(57)【要約】本発明はそれぞれ、ＨＳ−５ストロマ細胞系統由来のｃＤＮＡライブラリーから得られた新規ＳＬＩＴ‐様蛋白質、Ｓｌｉｔ様蛋白質またはそのフラグメントをコードする核酸分子、およびＳｌｉｔ様蛋白質を検出するか、または増幅するためのプローブまたはプライマーとして有用な核酸分子に関する。本発明はさらにＳｌｉｔ様蛋白質の使用に関する。また、本発明は因子またはそのフラグメントに結合することができる抗体を形成するような因子またはフラグメントの適用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｓｌｉｔ様蛋白質またはそのフラグメントをコードする実質的に精製された核酸分子であって、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１，ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２，ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３，ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４，それらの実質的な相同体、およびそれらの実質的なフラグメントからなる群から選択された少なくとも１核酸配列を含む前記核酸分子。
【請求項２】
遺伝コードの縮退を除いて、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１，ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２，ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３，およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４からなる群から選択された少なくとも１つの核酸配列と少なくとも８０％配列同一性を共有する、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項３】
Ｓｌｉｔ様蛋白質またはそのフラグメントをコードする実質的に精製された核酸分子であって、遺伝コードの縮退を除いて、ストリンジェントな条件下でＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１，ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２，ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３，およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４からなる群から選択された少なくとも１つの核酸配列とハイブリダイズする核酸配列を有する、前記核酸分子。
【請求項４】
核酸がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２，ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３，およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４の配列である、請求項１、２または３の核酸。
【請求項５】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７，ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８，ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７の変異体、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８の変異体，ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７のフラグメント，およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８のフラグメントからなる群から選択されたアミノ酸配列を有するＳｌｉｔ様蛋白質。
【請求項６】
実質的に精製された抗体またはそのフラグメントであって、請求項５のＳｌｉｔ様蛋白質に特異的に結合することができる前記抗体またはフラグメント。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本出願は２０００年、８月１０日に発行された米国特許出願第０９／６３６，１６９号の部分的継続であり、それを本明細書にそのまま参照として援用する。
【０００２】
発明の属する技術分野
本発明は、ストロマ細胞系統ＨＳ−５由来のｃＤＮＡライブラリーから得られた新規ＳＬＩＴ‐様蛋白質、Ｓｌｉｔ様蛋白質またはそのフラグメントをコードする核酸分子、およびＳｌｉｔ様蛋白質を検出するか、または増幅するためのプローブまたはプライマーとして有用な核酸分子に関する。本発明はさらにＳｌｉｔ様蛋白質の使用に関する。また、本発明は因子またはそのフラグメントに結合できる抗体を形成することのような適用に関する。
【０００３】
発明の背景
上皮成長因子（ＥＧＦ）は特有の６システインのモチーフをもつ、５３アミノ酸の可溶性ペプチドである。分子は特有のアミノ末端３重鎖β‐シート構造に堅く折り畳まれ、システイン残基のジスルフィド結合により安定化される。ＥＧＦモチーフの特徴は、６システイン残基の高度に保存された間隔である。このＥＧＦモチーフは、多様な機能の、多くの異なる蛋白質に見られる。可溶性ＥＧＦは細胞表面上のより大きな前駆体の蛋白質分解開裂に由来する。他の３つの成長因子はＥＧＦに極めて相同性である。形質転換成長因子‐α（ＴＧＦα）、ワクシニアウイルス成長因子（ＶＶＧＦ）、およびアンフィレギュリンでは、この３つの因子はすべてＥＧＦ受容体に結合するため、それらの相同性の機能的意義は明らかである。このＥＧＦモチーフは、多様な機能の多くの異なる蛋白質に反復されて見出されている。ＥＧＦのように、ＴＧＦ‐αおよびＶＶＧＦは共に膜貫通前駆体に由来する。ＴＧＦ‐α表面結合ＥＧＦ前駆体ドメインが細胞内情報伝達を媒介するという発見は、他の細胞表面分子の機能におけるＥＧＦモチーフの役割に関し、さらに重要な意味を持っている。ＥＧＦ反復はカルシウム結合、細胞‐細胞相互作用、および細胞運命決定に役割を果たす多数の異なる細胞表面分子に見出される（総説としてＤａｖｉｓ，Ｇ．，Ｔｈｅ  Ｎｅｗ  Ｂｉｏｌｏｇｉｓｔ  ２：４１０−４１９，１９９０を参照されたい）。この多様な群は以下のものを含む：リポ蛋白質受容体（Ｙａｍａｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｅｌｌ  ３９：２７−３８，１９８４）；トロンボモジュリン（Ｓｕｚｕｋｉ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  ６：１８９１−１８９７，１９８７）；内皮白血球接着分子‐１（ＥＬＡＭ‐１）のようなセレクチン（Ｂｅｃｖｉｌａｃｑｕａ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４３：１１６０−１１６５，１９８９）；テネイシン（Ｃｈｉｑｕｅｔ−Ｅｈｒｉｓｍａｎ  Ｒ．，Ｅｘｐｅｒｉｅｎｔｉａ  ５１：８５３−８６２，１９９５）、フィブリン（Ｐａｎ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１２３：１２６９−１２７７，１９９３）、ラメイン（ｌａｍａｉｎ）（Ｓａｓａｋｉ  Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  ８４：９３５−９３９，１９８８）、ニドゲン（ｎｉｄｏｇｅｎ）（Ｍａｎｎ，Ｋ．，ＥＭＢＯ  ８：６５−７２，１９８９）およびトロンボスポンジン（Ｍａｊａｋ，Ｒ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  ８３：９０５０−９０５４，１９８６）を含む、細胞外基質蛋白質（総説としてＥｎｇｅｌ，Ｊ．ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ２５１：１−７，１９８９を参照されたい）；凝固因子ＶＩＩ、ＩＸ、Ｘおよび蛋白質Ｃ（総説として、Ｆｕｒｉｅ  ａｎｄ  Ｆｕｒｉｅ，Ｃｅｌｌ  ５３：５０５−５１８，１９８８を参照されたい）、ならびに組織型プラスミノーゲン活性化因子（ｔ−ＰＡ）（Ｐｅｎｎｉｃａ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３０１；２１４−２２１，１９８３）のような可溶性分泌蛋白質；Ｓｌｉｔ（Ｒｏｔｈｂｅｒｇ，Ｊ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ＆Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ４：２１６９−２１８７，１９９０）および３種の哺乳動物Ｓｌｉｔ相同体（Ｉｔｏｈ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ６２：１７５−１８６，１９９��；Ｃｏｎｎｏｌｌｙ，Ｔ．ａｎｄ  Ｒａｊｕｐｕｔ，ＷＯ９９／２３２１９，１９９９）；分子の７回膜貫通領域白血球細胞表面ファミリー（ＥＧＦ−ＴＭ７）（総説としてＭｃＫｎｉｇｈｔ，Ａ．Ｊ．ａｎｄ  Ｇｏｒｄｏｎ，Ｓ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ  ６：２８３−２８７，１９９６を参照されたい）；および二元電位により細胞の発育運命を制御するホメオティック遺伝子のＮｏｔｃｈファミリー。
【０００４】
ショウジョウバエでは、Ｎｏｔｃｈ（Ｋｉｄｄ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．６：３０９４−３１０８，１９８６）ならびにそのリガンドＤｅｌｔａ（Ｖａｓｓｉｎ  Ｈ．，ＥＭＢＯ  ６：３４３１−３４４０，１９８７）およびＳｅｒｒａｔｅ（Ｆｌｅｍｉｎｇ  Ｒ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ＆Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ４：１１８８−２２０１）が神経成長に関連する。Ｃ．エレガンス（ｅｌｅｇａｎｓ）、ｌｉｎ−１２およびｇｌｐ−１の２遺伝子の産物は、構造がＮｏｔｃｈに密接に関連する。現在、４種のＮｏｔｃｈ相同体、Ｎｏｔｃｈ−１、―２、−３、および−４が脊椎動物で同定されている（Ｅｌｌｉｓｏｎ  Ｌ．Ｗ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ６６：６４９−６６１，１９９１；Ｗｅｉｎｍａｓｔｅｒ，Ｇ．ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １１６：９３１−９４１，１９９２；Ｌａｒｄｅｌｌｉ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｃｈ  Ｄｅｖ．４６：１２３−１２６，１９９４；Ｕｙｔｔｅｎｄａｅｌｅ  Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １２２：２２５１−２２５９，１９９６）。また、ヒト由来のＪａｇｇｅｄ−２を含む、ＪａｇｇｅｄおよびＤｅｌｔａ−様（ｄｌｋ）と呼ばれる４種のＮｏｔｃｈリガンドが脊椎動物からクローニングされている（Ｌｕｏ，Ｂ．ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ，１７：６０５７−６０６７，１９９７）。Ｎｏｔｃｈスーパーファミリーは、ショウジョウバエＮｏｔｃｈ−１のヒト相同体、ＴＡＮ−１（Ｅｌｌｉｓｏｎ，Ｌ．Ｗ．Ｃｅｌｌ  ６６：６４９−６６１，１９９１）、ならびにそのリガンドＪａｇｇｅｄ−２（Ｌｏｕ，Ｂ．ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ，１７：６０５７−６０６７，１９９７）およびｄｅｌｔａ−様（ｄｌｋ）を含む（ＷＯ９４／１３７０１，１９９４年６月２３日）。
【０００５】
ショウジョウバエＮｏｔｃｈのタンデムＥＧＦ反復をコードする配列への交差ハイブリダイゼーションにより同定されたゲノムＤＮＡの性状決定において、同様にＥＧＦ反復を有する非結合遺伝子座由来の関連遺伝子配列が同定された（Ｒｏｔｈｂｅｒｇ，Ｊ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ＆Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ４：２１６９−２１８７，１９９０）。その単離および性状決定は、ｓｌｉｔ遺伝子座への対応を示した。関連遺伝子配列のより詳細な性状決定はそれに対するヌル突然変異が胚の中枢神経系（ＣＮＳ）の破壊を生じることを証明した（Ｒｏｔｈｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．１９８８）。したがって、それが神経発生に関与することが示された。ショウジョウバエｓｌｉｔ蛋白質は２種の反復アミノ酸配列を含む：ロイシン‐リッチ反復（ＬＲＲ）および上皮成長因子‐様反復（ＥＧＦ）。そのＬＲＲは４群に分類され、それぞれは保存されたアミノ‐およびカルボキシ‐隣接領域 により囲まれた４または５のＬＲＲｓからなる。単一蛋白質内のＬＲＲｓおよびＥＧＦ‐様反復の両方の存在は、そのような組合せが既知の蛋白質のどの型にも見出されないことにおいて例外的である。典型的なシグナル配列および２種の既知の細胞外結合モチーフを有する配列における任意の潜在的膜貫通ドメインの欠如は、ｓｌｉｔ遺伝子座が分泌される細胞外蛋白質をコードすることを示唆する。ｓｌｉｔ蛋白質のＬＲＲ領域および関連蛋白質のそのような領域は細胞外蛋白質‐蛋白質相互作用に関与する。
【０００６】
本発明のＳｌｉｔ様蛋白質は他のどの蛋白質において報告されていない、特有のドメイン構造を有する。Ｓｌｉｔと異なり、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７のＳｌｉｔ様蛋白質はただ一つのロイシン‐リッチ反復（ＬＲＲ）領域、ただ一つのＥＧＦモチーフ、およびＳｌｉｔにはない潜在的膜貫通ドメインを有する。ＬＲＲはアミノ‐およびカルボキシ‐末端隣接領域に接した８から１０までのロイシン‐リッチ反復として配置される。
【０００７】
異なって発現された遺伝子を同定し、そして分析するためにいくつかの研究方法が使用された。これらの研究方法はディファレンシャルｃＤＮＡライブラリースクリーニング、サブトラクティブライブラリーおよびＰＣＲを基礎にしたディファレンシャルディスプレー、単一細胞増幅、およびＰＣＲ  Ｓｅｌｅｃｔを含む（Ｄｉａｔｃｈｅｎｋｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（Ｕ．Ｓ．Ａ．）９３：６０２５−６０３０（１９９６）；Ｍａｓｅｒ  ａｎｄ  Ｃａｌｖｅｔ，Ｓｅｍｉｎ．Ｎｅｐｈｒｏｌ．１５：２９−４２（１９９５）；Ｗａｔｓｏｎ  ａｎｄ  Ｍａｒｇｕｉｌｅｓ，Ｄｅｖ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１５：７７−８６（１９９３）；Ｍｉｌｅｓ  ａｎｄ  Ｗａｌｌａｃｅ，Ｂｅｈｒｉｎｇ．Ｉｎｓｔ．Ｍｉｔｔ．８８：１３３−１４１（１９９１））。
【０００８】
サブトラクティブライブラリーは新規蛋白質の単離のための標準的方法である。サブトラクティブハイブリダイゼーション法は、Ｓｗｅｎｄｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｌａ  Ｑｕａｇｌｉａ，Ｓｅｍｉｎ．Ｐｅｄｒｉａｔｒ．Ｓｕｒｇ．５：１４９−１５４（１９９６）；Ｅｒｍｏｌａｅｖａ  ａｎｄ  Ｓｖｅｒｄｌｏｖ，Ｇｅｎｅｔ．Ａｎａｌ．１３：４９−５８（１９９６）；Ｈａｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２１４：５８−６４（１９９３）により総説されている。サブトラクティブハイブリダイゼーションは主に免疫系において発現されるｃＤＮＡクローンを同定するために使用されている（Ｅｒｉｃｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．１００：２６１−２７７（１９８７））。幹細胞成長因子に関しては、しかし、サブトラクティブハイブリダイゼーションは扱いにくいと報告されている。
【０００９】
ディファレンシャルディスプレー法はＷａｎｇ  ａｎｄ  Ｆｅｕｅｒｓｔｅｉｎ，Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｒｅｓ．３５：４１４−４２１（１９９７）；Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｃｉ．１７：２７６−２７９（１９９６）；Ｌｉｖｅｓｅｙ  ａｎｄ  Ｈｕｎｔ，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１９：８４−８８（１９９６）；Ｓｕｎｄａｙ，Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２６９：Ｌ２７３−Ｌ２８４（１９９５）；およびＬｉａｎｇ  ａｎｄ  Ｐａｒｄｅｅ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．７：２７４−２８０（１９９５）；Ｍｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１９９：５６４−５６９（１９９４）により総説されている。サイトカイン誘導遺伝子がディファレンシャルディスプレー法により造血細胞から単離されたことが報告されている（Ｚｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．８５：１５３−１６１（１９９７）；Ｒｏｓｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｘｈｎｉｑｕｅｓ  ２１：１１４−１２１（１９９６））。
【００１０】
ＰＣＲ‐Ｓｅｌｅｃｔ（サプレッションサブトラクティブハイブリダイゼーション（ＳＳＨ））は単一の方法に平均化およびサブトラクションを組み合わせる（Ｄｉａｔｃｈｅｎｋｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（Ｕ．Ｓ．Ａ．）９３：６０２５−６０３０（１９９６）；Ｇｕｒｓｋａｙａ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２４０：９０−９７（１９９６）；ＰＣＲ‐Ｓｅｌｅｃｔ  ｃＤＮＡ  Ｓｕｂｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ，ＣＬＯＮＴＥＣＨｎｉｑｕｅｓ  Ｘ（４）：２−５（１９９５））。ＰＣＲ‐Ｓｅｌｅｃｔ法はサプレッションＰＣＲを利用する（米国特許第５，５６３，３４０号）。ＰＣＲ‐ＳｅｌｅｃｔのキットはＣｌｏｎｔｅｃｈ（Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）から入手可能である。
【００１１】
発明の概要
ＨＳ−５細胞系統の研究に基づき、実質的に精製された２９４の核酸配列のライブラリーが作製された。これらの配列はＨＳ−５により生成された遺伝子に由来し、そして全遺伝子検出のプローブとして、および遺伝子配列を増幅するためのプライマーとして有用である。また、本発明はＳｌｉｔ様蛋白質、その変異体、またはそのフラグメントをコードする実質的に精製された核酸分子に関し、そしてそれはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１，ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２，ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３，およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４、それらの実質的なフラグメント、それらの実質的な相同体、またはそれらの実質的な相補体からなる群から選択された少なくとも１核酸配列を含む。
【００１２】
本発明はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１，ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２，ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３，およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４、およびそれらの相補体からなる群から選択された少なくとも１核酸配列と実質的にハイブリダイズする核酸配列を有する、ＨＳ−５またはそのフラグメントをコードする実質的に精製された核酸分子を提供する。
【００１３】
本発明はさらに、第２の核酸分子に実質的にハイブリダイズする核酸分子によりコードされた、実質的に精製されたＳｌｉｔ様蛋白質、またはそのフラグメントに関し、ここで第２の核酸分子は本質的に、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１，ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２，ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３，およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４、およびそれらの相補体からなる群から選択された核酸配列からなる。
【００１４】
また、本発明は以下のことを含む細胞におけるＳｌｉｔ様蛋白質のレベルまたは型を決定するための方法に関する：
（Ａ）核酸ハイブリダイゼーションが可能な条件下で、マーカー核酸分子、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１，ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２，ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３，およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４、またはそれらの相補体からなる群から選択された核酸配列を有するマーカー核酸分子を、細胞から得られた相補的な核酸分子とインキュベートすること、ここでマーカー核酸分子と細胞から得られた相補的な核酸分子間の核酸ハイブリダイゼーションがＳｌｉｔ様蛋白質の検出を可能にする；
（Ｂ）マーカー核酸分子と細胞から得られた相補的な核酸分子間のハイブリダイゼーションを可能にすること；および
（Ｃ）相補的な核酸のレベルまたは型を検出すること、ここで相補的な核酸の検出はＳｌｉｔ様蛋白質のレベルまたは型を予測する。
【００１５】
また本発明は、細胞の存在が、以下の段階を含むＳｌｉｔ様蛋白質のレベルまたは型を変化させる突然変異を予測する、そのような細胞における突然変異を測定するための方法に関する：
（Ａ）核酸ハイブリダイゼーションが可能な条件下で、マーカー核酸分子、遺伝子、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１，ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２，ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３，およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４、またはそれらの相補体からなる群から選択された核酸配列を有する核酸分子に特異的にハイブリダイズする遺伝子に結合する核酸分子を含むマーカー核酸分子、および細胞から得られた相補的な核酸分子をインキュベートすること、ここでマーカー核酸分子と細胞から得られた相補的な核酸分子間の核酸ハイブリダイゼーションは、多形の存在が細胞におけるＳｌｉｔ様蛋白質のレベルまたは型を変化させる突然変異を予測する、そのような多形の検出を可能にする；
（Ｂ）マーカー核酸分子と細胞から得られた相補的な核酸分子間のハイブリダイゼーションを可能にすること；および
（Ｃ）多形の存在を検出すること、ここで多形の存在は突然変異を予測する。
【００１６】
また、本発明は以下のことを含む、過剰発現されたＳｌｉｔ様蛋白質を含む細胞を作製するための方法を提供する：
（Ａ）機能的核酸分子により細胞を形質転換すること、ここで機能的核酸分子はプロモータ領域を含み、ここでプロモータ領域は構造領域に結合し、ここで構造領域はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１，ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２，ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３，およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４、またはそれらの相補体からなる群から選択された核酸配列を有する核酸分子を含み；ここで構造領域は細胞において転写の終了およびｍＲＮＡ分子の３′末端へのポリアデニル化リボヌクレオチドの添加を引き起こすように機能する３′非翻訳配列に結合する；および
（Ｂ）形質転換された細胞を増殖させること。
【００１７】
本発明はさらに、以下のことを含む、Ｓｌｉｔ様蛋白質の減少したレベルを含む細胞を作製するための方法を提供する：
（Ａ）機能的核酸分子により細胞を形質転換すること、ここで機能的核酸分子はプロモータ領域を含み、ここでプロモータ領域は構造領域に結合し、ここで構造領域はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１，ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２，ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３，およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４、またはそれらの相補体からなる群から選択された核酸配列を有する核酸分子を含み、ここで構造領域は細胞において転写の終了およびｍＲＮＡ分子の３′末端へのポリアデニル化リボヌクレオチドの添加を引き起こすように機能する３′非翻訳配列に結合し；そしてここで機能的核酸分子はＳｌｉｔ様蛋白質の共抑制を引き起こす；および
（Ｂ）形質転換された細胞を増殖させること。
【００１８】
本発明はさらに、以下のことを含む、細胞においてＳｌｉｔ様蛋白質の減少した発現のための方法を提供する：
（Ａ）核酸分子（細胞においてｍＲＮＡ分子の産生を引き起こすように機能する外因性プロモータ領域を有する核酸分子）により細胞を形質転換すること、ここで外因性プロモータ領域は転写鎖および非転写鎖を有する転写核酸分子に結合し、ここで転写鎖はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１，ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２，ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３，およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４、またはそれらの相補体からなる群から選択された核酸配列を有する核酸分子に相補的であり、そして転写鎖は内因性ｍＲＮＡ分子に相補的であり；そしてここで転写核酸分子は細胞において転写の終了およびｍＲＮＡ分子の３′末端へのポリアデニル化リボヌクレオチドの添加を引き起こすように機能する３′非翻訳配列に結合する；および
（Ｂ）形質転換された細胞を増殖させること。
【００１９】
また、本発明は以下のことを含む、Ｓｌｉｔ様蛋白質またはそのフラグメントをコードする核酸を単離する方法を提供する：
（Ａ）核酸ハイブリダイゼーションが可能な条件下で、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１，ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２，ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３，およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４、またはそれらの相補体からなる群から選択された核酸配列を含む第１核酸分子を細胞から得られた相補的な第２核酸分子とインキュベートすること；
（Ｂ）第１核酸分子と細胞から得られた第２核酸分子間のハイブリダイゼーションを可能にすること；および
（Ｃ）第２核酸分子を単離すること。
【００２０】
また本発明は、サイトカイン混合物の存在下で造血幹細胞集団を培養することを含む、ｅｘ  ｖｉｖｏでの造血幹細胞集団を増殖させるか、または拡張させる方法を提供し、ここで混合物はＳｌｉｔ様蛋白質、ＷＯ９４／１２６３９およびＷＯ９４／１２６３８で教示されたＩＬ−３変異体、ＷＯ９５／２１１９７およびＷＯ９５／２１２５４で教示された融合蛋白質、ＷＯ９７／１２９７７に開示されたＧ−ＣＳＦ受容体アゴニスト、ＷＯ９７／１２９７８に開示されたｃ−ｍｐｌ受容体アゴニスト、ＷＯ９７／１２９７９に開示されたＩＬ−３受容体アゴニストおよびＷＯ９７／１２９８５で教示された多機能受容体アゴニスト、ＷＯ９８／１８９２３に開示されたｆｌｔ３受容体アゴニスト、ＷＯ９８／１８９２４に開示された幹細胞因子受容体アゴニストおよびＷＯ９８／１７８１０に開示された多機能キメラ造血受容体アゴニストを含み、そしてここで培養は骨髄型前駆細胞の増殖を促進する。本明細書で使用する“ＩＬ−３変異体”はＷＯ９４／１２６３９およびＷＯ９４／１２６３８で教示されたＩＬ−３変異体を表す。本明細書で使用する“融合蛋白質”はＷＯ９５／２１１９７およびＷＯ９５／２１２５４で教示された融合蛋白質を表す。本明細書で使用する“Ｇ−ＣＳＦ受容体アゴニスト”はＷＯ９７／１２９７８に開示されたＧ−ＣＳＦ受容体アゴニストを表す。本明細書で使用する“ｃ−ｍｐｌ受容体アゴニスト”はＷＯ９７／１２９７８に開示されたｃ−ｍｐｌ受容体アゴニストを表す。本明細書で使用する“ＩＬ−３受容体アゴニスト”はＷＯ９７／１２９７９に開示されたＩＬ−３受容体アゴニストを表す。本明細書で使用する“多機能受容体アゴニスト”はＷＯ９７／１２９８５で教示された多機能受容体アゴニストを表す。本明細書で使用する“ｆｌｔ３受容体アゴニスト”はＷＯ９８／１８９２３に開示されたｆｌｔ３受容体アゴニストを表す。本明細書で使用する“幹細胞因子受容体アゴニスト”はＷＯ９８／１８９２４に開示された幹細胞因子受容体アゴニストを表す。本明細書で使用する“エリスロポイエチン受容体アゴニスト”はＷＯ９８／１８９２６に開示されたエリスロポイエチン受容体アゴニストを表す。本明細書で使用する“多機能キメラ造血受容体アゴニスト”はＷＯ９８／１７８１０に開示された多機能キメラ造血受容体アゴニストを表す。
【００２１】
定義
以下は、本明細書で交換して使用可能な略語および対応する意味のリストである：
ＤＭＥＭ＝Ｄｕｌｂｅｃｃｏ変法Ｅａｇｌｅ培地
ＤＴＴ＝ジチオスレイトール
ＨＢＳＳ＝Ｈａｎｋｓ液
ＨＰＬＣ＝高性能液体クロマトグラフィー
ＩＭＤＭ＝Ｉｓｃｏｖｅの調製Ｄｕｌｂｅｃｃｏ培地
ｍｇ＝ミリグラム
ｍｌ＝ミリリットル
ｍＬ＝ミリリットル
μｇ＝マイクログラム
μｌ＝マイクロリットル
ＰＢＳ＝リン酸緩衝生理食塩水
ＴＦＡ＝トリフルオロ酢酸
μｇ＝マイクログラム
μｌ＝マイクロリットル
以下は本明細書で使用する各種用語の定義のリストである：
“変化した”という用語は、表現型を示さない細胞または組織の発現反応と発現が異なることを意味する。
【００２２】
“アミノ酸”という用語は、すべての天然に存在するＬ−アミノ酸を意味する。
“染色体歩行”という用語は、連続したハイブリダイゼーション段階により遺伝子地図を拡張する過程を意味する。
【００２３】
“クラスター”という用語は、メンバークローンの対ごとの配列比較由来のＢＬＡＳＴスコアが十分類似し、実験誤差に一致すると判断されることを意味する。
【００２４】
“完全な相補性”という用語は、１分子のどのヌクレオチドも別の分子のヌクレオチドに相補的であることを意味する。
“縮退する”という用語は、２種の核酸分子が同じアミノ酸配列をコードするが、異なるヌクレオチド配列を含むことを意味する。
【００２５】
“外因性遺伝物質”という用語は、任意の生物に挿入することができる任意の供与源由来の、天然に存在してもしなくてもよい、任意の遺伝物質を意味する。
“拡大”という用語は、細胞の分化および増殖を意味する。
【００２６】
“発現配列タグ（ＥＳＴｓ）”という用語は、ｃＤＮＡまたは相補的ＤＮＡライブラリーの任意に配列されたメンバーを意味する。
“発現反応”という用語は、１以上の核酸分子により部分、または全体がコードされた発現のレベルまたは型を変化させる突然変異を意味する。
【００２７】
“フラグメント”という用語は、その配列が標的または同定された核酸分子より短く、そして標的または同定された核酸分子の少なくとも１０隣接ヌクレオチドの実質的な相補体、または実質的な相同体を有する核酸分子を意味する。
【００２８】
“融合分子”という用語は、発現時に融合蛋白質を産生する、蛋白質をコードする分子またはフラグメントを意味する。
“融合蛋白質”という用語は、その蛋白質に由来しない１以上の付加的なペプチド領域を含む蛋白質またはフラグメントを意味する。
【００２９】
“マーカー核酸”という用語は、分子、細胞、または組織の特性または特徴（たとえば、存在または非存在、位置、相関関係など）を測定するために使用される核酸分子を意味する。
【００３０】
“模倣化合物”という用語は、天然に存在する化合物、またはその化合物のフラグメントに類似した性質を持つ化学的に合成された化合物を意味し、それはその化合物に対する抗体に特異的に結合する能力を示す。
【００３１】
“表現型”という用語は、生物、組織、または細胞の１以上の特徴のいずれかを意味する。
“プローブ”という用語は、分子、細胞、組織、または生物の特性または特徴（たとえば、存在または非存在、位置、相関関係など）を測定するために使用される物質を意味する。
【００３２】
“蛋白質フラグメント”という用語は、ペプチドまたはポリペプチド分子のアミノ酸配列がその蛋白質のアミノ酸配列の部分集合を含む、そのような分子を意味する。
【００３３】
“蛋白質分子／ペプチド分子”という用語は、５以上のアミノ酸を含むいずれかの分子を意味する。
“組換え体”という用語は、いずれかの物質（たとえばＤＮＡ、ペプチドなど）、すなわち、または間接的であっても、核酸分子のヒトによる操作の結果生じたものを意味する。
【００３４】
“選択可能であるか、またはスクリーニング可能であるマーカー遺伝子”という用語は、その発現を形質転換された細胞を同定または選択するための手段としてのプローブにより検出することができる遺伝子を意味する。
【００３５】
“シングルトン（ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ）”という用語は、単一クローンを意味する。
“特異的な結合”という用語は、抗体またはペプチドの結合が非関連分子の存在により競合的に阻害されないことを意味する。
【００３６】
“特異的にハイブリダイズする”という用語は、２つの核酸分子が反並行な、２本鎖核酸構造を形成することができることを意味する。
“幹細胞”という用語は、骨髄、脾臓、または末梢血から単離することができる全能造血幹細胞、ならびに初期前駆体および前駆体細胞を意味する。
【００３７】
“幹細胞成長因子”という用語は、前駆細胞および幹細胞上で作用する因子を意味する。
“実質的な相補体”という用語は、核酸配列が相補体と少なくとも８０％配列同一性を共有することを意味する。
【００３８】
“実質的なフラグメント”という用語は、少なくとも１００ヌクレオチドを含むフラグメントを意味する。
“実質的な相同体”という用語は、核酸分子が他と少なくとも８０％配列同一性を共有することを意味する。
【００３９】
“実質的にハイブリダイズする”という用語は、おたがいに９０％以上の配列同一性を示し、そしてこの同一性を少なくとも核酸分子の連続した５０ヌクレオチドに対して示す条件（たとえば塩および温度）下で、２つの核酸分子が反並行、２本鎖核酸構造を形成できることを意味する。
【００４０】
“実質的に精製された”という用語は、標的分子を含む天然に存在する試料中に存在するか、または存在してもよい、１以上の分子が除去されているか、または濃度を低下させているであろうことを意味する。
【００４１】
“組織試料”という用語は、１以上の細胞を含む任意の試料を意味する。
“変異体”という用語は、天然のアミノ酸配列に比較して少なくとも１アミノ酸の欠失および／または挿入、および／または置換を有する蛋白質を意味する。
【００４２】
発明の詳細な説明
発現配列タグ（ＥＳＴｓ）はＨＳ−５細胞系統由来のｃＤＮＡライブラリーから作製された。ＥＳＴｓはｃＤＮＡライブラリー（または相補的ＤＮＡ）の任意に配列されたメンバーである（ＭｃＣｏｍｂｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １：１２４−１３０（１９９２）；Ｋｕｒａｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ８：３６５−３７２（１９９４）；Ｏｋｕｂｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ２：１７３−１７９（１９９２）、参考文献はすべてそのまま援用する）。選択されたクローンはｍＲＮＡ転写物の全長までのコピーを表すことができる挿入物を含む。
【００４３】
ｃＤＮＡライブラリーはＨＳ−２１，ＨＳ−２７，およびＨＳ−２３に共通であるＨＳ−５中のｍＲＮＡを除去することにより部分的に作製された。ＥＳＴ配列はコンピュータアルゴリズムにより各種データベースの配列と比較した。本明細書で説明した配列は重要なことに、成長因子および／または分泌モチーフを有する。従って、これらの配列はＨＳ−５により発現され、そしてＨＳ−５ならし培地に見出されるが、ＨＳ−２１，ＨＳ−２７，およびＨＳ−２３により発現されないＳｌｉｔ様蛋白質に対応する。
【００４４】
異なる核酸が同じ蛋白質またはペプチドをコードすることを可能にする、遺伝コードの縮退は、文献で既知である（米国特許第４，７５７，００６号、それを参照としてそのまま援用する）。本明細書で使用するように、核酸分子が同じアミノ酸配列をコードするが、異なるヌクレオチド配列を含むとき、核酸分子は他の核酸分子の“縮退物”である。本発明の核酸分子は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１，ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２，ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３，ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４、またはそれらの相補体において明らかにされた相同核酸分子の縮退物である核酸分子を含むが、それらに限定されない。
【００４５】
本明細書で使用する核酸分子の“実質的な相同体”はそれと少なくとも８０％配列同一性を共有するものである。変動は遺伝コードの縮退のためである。好ましくは、相同体は標的核酸分子と少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を共有する。いくつかの態様において、実質的な相同体はわずか５ヌクレオチドまで、好ましくはわずか３ヌクレオチドまで標的核酸分子と異なるであろう。
