(57)【要約】本発明は、未刺激細胞を使って、染色体異常を研究するための簡易且つ迅速な方法を提供する。早発性染色体凝縮（ＰＣＣ）は、有糸分裂増強因子の存在下で未刺激細胞をインキュベートすることによって誘導される。本発明の方法は、細胞の刺激又は有糸分裂細胞との融合を伴い、従来技術の方法に比べて迅速である。本発明の方法によって生産された凝縮された染色体は、多種類の細胞遺伝学的分析、特にはインシツハイブリダイゼ−ションプローブ及び染色体ペインティングと共に使用され得る。本技法は、均一な全身低LET（線形エネルギートランスファー）暴露（uniform whole-body low-linear energy transfer exposure）を含む放射線被曝の生物学的線量測定に応用することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
有糸分裂増強特性を有するサイクリンキナーゼを含む、細胞における早発的染色体凝縮を誘導するための培地であって、サイクリンキナーゼが、早発的染色体凝縮を誘導する有効量で存在する、前記培地。
【請求項２】
サイクリンキナーゼが、ｐ３４ｃｄｃ２／サイクリンＢキナーゼである、請求項１に記載の培地。
【請求項３】
ホスファターゼ阻害剤を更に含む、請求項１に記載の培地。
【請求項４】
ホスファターゼ阻害剤が、オカダ酸、オカダ酸の塩、カリクリン、カンタリジン酸、カンタリジン、シペルメトリン、デルタメトリン、デホスタチン、３、４-デホスタチン、エンドタール、フェンバレート、ホストリエシン、ミクロシスチン-ＬＡ、ミクロシスチン-ＬＦ、ミクロシスチン-ＬＲ、ミクロシスチン-ＬＷ、ミクロシスチン-ＲＲ及びミクロシスチン-ＹＲから成る群より選択される、請求項３に記載の培地。
【請求項５】
エネルギー源を更に含む、請求項１に記載の培地。
【請求項６】
エネルギー源が、ＡＴＰ及びＧＴＰから成る群より選択される、請求項５に記載の培地。
【請求項７】
トランスフェクション試薬を更に含む、請求項１に記載の培地。
【請求項８】
請求項１乃至７のいずれか一項に記載の培地を含むキット。
【請求項９】
染色体を分析する方法であって、
（ａ）有糸分裂増強特性を有するサイクリンキナーゼを含む培地で細胞をインキュベートするステップであって、サイクリンキナーゼが、早発的染色体凝縮を誘導する有効量で存在する、前記ステップと、
（ｂ）凝縮した染色体を分析するステップと、
を含む、前記方法。
【請求項１０】
化合物の染色体異常誘発作用を評価する方法であって、
（ａ）細胞を化合物に接触させるステップと、
（ｂ）有糸分裂増強特性を有するサイクリンキナーゼを含む培地で細胞をインキュベートするステップであって、サイクリンキナーゼが、早発的染色体凝縮を誘導する有効量で存在する、前記ステップと、
（ｃ）切断、構造上及び／又は数値的異常について凝縮した染色体を分析するステップと、
を含む、前記方法。
【請求項１１】
細胞が、培地及び化合物に同時に接触せしめられる、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
化合物との接触後に、染色体修復を許容するための十分な時間にわたって、細胞をインキュベートするステップを更に含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
化合物の毒性を評価する方法であって、
（ａ）細胞を化合物に接触させるステップと、
（ｂ）有糸分裂増強特性を有するサイクリンキナーゼを含む培地で細胞をインキュベートするステップであって、サイクリンキナーゼが、早発的染色体凝縮を誘導する有効量で存在する、前記ステップと、
（ｃ）凝縮した染色体を分析するステップと、
を含む、前記方法。
【請求項１４】
細胞が、培地及び化合物に同時に接触せしめられる、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
化合物との接触後に、染色体修復を許容するための十分な時間にわたって、細胞をインキュベートするステップを更に含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
被検体における染色体異常を検出する方法であって、
（ａ）被検体から一つ以上の細胞を単離するステップと、
（ｂ）少なくとも一つ以上の細胞を、有糸分裂増強特性を有するサイクリンキナーゼを含む培地に接触させるステップであって、サイクリンキナーゼが、早発的染色体凝縮を誘導する有効量で存在する、前記ステップと、
（ｃ）染色体異常について凝縮した染色体を分析するステップと、
を含む、前記方法。
【請求項１７】
染色体異常が、細胞内で凝縮した染色体ドメイン又はスポットの数の評価に基づいて分析される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
被検体がインユテロである、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
異常が数値的な異常である、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
異常が構造上の異常である、請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
被検体が受けた放射線量を評価する方法であって、
（ａ）被検体から一つ以上の細胞を単離するステップと、
（ｂ）少なくとも一つ以上の細胞を、有糸分裂増強特性を有するサイクリンキナーゼを含む培地に接触させるステップであって、サイクリンキナーゼが、早発的染色体凝縮を誘導する有効量で存在する、前記ステップと、
（ｃ）染色体異常について凝縮した染色体を分析するステップと、
を含む、前記方法。
【請求項２２】
サイクリンキナーゼが、ｐ３４ｃｄｃ２／サイクリンＢキナーゼである、請求項９、１０、１３、１６又は２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
ホスファターゼ阻害剤を更に含む、請求項９、１０、１３、１６又は２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
ホスファターゼ阻害剤が、オカダ酸、オカダ酸の塩、カリクリン、カンタリジン酸、カンタリジン、シペルメトリン、デルタメトリン、デホスタチン、３、４-デホスタチン、エンドタール、フェンバレート、ホストリエシン、ミクロシスチン-ＬＡ、ミクロシスチン-ＬＦ、ミクロシスチン-ＬＲ、ミクロシスチン-ＬＷ、ミクロシスチン-ＲＲ及びミクロシスチン-ＹＲから成る群より選択される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
エネルギー源を更に含む、請求項９、１０、１３、１６又は２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
エネルギー源が、ＡＴＰ及びＧＴＰから成る群より選択される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
トランスフェクション試薬を更に含む、請求項９、１０、１３、１６又は２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
細胞がリンパ球である、請求項９、１０、１３、１６又は２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
細胞が哺乳動物細胞である、請求項９、１０、１３、１６又は２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
細胞がヒト末梢系血液リンパ球である、請求項９、１０、１３、１６又は２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
細胞が鼠細胞である、請求項９、１０、１３、１６又は２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
細胞が鼠末梢系血液リンパ球である、請求項９、１０、１３、１６又は２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
染色体を分析するステップが、染色体スプレッドを調製することを含む、請求項９、１０、１３、１６又は２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
染色体を分析するステップが、オリゴヌクレオチドを少なくとも一つの染色体にハイブリダイズさせ、且つ、染色体スポットを数えることを含む、請求項９、１０、１３、１６又は２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
オリゴヌクレオチドが、検出可能な成分を含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
検出可能な成分が蛍光成分である、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
検出可能な成分が、ビオチン、ジゴキシゲニン、抗原、酵素及びハプテンから成る群より選択される、請求項３５に記載の方法。
