(57)【要約】癌（例えば、肺癌）の治療および診断のための組成物および方法が開示される。組成物は、１つ以上の肺腫瘍タンパク質、その免疫原性部分、またはこのような部分をコードするポリヌクレオチドを含み得る。あるいは、治療用組成物は、肺腫瘍タンパク質を発現する抗原提示細胞、またはこのようなタンパク質を発現する細胞に特異的なＴ細胞を含み得る。このような組成物は、例えば、肺癌のような疾患の予防および処置のために用いられ得る。サンプルにおける、肺腫瘍タンパク質、またはこのようなタンパク質をコードするｍＲＮＡを検出する工程に基づく診断方法がまた提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離されたポリヌクレオチドであって、該ポリヌクレオチドは、以下：
（ａ）配列番号１〜４５１、４５３、および４５８に提供される配列；
（ｂ）配列番号１〜４５１、４５３、および４５８に提供される配列の相補体；
（ｃ）配列番号１〜４５１、４５３、および４５８に提供される配列の少なくとも２０個連続する残基からなる配列；
（ｄ）配列番号１〜４５１、４５３、および４５８に提供される配列に中程度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列；
（ｅ）配列番号１〜４５１、４５３、および４５８の配列に少なくとも７５％の同一性を有する配列；
（ｆ）配列番号１〜４５１、４５３、および４５８の配列に少なくとも９０％の同一性を有する配列；ならびに
（ｇ）配列番号１〜４５１、４５３、および４５８に提供される配列の縮重改変体、
からなる群より選択される配列を含む、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項２】
単離されたポリペプチドであって、該ポリペプチドは、以下：
（ａ）請求項１のポリヌクレオチドによってコードされる配列；
（ｂ）請求項１に記載のポリヌクレオチドによってコードされる配列に少なくとも７０％の同一性を有する配列；
（ｃ）請求項１に記載のポリヌクレオチドによってコードされる配列に少なくとも９０％の同一性を有する配列；
（ｄ）配列番号４５２、４５４、４５７、および４５９〜４７３；
（ｅ）配列番号４５２、４５４、４５７、および４５９〜４７３によってコードされる配列に少なくとも７０％同一性を有する配列；ならびに
（ｆ）配列番号４５２、４５４、４５７、および４５９〜４７３によってコードされる配列に少なくとも９０％同一性を有する配列、
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチド。
【請求項３】
発現制御配列に作動可能に連結された請求項１に記載のポリヌクレオチドを含む、発現ベクター。
【請求項４】
請求項３に記載の発現べクターで形質転換またはトランスフェクトされた、宿主細胞。
【請求項５】
請求項２に記載のポリペプチドに特異的に結合する、単離された抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項６】
患者における癌の存在を検出するための方法であって、該方法は、以下の工程：
（ａ）該患者から生物学的サンプルを得る工程；
（ｂ）請求項２に記載のポリペプチドに結合する結合因子と該生物学的サンプルを接触させる工程；
（ｃ）該結合因子に結合するポリペプチドの量を該サンプル中で検出する工程；および
（ｄ）該ポリペプチドの量を、所定のカットオフ値と比較し、そして、それから、該患者における癌の存在を決定する工程、
を包含する、方法。
【請求項７】
請求項２に記載の少なくとも１つのポリペプチドを含む、融合タンパク質。
【請求項８】
配列番号１〜４５１、４５３、および４５８に示される配列に中程度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、オリゴヌクレオチド。
【請求項９】
腫瘍タンパク質に特異的なＴ細胞を刺激および／または拡大するための方法であって、該方法は、以下：
（ａ）請求項２に記載のポリペプチド；
（ｂ）請求項１に記載のポリヌクレオチド；および
（ｃ）請求項２に記載のポリペプチドを発現する抗原提示細胞、
からなる群より選択される少なくとも１つの成分と、Ｔ細胞を、Ｔ細胞の刺激および／または拡大を可能にするのに十分な条件下および時間で接触させる工程、を包含する、方法。
【請求項１０】
請求項９に記載の方法に従って調製されたＴ細胞を含む、単離されたＴ細胞集団。
【請求項１１】
第１の成分および第２の成分を含む組成物であって、該第１の成分は、生理学的に受容可能なキャリアおよび免疫刺激剤からなる群より選択され、そして該第２の成分は、以下：
（ａ）請求項２に記載のポリペプチド；
（ｂ）請求項１に記載のポリヌクレオチド；
（ｃ）請求項５に記載の抗体；
（ｄ）請求項７に記載の融合タンパク質；
（ｅ）請求項１０に記載のＴ細胞集団；および
（ｆ）請求項２に記載のポリペプチドを発現する抗原提示細胞、
からなる群より選択される、組成物。
【請求項１２】
請求項１１に記載の組成物を患者に投与する工程を包含する、該患者における免疫応答を刺激するための方法。
【請求項１３】
請求項１１に記載の組成物を患者に投与する工程を包含する、該患者における癌の処置のための方法。
【請求項１４】
患者における癌の存在を決定するための方法であって、該方法は、以下の工程：
（ａ）該患者から生物学的サンプルを得る工程；
（ｂ）請求項８に記載のオリゴヌクレオチドと該生物学的サンプルを接触させる工程；
（ｃ）該オリゴヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドの量を該サンプル中で検出する工程；および
（ｄ）該オリゴヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドの量を、所定のカットオフ値と比較し、そして、それから、該患者における癌の存在を決定する工程、
を包含する、方法。
【請求項１５】
請求項８に記載の少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを備える、診断キット。
【請求項１６】
請求項５に記載の少なくとも１つの抗体および検出試薬を備える診断キットであって、該検出試薬がレポーター基を含む、診断キット。
【請求項１７】
患者における癌の発生を阻害するための方法であって、該方法は、以下の工程：
（ａ）Ｔ細胞が増殖するように、患者から単離されたＣＤ４＋  Ｔ細胞および／またはＣＤ８＋  Ｔ細胞を、以下：
（ｉ）請求項２に記載のポリペプチド；
（ｉｉ）請求項１に記載のポリヌクレオチド；および
（ｉｉｉ）請求項２に記載のポリペプチドを発現する抗原提示細胞、
からなる群より選択される少なくとも１つの成分と共にインキュベートする工程；
（ｂ）有効量の該増殖したＴ細胞を該患者に投与する工程、
を包含し、
それにより、該患者における癌の発生を阻害する、方法。
【請求項１８】
前記融合タンパク質が、配列番号４５７に提供されるアミノ酸配列を含む、請求項７に記載の融合タンパク質。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（本発明の技術分野）
本発明は、一般に、癌（例えば、肺癌）の治療および診断に関する。本発明は、より具体的には、肺腫瘍タンパク質の少なくとも１部を含むポリペプチド、およびこのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに関する。このようなポリペプチドおよびポリヌクレオチドは、肺癌の予防および処置のためのワクチンおよび薬学的組成物において、ならびにこのような癌の診断およびモニタリングのために、使用され得る。
【０００２】
（発明の背景）
癌は、世界中の重大な健康の問題である。癌の検出および治療において進歩はあったが、予防および処置のためのワクチンまたは他の普遍的に成功する方法は、現在利用可能でない。
【０００３】
肺癌は、米国における男性および女性の両方における癌での死亡の主な原因である。全ての肺癌患者における５年間の生存率は、診断時における疾患の病期に関わらず、１３％に過ぎない。これは、この疾患が局在されたままで検出される症例における４６％の５年間生存率とは対照的である。しかし、肺癌が広がる前に発見されるのはこの疾患の１６％に過ぎない。
【０００４】
早期発見は難しい。なぜなら、臨床症状は、この疾患が進行した病期に達するまでしばしばみられないからである。現在のところ、診断は、胸部Ｘ線、痰に含まれる細胞型の分析、および気管支道の光ファイバー試験の使用により補助される。処置の養生法は、癌の型および病期により決定され、そして手術、放射線治療および／または化学療法を含む。
【０００５】
この癌および他の癌の治療へのかなりの研究にも関わらず、肺は、診断および効果的に処置することが困難なままである。従って、当該分野において、このような癌を検出および処置するための改良された方法への必要性が残っている。本発明は、これらの必要を満たし、そしてさらに他の関連する利点を提供する。
【０００６】
（発明の要旨）
手短に述べると、本発明は、癌（例えば、肺癌）の診断および治療のための組成物および方法を提供する。第１の局面において、本発明は、肺腫瘍タンパク質またはその改変体の少なくとも１部を含むポリペプチドを提供する。特定の部分および他の改変体は免疫原性であり、その結果、この改変体が抗原特異的抗血清と反応する能力は、実質的に減少しない。特定の実施形態において、そのポリペプチドは、以下からなる群から選択されるアミノ酸を含む：（ａ）配列番号４５２、４５４、４５７、および４５９〜４７３；（ｂ）配列番号１〜４５１、４５３、４５５〜４５６、および４５８において列挙されたポリヌクレオチド配列によってコードされる配列；（ｃ）配列番号１〜４５１、４５３、４５５〜４５６、および４５８に列挙される配列の改変体；ならびに（ｄ）（ａ）または（ｂ）の配列の相補体。
【０００７】
本発明はさらに、上記のポリペプチドまたはその一部（例えば、肺腫瘍タンパク質の少なくとも１５のアミノ酸残基をコードする一部分）をコードするポリヌクレオチド、このようなポリヌクレオチドを含む発現ベクター、ならびにこのような発現ベクターで形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞を提供する。
【０００８】
他の局面において、本発明は、上記のポリペプチドまたはポリヌクレオチド、および薬学的に受容可能なキャリアを含む薬学的組成物を提供する。
【０００９】
本発明の関連する局面において、予防的または治療的使用のためのワクチンが提供される。このようなワクチンは、上記のポリペプチドまたはポリヌクレオチドおよび免疫刺激剤を含む。
【００１０】
本発明はさらに、以下を含む薬学的組成物を提供する：（ａ）肺腫瘍タンパク質に特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメント；および（ｂ）生理学的に受容可能なキャリア。
【００１１】
さらなる局面において、本発明は、以下を含む薬学的組成物を提供する：（ａ）上記のポリペプチドを発現する抗原提示細胞、および（ｂ）薬学的に受容可能なキャリアまたは賦形剤。抗原提示細胞としては、樹状細胞、マクロファージ、単球、線維芽細胞およびＢ細胞が挙げられる。
【００１２】
関連する局面において、以下を含むワクチンが提供される：（ａ）上記のようなポリペプチドを発現する抗原提示細胞、および（ｂ）免疫刺激剤。
【００１３】
本発明はさらに、他の局面において、上記の少なくとも１つのポリペプチドを含む融合タンパク質、ならびにこのような融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを提供する。
【００１４】
関連する局面において、融合タンパク質、融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む薬学的組成物は、生理学的に受容可能なキャリアと組み合わされて提供される。
【００１５】
他の局面において、融合タンパク質または融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むワクチンは、免疫刺激剤と組み合わされてさらに提供される。
【００１６】
さらなる局面において、本発明は、患者における癌の発生を阻害する方法を提供し、この方法は、上に列挙された薬学的組成物またはワクチンを、患者に投与する工程を包含する。患者が肺癌に冒され得る場合、この方法は、この疾患を処置するために提供され得るか、またはこのような疾患の危険があると考えられる患者は、予防的に処置され得る。
【００１７】
本発明はさらに、他の局面において、生物学的サンプルから腫瘍細胞を除去する方法を提供し、その方法は、生物学的サンプルを、肺癌腫瘍タンパク質と特異的に反応するＴ細胞と接触させる工程を包含する。ここで接触させる工程は、サンプルから、タンパク質を発現する細胞の除去を可能にするための十分な条件および時間で行われる。
【００１８】
関連する局面において、患者における癌の発生を阻害する方法が提供され、この方法は、上記のように処置された生物学的サンプルを、患者に投与する工程を包含する。
【００１９】
他の局面において、肺腫瘍タンパク質に特異的なＴ細胞を刺激および／または拡大するための方法がさらに提供され、この方法は、Ｔ細胞の刺激および／または拡大を可能にするのに十分な条件および時間の下で、Ｔ細胞を、以下の１つ以上と接触させる工程を包含する：（ｉ）上記のポリペプチド；（ｉｉ）このようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；および／または（ｉｉｉ）このようなポリペプチドを発現する抗原提示細胞。上記のように調製されたＴ細胞を含む単離されたＴ細胞集団はまた、提供される。
【００２０】
さらなる局面において、本発明は、患者における癌の発生を阻害するための方法を提供し、この方法は、有効量の上記のＴ細胞集団を、患者に投与する工程を包含する。
【００２１】
本発明は、さらに、患者における癌の発生を阻害する方法を提供し、この方法は以下の工程を包含する：（ａ）患者から単離されたＣＤ４＋Ｔ細胞および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞を、以下の１以上とともにインキュベートする工程：（ｉ）肺腫瘍タンパク質の少なくとも免疫原性部分を含むポリペプチド；（ｉｉ）このようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；および（ｉｉｉ）このようなポリヌクレオチドを発現する抗原提示細胞；ならびに（ｂ）有効量の増殖したＴ細胞を患者に投与し、そしてそれによって患者における癌の発生を阻害する工程。増殖した細胞は、患者への投与の前にクローン化され得るが、それは必要ではない。
【００２２】
さらなる局面において、本発明は、患者における癌の存在または非存在を決定する方法を提供し、この方法は、以下の工程を包含する：（ａ）患者から得られた生物学的サンプルを、上に列挙されたポリペプチドに結合する結合因子と接触させる工程；（ｂ）結合因子に結合するポリペプチドのサンプル中の量を検出する工程；および（ｃ）このポリペプチドの量を、予め決定されたカットオフ値と比較し、それから患者における癌の存在または非存在を決定する工程。好ましい実施形態において、結合因子は、抗体、より好ましくはモノクローナル抗体である。癌は、肺癌であり得る。
【００２３】
本発明はまた、他の局面において、患者における癌の進行をモニタリングする方法を提供する。このような方法は、以下の工程を包含する：（ａ）第１の時点で、患者より得た生物学的サンプルを、上に列挙されたポリペプチドに結合する結合因子と接触させる工程；（ｂ）結合因子に結合するポリペプチドのサンプル中の量を検出する工程；（ｃ）続く時点で、患者より得た生物学的サンプルを使用して、工程（ａ）および（ｂ）を反復する工程；ならびに（ｄ）工程（ｃ）で検出されたポリペプチドの量を、工程（ｂ）で検出された量と比較し、そしてそれから、患者における癌の進行をモニタリングする工程。
【００２４】
本発明は、他の局面において、患者における癌の存在または非存在を検出する方法をさらに提供し、その方法は、以下の工程を包含する：（ａ）患者から得られた生物学的サンプルを、肺腫瘍タンパク質をコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズするオリゴヌクレオチドと接触させる工程；（ｂ）オリゴヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチド、好ましくはｍＲＮＡ、のサンプル中のレベルを検出する工程；および（ｃ）このオリゴヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドのレベルを、予め決められたカットオフ値と比較し、それから患者における癌の存在または非存在を決定する工程。特定の実施形態において、ｍＲＮＡの量は、例えば、少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプライマー（上に列挙されたポリペプチドをコードするポリヌクレオチドまたはこのようなポリヌクレオチドの相補体にハイブリダイズする）を使用するポリメラーゼ連鎖反応を通じて検出される。他の実施形態において、ｍＲＮＡの量は、上記のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドまたはそのようなポリヌクレオチドの相補体にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブを使用してハイブリダイゼーション技術を使用して検出される。
【００２５】
関連する局面において、患者における癌の進行をモニタリングする方法を提供し、この方法は以下の工程を包含する：（ａ）患者から得られた生物学的サンプルを、肺腫瘍タンパク質をコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズするオリゴヌクレオチドと接触させる工程；（ｂ）オリゴヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドのサンプル中の量を検出する工程；（ｃ）続く時点で、患者より得られた生物学的サンプルを使用して、工程（ａ）および（ｂ）を反復する工程；ならびに（ｄ）工程（ｃ）で検出されたポリヌクレオチドの量を、工程（ｂ）で検出された量と比較し、それから患者における癌の進行をモニタリングする工程。
【００２６】
さらなる局面において、本発明は、上記のようにポリペプチドに結合するモノクローナル抗体のような抗体、ならびにそのような抗体を備える診断キットを提供する。上記のような１以上のオリゴヌクレオチドプローブまたはプライマーを供える診断キットもまた、提供される。
【００２７】
本発明のこれらの局面および他の局面は、以下の詳細な説明を参照すれば明確になる。本明細書中に開示されるすべての参考文献は、各々が個別に援用されるように、そのすべてが本明細書中で参考として援用される。
【００２８】
（配列識別子）
配列番号１は、Ｒ０１１９：Ａ０２について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【００２９】
配列番号２は、Ｒ０１１９：Ａ０６について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【００３０】
配列番号３は、Ｒ０１１９：Ａ０９について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【００３１】
配列番号４は、Ｒ０１１９：Ａ１０について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【００３２】
配列番号５は、Ｒ０１１９：Ａ１２について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【００３３】
配列番号６は、Ｒ０１１９：Ｂ０２について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【００３４】
配列番号７は、Ｒ０１１９：Ｂ０４について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【００３５】
配列番号８は、Ｒ０１１９：Ｂ１０について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【００３６】
配列番号９は、Ｒ０１１９：Ｃ１２について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【００３７】
配列番号１０は、Ｒ０１１９：Ｄ０２について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【００３８】
配列番号１１は、Ｒ０１１９：Ｄ０６について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【００３９】
配列番号１２は、Ｒ０１１９：Ｄ０９について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【００４０】
配列番号１３は、Ｒ０１１９：Ｄ１１ついて決定されたｃＤＮＡ配列である。
【００４１】
配列番号１４は、Ｒ０１１９：Ｄ１２について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【００４２】
配列番号１５は、Ｒ０１１９：Ｅ０２について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【００４３】
配列番号１６は、Ｒ０１１９：Ｅ０４について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【００４４】
配列番号１７は、Ｒ０１１９：Ｅ０５について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【００４５】
配列番号１８は、Ｒ０１１９：Ｅ１２について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【００４６】
配列番号１９は、Ｒ０１１９：Ｆ０１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【００４７】
配列番号２０は、Ｒ０１１９：Ｆ０７について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【００４８】
配列番号２１は、Ｒ０１１９：Ｆ０８について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【００４９】
配列番号２２は、Ｒ０１１９：Ｆ０９について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【００５０】
配列番号２３は、Ｒ０１１９：Ｆ１０について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【００５１】
配列番号２４は、Ｒ０１１９：Ｆ１１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【００５２】
配列番号２５は、Ｒ０１１９：Ｆ１２について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【００５３】
配列番号２６は、Ｒ０１１９：Ｇ０７について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【００５４】
配列番号２７は、Ｒ０１１９：Ｇ１０について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【００５５】
配列番号２８は、Ｒ０１１９：Ｈ０９について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【００５６】
配列番号２９は、Ｒ０１２０：Ａ０２について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【００５７】
配列番号３０は、Ｒ０１２０：Ａ０５について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【００５８】
配列番号３１は、Ｒ０１２０：Ａ０６について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【００５９】
配列番号３２は、Ｒ０１２０：Ａ０９について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【００６０】
配列番号３３は、Ｒ０１２０：Ａ１０について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【００６１】
配列番号３４は、Ｒ０１２０：Ａ１２について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【００６２】
配列番号３５は、Ｒ０１２０：Ｂ０２について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【００６３】
配列番号３６は、Ｒ０１２０：Ｂ０７について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【００６４】
配列番号３７は、Ｒ０１２０：Ｂ０８について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【００６５】
配列番号３８は、Ｒ０１２０：Ｂ１０について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【００６６】
配列番号３９は、Ｒ０１２０：Ｃ０３について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【００６７】
配列番号４０は、Ｒ０１２０：Ｃ０６について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【００６８】
配列番号４１は、Ｒ０１２０：Ｃ１２について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【００６９】
配列番号４２は、Ｒ０１２０：Ｄ０１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【００７０】
配列番号４３は、Ｒ０１２０：Ｄ０２について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【００７１】
配列番号４４は、Ｒ０１２０：Ｄ０３について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【００７２】
配列番号４５は、Ｒ０１２０：Ｄ０５について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【００７３】
配列番号４６は、Ｒ０１２０：Ｄ０６について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【００７４】
配列番号４７は、Ｒ０１２０：Ｄ０７について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【００７５】
配列番号４８は、Ｒ０１２０：Ｄ１１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【００７６】
配列番号４９は、Ｒ０１２０：Ｄ１２について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【００７７】
配列番号５０は、Ｒ０１２０：Ｅ０５について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【００７８】
配列番号５１は、Ｒ０１２０：Ｅ０７について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【００７９】
配列番号５２は、Ｒ０１２０：Ｅ１２について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【００８０】
配列番号５３は、Ｒ０１２０：Ｆ０２について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【００８１】
配列番号５４は、Ｒ０１２０：Ｆ０４について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【００８２】
配列番号５５は、Ｒ０１２０：Ｆ０７について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【００８３】
配列番号５６は、Ｒ０１２０：Ｆ１１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【００８４】
配列番号５７は、Ｒ０１２０：Ｇ０１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【００８５】
配列番号５８は、Ｒ０１２０：Ｇ０８について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【００８６】
配列番号５９は、Ｒ０１２０：Ｈ０９について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【００８７】
配列番号６０は、Ｒ０１２０：Ｈ１０について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【００８８】
配列番号６１は、Ｒ０１２１：Ａ０２について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【００８９】
配列番号６２は、Ｒ０１２１：Ａ１１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【００９０】
配列番号６３は、Ｒ０１２１：Ｂ０１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【００９１】
配列番号６４は、Ｒ０１２１：Ｂ０３について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【００９２】
配列番号６５は、Ｒ０１２１：Ｂ０４について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【００９３】
配列番号６６は、Ｒ０１２１：Ｃ０５について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【００９４】
配列番号６７は、Ｒ０１２１：Ｃ０６について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【００９５】
配列番号６８は、Ｒ０１２１：Ｄ０２について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【００９６】
配列番号６９は、Ｒ０１２１：Ｄ１１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【００９７】
配列番号７０は、Ｒ０１２１：Ｅ０５について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【００９８】
配列番号７１は、Ｒ０１２１：Ｅ０９について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【００９９】
配列番号７２は、Ｒ０１２１：Ｅ１２について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０１００】
配列番号７３は、Ｒ０１２１：Ｆ０２について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０１０１】
配列番号７４は、Ｒ０１２１：Ｆ０７について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０１０２】
配列番号７５は、Ｒ０１２１：Ｇ０３について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０１０３】
配列番号７６は、Ｒ０１２１：Ｇ０５について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０１０４】
配列番号７７は、Ｒ０１２１：Ｈ０２について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０１０５】
配列番号７８は、Ｒ０１２１：Ｈ０５について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０１０６】
配列番号７９は、Ｒ０１２１：Ｇ０８について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０１０７】
配列番号８０は、Ｒ０１２２：Ａ０３について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０１０８】
配列番号８１は、Ｒ０１２２：Ａ０６について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０１０９】
配列番号８２は、Ｒ０１２２：Ａ０９について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０１１０】
配列番号８３は、Ｒ０１２２：Ｂ０２について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０１１１】
配列番号８４は、Ｒ０１２２：Ｂ０６について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０１１２】
配列番号８５は、Ｒ０１２２：Ｂ０９について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０１１３】
配列番号８６は、Ｒ０１２２：Ｂ１０について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０１１４】
配列番号８７は、Ｒ０１２２：Ｃ０２について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０１１５】
配列番号８８は、Ｒ０１２２：Ｃ０３について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０１１６】
配列番号８９は、Ｒ０１２２：Ｃ０５について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０１１７】
配列番号９０は、Ｒ０１２２：Ｃ０７について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０１１８】
配列番号９１は、Ｒ０１２２：Ｃ１０について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０１１９】
配列番号９２は、Ｒ０１２２：Ｃ１１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０１２０】
配列番号９３は、Ｒ０１２２：Ｄ０５について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０１２１】
配列番号９４は、Ｒ０１２２：Ｄ０６について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０１２２】
配列番号９５は、Ｒ０１２２：Ｄ０７について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０１２３】
配列番号９６は、Ｒ０１２２：Ｅ０３について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０１２４】
配列番号９７は、Ｒ０１２２：Ｇ０２について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０１２５】
配列番号９８は、Ｒ０１２２：Ｆ０３について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０１２６】
配列番号９９は、Ｒ０１２２：Ｆ０５について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０１２７】
配列番号１００は、Ｒ０１２２：Ｆ０７について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０１２８】
配列番号１０１は、Ｒ０１２２：Ｆ０８について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０１２９】
配列番号１０２は、Ｒ０１２２：Ｆ０９について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０１３０】
配列番号１０３は、Ｒ０１２２：Ｆ１０について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０１３１】
配列番号１０４は、Ｒ０１２２：Ｇ０５について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０１３２】
配列番号１０５は、Ｒ０１２２：Ｇ０６について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０１３３】
配列番号１０６は、Ｒ０１２２：Ｇ０８について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０１３４】
配列番号１０７は、Ｒ０１２２：Ｇ０９について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０１３５】
配列番号１０８は、Ｒ０１２２：Ｇ１０について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０１３６】
配列番号１０９は、Ｒ０１２２：Ｇ１１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０１３７】
配列番号１１０は、Ｒ０１２２：Ｇ１２について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０１３８】
配列番号１１１は、Ｒ０１２２：Ｈ０２について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０１３９】
配列番号１１２は、Ｒ０１２２：Ｈ０３について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０１４０】
配列番号１１３は、Ｒ０１２２：Ｈ０６について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０１４１】
配列番号１１４は、Ｒ０１２２：Ｈ０７について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０１４２】
配列番号１１５は、Ｒ０１２２：Ｈ０８について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０１４３】
配列番号１１６は、Ｒ０１２２：Ｈ０９について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０１４４】
配列番号１１７は、Ｒ０１２３：Ａ０２について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０１４５】
配列番号１１８は、Ｒ０１２３：Ａ０９について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０１４６】
配列番号１１９は、Ｒ０１２３：Ｂ０３について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０１４７】
配列番号１２０は、Ｒ０１２３：Ｂ０４について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０１４８】
配列番号１２１は、Ｒ０１２３：Ｂ０７について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０１４９】
配列番号１２２は、Ｒ０１２３：Ｂ０８について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０１５０】
配列番号１２３は、Ｒ０１２３：Ｃ０３について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０１５１】
配列番号１２４は、Ｒ０１２３：Ｃ０４について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０１５２】
配列番号１２５は、Ｒ０１２３：Ｃ０７について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０１５３】
配列番号１２６は、Ｒ０１２３：Ｄ０３について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０１５４】
配列番号１２７は、Ｒ０１２３：Ｄ０５について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０１５５】
配列番号１２８は、Ｒ０１２３：Ｄ０７について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０１５６】
配列番号１２９は、Ｒ０１２３：Ｄ０９について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０１５７】
配列番号１３０は、Ｒ０１２３：Ｄ１０について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０１５８】
配列番号１３１は、Ｒ０１２３：Ｅ０４について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０１５９】
配列番号１３２は、Ｒ０１２３：Ｆ０１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０１６０】
配列番号１３３は、Ｒ０１２３：Ｆ０３について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０１６１】
配列番号１３４は、Ｒ０１２３：Ｆ０４について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０１６２】
配列番号１３５は、Ｒ０１２３：Ｆ１０について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０１６３】
配列番号１３６は、Ｒ０１２３：Ｇ０３について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０１６４】
配列番号１３７は、Ｒ０１２３：Ｇ１１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０１６５】
配列番号１３８は、Ｒ０１２３：Ｈ０４について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０１６６】
配列番号１３９は、Ｒ０１２３：Ｈ０５について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０１６７】
配列番号１４０は、Ｒ０１２３：Ｈ０８について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０１６８】
配列番号１４１は、Ｒ０１２３：Ｈ０９について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０１６９】
配列番号１４２は、Ｒ０１２３：ＨＨ１１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０１７０】
配列番号１４３は、Ｒ０１２４：Ａ０６について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０１７１】
配列番号１４４は、Ｒ０１２４：Ａ０７について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０１７２】
配列番号１４５は、Ｒ０１２４：Ａ０９について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０１７３】
配列番号１４６は、Ｒ０１２４：Ｂ０２について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０１７４】
配列番号１４７は、Ｒ０１２４：Ｂ０６について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０１７５】
配列番号１４８は、Ｒ０１２４：Ｂ０７について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０１７６】
配列番号１４９は、Ｒ０１２４：Ｂ０８について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０１７７】
配列番号１５０は、Ｒ０１２４：Ｃ０２について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０１７８】
配列番号１５１は、Ｒ０１２４：Ｃ０４について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０１７９】
