(57)【要約】本発明は、細胞増殖性疾患、ウイルス感染に関連した腫瘍、およびある種のウイルス感染をの治療方法に関する。開示した方法は、熱ショックタンパク質９０を阻害する化合物を使用する。かかる方法は、細胞周期のＧ２／Ｍ期でＲｂ陰性または欠損細胞を阻止し、迅速にそれらを破壊する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
網膜芽細胞腫遺伝子産物が欠損している細胞の破壊方法であって、ＨＳＰ９０機能を阻害することが可能な化合物を前記細胞に投与することを含む方法。
【請求項２】
前記化合物は、アンサマイシンである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記アンサマイシンは、ゲルダナマイシン、１７−ＡＡＧ、またはハービマイシンＡからなる群から選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記酸アンサマイシンは、１７−ＡＡＧである、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記化合物は、ラディシコールである、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記化合物は、ＨＳＰ９０のＡＴＰ結合部位に結合する合成化合物である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
網膜芽細胞腫遺伝子産物が欠損している細胞に関連した障害の治療方法であって、ＨＳＰ９０を阻害することが可能な化合物を治療上有効な量投与することを含む方法。
【請求項８】
前記障害は、小細胞肺癌である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記障害は、ウイルス感染に関連している、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記ウイルス感染は、ヒトパピローマウイルスにより引き起こされる、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記障害は、子宮頸癌である、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記化合物は、前記障害を治療するための別の療法と併用して与えられる、請求項７に記載の方法。
【請求項１３】
前記化合物は、アンサマイシンである、請求項７に記載の方法。
【請求項１４】
前記アンサマイシンは、ゲルダナマイシン、１７−ＡＡＧ、またはハービマイシンＡからなる群から選択される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記アンサマイシンは、１７−ＡＡＧである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記化合物は、ラディシコールである、請求項７に記載の方法。
【請求項１７】
前記化合物は、ＨＳＰ９０のＡＴＰ結合部位に結合する合成化合物である、請求項７に記載の方法。
【請求項１８】
前記細胞は、ＲＢ陰性である、請求項１または７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本出願は、２０００年７月２８日に提出された米国仮出願第６０／２２１，４１５号および２００２年１１月２日に提出された第６０／２４５，２６４号（その両方が、参照により本明細書に援用される）の利益を主張する。
【０００２】
［発明の背景］
真核性熱ショックタンパク質９０（ＨＳＰ９０）は、遍在性シャペロンタンパク質であり、ＡＴＰを結合して加水分解する。ＨＳＰ９０ファミリーのタンパク質としては、４つの既知の成員：Ｈｓｐ９０αおよびβ、Ｇｒｐ９４ならびにＴｒａｐ−１が挙げられる。細胞機能におけるＨＳＰ９０の役割は、完全に理解されていはいないが、最近の研究により、ＨＳＰ９０が、シグナル伝達、細胞周期制御および転写調節に関与した重要なタンパク質を含む広範なタンパク質のフォールディング、活性化および集合に関与することが示されている。例えば、研究者等により、ＨＳＰ９０シャペロンタンパク質が、Ｒａｆ−１、ＥＧＦＲ、ｖ−Ｓｒｃファミリーキナーゼ、Ｃｄｋ４、およびＥｒｂＢ−２のような、腫瘍形成に関与した多数のものを含むステロイドホルモン受容体およびプロテインキナーゼのような重要なシグナル伝達タンパク質に関連することが報告されている（Ｂｕｃｈｎｅｒ Ｊ．， １９９９， ＴＩＢＳ， ２４：１３６−１４１； Ｓｔｅｐａｎｏｖａ， Ｌ． ｅｔ ａｌ．， １９９６， Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ． １０：１４９１−５０２； Ｄａｉ， Ｋ． ｅｔ ａｌ．， １９９６， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７１： ２２０３０−４）。
【０００３】
ｉｎ　ｖｉｖｏ（生体条件内）およびｉｎ　ｖｉｔｒｏ（生体条件外）での研究により、コシャペロンの助けなしで、ＨＳＰ９０が、タンパク質をフォールディングまたは活性することは不可能であることが示されている。ｉｎ　ｖｉｔｒｏでのステロイド受容体の立体配座および会合に関して、ＨＳＰ９０は、Ｈｓｐ７０およびｐ６０／Ｈｏｐ／Ｓｔｉｌを必要とする（Ｃａｐｌａｎ， Ａ．， １９９９， Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．， ９：２６２−６８）。ｉｎ　ｖｉｖｏにて、ＨＳＰ９０は、ＨＳＰ７０およびそのコシャペロンと相互作用し得る。高等真核生物におけるＨＳＰ９０に関連する他のコシャペロンとしては、Ｈｉｐ、Ｂａｇ１、ＨＳＰ４０／Ｈｄｊ２／Ｈｓｊ１、イムノフィリン、ｐ２３、およびｐ５０が挙げられる（上述のＣａｐｌａｎ， Ａ．）。
【０００４】
アンサマイシン系抗生物質は、ストレプトミセス・ビグロスコピクス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ）に由来する天然産物であり、真核細胞に対して大いに影響する。ハービマイシンＡ（ＨＡ）およびゲルダナマイシン（ＧＭ）のような多くのアンサマイシン類は、ＨＳＰ９０のポケットにしっかりと結合する（Ｓｔｅｂｂｉｎｓ， Ｃ． ｅｔ ａｌ．， １９９７， Ｃｅｌｌ， ８９： ２３９−２５０）。アンサマイシン類のＨＳＰ９０への結合は、タンパク質のリフォールディングを阻害し、選ばれた群の細胞タンパク質のプロテアソーム依存的分解を引き起こすと報告されている（Ｓｅｐｐ−Ｌｏｒｅｎｚｉｎｏ， Ｌ．， ｅｔ ａｌ．， １９９５， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２７０： １６５８０−１６５８７； Ｗｈｉｔｅｓｅｌｌ， Ｌ． ｅｔ ａｌ．， １９９４， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ９１：８３２４−８３２８）。
【０００５】
アンサマイシン類は最初、ｖ−ｓｒｃ形質転換線維芽細胞を復帰させるそれらの能力に基づいて単離された（Ｕｅｈａｒａ， Ｙ． ｅｔ ａｌ．， １９８５， Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．， ７６：６７２−６７５）。次に、アンサマイシン類は、多数の発癌遺伝子、特にチロシンキナーゼをコードする発癌遺伝子で形質転換された細胞に対して抗増殖性効果を有すると言われてきた（Ｕｅｈａｒａ， Ｙ． ｅｔ ａｌ．， １９８８， Ｖｉｒｏｌｏｇｙ， １６４： ２９４−９８）。細胞成長の阻害は、アポトーシスに、またある種の細胞系では、分化誘導に関連する（Ｖａｓｉｌｅｖｓｋａｙａ， Ａ． ｅｔ ａｌ．， １９９９， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．， ５９：３９３５−４０）。ＧＭ誘導体は、現在第Ｉ相臨床試験中である。
【０００６】
アンサマイシン類を抗癌剤として使用することついては、米国特許第４，２６１，９８９号、第５，３８７，５８４号、および第５，９３２，５６６号に記載されている。アンサマイシン、ゲルダナマイシンの調製については、米国特許第３，５９５，９５５号（参照により本明細書に援用される）に記載されている。
【０００７】
Ｈｓｐ９０のＮ末端中のアンサマイシン結合ポケットは高度に保存され、ＤＮＡジャイレースのＡＴＰ結合部位に対して弱い相同性を有する（上述のＳｔｅｂｂｉｎｓ， Ｃ． ｅｔ ａｌ．； Ｇｒｅｎｅｒｔ， Ｊ．Ｐ． ｅｔ ａｌ．， １９９７， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２７２：２３８４３−５０）。このポケットは、低親和力でＡＴＰおよびＡＤＰを結合し、弱いＡＴＰ分解酵素活性を有すると報告されている（Ｐｒｏｒｏｍｏｕ， Ｃ． ｅｔ ａｌ．， １９９７， Ｃｅｌｌ， ９０：６５−７５； Ｐａｎａｒｅｔｏｕ， Ｂ． ｅｔ ａｌ．， １９９８， ＥＭＢＯ Ｊ．， １７： ４８２９−３６）。ｉｎ　ｖｉｔｒｏおよびｉｎ　ｖｉｖｏの研究により、アンサマイシン類によるポケットの占有は、ＨＳＰ９０機能を改変し、タンパク質のリフォールディングを阻害することが示されるとされている。高濃度で、アンサマイシン類は、ＨＳＰ９０に対するタンパク質基質の結合を阻止すると報告されている（Ｓｃｈｅｉｂｅｌ， Ｔ．，Ｈ． ｅｔ ａｌ．， １９９９， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９６：１２９７−３０２； Ｓｃｈｕｌｔｅ， Ｔ．Ｗ． ｅｔ ａｌ．， １９９５， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７０：２４５８５−８； Ｗｈｉｔｅｓｅｌｌ， Ｌ．， ｅｔ ａｌ．， １９９４， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９１：８３２４−８３２８）。あるいはまた、アンサマイシン類は、シャペロン関連タンパク質基質のＡＴＰ依存的放出を阻害するとも報告されている（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ， Ｃ．， Ｌ． ｅｔ ａｌ．， １９９６， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ９３：１４５３６−４１； Ｓｅｐｐ−Ｌｏｒｅｎｚｉｎｏ ｅｔ ａｌ．， １９９５， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７０：１６５８０−１６５８７）。両モデルにて、アンフォールディングされた基質は、プロテアソームにおけるユビキチン依存的プロセスにより分解されると言われている（上述のＳｃｈｎｅｉｄｅｒ， Ｃ．，Ｌ．；上述のＳｅｐｐ−Ｌｏｒｅｎｚｉｎｏ）。
