(57)【要約】本発明は、鳥類の家畜のマレク病様ウイルス（ＭＤＶ）およびヒトの水痘−帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）のような、いわゆる宿主細胞随伴性のヘルペスウイルスの分野に、およびこれらのウイルスによって引起こされる疾患に対するワクチン接種に関する。本発明は、本質的に宿主細胞が随伴されるヘルペスウイルスによって引起こされる感染に対して指向されるワクチンを提供し、該ヘルペスウイルスに由来する組換えウイルスゲノムを含み、該ゲノムは該宿主細胞が本質的にない組換えを可能とする。【特許請求の範囲】
【請求項１】
本質的に宿主細胞随伴性のヘルペスウイルスによって引起こされる感染に対して指向されるワクチンにおいて、該ヘルペスウイルスに由来する組換えゲノムを含み、該ゲノムは、該宿主細胞が本質的にない組換えを可能とすることを特徴とするワクチン。
【請求項２】
請求項１に記載のワクチンであって、前記ゲノムは宿主細胞における前記ヘルペスウイルスの複製および／または宿主細胞からの該ヘルペスウイルスの伝播のために必須の遺伝子における機能的な欠失を含むことを特徴とする請求項１に記載のワクチン。
【請求項３】
前記ゲノムが少なくとも、前記ヘルペスウイルスでの個体の感染に対する免疫応答を誘発し得る抗原性物質をコードする核酸を含むことを特徴とする、請求項１または２に記載のワクチン。
【請求項４】
前記ゲノムが、前記ワクチンでワクチン接種された個体と、前記本質的に細胞随伴性のヘルペスウイルスで感染された個体との間での区別を可能とする、前記ヘルペスウイルスに特異的なマーカー免疫応答を誘発するために必須の遺伝子における機能的な欠失を含むことを特徴とする、請求項１〜３のいずれかに記載のワクチン。
【請求項５】
前記ゲノムが少なくとも、前記ヘルペスウイルスでの個体の感染に対する免疫応答を誘発し得る抗原性物質をコードする核酸の転写および／または翻訳を調節し得るタンパク質分解性物質をコードする核酸を含むことを特徴とする、請求項１〜４のいずれかに記載のワクチン。
【請求項６】
前記ゲノムが前記ヘルペスウイルスに由来する本質的に完全長のコピーを含むことを特徴とする、請求項１〜５のいずれかに記載のワクチン。
【請求項７】
さらなる病原体の抗原性物質を少なくともコードする核酸をさらに含むことを特徴とする、請求項１〜６のいずれかに記載のワクチン。
【請求項８】
前記ヘルペスウイルスがマレク病ウイルスを含むことを特徴とする、請求項１〜７のいずれかに記載のワクチン。
【請求項９】
前記マレク病ウイルスが血清型１を含むことを特徴とする、請求項８に記載のワクチン。
【請求項１０】
前記マレク病ウイルスが、病原性の、非常に病原性の、または非常に病原性および現場のウイルスに由来することを特徴とする、請求項８または９に記載のワクチン。
【請求項１１】
本質的に宿主細胞随伴性であるヘルペスウイルスに由来する組換えウイルスゲノムであって、該ゲノムは該宿主細胞が本質的にない組換えを可能とすることを特徴とする、組換えウイルスゲノム。
【請求項１２】
少なくとも複製ミニゲノムを含むことを特徴とする、請求項１１に記載のゲノム。
【請求項１３】
該ゲノムが前記ヘルペスウイルスに由来する本質的に完全長のコピーを含むことを特徴とする、請求項１１に記載のゲノム。
【請求項１４】
本質的に宿主細胞随伴性のヘルペスウイルスでの感染によって引起こされる疾患に対して指向されるワクチンの調製のための、請求項１１〜１３のいずれかに記載のゲノムの使用。
【請求項１５】
本質的に宿主細胞随伴性のヘルペスウイルスでの感染によって引起こされる疾患を獲得するおよび充分に発現することに対する個体の危険性を制限するための方法であって、請求項１〜１０のいずれかに記載のワクチンまたは請求項１１〜１３のいずれかに記載のゲノムを該個体に投与する工程を含むことを特徴とする方法。
【請求項１６】
前記個体がトリであることを特徴とする、請求項１５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、鳥類の家畜のマレク病様ウイルス（ＭＤＶ）およびヒトの水痘−帯状疱疹ウイルス（Ｖａｒｉｃｅｌｌａ　Ｚｏｓｔｅｒ　Ｖｉｒｕｓ）（ＶＺＶ、潜伏性から再活性化後に水痘および帯状疱疹を引起こす）のような、いわゆる宿主細胞随伴性のヘルペスウイルスの分野に、ならびにこれらのウイルスによって引起こされる疾患に対するワクチン接種に関し、そして特に、鳥類の家畜の疾患に、特にマレク病に対するワクチン接種の分野に関する。
【０００２】
特に、マレク病は、鶏肉の集中強化的な生産の当初から、鳥類家畜産業の問題であった。これは、免疫抑制、神経学的異常、虚血、および不特定の無関心から開始され、そして感染のより後の段階で重篤なリンパ性ガンを伴って終結する、非常に多様な臨床的徴候を引起こすヘルペスウイルス疾患である。マレク病の歴史の最初は、処置および予防方策は何もなかった。ついで、無病原性（ａｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ）関連（血清型３）ウイルスが、シチメンチョウから単離され（ＨＶＴ）、そしてワクチン接種のために最初に使用された。
【０００３】
しかし、ＨＶＴでのワクチン接種の導入後のある時点で、マレク病が再度出現し、そして流布する現場のウイルスは、ＨＶＴ株によって誘導される防御を迂回するように変化されたことが明白になる。この時点で、新規な無病原性（ａｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ）ウイルスが発見され（Ｒｉｓｐｅｎｓ株）、これは一般に疾患を引起こすウイルスと同じ血清型を有する。このワクチン株は、市場に非常に迅速に導入され、および非常に良好なワクチン接種結果を生じた。
【０００４】
しかし、１０年後再び、疾患の新規な発生が生じ、再度流布する現場のウイルスは現在の使用におけるワクチン株によって誘導される防御を迂回するように変化した。次いで、両方のワクチン（ＨＶＴおよびＲｉｓｐｅｎｓ）の組合わせが、動物を防御するために使用されたが、満足の行く結果は一時的にしか見られなかった。現在、疾患の新規な発生が、すべてのこれらのワクチン接種にもかかわらず生じる。これについての理由は未だ理解されていないが、新規な強力なワクチンの導入についての明らかな必要性がある。
【０００５】
マレク病に対するワクチン接種と関連される問題は、マレクワクチンが長期間生成されてきたという事実にもかかわらず、ワクチンの調製のための方法が改善され得なかったことである。これについての理由は、一般に、本質的に宿主細胞随伴性のウイルスが、ＭＤＶまたはＨＶＴの場合におけるように、病原体のないニワトリのような鳥類家畜から調製される線維芽細胞のような一次宿主細胞において、および水痘−帯状疱疹ウイルスの場合におけるように、（本質的に一次）ヒト細胞（再度、もちろん混入する病原体はない）において、一次細胞においてのみ本質的に増殖し得、ならびに各宿主の特定の細胞の情況を逸脱しては達成され得ないか、または非常な困難を伴ってのみ達成され得ることである。これは一般に、実施レベルに対してほとんど不可能でないにしても、ウイルスの感染またはウイルスのこれらのタイプによって引起こされる疾患に対して指向されるワクチンが生成されることを困難にし、したがって高価にする。
【０００６】
たとえば、マレク病に対して指向されるＲｉｓｐｅｎｓワクチンは、唯一の充分に強力なワクチンであると現在考慮され、すべての血清型１マレクウイルスとして、厳密に宿主細胞随伴性である。細胞随伴性ウイルス（たとえば血清型１および２）の感染力は、通常の凍結および凍結溶解の間に完全に喪失される。それゆえ、ワクチンの調製は非常に複雑なおよび高価な工程を包含し、全細胞が液体窒素中で凍結されなくてはならない。ワクチンは、使用されるまで液体窒素下で、保存、および輸送、そして維持されなくてはならず、それゆえ輸送の間に途方もない費用および問題を引起こす。
【０００７】
次いで、使用の側で、ワクチンは非常に注意深く使用されなくてはならない。なぜなら、感染された細胞は、環境因子に対して非常に敏感であるからである。上昇された温度、光への曝露およびガラス器具中の残留洗浄剤のような因子はしばしばウイルスを障害し、その結果充分に生存可能なワクチンバッチは何ら調製され得ず、完全なワクチン失敗を導く。このような失敗は、疾患が既に出現し始め、および罹患された鳥類家畜が疾患の徴候を示す場合においてのみ認識され得る。
【０００８】
簡潔には、現在まで、マレク病に対して防御するための不活性化された、サブユニットのまたは組換えのワクチンを提供するためのすべての試みは失敗し、それゆえ、現在、マレク病を含む生の、細胞随伴性ワクチンに対する代替は何もない。マレク病はワクチンのような感染された細胞調製物の適用によって制御されたままである。これらの調製物は、ＤＭＳＯを含有する媒体中で懸濁された生存細胞および全体の多様な細胞抗原を含むのみでなく、これらはまた液体窒素中で保存されなくてはならない。したがって、冷却回路が、ワクチン生成からワクチン使用者まで、および投与まで維持されなくてはならない。さらに、一旦溶解されると、ワクチンは非常に短期間内に投与されなくてはならず、そしてすべてのトリに注射されなくてはならない。これらの問題のいくつかは、水痘−帯状疱疹ウイルスのような他の本質的に細胞随伴性のヘルペスウイルスに対するワクチンを調製するというそれらの願望によって共有される。
