品に安全に使用できる食品等級用のベクター（ｆｏｏｄ−ｇｒａｄｅ ｖｅｃｔｏｒ）の開発が要求されている。このために抗生剤の耐性遺伝子を除去して食品等級（ｆｏｏｄ ｇｒａｄｅ）として使用することができる選別遺伝子に代えるだけでなく外来遺伝子の発現を調節することができるプロモーター／オペレーター（ｐｒｏｍｏｔｅｒ／ｏｐｅｒａｔｏｒ）等を挿入することによって新しいシャトルベクターの開発が進行中にある。
【００１２】
下記表１にビフィドバクテリウムに含まれたプラスミドおよびこれから開発されたシャトルベクターを示した。
【００１３】
【表１】
2004519236.tif 000003
【００１４】
これに本発明者らは前記のような問題点を解決しながら目的遺伝子をビフィドバクテリウムで発現時に別の精製過程がなくても食品に添加することができる食品添加物または経口用ワクチンの製造に使われることができる、大腸菌およびビフィドバクテリウムで相互複製が可能でありながら目的遺伝子を発現させることができるシャトルベクターおよび前記目的遺伝子をビフィドバクテリウム内で強く発現させることができるプロモーターを開発することによって本発明を完成するようになった。
【００１５】
【課題を解決するための手段】
本発明は配列番号１で表示される塩基配列を有するプラスミドｐＭＧ１と前記プラスミドを含む菌株ビフィドバクテリウムロンガムＭＧ１（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ ＭＧ１）を提供する。
【００１６】
本発明の他の目的を達成するために、本発明は大腸菌およびビフィドバクテリウムで相互複製されて配列番号２で表示される塩基配列を有するＭｏｂ遺伝子、配列番号３で表示される塩基配列を有するＲｅｐ遺伝子および選別遺伝子を含むシャトルベクターを提供する。
【００１７】
本発明によるシャトルベクターにおいて、前記シャトルベクターはプラスミドｐＭＧ１と大腸菌由来の形質転換用ベクターを利用して製造されることが望ましい。前記大腸菌由来の形質転換用ベクターは具体的にｐＥＫ１０４（高麗大学校生命工学院の遺伝生化学実験室、Ｈｙｏｕ−Ｉｌ ＪＡＮＧ教授から譲渡を受ける）、ｐＵＣ１９（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）およびｐＢＲ３２２（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）でなされた群から選択されるいずれか一つであることが望ましい。具体的に、本発明ではプラスミドｐＭＧ１とｐＥＫ１０４を利用して製造されたシャトルベクターｐＢＥＳ２を提供する。
【００１８】
また、本発明によるシャトルベクターにおいて、選別遺伝子はアンピシリン（ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ）抵抗性の遺伝子、カナマイシン（ｋａｎａｍｙｃｉｎ）抵抗性の遺伝子およびクロラムフェニコ−ルアセチルトランスフェラーゼ（ｃｈｌｏｒａｍｐｈｅｎｉｃｏｌ ａｃｅｔｙｌ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）遺伝子でなされた群から選択されるひとつ以上であることが望ましい。
【００１９】
本発明のまた他の目的を達成するために、本発明はシャトルベクターｐＢＥＳ２に目的蛋白質をコーディングする目的遺伝子を挿入した組換えベクターを提供する。
【００２０】
本発明のまた他の目的を達成するために、本発明はビフィドバクテリウム由来のプラスミドと大腸菌由来のプラスミドとを利用してビフィドバクテリウムと大腸菌で相互複製されるシャトルベクターを製造する段階と、前記シャトルベクターに目的蛋白質をコーディングする目的遺伝子を結合させて組換えベクターを製造する段階とを有し、前記製造された組換えベクターに形質転換させるための宿主細胞として前記シャトルベクターの製造に利用されたビフィドバクテリウムを利用することを特徴とする形質転換方法を提供する。
【００２１】
本発明のまた他の目的を達成するために、本発明は配列番号４または配列番号５で表示される塩基配列を有するビフィドバクテリウムＧＥ６５（Ｂｉｆｉｄｏｂａｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．ＧＥ６５）のプロモーターを提供する。
【００２２】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００２３】