配列番号１５２は、Ｒ０１２４：Ｃ０６について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０１８０】
配列番号１５３は、Ｒ０１２４：Ｃ０７について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０１８１】
配列番号１５４は、Ｒ０１２４：Ｄ０２について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０１８２】
配列番号１５５は、Ｒ０１２４：Ｄ１０について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０１８３】
配列番号１５６は、Ｒ０１２４：Ｅ０３について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０１８４】
配列番号１５７は、Ｒ０１５９：Ａ０２について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０１８５】
配列番号１５８は、Ｒ０１５９：Ａ０３について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０１８６】
配列番号１５９は、Ｒ０１５９：Ａ０６について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０１８７】
配列番号１６０は、Ｒ０１５９：Ａ０７について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０１８８】
配列番号１６１は、Ｒ０１５９：Ａ０９について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０１８９】
配列番号１６２は、Ｒ０１５９：Ａ１０について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０１９０】
配列番号１６３は、Ｒ０１５９：Ａ１１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０１９１】
配列番号１６４は、Ｒ０１５９：Ａ１２について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０１９２】
配列番号１６５は、Ｒ０１５９：Ｂ０１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０１９３】
配列番号１６６は、Ｒ０１５９：Ｂ０２について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０１９４】
配列番号１６７は、Ｒ０１５９：Ｂ０３について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０１９５】
配列番号１６８は、Ｒ０１５９：Ｂ０４について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０１９６】
配列番号１６９は、Ｒ０１５９：Ｂ０５について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０１９７】
配列番号１７０は、Ｒ０１５９：Ｂ０８について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０１９８】
配列番号１７１は、Ｒ０１５９：Ｂ１１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０１９９】
配列番号１７２は、Ｒ０１５９：Ｃ０２について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０２００】
配列番号１７３は、Ｒ０１５９：Ｃ０５について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０２０１】
配列番号１７４は、Ｒ０１５９：Ｃ０９について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０２０２】
配列番号１７５は、Ｒ０１５９：Ｃ１０について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０２０３】
配列番号１７６は、Ｒ０１５９：Ｄ０４について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０２０４】
配列番号１７７は、Ｒ０１５９：Ｄ０９について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０２０５】
配列番号１７８は、Ｒ０１５９：Ｄ１０について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０２０６】
配列番号１７９は、Ｒ０１５９：Ｄ１１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０２０７】
配列番号１８０は、Ｒ０１５９：Ｅ０５について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０２０８】
配列番号１８１は、Ｒ０１５９：Ｅ０８について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０２０９】
配列番号１８２は、Ｒ０１５９：Ｆ０３について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０２１０】
配列番号１８３は、Ｒ０１５９：Ｆ０８について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０２１１】
配列番号１８４は、Ｒ０１５９：Ｆ１０について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０２１２】
配列番号１８５は、Ｒ０１５９：Ｆ１１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０２１３】
配列番号１８６は、Ｒ０１５９：Ｆ１２について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０２１４】
配列番号１８７は、Ｒ０１５９：Ｇ０１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０２１５】
配列番号１８８は、Ｒ０１５９：Ｇ０３について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０２１６】
配列番号１８９は、Ｒ０１５９：Ｇ０６について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０２１７】
配列番号１９０は、Ｒ０１５９：Ｇ０８について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０２１８】
配列番号１９１は、Ｒ０１５９：Ｇ０９について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０２１９】
配列番号１９２は、Ｒ０１５９：Ｇ１０について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０２２０】
配列番号１９３は、Ｒ０１５９：Ｇ１２について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０２２１】
配列番号１９４は、Ｒ０１５９：Ｈ０１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０２２２】
配列番号１９５は、Ｒ０１５９：Ｈ０２について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０２２３】
配列番号１９６は、Ｒ０１５９：Ｈ０７について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０２２４】
配列番号１９７は、Ｒ０１５９：Ｈ０８について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０２２５】
配列番号１９８は、Ｒ０１６０：Ａ０２について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０２２６】
配列番号１９９は、Ｒ０１６０：Ａ０３について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０２２７】
配列番号２００は、Ｒ０１６０：Ａ０９について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０２２８】
配列番号２０１は、Ｒ０１６０：Ｂ０３について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０２２９】
配列番号２０２は、Ｒ０１６０：Ｂ０５について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０２３０】
配列番号２０３は、Ｒ０１６０：Ｂ０６について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０２３１】
配列番号２０４は、Ｒ０１６０：Ｂ１０について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０２３２】
配列番号２０５は、Ｒ０１６０：Ｃ０１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０２３３】
配列番号２０６は、Ｒ０１６０：Ｃ０２について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０２３４】
配列番号２０７は、Ｒ０１６０：Ｃ０３について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０２３５】
配列番号２０８は、Ｒ０１６０：Ｃ０６について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０２３６】
配列番号２０９は、Ｒ０１６０：Ｃ１１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０２３７】
配列番号２１０は、Ｒ０１６０：Ｄ０３について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０２３８】
配列番号２１１は、Ｒ０１６０：Ｄ０５について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０２３９】
配列番号２１２は、Ｒ０１６０：Ｄ０６について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０２４０】
配列番号２１３は、Ｒ０１６０：Ｅ０５について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０２４１】
配列番号２１４は、Ｒ０１６０：Ｅ１０について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０２４２】
配列番号２１５は、Ｒ０１６０：Ｅ１１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０２４３】
配列番号２１６は、Ｒ０１６０：Ｆ０２について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０２４４】
配列番号２１７は、Ｒ０１６０：Ｆ０５について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０２４５】
配列番号２１８は、Ｒ０１６０：Ｇ０１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０２４６】
配列番号２１９は、Ｒ０１６０：Ｇ０５について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０２４７】
配列番号２２０は、Ｒ０１６０：Ｇ０６について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０２４８】
配列番号２２１は、Ｒ０１６０：Ｇ０７について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０２４９】
配列番号２２２は、Ｒ０１６０：Ｈ０１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０２５０】
配列番号２２３は、Ｒ０１６０：Ｈ０４について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０２５１】
配列番号２２４は、Ｒ０１６０：Ｈ０６について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０２５２】
配列番号２２５は、Ｒ０１６１：Ａ０５について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０２５３】
配列番号２２６は、Ｒ０１６１：Ａ０６について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０２５４】
配列番号２２７は、Ｒ０１６１：Ａ０８について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０２５５】
配列番号２２８は、Ｒ０１６１：Ａ０９について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０２５６】
配列番号２２９は、Ｒ０１６１：Ａ１１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０２５７】
配列番号２３０は、Ｒ０１６１：Ａ１２について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０２５８】
配列番号２３１は、Ｒ０１６１：Ｂ０１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０２５９】
配列番号２３２は、Ｒ０１６１：Ｂ０４について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０２６０】
配列番号２３３は、Ｒ０１６１：Ｂ０６について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０２６１】
配列番号２３４は、Ｒ０１６１：Ｂ０７について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０２６２】
配列番号２３５は、Ｒ０１６１：Ｂ１１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０２６３】
配列番号２３６は、Ｒ０１６１：Ｂ１２について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０２６４】
配列番号２３７は、Ｒ０１６１：Ｃ０１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０２６５】
配列番号２３８は、Ｒ０１６１：Ｃ０４について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０２６６】
配列番号２３９は、Ｒ０１６１：Ｃ０５について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０２６７】
配列番号２４０は、Ｒ０１６１：Ｃ０８について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０２６８】
配列番号２４１は、Ｒ０１６１：Ｃ０９について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０２６９】
配列番号２４２は、Ｒ０１６１：Ｃ１０について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０２７０】
配列番号２４３は、Ｒ０１６１：Ｃ１１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０２７１】
配列番号２４４は、Ｒ０１６１：Ｃ１２について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０２７２】
配列番号２４５は、Ｒ０１６１：Ｄ０２について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０２７３】
配列番号２４６は、Ｒ０１６１：Ｄ０３について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０２７４】
配列番号２４７は、Ｒ０１６１：Ｄ０４について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０２７５】
配列番号２４８は、Ｒ０１６１：Ｄ０５について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０２７６】
配列番号２４９は、Ｒ０１６１：Ｄ０８について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０２７７】
配列番号２５０は、Ｒ０１６１：Ｄ０９について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０２７８】
配列番号２５１は、Ｒ０１６１：Ｅ０２について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０２７９】
配列番号２５２は、Ｒ０１６１：Ｅ０３について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０２８０】
配列番号２５３は、Ｒ０１６１：Ｅ０４について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０２８１】
配列番号２５４は、Ｒ０１６１：Ｅ０５について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０２８２】
配列番号２５５は、Ｒ０１６１：Ｅ０６について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０２８３】
配列番号２５６は、Ｒ０１６１：Ｅ０７について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０２８４】
配列番号２５７は、Ｒ０１６１：Ｅ０８について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０２８５】
配列番号２５８は、Ｒ０１６１：Ｅ１０について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０２８６】
配列番号２５９は、Ｒ０１６１：Ｅ１２について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０２８７】
配列番号２６０は、Ｒ０１６１：Ｆ０１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０２８８】
配列番号２６１は、Ｒ０１６１：Ｆ０３について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０２８９】
配列番号２６２は、Ｒ０１６１：Ｆ０４について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０２９０】
配列番号２６３は、Ｒ０１６１：Ｆ０５について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０２９１】
配列番号２６４は、Ｒ０１６１：Ｆ０７について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０２９２】
配列番号２６５は、Ｒ０１６１：Ｆ０８について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０２９３】
配列番号２６６は、Ｒ０１６１：Ｆ１１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０２９４】
配列番号２６７は、Ｒ０１６１：Ｆ１２について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０２９５】
配列番号２６８は、Ｒ０１６１：Ｇ０１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０２９６】
配列番号２６９は、Ｒ０１６１：Ｇ０２について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０２９７】
配列番号２７０は、Ｒ０１６１：Ｇ０３について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０２９８】
配列番号２７１は、Ｒ０１６１：Ｇ０４について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０２９９】
配列番号２７２は、Ｒ０１６１：Ｇ０５について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０３００】
配列番号２７３は、Ｒ０１６１：Ｇ０７について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０３０１】
配列番号２７４は、Ｒ０１６１：Ｇ０９について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０３０２】
配列番号２７５は、Ｒ０１６１：Ｇ１２について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０３０３】
配列番号２７６は、Ｒ０１６１：Ｈ０３について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０３０４】
配列番号２７７は、Ｒ０１６１：Ｈ０６について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０３０５】
配列番号２７８は、Ｒ０１６１：Ｈ０７について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０３０６】
配列番号２７９は、Ｒ０１６１：Ｈ０８について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０３０７】
配列番号２８０は、Ｒ０１６１：Ｈ１０について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０３０８】
配列番号２８１は、Ｒ０１６２：Ａ０６について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０３０９】
配列番号２８２は、Ｒ０１６２：Ｂ０５について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０３１０】
配列番号２８３は、Ｒ０１６２：Ｂ０９について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０３１１】
配列番号２８４は、Ｒ０１６２：Ｂ１２について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０３１２】
配列番号２８５は、Ｒ０１６２：Ｃ０１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０３１３】
配列番号２８６は、Ｒ０１６２：Ｃ１０について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０３１４】
配列番号２８７は、Ｒ０１６２：Ｄ０１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０３１５】
配列番号２８８は、Ｒ０１６２：Ｄ０２について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０３１６】
配列番号２８９は、Ｒ０１６２：Ｄ０５について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０３１７】
配列番号２９０は、Ｒ０１６２：Ｄ０６について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０３１８】
配列番号２９１は、Ｒ０１６２：Ｄ０９について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０３１９】
配列番号２９２は、Ｒ０１６２：Ｄ１０について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０３２０】
配列番号２９３は、Ｒ０１６２：Ｄ１２について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０３２１】
配列番号２９４は、Ｒ０１６２：Ｅ０１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０３２２】
配列番号２９５は、Ｒ０１６２：Ｅ０２について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０３２３】
配列番号２９６は、Ｒ０１６２：Ｅ０４について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０３２４】
配列番号２９７は、Ｒ０１６２：Ｅ０５について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０３２５】
配列番号２９８は、Ｒ０１６２：Ｅ０６について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０３２６】
配列番号２９９は、Ｒ０１６２：Ｅ０８について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０３２７】
配列番号３００は、Ｒ０１６２：Ｅ０９について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０３２８】
配列番号３０１は、Ｒ０１６２：Ｅ１０について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０３２９】
配列番号３０２は、Ｒ０１６２：Ｅ１２について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０３３０】
配列番号３０３は、Ｒ０１６２：Ｆ０５について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０３３１】
配列番号３０４は、Ｒ０１６２：Ｇ０４について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０３３２】
配列番号３０５は、Ｒ０１６２：Ｇ０５について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０３３３】
配列番号３０６は、Ｒ０１６２：Ｇ０７について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０３３４】
配列番号３０７は、Ｒ０１６２：Ｇ０９について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０３３５】
配列番号３０８は、Ｒ０１６２：Ｈ０４について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０３３６】
配列番号３０９は、Ｒ０１６２：Ｈ０５について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０３３７】
配列番号３１０は、Ｒ０１６２：Ｈ１０について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０３３８】
配列番号３１１は、Ｒ０１６２：Ｈ１１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０３３９】
配列番号３１２は、Ｒ０１６３：Ａ０６について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０３４０】
配列番号３１３は、Ｒ０１６３：Ａ０８について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０３４１】
配列番号３１４は、Ｒ０１６３：Ａ１１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０３４２】
配列番号３１５は、Ｒ０１６３：Ａ１２について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０３４３】
配列番号３１６は、Ｒ０１６３：Ｂ０２について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０３４４】
配列番号３１７は、Ｒ０１６３：Ｂ０３について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０３４５】
配列番号３１８は、Ｒ０１６３：Ｂ０４について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０３４６】
配列番号３１９は、Ｒ０１６３：Ｂ０６について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０３４７】
配列番号３２０は、Ｒ０１６３：Ｂ０７について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０３４８】
配列番号３２１は、Ｒ０１６３：Ｂ０８について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０３４９】
配列番号３２２は、Ｒ０１６３：Ｂ０９について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０３５０】
配列番号３２３は、Ｒ０１６３：Ｃ０１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０３５１】
配列番号３２４は、Ｒ０１６３：Ｃ０２について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０３５２】
配列番号３２５は、Ｒ０１６３：Ｃ０４について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０３５３】
配列番号３２６は、Ｒ０１６３：Ｃ０５について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０３５４】
配列番号３２７は、Ｒ０１６３：Ｃ０６について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０３５５】
配列番号３２８は、Ｒ０１６３：Ｃ０７について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０３５６】
配列番号３２９は、Ｒ０１６３：Ｃ０８について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０３５７】
配列番号３３０は、Ｒ０１６３：Ｃ０９について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０３５８】
配列番号３３１は、Ｒ０１６３：Ｄ０１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０３５９】
配列番号３３２は、Ｒ０１６３：Ｄ０２について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０３６０】
配列番号３３３は、Ｒ０１６３：Ｄ０３について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０３６１】
配列番号３３４は、Ｒ０１６３：Ｄ０４について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０３６２】
配列番号３３５は、Ｒ０１６３：Ｄ０６について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０３６３】
配列番号３３６は、Ｒ０１６３：Ｄ０７について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０３６４】
配列番号３３７は、Ｒ０１６３：Ｄ０８について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０３６５】
配列番号３３８は、Ｒ０１６３：Ｄ０９について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０３６６】
配列番号３３９は、Ｒ０１６３：Ｅ０２について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０３６７】
配列番号３４０は、Ｒ０１６３：Ｅ０５について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０３６８】
配列番号３４１は、Ｒ０１６３：Ｅ０７について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０３６９】
配列番号３４２は、Ｒ０１６３：Ｆ０５について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０３７０】
配列番号３４３は、Ｒ０１６３：Ｆ０９について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０３７１】
配列番号３４４は、Ｒ０１６３：Ｇ０４について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０３７２】
配列番号３４５は、Ｒ０１６３：Ｇ０６について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０３７３】
配列番号３４６は、Ｒ０１６３：Ｇ０９について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０３７４】
配列番号３４７は、Ｒ０１６３：Ｈ０３について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０３７５】
配列番号３４８は、Ｒ０１６３：Ｈ０７について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０３７６】
配列番号３４９は、Ｒ０１６３：Ｇ０９について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０３７７】
配列番号３５０は、Ｒ０１６３：Ｈ１０について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０３７８】
配列番号３５１は、Ｒ０１６４：Ａ０５について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０３７９】
配列番号３５２は、Ｒ０１６４：Ａ０６について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０３８０】
配列番号３５３は、Ｒ０１６４：Ａ０７について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０３８１】
配列番号３５４は、Ｒ０１６４：Ａ０９について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０３８２】
配列番号３５５は、Ｒ０１６４：Ｂ０４について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０３８３】
配列番号３５６は、Ｒ０１６４：Ｂ０５について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０３８４】
配列番号３５７は、Ｒ０１６４：Ｂ０７について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０３８５】
配列番号３５８は、Ｒ０１６４：Ｂ０８について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０３８６】
配列番号３５９は、Ｒ０１６４：Ｂ０９について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０３８７】
配列番号３６０は、Ｒ０１６４：Ｂ１１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０３８８】
配列番号３６１は、Ｒ０１６４：Ｃ０２について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０３８９】
配列番号３６２は、Ｒ０１６４：Ｃ０３について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０３９０】
配列番号３６３は、Ｒ０１６４：Ｃ０５について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０３９１】
配列番号３６４は、Ｒ０１６４：Ｃ１０について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０３９２】
配列番号３６５は、Ｒ０１６４：Ｃ１１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０３９３】
配列番号３６６は、Ｒ０１６４：Ｄ０４について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０３９４】
配列番号３６７は、Ｒ０１６４：Ｄ０９について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０３９５】
配列番号３６８は、Ｒ０１６４：Ｄ１２について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０３９６】
配列番号３６９は、Ｒ０１６４：Ｅ０３について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０３９７】
配列番号３７０は、Ｒ０１６４：Ｅ０４について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０３９８】
配列番号３７１は、Ｒ０１６４：Ｅ０５について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０３９９】
配列番号３７２は、Ｒ０１６４：Ｅ０８について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０４００】
配列番号３７３は、Ｒ０１６４：Ｅ１０について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０４０１】
配列番号３７４は、Ｒ０１６４：Ｆ０３について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０４０２】
配列番号３７５は、Ｒ０１６４：Ｆ０７について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０４０３】
配列番号３７６は、Ｒ０１６４：Ｆ０８について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０４０４】
配列番号３７７は、Ｒ０１６４：Ｆ０９について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０４０５】
配列番号３７８は、Ｒ０１６４：Ｇ０１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０４０６】
配列番号３７９は、Ｒ０１６４：Ｇ０２について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０４０７】
配列番号３８０は、Ｒ０１６４：Ｇ０３について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０４０８】
配列番号３８１は、Ｒ０１６４：Ｇ０４について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０４０９】
配列番号３８２は、Ｒ０１６４：Ｇ０５について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０４１０】
配列番号３８３は、Ｒ０１６４：Ｇ０６について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０４１１】
配列番号３８４は、Ｒ０１６４：Ｇ０８について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０４１２】
配列番号３８５は、Ｒ０１６４：Ｇ１２について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０４１３】
配列番号３８６は、Ｒ０１６４：Ｈ０１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０４１４】
配列番号３８７は、Ｒ０１６４：Ｈ０２について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０４１５】
配列番号３８８は、Ｒ０１６４：Ｈ０３について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０４１６】
配列番号３８９は、Ｒ０１６４：Ｈ０４について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０４１７】
配列番号３９０は、Ｒ０１６４：Ｈ０５について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０４１８】
配列番号３９１は、Ｒ０１６４：Ｈ０６について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０４１９】
配列番号３９２は、Ｒ０１６４：Ｈ０７について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０４２０】
配列番号３９３は、Ｒ０１６４：Ｈ０８について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０４２１】
配列番号３９４は、Ｒ０１６４：Ｈ０９について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０４２２】
配列番号３９５は、Ｒ０１６４：Ｈ１０について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０４２３】
配列番号３９６は、Ｒ０１６５：Ａ０９について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０４２４】
配列番号３９７は、Ｒ０１６５：Ａ１１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０４２５】
配列番号３９８は、Ｒ０１６５：Ｂ０８について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０４２６】
配列番号３９９は、Ｒ０１６５：Ｂ０９について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０４２７】
配列番号４００は、Ｒ０１６５：Ｂ１１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０４２８】
配列番号４０１は、Ｒ０１６５：Ｃ０９について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０４２９】
配列番号４０２は、Ｒ０１６５：Ｄ０１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０４３０】
配列番号４０３は、Ｒ０１６５：Ｄ０２について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０４３１】
配列番号４０４は、Ｒ０１６５：Ｄ０３について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０４３２】
配列番号４０５は、Ｒ０１６５：Ｄ０４について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０４３３】
配列番号４０６は、Ｒ０１６５：Ｄ０８について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０４３４】
