(57)【要約】発酵食品の生産の改良方法、特に原料として全粒穀物を用いたテンペ型の発酵穀物生産物の製造の改良方法により、良好な微生物上、栄養上、および感覚上の特性の生産物を得ることが可能となる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
表面の変質が最小化された全粒穀物原料からの発酵食
品の製造方法であって、以下の工程、
−水溶液に全粒穀物原料を浸漬する工程、
−水性媒体中で全粒穀物原料を加熱処理する工程、
−全粒穀物原料を酸性化させる工程、
−クモノスカビ属の菌を接種する工程、および、
−接種された全粒穀物原料をインキュベーションする工程、
を含む方法。
【請求項２】
酸性化が穀物原料の浸漬に用いる水溶液への有機酸の添加からなることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
酸性化が、酢酸産生細菌、乳酸産生細菌およびプロピオン酸産生細菌からなる群から選択される酸産生細菌の添加からなることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
穀物原料の浸漬に用いられる水溶液の初期ｐＨが約ｐＨ２．５であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項５】
浸漬時間が約４時間から約８時間の間であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項６】
加熱処理時間が約５分から約１０分の間であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項７】
穀物原料が実質的に全粒の形態の大麦 (Hordeum vulgare)から構成されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項８】
クモノスカビ属の菌がリゾプス・オリゴスポルス（Rhizopus oligosporus）であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項９】
クモノスカビ属の菌がリゾプス・オリゴスポルス（Rhizopus oligosporus）分離株であるJ189 (NRRL 2710)、 J373 (CBS 337.62)、および J401 (ATTC 64063)から選択されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
クモノスカビ属の菌がリゾプス・オリゴスポルス（Rhizopus oligosporus）分離株J401 (ATTC 64063)であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
インキュベーションを３０℃から３７℃の間の温度で行うことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
接種された全粒穀物原料が発酵前に冷凍保存および解凍されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
発酵生産物がインキュベーションの完了後に水溶液中で煮沸または湯通しされることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
発酵生産物がインキュベーションの完了後に冷凍保存されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
インキュベートした生産物の煮沸または湯通しに用いられる水溶液に着色剤および香味料を添加することを特徴とする請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
全粒穀物およびクモノスカビ属の菌を含む発酵食品。
【請求項１７】
全粒穀物が主に大麦 (Hordeum vulgare)によって構成されることを特徴とする請求項１６に記載の発酵食品。
【請求項１８】
クモノスカビ属の菌が、リゾプス・オリゴスポルス分離株であるJ189 (NRRL 2710)、 J373 (CBS 337.62)、および J401 (ATTC 64063)から選択されることを特徴とする請求項１６に記載の発酵食品。
【請求項１９】
クモノスカビ属の菌が、リゾプス・オリゴスポルス分離株J401 (ATTC 64063)であることを特徴とする請求項１８に記載の発酵食品。
【請求項２０】
穀物中のフィチン酸含量が非処理穀物のフィチン酸含量と比較して少なくとも７０％減少していることを特徴とする、全粒穀物およびクモノスカビ属の菌を含む発酵食品。
【請求項２１】
請求項１から１５のいずれか１項に記載の方法によって生産された発酵食品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は人の食用の発酵食品、特にクモノスカビ（Rhizopus）属のカビを用いた全粒穀物からの発酵穀物食品の製造の改良方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
世界の人口は増えつつあり、食料供給はますます重要になっている。さらに食料の生産は、特に動物性タンパク質の生産からの廃棄物など、環境にかなりの悪影響を及ぼしている。食料を動物源から生産する場合、穀物からの場合と比較してエネルギーの損失も高い。増加しつつある人口を養うために世界の各国は食料として潜在的に好適なすべての原料の現在の利用を見直し、現存する動物用飼料のより多くを人間用食品へと変換しなければならない。
【０００３】
菜食の市場は加速的に成長しており、植物食料を動物源からの食料の代わりとしてあるいは補助的に用いることへの関心が広がりつつある。これはとりわけ最近取り入れられた菌タンパク質（mycoprotein）産物に見られる商業的成功によって例証される。本発明の目的の1つは発酵穀物生産物の製造の改良方法を提供することである。