【０００９】
マレク病ウイルス（ＭＤＶ）はヘルペスウイルスのアルファヘルペスウイルス（Ａｌｐｈａｈｅｒｐｅｓｖｉｒｉｎａｅ）サブファミリーのメンバーである、Ｌｅｅら、２０００、Ｍｕｒｐｈｙら、１９９５）。ニワトリについての病原性およびＴ細胞リンパ腫を誘導する能力に基づいて、ＭＤＶは一般に、３つの血清型（ＭＤＶ−１、ＭＤＶ−２、ＭＤＶ−３）に分類される。ＭＤＶ−３は、シチメンチョウのヘルペスウイルス（ＨＶＴ）を示し、これはＭＤＶ関連性疾患に対するワクチン接種について広範に使用された。しかし、ワクチン接種の失敗、そしていわゆる病原性の、または非常に病原性のＭＤＶ−１（Ｗｉｔｔｅｒ、１９８５）の発生の後、弱毒化されたＭＤＶ−２株、そして後には弱毒化されたＭＤＶ−１株（たとえば、株ＣＶＩ　９８８　Ｒｉｓｐｅｎｓ）が、ワクチン処方物において使用された（Ｗｉｔｔｅｒ、１９８５）。近年のおよび米国における最初の報告において、さらにより病原性のＭＤＶ−１、いわゆる非常に病原性＋（ｖｖ＋）、ＭＤＶ−１改変体が出現し、そしてマレク病の高い発生率、ならびに腫瘍発生および感染後初期の免疫沈降によって引起される死亡率を引起こした（Ｗｉｔｔｅｒ、１９９７）。１つのｖｖ＋株、５８４Ａは、ニワトリ胚線維芽細胞（ＣＲＦ）において１００回を越えて継代され、そしてニワトリについての病原性を緩めることが示された（Ｗｉｔｔｅｒ、１９９７）。しかし、ｖｖ＋ＭＤＶ−１の増加される病原性についての、および同様に病原性の喪失についての細胞基準は、ＭＤＶ−１の分子解析を実施することが困難であるので不十分に理解される。一方、感染性ウイルス子孫は全くまたは少量しか培養細胞中に放出されず、他方ＭＤＶ−１組換え体の生成は困難であり、および細胞培養物中の因子の高度な細胞随伴性の性質に起因して、ウイルス組換え体の複数回の精製が必要とされる（Ｃａｎｔｅｌｌｏら、１９９１；Ｓａｋａｇｕｃｈｉら、１９９３；Ｐａｒｃｅｌｌｓら、１９９４；Ｓｃｈａｔら、１９９８；Ａｎｄｅｒｓｏｎら、１９９８）。
【００１０】
上部ですでに上記されるように、ワクチン接種はマレク病現場のウイルスから動物を防御することを保証し得ない。ウイルス―すべてのヘルペスウイルスのような−は、ワクチンによって誘導される免疫応答を逃れるための方法を見出し得る。それゆえ、現場の状況に対するワクチンの迅速な適合が必要とされる。現在、これは、現場の単離物（たとえば、ＨＶＴもしくはＲｉｓｐｅｎｓ）の単離、および／またはインビトロにおけるさらなる弱毒化によって行われる。単離自身は、細胞随伴性の感染性ウイルスをニワトリから得ること、および細胞培養物中で細胞を感染することの困難性のために、途方もない問題を引起こす。その後の弱毒化工程は非常に困難であり、そして特にプラーク精製が極めて困難であるので時間の無駄づかいであり、これはまた、ウイルスの細胞随伴性の性質に起因する。
【００１１】
弱毒化からの結果は通常規定されない。これらの事実の結果として、長い間、現在のＨＶＴおよびＲｉｓｐｅｎｓ型ワクチンを損なうことを救済するような、市場に登場したワクチンはなにもなかった。さらにしばしば、過弱毒化がワクチン生成の間に生じる。なぜならウイルスが非常に多くの回数で継代されたからである。これは現場におけるＨＶＴ−およびＲｉｓｐｅｎｓ型ワクチンの低い効力をさらに悪化する。簡潔には、以下の問題が、ＭＤＶ制御における現在の難局の大きな部分を構成する。伝統的なワクチン生成の低い再現性、ワクチンウイルスの過弱毒化、ワクチンウイルスの規定されない弱毒化、高い精製費用、高い保存および輸送の費用、環境因子に対するワクチンの高い感受性、および特に細胞随伴性ウイルスについての新規なワクチン株の非常に遅延された開発が存在する。
【００１２】
これらの問題は、現在流布する現場のウイルスが鳥類家畜生成ストックにおいて非常に高い力価を生じるという事実によって構成され、それによってこれらの高い抗体力価は、卵における母性抗体を介して子孫を介して与えられる。現在のワクチンウイルスによる最初の感染の間のこれらの母性抗体の影響はさらに、マレク病に対するワクチン接種の現在の効果を減少する。
【００１３】
本発明は、本質的に宿主細胞に随伴されるヘルペスウイルスによって引起される感染に対して指向されるワクチンであって、該ヘルペスウイルス由来の組換えゲノムを含み、該ゲノムは該宿主細胞がない組換えを可能とすることを特徴とするワクチンを提供する。この効果に対して、本発明は本明細書中で本質的に宿主細胞随伴性であると考えられるヘルペスウイルスに由来する組換えウイルスゲノムを提供し、該ゲノムは好ましくは、該宿主細胞における複製の少なくともいくつかの測定を行い得、および同時に該宿主細胞がないまたはそれから独立した複製を許容し、真核生物細胞における相同組換えはもはや必要とされない。詳細な説明において、このようなゲノムはマレク病様ウイルスについて提供される。
【００１４】
そこで、例としてマレク病ウイルス血清型１（ＭＤＶ−１）、株５８４Ａｐ８０Ｃのゲノムが、細菌人工染色体（ＢＡＣ）としてＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉにおいてクローン化された。ＢＡＣベクター配列は、ウイルスＤＮＡと、ＭＤＶ−１　Ｕ２遺伝子および隣接領域の代わりにＢＡＣ配列およびＥｃｏ−ｇｐｔ遺伝子を含んだ組換えプラスミドｐＤＳ−ｐＨＡ１とでのニワトリ胚線維芽細胞（ＣＥＦ）の同時形質転換後の相同組換えによってＭＤＶ−１ゲノムのＵｓ２遺伝子配座に導入された。トランスフェクション子孫はミコフェノール酸（ｍｙｃｏｐｈｅｎｏｌｉｃ　ａｃｉｄ）およびキサンチン／ヒポキサンチンの存在下、ＣＥＦ細胞上で継代された。４回の選択後、ウイルスＤＮＡを調製され、そしてＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ株ＤＨ１０Ｂを形質転換するために使用された。完全なＭＤＶ−１ゲノムを保有するいくつかのコロニーが同定された。これらのＭＤＶ−１　ＢＡＣはＣＥＦ細胞にトランスフェクトされ、そしてトランスフェクション後３日目から感染性ＭＤＶ−１が回収された。種々のＢＡＣから回収されたＭＤＶ−１の増殖は、プラーク形成および増殖曲線の測定によってアッセイされるように、親ウイルスの増殖と区別できなかった。
【００１５】
本発明はしたがって、ＭＤＶおよび／またはＶＺＶ単離物に由来する（必要とされる場合、ほぼ完全なまたは完全な）感染性ヘルペスウイルス核酸を含む、組換えの本質的に宿主細胞随伴性のヘルペスウイルスゲノムを生成するまたは得るための方法を提供する。
【００１６】
もちろん、今や本質的に完全なゲノムは、元来堅固に随伴されると考えられていた宿主細胞がなく得られるので、本発明はまた、分子生物学の当業者に利用可能であるすべての組換え技術の充分な適用を可能とする本発明のゲノムを提供し、したがって本発明はたとえば、少なくとも（複製可能な）ミニゲノムを含む本発明のワクチンを提供する。
【００１７】
たとえば、本発明は糖タンパク質の組（たとえば、ｇＢ、ｇＣ、ｇＤ、またはそれらの組合せ）のみの、およびヘルペスウイルスにおける細胞性免疫を誘導することが示されたたとえばＩＣＰ４または別の遺伝子産物の、発現のためのみに提供されるミニゲノムを提供する。このようなミニ遺伝子はたとえば、遺伝子を同定するために作用し、これは防御において重要であり、（真核生物）宿主細胞におけるゲノムの複製はもはや提供されないことが考慮される。各遺伝子または遺伝子構築物の前にたとえばＨＣＭＶまたはＳＶ４０プロモーターを付加することは、最小防御単位の最終的な同定を提供する。複製適格性ミニゲノムについて、本発明はまた、ＵＳ領域の完全な、または主要な部分を欠失することを提供し、それによって得られるミニウイルスはまた宿主細胞において複製する。
【００１８】
別の実施態様において、本発明は該ヘルペスウイルスに由来する本質的に完全長のコピーを含むこのようなゲノムを提供し、本明細書中で本質的に完全長は、該ウイルスゲノムの大部分が存在することを示すが、詳細な説明において本明細書中に提供されるような宿主または宿主細胞培養物におけるウイルスの複製および伝播に必須の遺伝子のような好ましくは（少なくとも機能的に）除外されるいくつかを除く。そこで、たとえば、本発明の回収されたゲノムの１つ、ＢＡＣ２０において、糖タンパク質Ｂ（ｇＢ）をコードする配列は、直鎖状ＤＮＡフラグメントを使用する１工程のｒｅｃＥ媒介性変異誘発によって欠失された。ｇＢネガティブなＢＡＣ２０　ＤＮＡ（２０ＤｇＢ）のトランスフェクション後に再構成された糖タンパク質ＢネガティブなＭＤＶ−１は、トランスでｇＢを提供する細胞において増殖し得るのみであり、培養された宿主細胞においてｇＢがＭＤＶ−１増殖に必須であることを実証する。増殖に、およびトランスで遺伝子産物を生成する細胞が提供されることが必要な他の遺伝子は、ｇＨ、ＩＣＰ４、ＵＬ１５、ＵＬ２８，およびＵＬ９、または以下に列挙されるような増殖に必須と考慮される別の遺伝子である。
