(57)【要約】本発明は、Ｉ型ＩＦＮを単核細胞に接触させる工程を含む、培養中の上記単核細胞から樹状細胞を誘導する方法に関する。それにより短時間の単一の処理工程の後に、動物およびヒトの予防用および治療用ワクチン接種における細胞性アジュバントとして適した樹状細胞が得られる。それにより得られる樹状細胞、それを含む薬学的組成物、とりわけ上記細胞を活性主成分として含むワクチン、およびヒトにおける抗原の存在に関連する病理の処置方法、ならびに上記樹状細胞を誘導するためのキットおよびそれを用いるＴ細胞のエクソビボ増殖の方法が、本発明のさらなる目的である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
全末梢血単核細胞、付着性末梢血単核細胞および末梢血単核細胞から単離された高度に精製されたＣＤ１４＋単球から成る群から選択される単核細胞をＩ型インターフェロンを含有する培地中で培養する工程を含む樹状細胞の調製方法。
【請求項２】
樹状細胞が、３日以内に得られる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
Ｉ型インターフェロンが、天然または組換えＩＦＮα、天然または組換えＩＦＮβコンセンサスインターフェロンおよび合成Ｉ型インターフェロンから成る群から選択される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
培地中のＩ型インターフェロンの濃度が、１００IU/ml以上である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
濃度が、１００〜１００００IU/mlの間である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
濃度が、４００〜１００００IU/mlの間である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
濃度が、５００〜２０００IU/mlの間である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
濃度が、約１０００IU/mlである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
培地が、細胞成長因子を含有する、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
細胞成長因子が、ＧＭ−ＣＳＦである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
培地中のＧＭ−ＣＳＦの濃度が、２５０〜１０００IU/mlの間である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
得られた樹状細胞を成熟化剤と接触させる工程を更に含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法で得られる樹状細胞。
【請求項１４】
抗原性ペプチドまたはタンパク質、少なくとも１つの抗原を含有する細胞抽出物、または免疫応答が目的のものである抗原をコードする核酸分子で負荷されしている、請求項１３に記載の樹状細胞。
【請求項１５】
脱水形態または適当な凍結保存培地中で凍結形態にある、請求項１３または１４に記載の樹状細胞。
【請求項１６】
ａ）細胞の培養および洗浄に必要な１回使用の構成要素；
ｂ）Ｉ型ＩＦＮおよび適合する添加剤を含む組成物；
ｃ）場合により、細胞成長因子および適合する添加剤を含む組成物；及び
ｄ）場合により、抗原または免疫応答が目的のものである抗原をコードする核酸を含む組成物；
を含む、請求項１３に記載の樹状細胞を調製するためのキット。
【請求項１７】
アジュバントとして請求項１３〜１５のいずれか一項に記載の樹状細胞を少なくとも１つの免疫原および薬学的に許容されるベヒクルまたは補助剤と一緒に含む薬学的組成物またはワクチン。
【請求項１８】
活性主成分として請求項１３〜１５のいずれか一項に記載の樹状細胞を薬学的に許容されるベヒクルまたは補助剤と一緒に含む薬学的組成物またはワクチン。
【請求項１９】
樹状細胞が、請求項１５に記載の樹状細胞である、請求項１８に記載の薬学的組成物またはワクチン。
【請求項２０】
ヒト体内の抗原の存在に関連する病理の予防または処置のためのワクチンまたは薬学的組成物の調製のための、請求項１３〜１５のいずれか一項に記載の樹状細胞の使用。
【請求項２１】
病理が、感染性または腫瘍性疾患である、請求項２０に記載の使用。
【請求項２２】
感染性疾患が、ウイルス感染である、請求項２１に記載の使用。
【請求項２３】
ウイルス感染が、ＨＩＶ、ＨＢＶまたはＨＣＶ感染である、請求項２２に記載の使用。
【請求項２４】
腫瘍性疾患が、リンパ腫である、請求項２０に記載の使用。
【請求項２５】
腫瘍性疾患が、ウイルスにより誘起される、請求項２１または２４に記載の使用。
【請求項２６】
腫瘍性疾患が、エプスタイン・バールウイルスにより誘起される、請求項２５に記載の使用。
【請求項２７】
薬学的組成物が、感染部位でまたは腫瘍内での投与に適している、請求項２０〜２６のいずれか一項に記載の使用。
【請求項２８】
Ｔ細胞を１３〜１５のいずれか一項に記載の樹状細胞と接触させる工程を含むＴ細胞の生体外増殖のための方法。
【請求項２９】
活性主成分として請求項２８に記載のＴ細胞を含有する薬学的組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、免疫治療の分野、および特にアジュバントとしてヒトまたは動物樹状細胞を含むワクチンに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
樹状細胞（ＤＣ）は、当業界では公知である。系列特異的マーカーが不在の場合、その他の系列の白血球マーカー（Ｔ細胞系列に関してはＣＤ３、単球系および顆粒系に関しては、ＣＤ１４、ＣＤ１５、Ｂ細胞系列に関してはＣＤ１９、ＣＤ２０およびＣＤ２４、ならびにＮＫ細胞系列に関してはＣＤ１６、ＣＤ５６およびＣＤ５７）の欠如により、その特異的免疫表現型（表面抗原ＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８６に関して陽性）およびその形態学（樹状突起の存在または膜プロセスにより特徴づけられる）により、一般に樹状細胞が同定される（１−３）。
【０００３】
機能の観点では、ＤＣは、高度に強力な抗原提示細胞（ＡＰＣ）であり、免疫応答の初回抗原刺激（priming）においてインビボで中心的な役割を果たすことが解っている（１−３）。これに関連して、成熟および未成熟ＤＣ間に主要な区別がある。
【０００４】
未成熟ＤＣは、抗原の捕捉および抗原のプロセシングに特定化される免疫応答の弱いイニシエーターであり、アクセサリー分子ＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８６の低発現およびＣＤ８３の発現の欠如により表現型的に特徴づけられる。適当な刺激を行ったときに、ＤＣは大きく変化する：抗原捕捉機能の喪失、およびＣＤ８３およびＣＤ２５の誘導と共に共刺激分子（ＣＤ４０、ＣＤ８０およびＣＤ８６）の発現の上方制御（１−４）。
【０００５】
最終的に分化した／成熟したＤＣは、代わりにリンパ系組織内の未刺激のＴ細胞を容易に初回抗原刺激することができる。
【０００６】
したがって成熟状態のＤＣの表現型は、典型的には自己分泌／傍分泌メカニズムによりＤＣ自体のおよびその他の宿主細胞の表現型および機能的活性に影響し得ると考えられるＩＬ−１５（１−３、５、６）を含む種々のサイトカインの生成により特徴づけられる（７−９）。
【０００７】
成熟／活性化ＤＣの表現型は、また特異的走化特性により特徴づけられる。これに関連して、ＤＣの遊走は、成熟化の機能として厳密に制御されることは当業界で公知である（１０−１３）。
【０００８】
したがって、未成熟ＤＣは、炎症性ケモカイン、例えばＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、ランテス（RANTES）およびＭＩＰ−３α（１４）に対してケモカインレセプターＣＣＲ５およびＣＣＲ６の発現の結果として応答するが、一方成熟ＤＣは、同族レセプター発現または活性の下方制御の結果としてこれらのケモカインのほとんどに対してその応答性を喪失している（１５）。
【０００９】
逆に、成熟ＤＣは、未成熟ＤＣでは欠如しているその特異的レセプターＣＣＲ７の誘導の結果として、ＭＩＰ−３β／ＥＬＣおよび６Ｃｋｉｎｅ／ＳＬＣに対して応答することが報告されている（１０、１１、１５）。
【００１０】
一方、ＤＣは、それ自体一連のケモカインの生産者である。成熟時に、ＤＣはＭｉｐ−３α、Ｍｉｐ−３βおよびＩＬ−８を最初に一気に生産し、一方、ランテスおよびＭＣＰ−１をより持続的の様式で生成する。活性化／成熟ＤＣによるＭＩＰ−３β／ＥＬＣの生成もまた、ＣＣＲ７を選択的に発現する未刺激ＴおよびＢ細胞を補充することによる免疫応答の作製を支援するのに重要である。
【００１１】
成熟ＤＣは、また、レセプターＣＸＣＲ３に結合することにより活性化／メモリー化される胞Ｔｈ１細胞に対する強力な化学誘引物質であるＩＰ−１０を発現し（１０、１６、１７）、一方、未成熟ＤＣは、特異的に慢性的に活性化されているＴｈ２リンパ球を誘引するＭＤＣおよびＴＡＲＣを発現する。（１０、１８）。加えて、成熟ＤＣおよびＩＬ−１２の存在下、Ｔ−ヘルパー細胞は、ＩＦＮγ生成Ｔｈ１細胞に変化し、これは、免疫応答の細胞性免疫応答を促進し、一方、ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞は、活発な増殖を誘起される。ＩＦＮγおよびＩＬ−１２は、更にＴ細胞のキラー細胞への分化を促進する。
【００１２】
したがって、成熟ＤＣは、種々のＴ細胞の成長および活性化を刺激できると考えられる。
【００１３】
抗原特異的未刺激Ｔ細胞を初回抗原刺激する能力は、ＤＣの独特で重大な機能を表している。更に、ＨＬＡおよび共刺激性分子の発現増強のために、ＤＣは、同種間ＭＬＲ（これにより異なるＡＰＣが抗原に依存しないでＴ細胞増殖を刺激する能力を比較することが可能になる）を別の抗原提示細胞のいずれよりも更に効率よく刺激する。したがって、かかる細胞を感染性物質または腫瘍に対する予防用または治療用ワクチンのための細胞性アジュバントとして利用することに興味が深まる。
【００１４】
しかしながら、末梢血中の非常に低い存在頻度、および骨髄またはリンパ系器官への接近を目指す手順の侵襲性により、ＤＣの使用は、限定されていた。かかる限定によりアジュバントとしておよびそれに関連する適用に使用するＤＣの獲得を複雑にし、そして経費がかかることになる。
【００１５】
結果的に、インビトロでＤＣの生成を可能にするいくつかの方法が明らかにされている。これらの手法は、すべて、ＤＣが骨髄および血液中のＣＤ３４＋前駆細胞に由来するか、または末梢血単核ＣＤ１４＋細胞から誘導され得るいう情報に基づいている（１９、２０）。したがって、第１の研究法に従って、Ｆｌｔ３−ＬまたはＳＣＦ（幹細胞因子）、続いてＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４およびＴＮＦαを含む種々サイトカインの組み合わせを含有する培地中でＣＤ３４＋前駆細胞を培養することによりＤＣを作製する（３、４）。
【００１６】
第２の研究法では、ＣＤ３４＋前駆細胞の培養の初期段階をＧＭ−ＣＳＦ、ＴＮＦ−αおよびＩＬ−４（ＰＣＴ／ＡＵ９７／００８０１）の存在下で、続いてＩ型ＩＦＮと共に処理することにより実施する。
【００１７】
別の研究法に従って、臍帯血または骨髄からのＣＤ３４＋前駆細胞を、ＩＬ−３またはＧＭ−ＣＳＦの存在下で培養する（２１）。このように、この手法は、細胞増殖を引き起こすことが示されており、この増殖は、ＴＮＦαにより強く増強され、そして典型的なＤＣ形態学および表面マーカーを提示するＣＤｌａ＋細胞の出現に達する。ＧＭ−ＣＳＦおよびＴＮＦαの存在下で培養されたＣＤ３４＋前駆細胞は、５〜７日以内にＣＤ１４およびＣＤ１ａの独占的な発現により定義される２つの別個のＤＣ集団に分化する。しかしながら、更に培養することにより、ＣＤ１ａ発現は、通常ちょうどＣＤ８３が出現したときに下方制御される（３）。
【００１８】
第４の研究法によれば、ＩＬ−１３またはＩＬ−４と共に５〜７日間ＧＭ−ＣＳＦ中で培養されたＣＤ１４＋末梢血単球から出発して未成熟ＤＣを作製する。しかしながら、この手順に従って生成されたＤＣは、低レベルのＣＤ８０およびＣＤ８６を発現する未成熟ＤＣの特徴を呈し、未成熟ＤＣとして挙動する。結果的に、これらのＤＣは、弱い特異的Ｔ細胞応答およびＭＬＲのスティミュレーター（stimulator）として作用する。この設定では、更にＴＮＦα、ＩＬ−１、ＬＰＳ、単球コンディション培地（monocyte-condition medium）（２２）またはｓＣＤ４０Ｌを更に２日間添加することによりＤＣ成熟化を誘導することができる。
【００１９】
したがって、未成熟ＤＣへの他の因子の添加によるＤＣ成熟化のさらなる工程の要件により、臨床応答に非常に有効なＤＣを迅速に作製するのに強力な制限が提示される。更に、成熟ＤＣの使用が臨床適用に対して未成熟ＤＣを越える利点を提示するかどうかは明らかでない。この局面では、中間表現型および機能的特性、すなわち：成熟ＤＣに典型的な膜マーカーの発現および強力な免疫刺激能力に関連する高度な食作用活性が付与されているＤＣは、臨床適用に対して非常に興味深い新規細胞性構成要素に相当するであろう。
【発明の開示】
【００２０】
本発明の目的は、動物およびヒトの予防用および治療用ワクチン接種において使用するのに適した、部分的に成熟したおよび高度に機能的であるＤＣの迅速な作製を可能にする方法を提供することである。
【００２１】
かかる目的は、本発明の第１の態様に従って、上記単核細胞をその最初の培養から、最終濃度１００IU/ml以上でＩ型インターフェロンと接触させる工程を含む、培養中の単核細胞から樹状細胞を誘導するための方法により達成される。
