(57)【要約】本発明はバシラス属の好気性微生物を糖類を追加供給しながら培養することにより高濃縮ポリグルタミン酸を製造する方法を提供する。ポリグルタミン酸を製造する本方法は糖類を培養物に供給しながら流加式又はバッチ式培養方法でバシラス属を培養する工程を含む。高濃縮ポリグルタミン酸を製造する本方法は工業用規模の発酵に適用可能であり、ポリグルタミン酸の大量生産を費用効率のよい方法で実行することができる。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
グリセロール、クエン酸及びグルタミン酸を含む培地に糖類を添加して２ないし１０ｇ／Ｌの範囲の糖濃度に維持しながら流加式（ｆｅｄ−ｂａｔｃｈ）条件下でバシラス属微生物を培養する工程、及びそれよりポリグルタミン酸を得る工程を含む高濃縮ポリグルタミン酸の製造方法。
【請求項２】
バシラス属微生物がバシラス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ，ＡＴＣＣ ９９４５Ａ）である、請求項１に記載の高濃縮ポリグルタミン酸の製造方法。
【請求項３】
糖が果糖、乳糖、グルコース、ショ糖、麦芽糖及びガラクトースからなる群から選択される、請求項１に記載の高濃縮ポリグルタミン酸の製造方法。
【請求項４】
グリセロール、クエン酸及びグルタミン酸を含む培地に糖類を添加して２ないし１０ｇ／Ｌの範囲の糖濃度に維持しながらバッチ式（ｂａｔｃｈ）条件下でバシラス属微生物を培養する工程、及びそれよりポリグルタミン酸を得る工程を含む高濃縮ポリグルタミン酸の製造方法。
【請求項５】
バシラス属微生物がバシラス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ，ＡＴＣＣ ９９４５Ａ）である、請求項４に記載の高濃縮ポリグルタミン酸の製造方法。
【請求項６】
糖が果糖、乳糖、グルコース、ショ糖、麦芽糖及びガラクトースから成る群から選択される、請求項４に記載の高濃縮ポリグルタミン酸の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は糖類の追加供給を伴う高濃縮ポリグルタミン酸の製造方法に関する。より詳しく言えば、本発明は培養物に糖類を追加供給しながら、流加式（ｆｅｄ−ｂａｔｃｈ）又はバッチ式条件下でバシラス属微生物を培養することにより、望ましくない副産物が形成されることなく高収率で高濃縮ポリグルタミン酸を製造する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
微生物によって生産されるポリグルタミン酸は完全に生分解性であり、そのため、食品及び化粧品の成分として使用されてきた。最近、医療材料（参照： Ｋｉｓｈｉｄａ， Ａ． ａｎｄ Ｍｕｒａｋａｍｉ， Ｋ． ｅｔ ａｌ．， Ｊ． ｏｆ Ｂｉｏａｃｔｉｖｅ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ， １３：２７１−２７８， １９９８）、機能性担体、膜材料及び電気材料としてのポリグルタミン酸の利用に関する研究が当技術分野において積極的に行なわれている（参照：アメリカ特許第５６９３７５１号）。高濃縮ポリグルタミン酸を生産するための絶え間ない努力の中から、フラスコ又はバッチ式発酵に最適化された培地組成物（参照： Ｋｏ， Ｙ．Ｋ． ａｎｄ Ｇｒｏｓｓ， Ｒ．Ａ．， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ＆ Ｂｉｏｅｎｇ．， ５７：４３０−４３７， １９９８）及び流加式発酵用のクエン酸を添加した効果的な培地（参照：韓国特許第２５０６２７号）が報告されているが、それらは培地中に含まれるグリセロール及びクエン酸が微生物にはエネルギー源として容易に利用できないという点で満足できないものであった。それにもかかわらず、グルコース又は果糖のような有効な糖類が添加された流加式発酵用の培地についての教示はされていない。糖類は微生物類の代謝経路を通して多量のＡＴＰを産生するので、ポリグルタミン酸の合成経路のような大量のＡＴＰを消費する過程において良好なエネルギー源となる（参照：Ｔｒｏｙ Ｆ．Ａ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２４８：３０５−３１５， １９７３）。