【０００４】
インドネシアにおいて、肉の代替として、菌類による発酵によって生産されるダイズ生産物であるテンペ（tempeh (tempe)）がよく用いられている。テンペはインゲンマメ、エンドウマメ、小麦などの他の原料から製造することもできる。インドネシアではテンペは家庭で小規模生産されていることが多いが、オランダ、日本および米国ではダイズテンペの大規模生産が行われている。しかしテンペの生産では微生物の混入や品質の変動が起こりやすい。したがって本発明のもう１つの目的はテンペ型の発酵食品の製造の改良方法を提供することである。
【０００５】
穀物(小麦、大麦、ライ麦、オート麦)は非常に良好な栄養上の特性を有する。穀物は動物飼料としてよく用いられる。小麦およびオート麦は例えば朝食用シリアルを製造するためにも用いられ、小麦粉はパン菓子およびパンに用いられる。大麦は主にビールの製造に用いられる。ライ麦は主にパンの製造に用いられる。本発明の目的の１つは穀物の高価値の特性により消費者に利益を与えるため、人間の食料における穀物の使用を増加させるために新規な穀物からの生産物を提供することである。別の目的は、ミネラルの有効性の改良、ビタミン状態の改良などの良好な栄養上の価値を示し、低い糖血症指標を維持した穀物からの生産物を生産することである。
【０００６】
大麦 (Hordeum vulgare)は非常に良好な栄養特性を有するが、現在は主に動物飼料として用いられている。人の食用の大麦からの生産物を構成するものの中ではビールが最大である。しかしビールにおいては大麦の高価値の特性のすべてが消費者に恩恵を与えているわけではない。したがって本発明の目的の１つは、人間用の食料における大麦の利用を増加させるために、大麦からの新規な生産物を提供することである。別の目的は、人の食用の大麦からの生産物を生産することであり、ここで該生産物はミネラル有効性の改良などの良好な栄養上の価値および糖血症指標の改善を示すものである。
【従来技術】
【０００７】
３０年以上前、Hesseltine ら (New fermented cereal products, Dev. Ind. Microbiol., 1967, 8, 179-186)は、インドネシアのテンペ発酵から得られたリゾプス（クモノスカビ属）・オリゴスポルス（Rhizopus oligosporu）の選抜株を用いて、小麦、オート麦、ライ麦、大麦、米、および、米または小麦とダイズとの組合せから、 発酵テンペ型生産物を作ることができることを示した。皮をむいた種子の挽き割がカビの良好な成長に必須であることが見出された。皮をむいて挽き割にした種子の形態で大麦についても試したところ、発酵の前に１２分間の煮沸期間が必要であることが見出された。Hesseltine らの実験はクモノスカビ属（Rhizopus）の特定の株だけが利用できることを示すものであった。高活性のタンパク分解および脂質分解酵素系を有するがアミラーゼ活性をほとんどまたは全く有さない株が、皮をむいて挽き割にした穀物からの穀物テンペの生産に最適であることが判明した。
【０００８】
ＪＰ５８１５８１４８Ａ（１９８２年３月１５日のＪＰ１９８２００３９４１３号）には、豆類、穀類およびナッツ類を挽く、発酵食品の生産方法が開示されている。水を添加した結果生じるどろどろしたものを予備発酵させ、その後それを加熱して酸の添加によりｐＨを４．０〜７．０に調整する。次いで水分含量が３０〜６５％に達するまで水分を除去し、リゾプス・オリゴスポルス（Rhizopus oligosporus）種に属する微生物を添加し、どろどろしたものを２８〜３４℃で発酵させる。この生産物は西洋風の料理に有用であり、冷凍状態で保存できると主張されている。
【０００９】
より最近ではNowak (Acta Biotechnol., 12 (1992) 4, 345-348)などにより、穀物テンペの生産に関する問題がいくつか挙げられており、よいテンペを生産するために穀物と豆類とを混合することが推奨されている。
【００１０】
Hachmeister および Fung (Critical Reviews in Microbiology, 19(3):137-188 (1993))の幅広い概説記事によると、テンペの生産のための様々な穀物の使用が評価されている。大麦、小麦および米から作られたテンペは非常に良好な風味、食感および香りを有することが示されている。HachmeisterおよびFungは 、望ましくない微生物の成長を阻害するために酸により前処理する可能性について議論している。しかしこれはダイズにのみ適用されたようであり、Hachmeister および Fungは原料として小麦を用いる場合は酸処理は必要でないと述べており、穀物原料の酸処理は不必要であることを示している。しかし本発明者らの知るところによると、穀物からの生産物は市場性に達していないようであり、これは関連する実際的な問題が克服されていないことを示している。
【００１１】
上記概説において著者である Hachmeister および Fung は挽く工程を用いない全粒小麦を使用する従来の試みによっては、カビの成長が不良であると述べている。また、モロコシ、小麦およびライコムギを含む全粒から作られるテンペのパテは堅さに欠け、スライスに向かないことも判明している。
【００１２】
人の食用の新規な発酵穀物生産物を開発するにあたっては、健康上および安全上の局面を重視すべきである。他に考慮すべき問題としては、栄養素の有効性などの生産物の栄養上の価値、糖血症指標、微生物含量、風味、食感、および生産物の全体の外観などが挙げられる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明の具体的目的は、従来は不可能であると考えられていた特性である、穀物の構造上の堅さを保つことを可能にすることである。もしこれが達成されると、特に栄養上の観点から非常に有益である。工程の安定性および制御可能性、その経済的採算性およびその他の実際的または経済的問題も考慮することが必要である。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
