(57)【要約】本発明は、マトリックス・メタロプロテアーゼの発現に影響を及ぼす、好ましくはその発現を阻害することによる癌の治療における、活性作用物質、特に阻害剤の使用に関する。この活性作用物質の標的は特に、マトリックス・メタロプロテアーゼ９（ＭＭＰ−９）シグナル伝達経路の上流制御因子に関することが可能である。本発明に従って、特にｐ３８βおよびｐ３８γの阻害剤を適用することが可能であり、マイトジェン活性化キナーゼキナーゼ６（ＭＭＫ６）およびマイトジェン活性化キナーゼキナーゼ３（ＭＫＫ３）の阻害剤も同様に適用することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
癌治療のための薬剤または医薬組成物を製造するための、真核細胞におけるマトリックス・メタロプロテアーゼの発現に影響を及ぼす、特にその発現を阻害する、活性作用物質の使用。
【請求項２】
真核細胞が、マトリックス・メタロプロテアーゼの発現に影響を及ぼす、特にその発現を阻害する活性作用物質によって処理されることを特徴とする、癌の治療方法。
【請求項３】
前記マトリックス・メタロプロテアーゼが、マトリックス・メタロプロテアーゼ−９（ＭＭＰ−９）であることを特徴とする、請求項１または２に記載の使用または方法。
【請求項４】
前記活性作用物質が、マトリックス・メタロプロテアーゼシグナル伝達経路の少なくとも１種類のメンバーに対して標的化されることを特徴とする、請求項１から３の一項に記載の使用または方法。
【請求項５】
前記メンバーが、ｐ３８タンパク質ファミリーのメンバーであることを特徴とする、請求項４に記載の使用または方法。
【請求項６】
前記ｐ３８タンパク質が、ｐ３８βタンパク質であることを特徴とする、請求項５に記載の使用または方法。
【請求項７】
前記ｐ３８タンパク質が、ｐ３８γ（ＳＡＰＫ３またはＥＲＫ６）タンパク質であることを特徴とする、請求項５に記載の使用または方法。
【請求項８】
前記メンバーが、マイトジェン活性化キナーゼキナーゼファミリーのメンバーであることを特徴とする、請求項４に記載の使用または方法。
【請求項９】
前記マイトジェン活性化キナーゼキナーゼが、マイトジェン活性化キナーゼキナーゼ６（ＭＫＫ６）またはマイトジェン活性化キナーゼキナーゼ３（ＭＫＫ３）であることを特徴とする、請求項８に記載の使用または方法。
【請求項１０】
前記活性作用物質が、マトリックス・メタロプロテアーゼシグナル伝達経路の活性化因子、制御因子および／または生物学的な前駆物質に対して標的化されることを特徴とする、請求項１から９の一項に記載の使用または方法。
【請求項１１】
前記活性作用物質が、小分子化合物、好ましくは分子量（ＭＷ）＜１０００を有する小分子化合物であることを特徴とする、請求項１から１０の一項に記載の使用または方法。
【請求項１２】
前記小分子化合物が、イミダゾール誘導体であって、前記イミダゾール誘導体が、好ましくはＳＢ　２０３５８０またはＳＢ　２０２１９０である、請求項１１に記載の使用または方法。
【請求項１３】
前記活性作用物質が、マトリックス・メタロプロテアーゼの発現に影響を及ぼす、好ましくはその発現を阻害するペプチド、好ましくは、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであることを特徴とする、請求項１から１２の一項に記載の使用または方法。
【請求項１４】
前記癌が、浸潤性表現型の癌であることを特徴とする、請求項１から１３の一項に記載の使用または方法。
【請求項１５】
前記癌が；
ａ）扁平上皮癌、好ましくは、頭、首、皮膚若しくは胃の扁平上皮癌、または
ｂ）大腸癌、乳癌若しくは肝細胞癌、または
ｃ）胃の線維肉腫であることを特徴とする、請求項１から１４の一項に記載の使用または方法。
【請求項１６】
少なくとも１種類の適合量の活性作用物質を含有する医薬組成物であって、前記活性作用物質が、真核細胞におけるマトリックス・メタロプロテアーゼの発現に影響を及ぼし、好ましくはその発現を阻害し、かつ任意に薬学的に許容される担体をさらに含む医薬組成物。
【請求項１７】
請求項４から１３の一項に定義される活性作用物質によってさらに特徴づけられる、請求項１６に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、マトリックス・メタロプロテアーゼ発現の活性作用物質、特に阻害剤の使用に関する。さらに詳細には、本発明は、癌、特に癌の浸潤の治療に関連した、かかる薬剤の使用に関する。
【０００２】
公知のように、細胞外マトリックスの分解は非常に複雑なプロセスであり、それは、多くの病理学的および生理学的プロセスの一部である。それによって、細胞外マトリックスのタンパク分解性の分解は、非腫瘍性組織再構築プロセスにおける役割と同様に、癌の浸潤においても非常に重要な役割を果たす。癌の浸潤性表現型は、数種類のプロテアーゼの活性および発現に非常に依存する。この腫瘍細胞媒介性の細胞外マトリックスのタンパク質分解におけるマトリックス・メタロプロテアーゼ酵素の役割は、十分に証明されている。これらのマトリックス・メタロプロテアーゼの１つは、ＭＲ９２，０００のＩＶ型コラゲナーゼ（ＭＭＰ−９）である。ＭＭＰ−９は、大部分がＩＶ型コラーゲンで構成され、かつ間質性区画から上皮を通常分離する構造である、基底膜を分解する（１、２）。多くの成長因子が、次にシグナル伝達経路を活性化する膜貫通チロシン受容体に結合させることによって、ＭＭＰ−９および他のプロテアーゼの発現を誘導する（３、４）。しかしながら、いくらかの細胞系によって、かかる成長因子の非存在下でさえ、大量のプロテアーゼが生成され、根底にある一つのメカニズムとして、シグナル伝達カスケードの構成的活性が示唆されている（５）。実際に、シグナル伝達経路の構成的活性が、腎細胞癌、白血病ならびに多くの他の癌について記述されている。シグナル伝達経路のこれらの構成的活性に関して、Ｈ．オカ（Ｏｋａ）等の出版物およびＳ．Ｃ．キム（Ｋｉｍ）の出版物を参照する（６、７）。
【０００３】
ストレス−およびマイトジェン−活性化プロテインキナーゼ（ＳＡＰＫおよびＭＡＰＫ）が、シグナル伝達経路において中心的な役割を担うことは当業者には公知である。ｐ３８／ＲＫ、ＪＮＫ／ＳＡＰＫ、およびｐ４２／ｐ４４　ＭＡＰＫ／ＥＲＫを含む、３つの主要なサブファミリーが存在する。一般に、ＥＲＫは、マイトジェンおよび分化（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｖｅ）因子によって刺激され、ＪＮＫおよびｐ３８は、紫外線、浸透ストレスなどの環境ストレスによって活性化されるが、炎症性サイトカインによってもまた活性化される。３つのサブファミリーすべてが、アポトーシスを制御し、ＥＲＫは負の制御因子であるが、ＪＮＫおよびｐ３８は正の制御因子である（８）。今までに、ＳＡＰＫ３またはＥＲＫ６およびｐ３８δ（１２）とも呼ばれ（１２）、ＳＡＰＫ４とも呼ばれる、４種類のｐ３８ヒト・アイソフォーム：ｐ３８α（９），ｐ３８β（１０），ｐ３８γ（１１）がクローン化されている。α−およびβ−アイソフォームは主に、炎症誘発性シグナルを核に仲介し、アポトーシスを制御するのに関与している（８）。ｐ３８γは、筋肉の発達および低酸素ストレスに対する応答において役割を果たすと意味づけられている（１３、１４）。ｐ３８αおよびｐ３８βは、ヒト組織に広く分布しており、それらの発現は、脳および心臓で最も大量であることが見出された（１０）。ＳＡＰＫ３は主に、骨格筋に存在する（１５、１６）。ＳＡＰＫ４の機能については、ほとんど知られていない。高レベルの発現が、唾液腺、下垂体および副腎組織において見出された（１２）。ｐ３８アイソフォームの重要な上流制御因子には、プロテインキナーゼＭＫＫ６およびＭＫＫ３が含まれる。
【０００４】
癌の浸潤および転移におけるマトリックス・メタロプロテアーゼの関与に関する、今までの知見および研究は、種々のマトリックス・メタロプロテアーゼ酵素ドメインの機能および阻害ドメインとのそれらの相互作用に焦点が当てられている。例えば、細胞外マトリックスの分解に関与するマトリックス・メタロプロテアーゼのタンパク質分解活性は、それらの内在性タンパク質阻害剤、メタロプロテアーゼの組織阻害剤（ＴＩＭＰ）によって正確に制御されなければならないことが知られている。メタロプロテアーゼのこれらの組織阻害剤は、腫瘍細胞によるマトリックスの分解において重要な役割も果たす。ＴＩＭＰおよびＭＭＰの活性は、数種類の癌腫において、例えば腎細胞腫において、胃癌においてもまた同様に分析された。これらの研究に関して、Ａ． Ｋｕｇｌｅｒ および Ｇ．Ｉ． Ｍｕｒｒａｙ等の出版物を参照する（１７、１８）。メタロプロテアーゼのこれらの組織阻害剤は、分泌型メタロプロテアーゼの活性の制御において非常に重要な役割を担う分泌タンパク質のファミリーである。今までに、それらのうちの３種類が特徴づけられている（ＴＩＭ１、ＴＩＭＰ２およびＴＩＭＰ３）。それらは、プロメタロプロテアーゼの活性に影響を及ぼし、特に組織再構築および炎症プロセス中に、細胞外マトリックスのタンパク質分解を調節する働きをする。マトリックス・メタロプロテアーゼのこれらの組織阻害剤のキャラクタリゼーションは、Ｄ．Ｔ．デンハート（Ｄｅｎｈａｒｄｔ）等の出版物に記載されている（１９）。マリマスタット（ｍａｒｉｍａｓｔａｔ）（ＢＢ−２５１６）と同様の合成マトリックス・メタロプロテアーゼ阻害剤、ミクロモル範囲でＩＣ５０値を有するブタンジアミド誘導体もまた存在する。Ｃ． サイモン（Ｓｉｍｏｎ）等（２０）は、ホルボールミリステートアセテート（ＰＭＡ）で処理した後の、ヒト扁平上皮癌細胞系（ＵＭ−ＳＣＣ−１）における強化されたＭＭＰ−９分泌およびインビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）浸潤性、皮膚発癌の研究で広く用いられている公知の発癌プロモーター（（２１）で概説されている）を、一般的なｐ３８阻害剤ＳＢ　２０３５８０を使用することによって阻害することができることを実証した。
【０００５】
現在、驚くべきことに、ｐ３８の構成的活性は、ＭＫＫ６および／またはＭＫＫ３経路もまた同様に、癌細胞におけるＭＭＰ−９の高レベルな発現で非常に重要な役割を果たしていることが見出されている。これらの予想外の発見の結果として、癌、特に癌の浸潤を治療するための、ＭＭＰ−９発現の下流制御因子に対して標的化される／作られる活性作用物質の使用が可能となる。
【０００６】
このように、活性作用物質を癌の治療に利用できるようにすることの本発明の問題は、請求項１および２に記載の使用によって解決される。好ましい実施形態を従属請求項３から１７に記載する。これらの請求項すべての内容は、これによって参照により本明細書中に組み込まれる。
【０００７】
本発明に従って、癌の治療のために、真核細胞におけるマトリックス・メタロプロテアーゼの発現に影響を及ぼすため、特に発現を阻害するために、少なくとも１種類の活性作用物質を使用する。特にこれは、相当する薬剤または相当する医薬組成物を製造するための、かかる活性作用物質の使用もまた包含する。本発明に従って、その活性作用物質は任意に、その薬学的に許容される塩の形で、および任意に許容可能な担体と共に使用することができる。
【０００８】
本発明に従って使用される活性作用物質は、癌、好ましくは癌の浸潤に関与する上述のマトリックス・メタロプロテアーゼに影響を及ぼす、特にマトリックス・メタロプロテアーゼを阻害することが好ましい活性作用物質である。本発明に従って、癌の浸潤に関与する好ましいマトリックス・メタロプロテアーゼは、マトリックス・メタロプロテアーゼ９である。
【０００９】
本発明の好ましい一実施形態において、使用する活性作用物質は、マトリックス・メタロプロテアーゼのシグナル伝達経路の少なくとも１種類のメンバーに対して、特にＭＭＰ−９シグナル伝達経路の１種類のメンバーに対して標的化されることが好ましい。このＭＭＰ−９シグナル伝達経路の１種類の好ましいメンバーは、いわゆるｐ３８タンパク質ファミリーである。本発明に従った使用において、これらのｐ３８タンパク質のうちの１つは、ｐ３８βタンパク質であり、本発明の使用に従った、他の好ましいメンバーは、ｐ３８γ（ＳＡＰＫ３またはＰＲＫ６）タンパク質である。本発明による活性作用物質の他の好ましい標的は、マイトジェン活性化プロテインキナーゼキナーゼファミリーである。このマイトジェン活性化プロテインキナーゼキナーゼファミリーの好ましい２種類のメンバーは、マイトジェン活性化プロテインキナーゼキナーゼ６（ＭＫＫ６）およびマイトジェン活性化プロテインキナーゼキナーゼ３（ＭＫＫ３）である。本発明に従った使用において、ＭＭＰ−９シグナル伝達経路の１種類のメンバーを単独で、活性作用物質によって標的化することができるが、活性作用物質によって標的化されるＭＭＰ−９シグナル伝達経路の２種類または３種類以上の異なるメンバーのランダムな組み合わせもまた存在することができる。