配列番号４０７は、Ｒ０１６５：Ｄ０９について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０４３５】
配列番号４０８は、Ｒ０１６５：Ｅ０１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０４３６】
配列番号４０９は、Ｒ０１６５：Ｅ０５について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０４３７】
配列番号４１０は、Ｒ０１６５：Ｅ１１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０４３８】
配列番号４１１は、Ｒ０１６５：Ｆ０４について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０４３９】
配列番号４１２は、Ｒ０１６５：Ｆ０８について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０４４０】
配列番号４１３は、Ｒ０１６５：Ｆ１１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０４４１】
配列番号４１４は、Ｒ０１６５：Ｇ０１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０４４２】
配列番号４１５は、Ｒ０１６５：Ｇ０５について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０４４３】
配列番号４１６は、Ｒ０１６５：Ｇ１１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０４４４】
配列番号４１７は、Ｒ０１６５：Ｈ０１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０４４５】
配列番号４１８は、Ｒ０１６５：Ｈ０２について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０４４６】
配列番号４１９は、Ｒ０１６５：Ｈ０３について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０４４７】
配列番号４２０は、Ｒ０１６５：Ｈ０４について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０４４８】
配列番号４２１は、Ｒ０１６５：Ｈ１１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０４４９】
配列番号４２２は、’５４８５３．１’について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０４５０】
配列番号４２３は、’５４８５７．１’について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０４５１】
配列番号４２４は、’５４８６４．１’について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０４５２】
配列番号４２５は、’５４８７４．１’について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０４５３】
配列番号４２６は、’５４８８８．１’について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０４５４】
配列番号４２７は、’５４９２１．１’について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０４５５】
配列番号４２８は、’５４９２６．１’について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０４５６】
配列番号４２９は、’５４９４０．１’について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０４５７】
配列番号４３０は、’５５００２．１’について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０４５８】
配列番号４３１は、’５５００６．１’について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０４５９】
配列番号４３２は、’５５００７．１’について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０４６０】
配列番号４３３は、’５５０１５．１’について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０４６１】
配列番号４３４は、’５５０１６．１’について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０４６２】
配列番号４３５は、’５５０２２．１’について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０４６３】
配列番号４３６は、’５５０２７．２’について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０４６４】
配列番号４３７は、’５５０３２．１’について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０４６５】
配列番号４３８は、’５５０３６．１’について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０４６６】
配列番号４３９は、’５５０３９．１’について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０４６７】
配列番号４４０は、５６７１０．１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０４６８】
配列番号４４１は、５６７１２．１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０４６９】
配列番号４４２は、５６７１６．１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０４７０】
配列番号４４３は、５６７１８．１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０４７１】
配列番号４４４は、５６７２３．１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０４７２】
配列番号４４５は、５６７２４．１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０４７３】
配列番号４４６は、５６７３０．１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０４７４】
配列番号４４７は、５６７３２．１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０４７５】
配列番号４４８は、５８３７５．３について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０４７６】
配列番号４４９は、６０９８２．１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０４７７】
配列番号４５０は、６０９８３．２について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０４７８】
配列番号４５１は、６０９８３について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０４７９】
配列番号４５２は、配列番号４５１によってコードされるアミノ酸配列である。
【０４８０】
配列番号４５３は、全長Ｌ５８７Ｓ、クローン５５０２２の伸長した配列（配列番号４３５）について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０４８１】
配列番号４５４は、配列番号４５３によってコードされたアミノ酸配列である。
【０４８２】
配列番号４５５は、クローンＬ５８７Ｓのコード領域のついての順方向（フォワード）プライマーＰＤＭ−６４７である。
【０４８３】
配列番号４５６は、クローンＬ５８７Ｓのコード領域の逆方向（リバース）プライマーＰＤＭ−６４８である。
【０４８４】
配列番号４５７は、発現された組み換えＬ５８７Ｓのアミノ酸配列である。
【０４８５】
配列番号４５８は、組み換えＬ５８７ＳのＤＮＡコード配列である。
【０４８６】
配列番号４５９は、抗体の生成においてＬ５８７Ｓ特異的なエピトープであるアミノ酸７１〜８５に相当する。
【０４８７】
配列番号４６０は、抗体の生成においてＬ５８７Ｓ特異的なエピトープであるアミノ酸１１１〜１２５に相当する。
【０４８８】
配列番号４６１は、抗体の生成においてＬ５８７Ｓ特異的なエピトープであるアミノ酸１〜１５に相当する。
【０４８９】
配列番号４６２は、抗体の生成においてＬ５８７Ｓ特異的なエピトープであるアミノ酸４１〜５５に相当する。
【０４９０】
配列番号４６３は、抗体の生成においてＬ５８７Ｓ特異的なエピトープであるアミノ酸２２１〜２３５に相当する。
【０４９１】
配列番号４６４は、ＣＤ４  Ｔ細胞の生成においてＬ５８７Ｓ特異的なエピトープであるアミノ酸１７１〜１９０に相当する。
【０４９２】
配列番号４６５は、ＣＤ４  Ｔ細胞の生成においてＬ５８７Ｓ特異的なエピトープであるアミノ酸１５６〜１７５に相当する。
【０４９３】
配列番号４６６は、ＣＤ４  Ｔ細胞の生成においてＬ５８７Ｓ特異的なエピトープであるアミノ酸１６１〜１８０に相当する。
【０４９４】
配列番号４６７は、ＣＤ４  Ｔ細胞の生成においてＬ５８７Ｓ特異的なエピトープであるアミノ酸１６６〜１８５に相当する。
【０４９５】
配列番号４６８は、ＣＤ４  Ｔ細胞の生成においてＬ５８７Ｓ特異的なエピトープであるアミノ酸１５１〜１７０に相当する。
【０４９６】
配列番号４６９は、ＣＤ４  Ｔ細胞の生成においてＬ５８７Ｓ特異的なエピトープであるアミノ酸１４６〜１６５に相当する。
【０４９７】
配列番号４７０は、ＣＤ４  Ｔ細胞の生成においてＬ５８７Ｓ特異的なエピトープであるアミノ酸４１〜６０に相当する。
【０４９８】
配列番号４７１は、ＣＤ４  Ｔ細胞の生成においてＬ５８７Ｓ特異的なエピトープであるアミノ酸３６〜５５に相当する。
【０４９９】
配列番号４７２は、ＣＤ４  Ｔ細胞の生成においてＬ５８７Ｓ特異的なエピトープであるアミノ酸１６〜３５に相当する。
【０５００】
配列番号４７３は、ＣＤ４  Ｔ細胞の生成においてＬ５８７Ｓ特異的なエピトープであるアミノ酸１１〜３０に相当する。
【０５０１】
（発明の詳細な説明）
上記のように、本発明は一般に、組成物およびこの組成物を使用するための方法（例えば、肺癌のような癌の治療および診断）に関する。本明細書中に記載される特定の例示的な組成物としては、肺腫瘍ポリペプチド、このようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、抗原のような結合因子、抗原提示細胞（ＡＰＣ）および／または免疫系細胞（例えば、Ｔ細胞）が挙げられる。本明細書中で使用される場合、用語「肺腫瘍タンパク質」は、一般に、本明細書中で提供される代表的なアッセイを使用して決定する場合、正常組織における発現レベルよりも、少なくとも２倍、および好ましくは少なくとも５倍高いレベルで、肺腫瘍細胞中で発現されるタンパク質をいう。特定の肺腫瘍タンパク質は、肺癌に罹患した患者の抗血清と検出可能に反応する（ＥＬＩＳＡまたはウエスタンブロットのようなイムノアッセイで）腫瘍タンパク質である。
【０５０２】
その結果、上記に従って、そして以下でさらに記載されるように、本発明は、配列番号１〜４５１、４５３、４５５〜４５６、および４５８に記載される配列を有する例示的なポリヌクレオチド組成物、配列番号１〜４５１、４５３、４５５〜４５６、および４５８に記載のポリヌクレオチド配列によってコードされる例示的ポリペプチド組成物、ならびに配列番号４５２、４５４、４５７、および４５９〜４７３に記載されるアミノ酸配列、このようなポリペプチドに結合し得る抗体組成物、ならびにこのような組成物を使用する多数のさらなる実施形態（例えば、ヒト肺癌の検出、診断および／または治療）を提供する。
【０５０３】
（ポリヌクレオチド組成物）
本明細書中で使用される場合、用語「ＤＮＡセグメント」および「ポリヌクレオチド」は、特定の種の全ゲノムＤＮＡを含まない単離されたＤＮＡ分子をいう。従って、ポリペプチドをコードするＤＮＡセグメントは、ＤＮＡセグメントが得られる種の全ゲノムＤＮＡから実質的に単離されたか、またはこのゲノムＤＮＡから精製された、１つ以上のコード配列を含むＤＮＡセグメントをいう。ＤＮＡセグメントおよびこのようなセグメントのより小さなフラグメント、そしてまた、組換えベクター（例えば、プラスミド、コスミド、ファージミド、ファージ、ウイルスなどを含む）が、用語「ＤＮＡセグメント」および「ポリヌクレオチド」内に含まれる。
【０５０４】
当業者に理解されるように、本発明のＤＮＡセグメントは、タンパク質、ポリペプチド、ペプチドなどを発現するか、または発現し得るように適応されたゲノム配列、ゲノム外配列およびプラスミドにコードされる配列、ならびにより小さな操作された遺伝子セグメントを含み得る。このようなセグメントは、自然に単離され得るか、または人の手によって合成的に改変され得る。
【０５０５】
本明細書中で使用される場合、「単離された」は、ポリヌクレオチドが、実質的に他のコード配列から離れており、そしてＤＮＡセグメントが無関係のコードＤＮＡ（例えば、大きな染色体フラグメントまたは他の機能的遺伝子あるいはポリペプチドコード領域）の大部分を含まないことを意味する。当然のことながら、これは、最初に単離され、そして人の手によって後でセグメントに加えられた遺伝子またはコード領域を除外しないＤＮＡセグメントをいう。
【０５０６】
当業者に認識されるように、ポリヌクレオチドは、一本鎖（コードもしくはアンチセンス）または二本鎖であり得、そしてＤＮＡ分子（ゲノム、ｃＤＮＡもしくは合成）またはＲＮＡ分子であり得る。ＲＮＡ分子は、ＨｎＲＮＡ分子（これはイントロンを含み、そしてＤＮＡ分子に１対１の様式で対応する）、およびｍＲＮＡ分子（これは、イントロンを含まない）を含む。さらなるコード配列または非コード配列は、本発明のポリヌクレオチド内に存在し得るがその必要はなく、そしてポリヌクレオチドは、他の分子および／または支持材料に連結され得るがその必要はない。
【０５０７】
ポリヌクレオチドは、ネイティブの配列（すなわち、肺腫瘍タンパク質をコードする内因性配列またはその部分）を含み得るか、あるいはこのような配列の改変体、または生物学的もしくは抗原性の機能的均等物を含み得る。ポリヌクレオチド改変体は、以下にさらに記載されるように、好ましくはネイティブの腫瘍タンパク質と比較して、コードされたポリペプチドの免疫原性が減少しないように、１つ以上の置換、付加、欠失、および／または挿入を含み得る。コードされたポリペプチドの免疫原性の効果は、一般に、本明細書中に記載されるように評価され得る。用語「改変体」はまた、異種間の起源の相同な遺伝子を含む。
【０５０８】
ポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列を比較する場合、２つの配列におけるヌクレオチドまたはアミノ酸の配列が、以下に記載されるように最大一致について整列される場合に同じときに、２つの配列が「同一」であるといわれる。２つの配列の間の比較は、代表的には、配列類似性の局所領域を同定および比較するために、比較ウインドウ（ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｗｉｎｄｏｗ）にわたって配列を比較することによって行われる。本明細書中で使用される場合、「比較ウインドウ」は、少なくとも約２０、通常は３０〜約７５、４０〜約５０の連続した位置のセグメントをいい、ここで、２つの配列が最適に整列された後に、配列が連続した位置の同じ数の参照配列と比較され得る。
【０５０９】
比較のための配列の最適な整列は、バイオインフォマティクス（生命情報科学）ソフトウエアのＬａｓｅｒｇｅｎｅ  ｓｕｉｔｅにおけるＭｅｇａｌｉｇｎプログラム（ＤＮＡＳＴＡＲ，Ｉｎｃ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を使用して、デフォルトパラメーターを用いて行われ得る。このプログラムは、以下の参考文献に記載のいくつかの整列スキームを統合する：Ｄａｙｈｏｆｆ，Ｍ．Ｏ．（編）Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  ＤＣ  Ｖｏｌ．５，補遺３，３４５−３５８頁におけるＤａｙｈｏｆｆ，Ｍ．Ｏ．（１９７８）Ａ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ  ｃｈａｎｇｅ  ｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ−Ｍａｔｒｉｃｅｓ  ｆｏｒ  ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ  ｄｉｓｔａｎｔ  ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ．；Ｈｅｉｎ  Ｊ．（１９９０）Ｕｎｉｆｉｅｄ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  ｔｏ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ａｎｄ  Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｓ  ６２６−６４５頁  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ｖｏｌ．１８３，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ；Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｄ．Ｇ．およびＳｈａｒｐ，Ｐ．Ｍ．（１９８９）ＣＡＢＩＯＳ  ５：１５１−１５３；Ｍｙｅｒｓ，Ｅ．Ｗ．およびＭｕｌｌｅｒ  Ｗ．（１９８８）ＣＡＢＩＯＳ  ４：１１−１７；Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，Ｅ．Ｄ．（１９７１）Ｃｏｍｂ．Ｔｈｅｏｒ  １１：１０５；Ｓａｎｔｏｕ，Ｎ．Ｎｅｓ，Ｍ．（１９８７）Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｅｖｏｌ．４：４０６−４２５；Ｓｎｅａｔｈ，Ｐ．Ｈ．Ａ．およびＳｏｋａｌ，Ｒ．Ｒ．（１９７３）Ｎｕｍｅｒｉｃａｌ  Ｔａｘｏｎｏｍｙ−ｔｈｅ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｎｕｍｅｒｉｃａｌ  Ｔａｘｏｎｏｍｙ，Ｆｒｅｅｍａｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ；Ｗｉｌｂｕｒ，Ｗ．Ｊ．およびＬｉｐｍａｎ，Ｄ．Ｊ．（１９８３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．，Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８０：７２６−７３０。
【０５１０】
あるいは、比較のための配列の最適な整列は、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ（１９８１）Ａｄｄ．ＡＰＬ．Ｍａｔｈ  ２：４８２の局部同定アルゴリズムによって、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ（１９７０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３の同一性整列アルゴリズムによって、ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：２４４４の類似性検索方法によって、これらのアルゴリズムのコンピュータ化した実行（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ），５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩにおけるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ）によって、または検査によって行われ得る。
【０５１１】
配列同一性および配列類似性の割合を決定するために適切なアルゴリズムの１つの好ましい例は、ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムであり、これらはそれぞれ、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９７７）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２およびＡｌｔｓｃｈｕｌら（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０に記載される。ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ２．０は、本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドについての配列同一性の割合を決定するために、例えば、本明細書中に記載のパラメータを用いて使用され得る。ＢＬＡＳＴ分析を行うためのソフトウエアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｍａｔｉｏｎを通して公に利用可能である。１つの例示的な例において、累積スコアは、ヌクレオチド配列について、パラメーターＭ（一致する残基の対についての報酬スコア（ｒｅｗａｒｄ  ｓｃｏｒｅｄ）；常に＞０）およびＮ（ミスマッチ残基についてのペナルティスコア；常に＜０）を使用して算出され得る。アミノ酸配列について、スコアリング行列は、累積スコアを算出するために使用され得る。各指示におけるワードヒットの拡大は、以下の場合に停止する：累積整列スコアが、その最大到達値から量Ｘだけ低下した場合；累積スコアが、１以上の負のスコアの残基整列の累積に起因してゼロ以下になった場合；またはいずれかの配列の末端に到達した場合。このＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメーターＷ、ＴおよびＸは、整列の感度および速度を決定する。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列について）は、ワード長さ（Ｗ）１１、および期待値（Ｅ）１０をデフォルトとして、そしてＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックス（ＨｅｎｉｋｏｆｆおよびＨｅｎｉｋｏｆｆ（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：１０９１５を参照のこと）アラインメントは、（Ｂ）５０、期待値（Ｅ）１０、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、および両方の鎖の比較を使用する。
【０５１２】
好ましくは、「配列同一性のパーセンテージ」は、少なくとも２０の位置の比較ウインドウにわたる２つの最適に整列した配列を比較することによって決定され、ここで比較ウインドウ中のポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列の一部は、参照配列（これは、付加または欠失を含まない）と比較して、２つの配列の最適な整列について２０パーセント以下、通常は５〜１５パーセント、または１０〜１２パーセントの付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含み得る。このパーセンテージは、両方の配列で同一の核酸塩基またはアミノ酸残基が生じる位置の数を決定して一致する位置の数を得、この一致する位置の数を参照配列中の位置の総数（すなわち、ウインドウサイズ）で除算し、そしてこの結果に１００を掛けて配列同一性のパーセンテージを得ることによって算出される。
【０５１３】
従って、本発明は、本明細書中に開示される配列に実質的な同一性を有するポリヌクレオチド配列およびポリペプチド配列（例えば、本明細書中に記載される方法（例えば、以下に記載するような標準パラメーターを使用するＢＬＡＳＴ分析）を使用して本発明のポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列と比較して、少なくとも５０％の配列同一性、好ましくは少なくとも５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％以上の配列同一性を含む配列）を含む。当業者は、これらの値が、コドンの縮重、アミノ酸類似性、リーディングフレームの位置などを考慮することによって、２つのヌクレオチド配列によってコードされるタンパク質の対応する同一性を決定するために、適切に調整され得ることを認識する。
【０５１４】
さらなる実施形態において、本発明は、本明細書中に開示される配列の１つ以上に同一であるかまたは相補的な配列の種々の長さの連続したストレッチを含む単離されたポリヌクレオチドおよびポリペプチドを提供する。例えば、本発明に開示される配列の１つ以上の、少なくとも約１５、２０、３０、４０、５０、７５、１００、１５０、２００、３００、４００、５００または１０００以上、ならびにその間の中間の長さの連続したヌクレオチドを含むポリヌクレオチドが、本発明によって提供される。本発明の状況において、「中間の長さ」が、示される値の間の任意の長さ（例えば、１６、１７、１８、１９など；２１、２２、２３など；３０、３１、３２など；５０、５１、５２、５３など；１００、１０１、１０２、１０３など；１５０、１５１、１５２、１５３など；２００〜５００；５００〜１，０００などの間の全ての整数を含む）を意味することが容易に理解される。
【０５１５】
本発明のポリヌクレオチド、またはそのフラグメントは、そのコード配列自体の長さに関わらず、他のＤＮＡ配列（例えば、プロモーター、ポリアデニル化シグナル、さらなる制限酵素部位、マルチクローニング部位、他のコードセグメントなど）と組合わされ得、その結果、その全体の長さは、相当変化し得る。従って、ほとんど任意の長さの核酸フラグメントが使用され得ることが意図され、その全長は、好ましくは意図した組換えＤＮＡプロトコルにおける調製および使用の容易さによって制限される。例えば、約１０，０００、約５０００、約３０００、約２，０００、約１，０００、約５００、約２００、約１００、約５０の塩基対長など（全ての中間の長さを含む）の全長を有する例示的なＤＮＡセグメントが、本発明の多くの実行において有用であることが意図される。
【０５１６】
他の実施形態において、本発明は、中程度にストリンジェントな条件下で、本明細書中で提供されるポリヌクレオチド配列またはそのフラグメント、あるいはその相補配列にハイブリダイズし得るポリヌクレオチドに関する。ハイブリダイゼーション技術は、分子生物学の分野において周知である。例示の目的で、本発明のポリヌクレオチドの、他のポリヌクレオチドとのハイブリダイゼーションを試験するために適切な中程度にストリンジェントな条件は、５×ＳＳＣ、０．５％  ＳＤＳ、１．０ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）の溶液中での予洗；５０℃〜６５℃、５×ＳＳＣで一晩のハイブリダイゼーション；続いて０．１％  ＳＤＳを含む２×、０．５×、および０．２×ＳＳＣで各２０分、６５℃で２回の洗浄を含む。
【０５１７】
さらに、遺伝コードの縮重の結果として、本明細書中に記載されるようなポリペプチドをコードする多くのヌクレオチド配列が存在することが、当業者に理解される。これらのポリヌクレオチドのうちいくつかは、任意のネイティブな遺伝子のヌクレオチド配列に対して最小の相同性を有する。それにもかかわらず、コドンの用法における差異に起因して変化するポリヌクレオチドは、本発明によって詳細に意図される。さらに、本明細書中で提供されるポリヌクレオチド配列を含む遺伝子の対立遺伝子は、本発明の範囲内である。対立遺伝子は、１以上の変異（例えば、ヌクレオチドの欠失、付加および／または置換）の結果として変化する内因性遺伝子である。得られたｍＲＮＡおよびタンパク質は、変化した構造または機能を有し得るが、その必要はない。対立遺伝子は、標準的な技術（例えば、ハイブリダイゼーション、増幅および／またはデータベース配列比較）を用いて、同定され得る。
【０５１８】
（プローブおよびプライマー）
本発明の他の実施形態において、本明細書中に提供されるポリヌクレオチド配列は、核酸ハイブリダイゼーションのためのプローブまたはプライマーとして、有利に使用され得る。このように、本明細書中に開示される１５ヌクレオチド長の連続配列と同じ配列か、またはこれに相補的な配列を有する、少なくとも約１５ヌクレオチド長の連続配列の配列領域を含む核酸セグメントが特定の有用性を見出すことが、意図される。例えば、約２０、３０、４０、５０、１００、２００、５００、１０００（全ての中間的な長さのものを含む）およびまさに全長配列までの、より長い連続した同一配列または相補的な配列がまた、特定の実施形態において使用される。
【０５１９】
このような核酸プローブが目的の配列に特異的にハイブリダイズする能力は、所定のサンプル中の相補的配列の存在を検出する際にこれらが使用されることを可能にする。しかし、他の用途（例えば、変異種プライマーまたは他の遺伝的構築物の調製の際の使用のためのプライマーを調製するための配列情報の使用）がまた意図される。
【０５２０】
１０〜１４、１５〜２０、３０、５０、または１００〜２００ヌクレオチド程度（同様に中間的な長さを含む）の連続したヌクレオチドストレッチからなる配列領域を有し、本明細書中に開示されるポリヌクレオチド配列に同一または相補的なポリヌクレオチド分子は、例えばサザンブロッティングまたはノーザンブロッティングにおける使用のためのハイブリダイゼーションプローブとして特に意図される。これは、遺伝子産物またはそのフラグメントの、多様な細胞型およびまた種々の細菌細胞の両方における分析を可能とする。フラグメントの全サイズ、ならびに相補的ストレッチのサイズは、究極的には、特定の核酸セグメントの意図される用途または適用に依存する。より小さなフラグメントは、一般にハイブリダイゼーション実施形態における用途を見出し、ここで連続した相補領域の長さが変化され得る（例えば、約１５ヌクレオチドと約１００ヌクレオチドとの間）が、検出を望む相補配列の長さに従って、より長い連続した相補ストレッチが使用され得る。
【０５２１】
約１５〜２５ヌクレオチド長のハイブリダイゼーションプローブの使用は、安定かつ選択的な二重鎖分子の形成を可能にする。しかし、１５塩基長より長いストレッチの連続した相補配列を有する分子が、ハイブリッドの安定性および選択性を増加するために一般に好ましく、それによって、得られる特異的ハイブリッド分子の質および程度が改善される。１５〜２５の連続したヌクレオチド、または望まれる場合にはより長い遺伝子相補的ストレッチを有する核酸分子を設計するのが一般には好ましい。
【０５２２】
ハイブリダイゼーションプローブは、本明細書中に開示される配列のいずれかの、任意の部分から選択され得る。必要とされることの全ては、配列番号壱〜４５１および４５３に記載の配列、あるいはプローブまたはプライマーとしての利用を望む場合は、約１５〜２５ヌクレオチド長から全長配列まで、および全長配列を含む配列の任意の連続した部分までを再検討することである。プローブおよびプライマー配列の選択は、種々の要因によって支配され得る。例えば、全配列の末端に向かってプライマーを使用することが望まれ得る。
【０５２３】
小さなポリヌクレオチドセグメントまたはフラグメントは、通常は自動オリゴヌクレオチド合成機を使用して行われるので、例えば化学的手段によってフラグメントを直接合成することによって、容易に調製され得る。また、フラグメントは、核酸複製技術（例えば、米国特許第４，６８３，２０２号（本明細書中に参考として援用される）のＰＣＲＴＭ技術）の適用によって、組換え産生のために選択配列を組換えベクターに導入することによって、および一般に分子生物学の分野の当業者に公知の他の組換えＤＮＡ技術によって、得られ得る。
【０５２４】
本発明のヌクレオチド配列は、目的の完全遺伝子または遺伝子フラグメントの相補的ストレッチを有する、二重鎖分子を選択的に形成するその能力のために使用され得る。想定される適用に依存して、代表的には、標的配列に対するプローブの選択性の種々の程度を達成するために、ハイブリダイゼーションの種々の条件を使用することが望ましい。高い選択性を必要とする適用について、代表的には、ハイブリッドを形成するための比較的ストリンジェントな条件（例えば、比較的低濃度の塩、および／または高温の条件（例えば、約５０℃〜約７０℃の温度で、約０．０２Ｍ〜約０．１５Ｍの塩の塩濃度によって提供されるような）を使用することが望ましい。このような選択条件は、存在する場合、プローブとテンプレートまたは標的鎖との間のミスマッチにわずかに許容性であり、そして関連する配列の単離のために特に適切である。
【０５２５】
当然のことながら、いくつかの適用（例えば、潜在的なテンプレートにハイブリダイズする変異体プライマー鎖を使用する、変異体の調製が望ましい場合）について、低ストリンジェント（減少したストリンジェンシー）のハイブリダイゼーション条件は、ヘテロ二重鎖を形成するために代表的に必要とされる。これらの状況において、約２０℃〜約５５℃の温度範囲で約０．１５Ｍ〜約０．９Ｍの塩の条件のような塩条件を使用することが望ましくあり得る。これによって、交差ハイブリダイズ種は、コントロールハイブリダイゼーションに関して、陽性ハイブリダイズシグナルとして容易に同定され得る。任意の場合において、ホルムアミド（これは、増加した温度と同じ様式で、ハイブリッド二重鎖を不安定化するように作用する）の増加した量の添加によって、条件がよりストリンジェントになり得ることが一般に理解される。従って、ハイブリダイゼーション条件は、容易に操作され得、従って、一般に、所望の結果に依存する最良の方法である。
【０５２６】
（ポリヌクレオチドの同定および特徴づけ）
ポリヌクレオチドは、種々の十分に確立された技術のいずれかを使用して、同定、調製および／または操作され得る。例えば、ポリヌクレオチドは、以下により詳細に記載されるように、ｃＤＮＡのマイクロアレイを腫瘍に関連する発現（すなわち、本明細書中で提供される代表的なアッセイを使用して決定する場合、正常な組織における発現よりも、腫瘍での少なくとも２倍高い発現）についてスクリーニングすることによって、同定され得る。このようなスクリーニングは、例えば、製造者の指示に従ってＳｙｎｔｅｎｉマイクロアレイ（Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）を使用して（そして本質的にＳｃｈｅｎａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３：１０６１４−１０６１９，１９９６およびＨｅｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９４：２１５０−２１５５，１９９７に記載されるように）、行われ得る。あるいは、ポリヌクレオチドは、本明細書中に記載されるタンパク質を発現する細胞（例えば、肺腫瘍細胞）から調製されるｃＤＮＡから増幅され得る。このようなポリヌクレオチドは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を介して増幅され得る。このアプローチのために、配列特異的プライマーが、本明細書中で提供される配列に基づいて設計され得、そして購入または合成され得る。
【０５２７】
本発明のポリヌクレオチドの増幅した部分を使用して、適切なライブラリー（例えば、肺腫瘍ｃＤＮＡライブラリー）から周知の技術を使用して全長遺伝子を単離し得る。このような技術において、増幅に適した１以上のポリヌクレオチドプローブまたはプライマーを使用して、ライブラリー（ｃＤＮＡライブラリーまたはゲノムライブラリー）をスクリーニングする。好ましくは、ライブラリーはより大きな分子を含むようにサイズが選択される。ランダムプライムしたライブラリー（ｒａｎｄｏｍ  ｐｒｉｍｅｄ  ｌｉｂｒａｒｙ）もまた、遺伝子の５’領域および上流領域の同定ために好ましくあり得る。ゲノムライブラリーは、イントロンを入手することおよび５’配列を伸長させることについて好ましい。
【０５２８】
ハイブリダイゼーション技術に関して、部分配列は、周知の技術を使用して標識（例えば、ニックトランスレーションまたは３２Ｐでの末端標識）され得る。次いで、細菌ライブラリーまたはバクテリオファージライブラリーは、一般に、標識プローブと、変性した細菌コロニー（またはファージプラークを含む菌叢）を含むフィルターとをハイブリダイズすることによってスクリーニングされる（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８９を参照のこと）。ハイブリダイズするコロニーまたはプラークを選択し、そして増殖させる。そしてそのＤＮＡをさらなる分析のために単離する。ｃＤＮＡクローンを、付加配列の量を決定するために、例えば、部分配列由来のプライマーおよびそのベクター由来のプライマーを使用するＰＣＲによって分析し得る。制限酵素地図および部分配列を作成して、１以上の重複クローンを同定し得る。次いで、標準的な技術（これは、一連の欠失クローンを作製することを包含し得る）を使用して完全配列を決定し得る。次いで、得られた重複配列を１つの連続配列中に構築し得る。周知の技術を使用して、適切なフラグメントを連結することにより全長ｃＤＮＡ分子を生成し得る。
【０５２９】
あるいは、部分ｃＤＮＡ配列から全長コード配列を得るための多くの増幅技術が存在する。このような技術において、増幅は、一般的に、ＰＣＲを介して行われる。種々の市販キットのいずれかを使用して増幅工程を行い得る。例えば、当該分野で周知のソフトウエアを使用してプライマーを設計し得る。プライマーは、好ましくは、２２〜３０ヌクレオチド長であり、少なくとも５０％のＧＣ含有量を有し、そして標的配列に約６８℃〜７２℃の温度でアニールする。増幅した領域は、上記に記載されるように配列決定され得、そして重複配列を連続する配列へと構築する。
【０５３０】
このような増幅技術の１つは、逆（インバース）ＰＣＲである（Ｔｒｉｇｌｉａら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１６：８１８６，１９８８を参照のこと）。この技術は、制限酵素を使用して、その遺伝子の既知の領域内にフラグメントを生成する。次いで、このフラグメントを分子内連結により環化し、そして既知の領域に由来する多岐したプライマーを用いたＰＣＲのためのテンプレート（鋳型）として使用する。代替のアプローチにおいて、部分配列に隣接した配列を、リンカー配列に対するプライマーおよび既知の領域に特異的なプライマーを使用する増幅により取り出し得る。この増幅した配列を、代表的に、同じリンカープライマーおよび既知の領域に特異的な第２のプライマーを使用する２回目の増幅に供する。既知の配列から反対方向に伸長を開始する２つのプライマーを使用するこの手順についての改変は、ＷＯ  ９６／３８５９１に記載される。そのような別の技術は、「迅速なｃＤＮＡ末端の増幅」またはＲＡＣＥとして公知である。この技術は、公知配列の５’および３’である配列を同定するために、内部プライマーおよび外部プライマー（これらは、ポリＡ領域またはベクター配列にハイブリダイズする）の使用を含む。さらなる技術としては、キャプチャーＰＣＲ（Ｌａｎｇｅｒｓｔｒｏｍら，ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ａｐｐｌｉｃ．１：１１１−１９，１９９１）およびウォーキングＰＣＲ（Ｐａｒｋｅｒら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．１９：３０５５−６０，１９９１）が挙げられる。増幅を利用する他の方法もまた使用して、全長ｃＤＮＡ配列を入手し得る。
【０５３１】
特定の場合において、発現配列タグ（ＥＳＴ）データベース（例えば、ＧｅｎＢａｎｋより利用可能のもの）に提供される配列の分析により、全長ｃＤＮＡ配列を入手することが可能である。重複ＥＳＴの検索は、一般に、周知のプログラム（例えば、ＮＣＢＩ  ＢＬＡＳＴ検索）を使用して行われ得、そしてこのようなＥＳＴを使用して連続した全長配列を生成し得る。全長ＤＮＡ配列はまた、ゲノムフラグメントの分析により入手され得る。
【０５３２】
（宿主細胞におけるポリヌクレオチド発現）
本発明の他の実施形態において、本発明のポリペプチドまたはその融合タンパク質もしくは機能的等価物をコードするポリヌクレオチド配列またはそのフラグメントは、適切な宿主細胞におけるポリペプチドの発現を指向するように組換えＤＮＡ分子において使用され得る。遺伝コードの固有の縮重に起因して、実質的に同じか、または機能的に等価なアミノ酸配列をコードする他のＤＮＡ配列が産生され得、そしてこれらの配列を使用して所定のポリペプチドをクローン化し、そして発現させ得る。
【０５３３】
当業者によって理解されるように、いくつかの場合において、天然に存在しないコドンを所有するポリペプチドコードヌクレオチド配列を作製することが有利であり得る。例えば、特定の原核生物宿主または真核生物宿主に好まれるコドンは、タンパク質発現の速度を増加させるためか、または所望の特性（例えば、天然に存在する配列から生成される転写物の半減期よりも長い半減期）を有する組換えＲＮＡ転写物を産生するように選択され得る。
【０５３４】
さらに、本発明のポリヌクレオチド配列は、種々の理由（遺伝子産物のクローニング、プロセシング、および／または発現を変更する改変が挙げられるが、それらに限定されない）のためにポリペプチドコード配列を変更するために、当該分野において一般的に公知の方法を使用して操作され得る。例えば、無作為断片化によるＤＮＡシャッフリングならびに遺伝子フラグメントおよび合成オリゴヌクレオチドのＰＣＲ再アセンブリを使用して、ヌクレオチド配列を操作し得る。さらに、部位特異的変異誘発（ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）を使用して、新たな制限部位を挿入し得るか、グリコシル化パターンを改変し得るか、コドンの優先度（ｐｒｅｆｅｒｅｎｃｅ）を変化させ得るか、スプライス改変体を作製し得るか、または変異の導入などを行い得る。
【０５３５】
本発明の別の実施形態において、天然の核酸配列、改変された核酸配列、または組換え核酸配列は、融合タンパク質をコードする異種配列に連結され得る。例えば、ポリペプチド活性のインヒビターについてペプチドライブラリーをスクリーニングするために、市販の抗体により認識され得るキメラタンパク質をコードすることが有用であり得る。融合タンパク質はまた、ポリペプチドコード配列と異種タンパク質配列との間に位置する切断部位を含むように操作され得、その結果そのポリペプチドは、切断されて、そして異種部分から精製されて取り出され得る。
【０５３６】
所望のポリペプチドをコードする配列が、当該分野において周知の化学的方法を使用して、全体または部分的に合成され得る（Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ，Ｍ．Ｈ．ら、（１９８０）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．Ｓｙｍｐ．Ｓｅｒ．２１５〜２２３、Ｈｏｒｎ，Ｔ．ら、（１９８０）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．Ｓｙｍｐ．Ｓｅｒ．２２５〜２３２を参照のこと）。あるいは、タンパク質自体は、ポリペプチドのアミノ酸配列またはその一部を合成するための化学的方法を使用して産生され得る。例えば、ペプチド合成は、種々の固相技術を使用して実施され得（Ｒｏｂｅｒｇｅ，Ｊ．Ｙ．ら、（１９９５）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６９：２０２〜２０４）、そして自動化合成は、例えば、ＡＢＩ  ４３１Ａ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）を使用して達成され得る。
【０５３７】
新たに合成されたペプチドは、分取用高速液体クロマトグラフィー（例えば、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｔ．（１９８３）Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ａｎｄ  Ｍｏｌｃｕｌａｒ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ，ＷＨ  Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．）または当該分野において利用可能な他の同等技術により実質的に精製され得る。合成ペプチドの組成は、アミノ酸分析または配列決定（例えば、エドマン分解手順）により確認され得る。さらに、ポリペプチドのアミノ酸配列またはその任意の部分は、直接合成の間改変されて、そして／または化学的方法を使用して、他のタンパク質もしくはその任意の部分に由来する配列と組み合わせられて、改変体ポリペプチドを産生し得る。
