(57)【要約】抗原特異的Ｔリンパ球を検出可能に標識することができる内因性蛍光自己多量体化ＭＨＣ融合タンパク質、およびそれから構築した複合体が開示される。抗原特異的Ｔリンパ球を本発明の内因性蛍光複合体で標識する方法、特に、このようにして標識された抗原特異的Ｔリンパ球を検出、増強、濃縮および希釈するためのフローサイトメトリー法が開示される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＧＦＰ様発色団と、
少なくとも１つの多量体化ドメインと、
ＭＨＣペプチド提示部分と
を含む組み換え融合タンパク質。
【請求項２】
請求項１の融合タンパク質をコードする配列を含む、または、請求項１の融合タンパク質をコードする配列に相補的である核酸。
【請求項３】
請求項２の核酸を含む組換えベクター。
【請求項４】
前記ベクターが、宿主細胞中で前記融合タンパク質の発現させることができる請求項３の組換えベクター。
【請求項５】
請求項１の融合タンパク質、請求項２の核酸、請求項３のベクター、および請求項４の組換えベクターの任意の１つまたは複数を含む宿主細胞。
【請求項６】
複数のサブユニットを含む内因性蛍光多量体タンパク質複合体であって、以下の式で表される前記複合体において、前記サブユニットが４次式を有する内因性蛍光多量体タンパク質複合体。
（Ｆ）n
（式中、Ｆは請求項１に記載の融合タンパク質であり、ｎは１より大きい整数である。）
【請求項７】
複数のサブユニットを含む内因性蛍光多量体タンパク質複合体であって、以下の式で表される前記複合体において、前記サブユニットが４次式を有する内因性蛍光多量体タンパク質複合体。
（Ｆ1Ｓ1）n
（式中、
Ｆは請求項１に記載の組換え融合タンパク質であり、
Ｓは、β２ミクログロブリン、クラスIIβＭＨＣペプチド提示可溶性誘導体、およびクラスIIαＭＨＣペプチド提示可溶性誘導体からなる群から選択される可溶性タンパク質であり、
ＦがクラスＩαＭＨＣペプチド提示部分を含む場合、Ｓはβ２ミクログロブリンであり、ＦがクラスIIαＭＨＣペプチド提示部分を含む場合、ＳはクラスIIβＭＨＣペプチド提示可溶性誘導体であり、ＦがクラスIIβＭＨＣペプチド提示部分を含む場合、ＳはクラスIIαＭＨＣペプチド提示可溶性誘導体であり、
ｎは１より大きい整数である。）
【請求項８】
複数のサブユニットを含み、Ｔリンパ球をその抗原受容体の特異性にしたがって標識するための内因性蛍光多量体タンパク質複合体であって、以下の式で表される複合体において、前記サブユニットが４次式を有する内因性蛍光多量体タンパク質複合体。
（Ｆ1Ｓ1Ｐ1）n
（式中、
Ｆは請求項１に記載の組換え融合タンパク質であり、
Ｓは、β２ミクログロブリン、クラスIIβＭＨＣペプチド提示可溶性誘導体、およびクラスIIαＭＨＣペプチド提示可溶性誘導体からなる群から選択される可溶性タンパク質であり、
ＦがクラスＩαＭＨＣペプチド提示部分を含む場合、Ｓはβ２ミクログロブリンであり、ＦがクラスIIαＭＨＣペプチド提示部分を含む場合、ＳはクラスIIβＭＨＣペプチド提示可溶性誘導体であり、ＦがクラスIIβＭＨＣペプチド提示部分を含む場合、ＳはクラスIIαＭＨＣペプチド提示可溶性誘導体であり、
Ｐはペプチド抗原であり、
ｎは１より大きい整数である。）
【請求項９】
組換え融合タンパク質であって、
前記タンパク質のアミノ酸配列内に完全にコードされている蛍光手段と、
多量体を形成する手段と、
ＭＨＣ型Ｔリンパ球へのペプチド抗原の提示に寄与することができる手段と
を含む組換え融合タンパク質。
【請求項１０】
Ｔリンパ球をその抗原受容体の特異性にしたがって標識するための内因性蛍光多量体タンパク質複合体であって、
前記多量体複合体の少なくとも１つのサブユニットのアミノ酸配列内に完全にコードされている蛍光手段と、
Ｔリンパ球にその抗原受容体の特異性にしたがって結合する手段と
を含む内因性蛍光多量体タンパク質複合体。
【請求項１１】
Ｔリンパ球をその抗原受容体の特異性にしたがって検出可能に標識する方法であって、
請求項８に記載の内因性蛍光多量体複合体を前記Ｔリンパ球に接触させる工程であって、前記Ｔリンパ球の抗原受容体が前記複合体の前記ペプチド抗原および前記ＭＨＣ提示ドメインに特異的であり、前記Ｔリンパ球への前記複合体の検出可能な結合に十分な時間および条件下で接触させる工程を含む方法。
【請求項１２】
細胞サンプル中の、選択された抗原に特異的なＴリンパ球を検出する方法であって、
請求項８に記載の内因性蛍光多量体複合体を前記サンプルに接触させる工程であって、前記複合体のペプチド抗原が前記選択された抗原であり、前記複合体の前記ＭＨＣ提示ドメインが、検出を所望するＴリンパ球が特異的であるＭＨＣ提示ドメインであり、前記選択された抗原に特異的なＴリンパ球への前記複合体の検出可能な結合に十分な時間および条件下で接触させる工程と、
その後、前記サンプル中の特異的Ｔリンパ球を、これに結合した前記複合体の蛍光によって検出する工程と
を含む方法。
【請求項１３】
このようにして検出された抗原特異的Ｔリンパ球を計数する工程をさらに含む請求項１２の方法。
【請求項１４】
前記サンプルを少なくとも１つのフルオロフォア結合抗体に接触させる工程であって、前記抗体がｐａｎ−Ｔ抗体およびＴ細胞セブセット抗体からなる群から選択される工程と、
前記多量体蛍光複合体の、細胞に結合した蛍光を検出する工程と、
少なくとも１つのフルオロフォア結合抗体由来の、細胞に結合した蛍光を検出する工程と
をさらに含む請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
Ｔ細胞活性化抗原に特異的な少なくとも１つのフルオロフォア結合抗体を、前記サンプルに接触させる工程と、
その後、前記サンプル中の活性化特異的Ｔリンパ球を、前記多量体蛍光複合体の蛍光および少なくとも１つのそれに結合したフルオロフォア結合抗体によって検出する工程と
をさらに含む請求項１２の方法。
【請求項１６】
選択された抗原に特異的なＴリンパ球についてサンプルを濃縮する方法であって、
請求項８に記載の内因性蛍光多量体複合体に前記サンプルを接触させる工程であって、前記複合体の前記ペプチド抗原が前記選択された抗原であり、前記選択された抗原に特異的なＴリンパ球への前記複合体の検出可能な結合に十分な時間および条件下で接触させる工程と、
その後、前記特異的Ｔリンパ球をそれに結合した複合体の蛍光に基づいて濃縮する工程と
を含む方法。
【請求項１７】
選択された抗原に特異的なＴリンパ球についてサンプルを希釈する方法であって、
請求項８に記載の内因性蛍光多量体複合体に前記サンプルを接触させる工程であって、前記複合体の前記ペプチド抗原が前記選択された抗原であり、前記選択された抗原に特異的なＴリンパ球への前記複合体の検出可能な結合に十分な時間および条件下で接触させる工程と、
その後、前記特異的Ｔリンパ球についてそれに結合した複合体の蛍光に基づいてサンプルを希釈する工程と
を含む方法。
【請求項１８】
請求項７の多量体複合体とペプチド抗原とを個別に含むキット。
【請求項１９】
ｐａｎ−Ｔ抗体およびＴ細胞サブセット抗体からなる群から選択されるフルオロフォア結合抗体をさらに含む請求項１８のキット。
【請求項２０】
Ｔ細胞活性化抗原に特異的なフルオロフォア結合抗体をさらに含む請求項１８または１９のキット。
【請求項２１】
請求項８の多量体複合体と、
ｐａｎ−Ｔ抗体およびＴ細胞サブセット抗体からなる群から選択されるフルオロフォア結合抗体と
を個別に含むキット。
【請求項２２】
Ｔ細胞活性化抗原に特異的なフルオロフォア結合抗体をさらに含む請求項２１のキット。
【請求項２３】
赤血球溶解剤をさらに含む請求項１８または２１のキット。
【請求項２４】
可動性ペプチドスペーサーをさらに含む請求項１の組換え融合タンパク質。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［関連出願の相互参照］
本出願は、2001年1月12日提出の米国特許仮出願番号60/261,448号（その全体が本明細書中で参考として組み込まれる）の提出日の利益を主張する。
【０００２】
［発明の分野］
本発明は、内因性蛍光自己多量体化ＭＨＣ融合タンパク質（intrinsically fluorescent, self-multimerizing MHC fusion protein）およびその複合体、ならびに、特にフローサイトメトリーによる、抗原特異的Ｔリンパ球の標識、検出、計数、濃縮、単離、希釈（depletion）および活性化のためのこれらの複合体の使用方法を提供する。
【背景技術】
【０００３】
［発明の背景］
特異的ペプチド抗原が負荷され、蛍光標識された主要組織適合複合体（ＭＨＣ：major histocompatibility complex）タンパク質の可溶性四量体（「ＭＨＣ四量体」）が、抗原特異的Ｔリンパ球の検出、計数、特性決定、および精製に特に有用であることが、過去５年間に証明されている。ＭＨＣクラスＩ四量体の適用については、最近、Dohertyら、Annu.Rev.Immunol.、18、561-92、2000;Oggら、Immunol.Lett.、66(1-3)、77-80、1999;Mainiら、Immunol.Today、20(6)、262-6、1999;およびDoherty、Curr.Opin.Microbiol.、1(4)、419-22、1998で概説されている。ＭＨＣクラスII四量体の適用は、Reichstetterら、J.Immunol.、165(12)、6994-8、2000;Kwokら、J.Immunol.、164(8)、4244-9、2000;Liuら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、97(26)、14596-14601、2000;Novakら、J.Clin.Invest.、104(12)、R63-7、1999;Crawfordら、Immunity、8、675-682、1998;およびKozonoら、Nature、369、151-154、1994で考察されている。
【０００４】
ＭＨＣ四量体は、抗原特異的およびＭＨＣ特異的な様式でＴリンパ球のＴ細胞受容体（「ＴＣＲ：T cell receptor」）に結合する。例えば、Altmanra,Science,274,94,1996および米国特許第5,635,363号を参照のこと。
【０００５】
染色剤の特異性は、四量体複合体内に含まれるＭＨＣ部分およびペプチドによって付与される。したがって、β２ミクログロブリンと複合体を形成し、約９個のアミノ酸の抗原ペプチドが負荷されたＭＨＣクラスＩα鎖分子の細胞外ドメインを含む四量体は、負荷しているペプチドおよびＭＨＣ対立遺伝子に特異的なクラスＩ型（class I-restricted）（典型的には、ＣＤ８+）Ｔ細胞に結合する。抗原ペプチドを負荷した４つのクラスIIヘテロ二量体（各ヘテロ二量体は、ＭＨＣクラスIIαおよびクラスIIβ鎖の細胞外ドメインを含む）を含む四量体は、抗原特異的様式およびＭＨＣ型（MHC-restricted）様式でクラスII型（典型的にはＣＤ４+）Ｔ細胞に結合する。
【０００６】
Ｔリンパ球への安定な結合に十分な親和力（avidity）は、ＭＨＣ／ペプチド複合体の多量体形成に起因する。自己寛容（self-tolerance）を維持するために、ＴＣＲのＭＨＣ／ペプチドに対する天然の親和性は低く、これは免疫染色試薬として一価のＭＨＣ／ペプチド複合体を使用できないほど低い。Matsuiら、Science、254、1788-91、1991;Matsuiら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、91、12862-6、1994。多量体形成によって、ＴＣＲが十分に安定に結合するように、ＭＨＣ／ペプチド複合体の親和力が増加する。典型的には、ＭＨＣ鎖に組み込んだＢｉｒＡ基質ペプチドの酵素によるビオチン化（その後ビオチン化ＭＨＣ鎖は４：１のモル比でアビジンまたはストレプトアビジンに結合する）によって多量体形成を行う。
【０００７】
ＭＨＣ四量体は、フルオロフォアへの直接的または間接的な結合によって検出される。典型的には、予めフルオロフォアに結合させたストレプトアビジンまたはアビジン分子を使用したＭＨＣ／ペプチド分子の多量体化によって直接的結合を行う。このようなアビジンおよびストレプトアビジンタンパク質は、種々の業者（たとえば、Becton Dickinson Immunocytometry Systems、San Jose、CA、USA;Biomeda、Foster City、CA、USA;Ancell Corp.、Bayport、MN USA;Southern Biotechnology Assocs.,Inc.,Birmingham、AL、USA)から市販されている。アビジン／ストレプトアビジン部分または多量体化ＭＨＣ鎖の非多型決定基に対して特異性を有するフルオロフォア結合抗体を使用して、間接的標識を行うことができる。
【０００８】
ＭＨＣ四量体が非常に有用であると証明されているにもかかわらず、その合成におけるある側面には問題がある。
【０００９】
適切な多量体化には、ＭＨＣ鎖の制御された化学量論的な事前のビオチン化が必要であり、その後のビオチン化された鎖のアビジンまたはストレプトアビジンへの化学量論的結合がさらに必要である。これらの工程のいずれかまたは両方が非効率的または不正確であると、得られる四量体複合体の収率および有用性に悪影響を与える。
【００１０】
例えば、ＭＨＣ鎖の非効率的ビオチン化（すなわち、ＭＨＣ分子あたり少なくとも１つのビオチンの組み込みの失敗）により四量体の収率が減少する。反応生成物からの非結合ビオチンの不十分な除去（非結合ビオチン分子の多量体化反応物への残存）により、アビジン分子が飽和し、四量体の収率も減少し得る。
【００１１】
複数の部位でのＭＨＣ分子のビオチン化により、得られた四量体複合体の親和力が減少し得る。おそらく複数かつ無作為なＭＨＣ分子の化学修飾により多量体化複合体中のＭＨＣ／ペプチド部分の配向が無作為になり、しばしば不活性になるので、化学的ビオチン化を使用した多量体化の初期の試みは失敗した。酵素的ビオチン化によりビオチン化プロセスの制御が改良されたにもかかわらず、酵素的修飾自体を周知の変化（酵素濃度、基質濃度、基質の接近可能性、および酵素活性等への依存などを含む）に供し、複数の酵素的ビオチン化により、初期の化学的ビオチン化複合体で認められた不十分な親和力に類似することがある。
【００１２】
アビジンなどの外因性多量体化部分の必須の使用と組み合わせたＭＨＣ鎖の複数の部位でのビオチン化により、多量体化反応でのより高次の多量体の擬似的生成も可能になる。少数のＭＨＣ／ペプチドサブユニットが２つまたはそれ以上のビオチンを含む場合でさえ、アビジン／ストレプトアビジン部分の架橋が起こり得る。このようなより高次の多量体によって、立体障害による親和力の減少が認められ、逆に、他の環境では、親和力が増加したより高次の複合体を得ることができる。平均より増加または減少した親和力の変化により、ＴＣＲ密度または抗原親和性に無関係の種々の染色強度を得ることがある。より高次の多量体により、より強力な蛍光シグナルも発生することがあり、染色強度において混乱させる多様性を引き起こす。
【００１３】
逆に、非結合ビオチン分子が多量体反応物に残存することで、非結合ビオチンでアビジン／ストレプトアビジン部分が部分的に飽和され、４つのＭＨＣ／ペプチドサブユニット未満の多量体複合体が形成され得る。このようなより低次の複合体は、ＴＣＲに対してより低い親和力を示し、ＴＣＲ密度または抗原／ＭＨＣ親和性と無関係に、種々の染色強度を示し得る。
【００１４】
個別のフルオロフォア結合工程の条件により、収率の喪失、およびＴＣＲもしくは蛍光強度のいずれかまたはその両方に対する親和力における意図せぬ変化が起こり得る。
【００１５】
関連するアプローチでは、ＭＨＣの四量体よりもむしろＭＨＣ／Ｉｇキメラを使用して、抗原特異的Ｔリンパ球を標識する。Dal Portoら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、90、6671-6675、1993;Gretenら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、95、7568-7573、1998;Hamadら、J.Exp.Med.、188、1633-1640、1998;Schneckら、米国特許第6,015,884号および同第6,140,113号。