（発明の概要）
本発明は、クモノスカビ（リゾプス；Rhizopus）属のカビを用いた全粒穀物からの発酵穀物生産物、特にこのタイプの新規な大麦からの生産物の製造の新規な改良方法を提供する。引用によりこの明細書に含まれる特許請求の範囲において特定された改良方法を行うことにより、本発明者らは、クモノスカビ（Rhizopus）の胞子形成を回避するかあるいは最小化しつつ、快い風味および食感、良好な外観、そして微生物上の安全性および安定性を備えた、全粒からの発酵穀物生産物、特に大麦からの発酵生産物を生産した。さらに最終産物は均質であり、本発明の工程は良好な再現性および信頼性を示した。
【００１５】
（説明）
大麦 (Hordeum vulgare L.)はスウェーデンの主要作物の１つである。成長期はきわめて短く、乾燥、冠水および霜に対する耐性は良好である。大麦は約８０００年間栽培されており、すべての古くからの文化圏で知られている。
【００１６】
大麦穀粒は外皮を備えたままで収穫される。外皮は籾殻と外花頴から構成され、果皮（皮）に強固に結合している。穀果は、果皮、種皮、胚および内胚乳から構成される。大麦の糊粉層は多層であり、内胚乳細胞にはタンパク質マトリックスに組み込まれたデンプンが満たされている。
【００１７】
大麦を人の食用に精製する際、殻は脱外皮工程により除かれる。次いで穀粒は精麦として知られる工程において研磨され、胚と糊粉層が除かれる。精麦の程度を変えることにより灰含量が変化する。脱外皮された大麦はまた、穀粒を切断して便宜の大きさにすることにより大麦小粒へと処理され得る。
【００１８】
ここで「全粒」とは、少なくとも部分的に胚および糊粉層が除かれている(適用できる場合)が、種子の基本的な外形および構造的堅さが維持された粒状物を意味する。「全粒」とはまた、胚および糊粉層が除去されている(適用できる場合)ことを除いては、実質的に植物学的に無処置の粒状物としても定義される。
【００１９】
「裸麦」として知られる品種では、外皮が事実上存在せず、脱外皮工程および研磨工程を避けることができる。したがって、ミネラル、ビタミンおよび重要な食物繊維成分が失われる可能性を避けることができる。しかし種子が微生物を含む危険性が増加する。微生物の量は通常脱外皮工程および研磨工程において減少する。これらの品種はそのまま用いる場合または軽く前処理した後に用いる場合も「全粒穀物」の定義に含まれる。
【００２０】
大麦の組成は環境および遺伝子型によって変動する。大麦穀粒の主要な化学的構成物質はデンプンであり、その量はタンパク質のパーセンテージに反比例する。デンプン含量は５３〜６７％の間である。大麦デンプンのアミロペクチン含量は約７４〜７８％であり、残りの約２２〜２６％がアミロースである。タンパク質含量は一般に９〜１４％である。
【００２１】
精白大麦の食物繊維含量はおよそ１６％であり、その主な構成成分は、セルロース、キシラン構造、リグニンおよびβ−グルカンである。食物繊維は人間用食物において非常に重要である。というのは一般的見解として繊維の摂取は、血中コレステロールレベルの低下など、生理的に良好な効果を有するからである。大麦はかなり多くの量のβ−グルカンを含んでおり、内胚乳細胞壁の構成物のおよそ７５％の割合を占める。細胞壁においてβ−グルカンはタンパク質に結合し、タンパク分解酵素およびデンプン分解酵素の作用に対する障壁を形成する。
【００２２】
テンペの伝統的な原料であるダイズと大麦の間の相違がかなりのものであることは当業者には明白であろう。ダイズの主な構成成分はタンパク質であるのに対し、大麦の主な構成成分はデンプンである。それゆえこれらの物質上で同様に菌類が成長することは予測されない。したがって本発明者らは穀物テンペの産生に用いた場合、リゾプス・オリゴスポルス（R.oligosporu）の様々な分離株の間に機能において大きな相違があることを見出した。
【００２３】
本発明者らは全粒からの発酵穀物生産物、特にテンペ型の大麦からの発酵生産物の製造の改良方法を提供する。
【００２４】
該方法および生産物についての具体的な目的を表1に挙げる。
【００２５】
【表１】
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【００２６】
驚くべきことに全粒からの発酵穀物生産物の製造、特に全粒大麦テンペの製造においてインキュベーション時間が第一の最も重要なパラメーターであることが示された。さらに分離株の選択、浸漬時間、煮沸時間および浸漬工程におけるｐＨ、そしてインキュベーション温度が重要な因子であった。驚くべきことに、接種工程での胞子の濃度はあまり重要ではなかった。これは本発明による改良方法は接種工程における変動に対して固有の安定性を有することを意味するため興味深い知見である。従来から公表されてきた研究に鑑みると、全粒穀物を用いて許容できる生産物が製造できるだけでなく、高品質で多くのさらなる有利な特性を有する生産物が製造できるということも驚くべきことである。
【００２７】
穀物は種子穀粒に侵入する生物および表面に付着する生物の両方の大きなミクロフローラの宿主である。穀物の最も重要な汚染菌は、例えばコウジカビ属（Aspergillus）、アオカビ属（Penicillium）およびフザリウム属（Fusarium）の種などの菌類である。細菌混入菌の中では枯草菌（Bacillus subtilis）が パンにおける粘着性を引き起こすものとして知られている。本発明者らが行った、枯草菌（Bacillus subtilis）、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）、および大腸菌（Escherichia coli）を用いた微生物攻撃試験において、本発明の方法は微生物混入に対して固有の耐性を示し、最終生産物には試験において用いた微生物は含まれていないか含まれているとしても非常にわずかであることが判明した。
