(57)【要約】本発明は、メラニン細胞刺激ホルモン（ＭＳＨ）レセプターリガンドを含む、組織操作および／または外科的手順において使用するためのビヒクルを提供する。このビヒクルは、人工関節、移植物、マトリクス、ステント、ガーゼ、包帯、プラスター、生分解性マトリクスまたはポリマー性フィルムであり得る。本発明はまた、本発明のビヒクルを形成する方法を提供し、このようなビヒクルを使用するためのＭＳＨのカップリング方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
メラニン細胞刺激ホルモン（ＭＳＨ）レセプターリガンドを含む、組織操作および／または外科的手順において使用するためのビヒクル。
【請求項２】
前記ビヒクルが、人工器官、移植物、マトリクス、ステント、ガーゼ、包帯、プラスター、生分解性マトリクス、またはポリマーフィルムである、請求項１に記載のビヒクル。
【請求項３】
前記ＭＳＨレセプターリガンドが、ＭＳＨ、またはその機能性フラグメントである、請求項１または２に記載のビヒクル。
【請求項４】
前記レセプターリガンドが、ＭＳＨの構造改変体を含むペプチドであり、そしてＭＳＨレセプター結合機能を有する、請求項１または２に記載のビヒクル。
【請求項５】
前記ＭＳＨレセプターリガンドが、固定化されている、請求項１〜４のいずれか１項に記載のビヒクル。
【請求項６】
前記ＭＳＨレセプターリガンドが、タンパク分解性切断によって放出される、請求項１〜４のいずれか１項に記載のビヒクル。
【請求項７】
ＭＳＨレセプターリガンドに対して近位のタンパク分解性切断部位を含む、請求項６に記載のビヒクル。
【請求項８】
ＭＳＨレセプターリガンドが、リンカーによってビヒクルに連結されている、請求項１〜７のいずれか１項に記載のビヒクル。
【請求項９】
前記リンカーが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）リンカーである、請求項８に記載のビヒクル。
【請求項１０】
ＭＳＨレセプターリガンドと関連し、ＭＳＨレセプターリガンドにカップリングまたは連結するカリックスアーレンをさらに含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載のビヒクル。
【請求項１１】
プラズマ処理された表面をさらに含む、請求項１〜１０のいずれか１項に記載のビヒクル。
【請求項１２】
急性炎症性上皮障害または慢性炎症性上皮障害の処置において使用するための、請求項１〜１１のいずれか１項に記載のビヒクル。
【請求項１３】
ＭＳＨレセプター結合リガンドを、上皮表面に送達するのに使用するための、請求項１〜１２のいずれか１項に記載のビヒクル。
【請求項１４】
細胞が結合し得る細胞キャリア表面をさらに含む、請求項１〜１３のいずれか１項に記載のビヒクル。
【請求項１５】
前記細胞キャリア表面が、ケラチノサイト；メラノサイト、皮膚上皮細胞、気管支上皮細胞、膀胱上皮細胞、角膜上皮細胞、内皮細胞、線維芽細胞、平滑筋細胞、単球、胃腸粘膜上皮細胞および口腔粘膜上皮細胞のいずれかまたはこれらの組み合わせを用いる使用に適切である、請求項１４に記載のビヒクル。
【請求項１６】
軟骨修復；骨修復；筋肉修復；神経修復；結合組織修復；血管修復；膀胱修復における使用のための、請求項１〜１５のいずれか１項に記載のビヒクル。
【請求項１７】
前記ビヒクルが、美容術の組織操作を必要とする患者に塗布および／または移植されるために適合される、請求項１〜１６のいずれか１項に記載のビヒクル。
【請求項１８】
前記ビヒクルが、治療的な組織操作を必要とする患者に塗布および／または移植されるために適合される、請求項１〜１７のいずれか１項に記載のビヒクル。
【請求項１９】
請求項１〜１８のいずれか１項に記載のビヒクルを形成する方法であって、以下の工程：
ｉ）リンカーを介して、ＭＳＨペプチドを表面にカップリングする工程；
ｉｉ）ＭＳＨペプチドを、カリックスアーレンまたはカリックスアーレン処理した表面に結合する工程；
ｉｉｉ）ＭＳＨペプチドをプラズマ処理した表面に固定化する工程；
の１つ、またはこれらの工程の組み合わせを包含する、方法。
【請求項２０】
請求項１９に記載の方法であって、工程（ｉ）が、以下の工程；
ｉ）結合剤およびＭＳＨレセプターリガンドを提供する工程；
ｉｉ）ＭＳＨレセプターと該結合剤とが結合するのに適切な条件を提供する工程；および
ｉｉｉ）接触する結合された分子を、処理されるべき細胞表面に接触させる工程
の１つ、またはこれらの工程の組み合わせを包含する、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記リンカーが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含む、請求項１９または２０に記載の方法。
【請求項２２】
細胞培養表面を調製する方法であって、以下：
ｉ）少なくとも１つの有機モノマーを提供する、工程；
ｉｉ）前記モノマーのプラズマを作製する、工程；および
ｉｉｉ）ＭＳＨが結合し得る細胞培養表面を提供するために、該プラズマで表面をコーティングする、工程
を包含する、方法。
【請求項２３】
前記有機モノマーが、アルキルアミン、ブチルアミン、ヘプチルアミンまたはプロピルアミンのようなアミンである、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
