(57)【要約】本発明は、薬剤治療を受けている被検体のような被検体のミトコンドリアＤＮＡの相対量を決定するアッセイを提供する。被検体としては、例えば、ヌクレオシド又はヌクレオチドアナログのような核酸前駆体によってＨＩＶ感染に対する治療を受けている人間の患者とすることができる。本発明のアッセイは、ミトコンドリア配列とゲノム配列のような基準配列との同時増幅を伴う半定量的又は定量的ＰＣＲのようなＰＣＲアッセイを含むことができる。そのようなアッセイから得られる情報を評価して、被検体の細胞内の細胞核ＤＮＡに対するミトコンドリアＤＮＡの比を求めることができる。【選択図】図１
2004532043.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
薬剤により治療を受けている被検体からの試料中の細胞内のミトコンドリアＤＮＡの相対量を測定することを含む薬剤治療の毒性のモニタ方法であって、
前記試料は末梢血試料であり、かつ前記薬剤は核酸前駆体であること
を特徴とする方法。
【請求項２】
前記ミトコンドリアＤＮＡの相対量は、前記被検体の前記細胞内の細胞核ＤＮＡの量に対して測定されること
を特徴とする請求項１に記載のモニタ方法。
【請求項３】
前記各ＤＮＡの量は、ＰＣＲ法によって測定されること
を特徴とする請求項１又は２に記載のモニタ方法。
【請求項４】
前記ＰＣＲ法は、定量的ＰＣＲ法であると共に、前記ミトコンドリアＤＮＡの増幅は、基準ＤＮＡの増幅と比較されること
を特徴とする請求項３に記載のモニタ方法。
【請求項５】
前記被検体は、ＨＩＶに感染している人間の患者であること
を特徴とする請求項１〜４の何れか一項に記載のモニタ方法。
【請求項６】
前記被検体は、癌に罹患している人間の患者であること
を特徴とする請求項１〜４の何れか一項に記載のモニタ方法。
【請求項７】
前記薬剤は、ヌクレオシド又はヌクレオチドアナログであること
を特徴とする請求項１〜６の何れか一項に記載のモニタ方法。
【請求項８】
前記ヌクレオシドアナログは、ＡＺＴ、ｄｄＩ、ｄｄＣ、ｄ４Ｔ、３Ｔｃ、Ａｂａｃａｖｉｒ、Ｔｅｎｏｆｏｖｉｒ及びＤ４Ｔからなる群から選択されること
を特徴とする請求項７に記載のモニタ方法。
【請求項９】
前記ヌクレオシドアナログは、Ｄ４Ｔであること
を特徴とする請求項７に記載のモニタ方法。
【請求項１０】
前記細胞内ミトコンドリアＤＮＡ相対量が所定のレベルを下回ったとき、前記ヌクレオシドアナログによる被検体の治療を中止するステップを更に含むこと
を特徴とする請求項８又は９に記載のモニタ方法。
【請求項１１】
前記ヌクレオシドアナログによる被検体の治療の中止後、他のヌクレオシドアナログにより該被検体を治療するステップを更に含むこと
を特徴とする請求項８又は９に記載のモニタ方法。
【請求項１２】
ミトコンドリアＤＮＡの前記所定のレベルは、１に設定された基準ｍｔＤＮＡ／ｎＤＮＡ比を基準としたｎＤＮＡに対するｍｔＤＮＡの比として表されること、及び該所定のレベルは、０．４５以下の比であること
を特徴とする請求項８又は９に記載のモニタ方法。
【請求項１３】
前記被検体は、非ヒトの動物であること
を特徴とする請求項１に記載のモニタ方法。
【請求項１４】
前記ＰＣＲは、リアルタイムＰＣＲであると共に、増幅産物は、ハイブリダイゼーションプローブによって検出されること
を特徴とする請求項３に記載のモニタ方法。
【請求項１５】
前記薬剤は、逆転写酵素阻害剤であること
を特徴とする請求項１〜５の何れか一項に記載のモニタ方法。
【請求項１６】
前記被検体は、Ａ型、Ｂ型又はＣ型肝炎に感染している人間の患者であること
を特徴とする請求項１〜４の何れか一項に記載のモニタ方法。
【請求項１７】
前記被検体は、関節炎に罹患している人間の患者であること
を特徴とする請求項１〜４の何れか一項に記載のモニタ方法。
【請求項１８】
前記被検体は、神経系疾患に罹患している人間の患者であること
を特徴とする請求項１〜４の何れか一項に記載のモニタ方法。
【請求項１９】
前記神経系疾患は、アルツハイマー病、パーキンソン病又はハンチンチン関連疾患であること
を特徴とする請求項１８に記載のモニタ方法。
【請求項２０】
被検体からの試料中の細胞内のミトコンドリアＤＮＡの相対量を測定することを含む病状の診断方法であって、該試料は末梢血試料であり、かつ該病状は、男性の不妊症及び臓器機能不全からなる群から選択されること
を特徴とする診断方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸を伴う診断及び治療の分野に関する。
【背景技術】
【０００２】
核酸系逆転写酵素阻害剤（ＮＲＴＩｓ）は、ＨＩＶ感染に対する抗レトロウイルス治療の基礎をなしている。ＨＩＶ逆転写酵素によって転写される長いウイルスＤＮＡ分子へ該阻害剤を組み込むことにより、該阻害剤は、ウイルスの複製を効果的に阻害する。しかしながら、ＮＲＴＩｓは、ヒトＤＮＡポリメラーゼガンマ（ＰＯＬγ）（Martin et al. 1994）を、従ってミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）複製を阻害し、ｍｔＤＮＡの枯渇（減少）及び薬物毒性に繋がりうる（Brinkman et al. 1998、Lewis and Dalakas 1995、Kakuda 2000）。このミトコンドリア毒性（ＭＴ）は、乳酸アシドーシス、筋疾患、心筋症、神経障害、肝脂肪症（肝脂肪変性）、ネフローゼ（腎）毒性及び膵炎を含む種々の有害な副作用を引き起こす（Lewis and Dalakas 1995等）。ＮＲＴＩｓによって引き起こされる多種多様な臨床症状は、ｍｔＤＮＡの変異から生じる疾患によって引き起こされる複合症状を暗示している（概観のためにWallace 1999参照）。
【０００３】
