(57)【要約】本発明は、ロタウィルス感染および他の病原性微生物を阻害するとともに、胃酸及び胆汁酸に対する耐性を有した、動物由来のラクトバチルス・ロイテリ変異株に関する。また、本発明は、宿主の身体全体の健康に対してプロバイオティクスとして様々に寄与し、ロタウィルスおよび他の腸内病原体に関連する疾病または状態を予防および治療するための前記変異株を含む予防的および治療的組成物にも関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ロタウィルスおよび他の病原性生物の増殖を阻害する、ラクトバチルス・ロイテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｅｕｔｅｒｉ）Ｐｒｏｂｉｏ‐１６（受託番号：ＫＣＣＭ１０２１４）。
【請求項２】
有効量の請求項１に記載のプロバイオティックなラクトバチルス・ロイテリＰｒｏｂｉｏ‐１６と、担体とを含む医薬用、獣医用または食用組成物。
【請求項３】
前記組成物は、経口投与された場合に、ヒトを含む哺乳動物内の消化器系細菌を変化させるのに有用であることを特徴とする請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
前記組成物は、経口投与された場合に、ヒトを含む哺乳動物内の下痢の予防および治療に有用であることを特徴とする請求項２に記載の組成物。
【請求項５】
有効量の請求項２に記載のプロバイオティック組成物を含む供給原料または食品組成物。
【請求項６】
ヒトを含む哺乳動物において感染性下痢の発生を低減するか、該感染性下痢を治療するための方法であって、前記方法は、有効量の請求項１に記載のラクトバチルス・ロイテリＰｒｏｂｉｏ‐１６または請求項２に記載のプロバイオティック組成物を前記哺乳動物に経腸投与することを含む方法。
【請求項７】
ヒトを含む哺乳動物においてロタウィルスによって引き起こされる感染の発症を遅延させるか、該感染を治療するための方法であって、前記方法は、有効量の請求項１に記載のラクトバチルス・ロイテリＰｒｏｂｉｏ‐１６または請求項２に記載のプロバイオティック組成物を前記哺乳動物に経腸投与することを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、広義には新規プロバイオティック微生物に関し、より詳細には、ロタウィルス感染および他の病原性微生物を阻害するとともに、胃酸および胆汁酸に耐性を有する動物由来のラクトバチルス・ロイテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｅｕｔｅｒｉ）変異株に関する。また、本発明は、プロバイオティクスとして様々に宿主の身体全体の健康に寄与するとともに、ロタウィルスおよび他の腸内病原体に関連する疾病または状態を予防および治療するための、前記ラクトバチルス・ロイテリ変異株を含む予防用および治療用組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
下痢は世界中で最もありふれた感染性疾病の１つである。様々なウィルス性、細菌性、および寄生性物質が急性の感染性の下痢や胃腸炎の原因として疑われるが、ロタウィルスは、例えば小児や若年動物においては、先進国および発展途上国のいずれにおいても下痢や胃腸炎の最も重要なウィルス性物質として認められている。
【０００３】
ロタウィルスは、先進国および発展途上国のいずれにおいても、乳児や幼い子供における重篤な下痢症状の原因の３５〜５０％を占め、この年齢層における重篤な下痢の最も重要な病因物質である。ロタウィルスは、ブタ集団を含む多くの動物において下痢を引き起こす最も重要なウィルス性物質でもある。ロタウィルスを原因とする下痢は、通常は水状からペースト状の粘度を有し、色はかなり多様であろう。罹患したブタは通常は、元気がなく、食欲もなく、脱水症状を示す。ロタウィルスが小腸内の絨毛を破壊することにより、下痢において見られる臨床的兆候が発生する。さらに、ロタウィルスは、胃腸炎の発生と、罹患動物内の腸内細菌による二次感染とも結びつけられてきた。すなわち、ロタウィルス感染は二次細菌が伴う場合にその治療がより困難になり、発症の重症度が増すことになる。ロタウィルスに対する治療は、ロタウィルス感染とともに起こる脱水と飢餓に対処する対症治療を基本としている。二次細菌感染に対しては抗生物質を用いた治療しか有効でなく、抗生物質が食用肉中に残る可能性があるという欠点となっている。ロタウィルス感染の予防にはワクチン接種が有効かもしれないが、副作用を与える可能性もある。
【０００４】
腸内に住む細菌もまた、コロニー形成した宿主内で腸内の下痢などの疾病を引き起こすことがある。ヒトおよび動物の腸内には、腸内微生物叢を構成する広範な微生物が存在している。これらには、乳酸菌などの宿主にとって有益な細菌だけでなく、大腸菌、サルモネラ菌、ブドウ球菌などの宿主にとって潜在的もしくは直接的に有害な細菌も含まれる。ストレスの増加や有害微生物の感染などの外部環境の変化によって、腸内微生物叢の正常なバランスが乱されて、有益な微生物よりも有害な微生物が優勢になってしまうことがある。微生物叢の変化は宿主の健康状態に下痢などの異常を来すことがあり、最悪の場合には死に至らしめることもある。有害な微生物の数が腸内において高いレベルに達すると、宿主に対し通常は抗生物質投与による治療が行われる。この治療は有害な微生物の抑制には有効かもしれないが、抗生物質は宿主から完全には排出されず、宿主の組織内に部分的に残留する。さらに、抗生物質を長期にわたって投与すると、有害な微生物において抗生物質耐性が誘導され、最終的にはそれらが引き起こしている疾病を効果的に治療することができなくなる。さらに、食品衛生から生じた環境への関心に応えた近頃の法律は、家畜類の肉、牛乳および卵中の許容抗生物質レベルを実質的に引き下げるように制定されている。したがって、抗生物質の誤用や乱用は勿論のこと、その使用に対しての問題も起こりうる。
