(57)【要約】式に示した2-ヒドロキシメチル-ピロリジン-3,4-ジオールを調製する方法であって、ａ）式に示すN-保護されたアミノテトラオールを生体酸化する工程と、ｂ）対応するN-保護された5-アミノ-5-デオキシ-ペンツロースを脱保護する工程と、ｃ）対応する5-アミノ-5-デオキシ-ペンツロースを水素添加する工程とを具備する方法。【化１】2004532016.tif 000023
2004532016.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）次式のN-保護されたアミノテトラオールまたはその塩
【化１】
2004532016.tif 000012
（ここで、R1はH、置換もしくは非置換のC1-4-アルキル、置換もしくは非置換の
C2-4-アルケニル、またはOR2であり、R2は非置換のC1-4-アルキルである）
を、微生物もしくはその細胞フリーの抽出物を使用して酸化し、対応する次式のN-保護された 5-アミノ-5-デオキシ-ペンツロースを得る工程と、
【化２】
2004532016.tif 000013
（ここで、R1は上記で定義した通りである）
ｂ）前記N-保護された 5-アミノ-5-デオキシ-ペンツロース (II)のN-保護基を除去して、 対応する次式の 5-アミノ-5-デオキシ-ペンツロースを得る工程と、
【化３】
2004532016.tif 000014
ｃ）前記5-アミノ-5-デオキシ-ペンツロース (III)を触媒的に水素添加することにより、対応する次式の (2R)-および／または(2S)-2-ヒドロキシメチル-ピロリジン-3,4-ジオールを得る工程と
【化４】
2004532016.tif 000015
を具備する方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、R1は置換もしくは非置換のC1-2-アルキルまたはH、好ましくはHである方法。
【請求項３】
請求項１または２に記載の方法であって、前記N-保護されたアミノテトラオールが、N-保護された1-アミノ-l-デオキシ-L-アラビニトールまたはN-保護された1-アミノ-l-デオキシ-D-アラビニトール、好ましくはN-置換された1-アミノ-1-デオキシ-D-アラビニトールである方法。
【請求項４】
請求項１〜３の何れか１項に記載の方法であって、前記微生物はグルコノバクター属またはアセトバクター属に属し、好ましくはグルコノバクター・オキシダンス種に属する方法。
【請求項５】
請求項４に記載の方法であって、前記微生物は、グルコノバクター・オキシダンスsspサブオキシダンスDSM 2003（DSM 14076）、グルコノバクター・オキシダンスsspサブオキシダンスDSM 2343およびグルコノバクター・オキシダンスsspサブオキシダンスDSM 50049（ATCC 621）の株からなる群から選択される方法。
【請求項６】
請求項１〜６の何れか１項に記載の方法であって、前記酸化は、前記N-保護されたアミノテトラオールの濃度が50〜250 g/L、より好ましくは100〜250 g/Lにおいて行われる方法。
【請求項７】
請求項１〜６の何れか１項に記載の方法であって、前記酸化はpH4.3〜6.0、より好ましくはpH4.5〜5.5において、且つ10〜50℃、より好ましくは10〜20℃で行われる方法。
【請求項８】
請求項１〜７の何れか１項に記載の方法であって、前記N-保護基はアルカリ性条件下において、好ましくはN-保護された5-アミノ-5-デオキシ-ペンツロースに関して1〜2モル当量の水酸化アルカリの存在下で行われる方法。
【請求項９】
請求項１〜８の何れか１項に記載の方法であって、前記水素添加触媒はパラジウム触媒である方法。
【請求項１０】
請求項１〜９の何れか１項に記載の方法であって、前記水素添加に使用される触媒の量は、0.5〜20%（触媒の重量／5-アミノ-5-デオキシ-ペンツロースの重量）、好ましくは0.5〜10％である方法。
【請求項１１】
請求項１〜１０の何れか１項に記載の方法であって、前記N-保護基の除去および前記接触水素添加は同じ処理工程で行われる方法。
【請求項１２】
ａ） 次式のN-保護された5-アミノ-5-デオキシ-ペンツロースのN-保護基を除去して、
【化５】
2004532016.tif 000016
次式の5-アミノ-5-デオキシ-ペンツロース を得る工程と、
【化６】
2004532016.tif 000017
ｂ）5-アミノ-5-デオキシ-ペンツロース (III) を接触水素添加して、次式の対応する (2R)-および／または(2S)-ヒドロキシメチル-ピロリジン-3,4-ジオールを得る工程と
【化７】
2004532016.tif 000018
を具備する方法。
【請求項１３】
請求項１２に記載の方法であって、前記N-保護された5-アミノ-5-デオキシ-ペンツロースが、N-保護された5-アミノ-5-デオキシ-D-キシルロースまたはN-保護された5-アミノ-5-デオキシ-L-キシルロース、好ましくはN-保護された5-アミノ-5-デオキシ-D-キシルロースである方法。
【請求項１４】
請求項１２または１３に記載の方法であって、前記N-保護基はアルカリ性条件下において、好ましくはN-保護された5-アミノ-5-デオキシ-ペンツロースに関して1〜2モル当量の水酸化アルカリの存在下で行われる方法。
【請求項１５】
請求項１２〜１４の何れか１項に記載の方法であって、前記水素添加触媒はパラジウム触媒である方法。