ジドブジン誘導性筋疾患に関する初期の研究により、ヒト（Arnaudo et al. 1991）及びマウス（Lewis et al. 1992）の何れに関しても筋肉生検材料から単離された全ｍｔＤＮＡには減少が見られることがわかった。種々の抗ＨＩＶヌクレオシドアナログを用いたin vitroでの研究により、ＮＲＴＩｓはヒトリンパ芽球細胞（Chen et al. 1991、Zhang et al. 1994）、ＣＥＭ細胞（Medina et al. 1994）及びＨｅｐＧ２細胞（Pan-Zhou et al. 2000）のミトコンドリア量を減少するということもわかった。肝臓のｍｔＤＮＡの大幅な欠失は見られたが、ｍｔＤＮＡの枯渇は見られなかったことが、抗レトロウイルス治療中の乳酸アシドーシスによる死亡例と関連して、最近報告された（Bartley et al. 2001）。ＭｔＤＮＡの枯渇（又は欠失）は、ミトコンドリアＲＮＡを減少し、ｍｔＤＮＡにコードされたタンパク質合成を減少し、及び究極的にはミトコンドリアの機能不全を引き起こしうるということは既に示唆されていた（Lewis et al. 1992）。細胞レベルでは、そのような毒性の結果、酸化的リン酸化、細胞内脂質蓄積及び乳酸蓄積は減少される。生理学的レベルでは、これによって、高乳酸血症（hyperlactatemia）が引き起こされうる。この高乳酸血症は、疲労（倦怠感）、急激な体重減少、脂質異常（変性）（lipid abnormalities）及び肝脂肪症等のミトコンドリア毒性によるその他の症状を併発することも併発しないこともある。慢性高乳酸血症は、恐らく、ヌクレオシドアナログの毒性自体にその原因があるか否かにかかわらず肝臓の乳酸のクリアランスの障害を反映している（Brinkman 2000）。長期間に亘るという抗レトロウイルス治療の特質を考慮すると、最近確認されたこの高乳酸血症症候群は、抗レトロウイルス治療におけるＨＩＶ感染患者の数の増加とともに多く見出されるように思われる（Lonergan et al. 2000、Gerard et al. 2000）。その症状、重症度及び頻度は、急性乳酸アシドーシス、即ちしばしば死に至る稀に起こるＮＲＴＩ副作用の症状、重症度及び頻度とは異なる（Fortgang et al. 1995、Megarbane et al. 2000）。しかしながら、高乳酸血症が乳酸アシドーシスの危険因子であるか否かは未だ不明である。
【０００４】
このＮＲＴＩ誘導性高乳酸血症に罹患している患者の診断・治療は、依然問題を孕んでいる。例えば、疲労（倦怠感）及びるいそうという毒性の初期症状は、エイズ患者に比較的共通に見られ、かつ病気の進行に類似しうるため、その健康状態の診断は困難でありうる。ミトコンドリア毒性が確認されると、その後の治療は、ＮＲＴＩ治療を打ち切り、患者の健康状態の改善及び血中乳酸レベルをモニタすることになる（Brinkman 2000、Moyle 2000）。ミトコンドリア異常の診断は、筋生検又は肝生検によって行ってもいいが、実際にスクリーニング及びモニタリングのために日常的に行われるものであってはならない。ランダム静脈乳酸（ＲＶＬＡ）の測定値は有用なマーカであるが、その信頼性は、制御するのが困難な外的要因に対するその感受性によって制限される。抗レトロウイルス治療を受けたＨＩＶ陽性患者のコホート（群）に関しＲＶＬＡをモニタすることにより、継続的なＲＶＬＡの測定値は、各被検体間で一致し、かつ正常値を越えることが多いということが実証された（Harris et al. 2000）。更に、異常ＲＶＬＡ、及びスタブジン（Ｄ４Ｔ）とヒドロキシ尿素とによる治療、並びにＤ４Ｔに関する時間の長さの間の重要な相互関係が見出された（Harris et al. 2000）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、ＲＶＬＡのレベルの上昇は、ヌクレオシド関連性ミトコンドリアの毒性に対し特異的なものではなく、感染のような他の原因を持ちうる。ジドブジン以外のＮＲＴＩｓで観察されるヌクレオシド関連性毒性に関し入手可能なin vivoでのデータは殆ど存在しない。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
１つの局面において、本発明は薬剤治療の毒性のモニタ方法を提供する。この方法は、薬剤による治療を受けている被検体の細胞内のミトコンドリアＤＮＡの相対量を測定することを特徴とする。ミトコンドリアＤＮＡ量は、被検体の細胞内の細胞核ＤＮＡ量に対して測定することができる。ＤＮＡ量は、例えば、ミトコンドリアＤＮＡの増幅を基準ＤＮＡの増幅と比較する定量的ＰＣＲのようなＰＣＲによって測定することができる。本発明の方法は、（Ｄ４Ｔのような）ヌクレオシドアナログで治療を受けている患者のような、ＨＩＶ感染等の疾病に罹患している人間の患者に適用することができる。本発明の他の局面によれば、本発明の方法は、例えば動物モデルの被検体が薬剤による治療を受けているような動物モデルに関する試験化合物のミトコンドリア毒性をモニタするために使用することもできる。アッセイは、例えば、器官生検によって得られる細胞（これは例えば死後に得られるものであってもよい）のような組織から抽出した細胞において行うこともできる。
【０００７】
本発明の１つの局面において、例えば、ヌクレオシド関連性ミトコンドリア毒性（ＭＴ）症候を経験している患者においては末梢血単核細胞（ＰＢＭＣｓ）からｍｔＤＮＡが枯渇されることが明らかにされる。従って、静脈血試料からのＮＲＴＩ関連性ミトコンドリア毒性を検出及びモニタするために、半定量的アッセイが提供される。本発明の他の実施形態によれば、本発明の方法は、細胞のミトコンドリアＤＮＡの相対量が所定のレベルを下回ったとき、Ｄ４Ｔのようなヌクレオシドアナログによる被検体の治療を中断（中止）するステップを含むことができる。この場合、ミトコンドリアＤＮＡの所定のレベルとは、例えば、ミトコンドリアＤＮＡのベースラインレベルの５、１０、１５、２０、２５、３０又は３５％であり、またミトコンドリアＤＮＡのベースラインレベルは、当該被検体が当該薬剤で治療を受ける前に測定されるか、コントロール用の被検体で測定される。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