治療的手術または美容的手術を必要とする患者に、請求項１〜１８のいずれか１項に記載のビヒクルを投与する工程を包含する、処置の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、メラニン細胞刺激ホルモン（ＭＳＨ）を含む、治療的組織操作／外科的手順または美容的組織操作／外科的手順に使用するためのビヒクル、およびこのようなビヒクルを使用するためのＭＳＨのカップリング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
ドナーの組織および／または器官の不足と組み合わせて、身体部分の置換術の必要性は、組織操作産物の製造に繋がる。
【０００３】
組織操作は、新興科学であり、多くの臨床外科および美容外科の分野と関連している。より具体的には、組織操作は、損傷した組織および／または疾患した組織の、置換術および／または回復および／または修復（例えば、美容目的かあるいは組織および／または器官を機能的状態に戻すため）に関する。例えば、（そして限定の目的ではない）組織操作は、静脈潰瘍または糖尿病性潰瘍に起因する挫傷、熱傷、または治癒のための組織不全の結果生じる創傷を修復するための皮膚片の提供に有用である。
【０００４】
組織操作はまた、関節炎のような変性疾患に起因する関節の置換術、種々の環境原因（例えば、喫煙、ダイエット）および／または動脈弁／心臓弁の置換術を含む、先天性心臓疾患の結果としての損傷に起因する冠状動脈の置換術、器官移植、胃潰瘍の修復、骨粗鬆症のような疾患を処置するための骨組織の置換術、障害を介する神経筋疾患または神経筋損傷の結果としての筋肉および神経の置換術ならびに泌尿器疾患に対抗するための膀胱物質（ｂｌａｄｄｅｒ  ｍａｔｅｒｉａｌ）の置換術の間に実行される。
【０００５】
残念なことに、インビボでの細胞／組織の培養は、組織操作が直面する問題の一部のみを表す。多くの例において、培養における細胞増殖は、成功の主な障害ではない。適切なビヒクルを介する細胞／組織の移動によって、細胞／組織は、さらに多くの課せられた問題を示す、処置されるべき患者に組み込まれる。限定の目的ではなく、例示としての適切なビヒクルとしては、培養ウエア、人工器官、移植物、３次元マトリクス支持体、細胞外マトリクスタンパク質でコーティングした包帯、絆創膏またはプラスターが挙げられ得る。
【０００６】
置換組織の移動に適切なビヒクルは、それらが組織操作に有用である場合、特定の要求を満足させるべきである。典型的には、移動ビヒクルは、以下の特徴を有する：
ｉ）移動ビヒクルが、細胞がしっかりと接着し得る表面を提供すること；
ｉｉ）移動ビヒクルが、接着された細胞の、接着表面によって妨害されない増殖および分裂を可能にすること；
ｉｉｉ）適切な場合、移動ビヒクルが、接着された細胞の分化（または未分化）状態に影響を及ぼさない接着表面を提供すること；
ｉｖ）移動ビヒクルは、滅菌状態および免疫学的にサイレントな状態で細胞を維持すること；
ｖ）移動ビヒクルは、毒性が、患者に対して最小限であること；
ｖｉ）移動ビヒクルは、細菌疾患またはウイルス疾患を伝達しないこと；ならびに
ｖｉｉ）移動ビヒクルは、接着された細胞が容易に脱離し得る表面を提供し、そしてその結果置換術、回復または修復を必要とする組織部位に侵入する。
【０００７】
他の外科的手順は、細胞移送の状況において使用されないビヒクルに頼っており、そのビヒクルは、実質的には細胞を含み得ない。限定する目的ではなく、例示の目的として、このビヒクルは、炎症を軽減するための絆創膏またはデバイスであり得、例えば、火傷損傷、静脈下腿潰瘍、糖尿病性潰瘍または乾癬もしくは湿疹のような炎症性皮膚疾患の創傷治癒の状況において使用される。
【０００８】
皮膚細胞（ケラチノサイト、メラノサイトおよび線維芽細胞）によるＭＳＨ自己分泌産生は、内因性防御機構の一部であり、細胞が炎症および酸化的ストレスの期間に生存することを補助する。
【０００９】
ＭＳＨは、下垂体、腸および皮膚において産生される１３個のアミノ酸ペプチドである。色素細胞におけるメラニン形成制御におけるＭＳＨの役割は、最も公知である。ＭＳＨの色素外作用の理解は、近年急速に発展している。多くの研究は、可視的な色素沈着が、皮膚におけるＭＳＨのわずかな生理学的な役割を示すのみであり得ることを示唆する。以前は、メラノサイトのみがＭＳＨに応答すると考えられていた。現在は、ＭＳＨに対する応答能力は、色素を産生し得る細胞だけではなく、皮膚の多くの細胞によって共有されていると考えられている。さらに、メラノサイト、皮膚上皮細胞、気管支上皮細胞、膀胱上皮細胞、角膜上皮細胞、内皮細胞、線維芽細胞、平滑筋細胞および単球のような多くの異なる細胞型が、ＭＳＨについてのメラノコルチン−１レセプター（ＭＣ−１Ｒ）を保有する。
【００１０】
創傷を修復するための組織操作のアプローチは、従来の処置と比較して有意な治療利点を示すことに疑いはない。しかし、いくつかの問題がなお現在未解決である。特に、組織操作された物質が臨床的に使用される場合に生じる、炎症の最初の期間の間に細胞を保護するためのアプローチを開発することが必要である。この初期炎症応答は、移植術の最初の数日間における多くの物質の破壊および欠失について応答し得ると考えられる。有害な炎症応答はまた、冠状動脈ステントおよび人工器官のような外科的デバイスが使用される場合、および自家細胞（ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ  ｃｅｌｌ）が体内に再び導入される場合でさえしばしば観察される。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１１】