【請求項１６】
請求項１２〜１５の何れか１項に記載の方法であって、前記水素添加に使用される触媒の量は、0.5〜20%（触媒の重量／5-アミノ-5-デオキシ-ペンツロースの重量）、好ましくは0.5〜10％である方法。
【請求項１７】
請求項１２〜１６の何れか１項に記載の方法であって、前記N-保護基の除去および前記接触水素添加は同じ処理工程で行われる方法。
【請求項１８】
次式のN-ホルミル-アミノテトラオールまたはその塩
【化８】
2004532016.tif 000019
を、微生物またはその細胞フリーの抽出物で酸化して、対応する次式のN-ホルミル-5-アミノ-5-デオキシ-ペンツロース
【化９】
2004532016.tif 000020
を得る工程を具備した方法。
【請求項１９】
請求項１８に記載の方法であって、前記N-ホルミル-アミノテトラオールは、N-ホルミル-1-アミノ-1-デオキシ-D-アラビニトールまたは N-ホルミル-1-アミノ-1-デオキシ-L-アラビニトール、好ましくはN-ホルミル-1-アミノ-1-デオキシ-D-アラビニトールである方法。
【請求項２０】
請求項１８または１９に記載の方法であって、前記微生物はグルコノバクター属またはアセトバクター属に属し、好ましくはグルコノバクター・オキシダンス種に属する方法。
【請求項２１】
請求項１８または１９に記載の方法であって、前記微生物は、グルコノバクター・オキシダンスsspサブオキシダンスDSM 2003（DSM 14076）、グルコノバクター・オキシダンスsspサブオキシダンスDSM 2343およびグルコノバクター・オキシダンスsspサブオキシダンスDSM 50049（ATCC 621）の株からなる群から選択される方法。
【請求項２２】
請求項１８〜２１の何れか１項に記載の方法であって、前記酸化は、前記N-保護されたアミノテトラオールの濃度が50〜250 g/L、より好ましくは100〜250 g/Lにおいて行われる方法。
【請求項２３】
請求項１８〜２２の何れか１項に記載の方法であって、前記酸化はpH4.3〜6.0、より好ましくはpH4.5〜5.5において、且つ10〜50℃、より好ましくは10〜20℃で行われる方法。
【請求項２４】
次式のN-ホルミル-1-アミノ-l-デオキシ-L-アラビニトール。
【化１０】
2004532016.tif 000021
【請求項２５】
次式のN-ホルミル-l-アミノ-1-デオキシ-D-アラビニトール。
【化１１】
2004532016.tif 000022
【発明の詳細な説明】
【発明の分野】
【０００１】
本発明は、2-ヒドロキシメチル-ピロリジン-3,4-ジオール類の製造方法、N-ホルミル-5-アミノ-5-デオキシ-ペンツロースの製造方法、並びに化合物N-ホルミル-1-アミノ-1-デオキシ-D-アラビニトールおよび N-ホルミル-1-アミノ-1-デオキシ-L-アラビニトールに関する。
【０００２】
ポリヒドロキシル化ピロリジンは、グルコキシダーゼ阻害剤類を構成する。(2R,3R,4R)-2ヒドロキシメチル-ピロリジン-3,4-ジオールは、10μM未満のID50値で、幾つかのαおよびグルコシダーゼ類およびマンノシダーゼ類を阻害する（Hung et al. J Org. Chem. 1991,56,3849-3855）。そのエナンチオマーである(2S,3S,4S)-2-ヒドロキシメチル-ピロリジン-3,4-ジオールは、酵母のαグルコシダーゼを阻害することが示された（Fleet et al. Tetrahedron Lett. 1985,26,3127-3130）。
【０００３】
Fleet et al.（Tetrahedron Lett. 1985,26,3127-3130）は、D-キシロースからの、(2R,3R,4R)-および(2S,3S,4S)-2-ヒドロキシメチル-ピロリジン-3,4-ジオールの製造を記載している。両者の合成の欠点は、非常に多くの工程を含むこと、および全体の収率が低いことである。
【０００４】
Hung et al.（J Org. Chem. 1991,56,3849-3855）は、3-アジド-プロペニル-ベンゼンからの(2R,3R,4R)-2-ヒドロキシメチル-ピロリジン-3,4-ジオールの製造を記載している。3-アジド-プロペニル-ベンゼンのオゾン分解の後、得られたアジド-アセトアルデヒドとリン酸ジヒドロキシアセトンとの酵素触媒アルドール縮合に続く脱リン酸化によって、5-アジド-5-デオキシ-D-キシルロースが得られ、これをパラジウムの存在下で水素添加することにより、(2R,3R,4R)-2-ヒドロキシメチル-ピロリジン-3,4-ジオールが得られる。この合成の欠点は、水素添加が多量の触媒を用いて行われることである。
【０００５】
EP 0 624 652 Alは、2-ヒドロキシメチル-ピロリジン-3,4-ジオール類、およびそのN-置換誘導体類の製造を記載している。2-ヒドロキシメチル-ピロリジン-3,4-ジオールは、グルコノバクター属またはコリネバクテリウム属の微生物を使用したN-ベンジル-1-アミノ-1-デオキシ-アラビニトールの微生物的酸化と、その後のパラジウムを触媒に用いた水素添加によって製造される。N-ベンジル-1-アミノ-1-デオキシ-アラビニトールは、アラビノースおよびベンジルアミンから調製すればよい。この2-ヒドロキシメチル-ピロリジン-3,4-ジオールの製造の欠点は、微生物的酸化が低収量でしか酸化生成物を与えず、また接触水素添加が多量の触媒を用いて行われることである。