本発明の１つの局面において、末梢血細胞のミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）を定量し、以って当該ｍｔＤＮＡレベルが、治療処置の毒性によって引き起こされうるようなミトコンドリア欠乏を示すレベルにあるか否かを決定するアッセイが提供される。本発明は、薬物治療を受けている被検体のような被検体中のミトコンドリアＤＮＡの相対量を決定するアッセイを提供する。ここで、被検体とは、例えば、ヌクレオシド又はヌクレオチドアナログのような核酸前駆体によりＨＩＶ感染のための治療を受けている人間の患者とすることができる。本発明のアッセイは、ミトコンドリア配列とゲノム配列のような基準配列との同時増幅（co-amplification）を伴う半定量的又は定量的ＰＣＲのようなＰＣＲアッセイを含むこともできる。そのようなアッセイから得られる情報を評価して、被検体の細胞のミトコンドリアＤＮＡと細胞核ＤＮＡとの比を求めることもできる。
【０００９】
例えば、そのようなアッセイは、抗レトロウイルス治療を受けているＨＩＶ患者において実行することができる。本発明の１つの局面において、抗レトロウイルス治療は、それゆえ、本発明のｍｔＤＮＡアッセイの結果に応じて修正することができる。本発明の他の局面によれば、ヌクレオシド又はヌクレオチドアナログのような核酸前駆体により治療を受けている患者から得た試料を検査することができる。ここで、ヌクレオシドアナログは、例えば、ＡＺＴ及びＺＤＶ（Retrovir）、ｄｄＩ（Videx及びVidex EC）、ｄｄＣ（Hivid）、ｄ４Ｔ（Zerit）、３ＴＣ（Epivir）、ＡＢＣ（Ziagen）を含みうる。ヌクレオシドアナログには、修飾を受けた天然のヌクレオシドをすべて含む。ヌクレオシドアナログは、天然ヌクレオシドを代替し、ＨＩＶによる新たな細胞への感染中にウイルスＤＮＡ鎖の完成を阻止することができる。他の核酸前駆体には、（ＨＰＭＰＣとしても知られる）Cidofovirのようなヌクレオチドアナログが含まれる。ヌクレオシドアナログ及びその他の核酸前駆体は、癌細胞の増殖を阻止するために癌化学療法に使用することもできる。
【００１０】
ＨＩＶ陽性の患者から得た試料は、本発明の種々の局面において検査することができるが、そのような患者には、ヌクレオシドアナログ治療を受けている患者も含まれる。同様に、癌患者を、本発明の診断アッセイによってモニタすることもできるが、癌患者には、核酸前駆体で治療を受けている癌患者も含まれる。
【００１１】
本発明の種々の局面を説明する種々の実施形態によれば、疲労や急激な体重減少のような抗レトロウイルス薬剤関連性高乳酸血症及びその他のミトコンドリア毒性症候があり、核酸前駆体で治療を受けている患者から得た末梢血細胞においては、ミトコンドリアＤＮＡは枯渇（減少）されることが示されている。この枯渇（減少）は、静脈乳酸レベルの上昇に先立って起ったが、この知見は、高乳酸血症はｍｔＤＮＡの枯渇の結果であるということと一致する。従って、ある実施形態では、本発明のアッセイは、ミトコンドリア毒性が現れるか又は高乳酸血症を伴う程に重篤な状態になる前に臨床情報を提供することができる。幾つかのケースでは、短時間で血漿中薬剤濃度が減少し、ｍｔＤＮＡ／ｎＤＮＡ比が大きくなることさえ示されるが、患者が積極的に治療を受けている間に本発明の検査を実行することができるため有利であることが示される。
【００１２】
抗レトロウイルス治療の中止後、ｍｔＤＮＡ／ｎＤＮＡ比の上昇を示す以下に説明する実施例によって明らかにされるように、患者の中には、ｍｔＤＮＡレベルの枯渇（減少）が可逆的であるものもいることが示される。関連する実施例では、これは、正常なＶＬＡレベルへの漸進的復帰が伴っていた。また、実施例では、ｍｔＤＮＡレベルは、ＨＩＶポジティブ（陽性）コントロールグループでは、ＨＩＶネガティブ（陰性）コントロールグループの場合より著しく低くかったことが示されるが、その差は、前者の場合におけるより低いＣＤ４数では説明することはできなかった。従って、１つの局面において、本発明は、ＨＩＶ感染示す情報を提供することができる診断方法を提供する。また、ＨＩＶポジティブ（陽性）コントロールグループ内では、ＤＮＡ抽出前の貯蔵は、測定されたｍｔＤＮＡ／ｎＤＮＡ比（データ不掲載）との重要な相関関係を示さなかったということが見出された。ケースによっては、ｍｔＤＮＡレベルが、正常なレベルの凡そ３０％〜２０％以下に低下すると深刻な症状が起こりうるということが見出された。臨床的処置を提案しうるｍｔＤＮＡ枯渇の他の測定値は、ｎＤＮＡに対するｍｔＤＮＡの比が、０．５、０．４５、０．４、０．３５又は０．３未満である。
【００１３】
他の実施形態によれば、薬物治療は、ｍｔＤＮＡ対ｎＤＮＡ比が、本書において決定されるように、コントロール試料に関して測定された０．５、０．４５、０．４、０．３５又は０．３のような閾値を下回るとき中止（中断）することができる。本発明の方法は、Ｄ４Ｔのような特定のヌクレオシドによる被検体（患者）の治療を中止した後、他のヌクレオシドアナログによる患者の治療を行うことを含むこともできる。或いは、そのような患者を、ミトコンドリア療法剤、即ちミトコンドリア酵素の補因子又は前駆体のようなミトコンドリアにとって有用な成分によって治療することも可能である。ある実施形態によれば、そのようなミトコンドリア療法剤は、例えば、リボフラビン（ビタミンＢ２）、コエンザイムＱ１０、ビタミンＢ１（チアミン）、ビタミンＢ１２、ビタミンＫ、ｌ−アセチルシステイン及びニコチンアミドからなる群から選択することができる。
【００１４】
他の実施形態によれば、ある時間に亘るｍｔＤＮＡ濃度の変化の割合を求めて、付加的な診断情報を提供することができる。一部の患者に対しては、ｍｔＤＮＡの相対量における比較的急速な減少は、薬物毒性又は病的状態を示していることもありうる。例えば、図３Ｂに示したように、８〜１０日未満の期間におけるｎＤＮＡに対するｍｔＤＮＡの相対量の凡そ５０％以上（又は事例によっては４０％超）の比較的急速な減少から、患者が結局は薬剤から有害な副作用を受け、従ってより詳細にモニタされる必要があること、最終的には他の治療法に代えるか又は薬剤治療を中止する必要があることを看取することができる。
【００１５】