【０００８】
腫瘍細胞および非形質転換細胞の両方において、アンサマイシン類のＨＳＰ９０への結合は、シグナル伝達調節因子のサブセットの分解をもたらすと報告されている。これらには、Ｒａｆ（Ｓｃｈｕｌｔｅ， Ｔ．Ｗ． ｅｔ ａｌ．， １９９７， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ． ２３９：６５５−９； Ｓｃｈｕｌｔｅ， Ｔ．Ｗ．， ｅｔ ａｌ．， １９９５， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７０：２４５８５−８）、核内ステロイド受容体（Ｓｅｇｎｉｔｚ， Ｂ．， ａｎｄ Ｕ． Ｇｅｈｒｉｎｇ． １９９７， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７２： １８６９４−１８７０１； Ｓｍｉｔｈ， Ｄ．Ｆ． ｅｔ ａｌ．， １９９５， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． １５：６８０４−１２）、ｖ−ｓｒｃ（Ｗｈｉｔｅｓｅｌｌ， Ｌ． ｅｔ ａｌ．， １９９４， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９１：８３２４−８３２８）、およびＥＧＦ受容体（ＥＧＦＲ）およびＨｅｒ２／Ｎｅｕ（Ｈａｒｔｍａｎｎ， Ｆ．， ｅｔ ａｌ．， １９９７， Ｉｎｔ． Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ ７０：２２１−９； Ｍｉｌｌｅｒ， Ｐ． ｅｔ ａｌ．， １９９４， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５４：２７２４−２７３０； Ｍｉｍｎａｕｇｈ， Ｅ．Ｇ．， ｅｔ ａｌ．， １９９６， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７１：２２７９６−８０１； Ｓｃｈｎｕｒ， Ｒ． ｅｔ ａｌ．， １９９５， Ｊ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． ３８：３８０６−３８１２）のようなある種の膜貫通チロシンキナーゼ（Ｓｅｐｐ−Ｌｏｒｅｎｚｉｎｏ， Ｌ． ｅｔ ａｌ．， １９９５， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７０： １６５８０−１６５８７）が包含される。これらのタンパク質のアンサマイシン誘導性損失は、ある調節性経路の選択的崩壊を引き起こすと言われ、細胞周期の特定期での成長停止をもたらす（Ｍｕｉｓｅ−Ｈｅｉｍｅｒｉｃｋｓ， Ｒ． Ｃ． ｅｔ ａｌ．， １９９８， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７３：２９８６４−７２）。
【０００９】
Ｃｄｋ４またはＣｄｋ６と複合体状態にあるサイクリンＤおよびサイクリンＥ−Ｃｄｋ２は、網膜芽細胞腫遺伝子Ｒｂのタンパク質産物をリン酸化する。研究者等により、Ｒｂ遺伝子のタンパク質産物は、核リンタンパク質であり、Ｇ１からＳ期への移行に関与する遺伝子の転写を抑制することにより、細胞周期のＧ１期中に細胞を停止させると報告されている（Ｗｅｉｎｂｅｒｇ， Ｒ． Ａ．， １９９５， Ｃｅｌｌ， ８１：３２３−３３０）。脱リン酸化されたＲｂは、ある程度はＥ２Ｆ転写ファミリー成員とのその相互作用により、Ｇ１後期を介した進行を阻害し、最終的にＥ２Ｆ標的遺伝子の転写を阻止すると言われている（Ｄｙｓｏｎ， Ｎ．， １９８８， Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．， １２： ２２４５−２２６２）。Ｇ１中期から後期のサイクリン依存性キナーゼによるＲｂの進行性リン酸化は、Ｒｂ−Ｅ２Ｆ複合体からＲｂを解離させ、Ｅ２Ｆ標的遺伝子の発現およびＳ期への移行が可能となる。
【００１０】
網膜芽細胞腫遺伝子産物は、網膜芽細胞腫、骨肉腫および小細胞肺癌のような幾つかの腫瘍型で突然変異している。研究者等により、多くのさらなるヒトの癌において、結合タンパク質（例えば、子宮頸癌におけるヒトパピローマウイルス−Ｅ７タンパク質； Ｉｓｈｉｊｉ， Ｔ， ２０００， Ｊ Ｄｅｒｍａｔｏｌ．， ２７：７３−８６）による中和または最終的にそのリン酸化の原因となる経路の調節解除により、Ｒｂの機能が崩壊されることも示されている。Ｒｂ経路の不活性化は、多くの場合、ｐ１６ＩＮＫ４ａ、サイクリンＤ１、およびＣｄｋ４の混乱（ｐｅｒｔｕｒｂａｔｉｏｎ）に起因する。
【００１１】
網膜芽細胞腫遺伝子産物は、ヒトパピローマＥ７タンパク質の標的であることに加え、他の発癌性ウイルス遺伝子産物の標的でもある。例えば、研究により、シミアンウイルス４０ラージＴ抗原が、Ｒｂ、ｐ１０７、およびｐ１３０を含むＲｂファミリーのタンパク質を不活性化することが示されている（Ｚａｌｖｉｄｅ， Ｊ．Ｈ． ｅｔ ａｌ．， １９９８， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ．， １８： １４０８−１４１５）。また研究者により、アデノウイルスによる形質転換は、ＲｂへのＥ１Ａ結合を必要とすることが示されている（Ｅｇａｎ， Ｃ． ｅｔ ａｌ．， １９８９， Ｏｎｃｏｇｅｎｅ， ４：３８３−３８８）。
【００１２】
科学者等は、７０種以上の型のパピローマウイルスが、ヒトに感染する（ＨＰＶ）と推定している（Ｓａｓａｇａｗａ， Ｔ． ｅｔ ａｌ．， １９９６， Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｄｉａｇ． Ｌａｂ． Ｉｍｍｕｎｏｌ， ３： ４０３−４１０）。これらのうち数種が、ヒトの悪性腫瘍、特に子宮頸癌に関連する（Ｂｏｓｃｈ ｅｔ ａｌ．， １９９５， Ｊ． Ｎａｔｌ． Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．， ８７：７９６−８０２）。最近の証拠はまた、ＨＰＶが幾つかの頭部癌および頚部癌に関与を示している。幾種の型のＨＰＶは、高い危険性を有する悪性腫瘍に対する媒介物質に関連している（型１６、１８、３１、３３、３５、４５、および５６）（上述のＳａｓａｇａｗａ， Ｔ．， ｅｔ ａｌ．）。これらのＨＰＶによる感染では、ウイルスゲノムが感染細胞のゲノムに組み込まれ、続いてトランスフォーミング遺伝子Ｅ６およびＥ７が発現される。データは、これらの遺伝子産物は、２つの細胞腫瘍抑制タンパク質（ｐ５３およびＲｂ）の機能を改変することにより、悪性腫瘍の形質転換を促進し得ることを示す。Ｅ６は、ｐ５３のタンパク質分解性の分解を引き起こす（Ｓｃｈｅｆｆｎｅｒ ， Ｍ． ｅｔ ａｌ．， １９９０， Ｃｅｌｌ， ６３； １１２９−１１３６）。転写因子Ｅ２ＦからＲｂの放出を引き起こすＲｂとのＥ７複合体は、細胞増殖に関与する遺伝子の活性化を引き起こす（Ｄｙｓｏｎ， Ｎ． ｅｔ ａｌ．， １９８８， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２４３， ９３４−９３７）。
【００１３】
たいていの癌治療は、あらゆる型の癌で成功するわけではない。例えば、固形腫瘍型は、最終的に放射線または化学療法に応答しない。特定の癌型を標的とする癌治療が依然として必要である。本発明は、これらの必要性を満足させ、同様に関連の利点を提供する。本発明は、網膜芽細胞腫陰性または欠損細胞に関連した細胞増殖性障害およびウイルス感染を治療する新規な方法を提供する。
【００１４】
［発明の概要］
本発明は、Ｒｂ陰性または欠損細胞に関連した細胞増殖性障害またはウイルス感染を有する動物、好ましくは哺乳動物の治療に有用な方法に関連する。１つのかかる方法は、有効量の、薬学的に許容可能なキャリアおよび熱ショックタンパク質９０のＮ末端ポケットに結合する化合物を含む薬学的組成物を、Ｒｂ陰性またはＲｂ欠損性である細胞に投与することを含む。好ましい実施形態では、ＨＳＰ９０結合タンパク質は、アンサマイシンである。特に好ましい実施形態では、アンサマイシンは、１７−アリルアミノ−（１７）−デメトキシゲルダナマイシン（１７−ＡＡＧ）である。
【００１５】
本発明はさらに、網膜芽細胞遺伝子産物が欠損している細胞の破壊方法を提供する。１つのかかる実施形態では、上記方法は、有効量のＨＳＰ９０のＮ末端ポケットに結合する化合物を、Ｒｂ陰性またはＲｂ欠損性である細胞に投与することを含む。一実施形態では、ＨＳＰ結合化合物は、アンサマイシンである。特に好ましい実施形態では、アンサマイシンは、１７−ＡＡＧである。
【００１６】
別の実施形態では、本発明は、Ｒｂ陰性またはＲｂ欠損細胞の破壊方法であって、ハービマイシン、ゲルダナマイシン、および１７−ＡＡＧ、ラディシコール、またはＨＳＰ９０のＡＴＰ結合部位であるＨＳＰ９０のＮ末端ポケットに結合する合成化合物からなる群から選択される、ＨＳＰ９０のＮ末端ポケットに結合する化合物を有効量投与することを含む方法を提供する。
【００１７】
上記方法はさらに他の療法と併用して、哺乳動物を治療することを含む。他のかかる療法としては、化学療法、手術、および／または放射線療法が挙げられるが、これらに限定されない。