【００２２】
本発明の方法の第１の利点は、それにより部分的成熟ＤＣが、必須因子としてＩ型ＩＦＮを含む単一の工程の処理の後に、新鮮な単離された単球から得ることができるという点である。
【００２３】
本発明の方法の第２の利点は、短時間（培養３日間以内）で実施できるＤＣ生成のためのとりわけ迅速な方法を提供することである。
【００２４】
第３のおよび主要な利点は、高度に安定で、そしてとりわけ成熟したＤＣの作製である。かかるＤＣは、当業界で公知の手法により入手できるＤＣが呈するものよりも更に強力な「インビトロ」および「インビボ」活性が付与されている。
【００２５】
これに関連して、本発明の方法を好ましくは培養３日以内に、そして更に好ましくは培養中の単球／ＤＣ生存性を促進する成長因子、例えばＧＭ−ＣＳＦ（顆粒球／単球コロニー刺激因子）等の存在下で実施する。
【００２６】
使用されるＧＭ−ＣＳＦは、好ましくは２５０〜１０００U/mlの範囲の濃度である。
【００２７】
本発明の方法に適したＩ型ＩＦＮをいずれかの天然のＩＦＮα、いずれかの組換え種またはＩＦＮαのサブタイプ、コンセンサスＩＦＮ（本明細書ではＣＩＦＮとも称するＩＦＮｃｏｎ１）、天然または組換えＩＦＮβ、およびいずれかの合成Ｉ型ＩＦＮからなる群から選択することができる。
【００２８】
前記で報告したように、ＩＦＮは、好ましくは最終濃度１００IU/ml以上で培養培地中に存在する。しかしながらこれに関連して好ましい態様は、Ｉ型ＩＦＮが１００〜１０，０００IU/mlの範囲で、またはより好ましくは４００〜１０，０００IU/mlの範囲で、または５００〜２，０００IU/mlの範囲に含まれる、とりわけ１０００IU/mlの濃度で存在するものである。後者の範囲および濃度を用いると、ＤＣは、毒性効果が最低で、そして良好な細胞生存性を伴って、機能活性に随伴される膜マーカーの最適発現を獲得する。
【００２９】
ＧＭ−ＣＳＦは、単球由来のＤＣのための定常的な培養成分であるので、ＩＦＮ／ＧＭ−ＣＳＦ（本明細書ではＩＦＮ−ＤＣとも定義する）の存在下で作られるＤＣ集団に対する分化への影響は、ＩＦＮに帰する。
【００３０】
容易に入手可能な出発生成物を用いるというさらなる利点を有する実施態様では、本発明の方法に特に好ましい単核細胞が、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、およびとりわけＣＤ１４＋単球から単離される。または、記載された手法では、未分離または付着性のＰＢＭＣすべてを利用する。
【００３１】
ＤＣを「インビトロ」で培養するのに適したいずれかの培地で細胞を培養することができる。特定のヒト患者の処置の場合には、Ｘ−ＶＩＶＯ  ２０またはＡＩＭ−Ｖのような培養培地を用いるのが好ましい。
【００３２】
更に好ましい態様では、本発明の方法は、Ｉ型ＩＦＮで処理した細胞を成熟化物質と接触させる工程をも含む。かかる実施態様は、前記で報告したようにＩ型ＩＦＮで単核細胞を処理することにより得られるＤＣのさらなる成熟化が望ましいと当業者に同定され得る場合のすべてにとりわけ適している。
【００３３】
前記で報告したように、本発明の方法の主要な利点は、高度に安定で、そして機能的なＤＣの生成が可能になるという点である。
【００３４】
以下に詳記するように、かかるＤＣは、実際に、当業界で公知の他の方法に従って誘導されたＤＣでは現れない免疫表現型、形態学、化学走性および免疫学的活性を呈する。かかる特徴により本発明のＤＣが、ワクチン投与におけるアジュバントとしてとりわけ適したものとなる。
【００３５】
本発明のさらなる目的は、本発明の方法により得られる、好ましい実施態様では、抗原性ペプチドまたはタンパク質、または少なくとも１つの抗原を含有する細胞抽出物、または核酸で負荷されたＤＣ、ならびに上記ＤＣをアジュバントとして、または活性主成分として少なくとも１つの抗原および薬学的に許容される担体ベヒクルまたは補助剤と一緒に含む薬学的組成物およびワクチン、および上記薬学的組成物およびワクチンを生成するための方法である。（複数の）抗原は、その存在が病理に随伴されるウイルス、細菌または腫瘍抗原でよい。
【００３６】
ワクチン生成の技術分野に適合させたいずれかのベヒクル、担体、補助剤および処方を本発明のワクチンに用いることができる。当業者は、上記成分および相当する製造方法の全工程を特定することができる。
【００３７】
本発明の更に別の目的は、本発明のＤＣを薬学的に許容される担体、ベヒクルまたは補助剤と一緒に含む薬学的組成物またはワクチンであり、上記担体ベヒクルおよび補助剤は当業者により特定可能である。
【００３８】
本発明のワクチンおよび組成物は、好ましくは特異的抗原で負荷させたＤＣを含む。または、本発明のワクチンおよび組成物は、予め抗原と共にインキュベートされていないＤＣを含むことができる。後者の場合、一度組成物またはワクチンを、それを必要とする対象に注射すると、ＤＣにより抗原が局所的に獲得される。
【００３９】
前記したワクチンおよび薬学的組成物は、本発明に従ってヒト体内の抗原の存在に関連する病理を予防または治療するための方法に用いるのに適している。上記病理は、好ましくは感染または腫瘍性疾患である。更に好ましくは、上記病理は、リンパ腫、ＨＩＶ、ＨＢＶもしくはＨＣＶ感染のようなウイルス感染、またはウイルスにより誘起される腫瘍性疾患、例えばエプスタイン・バールウイルスにより誘起される腫瘍性疾患である。本発明は、また、適量、好ましくは、約１０７〜約５ｘ１０９、および好ましくは約１０８〜約１０９を含む量の本発明の単球由来樹状細胞を、それを必要とする対象に投与することを含む、ヒト体内の抗原の存在に関連する病理を予防または治療するための方法にも関する。
【００４０】
また本発明のＤＣをＴ細胞の生体外（ex vivo）エクソビボ増殖に用いることもでき、これは、ＣＤ４＋および／またはＣＤ＋８、またはその双方でよく、Ｔ細胞をエクソビボ増殖する方法では、上記Ｔ細胞を本発明の樹状細胞と接触させる工程を含む。このように処理したＴ細胞を免疫障害または悪化を処置するためにヒトに投与することができる。
【００４１】
また本発明の目的は、ＤＣの調製物のための手段を含有するキットである。
【００４２】
インビトロＤＣ誘導の方法
例えば精製されたまたは部分的に富化されたＣＤ１４＋単球またはＰＢＭＣ（末梢血単核細胞）画分など、とにかく当業者によりヒトまたは動物組織から得られるいずれかの単球細胞培養を本発明に従って処理できる。
【００４３】
しかしながらＤＣ前駆細胞を動員するためのいかなる薬理学的前処置をも施していない患者から直接収集できる血液由来の高度に精製されたＣＤ１４＋単球、付着性ＰＢＭＣまたは全ＰＢＭＣがとりわけ適している。続いて臨床使用するためには、濃縮の白血球アフェレシス（apheresis）の密度勾配遠心またはサイタフェレシス（cytapheresis）により細胞収集を実施する。臨床使用に適した標準的な装置、フラスコおよびインキュベーターにより細胞を培養する。
【００４４】
次いで全ＰＢＭＣ、とりわけ富化または高度に精製された単球をＩ型ＩＦＮの存在下、直接培養する。抗ＣＤ１４マイクロビーズ（ＭＡＣＳ  細胞単離キット、Miltenyi Biotec、ドイツ）により陽性免疫選択を用いて夾雑リンパ球を激減させて単球を精製することができる。または、製造者に推奨されるように、ハプテン結合ＣＤ３、ＣＤ７、ＣＤ１９、ＣＤ４５ＲＡおよびＣＤ５６抗体のカクテルに向けられたモノクローナル抗ハプテン抗体を結合させたマイクロビーズ（ＭＡＣＳ  細胞単離キット、Miltenyi Biotec、ドイツ）を用いる。
【００４５】
本発明に従って単球の集団の生成を確実にする他の手法または一連の手法を同様に用いることができる。
【００４６】
とりわけ適当な手法では、「閉鎖系処理装置」、例えば気体透過性疎水性バッグ（２１）中５％  ＣＯ２加湿空気中３７℃の細胞培養を含むＶＡＣｃｅｌｌ（登録商標）処理装置（２３）で、培地および自己血清と共に好ましくはＩ型ＩＦＮ  １０００IU/mlおよび好ましくはＧＭ−ＣＳＦ  ５００IU/mlの存在下、細胞を処理および培養する。本発明が属する技術分野のいずれの技術者にも認識されるように、無血清培地、ヒトＡＢまたは自己血清を便宜的に使用することができる。
【００４７】
続くＤＣの使用に従って、異なる型の標準培地（例えばＲＰＭＩ−１６３０、ＭＥＭ、イスコフ改変ダルベッコ培地、ダルベッコ改変イーグル培地）を用い、一方、ヒト患者の処置に適した培地、例えばＸ−ＶＩＶＯ  ２０またはＡＩＭ−Ｖを、臨床プロトコルに用いられるＤＣの培養に用いるのが好ましい。
【００４８】
本発明の方法に適したＩ型ＩＦＮに関して、いずれの型のＩ型ＩＦＮでもＩＦＮ−ＤＣの作製に用いることができる：健常対象の刺激された白血球からの天然ＩＦＮα（ＩＦＮα）またはリンパ芽球腫の天然ＩＦＮα、組換えＩＦＮα、例えばＩＦＮα２ｂおよびＩＦＮα２ａ、コンセンサスＩＦＮα（ＣＩＦＮ）、天然および組換えＩＦＮβ。好ましくは、Ｉ型ＩＦＮは、１００IU/ml以上の濃度で用いられ、好ましくは１００〜１０，０００IU/mlの範囲、更に好ましくは４００〜１０，０００IU/ml、または５００〜２，０００IU/mlの範囲で、とりわけ１，０００IU/mlで含まれる。共刺激分子の上方制御に関しては、最適増強効果は、ＩＦＮ用量が５００〜１，０００IU/mlで観察され、一方、ＩＦＮ  １００IU/mlは、何ら有意な効果に至らない。ＤＣ表現型に関する比較しうる増強効果は異なるＩ型ＩＦＮの調製物、例えば天然ＩＦＮ−α、ＩＦＮα２ｂ、ＣＩＦＮおよびＩＦＮβを用いて得られる。
【００４９】
予備試験されていない市販の調製物の使用の後、濃度調整が必要であろう。当業者は、いずれの場合も、用いる異なるＩＦＮおよび／または用いる異なる培養条件の効果においてかかる調整を適用することができる。
【００５０】
本発明に従って、ＩＦＮの培養物への添加を、最終濃度が前記で示された範囲内にあるという条件で、培養物中のＩ型ＩＦＮを誘導できるいずれかの物質との処理で置き換えることができる。
【００５１】
好ましくは、本発明の方法を成長因子の存在下で実施する。好ましくは、上記成長因子は、ＧＭ−ＣＳＦであり、好ましくはこれを２５０〜１０００IU/mlの間の濃度で用いる。
【００５２】
単核細胞のＩ型ＩＦＮおよび場合によっては成長因子での処理を、一般的には最大３日間実施し、その終わりには非付着性およびゆるやかな付着性ＤＣを収集する。
【００５３】
好ましくは、２日〜３日の間に収集された細胞を直接用いるか、または対向流遠心のエルトリエーション（elutriation）かもしくは系列特異的抗体に結合したビーズを用いる免疫磁性陰性選択のいずれかにより精製する。または、連続使用するためにＤＣを便宜的に凍結することができる。
【００５４】
本発明の好ましい実施態様では、方法は、単核細胞からのまたは単球からのＤＣの誘導の後、公知の成熟化物質の中から選択された成熟化物質、例えば細菌性抽出物、ポリ−ＩＣまたはＣＤ４０リガンドを用いるＤＣのさらなる成熟化工程を包含することができる。
【００５５】
樹状細胞を調製するためのキットもまた本発明の目的である。このキットは、本出願で記載する方法を実施化するための簡便化の手段を含有する。これらの手段は：ＰＢＭＣから単核細胞を収集するための可能な手段；適当なバッファー、洗浄および細胞保存溶液；単核細胞の培養培地、および培養培地を補充するもの、例えばＩ型ＩＦＮおよびことによるとＧＭ−ＣＳＦを調製するための手段を包含できる。
【００５６】
培養中の単核細胞からＤＣを誘導するためのキットは、：
・（複数の）バッグ、培養培地、バッファーおよび結合チューブなどの、細胞の培養および洗浄に必要な１回使用の構成要素；
・Ｉ型ＩＦＮおよび適合する添加剤を含む組成物；
・ことによると、細胞成長因子および適合する添加剤を含む組成物；ならびに
・ことによると、その抗原に対する免疫応答が目的である、抗原または抗原をコードする核酸を含む組成物；
を含むことができる。
【００５７】
当業者は、前記で報告した組成物に適した添加剤を、当業界で公知の化学的に適合する添加剤の中から容易に特定することができる。
【００５８】
本発明によるキットはまた、ことによると：
・白血球濃縮物を得るために血液を回収および遠心するための手段；
・他の白血球および夾雑する赤血球からリンパ球および単球を回収するための手段；
・細胞を保存するための適当な手段、例えば自己もしくはＡＢ＋血清またはヒト血清アルブミンの存在下のグリセロールまたはジメチルスルフォキシドを含む細胞を凍結するための手段。
・培養細胞のトランスフェクションのための手段および本発明の樹状細胞に対する抗原を標的化する手段；
を含有することもできる。
【００５９】
このキットは、好ましくは１回使用のキットである。これは、例えばＩＤＭ（パリ、フランス）のＶａｃＣｅｌｌ細胞処理装置の改良型でよい。
【００６０】
本発明の特定の実施態様では、本特許出願で記載した方法により得られるＤＣを抗原性ペプチドまたはタンパク質、少なくとも１つの抗原を含有する細胞抽出物、または核酸分子で負荷することができる。細胞抽出物は、細胞ライゼートまたは細胞から調製されるアポトーシス状の物からなってよい。この調製物のために想定された細胞は、系統細胞または予め患者から採取された自己細胞でよい。当業者に公知の方法に従ってペプチドでパルスを与えることにより、または食作用、飲作用、親和性結合、融合、核酸移入またはレセプターに媒介される取り込みにより、細胞に抗原を負荷することができる。
【００６１】
前記した条件に従って用いたＩ型ＩＦＮは、新鮮な単離された、好ましくはＧＭ−ＣＳＦ処理ヒト単球の、ｈｕ−ＰＢＬ−ＳＣＩＤマウス（２４）の「インビトロ」および「インビボ」の双方および走化性因子に応答する遊走能力において強力な機能的作用を付与されたＤＣへの迅速な分化を誘起することが示された。
ＩＦＮ／ＧＭ−ＣＳＦの存在下で作製されたＤＣの、ＩＬ−４／ＧＭ−ＣＳＦ処理後に得られたＤＣとの比較により、Ｉ型ＩＦＮが迅速で安定した分化方法を誘導するのに、ならびに「インビトロ」でおよびｈｕ−ＰＢＬ−ＳＣＩＤマウスの双方で強力な１次ヒト免疫応答を引き出すのに十分な能力を付与するのに決定的に優れていることが示された。
【００６２】