【００１６】
クラスＩキメラでは、ＭＨＣクラスＩα鎖の細胞外ドメインが、ＩｇＧ重鎖の可変領域にインフレームで融合する。適切な酸化条件下で、重鎖キメラはジスルフィド結合を介して自己二量体形成し、二量体形成によりＴ細胞標識試薬として二量体融合タンパク質の使用に十分なＴＣＲに対する親和力が付与される。ＭＨＣ四量体と同様に、二量体クラスＩキメラ分子は、抗原特異的Ｔ細胞が認識するために、β２ミクログロブリンと会合し、特異的抗原ペプチドを負荷しなければならない。ＭＨＣ四量体と異なり、ＭＨＣ／Ｉｇキメラ分子を、Ｉｇ軽鎖を使用する前に、さらに会合させなければならない。
【００１７】
クラスII  ＭＨＣ／Ｉｇキメラでは、ＭＨＣクラスIIαおよびβ鎖の細胞外ドメインを、Ｉｇ重鎖および軽鎖〔典型的には、ＩｇＧ重鎖にβサブユニットが融合し、Ｉｇ軽鎖（典型的には、κ鎖）にクラスIIαドメインが融合している〕に個別に融合させる。ＭＨＣ四量体と同様に、抗原特異的Ｔ細胞が認識するために、クラスIIキメラ分子は特異的抗原ペプチドを負荷しなければならず、安定性のために、抗原ペプチドをクラスIIβサブユニットのＮ末端に直接融合することができる(Kozonoら、Nature、369、151-154、1994;Liuら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、97、14596-14601、2000)。
【００１８】
二量体キメラの標識は、典型的には、フルオロフォア結合抗Ｉｇ二次抗体を使用して行う。
【００１９】
自己二量体化キメラにより、問題が付随するビオチン化工程およびＭＨＣキメラに必要な外因性多量体化部位の使用が回避される。二量体キメラにより、抗原ペプチドを合成後により容易に負荷することも可能である。
【００２０】
しかし、二量体キメラ自体に問題がないわけではない。
【００２１】
第１に、二価であることにより、四量体を使用した場合よりもＴＣＲに対する親和力が低くなり、低親和性ＴＣＲを標識する能力が減少または消滅し得る。
【００２２】
第２に、Ｉｇ軽鎖会合のさらなる要件（クラスＩキメラの場合、天然のＩｇ軽鎖、またはクラスIIキメラの場合、組換えＩｇ軽鎖融合部分でありうる）は、１つの宿主細胞での複数の組換え発現構築物の同時発現するか、クラスＩキメラの場合、Ｉｇ軽鎖を構成的に発現する宿主細胞株を使用しなければならない。
【００２３】
第３に、自己二量体化によりビオチン化工程およびＭＨＣ四量体の外因性多量体化部分に対する信頼が回避されて公知の結合価（複雑性）の多量体の収率が改良される可能性があるにもかかわらず、還元条件下で二量体が会合し得る。
【００２４】
さらに、二量体キメラを蛍光により検出する各ストラテジーは困難である。
【００２５】
例えば、視覚化のための二次抗体の使用により、複数の抗原の同時検出がより困難になり、多くの場合そうであるように、抗原特異的Ｔ細胞集団が小さく、細胞を正確に検出および計数するために複数のパラメータを使用しなければならない場合これは大きな問題である。二次抗体使用の代替法として、キメラに対するフルオロフォアの直接の化学的結合により、キメラのそのコグネイトＴＣＲとの親和性による相互作用が干渉される、または消滅することがある。直接の化学結合により、種々のモル比の標識を有するキメラ分子が得られることもあり、フローサイトメトリーまたは他の蛍光ベースの分析がより不確定になる。
【００２６】
したがって、抗原（およびＭＨＣ）特異性に基づいたＴリンパ球の標識に使用するできる試薬であって、表面ＴＣＲとの相互作用を介してＴリンパ球に安定に結合するのに十分な親和性を有すが、ビオチン化および外因性多量体化を必要としない試薬が必要であり、さらに、二次抗体またはフルオロフォアへの直接の化学結合を必要とせずに蛍光を発することができる抗原特異的Ｔ細胞標識試薬が同時に必要である。
【００２７】
基質に独立で、内在的に蛍光を発するAequorea victoria由来の緑色蛍光タンパク質（「ＧＦＰ」）は、細胞内でＧＦＰまたはＧＦＰ融合物を発現する細胞のフローサイトメトリー（「ＦＡＣＳ」）分析で使用されており、Galbraithら、「ＧＦＰ蓄積に基づいたフローサイトメトリー分析およびＦＡＣＳ選別」、Methods Cell Biol.、58、315-41、1999で概説されている。フローサイトメトリー用に改良した性質を有するＧＦＰ変異体は、米国特許第6,090,919号および同第5,804,387号；Cormackら、Gene、173、33-38、1996に記載されている。ＧＦＰおよびＧＦＰ変異体は、典型的には、細胞表面構造の外部標識よりもむしろ細胞の内部標識に使用されている。
【００２８】
最近、Discosoma coralからＤｓＲｅｄ（drFP583とも呼ばれる）と呼ばれるＧＦＰの遠いホモログがクローン化されており(Matzら、Nature Biotecchnol.、17、969-973、1999)、単独または融合タンパク質としてのＤｓＲｅｄの切断クローニング、細菌発現、および哺乳動物発現に適切なベクターが現在市販されている(Clontech Laboratories,Inc.、Palo Alto、CA、USA)。
【００２９】
天然のＤｓＲｅｄは、約５５８ｎｍの励起（吸収）極大を有し、約５８３ｎｍの発光極大を有し、約５０９ｎｍの発光極大を有するＧＦＰに対して実質的に赤方偏移を有する。したがって、ＤｓＲｅｄは、フローサイトメーターで日常的に利用可能な標準的な４８８ｎｍのレーザー光線によって容易に励起され、自己蛍光バックグラウンドおよびＧＦＰと容易に区別可能な発光スペクトルをするので、ＤｓＲｅｄはＧＦＰまたはＧＦＰのＦＡＣＳ至適化変異体と共に二色フローサイトメトリーの候補となる。
【００３０】
しかし、ＤｓＲｅｄの構造およびスペクトルの特性についての詳細な研究(Bairdら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、97、11984-11989、2000;Grossら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、97、11990-11995、2000;Heikalら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、97、11996-12001、2000;Wallら、Nature Structural Biol.、7、1133-1138、2000)により、フローサイトメトリーおよび他の蛍光分析におけるＤｓＲｅｄの広範な使用を妨げるといわれている２つの特徴が同定された。
【００３１】
第１に、ＤｓＲｅｄの赤色蛍光は成熟が遅く、インビトロおよびインビボの両方で緑色から赤色に完全に成熟するのに数日かかる。約数日間の成熟時間により、短期間の遺伝子発現のレポーターとしてのＤｓＲｅｄの使用、または、世代時間が短いもしくは成長の早い生物において融合タンパク質を追跡する試みが妨げられる。Bairdら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、97、11984-11989、2000。
【００３２】
第２に、ＤｓＲｅｄは、必須の自己多量体化四量体のようである。Bairdら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、97、11984-11989、2000;Wallら、Nature Structural Biol.、7、1133-1138、2000;Grossら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、97、11990-11995、2000。オリゴマー化は、遺伝子発現の簡単なレポーターとしてのＤｓＲｅｄの使用に無関係であり得るにもかかわらず、宿主タンパク質の輸送または相互作用について調査するために、宿主タンパク質に融合させる最もよく行われる適用において、重大な問題が引き起こされる。さらに、シグナル伝達における多数のタンパク質はオリゴマー化によって活性化されるため、ＤｓＲｅｄへの融合により構成的なシグナル伝達が引き起こされる。すでにオリゴマーである宿主タンパク質においては、ＤｓＲｅｄへの融合により、化学量論の不調和、四次構造の立体障害、または巨大な凝集体への架橋が起こる。
【００３３】
これらの「主な欠点」を考慮に入れると、「ＤｓＲｅｄの任意（多数）の潜在的な細胞生物学的適用には、四量体化の抑制および変異の促進が必要である」(Bairdら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、97、11984-11989、2000)。「ほとんどの生物工学的適用において、変異の遅さおよびＤｓＲｅｄのオリゴマー化は、系統的変異誘発によって取り組まなければならない望ましくない特性である」(Wallら、Nature Structural Biol.、7、1133-1138、2000)。「ＤｓＲｅｄの優れた輝度および安定性ならびに長波蛍光タンパク質の多くの使用可能性により、これらの残存する欠点を修復するための主要な努力についての十分な正当性が得られる」(Grossら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、97、11990-11995、2000)。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００３４】
［発明の要旨］
本発明の目的は、抗原（およびＭＨＣ）特異性に基づいたＴリンパ球の標識に使用することができ、ビオチン化および外因性の多量体化部分を使用することなく、表面ＴＣＲに安定に結合するのに十分なＴリンパ球に対する親和力を有し、二次抗体またはフルオロフォアへの直接的化学結合を使用することなく蛍光を発することができる試薬を提供することである。本発明のさらなる目的は、このような試薬を使用して抗原特異的Ｔリンパ球を標識、検出、計数、濃縮、単離、希釈、および活性化する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００３５】
これらおよび当該分野の他の要求は、新規に発見された内因性蛍光自己多量体化フルオロフォアであるＤｓＲｅｄにおいて不利といわれている性質（多量体化）を活用し、得られた四量体を細胞内標識としてよりもむしろ細胞外標識として使用することにより当該分野でＤｓＲｅｄに不利といわれている他の性質である翻訳後のタンパク質フルオロフォアの成熟の遅さに影響を受けない本発明によって満たされる。
【００３６】
したがって、第１の態様では、本発明は、ＧＦＰ様発色団と、少なくとも１つの多量体化ドメインと、ＭＨＣペプチド提示部分とを含む、組み換え融合タンパク質を提供する。機能的には、融合タンパク質は、タンパク質のアミノ酸配列内に完全にコードされている蛍光手段と、多量体を形成する手段と、ＭＨＣ型Ｔリンパ球へのペプチド抗原提示に寄与することができる手段とを含む。
【００３７】
好ましい実施形態では、本発明の融合タンパク質は、Ｎ末端からＣ末端に向けて、選択されたＭＨＣＩαサブユニットから得た連続的なα１、α２、およびα３ドメインと、その後にインフレームで実質的に全てのＤｓＲｅｄであって、ＧＦＰ様フルオロフォアおよび２つの異なる多量体化ドメインを備えるものとを含む。この好ましい融合タンパク質は、溶液中で自発的に四量体化する。
【００３８】
適切に多量体化してペプチドを負荷された場合、本発明の融合タンパク質は、外因性フルオロフォアへさらに直接または間接に結合させることなく、抗原（およびＭＨＣ）特異性に基づいたＴリンパ球の蛍光標識に使用することができるので、本発明の試薬を、現在ＭＨＣ四量体およびＭＨＣ／Ｉｇキメラ融合タンパク質を使用している全ての方法で使用することができる。
【００３９】
本発明の融合タンパク質を、典型的には、宿主細胞における組換え発現によって産生する。したがって、さらなる態様では、本発明は、上記の融合タンパク質をコードする核酸、その相補物、核酸を含むベクター、宿主細胞中での融合タンパク質発現用のベクター、本発明の融合タンパク質を発現することができるエピソームベクターおよび組込みベクター、ならびに１つまたは複数の内部細胞区画中に本発明の任意の１つの核酸、組換えベクター、発現ベクターおよび融合タンパク質を含む宿主細胞を含む。
【００４０】
他の態様では、本発明は、複数のサブユニットとして本発明の融合タンパク質を含む多量体複合体を提供する。適切な可溶性タンパク質パートナー（例えば、クラスＩＭＨＣペプチド提示部分を有する融合タンパク質に対してβ２ミクログロブリン）と適切に複合体化し、ペプチドを負荷された場合、これらの内因性蛍光多量体複合体を使用して、抗原（およびＭＨＣ）特異性に基づいてＴリンパ球を標識することができる。
【００４１】
最も簡単なこのような態様では、本発明は、複数のサブユニットを含む内因性蛍光多量体タンパク質複合体であって、（Ｆ）n（式中、Ｆは本発明にかかる融合タンパク質であり、ｎは１より大きい整数である。）で表される前記複合体において、前記サブユニットが４次式（quaternary formula）を有する内因性蛍光多量体タンパク質複合体を提供する。ＤｓＲｅｄまたは関連融合タンパク質によって融合タンパク質の多量体化ドメインが得られる場合、典型的には、複合体は四価（すなわち、ｎ＝４）で構築される。
【００４２】
関連する態様では、本発明は、さらに、複数のサブユニットを含む内因性蛍光多量体タンパク質複合体であって、（Ｆ1Ｓ1）n（式中、Ｆは本発明による組換え融合タンパク質であり、Ｓは可溶性タンパク質であり、ｎは１より大きい整数である。）で表される前記複合体において、前記サブユニットが４次式を有する内因性蛍光多量体タンパク質複合体を提供する。
【００４３】
Ｓは、β２ミクログロブリン、クラスIIβＭＨＣペプチド提示可溶性誘導体、およびクラスIIαＭＨＣペプチド提示可溶性誘導体からなる群から選択される。ＦがクラスＩαＭＨＣペプチド提示部分を含む場合、Ｓはβ２ミクログロブリンであり、ＦがクラスIIαＭＨＣペプチド提示部分を含む場合、ＳはクラスIIβＭＨＣペプチド提示可溶性誘導体であり、ＦがクラスIIβＭＨＣペプチド提示部分を含む場合、ＳはクラスIIαＭＨＣペプチド提示可溶性誘導体である。
【００４４】
したがって、可溶性タンパク質で適切に構築された多量体複合体〔すなわち、（Ｆ1Ｓ1）n四価（quaternary stoichiometry）〕に特異的ペプチドを負荷し、その抗原特異性に基づいたＴリンパ球の検出可能な標識に有用である内因性蛍光試薬を得ることができる。
【００４５】
したがって、別の態様では、本発明は、抗原受容体の特異性に基づくＴリンパ球標識のための内因性蛍光多量体タンパク質複合体を提供する。本発明のこの態様の複合体は、複数のサブユニットを含んでなり、（Ｆ1Ｓ1Ｐ1）n（式中、Ｆは上記のように本発明の組換え融合タンパク質であり、Ｓは、上記の可溶性タンパク質であり、Ｐはペプチド抗原であり、ｎは１より大きい整数である。）で表される前記複合体において、サブユニットは４次式を有する。
【００４６】
ＭＨＣ四量体およびＭＨＣ／Ｉｇキメラのように、ペプチド抗原は、本発明の多量体複合体のＭＨＣペプチド提示ドメインに結合する。クラスＩＭＨＣ内因性蛍光多量体では、融合タンパク質サブユニットのクラスＩαＭＨＣペプチド提示部分のα１およびα２ドメインに結合し、クラスII多量体では、複合体のＭＨＣペプチド提示部分および可溶性誘導体のα１およびβ１ドメインに結合する。
【００４７】
機能的には、Ｔリンパ球をその抗原受容体の特異性にしたがって標識するための内因性多量体タンパク質複合体は、多量体複合体の少なくとも１つのサブユニットのアミノ酸配列内に完全にコードされる蛍光手段と、抗原受容体の特異性にしたがってＴリンパ球に結合する手段とを含む。
【００４８】
一旦所与のペプチド抗原を負荷されると、本発明の内因性蛍光複合体は、多量体複合体の所与のペプチドおよびＭＨＣペプチド提示ドメインに特異的な抗原受容体を有するＴリンパ球に結合することができる。本発明の複合体のペプチド抗原およびＭＨＣペプチド提示ドメインの両方を変更することができるので、一般に、本発明の内因性蛍光多量体複合体を、抗原受容体の抗原（およびＭＨＣ）特異性に基づいたほぼ無限の種々のＴリンパ球の蛍光標識に使用することができる。