【００１９】
さらに、本発明は、ワクチンの生成のための本発明のゲノムの使用を提供し、１つの実施態様において、このようなワクチンは本質的に宿主細胞随伴性のヘルペスウイルスでの感染によって引起される疾患に対して指向されるが、別の実施態様において、このようなワクチンはベクターワクチンとして使用され得、そして他のおよびさらなる病原体またはそれについてコードする核酸ストレッチを含み得る。ＭＤＶについて、好ましいさらなる病原体核酸はたとえばＮｅｗｃａｓｔｌｅ　Ｄｉｓｅａｓｅウイルス、Ｅｉｍｅｒｉａ　ｓｐｐ、サルモネラ　ｓｐｐ、ニワトリ感染性虚血ウイルス、インフルエンザウイルス、感染性ブルサ病ウイルス、レオウイルス、または鳥類家畜において一般に見られる他の病原体に由来する核酸を包含する。
【００２０】
したがって、本発明はまた、ワクチンであって、該ゲノムは宿主細胞における該ウイルスの複製および／または伝播に必須の遺伝子における機能的な欠失を包含するか、または該ウイルスゲノムは少なくとも、該ヘルペスウイルスでの個体の感染に対して（好ましくは本質的に防御性の）免疫応答を誘発し得る抗原性物質をコードする核酸を含むことを特徴とするワクチンを提供する。欠失される典型的な必須遺伝子またはそのフラグメントは、たとえば、ＵＬ１＝糖タンパク質Ｌ；ＵＬ５；ＵＬ８；ＵＬ９；ＵＬ１５；ＵＬ１８；ＵＬ１９；ＵＬ２２＝糖タンパク質Ｈ；ＵＬ２６；ＵＬ２６．５；ＵＬ２７＝糖タンパク質Ｂ：ＵＬ２８；ＵＬ２９；ＵＬ３０；ＵＬ５２；ＵＬ５３；ＩＣＰ４のＭＤＶ相同体、またはゲノムのＵＳ領域から選択される遺伝子またはそのフラグメントであり得る（図１）。
【００２１】
好ましい実施態様において、本発明は、ワクチンであって、該ワクチンでワクチン接種された個体と、該本質的に細胞随伴性のヘルペスウイルスで感染された個体との間の免疫学的な区別を可能とする、該ヘルペスウイルスに特異的なマーカー免疫応答を誘発するために必須の遺伝子における機能的欠失を含むワクチンを提供する。好ましいマーカー応答はたとえば、ｇＣ、ｇＭ、ｇＤ、またはｇＥにて指向され、それによって詳細な説明はさらに（ここではｇＭの場合において）、マーカー免疫応答を誘発するために必須の遺伝子におけるこのような欠失を説明する。
【００２２】
さらに、本発明は、発明に従うワクチンであって、該ウイルスゲノムは少なくとも、該ヘルペスウイルスでの個体の感染に対して免疫応答を誘発し得る抗原性物質をコードする核酸の転写および／または翻訳を調節し得るタンパク質分解性物質をコードする核酸を含むことを特徴とするワクチンを提供する。
【００２３】
好ましくは、該ワクチンは、ワクチン接種された宿主におけるワクチンゲノムの転写および／または翻訳の効果的な調節のために必要とされる多くの機能を維持するために、該ヘルペスウイルスに由来する本質的に完全長のコピーを含むが、しかし、ミニゲノムワクチン接種がまた本明細書中で提供される。該ゲノムからさらなる病原体、またはそれに由来する抗原性物質を発現する場合、外来病原体、またはそれに由来する抗原性物質をコードする核酸の転写および／または翻訳を効果的に調節することはもちろん好ましく、およびまた外来（すなわち、非ヘルペスウイルス調節性エレメント）が、本発明のワクチンを提供する場合該ゲノムに提供されることが考えられ得るが、さらなる病原体をコードする核酸は除く。
【００２４】
特に、本発明は、発明に従うワクチンであって、該ヘルペスウイルスはマレク病様ウイルスを含むことを特徴とするワクチンを提供する。特に、該マレク病様ウイルスは血清型１を含むことを特徴とするワクチンを提供することが好ましい。また、ゲノムの操作のための方法は、ゲノムが元来随伴される宿主細胞の情況を超えて包含されるゲノムの操作のための方法が提供され、マレク病様ウイルスの通常弱毒化されるかまたは病原性の単離物に由来する代わりに、病原性の、非常に病原性の、または非常に病原性＋現場のウイルスから代わりに由来するワクチンが提供される。なぜなら、現場の単離物からの感染性クローンの迅速な単離が今や可能であるからであり、ニワトリおよびシチメンチョウにおけるマレク病ワクチンについての予防のためのＤＮＡワクチンの調製を許容し、ゲノムへの変異が非常に迅速に導入され得る。同じ系がまた、他の本質的に細胞随伴性のヘルペスウイルス様水泡−帯状疱疹ウイルスについて使用され得る。
【００２５】
本明細書中に提供されるような複製可能なウイルスゲノムの使用は部分または完全を含み、そして感染性マレク病ウイルス（ＭＤＶ−１）ゲノムは、より有効な、生物学的に安全な、および安定なＭＤＶ−１ワクチンを生成するための多様な新規な可能性を開く。組換えＭＤＶ−１がクローン化されたＤＮＡから回収されるという事実に起因して、ＤＮＡトランスフェクションから得られるウイルス子孫は、より良好に特徴付けられ得、およびワクチンウイルスの「過弱毒化」が回避される。たとえば、弱毒化と関連されるようである１３２ｂｐ反復（Ｍａｏｔａｎｉら、１９８６）の数は正確に決定され得、および−必要である場合−ワクチン生成についての必要性または現場における情況にしたがって減少または拡張され得る（以下を参照のこと）。変異体ＭＤＶ−１の生成は、非常に容易にされた。これまでのところ、ＭＤＶ−１変異体は、困難なおよび時間の無駄づかいである、真核生物細胞における相同組換え、ならびに選択手順によって作製された。これらの選択手順は―他のヘルペスウイルスについて報告されるように−しばしばこれらの所望される以外のゲノムの変異を生じ得る。特に本質的にＭＤＶ−１の場合において、選択手順、そして変異体の回収および増殖がさらにより複雑にされ、無細胞ウイルスを得ることができないからである。対照的に、本発明は、プラスミドｐＧＥＴｒｅｓｃに存在するｒｅｃＥ、ｒｅｃＴ、およびｒｅｃＢ／Ｃを抑制するλｇａｍ遺伝子（Ｎａｒａｙａｎａｎら、１９９９）を介する変異誘発に基づく、ウイルスゲノムを操作するための方法を提供する。系の利点は、（ｉ）わずか３０〜５０ｂｐの相同なアームが、検出されるべき特異的配列を標的するために必要とされること、すなわち、任意のオープンリーディングフレームの欠失が、組合せのカセットをクローン化する必要と伴わずに達成され得ること、（ｉｉ）方法は非常に早いこと、および（ｉｉｉ）変異誘発系を付与しそしてアンピシリン耐性を発現するｐＧＥＴｒｅｃベクターが、アンピシリンの不在下で迅速に細菌細胞から喪失されることである。
【００２６】
いわゆるＥ／Ｔクローン化手順を使用する強力な技術を使用して、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉにおける１工程の変異および選択が可能である（Ｍｕｙｒｅｒｓら、１９９９；Ｎａｒａｙａｎａｎら、１９９９；Ｚｈａｎｇら、１９９８）。この技術はまた、細胞株を相補することを使用する必要性を伴わずに必須ＭＤＶ−１遺伝子の欠失を可能とする。なぜなら、本明細書中で提供されるように変異されたＭＤＶ−１ゲノムの複製は欠失される必須遺伝子のトランス相補を必要としないからである。さらに、クローン化手順は完全に必要とされない。
【００２７】
別の実施態様において、本発明は、ＭＤＶ−１または他の（本質的に細胞随伴性のヘルペス）ウイルスＢＡＣを作製する方法を提供し、たとえば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＤＨ１０Ｂを細胞をプラスミドｐＢＡＤαβγ、ｐＧＥＴｒｅｃ、またはｒｅｃＥ、ｒｅｃＴ、およびλｇａｍ遺伝子を誘導的におよび安定に発現する任意の他のプラスミドで形質転換する工程、続いてたとえばエキスビボで採取された溶菌的にまたは潜在的に感染された細胞から、または細胞培養物から、環状ウイルスＤＮＡを調製する工程を包含する。平行なまたは別個の手順において、ＢＡＣベクター配列およびウイルスＤＮＡと、ＢＡＣベクター配列との相同組換えを可能とする配列を保有する直鎖状ＤＮＡが提供される。この直鎖状ＤＮＡは、たとえば、ＰＣＲによってまたはプラスミドＤＮＡを直鎖化することによって生成され得る。次いで、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉにおけるｒｅｃＥ、ｒｅｃＴおよびｇａｍ遺伝子の発現が提供され、そしてエレクトロコンピテントな細胞が提供される（たとえば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９）。次いで、ウイルスＤＮＡはＢＡＣベクター配列を保有する直鎖状ＤＮＡとともに、コンピテントなＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉにエレクトロポレートされる。適切な抗生物質を含有する寒天上へのプレーティングは、採集されるべきコロニー（単数または複数）を提供し、そしてＢＡＣ　ＤＮＡは、たとえば本明細書中の詳細な説明において記載されるように調製され得る。クローン化されたウイルスＢＡＣ　ＤＮＡの感染力は、感受性細胞のトランスフェクションによって確認される。ここで、本発明は、真核生物細胞における（相同）組換えを行う必要性を伴わずに、宿主細胞または組織に由来する本質的に宿主細胞随伴性のヘルペスウイルスゲノムを遺伝子組換えするための方法を提供し、（必要とされる場合、ほとんど完全なまたは完全な）感染性ゲノムまたは現場の単離物または弱毒化された単離物に由来するヘルペスウイルス核酸を得ることを可能とする。