ＤＣ  特徴づけ：ＦＡＣＳ分析、サイトカイン発現、走化特性
２つの異なる状態のＤＣ集団の第１の指標は、膜マーカー発現に関して相当な差異を示すＦＡＣＳ分析に由来する。
【００６３】
これに関連して、とりわけ３つの主要な型の表現型の相違が観察された：
ｉ．ＩＦＮ−ＤＣの培養プレートからの単球の初期の剥離、３日以内に高レベルのＣＤ４０、ＣＤ５４、ＣＤ８０、ＣＤ８６およびＨＬＡ−ＤＲ分子の迅速な獲得と並行した（図１）が、一方、ＩＬ−４／ＧＭ−ＣＳＦ処理単球は、未成熟ＤＣ表現型を完全に獲得するのに少なくとも６〜７日必要であった。
ｉｉ．相当なパーセンテージのＩＦＮ−ＤＣでのＣＤ８３およびＣＤ２５（典型的な成熟ＤＣのマーカー）の選択的発現（図１、表１）；特にこれに関連してＣＤ８３発現は、一定して高レベルのＨＬＡ−ＤＲおよびＣＤ８６と随伴した；ならびに
ｉｉｉ．膜抗原ＣＤ１２３（ＩＬ−３レセプターａ鎖）の有意な発現（図１）、これはＩＬ−４−ＤＣよりもＩＦＮ−ＤＣにおいてより多く発現した。
【００６４】
さらなる指標は、ＤＣ集団の形態学的種類の分析に由来し（図４）、これはＣＤ４４染色の後の免疫細胞化学により明白に検出されるように、ＩＦＮ−ＤＣが２〜３日以内に、目立った指向性の樹状突起の形成を伴う典型的なＤＣの特徴を迅速に獲得したことを示した。樹状突起の極性ＣＤ４４染色は、更にＩＦＮ−ＤＣに典型的であった。
【００６５】
特に、サイトカイン除去時に、ＩＦＮ／ＧＭ−ＣＳＦ処理培養物は、ＤＣ表現型を保持し、フラスコ表面には付着しない、一方、ＩＬ−４／ＧＮ−ＣＳＦ処理ＤＣは、最終分化まで刺激しないと、３日以内にマクロファージ特性を再度獲得し、そして培養フラスコに容易に再付着する。
【００６６】
成熟／活性化状態のＩＦＮ−ＤＣ対未成熟状態のＩＬ−４−ＤＣの第３の指標は、２つのＤＣ集団におけるサイトカイン発現の分析に由来し、これは、ＩＬ−１５がＩＦＮ−ＤＣで発現されたが、ＩＬ４−ＤＣでは発現されなかったことを示した（図５）。
【００６７】
第４の指標は、走化特性の分析に由来した。実際に、単球誘導ＩＦＮ−ＤＣは、ＩＬ−４−ＤＣに対して、ＣＣＲ５発現の増強を呈し、これは、炎症性βケモカイン（とりわけＭＩＰ−１β）に応答する遊走の増強と随伴した。同様に、ＩＦＮ−ＤＣは、ＣＣＲ７天然リガンド、すなわちＭＩＰ−３βの発現増強と共に、ＩＬ−４−ＤＣよりも高レベルのＣＣＲ７  ｍＲＮＡを発現し（図８Ａ）、これは成熟状態の獲得と合致した。特に、これに関連して、ＩＦＮ−ＤＣは、ＭＩＰ−３βに応答した強力な遊走応答を示し、これは、ＩＬ−４−ＤＣでは実質的に不在であった（図８Ｂ）。
【００６８】
実質的にすべての遊走細胞においてＣＤ８３上方制御により明らかであるように、目的のＭＩＰ−３βに対する「インビトロ」遊走応答は、成熟化に随伴され、これは、更にＩＦＮ−ＤＣが成熟化に対して非可逆的な関係付けを獲得したことを示している。
【００６９】
ＩＦＮ−ＤＣ対ＩＬ−４−ＤＣにおけるケモカイン発現の評価（図８Ｃ）は他の主要な相違を示し、これは、２つのＤＣ集団による免疫応答の極性化の相違に合致する。とりわけ、ＩＦＮ−ＤＣは、高レベルのＩＰ−１０およびＩＬ−１５を発現し、一方、ＩＬ−４−ＤＣは、優先的にＭＤＣおよびＴＡＲＣを発現した。
【００７０】
機能分析
本明細書に提示する本発明の目的である方法は、ＤＣを「インビトロ」および「インビボ」で用いるための培養および迅速な生成に有用である。
臨床等級の大量ＤＣをＩ型ＩＦＮおよびＧＭ−ＣＳＦと共に生成することにより、それを細胞ワクチンアジュバントとして使用することが可能になる。
【００７１】
本発明の方法に従ってＩＦＮ／ＧＭ−ＣＳＦの存在下で作製されたＤＣは、不活化ウイルスを自己Ｔリンパ球に「インビトロ」で取り込む、プロセシングを行う、および提示する強力な能力を示し、これは明らかにＩＬ−４／ＧＭ−ＣＳＦと共に培養されたＤＣを用いて観察されたものよりも明らかに優れていた（図９）。
これらの「インビトロ」結果に基づいて、とりわけＩＦＮ／ＧＭ−ＣＳＦまたはＩＬ−４／ＧＭ−ＣＳＦのいずれかの存在下で作製された、ＨＩＶ−１でパルスを与えたＤＣの「インビボ」でヒト１次免疫応答を引き出す能力を自己ＰＢＬで再構築されたＳＣＩＤマウスを用いて評価した。
【００７２】
ＡＴ−２不活化ＨＩＶ−１でパルスを与えた自己ＩＦＮ−ＤＣでのｈｕ−ＰＢＬ−ＳＣＩＤマウスの免疫により、ウイルスタンパク質の全スペクトルに対する特異的ヒト抗体の検出により評価されるように（示していない）、ＨＩＶ−１抗原に対する強力な１次免疫応答が顕著に作られることになる（図１０Ａ）。免疫の７日後、ヒト抗体は、たいていＩｇＭであることが判明したが、一方、２週にＨＩＶ−１特異的ＩｇＧ１抗体が検出され、これは、Ｔｈ１様応答を示唆している（図１０Ｂ）。
【００７３】
特に、ＩＦＮの存在下で作製されたＤＣで注射したマウスの血清において検出された抗体は、「インビトロ」でＨＩＶ−１に対して強力な中和活性を有した（図１０Ｃ）。
【００７４】
ＨＩＶ−１に対するヒト抗体のレベルは、ＩＬ−４の存在下で育成された、対応するウイルスでパルスを与えたＤＣで免疫した異種間キメラで検出されたレベルと比較して、免疫Ｉ型ＩＦＮの存在下で作製されたＤＣを注射したｈｕ−ＰＢＬ−ＳＣＩＤマウスにおいて一貫して高かった。
【００７５】
更に、以下の実施例９で示すように、ＨＩＶ抗原でパルスを与えたＩＦＮ−ＤＣでの免疫は、ＨＩＶで誘発された免疫マウスの臓器におけるプロウイルスＤＮＡ負荷の明確な削減に至った。
【００７６】
ＩＦＮ−ＤＣのＣＤ８＋Ｔ細胞特異的応答を刺激する能力を実証するために、３体の異なるドナーの単球からＧＭ−ＣＳＦ／ＩＦＮの存在下でＤＣを作製し、そして異なるＥＢＶ抗原から誘導されたＨＬＡクラスＩ制限ペプチドでパルスを与え、そして自己ＰＢＬを刺激するために使用した。以下の実施例１０で論じるように、ＩＮＦ−ＤＣは、インビトロで３体のすべてのドナーのＥＢＶ特異的ＣＤ８＋細胞の増殖および生存を効率的に促進することができる。ペプチドでパルスを与えたＩＦＮ−ＤＣでの刺激の後に増殖したＥＢＶ特異的ＣＤ８＋Ｔリンパ球がｈｕ−ＰＢＬ−ＳＣＩＤキメラモデルおいてリンパ腫生成を阻止できるかどうかを評価するために、ＳＣＩＤマウスを、以前にＳＣＩＤマウスへのＰＢＭＣ注射の後、リンパ腫形成能力に関して試験したドナーの１つからのＰＢＭＣで再構築した。自己ペプチドでパルスを与えたＩＦＮ−ＤＣでの再構築された動物のワクチン接種により、ワクチン接種していないＳＣＩＤマウスに関して、およびパルスを与えていないＩＦＮ−ＤＣでワクチン接種したマウスに関して観察されたものと比較して、高度に有意な生存時間の延長が引き起こされた（表２）。全体的には、これらの結果は、ＩＦＮ−ＤＣがエフェクターＣＤ８＋Ｔリンパ球の増殖の刺激に有効であることを示している。
【００７７】
得られた結果は、またＩＦＮ−ＤＣを体内の抗原の存在に随伴される病理の予防および処置に有効に用いることができることも示している。好ましくは、上記病理は、感染性または腫瘍性疾患である。本発明のＤＣは、とりわけリンパ腫、ウイルス感染、例えばＨＩＶ、ＨＢＶまたはＨＣＶ感染、およびウイルスにより引き起こされる腫瘍性疾患、例えばエプスタイン・バールウイルスにより引き起こされる疾患の防御および処置に適している。
【００７８】
したがって、本発明は、アジュバントして本発明のＤＣを少なくとも１つの免疫原および薬学的に許容される担体ベヒクルまたは補助剤と一緒に含むワクチンおよび薬学的組成物にも言及する。
【００７９】
本発明の別の目的は、活性主成分として、好ましくは１つまたはそれ以上の抗原で負荷した本発明の樹状細胞を薬学的に許容される担体ベヒクルまたは補助剤と一緒に含む薬学的組成物およびワクチンである。
【００８０】
患者のＨＬＡハプロタイプおよび誘発される応答の型に基づいて選択されたペプチドで３７℃で１〜２時間パルスを与えることにより本発明のＤＣに（複数の）抗原を負荷（１０〜２００μg/ml）することができる。または、本発明のＩＦＮ−ＤＣにタンパク質全体またはタンパク質複合体でパルスを与えることができる。
【００８１】
未知の腫瘍随伴抗原を示す悪性の場合、ＩＦＮ−ＤＣにカチオン性リポソームと複合体形成した腫瘍ＲＮＡで、または腫瘍細胞全体のライゼートでパルスを与えることができる。更に、アポプトーシス性または壊死性腫瘍細胞を貧食することにより、または細胞ライゼートに暴露することにより、ＩＦＮ−ＤＣに抗原の取り込みを誘導することができる。かかる場合では、インキュベーション時間を４〜５時間まで適当に延長することができる。実際に、ＩＦＮ−ＤＣが細胞ライゼート、ならびにアポプトーシス性または壊死性腫瘍細胞およびウイルス感染した細胞を貪食できることを「インビトロ」で実証した。
【００８２】
ＩＦＮ−ＤＣは、またウイルス粒子、細菌および酵母を有効に内部移行させ、複数のエピトープまたは複合抗原を不活化または遺伝子修飾された微生物を介してＤＣに標的化することが可能になる。更に、操作されたＤＮＡおよびＲＮＡでさえ直接内部移行させ、抗原コード化配列をＩＦＮ−ＤＣに送達することができる。
【００８３】
そのＣＤ１４＋単球が既にＢＣＲ−ＡＢＬ融合遺伝子またはその他の推定される腫瘍抗原を発現する慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）患者由来のＩＦＮ−ＤＣの場合のように、ＩＦＮ−ＤＣが利用前に何らパルスまたは腫瘍抗原投与を必要としない場合もある。
抗原負荷ＩＦＮ−ＤＣの可能な投与経路は、ワクチンを投与するために用いられるいずれかの経路であり、この抗原が何であろうと、結節内、皮下、静脈内、腹腔内、筋肉内、経皮または皮内注射などが含まれ、腫瘍内注射が含まれる。また別の投与様式には、補助的な外部注入ポンプを伴う緩徐なｉ．ｖ．注入などが含まれる。
【００８４】
ＩＦＮ−ＤＣを投与する別の様式には、１次腫瘍またはウイルス損傷、転移または流入領域リンパ節内の直接注射を含み、特異的抗原との前インキュベーションがなくとも、これはＩＦＮ−ＤＣにより注射後すぐに局所的に獲得された。投与様式および時間スケジュールを患者の年齢および体重、疾患およびその重篤度ならびに応答度合いに従って設計し、そして調整する。このように、前記した手法に従って、２ｘ１０６〜５ｘ１０７までのＩＦＮ−ＤＣを１回または毎週／毎月の時間間隔で注入することができる。
【００８５】
また抗原で負荷したＩＦＮ−ＤＣを「エクソビボ」Ｔ細胞増殖、例えばＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋またはその双方に用いて患者に再注入できる。かかる免疫介入は、持続性感染または腫瘍性疾患の経過中に認められるように、免疫障害または悪化を有するヒトの治療に有用である。
【００８６】
実施例
実施例１．
単球からのＤＣの誘導および免疫表現型およびその形態学的の特徴付け
単球からのＤＣの誘導
Ｆｉｃｏｌｌ密度勾配遠心（Seromed）により正常なドナーのヘパリン処理した血液から末梢血単核細胞を入手した。２５〜７５cm2フラスコ（Coster, Cambridge、マサチューセッツ州）中２時間付着させるか、または標準的なＰｅｒｃｏｌｌ密度勾配遠心のいずれかにより単球を入手した。
【００８７】
ハプテン結合ＣＤ３、ＣＤ７、ＣＤ１９、ＣＤ４５ＲＡおよびＣＤ５６抗体のカクテルに向いたモノクローナル抗ハプテン抗体を結合したマイクロビーズにより（ＭＡＣＳ細胞単離キット、Miltenyi Biotec、ドイツ）陰性免疫選択を用いて夾雑する細胞を激減させることにより単球を更に濃縮した。フローサイトメトリーにより評価されるように、これらの手順の後に得られた細胞集団は、＞９５％  ＣＤ１４＋単球で表された。
【００８８】
１０％  ＦＣＳを補充したＲＰＭＩ  １６４０（Gibco BRL, Gaithesburg、メリーランド州）中血液由来単球を、１〜２ｘ１０６細胞／ml・濃度でプレートした。ＧＭ−ＣＳＦ（５００U/ml）を以下のサイトカインと組み合わせて添加した：ＩＬ−４（５００U/ml）（R & D Systems, Minneapolis、ミネソタ州）および天然ＩＦＮα（１，０００IU/ml）：ＩＦＮαｎ（Alfaferone Alfa-Wassermann）。
【００８９】
使用したすべてのＩＦＮ調製物は、検出されるＬＰＳ夾雑物を何ら含まないことが示された。培養の３または６日後、非付着性およびゆるやかな付着性細胞を収集し、そして続く分析に使用した。
【００９０】
Ｉ型ＩＦＮ＋ＧＭ−ＣＳＦ処理を、６〜７日で単球から未成熟ＤＣを入手するために現在用いられているＩＬ−４＋ＧＭ−ＣＳＦ処理と比較するために実験を実施した。
【００９１】
これに関連して、ＩＦＮ／ＧＭ−ＣＳＦ処理に応答して、付着性単球は、３日以内に迅速に非付着性浮遊細胞になった。付着性の喪失は、細胞凝集と関連し、そしてＩＦＮ／ＧＭ−ＣＳＦ処理培養物中では大きな細胞クラスターが検出された、一方、大部分のＩＬ−４／ＧＭ−ＣＳＦ処理細胞は、依然プラスチック表面に強固に付着していた。したがってそのようにして得られたＤＣは、免疫表現型的および形態学的に更に特徴づけられる。
【００９２】
ＤＣの免疫表現型による特徴付け
細胞を洗浄し、そして１％ヒト血清を含有するＰＢＳ中で再懸濁し、そしてヒト抗原に対する一連の蛍光色素結合ｍＡｂと共に４℃で３０分間インキュベートした。以下のｍＡｂを免疫蛍光染色に使用した：抗−ＣＤ１４、−ＣＤ２５、−ＣＤ５４、−ＣＤ８０および−ＨＬＡ−ＤＲ（Becton Dickinson, San Jose、カリフォルニア州）、−ＣＤ１ａ、−ＣＤ２３、−ＣＤ４０、−ＣＤ８３および−ＣＤ８６（Pharmingen, San Diego、カリフォルニア州）。フローサイトメトリーにより細胞を分析した。データを収集し、そしてＦＡＣＳｏｒｔ（Becton Dickinson）フローサイトメーターを用いることにより分析した；ＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェア（Becton Dickinson）によりデータ分析を実施した。細胞砕片および夾雑するリンパ球を排除するために、光散乱特性に従ってＤＣを電気的にゲートで選別した。
【００９３】