まず、本発明は配列番号１で表示される塩基配列を有するプラスミドｐＭＧ１と前記プラスミドｐＭＧ１を含む菌株ビフィドバクテリウムロンガムＧ１（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ ＭＧ１）を提供する。本発明者らは韓国人の腸内に棲息している新しい乳酸菌を分離するために、人の糞便から公知の乳酸菌分離方法によって新しくて新規なプラスミドと菌株を分離した。
【００２４】
ビフィドバクテリウムは宿主菌に特異的なものとして知られていたし、人からはビフィダム（Ｂ． ｂｉｆｉｄｕｍ）、ロンガム（Ｂ． ｌｏｎｇｕｍ）、ブレベ菌（Ｂ． ｂｒｅｖｅ）、インファンティス菌（Ｂ． ｉｎｆａｎｔｉｓ）およびアドレスセンティス菌（Ｂ． ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓ）が発見されている。本発明者らは人の糞便から以前に発見されなかったビフィドバクテリウムロンガム新菌株を分離し、前記ビフィドバクテリウムロンガム新菌株から新規プラスミドを分離した。そして、本発明者らは前記ビフィドバクテリウムロンガム新菌株をビフィドバクテリウムロンガムＭ１と、前記新規プラスミドをｐＭＧ１と命名した。前記プラスミドｐＭＧ１を含むビフィドバクテリウムロンガムＭＧ１は２００１年３月２８日付で韓国微生物保存センターに寄託番号ＫＣＣＭ−１０２５４で寄託された。
【００２５】
本発明により新規に分離したビフィドバクテリウムロンガムＭＧ１はグラム染色およびビフィドス菌の固有酵素のＦ６ＰＰＫ（ｆｒｕｃｔｏｓｅ ６ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｐｈｏｓｐｈｏ ｋｅｔｏｌａｓｅ）検査を遂行して同定されて、その結果、形態学的には棍棒状やＹ字形等の特徴があり、グラム染色結果グラム陽性菌であり、Ｋ６ＰＰＫ活性を示すビフィドス菌であることが確認された。
【００２６】
本発明により分離したプラスミドｐＭＧ１は、その大きさが３，６８２ｂｐであり、Ｇ＋Ｃ含有量は６５．１％であった。塩基配列をＤＮＡＳＩＳ（Ｈｉｔａｃｈｉ）で分析した結果、発現が予想されるＯＲＦｓ（ｏｐｅｎ ｒｅａｄｉｎｇ ｆｒａｍｅｓ）があったし、このうち他の蛋白質のアミノ酸配列と相同性が高い配列を各々ＯＲＦＩおよびＯＲＦＩＩと命名した。ＯＲＦＩは分子量が２９，０００Ｄａでいろいろな種類のグラム陰性またはグラム陽性細菌の複製蛋白質（ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ）と高い相同性を示したし、その上部（ｕｐｓｔｒｅａｍ）には２２ｂｐ単位で四回反復されるイテロン（ｉｔｅｒｏｎ）として知られている塩基配列が存在する。ＯＲＦＩＩは分子量が７１，０００Ｄａで他の細菌等の移動蛋白質（ｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ）と高い配列相同性を示したし、その上部には接合（ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ）に重要な役割をするものとして推定されるｏｒｉ−Ｔ塩基配列が存在する。また、各ＯＲＦの１０−１５ｂｐの上部にリボソーム結合部位（ｒｉｂｏｓｏｍｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅ）と予想されるＡＧＧＡ配列が存在し、ＯＲＦＩの上部には２２ｂｐの塩基配列が四回反復的に現れるイテロン（ｉｔｅｒｏｎ）構造が存在し、このような構造はプラスミドの複製を調節する構造として知られている。合わせて、ＯＲＦＩＩの上部には１２ｂｐでなされたｏｒｉ−Ｔ構造が存在しており、この構造は接合によりプラスミドの転移が生じる基点として知られている。
【００２７】
本発明の他の目的を達成するために、本発明は大腸菌およびビフィドバクテリウムで相互複製されて配列番号２で表示される塩基配列を有するＭｏｂ遺伝子、配列番号３で表示される塩基配列を有するＲｅｐ遺伝子および選別遺伝子を含むシャトルベクターを提供する。
【００２８】
従来の形質転換宿主細胞として主に使われる大腸菌で目的蛋白質を発現させ、これを食品添加物または経口用ワクチンとして使用するためには、大腸菌蛋白質の毒性などを除去するための別の精製過程が必要であるために、人に毒性を示さないビフィドバクテリウムを宿主細胞として使用しようという研究が進行されてきた。また、ビフィドバクテリウムのプラスミドを利用して開発されたベクターらはすべて外来の抗生剤の耐性遺伝子を選別遺伝子（ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｍａｒｋｅｒ）として含有していて、これらを直接食品に使用することができなかった。
