(57)【要約】本発明は、アレルギー性疾患の治療、予防または改善のための新規の薬剤の提供に関する。特に、新規薬剤は、ＩｇＥのＣε２ドメインの表面露呈領域のエピトープまたはミモトープを組み入れる単離ペプチドである。本発明は、これら新規の領域が受動的および能動的免疫予防法または免疫療法のための標的で有り得ることを見出した。本発明はさらに、それらを含有する薬剤、製剤組成物の製造方法、ならびに医療におけるそれらの使用に関する。さらに本発明の一局面を構成しているのは、本発明の表面露呈ＩｇＥ領域を結合し得る配位子、特にモノクローナル抗体、ならびに受動的免疫療法または免疫予防法としての医療におけるそれらの使用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＩｇＥのＣε２ドメインの単離表面露呈エピトープを含むペプチド、またはそのミモトープ。
【請求項２】
Ｃε２の表面露呈エピトープがＰ１（配列番号１）である請求項１記載のペプチド、またはそのミモトープ。
【請求項３】
Ｃε２の表面露呈エピトープがＰ２（配列番号２）である請求項１記載のペプチド、またはそのミモトープ。
【請求項４】
Ｃε２の表面露呈エピトープがＰ３（配列番号３）である請求項１記載のペプチド、またはそのミモトープ。
【請求項５】
Ｃε２の表面露呈エピトープがＰ４（配列番号４）である請求項１記載のペプチド、またはそのミモトープ。
【請求項６】
Ｃε２の表面露呈エピトープがＰ５（配列番号５）である請求項１記載のペプチド、またはそのミモトープ。
【請求項７】
Ｃε２の表面露呈エピトープがＰ６（配列番号６）である請求項１記載のペプチド、またはそのミモトープ。
【請求項８】
Ｃε２の表面露呈エピトープがＰ７（配列番号７）である請求項１記載のペプチド、またはそのミモトープ。
【請求項９】
ペプチドである請求項１〜８のいずれかに記載のミモトープ。
【請求項１０】
単離エピトープがＩｇＥのＣε２ドメインのループ構造から得られる請求項１記載のペプチド。
【請求項１１】
ＩｇＥのＣε２ドメインのループ構造がＡ−ＢまたはＣ−Ｄループである請求項１０記載のペプチド。
【請求項１２】
Ｐ１のミモトープが一般式：
ｈｘｄｈｈａｎａｎｘｙ
（式中、ｈは疎水性アミノ酸残基であり、ｄはイオン結合供与アミノ酸残基であり、ａは産生アミノ酸残基であり、ｎはイオン的中性／非極性アミノ酸残基であり、そしてｘはアミノ酸である）
のペプチドである請求項２記載のペプチド。
【請求項１３】
Ｐ１のミモトープが一般式：
Ｑ，Ｘ１，Ｍ，Ｄ，Ｘ１，Ｘ２，Ｘ３
（式中、Ｘ１は、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、ＦまたはＡから選択され、Ｘ２は、ＤまたはＥから選択され、そしてＸ３は、Ｌ、Ｉ、Ｖ、Ｍ、ＡまたはＦから選択される）
のペプチドである請求項２記載のペプチド。
【請求項１４】
Ｐ１のミモトープがＰ１５ｑ（配列番号１１）、ＰＴ１０７９（配列番号１３）、ＰＴ１０７９ＧＳ（配列番号１５）、ＰＴ１０７８（配列番号１６）、ＰＴ１５（配列番号８）から成る群から選択される請求項２記載のペプチド。
【請求項１５】
Ｐ２のミモトープがＰ１６（配列番号２４）である請求項３記載のペプチド。
【請求項１６】
Ｐ３のミモトープがＰ１７（配列番号２６）である請求項４記載のペプチド。
【請求項１７】
さらに担体分子を含む請求項１〜１６のいずれかに記載のペプチドまたはミモトープを含むアレルギーの治療のための免疫原。
【請求項１８】
担体分子がプロテインＤまたはＢ型肝炎コア抗原から選択される請求項１７記載の免疫原。
【請求項１９】
請求項１〜１６記載のペプチドまたはミモトープの化学的複合体であるか、または融合タンパク質として発現される請求項１７または１８記載の免疫原。
【請求項２０】
ペプチドまたはペプチドミモトープが担体の一次配列内に提示される請求項１７〜１９のいずれかに記載の免疫原。
【請求項２１】
アジュバントをさらに含む請求項１７〜２０のいずれかに記載の免疫原を含むアレルギーの治療のためのワクチン。
【請求項２２】
ＩｇＥのＣε２ドメインの表面露呈エピトープを認識し得る配位子であって、ＰＴｍＡｂ０００５でないことを特徴とする配位子。
【請求項２３】
１９９９年３月８日のＥＣＡＣＣでのブダペスト条約特許寄託下で寄託番号９９０３０８０５で寄託されたＰＴｍＡｂ００１１である請求項２２記載の配位子。
【請求項２４】
ＩｇＥのＣε２ドメインの表面露呈エピトープを認識し得る配位子を含有する製剤組成物。
【請求項２５】
配位子がＩｇＥのＣε２ドメインのＣ−Ｄループを認識し得る請求項２４記載の製剤組成物。
【請求項２６】
配位子がＰＴｍＡｂ０００５またはＰＴｍＡｂ００１１から選択されるモノクローナル抗体である請求項２５記載の製剤組成物。
【請求項２７】
医療に用いるための請求項１〜１６のいずれかに記載のペプチド。
【請求項２８】
医療に用いるための請求項２１記載のワクチン。
【請求項２９】
医療に用いるための請求項１７〜２０のいずれかに記載の免疫原。
【請求項３０】
アレルギーの治療または予防のための薬剤の製造における請求項１〜１６のいずれかに記載のペプチドの使用。
【請求項３１】
医療に用いるためのＩｇＥのＣε２ドメインの表面露呈エピトープを認識し得る配位子。
【請求項３２】
アレルギーの治療のための薬剤の製造におけるＩｇＥのＣε２ドメインの表面露呈エピトープを認識し得る配位子の使用。
【請求項３３】
ＰＴｍＡｂ０００５またはＰＴｍＡｂ００１１である請求項３１または３２記載の配位子の使用。
【請求項３４】
Ｐ１のミモトープの同定におけるＰＴｍＡｂ０００５またはＰＴｍＡｂ００１１の使用。
【請求項３５】
ＰＴｍＡｂ０００５またはＰＴｍＡｂ００１１により認識され得るペプチド。
【請求項３６】
請求項３５記載のペプチドを含む免疫原。
【請求項３７】
診断におけるまたは血液からの循環抗ＩｇＥ抗体のアフィニティー精製における請求項１〜１６記載のペプチドの使用。
【請求項３８】
請求項１７〜２０のいずれかに記載の免疫原の製造およびアジュバントとともに免疫原を処方することを包含するワクチンの製造方法。
【請求項３９】
アレルギーに罹患しているかまたはそれが疑われる患者の治療方法であって、請求項１〜１６のいずれかに記載のペプチドの患者への投与を包含する方法。
【請求項４０】
アレルギーに罹患しているかまたはそれが疑われる患者の治療方法であって、請求項２１記載のワクチンの患者への投与を包含する方法。
【請求項４１】
アレルギーに罹患しているかまたはそれが疑われる患者の治療方法であって、請求項２４〜２６のいずれかに記載の製剤組成物の患者への投与を包含する方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、アレルギー疾患に対する新規な治療薬、予防薬、改善薬の提供に関する。特に、この新規な薬は、ＩｇＥのＣε２ドメインの表面露出領域のエピトープまたはミモトープを含む単離ペプチドである。発明者は、これらの新規な領域が、受動的および能動的な免疫防御または免疫療法の標的となっている可能性があることを見いだした。本発明はさらに、これらの領域を含む薬や薬理学的組成物の製造方法と、その薬や薬理学的組成物の医学への応用にも関する。また、本発明の表面露出ＩｇＥ領域と結合することのできるリガンド、中でもモノクローナル抗体と、受動的免疫療法としての医療または免疫防御におけるそのリガンドの使用も、本発明の一側面を構成している。非ペプチド・ミモトープも、本発明の一実施態様である。
【０００２】
アレルギー応答では、アレルギーに通常伴う症状は、ヒスタミンなどのアレルギー・メディエーターが免疫細胞から周囲の組織や血管構造に放出されることによってもたらされる。ヒスタミンは、通常はマスト細胞および好塩基球に貯えられていて、アレルゲン特異的ＩｇＥと相互作用することによって放出される。喘息、食品アレルギー、アトピー性皮膚炎、タイプＩの過敏症、アレルギー性鼻炎などのアレルギー応答が起こる際にＩｇＥが果たす役割はよく知られている。Ｂ細胞は、花粉や塵アレルゲンなどの抗原と出会うと、アレルゲン特異的ＩｇＥの合成を開始する。するとアレルゲン特異的ＩｇＥは、好塩基球やマスト細胞の表面にあるＦｃεＲＩ受容体（高アフィニティＩｇＥ受容体）と結合する。その後に何らかのアレルゲンと出会うと、その周辺でＩｇＥ／ＦｃεＲＩ複合体が架橋することにより、マスト細胞または好塩基球からヒスタミンの放出が開始される（サットンとグールド、Ｎａｔｕｒｅ、第３６６巻、４２１−４２８ページ、１９９３年；ＥＰ ０ ４７７ ２３１ Ｂ１）。
【０００３】
あらゆる免疫グロブリンと同様、ＩｇＥは、２つのＨ鎖と２つのＬ鎖を含んでいる。Ｈε鎖は、５つのドメインからなる。すなわち、１つの可変領域（ＶＨ）と、４つの定常領域（Ｃε１〜Ｃε４）である。ＩｇＥの分子量は約１９０，０００ドルトンであり、Ｈ鎖は長さが約５５０個のアミノ酸からなる。ＩｇＥの構造は、パドランとデイヴィス（Ｍｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．、第２３巻、１０６３−１０７５ページ、１９８６年）、およびヘルム他（ＰＤＢ（タンパク質データバンク、構造生物情報学のための共同研究所；ｈｔｔｐ：／／ｐｄｂ−ｂｒｏｗｓｅｒｓ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ）に１９９０年１０月２日に提出された２ＩｇＥモデル構造）が議論している。第２のドメインＣε２は、ＩｇＥのアミノ酸番号２２６−３２８をほぼ含んでいる（フラナガン， Ｊ．Ｇ．とラビッツ， Ｔ．Ｈ．、ＥＭＢＯ Ｊ．、第１巻、６５５−６６０ページ、１９８２年；ケンテン他、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、第７９巻、６６６１−６６６５ページ、１９８２年）が、さらにアミノ酸を含んでいる可能性もある。ＩｇＧ１の既知の構造と比較することにより、Ｃε３ドメインの出発点がセリン３３７であることが推定された。
【０００４】
ＩｇＥを媒介としたヒスタミン放出メカニズムを妨げるため、受動的または能動的な多数の免疫療法がこれまで研究されてきたが、その成果はさまざまである。これらの方法は、ＦｃεＲＩ受容体またはＦｃεＲＩＩ受容体（低アフィニティＩｇＥ受容体）との結合の際に競合する抗体またはＩｇＥ由来のペプチドを受動的に投与することにより、ＩｇＥまたはアレルゲン／ＩｇＥ複合体がこれら受容体と結合するのを妨げる操作を含んでいる。さらに、何人かの研究者は、能動的免疫法においてＩｇＥ由来の特異的ペプチドを用いることにより、ヒスタミンの放出を抑制するような免疫応答が促進されることを報告している。
【０００５】
ＩｇＥが対応する受容体に結合する際に関与するＩｇＥのドメインはＣε３とＣε４であることが報告されている（サットン， Ｂ．Ｊ．とグールド，Ｈ．Ｊ．、Ｎａｔｕｒｅ、第３６６巻、４２１−４２８ページ、１９９３年；ＷＯ９７／３１９４８）。そのため、これまでの治療戦略はこれら２つのドメインを焦点としていた。
【０００６】
この分野でこれまで研究を続けてきた研究者たちは、研究が進むにつれ、新規なアレルギー治療法を考案する際に考慮すべき多数の事柄および問題点にぶつかった。最も重大な問題点の１つは、ヒスタミン放出信号にＩｇＥの架橋が関わっていることを巡って展開している。ほとんどの場合、能動的ワクチン接種の間に生成する抗ＩｇＥ抗体は、アレルゲンなしで周辺のＩｇＥ−受容体複合体を架橋させるため、それ自体がヒスタミン放出の引き金となりうる。この現象は、アナフィラキシー誘発性と呼ばれている。実際、ＩｇＥ検出アッセイで通常用いられている市販の多くの抗ＩｇＥモノクローナル抗体はアナフィラキシー誘発性を持っているため、患者に投与しても無駄であり、潜在的に危険でもある。
【０００７】
抗体がアナフィラキシー誘発性を持っているかどうかは、ＩｇＥ分子の表面の標的エピトープの位置によって決まる。しかし、この分野で現在わかっていることに基づくと、研究者が大いに興味を持って多大な努力をしているにもかかわらず、どの抗体またはエピトープであれ、その特性をほとんどまたはまったく予測できず、患者に対する臨床効果がプラスになるかマイナスになるかもほとんどまたはまったく予測できない。
【０００８】
したがって、安全かつ効果的であるためには、受動的に投与される抗体、または接種によって誘導される抗体は、それ自体がアナフィラキシーを引き起こすことなく、ヒスタミンのトリガー経路を妨げることのできるＩｇＥの領域に結合しなくてはならない。本発明はこれらの目的をすべて達成しており、本発明により、ヒスタミンの放出を抑制するアナフィラキシー非誘発性抗体を生成させることのできる薬が提供される。この薬は、能動的ワクチン接種の基礎となりうる。またこの薬は、受動的免疫療法のための適切な抗体を生成させるのに用いることもできる。この薬そのものを受動的に投与して治療効果を得ることもできる。
【０００９】
ＩｇＥを媒介としたアレルギー応答に対して幾分かプラスの効果が実際にある特異的抗ＩｇＥ抗体を同定するため、当業者によって多くの研究がなされてきた（ＷＯ９０／１５８７８、ＷＯ８９／０４８３４、ＷＯ９３／０５８１０）。有効なこれらの抗体によって認識されるエピトープを同定し、そのエピトープのペプチド・ミモトープを作り、それを免疫原として用いて抗ＩｇＥ抗体を産生させるための多くの試みもなされてきた。
【００１０】
ＷＯ９７／３１９４８には、このタイプの研究の一例が記載されている。この出願にはさらに、能動的ワクチン接種を目的としてキャリヤー分子と共役したＣε３ドメインおよびＣε４ドメインからのＩｇＥペプチドも記載されている。これら免疫原は、ワクチン接種の研究において使用できる。また、これら免疫原は抗体を産生させることができ、続いてその抗体が生体内でヒスタミンの放出を抑制すると言われている。この出願には、Ｃε３ドメインに含まれていて、能動的ワクチン接種の目的に役立つＩｇＥペプチドと結合できると言われているモノクローナル抗体（ＢＳＷ１７）が記載されている。