【０５３８】
所望のポリペプチドを発現させるために、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列または機能的等価物は、適切な発現ベクター（すなわち、挿入されたコード配列の転写および翻訳のために必要なエレメントを含むベクター）内に挿入され得る。当業者に周知である方法を使用して、目的のポリペプチドをコードする配列および適切な転写制御エレメントおよび翻訳制御エレメントを含む発現ベクターを構築し得る。これらの方法としては、インビトロ組換えＤＮＡ技術、合成技術、およびインビボ遺伝子組換えが挙げられる。そのような技術は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら、（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，Ｎ．Ｙ．，およびＡｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら、（１９８９）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ．Ｎ．Ｙ．に記載される。
【０５３９】
種々の発現ベクター／宿主系が、ポリヌクレオチド配列を含み、そして発現させるように利用され得る。これらとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：微生物（例えば、組換えバクテリオファージ、プラスミド、またはコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換した細菌）；酵母発現ベクターで形質転換した酵母；ウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）で感染させた昆虫細胞系；ウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス、ＣａＭＶ；タバコモザイクウイルス、ＴＭＶ）または細菌発現ベクター（例えば、ＴｉもしくはｐＢＲ３２２プラスミド）で形質転換した植物細胞系；あるいは動物細胞系。
【０５４０】
発現ベクター内に存在する「制御エレメント」または「調節配列」は、転写および翻訳を実行するように宿主細胞タンパク質と相互作用する、それらのベクターの非翻訳領域（エンハンサー、プロモーター、５’および３’非翻訳領域）である。そのようなエレメントは、その長さおよび特異性を変更し得る。利用されるベクター系および宿主に依存して、多数の適切な転写エレメントおよび翻訳エレメント（構成的プロモーターおよび誘導性プロモーターを含む）が使用され得る。例えば、細菌系においてクローニングする場合、誘導性プロモーター（例えば、ＰＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴファージミド（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆ．）またはＰＳＰＯＲＴ１プラスミド（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）などのハイブリッドｌａｃＺプロモーター）が使用され得る。哺乳動物細胞系において、哺乳動物遺伝子または哺乳動物ウイルスに由来するプロモーターが、一般的に好ましい。ポリペプチドをコードする配列の複数のコピーを含む細胞株を生成することが必要とされる場合、ＳＶ４０またはＥＢＶベースのベクターが、適切な選択マーカーと共に有利に使用され得る。
【０５４１】
細菌系において、多数の発現ベクターのいずれかが、発現されるポリペプチドに対して意図される使用に依存して選択され得る。例えば、大量に必要とされる場合（例えば、抗体の誘導のために）、容易に精製される融合タンパク質の高レベルの発現を指向するベクターが使用され得る。そのようなベクターとしては、以下が挙げられるがそれらに限定されない：多機能性Ｅ．ｃｏｌｉクローニングベクターおよび発現ベクター（例えば、ＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ここでは目的のポリペプチドをコードする配列が、β−ガラクトシダーゼのアミノ末端Ｍｅｔおよびそれに引続く７残基についての配列とインフレームでベクター内に連結され得、その結果、ハイブリッドタンパク質が産生される）；ｐＩＮベクター（Ｖａｎ  Ｈｅｅｋｅ，Ｇ．およびＳ．Ｍ．Ｓｃｈｕｓｔｅｒ（１９８９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：５５０３−５５０９）など。ｐＧＥＸベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．）もまた、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）との融合タンパク質として外来ポリペプチドを発現させるために使用され得る。一般的に、そのような融合タンパク質は、可溶性であり、そしてグルタチオン−アガロースビーズに吸着させ、次に遊離のグルタチオンの存在下において溶出させることによって、溶解した細胞から容易に精製され得る。そのような系において作製されたタンパク質は、ヘパリン、トロンビン、または第ＸＡ因子プロテアーゼ切断部位を含むように設計され得、その結果、クローニングされた目的のポリペプチドが、随意にＧＳＴ部分から放出され得る。
【０５４２】
酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）において、構成的プロモーターまたは誘導性プロモーター（例えば、α因子、アルコールオキシダーゼおよびＰＧＨ）を含む多数のベクターが使用され得る。概説については、Ａｕｓｕｂｅｌら、（前出）およびＧｒａｎｔら、（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５３：５１６−５４４を参照のこと。
【０５４３】
植物発現ベクターを使用する場合において、ポリペプチドをコードする配列の発現は、任意の多数のプロモーターにより駆動され得る。例えば、ウイルスプロモーター（例えば、ＣａＭＶの３５Ｓプロモーターおよび１９Ｓプロモーター）は、単独でか、またはＴＭＶに由来するωリーダー配列と組み合わせて使用され得る（Ｔａｋａｍａｔｓｕ，Ｎ．（１９８７）ＥＭＢＯ  Ｊ．６：３０７−３１１）。あるいは、植物プロモーター（例えば、ＲＵＢＩＳＣＯの小サブユニットまたは熱ショックプロモーター）を使用し得る（Ｃｏｒｕｚｚｉ，Ｇ．ら、（１９８４）ＥＭＢＯ  Ｊ．３：１６７１−１６８０；Ｂｒｏｇｌｉｅ，Ｒ．ら、（１９８４）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２４：８３８−８４３；およびＷｉｎｔｅｒ，Ｊら、（１９９１）Ｒｅｓｕｌｔｓ  Ｐｒｏｂｌ．Ｃｅｌｌ  Ｄｉｆｆｅｒ．１７：８５−１０５）。これらの構築物は、直接的ＤＮＡ形質転換または病原体媒介性トランスフェクションによって植物細胞内に導入され得る。そのような技術は、多数の一般的に入手可能な概説に記載されている（例えば、Ｈｏｂｂｓ，Ｓ．またはＭｕｒｒｙ，Ｌ．Ｅ．，ＭｃＧｒａｗ  Ｈｉｌｌ  Ｙｅａｒｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９９２）ＭｃＧｒａｗ  Ｈｉｌｌ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．；１９１−１９６頁を参照のこと）。
【０５４４】
昆虫系はまた、目的のポリペプチドを発現させるために使用され得る。例えば、そのような１つの系において、オートグラファカリフォルニア核発汗病ウイルス（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓ  ｖｉｒｕｓ）（ＡｃＮＰＶ）は、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞またはＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｌａｒｖａｅにおいて外来遺伝子を発現させるベクターとして使用される。ポリペプチドをコードする配列は、ウイルスの非必須領域内（例えば、ポリへドリン（ｐｏｌｙｈｅｄｒｉｎ）遺伝子）にクローニングされ得て、ポリへドリンプロモーターの制御下に置かれ得る。ポリペプチドコード配列の首尾良い挿入は、ポリへドリン遺伝子を不活性化し、そしてコートタンパク質を欠損している組換えウイルスを産生する。次いで、この組換えウイルスを使用して、例えば、目的のポリペプチドが発現され得る、Ｓ．ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞またはＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｌａｒｖａｅに感染させ得る（Ｅｎｇｅｌｈａｒｄ，Ｅ．Ｋ．ら、（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９１：３２２４−３２２７）。
【０５４５】
哺乳動物宿主細胞において、多数のウイルスベースの発現系が一般的に利用可能である。例えば、アデノウイルスが発現ベクターとして使用される場合において、目的のポリペプチドをコードする配列は、後期プロモーターおよび３部からなるリーダー配列から構成されるアデノウイルス転写／翻訳複合体内に連結され得る。ウイルスゲノムの非必須Ｅ１またはＥ３領域における挿入を使用して、感染した宿主細胞においてポリペプチドを発現し得る、生存可能ウイルスを入手し得る（Ｌｏｇａｎ，Ｊ．およびＳｈｅｎｋ，Ｔ．（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８１：３６５５−３６５９）。さらに、転写エンハンサー（例えば、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）エンハンサー）を使用して、哺乳動物宿主細胞における発現を増加させ得る。
【０５４６】
特定の開始シグナルはまた、目的のポリペプチドをコードする配列のより効率的な翻訳を達成するために使用され得る。そのようなシグナルとしては、ＡＴＧ開始コドンおよび隣接配列が挙げられる。ポリペプチドをコードする配列、その開始コドンおよび上流配列が適切な発現ベクター内に挿入される場合において、さらなる転写制御シグナルまたは翻訳制御シグナルは必要とされなくとも良い。しかし、コード配列のみ、またはその一部のみが挿入される場合、ＡＴＧ開始コドンを含む外因性翻訳制御シグナルが提供されるべきである。さらに、開始コドンは、インサート全体の翻訳を確実にするために、正確なリーディングフレーム内にあるべきである。外因性翻訳エレメントおよび開始コドンは、種々の起源（天然および合成の両方）に由来し得る。発現の効率は、使用される特定の細胞系に適切なエンハンサー（例えば、文献（Ｓｃｈａｒｆ，Ｄ．ら、（１９９４）Ｒｅｓｕｌｔｓ  Ｐｒｏｂｌ．Ｃｅｌｌ  Ｄｉｆｆｅｒ．２０：１２５−１６２）に記載されるエンハンサー）の封入によって増大され得る。
【０５４７】
さらに、宿主細胞株は、挿入された配列の発現を調節するか、または所望の様式において発現されたタンパク質をプロセシングするその能力について選択され得る。ポリペプチドのそのような改変としては、アセチル化、カルボキシル化、グリコシル化、リン酸化、リピデーション（ｌｉｐｉｄａｔｉｏｎ）およびアシル化が挙げられるが、これらに限定されない。タンパク質の「プレプロ」形態を切断する翻訳後プロセシングはまた、正確な挿入、折り畳みおよび／または機能を促進させるために使用され得る。異なる宿主細胞（例えば、ＣＨＯ、ＣＯＳ、ＨｅＬａ、ＭＤＣＫ、ＨＥＫ２９３およびＷＩ３８）（これらは、そのような翻訳後活性についての特定の細胞機構（ｍａｃｈｉｎｅｒｙ）および特徴的機構（ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ）を有する）は、正確な改変および外来タンパク質のプロセシングを確実にするように選択され得る。
【０５４８】
長期間の組換えタンパク質の高収率の産生のために、安定な発現が一般的に好ましい。例えば、目的のポリヌクレオチドを安定に発現する細胞株が、ウイルス複製起点および／または内因性発現エレメントならびに同じかもしくは別個のベクター上の選択マーカー遺伝子を含み得る、発現ベクターを使用して形質転換され得る。そのベクターの導入後、細胞は、それらが選択培地に切換えられる前に、富化（ｅｎｒｉｃｈｅｄ）培地において１〜２日間の増殖が可能とされ得る。選択マーカーの目的は、選択に対する耐性を与えることであり、そしてその存在は、導入された配列を首尾良く発現する細胞の増殖および回収を可能とする。安定に形質転換された細胞の耐性クローンは、その細胞型に適切な組織培養技術を使用して、増殖され得る。
【０５４９】
多数の選択系を使用して、形質転換細胞株を回収し得る。これらの選択系としては、それぞれ、ｔｋ．ｓｕｐ．−細胞またはａｐｒｔ．ｓｕｐ−細胞において使用され得る、単純疱疹ウイルスチミジンキナーゼ（Ｗｉｇｌｅｒ，Ｍ．ら、（１９７７）Ｃｅｌｌ  １１：２２３−３２）およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｌｏｗｙ，Ｉ．ら、（１９９０）Ｃｅｌｌ  ２２：８１７−２３）遺伝子が挙げられるが、これらに限定されない。また、代謝拮抗剤耐性、抗生物質耐性または除草剤耐性は、選択のための基礎として使用され得る；例えば、ｄｈｆｒ（これは、メトトレキセートに対する耐性を与える（Ｗｉｇｌｅｒ，Ｍ．ら、（１９８０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７７：３５６７−７０））；ｎｐｔ（これは、アミノグリコシド、ネオマイシンおよびＧ−４１８に対する耐性を与える（Ｃｏｌｂｅｒｅ−Ｇａｒａｐｉｎ，Ｆ．ら、（１９８１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５０：１−１４））；ならびにａｌｓまたはｐａｔ（これらは、それぞれ、クロルスルフロンおよびホスフィノスリシンアセチルトランスフェラーゼに対する耐性を与える（Ｍｕｒｒｙ、前出））。さらなる選択遺伝子が記載されている。例えば、ｔｒｐＢ（これは、細胞がトリプトファンの代わりにインドールを利用することを可能にする）またはｈｉｓＤ（これは、細胞がヒスチジンの代わりにヒスチノールを利用することを可能にする）（Ｈａｒｔｍａｎ，Ｓ．Ｃ．およびＲ．Ｃ．Ｍｕｌｌｉｇａｎ（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８５：８０４７−５１）。最近、アントシアニン、β−グルクロニダーゼおよびその基質のＧＵＳ、ならびにルシフェラーゼおよびその基質のルシフェリンのようなマーカーを用いる、可視マーカーの使用の人気が高くなっており、形質転換体を同定するためのみならず、特定のベクター系に起因し得る一過性のタンパク質発現または安定なタンパク質発現の量を定量するためにもまた広範に使用されている（Ｒｈｏｄｅｓ，Ｃ．Ａ．ら、（１９９５）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．５５：１２１−１３１）。
【０５５０】
マーカー遺伝子発現の存在／非存在は、目的の遺伝子もまた存在するということを示唆しているが、その存在および発現は、確認されることを必要とし得る。例えば、ポリペプチドをコードする配列が、マーカー遺伝子配列内に挿入される場合、配列を含む組換え細胞は、マーカー遺伝子機能の非存在により同定され得る。あるいは、マーカー遺伝子は、１つのプロモーターの制御下にポリペプチドコード配列と直列に配置され得る。誘導または選択に応じてのマーカー遺伝子の発現は、通常、その直列遺伝子の発現も同様に示す。
【０５５１】
あるいは、所望のポリヌクレオチド配列を含み、かつ発現する宿主細胞は、当業者に公知の種々の手順によって同定され得る。これらの手順としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：核酸またはタンパク質の検出および／または定量化のための膜ベースの技術、溶液ベースの技術、またはチップベースの技術を含む、ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーション技術もしくはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリダイゼーション技術およびタンパク質バイオアッセイ技術またはイムノアッセイ技術。
【０５５２】
ポリヌクレオチドコード化産物に特異的なポリクローナル抗体もしくはモノクローナル抗体のいずれかを使用して、ポリヌクレオチドコード化産物の発現を検出および測定するための種々のプロトコルは、当該分野において公知である。例としては、酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）および蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）が挙げられる。所定のポリペプチド上の２つの非干渉性エピトープに対して反応性であるモノクローナル抗体を利用する２つの部位の、モノクローナルベースのイムノアッセイが、いくつかの適用のために好まれ得るが、競合的結合アッセイもまた、利用され得る。これらのアッセイおよび他のアッセイは、とりわけＨａｍｐｔｏｎ，Ｒ．ら、（１９９０；Ｓｅｒｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，ＡＰＳ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓｔ  Ｐａｕｌ．Ｍｉｎｎ．）およびＭａｄｄｏｘ，Ｄ．Ｅ．ら、（１９８３；Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１５８：１２１１−１２１６）に記載される。
【０５５３】
広範に種々の標識技術および結合技術は、当業者に公知であり、そして種々の核酸アッセイおよびアミノ酸アッセイにおいて使用され得る。ポリヌクレオチドに関連する配列を検出するための標識されたハイブリダイゼーションまたはＰＣＲプローブを作製するための手段としては、オリゴ標識（ｏｌｉｇｏｌａｂｅｌｉｎｇ）、ニックトランスレーション、末端標識または標識されたヌクレオチドを使用するＰＣＲ増幅が挙げられる。あるいは、ｍＲＮＡプローブの産生のために、配列またはその任意の部分が、ベクター内にクローニングされ得る。そのようなベクターは、当該分野において公知であり、市販されており、そして適切なＲＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｔ７、Ｔ３、またはＳＰ６）および標識されたヌクレオチドを添加することにより、ＲＮＡプローブをインビトロで合成するために使用され得る。これらの手順は、種々の市販キットを使用して実施され得る。使用され得る適切なレポーター分子または標識としては、放射性核種、酵素、蛍光、化学発光、または色素形成剤ならびに基質、コファクター（補助因子）、インヒビター、磁気粒子などが挙げられる。
【０５５４】
目的のポリヌクレオチド配列で形質転換された宿主細胞は、タンパク質の発現および細胞培養物からの回収に適した条件下において培養され得る。組換え細胞により産生されたタンパク質は、使用された配列および／またはベクターに依存して、細胞内に分泌され得るかまたは含まれ得る。当業者によって理解されるように、本発明のポリヌクレオチドを含む発現ベクターは、原核細胞膜または真核細胞膜を介して、コードされたポリペプチドの分泌を指向するシグナル配列を含むように設計され得る。他の組換え構築物を使用して、目的のポリペプチドをコードする配列を、可溶性タンパク質の精製を促進するポリペプチドドメインをコードするヌクレオチド配列に結合させ得る。そのような精製促進ドメインとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：固定された金属上での精製を可能にする金属キレート化ペプチド（例えば、ヒスチジン−トリプトファンモジュール）、固定された免疫グロブリン上での精製を可能にするプロテインＡドメイン、およびＦＬＡＧＳ伸長／アフィニティー精製システム（Ｉｍｍｕｎｅｘ  Ｃｏｒｐ．，Ｓｅａｔｔｌｅ，Ｗａｓｈ．）において利用されるドメイン。精製ドメインとコードされるポリペプチドとの間への、切断可能なリンカー配列（例えば、第ＸＡ因子またはエンテロキナーゼに対して特異的な配列（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ．Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．））の封入を使用して、精製を促進させ得る。そのような発現ベクターの１つは、目的のポリペプチドを含む融合タンパク質およびチオレドキシンまたはエンテロキナーゼ切断部位の前に６つのヒスチジン残基をコードする核酸の発現を提供する。ヒスチジン残基は、Ｐｏｒａｔｈ，Ｊ．ら、（１９９２、Ｐｒｏｔ．Ｅｘｐ．Ｐｕｒｉｆ．３：２６３−２８１）に記載されるように、ＩＭＩＡＣ（固定化金属イオンアフィニティークロマトグラフィー）上での精製を促進する一方で、エンテロキナーゼ切断部位は、融合タンパク質から所望のポリペプチドを精製するための手段を提供する。融合タンパク質を含むベクターの考察は、Ｋｒｏｌｌ，Ｄ．Ｊ．ら、（１９９３；ＤＮＡ  Ｃｅｌｌ  Ｂｏｉｌ．１２：４４１−４５３）において提供される。
【０５５５】
組換え産生方法に加えて、本発明のポリペプチドおよびそのフラグメントは、固相技術（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ  Ｊ．（１９６３）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５：２１４９−２１５４）を使用する、直接的ペプチド合成によって産生され得る。タンパク質合成は、手動技術を使用してか、または自動化によって実施され得る。自動化合成は、例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ４３１Ａペプチド合成装置（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を使用して、達成され得る。あるいは、種々のフラグメントは、別々に化学的に合成されて、そして全長分子を産生するために化学的方法を使用して組み合わせられ得る。
【０５５６】
（部位特異的変異誘発）
部位特異的変異誘発は、個々のペプチド、または生物学的に機能的等価なポリペプチドの調製の際に有用な技術であり、この変異誘発は、それらをコードする、基礎を成すポリヌクレオチドの特異的変異誘発を介する。当業者に周知の技術は、例えば、前述の考察の１つ以上を取り入れながら、１つ以上のヌクレオチド配列変化をＤＮＡ内に導入することによって配列改変体を調製し、そして試験する迅速な能力をさらに提供する。部位特異的変異誘発は、所望の変異のＤＮＡ配列をコードする特定のオリゴヌクレオチド配列ならびに十分な数の隣接ヌクレオチドの使用を介して変異体の産生を可能にし、横断される欠失結合部の両側に安定な二重鎖を形成するために、十分なサイズおよび配列複雑性のプライマー配列を提供する。変異は、ポリヌクレオチド自体の特性を改善するか、変更するか、減少させるか、修飾するか、さもなくば変化させるため、そして／またはコードされたポリペプチドの特性、活性、組成、安定性または一次配列を変更するために、選択されたポリヌクレオチド配列において使用され得る。
【０５５７】
本発明の特定の実施形態において、本発明者らは、コードされたポリペプチドの１つ以上の特性（例えば、ポリペプチドワクチンの抗原性）を変更するような、開示されたポリヌクレオチド配列の変異誘発を意図する。部位特異的変異誘発の技術は、当該分野に周知であり、ポリペプチドおよびポリヌクレオチドの両方の改変体を作製するために広範に使用される。例えば、部位特異的変異誘発は、しばしば、ＤＮＡ分子の特定部分を変更するために使用される。このような実施形態において、代表的に約１４ヌクレオチド長〜約２５ヌクレオチド長程度の長さを含むプライマーが使用され、配列の連結部の両側にある、約５残基〜約１０残基が変更される。
【０５５８】
当業者によって理解されるように、部位特異的変異誘発技術は、しばしば、一本鎖形態および二本鎖形態の両方で存在するファージベクターを使用してきた。部位特異的変異誘発において有用である代表的なベクターとしては、Ｍ１３ファージのようなベクターが挙げられる。これらのファージは、容易に商業的に入手可能であり、そしてそれらの使用は、一般的に当業者に周知である。二本鎖プラスミドもまた、目的の遺伝子をプラスミドからファージに転移する工程を除去する部位特異的変異誘発において慣用的に使用される。
【０５５９】
一般的に、本明細書に従う部位特異的変異誘発は、所望のペプチドをコードするＤＮＡ配列をその配列中に含む一本鎖ベクターを最初に入手する工程、またはこの配列を含む二本鎖ベクターの２本の鎖を融解して分ける工程によって実行される。所望の変異配列を保有するオリゴヌクレオチドプライマーは、一般的に、合成的に調製される。次いで、このプライマーは、一本鎖ベクターとともにアニーリングされ、そして変異を保有する鎖の合成を完了するために、ＤＮＡ重合酵素（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉポリメラーゼＩ  Ｋｌｅｎｏｗフラグメント）に供される。このようにヘテロ二重鎖が形成され、ここで一方の鎖が変異を有さないもともとの配列をコードし、そして２つめの鎖は所望の変異を保有する。次いで、このヘテロ二重鎖ベクターは、適切な細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞）を形質転換するために使用され、そして、変異した配列配置を保有する組換えベクターを含むクローンが選択される。
【０５６０】
部位特異的変異誘発を使用する、選択されたペプチドコードＤＮＡセグメントの配列改変体の調製は、潜在的に有用な種を産生する手段を提供し、そしてこれは、限定を意味するものではない。なぜなら、ペプチドの配列改変体およびそれらをコードするＤＮＡ配列を入手し得る他の方法が存在するからである。例えば、所望のペプチド配列をコードする組換えベクターは、変異誘発剤（例えば、ヒドロキシルアミン）で処理されて、配列改変体を入手し得る。これらの方法およびプロトコルに関する具体的な詳細は、Ｍａｌｏｙら、１９９４；Ｓｅｇａｌ、１９７６；ＰｒｏｋｏｐおよびＢａｊｐａｉ、１９９１；Ｋｕｂｙ、１９９４；およびＭａｎｉａｔｉｓら、１９８２（各々がその目的のために本明細書中に参考として援用される）の教示において見出され得る。
【０５６１】
本明細書中で使用される場合、用語「オリゴヌクレオチド特異的変異誘発手順」とは、テンプレート（鋳型）依存的プロセスおよびベクター媒介性増殖をいい、これは、その初期の濃度と比較して、特定の核酸分子の濃度の増加を生じるか、または検出可能なシグナルの濃度の増加（例えば、増幅）を生じる。本明細書中で使用される場合、用語「オリゴヌクレオチド特異的変異誘発手順」は、プライマー分子の鋳型依存的な伸長を含むプロセスをいうことが意図される。用語、鋳型依存的プロセスとは、新規に合成された核酸の鎖の配列は、相補的塩基対形成の周知の規則によって指示されるＲＮＡ分子またはＤＮＡ分子の核酸合成をいう（例えば、Ｗａｔｓｏｎ、１９８７を参照のこと）。代表的には、ベクター媒介性の方法論は、ＤＮＡまたはＲＮＡベクターへの核酸フラグメントの導入、ベクターのクローン性増幅、および増幅した核酸フラグメントの回収を包含する。このような方法論の例は、その全体が具体的に参考として本明細書中に援用される、米国特許第４，２３７，２２４号によって提供される。
【０５６２】
（ポリヌクレオチド増幅技術）
多数のテンプレート依存性プロセスが、サンプル中に存在する目的の標的配列を増幅するために利用可能である。最もよく知られた増幅方法の１つは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲＴＭ）であり、これは、米国特許第４，６８３，１９５号、同第４，６８３，２０２号、および同第４，８００，１５９号に詳細に記載され、これらの各々はその全体が本明細書中に参考として援用される。手短に言えば、ＰＣＲＴＭにおいては、標的配列の向かい合った相補鎖上の領域に対して相補的な２つのプライマー配列が調製される。過剰のデオキシヌクレオシド三リン酸を、ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｔａｑポリメラーゼ）とともに反応混合液に添加する。標的配列がサンプル中に存在する場合、プライマーはその標的に結合し、そしてポリメラーゼが、ヌクレオチドを付加することによって標的配列に沿ってプライマーを伸長させる。反応混合液の温度を上昇および下降させることによって、伸長したプライマーは、標的から解離して反応生成物を形成し、過剰のプライマーは標的および反応生成物に結合し、そしてこのプロセスが反復される。好ましくは、逆転写およびＰＣＲＴＭ増幅手順が、増幅されたｍＲＮＡの量を定量するために実行され得る。ポリメラーゼ連鎖反応方法論は、当該分野で周知である。
【０５６３】
増幅のための別の方法は、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲといわれる）であり、欧州特許出願公開番号３２０，３０８（その全体が特に本明細書中に参考として援用される）において開示されている。ＬＣＲにおいては、２つの相補的プローブ対が調製され、そして標的配列の存在下では、各対がその標的の向かい合った相補鎖に結合し、その結果、それらは隣接する。リガーゼの存在下では、これらの２つのプローブ対は、連結して１つの単位を形成する。温度サイクリングによって、ＰＣＲＴＭにおけるのと同様に、結合した連結単位は標的から解離し、次いで過剰のプローブ対の連結のための「標的配列」として働く。米国特許第４，８８３，７５０号（その全体が参考として本明細書中に援用される）は、標的配列に対するプローブ対の結合のためのＬＣＲに類似する増幅の代替方法を記載する。
【０５６４】
Ｑβレプリカーゼ（ＰＣＴ国際特許出願公開番号ＰＣＴ／ＵＳ８７／００８８０に記載され、その全体が参考として本明細書中に援用される）もまた、本発明におけるなお別の増幅方法として使用され得る。この方法において、標的の配列に相補的な領域を有するＲＮＡの複製配列が、ＲＮＡポリメラーゼの存在下でサンプルに添加される。このポリメラーゼは、次いで検出され得る複製配列をコピーする。
【０５６５】
等温増幅方法（ここで、制限エンドヌクレアーゼおよびリガーゼを使用して、制限部位の一方の鎖におけるヌクレオチド５’−［α−チオ］三リン酸を含む標的分子の増幅を達成する（Ｗａｌｋｅｒら、１９９２、その全体が参考として本明細書中に援用される））もまた、本発明における核酸の増幅において有用であり得る。
【０５６６】
鎖置換増幅（Ｓｔｒａｎｄ  Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）（ＳＤＡ）は、複数のラウンドの鎖置換および合成（すなわち、ニックトランスレーション）を含む核酸の等温増幅を実行する別の方法である。同様の方法（修復鎖反応（Ｒｅｐａｉｒ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）（ＲＣＲ）と呼ばれる）は、本発明において有用であり得る別の増幅方法であり、そして増幅のために標的化される領域全体にわたっていくつかのプローブをアニーリングする工程、続いて４塩基のうちの２塩基のみが存在する修復反応を包含する。他の２塩基は、容易な検出のためにビオチン化誘導体として添加され得る。同様のアプローチは、ＳＤＡにおいて使用される。
【０５６７】
配列はまた、周期的プローブ反応（ｃｙｃｌｉｃ  ｐｒｏｂｅ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）（ＣＰＲ）を使用して検出され得る。ＣＰＲにおいて、非標的ＤＮＡの３’配列および５’配列ならびに標的タンパク質特異的ＲＮＡの内部または「中間」配列を有するプローブは、サンプル中に存在するＤＮＡにハイブリダイズされる。ハイブリダイゼーションに際して、反応物はＲＮａｓｅＨで処理され、そしてプローブの生成物は、消化後に遊離されるシグナルを生成することによって特有の産物として同定される。もともとのテンプレートは、別のサイクリングプローブにアニーリングされ、そして反応が反復される。従って、ＣＰＲは、標的遺伝子特異的な発現した核酸に対するプローブのハイブリダイゼーションによって生成されるシグナルを増幅する工程を包含する。
【０５６８】
英国特許出願番号２  ２０２  ３２８号およびＰＣＴ国際特許出願公開番号ＰＣＴ／ＵＳ８９／０１０２５（これらの各々はその全体が本明細書中に参考として援用される）に記載されるなお他の増幅方法は、本発明に従って使用され得る。前者の出願において、「修飾された」プライマーが、ＰＣＲ様のテンプレートおよび酵素依存性合成において使用される。そのプライマーは、捕獲部分（例えば、ビオチン）および／または検出体部分（例えば、酵素）で標識することによって修飾され得る。後者の出願において、過剰の標識したプローブがサンプルに添加される。標的配列の存在下において、プローブが結合し、そして触媒的に切断される。切断後、標的配列は、過剰のプローブによって結合されるためにインタクトで遊離される。標識されたプローブの切断は、標的配列の存在をシグナルによって示す。
【０５６９】
他の核酸増幅手順には、転写に基づく増幅系（ＴＡＳ）（Ｋｗｏｈら、１９８９；ＰＣＴ国際特許出願公開番号ＷＯ  ８８／１０３１５（その全体が本明細書中に参考として援用される））が挙げられ、これには、核酸配列に基づく増幅（ＮＡＳＢＡ）および３ＳＲが含まれる。ＮＡＳＢＡにおいて、核酸は、標準的なフェノール／クロロホルム抽出、サンプルの熱変性、溶解緩衝液を用いる処理、ならびにＤＮＡおよびＲＮＡの単離のためのミニスピンカラムまたはＲＮＡの塩化グアニジウム抽出によって、増幅のために調製され得る。これらの増幅技術は、標的配列に特異的な配列を有するプライマーをアニーリングさせる工程を包含する。重合後、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドはＲＮａｓｅＨで消化され、一方、二本鎖ＤＮＡ分子は再度熱変性される。いずれの場合においても、一本鎖ＤＮＡは重合の前の第２の標的特異的プライマーの添加によって完全に二本鎖にされる。次いで、二本鎖ＤＮＡ分子は、ポリメラーゼ（例えば、Ｔ７またはＳＰ６）によって相乗的に転写される。等温サイクル反応において、ＲＮＡはＤＮＡに逆転写され、そして再度ポリメラーゼ（例えば、Ｔ７またはＳＰ６）を用いて転写される。得られる生成物は、短縮型または完全型のいずれにせよ、標的特異的配列を示す。
【０５７０】
欧州特許出願公開番号３２９，８２２（その全体が本明細書中に参考として援用される）は、一本鎖ＲＮＡ（「ｓｓＲＮＡ」）、ｓｓＤＮＡ、および二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）（これらは、本発明に従って使用され得る）をサイクル的に合成する工程を包含する核酸増殖プロセスを開示する。ｓｓＲＮＡは、第１のプライマーオリゴヌクレオチド（これは、逆転写酵素（ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ）によって伸長される）のための最初のテンプレートである。次いで、ＲＮＡは、得られるＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖からリボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅＨ、ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれかとの二重鎖のＲＮＡに特異的なＲＮａｓｅ）の作用によって除去される。得られたｓｓＤＮＡは、第２のプライマーのための第２のテンプレート（これはまた、そのテンプレートに対するその相同性に対して５’側であるＲＮＡポリメラーゼプロモーター（Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼによって例示される）の配列を含む）である。次いで、このプライマーは、ＤＮＡポリメラーゼ（Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡポリメラーゼＩの大きな「クレノウ（Ｋｌｅｎｏｗ）」フラグメントによって例示される）によって伸長され、プライマー間にもともとのＲＮＡの配列と同一の配列を有し、かつ一方の端にプロモーター配列をさらに有する二本鎖ＤＮＡ（「ｄｓＤＮＡ」）分子として得られる。このプロモーター配列は、ＤＮＡの多くのＲＮＡコピーを作製するために適切なＲＮＡポリメラーゼによって使用され得る。次いで、これらのコピーはサイクルに再び入り得、非常に迅速な増幅をもたらす。酵素の適切な選択を用いて、この増殖は、各サイクルで酵素の添加なしに等温で行われ得る。このプロセスのサイクル性の性質のために、開始配列は、ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれかの形態であるように選択され得る。
【０５７１】
ＰＣＴ国際特許出願公開番号ＷＯ  ８９／０６７００（その全体が本明細書中で参考として援用される）は、プロモーター／プライマー配列の多くのＲＮＡコピーの転写の前の、プロモーター／プライマー配列の標的一本鎖ＤＮＡ（「ｓｓＤＮＡ」）へのハイブリダイゼーションに基づく核酸配列増幅スキームを開示する。このスキームは、サイクル性ではない；すなわち、新しいテンプレートは、得られたＲＮＡ転写物から産生されない。他の増幅方法には、「ＲＡＣＥ」（Ｆｒｏｈｍａｎ、１９９０）および「片側（ｏｎｅ−ｓｉｄｅｄ）ＰＣＲ（Ｏｈａｒａ、１９８９）」が挙げられ、これらは当業者に周知である。
【０５７２】
生じる「ジ−オリゴヌクレオチド」の配列を有し、それによってジ−オリゴヌクレオチドを増幅する核酸の存在下での２つ（または２より多い）のオリゴヌクレオチドの連結に基づく方法（ＷｕおよびＤｅａｎ、１９９６、その全体が参考として本明細書中に援用される）もまた、本発明のＤＮＡ配列の増幅において使用され得る。
【０５７３】
（生物学的機能的等価物）
修飾および変化が、本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドの構造においてなされ得、そしてなお、所望の特性を有するポリペプチドをコードする機能的分子を入手し得る。上述のように、特定のポリヌクレオチド配列に１以上の変異を導入することがしばしば所望される。特定の状況において、得られるコードされたポリペプチド配列はこの変異によって変更されるか、または他の場合において、このポリペプチドの配列は、コードするポリヌクレオチドにおける１以上の変異によっては変化しない。
【０５７４】
等価物、または改善された第２世代の分子でさえも作製するために、ポリペプチドのアミノ酸配列を変化させることが所望される場合、このアミノ酸の変化は、表１に従ってＤＮＡ配列をコードするコドンの１以上を変化させることによって達成され得る。
【０５７５】
例えば、特定のアミノ酸は、例えば、抗体の抗原結合領域または基質分子上のの結合部位のような構造を有するタンパク質構造中の他のアミノ酸に、容易に感知できる程度の相互作用的な結合能の損失なしで、置換され得る。タンパク質の相互作用的な能力および性質がタンパク質の生物学的機能的活性を規定するので、特定のアミノ酸配列置換は、タンパク質配列、および当然ながら、その根底にあるＤＮＡコード配列においてなされ得、そしてそれにも関わらず、同様の特性を有するタンパク質が入手される。従って、種々の変化が、ペプチドの生物学的有用性または活性の感知できる程度の損失なしで、開示された組成物のペプチド配列またはそのペプチドをコードする対応するＤＮＡ配列においてなされ得ることが本発明者らによって意図される。
【０５７６】
【表１】
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このような変化を作製する際に、アミノ酸の疎水性親水性指標が考慮され得る。タンパク質に相互作用的な生物学的機能を付与する際の疎水性親水性アミノ酸指標の重要性は、一般的に当該分野において理解されている（ＫｙｔｅおよびＤｏｏｌｉｔｔｌｅ、１９８２、本明細書中に参考として援用される）。アミノ酸の相対的な疎水性親水性的性質は、得られるタンパク質の二次構造に寄与し、これが次に、他の分子（例えば、酵素、基質、レセプター、ＤＮＡ、抗体、抗原など）とのそのタンパク質の相互作用を規定することが受け入れられている。各アミノ酸は、その疎水性および電荷特性に基づいて疎水性親水性指標を割り当てられている（ＫｙｔｅおよびＤｏｏｌｉｔｔｌｅ、１９８２）。これらの値は以下である：イソロイシン（＋４．５）；バリン（＋４．２）；ロイシン（＋３．８）；フェニルアラニン（＋２．８）；システイン／シスチン（＋２．５）；メチオニン（＋１．９）；アラニン（＋１．８）；グリシン（−０．４）；スレオニン（−０．７）；セリン（−０．８）；トリプトファン（−０．９）；チロシン（−１．３）；プロリン（−１．６）；ヒスチジン（−３．２）；グルタミン酸（−３．５）；グルタミン（−３．５）；アスパラギン酸（−３．５）；アスパラギン（−３．５）；リジン（−３．９）；およびアルギニン（−４．５）。
【０５７７】
特定のアミノ酸が類似の疎水性親水性指標またはスコアを有する他のアミノ酸によって置換され得、そしてなお類似の生物学的活性を有するタンパク質を生じる（すなわち、生物学的に機能的に等価なタンパク質をなお入手する）ことが、当該分野において公知である。このような変化を作製する際に、その疎水性親水性指標が±２以内であるアミノ酸の置換が好ましく、その疎水性親水性指標が±１以内であるアミノ酸の置換が特に好ましく、そしてその疎水性親水性指標が±０．５以内であるアミノ酸の置換がなおより特に好ましい。同様なアミノ酸の置換が、親水性に基づいて有効になされ得ることもまた、当該分野で理解されている。米国特許第４，５５４，１０１号（その全体が本明細書中に参考として詳細に援用される）は、そのタンパク質の最大局所的平均親水性が、その隣接するアミノ酸の親水性によって支配されるので、そのタンパク質の生物学的特性と相関することを言及している。
【０５７８】
米国特許第４，５５４，１０１号に詳述されるように、以下の親水性値がアミノ酸残基に割り当てられた：アルギニン（＋３．０）；リジン（＋３．０）；アスパラギン酸（＋３．０±１）；グルタミン酸（＋３．０±１）；セリン（＋０．３）；アスパラギン（＋０．２）；グルタミン（＋０．２）；グリシン（０）；スレオニン（−０．４）；プロリン（−０．５±１）；アラニン（−０．５）；ヒスチジン（−０．５）；システイン（−１．０）；メチオニン（−１．３）；バリン（−１．５）；ロイシン（−１．８）；イソロイシン（−１．８）；チロシン（−２．３）；フェニルアラニン（−２．５）；トリプトファン（−３．４）。アミノ酸は、類似の親水性の値を有する別のアミノ酸に置換され得、そしてなお、生物学的な等価物（特に、免疫学的に等価なタンパク質）を得ることが理解される。このような変化において、その親水性値が±２以内であるアミノ酸の置換が好ましく、その親水性値が±１以内であるアミノ酸の置換が特に好ましく、そしてその親水性値が±０．５以内であるアミノ酸の置換がなおより特に好ましい。
【０５７９】
上記で概説したように、従って、アミノ酸置換は、一般的にアミノ酸側鎖置換基の相対的な類似性（例えば、その疎水性、親水性、電荷、大きさ、など）に基づく。前述の種々の特徴を考慮する典型的な置換は当業者に周知であり、そして以下を含む：アルギニンおよびリジン；グルタミン酸およびアスパラギン酸；セリンおよびスレオニン；グルタミンおよびアスパラギン；ならびにバリン、ロイシン、およびイソロイシン。
【０５８０】
さらに、任意のポリヌクレオチドが、インビボでの安定性を増加させるためにさらに改変され得る。可能性のある改変として以下が挙げられるがこれらに限定されない：５’末端および／または３’末端での隣接配列の付加；骨格におけるホスホジエステラーゼ結合ではなくホスホロチオエートまたは２’Ｏ−メチルの使用；ならびに／あるいは従来とは異なる塩基（例えば、イノシン、キューオシン、およびワイブトシン、ならびにアデニン、シチジン、グアニン、チミン、およびウリジンのアセチル、メチル、チオ、および他の修飾形態）の含有。
【０５８１】
（インビボポリヌクレオチド送達技術）
さらなる実施形態において、本発明のポリヌクレオチドの１以上を含む遺伝子構築物は、インビボで細胞に導入される。これは、種々のまたは周知のアプローチのいずれかを用いて達成され得、これらのいくつかは、例示の目的で以下に概説される。
【０５８２】
（１．アデノウイルス）
１以上の核酸配列のインビボ送達のための好ましい方法の１つは、アデノウイルス発現ベクターの使用を包含する。「アデノウイルス発現ベクター」は、（ａ）この構築物のパッケージングを支持するため、および（ｂ）センス方向またはアンチセンス方向でその中にクローニングされたポリヌクレオチドを発現するため、に十分なアデノウイルス配列を含む構築物を含むことを意味する。当然のことながら、アンチセンス構築物の文脈において、発現は、遺伝子産物が合成されることを必要としない。
【０５８３】
発現ベクターは、アデノウイルスの遺伝子操作された形態を含む。アデノウイルスの遺伝的構成の知見（３６ｋｂ、線状、二本鎖ＤＮＡウイルス）は、７ｋｂまでの外来性配列でアデノウイルスＤＮＡの大きな断片を置換することを可能にする（ＧｒｕｎｈａｕｓおよびＨｏｒｗｉｔｚ、１９９２）。レトロウイルスとは対照的に、宿主細胞のアデノウイルス感染は、染色体への組込みを生じない。なぜなら、アデノウイルスＤＮＡは、潜在的な遺伝毒性を有さないエピソーム性様式で複製し得るからである。また、アデノウイルスは構造的に安定であり、そして大規模な増幅後にゲノム再構成は検出されなかった。アデノウイルスは、細胞の細胞周期段階に関わりなく、実質的に全ての上皮細胞に感染し得る。今日まで、アデノウイルス感染は、穏やかな疾患（例えば、ヒトの急性呼吸器疾患）にのみに関連しているようである。