【００１８】
本発明により、Ｒｂ陰性またはＲｂ欠損性である細胞の破壊方法が提供される。本発明は、Ｒｂウイルス陰性表現型に関連した細胞増殖性障害、ウイルス感染に関連した腫瘍およびある種のウイルス感染を治療する手段を提供する。本発明のこれらおよび他の利点は、以下の記載する詳細な説明および実施例から理解されるであろう。詳細な説明および実施例は、本発明の理解を高めるものであり、本発明の範囲を限定するものと解釈されない。
【００１９】
［発明の詳細な説明］
本発明は、アンサマイシン類が、Ｒｂ陰性またはＲｂ欠損細胞に、有糸分裂停止、続いて迅速なプログラム細胞死を施すという驚くべき発見に関連する。これは、細胞を細胞周期のＧ１で停止させ、続いて場合によっては分化およびアポトーシスを導く野生型レベルのＲｂを含有する細胞のアンサマイシン処理と対照的である。迅速にプログラム細胞死へと導くＲｂ陰性またはＲｂ欠損細胞におけるアンサマイシン類による有糸分裂停止の誘導は、Ｒｂ機能が欠損した細胞に限られた現象である。有糸分裂は、野生型Ｒｂを持つ正常細胞では影響を受けない。したがって、本発明は、小細胞肺癌、網膜芽細胞腫、骨肉腫、ある乳癌、前立腺癌、膀胱癌、悪性肝癌、あるウイルス感染、およびヒトパピローマウイルスにより引き起こされるものを含めたウイルス誘導性腫瘍（例えば、子宮頸癌）のような、Ｒｂ陰性またはＲｂ欠損細胞に関連する細胞増殖性障害の治療を助長するであろう。
【００２０】
本出願の明細書および特許請求の範囲で使用される場合、「Ｒｂ欠損（性）」という用語は、検出可能な量の機能性Ｒｂタンパク質を産生しない細胞を含む数種の型の細胞について記載する。かかる細胞を、本明細書中では「Ｒｂ陰性」細胞と呼ぶ。Ｒｂを欠損した細胞は、機能的Ｒｂ遺伝子を含有しない細胞であってもよい。Ｒｂを欠損した細胞はまた、Ｒｂタンパク質をコードすることができるが、そのタンパク質が適切に機能しないか、または正常レベルより低レベルで産生される細胞であってもよい。Ｒｂ欠損表現型はまた、最終的にＲｂタンパク質のリン酸化をもたらす経路の混乱、例えば、ｐ１６ＩＮＫ４ａ、サイクリンＤ１、またはＣｄｋ４の混乱に起因して生じることができ、かかる混乱を有する細胞は、Ｒｂ欠損細胞である。
【００２１】
本出願の明細書および特許請求の範囲で使用する場合、「ＨＳＰ９０」という用語は、ＨＳＰ９０熱ショックタンパク質ファミリーを指す。したがって、この用語は、Ｈｓｐ９０αおよびＨｓｐ９０β、Ｇｒｐ９４ならびにＴｒａｐ−１を包含する。ＨＳＰ９０熱ショックタンパク質はそれぞれ、ＡＴＰおよびＡＤＰが結合する、タンパク質のＮ末端付近に位置する特徴的なポケットを保有する。これは、アンサマイシン抗生物質に結合することがわかっているのと同じポケットである。このポケットを、本明細書中では「ＨＳＰ９０のＮ末端ポケット」と呼ぶ。
【００２２】
正確なメカニズムはまだ理解されていないが、本出願は、ＨＳＰ９０機能の改変をもたらす様式で、ＨＳＰ９０のＮ末端ポケットに結合する組成物を利用する。本出願の明細書および特許請求の範囲で使用される場合、この機能の改変を、「ＨＳＰ９０機能の阻害」と呼ぶ。本発明によれば、この阻害は、アンサマイシン類のようなＨＳＰ９０結合化合物の投与時に起こり、有糸分裂でのＲｂ陰性または欠損細胞の停止を生じる。かかる細胞は、アポトーシスメカニズムにより一様に死滅する。Ｒｂ陰性または欠損性である細胞を破壊するこの新規メカニズムは、Ｒｂ陰性または欠損性である細胞に関連した細胞増殖性障害およびあるウイルス感染を特異的に治療する手段を提供する。
【００２３】
Ｒｂ陰性または欠損細胞の崩壊は、正常細胞または組織に対して低い細胞毒性を伴って起こり得る。例えば、正常Ｒｂ遺伝子産物を含有する細胞をＨＳＰ９０阻害剤で処理すると、その細胞は、細胞周期のＧ１期で停止し、場合によっては分化および死滅し得る。しかしながら、Ｒｂ陰性または欠損性の細胞は、ＨＳＰ９０阻害剤で処理すると一様に死滅する。さらに、かかる細胞は、他の薬剤または放射線治療の影響を受けやすく、死滅させるのに野生型網膜芽細胞腫遺伝子産物を有する細胞よりも低用量の薬剤が必要であろう。研究により、細胞周期のＧ２／Ｍ期は、細胞周期の最も放射線感受性が高い期であると示されている（Ｓｉｎｃｌａｉｒ， Ｗ．Ｋ， １９６８， ｒａｄｉａｔ． Ｒｅｓ．， ３３：６２０）。
【００２４】
本発明の一実施形態では、Ｒｂ陰性またはＲｂ欠損性の細胞を破壊する本方法で使用するＨＳＰ９０阻害剤のＩＣ５０は、Ｒｂ陰性または欠損性でない同様の細胞に対するＩＣ５０より低い。好ましくは、野生型Ｒｂを含有する類似の細胞と比較すると、ＩＣ５０は、５倍低く、より好ましくは、１０倍低く、さらには２０倍低く、最も好ましくは３０〜５０倍低い。
【００２５】
本明細書中で使用する場合、「ＩＣ５０」は、細胞５０％の死滅を達成するのに必要なＨＳＰ９０阻害剤の濃度と定義される。
【００２６】
本明細書中で使用される場合「有効量」という用語は、治療上の効果を提供することが可能な本発明の方法で利用される化合物の量を意味する。治療上および／または予防上の効果を得るための本発明により投与される化合物の具体的な用量は、当然のことながら、例えば投与化合物、投与経路、治療する状態および治療する個体を含む、その事情を取り巻く特定の環境により決定されるであろう。典型的な日用量（単回用量または分割用量で投与される）は、約０．０１ｍｇ／ｋｇ（体重）〜約５０ｍｇ／ｋｇ（体重）の本発明の活性化合物の投与量レベルを含有するであろう。好ましい日用量は一般に、約０．０５ｍｇ／ｋｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇであり、理想的には約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇであろう。
【００２７】
細胞増殖性障害に関して、本発明の方法の好ましい治療上の効果は、細胞増殖性障害を引き起こすか、またはそれに寄与する細胞の成長の、ある程度までの阻害である。治療上の効果は、細胞増殖性障害の症状の１つまたはそれ以上をある程度軽減する。癌治療に関しては、治療上の効果は、以下の：１）癌細胞数の減少、２）腫瘍サイズの減少、３）周辺器官への癌細胞浸潤の阻害（すなわち、ある程度減速、好ましくは停止）、４）腫瘍転移の阻害（すなわち、ある程度減速、好ましくは停止）、５）腫瘍成長のある程度までの阻害、および／または６）障害に関連した症状の１つまたはそれ以上のある程度までの軽減の１つまたはそれ以上を指す。
【００２８】
癌以外の細胞増殖性障害の治療に関しては、治療上の効果は、１）障害を引き起こす細胞の成長のある程度までの阻害、２）障害を引き起こす因子（例えば、成長因子）の産生のある程度までの阻害、および／または３）障害に関連した症状の１つまたはそれ以上のある程度までの軽減のいずれかを指す。
【００２９】
ウイルス感染に関して、好ましい治療上の効果は、ウイルス感染の阻害である。より好ましくは、治療上の効果は、ウイルスを含有する細胞の破壊である。
【００３０】
本発明の方法は、Ｒｂ陰性またはＲｂ欠損性に関連した細胞増殖性疾患、例えば、網膜芽細胞腫、骨肉腫、乳癌、膀胱癌、前立腺癌、腎癌、ヒトウイルスパピローマウイルスに関連した子宮頸癌のようなウイルス感染に関連した癌、および小細胞肺癌を阻害するのに有用である。さらに、本発明の方法は、ヒトパピローマウイルスのような、Ｒｂ陰性表現型を結果としてもたらすあるウイルス感染の治療に有用である。
【００３１】
「細胞増殖性障害」は、多細胞生物における細胞の１つまたはそれ以上のサブセット（複数可）の望ましくない細胞増殖が生じ、危害、例えば、生物に対する痛みまたは平均余命の減少をもたらす障害を指す。細胞増殖性障害としては、腫瘍、良性腫瘍、血管増殖性障害、自己免疫障害および線維障害が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３２】
本発明の方法は、単独で、あるいは特定の細胞増殖性障害もしくはウイルス感染を治療するのに有用な他の療法または方法と併用して、哺乳動物、好ましくはヒトにて使用され得る。
【００３３】
本発明の使用は、まず細胞増殖性障害またはウイルス感染が、Ｒｂ遺伝子産物の改変遺伝子を含有する細胞に付随して起こるかどうかを同定することにより助成される。かかる障害がいったん同定されれば、かかる障害を患う患者は、医師には既知の手法でそれらの症状を分析することで同定することができる。次に、かかる患者を本明細書に記載するように治療することができる。
【００３４】
細胞増殖性障害がＲｂ遺伝子産物の改変発現に関するかどうかの決定は、まず細胞増殖性障害またはウイルス感染を有することが疑わしい哺乳動物から単離した適切な細胞中のＲｂタンパク質発現を決定することにより実施することができる。例えば、小細胞肺癌の場合では、小細胞肺癌を有することが疑わしい哺乳動物から単離した細胞から決定されたＲｂタンパク質発現を、病気を持たない哺乳動物から単離した適切な細胞と比較することができる。Ｒｂ発現および／または突然変異は、免疫組織化学、サザンブロット分析、およびノーザンブロット分析分析を含むが、これらに限定されない当該技術で既知の方法を用いて測定することができる。Ｒｂ発現を決定するための免疫組織化学（例えば、ウェスタンブロット分析）の使用は、Ｈｉｇａｓｈｉｙａｍ Ｍ ｅｔ ａｌ．， １９９４， Ｏｎｃｏｇｅｎｅ， ５１： ５４４−５１、およびＫｏｈｎ Ｇ．Ｊ． ｅｔ ａｌ．， １９９７， Ｊ． Ｇａｓｒｏｅｎｔｅｒｏｌ． Ｈｅｐａｔｏｌ．， １２： １９８−２０３（これらの参照文献の両方が、その全体を参照により本明細書に援用される）に記載されている。Ｒｂ遺伝子における欠陥を決定するためのサザンブロット分析の使用は、Ｐｒｅｓｔｉ Ｊ．Ｃ． Ｊｒ． ｅｔ ａｌ．， １９９６， Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．， １６：５４９−５６（これは、その全体が参照により本明細書に援用される）により実証されている。ノーザンブロット分析を用いたＲｂ　ｍＲＮＡの測定は、Ｒｙｇａａｒｄ Ｋ． ｅｔ ａｌ．， １９９０， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．， ５０：５３１２−７（これは、その全体が参照により本明細書に援用される）により実証されている。分析により改変Ｒｂ発現の存在が示される場合、その患者は、本明細書中に記載する方法を用いた治療の候補である。
