(57)【要約】本発明は、核酸を固体表面に結合する方法、およびヌクレオチド類縁体がポリメラーゼ反応において成長中のＤＮＡ鎖に組み込まれた後に、各ヌクレオチド類縁体の種別を検出することで、核酸をシーケンシングする方法を提供する。本発明はまた、切断可能なリンカーによりヌクレオチド類縁体に結合される特有の標識、およびデオキシリボースの３’位にある−ＯＨ基をキャップする切断可能な化学基を含むヌクレオチド類縁体を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヌクレオチド類縁体がポリメラーゼ反応において成長中のＤＮＡ鎖に組み込まれた後に、該ヌクレオチド類縁体の種別を検出することで核酸をシーケンシングする方法において：
（ｉ）上記核酸の５’末端を固体表面に結合する工程と、
（ｉｉ）上記固体表面に結合された上記核酸に、プライマーを結合する工程と、
（ｉｉｉ）ポリメラーゼおよび１以上の異なるヌクレオチド類縁体を上記核酸に添加し、それにより上記成長中のＤＮＡ鎖にヌクレオチド類縁体を組み込む工程であって、ここで組み込まれたヌクレオチド類縁体は上記ポリメラーゼ反応を終結させ、また異なるヌクレオチド類縁体はそれぞれ、（ａ）アデニン、グアニン、シトシン、チミン、およびウラシル、ならびにそれらの類縁体からなる群から選択される塩基、（ｂ）切断可能なリンカーにより該塩基または該塩基の類縁体に結合される特有の標識、（ｃ）デオキシリボース、および（ｄ）該デオキシリボースの３’位にある−ＯＨ基をキャップするための切断可能な化学基を含む工程と、
（ｉｖ）上記固体表面を洗浄して、組み込まれていないヌクレオチド類縁体を除去する工程と、
（ｖ）上記成長中のＤＮＡ鎖に組み込まれた上記ヌクレオチド類縁体に結合された上記特有の標識を検出して、それにより組み込まれたヌクレオチド類縁体を同定する工程と、
（ｖｉ）１以上の化学的化合物を添加して、上記核酸に結合された上記プライマー上の全ての未反応−ＯＨ基、または１以上のヌクレオチド類縁体を上記プライマーに添加することにより形成されたプライマー伸長鎖上の全ての未反応−ＯＨ基を永久的にキャップする工程と、
（ｖｉｉ）上記成長中のＤＮＡ鎖に組み込まれた上記ヌクレオチド類縁体と上記特有の標識との間の上記切断可能なリンカーを切断する工程と、
（ｖｉｉｉ）上記デオキシリボースの上記３’位にある上記−ＯＨ基をキャップしている上記切断可能な化学基を切断して、上記−ＯＨ基からキャップを外し、上記固体表面を洗浄して、切断された化合物を除去する工程と、
（ｉｘ）工程（ｉｉｉ）〜（ｖｉｉｉ）を繰り返して、上記成長中のＤＮＡ鎖に新たに組み込まれたヌクレオチド類縁体の上記種別を検出する工程と
を含み、
上記特有の標識が色素である場合には、工程（ｖ）〜（ｖｉｉ）の順序は、（ｖ）、（ｖｉ）、および（ｖｉｉ）であり、
上記特有の標識が質量タグである場合には、工程（ｖ）〜（ｖｉｉ）の順序は、（ｖｉ）、（ｖｉｉ）、および（ｖ）である方法。
【請求項２】
前記固体表面は、ガラス、シリコン、または金である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記固体表面は、磁気ビーズ、チップ、チップ内チャネル、またはチップ内多孔質チャネルである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記核酸を前記固体表面に結合する前記工程は、以下の：
（ｉ）前記固体表面をホスフィン部分でコーティングすることと、
（ｉｉ）前記核酸の前記５’末端にアジド基を結合することと、
（ｉｉｉ）前記固体表面上の前記ホスフィン部分と、前記核酸の前記５’末端上の前記アジド基との間の相互作用により、前記核酸の前記５’末端を前記固体表面に固定化することと
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記固体表面を前記ホスフィン部分でコーティングする前記工程は、以下の：
（ｉ）前記表面を第一アミンでコーティングすることと、
（ｉｉ）トリアリールホスフィンのＮ−ヒドロキシスクシンイミジルエステルを前記第一アミンと共有結合させることと
を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記固体表面に結合される前記核酸は、一本鎖ＤＮＡである、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
工程（ｉ）で前記固体表面に結合される前記核酸は、二本鎖ＤＮＡであり、一方の鎖のみが、前記固体表面上に直接結合され、前記固体表面上に直接結合されない鎖は、工程（ｉｉ）に進む前に変性させることで除去される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記固体表面上に結合される前記核酸は、ＲＮＡであり、工程（ｉｉｉ）における前記ポリメラーゼは、逆転写酵素である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記プライマーは、工程（ｉｉ）において前記核酸の３’末端に結合され、結合されたプライマーは、前記ポリメラーゼ反応中に自己プライミングすることが可能である安定なループおよびデオキシリボースの３’位にある−ＯＨ基を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記核酸に前記プライマーを結合する前記工程は、前記核酸に前記プライマーをハイブリダイズすること、または前記核酸に前記プライマーを連結することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
１以上の４つの異なるヌクレオチド類縁体が工程（ｉｉｉ）において添加され、異なるヌクレオチド類縁体それぞれは、チミンもしくはウラシル、またはチミンもしくはウラシルの類縁体、アデニンまたはアデニンの類縁体、シトシンまたはシトシンの類縁体、およびグアニンまたはグアニンの類縁体からなる群から選択される異なる塩基を含み、該４つの異なるヌクレオチド類縁体はそれぞれ、特有の標識を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記ヌクレオチド類縁体中の前記デオキシリボースの前記３’位にある前記−ＯＨ基をキャップする前記切断可能な化学基は、−ＣＨ２ＯＣＨ３または−ＣＨ２ＣＨ＝ＣＨ２である、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ヌクレオチド類縁体に結合される前記特有の標識は、蛍光部分または蛍光半導体結晶である、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記蛍光部分は、５−カルボキシフルオレセイン、６−カルボキシローダミン−６Ｇ、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−６−カルボキシローダミン、および６−カルボキシ−Ｘ−ローダミンからなる群から選択される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記ヌクレオチド類縁体に結合される前記特有の標識は、エネルギー転移供与体およびエネルギー転移受容体を含む蛍光エネルギー転移タグである、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記エネルギー転移供与体は、５−カルボキシフルオレセインまたはシアニンであり、前記エネルギー転移授与体は、ジクロロカルボキシフルオレセイン、ジクロロ−６−カルボキシローダミン−６Ｇ、ジクロロ−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−６−カルボキシローダミン、およびジクロロ−６−カルボキシ−Ｘ−ローダミンからなる群から選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記ヌクレオチド類縁体に結合される前記特有の標識は、質量分析計により検出および識別することができる質量タグである、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記質量タグは、２−ニトロ−α−メチルベンジル基、２−ニトロ−α−メチル−３−フルオロベンジル基、２−ニトロ−α−メチル−３，４−ジフルオロベンジル基、および２−ニトロ−α−メチル−３，４−ジメトキシベンジル基からなる群から選択される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記特有の標識は、切断可能なリンカーにより、シトシンまたはチミンの５’位、あるいはデアザアデニンまたはデアザグアニンの７’位に結合される、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
前記特有の標識と前記ヌクレオチド類縁体との間の前記切断可能なリンカーは、１以上の物理的手段、化学的手段、物理化学的手段、熱、および光からなる群から選択される手段によって切断される、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
前記切断可能なリンカーは、２−ニトロベンジル部分を含む光切断可能なリンカーである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記デオキシリボースの前記３’位にある前記−ＯＨ基をキャップするのに使用する前記切断可能な化学基は、１以上の物理的手段、化学的手段、物理化学的手段、熱、および光からなる群から選択される手段によって切断される、請求項１に記載に方法。
【請求項２３】
前記核酸に結合された前記プライマー、または前記プライマー伸長鎖上にある如何なる未反応の−ＯＨ基をも永久的にキャップするために工程（ｖｉ）で添加される前記化学的化合物は、ポリメラーゼ、および１以上の異なるジデオキシヌクオレオチド、あるいはジデオキシヌクレオチドの類縁体である、請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
前記異なるジデオキシヌクレオチドは、２’，３’−ジデオキシアデノシン５’−三リン酸、２’，３’−ジデオキシグアノシン５’−三リン酸、２’，３’−ジデオキシシチジン５’−三リン酸、２’，３’−ジデオキシチミジン５’−三リン酸、２’，３’−ジデオキシウリジン５’−三リン酸、およびそれらの類縁体からなる群から選択される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
ポリメラーゼおよび１以上の４つの異なるジデオキシヌクレオチドが工程（ｖｉ）で添加され、異なるジデオキシヌクレオチドはそれぞれ、２’，３’−ジデオキシアデノシン５’−三リン酸、または２’，３’−ジデオキシアデノシン５’−三リン酸の類縁体、２’，３’−ジデオキシグアノシン５’−三リン酸、または２’，３’−ジデオキシグアノシン５’−三リン酸の類縁体、２’，３’−ジデオキシシチジン５’−三リン酸、または２’，３’−ジデオキシシチジン５’−三リン酸の類縁体、および２’，３’−ジデオキシチミジン５’−三リン酸、または２’，３’−ジデオキシウリジン５’−三リン酸、または２’，３’−ジデオキシチミジン５’−三リン酸の類縁体、あるいは２’，３’−ジデオキシウリジン５’−三リン酸の類縁体からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項２６】
前記質量タグは、試料タグを含む複数の試料の並行解析用の、複数の大気圧化学イオン化質量分析計を具備する並行質量分析システムを用いて検出される、請求項１７に記載の方法。
【請求項２７】
複数の異なる核酸を同時にシーケンシングする方法であって、請求項１に記載の方法を、該複数の異なる核酸に適用する方法。
【請求項２８】
一塩基多型の検出、遺伝子突然変異解析、遺伝子発現の順次解析、遺伝子発現解析、法医学における特定、遺伝子疾患関連研究、ＤＮＡシーケンシング、ゲノムシーケンシング、翻訳解析、または転写解析のための、請求項１または２７に記載の方法の使用。
【請求項２９】
核酸を固体表面に結合する方法であって、以下の：
（ｉ）前記固体表面をホスフィン部分でコーティングすることと、
（ｉｉ）前記核酸の５’末端にアジド基を結合することと、
（ｉｉｉ）前記固体表面上の前記ホスフィン部分と、前記核酸の前記５’末端上の前記アジド基との間の相互作用により、前記核酸の前記５’末端を前記固体表面に固定化することと
を含む方法。
【請求項３０】
前記固体表面を前記ホスフィン部分でコーティングする前記工程は、以下の：
（ｉ）前記表面を第一アミンでコーティングすることと、
（ｉｉ）トリアリールホスフィンのＮ−ヒドロキシスクシンイミジルエステルを前記第一アミンと共有結合させることと
を含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記固体表面は、ガラス、シリコン、または金である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
前記固体表面は、磁気ビーズ、チップ、チップ内チャネル、またはチップ内多孔質チャネルである、請求項２９に記載の方法。
【請求項３３】
前記固体表面に結合される前記核酸は、一本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＤＮＡ、またはＲＮＡである、請求項２９に記載の方法。
【請求項３４】
前記核酸は、二本鎖ＤＮＡであり、一方の鎖のみが、前記固体表面上に直接結合される、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記固体表面上に直接結合されない前記二本鎖ＤＮＡの鎖は、変性させることで除去される、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
遺伝子発現解析、マイクロアレイベースの遺伝子発現解析、突然変異検出、翻訳解析、または転写解析のための、請求項２９に記載の方法の使用。
【請求項３７】
ヌクレオチド類縁体であって、以下の：
（ａ）アデニンまたはアデニンの類縁体、シトシンまたはシトシンの類縁体、およびグアニンまたはグアニンの類縁体、チミンまたはチミンの類縁体、およびウラシルまたはウラシルの類縁体からなる群から選択される塩基と、
（ｂ）切断可能なリンカーにより該塩基または該塩基の類縁体に結合される特有の標識と、