（発明の記載）
本発明によって、ＭＳＨレセプターリガンドを含む組織操作／外科的手順に使用するためのビヒクルが提供される。
【００１２】
用語、ビヒクルは、組織操作／外科的手順に使用するための任意の構造物またはデバイスとして定義され得る。限定の目的ではなく、例示の目的で、この用語は、人工器官、移植物、マトリクス、ステント、ガーゼ、絆創膏、プラスター、生分解性マトリクス；またはポリマーフィルムを含む。
【００１３】
好ましくは、このビヒクルは、患者に送達された場合に、最小限の患者毒性を有し、そして好ましくない反応を誘発しない。
【００１４】
ＭＳＨレセプターリガンドは、ＭＳＨまたはＭＳＨの機能性フラグメントを含む別のペプチドに適しており、例えば、それはＭＳＨの機能性フラグメントであり得る。あるいは、このレセプターリガンドは、ＭＳＨの構造改変体を含むペプチドおよびＭＳＨレセプター結合機能を有するペプチドであり得る。用語、機能性フラグメントは、ＭＳＨから誘導された任意のペプチドを含む（例えば、ＭＳＨの６アミノ酸フラグメントおよび３アミノ酸フラグメントは、同一の生物学的効果を達成し得る）。
【００１５】
用語、構造改変体は、同一の生物学的活性を保持する配列改変体を含むか、または増加された生物学的活性を有する（例えば、１３アミノ酸長であるＭＳＨのような特に強力なペプチドが存在する）。表１に、ＭＳＨ全長配列（番号６のＭＳＨ全長配列は、特に強力なペプチドである）およびフラグメント配列を列挙する。
【００１６】
（表１  ＭＳＨ全長配列およびフラグメント配列）
【００１７】
【表１】
2004528089.tif 000002
本発明はまた、前述の任意のペプチドのペプチド模倣活性を含むビヒクルを含む。すなわち、同一の生物学的活性を伝達するが、これらのペプチドと同一の構造を有する必要はない。
【００１８】
本発明の１つの実施形態において、ビヒクルは、固定化されたＭＳＨを含む。代替の実施形態において、ＭＳＨは、タンパク分解性切断によってゆっくりと放出される。
【００１９】
（ＭＳＨのタンパク分解性切断および放出）
支持体の生体適合材料表面からのＭＳＨペプチドフラグメントの局所的な送達方法は、ＭＳＨペプチドに近位である、エンドペプチダーゼ／プロテイナーゼ／タンパク質分解性切断の組みこみによって示唆される。プロテイナーゼ活性は、移植されたデバイスを取り囲む宿主組織から生じ、酵素媒介性切断および生理活性なＭＳＨペプチドフラグメントの放出を容易にする。従って、引き続くＭＳＨペプチドと宿主組織レセプターとの間のレセプター媒介性相互作用が可能となる。
【００２０】
ＭＳＨペプチドの近位にある単一のタンパク分解性切断部位が示唆されるが、所定の部位に設計されたアミノ酸配列は、潜在的に大きく：ａ）所定のタンパク分解性酵素に有効な、異なるタンパク分解性切断部位の数に起因し、そしてｂ）この関係において潜在的に作用し得る組織酵素の数に起因する。従って、２つの例が、設計方法論を示すために以下に説明される：１）マトリクスメタロプロテイナーゼＩ（ＭＭＰ１：線維芽細胞コラゲナーゼ）について、そして２）プラスミン（フィブリン／フィブリノゲン切断）について。これらの例のそれぞれの場合において、放出されるＭＳＨペプチドフラグメントは、ＭＳＨ１１〜１３（Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ）またはＭＳＨ１０〜１３（Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ）に基づく。
【００２１】
（スキーム１：プロテアーゼ切断部位の例）
【００２２】
【数１】
2004528089.tif 000003
【００２３】
【数２】
2004528089.tif 000004
プロテアーゼ切断部位は＝によって示される。
【００２４】
プロテアーゼ切断命名（例えば、Ｐ１／Ｐ１’）は、上記の配列に示される。
【００２５】
上記のスキームにおいて、生理活性のＭＳＨテトラペプチドは、放出される。しかし、任意のＭＳＨペプチド配列（表１に詳述される）は、タンパク分解性放出のための候補生理活性ペプチドである。
【００２６】
プロテアーゼ切断部位が、ネイティブ（例えば、ＭＭＰ１、実施例１）として上に示される場合、ＭＳＨ１０〜１３配列は、このＣ末端に放出される。この場合、ＭＳＨ１０位のアミノ酸は、（Ｇｌｙがネイティブとして）ネイティブではないが、類似の化学特性を持つ置換されたアミノ酸は、Ｐ１’位に存在する（例えば、Ａｌａ、ＬｅｕまたはＶａｌ−すなわち、疎水性（ｈｙｄｏｐｈｏｂｉｃｉｔｙ）を保持する）。ネイティブのＭＳＨ１０〜１３テトラペプチド配列が上に示される場合（例えば、ＭＭＰ１、実施例２）、この切断部位は、プロテアーゼに対して全体的にネイティブではない。さらに、類似の特性を有するアミノ酸は、Ｐ１切断部分（例えば、Ａｌａ／Ｖａｌ  対  Ｇｌｙ、類似の脂肪族側鎖アミノ酸を使用して疎水性を保持する）に置換されている。ＭＭＰ１によって特異的に切断される場合、これは、宿主組織レセプターによる引き続く相互作用のためにネイティブのＭＳＨ１０〜１３ペプチドを放出する。
【００２７】