【００２８】
本明細書中で提供されるような方法はまた、候補ワクチンＭＤＶ−１をさらに弱毒化すること、および他の重要なニワトリ病原体の遺伝子を保有するＭＤＶ−１変異体を作製することを可能とする。さらに、潜在的に異なるおよび変化する抗原性特性を有する現場のＭＤＶ−１単離物の出現は、クローン化ＭＤＶ−１と現在の現場の単離物との間のそれぞれの変異された遺伝子の交換に基づくワクチンを提供することによって反撃される。これらの変化は―上記されるような−同じＥ／Ｔクローン化技術を用いて行われ得、したがって、現場におけるＭＤＶ−１の変化に対して非常に迅速に反応する可能性を提供する。しかし本明細書中に記載されるような感染性ＭＤＶ−１の回収の魅力的な利点は、ＤＮＡワクチンとしての本明細書中で提供されるようなゲノムの使用である。これまでのところ、マレク病は感染性細胞調製物の適用によって制御される。
【００２９】
これらの調製物は、ＤＭＳＯを含有する培地中で懸濁される生存細胞および全体の多様な細胞性抗原を含むのみでなく、これらはまた液体窒素中で保存されなくてはならない。したがって、ワクチン調製からワクチン使用者までの、および投与されるまでの冷却回路が維持されるべきである。さらに、一旦溶解されると、ワクチンは非常に短期間内に投与されなくてはならず、およびすべてのトリに注入されなくてはならない。本明細書中で提供されるようなＭＤＶ−１ゲノムを用い、「ワクチン」（ＤＮＡ）の精製は容易に実現可能であり、および再現可能である。ＤＮＡは極めて安定であり、冷却回路の維持は必要とされず、および感染性ＤＮＡはいくつかの経路（筋肉内、皮内、卵内、経口的に、呼吸経路によってなど）によって、および異なる処方物（キャリアを伴うおよび伴わない）中で投与され得る。さらに、母性抗体の存在は、免疫原の一次注入を妨害しない。
【００３０】
したがって、本明細書中で提供されるようなＭＤＶ−１ゲノムは、腫瘍化のおよび経済的に重要な疾患に対する非常に効果的なおよび生物学的に完全なワクチンを生成するおよび操作する可能性を最初に可能とする。したがって本発明は概して、本質的に細胞随伴性のヘルペスウイルスでの感染によって引起される疾患を獲得することまたは充分に出現することに対する個体の危険性を制限するための方法を提供し、本発明のワクチンまたは本発明のゲノムを該個体に投与する工程を包含する。
【００３１】
発明の詳細な説明
マレク病ウイルス（ＭＤＶ）は、ヘルペスウイルスのアルファヘルペスウイルスサブファミリーのメンバーである（ｖａｎ　Ｒｅｇｅｎｍｏｒｔｅｌら、１９９９）。ニワトリについての病原性およびＴ細胞リンパ腫を誘導する能力および抗原性特性に基づいて、ＭＤＶは一般に、３つの血清型（ＭＤＶ−１、ＭＤＶ−２、ＭＤＶ−３）に分類される（Ｐａｙｎｅ、１９８５）。ＭＤＶ−３は、シチメンチョウのヘルペスウイルス（ＨＶＴ）を示し、これはＭＤＶ関連性疾患に対するワクチン接種のために広範に使用されてきた。最も最近の命名法にしたがって、ＭＤＶ−１はｇａｌｌｉｄヘルペスウイルス２（ＧＨＶ−２）として、ＭＤＶ−２はＧＨＶ−３として、およびＨＶＴは、ｍｅｌｅａｇｒｉｄヘルペスウイルスとして分類される。すべての３つのウイルスは、アルファヘルペスウイルスのうちの新規なマレク病様ウイルス属に属する。
【００３２】
ＭＤＶ−１感染の制御は、主にＨＶＴでのワクチン接種によって達成されたが、ワクチン接種の失敗およびいわゆる「非常に毒性の」ＭＤＶ−１の記載（Ｗｉｔｔｅｒ、１９８９）の記載後、ＭＤＶ−２株、そして後には弱毒化されたＭＤＶ−１（例えは、株ＣＶＩ９８８　Ｒｉｓｐｅｎｓ）がワクチン処方物中で使用されてきた（Ｗｉｔｔｅｒら、１９８５）。
【００３３】
近年のおよび米国における最初の報告において、さらにより病原性のＭＤＶ−１、「非常に病原性＋」（ｖｖ＋）、ＭＤＶ−１改変体が出現し、そしてワクチン接種された集団においてであっても、高い死亡率を引起こした（Ｗｉｔｔｅｒ、１９９７）。これらのｖｖ＋株のうちの１つの、５８４Ａは、ニワトリ胚線維芽細胞（ＣＲＦ）において連続して継代され、そしてニワトリについての病原性を喪失した（Ｗｉｔｔｅｒら、１９９７）。ｖｖ＋　ＭＤＶ−１の増加される病原性についての、および同様に病原性の喪失についての細胞基準は、ＭＤＶ−１の分子解析を実施することが困難であるので充分には理解されていない。
【００３４】
一方、感染性ウイルス子孫は培養細胞中に放出されず、他方ＭＤＶ−１組換え体の生成は困難であり、およびインビトロでの因子の高度な細胞随伴性の性質に起因して、ウイルス組換え体の複数回の精製が必要とされる（Ｃａｎｔｅｌｌｏら、１９９１；Ｓａｋａｇｕｃｈｉら、１９９８；Ｐａｒｃｅｌｌｓら、１９９４、１９９５；Ｓｃｈａｔら、１９９８；Ａｎｄｅｒｓｏｎら、１９９８）。さらに、一次細胞は、ＭＤＶ−１の増殖のために使用されなくてはならず（Ｐａｙｎｅ）、トランスで相補する細胞株が何ら作製され得ないので本質的にＭＤＶ−１遺伝子の解析はほとんど不可能であるという事実を生じる。
【００３５】
マウスおよびヒトサイトメガロウイルス（ＭＣＭＶおよびＭＣＭＶ；Ｍｅｓｓｅｒｌｅら、１９９７；Ｂｏｒｓｔら、１９９９）、単純ヘルペスウイルス１型（ＨＳＶ−１；Ｓｕｔｅｒら、１９９８）、シュードモナスウイルス（ＰｒＶ；Ｓｍｉｔｈら、１９９９、２０００）、およびエプスタインバールウイルス（ＥＢＶ；Ｄｅｌｅｃｌｕｓｅら、１９９８）のゲノムは、この技術を使用して感染性ＢＡＣとしてクローン化された。
【００３６】
本研究の目的は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉにおける完全な１８０ｋｂｐゲノムのクローニングによる、ＭＤＶ−１組換え体の速いおよび効果的な生成のための基準を提供することであった。感染性ＭＤＶ−１は、ＣＥＦ細胞を使用してクローン化されたＭＤＶ−１　ＢＡＣ　ＤＮＡのトランスフェクション後に容易に回収され、およびＭＤＶ−１　ＢＡＣは、数回の細菌増殖またはＣＥＦ細胞における連続増殖後に安定であった。
【００３７】
最後に、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉにおける本質的ＭＤＶ−１遺伝子の１工程の欠失が可能になったので、系は本質的なおよび非本質的なＭＤＶ−１遺伝子のさらなる解析を容易にするための大きな可能性を有し得、そして生物学的に安全に改変された生ウイルスおよび／またはＤＮＡワクチンの生成のための道具として作用し得る。
【００３８】
材料および方法
ウイルスおよび細胞。一次および二次ニワトリ胚線維芽細胞（ＣＥＦ）またはウズラ筋肉（ＱＭ７）細胞は、５〜１０％胎児ウシ血清（ＦＣＳ）が補充されたダルベッコ改変必須培地（ＤＭＥＭ）中で維持された。ＭＤＶ−１株５８４Ａｐ８０Ｃは、Ｒｉｃｈａｒｄ　Ｗｉｔｔｅｒ博士、ＡＤＯＬ、Ｅａｓｔ　Ｌａｎｓｉｎｇ　Ｍｉｃｈｉｇａｎ、Ｕ．Ｓ．Ａ．によって快く提供された。５８４Ａｐ８０Ｃ株は、ｖｖ＋株５８４Ａの非病原性細胞培養物の継代された子孫を示し（Ｗｉｔｔｅｒ、１９９７）、および以前に記載される（Ｏｓｔｅｒｒｉｅｄｅｒ、１９９９）ように一次または二次ＣＥＦ細胞上で増殖された。ＱＭ７細胞は、これらがＭＤＶ−１の増殖のために使用された前に、ＰＣＲおよびゲノムの異なる領域を標的化するサザンブロットハイブリダイゼーションによってＭＤＶ−１配列の不在について試験された（ＺｅｌｎｉｋおよびＯｓｔｅｒｒｉｅｄｅｒ、未発表）。ウイルスの増殖曲線は、わずかな改変を伴って記載されるように行われた（Ｐａｒｃｅｌｌｓら、１９９４）。簡潔には、１００プラーク形成単位（ｐ．ｆ．ｕ．）が、２×１０６個の新鮮に播種されたＣＥＦ細胞を感染するために使用された。感染後の種々の時点（０、１２、２４、４８、７２、９６、１２０時間）で、感染された細胞がトリプシン処理され、そして新鮮なＣＥＦ細胞に対して力価測定された。プラークの数が測定され、そして結果は１つの独立した実験の平均を示す。
【００３９】
構成的にＭＤＶ−１　ｇＢを発現するＱＭ７細胞株が、１０μｇのｐｃＭｇＢでの１×１０６個のＱＭ７細胞のトランスフェクションによって得られ（図１）、これはｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に基づき、およびヒトサイトメガロウイルス即時型初期プロモーターの制御下で株Ｒｉｓｐｅｎｓ　ＣＶＩ９８８からのＭＤＶ−１ｇＢ遺伝子を含む。ｐｃＭｇＢを含有するＱＭ７細胞が、１ｍｇ／ｍｌ　Ｇ４１８の存在下で選択され、そしてｇＢを発現するクローンが、抗ｇＢモノクローナル抗体（ｍａｂ）２Ｋ１１（Ｊｅａｎ−Ｆｒａｎｃｏｉｓ博士　Ｖａｕｔｈｅｒｏｔ、ＩＮＲＡ、Ｔｏｕｒｓ、Ｆｒａｎｃｅによって快く提供された）を使用して同定された。得られるＭＤＶ−１　ｇＢを発現する細胞株をＭｇＢ１と呼んだ。