【００４６】
核酸分子は、分子の一つのどのヌクレオチドも他のヌクレオチドに相補的である場合（完全な相補性）、他のヌクレオチドの“相補体”であると言われる。“実質的な相補体”は少なくとも相補体と８０％配列同一性を共有する。好ましくは、実質的な相補体は、少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、相補体と配列同一性を共有する。ある態様において、実質的な相補体はわずか５ヌクレオチドまで、好ましくはわずか３ヌクレオチドまで相補体と異なる。
【００４７】
本明細書で使用する“フラグメント”は、配列が標的または同定された核酸分子より短く、同一で、実質的な相補体、または標的もしくは同定された核酸分子の少なくとも１０の連続したヌクレオチドの実質的な相同体を有する核酸分子を意味する。したがって、フラグメントは少なくとも１０ヌクレオチド、典型的には少なくとも５０ヌクレオチド、より典型的には少なくとも６０ヌクレオチド、そして好ましくは少なくとも１００ヌクレオチドを含む。ヌクレオチド数の上限は本質的に標的核酸分子のヌクレオチド数だけに制限される。
【００４８】
先に示したように、フラグメントはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１，ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２，ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３，およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４で明らかにされた配列の一つの実質的な相同体または実質的な相補体由来であってもよい。好ましくは、フラグメントはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１，ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２，ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３，ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４の一つにおける少なくとも５０の連続したヌクレオチドに対して同一であるか、相補的である。
【００４９】
本明細書で使用する“実質的に精製された”という用語は、標的分子を含む天然に存在する試料中に存在するか、または存在してもよい１以上の分子が除去されているか、または濃度を低下させているであろうことを意味する。
【００５０】
相同体、相補体、およびフラグメントを含む、先に記載の本発明の配列はまた、それらの標識された形状を含むということを理解すべきである（たとえば、蛍光ラベル（Ｐｒｏｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３８：３３６−３４０（１９８７）；Ａｌｂａｒｅｌｌａ  ｅｔ  ａｌ．，ヨーロッパ特許第１４４９１４号）、化学的ラベル（Ｓｈｅｌｄｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許第４，５８２，７８９号；Ａｌｂａｒｅｌｌａ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許第４，５６３，４１７号）修飾ヌクレオチド（Ｍｉｙｏｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，ヨーロッパ特許第１１９４４８号）。
【００５１】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１，ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２，ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３，ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４、またはそれらの相補体、それらの実質的な相同体、およびそれらの実質的なフラグメントを含む核酸分子は、それ自体、またはより長い配列の一部として、Ｓｌｉｔ様蛋白質、またはそのフラグメントをコードすることができる。したがって、本発明の一側面は、少なくともＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１，ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２，ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３，ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４で明らかにされた配列に対して、同一である１核酸配列を含む実質的に精製された核酸分子、実質的な相同体、または実質的な相補体である。本発明の一態様において、本発明の１以上の核酸分子はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１，ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２，ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３，ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４、またはその相補体で明らかにされた１以上の核酸配列と９０％から１００％の間の配列同一性を共有する。本発明の別の側面において、１以上の核酸分子はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１，ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２，ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３，ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４、またはその相補体で明らかにされた１以上の核酸配列と９５％から１００％の間、好ましくは９８％から１００％の間、そしてより好ましくは９９％から１００％の間の配列同一性を共有する。
【００５２】
好ましい態様において、本発明の核酸は適度にストリンジェントな条件下、たとえば約２ｘ塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）および約４０℃で、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１，ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２，ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３，ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４、またはその相補体で明らかにされた１以上の核酸分子と特異的にハイブリダイズするであろう。とりわけ好ましい態様において、本発明の核酸は高度にストリンジェントな条件下で、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１，ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２，ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３，ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４、またはその相補体で明らかにされた１以上の核酸分子と特異的にハイブリダイズするであろう。
【００５３】
慣用のストリンジェントな条件は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎ：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，二版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８９）），およびＨａｙｍｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎ：Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ（１９８５）に記載され、参照としてそのまま援用する。完全な相補性からの離脱が２本鎖構造を形成する分子の能力を完全に妨げない限り、そのような離脱はしたがって許容される。
【００５４】
ＤＮＡハイブリダイゼーションを促進する適切なストリンジェントな条件、たとえば６ｘＳＣＣ、４５℃、その後２ｘＳＳＣ、５０℃での洗浄は当業者に既知であるか、またはＣｕｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎ．Ｙ．（１９８９）、６．３．１−６．３．６に見出すことができる。たとえば、洗浄段階における塩濃度は約２ｘＳＳＣ、５０℃の低いストリンジェンシーから約０．２ｘＳＳＣ、５０℃の高いストリンジェンシーまで選択可能である。さらに、洗浄段階の温度は室温、約２２℃の低いストリンジェンシーから約６５℃の高いストリンジェンシーまで増加させることができる。温度および塩は共に変化してもよいか、または他の変数が変化する間、温度または塩濃度のいずれかが一定に維持されてもよい。
【００５５】
核酸分子またはそのフラグメントはある環境下で他の核酸分子に特異的にハイブリダイズすることができる。２つの核酸分子が反並行、２本鎖核酸構造を形成することができる場合、本明細書で使用するように、２つの分子はおたがいに“特異的にハイブリダイズする”ことができると言われる。
【００５６】
また、本発明は先に記載の配列によりコードされた実質的に精製された蛋白質、そのフラグメント、またはポリペプチド分子に関する。すなわち、実質的に精製された組換え体蛋白質、蛋白質フラグメントおよびポリペプチドである。本明細書で使用する用語“組換え体”はいずれかの物質（たとえばＤＮＡ、ペプチドなど）、すなわち、間接的であっても、核酸分子のヒトによる操作の結果生じたものを意味する。本明細書で使用する用語、“蛋白質分子”または“ペプチド分子”は５以上のアミノ酸を含むいずれかの分子を含む。蛋白質がたとえばジスルフィド結合、グリコシル化、リン酸化、またはオリゴマー化のような翻訳後修飾を含むが、それらに限定されない修飾を受けてもよいことは当技術分野で公知である。したがって、本明細書で使用する用語“蛋白質分子”または“ペプチド分子”はいずれかの生物学的、または非生物学的過程により修飾されるいずれかの蛋白質分子を含む。“アミノ酸”または“複数のアミノ酸”という用語は、すべて天然に存在するＬ−アミノ酸を表す。この定義はノルロイシン、オルニチン、ホモシステイン、およびホモセリンを含むことを意味する。
【００５７】
本発明の蛋白質またはフラグメント分子の非限定的な例は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１，ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２，ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３，ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４、またはその相補体で明らかにされた配列と実質的にハイブリダイズする配列によってコードされた新規Ｓｌｉｔ様蛋白質またはそのフラグメントである。好ましくは、蛋白質はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４またはそのフラグメントのＤＮＡ配列によりコードされるＳｌｉｔ様蛋白質である。本発明の核酸分子の別の側面は、それらがＳｌｉｔ様蛋白質の相同体またはそのフラグメントをコードできることである。本明細書で使用する相同体蛋白質分子またはそのフラグメントは第２の種における対応蛋白質分子またはそのフラグメントである（たとえばヒトのインターロイキン‐２サイトカインはマウスのインターロイキン‐２サイトカインの相同体である）。
【００５８】
本発明の一態様は図２に示されたＳｌｉｔ様蛋白質である。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７のＳｌｉｔ様蛋白質はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３のＤＮＡ配列から推定される。図２は潜在的な蛋白質分泌リーダーおよび開裂部位を示す。図３は潜在的な分泌シグナル、ロイシンリッチ反復（ＬＲＲ）、ＥＧＦモチーフ、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７のＳｌｉｔ様蛋白質の潜在的膜貫通ドメインを示す。ＬＲＲはアミノ‐およびカルボキシ‐末端隣接領域に接した８〜１０までのロイシンリッチ反復として配置される（図３および５の説明を参照されたい）。本発明の別の態様は、残基２３および２４の間の潜在的開裂部位で開裂された分泌リーダー配列を有する、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８の成熟Ｓｌｉｔ様蛋白質である。本発明の別の態様は、天然のアミノ酸配列に比べ、少なくとも１アミノ酸が欠失、および／または挿入、および／または置換された、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８のＥＧＦモチーフ反復蛋白質の変異体である。部位特異的突然変異誘発が、Ｓｌｉｔ様蛋白質変異体を作製するための核酸配列の修飾に利用されてもよい。この技術は１核酸分子によりコードされた１以上のアミノ酸の変化を可能にする（たとえばトレオニンがメチオニンに置換される）。部位特異的突然変異誘発のための３種の基礎的な方法がしばしば使用される。これらは、カセット変異誘発（Ｗｅｌｌｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  ３４：３１５−３２３（１９８５）、これをそのまま参照として援用する）、プライマー伸長（Ｇｉｌｌｉａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  １２：１２９−１３７（１９８０）、これをそのまま参照として援用する；Ｚｏｌｌｅｒ  ａｎｄ  Ｓｍｉｔｈ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１００：４６８−５００（１９８３）、これをそのまま参照として援用する；Ｄａｌｂａｄｉｅ−ＭｃＦａｒｌａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（Ｕ．Ｓ．Ａ．）７９：６４０９−６４１３（１９８２）、これをそのまま参照として援用する）およびＰＣＲに基づいた方法（Ｓｃｈａｒｆ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３３：１０７６−１０７８（１９８６）、これをそのまま参照として援用する；Ｈｉｇｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１６：７３５１−７３６７（１９８８）、これをそのまま参照として援用する）である。部位特異的突然変異誘発法はまた、ヨーロッパ特許第０３８５９６２号、これをそのまま参照として援用する、ヨーロッパ特許第０３５９４７２，これをそのまま参照として援用する、およびＰＣＴ特許出願ＷＯ９３／０７２７８、これをそのまま参照として援用する、に記載される。
【００５９】
ｉｎ  ｖｉｖｏおよびｉｎ  ｖｉｔｒｏ部位特異的突然変異誘発の両方に適用される部位特異的突然変異誘発法は、Ｌｉｎｇ  ａｎｄ  Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２５４：１５７−１７８（１９９７）；Ｃｈｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １７：７１９−７２０（１９９４）；Ｗｅｉｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  １５１：１１９−１２３（１９９４）；Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：６８２−６８４（１９９７）；Ｗｅｉｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  １２６：３５−４１（１９９３）により総説されている。
【００６０】
本発明の核酸分子のいずれかは、部位特異的突然変異誘発により修飾されるか、またはたとえば修飾のために他の核酸分子を標的にすることを目的として使用される核酸分子として使用されてもよい。１以上の変化した核酸分子を含む変異体は、制限フラグメントを単離し、そしてそのようなフラグメントを発現ベクターに連結するような一般的な実験室技術を使用して構築することができる（たとえば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）を参照されたい）。
【００６１】
１以上の蛋白質またはペプチド分子のフラグメントは化学合成、またはより好ましくは適切な細菌もしくは真核細胞宿主に発現されることにより作製してもよい。発現のための適切な方法はＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，二版，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８９））、または類似の書物に記載される。
【００６２】
“蛋白質フラグメント”は、アミノ酸配列がその蛋白質のアミノ酸配列のサブセットを含むペプチドまたはポリペプチド分子である。その蛋白質に由来しない１以上の付加的なペプチド領域を含む蛋白質またはそのフラグメントは、“融合蛋白質”である。そのような分子は、炭水化物または他の部分（たとえばスカシガイのヘモシアニンなど）を含むように誘導体化してもよい。本発明の融合蛋白質またはペプチド分子は好ましくは組換え手段により作製される。
【００６３】
本発明の配列は既知で慣用の手段により作製することができる。たとえば、遺伝子工学的技術が本発明のＤＮＡ配列の構築に使用されてもよい（米国特許第４，９３５，２３３号；Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ（１９８９））。各種方法のいずれかが先に記載の１以上の核酸分子を得るために使用されてもよい（Ｚａｍｅｃｈｉｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（Ｕ．Ｓ．Ａ）８３：４１４３−４１４６（１９８６）、これをそのまま参照として援用する；Ｇｏｏｄｃｈｉｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（Ｕ．Ｓ．Ａ）８５：５５０７−５５１１（１９８８）、これをそのまま参照として援用する；Ｗｉｃｋｓｔｒｏｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（Ｕ．Ｓ．Ａ）８５：１０２８−１０３２（１９８８）、これをそのまま参照として援用する；Ｈｏｌｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．８：９６３−９７３（１９８８）、これをそのまま参照として援用する；Ｇｅｒｗｉｒｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：１３０３−１３０６（１９８８）、これをそのまま参照として援用する；Ａｎｆｏｓｓｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（Ｕ．Ｓ．Ａ）８６：３３７９−３３８３（１９８９）、これをそのまま参照として援用する；Ｂｅｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．８：３６８５−３６９１（１９８９）；これをそのまま参照として援用する）。自動核酸シンセサイザーがこの目的のために使用されてもよい。そのような合成のかわりに、いずれか所望する核酸分子またはフラグメントを増幅し、そして得るための、ポリメラーゼ連鎖反応で使用することができる１対のプライマーを定義するために、開示された核酸分子を使用してもよい（Ｍｕｌｌｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．５１：２６３−２７３（１９８６）；Ｅｒｌｒｉｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，ヨーロッパ特許第５０，４２４号；Ｍｕｌｌｉｓ，ヨーロッパ特許第２０１，１８４号；Ｍｕｌｌｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許第４，６８３，２０２号；Ｅｒｌｒｉｃｈ，米国特許第４，５８２，７８８号；およびＳａｓａｋｉ，Ｒ．ｅｔ  ａｌ．，米国特許第４，６８３，１９４号、これらすべてをそのまま参照として援用する）。
【００６４】
本発明のヌクレオチド分子は、プローブを必要とする方法と関連してプローブとして使用してもよい。本明細書で使用する“プローブ”は分子、細胞、または組織の特質または特徴（たとえば、存在または非存在、位置、相関関係など）を測定するために使用される核酸分子である。好ましくは、本発明の核酸は幹細胞のプローブとして使用される。
【００６５】
本発明の核酸分子またはそのフラグメントは同じ種由来の他の核酸分子を得るために使用してもよい（たとえば、ＨＳ‐５細胞系統由来のＥＳＴｓは他の造血幹細胞またはストロマ細胞系統の他の核酸分子を得るために使用してもよい）。そのような核酸分子は蛋白質の完全なコーディング配列、ならびにそのような分子のプロモータおよび隣接配列をコードする核酸分子を含む。さらに、そのような核酸分子は他のアイソザイムまたは遺伝子ファミリーメンバーをコードする核酸分子を含む。そのような分子は、ｃＤＮＡまたは造血幹細胞から得られたゲノムライブラリーをスクリーニングするための、先に記載の核酸分子またはそのフラグメントを使用することにより容易に得ることができる。そのようなライブラリーを作製するための方法は当技術分野で公知である。
【００６６】
本発明の核酸分子またはそのフラグメントはまた、核酸相同体を得るために使用してもよい。そのような相同体は全体として、または部分的に他の造血幹細胞系統または他の組織（たとえば、ＨＳ−５ストロマ細胞系統など）の蛋白質相同体、プロモータおよび転写調節因子のような遺伝要素の配列をコードする核酸分子を含む、他の造血幹細胞系統または他の組織の核酸分子を含む。そのような分子は、ｃＤＮＡまたはゲノムライブラリーをスクリーニングするための、先に記載の核酸分子またはそのフラグメントを使用することにより容易に得ることができる。そのようなライブラリーを作製するための方法は当技術分野で公知である。完全な相補性は安定なハイブリダイゼーションには必要でないため、そのような相同体分子は、１以上のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１，ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２，ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３，ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４、またはその相補体に見出されるヌクレオチド配列とそれらの配列が異なっていてもよい。したがって、本発明の核酸分子は、核酸分子と特異的にハイブリダイズすることができるが、同様に“完全な相補性”を欠如してもよい分子を含む。
【００６７】
１以上の開示された核酸配列に関連する転写調節隣接配列を含むがそれらに限定されない、プロモータ配列（複数の配列）および他の遺伝要素も、提供された、開示核酸配列を使用して得ることができる。一態様において、そのような配列はＥＳＴ核酸分子、または好ましくはそのフラグメントをゲノムライブラリー（たとえば、ＨＳ−５ストロマ細胞系統）のメンバーとインキュベートし、そしてＥＳＴ核酸分子またはそのフラグメントにハイブリダイズするクローンを回収することにより得られる。第二の態様において、“染色体歩行”または逆ＰＣＲの方法がそのような配列を得るために使用されてもよい（Ｆｒｏｈｍａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（Ｕ．Ｓ．Ａ．）８５：８９９８−９００２（１９８８）；Ｏｈａｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（Ｕ．Ｓ．Ａ．）８６：５６７３−５６７７（１９８９）；Ｐａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ２２（６）：１０４６−１０４８（１９７７）；Ｈｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．６９：８９−９６（１９９７）；Ｈｕａｎｇ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．６７：２８７−２９４（１９９７）；Ｂｅｎｋｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｔ．Ａｎａｌ．１３：１２３−１２７（１９９６）；Ｈａｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．５８：２９３−３０１（１９９６）、これらはすべてそのまま参照として援用する）。
【００６８】
本発明の核酸分子は、細胞促進的、細胞特異的、組織促進的、組織特異的、および発生的または生理的に調節された発現特性のプロモータを単離するために使用してもよい。たとえば、ゲノムスクリーニング法およびＰＣＲ技術を使用した、ゲノムライブラリー由来のこれらの遺伝子の５′隣接プロモータ配列の単離および機能解析が、結果として有用なプロモータおよび転写調節要素を単離するであろう。これらの方法は当業者に既知であり、以下に記載されている（たとえば、Ｂｉｒｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａｎａｌｙｚｉｎｇ  ＤＮＡ，１，（１９９７）、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙを参照されたい、これをそのまま参照として援用する）。また、本発明の核酸分子を使用して得られたプロモータは、それらの調節特性を変化させるように修飾されてもよい。そのような修飾の例は、Ｋａｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３６：１２９９（１９８７）に報告されたエンハンサ配列を含むが、それに限定されないであろう。これらのような遺伝要素は新規および存在する造血幹細胞成長因子の遺伝子発現を促進するために使用することができる。
【００６９】
本発明の一側面において、本発明の１以上の核酸分子により部分、または全体がコードされた発現のレベル（すなわち、試料中のｍＲＮＡ濃度など）または型（すなわち、発現の動態、分解速度、安定性など）を変化させる突然変異（総合的には、細胞または組織の“発現反応”）を細胞（好ましくは造血細胞）が有するか否かを測定するために、１以上の核酸分子が使用される。本明細書で使用する細胞または組織により示された発現反応は、それが表現型を示さない細胞または組織の発現反応と異なる場合、“変化した”といわれる。発現反応が変化したか否かを確定するために表現型を示す細胞または組織により示された発現反応は、表現型を示さない類似した細胞または組織試料のそれと比較される。そのような比較を行う毎に、表現型を示さない細胞または組織試料の発現反応を再び測定する必要はない；具体的な細胞の発現反応は、たとえば、正常細胞のあらかじめ得られた値と比較してもよい。本明細書で使用する生物の“表現型”は、生物、組織、または細胞の１以上の特徴（たとえば、細胞増殖、細胞分化など）のいずれかである。遺伝子型または表現型の変化は一時的または永久であってもよい。本明細書で使用する“組織試料”は、１以上の細胞を含むいずれかの試料である。一側面において、組織試料は共通の特徴を共有する細胞を含む（たとえば、造血幹細胞に由来する、など）。
【００７０】
本発明の一態様において、特定のｍＲＮＡ分子が存在するか否かを特定するために評価が行われる。本発明の１以上の核酸分子、好ましくは本発明の１以上のＥＳＴ核酸分子はｍＲＮＡ種の存在または量を検出するために使用される。その後そのような分子は、核酸ハイブリダイゼーションを可能にするために十分な条件下で、細胞または細胞の組織抽出物と共にインキュベートされる。２本鎖プローブ‐ｍＲＮＡハイブリッド分子の検出はｍＲＮＡの存在を示す。形成されたハイブリッド分子の量はｍＲＮＡの量に比例する。したがって、そのようなプローブは細胞または組織におけるｍＲＮＡ産生のレベルおよび程度を確かめるために使用してもよい。そのような核酸ハイブリダイゼーションは定量的条件下で行われてもよい（それによって存在するｍＲＮＡ量の数値が提供される）。あるいは、アッセイはｍＲＮＡの存在、またはそのレベルが前もって定義された値を超えることを示す定性的アッセイとして行われてもよい。
【００７１】
ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションの原理は、標識された、１本鎖核酸プローブが細胞ＤＮＡまたはＲＮＡの相補鎖にハイブリダイズし、そして適切な条件下で、これらの分子が安定なハイブリッドを形成するであろうということにある。核酸ハイブリダイゼーションが組織学的技術と結合すると、特異的ＤＮＡまたはＲＮＡ配列が単一細胞内で同定可能である。核酸検出のためのより慣用の技術に優るｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションの利点は、組織または細胞内の核酸分子の正確な局所濃度を研究者が測定できることにある（Ａｎｇｅｒｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．１０１：４７７−４８４（１９８４）、これをそのまま参照として援用する；Ａｎｇｅｒｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．１１２：１５７−１６６（１９８５）、これをそのまま参照として援用する；Ｄｉｘｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．１０：１３１７−１３２４（１９９１）、これはそのまま参照として援用する）。ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションはＲＮＡ蓄積の定常状態レベルの測定のために使用してもよい。それは感度の高い技術であり、細胞につき５〜１０コピー存在するＲＮＡ配列を検出することができる（Ｈａｒｄｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２０２：４１７−４３１（１９８９）、これをそのまま参照として援用する）。多数のプロトコルが、組織試料、ハイブリダイゼーション、および洗浄条件それぞれに関してｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションのために考案されている。
【００７２】
ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションは組織または細胞内に蛋白質を局在させることができる（Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎ，Ｉｎ  ｓｉｔｕ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ（１９９２），これはそのまま参照として援用する）。本発明の１以上の分子、好ましくは本発明の１以上のＥＳＴ核酸分子または本発明の１以上の抗体をｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションにより、Ｓｌｉｔ様蛋白質経路酵素またはそのｍＲＮＡのレベルまたは型を検出するために使用してもよいということを理解すべきである。
【００７３】
蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションは染色体に沿って特定のＤＮＡ配列を局在化させる。この技術はとりわけ、遺伝子マッピング、ハイブリッド系において染色体をたどること、または転座、トランスバージョン、または欠失を持つ染色体を検出することに有用である。本発明の核酸分子を、染色体に沿って配列を局在化させるためのプローブまたはマーカーとして使用してもよいということを理解すべきである。
【００７４】
遺伝子発現のハイスループットモニタリングのためのマイクロアレイを基礎にした方法は、遺伝子特異的ハイブリダイゼーション標的を測定するために使用してもよい。この“チップ”を基礎にした研究方法は対応する遺伝子の発現を定量的に評価するための遺伝子特異的ハイブリダイゼーション標的として核酸分子のマイクロアレイを使用することを含む（Ｓｃｈｅｎａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７０：４６７−４７０（１９９５）、これはそのまま参照として援用する；Ｓｈａｌｏｎ，Ｐｈ．Ｄ．学位論文．Ｓｔａｎｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（１９９６），これはそのまま参照として援用する）。大きな配列中のどのヌクレオチドも同時に調べることができる。ハイブリダイゼーションはヌクレオチド配列を効率的に解析するために使用することができる。
【００７５】
いくつかのマイクロアレイ法が記載されている。ある方法は、ハイブリダイゼーションにより解析される配列をすべての可能なサブ配列を表す１組のオリゴヌクレオチドと比較する（Ｂａｉｎｓ  ａｎｄ  Ｓｍｉｔｈ，Ｊ．Ｔｈｅｏｒ．Ｂｉｏｌ．１３５：３０３−３０７（１９８９），これはそのまま参照として援用する）。第２の方法は試料をオリゴヌクレオチドまたはｃＤＮＡ分子のアレイにハイブリダイズする。標的配列のサブ配列に相補的なオリゴヌクレオチドからなるアレイは標的配列の同一性を確定し、その量を測定し、そして標的と参照配列間の差を検出するために使用することができる。核酸分子マイクロアレイはまた、蛋白質分子、またはそのフラグメントに特異的に結合する核酸分子を確定するために蛋白質分子、またはそのフラグメントによりスクリーニングしてもよい。
【００７６】
マイクロアレイ法はポリペプチド標的とともに使用してもよい（米国特許第５，４４５，９３４号；米国特許第５，１４３，８５４号；米国特許第５，０７９，６００号；米国特許第４，９２３，９０１号）。本質的に、ポリペプチドは基質（マイクロアレイ）上で合成され、そしてこれらのポリペプチドは以下のものを含むがそれらに限定されない、蛋白質分子またはそのフラグメントのいずれかによりスクリーニングすることができる：抗体、または蛋白質分子もしくはそのフラグメントのいずれかをスクリーニングするための核酸分子、または標的ポリペプチドに特異的に結合する核酸分子、または蛋白質分子に実質的な親和性を持つ小分子、または特異的蛋白質分子に実質的な親和性を持つ小分子。これらの技術の実施は、多数のオリゴヌクレオチドプローブのいずれかの整ったアレイを作製するための最近開発されたコンビナトリアル技術に依存する（Ｆｏｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５１：７６７−７７３（１９９１）、これをそのまま参照として援用する）。本発明の１以上の核酸分子または蛋白質もしくはそのフラグメントをマイクロアレイを基礎にした方法において使用してもよいということを理解すべきである。
【００７７】
部位特異的突然変異誘発は核酸配列を修飾するために使用してもよい。この技術は１核酸分子によりコードされた１以上のアミノ酸の変化を可能にする（たとえばトレオニンがメチオニンにより置換される）。部位特異的突然変異誘発のための３種の基礎的な方法がしばしば使用される。これらは、カセット変異誘発（Ｗｅｌｌｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  ３４：３１５−３２３（１９８５）、これをそのまま参照として援用する）、プライマー伸長（Ｇｉｌｌｉａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  １２：１２９−１３７（１９８０）、これをそのまま参照として援用する；Ｚｏｌｌｅｒ  ａｎｄ  Ｓｍｉｔｈ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１００：４６８−５００（１９８３）、これをそのまま参照として援用する；Ｄａｌｂａｄｉｅ−ＭｃＦａｒｌａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（Ｕ．Ｓ．Ａ．）７９：６４０９−６４１３（１９８２）、これをそのまま参照として援用する）およびＰＣＲに基づいた方法（Ｓｃｈｓｒｆ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３３：１０７６−１０７８（１９８６）、これをそのまま参照として援用する；Ｈｉｇｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１６：７３５１−７３６７（１９８８）、これをそのまま参照として援用する）である。部位特異的突然変異誘発法はまた、ヨーロッパ特許第０３８５９６２号、これをそのまま参照として援用する、ヨーロッパ特許第０３５９４７２，これをそのまま参照として援用する、およびＰＣＴ特許出願ＷＯ９３／０７２７８、これをそのまま参照として援用する、に記載される。
【００７８】
ｉｎ  ｖｉｖｏおよびｉｎ  ｖｉｔｒｏ部位特異的突然変異誘発の両方に適用された部位特異的突然変異誘発法は、Ｌｉｎｇ  ａｎｄ  Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２５４：１５７−１７８（１９９７）；Ｃｈｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １７：７１９−７２０（１９９４）；Ｗｅｉｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  １５１：１１９−１２３（１９９４）；Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：６８２−６８４（１９９７）；Ｗｅｉｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  １２６：３５−４１（１９９３）により総説されている。
【００７９】
本発明の核酸分子のいずれかは、部位特異的突然変異誘発により修飾されるか、またはたとえば修飾のための他の核酸分子を標的にするために使用される核酸分子として使用されてもよい。１以上の変化した核酸分子を含む変異体は、制限フラグメントを単離し、そしてそのようなフラグメントを発現ベクターに連結するような一般的な実験室技術を使用して構築することができる（たとえば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）を参照されたい）。
【００８０】