【００２８】
混入の異なる態様を例証するために浸漬前および煮沸後の両方で別々の実験において微生物を添加した。結果は枯草菌（B. subtilis）、黄色ブドウ球菌（S. aureus）、および大腸菌（E. coli）のいずれも発酵生産物において生存も成長もしないことを示すものであった。テンペの細菌含量が非常に高いということが広く知られているため、この結果は驚くべきものであり、かつ非常に満足の行くものであった。
【００２９】
本発明者らは浸漬時間が非常に重要であることも見出した。それは大麦穀粒の堅さに大きく影響するからである。約４から８時間、好ましくは約５から６．５時間、最も好ましくは約６時間の浸漬時間が発酵全粒穀物生産物、特にテンペ型の大麦発酵生産物の製造に好適であることが見出された。浸漬は従来重要なパラメーターであるとは考えられていなかったのでこの結果は驚くべきものであった。
【００３０】
浸漬水の酸性化は望ましくない変質をもたらす細菌の増殖を防ぐことが知られているが、それはクモノスカビ属（Rhizopus）カビは阻害しない。浸漬水の酸性化はダイズテンペの生産について開示されているが文献（前掲）にはそれは穀物テンペの生産には必要ではないと示されている。しかし本発明者らは驚くべきことに浸漬水の初期ｐＨを非常に低く、好ましくは約ｐＨ４未満にすべきであり、浸漬の継続時間中のわずかなｐＨの上昇は許容されることを見出した。もっとも好ましくは初期ｐＨは約２．５であり最終ｐＨは約３．５である。
【００３１】
本発明の１つの態様によると、酸性化は浸漬工程に用いられる水溶液への好適な酸の添加によって達成される。好適な酸は一般に安全であると認められている酸（ＧＲＡＳ：acids generally recognised as safe)であって食品への使用が認められているものである。好適な酸の例としては、酢酸、乳酸およびプロピオン酸が挙げられる。好ましくは乳酸を、好ましくは約０．７〜１体積％の濃度で用いる。
【００３２】
酸性化はまた、工程の途中、浸漬工程の前に酸生産微生物を添加することによっても達成できる。酸生産微生物には、酢酸生産微生物、乳酸生産微生物およびプロピオン酸生産微生物が含まれる。乳酸生産微生物のグループにはラクトバシラス属（Lactobacillus）、ラクトコッカス属（Lactococcus）、ロイコノストック属（Leuconostoc）、ペジオコッカス属（Pedicoccus）、およびストレプトコッカス属（Streptococcus）の微生物が含まれる。これらの微生物はグラム陽性であり、非胞子形成性であり、カタラーゼ陰性であり、発酵性代謝を示し、そして乳酸が糖発酵の間の主要な最終生産物であることを特徴とする。これらはさらに酸耐性で空気耐性の嫌気性菌である。食品生産に用いられ、本発明による使用に即好適な種の例には、ラクトバシラス・アシッドフィラス（Lactobacillus acidophilus）、ラクトバシラス・カゼイ（Lactobacillus casei）、ラクトバシラス・プランタルム（Lactobacillus plantarum）、ラクトバシラス・サンフランシスコ（Lactobacillus san francisco）およびラクトバシラス・ロイテリ（Lactobacillus reuteri）が含まれる。残りのグループのロイコノストック属（Leuconostoc）、ペジオコッカス属（Pedicoccus）、およびストレプトコッカス属（Streptococcus）の種も食品生産に有用であり、本発明による方法における使用に適用できる。
【００３３】
穀物原料の部分的な調理、すなわち煮沸も発酵穀物生産物の製造において重要な役割を果たしていることが知られている。しかし本発明者らは驚くべきことに、短い煮沸時間で十分であり、長すぎる煮沸時間は生産物の品質にとって悪影響を及ぼす結果となることを見出した。煮沸時間は好ましくは約７〜１５分間の間であり、約１０分間の煮沸時間がもっとも好適である。
【００３４】
従来の研究は主に煮沸工程だけに関するものであったが、本発明者らは浸漬と煮沸の特定の組み合わせが最終生産物の品質のためにもっとも好ましいことを見出した。長すぎる煮沸時間では、浸漬と煮沸との特定の組合せと同程度の穀粒の弾力性が得られなかった。感覚上の品質（口当たり）にとって非常に重要なこの効果は以前には報告されていない。例えば、大麦穀粒を６時間浸漬し、次いで３０分間煮沸した場合、穀粒はデンプンのゼラチン化のために非常に粘り気のあるものとなった。
【００３５】
さらに分離株の選択も最終生産物の味と色の両方に影響を及ぼすことが示された。様々な地域に由来する様々なリゾプス・オリゴスポルス（R. oligosporus）（ダイズテンペから）の分離株を評価した。表２を参照されたい。分離株はその菌株番号（JXXX, Dept. of Microbiology, Swedish University of Agricultural Sciences, Uppsala, Sweden)により呼称する。用いたリゾプス・オリゴスポルス（R. oligosporus）分離株の中で、特にＪ１８９、Ｊ４０１、およびＪ３７３が最終生産物の堅さ、香りおよび色の点で良好な特性を示した。
【００３６】
【表２】
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【００３７】
穀物はフィチン酸などの、二価カチオンをキレート化し、二価カチオンが人間の腸管において吸収されるのを妨げる抗−栄養素を含むことが知られているので、本発明の１つの目的はこの問題に取り組むことである。フィチン酸の濃度を下げ、キレート化されるミネラルの量を最小化してミネラルの取りこみを高めることを可能にすることが望まれた。驚くべきことに本発明ではフィチン酸含量を７０％以上下げることが可能となる。
【００３８】