【００４０】
ＭＤＶ−１　ＢＡＣの構築。ＭＤＶ−１　ＤＮＡは、以前に記載されるように（Ｍｏｒｇａｎら、１９９０）、ドデシル硫酸ナトリウム―プロテイナーゼＫ抽出によって感染された細胞から精製された。プラスミドｐＤＳ−ｐＨＡ１は以下のように構築された。ＭＤＶ−１　Ｕｓ２遺伝子のいずれかの側における２．１および３．１ｋｂフラグメントは、適切な制限酵素部位を含有する標準的なプライマー（表１）を使用してポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅され、そして両方のフラグメントはｐＴＺ１８Ｒ（Ｐｈａｒｍａｃｈｉａ−Ａｍｅｒｓｈａｍ）にクローン化された。ＨＣＭＶ即時型初期プロモーターの制御下でＥｃｏ−ｇｐｔ遺伝子を含有するＢＡＣベクターは、プラスミドｐＨＡ１（Ｍ．Ｍｅｓｓｅｒｌｅ博士、ＬＭＵ　Ｍｕｎｉｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙから提供された；Ｍｅｓｓｅｒｌｅら、１９９７）から放出され、そしてプラスミドｐＤＳに在する両方の２．１および３．１ｋｂｐフラグメントに導入されたＰａｃＩ部位に挿入された（図１）。
【００４１】
一次ＣＥＦ細胞は、２μｇの５８４Ａｐ８０Ｃ　ＤＮＡおよび１０μｇのｐＤＳ−ｐＨＡ１で同時トランスフェクトされた。トランスフェクション後５日目に、細胞は、２５０μｇ／ｍｌミコフェノール酸（ＭＰＡ）、５０μｇ／ｍｌキサンチン、および１００μｇ／ｍｌヒポキサンチンの存在下、一次ＣＥＦ細胞上にプレートされた。ＭＰＡ／キサンチン／ヒポキサンチン選択は、合計４回反復された。完全な細胞変性効果（ｃｐｅ）は、４回目の選択後に生じ、ウイルスＤＮＡが感染された細胞から調製され、そして１μｇの感染された細胞ＤＮＡがＤＨＢ１０　Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ細胞にエレクトポレートされた。コロニーが、８０μｇ／ｍｌクロラムフェニコールを含有する寒天培地（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９）上でのトランスフェクション１６時間後から検出された。単一のコロニーがつつかれ、そしてＢＡＣ　ＤＮＡが標準的なアルカリ溶解プロトコル（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９）後に、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉから調製された。ＢＡＣ　ＤＮＡの大規模調製が、市販のキット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｍａｃｈｅｒｅｙ　＆　Ｎａｇｅｌ）を使用するシリカベースのアフィニティークロマトグラフィーによって行われた。３つのＭＤＶ−１　５８４Ａｐ８０Ｃ　ＢＡＣクローン（ＢＡＣ１９、ＢＡＣ２０、ＢＡＣ２４）がさらなる解析のために選択された。
【００４２】
ＭＤＶ−１　ＢＡＣの変異誘発。Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉにおけるクローン化されたＭＤＶ−１　ＤＮＡの変異誘発のために、Ｅ／Ｔクローニングと呼ばれる、直鎖状ＤＮＡフラグメント間の相同組換えを促進するｒｅｃＥ触媒化反応が行われた（Ｚｈａｎｇら、１９９８；Ｎａｒａｙａｎａｎら、１９９９）。ｒｅｃＥ、ｒｅｃＴ、およびバクテリオファージ１　ｇａｍ遺伝子を保有するプラスミドｐＧＥＴｒｅｃ（Ｐａｎｏｓ　Ｉｏａｎｎｏｕ、Ｍｕｒｄｏｃｈ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｍｅｌｂｏｕｒｎｅ、Ａｕｓｔｒａｌｉａによって快く提供された）が、ＢＡＣ２０を含有するＤＨ１０Ｂ細胞に形質転換された（Ｎａｒａｙａｎａｎら、１９９９）。０．２％アラビノースの添加によるｒｅｃＥ、ｒｅｃＴ、およびｇａｍの誘導後、本質的には記載されるように（Ｎａｒａｙａｎａｎ）、エレクトロコンピテントな細胞が調製された。ＢＡＣ２０においてｇＢ遺伝子を欠失するために、プラスミドｐＥＧＦＰ−Ｎ１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）のカナマイシン耐性遺伝子（ｋａｎＲ）がＰＣＲによって増幅された。設計されたプライマーは、ｇＢ内に所望される欠失を保有する５０ヌクレオチド相同アーム、およびｋａｎＲの増幅のための２０ヌクレオチドをを含んだ（表１）。得られる１．６ｋｂｐフラグメントをアガロースゲル（Ｑｉａｇｅｎ）から精製し、そしてｐＧＥＴｒｅｃを含有するＢＡＣ２０細胞中にエレクトロポレ―トした。ｃａｍＲおよびｋａｎＲ遺伝子を保有するコロニーが、両方の抗生物質を含有するプレート（Ｎａｒａｙａｎａｎら、１９９９）上で同定された。
【００４３】
ＤＮＡ解析。ＢＡＣまたはウイルス５８４Ａｐ８０Ｃ　ＤＮＡが、ＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩ、ＢｇｌＩＩ、またはＳｔｕＩで切断され、そして０．８％アガロースゲル上で分離された。ＤＮＡフラグメントは、正に荷電されたナイロンメンブレン（Ｐｈａｒｍａｃｉａ−Ａｍｅｒｓｈａｍ）にトランスファーされ、そしてサザンブロットハイブリダイゼーションが、ジゴキシゲニンで標識されたＢＡＣ１９　ＤＮＡまたはＭＤＶ−１株ＧＡの個々のＢａｍＨＩフラグメント（Ｆｕｋｕｃｈｉら、１９９１；Ｏｓｔｅｒｒｉｅｄｅｒ、１９９９）を使用して行われた。
【００４４】
さらに、プラスミドｐｃｇＢからのｇＢ−特異的プローブ、およびｋａｎＲ遺伝子を保有するプローブが、ｇＢ−ネガティブなＭＤＶ−１　ＢＡＣの解析のために調製された。ＣＳＰＤ（商標）を使用するＤＮＡハイブリッドの化学発光検出が、製造業者（Ｒｏｃｈｅ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）の指示にしたがって行われた。
【００４５】
間接的な免疫蛍光。間接的な免疫蛍光解析（ＩＩＦ）のために、細胞は６−もしくは２４−ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ）、またはカバーガラス上で増殖され、そして続いて示される場所で感染された。細胞は、感染またはトランスフェクション後の種々の時点で９０％アセトンで固定化され、そしてＩＩＦが記載されるように（ＭｅｉｎｄｌおよびＯｓｔｅｒｒｉｅｄｅｒ、１９９９）正確に行われた。サンプルは蛍光顕微鏡または共焦点レーザー走査顕微鏡（ＣＬＳＭ）によって解析された。使用された抗体は、抗ｇＢ　ｍａｂ　２Ｋ１１、抗ｐｐ３８　ｍａｂ　Ｈ１９（Ｌｕｃｙ　Ｌｅｅ、ＡＤＯＬ、ＥＡＳＴ　Ｌａｎｓｉｎｇ、ＭＩによって快く提供された）またはＭＤＶ−１で感染されたニワトリからの回復期血清（ＭＤＳＩ）であった。
【００４６】
結果：
完全なＭＤＶ−１ゲノムを保有するＢＡＣの構築および解析。１００万個の一次ＣＥＦが１×１０４ｐ．ｆ．ｕ．のＭＤＶ−１株で感染され、すわわち、感染された細胞は未感染の細胞と混合された。完全な細胞変性効果が発生した後、ＤＮＡが感染された細胞から調製され、そして２μｇウイルスＤＮＡが１×１０６個の一次ＣＥＦ細胞に、１０μｇのｐＤＳ−ｐＨＡ１プラスミドＤＮＡと共にトランスフェクトされた。トランスフェクションの５日後、細胞は新鮮なＣＥＦと共に同時播種され、そして選択培地で重層された。
【００４７】
この手順は合計４回反復された。最後に、ＭＰＡ／キサンチン／ヒポキサンチンの存在下で増殖し得た組換えＭＤＶ−１からのＤＮＡが単離され、そして標識化ｐＨＡ１をプローブとして用いるサザンブロット解析に供された。ウイルスＤＮＡの部分が挿入されたＦプラスミド配列を含んだことが実証され得た（データ示されず）。１μｇのこのウイルスＤＮＡが、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＤＨ１０Ｂ細胞を形質転換するために使用された。形質転換された細菌は、３０μｇ／ｍｌクロラムフェニコールを含有する寒天上にプレートされ、そして単一のコロニーがつつかれた。細菌コロニーのＤＮＡが標準的なプラスミド調製手順（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９）によって抽出され、そして０．８アガロースゲル上で泳動された。
【００４８】