【０００５】
したがって、腸内のウィルスや微生物に起因する感染性下痢、ならびに抗生物質治療に関連する下痢を治療および予防する方法を開発することが緊急に必要とされている。
例えば、抗微生物成分を生産することにより、あるいは競合的増殖によって、宿主の微生物バランスに有益に影響する微生物種に対する関心が高まっている。
【０００６】
プロバイオティクスは、動物およびヒト宿主に有益に影響を及ぼす生きた微生物として定義される種類の微生物である。有益な効果としては、腸内微生物叢の微生物バランスの改善または常在微生物叢の特性を改善することによるものが挙げられる。ヒトおよび動物におけるプロバイオティクスをもっと理解するためには、以下の出版物を参照するとよい（フラー・アール．（Ｆｕｌｌｅｒ  Ｒ）：ヒトおよび動物のプロバイオティクス（Ｐｒｏｂｉｏｔｉｃｓ  ｉｎ  Ｍａｎ  ａｎｄ  Ａｎｉｍａｌｓ）、Ｊ  Ａｐｐｌ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、１９８９年、第６６巻、３６５〜３７８頁）。健康へ利益を与える積極的な方法での微生物の使用については、プロバイオティクスは腸内に存在する有益な微生物を調合することによって調製される。プロバイオティクスの調製に利用できる微生物の例としては、好気性細菌、嫌気性細菌、乳酸菌、および酵母が挙げられるが、乳酸菌が最も好まれる。プロバイオティクスは、抗生物質の乱用によって起こるような副作用をもたらすことなく、有害な微生物の異常な増殖を阻害して正常な腸内細菌叢を維持するとともに、病気の発症を防止するという利点を有している。プロバイオティック微生物の経腸投与の利点としては、有害微生物叢のコロニー形成に対する耐性を高め、他の多数の健康増進の領域を改善して疾病に対する宿主防御を強化することなどが知られている。プロバイオティクスは、新生児または高用量の抗生物質投与を受けた成人におけるバランスのとれた常在腸内微生物叢の形成または確立において重要な役割を果たすことが示唆されている。
【０００７】
家畜類または家禽類における下痢の予防と治療のために、抗生物質以外の物質として使用するための生きた細菌組成物が開発されてきた。生きた細菌組成物において、有用な生きた細菌を家畜類または家禽類に直接投与し、ここで該細菌は、生きた細菌が腸内を通過する間に、家畜類の腸内に保有されるか、あるいは例えば大腸菌などの腸内毒性細菌と拮抗して、該腸内毒性細菌を排除する。その結果、腸内細菌微生物叢が改善されて、家畜類の下痢が予防および治療される。さらに、研究結果は、家畜類にプロバイオティクスを持続的に投与すると、給餌効率が上昇し体重増加が起こることを開示している。
【０００８】
効果的に使用するために、プロバイオティクスは有害微生物に対する阻害活性を有することに加えて、酸、特に胃酸および胆汁酸に対して耐性を有していなければならない。プロバイオティクスは通常、栄養補助食品または機能性食品と様々に呼ばれる特別にデザインされた食品中で摂取されるため、腸に到達するまでに、まず最初に強い酸である胃液中、次に胆汁中で酸性の環境を経ることになる。一般に、細菌は胃酸および胆汁酸によって殺されるか不活性化される。したがって、プロバイオティクスは腸に到達してそれらの有益な機能を発揮するためには、胃液および胆汁を生き延びなければならない。
【０００９】
様々な種類の乳酸菌がすでにプロバイオティクスとして開示されている。中でもラクトバチルス属は最も研究された種であり、ある例では病原体の増殖に対抗することが示されている。実際に、近年ではラクトバチルス治療が増加し、プロバイオティックなラクトバチルス属が、（ａ）腸内微生物叢を改善し、（ｂ）下痢を防止し、（ｃ）ヒト集団に対しては大腸ガンを予防し、（ｄ）ラットにおける実験的に誘導された大きな腫瘍の発生率を減少させ、（ｅ）ヒトにおける前発がん物質から近発がん物質（ｐｒｏｘｉｍａｌ  ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎ）への変換を触媒することが知られている細菌酵素の糞便中濃度を減少させ、（ｆ）ブタにおける血清コレステロールレベルを減少させることが発見されている。最近、ラクトバチルス・ロイテリＢＳＡ‐１３１として識別される乳酸菌が、胃酸および胆汁酸に耐性を有するとともに、腸内の有害微生物の増殖を阻害することが報告された（チャン（Ｃｈａｎｇ）ら、Ｋｏｒｅａｎ  Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，第２７巻、２３〜３７頁；韓国特許第１０‐２１１５２９‐００００号）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明に至るまでに、本願発明者らはより強力なプロバイオティック活性を有する新規の株を得るために集中的かつ徹底的な研究を行い、その結果、ブタの排泄物から嫌気的に分離した菌株が、ロタウィルスを含む有害微生物に対する優れた阻害活性を有し、韓国特許第１０‐２１１５２９‐００００号で請求された従来のラクトバチルス・ロイテリＢＡＳ‐１３１を超える胃酸および胆汁酸耐性を有していることを発見した。新規の菌株は、ラクトバチルス・ロイテリの一種であると同定された。
【００１１】
したがって、本発明では、ロタウィルスおよび他の腸内病原性微生物の増殖を阻害して、それらの感染を防止することにおける、新規プロバイオティック乳酸菌の有効性を実証する。