【００１０】
他の好ましい実施形態では、マトリックス・メタロプロテアーゼシグナル伝達経路の、好ましくはＭＭＰ−９シグナル伝達経路の活性化因子（ａｃｔｉｖａｔｏｒ）、制御因子および／または生物学的前駆物質を、活性作用物質によって標的化し、かつ／またはそれらに影響を及ぼすこともまた任意に可能である。これらの活性化物質、制御因子および／または生物学的前駆物質は例えば、プロテアーゼの酵素活性の制御に関与することが知られているキナーゼ、プロテアーゼの発現レベルを担うＡＰ−１様の転写因子および他の転写因子、プロメタロプロテアーゼの活性化を担うプロテアーゼまたは組織阻害剤、または活性作用物質によって影響を受け得る、現在でさえ未知の化合物であってもよい。
【００１１】
本発明に従って、公知の活性作用物質または新規な活性作用物質もまた使用することが可能である。本発明の好ましい一実施形態では、その活性作用物質は、マトリックス・メタロプロテアーゼシグナル伝達経路の少なくとも１種類のメンバー、好ましくはＭＭＰ−９シグナル伝達経路に対して特異的な阻害能力を有する化合物である。この活性作用物質は、低分子量（ＭＷ）、特にＭＷ＜１０００を有する比較的小さな分子であることが好ましい。かかる活性作用物質は、イミダゾール誘導体であることがさらに好ましい。Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社（米国、カリフォルニア州サンディエゴ）からどちらも入手可能な、ＳＢ２０３５８０（ＭＷ３７７，４）もしくはＳＢ　２０２１９０（ＭＷ３３１，３）のようなかかるイミダゾール誘導体は、キナーゼ発現の強力な阻害剤であることが知られている。本発明の他の好ましい実施形態において、その活性作用物質は、ｐ３８タンパク質の阻害剤である。これは、ｐ３８タンパク質の公知の阻害剤またはさらに新規な阻害剤であることも可能である。本発明の他の好ましい実施形態では、その活性作用物質は、マイトジェン活性化キナーゼキナーゼファミリーの阻害剤である。この阻害剤は、この記述で使用されている標準分子生物学技術で作成されるキナーゼの非感受性変異体（ｄｅａｄ ｍｕｔａｎｔｓ）のような、マイトジェン活性化キナーゼキナーゼキナーゼファミリーのペプチド阻害剤、または新規な阻害剤化合物であることも可能である。数種類の阻害剤が知られており、Ｙ． フカミ（Ｆｕｋａｍｉ）等，Ｊ．Ｃ．リー（Ｌｅｅ）等，およびＤ．ファブロ（Ｆａｂｂｒｏ）等（２２〜２４）の出版物において、それらのいくつかを見つけ出すことができる。
【００１２】
本発明による他の好ましい実施形態において、その活性作用物質は、マトリックス・メタロプロテアーゼシグナル伝達経路の活性化物質、制御因子および／または生物学的前駆物質の阻害剤であり、キナーゼ阻害剤、転写因子阻害剤、例えばＡＰ−１阻害剤、組織阻害剤、プロテアーゼ阻害剤およびマトリックス・メタロプロテアーゼシグナル伝達経路の他の公知の阻害剤または新規な阻害剤であってもよい。
【００１３】
本発明による他の好ましい実施形態において、その活性作用物質は、マトリックス・メタロプロテアーゼの発現を阻害する、好ましくはｐ３８および／またはマイトジェン活性化キナーゼキナーゼ活性を阻害するペプチドまたはポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである。このペプチドは、例えばｐ３８キナーゼの欠損変異体、マイトジェン活性化キナーゼキナーゼの非感受性変異体および当業者に公知の他のペプチドであることが可能である。
【００１４】
本発明は、すべての種類の癌、特にマトリックス・メタロプロテアーゼの過剰発現を有する癌、したがってこの癌の高浸潤性および高転移性を有する癌の治療に用いることができる。ＭＭＰ−９の過剰発現は、頭、首、皮膚および胃の扁平上皮癌で報告され、胃の線維肉腫でもまた同様に報告された。増大したＭＭＰ−９レベルは、大腸癌、乳癌および肝細胞癌を有する患者の血清においても見出された。したがって、治療可能な疾患の中でも、上記の癌を特に参照する。一般に知られているように、転移性疾患（しかし、それ自体、浸潤癌の増殖である場合も多い）は、癌患者の生存を制限する。癌におけるシグナル伝達経路の構成的活性の理由は、現在まで未知である。それは、遺伝子増幅もしくはオートクリンループなどの成長因子受容体遺伝子の突然変異から、つまり同一組織におけるリガンドおよび受容体の発現から、生じる可能性がある。癌の浸潤はこれらの癌において厄介な問題であることから、上述の癌は、本発明による活性作用物質の有効な標的である。
【００１５】
本発明に従って、活性作用物質の投与形態を選択することが可能である。この形態は、患者の年齢、性別または他の特性、癌の重症度および他のパラメーターに適応させることができる。従来の薬剤担体、希釈剤または従来の添加剤が存在することができる。
【００１６】
投与量は、臨床状況および患者の状態の関数として自由に選択することができる。
【００１７】
最終的に、本発明は、真核細胞におけるマトリックス・メタロプロテアーゼの発現に影響を及ぼす、特に発現を阻害する少なくとも１種類の活性作用物質を含有する、癌を治療するための医薬組成物または薬剤を含む。かかる組成物または薬剤の個々の特徴に関して、それに対応する上記の説明文を参照する。
【００１８】
上述の特徴および本発明の更なる特徴は、サブクレームと共に好ましい実施形態の以下の説明から集めることができる。個々の特徴は、個々に、またはサブコンビネーションの形で実施することができる。
【００１９】
材料および方法
ベクター：他に記述されているように（３１〜３３）、セリン２０７およびトレオニン２１１をグルタミン酸によって置換することにより、ＭＫＫ−６の構成的に活性な変異体を産生し、セリン２０７およびトレオニン２１１をアラニンによって置換することにより、ドミナントネガティブなＭＫＫ−６表現型を産生し（３４）、およびｐ３８キナーゼの通常のＴＧＹ配列におけるフェニルアラニンによるアラニンおよびチロシンよってトレオニンを置換することによりキナーゼ欠損ｐ３８変異体を産生し、その結果得られたすべてのｃＤＮＡを、他に記述されているように（１１、３５、３６）、哺乳類の発現ベクターｐｃＤＮＡ３にサブクローニングした。ＭＭＰ−９プロモーターの５’欠失断片によって、または突然変異したプロモーター（−７９　ＡＧ−１　ｍｔ）によって操作される（ｄｒｉｖｅｎ）ＣＡＴレポーターが、他に記述されている（３７）。ＴＡＭ−６７構築物（ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ）は、３番目〜１２２番目のアミノ酸を欠いている突然変異体ｃ−ｊｕｎタンパク質をコードする（３８）。＊５ＡＰ−１　ｐＢＬＣＡＴ構築物は、最小チミジンキナーゼプロモーターのＣＡＴレポーターの前にあるＡＰ−１の５つの反復からなる（３９）。
【００２０】
組織培養および材料。ＵＭ−ＳＣＣ−１細胞（当業者には公知であり、ミシガン州ミシガン、アナーバーの大学、Ｄｒ．トーマス・ケアリー（Ｔｈｏｍａｓ Ｃａｒｅｙ））から入手可能）、Ｈｌａｃ８２（当業者には公知であり、ドイツ、チュービンゲンの大学、Ｄｒ．ハンス（Ｈａｎｓ）ピーター（Ｐｅｔｅｒ）ゼナー（Ｚｅｎｎｅｒ）から入手可能）およびＮＩＨ３Ｔ３細胞（ほぼすべての細胞生物学研究室によって保持されており、Ｄｒ．ハンス（Ｈａｎｓ）ピーター（Ｐｅｔｅｒ）ゼナー（Ｚｅｎｎｅｒ）からも入手可能である。上記参照）を、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ、Ｇｉｂｃｏ　Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、ドイツ、カールスルーエ）を補充したＭｃＣｏｙ５Ａ培地中に保持した。酵素電気泳動法およびウェスタンブロット法の条件培地を回収するために、指示される場合には、同時に添加されるＳＢ　２０３５８０（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社、カリフォルニア州サンディエゴ）または担体（ＤＭＳＯ）と共にまたは無しに、８０％融合ＵＭ−ＳＣＣ−１、Ｈｌａ８２およびＮＩＨ３Ｔ３細胞をそれぞれ、無血清培地（ＭｃＣｏｙ５Ａ培地、当業者には公知の成分であり、Ｇｉｂｃｏ　Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社（ドイツ、カールスルーエ）から入手可能）中で４８時間インキュベートした。以下では、「無血清培地」は「ＳＦＭ］とも省略される。０．２ｍｇ／ｍｌ　ＭＴＴ生体染色中で細胞をインキュベートし、ＤＭＳＯに溶解したホルマザン結晶のアリコートを分光測定によって５７０ｎｍにて読み取った後、その培地を回収し、増殖を決定した。細胞付着に１２時間見込み（０日目）、その後４日まで（１日目から４日目）血清および無血清条件下の後に、同時に添加した様々な量のＳＢ　２０３５８０を用いて、成長曲線を記述のように（２５）作成した。
【００２１】
酵素電気泳動法。０．１％（重量／容積）ゼラチンを含有するＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを用いて、酵素電気泳動法を記述と同様に正確に行い（２０、２５）、ＭＭＰ−９についてアッセイした。ＭＭＰ依存性タンパク質分解を、暗い領域中の白い区域として検出した。
【００２２】
ウェスタンブロット法。条件培地中のＭＭＰ−９を検出するために、等しい個数の細胞からの培地を還元剤の非存在下にて変性させ、タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、次いでニトロセルロースフィルターに移した。そのフィルターを３％ＢＳＡでブロックし、マトリックス・メタロプロテアーゼに対するマウスのモノクローナル抗体（＃ＩＭ３７Ｌ　Ｏｎｃｏｇｅｎｅ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社（マサチューセッツ州ケンブリッジ））と共にインキュベートした。続いて、そのブロットを、ホースラディッシュペルオキシダーゼ抱合型抗ウサギＩｇＧと共にインキュベートし、ＥＣＬ（化学発光増幅）、製造元（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅ社、イリノイ州アーリントンハイツ）によって記述されている市販の免疫ブロット検出システムによって、免疫反応性バンドを可視化した。ホスホ−ｐ３８およびデホスホ−ｐ３８を等しく認識するモノクローナル抗体（ｓｃ−５３５−Ｇおよびｓｃ−６０２３、カリフォルニア州サンタクルーズ、サンタクルーズ）を用いて、ｐ３８αおよびＳＡＰＫ３タンパク質を検出した。簡潔には、ＰＭＳＦ（１００ｍｇ／ｍｌ）およびオルトバナジン酸ナトリウム（１ｍＭ）を含有するＲＩＰＡバッファー中で細胞を抽出した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて、変性条件下で抽出したタンパク質を分離した。フィルターを３％ＢＳＡでブロックし、続いて、一次抗体とともに一晩インキュベートした。免疫反応性バンドを可視化するために、ＥＣＬシステムを再度使用した。
【００２３】
