(57)【要約】本発明は、ウリジン−５’−ジホスホスルホキノボース（ＵＤＰ−ＳＱ）の合成および改変に関連する組成物および方法に向けられる。特に、本発明の方法は、ＵＤＰ−ＳＱを合成して、ＵＤＰ−ＳＱをその後改変して、６−スルホ−ａ−Ｄ−キノボシルジアシルグリセロール（ＳＱＤＧ）およびアルキルスルホキノボシドを含むがこれらに限定されない化合物を生成するために、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）からの組み換え型酵素、ＵＤＰ−グルコース、および硫黄供与体を利用することを含む。本発明の組成物および方法は、ＵＤＰ−ＳＱを合成して、その後ＳＱＤＧを含むがこれらに限定されない化合物にＵＤＰ−ＳＱを改変するより単純で迅速な手段を提供する。
2004535767.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下を含む方法：
ａ）以下を提供する段階：
ｉ）ウリジン−５’−ジホスホグルコース；
ｉｉ）硫黄供与体；
ｉｉｉ）ウリジン−５’−ジホスホグルコースのウリジン−５’−ジホスホスルホキノボースへの変換を触媒することができる第一のペプチド；および
ｉｖ）ウリジン−５’−ジホスホスルホキノボースからのスルホキノボースをジアシルグリセロール上に転移することができる第二のペプチド；
ｂ）ウリジン−５’−ジホスホスルホキノボースが生成される条件で、上記のウリジン−５’−ジホスホグルコースを、上記の第一のペプチドおよび上記の硫黄供与体と反応させる段階；ならびに
ｃ）スルホキノボースジアシルグリセロールが生成される条件で、上記のウリジン−５’−ジホスホスルホキノボースを上記の第二のペプチドによって処置する段階。
【請求項２】
上記の第一のペプチドが、配列番号：５および配列番号：７からなる群より選択される核酸配列によってコードされる、請求項１記載の方法。
【請求項３】
上記の第二のペプチドが、配列番号：１、配列番号：３、および配列番号：４、ならびにその一部からなる群より選択される核酸配列によってコードされる、請求項１記載の方法。
【請求項４】
上記の硫黄供与体が、硫酸塩、硫化物、チオ硫酸塩、スルホグルタチオン、アデノシン−５’−ホスホスルフェート、および３’−ホスホアデノシン−５’−ホスホスルフェートからなる群より選択される、請求項１記載の方法。
【請求項５】
上記の硫黄供与体が亜硫酸塩である、請求項１記載の方法。
【請求項６】
以下を含む方法：
ａ）以下を提供する段階：
ｉ）ウリジン−５’−ジホスホグルコース；
ｉｉ）硫黄供与体；
ｉｉｉ）ウリジン−５’−ジホスホグルコースのウリジン−５’−ジホスホスルホキノボースへの変換を触媒することができるペプチド；
ｉｖ）酸触媒；
ｖ）短鎖アルコール；および
ｖｉ）長鎖アルコール；
ｂ）ウリジン−５’−ジホスホスルホキノボースが生成される条件で、上記のウリジン−５’−ジホスホグルコースを上記のペプチドおよび上記の硫黄供与体と反応させる段階；
ｃ）短鎖アルキルスルホキノボシドが生成される条件で、上記のウリジン−５’−ジホスホスルホキノボースを上記の短鎖アルコールおよび上記の酸触媒に反応させる段階；ならびに
ｄ）長鎖アルキルスルホキノボシドが生成される条件で、上記の短鎖アルキルスルホキノボシドを上記の長鎖アルコールによって処置する段階。
【請求項７】
上記の短鎖アルコールがメタノール、エタノール、プロパノール、ペンタノール、ヘキサノール、ヘプタノール、オクタノール、ノナノール、およびその異性体からなる群より選択される、請求項６記載の方法。
【請求項８】
上記の短鎖アルコールがブタノールである、請求項６記載の方法。
【請求項９】
上記の酸触媒が、Ｈ２ＳＯ４、ＨＣｌ、Ｈ３ＰＯ４、ＢＦ３、オルト−トルエンスルホン酸、メタ−トルエンスルホン酸、アルキルベンゼンスルホン酸、二級アルキルスルホン酸、スルホン酸樹脂、アルキルスルフェート、アルキルベンゼンスルホネート、アルキルスルホネート、およびスルホコハク酸からなる群より選択される、請求項６記載の方法。
【請求項１０】
上記の酸触媒が、パラ−トルエンスルホン酸である、請求項６記載の方法。
【請求項１１】
上記の長鎖アルコールが、ｎ−ドデシルアルコール、ｎ−テトラデシルアルコール、ｎ−ヘキサデシルアルコール、ｎ−オクタデシルアルコール、ｎ−オクチルアルコール、ｎ−デシルアルコール、ウンデシルアルコール、およびトリデシルアルコールからなる群より選択される、請求項６記載の方法。
【請求項１２】
請求項６に従って調製された長鎖アルキルスルホキノボシド。
【請求項１３】
以下を含む方法：
ａ）以下を提供する段階；
ｉ）ウリジン−５’−ジホスホグルコース；
ｉｉ）硫黄供与体；および
ｉｉｉ）配列番号：５に記載の核酸配列によってコードされるペプチド；ならびに
ｂ）ウリジン−５’−ジホスホスルホキノボースが生成される条件で、上記のウリジン−５’−ジホスホグルコースを上記のペプチドおよび上記の硫黄供与体と反応させる段階。
【請求項１４】
上記の硫黄供与体が亜硫酸塩である、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
以下を含む方法：
ａ）以下を提供する段階；
ｉ）ウリジン−５’−ジホスホグルコース；
ｉｉ）亜硫酸塩；
ｉｉｉ）配列番号：５に記載の核酸配列；および
ｉｖ）宿主細胞；
ｂ）ペプチドが発現される条件で上記の宿主細胞に上記の核酸をトランスフェクトする段階；ならびに
ｃ）ウリジン−５’−ジホスホスルホキノボースが生成される条件で、ウリジン−５’−ジホスホグルコースを上記のペプチドおよび上記の亜硫酸塩と反応させる段階。
【請求項１６】
以下を含む方法：
ａ）以下を提供する段階；
ｉ）ウリジン−５’−ジホスホスルホキノボース；
ｉｉ）ジアシルグリセロール；
ｉｉｉ）配列番号：１、配列番号：３、および配列番号：４からなる群より選択される核酸配列；ならびに
ｉｖ）宿主細胞；
ｂ）ペプチドが発現される条件で、上記の宿主細胞に上記の核酸をトランスフェクトする段階；ならびに
ｃ）スルホキノボシルジアシルグリセロールが生成される条件で、ウリジン−５’−ジホスホスルホキノボースを上記のペプチドおよび上記のジアシルグリセロールと反応させる段階。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明は、ウリジン−５’−ジホスホスルホキノボース（ＵＤＰ−ＳＱ）を合成してその後改変するための組成物および方法に関する。本発明の方法は、ＵＤＰ−ＳＱを合成するために、そしてＵＤＰ−ＳＱをその後改変して、６−スルホ−α−Ｄ−キノボシルジアシルグリセロール（ＳＱＤＧ）およびアルキルスルホキノボシドを含むがこれらに限定されない化合物を生成するために、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）の組み換え型酵素、ＵＤＰ−グルコース、および硫黄供与体を利用することを含む。
【０００２】
背景
ウリジン−５’−ジホスホスルホキノボース（ＵＤＰ−ＳＱ）は、そのスルホネート基で陰性荷電を有する特異な糖ヌクレオチドである。ＵＤＰ−ＳＱは、糖ヌクレオチド依存的グリコシルトランスフェラーゼと反応して、６−スルホ−α−Ｄ−キノボシルジアシルグリセロール（ＳＱＤＧ）を含むがこれらに限定されない貴重な化合物を形成するためにそのスルホネート基を他の基質に供与すると考えられている。ＵＤＰ−ＳＱは、それに対してそれが独自のスルホン酸ヘッドグループであるスルホキノボースを供与するＳＱＤＧの直接の前駆体であると考えられている。しかし、ＵＤＰ−ＳＱを合成する単純で迅速な方法、またはＵＤＰ−ＳＱを、ＳＱＤＧおよびアルキルスルホキノボシドを含むがこれらに限定されない化合物にその後改変するための効率的な方法はない。
【０００３】
ＳＱＤＧは、高等植物、コケ、シダ、藻類、およびほとんどの光合成細菌の光合成膜（チラコイド）膜に特異的に会合する豊富な硫黄含有非燐グリセロリピッドである。ＳＱＤＧは、酸素光合成に普遍的に関連して、生物学的硫黄サイクルの重要な成分である。
【０００４】
ＳＱＤＧは、いくつかの哺乳類ＤＮＡポリメラーゼおよびヒト免疫不全ウイルス逆転写酵素１（ＨＩＶ−ＲＴ１）の強力な阻害剤であることが示されており、そのため、抗ウイルス化合物として貴重である（オータ（Ｏｈｔａ）ら、「スルホキノボシルジアシルグリセロールＫＭ０４３、真核生物ＤＮＡポリメラーゼおよび海洋赤色藻類であるジガルチナ・テネラの１型ＨＩＶ逆転写酵素の新しい強力な阻害剤（Ｓｕｌｆｏｑｕｉｎｏｖｏｓｙｌｄｉａｃｙｌｇｌｙｃｅｒｏｌ， ＫＭ０４３， ａ ｎｅｗ ｐｏｔｅｎｔ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｏｆ ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｓ ａｎｄ ＨＩＶ−ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ ｔｙｐｅ １ ｆｒｏｍ ａ ｍａｒｉｎｅ ｒｅｄ ａｌｇａ， Ｇｉｇａｒｔｉｎａ ｔｅｎｅｌｌａ）」、Ｃｈｅｍ． Ｐｈａｒｍ． Ｂｕｌｌ． ４６（４）：６８４〜８６（１９９８））。その上、ＳＱＤＧはまた、その抗腫瘍促進特性および抗癌化学療法剤の殺細胞作用の増強能のために貴重であることが証明されている（シラハシ（Ｓｈｉｒａｈａｓｈｉ）ら、「淡水シアノバクテリア、ホルミジウム・テヌエからの抗腫瘍促進成分の単離と同定（Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｎｔｉ−ｔｕｍｏｒ−Ｐｒｏｍｏｔｉｎｇ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｆｒｏｍ ｔｈｅ Ｆｒｅｓｈ−Ｗａｔｅｒ Ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ Ｐｈｏｒｍｉｄｉｕｍ ｔｅｎｕｅ）」、Ｃｈｅｍ． Ｐｈａｒｍ． Ｂｕｌｌ． ４１（９）：１６６４〜６６（１９９３））。さらに、ＳＱＤＧは、一般的に優れた洗浄剤特性を有すると考えられている（ベンソン（Ｂｅｎｓｏｎ、Ａ．Ａ．）「植物のスルホリピッド（Ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｓｕｌｆｏｌｉｐｉｄ）」、Ａｄｖ． Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ． １：３８７〜９４（１９６３））。このように、ＵＤＰ−ＳＱを生成する方法、およびＳＱＤＧを含むがこれらに限定されない化合物にその後改変する方法が望ましい。
【０００５】
従来、ＵＤＰ−ＳＱは一連の化学反応によって合成されていた（ハインツ（Ｈｅｉｎｚ）ら、「異なるヌクレオシド５’−ジホスホスルホキノボースの合成および葉緑体におけるスルホリピッドの生合成に関する研究でのその利用（Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ ５’−ｄｉｐｈｏｓｐｈｏ−ｓｕｌｆｏｑｕｉｎｏｖｏｓｅｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｕｓｅ ｆｏｒ ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｎ ｓｕｌｆｏｌｉｐｉｄ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｉｎ ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔｓ）」、Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． １８４：４４５〜４５３（１９８９））。しかし、この化学的生成は、非常に複雑でそれによるＵＤＰ−ＳＱの産生量は少なく、完了するまでに数日を要する（同上）。その上、ＳＱＤＧに関するこれまでの研究は、光合成微生物からの陰イオンスルホリピッドの時間のかかる単離および精製を必要とした（オータ（Ｏｈｔａ）ら、「新規哺乳類ＤＮＡポリメラーゼ阻害剤であるスルホキノボシルジアシルグリセロールの作用（Ａｃｔｉｏｎ ｏｆ ａ Ｎｅｗ Ｍａｍｍａｌｉａｎ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ， Ｓｕｌｆｏｑｕｉｎｏｖｏｓｙｌ ｄｉａｃｙｌｇｌｙｃｅｒｏｌ）」、Ｂｉｏｌ． Ｐｈａｒｍ． Ｂｕｌｌ． ２２（２）：１１１〜１６（１９９９）；グスタフソン（Ｇｕｓｔａｆｓｏｎ）ら、「シアノバクテリア（青緑藻類）からのＡＩＤＳ−抗ウイルススルホリピッド（ＡＩＤＳ−Ａｎｔｉｖｉｒａｌ Ｓｕｌｆｏｌｉｐｉｄｓ Ｆｒｏｍ Ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉａ（Ｂｌｕｅ−Ｇｒｅｅｎ Ａｌｇａｅ））」、Ｊ． Ｎａｔｌ． Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ． ８１：１２５４〜２５８（１９８９））。このように、ＵＤＰ−ＳＱを合成するための、そしてＳＱＤＧを含むがこれらに限定されない化合物にＵＤＰ−ＳＱをその後改変するためのより単純で迅速な方法が必要である。
【０００６】
発明の概要
本発明は、ウリジン−５’−ジホスホスルホキノボース（ＵＤＰ−ＳＱ）の合成およびその後の改変のための方法に関する。本発明の方法は、ＵＤＰ−ＳＱを合成するためにシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）の組み換え型酵素、ＵＤＰ−グルコース、および硫黄供与体を利用することを含む。ＵＤＰ−ＳＱの現行の合成法とは異なり、本発明の合成法は単純かつ迅速である。実際に、本発明の方法によるＵＤＰ−ＳＱの産生は１時間未満で完了しうる。
【０００７】
一つの態様において、本発明は以下を含む、ＵＤＰ−ＳＱを合成する方法を意図する：ａ）ｉ）ウリジン−５’−ジホスホグルコース（ＵＤＰ−Ｇｌｃ）、ｉｉ）硫黄供与体、およびｉｉｉ）ＵＤＰ−Ｇｌｃのウリジン−５’−ジホスホスルホキノボース（ＵＤＰ−ＳＱ）への変換を触媒することができるペプチド、を提供する段階；ならびにｂ）ＵＤＰ−ＳＱが生成される条件で、上記のＵＤＰ−Ｇｌｃを上記の第一のペプチドおよび上記の硫黄供与体と反応させる段階。
【０００８】
本発明は、ＵＤＰ−Ｇｌｃおよび硫黄供与体のＵＤＰ−ＳＱへの変換を触媒することができる如何なる特定の第一のペプチドに限定されないと解釈される。一つの態様において、上記の第一のペプチドは、配列番号：５に記載の核酸配列によってコードされる遺伝子産物であるＳＱＤ１である。もう一つの態様において、上記の第一のペプチドは、配列番号：７に記載の核酸配列によってコードされる。
【０００９】
本発明は如何なる特定の硫黄供与体を用いることに限定されないと解釈される。一つの態様において、硫黄供与体は、硫酸塩、亜硫酸塩、硫化物、チオ硫酸塩、スルホグルタチオン、アデノシン５’−ホスホスルフェート（ＡＰＳ）、および３’−ホスホアデノシン−５’−ホスホスルフェート（ＰＡＰＳ）を含む群から選択される。好ましい態様において、硫黄供与体は亜硫酸塩である。
【００１０】
本発明は、ＵＤＰ−Ｇｌｃおよび硫黄供与体のＵＤＰ−ＳＱへの変換を触媒することができるペプチドを発現または生成するために如何なる特定の方法を用いることに限定されないと解釈される。一つの態様において、本発明は、ｐＱＥ−９、ｐＱＥ−１６、ｐＱＥ−３１、ｐＱＥ−３２、ｐＱＥ−４０、ｐＱＥ−６０、ｐＱＥ−７０、ｐＱＥ−８０、ｐＱＥ−８１、ｐＱＥ−８２、またはｐＱＥ−１００のような蛋白質発現ベクター群へのｓｑｄｌ遺伝子ｃＤＮＡのクローニングを意図する。もう一つの態様において、本発明は、蛋白質発現ベクターｐＱＥ−３０へのｓｑｄｌ遺伝子ｃＤＮＡのクローニングを意図する（図３を参照のこと）。
【００１１】
本発明の方法は、反応容器または容器において簡便に行われる。本発明は、特定の反応容器に制限されないと解釈される。試験管、フラスコ、および他のガラス製品を含むがこれらに限定されない多様な容器を用いることができる。
【００１２】
もう一つの態様において、本発明は、ｓｑｄ１遺伝子産物が発現されるように植物細胞または組織の形質転換を意図する。一つの態様において、本発明は、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）に導入して、アグロバクテリア形質転換によってトランスジェニック植物細胞をその後作製するために、バイナリベクターへのｓｑｄｌ遺伝子ｃＤＮＡ（配列番号：５）のクローニングを意図する。
【００１３】
本発明は、ＵＤＰ−ＧｌｃのＵＤＰ−ＳＱへの変換を触媒することができる組み換え型ペプチドを精製するために如何なる特定の方法を用いることに限定されないと解釈される。一つの態様において、本発明は、蛋白質発現ベクターに組み入れた６−Ｈｉｓタグを利用するペプチドの精製を意図し、それによって、ニッケルニトリロ酢酸（Ｎｉ−ＮＴＡ）アガロース樹脂に基づくクロマトグラフィーカラム上で蛋白質アフィニティ精製を行うことができる。
【００１４】
本発明は、ＵＤＰ−ＳＱ合成を検出するために如何なる特定の方法を用いることに限定されないと解釈される。本発明は、多様な方法またはアッセイフォーマットを意図する。一つの態様において、ＳＱＤ１の活性の反映としてＵＤＰ−グルコースのＵＤＰ−ＳＱへの変換を測定する酵素アッセイを提供する。もう一つの態様において、カップリングしたアデノシン−５’−ホスホスルフェート（ＡＰＳ）／ＳＱＤ１アッセイが意図される。
【００１５】
本発明は、６−スルホ−α−Ｄ−キノボシルジアシルグリセロール（ＳＱＤＧ）を含むがこれらに限定されない化合物を合成するために、ウリジン−５’−ジホスホスルホキノボース（ＵＤＰ−ＳＱ）をその後改変する方法に関する。ＵＤＰ−ＳＱの現行の合成法とは異なり、本発明の合成法は迅速かつ単純である。
【００１６】
一つの態様において、本発明は、以下を含む、ＵＤＰ−ＳＱを合成する方法を意図する：ａ）ｉ）ウリジン−５’−ジホスホグルコース（ＵＤＰ−Ｇｌｃ）、ｉｉ）硫黄供与体、ｉｉｉ）ＵＤＰ−Ｇｌｃのウリジン−５’−ジホスホスルホキノボース（ＵＤＰ−ＳＱ）への変換を触媒することができる第一のペプチド、およびｉｖ）スルホキノボースをＵＤＰ−ＳＱからジアシルグリセロールに転移させることができる第二のペプチドを提供する段階；ｂ）ＵＤＰ−ＳＱが生成される条件で、上記のＵＤＰ−Ｇｌｃを上記の第一のペプチドおよび上記の硫黄供与体と反応させる段階；ならびにｃ）スルホキノボースジアシルグリセロールが生成される条件で、上記のＵＤＰ−ＳＱを上記の第二のペプチドによって処置する段階。
【００１７】
本発明は、スルホキノボースをＵＤＰ−ＳＱからジアシルグリセロールに転移させることができる如何なる特定の第二のペプチドを用いることに限定されないと解釈される。一つの態様において、上記の第二のペプチドは、シアノバクテリア（Ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉａ）種に由来する配列番号：１に記載の核酸配列の遺伝子産物である。もう一つの態様において、上記の第二のペプチドは、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）に由来し、配列番号：３および配列番号：４の群から選択される核酸配列によってコードされる遺伝子産物である。
【００１８】
本発明は、スルホキノボースをＵＤＰ−ＳＱからジアシルグリセロールに転移させることができるペプチドを発現または生成するために如何なる特定の方法を用いることに限定されないと解釈される。一つの態様において、本発明は、ｐＱＥ−９、ｐＱＥ−１６、ｐＱＥ−３１、ｐＱＥ−３２、ｐＱＥ−４０、ｐＱＥ−６０、ｐＱＥ−７０、ｐＱＥ−８０、ｐＱＥ−８１、ｐＱＥ−８２、ｐＱＥ−１００を含む蛋白質発現ベクターの群へのｓｑｄＸ遺伝子のクローニングを意図する。もう一つの態様において、本発明は、蛋白質発現ベクターｐＱＥ−３０へのｓｑｄＸ遺伝子のクローニングを意図する（図３を参照のこと）。さらなる態様において、ｓｑｄＸ遺伝子は蛋白質発現ベクターｐＡＣＹＣ１８４にクローニングされる。
【００１９】
もう一つの態様において、本発明は、ｓｑｄＸ遺伝子が発現されるように植物細胞または組織の形質転換を意図する。一つの態様において、本発明は、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）に導入して、アグロバクテリア形質転換によってトランスジェニック植物細胞をその後作製するためにバイナリベクターへのｓｑｄＸ遺伝子ｃＤＮＡ（配列番号：１）のクローニングを意図する。もう一つの態様において、上記の遺伝子産物は、配列番号：３および配列番号：４の群から選択される核酸配列によってコードされる。
【００２０】
本発明は、スルホキノボースをＵＤＰ−ＳＱからジアシルグリセロールに転移することができる組み換え型ペプチドを精製するために如何なる特定の方法を用いることに限定されないと解釈される。一つの態様において、本発明は、蛋白質発現ベクターに組み入れた６−Ｈｉｓタグを利用するペプチドの精製を意図し、それによってニッケルニトリロ酢酸（Ｎｉ−ＮＴＡ）アガロース樹脂に基づくクロマトグラフィーカラム上で蛋白質アフィニティ精製を行うことができる。
【００２１】