【０００６】
本発明の目的は、2-ヒドロキシメチル-ピロリジン-3,4-ジオール類を製造するための経済的な方法を提供することである。本発明のもう一つの目的は、N-ホルミル-5-アミノ-5-デオキシ-ペンツロース類を製造するための経済的方法を提供すること、および新規なN-アシル化された1-アミノ-1-デオキシ-アラビニトール類を提供することである。
【０００７】
これらの目的は、請求項１、12および17に従う方法、および請求項22および23に従う化合物によって達成される。
【０００８】
2-ヒドロキシメチル-ピロリジン-3, 4ジオール類を製造するための本発明の方法は、
ａ）次式のN-保護されたアミノテトラオールまたはその塩
【化１２】
2004532016.tif 000003
（ここで、R1はH、置換もしくは非置換のC1-4-アルキル、置換もしくは非置換の
C2-4-アルケニル、またはOR2であり、R2は非置換のC1-4-アルキルである）
を、微生物もしくはその細胞フリーの抽出物を使用して酸化し、対応する次式のN-保護された 5-アミノ-5-デオキシ-ペンツロースを得る工程と、
【化１３】
2004532016.tif 000004
（ここで、R1は上記で定義した通りである）
ｂ）前記N-保護された 5-アミノ-5-デオキシ-ペンツロース (II)のN-保護基を除去して、 対応する次式の 5-アミノ-5-デオキシ-ペンツロースを得る工程と、
【化１４】
2004532016.tif 000005
ｃ）前記5-アミノ-5-デオキシ-ペンツロース (III)を触媒的に水素添加することにより、対応する次式の(2R)-および／または(2S)-2-ヒドロキシメチル-ピロリジン-3,4-ジオールを得る工程と
【化１５】
2004532016.tif 000006
を具備する。
【０００９】
式I、II、III、IVおよびVにおける星印は、定義されたコンフィギュレーションのキラル炭素原子を示している。
【００１０】
N-保護されたアミノテトラオール類は、N-保護された1-アミノ-1デオキシ-D-アラビニトール類、N-保護された1-アミノ-1-デオキシ-L-アラビニトール類、N-保護された1-アミノ-1デオキシ-D-リビトール類、N-保護された1-アミノ-1-デオキシ-L-リビトール類、N-保護された1-アミノ-1-デオキシ-D-キシリトール類、N-保護された1-アミノ-1-デオキシ-L-キシリトール類、N-保護された1-アミノ-1-デオキシ-D-リキシトール類(lyxitols)、およびN-保護された1-アミノ-1-デオキシ-L-リキシトール類からなる群から選ばれる。
【００１１】
好ましいN-保護されたアミノテトラオール類は、N-保護された1-アミノ-1-デオキシ-D-アラビニトール類、およびN-保護された1-アミノ-1-デオキシ-L-アラビニトール類である。
【００１２】
より好ましいN-保護されたアミノテトラオール類は、N-保護された1-アミノ-1-デオキシ-D-アラビニトール類である。
【００１３】
N-保護されたアミノテトラオール類の塩は、例えば、N-保護されたアミノテトラオール類をHClのような強い鉱酸で処理することにより形成された塩である。
【００１４】
N-保護された1-アミノ-1デオキシ-L-リビトールおよびN-保護された1-アミノ-1-デオキシ-D-リキシトールに対応するN-保護された5-アミノ-5-デオキシ-ペンツロースは、N-保護された5-アミノ-5-デオキシD-リブロースである。N-保護された1-アミノ-1-デオキシ-D-リビトールおよびN-保護された1-アミノ-1-デオキシ-L-リキシトールに対応するN-保護された5-アミノ-5-デオキシ-ペンツロースは、N-保護された5-アミノ-5-デオキシ-L-リブロースである。N-保護された1-アミノ-1-デオキシ-L-アラビニトールおよびN-保護された1-アミノ-1-デオキシ-L-キシリトールに対応するN-保護された5-アミノ-5-デオキシ-ペンツロースは、L-キシルロースである。N-保護された1-アミノ-1-デオキシ-D-キシリトールおよびN-保護された1-アミノ-1-デオキシ-D-アラビニトールに対応するN-保護された5-アミノ-5-デオキシ-ペンツロースは、N-保護された5-アミノ-5-デオキシ-D-キシルロースである。
【００１５】
N-保護された5-アミノ-5-デオキシ-D-リブロースに対応する5-アミノ-5-デオキシ-ペンツロースは、5-アミノ-5-デオキシ-D-リブロースである。従って、5-アミノ-5-デオキシ-L-リブロースは、N-保護された5-アミノ-5-デオキシ-L-リブロースに対応し、5-アミノ-5-デオキシ-L-キシルロースは、N-保護された5-アミノ-5-デオキシ-L-キシルロースに対応し、また5-アミノ-5-デオキシ-D-キシルロースは、N-保護された5-アミノ-5-デオキシ-D-キシルロースに対応する。
【００１６】
5-アミノ5-デオキシ-D-リブロースに対応する(2R)-および／または(2S)-2-ヒドロキシメチル-ピロリジン-3,4-ジオールは、(2R,3S,4R)-および／または(2S,3S,4R)-2-ヒドロキシメチル-ピロリジン-3,4ジオールである。従って、(2R,3R,4S)-および／または(2S,3R,4S)-ヒドロキシメチル-ピロリジン-3,4-ジオールは、5-アミノ-5-デオキシ-L-リブロースに対応し、(2R,3S,4)-および／または(2S,3S,4S)-2-ヒドロキシメチル-ピロリジン-3,4-ジオールは、5-アミノ-5-デオキシ-L-キシルロースに対応し、また(2R,3R,4R)-および／または(2S,3R,4R)-2-ヒドロキシメチル-ピロリジン-3,4-ジオールは、5-アミノ-5-デオキシ-D-キシルロースに対応する。