【００４９】
したがって、本発明の別の態様は、抗原受容体の特異性に基づいてＴリンパ球を検出可能に標識（染色）するための本発明の多量体複合体の使用方法を提供することである。
【００５０】
第１の実施形態では、本方法は、複合体のＴリンパ球への検出可能な結合に十分な時間および条件下で、本発明の内因性蛍光多量体複合体であって、Ｔリンパ球の抗原受容体が特異的なペプチド抗原およびＭＨＣペプチド提示ドメインを有する複合体を、標識すべきＴリンパ球に接触させる工程を含む。
【００５１】
典型的には、標識すべきＴリンパ球は、ヘテロロガスな細胞サンプル内に存在し、この集団内の抗原特異的Ｔリンパ球の検出およびしばしば計数が標識の目的である。
【００５２】
したがって、別の態様では、本発明は、細胞サンプル中の選択された抗原に特異的なＴリンパ球を検出する方法を提供する。本方法は、本発明の内因性蛍光多量体複合体をサンプルに接触させる工程であって、前記複合体の前記ペプチド抗原が前記選択された抗原であり、前記複合体の前記ＭＨＣ提示ドメインが、検出を所望するＴリンパ球が特異的であるＭＨＣ提示ドメインであり、サンプル中での選択された抗原およびＭＨＣに特異的なＴリンパ球への複合体の検出可能な結合に十分な時間および条件下で接触させる工程と、その後、サンプル中の特異的Ｔリンパ球を、これに結合した複合体の蛍光によって検出する工程とを含む。関連する態様では、本方法は、さらに、このようにして検出した抗原特異的Ｔリンパ球を計数する工程を含む。
【００５３】
使用される装置に依存して、抗原特異的Ｔリンパ球の検出を、その選別と直接または間接的に連結させることができ、このため、本発明の他の態様では、選択された抗原に特異的なＴリンパ球についてサンプルを濃縮および希釈（deplete）する方法が提供される。
【００５４】
一般に、本発明のこの態様の方法は、本発明の内因性蛍光多量体複合体をサンプルに接触させる工程であって、前記複合体の前記ペプチド抗原は前記選択された抗原であり、前記複合体の前記ＭＨＣ提示ドメインは、濃縮または希釈を所望するＴリンパ球が特異的であるＭＨＣ提示ドメインであり、サンプル中での選択された抗原およびＭＨＣに特異的なＴリンパ球への複合体の検出可能な結合に十分な時間および条件下で接触させる工程を含む。結合後、標識されたＴリンパ球を、結合した複合体の蛍光に基づいて濃縮または希釈する。
【００５５】
このような方法は、蛍光標示式細胞分取器を使用して好適に行われる。少なくとも一部が本発明の多量体複合体由来の蛍光に基づく選別により、細胞が除去されるサンプルが直接希釈され、細胞が収納されるアリコートが濃縮される。
【００５６】
本発明の多量体複合体の組成物を、通常、本発明の方法の実施を容易にするキットの形態で提供することができる。したがって、別の態様では、本発明は、本発明の内因性蛍光多量体複合体を含むキットを提供する。
【００５７】
一連の実施形態では、本発明のキットは、個別の組成物として、本発明の内因性蛍光（Ｆ1Ｓ1）n多量体および抗原ペプチドを含み、上記のように、ペプチドの選択は、標識試薬の所望する特異性に依存する。別の一連の実施形態では、多量体に予めペプチドを負荷する。必要に応じて任意であるが有利に、異なる組成としてこれらの一連のキットのいずれかに、ｐａｎ−ＴまたはＴ細胞サブセット抗原に対するフルオロフォア結合抗体、Ｔ細胞活性化抗原に特異的なフルオロフォア結合抗体、および赤血球溶解試薬のいずれかを含むことができる。
【００５８】
本発明の上記および他の目的ならびに利点は、添付の図面と併せて以下の詳細な説明の考慮によって明らかとなる。図面を通して類似の文字は類似の部分をいう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５９】
［発明の詳細な説明］
＜定義＞
本明細書中で使用される特に以下の用語は、以下の定義を有する。この節で特記しない場合、本明細書中で使用した全ての用語は、本発明に属する当業者に共通に理解される意味を有する。
【００６０】
「ＧＦＰ様発色団」は、中心αヘリックスを有する１１本の鎖からなるβバレル（β−ｃａｎ）を含む内因性蛍光タンパク質部分であって、中心αヘリックスが２つの芳香環系とその間の架橋とを含み結合Π共鳴系を有するものを意味する。「内因性蛍光」は、ＧＦＰ様発色団が完全にそのアミノ酸配列にコードされ、補因子または基質を使用せずに蛍光を発することができることを意味する。
【００６１】
「ＭＨＣペプチド提示部分」、「ＭＨＣペプチド提示可溶性誘導体」、および「ＭＨＣペプチド提示ドメイン」は全て、膜貫通ドメインを欠き（したがって、「溶解性」である）、Ｔ細胞受容体へのペプチド抗原提示に関与することができる主要組織適合複合体タンパク質鎖の一部をいう。用語「ＭＨＣペプチド提示部分」は、可溶性ＭＨＣ部分が融合タンパク質中に含まれる場合に使用され、異なる「ＭＨＣペプチド提示可溶性誘導体」は、タンパク質が融合しないで発現する場合に使用され、句「ＭＨＣペプチド提示ドメイン」は、一般に、両方の文脈で使用する。
【００６２】
クラスＩαＭＨＣペプチド提示ドメインは、ＭＨＣクラスＩ分子のα１、α２、およびα３ドメインの実質的に全てを含み、「実質的に全ての」は、それらの欠失体および置換体が、α３ドメインが内部ドメインのジスルフィド結合を形成する能力、またはα１およびα２ドメインがペプチドの結合のために適切に配置されたαヘリックスを形成する能力に干渉しない場合にのみ、欠失体および置換体が許容されることを意味する。
【００６３】
クラスIIαＭＨＣペプチド提示ドメインは、ＭＨＣクラスIIα鎖分子のα１およびα２ドメインの実質的に全てを含み、「実質的に全ての」は、それからの欠失体および置換体が、α２ドメインが内部ドメインのジスルフィド結合を形成する能力、またはα１ドメインがペプチド結合αヘリックスを形成する能力に干渉しない場合にのみ、欠失体および置換体が許容されることを意味する。
【００６４】
クラスIIβＭＨＣペプチド提示ドメインは、ＭＨＣクラスIIβ鎖分子のβ１およびβ２ドメインの実質的に全てを含む。「実質的に全ての」は、それからの欠失体および置換体が、β２ドメインが内部ドメインのジスルフィド結合を形成する能力またはβ１ドメインのペプチド結合αヘリックスを形成する能力に干渉しない場合にのみ、欠失体および置換体許容されることを意味する。
【００６５】
＜融合タンパク質＞
第１の態様では、本発明は、適切に多量体化してペプチドを負荷された場合に、外因性フルオロフォアを直接または間接的にさらに結合させることなく、Ｔリンパ球をその抗原（およびＭＨＣ）特異性に基づいて蛍光標識するために使用することができる組換え融合タンパク質を提供し、本発明の試薬を、現在Ｔ細胞のペプチド抗原特異的活性化を含むＭＨＣ四量体およびＭＨＣ／Ｉｇキメラ融合タンパク質が使用されている全ての方法で使用することができる。
【００６６】
本発明の融合タンパク質は、ＧＦＰ様発色団、少なくとも１つの多量体化ドメイン、およびＭＨＣペプチド提示部分を含む。
【００６７】
ＧＦＰ様発色団は、内因性蛍光タンパク質部分である。「内因性蛍光」は、ＧＦＰ様発色団が完全にそのアミノ酸配列にコードされ、補因子または基質を使用せずに蛍光を発することができることを意味する。
【００６８】
構造的に、ＧＦＰ様発色団は、中心αヘリックスを有する１１本の鎖からなるβバレル（β−ｃａｎ）を含み、中心αヘリックスは２つの芳香環系とその間の架橋とを含み結合Π共鳴系を有する。Π共鳴系は、アミノ酸間の自己触媒環状化（環状化はイミダソリノン中間体を介して進行する）およびその後の関連チロシンのＣα−Ｃβ結合での酸素分子による脱水素によって作製される。
【００６９】
ＧＦＰ様発色団を、A.victoria GFP（GenBankアクセッション番号AAA27721）、Renilla reniformis GFPであるFP583（GenBankアクセッション番号AF168419）(DsRed)、FP593(AF272711)、FP483(AF168420)、FP484(AF168424)、FP595(AF246709)、FP486(AF168421)、FP538(AF168423)、およびFP506(AF168422)などの天然に存在するタンパク質で見出されるＧＦＰ様発色団から選択することができ、発色団の内因性蛍光の維持に必要なだけの少量の天然タンパク質を含むことが必要である。蛍光に必要な最小ドメインを決定する方法は当該分野で公知である。Liら、「Aequorea victoriaの緑色蛍光タンパク質の欠失により、蛍光に必要な最小ドメインを定義する」、J.Biol.Chem.、272、28545-28549、1997。
【００７０】
あるいは、ＧＦＰ様発色団を、天然に見出される発色団から改良したＧＦＰ様発色団から選択することができる。典型的には、このような改変は、異種発現系（タンパク質配列の変異を有する、または有しない）における組換え産生を改良するため、天然タンパク質の励起および／または発光スペクトルを変化させるため、精製を容易にするため、クローニングを容易にするため、もしくはクローニングの結果なされ、または研究調査の偶然の結果である。
【００７１】
このような改変ＦＧＰ様発色団の操作方法および蛍光活性（単独およびタンパク質融合の一部の両方）についてのその試験方法は当該分野で周知である。これらの研究の初期の結果は、Heimら、Curr.Biol.、6、178-182、1996（その全体が本明細書中で参考として組み込まれる）で概説されており、有用な変異を表にしたさらに最近の概説は、Palmら、「緑色蛍光タンパク質のスペクトルの変異体」、Green Fluorescent Proteins、Conn編、Methods Enzymol.、第302巻、378-394、1999（その全体が本明細書中で参考として組み込まれる）に見出される。種々のこのような改変発色団は、現在市販されており、本発明の融合タンパク質として容易に使用することができる。
【００７２】
例えば、ＥＧＦＰ（「増強ＧＦＰ」）(Cormackら、Gene、173、33-38、1996;米国特許第6,090,919号、および同第5,804,387号)は、より高い輝度、哺乳動物細胞中でのより高い発現、およびフローサイトメーター用に至適化された励起スペクトルのために操作された赤方偏移ヒトコドン最適化ＧＦＰ変異体である。ＥＧＦＰにより、ＧＦＰ様発色団は本発明の融合タンパク質に有用に寄与することができる。種々のＥＧＦＰベクター（プラスミドおよびウイルスプラスミドの両方）（細菌発現用ベクター、Ｎ末端タンパク質融合発現用のベクター、Ｃ末端タンパク質融合用のベクター、およびバイシストロン性発現用ベクターを含む）は、市販されている(Clontech Labs、Palo Alto、CA、USA)。
【００７３】
発光スペクトルの他の末端に向かって、ＥＢＦＰ（「増強青色蛍光タンパク質」）およびＢＦＰ２は、発光が緑色から青色にシフトし、蛍光の輝度が増強され、タンパク質の溶解度が改良された４つのアミノ酸置換を含む(Heimら、Curr.Biol.、6、178-182、1996;Cormackら、Gene、173、33-38、1996)。ＥＢＦＰを哺乳動物細胞中での発現用に至適化し、元のクラゲコドンを保持するＢＦＰ２を細菌中で発現することができ、以下でさらに考察するように、産生宿主細胞は得られた融合タンパク質の有用性に影響を与えない。ＥＢＦＰおよびＢＦＰ２由来のＧＦＰ様発色団を、本発明の融合タンパク質に有用に含めることができ、これらの青色シフト変異体を含むベクターは、Clontech Labsから市販されている(Palo Alto、CA、USA)。
【００７４】
同様に、ＥＹＦＰ（「増強黄色蛍光タンパク質」）もまたClontech Labsから市販されており、発光スペクトルが緑色から黄緑色にシフトするＥＢＦＰと異なる４つのアミノ酸置換を含む(Ormoら、Science、273、1392-1395、1996)。シトリン（改良された黄色蛍光タンパク質変異体）は、Heikalら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、97、11996-12001、2000に記載されている。ＥＣＦＰ（「増強シアン蛍光タンパク質」）(Clontech Labs、Palo Alto、CA、USA)は、６つのアミノ酸置換を含み、その１つは発光スペクトルが緑色からシアンにシフトしている(Heimら、Curr.Biol.、6、178-182、1996;Miyawakiら、Nature、388、882-887、1997)。これらの各ＧＦＰ変異体のＧＦＰ様発色団を、本発明の融合タンパク質に有用に含めることができる。
【００７５】
ＧＦＰ様発色団を、米国特許第6,124,128号、同第6,096,865号、同第6,090,919号、同第6,066,476号、同第6,054,321号、同第6,027,881号、同第5,968,750号、同第5,874,304号、5,804,387号、同第5,777,079号、同第5,741,668号、および同第5,625,048号（その開示全体が本明細書中で参考として組み込まれる）に記載のＧＦＰを含む他の改変ＧＦＰから得ることもできる。
【００７６】
本発明の融合タンパク質は、さらに、少なくとも１つの多量体化ドメインを含む。複数の多量体化ドメインが存在する場合、ドメインは互いに同一である必要はない。多量体化ドメインは、ホモ多量体化またはヘテロ多量体化のいずれに影響を与えるように作用することができ、各サブユニットの非共有結合または共有結合に寄与することができる。
【００７７】
例えば、多量体化ドメインは、Dal Portoら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、90、6671-6675、1993;Gretenら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、95、7568-7573、1998;Hamadら、J.Exp.Med.、188、1633-1640、1998;Schneckら、米国特許第6,015,884号、および同第6,140,113号（その開示全体が本明細書中で参考として組み込まれる）にさらに記載の現存の自己二量体化ＭＨＣ／Ｉｇキメラから有用に得ることができる。これらのキメラの多量体化部分は、ジスルフィド結合ホモ二量体化が可能なＩｇＧ  Ｆｃ領域を含む。
【００７８】
他のタンパク質多量体化ドメインは周知であり、例えばロイシンジッパードメインが含まれる。
【００７９】
多量体化ドメインを、ＧＦＰ様発色団を備える同一のタンパク質から有用に得ることもできる。
【００８０】
ＤｓＲｅｄは、希釈溶液中でさえも必須の四量体として存在し、タンパク質の変性（不都合であり、好ましくない切断の原因になると当該分野で考えられている性質）を起こさない単量体化は確認されていない(Grossら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、97、11990-11995、2000;Wallら、Nature Structural Biol.、7、1133-1138、2000)。本発明では、この不都合な性質は、驚いたことに有用であり、ＤｓＲｅｄにより、本発明の融合タンパク質にＧＦＰ様発色団および多量体化ドメインが提供され、このような多量体化ドメインにより、本発明の融合タンパク質は、公知のＭＨＣ四量体の四価、すなわち親和力性を有するＭＨＣ／ペプチド複合体に容易に構築される。
【００８１】
ＤｓＲｅｄは、２つの異なる多量体化ドメイン（両方ともその四量体化に必要なようである）を含む。小さいほうのドメインは多数の高親和性のタンパク質−タンパク質相互作用における表面の典型的な特徴を示し、おそらく、ホモオリゴマー相互作用(homooligomeric interaction)に特異的に調整されている。大きいほうの境界は、化学的特徴が劇的に異なり、基質特異性のより広い調整が必要と考えられるオリゴマー化境界（origomerization interfaces）で認められる特徴を有する。
【００８２】
ＤｓＲｅｄの２つの多量体化ドメインを、天然のＤｓＲｅｄ  ＧＦＰ様発色団と共に本発明の融合タンパク質で有利に使用して、約５５８ｎｍの励起（吸収）極大、約５８３ｎｍの発光極大、光脱色への強力な耐性、および天然のＤｓＲｅｄタンパク質の強力なｐＨ依存性を得ることができる。