本発明者らはインキュベーションは約３０〜３７℃の範囲の温度で行うのが最も好ましいことを見出した。さらにインキュベーション時間が非常に重要であることを見出した。発酵穀物生産物、特に全粒大麦からのテンペ型の発酵生産物の製造のためには、約１５〜２５時間のインキュベーション時間が好ましい。約１７〜２３時間のインキュベーションが最も好ましいと考えられる。
【００３９】
菌類の成長は非常に良好で菌糸は生産物全体に均一に分布することが見出された。生産物は堅く(coherent)、そして取り扱い、例えばスライスしやすい。本発明の生産物はゆで処理または炒め処理などのさらなる処理の間、その形態を保持しており、様々な料理（例えば炒め物料理）における材料として非常に有用である。この結果は全粒穀物の使用に対して報告する従来技術に鑑みると驚くべきものである。
【００４０】
本発明の方法により生じる生産物は非常に淡い、くせのない、そして快い味および風味を有する。該生産物はまた、淡くくせのない色を有する。テンペ型の伝統的な生産物にはなかったこれらの両方の因子により、所望の味、風味または色を本発明の生産物に付加することが容易となる。天然または合成の香味料および着色料を、用いる香味料および着色料に応じて、発酵前の穀物原料に、または最終生産物に、あるいは原料と最終生産物の両方に添加することができる。好適な着色料および香味料は、天然の着色料および香味料、塩、スパイスおよび乾燥タマネギなどの、水分除去して乾燥させた、または焼いた野菜である。本発明の１つの態様によると生産物を所望の香味料および着色料を含む水中でゆがく。
【００４１】
本発明者らはまた、インキュベーション時の穀物集合体を取り巻く気相の相対湿度が重要な役割を果たすことも見出した。これはインキュベーション前の接種された集合体の均一な詰め方の問題に関連する。大規模生産において、インキュベーション時の相対湿度および気体組成、そして周囲気体の循環を制御することが重要となる。
【００４２】
本発明者らはまた、接種された穀物混合物を、微生物上の品質を低下させることなく発酵前に冷凍保存できることも見出した。高品質の最終生産物を生産することができただけでなく、驚くべき事に冷凍工程は試験した分離株の大半の胞子形成挙動に対して抑制効果を有していた。
【００４３】
発酵生産物の冷凍も試みた。驚くべきことに生産物を凍結および解凍してもその構造またはその他の点の品質を損なうことはなかった。この結果は予測されないものであった。というのは、菌糸は凍結において破壊され、望ましくない品質の劣化が起こると思われたからである。
【００４４】
また、驚くべきことに本発明の方法では用いた穀物の穀粒構造の保持に成功した。その結果生じる最終生産物は非常に魅力的な口当たりを有し、ミートローフに似た噛み応えであった。
【００４５】
本発明の方法の衛生上の安定性は非常に高く、本質的に汚染に対して耐性であることが示された。最終生産物はその長い貯蔵寿命から明らかなように高い安定性を示した。本発明の方法によって生産された生産物は３ヶ月以上＋８℃で保存することができることが示された。総合的に、工程および生産物の両方の望ましい特性（表１を参照されたい）が本発明の方法／生産物によって達成された。
【実施例】
【００４６】
１．工程の条件
１．１  浸漬条件
全部で３００ｇの穀粒（「Ｇｏｕｒｍｅｔｋｏｒｎ」と呼ぶ精麦および加熱処理した大麦、および「Ｋｏｒｎｇｒｙｎ」と呼ぶ大麦小粒、両方ともKungsornen, Jarna, Swedenから入手）を５００ｍｌの水道水に浸漬した。乳酸を様々な濃度となるように浸漬水に添加した（０．０４４、０．４６２および０．８８体積％）。浸漬時間１、３．５および６時間について評価した。フラスコを密封し、２℃で放置した。
【００４７】
結果の評価により浸漬時間は約４〜８時間、好ましくは約５〜６．５時間、そして最も好ましくは約６時間であることが示された。乳酸濃度は約０．７〜１体積％の範囲が好ましいことが判明した。
【００４８】
１．２  煮沸
浸漬水を切り、穀粒を７５０ｍｌの、６ｇの塩（２ｇ／１００ｇの乾燥穀粒）および様々な濃度（０．０２９、０．３０９５および０．５９％）の乳酸を含有する沸騰水に添加した。穀粒を次いで１０、２０または３０分間煮沸した。
【００４９】
結果は用いた条件下では約１０分間の煮沸時間が最適であることを示していた。煮沸時間をより長くするとデンプンのゼラチン化が起こってしまう。
【００５０】
１．３  酸性化
煮沸水に乳酸を添加することによって酸性化の効果および酸性ｐＨでの煮沸の結果を評価した。約０．０１〜０．１体積％の濃度が好ましいことが判明した。
【００５１】
２．リゾプス・オリゴスポルス（R. oligosporus）分離株の評価
最初のスクリーニングによりインキュベーション時間と分離株の選択が菌類発酵穀物の生産における２つの最も重要なパラメーターであることが示されたので、本発明者らは、リゾプス・オリゴスポルス（R. oligosporus）のその他の分離株が、許容できる最終生産物を生産することができるかを調べることにした。
【００５２】
リゾプス・オリゴスポルス（Rhizopus oligosporus）の様々な分離株をシリカゲル上で２℃で維持した。これら分離株は、Centraalbureau voor Schimmelcultures (CBS), Delft, The Netherlands または American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA, USA または Northern Regional Research Laboratory (NRRL), Peoria, IL, USA,から得たものであるが、以後その菌株番号（JXXX, Dept. of Microbiology, Swedish University of Agricultural Sciences, Uppsala, Sweden）によって称する。（表２を参照されたい）。
【００５３】
J189, J190, J373, J374, J398, J399, J400, J401, J402, および J403.