【００１７】
C1-4-アルキルは分岐もしくは非分岐であってよく、また少なくとも一つのヒドロキシル基および／またはハロゲン原子で置換されてもよい。ハロゲン原子はフッ素、塩素、臭素またはヨウ素であってよい。
【００１８】
非置換のC1-4-アルキルの例は、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、およびtert-ブチルである。R1が非置換 C1-4-アルキルである場合の対応するN-保護基は、アセチル、プロパノイル、ブタノイル、イソブタノイル、ペンタノイル、イソペンタノイルおよび2,2-ジメチルプロパノイル (ピバロイル)である。R1がOR2で且つR2が非置換C1-4-アルキルである場合の対応するN-保護基は、メトキシカルボニル、エトキシカルボニル、イソプロポキシカルボニル、ブトキシカルボニル、イソブトキシカルボニル、およびtert-ブトキシカルボニルである。置換C1-4-アルキルの例は、クロロメチル、ジクロロメチル、トリクロロメチル、フルオロメチル、ジフルオロメチル、トリフルオロメチル、ヒドロキシメチル、および1-ヒドロキシ-エチルである。R1が置換C1-4-アルキルである場合の対応するN-保護基は、クロロアセチル、ジクロロアセチル、トリクロロアセチル、フルオロアセチル、ジフルオロアセチル、トリフルオロアセチル、ヒドロキシアセチル、および2-ヒドロキシ-プロパノイルである。
【００１９】
C2-4-アルケニルは分岐鎖でも非分岐鎖でもよく、また少なくとも一つのヒドロキシル基および／またはハロゲン原子で置換されてもよい。ハロゲン原子はフッ素、塩素、臭素またはヨウ素であってよい。非置換C2-4-アルケニルの例は、エテニル、1-プロペニル、2-プロペニル、1-メチル-2-プロペニル、2-メチル-l-プロペニル、1-ブテニル、2-ブテニルおよび3-ブテニルである。R1が非置換C2-4-アルケニルである場合の対応するN-保護基は、アクリロイル、クロトノイル、3-ブテノイル、2-メチル-3-ブテノイル、3-メチル-2-ブテノイル、2-ペンテノイル、3-ペンテノイルおよび4-ペンテノイルである。置換C2-4-アルケニルの例は、1-クロロエテニルおよび2-クロロエテニルである。R1が置換C2-4-アルケニルである場合の対応するN-保護基は、2-クロロアクリロイルおよび3-クロロアクリロイルである。
【００２０】
R1がHである場合、対応するN-保護基はホルミルである。
【００２１】
好ましくは、R1はH、または置換もしくは非置換のC1-2アルキルである。より好ましくは、R1はHである。
【００２２】
ホルミル保護基は、水性媒質中における高溶解度のN-保護されたアミノテトラオールを与える利点を有している。従って、生体酸化は、高濃度のN-ホルミルアミノテトラオールにおいて生体酸化を行い、高収量のN-ホルミル-5アミノ-5-デオキシ-ペンツロースを得ることができる。N-ホルミル-1-アミノ-1-デオキシ-D-アラビニトールの生体酸化においては、200 g/LまでのN-ホルミル-5-アミノ-5-デオキシ-D-キシルロースの収量を達成することができる。
【００２３】
N-保護されたアミノテトラオール類は、対応するアミノテトラオールから、当業者に知られた方法によって調製することができる。N-ホルミル-アミノテトラオール類（R1はH）は、対応するアミノテトラオールから、該アミノテトラオールと蟻酸メチル、蟻酸エチルまたは蟻酸ブチルのような蟻酸アルキルとの反応、蟻酸フェニルのような蟻酸アリールとの反応、酢酸蟻酸無水物のような蟻酸およびもう一つのカルボン酸の混合酸無水物との反応、または蟻酸との反応によって調製すればよい。N-アシル-アミノテトラオール類（R1は置換もしくは非置換のC1-4-アルキルまたは置換もしくは非置換のC2-4-アルケニル）は、アミノテトラオールと適切な塩化アシルカルボン酸アルキルエステル、カルボン酸アリールエステル、カルボン酸無水物またはカルボン酸との反応によって調製すればよい。N-アセチルアミノテトラオール類は、対応するアミノテトラオールから、例えば塩化アセチル、酢酸無水物または酢酸との反応によって調製することができる。N-アルコキシカルボニル-アミノテトラオール類（R1はOR2、R2は置換C1-4-アルキルである)は、対応するアミノテトラオールを、適切なクロロ蟻酸アルキル、アジド蟻酸アルキルまたは適切なジカルボン酸ジアルキルと反応させることによって調製すればよい。N-tert-ブトキシカルボニル-アミノテトラオール類は、対応するアミノテトラオールを、例えばジカルボン酸ジ-tert-ブチルト反応させることによって調製すればよい。
【００２４】
アミノテトラオールは、D-アラビノース、L-アラビノース、D-キシロース、L-キシロース、D-リボース、L-リボース、D-リキソースおよびL-リキソースのような対応のペントースから、当業者に既知の方法によって調製すればよい。このペントースを、一級もしくは二級アミンと、またはヒドロキシルアミンと反応させて、対応するイミンまたはオキシムにし、これを触媒的に水素添加してアミノテトラオールを得ることができる。アラビノースの適切なエナンチオマーを還元条件下でベンジルアミント反応させ、得られた対応するN-ベンジル1-アミノ-1-デオキシ-アラビニトールを触媒的に水素添加することによって、1-アミノ-1-デオキシ-D-アラビニトールはD-アラビノースから、また1-アミノ-1-デオキシ-L-アラビニトールはL-アラビニトールから調製すればよい。