【請求項３８】
有糸分裂増強特性を有するサイクリンキナーゼを含む細胞培地及び細胞を含む組成物であって、サイクリンキナーゼが、早発的染色体凝縮を誘導する有効量で存在する、前記組成物。
【請求項３９】
サイクリンキナーゼが、ｐ３４ｃｄｃ２／サイクリンＢキナーゼである、請求項３８に記載の組成物。
【請求項４０】
ホスファターゼ阻害剤を更に含む、請求項３８に記載の組成物。
【請求項４１】
ホスファターゼ阻害剤が、オカダ酸、オカダ酸の塩、カリクリン、カンタリジン酸、カンタリジン、シペルメトリン、デルタメトリン、デホスタチン、３、４-デホスタチン、エンドタール、フェンバレート、ホストリエシン、ミクロシスチン-ＬＡ、ミクロシスチン-ＬＦ、ミクロシスチン-ＬＲ、ミクロシスチン-ＬＷ、ミクロシスチン-ＲＲ及びミクロシスチン-ＹＲから成る群より選択される、請求項４０に記載の組成物。
【請求項４２】
エネルギー源を更に含む、請求項３８に記載の組成物。
【請求項４３】
エネルギー源が、ＡＴＰ及びＧＴＰから成る群より選択される、請求項４２に記載の組成物。
【請求項４４】
トランスフェクション試薬を更に含む、請求項３８に記載の組成物。
【請求項４５】
請求項３８乃至４４のいずれか一項に記載の培地を含むキット。
【発明の詳細な説明】
【発明者】
【０００１】
パタジェ  Ｇ．Ｓ．プラサナ  及び  ウィリアム  Ｆ．ブレークリー
【発明の分野】
【０００２】
本発明は、細胞遺伝学、分子細胞遺伝学、細胞生物学、遺伝毒性学と遺伝学の分野に関わる。特に、本発明は、早発的染色体凝縮を誘導する方法及び凝縮した染色体を使って遺伝物質を分析する方法に関わる。
【背景】
【０００３】
種々の環境傷害は、遺伝物質に物理的損傷を誘導する可能性を持つ。環境毒素への被曝に加えて、人間の放射線への事故時被曝は、重大な関心事である。簡易で迅速な方法の開発は傷害線量評価のために必要である。そして、それは被爆した個人の処置のためになる。
【０００４】
Ｍｕｌｌｅｒ及びＳｔｒｅｆｆｅｒ（Muller et al.（1991）Int. J. Radiat. Biol. 59（863-873））は、放射線障害の生物学的指標の広範囲にわたる再検討を発表した。そして、線量評価のための生物学的線量測定について現在の技術を説明した。高い放射線量に曝されると、日常的な分裂中期スプレッド染色体異常分析による線量評価のためには、利用可能な有糸分裂細胞の数が十分ではない。暴露された個人の血液リンパ球で実行される早発的染色体凝縮（ＰＣＣ）アッセイは、臨床学的に有意義である迅速な生物線量測定法として考察されている(Pantelias et al. (1985) Mutat. Res. 149, 67-72; Blakely et al. (1995) Stem Cells 13, 223-230; and Prasanna et al. (1997) Health Phys. 72, 594-600。
【０００５】
現在、染色体への物理的損傷は、分裂中期スプレッドを調製した後、染色体の観察によって分析できる。染色体は、短期の細胞培養の後の有糸分裂細胞で視覚化される。この細胞培養では、細胞は有糸分裂促進剤によって刺激されて増殖し、その後、コルヒチン又はコルセミドで細胞周期停止を受ける。染色体は、染色法又は蛍光プローブでハイブリッドすることによって処理された後に顕微鏡下で観察される。この技術は、細胞が増殖するように連続的に刺激することに依存し、有用な収率を得るには４８時間以上にわたる細胞培養を必要とする。技術は、集中的労力を要し、実行するにあたって細胞遺伝学的技術経験を必要とする。この分析は、細胞の殺害及び処理によって誘導された細胞周期遅延によって、さらに複雑になる。それに加えて、凝縮された染色体の低い収率のため、統計学的に有意のデータを得るには、大量の分裂中期スプレッドが必要となる。
【０００６】
染色体の物理的損傷を分析するもう一つの方法は、細胞で早発的染色体凝縮（PCC）を誘導させて染色体スプレッドを調製することを含む。歴史的に、早発的染色体凝縮は、対象細胞を有糸分裂細胞と融合させることによって達成されてきた。これにより、試験細胞（test cells）において染色体凝縮が染色質様構造になる結果となった。この技術により早発的染色体凝縮は起こるが、その実施と関連して幾らかの困難がある。この技術は、試験細胞と融合する有糸分裂細胞の安定した供給を必要とする。有糸分裂細胞の培養及び維持は、この方法に更なる費用を追加する。その上、細胞融合技術（例えば、ＰＥＧ媒介融合）は、能率が悪くて、融合細胞の収率は低く変動的である。この結果、試験細胞での早発的染色体凝縮の収率は低くて変動することになる(Pantelias et al. (1983) Somatic Cell Genet. 9, 533-547)。
【０００７】
早発的染色体凝縮を誘導する有糸分裂細胞融合の欠陥は、本技術分野で周知であり、代替する簡易且つ迅速なプロトコルの探索は現在の研究のトピックである（Gotoh et al. (1996) Int. J. Radiat. Biol. 70, 517-520; Kanda et al. (1999) Int. J. Radiat. Biol. 75, 441-446; Durante et al. (1998) Int. J. Radiat. Biol. 74, 457-462; and Coco-Martin et al. (1997) Int. J. Radiat. Biol. 71, 265-273）。最近、早発的染色体凝縮は、有糸分裂促進剤で細胞を刺激した後、ホスファターゼ阻害剤の存在下で細胞を培養することによって誘導された。１型及び２Ａ型タンパク質ホスファターゼの阻害剤は、増殖細胞でＰＣＣを誘導するのに用いられた(Gotoh et al. (1996) Int. J. Radiat. Biol. 70, 517-520; Kanda et al. (1999) Int. J. Radiat. Biol. 75, 441-446; Durante et al. (1998) Int. J. Radiat. Biol. 74, 457-462; and Coco-Martin et al. (1997) Int. J. Radiat. Biol. 71, 265-273)。
【０００８】
ホスファターゼ阻害剤処理によって調製される凝縮された染色体は、ＰＣＣスプレッドでの染色体異常分析を使うことによって、生物学的な線量測定応用のために評価された。早発的染色体凝縮は、有糸分裂促進剤で刺激された細胞において、オカダ酸（ＯＡ）(Gotoh et al. (1996) Int. J. Radiat. Biol. 70, 517-520; Kanda et al. (1999) Int. J. Radiat. Biol. 75, 441-446)又はカリクリンＡ(Durante et al. (1998) Int. J. Radiat. Biol. 74, 457-462) によって誘導され、有糸分裂促進剤刺激から４８時間で得られた。ドゥランテら(Durante et al. (1998) Int. J. Radiat. Biol. 74, 457-462) は、200-kVpＸ線に曝された後の全染色体プローブ蛍光インシツハイブリダイぜーション（FISH）を用いて、Ｇ１及びＭ期の染色体異常の同時測定が可能なことを証明した。また。ＯＡ又はカリクリンＡを含んでいる細胞培地で活発に分割している腫瘍株をインキュベーションすると、ＰＣＣ誘導が起こることは示されている(Coco-Martin et al. (1997) Int. J. Radiat. Biol. 71, 265-273)。全染色体特異的プローブを使うことにより、放射線誘導染色体異常を含む化学的に誘導されたＰＣＣスプレッドを、２つよりも多い染色体スポットを持つ細胞として、容易に同定することができる。放射線感受性の相違は、放射線感受性細胞株（SCC61）と放射線抵抗性細胞株（A549）との間で示された(Coco-Martin et al. (1997) Int. J. Radiat. Biol. 71, 265-273)。
【０００９】
ホスファターゼ阻害剤の使用により、刺激された細胞又は増殖している細胞で早発的染色体凝縮は起こるが、現在利用可能な方法は、染色体異常分析に有用な早発的染色体凝縮が十分に高い収率で生じるような培養期間を要求する。
【発明の簡単な概要】
【００１０】
先に議論された方法にもかかわらず、本技術分野では、環境傷害による遺伝物質の損傷を評価するための迅速且つ簡易な方法に対する要求がある。現在、このような評価をすることの困難性の主な原因は、凝縮された染色体をその後の分析のために生成するのに必要とされる時間及び労力である。本発明は、未刺激細胞において、早発的染色体凝縮を迅速に且つ高収率で誘導する細胞培地を提供することによって、長く渇望されてきた要求に応ずる。本発明は、未刺激細胞において早発的染色体凝縮を誘導する細胞融合の必要性に対処し、且つ、本技術分野で知られる他の方法によって要求される刺激及びその後のインキュベーションの必要性に対処する。本発明の材料及び方法を使うことによって調製された凝縮された染色体は、化学的に誘導されたＰＣＣスプレッドで全染色体特異的プローブを用いたＦＩＳＨによって未刺激のＨＰＢＬでの特異的染色体への損傷を研究することができるということを示すために使われてきた。本発明の方法は、本技術分野で知られるものよりも簡易且つ迅速であり、オートメーション化した高スループットの染色体損傷アッセイに適している。これらの方法には、迅速な生物学的線量測定を含む多数の応用がある。