（ｃ）デオキシリボースと、
（ｄ）該デオキシリボースの３’位にある−ＯＨ基をキャップするための切断可能な化学基と
を含む。
【請求項３８】
前記デオキシリボースの前記３’位にある前記−ＯＨ基をキャップする前記切断可能な化学基は、−ＣＨ２ＯＣＨ３または−ＣＨ２ＣＨ＝ＣＨ２である、請求項３７に記載のヌクレオチド類縁体。
【請求項３９】
前記特有の標識は、蛍光部分または蛍光半導体結晶である、請求項３７に記載のヌクレオチド類縁体。
【請求項４０】
前記蛍光部分は、５−カルボキシフルオレセイン、６−カルボキシローダミン−６Ｇ、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−６−カルボキシローダミン、および６−カルボキシ−Ｘ−ローダミンからなる群から選択される、請求項３９に記載のヌクレオチド類縁体。
【請求項４１】
前記特有の標識は、エネルギー転移供与体およびエネルギー転移受容体を含む蛍光エネルギー転移タグである、請求項３７に記載のヌクレオチド類縁体。
【請求項４２】
前記エネルギー転移供与体は、５−カルボキシフルオレセインまたはシアニンであり、前記エネルギー転移授与体は、ジクロロカルボキシフルオレセイン、ジクロロ−６−カルボキシローダミン−６Ｇ、ジクロロ−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−６−カルボキシローダミン、およびジクロロ−６−カルボキシ−Ｘ−ローダミンからなる群から選択される、請求項４１に記載のヌクレオチド類縁体。
【請求項４３】
前記特有の標識は、質量分析計により検出および識別することができる質量タグである、請求項３７に記載の方法。
【請求項４４】
前記質量タグは、２−ニトロ−α−メチルベンジル基、２−ニトロ−α−メチル−３−フルオロベンジル基、２−ニトロ−α−メチル−３，４−ジフルオロベンジル基、および２−ニトロ−α−メチル−３，４−ジメトキシベンジル基からなる群から選択される、請求項４３に記載のヌクレオチド類縁体。
【請求項４５】
前記特有の標識は、切断可能なリンカーにより、シトシンまたはチミンの５’位、あるいはデアザアデニンまたはデアザグアニンの７’位に結合される、請求項３７に記載のヌクレオチド類縁体。
【請求項４６】
前記特有の標識と前記ヌクレオチド類縁体との間の前記リンカーは、１以上の物理的手段、化学的手段、物理化学的手段、熱、および光からなる群から選択される手段によって切断される、請求項３７に記載のヌクレオチド類縁体。
【請求項４７】
前記切断可能なリンカーは、２−ニトロベンジル部分を含む光切断可能なリンカーである、請求項４６に記載のヌクレオチド類縁体。
【請求項４８】
前記デオキシリボースの前記３’位にある前記−ＯＨ基をキャップするのに使用する前記切断可能な化学基は、１以上の物理的手段、化学的手段、物理化学的手段、熱、および光からなる群から選択される手段によって切断される、請求項３７に記載のヌクレオチド類縁体。
【請求項４９】
前記ヌクレオチド類縁体は、以下の：
【化１】
2004510433.tif 000015
（式中、Ｄｙｅ１、Ｄｙｅ２、Ｄｙｅ３、およびＤｙｅ４は、４つの異なる色素標識であり、
Ｒは、前記デオキシリボースの前記３’位にある前記−ＯＨ基をキャップするのに使用する切断可能な化学基である）
からなる群から選択される、請求項３７に記載のヌクレオチド類縁体。
【請求項５０】
前記ヌクレオチド類縁体は、以下の：
【化２】
2004510433.tif 000016
（式中、Ｒは、−ＣＨ２ＯＣＨ３または−ＣＨ２ＣＨ＝ＣＨ２である）
からなる群から選択される、請求項４９に記載のヌクレオチド類縁体。
【請求項５１】
前記ヌクレオチド類縁体は、以下の：
【化３】
2004510433.tif 000017
（式中、Ｔａｇ１、Ｔａｇ２、Ｔａｇ３、およびＴａｇ４は、４つの異なる質量タグ標識であり、
Ｒは、前記デオキシリボースの前記３’位にある前記−ＯＨ基をキャップするのに使用する切断可能な化学基である）
からなる群から選択される、請求項３７に記載のヌクレオチド類縁体。
【請求項５２】
前記ヌクレオチド類縁体は、以下の：
【化４】
2004510433.tif 000018
（式中、Ｒは、−ＣＨ２ＯＣＨ３または−ＣＨ２ＣＨ＝ＣＨ２である）
からなる群から選択される、請求項５１に記載のヌクレオチド類縁体。
【請求項５３】
一塩基多型の検出、遺伝子突然変異解析、遺伝子発現の順次解析、遺伝子発現解析、法医学における特定、遺伝子疾患関連研究、ＤＮＡシーケンシング、ゲノムシーケンシング、翻訳解析、または転写解析のための、請求項３７に記載のヌクレオチド類縁体の使用。
【請求項５４】
試料タグを含む複数の試料の並行解析用の、複数の大気圧化学イオン化質量分析計を具備する並行質量分析システム。
【請求項５５】
前記質量分析計は、四重極質量分析計、または飛行時間型質量分析計である、請求項５４に記載のシステム。
【請求項５６】
前記質量分析計は、１つの装置に含まれる、請求項５４に記載のシステム。
【請求項５７】
２つのターボ式ポンプをさらに具備するシステムであって、一方のポンプは、真空を生成するのに使用され、第２のポンプは、望ましくない成分を除去するのに使用される、請求項５４に記載のシステム。
【請求項５８】
少なくとも３つの質量分析計を具備する、請求項５４に記載のシステム。
【請求項５９】
前記質量タグは、１５０ダルトン〜２５０ダルトンの分子量を有する、請求項５４に記載のシステム。
【請求項６０】
ＤＮＡシーケンシング解析、一塩基多型の検出、遺伝子突然変異解析、遺伝子発現の順次解析、遺伝子発現解析、法医学における特定、遺伝子疾患関連研究、ＤＮＡシーケンシング、ゲノムシーケンシング、翻訳解析、または転写解析のための、請求項５４に記載のシステムの使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本出願は、２００１年６月２６日に提出された米国仮出願第６０／３００，８９４号の利益を主張し、また本出願は、２０００年１０月６日に提出された米国出願第０９／６８４，６７０号の一部継続出願である（この両方の内容は、その全体が参照により本出願に援用される）。
【０００２】
【発明の背景】
本出願全体にわたって、様々な刊行物を、著者と年月を括弧でくくって参照している。これらの参照文献に関する完全な引用は、本明細書の図面の簡単な説明の項の直前に記載する。これらの刊行物のその全体の開示は、本発明が関連する技術分野の事情についてより完全に記載するために、参照により本出願に援用される。
【０００３】
正確かつ迅速にデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）をシーケンシングする能力は、生物学および医学に大きな変革をもたらしている。壮大なヒトゲノムプロジェクトの集合は、ハイスループットの遺伝子解析術の開発を急激に成長させている。化学、工学、生物学、およびコンピュータ科学を含むこの迅速な技術の発達により、一度に単独遺伝子を研究することから、全ゲノムを解析および比較することへの移行を可能にする。
【０００４】
最初の全ヒトゲノム配列マップが完成すれば、エキソンおよびイントロンの両方において高度に多型であるゲノム中の多くの領域が知られるであろう。薬理ゲノミクスの挑戦は、薬剤応答の可変性に関連する遺伝子および機能的多型を包括的に特定することである（Ｒｏｓｅｓ， ２０００）。疾患の発症に関連するゲノム中の多型領域の再シーケンシングは、癌のような疾患の理解、および治療法の開発に大いに貢献するであろう。したがって、完全なヒトゲノム配列マップの最大限の可能性を探るためには、ゲノムの高可変性イントロン／エキソンを再シーケンシングするための正確なハイスループットの方法が必要である。例えばヒトゲノムプロジェクト（Ｐｅｎｎｉｓｉ ２０００）に使用されるハイスループットＤＮＡシーケンシング用の現在の最新技術は、レーザ誘起蛍光検出を用いたキャピラリーアレイＤＮＡシーケンサーである（Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．， １９８６； Ｊｕ ｅｔ ａｌ． １９９５， １９９６； Ｋｈｅｔｅｒｐａｌ ｅｔ ａｌ． １９９６； Ｓａｌａｓ−Ｓｏｌａｎｏ ｅｔ ａｌ． １９９８）。均一な終結効率を引き起こすポリメラーゼの改良および熱安定性ポリメラーゼの導入によっても、シーケンシングデータの質は有意に改善された（Ｔａｂｏｒ ａｎｄ Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ， １９８７， １９９５）。キャピラリーアレイＤＮＡシーケンシング技術は、大規模なＤＮＡシーケンシングプロジェクトの処理量および読取り長さ要件にある程度は対処し得るものの、突然変異研究に必要な処理量および精度は、疾患遺伝子の発見から法学医学的識別に及ぶ多種多様な用途に関して改善される必要がある。例えば、電気泳動ベースのＤＮＡシーケンシング法は、ヘテロ接合体を明確に検出することが困難であり、圧縮に起因して、グアニンまたはシトシンを含むヌクレオチドに富んだ領域では１００％正確であるわけではない（Ｂｏｗｌｉｎｇ ｅｔ ａｌ． １９９１； Ｙａｍａｋａｗａ ｅｔ ａｌ． １９９７）。さらに、プライミング部位後の最初の数個の塩基は、過剰な色素標識プライマーまたは色素標識ターミネーターからの高蛍光シグナルでマスクされる場合が多く、したがって特定しにくい。したがって、ＤＮＡシーケンシングに関する電気泳動の要件は、依然としてハイスループットＤＮＡ配列および突然変異検出プロジェクトの障壁である。
【０００５】
電気泳動を使用せずに合成によりＤＮＡシーケンシングするという概念は、１９９８年に最初に出現したものであり（Ｈｙｍａｎ， １９８８）、各ヌクレオチドがポリメラーゼ連鎖反応中の成長中のＤＮＡ鎖に組み込まれることから、各ヌクレオチドの種別（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）を検出することを包含している。チップフォーマットおよびレーザ誘導蛍光検出と一体となっているかかる仕組みは、ＤＮＡシーケンシングプロジェクトの処理量を顕著に増加させる能力を有する。したがって、幾つかのグループが、超ハイスループットのＤＮＡシーケンシング手法を構築する目的で、かかるシステムを研究してきた（Ｃｈｅｅｓｅｍａｎ １９９４， Ｍｅｔｚｋｅｒ ｅｔ ａｌ． １９９４）。現段階では、かかるシステムを使用してＤＮＡを明白にシーケンシングした完全な成功は報告されていない。合成によりＤＮＡをシーケンシングするための、４つの天然ヌクレオチド（アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、またはチミン（Ｔ）に塩基を含む）および数個の他の酵素を使用するパイロシーケンシング法（ｐｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ａｐｐｒｏａｃｈ）は、突然変異検出に現在広範に使用されている（Ｒｏｎａｇｈｉ １９８８）。このアプローチでは、検出は、ＤＮＡポリメラーゼ反応中に放出されるピロリン酸塩（ＰＰｉ）、スルフリラーゼによるアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）へのピロリン酸の定量的な変換、その後のホタルルシフェラーゼによる可視光の産生に基づく。この手法は、ヌクレオチド配列の３０個以下の塩基対（ｂｐ）をシーケンシングすることができるだけであり、４つのヌクレオチドはそれぞれ、別個に添加して、かつ別個に検出する必要がある。長く伸びた同じ塩基は、パイロシーケンシング方法を用いて明白に特定することはできない。
【０００６】
合成方法によるＤＮＡシーケンシングを探究する文献での最近の研究は、主としてデオキシリボヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）の３’−ＯＨ基をキャップするための、蛍光色素に連結された光切断可能な化学部分を設計および合成することに集中している（Ｗｅｌｃｈ ｅｔ ａｌ． １９９９）。ＤＮＡポリメラーゼによる３’修飾ヌクレオチドの組込みに関して、成功が限られていると報告されている。その理由は、デオキシリボース上の３’位が、ポリメラーゼの活性部位中のアミノ酸残基に非常に接近しており、その結果、ポリメラーゼがデオキシリボース環のこの領域での修飾に敏感であるためである。他方、修飾ＤＮＡポリメラーゼ（ＴｈｅｒｍｏシーケナーゼおよびＴａｑ　ＦＳポリメラーゼ）は、ピリミジン（ＴおよびＣ）の５位およびプリン（ＧおよびＡ）の７位にあるエネルギー転移色素のような嵩高い基により広範に修飾されたヌクレオチドを認識可能であることが知られている（Ｒｏｓｅｎｂｌｕｍ ｅｔ ａｌ． １９９７， Ｚｈｕ ｅｔ ａｌ． １９９４）。ラットＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡ鋳型−プライマー、およびジデオキシシチジン三リン酸（ｄｄＣＴＰ）の三元複合体が決定され（Ｐｅｌｌｅｔｉｅｒ ｅｔ ａｌ． １９９４）、この事実を支持する。図１に示すように、この三次元構造は、ｄｄＣＴＰにおけるデオキシリボース環の３’位の周辺領域が非常に混雑している一方で、シチジン塩基の５’位上には修飾用の十分なスペースが存在していることを示す。
【０００７】
本出願に開示するアプローチは、切断可能なリンカーにより、ヌクレオチド塩基またはヌクレオチド塩基の類縁体に、例えばピリミジン（ＴおよびＣ）の５位およびプリン（ＧおよびＡ）の７位に、蛍光色素または質量タグのような特有の標識を連結したヌクレオチド類縁体を作製すること、デオキシリボースの３’−ＯＨ基を不活性にするために、それをキャップする小さい切断可能な化学部分を使用すること、およびターミネーターとして、成長中のＤＮＡ鎖にヌクレオチド類縁体を組み込むことである。特有の標識の検出により、ヌクレオチド配列の種別が得られる。標識および３’−ＯＨキャッピング基を除去すると、ポリメラーゼ反応は進行して、次のヌクレオチド類縁体を組み込み、次の塩基を検出する。
【０００８】