本発明の一側面は、本発明の１以上の蛋白質もしくはペプチド分子に特異的に結合する抗体、１本鎖抗原結合分子、または他の蛋白質、およびそれらの相同体、融合体またはフラグメントに関連する。そのような抗体は、本発明の蛋白質またはペプチド分子を定量的または定性的に検出するために使用してもよい。本明細書で使用する抗体またはペプチドは、結合が非関連分子の存在により競合的に阻害されない場合、本発明の蛋白質またはペプチド分子に“特異的に結合する”といわれる。
【００８１】
本発明の蛋白質のすべてまたは部分をコードする核酸分子は、発現された蛋白質またはペプチドを結合することができる抗体を作製するために使用できる蛋白質またはペプチドを得るために、組換え手段により発現させることができる。そのような抗体はその蛋白質のためのイムノアッセイで使用してもよい。そのような蛋白質をコードする分子、またはそれらのフラグメントは、発現時に融合蛋白質を生じるような、“融合分子”（すなわち、さらに大きい核酸分子の一部）であってもよい。本発明の核酸分子のいずれかは、これらの核酸分子によりコードされた蛋白質またはペプチドを得るために組換え手段により発現されてもよい。
【００８２】
本発明の蛋白質または蛋白質フラグメントに特異的に結合する抗体はポリクローナルまたはモノクローナルであってもよく、そして無傷イムノグロブリン、またはイムノグロブリンフラグメントの抗原結合部分（たとえば（Ｆ（ａｂ′）、Ｆ（ａｂ′）２）、またはたとえば、組換え手段により作製可能な１本鎖イムノグロブリンを含んでいてもよい。当業者は、抗体の構築、操作、および単離のための特異的条件および方法を記載する標準の供与源資料に精通していると理解すべきである（たとえば、Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，Ｉｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８８），これをそのまま参照として援用する）。
【００８３】
マウスモノクローナル抗体がとりわけ好ましい。ＢＡＬＢ／ｃマウスはこの目的に好ましいが、相当する系統も使用することができる。動物は好ましくは、適切なアジュバント（たとえばＴｉｔｅｒＭａｘアジュバント（Ｖａｘｃｅｌ，Ｎａｒｃｒｏｓｓ，ＧＡ）中に乳化されている約２５μｇの精製された蛋白質で免疫する。免疫処置は好ましくは２筋肉内部位、１腹腔内部位、および尾の基部の１皮下部位で行う。標準生理食塩水中抗原約２５μｇの付加的なｉ．ｖ．注射は、好ましくは３週間後に行われる。２回目の注射後約１１日目に、マウスを瀉血し、血液を抗蛋白質またはペプチド抗体の存在に関してスクリーニングすることができる。好ましくは、直接結合エンザイムイムノアッセイ（ＥＬＩＳＡ）がこの目的に使用される。
【００８４】
より好ましくは、もっとも高い抗体価を有するマウスには３回目の約２５μｇの同じ蛋白質またはフラグメントのｉ．ｖ注射が行われる。この動物の脾臓白血球は３日後に回収し、もっとも好ましくは、ポリエチレングリコールを使用して、適切な骨髄腫細胞系統（たとえば、Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３骨髄腫細胞系統）の細胞と融合させることができる。ハイブリドーマ細胞は、約１週間、“ＨＡＴ”（ヒポキサンチン‐アミノプテリン‐チミン）選択下で細胞を培養することにより選択される。得られたクローンは次に、好ましくは直接ＥＬＩＳＡにより、モノクローナル抗体（ｍＡｂｓ）を産生するそれらの能力に関してスクリーニングされてもよい。
【００８５】
一態様において、抗蛋白質またはペプチドモノクローナル抗体は、免疫原として本発明の蛋白質もしくはペプチドの融合物、または本発明の蛋白質もしくはペプチドの抱合物を使用して単離される。したがって、たとえば１群のマウスはＦｒｅｕｎｄの完全アジュバント中に乳化された融合蛋白質を使用して免疫することができる（たとえば、免疫処置毎に抗原約５０μｇ）。３週間間隔で、同じ量の抗原がＦｒｅｕｎｄの不完全アジュバント中に乳化され、動物を免疫するために使用される。３回目の免疫処置後１０日目に、血清試料を採取し、抗体の存在を評価する。抗体価が非常に低い場合、４回目の追加免疫を行うことができる。蛋白質またはペプチドを結合することができる多血清（ｐｏｌｙｓｅｒａ）もこの方法を使用して得ることができる。
【００８６】
モノクローナル抗体を得るための好ましい方法において、先に記載の免疫化マウスの脾臓は除去され、破砕され、そして免疫脾細胞はフィコールグラジエントにより単離される。単離された脾細胞は、ポリエチレングリコールを使用して、ＢＡＬＢ／ｃ‐由来ＨＧＰＲＴ（ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ）欠乏Ｐ３ｘ６３ｘＡｇ８．６５３形質細胞腫細胞と融合させる。融合細胞は９６ウェルマイクロタイタープレート中で培養し、ハイブリドーマ細胞がヒポキサンチン、アミノプテリン、およびチミジンを補足した培地中で増殖する能力を２〜３週間スクリーニングする。
【００８７】
そのようなインキュベーションから生じたハイブリドーマ細胞は、好ましくは関心のある蛋白質に結合するイムノグロブリンを産生するそれらの能力に関してスクリーニングされる。間接ＥＬＩＳＡがこの目的のために使用されてもよい。簡潔に述べると、ハイブリドーマの上清が固定化蛋白質を含むマイクロタイターウェル中でインキュベートされる。洗浄後、結合イムノグロブリンの力価はたとえばホースラディッシュペルオキシダーゼに結合したヤギ抗マウス抗体を使用して測定することができる。付加的な洗浄後、固定化酵素の量が確定される（たとえば発色基質の使用により）。そのようなスクリーニングは、所望するクローンが非分泌隣接細胞により過剰増殖されていないことを確実にするためにハイブリドーマの同定後できるだけ速やかに行われる。好ましくは、ハイブリドーマの増殖速度が変化するため、融合プレートは数回スクリーニングされる。好ましい態様下において、ハイブリドーマをスクリーニングするために異なる抗原形態が使用されてもよい。したがって、たとえば脾細胞は１つの免疫原で免疫してもよいが、得られたハイブリドーマは異なる免疫原でスクリーニングすることができる。本発明の蛋白質またはペプチド分子のいずれかが抗体を作製するために使用されてもよいということを理解すべきである。
【００８８】
以下に記載するように、そのような抗体分子またはそれらのフラグメントは診断目的に使用してもよい。抗体が診断目的に使用する予定の場合、それらをたとえばリガンド基（たとえばビオチン）または検出可能なマーカー基（たとえば蛍光基、放射性同位体または酵素）により誘導体化することが望ましいであろう。
【００８９】
本発明の蛋白質またはペプチド分子に結合する抗体を産生する能力は、それらの分子の模倣化合物の同定を可能にする。“模倣化合物”は構造または機能のいずれかにおいて化合物に密接に関連する化合物、またはその化合物のフラグメントであるが、それにもかかわらず、それはその化合物に対する抗体に特異的に結合する能力を示す。
【００９０】
本発明の抗体のいずれかが発現され、そしてそのような発現が結果として生理的作用を生じるということを理解すべきである。また、発現された抗体のいずれかは触媒作用があるということを理解すべきである。
【００９１】
本発明の別の側面は、本発明のｓｌｉｔ様蛋白質の発現に使用するプラスミドＤＮＡベクターを提供する。これらのベクターは、本発明のポリペプチドをコードする、先に記載のＤＮＡ配列を含む。ｓｌｉｔ様蛋白質を発現することができる微生物を形質転換できる適切なベクターは、使用される宿主細胞に従って選択される転写および翻訳調節配列に結合したｓｌｉｔ様蛋白質をコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターを含む。
【００９２】
先に記載の修飾された配列を包含するベクターは本発明に含まれ、そしてｓｌｉｔ様蛋白質ポリペプチドの産生に有用である。方法で使用されるベクターはまた、本発明のＤＮＡコーディング配列と適切に関連した選択された調節配列を含み、そしてそれは選択された宿主細胞にその複製および発現を指示することができる。
【００９３】
蛋白質をコードする核酸の転移は、形質転換された細胞にその蛋白質を過剰発現させることができる。本発明の核酸分子によりコードされた１以上の蛋白質またはそのフラグメントは形質転換された細胞に過剰発現されてもよい。とりわけ、造血幹細胞成長因子またはそのフラグメントのいずれかが形質転換された細胞において過剰発現されてもよい。そのような過剰発現は外因性遺伝物質の一時的または安定な転移の結果であってもよい。“外因性遺伝物質”は任意の生物に挿入することができる任意の供与源由来の、天然に存在してもしなくてもよい、任意の遺伝物質である。
【００９４】
構築物またはベクターは、選択された蛋白質または蛋白質フラグメントを発現させるプロモータを含む。本発明のプロモータは造血幹細胞特異的プロモータであってもよい。好ましくは、本発明の造血幹細胞特異的プロモータはＣＤ３４プロモータ（Ｂｕｒｎ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許第５，５５６，９５４号）である。本発明で使用することができる付加的なプロモータは以下のものを含む：グルコース−６−ホスファターゼプロモータ（Ｙｏｓｈｉｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎ．Ｍｅｔａｂ．８３：１０１６−１０１９（１９９８））、インターロイキン‐１アルファプロモータ（Ｍｏｒｉ  ａｎｄ  Ｐｒａｇｅｒ，Ｌｅｕｋ．Ｌｙｍｐｈｏｍａ  ２６：４２１−４３３（１９９７））、ＣＭＶプロモータ（Ｔｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１８：７１９−７２５（１９９８）；Ｎｏｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｖａｃｃｉｎｅ  １５：８０１−８０３（１９９７））；ＲＳＶプロモータ（Ｅｌｓｈａｍｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．４：２１３−２２１（１９９７）；Ｂａｌｄｗｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．４：１１４２−１１４９（１９９７））；ＳＶ４０プロモータ（Ｈａｒｍｓ  ａｎｄ  Ｓｐｌｉｔｔｅｒ，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．６：１２９１−１２９７（１９９５））、ＣＤ１１ｃインテグリン遺伝子プロモータ（Ｃｏｒｂｉ  ａｎｄ  Ｌｏｐｅｚ−Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ，Ｌｅｕｋ．Ｌｙｍｐｈｏｍａ  ２５：４１５−４２５（１９９７）、ＧＭ−ＣＳＦプロモータ（Ｓｈａｒｒｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７：３０１−３２３（１９９７））、インターロイキン‐５Ｒアルファプロモータ（Ｓｕｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２１１：１７３−１８７（１９９６））、インターロイキン‐２プロモータ（Ｓｅｒｆｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １２６３：１８１−２００（１９９５）；Ｏ′Ｎｅｉｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  Ｐｒｏｃ．２３：２８６２−２８６６（１９９１））、ｃ−ｆｏｓプロモータ（Ｊａｎｋｎｅｃｈｔ，Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ  １９３：１３７−１４２（１９９５）；Ｊａｎｋｎｅｃｈｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ  １６：４４３−４５０（１９９５）；Ｔａｋａｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｉｎｃｅｓｓ  Ｔａｋａｍａｔｓｕ  Ｓｙｍｐ．２２：１９７−２０４（１９９１））、ｈ−ｒａｓプロモータ（Ｒａｃｈａｌ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＸＳ  ６４：３３０−３４２（１９９３））、およびＤＭＤ遺伝子プロモータ（Ｒａｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｄｖ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．２８０：１０７−１１１（１９９０））。
【００９５】
細菌における本発明のＳｌｉｔ様蛋白質の発現に適切なプロモータは、Ｈａｗｌｅｙ  ａｎｄ  ＭｃＣｌｕｒｅ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１１：２２３７−２２５５（１９８３）、およびＨａｒｌｅｙ  ａｎｄ  Ｒｅｙｎｏｌｄｓ  １５：２３４３−２３６１（１９８７）に記載されている。そのようなプロモータは、たとえばｒｅｃ  Ａプロモータ（Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ  ｄｅ  Ｈｅｎｅｓｔｒｏｓａ  ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．１４７：２０９−２１３（１９９７）；Ｎｕｓｓｂａｕｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．１１８：５７−６３（１９９４）；Ｗｅｉｓｅｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ  ７３：４５７−４７０（１９９１））、ｐｔａｃプロモータ（Ｈａｓａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  ５６：１４１−１５１（１９８７）；Ｍａｒｓｈ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１４：３６０３（１９８６））；およびｐｔａｃ‐ｒｅｃ  Ａハイブリッドプロモータを含む。
【００９６】
選択された特定のプロモータが十分な発現を引き起こし、結果として所望する表現型を生じるＳｌｉｔ様蛋白質の効果的な量を産生できることが好ましい。
関心のあるコード領域を持つ構築物またはベクターはまた、全体的または部分的にその領域の転写を終了するために作用する核酸配列を含む。
【００９７】
本発明の核酸分子は好ましくは造血幹細胞成長因子に結合した調節要素を単離するために使用してもよい。たとえば、本発明の核酸分子は造血幹細胞成長因子に結合したプロモータ配列を単離するために使用してもよい。より好ましくは、本発明の核酸分子は本発明のＨＳ−５細胞系統の成長因子に結合したプロモータ配列を単離するために使用される。
【００９８】
また、翻訳エンハンサがベクターＤＮＡの一部として取り込まれてもよい。ＤＮＡ構築物は得られたｍＲＮＡ由来の遺伝子産物の発現を増すことができる１以上の５′非翻訳リーダー配列を含むことができる。そのような配列は遺伝子を発現させるために選択されたプロモータ由来であってもよいか、またはｍＲＮＡの転写を増大させるために特異的に修飾されていてもよい。そのような領域はまた、ウイルスＲＮＡｓ、適切な真核細胞遺伝子、または合成遺伝子配列から得ることができる。
【００９９】
ベクターまたは構築物はまた、スクリーニング可能なマーカーを含んでいてもよい。スクリーニング可能なマーカーは発現をモニターするために使用してもよい。代表的なスクリーニング可能なマーカーは以下のものを含む：ｕｉｄＡ遺伝子にコードされたβ‐グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）（Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ，Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐ．５：３８７−４０５（１９８７）、これをそのまま参照として援用する；Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．６：３９０１−３９０７（１９８７）、これをそのまま参照として援用する）、β‐ラクタマーゼ（Ｓｕｔｃｌｉｆｆｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（Ｕ．Ｓ．Ａ．）７５：３７３７−３７４１（１９７８）、これをそのまま参照として援用する）、ルシフェラーゼ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）（Ｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３４：８５６−８５９（１９８６）、これをそのまま参照として援用する）；β‐ガラクトシダーゼ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）；ＧＳＴ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）；Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）；青色蛍光蛋白質（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）；および緑色蛍光蛋白質（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）。
【０１００】
また、形質転換された細胞を同定または選択する手段としてその分泌を検出することができる分泌可能マーカーをコードする遺伝子は、“分泌可能またはスクリーニング可能なマーカー遺伝子”という用語内に含まれる。例としては、抗体相互作用により同定することができる分泌可能マーカー、または触媒反応により検出できる分泌可能酵素さえコードするマーカーが挙げられる。分泌蛋白質は、検出可能な（たとえばＥＬＩＳＡにより）小拡散性蛋白質、細胞外溶液中で検出可能な小活性酵素（たとえば、α‐アミラーゼ、β‐ラクタマーゼ、ホスフィノトリシントランスフェラーゼ）、または細胞膜に挿入または捕捉された蛋白質（たとえばリーダー配列を含む蛋白質）を含む、多数のクラスに分類される。他の可能性のある分泌可能および／またはスクリーニング可能なマーカー遺伝子は当業者には明らかであろう。
【０１０１】
本発明の別の側面として、ｓｌｉｔ様蛋白質を産生するための方法が提供される。適切な細胞または細胞系統は細菌細胞であってもよい。たとえば、バイオテクノロジーの分野では、各種大腸菌株が宿主細胞として公知である。そのような株の例としては、大腸菌株ＪＭ１０１（Ｙａｎｉｓｈ−Ｐｅｒｒｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  ３３：１０３−１１９（１９８５）およびＭＯＮ１０５（Ｏｂｕｋｏｗｉｃｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｒｉｅｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ５８：１５１１−１５２３（１９９２））が挙げられる。バクテリオファージＭｕ（Ｗｅｉｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  １２６：２５−３３（１９９３））を基礎にした大腸菌の染色体発現ベクターを利用したｓｌｉｔ様蛋白質の発現も本発明に包含される。また、各種枯草菌株をこの方法に使用してもよい。当業者に既知の酵母菌の各種菌株も本発明のポリペプチドの発現のための宿主細胞として利用できる。
【０１０２】
また大腸菌細胞質において発現される場合、遺伝子コドンの５′末端が蛋白質のＮ−末端でＭｅｔ‐２‐Ａｌａ‐１またはＭｅｔ‐１をコードするように添加されるように、本発明のｓｌｉｔ様蛋白質をコードする遺伝子が構築されてもよい。大腸菌の細胞質で作製された蛋白質のＮ末端は、発現時にメチオニンがＮ−末端から切断されるように、メチオニンアミノペプチダーゼ（Ｂａｓｓａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃ．１６９：７５１−７５７（１９８７））およびことによると他のペプチダーゼによる翻訳後プロセシングにより影響を受ける。本発明のｓｌｉｔ様蛋白質はＮ−末端にＭｅｔ‐１、Ａｌａ‐１またはＭｅｔ‐２‐Ａｌａ‐１を有するｓｌｉｔ様蛋白質ポリペプチドであってもよい。これらのｓｌｉｔ様蛋白質ポリペプチドはまた、Ｎ−末端の分泌シグナルペプチドを融合することにより大腸菌で発現されてもよい。このシグナルペプチドは分泌過程の一部としてポリペプチドから開裂することができる。
【０１０３】
別の態様において、本発明のＳｌｉｔ様蛋白質は酵母細胞、好ましくはサッカロミセス  セレビジエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）に発現される。本発明の蛋白質はＵＲＡ３、ＣＹＣ１、またはＡＲＧ３遺伝子のＮ−末端にそれを融合することによりＳ．セレビジエに発現することができる（（Ｇｕａｒｅｎｔｅ  ａｎｄ  Ｐｔａｓｈｎｅ，Ｐｒｏｃ，Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（Ｕ．Ｓ．Ａ．）７８：２１１９−２２０３（１９８１）；Ｒｏｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ，Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（Ｕ．Ｓ．Ａ．）７８：２４６０−２４６４（１９８１）；およびＣｒａｂｅｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．２：２０５−２１２（１９８３））。あるいは、本発明のＳｌｉｔ様蛋白質はＰＧＫまたはＴＲＰ１遺伝子のいずれかに融合することができる（Ｔｕｉｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．１：６０３−６０８（１９８２）；およびＤｏｂｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．１１：２２８７−２３０２（１９８３））。より好ましくは、本発明のＳｌｉｔ様蛋白質は成熟蛋白質として発現される（Ｈｉｔｚｅｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ２９３：７１７−７２２（１９８１）；Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ２９８：３４７−３５０（１９８２）；およびＤｅｒｙｎｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１１：１８１９−１８３７（１９８３））。
【０１０４】
本発明の使用に適した、天然または工学的に設計された酵母プロモータはＲｏｍａｎｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｙｅａｓｔ  ８：４２３−４８８（１９９２）により総説されている。もっとも好ましくは本発明のＥＧＦモチーフは酵母細胞により分泌される（Ｂｌｏｂｅｌ  ａｎｄ  Ｄｏｂｂｅｒｓｔｅｉｎ，Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．６７：８３５−８５１（１９７５）；Ｋｕｒｊａｎ  ａｎｄ  Ｈｅｒｓｋｏｗｉｔｚ，Ｃｅｌｌ  ３０：９３３−９４３（１９８２）；Ｂｏｓｔｉａｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｅｌｌ  ３６：７４１−７５１（１９８４）；Ｒｏｔｈｍａｎ  ａｎｄ  Ｏｒｃｉ，Ｎａｔｕｒｅ  ３５５：４０９−４１５（１９９２）；Ｊｕｌｉｕｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ３２：８３９−８５２（１９８３）；ａｎｄ  Ｊｕｌｉｕｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ３６：３０９−３１８（１９８４））。
【０１０５】
所望する場合、本発明の方法において昆虫細胞を宿主細胞として利用してもよい（たとえば、Ｌｕｃｋｏｗ，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．Ｊ．Ｌ．Ｃｌｅｌａｎｄ．，Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ：１８３−２１８０（１９９６）およびそこに引用された参考文献を参照されたい）。さらに、バキュロウイルスベクターを使用した昆虫細胞における外来遺伝子の発現のための一般的方法は以下に記載される：Ｏ′Ｒｅｉｌｌｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ（１９９２），およびＫｉｎｇ  ａｎｄ  Ｐｒｏｓｓｅｅ，Ｔｈｅ  Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｇｕｉｄｅ，Ｌｏｎｄｏｎ，Ｃｈａｐｍａｎ＆Ｈａｌｌ．発現ベクターは、強力なバキュロウイルスプロモータ（たとえば、ポリへドロンプロモータ）が、所望する蛋白質のコード領域に翻訳的に結合した真核細胞分泌シグナルペプチドコード領域の転写を行う、バキュロウイルス転移ベクターを含むように構築される。たとえば、プラスミドｐＶＬ１３９３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａから入手）を使用することができる。所望する組換え蛋白質をコードする遺伝子を運搬するベクターの構築後、このＤＮＡ  ２マイクログラムをバキュロウイルスＤＮＡ  １マイクログラムと共に培養したスポドプテラフルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）（Ｓｆ９）昆虫細胞に共トランスフェクションさせる。あるいは、現在Ｂａｃ−Ｔｏ−Ｂａｃ（登録商標）Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）として市販される、バキュロウイルスシャトルベクター系（Ｌｕｃｋｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｏｌ．６７：４５６６−４５７９（１９９３））を使用して作製することができる。所望する遺伝子を運搬する純粋な組換え体バキュロウイルスは、たとえば、Ｅｘｃｅｌｌ  ４０１（ＪＲＨ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｌｅｎｅｘａ，Ｋａｎｓａｓ）またはｓｆ９００−ＩＩ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）のような無血清培地中で、培養した細胞に感染させるために使用される。培地に分泌された組換え体蛋白質は標準生化学的方法により回収することができる。組換え体蛋白質を発現する哺乳動物または昆虫細胞の上清は、初めに市販の濃縮装置のいずれかを使用して濃縮することができる。感染細胞内に蓄積する蛋白質は標準技術により、細胞ペーストから回収することができる。
【０１０６】
あるいは、本発明の核酸分子を発現させるために哺乳動物細胞を使用してもよい。宿主細胞に遺伝物質を導入するための、当業者に既知の各種の方法がある。ウイルスおよび非ウイルスの両方の多数のベクターが初代細胞に遺伝子を転移するために開発されている（Ｒｏｂｂｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １６：３５−４０（１９９８））。適切なウイルスベクターは以下のものを含むが、それらに限定されない：アデノウイルスベクター（複製欠陥組換え体アデノウイルス（Ｂｅｒｋｎｅｒ，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ６：６１６−６２９（１９８８）；Ｂｅｃｋｎｅｒ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５８：３９−６６（１９９２）；Ｂｒｏｄｙ  ａｎｄ  Ｃｒｙｓｔａｌ，Ａｎｎａｌ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７１６：９０−１０３（１９９４）を含む）、レトロウイルスベクター（複製欠陥組換え体レトロウイルス（Ｂｏｒｉｓ−Ｌａｗｒｉｅ  ａｎｄ  Ｔｅｍｉｎ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．Ｄｅｖ．３：１０２−１０９（１９９３）；Ｂｏｒｉｓ−Ｌａｗｒｉｅ  ａｎｄ  Ｔｅｍｉｎ，Ａｎｎａｌ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７１６：５９−７１（１９９４）；Ｍｉｌｌｅｒ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５８：１−２４（１９９２）を含む）、）ポックスウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、アデノ随伴ベクター（ＡＡＶ），アルファウイルスベクター、レンチウイルスベクター、および組合せベクター。非ウイルスを基礎にしたベクターは蛋白質／ＤＮＡ複合体（Ｃｒｉｓｔｉａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（Ｕ．Ｓ．Ａ．）．９０：２１２２−２１２６（１９９３）；Ｃｕｒｉｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（Ｕ．Ｓ．Ａ．）．８８：８８５０−８８５４（１９９１）；Ｃｕｒｉｅｌ，Ａｎｎａｌ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７１６：３６−５８（１９９４）、ならびにエレクトロポレーションおよび陽イオン性リポソーム（Ｆａｒｈｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎａｌ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７１６：２３−３５（１９９４）のようなリポソーム媒介送達を含む。
【０１０７】
好ましくは、本発明の核酸分子は、適切なレトロウイルスベクター（たとえばＤｕｎｂａｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  ８５：３０４８−３０５７（１９９５）；Ｂａｕｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｈｅｍａｔｏｔｈｅｒ．５：３２３−３２９（１９９６）；Ｂｒｅｇｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  ８０：１４１８−１４２２（１９９２）；Ｂｏｒｉｓ−Ｌａｗｒｉｅ  ａｎｄ  Ｔｅｍｉｎ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．Ｄｅｖ．３：１０２−１０９（１９９３）；Ｂｏｒｉｓ−Ｌａｗｒｉｅ  ａｎｄ  Ｔｅｍｉｎ，Ａｎｎａｌ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７１６：５９−７１（１９９４）；Ｍｉｌｌｅｒ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５８：１−２４（１９９２）を参照されたい）、アデノウイルスベクター（Ｂｅｒｋｎｅｒ，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ６：６１６−６２９（１９８８）；Ｂｅｃｋｎｅｒ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５８：３９−６６（１９９２）；Ｂｒｏｄｙ  ａｎｄ  Ｃｒｙｓｔａｌ，Ａｎｎａｌ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７１６：９０−１０３（１９９４）；Ｂａｌｄｗｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．４：１１４２−１１４９（１９９７））、ＲＳＶ、ＭｕＳＶ、ＳＳＶ、ＭｕＬＶ（Ｂａｕｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｈｅｍａｔｏｔｈｅｒ．５：３２３−３２９（１９９６））、ＡＡＶ（Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．５：５０−５８（１９９８）；Ｈａｌｌｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ  Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．２：６９−７９（１９９６））、ＡＥＶ、ＡＭＶ、またはＣＮＶ（Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２４１：３１３−３２４（１９８７））にクローニングされる。
【０１０８】
腸管でのサイトカインの発現のためのアデノウイルスベクターが報告されている（Ｍａｃｄｏｎａｌｄ，Ｇｕｔ  ４２：４６０−４６１（１９９８））。アデノウイルスベクターはまた、造血幹細胞においてアルファインターフェロンを発現することが報告されている（Ａｈｍｅｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌｅｕｋ．Ｒｅｓ．２２：１１９−１２４（１９９８））。
【０１０９】
ポックスウイルスベクターはワクシニアおよび各種鳥類の痘（カナリア痘および鶏痘）または豚痘ウイルスを含む。ＱｉｎおよびＣｈａｔｔｅｒｊｅｅ（Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．７：１８５３−１８６０（１９９６））はワクシニアウイルス由来のＧＭ−ＣＳＦの発現を報告する。ワクシニアおよび鶏痘ウイルスは、モデル腫瘍抗原を発現することが報告されている（Ｉｒｖｕｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．８９：１５９５−１６０１（１９９７））。
【０１１０】
いくつかのヘルペスウイルスベクターは、神経組織（Ｏｌｉｇｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．５：４９１−４９６（１９９８））または造血細胞（Ｄｉｌｌｏｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  ８９：１１９−１２７（１９９７）において遺伝子を発現することが報告されている。
【０１１１】
アデノ随伴ウイルスは血友病のイヌモデルにおいて第ＩＸ因子を発現することが報告されている（Ｍｏｎａｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．５：４０−４９（１９９８））。糖尿病マウスにおいてインスリン遺伝子がアデノ随伴ウイルスにより発現されたことも報告されている（Ｓｕｇｉｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｏｒｍ．Ｍｅｔａｂ．Ｒｅｓ．２９：５９９−６０３（１９９７））。
【０１１２】
レトロウイルスベクターは、ヒト遺伝子治療での使用が報告された最初のベクターであった。レトロウイルスは、マウス造血細胞における緑色蛍光蛋白質の発現（Ｂａｇｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ６５：１２３３−１２４０（１９９８））およびヒト臍帯血幹細胞における発現（Ｃｏｎｎｅａｌｌｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  ９１：３４８７−３４９３（１９９８））を含む、多くの組織型で蛋白質を発現させるために使用されている。
【０１１３】
レトロウイルスベクターはＨＩＶおよび関連するウイルスベクターからなる。ＨＩＶベクターはＨＩＶの治療における使用が報告されている（Ｃｏｒｂｅａｕ  ａｎｄ  Ｗｏｎｇ−Ｓｔａａｌ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２４３：２６８−２７４（１９９８））。これらのベクターはレトロウイルスベクターにより要求されるような、有糸分裂を経た標的細胞を用いずに標的細胞に結合することができる（Ｍｉｙａｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．９：４６７−４７５（１９９８））。
【０１１４】
アルファウイルスベクターはおもにシンドビスウイルス、セムリキ森林ウイルス、およびＶＥＥウイルスベクターからなるウイルスベクターのファミリーである。シンドビスベクター系は、遺伝子治療に関して報告されている（Ｈａｒｉｈａｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：９５０−９５８（１９９８））。Ｐｕｓｈｋｏ  ｅｔ  ａｌ．，（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２３９：３８９−４０１（１９９７））は、ワクチン送達に有用なベネズエラウマ脳炎ウイルスベクター系由来の異種蛋白質の発現について報告している。
【０１１５】
レトロウイルスおよびアデノウイルス成分からなるベクター系が報告されている（Ｆｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１５：８６６−８７０（１９９７））。この系はアデノウイルスの高い一時的発現とレトロウイルスの統合能を結びつける。
【０１１６】
ベクターは、本発明の核酸分子を発現する裸のプラスミドＤＮＡの送達のために使用することができる。送達はたとえば、筋肉内注射により水溶液で、または遺伝子銃法により行われてもよい。また、ベクターは送達のための各種リポソームにより製剤されてもよい。裸のＤＮＡ送達に適したベクターは、Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈから入手できるｐＣＭＶ（Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ７２：５１７４−５１８１（１９９８）およびＰｒｏｍｅｇａから入手できるｐＣＩ（Ｐｏｌｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １６：５１７−５１８（１９９８））を含むが、それらに限定されない。
【０１１７】
バクテリアおよび他の微生物を形質転換させるための方法および組成物は当技術分野で既知である（たとえば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８０））。
【０１１８】