【００２９】
本発明は、このような問題点を解決して食品に安全に使用することができる食品等級用ベクター（ｆｏｏｄ−ｇｒａｄｅ ｖｅｃｔｏｒ）を提供することに特徴がある。
【００３０】
具体的に、本発明は大腸菌およびビフィドバクテリウムで相互複製されて配列番号２で表示されるＭｏｂ遺伝子、配列番号３で表示されるＲｅｐ遺伝子および選別遺伝子を含むシャトルベクターｐＢＥＳ２を提供する。シャトルベクターｐＢＥＳ２の概略的な開裂地図（ｃｌｅａｖａｇｅ ｍａｐ）と製造過程が図２に示されている。本発明によるシャトルベクターｐＢＥＳ２は３０回程度の細胞分裂後にも細胞のなかで維持される高い安全性を見せた。
【００３１】
本発明によるシャトルベクターはｐＭＧ１と大腸菌由来の形質転換用ベクターを利用して製造することができ、前記大腸菌由来の形質転換用ベクターは具体的にｐＥＫ１０４、ｐＵＣ１９（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）およびｐＢＲ３２２（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）でなされた群から選択されるいずれか一つのものが望ましい。具体的に、本発明においては、プラスミドｐＭＧ１とｐＥＫ１０４を利用してシャトルベクターｐＢＥＳ２を製造した。
【００３２】
シャトルベクターに含まれる選別遺伝子としてはアンピシリン（ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ）抵抗性遺伝子、カナマイシン（ｋａｎａｍｙｃｉｎ）抵抗性遺伝子およびクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ｃｈｌｏｒａｍｐｈｅｎｉｃｏｌ ａｃｅｔｙｌ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）遺伝子からなる群から選択される一つ以上のものが望ましい。具体的に、本発明ではアンピシリン抵抗性遺伝子およびクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子を使用した。
【００３３】
本発明のまた他の目的を達成するために、本発明はシャトルベクターｐＢＥＳ２に目的蛋白質をコーディングする目的遺伝子を挿入した組換えベクターを提供する。
【００３４】
前記目的遺伝子はアミラーゼ遺伝子、ワクチン遺伝子、坑癌遺伝子および多様な生理活性を示すことができる遺伝子からなる群から選択されるいずれか一つであるものが望ましい。具体的に、本発明ではシャトルベクターｐＢＥＳ２に目的遺伝子でアミラーゼ遺伝子を挿入した組換えベクターｐＹＢａｍｙ５９を製造した。組換えベクターｐＹＢａｍｙ５９は大きさが１０．１ｋｂであり、その概略的な開裂地図と製造過程が図３に示されている。
【００３５】
本発明のまた他の目的を達成するために、本発明者らは形質転換の新しい方法としてシャトルベクターを製造するために使用したプラスミドを分離したビフィドバクテリウムを目的遺伝子が挿入された組換えベクターに形質転換することによって形質転換体が目的遺伝子を高い効率で発現させることができることを提示した。
【００３６】
前記形質転換方法を具体的に説明する。
【００３７】
まず、ビフィドバクテリウム由来のプラスミドと大腸菌由来のプラスミドを利用してビフィドバクテリウムと大腸菌で相互複製されるシャトルベクターを製造する。その後に、前記シャトルベクターに目的蛋白質をコーディングする目的遺伝子を結合させて組換えベクターを製造する。組換えベクターを製造する方法としては、本技術分野において一般的に知らされた公知の方法を使用することができる。
【００３８】
前記組換えベクターに形質転換させるための宿主細胞として前記シャトルベクターの製造に利用されたビフィドバクテリウムを利用することに本方法の特徴がある。
【００３９】
このように組換えベクターに形質転換させるための宿主細胞として組換えベクターの製造に利用されたシャトルベクターが由来された元来のビフィドバクテリウムを利用することによって形質転換効率を大きく向上させることができた。具体的に、本発明では組換えベクターの製造に利用されたシャトルベクターが由来されたビフィドバクテリウムにコンピテント（ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ）セルを製造すると同時に、形質転換時にオキシレイズ（ｏｘｙｒａｓｅ）酵素を処理することによって形質転換効率を１０倍以上増加させることができた。