【００１２】
本発明は、ブタの胃腸管から単離され、特に、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの病原性微生物に対する阻害活性、ならびに酸および胆汁に対する耐性によって選択された乳酸菌について記載する。
【００１３】
したがって、本発明の目的は、胃酸および胆汁酸に対して耐性を有するとともに、ヒトおよび動物に対して無害の新規腸内細菌株を提供することである。
本発明の別の目的は、食品、ヒトおよび家畜類に対する医薬品、ならびに供給原料において使用されるプロバイオティクスであって、腸内の有害な微生物、特にロタウィルスの増殖に対して優れた阻害活性を示すプロバイオティクスを提供することである。
【００１４】
本発明のさらなる目的は、ロタウィルスおよび他の有害な微生物の増殖を阻害する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明に基づけば、上記の目的は、ロタウィルスおよび他の病原性生物の増殖を阻害するラクトバチルス・ロイテリＰｒｏｂｉｏ‐１６（受託番号ＫＣＣＭ１０２１４）を提供することにより達成できた。
【００１６】
本発明の他の目的、利点および特徴は、当業者であれば以下の考察から明らかになるであろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
ブタに由来する腸内細菌であり、嫌気性条件下で成育可能な新規の株である、ラクトバチルス・ロイテリＰｒｏｂｉｏ‐１６が、ロタウィルスおよび他の微生物の増殖を阻害し、これにより、例えば家畜類、家禽類、ペット動物などの哺乳動物の下痢を予防および治療する効果を有することが発見された。
【００１８】
したがって、本発明は新規腸内細菌の同定と特性分析に関する。ラクトバチルス・ロイテリ種の一種として同定された本発明の新規細菌は、胃酸および胆汁酸に対する耐性を有することが明らかにされている。
【００１９】
本発明は、哺乳動物、特にヒトおよびブタにおけるロタウィルス感染に付随する下痢状態を治療するための予防的および治療的方法を改良するという発明者らの要望から生じた。より詳細には、本発明は、ロタウィルスおよび腸内細菌感染に関連した様々な状態を伴う下痢および／または胃腸炎を治療するための有効かつ強力な物質を提供する。本発明の微生物は、ロタウィルス感染を防止および遅延させるとともに、下痢の治療に有効である。したがって、本発明のプロバイオティック株は、食料品中および動物の胃腸管内において腸内病原性細菌の数を減らすために用いられる。
【００２０】
実際のところ、本発明の微生物は、腸細胞への付着が対照株より優れている以外にも、以下の特徴的性質を有することが見出された。
−  ロタウィルスおよび腸内病原体の増殖を阻害することができる。
【００２１】
−  好気生活と嫌気生活のいずれにおいても様々な条件、および種々のｐＨ値で増殖することができ、これらの特性は胃腸管を移動する間に遭遇する多様な生理学的および病理学的状況への良好な適応能力を与える。
【００２２】
−  乳酸の生産。
−  胃酸および胆汁酸への高い耐性。
−  生存能力を失うことなく凍結乾燥に耐える。
【００２３】
さらに、本発明の物質は、他の既知の治療の欠点および副作用を欠いている。
「プロバイオティック（プロバイオティクス）」とは、各個体の胃腸管内の微生物バランスを改善することにより、ヒト宿主を含む動物に有益に作用する、生きたまたは死んだ微生物の補助食品、例えばラクトバチルス・ロイテリや他のラクトバチルス・アシドフィラス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）のことをいう。すなわち、プロバイオティック微生物は、経口投与された場合に動物内の消化器系細菌を変えるのに有用である。たとえば、プロバイオティック微生物は経口投与されると、動物の消化器系内の天然または経口摂取された細菌集団を迅速に減少させるか、これと置きかわって、再発性の障害、特に腸内の障害を防止することができる。プロバイオティック微生物は、経口投与を中止した後も相当な期間にわたって消化器系内で効力を発揮し続ける。
【００２４】
本発明のプロバイオティック微生物を探索するために、以下の手順を実施した。
まず最初に、１ｇのブタ排泄物を、例えばＢＢＬ製の「ＧａｓＰａｋパウチ」と呼ばれる嫌気性バッグ内に回収し、ｐＨ２の嫌気希釈剤中に１０倍希釈し、振盪機内で１２０分間振盪した。１ｍＬの振盪希釈液を２％のＯｘｇａｌ（Ｄｉｆｃｏ、商標名）を含むＢＬ寒天培地上に広げ、３７℃で４８時間インキュベートした。培地上にコロニーが出現した後、顕微鏡観察によって１４４のコロニーから桿状の微生物を選び、ＧＡＭ‐半寒天培地中で培養した。培養物は使用時まで−８０℃で保存した。
【００２５】
次に、選ばれた桿状体（細菌）について、有害微生物の増殖阻害を調べた。これに関して、クロイワの方法（クロイワ（Ｋｕｒｏｉｗａ）ら、１９９０年）による抗菌性検定のために、以下の１３の病原種を用いた。