ｐ３８α活性についてのゲル中（Ｉｎ−ｇｅｌ）キナーゼアッセイおよびＳＡＰＫ３活性アッセイ。ｐ３８α活性のキナーゼアッセイを記述のように（２０）行った。簡潔には、バッファーＡ［１％ＮＰ４０（オクチルフェノキシポリエトキシエタノール）、２５ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、２５ｍＭ　ＮａＣｌ、１ｍＭバナジン酸ナトリウム、１０ｍＭ　ＮａＦ、１０ｎＭピロリン酸ナトリウム、１０ｎＭオカダ酸、０．５ｍＭ　ＥＧＴＡ、および１ｍＭフッ化フェニルメチルスルホニル］で細胞を抽出した。抽出したタンパク質を、ヒトおよびマウスｐ３８αと免疫反応性の抗ｐ３８α抗体（ｓｃ−５３５−Ｇ、カリフォルニア州サンタクルーズ、サンタクルーズ）２μｇと、免疫沈降のためのタンパク質Ａアガロースビーズ（２ｍｇ）と共にインキュベートした。そのビーズをバッファーＡで洗浄し、２×サンプルバッファー中に再懸濁し、ミエリン塩基性タンパク質を含有するポリアクリルアミドゲル中で、免疫複合体を電気泳動した。２０％２−プロパノール、５ｍＭ　２−メルカプトエタノール、６ＭグアニジンＨＣｌおよび０．０４％Ｔｗｅｅｎ４０−５ｍＭ２−メルカプトエタノールを含有するバッファーでゲルを処理した。次いで、そのゲルを、２ｍＭジチオスレイトール−０．１ｍＭ　ＥＧＴＡ−５ｍＭ　ＭｇＣｌ２を含有するバッファー中の１０μＭ　ＡＴＰおよび２５μＣｉの［３２Ｐ］ＡＴＰと共に２５℃で１時間インキュベートし、５％トリクロロ酢酸および１％ピロリン酸ナトリウムを含有する溶液中で洗浄し、乾燥させ、オートラジオグラフィーを行った。ＳＡＰＫ３活性のために、バッファーＡ中で細胞を抽出し、抽出したタンパク質を、ヒトおよびマウスＳＡＰＫ３と免疫反応性の抗ＳＡＰＫ３抗体（０６−６０３、Ｕｐｓｔａｔｅ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社、米国、ニューヨーク州レークプラシッド）２μｇと、タンパク質Ｇアガロースビーズと共にインキュベートした。バッファーＡおよびキナーゼバッファー（５０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ、０．１ｍＭ　ＥＤＴＡ、０．０００１％Ｂｒｉｊ３５、０．０００１％β−メルカプトエタノール、１５０ｍＭ　ＮａＣＬ、０１ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミン）中でビーズを洗浄し、反応バッファー（キナーゼバッファー、０．３ｍＭ　ＡＴＰ、０．４Ｍ　ＭｇＣｌ２）４０μｌ中で基質としての１μｇＡＴＦ２とのキナーゼ反応に３０℃で３０分間かけた。その反応を、２×還元サンプルバッファーを添加することによって終結させ、１００℃に５分間加熱した。遠心分離によって、ビーズを除去した。抗ホスホ−ＡＴＦ２抗体を用いて、上述のように上清を免疫ブロットにかけた。ＥＣＬシステムを用いて、免疫反応性ビーズを可視化した。
【００２４】
ｉｎ ｖｉｔｒｏ浸潤アッセイ。１／３希釈Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）／ＳＦＭ（Ｂｅｃｔｏｎ　Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社、マサチューセッツ州ベッドフォード）でコーティングされた、孔径８μｍを有するフィルターを用いて、記述のように（２０、２５）浸潤アッセイを行った。同様な濃度でＳＢ　２０３５８０もしくはＤＭＳＯ、ＳＢ　２０３５８０の担体を含有するＳＦＭ中で、細胞をプレーティングした。マウスモノクローナルＭＭＰ−９抗体（＃ＩＭ０９Ｌ、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、マサチューセッツ州ケンブリッジ）（０．５、１および１０μｇ／ｍｌ）を用いた実験で、ＳＦＭ＋ＳＦＭの抗体＋ほぼ同量の免疫前血清中で、細胞をいずれもプレーティングした。チャンバー中での全活性のパーセンテージとして、フィルター下側でＭＴＴ活性に基づいて、浸潤の量を決定した。
【００２５】
その後のＣＡＴ−ＥＬＩＳＡによる一過性トランスフェクション。製造元により記述されているように、一過性トランスフェクションのためのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎ（登録商標）（ＧＩＢＣＯ、Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、ドイツ、カールスルーエ）を用いて、一過性トランスフェクションを行った。記述のように（２６）ｐＣＤＮＡ３−ＭＫＫ−６もしくは−ＭＫＫ−３の構成的に活性な変異体（０．０３〜３μｇ）、またはプロモーター構築物に対して１倍もしくは２倍モル過剰量を有するドミナントネガティブなｐ３８α、β、ＳＡＰＫ３、ＳＡＰＫ４またはＭＫＫ６変異体（親切にも、Ｄｒ． Ｊ．ハン（Ｈａｎ）、Ｓｃｒｉｐｐｓ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ社、カリフォルニア州ラ・ホーヤによって提供された）と共に、転写開始部位もしくはプロモーターレスのＣＡＴ構築物（ＳＶ０）（３μｇ）を含む、ＭＭＰ９野生型プロモーター６７０ｂｐを含有するＣＡＴレポーター構築物を、ＵＭ−ＳＣＣ−１およびＮＩＨ３Ｔ３細胞にコンフルエンス（ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｅ）７０％で同時にトランスフェクトした。トランスフェクトされるＤＮＡ量を、偽の対照ベクターを用いて各サンプルにおいて等化した。ＣＡＴタンパク質発現を測定するＣＡＴ　ＥＬＩＳＡを、製造元（Ｒｏｃｈｅ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社、ドイツ、マンハイム）に従って行った。
【００２６】
実験１
１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ、Ｇｉｂｃｏ　Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、ドイツ、カールスルーエ）を補充したＭｃＣｏｙ５Ａ培地中で、ＵＭ−ＳＣＣ−１細胞をプレーティングし、翌日に、ＳＢ　２０３５８０（１０μＭ、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社、カリフォルニア州サンディエゴ）または担体（ジメチルスルホキシドＤＭＳＯ、０．０１％）を含有する無血清培地を補充した。４８時間後、条件培地を収集し、増殖速度を３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）でアッセイした。増殖の差に対して正規化された条件培地のアリコートを、モノクローナル抗ＭＭＰ−９抗体を用いて免疫ブロットにかけた。続いて、ホースラディッシュペルオキシダーゼ抱合型抗ウサギＩｇＧと共にインキュベートし、製造元（Ａｍｅｒｓｈａｍ社、イリノイ州アーリントンハイツ）によって記述されているようにＥＣＬによって、免疫反応性バンドを可視化した。タンパク質発現の７０％の減少が、濃度計による測定に従って示された。そのデータは、３通りの（ｔｒｉｐｌｉｃａｔｅ）実験に特有のものである。
【００２７】
実験１の結果を図１に示す。
【００２８】
図１Ａは、大量のＭＭＰ−９を構成的に産生し、かつｉｎ−ｖｉｔｒｏおよびｉｎ−ｖｉｖｏ浸潤表現型を表す扁平上皮癌細胞系ＵＭ−ＳＣＣ−１は、イミダゾール誘導体ＳＢ　２０３５８０での処理によって影響を受けることを示している。免疫ブロット分析によって証明されるように、ＳＢ　２０３５８０によって、濃度１０μＭで、ＭＭＰ−９タンパク質の発現が約７０％減少した。
【００２９】
図１Ｂでは、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）でプレコートされたフィルター上に、無血清培地中でＵＭ−ＳＣＣ−１細胞をプレーティングし、様々な量のＳＢ　２０３５８０と共に６０時間インキュベートして、ｉｎ−ｖｉｔｒｏ浸潤をアッセイした。担体（ＤＭＳＯ）の濃度を０．１％に維持した。浸潤は、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）に浸潤する細胞のパーセンテージとして表され、異なる濃度の抗体で処理した際の浸潤は、平均パーセンテージ＋／−Ｓ．Ｅ．で表され、各グループにおける３つのシャーレを表す。そのデータは、３通りの（ｔｒｉｐｌｉｃａｔｅ）実験に特有のものである。図１Ｂは、濃度５μＭおよび１０μＭをそれぞれ用いた場合、ｉｎ−ｖｉｔｒｏ浸潤が用量依存的に４３＋／−９％および６９＋／−８％減少することを示している。
【００３０】
図１Ｃは、ｐ３８阻害剤５μＭおよび１０μＭにＵＭ−ＳＣＣ−１細胞を５日間まで暴露した結果、ｉｎ−ｖｉｔｒｏ浸潤に対する阻害効果を担うべき化合物の抗分裂促進的効果を除いて、細胞成長は影響を受けないことを示している。ｐ３８アイソフォームは、ＳＢ　２０３５８０に対するそれらの感受性に関して異なる。報告されるＩＣ５０は、ｐ３８αで０．１μＭであるが、ｐ３８γでは５〜１０μＭである。ｐ３８γおよびｐ３８δは、イミダゾール誘導体によって阻害されない（２７）。したがって、ＭＭＰ−９発現およびＵＭ−ＳＣＣ−１細胞のｉｎ−ｖｉｔｒｏ浸潤を低減するのに必要なＳＢ　２０３５８０の濃度は、ｐ３８βのＩＣ５０と密接に合致する。この実験において、様々な量のＳＢ　２０３５８０と共に、１０％ＦＢＳを含有する培地中で細胞を５日間成長させた。生細胞数は、０．２ｍｇ／ｍｌ　ＭＴＴ−生体染色および指示された日にＤＭＳＯに溶解したホルマザン結晶を分光測定によって５７０ｎｍにて連続して読み取ることによって決定した。そのデータポイントは、３通りの実験に特有のものである。
【００３１】
このように、実験１およびそれに関連する図１から、ｐ３８ＳＡＰＫ阻害剤ＳＢ　２０３５８０が、細胞成長に全く影響を及ぼすことなく、ＭＭＰ−９の高レベルな発現およびＵＭ−ＳＣＣ−１細胞のｉｎ−ｖｉｔｒｏ浸潤を低減することが示されている。
【００３２】
実験２
この実験では、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）でプレコートしたフィルター上に、無血清培地中で異なる細胞系をプレーティングし、インキュベートした。浸潤は、平均パーセンテージ＋／−Ｓ．Ｅ．で示され、各グループにおいて３つのシャーレを表す。そのデータは、３通りの実験に特有のものである。ＭＭＰ−９がＵＭ−ＳＣＣ−１細胞のｉｎ−ｖｉｔｒｏ浸潤に必要かどうかの問題に取り組むために、３種類の異なる細胞系（ＵＭ−ＳＣＣ−１、ＮＩＨ３Ｔ３、Ｈｌａｃ８２）の最初の発現を、それらのｉｎ−ｖｉｔｒｏ浸潤の挙動と相関付けた。図２Ａは、細胞系の浸潤性に密接に対応する条件培地中のＭＭＰ−９の量を示す。ＵＭ−ＳＣＣ−１細胞が最大量のプロテアーゼを産生し、最大量の浸潤表現型を示す一方、検出可能なＭＭＰ−９を全く分泌しないＮＩＨ３Ｔ３細胞は、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）コートフィルター上での浸潤性が格段に低かった。興味深いことに、試験細胞系のＭＭＰ−２分泌と浸潤性との間には相関関係がなかった。これは、ＭＭＰ−２の活性化に、ＮＩＨ３Ｔ３細胞上で発現しない可能性のある、異なる膜タイプのマトリックス・メタロプロテアーゼ（ＭＴ−ＭＭＰ）（２１）の存在が必要なためである可能性がある。
【００３３】
図２Ｂに従って、異なる細胞系を無血清培地に変更し、４８時間培養した。条件培地を収集し、ＭＴＴを用いて細胞数を決定した。細胞数の違いに対して補正された条件培地のアリコートを、記述のように（２０、２５）、かつ当業者に公知のように、酵素電気泳動によってＭＭＰ−９活性についてアッセイした。そのデータは、３通りの実験に特有のものである。最も高い量のＭＭＰ−９を発現する細胞系のみが、酵素電気泳動で明瞭なバンドを示す。
【００３４】
最後に、ＵＭ−ＳＣＣ−１細胞のｉｎ−ｖｉｔｒｏ浸潤表現型に対するＭＭＰ−９活性の必要性を実証するために、図２Ｃにおいて、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）でプレコートしたフィルター上に、無血清培地中でＵＭ−ＳＣＣ−１細胞をプレーティングし、様々な量の抗ＭＭＰ−９抗体（０．５、１、１０μｇ／ｍｌ）または製造元により提供される等量の免疫前血清と共に６０時間インキュベートした。浸潤は、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）に浸潤する細胞のパーセンテージとして表される。ＭＭＰ−９または製造元から提供される免疫前血清の活性型および潜在型を認識する、異なる濃度の抗体で処理した際の浸潤は、平均パーセンテージ＋／−Ｓ．Ｅ．で示され、各グループにおいて３つのシャーレを表す。そのデータは、３通りの実験に特有のものである。図２Ｃは、増大濃度の抗体を用いたｉｎ−ｖｉｔｒｏ浸潤が用量依存的に減少することを示している。
【００３５】