【００１１】
ＥＰ ０ ４７７ ２３１ Ｂ１には、能動的ワクチン接種による免疫防御で用いられるスカシガイのヘモシアニン（ＫＬＨ）と共役した、ＩｇＥのＣε４ドメイン（残基４９７−５０６、スタンワース・デカペプチドとしても知られる）由来の免疫原が記載されている。ＷＯ９６／１４３３３は、ＥＰ ０ ４７７ ２３１ Ｂ１に記載した研究の続編である。
【００１２】
他の方法は、好塩基球またはマスト細胞の表面の高アフィニティ受容体または低アフィニティ受容体と結合するＩｇＥと競合するペプチドを同定することに基づいている（ＷＯ９３／０４１７３、ＷＯ９８／２４８０８、ＥＰ ０ ３０３ ６２５ Ｂ１、ＥＰ ０ ３４１ ２９０）。
【００１３】
本発明では、ＩｇＥのＣε２ドメインの新規な表面露出エピトープを同定する。このエピトープは、能動的または受動的な免疫防御またはアレルギー疾患状態の治療の標的として用いることができる。本発明により、単離されたエピトープを含むペプチドが提供され、さらに、新たに同定されたこのエピトープのミモトープも提供される。このミモトープそのものは、アレルギーの治療に使用すること、または能動的ワクチン接種による免疫防御または治療の際の免疫原において使用することができる。単離された本発明のエピトープまたはミモトープは、能動的ワクチン接種プロトコルのための免疫原において、自己抗ＩｇＥ抗体を誘導するのに用いることが好ましい。この自己抗ＩｇＥ抗体そのものが、ワクチン接種を受けた患者の体内でアレルギー応答またはアレルギー症状を制限したり、低減させたり、消失させたりする。また、本発明のミモトープまたは免疫原は、患者に受動的に投与して、ワクチン接種を受けた患者の体内でアレルギー応答またはアレルギー症状を制限したり、低減させたり、消失させたりすることもできる。
【００１４】
単離された本発明のエピトープを含むペプチドは、（例えばキャリヤー上に）適切に提示されたときに免疫原性を持ち、アナフィラキシー非誘発性で生体内のアレルギー応答を改善する機能を持つ自己抗ＩｇＥ抗体を誘導することができる。本発明のエピトープまたはミモトープは、Ｃε２ドメインにのみ由来し、他のどのドメインにも由来しないことが好ましい。すなわち本発明のエピトープまたはミモトープは、Ｃε１ドメイン、Ｃε３ドメイン、またはＣε４ドメインには見いだされないことが好ましい。特に、好ましい一実施態様では、本発明のエピトープまたはミモトープは、ヒトＩｇＥのセリン２２２〜アラニン３２９によってコードされているドメインに由来する。
【００１５】
本発明のミモトープまたは免疫原で用いるのに特に適していることがわかっていたＣε２ドメインの特異的エピトープは、本発明の発明者によって表面に露出していることがわかったエピトープである。ＩｇＥのどの領域の表面が露出するかは、モデル構造からわかる（パドランとデイヴィス、Ｍｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．、第２３巻、１０６３−１０７５ページ、１９８６年：ヘルム他、ＰＤＢ（タンパク質データバンク、構造生物情報学のための共同研究所）に１９９０年１０月２日に提出された２ＩｇＥモデル構造）。本発明の発明者は、本発明で有効なエピトープは、表面がよく露出していることも見いだした。発明者は、この観察結果から、他の適切なエピトープを提供する方法を考案した。このエピトープは、５残基移動ウインドウについての計算から非常にアクセスしやすいことがわかった領域を有するエピトープである。発明者は、分子シミュレーション・ソフトウエア（ＭＳＩ）を用いて５残基移動ウインドウについて計算することにより、Ｃε２ドメインの好ましい領域が、５０平方オングストロームよりも広い面積、好ましくは８０平方オングストロームよりも広い面積を有するアクセス可能な表面を有することを見いだした。
【００１６】
このように表面が露出したＣε２ ＩｇＥエピトープの具体例は、以下の通りである：
【００１７】
【表１】
2004538238.tif 000002
【００１８】
このようなエピトープを含むペプチドは、本発明の好ましい一側面を構成する。このエピトープと同じ特性を有するミモトープと、免疫応答を生じさせ、ＩｇＥ分子内でＩｇＥ Ｃε２エピトープと交差反応するミモトープを含む免疫原も、本発明の一部である。
【００１９】
したがって本発明には、天然のＩｇＥエピトープそのものを含む単離されたペプチドと、その任意のミモトープとが含まれる。ミモトープとは、天然のＩｇＥエピトープを認識する抗体が認識することのできるくらいに（ゲイセン， Ｈ．Ｍ．他、『抗原としての合成ペプチド』、ワイリー社、チチェスター、チバ財団シンポジウム１１９、１３０−１４９ページ、１９８６年；ゲイセン， Ｈ．Ｍ．、Ｍｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．、第２３巻、第７号、７０９−７１５ページ、１９８６年）；あるいは、適切なキャリヤーと結合させたときに、天然のＩｇＥエピトープと交差反応する抗体を産生させることができるくらいに、天然のＩｇＥエピトープと十分に似ているものと定義する。
【００２０】
本発明のミモトープは、ペプチドからなるもの、または非ペプチドのものが可能である。上で同定した表面露出ＩｇＥエピトープのペプチド・ミモトープは、天然のエピトープとは配列が異なっていてもよいし、天然のエピトープと配列が正確に一致していてもよい。そのような分子はエピトープのミモトープとして記述する。というのも、２つの分子が同じ配列を有するとはいえ、ミモトープはＣε２ドメイン構造全体に提示されるわけではなく、そうであるからにはミモトープが天然のＩｇＥエピトープとはわずかに異なった立体配置を取ることもできるからである。同定された上記の１次配列（Ｐ１〜Ｐ７）が、ＩｇＥの３次構造において、ＩｇＥの１次配列では離れているかもしれない他の領域と隣接することも、当業者には明らかであろう。そのため、例えばＰ１のミモトープは、Ｐ１の区画と、互いに離れたこれらアミノ酸残基からなる区画を含んでいる、または似ているという点を考慮すると、連続でも不連続でもよい。
【００２１】
本発明で利用することのできる好ましい表面露出領域は、ループ構造を伴う領域を含んでいる。したがって本発明のペプチドまたはミモトープは、Ｎ末端延長部またはＣ末端延長部を有するループを含むことができる。この末端延長部としては、隣接するβシートからの天然のアミノ酸残基が可能である。その実例として、Ｐ１はＩｇＥのＣε２ドメインのＣ−Ｄループを含んでおり、Ｐ２はＤ−Ｅループを含んでおり、Ｐ３はＥ−Ｆループを含んでおり、Ｐ４はＦ−Ｇループを含んでおり、Ｐ５はＡ−Ｂループを含んでおり、Ｐ６はＢ−Ｃループを含んでいる。したがって、これらループのミモトープは本発明の一側面を構成する。
【００２２】
特に好ましい薬は、エピトープＰ１とそのミモトープに基づいている。このエピトープを含むペプチドとそのミモトープは、キャリヤーと結合したときに、ヒト好塩基球からのヒスタミン放出を抑制することのできる抗ＩｇＥ免疫応答を誘導する能力を有する。さらに、この免疫応答はアナフィラキシー非誘発性である。Ｐ１のミモトープは、主として、免疫原にしたときに免疫応答を引き起こしうる任意のものであると記述される。この免疫応答により、ＩｇＥのＣε２ドメインにおいてＰ１を認識することができる。
【００２３】
Ｐ１は、Ｃε２ドメインのＣ−Ｄループに対応する。折り畳まれている免疫グロブリンのＣ−Ｄループ構造は、Ｃβ鎖の終端とＤβ鎖の始端を結合する鎖に対応している（『タンパク質の構造入門』、第２版、３０４ページ、ブランデンとトゥーズ、ガーランド出版、ニューヨーク、ＩＳＢＮ ０ ８１５３ ２３０５−０）。この結合鎖は、ＩｇＥ分子のアミノ酸残基番号トリプトファン２６８〜セリン２８０にほぼ対応している。したがって、ＩｇＥのＣε２ドメインのＣ−Ｄループのミモトープと、ＩｇＥのＣε２ドメインのＣ−Ｄループに結合することのできるリガンドは、本発明の好ましい一側面を構成する。
【００２４】
上で同定したＩｇＥのエピトープのペプチド・ミモトープに対し、選択したアミノ酸の付加、欠失、置換の操作を施すことにより、特定の目的に向けた設計にすることができる。したがって、本発明のペプチドを修飾して、タンパク質キャリヤーに容易に共役するようにできる。例えば、化学的共役法の中には、ＩｇＥのエピトープに対する末端システインを含めることが望ましいものがあろう。さらに、キャリヤー・タンパク質と共役したペプチドに、このペプチドの共役した末端から離れた疎水性末端を含め、このペプチドの共役していない自由な末端が、キャリヤー・タンパク質の表面と会合したままにすることも望ましかろう。こうするとペプチドの立体配座の自由度が小さくなり、したがってこのペプチドが、ＩｇＥ分子全体で見られるようなＩｇＥペプチドの立体配座と非常によく似た立体配座として提示される確率が大きくなる。例えばペプチドを変化させて、Ｎ末端にはシステインを、Ｃ末端には疎水性アミド化された尾部を持つようにすることができる。また、１つまたはそれ以上のアミノ酸のＤ立体異性体を付加または置換することにより、例えばペプチドの安定性を増す有利な誘導体を作り出すことができる。当業者であれば、そのように修飾されたペプチドまたはミモトープは、構成要素であるアミノ酸残基が必ずしも天然の２０種類のアミノ酸には限定されない、全体または一部が非ペプチドのミモトープが可能であることが理解できよう。さらに、このようなペプチドは、従来技術で知られている方法により環状化して、そのペプチドを、ペプチド配列がＩｇＥ分子全体の中にあるときの形と非常に似た立体配座にすることができる。
【００２５】
ジスルフィド架橋の形成を可能にする２つのシステイン残基を含む好ましい環状化ペプチドの具体例としては、ＰＴ１０７９（配列ＩＤ番号１４）、ＰＴ１０７９ｇｓ（配列ＩＤ番号１５）、ＰＴ１０７８（配列ＩＤ番号１６）、Ｐ１５ｑ（配列ＩＤ番号１１）が挙げられる。
【００２６】
さらに、当業者であれば、本発明のミモトープまたは免疫原は、単離されたエピトープよりも長くすることが可能であり、また、この明細書に開示した配列を含んでいてもよいことが理解できよう。したがって、本発明のミモトープは、Ｎ末端および／またはＣ末端の一端または両端に、他の多数の天然の残基からなる延長部を有することが可能である。ペプチド・ミモトープは、天然のＩｇＥ配列とは配列の方向が逆転しているレトロ配列にすることもできる。あるいは、ペプチド・ミモトープの配列の全部または少なくとも一部がＤ立体異性体のアミノ酸（反転配列）となっていることも可能である。また、ペプチド配列は、配列の方向が逆転していてアミノ酸がＤ立体異性体の形態であるレトロ−反転も可能である。このようなレトロ・ペプチド、またはレトロ−反転ペプチドは非自己であり、免疫系における自己寛容の問題を解決することができる（例えばＰ１５ｒ。以下の説明を参照のこと）。
【００２７】
また、ペプチド・ミモトープは、本発明のＩｇＥエピトープに結合することのできる抗体を用い、ファージ提示技術などの方法を利用して同定することができる（ＥＰ ０ ５５２ ２６７ Ｂ１）。この方法により、天然ペプチドの構造と似ているために抗天然ペプチド抗体と結合できるが、天然のＩｇＥペプチドとは必ずしも配列が有意なホモロジーではない多数のペプチド配列が生み出される。この方法は、免疫原性の諸特性が増強された（ＩｇＥ受容体または抗ＩｇＥ抗体へのアフィニティ結合特性がより大きいとか、ＩｇＥに結合するポリクローナル免疫応答をより大きなアフィニティで誘導することができるなどの）ペプチドを同定できるようにすることが可能であるとか、天然のペプチド配列を用いることに付随する可能性のある潜在的な自己抗原寛容のあらゆる問題を解決できるといった大きな利点を有する。さらに、この方法により、認識されたミモトープ配列に共通する化学的特性に関し、それぞれの天然ペプチドについて認識パターンを同定することができる。
【００２８】
修飾されたペプチド・ミモトープの好ましい具体例と、ミモトープに由来するバクテリオファージの具体例としては、以下のものがある：
【００２９】
【表２】
2004538238.tif 000003
【００３０】
他のミモトープにおいては、Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３、Ｐ４、Ｐ５、Ｐ６、またはＰ７のアミノ酸残基は、それぞれ、非常によく似たアミノ酸で置換することができる。例えばＡは、以下の表に示したようにＶ、Ｌ、またはＩで置換することができる：
【００３１】
【表３】
2004538238.tif 000004
【００３２】
表面が露出したＣε２ ＩｇＥエピトープに結合できるリガンドと、そのリガンドを含む薬理学的組成物は、本発明の一部をなす。そのようなリガンドは、受動的な予防法または治療法で用いることができる。例えばアレルギー疾患を改善するために、そのリガンドを患者に投与する。このような有用なリガンドの具体例としては、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体が挙げられる。例えば、アレルギーの予防または治療のため、ある動物の体内に誘導された抗体を精製して別の動物に受動的投与することができる。本発明のペプチドは、モノクローナル抗体ハイブリドーマ（例えばケーラーとミルステイン、Ｎａｔｕｒｅ、第２５６巻、４９５ページ、１９７５年の技術を用いる）、ヒト化されたモノクローナル抗体、またはＣＤＲ移植されたモノクローナルを従来技術を用いて産生させるのにも用いることができる。したがって、本発明の関連する一側面として、ＩｇＥのＣε２ドメインの表面露出エピトープと結合できるリガンドがある。このようなリガンドの具体例としては抗体（またはＦａｂ断片）が挙げられる。このような抗体は、受動的な免疫防御または免疫療法で使用したり、ＩｇＥペプチド・ミモトープの同定に用いたりすることができる。