すなわち、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）ＫＣＴＣ  ２４４１、大腸菌  ＫＣＴＣ  ２５７１、肺炎桿菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）ＫＣＴＣ  ２２０８、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）ＫＣＴＣ  １６２１、スタフィロコッカス・エピデルミス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｓ）ＫＣＴＣ  １９１７、サルモネラ・エンテリティディス（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ）ｋｉｍ  ｓｐ１４、シゲラ・フレクスネリ（Ｓｈｉｅｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉ）ＫＣＴＣ  ２００８、プロテウス・ブルガリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｖｕｌｇａｒｉｓ）ＫＣＴＣ  ２５７９、エンテロバクター・クロアカエ（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｃｌｏａｃａｅ）ＫＣＴＣ  ２３６１、エンテロコッカス・ラクティス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）ＫＣＴＣ  １９１３、セラチア・マルセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｍａｒｓｃｅｎｓ）ＫＣＴＣ  ２１７２、シトロバクター・フロインディ（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ  ｆｒｅｕｎｄｉｉ）ＫＣＴＣ  ２００６、バチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＫＣＴＣ  １０２１。
【００２６】
有害微生物をＭＲＳブロス中で１８時間嫌気的に培養した後、各培養液から１ｍＬをＭＲＳ寒天培地上に広げた。選ばれた細菌を上記と同じブロス培地中で１８時間嫌気的に培養した後、各細菌から３０μＬずつを直径８ｍｍのペーパーディスク上に接種した。このペーパーディスクを、有害微生物を広げたＭＲＳプレート上においた。一定の培養時間後に出現した阻害性の円（阻害範囲を示す円）を測定した。対照群と比べて最も大きい阻害効果を示すと測定された株を＃Ｐｒｏｂｉｏ‐１６と名付けた。
【００２７】
選ばれた株について、以下のようにしてロタウィルスの増殖阻害を調べた。ＴＦ‐１０４単層細胞をリン酸緩衝生理食塩水で２回洗浄し、ロタウィルスを接種した。ウィルスを３０分間細胞上に吸収させた後、血清を含まないイーグル最少必要培地（ＥＭＥＭ）を培地に加え、次に適量のトリプシンを加えた。３７℃で培養しながら、感染細胞の細胞変性効果（ＣＰＥ）を観察した。単層細胞の約７０％においてＣＰＥが観察された時点で、細胞を含むＭＥＭ培地を−７０℃で凍結し、解凍した。この凍結解凍の手順を２回繰り返した。培地を遠心分離した後、上清を使用時まで−７０℃で保存した。これとは別に、ＴＦ‐１０４単層細胞を９６ウェルマイクロプレートに置き、リン酸緩衝生理食塩水で２回洗浄した。ロタウィルス懸濁液を−７０℃から解凍した後、１０倍系列希釈液を作成した。各希釈液をＴＦ‐１０４単層細胞の１０ウェルに接種し、これを５％ＣＯ２を含む湿った雰囲気中、３７℃で７２時間、ＣＰＥを観察しながら培養した。観察結果に基づいて、培養中に存在するウィルスをリード（Ｒｅｅｄ）とムンチ（Ｍｕｅｎｃｈ）の方法（Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  第３版、デービス（Ｄａｖｉｓ）ら、Ｈａｒｐｅｒ＆Ｒｏｗ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，１９８０年）に従って定量的に決定した。
【００２８】
このようにして、発明者らは＃Ｐｒｏｂｉｏ‐１６が、ロタウィルスによる細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ感染、ならびに、動物モデルにおいてロタウィルスによって誘導される下痢および／または胃腸炎を阻害することを証明した。本発明の１つの実施例において、抗ウィルス活性検定は、ロタウィルス培養物を３７℃で１時間トリプシン処理することから開始した。前処理した培養物を血清を含まないイーグル最少必要培地で、ウィルス力価が１．０  ＴＣＩＤ５０／０．１ｍＬ、１０．０  ＴＣＩＤ５０／０．１ｍＬ、１００  ＴＣＩＤ５０／０．１ｍＬ、および１，０００  ＴＣＩＤ５０／０．１ｍＬとなるように希釈した。これとは別に、ＴＦ−１０４単層細胞を９６ウェルマイクロプレートのウェル中に分注し、リン酸緩衝生理食塩水で２回洗浄した。＃Ｐｒｏｂｉｏ‐１６の１つの培養サンプルあたり４ウェルを割り当てた。４ウェルには、１．０  ＴＣＩＤ５０／０．１ｍＬ、１０．０  ＴＣＩＤ５０／０．１ｍＬ、１００  ＴＣＩＤ５０／０．１ｍＬ、および１，０００  ＴＣＩＤ５０／０．１ｍＬをそれぞれ９０μＬ量ずつ加え、その後直ぐに１０μＬ（１０％）のラクトバチルス菌培養物を加えた。細胞を５％ＣＯ２を含む湿った雰囲気中、３７℃で培養しながら、これらの細胞に対して、２４時間、４８時間および７２時間目における細胞変性効果を観察した。ＣＰＥが確認されると、抗ウィルス活性が欠如していると見なした。
【００２９】
＃Ｐｒｏｂｉｏ‐１６の抗生物質感受性は、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ  ｈａｎｄｂｏｏｋ  第１巻（ヘンリー  ディー．アイセンバーグ（Ｈｅｎｒｙ  Ｄ．Ｉｓｅｎｂｅｒｇ）、ＡＳＭ）および韓国特許公報第９１‐４３６６号に従って検定した。これに関しては、１３の抗生物質、すなわち、セファレクシン、エリスロマシン、フルメキニン（ｆｌｕｍｅｑｕｉｎｉｎｅ）、フラゾリジン（ｆｕｒａｚｏｌｉｄｉｎｅ）、ゲンタマイシン、プロカインペニシリンＧ、ノルフロキサシン（ｎｏｒｆｌａｘａｃｉｎｅ）、スペクチノマイシン、テトラサイクリン、チアムリン、ネオマイシン、クロラムフェニコール、およびカナマイシンを適当な溶媒中に溶解した。濃度別に、調製された抗生物質溶液を、ペーパーディスク上に３０μＬの量で接種し、これを４℃で１時間放置した。２４時間の嫌気的インキュベーション後に現れた阻害性の円を測定した。