本発明は、ＳＱＤＧ合成を検出するために如何なる特定の方法を用いることに限定されないと解釈される。本発明は、多様なアッセイフォーマットを意図する。一つの態様において、ＳＱＤＧの合成は、ＳＱＤＧを含むことがわかっているシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）の葉の脂質抽出物との同時クロマトグラフィーによって、ヨウ素蒸気によって可視化して同定される。もう一つの態様において、ＳＱＤＧの産生は、反応産物がＴＬＣプレートから単離され、脂肪酸メチルエステルを調製するために用いられる定量的分析によって確認される。メチルエステルは、内部標準としてミリスチン酸を用いてガスクロマトグラフィーによって定量される。
【００２２】
本発明は、単一の宿主生物または植物におけるＵＤＰ−Ｇｌｃおよび硫黄供与体のＵＤＰ−ＳＱへの変換を触媒することができるペプチドの独立した発現に限定されないと解釈される。その上、本発明は、単一の宿主生物または植物において、スルホキノボースをＵＤＰ−ＳＱからジアシルグリセロールに転移させることができる第二のペプチドの独立した発現に限定されないと解釈される。一つの態様において、本発明は、単一の宿主生物において上記のペプチドの双方の同時発現を意図する。もう一つの態様において、本発明は、双方のペプチドが同時発現されるように植物細胞または組織の形質転換を意図する。
【００２３】
本発明は、ａ）ｉ）ウリジン−５’−ジホスホグルコース、ｉｉ）硫黄供与体、ｉｉｉ）ウリジン−５’−ジホスホグルコースのウリジン−５’−ジホスホスルホキノボースへの変換を触媒することができるペプチド、ｉｖ）酸触媒、ｖ）短鎖アルコール、およびｖｉ）長鎖アルコールを提供する段階；ｂ）ウリジン−５’−ジホスホスルホキノボースが生成される条件で、上記のウリジン−５’−ジホスホグルコースを上記のペプチドおよび上記の硫黄供与体と反応させる段階；ｃ）短鎖アルキルスルホキノボシドが生成される条件で上記のウリジン−５’−ジホスホスルホキノボースを上記の短鎖アルコールおよび上記の酸触媒と反応させる段階；ならびにｄ）長鎖アルキルスルホキノボシドが生成される条件で、上記の短鎖アルキルスルホキノボシドを上記の長鎖アルコールによって処理する段階、を含むＵＤＰ−ＳＱを改変する方法を意図する。
【００２４】
アルキルスルホキノボシド様化合物を生成する現行の方法とは対照的に、本発明の方法は、Ｃ−６位でスルホン化され、Ｃ−１位でアルコールによってアセタール化されたグリコシド単位からなる物質の群を生成する。その上、本発明によって生成されたアルキルスルホキノボシドは、他の陰イオン表面活性剤とは異なり、再生可能な天然資源から得ることができ、生体分解性である。
【００２５】
本発明は、方法に関して選択された短鎖アルコールに限定されないと解釈される。一つの態様において、短鎖アルコールは、その異性体を含むメタノール、エタノール、プロパノール、ペンタノール、ヘキサノール、ヘプタノール、オクタノール、ノナノールからなる群より選択される。もう一つの態様において、短鎖アルコールはブタノールである。
【００２６】
本発明は、方法に関して選択される酸触媒に限定されないと解釈される。一つの態様において、酸触媒は、Ｈ２ＳＯ４、ＨＣｌ、Ｈ３ＰＯ４、ＢＦ３、オルト−トルエンスルホン酸、メタ−トルエンスルホン酸、アルキルベンゼンスルホン酸、二級アルキルスルホン酸、スルホン酸樹脂、アルキルスルフェート、アルキルベンゼンスルホネート、アルキル−スルホネート、およびスルホコハク酸を含む群から選択される。もう一つの態様において、酸触媒はパラ−トルエンスルホン酸である。
【００２７】
本発明は、方法に関して選択される長鎖アルコールに限定されないと解釈される。一つの態様において、長鎖アルコールは、ｎ−ドデシルアルコール、ｎ−テトラデシルアルコール、ｎ−オクタデシルアルコール、ｎ−オクチルアルコール、ｎ−デシルアルコール、ウンデシルアルコール、およびトリデシルアルコールの群から選択される脂肪アルコールである。もう一つの態様において、長鎖アルコールは、重量比でラウリルアルコール約３に対しミリスチルアルコール約１の技術的混合物である。もう一つの態様において、長鎖アルコールは、オキソアルコールを含むがこれに限定されない分岐鎖一級アルコールである。もう一つの態様において、長鎖アルコールはｎ−ヘキサデシルアルコールである。
【００２８】
本発明は、方法によって生成されるアルキルスルホキノボシドに限定されないと解釈される。本発明は、多様なアルキルスルホキノボシドおよびその混合物の生成を意図する。一つの態様において、生成されるアルキルスルホキノボシドは、短鎖および長鎖アルキルスルホキノボシドの混合物を含む。もう一つの態様において、アルキルオリゴスルホキノボシドが生成される。もう一つの態様において、アルキルポリスルホキノボシドが生成される。さらなる態様において、アルキルモノスルホキノボシドが生成される。
【００２９】
本発明はまた、ＵＤＰ−ＳＱの生合成、ならびにＳＱＤＧおよびアルキルスルホキノボシドを含むがこれらに限定されない化合物へのその後の改変において用いられる組成物にも関する。一つの態様において、組成物は、配列番号：１、配列番号：３、または配列番号：４の少なくとも一部を含む実質的に純粋なヌクレオチド配列である。もう一つの態様において、組成物は、配列番号：１、配列番号：３、または配列番号：４の少なくとも一部から転写されたＲＮＡを含む。もう一つの態様において、組成物は、配列番号：１、配列番号：３、または配列番号：４の少なくとも一部から転写されたＲＮＡから翻訳された蛋白質を含む。もう一つの態様において、組成物は、翻訳された蛋白質から生成された抗体を含む。さらなる態様において、組成物は、配列番号：１、配列番号：３、または配列番号：４の少なくとも一部を含む発現構築物を含む。もう一つの態様において、組成物は、配列番号：１、配列番号：３、または配列番号：４の少なくとも一部を含むトランスジェニック植物細胞または組織を含む。
【００３０】
一つの態様において、本発明は、ａ）ｉ）ウリジン−５’−ジホスホグルコース、ｉｉ）亜硫酸塩、ｉｉｉ）配列番号：５に記載の核酸配列、およびｖ）宿主細胞を提供する段階；ｂ）ペプチドが発現される条件で上記の宿主細胞に上記の核酸をトランスフェクトさせる段階；ならびにｃ）ウリジン−５’−ジホスホスルホキノボースが生成される条件で、ウリジン−５’−ジホスホグルコースを上記のペプチドおよび上記の亜硫酸塩と反応させる段階、を含む方法を意図する。
【００３１】
もう一つの態様において、本発明は、ａ）ｉ）ウリジン−５’−ジホスホスルホキノボース、ｉｉ）ジアシルグリセロール、ｉｉｉ）配列番号：１、配列番号：３および配列番号：４からなる群より選択される核酸配列、およびｖ）宿主細胞を提供する段階；ｂ）ペプチドが発現される条件で上記の宿主細胞に上記の核酸をトランスフェクトさせる段階；ならびにｃ）スルホキノボシルジアシルグリセロールが生成される条件で、ウリジン−５’−ジホスホスルホキノボースを上記のペプチドおよび上記のジアシルグリセロールと反応させる段階、を含む方法を意図する。
【００３２】
定義
本発明を理解しやすくするため、用語を以下に定義する：
【００３３】
本明細書において用いられる「会合したペプチド」とは、他のペプチドに直接または間接的に結合しているペプチドを意味する。間接的に結合した会合ペプチドは、二つの会合ペプチドのあいだに一つまたはそれ以上の他のペプチドを有してもよい。ペプチドは、ペプチド結合、共有結合、および非共有結合によって結合してもよい。
【００３４】
本明細書において用いられる「機能的に組み合わせて」、「機能的な秩序で」、および「機能的に結合して」とは、所定の遺伝子の転写および／または所望の蛋白質分子の合成を指示することができる核酸分子が生成されるように、核酸配列が結合していることを意味する。この用語はまた、機能的な蛋白質が産生されるようにアミノ酸配列が結合していることも意味する。
【００３５】
本明細書において用いられる「発現構築物」、「発現ベクター」、および「プラスミド」とは、細胞または宿主生物（例えば、哺乳類）においてコード配列の発現にとって必要な配列に機能的に結合した所望のコード配列を含む一つまたはそれ以上の組み換え型ＤＮＡまたはＲＮＡ配列を意味する。配列は一本鎖または二本鎖であってもよい。
【００３６】
本明細書において用いられる「レポーター構築物」、「レポーター遺伝子」、および「レポーター蛋白質」とは、適当であれば、宿主細胞または生物において発現された場合に検出、測定、または定量される可能性があるＤＮＡ配列またはアミノ酸配列を意味する。
【００３７】
本明細書において用いられるように、「精製された」、または「精製する」という用語は、試料から一つまたはそれ以上の（望ましくない）成分を除去することを意味する。例えば、組み換え型ポリペプチドを細菌宿主細胞において発現させる場合、ポリペプチドは、宿主細胞蛋白質を除去して、それによって試料中の組み換え型ポリペプチドの割合を増加させることによって精製される。
【００３８】
本明細書において用いられるように、「部分的に精製された」という用語は、関係する物質が、混合物において測定可能な量（例えば、ピコグラム、ナノグラム、マイクログラム等）を占めるとして、当業者に既知の技術（例えば、染色、ブロッティング等）によって認識可能である程度に試料中の混入物を除去することを意味する。
【００３９】
本明細書において用いられるように、「実質的に精製された」という用語は、天然の環境から除去され、単離または分離されて、それらが本来会合している他の成分を少なくとも６０％含まない、好ましくは７５％含まない、およびより好ましくは９０％含まない分子（例えば、核酸またはアミノ酸配列）を意味する。
【００４０】
本明細書において用いられるように、溶液が固相マトリクスを通過する場合、これは「フロースルー」を含む。結合しない材料は、もし存在すれば、マトリクスの中を溶液と共にフロースルーまで通過する。全ての非特異的結合を排除するために、マトリクスを一つまたはそれ以上の洗浄液によって「洗浄する」、この洗浄液はマトリクスの通過後、一つまたはそれ以上の「溶出液」を含む。「溶出液」は、マトリクスに結合した材料（もし存在すれば）を解離させることができる化学溶液である；この解離した材料はマトリクスを通過して「溶出物」を含む。
【００４１】
本明細書において用いられる「抗体」とは、抗原（通常、しかし必ずしもそうではないがペプチド）、または抗体産生を生じる構造的に類似の抗原に対して高い特異性で結合するＢ細胞およびプラズマ細胞によって産生された糖蛋白質として定義されることを意味する。抗体は、既知の如何なる方法論によって産生してもよく、またはポリクローナル抗体もしくはモノクローナル抗体のいずれであってもよい。
【００４２】
本明細書において用いられるように、「染色」とは、細胞または複数の細胞の特定の成分および／または特徴を可視化するために用いられる当業者（典型的に色素を利用する）に既知の如何なるプロセスも意味する。
【００４３】
本明細書において用いられるように「アルコール」とは、飽和したｓｐ３−ハイブリダイズした炭素原子に結合したヒドロキシル官能基を有する成分を意味する。本明細書において用いられるように「短鎖アルコール」という用語は、炭素原子１０個未満を含むアルコールを意味する。そのような短鎖アルコールの例は、その異性体を含むメタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール、ペンタノール、ヘキサノール、ヘプタノール、オクタノール、ノナノールを含む。本明細書において用いられるように、「長鎖アルコール」という用語は、脂肪アルコール、特に炭素原子１０〜１８個を含む高級脂肪族一級アルコール、好ましくは飽和、および好ましくは天然の脂肪酸の工業的水素添加によって得ることができるタイプの直鎖アルコールを意味する。高級脂肪族アルコールの典型的な例は、例えば、ｎ−ドデシルアルコール、ｎ−テトラデシルアルコール、ｎ−ヘキサデシルアルコール、ｎ−オクタデシルアルコール、ｎ−オクチルアルコール、ｎ−デシルアルコール、ウンデシルアルコール、トリデシルアルコールのような化合物である。
【００４４】
本明細書において用いられるように、「硫黄供与体」とは、ウリジン−５’−ジホスホスルホキノボース（ＵＤＰ−ＳＱ）の生成においてスルホン酸基を提供することができる如何なる硫黄に基づく化合物も意味する。そのような硫黄供与体の例は、硫酸塩、亜硫酸塩、硫化物、チオ硫酸塩、スルホグルタチオン、アデニン−５’−ホスホスルフェート（ＡＰＳ）、および３’−ホスホアデノシン−５’−ホスホスルフェート（ＰＡＰＳ）を含む。
【００４５】
本明細書において用いられるように、「酸触媒」とは、脂肪アルコールと糖分子とのあいだのアセタール化反応を触媒するいわゆるルイス酸を含む如何なる化合物も意味する。工業プロセスにおいてこの目的のために用いられる酸の例は、Ｈ２ＳＯ４、ＨＣｌ、Ｈ３ＰＯ４、またはＢＦ３、またはスルホン酸もしくはその塩を含む。スルホン酸の例は、オルト−、メタ−、およびパラ−トルエンスルホン酸、アルキルベンゼンスルホン酸、二級アルキルスルホン酸、スルホン酸樹脂、アルキルスルフェート、アルキルベンゼンスルホネート、アルキルスルホネート、およびスルホコハク酸を含む。
【００４６】
本明細書において用いられるように、「アルキルスルホキノボシド」とは、Ｃ−６位でスルホン化され、Ｃ−１位でアルコールによってアセタール化されるグリコシド単位を含む基質の群を意味する。本発明の意味において、アルキルスルホキノボシドは、ＵＤＰ−スルホキノボースと脂肪アルコールの反応産物であると理解される。その最も広い意味において、アルキルスルホキノボシドにおける「アルキル」は、天然の脂肪から得ることができる脂肪族Ｃ８〜Ｃ１８アルコールの残基、すなわち飽和および不飽和残基ならびに鎖長が異なる残基を含むその混合物を含むと解釈される。アルキルオリゴスルホキノボシド、アルキルポリスルホキノボシドという用語は、アセタールの型での一つのアルキル残基が一つ以上のスルホキノボシド残基、すなわちポリスルホキノボシドまたはオリゴスルホキノボシド残基に結合しているタイプのアルキル化スルホキノボシドに当てはまる；これらの用語は、互いに同義であると見なされる。したがって、アルキルモノスルホキノボシドは、モノスルホキノボシドのアセタールである。糖と脂肪アルコールの反応産物は一般的に混合物であるため、アルキルスルホキノボシドという用語は、アルキルモノスルホキノボシドとアルキルポリ（オリゴ）スルホキノボシドの双方を含むと解釈される。
【００４７】
本明細書において用いられるように、「核酸配列」、「ヌクレオチド配列」、および「ポリヌクレオチド配列」とは、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド、およびその断片または一部、ならびにゲノムまたは合成起源のＤＮＡまたはＲＮＡを意味し、これらは一本鎖または二本鎖であってもよく、センスまたはアンチセンス鎖を表してもよい。
【００４８】
本明細書において用いられるように、「オリゴヌクレオチド」および「オリゴマー」という用語は、プローブまたは増幅子として用いることができる少なくとも約１０ヌクレオチド、多くとも約１００ヌクレオチド、好ましくは約１５〜３０ヌクレオチド、より好ましくは約２０〜２５ヌクレオチドの核酸配列を意味する。
【００４９】
「関係するヌクレオチド配列」という用語は、当業者によってそれを操作することが如何なる理由にとっても望ましいと思われる如何なるヌクレオチド配列も意味する。そのようなヌクレオチド配列には、構造遺伝子のコード配列（例えば、酵素コード遺伝子、レポーター遺伝子、選択マーカー遺伝子、腫瘍遺伝子、薬剤抵抗性遺伝子、増殖因子等）、およびｍＲＮＡまたは蛋白質産物をコードしない非コード調節配列（例えば、プロモーター配列、エンハンサー配列、ポリアデニル化配列、終了配列等）が含まれるがこれらに限定されない。
【００５０】
「アミノ酸配列」、「ポリペプチド配列」、「ペプチド配列」、および「ペプチド」は、本明細書においてアミノ酸の配列を意味するために互換的に用いられる。
【００５１】
ヌクレオチド配列に関して用いられる「一部」という用語は、そのヌクレオチド配列の断片を意味する。断片は、大きさが５ヌクレオチド残基〜完全なヌクレオチド配列マイナス１核酸残基の範囲であってもよい。アミノ酸配列に関して用いられる「一部」という用語は、そのアミノ酸配列の断片を意味する。断片は、大きさがアミノ酸３個〜完全なアミノ酸配列マイナス１アミノ酸残基の範囲であってもよい。
【００５２】
第一のヌクレオチド配列の「相同体」であるオリゴヌクレオチド配列は、本明細書において、長さが１０ ｂｐまたはそれより大きい配列を比較した場合に、第一のヌクレオチド配列と５０％以上またはそれに等しい同一性、およびより好ましくは７０％以上またはそれに等しい同一性を示すオリゴヌクレオチド配列であると定義される。
【００５３】
ＤＮＡ分子は、モノヌクレオチドが、一つのモノヌクレオチド五炭糖環の５’燐酸塩がホスホジエステル結合によって一つの方向に隣接する３’酸素に結合するようにオリゴヌクレオチドを作製するように反応するために、「５’末端」と「３’末端」とを有すると言われる。したがって、オリゴヌクレオチドの末端は、その５’燐酸塩がモノヌクレオチド五炭糖環の３’酸素に結合していなければ、「５’末端」であると呼ばれる。オリゴヌクレオチドの末端は、その３’酸素がもう一つのモノヌクレオチド五炭糖環の５’燐酸塩に結合していなければ、「３’末端」と呼ばれる。本明細書において用いられるように、核酸配列は、より大きいオリゴヌクレオチドに対して内部であっても、５’と３’末端とを有すると言ってもよい。直線状または環状ＤＮＡ分子において、個別の要素は、「上流」もしくは５’、または「下流」もしくは３’要素であると呼ばれる。この命名は、ＤＮＡ鎖に沿って転写が５’から３’方向に進行することを反映している。結合した遺伝子の転写を指示するプロモーターおよびエンハンサー要素は、一般的にコード領域の５’または上流に存在する。しかし、エンハンサー要素は、プロモーター要素およびコード領域の３’に存在する場合であっても、その作用を発揮することができる。転写終了およびポリアデニル化シグナルは、コード領域の３’または下流に存在する。
【００５４】
本明細書において用いられるように、「クローニング」という用語は、組み換え技術によって複製のために、ヌクレオチドライブラリ、細胞または生物からヌクレオチドを単離するプロセスを意味する。
【００５５】
本明細書において用いられるように、「組み換え型ＤＮＡ分子」という用語は、分子生物学的技術によって互いに結合したＤＮＡセグメントを含むＤＮＡ分子を意味する。
【００５６】
本明細書において用いられるように、「組み換え型蛋白質」または「組み換え型ポリペプチド」という用語は、組み換え型ＤＮＡ分子を用いて発現された蛋白質分子を意味する。
【００５７】
本明細書において用いられるように、「ベクター」および「媒体」という用語は、一つの細胞からもう一つの細胞にＤＮＡセグメントを転移する核酸分子に関して互換的に用いられる。
【００５８】
本明細書において用いられるように、「相補的」または「相補性」  という用語は塩基対形成規則によって関連した「ポリヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド」（ヌクレオチド配列を意味する互換的な用語である）に関連して用いられる。例えば、配列「５’−ＣＡＧＴ−３’」は、配列「５’−ＡＣＴＧ−３’」と相補的である。相補性は、「部分的」または「完全」となりうる。「部分的」相補性は、一つまたはそれ以上の核酸塩基が塩基対形成規則に従ってマッチしていない場合である。核酸間の「全体的」または「完全な」相補性は、個々のあらゆる核酸塩基が塩基対形成規則に従ってもう一つの塩基とマッチしている場合である。核酸の鎖の相補性の程度は、核酸の鎖のあいだのハイブリダイゼーションの効率および強度に対して有意な影響を及ぼす可能性がある。これは、核酸間の結合に依存する検出法と共に増幅反応において特に重要となる可能性がある。
【００５９】
本明細書においてヌクレオチド配列に関して用いられる「相同性」および「相同な」という用語は、他のヌクレオチド配列との相補性の程度を意味する。部分的相同性または完全な相同性（すなわち、同一性）であってもよい。核酸配列に対して部分的に相補性であるヌクレオチド配列（すなわち、「実質的に相同な」）は、完全に相補的な配列が標的核酸配列とハイブリダイズすることを少なくとも部分的に阻害する配列である。標的配列に対する完全に相補的な配列のハイブリダイゼーションの阻害は、低ストリンジェンシー条件でハイブリダイゼーションアッセイ（サザンまたはノザンブロット、溶液ハイブリダイゼーション等）を用いて調べてもよい。実質的に相同な配列またはプローブは、低ストリンジェンシー条件で、標的配列に対する完全に相同な配列の結合（すなわち、ハイブリダイゼーション）と競合して阻害するであろう。これは、低ストリンジェンシー条件が非特異的結合が許容される条件であると言っているわけではない；低ストリンジェンシー条件は、二つの配列の互いの結合が特異的（すなわち、選択的）相互作用となる必要がある。非特異的結合がないことは、部分的な程度の相補性も欠損する（例えば、約３０％未満の同一性）第二の標的配列を用いることによって調べてもよく；非特異的結合が存在しなければ、プローブは、第二の非相補的標的とハイブリダイズしないであろう。
【００６０】