高乳酸血症の他の研究（Lonergan et al. 2000、Gerard et al. 2000、John et al. 2000）の場合と同様に、患者はすべて、毒性が生じたときに薬剤処置の一部としてＤ４Ｔを投与されていた。抗レトロウイルス治療中に測定されたｍｔＤＮＡ／ｎＤＮＡ比は、患者がＤ４Ｔを除いたヌクレオシド含有療法を再開したときに観察されたｍｔＤＮＡ／ｎＤＮＡ比に極めて類似しているということがわかった。（表１、図２の患者３、４、５）。従って、本発明の１つの局面において、ｍｔＤＮＡの枯渇の閾値が検出されたときある薬剤による治療を中止し、他の薬剤（による治療）に切換えるという思想が提示される。例えば、患者は、あるヌクレオシドアナログ処置から他のヌクレオシドアナログ処置へ切換えることができる。
【００１６】
乳酸アシドーシスの発病率は、１９９５年の遡及研究において評価され、ＮＲＴＩｓ治療の１０００人・年当り１〜２例の範囲にあることがわかった（Fortgang et al. 1995）。しかしながら、腹部症候又は原因不明のアラニントランスフェラーゼの増加を伴う高乳酸血症によって規定される広範な事例についての他の研究により、発病率は、ＮＲＴＩｓ治療の１０００人・年当り２０．９例であると評価された（Lonergan et al. 2000）。本発明の試験対象となったコホート（群）において抗レトロウイルス治療を受けた患者の多くは、軽度から中程度の慢性高乳酸血症を示し、その大部分は、無症候性であった。本発明のアッセイは、そのような患者のミトコンドリア毒性及び慢性高乳酸血症の臨床結果をモニタ及び評価するために使用することができる。
【００１７】
本発明の１つの局面において、ｍｔＤＮＡのコピー数それ自体を決定する必要性を回避し、その代わりに、ｎＤＮＡ配列に対する量のようなｍｔＤＮＡの相対量の決定を可能にするプロトコールが提供される。ある局面においては、このアプローチは、本発明の診断アッセイを単純化することができる。例えば、図４に示したように、細胞核ゲノム当量を表す数（３０〜３０,０００）が、既知の細胞核ゲノム当量濃度のヒトＤＮＡコントロールで較正することによって求められるようなｎＤＮＡ増幅基準に割り当てられる。これと同じ数が、ミトコンドリア遺伝子に対する対応する標準曲線（検量線）に任意に割り当てられる（尤も、ミトコンドリア遺伝子のコピー数の計算値を表してはいない）。他のアプローチの１つでは、細胞核ゲノム当量を表す数を、試料の希釈度のみに基づいた、ｎＤＮＡ増幅基準に任意に割り当てることができ（そのため、その数は、細胞核ゲノム当量の相対コピー数を反映しているが、当該当量の絶対値は反映していない）、これら任意の数を同様にｍｔＤＮＡ増幅基準に割り当てることができる。本発明のアッセイの結果は、ｍｔＤＮＡ対ｎＤＮＡ比で表すことができ、ｍｔＤＮＡのコピー数の絶対値を求める必要はない。そのような実施形態では、十分なＰＣＲテンプレートを提供することにより増幅のサイクル数を、最少で５〜１５の任意の整数から最大で１５〜４０の任意の整数までのような最も信頼度の大きい結果が得られる範囲に収めることができるＤＮＡ試料の初濃度を利用することができるので好ましい。
【００１８】
ＮＡ配列の相対存在量を比較する方法は、以下のステップ：
ａ）  第１細胞核コントロール試料及び第２細胞核コントロール試料において細胞核増幅反応条件下で細胞核ＮＡ配列の増幅速度を測定し、コントロール細胞核増幅測定値を求めること、但し、該第１及び第２細胞核コントロール試料は、互いに異なる細胞核ＮＡ配列濃度を有する；
ｂ）  前記コントロール細胞核増幅測定値からコントロール細胞核ＮＡ配列データセットを構築し、前記細胞核ＮＡ配列の増幅速度及び濃度の間のモデル基準関係を求めること；
ｃ）  第１ミトコンドリアコントロール試料及び第２ミトコンドリアコントロール試料においてミトコンドリア増幅反応条件下でミトコンドリアＮＡ配列の増幅速度を測定し、コントロールミトコンドリア増幅測定値を求めること、但し、該第１及び第２ミトコンドリアコントロール試料は、互いに異なるミトコンドリアＮＡ配列濃度を有する
ｄ）  前記コントロールミトコンドリア増幅測定値からコントロールミトコンドリアＮＡ配列データセットを構築し、前記ミトコンドリアＮＡ配列の増幅速度及び濃度の間のモデル基準関係を求めること；
ｅ）  検査試料において前記細胞核増幅反応条件下で前記細胞核ＮＡ配列の増幅速度を測定し、検査試料細胞核増幅測定値を求めること；
ｆ）  前記細胞核ＮＡ配列の増幅速度及び濃度の間の前記モデル基準関係を、前記検査試料細胞核増幅測定値に適用し、検査試料細胞核ＮＡ配列濃度測定値を求めること;
ｇ）  検査試料において前記ミトコンドリア増幅反応条件下で前記ミトコンドリアＮＡ配列の増幅速度を測定し、検査試料ミトコンドリア増幅測定値を求めること；
ｈ）  前記ミトコンドリアＮＡ配列の増幅速度及び濃度の間の前記モデル基準関係を、前記検査試料ミトコンドリア増幅測定値に適用し、検査試料ミトコンドリアＮＡ配列濃度測定値を求めること;
ｉ）  前記検査試料細胞核ＮＡ配列濃度測定値と前記検査試料ミトコンドリアＮＡ配列濃度測定値とを比較し、前記検査試料における前記細胞核ＮＡ配列に対する前記ミトコンドリアＮＡ配列の相対濃度を求めること
を含む。
【００１９】
本発明の他の局面によれば、本発明のアッセイで使用される細胞は、例えば生検によって、心臓、脳、腎臓、脂肪又は肝臓のような種々の組織から得ることができる。
【００２０】
他の実施形態によれば、本発明の診断テストは、病気の診断に使用することができる。例えば、末梢血の試料のような被検体から得た試料中の細胞内のミトコンドリアＤＮＡの相対量の測定は、男性の不妊症、臓器機能不全、Ａ型、Ｂ型又はＣ型肝炎感染、ＨＩＶ感染、関節炎、神経系疾患（アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチンチン関連疾患（ハンチントン病）を含むがこれらには限定されない）のような疾患又は症候（症状）に関する情報を提供することができる。そのような病気の診断は、例えば、当該病気が核酸前駆体のような薬剤によって治療される場合、又は当該病気がそのような薬剤によって引き起こされる場合に行うことができる。
【００２１】