【００２５】
生体酸化工程は、N-保護されたアミノテトラオール類のC-4におけるヒドロキシル基をケト基に酸化できる何れかの微生物を用いて行うことができる。この微生物はバクテリアまたは真菌である。適切なバクテリアはグルコノバクター属、アセトバクターまたはコリネバクテリウムの菌である。適切な真菌類は、メチュニコビア（Metschnikowia）属、カンジダ属、またはサッカロマイセス属のものである。
【００２６】
好ましい微生物は、グルコノバクター属またはアセトバクター属のバクテリアである。より好ましい微生物は、グルコノバクター・オキシダンス種のものである。グルコノバクター・オキシダンス種の者である。グルコノバクター・オキシダンス種のバクテリアは、亜種グルコノバクター・オキシダンスsspサブオキシダンス（以前はアセトバクター・サブオキシダンスまたはアセトモナス・サブオキシダンスとして知られていた）、およびグルコノバクター・オキシダンスssp.オキシダンス（以前はアセトモナスオキシダンスとして知られていた）とも呼ばれる。
【００２７】
最も好ましい微生物は、DSM 2003（DSM 14076）、DSM 2343およびDSM 50049（ATCC 621）で指定されたグルコノバクターオキシダンスssp.サブオキシダンスからなる一群の株から選択される。
【００２８】
これらの株は、ドイツ細胞培養体および微生物寄託センター（Deutsche Sammlung fur Zellkulturen und Mikroorganismen GmbH (DSMZ); Mascheroder Weg lb, D-38124 Braunschweig, Germany）から得ることができる。グルコノバクター・オキシダンスssp.サブオキシダンスDSM 2003株は、DSM 14076の名称で、ブダペスト条約の下に、2001年2月23日にDSMZに寄託された。
【００２９】
また、寄託番号DSM 2003（DSM 14076）、DSM 2343およびDSM 50049（ATCC 621）のバクテリア株であるグルコノバクター・オキシダンスssp.サブオキシダンスは、グルコノバクター・オキシダンスssp.サブオキシダンス種に属するその変異体を意味し、N-保護されたアミノテトラオールのC-4におけるヒドロキシル基をケト基に酸化することができる。このような変異体は、上記バクテリア株の誘導された突然変異または自然突然変異の後、得られた変異体を単離し、ついでその単離された変異体を、N-保護されたアミノテトラオールのC-4におけるヒドロキシル基をケト基に酸化する能力についてスクリーニングすることにより得ることができる。変異の例は、ゲノムのDNA切片の一つまたは複数の塩基の置換、挿入もしくは欠失、または逆位である。自然変異は、DNA複製におけるエラー起因して天然に生じる変異である。誘導された変異は、放射線（紫外線照射、X線またはガンマ線）、変異性化学物質（メタンスルホン酸エチル、亜硝酸塩、またはブロモウラシル）、またはポリメラーゼ連鎖反応（PCR）のような当業者に既知の方法によって得ることができる。
【００３０】
これらの微生物は、大豆ペプトンおよび酵母エキスのような炭素源、窒素源およびエネルギー源として働く栄養素、およびN-保護されたアミノテトラオールのC-4ヒドロキシル基のケト基への酸化を触媒する酵素活性インデューサを含有する、適切な培地上で増殖させることができる。酵素活性の適切なインデューサは、D-マンニトール、L-マンニトール、D-ソルビトール、L-ソルビトール、ガラクチトール、エリスリトール、D-トレイトールおよびL-トレイトールのような糖アルコール類である。好ましいインデューサは、D-ソルビトールおよびL-ソルビトールである。より好ましいインデューサはD-ソルビトールである。
【００３１】
微生物の増殖は、pH5.0〜8.0、好ましくはpH5.5〜7.0、および 20〜35℃、好ましくは28〜32℃において行われる。
【００３２】
好ましくは、この増殖は好気的条件下で行われる。予備培養体はガス透過性の蓋を有するフラスコ内で増殖させればよく、また発酵は発酵装置、または例えば空気または酸素を供給しながら撹拌される容器内で行ってもよい。発酵は、周囲圧力（約1バール）または3バール以下の過剰圧力において行えばよい。より好ましくは、増殖は空気を供給することによって、発酵ブロス内の酸素量を60％（大気圧でのPo2/Po2 sat.）以上、最も好ましくは70％以上に維持しながら行う。
【００３３】
増殖の後、微生物は、例えば濾過または遠心分離によって回収することができる。
【００３４】
N-保護された1-アミノ-1-デオキシ-ペンツロースへのN-保護されたアミノテトラオールの生体酸化は、微生物またはその細胞抽出物を用いて行われる。この微生物は、固定化された休止細胞のような休止細胞として、または増殖中の細胞として用いればよい。その細胞抽出物とは、当業者に既知の微生物細胞破壊法または自己溶菌によって得られる粗製の細胞抽出物を意味する。微生物細胞破壊法の例は、超音波法またはフレンチプレス法である。好ましくは、生体酸化は微生物を用いて、好ましくは微生物の休止細胞を用いて行われる。