【０５８４】
アデノウイルスは、その中程度のサイズのゲノム、操作の容易さ、高い力価、広範な標的−細胞範囲、および高い感染力のため、遺伝子移入ベクターとしての使用のために特に適している。ウイルスゲノムの両端は１００〜２００塩基対の逆方向反復（ＩＴＲ）を含み、これらは、ウイルスＤＮＡの複製およびパッケージングに必要なシスエレメントである。ゲノムの初期（Ｅ）領域および後期（Ｌ）領域は、異なる転写単位を含み、これは、ウイルスＤＮＡ複製の開始によって分裂する。Ｅ１領域（Ｅ１ＡおよびＥ１Ｂ）は、ウイルスゲノムおよびいくつかの細胞遺伝子の転写の調節の原因であるタンパク質をコードする。Ｅ２領域（Ｅ２ＡおよびＥ２Ｂ）の発現は、ウイルスＤＮＡ複製のためのタンパク質の合成を生じる。これらのタンパク質は、ＤＮＡ複製、後期遺伝子発現、および宿主細胞シャットオフに関与する（Ｒｅｎａｎ、１９９０）。後期遺伝子の産物（ウイルスキャプシドタンパク質の大多数を含む）は、主要後期プロモーター（ＭＬＰ）によって与えられる単一の一次転写物の有意なプロセシング後にのみ発現される。ＭＬＰ（１６．８  ｍ．ｕ．に位置する）は、感染の後期の間に特に効率的であり、そしてこのプロモーターに由来するすべてのｍＲＮＡは、５’−３成分リーダー（ＴＰＬ）配列（この配列は、ＲＮＡを翻訳のために好ましいｍＲＮＡにする）を有する。
【０５８５】
現在の系では、組換えアデノウイルスが、シャトルベクターとプロウイルスベクターとの間の相同組換えから生成する。２つのプロウイルスベクター間の可能な組換えに起因して、野生型アデノウイルスは、このプロセスから生成され得る。従って、個々のプラークからウイルスの単一クローンを単離すること、およびそのゲノム構造を調べることが重要である。
【０５８６】
複製欠損である現在のアデノウイルスベクターの生成および増殖は、特有のヘルパー細胞株（２９３と称される）に依存し、そのヘルパー細胞株は、Ａｄ５ＤＮＡフラグメントによりヒト胚性腎臓細胞から形質転換され、そしてＥ１タンパク質を構成的に発現する（Ｇｒａｈａｍら、１９７７）。Ｅ３領域は、アデノウイルスゲノムから不必要であるので（ＪｏｎｅｓおよびＳｈｅｎｋ、１９７８）、２９３細胞の補助によって、現在のアデノウイルスベクターは、Ｅ１もしくはＤ３のいずれかまたはその両方の領域に、外来ＤＮＡを保有する（ＧｒａｈａｍおよびＰｒｅｖｅｃ、１９９１）。本質的には、アデノウイルスは、野生型ゲノムの約１０５％をパッケージし得（Ｇｈｏｓｈ−Ｃｈｏｕｄｈｕｒｙら、１９８７）、ＤＮＡより約２ｋＢ多い容量を提供する。Ｅ１およびＥ３領域で交換可能である約５．５ｋＢのＤＮＡと組合わせると、現在のアデノウイルスベクターの最大容量は、７．５ｋＢより低いか、またはベクターの全長の約１５％である。アデノウイルスのウイルス性のゲノムの８０％より多くは、ベクター骨格内にあり、そしてベクター保有（ｂｏｒｎｅ）細胞毒性の供給源である。また、Ｅ１欠失ウイルスの複製欠損は、不完全である。例えば、ウイルス遺伝子発現のリーク（ｌｅａｋａｇｅ）は、高い感染多重度（ＭＯＩ）で、現在利用可能なベクターで観察された（Ｍｕｌｌｉｇａｎ、１９９３）。
【０５８７】
ヘルパー細胞株は、ヒト細胞（例えば、ヒト胚性腎臓細胞、筋細胞、造血細胞または他のヒト胚性間葉細胞または上皮細胞）に由来し得る。あるいは、このヘルパー細胞は、ヒトアデノウイルスに許容性である他の哺乳動物種の細胞に由来し得る。このような細胞としては、例えば、Ｖｅｒｏ細胞または他のサル胚性間葉細胞または上皮細胞が挙げられる。上記のように、現在、好ましいヘルパー細胞株は、２９３である。
【０５８８】
最近、Ｒａｃｈｅｒら（１９９５）は、２９３細胞の培養およびアデノウイルスの増殖についての改良された方法を開示した。１つのフォーマットにおいて、天然の細胞の凝集物は、１００〜２００ｍｌの培地を含む１リットルのシリコン処理した攪拌フラスコ（Ｔｅｃｈｎｅ，Ｃａｍｂｒｉｇｅ、ＵＫ）内に、個々の細胞を接種することによって増殖する。４０ｒｐｍでの攪拌後、細胞生存度を、トリパンブルーで評価する。別のフォーマットにおいて、Ｆｉｂｒａ−Ｃｅｌマイクロキャリア（Ｂｉｂｂｙ  Ｓｔｅｒｌｉｎ、Ｓｔｏｎｅ，ＵＫ）（５ｇ／ｌ）を、以下のように使用する。５ｍｌの培地に再懸濁された細胞接種材料を、２５０ｍｌのＥｒｌｅｎｍｅｙｅｒフラスコ中のキャリア（５０ｍｌ）に添加し、そして時々攪拌しながら、１〜４時間、静止させておく。次いで培地を、５０ｍｌの新鮮な培地で置換し、そして振盪を開始する。ウイルス産生のために、細胞を、約８０％のコンフルーエンスまで増殖させ、その後、培地を置換し（最終容量の２５％まで）、そしてアデノウイルスを０．０５のＭＯＩで添加する。培養物を、一晩静止させ、その後容量を１００％まで増やし、そしてさらに７２時間の振盪を開始する。
【０５８９】
アデノウイルスベクターは、複製欠損または少なくとも条件付で複製欠損であるという必要性以外に、アデノウイルスベクターの特性は、本発明の実施の成功に重要でないと考えられる。アデノウイルスは、４２の異なる既知の血清型またはサブグループＡ〜Ｆの任意のアデノウイルスであり得る。サブグループＣのアデノウイルス５型は、本発明において使用するための条件付複製欠損アデノウイルスベクターを得るために好ましい開始物質である。なぜならアデノウイルス５型は、大量の生化学的情報および遺伝学的情報が公知であるヒトアデノウイルスであり、そしてそれは、ベクターとしてアデノウイルスを使用するほとんどの構築物に歴史的に使用されてきたからである。
【０５９０】
上記のように、本発明による代表的なベクターは、複製欠損であり、そしてアデノウイルスＥ１領域を有さない。従って、目的の遺伝子をコードするポリヌクレオチドを、Ｅ１コード配列が除去された位置に導入することが最も簡便である。しかし、アデノウイルス配列内の構築物の挿入物の位置は、本発明に重要ではない。目的の遺伝子をコードするポリヌクレオチドはまた、Ｋａｒｌｓｓｏｎら（１９８６）に記載されるように、Ｅ３置換ベクターに、欠失したＥ３領域の代わりに挿入され得るか、あるいはヘルパー細胞株またはヘルパーウイルスがＥ４欠損を補足するＥ４領域に挿入され得る。
【０５９１】
アデノウイルスは、容易に増殖し、かつ容易に操作され、そしてインビトロおよびインビボでの広い宿主範囲を示す。この群のウイルスは、高い力価（例えば、１０９〜１０１１プラーク形成単位／ｍｌ）で得られ得、そしてそれらは非常に感染性である。アデノウイルスの生活環は、宿主細胞ゲノムへの組込みを必要としない。アデノウイルスベクターによって送達された外来遺伝子は、エピソーム性であり、従って、宿主細胞に対して低い遺伝毒性を有する。野生型アデノウイルスでのワクチン接種の研究において、副作用がないことが報告されている（Ｃｏｕｃｈら、１９６３；Ｔｏｐら、１９７１）。このことは、インビボ遺伝子移入ベクターとしてのそれらの安全かつ治療的な可能性を示す。
【０５９２】
アデノウイルスベクターを、真核生物遺伝子発現（Ｌｅｖｒｅｒｏら、１９９１；Ｇｏｍｅｚ−Ｆｏｉｘら、１９９２）およびワクチンの開発（ＧｒｕｎｈａｕｓおよびＨｏｒｗｉｔｚ、１９９２；ＧｒａｈａｍおよびＰｒｅｖｅｃ，１９９２）に使用した。最近、動物研究は、組換えアデノウイルスは、遺伝子療法に使用され得ることを示唆した（Ｓｔｒａｔｆｏｒｄ−ＰｅｒｒｉｃａｕｄｅｔおよびＰｅｒｒｉｃａｕｄｅｔ、１９９１；Ｓｔｒａｔｆｏｒｄ−Ｐｅｒｒｉｃａｕｄｅｔら、１９９０；Ｒｉｃｈら、１９９３）。異なる組織に組換えアデノウイルスを投与する際の研究としては、気管点滴注入法（Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら、１９９１；Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら、１９９２）、筋肉注射（Ｒａｇｏｔら、１９９３）、末梢静脈内注射（ＨｅｒｚおよびＧｅｒａｒｄ、１９９３）および脳における定位接種法（Ｌｅ  Ｇａｌ  Ｌａ  Ｓａｌｌｅら、１９９３）が挙げられる。
【０５９３】
（２．レトロウイルス）
レトロウイルスは、逆転写のプロセスによって、感染された細胞においてそれらのＲＮＡを２本鎖ＤＮＡに転換する能力によって特徴付けられる一本鎖ＲＮＡウイルスの群である（Ｃｏｆｆｉｎ、１９９０）。次いで、生じるＤＮＡを、プロウイルスとして細胞染色体に安定に組み込み、そしてウイルスタンパク質を合成させる。この組込みは、レシピエント細胞およびその子孫におけるウイルス遺伝子配列の保持を生じる。レトロウイルスゲノムは、キャプシドタンパク質、ポリメラーゼ酵素、およびエンベロープ成分をそれぞれコードする３つの遺伝子（ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖ）を含む。ｇａｇ遺伝子の上流に見出された配列は、ビリオンへのゲノムのパッケージングのためのシグナルを含む。２つの長末端反復（ＬＴＲ）配列は、ウイルスゲノムの５’および３’末端に存在する。これらは、強力なプロモーター配列およびエンハンサー配列を含み、そしてまた宿主細胞ゲノムへの組込みに必要とされる（Ｃｏｆｆｉｎ，１９９０）。
【０５９４】
レトロウイルスベクターを構築するために、１つ以上の目的のオリゴヌクレオチド配列またはポリヌクレオチド配列をコードする核酸が、特定のウイルス配列の代わりにウイルスゲノムに挿入され、複製欠損であるウイルスを作製する。ビリオンを作製するために、ｇａｇ遺伝子、ｐｏｌ遺伝子、およびｅｎｖ遺伝子を含むが、ＬＴＲ成分およびパッケージング成分を含まないパッケージング細胞株が構築される（Ｍａｎｎら、１９８３）。レトロウイルスＬＴＲ配列およびパッケージング配列と一緒にｃＤＮＡを含む組換えプラスミドがこの細胞株に（例えば、リン酸カルシウム沈殿によって）導入される場合、パッケージング配列は、ウイルス粒子にパッケージングされる組換えプラスミドのＲＮＡの転写を可能にし、次いで培養培地に分泌される（ＮｉｃｏｌａｓおよびＲｕｂｅｎｓｔｅｉｎ，１９８８；Ｔｅｍｉｎ，１９８６；Ｍａｎｎら、１９８３）。次いで、この組換えレトロウイルスを含む培地は、収集され、必要に応じて濃縮され、そして遺伝子移入のために使用される。レトロウイルスベクターは、広範な細胞型に感染し得る。しかし、組み込みおよび安定な発現は、宿主細胞の分裂を必要とする（Ｐａｓｋｉｎｄら、１９７５）。
【０５９５】
レトロウイルスベクターの特異的な標的化を可能にするように設計された新規なアプローチが、最近、ラクトース残基のウイルスエンベロープへの化学的な付加によるレトロウイルスの化学的な変更に基づいて開発された。この改変は、シアロ糖タンパク質レセプターを介する肝細胞の特異的な感染を可能にし得る。
【０５９６】
組換えレトロウイルスの標的化のための異なるアプローチが、設計され、この方法においては、レトロウイルスエンベロープタンパク質に対するビオチン化抗体および特定の細胞レセプターに対するビオチン化抗体が使用された。この抗体は、ストレプトアビジンを使用することによってビオチン成分を介して結合された（Ｒｏｕｘら、１９８９）。主要組織適合性複合体の、クラスＩ型抗原およびクラスＩＩ型抗原に対する抗体を使用して、著者らは、インビトロでエコトロピックウイルスを伴なった表面抗原を保持する種々のヒト細胞の感染を実証した（Ｒｏｕｘら、１９８９）。
【０５９７】
（３．アデノ随伴ウイルス）
ＡＡＶ（Ｒｉｄｇｅｗａｙ，１９８８；ＨｅｒｍｏｎａｔおよびＭｕｚｙｃｓｋａ，１９８４）は、パルボウイルス（ｐａｒｏｖｉｒｕｓ）であり、アデノウイルスストックの汚染物質として発見された。ＡＡＶは、いかなる疾患にも関連していない遍在性の（抗体は、アメリカ人の集団の８５％に存在する）ウイルスである。ＡＡＶはまた、ＡＡＶの複製がヘルパーウイルス（例えば、アデノウイルス）の存在に依存するので、デペンドウイルスとして分類される。５つの血清型が単離されている。そのうち、ＡＡＶ−２は、最も特徴付けされている。ＡＡＶは、キャプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３にキャプシド形成され、直径２０ｎｍ〜２４ｎｍの正二十面体のビリオンを形成する、一本鎖の線状ＤＮＡを有する（ＭｕｚｙｃｚｋａおよびＭｃＬａｕｇｈｌｉｎ，１９８８）。
【０５９８】
このＡＡＶ  ＤＮＡは、約４．７キロ塩基長である。このＤＮＡは、２つのオープンリーディングフレームを含み、そして２つのＩＴＲに隣接される（図２）。ＡＡＶゲノム中には、２つの主な遺伝子（ｒｅｐおよびｃａｐ）が存在する。ｒｅｐ遺伝子は、ウイルスの複製を担うタンパク質をコードし、これに対し、ｃａｐは、キャプシドタンパク質ＶＰ１−３をコードする。各々のＩＴＲは、Ｔ形状のヘアピン構造を形成する。これらの末端反復は、染色体組み込みのために必須のＡＡＶのｃｉｓ成分のみである。従って、このＡＡＶは、全てのウイルスコード配列が除去および送達のための遺伝子のカセットで置換されたベクターとして使用され得る。それらの地図位置に従って、３つのウイルスプロモーターが同定され、そしてｐ５、ｐ１９、およびｐ４０と称されている。ｐ５およびｐ１９からの転写はｒｅｐタンパク質の産生を生じ、そしてｐ４０からの転写はキャプシドタンパク質を産生する（ＨｅｒｍｏｎａｔおよびＭｕｚｙｃｚｋａ，１９８４）。
【０５９９】
発現ベクターとしてｒＡＡＶを使用する可能性を研究するように研究者を促すいくつかの因子が存在する。１つは、宿主染色体に組み込むために遺伝子を送達する必要が、驚くほど少ないことである。１４５ｂｐのＩＴＲ（ＡＡＶゲノムのわずか６％である）を有することが必要である。これは、４．５ｋｂのＤＮＡ挿入物を作製する余地をベクターに残す。これは、ＡＡＶが大きな遺伝子を送達するのを妨げ得る能力を保有するが、本発明のアンチセンス構築物を送達するのに十分に適している。
【０６００】
ＡＡＶはまた、その安全性に起因して、送達ビヒクルの優れた選択である。相対的に複雑な救援機構が存在する：野生型のアデノウイルス遺伝子だけでなく、ＡＡＶ遺伝子もｒＡＡＶを動員する必要がある。同様に、ＡＡＶは、病原性ではなく、そしていかなる疾患にも関連しない。ウイルスコード配列の除去は、ウイルス遺伝子発現に対する免疫反応を最小化し、従って、ｒＡＡＶは、炎症応答を誘起しない。
【０６０１】
（４．発現構築物としての他のウイルスベクター）
他のウイルスベクターを、宿主細胞へのオリゴヌクレオチド配列またはポリヌクレオチド配列の送達のための本発明における発現構築物として用いてもよい。ワクシニアウイルス（Ｒｉｄｇｅｗａｙ，１９８８；Ｃｏｕｐａｒら、１９８８）、レンチウイルス、ポリオウイルス、およびヘルペスウイルスのようなウイルス由来のベクターを用いてもよい。これらは、種々の哺乳動物細胞に、いくつかの魅力のある特性を提供する（Ｆｒｉｅｄｍａｎｎ，１９８９；Ｒｉｄｇｅｗａｙ，１９８８；Ｃｏｕｐａｒら、１９８８；Ｈｏｒｗｉｃｈら、１９９０）。
【０６０２】
欠損Ｂ型肝炎ウイルスの最近の認識によると、新しい見識は、異なるウイルス配列の構造−機能の関連性を与えた。インビトロでの研究は、このウイルスが、そのゲノムの８０％までの欠失にもかかわらず、ヘルパー依存パッケージングおよび逆転写についての能力を保持し得ることを示した（Ｈｏｒｗｉｃｈら、１９９０）。このことは、ゲノムの大部分が外来の遺伝物質と交換され得ることを示唆した。肝臓向性（ｈｅｐａｔｏｔｒｏｐｉｓｍ）および持続性（組込み）は、肝臓指向性遺伝子移入についての特に魅力的な特性であった。Ｃｈａｎｇら、（１９９１）は、ポリメラーゼコード配列、表面コード配列、および前表面（ｐｒｅ−ｓｕｒｆａｃｅ）コード配列に代えて、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子をアヒルＢ型肝炎ウイルスゲノムに導入した。これを、野生型ウイルスと共に、トリ肝臓癌細胞株へと、同時トランスフェクトした。高力価の組換えウイルスを含む培養培地を用いて、初代仔ガモ肝細胞を感染させた。安定なＣＡＴ遺伝子発現を、トランスフェクション後の少なくとも２４日間検出した（Ｃｈａｎｇら、１９９１）。
【０６０３】
（５．非ウイルスベクター）
本発明のオリゴヌクレオチド配列またはポリヌクレオチド配列の発現をもたらすために、発現構築物は、細胞に送達されなければならない。この送達は、細胞株を形質転換するための実験手順の際のように、インビトロで達成され得るか、または特定の疾患状態の処置の際のように、インビボもしくはエキソビボで達成され得る。上記のように、送達のための１つの好ましい機構は、ウイルス感染を介する機構であり、ここで、発現構築物は、感染性ウイルス粒子の中にカプセル化される。
【０６０４】
一旦、発現構築物が、細胞の中に送達されると、所望のオリゴヌクレオチド配列またはポリヌクレオチド配列をコードする核酸は、異なる部位に配置され、そして異なる部位で発現し得る。特定の実施形態では、この構築物をコードする核酸は、細胞のゲノムの中に安定に組込まれ得る。この組込みは、相同組換えを介する特定の位置および特定の配向であってもよい（遺伝子置換）し、またはこれは無作為な非特異的な位置に組込まれてもよい（遺伝子増強）。なおさらなる実施形態では、核酸は、ＤＮＡの別個のエピソームセグメントとして、細胞の中で安定に維持され得る。このような核酸セグメント、または「エピソーム」は、宿主細胞周期から独立して、または宿主細胞周期に同調して維持および複製するのに十分な配列をコードする。どのように発現構築物を細胞に送達させ、そして細胞の中のどこで核酸を維持するかは、用いられる発現構築物の型に依存する。
【０６０５】
本発明の特定の実施形態では、１つ以上のオリゴヌクレオチド配列またはポリヌクレオチド配列を含む発現構築物は、単に、裸の組換えＤＮＡまたはプラスミドから構成されてもよい。この構築物の移入は、細胞膜を物理的または化学的に透過化処理する、上記の方法のいずれかにより行われ得る。このことは、特に、インビトロでの移入に適用可能であるが、これはインビボでの使用でも同様に適用され得る。Ｄｕｂｅｎｓｋｙら、（１９８４）は、ポリオーマウイルスＤＮＡを、成体および新生仔マウスの肝臓および腎臓に、リン酸カルシウム沈殿物の形態で首尾良く注入した。これは、能動的ウイルス複製および急性感染を実証した。ＢｅｎｖｅｎｉｓｔｙおよびＲｅｓｈｅｆ（１９８６）はまた、リン酸カルシウム沈降プラスミドの直接的腹腔内注入が、トランスフェクトされた遺伝子の発現を生じることを実証した。目的の遺伝子をコードするＤＮＡはまた、インビボで同じ様式で移入され得、遺伝子産物を発現することが想定される。
【０６０６】
細胞の中に裸のＤＮＡ発現構築物を移入するための本発明の別の実施形態では、微粒子ボンバードメントを包含し得る。この方法は、ＤＮＡをコーティングした微粒子を、この粒子が細胞膜を貫通し、そして細胞を殺傷することなく細胞に侵入することが可能な高速まで加速させる能力に依存する（Ｋｌｅｉｎら、１９８７）。小さな粒子を加速させるためのいくつかの装置が、開発されている。このような装置の１つは、高電圧放電に依存して電流を発生させ、これは、次いで推進力を提供する（Ｙａｎｇら、１９９０）。用いられる微粒子は、タングステンまたは金ビーズのような生物学的に不活性な物質からなっている。
【０６０７】
ラットおよびマウスの肝臓組織、皮膚組織、および筋肉組織を含む選択された器官を、インビボでボンバードした（Ｙａｎｇら、１９９０；Ｚｅｌｅｎｉｎら、１９９１）。このことは、銃と標的器官との間の任意の介在組織を除去する（すなわち、エキソビボ処置）ための、組織または細胞の外科的露出を必要とし得る。また、特定の遺伝子をコードするＤＮＡは、この方法を介して送達され、そしてなお本発明に組み込まれ得る。
【０６０８】
（アンチセンスオリゴヌクレオチド）
遺伝子情報の流れの最終的結果は、タンパク質の合成である。ＤＮＡは、ポリメラーゼによってメッセンジャーＲＮＡへと転写され、そしてリボソーム上で翻訳されて、フォールディングされた機能性タンパク質が生じる。従って、この経路に沿って、タンパク質合成が阻害され得るいくつかの段階が存在する。本明細書中に記載されるポリペプチドをコードするネイティブのＤＮＡセグメントは、すべての哺乳動物ＤＮＡ鎖のように、水素結合により結合された２つの鎖（センス鎖およびアンチセンス鎖）を有する。ポリペプチドをコードするメッセンジャーＲＮＡは、センスＤＮＡ鎖と同じヌクレオチド配列を有するが、ただし、そのＤＮＡのチミジンがウリジンに置き換わっている。従って、合成アンチセンスヌクレオチド配列は、ｍＲＮＡに結合し、そしてそのｍＲＮＡによりコードされるタンパク質の発現を阻害する。
【０６０９】
従って、アンチセンスオリゴヌクレオチドをｍＲＮＡに標的化することは、タンパク質合成を中断するための１つの機構であり、結果的に、強力かつ標的化された治療アプローチを示す。例えば、ポリガラクタウロナーゼの合成およびムスカリン２型アセチルコリンレセプターは、そのそれぞれのｍＲＮＡ配列に対して指向されたアンチセンスオリゴヌクレオチドによって阻害される（米国特許第５，７３９，１１９号および米国特許第５，７５９，８２９号（各々がその全体において本明細書中に特に参考として援用される））。さらに、アンチセンス阻害の例が、核タンパク質サイクリン、多剤耐性遺伝子（ＭＤＧ１）、ＩＣＡＭ−１、Ｅ−セレクチン、ＳＴＫ−１、線条体ＧＡＢＡＡレセプターおよびヒトＥＧＦを用いて示されている（Ｊａｓｋｕｌｓｋｉら、１９８８；ＶａｓａｎｔｈａｋｕｍａｒおよびＡｈｍｅｄ、１９８９；Ｐｅｒｉｓら、１９９８；米国特許第５，８０１，１５４号；同第５，７８９，５７３号；同第５，７１８，７０９号および同第５，６１０，２８８号（各々がその全体において本明細書中に特に参考として援用される））。種々の異常な細胞増殖（例えば、癌）を阻害しそして処置するために使用され得る、アンチセンス構築物もまた、記載されている（米国特許第５，７４７，４７０号；同第５，５９１，３１７号および同第５，７８３，６８３号（各々がその全体において本明細書中に特に参考として援用される））。
【０６１０】
従って、例示的な実施形態において、本発明は、本明細書中に記載されるポリヌクレオチド配列に特異的に結合し得る任意の配列もしくはその相補体のすべてまたは一部を含む、オリゴヌクレオチド配列を提供する。１つの実施形態において、そのアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡまたはその誘導体を含む。別の実施形態において、そのオリゴヌクレオチドは、ＲＮＡまたはその誘導体を含む。第３の実施形態において、そのオリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエート改変骨格を含む、改変ＤＮＡである。第４の実施形態において、そのオリゴヌクレオチド配列は、ペプチド核酸またはその誘導体を含む。各場合において、好ましい組成物は、本明細書中に開示されるポリヌクレオチドのうちの１つ以上の部分に相補的な、より好ましくは実質的に相補的な、そしてさらにより好ましくは完全に相補的な、配列領域を含む。
【０６１１】
所定の遺伝子配列に特異的なアンチセンス組成物の選択は、選択された標的配列（すなわち、これらの例示的例においては、ラット配列およびヒト配列）の分析ならびに二次構造、Ｔｍ、結合エネルギー、相対的安定性の決定に基づき、そしてアンチセンス組成物は、二量体、ヘアピン、または宿主細胞において標的ｍＲＮＡへの特異的結合を減少または妨げる他の二次構造を形成できないそれらの相対的能力に基づいて選択された。
【０６１２】
ｍＲＮＡの非常に好ましい標的領域は、ＡＵＧ翻訳開始コドンの領域またはその付近の領域、およびｍＲＮＡの５’領域と実質的に相補的な配列である。これらの二次構造分析および標的部位選択の考慮は、ＯＬＩＧＯプライマー分析ソフトウェアのバージョン４（Ｒｙｃｈｌｉｋ、１９９７）およびＢＬＡＳＴＮ  ２．０．５アルゴリズムソフトウェア（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、１９９７）を使用して実施した。
【０６１３】
短いペプチドベクター（ＭＰＧ（２７残基）と称する）を使用するアンチセンス送達法の使用もまた意図される。このＭＰＧペプチドは、ＨＩＶ  ｇｐ４１の融合配列由来の疎水性ドメインと、ＳＶ４０  Ｔ抗原の核局在化配列由来の親水性ドメインとを含む（Ｍｏｒｒｉｓら、１９９７）。このＭＰＧペプチドのいくつかの分子がアンチセンスオリゴヌクレオチドをコートし、そして比較的高効率（９０％）で１時間未満で培養哺乳動物細胞へと送達され得ることが示された。さらに、ＭＰＧとの相互作用は、ヌクレアーゼに対するそのオリゴヌクレオチドの安定性および形質膜を横切る能力の両方を強力に増加させる。
【０６１４】
（リボザイム）
タンパク質は、伝統的に、核酸の触媒のために使用されているが、別の種類の高分子が、この試みにおいて有用であるとして出現した。リボザイムは、部位特異的様式で核酸を切断するＲＮＡ−タンパク質複合体である。リボザイムは、エンドヌクレアーゼ活性を保有する特異的触媒ドメインを有する（ＫｉｍおよびＣｅｃｈ、１９８７；Ｇｅｒｌａｃｈら、１９８７；ＦｏｒｓｔｅｒおよびＳｙｍｓｏｎｓ、１９８７）。例えば、多数のリボザイムが、高い程度の特異性でホスホエステル転移反応を促進し、しばしば、オリゴヌクレオチド基質中の数個のホスホエステルのうちの１つだけを切断する（Ｃｅｃｈら、１９８１；ＭｉｃｈｅｌおよびＷｅｓｔｈｏｆ、１９９０；Ｒｅｉｎｈｏｌｄ−ＨｕｒｅｋおよびＳｈｕｂ、１９９２）。この特異性は、この基質が、化学反応の前にリボザイムの内部ガイド配列（「ＩＧＳ」）との特異的塩基対形成相互作用を介して結合するという要件に帰せられている。
【０６１５】
リボザイム触媒は、主に、核酸に関与する配列特異的切断／連結反応の一部として観察されている（Ｊｏｙｃｅ、１９８９；Ｃｅｃｈら、１９８１）。例えば、米国特許第５，３５４，８５５号（本明細書中に参考として詳細に援用される）は、特定のリボザイムが、既知のリボヌクレアーゼの配列特異性よりも高くかつＤＮＡ制限酵素の配列特異性に近い配列特異性を有するエンドヌクレアーゼとして作用し得ることを報告している。従って、遺伝子発現の配列特異的リボザイム媒介性阻害は、治療適用に特に適切であり得る（Ｓｃａｎｌｏｎら、１９９１；Ｓａｒｖｅｒら、１９９０）。最近、リボザイムが適用されたいくつかの細胞株においてそのリボザイムが遺伝子変化を惹起したこと；その変化した遺伝子がオンコジーンであるＨ−ｒａｓ，ｃ−ｆｏｓおよびＨＩＶの遺伝子を含んだことが、報告された。この研究のほどんどは、特定のリボザイムにより切断される特定の変異体コドンに基づく、標的ｍＲＮＡの改変に関した。
【０６１６】
天然に存在する酵素的ＲＮＡの６つの基本的変種が、現在公知である。各々が、生理学的条件下で、トランスで、ＲＮＡホスホジエステル結合の加水分解を触媒し得る（従って、他のＲＮＡ分子を切断し得る）。一般に、酵素的核酸は、まず、標的ＲＮＡへの結合によって作用する。このような結合は、標的ＲＮＡを切断するように作用する分子の酵素的部分に近接して保持される、酵素的核酸の標的結合部分を介して生じる。従って、その酵素的核酸はまず、標的ＲＮＡを認識し、次いで相補的塩基対形成を介してその標的ＲＮＡに結合し、そして一旦正確な部位に結合すると、その標的ＲＮＡを酵素的に切断するように作用する。このような標的ＲＮＡの戦略的切断は、コードされるタンパク質を直接合成する標的ＲＮＡの能力を破壊する。酵素的核酸がそのＲＮＡ標的に結合しそして切断した後、その酵素的核酸は、別の標的を探索するためにそのＲＮＡから離れ、そして繰り返し、新しい標的に結合しそして切断し得る。
【０６１７】
リボザイムの酵素特性は、多くの技術（例えば、アンチセンス技術（ここで、核酸分子は、翻訳を阻害するために核酸標的に簡単に結合する））に対して有利である。なぜなら、治療的処置に影響を与えるのに必要であるリボザイムの濃度は、アンチセンスオリゴヌクレオチの濃度よりも低いからである。この利点は、酵素学的に作用するリボザイムの能力を反映する。従って、単一のリボザイム分子は、標的ＲＮＡの多くの分子を切断し得る。さらに、このリボザイムは、高度に選択的なインヒビターであり、この阻害の特異性は、標的ＲＮＡに結合する塩基対形成の機構に依存するだけでなく、標的ＲＮＡの切断の機構にも依存する。切断部位付近の１個のミスマッチまたは塩基置換により、リボザイムの触媒活性が完全になくなり得る。アンチセンス分子内の同様のミスマッチでは、それらの作用は妨げられない（Ｗｏｏｌｆら、１９９２）。従って、リボザイムの作用の特異性は、同じＲＮＡ部位に結合するアンチセンスオリゴヌクレオチドの作用の特異性よりも高い。
【０６１８】
この酵素学的核酸分子は、ハンマーヘッド（ｈａｍｍｅｒｈｅａｄ）モチーフ、ヘアピンモチーフ、δ型肝炎ウイルスモチーフ、Ｉ群イントロンモチーフまたはＲＮａｓｅＰ  ＲＮＡモチーフ（ＲＮＡ誘導配列に関連する）あるいはＮｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ＶＳ  ＲＮＡモチーフに形成され得る。ハンマーヘッドモチーフの例は、Ｒｏｓｓｉら（１９９２）に記載される。ヘアピンモチーフの例は、Ｈａｍｐｅｌら（欧州特許出願公開番号ＥＰ  ０３６０２５７）、ＨａｍｐｅｌおよびＴｒｉｔｚ（１９８９）、Ｈａｍｐｅｌら（１９９０）および米国特許第５，６３１，３５９号（本明細書中に参考として詳細に援用される）に記載される。δ型肝炎ウイルスモチーフの例は、ＰｅｒｒｏｔｔａおよびＢｅｅｎ（１９９２）に記載される；ＲＮａｓｅＰモチーフの例は、Ｇｕｅｒｒｉｅｒ−Ｔａｋａｄａら（１９８３）に記載される；Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ＶＳ  ＲＮＡリボザイムモチーフは、Ｃｏｌｌｉｎｓ（ＳａｖｉｌｌｅおよびＣｏｌｌｉｎｓ、１９９０；ＳａｖｉｌｌｅおよびＣｏｌｌｉｎｓ、１９９１；ＣｏｌｌｉｎｓおよびＯｌｉｖｅ、１９９３）に記載される；そしてＩ群イントロンの例は、米国特許第４，９８７，０７１号（本明細書中に参考として詳細に援用される）に記載される。本発明の酵素学的核酸分子において重要であることは、１以上の標的遺伝子ＲＮＡ領域に相補的である特定の基質結合部位を有すること、およびこの分子にＲＮＡ切断活性を付与する、基質結合部位内のヌクレオチド配列またはこの基質結合部位の周囲のヌクレオチド配列を有することだけである。従って、リボザイム構築物は、本明細書中に記載される特定のモチーフに限定する必要はない。
【０６１９】
特定の実施形態において、所望の標的のＲＮＡ（例えば、本明細書中において開示される配列の１つ）に対して高度の特異性を示す酵素学的切断因子を産生することが重要であり得る。好ましくは、この酵素学的核酸分子は、標的ｍＲＮＡの高度に保存された配列領域に対して標的化される。このような酵素学的核酸分子は、必要とされる場合、特定の細胞に外因的に送達され得る。あるいは、このリボザイムは、特定の細胞に送達されるＤＮＡベクターまたはＲＮＡベクターから発現され得る。
【０６２０】
小さな酵素学的核酸モチーフ（例えば、ハンマーヘッド構造またはヘアピン構造のモチーフ）はまた、外因的送達のために使用され得る。これらの分子の単純な構造は、酵素学的核酸がｍＲＮＡ構造の標的化された領域に浸潤する能力を増大させる。あるいは、触媒ＲＮＡ分子は、細胞内で真核生物のプロモータから発現され得る（例えば、Ｓｃａｎｌｏｎら、１９９１；Ｋａｓｈａｎｉ−Ｓａｂｅｔら、１９９２；Ｄｒｏｐｕｌｉｃら、１９９２；Ｗｅｅｒａｓｉｎｇｈｅら、１９９１；Ｏｊｗａｎｇら、１９９２；Ｃｈｅｎら、１９９２；Ｓａｒｖｅｒら、１９９０）。当業者は、任意のリボザイムが、適切なＤＮＡベクター由来の真核生物細胞において発現されることを理解する。このようなリボザイムの活性は、第二リボザイムによる第一転写物からの解放によって増強され得る（国際特許出願公開番号ＷＯ  ９３／２３５６９、および国際特許出願公開番号ＷＯ  ９４／０２５９５（これらの両方は、本明細書によって参考として援用される）；Ｏｈｋａｗａら、１９９２；Ｔａｉｒａら、１９９１；ならびにＶｅｎｔｕｒａら、１９９３）。
【０６２１】
リボザイムは、直接的に添加されるか、またはリポソーム内にパッケージングされたカチオン性脂質と共に複合体化され（脂質複合体）、さもなければ、標的細胞に送達され得る。ＲＮＡまたはＲＮＡ複合体は、生体高分子中に組み込んだ状態または組み込んでない状態で、注射、エアロゾル吸入、注入ポンプまたはステントを介して、関連する組織にエキソビボ、またはインビボで局所的に投与され得る。
【０６２２】
リボザイムは、国際特許出願公開番号ＷＯ  ９３／２３５６９および国際特許出願公開番号ＷＯ  ９４／０２５９５（各々は、本明細書中で参考として詳細に援用される）に記載されるように設計され得、そして記載されるようにインビトロおよびインビボにおいて試験するために合成され得る。このようなリボザイムはまた、送達するために最適化され得る。特定の例が提供されるが、当業者は、他の種において等価なＲＮＡ標的が、必要な場合に利用され得ることを理解する。
【０６２３】
ハンマーヘッドリボザイムまたはヘアピンリボザイムを、コンピュータフォールディング（Ｊａｅｇｅｒら、１９８９）によって個々に分析し、リボザイム配列が、適切な２次構造に折り畳まれたかどうかを評価し得る。結合アーム（ｂｉｎｄｉｎｇ  ａｒｍ）と触媒中心との間で好ましくない分子内相互作用を有するこれらのリボザイムは、考慮から外される。種々の結合アームの長さが、活性を最適化するために選択され得る。一般に、各アームにおいて少なくとも５個程度の塩基が標的ＲＮＡに結合するか、さもなくばこの標的ＲＮＡと相互作用し得る。
【０６２４】
ハンマーヘッドモチーフまたはヘアピンモチーフのリボザイムは、ｍＲＮＡメッセージの種々の部位に対してアニールするように設計され得、そして化学的に合成され得る。使用される合成方法は、Ｕｓｍａｎら（１９８７）およびＳｃａｒｉｎｇら、（１９９０）に記載されるような通常のＲＮＡ合成のための手順に従い、そして一般的な核酸保護基および連結基（例えば、５’末端のジメトキシトリチルおよび３’末端のホスホルアミダイト）が使用される。平均的、段階的な連結収率は、代表的に、９８％より高い。ヘアピンリボザイムは、２個の部分で合成され得、そして活性リボザイムを再構築するためにアニールされ得る（ＣｈｏｗｒｉｒａおよびＢｕｒｋｅ、１９９２）。リボザイムは、大規模に改変され得、ヌクレアーゼ耐性基を用いて改変すること（例えば、２’−アミノ、２’−Ｃ−アリル、２’−フルオロ、２’−ｏ−メチル、２’−Ｈ（概説については、例えばＵｓｍａｎおよびＣｅｄｅｒｇｒｅｎ、１９９２を参照のこと））によって安定性が増大され得る。リボザイムは、一般的な方法を使用するゲル電気泳動または高圧液体クロマトグラフィーによって精製され得、そして水中に再懸濁され得る。
【０６２５】
リボザイムの活性は、リボザイムの結合アームの長さを変更することにより、または血清リボヌクレアーゼによる分解を防ぐ改変（例えば、国際特許出願番号ＷＯ  ９２／０７０６５；Ｐｅｒｒａｕｌｔら、１９９０；Ｐｉｅｋｅｎら、１９９１；ＵｓｍａｎおよびＣｅｄｅｒｇｅｎ、１９９２；国際特許公開番号ＷＯ  ９３／１５１８７；国際特許出願公開番号ＷＯ  ９１／０３１６２；欧州特許出願公開番号９２１１０２９８．４；米国特許第５，３３４，７１１号、および国際特許出願公開番号ＷＯ  ９４／１３６８８（これには、酵素学的ＲＮＡ分子の糖部分に対して成され得る、種々の化学的修飾が記載される）を参照のこと）、細胞中でのリボザイムの有効性を増強する改変、ならびにＲＮＡの合成時間を短縮および化学的必要性を低下させるための幹（ｓｔｅｍ）ＩＩ塩基を除去して、リボザイムを化学的に合成することによって最適化され得る。
【０６２６】
Ｓｕｌｌｉｖａｎら（国際特許出願公開番号ＷＯ  ９４／０２５９５）は、酵素学的ＲＮＡ分子の送達のための一般的な方法を記載する。リボザイムは、当業者に公知の種々の方法によって細胞に投与され得、これらには、リポソームへのカプセル化、イオン泳動法、あるいは、ヒドロゲル、シクロデキストリン、生分解性ナノカプセルおよび生体接着性ミクロスフィアのような他のビヒクルへの取り込みによるもの、が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの指針（指標）のために、リボザイムは、エキソビボで細胞または組織に、上記のビヒクルを使用してか、または使用せずに直接送達され得る。あるいは、ＲＮＡ／ビヒクルの組合せは、直接的な吸入、直接的な注射、またはカテーテル、注入ポンプまたはステントの使用により、局所的に送達され得る。他の送達経路としては、血管内注射、筋内注射、皮下注射または関節注射、エアロゾル吸入、経口送達（錠形態または丸薬形態）、局所送達、全身送達、眼送達、腹腔内送達および／またはくも膜下腔内送達が挙げられるが、これらに限定されない。リボザイム送達および投与のより詳細な記載は、国際特許出願公開番号ＷＯ  ９４／０２５９５および国際特許出願公開番号ＷＯ  ９３／２３５６９（各々は、本明細書中で参考として詳細に援用される）に提供される。
【０６２７】
高濃度のリボザイムを細胞内に蓄積する別の手段は、リボザイムコード配列をＤＮＡ発現ベクターに組み込むことである。リボザイム配列の転写は、真核生物ＲＮＡポリメラーゼＩ（ｐｏｌ  Ｉ）、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ（ｐｏｌ  ＩＩ）、またはＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ（ｐｏｌ  ＩＩＩ）のためのプロモーターにより駆動される。ｐｏｌ  ＩＩプロモーターまたはｐｏｌ  ＩＩＩプロモーターからの転写物は、全ての細胞内で高レベルで発現される；所定の細胞型における所定のｐｏｌ  ＩＩプロモーターのレベルは、近くに存在する遺伝子調節配列（エンハンサー、サイレンサーなど）の性質に依存する。原核生物のＲＮＡポリメラーゼプロモーターもまた使用され得るが、但し、原核生物ＲＮＡポリメラーゼ酵素は、適切な細胞において発現される（Ｅｌｒｏｙ−ＳｔｅｉｎおよびＭｏｓｓ、１９９０；ＧａｏおよびＨｕａｎｇ、１９９３；Ｌｉｅｂｅｒら、１９９３；Ｚｈｏｕら、１９９０）。このようなプロモーターから発現するリボザイムは、哺乳動物細胞において機能し得る（例えば、Ｋａｓｈａｎｉ−Ｓａｂｅｒら、１９９２；Ｏｊｗａｎｇら、１９９２；Ｃｈｅｎら、１９９２；Ｙｕら、１９９３；Ｌ’Ｈｕｉｌｌｉｅｒら、１９９２；Ｌｉｓｚｉｅｗｉｃｚら、１９９３）。このような転写ユニットは、哺乳動物細胞内への導入のための種々のベクター（プラスミドＤＮＡベクター、ウイルスＤＮＡベクター（例えば、アデノウイルスベクターまたはアデノ随伴ベクター）、またはウイルスＲＮＡベクター（例えば、レトロウイルス、セムリキフォレストウイルス、シンドビスウイルスベクター）が挙げられるがこれらに限定されない）に組み込まれ得る。
【０６２８】
リボザイムを診断ツールとして使用して、疾患細胞内の遺伝的変動および変異を試験し得る。これらをまた使用して、標的ＲＮＡ分子のレベルを評価し得る。リボザイム活性と標的ＲＮＡの構造との間の緊密な関係は、標的ＲＮＡの塩基対形成および３次元構造を変える分子の任意の領域における変異の検出を可能にする。複数のリボザイムを使用することにより、インビトロならびに細胞および組織でのＲＮＡの構造および機能に対して重要であるヌクレオチドの変化をマップし得る。リボザイムを用いる標的ＲＮＡの切断を使用して、遺伝子発現を阻害し得、そして疾患の進行における特定の遺伝子産物の役割（必須性）を規定し得る。この様式で、他の遺伝子標的が、その疾患の重要な媒介物として、規定され得る。これらの研究は、組合せ治療の可能性（例えば、異なる遺伝子を標的とする複数のリボザイム、公知の低分子インヒビターに結合したリボザイム、あるいはリボザイムおよび／または他の化学的分子もしくは生物学的分子と組み合わせた間欠性処置）を提供することにより、疾患の進行のより良好な処置を導く。リボザイムの他のインビトロでの他の用途は、当該分野で周知であり、そしてＩＬ−５に関連する状態に関するｍＲＮＡの存在の検出を含む。このようなＲＮＡは、標準的な方法を使用してリボザイムと共に処置した後に、切断産物の存在を決定することによって検出される。
【０６２９】
（ペプチド核酸）
特定の実施形態において、本発明者は、本発明の方法の実施において、ペプチド核酸（ＰＮＡ）の使用を考慮する。ＰＮＡは、ＤＮＡ模倣物であり、核酸塩基は、偽ペプチド骨格に結合される（ＧｏｏｄおよびＮｉｅｌｓｅｎ、１９９７）。ＰＮＡは、ＲＮＡまたはＤＮＡを伝統的に使用した多くの方法において利用され得る。しばしば、ＰＮＡ配列は、対応するＲＮＡ配列またはＤＮＡ配列よりも技術的により良く機能し、そしてＲＮＡにもＤＮＡにも固有でない有用性を有する。産生方法、特徴、および使用方法を含むＰＮＡの総説は、Ｃｏｒｅｙ（１９９７）によって提供され、そして本明細書中で参考として援用される。このように、特定の実施形態において、ＡＣＥ  ｍＲＮＡ配列の１以上の部分に相補的であるＰＮＡ配列を調製し得、そしてこのようなＰＮＡ組成物は、ＡＣＥ−特異的ｍＲＮＡの翻訳を調節、変更、減少、または低下させるために使用され得、これにより、このようなＰＮＡ組成物が投与された宿主細胞におけるＡＣＥ活性のレベルを変更する。
【０６３０】
ＰＮＡは、ＤＮＡの正常なホスホジエステル骨格を置換する２−アミノエチル−グリシン連結を有する（Ｎｉｅｌｓｅｎら、１９９１；Ｈａｎｖｅｙら、１９９２；ＨｙｒｕｐおよびＮｉｅｌｓｅｎ，１９９６；Ｎｅｉｌｓｅｎ、１９９６）。この化学は、３つの重要な結果を有する。第１に、ＤＮＡまたはホスホロチオエートオリゴヌクレオチドとは対照的に、ＰＮＡは、中性の分子であり；第２に、ＰＮＡは、アキラル（立体選択的な合成を開発する必要を避ける）であり；そして第３に、ＰＮＡ合成は、標準的なＢｏｃプロトコル（Ｄｕｅｈｏｌｍら、１９９４）またはＦｍｏｃプロトコル（Ｔｈｏｍｓｏｎら、１９９５）を、固相ペプチド合成に使用する。一方、改良型Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ法を含む他の方法が使用される（Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎら、１９９５）。
【０６３１】
ＰＮＡモノマーまたは既製のオリゴマーは、ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ，ＭＡ）から市販されている。ＢｏｃプロトコルまたはＦｍｏｃプロトコルのいずれかによるＰＮＡの合成は、手動プロトコルまたは自動プロトコルを使用して簡単に実施される（Ｎｏｒｔｏｎら、１９９５）。この手動（マニュアル）プロトコルは、それ自体で、化学的に修飾されたＰＮＡの産生または密接に関係するＰＮＡのファミリーの同時合成を導く。
【０６３２】
ペプチドの合成に関して、特定のＰＮＡ合成の成功は、選択した配列の特性に依存する。例えば、理論上、ＰＮＡは、ヌクレオチド塩基の任意の組合せを取り込み得るが、隣接するプリンの存在は、産物中に１以上の残基の欠失を導き得る。この困難性の見込みにおいて、隣接するプリンを有するＰＮＡを産生する際に、付加されているようである残基の連結を非効率的に繰り返すべきであることが示唆される。この後、ペプチド合成の間に観測されるのと類似する産物の収率および純度を提供する逆相高圧液体クロマトグラフィーによってＰＮＡを精製するべきである（Ｎｏｒｔｏｎら、１９９５）。
【０６３３】
所与の適用のためのＰＮＡの修飾が、固相合成の間にアミノ酸を連結することによって、または露出されたＮ末端アミンにカルボン酸基を含む化合物を付加することによって達成され得る。あるいは、ＰＮＡは、導入されたリジンまたはシステインに連結することによって合成した後に修飾され得る。ＰＮＡが修飾され得る簡便さにより、より良い溶解度または特定の機能的必要条件の最適化を容易にする。一旦合成されると、ＰＮＡおよびそれらの誘導体の同定は、質量分析法によって確認され得る。いくつかの研究が、ＰＮＡの修飾物を作製および利用した（Ｎｏｒｔｏｎら、１９９５；Ｈａａｉｍａら、１９９６；Ｓｔｅｔｓｅｎｋｏら、１９９６；Ｐｅｔｅｒｓｅｎら、１９９５；Ｕｌｍａｎｎら、１９９６；Ｋｏｃｈら、１９９５；Ｏｒｕｍら、１９９５；Ｆｏｏｔｅｒら、１９９６；Ｇｒｉｆｆｉｔｈら、１９９５；Ｋｒｅｍｓｋｙら、１９９６；Ｐａｒｄｒｉｄｇｅら、１９９５；Ｂｏｆｆａら、１９９５；Ｌａｎｄｓｄｏｒｐら、１９９６；Ｇａｍｂａｃｏｒｔｉ−Ｐａｓｓｅｒｉｎｉら、１９９６；Ａｒｍｉｔａｇｅら、１９９７；Ｓｅｅｇｅｒら、１９９７；Ｒｕｓｋｏｗｓｋｉら、１９９７）。米国特許第５，７００，９２２号は、ＰＮＡ−ＤＮＡ−ＰＮＡキメラ分子および診断におけるその分子の使用、生物体におけるタンパク質の調節、ならびに治療に対して影響を受け易い状態の処置について議論する。
【０６３４】
負に荷電した連結を含有するＤＮＡおよびＲＮＡとは対照的に、ＰＮＡ骨格は、中性である。この劇的な変更にもかかわらず、ＰＮＡは、Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ対形成によって相補的なＤＮＡおよびＲＮＡを認識し（Ｅｇｈｏｌｍら、１９９３）、Ｎｉｅｌｓｅｎら（１９９１）による初期のモデル化を確認する。ＰＮＡは、３’〜５’の極性を欠き、そして平行様式または逆平行様式のいずれかで結合し得るが、逆平行様式が好ましい（Ｅｇｈｏｌｍら、１９９３）。
【０６３５】
ＤＮＡオリゴヌクレオチドとＤＮＡおよびＲＮＡとのハイブリダイゼーションは、相補鎖の負に荷電したリン酸骨格の間の静電気的な反発によって不安定化される。対照的に、ＰＮＡ−ＤＮＡまたはＰＮＡ−ＲＮＡの二重鎖において電荷の反発がないことにより、融解温度（Ｔｍ）が上昇し、そして一価のカチオンまたは二価のカチオンの濃度へのＴｍの依存度が減少する（Ｎｉｅｌｓｅｎら、１９９１）。ハイブリダイゼーションの増加した速度および親和性は重要である。なぜならば、これらは、緩和した二重鎖ＤＮＡ内の相補配列の鎖侵入を実施するＰＮＡの驚くべき能力の原因となるからである。さらに、逆方向反復での効果的なハイブリダイゼーションは、ＰＮＡが、二重鎖ＤＮＡ内で効果的に二次構造を認識し得ることを示唆する。増強した認識はまた、表面上に固定されたＰＮＡで生じ、Ｗａｎｇらは、支持体に結合したＰＮＡが、ハイブリダイゼーション事象を検出するために使用され得ることを示した（Ｗａｎｇら、１９９６）。
【０６３６】