【００５４】
２．１  接種菌の調製
胞子嚢胞子懸濁液を得るために、分離株を１００ｐｐｍのクロラムフェニコール（MEAC, Sigma chemical Co, St Louis, MO）を追加したMalt Extract Agar (MEA, Oxoid, Basingstoke, England)で５〜６日間３０℃で平板培養(スクリーニング中) または傾斜培養 (スクリーニング後）した。生理的食塩水（０．９％ＮａＣｌ）を追加し、接種ループ（inoculation loop)で掻き取ることにより胞子を収集した。胞子懸濁液を取り出し次いで振盪して混合した。懸濁液を２回洗浄し、胞子を次いで所望の濃度となるように生理的食塩水に再懸濁した。
【００５５】
懸濁液の濃度は計数チャンバを用いて測定した。生死判別試験をＭＥＡＣプレート上で時折行って胞子懸濁液の濃度を確認した。
【００５６】
２．２穀物の発酵
最初の実験により大麦小粒（「Ｋｏｒｎｇｒｙｎ」）では、高度にゼラチン化し、細菌数も多く、満足の行く結果は得られないことが示された。したがって全粒のみについて研究を続けた。
【００５７】
「Ｇｏｕｒｍｅｔｋｏｒｎ」をモデル系と同様（乳酸溶液（０．８８体積％）で６時間浸漬、乳酸溶液（０．０２９体積％）で１０分間煮沸）に浸漬し、煮沸し、水を切って冷却したところ、スクリーニングアッセイにおいてすばらしい結果が得られることが判明した。
【００５８】
穀粒をこれにしたがって調製し、そしておよそ１．５ｘ１０４胞子／ｇの濃度となるように１０種類の分離株を接種した。リゾプス・オリゴスポルス（R. oligosporus）の１０の分離株すべてを別々にこの研究に使用した。各分離株を接種された穀粒を５つのペトリ皿に詰めた。２つのペトリ皿は３０℃でインキュベートし、３０時間および４０時間放置し、２つのペトリ皿は３５℃でインキュベートし２０時間および２５時間放置した。１つの分離株あたり１つのペトリ皿はインキュベーション前にフリーザーに移した。発酵を停止させた後、ケークをフリーザーに移した。官能検査の前にすべてのケークを室温で２時間解凍した。
【００５９】
スクリーニング研究により、色に関する反応とＤＧ１８（ジクロラングリセロール（Dichloran Glycerol）１８％ , Oxoid Ltd.)上のコロニー形成単位は高度に相関していることが示されたので、この研究の結果は、堅さ、匂いおよび色についてのみ試験パネルが評価した。大きなｐＨ変化を起こした分離株があったかを判定するために３５℃でインキュベートしたケークのｐＨも測定した。１０の分離株を用いて接種された穀粒を３０℃および３５℃で２０〜４０時間インキュベーションした結果、非常に様々な発酵したケークが生じた。
【００６０】
菌糸の生育は驚くべきことに分離株の種類によって異なる傾向にあった。高粘度で弾力性のある菌糸を産生し、時折胞子形成するものもあれば、わずかに酸性臭のするより綿状の菌糸を産生するものもあった。胞子形成は高い着色値によって表された。結果は、匂い、堅さ、色およびｐＨについて判定した。
【００６１】
その結果は主に３つのグループに分けられ、１つのグループは許容される生産物（良好）と定義されるものに非常に近かった。３５℃で２０時間および２５時間生育させた分離株J401 が評価において最高のスコアを示した。J401はインキュベーションの１７時間後に既に良好な生育を示し、２５時間後には菌糸は非常に密であり、高度に胞子形成していることはなかった。３５℃で生育させた場合は匂いは中程度から非常に良好であり、３０℃で生育させた場合にはより酸性気味の匂いを有していた。
【００６２】
２．３  凍結状態後の発酵
本発明者らは、新たに接種された穀類と同様のケークを産生するのに十分なほどに胞子が凍結状態後にも生存するのかどうかを知ることにも興味があったため、穀類にすべての分離株の胞子懸濁液を接種し、フリーザー（−１８℃）において２週間保存した後にインキュベートした。プレートを５℃で２時間解凍し、次いで３５℃で２０時間インキュベートした。
【００６３】
３つのグループのケークが確認された。５つの分離株は良好にカビが生育したケークに分類した (J189, J401, J398, J374 および J400)。４つのケークはカビの生育がそれほど良好でないケークに分類した(J190, J373, J402, および J403)、１つの分離株のみについては胞子形成していた (J399)。
【００６４】
驚くべきことにこの結果は、接種して詰めたすぐ後にケークをインキュベートした実験において得られた結果と大きく異なっていた。凍結した後にインキュベーションをした場合のケークにおいては胞子形成はほとんど検出できなかったのに対し、予め凍結せずにインキュベートしたケークの多くでは胞子形成がさかんであった。J399のみが両方の条件下でほぼ同様の特性を示した。明らかに凍結工程は多くの分離株の胞子形成挙動を遅らせる効果を有する。
【００６５】
３．発酵穀物ケークの衛生的評価
本発明の方法にしたがって生産した発酵穀物ケークから、２０ｇを２％ペプトン水 (Oxoid Ltd., UK)中でストマッカー (Stomacher, Lab Blender Model 400 (BA7021), Seward Medical, London, England)でホモジナイズし、連続希釈法を用いて菌類および細菌の含量を分析した。
【００６６】
菌類の成長は、ジクロラン・グリセロール（Dichloran Glycerol） (１８％)寒天基体（Agar Base） (DG18, Oxoid Ltd., UK)上で分析した。ジクロランは接合菌（Zygomycetes）の放射状の成長を抑制し、その他の菌類の存在の検出を可能にする。１００μｌのアリコットをプレートの表面に播き、プレートを２５℃で５日間インキュベートした。
【００６７】
細菌の総数を、菌類の成長を阻害するためにデルボシド（delvocid） (０．１ｇ／ｌ) (Gist-brocades, Delft, The Netherlands)を追加したトリプトン・グルコース・エクストラクト・アガー （Tryptone Glucose Extract Agar ）(TGEA, Oxoid Ltd., UK) 上で測定した。１ｍｌのアリコットを２０ｍｌの培地に混合し、その上層をＴＧＥＡで覆い、３０℃で７２時間インキュベートした。
【００６８】
腸内細菌科（Enterobacteriaceae）をデルボシド（０．１ｇ／ｌ）を追加したバイオレット・レッド・バイル・グルコース・アガー（Violet Red Bile Glucose Agar） (VRBG, Oxoid) 上で計数した。１ｍｌのアリコットを２０ｍｌの培地と混合し、ＶＲＢＧで上層を覆い、３７℃で２４時間インキュベートした。