本明細書において用いられるように、「ストリンジェンシー」という用語は、核酸ハイブリダイゼーションが実施される、温度、イオン強度、および有機溶媒のような他の化合物の存在に関する条件に関して用いられる。「ストリンジェンシー」は、典型的に約Ｔｍ℃〜Ｔｍより約２０℃〜２５℃下の範囲で起こる。当業者によって理解されるように、ストリンジェントなハイブリダイゼーションは、同一のポリヌクレオチド配列を同定もしくは検出するために、または類似もしくは関連するポリヌクレオチド配列を同定もしくは検出するために用いることができる。「ストリンジェントな条件」では、配列番号：１、配列番号：３、配列番号：４、および配列番号：５のヌクレオチド配列またはその一部は、その正確に相補的な密接に関連した配列とハイブリダイズするであろう。
【００６１】
低ストリンジェンシー条件は、長さが約１００〜約１０００ヌクレオチドのプローブを用いる場合、５×ＳＳＰＥ（４３．８ ｇ／ｌ ＮａＣｌ、６．９ ｇ／ｌ ＮａＨ２ＰＯ４・Ｈ２Ｏ、および１．８５ ｇ／ｌ ＥＤＴＡ、ＮａＯＨによってｐＨを７．４に調節）、０．１％ＳＤＳ、５×デンハルト試薬（５０×デンハルトは５００ ｍｌあたり、フィコール（タイプ４００、ファルマシア社）５ｇ、ＢＳＡ（分画Ｖ、シグマ社）５ｇを含む）、および１００ μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡからなる溶液中で６８℃で結合またはハイブリダイゼーションの後に２．０×ＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳを含む溶液中で室温で洗浄することに等しい条件を含む。
【００６２】
低ストリンジェンシー条件を含む多数の同等の条件を用いてもよいことは当技術分野において周知である；プローブの長さおよび性質（ＤＮＡ、ＲＮＡ、塩基組成）のような要因および標的の性質（ＤＮＡ、ＲＮＡ、塩基対組成、溶液で存在するか、固定されているか等）、ならびに塩および他の成分（例えばホルムアミド、硫酸デキストラン、ポリエチレングリコールの有無）の濃度と共に、ハイブリダイゼーション溶液の成分は、上記の条件とは異なるが同等の低ストリンジェンシーハイブリダイゼーションの条件を得るために変更してもよい。さらに、高ストリンジェンシー条件でハイブリダイゼーションを促進する条件（例えば、ハイブリダイゼーションおよび／または洗浄段階の温度を上昇させる、ハイブリダイゼーション溶液にホルムアミドを用いる等）は、当技術分野で周知である。核酸ハイブリダイゼーションに関して用いられる場合、高ストリンジェンシー条件は、長さが約１００〜約１０００ヌクレオチドのプローブを用いる場合、５×ＳＳＰＥ、１％ＳＤＳ、５×デンハルト試薬および１００ μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡからなる溶液中で６８℃での結合またはハイブリダイゼーションの後、０．１×ＳＳＰＥ、および０．１％ＳＤＳを含む溶液中で６８℃での洗浄を行うことに等しい条件を含む。
【００６３】
ｃＤＮＡまたはゲノムクローンのような二本鎖核酸配列に関して用いる場合、「実質的に相同な」という用語は、記述のように低ストリンジェンシー条件で二本鎖核酸配列のいずれかの鎖または双方の鎖と部分的または完全にハイブリダイズすることができる如何なるプローブも意味する。
【００６４】
一本鎖核酸配列に関して用いる場合、「実質的に相同な」という用語は、記述のように低ストリンジェンシー条件で一本鎖核酸配列とハイブリダイズすることができる如何なるプローブも意味する。
【００６５】
本明細書において用いられるように、「ハイブリダイゼーション」という用語は、それによって、塩基対形成を通して核酸の鎖が相補鎖と結合してハイブリダイゼーション複合体を形成する如何なるプロセスも用いる相補的核酸の対形成に関連して用いられる。ハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーション強度（すなわち、核酸間の会合強度）は、核酸間の相補性の程度、関係する条件のストリンジェンシー、形成されたハイブリッドのＴｍ、および核酸内のＧ：Ｃ比のような要因によって影響を受ける。
【００６６】
本明細書において用いられるように、「ハイブリダイゼーション複合体」という用語は、相補的なＧおよびＣ塩基間、ならびに相補的なＡおよびＴ塩基間の水素結合の形成によって二つの核酸配列のあいだに形成された複合体を意味する；これらの水素結合は塩基のスタッキング相互作用によってさらに安定化される可能性がある。二つの相補的核酸配列の水素結合は逆平行方向である。ハイブリダイゼーション複合体は、溶液中で形成されてもよく（例えば、Ｃ０ｔまたはＲ０ｔ分析）、または溶液中に存在する一つの核酸配列と固相支持体（例えば、サザンおよびノザンブロッティング、ドットブロッティングにおいて用いられるナイロンメンブレンもしくはニトロセルロースフィルター、またはＦＩＳＨ（蛍光インサイチューハイブリダイゼーション）を含むインサイチューハイブリダイゼーションにおいて用いられるスライドガラス）に固定したもう一つの核酸配列とのあいだで形成してもよい。
【００６７】
本明細書において用いられるように、「Ｔｍ」という用語は、「融解温度」に関連して用いられる。融解温度は、二本鎖核酸分子集団の半分が解離して一本鎖となる温度である。核酸のＴｍを計算する等式は当技術分野で周知である。標準的な参考文献によって示されるように、Ｔｍ値の単純な推定値は、核酸が１Ｍ ＮａＣｌ水溶液中に存在する場合、以下の等式によって計算してもよい：Ｔｍ＝８１．５＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）（例えば、アンダーソン＆ヤング（Ａｎｄｅｒｓｏｎ ａｎｄ Ｙｏｕｎｇ）、「定量的フィルターハイブリダイゼーション（Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ Ｆｉｌｔｅｒ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）」、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ［１９８５］を参照のこと）。他の引用文献には、Ｔｍを計算するために配列のみならず構造の特徴を考慮に入れる、より複雑な計算が含まれる。
【００６８】
「増幅」は、本明細書において核酸配列のさらなるコピーの産生として定義され、一般的に当技術分野で周知のポリメラーゼ連鎖反応技術を用いて行われる（例えば、ディーフェンバック＆ドベクスラー（Ｄｉｅｆｆｅｎｂａｃｈ ａｎｄ Ｄｖｅｋｓｌｅｒ）、「ＰＣＲプライマー、実験マニュアル（ＰＣＲ Ｐｒｉｍｅｒ， ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」、コールドスプリングハーバー出版、プレインビュー、ニューヨーク州［１９９５］を参照のこと）。本明細書において用いられるように、「ポリメラーゼ連鎖反応」（「ＰＣＲ」）という用語は、その全文が参照として本明細書に組み入れられる、米国特許第４，６８３，１９５号、第４，６８３，２０２号、および第４，９６５，１８８号の方法を意味し、それらの特許はクローニングまたは精製を行わずにゲノムＤＮＡの混合物における標的配列のセグメントの濃度を増加させる方法を記述する。所望の標的配列の増幅されたセグメントの長さは、互いに関連して二つのオリゴヌクレオチドプライマーの相対的な位置によって決定される。プロセスの反復局面のために、方法は、「ポリメラーゼ連鎖反応」（以降「ＰＣＲ」と呼ぶ）と呼ばれる。標的配列の所望の増幅セグメントが混合物において優勢な配列（濃度に関して）となれば、それらは「ＰＣＲ増幅された」と言われる。
【００６９】
ＰＣＲに関して、ゲノムＤＮＡにおける特異的標的配列の単一のコピーをいくつかの異なる方法論によって検出可能なレベルまで増幅することが可能である（例えば、標識したプローブとのハイブリダイゼーション；ビオチン結合プライマーの組み込み後アビジン−酵素結合体の検出；ｄＣＴＰまたはｄＡＴＰのような３２Ｐ−標識デオキシヌクレオチド三燐酸の増幅セグメントへの組み込み）。ゲノムＤＮＡの他に、如何なるオリゴヌクレオチド配列も適当な組のプライマー分子によって増幅することができる。特に、ＰＣＲプロセスそのものによって作製された増幅セグメントは、それ自身、その後のＰＣＲ増幅の効率的な鋳型である。
【００７０】
「逆転写ポリメラーゼ連鎖反応」および「ＲＴ−ＰＣＲ」という用語は、ｃＤＮＡ配列の混合物を生成するためにＲＮＡ配列を逆転写した後、クローニングまたは精製を行わずに混合物において転写されたｃＤＮＡ配列の所望のセグメントの濃度を増加させる方法を意味する。単一のプライマー（例えば、オリゴ−ｄＴプライマー）を用いてＲＮＡを逆転写してから、二つのプライマーを用いて転写されたＤＮＡの所望のセグメントのＰＣＲ増幅を行う。
【００７１】
本明細書において用いられるように、「プライマー」という用語は、精製された制限消化物のように天然に存在するか、または合成によって産生されたかによらず、核酸の鎖に対して相補的なプライマー伸長産物の合成が誘導される条件（すなわち、ヌクレオチドおよびＤＮＡポリメラーゼのような誘導物質の存在下で適した温度およびｐＨで）に置いた場合に、合成の開始点として作用することができるオリゴヌクレオチドを意味する。プライマーは、増幅効率が最高となるように好ましくは一本鎖であるが、または二本鎖であってもよい。二本鎖の場合、プライマーは、最初にその鎖を分離するための処理を行ってから、伸長産物を調製するために用いられる。好ましくは、プライマーは、オリゴデオキシリボヌクレオチドである。プライマーは、誘導物質の存在下で伸長産物の合成をプライミングするために十分に長くなければならない。プライマーの正確な長さは、温度、プライマーの起源、および用いる方法を含む多くの要因に依存するであろう。
【００７２】
本明細書において用いられるように、「プローブ」という用語は、精製された制限消化物のように天然に存在するか、または合成によって、組み換えによって、もしくはＰＣＲ増幅によって産生されたかによらず、関係するもう一つのオリゴヌクレオチドとハイブリダイズすることができるオリゴヌクレオチド（すなわちヌクレオチドの配列）を意味する。プローブは、一本鎖または二本鎖であってもよい。プローブは、特定の遺伝子配列を検出、同定、および単離するために有用である。本発明において用いられる如何なるプローブも、酵素（例えば、ＥＬＩＳＡと共に酵素に基づく組織化学アッセイ）、蛍光、放射活性および発光系を含むがこれらに限定されない如何なる検出系においても検出可能となるように、如何なる「レポーター分子」によっても標識されると意図される。本発明は如何なる特定の検出系または標識に制限されないと解釈される。
【００７３】
本明細書において用いられるように、「制限エンドヌクレアーゼ」および「制限酵素」という用語は、そのそれぞれが特定のヌクレオチド配列で、またはその近傍で二本鎖または一本鎖ＤＮＡを切断する細菌の酵素を意味する。
【００７４】
本明細書において用いられるように、「遺伝子をコードするヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチド」という用語は、遺伝子のコード領域を含む核酸配列、すなわち遺伝子産物をコードする核酸配列を意味する。コード領域は、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、またはＲＮＡ型のいずれかで存在してもよい。ＤＮＡ型で存在する場合、オリゴヌクレオチドは、一本鎖（すなわちセンス鎖）または二本鎖であってもよい。必要であれば、転写の適切な開始および／または一次ＲＮＡ転写物の正しいプロセシングが行われるように、エンハンサー、プロモーター、スプライス結合部、ポリアデニル化シグナル等のような適した制御要素を、遺伝子のコード領域の近位に置いてもよい。または、本発明の発現ベクターにおいて用いられるコード領域は、内因性のエンハンサー、スプライス接合部、介在配列、ポリアデニル化シグナル等、または内因性と外因性の制御要素の双方の組み合わせを含んでもよい。
【００７５】
本明細書において用いられるように、「プロモーター」、「プロモーター要素」、または「プロモーター配列」という用語は、オリゴヌクレオチド配列の５’末端（すなわちそれより前に）置いた場合に、オリゴヌクレオチド配列のｍＲＮＡへの転写を制御することができるＤＮＡ配列を意味する。プロモーターは、典型的に、それがそのｍＲＮＡへの転写を制御するオリゴヌクレオチド配列の５’に（すなわち上流に）存在して、ＲＮＡポリメラーゼによる特異的結合部位および転写開始部位を提供する。
【００７６】
本明細書において用いられるように、「コードする核酸分子」、「コードするヌクレオチド」、「コードするＤＮＡ配列」、および「コードするＤＮＡ」という用語は、デオキシリボ核酸の鎖に沿ったデオキシリボヌクレオチドの順序または配列を意味する。これらのデオキシリボヌクレオチドの順序は、ポリペプチド（蛋白質）鎖に沿ったアミノ酸の順序を決定する。このようにＤＮＡ配列は、アミノ酸配列をコードする。
【００７７】
核酸に関連して用いる場合に「単離オリゴヌクレオチド」のような「単離された」という用語は、それが通常、その天然資源において会合している少なくとも一つの混入核酸から分離されている核酸配列を意味する。単離核酸は、それが天然において認められる型または状況とは異なる型または状況で存在する核酸である。対照的に、単離されていない核酸は、それらが天然に存在する状況で認められるＤＮＡおよびＲＮＡのような核酸である。例えば、所定のＤＮＡ配列（例えば、遺伝子）は、隣接する遺伝子と近位の宿主細胞の染色体に認められる；特定の蛋白質をコードする特異的ｍＲＮＡ配列のようなＲＮＡ配列は、多数の蛋白質をコードする他のｍＲＮＡとの混合物として細胞に存在する。しかし、関係するポリペプチドをコードする単離核酸には、例として、関係するポリペプチドを通常発現する細胞において、天然の細胞とは異なる染色体もしくは染色体外の位置に存在する、またはそうでなければ本来認められる配列とは異なる核酸配列が隣接する、そのような核酸が含まれる。単離核酸またはオリゴヌクレオチドは、一本鎖または二本鎖型であってもよい。単離核酸は、多様な技術（例えば、ハイブリダイゼーション、ドットブロット等）によって容易に同定する（望ましければ）ことができる。蛋白質を発現するために単離核酸またはオリゴヌクレオチドを利用する場合、オリゴヌクレオチドは、少なくともセンスまたはコード鎖を含むであろう（すなわち、オリゴヌクレオチドは一本鎖であってもよい）。またはそれは、センス鎖とアンチセンス鎖の双方を含んでもよい（すなわち、オリゴヌクレオチドは二本鎖であってもよい）。
【００７８】
本明細書において用いられるように、構造遺伝子に関連して用いる場合、「コード領域」という用語は、ｍＲＮＡ分子の翻訳の結果として新生ポリペプチドにおいて認められるアミノ酸をコードするヌクレオチド配列を意味する。コード領域は、真核細胞において、イニシエータであるメチオニンをコードするヌクレオチドトリプレット「ＡＴＧ」によって５’側、停止コドンを明記する三つのトリプレット（すなわち、ＴＡＡ、ＴＡＧ、ＴＧＡ）の一つによって３’側の境界が定められる。
【００７９】
本明細書において用いられるように、「遺伝子」という用語は、構造遺伝子のコード領域を含むデオキシリボヌクレオチド配列を意味する。「遺伝子」はまた、遺伝子が完全長のｍＲＮＡの長さに対応するように、５’および３’末端の双方でコード領域に隣接して存在する非翻訳配列を含んでもよい。コード領域の５’に存在し、ｍＲＮＡ上に存在する配列は、５’非翻訳配列と呼ばれる。コード領域の３’または下流に存在して、ｍＲＮＡ上に存在する配列は、３’非翻訳配列と呼ばれる。「遺伝子」という用語は、遺伝子のｃＤＮＡとゲノム型の双方を含む。遺伝子のゲノム型またはクローンは、「イントロン」、または「介在領域」もしくは「介在配列」と呼ばれる非コード配列によって中断されたコード領域を含む。イントロンは、不均一な核ＲＮＡ（ｈｎＲＮＡ）に転写される遺伝子のセグメントである；イントロンは、エンハンサーのような調節要素を含んでもよい。イントロンは、核または一次転写物から除去される、または「スプライシングによって除去される」；したがって、イントロンは、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）転写物には存在しない。ｍＲＮＡは、新生ポリペプチドにおけるアミノ酸の配列または順序を指定するために翻訳のあいだ機能する。
【００８０】
イントロンを含むことの他に、遺伝子のゲノム型は、ＲＮＡ転写物に存在する配列の５’および３’末端の双方に存在する配列を含んでもよい。これらの配列は、「隣接」配列または領域と呼ばれる（これらの隣接配列は、ｍＲＮＡ転写物上に存在する非翻訳配列に対して５’または３’に存在する）。５’隣接領域は、遺伝子の転写を制御または影響を及ぼすプロモーターおよびエンハンサーのような調節配列を含んでもよい。３’隣接領域は、転写終了、転写後切断、およびポリアデニル化を指示する配列を含んでもよい。
【００８１】
細胞に関連して用いる場合に「トランスジェニック」という用語は、トランスジーンを含む細胞、またはトランスジーンの導入によってそのゲノムが変化している細胞を意味する。組織または植物に関して用いる場合、「トランスジェニック」という用語は、トランスジーンを含む一つもしくはそれ以上の細胞を含む、またはそのゲノムがトランスジーンの導入によって変化している組織もしくは植物を意味する。トランスジェニック細胞、組織、および植物は、核酸（通常、ＤＮＡ）を含む「トランスジーン」を標的細胞に導入すること、または本明細書に記載の方法のような、ヒトの介入によって標的細胞の染色体にトランスジーンを組み入れることを含むいくつかの方法によって作製してもよい。
【００８２】
本明細書において用いられるように、「トランスジーン」という用語は、実験操作によって細胞のゲノム導入された如何なる核酸配列も意味する。トランスジーンは、「内因性ＤＮＡ配列」、または「異種ＤＮＡ配列」（すなわち、「外来ＤＮＡ」）であってもよい。「内因性ＤＮＡ配列」という用語は、それが天然に存在する配列と比較して何らかの変異（例えば、点突然変異、選択マーカー遺伝子の存在等）を含まない限り、導入された細胞において本来認められるヌクレオチド配列を意味する。「異種ＤＮＡ配列」という用語は、本来ライゲーションされない核酸配列、または本来異なる位置にライゲーションされる核酸配列に対して、ライゲーションされるまたはライゲーションされるように操作されたヌクレオチド配列を意味する。異種ＤＮＡは、それが導入される細胞に対して内因性ではないが、もう一つの細胞から得られている。異種ＤＮＡにはまた、何らかの改変を含む内因性ＤＮＡ配列が含まれる。一般的に、必要ではないが、異種ＤＮＡは、発現される細胞によって通常産生されないＲＮＡおよび蛋白質をコードする。異種ＤＮＡの例には、レポーター遺伝子、転写および翻訳調節配列、選択マーカー蛋白質（例えば、薬剤抵抗性遺伝子を付与する蛋白質）等が含まれる。
【００８３】
「外来遺伝子」という用語は、実験操作によって細胞のゲノムに導入された如何なる核酸（例えば、遺伝子配列）も意味し、導入された遺伝子が天然に存在する遺伝子と比較して何らかの改変（例えば、点突然変異、選択マーカー遺伝子の存在等）を含む限り、細胞に認められる遺伝子配列を含んでもよい。
【００８４】
本明細書において用いられるように、「形質転換」という用語は、細胞へのトランスジーンの導入を意味する。細胞の形質転換は安定または一過性であってもよい。「一過性の形質転換」、または「一過性に形質転換された」という用語は、宿主細胞ゲノムにトランスジーンが組み入れられていない細胞に、一つまたはそれ以上のトランスジーンを導入することを意味する。一過性の形質転換は、例えば、一つまたはそれ以上のトランスジーンによってコードされるポリペプチドの存在を検出する酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）によって検出してもよい。または、一過性の形質転換は、本明細書において証明されるように、トランスジーン（例えば、ｕｉｄ Ａ遺伝子）によってコードされる蛋白質（例えば、β−グルクロニダーゼ）の活性を検出することによって検出してもよい［例えば、ＧＵＳ酵素の存在下で青色の沈殿物を生じるＸ−ｇｌｕｃ染色によるＧＵＳ酵素活性の組織化学アッセイ；およびＧＵＳ−光キット（トロピクス社）を用いるＧＵＳ酵素活性の化学発光アッセイ］。「一過性の形質転換体」という用語は、一つまたはそれ以上のトランスジーンを一過性に組み入れた細胞を意味する。対照的に、「安定な形質転換」、または「安定に形質転換された」という用語は、細胞のゲノムに一つまたはそれ以上のトランスジーンが導入され、組み入れられることを意味する。細胞の安定な形質転換は、一つまたはそれ以上のトランスジーンに結合することができる核酸配列と細胞のゲノムＤＮＡとのサザンブロットハイブリダイゼーションによって検出してもよい。または、細胞の安定な形質転換はまた、トランスジーン配列を増幅するために細胞のゲノムＤＮＡのポリメラーゼ連鎖反応によって検出してもよい。「安定な形質転換体」という用語は、ゲノムＤＮＡに一つまたはそれ以上のトランスジーンを安定に組み入れた細胞を意味する。このように、安定な形質転換体は、安定な形質転換体からのゲノムＤＮＡが一つまたはそれ以上のトランスジーンを含むが、一過性の形質転換体からのゲノムＤＮＡはトランスジーンを含まないという点において、一過性の形質転換体とは区別される。