ＭＳＨ配列に連結するプロテアーゼ切断部位に共通な一般的な設計は、ＭＳＨ生理活性ペプチド放出機能を満たすための多数の推定アミノ酸配列を生じる。従って、非常に多くの切断部位／ＭＳＨ配列の組み合わせを列挙する代わりに、限定的な数の通常の組織プロテアーゼが示唆され、このことから、本発明者らは、隣接ＭＳＨペプチドを放出する潜在能力についての候補酵素と関連することを予想する。従って、特定のＭＳＨ配列に連結したプロテアーゼ切断配列の個々の設計は、各プロテアーゼ／ＭＳＨペプチドの組み合わせについて存在する。
【００２８】
本発明の１つの実施形態において、ＭＳＨ（またはその構造フラグメントもしくは機能フラグメント）は、随伴性の細胞接着と関連しない。例えば、ＭＳＨペプチドは、急性または慢性の炎症性上皮障害の処置のための絆創膏／包帯、またはビーズと関連し得る。従って、絆創膏またはビーズへの適用は、慢性潰瘍（糖尿病、非治癒性静脈潰瘍または動脈潰瘍または床ずれ）、火傷損傷（例えば、小児科の火傷）または炎症性皮膚疾患（ここで、過剰な炎症は、例えば、乾癬および湿疹のような状態の寄与因子として見られる）の処置のために使用され得る。これらの用途において、絆創膏／包帯が治癒などの速度を増加させることが適度に予想され得る炎症の範囲を減少させるのに使用されることが認識される。細胞の引き続く適用は、治癒を加速させるかまたは創傷の閉鎖を達成するための処置の一部として伴っても伴わなくてもよい。ビーズ上に固定されたＭＳＨペプチドは、例えば、鼻粘膜（花粉症の処置）腸上皮（過敏性腸症候群、クローン病およびセリアック病のような慢性炎症性状態）または気道上皮表面（喘息）のような炎症に罹患する内蔵の上皮表面に送達するために使用され得る。あるいは、ＭＳＨペプチドは、冠状動脈ステント、人工器官、心臓弁または任意のデバイスのような移植可能な物質またはデバイスと関連し得、このデバイスは、炎症を引き起こすデバイスの能力を減少することが望ましい場合に、体内に挿入される。
【００２９】
本発明の代替的な実施形態において、ＭＳＨペプチドはまた、随伴性細胞接着のための絆創膏または包帯と関連し得る。この方法は、慢性的な潰瘍および火傷の処置のための皮膚送達デバイスに適用され得、おそらくＭＳＨペプチドが随伴性細胞接着なしに固定化される適用の結果として生じる。このビヒクルは、細胞が結合され得る細胞キャリア表面（例えば、表皮、ケラチノサイト、角膜上皮細胞、膀胱上皮細胞または腸上皮細胞接着のような上皮細胞表面）を含む。組織操作された心臓弁、再構築された肝臓、膀胱または冠状動脈ステントのような広範囲の移植可能な組織操作デバイスが、内皮細胞接着を促進させるような方法でするようにコーティングされる。これらのいずれかは、プロ炎症性サイトカインおよび酸化的ストレスに対する応答において、ＭＳＨペプチドの封入から、デバイス（および隣接細胞）上の細胞を助けるという利点があり得る。
【００３０】
好ましくは、本発明のビヒクルに関連する細胞は、ＭＣ−ＩＲレセプターを保有し、ＭＳＨレセプターリガンドに接着する。
【００３１】
本発明のなおさらなる好ましい実施形態において、前記ビヒクルは、哺乳動物起源の細胞、より好ましくは、ヒト起源の細胞を用いる使用にとって適切である。
【００３２】
より好ましくは、前記細胞は、以下のような細胞型から選択される：ケラチノサイト；メラノサイト、皮膚上皮細胞、気管支上皮細胞、膀胱上皮細胞、角膜上皮細胞、内皮細胞、線維芽細胞、平滑筋細胞、単球、胃腸粘膜上皮細胞および口腔粘膜上皮細胞。
【００３３】
本発明のビヒクルが、例えば、（限定の目的ではないが）急性および／もしくは慢性ならびに／または軽度および／もしくは重度の皮膚創傷（静脈性潰瘍および糖尿病性潰瘍を含む）；および／または軟骨修復；および／または骨修復；および／または筋肉修復；および／または神経修復；および／または結合組織修復；および／または血管修復；および／または膀胱修復への適用の前の、細胞が基質の表面上で増殖し得る臨床的適用において有用であることは、当業者に明らかである。
【００３４】
本発明の代替の実施形態に従って、その表面がＭＳＨレセプターリガンドと連結、カップリングまたは結合する点において特徴付けられる細胞キャリア表面を備える美容用のビヒクルが提供され、ここで、このビヒクルは、美容組織操作を必要とする患者に塗布および／または移植されるために適合される。
【００３５】
本発明の代替の実施形態に従って、その表面がＭＳＨレセプターリガンドと連結、カップリングまたは結合する点において特徴付けられる細胞キャリア表面を備える治療用のビヒクルが提供され、ここで、このビヒクルは、治療組織操作を必要とする患者に塗布および／または移植されるために適合される。
【００３６】
本発明は、ＭＳＨレセプターリガンドを含むビヒクルを提供する。本発明のビヒクルへのＭＳＨの導入は、炎症損傷に立ち向かうために、このビヒクルまたは構築物の中にＭＳＨレセプターが細胞を保持するのを助けるかまたは、ＭＳＨレセプターの、このビヒクルまたは構築物上の移動を助け、その結果、現存の組織操作／外科用ビヒクルに有意な利点を提供する。
【００３７】
組織操作された物質が臨床的に使用される際に起こる炎症の初期は、シクロスポリンのような免疫抑制剤の使用によって現在処置されている。シクロスポリンおよび他のこのようなステロイドは、全身的にか、または局所的に送達され得、そしてこれらを長期間の送達には不適切にする免疫系の重篤な減衰を伴う。都合の良いことに、ＭＳＨは、免疫系をブロックせず、長期間の送達に適している。
【００３８】
好ましくは、ＭＳＨレセプターリガンドと本発明のビヒクルとの結合は、以下のひとつまたは任意の組み合わせによって達成される：