他の局面において、本発明は、本発明の方法で使用する成分（要素）を有するキットを提供する。そのようなキットは、ｍｔＤＮＡ配列及びｎＤＮＡ配列に特異的なＰＣＲプライマーを含む以下に詳細に説明するようなＰＣＲ成分を含みうる。また、そのようなキットは、本書において説明するような本発明の方法を実行するための説明書を含むこともできる。
【００２２】
他の実施形態によれば、細胞中のミトコンドリアＤＮＡの相対量を測定するために種々の技術を使用することができる。定量的ＰＣＲ法は、例えば、以下の文献に開示されており、それら文献（の開示内容）はすべて引用を持って繰り込み本書に記載されているものとみなす：Ginzinger et al.に付与された米国特許第6,180,349号、発行日2001年1月30日、Kurnit et al.に付与された米国特許第6,033,854号、発行日2000年3月7日及びHyland et al.に付与された米国特許第5,972,602号、発行日1999年10月26日。
【実施例１】
【００２３】
以下の例で説明するように、ヌクレオシド関連性ミトコンドリア毒性は、血球ｍｔＤＮＡ量の著しい減少、即ち治療中断（中止）による可逆的な効果と関連する。アッセイは、例えば抗レトロウイルス治療を受けている患者に関するミトコンドリア毒性をモニタするために提供される。本発明の方法は、他の薬剤の毒性を評価し、及びｍｔＤＮＡレベルに影響を及ぼす遺伝病を有する患者のミトコンドリアに関する健康状態をモニタするために使用することもできる。
【００２４】
材料及び方法
ミトコンドリア毒性症状のため抗レトロウイルス治療を中止した８人の患者からの長期的血液試料の遡及研究を行った。これらの患者の症状は、中程度の高乳酸血症、疲労（倦怠感）、急速な体重減少及び心肺（機能）検査における低い無酸素性作業閾値を含んでいた。全ＤＮＡは、血球から抽出され、細胞核遺伝子もミトコンドリア遺伝子もハイブリダイゼーションプローブを用いたリアルタイムＰＣＲによって増幅・定量された。ＭｔＤＮＡレベルは、細胞核ＤＮＡに対するミトコンドリアＤＮＡの比（ｍｔＤＮＡ／ｎＤＮＡ）として表した。
【００２５】
試料採取及びＤＮＡ抽出
血漿ウイルス量検査に用いたものと同じ血液試料からバフィーコートを収集し、使用するまで−７０℃で凍結保存した。血漿ウイルス量は、Amplicor Ultra-Sensitive HIV-1 Monitor assay（ロシュ・モレキュラ・ダイアグノスティック・システムズ、ブランチバーグ、ニュージャージー）を用いて測定した。全ＤＮＡは、QIAamp DNA Blood Mini kit（キアゲン、ミシソーガ、オンタリオ、カナダ）を用い、キアーゲンのプロトコールに従って、バフィーコート２００μＬから抽出し、溶出バッファ２００μＬに再懸濁した。標準曲線（検量線）を作成するために、２４人のＨＩＶ陰性の男性ボランティアから同様の試料を採取し、ＤＮＡを抽出してプールした。ＨＩＶ陰性ＤＮＡプールの細胞核ゲノム当量（g.eq.）は、既知の細胞核g.eq.濃度の対照キットヒトＤＮＡ（ロッシュ・モレキュラー・バイオケミカルズ、ラヴァル、ケベック、カナダ）により較正することによって定量した。
【００２６】
ランダム静脈乳酸（定量）測定
乳酸（定量）測定のための静脈試料は、フッ化ナトリウム／シュウ酸カリウムチューブで収集した。その際、通常の止血帯を用い、患者に対しては、拳を固めたり手を上下させたりしないこと以外には特に指示しなかった。試験用の基準範囲は、０．７〜２．１ｍｍｏｌ／Ｌである。
【００２７】
定量的リアルタイムＰＣＲ
ＭｔＤＮＡ ＣＣＯＩ遺伝子に対しては、ＣＣＯＩ１Ｆ 5'-TTCGCCGACCGTTGACTATT-3'（配列番号１）及びＣＣＯＩ２Ｒ 5'-AAGATTATTACAAATGCATGGGC-3'（配列番号２）プライマーをＰＣＲ増幅のために使用し、オリゴヌクレオチド３'−フルオレセイン標識ＣＣＯＩＰＲ１ 5'- GCCAGCCAGGCAACCTTCTAGG-F-3'（配列番号３）及び５'ＬＣ Ｒｅｄ６４０標識ＣＣＯＩＰＲ２ 5'-L-AACGACCACATCTACAACGTTATCGTCAC-P-3'（配列番号４）（但し後者の３'末端はリン酸分子が付加されている）をハイブリダイゼーションプローブとして使用した。ｎＤＮＡ ＡＳＰＯＬγ遺伝子に対しては、ＡＳＰＧ３Ｆ 5'-GAGCTGTTGACGGAAAGGAG-3'（配列番号５）及びＡＳＰＧ４Ｒ 5'-CAGAAGAGAATCCCGGCTAAG-3'（配列番号６）プライマーをＰＣＲのために使用し、オリゴヌクレオチド３'−フルオレセイン標識ＡＳＰＧＰＲ１ 5'-GAGGCGCTGTTAGAGATCTGTCAGAGA-F-3'（配列番号７）及び５'ＬＣ Ｒｅｄ６４０標識、３'−リン酸付加ＡＳＰＧＰＲ２ 5'-L-GGCATTTCCTAAGTGGAAGCAAGCA-P-3'（配列番号８）をハイブリダイゼーションプローブとして使用した。リアルタイムＰＣＲ反応は、LightCycler FastStart DNA Master Hybridization Probes kit（ロシュ・モレキュラー・バイオケミカルズ、ラヴァル、ケベック、カナダ）を用いて、各遺伝子に対し独立かつ同一に行った。ＰＣＲ反応は、溶出バッファ中に、ＭｇＣｌ２５ｍＭ、プライマー各０．５μＭ、３'−フルオレセインプローブ０．１μＭ、５'ＬＣ Ｒｅｄ６４０プローブ０．２μＭ及び１：１０希釈のＤＮＡ抽出物４μＬを含んでいた。ＰＣＲ増幅は、９５℃、１０分の変性／酵素活性化を１ステップ行った後、２０℃／ｓの温度変化速度で、９５℃／０秒、６０℃／１０秒、７２℃／５秒を４５サイクル繰り返すことによって行った。利得（ゲイン）設定は、Ｆ１＝１、Ｆ２＝８であり、シングルフルオレセンス獲得は、アニーリングの各ステップの終了時に行った。細胞核g.eq.３０、３００、３０００及び３００００の外部標準曲線（検量線）は、LightCyclerの各試行に含まれており、同じ細胞核g.eq.値が、細胞核遺伝子（ＡＳＰＯＬγ）及びミトコンドリア遺伝子（ＣＣＯＩ）の何れにも用いられた。データは、各増幅反応の２次導関数の極大を用い、それをそれぞれの標準曲線（検量線）に当てはめることによって解析した。定量的ＰＣＲの結果は、所定の抽出物に対する複製ｎＤＮＡg.eq.の平均値に対する複製ｍｔＤＮＡg.eq.の平均値の相対比（ｍｔＤＮＡ／ｎＤＮＡ）で表した。それら２つの標準曲線（検量線）を作成するために同じ細胞核g.eq.値を用いたという事実によって、比は、凡そ１．０に任意に設定された。