相補的な配列に対するＰＮＡの強固な結合がまた、類似の（同じではない）配列との結合を増加し、ＰＮＡ認識の配列特異性を減少させることが予期され得る。しかし、ＤＮＡハイブリダイゼーションに関して、選択的認識は、オリゴマー長およびインキュベーション温度のバランスをとることにより達成され得る。さらに、ＰＮＡの選択的ハイブリダイゼーションは、ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーションよりも塩基ミスマッチの許容が低いＰＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーションによって促進される。例えば、１６ｂｐのＰＮＡ−ＤＮＡ二重鎖内での１個のミスマッチは、最大１５℃だけＴｍを低下させ得る（Ｅｇｈｏｌｍら、１９９３）。高いレベルの識別は、点変異の分析に対して、数種のＰＮＡに基づく戦略の開発を可能にする（Ｗａｎｇら、１９９６；Ｃａｒｌｓｓｏｎら、１９９６；Ｔｈｉｅｄｅら、１９９６；ＷｅｂｂおよびＨｕｒｓｋａｉｎｅｎ、１９９６；Ｐｅｒｒｙ−Ｏ’Ｋｅｅｆｅら、１９９６）。
【０６３７】
高親和性の結合は、ＰＮＡに対する分子認識および新規適用の開発のための明確な利点を提供する。例えば、１１〜１３個のヌクレオチドＰＮＡは、テロメラーゼ（必須のＲＮＡテンプレートを使用してテロメア末端を伸長するリボヌクレオ−タンパク質）の活性を阻害するが、類似のＤＮＡオリゴマーは、阻害しない（Ｎｏｒｔｏｎら、１９９６）。
【０６３８】
中性ＰＮＡは、類似のＤＮＡオリゴマーよりもより疎水性であり、そしてこのことは、特に、ＰＮＡが高いプリン含有量を有する場合、または二次構造を形成するような可能性を有する場合に、中性のｐＨでのこのＰＮＡの溶解をより困難にし得る。これらの溶解度は、１以上の正電荷をＰＮＡ末端に付与することによって増加され得る（Ｎｉｅｌｓｅｎら、１９９１）。
【０６３９】
Ａｌｌｆｒｅｙおよび共同実験者による知見は、鎖の侵入が染色体ＤＮＡ内の配列において自然に起こることを示唆している（Ｂｏｆｆａら、１９９５；Ｂｏｆｆａら、１９９６）。これらの研究は、ヌクレオチドＣＡＧの三塩基反復に対してＰＮＡを標的化し、そして転写性活性ＤＮＡを精製（Ｂｏｆｆａら、１９９５）し、そして転写を阻害（Ｂｏｆｆａら、１９９６）するためにこの認識を使用した。この結果は、ＰＮＡが細胞内に送達され得た場合、このＰＮＡが遺伝子発現の一般的な配列特異的調節因子となる可能性を有することを示唆する。アンチセンスおよび抗遺伝子試薬としてのＰＮＡの使用に関する研究および総説には、Ｎｉｅｌｓｅｎら（１９９３ｂ）、Ｈａｎｖｅｙら（１９９２）、ならびにＧｏｏｄおよびＮｉｅｌｓｅｎ（１９９７）が挙げられる。Ｋｏｐｐｅｌｈｕｓら（１９９７）は、ＨＩＶ−１の逆転写を阻害するためにＰＮＡを使用して、ＰＮＡが抗ウイルス治療に使用され得ることを示した。
【０６４０】
ＰＮＡのアンチセンス結合特性を特徴付ける方法は、Ｒｏｓｅ（１９９３）およびＪｅｎｓｅｎら（１９９７）において議論される。Ｒｏｓｅは、キャピラリーゲル電気泳動を使用して、相対的な結合速度論および化学量論を測定することで、その相補的オリゴヌクレオチドとＰＮＡとの結合を決定する。同じ型の測定が、ＢＩＡｃｏｒｅＴＭ技術を使用してＪｅｎｓｅｎらによってなされた。
【０６４１】
ＰＮＡの他の適用には、ＤＮＡ鎖の侵入（Ｎｉｅｌｓｅｎら、１９９１）、アンチセンス阻害（Ｈａｎｖｅｙら、１９９２）、変異分析（Ｏｒｕｍら、１９９３）、転写エンハンサー（Ｍｏｌｌｅｇａａｒｄら、１９９４）、核酸の精製（Ｏｒｕｍら、１９９５）、転写活性遺伝子の単離（Ｂｏｆｆａら、１９９５）、転写因子の結合の阻害（Ｖｉｃｋｅｒｓら、１９９５）、ゲノムの切断（Ｖｅｓｅｌｋｏｖら、１９９６）、バイオセンサー（Ｗａｎｇら、１９９６）、インサイチュハイブリダイゼーション（Ｔｈｉｓｔｅｄら、１９９６）、およびサザンブロットの代替（Ｐｅｒｒｙ−Ｏ’Ｋｅｅｆｅ、１９９６）における使用が挙げられる。
【０６４２】
（ポリペプチド組成物）
他の局面において、本発明は、ポリペプチド組成物を提供する。一般に、本発明のポリペプチドは、哺乳動物種由来の単離されたポリペプチド（もしくはエピトープ、改変体、またはその活性フラグメント）である。好ましくは、このポリペプチドは、本明細書中に開示されるポリヌクレオチド配列によって、または本明細書中に開示されるポリヌクレオチド配列に対して中程度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列によってコードされる。あるいは、このポリペプチドは、本明細書中に開示されるアミノ酸配列由来の連続アミノ酸配列を含むポリペプチド、または本明細書中に開示されるアミノ酸配列全体を含むポリペプチドとして規定され得る。
【０６４３】
本発明において、ポリペプチド組成物はまた、本発明のポリペプチド（特に、配列番号１〜４５１、４５３、４５５〜４５６、および４５８に開示されるポリヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド）、あるいはその活性フラグメント、または改変体もしくは生物学的機能性等価物に対して産生される抗体と免疫学的に反応性である１以上のポリペプチドを含むと考えられる。
【０６４４】
同様に、本発明のポリペプチド組成物は、配列番号１〜４５１、４５３、４５５〜４５６、および４５８に含まれる１以上の連続する核酸配列、あるいはその活性フラグメントまたは改変体、または中程度〜高いストリンジェンシー条件下でこれらの配列の１以上とハイブリダイズする１以上の核酸配列によってコードされる１以上のポリペプチドと免疫学的に反応性である抗体を惹起し得る１以上のポリペプチドを含むことが理解される。
【０６４５】
本明細書中で使用される場合、ポリペプチドの活性フラグメントは、ポリペプチドの全体または一部を含み、これは、従来の技術（例えば、突然変異誘発）により、または付加、失欠、もしくは置換によって改変されるが、活性フラグメントは、本明細書中に記載されるようなポリペプチドとして、実質的に同一の構造的機能性、抗原性などを示す。
【０６４６】
特定の例示的な実施形態において、本発明のポリペプチドは、本明細書中に記載されるように、肺癌タンパク質またはその改変体の少なくとも免疫原性部分を含む。上記のように、「肺腫瘍タンパク質」は、肺腫瘍細胞によって発現されるタンパク質である。肺腫瘍タンパク質であるタンパク質はまた、イムノアッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡ）において、肺癌を有する患者由来の抗血清と検出可能に反応する。本明細書中に記載のポリペプチドは、任意の長さであり得る。ネイティブなタンパク質および／または非相同的な配列由来のさらなる配列が存在し得、そしてこのような配列は、さらなる免疫原性特性または抗原性特性を有し得るが、必要ではない。
【０６４７】
本明細書中で使用される場合、「免疫原性部分」は、Ｂ細胞および／またはＴ細胞の表面抗原レセプターによって認識される（すなわち、特異的に結合される）タンパク質の一部である。一般に、このような免疫原性部分は、肺腫瘍タンパク質またはそれらの改変体の少なくとも５個のアミノ酸残基、より好ましくは、少なくとも１０個のアミノ酸残基、そしてさらにより好ましくは、少なくとも２０個のアミノ酸残基、を含む。特定の好ましい免疫原性部分は、Ｎ末端リーダー配列および／または膜貫通ドメインが欠失されているペプチドを含む。他の好ましい免疫原性部分は、成熟タンパク質と比較して、少ないＮ末端および／またはＣ末端失欠（例えば、１〜３０個のアミノ酸、好ましくは、５〜１５個のアミノ酸）を含む。
【０６４８】
免疫原性部分は、一般的にＰａｕｌ，Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，第３版、２４３−２４７（Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ，１９９３）およびそこに引用される参考文献に要約されるような周知技術を使用して、同定され得る。このような技術は、抗原特異的な抗体、抗血清および／あるいはＴ細胞株またはＴ細胞クローンと反応する能力についてポリペプチドをスクリーニングする工程を包含する。本明細書中で使用される場合、抗血清および抗体は、それらが抗原に特異的に結合する（すなわち、これらが、ＥＬＩＳＡまたは他の免疫アッセイにおいてそのタンパク質と反応し、無関係なタンパク質とは検出可能に反応しない）場合、「抗原特異的」である。このような抗血清および抗体は、本明細書中に記載されるように、そして周知技術を使用して調製され得る。ネイティブの肺腫瘍タンパク質の免疫原性部分は、（例えば、ＥＬＩＳＡおよび／またはＴ細胞反応性アッセイにおいて）その全長ポリペプチドの反応性よりも実質的に小さくないレベルで、このような抗血清および／またはＴ細胞と反応する部分である。このような免疫原性部分は、このようなアッセイにおいて、その全長ポリペプチドの反応性と類似またはそれより大きいレベルで反応し得る。このようなスクリーニングは、一般的に、当業者に周知の方法（例えば、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８に記載のような技術）を使用して行われ得る。例えば、ポリペプチドを固体支持体に固定し、そして患者の血清と接触させて、その血清中の抗体をその固定されたポリペプチドに結合させ得る。次いで、結合されなかった血清を除去し、結合された抗体を、例えば、１２５Ｉ標識プロテインＡを使用して検出し得る。
【０６４９】
上記のように、組成物は、ネイティブの肺腫瘍タンパク質の改変体を含み得る。本明細書中で使用される場合、ポリペプチド「改変体」は、ネイティブの肺腫瘍タンパク質と１以上の置換、欠失、付加および／または挿入で異なり、その結果、そのポリペプチドの免疫原性が、実質的には減少されないポリペプチドである。言い換えると、抗原特異的な抗血清と反応する改変体の能力は、そのネイティブタンパク質と比較して、増強されても、または変化されなくてもよく、あるいは、そのネイティブタンパク質と比較して、５０％未満、そしてより好ましくは、２０％未満減少されてもよい。このような改変体は、一般に、本明細書中に記載のように、上記ポリペプチド配列の１つを改変し、この改変ポリペプチドの抗原特異的な抗体または抗血清との反応性を評価することによって同定され得る。好ましい改変体は、１つ以上の部分（例えば、Ｎ末端リーダー配列または膜貫通ドメイン）が取り除かれた改変体を含む。他の好ましい改変体は、小さな部分（例えば、１〜３０アミノ酸、好ましくは５〜１５アミノ酸）が、成熟タンパク質のＮ末端および／またはＣ末端から取り除かれた改変体を含む。
【０６５０】
本発明によって含まれるポリペプチド改変体は、本明細書中に開示されたポリペプチドに対して、少なくとも約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％以上の同一性（上記のように決定された）を示すポリペプチド改変体を含む。
【０６５１】
好ましくは、改変体は、保存的置換を含む。「保存的置換」は、あるアミノ酸が、類似の特性を有する別のアミノ酸と置換されている置換であり、その結果、ペプチド化学の当業者は、そのポリペプチドの二次構造および疎水性親水性（ｈｙｄｒｏｐａｔｈｉｃ）性質が、実質的に変化されないことを予測する。アミノ酸置換は、一般に、残基の極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性および／または両親媒性性質の類似性に基づいてなされ得る。例えば、負に荷電したアミノ酸としては、アスパラギン酸およびグルタミン酸；正に荷電したアミノ酸としては、リジンおよびアルギニン；および類似の親水性値を有する非荷電の極性ヘッド基を有するアミノ酸としては、ロイシン、イソロイシンおよびバリン；グリシンおよびアラニン；アスパラギンおよびグルタミン；ならびにセリン、スレオニン、フェニルアラニンおよびチロシンが挙げられる。保存的変化を示し得るアミノ酸の他のグループとしては、（１）ａｌａ、ｐｒｏ、ｇｌｙ、ｇｌｕ、ａｓｐ、ｇｌｎ、ａｓｎ、ｓｅｒ、ｔｈｒ；（２）ｃｙｓ、ｓｅｒ、ｔｙｒ、ｔｈｒ；（３）ｖａｌ、ｉｌｅ、ｌｅｕ、ｍｅｔ、ａｌａ、ｐｈｅ；（４）ｌｙｓ、ａｒｇ、ｈｉｓ；および（５）ｐｈｅ、ｔｙｒ、ｔｒｐ、ｈｉｓが挙げられる。改変体はまた、またはあるいは、非保存的変化を含み得る。好ましい実施形態において、改変体ポリペプチドは、５または５より少ないアミノ酸の置換、欠失または付加によって、ネイティブの配列とは異なる。改変体はまた（またはあるいは）、例えば、ポリペプチドの免疫原性、二次構造および疎水性親水性性質に最小限の影響しか有さないアミノ酸の欠失または付加によって、改変され得る。
【０６５２】
上記のように、ポリペプチドは、タンパク質のＮ末端にシグナル（または、リーダー）配列を含み得、これは、翻訳と同時に、または翻訳後に、そのタンパク質の転移を指向する。このポリペプチドはまた、このポリペプチドの合成、精製または同定を容易にするために、またはこのポリペプチドの固体支持体への結合を増強するために、リンカー配列または他の配列（例えば、ポリＨｉｓ）に結合体化され得る。例えば、ポリペプチドは、免疫グロブリンＦｃ領域に結合体化され得る。
【０６５３】
ポリペプチドは、種々の周知技術のいずれかを使用して調製され得る。上記のようなＤＮＡ配列によってコードされる組換えポリペプチドは、当業者に公知の種々の発現ベクターのいずれかを使用して、ＤＮＡ配列から容易に調製され得る。発現は、組換えポリペプチドをコードするＤＮＡ分子を含む発現ベクターで形質転換またはトランスフェクトされた、任意の適切な宿主細胞において達成され得る。適切な宿主細胞としては、原核生物細胞、酵母細胞、および高等真核生物細胞（例えば、哺乳動物細胞および植物細胞）が挙げられる。好ましくは、使用される宿主細胞は、Ｅ．ｃｏｌｉ、酵母または哺乳動物細胞株（例えば、ＣＯＳまたはＣＨＯ）である。組換えタンパク質または組換えポリペプチドを培養培地中に分泌する適切な宿主／ベクター系からの上清は、市販のフィルターを使用して、最初に濃縮され得る。濃縮後、この濃縮物を、適切な精製マトリックス（例えば、アフィニティーマトリックスまたはイオン交換樹脂）に適用し得る。最終的に、１以上の逆相ＨＰＬＣ工程を使用して、組換えポリペプチドをさらに精製し得る。
【０６５４】
約１００アミノ酸未満、そして一般に、約５０アミノ酸未満のアミノ酸を有する部分および他の改変体もまた、当業者に周知の技術を使用して、合成手段によって生成され得る。例えば、このようなポリペプチドは、市販の固相技術のいずれか（例えば、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ固相合成法（ここでは、アミノ酸が連続的に付加されて、アミノ酸鎖を成長させる））を使用して、合成され得る。Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５：２１４９−２１４６，１９６３を参照のこと。ポリペプチドの自動合成のための装置は、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ／Ａｐｐｌｉｅｄ  ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）のような供給者から市販され、そして製造業者の説明書に従って操作され得る。
【０６５５】
特定の実施形態において、ポリペプチドは、本明細書中に記載の複数のポリペプチドを含むか、または本明細書に記載の少なくとも１つのポリペプチドおよび関連しない配列（例えば、公知の腫瘍タンパク質）を含む融合タンパク質であり得る。例えば、融合パートナーは、Ｔヘルパーエピトープ（、好ましくはヒトによって認識されるＴヘルパーエピトープを提供する際に補助し得る免疫学的融合パートナー）か、またはネイティブの組換えタンパク質より高い収量でタンパク質を発現する際に補助し得る（発現エンハンサー）。特定の好ましい融合パートナーは、免疫学的融合パートナーおよび発現増強融合パートナーの両方である。他の融合パートナーは、タンパク質の溶解度を増加するように、またはタンパク質が所望の細胞内コンパートメントに標的化されることを可能にするように選択され得る。なおさらなる融合パートナーには、親和性タグ（これは、タンパク質の精製を容易にする）が挙げられる。
【０６５６】
融合タンパク質は、一般に、標準的な技術（化学的結合体化を含む）を使用して調製され得る。好ましくは、融合タンパク質は、発現系において、組換えタンパク質として発現され、非融合タンパク質と比較して、増加したレベルの産生を可能にする。手短に言うと、このポリペプチド成分をコードするＤＮＡ配列を、別々にアセンブルし得、そして適切な発現ベクターに連結し得る。１つのポリペプチド成分をコードするＤＮＡ配列の３’末端は、ペプチドリンカーを用いてまたは用いずに、第２のポリペプチド成分をコードするＤＮＡ配列の５’末端に、これらの配列のリーディングフレームが同位相にあるように連結される。このことが、両方の成分ポリペプチドの生物学的活性を保持する単一の融合タンパク質への翻訳を可能にする。
【０６５７】
ペプチドリンカー配列は、各ポリペプチドがその二次構造および三次構造へと折り畳まれるのを保証するために十分な距離で第一および第二のポリペプチド成分を隔てるために用いられ得る。このようなペプチドリンカー配列は、当該分野で周知の標準的な技術を用いて融合タンパク質中に組み込まれる。適切なペプチドリンカー配列は、以下の因子に基づいて選択され得る：（１）伸長した可変コンホメーションを取る能力；（２）第一および第二のポリペプチド上の機能的なエピトープと相互作用し得る二次構造を取ることができないこと；ならびに（３）ポリペプチドの機能的なエピトープと反応し得る疎水性または荷電した残基の無いこと。好ましいペプチドリンカー配列は、Ｇｌｙ、ＡｓｎおよびＳｅｒ残基を含む。ＴｈｒおよびＡｌａのような中性に近い他のアミノ酸もまた、リンカー配列に用いられ得る。リンカーとして有用に用いられ得るアミノ酸配列としては、Ｍａｒａｔｅａら、Ｇｅｎｅ  ４０：３９−４６、１９８５；Ｍｕｒｐｈｙら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８３：８２５８−８２６２、１９８６；米国特許第４，９３５，２３３号および米国特許第４，７５１，１８０号に開示されるアミノ酸配列が挙げられる。リンカー配列は、一般的に１から約５０アミノ酸長であり得る。リンカー配列は、第一および第二のポリペプチドが、機能的ドメインを分離するため、および立体的な干渉を防ぐために用いられ得る非必須Ｎ末端アミノ酸領域を有する場合、必要とされない。
【０６５８】
連結されたＤＮＡ配列は、適切な転写または翻訳調節エレメントに作動可能に連結される。ＤＮＡの発現を担う調節エレメントは、第一のポリペプチドをコードするＤＮＡ配列の５’側にのみ位置する。同様に、翻訳および転写終結シグナルを終了するために必要とされる終止コドンは、第二のポリペプチドをコードするＤＮＡ配列の３’側にのみ存在する。
【０６５９】
融合タンパク質もまた提供される。このようなタンパク質は、関連しない免疫原性タンパク質と共に、本明細書中に記載されるようなポリペプチドを含む。好ましくは、免疫原性タンパク質は、リコール（ｒｅｃａｌｌ）応答を惹起し得る。このようなタンパク質の例としては、破傷風タンパク質、結核タンパク質および肝炎タンパク質が挙げられる（例えば、Ｓｔｏｕｔｅら、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．、３３６：８６−９１（１９９７）を参照のこと）。
【０６６０】
好ましい実施形態において、免疫学的融合パートナーは、グラム陰性の細菌Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ｂの表面タンパク質である、プロテインＤ（ＷＯ  ９１／１８９２６）に由来する。好ましくは、プロテインＤ誘導体は、このタンパク質のほぼ３分の１（例えば、最初のＮ末端１００〜１１０アミノ酸）を含み、そしてプロテインＤ誘導体は、脂質化（ｌｉｐｉｄａｔｅｄ）され得る。特定の好ましい実施形態において、リポタンパク質Ｄ融合パートナーの最初の１０９残基は、さらなる外因性Ｔ細胞エピトープを有するポリペプチドを提供するように、そしてＥ．ｃｏｌｉ中の発現レベルを増加する（従って、発現エンハンサーとして機能する）ように、Ｎ末端に含まれる。脂質テールは、抗原提示細胞への抗原の最適な提示を保証する。他の融合パートナーは、インフルエンザウイルス由来の非構造タンパク質、ＮＳ１（血球凝集素）を含む。代表的に、Ｎ末端の８１アミノ酸が用いられるが、Ｔヘルパーエピトープを含む異なるフラグメントが用いられてもよい。
【０６６１】
別の実施形態において、免疫学的融合パートナーは、ＬＹＴＡとして公知のタンパク質、またはその部分（好ましくはＣ末端部分）である。ＬＹＴＡは、アミダーゼＬＹＴＡ（ＬｙｔＡ遺伝子によりコードされる；Ｇｅｎｅ  ４３：２６５〜２９２，１９８６）として公知のＮ−アセチル−Ｌ−アラニンアミダーゼを合成するＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ由来である。ＬＹＴＡは、ペプチドグリカン骨格中の特定の結合を特異的に分解する自己溶解素である。ＬＹＴＡタンパク質のＣ末端ドメインは、コリンまたはいくつかのコリンアナログ（例えば、ＤＥＡＥ）への親和性についての原因である。この性質は、融合タンパク質の発現のために有用なＥ．ｃｏｌｉ  Ｃ−ＬＹＴＡ発現プラスミドの開発のために利用されてきた。アミノ酸末端にＣ−ＬＹＴＡフラグメントを含むハイブリッドタンパク質の精製が、記載されている（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：７９５〜７９８，１９９２を参照のこと）。好ましい実施形態において、ＬＹＴＡの反復部分は、融合タンパク質に組み込まれ得る。反復部分は、残基１７８で開始するＣ末端領域中に見出される。特に好ましい反復部分は、残基１８８〜３０５を組み込む。
【０６６２】
一般に、本明細書に記載されるようなポリペプチド（融合タンパク質を含む）およびポリヌクレオチドが単離される。「単離された」ポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、その元来の環境から取り出されたものである。例えば、天然に存在するタンパク質は、それが天然の系中で共存する物質のいくつかまたは全てから分離されている場合、単離されている。好ましくは、このようなポリペプチドは、少なくとも約９０％純粋、より好ましくは少なくとも約９５％純粋、そして最も好ましくは少なくとも約９９％純粋である。ポリヌクレオチドは、例えば、それが天然の環境の一部でないベクターにクローニングされる場合、単離されているとみなされる。
【０６６３】
（結合因子）
本発明は、肺腫瘍タンパク質に特異的に結合する因子（例えば、抗体およびその抗原結合フラグメント）をさらに提供する。本明細書において用いる場合、抗体またはその抗原結合フラグメントは、肺腫瘍タンパク質と検出可能レベルで反応し（例えば、ＥＬＩＳＡにおいて）、そして類似の条件下で無関係のタンパク質とは検出可能に反応しない場合、肺腫瘍タンパク質に「特異的に結合する」といわれる。本明細書において用いる場合、「結合（ｂｉｎｄｉｎｇ）」は、複合体が形成されるような２つの別々の分子間の非共有結合をいう。結合する能力は、例えば、複合体の形成についての結合定数を決定することにより評価され得る。結合定数は、複合体の濃度を成分濃度の積で割って得られる値である。一般に、２つの化合物は、複合体形成の結合定数が約１０３Ｌ／ｍｏｌを超える場合、本発明の文脈中で「結合している」といわれる。結合定数は、当該分野で周知の方法を用いて決定され得る。
【０６６４】
結合因子は、本明細書において提供される代表的なアッセイを用いて、癌（例えば、肺癌）を有する患者と有さない患者の間でさらに区別され得る。言い換えれば、肺腫瘍タンパク質に結合する抗体または他の結合因子は、疾患を有する患者の少なくとも約２０％において癌の存在を示すシグナルを生成し、そして癌を有さない個体の少なくとも約９０％において疾患が存在しないことを示すネガティブなシグナルを生成する。結合因子がこの要件を満たすか否かを決定するために、癌を有する患者および癌を有さない患者（標準的臨床試験を用いて決定した場合）由来の生物学的サンプル（例えば、血液、血清、痰、尿、および／または腫瘍生検）は、この結合因子に結合するポリペプチドの存在について、本明細書に記載のようにアッセイされ得る。疾患を有するサンプルおよび疾患を有さないサンプルの、統計的に有意な数のサンプルをアッセイすべきであることが明白である。それぞれの結合因子は、上記の基準を満たすべきであるが；当業者は、結合因子が感受性を改善するために組み合わせて用いられ得ることを認識する。
【０６６５】
上記の要件を満たす任意の因子が結合因子であり得る。例えば、結合因子はリボソーム（ペプチド成分を伴うかまたは伴わない）、ＲＮＡ分子またはポリペプチドであり得る。好ましい実施形態において、結合因子は、抗体またはその抗原結合フラグメントである。抗体は、当業者に公知の任意の種々の技術により調製され得る。例えば、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８を参照のこと。一般に、組換え抗体の産生を可能にするために、細胞培養技術（本明細書中に記載のモノクローナル抗体の産生を含む）によってか、または適切な細菌細胞宿主または哺乳動物細胞宿主への抗体遺伝子のトランスフェクションを介して、抗体は産生され得る。１つの技術では、ポリペプチドを含む免疫原は、広範な種々の哺乳動物のいずれか（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、またはヤギ）にまず注射される。この工程で、本発明のポリペプチドは、改変なしの免疫原として働き得る。あるいは、特に、比較的短いポリペプチドについて、このポリペプチドがキャリアタンパク質（例えば、ウシ血清アルブミンまたはキーホールリンペットヘモシアニン）に結合する場合、優れた免疫応答が惹起され得る。この免疫原は、好ましくは所定のスケジュール（１回以上のブースター免疫を組み込む）に従って、動物宿主に注射され、そしてこの動物は、定期的に採血される。次いで、このポリペプチドに特異的なポリクローナル抗体は、例えば、適切な固体支持体に結合しているポリペプチドを用いるアフィニティークロマトグラフィーにより、このような抗血清から精製され得る。
【０６６６】
目的の抗原性ポリペプチドについて特異的なモノクローナル抗体は、例えば、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：５１１−５１９、１９７６の技術、ならびにその改良型を使用して調製され得る。手短に言うと、これらの方法は、所望の特異性（すなわち、目的のポリペプチドとの反応性）を有する抗体を産生し得る不死化細胞株の調製を包含する。このような細胞株は、例えば、上記のように、免疫された動物から得られた脾臓細胞から産生され得る。次いで、脾臓細胞は、例えば、骨髄腫細胞融合パートナー（好ましくは、免疫された動物と同系のもの）との融合によって不死化される。種々の融合技術が使用され得る。例えば、脾臓細胞および骨髄腫細胞は、非イオン性界面活性剤と数分間組み合わせられ得、次いで、ハイブリッド細胞の増殖を支持するが、骨髄腫細胞の増殖を支持しない選択培地上で低密度でプレートされる。好ましい選択技術は、ＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）選択を使用する。十分な時間（通常約１〜２週間）後、ハイブリッドのコロニーが観察される。単一コロニーが選択され、そしてそれらの培養上清が、ポリペプチドに対する結合活性について試験される。高い反応性および特異性を有するハイブリドーマが好ましい。
【０６６７】
モノクローナル抗体を、増殖しているハイブリドーマコロニーの上清から単離し得る。さらに、種々の技術（例えば、適切な脊椎動物宿主（例えば、マウス）の腹膜腔へのハイブリドーマ細胞株の注入）が、収量を増大させるために利用され得る。次いで、モノクローナル抗体を、腹水または血液から収集し得る。夾雑物を、通常の技術（例えば、クロマトグラフィー、ゲル濾過、沈殿、および抽出）によって抗体から除去し得る。本発明のポリペプチドを、例えば、アフィニティークロマトグラフィー工程における精製工程において使用し得る。
【０６６８】
特定の実施形態において、抗体の抗原結合フラグメントの使用が好ましくあり得る。このようなフラグメントは、標準的な技術を使用して調製され得るＦａｂフラグメントを含む。手短に言うと、免疫グロブリンを、プロテインＡビーズカラム上のアフィニティークロマトグラフィー（ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、１９８８）によってウサギ血清から精製し得、そしてパパインによって消化して、ＦａｂフラグメントおよびＦｃフラグメントを産生し得る。ＦａｂフラグメントおよびＦｃフラグメントは、プロテインＡビーズカラム上のアフィニティークロマトグラフィーによって分離され得る。
【０６６９】
本発明のモノクローナル抗体は、１つ以上の治療薬剤に結合され得る。この点に関して、適切な薬剤としては、放射性核種、分化インデューサー、薬物、毒素、およびそれの誘導体が挙げられる。好ましい放射性核種としては、９０Ｙ、１２３Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、２１１Ａｔおよび２１２Ｂｉが挙げられる。好ましい薬物としては、メトトレキサート、ならびにピリミジンおよびプリンアナログが挙げられる。好ましい分化インデューサーとしては、ホルボールエステルおよび酪酸が挙げられる。好ましい毒素としては、リシン、アブリン、ジフテリア毒素、コレラ毒素、ゲロニン、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ体外毒素、Ｓｈｉｇｅｌｌａ毒素、およびアメリカヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質が挙げられる。
【０６７０】
治療剤は、適切なモノクローナル抗体に直接的または間接的に（例えば、リンカー基を介して）のいずれかで結合（例えば、共有結合）され得る。薬剤と抗体との間の直接的な反応は、各々が他のものと反応し得る置換基を有する場合に可能である。例えば、一方の上の求核基（例えば、アミノ基またはスルフヒドリル基）は、他方のカルボニル含有基（例えば、酸無水物または酸ハロゲン化物）または良好な脱離基（例えば、ハロゲン化物）を含むアルキル基と反応し得る。
【０６７１】
あるいは、リンカー基を介して治療剤と抗体とを結合させることが所望され得る。リンカー基は、結合の可能性を妨げることを回避するために、抗体を薬剤から隔てるためのスペーサーとして機能し得る。リンカー基はまた、薬剤または抗体上の置換基の化学的反応性を増加させるためにはたらき得、従って結合効率を増大させる。化学的反応性の増大はまた、薬剤または薬剤上の官能基の使用を促進し得る（さもなければ、可能ではない）。
【０６７２】
種々の二官能性または多官能性試薬、ホモ官能性とヘテロ官能性との両方（例えば、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬのカタログ中に記載されるもの）が、リンカー基として使用され得ることが当業者には明らかである。結合は、例えば、アミノ基、カルボキシル基、スルフヒドリル基、または酸化された炭水化物残基を介してもたらされ得る。このような方法論を記載する多数の参考文献（例えば、Ｒｏｄｗｅｌｌらに対する米国特許第４，６７１，９５８号）が存在する。
【０６７３】
本発明の免疫結合体の抗体部分がないときに治療剤がより強力である場合、細胞中へのインターナリゼーションの間に、またはその際に切断可能なリンカー基を使用することが望ましくあり得る。多数の異なる切断可能なリンカー基が記載されている。これらのリンカー基からの薬剤の細胞内放出についての機構は、ジスルフィド結合の還元（例えば、Ｓｐｉｔｌｅｒへの米国特許第４，４８９，７１０号）、感光性結合の照射（例えば、Ｓｅｎｔｅｒらへの米国特許第４，６２５，０１４号）、誘導体化されたアミノ酸側鎖の加水分解（例えば、Ｋｏｈｎらへの米国特許第４，６３８，０４５号）、血清補体媒介性加水分解（例えば、Ｒｏｄｗｅｌｌらへの米国特許第４，６７１，９５８号）、および酸触媒加水分解（例えば、Ｂｌａｔｔｌｅｒらへの米国特許第４，５６９，７８９号）による切断を含む。
【０６７４】
１つより多い薬剤を抗体に結合させることが望ましくあり得る。１つの実施形態において、薬剤の複数の分子が１つの抗体分子に結合される。別の実施形態において、１つより多い型の薬剤が１つの抗体に結合され得る。特定の実施形態に関わらず、１つより多い薬剤を有する免疫結合体は、種々の方法で調製され得る。例えば、１つより多い薬剤が、抗体分子に直接的に結合され得るか、または付着のための複数の部位を提供するリンカーが使用され得る。あるいは、キャリアが使用され得る。
【０６７５】
キャリアは、種々の方法（直接的にかまたはリンカー基を介するかのいずれかの共有結合を含む）で薬剤を保有し得る。適切なキャリアとしては、アルブミンのようなタンパク質（例えば、Ｋａｔｏらへの米国特許第４，５０７，２３４号）、ペプチド、およびアミノデキストランのような多糖類（例えば、Ｓｈｉｈらへの米国特許第４，６９９，７８４号）が挙げられる。キャリアはまた、例えばリポソーム小胞内に、非共有結合によってかまたはカプセル化によって、薬剤を保有し得る（例えば、米国特許第４，４２９，００８号および同第４，８７３、０８８号）。放射性核種薬剤に特異的なキャリアは、放射性ハロゲン化低分子およびキレート化合物を含む。例えば、米国特許第４，７３５，７９２号は、代表的な放射性ハロゲン化低分子およびそれらの合成を開示する。放射性核種キレートは、金属、または金属酸化物、放射性核種を結合するためのドナー原子として窒素原子および硫黄原子を含むものを含む、キレート化合物から形成され得る。例えば、Ｄａｖｉｓｏｎらへの米国特許第４，６７３，５６２号は、代表的なキレート化合物およびそれらの合成を開示する。
【０６７６】
抗体および免疫結合体についての投与の種々の経路が使用され得る。代表的には、投与は、静脈内、筋肉内、皮下、または切除した腫瘍の基底での投与である。抗体／免疫結合体の正確な用量は、使用される抗体、腫瘍上の抗原密度、および抗体のクリアランスの速度に依存して変化することは明白である。
【０６７７】
（Ｔ細胞）
免疫治療組成物はまた、またはあるいは、肺腫瘍タンパク質に特異的なＴ細胞を含み得る。このような細胞は、一般的に、標準的手順を使用して、インビトロまたはエキソビボで調製され得る。例えば、Ｔ細胞は、市販の細胞分離システム（例えば、ＩｓｏｌｅｘＴＭシステム（Ｎｅｘｅｌｌ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．（Ｉｒｖｉｎｅ，ＣＡ；米国特許第５，２４０，８５６号；米国特許第５，２１５，９２６号；ＷＯ８９／０６２８０；ＷＯ９１／１６１１６およびＷＯ９２／０７２４３もまた参照のこと）から入手可能）を使用して、患者の骨髄、末梢血あるいは骨髄または末梢血の画分から単離され得る。あるいは、Ｔ細胞は、関連または無関連のヒト、非ヒト哺乳動物、細胞株または培養物から誘導され得る。
【０６７８】
Ｔ細胞は、肺腫瘍ポリペプチド、肺腫瘍ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドおよび／またはそのようなポリペプチドを発現する抗原提示細胞（ＡＰＣ）を用いて刺激され得る。このような刺激は、このポリペプチドに特異的であるＴ細胞の生成を可能にする条件下および十分な時間、行われる。好ましくは、肺腫瘍ポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、送達ビヒクル（例えば、ミクロスフェア）中に存在して、特異的Ｔ細胞の生成を容易にする。
【０６７９】
Ｔ細胞は、このＴ細胞が、特異的に増殖するか、サイトカインを分泌するか、または腫瘍ポリペプチドで被覆されるかもしくはこのポリペプチドをコードする遺伝子を発現する標的細胞を殺傷する場合に、肺腫瘍ポリペプチドに特異的であるとみなされる。Ｔ細胞特異性は、種々の標準的技術のいずれかを使用して評価され得る。例えば、クロム放出アッセイまたは増殖アッセイにおいて、ネガティブコントロールと比較して、溶解および／または増殖における２倍を超える増加の刺激指標は、Ｔ細胞特異性を示す。このようなアッセイは、例えば、Ｃｈｅｎら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５４：１０６５−１０７０，１９９４に記載されるように、実行され得る。あるいは、Ｔ細胞の増殖の検出は、種々の公知の技術によって達成され得る。例えば、Ｔ細胞増殖は、ＤＮＡ合成の速度の増加を測定することによって検出され得る（例えば、トリチウム化チミジンでＴ細胞の培養物をパルス標識し、そしてＤＮＡに取り込まれたトリチウム化チミジンの量を測定することによって）。３〜７日間の肺腫瘍ポリペプチド（１００ｎｇ／ｍｌ〜１００μｇ／ｍｌ、好ましくは、２００ｎｇ／ｍｌ〜２５μｇ／ｍｌ）との接触は、Ｔ細胞の増殖において少なくとも２倍の増加を生じるはずである。２〜３時間の上記のような接触は、標準的なサイトカインアッセイを使用して測定されるように（ここで、サイトカイン（例えば、ＴＮＦまたはＩＦＮ−γ）放出のレベルの２倍の増加が、Ｔ細胞の活性化を示す）、Ｔ細胞の活性化を生じるはずである（Ｃｏｌｉｇａｎら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，第１巻、Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ（Ｇｒｅｅｎｅ  １９９８）を参照のこと）。肺腫瘍ポリペプチド、ポリヌクレオチドまたはポリペプチド発現ＡＰＣに応答して活性化されたＴ細胞は、ＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋であり得る。肺腫瘍ポリペプチド特異的Ｔ細胞は、標準的な技術を使用して拡大され得る。好ましい実施形態において、Ｔ細胞は、患者、関連するドナーまたは無関連のドナーに由来し、そして刺激および拡大後にその患者に投与される。
【０６８０】
治療目的で、肺腫瘍ポリペプチド、ポリヌクレオチドまたはＡＰＣに応答して増殖するＣＤ４＋Ｔ細胞またはＣＤ８＋Ｔ細胞は、インビトロまたはインビボのいずれかで大量に拡大され得る。このようなＴ細胞のインビトロでの増殖は、種々の方法で達成され得る。例えば、Ｔ細胞は、Ｔ細胞増殖因子（例えば、インターロイキン−２）の添加を伴うか、または伴わずに、肺腫瘍ポリペプチド、またはこのようなポリペプチドの免疫原性部分に対応する短いペプチドに対して再曝露され得、そして／または肺腫瘍ポリペプチドを合成する刺激細胞に対して再曝露され得る。あるいは、肺腫瘍ポリペプチドの存在下で増殖する１つ以上のＴ細胞は、クローニングによって数の上で拡大され得る。細胞をクローニングするための方法は、当該分野で周知であり、そしてこれらとしては、限界希釈が挙げられる。
【０６８１】
（薬学的組成物）
さらなる実施形態において、本発明は、細胞または動物に、単独で、または１つ以上の他の様式の療法との組み合わせのいずれかで投与するための、薬学的に受容可能な溶液中の本明細書中に開示されるポリヌクレオチド、ポリペプチド、Ｔ細胞および／または抗体組成物の１つ以上の処方物に関する。
【０６８２】
所望ならば、本明細書に開示されるようなポリペプチドを発現する核酸セグメント、ＲＮＡ、ＤＮＡまたはＰＮＡ組成物は、同様に、他の薬剤（例えば、他のタンパク質もしくはポリペプチドまたは種々の薬学的に活性な薬剤）と組み合わせて投与され得ることがまた理解される。事実、さらなる薬剤が、標的細胞または宿主組織との接触の際に有意な有害な効果を引き起こさなければ、また含まれ得る他の成分に実質的に制限はない。従って、これらの組成物は、特定の場合に必要に応じて種々の他の薬剤とともに送達され得る。このような組成物は、宿主細胞または他の生物学的供給源から精製され得るか、あるいは本明細書中に記載されるように化学的に合成され得る。同様に、このような組成物は、置換されたか、または誘導体化されたＲＮＡまたはＤＮＡ組成物をさらに含み得る。
【０６８３】
薬学的に受容可能な賦形剤およびキャリア溶液の処方は当業者に周知であり、これは、種々の処置レジメン（例えば、経口、非経口、静脈内、鼻腔内および筋肉内投与および処方が挙げられる）で、本明細書中に記載される特定の組成物の使用についての適切な用量および処置レジメンの開発である。
【０６８４】
（１．経口送達）
特定の適用において、本明細書に開示される薬学的組成物は、経口投与を介して動物に送達され得る。このように、これらの組成物は、不活性な希釈剤とともに処方され得るか、もしくは吸収可能な食用キャリアとともに処方され得るか、または、それらは、硬質殻または軟質殻のゼラチンカプセルに封入され得るか、またはそれらは、錠剤に圧縮され得るか、またはそれらは、治療食の食物と、直接混合され得る。
【０６８５】
活性化合物は、さらに賦形剤と共に組み込まれ得、そして経口摂取錠剤、経頬粘膜錠剤、トローチ、カプセル剤、エリキシル、懸濁液、シロップ、ウェハ剤などの形態で使用される（Ｍａｔｈｉｏｗｉｔｚら、１９９７；Ｈｗａｎｇら、１９９８；米国特許第５，６４１，５１５号；米国特許第５，５８０，５７９号および米国特許第５，７９２，４５１号（各々は、本明細書中で、その全体が参考として詳細に援用される））。錠剤、トローチ、丸剤、カプセル剤などはまた、以下を含み得る：バインダー（例えば、トラガカントゴム、アラビアゴム、コーンスターチまたはゼラチン）；賦形剤（例えば、リン酸二カルシウム）；崩壊剤（例えば、コーンスターチ、ジャガイモデンプン、アルギン酸など）；潤滑剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム）；および甘味料（例えば、スクロース、ラクトースまたはサッカリン）または香料（例えば、ペパーミント、ウインターグリーン油、またはチェリー香料）。投薬量単位形態がカプセル剤である場合、これは上記のタイプの材料に加えて液体キャリアを含み得る。様々な他の材料が、コーティングとして存在し得るか、またはそうでなければ投薬単位の物理的形態を改変し得る。例えば、錠剤、丸剤またはカプセル剤は、セラック、糖またはその両方でコーティングされ得る。エリキシルのシロップは、活性化合物、甘味料としてのスクロース、防腐剤としてのメチルパラベンおよびプロピパラベン、色素および香料（例えば、チェリーまたはオレンジ味）を含み得る。もちろん、任意の投薬単位形態を調製する際に使用される任意の材料は、薬学的に純粋でありかつ用いられる量で実質的に非毒性でなければならない。さらに、活性化合物が、持続性放出調製物および処方物に組み込まれ得る。
【０６８６】
代表的に、これらの処方物は、少なくとも約０．１％またはそれよりも多い活性化合物を含み得るが、活性成分の割合は、もちろん、変化し得、そして好都合に、全処方物の重量または体積の約１または２％と、約６０％または７０％以上のとの間であり得る。当然、治療的に有用な組成物の各々の中の活性化合物の量は、適切な投薬量が、化合物の任意の所定の単位用量において得られるような様式で、調製され得る。溶解度、バイオアベイラビリティー、生物学的半減期、投与の経路、製品の有効期限のような因子、および他の薬理学的考慮が、このような薬学的処方物を調製する分野の当業者によって意図され、そして、種々の投薬量および処置レジメンはそれ自体が、所望され得る。
【０６８７】
あるいは、経口投与について、本発明の組成物は、うがい薬、歯みがき剤、バッカル錠、経口スプレー、または舌下経口投与処方物の形態で、１つ以上の賦形剤と混合され得る。例えば、うがい薬は、活性成分を、必要とされる量で、適切な溶媒（例えば、ホウ酸ナトリウム溶液（Ｄｏｂｅｌｌ溶液））に組み込むように調製される。あるいは、活性成分は、経口溶液（例えば、ホウ酸ナトリウム、グリセリンおよび炭酸水素カリウムを含む溶液）に組み込まれ得るか、または歯みがき剤に分散され得るか、または治療的有効量で、水、バインダー、研磨剤、香料、発泡剤、および湿潤剤を含み得る組成物に添加され得る。あるいは、これらの組成物は、舌下に置かれ得るか、そうでなければ口の中で溶解され得る錠剤形態または溶液形態に成形され得る。
【０６８８】
（２．注入送達）
特定の状況において、本明細書中で開示される薬学的組成物を、米国特許第５，５４３，１５８号；米国特許第５，６４１，５１５号および米国特許第５，３９９，３６３号（各々は、その全体が、本明細書中で参考として詳細に援用される）に記載されるように、非経口送達、静脈内送達、筋肉内送達またはさらに腹腔内送達することが所望される。遊離塩基または薬学的に受容可能な塩としての活性化合物の溶液は、界面活性剤（例えば、ヒドロキシプロピルセルロース）と適切に混合された水中で調製され得る。分散物もまた、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、およびそれらの混合物中で、ならびにオイル中で調製され得る。保存および使用の通常の条件下で、これらの調製物は、微生物の増殖を防止するために、防腐剤を含む。
【０６８９】
注入用途のために適切な薬学的形態として、滅菌水性液剤または分散物および滅菌注射用液剤または分散物の即時調製のための滅菌散剤が挙げられる（米国特許第５，４６６，４６８号（これは、本明細書中でその全体が参考として詳細援用される））。全ての場合において、その形態は、滅菌でなけらばならず、そして容易に注射することができる程度に、流動性でなければならない。それは、製造および保存の条件下で安定でなければならず、そして微生物（例えば、細菌および真菌）の汚染作用に対して保存されなければならない。キャリアは、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、それらの適切な混合物、および／もしくは植物油を含む溶媒または分散媒体であり得る。適切な流動性は、例えば、コーティング（例えば、レシチン）の使用によって、分散物の場合には必要とされる粒子サイズの維持によって、そして界面活性剤の使用によって、維持され得る。微生物の作用の防止は、種々の抗菌剤および抗真菌剤（例えば、パラベン（ｐａｒａｂｅｎ）、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなど）によって促進され得る。多くの場合において、等張剤（例えば、糖または塩化ナトリウム）を含めることが、望ましい。注射可能な組成物の長期にわたる吸収は、組成物中での吸収を遅延させる薬剤（例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチン）の使用によって、もたらされ得る。