【００８３】
あるいは、天然のＤｓＲｅｄ発色団から、改変したＧＦＰ様発色団と共にＤｓＲｅｄの多量体化ドメインを使用することができる。例えば、緑色のみのＤｓＲｅｄ変異体Ｋ３８Ｒ(Bairdら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、97、11984-11989、2000によるナンバリングによる残基８３でのリジンからアルギニンへの置換）は、赤色蛍光に成熟することができないが四量体化するので、天然のＤｓＲｅｄフルオロフォアを使用した融合から構成された四量体の発光スペクトルと容易に区別可能な発光スペクトルを有する四量体が提供され、本発明の融合タンパク質での有用性が証明される。それに対して、ＤｓＲｅｄ変異体Ｋ８３Ｍは、比較的小さな残存緑色蛍光を有する６０２ｎｍの発光極大を有するので(Bairdら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、97、11984-11989、2000)、緑色および黄色発光フルオロフォアからさらにスペクトルを分離される。本質的にBairdら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、97、11984-11989、2000に記載のように、他のＤｓＲｅｄ発色団の変異体を、スペクトルおよびオリゴマー化の特徴について容易に作製、発現、およびスクリーニングすることができる。
【００８４】
さらに、ＤｓＲｅｄがＧＦＰと２２％しか配列が同一でないにもかかわらず、発色団の全構造は、これらの異なるホモログ間で非常に保存されている。したがって、A.victoria GFPおよびその多数の公知の変異体由来の発色団（を含むＥＧＦＰ、ＥＹＦＰ、ＥＢＦＰ、およびシトリンを含む）をＤｓＲｅｄ発色団に置換して、タンパク質のスペクトル特性を変化させながらＤｓＲｅｄ多量体化ドメインを維持することができる。ＤｓＲｅｄ発色団に隣接する既存のＤｓＲｅｄベクター制限部位であって、他のＧＦＰ様発色団をコードする配列を含むカセットによるＤｅＲｅｄ  ＧＦＰ様発色団の切り出しおよびインフレームでの置換に適切な制限部位の操作によってこれを有利に行うことができる。
【００８５】
したがって、このようなＤｓＲｅｄ／ＧＦＰキメラは、本発明の融合タンパク質への封入に適切であり、この封入に有利に使用することができる。以下でさらに考察するように、ＤｓＲｅｄ多量体化部分および異なるＧＦＰ様発色団を有する本発明の融合タンパク質を、蛍光共鳴エネルギー移動（「ＦＲＥＴ」）反応において各発色団がドナーおよびアクセプターを認識するヘテロ四量体に構築することができる。
【００８６】
ＤｓＲｅｄまたはA.victoria GFPの蛍光タンパク質ホモログによって、多量体化ドメインを得ることもできる。
【００８７】
例えば、Renilla reniformisのＧＦＰは、必須の二量体であると考えられている。Ward、「緑色蛍光タンパク質：性質、適用、およびプロトコール」、Chalfie & Kain編(Wiley、New York、1998)。Renilla GFP多量体形成ドメインは、本発明の融合タンパク質において有用に使用することができ、既存のＭＨＣ／Ｉｇキメラの二価、すなわち親和力性を有する複合体を自己構築させることができる。
【００８８】
さらに、Wallら、Nature Structural Biol.、7、1133-1138、2000では、オリゴマー化はＤｓＲｅｄ様蛍光タンパク質(FP593、FP483、FP484、FP595、FP486、FP538、およびFP506など)の一般的性質なようであると報告されている。したがって、これらの各蛍光タンパク質により、１つまたは複数の多量体形成ドメインが本発明の融合タンパク質に寄与する。ＤｓＲｅｄ多量体化ドメインの使用と同様に、本発明の融合タンパク質は、多量体化ドメインもしくはその変異体に寄与する蛍光タンパク質のＧＦＰ様発光団を含むことができ、また、別の類似の蛍光タンパク質もしくはその変異体のＧＦＰ様発色団を含むことができる。
【００８９】
本発明の融合タンパク質は、さらに、ＭＨＣペプチド提示部分を含む。
【００９０】
ＭＨＣペプチド提示部分は、Ｔ細胞受容体に対する抗原提示に関与することができるがそれ自体が抗原提示に十分ではない主要組織適合複合体タンパク質鎖の可溶性部分である。
【００９１】
ＭＨＣペプチド提示部分は、ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスII、または非古典的ＭＨＣ分子に由来し得る。
【００９２】
クラスＩに由来する場合、ＭＨＣペプチド提示部分はＭＨＣクラスＩα鎖に由来し、α１、α２、およびα３ドメインを含み、許容可能な欠失または置換は、α３ドメインがドメイン内ジスルフィド結合を形成する能力、またはα１およびα２ドメインがペプチドに結合するために適切に存在するαヘリックスを形成する能力を干渉することができない。
【００９３】
クラスIIに由来する場合、本発明の融合タンパク質のＭＨＣペプチド提示部分はＭＨＣクラスIIαまたはβ鎖のいずれかに由来し、クラスII型抗原特異的Ｔ細胞の標識に有用な本発明の多量体複合体は、クラスIIαおよびクラスIIβ由来のＭＨＣペプチド提示部分を有する両融合タンパク質を含む。
【００９４】
クラスIIα鎖に由来する場合、本発明の融合タンパク質のＭＨＣペプチド提示部分はα１およびα２ドメインを含み、許容可能な欠失または置換は、α２ドメインが鎖内ジスルフィド結合を形成する能力、またはα１ドメインがペプチド結合αヘリックスを形成する能力を干渉してはならない。クラスIIβに由来する場合、本発明の融合タンパク質のＭＨＣペプチド提示部分は、β１およびβ２ドメインを含み、許容可能な欠失または置換は、β２ドメインが鎖内ジスルフィド結合を形成する能力、またはβ１ドメインのペプチド結合αヘリックスを形成する能力を干渉してはならない。
【００９５】
非古典的ＭＨＣ分子に由来する場合、含まれるべきドメインは分子が古典的クラスＩまたはクラスIIＭＨＣ分子に対してより大きな配列相同性を有するかどうかに依存する。
【００９６】
ＭＨＣペプチド提示部分は、その各親ＭＨＣ分子の膜貫通領域を欠き、典型的には、ＭＨＣペプチド提示部分は、各ＭＨＣ分子の細胞質領域を欠く。
【００９７】
本発明の融合タンパク質のＭＨＣペプチド提示部分は、任意の哺乳動物または鳥類のＭＨＣ分子に由来し得る。抗原特異的Ｔ細胞の標識のための多量体複合体の使用のために、ＭＨＣペプチド提示部分は、Ｔ細胞が検出される種のＭＨＣ分子から有利に得られる。
【００９８】
したがって、本発明の融合タンパク質のＭＨＣペプチド提示部分は、ヒトおよび他の霊長類のＭＨＣ分子、げっ歯類（特に、マウス、ラット、ハムスター、モルモット）のＭＨＣ、ウサギ、ウシ、イヌ、ネコ、およびウマのＭＨＣに有利に由来し得る。したがって、本発明の融合タンパク質のＭＨＣペプチド提示部分は、ヒトクラスIIサブユニット（ＨＬＡ−ＤＰα、ＨＬＡ−ＤＰβ、ＨＬＡ−ＤＱα、ＨＬＡ−ＤＱβ、ＨＬＡ−ＤＲα、およびＨＬＡ−ＤＲβ）、ヒトクラスＩサブユニット（ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ）、マウスクラスＩＩサブユニット（Ｉ−Ａα、Ｉ−Ａβ、ＩＥ−α、ＩＥ−β）、およびマウスクラスＩサブユニット（Ｈ−２Ｋ、Ｈ−２Ｄ、およびＨ−２Ｌ）から有用に得ることができる。
【００９９】
本発明の融合タンパク質のＭＨＣペプチド提示部分は、ＭＨＣ四量体のＭＨＣ由来部分に実質的に同一であり、同一であることができ、これは、Dohertyら、Annu.Rev.Immunol.、18、561-92、2000;Oggら、Immunol.Lett.、66(1-3)、77-80、1999;Mainiら、Immunol.Today、20(6)、262-6、1999;Doherty、Curr.Opin.Microbiol.、1(4)、419-22、1998;Reichstetterら、J.Immunol.、165(12)、6994-8、2000;Kwokら、J.Immunol.、164(8)、4244-9、2000;Liuら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、97(26)、14596-14601、2000;Novakら、J.Clin.Invest.、104(12)、R63-7、1999;Crawfordら、Immunity、8、675-682、1998;Kozonoら、Nature、369、151-154、1994;Altmanら、Science、274、94、1996;Altmanら、米国特許第5,635,363号にさらに記載されている。
【０１００】
本発明の融合タンパク質のＭＨＣペプチド提示部分は、ＭＨＣ／ＩｇキメラのＭＨＣ由来部分に実質的に同一であり、同一であることができ、これは、Dal Portoら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、90、6671-6675、1993;Gretenら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、95、7568-7573、1998;Hamadら、J.Exp.Med.、188、1633-1640、1998;Schneckら、米国特許第6,015,884号、および同第6,140,113号（その開示全体が本明細書中で参考として組み込まれる）にさらに記載されている。
【０１０１】
ＭＨＣペプチド提示部分に寄与することができる他のＭＨＣ分子は、「免疫学的目的のタンパク質配列」、Kabatら編、第５版、米国健康福祉省、公衆衛生部、国立衛生研究所、1991（その開示全体が本明細書中で参考として組み込まれる）、免疫学的目的のタンパク質配列のKabatデータベース(http://immuno.bme.nwu.edu/)で見出すことができ、さらに、Johnsonら、Nucl.Acids Res.、29、205-206、2001に記載されている。
【０１０２】
典型的であるが、不変ではなく、ＭＨＣペプチド提示部分は、本発明の融合タンパク質のＧＦＰ様発色団および多量体化ドメインの両方のＮ末端に存在する。同様に、発色団および多量体化ドメインの相対的位置は、大部分がその供給源に依存する。
【０１０３】
例えば、既存のＭＨＣ／Ｉｇキメラから多量体化ドメイン（およびおそらくＭＨＣペプチド提示部分も）が得られる場合、ＧＦＰ様発色団を既存のＭＨＣ／ＩｇキメラのＣ末端に有利に融合する。別の例として、ＤｓＲｅｄなどの単一性タンパク質から得られる場合、関連する位置を、天然タンパク質のその相対的位置によって決定する。多量体化ドメインおよびＧＦＰ様発色団の相対的位置付けはまた、クローニング検討材料（十分に分子生物学分野の当業者の知識内である解決法）に依存し得る。
【０１０４】
好ましい実施形態では、本発明の融合タンパク質は、Ｎ末端からＣ末端に向けて、選択されたＭＨクラスＩαサブユニットから得た連続的なα１、α２、およびα３ドメイン、その後にインフレームでＧＦＰ様発色団および２つの異なる多量体化ドメインを提供する実質的に全てのＤｓＲｅｄを含む。この融合タンパク質は、溶液中で自発的に四量体化する。得られた四量体は、さらに標識することなく、β２ミクログロブリンとの複合体化およびペプチドの負荷後に、古典的クラスＩ  ＭＨＣ四量体およびクラスＩ  ＭＨＣ／Ｉｇキメラが有用であることが証明されている全ての用途で使用することができる。
【０１０５】
本発明の融合タンパク質はまた、ＭＨＣ提示部分のＮ末端、抗原ペプチド自体を有用に含むことができ、これは、ＭＨＣクラスIIβサブユニットペプチド提示部分を含む融合で特に有用である。Kozonoら、Nature、369、151-154、1994;Liuら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、97、14596-14601、2000（その全体が本明細書中で参考として組み込まれる）。
【０１０６】
融合タンパク質はまた、Ｎ末端またはＣ末端に精製に有用な配列を有利に含み得る。ＭＨＣペプチド提示部分に直接隣接して存在する場合、この融合タグは、選択的に除去可能であることが好ましい。
【０１０７】
例えば、融合タンパク質は、例えば、NiNTA樹脂(Qiagen Inc.、Valencia、CA、USA)またはTALON(商標)樹脂（コバルト固定アフィニティークロマトグラフィー担体、Clontech Labs、Palo Alto、CA、USA)を使用した固定金属アフィニティークロマトグラフィーによって精製可能なポリヒスチジンタグを含み得る。別の例として、融合タンパク質は、融合タグの自己除去を使用したキチンベースの精製が可能なキチン結合タグおよび自己切り出しインテイン(IMPACT(商標)、System New England Biolabs,Inc.、Beverley、MA、USA)を含み得る。あるいは、融合タンパク質は、カルモジュリンアフィニティー樹脂(Stratagene、La Jolla、CA、USA)による精製が可能なカルモジュリン結合ペプチドタグまたはアビジン樹脂およびその後のタグ除去を使用したインビボでのビオチン化タンパク質の精製が可能なビオチンカルボキシラーゼキャリアタンパク質の特異的に切り出し可能なフラグメント(Promega、Madison、WI、USA)を含み得る。
【０１０８】
別の実施形態では、融合タンパク質はまた、ＭＨＣ提示部分と任意のＧＦＰ様発色団と多量体化ドメインとの間をインフレームで融合したタンパク質スペーサーを有利に含むことができ、スペーサーにより、融合タンパク質のＭＨＣ提示部分と他の成分との間に可動性結合が得られる。リンカー配列は、１回または複数回のこの配列のタンデム反復として出現し得る。ＭＨＣ提示部分とＤｓＲｅｄとの間に可動性結合が得られる適切なアミノ酸配列および融合構築物へのこのようなスペーサーの挿入技術は、当業者の知識の範囲内である。
【０１０９】
＜核酸、ベクター、および宿主細胞＞
本発明の融合タンパク質は、典型的には、宿主細胞における組換え発現によって産生される。したがって、さらなる態様では、本発明は、上記融合タンパク質をコードする核酸、核酸を含むベクター、宿主細胞中で融合タンパク質を発現するためのベクター、本発明の融合タンパク質を発現することができるエピソームベクターまたは組み込みベクターを含む宿主細胞、および１つまたは複数の内部細胞区画中で本発明の融合タンパク質を含む宿主細胞を含む。
【０１１０】
本発明の核酸は、融合タンパク質をコードする、または融合タンパク質をコードする配列に配列中で相補的な配列を含む。核酸（またはその各相補物）は、１つの読み取り枠として融合タンパク質をコードすることができる、または、コード核酸が融合タンパク質の真核細胞での発現で使用される場合には、介在イントロンを含む複数のエクソンとして融合タンパク質をコードすることができる。
【０１１１】
本発明の核酸は、ＤＮＡの形態（典型的に、しかし不変ではなく、二本鎖ではない）またはＲＮＡの形態であり得る。ＤＮＡが複数のエクソンとしての融合タンパク質をコードする場合、ＲＮＡ転写物は、イントロンを含む非スプライシング形態および１つまたは複数のスプライシング形態の両方で存在することができる。本発明の核酸はまた、典型的には、核酸を融合タンパク質の発現よりもプローブとして使用する場合、非天然ヌクレオチドもしくは別のヌクレオチド間の連結またはその両方を含み得る。図１１および図１３に示すように、プローブは、核酸の宿主細胞へのトランスフェクションおよびその転写の確認に有用であるが、蛍光発光自体がトランスフェクションおよび発現効率の基準として使用することもできる。
【０１１２】
本発明の核酸を、種々の型の宿主細胞における発現用に至適化されたコドンを使用するように操作して、同一の融合タンパク質をコードする異なる核酸配列の核酸分子を得ることができる。本発明の核酸は単離および精製形態であり（例えば、精製プラスミド調製物の形態）、１つまたは複数の原核または真核宿主細胞の染色体に組み込まれた核酸の形態でもあり得る。
【０１１３】