【００３５】
好ましくは、N-保護されたアミノテトラオールの濃度は、50〜250 g/L、より好ましくは100〜250 g/L、最も好ましくは150〜250 g/Lである。
【００３６】
好ましくは、生体酸化はpH4.3〜6.0、より好ましくはpH4.5〜5.5で、且つ10〜50℃、より好ましくは10〜20℃で行われる。
【００３７】
生体酸化は、バッチプロセス、流加プロセス(fed-batch)として行ってもよく、または連続プロセスとして行ってもよい。
【００３８】
生体酸化は、通常は12〜84時間、好ましくは12〜36時間行われる。
【００３９】
生体酸化の後、細胞は、例えば濾過または遠心分離によって除去される。こうして得られた溶液は次の工程で直接用いてもよく、または、次の工程で用いる前にN-保護された5-アミノ-5-デオキシ-D-キシルロースを該溶液から単離してもよい。
【００４０】
N-保護された5-アミノ-5-デオキシ-ペンツロースのN-保護基の除去は、中性、アルカリ性または酸性の条件下での化水分解によって、またはアシラーゼのような酵素を使用することによって行われる。
【００４１】
好ましくは、N-保護基はアルカリ性条件下で除去される。適切な塩基の例は、水酸化アルカリ金属、水酸化アルカリ土類金属、水酸化アンモニウム、水酸化ジアルキルアンモニウム、水酸化トリアルキルアンモニウム、水酸化テトラアルキルアンモニウム、炭酸アルカリ金属または炭酸アルカリ土類金属である。水酸化アルカリ金属の例は、水酸化ナトリウム、水酸化カリウムおよび水酸化リチウムである。水酸化アルカリ土類金属の例は、水酸化カルシウムおよび水酸化バリウムである。水酸化ジアルキルアンモニウムの一例は、水酸化ジイソプロピルアンモニウムである。水酸化トリアルキルアンモニウムの一例は、水酸化トリエチルアンモニウムである。水酸化テトラアルキルアンモニウムの一例は、水酸化テトラブチルアンモニウムである。炭酸アルカリ金属の例は、炭酸ナトリウム、炭酸カリウムおよび炭酸リチウムである。炭酸アルカリ土類金属の例は、炭酸カルシウムおよび炭酸バリウムである。
【００４２】
より好ましくは、N-保護基は、N-保護された5-アミノ-5-デオキシ-ペンツロースに関して1〜2モル当量の水酸化アルカリを用いて除去される。
【００４３】
最も好ましくは、N-保護基は、N-保護された5-アミノ-5-デオキシ-ペンツロースに関して1〜2モル当量の水酸化ナトリウムまたは水酸化カリウムを用いて除去される。
【００４４】
還元剤としての適切な水素添加触媒には、ニッケル、またはパラジウム、ロジウムもしくはプラチナのような貴金属が含まれる。水素添加触媒の例は、ラネーニッケル、パラジウム-炭素、パラジウム-硫酸バリウム、パラジウム-炭酸カルシウム、プラチナ-炭素、ロジウム-炭素、およびロジウム-酸化アルミニウムである。この触媒の貴金属は、1〜20％（w/w）、好ましくは 4〜10％（w/w）である。好ましくは、水素添加触媒はパラジウム触媒であり、更に好ましくは、水素添加触媒はパラジウム-炭素である。
【００４５】
水素添加に使用する触媒の量は、0.1〜100％（触媒の重量／5-アミノ-5-デオキシ-ペンツロースの重量）、好ましくは0.5〜20％、より好ましくは0.5〜10％である。
【００４６】
水素添加に使用する溶媒は、水、またはメタノール、エタノール、プロパノールもしくはイソプロパノールのような水混和性アルコール、または水と水混和性アルコールの混合物であり、より好ましくは水である。
【００４７】
水素添加は、0〜120℃、好ましくは15〜40℃、より好ましくは20〜30℃の温度、および0.5〜100バール、好ましくは2〜10バール、より好ましくは4〜6バールの水素圧力で行うことができる。
【００４８】
水素添加の反応時間は、通常は1〜50時間、好ましくは5〜40時間、より好ましくは10〜30時間である。
【００４９】
水素添加によって、通常は、(2R)-または(2S)-2-ヒドロキシメチル-ピロリジン-3,4-ジオールが高いジアステレオマー過剰（d.e.）、好ましくは＞80％d.e.、より好ましくは＞90％d.e.で与えられる。
【００５０】
水素添加の後、触媒は例えば濾過により除去することができる。生成物である2-ヒドロキシメチル-ピロリドンは、イオン交換クロマトグラフィーによって精製することができる。
【００５１】
N-保護基の除去および接触水素添加は、別々の処理工程で行うこともでき、または同じ処理工程で行うこともできる。好ましくは、N-保護基の除去および接触水素添加は同じ処理工程で行われる。
【００５２】
また、本発明の一部は、2-ヒドロキシメチル-3,4ジオールの調製方法であって：
ａ） 次式のN-保護された5-アミノ-5-デオキシ-ペンツロースのN-保護基を除去して、
【化１６】
2004532016.tif 000007
次式の5-アミノ-5-デオキシ-ペンツロースを得る工程と、
【化１７】
2004532016.tif 000008
ｂ）5-アミノ-5-デオキシ-ペンツロース(III) を接触水素添加して、次式の対応する (2R)-および／または(2S)-ヒドロキシメチル-ピロリジン-3,4-ジオールを得ることと
【化１８】
2004532016.tif 000009
を具備する。
【００５３】