このように、実験２およびそれに関連する図２から、細胞系のｉｎ−ｖｉｔｒｏ浸潤には、ＵＭ−ＳＣＣ−１細胞の条件培地中へのＭＭＰ−９分泌の必要性があることが示されている。したがって、ＳＢ　２０３５８０は、ｐ３８シグナル伝達経路を介してＭＭＰ−９の発現を低減することによって、ＵＭ−ＳＣＣ−１細胞のｉｎ−ｖｉｔｒｏ浸潤を阻害すると結論づけることができる。
【００３６】
実験３
ＭＭＰ−９発現は、プロモーターレベルでほとんど独占的に制御されるため、ＭＭＰ−９発現の制御における、異なるｐ３８アイソフォームの役割をさらに特徴づけるために、製造元によって記述されるようにＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎ（登録商標）（Ｇｉｂｃｏ　Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、ドイツ、カールスルーエ）および野生型ＭＭＰ−９プロモーターによって操作されるクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）レポーターまたはプロモーターレスのＣＡＴ構築物（ＳＶ０）およびドミナントネガティブなｐ３８α、ｐ３８β、ｐ３８γおよびｐ３８δもしくは空ベクター（ｐＣＤＮＡ３）を含む、指定量（２は、レポーター構築物に対して２倍モル過剰量のエフェクタープラスミドである）の発現ベクターを用いて、ＵＭ−ＳＣＣ−１細胞を一過的にトランスフェクトした。トランスフェクトしたＤＮＡ量の違いを空ベクターで正規化した。タンパク質量の違いに対して正規化された細胞抽出物を、製造元（Ｒｏｃｈｅ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社、ドイツ、マンハイム）に従ってＣＡＴ−ＥＬＩＳＡを用いて、ＣＡＴ発現に関してアッセイした。データは、対照の平均パーセント＋／−Ｓ．Ｅとして表され、各グループにおける２つのシャーレを表し、３通りの異なる実験で行われた。当業者に公知の標準分子生物学技術によって、哺乳類発現ベクターｐＣＤＮＡ３にクローニングされたｐ３８キナーゼおよび得られたすべてのｃＤＮＡの典型的なＴＧＹ配列において、トレオニンをアラニンによって、およびチロシンをフェニルアラニンによって置換することにより、キナーゼ欠損変異体を作成した。
【００３７】
図３Ａに従って、ＳＢ　２０３５８０感受性アイソフォーム変異体、ｐ３８βは、２倍モル過剰量でＣＡＴレポータにより操作されるＭＭＰ−９プロモーターの活性を６２＋／−２０％阻害することが見出され、それと全く対照的に、ｐ３８α変異体は、ＭＭＰ−９プロモーター活性を２１＋／−２０％低減するのみであった。ｐ３８δ変異体は、ＭＭＰ−９プロモーターを５５＋／−９％阻害した。ｐ３８γ変異体とのトランスフェクションは、ＭＭＰ−９プロモーターを実質上静まらせた。つまり、プロモーター活性が９９．９＋／−０．５％阻害された。プロモーターレスのＣＡＴ構築物のトランスフェクションでは、著しいＣＡＴ発現は示されなかった。
【００３８】
図３Ａによって、ｐ３８αはそうではないが、ｐ３８βおよびｐ３８δの他にｐ３８γ、ドミナントネガティブ発現構築物が、ＭＭＰ−９プロモーター活性を低下させることが示されている。この実験はさらに、ＭＭＰ−９プロモーターの構成的活性に、ｐ３８αではなくｐ３８βが関与していることを裏付けており、それらは、ＭＭＰ−９プロモーターの構成的活性におけるｐ３８δの役割および最も重要なことにはｐ３８γの役割を裏付けている。
【００３９】
図３Ｂ−Ｅにおいて、ＵＭ−ＳＣＣ−１およびＮＩＨ３Ｔ３細胞を、１０％ＦＢＳを含有する培地中に保持した。タンパク質抽出物（同等のタンパク質）およびゲル中キナーゼアッセイを上述のように作成し、ポリクローナル抗ｐ３８α−またはＳＡＰＫ３−抗体を用いた免疫ブロット（Ｂ）および（Ｄ）に、あるいは基質としてＭＢＰを用いたゲル中キナーゼアッセイ（Ｃ）に、あるいは基質として組換えＡＴＦ２を用いた免疫キナーゼ（ｉｍｍｕｎｏｋｉｎａｓｅ）反応（Ｅ）にかけた。そのデータは、３通りの実験に特有のものである。これらの実験によって、キナーゼ欠損変異体によるｐ３８αの阻害後に観察される、ＭＭＰ−９プロモーター活性の少なめな減少も、キナーゼの発現および／または活性の欠失（ｍｉｓｓｉｎｇ）が原因でありうるということが排除された。このために、ＵＭ−ＳＣＣ−１細胞およびＮＩＨ３Ｔ３細胞（ネガティブコントロール）を、ｐ３８αの活性および発現についてアッセイした。ｐ３８γの発現および活性もまた、ポリクローナルＳＡＰＫ３抗体での免疫沈降によって、続いて同様な実験でのキナーゼ反応によって分析した。
【００４０】
図３Ｂ〜Ｅから判断できるように、タンパク質、ｐ３８αおよびｐ３８γ両方の存在が、両方の細胞系（図３ＢおよびＣ）において示された。しかしながら、ｐ３８アイソフォーム両方の酵素活性は、ＮＩＨ３Ｔ３細胞で検出不可能であるのに対して、ＵＭ−ＳＣＣ−１細胞では高いことが見出された。したがって、ｐ３８αおよびｐ３８γは、ＵＭ−ＳＣＣ−１細胞中に存在し、かつ構成的に活性である。
【００４１】
実験４
ここでは、ＵＭ−ＳＣＣ−１およびＮＩＨ３Ｔ３細胞を無血清培地に変更し、４８時間培養した。条件培地を収集し、ＭＴＴを用いて細胞数を決定した。細胞数の違いに対して補正された条件培地のアリコートを、酵素電気泳動によってＭＭＰ−９活性についてアッセイした。そのデータは、３通りの実験に特有のものである。
【００４２】
図４Ａによって、ＮＩＨ３Ｔ３はそうではないが、ＵＭ−ＳＣＣ−１細胞は、マトリックス・メタロプロテアーゼ９（ＭＭＰ−９）を発現することが示されている。
【００４３】
ＭＫＫ６タンパク質キナーゼは、ｐ３８アイソフォームを広く活性化するため（ｐ３８αおよびＳＡＰＫ４／ｐ３８δアイソフォームのむしろ特異的活性化因子として働くＭＫＫ３と対照的に）（２６、３０）、ＭＭＰ−９の制御におけるＭＫＫ６の役割を決定するために、図４Ｂにおいて、野生型ＭＭＰ−９プロモーターによって操作されるＣＡＴレポーターまたはプロモーターレスのＣＡＴ構築物（ＳＶ０）およびキナーゼの非感受性ＭＫＫ６変異体をコードする指定量（２は、レポーター構築物に対して２倍モル過剰量のエフェクタープラスミドである）の発現ベクターを用いて、ＵＭ−ＳＣＣ−１細胞を一過的にトランスフェクトした。キナーゼの非感受性表現型は、上記の出版物（２６）に従ってセリン１５１およびトレオニン１５５をアラニンと置換することによって作成した。ＭＭＰ−９活性の９９＋／−０．５％の大幅な減少が観察された。これらのデータによって、ＭＫＫ６キナーゼ欠損変異体は、ＵＭ−ＳＣＣ−１細胞においてＭＭＰ−９プロモーター活性を阻害し、かつＭＫＫ６は、ｐ３８アイソフォームを介してシグナル伝達するらしい、ＭＭＰ−９の上流制御因子であることが実証されている。
【００４４】
ＭＭＰ−９プロモーターの制御におけるＭＫＫ６の役割をさらに特徴づけるために、ＭＫＫ６キナーゼの構成的活性化の効果を調べた。図４Ｃにおいて、野生型ＭＭＰ−９プロモーターによって操作されるＣＡＴレポーターまたはプロモーターレスのＣＡＴ構築物（ＳＶ０）およびキナーゼの非感受性ＭＫＫ６変異体をコードする指定量（２は、レポーター構築物に対して２倍モル過剰量のエフェクタープラスミドである）の発現ベクターまたは空ベクターを用いて、ＮＩＨ３Ｔ３細胞を一過的にトランスフェクトした。トランスフェクトしたＤＮＡ量の違いを、空ベクターで正規化した。タンパク質量の違いに対して正規化された細胞抽出物を、ＣＡＴ−ＥＬＩＳＡを用いて、ＣＡＴ発現に関してアッセイした。データは、対照の平均パーセント＋／−Ｓ．Ｅとして表され、各グループにおける２つのシャーレを表し、３通りの異なる実験で行われた。ＭＫＫ６の構成的活性化は、Ｊ．ハーン（Ｈａｈｎ）の出版物（２６）に従って、セリン１５１およびトレオニン１５５をグルタミン酸で置換することによって達成された。内在性刺激物質によって、プロモーターの活性化が妨げられるのを避けるために、内在性ＭＭＰ−９を発現しないＮＩＨ３Ｔ３細胞（図４Ａ）を用いた。１倍モル過剰量でＣＡＴレポーターおよびＭＫＫ６変異体を同時にトランスフェクトした後、ＭＭＰ−９プロモーターの５倍活性化が示された。同様に作成されたＭＫＫ３変異体を用いて、同じ実験を繰り返し行った。同様のモル過剰量で、観察されたプロモーターの誘導は、わずか２．８倍であった。
【００４５】
図４Ｃから、ＭＫＫ６によって、すべてのｐ３８アイソフォーム（ｐ３８γを含む）がむしろ非特異的に活性化され、ＭＫＫ３はさらに厳密に、ｐ３８αおよびｐ３８δを標的化することが実証されている。これらの結果は、ＭＭＰ−９の制御におけるｐ３８γの役割を裏付けるものである。
【００４６】
実験５
この実験では、野生型ＭＭＰ−９プロモーターの５’フランキング領域によって操作されるＣＡＴレポーター（３μｇ）および構成的活性化ＭＫＫ−６タンパク質（ＭＫＫ６（Ｇｌｕ））をコードする発現ベクター（０．４μｇ）を、６７０ｂｐ−ＣＡＴレポーターに対するエフェクタープラスミドのモル比０．１〜１で、ＮＩＨ３Ｔ３細胞に一過的にトランスフェクトした。ＤＮＡ量の違いを、空ベクターで正規化した。タンパク質量の違いに対して正規化された細胞抽出物を、ＣＡＴ−ＥＬＩＳＡを用いて、ＣＡＴ発現に関してアッセイした。対照（ＭＭＰ−９　６７０ｂｐ−ＣＡＴ構築物）に対する誘導の平均倍数（ａｖｅｒａｇｅ ｆｏｌｄ）±ＳＥを示し、データは３通りの異なる実験を表す。
【００４７】
特異的ｐ３８シグナル伝達経路の活性化因子ＭＫＫ−６による刺激に必要とされるプロモーター領域を決定するために、９２ｋＤａコラゲナーゼ野生型プロモーターの５’欠失断片によって操作されるＣＡＴレポーターを、ＮＩＨ３Ｔ３細胞に同時にトランスフェクトした。ＭＭＰ−９プロモーターの１４４ｂｐ断片を含む、試験されたすべての構築物が、ＭＫＫ−６によって同様に活性化された（ＭＭＰ−９の量に対するＭＫＫ−６構築物のモル比０．１で３．５倍）。それと対照的に、９０ｂｐまたは７３ｂｐの５’フランキング配列によって操作されるＣＡＴレポーター構築物を使用した場合、たとえ刺激が達成されたとしてもわずかであり、−１４４と転写開始部位と間の領域における特定の転写因子結合部位が、ＭＫＫ−６依存性ＭＭＰ−９プロモーター活性化に必要とされることが示唆されている（図５Ａ）。配列のこの部分の研究によって、−７９にＡＰ−１（活性化転写因子１）結合部位が存在することが示された（３７）。ＡＰ−１は、Ｆｏｓ（ｃ−Ｆｏｓ、ＦｏｓＢ、Ｆｒａ１、Ｆｒａ２）およびＪｕｎ（ｃ−Ｊｕｎ、ＪｕｎＤ、ＪｕｎＢ）ファミリーメンバーで構成されるタンパク質二量体である。結果として生じた複合体は、ＡＰ−１部位またはテトラデカノイルホルボール（ＴＰＡ）応答エレメント（ＴＲＥ）として公知の特異的ＤＮＡ配列に結合する。この用語は、タンパク質発現およびリン酸化の増大のために、ＴＰＡが強力に、ＡＰ−１のＤＮＡ結合を刺激するという事実を意味する（４０）。ＭＭＰ−９プロモーターは、かかるＴＲＥエレメントを含有する。１つのＡＰ−１部位は−７９で見出され、もう１つは、主要な転写開始部位から離れた−５４０で見出された（３７、４１）。次いで、ＭＫＫ−６によるＭＭＰ−９プロモーターの活性化におけるＴＲＥ−エレメントの役割を決定した。点突然変異をＡＰ−１部位（−７９）を導入することによって（ＴＴＴＧＴＣＡ中にＴＧＡＧＴＣＡ）（３７）、ＭＫＫ−６による完全長の野生型ＭＭＰ−９プロモーターの誘導能が完全に抑止された。ＭＭＰ−９プロモーターの近位１４４ｂｐの５’フランキング領域内に含まれる、ＭＫＫ−６依存性トランス活性化に対する、ＭＭＰ−９プロモーターのこの領域の必要性が、これによって示されている（図５Ｂ）。
【００４８】
実験６
この実験では、構造的に活性化されたＭＫＫ−６変異タンパク質（ＭＫＫ６（Ｇｌｕ））をコードする構築物（１μｇ）、最小チミジンキナーゼプロモーターからなるプロモーターによって操作されるＣＡＴレセプター、および５つのＡＰ−１モチーフの反復（１μｇ）（５＊ＡＰ−１）、およびキナーゼ欠損ｐ３８タンパク質アイソフォーム変異体（ｐ３８α、ｐ３８β、ｐ３８γ、ｐ３８δ）をコードするベクター（２μｇ）を、ＮＩＨ３Ｔ３細胞に一過的にトランスフェクとした。５＊ＡＰ−１構築物における最小チミジンキナーゼプロモーターの効果を対照するために、ＡＰ−１の反復を欠くプラスミドを同様の量で使用した（１μｇ、ｐＢＬＣＡＴ）。トランスフェクトしたＤＮＡ量の違いを、空ベクター（ｐｃＤＮＡ３）で正規化した。ＣＡＴ−ＥＬＩＳＡを用いて、タンパク質量の違いに対して正規化された細胞抽出物をＣＡＴ発現についてアッセイした。データは、対照（５＊ＡＰ−１　ＣＡＴレポーター）に対するＣＡＴ発現の誘導の倍加として表される。そのデータは、２通りの異なる実験を表す（図６Ａ）。図６Ｂにおいて、構成的に活性化されたＭＫＫ−６変異タンパク質をコードする構築物（ＭＫＫ６（Ｇｌｕ））（４μｇ）、６７０ｂｐ野生型ＭＭＰ−９プロモーターによって操作されるＣＡＴレポーター（３μｇ）、およびトランス活性化ドメインを欠くｃ−ｊｕｎタンパク質をコードするベクター（ＴＡＭ６７）（２μｇ）を、ＮＩＨ３Ｔ３細胞に一過的にトランスフェクトした。トランスフェクトしたＤＮＡ量の違いを、空ベクター（それぞれ、ｐｃＤＮＡ３、ＣＭＶ５）で正規化した。ＣＡＴ−ＥＬＩＳＡを用いて、タンパク質量の違いに対して正規化された細胞抽出物を、ＣＡＴ発現についてアッセイした。データは、対照（ＭＭＰ−９野生型プロモーターのＣＡＴ構築物）に対する、ＣＡＴ発現の誘導の倍加として表される。その実験は、２通りの異なる実験を表す。