以下の実施例でさらに示されるように、通常、本発明の核酸を、１つまたは複数の型の真核および原核宿主細胞〔哺乳動物細胞（特に、ヒトおよびげっ歯類細胞）、昆虫細胞、酵母細胞、および細菌細胞（特に、大腸菌細胞）を含む〕中で本発明の核酸を増殖および増可能なベクターに組み込んで、プローブ構築、さらなる組換え操作（変異誘発など）、およびさらなるベクターへのクローニングのための核酸を得ることができる。
【０１１４】
本発明のベクターは、プラスミド、ウイルス、またはその組み合わせもしくは変異体（例えば、ファージミド、コスミド）であるか、人工染色体（例えば、ＢＡＣ、ＹＡＣ、ＨＡＣ）であるか、当該分野で公知の任意の他のクローニングベクター型および／または発現ベクター型であり得る。
【０１１５】
特に、Sambrookら、「分子クローニング：実験マニュアル」、第３版、Cold Spring Harbor Laboratory Press、2000;Ausubelら編、「分子生物学ショートプロトコール：現在の分子生物学プロトコールの方法の概論」、第４版、John Wiley & Sons、1999;Jonesら編、「ベクター：クローニング法：基本的技術」(基本技術シリーズ)、John Wiley & Son Ltd.、1998;Cid-Arreguiら編、「ウイルスベクター：基礎科学および遺伝子治療」、Eaton Publishing Company/Bio Techniques Books Division、2000（その開示全体が本明細書中で参考として組み込まれる）に記載のように、当該分野で周知の技術を使用して、ベクターを新規で構築することができる。
【０１１６】
あるいは、本発明のベクターを、ＤｓＲｅｄおよび／または他の蛍光タンパク質（ＭＨＣ四量体）および／またはＭＨＣ／Ｉｇキメラの増殖および／または発現に現在使用されているベクターの関連部分から有用かつ有利に改変するかこの部分を含むことができる。
【０１１７】
例えば、本発明のベクター構築の出発材料として有用な種々のＤｓＲｅｄベクターは、Clontech Labs(Palo Alto、CA、USA)から市販されている。ｐＤｓＲｅｄベクターは、マルチクローニング部位に隣接した天然のＤｓＲｅｄ配列を含む原核発現ベクターであり、ＤｓＲｅｄクローニング配列を、制限消化で切り出すか、ＰＣＲ増幅によって回収することができる。ｐＤｓＲｅｄ１−１は、哺乳動物細胞での発現を至適化するために第２位にサイレントに変化する１４４個のバリン挿入が挿入されたＤｓＲｅｄ変異体をコードする。ｐＤｓＲｅｄ１−Ｎ１は、ＤｓＲｅｄのＮ末端に哺乳動物発現を容易に融合可能であり、ｐＤｓＲｅｄ１−Ｃ１は、ＤｓＲｅｄのＣ末端に哺乳動物発現を容易に融合可能である。
【０１１８】
例えば、本発明のベクターの構築用の出発材料として有用なＭＨＣ四量体発現ベクターは、Dohertyら、Annu.Rev.Immunol.、18、561-92、2000;Oggら、Immunol.Lett.、66(1-3)、77-80、1999;Mainiら、Immunol.Today、20(6)、262-6、1999;Doherty、Curr.Opin.Microbiol.、1(4)、419-22、1998;Reichstetterら、J.Immunol.、165(12)、6994-8、2000;Kwokら、J.Immunol.、164(8)、4244-9、2000;Liuら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、97(26)、14596-14601、2000;Novakら、J.Clin.Invest.、104(12)、R63-7、1999;Crawfordら、Immunity、8、675-682、1998;Kozonoら、Nature、369、151-154、1994;Altmanら、Science、274、94、1996;Altmanら、米国特許第5,635,363号（その開示全体が本明細書中で参考として組み込まれる）に記載されている。
【０１１９】
本発明のベクターの構築用の出発材料として有用なＭＨＣ／Ｉｇキメラ発現ベクターは、Dal Portoら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、90、6671-6675、1993;Gretenら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、95、7568-7573、1998;Hamadら、J.Exp.Med.、188、1633-1640、1998;Schneckら、米国特許第6,015,884号、および同第6,140,113号（その開示全体が本明細書中で参考として組み込まれる）にさらに記載されている。
【０１２０】
本発明のベクターのうちで特に有用なベクターは、宿主細胞における本発明の融合タンパク質の発現に使用することができるベクターである。発現ベクター構築の詳細は当該分野で周知であり、本明細書中に概説する必要はない。しかし、一般論として、本発明の発現ベクターには、宿主細胞内でエピソームにより複製されるベクターおよび宿主細胞ゲノムの１つまたは複数の位置に組み込まれたベクターが含まれ、ベクター由来の融合タンパク質の発現は構成性または誘導性であり、発現した融合タンパク質を細胞内に保持するか分泌することができる。
【０１２１】
本発明は、さらに、エピソームとしての、または宿主細胞染色体中の１つまたは複数の位置に組み込まれた本発明の核酸（典型的には、発現ベクターを含むベクター）を含む。組み込まれた場合、発現ベクターは、複数のコピー中に有用に存在し、コピー数の増加は、当該分野で周知の増幅技術に影響を受け得る（例えば、Axelら、米国特許第4,399,216号（その開示が本明細書中で参考として組み込まれる）を参照のこと）。宿主細胞が本発明の発現ベクターを含む場合、宿主細胞は、典型的には、１つまたは複数の細胞区画中に本発明の融合タンパク質をさらに含む。
【０１２２】
本発明の宿主細胞は、本発明の複数のベクター（発現ベクターを含む）を含むことができ、複数のベクターはそれぞれ複数の異なる融合タンパク質をコードするので、ヘテロマーの多量体の細胞内に発現される。さらに記載するように、このようなヘテロマー多量体は、同一のＭＨＣ抗原提示部分および多量体化ドメインを有するが異なるＧＦＰ様発色団を有する融合タンパク質を有用に含む。
【０１２３】
本発明の核酸増殖に有用な宿主細胞には、細菌細胞（特に、大腸菌細胞）および真核細胞が含まれる。
【０１２４】
本発明の融合タンパク質の組換え産生に有用な宿主細胞には、組換え発現に典型的に使用される全ての型の細胞が含まれ、これらには、原核細胞および真核細胞の両方を含み、後者には、ヒト、げっ歯類、昆虫、および酵母細胞が含まれる。
【０１２５】
Ｓｆ９およびＴｎｉ細胞などの昆虫細胞には、本発明の融合タンパク質発現で一定の利点が存在し、これらには、高収率であること（例えば、図１１および１３を参照のこと）およびおそらく合成中の発生段階の多量体に擬似的に負荷される外因性ペプチドの負荷が低いことが含まれる。げっ歯類骨髄腫細胞には、特に、融合タンパク質がＧＦＰ様発色団に融合したほとんどまたは全てのＩｇ／ＭＨＣキメラを含む場合に一定の利点が存在し、このような利点の顕著なものにはＩｇ軽鎖の同時産生である。
【０１２６】
発現すべき融合タンパク質がクラスＩＭＨＣ分子由来のＭＨＣペプチド提示部分を含む場合、本発明の宿主細胞はまた、β２ミクログロブリンを内因性または第２の組換え構築物の発現を介して有用かつ構成性に発現することができる。
【０１２７】
発現した融合タンパク質が細胞内環境で多量体化することができる場合、典型的には、宿主細胞はこのような多量体をさらに含む。
【０１２８】
＜多量体複合体＞
別の実施形態では、本発明は、複数のサブユニットとして本発明の融合タンパク質を含む多量体複合体を提供する。適切な可溶性タンパク質パートナー（例えば、クラスＩ  ＭＨＣペプチド提示部分を有する融合タンパク質のβ２ミクログロブリン）と適切に複合体化し、ペプチドが負荷された場合、これらの内因性蛍光多量体複合体を使用して、その抗原（およびＭＨＣ）特異性に基づいてＴリンパ球を標識することができる。
【０１２９】
その最も簡単な形態では、本発明の多量体複合体は、本発明の融合タンパク質の多量体を含み、前記複合体を（Ｆ）n（式中、Ｆは上記の融合タンパク質であり、ｎは１より大きい整数である）で表される４次式にする。
【０１３０】
多量体化は、融合タンパク質の多量体化ドメインによって駆動および媒介される。融合タンパク質サブユニットの多量体化ドメインがＤｓＲｅｄ、その変異体、または関連蛍光タンパク質から得られた場合、融合タンパク質サブユニットは、典型的には四量体（ｎ＝４）に優先的に構築され、弱く結合した八量体（ｎ＝８）の形態も可能である。融合タンパク質サブユニットの多量体化ドメインが代わりにRenilla GFPまたはＩｇＧ  Ｆｃ領域から得られた場合、融合タンパク質サブユニットは、典型的には、二量体（ｎ＝２）に優先的に構築される。
【０１３１】
融合タンパク質サブユニットがげっ歯類骨髄腫細胞または昆虫細胞などの真核細胞で発現される場合、融合タンパク質サブユニットは、典型的には、細胞内で予想される原子価の複合体を自己構築する。ＭＨＣ四量体分野で周知のように、融合タンパク質サブユニットが代わりに大腸菌などの原核細胞で発現される場合、サブユニットは、典型的には、変性（例えば、８Ｍ尿素）および復元後のみに構築される。
【０１３２】
得られた多量体複合体は、それぞれ関与するサブユニット中のＧＦＰ様発色団の存在により内因性蛍光性である。複合体のスペクトル量は、複合体中に存在する各ＧＦＰ様発色団のスペクトルの性質のみでなく、その集合的相互作用によっても予想される。
【０１３３】
ＧＦＰ様発色団における特に有意な相互作用は、蛍光共鳴エネルギー移動（「ＦＲＥＴ」）である。
【０１３４】
融合タンパク質サブユニットがその各多量体化ドメインを介して多量体化することができる限り、本発明の多量体複合体は、異なるＧＦＰ様発色団を有する融合タンパク質サブユニットを含み得る。典型的であるが、不変ではなく、このようなヘテロ多量体複合体の融合タンパク質サブユニットは全て同一のＭＨＣペプチド提示部分を有する。異なるＧＦＰ様発色団が適切なスペクトルの重複を有する場合、多量体複合体内のその近さおよび相対角変位により、異なるＧＦＰ様発色団間の蛍光共鳴エネルギー移動を得ることができる。
【０１３５】
例えば、ＤｓＲｅｄ発色団を増強緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）または黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）の変異体を使用した蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）対中のアクセプターとして使用することができることが公知である。Heikalら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、97、11996-12001、2000。さらに、天然のＤｓＲｅｄ四量体中の単量体間の蛍光共鳴エネルギー移動が報告されている。したがって、本発明の多量体複合体がＤｓＲｅｄ  ＧＦＰ様発色団を有する融合タンパク質サブユニットおよびＥＧＦＰ  ＧＦＰ様発色団を有する融合タンパク質サブユニットの両方を含む場合、複合体スペクトルの性質は、ＥＧＦＰとＤｓＲｅｄ発色団との間の蛍光共鳴エネルギー移動を反映し、ＤｓＲｅｄ発色団のみを有するホモ四量体を用いるよりもＥＧＦＰ吸収極大で複合体を容易に励起可能である。
【０１３６】
上記のように、蛍光共鳴エネルギー移動は、本発明の多量体複合体のサブユニット中に存在するＧＦＰ様発色団の間に起こり得る。ＦＲＥＴを、１つまたは複数の複合体のサブユニットのＧＦＰ様発色団とそれに会合したフルオロフォアとの間にさらに有用に確立することができる。
【０１３７】
ＦＲＥＴを補助するためにサブユニットへのフルオロフォアの結合、連結、もしくは付加またはサブユニットのフルオロフォアでの修飾によって多量体複合体のサブユニットにフルオロフォアを会合する技術は、当業者の知識の範囲内である。
【０１３８】
特異的ＧＦＰ様発色団型に関連するフルオロフォアの吸収および発光スペクトルに依存して、フルオロフォアまたはＧＦＰ様発色団のいずれかを、蛍光エネルギードナーまたはアクセプターとして使用することができる。
【０１３９】
１つまたは複数の本発明の多量体複合体のサブユニットに会合する場合のＦＲＥＴドナーまたはアクセプターとして有用なフルオロフォアには、シアニン３（例えば、Cy3、Cy3B）、シアニン５（例えば、Cy5、Cy5Q）、シアニン５．５、シアニン７（例えば、Cy7Q）、SYBR（登録商標）Green(Molecular Probes)、フルオレセインおよびフルオレセイン誘導体（例えば、６−カルボキシフルオレセイン）、ローダミンおよびローダミン誘導体（例えば、ジクロロローダミン、dR110、dR6G、dTAMRA、dROX）、アロフィコシアニンおよびアロフィコシアニン誘導体（例えば、GT5 APC）、Ｒ−フィコエリスリン、Ｂ−フィコエリスリン、Ｙ−フィコエリスリン、Ｒ−フィコシアニン、Ｃ−フィコシアニン、Texas Red（登録商標）、およびタンパク質性フルオロフォア（例えば、PerCP）が含まれる。
【０１４０】
好ましい実施形態によれば、ＧＦＰ様発色団をＦＲＥＴドナーとして使用し、フルオロフォアをＦＲＥＴアクセプターとして使用する。この様式では、適切な波長の刺激用光エネルギーはＧＦＰ様発色団によって吸収され、分子内でフルオロフォアに移行し、その後異なるより長い波長で蛍光エネルギーを発する。
【０１４１】
この組み合わせにより、蛍光発生率を有用に促進することができる。
【０１４２】
光刺激後のいくつかのＧＦＰ様発色団の蛍光の減衰速度は比較的遅い。例えば、活性化したＤｓＲｅｄ発色団は、長期間にわたる蛍光発光によりその基底状態まで減衰する。それに対して、ＤｓＲｅｄなどのＧＦＰ様発色団と会合したフルオロフォアとの間のＦＲＥＴによる分子内エネルギー移動が典型的にはナノ秒で起こる。結果として、フルオロフォアによる蛍光発光は、ＧＦＰ様発色団による蛍光発光より速くなり得る。蛍光エネルギー発生速度におけるこの相違の効果は、所定の短時間内でＦＲＥＴによりＧＦＰ様発色団に結合したフルオロフォアによる蛍光発光がより高く、より明るいシグナルが出現することである。それに対して、同一の時間内で、ＦＲＥＴおよびフルオロフォアによって補助されていないＧＦＰ様発色団による蛍光発光はより低く、小さなシグナルが出現する。
【０１４３】
上記のＦＲＥＴ媒介機構などによるＧＦＰ様発色団の蛍光発光速度は、特に、フローサイトメトリーを使用した場合に有利であり得る。フルオロフォアのＧＦＰ様発色団との会合による蛍光発光のＦＲＥＴ媒介促進はまた、シグナルを迅速に得るかシグナルを最大にしなければならない任意の他の適用で望ましい。
【０１４４】
一般に、複合体中に多量体化される融合タンパク質サブユニット中に含まれるべきＧＦＰ様発色団（および必要に応じて任意にＦＲＥＴドナーおよびそれに結合するアクセプター）を適切に選択することで、複合体のスペクトルの特徴が良好に調整可能である。このような調整の１つの重要な有用性は、分析装置（典型的にはフローサイトメーター）の励起および検出パラメータに対する複合体の吸収および発光特性に適合することである。逆に、以下でさらに考察するように、多量体複合体の吸収および発光特性に適合するレーザー、フィルターセット、および検出器を選択することができる。
【０１４５】
抗原特異的Ｔリンパ球の検出可能な標識のために、本発明の多量体複合体は、さらに、可溶性タンパク質パートナーおよびペプチドを含む。しかし、上記の（Ｆ）n複合体は、これらの標識試薬の調製における有用な中間体であり、この中間体の複合体への完全な形成を所望する末端消費者に有用に販売される。
【０１４６】
したがって、さらなる態様では、本発明は、複数のサブユニットを含む内因性蛍光多量体タンパク質複合体であって、（Ｆ1Ｓ1）n（式中、上記のように、Ｆは本発明の組換え融合タンパク質であり、Ｓは可溶性タンパク質であり、ｎは１より大きい整数である。）で表される前記複合体において、前記サブユニットが４次式を有する内因性蛍光多量体タンパク質複合体を含む。
【０１４７】