細胞へのＤＮＡの導入の技術は当業者に公知である。細胞に遺伝子を送達するための４種の代表的な方法が記載されている：（１）化学的方法（Ｇｒａｈａｍ  ａｎｄ  ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｅｂ，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ５４：５３６−５３９（１９７３）、これをそのまま参照として援用する）；（２）マイクロインジェクション（Ｃａｐｅｃｃｈｉ，Ｃｅｌｌ  ２２：４７９−４８８（１９８０）、これをそのまま参照として援用する）、エレクトロポレーション（Ｗｏｎｇ  ａｎｄ  Ｎｅｕｍａｎｎ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１０７：５８４−５８７（１９８２）；Ｆｒｏｍｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（Ｕ．Ｓ．Ａ．）８２：５８２４−５８２８（１９８５）；米国特許第５，３８４，２５３号、これらのすべてを参照として援用する）；および遺伝子銃（Ｊｏｈｎｓｔｏｎ  ａｎｄ  Ｔａｎｇ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．４３：３５３−３６５（１９９４）、これをそのまま参照として援用する）のような物理的方法；（３）ウイルスベクター（Ｃｌａｐｐ，Ｃｌｉｎ．Ｐｅｒｉｎａｔｏｌ．２０：１５５−１６８（１９９３）；Ｌｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７８：２０８９−２０９６（１９９３）；Ｅｇｌｉｔｉｓ  ａｎｄ  Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，６：６０８−６１４（１９９８）、これらのすべてをそのまま援用する）；（４）受容体媒介機序（Ｃｕｒｉｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎ．Ｔｈｅｒ．３：１４７−１５４（１９９２）、Ｗａｇｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（Ｕ．Ｓ．Ａ．）８９：６０９９−６１０３（１９９２））。
【０１１９】
形質転換はリン酸カルシウム沈降、ポリエチレングリコール処理、エレクトロポレーション、およびこれらの処理の組合せを基礎にした方法を使用して行うことができる（たとえば、Ｐｏｔｒｙｋｕｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２０５：１９３−２００（１９８６）；Ｌｏｒｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．１９９：１７８（１９８５）；Ｆｒｏｍｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３１９：７９１（１９８６）；Ｕｃｈｉｍｉｙａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２０４：２０４（１９８６）；Ｍａｒｃｏｔｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３３５：４５４−４５７（１９８８））。
【０１２０】
クローニングされた核酸構築物の一時的発現に基づいた遺伝子発現のためのアッセイは、ポリエチレングリコール処理、エレクトロポレーション、または粒子衝撃法による細胞への核酸分子の導入により開発されてきた（Ｍａｒｃｏｔｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３３５：４５４−４５７（１９８８）、これをそのまま参照として援用する；ＭｃＣａｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ６６：８９５−９０５（１９９１）、これをそのまま参照として援用する；Ｈａｔｔｏｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．６：８９５−９０５（１９９１）、これをそのまま参照として援用する；Ｇｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．９：２５１７−２５２２（１９９０）。これをそのまま参照として援用する）。一時的発現系は遺伝子構築物を機能的に切断するために使用してもよい（一般に、Ｍａｉｌｇａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ（１９９５）を参照されたい）。
【０１２１】
栄養的用途
本発明のポリヌクレオチドおよび蛋白質はまた、栄養供与源またはサプリメントとして使用してもよい。そのような用途は蛋白質またはアミノ酸サプリメントとしての用途、炭素供与源としての用途、窒素供与源としての用途および炭水化物供与源としての用途を含むが、それらに限定されない。そのような場合、本発明の蛋白質またはポリヌクレオチドは具体的な生物の飼料に添加してもよく、またはたとえば粉末、錠剤、溶液、懸濁液もしくはカプセル剤の形状のような、別の固体または液体製剤として投与してもよい。微生物の場合、本発明の蛋白質またはポリヌクレオチドは微生物が培養される培地中、または培地上に添加してもよい。
【０１２２】
サイトカインおよび細胞増殖／分化活性
本発明の蛋白質はサイトカイン、細胞増殖（誘導または阻害のいずれか）または細胞分化（誘導または阻害のいずれか）活性を示してもよく、またはある細胞集団において他のサイトカインの産生を誘導してもよい。本発明のポリヌクレオチドは、そのような特性を示すポリペプチドをコードすることができる。すべての既知のサイトカインを含む、現在までに発見された多くの蛋白質因子は、１以上の因子依存的細胞増殖アッセイにおいて活性を示しているため、アッセイはサイトカイン活性の都合のよい裏付けとして役立つ。本発明の蛋白質の活性は、以下のものを含むがそれらに限定されない、細胞系統のための多数の日常的な因子依存的細胞増殖アッセイのいずれか一つにより証明される：３２Ｄ，ＤＡ２、ＤＡ１Ｇ、ＴＩ０、Ｂ９、Ｂ９／１１、ＢａＦ３、ＭＣ９／Ｇ、Ｍ＋（ｐｒｅＢ  Ｍ＋），２Ｅ８、ＲＢ５、ＤＡ１、１２３、ＴＩ１６５，ＨＴ２、ＣＴＬＬ２、ＴＦ−１、Ｍｏ７ｅおよびＣＭＫ。本発明の蛋白質の活性は、他の手段の中でもとりわけ、以下の方法により測定される：
Ｔ細胞または胸腺細胞増殖のためのアッセイは以下に記載のものを含むが、それらに限定されない：Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｊ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ，Ａ．Ｍ．Ｋｒｕｉｓｂｅｅｋ，Ｄ．Ｈ．Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ，Ｅ．Ｍ．Ｓｈｅｖａｃｈ，Ｗ．Ｓｔｒｏｂｅｒ編、Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ発行（第３章、Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  ａｓｓａｙｓ  ｆｏｒ  Ｍｏｕｓｅ  Ｌｙｐｈｏｃｙｔｅ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ３．１−３．１９；第７章、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃ  ｓｔｕｄｉｅｓ  ｉｎ  Ｈｕｍａｎｓ）；Ｔａｋａｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３７：３４９４−３５００，１９８６；Ｂｅｒｔａｇｎｏｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４５：１７０６−１７１２，１９９０；Ｂｅｒｔａｇｎｏｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １３３：３２７−３４１，１９９１；Ｂｅｒｔａｇｎｏｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，１．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４９：３７７８−３７８３，１９９２；Ｂｏｗｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：１７５６−１７６１，１９９４．脾臓細胞、リンパ節細胞または胸腺細胞のサイトカイン産生および／または増殖のためのアッセイは以下に記載のものを含むが、それらに限定されない：Ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ、Ｋｒｕｉｓｂｅｅｋ，Ａ．Ｍ．ａｎｄ  Ｓｈｅｖａｃｈ，Ｅ．Ｍ．Ｉｎ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．Ｊ．Ｅ．ｅ．ａ．Ｃｏｌｉｇａｎ編．１巻  ｐｐ．３．１２．１−３．１２．１４，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｔｒｏｎｔｏ．１９９４；およびＭｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｍｏｕｓｅ  ａｎｄ  ｈｕｍａｎ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ  ｇａｍｍａ．，Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒ，Ｒ．Ｄ．Ｉｎ  Ｉｎ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．Ｊ．Ｅ．ｅ．ａ．Ｃｏｌｉｇａｎ編．１巻  ｐｐ．６．８．１−６．８．８，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｔｒｏｎｔｏ．１９９４。
【０１２３】
造血およびリンパ球生成細胞の増殖および分化のためのアッセイは以下のものを含むが、それらに限定されない：Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  ａｎｄ  Ｍｕｒｉｎｅ  Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎｅ  ２  ａｎｄ  Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎｅ  ４，Ｂｏｔｔｏｍｌｙ，Ｋ．，Ｄａｖｉｓ，Ｌ．Ｓ．ａｎｄ  Ｌｉｐｓｋｙ，Ｐ．Ｅ．Ｉｎ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．Ｊ．Ｅ．ｅ．ａ．Ｃｏｌｉｇａｎ編．１巻  ｐｐ．６．３．１−６．３．１２，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｔｒｏｎｔｏ．１９９１；ｄｅＶｒｉｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７３：１２０５−１２１１，１９９１；Ｍｏｒｅａｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３３６：６９０−６９２，１９８８；Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（Ｕ．Ｓ．Ａ．）．８０：２９３１−２９３８，１９８３；Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｍｏｕｓｅ  ａｎｄ  ｈｕｍａｎ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ  ６――Ｎｏｒｄａｎ，Ｒ．Ｉｎ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．Ｊ．Ｅ．ｅ．ａ．Ｃｏｌｉｇａｎ編．１巻  ｐｐ．６．６．１−６．６．５，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｔｒｏｎｔｏ．１９９１；Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（Ｕ．Ｓ．Ａ．）．８３：１８５７−１８６１，１９８６；Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ  １――Ｂｅｎｎｅｔｔ，Ｆ．，Ｇｉａｎｎｏｔｔｉ．，Ｊ．Ｃｌａｒｋ，Ｓ．Ｃ．ａｎｄ  Ｔｕｒｎｅｒ，Ｋ．Ｊ．Ｉｎ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．Ｊ．Ｅ．ｅ．ａ．Ｃｏｌｉｇａｎ編．１巻  ｐｐ．６．１５．１，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｔｒｏｎｔｏ．１９９１；Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｍｏｕｓｅ  ａｎｄ  ｈｕｍａｎ  Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ  ９――Ｃｉａｌｅｔｔａ，Ａ．，Ｇｉａｎｎｏｔｔｉ．，Ｊ．Ｃｌａｒｋ，Ｓ．Ｃ．ａｎｄ  Ｔｕｒｎｅｒ，Ｋ．Ｊ．Ｉｎ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．Ｊ．Ｅ．ｅ．ａ．Ｃｏｌｉｇａｎ編．１巻  ｐｐ．６．１３．１，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｔｒｏｎｔｏ．１９９１。
【０１２４】
生理活性ヒトインターロイキン‐３のためのＡＭＬ増殖アッセイ
因子依存的細胞系統ＡＭＬ１９３はＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）から入手する。急性骨髄性白血病患者から樹立されたこの細胞系統は、ＧＭ−ＣＳＦ補足培地で促進された増殖を示した成長因子依存的細胞系統である（Ｌａｎｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｌｏｄ  ７０：１９２（１９８７）；Ｖａｌｔｉｅｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ。１３８：４０４２（１９８７））。ヒトＩＬ−３の存在下で増殖するＡＭＬ１９３細胞の能力も報告されている。（Ｓａｎｔｏｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３９：３４８（１９８７））。増殖因子を洗い流し、サイトカイン依存的ＡＭＬ１９３細胞を増殖因子に対して２４時間飢餓状態にすることにより、ＩＬ−３中での長期増殖に適応させた、細胞系統変異体、ＡＭＬ１９３  １．３が使用される。細胞はその後、２４ウェルプレートで１００Ｕ／ｍＬ  ＩＬ−３を含む培地中、１ｘ１０５細胞／ウェルで再び培養される。細胞がＩＬ−３中で速やかに増殖するには、約２ヶ月かかる。これらの細胞は、その後ＡＭＬ１９３  １．３として、組織培養液をヒトＩＬ−３で補足することにより維持される。
【０１２５】
ＡＭＬ１９３  １．３細胞は、細胞懸濁液を２５０ｘｇ  １０分間、遠心分離し、その後上清をデカンテーションすることにより冷Ｈａｎｋｓ液（ＨＢＳＳ，Ｇｉｂｃｏ，Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）で６回洗浄する。ペレット化した細胞は、ＨＢＳＳに再懸濁し、６回洗浄サイクルが完了するまで手順が繰り返される。この手順により６回洗浄された細胞は、２ｘ１０５生細胞／ｍＬからの範囲の密度で組織培養液に再懸濁する。この培地は、アルブミン、トランスフェリン、脂質および２−メルカプトエタノールを補足したＩｓｃｏｖｅ改変Ｄｕｌｂｅｃｃｏ培地（ＩＭＤＭ，Ｈａｚｅｌｔｏｎ，Ｌｅｎｅｘａ，ＫＳ）により調製した。ウシアルブミン（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）は５００μｇ／ｍＬ添加され；ヒトトランスフェリン（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）は１００μｇ／ｍＬ添加され；大豆脂質（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）は５０μｇ／ｍＬ添加され；そして２−メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）は５ｘ１０−５Ｍ添加される。
【０１２６】
ヒトインターロイキン‐３またはＳｌｉｔ様蛋白質の系列希釈は、９６ウェルＣｏｓｔａｒ３５９６組織培養プレート中、先に記載のように補足した組織培養液中で、トリプリケート系列で行われる。系列希釈が完了すると、各ウェルはインターロイキン‐３またはＳｌｉｔ様蛋白質を含む培地５０μｌで満たされた。対照ウェルは組織培養液だけを満たした（陰性対照）。上記のように調製したＡＭＬ１９３  １．３細胞は、各ウェルに５０μｌ（２．５ｘ１０４細胞）をピペット操作により各ウェルに添加する。組織培養プレートは、加湿下、３日間、５％  ＣＯ２、３７℃でインキュベートする。３日目に、０．５μＣｉ  ３Ｈ−チミジン（２Ｃｉ／ｍＭ，Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｎｕｃｌｅａｒ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）を組織培養液５０μｌに添加する。培養物は、加湿下、１８〜２４時間、５％  ＣＯ２、３７℃でインキュベートする。細胞ＤＮＡは、水洗工程および７０％  エタノール洗浄工程を利用したＴＯＭＴＥＣ  ｃｅｌｌ  ｈａｒｖｅｓｔｅｒ（ＴＯＭＴＥＣ，Ｏｒａｎｇｅ，ＣＴ）を使用して、グラスフィルターマット（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ＬＫＢ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）上に採取される。フィルターマットは空気乾燥させ、その後試料袋に入れ、シンチレーション液（Ｓｃｉｎｔｉｖｅｒｓｅ  ＩＩ，Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯまたはＢｅｔａＰｌａｔｅ  Ｓｃｉｎｔｉｌｌａｔｉｏｎ  ｆｌｕｉｄ，Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ＬＫＢ、Ｇａｉｔｈｅｒｂｕｒｇ，ＭＤ）を添加する。個々の組織培養ウェル由来の試料のベータ放射はＬＫＢ  ＢｅｔａＰｌａｔｅ  ｍｏｄｅｌ  １２０５  ｓｃｉｎｔｉｌｌａｔｉｏｎ  ｃｏｕｎｔｅｒ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ＬＫＢ，Ｇａｉｔｈｅｒｂｕｒｇ，ＭＤ）で計数し、データは各組織培養ウェルから細胞に取り込まれた３Ｈ−チミジンの１分あたりのカウントとして表される。それぞれのヒトインターロイキン‐３試料またはＳｌｉｔ様蛋白質試料の活性は、インターロイキン‐３または造血ＥＧＦモチーフの段階的濃度により導入された細胞の増殖（３Ｈ−チミジン取込）により評価される。一般に、これらのアッセイでは、０．０５ｐＭ〜１０５ｐＭまでの濃度範囲が評価される。活性は、最大増殖の５０％を提供するインターロイキン‐３またはＳｌｉｔ様蛋白質の量（ＥＣ５０＝０．５ｘ（試験したインターロイキン‐３全濃度のトリプリケート培養物間のウェル毎に取り込まれた３Ｈ−チミジンの１分あたりの最大平均カウント−インターロイキン‐３非存在下でのトリプリケート培養物において観察された３Ｈ−チミジン取込により測定されたバックグラウンド増殖）を測定することにより確定される。このＥＣ５０値はまた生理活性の１単位に相当する。相対活性レベルを特定できるように、どのアッセイも標準試料としての天然のインターロイキン‐３により行われる。
【０１２７】
一般に、Ｓｌｉｔ様蛋白質は系列２倍希釈で滴定した２００ｐＭから０．０６ＰＭまでの濃度範囲で試験される。
それぞれの試料の活性は、データに４−パラメータロジスティックモデルを適合させることにより、最大反応の５０％を与える濃度により測定される。試料および比較される標準品の上部プラトー（最大反応）は異ならなかったということが観察される。したがって、それぞれの試料の相対効力の予測は先に記載のように、試料および標準品のＥＣ５０推定値から決定される。ＡＭＬ１９３  １．３細胞はｈＩＬ−３、ｈＧＭ−ＣＳＦ、およびｈＧ−ＣＳＦに反応して増殖する。したがって、Ｇ−ＣＳＦ受容体アゴニスト蛋白質が活性であるということを示すためにいくつかの試料に対して以下の付加的なアッセイが行われる。増殖アッセイはＳｌｉｔ様蛋白質プラスおよびマイナス中和モノクローナル抗体により行われる。
【０１２８】
ＴＦ１ｃ−ｍｐｌリガンド依存的増殖アッセイ
ｃ−ｍｐｌリガンド増殖アッセイは多分化能性ヒト細胞系統ＴＦ１のサブクローンを使用して行うことができる（Ｋｉｔａｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  １４０：３２３−３３４，［１９８９］）。ＴＦ１細胞はｈ−ＩＬ−３に維持される（１００Ｕ／ｍＬ）．ｃ−ｍｐｌリガンドに反応性のサブクローンを樹立するために、細胞はｃ−ｍｐｌリガンドの１−１５３の形状を発現する遺伝子（ｐＭＯＮ２６４４８）でトランスフェクトされたＢＨＫ細胞由来の１０％上清を含む継代培地中に維持される。細胞の大部分は死に至るが、細胞のサブセットは生き残る。希釈クローニング後、ｃ−ｍｐｌリガンド反応性のクローンは選択され、そしてこれらの細胞はアッセイ準備の前に、０．３ｘ１０６細胞／ｍＬの密度で継代培地に分割される。これらの細胞のための継代培地は以下のとおりである：ＲＰＭＩ  １６４０（Ｇｉｂｃｏ）、１０％  ＦＢＳ（Ｈａｒｌａｎ，Ｌｏｔ＃９１２０６）、トランスフェクトされたＢＨＫ細胞由来の１０％  ｃ−ｍｐｌリガンド上清、１ｍＭ  ピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ）、２ｍＭ  グルタミン（Ｇｉｂｃｏ）、および１００μｇ／ｍＬ  ペニシリン‐ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）。翌日、細胞を採取し、ＲＰＭＩまたはＩＭＤＭ培地で２回洗浄し、ＡＴＬまたは他のアッセイ培地で最終洗浄する。ＡＴＬ培地は以下のものからなる：ＡＴＬ  １０００ｍＬにつき、ＩＭＤＭ（Ｇｉｂｃｏ）、５００μｇ／ｍＬ  ウシ血清アルブミン、１００μｇ／ｍＬ  ヒトトランスフェリン、５０μｇ／ｍＬ  大豆脂質、４ｘ１０−８Ｍ  ベータ‐メルカプトエタノールおよび２ｍＬ  Ａ９９０９（Ｓｉｇｍａ，抗生物質溶液）。細胞は９６ウェル低蒸発プレート（Ｃｏｓｔａｒ）中、最終密度０．２５ｘ１０６細胞／ｍＬにアッセイ培地で希釈し、最終容積５０μｌとする。トランスフェクトされたクローン由来の一時的上清（ならし培地）を容積５０μｌで、デュプリケート試料として最終濃度５０％に添加し、３倍希釈して最終希釈１．８％にする。１ｎｇ／ｍＬから開始し、３倍希釈を使用して０．００１４ｎｇ／ｍＬに希釈したＩＬ−３変異体ｐＭＯＮ１３２８８の用量曲線のトリプリケート試料が陽性対照として包含される。プレートは５％  ＣＯ２、３７℃でインキュベートする。培養６日目に、プレートは容積２０μｌ／ウェル中、３μｌ／ウェルの０．５μＣｉ（ＮＥＮ）で標識し、５％  ＣＯ２、３７℃で４時間インキュベートする。プレートは採取され、ＢｅｔａＰｌａｔｅカウンターで計数される。
【０１２９】
ＭＵＴＺ−２細胞系統増殖アッセイ
ＭＵＴＺ−２細胞は、ウシ血清アルブミン（５００ｍｇ／ｍｌ）、ヒトトランスフェリン（１００ｍｇ／ｍｌ）、大豆脂質（５０ｍｇ／ｍｌ；Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｈｅｉｍ）および２−メルカプトエタノール（５０ｍＭ）を含む無血清ＩＭＤＭ中でサイトカインを含むか、または含まないマイクロウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ）のウェルにつき２．５ｘ１０４細胞が接種される。６０時間後、細胞はウェルにつき０．５ｍＣｉ（１８．５ｋＢｑ）の［メチル‐３Ｈ］チミジン（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｎｕｃｌｅａｒ）と共に６時間インキュベートし、その後ベータカウンター（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ＬＫＢ）による放射能の測定のためにグファイバーフィルターマット上に採取することができる。
【０１３０】
他のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの細胞を基にした増殖アッセイ
当業者には既知の、他のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの細胞を基にした増殖アッセイも、ＡＭＬ１９３．１．３細胞増殖アッセイで記載されたものと同様の方法において、分子を含む因子に依存したＳｌｉｔ様蛋白質の活性を測定するために有用であってもよい。以下は他の有用なアッセイの例である。
【０１３１】
ＴＦ１増殖アッセイ：ＴＦ１はｈＩＬ−３に反応する多能性ヒト細胞である（Ｋｉｔａｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  １４０：３２３−３３４（１９８９））。
【０１３２】
３２Ｄ増殖アッセイ：３２ＤはマウスＩＬ−３依存的細胞系統であり、それはヒトＩＬ−３には反応しないが、種に限定されないヒトＧ−ＣＳＦに反応する。  Ｂａｆ／３増殖アッセイ：Ｂａｆ／３はマウスＩＬ−３依存的細胞系統であり、ヒトＩＬ−３またはヒトｃ−ｍｐｌリガンドには反応しないが、種に限定されないヒトＧ−ＣＳＦに反応する。
【０１３３】
Ｔ１１６５増殖アッセイ：Ｔ１１６５細胞はＩＬ−６依存的マウス細胞系統（Ｎｏｒｄａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３３：５６６−５６９（１９８６））であり、ＩＬ−６およびＩＬ−１１に反応する。
【０１３４】
Ｈｕｍａｎ  Ｐｌａｓｍａ  Ｃｌｏｔ  ｍｅｇ−ＣＳＦアッセイ：巨核球コロニー形成活性をアッセイするために使用される（Ｍａｚｕｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．６８：７３３−７４１（１９８１））。
【０１３５】
トランスフェクトされた細胞系統
マウスＢａｆ／３細胞系統のような細胞系統は、その細胞系統が持たない、ヒトＧ−ＣＳＦまたはヒトｃ−ｍｐｌ受容体のような、コロニー刺激因子受容体をトランスフェクトされてもよい。これらのトランスフェクトされた細胞系統は、受容体が細胞系統にトランスフェクトされているリガンドの活性を測定するために使用することができる。
【０１３６】
そのようなトランスフェクトされたＢａｆ／３細胞系統のひとつは、ｃ−ｍｐｌ反応性細胞系統から作製され、プラスミドｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａ）の多重クローニング部位にクローニングされ、ライブラリーからｃ−ｍｐｌをコードするｃＤＮＡをクローニングすることにより作製された。Ｂａｆ／３細胞はエレクトロポレーションによりプラスミドをトランスフェクトされる。細胞は、Ｗｅｈｉならし培地中、マウスＩＬ−３の存在下でＧ４１８選択を受けて増殖する。クローンは限界希釈により樹立される。
【０１３７】
同様の方法で、ヒトＧ−ＣＳＦ受容体をＢａｆ／３細胞系統にトランスフェクトし、造血ＥＧＦモチーフの生理活性を測定するために使用することができる。
ｃ−ｍｐｌリガンド増殖活性の分析
１．骨髄増殖アッセイ
ａ．ＣＤ３４＋細胞増殖
骨髄吸引物（１５〜２０ｍＬ）はインフォームドコンセント後に正常な同種骨髄ドナーから得る。細胞はリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）で１：３に希釈し、３０ｍＬを１５ｍＬ  Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ−１０７７（Ｓｉｇｍａ）上に重ね、３０分間、３００ｘｓで遠心分離する。単核界面層を集め、ＰＢＳで洗浄する。ＣＤ３４＋細胞は、取り扱い説明書に従いアフィニティーカラム（ＣｅｌｌＰｒｏ，Ｉｎｃ，Ｂｏｔｈｅｌｌ  ＷＡ）を使用して単核細胞試料から濃縮する。濃縮後、フルオレセインに結合した抗ＣＤ３４モノクローナル抗体およびフィコエリトリン（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ  ＣＡ）に結合した抗ＣＤ３８を使用したフローサイトメトリー分析を使用することにより測定したＣＤ３４＋細胞の純度は、平均で７０％である。
【０１３８】
細胞は、Ｘ−Ｖｉｖｏ１０培地（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ，Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ）に４０，０００細胞／ｍＬで再懸濁し、そして１ｍＬを１２ウェル組織培養プレート（Ｃｏｓｔａｒ）で培養する。成長因子ｒｈＩＬ−３をいくつかのウェルに１００ｎｇ／ｍＬ（ｐＭＯＮ５８７３）添加する。ＨＩＬ３変異体は１０ｎｇ／ｍＬから１００ｎｇ／ｍＬまで使用される。ｃ−ｍｐｌリガンドまたはＳｌｉｔ様蛋白質をコードするプラスミドをトランスフェクトしたＢＨＫ細胞由来のならし培地は、１ｍＬ培養物に添加された上清１００μｌ（約１０％希釈）の添加により試験される。細胞は、３７℃の加湿インキュベータ中、、３７℃、８〜１４日間、５％  ＣＯ２でインキュベートされる。
ｂ．細胞採取および分析：
培養終了時にそれぞれの条件における全細胞数が得られる。蛍光分析および倍数性測定のために、細胞は巨核球バッファー（ＭＫバッファー、１３．６ｍＭ  クエン酸ナトリウム、１ｍＭ  テオフィリン、２．２μｍ  ＰＧＥ１、１１ｍＭ  グルコース、３％ｗ／ｖ  ＢＳＡ、ＰＢＳ中ｐＨ７．４中）（Ｔｏｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  ７０：１７３５−１７４２（１９８７））で洗浄し、抗ＣＤ４１ａＦＩＴＣ抗体（１：２００，ＡＭＣ，Ｗｅｓｔｂｏｏｋ，ＭＥ）を含むＭＫバッファー５００μｌに再懸濁し、そしてＭＫバッファーで洗浄した。ＤＮＡ分析のために、０．５％  ＴＷＥＥＮ２０（Ｆｉｓｈｅｒ，Ｆａｉｒ  Ｌａｗｎ，ＮＪ）を含むＭＫバッファー中、氷上で２０分間、細胞を透過性とし、０．５％  Ｔｗｅｅｎ‐２０および１％パラホルムアルデヒド（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ）中で３０分間固定し、５５％ｖ／ｖ  ＭＫバッファー（２００ｍＯｓｍ）中のよう化プロピジウム（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ  Ｃａ）（５０μｇ／ｍＬ）およびＲＮアーゼ（４００Ｕ／ｍＬ）と１〜２時間、氷上でインキュベーションする。細胞はＦＡＣＳｃａｎまたはＶａｎｔａｇｅ  ｆｌｏｗ  ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）上で分析する。ＤＮＡ倍数性を測定するために、緑色蛍光（ＣＤ４１ａ‐ＦＩＴＣ）を赤色蛍光（ＰＩ）の線状対数シグナルと一緒に集める。ＣＤ４１＋である細胞の割合を測定するためにすべての細胞が集められた。データの分析は、ＬＹＳＩＳ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）のソフトウェアを使用して行う。ＣＤ４１抗原を発現する細胞の割合は、フローサイトメトリー分析から得られる（パーセント）。ＣＤ４１＋細胞／ｍＬの絶対数（Ａｂｓ）は（Ａｂｓ）＝（細胞数）＊（パーセント）／１００により計算する。
２．巨核球フィブリン凝塊アッセイ
ＣＤ３４＋濃縮集団は、上記のように単離される。細胞は、０．３％  ＢＳＡ、０．４ｍｇ／ｍＬ  アポトランスフェリン、６．６７μＭ  ＦｅＣｌ２、２５μｇ／ｍＬ  Ｌ−アスパラギン、５００μｇ／ｍＬ  α−アミノ−ｎ−カプロン酸およびペニシリン／ストレプトマイシンを補足したＩｓｃｏｖｅｓの基礎ＩＭＤＭ培地からなる培地中で、サイトカイン存在下または非存在下で、２５，０００細胞／ｍＬに懸濁する。３５ｍｍプレートで培養する前に、凝塊形成を開始させるためにトロンビン（０．２５ユニット／ｍＬ）を添加する。細胞は、３７℃の加湿インキュベータ中、３７℃、１３日間、５％  ＣＯ２でインキュベートする。
【０１３９】
培養終了時に、プレートをメタノール：アセトン（１：３）で固定し、空気乾燥し、染色まで−２０℃で保存する。抗ＣＤ４１ａ、ＣＤ４２およびＣＤ６１からなる初代モノクローナル抗体の混合物を使用したペルオキシダーゼイムノサイトケミストリー染色法（Ｚｙｍｅｄ，Ｈｉｓｔｏｓｔａｉｎ−ＳＰ．ＳａｎＦｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）が使用される。染色後、コロニーを計数し、陰性、ＣＦＵ−ＭＫ（小コロニー、１〜２細胞増殖巣および約２５細胞より少ない）、ＢＦＵ−ＭＫ（＞２５細胞の大きい、多重細胞増殖巣コロニー、）または混合コロニー（陽性および陰性細胞両方の混合物）に分類する。
【０１４０】
メチルセルロースアッセイ
このアッセイは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで正常な骨髄細胞を刺激して、異なる型の造血コロニーを産生させるコロニー刺激因子の能力を反映する（Ｂｒａｄｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｕｓｔ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｓｃｉ．４４：２８７−３００（１９９６）、Ｐｌｕｚｎｉｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｃｏｍｐ．Ｐｈｙｓｉｏｌ  ６６：３１９−３２４（１９６５））。
【０１４１】
方法
新鮮、正常、健康な骨髄吸引物約３０ｍｌをインフォームドコンセント後に個体から得る。５０ｍＬコニカルチューブ（＃２５３３９−５０  Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｃｏｒｎｉｎｇ  ＭＤ）中で、試料を無菌的に１Ｘ  ＰＢＳ（＃１４０４０．０５９  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｂｕｒｇ，ＭＤ．）で１：５に希釈する。希釈した試料の下にＦｉｃｏｌｌ（Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ  １０７７  Ｓｉｇｍａ  Ｈ−８８８９）を層にして、３００Ｘｇで３０分間遠心分離する。単核細胞帯を除去し、１Ｘ  ＰＢＳで２回洗浄し、１％  ＢＳＡ  ＰＢＳ（ＣｅｌｌＰｒｏ  Ｃｏ．，Ｂｏｔｈｅｌ，Ｗａ）で１回洗浄する。単核細胞を計数し、ＣＤ３４＋細胞はＣｅｐｒａｔｅ  ＬＣ（ＣＤ３４）Ｋｉｔ（ＣｅｌｌＰｒｏ  Ｃｏ．，Ｂｏｔｈｅｌ，ＷＡ）カラムを使用して選択する。この分画法は、骨髄内のすべての幹および前駆細胞はＣＤ３４表面抗原を提示することから行われる。
【０１４２】
培養は３５ｘ１０ｍｍのペトリ皿（Ｎｕｎｃ＃１７４９２６）中、最終容積１．０ｍＬでトリプリケートで行う。培地はＴｅｒｒｙ  Ｆｏｘ  Ｌａｂｓ．（ＨＣＣ−４２３０培地（Ｔｅｒｒｙ  Ｆｏｘ  Ｌａｂｓ，Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，Ｂ．Ｃ．，Ｃａｎａｄａ）から購入し、エリスロポイエチン（Ａｍｇｅｎ，Ｔｈｏｕｓａｎｄ  Ｏａｋｓ，ＣＡ．）を培地に添加する。皿ごとに３，０００〜１０，０００のＣＤ３４＋細胞を添加する。哺乳動物細胞または大腸菌から精製された組換え体ＩＬ−３、およびトランスフェクトされた哺乳動物細胞由来のならし培地中の、またはトランスフェクトされた哺乳動物細胞または大腸菌由来のならし培地から精製されたｓｌｉｔ様蛋白質を添加し、最終濃度を０．００１ｎＭから１０ｎＭの範囲とする。組換え体ｈＩＬ−３、ＧＭ−ＣＳＦ、ｃ−ｍｐｌリガンドおよびＳｌｉｔ様蛋白質はＭｏｎｓａｎｔｏから供給される。Ｇ−ＣＳＦ（Ｎｅｕｒｏｇｅｎ）はＡｍｇｅｎ（Ｔｈｏｕｓａｎｄ  Ｏａｋｓ  Ｃａｌｆ．）から入手する。培養物は３−ｃｃシリンジを使用して再懸濁し、１．０ｍＬを皿に播く。対照（基礎線反応）培養物にはコロニー刺激因子を添加しなかった。陽性対照培養物にはならし培地が与えられる（ＰＨＡ刺激ヒト細胞：Ｔｅｒｒｙ  Ｆｏｘ  Ｌａｂ．Ｈ２４００）。培養物は加湿空気下、３７℃、５％  ＣＯ２でインキュベートする。５０細胞以上であると定義される造血コロニーは、４０ｘ対物レンズを組み合わせたＮｉｋｏｎ倒立顕微鏡を使用して、ピーク反応の日（１０〜１１日目）に計数する。５０より少ない細胞を含む細胞の群は、クラスターと呼ばれる。あるいは、コロニーはスライドグラス上にコロニーを広げることにより同定し、染色するか、またはそれらは採取し、再懸濁し、そしてサイトスピン（ｃｙｔｏｓｐｉｎ）スライドグラス上に染色のために広げてもよい。
【０１４３】
ＡＳ−Ｅ２細胞増殖アッセイ
急性骨髄性白血病患者から樹立した因子依存的細胞系統、ＡＳ−Ｅ２細胞系統は、エリスロポイエチン（ＥＰＯ）補足培地中で促進された増殖を提示した、成長因子依存的細胞系統である（Ｍｉｙａｚａｋｉ，Ｙ．，Ｋｕｒｉｙａｍａ，Ｋ．，Ｈｉｇｕｃｈｉ，Ｍ．，Ｔｓｕｓｈｉｍａ，Ｈ．，Ｓｏｈｄａ，Ｈ．，Ｉｍａｉ，Ｎ．，Ｓａｉｔｏ，Ｍ．，Ｋｏｎｄｏ，Ｔ．，およびＴｏｍｏｎａｇａ，Ｍ．Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｎｅｗ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ａｃｕｔｅ  ｍｙｅｌｏｉｄ  ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ、ＡＳ−Ｅ２．Ｌｅｕｋｅｍｉａ，１１；１９４１−９，１９９７）。この細胞系統はまた、ＨＳ−５  ＣＭに反応して促進された増殖を提示し、そしてＨＳ−５誘発増殖を測定するために使用された。
【０１４４】
ＡＳ−Ｅ２細胞は、２０％  ウシ胎児血清（ＦＢＳ，Ｈａｒｌａｎ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ），４ｍＬ／リットル  ２−メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ），および１単位／ｍｌ  ＥＰＯ（Ｅｐｏｇｅｎ，Ａｍｇｅｎ，Ｔｈｏｕｓａｎｄ  Ｏａｋｓ，ＣＡまたはＰｒｏｃｒｉｔ，Ｏｒｔｈｏ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｒａｒｉｔａｎ，ＮＪ）を含むＩＭＤＭにより調製された組織培養液中に１ｘ１０５から５ｘ１０５細胞／ｍｌまでの密度で維持された。３ヶ月毎に、ＡＳ−Ｅ２細胞培養物は冷凍保存物から開始された新規培養物と交換した。増殖アッセイのために、培地中のＡＳ−Ｅ２細胞は細胞懸濁液を２５０ｘｇで５分間、遠心分離することにより採取した。細胞は上記のように再懸濁および遠心分離により、冷Ｄｕｌｂｅｃｃｏリン酸緩衝生理食塩水で２回洗浄した。最終細胞ペレットは、１ｘ１０４から５ｘ１０４生存細胞／５０ｍｌまでの密度でアッセイ培地に再懸濁した。アッセイ培地は、２０％  ウシ胎児血清（ＦＢＳ，Ｈａｒｌａｎ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）、４ｍｌ／リットル  ２−メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、および１ｍｌ／リットル  ペニシリン／ストレプトマイシン溶液（１０，０００単位ペニシリン／ｍｌおよび１０ｍｇストレプトマイシン／ｍｌ標準生理食塩水、Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）でＩｓｃｏｖｅ改変Ｄｕｌｂｅｃｃｏ培地（ＩＭＤＭ，Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ，Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）を補足することにより作製した。
【０１４５】
ヒト臍帯血造血成長因子アッセイ