【００３５】
非癌細胞の望ましくない増殖に起因して生じる細胞増殖性障害の場合では、Ｒｂ遺伝子産物レベルを、一般集団に見られるレベル（例えば、細胞増殖性障害を患うヒトまたは動物を除くヒトまたは細胞の一般集団に見られる平均レベル）と比較する。望ましくない細胞増殖障害が、一般集団に見られるレベルよりも異常なＲｂレベルを特徴とする場合、その障害は、本明細書中に記載する方法を用いた治療の候補である。
【００３６】
子宮頸癌とのＨＰＶ関連を決定する方法は、上述のＳａｓａｇａｗａ， Ｔ． ｅｔ ａｌ（これは、参照により本明細書に援用される）に記載されている。
【００３７】
上記に参照したものを含む細胞増殖性障害は、必ずしも独立しているとは限らない。例えば、線維障害は、血管障害に関連し得るか、あるいはそれと共通点があり得る。さらに、例えば、アテローム性動脈硬化症（これは、本明細書中では血管障害として特徴付けられる）は、線維組織の異常形成に関連する。
【００３８】
癌細胞とは、様々な型の悪性新生物を指し、その多くが、Ｓｔｅｄｍａｎ’ｓ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ２５ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ （Ｈｅｎｓｙｌ ｅｄ． １９９０）により定義されるように、周囲組織に侵入することができ、種々の部位へと転移し得る。
【００３９】
血管の形成および拡大、あるいは脈管形成および血管新生はそれぞれ、胚の発達、創傷治癒および臓器再生のような各種の生理学的プロセスにおいて重要な役割を果たす。それらはまた、癌の発達においても役割を果たす。血管増殖障害とは、一般に血管の異常増殖に起因する血管新生疾患および脈管形成障害を指す。かかる障害の例としては、再狭窄、網膜症、およびアテローム性動脈硬化症が挙げられる。
【００４０】
上述のように、他のかかる増殖性疾患は、標準的な技法により、また本明細書中に記載する化合物の作用効率の決定により同定することができる。
【００４１】
Ａ．Ｒｂ陰性または欠損細胞は、アンサマイシンで処理した後に、有糸分裂を停止させる
アンサマイシンもしくはラディシコールで処理したＲｂ陰性または欠損細胞は、双極性紡錘体を含有していることがわかり、サイクリンＢ１関連キナーゼ活性を上昇させた。しかしながら、染色体整列は破壊され、染色体は、紡錘体の長さ方向に沿って分散した。両極で対を成す染色体の存在は、染色体が中期板に整列することができない結果、ＨＡ処理細胞が前中期にて停止したとの結論を導き出した。野生型Ｒｂの導入が薬剤の存在における有糸分裂を介した進行を可能にすることから、この停止は、Ｒｂの欠如に依存していた。Ｓ期中にアンサマイシンで処理すると、Ｒｂ陰性細胞は、続く有糸分裂を阻止するが、Ｒｂ野生型細胞は、有糸分裂を介して進行し、Ｇで停止した。したがって、Ｈｓｐ９０機能が阻害される場合、有糸分裂の完了にはＲｂが必要である。
【００４２】
検査した１２個の腫瘍細胞系では、アンサマイシン処理により、Ｇ１で成長停止が生じた（図１Ａ）。この停止は、Ｄ−サイクリン関連キナーゼ活性の迅速な減退およびＲｂの低リン酸化に随伴し、アンサマイシンが、サイクリンＤ−関連経路を介してＧ１に影響を及ぼすことを示唆した（Ｓｔｒｅｔｈａｐａｋｄｉ， Ｍ．， Ｆ． Ｌｉｕ， Ｒ． Ｔａｖｏｒａｔｈ， ａｎｄ Ｎ． Ｒｏｓｅｎ， ２０００， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ６０： ３９４０−６）。これらの影響は、効力に関してのみ異なる３つのアンサマイシン：ＨＡ、ＧＭおよびその誘導体である１７−アリルアミノ−（１７）デメトキシゲルダナマイシン（１７−ＡＡＧ）により誘発された。主としてＨＡを用いてこれらの実験を行ったが、ゲルダナマイシン、１７−ＡＡＧのようなゲルダナマイシン誘導体、ハービマイシン、およびマクベシン（ｍａｃｂｅｃｉｎ）、またはラディシコールのようなＨＳＰ９０ポケットに結合する他の化合物を含むが、これらに限定されないベンゾキノンアンサマイシン類のような、ＨＳＰ９０ポケットに結合する他のアンサマイシンを用いても同様の効果が得られることが理解されよう。アンサマイシン類が、サイクリンＤ−Ｒｂ経路を阻害することによりＧ１の進行を崩壊するかどうかを決定するために、機能的Ｒｂを欠如した細胞系においてそれらの効果を検査した。Ｒｂは、サイクリンＤ関連キナーゼの唯一知られている基質である（Ｂａｌｄｉｎ， Ｖ．， ｅｔ ａｌ．， １９９３， Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ． ７：８１２−２１； Ｅｗｅｎ， Ｍ．Ｅ．ｅｔ ａｌ．， １９９３， Ｃｅｌｌ ７３：４８７−９７； Ｋａｔｏ， Ｊ．， Ｈ． ｅｔ ａｌ．， １９９３， Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ． ７：３３１−４２； Ｍａｔｓｕｓｈｉｍｅ， Ｈ．， ｅｔ ａｌ．， １９９２， Ｃｅｌｌ ７１：３２３−３４； Ｍａｔｓｕｓｈｉｍｅ， Ｈ．， Ｄ． ｅｔ ａｌ．， １９９４， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． １４： ２０６６−７６； Ｍｅｙｅｒｓｏｎ， Ｍ．， ａｎｄ Ｅ． Ｈａｒｌｏｗ， １９９４， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． １４：２０７７−８６； Ｑｕｅｌｌｅ， Ｄ．Ｅ．， ｅｔ ａｌ．， １９９３， Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ． ７：１５５９−１５７１； Ｇｕａｎ， Ｋ．−Ｌ．， ｅｔ ａｌ．， １９９４， Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ． ８：２９３９−５２； Ｋｏｈ， Ｊ． ｅｔ ａｌ．， １９９５， Ｎａｔｕｒｅ ３７５：５０６−１０； Ｌｕｋａｓ， Ｊ． ｅｔ ａｌ．， １９９５， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． １５：２６００−１ １； Ｌｕｋａｓ， Ｊ．， Ｈ． ｅｔ ａｌ．， １９９４， Ｊ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． １２５：６２５−３８； Ｌｕｋａｓ． Ｊ．， Ｄ． ｅｔ ａｌ．， １９９５， Ｎａｔｕｒｅ ３７５：５０３−６； Ｍｅｄｅｍａ， Ｒ．Ｈ． ｅｔ ａｌ．， １９９５， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ９２：６２８９−９３）。突然変異Ｒｂを有する腫瘍細胞系（ＭＢ−ＭＤＡ　４６８、ＢＴ５４９、ＤＵ１４５、およびＤＵ４４７５）では、ＨＡ処理によりＧ１阻止が誘導されなかったが、代わりに４ｎＤＮＡ量を有する細胞の蓄積を引き起こした（図１Ｂ）。
【００４３】
ＨＡ処理によりＲｂ陰性細胞がＧ２または有糸分裂で停止するかどうかを決定するために、ビスベンズイミド染色により分裂指数を決定し、凝縮染色体の存在により有糸分裂にスコア付けした。ＭＢ−ＭＤＡ４６８細胞では、対照集団の分裂指数が５〜１０％であり、ＨＡ処理細胞の６０〜７０％が、有糸分裂の状態であった。したがって、Ｒｂ機能の非存在下では、ＨＡ処理は、有糸分裂停止をもたらした。
【００４４】
ＨＡ誘導性有糸分裂欠陥の性質をさらに規定するために、ビスベンズイミド、抗α−チュブリン抗体および抗セントロメア自己免疫血清（ＡＣＡ／ＣＲＥＳＴ）で細胞を三重染色した。α−チュブリン染色により、停止細胞は、双極性紡錘体を含有することが明らかとなり、ＨＡは、紡錘体形成を妨害しないことが実証された。しかしながら、ビスベンズイミドおよびＡＣＡ／ＣＲＥＳＴ染色による染色体崩壊の検査により、ほとんどの細胞において、染色体は、両極に、および紡錘体内の両方に局在化することがわかった。
【００４５】
いかなる理論にも拘束されないが、観察された両極での染色体蓄積は、染色体が中期に整列することができないこと、あるいは障害性姉妹染色分体分離を伴う異常後期に起因する前中期の停止のいずれかに一致する。しかしながら、ＡＣＡ染色により、両極で染色体上にセントロメアが明らかとなり、それらが非分離の姉妹染色分体であることを示唆した（図３Ｂ）。両極に局在化した７７個の染色体では、ＡＣＡ染色に関する二重ドットとして８７％のスコアを得た。このことは、両極での染色体蓄積が、未熟または不完全分離に起因するのではなく、対の染色分体が紡錘体赤道面に集合することができないことに起因していたことを実証している。これらのデータは、ＨＡ処理細胞が前中期で停止し、Ｒｂ陰性細胞では、ＨＡが染色体整列を妨害することで有糸分裂停止を誘導することを示す。
【００４６】
前中期と後期とをさらに区別するために、有糸分裂サイクリンの発現および関連キナーゼ活性を評価した。サイクリンＡ関連キナーゼ活性レベルは、前中期では衰退し始めたが、一方サイクリンＢ関連キナーゼ活性は、後期まで上昇したままである（Ｆｕｒｕｎｏ Ｎ．， Ｎ． ｄｅｎ Ｅｉｚｅｎ， ａｎｄ Ｊ． Ｐｉｎｅｓ， １９９９， Ｊ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． １４７：２９５−３０６； Ｔｏｗｎｓｌｅｙ， Ｆ．Ｍ．， ａｎｄ Ｊ．Ｖ．Ｒｕｄｅｒｍａｎ， １９９８， Ｔｒｅｎｄｓ Ｃｅｌ Ｂｉｏｌ． ８：２３８−２４４； Ｚａｃｈａｒｉａｅ， Ｗ．， ａｎｄ Ｋ． Ｎａｓｍｙｔｈ， １９９９， Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ． １３； ２０３９−５８）。ＨＡ阻止集団における分裂指数は、たった６０〜７０％であるため、有糸分裂で停止した細胞を、分裂指数が９０％を超えるゆるく接着した細胞集団を用いてのみ濃縮した。サイクリンＢ１関連キナーゼ活性は、対照と比較してＨＡ処理細胞では５倍の上昇し、ノコダゾールで停止した細胞に見られる活性に匹敵した（図２Ｂ）。キナーゼ活性と並行して、サイクリンＢ１タンパク質発現もまた、ＨＡ処理細胞で増加した（図２Ｂ）。対照的に、サイクリンＡ発現および関連キナーゼ活性は、対照細胞の活性と比較してＨＡおよびノコダゾールで停止した細胞でわずかに減少した。したがって、ＨＡは、サイクリンＡのタンパク質分解が始まり、サイクリンＢ１のタンパク質分解が始まらない後期の初め以前のかつ前期以降の時点での停止を誘導する。この結果は、停止が有糸分裂の前中期で起きることを示す。