【００８５】
「形質転換細胞」は、何代もの世代にわたって細胞培養における増殖能、軟寒天での増殖能、および細胞−細胞接触によって細胞の増殖が阻害されないことを獲得した細胞または細胞株である。この点において、形質転換は、細胞または生物に外来遺伝子材料を導入することを意味する。形質転換は、核酸の細胞への導入を成功させる、そしてその結果導入された核酸が発現される如何なる既知の方法によって行ってもよい。「形質転換」法には、マイクロインジェクション、電気穿孔、およびＤＮＡ粒子「衝突」のような方法が含まれるがこれらに限定されない。形質転換は、如何なる発現ベクターも用いて行ってもよい。例えば、植物細胞に外来核酸を導入するためにアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）を用いることが意図される。さらに、形質転換は、通常遺伝子変異を通して、天然に形質転換された細胞を意味する。
【００８６】
「アグロバクテリア（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）」という用語は、根頭癌腫病を引き起こす土壌系のグラム陰性の桿状の植物病原菌を意味する。「アグロバクテリア」という用語には、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）（典型的に感染植物において根頭癌腫病を引き起こす）種とアグロバクテリウム・リゾゲンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｈｉｚｏｇｅｎｓ）（感染宿主植物において毛根病を引き起こす）種が含まれるがこれらに限定されない。植物細胞にアグロバクテリアが感染すると、感染細胞によるオピン（例えば、ノパリン、アグロピン、オクトピン等）の産生が起こる。このように、ノパリンの産生を引き起こすアグロバクテリア種（例えば、株ＬＢＡ４３０１、Ｃ５８、Ａ２０８）は、「ノパリン型」アグロバクテリアと呼ばれ、オクトピンの産生を引き起こすアグロバクテリア種（例えば、株ＬＢＡ４４０４、Ａｃｈ５、Ｂ６）は、「オクトピン型」アグロバクテリアと呼ばれ；そしてアグロピンの産生を引き起こすアグロバクテリア種（例えば、株ＥＨＡ１０５、ＥＨＡ１０１、Ａ２８１）は、「アグロピン型」アグロバクテリアと呼ばれる。
【００８７】
「衝突する」、「衝突」、および「バイオリスティック（ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ）衝突」という用語は、標的生体試料中の細胞の細胞膜の創傷を引き起こすために、および／または標的生体試料への粒子の流入を引き起こすために、標的生体試料（例えば、細胞、組織等）に対して粒子を加速するプロセスを意味する。バイオリスティック衝突法は、当技術分野で既知であり（例えば、その内容が参照として本明細書に組み入れられる、米国特許第５，５８４，８０７号）、市販されている（例えば、ヘリウムガス駆動微小発射物加速器（ＰＤＳ−１０００／Ｈｅ）（バイオラド社））。
【００８８】
植物組織に関して行う場合の「微小創傷」という用語は、その組織における顕微鏡的創傷の導入を意味する。微小創傷は、本明細書に記載するように、例えば、粒子衝突によって得てもよい。
【００８９】
本明細書において用いられるように、「植物」という用語は、植物発達の如何なる段階にも存在する、ある構造に十分に分化した複数の植物細胞を意味する。そのような構造には、果実、苗条、茎、葉、花弁等が含まれるがこれらに限定されない。「植物組織」という用語には、根、苗条、葉、花粉、種子、腫瘍組織、および様々なタイプの細胞培養物（例えば、単細胞、プロトプラスト、胚、カルス、プロトコルム様体等）を含むがこれらに限定されない植物の分化および未分化組織が含まれる。植物組織は、植物内、器官培養、組織培養、または細胞培養であってもよい。
【００９０】
植物細胞に関して本明細書において用いられる「胚細胞」という用語は、植物組織または植物に分化することができる一つまたはそれ以上の植物細胞（分化または未分化によらず）を意味する。胚細胞には、イチゴ、蓮、ウマゴヤシ、オノブリキス（Ｏｎｏｂｒｙｃｈｉｓ）、ジャジクソウ、トリゴネラ（Ｔｒｉｇｏｎｅｌｌａ）、ササゲ、柑橘類、アマ、ゼラニウム、キャッサバ、ニンジン、シロイヌナズナ、アブラナ、ダイコン、カラシ、ロウトウ、トウガラシ、ヒヨス、トマト、タバコ、ナス、ペチュニア、ジギタリス、マジョラナ、シオホリウム（Ｃｉｏｈｏｒｉｕｍ）、ヒマワリ、レタス、ブロムグラス、アスパラガス、キンギョソウ、ヘレロカリス（Ｈｅｒｅｒｏｃａｌｌｉｓ）、ネメシア、ペラルゴニウム、キビ、チカラシバ、キンポウゲ、サワギク、サルピグロッシス、キュウリ、ブロワリア、ダイズ、ライグラス、トウモロコシ、コムギ、モロコシ、およびチョウセンアサガオ属に由来するようなプロトプラストが含まれるがこれらに限定されない。同様に、胚（モロコシ、トウモロコシ、バナナの胚のような）、胚分裂組織（大豆の胚分裂組織のような）、胚発生カルス（サトウキビのカルスのような）、プロトコルム様体（パインアップルのような）、およびニンニクの胚発生細胞によって示される胚発生細胞が含まれる。胚細胞の植物への分化能は、当技術分野で既知の方法によって決定される。例えば、パインアップルのプロトコルム様体の苗条への分化は、寒天固化ホルモン不含改変ムラシゲ＆スクーグ（ＭＳ）培地または寒天固化ＰＭ２培地（参照として本明細書に組み入れられる、米国特許第６，０９１，００３号）上でプロトコルム様体を培養することによって得てもよい。パインアップルの根への分化は、１ｍｇ／Ｌ ＮＡＡを含む液体改変ＭＳ培地中でプロトコルム様体を培養することによって得てもよい。
【００９１】
本明細書において用いられるように、「接合」という用語は、遺伝材料が、一つの微生物から二つの細胞のあいだの物理的結合または合体を含むもう一つの微生物に転移するプロセスを意味する。このプロセスは、細菌、原虫、ならびに特定の藻類および菌類において起こることが一般的に知られている。
【００９２】
発明の詳細な説明
本発明は、ウリジン−５’−ジホスホスルホキノボース（ＵＤＰ−ＳＱ）の合成およびその後の改変法に関する。
【００９３】
１．ウリジン−５’−ジホスホスルホキノボース生合成法
本発明の方法は、ＵＤＰ−ＳＱを合成するために、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）の組み換え型酵素、ＵＤＰ−グルコース、および硫黄供与体を利用することを含む。本発明は、如何なる特定の反応機構に限定されないが、一つの態様において、ＵＤＰ−グルコース、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）組み換え型ＳＱＤ１酵素蛋白質、および亜硫酸塩を含む反応混合物からのＵＤＰ−ＳＱの産生が意図される（図１を参照のこと）。
【００９４】
ウリジン−５’−ジホスホスルホキノボース（ＵＤＰ−ＳＱ）の生合成
シロイヌナズナの組み換え型ＳＱＤ１酵素蛋白質は、ＵＤＰ−グルコースおよび硫黄供与体からのスルホン酸前駆体ＵＤＰ−ＳＱの形成を触媒する。一つの態様において、ＵＤＰ−ＳＱ産生反応は、精製ＳＱＤ１蛋白質、Ｎａ２ＳＯ３、放射標識ＵＤＰ−グルコース、およびトリスを含む緩衝液において３７℃で４０分行う。次に、反応混合物を熱変性させて、組み換え型酵素を不活化して、１０，０００×ｇで５分間遠心する。ＳＱＤ１活性の反映としてのＵＤＰ−ＳＱの産生を下記のように検出する。
【００９５】
本発明によって意図されるＵＤＰ−ＳＱの生合成は、如何なる特定のｐＨ値に限定されない。一つの態様において、ｐＨは７．０〜９．５のあいだである。好ましい態様において、反応のｐＨは７．５である。
【００９６】
本発明は、如何なる特定の硫黄供与体を用いることに限定されないが、一つの態様において、硫黄供与体は、硫酸塩、硫化物、チオ硫酸塩、スルホグルタチオン、アデノシン−５’−ホスホスルフェート（ＡＰＳ）、および３’−ホスホアデノシン−５’−ホスホスルフェート（ＰＡＰＳ）を含む群から選択される。好ましい態様において、硫黄供与体は亜硫酸塩である（実施例１も参照のこと）。
【００９７】
本発明の方法によって産生されたウリジン−５’−ジホスホスルホキノボース（ＵＤＰ−ＳＱ）の検出
本発明は、上記の生合成法の最終産物としてＵＤＰ−ＳＱを検出する如何なる特定の手段にも限定されない。一つの態様において、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いることを含むＵＤＰ−ＳＱの産生を検出する手段は、以下の通りである。例えば、熱変性反応混合物に、４２℃に維持したベックマン（フュラートン、カリフォルニア州）ウルトラスフェアＯＤＳカラム（４．６ ｍｍ×２５ ｃｍ、粒子径５μＭ）を用いるＨＰＬＣによる分析を行う（ウォータース社、ミルフォード、マサチューセッツ州）。ＫＯＨによってｐＨ ６．０に調節した３０ ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、２ｍＭ水酸化テトラブチルアンモニウム（フィッシャーサイエンティフィック、フェアローン、ニュージャージー州）の直線勾配をＨＰＬＣ等級のアセトニトリル（ＥＭサイエンス、ギブスタウン、ニュージャージー州）に流速１ｍｌ／分で４５分間適用することによって、基質および産物を分離する。上記のＨＰＬＣ系において、反応によって産生された主要化合物は、真正ＵＤＰ−ＳＱと同時クロマトグラフされ、この化合物がＵＤＰ−ＳＱであること、そして精製ＳＱＤ１が、アッセイにおいて産生されたＵＤＰ−ＳＱの合成を触媒することを示している。
【００９８】
シロイヌナズナ組み換え型ＳＱＤ１酵素蛋白質の産生
エッシンマンら（Ｅｓｓｉｎｇｍａｎ、「ホスフェートの利用率はチラコイド脂質組成およびシロイヌナズナにおけるスルホリピッドの生合成にとって必要な遺伝子であるＳＱＤ１の発現に影響を及ぼす（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ Ａｆｆｅｃｔｓ ｔｈｅ Ｔｈｙｌａｋｏｉｄ Ｌｉｐｉｄ Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＳＱＤ１， ａ Ｇｅｎｅ Ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ Ｓｕｌｆｏｌｉｐｉｄ Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｉｎ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）」、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９５：１９５０〜９５５（１９９８））は、ＰＣＲに基づく戦略を用いて大腸菌におけるシロイヌナズナの組み換え型ＳＱＤ１蛋白質の産生を開示し、ＳＱＤ１がＵＤＰ−グルコースからのＵＤＰ−ＳＱの生合成に関係していると推測している。
【００９９】
本発明は、ＵＤＰ−ＳＱの産生において用いられる組み換え型ＳＱＤ１酵素を産生するための如何なる特定の方法に限定されない。一つの態様において、配列番号：６に記載のアミノ酸配列を有するシロイヌナズナの組み換え型ＳＱＤ１酵素蛋白質を産生する手段は、以下の通りである。
【０１００】
チラコイド膜のヘッドグループ生合成に関係する酵素をコードするシロイヌナズナの遺伝子を単離するために、発現された配列タグに関するｄｂＥＳＴデータベースを、ＴＢＬＡＳＴＮを用いて細菌ｓｑｄＢ遺伝子の予想アミノ酸配列に関して検索した。この検索を通して、細菌ｓｑｄＢ遺伝子産物と高度の配列類似性を有する推定の蛋白質をコードする部分的なコメｃＤＮＡ（ＥＳＴ Ｄ４６４７７）が発見された。（図１７；配列番号：８を参照のこと）。部分的なコメｃＤＮＡの断片をプローブとして用いて、異種ＤＮＡハイブリダイゼーションによってシロイヌナズナＰＲＬ２ ｃＤＮＡライブラリをスクリーニングした。本発明は、如何なる特定のハイブリダイゼーション条件またはメンブレンに限定されないが、ハイボンドＮ＋（アマシャム社）メンブレンを用い、ハイブリダイゼーションは、ＳＤＳ、ＥＤＴＡ、およびＢＳＡを含む燐酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ ７．２）において５３℃で行った。ハイブリダイゼーション後、メンブレンをＳＳＰＥ、ＳＤＳ溶液中で５３℃で２０分間２回洗浄した。１，７９９塩基対のインサートを有するクローンを含むいくつかのｃＤＮＡクローンを単離して、これをシークエンシングした（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ０２２０８２）（図１３；配列番号：５を参照のこと）。シロイヌナズナの対応する座をＳＱＤ１と命名し、１，７９９ ｂｐのインサートを有するｃＤＮＡを含むプラスミドをｐＳＱＤ１と命名した。（実施例２．ａも参照のこと）。
【０１０１】
本発明は、組み換え型ＳＱＤ１蛋白質を発現する如何なる特定の手段にも限定されない。一つの態様において、組み換え型ＳＱＤ１蛋白質を大腸菌において発現させるために、ｐＳＱＤ１の断片を、ＰＣＲに基づく戦略を用いて、Ｈｉｓ−タグ発現ベクターｐＱＥ−３０（キアゲンインク、バレンシア、カリフォルニア州；カタログ番号３２１４９）（図３を参照）にクローニングした。本発明は、如何なる特定の蛋白質発現ベクターまたは系を用いることに限定されない。一つの態様において、蛋白質発現ベクターは、ｐＱＥ−９、ｐＱＥ−１６、ｐＱＥ−３１、ｐＱＥ−３２、ｐＱＥ−４０、ｐＱＥ−６０、ｐＱＥ−７０、ｐＱＥ−８０、ｐＱＥ−８１、ｐＱＥ−８２、ｐＱＥ−１００（全てキアゲンインク、バレンシア、カリフォルニア州から入手可能）を含む群から選択される。もう一つの態様において、蛋白質発現ベクターは、ｐＡＣＹＣ１８４（ニューイングランドバイオラブス、ビバリー、マサチューセッツ州；カタログ番号Ｅ４１５２Ｓ）である。（図６を参照のこと）。好ましい態様において、蛋白質発現ベクターはｐＱＥ−３０である（図３を参照のこと）。
【０１０２】
本発明は、組み換え型ＳＱＤ１蛋白質を精製する如何なる特定の手段に限定されない。一つの態様において、得られたプラスミド構築物、ｐＳＱＤ１−ＴＰによって、組み換え型ＳＱＤ１蛋白質を大腸菌において発現させることができ、製造元（キアゲンインク、バレンシア、カリフォルニア州：カタログ番号３０２１０）の説明書に従って、ニッケルニトリロ酢酸（Ｎｉ−ＮＴＡ）アガロース樹脂に対する６個のＮ−末端ヒスチジン残基の選択的結合により蛋白質を精製すること可能となった。組み換え型蛋白質を溶出して、グリセロール、ＮａＣｌ、およびＮａＨ２ＰＯ４（ｐＨ ７．５）を含む緩衝液において−２０℃で保存した。ＳＱＤ１蛋白質は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル分析によって約９５％純粋であると推定された（図４を参照のこと）。
【０１０３】
ＳＱＤ１活性を測定するためのアッセイ
本発明は、本発明によって産生された組み換え型ＳＱＤ１蛋白質の活性を測定する如何なる特定の手段に限定されない。一つの態様において、ＳＱＤ１活性の反映として、ＵＤＰ−グルコースのＵＤＰ−ＳＱへの変換を測定する酵素アッセイを開発した。基礎活性アッセイは、精製ＳＱＤ１蛋白質、Ｎａ２ＳＯ３、放射標識ＵＤＰ−グルコース、およびトリス（ｐＨ ７．５）を含む反応混合物において全量１００ μｌで３７℃で４０分間行った。反応混合物を１０分間インキュベートして、熱変性させ、遠心して、ＨＰＬＣによって分析した。ＫＯＨによってｐＨ ６．０に調節したＫＨ２ＰＯ４、水酸化テトラブチルアンモニウム（フィッシャーサイエンティフィック社、フェアローン、ニュージャージー州）の直線勾配をＨＰＬＣ等級のアセトニトリル（ＥＭサイエンス社、ギブスタウン、ニュージャージー州）に適用することによって、基質および産物を分離した。
【０１０４】
上記のようにＳＱＤ１蛋白質を標識したＵＤＰ−グルコースと共にインキュベートした結果、ＨＰＬＣによって分析すると、ＵＤＰ−グルコースと比較して独自の保持時間を有する２つの化合物が形成された。上記のＨＰＬＣ系において、一つの化合物が真正のＵＤＰ−ＳＱと共にクロマトグラフされた、このことは、この化合物がＵＤＰ−ＳＱであること、そして精製ＳＱＤ１がこのアッセイにおいて生成されたＵＤＰ−ＳＱの合成を触媒することを示した。（実施例１および２．ｂも参照のこと）。
【０１０５】
２．６−スルホ−α−Ｄ−キノボシルジアシルグリセロール（ＳＱＤＧ）の生合成
本発明の方法は、６−スルホ−α−Ｄ−キノボシルジアシルグリセロール（ＳＱＤＧ）を含むがこれに限定されない化合物を形成するためにＵＤＰ−ＳＱをその後改変することをさらに含む。本発明は、如何なる特定の反応機構に限定されないが、一つの態様において、ＵＤＰ−ＳＱ、ジアシルグリセロール、およびＵＤＰ−ＳＱからのスルホキノボースをジアシルグリセロールに転移させることができる組み換え型ペプチドを含む反応混合物からのＳＱＤＧの産生が、以下のように意図される。（図５を参照のこと）。
【０１０６】
一つの態様において、ＳＱＤＧは、１００ μＭ ＵＤＰ−ＳＱ、１００ μＭジアシルグリセロール、および配列番号：１に記載した核酸配列によってコードされる遺伝子産物である実質的に精製されたペプチド１０ μｇを反応容積１００ μｌで３７℃で４０分間反応させることによる手段を含む反応において生成される。もう一つの態様において、上記のペプチドは、配列番号：３に記載の核酸配列によってコードされる遺伝子産物である。もう一つの態様において、上記のペプチドは配列番号：４に記載の核酸配列によってコードされる遺伝子産物である。
【０１０７】
本発明は、上記の方法によってＳＱＤＧの生成を確認する特定の手段に限定されない。一つの態様において、ＳＱＤＧの生成は以下の手段によって確認する。上記の反応物の少量を、活性化硫酸アンモニウム含浸シリカゲルＴＬＣプレート上でアセトン−トルエン−水（９１：３０：８、容積／容積／容積）を含む溶媒系によって薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）によって分析する。次に、上記の反応産物をヨウ素蒸気によって可視化して、ＳＱＤを含むことがわかっているシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）の葉の脂質抽出物と同時クロマトグラフすることによって同定する（図９を参照のこと）。もう一つの態様において、ＳＱＤＧの生成は、反応産物がＴＬＣプレートから単離されて、これを用いて脂肪酸メチルエステルを調製する定量的分析によって確認する。メチルエステルは、下記のように、内部標準としてミリスチン酸を用いるガスクロマトグラフィーによって定量する。
【０１０８】
薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）によるＳＱＤＧ産生の検出
脂質ＳＱＤＧを産生することがわかっているＲ．スファエロイデス（Ｒ． ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ）細胞の変異誘発集団からの無作為に選択したコロニーを、新鮮なＺ−ブロスプレート上で小片として（０．５ ｃｍ×０．５ ｃｍ）画線培養する。細胞を平坦な爪楊枝の広い末端部に採取して、材料を、ポリプロピレン遠心管においてクロロホルム−メタノール（１：１、容積／容積）７５ μｌ中で材料を旋回させることによって、脂質をこれらの小片から単離する。１Ｎ ＫＣｌ−０．２ Ｍ Ｈ３ＰＯ４ ２５ μｌを添加した後、試験管をボルテックスによって攪拌して、有機相と水相とを遠心分離する。脂質を含む下層から１０ μｌの少量を採取して、これを活性化硫酸アンモニウム含浸シリカゲル薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）プレート上に直接スポットする。この目的に関して、前吸着層を有するベイカーＳｉ２５０シリカプレートは、０．１５ Ｍ硫酸アンモニウムに３０秒間含浸した後、完全に乾燥するまで空気乾燥させることによって調製する。使用直前に、プレートを１２０℃で２．５時間活性化する。硫酸アンモニウム処置プレートを１２０℃で活性化させると、硫酸を発生させ、これはホスファチジルグリセロールをプロトン化してより極性を低くする。アセトン−ベンゼン−水混合物（９１：３０：８、容積／容積／容積）を溶媒系として用いる。プレートに５０％硫酸を噴霧した後、１６０℃で１０〜１５分加熱して脂質を炭化させることによって、脂質を可視化した。
【０１０９】
ＳＱＤＧの生成を確認するための定量的脂質分析
それぞれの株に関して、５０ ｍｌ培養物３本をシストロム培地において振とうさせながら３２℃の暗所で好気的に増殖させた。細胞を遠心して、水０．５ ｍｌに浮遊させ、クロロホルム−メタノール（１：１、容積／容積）４ｍｌによって攪拌して抽出した。１Ｍ ＫＣｌ−０．２ Ｍ Ｈ３ＰＯ４ １．３ ｍｌを加えて、攪拌し、遠心すると、下のクロロホルム層への脂質の相分配が得られる。クロロホルム層を採取して、Ｎ２流の下で蒸発させて０．２ ｍｌに濃縮する。試料を分割して、材料を活性化（１１０℃で３０分）シリカＴＬＣプレート（Ｓｉ２５０；ベイカー）にスポットする。プレートを２方向に、最初はクロロホルム−メタノール−水（６５：２５：４、容積／容積／容積）によって、次にクロロホルム−アセトン−メタノール−酢酸−水（５０：２０：１０：１０：５、容積）によって展開する。