【００１１】
本発明は、細胞における早発的染色体凝縮を誘導するための培地を提供する。好ましい実施形態では、細胞培地は、一つ以上の有糸分裂増強因子を含む。幾つかの実施形態では、有糸分裂増強因子は、一つ以上のサイクリン、サイクリンキナーゼ、ヒストンキナーゼ、サイクリン、トポイソメラーゼ、染色体構造維持（ＳＭＣ）タンパク質、ヒストン、ｃｄｋｌ基質及び有糸分裂増強因子の成分である。好ましい実施形態では、有糸分裂増強因子は、ｐ３４ｃｄｃ２／サイクリンＢキナーゼである。
【００１２】
本発明の細胞培地は、ホスファターゼ阻害剤を含んでいてよい。この場合、ホスファターゼ阻害剤は、オカダ酸、オカダ酸の塩、カリクリン、カンタリジン酸、カンタリジン、シペルメトリン、デルタメトリン、デホスタチン、３、４-デホスタチン、エンドタール、フェンバレート、ホストリエシン、ミクロシスチン-ＬＡ、ミクロシスチン-ＬＦ、ミクロシスチン-ＬＲ、ミクロシスチン-ＬＷ、ミクロシスチン-ＲＲ及びミクロシスチン-ＹＲの一つ以上を含むことができる。本発明の細胞培地は、エネルギー源（好ましくは、ＡＴＰ及び／又はＧＴＰ）を含んでよい。
【００１３】
本発明は、有糸分裂増強因子を含む培地であって早発的染色体凝縮を誘導するものを用いて細胞をインキュベートするステップと、凝縮した染色体を分析するステップと、を含む、染色体を分析する方法を提供する。幾つかの実施形態では、有糸分裂増強因子は、サイクリンキナーゼ、ヒストンキナーゼ、サイクリン、トポイソメラーゼ、ＳＭＣタンパク質、ｃｄｋｌ基質、ヒストン及び有糸分裂増強因子（ＭＰＦ）の成分である。幾つかの好ましい実施形態では、有糸分裂増強因子は、ｐ３４ｃｄｃ２／サイクリンＢキナーゼを含む。
【００１４】
染色体を分析する方法に使用される培地は、ホスファターゼ阻害剤を含んでいてよい。好ましくは、ホスファターゼ阻害剤は、オカダ酸、オカダ酸の塩、カリクリン、カンタリジン酸、カンタリジン、シペルメトリン、デルタメトリン、デホスタチン、３、４-デホスタチン、エンドタール、フェンバレート、ホストリエシン、ミクロシスチン-ＬＡ、ミクロシスチン-ＬＦ、ミクロシスチン-ＬＲ、ミクロシスチン-ＬＷ、ミクロシスチン-ＲＲ及びミクロシスチン-ＹＲの一つ以上を含むことができる。培地は、エネルギー源（好ましくは、ＡＴＰ及び／又はＧＴＰ）を含んでよい。培地は、トランスフェクション試薬を含んでよい。
【００１５】
染色体の分析方法は、いかなる種類の細胞でも実施されてよい。幾つかの実施形態では、細胞はリンパ球である。好ましくは、細胞は哺乳動物細胞である。幾つかの実施形態では、細胞はヒト末梢系血液リンパ球である。幾つかの実施形態では、細胞は鼠細胞であり、好ましくは、鼠末梢系血液リンパ球である。
【００１６】
染色体の分析方法は、染色体スプレッドを調製することを含んでよい。該方法は、一つ以上のオリゴヌクレオチドを一つ以上の染色体にハイブリダイズさせ、且つ、染色体スポットを数えることを含むことができる。幾つかの実施形態では、一つ以上のオリゴヌクレオチドは検出可能な成分を含んでよい。好ましくは、検出可能な成分は蛍光成分であるが、ビオチン、ジゴキシゲニン、抗原、酵素及びハプテンの一つ以上であってもよい。
【００１７】
また、本発明は、化合物の染色体異常誘発作用を評価する方法であって、細胞を化合物に接触させるステップと、有糸分裂増強因子を含む培地であって早発的染色体凝縮を誘導するもので細胞をインキュベートするステップと、切断、構造上及び／又は数値的な異常について凝縮した染色体を分析するステップとを含む方法を提供する。幾つかの実施形態では、細胞は、培地及び化合物に同時に接触せしめられる。その他の実施形態では、細胞は、化合物に接触せしめられた後に適切な培地に移されてもよい。幾つかの場合においては、化合物との接触後に、染色体修復を許容するための十分な時間にわたって、細胞をインキュベートすることが望ましい。幾つかの実施形態では、有糸分裂増強因子は、サイクリンキナーゼ、ヒストンキナーゼ、サイクリン、トポイソメラーゼ、ＳＭＣタンパク質、ｃｄｋｌ基質、ヒストン及び有糸分裂増強因子（ＭＰＦ）の成分である。幾つかの好ましい実施形態では、有糸分裂増強因子は、ｐ３４ｃｄｃ２／サイクリンＢキナーゼを含む。
【００１８】
化合物の染色体異常誘発作用を評価する方法に使用される培地は、ホスファターゼ阻害剤を含んでいてよい。好ましくは、ホスファターゼ阻害剤は、オカダ酸、オカダ酸の塩、カリクリンＡ、カンタリジン酸、カンタリジン、シペルメトリン、デルタメトリン、デホスタチン、３、４-デホスタチン、エンドタール、フェンバレート、ホストリエシン、ミクロシスチン-ＬＡ、ミクロシスチン-ＬＦ、ミクロシスチン-ＬＲ、ミクロシスチン-ＬＷ、ミクロシスチン-ＲＲ及びミクロシスチン-ＹＲの一つ以上を含むことができる。培地は、エネルギー源（好ましくは、ＡＴＰ及び／又はＧＴＰ）を含んでよい。培地は、トランスフェクション試薬を含んでよい。
【００１９】
化合物の染色体異常誘発作用を評価する方法は、いかなる種類の細胞でも実施されてよい。幾つかの実施形態では、細胞はリンパ球である。好ましくは、細胞は哺乳動物細胞である。幾つかの実施形態では、細胞はヒト末梢系血液リンパ球である。幾つかの実施形態では、細胞は鼠細胞であり、好ましくは、鼠末梢系血液リンパ球である。
【００２０】
化合物の染色体異常誘発作用を評価する方法は、染色体スプレッドを調製することを含んでよい。該方法は、一つ以上のオリゴヌクレオチドを一つ以上の染色体にハイブリダイズさせ、且つ、染色体スポットを数えることを含むことができる。幾つかの実施形態では、一つ以上のオリゴヌクレオチドは検出可能な成分を含んでよい。好ましくは、検出可能な成分は蛍光成分であるが、ビオチン、ジゴキシゲニン、抗原、酵素及びハプテンの一つ以上であってもよい。
【００２１】
また、本発明は、化合物の毒性を評価する方法であって、細胞を化合物に接触させるステップと、有糸分裂増強因子を含む培地であって早発的染色体凝縮を誘導するもので細胞をインキュベートするステップと、凝縮した染色体を分析するステップとを含む方法を提供する。幾つかの実施形態では、細胞は、培地及び化合物に同時に接触せしめられる。その他の実施形態では、細胞は、化合物に接触せしめられた後に適切な培地に移されてもよい。幾つかの場合においては、化合物との接触後に、染色体修復を許容するための十分な時間にわたって、細胞をインキュベートすることが望ましい。幾つかの実施形態では、有糸分裂増強因子は、サイクリンキナーゼ、ヒストンキナーゼ、サイクリン、トポイソメラーゼ、ＳＭＣタンパク質、ｃｄｋｌ基質、ヒストン及び有糸分裂増強因子（ＭＰＦ）の成分である。幾つかの好ましい実施形態では、有糸分裂増強因子は、ｐ３４ｃｄｃ２／サイクリンＢキナーゼを含む。
【００２２】
化合物の毒性を評価する方法に使用される培地は、ホスファターゼ阻害剤を含んでいてよい。好ましくは、ホスファターゼ阻害剤は、オカダ酸、オカダ酸の塩、カリクリンＡ、カンタリジン酸、カンタリジン、シペルメトリン、デルタメトリン、デホスタチン、３、４-デホスタチン、エンドタール、フェンバレート、ホストリエシン、ミクロシスチン-ＬＡ、ミクロシスチン-ＬＦ、ミクロシスチン-ＬＲ、ミクロシスチン-ＬＷ、ミクロシスチン-ＲＲ及びミクロシスチン-ＹＲの一つ以上を含むことができる。培地は、エネルギー源（好ましくは、ＡＴＰ及び／又はＧＴＰ）を含んでよい。培地は、トランスフェクション試薬を含んでよい。
【００２３】
化合物の毒性を評価する方法は、いかなる種類の細胞でも実施されてよい。幾つかの実施形態では、細胞はリンパ球である。好ましくは、細胞は哺乳動物細胞である。幾つかの実施形態では、細胞はヒト末梢系血液リンパ球である。幾つかの実施形態では、細胞は鼠細胞であり、好ましくは、鼠末梢系血液リンパ球である。
【００２４】
化合物の毒性を評価する方法は、染色体スプレッドを調製することを含んでよい。該方法は、一つ以上のオリゴヌクレオチドを一つ以上の染色体にハイブリダイズさせ、且つ、染色体スポットを数えることを含むことができる。幾つかの実施形態では、一つ以上のオリゴヌクレオチドは検出可能な成分を含んでよい。好ましくは、検出可能な成分は蛍光成分であるが、ビオチン、ジゴキシゲニン、抗原、酵素及びハプテンの一つ以上であってもよい。
【００２５】
また、本発明は、被検体における染色体異常を検出する方法であって、被検体から一つ以上の細胞を単離するステップと、少なくとも一つ以上の細胞を、有糸分裂増強因子を含む培地であって早発的染色体凝縮を誘導するものに接触させるステップと、染色体異常について凝縮した染色体を分析するステップとを含む方法を提供する。幾つかの実施形態では、有糸分裂増強因子は、サイクリンキナーゼ、ヒストンキナーゼ、サイクリン、トポイソメラーゼ、ＳＭＣタンパク質、ｃｄｋｌ基質、ヒストン及び有糸分裂増強因子（ＭＰＦ）の成分である。幾つかの好ましい実施形態では、有糸分裂増強因子は、ｐ３４ｃｄｃ２／サイクリンＢキナーゼを含む。
【００２６】