ｉ）リンカー（例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）リンカー）を介する表面へのＭＳＨペプチドのカップリング；
ｉｉ）ＭＳＨペプチドと、カリックスアーレン、またはカリックスアーレン処理された表面との結合；
ｉｉｉ）ＭＳＨペプチドのプラズマ重合された表面への固定化。
【００３９】
（ｉ）  ＭＳＨ連結分子）
ＲＧＤモチーフは、ＰＥＧに連結し得ることが知られている（例えば、Ｄｒｕｍｈｅｌｌｅｒら、１９９４）。スキーム２は、ＭＳＨとＰＥＧとの連結を記載する。
【００４０】
本発明のさらなる実施形態に従って、ＭＳＨレセプターリガンドが結合し得る表面を調製する代替の方法が提供され、その方法は、以下の工程を包含する：
ｉ）連結剤およびＭＳＨレセプターリガンドを提供する工程；
ｉｉ）この薬剤とＭＳＨレセプターリガンドとの連結に適切な条件を提供する工程；および
ｉｉｉ）連結した分子を移動させ、処理すべき細胞表面と接触させる工程。
【００４１】
本発明の好ましい方法において、この連結剤は、ポリエチレングリコールである。他の結合剤も利用可能であり、この目的のために使用され得る。
【００４２】
（ｉｉ）カリックスアーレンおよびＭＳＨ（スキーム３参照））
カリックスアーレンは、両親媒性分子であり、この一般的な構造は、脚上の分子鉢の構造であり、その鉢の端にはヒドロキシル基が整列しておりそしてその脚は長鎖のアルキル基からなる。カリックスアーレンの異なる型およびそれらの製造方法の詳細な総説は、Ｂｏｈｍｅｒ、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｄ．Ｅｄ．Ｅｃｇｌ．１９９５、３４、７１３−７４５（この開示全体は、本明細書中で全ての目的のために参考として援用される）において与えられる。
【００４３】
カリックスアーレンの鉢の端に並ぶヒドロキシル基は、親水性基材に強く結合し得ることが公知であり、また、カリックスアーレンがまた疎水性のペンダント脚をも有する場合、カリックスアーレンが基材に高度に撥水性の表面を与え得ることも知られている（ＷＯ９７／３９０７７を参照のこと）。疎水性表面は、多くの手段（親水性「モノマー」のプラズマ重合化によるものを含む）によって親水性にされ得る。
【００４４】
本発明者らは、レゾルシンアレン（ｒｅｓｏｒｃｉｎａｒｅｎｅ）（Ｘ＝Ｈ）およびピロガレン（ｐｙｒｏｇａｌｌｅｎｅ）（Ｘ＝ＯＨ）（ここでｎ＝４）について最初に研究した。しかし、Ｘは、より広く変化し得（例えば、ＣＨ２ＺまたはＯＣＨ２Ｚ）、そしてｎもまた６または８であり得る。ペンダントのＹ基は、本発明の化合物中の長鎖のアルキルまたはペルフルオロアルキルであるが、二重結合、三重結合、ＳＲ、ＯＨまたはＳＨのような官能基の鎖の末端への組み込みがまたなされ得る１，９。Ｙはまた、長いポリエチレンオキシド鎖であり得る。
【００４５】
このアプローチの主な利点は、処理の単純さと低い負荷であり、このことは、バルク物質に容易に適用し得ることを意味する。他の利点は、化合物が表面上で規則正しい単一層を形成する場合、固定された種／吸着された種は、より規定された環境にある（細胞表面を模倣するためにそれ自身が修飾され得る）。
【００４６】
本発明のさらなる実施形態において、ＭＳＨレセプターリガンドに結合し得る、カップリングまたは連結したカリックスアーレンが提供される。
【００４７】
本発明のなおさらなる実施形態において、ＭＳＨレセプターリガンドにカリックスアーレンをカップリングさせるか連結させる方法を提供し、その方法は、以下の工程を包含する：
最初の例において、ペンダント鎖Ｙは、前に記載したようにＯＨを有する末端部分で官能化である。これらのＯＨ基は、十分確立された合成技術に従ってＮＨ２に転換される。カリックスアーレン溶液による物質の簡単な処理は、この物質に、規則正しいアミン官能化の表面を提供する。
【００４８】
あるいは、前に記載したカップリング技術および物質処理のために使用される全体の構築を使用して、カリックスアーレンとＭＳＨとの事前のカップリングが行われ得る。
【００４９】
同様に、カリックスアーレンは、鎖（ｔｅｔｈｅｒ）を介して単一のＭＳＨによって官能化される。モノ官能化カリックスアーレンは、Ｓ．Ｓａｉｔｏ，Ｄ．Ｍ．ＲｕｄｋｅｖｉｃｈおよびＪ．Ｒｅｂｅｋ  Ｊｒ，Ｏｒｇ．Ｌｅｔｔ．１９９９，１（８），１２４１−１２４４によって記載されるように合成され得、そしてアミノ官能化形態に転換され、これは、ポリエチレングリコールに繋がれたＭＳＨによる容易な誘導を可能にする。
【００５０】
この合成アプローチは、以下に示されるスキーム中でレソルシアレンを作製するためになされる。ヒドロキシ末端化された化合物は周知であり、アルケン付加カリックスアーレンのように本発明者らによって合成される。
【００５１】
十分に官能化され得るカリックアーレンは、カリックアーレンが表面に結合される前か後のいずれかに鎖に結合され得る。このことは、ＮＨ２形態が、ＭＳＨに付加されたポリエチレングリコールへのアミンの接着を介して連結されるということである。これは、他のアプローチと同じ技術である。
【００５２】
両方の場合において、表面の官能化のレベルは、非官能性Ｙ基を有するカリックスアーレンで、官能化されたカリックスアーレンを希釈することによって制御され得る。多官能性のカリックスアーレン（すなわち、カリックスアーレンあたり４つの接着部位を有する）は、スキーム４を参照のこと。
【００５３】
（ｉｉｉ）プラズマ重合）