３’−ＯＨ基をキャップするための光切断可能な基を使用することもまた望ましい。しかしながら、光切断可能な基は一般に嵩高く、したがってＤＮＡポリメラーゼは、３’−ＯＨ基をキャップする光切断可能な部分を含むヌクレオチド類縁体を組み込むことが困難である。高収率で化学的に容易に切断することができる小さな化学部分が３’−ＯＨ基をキャップするのに使用できる場合、かかるヌクレオチド類縁体はまた、ＤＮＡポリメラーゼ用の基質として認識されるはずである。３’−Ｏ−メトキシ−デオキシヌクレオチドは、幾つかのポリメラーゼ用の良好な基質であることが報告されている（Ａｘｅｌｒｏｄ ｅｔ ａｌ． １９７８）。３’−Ｏ−アリル−ｄＡＴＰもまた、Ｖｅｎｔｒ（ｅｘｏ−）ＤＮＡポリメラーゼにより成長中のＤＮＡ鎖中に組み込まれることがわかっていた（Ｍｅｔｚｋｅｒ ｅｔ ａｌ． １９９４）。しかしながら、メトキシ基を化学的に切断する手法は厳格であり、無水条件が必要とされる。したがって、合成によりＤＮＡをシーケンシングするために、３’−ＯＨ基のキャッピングにメトキシ基を使用することは実用的ではない。エステル基もまた、ヌクレオチドの３’ＯＨ基をキャップするのに探究されたが、それは、ＤＮＡポリメラーゼの活性部位中の求核試剤により切断されることがわかった（Ｃａｎａｒｄ ｅｔ ａｌ． １９９５）。ケトン基のような求電子剤を有する化学基は、ポリメラーゼ中の強力な求核剤の存在に起因して、酵素反応においてヌクレオチドの３’−ＯＨを保護するには適さない。ＭＯＭ（−ＣＨ２ＯＣＨ３）およびアリル（−ＣＨ２ＣＨ＝ＣＨ２）基は、−ＯＨ基をキャップするのに使用することができ、高収率で化学的に切断することができる（Ｉｒｅｌａｎｄ ｅｔ ａｌ． １９８６； Ｋａｍａｌ ｅｔ ａｌ． １９９９）。本出願に開示するアプローチは、蛍光色素または質量タグのような切断可能な特有の標識で標識され、且つ３’−ＯＨがＭＯＭ基（−ＣＨ２ＯＣＨ３）またはアリル基（−ＣＨ２ＣＨ＝ＣＨ２）のような切断可能な化学部分でキャップされているヌクレオチド類縁体を、ターミネーターとして、成長中のＤＮＡ鎖に組み込むことである。次いで、最適化されたヌクレオチドセット（３’−ＲＯ−Ａ−ＬＡＢＥＬ１、３’−ＲＯ−Ｃ−ＬＡＢＥＬ２、３’−ＲＯ−Ｇ−ＬＡＢＥＬ３、３’−ＲＯ−Ｔ−ＬＡＢＥＬ４：ここでＲは、３’−ＯＨをキャップするのに使用される化学基を意味する）を、合成アプローチによるＤＮＡシーケンシングに使用することができる。
【０００９】
質量分析（ＭＳ）を用いて小さく且つ安定な分子を検出することには多くの利点がある。例えば、質量分解能は１ダルトン程度と良好であり得る。したがって、蛍光放出スペクトルの重複によりヘテロ接合体の検出を困難にするゲル電気泳動シーケンシングシステムおよびレーザ誘導蛍光検出アプローチと比較して、本出願に開示するＭＳアプローチは、長いＤＮＡ断片でなく、切断された小さな質量タグを検出することにより、非常に高分解能のシーケンシングデータをもたらす。この方法はまた、マイクロ秒の時間スケールで、きわめて迅速な分離をもたらす。高分解能により、正確なデジタル突然変異およびヘテロ接合体検出が可能となる。小さな質量タグを検出することによる質量分析を用いたシーケンシングの別の利点は、ゲルベースのシステムに関連した圧縮が完全に排除されることである。
【００１０】
鋳型ＤＮＡとハイブリダイズした連続したプライマー伸長産物を維持するために、ポリメラーゼ反応において自己プライミングが可能な独立体を形成する安定なループを含むプライマーを、チップのような固体表面上に固定化される各一本鎖ＤＮＡ鋳型の３’末端に連結させることができる。このアプローチは、各サイクルにおける成長中の伸長産物の洗い流しの問題を解決する。
【００１１】
ＳａｘｏｎおよびＢｅｒｔｏｚｚｉ（２０００）は、生物学的セルの表面上のアジド基に、ホスフィン部分を含有する特定基を化学的に連結させる、洗練され且つ高度に特異的なカップリングを開発した。本出願では、このカップリングの化学は、共有結合させたホスフィン部分でコーティングされた固体表面を形成するために、またＤＮＡ鋳型を固体表面と特異的にカップリングさせるための、５’末端にあるアジド基を含有するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）産物を生成させるために適合される。固体表面の一例は、表面積を増大させるためのでこぼこした表面または多孔質表面を有する内壁を有するガラスチャネルである。別の例は、チップである。
【００１２】
本出願は、チップのような固体表面に共有結合させた安定なＤＮＡ鋳型（これは、ポリメラーゼ反応を自己プライミングすることが可能である）、および４つの特有のヌクレオチド類縁体（３’−ＲＯ−Ａ−ＬＡＢＥＬ１、３’−ＲＯ−Ｃ−ＬＡＢＥＬ２、３’−ＲＯ−Ｇ−ＬＡＢＥＬ３、３’−ＲＯ−Ｔ−ＬＡＢＥＬ４）を用いた合成アプローチによる、ＤＮＡシーケンシングのための新規かつ好適なシステムを開示する。この新規システムの成功により、多型、薬理ゲノミクス用途、および全ゲノムシーケンシング用の超ハイスループットかつ高フィデリティのＤＮＡシーケンシングシステムの開発が可能となるであろう。この迅速かつ正確なＤＮＡ再シーケンシングシステムは、一塩基多型（ＳＮＰ）（Ｃｈｅｅ ｅｔ ａｌ． １９９６）、遺伝子発現の順次解析（ＳＡＧＥ）（Ｖｅｌｃｕｌｅｓｃｕ ｅｔ ａｌ． １９９５）、法医学における特定、および遺伝子疾患関連研究の検出のような分野で必要とされる。
【００１３】
【発明の概要】
本発明は、ヌクレオチド類縁体がポリメラーゼ反応において成長中のＤＮＡ鎖に組み込まれた後に、該ヌクレオチド類縁体の種別を検出することで核酸をシーケンシングする方法において：
（ｉ）上記核酸の５’末端を固体表面に結合する工程と、
（ｉｉ）上記固体表面に結合された上記核酸に、プライマーを結合する工程と、
（ｉｉｉ）ポリメラーゼおよび１以上の異なるヌクレオチド類縁体を上記核酸に添加し、それにより上記成長中のＤＮＡ鎖にヌクレオチド類縁体を組み込む工程であって、ここで組み込まれたヌクレオチド類縁体は上記ポリメラーゼ反応を終結させ、また異なるヌクレオチド類縁体はそれぞれ、（ａ）アデニン、グアニン、シトシン、チミン、およびウラシル、ならびにそれらの類縁体からなる群から選択される塩基、（ｂ）切断可能なリンカーにより該塩基または該塩基の類縁体に結合される特有の標識、（ｃ）デオキシリボース、および（ｄ）該デオキシリボースの３’位にある−ＯＨ基をキャップするための切断可能な化学基を含む工程と、
（ｉｖ）上記固体表面を洗浄して、組み込まれていないヌクレオチド類縁体を除去する工程と、
（ｖ）上記成長中のＤＮＡ鎖に組み込まれた上記ヌクレオチド類縁体に結合された上記特有の標識を検出して、それにより組み込まれたヌクレオチド類縁体を同定する工程と、
（ｖｉ）１以上の化学的化合物を添加して、上記核酸に結合された上記プライマー上の全ての未反応−ＯＨ基、または１以上のヌクレオチド類縁体を上記プライマーに添加することにより形成されたプライマー伸長鎖上の全ての未反応−ＯＨ基を永久的にキャップする工程と、
（ｖｉｉ）上記成長中のＤＮＡ鎖に組み込まれた上記ヌクレオチド類縁体と上記特有の標識との間の上記切断可能なリンカーを切断する工程と、
（ｖｉｉｉ）上記デオキシリボースの上記３’位にある上記−ＯＨ基をキャップしている上記切断可能な化学基を切断して、上記−ＯＨ基からキャップを外し、上記固体表面を洗浄して、切断された化合物を除去する工程と、
（ｉｘ）工程（ｉｉｉ）〜（ｖｉｉｉ）を繰り返して、上記成長中のＤＮＡ鎖に新たに組み込まれたヌクレオチド類縁体の上記種別を検出する工程と
を含み、
上記特有の標識が色素である場合には、工程（ｖ）〜（ｖｉｉ）の順序は、（ｖ）、（ｖｉ）、および（ｖｉｉ）であり、
上記特有の標識が質量タグである場合には、工程（ｖ）〜（ｖｉｉ）の順序は、（ｖｉ）、（ｖｉｉ）、および（ｖ）である方法に関する。
【００１４】
本発明は、核酸を固体表面に結合する方法であって：
（ｉ）上記固体表面をホスフィン部分でコーティングすることと、
（ｉｉ）上記核酸の５’末端にアジド基を結合することと、
（ｉｉｉ）上記固体表面上の上記ホスフィン部分と、上記核酸の上記５’末端上の上記アジド基との間の相互作用により、上記核酸の上記５’末端を上記固体表面に固定化することと
を含む方法を提供する。
【００１５】
本発明は、ヌクレオチド類縁体であって：
（ａ）アデニンまたはアデニンの類縁体、シトシンまたはシトシンの類縁体、およびグアニンまたはグアニンの類縁体、チミンまたはチミンの類縁体、およびウラシルまたはウラシルの類縁体からなる群から選択される塩基と、
（ｂ）切断可能なリンカーにより該塩基または該塩基の類縁体に結合される特有の標識と、
（ｃ）デオキシリボースと、
（ｄ）該デオキシリボースの３’位にある−ＯＨ基をキャップするための切断可能な化学基と
を含むヌクレオチド類縁体を提供する。
【００１６】
本発明は、並行質量分析システムであって、試料タグを含む複数の試料を並行解析するための、複数の大気圧化学イオン化質量分析計を具備する並行質量分析システムを提供する。
【００１７】
【発明の詳細な記述】
以下の定義は、本発明を理解するための補助として提供される。
【００１８】
本明細書中で使用する場合、−ＯＨ基を「キャップする」とは、−ＯＨ基中の「Ｈ」を化学基で置き換えることを意味する。本明細書中で使用する場合、ヌクレオチド類縁体の−ＯＨ基は、切断可能な化学基でキャップされる。−ＯＨ基から「キャップを外す」とは、キャップした−ＯＨ基から化学基を切断して、化学基を「Ｈ」で置き換えること、すなわち、−ＯＲ中の「Ｒ」を「Ｈ」で置き換えることを意味する。ここで「Ｒ」は、−ＯＨ基をキャップするのに使用される化学基である。
【００１９】
ヌクレオチド塩基は以下の通りに略記する：アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）、およびウラシル（Ｕ）。
【００２０】
「ヌクレオチド塩基の類縁体」とは、ポリメラーゼにより基質として認識され得るヌクレオチド塩基の構造的かつ機能的類縁体を指す。すなわち、例えば、二重らせんフォーマットでは、アデニン（Ａ）の類縁体は、チミン（Ｔ）と水素結合を形成すべきであり、Ｃ類縁体は、Ｇと水素結合を形成すべきであり、Ｇ類縁体は、Ｃと水素結合を形成すべきであり、Ｔ類縁体は、Ａと水素結合すべきである。ヌクレオチド塩基の類縁体の例としては、７−デアザ−アデニン、および７−デアザ−グアニン（ここで、アデニンまたはグアニンの７位にある窒素原子が炭素原子で置換されている）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２１】
「ヌクレオチド類縁体」とは、ヌクレオチドに構造的および機能的に類似している化学的化合物を指す。すなわち、ヌクレオチド類縁体は、ポリメラーゼに基質として認識され得る。すなわち、例えば、二重らせんフォーマットでは、アデニンまたはアデニンの類縁体を含むヌクレオチド類縁体は、チミンと水素結合を形成すべきであり、ＣまたはＣの類縁体を含むヌクレオチド類縁体は、Ｇと水素結合を形成すべきであり、ＧまたはＧの類縁体を含むヌクレオチド類縁体は、Ｃと水素結合を形成すべきであり、ＴまたはＴの類縁体を含むヌクレオチド類縁体は、Ａと水素結合を形成すべきである。本明細書中で開示するヌクレオチド類縁体の例としては、７−デアザ−アデニンまたは７−デアザ−グアニン（ここで、アデニンまたはグアニンの７位にある窒素原子が炭素原子で置換されている）のようなヌクレオチド塩基の類縁体を含む類縁体が挙げられる。さらなる例としては、切断可能なリンカーにより、シトシンまたはチミンの５位、あるいはデアザ−アデニンまたはデアザ−グアニンの７位に標識が連結されている類縁体が挙げられる。他の例としては、デオキシリボースの３’位で−ＯＨ基をキャップするのに−ＣＨ２ＯＣＨ３または−ＣＨ２ＣＨ＝ＣＨ２のような小化学部分を使用している類縁体が挙げられる。ジデオキシヌクレオチドの類縁体は同様に調製することができる。
【００２２】
本明細書中で使用する場合、「多孔質」表面は、孔を含有するか、そうでなければでこぼこしている表面であり、その結果多孔質表面の表面積は、表面が滑らかな場合の表面積に対して増大する。
【００２３】
本発明は、ヌクレオチド類縁体がポリメラーゼ反応において成長中のＤＮＡ鎖に組み込まれた後に、該ヌクレオチド類縁体の種別を検出することで核酸をシーケンシングする方法において：
（ｉ）上記核酸の５’末端を固体表面に結合する工程と、
（ｉｉ）上記固体表面に結合された上記核酸に、プライマーを結合する工程と、
（ｉｉｉ）ポリメラーゼおよび１以上の異なるヌクレオチド類縁体を上記核酸に添加し、それにより上記成長中のＤＮＡ鎖にヌクレオチド類縁体を組み込む工程であって、ここで組み込まれたヌクレオチド類縁体は上記ポリメラーゼ反応を終結させ、また異なるヌクレオチド類縁体はそれぞれ、（ａ）アデニン、グアニン、シトシン、チミン、およびウラシル、ならびにそれらの類縁体からなる群から選択される塩基、（ｂ）切断可能なリンカーにより該塩基または該塩基の類縁体に結合される特有の標識、（ｃ）デオキシリボース、および（ｄ）該デオキシリボースの３’位にある−ＯＨ基をキャップするための切断可能な化学基を含む工程と、
（ｉｖ）上記固体表面を洗浄して、組み込まれていないヌクレオチド類縁体を除去する工程と、
（ｖ）上記成長中のＤＮＡ鎖に組み込まれた上記ヌクレオチド類縁体に結合された上記特有の標識を検出して、それにより組み込まれたヌクレオチド類縁体を同定する工程と、
（ｖｉ）１以上の化学的化合物を添加して、上記核酸に結合された上記プライマー上の全ての未反応−ＯＨ基、または１以上のヌクレオチド類縁体を上記プライマーに添加することにより形成されたプライマー伸長鎖上の全ての未反応−ＯＨ基を永久的にキャップする工程と、
（ｖｉｉ）上記成長中のＤＮＡ鎖に組み込まれた上記ヌクレオチド類縁体と上記特有の標識との間の上記切断可能なリンカーを切断する工程と、
（ｖｉｉｉ）上記デオキシリボースの上記３’位にある上記−ＯＨ基をキャップしている上記切断可能な化学基を切断して、上記−ＯＨ基からキャップを外し、上記固体表面を洗浄して、切断された化合物を除去する工程と、
（ｉｘ）工程（ｉｉｉ）〜（ｖｉｉｉ）を繰り返して、上記成長中のＤＮＡ鎖に新たに組み込まれたヌクレオチド類縁体の上記種別を検出する工程と
を含み、
上記特有の標識が色素である場合には、工程（ｖ）〜（ｖｉｉ）の順序は、（ｖ）、（ｖｉ）、および（ｖｉｉ）であり、
上記特有の標識が質量タグである場合には、工程（ｖ）〜（ｖｉｉ）の順序は、（ｖｉ）、（ｖｉｉ）、および（ｖ）である方法に向けられている。
【００２４】
