(57)【要約】本発明は、リステリア属の細菌、特にリステリア・モノサイトゲネスの細菌を単離するための培地に関する。本発明は、リステリア培地中に、固形培地中での使用のためのα-マンノシダーゼを同定するための少なくとも1種類の特異的な物質を含有することを特徴とする。【特許請求の範囲】
【請求項１】
リステリア属の細菌を検出および／または識別するための培地であって、リステリア培地中に、固形培地中で使用され得るα-マンノシダーゼを同定するための少なくとも1種の特異的な物質を含有することを特徴とする培地。
【請求項２】
固形培地中で使用され得るα-マンノシダーゼを同定するための特異的な物質が、α-マンノシダーゼの基質から選択される発色性物質または蛍光発生物質であることを特徴とする、請求項1に記載の培地。
【請求項３】
発色性物質が、加水分解によって、インドキシル、ハロインドキシル（ブロモインドキシル、クロロインドキシル、フルオロインドキシル、ヨードインドキシル、ジクロロインドキシル、クロロブロモインドキシル、トリクロロインドキシル）、メチルインドキシル、またはヒドロキシキノリンの誘導体、特に、6-クロロインドキシル、5-ブロモインドキシル、3-ブロモインドキシル、6-フルオロインドキシル、5-ヨードインドキシル、4，6-ジクロロインドキシル、6，7-ジクロロインドキシル、5-ブロモー4-クロロインドキシル、5-ブロモ-6-クロロインドキシル、4，6，7-トリクロロインドキシル、N-メチルインドキシル、または8-ヒドロキシルキノリンの誘導体から選択される沈殿可能な発色団を放出することを特徴とする、請求項2に記載の培地。
【請求項４】
α-マンノシダーゼの基質と連結した蛍光発生物質が4-メチルウンベリフェリルであることを特徴とする、請求項2に記載の培地。
【請求項５】
発色反応アクチベーターをさらに含むことを特徴とする、請求項1〜4のいずれか1項に記載の培地。
【請求項６】
アクチベーターがメチル-α-マンノシドであることを特徴とする、請求項5に記載の培地。
【請求項７】
リステリアについて選択される因子をさらに含むことを特徴とする、請求項1〜6のいずれか1項に記載の培地。
【請求項８】
α-マンノシダーゼの基質がインドキシル-α-マンノシドであることを特徴とする、請求項1〜7のいずれか1項に記載の培地。
【請求項９】
1リットルあたり以下の成分を含有することを特徴とする、請求項1〜8のいずれか1項に記載の培地：
寒天  10g
仔ウシ脳インフュージョン  12.5g
プロテオースペプトン  10g
ウシ心臓インフュージョン  5g
塩化ナトリウム  5g
Na2HPO4  4g
KH2PO4  2g
グルコース  2g
塩化リチウム  7.5g
レシチン  3g
オフロキサシン  0.0004g
コリスチン  0.015g
セフタジジム  0.0134g
メチル-α-マンノシド  0.25g
インドキシル-α-マンノシド  0.05g。
【請求項１０】
リステリア・モノサイトゲネスに特異的であることを特徴とする、請求項1〜9のいずれか1項に記載の培地。
【請求項１１】
リステリア属の細菌を検出および／または識別するための、請求項1〜10のいずれか1項に規定される培地の使用。
【請求項１２】
以下の工程を含むことを特徴とする、試料中のリステリア属の細菌を検出および／または識別するための方法：
（a）請求項1〜10のいずれか1項に規定されるような培地に、試料または該試料由来の接種材料を接種する工程、
（b）該培地上でリステリア属の細菌の存在を検出する工程、
（c）選択的に、該培地上に存在する、リステリア・モノサイトゲネスを、リステリア・イヴァノビおよび他のリステリアから区別する工程。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、リステリア属の細菌、特にリステリア・モノサイトゲネス（Listeria  monocytogenes）の細菌を実証することを意図する発色性培地に関する。
【背景技術】
【０００２】