プラズマ重合は、超薄（例えば、約２００ｎｍ）の架橋された重合体フィルムが、複雑な幾何学であり、制御可能な化学官能性を有する基材上に沈着されるのを可能にする技術である。結果として、物質の表面化学は、そのように処理された基材のバルク特性に影響を及ぼさずに修飾され得る。
【００５４】
プラズマガスまたはイオン化されたガスは、通常、電場によって励起される。これらは、イオン、電子、中性化化学種（ラジカル化学種、準安定種、基底状態の種および励起状態の種）および電磁放射を含む、高反応性の化学環境である。低圧において、電子の温度がイオンおよび中性化化学種の温度と実質的に異なる領域（ｒｅｇｉｍｅ）が達成され得る。このようなプラズマは、「冷たい（ｃｏｌｄ）」プラズマまたは「非平衡」プラズマと呼ばれる。このような環境において、多くの揮発性有機化合物（例えば、揮発性アルコール、揮発性酸、揮発性アミン、または揮発性炭化水素）ニートまたは他のガス（例えば、アルゴン）と共にが、プラズマおよび放電の下流と接触した両面のコーティングを重合化することが示されている（Ｈ．Ｋ．Ｙａｓｕｄａ，Ｐｌａｓｍａ  Ｐｌｙｍｅｒｉｓａｔｉｏｎ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ  １９８５）。この有機化合物は、しばしば「モノマー」と呼ばれる。この沈着物はしばしば「プラズマポリマー」と呼ばれる。プラズマは、減圧したガス（モノマー）への電場の印加によって作製され得、そして維持され得る。広範囲のプラズマ反応器幾何学が記載されており、電力入力（マイクロ波、無線周波数、可聴周波など）の手段である。本明細書中で、本発明者らは、誘導的にカップリングされた（１３．５６ＭＨｚ）ＲＦプラズマの使用を記載するが、電力入力についての所定の数／値、気圧流れ（ｇａｓ  ｐｒｅｓｓｕｒｅ  ｆｌｏｗ）などは、当業者によって他のプラズマ反応器／電力供給源に容易に適応され得る（図１を参照のこと）。
【００５５】
このポリマー性フィルムは、揮発性有機化合物のプラズマから得られえる（１０−２ｍｂａｒの減圧および理想的には１００℃未満で）。プラズマポリマー沈着において、一般的には、開始化合物またはイオン化されたガスの大量のフラグメーションが存在し、広範囲な得られるフラグメントまたは官能基が、その沈着物中に望まれずに組み込まれる。このような様式の重合化の利点としては、潜在的に以下が挙げられる：超薄ピンホールフリーフィルム沈着；プラズマポリマーは、広範囲の基材上に沈着し得る；このプロセスは、溶媒を必要とせず、プラズマポリマーは、汚染物質を含まない。低いプラズマ入力電力（低いプラズマ電力／モノマー流速の比）を使用することによって、高程度の官能基保持を有するフィルムを作成することが可能である。このような低電力／速度比の例は、２Ｗおよび２．０ｓｃｃｍの流速である。典型的な範囲は、１〜１０Ｗ、および１〜５ＳＣＣＭである。これは、分子構造の「保持」および沈着物の化学官能性が必要とされる場合に重要である。
【００５６】
他の比較的低い比率が使用され得、これらは当業者に公知である。例えば、パルス波が使用される場合、対応する補正がプラズマ電力および流速に対して当業者に公知であるようになされる。当業者にとってはまた、反応器条件が反応器幾何学に依存して変化することもまた明らかである。
【００５７】
あるいは、プラズマポリマー沈着は、プラズマまたはイオン化ガスをパルスすることによって形成され得る。プラズマは、単一のモノマー種または有機分子の組み合わせのいずれかから形成される。プラズマ重合化による表面のコーティングは、ＰＣＴ公開  ＷＯ００／７８９２８に開示される。
【００５８】
引き続く細胞接着を伴わない例について、アミンコーティング化合物（不飽和であるか不飽和でない、一級アミン、二級アミンもしくは三級アミン）は、重合化（または別の分子と共重合化）されて、ＭＳＨが連結され得る安定なプラズマ重合化アミンプラットホームを提供し得る。
【００５９】
アミンのホモ重合化のために、不飽和であるか不飽和でない、一級アミン、二級アミンもしくは三級アミン（例えば、アリルアミン）が（かなり広範囲の条件下で）重合化され得、ＭＳＨが連結され得る安定なプラズマ重合化藍ンプラットホームを提供し得る。ＭＳＨペプチドは、「リンカー」分子（例えば、ＰＥＧ）に繋がれる。この分子は、ＭＳＨペプチドの共有結合的連結のために活性部位（部分）を含む。
【００６０】
共重合化は、Ａ．Ｊ．Ｂｅｃｋ，１９９６に記載される。好ましい方法は、エチレンオキシド（ＥＯ）様分子（例えば、トリグライム（ｔｒｉｇｌｙｍｅ）またはテトラグライム（ｔｅｔｒａｇｙｍｅ））と少量のアミン含有化合物（例えば、ホモ重合化において上で同定された任意の化合物）とのプラズマ共重合化である。
【００６１】
このストラテジーは、引き続くＭＳＨフラグメントの連結のために、密度を制御された「反応性」アミン部位を有する、プラズマ重合された「ＥＯ様」プラットホームを提供する。このプラズマ重合されたＥＯ様プラットホームは、一般的なタンパク質耐性特性を付与する（Ｓ．Ｂｅｙｅｒら、１９９７、Ｙ．Ｊ．Ｙｕら、２０００およびＧ．Ｐ．Ｌｏｐｅｚら、１９９２）。これは、ＥＯ特徴から現れ、そして関連するＭＳＨ活性をより長期間維持する非特異的タンパク質吸着の程度を減少する。
【００６２】
本発明のさらなる局面に従って、細胞培養表面を調製する方法が提供され、その方法は以下の工程を包含する：
ｉ）少なくとも１つの有機モノマーを提供する工程；
ｉｉ）この有機モノマーのプラズマを作製する工程；および