【００６９】
芽胞形成性細菌の量をリインフォースド・クロストリジアル・アガー（Reinforced Clostridial Agar） (RCM, Oxoid Ltd., UK)上で計数した。栄養細胞を殺すために８０℃で１３分間熱処理を行い、１００μｌのアリコットをプレートの表面に播いた。クロストリジウム属の種（Clostridium spp.）とバシラス属の種（Bacillus spp.）を識別するためにＲＣＭアガーに、０．０００５％ニュートラルレッド (Fluka, LabKemi, Stockholm, Sweden) および０．０２％シクロセリン (Sigma, St Louis, USA)を追加した。ニュートラルレッドはｐＨの指標として作用し、クロストリジウム属の種（Clostridium spp.）が成長すると黄色のゾーンが生じる。また、シクロセリンはバシラス属の種（ Bacillus spp.）の成長を阻害する。バシラス（Bacillus）の分析用のプレートは３７℃で２４時間インキュベートし、クロストリジウム（Clostridium）用のプレートは嫌気状態で３７℃で７２時間インキュベートした。
【００７０】
結果は酸性化により最終生産物における細菌の成長が抑制されることを示すものであった。概して、衛生的評価は本発明の方法により衛生上の品質の高い発酵生産物が得られることを示すものであった。これはまた、後述する微生物攻撃試験によっても確認された。
【００７１】
４．衛生的品質：＋４℃での保存
本発明の方法によって発酵生産物を生産し、該生産物のケークを水中で３分間煮沸し、それを直接インキュベーションした。室温で冷却した後、発酵生産物のケークを清浄なペトリ皿に入れ、＋４℃で置いた。ケークからの試料（２５ｇ）を保存期間中定期的に採取した。試料をさらに（３．発酵穀物ケークの衛生的評価（前述））に記載のように処理してホモジナイズした。
【００７２】
この研究において、細菌の総数、枯草菌(Bacillus subtilis)の量および菌類の成長を測定した。結果を表３に示す。これらを分析する方法は上述のものと同じであった。生産物は驚くべく高度に衛生的安定性を示し、４℃での１５週間の保存の間、細菌および菌類の成長は見られなかった。
【００７３】
【表３】
2004519238.tif 000004
1最初の十倍希釈において測定
2 b.d. = 検出限界未満
【００７４】
新鮮なまたは保存したダイズテンペにおける有害微生物の研究は、Nout et al. (Nout, M. J. R., G. Beernink, et al. (1987). "Growth of Bacillus cereus in soyabean tempeh." Int. J. Food Microbiol. 4: 293-301)にしたがって行った。結果を比較のために以下に示す（表４）。
【００７５】
【表４】
2004519238.tif 000005
1測定せず
【００７６】
さらに市販のダイズテンペの微生物品質の調査をオランダにおいて行った。この研究は生産後４週間まで保存した生産物から収集した実際の試料からのデータを示す（表５）。 (Samson, R. A., J. A. van Kooij, et al. (1987). "Microbiological quality of commercial tempeh in the Netherlands." Journal of Food Protection 50(2): 92-94.)。
【００７７】
【表５】
2004519238.tif 000006
【００７８】
セレウス菌（Bacillus cereus）および黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）はともに食中毒を起こし得る。この調査では数において試料の約１１％がセレウス菌（B. cereus）を、そして試料の約１３％が黄色ブドウ球菌（S. aureus）を含んでいた。これは食中毒の原因となりうる。
【００７９】
５．発酵穀物ケークの官能試験
経験を積んでいない５人のパネルがインキュベーション後の発酵穀物ケークを評価した。ケーク（ｎ＝３６）を匂い（スケール１〜５、１は許容できない匂いに対応し、５は非常に良好）、堅さ（スケール１〜５）および色（スケール１〜７）について評価した。色はカラースケールを用いて表した。程度１の色は成長無しに対応し、３〜５は許容可能な白っぽい色に対応し、６〜７は胞子形成したケークの暗い色に対応する。許容可能なケーク（高い衛生的品質であって高度に胞子形成はしていないもの、ｎ＝１８）を油で揚げてスケール１（不良）から５（非常に良好）のスケールを用いて味について評価した。
【００８０】
発酵穀物ケークは匂いについては「中程度」から「良好」とみなされることが多く、味に関しては１〜４とされることが多く、これは味は一般に色と比べて満足のいくものではなかったことを示す。美味とみなされたケーク（３．５、４．６、４．０）も生産され、これは本発明の方法の実現可能性を示す。
【００８１】
また、本発明の方法によって生産した生産物について優先期間に食品業界で熟練のパネルによる試験を行った。パネルは該生産物に対して味、口当りおよび全体の外観について高い評価を下した。様々な製造業者の研究開発部門におけるさらなる処理手続を伴う実地試験により、該生産物は幅広い料理の材料のための使用に好適であることが示された。発酵全粒生産物は取り扱い性がよく、感覚上の特性を失うことなくスライスしたり刻んだり、ゆでたり焼いたりすることができる。
【００８２】
６．微生物の攻撃
本発明の方法の微生物上の安定性および汚染への耐性を評価するために、選択した微生物を工程中に添加した。この研究に用いた細菌は、胞子形成細菌を代表する枯草菌（B. subtilis）、耐熱性毒素の生産菌として選ばれた黄色ブドウ球菌（S. aureus）および一般的な汚染菌であり食品安全性の指標として用いられることの多いものとして選ばれた大腸菌（E. coli）であった。枯草菌（B. subtilis）培養物は穀物から単離され、Ann-Sofie Johansson, Kungsornen AB, Jarna, Swedenによって提供された。黄色ブドウ球菌（S. aureus） (SLV-350, ATCC 25923) および大腸菌（E. coli） (SLV-082) はthe Swedish National Food Administration, Uppsala, Swedenから提供された参照試料（２０００：１）から単離した。