被検体における染色体異常を検出する方法に使用される培地は、ホスファターゼ阻害剤を含んでいてよい。好ましくは、ホスファターゼ阻害剤は、オカダ酸、オカダ酸の塩、カリクリンＡ、カンタリジン酸、カンタリジン、シペルメトリン、デルタメトリン、デホスタチン、３、４-デホスタチン、エンドタール、フェンバレート、ホストリエシン、ミクロシスチン-ＬＡ、ミクロシスチン-ＬＦ、ミクロシスチン-ＬＲ、ミクロシスチン-ＬＷ、ミクロシスチン-ＲＲ及びミクロシスチン-ＹＲの一つ以上を含むことができる。培地は、エネルギー源（好ましくは、ＡＴＰ及び／又はＧＴＰ）を含んでよい。培地は、トランスフェクション試薬を含んでよい。
【００２７】
被検体における染色体異常を検出する方法は、いかなる種類の細胞でも実施されてよい。幾つかの実施形態では、細胞はリンパ球である。好ましくは、細胞は哺乳動物細胞である。幾つかの実施形態では、細胞はヒト末梢系血液リンパ球である。幾つかの実施形態では、細胞は鼠細胞であり、好ましくは、鼠末梢系血液リンパ球である。幾つかの実施形態では、細胞は、被検体からインユテロで得られる。
【００２８】
被検体における染色体異常を検出する方法は、染色体スプレッドを調製することを含んでよい。該方法は、一つ以上のオリゴヌクレオチドを一つ以上の染色体にハイブリダイズさせ、且つ、染色体スポットを数えることを含むことができる。幾つかの実施形態では、一つ以上のオリゴヌクレオチドは検出可能な成分を含んでよい。好ましくは、検出可能な成分は蛍光成分であるが、ビオチン、ジゴキシゲニン、抗原、酵素及びハプテンの一つ以上であってもよい。
【００２９】
また、本発明は、被検体が受けた放射線量を評価する方法であって、被検体から一つ以上の細胞を単離するステップと、少なくとも一つ以上の細胞を、有糸分裂増強因子を含む培地であって早発的染色体凝縮を誘導するものに接触させるステップと、切断、構造上及び／又は数値的な異常について凝縮した染色体を分析するステップとを含む方法を提供する。幾つかの実施形態では、有糸分裂増強因子は、サイクリンキナーゼ、ヒストンキナーゼ、サイクリン、トポイソメラーゼ、ＳＭＣタンパク質、ｃｄｋｌ基質、ヒストン及び有糸分裂増強因子（ＭＰＦ）の成分である。幾つかの好ましい実施形態では、有糸分裂増強因子は、ｐ３４ｃｄｃ２／サイクリンＢキナーゼを含む。
【００３０】
被検体が受けた放射線量を評価する方法に使用される培地は、ホスファターゼ阻害剤を含んでいてよい。好ましくは、ホスファターゼ阻害剤は、オカダ酸、オカダ酸の塩、カリクリンＡ、カンタリジン酸、カンタリジン、シペルメトリン、デルタメトリン、デホスタチン、３、４-デホスタチン、エンドタール、フェンバレート、ホストリエシン、ミクロシスチン-ＬＡ、ミクロシスチン-ＬＦ、ミクロシスチン-ＬＲ、ミクロシスチン-ＬＷ、ミクロシスチン-ＲＲ及びミクロシスチン-ＹＲの一つ以上を含むことができる。培地は、エネルギー源（好ましくは、ＡＴＰ及び／又はＧＴＰ）を含んでよい。培地は、トランスフェクション試薬を含んでよい。
【００３１】
被検体が受けた放射線量を評価する方法は、いかなる種類の細胞でも実施されてよい。幾つかの実施形態では、細胞はリンパ球である。好ましくは、細胞は哺乳動物細胞である。幾つかの実施形態では、細胞はヒト末梢系血液リンパ球である。幾つかの実施形態では、細胞は鼠細胞であり、好ましくは、鼠末梢系血液リンパ球である。
【００３２】
被検体が受けた放射線量を評価する方法は、染色体スプレッドを調製することを含んでよい。該方法は、一つ以上のオリゴヌクレオチドを一つ以上の染色体にハイブリダイズさせ、且つ、染色体スポットを数えることを含むことができる。幾つかの実施形態では、一つ以上のオリゴヌクレオチドは検出可能な成分を含んでよい。好ましくは、検出可能な成分は蛍光成分であるが、ビオチン、ジゴキシゲニン、抗原、酵素及びハプテンの一つ以上であってもよい。
【００３３】
また、本発明は、細胞及び細胞培地を含む組成物を提供する。ここで、細胞培地は、有糸分裂増強因子を含み、細胞において早発的染色体凝縮を誘導する。本発明の組成物では、有糸分裂増強因子は、サイクリンキナーゼ、ヒストンキナーゼ、サイクリン、トポイソメラーゼ、染色体構造維持（ＳＭＣ）タンパク質、ヒストン、ｃｄｋｌ基質及び有糸分裂増強因子の成分の一つ以上であってよい。幾つかの好ましい実施形態では、有糸分裂増強因子は、ｐ３４ｃｄｃ２／サイクリンＢキナーゼを含む。本発明の組成物は、ホスファターゼ阻害剤を含んでいてよい。ホスファターゼ阻害剤は、オカダ酸、オカダ酸の塩、カリクリンＡ、カンタリジン酸、カンタリジン、シペルメトリン、デルタメトリン、デホスタチン、３、４-デホスタチン、エンドタール、フェンバレート、ホストリエシン、ミクロシスチン-ＬＡ、ミクロシスチン-ＬＦ、ミクロシスチン-ＬＲ、ミクロシスチン-ＬＷ、ミクロシスチン-ＲＲ及びミクロシスチン-ＹＲの一つ以上を含むことができる。培地は、エネルギー源（好ましくは、ＡＴＰ及び／又はＧＴＰ）を含んでよい。
【００３４】
本発明は、試験細胞において早発的染色体凝縮を誘導するためのキットを提供する。幾つかの実施形態では、キットは、有糸分裂増強因子を含み、細胞において早発的染色体凝縮を誘導する細胞培地の容器を一つ以上備えていてよい。有糸分裂増強因子は、サイクリンキナーゼ、ヒストンキナーゼ、サイクリン、トポイソメラーゼ、染色体構造維持（ＳＭＣ）タンパク質、ヒストン、ｃｄｋｌ基質及び有糸分裂増強因子の成分の一つ以上であってよい。幾つかの好ましい実施形態では、有糸分裂増強因子は、ｐ３４ｃｄｃ２／サイクリンＢキナーゼを含む。本発明のキットは、一つ以上のホスファターゼ阻害剤を保持する一つ以上の容器を備えてよい。ホスファターゼ阻害剤は、オカダ酸、オカダ酸の塩、カリクリンＡ、カンタリジン酸、カンタリジン、シペルメトリン、デルタメトリン、デホスタチン、３、４-デホスタチン、エンドタール、フェンバレート、ホストリエシン、ミクロシスチン-ＬＡ、ミクロシスチン-ＬＦ、ミクロシスチン-ＬＲ、ミクロシスチン-ＬＷ、ミクロシスチン-ＲＲ及びミクロシスチン-ＹＲの一つ以上を含むことができる。キットは、また、エネルギー源（好ましくは、ＡＴＰ及び／又はＧＴＰ）を保持する一つ以上の容器をも備えていてよい。本発明のキットは、一つ以上のトランスフェクション試薬を保持す
る一つ以上の容器を備えていてよい。
【００３５】
本発明は、有糸分裂促進因子で細胞を刺激する必要なしに、細胞で早発的染色体凝縮を誘導するための材料及び方法を提供する。さらに、本発明は、早発的染色体凝縮を誘導することによる遺伝物質を分析する方法と、凝縮した染色体の物理的構造を分析する方法を提供する。本発明は、試験細胞で早発的染色体凝縮を必要するどんな適用にも有用である。本発明は、特に細胞遺伝学、分子細胞遺伝学、細胞生物学、遺伝毒性学及び遺伝学の分野で有用である。
【００３６】
幾つかの態様において、本発明は、診断細胞遺伝学で有用な材料と方法を提供する。本発明の材料と方法は、試験細胞の遺伝物質を評価するために、出産前、生後、およびプレ体内移植検定で使用され得る。例えば、本明細書で記述される方法は、精液で染色体異常の有無を決定するために潜在的な精液ドナーで遺伝物質を評価するのに用いられ得る。同様に、本発明は、インユテロで被検者の遺伝物質を分析するために用いられ得る。
【００３７】
関連した幾つかの態様においては、本発明は、細胞遺伝学的研究において使用できる。例えば、遺伝学の分野で、本発明は、染色体異常（例えば、ダウン症候群）によって特徴づけられる種々の症候群と関連した遺伝子を検出するために使用される。特定の実施形態では、本発明は、ミクロ欠損症候群と関連する遺伝子の検出に使用される。もう一つの実施形態では、本発明は、癌と関連する（数と構造上の）染色体異常の検出に使用される。幾つかの好ましい実施形態では、本発明は、遺伝子増幅の検出に使用される。
【００３８】
環境試験の分野では、本発明は、被検者の環境傷害への照射の評価に使用される。幾つかの好ましい実施形態では、被検者が受ける線量の評価に使用される。放射線量は、事故被曝の結果として受け取られるか、職業上被曝の結果として受け取られる。本発明は、特に多数の被検者の照射の場合に有用である。本発明が自動化できる能力は、高スループットの自動化スクリーニングシステムに適しているからである。他の実施形態では、染色体異常を誘導する化合物への被検者の照射が評価され得る。
【００３９】
幾つかの好ましい実施形態では、本発明は、薬の毒性を評価する方法を提供する。これらの方法は、染色体切断を誘導することができる試薬を有することが望ましい場合において、可能性のある化学療法剤を確認するのに有用である。この態様では、本発明の方法は、特定の試剤のクラストゲニシティ（染色体破壊能力）の評価に使用される。また、本発明の方法は、治療薬が染色体異常を誘発するかどうか決定するための初期的安全スクリーンとして使われる。
【００４０】
細胞
本発明の実施には、遺伝物質を有するいかなる種類の細胞を使用してもよい。例えば、細胞源として心臓、肺、肝臓、腎臓その他の組織からの細胞を使用できる。種々の組織からの細胞の単離は、当業者に既知のいかなる手法を使用しても達成される。好ましい実施形態では、細胞は、ヒト又は鼠細胞等の哺乳類起源のものである。幾つかの好ましい実施形態では、早発的染色体凝縮及び分析のために末梢血液リンパ球を使用してもよい。他の好ましい実施形態では、卵母細胞、又は、胎児、羊水又は株化細胞系統（幹細胞等）から得られたものでよい。