【０６９０】
水溶液の非経口投与のために、例えば、必要ならばその溶液は、適切に緩衝化されるべきであり、そして液体希釈剤が、最初に、十分な生理食塩水またはグルコースで等張にされる。これらの特定の水溶液は、特に、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、および腹腔内投与に適切である。これに関連して、使用され得る滅菌水性媒体は、本開示の観点から当業者に公知である。例えば、一投与量は、１ｍｌの等張性ＮａＣｌ溶液に溶解され得、そして１０００ｍｌの皮下注入流体に添加され得るか、または注入予定部位で注入され得るかのいずれかである（例えば、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」、第１５版、１０３５〜１０３８頁および１５７０〜１５８０頁を参照のこと）。投薬量におけるいくらかの変化が、処置される被験体の状態に依存して必然的に生じる。投与に責任のある人物は、いずれにしても、個々の被験体のための適切な用量を決定する。さらに、ヒト投与について、調製物は、ＦＤＡ  Ｏｆｆｉｃｅ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ  ｓｔａｎｄａｒｄｓによって要求されるような、無菌性、発熱性、ならびに一般的な安全性標準および純度標準を満たすべきである。
【０６９１】
滅菌注入溶液は、適切な溶媒中の必要量の活性化合物を、上記に列挙される種々の他の成分と混合し、必要ならば、その後濾過滅菌することによって調製される。一般に、分散体は、種々の滅菌された活性成分を、基本的な分散媒体および上に列挙される成分からの必要とされる他の成分を含む滅菌ビヒクルに組み込むことによって調製される。滅菌注入溶液の調製のための滅菌散剤の場合において、調製の好ましい方法は、真空乾燥技術および凍結乾燥技術であり、これらは、予め滅菌濾過されたその溶液から、活性成分の粉末およびの任意のさらなる所望の成分を得る。
【０６９２】
本明細書中に開示される組成物は、中性形態または塩形態として処方され得る。薬学的に受容可能な塩は、酸付加塩（タンパク質の遊離アミノ基とともに形成される）を含み、そしてこれらの塩は、無機酸（例えば、塩酸、リン酸など）、または酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸などの有機酸とともに形成される。遊離カルボキシル基とともに形成された塩もまた、無機塩基（例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム、または水酸化鉄（ＩＩＩ））、およびイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカインなどの有機塩基から誘導され得る。処方の際に、溶液は、この投薬処方と適合する様式でかつ治療的に有効な量で投与される。この処方物は、種々の投薬形態（例えば、注入溶液、薬物放出カプセルなど）で容易に投与される。
【０６９３】
本明細書中で使用される場合、「キャリア」は、任意および全ての溶媒、分散媒体、ビヒクル、コーティング、希釈剤、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収を遅延させる薬剤、緩衝液、キャリア溶液、懸濁液、コロイドなどを含む。薬学的活性物質のためのこのような媒体および薬剤の使用は、当該分野で周知である。任意の従来の媒体または薬剤が、活性成分と不適合である限りを除いては、治療組成物におけるその使用が、企図される。補助的活性成分もまた、これらの組成物に組み込まれ得る。
【０６９４】
句「薬学的に受容可能な」とは、ヒトに投与される場合に、アレルギー反応または類似の厄介な反応を生じない分子実体および組成物をいう。活性成分としてタンパク質を含む水性組成物の調製は、当該分野で十分に理解されている。代表的に、このような組成物は、注入可能物として、液体溶液または懸濁液のいずれかとして調製され；注入前に、液体中の溶液または懸濁液に適切な固体形態もまた、調製され得る。この調製物はまた、乳化され得る。
【０６９５】
（３．経鼻送達）
特定の実施形態において、薬学的組成物は、鼻腔内スプレー、吸入、および／または他のエアロゾル送達ビヒクルによって送達され得る。遺伝子、核酸およびペプチド組成物を、経鼻エアロゾルスプレーを介して肺に直接送達するための方法は、例えば、米国特許第５，７５６，３５３号および米国特許第５，８０４，２１２号（各々は、本明細書中で、その全体が、参考として特に援用される）に記載されている。同様に、鼻腔内微粒子樹脂（Ｔａｋｅｎａｇａら、１９９８）およびリゾホスファチジル−グリセロール化合物（米国特許第５，７２５，８７１号（本明細書中で、その全体が参考として特に援用される））を使用する薬物の送達もまた、薬学分野で周知である。同様に、ポリテトラフルオロエチレン支持マトリックスの形態での経粘膜薬物送達は、米国特許第５，７８０，０４５号（その全体が、参考として本明細書中で特に援用される）に記載される。
【０６９６】
（４．リポソーム媒介送達、ナノカプセル媒介送達、および微粒子媒介送達）
特定の実施形態において、本発明は、リポソーム、ナノカプセル、微粒子、ミクロスフェア、脂質粒子、小胞などを、適切な宿主細胞への本発明の組成物の導入のために使用することを意図する。特に、本発明の組成物は、脂質粒子、リポソーム、小胞、ナノスフェア、またはナノ粒子などのいずれかにカプセル化されて、送達のために処方され得る。
【０６９７】
このような処方物は、本明細書中に開示される核酸または構築物の薬学的に受容可能な処方物の導入のために好ましくあり得る。リポソームの形成および使用は、一般に、当業者に公知である（例えば、Ｃｏｕｖｒｅｕｒら、１９７７；Ｃｏｕｖｒｅｕｒ、１９８８；Ｌａｓｉｃ、１９９８；これらは、細胞内細菌感染および細胞内細菌疾患に対する標的化抗菌治療におけるリポソームおよびナノカプセルの使用を記載する）。近年、改善された血清安定性および循環半減期を有するリポソームが、開発された（ＧａｂｉｚｏｎおよびＰａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓ，１９８８；ＡｌｌｅｎおよびＣｈｏｕｎ，１９８７；米国特許５，７４１，５１６（その全体が、参考として本明細書中で特に援用される））。さらに、潜在的な薬物キャリアとしての、リポソームおよびリポソーム様調製物の種々の方法が、総説されている（Ｔａｋａｋｕｒａ，１９９８；Ｃｈａｎｄｒａｎら，１９９７；Ｍａｒｇａｌｉｔ，１９９５；米国特許５，５６７，４３４号；米国特許第５，５５２，１５７号；米国特許５，５６５，２１３号；米国特許５，７３８，８６８号および米国特許第５，７９５，５８７号（各々、その全体が、参考として本明細書中で特に援用される））。
【０６９８】
リポソームは、Ｔ細胞懸濁液、初代肝細胞培養物およびＰＣ１２細胞を含む他の手順によるトランスフェクションに通常耐性である多くの細胞型とともに、首尾よく使用されている（Ｒｅｎｎｅｉｓｅｎら、１９９０；Ｍｕｌｌｅｒら、１９９０）。さらに、リポソームは、ウイルスベースの送達系の代表であるＤＮＡ長の制限がない。リポソームは、遺伝子、薬物（ＨｅａｔｈおよびＭａｒｔｉｎ，１９８６；Ｈｅａｔｈら、Ｂａｌａｚｓｏｖｉｔｓら、１９８９；ＦｒｅｓｔａおよびＰｕｇｌｉｓｉ，１９９６）、放射線治療剤（Ｐｉｋｕｌら、１９８７）、酵素（Ｉｍａｉｚｕｍｉら、１９９０ａ；Ｉｍａｉｚｕｍｉら、１９９０ｂ）、ウイルス（ＦａｌｌｅｒおよびＢａｌｔｉｍｏｒｅ、１９８４）、転写因子およびアロステリックエフェクター（ＮｉｃｏｌａｕおよびＧｅｒｓｏｎｄｅ、１９７９）を、種々の培養された細胞株および動物に導入するために効果的に使用されている。さらに、リポソーム媒介薬物送達の有効性を試験するいくつかの成功した臨床試験が、完了している（Ｌｏｐｅｚ−Ｂｅｒｅｓｔｅｉｎら、１９８５ａ；１９８５ｂ；Ｃｏｕｎｅ、１９８８；Ｓｃｕｌｉｅｒら、１９８８）。さらに、いくつかの研究は、リポソームの使用が、全身送達後の自己免疫応答、毒性または生殖腺局在化に関連しないことを示唆している（ＭｏｒｉおよびＦｕｋａｔｓｕ、１９９２）。
【０６９９】
リポソームは、水性媒体中に分散したリン脂質から形成され、そして多層の同心性二重層小胞（多層小胞（ＭＬＶ）とも呼ばれる）を自発的に形成する。ＭＬＶは、一般的に、２５ｎｍ〜４μｍの直径を有する。ＭＬＶの超音波処理は、小さな単層小胞（ＳＵＶ）の形成を生じる。この単層小胞は、そのコアに水溶液を含む２００〜５００Åの範囲の直径を有する。
【０７００】
リポソームは、細胞膜との類似点を有し、そしてペプチド組成物のためのキャリアとして、本発明と組み合わせての使用が企図される。それらは、トラップされ得る水溶性物質および脂溶性物質の両方として（すなわち、それぞれ水性空間において、そして二重層自体内で）、広く適切である。薬物保有リポソームは、リポソーム処方物を選択的に改変することによって、活性薬剤の部位特異的送達のためにさらに使用され得ることが可能である。
【０７０１】
Ｃｏｕｖｒｅｕｒら（１９７７；１９８８）の教示に加えて、以下の情報が、リポソーム処方物を作製する際に利用され得る。リン脂質は、水中に分散される場合、水に対する脂質のモル比に依存して、リポソーム以外の種々の構造を形成し得る。低い比において、リポソームは、好ましい構造である。リポソームの物理的特徴は、ｐＨ、イオン強度、および二価のカチオンの存在に依存する。リポソームは、イオン性物質および極性物質に対する低い透過性を示し得る。しかし、高温において、リポソームは、それらの透過性を顕著に変える相転移を受ける。この相転移は、密にパッキングした秩序構造（ゲル状態として既知）から、ゆるくパッキングした秩序性の低い構造（流体状態として既知）への変化を含む。これは、特徴的な相転移温度で起こり、そしてイオン、糖および薬物に対する透過性の増加を生じる。
【０７０２】
温度に加えて、タンパク質への暴露は、リポソームの透過性を変更し得る。特定の可溶性タンパク質（例えば、シトクロムｃ）は、二重層に結合し、その二重層を変形させ、そしてその二重層を貫通し、それによって、透過性の変化を引き起こす。コレステロールは、リン脂質をより密にパッキングすることによって、明らかにタンパク質のこの貫通を阻止する。抗生物質およびインヒビターの送達のための最も有用なリポソーム処方物が、コレステロールを含むことが意図される。
【０７０３】
溶質をトラップする能力は、異なるタイプのリポソーム間で変化する。例えば、ＭＬＶは、溶質のトラッピングにおいて中程度に効率的であるが、しかし、ＳＵＶは、極端に非効率である。ＳＵＶは、サイズ分布における均一性および再現性の利点を提供するが、サイズとトラップ効率との間の妥協が、大きい単層小胞（ＬＵＶ）によって提供される。これらは、エーテルエバポレーションによって調製され、そして溶質のトラップが、ＭＬＶよりも３〜４培効率的である。
【０７０４】
リポソームの特徴に加えて、トラップ化合物における重要な決定因子は、化合物自体の物理化学的特性である。極性化合物は、水性空間にトラップされ、そして非極性化合物は、小胞の脂質二重層に結合する。極性化合物は、浸透を通してか、または二重層が壊れた場合に放出されるが、非極性化合物は、温度によって崩壊するか、またはリポタンパク質に暴露されるまで、二重層に残ったままである。両方のタイプは、相転移温度において、最大の流出速度を示す。
【０７０５】
リポソームは、以下の４つの異なる機構を介して細胞と相互作用する：細網内皮系の食作用細胞（例えば、マクロファージおよび好中球）によるエンドサイトーシス；非特異的な弱い疎水性力または静電力によってか、または細胞表面成分との特異的な相互作用によってかのいずれかによる、細胞表面への吸着；リポソーム内容物の細胞質への刺激性放出を伴う、リポソームの脂質二重膜の形質膜への挿入による形質細胞膜との融合；およびリポソーム内容物のいずれの会合もなく、リポソーム脂質の細胞膜または細胞内膜への移動、またはその逆による。どの機構が作用しているのか、そして１より多い機構が同時に作用し得るのかを決定することは、しばしば困難である。
【０７０６】
静脈内注入されたリポソームの運命および動向は、それらの物理的特質（例えば、サイズ、流動性、および表面電荷）に依存する。それらは、それらの組成に依存して数時間〜数日の間、組織内で持続し得、そして血液中で数分〜数時間の範囲の半減期を有する。より大きいリポソーム（例えば、ＭＬＶおよびＬＵＶ）は、細網内皮系の食作用細胞によって急速に取り込まれるが、循環器系の生理学は、ほとんどの部位においてこのような大きな種の放出を制限する。それらは、毛細管の内皮において、大きな開口部または孔（例えば、肝臓および脾臓の洞様毛細血管）が存在する場所においてのみ出て行き得る。従って、これらの器官は、取り込みの主な部位である。一方で、ＳＵＶは、より広い組織分布を示すが、なおも肝臓および脾臓において、高度に隔離されている。一般に、このインビボ挙動は、それらの大きなサイズにアクセス可能なこれらの器官および組織のみへの、リポソームの潜在的な標的化を制限する。これらは、血液、肝臓、脾臓、骨髄およびリンパ器官を含む。
【０７０７】
標的化は、一般的には、本発明に関しては限定ではない。しかし、特定の標的化が所望される場合は、これを達成する方法が利用可能である。抗体は、リポソーム表面に結合するため、そしてその抗体およびその薬物内容物を特定の細胞型表面上に位置する特定の抗原性レセプターへと指向するために使用され得る。糖質決定基（細胞間の認識、相互作用および接着において役割を果たす、糖タンパク質または糖脂質細胞表面成分）もまた、それらは特定の細胞型にリポソームを指向させることに能力を有するので、認識部位として使用され得る。たいてい、リポソーム調製物の静脈内注射が使用されることが意図されるが、他の投与経路も考えられる。
【０７０８】
あるいは、本発明は、本発明の組成物の薬学的に受容可能なナノカプセル処方物を提供する。ナノカプセルは、一般に、安定かつ再現可能な様式で化合物を捕獲する（Ｈｅｎｒｙ−Ｍｉｃｈｅｌｌａｎｄら、１９８７；Ｑｕｉｎｔａｎａｒ−Ｇｕｅｒｒｅｒｏら、１９９８；Ｄｏｕｇｌａｓら、１９８７）。過剰な細胞内ポリマー負荷に起因する副作用を回避するために、このような超微細粒子（約０．１μｍの大きさ）が、インビボで分解され得るポリマーを使用して設計されるべきである。これらの要件を満たす生分解性ポリアルキル−シアノアクリレートナノ粒子が、本発明における使用のために意図される。このような粒子は、記載されるように（Ｃｏｕｖｒｅｕｒら、１９８０；１９８８；ｚｕｒ  Ｍｕｈｌｅｎら、１９９８；Ｚａｍｂａｕｘら、１９９８；Ｐｉｎｔｏ−Ａｌｐｈａｎｄｒｙら、１９９５および米国特許第５，１４５，６８４号（本明細書中にその全体が参考として特に援用される））、容易に作製され得る。
【０７０９】
（ワクチン）
本発明の特定の好ましい実施形態において、ワクチンが提供される。このワクチンは一般的に、免疫刺激剤と組み合わせて、１つ以上の薬学的組成物（例えば、上記のようなもの）を含む。免疫刺激剤は、外因性抗原に対する免疫応答（抗体媒介性および／または細胞媒介性）を促進または増強する任意の物質であり得る。免疫刺激剤の例としては、アジュバント、生分解性ミクロスフェア（例えば、ポリ乳酸ガラクチド）およびリポソーム（この化合物が中に組み込まれる；例えば、Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ、米国特許第４，２３５，８７７号を参照のこと）が挙げられる。ワクチン調製物は、例えば、Ｍ．Ｆ．ＰｏｗｅｌｌおよびＭ．Ｊ．Ｎｅｗｍａｎ編「Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｄｅｓｉｇｎ（ｔｈｅ  ｓｕｂｕｎｉｔ  ａｎｄ  ａｄｊｕｖａｎｔ  ａｐｐｒｏａｃｈ）」Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ（ＮＹ、１９９５）に一般的に記載されている。本発明の範囲内の薬学的組成物およびワクチンはまた、生物学的に活性であっても不活性であってもよい他の化合物を含み得る。例えば、他の腫瘍抗原の１つ以上の免疫原性部分が、その組成物中またはワクチン中に、融合ポリペプチドへと組み込まれてかまたは別個の化合物としてかのいずれかで、存在し得る。
【０７１０】
例示的ワクチンは、上記のようなポリペプチドのうちの１つ以上をコードするＤＮＡを、そのポリペプチドがインサイチュで生成されるように含み得る。上記のように、そのＤＮＡは、当業者に公知の種々の送達系（核酸発現系、細菌発現系およびウイルス発現系を含む）のいずれかに存在し得る。多数の遺伝子送達技術が当該分野で周知であり、例えば、Ｒｏｌｌａｎｄ、Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｔｈｅｒａｐ．Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  １５：１４３〜１９８、１９９８およびその中に引用される参考文献により記載される技術である。適切な核酸発現系は、患者における発現に必要なＤＮＡ配列（例えば、適切なプロモーターおよび終止シグナル）を含む。細菌送達系は、その細胞表面上にそのポリペプチドの免疫原性部分を発現するかまたはそのようなエピトープを分泌する、細菌（例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ−Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｒｉｎ）の投与を包含する。好ましい実施形態において、そのＤＮＡは、ウイルス発現系（例えば、ワクシニアウイルスまたは他のポックスウイルス、レトロウイルス、またはアデノウイルス）を使用して導入され得、このウイルス発現系は、非病原性（欠損）複製コンピテントウイルスの使用を含み得る。適切な系は、例えば、以下に開示される：Ｆｉｓｈｅｒ−Ｈｏｃｈら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：３１７〜３２１、１９８９；Ｆｌｅｘｎｅｒら、Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．５６９：８６〜１０３、１９８９；Ｆｌｅｘｎｅｒら、Ｖａｃｃｉｎｅ  ８：１７〜２１、１９９０；米国特許第４，６０３，１１２号、同第４，７６９，３３０号および同第５，０１７，４８７号；ＷＯ８９／０１９７３；米国特許第４，７７７，１２７号；ＧＢ  ２，２００，６５１：ＥＰ  ０，３４５，２４２；ＷＯ  ９１／０２８０５；Ｂｅｒｋｎｅｒ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ６：６１６〜６２７、１９８８；Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５２：４３１〜４３４、１９９１；Ｋｏｌｌｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：２１５〜２１９、１９９４；Ｋａｓｓ−Ｅｉｓｌｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：１１４９８〜１１５０２、１９９３；Ｇｕｚｍａｎら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ８８：２８３８〜２８４８、１９９３；ならびにＧｕｚｍａｎら、Ｃｉｒ．Ｒｅｓ．７３：１２０２〜１２０７、１９９３。このような発現系にＤＮＡを組み込む技術は、当業者に周知である。このＤＮＡはまた、例えば、Ｕｌｍｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５９：１７４５〜１７４９、１９９３に記載されそしてＣｏｈｅｎ、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５９：１６９１〜１６９２、１９９３により概説されるように、「裸」でもあり得る。裸のＤＮＡの取り込みは、生分解性ビーズ（これは、細胞に効率的に輸送される）上にそのＤＮＡをコーティングすることによって増加され得る。ワクチンがポリヌクレオチドおよびポリペプチド成分の両方を含み得ることは、明らかである。このようなワクチンは、増強した免疫応答を提供し得る。
【０７１１】
ワクチンが、本明細書中で提供されるポリヌクレオチドおよびポリペプチドの薬学的に受容可能な塩を含み得ることは、明らかである。このような塩は、薬学的に受容可能な非毒性塩基（有機塩基（例えば、一級アミンの塩、二級アミンの塩および三級アミンの塩、ならびに塩基性アミノ酸の塩）ならびに無機塩基（例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩、アンモニウム塩、カルシウム塩およびマグネシウム塩）を含む）から調製され得る。
【０７１２】
当業者に公知の任意の適切なキャリアが、本発明のワクチン組成物において使用され得るが、キャリアの型は、投与様式に依存して変化する。本発明の組成物は、任意の適切な投与様式（例えば、局所投与、経口投与、経鼻投与、静脈内投与、頭蓋内投与、腹腔内投与、皮下投与、または筋肉内投与を含む）のために処方され得る。非経口投与（例えば、皮下注射）のために、そのキャリアは、好ましくは、水、生理食塩水、アルコール、脂肪、ろう、または緩衝剤を含む。経口投与のために、上記のキャリアのいずれか、または固体キャリア（例えば、マンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、タルク、セルロース、グルコース、ショ糖、および炭酸マグネシウム）が使用され得る。生分解性ミクロスフェア（例えば、ポリ乳酸、ポリグリコール酸）もまた、本発明の薬学的組成物のためのキャリアとして使用され得る。適切な生分解性ミクロスフェアは、例えば、米国特許第４，８９７，２６８号；同第５，０７５，１０９号；同第５，９２８，６４７号；同第５，８１１，１２８号；同第５，８２０，８８３号；同第５，８５３，７６３号；同第５，８１４，３４４号および同第５，９４２，２５２号に開示される。米国特許第５，９２８，６４７号に記載される微粒子−タンパク質複合体を含むキャリアもまた使用され得、このキャリアは、宿主においてクラスＩ拘束細胞傷害性Ｔリンパ球応答を誘導し得る。
【０７１３】
このような組成物はまた、緩衝剤（例えば、中性の緩衝化生理食塩水またはリン酸緩衝化生理食塩水）；糖質（例えば、グルコース、マンノース、スクロースまたはデキストラン）；マンニトール；タンパク質；ポリペプチドまたはアミノ酸（例えば、グリシン）；抗酸化剤；静菌剤；キレート剤（例えば、ＥＤＴＡまたはグルタチオン）；アジュバント（例えば、水酸化アルミニウム）；処方物をレシピエントの血液に対して等張性、低張性または弱く高張性にする溶質；懸濁剤；濃化剤および／または保存剤を含み得る。あるいは、本発明の組成物は、凍結乾燥物として処方され得る。化合物はまた、周知の技術を使用してリポソーム内にカプセル化され得る。
【０７１４】
種々の任意の免疫刺激剤が、本発明のワクチンにおいて使用され得る。例えば、アジュバントが含まれ得る。ほとんどのアジュバントは、抗原を迅速な異化作用から保護するように設計された物質（例えば、水酸化アルミニウムまたは鉱油）および免疫応答の刺激物（例えば、リピドＡ、Ｂｏｒｔａｄｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ由来のタンパク質またはＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ由来のタンパク質）を含む。適切なアジュバントは、例えば、フロイント不完全アジュバントおよびフロイント完全アジュバント（Ｄｉｆｃｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｄｅｔｒｏｉｔ、ＭＩ）ならびにＭｅｒｃｋ  Ａｄｊｕｖａｎｔ  ６５（Ｍｅｒｃｋ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｉｎｃ．、Ｒａｈｗａｙ、ＮＪ）；ＡＳ−２（ＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ  Ｂｅｅｃｈａｍ、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、ＰＡ）；アルミニウム塩（例えば、水酸化アルミニウムゲル（ミョウバン）またはリン酸アルミニウム；カルシウム塩、鉄塩または亜鉛塩；アシル化チロシンの不溶性懸濁物；アシル化糖；カチオン誘導体化多糖またはアニオン誘導体化多糖；ポリフォスファーゼン；生分解性ミクロスフェア；モノホスホリルリピドＡおよびｑｕｉｌ  Ａとして市販されている。サイトカイン（例えば、ＧＭ−ＣＳＦ、あるいはインターロイキン−２、インターロイキン−７、またはインターロイキン−１２）もまた、アジュバントとして使用され得る。
【０７１５】
本明細書中に提供されるワクチンにおいて、そのアジュバント組成物は、好ましくは、優勢にＴｈ１型の免疫応答を誘導するように設計される。高レベルのＴｈ１型サイトカイン（例えば、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦα、ＩＬ−２およびＩＬ−１２）は、投与される抗原に対する細胞媒介性応答の誘導を支持する傾向がある。対照的に、高レベルのＴｈ２型サイトカイン（例えば、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６およびＩＬ−１０）は、体液性免疫応答の誘導を支持する傾向がある。本明細書中に提供されるようなワクチンの適用の後、患者は、Ｔｈ１型応答およびＴｈ２型応答を含む免疫応答を支持する。応答が優勢にＴｈ１型である好ましい実施形態において、Ｔｈ１型サイトカインのレベルは、Ｔｈ２型サイトカインのレベルより高い程度まで増加する。これらのサイトカインのレベルは、標準的アッセイを使用して容易に評価され得る。サイトカインのファミリーの概説については、ＭｏｓｍａｎｎおよびＣｏｆｆｍａｎ、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．７：１４５〜１７３、１９８９を参照のこと。
【０７１６】
優勢なＴｈ１型応答を惹起する際の使用に好ましいアジュバントとしては、例えば、モノホスホリルリピドＡ（好ましくは３−ｄｅ−Ｏ−アシル化モノホスホリルリピドＡ（３Ｄ−ＭＰＬ））とアルミニウム塩との組み合わせが挙げられる。ＭＰＬアジュバントは、Ｃｏｒｉｘａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｓｅａｔｔｌｅ、ＷＡ；米国特許第４，４３６，７２７号；同第４，８７７，６１１号；同第４，８６６，０３４号および同第４，９１２，０９４号を参照のこと）から入手可能である。ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチド（そのＣｐＧジヌクレオチドはメチル化されていない）もまた、優勢なＴｈ１応答を誘導する。このようなオリゴヌクレオチドは周知であり、例えば、ＷＯ  ９６／０２５５５、ＷＯ  ９９／３３４８８ならびに米国特許第６，００８，２００号および同第５，８５６，４６２号に記載されている。免疫刺激性ＤＮＡ配列もまた、例えば、Ｓａｔｏら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７３：３５２、１９９６により記載されている。別の好ましいアジュバントは、サポニン（好ましくはＱＳ２１（Ａｑｕｉｌａ  Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  Ｉｎｃ．、Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ、ＭＡ）であり、これは、単独で、または他のアジュバントと組み合わせて、使用され得る。例えば、増強された系は、モノホスホリルリピドＡとサポニン誘導体との組み合わせ（例えば、ＷＯ  ９４／００１５３に記載されるような、ＱＳ２１と３Ｄ−ＭＰＬとの組み合わせ）またはＷＯ  ９６／３３７３９に記載されるような、ＱＳ２１がコレステロールでクエンチされている反応生成が低い（ｌｅｓｓ  ｒｅａｃｔｏｇｅｎｉｃ）組成物を含む。他の好ましい処方物は、水中油エマルジョンおよびトコフェロールを含む。水中油エマルジョン中にＱＳ２１、３Ｄ−ＭＰＬおよびトコフェロールを含む、特に強力なアジュバント処方物が、ＷＯ  ９５／１７２１０に記載されている。
【０７１７】
他の好ましいアジュバントとしては、Ｍｏｎｔｈａｎｉｄｅ  ＩＳＡ  ７２０（Ｓｅｐｐｉｃ，Ｆｒａｎｃｅ）、ＳＡＦ（Ｃｈｉｒｏｎ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ）、ＩＳＣＯＭＳ（ＣＳＬ）、ＭＦ−５９（Ｃｈｉｒｏｎ）、ＳＢＡＳシリーズのアジュバント（例えば、ＳＢＡＳ−２またはＳＢＡＳ−４（ＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ  Ｂｅｅｃｈａｍ、Ｒｉｘｅｎｓａｒｔ，Ｂｅｌｇｉｕｍから入手可能）、Ｄｅｔｏｘ（Ｃｏｒｉｘａ、Ｈａｍｉｌｔｏｎ、ＭＴ）、ＲＣ−５２９（Ｃｏｒｉｘａ、Ｈａｍｉｌｔｏｎ、ＭＴ）、ならびに他のアミノアルキルグルコサミニド４−ホスフェート（ＡＧＰ）（例えば、係属中の米国特許出願第０８／８５３，８２６号および同第０９／０７４，７２０号（その開示は、全体が本明細書中に参考として援用される）に記載されるもの）が挙げられる。
【０７１８】
本明細書中に提供される任意のワクチンは、抗原、免疫応答エンハンサーおよび適切なキャリアもしくは賦形剤の組み合わせを生じる、周知の方法を使用して調製され得る。本明細書中に記載される組成物は、徐放性処方物（すなわち、投与後に化合物のゆっくりした放出をもたらす、カプセル、スポンジまたはゲル（例えば、多糖から構成される）のような処方物）の一部として投与され得る。このような処方物は、一般的に、周知の技術（例えば、Ｃｏｏｍｂｅｓら、Ｖａｃｃｉｎｅ  １４：１４２９〜１４３８、１９９６を参照のこと）を使用して調製され得、そして例えば、経口投与、直腸投与もしくは皮下移植または所望の標的部位への移植により投与され得る。徐放性処方物は、キャリアマトリックス中に分散され、そして／または速度制御膜により囲まれた貯蔵所中に含まれる、ポリペプチド、ポリヌクレオチドもしくは抗体を含み得る。
【０７１９】
このような処方物内での使用のためのキャリアは、生体適合性であり、そしてまた、生分解性であり得；好ましくはその処方物は、比較的一定レベルの活性成分放出を提供する。このようなキャリアとしては、ポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコリド）、ポリアクリレート、ラテックス、デンプン、セルロース、デキストランなどの微粒子が挙げられる。他の遅延性放出キャリアとしては、超分子バイオベクター（ｓｕｐｒａｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｖｅｃｔｏｒ）が挙げられ、これは、非液性（ｎｏｎ−ｌｉｑｕｉｄ）親水性コア（例えば、架橋した多糖またはオリゴ糖）と、必要に応じて両親媒性化合物（例えば、リン脂質）を含む外層とを含む（例えば、米国特許第５，１５１，２５４号およびＰＣＴ出願ＷＯ９４／２００７８、ＷＯ／９４／２３７０１およびＷＯ  ９６／０６６３８を参照のこと）。徐放性処方物中に含まれる活性化合物の量は、移植部位、放出の速度および予想持続期間、ならびに処置もしくは予防される状態の性質に依存する。
【０７２０】
種々の任意の送達ビヒクルが、腫瘍細胞を標的とする抗原特異的免疫応答の生成を促進するために、薬学的組成物およびワクチン内で使用され得る。送達ビヒクルとしては、抗原提示細胞（ＡＰＣ）（例えば、樹状細胞、マクロファージ、Ｂ細胞、単球、ならびに有効なＡＰＣであるように操作され得る他の細胞）が挙げられる。このような細胞は、抗原を提示するための能力を増加するように、Ｔ細胞応答の活性化および／もしくは維持を改善するように、それ自体が抗腫瘍効果を有するように、そして／または受容物と免疫学的に適合性（すなわち、一致したＨＬＡハロタイプ）であるように、遺伝子改変され得るが、必ずしもその必要はない。ＡＰＣは、一般的には、種々の生物学的流体ならびに器官（腫瘍組織および腫瘍周辺組織を含む）のいずれかから単離され得、そして自系細胞でも、同種異系細胞でも、同系細胞でも、または異種細胞でもよい。
【０７２１】
本発明の特定の好ましい実施形態は、抗原提示細胞として、樹状細胞またはその前駆細胞を使用する。樹状細胞は、高度に強力なＡＰＣであり（ＢａｎｃｈｅｒｅａｕおよびＳｔｅｉｎｍａｎ、Ｎａｔｕｒｅ  ３９２：２４５−２５１、１９９８）、そして予防的または治療的な抗腫瘍免疫性を誘発するための生理学的アジュバントとして有効であることが示されてきた（ＴｉｍｍｅｒｍａｎおよびＬｅｖｙ、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｍｅｄ．５０：５０７−５２９、１９９９を参照のこと）。一般に、樹状細胞は、それらの代表的な形状（インサイチュでは星状、インビトロでは目に見える顕著な細胞質プロセス（樹状突起）を有する）、高い効率で抗原を取り込み、プロセシングし、そして提示するそれらの能力、および未処理のＴ細胞応答を活性化するそれらの能力に基づいて同定され得る。もちろん樹状細胞は、インビボまたはエキソビボで樹状細胞上に通常見出されない特定の細胞表面レセプターまたはリガンドを発現するように操作され得、このような改変樹状細胞は本発明によって意図される。樹状細胞の代替として、分泌小胞抗原ロード樹状細胞（ｓｅｃｒｅｔｅｄ  ｖｅｓｉｃｌｅｓ  ａｎｔｉｇｅｎ−ｌｏａｄｅｄ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌ）（エキソソーム（ｅｘｏｓｏｍｅ）と呼ばれる）がワクチン内で使用され得る（Ｚｉｔｖｏｇｅｌら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．４：５９４−６００，１９９８を参照のこと）。
【０７２２】
樹状細胞および前駆細胞は、末梢血、骨髄、腫瘍浸潤細胞、腫瘍周辺組織浸潤細胞、リンパ節、脾臓、皮膚、臍帯血、または任意の他の適切な組織もしくは流体から得られ得る。例えば、樹状細胞は、末梢血から収集された単球の培養物に、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、ＩＬ−１３および／またはＴＮＦαのようなサイトカインの組み合わせを添加することによってエキソビボで分化され得る。あるいは、末梢血、臍帯血または骨髄から収集されたＣＤ３４陽性細胞は、培養培地にＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−３、ＴＮＦα、ＣＤ４０リガンド、ＬＰＳ、ｆｌｔ３リガンドおよび／または樹状細胞の分化、成熟、および増殖を誘導する他の化合物の組み合わせを添加することによって、樹状細胞に分化され得る。
【０７２３】
樹状細胞は、「未熟」細胞および「成熟」細胞として都合良く分類され、このことは、２つの充分に特徴付けられた表現型の間を単純な方法で区別することを可能にする。しかしこの命名は、あらゆる可能な分化の中間段階を排除すると解釈されるべきではない。未熟な樹状細胞は、抗原の取り込みおよびプロセシングの高い能力を有するＡＰＣとして特徴付けられ、この能力は、Ｆｃγレセプターおよびマンノースレセプターの高度な発現と相関する。成熟表現型は、代表的に、クラスＩおよびクラスＩＩ  ＭＨＣ、接着分子（例えば、ＣＤ５４およびＣＤ１１）ならびに同時刺激性分子（例えば、ＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８６および４−１ＢＢ）のようなＴ細胞活性化を担う細胞表面分子の高度な発現ではなく、これらのマーカーのより低い発現によって特徴付けられる。
【０７２４】
ＡＰＣは、一般的には、肺腫瘍タンパク質（あるいはその一部もしくは他の改変体）をコードするポリヌクレオチドで、その肺腫瘍ポリペプチドまたはその免疫原性部分が細胞表面上で発現されるように、トランスフェクトされ得る。このようなトランスフェクションは、エキソビボで生じ得、次いで、このようなトランスフェクトされた細胞を含む組成物またはワクチンは、本明細書中に記載されるような治療目的のために使用され得る。あるいは、樹状細胞または他の抗原提示細胞を標的とする遺伝子送達ビヒクルが患者に投与され得、インビボで生じるトランスフェクションをもたらす。例えば、樹状細胞のインビボおよびエキソビボでのトランスフェクションは、一般的には、当該分野で公知の任意の方法（例えば、ＷＯ  ９７／２４４４７に記載される方法、あるいはＭａｈｖｉら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ７５：４５６〜４６０、１９９７により記載される遺伝子銃アプローチ）を使用して実施され得る。樹状細胞の抗原ローディングは、樹状細胞または前駆細胞を肺腫瘍ポリペプチド、ＤＮＡ（裸またはプラスミドベクター内）もしくはＲＮＡとともに、または抗原を発現する組換え細菌もしくは組換えウイルス（例えば、ワクシニアウイルスベクター、鶏痘ウイルスベクター、アデノウイルスベクターもしくはレンチウイルスベクター）とともに、インキュベートすることによって達成され得る。ローディングの前に、そのポリペプチドは、Ｔ細胞の補助を提供する免疫学的パートナー（例えば、キャリア分子）に共有結合により結合体化され得る。あるいは、樹状細胞は、非結合体化免疫学的パートナーを用いて、別々にかまたはそのポリペプチドの存在下で、パルスされ得る。
【０７２５】
ワクチンおよび薬学的組成物は、単位用量容器または複数用量容器（例えば、シールされたアンプルまたはバイアル）にて提供され得る。このような容器は、好ましくは、使用するまで処方物の滅菌性を保存するために密封シールされる。一般的には、処方物は、油性ビヒクルまたは水性ビヒクル中の懸濁物、溶液またはエマルジョンとして保存され得る。あるいは、ワクチンまたは薬学的組成物は、滅菌した液体キャリアを使用直前に添加することのみを必要とする、凍結乾燥状態で保存され得る。
【０７２６】
（癌治療）
本発明のさらなる局面において、本明細書中に記載される組成物は、癌（例えば、肺癌）の免疫治療に使用され得る。このような方法において、組成物およびワクチンは代表的には、患者に投与される。本明細書中で使用される場合、「患者」とは、任意の温血動物（好ましくはヒト）をいう。患者は、癌に冒されていてもよいしまたはそうでなくてもよい。従って、上記薬学的組成物およびワクチンは、癌の発症を予防するため、または癌に罹患した患者を処置するために、使用され得る。癌は、当該分野で一般的に認められた基準（悪性腫瘍の存在を含む）を使用して診断され得る。薬学的組成物およびワクチンは、原発性腫瘍の外科的除去および／もしくは処置（例えば、放射性治療もしくは従来の化学療法薬物の投与）の前あるいは後のいずれかに投与され得る。投与は、適切な任意の方法（静脈内経路、腹腔内経路、筋肉内経路、皮下経路、鼻内経路、皮内経路、肛門経路、膣経路、局所経路および経口経路による投与を含む）によってであり得る。
【０７２７】
特定の実施形態において、免疫療法は、能動的免疫療法であり得、この療法にける処置は、免疫応答改変剤（例えば、本明細書中で提供されるポリペプチドおよびポリヌクレオチド）の投与を用いる、腫瘍に対して反応する内因性宿主免疫系のインビボ刺激に依存する。
【０７２８】
他の実施形態において、免疫療法は、受動的免疫療法であり得、この療法における処置は、確立された腫瘍免疫反応性を有する因子（例えば、エフェクター細胞または抗体）（これらは、抗腫瘍効果を直接的または間接的に媒介し得、そして必ずしもインタクトな宿主免疫系に依存しない）の送達を含む。エフェクター細胞の例としては、上記のようなＴ細胞、本明細書中に提供されるポリペプチドを発現するＴリンパ球（例えば、ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球およびＣＤ４＋Ｔヘルパー腫瘍浸潤性リンパ球）、キラー細胞（例えば、ナチュラルキラー細胞およびリンホカイン活性化キラー細胞）、Ｂ細胞および抗原提示細胞（例えば、樹状細胞およびマクロファージ）が挙げられる。本明細書中に列挙されるポリペプチドに特異的なＴ細胞レセプターおよび抗体レセプターは、養子免疫療法のために他のベクターまたはエフェクター細胞中にクローニングされ、発現され、そして移入され得る。本明細書に提供されるポリペプチドはまた、受動免疫療法のための抗体または抗イディオタイプ抗体（上記および米国特許第４，９１８，１６４号に記載される）を生成するために用いられ得る。
【０７２９】
エフェクター細胞は、一般に、本明細書中に記載されるように、インビトロでの増殖により養子免疫治療のために十分な量で得られ得る。単一の抗原特異的エフェクター細胞を、インビボでの抗原認識を保持しながら数十億まで増殖させるための培養条件は当該分野で周知である。このようなインビトロの培養条件は代表的に、しばしばサイトカイン（例えば、ＩＬ−２）および分裂しない支持細胞の存在下で、抗原での間欠刺激を用いる。上で述べたように、本明細書中で提供される免疫反応性ポリペプチドは、抗原特異的Ｔ細胞培養物を急速に増殖するために用いられ、免疫治療に十分な数の細胞を生成し得る。詳細には、抗原提示細胞（例えば、樹状細胞、マクロファージ、単球、繊維芽細胞、および／またはＢ細胞）は、当該分野で周知の標準的技術を用いて、免疫反応性ポリペプチドでパルスされ得るか、または１つ以上のポリヌクレオチドでトランスフェクトされ得る。例えば、抗原提示細胞は、組換えウイルスまたは他の発現系における発現を増大するのに適切なプロモーターを有するポリヌクレオチドでトランスフェクトされ得る。治療において使用するための培養されたエフェクター細胞は、インビボで増殖されかつ広範に分散され得、そして長期間生存し得なければならない。培養されたエフェクター細胞が、インビボで増殖し、そしてＩＬ−２を補充された抗原での反復刺激によって、長期間、多数生存するように誘導され得ることが研究で示されている（例えば、Ｃｈｅｅｖｅｒら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  １５７：１７７、１９９７を参照のこと）。
【０７３０】
あるいは、本明細書において列挙されるポリペプチドを発現するベクターは、患者から得られた抗原提示細胞に導入され得、そして同じ患者に戻す移植のためにエキソビボでクローン的に増殖され得る。トランスフェクトされた細胞は、当該分野で公知の任意の手段（好ましくは、静脈投与、腔内投与、腹腔内投与、または腫瘍内投与による滅菌形態）を用いて患者に再導入され得る。
【０７３１】
本明細書中に記載される治療的組成物の投与の経路および頻度、ならびに投薬量は、個々人で異なり、そして標準的技術を用いて容易に確立され得る。概して、薬学的組成物およびワクチンは、注射（例えば、皮内、筋肉内、静脈内、または皮下）により、経鼻的に（例えば、吸引により）または経口的に、投与され得る。好ましくは、５２週間にわたって１〜１０用量の間が投与され得る。好ましくは、１ヶ月の間隔で６用量が投与され、そしてブースター（追加）ワクチン接種がその後定期的に与えられ得る。交互のプロトコールが個々の患者に適切であり得る。適切な用量は、上記のように投与された場合、抗腫瘍免疫応答を促進し得、そして基底（すなわち、未処置）レベルより少なくとも１０〜５０％上である、化合物の量である。このような応答は、患者内の抗腫瘍抗体を測定することによってか、または患者の腫瘍細胞をインビトロで殺傷し得る細胞溶解性エフェクター細胞のワクチン依存性の生成によってモニターされ得る。このようなワクチンはまた、ワクチン接種されていない患者と比較すると、ワクチン接種された患者において、改善された臨床的結果（例えば、より頻繁な寛解、完全もしくは部分的に疾患を有さないか、またはより長く疾患を有さない生存）を導く免疫応答を生じ得るはずである。一般に、１つ以上のポリペプチドを含む薬学的組成物およびワクチンについて、用量中に存在する各ポリペプチドの量は、宿主の体重（ｋｇ）あたり、約２５μｇ〜５ｍｇの範囲である。適切な用量サイズは、患者の大きさで変化するが、代表的には約０．１ｍＬ〜約５ｍＬの範囲である。
【０７３２】
一般に、適切な投薬量および処置レジメンは、治療的および／または予防的利点を提供するのに十分な量の活性化合物を提供する。このような応答は、処置されていない患者と比較して、処置された患者において、改善された臨床的結果（例えば、より頻繁な寛解、完全なまたは部分的な、あるいはより長い疾患なしでの生存）を確立することによってモニターされ得る。肺腫瘍タンパク質に対する既存の免疫応答における増加は、一般的に、改善された臨床的結果と関連する。このような免疫応答は、一般的に、標準的な増殖アッセイ、細胞障害性アッセイまたはサイトカインアッセイを使用して評価され得、これは、処置の前または後に患者から得られるサンプルを使用して行われ得る。
【０７３３】
（癌の検出および診断）
一般的に、癌は、この患者から得た生物学的サンプル（例えば、血液、血清、痰尿および／または腫瘍生検材料）中の１以上の肺腫瘍タンパク質および／または、このようなタンパク質をコードするポリヌクレオチドの存在に基づいてその患者において検出され得る。言いかえると、このようなタンパク質は、肺癌のような癌の存在または非存在を示すマーカーとして使用され得る。さらに、このようなタンパク質は、他の癌の検出のために有用であり得る。本明細書中で提供される結合因子は、一般的に、この生物学的サンプルにおいてこの因子に結合する抗原のレベルの検出を可能にする。ポリヌクレオチドプライマーおよびプローブは、腫瘍タンパク質をコードするｍＲＮＡのレベルを検出するために使用され得、これはまた、癌の存在または非存在を示す。一般的に、肺腫瘍配列は、正常組織においてよりも少なくとも３倍高いレベルで腫瘍組織において存在するはずである。
【０７３４】