Ｓは、β２ミクログロブリン、クラスIIβＭＨＣペプチド提示可溶性誘導体、およびクラスIIαＭＨＣペプチド提示可溶性誘導体からなる群から選択され、ＦがクラスＩαＭＨＣペプチド提示部分を含む場合、Ｓはβ２ミクログロブリンであり、ＦがクラスIIαＭＨＣペプチド提示部分を含む場合、ＳはクラスIIβＭＨＣペプチド提示可溶性誘導体であり、ＦがクラスIIβＭＨＣペプチド提示部分を含む場合、ＳはクラスIIαＭＨＣペプチド提示可溶性誘導体である。
【０１４８】
典型的には、可溶性タンパク質は、複合体中の融合タンパク質のＭＨＣペプチド提示部分を提供するものと同一の分類学上の種に由来する。例えば、融合タンパク質がマウス由来のＭＨＣクラスＩαドメインを含む場合、多量体複合体で使用する可溶性β２ミクログロブリンは、マウスβ２ミクログロブリンである。例えば、融合タンパク質がヒトＨＬＡ−ＤＱαドメインを含む場合、複合体内に含まれるＭＨＣペプチド提示可溶性誘導体は、ＨＬＡ−ＤＱβドメインなどのヒトクラスIIβドメインを含む。
【０１４９】
可溶性タンパク質を、１つの宿主細胞中で融合タンパク質サブユニットと共に同時に発現させて細胞内で（Ｆ1Ｓ1）n複合体の自己構築を促進することができ、また、四次式Ｆnを有する先に構築された複合体に付加することができる。多量体複合体の融合タンパク質サブユニットがクラスII  ＭＨＣペプチド提示部分を含む場合、クラスII  ＭＨＣペプチド提示可溶性誘導体は、最も典型的には、特に融合タンパク質が真核細胞で発現する場合に同時発現され、多量体複合体の融合タンパク質サブユニットがクラスＩαＭＨＣペプチド提示部分を含む場合、β２ミクログロブリン可溶性タンパク質は同時発現されるか（Ｆ）n多量体の構築後に付加することができる。真核細胞でのβ２ミクログロブリンの同時発現は、組換え構築物由来の発現または宿主細胞の選択に依存する宿主細胞自体による内因性発現のいずれかに起因し得る。
【０１５０】
可溶性タンパク質で適切に構築された多量体複合体に、その後に特異的ペプチドを負荷して、その抗原特異性に基づいたＴリンパ球の検出可能な標識（および、他の方法では、活性化）に有用な内因性蛍光試薬を得ることができる。
【０１５１】
上記の複合体（すなわち、融合タンパク質および可溶性タンパク質サブユニットを含むがペプチド抗原を欠く）に、多数の種々のペプチド抗原を負荷し、各ペプチドが完成した標識試薬に対してその特異性を付与することができると理解される。したがって、上記の（Ｆ1Ｓ1）n複合体は標識試薬の調製に非常に有用であり、しばしば、本発明の内因性蛍光複合体は、末端消費者が選択されたペプチド抗原を複合体に負荷可能なような形態で末端消費者に有意に販売される。
【０１５２】
ペプチド抗原を負荷された多量体複合体は、そのＴ細胞受容体の抗原（およびＭＨＣ）特異性に基づいてＴリンパ球の直接的標識に有用である。したがって、別の態様では、本発明は、複数のサブユニットを含むＴリンパ球標識のための内因性蛍光多量体タンパク質複合体であって、（Ｆ1Ｓ1Ｐ1）n（式中、Ｆは上記のように本発明の組換え融合タンパク質であり、Ｓは、上記の可溶性タンパク質であり、Ｐはペプチド抗原であり、ｎは１より大きい整数である。）で表される前記複合体において、前記サブユニットが４次式を有する内因性蛍光多量体タンパク質複合体を提供する。
【０１５３】
ペプチド抗原は、ＭＨＣ四量体およびＭＨＣ／Ｉｇキメラの場合、本発明の多量体複合体のＭＨＣペプチド提示ドメインに結合し、クラスＩＭＨＣ内因性蛍光多量体では、融合タンパク質サブユニットのクラスＩαＭＨＣペプチド提示部分のα１およびα２ドメインに結合し、クラスII多量体では、複合体のＭＨＣペプチド提示部分および可溶性誘導体のα１およびβ１ドメインに結合する。
【０１５４】
本発明の複合体がクラスＩ多量体である場合、ペプチド抗原は、典型的には約５アミノ酸長ほどであり、より典型的には約６アミノ酸長ほどであり、より典型的には約７アミノ酸長ほどであり、しばしば約８または９アミノ酸長ほどであり、典型的には約１５アミノ酸長ほどであり、典型的には約１４アミノ酸長であり、より典型的には約１３、１２、または１１アミノ酸長ほどであり、しばしば約１０または９アミノ酸長ほどである。
【０１５５】
免疫分野で周知であるように、ＭＨＣクラスIIと複合体化した場合、抗原ペプチドはより長くなり得る。したがって、クラスII多量体の負荷のために、ペプチドは、典型的には約８アミノ酸長ほどであり、典型的には約９、１０、１１、または１２アミノ酸長ほどであり、典型的には約３０アミノ酸長ほどであり、典型的には約２５アミノ酸長ほどであり、典型的には約１９、１８、１７、または１６アミノ酸長であり、しばしば約１２アミノ酸長ほどである。上記のように、クラスII多量体のために、ペプチドをＭＨＣペプチド提示部分または可溶性誘導体のＮ末端に非共有結合よりもむしろ共有結合によって融合することができる(Kozonoら、Nature、369、151-154、1994;Liuら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、97、14596-14601、2000)。
【０１５６】
典型的には、ペプチドは実質的に純粋かつ均一な配列であり、例えば、化学合成およびその後の必要に応じて任意のさらなる精製（例えば、ＨＰＬＣによる）で有利に調製することができる。しかし、いくつかの用途では、ペプチド集団〔例えば、WO00/75180（その開示全体が本明細書中で参考として組み込まれる）に記載のＣＭＶに対するワクチン接種に有用なペプチド集団〕を使用して、本発明の内因性蛍光多量体を負荷することができる。この後者の場合、任意の負荷ペプチドを認識するＴリンパ球を集合的に標識する多量体集団を作製する。このような目的のために、ウイルスタンパク質などの天然のタンパク質のエンド型タンパク質消化によってペプチドを有利に作製することができる。
【０１５７】
ペプチドは、非天然アミノ酸および非天然結合を含むことができ、このような非天然アミノ酸および／または非天然結合は、内因性蛍光複合体のＴリンパ球を標識する能力を干渉しない。例えば、非天然アミノ酸および／または結合を使用して、このような非天然アミノ酸または結合を含むタンパク質またはペプチドでの免疫化に対するＴ細胞応答を評価する、または、非天然アミノ酸および／または結合がペプチドの三次元構造に影響を与えないその天然形態でペプチドに特異的なＴリンパ球を検出することができる。
【０１５８】
本発明の多量体複合体を真核細胞（特に、哺乳動物細胞）における組換え発現によって調製する場合、多量体は宿主細胞に対して内因性のペプチドを擬似的に含むことができる。昆虫細胞での発現は内因性ペプチド負荷の量を減少させるにもかかわらず、意図的な負荷の前に一定比率のペプチド結合部位で占められ得る。このような場合、多量体複合体のペプチド負荷は、ある程度のペプチドが交換される。３７℃などのより高い温度およびより高濃度の負荷ペプチドによって交換を促進することができる。負荷に使用するペプチド濃度が高い場合、実際に種々のペプチド濃度では、必要に応じて任意に負荷の完了後に透析を行って非結合ペプチド濃度を減少させることができる。
【０１５９】
負荷ペプチド配列を、標識試薬の使用によって予測する。例えば、ウイルス感染またはウイルスワクチン接種に対する抗原特異的ＣＤ８+Ｔ細胞応答を検出するために、ウイルスタンパク質由来のペプチド配列を使用してクラスＩ内因性蛍光多量体を負荷し、多発性硬化症に関連する自己免疫Ｔリンパ球の存在を検出するために、ミエリン塩基性タンパク質由来のペプチドを使用して、クラスＩまたはクラスII内因性蛍光多量体を負荷することができる。
【０１６０】
上記のように、ウイルス由来のペプチド〔ＨＩＶ（ヒト免疫不全ウイルス）、ＳＩＶ（サル免疫不全ウイルス）、ＣＭＶ（サイトメガロウイルス）、ＨＢＶ（Ｂ型肝炎ウイルス）、ＨＣＶ（Ｃ型肝炎ウイルス）、ＨＳＶ（単純ヘルペスウイルス）、ＥＢＶ（エプスタイン−バーウイルス）、およびＨＰＶ（ヒト乳頭種ウイルス）など〕が特に有用である。細菌ペプチド（ＴＢを含むマイコバクテリア由来のペプチド）もまた有用である。有利に使用される別のクラスのペプチドは、癌関連抗原、特に、潜在的な癌ワクチンで使用される癌抗原（特に、黒色腫、前立腺癌、および乳癌に対するワクチン）由来のペプチドである。
【０１６１】
本発明の多量体複合体で使用されるペプチドを、非ペプチド構造（炭水化物など）のその模倣性に基づいて選択することもできる(Luoら、J.Biol.Chem.、275(21)、16146-54、2000;Oら、Biochem.Biophys.Res.Commun.、5、268(1)、106-11、2000;Grothausら、Vaccine、8(13)、1253-63、2000;およびPhaliponら、Eur.J.Immunol.、27(10)、2620-5、1997)。
【０１６２】
ペプチドが会合した、または会合していない本発明の多量体複合体〔すなわち、四次式（Ｆ1Ｓ1）nまたは（Ｆ1Ｓ1Ｐ1）nのいずれか〕を、典型的には緩衝液、塩、および／または安定剤を含む水性組成物（例えば、ゼラチンおよび０．１％アジ化ナトリウムを含むリン酸緩衝化生理食塩水）として有用に得ることができるので、本発明の別の態様は、このような組成物を提供することである。あるいは、非水性凍結乾燥組成物として複合体を得ることができる。
【０１６３】
＜使用方法＞
一旦所与のペプチド抗原が負荷されると、本発明の内因性蛍光複合体は、多量体複合体の所与のペプチドおよびＭＨＣペプチド提示ドメインに特異的な抗原受容体を有するＴリンパ球に結合することができる。本発明の複合体のペプチド抗原およびＭＨＣペプチド提示ドメインを共に変化させることができるので、一般に、本発明の内因性蛍光多量体複合体を使用して、抗原受容体の抗原（およびＭＨＣ）特異性に基づいてほぼ無限の種々のＴリンパ球を蛍光標識することができる。
【０１６４】
したがって、本発明の別の態様は、抗原受容体の特異性に基づいてＴリンパ球を検出可能に標識（染色）するための本発明の多量体複合体の使用法を提供することである。
【０１６５】
第１の実施形態では、本方法は、本発明の内因性蛍光多量体複合体を標識すべきＴリンパ球に接触させる工程であって、内因性蛍光多量体複合体は、Ｔリンパ球の抗原受容体が特異的なペプチド抗原およびＭＨＣペプチド提示ドメインを有し、Ｔリンパ球への複合体の検出可能な結合に十分な時間および条件下で接触させる工程を含む。
【０１６６】
この文脈では、Ｔリンパ球がペプチド抗原に特異的であるとは、複合体のＭＨＣ環境におけるペプチド抗原に対するその抗原受容体（ＴＣＲ）の親和性が、リンパ球表面でのＴＣＲへの複合体の検出可能な結合に十分なＴリンパ球に対する完全な親和力を複合体へ付与するのに十分高い場合をいう。
【０１６７】
しばしば、Ｔリンパ球がこの定義によって特異的といわれるペプチド抗原は、Ｔリンパ球によるサイトカイン発現を刺激することもできるが、ＭＨＣ四量体に関しては本発明の多量体複合体の有用性が機能的応答性Ｔリンパ球の標識および同定に制限されないので、このような機能的応答は必要ない。さらに、この定義により、その表面上に１つのαβまたはγδ  ＴＣＲ種を有する１つのＴリンパ球は、複数の（典型的には、密接に関連する）ペプチド抗原に特異的ということは不可能ではない。この場合、典型的には、ＴＣＲは、他のものよりペプチドの１つに対して親和性を有する。
【０１６８】
このような標識に適切な条件および時間を、当該分野でＭＨＣ四量体またはＭＨＣ／Ｉｇ融合物でのＴリンパ球の染色で使用されるものから都合よく適合させることができる。
【０１６９】
例えば、Altmanら、Science、274、94-96、1996は、約０．５ｍｇ／ｍｌの四量体濃度での４℃で１時間のインキュベーションによって、ＭＨＣ四量体で200,000個の細胞傷害性リンパ球を染色しており、NIAID Tetramer facility(http://www.niaid.nih.gov/reposit/tetramer/genguide.htm)は、現在、ノイズ比に対するシグナルを至適化するためにそれぞれ４℃、室温、および３７℃で１５〜６０分間の染色（インキュベーション時間が長いほど温度を高くする）を推奨しており、Gretenら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、95、7568-7573、1998は、１×１０5個の末梢血単球を４℃で３μｇのＭＨＣクラスＩ  ＭＨＣ／Ｉｇキメラで染色している。
【０１７０】
したがって、４℃と３７℃との間の温度で１５〜６０分間のインキュベーションを使用した約１０4、１０5、１０6、またはさらに１０7個の末梢血単球の標識に少なくとも約０．１μｇ、典型的には少なくとも約０．２５μｇ、より典型的には少なくとも約１μｇ、２μｇ、３μｇ、４μｇ、またはさらに少なくとも約５μｇの多量体を使用した本発明の方法にて内因性蛍光多量体複合体でＴリンパ球を都合よく標識することができる。
【０１７１】
ＭＨＣ四量体、ＭＨＣ／Ｉｇ融合物、およびフルオロフォア結合抗体を使用したＴリンパ球標識についての当業者は、これらの広範な例示的ガイドラインから出発して、至適標識条件を容易に決定することができる。使用する多量体試薬の量、温度、および染色時間に影響を与える変数には、Ｔリンパ球に関連する変数〔複合体のペプチド抗原（およびＭＨＣ）に特異的なサンプル中のＴリンパ球数、細胞サンプルの形態｛例えば、全血、赤血球溶解後の全血、Ficoll精製末梢血単球（ＰＢＭＣ）画分｝〕および多量体複合体に関連する変数（標識複合体の化学量論および分子量、ペプチド抗原の同一性、ならびに複合体中に含まれるＭＨＣ対立遺伝子の選択を含む）が含まれる。
【０１７２】
標識条件を至適化するために、１種の多量体複合体および種々の標識条件（例えば、温度、持続時間、複合体濃度、細胞数、細胞濃度、細胞の純度）を使用して標識すべき細胞サンプルの並行アリコートを使用して標識反応を容易に行うことができる。ネガティブコントロールは、多量体を使用しないか、多量体を欠くペプチド、および／またはＭＨＣペプチド提示ドメインおよび／または細胞サンプル中でＴリンパ球によって認識されないペプチド抗原を使用した標識反応を含み得る。蛍光複合体を結合したサンプル中のＴリンパ球のフローサイトメトリーによる計数によって各アリコートについての標識の有効性を容易に決定することができる。フローサイトメトリー分野で周知であるように、フローサイトメトリー前に標識細胞を洗浄して、細胞および培地から非結合複合体を除去することができる。これら全ての至適化技術およびアプローチは日常的作業であり、フローサイトメトリー分野の当業者によって日常的に行う。
【０１７３】
典型的には、標識すべきＴリンパ球は、ヘテロロガスな細胞サンプル中に存在し、標識の目的は、この集団内の抗原特異的Ｔリンパ球を検出、しばしば計算することである。
【０１７４】
したがって、別の態様では、本発明は、細胞サンプル中で選択された抗原に特異的なＴリンパ球を検出する方法を提供する。本方法は、サンプル中での選択された抗原およびＭＨＣに特異的なＴリンパ球への複合体の検出可能な結合に十分な時間および条件下で、本発明の内因性蛍光多量体複合体にサンプルを接触させる工程であって、前記複合体のペプチド抗原は前記選択された抗原であり、前記複合体のＭＨＣ提示ドメインは、検出を所望するＴリンパ球が特異的であるＭＨＣ提示ドメインである工程と、その後、サンプル中の特異的Ｔリンパ球を、それに結合した複合体の蛍光によって検出する工程とを含む。
【０１７５】
典型的には、フローサイトメーター(FACSVantage(商標)、FACSVantage(商標)SE、またはFACSCalibur(商標)フローサイトメーター(Becton Dickinson Immunocytometry Systems、San Jose、CA、USA)など)を使用して細胞に結合した蛍光（cell-bound fluorescence）の検出を行う。励起用に選択したレーザーを、多量体複合体およびサンプル中での同時検出を所望するさらなるフルオロフォアの吸収スペクトルによって決定する。例えば、多量体複合体が天然のＤｓＲｅｄのスペクトルの特徴を有する（例えば、融合タンパク質サブユニット全てが天然のＤｓＲｅｄ様発色団を有する）場合、４８８ｎｍの標準的アルゴンイオンレーザーを励起に使用することができる。検出のために、フィルターセットおよび検出器の型を多量体複合体およびサンプル中での検出を所望するさらなるフルオロフォアの発光スペクトルによって選択する。例えば、多量体複合体が約５８３ｎｍの発光極大の天然のＤｓＲｅｄのスペクトルの特徴を有する場合、複合体からの蛍光発光を、ＰＥセットアップを使用したＦＬ２チャネルで検出することができる。