【００３３】
“抗体”という用語は、この明細書では、有効な抗原結合特異性を有する分子を指すのに用いる。当業者であれば、この用語には、同じ機能または非常によく似た機能を果たす抗体断片であるポリペプチドまたは抗体誘導体であるポリペプチドも含めうることが容易に理解できよう。そこでこのような抗体断片または抗体誘導体は、この明細書で用いる抗体という用語に含めるつもりである。
【００３４】
好ましいリガンドはモノクローナル抗体である。特に好ましいリガンドは、Ｐ１のリガンドであり、それはモノクローナル抗体であることが好ましい。例えばＰＴｍＡｂ００１１は、ブダペスト条約に基づく特許寄託としてＥＣＡＣＣ（欧州細胞培養物コレクション、ワクチン研究・製造研究所、公衆衛生研究部門、応用微生物学研究センター、ポートン・ダウン、ソールズベリー、ウィルトシャー、ＳＰ４ ＯＪＧ、イギリス）に１９９９年３月８日に登録番号９９０３０８０５号として寄託されたマウスのＩｇＧ１タイプのモノクローナル抗体の参照名である。
【００３５】
例えばＰＴｍＡｂ００１１はＣε２のＣ−Ｄループを認識する。ＰＴｍＡｂ００１１はまた、ヒト好塩基球の表面の高アフィニティ受容体と結合したとき、脱顆粒を起こすことなくＩｇＥを認識することができる。ＰＴｍＡｂ００１１はさらに、ＩｇＥがＦｃεＲ１αに結合するのを妨げることにより非アレルギー性好塩基球の受動的感作を阻止し、アレルギー性好塩基球においてＬｏｌＰ１によってトリガーされるヒスタミンの放出を抑制することができる。Ｃε２のＣ−Ｄループを認識する別のモノクローナル抗体はＰＴｍＡｂ０００５である（シグマ・ケミカルズ社からカタログ番号Ｉ６５１０、クローン番号ＧＥ−１として入手可能）。本発明により、このモノクローナル抗体が薬理学的組成物中に含まれた形で提供される。
【００３６】
Ｐ１のリガンドは、バクテリオファージ選別法において新しいＰ１ミモトープを同定するのに用いられている。例えばＰ１を認識することのできるモノクローナル抗体は、以下の配列を発現するバクテリオファージと結合する：
【００３７】
【表４】
2004538238.tif 000005
【００３８】
Ｃε２ ＩｇＥのＣ−Ｄループの他のペプチド・ミモトープは、ＰＴｍＡｂ００１１とＰＴｍＡｂ０００５を用いたバクテリオファージ選別法によって同定されている。そのようなミモトープの具体例としては以下のものが挙げられる：
【００３９】
【表５】
2004538238.tif 000006
【００４０】
したがって、ＰＴｍＡｂ０００５またはＰＴｍＡｂ００１１と結合できるＣε２ ＩｇＥのミモトープと、このミモトープを含む免疫原は、本発明の重要な一側面を構成する。ＰＴｍＡｂ０００５またはＰＴｍＡｂ００１１と結合することのできるミモトープを含むワクチンは、アレルギー治療に有効である。
【００４１】
Ｐ１のミモトープについての幅広い定義を制限することなく、これらのファージ配列および他のファージ配列から、Ｐ１様ペプチドの部分集合についてコアとなるパターンを同定した。このパターンはＰ１のミモトープの部分集合であり、各位置のアミノ酸を、以下のような特定の抗Ｐ１モノクローナル抗体が認識するのに望ましい化学的性質という観点から見たミモトープの記述になっている。
【００４２】
ｙ ｈ ｘ ｄ ｈ ｈ ａ ｎ ａ ｎ ｘ ｙ
ここに、
ｙ．．． ．．．ｙは環状にすることができる。
【００４３】
ｈは疎水性である（システイン、プロリン、グリシン、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、トリプトファン、メチオニン、フェニルアラニン）。
【００４４】
ｄはイオン結合を与える（アルギニン、リシン、ヒスチジン、グルタミン、アスパラギン、トリプトファン、チロシン、トレオニン、セリン）。
【００４５】
ａは酸性である（アスパラギン酸、グルタミン酸）。
【００４６】
ｎはイオン的に中性／非極性である（アスパラギン酸、グルタミン酸、リシン、アルギニンを除くすべて）。
【００４７】
ｘは任意のアミノ酸である（ｎ＝０〜３）。
【００４８】
したがって、一実施態様では、Ｐ１のミモトープは、上記の一般的なコア構造ｙ ｈ ｘ ｄ ｈ ｈ ａ ｎ ａ ｎ ｘ ｙで記述することができる。ペプチドＰ１またはそのミモトープは、いずれかの端部に他のアミノ酸が隣接して、共役を助けたり、他の任意の目的を果たしていたりしてもよい。
【００４９】
Ｐ１の特に好ましいミモトープは、Ｐ１５ｓ（配列ＩＤ番号１７）である。この配列の残基の中でＱとＭと最初のＤが、ＰＴｍＡｂ００１１とＰＴｍＡｂ０００５の結合活性にとって極めて重要であることがわかっている（実施例を参照のこと）。したがって、Ｐ１５ｓに対するミモトープの配列は、
Ｑ、Ｘ１、Ｍ、Ｄ、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３
となる（本質的ではない残基は、（上に概説したように）似たようなアミノ酸で置換した）。ここにＸ１はＶ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ａの中から選択し、Ｘ２はＤまたはＥであり、Ｘ３はＬ、Ｉ、Ｖ、Ｍ、Ａ、Ｆの中から選択する。
【００５０】
ＰＴｍＡｂ０００５とＰＴｍＡｂ００１１を使用してＩｇＥの新規なミモトープを同定し、続いてそれをアレルギー治療に使用することも、本発明の重要な１つの側面を構成する。ＰＴｍＡｂ０００５は市販されているため、本発明の組成物にはならない。しかしＰＴｍＡｂ０００５を含む薬理学的組成物と、それを利用したＰ１のミモトープの同定法は、本発明の２つの重要な側面を構成する。
【００５１】
Ｐ２、Ｐ３、Ｐ４、Ｐ５のミモトープも、本発明の重要な一側面を構成する。例えばＰ１６とＰ１７は、それぞれＰ２とＰ３のミモトープである。これらのペプチドは、キャリヤー上に適切に提示されたときには、どちらもアナフィラキシー非誘発性である強力な抗ＩｇＥ抗体反応を誘導することができる。
【００５２】
好ましい一実施態様では、同定された上記エピトープを含むペプチド、あるいはペプチド性または非ペプチド性ミモトープを含む本発明のペプチドは、サイズが小さくて、Ｃε２ドメイン全体から選択した領域と似ている。したがってペプチド性ミモトープは、アミノ酸の長さが１００個未満、好ましくは７５個未満、さらに好ましくは５０個未満、最も好ましくは４〜２５個となっているはずであることが予想される。好ましいペプチド・ミモトープの具体例はＰＴ１０７９とＰ１５ｑである。これらは、アミノ酸の長さがそれぞれ２１個と１３個である。非ペプチド・ミモトープは、モル体積に関しては対応するペプチド・ミモトープと似たようなサイズであることが予想される。
【００５３】
当業者にとっては、特定の構造体の状態がミモトープであることを確認するのにさまざまな技術を利用できることは明らかであろう。そうした技術としては、以下のものがある。ミモトープと推定されるものを調べてその免疫原性を確かめることができるため、そのミモトープと推定されるものによって培養した抗血清は、天然のＩｇＥ分子と交差反応するとともに、アレルギー・エフェクター細胞からのアレルギー・メディエーターの放出を阻止する機能も有する。このような反応の特異性は、抗血清の活性を、ミモトープそのものまたは天然のＩｇＥ、および／またはＩｇＥのＣε２内の表面に露出したエピトープと結合することが知られている特異的モノクローナル抗体で阻害するという競合実験によって確かめることができる。競合アッセイで使用するこのようなモノクローナル抗体の具体例としては、例えば、ＰＴｍＡｂ０００５とＰＴｍＡｂ００１１が挙げられる。これらを用いると、ミモトープと推定されるものがＩｇＥのＣε２ドメインのＣ−Ｄループのミモトープであるかどうかを確認することができよう。
【００５４】
本発明の一実施態様では、ＩｇＥのエピトープまたはミモトープを含む上記の少なくとも１つのペプチドをキャリヤー分子と結合させ、ワクチン・プロトコルのための免疫原を作る。キャリヤー分子は天然のＩｇＥ分子とは関係がないことが好ましい。ペプチドまたはミモトープは、化学的共有結合によって、または遺伝子工学で作った融合パートナーを発現させることによって、あるいはまたリンカー配列によって、結合させることができる。
【００５５】
免疫誘導性キャリヤーとペプチドを共有結合させるには、従来技術において周知の方法を用いることができる。例えば、直接的共有結合のためには、カルボジイミド、グルタルアルデヒド、または（Ｎ−［γ−マレイミドブチリルオキシ］）スクシンイミドエステルを用いることが可能である。その際、一般に市販されているＣＤＡＰやＳＰＤＰなどのヘテロ二機能性リンカーを（製造者の指示に従って）利用する。結合反応の後、免疫原は、透析法、ゲル濾過法、分画法などによって容易に単離し、精製することができる。
【００５６】
本発明の免疫原で使用するキャリヤーのタイプは、当業者には容易にわかるであろう。キャリヤーの機能は、ＩｇＥペプチドに対する免疫応答の誘導を促進するためにサイトカインの協力を提供することである。本発明で用いることのできるキャリヤーのリストには、スカシガイのヘモシアニン（ＫＬＨ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）などの血清アルブミン、破傷風毒素（ＴＴ）やジフテリア毒素（ＤＴ）などの不活性化した細菌毒素またはこれらの組み換え断片（例えば、ＴＴの断片Ｃのドメイン１、またはＤＴのトランスロケーション・ドメイン）、ツベルクリンの精製タンパク質誘導体（ＰＰＤ）などが含まれるが、これだけに限定されるわけではない。また、ミモトープまたはエピトープは、リポソーム・キャリヤーに直接共役させることもできる。なおこのキャリヤーは、Ｔ細胞を助けることのできる免疫原をさらに含んでいてもよい。ペプチドとキャリヤーの比は、約１：１〜２０：１であることが好ましく、各キャリヤーは３〜１５個のペプチドを含んでいることが好ましい。
【００５７】
本発明の一実施態様では、好ましいキャリヤーは、ヘモフィルス・インフルエンザに由来するプロテインＤである（ＥＰ ０ ５９４ ６１０ Ｂ１）。プロテインＤは、ヘモフィルス・インフルエンザに由来するＩｇＤ結合タンパク質であり、フォースグレンがこれについて特許を取得している（ＷＯ ９１／１８９２６につき、ＥＰ ０ ５９４ ６１０ Ｂ１として特許取得）。場合によっては、例えば組み換え免疫原発現系において、プロテインＤの断片、例えばプロテインＤの１／３（プロテインＤのＮ末端の１００〜１１０個のアミノ酸を含む（ＧＢ９７１７９５３．５））を用いることが望ましかろう。
【００５８】
本発明のＩｇＥペプチドを提示する別の好ましい方法では、組み換え融合分子が関係する。例えばＥＰ ０ ４２１ ６３５ Ｂは、キメラになったヘパドナウイルスのコア抗原粒子を用いてウイルス様粒子内で外来性ペプチド配列を提示する方法を記述している。そのようなわけで、本発明の抗原は、Ｂ型肝炎コア抗原からなるキメラ粒子内に提示されるＩｇＥペプチドを含むことができる。さらに、組み換え融合タンパク質は、本発明のミモトープと、インフルエンザ・ウイルスのＮＳ１などのキャリヤー・タンパク質を含むことができる。組み換えによって発現する本発明の任意のタンパク質をコードする核酸も、本発明の一側面を構成する。
【００５９】
本発明で用いるペプチドは、従来技術で周知の固相法を用いて容易に合成することができる。適切な合成は、“Ｔ−ｂｏｃ”法または“Ｆ−ｍｏｃ”法を用いて行なうことができる。環状ペプチドは、周知の“Ｆ−ｍｏｃ”法とポリアミド樹脂を用いた固相法により、完全に自動化された装置内で合成することができる。また、当業者であれば、この方法を手で実施するのに必要な実験手続きを知っているであろう。固相合成の技術と方法は、ＩＲＬによってオックスフォード大学出版から発行されたＥ． アサートンとＲ．Ｃ． シェパード著、『固相ペプチド合成：実践的方法』、１９８９年に記載されている。また、ペプチドは、ミモトープをコードしている核酸分子を細菌または哺乳類の細胞系列の中で発現させた後、その発現したミモトープを精製するという操作を含む組み換え法によっても産生させることができる。ペプチドやタンパク質を組み換え発現させる技術は従来から知られており、マニアティス， Ｔ．、フリッチ， Ｅ．Ｆ．、サムブルック他、『分子クローニング、実験室マニュアル』、第２版、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス、コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨーク州、１９８９年に記載されている。
【００６０】
本発明の免疫原は、ミモトープなどの上記ペプチドを含むことができる。また本発明の免疫原としては、免疫学的交差活性誘導体、またはその断片が可能である。本発明の免疫原、ペプチド、ミモトープ、またはこれらの誘導体をコードする核酸の一部も本発明の一部を構成する。さらに、本発明の免疫原は、同じ免疫原内に、２種類以上のエピトープ、すなわちＰ１とＰ２を含むことができる。あるいはミモトープそのものが、２種類以上のエピトープを含むことができる。
【００６１】
したがって本発明により、（上で説明したように）本発明のエピトープまたはミモトープを含む新規なペプチドを用いてアレルギーを予防または治療するための薬理学的組成物の製造方法が提供される。本発明のミモトープまたはペプチドを含む免疫原と、キャリヤー分子も、アレルギーの免疫防御または治療のためのワクチンで使用するのに提供される。したがって、本発明のミモトープ、ペプチド、または免疫原は、医学と、アレルギー疾患の治療または予防において使用するのに提供される。従って、アレルギーを患っている患者またはアレルギーになりやすい患者に本発明のワクチンまたは薬を投与する操作を含むアレルギー治療法が提供される。