ｉｉｉ）このプラズマで表面をコーティングし、ＭＳＨが結合し得る細胞培養表面を提供する工程。
【００６３】
本発明の好ましい方法において、この有機モノマーは、以下から選択される：
ａ）アルキルアミン、ブチルアミン、ヘプチルアミン、プロピルアミンなど由来のアミン。候補アミンは、１００℃未満で十分な蒸気圧（すなわち、ＲＴＰで６．６Ｐａより高い、好ましくは約１３０Ｐａ）を持つ一級アミン、二級アミン、三級アミンである。
【００６４】
ｂ）ＥＯ型表面は、テトラエチレングリコール、ジメチルエーテル（テトラグライム（ｔｅｔｒａｇｌｙｍｅ））、テトラエチレングリコールジビニルエーテル、ジエチレンオキシドジビニルエーテルおよびトリエチレンオキシドモノアリルエーテルから選択される。
【００６５】
本発明の１つの実施形態において、メラニン細胞刺激ホルモン（ＭＳＨ）レセプターリガンドを含む、組織操作／外科手段における使用のためのビヒクルが提供され、ここでこのビヒクルは、これに取り囲まれるかまたはこれに塗布されるプラズマ重合によって得られ得る細胞キャリア表面を有する。
【００６６】
本発明のさらなる実施形態において、組織操作／外科的手順においてＭＳＨレセプターリガンドを患者に投与する工程を包含する処置方法を提供する。
【００６７】
本発明のさらなる実施形態において、皮膚再構築、膀胱再構築、角膜上皮移植片、インステント（ｉｎ−ｓｔｅｎｔ）再狭窄を防ぐための冠状動脈心臓疾患のためのステントのコーティング、コンタクトレンズコーティング、臀部交換術または心臓弁コーティングにおける使用のためのＭＳＨレセプターリガンドを提供する。
【００６８】
好ましくは、ＭＳＨレセプターリガンドは、ビヒクルと結合し、好ましくは、このビヒクルは細胞キャリア表面を含む。
【００６９】
この結合は、任意の適切な手段によって達成され得る。好ましくは、ＭＳＨレセプターリガンドは、リンカー（特に、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）リンカー）を介して、カリックスアーレンを使用するＭＳＨの取り込み、またはプラズマ重合およびＭＳＨでのコーティングによってビヒクルと連結される。
【００７０】
本発明のさらなる実施形態において、治療的手術または美容的手術を必要とする患者に、ＭＳＨレセプターリガンドと結合した細胞キャリア表面を投与する工程を包含する処置方法を提供する。
【００７１】
ここで、本発明は、例示の目的で、そして以下の表および図面を参照して記載される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００７２】
（発明の詳細な説明）
（材料および方法）
固定化されたＭＳＨ上で培養される細胞は、上皮細胞、内皮細胞および神経冠由来細胞であり、従って、皮膚表皮ケラチノサイト、角膜上皮細胞、膀胱上皮細胞、胚性幹細胞、胚性生殖細胞、造血幹細胞、神経幹細胞、骨芽細胞、破骨細胞である。皮膚表皮ケラチノサイトの培養についての詳細は、Ｃｈａｋｒａｂａｒｔｙら、１９９９に十分に与えられ、他の上皮細胞、内皮細胞および神経冠胞は、科学文献において公開されるように、確立された培養方法論を使用して培養される。
【００７３】
（固定化技術または吸着技術）
多くの異なるアプローチが、ＭＳＨレセプターリガンドを組織操作に使用されるキャリア表面または他のこのような組織操作デバイスに連結、カップリングまたは結合するのに使用され得る。
【００７４】
（（ｉ）ＰＥＧへのペプチド連結）
スキーム２に記載するとおり。
【００７５】
このスキームは、タンパク分解的に切断可能な部分を挿入するために容易に適応され得る。これらの多くは、スキーム１に示すとおりに同定される。
【００７６】
（（ｉｉ）ヒドロキシ官能化されたカリックスアーレン（Ｘ＝Ｈ、Ｙ＝（ＣＨ２）１０ＯＨ）の合成）：
濃塩酸（３．２ｍｌ）を、エタノール（３０ｍｌ）中のレゾルシノール（１．９７ｇ、１７．９ｍｍｏｌ）および１，１−ジメトキシ−１１−ウンデカノール（４．１５ｇ、１７．９ｍｍｏｌ）の攪拌溶液に０℃で滴下した。この反応混合物を５５℃で１８時間、アルゴン下で加熱した。冷却後、黄色に着色した溶液を水（２５０ｍｌ）に注いで、淡黄色の沈殿物を得た。これを濾過によって回収し、温水（６×１００ｍｌ）で洗浄し、乾燥してレゾルカレン（ｒｅｓｏｒｃａｒｅｎｅ）を淡黄色固体（４．５８ｇ、９２％）として得た（融点２３３〜２３９℃）。この粗製物質をメタノール／クロロホルムから再結晶化した（３．８７ｇ、７８％）（融点２３７．５〜２３８．５℃）。利用可能な特徴付け。
【００７７】
（エン−官能化カリックスアーレン（Ｘ＝Ｈ、Ｙ＝（ＣＨ２）８ＣＨ＝ＣＨ２）の合成）：
濃塩酸（３．２ｍｌ）を、エタノール（３０ｍｌ）中のレゾルシノール（１．９７ｇ、１７．９ｍｍｏｌ）および１０−ウンデカノール（ｕｎｄｅｃｅｎａｌ）（３．０５ｇ、１７．９ｍｍｏｌ）の攪拌溶液に０℃で滴下した。この反応混合物を５５℃で１８時間、アルゴン下で加熱した。冷却後、黄色に着色した溶液を水（２５０ｍｌ）に注いで、淡黄色の沈殿物を得た。これを濾過によって回収し、温水（６×１００ｍｌ）で洗浄し、乾燥してレゾルカレン（ｒｅｓｏｒｃａｒｅｎｅ）を淡黄色固体（４．５ｇ、９０％）として得た。利用可能な特徴付け。
【００７８】
スキーム７を参照。
【００７９】
（（ｉｉｉ）コポリマー表面をプラズマ化するためのペプチドの連結）
（プラズマ重合）
エチレンオキシド「ＥＯ」様プラズマポリマーの生成およびアリルアミンとの共重合のための実験条件の概要。
【００８０】