【００４７】
野生型ＲＢを有する細胞は、ＨＡの存在下にて有糸分裂を通過する
驚くべきことに、ＨＡ誘導性有糸分裂阻止は、野生型Ｒｂを欠如した細胞においてのみ観察された。ＨＡは、Ｇ１調節因子の発現に影響を及ぼすよりもゆっくりと有糸分裂調節因子の分解を引き起こす可能性が高い。Ｒｂの欠如は、Ｇ１に対する影響を妨げ、有糸分裂表現型を露呈させるであろう。次に、Ｓ期で阻止されたＲｂ陰性細胞へＨＡを添加することにより、薬剤添加直後に有糸分裂にて停止させることはできない。これを実証するために、Ｃｏｌｏ　２０５細胞およびＭＢ−ＭＤＡ　４６８細胞をアフィディコリンでＧ１／Ｓ期で停止させた後、ＨＡまたはＤＭＳＯのいずれかの存在下で、阻止から解放させた。ＨＡの存在下では、Ｒｂ野生型Ｃｏｌｏ２０５細胞は、Ｇ２および有糸分裂を介して進行し、次のＧ１で停止した（図３Ａ）。対照的に、アフィディコリンからの解放後、Ｒｂ陰性ＭＢ−ＭＤＡ４６８細胞は、１２時間以内に次の有糸分裂で停止した（図３Ｂ）。したがって、Ｒｂを含有する細胞は、ＨＡの存在下にて有糸分裂を介して正常に進行することが可能であるが、一方Ｒｂ機能を欠如した細胞は進行することはできない。
【００４８】
ＨＡは、ＨＰＶ１６Ｅ６およびＥ７を発現する一次細胞で、Ｍ停止を誘導し、Ｇ停止を誘導しない
上記の観察は、形質転換を生じるＲｂ突然変異で補足された他の遺伝子中の突然変異に起因し得るかどうかに関して、ＨＡの細胞周期に対する影響を、ヒトパピローマウイルス−１６（ＨＰＶ−１６）Ｅ６およびＥ７を発現する一次ヒト表皮角化細胞（ＨＦＫ）において検査した。これらのウイルス発現遺伝子は、それぞれｐ５３およびＲｂを機能的に不活性化する。ｐ５３野生型バックグランドにおけるＲｂ機能の損失により、細胞がアポトーシスを受けやすくなることが示されていることから、Ｅ６およびＥ７の導入は必須であった（Ｊｏｎｅｓ， Ｄ．Ｌ．， Ｄ．Ａ． Ｔｈｏｍｐｓｏｎ， ａｎｄ Ｋ． Ｍｕｎｇｅｒ， １９９７， Ｖｉｒｏｌｏｇｙ， ２３９：９７−１０７； Ｐａｎ， Ｈ．， ａｎｄ Ａ．Ｅ． Ｇｒｉｅｐ， １９９４， Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ． ８：１２８５−９９； Ｗｈｉｔｅ， Ａ．Ｆ．， Ｅ．Ｍ． Ｌｉｖａｎｏｓ， ａｎｄ Ｔ．Ｄ． Ｔｌｓｔｙ， １９９４， Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ． ８：６６６−７７）。ＨＡは、大部分の一次ＨＦＫ細胞をＧ１で蓄積させる（図４Ａ）一方で、Ｅ６／Ｅ７トランスフェクタントは、４ｎＤＮＡ量で停止した（図４Ｂ）。これらの結果はさらに、ＨＡに対する細胞周期応答が、Ｒｂの状態により左右されること、さらにはＲｂは、薬剤曝露後の有糸分裂移行に必要であるという証拠を提供する。試験した複数のｐ５３陰性／Ｒｂ陽性細胞系が、アンサマイシン類の存在下にて有糸分裂を首尾よく移行するため、ｐ５３機能単独の損失では、有糸分裂阻止には不十分である。
【００４９】
Ｒｂ陰性細胞へのＲｂ導入により、ＨＡ存在下においてＭを介した進行が可能である
Ｓ期で細胞にＨＡを添加することにより、Ｒｂ陰性Ｍｂ−ＭＤＡ　４６８細胞で有糸分裂停止を誘導するが、Ｒｂ野生型Ｃｏｌｏ　２０５細胞を停止させないという発見により、Ｒｂが、これらの条件下で有糸分裂を介して進行することが可能であることが示唆される。このことを試験するために、野生型Ｒｂを、細胞系ＭＢ−ＭＤＡ　４６８に導入した。おそらく高いＲｂ発現が細胞成長を阻害するために、低いトランスフェクション効率が観察された。最終的に５つの陽性クローンが得られた。これらのトランスフェクタントは、Ｒｂ野生型腫瘍細胞系と比較すると、低レベルのＲｂを発現した。異なるレベルのＲｂを発現する２つの安定なトランスフェクトクローン（４６８−７および４６８−１９）を分析用に選択した（図５Ａ）。対数的に成長する集団のＦＡＣＳ分析により、これらのクローン中のＲｂ発現は、細胞周期分布を改変しないが、細胞はわずかに長い倍加時間を有することが明らかになった。ＨＡで処理すると、対照トランスフェクタントは、４ｎＤＮＡ量で蓄積した。対照的に、その薬剤は、ＲｂトランスフェクタントではＧ２／Ｍに対して全く影響せず、その代わりにＧ１での増加をもたらした。さらに、ＨＡによりアフィディコリン阻止から解放されると、両クローン４６８−７および４６８−１９は、有糸分裂を介して循環し、Ｇ１期に入った（図５ＣおよびＤ）。対照的に、アフィディコリン阻止後にＨＡで処理されると、ＭＢ−ＭＤＡ　４６８細胞は、Ｇ１に到達することができず、１２時間のうちに有糸分裂で停止した（図５Ｄ）。アンサマイシン類により誘導される細胞死の量は、Ｒｂトランスフェクト細胞と非トランスフェクト細胞で同様であった。したがって、Ｒｂトランスフェクタントでは、Ｇ１での高い割合の細胞の出現は、Ｇ２／Ｍでの細胞のアポトーシスの増加に起因しない。これらの細胞系はＲｂ状態のみ異なるため、この見解は、ＨＡ存在下において有糸分裂を介して進行させるのにはＲｂ発現のみで十分であることを実証している。
【００５０】
ラディシコールによるＨｓｐ９０の阻害により、ＭＢ−ＭＤＡ４６８細胞において有糸分裂停止が誘導される
ＨＡは、Ｈｓｐ９０に結合するが、その化学的特性に関する他の影響を及ぼし得る。ＧＭおよび１７−ＡＡＧで処理すると、ＨＡを用いた場合に観察されるように、同一のＲｂ依存性細胞周期プロフィールおよび有糸分裂表現型が発生した。ラディシコールは、Ｎ末端Ｈｓｐ９０ポケットに結合し（Ｓｃｈｕｌｔｅ， Ｔ． ｅｔ ａｌ．， １９９９， Ｍｏｌ． Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ． １３：１４３５−１４４８； Ｓｃｈｕｌｔｅ， Ｔ． ｅｔ ａｌ．， １９８８， Ｃｅｌｌ Ｓｔｒｅｓｓ Ｃｈａｐｅｒｏｎｅｓ ３：１００−８）、アンサマイシン類が影響を及ぼす同一範囲のタンパク質の分解を誘導する（Ｓｏｇａ， Ｓ． ｅｔ ａｌ．， １９９８， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７３：８２２−８２８）ことがわかっている非アンサマイシン系天然産物である。ラディシコール処理は、Ｒｂ陽性細胞系であるＣｏｌｏ２０５およびＭＣＦ７でＧ１停止を誘導するが、Ｒｂ陰性ＭＤＡ−４６８細胞をＧ２で停止できず、その代わりにアンサマイシンと同様に、４ｎＤＮＡ量を有する細胞を蓄積させた。ラジコールで停止したＭＤＡ４６８細胞はまた、両極に局在化した染色体、ならびに紡錘体に沿って散在した染色体を示した。
【００５１】
Ｂ．投与および薬学的組成物
本発明の方法で利用される化合物は、単独で、あるいは標準的な薬学的実践にしたがって、薬学的組成物中にて薬学的に許容可能なキャリア、賦形剤または希釈剤と併用して投与してもよい。化合物は、経口的に、あるいは静脈内、筋内、腹腔内、皮下、経直腸、および局所的投与経路を含めた非経口的に投与することができる。
【００５２】
本発明の方法で使用される薬学的組成物は、経口用途に適した形態、例えば、錠剤、トローチ剤、ロゼンジ、水性または油性懸濁剤、分散性散剤または顆粒剤、乳剤、硬質または軟質カプセル、あるいはシロップ剤またはエリキシル剤にて有効成分を含有することができる。経口用途を対象とする組成物は、薬学的組成物の製造に関して当該技術分野で既知の任意の方法にしたがって調製されてもよく、かかる組成物は、薬学的に洗練され口に合う調製物を提供するために、甘味剤、香料剤、着色剤、および防腐剤からなる群から選択される１つまたはそれ以上の薬剤を含有してもよい。錠剤は、錠剤を製造するのに適切な無毒性の薬学的に許容可能な賦形剤と混合して有効成分を含有する。これらの賦形剤は、例えば、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、ラクトース、リン酸カルシウムまたはリン酸ナトリウムのような不活性希釈剤、微結晶性セルロース、クロスカルメロースナトリウム、コーンスターチまたはアルギン酸のような顆粒剤または崩壊剤、結合剤（例えば、デンプン、ゼラチン、ポリビニル−ポリピロリドンまたはアラビアゴム）、および潤滑剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸またはタルク）であり得る。錠剤は、コーティングされなくてもよく、あるいは薬剤の不快な風味を遮断するか、または胃腸管での崩壊および吸収を遅延させて、それにより長期にわたる持続性作用を提供する既知の技法によりコーティングしてもよい。例えば、ヒドロキシプロピルメチルセルロースまたはヒドロキシプロピルセルロースのような遮断物質、あるいはエチルセルロース、セルロースアセテートブチレートのような時間遅延物質を使用してもよい。
【００５３】
経口用途のための配合物はまた、有効成分を不活性固体希釈剤（例えば炭酸カルシウム、リン酸カルシウムまたはカオリン）と混合した硬質ゼラチンカプセル、または有効成分をポリエチレングリコールまたは油媒質（例えば、ピーナッツ油、流動パラフィン、またはオリーブ油）のような水溶性キャリアと混合した軟質ゼラチンカプセルとして提供されてもよい。
【００５４】