【００３０】
ラクトバチルス・ロイテリ菌株の同定は、標準的な微生物学的および物理生化学的試験、当該種の分類学的特性および１６Ｓ  ｒＲＮＡシーケンシングを用いて行う。
＃Ｐｒｏｂｉｏ‐１６の形態学的および物理生化学的特性に関して、この株は好気的および嫌気的条件のいずれにおいても胞子を形成せずに増殖することができ、運動性を有しないグラム陽性細菌である。この株の至適温度は３０〜３７℃の範囲である。この細菌はガスおよびインドールを発生せず、溶血性を示すこともなく、硝酸を還元することもない。この株は尿素およびタンパク質を分解することができないが、マンノースおよびラフィノースを発酵させ、５％の胆汁酸に耐性である。この細菌は、アルギニンデヒドロラーゼ、アルギニンアリールアミダーゼ、プロリンアリールアミダーゼ、ロイシルグリシンアリールアミダーゼ、ロイシンアリールアミダーゼ、フェニルアラニンアリールアミダーゼ、チロシンアリールアミダーゼ、アラニンアリールアミダーゼ、グリシンアリールアミダーゼ、ヒスチジンアリールアミダーゼ、セリンアリールアミダーゼ、α‐ガラクトシダーゼ、α‐グルコシダーゼ、β‐グルコシダーゼ、α‐アラビノシダーゼ、およびβ‐グルクロニダーゼ活性は陽性であり、カタラーゼ、リパーゼ、レシチナーゼ、アルカリフォスファターゼ、グルタミン酸デカルボキシラーゼ、ピログルタミン酸アリールアミダーゼ、グルタミルグルタミン酸アリールアミダーゼ、６‐リン酸‐β‐ガラクトシダーゼ、β‐Ｎ‐アセチル‐グルコシダーゼ、およびα‐フルクトシダーゼ活性は陰性である。
【００３１】
＃Ｐｒｏｂｉｏ‐１６の１６Ｓ  ｒＤＮＡは、配列番号１に挙げたヌクレオチド配列を有している。１６Ｓ  ｒＤＮＡ配列に基づいた分子系統学的分析からは、＃Ｐｒｏｂｉｏ‐１６がラクトバチルス・ロイテリの基準株と９９．５％の相同性を有することが分かり、調べた菌株の間では最も高い系統学的類似性を示した。これらの結果に基づいて、＃Ｐｒｏｂｉｏ‐１６は、ラクトバチルス・ロイテリ株の一種であると同定され、微生物寄託に関するブダペスト条約の条項と規定に従って、韓国微生物保存センターに寄託された（２０００年１０月２日、受託番号ＫＣＣＭ１０２１４）。
【００３２】
また、本発明は、新規の株を用いて有害な微生物を阻害する方法も対象としている。本方法において、有害微生物の増殖に対するラクトバチルス・ロイテリＰｒｏｂｉｏ‐１６の阻害活性は、３０〜７０℃において最適に発揮された。
【００３３】
抗生物質感受性の実験から、ラクトバチルス・ロイテリＰｒｏｂｉｏ‐１６の感受性は、セファレクシンに対しては９０μｇ／ｍＬの最小阻害濃度（ＭＩＣ）、エリスロマシンに対しては４μｇ／ｍＬのＭＩＣ、フルメキニンに対しては４，０００μｇ／ｍＬのＭＩＣ、フラゾリジンに対しては９０μｇ／ｍＬのＭＩＣ、ゲンタマイシンに対しては１００μｇ／ｍＬのＭＩＣ、ペニシリンＧに対しては４μｇ／ｍＬのＭＩＣ、ノルフロキサシンに対しては１００μｇ／ｍＬのＭＩＣ、スペクチノマイシンに対しては２，５００μｇ／ｍＬのＭＩＣ、テトラサイクリンに対しては１，５００μｇ／ｍＬのＭＩＣ、チアムリンに対しては３００μｇ／ｍＬのＭＩＣ、ネオマイシンに対しては１００μｇ／ｍＬのＭＩＣ、クロラムフェニコールに対しては２００μｇ／ｍＬのＭＩＣ、およびカナマイシンに対しては４，０００μｇ／ｍＬのＭＩＣであることが示された。
【００３４】
長期間安定して保存するために、本発明の微生物は、グリセロール中で−８０℃で保存するか、あるいは１０％脱脂乳中の懸濁液として凍結乾燥した。
さらに、本発明は、新規の微生物を含む、食品、ヒトおよび動物のための医薬品ならびに供給原料も対象とする。本発明の微生物は、単独で用いてもよいし、担体とともに使用してもよいし、食品への添加物としてもよいし、あるいはヒトおよび家畜が摂取するのに適した他の組成物中で使用してもよい。すなわち、本発明の微生物は、プロバイオティック細菌を含まない食品（当該製品にプロバイオティックとしての価値も与える目的で）と、すでに何らかのプロバイオティック細菌を含んでいる食品（それらのプロバイオティックとしての価値を強化および／または完全なものにする目的で）のいずれにも、添加することができるので有用である。
【００３５】
本発明の医薬用、獣医用および食用組成物は、プロバイオティック乳酸菌として単離されたラクトバチルス・ロイテリＰｒｏｂｉｏ‐１６を単独で含むか、適当な賦形剤（担体）と混合された２種類以上の菌株の混合物として含んでいる。例えば、本発明の組成物に従って用いてもよい他の好ましいプロバイオティック株は、ヒトまたは動物が摂取するのに適し、ヒトまたは動物の腸内で微生物バランスを改善することのできる１つ以上の微生物から選ぶことができる。適切なプロバイオティック微生物の例としては、サッカロミセス、カンジダ、ピキア、トルロプシスなどの酵母、アスペルギルス、リゾプス、ムコールペニシリウムなどのカビ、および、ラクトバチルス属、ビフィドバクテリウム属、クロストリジウム属、ロイコノストック属、バクテロイド属、スタフィロコッカス属、ラクトコッカス属、バチルス属、ストレプコッカス属、フソバクテリウム属、プロピオニバクテリウム属、エンテロコッカス属、ペディコッカス属、およびミクロコッカス属などの細菌が挙げられる。適切なプロバイオティック微生物の具体例としては、以下のものが挙げられる。