細菌コロニーのいくつかは、高い分子量の染色体外ＤＮＡを含むことが示され、コロニーのうちの３つ（ＢＡＣ１９、ＢＡＣ２０、およびＢＡＣ２４）がさらなる解析のために選択された（図２）。単離されたＢＡＣクローンをさらに特徴づけするために、プローブとして標識されたＢＡＣ１９ＤＮＡを用いる、ＢａｍＨＩまたはＥｃｏＲＩでの切断後の５８４Ａｐ８０ＣおよびＢＡＣ　ＤＮＡのサザンブロット解析が行われた。親の５８４Ａｐ８０Ｃの制限酵素フラグメントパターンに比較される場合、ＢＡＣ１９、ＢＡＣ２０、およびＢＡＣ２４のＤＮＡがほとんど同一の制限酵素フラグメントパターンを示したことが実証され得た（図３Ａ、およびＢ）。しかし、２つの顕著な例外が容易に認識された。５８４Ａｐ８０Ｃに存在する２０ｋｂｐ　ＢａｍＨＩ−Ａフラグメントは、すべての解析されたＢＡＣクローンに不在であった。その代わりに、１６および１０ｋｂｐの大きさのフラグメントが、ＢＡＣ１９、ＢＡＣ２０、およびＢＡＣ２４のＤＮＡにおいて検出された（図３Ｂ）。これらの２つのバンドは、伸長されたＢａｍＨＩ−Ａフラグメントを示し、Ｆプラスミドの挿入およびＵｓ２配列の欠失のために、さらなるＢａｍＨＩ部位が導入された（図１）。
【００４９】
ＥｃｏＲＩ消化されたＢＡＣ　ＤＮＡにおいて、Ｕｓ２遺伝子の欠失によって生じた５．８ｋｂｐ（ＢＡＣ配列）の１つのさらなるバンドおよびフラグメントの大きさの少数の変化が、観察された（図１および３Ｂ）。種々のクローンにおけるＢＡＣ配列の正確な挿入が、プラスミドｐＤＳまたはｐＨＡ１の標識化インサートをプローブとして用いるサザンブロットハイブリダイゼーションによってさらに解析され、そしてＢａｍＨＩ−またはＥｃｏＲＩ−消化ＤＮＡにおいて予測される制限パターンが観察された。ＢａｍＨＩ消化されたＢＡＣ　ＤＮＡにおいて、１６および１０ｋｂｐのＢａｍＨＩフラグメントは、ｐＤＳプローブと共に特異的に反応されたが、１０ｋｂｐフラグメントのみがプラスミドｐＨＡ１に由来するプローブと反応性であった（図１；図３ＣおよびＤ）。
【００５０】
ＥｃｏＲＩ消化されたＢＡＣ１９、ＢＡＣ２０、またはＢＡＣ２４のＤＮＡ。４．３、２．８、および１．７ｋｂｐのフラグメントは、ｐＤＳプローブと特異的に反応され、一方５．８および１．７ｋｂｐフラグメントはｐＨＡ１プローブと特異的にハイブリダイズされた（図１、図３ＣおよびＤ）。これらのフラグメントは、ｐＨＡ１配列の挿入後に予測されるフラグメントに正確に対応し（図１）、そしてＦプラスミド配列が、解析された全てのＭＤＶ−１　ＢＡＣにおいてＵｓ２　ＯＲＦの代わりに正確に挿入されたことが結論された。さらに、ＢＡＣ１９、ＢＡＣ２０、およびＢＡＣ２４の結合パターンにおけるいくつかの変化、たとえば、ＢａｍＨＩ消化されたＢＡＣ１９　ＤＮＡにおける約６．２ｋｂｐのさらなるバンド、またはＢＡＣ２０およびＢＡＣ２４のＥｃｏＲＩ消化されたＤＮＡにおけるさらなるバンドが、ＢａｍＨＩまたはＥｃｏＲＩ消化されたＤＮＡのいずれかにおいて注目された（図２、３ＡおよびＢ）。個々の制限酵素フラグメントの観察されたサイズ変化の問題を取組むために、標識化ＢａｍＨＩ−Ｄフラグメントでのハイブリダイゼーションが行われた。なぜなら独特の長い領域における末端および内部反復（ＴＲＬおよびＩＲＬ）におけるサイズ変化は一般的であるからである。
【００５１】
サザンブロッティングによって、ＢＡＣ１９、ＢＡＣ２０、またはＢＡＣ２４のＢａｍＨＩ−またはＥｃｏＲＩで消化されたＤＮＡのいずれかにおいて観察されたさらなるフラグメントは、実際ＴＲＬおよびＩＲＬにおける変化から生じたことが示された。一方、ＢａｍＨＩ−Ｄプローブを用いて、２つの広範なスメアが、ＢａｍＨＩで消化されたウイルス５８４Ａｐ８０Ｃ　ＤＮＡにおいて検出され、これは約９〜１５ｋｂｐ、および４〜８ｋｂｐ（それぞれ、病原性ＭＤＶ−１のＢａｍＨＩ−Ｄおよび−Ｈフラグメントに対応する、図１）に及んだが、明らかに区別される異なるバンドが解析されたすべてのＢＡＣクローンにおいて観察された（図４）。異なるＢＡＣクローンのすべての他の制限酵素フラグメントは、ウイルス５８４Ａｐ８０Ｃ　ＤＮＡの制限酵素フラグメントと同一であるようであった。これは、ＢａｍＨＩ−Ａ、−Ｂ、−Ｃ、およびＩ２フラグメントを含む、いくつかの他の標識化ＢａｍＨＩフラグメントをプローブとして使用することによって確認された（ＢａｍＨＩ−Ｃプローブについてのデータは図４において例示的に示される）。
【００５２】
クローン化されたＤＮＡからの感染性ＭＤＶ−１の再構築。ＢＡＣ１９、ＢＡＣ２０、またはＢＡＣ２４のＤＮＡは、一次ＣＥＦにトランスフェクトされた。トランスフェクション後３〜７日目にてＭＤＶ−１特異的ウイルスプラークが、抗ＭＤＶ−１　ｇＢ　ｍａｂを使用するＩＩＦによって実証されるように出現した。種々のＢＡＣのトランスフェクション後に救出されたＭＤＶ−１は次いで、新鮮なＣＥＦとともに同時播種され、そしてプラークの大きさが親の５８４Ａｐ８０Ｃによって誘導されるプラークの大きさに比較された。２日目ｐ．ｉ．で染色されるプラークについて例示的に示されるように、組換え体と親ウイルスとの間にプラークの大きさにおける明らかな差異はなんら検出されなかった（図５Ａ）。
【００５３】
ＢＡＣトランスフェクション後に回収されたＭＤＶ−１の生物学的特性をさらに特徴付けるために、これらのウイルスの増殖動力学が、親の５８４Ａｐ８０Ｃの増殖動力学に比較された。ＢＡＣの場合において、トランスフェクション後５日目で回収されたウイルスが、６ウェルプレート上で播種される新鮮なＣＥＦを感染するために使用された（５０ｐ．ｆ．ｕ．のウイルスが１×１０６細胞を含有する１つのウェルを感染するために使用された）。同様に、５８４Ａｐ８０Ｃの５０ｐ．ｆ．ｕ．が、同じ方法において新鮮なＣＥＦを感染するために使用された。種々の時点ｐ．ｉ．で、ウイルスは採集され、そして１０倍ウイルス希釈物を新鮮なＣＥＦ細胞とともに同時播種することによって力価測定した。これらの実験の結果は、図５Ｂにおいてまとめられる。
【００５４】
試験されたすべてのＭＤＶ−１　ＢＡＣが、親の５８４Ａｐ８０Ｃの増殖特性にほとんど同一であった増殖特性を示したことが実証され得た（図５Ｂ）。最大の力価は、７２時間ｐ．ｉ．にて達成され、そして１２０時間ｐ．ｉ．での観察期間の終わりまで実質的に一定のままであった。プラークの大きさおよび増殖特性から、本発明者らは、インビトロでのＭＤＶ−１　ＢＡＣの生物学的特性が、親株の生物学的特性から実質的に区別できなかったことを結論した。
【００５５】
ＢＡＣ由来のウイルスの安定性を評価するために、ＢＡＣ１９およびＢＡＣ２０のＢＡＣトランスフェクションの子孫が４回継代され、そしてウイルスＤＮＡが調製された。ウイルスＤＮＡはＢａｍＨＩまたはＥｃｏＲＩで切断され、０．８％アガロースゲル電気泳動によって分離され、そしてナイロンメンブレンにトランスファーされた。ハイブリダイゼーションが、ｐＤＳまたはｐＨＡ１プローブを使用して行われた。上記のように類似するＤＮＡフラグメントが観察され、そして結合パターンは、２つのプローブを用いて解析されたようにトランスフェクションの連続継代物と変化しなかった（図６）。これらの結果から、本発明者らは、Ｆプラスミド由来の配列が、ＣＥＦ細胞における連続継代後であっても、個々のＭＤＶ−１　ＢＡＣクローンから回収された５８４Ａｐ８０Ｃゲノム内に安定に挿入されたままであったことを結論した。
【００５６】
しかし、ＢａｍＨＩ−ＤフラグメントでのハイブリダイゼーションおよびＰＣＲ解析によって示されるように、１３２ｂｐ反復配列の可変性が回復され、そして反応バンドの拡散スメアが、最初のウイルス継代後既に、トランスフェクション子孫のＢａｍＨＩ−またはＥｃｏＲＩ−切断されたＤＮＡにおいて観察された（データ示されず）。
【００５７】
ＢＡＣ２０の変異誘発およびｇＢをコードする配列の欠失。次の実験において、ＢＡＣの変異誘発のために近年開発された方法が、ＢＡＣ２０からの２．８ｋｂｐ　ｇＢ遺伝子の２．３ｋｂｐを取り出すために適用された（図７）。ＢＡＣ２０を含有するＤＨ１０ＢへのプラスミドｐＧＥＴｒｅｃ（Ｎａｒａｙａｎａｎ）の形質転換後、ｋａｎＲ遺伝子が、ＭＤＶ−１　ｇＢ配列との相同組換えを許容したプライマーを用いて増幅され（表１；図８）、そしてＢＡＣ２０−ｐＧＥＴｒｅｃ細胞にエレクトロポレートされた。細菌は、クロラムフェニコールおよびカナマイシンを含有するＬＢ寒天上にプレートされ、そして二重耐性コロニーがつつかれた。個々のコロニーのＤＮＡ単離後、ｇＢ遺伝子内に欠失を保有する組換えＢＡＣ２０（２０ＤｇＢ）のサザンブロット解析が行われた。ＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲＩ、ＢｇｌＩＩ、またはＳｔｕＩでの切断後に、ｋａｎＲおよびｇＢ特異的プローブは２０ＤｇＢのフラグメントを検出し、これはｇＢをコードする配列へのｋａｎＲ耐性遺伝子の導入後に算定されるフラグメントに完全な一致にあった（図９）。−以前に報告されるように―アンピシリン耐性を付与するｐＧＥＴｒｅｃは、抗生物質の不在下で増殖されたＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ細胞から容易に喪失された（図９）。これらの結果から、本発明者らは、ｇＢオープンリーディングフレームが２０ＤｇＢからほとんど完全に除去されたことを結論した。
【００５８】