【００６２】
本発明のワクチンは、アジュバントも含んでいることが好ましい。本発明のワクチンにとって適切なアジュバントは、ＩｇＥペプチド免疫原に対する抗体応答を増大させることのできるアジュバントである。アジュバントは従来技術でよく知られている（『ワクチンの設計  −  サブユニットとアジュバントのアプローチ』、１９９５年、薬理学のバイオテクノロジー、第６巻、パウエル， Ｍ．Ｆ．とニューマン， Ｍ．Ｊ．編、プレナム・プレス、ニューヨークとロンドン、ＩＳＢＮ ０−３０６−４４８６７−Ｘ）。本発明の免疫原とともに用いるのが好ましいアジュバントとしては、アルミニウム塩またはカルシウム塩（例えば水酸化物塩、リン酸塩）が挙げられる。他のアジュバントとしては、サポニン・アジュバントであるＱＳ２１（アメリカ合衆国特許第５，０５７，５４０号）と３Ｄ−ＭＰＬ（イギリス国第２２２０ ２１１号）がある。
【００６３】
本発明のワクチンは、一般に、開始用量と追加用量の投与がある。追加用量は、１回ごとの投与間隔を十分にあけるか、好ましくは、毎年投与するか、抗体の循環レベルが所望のレベルよりも下がった時期に投与することを想定している。追加用量は、元のキャリヤー分子が存在しないペプチドで構成されている可能性がある。このような追加投与物は、別のキャリヤーを含んでいてもよいし、まったくキャリヤーを含んでいなくてもよい。
【００６４】
本発明のさらに別の側面では、医学で使用される本明細書記載のワクチンが提供される。
【００６５】
本発明のワクチン調製物は、このワクチンを全身経路または粘膜経路を通じて投与することにより、アレルギーになりやすい哺乳類、またはアレルギーになっている哺乳類を保護または治療するのに用いることができる。投与法としては、筋肉内注射、腹腔内注射、皮内注射、皮下注射、または、経口／消化器、呼吸器、泌尿生殖器といった経路の粘膜への投与が可能である。好ましい投与経路は経皮経路であり、例えば皮膚パッチによる。
【００６６】
１回のワクチン用量に含まれるタンパク質の量は、典型的なワクチンにおける重大なマイナスの副作用なしに免疫防御応答を誘導する量を選択する。そのような量は、どの特異的免疫原を用いるかと、どのようにその特異的免疫原を提示するかによって異なるであろう。一般に、１回の用量は、タンパク質を１〜１０００μｇ、好ましくは１〜５００μｇ、さらに好ましくは１〜１００μｇ、最も好ましくは１〜５０μｇ含むことになる。個々のワクチンの最適量は、被検対象内における適切な免疫応答を観察することを含め、標準的な研究によって確認する。被検対象は、最初のワクチンの後、１回ごとの投与間隔を十分にあけた１回〜数回の追加免疫処置を受ける可能性がある。
【００６７】
リガンドを含む上記の薬理学的組成物も、本発明の一側面を構成する。本発明により、医学におけるリガンドの使用法と、アレルギーを治療するための薬の製造におけるリガンドの使用法も提供される。
【００６８】
本発明のさまざまな側面は、診断でも利用することができる。例えば、本発明のさまざまなペプチドを認識する一群のリガンドは、患者から採取した血清中の抗ＩｇＥの力価を調べるのに用いることができる。さらに、ペプチドそのものは、循環する抗ＩｇＥをタイプ分けするのに用いることができる。ある種の状況では、例えばアトピー患者の体内を循環する抗ＩｇＥのレベルを調べることが適切であろう。すると、本発明のペプチドとポリクローナル／モノクローナル抗体を用いてアトピーの診断を行なうことができる。さらに、ペプチドを用いて、患者の血液から循環する抗ＩｇＥをアフィニティ除去した後、その血液を再びその患者に注入することができる。
【００６９】
免疫防御またはアレルギーの治療のため、ＩｇＥの構造についてのコンピュータ・モデルを用いてＩｇＥの表面露出ペプチドを同定する操作を含むペプチド免疫原同定法も本発明の一部を構成する。次にこれら領域を免疫原にして、医学で利用する。したがって、アレルギーの免疫防御と治療で用いるペプチドを同定する際にＰＴｍＡｂ０００５とＰＴｍＡｂ００１１を使用することは、本発明の一部を構成する。
【００７０】
ワクチン調製物は、全体像が、ヴォラー他編、『ワクチンの新しい潮流と展開』、ユニヴァーシティ・パーク・プレス、バルチモア、メリーランド州、アメリカ合衆国、１９７８年に記載されている。巨大分子に対するタンパク質の共役は、リカイトのアメリカ合衆国特許第４，３７２，９４５号と、アーモア他のアメリカ合衆国特許第４，４７４，７５７号に開示されている。
【００７１】
ＩｇＥのアミノ酸残基のナンバリング・システムは、ドリントン， Ｋ．Ｊ．とベンニッチ， Ｈ．、Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｒｅｖ．、第４１巻、３−２５ページ、１９７８年；ベンニッチ， Ｈ．とバー−リンダストローム， Ｈ． フォン、Ｐｒｏｇ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．、第１１巻、４９−５８ページ、１９７８年に記載されているシステムであることがしばしばある。しかし、その後ヒトＩｇＥの遺伝子およびｃＤＮＡ配列が決定された（マックス， Ｅ．Ｅ．他、Ｃｅｌｌ、第２９巻、６９１−６９９ページ、１９８２年；フラナガン， Ｊ．Ｇ．とラビッツ， Ｔ．Ｈ．、前掲文献、１９８２年；ケンテン， Ｊ．Ｈ．他、前掲文献、１９８２年）ことにより、余分なロイシンがＣε２内の２７３番目の位置（カバート・ナンバリング）にあることが明らかになった。このことは初期の文献には報告されていない。本発明で利用するナンバリング・システムは、したがって、ドリントン， Ｋ．Ｊ．とベンニッチ， Ｈ．によるものとは異なる可能性がある。
【００７２】
本発明を以下の実施例に基づいて説明するが、本発明がこれら実施例に限定されることはない。
【００７３】
第１部  本発明のミモトープと免疫原
実施例１．
１．１  表面が露出したエピトープの同定、化学的共役、血清学的方法
ＩｇＥのＣε２ドメインの表面露出エピトープを、パドランとデイヴィス（Ｍｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．、第２３巻、１０６３−１０７５ページ、１９８６年）が記述しているヒトＩｇＥのモデル構造を用いて同定した。連続的なペプチドと溶媒にさらしたペプチドの両方を同定した。これは、分子シミュレーション・ソフトウエア（ＭＳＩ）を用いてＩｇＥの各アミノ酸の近づきやすさを計算し、近づくことが可能な表面を５残基移動ウインドウで平均し、その５マーの平均値が８０平方オングストロームよりも大きいＩｇＥペプチドの領域を同定することによって実現した。テスト結果を図１に示す。
【００７４】
結果
図１から、また１９９０年のヘルムらのモデル（ＰＤＢ（タンパク質データバンク、構造生物情報学のための共同研究所）に１９９０年１０月２日に提出された２ＩｇＥモデル構造）を利用して同じ方法を繰り返した結果から、ＩｇＥに対する抗体を作るための免疫原として使用できる多数の天然ペプチドが存在していることがわかる。
【００７５】
【表６】
2004538238.tif 000007
【００７６】
これらペプチド、またはそのミモトープを合成し、それをキャリヤーと共役させるか、あるいはそれを肝炎コア抗体構造体にして、ウイルス様粒子を発現する組み換えペプチドを作る。
【００７７】
１．２  スクシンイミド−マレイミド交差リンカーを用いたＩｇＥペプチド／プロテインＤ複合体の合成
スクシンイミド−マレイミド交差リンカーを用いてプロテインＤをＩｇＥペプチドに直接共役させることにより、本発明の抗原を作ることができる。この化学反応を利用すると、スクシンイミド基の固定を通じてキャリヤー残基のＮＨ２活性化を制御することが可能になる。マレイミド基はシステイン結合部位である。したがって、以下の実施例の目的を達成するためには、共役するはずのＩｇＥペプチドのＮ末端にシステインを付加する必要がある。
【００７８】
結合剤は選択的ヘテロ二機能性交差リンカーであり、その一端は、スクシンイミジルエステルによってタンパク質キャリヤーのアミノ基を活性化し、他端は、マレイミド基によってペプチドのスルフヒドリル基を結合させる。反応経路は以下の通りである。
【００７９】
ａ．リシンとスクシンイミジルエステルの反応によるタンパク質の活性化
【００８０】
【化１】
2004538238.tif 000008
【００８１】
ｂ．マレイミド基との反応による、活性化したタンパク質とペプチド中のシステインの結合
【００８２】
【化２】
2004538238.tif 000009
【００８３】
１．３  ＩｇＥペプチド−プロテインＤ複合体の調製
プロテインＤを、ｐＨが７．２で濃度が２．５ｍｇ／ｍｌのリン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）に溶解させる。結合剤（Ｎ−［γ−マレイミドブチリルオキシ］スクシンイミドエステル − ＧＭＢＳ）をＤＭＳＯの中に１０２．５ｍｇ／ｍｌの割合で溶かし、タンパク質溶液に添加する。割合としては、１ｍｇのプロテインＤにつき、ＧＭＢＳを１．０２５ｍｇ用いる。反応溶液を室温で１時間培養する。副産物を脱塩ステップで除去し、セファクリル２００ＨＲ透過ゲルの上に載せる。使用する溶離液は、ｐＨが６．８の０．１％リン酸緩衝溶液−トゥイーン８０（商標）である。活性化したタンパク質を回収し、貯蔵する。ペプチド（表１に記載のもの、あるいはその誘導体またはミモトープ）を４ｍｇ／ｍｌの割合で０．１Ｍの酢酸に溶かし、ジスルフィド結合が形成されないようにする。活性化した１分子のプロテインＤにつき２〜２０個のペプチドというモル比にして結合を行なわせる。ペプチド溶液をゆっくりとタンパク質に添加し、得られる混合物を２５℃で１時間培養する。結合中はｐＨを６．６に維持する。２５℃でｐＨを６．５にしてシステインを３０分間添加する（１ｍｇの活性化したプロテインＤにつき０．１ｍｇのシステインを、０．１Ｍの酢酸に４ｍｇ／ｍｌとなるように溶かす）ことにより停止ステップを実施する。１５０ｍＭのＮａＣｌ＋０．１％のトゥイーン８０に対して２回透析を行ない、過剰なシステインまたはペプチドを除去する。
【００８４】
最終ステップは、０．２２μｍの膜を使った滅菌濾過である。最終生成物は透明な濾過性溶液であり、それを４℃で保存する。ペプチド／プロテインＤの最終的な比は、アミノ酸分析によって測定する。
【００８５】
同様の方法で、本発明のペプチドを、ＢＳＡを含むキャリヤーと共役させることができる。
【００８６】
Ｐ１のミモトープが合成されてＣＬＥＤＧＱＶＭＤＶＤＬＬ（Ｐ１５、配列ＩＤ番号８）が得られた。これを、上記の方法を利用してプロテインＤとＢＳＡの両方に共役させた。
【００８７】
１．４  ＥＬＩＳＡ法
抗ペプチドＥＬＩＳＡまたは抗ペプチド・キャリヤーＥＬＩＳＡ
抗ペプチド免疫応答および抗キャリヤー免疫応答を、以下に概略を示すＥＬＩＳＡ法で調べた。マイクロタイター・プレート（ナンク社）を、２μｇ／ｍｌのストレプトアビジンを含むＰＢＳ（４℃、一晩）中にて特異的抗原でコーティングし（続いてビオチン化したペプチド（１μＭ）で３７℃にて１時間培養し）た。３×ＰＢＳ−０．１％のトゥイーン２０で洗浄する。３７℃で１時間にわたり、ＰＢＳ−１％のＢＳＡ−０．１％のトゥイーン２０（飽和緩衝溶液）でプレートを飽和させる。添加その１として、抗体＝（飽和緩衝溶液中に）２ステップで希釈した血清を添加し、３７℃で１時間３０分培養する。３×ＰＢＳ−０．１％のトゥイーン２０で洗浄する。添加その２として、ＨＲＰと結合した抗マウスＩｇ（または抗マウス・アイソタイプ特異的モノクローナル抗体）を添加する。３７℃で１時間培養する。５×ＰＢＳ−０．１％のトゥイーン２０で洗浄する。暗所で室温にて１０分間ＴＭＢ（バイオラド社）を用いることにより、見えなかったものを見えるようにする。０．４ＮのＨ２ＳＯ４を用いて反応を止める。
【００８８】
マウス血清における抗ヒトＩｇＥの反応性の検出方法（ＩｇＥプレート結合ＥＬＩＳＡ）
ｐＨが９．６のカルボン酸塩／ジカルボン酸塩コーティング用緩衝溶液の中で、３７℃で１時間、または４℃で一晩かけて、ＥＬＩＳＡプレートを、１μｇ／ｍｌのヒトのキメラＩｇＥでコーティングする。５％ｗ／ｖのマーヴェル粉ミルクを含むＰＢＳ／０．０５％のトゥイーン２０を用い、３７℃で１時間かけて非特異的結合部位をブロックする。ＰＢＳ／０．０５％のトゥイーン２０／１％ｗ／ｖのＢＳＡ／４％のウシ胎仔血清の中でさまざまな濃度に順次希釈したマウス血清を３７℃で１時間にわたって添加する。ポリクローナル血清の結合をヤギ抗マウスＩｇＧ−ビオチン（１／２０００）で検出し、次いでストレプトアビジン−ＨＲＰ（１／１０００）で検出する。共役した抗体を、ＴＭＢ基質を用いて４５０ｎｍで検出する。ＰＴｍＡｂ００１１の標準曲線をそれぞれのプレートに含めておき、血清サンプル中の抗ＩｇＥの活性をμｇ／ｍｌの単位で計算できるようにする。
【００８９】
マウス血清中で抗ヒト受容体と結合したＩｇＥの活性の検出方法
ｐＨが９．６のカルボン酸塩／ジカルボン酸塩コーティング緩衝溶液の中で、３７℃で１時間、または４℃で一晩かけて、ＥＬＩＳＡプレートを、０．５μｇ／ｍｌの組み換えヒトＦｃεＲ１αでコーティングする。５％ｗ／ｖのマーヴェル粉ミルクを含むＰＢＳ／０．０５％のトゥイーン２０を用い、３７℃で１時間かけて非特異的結合部位をブロックする。次に、１μｇ／ｍｌのヒトＩｇＥを３７℃で１時間にわたって添加する。次に、ＰＢＳ／０．０５％のトゥイーン２０／１％ｗ／ｖのＢＳＡ／４％のウシ胎仔血清の中でさまざまな濃度に順次希釈したマウス血清を３７℃で１時間にわたって添加する。ポリクローナル血清の結合をヤギ抗マウスＩｇＧ−ビオチン（１／２０００）で検出し、次いでストレプトアビジン−ＨＲＰ（１／１０００）で検出する。共役した抗体を、ＴＭＢ基質を用いて４５０ｎｍで検出する。ＰＴｍＡｂ００１１の標準曲線をそれぞれのプレートに含めておき、血清サンプル中の抗ＩｇＥの活性をμｇ／ｍｌの単位で計算できるようにする。