臨床分野および農業食品分野の両方において、リステリア、および特にリステリア・モノサイトゲネスを分析することは、ますます重要になっている。なぜなら、これらの細菌は、しばしば農業食品製品中に広がり、感受性の高い患者（妊婦、高齢者など）において重篤な感染をもたらすからである。
【０００３】
実際、数年間、特に農業食品産業の製品について、政府は厳しいサーベイランスネットワークの設置を増加させてきた。このように、一般化された、リステリア・モノサイトゲネスの疫学的なサーベイランスが監視されている。
【０００４】
従って、これらの細菌による汚染を検出するための、信頼性が高くかつ迅速な試験方法（この試験方法は高感度かつ特異的の両方でなければならない）を確保することが重要である。
【０００５】
今日、ある程度選択性であり、試料中のリステリアの存在を検出することが可能な、リステリアを検出するための特定の培地（例えば、PALCAM培地またはOXFORD培地）が存在している。これらの培地を使用して得られる結果は、ある程度の不正確さを示し得る。このことは、リステリア・モノサイトゲネスの存在を確認するために他の試験を実施することの必要性を示す。
【０００６】
これらの培地は、実際、選択性を提供する抗微生物物質、および特異性を提供する酵素の検出の組み合わせに基づいている。しかし、これらの培地は、特に多くの偽陽性または偽陰性の存在を引き起こすため、これらの培地の選択性および特異性の両方は、改善され得る余地がある。これらの培地の不利な点は、これらの培地がリステリア・モノサイトゲネス種を区別することができないという点である。
【０００７】
コロニーの特異的な着色またはコロニーを取り囲む特異的なハロー（halo）によってリステリア・モノサイトゲネスを直接検出するために、ホスホリパーゼの検出に基づく試験を含む培地もまた存在する。しかし、これらの試験は、天然でホスホリパーゼ＋であるリステリア・イヴァノビ（L.ivanovii）についても陽性である。
【０００８】
単離工程の後の同定工程で、特に「アミノペプチダーゼ」表現型における差異に基づく試験を用いて、リステリア・イヴァノビからリステリア・モノサイトゲネスを区別することも示唆された。
【発明の開示】
【０００９】
リステリア・イヴァノビからリステリア・モノサイトゲネスを区別する目的のために、本発明は、リステリア・モノサイトゲネスについては陽性であり、リステリア・イヴァノビについては陰性であることを特徴とする、α-マンノシダーゼの検出に基づいている。本発明の特徴としては、例えば、酵素基質であるニトロフェニル-α-マンノシドを使用して、純粋な培養物であることを示すことができる。この基質は無色であるが、試験が陽性である場合に、黄色に着色したニトロフェニルを放出する。
【００１０】
本発明は、固形培地中で発色性基質または蛍光発生基質を用いてα-マンノシダーゼを検出することによって、固形培地上のコロニー中のα-マンノシダーゼを示すことが可能であることを実証する。固形培地中でのα-マンノシダーゼについての基質の使用は、本願において初めて導き出され、特に固形培地を調製する利点を有する。ここでは、単離が実行されるとすぐに、さらなる試験を実施する必要なしに、リステリア・イヴァノビからリステリア・モノサイトゲネスを区別することが可能である。
【００１１】
従って、本発明は、リステリア属の細菌を検出および／または識別するための新規な培地に関し、上記培地は、リステリア培地中に、固形培地中で使用され得るα-マンノシダーゼを同定するための少なくとも1種の特異的な物質を含有することを特徴とする。固形培地中で使用され得るα-マンノシダーゼを同定するための特異的な物質は、好ましくは、α-マンノシダーゼの基質から選択される発色性物質または蛍光発生物質である。
【００１２】
α-マンノシダーゼの基質である発色性物質は、好ましくは、この酵素による基質の加水分解によって放出される沈殿可能な発色団を含有する。従って、細菌のコロニーは、放出される発色団の関数として着色し、放出された発色団は培地中で固体状態である。それゆえ、発色団が放出されたコロニーに局在したまま残っている。