培養の３日後、ＩＦＮ／ＧＭ−ＣＳＦまたはＩＬ−４／ＧＭ−ＣＳＦのいずれかで処理した細胞を、ＤＣ分化に随伴される表面マーカーおよび単球マーカーＣＤ１４の発現に関して分析した。標準的なＦｉｃｏｌｌおよび４６％  Ｐｅｒｃｏｌｌ密度勾配遠心により、続いて免疫磁性仕分けにより単球を精製した。図１は、単球をＩＦＮα  １０００IU/mlおよびＧＭ−ＣＳＦ  ５００U/ml（パネルＡ）で単球を処理したときの選択マーカーの発現をＩＬ−４  ５００U/mlおよびＧＭ−ＣＳＦ  ５００U/mlで処理（パネルＢ）したときと比較して説明している。共刺激分子（ＣＤ８０、ＣＤ８６およびＣＤ４０）の上方制御は、ＩＦＮ−ＤＣにおいてサイトカイン処理後３日ほども早く、ＩＬ−４−ＤＣよりも一貫して高かった。培養の３日間、血液由来単球にＧＭ−ＣＳＦと組み合わせて加えた異なるＩ型ＩＦＮ（すなわちＩＦＮαｎ、ＩＦＮα２ｂ、ＣＩＦＮおよびＩＦＮβ）を用いて、ＤＣ表現型に及ぼす比較しうる増強効果を観察した。これに関して、図２は、サイトカイン処理の３日に得られた代表的なＦＡＣＳプロファイルの比較を示し、ここでは単球画分は、標準的なＦｉｃｏｌｌ密度勾配遠心および、続いて４６％  Ｐｅｒｃｏｌｌ密度勾配遠心により濃縮され、そして異なるＩＦＮ調製物を同一の濃度１０００IU/mlで使用した。
【００９４】
この比較結果はすべてのＩ型ＩＦＮ調製物がＤＣ作製に適していることを示している。
【００９５】
これに関連して、以下の表１は、５００U/ml  ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＦＮαｎ、ＩＦＮβまたはＣＩＦＮ  １０００IU/mlのいずれかで処理した血液単球から得られたＤＣの免疫表現型特徴を、サイトカイン処理の３日後のＩＬ−４−ＤＣと比較してまとめている。新鮮に単離した単球をＦｉｃｏｌｌおよびＰｅｒｃｏｌｌ密度遠心により部分的に精製し、そして前記のように処理した。フローサイトメトリーによりＤＣを分析し、光散乱特性に従ってＤＣをゲートで選別した。データを得て、それをＦＡＣＳｏｒｔ装置および「Cell Quest」ソフトウェア（Becton Dickinson）を用いることにより分析した。値を９回の実験の平均±Ｓ．Ｄ．で表している（各々の異なるＩ型ＩＦＮ調製物に関して３回の異なる実験）。値は、抗原発現のドットヒストグラム分析により得られ、規定の表面抗原に関する陽性細胞の平均パーセンテージおよびその平均蛍光強度（ＭＦＩ）を表している。
【００９６】
【表１】
2004526455.tif 000002
【００９７】
特に、ＩＦＮで処理した単球は、共刺激分子およびＨＬＡ−ＤＲ抗原の顕著な上方制御のみならず、双方共に成熟／活性化ＤＣのマーカーと考えられている、ＣＤ８３（陽性細胞の１５〜４０％）およびＣＤ２５抗原の発現の明確な削減をも示した。対照的に、ＣＤ８３は、極少数のＩＬ−４／ＧＭ−ＣＳＦ培養ＤＣによってのみ発現された（１〜４％）。
【００９８】
Ｉ型ＩＦＮの異なる用量、ゆえにとりわけ用量１０００IU/ml、５００IU/mlおよび１００IU/mlの効果を評価した。この目的のために、新鮮に単離した単球を単離し、サイトカインと共に培養し、そして３日目に抗原発現に関して分析した。
【００９９】
関連する用量−応答性の結果を図３に示し、これは、共刺激分子の上方制御に最適なＩ型ＩＦＮ濃度が５００〜１０００IU/mlの範囲内であることが表され、一方、ＩＦＮ  １００IU/mlは、なんら有意な効果に至らなかった。
【０１００】
全体では、これらの結果は、ＩＬ−４／ＧＭ−ＣＳＦの代わりにＩ型ＩＦＮ／ＧＭ−ＣＳＦに新鮮に単離された単球を３日間暴露することにより、とりわけＣＤ８３およびＣＤ２５の有意な発現により明示されるように、部分的に成熟した特徴的な型のＤＣが作製されることを明確に示した。これらのデータは、ＩＦＮ処理が共刺激分子の上方制御を誘起したのみならず、部分的に活性化されたＣＤ８３＋ＤＣの出現をも促進したことを示している。
【０１０１】
ＩＦＮ−ＤＣが進行した成熟化過程を受けたという非可逆的確約は、サイトカインを除去したときに、これらの細胞がプラスチック表面に付着せずにＤＣ表現型を維持するが、一方、ＩＬ−４−ＤＣは、予防的にＬＰＳにより最終分化まで刺激しない場合、マクロファージの特徴を再度獲得し、そして３日以内に培養プレートに容易に再付着したという知見により示唆された。
【０１０２】
ＤＣの形態学的特徴づけ
予備試験により、ＣＤ４４タンパク質が特異的に樹状突起で発現され、その染色が明らかにこれらの構造の輪郭を描くことが示されたので、更にＩＦＮ−ＤＣおよびＩＬ−４−ＤＣ間の潜在的で関係する相違を検出するために、ＣＤ４４抗体を用いることにより免疫細胞化学分析を実施した。
【０１０３】
３日間のサイトカイン処理の後に得られたＩＦＭ−またはＩＬ−４−ＤＣを１０４細胞／mlの濃度でガラススライド（Shandon, Cheshire、英国）上で延ばし、エタノール（７０％）で＋４℃で１０分間固定し、そしてペルオキシダーゼ抗ペルオキシダーゼ（ＰＡＰ／ＡＥＣ）（Dako、デンマーク）法を用いてＣＤ４４（Dako、デンマーク）に関してペル免疫細胞化学により染色した。Ｍａｙｅｒヘマトキシリンで細胞を対比染色した。
【０１０４】
異なる培養時間でのＩＦＮ−ＤＣおよびＩＬ−４−ＤＣの比較において明確な相違が観察された。とりわけ、ＣＤ４４染色樹状突起の数がＩＬ−４−ＤＣと比較して、ＩＦＮ−ＤＣにおいて顕著に多く観察された（図４）。ＩＦＮ−ＤＣの樹状突起は、たいてい細く、そして長く、２１〜３０μmの長さに達し（細胞体の直径の３〜４倍）、一方向性に配向していた（パネルＡ）。特に、ＣＤ４４染色は、典型的には樹状突起に局在し、うまくその輪郭を描いていた。
【０１０５】
対照的に、典型的なＣＤ４４＋染色されたＩＬ−４−ＤＣの形態学（パネルＢ）は、異なる大きさの波状の非常に類似する、縮まりそして短い樹状突起を有する大きな細胞の形態学であった。
【０１０６】
一般に、ＩＬ−４−ＤＣは、ＩＦＮ−ＤＣに典型的な樹状突起の一方向性の配向を示さなかった。全体的には、これらの結果は、走査型電子顕微鏡により得られた結果と合致し、そして血液ＤＣの特徴である形態学的および表現型的特徴がＩ型ＩＦＮでの処理の２〜３日後に作製されたことが示唆された。
【０１０７】
実施例２
ＩＦＮ−ＤＣおよびＩＬ４−ＤＣによるサイトカインの生成
ＤＣは、とりわけＴ細胞との相互作用によるか、またはウイルス性病原体および細菌生成物と遭遇することにより活性化された場合の免疫応答の開始に関係する一連のサイトカインを生成する。したがって、ＩＦＮ／ＧＭ−ＣＳＦ処理したＤＣが、ＩＬ−４／ＧＭ−ＣＳＦの存在下で培養された細胞と比較して、サイトカイン発現のなんらかの特異的パターンを呈するかどうかを評価することは興味深かった。この目的を達成するために、比較ＲＴ−ＰＣＲ分析を実施した。
【０１０８】
ＲＮＡｚｏｌ  ＢによりＤＣからの全ＲＮＡを抽出し、以前に記載されたように処理した（２４）。
【０１０９】
【表２】
2004526455.tif 000003
2004526455.tif 000004
の特異的プライマー対で逆転写されたＲＮＡを増幅することにより転写物を検出した。
【０１１０】
ＧＡＰＤＨ  ＲＴ−ＰＣＲを平行して行い、全サンプル中のヒトＲＮＡのレベルを標準化した。ＲＴ−ＰＣＲの全産物は、直線的な範囲内の増幅であった。
【０１１１】
図５Ａで報告される、該当の結果は、ＩＦＮ−ＤＣが、ＩＬ−１βに関して高レベルのｍＲＮＡを発現したことを示した。特に、ＩＬ−１５発現の誘導は、ＩＦＮ／ＧＭ−ＣＳＦで処理された培養物中で選択的に検出された。ＩＬ−１５発現は、翻訳レベルで厳密に制御されているので、検出可能なレベルのサイトカインが、ＩＦＮ処理した培養物の上澄で示され得るかどうかを決定することは興味深かった。種々Ｉ型ＩＦＮ調製物およびＧＭ−ＣＳＦの存在下で分化したＤＣの上澄におけるＩＬ−１５の分泌が、３日間のＩＬ−４／ＧＭ−ＣＳＦと比較して、図５Ｂに報告してあり、これは、顕著なレベルのＩＬ−１５がＩＦＮ／ＧＭ−ＣＳＦ処理に応答して分泌されたことを示している。
【０１１２】
実施例３
ＩＦＮ−ＤＣの同種刺激能力
ＩＦＮ／ＧＭ−ＣＳＦの存在下で作製されたＤＣの同種刺激特性の増強
ＩＦＮ／ＧＭ−ＣＳＦまたはＩＬ−４／ＧＭ−ＣＳＦの存在下で単球から作製されたＤＣのＭＬＲアッセイにおける同種ＰＢＬによる増殖およびＩＦＮγ生成を刺激する能力を比較するために一連の機能実験を実施した。
【０１１３】
単球激減ＰＢＬを１０５細胞／ウェルで９６ウェルプレート（Costar, Cambridge、マサチューセッツ州）に播種した。精製された同種ＤＣ（５ｘ１０３）を三重で各ウェルに加えた。５日後、メチル−３Ｈ−チミジン１μＣｉ（Amersham）を各ウェルに加え、そして更に１８時間インキュベーションを続けた。最終的にMach II Mcell（Tomtec）ハーベスターにより細胞を収集し、そしてチミジンの取り込みを1205 Betaplate（Pharmacia）で液体シンチレーションカウンティングにより定量化した。
【０１１４】
Ｉ型ＩＦＮおよび／ＧＭ−ＣＳＦまたはＩＬ−４／ＧＭ−ＣＳＦの種々調製物の存在下、ＭＬＲ比較アッセイの結果について報告している図６Ａで示すように、ＩＦＮ−ＤＣは、３Ｈ−チミジン組み込みアッセイにより表されるように、同種ＰＢＬの増殖の誘導において、ＩＬ−４−ＤＣと比較して優れていることが判明した。
【０１１５】
特に、ＧＭ−ＣＳＦ  ５００U/mlと組み合わせた異なる濃度のＩＦＮの、ＤＣが同種リンパ球の増殖を誘導する能力に及ぼす影響を報告している図６Ｂで示すように、ＩＦＮ  １００IU/mlの存在下で作製されたＤＣは、増殖応答をあまり誘発しなかった。
【０１１６】
ＩＦＮ  １００IU/mlで作製されたＤＣは、フローサイトメトリー分析により決定されるように、非常に低レベルの共刺激分子を示したので、これは、前記で報告された結果に基づいて、推測されないものではなかった（図３）。
【０１１７】
ＩＦＮ−ＤＣで作製されたＭＬＲの特異的な特徴は、相当なＩＦＮγの生成であり、これは、ＩＬ−４で作製されたＤＣを用いる対応する共培養において見出されるものよりも明確に高く（図６Ｃ）、これは、ＩＦＮ／ＧＭ−ＣＳＦ−ＤＣのＴｈ１応答を促進する顕著な能力を示唆している。
【０１１８】
実施例４
ケモカインに対する遊走応答の分析
ＤＣの遊走および機能は、ケモカインに対するその応答性およびＤＣ誘導ケモカインの発現により厳密に制御され、その生成は、ＤＣの機能的作用を著明に形作ることができる。ＩＦＮ−ＤＣおよびＩＬ−４−ＤＣにおいて化学走化性刺激に応答して遊走する姿勢を、双方のＤＣ集団におけるケモカイン／ケモカインレセプターの発現と一緒に分析した。
【０１１９】
ａ．βケモカインに対する応答
ケモカイン含有培地を伴う２室系を用いてＤＣの遊走能力を測定することにより、炎症性βケモカインに対する走化性応答を試験した（図７）。２４ウェルトランスウェル細胞培養チャンバー（Ｃｏｓｔａｒ）中で細胞遊走を実施した。簡単には、完全培地中ＩＦＮ／ＧＭ−ＣＳＦまたはＩＬ−４／ＧＭ−ＣＳＦと共に３日間培養した５ｘ１０５細胞を、完全培地に再懸濁し、そして孔径８μmフィルタートランスウェルチャンバーの上室に播種した。
【０１２０】
ＲＡＮＴＥＳ、ＭＩＰ１α、ＭＩＰ１β（５００ng/ml）（R & D System）を無血清培地で希釈し、そして下室に添加し、一方、コントロールチャンバーの下部のウェルには、培地単独を入れた。３７℃で２時間のインキュベーションの後、下室の孔径８μmのポリカーボネートフィルターを通って遊走した細胞を収集し、そして計数した。各々のアッセイを三重で実施した。
【０１２１】
興味深いことに、Ｉ型ＩＦＮおよびＧＭ−ＣＳＦを用いた３日でのＤＣの作製は、ＩＬ−４およびＧＭ−ＣＳＦで作製したＤＣに比較して、βケモカイ、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＩＰ−１αに対して、そしてとりわけＭＩＰ−１βに対して、より強力な走化性応答と関連し、これは、炎症性ケモカインに対する迅速な応答に対するＩＦＮ−ＤＣの固有の姿勢を示唆した。
【０１２２】
ｂ．ＩＦＮ−ＤＣは、ＣＣＲ７を過剰発現し、そしてＭｉｐ−３βに応答する遊走能力を増強させる
成熟ＤＣは、そのレセプター（ＣＣＲ７）の上方制御の結果としてＭＩＰ−３β／ＥＬＣおよび６Ｃｋｉｎｅ／ＳＬＣに応答することが報告されている。興味深いことに、ＣＣＲ７のノックアウトマウスでの最近の研究では、１次免疫応答を生じるためのＣＣＲ７／ＭＩＰ−３β相互作用の重大な重要性が示されている（２５）。したがって、我々は、ＩＦＮ−ＤＣにおけるＣＣＲ７の発現をＩＬ−４−ＤＣと比較して評価した。
【０１２３】
【表３】
2004526455.tif 000005
の特異的プライマー対で逆転写されたＲＮＡを増幅することにより転写物を検出した。
【０１２４】
以下の条件：９４℃  ４０”、６２℃  ４０”、７２℃  ４０”で、２５〜３５サイクルでサンプルを増幅した。ｈＭＩＰ−３β  ｍＲＮＡを増幅するために、アニーリング温度を５８℃にした。αアクチンＲＴ−ＰＣＲを並行して行い、全サンプルでヒトＲＮＡのレベルを標準化した。全ＲＴ−ＰＣＲ産物は直線的な範囲内の増幅であった。ＩＦＮ−ＤＣ対ＩＬ−４−ＤＣでケモカインＭＩＰ−３βおよびそのレセプターＣＣＲ７のｍＲＮＡレベルでの発現を比較する図８（パネルＡ）で示すように、ＲＴ−ＰＣＲ分析により、ＩＦＮ−ＤＣは、ＩＬ−４−ＤＣと比較して高レベルのＣＣＲ７  ｍＲＮＡを発現したことが表された。
【０１２５】
興味深いことに、双方の型のＤＣをＣＣＲ７の天然リガンドに応答して遊走するその能力に関して試験した場合、ＭＩＰ−３βに対する顕著な走化性応答が、ＩＦＮ−ＤＣで特異的に観察された。これに関連して、Ｍｉｐ−３αおよびＭｉｐ−３βに応答する、ＩＬ−４−ＤＣ対ＩＦＮ−ＤＣ（ＧＭ−ＣＳＦおよび指示された異なるＩ型ＩＦＮ調製物で作製された）の遊走応答を比較する図８のパネルＢ参照。したがって、ＩＦＮ−ＤＣは、ＣＣＲ７を発現し、そしてその天然リガンド、Ｍｉｐ−３βに非常に効率的に応答することが見出され、これによりＩＦＮ−ＤＣが少なくとも部分的に成熟ＤＣの特徴を呈することが確認された。
【０１２６】