サンプル中のポリペプチドマーカーを検出するために結合因子を使用するための、当業者に公知の種々のアッセイ型式が存在する。例えば、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８を参照のこと。一般的に、患者における癌の存在または非存在は、（ａ）患者から得られた生物学的サンプルを結合因子と接触させる工程；（ｂ）結合因子に結合するポリペプチドのレベルをサンプルにおいて検出する工程；および（ｃ）ポリペプチドのレベルと所定のカットオフ値とを比較する工程によって決定され得る。
【０７３５】
好ましい実施形態において、このアッセイは、ポリペプチドに結合するためおよびサンプルの残りからポリペプチドを除くために固体支持体上に固定された結合因子の使用を含む。次いで、結合されたポリペプチドは、レポーター基を含み、結合因子／ポリペプチド複合体に特異的に結合する検出試薬を使用して検出され得る。このような検出試薬は、例えば、ポリペプチドまたは抗体に特異的に結合する結合因子あるいは結合因子に特異的に結合する他の薬剤（例えば、抗免疫グロブリン、プロテインＧ、プロテインＡまたはレクチン）を含み得る。あるいは、競合アッセイが、使用され得、ここで、ポリペプチドは、レポーター基で標識され、そしてサンプルと結合因子のインキュベーション後にその固定された結合因子に結合される。サンプルの成分が、標識ポリペプチドの結合因子への結合を阻害する程度は、サンプルの固定された結合因子との反応性を示す。このようなアッセイにおける使用に適切なポリペプチドは、上記のような、全長肺腫瘍タンパク質および結合因子が結合するその部分を含む。
【０７３６】
固体支持体は、腫瘍タンパク質が付着され得る当業者に公知の任意の材料であり得る。例えば、固体支持体は、マイクロタイタープレートにおける試験ウェルあるいはニトロセルロースまたは他の適切な膜であり得る。あるいは、その支持体は、ビーズまたはディスク（例えば、ガラス）、ファイバーグラス、ラテックス、またはプラスチック物質（例えば、ポリスチレン、またはポリ塩化ビニル）であり得る。その支持体はまた、磁気粒子または光ファイバーセンサー（例えば、米国特許第５，３５９，６８１号に記載のような）であり得る。この結合因子は、当業者に公知の種々の技術を使用して固体支持体上に固定され得、これらは特許および科学文献に十分に記載されている。本発明の状況において、用語「固定化」とは、非共有結合的な会合（例えば、吸着）および共有結合的な付着（これは、薬剤と支持体上の官能基との間で直接結合され得るかまたは架橋剤を用いる結合であり得る）の両方をいう。マイクロタイタープレートのウェル、または膜への吸着による固定化は好ましい。このような場合、吸着は、適切な緩衝液中で固体支持体を用いて適切な時間量で結合因子に接触させることによって達成され得る。接触時間は、温度によって変化するが、代表的には、約１時間から約１日の間である。一般的には、約１０ｎｇ〜約１０μｇ、そして好ましくは約１００ｎｇ〜約１μｇの範囲の量の結合因子とプラスチックマイクロタイタープレート（例えば、ポリスチレンまたはポリ塩化ビニル）のウェルを接触させることは、適切な量の結合因子を固定化するのに十分である。
【０７３７】
固体支持体への結合因子の共有結合的付着は、一般に、支持体および結合因子上の官能基（例えば、水酸基またはアミノ基）の両方と反応する二官能性試薬と支持体を最初に反応させることによって達成され得る。例えば、この結合因子は、ベンゾキノンを用いるかまたは結合パートナー上のアミンおよび活性水素と支持体上のアルデヒド基との縮合によって、適切なポリマーコーティングを有する支持体に、共有結合的に付着され得る（例えば、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃａｔａｌｏｇ  ａｎｄ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ、１９９１、Ａ１２−Ａ１３を参照のこと）。
【０７３８】
特定の実施形態において、このアッセイは、２抗体サンドイッチアッセイである。本アッセイは、最初に、固体支持体（一般に、マイクロタイタープレートのウェル）上で固定されている抗体をサンプルに接触させて、その結果、サンプル内のポリペプチドを固定された抗体に結合させることによって実施され得る。次いで、非結合サンプルは固定されたポリペプチド−抗体複合体から除去され、そして検出試薬（好ましくは、そのポリペプチド上の異なる部位に結合し得る第２の抗体（レポーター基を含む））が添加される。次いで、固体支持体に結合したままである検出試薬の量が、特定のレポーター基に関して適切な方法を用いて決定される。
【０７３９】
より詳細には、一旦抗体が上記のように支持体上に固定化されると、支持体上の残りのタンパク質結合部位は、典型的にはブロックされる。任意の適切なブロック剤（例えば、ウシ血清アルブミンまたはＴｗｅｅｎ２０ＴＭ（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ））は、当業者に公知である。固定された抗体は次いで、サンプルとインキュベートされ、そしてポリペプチドをこの抗体に結合させる。インキュベーションの前に、このサンプルは適切な希釈液（例えば、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ））で希釈され得る。概して、適切な接触時間（すなわち、インキュベーション時間）は、肺癌を有する個体から得られたサンプル内のポリペプチドの存在を検出するのに十分な時間である。好ましくは、この接触時間は、結合ポリペプチドと非結合ポリペプチドとの間の平衡で達成される結合レベルの少なくとも約９５％である結合レベルを達成するのに十分な時間である。当業者は、ある時間にわたって起こる結合レベルをアッセイすることによって、平衡に達するまでに必要な時間が容易に決定され得ることを認識する。室温では、一般に、約３０分間のインキュベーション時間で十分である。
【０７４０】
次いで、非結合サンプルが、適切な緩衝液（例えば、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０ＴＭを含むＰＢＳ）を用いて固体支持体を洗浄することによって除去される。レポーター基を含む第２の抗体が次いで、固体支持体に添加され得る。好ましいレポーター基は、上記の基を含む。
【０７４１】
次いで、検出試薬が、結合されたポリペプチドを検出するのに十分な量の時間、固定された抗体−ポリペプチド複合体とインキュベートされる。適切な量の時間は、一般に、ある時間にわたって起こる結合のレベルをアッセイすることによって決定され得る。次いで、非結合の検出試薬は除去され、そして結合した検出試薬は、レポーター基を用いて検出される。レポーター基を検出するために使用される方法は、レポーター基の性質に依存する。放射性基について、一般的には、シンチレーション計数法またはオートラジオグラフィー法が適切である。分光法は、色素、発光基および蛍光基を検出するために使用され得る。ビチオンは、異なるレポーター基（一般に、放射性もしくは蛍光基または酵素）に結合されたアビジンを使用して検出され得る。酵素レポーター基は、一般に、基質の添加（一般には、特定の時間の間）、続いて反応産物の分光分析または他の分析により検出され得る。
【０７４２】
癌（例えば、肺癌）の存在または非存在を決定するために、固体支持体に結合したままのレポーター基から検出されるシグナルが、一般に、所定のカットオフ値と対応するシグナルと比較される。１つの好ましい実施形態において、癌の検出のためのカットオフ値は、固定された抗体を、癌を有さない患者由来のサンプルとインキュベートした際に得られる平均シグナル値である。概して、所定のカットオフ値を３標準偏差上回るシグナルを生じるサンプルが、癌に対して陽性とみなされる。代替の好ましい実施形態において、このカットオフ値は、Ｓａｃｋｅｔｔら、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｂａｓｉｃ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ｆｏｒ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｌｉｔｔｌｅ  Ｂｒｏｗｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．，１９８５，１０６〜７頁の方法に従って、レシーバーオペレーターカーブ（Ｒｅｃｅｉｖｅｒ  Ｏｐｅｒａｔｏｒ  Ｃａｒｖｅ）を使用して決定される。簡単に言うと、本実施形態において、このカットオフ値は、診断試験結果についての各可能なカットオフ値に対応する真の陽性割合（すなわち、感度）および偽陽性割合（１００％−特異性）の対のプロットから決定され得る。プロット上の上方左手角に最も近いカットオフ値（すなわち、最大領域を囲む値）が、最も正確なカットオフ値であり、そして本方法によって決定されたカットオフ値より高いシグナルを生ずるサンプルが陽性と見なされ得る。あるいは、カットオフ値は、偽陽性割合を最小にするためにプロットに沿って左へシフトされ得るか、または偽陰性割合を最小にするために右へシフトされ得る。概して、本方法によって決定されたカットオフ値より高いシグナルを生ずるサンプルが、癌に対して陽性と見なされる。
【０７４３】
関連の実施形態において、このアッセイは、フロースルー試験形式またはストリップ試験形式で実行される（ここで、結合因子は、ニトロセルロースのような膜上で固定化される）。フロースルー試験では、サンプル内のポリペプチドは、サンプルが膜を通過するにつれて固定された結合因子に結合する。次いで、第２の標識化された結合因子が、この第２の結合因子を含む溶液がその膜を介して流れるにつれて、結合因子−ポリペプチド複合体と結合する。次いで、結合した第２の結合因子の検出は、上記のように実行され得る。ストリップ試験形式では、結合因子が結合される膜の一端を、サンプルを含む溶液中に浸す。このサンプルは、膜に沿って、第２の結合因子を含む領域を通って、そして固定された結合因子の領域まで移動する。固定された抗体の領域での第２の結合因子の濃度が、癌の存在を示す。代表的には、その部位での第２の結合因子の濃度は、視覚的に読みとられ得るパターン（例えば、線）を生成する。このようなパターンを示さないことは陰性の結果を示す。概して、この膜上に固定化される結合因子の量は、生物学的サンプルが、上記の形式において、２抗体サンドイッチアッセイにおいて陽性シグナルを生じるのに十分であるレベルのポリペプチドを含む場合、視覚的に識別可能なパターンを生じるように選択される。このようなアッセイにおける使用に好ましい結合因子は、抗体およびその抗原結合フラグメントである。好ましくは、膜上に固定化される抗体の量は、約２５ｎｇ〜約１μｇの範囲であり、そしてより好ましくは、約５０ｎｇ〜約５００ｎｇの範囲である。このような試験は、代表的には、非常に少ない量の生物学的サンプルを用いて実行され得る。
【０７４４】
もちろん、本発明の腫瘍タンパク質または結合因子との使用に適する多数の他のアッセイプロトコルが存在する。上記の記載は、例示であることを意図するにすぎない。例えば、上記プロトコルが、肺腫瘍ポリペプチドを使用するために容易に改変され得て、生物学的サンプル内でこのようなポリペプチドに結合する抗体を検出し得ることが当業者に明かである。このような肺腫瘍タンパク質特異的抗体の検出は、癌の存在と相関し得る。
【０７４５】
癌もまた、あるいは癌が、生物学的サンプル中の肺腫瘍タンパク質と特異的に反応するＴ細胞の存在に基づいて検出され得る。特定の方法では、患者から単離されたＣＤ４＋Ｔ細胞および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞を含む生物学的サンプルは、肺腫瘍ポリペプチド、このようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドおよび／またはこのようなポリペプチドの少なくとも免疫原性部分を発現するＡＰＣとともにインキュベートされ、そしてＴ細胞の特異的活性化の存在または非存在が検出される。適切な生物学的サンプルとしては、単離されたＴ細胞が挙げられるがこれらに限定されない。例えば、Ｔ細胞は、慣用技術によって（例えば、末梢血リンパ球のＦｉｃｏｌｌ／Ｈｙｐａｑｕｅ密度勾配遠心分離法によって）患者から単離され得る。Ｔ細胞は、２〜９日間（代表的に４日間）、３７℃にてポリペプチド（例えば、５〜２５μｇ／ｍｌ）とともにインビトロでインキュベートされ得る。Ｔ細胞サンプルの別のアリコートを、コントロールとして役立てるために、肺腫瘍ポリペプチドの非存在下でインキュベートすることが所望され得る。ＣＤ４＋Ｔ細胞に関して、活性化は好ましくは、Ｔ細胞の増殖を評価することによって検出される。ＣＤ８＋Ｔ細胞に関しては、活性化は好ましくは、細胞溶解活性を評価することによって検出される。疾患のない患者におけるよりも少なくとも２倍高い増殖レベルおよび／または少なくとも２０％高い細胞溶解活性レベルは、患者における癌の存在を示す。
【０７４６】
上記のように、癌もまた、あるいは癌が、生物学的サンプル中の肺腫瘍タンパク質をコードするｍＲＮＡレベルに基づいて検出され得る。例えば、少なくとも２つのオリゴヌクレオチドプライマーをポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に基づくアッセイにおいて用いて、生物学的サンプルに由来する肺腫瘍ｃＤＮＡの一部を増幅し得、ここで、オリゴヌクレオチドプライマーのうちの少なくとも１つは、肺腫瘍タンパク質をコードするポリヌクレオチドに特異的である（すなわち、ハイブリダイズする）。次いで、増幅されたｃＤＮＡが、当該分野で周知の技術（例えば、ゲル電気泳動）を用いて分離され、そして検出される。同様に、肺腫瘍タンパク質をコードするポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブをハイブリダイゼーションアッセイにおいて用いて、生物学的サンプル中でこの腫瘍タンパク質をコードするポリヌクレオチドの存在を検出し得る。
【０７４７】
アッセイ条件下でのハイブリダイゼーションを可能にするために、オリゴヌクレオチドのプライマーおよびプローブは、少なくとも１０ヌクレオチド、そして好ましくは少なくとも２０ヌクレオチドの長さの、肺腫瘍タンパク質をコードするポリヌクレオチドの一部に対して少なくとも約６０％、好ましくは少なくとも約７５％、そしてより好ましくは少なくとも約９０％の同一性を有するオリゴヌクレオチド配列を含むべきである。好ましくは、オリゴヌクレオチドプライマーおよび／またはプローブは、上記に規定されるような、中程度にストリンジェントな条件下で、本明細書中に記載されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズする。本明細書中に記載される診断方法において有用に用いられ得るオリゴヌクレオチドのプライマーおよび／またはプローブは、好ましくは、少なくとも１０〜４０ヌクレオチドの長さである。好ましい実施形態において、オリゴヌクレオチドプライマーは、配列番号１〜４５１、および４５３に記載される配列を有するＤＮＡ分子の少なくとも１０の連続するヌクレオチド、より好ましくは少なくとも１５の連続するヌクレオチドを含む。ＰＣＲに基づくアッセイおよびハイブリダイゼーションアッセイの両方についての技術は、当該分野で周知である（例えば、Ｍｕｌｌｉｓら，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．，５１：２６３，１９８７；Ｅｒｌｉｃｈ編，ＰＣＲ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ，１９８９を参照のこと）。
【０７４８】
１つの好ましいアッセイは、ＲＴ−ＰＣＲを用い、ＲＴ−ＰＣＲでは、ＰＣＲは、逆転写と組み合わせて適用される。代表的に、ＲＮＡは生物学的サンプル（例えば、生検組織）から抽出され、そして逆転写されてｃＤＮＡ分子を生成する。少なくとも１つの特異的プライマーを用いるＰＣＲ増幅は、ｃＤＮＡ分子を生成し、このｃＤＮＡ分子は、例えば、ゲル電気泳動を用いて分離および可視化され得る。増幅は、試験患者および癌に罹患していない個体から採取された生物学的サンプルについて行われ得る。増幅反応は、２桁の大きさに及ぶいくつかのｃＤＮＡ希釈物について行われ得る。試験患者サンプルのいくつかの希釈物における発現の増加が、癌のないサンプルの同一希釈の物と比較して２倍以上である場合、これは、代表的に、陽性とみなされる。
【０７４９】
別の実施形態において、本明細書中に記載される組成物は、癌の進行のマーカーとして使用され得る。この実施形態において、癌の診断のための上記のようなアッセイが、経時的に実施され得、そして反応性ポリペプチドまたはポリヌクレオチドのレベルの変化が評価され得る。例えば、このアッセイは、６ヶ月〜１年の期間に２４〜７２時間ごとに実施され得、その後も必要に応じて実施され得る。一般的に、癌は、検出されるポリペプチドまたはポリヌクレオチドのレベルが経時的に増加する患者において進行している。対照的に、この癌は、反応性ポリペプチドまたはヌクレオチドのレベルが一定のままであるかまたは時間とともに減少するかのいずれかである場合には、進行していない。
【０７５０】
特定のインビボ診断アッセイは、腫瘍に対して直接実施され得る。１つのこのようなアッセイは、腫瘍細胞を結合因子と接触させる工程を包含する。次いで、結合された結合因子が、レポーター基を介して直接的または間接的に検出され得る。このような結合因子はまた、組織学的適用において使用され得る。あるいは、ポリヌクレオチドプローブが、このような適用において使用され得る。
【０７５１】
上記のように、感度を改善するために、複数の肺腫瘍タンパク質マーカーが、所定のサンプルにおいてアッセイされ得る。本明細書中に提供される異なるタンパク質に特異的な結合因子が、単一のアッセイ中で組み合わされ得ることは、明らかである。さらに、複数のプライマーまたはプローブが、同時に使用され得る。腫瘍タンパク質マーカーの選択は、最適な感度を生じる組み合わせを決定するための慣用的実験に基づき得る。さらに、またはあるいは、本明細書中に提供される腫瘍タンパク質についてのアッセイが、他の公知の腫瘍抗原についてのアッセイと組み合わされ得る。
【０７５２】
（診断キット）
本発明は、上記の診断方法のうちのいずれかにおける使用のためのキットをさらに提供する。このようなキットは、代表的には、診断アッセイを実施するために必要な２つ以上の成分を含む。成分は、化合物、試薬、容器および／または器具であり得る。例えば、キット中の１つの容器は、肺腫瘍タンパク質に特異的に結合する、モノクローナル抗体またはそのフラグメントを含み得る。このような抗体またはフラグメントは、上記のように、支持体材料に結合して提供され得る。１つ以上のさらなる容器が、このアッセイにおいて使用される要素（例えば、試薬または緩衝液）を含み得る。このようなキットはまた、またはあるいは、抗体結合の直接検出または間接検出に適切なレポーター基を含む、上記のような検出試薬を含み得る。
【０７５３】
あるいは、生物学的サンプル中の肺腫瘍タンパク質をコードするｍＲＮＡレベルを検出するためのキットが設計され得る。このようなキットは、一般的に、上記のような、腫瘍タンパク質をコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズする、少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプローブまたはプライマーを含む。このようなオリゴヌクレオチドは、例えば、ＰＣＲまたはハイブリダイゼーションアッセイにおいて使用され得る。このようなキット中に存在し得るさらなる成分としては、肺腫瘍タンパク質をコードするポリヌクレオチドの検出を容易にするための、第２のオリゴヌクレオチドおよび／または診断試薬もしくは診断容器が挙げられる。
【０７５４】
以下の実施例は、例示として提供され、限定としては提供されない。
【０７５５】
（実施例）
（実施例１）
（肺腫瘍タンパク質ｃＤＮＡの同定）
本実施例は、肺腫瘍タンパク質をコードするｃＤＮＡ分子の同定を例示する。
【０７５６】
本明細書に開示されるｃＤＮＡは、以下にさらに記載している、サブトラクトした肺扁平上皮腫瘍ｃＤＮＡライブラリー、ＬＳＴ−Ｓ５、およびサブトラクトした転移性肺腺癌ｃＤＮＡライブラリー、ＭＳ１（ｍｅｔｓ３２０９−Ｓ１）の配列決定によって生成した。
【０７５７】
（組織およびＲＮＡの供給源）
本試験中で使用した腫瘍およびいくつかの正常組織は、Ｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｅ  Ｈｕｍａｎ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｎｅｔｗｏｒｋ（ＣＨＴＮ）、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｔｅｒｃｈａｎｇｅ（ＮＤＲＩ）、およびＲｏｓｗｅｌｌ  Ｐａｒｋ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｎｔｅｒから入手した。
【０７５８】
（ｃＤＮＡライブラリーの構築）
改良したＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を用いて、ＬＳＴ−Ｓ５についての２つの患者組織、およびＭＳ１についての転移性腺癌組織のプールから抽出したポリＡ＋ＲＮＡからｃＤＮＡライブラリーを構築した。要するに、ＢｓｔＸＩ／ＥｃｏＲＩアダプター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を用い、そしてｃＤＮＡを、ＢｓｔＸＩおよびＥｃｏＲＩで消化したｐｃＤＮＡ３．１＋ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）にクローニングした。ＬＳＣＣおよび肺腺癌ｃＤＮＡライブラリー（ここでは、１００％のコロニーがインサートを有し、その平均インサートサイズは２，１００塩基対である）について、全部で１．６×１０６〜２．７×１０６の独立したコロニーを得た。
【０７５９】
（正常な肺、心臓および肝臓の組織を用いるｃＤＮＡライブラリーの構築）
本質的に同じ手順を用いて、４つの肺組織標品のプールから正常なヒト肺ｃＤＮＡライブラリーを調製し、正常な食道ｃＤＮＡライブラリーを２つの食道総ＲＮＡサンプルのプールから調製し、そして混合した正常組織ｃＤＮＡライブラリーを、肺、肝臓、膵臓、皮膚、脳およびＰＢＭＣから単離した、当量の総ＲＮＡから調製した。正常な肺ライブラリーは、１．４×１０６の独立したコロニーを含み、このコロニーの９０％がインサートを有し、そしてこの平均インサートサイズは、１，８００塩基対である。正常な食道ｃＤＮＡライブラリーは、１．０×１０６の独立したコロニーを含み、このコロニーの１００％がインサートを有し、そしてこの平均インサートサイズは、１，６００塩基対である。混合した正常組織ｃＤＮＡライブラリーは、２．０×１０６の独立したコロニーを含み、このコロニーの１００％がインサートを有し、そしてこの平均インサートサイズは、１，５００塩基対である。
【０７６０】
（肺扁平上皮細胞癌および肺腺癌特異的サブトラクトｃＤＮＡライブラリー）
ＬＳＣＣおよび／または肺の腺癌において優先的に発現された遺伝子について富化するため、本発明者らは、前に記載（ＳａｒｇｅｎｔおよびＤａｗｉｄ，１９８３；ＤｕｇｕｉｄおよびＤｉｎａｕｅｒ，１９９０）（改変）したように、ドライバーとして、テスターおよび正常組織ｃＤＮＡライブラリーとして上記の肺扁平上皮細胞および腺癌ｃＤＮＡライブラリーを用いてｃＤＮＡライブラリーサブトラクションを実施した。正常な肺、食道および混合ｃＤＮＡ（各々４０μｇ）を、ＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩで消化し、続いてフェノールクロロホルム抽出およびエタノール沈殿した。次いで、フォトプローブロングアームビオチン（ｐｈｏｔｏｐｒｏｂｅ  ｌｏｎｇ−ａｒｍ  ｂｉｏｔｉｎ）（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）で標識し、得られた物質をエタノール沈殿し、そして２ｍｇ／ｍｌでＨ２Ｏに溶解してドライバーＤＮＡを準備した。テスターＤＮＡについては、１０μｇの肺扁平上皮細胞癌または肺腺癌ｃＤＮＡをＮｏｔＩおよびＳｐｅＩで消化し、続いてフェノールクロロホルム抽出し、Ｃｈｒｏｍａ  ｓｐｉｎ−４００カラムを用いてサイズ分画した（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）。５μｇのテスターＤＮＡを２５μｇのドライバーＤＮＡと混合し、そして等容積の２×ハイブリダイゼーション緩衝液（１．５Ｍ  ＮａＣｌ／１０  ｍＭ  ＥＤＴＡ／５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．５／０．２％ドデシル硫酸ナトリウム）を添加して、６８℃でハイブリダイゼーション用に処理した。ハイブリダイゼーション後、数回のストレプトアビジン処理およびフェノールクロロホルム抽出を実施してビオチン化したＤＮＡ、ドライバーＤＮＡおよびドライバーＤＮＡにハイブリダイズしたテスターＤＮＡの両方を除いた。次いで、テスター特異的ＤＮＡについて富化されたサブトラクトされたＤＮＡを、２回のサブトラクションでさらなるドライバーＤＮＡにハイブリダイズさせた。２回のサブトラクション後、ＤＮＡを沈殿させ、そしてｐＢＣＳＫ＋プラスミドベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）に連結し、ＬＳＴ−５と呼ばれる、肺扁平上皮腫瘍特異的サブトラクトｃＤＮＡライブラリー（Ｌｕｎｇ  Ｓｑｕａｍｏｕｓ  Ｔｕｍｏｒ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｓｕｂｔｒａｃｔｅｄ  ｃＤＮＡライブラリー）、およびＭＳ１と呼ばれる、サブトラクトした転移性肺腺癌ｃＤＮＡライブラリーを得た。
【０７６１】
サブトラクトしたライブラリーを分析するため、２０〜３００クローンを無作為に拾い上げ（ピックし）、そしてＰｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ／Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ  Ａｕｔｏｍａｔｅｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ  Ｍｏｄｅｌ  ３７３Ａおよび／またはＭｏｄｅｌ３７７（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を用いた配列分析用にプラスミドＤＮＡを調製した。これらの配列をＧｅｎＢａｎｋおよびヒトＥＳＴデータベースにおける配列と比較した。次いで、各サブトラクトしたｃＤＮＡライブラリーの冗長性（重剰性）および複雑性を、回収した各々の特有のｃＤＮＡの頻度に基づいて評価した。次いで、高度に冗長なｃＤＮＡをプローブとして用いて、サブトラクトしたｃＤＮＡライブラリーをプレスクリーニングして、マイクロアレイ技術によって分析されるべきライブラリーから冗長性（重剰性）ｃＤＮＡフラグメントを排除した。
【０７６２】
（マイクロアレイ技術を用いるｃＤＮＡ発現の分析）
ＬＳＴ−５において単離した全部で６７２のｃＤＮＡ配列、およびＭＳ１から単離した全部で５３１のｃＤＮＡ配列を、個々のコロニーからＰＣＲ増幅した。肺腫瘍、正常肺、ならびに他の正常組織および腫瘍組織におけるそれらのｍＲＮＡ発現プロフィールを、記載された（Ｓｈｅｎａら、１９９５）ようなｃＤＮＡマイクロアレイ技術を用いて試験した。手短かには、これらのクローンを、各位置が特有のｃＤＮＡクローンに対応する、複数のレプリカとして、ガラススライド上に整列させた（５５００ほどの多さのクローンが単一のスライドまたはチップ上に整列され得る）。各チップを一対のｃＤＮＡプローブ（それぞれ、Ｃｙ３およびＣｙ５で蛍光標識された）とハイブリダイズした。代表的に、１μｇのポリＡ＋ＲＮＡを用いて各ｃＤＮＡプローブを生成した。ハイブリダイゼーション後、チップをスキャンし、そして蛍光強度をＣｙ３チャネルおよびＣｙ５チャネルの両方について記録した。複数の内臓された品質制御工程が存在する。第一に、１８の偏在性に発現された遺伝子のパネルを用いて、プローブの品質をモニターした。第二に、この制御プレートはまた、酵母ＤＮＡフラグメントを有し、その相補的なＲＮＡをプローブの品質および分析の感度を測定するためのプローブ合成中にスパイクした。現在、この技術は、１００，０００コピーのｍＲＮＡ中に１の感度を提供する。結局、この技術の再現性は、異なる位置で複製された制御ｃＤＮＡエレメントを含むことによって確実にされた。いくつかの示差的に発現された遺伝子がこの研究において複数回同定されたこと、およびこれらの遺伝子の発現プロフィールが非常に匹敵すること（示さず）から、このプロセスのさらなるバリデーション（確証）が、示された。
【０７６３】
以下の結果を得て、表２に示す：
【０７６４】
【表２】
2004524003.tif 000003
上記の表におけるシグナル２に対するシグナル１の比は、腫瘍対正常組織において同定された配列の発現のレベルの測定を提供する。例えば、配列番号４２２について、腫瘍特異的シグナルは、試験した正常組織のシグナルの２．３５倍であった；配列番号４２３について、腫瘍特異的シグナルは、正常組織などのシグナルの５２．５２倍であった。
【０７６５】
ＬＳＴ−Ｓ５およびＭＳ１のサブトラクトライブラリー由来の配列を含む肺マイクロアレイチップ上でさらなる分析を実施した。１つの分析において、腫瘍中で２倍過剰発現以上、および正常組織中での平均発現が０．２以下という基準を用いて、以下の結果を得て、表３に記載する：
【０７６６】
【表３】
2004524003.tif 000004
別の分析において、選択した腫瘍サンプル中で過剰発現したｃＤＮＡを同定するためにビジュアルアナログスケールを用いた。これらのｃＤＮＡのいくつかは、元のｃＤＮＡをサブトラクトした非小細胞肺癌腫瘍サンプルから同定したにもかかわらず、いくつかの小細胞肺癌サンプルにおいて優先的に過剰発現されることが見出された。この分析の結果を以下の表４にまとめる。
【０７６７】
【表４】
2004524003.tif 000005
（ＬＳＣＣおよび腺癌特異的遺伝子の定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ分析）
ＰＣＲ産物の定量は、ＤＮＡの量がバックグラウンドを辛うじて上回るところからプラトーに対数的に増幅する数回のサイクルに依存する。連続的な蛍光モニタリングを用いて、ＤＮＡが対数的に増幅する閾値サイクル数を、各ＰＣＲ反応で容易に決定する。２つの蛍光検出システムが存在する。１つは二本鎖ＤＮＡ特異的結合色素ＳＹＢＲグリーンＩ色素に基づく。もう一方は、５’末端でレポーター色素（ＦＡＭ）、３’末端でＱｕｅｎｃｈｅｒ色素（ＴＡＭＲＡ）を含有するＴａｑＭａｎプローブを用いる（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ／Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）。標的特異的ＰＣＲ増幅は、ＡｍｐｌｉＴａｑ  ＧｏｌｄＴＭ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ／Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）のヌクレアーゼ活性によって、プローブを含有するＱｕｅｎｃｈｅｒからのレポーター色素の切断および遊離を生じる。従って、遊離されたレポーター色素から生成された蛍光シグナルは、ＰＣＲ産物の量に比例する。両方の検出方法は、匹敵する結果を生じることが見出された。複数の組織サンプルにおける遺伝子発現の相対的レベルを比較するため、組織および／または細胞株由来のＲＮＡを用いてｃＤＮＡのパネルを構築し、そして遺伝子特異的プライマーを用いてリアルタイムＰＣＲを実施して各ｃＤＮＡサンプルにおけるコピー数を定量する。各ｃＤＮＡサンプルを一般に二連で実施し、そして各反応を複製したプレートで繰り返した。最終のリアルタイムＰＣＲの結果は、代表的に、各ｃＤＮＡサンプルにおける内部アクチン数に対して正規化した目的の遺伝子のコピー数の平均として報告される。リアルタイムＰＣＲ反応は、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ色素を用いるＧｅｎｅＡｍｐ  ５７００  Ｄｅｔｅｃｔｏｒ上か、またはＴａｑＭａｎプローブ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ／Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を用いてＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ７７００  Ｄｅｔｅｃｔｏｒ上で実施され得る。
【０７６８】
（実施例２）
（Ｌ５８７Ｓの全長ｃＤＮＡおよびタンパク質）
Ｌ５８７Ｓの全長ｃＤＮＡを得た。このｃＤＮＡは、２５５アミノ酸を有する新規なタンパク質をコードする。Ｌ５８７Ｓは、マイクロアレイ、リアルタイムＰＣＲ、およびノーザン分析によって、肺小細胞癌における過剰発現を示した。全長ｃＤＮＡは、配列番号４５３に示され、そしてクローン５５０２２の伸長した配列（配列番号３５）を示す。Ｌ５８７Ｓアミノ酸配列は、配列番号４５４に示される。本質的に上記実施例１に記載されるように実行したマイクロアレイ分析は、Ｌ５８７Ｓが、正常組織に比較して小細胞肺癌腫で過剰発現されることを実証した。リアルタイムＰＣＲによって、Ｌ５８７は、試験された小細胞原発性腫瘍および腫瘍細胞株の全てにおいて高度に発現されることが見出された。小細胞原発性腫瘍および腫瘍細胞株における発現レベルは代表的に、正常肺組織において観察された発現レベルの約５倍〜約５０倍大きかった。腺癌および扁平肺腫瘍のプールにおいても発現を検出した。正常な肺、脳、脳下垂体、副腎、甲状腺、膵臓、心臓、肝臓、骨格筋、腎臓、小腸、膀胱、皮膚、唾液腺、ＰＢＭＣ、脾臓または脊髄においては、有意な発現は観察されなかった。胃、結腸、食道、気管、骨髄、リンパ節、および胸腺においてはある程度低レベルの発現が観察されたが、この発現は、小細胞腫瘍および腫瘍細胞株において観察されたよりはかなり低レベルであった。Ｌ５８７Ｓのノーザン分析によって、肺小細胞癌における約２ｋｂの２つのアイソフォームの存在が実証された。
【０７６９】
（実施例３）
（Ｌ５８７Ｓ  ｈｉｓ  ｔａｇ融合タンパク質のＥ．ｃｏｌｉにおける発現）  Ｌ５８７Ｓの全長ｃＤＮＡ配列（配列番号４５３）を実施例２に記載する。これは、請求項以上組織に比べて腫瘍組織におｋて高度に発現されることが見出された。本実施例は、Ｅ．ｃｏｌｉにおけるＬ５８７Ｓの発現を記載する。
【０７７０】
以下のプライマーを用いてＬ５８７Ｓコード領域でＰＣＲを実施した：
フォワードプライマーＰＤＭ−６４７：５’ｇｃｃｔｃｇｔｃａｇａｔｃｔｇｇａａｃａａｔｔａｔｇｃｔｃ（配列番号４５５）Ｔｍ６１℃。
【０７７１】
リバースプライマーＰＤＭ−６４８：５’ｃｇｔａａｃｔｃｇａｇｔｃａｔｃａｇｇｔｔａｔａａｃａｔａａｃ３’ＴＭ５９℃。
【０７７２】
ＰＣＲ条件は以下のとおりであった：
１０μｌ  １０×Ｐｆｕ緩衝液
１．０μｌ  １０ｍＭ  ｄＮＴＰｓ
２．０μｌ  １０μＭ各プライマー
８３μｌ滅菌水
１．５μｌ  Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，ＬＡ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）
５０ｎｇ  ＤＮＡ
ＰＣＲ増幅を以下の条件下で実行した：
初めに９６℃で２分間、続いて９６℃で２０秒間、６０℃で１５秒間、および７２℃で９０秒間を４０サイクル。これに続いて最終の７２℃の伸長工程を４分間行った。
【０７７３】
ＰＣＲ産物をＸｈｏＩ制限酵素で消化し、ゲル精製し、そしてＥｃｏ７２ＩおよびＸｈｏＩ制限酵素で消化したｐＰＤＭ  Ｈｉｓ（インフレームでＨｉｓタグを有する改変ｐＥＴ２８ベクター）中にクローニングした。正確な構築物をＤＮＡ配列分析によって確認し、次いで発現のためにＢＬＲ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳおよびＢＬＲ（ＤＥ３）ＣｏｄｏｎＰｌｕｓ  ＲＰ細胞中に形質転換した。ＩＰＴＧを用いてタンパク質発現を誘導した。
【０７７４】
発現された組み換えＬ５８７Ｓのアミノ酸配列を配列番号４５７に開示し、そしてＤＮＡコード領域の配列を配列番号４５８に示す。
【０７７５】
（実施例４）
（ポリペプチドの合成）
ポリペプチドは、ＨＰＴＵ（Ｏ−ベンゾトリアゾール−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート）活性化を伴うＦＭＯＣ化学を使用するＰｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ／Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ  ４３０Ａペプチドシンセサイザー上で合成され得る。Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ配列は、抱合体化、固定された表面への結合、またはペプチドの標識化の方法を提供するためにそのペプチドのアミノ末端に付着され得る。固体支持体からのそのペプチドの切断は、以下の切断混合物を使用して実施され得る：トリフルオロ酢酸：エタンジチオール：チオアニソール：水：フェノール（４０：１：２：２：３）。２時間の切断の後、そのペプチドを、冷したメチル−ｔ−ブチル−エーテル中において沈殿させ得る。次いで、そのペプチドペレットを水含有０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）中に溶解し得、そしてＣ１８逆相ＨＰＬＣによる精製の前に凍結乾燥し得る。水中（０．１％ＴＦＡ含有）０％〜６０％のアセトニトリル（０．１％ＴＦＡ含有）の勾配を使用して、ペプチドを溶出させ得る。純粋な画分の凍結乾燥後、そのペプチドを、エレクトロスプレーもしくは他の型の質量分析法を使用し、そしてアミノ酸分析によって特徴付け得る。
【０７７６】
（実施例５）
（小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）を有する患者からの肺多量浸出液（ＬＰＥ）中のＬ５８７特異的抗体の検出）
組み換えタンパク質をＬ５８７Ｓ（配列番号４５７）について生成し、そしてタンパク質に基づくＥＬＩＳＡにおいて用いて、ＳＣＬＣに罹患した患者のＬＰＥにおけるＬ５８７Ｓ特異的抗体の存在を検出した。ＳＣＬＣ患者７例のうち３例が、検出可能なレベルのＬ５８７Ｓ特異的抗体を有した（患者番号：２９８〜４２、５７４〜５７、およびＧ４１２）、しかし、Ｌ５８７Ｓに対するＡｂは、試験した６例の正常ドナーでは検出限界未満であった。この知見をウエスタンブロット分析で確認した。Ｌ５８７Ｓタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥで泳動し、そしてＳＣＬＳを罹患している７例の患者由来のＬＰＥでプローブした。タンパク質に基づくＥＬＩＳＡから生成したデータと一致して、タンパク質に基づくＥＬＩＳＡを用いて陽性であった同じ患者（患者番号：２９８〜４２、５７４〜５７、およびＧ４１２）中のＬ５８７特異的バンドの存在が分析によって示された。
【０７７７】
Ｏ５８７Ｓの部分が免疫原性であることを決定するために、Ｏ５８７Ｓに特異的なペプチドを合成した。これらのペプチドは、１０アミノ酸重複した１５マーであった。ペプチドに基づくＥＬＩＳＡを用いて、患者番号５７４〜５７および患者番号２９８〜４２を両方とも試験した。エピトープ分析によって、患者番号５７４〜５７は、１５番（アミノ酸７１〜８５）、および２３番（アミノ酸１１１〜１２５）（その配列が配列番号４５９および４６０に開示されている）に対して反応したことが示された。患者番号２９８〜４２は、ペプチド番号１（アミノ酸１〜１５）、９番（アミノ酸４１〜５５）、および４５番（アミノ酸２２１〜２３５）（その配列は配列番号４６１〜４６３に開示される）に対して反応することが示された。
【０７７８】
（実施例６）
（Ｌ５８７特異的細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）の生成）
Ｌ５８７ＳがＣＤ８＋Ｔ細胞免疫応答を生成し得るか否かを決定するため、インビトロプライミング方法を用いてＣＴＬを生成した。これを行うために、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、Ｐｅｒｃｏｌ勾配、それに続くプラスチック接着によって、正常ドナーから単離した。次いで、１％ヒト血清、５０ｎｇ／ｍｌ  ＧＭ−ＣＳＦ、および３０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−４を補充したＲＰＭＩの存在下で、接着集団を５日間培養した。５日間の培養後、樹状細胞（ＤＣ）集団を構成する非接着細胞を回収し、そして１０の感染効率でＬ５８７Ｓ発現アデノウイルスを用いて２４時間感染させた。次いで、２μｇ／ｍｌのＣＤ４０リガンドの添加によってＤＣをさらに２４時間成熟させた。ＣＴＬ株を生成するため、自系のＰＢＭＣを単離し、そしてＣＤ８＋Ｔ細胞を、ＣＤ４＋、ＣＤ１４＋、およびＣＤ１６＋に対して結合体化した磁気ビーズを用いるネガティブ選択によって富化した。Ｌ５８７Ｓに特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞株を、１０％ヒト血清、５ｎｇ／ｍｌＩＬ−１２、および１０ｎｇ／ｍｌ  ＩＬ−６で補充したＲＰＭＩを含有する１ウェルあたり１０，０００個のＬ５８７Ｓ発現ＤＣおよび１００，０００のＣＤ８＋Ｔ細胞を用いてＵ底９６ウェルプレート中で樹立した。Ｌ５８７ＳおよびＣＤ８０を発現するようにレトロウイルスで形質導入された自系の線維芽細胞を用いて７日ごとに培養物を再刺激した。この細胞をまたＭＨＣクラスＩを上方制御するようにＩＦＮγで刺激した。培地に、再刺激の時点で、ならびに刺激後２日および５日の時点で、１０Ｕ／ｍｌのＩＬ−２を補充した。４サイクルの刺激後、ＩＦＮγ処理したＬ５８７Ｓ／ＣＤ８０発現自系線維芽細胞に対する曝露に応答してＩＦＮγを生成したが、コントロールの抗原で形質導入した細胞に対しては応答しなかった、３つのＬ５８７Ｓ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞株を同定した。これらの３つの株を、７５，０００個の照射したＰＢＭＣ、１０，０００個の照射したＢ−ＬＣＬ、３０ｎｇ／ｍｌ  ＯＫＴ３（抗−ＣＤ３）、および５０ｕ／ｍｌ  ＩＬ−２の存在下で、１ウェルあたり０．５または２のいずれかの頻度のＣＤ８＋Ｔ細胞を用いて９６ウェルプレート中にクローニングした。２週間のクローニング後、増殖について陽性のウェルから細胞のアリコートをとり、Ｌ５８７Ｓで形質導入した線維芽細胞に対してこれらの細胞を試験した。Ｅｌｉｓｐｏｔの結果によって、１つのクローン（５Ｅ９／Ａ６）が、Ｌ５８７Ｓを発現する線維芽細胞に特異的に応答して反応したことが示された。
【０７７９】
（実施例７）
（ＣＤ４特異的Ｔヘルパー細胞応答を刺激し得るＬ５８７免疫原性ペプチドの同定）
Ｌ５８７Ｓアミノ酸配列から誘導された一連のペプチドを合成して、インビトロのプライミング実験に用いＬ５８７Ｓについて特異的なＣＤ４＋Ｔヘルパー細胞を生成した。これらのペプチドは１９〜２２マーのサイズにわたり、そして５アミノ酸重複した。
【０７８０】
ＣＤ４＋Ｔヘルパー細胞を生成するため、ペプチドを１０のプールへと併せ、そして０．２５μｇ／ｍｌの濃度でＤＣを２４時間にわたってパルス刺激した。次いで、このＤＣを洗浄し、そして９６ウェルのＵ底プレート中のポジティブ選択されたＣＤ４＋Ｔ細胞と混合した。ペプチドプールを充填した新鮮ＤＣ上でこの培養物を再刺激した。全部で３回の刺激後、細胞を１週間休息させ、その後各々のペプチドプールでパルス刺激した抗原提示細胞（ＡＰＣ）を用いて特異性について試験した。Ｔ細胞株の特異性をＩＦＮγ  ＥＬＩＳＡおよびＴ細胞増殖アッセイを用いて測定した。これらのアッセイを実施するために、関連するペプチドプールまたは無関連のペプチドプールのいずれかが充填した接着性単球をＡＰＣとして用いた。サイトカイン放出および増殖の両方によって、Ｌ５８７特異的ペプチドプールを特異的に認識するＴ細胞株を、同定した。Ｔ細胞は、ペプチドプール１、３、および４に対して反応することが見出された。
【０７８１】
特異的なペプチドプールについて陽性である試験したＣＤ４Ｔ細胞株を次いで、そのプール由来の個々のペプチドに対してスクリーニングした。これらのアッセイのために、０．２５μｇのプールしたＬ５８７Ｓペプチド、または０．２５μｇの個々のペプチドを用いてＡＰＣをパルス刺激した。試験したドナーにおいてＣＤ４＋Ｔヘルパー応答を生成し得るペプチドを表５にまとめる。
【０７８２】
【表５】
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Ｐｒｏｌｉｆ＝増殖（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）；ａａ＝アミノ酸（ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ）；ＳＩ＝刺激係数（ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ  ｉｎｄｅｘ）  上記より、本発明の特定の実施形態が本明細書において例示の目的で記載されているが、種々の改変が本発明の趣旨および範囲から逸脱することなくなされ得ることが理解される。従って、本発明は、添付の特許請求の範囲を除いては限定されない。
【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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