水性懸濁液剤は、水性懸濁剤の製造に適した賦形剤と混合して活性物質を含有する。かかる賦形剤は、懸濁剤（例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、ポリビニル−ピロリドン、トラガカントゴム、およびアラビアゴム）である。分散剤または湿潤剤は、天然に存在するホスファチド（例えば、レシチン）、またはアルキレンオキシドと脂肪酸との縮合生成物（例えば、ステアリン酸ポリオキシエチレン）、またはエチレンオキシドと長鎖脂肪族アルコールとの縮合生成物（例えば、ヘプタデカエチレン、オキシセタノール）、またはエチレンオキシドと、脂肪酸およびヘキシトールに由来する部分エステルとの縮合生成物（例えば、モノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビトール）、またはエチレンオキシドと、脂肪酸およびヘキシトール無水物に由来する部分的エステルとの縮合生成物（例えば、モノオレイン酸ポリエチレンソルビタン）であり得る。水性懸濁剤はまた、１つまたはそれ以上の防腐剤（例えば、ｐ−ヒドロキシ安息香酸エチルまたはｎ−プロピル）、１つまたはそれ以上の着色剤、１つまたはそれ以上の香料、および１つまたはそれ以上の甘味剤（例えば、ショ糖、サッカリンまたはアスパルテーム）を含有してもよい。
【００５５】
油性懸濁剤は、植物油、例えば、落花生油、オリーブ油、ゴマ油またはヤシ油中に、あるいは流動パラフィンのような鉱油中に有効成分を懸濁させることで配合してもよい。油性懸濁剤は、増粘剤（例えば、蜜蝋、固形パラフィンまたはセチルアルコール）を含有してもよい。口に合う経口調製物を提供するために、上述のような甘味剤、および風味剤を添加してもよい。これらの組成物は、ブチル化ヒドロキシアニソールまたはα−トコフェロールのような酸化防止剤を添加することで保存され得る。
【００５６】
水を添加することによる水性懸濁剤の調製に適切な分散性散剤および顆粒剤は、分散剤または湿潤剤、懸濁剤および１つまたはそれ以上の防腐剤と混合して有効成分を提供する。かかる分散剤または湿潤剤、および懸濁剤は、すでに上述で例示してある。さらなる賦形剤、例えば、甘味剤、風味剤および着色剤が存在してもよい。これらの組成物は、アスコルビン酸のような酸化防止剤を添加することで保存され得る。
【００５７】
本発明の方法で使用する薬学的組成物はまた、水中油型乳剤の形態であってもよい。油相は、植物油（例えば、オリーブ油または落花生油）、または鉱油（例えば、流動パラフィン）、あるいはこれらの混合物であり得る。適切な乳化剤は、天然に存在するホスファチド（例えば、ダイズレシチン）、および脂肪酸およびヘキシトール無水物に由来するエステルまたは部分的エステル（例えば、モノオレイン酸ソルビタン）、および上記部分的エステルとエチレンオキシドとの縮合生成物（例えば、モノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン）であり得る。乳化剤はまた、甘味剤、風味剤、防腐剤、および酸化防止剤を含有してもよい。
【００５８】
シロップ剤またはエリキシル剤は、甘味剤、例えば、グリセロール、プロピレングリコール、ソルビトール、またはショ糖を用いて配合してもよい。かかる配合物はまた、粘滑約、防腐剤、風味剤、着色剤、および酸化防止剤を含有してもよい。
【００５９】
薬学的組成物は、滅菌注射用水溶液の形態であってもよい。使用してもよい許容可能な媒質および溶媒としては、水、リンゲル溶液および等張塩化ナトリウム溶液である。
【００６０】
無菌注射用調製物はまた、有効成分が油相に溶解している滅菌注射用水中油型ミクロエマルジョンであってもよい。例えば、有効成分をまずダイズ油とレシチンの混合物中に溶解する。次に、油性溶液を水とグリセロールの混合物中に導入して、処理して、ミクロエマルジョンを形成する。
【００６１】
注射用溶液またはミクロエマルジョンは、局所的ボーラス注射により患者の血流に導入してもよい。あるいは、一定の循環濃度の本発明の化合物を維持するように、溶液またはミクロエマルジョンを投与することは好適であり得る。かかる一定濃度を維持するために、連続静脈内送達装置を利用してもよい。かかる装置の例としては、ＤｅｌｔｅｃのＣＡＤＤ−ＰＬＵＳ（登録商標）モデル５４００静脈内ポンプである。
【００６２】
薬学的組成物は、筋内および皮下投与用の無菌注射用水性懸濁液または油性懸濁液の形態であってもよい。この懸濁液は、上述の適切な分散剤または湿潤剤、および懸濁剤を用いて、既知の技術にしたがって配合してもよい。無菌注射用調製物はまた、無毒性の非経口的に許容可能な希釈剤または溶媒中の無菌注射用溶液あるいは懸濁液、例えば、１，３−ブタンジオール中の溶液であってもよい。さらに、溶媒または懸濁用媒質として無菌不揮発性油が従来使用されている。この目的で、合成モノグリセリドまたはジグリセリドを含む任意の無刺激不揮発性油を使用してもよい。さらに、オレイン酸のような脂肪酸は、注射用調製物で使用される。
【００６３】
本発明の方法で使用されるＨＳＰ９０阻害剤はまた、薬剤の直腸投与用の坐剤の形態で投与されてもよい。これらの組成物は、常温で固体であるが、直腸の温度で液体であり、したがって直腸で溶融して薬剤を放出するような適切な非刺激性賦形剤と阻害剤を混合することで調製することができる。かかる物質としては、カカオ脂、グリセリンゼラチン、水素化植物油、様々な分子量を有するポリエチレングルコールの混合物、およびポリエチレングリコールの脂肪酸エステルが挙げられる。
【００６４】
局所用途に関しては、ＨＳＰ９０阻害剤を含有するクリーム、軟膏、ゼリー、溶液または懸濁液等を使用することができる。（本明細書中で使用する場合、局所用途は、うがい薬および含そう薬を包含し得る）。
【００６５】
本発明の方法で使用する化合物は、適切な鼻腔内媒質および送達デバイスの局所使用による鼻腔内形態で、あるいは当業者に既知の経皮的皮膚パッチの形態を用いた経皮経路により投与することができる。経皮送達系の形態で投与するには、投薬は、当然のことながら、投薬レジメン全体にわたって断続的ではなく連続的であろう。
【００６６】
本発明で使用するＨＳＰ９０阻害剤はまた、治療される状態に対する特定の有用性に関して選択される他の既知の治療薬と同時投与してもよい。例えば、本発明の化合物は、既知の抗癌剤および細胞障害剤と併用して有用であり得る。同様に、本発明の化合物は、Ｒｂ陰性表現型と関連したあるウイルス感染または他の状態の治療および防止にて有効な薬剤と併用して有用であり得る。本発明の化合物は、細胞増殖を開始させる核シグナルに対する細胞表面増殖因子受容体に関連するシグナル伝達経路の一部の他の阻害剤と併用しても有用であり得る。
【００６７】
本発明の方法はまた、血管新生を阻害し、それにより腫瘍細胞の成長および浸潤を阻害する他の薬剤（これには、リボザイムおよびＶＥＧＦ受容体を標的としたアンチセンスを含むＶＥＧＦ受容体阻害剤、アンジオスタチンならびにエンドスタチンが含まれるが、これらに限定されない）を用いても有用であり得る。
【００６８】
本発明の方法と併用して使用することができる抗腫瘍剤の例としては一般に、アルキル化剤、代謝拮抗剤、エピドフィロトキシン、抗腫瘍性酵素、トポイソメラーゼ阻害剤、プロカルバジン、ミトキサントロン、白金配位錯体、生物学的応答改質剤および成長阻害剤、ホルモン性／抗ホルモン性治療薬および造血成長因子が挙げられる。
【００６９】
抗腫瘍剤の実例類としては、例えば、アントラサイクリン群の薬剤、ビンカ薬、マイトマイシン類、ブレオマイシン類、細胞障害性ヌクレオシド、エポチロン類、ディスコデルモリド、プテリジン群の薬剤、ジイネン類およびポドフィロトキシン類が挙げられる。これらの種類のうち特に有用な成員としては、例えば、カルミノマイシン、ダウノルビシン、アミノプテリン、メトトレキサート、メトプテリン、ジクロロメトトレキサート、マイトマイシンＣ、プロフィロマイシン（ｐｏｒｆｉｒｏｍｙｃｉｎ）、５−フルオロウラシル、６−メルカプトプリン、ゲムシタビン、シトシンアラビノシド、ポドフィロトトキシンまたはエトポシド、リン酸エトポシドまたはテニポシドのようなポドフィロトキシン誘導体、メルファラン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ロイロシジン（ｌｅｕｒｏｓｉｄｉｎｅ）、ビンデシン、ロイロシン、パクリタキセル等が挙げられる。他の有用な抗腫瘍剤としては、エストラムスチン、カルボプラチン、シクロホスファミド、ブレオマイシン、ゲムシタビン、イホサミド、メルファラン、ヘキサメチルメラミン、チオテパ、シタラビン、イダトレキサート、トリメトレキサート、ダカルバジン、Ｌ−アスパラギナーゼ、カンプトテシン、ＣＰＴ−ＩＩ、トポテカン、アラＣ、ビカルタミド、フルタミド、ロイプロリド、ピリドベンゾインドール誘導体、インターフェロン、およびインターロイキンが挙げられる。
【００７０】
本発明の方法で使用するＨＳＰ９０阻害剤を、ヒト被験体に投与する場合、一投与量は通常、処方医により決定され、投与量は一般に、個々の患者の年齢、体重および応答、ならびに患者の症状の重篤性により様々である。
【００７１】
１つの例示的用途では、適切な量のＨＳＰ９０阻害剤が、癌治療を受ける哺乳動物に投与される。１日当たり約０．１ｍｇ／ｋｇ（体重）〜約６０ｍｇ／ｋｇ（体重）、好ましくは１日当たり約０．５ｍｇ／ｋｇ（体重）〜約４０ｍｇ／ｋｇ（体重）の各型の阻害剤量で、投与が行われる。本発明の組成物を含む特定の治療投与量は、約０．０１ｍｇ〜約１０００ｍｇのＨＳＰ９０阻害剤を含む。好ましくは、投与量は、約１ｍｇ〜約１０００ｍｇのＨＳＰ９０阻害剤を含む。
【００７２】
好ましくは、薬学的調製物は、単位投薬形態である。かかる形態では、調製物を、適切な量の活性成分（例えば所望の目的を達成するのに有効な量）を含有する単位用量に細分する。
【００７３】
調製物の単位用量中の活性化合物量は、特定用途に応じて、約０．１ｍｇ〜１０００ｍｇ、好ましくは約１ｍｇ〜３００ｍｇ、より好ましくは１０ｍｇ〜２００ｍｇに変化または調節してもよい。
【００７４】
使用する実際の投与量は、患者の要件および治療する状態の重篤性に応じて様々であり得る。特定状況に関する適した投与量の決定は、当業者の範囲内である。一般に、治療は、化合物の最適用量未満の少量の投与量から開始される。その後、その状況下で最適な効果に到達するまで、少量ずつ投与量を増加する。便宜上、全１日投与量を分割して、その日のうちに分けて投与してもよい。