【００４１】
本発明に使われる細胞の単離は、当業者に既知のいかなる手段であってもよい。幾つかの好ましい実施形態では、末梢血液リンパ球（ＨＰＢＬｓ）が使用される。末梢血液リンパ球の単離は、本分野では日常的である。一つの適当なプロトコールが下記に記載されており、当業者に既知の他のプロトコールも使用できる。以下のプロトコールでは、ヒト被検体から末梢血液リンパ球が単離される。末梢血液リンパ球は、同等に、いかなる被検体からも単離される。幾つかの好ましい実施形態では、被検体は、哺乳動物である。他の好ましい実施形態では、被検体は、ヒト又はマウスである。
【００４２】
リンパ球は、当業者に既知の適当な手法を使用して、全血液サンプルから単離される。適当な手法の例としては、例えば、Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ１０７７（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．）を使用する密度勾配遠心法が挙げられる。遠心の後、細胞を収集してリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．０）で二回洗浄する。その後、適当な細胞培地に細胞を再懸濁させる。所与の種類の細胞に対して適当な細胞培地を選択することは、当業者にとって日常的である。細胞がリンパ球である場合、適当な培地はＫａｒｙｏｍａｘ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓＩｎｃ．）である。引き続く分析に適当な濃度で細胞を再懸濁させる。例えば、約１×１０６細胞／ｍｌから約１．５×１０６細胞／ｍｌの濃度である。
【００４３】
細胞培地
本発明は、試験細胞で早発的染色体凝縮を誘導させる細胞培地を提供する。いかなる適当な細胞培地も一つ以上の有糸分裂増強因子で補充されて、本発明の細胞培地として使用される。適当な細胞培地は、早発的染色体凝縮の誘導期間にわたって対象の細胞を成育可能な状態にて維持できるものである。任意に、適当な細胞培地は、遷延性期間にわたって試験細胞を維持できるものである。
【００４４】
本発明の細胞培地は、一般的に、試験細胞の生育力を維持するために選択された種々の成分を含む。このような成分は、アミノ酸、ビタミン、無機塩、緩衝液又は緩衝液塩、糖、脂質、微量元素、サイトカイン及びホルモンを含むが、これらに限定されない。適当な細胞培地は、例えばＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．から市販されている。
【００４５】
好ましい実施形態では、本発明の細胞培地は、一つ以上の有糸分裂増強因子を含む。有糸分裂増強因子は、有糸分裂への細胞周期の進行に関連した試薬である。有糸分裂増強因子は、サイクリン、サイクリンキナーゼ、ヒストンキナーゼ、トポイソメラーゼ、ＳＭＣタンパク質、ｃｄｋ１基質、ヒストン、及び有糸分裂促進因子（ＭＰＦ）の成分を含むが、これらに限定されない。好ましい実施形態では、有糸分裂増強因子は、精製された有糸分裂増強因子であってよい。有糸分裂増強因子は、所望の純度レベルに精製され得る。好ましくは、有糸分裂増強因子は、少なくとも５０％の純度（つまり、有糸分裂増強因子が、細胞培地に加えられる有糸分裂増強因子含有物質の重量の少なくとも５０％までを成す）である。他の好ましい実施形態では、有糸分裂増強因子は、７５％以上の純度、８０％以上の純度、８５％以上の純度、９０％以上の純度又は８５％以上の純度である。好ましい実施形態では、本発明の細胞培地は、ｐ３４ｃｄｃ２／サイクリンＢキナーゼを含んでよい。適当なｐ３４ｃｄｃ２／サイクリンＢキナーゼは、例えばＮｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓから市販されている。
【００４６】
有糸分裂増強因子は、単独で又は他の因子との組み合わせで、培地に加えられる。有糸分裂増強因子は、天然タンパク質型であっても、突然変異タンパク質型であってもよい。例えば、有糸分裂増強因子を含む融合タンパク質を使うことができる。融合タンパク質を製造するために、有糸分裂増強因子は、タンパク質又は他のタンパク質のペプチド部分とフレームに配置され得る。融合タンパク質の構築は、本技術分野では日常的である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓを参照）。好ましい実施形態では、本発明の融合タンパク質は、有糸分裂増強因子に加えて、融合タンパク質、核局在化シグナル、精製標識、エピトープ等の細胞アップテイクを容易にするために、レセプタに対する一つ以上のリガンドを含んでよい。好ましい実施形態では、本発明の細胞培地は、有糸分裂増強因子及び核局在化配列を含む融合タンパク質を含む。適当な核局在化シグナルは、本技術分野では既知であり、例えば、米国特許第６０５１４２９号及び５７３６３９２号に見出される。
【００４７】
有糸分裂増強因子に加えて、本発明の細胞培地は、ＡＴＰ及びＧＴＰに限定されない、一つ以上のエネルギー源を含んでいてよい。
【００４８】
本発明の細胞培地は、一つ以上のトランスフェクション試薬を任意に含んでよい。本明細書では、トランスフェクション試薬とは、細胞培地に加えられた場合に、試験細胞による有糸分裂増強因子のアップテイクを向上させるいかなる試薬も含むと考えられる。トランスフェクション試薬には、中性脂質、カチオン性脂質、中性脂質とカチオン性脂質の混合物、タンパク質、ペプチド、リポタンパク質、リポペプチド等が含まれるが、これらに限定されない。適当なトランスフェクション試薬は、例えばＰｒｏｍｅｇａ  Ｉｎｃ．及びＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃから市販されている。幾つかの好ましい実施形態では、本発明のトランスフェクション試薬は、レセプタ媒介エンドサイトーシスを向上させるペプチドを含んでいてよい。このようなトランスフェクション試薬の例として、米国特許第６１０３５２９号に見出せる。トランスフェクション試薬は、培地に直接的に加えられても、有糸分裂増強因子を培地へ加える前に有糸分裂増強因子と組み合わせてもよい。
【００４９】
本発明の細胞培地は、一つ以上のホスファターゼ阻害剤を任意に含んでよい。幾つかの好ましい実施形態では、タンパク質ホスファターゼ阻害剤は、セリン／スレオニンタンパク質ホスファターゼを特異的に阻害できる。幾つかの好ましい実施形態では、ホスファターゼ阻害剤は、タンパク質ホスファターゼ１及び２Ａを特異的に阻害することができる。適当なホスファターゼ阻害剤には、オカダ酸、オカダ酸の塩、カリクリンＡ、カンタリジン酸、カンタリジン、シペルメトリン、デルタメトリン、デホスタチン、３、４-デホスタチン、エンドタール、フェンバレート、ホストリエシン、ミクロシスチン-ＬＡ、ミクロシスチン-ＬＦ、ミクロシスチン-ＬＲ、ミクロシスチン-ＬＷ、ミクロシスチン-ＲＲ及びミクロシスチン-ＹＲが含まれるが、これらに限定されない。
【００５０】
細胞培養組成物
本発明の細胞培地は、細胞又は細胞群及び本発明の細胞培地を含む細胞培養組成物を調製するために使用され得る。細胞は、早発的染色体凝縮が誘導されるものであればいかなるものであってもよい。被検体から単離された細胞が特に好ましい。単離細胞は、被検体の器官又は組織に由来するものであってよく、血液、心臓、肺、上皮組織及び／又は小腸組織が含まれるが、これらに限定されない。
【００５１】
キット
本発明は、細胞遺伝学研究での使用に適用されるキットを意図する。一般的に、本発明のキットは、本発明の細胞培地を保持する一つ以上の容器を含んでよい。細胞培地は、液体の形態でもよいし、乾燥粉末濃縮物の形態でもよい。本発明のキットは、一つ以上の有糸分裂増強因子を保持する一つ以上の容器を含んでよい。この因子は、溶液中にあってもよいし、乾燥粉末の形態でもよい。本発明のキットは、一つ以上のホスファターゼ阻害剤を保持する一つ以上の容器を含んでよい。任意に、本発明のキットは、一つ以上のトランスフェクション試薬及び／又は一つ以上のエネルギー源を、溶液中に又は乾燥形態で保持する一つ以上の容器を含んでよい。
【００５２】
本発明のキットは、本発明の材料及び方法を使用して早発的染色体凝縮を誘導するインストラクションを含んでいることが好ましい。特に、該インストラクションは、有糸分裂促進剤で細胞又は細胞群を刺激する必要なく、細胞又は細胞群で早発的染色体凝縮を誘導させるための詳細なプロトコールを提供するものである。
【００５３】
染色体スプレッドの調製及び分析
ＰＣＣスプレッドは、必要な処理の直後に、細胞遺伝学的手法に従い調製することができる。簡潔には、低張性塩化カリウム（０．０７５Ｍ）溶液で細胞を５分間にわたって処理して、酢酸：メタノール（１：３）固定液で固定する。固定された細胞は、酸洗浄されたガラス板上に落される。
【００５４】
スプレッド染色体を直接的に可視化するために、スライドを染色する。適当な染色剤が当業者には既知であり、例えば、光学顕微鏡による観察には、ギームザ染色剤の４％水溶液を使うことができる。１０００倍の拡大率でコード化されたスライドを分析することができる。染色体の少なくとも部分的分離を示している凝縮した染色質物質を持つ細胞は、ＰＣＣスプレッドとしてスコア化される。