【００４９】
ＭＫＫ６依存性誘導に対する、ＭＭＰ−９野生型プロモーターの近位領域におけるＡＰ−１部位の存在および完全性の必要性によって、ＭＫＫ−６がＡＰ−１依存性転写の活性因子であることが示唆された。したがって、最小チミジンキナーゼプロモーターの前方の５回反復されるＡＰ−１コンセンサス部位によって操作されるＣＡＴレポーターと共に、構成的に活性なＭＫＫ−６構築物を、ＮＩＨ３Ｔ３細胞に同時にトランスフェクトした。ＭＫＫ−６は、５＊ＡＰ−１のＣＡＴレポーター構築物を強く活性化することが見出された。プロモーターからＡＰ−１の反復を除去することによって、またはｐ３８アイソフォームドミナントネガティブ変異体のいずれかの同時トランスフェクションによって、この活性化を抑止した。その結果ＭＫＫ−６は実際に、ｐ３８キナーゼ活性を必要とする経路を介して、ＡＰ−１依存性転写を活性化することができる（図６Ａ）。
【００５０】
その転写活性化ドメインを欠くｃ−ｊｕｎ（ＴＡＭ６７）の発現は、ＭＫＫ−６依存性ＭＭＰ−９プロモーターの活性化を抑止する。ＭＫＫ−６依存性ＭＭＰ−９プロモーターの転写活性化には、近位のＴＲＥエレメント（−７９）および数種類のｐ３８キナーゼアイソフォームによるＡＰ−１依存性転写を活性化するＭＫＫ−６の能力が必要とされることが示された。したがって、ＭＫＫ−６が、転写因子ＡＰ−１の活性化によってＭＭＰ−９野生型プロモーターの活性を誘導することは明らかである。これを実証するために、そのトランス活性化ドメインを欠いており、このためドミナントネガティブＡＰ−１変異体として働くｃ−ｊｕｎタンパク質（４２）を、活性化されたＭＫＫ−６変異体と共に、ＮＩＨ３Ｔ３細胞に同時にトランスフェクトした。一過的に発現したタンパク質は、ｆｏｓたんぱく質に結合し、かつＭＭＰ−９プロモーターにおいてＴＲＥエレメントに結合するためにインタクトなＡＰ−１と競合する、トランス活性化が欠乏したＡＰ−１複合体を産生する。この変異体タンパク質の発現によって、既知の対照（空ベクター）とは対照的に、完全長ＭＭＰ−９プロモーターＣＡＴレポーターの量に対してモル比０．５〜１で、ＭＫＫ−６依存性ＭＭＰ−９プロモーター活性化がほぼ完全に阻害され、ＭＫＫ−６依存性ＭＭＰ−９プロモーターのトランス活性化に対する、ＡＰ−１複合体の推定的な必要性が示されている（図６Ｂ）。
【００５１】
実験５および６の結果から、ＭＫＫ−６は、ＭＭＰ−９プロモーターの誘導に必要とされるＡＰ−１依存性転写活性を誘導することが可能であり、ＭＫＫ−６により仲介される活性化に、ＭＭＰ−９プロモーターにおいて近位のＡＰ−１部位が必要であることが示されている。
【００５２】
実験すべての結果から、本発明に従って、癌、好ましくは癌転移の浸潤性が、ＭＭＰ−９シグナル伝達経路の下流制御因子に影響を及ぼす、特にその制御因子を阻害する活性作用物質の投与によって、正に影響を受けるであろうことが明確に実証されている。
【００５３】
文献
１． サイモン（Ｓｉｍｏｎ）， Ｃ．， Ｍ．Ｊ． ヒックス（Ｈｉｃｋｓ）， Ａ．Ｊ． ネメチェック（Ｎｅｍｅｃｈｅｋ）， Ｒ． メーサ（Ｍｅｅｔｈａ）， Ｂ．Ｗ．オーマレイ（ Ｏ’Ｍａｌｌｅｙ）， Ｈ． ゲッパート（Ｇｏｅｐｆｅｒｔ）， Ｃ．Ｍ． フライツ（Ｆｌａｉｔｚ）， ａｎｄ Ｄ．ボイド（Ｂｏｙｄ）． １９９９． ＰＤ ０９８０５９， ａｎ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｏｆ ＥＲＫ１ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ， ａｔｔｅｎｕａｔｅｓ ｔｈｅ ｉｎ ｖｉｖｏ ｉｎｖａｓｉｖｅｎｅｓｓ ｏｆ ｈｅａｄ ａｎｄ ｎｅｃｋ ｓｑｕａｍｏｕｓ ｃｅｌｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ（「ＰＤ ０９８０５９、ＥＲＫ１活性化の阻害剤が、頭および首の扁平上皮癌のｉｎ ｖｉｖｏ浸潤性を減弱する」）．Ｂｒ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ ８０： １４１２−１４１９
２． イケベ（Ｉｋｅｂｅ）， Ｔ．， Ｍ． シノハラ（Ｓｈｉｎｏｈａｒａ）， Ｈ．タケウチ（ Ｔａｋｅｕｃｈｉ）， Ｍ． ベップ（Ｂｅｐｐｕ）， Ｓ． クラハラ（Ｋｕｒａｈａｒａ）， Ｓ． ナカムラ（Ｎａｋａｍｕｒａ）， ａｎｄ Ｋ． シラスナ（Ｓｈｉｒａｓｕｎａ）． １９９９． Ｇｅｌａｔｉｎｏｌｙｔｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｍａｔｒｉｘ ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ ｉｎ ｔｕｍｏｒ ｔｉｓｓｕｅｓ ｃｏｒｒｅｌａｔｅｓ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｉｎｖａｓｉｖｅｎｅｓｓ ｏｆ ｏｒａｌ ｃａｎｃｅｒ（「腫瘍組織におけるマトリックス・メタロプロテイナーゼのゼラチン分解が口腔癌の浸潤性と相関する」）．Ｃｌｉｎ Ｅｘｐ Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ １７：（４） ３１５−３２３
３． デンハート（Ｄｅｎｈａｒｄｔ）， Ｄ．Ｔ． １９９６． Ｓｉｇｎａｌ−ｔｒａｎｓｄｕｃｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ ｃａｓｃａｄｅｓ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｂｙ Ｒａｓ／Ｒｈｏ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ ｔｈｅ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌ（「哺乳類細胞におけるＲａｓ／Ｒｈｏタンパク質によって仲介される、シグナル伝達タンパク質リン酸化カスケード」）： ｔｈｅ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｆｏｒ ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ（「多重シグナル伝達の可能性」）． Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ ３１８： ７２９−７４７
４． ハンター（Ｈｕｎｔｅｒ）， Ｔ． １９９７． Ｏｎｃｏｐｒｏｔｅｉｎ ｎｅｔｗｏｒｋｓ（「腫瘍性タンパク質ネットワーク」）． Ｃｅｌｌ ８８：（３） ３３３−３４６
５． レンギエル（Ｌｅｎｇｙｅｌ）， Ｅ．， Ｒ．ガム（Ｇｕｍ）， Ｅ．ステップ（Ｓｔｅｐｐ）， Ｊ． フアレス（Ｊｕａｒｅｚ）， Ｈ．ワン（Ｗａｎｇ）， ａｎｄ Ｄ． ボイド（Ｂｏｙｄ）． １９９６． Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｕｒｏｋｉｎａｓｅ−ｔｙｐｅ ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｂｙ ａｎ ＥＲＫ１−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｐａｔｈｗａｙ ｉｎ ａ ｓｑｕａｍｏｕｓ ｃｅｌｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ（「扁平上皮癌細胞系におけるＥＲＫ１依存性シグナル伝達経路による、ウロキナーゼ型プラスミノゲンアクチベーター発現の制御」）． Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ． ６１：（３） ４３０−４４３
６． オカ（Ｏｋａ）， Ｈ．， Ｙ．チャタニ（Ｃｈａｔａｎｉ）， Ｒ．ホシノ（Ｈｏｓｈｉｎｏ）， Ｏ． オガワ（Ｏｇａｗａ）， Ｙ．カケヒ（Ｋａｋｅｈｉ）， Ｔ． テラチ（Ｔｅｒａｃｈｉ）， Ｙ．オカダ（Ｏｋａｄａ）， Ｍ．カワイチ（Ｋａｗａｉｃｈｉ）， Ｍ．コウノ（Ｋｏｈｎｏ）， ａｎｄ Ｏ． ヨシダ（Ｙｏｓｈｉｄａ）．１９９５． Ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｉｔｏｇｅｎ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ （ＭＡＰ） ｋｉｎａｓｅｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｒｅｎａｌ ｃｅｌｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ（「ヒト腎細胞癌におけるマイトジェン活性化タンパク質（ＭＡＰ）キナーゼの構成的活性化」）． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ５５：（１８） ４１８２−４１８７
７． キム（Ｋｉｍ）， Ｓ．Ｃ．， Ｊ．Ｓ．ハーン（Ｈａｈｎ）， Ｙ．Ｈ．ミン（Ｍｉｎ）， Ｎ．Ｃ．ヨー（Ｙｏｏ）， Ｙ．Ｗ．コー（Ｋｏ）， ａｎｄ Ｗ．Ｊ．リー（Ｌｅｅ）． １９９９． Ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｓｉｇｎａｌ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｋｉｎａｓｅ ｉｎ ｈｕｍａｎ ａｃｕｔｅ ｌｅｕｋｅｍｉａｓ（「ヒトの急性白血病における細胞外シグナル制御されたキナーゼの構成的活性化」）： ｃｏｍｂｉｎｅｄ ｒｏｌｅ ｏｆ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ＭＥＫ， ｈｙｐｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｓｉｇｎａｌ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｋｉｎａｓｅ， ａｎｄ ｄｏｗｎｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ， ＰＡＣ１（「ＭＥＫの活性化、細胞外シグナル制御されたキナーゼの過剰発現、およびホスファターゼ、ＰＡＣ１の下流制御の組み合わせられた役割」）． Ｂｌｏｏｄ ９３：（１１） ３８９３−３８９９
８． ガリントン（Ｇａｒｒｉｎｇｔｏｎ）， Ｔ．Ｐ． ａｎｄ Ｇ．Ｌ． ジョンソン（Ｊｏｈｎｓｏｎ）． １９９９． Ｏｒｇａｎｉｓａｔｉｏｎ ａｎｄ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｉｔｏｇｅｎ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｐａｔｈｗａｙｓ（「マイトジェン活性化タンパク質キナーゼシグナル伝達経路」）． Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １１：（２） ２１１−２１８