【０１７６】
あるいは、細胞結合複合体蛍光を、IMAGN2000(Becton Dickinson Immunocytometry Systems、San Jose、CA、USA)などの微量蛍光光度計を使用して検出することができる。血球の特性決定に対する微量蛍光分析の適用および条件は、特に、Seghatchianら、Transfus.Sci.、22(1-2)、77-9、2000;Glencrossら、Clin.Lab.Haematol.、21(6)、391-5、1999;およびReadら、J.Hematother.、6(4)、291-301、1997に記載されている。
【０１７７】
あるいは、細胞結合複合体蛍光を、レーザースキャニングサイトメーター(Compucyte Corp.、Cambridge、MA、USA)を使用して検出することができる。
【０１７８】
本質的にSkinnerら、「最先端：組織中の抗原特異的Ｔ細胞のインサイチュー四量体染色」、J.Immunol.、165(2)、613-7、2000に記載の条件を使用して、多量体複合体の、細胞に結合した蛍光を顕微鏡スライド上で直接検出することもできる。
【０１７９】
Ｔリンパ球含有サンプルは、全血サンプル、典型的には、抗凝固回収チューブに直接入れられた末梢静脈血検体（例えば、ＥＤＴＡ含有またはヘパリン含有Vacutainer（商標）チューブ、Beckton Dickinson Vacutainer System、Franklin Lakes、NJ、USA）であり得る。
【０１８０】
特に、Changら、米国特許第4,902,613号および同第4,654,312号に記載のように、有利には、Ｔリンパ球含有サンプルは、赤血球（ＲＢＣ）溶解剤での検出前に処理された全血サンプルでもあってよく、溶解剤は当該分野で周知であり、多数の販売者(FACS(商標)溶解溶液、Becton Dickinson Immunocytometry Systems、San Jose、CA、USA;Cal-Lyse(商標)溶解溶液、Caltag Labs、Burlingame、CA、USA;No-Wash溶解溶液、Beckman Coulter,Inc.、Fullerton、CA)から市販されている。必要に応じて任意に、ＲＢＣ溶解後および検出前にサンプルを洗浄することができる。
【０１８１】
本発明の方法によってＴリンパ球を検出することを所望するサンプルはまた、末梢血画分、有利には単球（ＰＢＭＣ）画分であり得る。ＰＢＭＣを、当該分野で周知の任意の受け入れられている技術(特に、Ficoll-Paque(Amersham Pharmacia Biotech、Piscataway、NJ、USA)などの密度培地による遠心分離および特にデザインされた細胞調製血液回収チューブ（例えば、Vacutainer（商標）ＣＰＴ（商標）細胞調製チューブ、Becton Dickinsohn、Franklin Lakes、NJ、USA)における直接遠心分離）によって調製することができる。
【０１８２】
本発明の方法よるＴリンパ球の検出を所望するサンプルはまた、有利には、Ｔリンパ球中で濃縮されたサンプルであり得る。例えば、サンプルは、培養リンパ球サンプル（クローン性細胞株またはマルチクローン培養由来）、リンパ球浸潤を有する組織から抽出または溶出したリンパ球サンプル（例えば、腫瘍生検から抽出し、必要に応じて任意に培養によって拡大した腫瘍浸潤リンパ球）、リンパ管もしくは胸腺から採取したリンパ球サンプル、または少なくとも第１回の蛍光標示式細胞分取後に得たリンパ球サンプルであり得る。
【０１８３】
別の実施形態では、本方法は、このようにして検出した抗原特異的Ｔリンパ球を計数する工程をさらに含む。計数を、全細胞数、アッセイした細胞中の抗原特異的Ｔリンパ球の比率（全部、単球、またはＴリンパ球）、またはＴ細胞サブセット中の抗原特異的リンパ球の比率で示すことができる。
【０１８４】
これらのいくつかの測定基準のために、全体としてのサンプル内のＴリンパ球の総数、または全体としてのサンプル内の特定のサブセットのＴリンパ球の総数をさらに定量する必要がある。
【０１８５】
したがって、他の実施形態では、本発明の方法は、サンプルを少なくとも１つのフルオロフォア結合抗体に接触させる工程であって、前記抗体がｐａｎ−Ｔ抗体およびＴ細胞セブセット抗体からなる群から選択される工程と、多量体蛍光複合体およびフルオロフォア結合抗体から蛍光を同時に検出する工程とをさらに含む。「ｐａｎ−Ｔ抗体」は、全てまたは実質的に全てのＴリンパ球上に存在する表面マーカーまたはエピトープを認識する抗体を意図する。「Ｔ細胞サブセット抗体」は、全てのＴリンパ球よりも少数のＴリンパ球上に存在する表面マーカーに結合する抗体を意味する。
【０１８６】
この実施形態で通常使用される抗体には、CD3、CD4、CD8、CD45RO、CD45RA、およびCD27に特異的な抗体が含まれる。理解されるように、抗体は、典型的にはＴリンパ球が検出されるか交差反応する分類学上の種（ヒト、マウス、ラットなど）によって発現されるマーカーに特異的である。
【０１８７】
フローサイトメトリー分野で周知なように、ｐａｎ−Ｔおよび／またはＴリンパ球サブセット抗体由来の蛍光発光を、データ獲得の誘発（triggering data acquisition）、生きたゲーティング（live gating）、またはデータ獲得前のゲーティング（gating prior-acquired data）のいずれかまたは全てに使用することができる。
【０１８８】
多数のサンプルにおいて、抗原特異的Ｔリンパ球は稀にしか生じないので、多数の事象を捕捉することが本発明の方法では有利な場合がある。さらに、Ｔリンパ球活性化抗原に特異的な抗体由来の蛍光の誘発またはゲーティングにより、このような稀な抗原特異的Ｔ細胞の検出のためにシグナル：ノイズ比を改良することが可能である。
【０１８９】
したがって、別の実施形態では、本方法は、Ｔ細胞活性化抗原に特異的な少なくとも１つのフルオロフォア結合抗体にサンプルを接触させる工程と、その後に、多量体蛍光複合体およびフルオロフォア結合抗体由来の蛍光を同時に検出する工程とをさらに含む。抗体は、通常、ＣＤ６９、ＣＤ２５、ＣＤ７１、およびＭＨＣクラスII（ヒトＴリンパ球、有利にはＨＬＡ−ＤＲの標識用）からなる群から選択される活性化抗原に特異的であり得る。
【０１９０】
有利には、本発明の方法のこれらの実施形態で使用される抗体は、フルオロフォア、典型的には内因性蛍光多量体Ｔ細胞標識複合体の発光およびこの方法で同時に使用される他のフルオロフォアの発光とフローサイトメトリーで区別可能なフルオロフォアに事前に直接結合されている。フルオロフォアを、通常、フルオレセインイソチオシアナート（ＦＩＴＣ）、フィコエリスリン（ＰＥ）、ペリジニンクロロフィルタンパク質（ＰｅｒＣＰ）、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）、Texas Red、Alexa Fluor488(Molecular Probes,Inc.、Eugene Or.)、およびタンデムフルオロフォアPerCP-Cy5.5、PE-Cy5、PE-Cy7、およびAPC-Cy7からなる群から選択することができる。抗体を、ビオチンに有用に結合して、フルオロフォア標識ストレプトアビジンを使用して第２ステージの検出を行うこともできる。
【０１９１】
本発明の抗原特異的Ｔリンパ球の検出および計数方法は、先行技術の方法と同一の抗原特異的Ｔリンパ球の検出および計数方法〔ＴＣＲの表面標識に基づく方法（ＭＨＣ四量体およびＭＨＣ／Ｉｇキメラの使用）、ならびに抗原特異的Ｔ細胞の機能的応答の検出に基づく方法｛限界希釈アッセイ、酵素結合免疫スポットアッセイ、および細胞内サイトカイン発現のフローサイトメトリー検出(Waldropら、J.Clin.Invest.、99(7)、1739-50、1997)｝を含む〕と同一の目的で使用することができる。したがって、本方法を使用して、例えば感染およびワクチンに対するＣＤ４+およびＣＤ８+Ｔ細胞応答および自己免疫性を評価することができる。
【０１９２】
使用される装置に依存して、抗原特異的Ｔリンパ球の検出を直接または間接的にその選別に連結することができるので、本発明の他の態様では、選択された抗原に特異的なＴリンパ球についてサンプルを濃縮および希釈する方法が提供される。
【０１９３】
一般に、これらの方法は、本発明の内因性蛍光多量体複合体をサンプルに接触させる工程であって、前記複合体の前記ペプチド抗原は前記選択された抗原であり、前記複合体の前記ＭＨＣ提示ドメインは濃縮または希釈を所望するＴリンパ球が特異的であるＭＨＣ提示ドメインであり、サンプル中での選択された抗原およびＭＨＣに特異的なＴリンパ球への複合体の検出可能な結合に十分な時間および条件下で接触させる工程とを含む。結合後、標識されたＴリンパ球を、結合した複合体の蛍光に基づいて濃縮または希釈する。
【０１９４】
このような方法は、蛍光標示式細胞分取器を使用して好適に行われる。少なくとも一部が本発明の多量体複合体由来の蛍光に基づく選別により、細胞が除去されるサンプルが直接希釈され、細胞が収納されるアリコートが濃縮される。
【０１９５】
しかし、本発明の多量体は、蛍光標示式細胞分取器以外のアプローチを使用した特定の抗原特異性のＴリンパ球中のサンプルの濃縮または希釈に使用することができる。
【０１９６】
例えば、多量体で特異的に染色したＴリンパ球を、蛍光分析よりもむしろＴＣＲ結合複合体の超常磁性粒子へのさらなる結合によって磁石的に分離することができる。例えば、磁性粒子に結合し、融合タンパク質のエピトープに特異的な抗体を使用してこれを行うことができる（例えば、ＤｓＲｅｄがＧＦＰ様発色団および／または多量体化ドメインに寄与する場合、抗体は、Clontech Labs、Palo Alto、CA、USAから市販されているＤｓＲｅｄ特異的抗体であり得る）。
【０１９７】
別の例として、多量体で特異的に染色したＴリンパ球を、蛍光よりもむしろＴＣＲ結合複合体のビオチンへのさらなる結合およびその後のアビジンアフィニティーマトリクスの使用によるビオチン／アビジン親和性相互作用を使用して分離することができる。融合タンパク質のエピトープに特異的なビオチン結合抗体を使用して、この多量体複合体へのさらなる標識を間接的に行うことができる。あるいは、多量体自体を複合体（典型的には、融合タンパク質）へのＢｉｒＡ基質ペプチドの化学的または酵素的操作によってビオチンに予め結合することができる。
【０１９８】
本発明の方法によって抗原特異的Ｔ細胞について濃縮したサンプルを、抗原特異的Ｔ細胞の抗原提示細胞、細胞傷害性標的（Ｂ細胞）、または免疫系の他の細胞エレメントとの特異的相互作用の研究にインビトロで使用することができる。本発明の方法によって抗原特異的Ｔ細胞について濃縮したサンプルを、このような相互作用を改変するためにインビトロで使用することもできる。例えば、Dal Portoら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、90、6671-6675、1993を参照のこと。
【０１９９】
本発明の方法によって抗原特異的Ｔ細胞において濃縮したサンプルを、腫瘍免疫療法などのインビボ治療診療（in vivo therapeutic intervention）に使用することもできる。例えば、Oelkeら、Clin.Cancer Res.、6(5)、1997-2005、2000を参照のこと。逆に、本発明の方法によって特定の抗原特異的Ｔ細胞について希釈したサンプルを、この抗原特異性を有するＴ細胞を含む血液画分の注入により疾患または病的状態を引き起こす患者に有利に投与することができる。
【０２００】
ペプチド特異的Ｔ細胞の蛍光検出への別の有用性として、本発明の多量体タンパク質複合体を有利に使用して、Ｔ細胞のペプチド抗原特異的ＭＨＣ依存性活性化を刺激することもできる。
【０２０１】
当該分野で公知のように、ペプチドが負荷された複数のＭＨＣ分子を含む複合体は、非複合化単量体ＭＨＣペプチドの組み合わせよりも、ＭＨＣ依存性機構によってペプチドに特異的に結合したＴ細胞の刺激について強力である。例えば、Stryhnら、「精製ペプチド／主要組織適合性クラスＩ複合体は、クラスＩ型Ｔ細胞ハイブリドーマよりも強力な刺激物質である」、Eur.J.Immunol.、24(6)、1404-9、1994年6月、Cochran J.R.ら、「化学的に定義されたＭＨＣクラスIIオリゴマーを使用して探索したＭＨＣ−ペプチド結合とＴ細胞活性化との間の関係」、Immunity、12(3)、241-50、2000年3月、およびPiccirillo C.A.、Shevach E.M.、「最先端：ＣＤ４＋ＣＤ２５＋免疫調節細胞によるＣＤ８＋Ｔ細胞活性化の制御」、J.Immunol.、167(3)、1137-40、2001年8月（各開示全体が本明細書中で参考として組み込まれる）を参照のこと。
【０２０２】
したがって、本発明の多量体複合体のＤｓＲｅｄサブユニット内に含まれる多量体化ドメインの相互作用によって形成されたＭＨＣペプチド提示部分の四量体は、ペプチドを負荷し、Ｔ細胞の混合集団とインキュベートすることができる。ＭＨＣ依存的にペプチドを特異的に結合することができるＴ細胞受容体を保有するＴ細胞の亜集団が活性化される。単量体、二量体、または三量体と比較してより強力な四量体により、低濃度のペプチド−ＭＨＣ複合体を使用してＴ細胞活性化が促進される。これにより、試薬のコストが減少し、高濃度の活性化ペプチド−ＭＨＣ複合体による擬似的活性化が減少する。あるいは、四量体のより高い効力により、ペプチドに対するより低い親和性で受容体を保有するＴ細胞亜集団の活性化が促進される。
【０２０３】
別の実施形態によれば、定義されたペプチド特異性を有するＴ細胞のクローン集団全てを、低濃度の四量体ペプチド−ＭＨＣ複合体を使用して活性化することができる。
【０２０４】
したがって、別の態様では、本発明は、活性化に十分な期間、ペプチドが結合した本発明の内因性蛍光自己多量体化多量体複合体をＴ細胞に接触させる工程を含む、ペプチド抗原特異的ＭＨＣ依存性Ｔ細胞の活性化方法を提供する。
【０２０５】
＜キット＞
本発明の多量体複合体組成物を、本発明の方法の実施を容易にするキットの形態で有用に得ることができる。したがって、別の態様では、本発明は、本発明の内因性蛍光多量体複合体を含むキットを提供する。
【０２０６】
１つの実施形態では、本発明のキットは、個別の成分として、本発明の内因性蛍光（Ｆ1Ｓ1）n多量体および抗原ペプチドを含む。上記のように、ペプチドの選択は、標識試薬が所望する特異性に依存する。
【０２０７】
いくつかの実施形態では、ネガティブコントロールである第２のペプチドを含むさらなる組成物が有用に含まれる。ネガティブコントロールペプチドが、キットの内因性蛍光（Ｆ1Ｓ1）n多量体の負荷に使用される場合、試験サンプル中の大部分のＴリンパ球を標識しないと以前に示された多量体複合体が得られ、従ってサンプル中の細胞への多量体の非特異的結合に起因し得るバックグラウンドの測定が得られる。
【０２０８】
他の実施形態では、キットは、少なくとも１つのｐａｎ−ＴまたはＴリンパ球サブセット抗体をさらに含む。上記のように、「ｐａｎ−Ｔ抗体」は、全てまたは実質的に全てのＴリンパ球上に存在する表面マーカーまたはエピトープを認識する抗体を意図する。「Ｔ細胞サブセット抗体」は、全てのＴリンパ球よりも少数のＴリンパ球上に存在する表面マーカーに結合する抗体を意図する。
【０２０９】
内因性蛍光多量体が予めペプチドを負荷されている場合、このようなキットは、典型的には、個別の成分として、多量体および少なくとも１つのｐａｎ−Ｔまたはサブセット抗体を含み、予めペプチドを負荷されることなく〔すなわち、（Ｆ1Ｓ1）n構造として〕内因性蛍光多量体が与えられる場合、キットは、通常、個別の成分として内因性蛍光多量体、ペプチド、および少なくとも１つのｐａｎ−Ｔまたはサブセット抗体を含む。
【０２１０】