【００１３】
好ましくは、上記発色団は、インドキシル、ハロインドキシル（ブロモインドキシル、クロロインドキシル、フルオロインドキシル、ヨードインドキシル、ジクロロインドキシル、クロロブロモインドキシル、トリクロロインドキシル）、メチルインドキシル、またはヒドロキシキノリンの誘導体から選択される。好ましい誘導体は、特に、以下の誘導体：6-クロロインドキシル、5-ブロモインドキシル、3-ブロモインドキシル、6-フルオロインドキシル、5-ヨードインドキシル、4，6-ジクロロインドキシル、6，7-ジクロロインドキシル、5-ブロモ-4-クロロインドキシル、5-ブロモ-6-クロロインドキシル、4，6，7-トリクロロインドキシル、N-メチルインドキシル、および8-ヒドロキシルキノリンから選択される。
【００１４】
α-マンノシダーゼの基質が蛍光発生物質と連結される場合、4-メチルウンベリフェリルが好ましく使用される。
【００１５】
好ましくは、α-マンノシダーゼの基質は、インドキシル-α-マンノシドである。培地中の発色性物質の濃度は、約0.01〜0.5g／lの間である。好ましい濃度は0.05g／lである。
【００１６】
観察される反応の質を改善するために、発色反応アクチベーターを上記培地に添加することもまた、利点であり得る。このような用途のための適切なアクチベーターは、メチル-α-マンノシドであり、約0.01〜0.5g／lの間、好ましくは0.25g／lの濃度で培地に取り込まれる。
【００１７】
従って、本発明に従う培地は、いかなるさらなる試験をも実行することなく、リステリア・モノサイトゲネスを検出することを可能にし、そしてリステリア・モノサイトゲネスを、リステリア・イヴァノビから識別することを可能にする。本発明に従う培地によって得られた結果を最適化するために、先行技術の培地中で使用されているように、リステリア属に対して選択的な因子を追加することが有利であり得る。その結果、リステリア・モノサイトゲネスに特異的な培地が得られる。
【００１８】
本発明の目的はまた、リステリア属、特にリステリア・モノサイトゲネスの細菌を検出および／または識別するための、本発明に従う培地の使用に関する。
【００１９】
本発明の目的はまた、試料中のリステリア属の細菌を検出および／または識別するための方法に関し、上記方法は、
（a）本発明に従う培地に、試料または試料由来の接種材料を接種する工程、
（b）培地上でリステリア属の細菌の存在を検出する工程、および
（c）選択的に、培地上に存在する、リステリア・モノサイトゲネスを、リステリア・イヴァノビおよび他のリステリアから区別する工程、
を含むことを特徴とする。
【００２０】
実施例
実施例1
本発明を実施するための好ましい培地は以下の成分を含有する（1リットルあたり）：
寒天  10g
仔ウシ脳インフュージョン  12.5g
プロテオースペプトン  10g
ウシ心臓インフュージョン  5g
塩化ナトリウム  5g
Na2HPO4  4g
KH2PO4  2g
グルコース  2g
塩化リチウム  7.5g
レシチン  3g
オフロキサシン  0.0004g
コリスチン  0.015g
セフタジジム  0.0134g
メチル-α-マンノシド  0.25g
インドキシル-α-マンノシド  0.05g。
【００２１】
実施例2
本発明に従う培地上に細菌を播種して、以下の結果を得た（37℃で24時間インキュベーション）：
【００２２】
【表１】
2004524017.tif 000002
【００２３】
従って、本発明に従う培地の使用は、リステリア・モノサイトゲネス、リステリア・イヴァノビ、および他のリステリアの種を検出および識別することを可能にする。
【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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