【００４０】
本発明による組換えベクターｐＹＢａｍｙ５９に形質転換されたビフィドバクテリウムロンガムＭＧ１は２００１年３月２８日付で韓国微生物保存センターに寄託番号ＫＣＣＭ−１０２５５で寄託された。
【００４１】
本発明のまた他の目的を達成するために、本発明は配列番号４または配列番号５で表示される塩基配列を有するビフィドバクテリウムＧＥ６５ （Ｂｉｆｉｄｏｂａｔｅｒｉｕｍ ｓｐ． ＧＥ６５）のプロモーターを提供する。ビフィドバクテリウム内で目的遺伝子の発現効率をさらに増加させるためにビフィドバクテリウムＧＥ６５から活性が強いプロモーター（ｐｒｏｍｏｔｅｒ）を分離するようになった。
【００４２】
前記活性が強いプロモーターを分離することができる菌株としては、ビフィドバクテリウムＧＥ６５、ビフィドバクテリウムロンガムＭＧ１、ビフィドバクテリウムアドレスセンティスＩＮＴ５７およびビフィドバクテリウムロンガムＡＴＣＣ１５７０７を使用することが望ましく、本発明においては、ビフィドバクテリウムＧＥ６５を使用して配列番号４および５で表示されるプロモーターを分離した。
【００４３】
ビフィドバクテリウムのプロモーターをスクリーニングする方法としては当業界で知らされた通常の方法が利用できるが、具体的に、本発明においてはリポーター遺伝子として使われているｇｆｐ遺伝子を利用してスクリーニングした。
【００４４】
プロモーターと結合するプロモーター探針ベクター（ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｐｒｏｂｅ ｖｅｃｔｏｒ）を製造した後、前記プロモーター探針ベクターを利用して大腸菌ＤＨ５αでＧＦＰを発現するプロモーターが挿入されているベクターｐｂｉｆＧＦＰ１、２、４、５、６、７および１０を各々分離したし、これらのうちプロモーター活性が相対的に強い配列番号４で表示される ＰＧ７プロモーターを含むベクターｐｂｉｆＧＦＰ７および配列番号５で表示される ＰＧ１０を含むベクターｐｂｉｆＧＦＰ１０を得た。図４にプロモーター探針ベクターの概略的な製造過程とベクターｐｂｉｆＧＦＰ７またはｐｂｉｆＧＦＰ１０の概略的な開裂地図が示されている。前記ベクターｐｂｉｆＧＦＰ７またはｐｂｉｆＧＦＰ１０を含む大腸菌のＧＦＰ発現はＵＶ波長を照射して緑色蛍光を確認することによって選別することができる。具体的に、前記ベクターｐｂｉｆＧＦＰ７またはｐｂｉｆＧＦＰ１０と本発明によるシャトルベクターｐＢＥＳ２を組換えして本発明によるプロモーター ＰＧ７または ＰＧ１０で目的遺伝子のアミラーゼを発現させることができるベクターｐＹＢＧＦＰ７またはｐＹＢＧＦＰ１０を製造した。前記ベクターｐＹＢＧＦＰ７またはｐＹＢＧＦＰ１０の概略的な開裂地図が図５に示されている。
【００４５】
前述したように大腸菌およびビフィドバクテリウムで相互複製されるシャトルベクターに目的遺伝子を挿入して組換え蛋白質を製造し、前記組換えベクターをビフィドバクテリウムで発現させることによって、目的遺伝子の発現時に、別の精製過程がなくても食品に添加することができる食品添加物または経口用ワクチンの製造に使用することができる。また、本発明においては従来に開発された大腸菌およびビフィドバクテリウムで相互複製されるシャトルベクターを利用してビフィドバクテリウムを形質転換させて目的遺伝子を発現させるとき、形質転換効率が非常に低いながら目的遺伝子がよく発現されない問題点を解決することによって前記アミラーゼ遺伝子を高い効率で発現させることができた。具体的に、本発明においてはシャトルベクターｐＢＥＳ２の製造時に使用したプラスミドｐＭＧ１を分離したビフィドバクテリウムロンガムＭＧ１をアミラーゼ遺伝子を挿入した組換えベクターｐＹＢａｍｙ５９に形質転換させることによって形質転換体が澱粉を分解することを確認した。
【００４６】
【実施例】
以下、本発明を実施例によってより詳細に説明する。
【００４７】
ただし、下記実施例は本発明を例示するものであり、本発明の内容がこれに限定されることはない。
【００４８】
＜実施例１＞
ビフィドバクテリウムロンガムＭＧ１の分離および培養