【００５５】
ＰＣＣインデックスは、以下のように決定される。
ＰＣＣスプレッド数／（分裂間期細胞数  ＋  ＰＣＣスプレッド数）  ×  １００
蛍光インシツハイブリダイゼイション分析（ＦＩＳＨ）を伴う実験については、染色体スプレッドの調製後、全染色体ＤＮＡハイブリダイゼーションプローブは、一つ以上の染色体に特異的である。任意的に、全染色体ＤＮＡハイブリダイゼーションプローブは、検出可能な成分で直接にラベル化され、スプレッド染色体の分析に使用される。このようなラベル化された染色体プローブは、市販されている。例えば、スペクトラム緑色蛍光色素でラベル化された染色体１に特異的な全染色体プローブは、Ｖｙｓｉｓ  Ｉｎｃから得られる。
【００５６】
インシツハイブリダイゼイション及び染色体ペインティング（chromosome painting）は、本技術分野で周知の技法（例えば、Brown et al. (1992) Int. J. Radiat. Oncol. Biol. Phys. 24, 279-286）を使って行われる。
【００５７】
以下に開示された本発明の実施例では、Ｖｙｓｉｓ  Ｉｎｃからの染色体１プローブが、製造者のプロトコールに従って使われた。他の適当なプローブは、当業者に既知であり、本発明の意図から逸脱することなく使用され得る。他の好ましいプローブには、病的状態に特異的なプローブが含まれる。
【００５８】
ＤＡＰＩ及びフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）用のフィルターが装備された蛍光顕微鏡（Ｌｅｉｔｚ）下で染色体１異常を分析するために、４，６‐ジアミジノ‐２‐フェニール‐インドール（ＤＡＰＩ）を含む培地に細胞をマウントすることができる。
【００５９】
コード化されたスライドは、染色体１を伴う異常を分析するために、１０００倍の拡大率で観察することができる。染色体異常分析は、以下の一般的基準に基づく。
【００６０】
分析においてインキュベートされる細胞は、次のうちの一つ以上（好ましくは全て）を示すべきである：（ａ）ＤＡＰＩ対比染色によって決定される凝縮された染色質物質を持つ染色体の少なくとも部分的分離、（ｂ）明るい緑色蛍光シグナルを持つ、２つ以上のはっきりと分離された染色体１特異的スポット（シグナル緑色スポットを持つ細胞は、オーバーラップシグナルで起こるので、含めなかった）、（ｃ）蛍光強度が類似のスポット、及び（ｄ）偽処理されたコントロールからのサンプルで観察されたスポットの約１５から１００％の領域を表す領域。
【００６１】
コントロールサンプルのスポット領域は、常に均一ではない。それは、染色体凝縮の異なりからであり、少しの場合には、顕微鏡下での角度表象（angular presentation）による。このような曖昧な場合には、分析から細胞は除外されるべきである。
【００６２】
本発明の範囲又は本発明の実施形態から逸脱することなく他の適当な修飾及び適用が本発明の材料及び方法に成され得ることは当業者には容易に認識されよう。本発明を詳細に記載してきた。本発明は、図面及び以下の非限定的な実施例を参照することにより、一層明らかに理解されよう。
【００６３】
実施例
（実施例１）
有糸分裂促進剤刺激細胞における早発的染色体凝縮の誘導
比較目的のため及びホスファターゼ阻害剤の適当なレベルを決定するために、先行技術の方法を使用して、ＨＰＢＬｓにおいて早発的染色体凝縮を誘導させた。
【００６４】
エネルギー源で補充された細胞培地中で、上述のようにして調製したＨＰＢＬｓをインキュベートする。ＰＣＣのための最適ＯＡ濃度及びインキュベーション期間を決定するために、フィトヘマグルチニン（ＰＨＡ、１０μｇ／ｍｌ；Ｍｕｒｅｘ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を培地に引き続き加えて、増殖を刺激した。この完全培地は、有糸分裂増強因子を含まなかった。
【００６５】
ＯＡを単独で含む細胞培地中での未刺激ＨＰＢＬのインキュベーションでは、ＰＣＣ誘導は起こらなかった。従って、ＰＨＡは、細胞周期進行を助けるために使われた。１００μＭのＡＴＰを含む細胞培地中、０．２５〜１μＭの範囲の濃度のＯＡでＨＰＢＬを処理し、２４時間までの種々の期間にわたって３７℃でインキュベートした。上述の説明のように、スライドを調製してＰＣＣインデックスを決定した。
【００６６】
図２Ａは、ギームザで染色された有糸分裂促進剤刺激ＨＰＢＬにおいて、ＯＡで処理することによって誘導されたＰＣＣを示す代表的な写真である。細胞膜の溶解、染色質物質の凝縮、及び染色体の部分的分離は、ＯＡ誘導ＰＣＣを特徴付けた。分離されていない染色体は、分裂中期染色体又は有糸分裂細胞融合法によって誘導されたＰＣＣと比較すると、より凝縮されていないように見え、染色体凝集塊がほとんどの細胞において依然として見える。
【００６７】
図３は、有糸分裂促進剤刺激ＨＰＢＬモデルにおける、ＯＡ濃度及びインキュベーション期間のＰＣＣ誘導に対する効果を示す。二つ以上の独立の実験からプールされたデータが示されている。各濃度及び時間の点は、１０００個を越える細胞を代表する。有糸分裂促進剤刺激ＨＰＢＬをＯＡ（０．２５μＭ）で処理することにより、１時間以内で、コントロールと比較して、ＰＣＣインデックスで決定される有意のＰＣＣレベル（ｐ＜０．００１、学生のｔ検定）が得られた。ＰＣＣインデックスは、１μＭ濃度で８時間で最大６１％に達した。０．７５μＭ濃度では、インデックスは、２時間でピークであり、２０％の細胞がＰＣＣを提示し、２４時間にわたるまでこのレベルに維持された。０．７５μＭ濃度でのＯＡは、細胞増殖抑制性でなく、有糸分裂促進剤刺激ＨＰＢＬも出る適度に高いＰＣＣ収率を誘導すると考えられる。従って、未刺激ＨＰＢＬにおいてＰＣＣを誘導するための、ｐ３４ｃｄｃ２／サイクリンＢキナーゼを用いた更なる研究は、この濃度を用いて行った。
【００６８】
ＯＡ又はカリクリンＡ等のホスファターゼ阻害剤を用いて有糸分裂促進剤刺激ＨＰＢＬを処理することにより、染色質物質が早発的に誘導されることについては、以前に実証されている。これらの研究においては、ＨＰＢＬは、ＰＨＡ刺激の４１時間後から４５時間後に、１時間から６時間の種々の期間にわたって、０．１μＭから０．５μＭのＯＡ用量（Gotoh et al. (1996) Int. J. Radiat.Biol. 70, 517-520; Kanada et al. (1999) Int. J. Radiat. Biol. 75, 441-446）又は０．０５μＭのカリクリンＡ（Durante et al. (1998) Int. J. Radiat. Biol. 74, 457-462）で、細胞周期のＳ期又はＧ２期から有糸分裂様状態への進出を誘導するために処理された。本実験では、ＨＰＢＬの有糸分裂促進剤刺激の直後から２４時間後に処理された、０．２５μＭから１μＭの間のＯＡ濃度の効果を研究した。細胞周期進行の活性化を援助するためにＰＨＡを使った。この研究においては、早ければ１時間で、ＰＣＣ収率の有意な（Ｐ＜０．０１）上昇が観察された。これは、有糸分裂促進剤刺激ＨＰＢＬ集団群の迅速に分化しない群では、ＤＮＡ複製前にＰＣＣ誘導されることを示唆する。ＯＡでの処理後に早ければ１時間で観察されたＰＣＣインデックスの有意な（Ｐ＜０．０１）上昇は、他の研究による増殖細胞で見られるものに相当する（Gotoh et al. (1996) Int. J. Radiat.Biol. 70, 517-520; Durante et al. (1998) Int. J. Radiat. Biol. 74, 457-462; Coco-Martin Et al. (1997) Int. J. Radiat. Biol. 71, 265-273; and Ghosh et al. (1992) Exp. Cell Res. 201, 535-540）。
【００６９】
最適化研究では（図３）、０．７５μＭのＯＡにより、２時間で２０％のピークＰＣＣレベルが得られ、２４時間にわたるまでこのレベルに維持された。この用量は、未刺激ＨＰＢＬモデルにおいてＰＣＣを誘導するための、ｐ３４ｃｄｃ２／サイクリンＢキナーゼを用いた処理に使われた。この用量を選択したのは、ＰＣＣ収率だけでなく、ＰＣＣスプレッドの質にもよる。Ｋａｎｄａら（Kanada et al. (1999) Int. J. Radiat. Biol. 75, 441-446）の観察と同じく、より高濃度のＯＡでの持続性の処理では、スプレッドの質が悪いことが観察され、これはおそらく毒性によると思われる。更に、ＯＡは、ヒト骨髄性の白血病の細胞株において、濃度依存及び時間依存により、細胞周期進行を止めることが分かった（Ishida et al. (1992) J. Cell. Physiol. 150, 484-492）。ＰＣＣ誘導可能な高濃度（０．５μＭよりも高濃度）では、細胞周期停止は、Ｇ１−Ｓ期に起こる。しかし、低濃度では、細胞周期停止は、Ｇ２−Ｍ期に起こる（Ishida et al. (1992) J. Cell. Physiol. 150, 484-492）。