【００２８】
ある実施例では、本発明のＰＣＲ法は、リアルタイムＰＣＲを採用することができるが、これは、増幅産物が、LightCycler FastStart DNA Master Hybridization Probes kit（ロシュ・モレキュラー・バイオケミカルズ、ラヴァル、ケベック、カナダ）を使用する上述のようなハイブリダイゼーションプローブ又は（例えばＰＣＲプロセス中にＰＣＲ産物の蓄積を連続的に検出するABI Prism 7700 instrument、アプライド・バイオシステムズ、フォスターシティ、カリフォルニア、ＵＳＡを使用する）ABI Taqman（登録商標）technologyのような商業的に入手可能な他の技術によって検出される。その他のＰＣＲ法及び上記方法のバリエーションを採用することもできる。これらの方法に関しては、以下の米国特許に開示されているが、これら文献の開示内容は引用を持って繰り込み本書に記載されているものとみなす：米国特許第6,180,349号（Ginzinger et al；2001年1月30日）、米国特許第6,033,854号（Kurnit et al；2000年3月7日）、米国特許第5,972,602号（Hyland et al；1999年10月26日）、米国特許第5,476,774号及び第5,219,727号（Wang；1995年12月19日及び1993年6月15日）、米国特許第6,174,670号（Wittwer et al；2001年1月16日）、米国特許第6,143,496号（Brown；2000年11月7日）、米国特許第6,090,556号（Kato；2000年7月18日）、米国特許第6,063,568号（Gerdes et al；2000年3月16日）。
【００２９】
血漿薬剤レベル
プロテアーゼ阻害剤（ＰＩｓ）（indinavir、ritonavir、saquinavir、nelfinavir及びlopinavir）及び非ヌクレオシド系逆転写酵素阻害剤（ＮＮＲＴＩｓ）（nevirapine、delavirdine及びefavirenz）の濃度は、ウイルス量検査のために収集された保存血漿試料で決定した。この濃度決定は、タンデム型質量分析法（API-2000 LC/MS/MS System, AB/MDS-Sciex, フォスターシティ、カリフォルニア）と組合わせた高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）（HP 1100, アジレント・パロ・アルト, カリフォルニア）を用いて行った。簡単に説明すると、ＰＩｓとＮＮＲＴＩｓは、アセトニトリルによって抽出し、沈殿した血漿タンパクは、Ultrafree-MCフィルタ（ミリポア, ベッドフォード, マサチューセッツ）によって濾過して分離した。濾液中の薬剤は、Zorbax XDB C-18カラム（アジレント・パロ・アルト, カリフォルニア）を用いたＨＰＬＣによって部分的に分離し、質量分析器による標準的な方法によって定量した。試料は、血液をやや希釈するクエン酸デキストロース（ACD）チューブで収集したが、最後の一発（フラクション）が分与された時間は不明であった。このため、血漿薬剤レベルは、抗レトロウイルス剤が定期的に服用され、血液循環系に到達していたか否かについての定性評価をなすものとみなした。
【００３０】
統計分析
ウィルコクソン符号付順位検定（signed-rank test）を用いて、対比較による測定値間の差を評価した（表３）。ノンパラメトリック・スピアマンのロー相関係数を用いて、臨床試験とｍｔＤＮＡ／ｎＤＮＡ比との間の相関を評価した。
【００３１】
結果
ミトコンドリア毒性症候（Ｎ＝８）は、著しく小さいｍｔＤＮＡ／ｎＤＮＡ比（即ちＨＩＶネガティブ（陰性）コントロール（Ｎ＝２４）より７０％低く、ＨＩＶ陽性／抗レトルウイルス治療未処置コントロール（Ｎ＝４７）より４５％低い）と関連していた。ｍｔＤＮＡ比は、治療中止（中断）後著しく増加した（ｐ＝０．０１６）。ｍｔＤＮＡの減少は、静脈乳酸レベルの増加より先に起こった。同様に、ｍｔＤＮＡの治療後のリバウンドは、正常な乳酸レベルの回復より先に起こったと考えられる。ＣＤ４数（ｐ＝０．１７０）又は血小板数（ｐ＝０．１４１）とｍｔＤＮＡ／ｎＤＮＡ比との間には重要な相関は見られなかった。
【００３２】
患者の特徴
ブリティッシュコロンビア大学セントポール病院ＨＩＶ／ＡＩＤＳ上級センターの薬剤治療プログラムに登録された８人のＨＩＶ感染者に関し遡及的研究を行った（表１）。これらの患者は、慢性高乳酸血症、疲労、急激な体重減少及び心肺運動試験中の低い無酸素性作業閾値（データ不掲載）を含むミトコンドリア毒性（ＭＴ）症候（症状）を経験していた。患者のうちの２人は、４つのヌクレオシドアナログからなる薬剤治療措置を受け、（他の）２人には、ヒドロキシ尿素を投与し、ＭＴ症候が生じた者は全員、その時、Ｄ４Ｔが投与された。この薬剤毒性が生じた結果、患者は全員治療担当医によって抗レトロウイルス治療を中止され、その乳酸レベルがＲＶＬＡ対時間でモニタされた。治療中止時、患者８人中７人は、その血漿ウイルス量が、検出限界以下の５０コピー／ｍＬ（血漿）であった。抗レトロウイルス治療中止後、ＭＴ症状（症候）は、患者全員について徐々に消滅した。治療不実施の平均時間は、１５．６週であり、患者８人中５人は、その後、Ｄ４Ｔ及びＤＤＩを除いた薬剤による別の薬剤治療措置によって抗レトルウイルス治療を再開し、血漿ウイルス量は検出不能なレベルに達した。患者のうち２人（４と５）は、中止前措置（pre-interruption regimen）の開始前に、肝臓酵素（レベル）を上昇した。他の患者は全員、ＭＴ症状が発症する前は、正常な肝臓酵素（レベル）、ＩＮＲ（レベル）及びアルブミンレベルを示した（データ不掲載）。
【００３３】
ＭｔＤＮＡ／ｎＤＮＡ比及び抗レトロウイルス治療