【００７５】
本発明の方法で使用するＨＳＰ９０阻害剤の投与の量と頻度、ならびに適用可能であれば他の化学療法剤および／または放射線療法は、患者の年齢、状態および大きさ、ならびに治療する疾患の重篤性のような要因を考慮して、主治医（医師）の判断に従って調節されるであろう。
【００７６】
化学療法剤および／または放射線療法は、当該技術分野で既知の治療プロトコルに従って施すことができる。化学療法剤および／または放射線療法の適用は、治療する疾患、ならびにその疾患に対する化学療法剤および／または放射線療法の既知の効果に応じて様々であり得ることは、当業者には明らかであろう。また、熟練臨床医の知識にしたがって、治療プロトコル（例えば、投薬量および投与期間）は、患者に対する投与した治療薬（すなわち、抗腫瘍剤または放射線）の観察される効果を考慮して、また投与した治療薬に対する疾患の観察される効果を考慮して変更してもよい。
【００７７】
また、一般に、ＨＳＰ９０阻害剤および化学療法剤は、同じ薬学的組成物中で投与する必要はなく、種々の物理的特性および化学的特性により、異なる経路で投与しなくはならない。例えば、ＨＳＰ９０阻害剤は経口投与されて、その良好な血中レベルをもたらして維持し得る一方で、化学療法剤は静脈内に投与され得る。同じ薬学的組成物中での投与様式および投与の適否の決定は、可能である場合、十分に熟練臨床医の知識内にある。初期投与は、当該技術分野で既知の確立されたプロトコルに従って行うことができ、続いて、観察される効果に基づいて、熟練臨床医は投与様式および投与回数を変更することができる。
【００７８】
ＨＳＰ９０阻害剤の特定の選択、ならびに化学療法剤および／または放射線は、主治医の診断および患者の状態と適切な治療プロトコルの彼等の判断次第であろう。
【００７９】
ＨＳＰ９０阻害剤、ならびに化学療法剤および／または放射線は、増殖性疾患の性質、患者の状態、ならびにＨＳＰ９０阻害剤と併せて投与される（すなわち、単一治療プロトコル内で）化学療法剤および／または放射線の実際の選択に応じて、ともに（例えば、同時に、本質的に同時に、または同じ治療プロトコル内で）、または順次投与してもよい。
【００８０】
ＨＳＰ９０阻害剤、ならびに化学療法剤および／または放射線が同時または本質的に同時に投与されない場合、ＨＳＰ９０阻害剤、ならびに化学療法剤および／または放射線の初期の投与順序は、重要ではない。したがって、ＨＳＰ９０阻阻害剤を最初に投与して、続いて化学療法剤および／または放射線を投与してもよく、あるいは化学療法剤および／または放射線を最初に投与して、続いてＨＳＰ９０阻害剤を投与してもよい。この交互の投与を単一治療プロトコル中に繰り返してもよい。投与順序、および治療プロトコル中の各治療薬の投与反復回数のの決定は、治療する疾患と患者の状態を評価した後には、十分に熟練臨床医の知識内である。例えば、特に化学療法剤および／または放射線が細胞障害性薬剤である場合、それをまず投与し、次に治療はＨＳＰ９０阻害剤の投与を続け、好適であると決定される場合、続いて治療プロトコルが完了するまで、化学療法剤および／または放射線の投与等々を行ってもよい。
【００８１】
したがって、治療が進むにつれ、経験および知識にしたがって、個々の患者の必要性に応じて治療の成分（治療薬、すなわち、ＨＳＰ９０阻害剤、化学療法剤または放射線）の投与に関するそれぞれのプロトコルを変更することができる。
【００８２】
治療が投与した投与量で有効であるかどうかを判断する際に、主治医は、患者の一般的健康状態、ならびに疾患関連症状の軽減、腫瘍成長の抑制、腫瘍の実際の縮小、または転移の抑制のようなより明確な徴候を考慮するであろう。腫瘍サイズは、放射線医学的研究のような標準的方法、例えばＣＡＴまたはＭＲＩスキャンで測定することができ、一連の測定を用いて、腫瘍成長が遅延、さらには縮退するか否かを判断することができる。疼痛のような疾患関連症状の軽減、および全体の状態の改善は、治療の有効性の判断の手助けとして使用することができる。
【００８３】
以下の実施例は限定的でなく、本発明の様々な態様および特徴の単なる代表例に過ぎない。上記および下記で参照した参照文献はすべて、参照により本明細書に援用される。
【００８４】
実施例
実施例１：機能的Ｒｂタンパク質を有する細胞および機能的Ｒｂタンパク質を欠如した細胞に対するアンサマイシン類の影響
細胞培養：
ヒト乳癌細胞系ＭＢ−ＭＤＡ　４６８、ＭＣＦ７およびＢＴ−５４９、ならびに結腸癌腫細胞系Ｃｏｌｏ　２０５をＡＴＣＣから入手した。乳細胞系をＤＭＥ−Ｆ１２培地中に、Ｃｏｌｏ　２０５細胞をＲＰＭＩ中に維持した。両培地には、５％ウシ胎児血清（ＢＲＬ）、２ｍＭグルタミン、それぞれ５０ｕ／ｍｌのペニシリンおよびストレプトマイシンを補充した。細胞すべてを５％ＣＯ２中で３７にてインキュベートした。
【００８５】
ＤＭＳＯ中に溶解した２５０ｎｇ／ｍｌのハービマイシンＡ（Ｇｉｂｃｏ）または４３５ｎＭのラディシコール（Ｓｉｇｍａ）で細胞を２４時間処理した。
【００８６】
処理後、核を臭化エチジウムで染色して、フローサイトメトリーで分析することができる。
【００８７】
フローサイトメトリー
臭化エチジウムで染色した核をフローサイトメトリーアッセイ用に単離し、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎの蛍光標示式細胞分取器を用いて分析した。Ｍｕｌｔｉｃｙｃｌｅプログラムソフトウェアを用いて、統計学的データが得られた。
【００８８】
結果：
図１に示すように、検査した１２個の腫瘍細胞系では、アンサマイシン処理は、成長をＧ１で停止させた。突然変異Ｒｂを有する腫瘍細胞系では、ＨＡ処理は、Ｇ１阻止を誘導しなかったが、その代わりに４ｎＤＮＡ量を有する細胞の蓄積という結果をもたらした（図１Ｂ）。
【００８９】
実施例２：ＨＳＰ９０阻害剤で処理したＲｂ陰性細胞およびＲｂ陽性細胞における細胞停止の分析
分裂指数：
分裂指数のために、細胞をトリプシン処理し、ＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳ中の３％パラホルムアルデヒドで２０分間固定した。次に、３μｇ／ｍｌのビスベンズイミド（Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３２５８； Ｓｉｇｍａ）で１５分間細胞を染色し、蛍光顕微鏡下で検査した。凝集染色体の存在により有糸分裂をスコア付けした。
【００９０】
免疫蛍光分析：
免疫蛍光分析のために、収集した細胞をＰＢＳで洗浄し、−２０℃で２０分間メタノールで固定し、再び洗浄して、ＰＢＳ中の２％ＢＳＡで３０分間ブロックした。次に、ＰＢＳ中の２％ＢＳＡ中の抗−α−チュブリン（Ｓｉｇｍａ）および抗セントロメアタンパク質抗体（ＡＣＡ／ＣＲＥＳＴ）（Ｊ．Ｄ． Ｒａｔｔｎｅｒ博士から提供）で１時間、細胞を染色した。ＰＢＳ中の０．５％ＢＳＡで３回洗浄した後、ＰＢＳ中の２％ＢＳＡ中の抗ヒトＦＩＴＣ複合抗マウスローダミン複合抗体（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）および２μｇ／ｍｌビスベンズイミドとともに４５分間細胞をインキュベートした。次に、ＰＢＳ中の０．５％ＢＳＡで４回細胞を洗浄し、ＰＢＳ中に再懸濁させて、共焦点鏡検により、あるいはＣＣＤカメラを用いて画像をとらえた。次にＳｌｉｄｅｂｏｏｋ３．０およびＡｄｏｂｅ　ｐｈｏｔｏｓｈｏｐプログラムソフトウェアを用いて画像を処理した。
【００９１】
同調性実験のために、１μｇ／ｍｌのアフィディコリン（Ｓｉｇｍａ）で１８時間、細胞を処理し、洗浄して、ＤＭＳＯまたはＨＡを含有する培地中で再度平板培養した。
【００９２】
結果：
図３に示すように、α−チュブリン染色は、停止細胞が双極性紡錘体を含有していたことを実証し、アンサマシン類が紡錘体形成を妨害しないことを示す。さらに、たいていの細胞で、染色体は、両極に、および紡錘体内に局在化していた（図３Ａ）。ＡＣＡ染色により、両極において染色体上で対をなすセントロメアが明らかとなった（図３Ｂ）。両極に局在化した７７個の染色体では、ＡＣＡ染色に関する二重ドットとして８７％のスコアを得ており、両極での染色体の蓄積が、未熟または不完全分離の結果ではなく、対をなす染色分体が紡錘体赤道面に集合することができないことの結果であることを示す。これらのデータは、ＨＡ処理細胞が前中期で停止し、Ｒｂ陰性細胞では、ＨＡは、染色体整列を妨害することで有糸分裂停止を誘導することを示す。
【００９３】
実施例３：有糸分裂サイクリンの測定
イムノブロット分析：
ハービマイシンで停止させたＭＢ−ＭＤ　４６８細胞中の有糸分裂サイクリン発現および関連キナーゼ活性のレベルを、以下に示すようにイムノブロット分析およびｉｎ　ｖｉｔｒｏキナーゼアッセイを用いて評価した。ハービマイシンとともに培養した細胞を、分裂指数が９０％を超えるゆるく接着した集団のみを用いることで有糸分裂的に停止した細胞に関して濃縮した。
【００９４】
ＤＭＳＯ、ノコダゾールまたはハービマイシンで処理した細胞由来の溶解産物のイムノブロット分析を、抗サイクリンＡまたは抗Ｂ１抗体を用いたウェスタンブロット分析により分析した。処理細胞を収集し、ＰＢＳで洗浄して、氷上で３０分間、ＮＰ４０溶解緩衝液（５０ｍＭ　トリスｐＨ７．４、１％　ＮＰ４０、１５０ｍＭ　ＮａＣｌ、４０ｍＭ　ＮａＦ、１ｍＭ　Ｎａ３ＶＯ４、１ｍＭ　フッ化フェニルメチルスルホニル、ならびにそれぞれ１０μｇ／ｍｌのロイペプチン、アプロチニンおよびダイズトリプシン阻害剤）中に溶解させた。溶解産物を１５，０００×ｇで１０分間遠心分離し、ビシンコニン酸タンパク質アッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ）によりタンパク質濃度を決定した。等量の全タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分解して、エレクトロブッティングによりイモビロンＰＶＤＦ膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）上に転写した。ブロットをＴＢＳ−Ｔ（０．１％ツィーン−２０ＴＢＳ、１０ｍＭ　トリスｐＨ７．４、１５０ｍＭ　ＮａＣｌ）中の５％脱脂乳中にて４℃で一晩ブロックした後、抗サイクリンＡまたはサイクリンＢ１抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を用いてプローブした。ＨＲＰ結合二次抗体とともにインキュベーションした後に、化学発光（Ａｍｅｒｓｈａｍ）によりタンパク質を検出した。