適切なN-保護された5-アミノ-5-デオキシ-ペンツロースは、N-保護された5-アミノ-5-デオキシ-D-キシルロース、N-保護された5-アミノ-5-デオキシ-L-キシルロース、N-保護された5-アミノ-5-デオキシ-D-リブロース、およびN-保護された5-アミノ-5-デオキシ-L-リブロースである。好ましいN-保護された5-アミノ-5-デオキシペンツロースは、N-保護された5-アミノ-5-デオキシ-D-キシルロース、およびN-保護された5-アミノ-5-デオキシ-L-キシルロースである。より好ましいN-保護された5-アミノ-5-デオキシ-ペンツロースは、5-アミノ-5-デオキシ-D-キシルロースである。
【００５４】
N-保護されたアミノテトラオール(I)からの2-ヒドロキシメチル-ピロリジン-3,4-ジオールの調製について与えられた全ての定義は、適切なときは、このプロセスに対してもそのまま適用される。
【００５５】
本発明のもう一つの目的は、次式のN-ホルミル-アミノテトラオールまたはその塩
【化１９】
2004532016.tif 000010
を、微生物またはその細胞フリーの抽出物で酸化して、対応する次式のN-ホルミル-5-アミノ-5-デオキシ-ペンツロース
【化２０】
2004532016.tif 000011
を得る工程を具備した方法である。
【００５６】
適切なN-ホルミル-アミノテトラオールは、N-ホルミル-l-アミノ-1-デオキシ-D-アラビニトール、N-ホルミル-1-アミノ-1-デオキシ-L-アラビニトール、N-ホルミル-1-アミノ-1-デオキシ-D-リビトール、N-ホルミル-1-アミノ-1-デオキシ-L-リビトール、N-ホルミル-1-アミノ-1-デオキシ-D-キシリトール、N-ホルミル-1-アミノ-1-デオキシ-L-キシリトール、N-ホルミル-1-アミノ-1-デオキシ-D-リキシトール、およびN-ホルミル-1-アミノ-1-デオキシ-L-リキシトールからなる群から選択される。
【００５７】
好ましいN-ホルミル アミノテトラオールは、N-ホルミル-l-アミノ-l-デオキシ-D-アラビニトール、およびN-ホルミル-1-アミノ-1-デオキシ-L-アラビニトールである。より好ましいN-保護されたアミノテトラオールは、N-ホルミル-1-アミノ-1-デオキシ-D-アラビニトールである。
【００５８】
N- 保護されたアミノテトラオール(I)からの2-ヒドロキシメチル-ピロリジン-3,4-ジオールの調製について与えられた全ての定義は、適切なときは、この方法にもそのまま適用される。
【００５９】
化合物N-ホルミル-1-デオキシ-1-アミノ-D-アラビニトール、およびN-ホルミル-1-デオキシ-l-アミノ-L-アラビニトールもまた、本発明の一部である。
【実施例】
【００６０】
実施例１
N-ホルミル-1-アミノ-1-デオキシ-D-アラビニトールの調製
1-アミノ-l-デオキシ-D-アラビニトール（50.0 g, 330 mmol）を、メタノール（1300 mL）中に35℃まで加温することにより溶解した。20℃に冷却した後、 蟻酸メチル（43.6 g, 725 mmol）を添加し、機械的撹拌機および加熱冷却システムを備えた二重壁フラスコ内において、この溶液を約20℃で撹拌した。2時間後に白色の固体が沈殿した。全体で3時間の反応時間の後、混合物を撹拌しながら0℃で1時間冷却した。仕上げのために、得られた白色懸濁液を濾過し、冷メタノールで2回（各35 mL）洗浄した。この沈殿を40℃および25 mbarで乾燥して、N-ホルミル-1-アミノ-1-デオキシ-D-アラビチノールを得た（82%）。
【００６１】
実施例２
N-ホルミル-1-アミノ-1-デオキシ-L-アラビニトールの調製
出発物質として1-アミノ-1-デオキシ-L-アラビニトールを用い、N-ホルミル-1-アミノ-1-デオキシ-L-アラビチノールを得た点を除き、実施例１に記載したようにしてホルミル化を行った。
【００６２】
実施例３
バイオマスの調製
酵母エキス（3 g/L）、D-ソルビトール（60 g/L）および大豆ペプトン（5 g/L）を脱イオン水中に溶解し、NaOHでpHを6.3±0.3に調節することにより、培地Ａを調製した。培地Ａを三つのエルレンマイヤーフラスコ（各100 mL）の中に配置し、滅菌し（121℃、20分、1 bar）、グルコノバクター・オキシダンスssp.サブオキシダンスDSM 2003（DSM 14076）を接種した（各1 mL）。この予備培養物を、30℃および200 rpmで24時間インキュベートした。培地Ａ（11.5 L）を30 Lの発酵装置の中に配置し、滅菌し（121℃、30分、1 bar）、予備培養物（200 mL）を接種した。発酵は、空気を供給することによって発酵ブロス中の酸素量を70％以上（大気圧でのPo2/Po2 sat.）に維持しながら、28℃およびpH6.3で行われた。約13時間後、発酵ブロスを冷却し、4℃で濾過した。MgSO4水溶液（20 mM）を用いて超遠心により細胞を洗浄し、濃縮した。濃縮した細胞懸濁液を、MgSO4水溶液（20 mM）を用いてOD650nm 200まで希釈し、4℃で保存した。
【００６３】
実施例４
N-ホルミル-1-アミノ-1-デオキシ-D-アラビニトールの生体酸化
N-ホルミル-1-デオキシ-l-アミノ-D-アラビニトール（20 g, 111 mmol）を、水（100 mL）の中に溶解した。実施例３に記載したようにして調製したグルコノバクター・オキシダンスssp.サブオキシダンスDSM 2003（DSM 14076）を添加し、pHを5.0に調節した。この生体酸化は、15℃およびpH5において震盪しながら行った。24時間後、TLCによって測定したところ、出発物質は殆ど定量的に N-ホルミル-5-アミノ-5-デオキシ-D-キシルロースに変換された。細胞を遠心分離によって除去し、得られた溶液は水素添加を行うまで保存した。