従って、微生物が容易に利用できる糖類を効率よく供給することによりポリグルタミン酸の収率を高められる発酵技術の開発が引き続き求められている。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
本発明者らは高濃縮ポリグルタミン酸を高い収率で生産できる発酵技術を確立するため鋭意努力した結果、グリセロール、クエン酸及びグルタミン酸を含む培地に糖類を追加供給しながら、流加式又はバッチ式条件下でバシラス属微生物を培養することにより、望ましくない副産物が形成されることなく高収率で高濃縮ポリグルタミン酸が得られることを見出した。
すなわち、本発明の主たる目的は糖類の追加供給を伴う高濃縮ポリグルタミン酸の製造方法を提供することにある。
上記の及びその他の本発明の目的及び特徴は、添付の図面と合わせて以下の説明から明らかになるであろう。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
糖類を追加供給しながらバシラス属微生物を培養することにより高濃縮ポリグルタミン酸を製造する方法は、グリセロール、クエン酸及びグルタミン酸を含む培地に糖類の濃度が２ないし１０ｇ／Ｌの範囲に維持されるように糖類を追加供給する工程を含むことにより特徴付けられる。バシラス属微生物は、これに限定されるものではないが、好ましくはバシラス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ，ＡＴＣＣ ９９４５Ａ）であり、発酵方法はバッチ式発酵又は流加式発酵でもよく、好ましくは流加式発酵である。発酵をバッチ式条件下で行う場合は、糖類濃度を好ましくは２ないし１０ｇ／Ｌに調整し、流加式条件下では糖類を追加的に加えることにより２ないし３ｇ／Ｌに調整することが好ましい。糖類としては、果糖、乳糖、グルコース、ショ糖、麦芽糖またはガラクトースなどの単糖または二糖が挙げられるが、最も好ましくはグルコースである。
【０００５】
微生物がポリグルタミン酸を合成する際には多量のＡＴＰが消費されるという従来の知見の元で、微生物がエネルギー源として容易に利用できる糖類を追加的に供給することによって、生産収率及び生産速度の改善をめざして鋭意努力してきた。
【０００６】
まず、ポリグルタミン酸生産における糖類の効果を調べるために、バッチ式条件下で発酵物に種々のタイプの糖類を種々の濃度で加え、その結果起こるポリグルタミン酸の合成と多糖類のような副産物の形成を調査した。この実験から、糖類を追加供給することによりポリグルタミン酸の収率を高めることはできるが、糖類の濃度が一定以上になると多糖類などの望ましくない副産物の形成も検出されることが分かった。副産物はポリグルタミン酸の単離及び精製において多くの問題を引き起こし、小規模の発酵では非常に少量の副産物であったとしても大規模発酵に移行した際に重大な問題を引き起こしかねないので、望ましくない副産物を形成しないように糖類の濃度を可能な限り低く維持することが極めて重要である。糖類の濃度を副産物が形成されないように十分に低く保っていても、一定時間以後に蓄積される酢酸により引き起こされる微生物の生長速度の低下によりポリグルタミン酸の収率が減少し、それにより、発酵期間中を通して糖類の濃度を低く一定に保つことができる流加式発酵を用いるのが好ましいということが分かった。
【０００７】
ポリグルタミン酸を生産するための従来の流加式発酵は、クエン酸を除いた培地で微生物を培養し、微生物の生育が一定の段階に到達した後にクエン酸を追加するか、又はクエン酸濃度は低く保ったまま濃縮されたＥ−培地を添加することにより行なわれる。本発明では、利用可能なエネルギー源の欠乏を克服することによって生産収率及び生産速度の改善が成し遂げられた。すなわち、流加式条件下で糖類の追加供給によって得られる一定の糖類濃度で微生物を生育させた。上記のバッチ式発酵で示したように、グルコースを用いた場合に最良の結果が得られ、すなわち、グルコースをエネルギー源として用い、これを副産物や過剰な酢酸の形成を避けるために低濃度で供給した。その結果、流加式発酵によるポリグルタミン酸の収率は従来のバッチ式発酵の場合に比較して実質的に増加した。
【０００８】
【実施例】
以下の実施例で本発明をさらに説明するが、これらは本発明の範囲を制限するものではない。
【０００９】
実施例１：バッチ式培養において糖類の効果