【００８３】
６．１  攻撃微生物の調製
攻撃微生物を選択培地上に維持し、競合する生物のコロニーを２％ペプトン水溶液に混合した。枯草菌（B. subtilis）懸濁液を８０℃で１３分間熱処理した。適当な培地について分析するために連続希釈法を行った。枯草菌（B. subtilis）および大腸菌（E. coli）は３７℃で２４時間インキュベートし、黄色ブドウ球菌（S. aureus）は３７℃で４８時間インキュベートした。
【００８４】
６．２  浸漬前の攻撃微生物の添加
現実の汚染に見合う量の攻撃微生物を３２０ｇの大麦 (ｇｏｕｒｍｅｔｋｏｒｎ)に添加し、よく混合して添加した生物が大麦に付着する機会を与えるために３０分間放置した。大麦を０．８８％ＬＡｃ (KEBO Lab AB, Spanga)を含む水中で２℃で６時間浸漬した。サンプリング後、大麦の残りの部分を０．０２９％ＬＡｃ (KEBO Lab AB, Spanga)および７５０ｍｌ当たり６ｇのＮａＣｌとともに１０分間煮沸した。煮沸した大麦を乾燥および冷却（およそ４０℃まで）し、リゾプス・オリゴスポルス（R.oligosporu） (大麦１ｇあたり１０５の胞子）を接種した。接種した混合物をペトリ皿に詰め、３５℃で２０時間インキュベートした。
【００８５】
試料を採取（ａ，ｂ，ｃ，ｄ）し、各分析について２０ｇを用いた。
（ａ）開始レベルの分析用に攻撃微生物の添加後、
（ｂ）攻撃生物の生存／成長の分析用に浸漬後、
（ｃ）煮沸中の競合する生物の生存の分析用に煮沸後、
（ｄ）発酵したケークについて。
【００８６】
６．３  煮沸後の攻撃微生物の添加
上述の方法にしたがって発酵大麦生産物を作った。乾燥および冷却の後、リゾプス・オリゴスポルス（R.oligosporu）(大麦１ｇあたり１０５の胞子）および攻撃細菌の懸濁液を煮沸した大麦に添加した。ケークを３５℃で２０時間インキュベートした。
【００８７】
試料を採取（ａ，ｂ）し、各分析について２０ｇを用いた。
（ａ）開始値を得るために接種された大麦をサンプリングした。
（ｂ）発酵したケークについて。
【００８８】
枯草菌（B. subtilis）および大腸菌（E. coli）を前の研究と同様にして計数した。黄色ブドウ球菌（S. aureus）は、エッグヨークエマルジョン（Egg Yolk Emulsion）２０％を含有し、デルボシド（delvocid）（０．１ｇ／ｌ）を追加したBaird-Parker 培地 (Oxoid Ltd., UK)で分析し、３７℃で４８時間インキュベートした。
【００８９】
結果は、発酵生産物において、枯草菌（B. subtilis）、黄色ブドウ球菌（S. aureus）、大腸菌（E. coli）のいずれも生存せず、成長しないことを示していた（表６および７）。実際、試験したすべての微生物について生産物における汚染レベルはthe Swedish National Food Administration (Guidelines for microbial evaluation of food samples)によって示される閾値よりも有意に低かった。
【００９０】
【表６】
2004519238.tif 000007
1. b.d. ＜検出限界 (＜ 102 cfu/g)
2. セレウス菌（B. cereus）
3. 凝固酵素陽性スタフィロコシエ（staphylococcae）
【００９１】
【表７】
2004519238.tif 000008
1. b.d. ＜検出限界 (＜ 102 cfu/g)
2. セレウス菌（B. cereus）
3. 凝固酵素陽性スタフィロコシエ（staphylococcae）
4. エンテロバクテリアシアエ（Enterobacteriaceae）−総数
【００９２】
結論は、本発明による生産物は高度に衛生的な基準および安定性を示すということである。
【００９３】
７．栄養上の評価
以下に引用する方法にしたがって生産物を分析した。結果を表８に示す。
【表８】
2004519238.tif 000009
* HI= 加水分解指標 ** GI=糖血症指標
【００９４】
1 Aman, P, Graham, H (1987). 1987. Analysis of total and insoluble mixed linked (1-]3),(1-]4)- Beta-D-glucans in barley and oats. Journal of agricultural and food chemistry. 35: 704-709.
【００９５】
2 Skoglund, E. Carlsson, N.-G. and Sandberg, A.-S. (1997). Determination of isomers of inositol mono- to hexaphosphates in selected foods and intestinal contents using high-performance ion chromatography. J. Agric. Food Chem. 45(2):431-436; Skoglund, E. Carlsson, N.-G. and Sandberg, A.-S. (1998). High performance chromatograpic separation of inositol phosphate isomers on stron anion exchange columns. J. agric. Food Chem. 46(5):1877-1882.
【００９６】
3 Y. Granfeldt, I. Bjorck, A. Drews and J. Tovar. An in vitro procedure based on chewing to predict metabolic response to starch in cereal and legume products. European Journal of Clinical Nutrition (1992) 46, 649-660.
【００９７】
本発明を好適な態様について記載してきたが、これは出願時に本発明者らによって知られている最良の態様を構成するものであり、当業者にとって明白な様々な変更および改変を本願の特許請求の範囲に記載する本発明の枠内から逸脱することなく行うことができることが理解されるべきである。
【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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