【０１１０】
脂質はヨウ素蒸気によって可視化して、ヨウ素を脱着後、スポットを８ｍｌスクリューキャップ試験管に個々に掻き取った。細菌の脂質にはごく無視できる量の内因性ミリスチン酸が認められるため、試料にミリスチン酸メチルエステル５μｇのヘキサン溶液０．１ ｍｌを内部標準として加えた。脂肪酸メチルエステルは、１Ｎ無水メタノールＨＣｌ（スペルコ）１ｍｌを加えた後８０℃で１時間インキュベートすることによって調製する。０．９５％（重量／容積）ＫＣｌ１ｍｌを加えた後、脂肪酸メチルエステルをヘキサン１ｍｌによって抽出して、容積０．１ ｍｌまで乾燥させた。
【０１１１】
試料（各２μｌ）を、１００／１２０クロモソルブＷＡＷ（スペルコ）上で３％ＳＰ−２３１０および２％ＳＰ−２３００を充填した２．４ ｍカラム（内径２ｍｍ）を備えたガスクロマトグラフ（バリアン２０００）に注入した。担体ガス（Ｎ２）の流速を２０ ｍｌ／分に調節して、カラムの温度を１８０℃で２分、１０分かけて２００℃に、そして２００℃で４分に設定した。脂肪酸メチルエステルを水素炎イオン化検出器によって検出して、データをスペクトラフィジックス積分器によって積分した。分析に含めた８個の極性脂質の相対量を計算するために、各脂質に含まれる脂肪酸の量を計算した。計算の正当性は、未同定脂質を含む脂質のそれぞれが１分子あたり脂肪酸２個を含み、異なる脂質が類似の脂肪酸組成を有するという仮定に基づいた。
【０１１２】
ＵＤＰ−ＳＱからのスルホキノボースをジアシルグリセロールに転移することができる組み換え型ペプチドの産生および精製
ａ．シアノバクテリアペプチド
本発明は、ＵＤＰ−ＳＱからのスルホキノボースをジアシルグリセロールに転移することができる組み換え型ペプチドを発現させる特定の手段に限定されない。一つの態様において、配列番号：１に記載の核酸配列によってコードされる実質的に精製されたペプチドの産生手段は以下の通りである。
【０１１３】
一つの態様において、組み換え型ＳＱＤＸ蛋白質を大腸菌において発現するために、配列番号：１（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ１５５０６３）のヌクレオチド１８００〜２９３３位を含むｐＳＹＢ（実施例４を参照のこと）１，１３３塩基対断片を、ＰＣＲに基づく戦略を用いてＨｉｓタグ発現ベクターｐＱＥ−３０（キアゲンインク、バレンシア、カリフォルニア州、カタログ番号３２１４９）にクローニングした。この目的に関して、ｐＱＥ−３０へのクローニングのためにＢａｍＨＩおよびＨＩｎｄＩＩＩ部位が提供されるように、ヌクレオチド配列
2004535767.tif 000003
を有するフォワードプライマーおよびヌクレオチド配列
2004535767.tif 000004
を有するリバースプライマーを用いた。フォワードプライマーは、Ｍｅｔ開始部位（ＡＴＧ）を省略して遺伝子の最初を増幅し、第二のアミノ酸から直ちに始まる（図１６；配列番号：２を参照のこと）。リバースプライマーは、得られたＰＣＲ産物においてｓｑｄＸ遺伝子の停止コドンを含む。
【０１１４】
本発明は、如何なる特定の蛋白質発現ベクターまたは系も用いることに限定されない。一つの態様において、蛋白質発現ベクターは、ｐＱＥ−９、ｐＱＥ−１６、ｐＱＥ−３１、ｐＱＥ−３２、ｐＱＥ−４０、ｐＱＥ−６０、ｐＱＥ−７０、ｐＱＥ−８０、ｐＱＥ−８１、ｐＱＥ−８２、ｐＱＥ−１００（全てキアゲンインク、バレンシア、カリフォルニア州から入手可能）を含む群から選択される。もう一つの態様において、蛋白質発現ベクターは、ｐＡＣＹＣ１８４（ニューイングランドバイオラブズ社、ビバリー、マサチューセッツ州；カタログ番号Ｅ４１５２Ｓ）である。（図６を参照のこと）。好ましい態様において、蛋白質発現ベクターはｐＱＥ−３０である。（図３を参照のこと）。
【０１１５】
本発明は、組み換え型ＳＱＤＸ蛋白質を精製する如何なる特定の手段に限定されない。一つの態様において、得られたプラスミド構築物によって、大腸菌においてＳＱＤＸ蛋白質を発現することができ、製造元の説明書（キアゲンインク、バレンシア、カリフォルニア州；カタログ番号３０２１０）に従ってＮｉ−ＮＴＡアガロースに対するプラスミド構築物の６個のＮ−末端ヒスチジン残基の選択的結合によって蛋白質の精製を行うことが可能であった。組み換え型蛋白質を２００ ｍＭイミダゾールによって溶出し、その後イミダゾールはミリポアウルトラフリー４濃縮器（ミリポアインク、ベッドフォード、マサチューセッツ州）を用いることによって除去した。蛋白質は、２０％グリセロール、３００ ｍＭ ＮａＣｌ、および２５ ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４（ｐＨ ７．５）において−２０℃で保存した。
【０１１６】
ｂ．  シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）のペプチド−シアノバクテリアｓｑｄＸ遺伝子相同体
もう一つの態様において、ＵＤＰ−ＳＱからのスルホキノボースをジアシルグリセロールに転移することができる実質的に精製された組み換え型シロイヌナズナのペプチドの生成が意図される。一つの態様において、配列番号：３に記載の核酸配列によってコードされるシロイヌナズナのｓｑｄＸ遺伝子相同体を産生する手段を記述する。シアノバクテリアｓｑｄＸ遺伝子をシロイヌナズナのゲノム配列とＢＬＡＳＴによって比較したところ、いくつかの可能性がある相同体が判明した。一つの態様において、シアノバクテリアｓｑｄＸ遺伝子および配列番号：３に記載の核酸配列と３７％のアミノ酸同一性を有する相同体であるＡｔＳＱＤＸ−１が意図される。
【０１１７】
本発明は、如何なる特定のシロイヌナズナｓｑｄＸ相同体の発現に限定されないが、一つの態様において、ＡｔＳＱＤＸ−１を以下のようにクローニングして発現させる。
【０１１８】
２週齢のシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）野生型植物の葉からの総ＲＮＡを、下記のようにロゲマンら（Ｌｏｇｅｍａｎｎ、「植物組織からＲＮＡを単離するための改善された方法（Ｉｍｐｒｏｖｅｄ Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ ＲＮＡ ｆｒｏｍ Ｐｌａｎｔ Ｔｉｓｓｕｅｓ）」、Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． １６３：１６〜２０（１９８７））に従って単離する。一つの態様において、シロイヌナズナの葉から燐酸塩を枯渇して、ＳＱＤＸ配列を濃縮する。次に、単離された総ＲＮＡを、下記のように製造元の説明書に従ってオリゴテックスｍＲＮＡミニキット（キアゲン社カタログ番号７００２２）を用いてポリＡ＋ ｍＲＮＡに関して濃縮する。ＡｔＳＱＤＸ−１のオープンリーディングフレームを含むｃＤＮＡを作製するために、プロスターＨＦシングルチューブＲＴ−ＰＣＲシステム（ストラタジーン社、ラホヤ、カリフォルニア州；カタログ番号６００１６４）を用いてｍＲＮＡにｃＤＮＡ生合成を行う。蛋白質発現ベクターｐＱＥ−３０へのインフレームクローニングを行うために、ＡｔＳＱＤＸ−１（配列番号：３）（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＬ１３７１８９）の利用可能なゲノム配列に基づくプライマーをデザインする。
【０１１９】
一つの態様において、組み換え型ＡｔＳＱＤＸ−１蛋白質を大腸菌において発現させるために、配列番号：３（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＣＡＢ６９８５０）に記載の核酸配列の少なくとも一部を含むｐＳＹＢの１，４１０塩基対断片をＰＣＲに基づく戦略を用いてＨｉｓタグ発現ベクターｐＱＥ−３０（キアゲンインク、バレンシア、カリフォルニア州；カタログ番号３２１４９）にクローニングした。この目的に関して、ｐＱＥ−３０にクローニングするためにＢａｍＨＩ部位が提供されるように、ヌクレオチド配列
2004535767.tif 000005
を有するフォワードプライマー、およびヌクレオチド配列
2004535767.tif 000006
を有するリバースプライマーを用いた。
【０１２０】
本発明は、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）ｓｑｄＸ相同体を作製するために用いられる如何なる特定のプライマーに限定されない。もう一つの態様において、プライマー
2004535767.tif 000007
およびリバースプライマー
2004535767.tif 000008
は、ＳＱＤ２遺伝子のｃＤＮＡを生成する（実施例５を参照のこと）。
【０１２１】
本発明は、ＵＤＰ−ＳＱからのスルホキノボースをジアシルグリセロールに転移することができる組み換え型シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）ペプチドを作製するために、蛋白質発現ベクターに如何なる特定のヌクレオチド配列をクローニングすることに限定されない。一つの態様において、配列番号：４に記載の核酸配列の少なくとも一部を含むＳＱＤ２遺伝子の断片をｐＱＥ−３０にクローニングする。
【０１２２】
本発明は、如何なる特定の蛋白質発現ベクターまたは系を用いることに限定されない。一つの態様において、蛋白質発現ベクターは、ｐＱＥ−９、ｐＱＥ−１６、ｐＱＥ−３１、ｐＱＥ−３２、ｐＱＥ−４０、ｐＱＥ−６０、ｐＱＥ−７０、ｐＱＥ−８０、ｐＱＥ−８１、ｐＱＥ−８２、ｐＱＥ−１００の群から選択される（全てキアゲンインク、バレンシア、カリフォルニア州から入手可能）。もう一つの態様において、蛋白質発現ベクターは、ｐＡＣＹＣ１８４である（図６を参照のこと）。好ましい態様において、蛋白質発現ベクターはｐＱＥ−３０である（図３を参照のこと）。
【０１２３】
本発明は、ＵＤＰ−ＳＱからのスルホキノボースをジアシルグリセロールに転移することができる組み換え型シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）ペプチドを精製する如何なる手段に限定されない。一つの態様において、得られたプラスミド構築物によって、組み換え型ＡｔＳＱＤＸ−１蛋白質を発現することができ、製造元の説明書（キアゲンインク、バレンシア、カリフォルニア州；カタログ番号３０２１０）に従ってＮｉ−ＮＴＡアガロース樹脂に対するプラスミド構築物の６個のＮ−末端ヒスチジン残基の選択的結合によって、蛋白質の精製を行うことが可能であった。組み換え型蛋白質を２００ ｍＭイミダゾールによって溶出し、その後イミダゾールはミリポアウルトラフリー４濃縮器（ミリポアインク、ベッドフォード、マサチューセッツ州）を用いて除去した。蛋白質は、２０％グリセロール、３００ ｍＭ ＮａＣｌ、および２５ ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４（ｐＨ ７．５）において−２０℃で保存した。
【０１２４】
もう一つの態様において、ＵＤＰ−ＳＱからのスルホキノボースをジアシルグリセロールに転移することができるＳＱＤ２遺伝子産物の精製が意図される。
【０１２５】
シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）組織からの総ＲＮＡの単離
本発明は、シロイヌナズナ（Ａ． ｔｈａｌｉａｎａ）組織からの総ＲＮＡを単離するための如何なる特定の方法に限定されないと解釈される。一つの態様において、以下のように塩酸グアニジン抽出によって上記の組織から総ＲＮＡを単離する。上記の組織を液体窒素中で凍結して、ワーリングブレンダーを用いて細粉にホモジナイズする。組織が少量（０．５ ｇ未満）である場合、１．５ ｍｌエッペンドルフチューブ中で回転するピンを用いて組織をホモジナイズする。８Ｍ塩酸グアニジン、２０ ｍＭ ＭＥＳ（４−モルフォリンエタンスルホン酸）、２０ ｍＭ ＥＤＴＡ、および５０ ｍＭ ２−メルカプトエタノールを含むグアニジン緩衝液、ｐＨ ７．０の２容量を加えて、抽出物を室温でさらにホモジナイズする。
【０１２６】
塩酸グアニジン抽出物を予め冷却した（４℃）遠心機において１０，０００ ｒｐｍで１０分間遠心する。その後、浮遊する粒子を除去するために、ＲＮＡ含有上清をチーズクロス１層で濾過する。少なくとも０．２〜１．０容量のフェノール／クロロホルム／ＩＡＡを加えて蛋白質を抽出する。抽出後、混合物を１０，０００ ｒｐｍで室温で４５分間遠心して相を分離する。ＲＮＡ含有水相を採取して、ＲＮＡを沈殿させ、上清中のＤＮＡおよび残留蛋白質を除去するために、予め冷却したエタノール０．７容量および１Ｍ酢酸０．２容量と混合する。−２０℃で一晩インキュベート、または−７０℃で１時間インキュベートすることが推奨される。
【０１２７】
沈殿したＲＮＡを１０，０００ ｒｐｍで１０分間遠心して沈殿させ、滅菌３Ｍ酢酸ナトリウムによってｐＨ ５．２で室温で２回洗浄する。低分子量ＲＮＡおよび混入多糖類は溶解するが、無傷のＲＮＡは１０，０００ ｒｐｍで５分間の遠心後にペレットとして留まる。７０％エタノールによる最終洗浄によって塩を除去し、ＲＮＡペレットを滅菌水にその後溶解して必要となるまで２０℃で保存する。
【０１２８】
シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）総ＲＮＡからのポリＡ＋ ｍＲＮＡ単離
本発明は、シロイヌナズナの葉の総ＲＮＡからのポリＡ＋ ｍＲＮＡを単離する如何なる特定の手段にも限定されない。一つの態様において、以下のように製造元の説明書に従ってオリゴテックスｍＲＮＡミニキット（キアゲン社、カタログ番号７００２２）を用いて、ポリＡ＋ ｍＲＮＡをシロイヌナズナの葉の総ＲＮＡから単離した。
【０１２９】
オリゴテックス浮遊液を加熱ブロックにおいて３７℃に加熱して、ボルテックスミキサーによって混合して、室温で放置した。シロイヌナズナの葉の総ＲＮＡ ０．２５ ｍｇを含む試料を、ピペットによりＲＮアーゼ不含１．５ ｍｌ微量遠心管に採取して、反応物の容量をＲＮアーゼ不含水によって０．２５ ｍｌに調節する。緩衝液ＯＢＢ ０．２５ ｍｌの容量とオリゴテックス浮遊液０．０１５ ｍｌとを反応に加える。内容物をピペッティングによって十分に混合する。ＲＮＡの二次構造を破壊するために試料を水浴中または加熱ブロックで７０℃で３分間インキュベートした。試料を加熱ブロックから外して、室温（２０〜３０℃）で１０分間放置することによって、オリゴテックス粒子のオリゴｄＴ３０と、ｍＲＮＡのポリ−Ａテールとをハイブリダイズさせる。オリゴテックスｍＲＮＡ複合体を最高速度で２分間遠心することによって沈降させ（１４，０００〜１８，０００×ｇ）、上清をピペッティングによって除去する。
【０１３０】
オリゴテックスｍＲＮＡペレットを緩衝液ＯＷ２ ４００ μｌにおいてボルテックスミキサーによって再浮遊させ、キットに添付の小さいスピンカラムにピペッティングする。スピンカラムを最高速度（１４，０００〜１８，０００×ｇ）で１分間遠心する。スピンカラムを新しいＲＮアーゼ不含１．５ ｍｌ微量遠心管に移して、緩衝液ＯＷ２ ４００ μｌをカラムに加えた。スピンカラムを最高速度で１分間遠心して、フロースルー分画を捨てる。
【０１３１】
スピンカラムを別の１．５ ｍｌ微量遠心管に移す。熱い（７０℃）緩衝液ＯＥＢ ２０〜１００ μｌをピペットによってカラムに移す。上下に３、４回ピペッティングさせて樹脂を再浮遊させ、ｍＲＮＡを溶出させて、最高速度で１分間遠心して浮遊液を沈殿させる。ポリＡ＋ ｍＲＮＡを含むフロースルー分画を単離して、使用するまで−２０℃で保存する。
【０１３２】
シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）ｃＤＮＡの生合成
本発明は、シロイヌナズナｃＤＮＡの生合成に関する如何なる特定の方法に限定されないが、一つの態様において、上記のｃＤＮＡをプロスターＨＦシングルチューブＲＴ−ＰＣＲシステム（ストラタジーン社、ラホヤ、カリフォルニア州：カタログ番号６００１６４）を用いて以下のように生合成した。
【０１３３】
対照および実験反応は、以下の成分を以下の順に異なる滅菌０．５ ｍｌ微量遠心管に加えることによって調製する：
対照反応
ＲＮアーゼ不含水（ＤＥＰＣ−処置水ではない）    ４０．５ μｌ
１０×ＨＦ ＲＴ−ＰＣＲ緩衝液                       ５．０ μｌ
対照プライマーセット（２００ ｎｇ／μｌ）        １．０ μｌ
ｄＮＴＰミクス（４０ ｍＭ）                       １．０ μｌ
対照ｍＲＮＡ                                  １．０ μｌ
実験反応
ＲＮアーゼ不含水（ＤＥＰＣ−処置水ではない）    ３９．５ μｌ
１０×ＨＦ ＲＴ−ＰＣＲ緩衝液                       ５．０ μｌ
フォワードプライマー（１００ ｎｇ）            １．０ μｌ
リバースプライマー（１００ ｎｇ）              １．０ μｌ
ｄＮＴＰミクス（４０ ｍＭ）                       １．０ μｌ
単離ポリＡ＋ ｍＲＮＡ（０．１〜１０ ｎｇ）             １．０ μｌ
【０１３４】
使用直前に、ストラタスクリプトＲＴ（２０ Ｕ／μｌ）０．５ μｌをＲＮアーゼ不含水６．７ μｌおよび１０×ＨＦ ＲＴ−ＰＣＲ緩衝液０．８ μｌによって最終容積８．０ μｌに希釈する。希釈したストラタスクリプトＲＴ １．０ μｌを各反応物に加える。タックプラスプレシジョンＤＮＡポリメラーゼ混合物０．５ μｌを各反応物に加える。気泡を生じないように反応物をボルテックスミキサーによって軽く攪拌する。対照および実験反応をいずれもジーンアンプＰＣＲシステム９６００サーマルサイクラー（アプライドバイオシステムズ、フォスターシティ、カリフォルニア州：カタログ番号Ｎ８０１−０００１）に入れる。次に、反応に以下のサーマルサイクリングプログラムを行って、ｍＲＮＡ鋳型から一本鎖ｃＤＮＡを合成して、ｃＤＮＡをＰＣＲによって増幅する：４２℃で３０分を１サイクル；９５℃で１分を１サイクル；９５℃で３０秒、６０℃で３０秒、および６８℃で２分を含む４０サイクル；ならびに６８℃で１０分を１サイクル。
【０１３５】
サーマルサイクリングプログラムが終了した後、ＲＴ−ＰＣＲ産物を１．０％（ｗ／ｖ）アガロースゲル電気泳動によって分析する。対照ｍＲＮＡと対照プライマーセットとを含む対照反応のＲＴ−ＰＣＲ増幅は、５００塩基対の産物を生成する。反応産物は、エチジウムブロマイド染色アガロースゲルのＵＶ透視によって容易に目に見えるであろう。上記の反応によって産生されるｃＤＮＡを含む産物は、必要となるまで−２０℃で保存する。
【０１３６】
シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）組み換え型ペプチドの同時発現
本発明は、単一の宿主生物または植物において、ＵＤＰ−Ｇｌｃおよび硫黄供与体のＵＤＰ−ＳＱへの変換を触媒することができるペプチドの独立した発現に限定されないと解釈される。その上、単一の宿主生物または植物においてＵＤＰ−ＳＱからのスルホキノボースをジアシルグリセロールに転移することができる第二のペプチドの独立した発現に限定されないと解釈される。一つの態様において、本発明は、単一の宿主生物または植物において上記のペプチドをいずれも同時発現することを意図する。一つの態様において、スルホリピッド生合成経路が再構築されるように、大腸菌においてペプチドＳＱＤ１とＳＱＤＸ（例えば、異なる蛋白質発現ベクターにおいて）とを同時発現することが以下のように意図される。
【０１３７】
大腸菌において２つの蛋白質を発現させるために、蛋白質発現能を有する２つの適合性のプラスミド、すなわち一つはＳＱＤ１のため、もう一つはＳＱＤＸのためのプラスミドを利用する。それぞれのプラスミドは、プラスミドの正確な組み合わせを有する形質転換体を選択するために、異なる抗生物質抵抗性を有しなければならない。プラスミドｐＱＥ−３０は、アンピシリン抵抗性を提供し、一方プラスミドｐＡＣＹＣ１８４はクロラムフェニコール抵抗性を提供する。ＳＱＤ１コード領域は、ｐＱＥ−３０の蛋白質発現カセットと共に、制限酵素Ｘｈｏ ＩおよびＰｖｕ ＩＩを用いてこのプラスミドから採取して、Ｓａｌ ＩおよびＥｃｏＲ Ｖによって切断したｐＡＣＹＣ１８４プラスミド（ニューイングランドバイオラブズ社、ビバリー、マサチューセッツ州：カタログ番号Ｅ４１５２Ｓ）（図６を参照のこと）にライゲーションする。Ｍ１５細胞株（キアゲンインク、バレンシア、カリフォルニア州）をｐＱＥ−３０／ＳＱＤＸ蛋白質発現構築物（上記のように）によって形質転換する。ＳＱＤ１／ｐＡＣＹＣ１８４発現構築物を、ｐＱＥ−３０／ＳＱＤＸ発現ベクターを含むＭ１５細胞株に形質転換する。１〜５ｍＭイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）（アマシャムファルマシアバイオテック社、ピスキャタウェイ、ニュージャージー州：カタログ番号２７−３０５４−０３）によって発現を誘導すると、双方の蛋白質が発現される。
【０１３８】