【００７０】
（実施例２）
休止細胞における早発的染色体凝縮の誘導
本発明の以下の実施例では、ＯＡ（０．７５μＭ）を含むＡＴＰ（１００μＭ）で補充された完全培地にｐ３４ｃｄｃ２／サイクリンＢキナーゼを加え、３７℃で３時間にわたってインキュベーションすることによって、未刺激ＨＰＢＬでのＰＣＣ誘導を達成した。２つ以上の独立した実験からＰＣＣインデックスを決定した。各データ点は、１０００個以上の細胞を代表する。プールされたデータを、有糸分裂促進剤刺激ＨＰＢＬモデルにおいて、ＯＡでの単独処理によって得られた収率と比較した。得られた結果を、先行例の先行技術の方法によって得られた結果と比較した。
【００７１】
５ユニット／ｍｌまで低い濃度でｐ３４ｃｄｃ２／サイクリンＢキナーゼが存在することにより、未刺激ＨＰＢＬにおいてＰＣＣ誘導が起こった。この濃度では、ＰＣＣ収率は、有糸分裂促進剤刺激ＨＰＢＬにおいてＯＡ単独により処理された群の収率よりも約３０％高かった（図４）。酵素濃度の増加により、濃度依存性で且つ有意な（ｐ＜０．０５；学生のｔ検定）増加がＰＣＣ収率に起こった（図４）。また、染色質物質の凝集及びスプレッドが改善され、ＰＣＣスプレッドのより質の高いものがもたらされた（図２Ｂ）。
【００７２】
（実施例３）
未刺激細胞からの染色体スプレッドを使用した放射線量の決定
未刺激細胞から調製されたＰＣＣスプレッドは、Ｃｏｃｏ−Ｍａｒｔｉｎ及びＢｅｇｇ（Coco-Martin et al. (1997) Int. J. Radiat.Biol. 71, 265-273）によって記載された「スポットアッセイ」によって全染色体プローブでハイブリダイズされた特異的な染色体を伴う放射線誘導染色体異常の検出に適切であった。
【００７３】
カリオマックス（Karyomax）中の細胞懸濁液を１５ｍｌポリプロピレン遠心分離管の中に入れ、室温で、６０Ｃｏ施設の左右対称場において１Ｇｙ／分の線量率でガンマ線に晒した。照射源及び線量測定手法は、先に記載されている（Stankus et al. (1995) Int. Radiat. Biol. 68, 1-9）。線量率は、照射の前に組織等価イオン化チャンバで測定された。左右対称場は、２％の範囲内で均一である。放射線量−応答の研究では、未刺激ＨＰＢＬを、ＰＣＣ誘導前に、完全培地中で照射後２１時間にわたって３７℃でインキュベートした。
【００７４】
ＯＡ、ＡＴＰ及びｐ３４ｃｄｃ２／サイクリンＢキナーゼを含む培地中で未刺激ＨＰＢＬをインキュベートすることによって得られたＰＣＣスプレッドにおいて、染色体１を伴う照射誘導による構造上の異常を持つ細胞を定量化するためにＦＩＳＨを使った。この研究は、生物学的な線量測定への「スポットアッセイ」の潜在適応性について評価し、０から７．５Ｇｙのガンマ線量への暴露に続く３７℃での２４時間修復インキュベーションを含んだ。上記で説明したように、ＰＣＣスプレッドを調製し、ＦＩＳＨ手法を適用した。実験ごとの最大差異は重大ではなかった（1次自由度について、カイ自乗値＝０．２６５、ｐ＝０．６０６）ので、４つの独立した実験からデータをプールした。各線量レベルは、２つ以上の実験を代表するものである。染色体１を伴っている異常を数えるために、少なくとも１０００個の細胞を分析した。
【００７５】
照射されなかった細胞では、２つの蛍光（緑色）スポットが見られた。これは、染色体１の２つのコピーと考えられる（図２Ｃ）。照射された細胞では、染色体１に異常が誘導されたことにより、２つ以上の蛍光スポットが度々見られた（図２Ｄ）。これは、照射により誘導された断片又は置換であるだろうと考えられる。異なる線量のガンマ照射に晒された後での、染色体１を伴う異常を持つ細胞の頻度分布についてのデータについては、表１に示してある。
【００７６】
これらのデータにより、異常染色体１を持つ細胞は、０Ｇｙから７．５Ｇｙの間の放射線量と伴に増加することが実証される。これは、一般的に、細胞遺伝子学エンドポイントについての線量−効果とよく一致する。染色体１の過剰スポット数は、０．５Ｇｙで細胞当たり０．０３５±０．００５８から７．５Ｇｙで０．２３６±０．０１２６へと、放射線量と供に増加した。ＦＩＳＨ−ペイントＰＣＣスプレッドにおける染色体１異常を持つ細胞のベースライン頻度は、０．００６±０．００２０であった。２つのスポットを持つ細胞の頻度は、０．５Ｇｙで０．９６５から７．５Ｇｙで０．８０３へと減少し、２つを超えるスポットを持つ細胞の頻度に相当する増加があった（表）。染色体１について２つを超えるスポットを持つ細胞数は、０Ｇｙから７．５Ｇｙへの放射線量に伴って増加し、１９．７０±１．２５８パーセントで最大に達した（図５）。
【００７７】
異常染色体１を持つ数々の細胞の線量−反応データは、２つのモデルに適合した。荷重付加最小自乗回帰方法（荷重は平均値二乗のＳＥの逆数）によって適合する線形モデル（Y=(2.77 ± 0.230) D + 0.90 ± 0.431及び r2= 0.966）及び非線形パワーモデル（Y = (5.70 ±0.46)D(0.61±0.05)及び r2= 0.9901）である。非線形パワーモデルと適合する場合、線量−反応曲線の横軸方向への曲がりが観察された。
【００７８】
【表１】
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【００７９】
線量−反応の関係は、他の分裂中期-スプレッドに基づく細胞遺伝学アッセイ又は小核アッセイ（micronucleus assay）よりも、広範な線量範囲を持つ。非線形パワーモデル適合では、線量−反応曲線の横軸方向への下向き曲率が観察された。ただ１つの染色体対のみがペイントされており、これはゲノムの断片のみを表すので、放射線量を増加させるとシグナルの若干の飽和が起こると予期される。この効果は、高い放射線量では特に確かである。高い放射線量では、複合体（置換物及び断片の両方）によって作られる数々の分離シグナルが制限される。所与の細胞においては核領域は一定である。更に、細胞当たりの平均値置換（mean exchanges）は、低ＬＥＴ放射による正の上方向曲率で増加することが知られている。この場合、この曲率は、幾分小さくなる。屈曲をゆがめる（異なる線量−反応屈曲を持つ）断片の含有のためである。非線形パワーモデルへのより良い適合により、このアッセイは比較的低放射線量において感度が高いことが示唆される。このデータは、Ｃｏｃｏ−Ｍａｒｔｉｎ及びＢｅｇｇ（Coco-Martin et al. (1997) Int. J. Radiat. Bio. 71, 265-273）の先のデータで、ＯＡによって誘導されたＧ１期ＰＣＣにおけるヒト腺癌細胞株（Ａ５４９）をガンマ線照射することによって誘導された染色体４異常の測定を伴うものとよく一致する。
【００８０】
（実施例４）
放射線量の決定のインビボ検証
本明細書に記載された方法は、被検体が受ける放射線量を評価するために使用できる。このことは、異なる線量のガンマ線への暴露に続き、３７℃で２４時間にわたり修復インキュベーションを行った後、ＨＰＢＬｓの早発的染色体凝縮スプレッドを使って実証された。このアッセイでは、未刺激ＨＰＢＬにおいて、染色体１異常を伴う細胞当たりのベースライン頻度は、０．００６±０．００２０と観察された。この頻度は、他の細胞遺伝学アッセイについてのベースライン頻度よりも高い（例えば、分裂中期スプレッドではジセントリクス（細胞当たり０．００１）が測定される）。より高いベースライン頻度は、一般には、異常を持っている若干の細胞が有糸分裂前に細胞集団から消失するので、分裂中期スプレッドをベースにした細胞遺伝学アッセイによっては検出されないことを示唆する。従って、本発明の方法は、細胞の状態をより正確に評価することができる。有糸分裂を経ることのできない細胞が依然としてデータセットに表示されて消失されないからである。
【００８１】
タイのバンコクで起こっている放射能漏れ源であるくず鉄からの６０Ｃガンマ線放射に晒された個々人からＨＰＢＬサンプルを収集した。これらの個々人は、０．１Ｇｙから１６Ｇｙの放射線量を、２００μＳｖ／ｈに及び線量速度で受けていた。放射線に晒されたこれらの人（３０人以上）から、照射から約４ヶ月後に、１２サンプルを収集し、コントロールを備えた９サンプルを先に記載したＦＩＳＨ法によって分析して、染色体１中の染色体異常の数について決定した。図６にデータを示す。図６は、放射線に照射された患者から単離された細胞においては、２つ以上の蛍光スポットを持つ細胞の割合が、正常コントロール細胞と比較した場合に増加することを示している。
【００８２】
照射された個々人のＨＰＢＬについて実行されたＰＣＣアッセイによって例示されたように、本発明の方法は、生物線量測定のための直接的且つ高感度のツールを提供する（Pantelias et al. (1985) Mutat. Res. 149, 67-72; Prasanna et al. (1997) Health Phys. 72, 594-600; and Cornforth et al. (1983) Science 222, 1141-1143）。このアッセイは、吸収された線量を素早く（実験室で血液サンプルを受けてから２４時間以内に）予測することができ、効果的な臨床学的処置を可能にする。未刺激細胞について行われ、細胞分裂を要求しないので、放射誘導による細胞周期遅延（Poncelet et al. (1988) Strehlanther. Und Onkol. 164, 542-543）及び細胞死（MacVittie et al. (1996) Acvances in the Treatment of Radiation Injury, Elsevier Science, 263-269）等の交絡因子（cofounding factors）は、線量の見積もりと干渉しあわない。