別の一連の研究では、ＤＣに由来するｍＲＮＡをＲＮＡｚｏｌ  Ｂで抽出し、そして以前に報告されたように処理して一連のケモカインの発現を検出した。以下のプライマーのセットを使用した：
【０１２７】
【表４】
2004526455.tif 000006
【０１２８】
ＩＦＮ／ＧＭ−ＣＳＦまたはＩＬ−４／ＧＭ−ＣＳＦでの単球の３日間の処理の後に実施したＲＴ−ＰＣＲ分析について報告している図８Ｃで示すように、ヒトＤＣにより特異的に高レベルで発現されるケモカインであるＤＣ−ＣＫ１のｍＲＮＡが、ＩＦＮ−ＤＣにおいて強く発現された。更に、ＩＰ−１０  ｍＲＮＡは、ＩＬ−４−ＤＣに対してＩＦＮ−ＤＣにおいて高レベルで発現され、一方、ＭＤＣおよびＴＡＲＣ発現は、ＩＬ−４−ＤＣにおいて上方制御された。
【０１２９】
実施例５
ＩＦＮ−ＤＣにより「インビトロ」で誘発されたＨＩＶ抗原に対する１次応答：ＩＬ−４／ＧＭ−ＣＳＦの存在下で作製されたＤＣの活性との比較
ＩＦＮ／ＧＭ−ＣＳＦまたはＩＬ−４／ＧＭ−ＣＳＦのいずれかの存在下で作製されたＤＣの、自己ＰＢＬにおいて１次応答を開始する能力を、免疫原として不活化ＨＩＶ−１を用いることにより評価した。ｐ７ヌクレオキャプシド（ＮＣ）タンパク質を選択的に破壊し、ｇｐ１２０  ＨＩＶ−１タンパク質のコンフォメーションおよび融合活性を無傷のままにする（２６）ことにより、ＨＩＶを不活性化する、２，２−ジチオジピリジン（アルドリチオール；ＡＴ−２）の使用からなる、最近記載された手法（２２）をＨＩＶを不活化するために適用した。
【０１３０】
自己ＰＢＬをＡＴ−２不活化ＨＩＶ−１でパルスを与えたＤＣで刺激した。ＨＩＶ−１  ＳＦ１６２株をＡＴ−２により不活化し、用時まで−１４０℃で保存した。ＩＦＮ／ＧＭ−ＣＳＦまたはＩＬ−４／ＧＭ−ＣＳＦのいずれかで３日間処理することにより作製された自己ＤＣ  １ｘ１０６でＰＢＬ（４ｘ１０６）を刺激し、ＡＴ−２不活化ＨＩＶ−１（ｐ２４  ４０ｎｇ）で３７℃で２時間パルスを与えた。対照培養物を、パルスを与えていない自己ＤＣと共にインキュベートした。７日後にパルスを与えていないかまたは不活化ウイルスでパルスを与えたＤＣでＰＢＬを刺激した。外来性ＩＬ−２（２５U/ml）を４日毎に添加した。１４日目に増殖アッセイを以下のように実施した：パルスを与えていないかまたは不活化ウイルスでパルスを与えたＤＣ  ５ｘ１０３を、三重でウェルの自己ＰＢＬ  １０５に添加した。６日後、メチル−３Ｈ−チミジン  １μＣｉを各ウェルに加え、そして更に１８時間インキュベーションを続けた。細胞を収集し、そしてチミジンの取り込みを実施例４に記載したように定量化した。
【０１３１】
また細胞および細胞培養物からの上澄を、各々ＩＦＮγ生成に関してＥＬＩＳＰＯＴ分析およびＥＬＩＳＡにより試験した。
【０１３２】
ウイルスでパルスを与えたＩＦＮ−ＤＣは、ＩＬ−４−ＤＣよりも良好な自己ＰＢＬによる３Ｈ−チミジンの取り込みのスティミュレーターであることが判明したのみならず、強力なＴｈ１志向性応答を誘起した。図９（パネルＡ）では、ＡＰＣとしてＤＣを用いるＨＩＶ抗原に対するリンパ球増殖アッセイの結果を報告している。前記されたように、刺激された１次培養におけるＩＦＮγ生成細胞（ＥＬＩＳＰＯＴにより評価した）の頻度およびＩＬ−４およびＩＦＮγ生成のレベル（ＥＬＩＳＡにより測定）を各々同一の図９のパネルＢおよびＣで報告する。
【０１３３】
ＥＬＩＳＰＯＴアッセイ（Euroclone、英国）により製造者の指示書に従ってＩＦＮγ生成細胞の評価を行った。簡単には、９６ウェルプラスチックプレート（Maxisorp Nunc）を抗ＩＦＮγ捕捉抗体で被覆し、そして２％  ＢＳＡでブロックした。１次培養物からのＰＢＬの１０倍希釈物（１０５〜１０２）を、不活化ＨＩＶ−１でパルスを与えたＤＣで一晩再刺激し、三重でウェルに加え、そして１８時間インキュベーションした。細胞を除去した後、プレートを抗ＩＦＮγ検出ビオチン化抗体およびストレプトアビジン結合アルカリ性ホスファターゼと共にインキュベートした。次いで、基質溶液を加え、倒立顕微鏡の単一のスポットを計数することによりＩＦＮγ生成細胞の頻度を評価した。
【０１３４】
図９のパネルＢで示すように、ＥＬＩＳＰＯＴ分析により、Ｉ型ＩＦＮ＋ＧＭ−ＣＳＦの異なる調製物で作製したＤＣで刺激した１次培養物中のＩＦＮγ生成細胞の数が、ＩＬ−４−ＤＣで刺激された培養物と比較して、より多いことが示された。これらの結果は、前記したように刺激された１次培養の上澄のＥＬＩＳＡにより測定されるＩＬ−４およびＩＦＮγ生成のレベルを報告している図９のパネルＣで示すように、ＩＦＮ−ＤＣの上澄のＩＦＮγの高レベルの分泌と合致した。特に、ウイルスでパルスを与えたＩＦＮ−ＤＣで刺激した培養物中では、ＩＬ−４の分泌は、ほとんどまたは全く検出されなかったが、一方、このサイトカインは、ウイルスでパルスを与えたＩＬ−４−ＤＣに暴露した培養物の上澄では相当量見出された（図９Ｃ）。
【０１３５】
実施例６
ｈｕ−ＰＢＬ−ＳＣＩＤマウスモデルにおいてＩＦＮ−ＤＣにより誘発されたＨＩＶ抗原に対する１次抗体応答：ＩＬ−４／ＧＭ−ＣＳＦの存在下で作製されたＤＣの活性との比較
ヒトＰＢＬで再構築されたＳＣＩＤマウスのモデルにおける「インビボ」１次免疫および抗体応答に及ぼすＩＦＮ−ＤＣの影響の評価を実施した。実際に、最近のデータは、キメラに抗原でパルスを与えたＤＣを注射すると、ヒト１次免疫応答をｈｕ−ＰＢＬ−ＳＣＩＤマウスにおいて作製することができることを示唆している（２４、２８）。
【０１３６】
４週齢のＣＢ１７ｓｃｉｄ／ｓｃｉｄ雌マウス（Harlan, Nossan、イタリア）を特定病原体感染防止条件下（specific pathogen-free conditions）で維持した。ＳＣＩＤマウスをマイクロアイソレーターケージで飼育し、すべての食餌、水および床敷きを使用前に高圧滅菌した。健常ドナーの末梢血からｈｕ−ＰＢＬを入手した。提供する前に、全ドナーをＨＩＶ−１および肝炎ウイルスに関してスクリーニングした。Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ密度勾配遠心によりｈｕ−ＰＢＬを入手した。２０００００００個の細胞をＲＰＭＩ１６４０培地０．５mlに再懸濁し、そして受体マウスにｉ．ｐ．注射した。ＡＴ−２不活化ＨＩＶ−１（免疫用量あたりｐ２４  １００ｎｇ）で３７℃で２時間パルスを与えた自己ＤＣ  ２ｘ１０６をマウスにｉ．ｐ．注射した。７日後、ＡＴ−２不活化ＨＩＶでパルスを与えたＤＣの追加免疫用量をマウスに与えた。７および１４日にｈｕ−ＰＢＬ−ＳＣＩＤマウスに由来する血清をヒト抗ＨＩＶ抗体の存在に関して評価した。
【０１３７】
ウイルスでパルスを与えたＤＣを注射したｈｕ−ＰＢＬ−ＳＣＩＤマウスに由来するプールした血清でウェスタンブロット分析を実施することにより、ＨＩＶ−１タンパク質に対するヒト抗体の全スペクトルを評価した。ＨＩＶ−１でパルスを与えたＤＣを注射したｈｕ−ＰＢＬ−ＳＣＩＤマウスに由来する血清をウェスタンブロットで検定した（Cambridge Biotech  ＨＩＶウェスタンブロットキット、Rockville、メリーランド州）。簡単には、ニトロセルロースストリップを個々のマウス血清サンプル（１：２０希釈）またはヒト陽性対照血清（１：１０００希釈）と共に一晩インキュベートした。ビオチン結合ヤギ抗ヒトＩｇＧおよびストレプトアビジン結合西洋ワサビペルオキシダーゼの添加の後、基質色素原と共にインキュベートすることによりＨＩＶ−１タンパク質に対するヒトＩｇ特異的結合の可視化が得られた。ＨＩＶ−１  ｇｐ１２０／１６０およびｐ２４抗原に対する血清抗体反応性の強度を検出するために、Quantity One 4.2.1.ソフトウェア（Bio Rad）を用いるデンシトメトリーによりウェスタンブロットストリップを試験した。３つの対照非免疫ｈｕ−ＰＢＬ−ＳＣＩＤマウスに由来する血清で検出される平均値をカットオフとして用いて、免疫キメラに由来する血清中の特異的抗体反応性を決定した。
【０１３８】
ＥＬＩＳＡ系を利用して、抗ヒト全Ｉｇおよび抗ＩｇＭ（Cappel-Cooper Biomedical, West Chester、ペンシルバニア州）および抗ＩｇＧ１または抗ＩｇＧ４（pharmingen）を用いることにより、ヒト全Ｉｇ、ＩｇＭ、ＩｇＧ１およびＩｇＧ４免疫グロブリンを定量した。全ＥＬＩＳＡを二重で実施し、各々のプレートで研究室標準を含めた。再構築しなかったＳＣＩＤマウスに由来する血清を全ＥＬＩＳＡ測定の陰性対照として用いた。ＨＩＶ−１  ｇｐ４１タンパク質の５９１〜６１１アミノ酸に相当する特異的ペプチド（すなわちＥＲＹＬＫＤＱＱＬＬＧＩＷＧＣＳＧＫＬＩＣ）を用いて、特異的抗ＨＩＶ抗体を検出するためのＥＬＩＳＡを実施した。合成ペプチドを４℃で一晩インキュベートすることにより、Dytnatec（Dynal, Oslo、スウェーデン）マイクロタイタープレートに固定した。段階希釈マウス血清を添加し、そして室温で９０分間インキュベートした。最終的に基質色素原と共にインキュベートした後のＡ４９０値を読むことにより結合が表された。値は、二重で試験された各個体の血清の吸光度の平均値を示す。すべての対照血清の吸光度の平均値プラス０．１００Ａとしてカットオフを算出した。この閾値よりも高いＡ４９０値を示す血清を抗ＨＩＶ抗体に関する陽性と考えた。
【０１３９】
ＩＦＮ／ＧＭ−ＣＳＦの存在下で作製したＤＣで免疫したｈｕ−ＰＢＬ−ＳＣＩＤマウスは、ＩＬ−４／ＧＭ−ＣＳＦ処理の後に得られたＤＣを注射した異種間キメラに比較して、ｇｐ１６０／１２０およびｐ２４抗原に向けられた高レベルの抗ＨＩＶ抗体を示した。図１０（パネルＡ）は、とりわけ、双方共にＡＴ−２不活化ＨＩＶ−１でパルスを与えた（３７℃で２時間）ＩＦＮ−ＤＣ  またはＩＬ−４−ＤＣ  １．５ｘ１０６で免疫および追加免疫（７日後）した個々のｈｕ−ＰＢＬ−ＳＣＩＤマウスに由来する血清中で検出されたヒト抗ＨＩＶ−１  ｇｐ１６０／１２０およびｐ２４抗体のレベル（全Ｉｇ）を示す（ＩＦＮαおよびＧＭ−ＣＳＦで３日間処理することによりＤＣが得られた）。ウェスタンブロットアッセイの後、対応するバンドのデンシトメトリースキャニングにより値が得られた。
【０１４０】
７および１４日での抗ｇｐ４１抗体アイソタイプの特徴づけを報告している図１０のパネルＢで示すように、ＥＬＩＳＡ実験により、ＨＩＶ−１でパルスを与えたＩＦＮ−ＤＣで免疫したｈｕ−ＰＢＬ−ＳＣＩＤマウスの抗ｇｐ４１抗体が高レベルで存在することが示された。更にこれに関連して、７日には、抗ＨＩＶ−１抗体が、主にＩｇＭ  アイソタイプに属することが示され（図１０Ｂ）、一方、１４日にはＩｇＧ１  アイソタイプに属する抗体が、とりわけＩＦＮ／ＧＭ−ＣＳＦ培養ＤＣで免疫したマウスにおいて検出され、これは抗原追加免疫を行ったときのアイソタイプスイッチングを示しており、そしてより強力なＴｈ１に基づく応答を示唆している（図１０Ｂ）。
【０１４１】
特に、２１日に収集された免疫ｈｕ−ＰＢＬ−ＳＣＩＤマウスに由来する血清のＨＩＶに対する「インビトロ」中和作用を報告している図１０のパネルＣで示すように、ウイルスでパルスを与えたＩＦＮ−ＤＣで免疫したｈｕ−ＰＢＬ−ＳＣＩＤマウスに由来する血清は、ヒト陽性対照血清を用いるウェスタンブロット分析により検出される実質的にすべてのＨＩＶ−１タンパク質を認識できる。
【０１４２】
免疫ｈｕ−ＰＢＬ−ＳＣＩＤマウスに由来する血清の段階希釈を、１０ＴＣＩＤ５０  ＨＩＶ−１  ＳＦ１６２株と組み合わせ、そしてＰＨＡ活性化ＰＢＭＣに添加した。３日後、上澄をｐ２４生成に関して検定した。特に、ＩＦＮ−ＤＣで免疫した異種間キメラに由来し高レベルの抗ＨＩＶ−１抗体を示した血清は、「インビトロ」で活性化ヒトＰＢＬのＨＩＶ−１感染を効率的に中和したことが示された。ワクチン接種したおよび対照再構築ｈｕ−ＰＢＬ−ＳＣＩＤマウスの腹膜洗浄液中のヒトＩＦＮγの力価測定のためにＥＬＩＳＡ試験を実施した。有意な量のＩＦＮγが、ワクチン接種した異種間キメラにおいて選択的に検出され、ＩＬ−４−ＤＣでワクチン接種したマウスと比較して、このサイトカインは、ＩＦＮ−ＤＣワクチン接種したマウスに由来する腹水中で高レベルであった（図１０Ｄ）。
【０１４３】
実施例７
不活化ＨＩＶ−１でパルスを与えた自己ＩＦＮ−ＤＣで刺激したときのインビトロ培養における全ＰＢＬおよび高度に精製されたＣＤ８＋によるＩＦＮγ生成の時間経過分析
全ＰＢＬおよび免疫磁性により精製した（ＭＡＣＳ  細胞単離キット、Miltenyi Biotec、ドイツ）ＣＤ８＋リンパ球（＞９８％）を７日間隔で、ＡＴ２不活化ＨＩＶ−１ビリオンでパルスを与えた自己ＩＦＮ−ＤＣで４回刺激した。培養上澄を各刺激後４日のＩＦＮγ生成に関して検定した。ウイルスでパルスを与えたＩＦＮ−ＤＣでの反復刺激は、ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞の不在下でさえ、顕著なＩＦＮγ生成に至り、これは、最初の刺激の直後に開始され、ＩＦＮγ濃度は、およそ１００ｐｇ／mlであり、そして続くリコール刺激で２ng/mlの濃度に到達するまで増加した（図１１）。興味深いことに、培養上澄におけるＩＦＮγ生成は、実質的なＩＬ−４不在と並行した（データは示していない）。
【０１４４】
実施例８
ＨＩＶ−１抗原および保存ＣＴＬエピトープに対して反応性を示すＣＤ８＋エフェクターリンパ球の生成
ウイルス特異的ＣＤ８＋リンパ球は、感染した細胞の殺害ならびにサイトカイおよびケモカインを生成する能力などの各種の抗ウイルス活性を保持する。ＩＦＮγは、ウイルス感染部位でエフェクターＣＤ８＋  Ｔ細胞により生成される重要な抗ウイルス性サイトカインであり、一方、βケモカインは、ウイルスの標的細胞への進入を阻止することによりＨＩＶ感染を抑制する。
【０１４５】
ｈｕ−ＰＢＬ−ＳＣＩＤマウスを自己ＡＴ２−ＨＩＶでパルスを与えたＤＣでワクチン接種したときの、ウイルス特異的ＩＮＦγ生成ＣＤ８＋  Ｔ細胞の「インビボ」誘発を評価した。マウス脾臓または腹膜腔からヒトＣＤ８＋  Ｔ細胞を救済し、そしてＣＤ８応答を評価するための、および現在ＣＴＬエピトープのマッピングに適用されている信頼できる方法であるＩＦＮγＥｌｉｓｐｏｔアッセイによりＣＴＬエフェクターを評価した。このアッセイでＨＩＶに応答する細胞をＣＴＬと称するが、これは、ＩＦＮγ分泌細胞であることを意味している。