９． リー（Ｌｅｅ）， Ｊ．Ｃ．， Ｊ．Ｔ．レイドン（Ｌａｙｄｏｎ）， Ｐ．Ｃ．マクドーネル（ＭｃＤｏｎｎｅｌｌ）， Ｔ．Ｆ．ギャラガー（Ｇａｌｌａｇｈｅｒ）， Ｓ．クマー（Ｋｕｍａｒ）， Ｄ．グリーン（Ｇｒｅｅｎ）， Ｄ．マクナルティー（ＭｃＮｕｌｔｙ）， Ｍ．Ｊ．ブルメンタル（Ｂｌｕｍｅｎｔｈａｌ）， Ｊ．Ｒ．ヘイズ（Ｈｅｙｓ）， Ｓ．Ｗ．ランドバター（Ｌａｎｄｖａｔｔｅｒ）， Ｊ．Ｅ．ストリックラー（Ｓｔｒｉｃｋｌｅｒ）， Ｍ．Ｍ． マクローリン（ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎ）， Ｉ．Ｒ． シーメンス（Ｓｉｅｍｅｎｓ）， Ｓ．Ｍ．フィッシャー（Ｆｉｓｈｅｒ）， Ｇ．Ｐ．リヴィ（Ｌｉｖｉ）， Ｊ．Ｒ．ホワイト（Ｗｈｉｔｅ）， Ｊ．Ｌ．アダムス（Ａｄａｍｓ）， ａｎｄ Ｐ．Ｒ．ヤング（Ｙｏｕｎｇ）． １９９４． Ａ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｃｙｔｏｋｉｎｅ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（「炎症性サイトカイン生合成の制御に関与するタンパク質キナーゼ」）． Ｎａｔｕｒｅ ３７２： ７３９−７４６
１０． ジアング（Ｊｉａｎｇ）， Ｙ．， Ｃ．チェン（Ｃｈｅｎ）， Ｚ． Ｌｉ， Ｗ．グオ（Ｇｕｏ）， Ｊ．Ａ．ゲグナー（Ｇｅｇｎｅｒ）， Ｓ．リン（Ｌｉｎ）， ａｎｄ Ｊ．ハン（Ｈａｎ）． １９９６． Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｎｅｗ ｍｉｔｏｇｅｎ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ （ｐ３８β）（「新規なマイトジェン活性化タンパク質キナーゼ（ｐ３８β）の構造および機能のキャラクタリゼーション」）． Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７１：（３０） １７９２０−１７９２６
１１． リ（Ｌｉ）， Ｚ．， Ｙ．ジアング（Ｊｉａｎｇ）， Ｒ．Ｊ． ウレヴィッチ（Ｕｌｅｖｉｔｃｈ）， ａｎｄ Ｊ．ハン（Ｈａｎ）． １９９６． Ｔｈｅ ｐｒｉｍａｒｙ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｐ３８γ： Ａ ｎｅｗ ｍｅｍｂｅｒ ｏｆ ｐ３８ ｇｒｏｕｐ ｏｆ ＭＡＰ ｋｉｎａｓｅｓ（「ＭＡＰキナーゼのｐ３８グループの新規なメンバー」）． Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ ２２８：（２） ３３４−３４０
１２． ワン（Ｗａｎｇ）， Ｘ．Ｓ．， Ｋ．ジエナー（Ｄｉｅｎｅｒ）， Ｃ．Ｌ．マンゼイ（Ｍａｎｔｈｅｙ）， Ｓ． ワン（Ｗａｎｇ）， Ｂ． ローゼンズウェイグ（Ｒｏｓｅｎｚｗｅｉｇ）， Ｊ．ブレイ（Ｂｒａｙ）， Ｊ． デラニー（Ｄｅｌａｎｅｙ）， Ｃ．Ｎ．コール（Ｃｏｌｅ）， Ｐ．チャン−ヒュイ（Ｃｈａｎ−Ｈｕｉ）， Ｎ．マントロ（Ｍａｎｔｌｏ）， Ｈ．Ｓ． リケンステイン（Ｌｉｃｈｅｎｓｔｅｉｎ）， Ｍ．ズコウスキー（Ｚｕｋｏｗｓｋｉ）， ａｎｄ Ｚ．ヤオ（Ｙａｏ）． １９９７． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｎｏｖｅｌ ｐ３８ ｍｉｔｏｇｅｎ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ（「新規なｐ３８マイトジェン活性化プロテインキナーゼ」）． Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７２：（３８） ２３６６８−２３６７４
１３． レクナー（Ｌｅｃｈｎｅｒ）， Ｃ．， Ｍ．Ａ．ザハルカ（Ｚａｈａｌｋａ）， Ｊ．Ｆ．ギオット（Ｇｉｏｔ）， Ｎ．Ｐ．モラー（Ｍｏｌｌｅｒ）， ａｎｄ Ａ．ウルリッチ（Ｕｌｌｒｉｃｈ）． １９９６． ＥＲＫ６， ａ ｍｉｔｏｇｅｎ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ Ｃ２Ｃ１２ ｍｙｏｂｌａｓｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ（「Ｃ２Ｃ１２筋芽細胞の分化に関与するＥＲＫ６、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ」）． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９３：（９） ４３５５−４３５９
１４． コンラッド（Ｃｏｎｒａｄ）， Ｐ．Ｗ．， Ｒ．Ｔ．ラスト（Ｒｕｓｔ）， Ｊ．ハン（ｈａｎ）， Ｅ．Ｅ．ミルホーン（Ｍｉｌｌｈｏｒｎ）， ａｎｄ Ｄ．ベイトナー−ジョンソン（Ｂｅｉｔｎｅｒ−Ｊｏｈｎｓｏｎ）． １９９９． Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｐ３８ａ ａｎｄ ｐ３８ｇ ｂｙ ｈｙｐｏｘｉａ（「低酸素症によるｐ３８αおよびｐ３８γの選択的活性化」）． Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７４：（３３） ２３５７０−２３５７６
１５． マーテンス（Ｍｅｒｔｅｎｓ）， Ｓ．， Ｍ． クラクストン（Ｃｒａｘｔｏｎ）， ａｎｄ Ｍ．ゴーデルト（Ｇｏｅｄｅｒｔ）． １９９６． ＳＡＰ ｋｉｎａｓｅ−３， ａ ｎｅｗ ｍｅｍｂｅｒ ｏｆ ｔｈｅ ｆａｍｉｌｙ ｏｆ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｓｔｒｅｓｓ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅｓ（「哺乳類ストレス活性化プロテインキナーゼのファミリの新規なメンバー、ＳＡＰ ｋｉｎａｓｅ−３」）． ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ ３８３：（３） ２７３−２７６
１６． ファング（Ｆａｎｇ）， Ｆ．Ｍ．， Ｓ．Ｗ．レウング（Ｌｅｕｎｇ）， Ｃ．Ｃ．フアング（Ｈｕａｎｇ）， Ｙ．Ｔ． リュー（Ｌｉｕ）， Ｃ．Ｊ．ワン（Ｗａｎｇ）， Ｈ．Ｃ．チェン（Ｃｈｅｎ）， Ｌ．Ｍ．サン（Ｓｕｎ）， ａｎｄ Ｄ．Ｔ．フアング（Ｈｕａｎｇ）． １９９７． Ｃｏｍｂｉｎｅｄ−ｍｏｄａｌｉｔｙ ｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ ｓｑｕａｍｏｕｓ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｏｆ ｔｈｅ ｂｕｃｃａｌ ｍｕｃｏｓａ： ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｒｅｓｕｌｔｓ ａｎｄ ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ ｆａｃｔｏｒｓ（「頬側粘膜の扁平上皮癌に対する併用理学療法：治療結果および予後因子」）． Ｈｅａｄ Ｎｅｃｋ １９（６） ５０６−５１２
１７． カグラー（Ｋｕｇｌｅｒ）， Ａ． １９９９． Ｍａｔｒｉｘ ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ（「マトリックスメタロプロテイナーゼおよびそれらの阻害剤」）． Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １９：（２Ｃ） １５８９−１５９２
１８． マレイー（Ｍｕｒｒａｙ）， Ｇ．Ｉ．， Ｍ．Ｅ．ダンカン（Ｄｕｎｃａｎ）， Ｅ．アーバックル（Ａｒｂｕｃｋｌｅ）， Ｗ．Ｔ．メルヴィン（Ｍｅｌｖｉｎ）， ａｎｄ Ｊ．Ｅ． フォザーギル（Ｆｏｔｈｅｒｇｉｌｌ）． １９９８． Ｍａｔｒｉｘ ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｉｎ ｇａｓｔｒｉｃ ｃａｎｃｅｒ（「胃癌におけるマトリックスメタロプロテイナーゼおよびそれらの阻害剤」）． Ｇｕｔ ４３：（６） ７９１−７９７
１９． デンハート（Ｄｅｎｈａｒｄｔ）， Ｄ．Ｔ．， Ｂ．フェン（Ｆｅｎｇ）， Ｄ．Ｒ．エドワード（Ｅｄｗａｒｄｓ）， Ｅ．Ｔ． コクジィー（Ｃｏｃｕｚｚｉ）， ａｎｄ Ｕ．Ｍ．マルヤンカー（Ｍａｌｙａｎｋａｒ）． １９９３． Ｔｉｓｓｕｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｏｆ ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ （ＴＩＭＰ， ａｋａ ＥＰＡ）：； ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ， ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ（「メタロプロテイナーゼの組織阻害剤（ＴＩＭＰ、別名ＥＰＡ）：；構造、発現の制御および生物学的機能」）． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｔｈｅｒ ５９：（３） ３２９−３４１
２０． サイモン（Ｓｉｍｏｎ）， Ｃ．， Ｈ．ゴープフェルト（Ｇｏｅｐｆｅｒｔ）， ａｎｄ Ｄ．ボイド（Ｂｏｙｄ）． １９９８． Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｐ３８ ｍｉｔｏｇｅｎ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ ｂｙ ＳＢ ２０３５８０ ｂｌｏｃｋｓ ＰＭＡ−ｉｎｄｕｃｅｄ Ｍｒ ９２，０００ ｔｙｐｅ ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｉｎｖａｓｉｏｎ（「ＳＢ ２０３５８０ブロックＰＭＡ誘導Ｍｒ９２，０００型コラゲナーゼによるｐ３８マイトジェン活性化プロテインキナーゼの阻害剤およびｉｎ ｖｉｔｒｏ浸潤」） Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ５８： １１３５−１１３９
２１． プライス（Ｐｒｉｃｅ）， Ｊ．Ｔ．， Ｍ．Ｔ． ボノヴィッチ（Ｂｏｎｏｖｉｃｈ）， ａｎｄ Ｅ．Ｃ． コーン（Ｋｏｈｎ）． １９９７． Ｔｈｅ ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ ｃａｎｃｅｒ ｄｉｓｓｅｍｉｎａｔｉｏｎ（「癌転移の生物化学」）． Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ３２：（３） １７５−２５３
２２． フカミ（Ｆｕｋａｍｉ）， Ｙ．， Ａ．Ａ．トクマコヴ（Ｔｏｋｍａｋｏｖ）， Ｋ．コナカ（Ｋｏｎａｋａ）， ａｎｄ Ｋ．サトウ（Ｓａｔｏ）． １９９９． Ｐｅｐｔｉｄｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｏｆ ｔｈｅ ｍｉｔｏｇｅｎ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ ｐａｔｈｗａｙ： ａ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ −ｍｉｍｅｔｉｃ ｐｅｐｔｉｄｅ ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ ｔｏ ｔｈｅ ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ ｉｎｔｅｒ−ＤＦＧ−ＡＰＥ ｒｅｇｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｋｉｎａｓｅ ｄｏｍａｉｎ（「マイトジェン活性化プロテインキナーゼ経路のペプチド阻害剤：キナーゼドメインにおける保存ＤＦＧ−ＡＰＥ間領域に対応する構造−擬似ペプチド」）． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｔｈｅｒ ８２：（２−３） ３９９−４０７
２３． リー（Ｌｅｅ）， Ｊ．Ｃ．， Ｓ． カシス（Ｋａｓｓｉｓ）， Ｓ．クマー（Ｋｕｍａｒ）， Ａ． バドガー（Ｂａｄｇｅｒ）， ａｎｄ Ｊ．Ｌ．アダムス（Ａｄａｍｓ）． （１９９９）． ｐ３８ ｍｉｔｏｇｅｎ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ−ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ａｎｄ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｐｏｔｅｎｔｉａｌｓ（「ｐ３８マイトジェン活性化プロテインキナーゼ阻害剤−メカニズムおよび治療可能性」）． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｔｈｅｒ ８２：（２−３） ３８９−３９７