「ＥＯ様」ＰＰの生成に使用されるモノマーは、テトラエチレングリコールジメチルエーテル（テトラグライム）またはテトラエチレングリコールジビニルエーテルである。
【００８１】
適切な流速である２〜３ｓｃｃｍに達するために、モノマーは、水浴中で８０〜９０℃まで加熱される。これによって、プラズマ反応器中の約４〜６×１０−２ｍｂａｒの圧力が得られる。２〜３Ｗのプラズマ電力および２０分の重合時間が使用される。これらの条件を使用して、ＰＰ（テトラエチレングリコールジメチルエーテル）の初期ＸＰＳ結果は、０．５６のＯ／Ｃ比および約７２％のエーテル官能性の％保持（カーブフェィッティングより、Ｃ１ｓコアレベルである）を示す。これは、Ｌｏｐｅｚら（１９９２）によって報告される０．４〜０．４８のＯ／Ｃ比と、非常に好都合に匹敵する（Ｃ１ｓカーブフィットが示されていないことに注意のこと）。
【００８２】
これらの増加された揮発性、従ってモノマー流のより容易な制御に起因して、目的の他のモノマーは、ジエチレンオキシドジビニルエーテルおよびトリエチレンオキシドモノアリルエーテルである。これらの物質からのプラズマポリマーの生成は、Ｙｕら（２０００）およびＢｅｙｅｒら（１９９７）による最近の研究の対象である。
【００８３】
上記のモノマーの全ては、アリルアミンと共重合化されて、ＭＳＨ／ペプチド固定化のための反応性アミン部位を提供し得る。共重合化は、Ｂｅｃｋら（１９９６）によって以前に記載されるとおりである。
【００８４】
ＰＥＧ／ＭＳＨ合成は、すでに記載されるとおりである（スキーム２）。スキーム５は、例としてＭＳＨを使用して、ＰＥＧ／ペプチド分子による表面アミンの置換反応を例示する。
【００８５】
この反応の実現可能性に関連するいくつかの初期の結果が、ここで示される。ブロモアセチルブロミドは、スキーム６に示されるように、アミンと同様の反応を経る。この反応は、スキーム５に示される反応について表面アミンの利用可能性を試験するために使用されている。
【００８６】
このスキームの実現可能性は、ブロモアセチルブロミドを使用して実証されている。アリルアミンのＰＰにおける表面アミンとのブロモアセチルブロミドの反応の結果が、評価されている。この結果は、表２および３にまとめられる。
【００８７】
（表２．アリルアミンＰＣＰによるブロモアセチルブロミドの洗浄および反応についてのＸＰＳ結果の要約（全てのサンプルを、プラズマ重合の２日以内に調製した））
【００８８】
【表２】
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（表３．Ｂｒ  ３ｄコアレベルのピークフィットからの「物理吸着された（ｐｈｙｓｉｓｏｒｂｅｄ）」および「固定化された」臭素の相反的寄与（全てのサンプルを、プラズマ重合の２日以内に調製した）。電荷は、２８５ｅＶにてＣ１ｓで補正された。
【００８９】
【表３】
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ブロモアセチルブロミドとのＰＰの反応の際に、臭素は、ＰＰの表面上でＸＰＳによって検出される（Ｂｒ／Ｎ＝０．２２）。この結果は、この反応がおこるが、共有結合的に固定化された臭素と基材に物理吸着された臭素との間を区別するために注意が払われるべきであることを示す（本発明者らは、アリルアミンＰＰとのＢｒ−の強力な電荷ベースの相互作用を予想することに注意のこと）。表２中のこのデータは、水による洗浄の際の吸着された臭素に対する固定化された臭素の比を変化させる点を例示する。現在、吸着された臭素は、洗浄の際に表面から完全に除去され得ないが、Ｂｒ  ３ｄコアレベルのピークフィットは、この相対量を区別するのを可能にする。
【００９０】
上記の結果に加えて、本発明者らは、アリルアミンのＰＰとのＰＥＧ／シスチンの反応を実証し、この反応は、表面上のシスチン残基の連結を生じる（データは示さず）。
【００９１】
（参考文献）
【００９２】
【数３】
2004528089.tif 000007
【００９３】
【数４】
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【図面の簡単な説明】
【００９４】
【図１】なし
【図２−１】なし
【図２−２】なし
【図２−３】なし
【図３】なし
【図４】なし
【図５】なし
【図６】なし
【図７】なし
【図１】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図２−３】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際公開パンフレット】
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2004528089.tif 000049
2004528089.tif 000050
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004528089.tif 000051
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004528089.tif 000052
【国際調査報告】
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2004528089.tif 000054
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