【００９０】
ミモトープ・ペプチド、可溶性ＩｇＥ、またはＰＴｍＡｂ００１１がＩｇＥと結合する際の競合
あらかじめブロックしたポリスチレン製９６ウエル・プレートの中で、マウスのポリクローナル血清の１種類の希釈液を、１種類の濃度のミモトープ・ペプチド、またはヒトＩｇＥと混合する。この混合物を３７℃で１時間培養し、次に、ＩｇＥでコーティングされたＥＬＩＳＡプレートに３７℃で１時間かけて添加する。ポリクローナル血清の結合をヤギ抗マウスＩｇＧ−ビオチン（１／２０００）で検出し、次いでストレプトアビジン−ＨＲＰ（１／１０００）で検出する。共役した抗体を、ＴＭＢ基質を用いて４５０ｎｍで検出する。血清とＰＴｍＡｂ００１１がＩｇＥとの結合において競合するようにするため、血清とＰＴｍＡｂ００１１−ビオチンの混合物を、ＩｇＥでコーティングされたＥＬＩＳＡプレートに添加する。ＰＴｍＡｂ００１１の結合を、ストレプトアビジン−ＨＲＰ（１／１０００）で検出する。
【００９１】
１．５  ヒト好塩基球アッセイ
ヒト好塩基球（ＨＢＡ）を用いて２種類のアッセイを行なった。１つは、モノクローナル抗体のアナフィラキシー誘発性を調べるためであり、単離したＰＢＭＣに抗体を添加する操作を行なう。もう１つは、あらかじめＨＢＡを培養し、ＬｏｌＰＩ（強力なアレルゲン）によって引き起こされるヒスタミン放出をモノクローナル抗体が抑制することを測定するためである。
【００９２】
アレルギーのドナーから静脈穿刺によって血液を回収し、０．１容積の２．７％ＥＤＴＡ（ｐＨ７．０）を収容したチューブに入れる。次にこの血液を、０．１％ヒト血清アルブミン（ＨＢＨ／ＨＳＡ）を含む等容積のＨＢＨ溶媒を用いて１／２に希釈する。得られる細胞分散液を、５０容積％フィコール−パックの上に層をなすようにして載せ、４００ｇで室温にて３０分間遠心分離する。境界面の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）層を回収し、ペレットを廃棄する。細胞をＨＢＨ／ＨＳＡの中で１回洗浄し、数を数え、細胞密度が１ｍｌにつき２．０×１０６個となるようにしてＨＢＨ／ＨＳＡの中に再び分散させる。この細胞分散液１００μｌを、希釈した試験サンプルまたはモノクローナル抗体を１００μｌ含むＶ底の９６ウエル・プレートに添加する。それぞれの試験サンプルをさまざまな希釈度でテストするが、テストは、各希釈度について６つのウエルで行なう。ウエルの内容物をプレート撹拌装置を用いて軽く混合してから、１２０ｒｐｍの撹拌速度で３７℃にて３０分間培養する。
【００９３】
各血清希釈物につき、３つのウエルにはＬｏｌＰＩ抽出物を１０μｌ添加し（最終希釈度１／１００００）てトリガーとし、３つのウエルにはアナフィラキシー誘発性を調べるためにＨＢＨ／ＨＳＡを１０μｌ添加する。ウエルの内容物を再びプレート撹拌装置を用いて混合してから、１２０ｒｐｍの撹拌速度で３７℃にてさらに３０分間培養する。培養を終えてから、５００ｇで５分間遠心分離する。上澄みを除去し、市販されているヒスタミンＥＩＡ測定キット（イムノテック社）を用いてヒスタミン・アッセイを行なう。試験サンプルを含まない対照のウエルをルーチン作業に含め、自発的放出とトリガーによる放出を調べる。細胞と０．０５％のイゲパル洗浄剤を含むウエルもルーチン作業に含め、細胞の全ヒスタミンを調べる。
【００９４】
結果は以下のように表記する。
【００９５】
アナフィラキシー誘発アッセイ
試験サンプルに起因するヒスタミン放出＝（試験サンプルで処理した細胞から放出されたヒスタミンの％）−（自発的なヒスタミン放出の％）。
【００９６】
遮断アッセイ
ヒスタミン放出の抑制度は、以下の式を用いて計算することができる：
抑制％＝［１−（試験サンプルで処理した細胞から放出されたヒスタミン＊）／（抗原で刺激した細胞から放出されたヒスタミン＊）×１００］。
＊自発的放出が補正された数値。
【００９７】
実施例２．Ｐ１５複合体（Ｐ１５−ＢＳＡまたはＰ１５−ＰＤ）を用いてマウスを免疫処置することによって抗ヒトＩｇＥ抗体の産生が誘導される
１．４に記載したミモトープＰ１５（２５μｇタンパク質／用量）を含む複合体を、ＷＯ９５／１７２１０に記載されているＱＳ２１と３Ｄ−ＭＰＬを含む水中油乳剤をアジュバントとして、１０匹のＢａｌｂＣマウスからなる複数のグループに投与した。追加投与は、２１日目と４２日目に行ない、血清は４２日目と５６日目に回収することができる。抗ペプチドと抗プレートが結合したＩｇＥに対する免疫応答は、実施例１に記載した方法で調べた。
【００９８】
結果
３回目のワクチン接種から１４日目に測定した抗ペプチド応答と抗ＩｇＥ応答の結果を表２に示す。
【００９９】
【表７】
2004538238.tif 000010
【０１００】
実施例３．複合体で免疫処置した後にマウスに誘導される抗ＩｇＥはアナフィラキシー非誘発性である
複合体で免疫処置したマウスからの完全血清またはそのマウスから精製したＩｇＧについての何種類かの希釈液は、アレルギー患者から採取したばかりの末梢血に由来する好塩基球の存在下でテストすることができる。
【０１０１】
アナフィラキシー誘発性は、以下に説明するように、テストする抗体によって放出が誘導されたヒスタミンを測定することによって評価できる。
【０１０２】
・赤血球をグルコース・デキストラン勾配の上で末梢血から除去する。
【０１０３】
・細胞を洗浄し、テストするサンプル（例えばアレルゲン、抗体、アレルゲン＋抗体など）でコーティングする。
【０１０４】
・培養の後、上澄みを回収し、ヒスタミンの放出を製造者の指示に従って測定する（イムノテック社、ヒスタミン酵素イムノアッセイ・キット）。
【０１０５】
Ｐ１５−ＢＳＡまたはＰ１５−ＰＤとともに生成したどの抗血清もアナフィラキシー誘発性ではなかった。
【０１０６】
実施例４．複合体で免疫処置した後にマウスに誘導される抗ＩｇＥは、アレルゲンがアレルギー患者からの好塩基球に働きかけることで誘導される、ＩｇＥを媒介としたヒスタミン放出を阻止することができる
ヒスタミンの放出は、複合体で免疫処置したマウスからの完全血清またはそのマウスから精製したＩｇＧについての何種類かの希釈液の存在下または不在下で、何種類かの濃度のアレルゲンを用いてトリガーした好塩基球サンプルにおいて測定することができる。抗血清中の抗Ｐ１５抗体の阻止活性は、アレルゲンによって誘導されたヒスタミン放出の抑制を測定することによって評価した。ヒスタミンの放出と抑制は、実施例３に記載したようにして測定した。Ｐ１５はＰ１のミモトープであるため、ＰＴｍＡｂ００１１を対照として用いた。というのも、ＰＴｍＡｂ００１１は同じエピトープ（Ｐ１）に結合することがわかっているからである。結果を表３に示す。
【０１０７】
【表８】
2004538238.tif 000011
【０１０８】
実施例５．Ｐ２とＰ３のミモトープの免疫原性
実施例１．２に記載した方法を用いて以下のミモトープをＢＳＡと共役させ、実施例２に記載したのと同じ処方およびスケジュールに従って、その複合体を用いてマウスを免疫処置した。
【０１０９】
【表９】
2004538238.tif 000012
【０１１０】
最後に免疫処置した後にマウスから採血し、ＩｇＥプレートが結合したＥＬＩＳＡの中の抗ＩｇＥ活性をテストした。個々の結果、結果の平均（Ａｖ）、幾何平均（ＧＭ）を以下の表にまとめてある（ＳＤ＝標準偏差）。
【０１１１】
【表１０】
2004538238.tif 000013
【０１１２】
実施例６．Ｐ１のミモトープの製造と、その免疫原性／機能活性
６．１  免疫原の製造
Ｐ１のミモトープは、ファージ提示法、またはＩｇＥのＣε２ドメインのＣ−Ｄループの分子モデリングによる合理的設計のいずれかによって得られたものであった。以下のペプチドを合成し、ＢＳＡ−ペプチド複合体とＨｅｐＢコア−抗原組み換え構造体の両方を作った。
【０１１３】
【表１１】
2004538238.tif 000014
【０１１４】
ペプチド／タンパク質キャリヤー構造体を以下のようにして製造した。アシルヒドラジン・ペプチド誘導体を化学合成経路１（図２）に示したようにして固相上で調製した。このペプチド誘導体は、ポリアミドまたはポリエチレングリコール−ポリスチレン（ＰＥＧ−ＰＳ）の支持体を用いる周知の“Ｆｍｏｃ”法を利用し、完全に自動化された装置内で従来技術で周知の技術により、容易に調製することができる（固相合成のための技術と方法は、ＩＲＬによってオックスフォード大学出版から発行されたＥ． アサートンとＲ．Ｃ． シェパード著、『固相ペプチド合成：実践的方法』、１９８９年に記載されている）。酸を媒介とした開裂により、直線状で、保護されておらず、修飾されたペプチドが得られた。このペプチドは容易に酸化する。このペプチドを精製することにより、ジスルフィド結合によって修飾されたエピトープを得ることができよう。なお修飾には、『分子生物学におけるいろいろな方法』、第５巻：『ペプチド合成のプロトコル』（Ｍ．Ｗ． ペンニントンとＢ．Ｍ． ダン編）の中で、Ｄ． アンドローが書いた第７章、９１−１７１ページに概略が記載されている方法を用いる。
【０１１５】
このようにして合成されたペプチドは、次に、以下の方法を用いてタンパク質キャリヤー（ここではウシ血清アルブミン（ＢＳＡ））と共役させることができる。
【０１１６】
６．２  修飾されたキャリヤーの合成
アリールアルデヒド基の導入には、化学合成経路２（図３。詳細についてはＷＯ９８／１７６２８を参照のこと）に示したようにして調製したスクシンイミド活性エステル（ＢＡＬ−ＯＳｕ）を用いた。ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）のアミノ基を約５０％置換すると、修飾された可溶性タンパク質が常に得られた。ＢＳＡをさらに置換すると、溶けない構造体が得られた。同じモル数のＢＳＡとＢＡＬ−ＯＳｕをＤＭＳＯ／緩衝溶液の中で２時間混合した（化学合成経路３、図３を参照）。自由なアミノ基を探すフルオレスカミン・テストによって判定したところ、実験的に得られたこのプロトコルにより、ＢＳＡが約５０％置換された。
【０１１７】
６．３  ペプチド−ＢＳＡ構造体
修飾されたペプチドと誘導体化したＢＳＡを単純に組み合わせることにより、透析によって容易に単離することのできるペプチド−ＢＳＡ構造体が得られた（化学合成経路４、図４）。ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて分子量の増加を確認した。
【０１１８】
６．４  肝炎コア抗原構造体
ＥＰ ０ ４２１ ６３５Ｂに記載されている分子生物学の方法を用いて肝炎コア抗原組み換え構造体（ＨＢＣ）も調製した。ＨＢＣの実験において、ＰＴ１０７９を修飾し、末端のリシンを除去した。
【０１１９】
【表１２】
2004538238.tif 000015
【０１２０】
ＰＴｍＡｂ０００５とＰＴｍＡｂ００１１を用いたＢＩＡコア実験により、Ｐ１−ミモトープ・ペプチドの発現を確認した。免疫原性は、ＨＢＣをほんの３μｇ／用量を投与するだけで生じた。
【０１２１】
６．５  免疫原性の研究
ミモトープ／ＨＢＣ構造体とミモトープ／ＢＳＡ構造体を精製してワクチンにするとともに、ＷＯ９５／１７２１０に記載されているＱＳ２１と３Ｄ−ＭＰＬを含む水中油乳剤をアジュバントとして使用した（２５μｇのＢＳＡ複合体／用量）。このワクチンを１０匹のＢａｌｂＣマウスからなる複数のグループに投与した。追加投与は、１４日目と２８日目に行ない、血清は４２日目に回収した。抗プレートに結合したＩｇＥと受容体指向性ＩｇＥに対する免疫応答は、実施例１．４に記載した方法で調べた。また、アレルギー性好塩基球からのヒスタミン放出抑制における抗血清の活性は、実施例１．５に記載した方法で測定した。
【０１２２】
６．６  結果
ＢＳＡ構造体とＨＢＣ構造体はすべて、ＩｇＥが直接ＥＬＩＳＡプレートに結合したときと、高アフィニティ・レポーターのほうを向いたときに、高力価の抗ＩｇＥ抗体を誘導した。さらに、これら応答はすべて、自由なＩｇＥとミモトープそのものが競合し、非特異的ペプチドによっては競合しないという点で特異的であることが確認された。これら免疫原によって誘導される抗ＩｇＥは、アレルギーのドナー（ライムギ、ＬｏｌＰ１）に由来するヒト好塩基球からのヒスタミン放出を抑制することができる。
【０１２３】
Ｃ６７−８の結果については、図５、図６、図１３、図１５を参照のこと。ＰＴ１０７８の結果については、図９、図１０、図１４、図１５を参照のこと。ＰＴ１０７９の結果については、図７、図８、図１４、図１５を参照のこと。ＰＴ１０７９ｇｓの結果については、図１１、図１２、図１５を参照のこと。
【０１２４】
さらに、これらペプチド・ミモトープによって生じた免疫応答は、アナフィラキシー誘発性ではなかった。
【０１２５】
【表１３】
2004538238.tif 000016
【０１２６】
第２部  本発明のエピトープおよびミモトープと結合するリガンド
ペプチド免疫原について第１部で説明した。ペプチド免疫原は、ワクチンの形態で哺乳類に投与すると、免疫応答を引き起こす。この免疫応答により、（ａ）ＩｇＥを認識し、（ｂ）インビトロでヒスタミン放出を抑制することができる。第２部では、本発明のエピトープまたはミモトープと結合することのできるリガンドと、その機能について説明する。ＩｇＥのＣε２のＣ−Ｄループを認識するＰＴｍＡｂ０００５とＰＴｍＡｂ００１１という２種類のモノクローナル抗体が同定されている。このペプチドのミモトープは、第１部において、免疫原性があり、活性ワクチン接種において機能を発揮することが示された。このセクションでは、これらモノクローナル抗体のキャラクテリゼーションについて説明し、これらモノクローナル抗体が受動的ワクチン接種において有効である証拠を示す。
【０１２７】