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｅａｅ，  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏａｇｕｌａｎｓ，  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ，  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ，  Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｉｆｉｄｕｍ，  Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｉｎｆａｎｔｉｓ，  Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ，  Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ，  Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ，  Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ，  Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｌｉｍｅｎｔａｒｉｕｓ，  Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｓｅｉ，  Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｕｒｖａｔｕｓ，  Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｄｅｌｂｒｕｃｋｉｉ，  Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ，  Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆａｒｃｉｍｉｎｕｓ，  Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇａｓｓｅｒｉ，  Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ，  Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｈａｍｎｏｓｕｓ，  Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｋｅ，  Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ，  Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｖａｒｉａｎｓ，  Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ  ａｃｉｄｉｌａｃｔｉｃｉおよびＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｘｙｌｏｓｕｓ。他の物質、例えば、この特定の用途のための組成物に添加してもよい物質としては、充填剤、カーボンブラック、高繊維添加物、カプセル化剤、プロテアーゼ阻害剤、グリコシダーゼ阻害剤、および担体脂質、随意でミセル化剤が挙げられる。これらは当該技術分野における周知の量で存在させることができる。組成物中、単離されたラクトバチルス・ロイテリＰｒｏｂｉｏ‐１６は凍結乾燥状態、またはカプセル、溶液もしくは飲用懸濁液もしくは粉末の形態で存在している。また、プロバイオティック微生物は好ましくは粉末乾燥形態であり、特に胞子形態である。さらに、所望により、プロバイオティック微生物は生存率をさらに高めるためにカプセル化してもよい。
【００３６】
上記の組成物は、例えば、様々な原因の腸内下痢、潰瘍性大腸炎および関連する病変などの場合のように、乳酸桿菌の投与が望ましい胃腸の病変の治療または予防のために、経口投与することもできるし、または、供給原料もしくは食料品（牛乳、ヨーグルトまたは乳製品、ジュース、シリアル、チューイングガム、クラッカー、キャンディー、ビタミンサプリメント、食肉、野菜および果物など）と混合し、配合し、または例えばクッキーのようなベビーフードとして投与することもできる。
【００３７】
本発明の他の実施形態において、組成物の代わりに、細胞壁成分を含む調製細胞、そのホモジネートまたは一部を、液体、一般的には水性液体の形態で、家畜類、家禽類、ペット動物などに経口投与してもよく、あるいは必要かつ所望であれば、本微生物を粉末状態に乾燥させて、家畜類、家禽類、ペット類などの飼料に添加してもよい。
【００３８】
従来の抗生物質に代わる有用な、新規の株を含む本発明の食品、医薬品および供給原料は、有害な腸内微生物を阻害して、ヒトおよび動物の腸内フローラにおいて安定なバランスを維持することにより、ヒトの健康に利益をもたらすとともに、家畜における体重増加、肉質、牛乳生産、および免疫性に改善をもたらす。すなわち、本発明の組成物は、抗生物質治療の結果として、非病原性腸内細菌フローラを維持するために投与することもできる。また、本発明の飼料の組成物は、体重増加速度、一日あたりの体重増加、および給餌効率における優れた結果を達成し、ウシ、ブタ、イヌ、ニワトリなどの様々な家畜に好適であることが理解されるであろう。
【００３９】
さらに、本発明の新規の抗ロタウィルス微生物は、ロタウィルス感染の殆どの事例において、特に、他の治療が有効でないか臨床的に禁忌である場合に使用するのに適している。