【０１４６】
我々は、ｈｕ−ＰＢＬ−ＳＣＩＤマウスからヒト細胞を救済し、そしてＨＩＶ−１  ＳＦ１６２株（５ｘ１０３ＴＣＩＤ５０／１０６細胞）またはＨＩＶ−１のＩＩＩＢ株に由来するｇａｇおよびｐｏｌ抗原をコードする組換えワクシニアウイルスベクターのいずれかで感染した自己「Ｂリンパ芽球腫細胞系」（ＢＬＣＬ）標的に関してそれを試験した。自己ＢＬＣＬをＨＩＶ−１（ＳＦ１６２）および組換えＨＩＶ−１ワクシニアウイルスベクターで各々４８および１２時間感染させ、洗浄し、放射線照射し、そして抗原提示細胞として使用した。パルスを与えていないＢＬＣＬおよびワクシニアウイルスベクターで感染したＢＬＣＬを陰性対照として用いた；ＰＨＡ（１μg/ml）刺激を陽性対照として用いた。ＰＢＭＣをウェルあたり１ｘ１０６加え、そして培地（２mM  Ｌ−グルタミンおよび１０％  非動化ウシ胎仔血清を補充したＲＰＭＩ  １６４０）の最終容量２mlで３７℃で一晩インキュベートした。自己ＢＬＣＬでインキュベートした後、ＣＤ８＋  Ｔ細胞をＭＡＣＳマイクロビーズ（Miltenyi Biotec GmbH）で陽性選択し、そしてＩＦＮ−γ（Euroclone Ltd、英国）の生成に関してＥＬＩＳＰＯＴアッセイで試験した。ウェルあたり１００μl中ＣＤ８＋  Ｔ細胞２．５ｘ１０４を９６ウェル抗ガンマインターフェロン抗体被覆プレートに分配し、そして一晩インキュベートした後、細胞を溶解し、捕捉されたサイトカイン分子をビオチン化検出２次抗体により表し、そしてストレプトアビジン・アルカリ性ホスファターゼと共にインキュベートし、続いてゲル・オーバーレイ中のＢＣＩＰ基質と共にインキュベートすることにより展開した。着色スポットを倒立顕微鏡で拡大率４０で計数した。対照未感染ＢＬＣＬまたはワクシニアベクター感染ＢＬＣＬ標的により誘発されたバックグラウンドスポットを差し引くことにより特異的ＩＦＮγスポット形成細胞を算出した。
【０１４７】
図１２で示すように、異なるドナーに由来するＰＢＬで得られたｈｕ−ＰＢＬ−ＳＣＩＤマウスのワクチン接種により、ＨＩＶ−１抗原に対するＣＤ８応答に至った。いくらかの変動が異なるドナー間で観察されたが、ＡＴ２−ＨＩＶでパルスを与えたＩＦＮ−ＤＣは、強力に相同性ウイルス株ＳＦ１６２ならびにＨＩＶ−１  ＩＩＩＢ株に由来するｇａｇおよびｐｏｌタンパク質に対するＣＤ８応答を誘発した。我々は、またワクチン接種した異種間キメラにおいてＨＬＡ−Ａ＊０２０１制限ＣＴＬエピトープＳＬ９（ＳＬＹＮＴＶＡＴＬ）に対する応答をも分析した。この免疫優性ＨＩＶ−ｇａｇ  ｐ１７由来のエピトープは、保存され、そして強力なＣＴＬ応答を誘発し、これは、一般にウイルス逃避に対する強力な選択圧の存在下でさえいくつかの個体では維持されている。本明細書で報告したデータは、ＡＴ２不活化ＨＩＶビリオン全体でパルスを与えたＤＣでのＨＬＡ−Ａ＊０２０１個体のワクチン接種が、保存されたＳＬ９エピトープに対して「インビボ」で強力な応答を誘発できることを示している（図１３）。
【０１４８】
実施例９
ウイルスでパルスを与えたＩＦＮ−ＤＣでワクチン接種したｈｕ−ＰＢＬ−ＳＣＩＤマウスのＨＩＶ−１感染からの防御
完全免疫スケジュールを完了した７日後に、１群のｈｕ−ＰＢＬ−ＳＣＩＤマウスを１０２  ＴＣＩＤ５０  のＳＦ１６２で腹腔内で誘発した。２週間後、異種間キメラマウスを屠殺し、そしてウイルス誘発からの防御のレベルを評価した。感染した異種間キメラの脾臓およびリンパ節におけるウイルス性ｇａｇ配列に関するＰＣＲ分析により、免疫マウスの器官のプロウイルスＤＮＡ負荷における明確な削減、それと一緒に、腹膜細胞のＰＨＡ活性化Ｔリンパ球との共培養による感染性ウイルスを救済する能力の低下、およびＥＬＩＳＡ（Dupont,Brussels、ベルギー）による培養上澄におけるｐ２４抗原検出が実証された（図１４）。
【０１４９】
実施例１０
ＣＤ８＋  Ｔ細胞特異的応答のスティミュレーターとしてのエプスタイン・バールウイルス（ＥＢＶ）ペプチドでパルスを与えたＩＦＮ−ＤＣ
異なるＥＢＶ抗原に由来するＨＬＡクラスＩ制限ペプチドでパルスを与えた後のＩＦＮ−ＤＣ対ＩＬ−４−ＤＣのＥＢＶ特異的ＣＤ８＋  Ｔ細胞応答を刺激する能力を評価した。３体のドナーをこれらの研究に用いた：ＬＬ（ＨＬＡ−Ａ２）；ＦＺ（ＨＬＡ−Ａ３、−Ｂ３５）；ＦＢ（ＨＬＡ−Ａ１１、−Ｂ２７）。ＧＭ−ＣＳＦ／ＩＦＮまたはＧＭ−ＣＳＦ／ＩＬ−４の存在下３日間ＣＤ１４＋単球を培養することによりＤＣを作製した。この時、プールしたＨＬＡクラスＩ制限ＥＢＶペプチドでＤＣにパルスを与え、そしてこれを用いて自己ＰＢＬを刺激した。最初の共培養の７および１４日後に、ペプチドでパルスを与えたＤＣで培養物を再刺激した。ペプチドでパルスを与えた自己単球（ドナーＦＺおよびＦＢに関して）またはＴ２細胞（ＴＡＰ−／−、ＨＬＡ−Ａ２＋）（ドナーＬＬに関して）と共に一晩インキュベートした後、ＩＦＮγを生成するＴ細胞の数を評価するために、刺激していないＰＢＬで、そして１または２ラウンドの刺激後にＥＬＩＳＰＯＴアッセイを実施した。２ラウンドの刺激後に実施したＩＬＩＳＰＯＴの結果を図１５Ａ、１５Ｂ、１５Ｃで示す。刺激していないＰＢＬ培養物（０日）では３体すべてのドナーで、ペプチド特異的Ｔ細胞は検出できないか、または非常に低い頻度でしか存在しない、のいずれかであり、ペプチドに依存した。ドナーＬＬに関しては、ＢＭＬＦ−１−およびＥＢＮＡ  ３Ｃ由来のペプチドを特異的に認識するＴ細胞の類似の増殖が、ＩＦＮ−ＤＣおよびＩＬ−４−ＤＣにより刺激されたが、ＬＭＰ−２、ＥＢＮＡ  ３Ａおよびｇｐ３５０抗原から誘導されたＣＴＬエピトープに特異的なＴ細胞の頻度の有意な増加は、ＩＦＮ−ＤＣで刺激されたＰＢＬ培養物においてのみ観察された。ドナーＦＺおよびＦＢに関しては、選択されたＥＢＮＡ  ３ＡまたはＥＢＮＡ  ３Ｂ由来のペプチドに対して反応するＩＦＮ−γ生成Ｔリンパ球の頻度は、ＩＬ−４−ＤＣ刺激ＰＢＬに比較してＩＦＮ−ＤＣで刺激されたＰＢＬの培養物において有意に高かった。
【０１５０】
ＩＦＮ−ＤＣ対ＩＬ−４−ＤＣによる細胞障害性Ｔリンパ球の誘導を、精製された自己ＣＤ８＋  Ｔ細胞の、ペプチドでパルスを与えられたＤＣでの３ラウンドの刺激後にドナーＦＢに関して評価した（図１６）。ＩＬ−４−ＤＣに比較して、試験した双方の標的対エフェクター比率で、有意に高いレベルの特異的細胞障害性活性が、ＩＦＮ−ＤＣで刺激された培養物により発揮された（図１６）。更に標的対エフェクター比率を下げることにより、ＩＦＮ−ＤＣで刺激された培養物において細胞障害性がわずかだけ低下するに至ったが、一方、これはＩＬ−４−ＤＣ刺激したＣＤ８＋培養物において特異的な殺害の実質的な抑止を引き起こした（図１６、右パネル）。ドナーＦＢからのＣＤ８＋細胞の培養を、ＩＬ−４−またはＩＦＮ−ＤＣでの刺激の前後にＣＤ２７およびＣＤ４５ＲＡマーカーの発現に関して分析した（図１７）。メモリー表現型を伴うＣＤ８＋細胞（ＣＤ４５ＲＡ−  ＣＤ２７＋）のパーセンテージの類似の増加が、ペプチドでパルスを与えたＩＬ−４−ＤＣ（パネルＥ）またはＩＦＮ−ＤＣ（パネルＦ）での２ラウンドの刺激後に観察され、刺激されていないＣＤ８＋細胞（パネルＢ）およびパルスを与えていないＩＬ−４−ＤＣ（パネルＣ）またはＩＦＮ−ＤＣ（パネルＤ）で刺激されたＣＤ８＋細胞に関しても観察した。パルスを与えていないＤＣで刺激された培養物では、２回目の刺激の後、ＣＤ８＋細胞の数は、急速に低下し、さらなる刺激および表現型分析が妨げられた。興味深いことに、ＣＤ４５ＲＡ−  ＣＤ２７＋細胞のレベル増加は、ペプチドでパルスを与えられたＩＦＮ−ＤＣでのＣＤ８＋培養物の３回目の刺激の後も維持された（パネルＨ）が、一方、メモリー表現型を有するＣＤ８＋細胞のパーセンテージの急速な低下は、ペプチドでパルスを与えたＩＬ−４−ＤＣでの３ラウンドの刺激後に観察された（パネルＧ）。まとめると、これらの観察は、ＩＦＮ−ＤＣがインビトロで細胞障害性エフェクターとして作用するＥＢＶ特異的メモリーＣＤ８＋細胞の増殖および生存性を効率的に促進できることを示唆している。
【０１５１】
次いでＥＢＶペプチドでパルスを与えたＩＦＮ−ＤＣが、インビボでＥＢＶ陽性ドナーに由来するＰＢＭＣで再構築したＳＣＩＤマウスの、リンパ腫生成を阻止できるＳＣＩＤマウス特異的ＣＤ８＋  Ｔ細胞を刺激できるかどうかを評価した（２９、３０）。ＳＣＩＤマウスをドナーＦＢに由来するＰＢＭＣ  ４ｘ１０７で再構築した。再構築の３時間後、マウスを３群に分けた。マウスの第１群には、更に処理を行うことなく、一方、第２および第３群のマウスには、２ｘ１０６のパルスを与えていないＩＦＮ−ＤＣ、またはＥＢＮＡ  ３ＡおよびＥＢＮＡ  ３Ｂ由来のペプチドのプールでパルスを与えたＩＦＮ−ＤＣを各々ｉ．ｐ．注射した。これらのペプチドは、ドナーＦＢ  ＰＢＬのインビトロ刺激に用いたものと同一であった。７日後、追加免疫の用量（２ｘ１０６）の、パルスを与えていないかまたはペプチドでパルスを与えたＩＦＮ−ＤＣを第２および第３群のマウスに各々ｉ．ｐ．注射した。この実験で利用したＤＣは、ドナーＦＢの一卵性双生児であるドナーＡＢから得られたＣＤ１４＋単球から誘導された。群あたりマウスは、５匹であった。
【０１５２】
以下の表２で示すように、自己ペプチドでパルス与えたＩＦＮ−ＤＣでの再構築動物のワクチン接種により、ワクチン接種していないＳＣＩＤマウスおよびパルスを与えていないＩＦＮ−ＤＣでワクチン接種したマウスで観察されたものと比較して、生存時間の高度に有意な延長が引き起こされた。全体的には、これらの結果は、ＩＦＮ−ＤＣが、エフェクターＣＤ８＋  Ｔリンパ球の増殖をインビボで刺激するのに有効であることを示している。
【０１５３】
【表５】
2004526455.tif 000007
【０１５４】
実施例１１
全ＰＢＭＣからの樹状細胞の作製
ＩＦＮ−αが全末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から樹状細胞を分化する能力を、ＶａｃＣｅｌｌ（登録商標）技術（IDM, Paris、フランス）を用いて評価した。ＩＦＮ−αの存在下で分化した細胞をＩＦＮ−ＤＣと称する。ＩＦＮ−αの２つの供給源を試験した：天然ＩＦＮ−α（Interferon Sciences）および組換えＩＦＮ−α（Pepro Tech）。
【０１５５】
１）材料および方法
健常ドナーに由来する白血球をサイタフェレーシスにより末梢血から単離した。５００ｒｐｍでの遠心により、ＶａｃＣｅｌｌ（登録商標）プロセッサに含まれる洗浄バッファー（マグネシウムもカルシウムも含まないＰＢＳグルコース）を用いて細胞を３回洗浄した。
【０１５６】
ＥＶＡ（酢酸エチレンビニル）バッグで、ＧＭ−ＣＳＦ（Leucomax, Novartis、５００IU/ml）およびＩＦＮ−αの存在下、ＡＩＭＶ改変培地（Invitrogen）中５．１０６細胞／ml（ＳＴＥＤＩＭ、６０ml）でＰＢＭＣを播種した。健常ドナー３体に関しては、ＩＦＮ−αの２つの濃度を試験し（５．０００および１．０００IU/ml）、そして健常ドナー２体に関してはＩＦＮ−α  ５０００IU/mlのみを使用した。３７℃で３日間の培養の後、以前に記載されたように細胞を洗浄した。
【０１５７】
培養物中の細胞形態学を試験し、そして０日の形態学と比較した。Malassezの計数により細胞の実収率を、そしてトリパン・ブルーまたはＴＯＰＲＯ３染色により細胞生存性を決定した。
【０１５８】
ＣＤ１４（クローン  ＲＭＯ５２）、ＣＤ１ａ、ＣＤ８０（クローン  ＭＡＢ１０４）、ＣＤ８３（クローン  ＨＢ１５ａ）、ＣＤ８６（ＨＡ５．２Ｂ７）、ＨＬＡ−ＡＢＣ（Ｂ９．１２．１）、ＨＬＡ−ＤＲ（Ｂ８．１２．２）、ＣＤ４０（クローン  ＭＡＢ８９）およびＣＤ２５（Ｂ１．１９．９）に関して細胞を蛍光色素に結合したモノクローナル抗体（Beckmann Coulter Immunotech, Marseille）で表現型に分類し、ＴＯＰＲＯ３染色により死細胞の排除を用いることにより表面発現を測定した。
【０１５９】
得られたＩＦＮ−ＤＣの一部を以下の条件を用いて成熟させた：１００μg/mlポリＩ：Ｃおよび３μg/ml  抗ＣＤ４０が入った２４ウェルプレート中１．１０６細胞／ウェル（０．５ml）、そして４０時間培養した。成熟表現型を決定した。
【０１６０】
Ｒ＆Ｄの試薬を用いて、ＥＬＩＳＡにより上澄におけるＩＬ−１２およびＩＬ−１０分泌を評価した。
【０１６１】
以下に従って実施したＭＬＲアッセイで同種抗原を展示する能力に関して細胞を試験した：
生存ＩＦＮ−ＤＣを、マイトマイシンＣを最終濃度５０μg/mlで含有する完全培地（ＡＩＭＶ、１％  抗生物質Ｐ．Ｓ、５％  ＡＢヒト血清）中１．１０６細胞／mlの密度で（ｆａｌｃｏｎコニカル１５mlチューブ）３７℃で３０分間再懸濁した。ＩＦＮ−ＤＣをＡＩＭＶで３回洗浄し、そして適当な密度：１／３（０．３３  １０６細胞／ml）１／１０、１／３０、１／１００および１／３００の比率で完全培地に再懸濁した。同種Ｔ細胞を完全培地中１ｘ１０６細胞／mlの濃度に調整した。９６ウェルコニカル底プレートにＴ細胞１ｘ１０５（１００μl）を播種し、次いで異なる希釈のＩＦＮ−ＤＣ  １００μlを添加した。対照条件は、ＩＦＮ−ＤＣ単独、Ｔ細胞単独（陰性対照）およびＴ細胞＋１μg/ml  ＰＨＡ（１００μl完全培地で完了）であった。４日に３ＨチミジンをＡＩＭＶ＋５％  ＡＢヒト血清（１０μl／ウェル＝１μＣｉ／ウェル）中１００μＣｉ／mlの濃度で添加し、そして３７℃で１８時間放置した。５日目に放射活性を計測した。
【０１６２】
２）結果：
分化の３日後に以下のパラメーターを評価した：
ａ）形態学：
分化の３日後のＩＦＮ−ＤＣ形態は、樹状細胞の形態に特徴的であった。
ｂ）単球のＩＦＮ−ＤＣへの分化収率：
各培養条件に関して、血液サンプル中の分化後のＤＣのパーセンテージを単球のパーセンテージと比較することにより評価した。得られた結果を以下の表３に示す。
【０１６３】
【表６】
2004526455.tif 000008
【０１６４】