抗体の標的となるエピトープは、ファージ選別法を用いて、すなわち複数のバクテリオファージ標的の配列アラインメントを用いて同定し、それに続けてドメイン・マッピングと位置指定突然変異誘発によってその同定結果を洗練し、確認した。抗体の機能活性は、インビトロにおける抗ＩｇＥの認識とアレルギー・メディエーターの放出抑制を調べるだけでなく、サルにおけるインビボでの受動的皮膚アナフィラキシー（ＰＣＡ）研究によっても確認した。
【０１２８】
実施例７
７．１  モノクローナル抗体標的のファージマッピング
ファージｇＶＩＩＩｐのＮ末端にＸＣＸ１５、ＸＣＸ１０またはＸＡＸ１０ペプチド配列（ここで、Ｘは任意のアミノ酸である）を表示する３つの異なるファージライブラリーを用いてモノクローナル抗体の結合部位をマッピングするために、ファージ表示ライブラリーを用いた。表６および７は、それぞれ抗ヒトＩｇＥモノクローナル抗体ＰＴｍＡｂ０００５を有するペプチド配列に関する選択の結果を示す。ペプチドおよびヒトＩｇＥ間のアミノ酸パターン類似性は、ＩｇＥのＣε２ドメイン中のｃ−ｄループとの強力な相同適合を明示する。ファージ回復から生成される相同パターンは、Ｑｈｈａｈａｈ（ここで、ｈ＝疎水性アミノ酸およびａ＝アミノ酸）であり、これは、ヒトＩｇＥ  Ｃε２ドメインのＣ−Ｄループ中の配列ＱＶＭＤＶＤＬ（配列番号１７）と一列に整列した。
【０１２９】
ファージパニング実験から得られ、ＰＴｍＡｂ０００５に対して最高アフィニティーを有するペプチドであるＩｇＥＣ６７も、エピトープマッピングした。これは、ＰＣＲ突然変異誘発により無作為突然変異を誘導し、小繊維状ファージタンパク質ｇＩＩＩｐ表示に関してヒューズ５ベクター中でサブクローニングすることにより実施した。ＩｇＥＣ６７突然変異体を、表８に示したようにＰＴｍＡｂ０００５との結合の順に等級付けした。これらのならびにその他の結果は、Ｃε２エピトープと整列したＩｇＥＣ６７内のアミノ酸の重要性を確証した。例えば、Ｌ８Ｐ、Ｄ１０Ｇ、Ｌ１１Ｍ、Ｅ１２ＧおよびＬ１３Ｒ突然変異体はすべて、抗ＩｇＥ  ＰＴｍＡｂ０００５との結合を低減した（データは示されていない）。その他の部位における突然変異は、ＰＴｍＡｂ０００５に対するアフィニティーにほとんど影響を及ぼさなかった。
【０１３０】
最高アフィニティーＰＴｍＡｂ０００５およびＰＴｍＡｂ００１１ファージ表示由来ペプチドから無作為サブライブラリーを作製して、前に記載された方法（Ｙｕ， Ｊ． ａｎｄ Ｓｍｉｔｈ， Ｇ．Ｐ．（１９９６）“Ａｆｆｉｎｉｔｙ ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｈａｇｅ−ｄｉｓｐｌａｙｅｄ ｐｅｐｔｉｄｅ ｌｉｇａｎｄｓ．”Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ， ２６７， ３−２７）を適応することにより、抗体に対するペプチドのアフィニティーを強化した。これは、無作為ＰＣＴ工程による大コートタンパク質（ｇＶＩＩＩｐ）繊維状ファージ表示ベクターから低コピー数小ファージコートタンパク質（ｇＩＩＩｐ）表示ベクターへのＤＮＡサブクローニング転移を包含する。サブライブラリーは、最高アフィニティーＰＴｍＡｂ０００５配位子ＩｇＥＣ６７およびＩｇＥＣ６７−８を含めたいくつかのファージ配列から作製される。Ｃ６７およびＣ６７−８に対するアフィニティー成熟化配列を、それぞれ表８および９に示す。表に含まれるのは、等級順位、それに利用可能な場合にはＢＩＡコアアフィニティーもである。ペプチド発現ファージが免疫原として用いられる場合には、ＩｇＥＣ６７−８は、マウスにおける抗ヒトＩｇＥ応答を誘導可能である。
【０１３１】
７．２  ドメインマッピングによる標的の確証
ＩｇＥ定常ドメインに関してＰＴｍＡｂ０００５およびＰＴｍＡｂ００１１の結合特異性をマッピングするために、多数の構築物を生成した。以下の構築物を生成した：Ｃε２−４、Ｃε２−３、Ｃε３−４、Ｃε３−４Ｌ（Ｃε３−４＋ドメインＣε２およびＣε３間のリンカー配列）およびＣε２単独。
【０１３２】
ヒトＩｇＥ  Ｆｅの種々のドメイン（単数または複数）を包含する断片を、キメラヒトＩｇＥを発現するハイブリドーマ株ＪＷ８／５／１３から得られるｃＤＮＡを用いてクローニングした（Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ， ＭＳ ｅｔ ａｌ（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ ３１４， ２６８−２７０； Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎ， Ｍ ｅｔ ａｌ（１９８７）Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １６６， １３５１−６１）。適切なプライマー対およびＪＷ／８／５／３ｃＤＮＡを鋳型として用いて、ＩｇＥ  Ｆｅ断片を増幅した。ｃε２−４断片は、アミノ酸（ａａ）Ｓ２２５−Ｋ５４７をコードする。ｃε３−４断片は、ａａＧ３３５−５４７をコードする。ｃε３−４Ｌ断片（ドメイン３−４＋ｃε２をｃε３に連結するリンカー配列）は、ａａＥ３２２−Ｋ５４７をコードする。ｃε２−３断片は、ａａＳ２２５−Ｇ４３６をコードする。ｃε２断片は、ａａＳ２２５−Ｓ３２４をコードする。構築物はすべて、検出および精製目的のためのＣＯＯＨ末端ヘキサヒスチジン尾を含有する。発現断片の分泌を指図するためにＣＤ３３由来リーダーコード配列を有する枠内で真核生物発現ベクター中でこれらの断片をクローニングした。これは、哺乳類細胞株中での発現を可能にした。ベクターは、ｐｃＤＮＡ３．１＋（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）から得た。クローン化断片を発現するために、適切なクローンをＣＯＳ−７細胞中にトランスフェクトして、その結果生じた状態調節化培地をトランスフェクションの４８〜６０時間後に収穫した。
【０１３３】
ＥＬＩＳＡ検定により、ＥＬＩＳＡプレートに構築物を結合し、その後モノクローナル抗体を用いたインキュベーション、ならびに抗マウス抗体による暴露により、発現化ＩｇＥドメインとのＰＴｍＡｂ０００５およびＰＴｍＡｂ００１１の結合を検査した。さらに、変性構築物との結合を、ウエスタンブロットの周知の技法により検査した。
【０１３４】
ＰＴｍＡｂ０００５に関する結果は、それらのネイティブ形態でのＣε２−４、Ｃε２−３およびＣε２−との強い結合を示し、ウエスタンブロットにおける変性後も、Ｃε２−４およびＣε２と結合した。Ｃε３−４またはＣε３−４Ｌとの結合は、いずれの検定においても観察されなかった。
【０１３５】
ＰＴｍＡｂ００１１は、それらのネイティブ形態でＣε２−４、Ｃε２−３およびＣε２とも結合し、さらにそれらの変性形態でＣε２−４およびＣε２と結合した。
【０１３６】
したがって、抗体が、ＩｇＥのＣε２ドメイン中に存在する標的エピトープを認識したことは明らかである。
【０１３７】
７．３  特定部位の突然変異誘発による標的の確証
ドメインマッピング試験は、両ｍＡｂがＣε２ドメイン単独と結合し得る、ということを実証した。ファージ表示化ペプチドライブラリーのバイオパニングから得られた配列の分析は、ＰＴｍＡｂ０００５由来配列がＰ１との顕著な類似性を示すことを明示した。この領域は、ＩｇＥモデル構造におけるＣε２のＣ−Ｄβ鎖間にループを形成する。特定部位の突然変異誘発試験に着手して、ＰＴｍＡｂ０００５およびＰＴｍＡｂ００１１に関するエピトープとしてこの配列を有効なものにした。
【０１３８】
パネルファージ配列の分析およびＩｇＥモデル構造（Ｈｅｌｍ ｅｔ ａｌ １９９０，上記）とヒトＩｇＧ１Ｆｃの既知の構造（Ｄｅｉｓｅｎｈｏｆｆｅｒ， Ｊ．， １９８１， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ２０， ２３６１−２３７０）との比較により、抗体認識に関与すると思われる３つの残基の同定がなされた。これらの残基は、グルタミン（Ｑ）２７３、メチオニン（Ｍ）２７５およびアスパラギン酸（Ｄ）２７６である。これらを各々、アラニン（Ａ）および以下に示すような少なくとも１つのその他のアミノ酸残基に変えた。
【０１３９】
Ｑ２７３：ＡおよびＥ（グルタミン酸）
Ｍ２７５：ＱおよびＫ（リシン）
Ｄ２７６：ＡおよびＮ（アスパラギン）
アラニン突然変異は、標的残基の構造および化学的性質をともに変えたが、一方、多の突然変異は構造を保持し（できるだけ近く）、しかし例えばＱ２７３Ｅを変えた。ここで、グルタミン酸は、本質的にはグルタミンと同一構造を有するが、しかし中性の代わりに負に荷電する。
【０１４０】
Ｃε２−４構築物中で、各突然変異を別々に生成した。各突然変異体ポリペプチドを野生型（ＷＴ）Ｃε２−４と同様レベルに発現させ、ＥＬＩＳＡベースの検定において、ＷＴｃε２−４と同様に効率的に、各々を組換え体ＦｃεＲ１αエクトドメインに結合させ得た。同時に、これらのデータは、突然変異は発現系におけるポリペプチドの生成／分泌に影響を及ぼさないが、ｃε２−４断片の構造に相対的に影響を及ぼさないということを実証した。
【０１４１】
突然変異はすべて、ＰＴｍＡｂ０００５との結合を〜５０％だけ低減するＤ２７６Ｎ以外は、本質的にはＰＴｍＡｂ０００５およびＰＴｍＡｂ００１１の両方と結合することを阻害する（表１０）。Ｃε２内の代替的グルタミン残基、Ｑ３１７の突然変異は、これらの実験における対照として作用するよう実行した。Ｑ３１７ＥおよびＱ３１７Ｋ突然変異体を生成し、Ｃε２−４を認識するＰＴｍＡｂ０００５およびＰＴｍＡｂ００１１の能力に影響を及ぼさないことを見出した。同様に、ＦｃεＲ１αの認識にも影響を及ぼさなかった。
【０１４２】
したがって、ＰＴｍＡｂ０００５およびＰＴｍＡｂ００１１の結合活性は、Ｃε２のＣ−Ｄループ内の突然変異により特異的に影響される。
【０１４３】
要するに、配列Ｐ１は、ＰＴｍＡｂ０００５およびＰＴｍＡｂ００１１の両方に関する主要結合決定基を含む。
【０１４４】
【表１４】
2004538238.tif 000017
【０１４５】
７．４  ＩｇＥ  Ｃε２のＣ−Ｄループの精製モデル作製
ヒトＩｇＥの正確な構造はまだ確定されていない（モデルは利用可能であるが）ので、詳細なレベルでの検査後には、このモデル構造に誤差が存在すると思われる。したがって本発明は、ヒトＩｇＧ１のＣγ２の等価領域でのこのループのマッピングにより、ＩｇＥのＣε２ループ領域のこのモデルを精製した（Ｄｅｉｓｅｎｈｏｆｆｅｒ Ｊ １９８１上記）。
【０１４６】
構造的特徴の境界についてのこの新しい情報から、合成した場合に全ＩｇＥ分子の情況においてＣε２のＣ−Ｄループのものと非常によく似た配座を適応すべきである環化ペプチドを設計した。このペプチド、Ａｃ−ＣＬＥＤＧＶＱＭＤＶＤＬＣＰＲＥＡＡＥＧＤＫ（Ａｃ）−ＮＨ２を、ＰＴ１０７９（配列番号１４）と名付けた。
【０１４７】
ＢＩＡｃｏｒｅ技法を用いてＰＴｍＡｂ０００５およびＰＴｍＡｂ００１１の両方に対するＰＴ１０７９のアフィニティーを測定し、これらのモノクローナル抗体の両方に対する非常に強い認識（それぞれ〜２０ ｎＭおよび〜２５０ ｎＭの見掛けのアフィニティーでＰＴｍＡｂ０００５およびＰＴｍＡｂ００１１の両方により認識される）を示すことを見出した。環化のＶが１つのアミノ酸残基のみによりシフト去れ、それにより１つのアミノ酸残基だけ環化部位間のペプチドの長さを減少する対照であるＰＴ１０７９の誘導体ペプチド（ＰＴ１０７８）は、ＰＴｍＡｂ０００５またはＰＴｍＡｂ００１１とのペプチドの結合を低減した。さらに、ループ領域がＰＴ１０７９と同数の残基を有するようさらに別の残基が付加されるようにＰＴ１０７８を修飾したが、しかしながら、この修飾はＰＴｍＡｂ０００５またはＰＴｍＡｂ００１１との結合を修復できなかった。したがって、全ＩｇＥ分子の情況においてネイティブ標的と非常によく似た形状に適応するよう本発明のペプチドの表示を修正することの重要性を示している。
【０１４８】
【化３】
2004538238.tif 000018
【０１４９】
要約
ここで説明した作業は、モノクローナル抗体ＰＴｍＡｂ０００５およびＰＴｍＡｂ００１１がＰ１を特異的に認識することを示す。これらの抗体は、高アフィニティーでモノクローナル抗体により認識されるＩｇＥのＣε２ドメインのｃ−ｄループのミモトープを同定するために、ファージ表示試験に用いられてきた。
【０１５０】
７．５  ＰＴｍＡｂ０００５およびＰＴｍＡｂ００１１の特徴の機能的特徴
以下の実験は、ＰＴｍＡｂ０００５およびＰＴｍＡｂ００１１の機能的特徴を記載する。したがって、これらの抗体の標的の使用は、ＰＴｍＡｂ０００５およびＰＴｍＡｂ００１１様免疫応答を誘導する。したがって、これらのペプチドベースの免疫原を用いたワクチン接種は、同一機能特徴を有する。
【０１５１】
実施例８
８．１  材料および方法
８．１．１  ＦｃεＲＩα結合検定（プロテインＡプレート）
この検定では、ＩｇＥに対する高アフィニティー受容体のα鎖のエクトドメイン（αエクトドメイン）の組換え体形態を用いて、キメラＩｇＥを結合する。αエクトドメインのカルボキシル末端を人ＩｇＧ１Ｆｃ配列と融合させる。これは、組換え体分子をＦｃ領域を介してプロテインＡ被覆微小滴定プレートに結合させる。それゆえ、大多数のαエクトドメイン分子は結合配位子に対して利用可能であるべきであり、そしてＩｇＥ−受容体相互作用の分析のための系を提供する。以下に記載するフォーマットは、抗ＩｇＥ抗体の（高アフィニティー）受容体遮断活性の検出を目的とする。
【０１５２】
８．１．２  高アフィニティー受容体のα鎖エクトドメインとのＩｇＥの結合の検出のためのＥＬＩＳＡプロトコール