本発明者らは韓国人の大腸に棲息する新しい乳酸菌の菌株を分離するために本発明者らが開発したＴＰ培地を使用して菌株を分離した（韓国特許出願第１３５，７８０号）。前記ＴＰ培地は、１０ｇトリプティケース（ｔｒｙｐｔｉｃａｓｅ）、３．５ｇプロテオースペプトンＮｏ．３、３ｇ硫酸アンモニウム （ａｍｍｏｎｉｕｍ ｓｕｌｆａｔｅ）、２ｇＫＨ２ＰＯ４、１ｇＫ２ＨＰＯ４、０．５ｇシステイン・ＨＣｌ（Ｌ−ｃｙｓｔｅｉｎ・ＨＣｌ・Ｈ２Ｏ）、０．２ｇＭｇＳＯ４、１５ｇ寒天（ａｇａｒ）、５０ｍｌトランスガラクトオリゴサカライド （ｔｒａｎｓｇａｌａｃｔｏｏｌｏｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）および５０ｍｌ０％ナトリウムプロピオナート（ｓｏｄｉｕｍ ｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ）により構成されており、ｐＨを７．０に調整して使用した。
【００４９】
人の糞便を０．８５％ＮａＣｌにより構成された希釈液で１０−８ないし１０−９に希釈した後ＴＰ培地に塗抹し、その後に嫌気性培養器（ＤＩＦＣＯ）で３７℃、４８時間の間培養して単一コロニーを分離した。前記単一コロニーを顕微鏡でその形態学的な特徴を分析して、グラム染色およびビフィドス菌の固有酵素のＦ６ＰＰＫ（ｆｒｕｃｔｏｓｅ ６ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｐｈｏｓｐｈｏｋｅｔｏｌａｓｅ）検査を遂行して菌株を同定した。その結果、形態学的には棍棒状やＹ字形の特徴があり、グラム染色結果グラム陽性菌であり、Ｋ６ＰＰＫ活性を示すビフィドス菌であることを確認した。また、分離された菌株のうちプラスミドを含有した菌株のみを分離したし、１６Ｓ ｒＤＮＡ塩基配列分析を通じてビフィドバクテリウムロンガムＭＧ１（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ ＭＧ１）で同定された。
【００５０】
このように分離された菌株を０．０５％システイン・ＨＣｌ（Ｌ−ｃｙｓｔｅｉｎｅ・ＨＣｌ・Ｈ２Ｏ）が含まれたＢＨＩまたはＭＲＳ培地を利用して保管または培養した。ＢＨＩ培地は３７ｇ ＢＨＩ（Ｄｉｆｃｏ）、０．０１ｇヘミン（Ｈｅｍｉｎ）、０．０５ｇシステイン塩酸、０．００１ｇレザズリン（ｒｅｓａｚｕｒｉｎ）および０．００１ｇビタミンＫでなされている。また、ＭＲＳ培地は１８．５ｇグルコース（ｇｌｕｃｏｓｅ）、１０ｇパンクレアチンで分解したゼラチン、８ｇビーフ抽出物（ｂｅｅｆ ｅｘｔｒａｃｔ）、４ｇイースト抽出物（ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ）、３ｇナトリウムアセテート（ｓｏｄｉｕｍ ａｃｅｔａｔｅ）、２ｇＫ２ＨＰＯ４、２ｇアンモニウムシーツレート（ａｍｍｏｎｉｕｍ ｃｉｔｒａｔｅ）、１ｇポリソルベート（ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ）８０、０．２ｇＭｇＳＯ４、０．０５ｇ ＭｎＳＯ４および０．５ｇシステイン塩酸でなされている。
【００５１】
＜実施例２＞
ビフィドバクテリウムロンガムＭＧ１からｐＭＧ１の分離および分析
＜２−１＞ビフィドバクテリウムロンガムＭＧ１からｐＭＧ１の分離
前記実施例１で分離・同定されたビフィドバクテリウムロンガムＭＧ１から朴等の方法（Ｍ． Ｓ． ＰＡＲＫ， ｅｔ ａｌ．， Ｌｅｔｔｅｒｓ ｉｎ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、２５：５−７、１９９７）を利用して配列番号１で表示されるプラスミドｐＭＧ１を分離した。
【００５２】
ビフィドバクテリウムロンガムＭＧ１を０．０５％システイン・ＨＣｌを含む１５−２０ｍｌのＭＲＳ培地を利用して３７℃で嫌忌的に培養した。遠心分離して菌体を回収した後、再び３０ｍＭＴｒｉｓ・ＨＣｌ、５０ｍＭＮａＣｌ、５ｍＭＥＤＴＡで構成されたＴＥＳ（ｐＨ８．０）溶液で２回洗浄した。上等液を捨てた後４０ｍｇ／ｍｌのリゾチーム（ｌｙｓｏｚｙｍｅ）を含む５％スクロース（Ｓｕｃｒｏｓｅ）、５０ｍＭＴｒｉｓ・ＨＣｌ、１ｍＭＥＤＴＡを含む２００μｌのスクロース溶液（ｐＨ８．０）を添加して３７℃で１時間の間反応した。ここに３％ＳＤＳ、０．２ＮＮａＯＨを含む４００μｌのアルカラインＳＤＳ溶液を添加した後、直ちに１５，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離した。上に浮く（ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ）液を新しいチューブに移して、ここに６５０μｌのイソプロパノール（ｉｓｏｐｒｏｐａｎｏｌ）を添加してよく混合した。この後、１５，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離して上等液を除去して３２０μｌの滅菌水に溶かした。ここに２００μｌの０．５ｍｇ／ｍｌ ＥｔＢｒを含む７．５Ｍアンモニウムアセテート（ａｍｍｏｎｉｕｍ ａｃｅｔａｔｅ）および３５０μｌのフェノール／クロロホルム（ｐｈｅｎｏｌ／ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ）を添加した。ボールテキシング（ｖｏｒｔｅｘｉｎｇ）した後、上に浮く液を新しいチューブに移した後エタンオールで沈殿して精製した。