このようなキットに通常含まれるｐａｎ−Ｔおよびサブセット抗体には、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ４５ＲＡ、およびＣＤ７に特異的なものが含まれる。理解されるように、これらの抗体は、典型的には、Ｔリンパ球が内因性蛍光多量体複合体によって認識される分類学上の種のＴリンパ球が発現する表面マーカー（例えば、マウスＭＨＣペプチド提示部分および可溶性誘導体を含むキット中の抗マウスＣＤ３抗体）に特異的である。
【０２１１】
他の実施形態では、キットは、Ｔ細胞活性化抗原に対する少なくとも１つの抗体を含む。このようなキット中に通常含まれるＴ細胞活性化抗原には、ＣＤ６９、ＣＤ２５、ＣＤ７１、およびヒトＴリンパ球の標識用のＨＬＡ−ＤＲに特異的なものが含まれる。このようなキットはまた、上記のｐａｎ−Ｔおよび／またはＴ細胞サブセット抗体を有利に含むことができる。
【０２１２】
抗体を含むキットでは、抗体は、通常、フルオロフォア、典型的には内因性蛍光多量体Ｔ細胞標識複合体の発光およびキットで使用される他のフルオロフォアの発光とフローサイトメトリーで区別可能なフルオロフォアに予め直接結合されている。フルオロフォアを、通常、フルオレセインイソチオシアナート(FITC)、フィコエリスリン(PE)、ペリジニンクロロフィルタンパク質(PerCP)、アロフィコシアニン(APC)、Texas Red、Alexa Fluor488(Molecular Probes,Inc.、Eugene Or.)、およびタンデムフルオロフォアPerCP-Cy5.5、PE-Cy5、PE-Cy7、およびAPC-Cy7からなる群から選択することができる。キット中の抗体をビオチンに有用に結合して、標識ストレプトアビジンを使用して第２ステージの検出を行うこともできる。
【０２１３】
抗体を含むキット実施形態には、通常、イソ型コントロール抗体も含まれ、周知のように、このようなイソ型コントロール抗体は、蛍光結合抗体と同一のイソ型であるが、バックグラウンド結合および蛍光の測定に適切な無関係の特異性を指向する抗体（ＫＬＨなど）である。
【０２１４】
特に、Changら、米国特許第4,902,613号および同第4,654,312号に記載のように、他のキット実施形態は、さらに、赤血球溶解剤を含む。溶解剤は当該分野で周知であり、多数の販売者（ＦＡＣＳ（商標）溶解溶液、Becton Dickinson Biosciences Immunocytometry Systems、San Jose、CA、USA;Cal-Lyse(商標)溶解溶液、Caltag Labs、Burlingame、CA、USA;No-Wash溶解溶液、Beckman Coulter,Inc.、Fullerton、CA)から市販されている。
【０２１５】
多数のキット実施形態は、さらに、多量体複合体での標識（染色）およびフローサイトメトリー分析のための装置を含む。
【０２１６】
他のキット実施形態は、さらに、ＤｅＲｅｄまたは抗体がフルオロフォアに結合する他のＧＦＰ様発色団を特異的に認識することができる抗体を含む。この様式では、間接的免疫蛍光技術を使用することができる。例えば、第１の工程では、ペプチドを保有する本発明の内因性蛍光多量体タンパク質複合体をＴ細胞とインキュベートして、ペプチドのＴ細胞受容体への特異的結合を行う。その後、第２の工程では、蛍光標識二次抗体を、抗体がＴ細胞に結合したＧＦＰ様発色団に結合するようにＴ細胞とインキュベートする。分析のために、二次抗体と会合したフルオロフォアを、典型的には、しかし不変ではなく、ＧＦＰ様発色団による蛍光発色の実質的な刺激を回避するように選択する適切な波長の光で刺激する。
【０２１７】
第３の工程で間接的免疫蛍光を行うこともできる。第２の工程に関しては、二次抗体を使用してＧＦＰ様発色団を結合するが、二次抗体自体はフルオロフォアに結合しない。むしろ、第３の工程では、二次抗体に特異的であり、かつ結合する蛍光標識した第３の抗体を添加する。分析中に、第３の抗体に結合したフルオロフォアを、適切な波長で刺激する。したがって、本発明のキットは、ＧＦＰ様発色団を認識する二次抗体および二次抗体を認識する蛍光標識された第３の抗体をさらに含むことができる。
【０２１８】
本明細書中で使用される、用語「抗体」は、完全な抗体（IgG、IgM、IgA、IgE、およびIgDクラスの抗体が含まれるが、これらに限定されない）および抗原特異的抗体フラグメント（Ｆａｂ、（Ｆａｂ’）2、ファージディスプレイ抗体（ｐｈＡｂ）、および一本鎖可変領域抗体（ｓｃＦｖ）が含まれるが、これらに限定されない）を含む。
【０２１９】
例示のために以下の実施例を示すが、これらに制限されるものではない。
【実施例１】
【０２２０】
［ＭＨＣ−ＤｓＲｅｄ融合タンパク質発現用の発現ベクターの構築］
標準的な分子生物学技術を使用して、Ｈ２−Ｌｄ  ｃＤＭＡからマウスＨ２−Ｌｄ  ＭＨＣクラスＩタンパク質の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）をコードするＤＮＡ配列を取り出し、酵素ＨｉｎｄIIIおよびＢａｍＨＩで消化したベクターｐＤｓＲｅｄ２−Ｎ１(BD Bioscience-Clontechカタログ番号6973-1)のマルチクローニング部位にライゲーションする。これにより、融合物のアミノ末端部分に配置されたＥＣＤのコード配列が、融合物のカルボキシ末端に配置されたＤｓＲｅｄ発色団のコード配列とインフレームで融合する。融合構築物の構築を、図１に示す。
【０２２１】
次いで、Ｈ２Ｌｄ−ＤｓＲｅｄ２融合構築物を、ｐＢＤ１０３１Ｓ１(PVL1393(カタログ番号21201P)から開発したBD Biosciences-Pharmingenベクター）のＮｄｅＩおよびＮｏｔＩ制限酵素にライゲーションする。ｐＢＤ１０３１Ｓ１ベクターは、細菌での融合構築物発現用のＴ７  ＲＮＡポリメラーゼプロモーターおよび種々の昆虫細胞株（Ｓｆ９およびＴｎｉ細胞を含む）での融合構築物発現用のバキュロウイルスポリヘドリンプロモーターを含む二重発現ベクターである。dSS-H2LdECD-DsRed-pBD1031S1と呼ばれる発現ベクターの概略および制限酵素地図を、図２に示す。
【０２２２】
ライゲーション反応の完了後、標準的な技術を使用して、ライゲーションＤＮＡを精製し、これを使用して大腸菌細菌を形質転換し、その後アンピシリンを含む寒天プレート上で一晩成長させて形質転換細胞を選択する。各ａｍｐ制限クローンを液体培地で成長させ、細菌のアリコートを取り出し、これからプラスミドＤＮＡを単離および精製する。
【０２２３】
プラスミドＤＮＡを、ＮｄｅＩおよびＮｏｔＩ制限酵素で二重に消化して、ベクター中のＬｄ−ＤｓＲｅｄインサートの存在について試験する。消化物を、０．７％アガロースゲルでの電気泳動で分離し、その後臭化エチジウム、他の蛍光ＤＮＡ染色剤で染色し、ＵＶ光で発光させ、ビデオスチールカメラを使用して撮影する。１．５ｋｂと推定されるインサートを含むプラスミドを、融合構築物インサートの存在を確認するための配列決定（以下を参照のこと）によるさらなる分析用に確保する。ＮｄｅＩ／ＮｏｔＩ消化によって放出された１．５ｋｂのインサートの７つのプラスミドクローンの存在を示すアガロースゲルの写真を、図３に示す。
【０２２４】
インサート陽性プラスミドクローンの同定後、標準的な技術を使用して、発現ベクターとＨ２Ｌｄ  ＥＣＤのＤＮＡ配列との間のＮｄｅＩ連結点を横切ってクローンを配列決定して、シグナルペプチド配列の非存在および正確なアミノ末端コード配列の存在を確認する。正確なアミノ末端コード配列を有するクローンの配列決定由来の自動化シークエンサーによる配列の軌跡を図４に示す。
【実施例２】
【０２２５】
［細菌でのＨ２Ｌｄ−ＤｓＲｅｄ融合タンパク質の発現］
標準的な技術を使用し、Ｈ２Ｌｄ−ＤｓＲｅｄ融合構築物発現ベクターの５つのクローンを使用して、ＩＰＴＧ誘導性Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼを含むコンピテント大腸菌細菌を形質転換する。アンピシリン−ＬＢプレート上で一晩の成長後、形質転換細胞クローンを取り出し、ＬＢ培地中で一晩の成長によって増殖させる。翌日、一晩の培養物を、ＩＰＴＧ（最終濃度１ｍＭ）を含む新鮮なＬＢ培地中、３７℃で２時間さらに成長させる。
【０２２６】
誘導培地由来の細菌サンプルを取り出し、ＳＤＳ含有緩衝液で溶解し、その後構成性タンパク質をＳＤＳ変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）によって分離する。電気泳動後、ゲルをクマシー染色で染色し、その後分離した染色タンパク質を可視光線で発光させ、目視分析のためにビデオスチールカメラで撮影する。
【０２２７】
図５に示すように、大腸菌の形質転換に使用する５つの各Ｈ２Ｌｄ−ＤｓＲｅｄ融合構築物発現ベクターにより、ＩＰＴＧでの誘導によって、Ｈ２Ｌｄ−ＤｓＲｅｄ融合タンパク質の推定分子量に適合する６０ｋＤのタンパク質が発現する。それに対して、ＩＰＴＧ誘導性ではないネガティブコントロールでは、誘導された６０ｋＤのバンドは存在しない（図５）。
【０２２８】
図６に示すように、ＩＰＴＧ依存性誘導の程度は、Ｈ２Ｌｄ−ＤｓＲｅｄ発現ベクターで形質転換された大腸菌株に依存し、「ＮｏｖａＢｌｕｅ」および「Ｏｒｉｇａｍｉ」株は、６０ｋＤタンパク質の強力なＩＰＴＧ誘導を示す。標準的な技術を使用して、抗ＤｓＲｅｄ抗体で染色したゲルのウェスタンブロット分析により、６０ｋＤバンドがＤｓＲｅｄタンパク質を含むことが確認される（データ示さず）。
【実施例３】
【０２２９】
［昆虫細胞でのＨ２Ｌｄ−ＤｓＲｅｄ融合タンパク質の発現］
BD BaculoGold（商標）線状化バキュロウイルスＤＮＡ技術データシート（その全体が本明細書中で参考として組み込まれ、Pharmingenウェブサイト(http://www.bdbiosciences.com/pharmingen/)から利用可能である。）で考察されている標準的な技術を使用して、Ｈ２Ｌｄ−ＤｓＲｅｄ発現ベクターを、Ｓｆ９およびＴｎｉ昆虫細胞にBaculoGold（商標）ＤＮＡ（BD-Pharmingen、カタログ番号554739、以前のカタログ番号21100Ｄ）でトランスフェクトする。BaculoGold（商標）ウイルスＤＮＡの欠失を相補するように、発現ベクターを導入ベクターとして使用し、ゲノム中にＨ２Ｌｄ−ＤｓＲｅｄ融合タンパク質をコードするＤＮＡを含む感染ウイルスを産生する。標準的な技術を使用して行ったトランスフェクションから３日後にトランスフェクトした細胞培養物由来の培地を収集し、細胞を除去し、上清を３回の増殖の第１回目に使用して、感染性バキュロウイルスの高力価ストック溶液を得る。
【０２３０】
標準的な技術を使用し、高力価ストックを使用して、組換えＨ２Ｌｄ−ＤｓＲｅｄタンパク質産生のためにＳｆ９およびＴｎｉ細胞に感染させる。形質転換ＩＰＴＧ誘導細菌で記載のように、感染細胞をＳＤＳ緩衝液に溶解し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析する。図７に示すように、Ｓｆ９およびＴｎｉ細胞で６０ｋＤのタンパク質バンドが認められたが、ネガティブコントロールである非感染細胞では認められなかった。標準的な技術を使用して、抗ＤｓＲｅｄ抗体で染色したゲルのウェスタンブロット分析により、６０ｋＤバンドはＤｓＲｅｄタンパク質を含むことが確認される（データ示さず）。
【実施例４】
【０２３１】
［Ｈ２Ｌｄ−ＤｓＲｅｄ感染昆虫細胞でのＤｅＲｅｄの蛍光検出］
実施例３に記載のように産生されたＨ２Ｌｄ−ＤｓＲｅｄ融合構築物組換えバキュロウイルスに感染させた昆虫細胞を、Ｈ２Ｌｄ−ＤｓＲｅｄ融合タンパク質発現について分析する。機能的ＤｓＲｅｄ発色団を含むＨ２Ｌｄ−ＤｓＲｅｄ融合タンパク質を産生する感染細胞は、蛍光発光により、赤色光を発光すると予想される。
【０２３２】
図８は、従来の光学顕微鏡による、培地で３日間培養後のネガティブコントロールである非感染Ｓｆ９細胞を示す。図９に示すように、ネガティブコントロールＳｆ９細胞は、刺激し、感染から３日後の蛍光顕微鏡によって分析した場合に赤色蛍光を発光しない。
【０２３３】
それに対して、図１０は、従来の光学顕微鏡による、感染後培地中で３日間培養後のＨ２Ｌｄ−ＤｓＲｅｄ融合構築物組換えバキュロウイルスに感染したＳｆ９細胞を示す。図１１に示すように、感染Ｓｆ９細胞は、刺激し、感染から３日後の蛍光顕微鏡によって分析した場合に赤色蛍光を発光する。赤色光の蛍光発光は、Ｈ２Ｌｄ−ＤｓＲｅｄ融合物を感染させたＳｆ９細胞によって機能的な（したがって、確実に四量体化した）ＤｓＲｅｄ発色団が産生されたことを示す。
【０２３４】
Ｔｎｉ昆虫細胞で類似の結果が認められる。図１２は、従来の光学顕微鏡による、感染後培地中で３日間培養後のＨ２Ｌｄ−ＤｓＲｅｄ融合構築物組換えバキュロウイルスに感染したＴｎｉ細胞を示す。図１３に示すように、感染Ｔｎｉ細胞は、刺激し、感染から３日後の蛍光顕微鏡によって分析した場合に赤色蛍光を発光する。赤色光の蛍光発光は、Ｈ２Ｌｄ−ＤｓＲｅｄ融合物を感染させたＴｎｉ細胞によって機能的なＤｓＲｅｄ発色団が産生されたことを示す。
【０２３５】
本明細書中に引用した全ての特許書類および出願書類は、それぞれ本明細書中で特異的かつ個別に参考として組み込まれるように本明細書中で参考として組み込まれる。上記の発明を説明するために、および例としていくらか詳細に記載したが、本明細書中の教示に照らして、本発明の範囲を単独で定義する添付の特許請求の範囲の精神または範囲を逸脱することなく、等価物の全範囲と共に、一定の変更および修正を行うことができることが当業者に容易に明らかである。
【図面の簡単な説明】
【０２３６】
【図１】本発明によるＨ２Ｌｄ  ＭＨＣクラスＩ−ＤｓＲｅｄ組換え融合構築物の構造を示す図である。
【図２】本発明によるＨ２Ｌｄ−ＤｓＲｅｄ組換え融合構築物を含む二重プロモーター発現ベクターを示す図である。
【図３】ＮｄｅＩおよびＮｏｔＩで消化した発現ベクタープラスミドからの放出の際の推定される１．５ｋＤのＨ２Ｌｄ−ＤｓＲｅｄ組換え融合構築物インサートを示すアガロースゲルの写真である。
【図４】発現ベクター骨格とＨ２Ｌｄインサートとの間の連結点の正確なＤＮＡ配列をさらに確認する自動ＤＮＡシークエンサーの軌跡である。
【図５】形質転換大腸菌におけるＨ２Ｌｄ−ＤｓＲｅｄ組換え融合タンパク質のＩＰＴＧによる誘導を示す染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの写真である。
【図６】異なる形質転換大腸菌株におけるＨ２Ｌｄ−ＤｓＲｅｄ組換え融合タンパク質のＩＰＴＧによる誘導を示す染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの写真である。
【図７】Ｈ２Ｌｄ−ＤｓＲｅｄ組換えバキュロウイルスに感染した昆虫細胞におけるＨ２Ｌｄ−ＤｓＲｅｄ組換え融合タンパク質の発現を示す染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの写真である。
【図８】３日間培養した非感染Ｓｆ９細胞の従来の顕微鏡写真である。
【図９】３日間培養した非感染Ｓｆ９細胞のローダミンフィルターを使用した蛍光顕微鏡写真である。
【図１０】感染後３日間培養したＨ２Ｌｄ−ＤｓＲｅｄ組換えバキュロウイルスに感染したＳｆ９細胞の従来の顕微鏡写真である。
【図１１】感染後３日間培養したＨ２Ｌｄ−ＤｓＲｅｄ組換えバキュロウイルスに感染したＳｆ９細胞のローダミンフィルターを使用した蛍光顕微鏡写真（赤色蛍光を示す）である。
【図１２】感染後３日間培養したＨ２Ｌｄ−ＤｓＲｅｄ組換えバキュロウイルスに感染したＴｎｉ細胞の従来の顕微鏡写真である。
【図１３】感染後３日間培養したＨ２Ｌｄ−ＤｓＲｅｄ組換えバキュロウイルスに感染したＴｎｉ細胞のローダミンフィルターを使用した蛍光顕微鏡写真（赤色蛍光を示す）である。
【図３】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際公開パンフレット】
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2004524019.tif 000101
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004524019.tif 000102
【国際調査報告】
2004524019.tif 000103