８人の患者からの長期的血液試料（患者一人当り６〜１７個の異なる試料、２２〜２８ヶ月間に亘って行った）は、抗レトロウイルス治療中止前、中、後に収集し、そのｍｔＤＮＡ／ｎＤＮＡ比を求めた（図１ｃ、図２；表２）。コントロールとして、２４人のＨＩＶ陰性の健康な男性と４７人のＨＩＶ陽性薬剤治療未処置の男性についてｍｔＤＮＡ／ｎＤＮＡ比を求めた（図１ａ、図１ｂ；表２）。
【００３４】
種々のグループに付いて得られた比を統計的に比較した結果を表３に示した。ＨＩＶネガティブ（陰性）コントロールの平均ｍｔＤＮＡ／ｎＤＮＡ比は、ＨＩＶポジティブ（陽性）／薬剤治療未処置グループの平均ｍｔＤＮＡ／ｎＤＮＡ比より著しく大きかった。治療中止前平均（pre-therapy interruption mean）の計算（予測）により、試料はすべて、処方されたＰＩ及びＮＮＲＴＩ血漿薬剤レベルが検出不能であるか、（製薬業者のモノグラフに応じ）＞２の標準偏差で平均トラフ（極小）濃度を下回るよう測定されるものを含んでいると考えられた（図２）。治療中止後試料は、時間に関しては特に制限を受けることなく治療の中止後に収集された試料をすべて含む。患者１は、抗レトロウイルス治療不実施の期間中にバフィーコートを入手することができなかったので、この分析から除外された。患者８人のうち５人については、新たな治療措置からヌクレオシドアナログＤ４Ｔ及びＤＤＩを除いた抗レトロウイルス治療を再開した（表１）。その期間に収集した試料はすべて、Ｄ４Ｔなしの平均ｍｔＤＮＡ／ｎＤＮＡ比の計算（予測）に含まれていた。
【００３５】
８人のＭＴ患者に対し、治療中止前（但し、最後の薬剤治療措置の開始後少なくとも１ヶ月経過後）の観察された平均ｍｔＤＮＡ／ｎＤＮＡ比は、ＨＩＶネガティブコントロールグループ又はＨＩＶポジティブ／抗レトロウイルス治療未処置コントロールグループ（ｐ＜０．００１）について得た平均ｍｔＤＮＡ／ｎＤＮＡ比より著しく低かった。完全な治療中止及びＤ４Ｔなし治療（これらは、それぞれ、抗レトロウイルス薬をすべて除いた治療及びＤ４Ｔを除いた抗レトロウイルス薬治療措置の場合を含む）中に測定された平均ｍｔＤＮＡ／ｎＤＮＡ比はいずれも、ＨＩＶポジティブ／薬剤治療未処置コントロールに対して得た平均値に極めて類似していた。実際、治療中止前に収集したすべての試料の平均ｍｔＤＮＡ／ｎＤＮＡ比は、抗レトロウイルス薬全部なしの場合の平均ｍｔＤＮＡ／ｎＤＮＡ比（ｐ＝０．０１６）及びＤ４Ｔなしの場合の平均ｍｔＤＮＡ／ｎＤＮＡ比（ｐ＝０．００８）の何れよりも著しく小さかった（表３）。
【００３６】
更に何人かの患者についての臨床試験結果について、当該結果がｍｔＤＮＡ／ｎＤＮＡ比との関連性を示すか否かを求めるために研究した。ＨＩＶポジティブ／抗レトロウイルス治療未処置グループの場合（ｐ＝０．５９３）でもＭＴ患者グループの場合（ｐ＝０．１７０）でも、ｍｔＤＮＡ／ｎＤＮＡ比とＣＤ４数との間には重要な相関はなかった。血小板は、ｍｔＤＮＡ／ｎＤＮＡ比に影響を及ぼしうる細胞当り少数のｍｔＤＮＡを含む（Shuster et al. 1988）。しかしながら、血小板のデータは、ＭＴグループを除きコントロールグループについては入手できなかったが、（ＭＴグループについて）ｍｔＤＮＡ／ｎＤＮＡ比と血小板数（ｐ＝０．１４）との間には重要な相関はなかった。同様に、ＭＴ患者について、ｍｔＤＮＡ／ｎＤＮＡ比と、白血球細胞数（ｐ＝０．２１）、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＺ）（ｐ＝０．４７）又はＩＮＲとの間に相関は見られなかった。しかしながら、ｍｔＤＮＡ／ｎＤＮＡ比と、ＡＳＴ（ｐ＝０．０２）及びアルブミンレベル（ｐ＝０．０２）との間には弱い相関は見られた。
【００３７】
ＭｔＤＮＡ及び乳酸レベル
患者１、４及び８では（図２）、ｍｔＤＮＡの枯渇（減少）は、明らかに、高乳酸血症より先に起こっている（乳酸値に関する初期データについては、他の５人の患者については入手できなかった）。同様に、患者４、６及び８では、ｍｔＤＮＡレベルがリバウンド（回復）するのに必要な時間は、高乳酸血症が正常化（０．５〜２．１ｍｍｏｌ／Ｌの範囲）するのに必要な時間と同じ程度かより短かった。幾つかのケースでは、ｍｔＤＮＡのリバウンドは、血漿ウイルス量のリバウンド（データ不掲載）よりも先に起こった。利用できた僅かなｍｔＤＮＡ／ｎＤＮＡデータに基づいて評価したところ、最大ｍｔＤＮＡ半減期は、４．５週間（患者３）〜８週間（患者４）の範囲であり、最大ｍｔＤＮＡ倍加時間は、４週間（患者５）〜１６週間（患者１）の範囲であった。（患者３、４、７に対して見られるような）治療中の短い中断及び極めて低い循環薬剤レベル（患者４、６、７）もまた、ｍｔＤＮＡレベルの上昇に影響を与えた。利用可能なデータに基づくと、乳酸レベルが正常レベルに回復する前の最大薬剤非投与時間は、４週間（患者８）〜２８週間（患者５）の範囲であった。更に、乳酸レベルは、３ＴＣ＋abacavir（ＡＢＡ）又はzidovudine（ＡＺＴ）を含む治療の再開後数ヶ月間正常レベルの範囲内に維持された。抗レトロウイルス薬投与及び非投与治療における静脈乳酸レベル間には、有意な差はなかった（表３）。このことは、治療に関する変化と乳酸レベルにおける変化との間のタイムラグ、即ちｍｔＤＮＡ／ｎＤＮＡ比の変化と乳酸レベルとの間にも見られた遅れ（図２の患者１及び患者４参照）が原因である可能性が大きい。
【００３８】
【表１】
2004532043.tif 000003
【００３９】
【表２】
2004532043.tif 000004
ａ）  Ｎは、各グループに含まれる個体の数を表す。ＭｔＤＮＡ／ｎＤＮＡ数は、各グループについて平均値を計算する際に考慮された個人データ点の数を表す。
治療実施（on therapy）データは、１ヶ月以上前から行われている最後の治療措置を患者が受けている間に収集されたデータを意味する。
治療不実施（off therapy）は、如何なる抗レトロウイルス薬による治療を受けていないことを意味する。
Ｄ４Ｔなし（off Ｄ４Ｔ）は、如何なる抗レトロウイルス薬による治療を受けていないこと及び／又はＤ４Ｔを含まないＡＲＶ治療を受けていることを意味する。
【００４０】
【表３】
2004532043.tif 000005