【００４０】
したがって、本発明は、患者の細胞のロタウィルス感染の発症を遅延させる、またはこれに対抗する方法を提供し、該方法は、ロタウィルス感染へのリスクを有するかロタウィルスに感染した患者に、上述のように、抗ロタウィルス有効量の本発明の微生物もしくはその混合物、または、本発明の微生物および／または医薬として許容可能な担体および／または食料品および／または他の添加剤を含んで成る組成物を投与することを含む。上記組成物には、年齢、身体全体の健康、患者の栄養状態を考慮して、ロタウィルス感染の有効な治療に適するように、他の抗ウィルスまたは抗微生物物質を取り入れてもよい。したがって、本発明はロタウィルスおよび関連する微生物によって引き起こされる下痢や胃腸炎などの疾患の予防および治療に用いることができる。
【００４１】
本発明の微生物は、前述のように正常な腸内微生物叢であることから、家畜類の治療に対してもさらなる利点を示す。本発明の微生物は、治療対象となる患者において、毒性、免疫学的またはアレルギー反応を引き起こしにくい。
【００４２】
本発明において、家畜類には、ブタ、ウシ、ウマ、ヤギ、ヒツジなどが含まれ、家禽類としては、ニワトリなどの鳥類が含まれ、ペットにはイヌやネコなどが含まれる。
本発明は以下の実施例を参照してより詳細に理解されるが、以下の実施例は説明のためのものであり、本発明を限定することを意図していない。
【実施例１】
【００４３】
胃酸および胆汁酸に対して耐性を有する細菌の単離
健康な１１ヶ月齢のメスブタから、排泄物を嫌気的にＧａｓＰａｋパウチ（ＢＢＬ）中に回収した。１ｇのブタ排泄物をｐＨ２に調整した嫌気性希釈剤（０．７８％Ｋ２ＨＰＯ４、塩混合物３７．５ｍＬ、Ｌ−システイン０．５ｇ、２５％Ｌアスコルビン酸２ｍＬ、８％Ｎａ２ＣＯ３  ５０ｍＬ、および０．１％レサズリン１ｍＬを蒸留無菌水８６０ｍＬに溶解した溶液に、０．５ｇ寒天を添加したもの）で１：１０に希釈し、振盪機内で１２０分間振盪した。１ｍＬの振盪した希釈液を２％のＯｘｇａｌ（Ｄｉｆｃｏ）を含むＢＬ寒天培地上に広げ、３７℃で４８時間インキュベートした。顕微鏡を用いて培地上に出現したコロニーを観察した後、１４４個の桿状細菌を選び、ＧＡＭ半寒天培地中で培養した。培養物は使用時まで−８０℃で保存した。
【実施例２】
【００４４】
抗ロタウィルス活性の測定
リン酸緩衝生理食塩水で２回洗浄した後、ＴＦ‐１０４単層細胞にロタウィルスを接種した。ロタウィルスを３０分間細胞上に吸収させ、培地に、血清を含まないイーグル最少必要培地（ＥＭＥＭ）、次に適量のトリプシンを添加した。３７℃でのインキュベーションの間、感染細胞の細胞変性効果（ＣＰＥ）を観察した。単層細胞の約７０％においてＣＰＥが観察された時点で、細胞培養物を−７０℃で凍結して解凍するプロセスを２回繰り返した。細胞培養物を遠心分離した後、細胞を含まない上清を使用時まで−７０℃で保存した。これとは別に、ＴＦ‐１０４単層細胞を９６ウェルマイクロプレート上に置き、リン酸緩衝生理食塩水で２回洗浄した。−７０℃で保存されているロタウィルス懸濁液を解凍して、１０倍系列希釈液を作成した。各希釈液をＴＦ‐１０４単層細胞の１０ウェルに接種し、これを５％ＣＯ２を含む湿った雰囲気中、３７℃で７２時間、ＣＰＥを観察しながら培養した。観察結果に基づいて、培養物中に存在するウィルスをリード（Ｒｅｅｄ）とムンチ（Ｍｕｅｎｃｈ）の方法（Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  第３版、デービス（Ｄａｖｉｓ）ら、Ｈａｒｐｅｒ＆Ｒｏｗ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，１９８０年）に従って定量的に決定した。
【００４５】
抗ウィルス活性検定のために、ロタウィルス培養物を３７℃において１時間トリプシン処理し、血清を含まないイーグル最少必要培地で、ウィルス力価が１．０  ＴＣＩＤ５０／０．１ｍＬ、１０．０  ＴＣＩＤ５０／０．１ｍＬ、１００  ＴＣＩＤ５０／０．１ｍＬ、および１，０００  ＴＣＩＤ５０／０．１ｍＬとなるように希釈した。これとは別に、ＴＦ‐１０４単層細胞を９６ウェルマイクロプレートのウェル中に分注し、リン酸緩衝生理食塩水で２回洗浄した。単離株の１つの培養サンプルあたり４ウェルを割り当てた。４ウェルには、１．０  ＴＣＩＤ５０／０．１ｍＬ、１０．０  ＴＣＩＤ５０／０．１ｍＬ、１００  ＴＣＩＤ５０／０．１ｍＬ、および１，０００  ＴＣＩＤ５０／０．１ｍＬをそれぞれ９０μＬ量で加え、その後直ぐに１０μＬ（１０％）の細菌培養物を加えた。細胞を５％ＣＯ２を含む湿った雰囲気中、３７℃で培養しながら、これらの細胞に対して、２４時間、４８時間および７２時間目における細胞変性効果を観察した。ＣＰＥが確認されると、抗ウィルス活性が欠如していると見なした。
【００４６】
選択された株のロタウィルスに対する阻害効果を下記の表１に示した。
【００４７】
【表１】
2004523241.tif 000002
【実施例３】
【００４８】
有害微生物の増殖に対する単離株の阻害活性の試験
選択された株について、クロイワの方法（クロイワ（Ｋｕｒｏｉｗａ）ら、１９９０年）により、抗生物質効力検定のために通常使用される１３種の微生物を用いて有害微生物の増殖阻害を調べた。有害微生物をＭＲＳブロス（Ｄｉｆｃｏ）中で１８時間嫌気的に培養した後、各培養液から１ｍＬをＭＲＳ寒天培地状に広げた。その後、上記と同じブロス培地中で１８時間嫌気的に培養した、選ばれた細菌からそれぞれ３０μＬずつを、直径８ｍｍのペーパーディスク上に接種した。このペーパーディスクを、有害微生物を広げたＭＲＳプレート上においた。一定の培養時間後に現れた阻害性の円を測定した。対照群と比べて最も大きい阻害効果を示すと測定された株を＃Ｐｒｏｂｉｏ‐１６と名付けた。