ポリグルタミン酸の濃度を測定し培養物中に形成される多糖類を同定するために、２５０ｍＬのフラスコ中でバシラス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ，ＡＴＣＣ ９９４５Ａ）を種々の糖類を種々の濃度で添加した５０ｍＬのＥ−培地中で、２５０ｒｐｍ、３７℃の条件下で６０時間培養し、その後、生産されたポリグルタミン酸の濃度を測定し生産された多糖類のタイプを同定した（表１参照）。Ｅ−培地の組成は以下の通りである：８０ｇ／Ｌ グリセロール、２０ｇ／Ｌ Ｌ−グルタミン酸、１２ｇ／Ｌ クエン酸、７ｇ／Ｌ ＮＨ４Ｃｌ、０．５ｇ／Ｌ Ｋ２ＨＰＯ４、０．５ｇ／Ｌ ＭｇＳＯ４ ７Ｈ２Ｏ、０．０４ｇ／Ｌ ＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏ、０．１５ｇ／Ｌ ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ及び０．１０４ｇ／Ｌ ＭｎＳＯ４・Ｈ２Ｏ。
【００１０】
【表１】
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【００１１】
上記表１に示すように、糖類の濃度が４０ｇ／Ｌ以上の場合、添加された糖の種類に関わらず全てのサンプルで多糖類副産物の形成が検出された。グルコース濃度を１０ｇ／Ｌ以下に維持した場合、多糖類副産物が形成されることなく２４ｇ／Ｌのポリグルタミン酸が生産され、これはＥ−培地を用いて得られた１５ｇ／Ｌのポリグルタミン酸濃度より１．６倍高い。上記の結果より、糖類の種類によって違いはあるが、副産物の形成を防ぐことによりポリグルタミン酸の収率を改善するには、添加する糖類の濃度が１０ｇ／Ｌを越えないようにすべきであることが見出された。従って、糖類を最適な濃度で炭素源に用いることによりポリグルタミン酸の生産性を向上させられることが明らかに証明された。
【００１２】
実施例２：グルコースの追加供給を伴うバッチ式発酵
糖類の濃度を１０ｇ／Ｌ以下に保つと副産物の形成が実質的に減少するため、バッチ式発酵条件下で１０ｇ／Ｌグルコースを添加したＥ−培地中でバシラス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ，ＡＴＣＣ ９９４５Ａ）を生育させた。５Ｌの発酵槽中３ＬのＥ−培地で３７℃、ｐＨ６．５の条件下で発酵を行い、純粋な酸素と空気の混合物を流入させて１０％以上の空気飽和度で溶存酸素圧を維持した（図１参照）。図１は糖類の追加供給を伴うバッチ式発酵方法における、ポリグルタミン酸生産の時間経過を示すグラフである；（●）はグルコースの濃度、（▲）はアセテートの濃度、及び（■）はポリグルタミン酸の濃度をそれぞれ示す。図１に示すように、２３時間の発酵後、３２ｇ／Ｌのポリグルタミン酸が得られたが副産物は形成されなかった。また、培地中のアセテートの濃度は培養時間とともに増加し、その結果、細胞の成長率が急激に低下し、続いてポリグルタミン酸の生産率も低下した。
【００１３】
実施例３：流加式発酵
実施例２に示されたようにアセテートの形成を抑制することによりポリグルタミン酸の収率を上昇させられるという仮定の下で、一定濃度の糖類を維持することができる流加式発酵培養を行なった。ポリグルタミン酸を生産するには、流加式方法は基質を適当に供給することによって収率と濃度を同時に増加させることができる効率よい発酵方法である。そこで、代表的な糖であるグルコースをポリグルタミン酸の生産性と濃度を増加させるために流加式発酵に用いた。グルコースを添加する以外は、実施例２と同じの培養条件を用いた（図２参照）。グルコースは指数成長期の初期段階で添加し、培養物中のグルコース濃度は３ｇ／Ｌに維持した。その結果、実施例２のバッチ式発酵とは逆に、２０時間の発酵後アセテートは検出されなかった。図２はグルコース濃度を３ｇ／Ｌに維持したポリグルタミン酸の流加式発酵を示すグラフであり；（●）はグルタミン酸濃度、（▲）はポリグルタミン酸濃度、（◆）はクエン酸濃度、及び（■）はグリセロール濃度をそれぞれ示す。図２に示すように、２２時間の発酵後５７．５ｇ／Ｌポリグルタミン酸が得られ、これは時間当り２．６ｇ／Ｌであり、従来の方法に比較して生産性が２倍上昇している。また、グリセロール、クエン酸又はグルタミン酸の微生物による取り込みはグルコースの添加による影響を受けないことが見出されている。微生物による培地からのグリセロール、クエン酸又はグルタミン酸の取り込みはポリグルタミン酸の生産において必須の過程であることが知られている（参照：韓国特許第２５０６２７号）ため、エネルギー源としてのグルコースの添加は、微生物のグリセロール、クエン酸又はグルタミン酸の取り込みを阻害してそれによりポリグルタミン酸生産の減少をまねくことがある異化作用の抑制をもたらさなかったと言うことができる。