【００５３】
＜２−２＞ビフィドバクテリウムロンガムＭＧ１のｐＭＧ１の分析
前記実施例２−１で分離したプラスミドｐＭＧ１を制限酵素ＰｖｕＩＩ、ＨｉｎｃＩＩ、ＰｓｔＩ、ＮｃｏＩおよびＳｍａＩで処理して制限酵素地図を作成し、その結果を図１に示した。また、ｐＭＧ１の全体塩基配列を決定するために、ｐＭＧ１をＰｖｕＩＩで処理して、大腸菌ベクターｐＵＣ１９（ＣｌｏｎＴｅｃｈ）のＨｉｎｃＩＩ位置に挿入してｐＢＥＳ１を製造した。ｐＢＥＳ１をエキソヌクレアーゼＩＩＩ（ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ ＩＩＩ）で処理して結実突然変異プラスミドらを得た後これらを各々公知の方法でシーケンシング（ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）して塩基配列を決定した。
【００５４】
その結果、ｐＭＧ１の大きさは３，６８２ｂｐでありＧ＋Ｃ含有量は６５．１％だけ現れた。塩基配列をＤＮＡＳＩＳ（Ｈｉｔａｃｈ）で分析した結果、発現が予想されるＯＲＦｓ（ｏｐｅｎ ｒｅａｄｉｎｇ ｆｒａｍｅｓ）があったし、このうち他の蛋白質のアミノ酸配列と相同性が高い配列を各々ＯＲＦ ＩおよびＯＲＦ ＩＩと命名した。ＯＲＦ Ｉは分子量が２９，０００Ｄａでいろいろな種類のグラム陰性またはグラム陽性細菌の複製蛋白質（ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ）と高い相同性を示したし、その上部（ｕｐｓｔｒｅａｍ）には２２ｂｐ単位で四回反復されるイテロン（ｉｔｅｒｏｎ）として知られた塩基配列が存在する。ＯＲＦ ＩＩは分子量が７１，０００Ｄａで他の細菌等の移動蛋白質（ｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ）と高い配列相同性を示したし、その上部には接合（ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ）に重要な役割をするものとして推定されるｏｒｉ−Ｔ塩基配列が存在する。また、前記ＯＲＦ ＩおよびＯＲＦ ＩＩの細胞内の発現を調べるためにＲＴ−ＰＣＲ方法でＯＲＦ ＩおよびＯＲＦ ＩＩを増幅した結果各々７５０ｂｐおよび６００ｂｐの反応産物を確認した。
【００５５】
また、各ＯＲＦの１０−１５ｂｐの上部にリボソーム結合部位（ｒｉｂｏｓｏｍｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅ）で予想されるＡＧＧＡ配列が存在し、ＯＲＦ Ｉの上部には２２ｂｐの塩基配列が四回反復的に現れるイテロン（ｉｔｅｒｏｎ）構造が存在してこのような構造はプラスミドの複製を調節する構造として知られている。また、ＯＲＦ ＩＩの上部には１２ｂｐでなされたｏｒｉ−Ｔ構造が存在してこの構造は接合によりプラスミドの転移が生じる基点として知られている。
【００５６】
＜実施例３＞
シャトルベクターｐＢＥＳ２の製造
大腸菌およびビフィドバクテリウムで相互複製されるシャトルベクターを製造するために、ｐＵＣ１９（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）にスターピローココス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）由来のクロラムフェニコ−ルアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子を有したｐＥＫ１０４を制限酵素ＰｓｔＩで切断した後、同一の制限酵素で切断した前記実施例２−１で分離したｐＭＧ１と連結してシャトルベクターｐＢＥＳ２を製造した。図６に前記ｐＥＫ１０４ベクターの概略的な開裂地図が示されている。図２に示したように、シャトルベクターｐＢＥＳ２はｐＭＧ１で由来した配列番号２で表示される塩基配列を有するＭｏｂ遺伝子、配列番号３で表示される塩基配列を有するＲｅｐ遺伝子およびｐＥＫ１０４で由来したアンピシリン抵抗性遺伝子、ＣＡＴ遺伝子を含んでおり、その大きさは７．８ｋｂである。前記シャトルベクターは３０回程度の細胞分裂後にも細胞内で維持される高い安全性を見せた。