２０ＤｇＢから再構築されたｇＢネガティブなＭＤＶ−１の解析。ｇＢは今日までに解析されたすべてのヘルペスウイルスの増殖に必須であるので（Ｐｅｒｅｉｒａにおいて概説される）、ＨＣＭＶ即時型初期プロモーターの制御下でＭＤＶ−１　ｇＢを発現したＱＭ７細胞株が作製された。間接的な免疫蛍光解析は、細胞株ＭｇＢ１の実質的にすべての細胞が、ｍａｂ２Ｋ１１または回復期のニワトリ血清（ＭＤＳＩ）を使用して実証されるように、ＭＤＶ−１　ｇＢを構成的に発現した（図１０）。種々の細胞株におけるＢＡＣ２０および２０ＤｇＢの増殖を解析するために、ＤＮＡが調製され、そしてＣＥＦ、ＱＭ７、またはＭｇＢ１細胞をトランスフェクトするために使用された。トランスフェクション後３〜５日目で、ウイルスプラークがＢＡＣ２０で形質転換されたすべての細胞において観察された（図１０）。
【００５９】
しかし、２０ＤｇＢ　ＤＮＡのトランスフェクション後、プラークはｇＢを発言するＭｇＢ１細胞のみにおいて観察された（図１１）。２０ＤｇＢでトランスフェクトされたＣＥＦおよびＱＭ７細胞において、単一の細胞が、ｍａｂＨ１９（Ｌｅｅら）との反応性によって実証されるように、初期ＰＰ３８遺伝子を発現したが、プラーク形成は阻害された（図１１）。インビトロでのＭＤＶ−１細胞間伝播に必須であるｇＢのこれらの結果は、２０ＤｇＢで感染されたＭｇＢ１細胞を、ＣＥＦ、ＱＭ７、または新鮮なＭｇＢ１細胞と共に同時播種することによって確認された。一次トランスフェクション後に示されるように、プラーク形成はｇＢを発現する細胞との同時播種後にのみ観察された（表２）。これらの結果から本発明者らは、ＭＤＶ−１　ｇＢが、培養細胞においてＭＤＶ−１の細胞間伝播に必須に必要とされることを結論した。
【００６０】
マレク病ウイルスは感染された動物においてＴ細胞腫瘍および高い死亡率を引起すニワトリの重要な病原体であるが、感染の溶菌期、潜伏期、または腫瘍期における個々の遺伝子および遺伝子産物の機能についてはほとんど知られていない。ＭＤＶ−１遺伝子および遺伝子産物の解析は、２つの主要な理由のために非常に障害されてきた。第１に、ＭＤＶ−１で感染された培養細胞は遊離の感染性ウイルスを生じず、そして第２に、培養細胞におけるＭＤＶ−１の効果的な増殖は一次または二次ニワトリ胚線維芽細胞に制限される。
【００６１】
したがって、他のＡｌｐｈａｈｅｒｐｅｓｖｉｒｉｎａｅを変異誘発するための従来の相同組換えを使用する変異誘発は、困難であり、時間の無駄づかいであり、および一次細胞の一定の供給を必要とする。ＨＳＶおよびＰｒＶの変異誘発は、ＢＡＣ技術を使用することによって確かに容易にされたが、真核生物細胞における相同組換えに依存する従来の変異誘発は、これらの２つのウイルスについての標準的な技術を示し、および多くの変異体ウイルスが作製された。対照的に、ＭＤＶ−１　ＢＡＣの変異誘発について、クローニングおよび変異誘発は主要な利点である。一旦ＭＤＶ−１ゲノムはＢＡＣとしてクローン化され、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉにおいて安定に維持され得ると、必須遺伝子の変異体の作製および解析は比較的容易であるべきである。事実、感染性ＢＡＣとして、株５８４Ａｐ８０Ｃの完全なゲノムをクローン化することが可能であった。株５８４Ａｐ８０Ｃは、ＣＥＦ細胞における８０回の連続継代後の、非常に病原性＋（ｖｖ＋）ＭＤＶ−１株５８４Ａの子孫である（Ｗｉｔｔｅｒ、１９９７）。ＢＡＣ１９、ＢＡＣ２０、およびＢＡＣ２４に存在するクローン化されたＭＤＶ−１ゲノムの解析は、制限酵素パーターンの変化が明白であったことを実証した。
【００６２】
このヘテロ原性は、ＢａｍＨＩ−Ｄおよび−Ｈフラグメントにおける変化に起因され得た。種々の数の１３２ｂｐタンデム反復が、種々のＭＤＶ−１株に存在すること、および反復の数は、培養細胞において連続継代後に増加することが知られる（Ｍａｏｔａｎｉ、Ｓｉｌｖａ、Ｆｕｋｕｃｈｉ）。さらに、これらの単位の一定の数のが病原性株において実証されたので（Ｆｕｋｕｃｈｉら、１９８５；Ｂｒａｄｌｅｙら、１９８９）、タンデムな１３２ｂｐ反復の数は、発ガン性の喪失と関連されたが、広範に使用されるＲｉｓｐｅｎｓ　ＣＶＩ　９８８ワクチン株に対する近年の研究は、少数の１３２ｂｐ反復および病原性の直接的な相関は何もないかもしれないということを実証した。ＭＤＶ−１株５８４Ａｐ８０Ｃの場合において、ＢａｍＨＩ−Ｄフラグメントを用いる、制限酵素で消化されたウイルスＤＮＡのハイブリダイゼーションは、拡散バンドパターンを生じ、ウイルス集団に存在する反復の可変性の数を示す。対照的に、単一の強力に反応性のハンドが、同じプローブを用いて、ＢＡＣクローンのそれぞれにおいて同定された。しかし、ＢａｍＨＩまたはＥｃｏＲＩでの切断後の反応性バンドの大きさは、ＢＡＣ１９と、ＢＡＣ２０と、ＢＡＣ２４との間で変化し、１３２ｂｐ反復の異なる数を含むゲノムがクローン化されたことを示す。この解釈は、１３２ｂｐ反復を標的化するＰＣＲ解析によって実証された。５８４Ａｐ８０Ｃ（Ｂｅｃｋｅｒら、１９９３）のＤＮＡを用いて、ＰＣＲ産物の典型的なラダー様出現が得られたが、異なるバンドが、ＢＡＣ１９、ＢＡＣ２０、およびＢＡＣ２４の場合においてクローン化されたウイルスＤＮＡから増幅された。
【００６３】
それゆえ、異なるＢＡＣクローンの可変性の制限酵素パターンが、個々のクローンに存在する種々の数の１３２ｂｐ反復から生じ、これは感染性ウイルスは異なるＢＡＣクローンのそれぞれから単離されたＤＮＡのトランスフェクション後に取り出されたので、クローン化されたＤＮＡの感染力を影響しなかった。
【００６４】
完全なＭＤＶ−１ゲノムのクローニングおよびクローン化されたＭＤＶ−１　ＤＮＡの感染力の証明の後、直鎖状ＤＮＡフラグメントが細菌耐性ＤＮＡに再構成され、そしてｒｅｃＥ（Ｎａｒａｙａｎａｎ、ｍｕｙｒｅｒｓ）によって触媒される近年開発された変異誘発系が、ＢＡＣ２０のｇＢをコードする配列を欠失するために使用された。変異誘発は、プラスミドｐＧＥＴｒｅｃ上に存在するｒｅｃＥ、ｒｅｃＴ、およびｒｅｃＢ／Ｃを抑制するλｇａｍ遺伝子に基づく（Ｎａｒａｙａｎａｎら、１９９９）。
【００６５】
ウイルスゲノムを操作するために最初に使用された系の大きな利点は、（ｉ）わずか３０〜５０ｂｐの相同なアームが、検出されるべき特異的配列を標的するために必要とされる、すなわち、任意のオープンリーディングフレームの欠失が、組合せのカセットをクローン化する必要を伴わずに達成され得ること、（ｉｉ）方法は非常に早いこと、および（ｉｉｉ）変異誘発系を付与しそしてアンピシリン耐性を発現するｐＧＥＴｒｅｃベクターが、アンピシリンの不在下で迅速に細菌細胞から喪失されることである。ｐＧＥＲｒｅｃを含有するＢＡＣ２０細胞へのｇＢノックアウトＰＣＲ産物のエレクトロポレーション後、１０と３０との間のｃａｍＲおよびＫａｍＲ二重耐性コロニーが得られた。コロニーのうちの１つは、２０ＤｇＢ−１と呼ばれ、そしてこれがクロラムフェニコールおよびカナマイシンを含有する寒天上へのプレーティング後即座にｐＧＥＴｒｅｃを喪失したのでさらなる解析のために選択された。
【００６６】
サザンブロット解析は、２０ＤｇＢ−１におけるｇＢ遺伝子の首尾よい欠失およびＫａｎＲ遺伝子の挿入を実証した。２０ＤｇＢ−１でのＣＥＦ細胞のトランスフェクション後に回収されたＭＤＶ−１は、感染された細胞から隣接の細胞に伝播し得ず、ＭＤＶ−１　ｇＢは、他のヘルペスウイルスにおけるその対応物のように、完成力の細胞間伝播に必須であることを示す。ＭＤＶ−１は、培養細胞において非常に細胞随伴性であり、および培養培地に感染性ウイルスを放出しないので、本発明者らは、ウイルス入場におけるＭＤＶ−１　ｇＢの潜在的な役割を調査し得なかった。作製されたｇＢ変異体は、必須遺伝子の欠失を伴うＭＤＶ−１の第１の例を示し、およびＭＤＶ−１の場合において特に有用であるＢＡＣクローニングおよび変異誘発の能力を実証する。ＭＤＶ−１　ＢＡＣおよびＭＤＶ−１増殖を許容し、および−ウズラ線維芽ＱＴ３５細胞株とは異なり、ＭＤＶ−１配列を保有しない永久細胞株ＱＭ７（Ｚｅｌｎｉｋら、未発表）を使用することは、必須のＭＤＶ−１遺伝子を徹底的に解析するための優れた組合せを示す。さらに、種々のアルファヘルペスウイルスの遺伝子機能に対する比較解析は今やＭＤＶ−１を含み、そして１つのウイルスファミリーのＶＺＶまたはＢＨＶ−４のような非常に離れて関連されるメンバーに対する研究を可能とする。
【００６７】
本明細書中で提供されるようなクローン化されたゲノムを手近に用いて、溶菌、潜伏、腫瘍を誘導する遺伝子の詳述されるさらなる評価が、使用される遺伝子操作が非常に制限されたウイルスについて提供された。
【００６８】
【表１】
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【００６９】
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【００７０】
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【００７１】