骨髄細胞は造血コロニー刺激因子（ＣＳＦ）活性のｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイに慣例的に使用される。しかし、ヒト骨髄は必ずしも入手可能ではなく、そしてドナー間でかなり多様である。臍帯血は造血幹細胞および前駆細胞の供与源として骨髄に匹敵する（Ｂｒｏｘｍｅｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（Ｕ．Ｓ．Ａ．）８９：４１０９−１１３（１９９２）；Ｍａｙａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  ８１：３２４２−３２５８（１９９３）。骨髄と対照的に、臍帯血は定期的により容易に入手できる。また、数人のドナーから得られたばかりの細胞をプールすることによりアッセイの変動性を低下させること、またはこの目的のための凍結保存細胞のバンクを創設することの可能性がある。培養条件を修正することにより、および／または系列特異的マーカーを分析することにより、顆粒球／マクロファージコロニー（ＣＦＵ−ＧＭ）、巨核球ＣＳＦ活性、高増殖能コロニー形成細胞（ＨＰＰ−ＣＦＣ）を特異的にアッセイすることが可能である。
【０１４６】
方法
単核細胞（ＭＭＣ）は標準密度勾配（１．０７７ｇ／ｍＬ  Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ）を使用して、臍帯血から採集後２４時間以内に単離される。臍帯血ＭＮＣは、以下のものを含むいくつかの手順により幹細胞および前駆細胞に関してさらに濃縮される；ＣＤ１４−ＣＤ３４＋細胞に関する免疫磁気選択；Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｉｍｍｕｎｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ（Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，ＣＡ）の被覆フラスコを使用したＳＢＡ−、ＣＤ３４＋画分の選別、およびＣｅｌｌＰｒｏ（Ｂｏｔｈｅｌｌ，ＷＡ）アビジンカラムを使用したＣＤ３４＋選択。新たに単離、または凍結保存したＣＤ３４＋濃縮画分のいずれかがアッセイに使用される。試料の各系列希釈液（１ｐＭから１２０４ｐＭの濃度範囲）のデュプリケート培養物は、付加的な成長因子を含まない培地（Ｍｅｔｈｏｃｕｌｔ  Ｈ４２３０  ｆｒｏｍ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，ＢＣ．）を含む０．９％メチルセルロース  １ｍｌ中、１ｘ１０４細胞に調製する。いくつかの実験では、Ｍｅｔｈｏｃｕｌｔ  Ｈ４２３０のかわりにエリスロポイエチン（ＥＰＯ）を含むＭｅｔｈｏｃｕｌｔ  Ｈ４３３０が使用されるか、またはＳｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｆａｃｔｏｒ（ＳＣＦ）、５０ｎｇ／ｍＬ（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｃａｍａｒｉｌｌｏ，ＣＡ）が添加される。７〜９日間培養後、＞３０細胞を含むコロニーが計数される。測定の主観による偏りを除くために、アッセイは盲検で行われる。
【０１４７】
抗原に対するＴ細胞クローンの反応に関するアッセイ（それはとりわけ、増殖およびサイトカイン産生を測定することによりＡＰＣ−Ｔ細胞相互作用および直接的なＴ細胞作用を変化させる蛋白質を同定するであろう）は以下に記載のものを含むが、それらに限定されない：Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｊ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ，Ａ．Ｍ．Ｋｒｕｉｓｂｅｅｋ，Ｄ．Ｈ．Ｍａｒｇｕｉｌｅｓ，Ｅ．Ｍ．Ｓｈｅｖａｃｈ，Ｗ  Ｓｔｒｏｂｅｒ編、Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ発行（第３章、Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  ａｓｓａｙｓ  ｆｏｒ  Ｍｏｕｓｅ  Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  Ｆｕｃｔｉｏｎ；第６章，Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ；第７章，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃ  ｓｔｕｄｉｅｓ  ｉｎ  Ｈｕｍａｎｓ）；Ｗｅｉｎｂｅｒｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７：６０９１−６０９５，１９８０；Ｗｅｉｎｂｅｒｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎ．１１：４０５−４１１，１９８１；Ｔａｋａｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３７：３４９４−３５００，１９８６；Ｔａｋａｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４０：５０８−５１２，１９８８．
免疫刺激または抑制活性
本発明の蛋白質はまた、活性に関するアッセイが本明細書に記載されるそのような活性を含むがそれらに限定されない、免疫刺激または抑制活性を提示してもよい。本発明のポリヌクレオチドは、そのような活性を提示するポリペプチドをコードすることができる。蛋白質は、各種免疫不全症および疾患（重度複合免疫不全症（ＳＣＩＤ））を含む）の処置において、たとえばＴおよび／またはＢリンパ球の成長および増殖を調節（アップまたはダウン）する、およびＮＫ細胞および他の細胞集団の細胞溶解反応をもたらすことにおいて有用であってもよい。これらの免疫不全症は遺伝的であるか、またはウイルス（たとえばＨＩＶ）、および細菌もしくは真菌感染により引き起こされてもよく、または自己免疫病の結果生じてもよい。さらに具体的には、以下のものを含むウイルス、細菌、真菌または他の感染により引き起こされた感染症が本発明の蛋白質を使用して治療可能であってもよい：ＨＩＶ、肝炎ウイルス、ヘルペスウイルス、マイコバクテリア、リーシュマニア種、マラリア種による感染、およびカンジタ症のような各種真菌感染。もちろん、この点に関して、本発明の蛋白質はまた、免疫系の亢進が通例所望される場合、すなわち癌の治療において有用であってもよい。本発明の蛋白質を使用して治療することができる自己免疫病は、たとえば結合織疾患、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス、リウマチ性関節炎、自己免疫肺炎、ギランバレー症候群、自己免疫甲状腺炎、インスリン依存的糖尿病、重症筋無力症、移植片対宿主疾患、および自己免疫炎症性眼疾患を含む。本発明のそのような蛋白質はまた、喘息（とりわけアレルギー性喘息）または他の呼吸疾患のようなアレルギー性反応および状態の治療に有用であってもよい。免疫抑制が望まれる（たとえば臓器移植を含む）他の状態も、本発明の蛋白質を使用して治療可能であってもよい。
【０１４８】
また本発明の蛋白質を使用して、多数の方法で免疫反応を調節することが可能であってもよい。ダウンレギュレーションはすでに進行中の免疫反応を阻害または阻止する形態であってもよいか、または免疫反応の誘発を妨げることに関与してもよい。活性化Ｔ細胞の機能は、Ｔ細胞の反応を抑制することによるか、もしくはＴ細胞に対して特異的な耐性を誘導することにより、または両方により阻害されてもよい。Ｔ細胞反応の免疫抑制は通例活性な、非抗原特異的過程であり、それは抑制物質へのＴ細胞の持続的暴露を必要とする。Ｔ細胞における非反応性またはアネルギーを誘発することを含む耐性は、通例抗原特異的である免疫抑制と区別可能であり、そして耐性を起こす物質への暴露を停止した後も持続する。具体的には、耐性は耐性を起こす物質の非存在下で特異的抗原に再暴露したときにＴ細胞反応が欠如することにより示すことができる。
【０１４９】
１以上の抗原機能（限定するものではないが、（たとえばＢ７のような）Ｂリンパ球抗原機能を含む）をダウンレギュレーションするか、または妨げること、たとえば活性化Ｔ細胞により高レベルのリンホカイン合成を妨げることは組織、皮膚および臓器移植の状況において、ならびに移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）において有用であろう。たとえば、Ｔ細胞機能の阻害は組織移植において組織破壊の減少を引き起こすべきであろう。一般に、組織移植片において、移植片の拒絶はＴ細胞による異物としての認識から開始し、移植片を破壊する免疫反応が続く。移植前に、Ｂ７リンパ球抗原と免疫細胞上のその天然のリガンド（複数のリガンド）の相互作用を阻害または阻止する分子（たとえば、別のＢリンパ球抗原（たとえばＢ７−１、Ｂ７−３）の活性を有するか、またはＢ７−２活性を単独で、または抗体を阻止するペプチドの単量体形とともに有する可溶性の単量体形）の投与は、対応する共刺激性シグナルを伝達せずに、免疫細胞上の天然のリガンド（複数のリガンド）分子の結合を導くことができる。この点においてＢリンパ球抗原を阻止することは、Ｔ細胞のような免疫細胞によるサイトカイン合成を阻害し、したがって免疫抑制剤として作用する。さらに、共刺激の欠如はまた、Ｔ細胞の活性を低下させ、対象における耐性を誘発するのに十分である。Ｂリンパ球抗原阻害試薬による長期耐性の誘導は、これらの阻害試薬の反復投与の必要性を回避することができる。対象において十分な免疫抑制または耐性を得るために、Ｂリンパ球抗原の組合せの機能を阻止することが同様に必要であってもよい。
【０１５０】
臓器移植拒絶を阻害することにおける具体的な阻害試薬の、または使用することができる適切な系の有効性は、ラットにおける同種心臓移植片およびマウスにおける異種膵ランゲルハンス島細胞移植片を含み、それらは共に以下に記載のようにｉｎ  ｖｉｖｏでのＣＴＬＡ４１ｇ融合蛋白質の免疫抑制作用を調べるために使用されている：Ｌｅｎｓｃｈｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５７：７８９−７９２（１９９２）およびＴｕｒｃａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：１１１０２−１１１０５（１９９２）。さらに、ＧＶＨＤのマウスモデル（Ｐａｕｌ編，Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８９，ｐｐ８４６−８４７を参照されたい）はこの疾患の進行に関するｉｎ  ｖｉｖｏでのＢリンパ球抗原機能を阻害する効果を測定するために使用することができる。
【０１５１】
抗原機能の阻害はまた、自己免疫疾患を処置するために治療的に有用である。多くの自己免疫病はＴ細胞の不適切な活性化の結果であり、それは自己組織に対して反応し、疾患の病因に関与するサイトカインおよび自己抗体の産生を促進する。自己反応性Ｔ細胞の活性化を阻害することは、疾患の症状を緩和または除去する。Ｂリンパ球抗原の受容体：リガンド相互作用を妨げることによりＴ細胞の共刺激を阻害する試薬の投与は、Ｔ細胞の活性化を阻害するために使用し、疾患過程に関与することが可能な自己抗体またはＴ細胞由来サイトカインの産生を阻害することができる。さらに、阻害試薬は自己反応性Ｔ細胞の抗原特異的耐性を誘発してもよく、それらは疾患の長期緩和を導くことができる。自己免疫疾患を阻害または緩和する阻害試薬の効力は、十分に特徴付けられたヒト自己免疫疾患の多数の動物モデルを使用して測定することができる。例としては、マウス実験的自己免疫脳炎、ＭＲＬ／ｌｐｒ／ｌｐｒマウスまたはＮＺＢハイブリッドマウスにおける全身性エリテマトーデス、マウス自己免疫コラーゲン関節炎、ＮＯＤマウスおよびＢＢラットにおける糖尿病、およびマウス実験的重症筋無力症が挙げられる（Ｐａｕｌ編，Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８９，ｐｐ８４０−８５６を参照されたい）。
【０１５２】
免疫反応をアップレギュレーションするための手段としての抗原機能（好ましくはＢリンパ球抗原機能）のアップレギュレーションはまた、治療に有用であってもよい。免疫反応のアップレギュレーションは存在する免疫反応を促進するか、または初期の免疫反応を引き起こす形態であってもよい。たとえば、Ｂリンパ球抗原機能を刺激することによる免疫反応の促進は、ウイルス感染の場合に有用であってもよい。さらに、インフルエンザ、風邪、および脳炎のような全身性ウイルス性疾患は、全身的なＢリンパ球抗原の刺激型の投与により緩和することができる。
【０１５３】
あるいは、抗ウイルス免疫反応は、感染した患者において以下の手順により促進することができる：患者からＴ細胞を除去し、本発明のペプチドを発現するか、または本発明の可溶性ペプチドの刺激型と一緒にウイルス抗原で標識したＡＰＣ′ｓでＴ細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで刺激し、そしてｉｎ  ｖｉｔｒｏで活性化したＴ細胞を患者に再導入する。抗ウイルス免疫反応を促進する他の方法は、患者から感染した細胞を単離し、本明細書に記載のように本発明の蛋白質をコードする核酸をそれらにトランスフェクトし、細胞にそれらの表面上の蛋白質のすべてまたは一部を発現させ、そして患者にトランスフェクトされた細胞を再導入することである。感染した細胞は、今やｉｎ  ｖｉｖｏでＴ細胞に共刺激シグナルを送達し、そしてそれにより活性化することができるであろう。
【０１５４】
腫瘍細胞表面上のＢリンパ球抗原（複数の抗原）の活性を有する本発明のペプチドの存在は、トランスフェクトされた腫瘍細胞に対するＴ細胞媒介免疫反応を誘発するためにＴ細胞に必要な共刺激を提供する。さらに、ＭＨＣクラスＩまたはクラスＩＩ分子を欠如するか、またはＭＨＣクラスＩまたはクラスＩＩ分子の十分な量を再発現することができない腫瘍細胞は、ＭＨＣクラスＩα鎖蛋白質およびβサブ２ミクログロブリン蛋白質、またはＭＨＣクラスＩＩα鎖蛋白質およびＭＨＣクラスＩＩβ鎖蛋白質のすべてまたは一部（たとえば、細胞質ドメイン切断部分）をコードする核酸をトランスフェクトすることができる。Ｂリンパ球抗原（たとえばＢ７−１，Ｂ７−２，Ｂ７−３）の活性を有するペプチドと一緒の、適切なクラスＩまたはクラスＩＩ  ＭＨＣの発現は、トランスフェクトされた腫瘍細胞に対するＴ細胞媒介免疫反応を誘発する。場合により、不変鎖のような、ＭＨＣクラスＩＩ関連蛋白質の発現を阻害するアンチセンス構築物をコードする遺伝子も、腫瘍関連抗原の提示を促進し、腫瘍特異的免疫を誘発するためのＢリンパ球抗原の活性を有するペプチドをコードするＤＮＡとともに共トランスフェクトすることができる。したがって、ヒト対象におけるＴ細胞媒介免疫反応の誘発が、対象における腫瘍特異的耐性に打ち勝つために十分であってもよい。
【０１５５】
本発明の蛋白質の活性は、とりわけ以下の方法により測定することができる：
胸腺細胞または脾細胞の細胞毒性に適切なアッセイは以下に記載のものを含むが、それらに限定されない：Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｊ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ，Ａ．Ｍ．Ｋｒｕｉｓｂｅｅｋ，Ｄ．Ｈ．Ｍａｒｇｕｉｌｅｓ，Ｅ．Ｍ．Ｓｈｅｖａｃｈ，Ｗ．Ｓｔｒｏｂｅｒ編、Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ発行（第３章、Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  ａｓｓａｙｓ  ｆｏｒ  Ｍｏｕｓｅ  Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  Ｆｕｃｔｉｏｎ３．１−３．１９；第７章，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃ  ｓｔｕｄｉｅｓ  ｉｎ  Ｈｕｍａｎｓ）；Ｈｅｒｒｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７８：２４８８−２４９２，１９８１；Ｈｅｒｒｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２８：１９６８−１９７４，１９８２；Ｈａｎｄａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３５：１５６４−１５７２，１９８５；Ｔａｋａｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３７：３４９４−３５００，１９８６；Ｔａｋａｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４０：５０８−５１２，１９８８，Ｈｅｒｒｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７８：２４８８−２４９２，１９８１；Ｈｅｒｒｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２８：１９６８−１９７４，１９８２；Ｈａｎｄａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３５：１５６４−１５７２，１９８５；Ｔａｋａｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３７：３４９４−３５００，１９８６；Ｂｏｗｍａｎｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ６１：１９９２−１９９８；Ｔａｋａｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４０：５０８−５１２，１９８８；Ｂｅｒｔａｇｎｏｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １３３：３２７−３４１，１９９１；Ｂｒｏｗｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  １５３：３０７９−３０９２，１９９４．
Ｔ細胞依存的イムノグロブリン反応およびアイソタイプスイッチング（それは、とりわけ、Ｔ細胞依存的抗体反応を調節し、Ｔｈ１／Ｔｈ２特性を変化させる）のアッセイは以下のものを含むが、それらに限定されない：Ｍａｌｉｓｚｅｗｓｋｉ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４４：３０２８−３０３３，１９９０；およびＢ細胞機能のアッセイ：Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，Ｍｏｎｄ，Ｊ．Ｊ．ａｎｄ  Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ，Ｍ．Ｉｎ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｊ．Ｅ．ｅ．ａ．Ｃｏｌｉｇａｎ編、第１巻ｐｐ３．８．１−３．８．１６，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｔｏｒｏｎｔｏ．１９９４．
混合リンパ球反応（ＭＬＲ）アッセイ（それはとりわけ、おもにＴｈ１およびＣＴＬ反応を引き起こす蛋白質を同定するであろう）は以下に記載のものを含むが、それらに限定されない：Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｊ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ，Ａ．Ｍ．Ｋｒｕｉｓｂｅｅｋ，Ｄ．Ｈ．Ｍａｒｇｕｉｌｅｓ，Ｅ．Ｍ．Ｓｈｅｖａｃｈ，Ｗ．Ｓｔｒｏｂｅｒ編、Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ発行（第３章、Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  ａｓｓａｙｓ  ｆｏｒ  Ｍｏｕｓｅ  Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  Ｆｕｃｔｉｏｎ  ３．１−３．１９；第７章，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃ  ｓｔｕｄｉｅｓ  ｉｎ  Ｈｕｍａｎｓ）；Ｔａｋａｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３７：３４９４−３５００，１９８６；Ｔａｋａｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４０：５０８−５１２，１９８８；Ｂｅｒｔａｇｎｏｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４９：３７７８−３７８３，１９９２．
樹状細胞依存的アッセイ（これはとりわけ、ナイーブＴ細胞を活性化する樹状細胞により発現された３０蛋白質を同定するであろう）は以下に記載のものを含むが、それらに限定されない：Ｇｕｅｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３４：５３６−５４４，１９９５；Ｉｎａｂａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  １７３：５４９−５５９，１９９１；Ｍａｃａｔｏｎｉａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １５４：５０７１−５０７９，１９９５；Ｐｏｒｇａｄｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  １８２：２５５−２６０，１９９５；Ｎａｉｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ６７：４０６２−４０６９，１９９３；Ｈｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６４：９６１−９６５，１９９４；Ｍａｃａｔｏｎｉａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  １６９：１２５５−１２６４，１９８９；Ｂｈａｒｄｗａｊ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ  ９４：７９７−８０７，１９９４；およびＩｎａｂａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  １７２：６３１−６４０，１９９０．
リンパ球生存／アポトーシスのアッセイ（これはとりわけ、スーパー抗原誘発後にアポトーシスを阻害する蛋白質およびリンパ球恒常性を調節する蛋白質を同定するであろう）は以下に記載のものを含むが、それらに限定されない：Ｄａｒｚｙｋｉｅｗｉｃｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  １３：７９５−８０８，１９９２；Ｇｏｒｃｚｙｃａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌｅｕｋｅｍｉａ  ７：６５９−６７０，１９９３；Ｇｏｒｃｚｙｃａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５３：１９４５−１９５１，１９９３；Ｉｔｏｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ６６：２３３−２４３，１９９１；Ｚａｃｈａｒｃｈｕｋ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １４５：４０３７−４０４５，１９９０；Ｚａｍａｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  １４：８９１−８９７，１９９３；Ｇｏｒｃｚｙｃａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  １：６３９−６４８，１９９２．
Ｔ細胞コッミットメントの初期段階および成長１５に影響を与える蛋白質のアッセイは以下に記載のものを含むが、それらに限定されない：Ａｎｔｉｃａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  ８４：１１１−１１７，１９９４；Ｆｉｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １５５：１１１−１１２，１９９４；Ｇａｌｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  ８５：２７７０−２７７８，１９９５；Ｔｏｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８：７５４８−７５５１，１９９１．
造血調節活性
本発明の蛋白質は造血の調節において、したがって骨髄またはリンパ細胞欠乏の治療において有用であってもよい。コロニー形成細胞、または因子依存的細胞系統の支持における不十分な生物学的活性でさえ、以下のように造血の調節における関与を示す：たとえば単独で、または他のサイトカインと共に赤血球前駆細胞の成長および増殖を支持し、それによって、たとえば各種貧血の治療における、または照射／化学療法と共に赤血球前駆体および／または赤血球細胞の産生を刺激する用途のための有用性を示すこと；たとえば、化学療法と共に結果として生じる骨髄抑制を予防するか、または治療するために有用な、顆粒細胞および単球／マクロファージ（すなわち、慣用のＣＳＦ活性）のような骨髄細胞の成長および増殖を支持すること；巨核球および結果として生じる血小板の成長および増殖を支持し、それにより血小板減少症のような各種血小板疾患を予防および治療し、そして通例血小板輸血のかわりに、またはそれに補足的に使用すること；および／または先に記載の造血細胞のいずれか、またはすべてに成熟することができる造血幹細胞の成長および増殖を支持し、したがって各種幹細胞疾患（たとえば、再生不良性貧血および発作性夜間ヘモグロビン尿症を含むが、それらに限定されない移植により治療される疾患）、およびｉｎ  ｖｉｖｏまたはｅｘ−ｖｉｖｏで照射／化学療法後（すなわち、骨髄移植、または末梢前駆細胞移植（同種または異種）と共に）に、正常細胞としてか、または遺伝子治療のために遺伝的に操作して幹細胞コンパ−トメントを再生することに治療的用途を見出すこと。
【０１５６】
本発明の蛋白質はとりわけ、以下の方法により測定されてもよい：
各種造血細胞系統の増殖および分化に適切なアッセイは、先に引用される。
胚幹細胞分化のアッセイ（これはとりわけ、胚の分化および造血に影響を与える蛋白質を同定するであろう）は、以下に記載のものを含むが、それらに限定されない：Ｊｏｈａｎｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １５：１４１−１５１，１９９５；Ｋｅｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １３：４７３−４８６，１９９３；ＭｃＣｌａｎａｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｌｏｏｄ  ８１：２９０３−２９１５，１９９３．
幹細胞生存および分化のアッセイ（これはとりわけ、リンパ‐造血を調節する蛋白質を同定するであろう）は以下に記載のものを含むが、それらに限定されない：Ｍｅｔｈｙｌｃｅｌｌｕｌｏｓｅ  ｃｏｌｏｎｙ  ｆｏｒｍｉｎｇ  ａｓｓａｙｓ，Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｍ．Ｇ．Ｉｎ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  Ｃｅｌｌｓ．Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，ｅｔ  ａｌ．，編  Ｖｏｌ  ｐｐ．２６５−２６８，Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．１９９４；Ｈｉｒａｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：５９０７−５９１１，１９９２；Ｐｒｉｍｉｔｉｖｅ  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｃｏｌｏｎｙ  ｆｏｒｍｉｎｇ  ｃｅｌｌｓ  ｗｉｔｈ  ｈｉｇｈ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ，ＭｃＮｉｅｃｅ，Ｉ．Ｋ．ａｎｄ  Ｂｒｉｄｄｅｌｌ，Ｒ．Ａ．Ｉｎ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  Ｃｅｌｌｓ．Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，ｅｔ  ａｌ．，編  Ｖｏｌ  ｐｐ．２３−３９，Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．１９９４；Ｎｅｂｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ  ２２：３５３−３５９，１９９４；Ｃｏｂｂｌｅｓｔｏｎｅ  ａｒｅａ  ｆｏｒｍｉｎｇ  ｃｅｌｌ  Ａｓｓａｙ，Ｐｌｏｅｍａｃｈｅｒ，Ｒ．Ｅ．Ｉｎ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  Ｃｅｌｌｓ．Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．Ｖｏｌ  ｐｐ．１−２１，Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．１９９４；Ｌｏｎｇ  ｔｅｒｍ  ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｐｒｅｓｅｎｃｅ  ｏｆ  ｓｔｒｏｍａｌ  ｃｅｌｌｓ，Ｓｐｏｏｎｅｒ，Ｅ．，Ｄｅｘｔｅｒ，Ｍ．ａｎｄ  Ａｌｌｅｎ，Ｔ．Ｉｎ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  Ｃｅｌｌｓ．Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，ｅｔ  ａｌ．，編  Ｖｏｌ  ｐｐ．１６３−１７９，Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．１９９４；Ｌｏｎｇ  ｔｅｒｍ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｉｎｉｔｉａｔｉｎｇ  ｃｅｌｌ  ａｓｓａｙ，Ｓｕｔｈｅｒｌａｎｄ，Ｈ．Ｊ．Ｉｎ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  Ｃｅｌｌｓ．Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，ｅｔ  ａｌ．，編  Ｖｏｌ  ｐｐ．１３９−１６２，Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．１９９４。
【０１５７】
組織成長活性
本発明の蛋白質はまた、骨、軟骨、腱、靱帯および／または神経組織成長もしくは再生のために、ならびに創傷治癒および組織修復および交換のために使用される組成物において、および熱傷、切開および潰瘍の治療において有用であってもよい。
【０１５８】
本発明の蛋白質は、骨が正常に形成されない状況において軟骨および／または骨成長を誘発し、ヒトおよび他の動物における骨折および軟骨損傷または欠陥の治癒に適用される。本発明の蛋白質を使用するそのような調整物はまた、閉鎖骨折および開放骨折において、ならびに人工関節の改善された固定において予防的用途を有してもよい。造骨剤により誘発された新規骨形成は、先天的、外傷誘発、または腫瘍切開誘発頭蓋顔面欠陥の修復に役立ち、そして美容形成手術にも有用である。
【０１５９】
本発明の蛋白質はまた、歯周疾患の治療において、および他の歯修復過程において使用してもよい。そのような物質は、骨形成細胞を引きつけるための環境を提供し、骨形成細胞の成長を刺激するか、または骨形成細胞前駆細胞の分化を誘導してもよい。本発明の蛋白質はまた、たとえば骨および／または軟骨修復によるか、または炎症過程により媒介される炎症または組織破壊の過程（コラゲナーゼ活性、破骨細胞活性など）を妨害することにより、骨粗鬆症、または変形性関節炎の治療に有用であってもよい。
【０１６０】
本発明の蛋白質に起因してもよい組織再生活性の別のカテゴリーは腱／靱帯形成である。本発明の蛋白質は、腱／靱帯様組織が正常に形成されない状況において、そのような組織に類似した組織または他の組織形成を誘発し、ヒトおよび他の動物における腱または靱帯断裂、変形および他の腱または靱帯欠陥の治癒に適用される。蛋白質を含む腱／靱帯様組織を使用するそのような調整物は、腱または靱帯組織の損傷を予防することにおいて、および骨または他の組織への腱または靱帯の改善された固定において、ならびに腱または靱帯組織の欠陥を修復することにおいて、予防的用途を有する。新規腱／靱帯様組織形成は、先天的、外傷誘発、または他の起源の他の腱または靱帯欠陥の修復に役立ち、そして腱または靱帯の付加または修復のための美容形成手術にも有用である。本発明の組成物は、腱または靱帯形成細胞を引きつけ、腱または靱帯形成細胞前駆体の分化を誘導するための、または組織修復をもたらすために、ｉｎ  ｖｉｖｏに戻すためのｅｘ  ｖｉｖｏでの腱／靱帯細胞もしくは前駆細胞の成長を誘発するための環境を提供してもよい。本発明の組成物はまた、腱炎、手根管症候群、および他の腱または靱帯欠陥の治療において有用であってもよい。組成物はまた、当技術分野で公知のキャリアとしての適切な基質および／または封鎖剤を含む。
【０１６１】
本発明の蛋白質はまた、神経細胞の増殖および神経および脳組織の再生、すなわち神経細胞または神経組織の変性、死、または外傷に関与する、中枢および末梢神経系疾患およびニューロパシー、ならびに機械的および外傷性障害の治療に有用であってもよい。さらに具体的には、蛋白質は末梢神経障害、末梢ニューロパシーおよび局所性ニューロパシーのような、末梢神経系疾患、およびアルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症、およびシャイ‐ドレーガー症候群のような中枢神経系疾患の治療において有用であってもよい。本発明に従って治療してもよい別の状態は、脊髄疾患、頭部外傷、および卒中のような脳血管疾患のような機械的および外傷性障害を含む。化学療法または他の医学的治療の結果生じる末梢ニューロパシーも本発明の蛋白質を使用して治療可能である。
【０１６２】
本発明の蛋白質はまた、圧迫潰瘍、血管機能不全に関連した潰瘍、外科的および外傷性創傷などのような非治癒創傷のよりよい、またはより速い閉鎖に有用であってもよい。
【０１６３】
本発明の蛋白質はまた、器官（たとえば、膵臓、肝臓、腸、腎臓、皮膚、内皮を含む）、筋肉（平滑筋、骨格筋、心筋）および血管（血管内皮を含む）組織のような他の組織の発生または再生のための、またはそのような組織を含む細胞の増殖を促進するための活性を提示してもよい。所望する効果の一部は、正常組織を再生させるような線維性瘢痕の阻害または修飾によるものであってもよい。本発明の蛋白質はまた、血管新生活性を提示してもよい。
【０１６４】
本発明の蛋白質はまた、腸管保護または再生および肺または肝線維症の治療、各種組織における再潅流障害、ならびに全身性サイトカイン傷害の結果生じる状態に有用であってもよい。
【０１６５】
本発明の蛋白質はまた、前駆組織または細胞から先に記載の組織の分化を促進すること、または阻害することに有用であってもよい。
本発明の蛋白質はまた、とりわけ以下の方法により測定することができる：
組織生成活性のアッセイは以下に記載のものを含むが、それらに限定されない：国際特許公開公報第ＷＯ９５／１６０３５号（骨、軟骨、腱）：国際特許公開公報第ＷＯ９５／０５８４６号（神経、ニューロン）；国際特許公開公報第ＷＯ９１／０７４９１号（皮膚、内皮）。
【０１６６】
創傷治癒活性のアッセイは、以下に記載のものを含むが、それらに限定されない：Ｗｉｎｔｅｒ，Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  Ｗｏｕｎｄ  Ｈｅａｌｉｎｇ，ｐｐｓ．７１−１１２（Ｍａｉｂａｃｈ，Ｈ．Ｉ．ａｎｄ  Ｒｏｖｅｅ，Ｄ．Ｔ．編），Ｙｅａｒ  Ｂｏｏｋ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｉｎｃ．Ｃｈｉｃａｇｏ，Ｅａｇｌｓｔｅｉｎ  ａｎｄ  Ｍｅｒｔｚ，Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ  ７１：３８２−８４（１９７８）により改変。
【０１６７】
アクチビン／インヒビン活性
本発明の蛋白質はまた、アクチビンまたはインヒビン関連活性を提示してもよい。本発明のポリヌクレオチドは、そのような特性を提示するポリヌクレオチドをコードしてもよい。インヒビンは卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）の放出を阻害する能力により特徴付けられるが、アクチビンは卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）の放出を刺激する能力により特徴付けられる。したがって、本発明の蛋白質は、単独で、またはインヒビンα‐ファミリーのメンバーとのヘテロダイマーにおいて、雌ほ乳動物における生殖能力を低下させ、そして雄ほ乳動物における精子形成を減少させるインヒビンの能力に基付いた避妊薬として有用であってもよい。他のインヒビンの十分な量の投与は、これらのほ乳動物における不妊を誘導することができる。あるいは、本発明の蛋白質は、ホモダイマーとして、またはインヒビン‐Ｄ群の他の蛋白質サブユニットとのヘテロダイマーとして下垂体前葉の細胞からのＦＳＨ放出を刺激するアクチビン分子の能力に基付いて生殖能力誘導治療薬として有用であってもよい。たとえば、米国特許第４，７９８，８８５号を参照されたい。本発明の蛋白質はまた、性的に未熟なほ乳動物における生殖能力の開始の促進に有用であってもよく、その結果ウシ、ヒツジ、およびブタの生涯の生殖行動を増大させる。
【０１６８】
本発明の蛋白質はとりわけ、以下の方法により測定することができる：Ｖａｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  ９１：５６２−５７２，１９７２；Ｌｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：７７９−７８２，１９８６；Ｖａｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：７７６−７７９，１９８６；Ｍａｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３１８：６５９−６６３，１９８５；Ｆｏｒａｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８３：３０９１−３０９５，１９８６．
走化性／遊走性活性（ｃｈｅｍｏｔａｃｔｉｃ／ｃｈｅｍｏｋｉｎｅｔｉｃ  ａｃｔｉｖｉｔｙ）