【００９５】
免疫沈降およびｉｎ　ｖｉｔｒｏキナーゼアッセイ：
免疫沈降のために、全タンパク質１００μｇを抗サイクリンＡまたは抗サイクリンＢ１（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）抗体とともに４℃で２時間、続いてプロテインＡ−セファロースの添加後に１時間インキュベートした。免疫複合体を溶解緩衝液で４回洗浄し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ試料緩衝液中で５分間沸騰させた。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後、タンパク質をイモビロン上に転写し、ウェスタンブロッティングで分析した。
【００９６】
ｉｎ　ｖｉｔｒｏキナーゼ反応のために、免疫複合体を溶解緩衝液で４回、キナーゼ緩衝液（２０ｍＭのトリスｐＨ７．４、７．５ｍＭ　ＭｇＣｌ２、１ｍＭ　ＤＴＴ）で２回洗浄し、ヒストンＨＩ　２μｇ、［γ−３２Ｐ］ＡＴＰ　１０μＣｉ、および３００μＭ　ＡＴＰを含有するキナーゼ緩衝液４０μｌ中で３７℃にて１０分間インキュベートした。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ試料緩衝液を添加することで反応を停止し、５分間沸騰させた。タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分解し、イモビロン上に転写し、オートラジオグラフィフィルムまたはホスホイメージャースクリーンに曝露させた。ＦＵＪＩＸホスホイメージャーおよびＭａｃＢＡＳプログラムソフトウェアによりキナーゼ活性を定量化した。
【００９７】
結果：
対照と比較してＨＡ処理細胞では、サイクリンＢ１関連キナーゼ活性は５倍増加し、ノコダゾール停止細胞で見られる活性に匹敵していた（図４Ｂ）。サイクリンＢ１タンパク質発現もまた、ＨＡ処理細胞で増加した（図４Ｂ）。対照的に、サイクリンＡ発現およびその関連キナーゼ活性は、対照細胞と比較してＨＡおよびノコダゾール停止細胞ではわずかに下回った（図４Ａ）。
【００９８】
実施例４：ヒトパピローマウイルス−１６Ｅ６およびＥ７を発現する細胞中のハービマイシンの影響
ＨＰＶ−１６Ｅ１６および１７でトランスフェクトした一次ヒト表皮角化細胞は、Ｈ． Ｓｔｏｐｐｌｅｒ博士およびＲ． Ｓｃｈｌｅｇｅｌ博士（Ｇｅｏｒｇｅｔｏｗｎ Ｕｎｉｖ．）から提供され、それを上述のように成長させた。一次ヒト表皮角化細胞またはＨＰＶ１６Ｅ６／Ｅ７トランスフェクトヒト表皮角化細胞をＨＡまたはＤＭＳＯで２４間処理して、臭化エチジウムで染色した核を上述のようにフローサイトメトリーで分析した。
【００９９】
結果：
ＨＡは、大部分の一次ＨＦＫ細胞をＧ１期に蓄積させ（図６Ａ）、対比してＥ６／Ｅ７トランスフェクタントは、４ｎＤＮＡ量を伴って停止した（図６Ｂ）。
【０１００】
実施例５：Ｒｂ陰性細胞へのＲｂ遺伝子のトランスフェクション
Ｒｂトランスフェクション：
Ｒｂ遺伝子の遺伝子産物がＨＳＰ９０阻害剤の存在下にて有糸分裂を介して進行させることをさらに確認するために、ＭＢ−ＭＤＡ　４６８細胞を、完全長４．７ｋｂのヒトＲｂ　ｃＤＮＡを含有するプラスミドｐＵＨＤ１０−３ＨＧＲでトランスフェクトした。Ｒｂトランスフェクタントを、５％ウシ胎児血清（ＢＲＬ）、２ｍＭグルタミン、ならびにそれぞれ５０μｇ／ｍｌのペニシリンおよびストレプトマイシン、および１００μｇ／ｍｌのハイグロマイシンＢ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を補充したＤＭＥ−Ｆ１２培地中で成長させた。Ｒｂ遺伝子産物の存在を確認するために、本明細書に記載するように、抗Ｒｂ抗体（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を用いてウェスタンブロット分析を実施した。ベクター対照、ＭＢ−ＭＤＡ　４６８、およびＲｂトランスフェクトＭＢ−ＭＤＡ　４６８細胞を、上述のようにアフィディコリンで停止させた。アフィディコリン停止から解放した後、トランスフェクトＭＭ−ＭＤＡ　４６８細胞および非トランスフェクトＭＭ−ＭＤＡ　４６８細胞を、実施例１に記載するように、アンサマイシン阻害剤の存在下で培養した。上述のように、臭化エチジウムで染色した核のフローサイトメトリーによる分析で、細胞進行をモニターした。
【０１０１】
結果：
ＨＡで処理すると、対照トランスフェクタント（ＭＢ−ＭＤＡ　４６８細胞）は、４ｎＤＮＡ量を伴って蓄積した。対照的に、Ｒｂトランスフェクタント（４６８−７、４６８−１９）では、ＨＡはＧ１期を増加させ、Ｇ２／Ｍには影響を及ぼさなかった（データは示さず）。ＨＡによりアフィディコリン阻止から解放すると、Ｒｂトランスフェクタントは有糸分裂を介して循環し、Ｇ１に入った（図５Ｃ〜５Ｄ）。対照的に、アフィディコリン阻止後にＨＡで処理すると、ＭＢ−ＭＤＡ　４６８細胞は、Ｇ１に到達することができず、１２時間のうちに有糸分裂で停止した（図５Ｂ）。
【０１０２】
本明細書中で言及した特許および刊行物はすべて、本発明が関連する技術の当業者水準を示す。本開示中に引用した参考文献はすべて、それぞれの参照文献が別個にその全体を参照として援用されたのと同程度に、参照により本明細書に援用される。参照文献は先行技術とは認識されない。
【０１０３】
本発明が、課題を実施し、記載した目的および利点、ならびにそこに本来備わっているものを獲得するのに十分に適応することが当業者には容易に認識されよう。好ましい実施形態の現在の代表例として本明細書中に記載した方法および組成物は例示であり、本発明の範囲を限定するものであると解釈されない。当業者は、そこでの変更、および他の使用を思い付くであろうが、それは本発明の精神内に包含され、特許請求の範囲により規定される。
【０１０４】
本発明の範囲および精神を逸脱することなく、本明細書中で開示した発明に対して、様々な置換および変更を実施してもよいことは当業者には容易に明らかとなるであろう。したがって、このようなさらなる実施形態は、本発明および併記の特許請求の範囲内である。
【０１０５】
本明細書中で適切に説明的に記載した本発明は、本明細書中に具体的に開示されない任意の要素（単数または複数）、限定（単数または複数）の非存在下で実施してもよい。したがって、例えば、本明細書中のそれぞれの場合で、「を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「から本質的に構成される（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」、および「から構成される（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」の用語のいずれも、他の２つの用語のどちらかで置き換えてもよい。使用した用語および表現は、説明の用語として使用したものであり、限定の用語としては使用しない。かかる用語および表現の使用においては、示して記載した特徴またはその一部の任意の等価体を排除する意図はなく、特許請求した本発明の範囲内で様々な変更が可能であることが理解されよう。したがって、好ましい実施形態により本発明を具体的に開示してきたが、当業者は、本明細書中に開示した概念の任意の形態、変更および変形を行ってもよく、かかる変更および変形は、詳細な説明および併記の特許請求の範囲により規定される本発明の範囲内であるとみなされると理解されるはずである。
【０１０６】
さらに、本発明の特徴または態様が、マーカッシュ群または代替的な他のグループ分けに関して記載される場合、本発明はまた、それによりマーカッシュ群または他の群の任意の個々の成員あるいはその成員の部分群に関して記載されることが当業者には理解されよう。
【０１０７】
他の実施形態は、併記の特許請求の範囲内である。
【図面の簡単な説明】
【図１】Ｒｂ野生型細胞（Ａ）およびＲｂ陰性細胞（Ｂ）に対するハービマイシンの差次的細胞周期効果を示す図である。（Ａ）ＭＣＦ７およびＣｏｌｏ　２０５、（Ｂ）ＭＢ−ＭＤＡ　４６８およびＢＴ　５４９。
【図２】ハービマイシンで停止したＭＢ−ＭＤ４６８細胞中の有糸分裂サイクリン発現および関連キナーゼ活性のレベルを示す図である。図２（Ａ）は、抗サイクリンＡを用いたウェスタンブロットを示し、また抗サイクリンＡを用いて単離した免疫沈降物のｉｎ　ｖｉｔｒｏキナーゼアッセイを示す。図２（Ｂ）は、抗サイクリンＢ抗体を用いたウェスタンブロットを示し、また抗サイクリンＢ１を用いて単離した免疫沈降物のｉｎ　ｖｉｔｒｏキナーゼアッセイを示す。
【図３】アフィディコリンによる停止後、ＨＡ存在下でのＲｂ野生型細胞の完全有糸分裂を示す図である（図３Ａ）。図３Ｂは、アフィディコリンから解放後、Ｒｂ陰性ＭＢ−ＭＤＡ　４６８細胞は、次の有糸分裂で停止したことを示す。
【図４ＡおよびＢ】
ＨＡは、ＨＰＶ１６　Ｅ６およびＥ７を発現する一次細胞にて、有糸分裂停止を誘導し、Ｇ１停止を誘導しないことを示す図である。
【図５】Ｒｂ遺伝子でトランスフェクトしたＲｂ陰性細胞に対するＨＡの効果を示す図である。図５Ａは、ＭＢ−ＭＤＡ　４６８、４６８−７および４６８−１９におけるＲｂ発現のウェスタンブロット分析を示す。図５Ｂ〜Ｄは、Ｒｂ遺伝子の導入により、ＭＢ−ＭＤＡ　４６８細胞において、ＨＡ誘導性有糸分裂停止が抑止されることを示す。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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