【００４９】
有害微生物に対する＃Ｐｒｏｂｉｏ‐１６の阻害活性を下記表２に示す。
【００５０】
【表２】
2004523241.tif 000003
データより明らかなように、＃Ｐｒｏｂｉｏ‐１６は、上記１３種の微生物に対して同様の阻害活性を有し、非常に有効であると同定された。さらに、＃Ｐｒｏｂｉｏ‐１６は、チャン（Ｃｈａｎｇ）ら（Ｋｏｒ．Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、第２７巻、２３‐２７ページ；韓国特許第１０‐２１１５２９‐００００号）に開示されている既存のラクトバチルス・ロイテリ株（ＢＳＡ‐１３１）よりも、有害微生物に対する高い阻害性を示すことが分かった。また、本発明の新規株は、従来のものよりも生存性が高いと測定された。
【実施例４】
【００５１】
＃Ｐｒｏｂｉｏ‐１６の抗生物質に対する感受性
＃Ｐｒｏｂｉｏ‐１６の抗生物質感受性の検定は、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  第１巻（ヘンリー  ディー．アイセンバーグ（Ｈｅｎｒｙ  Ｄ．Ｉｓｅｎｂｅｒｇ）、ＡＳＭ）および韓国特許公報第９１‐４３６６号に従って、セファレクシン、エリスロマシン、フルメキニン、フラゾリジン、ゲンタマイシン、プロカインペニシリンＧ、ノルフロキサシン、スペクチノマイシン、テトラサイクリン、チアムリン、ネオマイシン、クロラムフェニコール、およびカナマイシンを含む１３の抗生物質に関して行った。濃度別に、調製された抗生物質溶液を、ペーパーディスク上に３０μＬの量で接種し、これを４℃で１時間放置した。２４時間の嫌気的インキュベーション後に現れた阻害性の円を測定した。結果を下記の表３に示す。
【００５２】
【表３】
2004523241.tif 000004
【実施例５】
【００５３】
＃Ｐｒｏｂｉｏ‐１６の同定
実施例１において単離した菌株＃Ｐｒｏｂｉｏ‐１６をＭＲＳ培地（Ｄｉｆｃｏ）中、３７℃で培養した。＃Ｐｒｏｂｉｏ‐１６を同定するために、この株の形態学的および物理生化学的特性をユーンの方法（ユーン（Ｙｏｏｎ）ら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｓｙｓｔ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，第４７巻，９０４頁，１９９７年）に従って、ＡＰＩ３２ＡおよびＣＨＬキット（Ｂｉｏｍｅｒｉｏ）を用いて調べ、その１６Ｓ  ｒＤＮＡの配列決定を行い、ユンの方法（ユン（Ｙｏｏｎ）ら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｓｙｓｔ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，第４７巻，９３３頁，１９９７年）に従って分析した。
【００５４】
＃Ｐｒｏｂｉｏ‐１６の形態学的および物理生化学的特性を下記の表４にまとめる。
【００５５】
【表４】
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表４から分かるように、＃Ｐｒｏｂｉｏ‐１６は、好気的および嫌気的条件のいずれにおいても胞子を形成せずに増殖することができる、運動性を有しないグラム陽性細菌である。この株の至適増殖温度は３０〜３７℃の範囲である。この細菌はガスおよびインドールを発生せず、溶血性を示すこともなく、硝酸を還元することもない。この株は尿素およびタンパク質を分解することができないが、マンノースおよびラフィノースを発酵させ、５％の胆汁酸に耐性であり、アルギニンデヒドロラーゼ、アルギニンアリールアミダーゼおよびプロリンアリールアミダーゼ活性は陽性である。
【００５６】
＃Ｐｒｏｂｉｏ‐１６の１６Ｓ  ｒＤＮＡは、配列番号１に示したヌクレオチド配列を有している。
１６Ｓ  ｒＤＮＡ配列に基づいた分子系統学的分析からは、＃Ｐｒｏｂｉｏ‐１６はラクトバチルス・ロイテリの基準株と９９．５％の相同性を有することが分かり、調べた株の間では最も高い系統学的類似性を示した。また、＃Ｐｒｏｂｉｏ‐１６は２つのヌクレオチド配列が既存のプロバイオティックＢＳＡ‐１３１と異なっていることが分かった。これらの結果に基づいて、＃Ｐｒｏｂｉｏ‐１６は、新規なラクトバチルス・ロイテリ株であると同定され、韓国微生物保存センターに寄託された（２０００年１０月２日、受託番号ＫＣＣＭ１０２１４）。
【産業上の利用可能性】
【００５７】
前述のように、本発明の新規の株は、ロタウィルスおよび病原性細菌に対して阻害活性を有するとともに、胃酸および胆汁酸に対する耐性を有する。したがって、従来の抗生物質の代用品となりうるプロバイオティクスとして有用であり、本発明の新規の株は、有害な腸内微生物を阻害して、ヒトおよび動物の腸内フローラにおける安定なバランスを維持することにより、ヒトの健康に利益をもたらすとともに、家畜における体重増加、肉質、牛乳生産、および免疫性に改善をもたらす。
【００５８】
本発明を説明的に記載してきたが、使用した用語は限定ではなく説明を意図していると理解すべきである。上述の教示に鑑みた本発明の多くの変形および変更が可能である。したがって、本発明は添付の請求項の範囲内で、具体的に記載した以外のように実施されてもよい。
【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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