【００１４】
比較実施例１： バッチ式発酵
本発明のポリグルタミン酸の製造方法が従来の方法よりも優れていることを証明するために、糖類の添加を除けば実施例３に述べたのと同等なバッチ式発酵条件下でバシラス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ，ＡＴＣＣ ９９４５Ａ）をＥ−培地中で生育させた。（図３参照）。図３はバッチ式発酵における、ポリグルタミン酸生産の時間経過を示すグラフである：（●）はグルタミン酸濃度、（▲）はポリグルタミン酸濃度、（◆）はクエン酸濃度、及び（■）はグリセロール濃度をそれぞれ示し、２２時間の発酵後２３．５ｇ／Ｌのポリグルタミン酸が得られた。
【００１５】
実施例２及び３並びに比較実施例１の結果を比較して、糖類の追加供給を伴うバッチ式発酵によるポリグルタミン酸の収率は従来の方法のような糖類の追加供給を行なわない場合よりも高く、また糖類を追加供給する場合はバッチ式発酵よりも流加式発酵のほうがポリグルタミン酸のより高い生産性をもたらすことが見出された（図４参照）。
【００１６】
実施例４：大規模の流加式発酵
実施例３で開示した方法がポリグルタミン酸の大規模発酵に適用できるかどうかを調べるために、実施例３のようにグルコースの追加供給を伴う流加式発酵を３０Ｌと３００Ｌの醗酵槽でそれぞれ行なった。３０Ｌ醗酵槽には２０ＬのＥ−培地を加え、３００Ｌ醗酵槽には２００ＬのＥ−培地を加え、３００Ｌ醗酵槽中の溶存酸素圧は、純粋酸素を使用する代りに０．１ないし０．４ａｔｍの圧力をかけることにより５ないし１０％空気飽和度に調節した。２２時間の発酵の後、３０Ｌ及び３００Ｌの醗酵槽からそれぞれ５５ｇ／Ｌ及び４６ｇ／Ｌのポリグルタミン酸が得られた（図５参照）。図５は大規模な流加式発酵法における、ポリグルタミン酸生産の時間経過を示すグラフである：（●）は３０Ｌ醗酵槽を示し、（■）は３００Ｌ醗酵槽を示す。図５に示すように、３０Ｌ醗酵槽から得られた結果は５Ｌ醗酵槽からの結果と同様であった、３００Ｌ醗酵槽でのポリグルタミン酸の濃度と収率はいくらか低いことがわかった、これは培養液の高粘性によって起きる不均一な混合と物質移動率の低さによるものと推測される。従って、醗酵槽の最適な設計により上記の問題を克服することができれば、大規模の発酵も小規模の発酵と同様の結果をもたらすものと期待できる。５５ｇ／Ｌ及び４６ｇ／Ｌのポリグルタミン酸濃度は従来の方法によって得られるものより高く、そのため、実施例３において提示された方法は大規模の発酵にも適用できることが分かった。上記の戦略がとりわけポリグルタミン酸を生産するバシラス属微生物に適用できることは当業界では自明であろう。
【００１７】
【発明の効果】
以上に説明及び立証したように、本発明は容易に利用可能な糖類を培養物に追加供給しながら、流加式又はバッチ式条件下でバシラス属微生物を培養することにより、望ましくない副産物が形成されることなく高収率で高濃縮ポリグルタミン酸を製造する方法を提供する。高濃縮ポリグルタミン酸を製造する本方法は工業用規模の発酵に適用可能なので、ポリグルタミン酸の大量生産が費用効率の良い方法で実行することができる。
【００１８】
【図面の簡単な説明】
【図１】糖類の追加供給を伴うバッチ式発酵方法におけるポリグルタミン酸生産の時間経過を示すグラフである。
【図２】糖類の追加供給を伴う流加式発酵方法におけるポリグルタミン酸生産の時間経過を示すグラフである。
【図３】バッチ式発酵方法におけるポリグルタミン酸生産の時間経過を示すグラフである。
【図４】種々の発酵方法によって生産されるポリグルタミン酸の濃度比較を示すグラフである。
【図５】大規模な流加式発酵法における、ポリグルタミン酸生産の時間経過を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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