本明細書中に記載するヌクレオチド類縁体のいずれかの一実施形態では、ヌクレオチド塩基はアデニンである。一実施形態では、ヌクレオチド塩基はグアニンである。一実施形態では、ヌクレオチド塩基はシトシンである。一実施形態では、ヌクレオチド塩基はチミンである。一実施形態では、ヌクレオチド塩基はウラシルである。一実施形態では、ヌクレオチド塩基はアデニンの類縁体である。一実施形態では、ヌクレオチド塩基はグアニンの類縁体である。一実施形態では、ヌクレオチド塩基はシトシンの類縁体である。一実施形態では、ヌクレオチド塩基はチミンの類縁体である。一実施形態では、ヌクレオチド塩基はウラシルの類縁体である。
【００２５】
本明細書中に記載する本発明のいずれかの異なる実施形態では、固体表面は、ガラス、シリコン、または金である。異なる実施形態では、固体表面は、磁気ビーズ、チップ、チップ内チャネル、またはチップ内多孔質チャネルである。一実施形態では、固体表面はガラスである。一実施形態では、固体表面は、シリコンである。一実施形態では、固体表面は、金である。一実施形態では、固体表面は、磁気ビーズである。一実施形態では、固体表面は、チップである。一実施形態では、固体表面は、チップ内チャネルである。一実施形態では、固体表面は、チップ内多孔質チャネルである。他の材料も、その材料が上記方法の工程を妨害しない限り使用することができる。
【００２６】
一実施形態では、核酸を固体表面に結合する工程は、以下の：
（ｉ）上記固体表面をホスフィン部分でコーティングすることと、
（ｉｉ）上記核酸の５’末端にアジド基を結合することと、
（ｉｉｉ）上記固体表面上の上記ホスフィン部分と、上記核酸の上記５’末端上の上記アジド基との間の相互作用により、上記核酸の上記５’末端を上記固体表面に固定化することと
を含む。
【００２７】
一実施形態では、固体表面をホスフィン部分でコーティングする工程は、以下の：
（ｉ）上記固体表面を第一アミンでコーティングすることと、
（ｉｉ）トリアリールホスフィンのＮ−ヒドロキシスクシンイミジルエステルを上記第一アミンと共有結合させることと
を含む。
【００２８】
一実施形態では、固体表面に結合される核酸は、一本鎖デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）である。別の実施形態では、工程（ｉ）で固体表面に結合される核酸は、二本鎖ＤＮＡであり、ここで一方の鎖のみが、固体表面上に直接結合され、固体表面上に直接結合されない鎖は、工程（ｉｉ）に進む前に変性させることで除去される。一実施形態では、固体表面上に結合される核酸は、リボ核酸（ＲＮＡ）であり、工程（ｉｉｉ）におけるポリメラーゼは、逆転写酵素である。
【００２９】
一実施形態では、プライマーは、工程（ｉｉ）において核酸の３’末端に結合され、結合されたプライマーは、ポリメラーゼ反応中に自己プライミングすることが可能である安定なループおよびデオキシリボースの３’位にある−ＯＨ基を含む。一実施形態では、核酸にプライマーを結合する工程は、核酸にプライマーをハイブリダイズすること、または核酸にプライマーを連結することを含む。一実施形態では、プライマーは、核酸の３’末端とプライマーの５’末端とを連結する連結反応により核酸に結合される。
【００３０】
一実施形態では、１以上の４つの異なるヌクレオチド類縁体が工程（ｉｉｉ）において添加され、ここで異なるヌクレオチド類縁体それぞれは、チミンもしくはウラシル、またはチミンもしくはウラシルの類縁体、アデニンまたはアデニンの類縁体、シトシンまたはシトシンの類縁体、およびグアニンまたはグアニンの類縁体からなる群から選択される異なる塩基を含み、４つの異なるヌクレオチド類縁体はそれぞれ、特有の標識を含む。
【００３１】
一実施形態では、ヌクレオチド類縁体中のデオキシリボースの３’位にある−ＯＨ基をキャップする切断可能な化学基は、−ＣＨ２ＯＣＨ３または−ＣＨ２ＣＨ＝ＣＨ２である。基が、１）ポリメラーゼ連鎖反応中に安定であり、２）基質としてのポリメラーゼによるヌクレオチド類縁体の認識を妨害せず、３）切断可能である限り、任意の化学基を使用することができる。
【００３２】
一実施形態では、ヌクレオチド類縁体に結合される特有の標識は、蛍光部分または蛍光半導体結晶である。さらなる実施形態では、蛍光部分は、５−カルボキシフルオレセイン、６−カルボキシローダミン−６Ｇ、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−６−カルボキシローダミン、および６−カルボキシ−Ｘ−ローダミンからなる群から選択される。一実施形態では、蛍光部分は、５−カルボキシフルオレセインである。一実施形態では、蛍光部分は、６−カルボキシローダミン−６Ｇ、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−６−カルボキシローダミンである。一実施形態では、蛍光部分は、６−カルボキシ−Ｘ−ローダミンである。
【００３３】
一実施形態では、ヌクレオチド類縁体に結合される特有の標識は、エネルギー転移供与体およびエネルギー転移受容体を含む蛍光エネルギー転移タグである。さらなる実施形態では、エネルギー転移供与体は、５−カルボキシフルオレセインまたはシアニンであり、エネルギー転移授与体は、ジクロロカルボキシフルオレセイン、ジクロロ−６−カルボキシローダミン−６Ｇ、ジクロロ−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−６−カルボキシローダミン、およびジクロロ−６−カルボキシ−Ｘ−ローダミンからなる群から選択される。一実施形態では、エネルギー転移授与体は、ジクロロカルボキシフルオレセインである。一実施形態では、エネルギー転移授与体は、ジクロロ−６−カルボキシローダミン−６Ｇである。一実施形態では、エネルギー転移授与体は、ジクロロ−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−６−カルボキシローダミンである。一実施形態では、エネルギー転移授与体は、およびジクロロ−６−カルボキシ−Ｘ−ローダミンである。
【００３４】
一実施形態では、ヌクレオチド類縁体に結合される特有の標識は、質量分析計により検出および識別することができる質量タグである。さらなる実施形態では、質量タグは、２−ニトロ−α−メチルベンジル基、２−ニトロ−α−メチル−３−フルオロベンジル基、２−ニトロ−α−メチル−３，４−ジフルオロベンジル基、および２−ニトロ−α−メチル−３，４−ジメトキシベンジル基からなる群から選択される。一実施形態では、上記質量タグは、２−ニトロ−α−メチルベンジル基である。一実施形態では、上記質量タグは、２−ニトロ−α−メチル−３−フルオロベンジル基である。一実施形態では、上記質量タグは、２−ニトロ−α−メチル−３，４−ジフルオロベンジル基である。一実施形態では、上記質量タグは、２−ニトロ−α−メチル−３，４−ジメトキシベンジル基である。一実施形態では、質量タグは、試料タグを含む複数の試料を並行解析するための、複数の大気圧化学イオン化質量分析計を具備する並行質量分析システムを用いて検出される。
【００３５】
一実施形態では、特有の標識は、切断可能なリンカーにより、シトシンまたはチミンの５’位、あるいはデアザアデニンまたはデアザグアニンの７’位に結合される。特有の標識は、標識の結合がポリメラーゼ連鎖反応中に安定であり、かつヌクレオチド類縁体がポリメラーゼにより基質として認識され得る限り、切断可能なリンカーにより、ヌクレオチド類縁体の別の位置に結合することができる。例えば、切断可能な標識は、デオキシリボースに結合することができる。
【００３６】
一実施形態では、特有の標識とヌクレオチド類縁体との間の切断可能なリンカーは、１以上の物理的手段、化学的手段、物理化学的手段、熱、および光からなる群から選択される手段によって切断される。一実施形態では、リンカーは、物理的手段によって切断される。一実施形態では、リンカーは、化学的手段によって切断される。一実施形態では、リンカーは、物理化学的手段によって切断される。一実施形態では、リンカーは、熱によって切断される。一実施形態では、リンカーは、光によって切断される。一実施形態では、リンカーは、紫外線によって切断される。さらなる実施形態では、切断可能なリンカーは、２−ニトロベンジル部分を含む光切断可能なリンカーである。
【００３７】
一実施形態では、デオキシリボースの３’位にある−ＯＨ基をキャップするのに使用する切断可能な化学基は、１以上の物理的手段、化学的手段、物理化学的手段、熱、および光からなる群から選択される手段によって切断される。一実施形態では、リンカーは、物理化学的手段によって切断される。一実施形態では、リンカーは、熱によって切断される。一実施形態では、リンカーは、光によって切断される。一実施形態では、リンカーは、紫外線によって切断される。
【００３８】
一実施形態では、核酸に結合されたプライマー、またはプライマー伸長鎖上にある如何なる未反応の−ＯＨ基をも永久的にキャップするために工程（ｖｉ）で添加される化学的化合物は、ポリメラーゼ、および１以上の異なるジデオキシヌクオレオチド、あるいはジデオキシヌクレオチドの類縁体である。さらなる実施形態では、異なるジデオキシヌクレオチドは、２’，３’−ジデオキシアデノシン５’−三リン酸、２’，３’−ジデオキシグアノシン５’−三リン酸、２’，３’−ジデオキシシチジン５’−三リン酸、２’，３’−ジデオキシチミジン５’−三リン酸、２’，３’−ジデオキシウリジン５’−三リン酸、およびそれらの類縁体からなる群から選択される。一実施形態では、ジデオキシヌクレオチドは、２’，３’−ジデオキシアデノシン５’−三リン酸である。一実施形態では、ジデオキシヌクレオチドは、２’，３’−ジデオキシグアノシン５’−三リン酸である。一実施形態では、ジデオキシヌクレオチドは、２’，３’−ジデオキシシチジン５’−三リン酸である。一実施形態では、ジデオキシヌクレオチドは、２’，３’−ジデオキシチミジン５’−三リン酸である。一実施形態では、ジデオキシヌクレオチドは、２’，３’−ジデオキシウリジン５’−三リン酸である。一実施形態では、ジデオキシヌクレオチドは、２’，３’−ジデオキシアデノシン５’−三リン酸の類縁体である。一実施形態では、ジデオキシヌクレオチドは、２’，３’−ジデオキシグアノシン５’−三リン酸の類縁体である。一実施形態では、ジデオキシヌクレオチドは、２’，３’−ジデオキシシチジン５’−三リン酸の類縁体である。一実施形態では、ジデオキシヌクレオチドは、２’，３’−ジデオキシチミジン５’−三リン酸の類縁体である。一実施形態では、ジデオキシヌクレオチドは、２’，３’−ジデオキシウリジン５’−三リン酸の類縁体である。
【００３９】
一実施形態では、ポリメラーゼおよび１以上の４つの異なるジデオキシヌクレオチドが工程（ｖｉ）で添加され、ここで異なるジデオキシヌクレオチドはそれぞれ、２’，３’−ジデオキシアデノシン５’−三リン酸、または２’，３’−ジデオキシアデノシン５’−三リン酸の類縁体、２’，３’−ジデオキシグアノシン５’−三リン酸、または２’，３’−ジデオキシグアノシン５’−三リン酸の類縁体、２’，３’−ジデオキシシチジン５’−三リン酸、または２’，３’−ジデオキシシチジン５’−三リン酸の類縁体、および２’，３’−ジデオキシチミジン５’−三リン酸、または２’，３’−ジデオキシウリジン５’−三リン酸、または２’，３’−ジデオキシチミジン５’−三リン酸の類縁体、あるいは２’，３’−ジデオキシウリジン５’−三リン酸の類縁体からなる群から選択される。一実施形態では、ジデオキシヌクレオチドは、２’，３’−ジデオキシアデノシン５’−三リン酸である。一実施形態では、ジデオキシヌクレオチドは、２’，３’−ジデオキシアデノシン５’−三リン酸の類縁体である。一実施形態では、ジデオキシヌクレオチドは、２’，３’−ジデオキシグアノシン５’−三リン酸である。一実施形態では、ジデオキシヌクレオチドは、２’，３’−ジデオキシグアノシン５’−三リン酸の類縁体である。一実施形態では、ジデオキシヌクレオチドは、２’，３’−ジデオキシシチジン５’−三リン酸である。一実施形態では、ジデオキシヌクレオチドは、２’，３’−ジデオキシシチジンの類縁体である。一実施形態では、ジデオキシヌクレオチドは、２’，３’−ジデオキシチミジン５’−三リン酸である。一実施形態では、ジデオキシヌクレオチドは、２’，３’−ジデオキシウリジン５’−三リン酸である。一実施形態では、ジデオキシヌクレオチドは、２’，３’−ジデオキシチミジン５’−三リン酸の類縁体である。一実施形態では、ジデオキシヌクレオチドは、２’，３’−ジデオキシウリジン５’−三リン酸の類縁体である。
【００４０】
−ＯＨ基と特異的に反応する別のタイプの化学的化合物も、核酸に結合されたプライマー上、あるいは１以上のヌクレオチドまたはヌクレオチド類縁体をプライマーに付加することにより形成されるプライマー伸長鎖上の如何なる未反応の−ＯＨ基をも永久的にキャップするのに使用することができる。
【００４１】
本発明は、複数の異なる核酸を同時にシーケンシングする方法であって、該複数の異なる核酸をシーケンシングするために、本明細書中に開示する方法のいずれかを同時に適用することを含む方法を提供する。異なる実施形態では、上記方法を使用して、１個から１００，０００個以上の異なる核酸を同時にシーケンシングすることができる。
【００４２】
本発明は、一塩基多型の検出、遺伝子突然変異解析、遺伝子発現の逐次解析、遺伝子発現解析、法医学における特定、遺伝子疾患関連研究、ＤＮＡシーケンシング、ゲノムシーケンシング、翻訳解析、または転写解析のための、本発明に開示する方法のいずれかの使用を提供する。
【００４３】
本発明は、核酸を固体表面に結合する方法であって、以下の：
（ｉ）上記固体表面をホスフィン部分でコーティングすることと、
（ｉｉ）上記核酸の５’末端にアジド基を結合することと、
（ｉｉｉ）上記固体表面上の上記ホスフィン部分と、上記核酸の上記５’末端上の上記アジド基との間の相互作用により、上記核酸の上記５’末端を上記固体表面に固定化することと
を含む方法を提供する。
【００４４】
一実施形態では、固体表面をホスフィン部分でコーティングする工程は、以下の：
（ｉ）上記固体表面を第一アミンでコーティングすることと、
（ｉｉ）トリアリールホスフィンのＮ−ヒドロキシスクシンイミジルエステルを上記第一アミンと共有結合させることと
を含む。
【００４５】
異なる実施形態では、固体表面は、ガラス、シリコン、または金である。異なる実施形態では、固体表面は、磁気ビーズ、チップ、チップ内チャネル、またはチップ内多孔質チャネルである。
【００４６】
異なる実施形態では、固体表面に結合される核酸は、一本鎖もしくは二本鎖ＤＮＡ、またはＲＮＡである。一実施形態では、核酸は、二本鎖ＤＮＡであり、一方の鎖のみが、上記固体表面上に直接結合される。さらなる実施形態では、固体表面上に直接結合されない二本鎖ＤＮＡの鎖は、変性させることで除去される。