本発明は、２つの組み換え型蛋白質の同時発現を生じる如何なる特定の蛋白質発現ベクターを用いることに限定されない。一つの態様において、蛋白質発現ベクターは、ｐＢＫ−ＣＭＶ（ストラタジーン社、ラホヤ、カリフォルニア州：カタログ番号２１２２０９）、ｐＧＥＸ−６Ｐ−１（アマシャムファルマシアバイオテック社、ピスキャタウェイ、ニュージャージー州：カタログ番号２７−４５９７−０１）、またはｐＵＣ１９（ニューイングランドバイオラブズ社、ビバリー、マサチューセッツ州：カタログ番号Ｎ３０４１Ｓ）を含む群から選択される。
【０１３９】
もう一つの態様において、スルホリピッド生合成経路が再構築されるように、実施例５ｃに記載のように、大腸菌においてペプチドＳＱＤ１とＳＱＤ２（例えば、異なる蛋白質発現ベクターにおいて）とを同時発現することが意図される。
【０１４０】
トランスジェニック植物におけるシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）組み換え型ペプチドの発現
植物細胞におけるトランスジーンの転移および発現は今では、当業者にとって日常的な業務である。これは、遺伝子発現研究を行うため、そして農業または商業的に重要な改善された植物品種を得ようとするための主要なツールとなった。本発明は、単一の宿主生物においてＵＤＰ−Ｇｌｃおよび硫黄供与体のＵＤＰ−ＳＱへの変換を触媒することができる第一のペプチド、または細菌細胞においてＵＤＰ−ＳＱからのスルホキノボースをジアシルグリセロールに転移することができる第二のペプチドの発現に限定されない。本発明は、クロー＆ベント（Ｓ． Ｃｌｏｕｇｈ ａｎｄ Ａ． Ｂｅｎｔ、「花弁の液浸：シロイヌナズナのアグロバクテリウム媒介形質転換の単純な方法（Ｆｌｏｒａｌ ｄｉｐ：ａ ｓｉｍｐｌｉｆｉｅｄ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）」、Ｐｌａｎｔ Ｊ． １６：７３５〜４３（１９９８））によって記載されるように、トランスジェニック植物におけるシロイヌナズナ組み換え型ペプチドの発現を意図する。（実施例３を参照のこと）。
【０１４１】
一つの態様において、植物細胞のゲノムに転移され、それによって組み換え型ペプチドの発現が起こるように遺伝子を操作する一般的な方法は２段階で行われる。第一に、全てのクローニングおよびＤＮＡ改変段階は大腸菌において行われ、関係する遺伝子構築物を含むプラスミドは接合によってアグロバクテリウムに転移される。第二に、得られたアグロバクテリア株を用いて植物細胞を形質転換する。このように、全般的な植物発現ベクターに関して、プラスミドは、アグロバクテリアにおいてそれを複製させる複製開始点および大腸菌において機能的な高コピー数の複製開始点を含む。これによって、植物にその後導入するためにアグロバクテリアに転移する前に、大腸菌においてトランスジーンを容易に産生して、試験することができる。抵抗性遺伝子はベクター上で運ぶことができ、一つは細菌において選択するためであり（例えば、ストレプトマイシン）、もう一つは、植物において発現される（例えば、カナマイシン抵抗性遺伝子をコードする遺伝子、またはヒグロマイシンのような除草剤に対する抵抗性をコードする遺伝子）。同様に、適当な調節配列に機能的に結合した一つまたはそれ以上のトランスジーンを付加するための制限エンドヌクレアーゼ部位、およびアグロバクテリアの転移機能によって認識された場合に、植物に転移される領域の範囲を定める指向性のＴ−ＤＮＡ境界配列も同様に存在する。
【０１４２】
もう一つの態様において、植物細胞は、その上にクローニングしたＤＮＡが沈殿するタングステン微小発射物を細胞に発射することによって形質転換してもよい。（例えば、ゴードン−カム（Ｇｏｒｄｏｎ−Ｋａｍｍ）ら、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ２：６０３（１９９０）を参照のこと）。一つの態様において、バイオリスティック装置（バイオラド社、ハーキュルズ、カリフォルニア州）は、火薬充填して発射するため（２２口径のパワーピストンツールチャージ）、または銃身を通してプラスチック製のマクロ発射物を駆動する空気爆風によって発射するために用いる。その上にＤＮＡが沈殿するタングステン粒子懸濁液の少量をプラスチック製のマクロ発射物の前に配置する。マクロ発射物を、マクロ発射物が通過するには小さすぎる穴を有するアクリル製の停止板で発火する。その結果、プラスチック製のマクロ発射物が停止板を強打して、タングステンの微小発射物は板の穴を通してその標的に向かう。本発明に関して、標的は如何なる植物細胞、組織、種子、または胚となりうる。微小発射物上で細胞に導入されたＤＮＡは、核または葉緑体のいずれかに組み込まれる。
【０１４３】
本発明は、それによって植物において如何なる特定の組み換え型シロイヌナズナ（Ａ． ｔｈａｌｉａｎａ）ペプチドの発現が得られる特定の様式に限定されないと解釈される。一つの態様において、配列番号：５に記載の核酸配列によってコードされるペプチドが植物において発現される。もう一つの態様において、配列番号：１、配列番号：３、または配列番号：４に記載される核酸配列によってコードされるペプチドが植物において発現される。さらなる態様において、配列番号：１、配列番号：３、配列番号：４、および配列番号：５を含む核酸配列の群によってコードされる２つの組み換え型シロイヌナズナ（Ａ． ｔｈａｌｉａｎａ）ペプチドが植物において同時発現される。
【０１４４】
本発明は、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）の組み換え型ペプチドの発現を生じる如何なる特定の植物、細胞タイプに限定されないと解釈される。一つの態様において、植物細胞は単子葉植物に由来する。もう一つの態様において、植物細胞は双子葉植物に由来する。もう一つの態様において、植物細胞は、カシューナッツ、ナンキンマメ、アスパラガス、ロウトウ、カラスムギ、アブラナ、柑橘類、スイカ、トウガラシ、ベニバナ、ヤシ、クフェア、キュウリ、カボチャ、ニンジン、アブラヤシ、イチゴ、ダイズ、ワタ、ヒマワリ、ヘテロカリス、オオムギ、ヒヨス、レタス、アマ、ライグラス、ルピナス、トマト、リンゴ、キャッサバ、マジョラナ、ウマゴヤシ、タバコ、オリーブ、イネ、パニエウム（Ｐａｎｉｅｕｍ）、パネセツム（Ｐａｎｎｅｓｅｔｕｍ）、アボガド、インゲンマメ、ピスタチア、エンドウ、ナシ、サクラ、ダイコン、トウゴマ、ライムギ、サワギク、セネシオ、カラシ、ナス、モロコシ、テオブロムス（Ｔｈｅｏｂｒｏｍｕｓ）、コロハ、コムギ、ソラマメ、ブドウ、ササゲ、およびエンドウ属を含む群に由来する。好ましい態様において、植物細胞はシロイヌナズナに由来する。
【０１４５】
３．アルキルスルホキノボシドを生成するためのＵＤＰ−ＳＱのその後の改変
本発明の方法は、アルキルスルホキノボシドを含むがこれに限定されない化合物を生成するためにＵＤＰ−ＳＱを後に改変することをさらに含む。（図７を参照のこと）。本発明の方法は、アルキルスルホキノボシドの生成に限定されない。さらに、本発明は、如何なる特定の反応機構に限定されない。一つの態様において、本発明は、水を消失させる適した酸触媒の存在下でＵＤＰ−スルホキノボースの加水分解切断によって生じるスルホキノボースと短鎖アルコールとを反応させることによって、アルキルスルホキノボシドを生成するためのプロセスに関する。次に、短鎖アルキルスルホキノボシドを長鎖アルコールによってトランスアセタール化して、長鎖スルホキノボシドを形成する。
【０１４６】
本発明の方法は、生成されるアルキルスルホキノボシドの構造に関して限定されないが、一つの態様において、アルキルスルホキノボシドは、Ｃ−６位でスルホン化され、Ｃ−１位でアルコールによってアセタール化されたグリコシド単位からなる物質の群である。もう一つの態様において、アルキルスルホキノボシドは、ＵＤＰ−スルホキノボースと脂肪アルコールの反応産物であると理解される。好ましい態様において、アルキルスルホキノボシドにおける「アルキル」という用語は、脂肪族Ｃ８〜Ｃ１８アルコール、好ましくは天然脂肪（すなわち、飽和および不飽和残基、同様に長さの異なる鎖を有する残基を含むその混合物）から得ることができる脂肪アルコールの残基を含むと解釈される。
【０１４７】
アルキルオリゴスルホキノボシドおよびアルキルポリスルホキノボシドという用語は、アセタールの形での一つのアルキル残基が一つ以上のスルホキノボシド残基に結合しているアルキル化スルホキノボシド（すなわち、ポリスルホキノボシドまたはオリゴスルホキノボシド残基）に適用される。したがって、アルキルモノスルホキノボシドはモノスルホキノボシドのアセタールである。糖と脂肪アルコールとの反応産物は一般的に混合物であるため、アルキルスルホキノボシドという用語は、アルキルモノスルホキノボシドと同様にアルキルポリ（オリゴ）スルホキノボシドの双方を含むと解釈される。
【０１４８】
一つの態様において、アルキルスルホキノボースの合成は、短鎖アルコールによるトランスアセタール化法によって行われる。本発明において引用した方法は、如何なる特定の短鎖アルコールに限定されないと解釈されるが、一つの態様において、短鎖アルコールは、その異性体を含むメタノール、エタノール、プロパノール、ペンタノール、ヘキサノール、ヘプタノール、オクタノール、ノナノールを含む群から選択される。好ましい態様において、短鎖アルコールはブタノールである。
【０１４９】
一つの態様において、アルキルスルホキノボシドの合成は、ＵＤＰ−スルホキノボースの加水分解切断から始まる。次に、スルホキノボースをブタノール中で酸触媒によって還流して、反応の水を真空下での蒸留によって除去する。酸触媒の目的は、グルコシド結合を含む反応に都合がよいことである。
【０１５０】
本発明の方法は、如何なる特定の酸触媒に限定されないが、一つの態様において、如何なる酸化合物（脂肪アルコールと糖分子とのアセタール化反応を触媒するいわゆるルイス酸を含む）も触媒として用いてもよい。一つの態様において、酸触媒は、Ｈ２ＳＯ４、ＨＣｌ、Ｈ３ＰＯ４、またはＢＦ３を含む無機酸である。もう一つの態様において、酸触媒は、オルト−トルエンスルホン酸、メタ−トルエンスルホン酸、アルキルベンゼンスルホン酸、二級アルキルスルホン酸、スルホン酸樹脂、アルキルスルフェート、アルキルベンゼンスルホネート、アルキルスルホネート、およびスルホコハク酸を含むスルホン酸またはその塩である。より好ましい態様において、酸触媒はパラ−トルエンスルホン酸である。
【０１５１】
本発明の方法は、特定の組の反応条件に限定されないと解釈されるが、より低い沸点のブタノール／水混合物の形成に関して、一つの態様において、還流温度は１１８℃；蒸気温度９５〜１１０℃が確立される；ブタノールによるアセタール化は、軽い真空（すなわち、８００〜９５０ ｍｂａｒの気圧下）で行い；およびブタノールの共沸量は、水によって除去する。
【０１５２】
一つの態様において、ブチルスルホキノボシドは、長鎖アルコールによって真空下で酸触媒の存在下で処理する。一つの態様において、１０ ｍｂａｒの減圧下で蒸留によってブタノールを除去することによってブチルスルホキノボシドの含有量を減少させることが望ましい。一つの態様において、ブタノールを除去後の触媒の中和物は、好ましくは、反応混合物を１００〜１１５℃の温度で通常の圧力下で攪拌する約１時間までの時間によって分離される。このようにして、ブチルスルホキノボシドと脂肪アルコールとの反応は、制御下で継続することができる。
【０１５３】
本発明の方法は、特定の長鎖アルコールに限定されないと解釈されるが、一つの態様において、長鎖アルコールは脂肪アルコールである；より好ましくは、炭素原子８〜１８個を含む高級脂肪族一級アルコール；およびさらにより好ましくは、本来の脂肪酸の工業的水素添加によって得ることができるタイプの飽和で、好ましくは直鎖アルコールである。一つの態様において、高級脂肪族アルコールは、ｎ−ドデシルアルコール、ｎ−テトラデシルアルコール、ｎ−オクタデシルアルコール、ｎ−オクチルアルコール、ｎ−デシルアルコール、ウンデシルアルコール、トリデシルアルコールを含む群から選択される。もう一つの態様において、長鎖アルコールは、ラウリルアルコールが重量で約３とミリスチルアルコールが重量で１の技術的混合物である。もう一つの態様において、長鎖アルコールは、オキサアルコールを含むがこれらに限定されない分岐鎖一級アルコールである。好ましい態様において、長鎖アルコールはｎ−ヘキサデシルアルコールである。
【０１５４】
本発明の方法は、特定の組の反応条件に限定されないと解釈されるが、一つの態様において、短鎖および長鎖アルキルスルホキノボシド、長鎖アルコール、および酸触媒を含む反応混合物は、その後温度を９５℃未満まで冷却する。一つの態様において、酸触媒は、後に塩基の付加によって中和して、中和した反応混合物のｐＨを少なくとも８に調節する。好ましい態様において、中和した反応混合物のｐＨは８．５である。
【０１５５】
本発明の方法は、特定の塩基に限定されないと解釈されるが、一つの態様において、塩基は、水酸化アルカリ金属、炭酸塩、および重炭酸塩のようなアルカリ金属塩基を含む有機または無機塩基材料から選択される。もう一つの態様において、塩基は、酸化カルシウムおよび酸化マグネシウムのようなアルカリ土類塩基を含む群から選択される。もう一つの態様において、水酸化アルミニウムまたはその塩基性アルカリアルミニウム成分のようなアルミニウム塩基が意図される。さらなる態様において、塩基は、水酸化アンモニウム、ならびに一級、二級、三級、および複素環アミンを含むがこれらに限定されないアミンのようなアンモニアに基づく化合物を含む群から選択される。
【０１５６】
本発明の方法は、反応混合物を濾過するための特定の温度範囲に限定されないと解釈されるが、一つの態様において、反応混合物は８０〜９０℃の温度で濾過され、過剰量の脂肪アルコールは重量で５％未満まで蒸留によって除去される。一つの態様において、排水だめの温度はアルカリスルホキノボシドが熱安定であるレベルで維持しなければならない。好ましい態様において、排水だめの温度は１６０℃の値を超えてはならない。
【０１５７】
本発明の方法は、如何なる特定の含有量の短鎖および長鎖アルキルスルホキノボシドの産物を生成することに限定されないが、一つの態様において、得られた産物は、高い含有量の長鎖アルキルスルホキノボシド、および低い含有量のブチルスルホキノボシド、アルキルモノスルホキノボシド、および同様にポリ（オリゴ）スルホキノボシドを有する。
【０１５８】
アルキルスルホキノボシドは、洗浄剤およびクリーニング調製物の製造のための工業的界面活性剤として用いるために適した陰イオン性界面活性剤である。ビアマン（Ｂｉｅｒｍａｎｎ）らの米国特許第５，３７４，７１６号は、界面活性アルキルグリコシドを生成するためのプロセスを教示する。ミヤノ＆ベンソン（Ｍｉｙａｎｏ， Ｍ ａｎｄ Ｂｅｎｓｏｎ， Ａ．Ａ．、「植物スルホリピッドＶＩＩ、６−スルホ−α−Ｄ−キノボピラノシル−（１→１’）−グリセロールの合成とスルホリピッドの放射化学合成（Ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｓｕｌｆｏｌｉｐｉｄ ＶＩＩ． Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ６−ｓｕｌｆｏ−α−Ｄ−ｑｕｉｎｏｖｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ−（１→１’）−ｇｌｙｃｅｒｏｌ ａｎｄ Ｒａｄｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ｓｕｌｆｏｌｉｐｉｄｓ）」、Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． ８４：５９〜６２（１９６２））は、硫酸塩の置換による１，２−イソプロピリデン−６−Ｏ−オシル−Ｄ−グルコフラノースから６−スルホ−Ｄ−キノボースの調製、その後のアリルα−グリコシドへの変換、および過マンガン酸塩によるその酸化によってスルホキノボシルグリセロールの形成を教示する。ロイ＆ヒューリンズ（Ｒｏｙ， Ａ．Ｂ． ａｎｄ Ｈｅｗｌｉｎｓ， Ｊ．Ｅ．、「スルホキノボースとそのアルドン酸：その調製と過ヨウ素酸による２−スルホアセトアルデヒドへの酸化（Ｓｕｌｆｏｑｕｉｎｏｖｏｓｅ ａｎｄ ｉｔｓ ａｌｄｏｎｉｃ ａｃｉｄ：ｔｈｅｉｒ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｏｘｉｄａｔｉｏｎ ｔｏ ２−ｓｕｌｆｏａｃｅｔａｌｄｅｈｙｄｅ ｂｙ ｐｅｒｉｏｄａｔｅ）」、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｒｅｓ． ３０２：１１３〜１７（１９９７））は、スルホキノボースまたはそのアルドン酸の過ヨウ素酸塩による酸化による２−スルホアセトアルデヒドの調製を教示する。
【０１５９】
実験
実施例１
本実施例において、ＵＤＰ−グルコース、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）の組み換え型ＳＱＤ１酵素蛋白質、および亜硫酸塩を含む反応混合物からＵＤＰ−ＳＱを生成する手段を記述する。一つの態様において、ＵＤＰ−ＳＱ産生反応は、精製ＳＱＤ１蛋白質１０ μｇ、１００ μＭ Ｎａ２ＳＯ３、２．２ ｍＭ ＵＤＰ−グルコース［１４Ｃ（Ｕ）−グルコース］（６９ Ｂｑ／ｎｍｏｌ）、および５０ ｍＭトリス（ｐＨ ７．５）を含む緩衝液において全量１００ μｌで３７℃で４０分間行う。次に、反応混合物を９５℃で５分間変性させて、組み換え型酵素を不活化して、１０，０００×ｇで５分間遠心して、４２℃で一定に維持したベックマン（フュラートン、カリフォルニア州）ウルトラスフェアＯＤＳカラム（４．６ ｍｍ×２５ ｃｍ、粒子径５μＭ）を用いる高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）（ウォータース社、ミルフォード、マサチューセッツ州）によって分析する。ＫＯＨによってｐＨ ６．０に調節した３０ ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、２ｍＭ水酸化テトラブチルアンモニウム（フィッシャーサイエンティフィック社、フェアローン、ニュージャージー州）の直線勾配をＨＰＬＣ等級のアセトニトリル（ＥＭサイエンス、ギブスタウン、ニュージャージー州）に流速１ｍｌ／分で４５分間適用することによって、基質と産物とを分離した。
【０１６０】
上記のようにＳＱＤ１蛋白質を標識ＵＤＰ−グルコースと共にインキュベートすると、２つの化合物（Ｕ１およびＵ２）が形成され、これをＨＰＬＣによって分析するとＵＤＰ−グルコース（図２Ａおよび２Ｂを参照のこと）と比較して独自の保持時間を示した。反応混合物を変性させずにアミコンフィルター（分子量カットオフ、１０，０００；ミリポア社、ベッドフォード、マサチューセッツ州）を用いて濾過すると、化合物Ｕ２の７７％（図２Ｂを参照のこと）が、溶液中で遊離で存在したのに対し、化合物Ｕ１は３５％であったことが判明した。反応混合物に亜硫酸塩を加えると、化合物Ｕ１が完全に消失して、化合物Ｕ２の形成をさらに刺激した（図２Ｃを参照のこと）。化合物Ｕ２は上記のＨＰＬＣ系において［３５Ｓ］ＵＤＰ−ＳＱと同時クロマトグラフされ、このことは、反応混合物において生成された化合物がＵＤＰ−ＳＱであることを示している（図２Ｄを参照のこと）。標識化合物はβ−Ｒａｍモデル２フロースルーモニターを用いて検出した（ＩＮＵＳシステムズ社、タンパ、フロリダ州）。
【０１６１】
実施例２
本実施例において、実施例１に記載した方法において用いられ、配列番号：５に記載の核酸配列によってコードされるシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）組み換え型ＳＱＤ１酵素蛋白質の生成手段を記述する。
【０１６２】
ａ．チラコイド膜のヘッドグループ生合成に関係する酵素をコードするシロイヌナズナ遺伝子を単離するために、発現された配列タグのｄｂＥＳＴデータベースを、ＴＢＬＡＳＴＮを用いて細菌ｓｑｄＢ遺伝子の予想アミノ酸配列によって検索した。この検索を通して、細菌ｓｑｄＢ遺伝子産物と高い配列類似性を有する推定の蛋白質をコードする部分的なコメｃＤＮＡ（ＥＳＴ Ｄ４６４７７）が発見された。部分的コメｃＤＮＡの４００塩基対のＸｈｏ Ｉ−ＥｃｏＲＶ断片をプローブとして用いて、異種ＤＮＡハイブリダイゼーションによってシロイヌナズナのＰＲＬ２ ｃＤＮＡライブラリ（オハイオ州コロンブスのオハイオ州立大学シロイヌナズナ生物資源センターから入手できるラムダＺｉｐＬｏｘ−に基づくライブラリ）のプラーク形成単位（ｐｆｕ）２４０万個をスクリーニングした。ハイボンドＮ＋（アマシャム社）メンブレンを用いて、７％（ｗｔ／ｖｏｌ）ＳＤＳ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、および１％（ｗｔ／ｖｏｌ）ＢＳＡを含む０．２５ Ｍ燐酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ ７．２）において５３℃でハイブリダイゼーションを行った。ハイブリダイゼーション後、メンブレンを２×ＳＳＰＥ、０．１％（ｗｔ／ｖｏｌ）ＳＤＳ溶液中で５３℃で２回２０分間洗浄した。
【０１６３】