２４． ファブロ（Ｆａｂｂｒｏ）， Ｄ．， Ｅ． ブフダンガー（Ｂｕｃｈｄｕｎｇｅｒ）， Ｊ．ウッド（Ｗｏｏｄ）， Ｊ．メスタン（Ｍｅｓｔａｎ）， Ｆ．ホフマン（Ｈｏｆｍａｎ）， Ｓ．フェラーリ（Ｆｅｒｒａｒｉ）， Ｈ．メット（Ｍｅｔｔ）， Ｔ．オーレイリー（Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙ）， ａｎｄ Ｔ．メイヤー（Ｍｅｙｅｒ）． （１９９９）． Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅｓ： ＣＧＰ ４１２５１， ａ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｗｉｔｈ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ａｓ ａｎ ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ ａｇｅｎｔ（「プロテインキナーゼの阻害剤：ＣＧＰ ４１２５１、抗癌剤としての可能性を有するプロテインキナーゼ」）． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｔｈｅｒ ８２：（２−３） ２９３−３０１
２５． サイモン（Ｓｉｍｏｎ）， Ｃ．， Ｊ．フアレス（Ｊｕａｒｅｚ）， Ｇ．Ｌ．ニコルソン（Ｎｉｃｏｌｓｏｎ）， ａｎｄ Ｄ．ボイド（Ｂｏｙｄ）． １９９６． １９９６． Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ＰＤ ０９８０５９， ａ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｏｆ ｍｉｔｏｇｅｎ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ ｋｉｎａｓｅ， ｏｎ ｕｒｏｋｉｎａｓｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｉｎｖａｓｉｏｎ（「ウロキナーゼ発現およびｉｎ ｖｉｔｒｏ浸潤に対する、マイトジェン活性化プロテインキナーゼキナーゼの特異的阻害剤、ＰＤ ０９８０５９の効果」）． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ５６： ５３６９−５３７４
２６． ハン（Ｈａｎ）， Ｊ．， Ｊ．Ｄ． リー（Ｌｅｅ）， Ｙ．ジアング（Ｊｉａｎｇ）， Ｚ． リ（Ｌｉ）， Ｌ．フェング（Ｆｅｎｇ）， ａｎｄ Ｒ．Ｊ．ウレヴィッチ（Ｕｌｅｖｉｔｃｈ）． １９９６． Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｎｏｖｅｌ ＭＡＰ ｋｉｎａｓｅ ｋｉｎａｓｅ （ＭＫＫ６）（「新規なＭＡＰキナーゼキナーゼ（ＭＫＫ６）の構造および機能のキャラクタリゼーション」）． Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７１：［６） ２８８６−２８９１
２７． クマー（Ｋｕｍａｒ）， Ｓ．， Ｐ．Ｃ． マクドーネル（ＭｃＤｏｎｎｅｌｌ）， Ｒ．Ｊ．ガム（Ｇｕｍ）， Ａ．Ｔ．ハンド（Ｈａｎｄ）， Ｊ．Ｃ．リー（Ｌｅｅ）， ａｎｄ Ｐ．Ｒ．ヤング（Ｙｏｕｎｇ）． １９９７． Ｎｏｖｅｌ ｈｏｍｏｌｏｇｕｅｓ ｏｆ ＣＳＢＰ／ｐ３８ ＭＡＰ ｋｉｎａｓｅ： Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ， ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ａｎｄ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｔｏ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｂｙ ｐｙｒｉｄｉｎｙｌ ｉｍｉｄａｚｏｌｅｓ（「ＣＳＢＰ／ｐ３８ ＭＡＰキナーゼの新規な相同体：ピリジニルイミダゾールによる阻害に対する活性化、基質特異性および感受性」）． Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ ２３５：（３） ５３３−５３８
２８． ガム（Ｇｕｍ）， Ｒ．， Ｈ． ワン（Ｗａｎｇ）， Ｅ． レンゲル（Ｌｅｎｇｙｅｌ）， Ｊ． フアレス（Ｊｕａｒｅｚ）， ａｎｄ Ｄ．ボイド（Ｂｏｙｄ）． １９９７． Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ９２ ｋＤａ ｔｙｐｅ ４ ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｂｙ ｔｈｅ ｊｕｎ ａｍｉｎｏｔｅｒｍｉｎａｌ ｋｉｎａｓｅ− ａｎｄ ｔｈｅ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｓｉｇｎａｌ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｋｉｎａｓｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｃａｓｃａｄｅｓ（「ｊｕｎアミノ末端キナーゼおよび細胞外シグナル制御−キナーゼ依存性シグナル伝達カスケードによる９２ｋＤａの４型コラゲナーゼの制御」）． Ｏｎｃｏｇｅｎｅ １４： １４８１−１４９３
２９． ガム（Ｇｕｍ）， Ｒ．， Ｅ．レンゲル（Ｌｅｎｇｙｅｌ）， Ｊ．フアレス（Ｊｕａｒｅｚ）， Ｊ．Ｈ．チェン（Ｃｈｅｎ）， Ｈ．サトウ（Ｓａｔｏ）， Ｍ．セイキ（Ｓｅｉｋｉ）， ａｎｄ Ｄ．ボイド（Ｂｏｙｄ）． １９９６． Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ９２−ｋＤａ ｇｅｌａｔｉｎａｓｅ Ｂ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｂｙ ｒａｓ ｉｓ ｍｉｔｏｇｅｎ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ　　　ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ ｋｉｎａｓｅ−１−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ａｎｄ ｒｅｑｕｉｒｅｓ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅｓ ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ｃｌｏｓｅｌｙ ｓｐａｃｅｄ ＰＥＡ３／ｅｔｓ ａｎｄ ＡＰ−１ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ（「ｒａｓによる９２ｋＤａゲラチナーゼＢプロモーター活性の刺激は、マイトジェン活性化プロテインキナーゼキナーゼ‐１非依存性であり、密接な間隔のＰＥＡ３／ｅｔｓおよびＡＰ−１配列を含む、複数の転写因子を必要とする」）． Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７１：（１８） １０６７２−１０６８０
３０． クエンダ（Ｃｕｅｎｄａ）， Ａ．， Ｐ．コーヘン（Ｃｏｈｅｎ）， Ｖ． ビュー‐シェラー（Ｂｕｅｅ−Ｓｃｈｅｒｒｅｒ）， ａｎｄ Ｍ． ゴーデルト（Ｇｏｅｄｅｒｔ）． １９９６． Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｔｒｅｓｓ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ−３ （ＳＡＰＫ３） ｂｙ ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ ａｎｄ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｓｔｒｅｓｓｅｓ ｉｓ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｖｉａ ＳＡＰＫＫ３ （ＭＫＫ６）： ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｉｅｓ ｏｆ ＳＡＰＫ３ ａｎｄ ＳＡＰＫ２ （ＲＫ／ｐ３８）（「サイトカインおよび細胞ストレスによるストレス活性化プロテインキナーゼ‐３（ＳＡＰＫ３）の活性化は、ＳＡＰＫＫ３ （ＭＫＫ６）によって仲介される：ＳＡＰＫ３および ＳＡＰＫ２ （ＲＫ／ｐ３８）の特異性の比較」）． ＥＭＢＯ Ｊ １６：（２） ２９５−３０
３１． ザング（Ｚｈａｎｇ）， Ｈ．， Ｘ．シー（Ｓｈｉ）， Ｍ． ハンポン（Ｈａｍｐｏｎｇ）， Ｌ． ブラニス（Ｂｌａｎｉｓ）， ａｎｄ Ｓ． ペレチ（Ｐｅｌｅｃｈ）． ２００１． Ｓｔｒｅｓｓ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ＥＲＫ１ ａｎｄ ＥＲＫ２ ｂｙ ｄｉｒｅｃｔ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｐ３８ ＭＡＰ ｋｉｎａｓｅ（「ｐ３８ ＭＡＰキナーゼとの直接的相互作用による、ＥＲＫ１およびＥＲＫ２のストレス誘導阻害」）． Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７６： ６９０５−６９０８
３２． フーバー（Ｈｏｏｖｅｒ）， Ｈ．Ｅ．， Ｄ．Ｊ． トゥーラウフ（Ｔｈｕｅｒａｕｆ）， Ｊ．Ｊ： マーチンデイル（Ｍａｒｔｉｎｄａｌｅ）， ａｎｄ Ｃ．Ｃ． グレムボトスキー（Ｇｌｅｍｂｏｔｓｋｉ）． ２００１． ａｌｐｈａ Ｂ−ｃｒｙｓｔａｌｌｉｎ ｇｅｎｅ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ ｂｙ ＭＫＫ６−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｐ３８． Ａ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｒｏｌｅ ｆｏｒ ａｌｐｈａ Ｂ−ｃｒｙｓｔａｌｌｉｎ ａｓ ａ ｔａｒｇｅｔ ｏｆ ｔｈｅ ｐ３８ ｂｒａｎｃｈ ｏｆ ｔｈｅ ｃａｒｄｉａｃ ｓｔｒｅｓｓ ｒｅｓｐｏｎｓｅ（「ＭＫＫ６‐活性化ｐ３８によるαＢ‐クリスタリン遺伝子誘導およびリン酸化。心臓ストレスのｐ３８ブランチの標的としてのαＢ‐クリスタリンに対する潜在的役割」）． Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７５： ２３８２５−２３８３３
３３． レインゲウド（Ｒａｉｎｇｅａｕｄ）， Ｊ．， Ａ．Ｊ．ウィットマーシュ（Ｗｈｉｔｍａｒｓｈ）， Ｔ． バレット（Ｂａｒｒｅｔｔ）， Ｂ． デリジャード（Ｄｅｒｉｊａｒｄ）， ａｎｄ Ｒ．Ｊ． デイビス（Ｄａｖｉｓ）． １９９６． ＭＫＫ３− ａｎｄ ＭＫＫ６−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｓ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｂｙ ｔｈｅ ｐ３８ ｍｉｔｏｇｅｎ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ ｓｉｇｎａｌ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｐａｔｈｗａｙ（「ＭＫＫ３− およびＭＫＫ６−制御遺伝子発現は、ｐ３８マイトジェン活性化プロテインキナーゼシグナル伝達経路によって仲介される」）． Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． １６： １２４７−１２５５