【００６４】
実施例５
N-ホルミル-1-アミノ-1-デオキシ-L-アラビニトールの生体酸化
出発物質としてN-ホルミル-l-アミノ- 1-デオキシ-L-アラビニトールを使用した点を除き、実施例４に記載したのと同様にして生体酸化を行った。N-ホルミル-1-アミノ-1-デオキシ-L-アラビニトールは、N-ホルミル-5-アミノ-5-デオキシ-L-キシルロースに変換された。
【００６５】
実施例６
N-ホルミル-5-アミノ-5-デオキシ-D-キシルロースの接触水素添加
実施例４に記載したようにして得たN-ホルミル-5-アミノ-5-デオキシ-D-キシルロース（100 g, 111 mmol）、KOH（1 M, 111 mL, 111 mmol）および Pd/C（4％で53.4 %の水 (Degussa-Huls), 1.0 g）の水溶液を、加熱冷却システムを備えたハステロイ（Hastelloy）の1 Lオートクレーブ中で脱イオン水（50 mL）の中に混合した。この反応混合物を窒素（5 bar）で3回パージし、次いでH2（5 bar）で3回パージした。反応容器は、H2（5 bar）で加圧した。23℃で20時間撹拌した後、反応混合物をN2で3回パージした。セライト（Celit；登録商標）上で濾過した後、茶色の溶液（183 g）を得た。この溶液をイオン交換樹脂カラム（直径3cm、高さ20cm、Dowex（登録商標）50Wx8H、100-200メッシュ）で精製した。この樹脂は、HCl水溶液（7％）で活性化し、次いでpH3〜4まで水で洗浄した。生成物をロードした後、カラムを水で5回パージし（各回毎に168 mL）、次いでNH3水溶液（5%, 114 mL）で溶出し、終了時点において水（283 mL）で洗浄した。画分を回収し、TLCでチェックした（溶媒系：ジクロロメタン／水／アンモニア水溶液(25%)= 17/3/2、検出：KMnO4/Na2CO3= 1/1)）。Rf〔(2R,3R,4R)-2-ヒドロキシメチル-ピロリジン-3,4-ジオール)=0.2-0.4〕、Rf〔(N-ホルミル-5-アミノ-5-デオキシ-D-キシルロース)=0.83〕。同一の画分をプールして水を除去した後、高圧キャピラリー電気泳動（HPCE）で測定したときのジアステレオマー過剰が94.4％の、(2R,3R,4R)-2-ヒドロキシメチル-ピロリジン-3,4-ジオールが得られた（N-ホルミル-1-アミノ-1-デオキシ-D-アラビニトールから出発して72％）。
【００６６】
実施例７
N-ホルミル-5-アミノ-5-デオキシ-L-キシルロースの水素添加
水素添加は、N-ホルミル-5アミノ-5-デオキシ-L-キシルロースを出発物質として用いた以外は、実施例６に記載したのと同様に行った。(2S,3S,4S)-2-ヒドロキシメチル- ピロリジン-3,4-ジオールが得られた。
【００６７】
実施例８
接触水素添加に先立つN-ホルミル保護基の除去
実施例に記載したようにして得らたN-ホルミル-5-アミノ-5-デオキシ-D-キシルロース（100 g, 111 mmol）、KOH（1 M, 111 mL, 111 mmol）および脱イオン水（50 mL）の水溶液を、加熱冷却システムを備えたハステロイ（Hastelloy）の1 Lオートクレーブ中において、約23℃で1時間撹拌した。Pd/C（4％で53.4 %の水 (Degussa-Huls), 1.0 g）を添加し、実施例６に記載した能登同様にして水素添加を行った。(2R,3R,4R)-2-ヒドロキシメチル-ピロリジン-3,4-ジオールが得られた。
【国際公開パンフレット】
2004532016.tif 000024
2004532016.tif 000025
2004532016.tif 000026
2004532016.tif 000027
2004532016.tif 000028
2004532016.tif 000029
2004532016.tif 000030
2004532016.tif 000031
2004532016.tif 000032
2004532016.tif 000033
2004532016.tif 000034
2004532016.tif 000035
2004532016.tif 000036
2004532016.tif 000037
2004532016.tif 000038
2004532016.tif 000039
2004532016.tif 000040
2004532016.tif 000041
2004532016.tif 000042
2004532016.tif 000043
2004532016.tif 000044
2004532016.tif 000045
2004532016.tif 000046
2004532016.tif 000047
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004532016.tif 000048
2004532016.tif 000049
【国際調査報告】
2004532016.tif 000050
2004532016.tif 000051
2004532016.tif 000052
2004532016.tif 000053