【００５７】
＜実施例４＞
組換えベクターの製造および発現
前記実施例３で製造されたシャトルベクターｐＢＥＳ２に目的遺伝子を挿入して本実施例で使用した形質転換方法を利用して組換えベクターを製造した。
【００５８】
＜４−１＞組換えベクターの製造
ビフィドバクテリウムロンガムＭＧ１で発現させる組換えベクターを製造するために、ビフィドバクテリウムアドレスセンティス菌（Ｂ． ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓ）Ｉｎｔ５７由来のアミラーゼ遺伝子を含んでいるｐＢＢ３（Ｓｕｎｇ−Ｙｏｕｎｇ ＨＯＮＧ、１９９１、高麗大学修士学位論文）をＸｂａＩ、ＢａｍＨＩで各々切断した。切断した前記ベクターに同一の制限酵素で切断された前記実施例３で製造したシャトルベクターｐＢＥＳ２を連結することによって組換えベクターｐＹＢａｍｙ５９を構築した。組換えベクターｐＹＢａｍｙ５９の概略的な開裂地図と製造過程が図３に示されている。前記組換えベクターで大腸菌ＤＨ５α（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）を電気穿孔法で形質転換した。前記形質転換体から発現されるアミラーゼ活性を調べるために、形質転換体を１％澱粉および２０μｇ／ｍｌクロラムフェニコ−ルが入っているＬＢプレートに塗抹して３７℃で２４時間の間培養した。プレート上のコロニーにルゴール溶液（０．５％ Ｉ２、５％ ＫＩ；ｗ／ｖ）を入れてコロニー周囲に透明環が生じることを確認することによってアミラーゼ活性を確認した。また、前記大腸菌形質転換体をＬＢ培地で培養し、ｐＹＢａｍｙ５９を公知のプラスミド分離方法によって分離して１．０−１．５μｇ／μｌで濃縮させた後、ビフィドバクテリウムを形質転換するのに使用した。
【００５９】
＜４−２＞シャトルベクターを利用したビフィドバクテリウムロンガムの形質転換
実施例１で分離したビフィドバクテリウムロンガムＭＧ１を０．０５％システイン・塩酸（ｃｙｃｔｅｉｎ・ＨＣｌ）、０．５Ｍスクロース（ｓｕｃｒｏｓｅ）が含まれたＭＲＳ培地に接種して３７℃で嫌気性条件で夜通し培養をした。前記と同一造成の培地２５０ｍｌに種培養液を接種して６００ｎｍでの吸光度値が０．２になる時まで培養した。前記培養液を６，０００ｒｐｍで１０分間４℃で遠心分離して菌を回収して回収された菌を冷たい０．５Ｍスクロース溶液で懸濁した。このように遠心分離と懸濁を２回反復してコンピテントセル（ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ ｃｅｌｌ）を製造した。
【００６０】
前述したようにして製造されたコンピテントセルをシャトルベクターｐＢＥＳ２で電気穿孔法（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）を利用して形質転換し、このときオキシレイズ（ｏｘｙｒａｓｅ）酵素を処理することによって形質転換効率を１０倍以上増加させることができた。
【００６１】
＜４−３＞組換えベクターの発現
前記実施例４−１で大腸菌から増幅したｐＹＢａｍｙ５９でビフィドバクテリウムロンガムＭＧ１およびビフィドバクテリウムロンガムＫＪを電気穿孔法に形質転換した。前記形質転換体を１％の澱粉および４μｇ／ｍｌクロラムフェニコ−ルを含むＢＨＩ培地で３７℃で４８時間の間培養した後、実施例４−１と同一の方法でアミラーゼ活性を確認した。その結果本発明で製造した組換えベクターｐＹＢａｍｙ５９でビフィドバクテリウムが形質転換されたことを確認しただけでなく、アミラーゼがビフィドバクテリウム内で高い効率で発現されることを確認することができた。
【００６２】
＜実施例５＞
ビフィドバクテリウムＧＥ６５のプロモーター分離および発現
ビフィドバクテリウム内で目的遺伝子をより効果的に発現させるためにビフィドバクテリウムのプロモーターを分離してその発現程度を調べた。
【００６３】
＜５−１＞ビフィドバクテリウムＧＥ６５のプロモーター分離