３４． マツダ（Ｍａｔｓｕｄａ）， Ｓ．， Ｔ．モリグチ（Ｍｏｒｉｇｕｃｈｉ）， Ｓ．コヤス（Ｋｏｙａｓｕ）， ａｎｄ Ｅ．ニシダ（Ｎｉｓｈｉｄａ）． １９９８． Ｔ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｓｉｇｎａｌｓ ｆｏｒ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−２ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎｖｏｌｖｅ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ＭＫＫ６−ｐ３８ ａｎｄ ＭＫＫ７−ＳＡＰＫ／ＪＮＫ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｐａｔｈｗａｙｓ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｔｏ ｃｙｃｌｏｓｐｏｒｉｎ Ａ（「インターロイキン‐２を産生するＴリンパ球活性化シグナルは、ＴサイクロスポリンＡに対して感受性のＭＫＫ６−ｐ３８およびＭＫＫ７−ＳＡＰＫ／ＪＮＫシグナル伝達経路の活性化を伴う」）． Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７３： １２３７８−１２３８２
３５． ワン（Ｗａｎｇ）， Ｘ．， Ｃ．Ｈ． マクゴーワン（ＭｃＧｏｗａｎ）， Ｍ． ザオ（Ｚｈａｏ）， Ｌ．ヘ（Ｈｅ）， Ｊ．Ｓ． ドウネイ（Ｄｏｗｎｅｙ）， Ｃ． フェアルンス（Ｆｅａｒｎｓ）， Ｙ． ワン（Ｗａｎｇ）， Ｓ． ファング（Ｈｕａｎｇ）， ａｎｄ Ｊ． ハン（Ｈａｎ）． ２００１． Ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ ｏｆ ｔｈｅ ＭＫＫ６−ｐ３８ｇａｍｍａ ｃａｓｃａｄｅ ｉｎ ｇａｍｍａ−ｒａｄｉａｔｉｏｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｃｅｌｌ ｃｙｃｌｅ ａｒｒｅｓｔ（「γ放射線‐誘導細胞周期停止におけるＭＫＫ６−ｐ３８γカスケードの関与」）． Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． ２０： ４５４３−４５５２
３６． ファング（Ｈｕａｎｇ）， Ｓ．， Ｌ．ニュー（Ｎｅｗ）， Ｚ：パン（Ｐａｎ）， Ｊ．ハン（Ｈａｎ）， ａｎｄ Ｇ．Ｒ． ネメロウ（Ｎｅｍｅｒｏｗ）． ２００１． Ｕｒｏｋｉｎａｓｅ ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ ａｃｔｉｖａｔｏｒ／ｕｒｏｋｉｎａｓｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｓｕｒｆａｃｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｍａｔｒｉｘ ｉｎｖａｓｉｏｎ ｂｙ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌｓ ｒｅｑｕｉｒｅｓ ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ ｐ３８ａｌｐｈａ ｍｉｔｏｇｅｎ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ（「ウロキナーゼ・プラスミノゲン活性因子／ウロキナーゼ特異的な、乳癌細胞による表面受容体発現およびマトリックスの浸潤は、構成的ｐ３８αマイトジェン活性化プロテインキナーゼ活性を必要とする」）． Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７５： １２２６６−１２２７２
３７． サトウ（Ｓａｔｏ）， Ｈ．， ａｎｄ Ｍ．セイキ（Ｓｅｉｋｉ）． １９９３． Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ９２ ｋＤａ ｔｙｐｅ ＩＶ ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｗｈｉｃｈ ｉｓ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｉｎｖａｓｉｖｅｎｅｓｓ ｏｆ ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌｓ（「腫瘍細胞の浸潤性に関連する９２ｋＤａのＩＶ型コラゲナーゼ遺伝子発現の制御メカニズム」）． Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ８： ３９５−４０５
３８． ゼヒナー（Ｚｅｃｈｎｅｒ）， Ｄ．， Ｄ．Ｊ．トゥーラウフ（Ｔｈｕｅｒａｕｆ）， Ｄ．Ｓ． ハンフォルド（Ｈａｎｆｏｒｄ）， Ｐ．Ｍ． マクドナッフ（ＭｃＤｏｎｏｕｇｈ）， ａｎｄ Ｃ．Ｃ． グレムボトスキー（Ｇｌｅｍｂｏｔｓｋｉ）． １９９７． Ａ ｒｏｌｅ ｆｏｒ ｔｈｅ ｐ３８ ｍｉｔｏｇｅｎ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ ｐａｔｈｗａｙ ｉｎ ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ ｃｅｌｌ ｇｒｏｗｔｈ， ｓａｒｃｏｍｅｔｒｉｃ ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ， ａｎｄ ｃａｒｄｉａｃ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ（「心筋細胞成長、サルコメアの組織化および心臓特異的な遺伝子発現におけるｐ３８マイトジェン活性化プロテインキナーゼ経路の役割」）． Ｊ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． １３９： １１５−１２７
３９． アンゲル（Ａｎｇｅｌ）， Ｐ．， Ｋ．ハットリ（Ｈａｔｔｏｒｉ）， Ｔ．スミール（Ｓｍｅａｌ）， ａｎｄ Ｍ．カリン（Ｋａｒｉｎ）． １９８８． Ｔｈｅ ｊｕｎ ｐｒｏｔｏ−ｏｎｃｏｇｅｎｅ ｉｓ ｐｏｓｉｔｉｖｅｌｙ ａｕｔｏｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｂｙ ｉｓｔ ｐｒｏｄｕｃｔ， Ｊｕｎ／ＡＰ−１（「ｊｕｎプロトオンコジーンは、ｉｓｔ産物、Ｊｕｎ／ＡＰ−１によって正に自己調節される」）． Ｃｅｌｌ ５５： ８７５−８８５
４０． フロスト（Ｆｒｏｓｔ）， Ｊ．， Ｔ． ゲッパート（Ｇｅｐｐｅｒｔ）， Ｍ． コッブ（Ｃｏｂｂ）， ａｎｄ Ｊ． フェラミスコ（Ｆｅｒａｍｉｓｃｏ）． １９９４． Ａ ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔ ｆｏｒ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｓｉｇｎａｌ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｋｉｎａｓｅ （ＥＲＫ） ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ＡＰ−１ ｂｙ Ｈａ−Ｒａｓ， ｐｈｏｒｂｏｌ １２−ｍｙｒｉｓｔａｔｅ １３−ａｃｅｔａｔｅ， ａｎｄ ｓｅｒｕｍ（「Ｈａ−Ｒａｓ、ホルボール１２‐ミリステート１３‐アセテート、および血清によるＡＰ−１の活性化における細胞外シグナル‐制御キナーゼ（ＥＲＫ）機能の必要性」）． Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９１： ３８４４−３８４８
４１． サトウ（Ｓａｔｏ）， Ｈ．， Ｍ． キタ（Ｋｉｔａ）， ａｎｄ Ｍ．セイキ（Ｓｅｉｋｉ）． １９９３． ｖ−Ｓｒｃ ａｃｔｉｖａｔｅｓ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ９２−ｋＤａ ｔｙｐｅ ＩＶ ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ ｇｅｎｅ ｔｈｒｏｕｇｈ ｔｈｅ ＡＰ−１ ｓｉｔｅ ａｎｄ ｔｈｅ ＧＴ ｂｏｘ ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｔｏ ｒｅｔｉｎｏｂｌａｓｔｏｍａ ｃｏｎｔｒｏｌ ｅｌｅｍｅｎｔｓ（「ｖ−Ｓｒｃは、ＡＰ−１部位および網膜芽細胞腫調節エレメントに相同性のＧＴボックスを介して、９２ｋＤａのＩＶ型コラゲナーゼ遺伝子の発現を活性化する」）． Ａ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｒｅｇｕｌａｔｉｎｇ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｏｆ ｔｈａｔ ｂｙ ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ（「炎症性サイトカインによる、それに非依存的な遺伝子発現を制御するメカニズム」）． Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６８： ２３４６０−２３４６８
４２． グラント（Ｇｒａｎｔ）， Ｓ．， Ａ．Ｊ．フリーマン（Ｆｒｅｅｍａｎ）， Ｍ．Ｊ．ビルラー（Ｂｉｒｒｅｒ）， Ｈ．Ａ． マーチン（Ｍａｒｔｉｎ）， Ａ．Ｊ．ターナー（Ｔｕｒｎｅｒ）， Ｅ． スザボ（Ｓｚａｂｏ）， Ｊ． チェリアー（Ｃｈｅｌｌｉａｈ）， ａｎｄ Ｗ．Ｄ． ジャービス（Ｊａｒｖｉｓ）． １９９６． Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ １−ｂｅｔａ−Ｄ−ａｒａｂｉｎｏｆｕｒａｎｏｓｙｌｃｔｏｓｉｎｅ ｏｎ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ａｎｄ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｍｏｎｏｃｙｔｉｃ ｌｅｕｋａｅｍｉａ ｃｅｌｌｓ （Ｕ９３７） ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ａ ｃ−Ｊｕｎ ｄｏｍｉｎａｎｔ−ｎｅｇａｔｉｖｅ ｍｕｔａｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ （ＴＡＭ６７）（「ｃ−Ｊｕｎドミナントネガティブな変異体タンパク質（ＴＡＭ６７）を発現するヒト単球性白血病細胞（Ｕ９３７）におけるアポトーシスおよび分化に対する１−β−Ｄ−アラビノフラノシルシトシンの効果」）． Ｃｅｌｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｄｉｆｆｅｒ． ７： ６０３−６１３
【図面の簡単な説明】
【図１】ＭＭＰ−９発現に対するＳＢ２０３５８０の影響（図１Ａ）。
【図２】ＵＭ−ＳＣＣ−１細胞のｉｎ−ｖｉｔｒｏ浸潤（図１Ｂ）および成長（図１Ｃ）。
【図３】異なる細胞系におけるｉｎ−ｖｉｔｒｏ浸潤に対するＭＭＰ−９分泌の必要量（図２Ａ）、および抗ＭＭＰ−９抗体と共にインキュベートした後のｉｎ−ｖｉｔｒｏ浸潤のパーセンテージ（図２Ｃ）。
【図４】異なる細胞系におけるＭＭＰ−９の発現（図２Ｂ）
【図５】ドミナントネガティブなｐ３８アイソフォームタンパク質で処理した後のＭＭＰ−９プロモーター活性の影響（図３Ａ）。
【図６】２種類の異なる細胞系におけるｐ３８αおよびｐ３８γの発現（図３Ｂ〜Ｅ）。
【図７】２種類の異なる細胞系におけるＭＭＰ−９の発現（図４Ａ）。
【図８】キナーゼ欠損ＭＫＫ６（図４Ｂ）および構成的に活性なＭＫＫ６およびＭＫＫ３（図４Ｃ）変異体で処理した後のＭＭＰ−９プロモーター活性の影響。
【図９】ＭＫＫ−６によるＭＭＰ−９プロモーター活性の誘導（図５Ａ）、およびＭＫＫ−６依存性プロモーター活性化に対する、ＡＰ−１モチーフにおける点突然変異の影響（図５Ｂ）。
【図１０】ＣＡＴレポーターに対する、構成的に活性化されたＭＫＫ−６の影響（図６Ａ）、および異なるベクターで処理した後のＭＫＫ−６依存性ＭＭＰ−９プロモーターの活性化（図６Ｂ）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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