１，７９９塩基対のインサートを有するクローンを含むいくつかのｃＤＮＡクローンを単離し、これをシークエンシングした（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ０２２０８２）。ヌクレオチド１７０位で始まるオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）は、計算分子量５３．１ ｋＤａの推定の蛋白質をコードする。シネココッカス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ）種ＰＣＣ７９４２のｓｑｄＢ遺伝子およびシロイヌナズナｃＤＮＡの推定アミノ酸配列のアミノ酸比較分析によって、４２％の配列同一性が判明した。シロイヌナズナの対応する座をＳＱＤ１と命名して、１，７９９ ｂｐのインサートを有するｃＤＮＡを含むプラスミドをｐＳＱＤ１と命名した。アミノ酸レベルで、部分的なコメｃＤＮＡ配列は、シロイヌナズナのＳＱＤ１配列と８６％同一であった。
【０１６４】
大腸菌において組み換え型ＳＱＤ１蛋白質を生成するために、ＰＣＲに基づく戦略を用いて、ｐＳＱＤ１の１，１９９塩基対断片（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ０２２０８２のヌクレオチド番号４２５〜１６０３）をヒスチジンタグ発現ベクターｐＱＥ−３０（キアゲンインク、バレンシア、カリフォルニア州）にクローニングした。この目的のために、ｐＱＥ−３０にクローニングするためにＢａｍＨＩ部位が提供されるように、そして推定のシグナルペプチドを含むＮ−末端アミノ酸８５個が除去されるように、ヌクレオチド配列
2004535767.tif 000009
を有するフォワードプライマーおよびヌクレオチド配列
2004535767.tif 000010
を有するリバースプライマーを用いた。得られたプラスミド構築物ｐＳＱＤ１−ＴＰによって、大腸菌において組み換え型ＳＱＤ１蛋白質を発現させることができ、製造元の説明書（キアゲンインク、バレンシア、カリフォルニア州）に従ってＮｉ−ＮＴＡアガロースに対するプラスミド構築物の６個のＮ−末端ヒスチジン残基の選択的結合により蛋白質の精製を行うことが可能となった。
【０１６５】
組み換え型蛋白質を２００ ｍＭイミダゾールによって溶出して、イミダゾールはその後ミリポアウルトラフリー４濃縮器（ミリポアインク、ベッドフォード、マサチューセッツ州）を用いて除去した。蛋白質を２０％グリセロール、３００ ｍＭ ＮａＣｌ、および２５ ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４（ｐＨ ７．５）において−２０℃で保存した。ＳＱＤ１蛋白質は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル分析によって約９５％純粋であると推定された（図４を参照のこと）。
【０１６６】
ｂ．ＳＱＤ１活性に関して予想されるよにＵＤＰ−グルコースのＵＤＰ−ＳＱへの変換を測定するために酵素アッセイを開発した。基礎活性のアッセイは、精製ＳＱＤ１蛋白質１０ μｇ、１００ μＭ Ｎａ２ＳＯ３、５００ μＭ ＵＤＰ−グルコース［１４Ｃ（Ｕ）−グルコース］（８９ Ｂｑ／ｎｍｏｌ）および５０ ｍＭトリス（ｐＨ ７．５）を含む緩衝液において３７℃で全量１００ μｌで４０分間行った。さらにもう一つのアッセイであるカップリングしたアデノシン５’−ホスホスルフェート（ＡＰＳ）（シグマ社、セントルイス、ミズーリ州）／ＳＱＤ１アッセイは、５０ ｍＭトリス（ｐＨ ８．５）、１０ ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ）、２５ μＭ［３５Ｓ］ＡＰＳ（５００ Ｂｑ／ｎｍｏｌ）、２５０ ｍＭ Ｎａ２ＳＯ４、１ｍＭ ＥＤＴＡ、５００ μＭ ＵＤＰ−グルコース、精製ＳＱＤ１蛋白質６６ μｇ、およびシロイヌナズナ（Ａ． ｔｈａｌｉａｎａ）のＡＰＲ１ １２ μｇを含んだ（図８を参照のこと）。いずれのアッセイにおいても、反応物は３０℃で１０分間インキュベートした。試料を９５℃で５分間熱変性させて、１０，０００×ｇで５分間遠心し、４２℃の一定に維持したベックマン（フュラートン、カリフォルニア州）ウルトラスフェアＯＤＳカラム（４．６ ｍｍ×２５ ｃｍ、粒子径５μＭ）を用いるＨＰＬＣ（ウォータース社、ミルフォード、マサチューセッツ州）によって分析した。基質および産物は、実施例１において先に記述したようにＨＰＬＣによって分離および分析した。
【０１６７】
実施例３
本実施例において、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）の単純な形質転換手段を本明細書において記述し、それはクロー＆ベント（Ｓ． Ｃｌｏｕｇｈ ａｎｄ Ａ． Ｂｅｎｔ、「花弁の液浸：シロイヌナズナのアグロバクテリウム媒介形質転換の単純な方法（Ｆｌｏｒａｌ ｄｉｐ：ａ ｓｉｍｐｌｉｆｉｅｄ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）」、Ｐｌａｎｔ Ｊ． １６：７３５〜４３（１９９８））の方法に従う。
【０１６８】
ａ．バイナリベクター上に関係する遺伝子ＳＱＤ１を有するアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）を以下のように調製する。遷移ペプチドを含むが遺伝子のＤＮＡ５プライムを除外する完全なＳＱＤ１コード配列（配列番号：６を参照のこと）を、ＰＣＲに基づく戦略を用いて、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ（ストラタジーン社、ラホヤ、カリフォルニア州）にクローニングする。この目的のために、上記のＳＱＤ１配列を、ヌクレオチド配列
2004535767.tif 000011
を有するフォワードプライマー、および
2004535767.tif 000012
を有するリバースプライマーを用いてＰＣＲによって増幅した。プライマーは、ＳＱＤ１ ｃＤＮＡ断片のｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩへのクローニングのためにＫｐｎ ＩおよびＢａｍＨＩ部位が提供されるように構築した。
【０１６９】
次に、ＳＱＤ１ ｃＤＮＡ断片を上記の制限エンドヌクレアーゼを用いてｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩから切除して、バイナリベクターｐＢＩＮＡＲ−Ｈｙｇの対応する制限部位にサブクローニングする。このベクターは、ｐＡ７（ベルリン自由大学、フォンシャーベン（ｖｏｎ Ｓｃｈａｅｖｅｎ， Ａ．）博士の学位論文（１９８９））の中心部からのＨｉｎｄ ＩＩＩ−ＥｃｏＲＩ断片の挿入によって、ｐＢＩＢ−Ｈｙｇ（ベッカー（Ｂｅｃｋｅｒ， Ｄ．）、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １８：２０３（１９９０））から導出する。この構築物を、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）Ｃ５８Ｃ１に導入して、これを用いて下記のようにシロイヌナズナのＣｏｌ−２植物を形質転換する。
【０１７０】
ｂ．シロイヌナズナ植物を、開花するまで、ブライダルベール、カーテン、またはチーズクロスによって覆った土壌でポットにおいて長日下で生育させる。最初に出た茎を摘み取って、多くの二次的な茎の増殖を促進して、摘み取った後植物を約４〜６日間生育させた。最適な植物は多くの未成熟な花の集団を有し、あまり多くない受精長角果を有するが、広範囲の段階の植物を首尾よく形質転換することができる。
【０１７１】
バイナリベクター上に関係する遺伝子を有するアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）を、バイナリプラスミドを選択するために２５ μｇ／ｍｌヒグロマイシンＢ（カルビオケム社）を含むＬＢ（水１Ｌ中にトリプトン１０ ｇ、酵母抽出物５ｇ、ＮａＣｌ５ｇ）において２８℃で大きい液体培養において生育させる。アグロバクテリア培養物を５５００×ｇで２０分間の遠心によって沈殿させ、滅菌５％蔗糖溶液においてＯＤ６００＝０．８となるように再浮遊させる。
【０１７２】
シロイヌナズナ植物の上記のすりつぶした部分を、再浮遊させたアグロバクテリア／蔗糖溶液に液浸する前に、シルウェットＬ−７７（ＯＳｉスペシャルティズインク、ダンバリー、コネチカット州）を濃度０．０５％（５００ μｌ／Ｌ）となるように加えて十分に混合する。シロイヌナズナ植物の上記のすりつぶした部分をアグロバクテリア溶液に、軽く攪拌しながら２〜３秒液浸する。液浸した植物は、高い湿度を維持するためにドームの下に置くか、または１６〜２４時間覆った。液浸した植物は、ドーム下の空気が暑くなりうるために過剰な太陽光に曝露しない。
【０１７３】
植物を、さらに３〜５週間生育させて、通常のように水をやり、パラフィン紙、テープ、支柱、ねじれた結び目、または他の手段によって束ねていない茎を結ぶ。植物の種子が成熟するまで水やりを停止する。成熟すると、きれいな紙片の上で指で集まった花序（すなわち、花の集団）を軽く押して乾燥した種子を採取する。茎および莢の材料の大部分を紙から除去して、種子を４℃の乾燥下で保存する。
【０１７４】
組み換え型シロイヌナズナペプチドを発現することができる成功した形質転換体を、抗生物質または除草剤選択マーカーを用いて選択する。本実施例において、採取した種子２０００個（０．１％アガロース４ｍｌに再浮遊させる）を、気相滅菌して、５０ μｇ／ｍｌヒグロマイシンＢによる選択プレート上で播種し、２日間低温処理した後、連続光（５０〜１００ μアインシュタイン）の下で７〜１０日間生育させる。実施例の選択プレートは、さらに０．５×ムラシゲ−スクーグ培地（シグマケミカル社、カタログ番号Ｍ−５５１９）および０．８％組織培養寒天（シグマケミカル社、カタログ番号Ａ−１２９６）。成功した形質転換体は、緑色の葉と選択培地内で十分に確立された根を生じるヒグロマイシン抵抗性の実生として同定される。
【０１７５】
成功した形質転換体の試料を、十分に湿らせたポット用土壌に移植することによって成熟するまで生育させる。形質転換体からの葉を採取して、ＤＮＡ抽出を行い、植物のゲノムＤＮＡを単離する。その後抽出したゲノムＤＮＡに制限エンドヌクレアーゼ消化およびサザンブロッティングを行い、関係する遺伝子が植物ゲノムに組み入れられていることを確認する。
【０１７６】
実施例４
本実施例において、上記の実施例において意図されるペプチド、ＳＱＤＸ（配列番号：１）を発現させるための手段を記述する。シネココッカス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ）のｓｑｄＢ遺伝子を有するプラスミドｐＳＹＢの完全なインサートをシークエンシングしたところ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ１５５０６３）、ｓｑｄＢの３’に直ちに隣接して新しいＯＲＦ（オープンリーディングフレーム）が同定された。プラスミドｐＳＹＢは、プラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ＋（ストラタジーン社、ラホヤ、カリフォルニア州、カタログ番号２１２２０５）に由来し、プラスミドＫｐｎＩおよびＢａｍＨＩ部位にクローニングされたｓｑｄＢ遺伝子ｃＤＮＡ（配列番号：７）の完全な配列を含む。このＯＲＦは、アミノ酸３７７個の推定の蛋白質をコードし、これはＲ．スファエロイデス（Ｒ． ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ）について記述されたｓｑｄ遺伝子産物の如何なるものとも配列類似性を有しない。ＧＴＧから始まる先に存在するｓｑｄＢ ＯＲＦとは異なり、第二のＯＲＦは、ｓｑｄＢ遺伝子の３’末端から１５ ｂｐのＡＴＧで始まる。このＯＲＦをｓｑｄＸと命名した。Ｐｆａｍ（蛋白質ファミリーアラインメントデータベース）を用いるｓｑｄＸの推定アミノ酸配列（図１６：配列番号：２）の分析から、残基２２８〜３４７個のあいだのグリコシルトランスフェラーゼグループＩドメインが判明した。
【０１７７】
シアノバクテリアであるシネココッカス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ）におけるｓｑｄＸ遺伝子が機能的に相同な蛋白質をコードすることを確認するために、シネココッカスのｓｑｄＸオープンリーディングフレームを、移動可能な広い宿主範囲のプラスミドｐＲＬ５９ＥＨ（ブラック（Ｂｌａｃｋ）ら、「アナベナ種ＰＣＣ７１２０におけるＨｅｔ−変異の分析は、異型細胞のスペーシング調節における二次代謝物の関与を示す（Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ａ Ｈｅｔ−ｍｕｔａｔｉｏｎ ｉｎ Ａｎａｂａｅｎａ ｓｐ． ＰＣＣ７１２０ ｉｍｐｌｉｃａｔｅｓ  ａ ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅ ｉｎ ｔｈｅ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｅｔｅｒｏｃｙｓｔ ｓｐａｃｉｎｇ）」、Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １７４：２２８２〜２２９２（１９９４））においてｔａｃプロモーターの後ろに挿入して、ウォルクら（Ｗｏｌｋ、「大腸菌から窒素固定線維様シアノバクテリアに接合的転移することができるシャトルベクターの構築（Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｓｈｕｔｔｌｅ ｖｅｃｔｏｒｓ ｃａｐａｂｌｅ ｏｆ ｃｏｎｊｕｇａｔｉｖｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｆｒｏｍ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｔｏ ｎｉｔｒｏｇｅｎ−ｆｉｘｉｎｇ ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉａ）」、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８１：１５６１〜１５６５（１９８４））に記載のようにシネココッカス変異体７９４２△ｓｑｄＸへの接合によって構築物に転移した。最初のインフレーム停止コドン（ゲノム配列の２３８５９１２〜２３８７１６８位）までの推定されるＡＴＧの５’の配列が含まれた。シネココッカスのｓｑｄＸ遺伝子は、プライマー
2004535767.tif 000013
および
2004535767.tif 000014
を用いてプラスミドｐＳＹＢからｐＲＬ５９ＥＨのＨｉｎｄ ＩＩＩ／ＢａｍＨＩ部位にＰＣＲ−クローニングした。スペクチノマイシンおよびストレプトマイシン抵抗性を付与するプラスミドｐＨＰ４５ΩからのΩカセット（プレンツキ＆クリシュ（Ｐｒｅｎｔｋｉ， Ｐ． ａｎｄ Ｋｒｉｓｃｈ， Ｈ．Ｍ．）、「選択的ＤＮＡ断片によるインビトロ挿入変異誘発（Ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｉｎｓｅｒｔｉｏｎａｌ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｗｉｔｈ ａ ｓｅｌｅｃｔａｂｌｅ ＤＮＡ ｆｒａｇｍｅｎｔ）」、Ｇｅｎｅ ２９：３０３〜３１３（１９８４））を、適した選択マーカーを提供するために、これらのプラスミドのＨｉｎｄ ＩＩＩ部位に挿入した。シネココッカスのｓｑｄＸを含む得られたプラスミドをｐＳＱＤＸ−７９４２と命名した。接合完了体を２５ μｇ／ｍｌカナマイシン、１０ μｇ／ｍｌスペクチノマイシン、および１μｇ／ｍｌストレプトマイシンを含むＢＧ１１培地上で選択して、ＤＮＡ／ＤＮＡハイブリダイゼーションによって分析して、適切なプラスミド構築物が存在することを確認した。ｓｑｄＸ構築物を挿入すると、ＴＬＣ脂質分析によって示されるように、シネココッカス変異体７９４２△ｓｑｄＸにおけるスルホリピッド生合成活性が回復した。認められた遺伝子相補性に基づいて、シアノバクテリアｓｑｄＸ遺伝子は、スルホリピッド生合成に関係する蛋白質をコードするという結論が得られる。
【０１７８】
実施例５
本実施例において、配列番号：４に記載の核酸配列によってコードされるシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）のｓｑｄＸ遺伝子相同体ＳＱＤ２を生成するための一つの手段を記述する。
【０１７９】
ａ．ＳＱＤ２ ｃＤＮＡのクローニング。
ＢＡＣ座Ｆ７Ｊ８＿２００（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＬ１３７１８９）から予想される蛋白質（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＣＡＢ６９８５０）に対応するＳＱＤ２オープンリーディングフレームを、プライマー
2004535767.tif 000015
および
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を用いてＲＴ−ＰＣＲによってクローニングした。上記のロゲマン（Ｌｏｇｅｍａｎｎ）らの方法に従って、約２０日齢の植物（Ｃｏｌ−２）から総葉ＲＮＡを単離した。ポリＡ＋ ｍＲＮＡを、上記のようにキアゲンインク（バレンシア、カリフォルニア州）のオリゴテックスキットを用いて精製した。ＲＴ−ＰＣＲ反応は、先に記述したようにストラタジーン社（ラホヤ、カリフォルニア州）のプロスターＨＦシングルチューブＲＴ−ＰＣＲシステムを用いて行った。ＰＣＲ産物を、ライゲーションレディストラタジーンベクターｐＰＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ Ａｍｐ ＳＫ＋にクローニングして、ベクターｐＰＣＲ−ＳＱＤ２を得た。インサートをシークエンシングしたところ、配列は、Ｆ７Ｊ８＿２００（アクセッション番号ＡＬ１３７１８９）に関して予想される集合コード配列と同一であることが判明した。
【０１８０】
ｂ．ノザンブロット分析
上記のように単離した総ＲＮＡをアガロースゲル電気泳動によって分離して、標準的な技法（サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、１９８９）を用いてハイボンドＮ＋（アマシャムファルマシアバイオテックインク、ピスキャタウェイ、ニュージャージー州）メンブレンにブロッティングした。２５０ ｍＭ燐酸ナトリウム緩衝液ｐＨ ７．４、７％ＳＤＳ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１％ＢＳＡおよび０．１ ｍｇ／ｍｌ変性ニシン精子ＤＮＡを含む緩衝液１５ ｍｌにおいてプレハイブリダイゼーションを６５℃で５時間行った。プローブを同じ緩衝液において同じ温度で１６時間ハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーション温度でフィルターを２×ＳＳＣ（サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、１９８９）において５分を１回、２０分を２回の計３回洗浄した後、１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中で１回１０分間洗浄した。
【０１８１】
ｃ．大腸菌におけるＳＱＤ１およびＳＱＤ２の発現
ＳＱＤ２がスルホリピッドシンターゼをコードすることを直接証明するため、そしてシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）の２つの蛋白質ＳＱＤ１およびＳＱＤ２が植物におけるスルホリピッド生合成に対して特異的な生合成機構を表すか否かを調べるために、これらの２つの遺伝子を大腸菌に同時発現させた。この細菌は、通常スルホリピッドを含まない。葉緑体遷移ペプチドを欠損するＳＱＤ１蛋白質の切断型を大腸菌に予め発現させると、精製組み換え型蛋白質は、インビトロでＵＤＰ−グルコース、亜硫酸塩、およびジアシルグリセロールからのＵＤＰ−スルホキノボースの形成を触媒することが示された（サンダ（Ｓａｎｄａ）ら、「組み換え型シロイヌナズナＳＱＤ１は、ＵＤＰ−グルコースおよび亜硫酸塩をインビトロでスルホリピッドヘッド前駆体ＵＤＰ−スルホキノボースに変換する（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ＳＱＤ１ ｃｏｎｖｅｒｔｓ ＵＤＰ−ｇｌｕｃｏｓｅ ａｎｄ ｓｕｌｆｉｔｅ ｔｏ ｔｈｅ ｓｕｌｆｏｌｉｐｉｄ ｈｅａｄ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ ＵＤＰ−ｓｕｌｆｏｑｕｉｎｏｖｏｓｅ ｉｎ ｖｉｔｒｏ）」、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７０：２５７９２〜２５７９７（２００１））。双方の蛋白質を発現させるために、われわれは、大腸菌における植物ガラクトリピッドの生合成の再構築に用いた戦略と類似の戦略を用いた（デルマン（Ｄｏｒｍａｎｎ）ら、「ＤＧＤ１によって媒介されるシロイヌナズナガラクトリピッド生合成と脂質の移動（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｇａｌａｃｔｏｌｉｐｉｄ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ ｌｉｐｉｄ ｔｒａｆｆｉｃｋｉｎｇ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｂｙ ＤＧＤ１）」、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８４：２１８１〜２１８４（１９９９））。したがって、ＳＱＤ２蛋白質は、ＳＱＤ１遺伝子を発現するプラスミド（ｐＳＱＤ１）と適合性である第二のプラスミド（ｐＳＱＤ２）から発現された。