ビフィドバクテリウムのプロモーターをスクリーニングするためにリポーター遺伝子で使われているｇｆｐ遺伝子を使用した。図４に示したようにｐＥＧＦＰ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）からＰｌａｃを制限酵素ＰｖｕＩＩおよびＨｉｎｃＩＩを処理して除去してプロモーター探針ベクター（ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｐｒｏｂｅ ｖｅｃｔｏｒ）ｐＥＧＦＰ△ｐｒｏを製造した。前記プロモーター探針ベクターをＢａｍＨＩで切断した後Ｓａｕ３ＡＩで部分切断したビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）ＧＥ６５染色体ＤＮＡと連結した。これから大腸菌ＤＨ５αでＧＦＰを発現するプロモーターｐｂｉｆＧＦＰ１、２、４、５、６、７、１０を各々分離し、これらのうちプロモーター活性が相対的に強いｐｂｉｆＧＦＰ７および１０を得た。図４の ＰＧ１、 ＰＧ２、 ＰＧ４、 ＰＧ５、 ＰＧ６、 ＰＧ７、 ＰＧ１０はｐｂｉｆＧＦＰにクローニングされたそれぞれのプロモーターを示し、矢印の長さはプロモーターの長さを示すものとして配列番号４で表示されるＰＧ７および配列番号５で表示される ＰＧ１０は各々その大きさが２２８および２２４ｂｐである。前記ｐｂｉｆＧＦＰを含む大腸菌のＧＦＰ発現はＵＶ波長を照射して緑色蛍光を確認することによって選別した。
【００６４】
＜５−２＞ビフィドバクテリウムＧＥ６５のプロモーター発現
本発明により製造したシャトルベクターｐＢＥＳ２を制限酵素ＸｂａＩで切断した後、前記実施例５−１で分離したｐｂｉｆＧＦＰ７または１０を同一の制限酵素で切断して得たプロモーター ＰＧ７または ＰＧ１０およびｇｆｐ遺伝子を前記シャトルベクターｐＢＥＳ２に挿入し、組換えベクターｐＹＢＧＦＰ７またはｐＹＢＧＦＰ１０を製造した。前記組換えベクターｐＹＢＧＦＰ７またはｐＹＢＧＦＰ１０の概略的な開裂地図と製造過程が図５に示されている。前記組換えベクターｐＹＢＧＦＰ７またはｐＹＢＧＦＰ１０でビフィドバクテリウムロンガムＭＧ１を電気穿孔法に形質転換した。前記形質転換体をＭＲＳ培地に塗抹した後空気中に４８時間露出してＵＶを照射してＧＦＰ蛋白質の緑色蛍光を確認することによって実施例５−１で分離したビフィドバクテリウムのプロモーター活性を確認することができた。また、ＲＴ−ＰＣＲ方法（Ｓａｍｂｒｏｏｋ、１９８９）でＧＦＰ蛋白質の発現を転写段階で確認した結果、ｇｆｐ遺伝子の大きさに該当する４００ｂｐのバンドを確認することができた。
【００６５】
【発明の効果】
前述したように、本発明者らは大腸菌およびビフィドバクテリウムで相互複製が可能でありながら目的遺伝子を効率的に発現させることができるシャトルベクターを開発してビフィドバクテリウム内で目的遺伝子を強く発現させるプロモーターを分離した。本発明のシャトルベクターおよびプロモーターを利用すれば目的遺伝子を発現時に別の精製過程が必要ないし、ビフィドバクテリウム内で発現された目的遺伝子を直ちに食品に添加することができて食品添加物または経口用ワクチンの製造に使われることができる長所がある。また、このようなシャトルベクター開発を通じてビフィドバクテリウムを利用したプロバイオティックスの潜在力と可能性を画期的に高めることができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】ビフィドバクテリウムロンガムＭＧ１（Ｂｉｆｉｄｏｂａｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ ＭＧ１）から分離したｐＭＧ１の概略的な開裂地図を示した図
【図２】大腸菌とビフィドバクテリウム内で相互複製が可能なシャトルベクターｐＢＥＳ２の製造過程を示した図
【図３】図２で製造されたシャトルベクターｐＢＥＳ２を利用して目的遺伝子でアミラーゼ遺伝子を挿入した組換えベクターｐＹＢａｍｙ５９の製造過程を示した図
【図４】配列番号４または配列番号５で表示される塩基配列を有するビフィドバクテリウムＧＥ６５（Ｂｉｆｉｄｏｂａｔｅｒｉｕｍ ｓｐ． ＧＥ６５）のプロモーターが含むｐｂｉｆＧＰＦ７またはｐｂｉｆＧＰＦ１０を製造する過程を示した
【図５】図４で製造したｐｂｉｆＧＰＦ７またはｐｂｉｆＧＰＦ１０でプロモーターおよびＧＦＰを分離してｐＢＥＳ２に挿入したｐＹＢＧＦＰ７またはｐＹＢＧＦＰ１０の製造過程を示した図
【図６】シャトルベクターｐＢＥＳ２の製造に利用されるｐＥＫ１０４ベクターの概略的な開裂地図を示した図
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004519236.tif 000050
2004519236.tif 000051
【国際調査報告】
2004519236.tif 000052