【００４７】
本発明は、遺伝子発現解析、マイクロアレイベースの遺伝子発現解析、突然変異検出、翻訳解析、転写解析、または他の遺伝的用途のための、本明細書中に開示する核酸を固体表面に結合する方法のいずれかの使用を提供する。
【００４８】
本発明は、以下の：
（ａ）アデニンまたはアデニンの類縁体、シトシンまたはシトシンの類縁体、およびグアニンまたはグアニンの類縁体、チミンまたはチミンの類縁体、およびウラシルまたはウラシルの類縁体からなる群から選択される塩基と、
（ｂ）切断可能なリンカーにより該塩基または該塩基の類縁体に結合される特有の標識と、
（ｃ）デオキシリボースと、
（ｄ）該デオキシリボースの３’位にある−ＯＨ基をキャップするための切断可能な化学基と
を含むヌクレオチド類縁体を提供する。
【００４９】
ヌクレオチド類縁体の一実施形態では、デオキシリボースの３’位にある−ＯＨ基をキャップする切断可能な化学基は、−ＣＨ２ＯＣＨ３または−ＣＨ２ＣＨ＝ＣＨ２である。
【００５０】
一実施形態では、特有の標識は、蛍光部分または蛍光半導体結晶である。さらなる実施形態では、蛍光部分は、５−カルボキシフルオレセイン、６−カルボキシローダミン−６Ｇ、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−６−カルボキシローダミン、および６−カルボキシ−Ｘ−ローダミンからなる群から選択される。
【００５１】
一実施形態では、特有の標識は、エネルギー転移供与体およびエネルギー転移受容体を含む蛍光エネルギー転移タグである。さらなる実施形態では、エネルギー転移供与体は、５−カルボキシフルオレセインまたはシアニンであり、エネルギー転移授与体は、ジクロロカルボキシフルオレセイン、ジクロロ−６−カルボキシローダミン−６Ｇ、ジクロロ−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−６−カルボキシローダミン、およびジクロロ−６−カルボキシ−Ｘ−ローダミンからなる群から選択される。
【００５２】
一実施形態では、特有の標識は、質量分析計により検出および識別することができる質量タグである。さらなる実施形態では、質量タグは、２−ニトロ−α−メチルベンジル基、２−ニトロ−α−メチル−３−フルオロベンジル基、２−ニトロ−α−メチル−３，４−ジフルオロベンジル基、および２−ニトロ−α−メチル−３，４−ジメトキシベンジル基からなる群から選択される。
【００５３】
一実施形態では、上記特有の標識は、切断可能なリンカーにより、シトシンまたはチミンの５’位、あるいはデアザアデニンまたはデアザグアニンの７’位に結合される。特有の標識は、標識の結合がポリメラーゼ連鎖反応中に安定であり、かつヌクレオチド類縁体がポリメラーゼにより基質として認識され得る限り、切断可能なリンカーにより、ヌクレオチド類縁体の別の位置に結合することができる。例えば、切断可能な標識は、デオキシリボースに結合することができる。
【００５４】
一実施形態では、特有の標識とヌクレオチド類縁体との間の切断可能なリンカーは、１以上の物理的手段、化学的手段、物理化学的手段、熱、および光からなる群から選択される手段によって切断される。さらなる実施形態では、切断可能なリンカーは、２−ニトロベンジル部分を含む光切断可能なリンカーである。
【００５５】
一実施形態では、デオキシリボースの３’位にある−ＯＨ基をキャップするのに使用する切断可能な化学基は、１以上の物理的手段、化学的手段、物理化学的手段、熱、および光からなる群から選択される手段によって切断される。
【００５６】
異なる実施形態では、ヌクレオチド類縁体は、以下の：
【００５７】
【化５】
2004510433.tif 000002
【００５８】
（式中、Ｄｙｅ１、Ｄｙｅ２、Ｄｙｅ３、およびＤｙｅ４は、４つの異なる色素標識であり、
Ｒは、デオキシリボースの３’位にある−ＯＨ基をキャップするのに使用する切断可能な化学基である）
からなる群から選択される。
【００５９】
異なる実施形態では、ヌクレオチド類縁体は、以下の：
【００６０】
【化６】
2004510433.tif 000003
【００６１】
（式中、Ｒは、−ＣＨ２ＯＣＨ３または−ＣＨ２ＣＨ＝ＣＨ２である）
からなる群から選択される。
【００６２】
異なる実施形態では、ヌクレオチド類縁体は、以下の：
【００６３】
【化７】
2004510433.tif 000004
【００６４】
（式中、Ｔａｇ１、Ｔａｇ２、Ｔａｇ３、およびＴａｇ４は、４つの異なる質量タグ標識であり、
Ｒは、デオキシリボースの３’位にある−ＯＨ基をキャップするのに使用する切断可能な化学基である）
からなる群から選択される。
【００６５】
異なる実施形態では、ヌクレオチド類縁体は、以下の：
【００６６】
【化８】
2004510433.tif 000005
【００６７】
（式中、Ｒは、−ＣＨ２ＯＣＨ３または−ＣＨ２ＣＨ＝ＣＨ２である）
からなる群から選択される。
【００６８】
本発明は、一塩基多型の検出、遺伝子突然変異解析、遺伝子発現の順次解析、遺伝子発現解析、法医学における特定、遺伝子疾患関連研究、ＤＮＡシーケンシング、ゲノムシーケンシング、翻訳解析、または転写解析のための、本明細書中に開示するヌクレオチド類縁体のいずれかの使用を提供する。
【００６９】
本発明は、試料タグを含む複数の試料を並行解析するための、複数の大気圧化学イオン化質量分析計を具備する並行質量分析システムを提供する。一実施形態では、質量分析計は、四重極質量分析計である。一実施形態では、質量分析計は、飛行時間型質量分析計である。一実施形態では、質量分析計は、１つの装置に含まれる。一実施形態では、上記システムは、２つのターボ式ポンプをさらに具備し、ここで一方のポンプは、真空を生成するのに使用され、第２のポンプは、望ましくない成分を除去するのに使用される。一実施形態では、上記システムは、少なくとも３つの質量分析計を具備する。一実施形態では、質量タグは、１５０ダルトン〜２５０ダルトンの分子量を有する。本発明は、ＤＮＡシーケンシング解析、一塩基多型の検出、遺伝子突然変異解析、遺伝子発現の順次解析、遺伝子発現解析、法医学における特定、遺伝子疾患関連研究、ＤＮＡシーケンシング、ゲノムシーケンシング、翻訳解析、または転写解析のための、上記システムの使用を提供する。
【００７０】
本発明は、以下の実験的な詳細からより理解されるであろう。しかしながら、議論する特定の方法および結果は、上述に記載した特許請求の範囲でより完全に記載されている本発明の単なる説明であることは、当業者には容易に理解されよう。
【００７１】
【実験の詳細】
１．合成アプローチによるシーケンシング
合成によりＤＮＡをシーケンシングすることは、各ヌクレオチドがポリメラーゼ連鎖反応中の成長中のＤＮＡ鎖に組み込まれることから、各ヌクレオチドの種別を検出することを包含している。かかるシステムを作動させるための基本的な要件は、（１）それぞれが特有の標識で標識され、かつ３’−ＯＨ基をキャップしている化学部分を含有する４つのヌクレオチド類縁体（ａＡ、ａＣ、ａＧ、ａＴ）の入手可能性、（２）４つのヌクレオチド類縁体（ａＡ、ａＣ、ａＧ、ａＴ）が、ポリメラーゼ反応中に、ターミネーターとして、効率的かつ正確にＤＮＡポリメラーゼにより組み込まれる必要があること、（３）次のヌクレオチドの組込みおよび検出を可能とするために、タグおよび３’−ＯＨをキャップしている基が高収率で除去される必要があること、および（４）成長中のＤＮＡ鎖は、洗浄、検出および切断過程を生き残り、ＤＮＡ鋳型にアニーリングされたままであるべきことである。
【００７２】
本明細書中に開示する合成アプローチによるシーケンシングを図２Ａ〜２Ｂに示す。図２Ａには、特有の標識が蛍光色素であり、表面がチップである例を示す。図２Ｂでは、特有の色素が質量タグであり、表面は、チップにエッチングしたチャネルである。該合成アプローチは、ポリメラーゼ反応を開始するために自己プライミングすることが可能な固定化ＤＮＡ鋳型を有するガラスチップのような固体表面、およびそれぞれが、プリンまたはピリミジン塩基上の特定位置にて特有の標識（例えば蛍光色素または質量タグ）で標識され、かつ３’−ＯＨ基をキャップするための切断可能な小さな化学基（Ｒ）を含有する４つのヌクレオチド類縁体（３’−ＲＯ−Ａ−ＬＡＢＥＬ１、３’−ＲＯ−Ｃ−ＬＡＢＥＬ２、３’−ＲＯ−Ｇ−ＬＡＢＥＬ３、３’−ＲＯ−Ｔ−ＬＡＢＥＬ４）を使用する。４つのヌクレオチド類縁体およびＤＮＡポリメラーゼを添加すると、鋳型上の次のヌクレオチドに相補的な唯一のヌクレオチド類縁体が、表面の各スポット上でポリメラーゼにより組み込まれる（図２Ａおよび２Ｂの工程１）。
【００７３】
特有の標識が色素である図２Ａでは、過剰な試薬を除去し、チップ上の組み込まれてない全てのヌクレオチド類縁体を洗い流した後に、検出器を用いて特有の標識を検出する。例えば、４つの色彩蛍光撮像機を用いてチップの表面を画像化し、チップの各スポット上におけるヌクレオチド類縁体上の特定の色素による特有の蛍光放出により、組み込まれたヌクレオチドの種別が明らかとなるであろう（図２Ａの工程２）。画像化後、自己プライミングされた鋳型部分上の少量の未反応３’−ＯＨ基を、過剰のジデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄｄＮＴＰ）（ｄｄＡＴＰ、ｄｄＧＴＰ、ｄｄＴＴＰ、およびｄｄＣＴＰ）およびＤＮＡポリメラーゼによりキャップし、次回の合成の妨害を回避する（図２Ａの工程３）。これは、自動固相ＤＮＡ合成でのキャッピング工程と同様の概念である（Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ， １９８５）。３’−水酸基を欠如しているｄｄＮＴＰは、色素標識ヌクレオチドと比較してその小サイズ、およびそれらがＤＮＡポリメラーゼにより組み込まれる優れた効率に起因して、ヌクレオチドの未反応３’−ＯＨ基をキャップするのに選択される。次に、色素部分を光（およそ３５０ｎｍ）で切断し、３’−ＯＨを保護するＲ基を化学的に除去して、高収率で遊離の３’−ＯＨ基を生成させる（図２Ａの工程４）。洗浄工程を適用して、切断された色素およびＲ基を洗い流す。この段階にあるチップ上の自己プライミングされたＤＮＡ部分は、鋳型ＤＮＡの次のヌクレオチド配列を特定するための次の反応サイクルの準備ができている（図２Ａの工程５）。
【００７４】
４ｃｍ×１ｃｍのガラスチップ上の高密度（チップ当たり１０，０００スポット以上）の一本鎖ＤＮＡを固定化することは、現在では日常的な手順である（Ｓｃｈｅｎａ ｅｔ ａｌ． １９９５）。したがって、本明細書中に開示するＤＮＡシーケンシングシステムでは、各サイクル後には１０，０００個を超える塩基を特定することができ、１００サイクル後には、１つのシーケンシングチップから百万個の塩基対を生成するであろう。
【００７５】
考え得るＤＮＡポリメラーゼとしては、Ｔｈｅｒｍｏシーケナーゼ、Ｔａｑ　ＦＳ　ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ７　ＤＮＡポリメラーゼ、およびＶｅｎｔ（ｅｘｏ−）ＤＮＡポリメラーゼが挙げられる。各特定の色素からの蛍光放出は、スライドガラスからの蛍光を検出するためのアクセサリを装備した蛍光分析計を用いて検出することができる。大量スケールの評価に関しては、スライドガラス上の複数の異なる蛍光色素（５００ｎｍ〜７００ｎｍ）を検出することが可能な多色スキャンニングシステム（ＧＳＩ Ｌｕｍｏｎｉｃｓ ＳｃａｎＡｒｒａｙ ５０００ Ｓｔａｎｄａｒｄ Ｂｉｏｃｈｉｐ Ｓｃａｎｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ）を使用することができる。
【００７６】
質量タグを用いた合成アプローチによるシーケンシングの例を図２Ｂに示す。このアプローチは、ポリメラーゼ反応を開始するために自己プライミングすることが可能な固定化ＤＮＡ鋳型を有するチップ内の多孔質シリカガラスチャネルのような固体表面、およびそれぞれが、塩基上の特定位置にて特有の光切断可能な質量タグで標識され、かつ３’−ＯＨ基をキャップするための切断可能な小さな化学基（Ｒ）を含有する４つのヌクレオチド類縁体（３’−ＲＯ−Ａ−Ｔａｇ１、３’−ＲＯ−Ｃ−Ｔａｇ２、３’−ＲＯ−Ｇ−Ｔａｇ３、３’−ＲＯ−Ｔ−Ｔａｇ４）を使用する。４つのヌクレオチド類縁体およびＤＮＡポリメラーゼを添加すると、鋳型上の次のヌクレオチドに相補的な唯一のヌクレオチド類縁体が、ガラスチップの各チャネルにおいてポリメラーゼにより組み込まれる（図２Ｂの工程１）。過剰な試薬を除去し、チップ上の組み込まれてない全てのヌクレオチド類縁体を洗い流した後に、自己プライミングされた鋳型部分上の少量の未反応３’−ＯＨ基を、過剰のｄｄＮＴＰ（ｄｄＡＴＰ、ｄｄＧＴＰ、ｄｄＴＴＰ、およびｄｄＣＴＰ）およびＤＮＡポリメラーゼによりキャップし、次回の合成の妨害を回避する（図２Ｂの工程２）。ｄｄＮＴＰは、色素標識ヌクレオチドと比較してその小サイズ、およびそれらがＤＮＡポリメラーゼにより組み込まれる優れた効率に起因して、ヌクレオチドの未反応３’−ＯＨ基をキャップするのに選択される。質量タグを光による照射（およそ３５０ｎｍ）で切断し（図２Ｂの工程３）、続いて質量分析計で検出する。各タグの特有の質量により、各チャネル中のヌクレオチドの種別が得られる（図２Ｂの工程４）。次に、Ｒ保護基を化学的に除去して、洗い流して、高収率で遊離３’−ＯＨ基を生成させる（図２Ｂの工程５）。この段階にあるチップ上の自己プライミングされたＤＮＡ部分は、鋳型ＤＮＡの次のヌクレオチド配列を特定するための次の反応サイクルの準備ができている（図２Ｂの工程６）。
【００７７】