細胞実収率のパーセンテージは、用いたＩＦＮの用量に従って非常に高い（９５％）から高い（ほぼ８０％）の範囲にわたる。これらの結果は、精製された細胞で得られた結果よりも幾分良好であり、夾雑細胞により発揮される保存効果の可能性を示唆している。
【０１６５】
ｃ）細胞生存性：
成熟後のＤＣ生存性をＴＯＰＲＯ３染色により評価し、そして約７８〜約９２％の範囲にわたった。以下の表４に示すように、ＤＣの生存性は、９０％を上回った。ＩＦＮαの供給源にかかわらず、細胞生存性は、同等であった。
【０１６６】
【表７】
2004526455.tif 000009
【０１６７】
ｄ）表面マーカー発現
ＣＤ１４、ＣＤ８３およびＨＬＡ−ＤＲの発現を図１８に示す。細胞の一般的な表現型特性は、以下の表５にまとめる：
【０１６８】
【表８】
2004526455.tif 000010
【０１６９】
ｅ）ＩＬ−１２およびＩＬ−１０分泌（結果をドナー１体に関してｐｇ／mlで表す）
培養の３日後、細胞を洗浄し、そして２．１０６細胞／mlの濃度で成熟化物質を含有するかまたは含有しない培養培地と２４時間接触させた。ＩＬ−１０およびＩＬ−１２分泌を古典的なＥＬＩＳＡにより評価した。
【０１７０】
【表９】
2004526455.tif 000011
【０１７１】
未成熟ＩＦＮ−ＤＣは、ＩＬ−１２のみを分泌し、ＩＬ−１０を分泌しなかった。ポリＩＣおよび抗ＣＤ４０での成熟により、全ドナーでＩＦＮ−ＤＣによるＩＬ−１０分泌が誘起された。これらの実験では、３日で得られたＩＦＮ−ＤＣに関しては、ＩＬ−１２分泌が比較的弱いようである。得られた結果は、未精製細胞の分泌の特定の時点での観察を示している。
【０１７２】
ｆ）混合リンパ球反応（ＭＬＲ）で評価される未成熟または成熟ＩＦＮ−ＤＣの同種抗原を提示する能力
未成熟ＩＦＮ−ＤＣは、Ｔ細胞に対して効率的に同種抗原提示を行うことができる。この能力は、ＩＦＮ−ＤＣが更に成熟したときに増強される（図１９）。
これらの実験により、形態、表面マーカー発現および効率的な同種抗原提示により規定されるＤＣが、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＦＮ−αの存在下、３日の培養でＰＢＭＣから分化できることが実証される。得られたＩＦＮ−ＤＣは、ポリＩＣおよび抗ＣＤ４０との処理で表現型的に更に成熟する能力を有した。試験したＩＦＮ−αの２つの濃度間では、体系統的な相違は、観察されなかった。
【０１７３】
【表１０】
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【図面の簡単な説明】
【０１７４】
【図１Ａ】血液由来のＣＤ１４＋単球をＩＦＮαｎ  １，０００IU/ml（天然ＩＦＮα、Alfa-Wasserman）およびＧＭ−ＣＳＦ  ５００U/ml（ＩＦＮ−ＤＣ）で３日間処理することにより得られたＤＣの免疫表現型のドットヒストグラム分析を、ＩＬ−４  ５００U/mlおよびＧＭ−ＣＳＦ  ５００U/ml（ＩＬ−４−ＤＣ）で３日間処理することにより得られたＤＣと比較して示している。標準的なＦｉｃｏｌｌおよび４６％  Ｐｅｒｃｏｌｌ密度グラジエント遠心により単球を精製し、続いてＣＤ１４＋細胞に関して陽性の免疫磁気的仕分けを行った（純度＞９５％）。単球を２ｘ１０６細胞／mlの濃度で再懸濁し、「発明の説明」に詳記するように３日間処理した。細胞膜マーカーに対する蛍光色素結合したモノクローナル抗体で染色した後、夾雑するリンパ球および細胞砕片を排除するために光散乱特性に従ってＤＣを電気的にゲートで選別するフローサイトメトリーにより細胞を分析した。データを得て、それをＦＡＣＳｏｒｔフローサイトメーターおよび「Cell Quest」ソフトウェア（Becton Dickinson）を用いて分析した。図のダイアグラムはＩＦＮ−ＤＣ（パネルＡ）の一連の膜マーカーの発現を示している。各々のダイアグラムでは、ｘ軸は、分析したマーカーに相対する細胞蛍光強度を示し、一方、ｙ軸は、陽性細胞数を表す。点線は、不適切な抗原に対するアイソタイプ対応対照抗体の染色を示す。
【図１Ｂ】血液由来のＣＤ１４＋単球をＩＦＮαｎ  １，０００IU/ml（天然ＩＦＮα、Alfa-Wasserman）およびＧＭ−ＣＳＦ  ５００U/ml（ＩＦＮ−ＤＣ）で３日間処理することにより得られたＤＣの免疫表現型のドットヒストグラム分析を、ＩＬ−４  ５００U/mlおよびＧＭ−ＣＳＦ  ５００U/ml（ＩＬ−４−ＤＣ）で３日間処理することにより得られたＤＣと比較して示している。標準的なＦｉｃｏｌｌおよび４６％  Ｐｅｒｃｏｌｌ密度グラジエント遠心により単球を精製し、続いてＣＤ１４＋細胞に関して陽性の免疫磁気的仕分けを行った（純度＞９５％）。単球を２ｘ１０６細胞／mlの濃度で再懸濁し、「発明の説明」に詳記するように３日間処理した。細胞膜マーカーに対する蛍光色素結合したモノクローナル抗体で染色した後、夾雑するリンパ球および細胞砕片を排除するために光散乱特性に従ってＤＣを電気的にゲートで選別するフローサイトメトリーにより細胞を分析した。データを得て、それをＦＡＣＳｏｒｔフローサイトメーターおよび「Cell Quest」ソフトウェア（Becton Dickinson）を用いて分析した。図のダイアグラムはＩＬ−４−ＤＣ（パネルＢ）の一連の膜マーカーの発現を示している。各々のダイアグラムでは、ｘ軸は、分析したマーカーに相対する細胞蛍光強度を示し、一方、ｙ軸は、陽性細胞数を表す。点線は、不適切な抗原に対するアイソタイプ対応対照抗体の染色を示す。
【図２】別のＩ型ＩＦＮ調製物  １０００IU/mlおよびＧＭ−ＣＳＦ  ５００U/mlで３日間処理した単球濃縮ＰＢＭＣから得られたＤＣの比較ドットヒストグラムプロファイルを示す。血液由来のＰＢＭＣの標準的なＦｉｃｏｌｌ密度グラジエント遠心、および続いて４６％  Ｐｅｒｃｏｌｌ密度グラジエントでの遠心により単球画分を濃縮した。部分的精製の後、細胞懸濁液は、夾雑リンパ球＜３５％を含有した。図１で記載したように、表面マーカーに対する蛍光色素結合したモノクローナル抗体で染色した後、光散乱特性に従ってＤＣを電気的にゲートで選別し、フローサイトメトリーにより分析した。特異的表面マーカーの発現を示す各々のダイアグラムでは、ｘ軸は、細胞蛍光強度を示し、一方、ｙ軸は、細胞数を表す。対照染色プロファイルは、すべて蛍光強度の最初の対数目盛り（logaritic decade）内に入る。
【図３】異なる用量、とりわけＩ型ＩＦＮ  １，０００IU/ml、５００IU/mlおよび１００IU/ml、をＧＭ−ＣＳＦ  ５００U/mlと一緒に加えた場合の共刺激分子の発現に及ぼす影響の比較のダイアグラムを示す。新鮮な単離した単球をＦｉｃｏｌｌおよびＰｅｒｃｏｌｌ密度遠心により部分的に精製し、サイトカインと共に培養し、そして３日目にフローサイトメトリーにより抗原発現に関して分析した。３つの実験のうちの１つの代表的なデータを示す。棒グラフは、図に示す選択されたＤＣ膜抗原の蛍光強度の平均値を表す。
【図４】ＩＬ−４−ＤＣ（ｂ）と比較する、Ｉ型ＩＦＮの存在下に生じたＤＣ（ａ）におけるＣＤ４４発現に関する免疫細胞化学（ＰＡＰ／ＡＥＣおよびヘマトキシリン対比染色；拡大率  １５００ｘ）。写真は、ＩＦＮ／ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４／ＧＭ−ＣＳＦ誘導ＤＣの典型的な形態学を示している。ＩＬ−４−ＤＣの縮んだ樹状に比較してＩＦＮ誘導ＤＣの細く、そして長い樹状に注目されたい。明らかに、ＣＤ４４染色は、典型的に樹状突起に局在し、うまくその輪郭を描いている。
【図５Ａ】パネルＡは、３日間、Ｉ型ＩＦＮおよびＧＭ−ＣＳＦまたはＩＬ−４／ＧＭ−ＣＳＦのいずれかの存在下で生じたＤＣにおけるサイトカインｍＲＮＡの発現のＲＴ−ＰＣＲ分析を示す。実施例に記載するようにＲＴ−ＰＣＲを実施した。パネルＡは、臭化エチジウムで染色した１．５％  アガロース電気泳動ゲルの透過光から明らかなように、異なるｍＲＮＡの特異的増幅から誘導されるＰＣＲ産物の写真を示す。
【図５Ｂ】パネルＢは、ＤＣ培養上澄におけるＩＬ−１５の分泌を示す。ヒストグラムは、全例で３日間ＧＭ−ＣＳＦ  ５００U/mlと共に、異なるＩ型  ＩＦＮ調製物  １０００IU/mlの存在下、およびＩＬ−４  ５００U/mlの存在下で作製されたＤＣからの上澄中の、ＥＬＩＳＡにより評価されるＩＬ−１５タンパク質の濃度を表す。値は、３実験の平均±Ｓ．Ｄ．として表現する。
【図６Ａ】パネルＡは、Ｉ型ＩＦＮおよびＧＭ−ＣＳＦまたはＩＬ−４／ＧＭ−ＣＳＦの種々調製物の存在下で生じたＤＣでのＭＬＲ比較アッセイを示す。同種ＰＢＬは、予めＩＦＮ／ＧＭ−ＣＳＦまたはＩＬ−４／ＧＭ−ＣＳＦと共に３日間培養したＤＣにより（異なるスティミュレーター／レスポンダー比率で）刺激された。実施例に記載するように、β線照射シンチレーションカウンティングにより測定されるＨ３−チミジン取り込みによりリンパ球増殖を評価した。
【図６Ｂ】パネルＢはＧＭ−ＣＳＦ  ５００U/mlと組み合わせたＩＦＮ  １００および１０００  IU/mlの、レスポンダーに対するスティミュレーターの比率１：２０でＤＣが同種リンパ球の増殖を誘起する能力に及ぼす影響を示す（同種ＭＬＲ）。ヒストグラムは、β線照射シンチレーションカウンティングにより評価されるＨ３−チミジン組み込みを表す。
【図６Ｃ】パネルＣは、５日間の共培養の後、同種ＭＬＲからの上澄中のＩＦＮ−γの生成を示す。４体の異なるドナーの各々からのＰＢＬを、スティミュレーター：レスポンダーの比率１：２０でＩＦＮαｎ／ＧＭ−ＣＳＦまたはＩＬ−４／ＧＭ−ＣＳＦのいずれかとの存在下で３日間細胞を培養することにより生じた同種ＤＣで刺激した。各棒グラフは、市販のＥＬＩＳＡキットにより評価される、個々の同種ドナーからのＰＢＬを伴うＤＣのＭＬＲ培養からの上澄中のＩＦＮγ濃度を表す。
【図７】β−ケモカインに対するＤＣの走化性応答の比較分析を示す。ＧＭ−ＣＳＦの存在下、Ｉ型ＩＦＮまたはＩＬ−４の異なる調製物でＤＣを作製した。ＧＭ−ＣＳＦと３日間処理した後に作製されたＤＣ  ５ｘ１０５および指示されたサイトカインを完全培地に再懸濁し、そして８μ孔径のフィルターのトランスウェルチャンバーの上室に播種し、一方、無血清培地の適切なケモカイン  ０．５μg/mlを下室に添加した。コントロールチャンバーの下室には、培地が単独で入っていた。棒グラフは、２時間のインキュベーションの後、ケモカインに応答して下室に遊走した細胞数を表す。アッセイは、三重で行った。
【図８Ａ】パネルＡは、ＩＬ−４−ＤＣに比較したＩＦＮ−ＤＣにおけるケモカインＭＩＰ−３βおよびそのレセプターＣＣＲ７のｍＲＮＡレベルでの発現を示す。臭化エチジウムで染色した１．５％  アガロース電気泳動ゲルの透過光でＰＣＲ産物を写真撮影した。
【図８Ｂ】パネルＢは、ＧＭ−ＣＳＦおよび指示された異なるＩＦＮ調製物で作製され、ＭＩＰ−３αおよびＭＩＰ−３βにより誘発されたＩＬ−４−ＤＣ対ＩＦＮ−ＤＣの遊走性応答を示す。図７で記載したように走化性アッセイを実施した。棒グラフは、２時間のインキュベーションの後、ケモカインに応答して下室に遊走した細胞数を表す。アッセイは、三重で行った。
【図８Ｃ】パネルＣは、単球をＩＦＮ／ＧＭ−ＣＳＦまたはＩＬ４／ＧＭ−ＣＳＦのいずれかで３日間処理した後、ＲＴ−ＰＣＲ分析により評価されるＩＦＮ−ＤＣ対ＩＬ−４−ＤＣにおけるケモカインの発現を示す。臭化エチジウムで染色した１．５％  アガロース電気泳動ゲルの透過光でＰＣＲ産物を写真撮影した。
【図９Ａ】不活化されたＨＩＶ−１でパルスを与えた自己ＤＣと共培養したＰＢＬ中のＨＩＶ−１抗原に対する1次免疫応答の「インビトロ」誘導を示す。  実施例に記載するように、新鮮な単離された単球を異なるＩ型ＩＦＮ調製物およびＧＭ−ＣＳＦまたはＩＬ−４／ＧＭ−ＣＳＦで３日間処理することによりＤＣを作製した。ＰＢＬを、スティミュレーター：レスポンダーの比率１：４でＡＴ−２不活化ＨＩＶ−１でパルスを与えた自己ＤＣで０日に刺激し、そして７日再刺激した。対照培養を、パルスを与えていない自己ＤＣと共にインキュベーションした。外来性ＩＬ−２（２５U/ml）を４日ごとに添加した。１４日に培養物をＡＴ−２不活性化ＨＩＶ−１でパルスを与えたＤＣで再刺激し、２４時間後に３Ｈチミジンを添加した。細胞を１８時間の培養の後、収穫した。ＥＬＩＳＰＯＴ分析（パネルＢ）およびＥＬＩＳＡ（パネルＣ）により細胞および細胞培養物からの上澄をＩＦＮγ生成に関して試験した。  パネルＡは、３Ｈチミジン取り込みおよびβ線照射シンチレーションカウンティングにより評価される、ＡＰＣとしてＤＣを用いるＨＩＶ抗原に対するリンパ球増殖アッセイの結果を示す。黒色の棒グラフは、不活化ＨＩＶ−１でパルスを与えた自己ＤＣと共培養されたＰＢＬによる３Ｈチミジン取り込みを表す；一方、白色棒グラフは、対照培養による３Ｈチミジン取り込みを表す。
【図９Ｂ】パネルＢは、ウイルスでパルスを与えたＤＣでの３回目の刺激の２４時間後に収穫された細胞を用いるＥＬＩＳＰＯＴによる単一のＩＦＮ−γ生成細胞の算出により決定される、ウイルスでパルスを与えたＤＣで刺激したＰＢＬの培養物中のＩＦＮ−γ生成細胞の頻度を示す。各々の棒グラフは、Ｔ細胞１０６あたりの三重のスポット数の平均±Ｓ．Ｄ．を表す。ＨＩＶ反応性ＩＦＮ−γ生成細胞の数をウイルスでパルスを与えたＤＣにより誘導されたＴ細胞の平均スポット数からパルスを与えていない自己ＤＣにより誘導されたＴ細胞の平均スポット数を差し引くことにより算出した。
【図９Ｃ】パネルＣは、前記のように刺激された１次培養物の上澄のＥＬＩＳＡにより評価されるＩＦＮ−γおよびＩＬ−４生成のレベルを示す。灰色の棒グラフは、ウイルスでパルスを与えたＤＣと共培養したＰＢＬからの上澄におけるサイトカイン濃度を示し、一方、白色棒グラフは、対照培養からの上澄におけるサイトカイン濃度を示す。
【図１０Ａ】ｈｕ−ＰＢＬ−ＳＣＩＤマウスモデルにおけるＨＩＶ抗原に対するヒト１次応答の「インビボ」誘導の代表的な実験を示す（実験の詳細に関しては実施例を参照されたい）。パネルＡは、ＡＴ−２不活化ＨＩＶ−１でパルスを与えた（３７℃で２時間）ＩＦＮ−ＤＣまたはＩＬ−４−ＤＣ  １．５ｘ１０６で免疫および追加免疫（７日後）された個々のｈｕ−ＰＢＬ−ＳＣＩＤマウスからの血清中のヒト抗ＨＩＶ−１  ｇｐ１６０／１２０およびｐ２４抗体（全Ｉｇ）を示す（ＩＦＮ−ＤＣは、ＩＦＮαｎおよびＧＭ−ＣＳＦと共に３日間処理することにより得られた）。値は、ウェスタンブロットアッセイの後、対応するバンドのデンシトメトリースキャニングにより得られた。