本発明の蛋白質は、たとえば単球、線維芽細胞、Ｔ細胞、肥満細胞、好酸球、上皮／内皮細胞を含むほ乳動物細胞に対して走化性または遊走性活性（たとえば、ケモカインとして作用する）を有していてもよい。本発明のポリヌクレオチドはそのような特性を提示するポリペプチドをコードすることができる。走化性および遊走性蛋白質は所望する作用部位に所望する細胞集団を動員するか、または引きつけるために使用することができる。走化性または遊走性蛋白質は、創傷および組織に対する他の外傷の治療において、ならびに局所炎症の治療において具体的な利点を提供する。たとえば、腫瘍または感染部位へのリンパ球、単球、または好中球の誘引は、腫瘍または感染物質に対する改善された免疫反応を引き起こすことができる。
【０１６９】
蛋白質またはペプチドが、直接的または間接的に、具体的な細胞集団の指示されたオリエンテーションまたは運動を刺激することができる場合、それはそのような集団に対して走化活性を有する。好ましくは、蛋白質またはペプチドは細胞の指示された運動を直接的に刺激するための能力を有する。具体的な蛋白質が細胞の集団に対して走化活性を有するか否かは、細胞走化性のいずれか既知のアッセイにそのような蛋白質またはペプチドを用いることにより、容易に確定することができる。
【０１７０】
本発明の蛋白質の活性はとりわけ、以下の方法により測定することができる：
走化活性のアッセイ（これは走化性を誘発するか、または妨げる蛋白質を同定するであろう）は、膜を横切る細胞の移動を誘発する蛋白質の能力、および１細胞集団の別の細胞集団への接着を誘発する能力を測定するアッセイからなる。運動および接着のための適切なアッセイは以下に記載のものを含むが、それらに限定されない：Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｊ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ，Ａ．Ｍ．Ｋｒｕｉｓｂｅｅｋ，Ｄ．Ｈ．Ｍａｒｇｕｉｌｅｓ，Ｅ．Ｍ．Ｓｈｅｖａｃｈ，Ｗ．Ｓｔｒｏｂｅｒ編、Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ発行（第６章．１２，Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ａｌｐｈａ  ａｎｄ  ｂｅｔａ  Ｃｈｅｍｏｋｉｎｅｓ  ６．１２．１−６．１２．２８）；Ｔａｕｂ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９５：１３７０−１３７６，１９９５；Ｌｉｎｄ  ｅｔ  ａｌ．ＡＰＭＩＳ  １０３：１４０−１４６，１９９５；Ｍｕｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ  Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２５：１７４４−１７４８；Ｇｒｕｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：５８６０−５８６７，１９９４；Ｊｏｈｎｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５３：１７６２−１７６８．１９９４．
止血および血栓溶解活性
本発明の蛋白質はまた、止血および血栓溶解活性を提示してもよい。本発明のポリヌクレオチドはそのような特性を提示するポリペプチドをコードすることができる。そのような蛋白質は、各種凝血障害（血友病のような遺伝性障害を含む）の治療に有用であること、または外傷、外科手術、または他の原因により引き起こされる創傷を治療することにおける凝血および他の止血事象を促進することが期待される。本発明の蛋白質はまた、血栓を溶解するか、またはその形成を阻害すること、およびそこから生じる状態（たとえば、心筋および中枢神経系血管の梗塞（たとえば卒中））の治療および予防に有用であってもよい。
【０１７１】
止血および血栓溶解活性のアッセイはとりわけ、以下の方法により測定することができる：
止血および血栓溶解活性のアッセイは以下に記載のものを含むが、それらに限定されない：Ｌｉｎｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２６：１３１−１４０，１９９６；Ｂｕｒｄｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ  Ｒｅｓ．４５：４１３−４１９，１９８７；Ｈｕｍｐｈｒｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｓｉｓ  ５：７１−７９（１９９１）；Ｓｃｈａｕｂ，Ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎｓ  ３５：４６７−４７４、１９８８．
受容体／リガンド活性
本発明の蛋白質はまた、受容体、受容体リガンドもしくは阻害剤、または受容体／リガンド相互作用のアゴニストとしての活性を示してもよい。本発明のポリヌクレオチドはそのような特徴を提示するポリヌクレオチドをコードすることができる。そのような受容体およびリガンドの例は以下のものを含むが、それらに限定されない：サイトカイン受容体およびそれらのリガンド、受容体キナーゼおよびそれらのリガンド、受容体ホスファターゼおよびそれらのリガンド、細胞‐細胞相互作用に関与する受容体およびそれらのリガンド（細胞接着分子（たとえばセレクチン、インテグリン）を含むが、それらに限定されない）、ならびに抗原提示、抗原認識および細胞性および体液性免疫反応に関与する受容体／リガンド対。
【０１７２】
受容体‐リガンド活性の適切なアッセイは以下に記載のものを含むが、それらに限定されない：Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｊ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ，Ａ．Ｍ．Ｋｒｕｉｓｂｅｅｋ，Ｄ．Ｈ．Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ，Ｅ．Ｍ．Ｓｈｅｖａｃｈ，Ｗ．Ｓｔｒｏｂｅｒ編、Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ発行（第７章．２８，Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｕｎｄｅｒ  ｓｔａｔｉｃ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ  ７．２８，１−７．２８．２２）；Ｔａｋａｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４：６８６４−６８６８，１９８７；Ｂｉｅｒｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６８：１１４５−１１５６，１９８８；Ｒｏｓｅｎｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６９：１４９−１６０，１９８９；Ｓｔｏｌｔｅｎｂｏｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １７５：５９−６８，１９９４；Ｓｔｉｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ８０：６６１−６７０，１９９５．
抗炎症活性
本発明の蛋白質はまた、抗炎症活性を提示してもよい。抗炎症活性は、炎症反応に関与する細胞に刺激を提供することにより、細胞−細胞相互作用（たとえば細胞接着）を阻害すること、もしくは促進することにより、細胞浸出を阻害すること、もしくは促進することにより、または炎症反応をより直接的に阻害するか、または促進する他の因子の産生を刺激すること、もしくは抑制することにより達成することができる。そのような活性を提示する蛋白質は以下のものを含むが、それらに限定されない炎症状態（慢性または急性状態を含む）を治療するために使用することができる：感染に関連した暗示（たとえば、敗血症性ショック、敗血症または全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ））、虚血‐再潅流障害、エンドトキシン致死、関節炎、相補体媒介超急性拒絶反応、腎炎、サイトカイン‐ケモカイン誘発肺傷害、炎症性腸疾患、クローン病またはＴＮＦもしくはＩＬ−１のようなサイトカインの過剰産生により引き起こされるもの。本発明の蛋白質はまた、抗原性物質または材料に対するアナフィラキシーおよび過敏症を治療するために有用であってもよい。
【０１７３】
白血病
白血病および関連する疾患は、本発明のポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチドの機能を促進するか、または阻害する治療薬の投与により治療または予防することができる。そのような白血病および関連する疾患は、以下のものを含むが、それらに限定されない：急性白血病、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、骨髄芽球性、骨髄球細胞性、骨髄単球性、単球性、赤白血病、慢性白血病、慢性骨髄性（顆粒球性）白血病および慢性リンパ性白血病（そのような疾患の総説として、Ｆｉｓｈｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８５，Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，２版，Ｊ．Ｂ．Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｃｏ．，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａを参照されたい）。
【０１７４】
神経系疾患
本発明のポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチドの活性を修飾する化合物による介入の効力に関して試験してもよく、したがって治療的有用性の徴候を観察するときに処理することができる細胞型を含む神経系疾患は、神経系傷害、および軸索の切断、ニューロンの縮小もしくは変性、または脱髄のいずれかを引き起こす病気もしくは疾患を含むが、それらに限定されない。本発明に従って患者（ヒトおよび非ヒトほ乳動物患者を含む）を治療してもよい神経系損傷は、中枢（脊髄、脳を含む）または末梢神経系のいずれかの以下の損傷を含むが、それらに限定されない：
（ｉ）物理的損傷により引き起こされるか、または手術に関連した損傷、たとえば神経系の一部を切断する損傷、もしくは圧迫傷を含む、外傷性損傷；
（ｉｉ）脳梗塞もしくは虚血、または脊髄梗塞もしくは虚血を含む、神経系の一部における酸素の欠乏が神経傷害または死を引き起こす、虚血性損傷；
（ｉｉｉ）神経系に関連した悪性腫瘍、または非神経系組織由来の悪性腫瘍のいずれかである悪性の組織により神経系の一部が破壊されるか、または損傷される、悪性損傷；
（ｉｖ）たとえば、膿瘍によるか、またはヒト免疫不全ウイルス、帯状ヘルペス、もしくは単純ヘルペスウイルスによる感染、またはライム病、結核、梅毒に関連した感染の結果として、神経系の一部が破壊されるか、または損傷される、感染性損傷；
（ｖ）パーキンソン病、アルツハイマー病、ハンチントン舞踏病、または筋萎縮性側索硬化症に関連した変性を含むがそれらに限定されない、変性過程の結果として神経系の一部が破壊されるか、または損傷される、変性性損傷；
（ｖｉ）ビタミンＢ１２欠乏、葉酸欠乏、ウェルニッケ病、タバコ‐アルコール弱視、マルキアファーバ‐ビニャーミ病（脳梁の主な変性）、およびアルコール性小脳変性を含むが、それらに限定されない、栄養異常または代謝異常により神経系の一部が破壊されるか、または損傷される、栄養病または疾患に関連した損傷；
（ｖｉｉ）糖尿病（糖尿病性ニューロパシー、ベル麻痺）、全身性エリテマトーデス、癌腫、サルコイドーシスを含むが、それらに限定されない全身疾患に関連した神経損傷；
（ｖｉｉｉ）アルコール、鉛、または特定の神経毒を含む毒性物質により引き起こされる損傷；および
（ｉｘ）多発性硬化症、ヒト免疫不全ウイルス関連ミエロパシー、横断ミエロパシーもしくは各種病因を含むが、それらに限定されない脱髄疾患、進行性多巣性白質脳症、および橋中央ミエリン溶解により神経系の一部が破壊されるか、または損傷される、脱髄損傷。
【０１７５】
神経系疾患の治療のための本発明に記載の有用な治療薬は、ニューロンの生存または分化を促進することにおける生物活性に関して試験することにより選択することができる。たとえば、そしてそれらに限定されないが、以下の効果のいずれかを引き起こす治療薬は本発明に従って有用であってもよい：
（ｉ）培養における増大したニューロンの生存時間；
（ｉｉ）培養またはｉｎ  ｖｉｖｏにおける増大したニューロンの成長；
（ｉｉｉ）培養またはｉｎ  ｖｉｖｏにおける増大したニューロン関連分子、たとえば運動ニューロンに関する１０コリンアセチルトランスフェラーゼまたはアセチルコリンエステラーゼの産生；または
（ｉｖ）ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるニューロン機能障害の減少した症状。
そのような効果は当技術分野で既知のいずれかの方法により測定することができる。好ましい非限定的態様において、ニューロンの増大した生存はＡｒａｋａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９０，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１０：３５０７−３５１５）による方法により測定してもよく；ニューロンの増大した成長は、Ｐｅｓｔｒｏｎｋ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８０，）Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．７０：６５−８２）またはＢｒｏｗｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８１，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．４：１７−４２）による方法により検出してもよく；ニューロン関連分子の増大した産生は、測定する分子に依存して、バイオアッセイ、酵素的アッセイ、抗体結合、ノーザンブロットアッセイなどにより測定してもよく；そして運動ニューロン機能不全は、たとえば脱力、運動神経伝導速度、または機能傷害のような運動ニューロン疾患の身体的特徴を評価することにより測定してもよい。
【０１７６】
具体的な態様において、本発明に従って治療することができる運動神経疾患は、梗塞、感染、毒への暴露、外傷、手術による傷害、変性疾患または運動ニューロンおよび他の神経系成分に作用可能な悪性腫瘍のような疾患、および筋萎縮性側索硬化症のように選択的にニューロンに作用する疾患を含むがそれらに限定されず、そして進行性脊髄性筋萎縮症、進行性延髄萎縮症、原発性側索硬化症、小児および若年性筋萎縮症、小児の進行性延髄麻痺（ファチオ‐ロンデ症候群）、ポリオおよびポリオ後症候群、および遺伝性運動感覚性ニューロパシー（シャルコー‐マリー‐ツース病）を含む。
【０１７７】
他の活性
本発明の蛋白質はまた、１以上の以下の付加的な活性または効果を提示してもよい：細菌、ウイルス、真菌および他の寄生生物を含むが、それらに限定されない致死性、感染因子の増殖、感染または機能を阻害すること；身長、体重、毛色、眼色、皮膚、脂身対赤身比もしくは他の組織色素沈着、または臓器もしくは身体部分のサイズもしくは形態（たとえば、胸部増大または縮小、骨形状または形態の変化）を含むが、それらに限定されない身体上の特徴を変化させること（抑制することまたは促進すること）；バイオリズムまたは心臓周期もしくはリズムを変化させること；食物脂肪、脂質、蛋白質、炭水化物、ビタミン、ミネラル、補因子または他の栄養因子もしくは成分（複数の成分）の代謝、異化、同化、処理、利用、貯蔵または除去を変化させること；食欲、性欲、ストレス、認知（認知障害を含む）、抑鬱（抑鬱障害を含む）および暴力的行動を変化させること；鎮痛効果および他の疼痛低下作用を提供すること；造血系統以外の系統における胚幹細胞の分化および増殖を促進すること；酵素の場合、酵素欠乏を修正し、欠乏に関連した病気を治療すること；過増殖性疾患（たとえば、乾癬）の治療；イムノグロブリン様活性（たとえば、抗原または相補体に結合する能力）；およびそのような蛋白質または、そのような蛋白質と交差反応性である他の物質または実体に対して免疫反応を引き起こすためのワクチン組成物中で抗原として作用する能力。
【０１７８】
医薬製剤および投与経路
本発明の蛋白質（組換え体および非組換え体供与源を含むが、それらに限定されない、いずれかの供与源に由来する）は、それ自体を、または各種疾患を治療または緩和するための用量において、それを適切なキャリアまたは賦形剤（複数の賦形剤）と混合した医薬組成物として、必要とする患者に投与してもよい。そのような組成物はまた、（蛋白質およびキャリアに加え）希釈剤、増量剤、塩類、バッファー、安定化剤、および当技術分野で公知の他の材料を含む。“薬剤的に受容できる”という用語は、活性成分（複数の成分）の生物学的活性の有効性を妨げない、非毒性材料を意味する。キャリアの特徴は、投与経路に依存するであろう。本発明の医薬組成物はまた、サイトカイン、リンホカイン、またはＭ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＮＦ、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４，ＩＬ−１５、ＩＦＮ、ＴＮＦＯ、ＴＮＦ１、ＴＮＦ２、Ｇ−ＣＳＦ、Ｍｅｇ−ＣＳＦ、トロンボポイエチン、幹細胞因子、およびエリスロポイエチンのような他の造血因子を含んでいてもよい。医薬組成物はさらに他の物質を含んでいてもよく、それらは蛋白質の活性を促進するか、または治療におけるその活性もしくは使用を補足する、他の物質を含んでいてもよい。そのような付加的な因子および／または物質は、本発明の蛋白質とともに相乗作用を生み出すか、または副作用を最小にするための医薬組成物に含まれていてもよい。逆に、本発明の蛋白質はサイトカイン、リンホカイン、他の造血因子、血栓溶解もしくは抗血栓因子、または抗炎症剤の副作用を最小化するために、具体的なサイトカイン、リンホカイン、他の造血因子、血栓溶解もしくは抗血栓因子、または抗炎症剤の製剤に含まれていてもよい。本発明の蛋白質は多量体（たとえば、ヘテロダイマーまたはホモダイマー）またはそれ自体もしくは他の蛋白質との複合体において活性であってもよい。結果として、本発明の医薬組成物はそのような多量体または複合体中の本発明の蛋白質を含んでいてもよい。
【０１７９】
本特許出願の化合物の製剤および適用のための技術は“Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ′ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，”Ｍａｒｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ，最新版に見出すことができる。治療的有効量はさらに症状の緩和、たとえば適切な医学的状態の治療、治癒、予防、もしくは緩和、またはそのような状態の治療、治癒、予防もしくは緩和速度の増加をもたらすために十分な化合物の量を表す。単独で投与される活性成分を個体に適用するとき、治療的有効量はその成分のみを表す。組み合わせて投与するとき、組合せ、連続または同時のいずれで投与されても、治療的有効量は、治療効果を引き起こす活性成分の組み合わせた量を表す。
【０１８０】
本発明の治療の方法または使用の実行において、本発明の蛋白質の治療的有効量は治療される状態を有するほ乳動物に投与される。本発明の蛋白質は本発明の方法に従って、単独で、またはサイトカイン、リンホカイン、もしくは他の造血因子を利用した、他の治療法と組み合わせて投与される。１以上のサイトカイン、リンホカイン、または他の造血因子と共投与するとき、本発明の蛋白質はサイトカイン（複数のサイトカイン）、リンホカイン（複数のリンホカイン）、他の造血因子（複数の造血因子）、血栓溶解もしくは抗血栓因子と同時に、または連続的に、のいずれかで投与してもよい。連続して投与する場合、主治医がサイトカイン（複数のサイトカイン）、リンホカイン（複数のリンホカイン）、他の造血因子（複数の造血因子）、血栓溶解もしくは抗血栓因子と組み合わせた本発明の蛋白質を投与する適切な順番を決定するであろう。
【０１８１】
投与経路
適切な投与経路は、たとえば経口、直腸内、経粘膜、または腸管投与；クモ膜下、直接脳室内、静脈内、腹腔内、鼻腔内、または眼内注射に加え、筋肉内、皮下、髄内注射を含む非経口送達を含む。医薬組成物または本発明の方法の実行に使用される本発明の蛋白質の投与は、各種の慣用の方法、たとえば、経口摂取、吸入、局所適用または皮膚、皮下、腹腔内、非経口もしくは静脈内注射で行うことができる。患者への静脈内投与が好ましい。
【０１８２】
あるいは、化合物は全身的よりむしろ局所的方法で、しばしばデポー剤または徐放性製剤で、たとえば、関節への、または線維性組織中への直接的な化合物の注射により投与してもよい。緑内障手術の合併症としてしばしば発生する瘢痕形成を阻害するために、化合物は、たとえば点眼剤として局所的に適用してもよい。さらに、標的薬物送達系で、たとえば関節または線維性組織を標的とする特異的抗体により被覆されたリポソームで薬物を投与してもよい。リポソームは罹患組織を標的にし、それにより選択的に取り込まれるであろう。
【０１８３】
組成物／製剤
本発明に従った使用のための医薬組成物はしたがって、医薬的に使用可能で、製剤への活性化合物の加工を促進する、賦形剤および補助物質を含む１以上の生理的に受容できるキャリアを使用して慣用の方法で製剤することができる。これらの医薬組成物はそれ自体既知の方法、たとえば混合、溶解、造粒、糖衣錠形成、研和、乳化、カプセル封入、捕捉または凍結工程の手段により、製造してもよい。適切な製剤は選択された投与経路に依存する。本発明の蛋白質の治療的有効量が経口的に投与される場合、本発明の蛋白質は錠剤、カプセル剤、粉末剤、溶液、またはエリキシル剤の形状であろう。錠剤形で投与される場合、本発明の医薬組成物は付加的にゼラチンまたはアジュバントのような固体キャリアを含んでいてもよい。錠剤、カプセル剤、および粉末剤は本発明の蛋白質を約５〜９５％まで、そして好ましくは本発明の蛋白質を約２５〜９０％まで含む。液体の形状で投与される場合、水、石油、ピーナツ油、鉱物油、大豆油、または合成油のような動物または植物起源の油が添加されてもよい。医薬組成物の液体の形状は、さらに生理的食塩水、ブドウ糖もしくは他の糖溶液、またはエチレングリコール、プロピレングリコール、もしくはポリエチレングリコールのようなグリコールを含んでいてもよい。液体の形状で投与される場合、医薬組成物は本発明の蛋白質の重量で約０．５〜９０％まで、そして好ましくは本発明の蛋白質を約１〜５０％まで含む。
【０１８４】
本発明の蛋白質の治療的有効量が静脈内、皮膚、または皮下注射により投与される場合、本発明の蛋白質は発熱物質を含まない、非経口的に受容できる水溶液の形状であろう。ｐＨ，等張性、安定性などに相応の配慮をした、そのような非経口的に受容できる蛋白質溶液の製剤は、当技術分野の技術内である。静脈内、皮膚、または皮下注射のための好ましい医薬組成物はまた、本発明の蛋白質に加えて、塩化ナトリウム液、リンゲル液、ブドウ糖液、ブドウ糖および塩化ナトリウム液、乳酸加リンゲル液、または当業者に既知の他の添加剤を含んでいてもよい。本発明の医薬組成物はまた、安定化剤、保存剤、バッファー、抗酸化剤、または当業者に既知の他の添加剤を含んでいてもよい。注射のためには、本発明の物質は水溶液中で、好ましくはハンクス液、リンゲル液、または生理的食塩水バッファーのような生理的に適合したバッファー中で製剤してもよい。経粘膜投与のためには、透過する障壁に適切な浸透剤が製剤中で使用される。そのような浸透剤は当技術分野で通例既知である。
【０１８５】
経口投与のためには、化合物は当技術分野で公知の薬剤的に受容できるキャリアと活性化合物を結合させることにより、容易に製剤することができる。そのようなキャリアは、治療される患者による経口摂取のために、本発明の化合物を錠剤、丸剤、糖衣錠、カプセル剤、液体、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁液などに製剤することを可能にする。経口使用のための医薬製剤は、錠剤または糖衣錠核を得るために、所望する場合、適切な補助物質を添加した後、場合により得られた混合物を製粉し、そして顆粒混合物を処理して固体賦形剤を得ることができる。適切な賦形剤は、とりわけ、乳糖、ショ糖、マンニトール、またはソルビトールを含む糖のような増量剤；たとえば、トウモロコシデンプン、小麦デンプン、米デンプン、ジャガイモデンプン、ゼラチン、トラガカントゴム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、および／またはポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）のようなセルロース調製物である。所望する場合、架橋ポリビニルピロリドン、寒天、またはアルギン酸、もしくはその塩、たとえばアルギン酸ナトリウムのような崩壊剤が添加されてもよい。糖衣錠核は、適切な被覆剤により提供される。この目的のためには、濃縮糖溶液が使用されてもよく、それらは場合によりアラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カルボポールゲル、ポリエチレングリコール、および／または二酸化チタン、ラッカー溶液、および適切な有機溶媒または溶媒混合物を含んでいてもよい。染料または色素は活性化合物量の異なる組合せを同定または識別するために、錠剤または糖衣錠被覆剤に添加されてもよい。
【０１８６】
経口的に使用することができる医薬製剤は、ゼラチンから製造したプッシュフィットカプセル剤、ならびにゼラチンおよびグリコールまたはソルビトールのような可塑剤から製造したソフト密封カプセル剤を含む。プッシュフィットカプセル剤は、乳糖のような増量剤、デンプンのような結合剤、および／またはタルクまたはステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、および場合により安定化剤を含んでいてもよい。ソフトカプセル剤では、活性化合物は脂肪油、液体パラフィン、または液体ポリエチレングリコールのような適切な液体中に溶解または懸濁させてもよい。さらに、安定化剤が添加されてもよい。経口投与のためのすべての製剤はそのような投与に適した投与量でなければならない。口腔内投与のためには、組成物は慣用の方法で製剤された錠剤またはトローチ剤の形状であってもよい。
【０１８７】
吸入による投与のためには、本発明に従った使用のための化合物は、たとえばジクロロフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素、または他の適切な気体のような、適切な発射薬の使用により、加圧パックまたはネブライザーからのエーロゾル噴霧提示の形状において好都合に送達される。加圧エーロゾルの場合には、投与量単位は計量された量を送達するための弁を提供することにより決定してもよい。吸入器または注入器で使用するためのたとえばゼラチンのカプセルまたはカートリッジは、化合物と乳糖またはデンプンのような適切な粉末基剤の粉末混合物を含むように製剤されてもよい。化合物は注射、たとえばボーラス注射または持続的注入による非経口投与のために製剤されてもよい。注射のための製剤は、添加された保存剤とともに、アンプルまたは多重投与量容器中に単位投与量の形状で提示されてもよい。組成物は油性または水性ベヒクル中で懸濁液、溶液、または乳濁液のような形状をとってもよく、そして懸濁化剤、安定化剤、および／または分散剤のような製剤用物質を含んでいてもよい。
【０１８８】
非経口投与のための医薬的製剤は、水溶性の形状において活性化合物の水溶液を含んでいてもよい。さらに、活性化合物の懸濁液は、油性注射用懸濁剤として製造されてもよい。適切な親油性溶媒またはベヒクルはゴマ油のような脂肪油、またはエチルオレイン酸もしくはトリグリセリドのような合成脂肪酸エステル、またはリポソームを含む。水性注射用懸濁剤はカルボキシメチルセルロース、ソルビトール、またはデキストランのような、懸濁剤の粘性を増加させる物質を含んでいてもよい。場合により、懸濁剤はまた、高度に濃縮された溶液の製剤が可能になるように化合物の溶解度を増大させる適切な安定化剤または物質を含んでいてもよい。あるいは、活性成分は使用前に、適切なベヒクル、たとえば発熱物質を含まない、滅菌した水との組成のための粉末の形状であってもよい。
【０１８９】
化合物はまた、ココアバターまたは他のグリセリドのような慣用の坐薬基剤を含む、坐薬または停滞浣腸剤のような直腸組成物として製剤してもよい。先に記載の製剤に加え、化合物はまた、デポー製剤として製剤してもよい。そのような長期作用製剤は植え込み（たとえば皮下または筋肉内）によるか、または筋肉内注射により投与してもよい。したがって、たとえば化合物は適切な高分子もしくは疎水性材料（たとえば受容できる油中の乳濁液として）またはイオン交換樹脂と共に、またはわずかに溶解する誘導体として、たとえばわずかに溶解する塩として製剤してもよい。
【０１９０】
本発明の疎水性化合物のための薬剤的キャリアはベンジルアルコール、非極性界面活性剤、水混和性有機高分子を含む共溶媒系、および水相である。共溶媒系はＶＰＤ共溶媒系であってもよい。ＶＰＤは、無水エタノールで容積を調整する、３％ｗ／ｖベンジルアルコール、８％ｗ／ｖ非極性界面活性剤ポリソルベート８０、および６５％ｗ／ｖポリエチレングリコール３００の溶液である。ＶＰＤ共溶媒系（ＶＰＤ：５Ｗ）は水溶液中５％ブドウ糖により１：１に希釈されたＶＰＤからなる。この共溶媒系は、疎水性化合物をよく溶解し、そして全身投与時に、それ自体低毒性である。当然、共溶媒系の比率はその溶解性および毒性の特徴を変化させずに、かなり多様であってもよい。さらに、共溶媒成分の同一性が変化してもよい：たとえば、他の低毒性非極性界面活性剤がポリソルベート８０のかわりに使用されてもよく；ポリエチレングリコールの割合が変化してもよく；たとえば、ポリビニルピロリドンのような他の生体適合性高分子がポリエチレングリコールの代わりとなってもよく；そして他の糖または多糖がブドウ糖の代わりとなってもよい。あるいは、疎水性薬剤的化合物のための他の送達系が利用されてもよい。リポソームおよび乳化剤は疎水性薬剤のための送達ベヒクルまたはキャリアの公知の例である。通常、さらに強い毒性という犠牲を払って、ジメチルスルホキシドのような特定の有機溶媒も使用することができる。さらに、治療薬を含む固体疎水性高分子の半透過性基質のような、徐放系を使用して化合物が送達されてもよい。各種徐放性基質が樹立されていて、当業者に公知である。徐放性カプセル剤はそれらの化学的性質に依存して、数週間から１００日を越えるまでの間化合物を放出することができる。治療的試薬の化学的性質および生物学的安定性に依存して、蛋白質安定化のための付加的な方法が利用されてもよい。
【０１９１】
医薬組成物はまた、適切な固体またはゲル相キャリアもしくは賦形剤を含んでいてもよい。そのようなキャリアまたは賦形剤の例としては、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、各種糖、デンプン、セルロース誘導体、ゼラチン、およびポリエチレングリコールのような高分子が挙げられるが、それらに限定されない。本発明のプロテイナーゼ阻害化合物の多くは、薬剤的に適合する対イオンとの塩として提供される。そのような薬剤的に受容できる塩基付加塩は遊離酸の生物学的な有効性および性質を保持する塩であり、そして水酸化ナトリウム、水酸化マグネシウム、アンモニア、トリアルキルアミン、ジアルキルアミン、モノアルキルアミン、二塩基性アミノ酸、酢酸ナトリウム、安息香酸カリウム、トリエタノールアミンなどのような無機または有機塩基との反応により得られる。
【０１９２】
本発明の医薬組成物は、蛋白質またはペプチド抗原に加え、本発明の蛋白質（複数の蛋白質）の複合体の形状であってもよい。蛋白質および／またはペプチド抗原はＢおよびＴリンパ球への刺激シグナルを送達するであろう。Ｂリンパ球はそれらの表面イムノグロブリン受容体を通して抗原に反応するであろう。Ｔリンパ球は、ＭＨＣ蛋白質による抗原の提示後にＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を通して抗原に反応するであろう。ＭＨＣおよび宿主細胞上のクラスＩおよびクラスＩＩＭＨＣ遺伝子によりコードされたものを含む構造的に関連した蛋白質はＴリンパ球にペプチド抗原（複数の抗原）を提示するであろう。抗原成分はまた、精製されたＭＨＣ‐ペプチド複合体として単独に、または直接的にＴ細胞にシグナル伝達することができる共刺激分子と共に供給されてもよい。あるいは、ＴＣＲおよびＴ細胞上の他の分子に結合することができる抗体だけでなく、表面イムノグロブリンおよびＢ細胞上の他の分子に結合することができる抗体が、本発明の医薬組成物と結合してもよい。本発明の医薬組成物はリポソームの形状であってもよく、それは他の薬剤的に受容できるキャリアに加え、ミセルとして凝集体中に存在する脂質のような両親媒性物質、不溶性単層、脂質結晶、または水溶液中のラメラ層と結合する。リポソーム形成のための適切な脂質はモノグリセリド、ジグリセリド、スルファチド、リン脂質、サポニン、胆汁酸などを含むが、それらに限定されない。そのようなリポソーム製剤の調製はたとえば、米国特許第４，２３５，８７１号；第４，５０１，７２８号、４，８３７，０２８号および４，７３７，３２３に開示されたような、当技術分野の技術のレベル内にあり、それらのすべては参照として本明細書に援用する）。
【０１９３】
本発明の医薬組成物のＳｌｉｔ様蛋白質の量は、治療される状態の性質および重症度、および患者が受けた以前の治療の性質に依存するであろう。最終的に、主治医が個々の患者を治療するための本発明の蛋白質の量を決定するであろう。はじめに、主治医は本発明の蛋白質の低用量を投与し、患者の反応を観察するであろう。患者にとって最適な治療効果が得られるまで、本発明の蛋白質のさらに多い量が投与されてもよく、そしてその時点で投与量はそれ以上増やされない。本発明の方法を実行するために使用される各種医薬組成物は、ｋｇ体重あたり本発明の蛋白質の約０．０１μｇから約１００ｍｇまで（好ましくは約０．１μｇから約１０ｍｇまで、より好ましくは約０．１μｇから約１ｍｇまで）を含むべきであることを企図する。骨、軟骨、腱または靱帯再生に有用な本発明の組成物に関して、治療法は移植物または装置として局所的に、全身的に、または局部的に組成物を投与することを含む。投与される場合、本発明において使用のための治療的組成物はもちろん、発熱物質を含まない、生理的に受容できる形状にある。さらに、組成物は好ましくは、骨、軟骨、または組織損傷部位への送達のための粘性の形状において封入または注入されてもよい。局所投与は創傷治癒および組織修復に適切であってもよい。先に記載のように、組成物中に場合によっては含まれていてもよい本発明の蛋白質以外に治療的に有用な物質は、代わりにまたは付加的に、本発明の方法の組成物と同時にまたは連続して投与してもよい。骨および／または軟骨形成のために好ましくは、組成物は骨および軟骨を成長させるための構造を提供する、骨および／または軟骨損傷の部位に蛋白質含有組成物を送達することができる、そして最適には身体に吸収されることができる基質を含むであろう。そのような基質は、現在他の移植医学的な適用に使用される基質から形成されてもよい。
【０１９４】
基質物質の選択は生体適合性、生体分解性、機械的性質、化粧用外観、および界面の性質に基づく。組成物の具体的な適用が適切な製剤を定義するであろう。組成物のための潜在的な基質は、生体分解性で、化学的に定義された硫酸カルシウム、リン酸トリカルシウム、ヒドロキシアパタイト、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、およびポリ無水物であってもよい。他の潜在的基質は、骨または皮膚コラーゲンのように、生体分解性で生物学的に十分に定義されている。別の基質は純粋な蛋白質、または細胞外基質成分からなる。他の潜在的な基質は、焼結ヒドロキシアパタイト、バイオガラス、アルミン酸塩、または他のセラミックのような非生体分解性で、化学的に定義される。基質は、ポリ乳酸およびヒドロキシアパタイトまたはコラーゲンおよびリン酸トリカルシウムのような、先に記載の物質の型の任意の組合せを含んでいてもよい。バイオセラミックは、カルシウム‐アルミン酸‐リン酸のように組成を変化させ、そしてポアサイズ、粒子サイズ、粒子形態、および生体分解性を変化させるために加工されてもよい。１５０から８００ミクロンまでの範囲の直径を有する多孔質粒子の形状において、乳酸およびグリコール酸５０：５０（モル重量）の共重合体が現在好ましい。いくつかの適用において、基質から蛋白質組成物が解離するのを妨げるために、カルボキシメチルセルロースまたは自己凝血塊のような封鎖剤を利用することが有用であろう。
【０１９５】
封鎖剤の好ましいファミリーは、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、およびカルボキシメチルセルロースを含む（ヒドロキシアルキルセルロースを含む）アルキルセルロースであり、もっとも好ましいものはカルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）のカチオン塩である。他の好ましい封鎖剤はヒアルロン酸、アルギン酸ナトリウム、ポリ（エチレングリコール）、ポリエチレンオキシド、カルボキシビニル重合体、およびポリ（ビニルアルコール）を含む。本明細書で有用な封鎖剤の量は、全製剤重量に基づいて０．５％〜２０ｗｔ％、好ましくは１〜１０ｗｔ％であり、それは高分子基質からの蛋白質の脱着を妨げるために必要な量を表すが、前駆細胞が基質に浸潤するのを妨げるほど多くなく、そのため蛋白質に前駆細胞の骨形成活性を援助する機会を提供する。別の組成物において、本発明の蛋白質は骨および／または軟骨欠陥、創傷、または組織の治療に有用な他の物質と結合してもよい。これらの物質は表皮成長因子（ＥＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、形質転換成長因子（ＴＧＦ‐アルファ、およびＴＧＦ‐ベータ、およびインスリン様成長因子（ＩＧＦ）のような各種成長因子を含む。
【０１９６】
治療組成物はまた、現在動物への適用に有用である。とりわけ、ヒトに加え、家畜およびサラブレッド種の馬は、本発明の蛋白質によるそのような治療のために適切な患者である。組織再生に使用される蛋白質含有医薬組成物の投与計画は、蛋白質の作用を修飾する各種因子、たとえば形成される適切な組織重量、損傷部位、損傷組織の状態、創傷のサイズ、損傷組織の型（たとえば、骨）、患者の年齢、性、および飲食物、いずれかの感染の重症度、投与時間、および他の臨床的因子を考慮する主治医により決定されるであろう。投与量は再構成に使用される基質の型により、および医薬組成物における他の蛋白質の含有により変化してもよい。たとえば、ＩＧＦ１（インスリン様成長因子１）のような他の既知の成長因子の最終組成物への添加も投与量を変化させてよい。経過は、たとえばＸ線、組織形態計測的測定、およびテトラサイクリン標識のような組織／骨成長、および／または修復の定期的評価によりモニターすることができる。
【０１９７】
本発明のポリヌクレオチドはまた、遺伝子治療に使用することができる。そのようなポリヌクレオチドはｉｎ  ｖｉｖｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏのいずれかで哺乳動物対象の細胞に発現のために導入することができる。本発明のポリヌクレオチドはまた、細胞または有機体（ウイルスベクターまたは裸のＤＮＡの形状を含むが、それらに限定されない）への核酸の導入のための他の既知の方法により投与することができる。細胞はまた、そのような細胞において、増殖するためか、または所望する効果、または活性を生み出すためにｅｘ  ｖｉｖｏで培養してもよい。処理された細胞は治療目的のためにｉｎ  ｖｉｖｏで導入することができる。