マトリクス支援レーザ脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）、およびエレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）のような新たなイオン化技法の開発以来、質量分析は、生物医学的研究の多くの分野で欠かせないツールとなってきた。これらのイオン化方法は、ペプチドおよびタンパク質のような生体有機分子の解析に適切であるが、ＤＮＡシーケンシング用途での質量分析の実施には、検出および試料調製の両方での改良が必要である。本明細書中に開示するアプローチは、小さくて安定な質量タグを使用するため、大きなＤＮＡシーケンシング断片を直接検出する必要はなく、検出用にＭＡＬＤＩまたはＥＳＩ方法を使用する必要はない。大気圧化学イオン化（ＡＰＣＩ）は、大気圧にて気相イオン分子反応を使用するイオン化方法である（Ｄｉｚｉｄｉｃ ｅｔ ａｌ． １９７５）。この方法では、クロマトグラフィまたはフローインジェクションのいずれかにより、試料を空気式ネブライザーに導入し、そこで試料は、窒素ガスの高速ビームにより小滴に変換される。加熱ガスおよび溶液が反応領域に到達すると、過剰量の溶媒が、コロナ放電によりイオン化される。このイオン化された移動相は、試料に対するイオン化剤として作用し、擬似分子（Ｍ＋Ｈ）＋および（Ｍ−Ｈ）−イオンを生じる。コロナ放電イオン化方法により、高イオン化効率を達成することができ、小さくて安定な有機化合物に関するフェムトモル領域未満の検出感度をもつ安定なイオン化状態を維持する。しかしながら、大きな分子の検出限界により、ペプチドおよび核酸の解析に関してＡＰＣＩは、ＥＳＩおよびＭＡＬＤＩに置き換えられてきた。開示するアプローチでは、検出されるべき質量タグが比較的小さくて、非常に安定な有機分子であるため、ＥＳＩおよびＭＡＬＤＩを用いることで獲得される、大きな生物学的分子を検出する能力は必要でない。ＡＰＣＩは、標的プレート上の結晶を調製するために、脱塩すること、またはマトリクスと混合することといった任意の面倒な試料調製を必要としないことから、ＡＰＣＩは、ＥＳＩおよびＭＡＬＤＩを上回る利点が幾つかある。ＥＳＩでは、試料の性質および試料調製条件（すなわち、緩衝液または無機塩の存在）がイオン化効率を抑制する。ＭＡＬＤＩは、質量分析計に試料導入する前にマトリクスを添加する必要があり、また解釈可能な質量スペクトルを得るために理想の照射スポットを探索することの必要性により、その速度が制限されることが多い。質量タグ試料が、さらなる試料精製および調製なしで、質量分析計に直接注入することができるので、これらの制限は、ＡＰＣＩによる克服される。質量タグ付け試料は揮発性であり、小さな質量数を有するため、これらの化合物は、高感度でＡＰＣＩイオン化により容易に検出が可能である。このシステムは、ハイスループット操作にスケールアップすることができる。
【００７８】
合成システムによるシーケンシングの各構成成分について、以下に詳述する。
【００７９】
２．自己プライミングされた固定化ＤＮＡ部分を含有する表面の構築
表面上に固定化した一本鎖ＤＮＡ鋳型を、図３に示すスキームに従って調製する。表面は、例えば４ｃｍ×１ｃｍのガラスチップのようなガラスチップ、またはガラスチップ内チャネルであり得る。まず表面を０．５Ｍ　ＮａＯＨで処理して、水で洗浄した後、高密度の３−アミノプロピルトリメトキシシランのエタノール水溶液でコーティングして（Ｗｏｏｌｌｅｙ ｅｔ ａｌ． １９９４）、第一アミン表面を形成する。トリアリールホスフィンのＮ−ヒドロキシスクシンイミジル（ＮＨＳ）エステル（１）を、第一アミン基と共有結合させて、アミン表面を新規トリアリールホスフィン表面に変換し、その表面は、アジド基を含有するＤＮＡ（２）と特異的に反応して、固定化ＤＮＡを有するチップを形成する。アジド基は、ＤＮＡの５’末端のみに位置し、カップリング反応は、水溶液中のアジド基とトリアリールホスフィン部分との特有の反応によるものである（Ｓａｘｏｎ ａｎｄ Ｂｅｒｔｏｚｚｉ ２０００）ため、かかるＤＮＡ表面は、ハイブリダイゼーション用の最適な状態を提供するであろう。
【００８０】
トリアリールホスフィンのＮＨＳエステル（１）は、図４に示すスキームに従って調製される。３−ジフェニルホスフィノ−４−メトキシカルボニル安息香酸（３）は、Ｂｅｒｔｏｚｚｉ等により記載された手順に従って調製される（Ｓａｘｏｎ ａｎｄ Ｂｅｒｔｏｚｚｉ ２０００）。Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドでの（３）の処理により、相当するＮＨＳエステル（４）を形成する。アミノカルボン酸部分と（４）とのカップリングにより、表面上でのＤＮＡとの最適化されたカップリング用の長いリンカー（ｎ＝１〜１０）を有する化合物（５）が生じる。Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドでの（５）の処理により、第一アミンでコーティングした表面とのカップリングの準備が整っているＮＨＳエステル（１）が生成する（図３）。
【００８１】
アジド標識ＤＮＡ（２）は、図５に示すスキームに従って合成される。アジ化ナトリウムでの５−ブロモ吉草酸のエチルエステルの処理、続く加水分解により、５−アジド吉草酸が生じ（Ｋｈｏｕｋｈｉ ｅｔ ａｌ．， １９８７）、これは続いて、アミノリンカー標識オリゴヌクレオチドプライマーとのカップリング用のＮＨＳエステルに変換される。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）反応を実施するためのアジド標識プライマーを用いることで、トリアリールホスフィン修飾表面とのカップリング用のアジド標識ＤＮＡ鋳型（２）が生成する（図３）。
【００８２】
シーケンシングチップ上の自己プライミングされたＤＮＡ鋳型部分は、酵素連結反応を用いて、図６（ＡおよびＢ）に示すように構築される。５’−リン酸化され、３’−ＯＨをキャップされたループオリゴヌクレオチドプライマー（Ｂ）は、固相ＤＮＡ合成機により合成される。プライマー（Ｂ）は、連結反応中のプライマーの自己連結反応を防止するために、オリゴヌクレオチドの３’末端にて３’−ＯＨがＭＯＭ（−ＣＨ２ＯＣＨ３）基またはアリル（−ＣＨ２ＣＨ＝ＣＨ２）基のいずれか（図６中では「Ｒ」で示す）でキャップされている修飾Ｃホスホルアミダイトを用いて合成される。したがって、ループを形成したプライマーは、Ｔ４　ＲＮＡリガーゼを用いて、シーケンシングチップ上に固定化されたＤＮＡ鋳型の末端のみと連結して（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ． １９９６）、自己プライミングされたＤＮＡ鋳型部分を形成することができる（Ａ）。ループを形成したプライマー（Ｂ）は、非常に安定なループ（Ａｎｔａｏ ｅｔ ａｌ． １９９１）、およびいったんプライマーがシーケンシングチップ上の固定化ＤＮＡに連結され、３’−ＯＨキャップ基が化学的に切断されると、ポリメラーゼ反応中での効率的なプライミングのためのＭ１３逆ＤＮＡシーケンシングプライマーの配列を含有する基部（Ｉｒｅｌａｎｄ ｅｔ ａｌ． １９８６； Ｋａｍａｌ ｅｔ ａｌ． １９９９）を含有するように設計される。
【００８３】
３．ヌクレオチド類縁体体３’−ＨＯ−Ａ−Ｄｙｅ１、３’−ＨＯ−Ｃ−Ｄｙｅ２、３’−ＨＯ−Ｇ−Ｄｙｅ３、３’−ＨＯ−Ｔ−Ｄｙｅ４を用いた合成評価によるシーケンシング
種々の色素を用いた光切断効率の評価、および合成アプローチによるシーケンシングの試験のための体系を開発した。それぞれが光切断可能なリンカーにより特有の蛍光色素で標識した４つのヌクレオチド類縁体３’−ＨＯ−Ａ−Ｄｙｅ１、３’−ＨＯ−Ｃ−Ｄｙｅ２、３’−ＨＯ−Ｇ−Ｄｙｅ３、３’−ＨＯ−Ｔ−Ｄｙｅ４を合成し、合成アプローチによるシーケンシングで使用する。色素の例としては、Ｄｙｅ１＝ＦＡＭ、すなわち５−カルボキシフルオレセイン、Ｄｙｅ２＝Ｒ６Ｇ、すなわち６−カルボキシローダミン−６Ｇ、Ｄｙｅ３＝ＴＡＭ、すなわちＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−６−カルボキシローダミン、およびＤｙｅ４＝ＲＯＸ、すなわち６−カルボキシ−Ｘ−ローダミンが挙げられるが、これらに限定されない。４つのヌクレオチド類縁体の構造は図７に示す（Ｒ＝ｈ）。
【００８４】
光切断可能な２−ニトロベンジル部分は、ＵＶ光（およそ３５０ｎｍ）による効率的除去のために、ビオチンをＤＮＡおよびタンパク質に連結するのに使用されている（Ｏｌｅｊｎｉｋ ｅｔ ａｌ． １９９５， １９９９）。本明細書中に開示するアプローチでは、２−ニトロベンジル基は、図７に示すように、蛍光色素とヌクレオチドを一緒に架橋して、色素標識ヌクレオチドを形成するのに使用される。
【００８５】
代表的な例として、３’−ＨＯ−Ｇ−Ｄｙｅ３（Ｄｙｅ３＝Ｔａｍ）の合成を図８に示す。７−デアザ−アルキルアミノ−ｄＧＴＰを、十分確立された手法（Ｐｒｏｂｅｒ ｅｔ ａｌ． １９８７、Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ． １９９２、およびＨｏｂｂｓ ｅｔ ａｌ． １９９１）を用いて調製する。リンカー−Ｔａｍは、光切断可能なリンカー（Ｒｏｌｌａｆ １９８２）をＮＨＳ−Ｔａｍとカップリングすることで合成される。次に、７−デアザ−アルキニルアミノ−ｄＧＴＰをリンカー−Ｔａｍとカップリングして、３’−ＨＯ−Ｇ−Ｔａｍを製造する。遊離３’−ＯＨ（すなわち、Ｒ＝Ｈ）を有するヌクレオチド類縁体は、ポリメラーゼの良好な基質である。プライミング部位後に反復配列を有さないヌクレオチド配列ＡＣＧＴＡＣＧＡＣＧＴ（配列番号１）の一部を含有する固定化ＤＮＡ鋳型を合成する（図９）。３’−ＨＯ−Ａ−Ｄｙｅ１およびＤＮＡポリメラーゼを自己プライミングされたＤＮＡ部分に添加して、それがＤＮＡの３’部位に組み込まれる。次に、図２Ａの工程を行い（３’−ＯＨが遊離しているので、化学的切断工程は不要である）、５２０ｎｍでのＤｙｅ−１からの蛍光シグナルを検出する。次に、３’−ＨＯ−Ｃ−Ｄｙｅ２を添加して、５５０ｎｍでのＤｙｅ−２からの蛍光シグナルを画像化する。次に、３’−ＨＯ−Ｇ−Ｄｙｅ３を添加して、５８０ｎｍでのＤｙｅ−３からの蛍光シグナルを画像化し、最後に３’−ＨＯ−Ｔ−Ｄｙｅ４を添加して、６１０ｎｍでのＤｙｅ−４からの蛍光シグナルを画像化する。
【００８６】
光化学切断効率に関する結果
ＤＮＡの３’末端にある光切断可能な蛍光色素を含有するＤＮＡの予測光分解産物を図１０に示す。２−ニトロベンジル部分は、光切断可能な保護基として広範な研究に首尾よく使用されている（Ｐｉｌｌａｉ １９８０）。光切断工程の効率は、２−ニトロベンジル部分の光吸収効率、一次光化学工程の効率、および最終的な切断プロセスを引き起こす二次熱プロセスの効率を含む幾つかの要因に依存する（Ｔｕｒｒｏ １９９１）。Ｂｕｒｇｅｓｓ等（１９９７）は、ヌクレオチド部分上の２−ニトロベンジルリンカーにより結合された蛍光色素の首尾よい光切断を報告しており、蛍光色素は、光切断プロセスを抑制しないことを示している。２−ニトロベンジル発色団に基づく感光性保護基もまた、光切断を含む生物学的標識用途のために開発された（Ｏｌｅｊｎｉｋ ｅｔ ａｌ． １９９９）。本明細書中に開示するプロトコルを用いて、図１０に示す光切断プロセスを最適化する。２−ニトロベンジル化合物の吸収スペクトルを検査して、蛍光色素の吸収スペクトルと定量的に比較する。２−ニトロベンジル部分の数と色素分子との間に１対１の関係が存在するため、これら２つの種の吸光係数の比は、特定の波長での光吸収に関する競合を反映するであろう。この情報から、２−ニトロベンジル部分が最も競合的に吸収された波長を、Ｏｌｅｊｎｉｋ等（１９９５）により報告されるアプローチと同様に決定することができる。
【００８７】
モノクロメータ（Ｋｒａｔｏｓ， Ｓｃｈｏｅｆｆｅｌ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）と併合させた１００Ｗ高圧キセノンランプ（ＬＸ１０００ＵＶ、ＩＬＣ）からの高流量の単色光を可能にする光分解設定を使用することができる。この機器により、吸収される光の強度および励起波長の関数として、モデルシステムの光切断の評価が可能である。標準的な分析的解析を用いて、光切断の度合いを決定する。この情報から、波長の関数としての光切断の効率を決定することができる。光切断が最も効率的に行われ得る波長を、シーケンシングシステムでの使用に選択することができる。
【００８８】
光切断の結果は、図１１に示すように、モデルシステムを用いて得られた。ジメチルスルホニルオキシド（ＤＭＳＯ）／ＮａＨＣＯ３（ｐＨ＝８．２）中で室温にて一晩、ＰＣ−ＬＣ−ビオチン−ＮＨＳエステル（Ｐｉｅｒｃｅ， Ｒｏｃｋｆｏｒｄ ＩＬ）を５−（アミノアセトアミド）−フルオレセイン（５−アミノＦＡＭ）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ， Ｅｕｇｅｎｅ ＯＲ）とカップリングさせて、一端にあるビオチン、中央にある光切断可能な２−ヒドロキシベンジル基、および他端にある色素タグ（ＦＡＭ）から構成されるＰＬ−ＬＣ−ビオチン−ＦＡＭが生産される。この光切断可能な部分は、図１０に示す設計した光切断可能なヌクレオチド類縁体を綿密に模倣する。したがって、ＰＣ−ＬＣ−ビオチン−ＦＡＭ部分の首尾よい光切断は、ＤＮＡシーケンシングシステムで使用される場合に、高効率の光分解の原理の証明を提供する。光分解研究に関して、ＰＣ−ＬＣ−ビオチン−ＦＡＭを、まずストレプトアビジン（ＸＥＮＯＰＯＲＥ， Ｈａｗｔｈｏｒｎｅ ＮＪ）でコーティングした顕微鏡スライドガラス上に固定化する。固定化されていないＰＣ−ＬＣ−ビオチン−ＦＡＭを洗い流した後、固定化ＰＣ−ＬＣ−ビオチン−ＦＡＭの蛍光放出スペクトルを、図１２に示すようにとった（スペクトルａ）。強力な蛍光放出は、ＰＣ−ＬＣ−ビオチン−ＦＡＭが、ストレプトアビジンでコーティングしたスライドガラスに首尾よく固定化されていることを示す。次に、３５０ｎｍでの照射による２−ニトロベンジルリンカーの光切断性を試験した。１０分の光分解（λｉｒｒ＝３５０ｎｍ、およそ０．５ｍＷ／ｃｍ２）後、かつ任意の洗浄前に、強度の減少を示さないスライド上の同じスポットの蛍光放出スペクトルが得られた（図１２、スペクトルｂ）。これは、色素（ＦＡＭ）が、３５０ｎｍでの光分解プロセス中に漂白されていないことを示す。光分解後にＨＰＬＣ水でのスライドガラスを洗浄した後、スライド上の同じスポットの蛍光放出スペクトルは、有意な強度減少を示した（図１２、スペクトルｃ）。これは、蛍光色素（ＦＡＭ）の大部分が、固定化ビオチン部分から切断され、洗浄手順により除去されたことを示す。この実験は、蛍光色素の高効率切断が、２−ニトロベンジル光切断可能なリンカーを用いて得ることができることを示す。
【００８９】
４．ヌクレオチド類縁体３’−ＲＯ−Ａ−Ｄｙｅ１、３’−ＲＯ−Ｃ−Ｄｙｅ２、３’−ＲＯ−Ｇ−Ｄｙｅ３、３’−ＲＯ−Ｔ−Ｄｙｅ４を用いた合成評価によるシーケンシング