【図１０Ｂ】パネルＢは、７日および１４日での抗ｇｐ４１抗体アイソタイプの特徴づけを示す；棒グラフは、ウイルスでパルスを与えたＩＦＮ−ＤＣまたはＩＬ−４−ＤＣでワクチン接種した３匹のマウスから得られた平均値を表す。
【図１０Ｃ】パネルＣは、２１日に収集した免疫ｈｕ−ＰＢＬ−ＳＣＩＤマウスからの血清のＨＩＶに対する「インビトロ」中和活性を示す。段階希釈した免疫ｈｕ−ＰＢＬ−ＳＣＩＤマウスからの血清を１０ＴＣＩＤ５０のＨＩＶ−１  ＳＦ１６２株と合わせ、そしてＰＨＡ活性化ＰＢＭＣに添加した。３日後、上澄をｐ２４生成に関して検定した。プロットは、異なるＤＣで免疫された個々のマウスからの血清の中和活性を表す。
【図１０Ｄ】パネルＤは、ＥＬＩＳＡにより評価される、免疫および対照ｈｕ−ＰＢＬ−ＳＣＩＤマウスの腹膜におけるヒトＩＦＮγ生成のレベルを示す。
【図１１】不活化ＨＩＶでパルスを与えた自己ＩＦＮ−ＤＣで刺激した時の全ＰＢＬおよび高度に精製されたＣＤ８＋インビトロ培養によるＩＦＮγ生成の時間経過。  ７日間隔で全リンパ球および精製されたＣＤ８＋リンパ球（＞９８％）をＡＴ２不活化ＨＩＶ−１ビリオンでパルスを与えた自己ＩＦＮ−ＤＣで４回刺激した。各々の刺激の４日後にＩＦＮγ生成に関して培養上澄を検定した。
【図１２】ＩＦＮガンマＥＬＩＳＰＯＴアッセイを用いてＨＩＶ−１抗原に対するＣＤ８＋  Ｔ細胞応答の定量化  ＩＦＮ−ＤＣ（黒色棒グラフ）またはＩＬ−４−ＤＣ（白抜き棒グラフ）でワクチン接種された異種間キメラマウスからのＨＩＶ特異的ＩＦＮγ生成ＣＤ８＋細胞。  自己ＢＬＣＬをＨＩＶ−１（ＳＦ１６２）（５．０００ＴＣＩＤ５０／１０６細胞）および組換えＨＩＶ−１ワクシニアウイルスベクター（ＭＯＩ  ３）で各々４８および１２時間感染させ、洗浄し、放射線照射し、そして抗原提示細胞として使用した。パルスを与えていないＢＬＣＬおよびワクシニアウイルスベクターで感染したＢＬＣＬを陰性対照として用いた；ＰＨＡ（１μg/ml）刺激を陽性対照として用いた。ＰＢＭＣをウェルあたり１ｘ１０６で加え、そして培地（２mM  Ｌ−グルタミンおよび１０％  非動化ウシ胎仔血清を補充したＲＰＭＩ  １６４０）最終容量２ml中で５％  ＣＯ２と共に３７℃で一晩インキュベートした。  自己ＢＬＣＬと共にインキュベートした後、ＣＤ８＋Ｔ細胞をＭＡＣＳマイクロビーズ（Miltenyi Biotec GmbH）で陽性選択し、ＩＦＮ−γの生成に関してＥＬＩＳＰＯＴで試験した（Euroclone Ltd  英国）。ウェルあたり１００μl中ＣＤ８＋Ｔ細胞  ２．５ｘ１０４を９６ウェル抗γインターフェロン抗体被覆プレート（２mM  Ｌ−グルタミンおよび１０％  非動化ウシ胎仔血清を補充したＲＰＭＩ  １６４０中）に分配した；一晩インキュベートし、そして細胞を溶解した後、ビオチン化検出２次抗体により捕捉されたサイトカイン分子が明らかになり、そしてストレプトアビジン・アルカリ性ホスファターゼと共にインキュベートし、続いてゲル・オーバーレイ中ＢＣＩＰ基質と共にインキュベートすることにより展開させた。倒立顕微鏡で拡大率４０で着色スポットを計数した。対照未感染ＢＬＣＬによりまたはワクシニアベクター感染ＢＬＣＬ標的により誘発されたバックグラウンドスポットを差し引くことにより特異的ＩＦＮγスポット形成細胞を算出した。
【図１３】ＩＦＮガンマＥＬＩＳＰＯＴアッセイを用いるＨＩＶ−１  ＣＴＬエピトープＳＬ９に対するＣＤ８＋Ｔ細胞応答の定量化。ＢＬＣＬを５０μlの容量中１０−５Ｍ  「ＳＬ９」ペプチドでパルスを与え、洗浄し、そして前記で報告したように使用した。ＩＦＮ−ＤＣ（黒色棒グラフ）またはＩＬ−４−ＤＣ（白抜き棒グラフ）でワクチン接種した異種間キメラマウスの腹腔内および脾臓におけるＩＦＮγスポット形成ＣＤ８＋細胞。
【図１４Ａ】ＨＩＶ−１で誘発された、ワクチン接種されたｈｕ−ＰＢＬ−ＳＣＩＤマウスにおける共培養アッセイおよびプロウイルス負荷。  前記したようにヒトＰＢＬでｈｕ−ＰＢＬ−ＳＣＩＤマウスを再構築し、前記したように不活化ＨＩＶ−１でパルスを与えたＩＦＮ−ＤＣの注射により再構築の３日後にワクチン接種した。パルスを与えたＩＦＮ−ＤＣ抗原での追加免疫注射を７日後に行い、そして遊離の精製された不活化ＨＩＶビリオンから成る２回目のリコール注射（recall injection）を更に７日後に行った。免疫スケジュールの完成７日後に免疫異種間キメラマウスを１０２  ＴＣＩＤ５０のＳＦ１６２で腹腔内誘発し、そして７日後に屠殺した。  パネルＡは、ＰＨＡ活性化ＰＢＬの感染マウスから救済された腹膜細胞との共培養の上澄中のウイルスｐ２４レベルを示す。
【図１４Ｂ】パネルＢは、誘発された異種間キメラマウスの脾臓およびリンパ節におけるＨＩＶ−１プロウイルス配列に関するＰＣＲ分析を示す。
【図１５Ａ】ＨＬＡクラスＩ制限ＥＢＶペプチドでパルスを与えたＩＦＮ−ＤＣまたはＩＬ−４−ＤＣでのＰＢＬの刺激後のＥＢＶ抗原特異的Ｔ細胞の頻度。指示されたドナーから全ＰＢＭＣを単離した。Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐｅｒｃｏｌｌ分離の後、ＣＤ１４＋単球を免疫磁気法により精製し、新鮮または凍結保存サンプルとして用い、そしてＴ細胞濃縮画分を一定分量で凍結保存した。ＧＭ−ＣＳＦ／ＩＦＮまたはＧＭ−ＣＳＦ／ＩＬ−４の存在下、３日間の２ｘ１０６細胞／ml  単球の培養によりＤＣを作製し、次いで選択されたドナーのＨＬＡにより提示されるＣＴＬエピトープとして公知のＥＢＶ誘導ペプチド  １０μg/mlでパルスを与えた。ペプチドでパルスを与えたＤＣを自己Ｔ細胞濃縮ＰＢＬに添加した。３〜４日後、ＩＬ−２  １０U/mlを培養物に添加した。最初の共培養後、７および１４日にＴ細胞を凍結保存単球から作成したペプチドでパルスを与えたＤＣで再刺激した。各々の刺激から７日後にＥＬＩＳＰＯＴアッセイを実施し、自己ＬＣＬ（ドナーＦＺおよびＦＢに関して）またはペプチドでパルスを与えたＴ２（ＴＡＰ−／−、ＨＬＡ−Ａ２）細胞（ドナーＬＬに関して）と一晩インキュベートした後、ＩＦＮγを生成するＴ細胞の数を評価した。ペプチドでパルスを与えた自己ＩＦＮ−ＤＣまたはＩＬ−４−ＤＣでのＴ細胞濃縮ＰＢＬの刺激の２ラウンド後に実施したＥＬＩＳＰＯＴアッセイの結果を示す。各々の棒グラフは、Ｔ細胞２ｘ１０４または５ｘ１０４につき三重のスポット数の平均±ＳＤを表す。パルスを与えていない自己単球により誘導されたＴ細胞の平均スポット数をＬＣＬ（ドナーＦＺまたはＦＢに関して）またはペプチドでパルスを与えたＴ２細胞（ドナーＬＬに関して）により誘導されたＴ細胞の平均スポット数から差し引くことにより、ペプチド反応性細胞の数を算出した。
【図１５Ｂ】ＨＬＡクラスＩ制限ＥＢＶペプチドでパルスを与えたＩＦＮ−ＤＣまたはＩＬ−４−ＤＣでのＰＢＬの刺激後のＥＢＶ抗原特異的Ｔ細胞の頻度。指示されたドナーから全ＰＢＭＣを単離した。Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐｅｒｃｏｌｌ分離の後、ＣＤ１４＋単球を免疫磁気法により精製し、新鮮または凍結保存サンプルとして用い、そしてＴ細胞濃縮画分を一定分量で凍結保存した。ＧＭ−ＣＳＦ／ＩＦＮまたはＧＭ−ＣＳＦ／ＩＬ−４の存在下、３日間の２ｘ１０６細胞／ml  単球の培養によりＤＣを作製し、次いで選択されたドナーのＨＬＡにより提示されるＣＴＬエピトープとして公知のＥＢＶ誘導ペプチド  １０μg/mlでパルスを与えた。ペプチドでパルスを与えたＤＣを自己Ｔ細胞濃縮ＰＢＬに添加した。３〜４日後、ＩＬ−２  １０U/mlを培養物に添加した。最初の共培養後、７および１４日にＴ細胞を凍結保存単球から作成したペプチドでパルスを与えたＤＣで再刺激した。各々の刺激から７日後にＥＬＩＳＰＯＴアッセイを実施し、自己ＬＣＬ（ドナーＦＺおよびＦＢに関して）またはペプチドでパルスを与えたＴ２（ＴＡＰ−／−、ＨＬＡ−Ａ２）細胞（ドナーＬＬに関して）と一晩インキュベートした後、ＩＦＮγを生成するＴ細胞の数を評価した。ペプチドでパルスを与えた自己ＩＦＮ−ＤＣまたはＩＬ−４−ＤＣでのＴ細胞濃縮ＰＢＬの刺激の２ラウンド後に実施したＥＬＩＳＰＯＴアッセイの結果を示す。各々の棒グラフは、Ｔ細胞２ｘ１０４または５ｘ１０４につき三重のスポット数の平均±ＳＤを表す。パルスを与えていない自己単球により誘導されたＴ細胞の平均スポット数をＬＣＬ（ドナーＦＺまたはＦＢに関して）またはペプチドでパルスを与えたＴ２細胞（ドナーＬＬに関して）により誘導されたＴ細胞の平均スポット数から差し引くことにより、ペプチド反応性細胞の数を算出した。
【図１５Ｃ】ＨＬＡクラスＩ制限ＥＢＶペプチドでパルスを与えたＩＦＮ−ＤＣまたはＩＬ−４−ＤＣでのＰＢＬの刺激後のＥＢＶ抗原特異的Ｔ細胞の頻度。指示されたドナーから全ＰＢＭＣを単離した。Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐｅｒｃｏｌｌ分離の後、ＣＤ１４＋単球を免疫磁気法により精製し、新鮮または凍結保存サンプルとして用い、そしてＴ細胞濃縮画分を一定分量で凍結保存した。ＧＭ−ＣＳＦ／ＩＦＮまたはＧＭ−ＣＳＦ／ＩＬ−４の存在下、３日間の２ｘ１０６細胞／ml  単球の培養によりＤＣを作製し、次いで選択されたドナーのＨＬＡにより提示されるＣＴＬエピトープとして公知のＥＢＶ誘導ペプチド  １０μg/mlでパルスを与えた。ペプチドでパルスを与えたＤＣを自己Ｔ細胞濃縮ＰＢＬに添加した。３〜４日後、ＩＬ−２  １０U/mlを培養物に添加した。最初の共培養後、７および１４日にＴ細胞を凍結保存単球から作成したペプチドでパルスを与えたＤＣで再刺激した。各々の刺激から７日後にＥＬＩＳＰＯＴアッセイを実施し、自己ＬＣＬ（ドナーＦＺおよびＦＢに関して）またはペプチドでパルスを与えたＴ２（ＴＡＰ−／−、ＨＬＡ−Ａ２）細胞（ドナーＬＬに関して）と一晩インキュベートした後、ＩＦＮγを生成するＴ細胞の数を評価した。ペプチドでパルスを与えた自己ＩＦＮ−ＤＣまたはＩＬ−４−ＤＣでのＴ細胞濃縮ＰＢＬの刺激の２ラウンド後に実施したＥＬＩＳＰＯＴアッセイの結果を示す。各々の棒グラフは、Ｔ細胞２ｘ１０４または５ｘ１０４につき三重のスポット数の平均±ＳＤを表す。パルスを与えていない自己単球により誘導されたＴ細胞の平均スポット数をＬＣＬ（ドナーＦＺまたはＦＢに関して）またはペプチドでパルスを与えたＴ２細胞（ドナーＬＬに関して）により誘導されたＴ細胞の平均スポット数から差し引くことにより、ペプチド反応性細胞の数を算出した。
【図１６】ＨＬＡクラスＩ制限ＥＢＶペプチドでパルスを与えたＩＦＮ−ＤＣまたはＩＬ−４−ＤＣで刺激したＣＤ８＋Ｔ細胞の細胞障害性作用。ＣＤ８＋Ｔリンパ球をＦＢ  ＰＢＬドナーから免疫磁気により精製し、そしてパルスを与えていないまたはレスポンダーに対するスティミュレーターの比率１：１０でペプチドでパルスを与えたＩＦＮ−ＤＣまたはＩＬ−４−ＤＣで刺激した。ＤＣにパルスを与えるのに用いたペプチドは、図１５Ａ、１５Ｂ、１５Ｃで示したものと同一であった。３回目の刺激後６日に、標準的な５１Ｃｒ放出アッセイにおいて、パルスを与えていないまたはペプチドでパルスを与えた自己のＬＣＬに対する細胞障害性作用に関してＣＤ８＋細胞を検定した。具体的な細胞障害性を式：特異的溶解のパーセンテージ＝１００ｘ［（実験的放出cpm−自然放出cpm）／（最大放出cpm−自然放出cpm）］に従って決定した。
【図１７】ＥＢＶペプチドでパルスを与えたＩＦＮ−ＤＣで刺激した後のメモリー表現型を有するＣＤ８＋の増殖持続。ドナーＦＢ  ＰＢＬから精製されアイソタイプ適合対照抗体（Ａ）または抗ＣＤ４５ＲＡおよび抗ＣＤ２７抗体で二重染色されたＣＤ８＋Ｔリンパ球細胞のドットプロットＦＡＣＳ分析：刺激前（Ｂ）；パルスを与えていないＩＬ−４−ＤＣ（Ｃ）またはＩＦＮ−ＤＣ（Ｄ）、またはＥＢＶペプチドでパルスを与えたＩＬ−４−ＤＣ（Ｅ）またはＩＦＮ−ＤＣ（Ｆ）での刺激の２ラウンド後；ＥＢＶペプチドでパルスを与えたＩＬ−４−ＤＣまたはＩＦＮ−ＤＣ（Ｈ）での刺激の３ラウンド後。ＤＣにパルスを与えるのに用いたペプチドは、図１５Ａ、１５Ｂ、１５Ｃで示したものと同一であった。
【図１８Ａ】３日間インターフェロン  １０００IU/mlまたは５０００IU/mlおよびＧＭ−ＣＳＦ  ５００U/mlで全ＰＢＭＣを処理することにより得られるＩＦＮ−ＤＣの免疫表現型のドットヒストグラム分析。ＰＢＭＣを得て、そして実施例１１に記載するように処理した。図１８Ａは、成熟化処理をなんら施さないＩＦＮ−ＤＣに関する。平均蛍光強度が示される。
【図１８Ｂ】図１８Ｂは、成熟化処理（ポリＩＣおよび抗ＣＤ４０）の後のＩＦＮ−ＤＣに関する。平均蛍光強度が、示される。
【図１９】ポリＩＣおよび抗ＣＤ４０（ｍＤＣ）の存在下４０時間の成熟化の後、または成熟化せずに（ｉＤＣ）、ＧＭ−ＣＳＦ（５００IU/ml）および天然のＩＦＮ−α（５０００IU/ml）または組換えＩＦＮ−α（５０００IU/ml）のいずれかの存在下における単球分化３日後に得られたＩＦＮ−ＤＣを用いた混合リンパ球反応の結果。ＡＰＣ／ＰＢＭＣ比率を低下させたＩＦＮ−ＤＣ（ＡＰＣ）およびＰＢＭＣ間の共培養の５日後に、健常ドナー（ＨＤ１３１３４−）に由来する同種ＰＢＭＣの増殖によりこれらのＩＦＮ−ＤＣの同種抗原提示を評価した。結果を三重で実施した種々のＡＰＣ／ＰＢＭＣ比率におけるのＰＢＭＣ増殖（cpm）による３Ｈ−ｄＴＴＰの細胞への取り込みの平均レベルとして表す。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１０Ｄ】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１５Ｃ】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１９】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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