【０１８２】
ＳＱＤ２を発現するために、遷移蛋白質コード配列を含むｐＰＣＲ−ＳＱＤ２のＢａｍＨＩ／Ｋｐｎ Ｉ断片を、キアゲンインク（バレンシア、カリフォルニア州）の発現ベクターｐＱＥ−３２にインフレームでクローニングすると、ｐＳＱＤ２が得られた。Ｎ−末端アミノ酸８４個の遷移ペプチドを欠損するＳＱＤ１蛋白質をコードする発現カセットをＸｈｏ Ｉ／Ｐｖｕ ＩＩによってｐＳＱＤ１−ＴＰ（エッシマン（Ｅｓｓｉｇｍａｎｎ）ら、１９９８）から切除して、Ｓａｌ Ｉ／ＥｃｏＲＶによって切断したｐＡＣＹＣ−１８４（チャン＆コーエン（Ｃｈａｎｇ ａｎｄ Ｃｏｈｅｎ）、「Ｐ１５Ａ潜在ミニプラスミドに由来する増幅可能な多コピーＤＮＡクローニング媒体の構築と特徴付け（Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａｍｐｌｉｆｉａｂｌｅ ｍｕｌｔｉｃｏｐｙ ＤＮＡ ｃｌｏｎｉｎｇ ｖｅｈｉｃｌｅｓ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ ｔｈｅ Ｐ１５Ａ ｃｒｙｐｔｉｃ ｍｉｎｉｐｌａｓｍｉｄ）」、Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １３４：１１４１〜１１５６（１９７８））にライゲーションすると、大腸菌においてｐＳＱＤ２と適合性であるｐＳＱＤ１が得られた。双方のプラスミドを大腸菌宿主ＸＬ１−Ｂｌｕｅ（ストラタジーン社、ラホヤ、カリフォルニア州）に転移して、１００ μｇ／ｍｌアンピシリンおよび３４ μｇ／ｍｌクロラムフェニコールの存在下で選択した。一晩培養物３ｍｌ（抗生物質を含むＬＢ培地）を遠心して、細胞を洗浄して、同じ培地であるが１５０ μｇ／ｍｌアンピシリンおよび５０ μｇ／ｍｌクロラムフェニコールを含む培地１０ ｍｌに再浮遊させた。培養物を３７℃で２時間インキュベートした。イソプロピルチオ−β−Ｄ−ガラクトシドを加えた後、２８℃で３時間インキュベートすることによって、プラスミドからの発現を誘導してから分析を行った。
【０１８３】
ｄ．相補性分析
遷移ペプチドを含む完全長のコード配列を含むｐＰＣＲ−ＳＱＤ２のインサートを、プライマー
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および
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を用いてＰＣＲによって増幅した。この断片を、Ｋｐｎ ＩおよびＸｂａ Ｉ部位を用いてバイナリベクターｐＢＩＮＡＲ−Ｈｙｇ（ベッカー（Ｂｅｃｋｅｒ）、１９９０；エッシマン（Ｅｓｓｉｇｍａｎｎ）ら、１９９８）にクローニングした。得られたプラスミドｐＢＩＮＡＲ−Ｈｙｇ／ＳＱＤ２を用いて、ベクトルド＆ペレティエ（Ｂｅｃｈｔｏｌｄ ａｎｄ Ｐｅｌｌｅｔｉｅｒ、「真空浸潤における成体シロイヌナズナ植物の植物内アグロバクテリア媒介形質転換（Ｉｎ ｐｌａｎｔ Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ａｄｕｌｔ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ ｐｌａｎｔｓ ｂｙ ｖａｃｕｕｍ ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）」、「シロイヌナズナのプロトコール（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ）」、マルチネス−ザパター＆サリナス（Ｊ． Ｍａｒｔｉｎｅｚ−Ｚａｐａｔｅｒ ａｎｄ Ｊ． Ｓａｌｉｎａｓ）編（ヒュマナ出版：トトワ、ニュージャージー州）、２５９〜２６６頁（１９９８））に記載の真空浸潤によってｓｑｄ２変異体を形質転換した。トランスジェニック植物は、カナマイシン（６０ μｇ／ｍｌ）およびヒグロマイシンＢ（２５ μｇ／ｍｌ）の存在下で蔗糖を欠如するＭＳ培地において選択した。
【０１８４】
ｅ．脂質および脂肪酸分析
回収した葉を液体窒素において直ちに凍結して、脂質を上記のように抽出した。（同様に、デルマン（Ｄｏｒｍａｎｎ）ら、「チラコイド脂質ジガラクトシルジアシルグリセロールを欠損するシロイヌナズナ変異体の単離および特徴付け（Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｍｕｔａｎｔ ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ ｉｎ ｔｈｙｌａｋｏｉｄ ｌｉｐｉｄ ｄｉｇａｌａｃｔｏｓｙｌｄｉａｃｙｌｇｌｙｃｅｒｏｌ）」、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ７：１８０１〜１０（１９９５）を参照のこと）。沈殿させた大腸菌細胞を同じように抽出した。脂質抽出物を活性化硫酸アンモニウム含浸シリカゲルＴＬＣプレート上でアセトン／トルエン／水（９１：３０：６、ｖ／ｖ／ｖ）の溶媒系を用いて分析した。脂質は、ヨウ素蒸気または糖感受性α−ナフトール試薬（ゲージ（Ｇａｇｅ）ら、「タンデム質量分析によるほうれん草と紫色の細菌ロードバクター・スファエロイデスからのスルホキノボシルジアシルグリセロールの比較（Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｓｕｌｆｏｑｕｉｎｏｖｏｓｙｌ ｄｉａｃｙｌｇｌｙｃｅｒｏｌ ｆｒｏｍ ｓｐｉｎａｃｈ ａｎｄ ｔｈｅ ｐｕｒｐｌｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ ｂｙ ｆａｓｔ ａｔｏｍ ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ ｔａｎｄｅｍ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）」、Ｌｉｐｉｄｓ ２７：６３２〜３６（１９９２））によって可視化して、既知の組成の脂質抽出物との同時クロマトグラフィーによって同定した。定量的分析のために、個々の脂質をＴＬＣプレートから単離して、これを用いて脂肪酸メチルエステルを調製した。メチルエステルは内部標準としてミリスチン酸を用いてＧＬＣによって定量した（ロサク（Ｒｏｓｓａｋ）ら、「ｓｑｄＣにおいて不活化したロードバクター・スファエロイデスのスルホリピッド欠損変異体におけるスルホキノボシル−１−Ｏ−ジヒドロキシアセトンの蓄積（Ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｕｌｆｏｑｕｉｎｏｖｏｓｙｌ−１−Ｏ−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙａｃｅｔｏｎｅ ｉｎ ａ ｓｕｌｆｏｌｉｐｉｄ−ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ ｍｕｔａｎｔ ｏｆ Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄ ｉｎ ｓｑｄＣ）」、Ａｒｃｈ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． ３４０：２１９〜３０（１９９７））。３５Ｓ−標識脂質を分析する場合、３週齢の植物の葉４枚を葉柄を通して中心で切断して、担体不含３５Ｓ−硫黄（３．７ ＭＢｑ／ｍｌ；ＮＥＮライフサイエンスプロダクツ、ボストン、マサチューセッツ州）水溶液１００ μｌを含むポリプロピレン遠心管に葉柄を直ちに入れた。
【０１８５】
脂質は、上記のように１時間インキュベート後に抽出した。脂質を上記のように二次元ＴＬＣによって分離して（同様に、ベニング（Ｂｅｎｎｉｎｇ）ら、１９９５も参照のこと）、標識化合物をオートラジオグラフィーによって可視化した。同様に、放射活性硫酸塩のみを含むＭ９培地において増殖させた大腸菌（サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、１９８９）を標識して脂質を分析した。スルホリピッドの質量分析（ＦＡＢ−ＭＳ）測定は、ゲージ（Ｇａｇｅ、１９９２）らが記述した通りに実施した。
【０１８６】
実施例６
本実施例において、ＵＤＰ−ＳＱを後に改変してアルキルスルホキノボシドを生成する手段を記述する。アルキルスルホキノボシドの合成は、ＵＤＰ−ＳＱの加水分解切断から始まる。次に、スルホキノボースを短鎖アルコールであるブタノールの存在下で、酸触媒であるパラトルエンスルホン酸と共に還流すると、短鎖ブチルスルホキノボシドが形成される。還流温度は１１８℃である。低沸点ブタノール／水混合物の形成により、９５℃〜１１０℃の蒸気温度が得られる。ブタノールのアセタール化は、軽い真空下、すなわち８００〜９５０ ｍｂａｒの気圧下で行う。ブタノールの共沸量を蒸留プロセスによって水と共に除去する。
【０１８７】
次に、ブチルスルホキノボシドを、長鎖アルコール、ｎ−ヘキサデシルアルコールと共に、酸触媒の存在下で真空で処置して、長鎖スルホキノボシドを形成する。低含有量のブチルスルホキノボシドを得るために、１０ ｍｂａｒまで低下した減圧下での蒸留によってブタノールを除去して、触媒の中和物は、好ましくは１００℃〜１１５℃の温度での通常気圧下で反応混合物を攪拌する約１時間までの期間で分離される。
【０１８８】
次の段階において、反応混合物を９５℃未満の温度に冷却する。塩基、ＮａＯＨ、を加えて、中和した反応混合物のｐＨをｐＨ ８．５に調節することによって酸触媒を中和する。反応混合物を８０〜９０℃の温度で濾過した後、過剰量の脂肪アルコールを蒸留によって重量の５％未満のレベルまで除去する。そのような技法を用いる場合、いわゆる排液だめの温度は、アルキルスルホキノボシドが熱安定であるレベルに維持しなければならない（すなわち、排液だめの温度は、１６０℃の値を超えてはならない）。得られた産物は、高い含有量の長鎖アルキルスルホキノボシドと、低い含有量のブチルスルホキノボシド、アルキルモノスルホキノボシドおよび同様にアルキルポリ（オリゴ）スルホキノボシドを有する。
【０１８９】
実施例７
ＡｔＳＱＤＸ相同体のクローニングおよびシークエンシング
メカニズムの理解は、本発明を用いるために必要ではないが、本実施例は、ＡｔＳＱＤＸ相同体を単離して、アミノ酸およびヌクレオチド配列を決定するためにデザインした実験について記述する。ＡｔＳＱＤＸ遺伝子を含む既知のゲノム配列を用いてＡｔＳＱＤＸをコードする遺伝子をクローニングするためのオリゴヌクレオチドプローブを作製する（サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、「分子のクローニング：実験マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」第二版、コールドスプリングハーバー研究所出版、ニューヨーク州、１６．７〜１６．８頁（１９８９））。配列を単離してＰＣＲによって増幅する（例えば、ディーフェンバック＆ドベクスラー（Ｄｉｅｆｆｅｎｂａｃｈ ａｎｄ Ｄｖｅｋｓｌｅｒ）、「ＰＣＲプライマー、実験マニュアル（ＰＣＲ Ｐｒｉｍｅｒ， ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」、コールドスプリングハーバー研究所出版、プレインビュー、ニューヨーク州（１９９５）、ならびに参照として本明細書に組み入れられる、米国特許第４，６８３，１９５号、第４，６８３，２０２号、および第４，９６５，１８８号を参照のこと）。精製後、単離された配列を、細胞不含の原核細胞または真核細胞発現系にトランスフェクションするために、発現ベクターにクローニングする（アウスユベール（Ａｕｓｕｂｅｌ）ら、「分子生物学の短いプロトコール（Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、ジョンウィリー＆サンズ、ニューヨーク州（１９９２）を参照のこと）。発現後、蛋白質を単離して精製する。次に、蛋白質は抗体を産生するために用いてもよい（一般的に、ハワード＆ベテル（Ｈｏｗａｒｄ ａｎｄ Ｂｅｔｈｅｌｌ）、例えば、「抗体産生と特徴付けのための基本的方法（Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ）」、ＣＲＣ出版、（２０００）を参照のこと）。
【０１９０】
または、調製試薬を作製して、所望の配列を含むことがわかっているゲノム配列の断片の発現によって生じた抗体を結合させることによって、特異的標的を単離する。抗体は抗ＡｔＳＱＤＸ抗体を産生するために、当技術分野で既知の方法によって産生する（一般的に、ハワード＆ベテル（Ｈｏｗａｒｄ ａｎｄ Ｂｅｔｈｅｌｌ）、例えば、「抗体産生と特徴付けのための基本的方法（Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ）」、ＣＲＣ出版、（２０００）を参照のこと）。抗体はアガロースビーズに結合させる。さらに、アガロースビーズを対照免疫グロブリンに同時に結合させる。所望の細胞株からの超遠心した細胞溶解物を対照非免疫Ｉ結合ビーズに曝露して、非特異的結合蛋白質を除去する。未結合の溶解物を回収して、直接的なアフィニティ精製のために抗ＡｔＳＱＤＸ抗体結合アガロースビーズに曝露する。抗ＡｔＳＱＤＸ抗体／ＡｔＳＱＤＸ複合体を２．５ Ｍ ＫＣｌによって洗浄して、非特異的結合材料を除去して、ＡｔＳＱＤＸを０．５ Ｍ ＮａＣｌの存在下で０．１ Ｍグリシン塩酸によってアガロースビーズから溶出させる。カラムから溶出した材料を１ＭトリスｐＨ ８．０によって中和して、十分に透析して塩濃度を１５０ ｍＭに減少させた後、再度濃縮する。再度濃縮した材料を、分子の大きさに基づいて最終的に精製するために、非還元条件でＳＤＳ−ＰＡＧＥに載せる。この材料を、アミノ酸配列のエレクトロスプレータンデム質量分析のためのメンブレンに移す。この後者の配列を用いてＡｔＳＱＤＸをコードする遺伝子をクローニングするためのオリゴヌクレオチドプローブを作製する。
【０１９１】
上記の明細書において言及した全ての出版物および特許は、参照として本明細書に組み入れられる。本発明の記述の方法および系に関して様々な改変および変更が当業者に明らかであるが、それらも本発明の範囲および精神に含まれる。本発明は、特定の好ましい態様に関連して説明してきたが、請求の本発明は、そのような特定の態様に不当に限定されないと理解すべきである。実際に、本発明を実施するために記載の様式の様々な改変が当業者に明らかであるが、それらも以下の請求の範囲に含まれると解釈される。
【図面の簡単な説明】
【図１】ＵＤＰ−ＳＱ生合成の生化学経路の略図を示す。
【図２】ＳＱＤ１によるＵＤＰ−Ｇｌｃの変換を検出するためのアッセイの結果を示すクロマトグラフである。１４Ｃ−標識基質および反応産物のＨＰＬＣによるクロマトグラフィー分析を示す（Ａ−Ｃ）。（Ａ）ＳＱＤ１蛋白質を含まないＵＤＰ−Ｇｌｃ、（Ｂ）ＵＤＰ−ＧｌｃおよびＳＱＤ１蛋白質、（Ｃ）ＵＤＰ−Ｇｌｃ、ＳＱＤ１蛋白質、および亜硫酸塩、（Ｄ）シアノバクテリアＲ． スファエロイデス（Ｒ． Ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ）のｓｑｄＤ変異体から単離した真正の３５Ｓ−標識ＵＤＰ−ＳＱ。Ｕ１およびＵ２、本文に記載した産物。
【図３】蛋白質発現ベクターｐＱＥ−３０、ｐＱＥ−３１、およびｐＱＥ−３２の制限エンドヌクレアーゼ認識部位を含むベクターマップを示す。ｐＱＥ−３０のポリリンカー領域のヌクレオチド配列を配列番号：２２に提供する。ｐＱＥ−３１のポリリンカー領域のヌクレオチド配列を配列番号：２３に提供する。ｐＱＥ−３２のポリリンカー領域のヌクレオチド配列を配列番号：２４に提供する。
【図４】組み換え型ＳＱＤ１の精製結果を示すドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）ゲルの写真を示す。ＳＱＤ１蛋白質を発現する粗大腸菌細胞培養抽出物（Ａ）ならびに（Ｂ）ＳＱＤ１および（Ｃ）Ｔｈｒ１４５Ａｌａ変異体（各４μｇ）のＮｉ−ＮＴＡカラム精製物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析。
【図５】スルホキノボースのジアシルグリセロール（ＤＡＧ）への転移を含むＳＱＤＧ生合成の生化学経路の略図を示す。
【図６】蛋白質発現ベクターｐＡＣＹＣ１８４の制限塩素ヌクレアーゼ認識部位を含むベクターマップの略図を示す。このプラスミドは、長さが４，２４４塩基対でテトラサイクリン（塩基番号１５８０〜２７７０）およびクロラムフェニコール（塩基番号２１９〜３８０４）抵抗性遺伝子を有する小さい低コピー数の大腸菌クローニングベクターである。マップは、分子を１回または２回切断する制限酵素部位の位置を示す；独自の部位を太字で示す。座標は、各認識配列における５’塩基の位置を意味する。ベクターのヌクレオチド１位は、独自のＥｃｏＲＩ部位「ＧＡＡＴＴＣ」の最初の「Ｇ」である。マップはまた、抗生物質抵抗性遺伝子の相対的な位置および塩基番号８４５〜８４７位でのＤＮＡ複製開始点（ＯＲＩ）を示す。
【図７】アルキルスルホキノボシドを生成するために短鎖および長鎖アルコールならびに酸触媒によるＵＤＰ−ＳＱの化学的改変に関する一つの態様を略図で示す。
【図８】カップリングしたＡＰＳレダクターゼ／ＳＱＤ１アッセイの結果を示すクロマトグラフである。反応産物および標準物質のＨＰＬＣクロマトグラフを示す。（Ａ）酵素を含まない３５Ｓ−標識基質ＡＰＳ；（Ｂ）ＡＰＳレダクターゼ単独とインキュベートした後の３５Ｓ−標識反応産物、または（Ｃ）ＡＰＳレダクターゼおよびＳＱＤ１の存在下；（Ｄ）標準的なＳＤＱ１アッセイからの１４Ｃ−標識ＵＤＰ−ＳＱ（Ｕ２）。
【図９】ＵＤＰ−ＳＱおよびジアシルグリセロールをＳＱＤＧに特異的に変換するチラコイド膜に会合したスルホリピッドシンターゼアッセイのＴＬＣ結果を示す。（Ａ）ほうれん草のチラコイド膜を、標識反応産物Ｕ２、または対照目的としてのガラクトリピッド生合成の基質である１４Ｃ−標識ＵＤＰ−Ｇａｌと共にインキュベートした後の脂質の薄層クロマトグラフィー。脂質はオートラジオグラフィーによって可視化した。（Ｂ）Ｕ２レーンのヨウ素染色。ＤＧＤＧ（ジガラクトシル−ジアシルグリセロール）；ＭＧＤＧ（モノガラクトシルジアシルグリセロール）；ＰＣ（ホスファチジルコリン）；ＰＧ（ホスファチジルグリセロール）；ＳＱＤＧ（スルホキノボシルジアシルグリセロール）。
【図１０】シアノバクテリアｓｑｄＸ遺伝子（配列番号：１）の核酸配列を示す（ＧｅｎＢａｎｋデータベースに提出され、アクセッション番号Ｕ４５３０８を割り当てられた、ヌクレオチド番号１８００−２９３３）。開始および停止コドンを強調する。
【図１１】ＡｔＳＱＤＸ−１遺伝子（配列番号：３）を含むシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）のゲノム核酸配列を示す（ＧｅｎＢａｎｋデータベースに提出され、アクセッション番号ＡＬ１３７１８９を割り当てられた、ヌクレオチド番号８２３２４−８５３０２）。
【図１２】シロイヌナズナＳＱＤ２遺伝子ｃＤＮＡ（配列番号：４）の核酸配列を示す。
【図１３】シロイヌナズナＳＱＤ１遺伝子ｃＤＮＡ（配列番号：５）の核酸配列を示す（ＧｅｎＢａｎｋデータベースに提出され、アクセッション番号ＡＦ０２２０８２を割り当てられた）。開始および停止コドンは強調のため明るく示した。
【図１４】シアノバクテリアｓｑｄＢ遺伝子（配列番号：７）の核酸配列を示す（ＧｅｎＢａｎｋデータベースに提出され、アクセッション番号Ｕ４５３０８を割り当てられた、ヌクレオチド番号５７６−１７８４）。開始および停止コドンを強調する。
【図１５】シロイヌナズナＳＱＤ１遺伝子ｃＤＮＡ産物（配列番号：６）のアミノ酸配列を示す（ＧｅｎＢａｎｋデータベースに提出され、アクセッション番号ＡＦ０２２０８２を割り当てられた）。
【図１６】シアノバクテリアｓｑｄＸ遺伝子産物（配列番号：２）のアミノ酸配列を示す（ＧｅｎＢａｎｋデータベースに提出され、アクセッション番号Ｕ４５３０８を割り当てられた）。
【図１７】シアノバクテリアｓｑｄＢ遺伝子産物（配列番号：８）のアミノ酸配列を示す（ＧｅｎＢａｎｋデータベースに提出され、アクセッション番号Ｕ４５３０８を割り当てられた）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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