セクション３の工程および条件がいったん最適化されれば、ヌクレオチド類縁体３’−ＲＯ−Ａ−Ｄｙｅ１、３’−ＲＯ−Ｃ−Ｄｙｅ２、３’−ＲＯ−Ｇ−Ｄｙｅ３、３’−ＲＯ−Ｔ−Ｄｙｅ４の合成は、システムのさらなる研究のために実行することができる。ここで、４つ全てのヌクレオチド類縁体において３’−ＯＨをキャップし、続いて、ＤＮＡポリメラーゼとともに混合して、図９のスキームで使用するシーケンシングシステムを評価するのに使用することができる。ＭＯＭ（−ＣＨ２ＯＣＨ３）またはアリル（−ＣＨ２ＣＨ＝ＣＨ２）基を用いて、十分確立された合成手順を使用して３’−ＯＨ基をキャップする（図１３）（Ｆｕｊｉ ｅｔ ａｌ． １９９７５， Ｍｅｔｚｋｅｒ ｅｔ ａｌ． １９９４）。図１４に示すように、これらの基を、高収率で化学的に切断することができる（Ｉｒｅｌａｎｄ， ｅｔ ａｌ． １９８６； Ｋａｍａｌ ｅｔ ａｌ． １９９９）。ＭＯＭおよびアリル基の化学的切断は、かなり穏やかで特異的であり、ＤＮＡ鋳型部分を減成しない。例えば、アリル基の切断は、９３％を超える収率を伴って３分かかり（Ｋａｍａｌ ｅｔ ａｌ． １９９９）、一方ＭＯＭ基は、ほぼ１００％の収率で切断されることが報告されている（Ｉｒｅｌａｎｄ， ｅｔ ａｌ． １９８６）。
【００９０】
５．合成システムによるシーケンシングを最適化するためのエネルギー転移共役色素の使用
蛍光タグのスペクトル特性は、エネルギー転移（ＥＴ）共役色素を用いることで最適化することができる。ＥＴプライマーおよびＥＴジデオキシヌクレオチドは、１つのレーザの使用が蛍光タグの複数セットを励起するのを可能とする４色ＤＮＡシーケンシングの試薬の優れたセットであることがわかっている（Ｊｕ ｅｔ ａｌ． １９９５）。ＤＮＡポリメラーゼ（ＴｈｅｒｍｏシーケナーゼおよびタグＦＳ）は、ＥＴ色素標識ジデオキシリボヌクレオチドを効率よく組み込むことができることがわかっている（Ｒｏｓｅｎｂｌｕｍ ｅｔ ａｌ． １９９７）。これらのＥＴ色素標識シーケンシング試薬は現在、ヒトゲノムプロジェクトのような大量スケールのＤＮＡシーケンシングプロジェクトで使用されている。ＥＴ色素標識ヌクレオチド類縁体ライブラリーは、ＤＮＡシーケンシングシステムの最適化用に、図１５に示すように合成することができる。供与体としてＦＡＭを、受容体としてジクロロ（ＦＡＭ、Ｒ６Ｇ、ＴＡＭ、ＲＯＸ）を用いたＥＴセット（ＦＡＭ−Ｃｌ２ＦＡＭ、ＦＡＭ−Ｃｌ２Ｒ６Ｇ、ＦＡＭ−Ｃｌ２ＴＡＭ、ＦＡＭ−Ｃｌ２ＲＯＸ）は文献に報告されており（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ． １９９７）、市販のＤＮＡシーケンシング試薬セットを構成する。これらのＥＴ試薬セットは、増大した蛍光強度を生じることが証明されており、ＴおよびＣの５位、ならびにＧおよびＡの７位にてこれらのＥＴ色素で標識したヌクレオチドは、ＤＮＡポリメラーゼの優れた基質である。あるいは、ＥＴ色素セットは、供与体としてシアニン（Ｃｙ２）を、エネルギー受容体としてＣｌ２ＦＡＭ、Ｃｌ２Ｒ６Ｇ、Ｃｌ２ＴＡＭ、またはＣｌ２ＲＯＸを用いて構築することができる。Ｃｙ２は、ローダミンおよびフルオレセイン誘導体と比較して、より高いモル吸光度を保有するため、供与体としてＣｙ２を用いたＥＴ系は、供与体としてＦＡＭを用いた系よりも相当強力な蛍光シグナルを生じる（Ｈｕｎｇ ｅｔ ａｌ． １９９６）。図１６は、供与体としてＦＡＭを用いたエネルギー転移系の合成に関するのと同様のカップリング化学を用いた、供与体としてＣｙ２、および受容体としてＣｌ２ＦＡＭを用いたＥＴ色素標識ヌクレオチド類縁体に関する合成スキームを示す（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ． １９９７）。スペーサ−である４−アミノメチル安息香酸（ＩＩ）とＣｌ２ＦＡＭ（Ｉ）とのカップリングにより、ＩＩＩが生じ、続いてこれをＮＨＳエステルＩＶに変換する。ＩＶのアミノ−Ｃｙ２とのカップリング、続く得られた化合物のＮＨＳエステルへの変換により、Ｖが得られ、続いてこれをアミノ−光リンカーヌクレオチドＶＩとカップリングさせて、ＥＴ色素標識ヌクレオチドＶＩＩが得られる。
【００９１】
６．ヌクレオチド類縁体３’−ＨＯ−Ａ−Ｔａｇ１、３’−ＨＯ−Ｃ−Ｔａｇ２、３’−ＨＯ−Ｇ−Ｔａｇ３、３’−ＨＯ−Ｔ−Ｔａｇｅ４を用いた合成評価によるシーケンシング
質量タグの４つの例の前駆体を図１７に示す。前駆体は、（ａ）アセトフェノン、（ｂ）３−フルオロアセトフェノン、（ｃ）３，４−ジフルオロアセトフェノン、および（ｄ）３，４−ジメトキシアセトフェノンである。ニトロ化および還元すると、４つの光活性タグが４つの前駆体から生じ、これらを用いて、４つのヌクレオチド（Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ）のそれぞれの種別をコードする。明瞭なＡＰＣＩ質量スペクトルが、図１８に示すように、４つの質量タグ前駆体（ａ、ｂ、ｃ、ｄ）に関して得られる。１２１のｍ／ｚを有するピークがａ、１３９がｂ、１５７がｃ、１８１がｄである。これの結果は、これらの４つの質量タグが極めて安定であり、質量タグ環の混信なくＡＰＣＩ質量分析計において非常に高い分解能データを生成する。以下に示す例では、各質量タグからの特有のｍ／ｚそれぞれが、ヌクレオチドの種別へと変換される［Ｔａｇ−１（ｍ／ｚ，１５０）＝Ａ、Ｔａｇ−２（ｍ／ｚ，１６８）＝Ｃ、Ｔａｇ−３（ｍ／ｚ，１８６）＝Ｇ、ＴＡｇ−４（ｍ／ｚ，２１０）＝Ｔ］。
【００９２】
一般スキームに示すように、質量タグおよびヌクレオチドの種々の組合せ：体３’−ＨＯ−Ａ−Ｔａｇ１、３’−ＨＯ−Ｃ−Ｔａｇ２、３’−ＨＯ−Ｇ−Ｔａｇ３、３’−ＨＯ−Ｔ−Ｔａｇｅ４（ここで、Ｔａｇ１、Ｔａｇ２、Ｔａｇ３、およびＴｇａ４は、４つの異なる特有の質量タグである）を使用することができる。ヌクレオチド類縁体の４つの具体例を図１９に示す。図１９では、３’−ＯＨ基がキャップされていない場合、「Ｒ」は、Ｈである。上述のように、光切断可能な２−ニトロベンジル部分は、ＵＶ光（およそ３５０ｎｍ）照射による効率的除去のために、ビオチンをＤＮＡおよびタンパク質に連結するのに使用されている（Ｏｌｅｊｎｉｋ ｅｔ ａｌ． １９９５， １９９９）。質量タグとして異なる分子量を有する４つの異なる２−ニトロベンジル基を用いて、図１９に示すように質量タグ標識ヌクレオチド：Ａをコードする２−ニトロ−α−メチルベンジル（Ｔａｇ−１）、Ｃをコードする２−ニトロ−α−メチル−３−フルオロベンジル（Ｔａｇ−２）、Ｇをコードする２−ニトロ−α−メチル３，４−ジフルオロベンジル（Ｔａｇ−３）、Ｔをコードする２−ニトロ−α−メチル−３，４−ジメトキシベンジル（Ｔａｇ−４）を形成する。
【００９３】
代表例として、１つの質量タグ（Ｔａｇ−３）のＮＨＳエステルの合成を図２０に示す。同様のスキームを用いて、他の質量タグを創出する。３’−ＨＯ−Ｇ−Ｔａｇ３の合成は、十分確立された手順を用いて図２１に示す（Ｐｒｏｂｅｒ ｅｔ ａｌ． １９８７、Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ． １９９２、およびＨｏｂｂｓ ｅｔ ａｌ． １９９１）。７−Ｉ−ｄＧＴＰをＮ−トリフルオロアセチルプロパルギルアミンと反応させることで、まず７−プロパルギルアミノ−ｄＧＴＰを調製し、次にそれをＮＨＳ−Ｔａｇ−３とカップリングさせて、３’−ＨＯ−Ｇ−Ｔａｇ３を生じる。遊離３’−ＯＨを有するヌクレオチド類縁体は、ポリメラーゼの良好な基質である。
【００９４】
合成アプローチによるシーケンシングを、図９の色素に関して示すスキームと同様のスキームを用いて、質量タグを使用して試験することができる。プライミング部位後に反復配列を有さないヌクレオチド配列の一部を含有するＤＮＡ鋳型を合成して、ガラスチャネルに固定化する。３’−ＨＯ−Ａ−Ｔａｇ１およびＤＮＡポリメラーゼを、自己プライミングされたＤＮＡ部分に添加して、ＤＮＡの３’部位へのヌクレオチドの組込みを可能とする。次に、工程２Ｂの工程を行い（３’−ＯＨが遊離しているので、化学的切断工程は不要である）、Ｔａｇ−１（ｍ／ｚ＝１５０）からの質量タグを検出する。次に、３’−ＨＯ−Ｃ−Ｔａｇ２を添加して、Ｔａｇ−２（ｍ／ｚ＝１８６）の切断後に得られる質量スペクトルを測定する。次に、３’−ＨＯ−Ｇ−Ｔａｇ３、および３’−ＨＯ−Ｔ−Ｔａｇ４を順に添加して、切断産物Ｔａｇ−３（ｍ／ｚ＝１８６）およびＴａｇ−４（ｍ／ｚ＝２１０）の質量スペクトルを測定する。予測光切断産物の例を図２２に示す。光切断機構は、特有の標識が色素である場合に関して上述している。芳香族２−ニトロベンジル部分による光吸収（３００〜３６０ｎｍ）は、２−ニトロ基をニトロソ基へと還元し、２位に位置する炭素−水素結合に酸素を挿入させ、続いて切断および脱炭酸を引き起こす（Ｐｉｌｌａｉ １９８０）。
【００９５】
ヌクレオチド類縁体３’−ＲＯ−Ａ−Ｔａｇ１、３’−ＲＯ−Ｃ−Ｔａｇ２、３’−ＲＯ−Ｇ−Ｔａｇ３、３’−ＲＯ−Ｔ−Ｔａｇ４の合成は、特有の標識が色素である場合に関して上述しているシステムのさらなる研究のために実行することができる。ここで、４つ全てのヌクレオチド類縁体において３’−ＯＨをキャップし、続いて、ＤＮＡポリメラーゼとともに混合して、図９のスキームで使用するシーケンシングシステムを評価するのに使用することができる。ＭＯＭ（−ＣＨ２ＯＣＨ３）またはアリル（−ＣＨ２ＣＨ＝ＣＨ２）基を用いて、十分に確立された合成手順を使用して３’−ＯＨ基をキャップする（図１３）（Ｆｕｊｉ ｅｔ ａｌ． １９９７５， Ｍｅｔｚｋｅｒ ｅｔ ａｌ． １９９４）。図１４に示すように、これらの基を、高収率で化学的に切断することができる（Ｉｒｅｌａｎｄ， ｅｔ ａｌ． １９８６； Ｋａｍａｌ ｅｔ ａｌ． １９９９）。ＭＯＭおよびアリル基の化学的切断は、かなり穏やかで特異的であり、ＤＮＡ鋳型部分を減成しない。
【００９６】
７．合成によるシーケンシングに関する並行チャネルシステム
図２３は、並行チャネルシステムの例を示す。このシステムは、図示するような質量タグ標識、また同様に色素標識を用いて使用することができる。シリカガラスチップ内の複数のチャネルは、そのチャネルの各端をウェルプレート中のウェルに接続させている。図示した例では、それ自身のウェルにそれぞれが接続された９６個のチャネルが存在する。シーケンシングシステムはまた、９６個以外のチャネル数を使用することも可能である。断片を分離、ＤＮＡシーケンシング、およびサイジングする９６チャネルの装置が報告されている（Ｗｏｏｌｌｅｙ ａｎｄ Ｍａｔｈｉｅｓ １９９４， Ｗｏｏｌｌｅｙ ｅｔ ａｌ． １９９７， Ｓｉｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ． １９９８）。フォトリソグラフィーマスキングおよび化学的エッチング技法により、チップが作製される。フォトリソグラフィー的に規定されるチャネルパターンをシリカガラス基板にエッチングした後、第２のシリカスライドガラスにエッチングした基板を熱的に結合させることで、キャピラリーチャネル（内径およそ１００μｍ）が形成される。表面積を増大させるために、チャネルは多孔質である。固定化一本鎖ＤＮＡ鋳型チップは、図３に示すスキームに従って調製される。各チャネルをまず０．５Ｍ　ＮａＯＨで処理して、水で洗浄した後、高密度の３−アミノプロピルトリメチルシランのエタノール水溶液でコーティングして（Ｗｏｏｌｅｙ ｅｔ ａｌ． １９９４）、第１アミン表面を形成する。トリアリールホスフィンのスクシンイミジル（ＮＨＳ）エステル（１）を、第１アミン基と共有結合させて、アミン表面を新規トリアリールホスフィン表面に変換して、その表面は、アジド基を含有するＤＮＡ（２）と特異的に反応して、固定化ＤＮＡを有するチップを形成する。アジド基は、ＤＮＡの５’末端のみに位置し、カップリング反応は、水溶液中のアジド基とトリアリールホスフィンとの特有の反応によるものである（Ｓａｘｏｎ ａｎｄ Ｂｅｒｔｏｚｚｉ ２０００）ため、かかるＤＮＡ表面は、ハイブリダイゼーション用の最適な状態を提供するであろう。シーケンシング試薬および洗浄溶液のような液体は、ポリメラーゼ反応を実施するため、ならびに光分解した標識を収集するために、チップ内の各チャネルを洗浄して、そこに試薬を添加する目的で、２つの９６ウェルプレート間を容易に圧力駆動することができる。シリカチップは、紫外光（λおよそ３５０ｎｍ）に対して透過性である。図では、ＵＶ光源で照射した際、光切断された質量タグを、ＡＰＣＩ質量分析計で検出している。
【００９７】
８．合成システムによる並行質量タグシーケンシング
本明細書中に開示するアプローチは、４つの特有の光放出質量タグを検出することを含み、これらのタグは、１５０〜２５０ダルトンの分子量を有することができ、ＤＮＡ配列を解読することができ、それにより質量分析計を用いて大きなＤＮＡ断片を検出する問題、ならびに長いＤＮＡ断片を直接検出するための質量分析計を用いた場合の厳しい試料要件を回避する。ＡＰＣＩ質量分析計を用いて各質量タグを解析するのに、１０秒以下を要する。システムにおいて８個の小型ＡＰＣＩ質量分析計を用いた場合、このアプローチを用いて各装置につき毎日、およそ１００，０００ｂｐの質の高いディジタルＤＮＡシーケンシングデータを生成することができる。このアプローチを用いる場合、分離および精製要件が存在しないため、かかるシステムは、費用効率が良い。
【００９８】
ＤＮＡを解析する９６ウェルキャピラリーアレイ方法に対抗する質量分析を作製するために、並行質量分析計アプローチが必要である。かかる完全システムは、質量分析計のほとんどが大きな生体分子に適した分解能を達成するように設計されているという事実に主に起因して報告されていない。本明細書中に開示するシステムは、４つのヌクレオチド（Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ）の種別をコードする、１５０〜２５０ダルトンの範囲の分子量を有する４つの質量タグの検出を要する。これらの質量タグの検出専用の質量分析計は、広い質量範囲を網羅するのではなく、１５０〜２５０ダルトンの質量範囲に関する高分解能が必要とされるだけであるため、質量分析計を小型化することができ、単純な設計を有する。四重極（イオントラップ検出器を含む）または飛行時間型のいずれかの質量分析計は、イオン光学に関して選択することができる。近代的な質量分析技術は、小型化質量分析計を製造することを可能としてきた一方で、最新の研究は、独立型小型化質量分析計の設計に焦点を当てている。質量分析計の個々の構成成分は、質量分析計の解析容量を増大するために小型化されている（Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ． ２０００， Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ． １９９９）。並行して複数の分析器（最大１０個）を用いた小型化質量分析システムが報告されている（Ｂａｄｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｏｋｓ ２０００）。しかしながら、Ｂａｄｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｏｋの質量分析計は、並行した複数の試料ではなく単一試料のみを測定するように設計されていた。彼等はまた、イオントラップの小型化は、質量分析計の広い質量範囲をスキャンする容量を制限すると特筆した。本明細書中に開示するアプローチは、４つの小さな質量タグ（質量範囲は、３００ダルトン未満である）を検出することに焦点を当てているため、複数の小型化ＡＰＣＩ質量分析計を、ＤＮＡシーケンシング解析用の質量タグの並行解析用の単一ユニットに、容易に構築および組み立てられる。