遮断緩衝液（ＰＢＳ／５％ＢＳＡ／０．０５％トゥイーン２０）中で０．２５μｇ／ｍｌに稀釈した１００μｌ／ウエルのα−エクト−Ｉｇ融合タンパク質でプロテインＡプレートを被覆する。３７℃で１時間インキュベートする。キメラＩｇＥを１０％ブタ血清中で０．０３１２５μｇ／ｍｌに稀釈する。このＩｇＥ溶液中で抗ＩｇＥ抗体を適切な試験濃度（単数または複数）に稀釈する。室温で１時間インキュベートする。プレート洗浄機を用いて、ＰＢＳ／０．０５％トゥイーン２０で３回、プレートを洗浄する。１００μｌ／ウエルのＩｇＥ：抗ＩｇＥ溶液（各抗ＩｇＥ濃度を４回検定する）を付加する。３７℃で１時間インキュベートする。プレート洗浄機を用いて、ＰＢＳ／０．０５％トゥイーン２０で３回、プレートを洗浄する。遮断溶液中で１：６０００稀釈溶液に稀釈した１００μｌ／ウエルのヤギ抗マウスλ鎖ＨＲＰＯ複合抗体を付加する。３７℃で１時間インキュベートする。プレート洗浄機を用いて、ＰＢＳ／０．０５％トゥイーン２０で３回、プレートを洗浄する。２００μｌ／ウエルのＯＰＤ基質を付加し、暗所で室温で２〜１０分間インキュベートする。２５μｌの２５％Ｈ２ＳＯ４の付加により反応を停止する。プレート振盪機−ＳＬＯＷ速で停止反応物を混合する。４９０ ｎｍでＯＤを読み取る。
【０１５３】
ＩｇＥのその受容体との結合の抑制％に関する数値を算定し得る。１０％ブタ血清単独中にＩｇＥを含有した（即ち、非抗ＩｇＥ）一組のウエルの平均から、ＩｇＥに関する最大結合値を確定する。
【０１５４】
したがって、％抑制値は、以下のように算定される：
（最大ＩｇＥ値−抗ＩｇＥ複製物の平均値）／最大ＩｇＥ値ｘ１００
８．１．３  ＦｃεＲＩα結合検定（縮小エクトドメイン）
本検定は、本質的には前検定と同一であるが、但し、ＦｃεＲＩαエクトドメイン／ＩｇＧ構築物をタンパク質分解酵素Ｘ因子で処理して、２つの部分を開裂する。プロテインＡビーズを用いてＩｇＧ  Ｆｃ部分を除去し、ストレプタビジンビーズを用いてＸ因子を除去し、したがって、本質的純粋α鎖エクトドメイン生成物を残す。この検定フォーマットでは、αエクトドメインはプラスチック微小滴定プレートに結合される。その他の検定詳細はすべて、前記の党利である。
【０１５５】
８．１．４  ＣＤ２３−結合検定（ＦｃεＲＩＩ、低アフィニティー受容体）
ＲＰＭＩ８８６６細胞または一次ヒトＢ細胞で、本検定を実施した。２つのフォーマットを用い得る：即ち、ＦｃεＲＩＩと会合したＩｇＥと結合するｍＡｂの検出のためのものと、ｍＡｂがＦｃεＲＩＩと会合するＩｇＥを妨害するか否かを分析する第二のものであった。最初の検定に関しては、ＰＢＳ、１％ＦＢＳ、０．１％ＮａＮ３中で氷上で１時間、キメラＩｇＥ（１μｇ／ｍｌ）を細胞に負荷した。余分量のＩｇＥを除去し、抗ＩｇＥｍＡｂを付加した。ＦＩＴＣ複合化ラット抗マウスＩｇＧ１抗体で結合ｍＡｂを明らかにした。第二検定に関しては、細胞に付加する前に、静かに混合しながら室温で１時間、抗ＩｇＥｍＡｂとともにキメラＩｇＥ（１μｇ／ｍｌ）を予備インキュベートした。混合物を細胞とともに氷上で１時間インキュベートし、次に洗浄して非結合ＩｇＥを除去した。ＦＩＴＣ−ヤギ抗ヒトＩｇＥで結合ＩｇＥを検出し、あるいはＦＩＴＣ−複合化ラット抗マウスＩｇＧ１抗体で結合抗ＩｇＥｍＡｂを検出した。ＰＢＭＣで試験を実施した場合、ＰＥ−複合化抗ＣＤ１９抗体により構成Ｂ細胞を同定した。フローサイトメトリーにより、試料を分析した。
【０１５６】
８．２  結果
ＰＴｍＡｂ０００５およびＰＴｍＡｂ００１１に関する結果を、図１６〜２１に示す。図１６は、プレート結合ＩｇＥとのモノクローナル抗体の濃度依存性結合を示す。図１７は、ＰＴｍＡｂ０００５およびＰＴｍＡｂ００１１によるＦｃεＲ１α／ＩｇＧ構築物と結合するＩｇＥの濃度依存性抑制を示す。図１８は、抗体ＰＴｍＡｂ０００５およびＰＴｍＡｂ００１１による、プラスチックプレートに直接結合されたＦｃεＲＩαの縮小エクトドメインに結合するＩｇＥの抑制を示す。図１９は、抗体ＰＴｍＡｂ０００５（クローンＧＥ−１）およびＰＴｍＡｂ００１１によるＦｃεＲＩＩ（ＣＤ２３）と結合するＩｇＥの抑制の欠如を示す。図２０および２１は、抗体ＰＴｍＡｂ０００５およびＰＴｍＡｂ００１１によるアレルギー性ヒト血中好塩基球からのヒスタミン放出の濃度依存性遮断を示す。
【０１５７】
ＰＴｍＡｂ００１１はヒトＩｇＥに対する特異性を有するマウスモノクローナル抗体であり、その他のヒトＩｇアイソタイプまたはラット／マウスＩｇＥとの交差反応性を示さない。ＰＴｍＡｂ００１１は、無作為配向でＥＬＩＳＡプレートに結合される場合、ネイティブおよび熱処理ＩｇＥの療法と結合し、これは、ＩｇＥ上のその認識部位が熱不安定性であることを示す。ＰＴｍＡｂ００１１は、抗原を介してＥＬＩＳＡプレートに結合される場合、ＩｇＥも認識する。このｍＡｂが、ヒトＩｇＥと高アフィニティーＩｇＥ受容体（ＦｃεＲＩ）のα鎖結合構成成分との間の相互作用を完全に遮断し得る、ということは重要である。しかしながら、このｍＡｂは、ＦｃεＲＩに前結合される場合、依然としてヒトＩｇＥを認識し、これは、ｍＡｂ結合部位が受容体結合時に損失されないことを示す。
【０１５８】
実施例９
９．１  正常および抗原配向化ＥＬＩＳＡによるＰＴｍＡｂ００１１のＩｇＥ結合特性の分析
実施例１に記載したように、ヒトキメラＩｇＥ、骨髄腫ＩｇＥ、ヒトＩｇアイソタイプまたは齧歯類ＩｇＥでプレートをコーティングすることにより（ｐＨ９．６炭酸塩／重炭酸塩コーティング緩衝液中１μｇ／ｍｌ）、正常ＩｇＥ結合ＥＬＩＳＡ法を実施した。抗原配向化ＥＬＩＳＡに関しては、キメラＩｇＥ（１μｇ／ｍｌ）の付加前に、飽和濃度でＮＰ−ＢＳＡを被覆した。あるいは、可溶性ヒトＦｃεＲＩα鎖を被覆（０．２５μｇ／ｍｌ）し、その後、キメラＩｇＥを付加した。実験１に記載した通りに、残りのＥＬＩＳＡを実行した（マウス抗ヒトＩｇＥｍＡｂの検出のためのＥＬＩＳＡプロトコール）。
【０１５９】
９．２  結果
図２２は、無作為配向様式でＥＬＩＳＡプレートに結合される場合、ＰＴｍＡｂ００１１がヒト／マウスキメラＩｇＥおよびヒト骨髄腫ＩｇＥの両方と結合することを説明する。同様に、抗原配向化ＩｇＥとの結合（即ち、得れと結合ＮＰ−ＢＳＡに結合されるＩｇＥ）は、用量依存性である。一連の期間の間の５６℃での熱処理後のキメラＩｇＥを認識するその能力に関しても、ＰＴｍＡｂ００１１を分析した。図２２は、ＩｇＥに関するＰＴｍＡｂ００１１の結合能力が熱処理により影響されないことを示す。
【０１６０】
ＰＴｍＡｂ００１１が、高アフィニティーＩｇＥ受容体のα鎖構成成分とのＩｇＥの相互作用を抑制し得るか否かを確定するために、ｍＡｂ特性化をさらに拡張した（図２３）。プレート結合ＦｃεＲＩα鎖への付加前のＰＴｍＡｂ００１１の予備インキュベーションは、ＦｃεＲＩα鎖とのＩｇＥの相互作用の用量依存性抑制を生じた。ＰＴｍＡｂ００１１は同様に（図２４）、用量依存様式で、ＦｃεＲＩα鎖関連ＩｇＥを認識する。
【０１６１】
実施例１０
１０．１  一次ヒトＢ細胞からのＩｇＥ分泌の分析
ＩＬ−４および抗ＣＤ４０を補充した培地中の９６Ｕウエルプレート中で２ ｘ １０５細胞／ウエルでＰＢＭＣをプレート化した。ＰＴｍＡｂ００１１またはアイソタイプ適合化対照ｍＡｂを付加し、細胞を１４日間インキュベートした後、ＩｇＥ分析のために上清を収穫した。０．５ Ｍ炭酸塩／重炭酸塩緩衝液（ｐＨ９．６）中のウサギ抗ヒトＩｇＥ抗体（１０μｇ／ｍｌ）でＥＬＩＳＡプレートをコーティングすることにより、全ＩｇＥレベルを測定した。洗浄したプレートをＰＢＳ、０．０５％トゥイーン２０、５％ＢＳＡで遮断した。細胞上清およびＩｇＥ標準の両方を飽和量のＰＴｍＡｂ００１１（１０μｇ／ｍｌ）とともに室温で１時間インキュベートした後、ＥＬＩＳＡプレートに付加して、ＩｇＥ／抗ＩｇＥ複合体を生成させた。インキュベーションおよび洗浄過程後、ＨＲＰ−ヒツジ抗ヒトＩｇＥで、その後ＯＰＤ基質により、結合ＩｇＥを検出した。次に、細胞上清中のＩｇＥのレベルを、標準曲線と比較して概算した。
【０１６２】
１０．２  結果
１０μｇ／ｍｌ〜０．５μｇ／ｍｌの用量範囲に亘るＰＴｍＡｂ００１１を用いてＩｇＥを予備インキュベートし、ヒトＢ細胞株ＲＰＭＩ８８６６に及ぼすＦｃεＲＩＩとのその後のＩｇＥ結合に及ぼすその作用に関して検査した。図２５は、ＰＴｍＡｂ００１１によるＩｇＥの予備インキュベーションがＦｃεＲＩＩとのＩｇＥ結合を強化することを説明する。非Ｐ１特異的モノクローナル抗体（ＰＴｍＡｂ００１７）はＦｃεＲＩＩ受容体とのＩｇＥの結合を強化しなかった。ＰＴｍＡｂ００１１は、一次Ｂ細胞上でのＦｃεＲＩＩとのＩｇＥ結合を強化する（図２６）。
【０１６３】
１０．３  一次ヒトＢ細胞からのＩｇＥ分泌に及ぼすＰＴｍＡｂ００１１の作用
ＩｇＥ分泌へのＢ細胞アイソタイプ切り換えを促すために、付加的ＩＬ−４および抗ＣＤ４０抗体の存在下で、末梢血単核球をＰＴｍＡｂ００１１とともに培養した。全ＩｇＥレベル、即ち遊離ＩｇＥおよびＰＴｍＡｂ００１１複合化ＩｇＥの測定を可能にするＥＬＩＳＡ検定を開発した。このような定量を成し遂げるために、分泌ＩｇＥを飽和レベルのＰＴｍＡｂ００１１とともに予備インキュベートして、すべてのＩｇＥを複合体化させた。飽和レベルのＰＴｍＡｂ００１１と複合体化されていたＩｇＥの標準曲線と比較して、組織培養上清内の全ＩｇＥを定量した。図２７は、３つの異なるドナーにおいて、ＰＴｍＡｂ００１１（１μｇ／ｍｌ）を用いた一次Ｂ細胞のインキュベーションが全レベルの分泌ＩｇＥにおける有意の低減を生じたことを説明する。このような抑制は、アイソタイプ適合化対照抗体では観察されなかった。
【０１６４】
１０．４  ヒト好塩基球からのヒスタミン放出の確定
２つの検定フォーマットを適応させた。非アレルギー性ドナーからのＰＢＭＣを１μｇ／ｍｌのキメラＩｇＥで３７℃で３０分間受動的に感作し、洗浄して、モノクローナル抗体で３７℃で３０分間処理した。あるいは、ＬｏｌＰ１−感受性ドナーからのＰＢＭＣをモノクローナル抗体で３７℃で３０分間、直接処理した。遠心分離により反応を停止させた。特異的イムノアッセイ（Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈ ２５６２）により、細胞上清中のヒスタミン放出を確定した。０．５％イゲパル洗剤で溶解した細胞中で、全細胞性ヒスタミン含量を確定した。
【０１６５】
１０．５  好塩基球遮断検定
モノクローナル抗体およびＩＬ−３の存在下で３７℃で３０分間、キメラＩｇＥを用いた非アレルギー性ドナーからのＰＢＭＣのインキュベーションにより、ヒト好塩基球におけるＦｃεＲ１とのキメラＩｇＥの結合を遮断する抗ＩｇＥ抗体の能力を確定した。細胞を洗浄し、３７℃でさらに３０分間、ＮＰ−ＢＰＡによりヒスタミン放出を触発した。遠心分離により反応を停止させて、ヒスタミン放出を前記と同様に測定した。
【０１６６】
１０．６  アレルギー性好塩基球抑制検定
ＬｏｌＰ１で触発する前に、３７℃で３０分間、ＬｏｌＰ１感受性ドナーからのＰＢＭＣをモノクローナル抗体とともに予備インキュベートすることにより、アレルゲン触発化脱顆粒化を抑制する抗ＩｇＥ抗体の能力を調べた。
【０１６７】
１０．７  ヒト肺マスト細胞からのトリプターゼ放出の確定
ヒアルロニダーゼ、プロナーゼおよびＤＮアーゼを包含するカクテルによる酵素的消化により、ヒト肺組織から粗製マスト細胞懸濁液を調製した。細胞は、直接用いるか、または抗ＩｇＥ抗体での処理の前にキメラＩｇＥで予備感作した。顆粒酵素トリプターゼの比色検定により、マスト細胞脱顆粒化を確定した。
【０１６８】
１０．８  ヒトＦｃεＲ１αでトランスフェクトしたＲＢＬ細胞からのβヘキソサミニダーゼ放出の確定
シェフィール°大学のＢ． Ｈｅｌｍ博士から、トランスフェクト化細胞株ＲＢＬ  Ｊ４１を入手した。マウスモノクローナルＩｇＥ抗ＤＮＰまたはヒトキメラＩｇＥ抗ＮＰで細胞を受動的感作し、抗ヒトＩｇＥ抗体で触発した。β−ヘキソサミニダーゼ放出の比色検定により、脱顆粒化を測定した。
【０１６９】
１０．９  結果
１０．９．１  ヒト好塩基球中の抗ＩｇＥモノクローナル抗体のアナフィラクトゲン性
多数の異なる抗モノクローナル抗体を、アレルギー性および非アレルギー性好塩基球からのヒスタミン放出を触発するそれらの能力に関して検定した（図２８）。その他の抗体と対照をなして、ＰＴｍＡｂ００１１は、一貫して有意のヒスタミン放出を生じ得ない。
【０１７０】
１０．９．２  ヒト肺マスト細胞における抗ＩｇＥモノクローナル抗体のアナフィラクトゲン性
ＰＴｍＡｂ００１１は、感作および非感作ヒト肺マスト細胞の両方においても有意量のトリプターゼを放出し得ない（図２９）。ポリクローナル抗ヒトＩｇＥは、これらの細胞において６０〜７０％放出を示す。
【０１７１】
１０．９．３  ヒトＦｃεＲ１αでトランスフェクトしたＲＢＬ細胞における抗ＩｇＥモノクローナル抗体のアナフィラクトゲン性
キメラヒトＩｇＥ抗ＮＰで受動的感作したＲＢＬ  Ｊ４１細胞は、抗ＮＰ−ＢＳＡで、ならびにポリクローナル抗ヒトＩｇＥで触発され得たが、しかしＰＴｍＡｂ００１１ではされなかった（図３０）。これに対比して、細胞をマウスＩｇＥ抗ＤＮＰで感作した場合には、両抗ヒトＩｇＥ抗体は作用を伴わなかった。細胞は、抗原ＤＮＰ−ＢＳＡにより依然として触発され得た。
【０１７２】
１０．９．４  好塩基球遮断検定
ＰＴｍＡｂ００１１は、非アレルギー性好塩基球におけるＦｃεＲ１とのＩｇＥの結合を遮断し、したがってＮＰ−ＢＳＡ抗原によるその後の触発を抑制し得た。この活性のＩＣ５０値は、約６０ ｎｇ／ｍｌであった（図３１）。ＰＴｍＡｂ００１１は、４０ ｎｇ／ｍｌのＩＣ５０値でアレルギー性好塩基球からのＬｏｌＰ１−触発性ヒスタミン放出も強力に抑制し得た（図３１）。
【０１７３】
実施例１１  サル受動的皮膚アナフィラキシー試験