【０１９８】
効果的な投与量
本発明において使用のために適切な医薬組成物は、活性成分がその意図する目的を得るための効果的な量において含まれる組成物を含む。より具体的には、治療的有効量は、治療される患者に存在する症状の進行を妨げるか、または緩和するための効果的な量を意味する。効果的な量の決定は、とりわけ本明細書に提供された詳細な開示の観点から、好都合には当業者の能力の範囲内である。本発明の方法において使用されるいずれかの化合物では、治療的有効量ははじめに細胞培養アッセイから推定してもよい。たとえば、用量は細胞培養で決定されたＩＣ５０（Ｃ−プロテイナーゼ活性の最大阻害の１／２が得られる試験化合物の濃度）を含む循環濃度範囲を得るための動物モデルにおいて製剤することができる。そのような情報はヒトにおける有用な用量をより正確に決定するために使用することができる。
【０１９９】
治療的有効量は、患者において症状の緩和または生存の延長を引き起こす化合物の量を表す。そのような化合物の毒性および治療効果は、たとえばＬＤ５０（集団の５０％致死量）およびＥＤ５０（集団の５０％治療的有効量）を決定するための細胞培養または実験動物における標準薬剤的手順により確定することができる。毒性および治療効果間の用量比は治療指数であり、それはＬＤ５０およびＥＤ５０間の比として表すことができる。高い治療指数を示す化合物が好ましい。これらの細胞培養アッセイおよび動物試験から得られたデータは、ヒトにおける使用のための投与量の範囲を表すために使用することができる。そのような化合物の投与量は、好ましくは、ほとんどまたは全く毒性のないＥＤ５０を含む循環濃度の範囲内にある。投与量は使用した投与量および利用した投与経路に依存してこの範囲内で変化してもよい。的確な処方、投与経路および投与量は患者の状態を考慮して、主治医が選択することができる。Ｆｉｎｇｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９７５，“Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，”Ｃｈ．１  ｐ．１．を参照されたい。投与量および間隔は、Ｃ−プロテイナーゼ阻害効果、または最小有効濃度（ＭＥＣ）を維持するために十分である、活性部分の血漿レベルを提供するように、個々に調整することができる。ＭＥＣはそれぞれの化合物に対して変化するであろうが、ｉｎ  ｖｉｔｒｏデータから推定することができる；たとえば本明細書に記載のアッセイを使用してＣ−プロテイナーゼの５０〜９０％阻害をえるために必要な濃度。ＭＥＣを得るために必要な投与量は、個体の特性および投与経路に依存するであろう。しかし、ＨＰＬＣアッセイまたはバイオアッセイは血漿中濃度を測定するために使用することができる。投与間隔はまた、ＭＥＣ値を使用して決定することができる。化合物は、間隔の１０〜９０％の間、好ましくは３０〜９０％の間、そしてもっとも好ましくは５０〜９０％の間、血漿レベルをＭＥＣ以上に維持する処方計画を使用して投与されるべきである。局所投与または選択的取込の場合は、薬物の効果的な局所濃度は血漿中濃度に関連しなくてもよい。投与される組成物の量は、もちろん、治療される対象、対象の体重、苦痛の激しさ、投与法および主治医の判断に依存するであろう。
【０２００】
包装
組成物は所望する場合、活性成分を含む１以上の単位投与量の形状を含むことができる、パックまたはディスペンサー装置中に提示することができる。パックは、たとえばブリスターパックのように、金属またはプラスチックホイルをふくんでいてもよい。パックまたはディスペンサー装置には投与のための説明書を添付してもよい。適合した薬剤的キャリア中に製剤された本発明の化合物を含む組成物はまた、指示された状態の治療のために製造し、適切な容器に入れ、そしてラベルを貼ってもよい。
【０２０１】
抗体
本発明の別の側面は、本発明のポリヌクレオチドに特異的に結合する抗体である。そのような抗体はトランスジェニック動物で産生されるような、モノクローナルまたはポリクローナル抗体のいずれか、およびそれらのフラグメントならびにヒト化された形状または完全にヒトの形状であってもよい。本発明はさらに、本発明に記載の抗体を産生するハイブリドーマを提供する。本発明の抗体は、本発明のポリペプチドの検出および／または精製に有用である。本発明の蛋白質はまた、蛋白質と特異的に反応するポリクローナルおよびモノクローナル抗体を得るために動物を免疫するために使用してもよい。そのような抗体は、抗原として全蛋白質またはそのフラグメントのいずれかを使用して得ることができる。ペプチド抗原は付加的にカルボキシル末端にシステイン残基を含んでいてもよく、そしてスカシガイヘモシアニン（ＫＬＨ）のようなハプテンに結合する。そのようなペプチドを合成するための方法は、たとえばＲ．Ｐ．Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５：２２４９−２１５４（１９６３）；Ｊ．Ｌ．Ｋｒｓｔｅｎａｎｓｋｙ，ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．２１１，１０（１９８７）のように当技術分野で既知である。本発明の蛋白質に結合するモノクローナル抗体は、蛋白質の免疫検出のための有用な診断薬であってもよい。蛋白質に結合する中和モノクローナル抗体はまた、蛋白質に関連した状態、および蛋白質の異常発現が関与する癌のいくつかの形状の治療の両方に関して有用な治療薬であってもよい。癌性細胞または白血病細胞の場合、蛋白質に対する中和モノクローナル抗体は、蛋白質により媒介されてもよい癌性細胞の転移性蔓延を検出するため、および妨げるために有用であってもよい。一般に、所望する抗体を産生することができるポリクローナルおよびモノクローナル抗体、ならびにハイブリドーマを調製するための技術は当技術分野で既知である（Ｃａｍｂｅｌｌ，Ａ．Ｍ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ（１９８４）：Ｓｔ．Ｇｒｏｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  ３５：１−２１（１９９０）；Ｋｏｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５−４９７（１９７５））、ｔｈｅ  ｔｒｉｏｍａ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  Ｂ−ｃｅｌｌ  ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ（Ｋｏｚｂｏｒ  ｅｔ  ａｌ，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ  ４：７２（１９８３）；Ｃｏｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，ｉｎ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．（１９８５），ｐｐ７７−９６）。
【０２０２】
抗体を産生することが知られているいずれかの動物（マウス、ウサギなど）は本発明の蛋白質のペプチドまたはポリペプチドにより免疫することができる。免疫のための方法は当技術分野で既知である。そのような方法はポリペプチドの皮下または腹腔内注射を含む。当業者は免疫処置に使用される本発明のＯＲＦによりコードされる蛋白質の量は免疫される動物、抗原性および注射部位に基づいて変化するであろうということを認識するであろう。抗原として使用される蛋白質は蛋白質の抗原性を増大させるため修飾され、アジュバントとともに投与されてもよい。蛋白質の抗原性を増加させるための方法は当技術分野で既知であり、異種蛋白質（たとえばグロブリンまたは０−ガラクトシダーゼ）と抗原を結合させることまたは免疫処理中にアジュバントを包含させることを含むが、それらに限定されない。
【０２０３】
モノクローナル抗体に関しては、免疫動物の脾臓細胞が除去され、ＳＰ２／０−Ａｇｌ４骨髄腫のような、骨髄腫細胞と融合してモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ細胞になる。当技術分野で既知の多数の方法のいずれか一つが、所望する特徴を持つ抗体を産生するハイブリドーマ細胞を同定するために使用されてもよい。これらは、ＥＬＩＳＡアッセイ、ウェスタンブロット法、またはラジオイムノアッセイによるハイブリドーマのスクリーニング（Ｌｕｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓｅａｃｈ．１  ７５：１０９−１２４（１９８８））を含む。所望する抗体を分泌するハイブリドーマをクローニングし、クラスおよびサブクラスを当技術分野で既知の方法により決定する（Ｃａｍｂｅｌｌ，Ａ．Ｍ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ（１９８４））。１本鎖抗体産生のために記載された技術（米国特許第４，９４６，７７８号）は、本発明の蛋白質に対する１本鎖抗体を産生するために適応させてもよい。
【０２０４】
ポリクローナル抗体に関しては、抗体含有血清を免疫された動物から単離し、そして先に記載の方法を使用して所望する特異性を持つ抗体の存在をスクリーニングする。本発明はさらに検出可能なレベルの形状において先に記載の抗体を提供する。抗体は放射性同位体、親和性標識（たとえばビオチン、アビジンなど）、酵素標識（たとえばホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼなど）、蛍光標識（たとえばＦＩＴＣまたはローダミンなど）、常磁性原子などの使用により検出可能に標識することができる。そのような標識を行うための方法は当技術分野で既知であり、たとえば（Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．１８：３１５（１９７０）；Ｂａｙｅｒ，Ｅ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍ．６２：３０８（１９７９）；Ｅｎｇｖａｌ，Ｅ．ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ  １０９：１２９（１９７２）；Ｇｏｄｉｎｇ，Ｊ．Ｗ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈ．１３：２１５（１９７６）を参照されたい。
【０２０５】
本発明の標識抗体は、関心のあるポリペプチドのフラグメントが発現される細胞または組織を同定するためにｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｉｎ  ｖｉｖｏ、およびｉｎ  ｓｉｔｕアッセイに使用することができる。抗体はまた、治療または他の診断に直接使用することができる。本発明はさらに、固体支持体上に先に記載の抗体を提供する。そのような固体支持体の例としては、ポリアクリルアミド、アガロースおよびセファロースのような複合糖質、ポリアクリルアミドのようなアクリル樹脂およびラテックスビーズが挙げられる。そのような固体支持体に抗体を結合させる技術は当技術分野で公知である（Ｗｅｉｒ，Ｄ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，“Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ”４版，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ，Ｃｈａｐｔｅｒ  １０（１９８６）；Ｊａｃｏｂｙ，Ｗ．Ｄ．ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍ．３４  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．（１９７４））。本発明の固定化された抗体は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｉｎ  ｖｉｖｏ、およびｉｎ  ｓｉｔｕアッセイ、ならびに本発明の蛋白質の免疫親和性精製のために使用することができる。
【０２０６】
本発明の別の側面は幹細胞のｅｘ  ｖｉｖｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏの両方における増殖および／または拡大におけるＳｌｉｔ様蛋白質の使用である。幹細胞のｅｘ  ｖｉｖｏ拡大のためのいくつかの方法が報告されている。そのような選択方法および拡大方法は以下のものを含む各種コロニー刺激因子を使用する：ｃ−ｋｉｔリガンド（Ｂｒａｎｄｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  ８３：１５０７−１５１４（１９９４）；ＭｃＫｅｎｎａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  ８６：３４１３−３４２０（１９９５））、ＩＬ−３（Ｂｒａｎｄｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  ８３：１５０７−１５１４（１９９４）；Ｓａｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  ８２：３６００−３６０９（１９９３））、Ｇ−ＣＳＦ（Ｓａｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  ８２：３６００−３６０９（１９９３））、ＩＬ−１（Ｍｕｅｎｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  ８１：３４６３−３４７３（１９９３））、ＩＬ−６（Ｓａｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  ８２：３６００−３６０９（１９９３））、ＩＬ−１１（Ｌｅｍｏｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｘｐ．Ｈｅｍ．２１：（１６６８−１６７２（１９９３）；Ｓａｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  ８２：３６００−３６０９（１９９３））、ｆｌｔ−３リガンド（Ｍｃｋｅｎｎａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  ８６：３１２３−３４２０（１９９５）、ＧＭ−ＣＳＦ（Ｈａｙｌｏｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  ８０：１４０５−１４１２（１９９２）；Ｓａｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  ８２：３６００−３６０９（１９９３））；ＥＰＯ（Ｆｉｓｈｅｒ，Ｐ．Ｓ．Ｅ．Ｂ．Ｍ．２１６：３５８−３６６（１９９７）；ＴＰＯ（Ｓｃｉｐｐｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｒ．Ｊ．Ｈａｅｍａｔｏｌ．１０１：４２５−４３５（１９９８）；および／またはそれらの組合せ（Ｂｒａｎｄｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  ８３：１５０７−１５１４（１９９４）；Ｈａｙｌｏｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  ８０：１４０５−１４１２（１９９２）；Ｋｏｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １１：３５８−３６３（１９９３）；Ｌｅｍｏｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｘｐ．Ｈｅｍ．２１：（１６６８−１６７２（１９９３）；ＭｃＫｅｎｎａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  ８６：３４１３−３４２０（１９９５）；Ｍｕｅｎｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  ８１：３４６３−３４７３（１９９３）；Ｐａｔｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ  ７：１３−２６（１９９４）；Ｓａｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  ８２：３６００−３６０９（１９９３）；Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｘｐ．Ｈｅｍ．２１：（８７０−８７７（１９９３）；Ｓｔｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  １２：２１４−２２４（１９９４）；Ｔｓｕｊｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｘｐ．Ｈｅｍ．２１：１３７９−１３８６（１９９３）。ＩＬ−３は拡大する末梢血ＣＤ３４＋細胞においてもっとも強力な成長因子であると報告されている（Ｓａｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  ８２：３６００−３６０９（１９９３）；Ｋｏｂａｙａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  ７３：１８３６−１８４１（１９８９）が、複数の因子の組合せと同じ程度に効果的である単独因子は報告されていない。したがって、本発明の態様にお��て、本発明のＳｌｉｔ様蛋白質は少なくとも１つの他の造血成長因子、サイトカインまたはインターロイキンと共に共投与される。
【０２０７】
一態様において、本発明の核酸分子は、他の成長因子の活性を測定する代替マーカーとして使用される。全成長因子は幹細胞のｅｘ  ｖｉｖｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏの両方における増殖および／または拡大ができる。したがって、本発明の核酸分子は成長因子の増殖および／または拡大活性を測定するための代替マーカーとして使用される。
【０２０８】
本発明の発現されたＳｌｉｔ様蛋白質は造血前駆細胞のｅｘ  ｖｉｖｏ拡大に使用してもよいことを理解すべきである。骨髄移植片は好中球減少症および血小板減少症の患者を治療するために使用されている。妥協した造血系の再構成における骨髄の使用に関連していくつかの問題が挙げられる：骨髄、脾臓、または末梢における幹細胞の限定された数；移植片対宿主疾患；移植片拒絶；および腫瘍細胞の潜在的な混入。幹細胞は細胞の数が多いほど、より促進された造血回復をするような用量反応を示すことが報告されている。したがって、幹細胞のｅｘ  ｖｉｖｏ拡大は造血回復を促進し、それにより患者の生存を促進すべきである。
【０２０９】
移植片対宿主疾患および移植片拒絶は、ＨＬＡ適合同胞ドナーに対してさえ、報告されている。同種非骨髄移植片に代わるものは自己骨髄移植片である。自己骨髄移植片において、患者の骨髄の一部はミエロブラスティブ（ｍｙｅｌｏｂｌａｔｉｖｅ）な療法、たとえば、化学療法および放射線療法の前に採取され、ミエロブラスティブな療法完了後に患者に戻される。自己骨髄移植は移植片対宿主疾患および移植片拒絶のリスクを取り除く。しかし、自己骨髄移植には骨髄における幹細胞の限定された数、および腫瘍細胞の潜在的な混入の点において依然として問題がある。幹細胞の限定された数は幹細胞のｅｘ  ｖｉｖｏ拡大により打ち勝つことができる。
【０２１０】
本発明の別の態様において、ｅｘ  ｖｉｖｏで拡大された造血前駆細胞が骨髄移植において使用される（Ｋｅｓｓｉｎｇｅｒ  ａｎｄ  Ａｒｍｉｔａｇｅ、Ｂｌｏｏｄ  ７７：２１１−２１３（１９９１））。造血前駆細胞を拡大することにより、自己移植中に必要とされる白血球除去の数および期間を減少させ、それによりアフェレーシス生成物における疾患の混入のリスクを低下させることができる（Ａｌｃｏｒｎ  ａｎｄ  Ｈｏｌｙｏａｋｅ，Ｂｌｏｏｄ  Ｒｅｖ．１０：１６７−１７６（１９９６））。
本発明の別の態様において、本発明のＳｌｉｔ様蛋白質が臍帯血細胞のｅｘ  ｖｉｖｏ拡大に使用される（Ｌｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．２１：１４４２−１４４６（１９９３）；Ｗｅｓｔｗｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｒ．Ｊ．Ｈａｅｍａｔｏｌ．８６：４６８−４７４（１９９４）；Ｔｒａｕｃｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  ８５：２０５９−２０６８（１９９５）；Ｒｅｅｍｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ．Ｂｌｏｏｄ  Ｍａｒｒｏｗ  Ｔｒａｎｓｐ．３：１３３−１４１（１９９７）。拡大された臍帯血細胞はその後同種移植に使用することができる。あるいは、本発明のＳｌｉｔ様蛋白質は胎児組織のｅｘ  ｖｉｖｏ拡大に使用される。Ｒｅｅｍ  ｅｔ  ａｌ．，はＨＳ−５上清およびｋｉｔリガンドの存在下における臍帯血細胞のｅｘ  ｖｉｖｏ拡大を記載する（Ｒｅｅｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ．Ｂｌｏｏｄ  Ｍａｒｒｏｗ  Ｔｒａｎｓｐ．３：１３３−１４１（１９９７））。
【０２１１】
一態様において、インターロイキン、ＥＧＦモチーフ、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子および本発明のＳｌｉｔ様蛋白質の各種組合せの存在下で、造血前駆細胞のｅｘ  ｖｉｖｏ拡大がストロマフリー長期培養において見出される。ストロマフリーで、サイトカインを基礎にした培養が好ましく、それにおいて培養物は相対的に定義された無血清状態下で樹立することができ、そして細胞増殖および分化は使用される造血成長因子（複数の因子）に従って操作することができる（Ｍａｙａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  ８２：２６６４−２６７２（１９９４）；Ｒｅｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  ８３：１２８−１３６（１９９４）；Ｐｌｏｅｍａｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌｅｕｋｅｍｉａ  ７：１３８１−１３８８（１９９３）；Ｈｅｎｓｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  ８４：２８９８−２９０３（１９９４）；）。ストロマフリー長期培養における造血前駆細胞のｅｘ  ｖｉｖｏ拡大はＤｅ  Ｂｒｕｙｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｈｅｍａｔｏｔｈｅｒａｐｙ  ６：９３−１０２（１９９７）により記載されている。ストロマ長期培養における造血前駆細胞のｅｘ  ｖｉｖｏ拡大はＤｅｘｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ９１：３３５−３４４（１９９７）により記載されている。さらに好ましくは、造血前駆細胞拡大のためのｅｘ  ｖｉｖｏ法は長期ｅｘ  ｖｉｖｏ拡大を可能にする。
【０２１２】
コロニー刺激因子（ＣＳＦｓ）、たとえばｈＩＬ−３は、好中球減少症および血小板減少症を治療するための高用量化学療法に続いて、単独で、他のＣＳＦｓと共に、または骨髄移植片と組み合わせて投与されている。しかしＣＳＦｓの投与は、好中球減少症および血小板減少症を完全に排除するために十分ではなかった。単球（マクロファージ）、顆粒球（好中球を含む）および巨核球からなる骨髄細胞系譜は、潜在的な致命的な感染および出血を防ぐために役割を果たす。
【０２１３】
本発明のＳｌｉｔ様蛋白質は造血系内で、骨髄細胞、赤血球、リンパ球、もしくは巨核球細胞、またはそれらの組み合わせのいずれかの低下したレベルにより特徴付けられる病気の治療において使用してもよい。さらに、それらは成熟した骨髄および／またはリンパ球細胞を活性化するために使用してもよい。本発明のＳｌｉｔ様蛋白質により治療するか、または緩和することができる状態または病気は白血球減少症、好中球減少症、再生不良性貧血、周期性好中球減少症、特発性好中球減少症、チェディアック‐東症候群、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、白血病、骨髄異形成症候群、骨髄線維症、および血小板減少症を含むが、それらに限定されない。
【０２１４】
白血球減少症はあるウイルスへの暴露または照射により誘発されると報告されている循環白血球（ｗｈｉｔｅ  ｂｌｏｏｄ  ｃｅｌｌ）の数の減少である。それはしばしば、癌治療の各種形態、たとえば化学療法剤への暴露または放射線療法、および感染または出血の報告された副作用である。本発明のＳｌｉｔ様蛋白質による白血球減少症の治療は、癌治療の各種形態による治療により引き起こされる望ましくない副作用を避けるか、または緩和することができる。
【０２１５】
血小板減少症の唯一の報告された治療は、経費が高く、感染（たとえば、ＨＩＶ、ＨＢＶなど）の際だったリスクをもたらす血小板輸液、および同種異系免疫処置である。本発明のＳｌｉｔ様蛋白質は、血小板輸液の必要性を軽減するか、または取り除く。
【０２１６】
本発明のＳｌｉｔ様蛋白質は末梢血における造血前駆細胞および幹細胞の動員に使用されてもよい。末梢血由来前駆細胞は自己骨髄移植を受けた患者の再形成に有効であることが報告されている。造血成長因子Ｇ−ＣＳＦおよびＧＭ−ＣＳＦは末梢血中の循環前駆細胞および幹細胞の数を増やすことが報告されている。これは末梢幹細胞収集の手順を簡素化し、必要なフェレーシスの数を減少させることにより、手順の費用を減少させてきた。本発明のＳｌｉｔ様蛋白質は幹細胞の動員、さらに末梢幹細胞移植の効率を上げることに使用してもよい。
【０２１７】
本発明の一側面は幹細胞の選択的ｅｘ  ｖｉｖｏ拡大の方法を提供する。“幹細胞”という用語は、全能性造血幹細胞、ならびに前駆体および前駆細胞を表し、それらは骨髄、脾臓、または末梢血から単離することができる。“拡大”という用語は細胞の分化および増殖を表す。本発明は以下のことを含む幹細胞の選択的ｅｘ  ｖｉｖｏ拡大の方法を提供する：（ａ）Ｓｌｉｔ様蛋白質を含む選択的培地により単離し、精製された幹細胞を培養することおよび（ｂ）上記の幹細胞を採取すること。
【０２１８】
好中球、赤血球、血小板などになることが約束された幹細胞および前駆細胞は、これらの細胞の表面に存在するＣＤ３４のような、特定の前駆細胞マーカーの存在下、または非存在下により、および／または形態学的特徴により多くの他の細胞と区別することができる。高度に濃縮されたヒト幹細胞集団の表現型はＣＤ３４＋、ＣＤ３８−、Ｔｈｙ‐−およびｌｉｎ−として報告される。本発明はこの幹細胞集団に限定されないということを理解すべきである。
【０２１９】
ＣＤ３４＋濃縮ヒト幹細胞は、ＣＤ３４＋のような表面抗原に対する抗体を使用して、アフィニティーカラムもしくはビーズ、磁気ビーズまたはフローサイトメトリーを含む多数の報告された方法により分離することができる。さらに、向流エルトリエーションのような物理的分離法が造血前駆細胞を濃縮するために使用されてもよい。ＣＤ３４＋前駆細胞は異質性であると報告され、そして細胞表面関連分子に関連した異なる系譜の共発現の存在または非存在により特徴付けられるいくつかの亜集団に分割されてもよい。非常に未熟な前駆細胞が、いずれかの報告された系譜関連マーカー、たとえばＨＬＡ‐ＤＲまたはＣＤ３８を発現することは報告されていないが、それらはＣＤ９０（ｔｈｙ‐１）を発現してもよい。ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４１、ＣＤ７１、ＨＬＡ‐ＤＲ、またはｃ−ｋｉｔのような他の表面抗原は造血前駆細胞を選択的に単離するために使用することができる。癌細胞中でアップレギュレートされ、その上に特異的に発現される細胞表面抗原が報告されている（Ｇｒｅｉｐｐ  ａｎｄ  Ｗｉｔｚｉｇ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ  Ｏｎｃｏｌ．８：２０−２７（１９９６）。
【０２２０】
分離された細胞は培養ブラスコ、滅菌バッグ、または中空繊維中、選択された培地中でインキュベートすることができる。各種コロニー刺激因子は細胞を選択的に拡大するために利用することができる。骨髄のｅｘ  ｖｉｖｏ拡大において報告されている因子は以下のものを含むが、それらに限定されない：ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ｃ−ｍｐｌリガンド（ＴＰＯまたはＭＧＤＦとしても既知）、Ｍ−ＣＳＦ、エリスロポイエチン（ＥＰＯ）、ＩＬ−１、ＩＬ−４、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＬＩＦ、ｆｔｌ３リガンド、Ｓｔｅｅｌ因子もしくはｃ−ｋｉｔリガンドとしても既知の幹細胞因子（ＳＣＦ）、およびそれらの組合せ。
【０２２１】
本発明の別の側面は、培養容器に細胞を接種することを含む、造血前駆細胞を維持し、および／または拡大するための方法を提供し、そのような容器は本発明のＳｌｉｔ様蛋白質で補足されているストロマ細胞系統、とりわけＨＳ−５（ＷＯ９６／０２６６２，Ｒｏｅｃｋｌｅｉｎ  ａｎｄ  Ｔｏｒｏｋ−Ｓｔｒｏｂ，Ｂｌｏｏｄ  ８５：９９７−１１０５，１９９５）に暴露することにより調製されている培地を含む。
【０２２２】
多くの薬物が骨髄抑制または造血欠陥を引き起こすことが報告されている。そのような薬物の例としては、ＡＺＴ、ＤＤＩ、化学療法に使用されるアルキル化剤および代謝拮抗物質、クロラムフェニコール、ペニシリン、ガンシクロビル、ダウノマイシンおよびサルファ剤、フェノチアゾン、メプロバメートのようなトランキライザー、アミノピリンおよびジピロンのような鎮痛剤、フェニトインまたはカルバマゼピンのような抗けいれん剤、プロピルチオウラシルおよびメチマゾールのような抗甲状腺薬ならびに利尿剤が挙げられる。本発明のＳｌｉｔ様蛋白質は、これらの薬物で治療される患者にしばしば見られる、骨髄抑制もしくは造血欠陥の予防または治療に有用であってもよい。
【０２２３】
造血欠陥はまた、ウイルス、微生物、または寄生虫感染の結果として、および腎臓病または腎不全の治療、たとえば透析の結果として引き起こされる可能性がある。本発明のＳｌｉｔ様蛋白質はそのような造血欠陥の治療に有用であってもよい。
【０２２４】
造血欠陥の治療は、患者へのＳｌｉｔ様蛋白質を含む医薬組成物の投与を含んでいてもよい。本発明のＳｌｉｔ様蛋白質はまた、患者に造血前駆細胞を注入する前に、これらの細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで本発明のＳｌｉｔ様蛋白質により処理することによる、細胞の活性化および増幅に有用であってもよい。
【０２２５】
各種免疫不全症、たとえば、Ｔおよび／またはＢリンパ球における、または免疫疾患、たとえばリウマチ性関節炎も本発明のＳｌｉｔ様蛋白質により都合よく治療することができる。免疫不全症はたとえばＨＴＬＶＩ、ＨＴＬＶＩＩ、ＨＴＬＶＩＩＩのようなウイルス感染、放射線への強い暴露、癌治療または他の医学的治療の結果である可能性がある。本発明のＳｌｉｔ様蛋白質はまた、血小板減少症（血小板欠乏）を含む他の血液細胞不全、または貧血の治療において単独で、または他のコロニー刺激因子と組み合わせて使用してもよい。これらのポリペプチドの他の用途は、骨髄移植から回復する患者のｉｎ  ｖｉｖｏおよびｅｘ  ｖｉｖｏ治療、および診断または治療的用途のために標準法により生成されたモノクローナルおよびポリクローナル抗体の拡大である。
【０２２６】
本発明の他の側面は、先に記載の状態を治療するための方法および治療的組成物である。そのような組成物は、薬剤的に受容できるキャリアとの混合物中に１以上の本発明のＳｌｉｔ様蛋白質の治療的有効量を含む。この組成物は、非経口的、静脈内または皮下に投与することができる。投与する場合、本発明における使用のための治療的組成物は好ましくは、発熱物質を含まない、非経口的に受容できる水溶液の形状である。ｐＨ，等張性、安定性などに十分配慮したそのような非経口的に受容できる蛋白質溶液の製剤は、当技術分野の技術の範囲内である。
【０２２７】
先に記載の状態を治療するための方法に含まれる投与計画は、薬物の作用を変化させる各種因子、たとえば患者の状態、体重、性および飲食物、いずれかの炎症の重症度、投与の時期および他の臨床的因子を考慮する主治医により決定されるであろう。一般に、１日投与量は体重１キログラムにつき、Ｓｌｉｔ様蛋白質０．２〜１５０μｇ／ｋｇの範囲であってもよい。好ましくは、１日投与量は体重１キログラムにつき、Ｓｌｉｔ様蛋白質０．２〜１００μｇ／ｋｇの範囲である。より好ましくは、１日投与量は体重１キログラムにつき、Ｓｌｉｔ様蛋白質０．５〜５０μｇ／ｋｇの範囲であり、そしてもっとも好ましくは０．５〜１０μｇ／ｋｇの範囲である。投与量が投与されるＳｌｉｔ様蛋白質の活性に関して調整され、そして投与計画が１日に体重１キログラムにつき０．１マイクログラム、および１ミリグラムの投与量を含んでいてもよいということを認めることは不合理ではないであろう。さらに、Ｓｌｉｔ様蛋白質の投与量が体重１キログラムにつき、０．２〜１５０マイクログラムの範囲より高くか、または低く調整される特異的な状況が存在してもよい。これらはＩＬ−３変異体の他のコロニー刺激因子または成長因子との共投与；化学療法剤および／または照射との共投与；グリコシル化Ｓｌｉｔ様蛋白質の使用；およびこの節で先に記載の各種の患者に関連する問題点を含む。
【０２２８】
先に示したように、治療方法および組成物はまた他のヒト因子との共投与を含んでいてもよい。本発明のポリペプチドとの同時または連続共投与のための他の適切なコロニー刺激因子（ＣＳＦｓ）、サイトカイン、リンホカイン、造血成長因子、およびインターロイキンの非限定的なリストは、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ｃ−ｍｐｌリガンド（ＴＰＯまたはＭＧＤＦとしても既知）、Ｍ−ＣＳＦ、エリスロポイエチン（ＥＰＯ）、ＩＬ−１、ＩＬ−４、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＬＩＦ、ｆｔｌ３リガンド、Ｓｔｅｅｌ因子もしくはｃ−ｋｉｔリガンドとしても既知の幹細胞因子（ＳＣＦ）、またはそれらの組合せを含む。先に記載の投与量は、治療的組成物におけるそのような付加的な成分を補うように調整されるであろう。治療される患者の経過は、造血特性、たとえば分化した細胞数などの定期的な評価によりモニターすることができる。
【０２２９】
一態様において、本発明の核酸分子は造血欠陥を治療するための治療的組成物の有効性を測定するための代替マーカーとして使用される。あるいは、本発明の核酸分子は造血欠陥を引き起こす薬物の効果を測定するための代替マーカーとして使用することができる。そのような測定はたとえば、本発明の核酸分子に相補的な核酸分子の存在、非存在、または発現レベルを測定することにより行うことができる。
【０２３０】
実施例
これまでに本発明の一般的な記載してきたが、同じことが以下の実施例を参照することによりさらに容易に理解されるであろうが、それらは説明のために提供され、そして特記しない限り本発明を限定することを意図しないものである。
【０２３１】
実施例１
ＨＳ−５、ＨＳ−２１、ＨＳ−２２、ＨＳ−２３、およびＨＳ−２７細胞は液体窒素中に別々に凍結し、既知のＲＮＡ単離法を使用して単離する。単離されたＲＮＡはその後の操作まで−８０℃で保存される。
【０２３２】
保存されたＲＮＡは、製造業者が推奨する方法に基本的に従って、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，Ｍａｒｙｌａｎｄ）のＴｒｉｚｏｌ試薬を使用して精製する。ポリＡ＋ＲＮＡ（ｍＲＮＡ）は製造業者（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ，Ｄｙｎａｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｌａｋｅ  Ｓｕｃｃｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）が推奨する方法に基本的に従って、磁気オリゴｄＴビーズを使用して精製する。
【０２３３】
ｃＤＮＡライブラリーの構築は当技術分野で既知であり、多数のクローニング法が存在する。多数のｃＤＮＡライブラリー構築キットが市販されている。ＰＣＲ−Ｓｅｌｅｃｔ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）が製造業者に指示された条件に従って使用される。
【０２３４】
平均化ライブラリーは本質的にＳｏａｒｅｓ法（Ｓｏａｒｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（Ｕ．Ｓ．Ａ．）９１：９２２８−９２３２（１９９４）、これをそのまま参照として援用する）を使用して作製する。この方法は、ライブラリーの総体的な配列複雑性を維持しながら、個々のｃＤＮＡ頻度における初期の１０，０００倍の変動を軽減させ、１桁内にするために設計されている。平均化過程において、豊富な存在量のｃＤＮＡの出現率は劇的に低下し、中間レベルの存在量のクローンは比較的変化せず、そしてまれな転写物のクローンは効果的に存在量が増加する。
【０２３５】
実施例２
ｃＤＮＡライブラリーを持つ細菌は選択のための適切な抗体を含むＬＢ寒天上で培養し、個々のクローンが成長するために十分な期間、３７℃でインキュベートする。単一コロニーは選択抗生物質を含むＬＢ液を含む９６ウェルマイクロタイタープレートの各ウェルに個々に入れられる。プレートは、培養物の増殖を促進するために穏やかに振とうしながら一晩３７℃でインキュベートする。プラスミドＤＮＡは、製造業者（Ｑｉａｇｅｎ  Ｉｎｃ．Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，ＣＡ）に勧められた条件を使用してＱｉａｐｒｅｐ  ｐｌａｓｍｉｄ  ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｋｉｔを使用して各クローンから単離する。
【０２３６】
鋳型プラスミドＤＮＡは次の配列決定に使用する。ＡｍｐｌｉＴａｑ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ、ＦＳを含むＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ｄＲｏｄａｍｉｎｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＰＥ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）が配列決定のために使用される。
【０２３７】
実施例３
ＤＮＡ単離および性状決定
プラスミドＤＮＡはＰｒｏｍｅｇａ  Ｗｉｚａｒｄ（登録商標）Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  ｋｉｔ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ），Ｑｉａｇｅｎ  ＱＩＡｗｅｌｌ  Ｐｌａｓｍｉｄ  ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ，ＧＡ）またはＱｉａｇｅｎ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍｉｄｉ  ｋｉｔを使用して単離する。これらのキットはプラスミド単離のための同じ一般的手順に従う。手短に述べると、細胞は遠心分離（５０００ｘｇ）によりペレットにし、プラスミドＤＮＡを連続したＮａＯＨ／酸処理で遊離させ、そして細胞片を遠心分離（１０００ｘｇ）により除去する。上清（プラスミドＤＮＡを含む）をＤＮＡ‐結合樹脂を含むカラム上に置き、カラムを洗浄し、そしてプラスミドＤＮＡをＴＥで溶出する。関心のあるプラスミドによりコロニーをスクリーニングした後、大腸菌細胞を適切な抗生物質を加えた５０〜１００ｍｌｓのＬＢに接種し、３７℃で一晩、空気インキュベータ中で振とうしながら増殖させる。精製されたプラスミドＤＮＡはＤＮＡ配列決定、さらに制限酵素消化、ＤＮＡフラグメントの付加的なサブクローニングおよび哺乳動物、大腸菌または他の細胞へのトランスフェクションまたは形質導入に使用する。