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【００７２】
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【００７３】
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【図面の簡単な説明】
【図１】
完全なＭＤＶ−１ゲノムを保有するＢＡＣを作製するためのクローニング手順の模式的な説明。示されるのは、約１８０ｋｂｐ　ＭＤＶ−１ゲノムの機構（Ａ）、およびＦｕｋｕｃｈｉら（１１）に従うＢａｍＨＩ制限地図（Ｂ）である。独特の短い領域（Ｕｓ）およびＵｓ上に位置されるＯＲＦが示される（ＣおよびＤ）。Ｕｓ２遺伝子を保有する２．１および３．１ｋｂｐフラグメント（灰色の囲み）は、ＰＣＲによって増幅され、そしてプラスミドｐＴＺ１８Ｒにクローン化されて、組換えプラスミドｐＤＳを生じた。組換えプラスミドｐＨＡ１（１５）から放出された７．２ｋｂｐ　ＢＡＣベクターは、ｐＤＳに挿入されて、プラスミドｐＤＳ−ｐＨＡ１を与えた（Ｅ）。（２）に従う制限酵素部位は略記される：Ｂ＝ＢａｍＨＩ、Ｅ＝ＥｃｏＲＩ、Ｐ＝ＰｓｔＩ、Ｐａ＝ＰａｃＩ、Ｓ＝ＳａｌＩ。
【図２】
エチジュームブロミド染色された０．８％アガロースゲルのデジタル走査化画像。Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＤＨ１０ＢクローンのＢＡＣ１９、ＢＡＣ２０、およびＢＡＣ２４から単離されたＤＮＡは、ＢａｍＨＩまたはＥｃｏＲＩで切断され、そして分離された。制限酵素消化は、１ｋｂラダー（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）によって隣接される。アステリスクは、ＢＡＣクローン間の個々のフラグメントのさらなるバンドまたは大きさの変化を示す。
【図３】
ＢａｍＨＩまたはＥｃｏＲＩで切断され、０．８％アガロースゲル電気泳動によって分離され、そしてエチジュームブロミドで染色された（左側パネル）、５８４Ａｐ８０Ｃ（Ｖ）、ＢＡＣ１９、ＢＡＣ２０、およびＢＡＣ２４のＤＮＡのデジタル走査化画像。ナイロンメンブレンへのＤＮＡフラグメントのサザントランスファー後、プラスミドｐＤＳまたはｐＨＡ１から放出されたジゴキシゲニン標識化フラグメントでのハイブリダイゼーションが行われた。サイズマーカー（１ｋｂラダー、Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）および反応性バンドの大きさが与えられる。
【図４】
ＢＡＣ１９、ＢＡＣ２０、およびＢＡＣ２４　ＤＮＡにおける大きさの変化を解析するためのサザンブロットのデジタル走査化画像。５８４Ａｐ８０Ｃ（Ｖ）および個々のＢＡＣのウイルスＤＮＡは、ＢａｍＨＩまたはＥｃｏＲＩで処理され、そしてナイロンメンブレンにトランスファーされた。シートは、ジゴキシゲニン標識化ＢＡＣ１９　ＤＮＡまたは標識化ＢａｍＨＩ−Ｃ、またはＢａｍＨＩ−Ｄフラグメントとともにインキュベートされた。サイズマーカー（１ｋｂラダー、Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）が与えられた。５８４Ａｐ８０Ｃ　ＤＮＡの場合において、ＢａｍＨＩ−Ｄ配列とハイブリダイズされた場合のバンドのスメア様出現が、括弧によって示される。
【図５】
（Ａ）ＢＡＣ１９、ＢＡＣ２０、またはＢＡＣ２４　ＤＮＡののトランスフェクション後のＭＤＶ−１プラークのＩＩＦ解析。感染後５日目で、感染された細胞は固定化され、そして抗ｇＢ　ｍａｂ　２Ｋ１１を使用する間接的な免疫蛍光に供された。結合された抗体の検出は、抗マウスＡｌｅｘａ（商標）４８８（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｐｒｏｂｅｓ）を用いて行われ、そして核はヨウ化プロピジウムを用いて対比染色された。拡大率＝４００×
（Ｂ）ＭＤＶ−１株５８４Ａおよび種々のＢＡＣの増殖曲線。１００ｐ．ｆ．ｕ．の５８４Ａｐ８０ＣまたはＢＡＣ１９、ＢＡＣ２０、またはＢＡＣ２４のトランスフェクション子孫でのＣＥＦ細胞の感染後、ウイルス力価が、新鮮なＣＥＦ細胞を同時播種することによって、示された時間（ｐ．ｉ．）にて測定された。プラークは、ｍａｂ　２Ｋ１１での免疫蛍光染色後に計数された。
【図６】
ＢＡＣ１９およびＢＡＣ２０のトランスフェクション後に回収されたウイルスにおけるＢＡＣベクターの安定性を解析するためのサザンブロットのデジタル走査化画像。トランスフェクション子孫を、４回継代し、そして各継代後、ウイルスＤＮＡが単離された。ウイルスＤＮＡはＢａｍＨＩまたはＥｃｏＲＩで切断され、０．８％アガロースゲル電気泳動によって分離され、そしてナイロンメンブレンにトランスファーされた。サザンブロットハイブリダイゼーションが、プラスミドｐＤＳまたはｐＨＡ１のジゴキシゲニン標識化フラグメントを使用して行われた。略語：Ｖ＝５８４Ａｐ８０Ｃ、１９＝ＢＡＣ１９、２０＝ＢＡＣ２０。ＢＡＣ１９　ＤＮＡのトランスフェクション後の継代１〜４は、番号１〜４によって示される。ＢＡＣ２０　ＤＮＡのトランスフェクション後の継代４は、それぞれ、最後のレーンにロードされ、そして４ａによって示される。反応性フラグメントの大きさが与えられる。アステリスクは、１．６ｋｂバンドのマーカーを示す（１ｋｂラダー、Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）。
【図７】
（Ａ）ｇＢをコードする配列を取り出すためのＢＡＣ２０の変異誘発の模式的な説明。Ｌ−アラビノース誘導性ｒｅｃＥ、ｒｅｃＴ、およびｇａｍ遺伝子をコードする組換えプラスミドｐＧＥＴｒｅｃが、ＢＡＣ２０を含有するＤＨ１０Ｂ細胞に形質転換された。ｇＢ欠失を保有する５０ヌクレオチド相同アームをまた含んだプライマーを用いたプラスミドｐＥＧＦＰ−Ｎ１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）のｋａｎＲ遺伝子のＰＣＲ増幅後、１．６ｋｂｐ　ＰＣＲ増幅物が、ＢＡＣ２０およびｐＧＥＴｒｅｃを保有するＤＨ１０Ｂ細胞にエレクトロポレートされた。細菌配列は、３０μｇ／ｍｌカナマイシンおよび３０μｇ／ｍｌクロラムフェニコールを含有する寒天上にプレートされた。二重耐性コロニーがつつかれ、そしてさらなる解析に供された。
（Ｂ）ＭＤＶ−１におけるｇＢ遺伝子の位置およびＢＡＣ　２０ＤｇＢに存在する欠失の模式的な説明。
【図８】
ＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲＩ、ＢｇｌＩ、またはＳｔｕＩで切断され、０．８％アガロースゲル電気泳動によって分離された（左側パネル）、ＢＡＣ２０および２０ＤｇＢ　ＤＮＡを含有する、エチジュームブロミドで染色された、０．８％アガロースゲルの走査化画像。ＤＮＡフラグメントは、ナイロンメンブレンにトランスファーされ、そしてジゴキシゲニン標識化ｋａｎＲ−またはｇＢ特異的プローブでハイブリダイズされた。反応性ＤＮＡフラグメントの大きさが示される。略語：Ｂ＝ＢａｍＨＩ、Ｅ＝ＥｃｏＲＩ、Ｂｇ＝ＢｇｌＩ、Ｓ＝ＳｔｕＩ。
【図９】
ＭＤＶ−１　ｇＢを構成的に発現するＭｇＢ１細胞の共焦点レーザー走査解析。ＭｇＢ１またはＱＭ７細胞が、カバーガラス上に播種され、そして、抗ｇＢ　ｍａｂ　２Ｋ１１または回復期のニワトリ血清ＭＤＳＩと共にインキュベートされた。二次抗体は、抗マウスまたは抗ニワトリＩｇＧ　Ａｌｅｘａ（商標）４８８結合体（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｐｒｏｂｅｓ）であった。核をヨウ化プロピジュームで対比染色された。バーは１０μｍを示す。
【図１０】
ＢＡＣ２０（上部パネル）または２０ＤｇＢ（下部パネル）でのトランスフェクション後のＭｇＢ１、ＱＭ７、またはＣＥＦ細胞のＩＩＦ解析。トランスフェクション後５日目にて、細胞はアセトンで固定化され、そして抗ｐｐ３８　ｍａｂ　Ｈ１９と共にインキュベーションされた。二次抗体は、抗マウスＩｇＧ　Ａｌｅｘａ（商標）４８８（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｐｒｏｂｅ）であった。ＢＡＣ２０　ＤＮＡのトランスフェクション後、ＭＤＶ−１プラークはすべての細胞株において観察されたのに対して、２０ＤｇＢでのトランスフェクション後、ウイルスプラークはＭｇＢ１細胞においてのみ観察された。単一の感染された細胞のみが、ＱＭ７およびＣＥＦ細胞（矢頭）において観察された。拡大率＝４００×。
【図５】
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【図７】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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