ＰＴｍＡｂ０００５およびＰＴｍＡｂ００１１を、ｉｎ ｖｉｖｏ活性に関しても試験した。要するに、アフリカミドリザルの局所的皮膚マスト細胞をそぎ取って、両腕への１００ ｎｇの抗ＮＰＩｇＥ（ヒトＩｇＥ抗ニトロフェニルアセチル（ＮＰ）、Ｓｅｒｏｔｅｃｈから購入）の皮内投与により感作した。２４時間後、試験したモノクローナル抗体の用量範囲を、片腕のヒトＩｇＥと同じ注射部位に注射した。同一動物の反対腕の対照部位に、リン酸塩緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）または非特異的ヒトＩｇＥ（ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）またはヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）に対して特異的である）を投与した。５時間後、１０ ｍｇのＢＳＡ−ＮＰ複合体（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから購入）を静注により投与した。１５〜３０分後、対照動物は、アナフィラキシーからの容易に観察可能なほぼ環状の浮腫を発症し、これはミリメートルで測定可能である。結果は、３匹のサルの群の平均浮腫直径で、またはＰＢＳ対照との比較における抑制パーセンテージとして表される。ヒトＩｇＥのＣε４ドメイン中のペプチド４９６〜５０６を認識するＤｅｃ７ＢはＥＰ０４７７２３１Ｂに記載されており、陽性対照として用いられた。
【０１７４】
【表１５】
2004538238.tif 000019
【０１７５】
【表１６】
2004538238.tif 000020
【０１７６】
【表１７】
2004538238.tif 000021
【０１７７】
【表１８】
2004538238.tif 000022
【０１７８】
【表１９】
2004538238.tif 000023
【０１７９】
【表２０】
2004538238.tif 000024
【０１８０】
【表２１】
2004538238.tif 000025
【０１８１】
【表２２】
2004538238.tif 000026
【０１８２】
【表２３】
2004538238.tif 000027
【０１８３】
【表２４】
2004538238.tif 000028
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は、パドランとデイヴィスの１９８６年のモデルを用いたＩｇＥのアミノ酸表面の露出を示す。
【図２】
図２は、化学合成経路１の図であり、固相ペプチド合成を示す。
【図３】
図３は、化学合成経路２と３の図であり、修飾されたキャリヤーの調製を示す。
【図４】
図４は、化学合成経路４の図であり、ペプチド／キャリヤー複合体の形成を示す。
【図５】
図５は、Ｃ６７−８抗ＩｇＥのデータである。（Ａ）２５μｇのＢＳＡ−ＩｇＥ Ｃ６７−８（ＰＴＬ化学反応を利用して共役させた）または３μｇのＨｅｐＢコア−ＩｇＥ Ｃ６７−８構造体を用いて免疫処置したＢａｌｂ Ｃマウスに由来する血清の抗プレート結合ＩｇＥ反応性。（Ｂ）２５μｇのＢＳＡ−ＩｇＥ Ｃ６７−８（ＰＴＬ化学反応を利用して共役させた）または３μｇのＨｅｐＢコア−ＩｇＥ Ｃ６７−８構造体を用いて免疫処置したＢａｌｂ Ｃマウスに由来する血清の抗受容体結合ＩｇＥ反応性。
【図６】
図６は、可溶性ＩｇＥとＩｇＥ Ｃ６７−８ペプチドを用いた競合アッセイの図である。ＢＳＡ−ＩｇＥ Ｃ６７−８またはＨＢＣ−ＩｇＥ Ｃ６７−８で免疫処置したマウスに由来する血清を、可溶性ＩｇＥ（１０μｇ／ｍｌ）またはＩｇＥ Ｃ６７−８ペプチド（２５μＭ）または無関係なペプチドＰＴ３２６（２５μＭ）を用いてあらかじめ培養し、ＩｇＥでコーティングしたＥＬＩＳＡプレートに添加した。データは、平均±測定の標準誤差（ｎ＝１０）である。
【図７】
図７は、ＰＴ１０７９抗ＩｇＥのデータである。（Ａ）２５μｇのＢＳＡ−ＰＴ１０７９（ＰＴＬ化学反応を利用して共役させた）または３μｇのＨｅｐＢコア−ＰＴ１０７９構造体を用いて免疫処置したＢａｌｂ Ｃマウスに由来する血清の抗プレート結合ＩｇＥ反応性。（Ｂ）２５μｇのＢＳＡ−ＰＴ１０７９（ＰＴＬ化学反応を利用して共役させた）または３μｇのＨｅｐＢコア−ＰＴ１０７９構造体を用いて免疫処置したＢａｌｂ Ｃマウスに由来する血清の抗受容体結合ＩｇＥ反応性。
【図８】
図８は、可溶性ＩｇＥとＰＴ１０７９ペプチドを用いた競合アッセイの図である。ＢＳＡ−１０７９またはＨＢＣ−ＰＴ１０７９で免疫処置したマウスに由来する血清を、可溶性ＩｇＥ（１０μｇ／ｍｌ）またはＰＴ１０７９ペプチド（２５μＭ）または無関係なペプチドＰＴ３２６（２５μＭ）を用いてあらかじめ培養し、ＩｇＥでコーティングしたＥＬＩＳＡプレートに添加した。データは、平均±測定の標準誤差（ｎ＝１０）である。
【図９】
図９は、ＰＴ１０７８抗ＩｇＥのデータである。（Ａ）２５μｇのＢＳＡ−ＰＴ１０７８（ＰＴＬ化学反応を利用して共役させた）を用いて免疫処置したＢａｌｂ Ｃマウスに由来する血清の抗プレート結合ＩｇＥ反応性。（Ｂ）２５μｇのＢＳＡ−ＰＴ１０７８（ＰＴＬ化学反応を利用して共役させた）を用いて免疫処置したＢａｌｂ Ｃマウスに由来する血清の抗受容体結合ＩｇＥ反応性。
【図１０】
図１０は、可溶性ＩｇＥとＰＴ１０７８ペプチドを用いた競合アッセイの図である。ＢＳＡ−１０７８で免疫処置したマウスに由来する血清を、可溶性ＩｇＥ（１０μｇ／ｍｌ）またはＰＴ１０７８ペプチド（２５μＭ）または無関係なペプチドＰＴ３２６（２５μＭ）を用いてあらかじめ培養し、ＩｇＥでコーティングしたＥＬＩＳＡプレートに添加した。データは、平均±測定の標準誤差（ｎ＝１０）である。
【図１１】
図１１は、ＰＴ１０７９ｇｓ抗ＩｇＥのデータである。（Ａ）３μｇのＨＢＣ−ＰＴ１０７９ｇｓを用いて免疫処置したＢａｌｂ Ｃマウスに由来する血清の抗プレート結合ＩｇＥ反応性。（Ｂ）３μｇのＨＢＣ−ＰＴ１０７９ｇｓを用いて免疫処置したＢａｌｂ Ｃマウスに由来する血清の抗受容体結合ＩｇＥ反応性。
【図１２】
図１２は、可溶性ＩｇＥとＰＴ１０７９ペプチドを用いた競合アッセイの図である。ＨＢＣ−ＰＴ１０７９ｇｓで免疫処置したマウスに由来する血清を、可溶性ＩｇＥ（１０μｇ／ｍｌ）またはＰＴ１０７９ペプチド（２５μＭ）または無関係なペプチドＰＴ３２６（２５μＭ）を用いてあらかじめ培養し、ＩｇＥでコーティングしたＥＬＩＳＡプレートに添加した。データは、平均±測定の標準誤差（ｎ＝１０）である。
【図１３】
図１３は、マウスＢＳＡ−Ｃ６７−８で誘導した抗血清の抑制活性を示す。ＬｏｌＰ１感受性ドナーからの細胞をマウス血清（１／５０に希釈）で処理し、次にＬｏｌＰ１でヒスタミンの放出を開始させた。データは、平均±測定の標準誤差（ｎ＝１０）である。
【図１４】
図１４は、ＢＳＡ−ＰＴ１０７８とＢＳＡ−ＰＴ１０７９で誘導したマウス血清の抑制活性を示す。ＬｏｌＰ１感受性ドナーからの細胞をマウス血清で処理し（ＢＳＡ抗血清とＢＳＡ−ＰＴ１０７８抗血清は１／５０に希釈；ＢＳＡ−ＰＴ１０７９抗血清は１／１２５０に希釈）、次にＬｏｌＰ１でヒスタミンの放出を開始させた。データは、平均±測定の標準誤差（ｎ＝１０）である。
【図１５】
図１５は、ＨＢＣ−Ｃ６７−８、ＨＢＣ−ＰＴ１０７８、ＨＢＣ−ＰＴ１０７９、ＨＢＣ−ＰＴ１０７９ｇｓで誘導したマウス血清の抑制活性を示す。ＬｏｌＰ１感受性ドナーからの細胞をマウス血清で処理し（ＨＢＣ野生型（ｗｔ）とＨＢＣ−−ＩｇＥ Ｃ６７−８抗血清は１／５０に希釈；ＨＢＣ−ＰＴ１０７９とＨＢＣ−ＰＴ１０７９ｇｓ抗血清は１／１２５０に希釈）、次にＬｏｌＰ１でヒスタミンの放出を開始させた。データは、平均±測定の標準誤差（ｎ＝１０）である。
【図１６】
図１６は、ＩｇＥに対する抗体ＰＴｍＡｂ０００５とＰＴｍＡｂ００１１の結合が濃度に依存することを示す。
【図１７】
図１７は、対照と比較すると、抗体ＰＴｍＡｂ０００５とＰＴｍＡｂ００１１によって、Ｆｃε１α／ＩｇＧ構造体に対するＩｇＥの結合の抑制が濃度に依存するようになっていることを示す。
【図１８】
図１８は、対照と比較すると、抗体ＰＴｍＡｂ０００５によって、プラスチック・プレートに直接結合したＦｃεＲ１αの切断された外ドメインに対するＩｇＥの結合の抑制が濃度に依存するようになっていることを示す。
【図１９】
図１９は、抗体ＰＴｍＡｂ０００５（ＧＥ−１）とＰＴｍＡｂ００１１によってＩｇＥがＦｃεＲＩＩ（ＣＤ２３）に結合する様子を示す。
【図２０】
図２０は、アレルギーの人の血液中にある好塩基球からのヒスタミン放出が、対照と比較すると抗体ＰＴｍＡｂ０００５とＰＴｍＡｂ００１１の濃度に依存して抑制されることを示す。
【図２１】
図２１は、アレルギーの人の血液中にある好塩基球からＬｏｌＰ１によってトリガーされるヒスタミンの放出が、ＰＴｍＡｂ０００５とＰＴｍＡｂ００１１の両方によって抑制されることを示す。
【図２２】
図２２は、さまざまなＩｇＥに結合するＰＴｍＡｂ００１１を示す；（Ａ）キメラＩｇＥに結合するＰＴｍＡｂ００１１；（Ｂ）ミエローマＩｇＥに結合するＰＴｍＡｂ００１１；（Ｃ）抗原指向性ＩｇＥに結合するＰＴｍＡｂ００１１；（Ｄ）熱で変性したＩｇＥに結合するＰＴｍＡｂ００１１。
【図２３】
図２３は、ＦｃεＲ１αに対するＩｇＥの結合がＰＴｍＡｂ００１１によって抑制される様子を示す。
【図２４】
図２４は、受容体と結合したＩｇＥに対するＰＴｍＡｂ００１１の結合を示す。
【図２５】
図２５は、（Ａ）ＩｇＥ上のＰＴｍＡｂ００１１が、ＲＰＭＩ８８６６細胞上のＦｃεＲＩＩへの結合に及ぼす影響を示す。ＲＰＭＩ８８６６細胞（１×１０６／ｍｌ）を、キメラＩｇＥ（１μｇ／ｍｌ）および抗ＩｇＥ ｍＡｂ（１０〜０μｇ／ｍｌ）とともに氷の上で１時間培養した。ＩｇＥと抗ＩｇＥは、室温で１時間あらかじめ培養してから細胞に添加した。結合したＩｇＥは、ＦＩＴＣ−ヤギ抗ヒトＩｇＥを用いて検出した。その結果として、ゲートを通った１０，０００の注目事象をフロー・サイトメトリー分析によって測定した、複製サンプルの平均チャネル蛍光発光（ＭＣＦ）を示す。（Ｂ）非Ｐ１特異的抗体ＰＴｍＡｂ００１７。
【図２６】
図２６は、ＩｇＥ上のＰＴｍＡｂ００１１が、一次ヒトＢ細胞上のＦｃεＲＩＩへの結合に及ぼす影響を示す。末梢血単核細胞（１×１０６／ｍｌ）を、キメラＩｇＥ（１μｇ／ｍｌ）と、抗ＩｇＥ ｍＡｂ（１０〜０μｇ／ｍｌ；オープン）またはアイソタイプが一致した同じ濃度の対照ｍＡｂ（固体）とともに、氷の上で１時間培養した。ＩｇＥと抗ＩｇＥは、室温で１時間あらかじめ培養してから細胞に添加した。結合したＩｇＥは、ＦＩＴＣ−ヤギ抗ヒトＩｇＥを用いて検出し、ＰＥが共役した抗ＣＤを用いて一次Ｂ細胞を明らかにした。その結果として、ゲートを通った５，０００の注目事象をフロー・サイトメトリー分析によって測定した、複製サンプルの平均チャネル蛍光発光（ＭＣＦ）を示す。
【図２７】
図２７は、一次ヒトＢ細胞から分泌されるＩｇＥに対するＰＴｍＡｂ００１１の効果を示す。末梢血単核細胞（２×１０５／ｍｌ）を、ＩＬ−４（１０ｎｇ／ｍｌ）と抗ＣＤ４０抗体（１μｇ／ｍｌ）を追加した培地で培養した。ＰＴｍＡｂ００１１またはアイソタイプが一致した対照のｍＡｂを１４日間にわたって添加し（１μｇ／ｍｌ）、上澄みの細胞を回収し、ＥＬＩＳＡによってＩｇＥの全含有量を分析した。結果は、いかなる抗体も存在していない状態で分泌されるＩｇＥ量を％で表示してある。
【図２８】
図２８は、アレルギーのヒト好塩基球（Ａ）と非アレルギーのヒト好塩基球（Ｂ）における抗ヒトＩｇＥモノクローナル抗体のアナフィラキシー誘発性を示す。１μｇ／ｍｌのキメラＩｇＥを用いて受動感作した、アレルギーのドナーまたは非アレルギーのドナーからのＰＢＭＣを、ｍＡｂｓを用いて３７℃で３０分間処理した。ヒスタミン放出を特異的ＥＩＡによって測定した。データは、それぞれ異なるドナーを用いて行なった別々の３回の実験の平均である。
【図２９】
図２９は、感作したヒト肺マスト細胞（Ａ）と非感作のヒト肺マスト細胞（Ｂ）における抗ヒトＩｇＥ抗体のアナフィラキシー誘発性を示す。感作した、または感作していない未精製ヒト肺マスト細胞の分散液を、抗体を用いて３７℃で４５分間処理した。上澄みへのトリプターゼの放出を比色アッセイで測定した。データは、代表的な１つの実験を２回繰り返した結果の平均である。
【図３０】
図３０は、ヒトＦｃεＲＩ（Ａ）とマウスＦｃεＲＩ（Ｂ）からのＲＢＬ Ｊ４１細胞における抗ヒトＩｇＥ抗体のアナフィラキシー誘発性を示す。ＲＢＬ Ｊ４１細胞は、ヒトのキメラＩｇＥまたはマウスＩｇＥを用いて感作し、抗体を用いて３７℃で３０分間処理した。上澄みへのβヘキソサミニダーゼの放出を比色アッセイで測定した。データは、代表的な１つの実験を３回繰り返した結果の平均である。
【図３１】
図３１は、ヒト好塩基球においてアレルゲンが引き金となるヒスタミン放出がＰＴｍＡｂ００１１によって抑制される様子を示す。ＰＢＭＣは、ＰＴｍＡｂ００１１だけを用いて（アレルギー・アッセイ（Ａ））、またはＰＴｍＡｂ００１１とＩｇＥを用いて（遮断アッセイ（Ｂ））３７℃で３０分間培養した。次に抗原を用いて細胞を３７℃で３０分間トリガーし、特異的ＥＩＡによりヒスタミン放出を測定した。データは、それぞれ異なるドナーを用いて行なった別々の３回の実験の平均±測定の標準誤差である。
【図３２】
図３２は、ＰＴｍＡｂ００１１とＰＴｍＡｂ０００５によってサルの皮膚において受動的皮膚アナフィラキシーが抑制される様子を示す。モノクローナル抗体Ｄｅｃ７Ｂ（スタンワース・デカペプチド）を対照として用いた。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図１−３】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２−１】
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【図２２−２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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