【００９９】
完全並行質量分析システムは、適切なエレクトロニクスおよび電源配置と一体となって、複数の分析器とインターフェースで連結された複数のＡＰＣＩ源を包含する。並行検出容量を有する質量分析システムは、ＤＡＮ解析での適用に関する処理量障害問題を克服するであろう。単一装置中に複数の質量分析計を含有する並行システムを図２３および２４に示す。図中の例は、並行して３つの質量分析計を有するシステムを示す。より多数の並行質量分析計を用いれば、より高い処理量が得られる。
【０１００】
図２４では、３つの小型質量分析計が、２つのターボ式ポンプととともに１つの装置に含まれている。試料をイオン源に注入し、そこで試料は、ネブライザーガスと混合されて、イオン化される。イオン源と分析器との間の開口部にある一方のターボ式ポンプを差動排気システムとして用いて、イオン源から生じるフリーラジカル、中性化合物および他の望ましくない要素を連続して一掃する。第２のターボ式ポンプを用いて、３つ全ての分析器および検出器に同時に連続真空を発生させる。質量分析計のコロナ放電モードおよびスキャンニングモードは、各小型化質量分析計に関して同じであるため、各分析器およびイオン化源用の１つ電源が、３つ全ての装置に必要な電力を供給することができる。３つの別個の検出器それぞれ用の１つの電源が、スペクトル収集に使用される。得られたデータは、３つの別個のＡ／Ｄ変換器に移送され、同時にデータシステムにより処理されて、注入された試料中の質量タグを特定し、したがってヌクレオチドを特定する。３つ質量分析計を含有するにもかかわらず、装置全体は、研究室ベンチトップ上に適合可能である。
【０１０１】
９．ｐ５３遺伝子をシーケンシングすることによる、合成システムによる完全シーケンシングの確証
腫瘍抑制遺伝子ｐ５３を、ＤＮＡシーケンシングシステムを確証するためのモデル系として使用することができる。ｐ５３遺伝子は、ヒト癌において最も頻繁に突然変異される遺伝子の１つである（Ｏ’Ｃｏｎｎｏｒ ｅｔ ａｌ． １９９７）。まず、５’末端におけるアジド基およびｐ５３遺伝子のエキソン７およびエキソン８由来の配列の一部を含有する塩基対ＤＮＡ鋳型（以下に示す）：
５’−Ｎ３−ＴＴＣＣＴＧＣＡＴＧＧＧＣＧＧＣＡＴＧＡＡＣＣＣＧＡＧＧＣＣＣＡＴＣＣＴＣＡＣＣＡＴＣＡＴＣＡＣＡＣＴＧＧＡＡＧＡＣＴＣＣＡＧＴＧＧＴＡＡＴＣＴＡＣＴＧＧＧＡＣＧＧＡＡＣＡＧＣＴＴＴＧＡＧＧＴＧＣＡＴＴ−３’（配列番号２）
を合成する。
【０１０２】
この鋳型は、群を成すホットスポット単一塩基突然変異の検出用シーケンシングシステムの使用を探究するのに選択される。合成鋳型中で突然変異の可能性がある塩基に下線を付した（Ａ、Ｇ、Ｃ、およびＴ）。合成鋳型を、シーケンシングチップまたはガラスチャネル上に固定化し、続いて図６に記載するように、ループプライマーを固定化鋳型に連結させ、次にシーケンシング評価のために図２の工程を行う。ＰＣＲにより生成するＤＮＡ鋳型を用いて、ＤＮＡシーケンシングシステムをさらに確証することができる。シーケンシング鋳型は、Ｆｕ等（１９９８）に記載するように、ゲノムＤＮＡプール（Ｂｅｈｒｉｎｇｅｒ， Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ， ＩＮ）からの各ｐ５３エキソン境界に位置するイントロン領域中の隣接プライマー（対の一方は、５’末端にてアジド基で標識される）を用いてＰＣＲにより生成することができ、続いてシーケンシング評価のためにＤＮＡチップ上に固定化することができる。
［参照文献］
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【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】
ラットＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡ鋳型−プライマー、およびジデオキシシリジン三リン酸（ｄｄＣＴＰ）の三元複合体の三次元構造。図の左側は、ｄｄＣＴＰの付加に関する機構を示し、図の右側は、ポリメラーゼの活性部位を示す。ジデオキシリボース環の３’位が非常に混雑している一方で、シチジン塩基の５位では十分なスペースが利用可能であることに留意されたい。
【図２Ａ】
合成アプローチによるシーケンシングのスキーム。Ａ：特有の標識が色素であり、固体表面がチップである例。Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ，塩基アデニン、シトシン、グアニン、およびチミンを含むヌクレオチド三リン酸；ｄ，デオキシ；ｄｄ，ジデオキシ；Ｒ，−ＯＨ基をキャップするのに使用される切断可能な化学基；Ｙ，切断可能なリンカー。
【図２Ｂ】
合成アプローチによるシーケンシングのスキーム。Ｂ：特有の標識が質量タグであり、固体表面がガラスチップにエッチングされたチャネルである例。Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ，塩基アデニン、シトシン、グアニン、およびチミンを含むヌクレオチド三リン酸；ｄ，デオキシ；ｄｄ，ジデオキシ；Ｒ，−ＯＨ基をキャップするのに使用される切断可能な化学基；Ｙ，切断可能なリンカー。
【図３】
トリアリールホスフィン部分でコーティングした固体表面へ、アジド（Ｎ３）標識ＤＮＡ断片を固体化するための合成スキーム。Ｍｅ，メチル基；Ｐ，リン；Ｐｈ，フェニル。
【図４】
トリアリールホスフィンＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステルの合成。
【図５】
リンカーによりアジド（Ｎ３）基をＤＮＡ断片の５’末端に結合するための合成スキームであり、アジド基は続いて、固体表面上のトリアリールホスフィン部分とカップリングするのに使用される。ＤＭＳＯ，ジメチルスルホニルオキシド。
【図６】
ループを形成したプライマー（Ｂ）を、固体表面上の自己プライミングされたＤＮＡ鋳型部分を形成する固定化一本鎖ＤＮＡ鋳型へ連結する図。Ｐ（円中），リン酸）。
【図７】
合成アプローチによるシーケンシングで使用する４つのヌクレオチド類縁体の構造例。ヌクレオチド類縁体はそれぞれ、光切断可能なリンカーにより塩基に結合された特有の蛍光色素を有しており、３’−ＯＨは、露出しているか、またはＭＯＭ基もしくはアリル基でキャップされている。ＦＡＭ，５−カルボキシフルオレセイン；Ｒ６Ｇ、６−カルボキシローダミン−６Ｇ；ＴＡＭ，Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−６−カルボキシローダミン；ＲＯＸ，６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン。Ｒ＝Ｈ、ＣＨ２ＯＣＨ３（ＭＯＭ）またはＣＨ２ＣＨ＝ＣＨ２（アリル）。
【図８】
ヌクレオチド類縁体３’−ＲＯ−Ｇ−Ｔａｍの合成に関する代表的スキーム。同様のスキームを用いて、他の３つの修飾ヌクレオチド：３’−ＲＯ−Ａ−Ｄｙｅ１、３’−ＲＯ−Ｃ−Ｄｙｅ２、３’−ＲＯ−Ｔ−Ｄｙｅ４を創出することができる。（ｉ）テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０）；（ｉｉ）ＰＯＣｌ３、Ｂｎ４Ｎ＋ピロリン酸塩；（ｉｉｉ）ＮＨ４ＯＨ；（ｉｖ）Ｎａ２ＣＯ３／ＮａＨＣＯ３（ｐＨ＝９．０）／ＤＭＳＯ）。
【図９】
合成アプローチによるシーケンシングの試験に関するスキーム。特有の蛍光色素の結合で修飾した各ヌクレオチドを、相補鋳型に基づいて、順に添加する。色素を検出および切断して、アプローチを試験する。Ｄｙｅ１＝Ｆａｍ；Ｄｙｅ２＝Ｒ６Ｇ；Ｄｙｅ３＝Ｔａｍ；Ｄｙｅ＝Ｒｏｘ。
【図１０】
光切断可能な色素（Ｔａｍ）を含有するＤＮＡの予測光切断産物。芳香族２−ニトロベンジル部分による光吸収（３００〜３６０ｎｍ）は、２−ニトロ基をニトロソ基へと還元し、２位に位置する炭素−水素結合に酸素を挿入させ、続いて切断および脱炭酸を引き起こす（Ｐｉｌｌａｉ １９８０）。
【図１１】
光切断可能なリンカー２−ニトロベンジル基とカップリングさせたフルオロフォアの光分解効率を評価するための、ＰＣ−ＬＣ−ビオチン−ＦＡＭの合成。
【図１２】
ストレプトアビジンでコーティングした顕微鏡スライドガラス上に固定化したＰＣ−ＬＣ−ビオチン−ＦＡＭの蛍光スペクトル（λｅｘ＝４８０ｎｍ）（ａ）、１０分の光分解（λｉｒｒ＝３５０ｎｍ、およそ０．５ｍＷ／ｃｍ２）後の蛍光スペクトル（ｂ）、および光切断された色素を除去するために水で洗浄した後の蛍光スペクトル（ｃ）。
【図１３】
ヌクレオチドの３’−ＯＨをキャップするための合成スキーム。
【図１４】
ヌクレオチド中の３’−ＯＨを遊離させるための、ＭＯＭ基（上列）およびアリル基（下列）の化学的切断。ＣＩＴＭＳ＝クロロトリメチルシラン。
【図１５Ａ】
エネルギー転移共役系の例。ここで、ＦａｍまたはＣｙ２は、光吸収体（エネルギー転移供与体）として用いられ、Ｃｌ２Ｆａｍ、Ｃｌ２Ｒ６Ｇ、Ｃｌ２Ｔａｍ、またはＣｌ２Ｒｏｘは、エネルギー転移受容体として用いられる。Ｃｙ２，シアニン；ＦＡＭ，５−カルボキシフルオレセイン；Ｒ６Ｇ，６−カルボキシローダミン−６Ｇ；ＴＡＭ，Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−６−カルボキシローダミン；ＲＯＸ，６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン。
【図１５Ｂ】
エネルギー転移共役系の例。ここで、ＦａｍまたはＣｙ２は、光吸収体（エネルギー転移供与体）として用いられ、Ｃｌ２Ｆａｍ、Ｃｌ２Ｒ６Ｇ、Ｃｌ２Ｔａｍ、またはＣｌ２Ｒｏｘは、エネルギー転移受容体として用いられる。Ｃｙ２，シアニン；ＦＡＭ，５−カルボキシフルオレセイン；Ｒ６Ｇ，６−カルボキシローダミン−６Ｇ；ＴＡＭ，Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−６−カルボキシローダミン；ＲＯＸ，６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン。
【図１６】
光切断可能なエネルギー転移色素標識ヌクレオチドの合成。ＤＭＦ，ジメチルホルムアミド。ＤＥＣ＝１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド塩酸塩。Ｒ＝Ｈ、ＣＨ２ＯＣＨ３（ＭＯＭ）またはＣＨ２ＣＨ＝ＣＨ２（アリル）。
【図１７】
４つの質量タグ前駆体、および４つの光活性質量タグの構造。前駆体：ａ）アセトフェノン、ｂ）３−フルオロアセトフェノン、ｃ）３，４−ジフルオロアセトフェノン、およびｄ）３，４−ジメトキシアセトフェノン。４つの光活性質量タグを用いて、４つのヌクレオチド（Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ）のそれぞれの種別をコードする。
【図１８】
図１７に示す質量タグ前駆体の大気圧化学イオン化（ＡＰＣＩ）質量スペクトル。
【図１９】
合成アプローチによるシーケンシングで使用するための４つのヌクレオチド類縁体の構造例。ヌクレオチド類縁体はそれぞれ、光切断可能なリンカーにより塩基に結合された特有の質量タグを有しており、３’−ＯＨは、露出しているか、またはＭＯＭ基もしくはアリル基でキャップされている。角括弧は、質量タグが切断可能であることを示している。Ｒ＝Ｈ、ＣＨ２ＯＣＨ３（ＭＯＭ）またはＣＨ２ＣＨ＝ＣＨ２（アリル）。
【図２０】
質量タグの１つ（Ｔａｇ−３）のＮＨＳエステルの合成例。同様のスキームを用いて、他の質量タグを創出する。
【図２１】
ヌクレオチド類縁体体３’−ＲＯ−Ｇ−Ｔａｇ３の合成に関する代表的スキーム。同様のスキームを用いて、他の３つの修飾塩基：３’−ＲＯ−Ａ−Ｔａｇ１、３’−ＲＯ−Ｃ−Ｔａｇ２、３’−ＲＯ−Ｔ−Ｔａｇ４を創出することができる。（ｉ）テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０）；（ｉｉ）ＰＯＣｌ３、Ｂｎ４Ｎ＋ピロリン酸塩；（ｉｉｉ）ＮＨ４ＯＨ；（ｉｖ）Ｎａ２ＣＯ３／ＮａＨＣＯ３（ｐＨ＝９．０）／ＤＭＳＯ）。
【図２２】
光切断可能な質量タグを含有するＤＮＡの予測光切断産物の例。
【図２３】
並行した複数チャネルおよび並行した複数質量分析計を含むＤＮＡシーケンシング用システム。例は、シリカガラスチップ内の９６チャネルを示す。
【図２４】
ＤＮＡシーケンシング用の並行質量分析システム。例は、並行した３つの質量分析計を示す。試料をイオン源に注入し、そこで試料は、ネブライザーガスと混合されて、イオン化される。ターボ式ポンプを用いて、イオン源から生じるラジカル、中性化合物および他の望ましくない要素を連続して一掃する。第２のターボ式ポンプを用いて、３つ全ての分析器および検出器に同時に連続真空を発生させる。次に、取得したシグナルを、Ａ／Ｄ変換器でデジタル信号に変換する。続いて、３つ全ての信号をデータ取得プロセッサに送り、信号を変換して、注入試料中の質量タグを特定し、したがってヌクレオチド配列を特定する。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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2004510433.tif 000168
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