【０２３８】
配列確認
精製されたプラスミドＤＮＡはｄＨ２Ｏに再懸濁し、Ｂａｕｓｃｈ  ａｎｄ  Ｌｏｍｂ  Ｓｐｅｃｔｒｏｎｉｃ  ６０１  ＵＶ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒで、２６０／２８０ｎｍの吸光度を測定することにより定量する。ＤＮＡ試料は、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ（登録商標）ＤｙｅＤｅｏｘｙ（登録商標）ターミネータ配列決定ケミストリー（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｌｉｎｃｏｌｎ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）キット（Ｐａｒｔ  ｎｕｍｂｅｒ  ４０１３８８または４０２０７８）を使用して、通常配列決定混合物への５％  ＤＭＳＯの添加により修正した、製造業者に指示されたプロトコルに従って配列決定する。配列決定反応は、提示された増幅条件に従って、Ｍｏｄｅｌ  ４８０  ＤＮＡ  ｔｈｅｒｍａｌ  ｃｙｃｌｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴ）中で行われる。試料はＣｅｔｒｉ―Ｓｅｐ（登録商標）スピンカラム（Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ，Ａｄｅｌｐｈｉａ，ＮＪ）で精製し、過剰なダイターミネータを除去して凍結乾燥する。蛍光色素標識配列決定反応物は、脱イオン化ホルムアルデヒドで再懸濁し、ＡＢＩ  Ｍｏｄｅｌ  ３７３Ａ  自動ＤＮＡシークエンサーを使用して、変性４．７５％  ポリアクリルアミド‐８Ｍ  尿素ゲル上で配列決定する。重複したＤＮＡ配列フラグメントを分析し、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ  ｖ３．０  ＤＮＡ解析ソフトウェア（Ｇｅｎｅ  Ｃｏｄｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ，ＭＩ）を使用してマスターＤＮＡコンティグに構築する。
【０２３９】
哺乳動物細胞におけるＳｌｉｔ様蛋白質の発現
哺乳動物トランスフェクション／ならし培地の作製
ＢＨＫ‐２１細胞系統はＡＴＣＣ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）から得る。細胞は、２ｍＭ（ｍＭ）Ｌ‐グルタミンおよび１０％  ウシ胎児血清（ＦＢＳ）で補足した、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ変法Ｅａｇｌｅ培地（ＤＭＥＭ／高グルコース）で培養する。この処方はＢＨＫ増殖培地と呼ぶ。選択培地は４５３単位／ｍＬ  ヒグロマイシンＢ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）で補足したＢＨＫ増殖培地である。ＢＨＫ‐２１細胞系統は、プラスミドｐＭＯＮ３３５９上に見出されるＩＥ１１０プロモータを転写促進する、ＨＳＶ転写促進蛋白質ＶＰ１６を安定にトランスフェクトされる（Ｈｉｐｐｅｎｍｅｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １１：１０３７−１０４１（１９９３）を参照されたい）。ＶＰ１６蛋白質は挿入された遺伝子をＩＥ１１０プロモータの後ろに発現させる。転写促進蛋白質ＶＰ１６を発現するＢＨＫ‐２１細胞は、ＢＨＫ‐ＶＰ１６と呼ばれる。プラスミドｐＭＯＮ１１１８（Ｈｉｇｈｋｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｏｕｌｔｒｙ  Ｓｃｉ．７０：９７０−９８１（１９９１）を参照されたい）はＳＶ４０プロモータ由来のヒグロマイシン抵抗性遺伝子を発現させる。ＡＴＣＣから入手できる類似したプラスミドはｐＳＶ２‐ｈｐｈである。
【０２４０】
ＢＨＫ‐ＶＰ１６細胞はトランスフェクション２４時間前に、６０ミリメートル（ｍｍ）組織培養皿に、皿につき３ｘ１０５細胞を接種する。細胞は、皿ごとに、関心のある遺伝子を含むプラスミドＤＮＡ１０μｇ、３μｇ  ヒグロマイシン  抵抗性プラスミド、ｐＭＯＮ１１１８，およびＧｉｂｃｏ‐ＢＲＬ  ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（登録商標）を含むＯＰＴＩＭＥＭ（登録商標）（Ｇｉｂｃｏ‐ＢＲＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）３ｍＬ中で１６時間トランスフェクションする。次に培地を吸引し、３ｍＬ  増殖培地と交換する。トランスフェクション後４８時間に各皿の培地を集め、活性をアッセイする（一時的ならし培地）。細胞は１：１０に希釈したトリプシン‐ＥＤＴＡにより皿から除去し、選択培地１０ｍＬを含む１００ｍｍ組織培養皿に移す。約７日後、抵抗性細胞は直径数ミリメートルのコロニーに増殖する。コロニーは濾紙（コロニーと同じサイズに切断し、トリプシン／ＥＤＴＡに浸す）で皿から除去し、選択培地１ｍＬを含む２４ウェルプレートの個々のウェルに移される。コロニーがコンフルエントになった後、ならし培地を再アッセイし、陽性のクローンを増殖培地中で拡大させる。
【０２４１】
大腸菌におけるＳｌｉｔ様蛋白質の発現
関心のあるプラスミドをもつ大腸菌系統ＭＯＮ１０５またはＪＭ１０１はＮｅｗ  Ｂｒｕｓｗｉｃｋ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｅｄｉｓｏｎ，ＮＥＷ  Ｊｅｒｓｅｙ）のエアーインキュベータＭｏｄｅｌ  Ｇ２５中で振とうしながら、Ｍ９プラスカザミノ酸培地中、３７℃で増殖させる。増殖は１．０の値に到達するまでＯＤ６００でモニターし、その時点で０．１Ｎ  ＮａＯＨ中のナリジクス酸（１０ミリグラム／ｍＬ）を添加し、最終濃度５０μｇ／ｍＬとする。培養物はさらに３〜４時間３７℃で振とうする。所望する遺伝子産物の最大産生を得るために培養期間中、激しいエアレーションを維持する。細胞は光学顕微鏡下で封入体（ＩＢ）の存在を試験する。ペレットにした細胞を沸騰させ、培養物１ｍＬアリコートを蛋白質含量を分析するために除去し、還元バッファーでそれらを処理し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより電気泳動する（Ｍａｎｉａｔｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（１９８２）を参照されたい）。培養物は遠心分離（５０００ｘｇ）し、細胞をペレットにする。
【０２４２】
封入体調製、抽出、再生、透析、ＤＥＡＥクロマトグラフィー、およびＳｌｉｔ様蛋白質の性状決定
封入体の単離：
大腸菌培養物３３０ｍＬ由来の細胞ペレットは超音波処理バッファー（１０ｍＭ  ２−アミノ−２−（ヒドロキシメチル）１，３−プロパンジオール塩酸（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ）＋１ｍＭ  エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）  １５ｍＬに再懸濁する。超音波処理バッファー中での超音波処理、続く遠心分離のこれらのラウンドは細胞を破壊し、封入体（ＩＢ）を洗浄するために使用される。超音波処理の第１ラウンドは３分間バースト、続いて１分間バーストであり、そして超音波処理の最終２ラウンドはそれぞれ１分間である。
【０２４３】
封入体ペレットからの蛋白質の抽出および再生：
最終の遠心分離後、ＩＢペレットは１０ｍＬの５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ９．５、８Ｍ  尿素および５ｍＭ  ジチオスレイトール（ＤＴＴ）に再懸濁し、室温で約４５分間撹拌し、発現された蛋白質を変性させる。
【０２４４】
抽出溶液は７０ｍＬの５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ９．５、２．３Ｍ  尿素を含むビーカーに移し、４℃で空気に曝しながら１８〜４８時間、穏やかに撹拌し、蛋白質を再生させる。再生はＶｙｄａｃ（Ｈｅｓｐｅｒｉａ，Ｃａ．）Ｃ１８逆相高圧液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）カラム（０．４６ｘ２５ｃｍ）上での分析によりモニターする。０．１５トリフルオロ酢酸（ＴＥＡ）を含む４０％〜６５％の直線グラジエントが、再生をモニターするために使用される。このグラジエントは１分間につき１．５ｍＬの流速で３０分間にわたり展開させる。変性蛋白質は一般に、再生された蛋白質より後のグラジエントで溶出する。
【０２４５】
精製：
再生後、混入している大腸菌蛋白質は酸沈殿により除去される。再生溶液のｐＨは１５％（ｖ／ｖ）酢酸（ＨＯＡｃ）を使用して、ｐＨ５．０およびｐＨ５．２間に滴定する。この溶液を４℃で２時間撹拌し、１２，０００ｘｇで２０分間遠心分離し、任意の不溶蛋白質を沈殿させる。
【０２４６】
酸沈殿段階由来の上清は、３，５００ダルトンの分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）を持つＳｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ３を使用して透析する。透析は全部で１８時間、４リットル（５０倍過剰）の１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０を２回交換する。透析は試料の伝導度を低下し、ＤＥＡＥクロマトグラフィーの前に尿素を除去する。試料はその後遠心分離（１２，０００ｘｇで２０分間）し、透析後に任意の不溶蛋白質を沈殿させる。
【０２４７】
Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｂｉｏ−Ｓｃａｌｅ  ＤＥＡＥ２カラム（７ｘ５２ｍｍ）がイオン交換クロマトグラフィーのために使用される。カラムは、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０を含むバッファー中で平衡化し、４５カラム容積以上の平衡バッファー中の０〜５００ｍＭ  塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）グラジエントが蛋白質を溶出するために使用される。１分につき１．０ｍＬの流速が手順中使用される。カラム画分（画分につき２．０ｍＬ）はグラジエントを横切って集め、Ｖｙｄａｃ（Ｈｅｓｐｅｒｉａ，Ｃａ）Ｃ１８カラム（０．４６ｘ２５ｃｍ）上でＲＰ−ＨＰＬＣにより分析する。０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＥＡ）を含む、４０％〜６５％アセトニトリルの直線グラジエントが使用される。このグラジエントは１分間につき１．５ｍＬの流速で、３０分間かけて展開される。貯留された画分は次に全部で１８時間、４リットル（５０〜５００倍過剰）の１０ｍＭ  酢酸アンモニウム（ＮＨ４Ａｃ）、ｐＨ４．０の２交換に対して透析する。透析は３，５００ダルトンのＭＷＣＯを持つＳｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ３膜を使用して行う。最後に、試料は０．２２μｍ  シリンジフィルター（μＳｔａｒ  ＬＢ  ｓｙｒｉｎｇｅ  ｆｉｌｔｅｒ、Ｃｏｓｔａｒ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，Ｍａ．）を使用して無菌濾過し、４℃で保存する。
【０２４８】
いくつかの場合は、折りたたまれた蛋白質は適切な基質に結合したｍＡｂｓまたは受容体サブユニットのような親和性試薬を使用して親和性精製することができる。あるいは、（またはさらに）精製は以下のような各種クロマトグラフィー法のいずれかを使用して行うことができる：イオン交換、ゲル濾過または疎水性クロマトグラフィーもしくは逆相ＨＰＬＣ。
【０２４９】
これらおよび他の蛋白質精製法は、Ｄｅｕｔｇｓｃｈｅｒ編、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１８２‘Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ’Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ（１９９０）に記載される。
【０２５０】
蛋白質性状決定：
精製された蛋白質はＲＰ−ＨＰＬＣ、エレクトロスプレー質量分析、およびＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析する。蛋白質定量はアミノ酸組成、ＲＰ−ＨＰＬＣ、およびＢｌａｄｆｏｒｄ蛋白質測定により行う。いくつかの場合、トリプシンペプチドマッピングが蛋白質の同一性を確認するためにエレクトロスプレー質量分析と組み合わせて行われる。
【０２５１】
変異体を作製し、細菌、哺乳動物細胞または昆虫細胞においてそれらを発現させるために使用することができる組換えＤＮＡ法についての付加的な詳細、所望する蛋白質の精製および再生および蛋白質の生理活性を測定するためのアッセイはＷＯ９５／００６４６，ＷＯ９４／１２６３９、ＷＯ９４／１２６３８，ＷＯ９５／２０９７６、ＷＯ９５／２１１９７，ＷＯ９５／２０９７７，およびＷＯ９５／２１２５４に見出すことが可能であり、それらはそのまま参照として本明細書に援用する。
【０２５２】
当技術分野で既知の別の詳細は、Ｍａｎｉａｔｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、（１９８２）；およびＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、２版，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，（１９８９）に見出すことができる。
【０２５３】
実施例４
ｃＤＮＡライブラリーの作製
ＨＳ−５細胞はＲＰＭＩ培地に維持された。フラスコにつき約１ｘ１０７ＨＳ−５細胞を持つ１７５ｃｍ２フラスコを得た。細胞は、トリプシン処理し、１ｘＰＢＳで１回洗浄し、ＴＲＩｚｏｌ試薬（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）  １２ｍｌで再懸濁した。発現された配列タグはＨＳ５細胞からＲＮＡを調製することにより得た。１７ＲＮＡは、いくつか修正した、製造業者（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）により提供された標準プロトコルを使用して調製した：
１．細胞は室温で３０分間、ＴＲＩｚｏｌで溶解した
２．ＲＮＡを沈殿させ、そして９日間、−２０℃で保存した
３．残存する汚染物質を除去するために、ＲＮＡの２回目のＴＲＩｚｏｌ処理を使用した。
プロトコルはＲＮＡを全部で１．５ｍｇ回収した。
【０２５４】
ポリＡ＋ｍＲＮＡ選択法による精製のために全ＲＮＡは２つの同一のアリコートに分割した。ポリＡ＋ｍＲＮＡをオリゴｄＴセルロースカラム上の反復通過により２回選択したこと以外は、製造業者に特定された標準キットプロトコルを使用し、Ｍｉｎｉ−ｏｌｉｇｏ  ｄＴセルローススピンカラム（５ｐｒｉｍｅ→３ｐｒｉｍｅ  Ｉｎｃ．）をポリＡ＋ｍＲＮＡを単離するために使用した。
【０２５５】
ライブラリーはＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（登録商標）Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｓｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用してｍＲＮＡから構築した。ｃＤＮＡは３．５μｇ  ポリＡ＋から合成した。ライブラリーは以下の変更を伴って、本質的に製造業者のプロトコルに従って作製した；
１．６０分間４２℃での第１鎖合成。次に１μｌ  ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩを添加し、そして反応物を５０℃で２０分間インキュベートした。
【０２５６】
２．Ｔ４  ＤＮＡリガーゼおよびＮｏｔＩ反応はＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ試薬を使用して行った。
３．ｃＤＮＡは１ｘＴＡＥ（Ｍａｎｔｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，）中、４℃で０．％  低溶解性ＳｅａＰｌａｑｕｅ  ＧＴＧアガロース（ＦＭＣ）ゲルにより、サイズ分画した。
【０２５７】
４．第２鎖合成、ＳａＩＩアダプタ連結、ＮｏｔＩ消化、およびサイズ分画完了後、ｃＤＮＡはＧｅｎｅＣｌｅａｎ  ＩＩ（ＢＩＯ１０１）を使用して、水（６５℃）１０μｌで２回溶出して精製した。
得られたｃＤＮＡはサイズ分画し、２種の別個のプール、０．５〜２．３ｋｂｐおよび２．３〜７ｋｂｐの範囲を集めた。クローニングされたｃＤＮＡ収集物は集合的にライブラリーＨＳ５と呼ばれた。ライブラリーは大腸菌を形質転換させ、個々のコロニーを配列決定のために任意に選択した。ＨＳ５Ｒ、ＨＳ５ＲＯＤＩ、ＨＳ５ＲＯＤＩ３、およびＨＳ５ＯＤＩＩ３と呼ばれるライブラリーは同様にして作製された。
【０２５８】
サブトラクティブライブラリー
２回選択されたポリＡ＋ｍＲＮＡは、Ａｍｂｉｏｎ（Ａｕｓｔｉｎ、ＴＸ）のＰＯｌｙ（Ａ）Ｐｕｒｅ  ｋｉｔｓ（Ｃａｔ＃１９１５）のための標準プロトコルを使用してネガティブＨＳ細胞系統から単離した。ＨＳ５ｍＲＮＡは“テスター”として、およびＨＳ２７ｍＲＮＡ、ネガティブ姉妹細胞系統は“ドライバー”として機能した。ｃＤＮＡサブトラクション後、ＰＣＲで増幅したライブラリーのｃＤＮＡをＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）のベクターｐＣＲ２．１に連結した。得られたライブラリーはＨＳ５２７Ａと呼ばれ、標準法により性状決定した。ＬＩＢ３２およびＬＩＢ３３と呼ばれるライブラリーは、ネガティブ細胞系統としてそれぞれ細胞系統ＨＳ２７およびＨＳ２３を使用して同様の方法で作製した。ライブラリーＨＳ５ＰＯＯＬは、ネガティブ細胞系統として細胞系統ＨＳ２１、ＨＳ２２およびＨＳ２７を一緒に使用して同様の方法で作製した。ライブラリーＨＳ５５２１２２は、ネガティブ細胞系統として細胞系統ＨＳ２１およびＨＳ２２を一緒に使用して同様の方法で作製した。
【０２５９】
実施例５
ＨＳ−５ＥＳＴ候補の同定
ＨＳ５選択
第１の方法において、すべての既知の成長因子配列を、キーワード検索および／または手入力による検索を使用して、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔデータベースのような適切なデータベースから抽出する。ＨＳ−５  ＥＳＴは、各データベース質問を６−リーディングフレームに翻訳することにより、ＤＮＡデータベースに対して蛋白質のクエリー（ｑｕｅｒｙ）を検索するＴＢＬＡＳＴＮにより、既知の成長因子の収集物に対して検索する。あるいは、ＨＳ−５  ＥＳＴｓは、ＤＮＡクエリーをペプチド候補に翻訳するＢＬＡＳＴＸにより、既知の成長因子の収集物に対して検索する。５種のＢＬＡＳＴ実施法があり、３種（ＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＸ、およびＴＢＬＡＳＴＸ）はヌクレオチド配列クエリーに対して設計され、２種（ＢＬＡＴＰおよびＴＢＬＡＳＴＮ）は蛋白質配列クエリーに対して設計される（Ｃｏｕｌｓｏｎ，Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １２：７６−８０（１９９４）；Ｂｉｒｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  １：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  ５４３−５５９（１９９７））。ＢＬＡＳＴＮはヌクレオチド配列（クエリー配列）およびその逆相補配列をとり、それらをヌクレオチド配列データベースに対して検索する。ＢＬＡＳＴＮはヌクレオチド配列をとり、それを３つの正リーディングフレームおよび３つの逆相補的リーディングフレームに翻訳し、そして蛋白質配列データベースに対して６つの翻訳を比較する。ＢＬＡＳＴＸは予備（単回通過）配列データの高感度分析に有用であり、配列エラーに抵抗性がある（Ｇｉｓｈ  ａｎｄ  Ｓｔａｔｅｓ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ３：２６６−２７２（１９９３）、これをそのまま参照として本明細書に援用する）。ＢＬＡＳＴＮおよびＢＬＡＳＴＸはＥＳＴデータを分析するために同時に使用してもよい（Ｃｏｕｌｓｏｎ，Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １２：７６−８０（１９９４）；Ｂｉｒｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  １：５４３−５５９（１９９７））。
【０２６０】
次にペプチド候補を適切な蛋白質配列データベースに対して検索する。この方法において、ＢＬＡＳＴＸ値＝０．００１（確率）またはＢＬＡＳＴスコア＝９０により見出された適合はヒットとして分類される。
【０２６１】
第２の方法において、ＢＬＡＳＴＮ検索はＧｅｎＢａｎｋ非レダンダント（ｎｏｎｒｅｄｕｎｄａｎｔ）核酸データベースに対して行われ、そしてＢＬＡＳＴＸ検索はＧｅｎＢａｎｋ非レダンダント蛋白質配列データベースに対して行われる。ＴＢＬＡＳＴＮおよびＢＬＡＳＴＸ検索は蛋白質翻訳候補としてＨＳ−５データベースを検索するため、ｍＲＮＡの非翻訳領域（たとえば５′ＵＴＲおよび３′ＵＴＲ）由来のＥＳＴｓはナンセンスペプチド翻訳のために見落とすか、または誤って分類される可能性がある。ＢＬＡＳＴＮ検索はナンセンスペプチド翻訳によるＥＳＴｓの誤った分類を減少させるために設計される。ＴＢＬＡＳＴＮ検索は成長因子と非成長因子蛋白質間に共有される共通の特徴のために誤った分類をする結果になる可能性がある。ＢＬＡＳＴＸ検索は共通（および／または異質の）特徴のために、非成長因子配列が成長因子配列として誤って分類されることを減らすために設計される。成長因子として既知であるか、または成長因子結合、シグナル伝達もしくは増殖に関連する核酸もしくは蛋白質配列に対する値＝０．０００１（確率）のＢＬＡＳＴＸもしくはＢＬＡＳＴＮに見出された適合はヒットとして分類される。
【０２６２】
第３の方法において、隠れマルコフモデル（ｈｉｄｄｅｎ  Ｍａｒｋｏｖ  ｍｏｄｅｌ）（またはＨＭＭＥＲ）がＨＳ−５候補および既知の成長因子ファミリー間のより離れた配列類似性を検出するために使用される（Ｂａｒｒｅｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．１３：１９１−１９９（１９９７）；ＭｃＣｌｕｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｓｍｂ．４：１５５−１６４（１９９６）を参照されたい）。この方法において、既知の成長因子ファミリーの隠れマルコフモデルはＨＳ−５  ＥＳＴ翻訳物における成長因子様配列を検索するために使用される。スコア＝５のヒットは成長因子配列類似性に関して陽性であると考えられる。ＨＭＭＥＲプログラム（特定の遺伝子ファミリーを検出するために構築された隠れマルコフモデルに基づく）が使用される場合、ＨＭＭＥＲスコア＝１０がヒットとして分類される。
【０２６３】
ＨＳ−５成長因子活性候補がＨＳ−５ならし培地に存在するため、ＨＳ−５成長因子候補は細胞の分泌経路において合成されると予想される。分泌蛋白質配列（本質的にすべての成長因子および成長因子受容体を含む）はシグナルペプチドと呼ばれるＮ−末端におけるリーダー配列を共有する。したがって、ＨＳ−５成長因子候補をコードする陽性ＨＳ−５  ＥＳＴｓを同定するための別の方法はシグナルペプチドをコードするＨＳ−５  ＥＳＴｓを同定することである。２つの方法はシグナルペプチドをコードするＨＳ−５  ＥＳＴｓの同定に使用される。
【０２６４】
新規分泌ＨＳ５（間接的）
間接的方法においてデータベース検索法を使用して同定されたＨＳ−５成長因子ＥＳＴｓ候補は、ＥＳＴｓがシグナルペプチドをコードするか否かを確定するための、神経ネットワークを基礎にしたアルゴリズム、ＳｉｇｎａｌＰを使用して分析する。デフォルトパラメータが使用される。ｍａｘ．Ｙ、ｍａｘ．Ｓ、および平均Ｓのスコアがすべてカットオフ（ＳｉｇｎａｌＰにより設定）より大きい場合、陽性と予測される。
【０２６５】
新規分泌ＨＳ５（直接的）
直接的方法において、配列データベース検索中にいずれかのヒットを認められなかった配列は２−ステップ法を使用して分析される。はじめに、ＧｅｎｅＭａｒｋ  ｐｒｏｇｒａｍがＥＳＴ配列のコード領域を予測するために使用される。ＧｅｎｅＭａｒｋｐｒｏｇｒａｍは核酸配列の特徴同定するコンピュータアルゴリズムである（Ｉｓｏｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，ＤＮＡ  Ｒｅｓ．１：２６３−２６９（１９９４）；ＭｃＩｎｉｎｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｓｍｂ．４：１６５−１７５（１９９６）；Ｌｕｋａｓｈｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２６：１１０７−１１１５（１９９８）を参照されたい）。とりわけ、ＧｅｎｅＭａｒｋアルゴリズムは遺伝子の正確な境界を予測するために使用することができる。コード領域はＰ＞０．５のカットオフを持つものとして示される。第２に、ＧｅｎｅＭａｒｋアルゴリズムにより同定されたコード領域はＳｉｇｎａｌＰプログラムにより特徴付けられる。ｍａｘ．Ｙ、ｍａｘ．Ｓ、および平均Ｓのスコアがすべてカットオフ（ＳｉｇｎａｌＰにより設定）より大きい場合、陽性の予測がされる。
【０２６６】
実施例６
ＨＳ５細胞系統から分泌される蛋白質をコードする核酸配列は、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔデータベース中で分泌された蛋白質配列を比較することにより同定する。ＳｗｉｓｓＰｒｏｔデータベースおよびＨＳ−５  ＥＳＴｓ間の配列比較はＢＬＡＳＴＸにより行い、それはＥＳＴ質問を６リーダーフレームに翻訳し、ブティックライブラリーの蛋白質配列に対して得られた６ペプチド配列を比較する。０．００１（確率）に等しいか、もしくはより少ないＢＬＡＳＴＸ値、または９０に等しいか、もしくは大きいＢＬＡＳＴスコアにより見出された適合は、それらの注釈（ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ）により分類される。ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ注釈は分泌蛋白質であることが既知のポリペプチドを示すために“分泌”と標識された特定の欄を含む。ＳｗｉｓｓＰｒｏｔで適合したものの注釈は、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔで適合したものが分泌蛋白質であるか否かを明らかにするために分析する。ＨＳ５  ＥＳＴが分泌蛋白質であるＳｗｉｓｓＰｒｏｔエントリーに適合した場合、ＥＳＴをヒットとして分類する。
【０２６７】
実施例７
ＨＳ−５  ＥＳＴｓのノーザンブロット法
ノーザンブロット法はＨＳ−５ｃＤＮＡライブラリー由来の関心のある１２ＥＳＴｓに関して行われた。表Ｂは以下に記載のノーザンブロット法により確定したクローンＩＤ、ＥＳＴ配列ＩＤおよび全長転写物サイズを表す。２回選択されたポリ‐Ａ＋ｍＲＮＡは、５ｐｒｉｍｅ→３ｐｒｉｍｅ  Ｉｎｃ．のＭｉｎｉ−Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）Ｃｅｌｌｕｒｏｓｅ  Ｓｐｉｎ  Ｃｏｌｕｍｎ  Ｋｉｔ  のための標準プロトコルを使用して、ＨＳ−５細胞から調製した。変性バッファー中の約１マイクログラムは、１ｘＭＯＰＳバッファー（ＦＭＣＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ．）中の非変性１．２５％アガロースゲルのレーンで電気泳動させた。ゲルは、サイズ予想値を提供するためにウェルにつき５マイクログラムのＲＮＡ  Ｌａｄｄｅｒ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ／Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を包含した。すべての試料は負荷前に熱変性させた。ＲＮＡゲルは１ｘ  ＭＯＰＳバッファー中、約３．５ボルト／ｃｍゲル長をかけられた。ゲルは脱イオンＲＮアーゼフリー水で５分間洗浄した。標準物を含むゲルの部分は、エチジウムブロミド染色およびその後のサイズ分画のために除去した。ＨＳ−５  ｍＲＮＡを含むＧｅｌ＃１のレーンも、ｍＲＮＡを視覚化するためのエチジウムブロミド染色のために除去した。ゲルの残りの部分は、ナイロン膜へのキャピラリー移動のために調製された。ゲルははじめに０．０５Ｍ  水酸化ナトリウムに２０分間浸せきした。それらは次にそれぞれ２０ｘＳＳＣバッファーで１５分間、３回浸せきした。正に荷電したナイロンははじめに脱イオンＲＮアーゼフリー水、次に２０ｘＳＳＣバッファーで１０分間濡らした。キャピラリー移動物は、２０ｘＳＳＣバッファーを使用して、標準法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ；Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ  ａｌ．，）で集めた。移動は室温で約１６時間行われた。キャピラリー移動の完了時に、ｍＲＮＡはナイロン膜に不可逆的にＵＶ架橋された。ナイロンは部分に切断し、部分毎に１レーンのＨＳ−５  ＲＮＡを提供した。ナイロン部分は、関心のある遺伝子に特異的な非放射活性ジゴキシゲニン標識ＰＣＲ産物と別々にハイブリダイズされた。プローブは、鋳型として関心のあるそれぞれの遺伝子の精製されたプラスミドＤＮＡ、遺伝子特異的オリゴヌクレオチド、およびＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  ＭａｎｎｈｅｉｍのＰＣＲ  ＤＩＧ  Ｐｒｏｂｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔを使用して標準プロトコルにより作製された。膜部分は、ＤＩＧ  Ｅａｓｙ  Ｈｙｂ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）中、摂氏５０度で１時間、別々にインキュベートした。プローブは熱変性させ、総容積１０ミリリットルＤＩＧ  Ｅａｓｙ  Ｈｙｂｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ、１ミリリットルにつき２マイクログラムで利用した。プローブ溶液はプレハイブリダイゼーションバッファーの除去後添加された。プローブおよびナイロンのインキュベーションは、撹拌しながら摂氏５０度で最低１６時間行なった。部分は洗浄し、ＤＩＧ  Ｗａｓｈ  Ｋｉｔ  ｐｒｏｔｏｃｏｌ、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍに従って展開させた。一度オートラジオグラフィーが得られると、エチジウムブロ��ド染色ＲＮＡ標準物とフィルム上の可視のバンド間で補正が行われた。このデータは添付した表およびオートラジオグラフの写真で示される。図１は１２ＥＳＴクローンのノーザンブロット解析を表し、図の星印はハイブリダイゼーションシグナルを表す。クローンの名称は各レーンの下に示される。サイズマーカーの位置は数および破線により示す。転写物のサイズは、ＲＮＡマーカーを使用して作製した標準曲線の外捜により決定した。
【０２６８】
実施例８
ＥＳＴクローンＨＳ５Ｒ−１７８−Ａ９（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）の全長ｃＤＮＡを同定するために、遺伝子特異的プライマーペアがＥＳＴクローンＨＳ５Ｒ−１７８−Ａ９の配列を基に設計された。１７８−Ａ９センスプライマー配列は、ＡＧＧＴＡＣＡＡＧＧＡＴＣＣＣＴＧＣＧＣＴＡ  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５，であり、１７８Ａ９アンチセンスプライマー配列は、ＣＡＣＡＴＣＡＴＡＡＣＡＴＴＧＣＡＧＧＣ  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６であった。プローブはプライマー１７８Ａ９センスおよび１７８Ａ９アンチセンスならびにＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ  ＰＣＲ  ＤＩＧ  Ｐｒｏｂｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｋｉｔの試薬を使用して、配列の部分を増幅することにより作製し、ＤＩＧ標識ｄＵＴＰをＰＣＲ産物に取り込ませた。ＨＳ−５ｃＤＮＡクローンはＴＢ−ａｍｐ１００に懸濁し、懸濁液１ｍＬを１２ｘ９６ディープウェルブロック（Ｑｉａｇｅｎ  ｃａｔ＃２６１７３）の各ウェルに分配し、ウェル毎に〜１０００の初代クローンが存在した。培養物は振とうしながら３日間、室温でインキュベートし、各培養物の画分はグリセロールと混合して凍結し、プラスミドＤＮＡは各培養物の残りから単離した。プラスミドＤＮＡ試料は、９６ウェルフォーマットの正荷電したナイロン膜（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）上にロボットにより複製された。約１００ｍＬ  ＤＩＧ  Ｅａｓｙ  Ｈｙｂ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）中の約１５００ｎｇ  ＤＩＧ標識プローブは、４２℃で一晩膜とハイブリダイズさせた。洗浄および検出がＤＩＧ  Ｓｙｓｔｅｍプロトコルに従って行われ、プローブと相同性を持つクローンを含むウェルを同定した。各陽性ウェルに対応するフリーザー培養の画分は振とうしながら３７℃で一晩、ＴＢ−ａｍｐ１００中で継代培養し、プラスミドＤＮＡは一晩の培養物から調製した。プラスミドＤＮＡ  １μｇは制限酵素ＳａＩＩおよびＮｏｔＩで消化して挿入物を遊離させ、消化は１％  アガロースゲル上で行い、正荷電したナイロン膜（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）に移した。ハイブリダイゼーションおよび検出は、初期のアッセイに使用したものと同じプローブ溶液およびプロトコルで行い、各陽性プール中の陽性クローンの挿入物のサイズを同定した。１以上のより大きいクローンは、各ウェルから保存された凍結培養物を滴定し、力価のコロニーリフトに対してハイブリダイズし、ハイブリダイゼーションシグナルにより整列したコロニーを継代培養することにより単離した。クローンは５′および３′末端からのプライマー歩行により配列決定した。得られた全長クローンはｐＭＯＮ３７９０４と呼ばれ、推定したＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７のＳｌｉｔ様蛋白質をコードするＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２のＤＮＡ配列を包含した。ＳｉｇｎａｌＰ分析（Ｎｉｅｌｓｏｎ、Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  １０（１）、１９９７）は、配列のもっとも大きいオープンリーディングフレームにおいて推定シグナルペプチドを予測し、クローンが全長であることを示唆した。
【０２６９】
本明細書に引用されたすべての参考文献および特許または特許出願はそのまま参照として援用される。
各種の他の態様は、本発明の意図および範囲から逸脱することなく、本開示を読めば当業者には明らかであろう。すべてのそのような他の実施例は付加した請求項の範囲内に包含されることを意図する。
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は潜在的な成長因子として同定された各種候補クローンの転写物サイズを特定するためのＨＳ−５ポリＡ＋ＲＮＡのノーザンブロット分析を示す。ポリＡ＋ＲＮＡはホルムアルデヒドゲル上で電気泳動させ、そして関心のあるＥＳＴのジゴキシゲニン標識ＰＣＲフラグメントにより検出した。ＲＮＡマーカーは数字で示す。
【図２】
図２はＤＮＡ配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７の推定Ｓｌｉｔ様蛋白質を示す。
【図３】
図３は潜在的分泌シグナル、ロイシンリッチ反復（ＬＲＲ）、ＥＧＦモチーフ、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７のＳｌｉｔ様蛋白質の潜在的膜貫通ドメインを示す。ＬＲＲはアミノ‐およびカルボキシ‐末端隣接領域に接した８ロイシンリッチ反復として配置される。ロイシンリッチ反復モチーフはＬＲＲコンセンサスモチーフ、ＦｘｘＬｘｘＬｘｘＬｘｘＬｘｘＮｘＩｘｘＬ，およびＳｌｉｔのアミノ‐およびカルボキシ‐末端隣接領域に基づく（Ｒｏｔｈｂｅｒｇ，Ｊ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ＆Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ４：２１６９−２１８７，１９９０）。
【図４】
図４はＲｏｔｈｂｅｒｇ（同書中）由来のＳｌｉｔコンセンサスモチーフに比較したＬＲＲｓのアラインメントを示す。
【図５】
図５はＨＭＭＥＲ２．１．１（１９９８年１２月）ソフトウェア（版権１９９２−１９９８  Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｓｃｈｏｏｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）を使用した、ロイシンリッチ反復、アミノ‐およびカルボキシ‐末端隣接領域およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７のＥＧＦモチーフコンセンサスを示す。ＨＭＭＥＲソフトウェアはＧＮＵ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｐｕｂｌｉｃ  Ｌｉｃｅｎｓｅ（ＧＰＬ）下、無料で配布される。ＨＭＭＥＲソフトウェアはコンセンサスＬＲＲモチーフ、ｎＬｅｅＬｄＬｓｎＮ．ＬｔｓｌｐｐｇｌｆｓｎＬｐ、および予言されたアミノ‐およびカルボキシ‐末端隣接領域に基づいて１０ロイシンリッチ反復モチーフを予言する。
【図６】
図６はＨＭＭＥＲソフトウェアから予言されたＳｌｉｔコンセンサスモチーフに比較したＬＲＲｓのアラインメントを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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