ａ）  ウィルコクソン符号付順位検定（Wilcoxon signed-rank test）により求めた。
【実施例２】
【００４１】
１つの局面において、本発明のアッセイは、ミトコンドリア障害を特徴とする臓器機能不全（障害）に関する情報を提供するために死後組織に対しても使用することができるということが見出された。この実施例では、組織の死後分析は、死因と高い関連性がある。死因が乳酸アシドーシス及び肝臓脂肪症の場合、ｍｔＤＮＡ／ｎＤＮＡ比は、ＨＩＶ＋及びＨＩＶ−のコントロール試料と比べると肝臓では減少していた。腎機能不全が死に伴っている場合、ｍｔＤＮＡ／ｎＤＮＡ比は、コントロールと比べると腎臓では著しく減少していた。
【００４２】
引用文献
以下の文献は、引用を持って本書に繰り込まれたものとみなす。
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【００４３】
結び
本発明の種々の実施形態を本書に開示したが、本発明の技術的思想の範囲内において当業者の通常の知識に基づいてなしうる変形・修正は多々ある。そのような修正には、同一の結果を実質的に同一の態様により達成するため、本発明の何れかのアスペクト（局面）に対応する既知の均等物による置換を含む。本書において、用語「含むこと（comprising）」は、実質的に「を含むが、それ（それら）に限定されない（including, but not limited to）」という言い回しと等価な非限定型表現として使用され、用語「含む（comprise）」は、それに対応する（動詞的）意味を有する。本書における文献の引用は、そのような文献に記載された発明が本発明に対する従来技術であることを自認したものとして理解すべきではない。本書において引用した特許及び特許出願を含むがそれらに限定されないすべての刊行物は、あたかも個々の刊行物がそれぞれ明確かつ各別に引用を持って本書に繰り込まれることを指示されかつあたかも完全に本書に記載されているかのように、引用を持って繰り込み本書に記載されたものとみなす。本発明は、実質的に上述し、実施例及び図面を参酌することにより理解されるあらゆる実施形態及び変形形態を含む。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１】Ａ）ＨＩＶ陰性の男性、Ｂ）ＨＩＶ陽性／薬剤治療未処置の男性（ＰＩ／ＮＮＲＴＩは血漿試料中では検出されなかった）、Ｃ）ＨＩＶ陽性／ＭＴ症候（症状）患者に関するＰＢＭＣのｍｔＤＮＡ／ｎＤＮＡ比のグラフ。黒色のバーは、抗レトロウイルス治療の間に測定された最少ｍｔＤＮＡ／ｎＤＮＡ比を表しており、灰色のバーは、最初の抗レトロウイルス治療を中断した後到達した最大比を表している。
【図２】ＭＴ症候を有する患者に関する、時間に対する静脈内乳酸レベル（左側の縦軸）及びｍｔＤＮＡレベル（右側の縦軸）及び抗レトロウイルス薬剤処置（底部のバー）の長期間分析。バーは、患者が、ＭＴを引き起こす薬剤処置を受けているときは濃灰色、抗レトロウイルス薬がすべて除去されているときは白色、Ｄ４Ｔを含まない新たな処置を受けているときはハッチングによって表されている（表１参照）。この抗レトロウイルス薬剤のデータは、医療カルテ情報、薬剤処方日及び血漿薬剤レベルに基づいている。薄い灰色の領域は、ＰＩ及び／又はＮＮＲＴＩに対する血漿薬剤レベルが（製薬業者のモノグラフに応じ）＞２の標準偏差で平均トラフ（極小）濃度を下回って測定された試料を示している。なお、明瞭化及び簡略化のため、時間は、試料を採取した特定の日で表わされている。
【図３】スタブジン（ｄ４Ｔ）、ジダノシン（ddＩ）及びエファビレンズ（ＥＦＶ）による抗レトロウイルス治療処置を受けている患者に対する、日で示された時間変化（横軸）に対するｍｔＤＮＡレベルの長期間分析（左側の縦軸はｍｔＤＮＡ／ｎＤＮＡ比）。Ａ）は、有害な副作用がなかった２人の患者についてのグラフであり、Ｂ）は、有害な副作用（高乳酸血症、体重減少、＋／−末梢神経障害）が生じた３人の患者についてのグラフである。白抜きの記号は、治療を行っている状態を意味し、黒塗りの記号は、有害な副作用のため治療を中断している状態を意味する。丸印で表された患者もヒドロキシ尿素が投与されている。
【図４】ＨＩＶ陰性の男性のボランティアからのプールＤＮＡ抽出物の段階希釈を用いて行った、細胞核遺伝子ＡＳＰＯＬＧ及びミトコンドリア遺伝子ＣＣＯＩに対し求められた一般的なライトサイクラーを用いたリアルタイムＰＣＲの標準曲線（検量線）。細胞核遺伝子に対する標準曲線（検量線）に示された数（３０〜３０,０００）は、各試行に含まれる細胞核ゲノム当量の数を示している。これと同じ数が、ミトコンドリア遺伝子に対する標準曲線（検量線）にも当てはめられた（尤も、それらは、ミトコンドリア遺伝子の計算によるコピー数は表していない）。ＨＩＶ陰性ＤＮＡプールの細胞核ゲノム当量含量は、（例えばロッシュ・アプライド・サイエンス、ラヴァル、ケベック、カナダから入手可能であるもののような）細胞核ゲノム当量濃度が既知のコントロール用のヒトＤＮＡによって較正することにより求められた。
【図５】ＨＩＶに感染していない男性（平均値±標準偏差＝１．２８±０．３８、Ｎ＝２４）のグループと、ＨＩＶに感染した無症候性／抗レトロウイルス治療未処置の男性（血漿試料中には検出可能なＰＩ／ＮＮＲＴＩは不存在）（０．７２±０．１９、Ｎ＝４７）のグループと、ＨＩＶ感染／抗レトロウイルス治療されたミトコンドリア毒性の症候性患者のグループとの間のｍｔＤＮＡ／ｎＤＮＡ比の比較箱型図。３番目のグループは、更に、治療が行われているグループ（０．４１±０．０８、Ｎ＝８）と治療が行われていないグループ（０．７４±０．１３、Ｎ＝７）に対するｍｔＤＮＡ／ｎＤＮＡ比が示されている。（上下に伸びる）直線は、各グループ内で観察された最大及び最少ｍｔＤＮＡ／ｎＤＮＡ比を示し、箱の（上下の）辺は、２５％及び７５％四分位値を示し、（箱の）真中の直線は、平均値を示し、黒塗りの正方形は、平均ｍｔＤＮＡ／ｎＤＮＡ比示している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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