【００８３】
これらの結果により、本発明の方法が、放射線暴露の生物学的線量測定につき、現在使われている手法（有糸分裂細胞融合の後の、分裂中期又はＰＣＣスプレッドの染色体異常の分析等）に比べて、より簡易で且つより信頼できる手法を提供できることが示される。本発明の方法は、未刺激細胞にＰＣＣを誘導させ、特定の染色体に関与する異常を分析することを伴う。本方法は、早発的染色体凝縮を誘導させるために、有糸分裂促進因子を含み且つホスファターゼ阻害剤及びエネルギー源（例えば、ｐ３４ｃｄｃ２／サイクリンＢキナーゼ、ＯＡ及びＡＴＰ）を任意に含む細胞培地中で試験細胞を単にインキュベートすることを伴い、簡易であり、代替的ＰＣＣ誘導プロトコール（Pantelias et al. (1983) Somatic Cell Genet. 9, 533-547; Johnson et al. (1970) Nature 226, 717-722）と関連する技術的な専門知識を必要としない。
【００８４】
（実施例５）
卵母細胞、胚盤胞、幹細胞と胚細胞での染色体完全性の検査
実施例２の方法を使って、卵母細胞等の単一細胞、芽細胞からの極体または細胞、多発性細胞（例えば、羊水サンプル又は確立されたヒト幹細胞株からの細胞）でＰＣＣを誘導させた。マウスからの卵母細胞又は胚細胞を使うこともできる。細胞又は細胞（複数）を、実施例２に記載された完全培地中で、３７℃で３時間にわたってインキュベートする。染色体スプレッドを調製して、先に記載された方法のいずれかを使って検査する。構造上の異常（例えば、２つを超える蛍光スポット）は、ＦＩＳＨ法を使って示されるか、染色体に結合する遺伝子座特定のプローブの欠損によって示される。健全な胚または細胞株を、培養中又はインユテロで維持し、健全な卵母細胞（その相当する極体は検証される）は受精させる。異常な細胞は培養中で維持されず、以降の手順にも使用されない。
【００８５】
完全培地の最適化のためには、複数の細胞を含むサンプルを部分に分け、実施例２の完全培地中で各部分をインキュベートするが、各部分には、ホスファターゼ阻害剤（オカダ酸又はカリクリンＡ）又はエネルギー源（ＡＴＰ）又はサイクリンキナーゼ（ｐ３４ｃｄｃ２／サイクリンＢキナーゼ）が異なる濃度で含まれている。利用可能なサンプル部分の数に従って、複数の成分を最適化することができる。染色体スプレッドを得るためには、３７℃で３時間経った後細胞を収穫し、低張性処理して、メタノール／酢酸で固定し、スライド上に置き染色する。ＰＣＣが誘導される細胞の割合を、各サンプルについて計算し、線量−反応の関係を決定する。その後、一つ以上の成分の最適な濃度を使って、引き続く分析のための完全培地を調製する。
【００８６】
単一細胞胚又は卵母細胞を操作するためには、ミクロ操作法を使う。マイクロピペット・チップに細胞を付けて保持し、完全培地を有する培養皿に入れる。ＰＣＣの誘導前に、３７℃で数時間にわたって細胞をインキュベートする。代替として、ｐ３４ｃｄｃ２／サイクリンＢキナーゼと、オカダ酸又はカリクリンＡのいずれかとの溶液を、マイクロインジェクション又は電気泳動により、細胞に導入する。その後、培養皿の中身を、低張液、固定液と続けて置換して、染色体スプレッドを調製する。第二の代替として、インキュベーション用の完全培地を含む毛細管内に細胞を保持して、吸引と補充により先に記述した処理を行う。この手順は、立体顕微鏡の下で行われる。同様にして染色体スプレッドを調製する。
【００８７】
上述の通り、インシツハイブリダイゼーション、染色体ペインティング又は蛍光顕微鏡により染色体を検査する。染色体が市販の蛍光分子でラベルされる全染色体ＤＮＡハイブリダイゼーションは、単一の染色体に特異的である。インシツハイブリダイゼーション及び染色体ペインティングは、標準法に従い実施される。ＰＣＣ誘導の後、ＤＡＰＩ及びＦＩＴＣ用のフィルターを備えた蛍光顕微鏡の下で、ＤＡＰＩ含有培地に細胞サンプルを置く。染色体１で研究されたような染色体異常が可視化され、種類と数について分析することができる。
【００８８】
（実施例６）
ＰＣＣ感受性リンパ球部分母集団の高スループット単離
多数のサンプルを伴う細胞遺伝学的適用及び分析のためには、ＰＣＣの影響を受け易いリンパ球の部分母集団を単離する高スループット手順が必要である。現在の手順は、長たらしく能率が悪い。つまり、密度勾配上（例えば、フィコール、Histopaque）での単離には、有糸分裂促進剤及びＰＨＡを用いた処理が続けて行われる。その後、分裂中期スプレッドが調製され、コルセミドでの処理によって周期が止められる。その後、これらの細胞を培養して、有糸分裂収率が４−５％の部分母集団が生産される。
【００８９】
十分な数のＰＣＣ感受性末梢血液リンパ球を迅速に且つ簡易に生産するために、遠心分離管（例えば、５０ｍｌの円錐形の遠心分離管）中で、ロゼットセップ（ＲｏｓｅｔｔｅＳｅｐ(R)）（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）多価抗体を含むカクテルと全血液を混合させる。遠心分離管を室温にて２０分間にわたりインキュベートする。有糸分裂促進剤及びＰＣＣ非感受性リンパ球及び非リンパ球白血球を抗体で架橋させて、四量体「ロゼット」複合体（tetrameric “rosette” complexes）を形成する。各遠心分離管中の内容物の下に、その後、フィコールが置かれ、２０分間にわたって遠心にかける。上部の血漿層と下部のフィコール層との間に、ＰＣＣ感受性である精製されたリンパ球部分母集団を含むインターフェースが形成される。不必要な白血球、赤血球及び他の細胞様及び粒状の血液成分は、底にペレットされる。
【００９０】
この手順は、多数の血液サンプルを含むためにスケーラブルであり（自動化単離しステムの使用により、１ラン当たり＞５００）、有糸分裂収率の１０倍増加が達成可能である。その結果、この手順は、細胞遺伝学適用のための現在の方法にとって好ましい。免疫系疾患に関連する臨床学的適応に対して、この手順は、ＣＤ３＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞及びＣＤ８＋Ｔ細胞等のＴ細胞部分母集団の単離のために、より良く適している。
【００９１】
ＰＣＣ感受性リンパ球部分母集団の単離もまた、ステムセップ（ＳｔｅｍＳｅｐ(R)）（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）免疫磁気細胞選択アッセイを使って達成される。このアッセイでは、試薬カクテルは、サンプル中の不必要な細胞の表面に存在するマーカーに対している抗体から成る。これらの抗体でラベルされた細胞は、磁気カラムを通って通過することにより効果的に除去される。その一方で、所望の細胞は、流れて、ラベル化されないで、高度に濃縮されて、カラムに集められる。ＳｔｅｍＳｅｐ(R)免疫磁気陰性細胞選択は、メモリーＣＤ４＋Ｔ細胞（ＣＤ４＋Ｔ細胞カクテルにＣＤ４５ＲＡを追加）、静止ＣＤ４＋Ｔ細胞（ＣＤ４＋Ｔ細胞カクテルに一つ以上のＣＤ２５，ＣＤ６９ＨＬＡ−ＤＲを追加）、静止ＣＤ８＋Ｔ細胞（ＣＤ８＋Ｔ細胞カクテルに一つ以上のＣＤ２５、ＣＤ２７、ＣＤ６９ＨＬＡ−ＤＲを追加）、αβＴ細胞（Ｔ細胞カクテルにＴＣＲγδを追加）及びγδＴ細胞（Ｔ細胞カクテルにＴＣＲαβを追加）の単離に使われる。
【００９２】
本発明の明瞭な理解のために、例示及び実施例として、その詳細につき十分に記載してきた。当業者には、条件、調剤及び他のパラメタについて広範且つ等価の範囲内で、本発明を修飾又は置換したとしても、本発明の範囲又は特定の実施形態に影響を与えることなく、同一のことが実行されることが明らかであろう。これらの修飾又は置換は、請求項の範囲内であると意図される。
【００９３】
本明細書で言及された全ての出版物、特許及び特許出願は、本発明と関連する当業者の水準を示すものであり、参照として本明細書に明確に取り込まれている。
【図面の簡単な説明】
【００９４】
【図１】種々の細胞周期における種々の有糸分裂増強因子のアセンブリ及びリン酸化状態を表す図解である。
【図２】（Ａ）から（Ｄ）は、早発性染色体凝縮を誘導するために処理した細胞の染色体スプレッドを示す。（Ａ）は、ギームザ染色されたＨＰＢＬｓの染色体スプレッドの顕微鏡写真であり、早発性染色体凝縮は、有糸分裂促進剤刺激及びＯＡ存在下でのインキュベーションによって誘導されている。（Ｂ）は、ギームザ染色されたＨＰＢＬｓの染色体スプレッドの顕微鏡写真であり、早発性染色体凝縮は、ｐ３４ｃｄｃ２／サイクリンＢキナーゼ及びＯＡの存在下でのインキュベーションによって誘導されている。（Ｃ）は、非照射ＨＰＢＬｓの染色体１のＦＩＳＨ分析を示す顕微鏡写真であり、早発性染色体凝縮は、ｐ３４ｃｄｃ２／サイクリンＢキナーゼ及びＯＡの存在下でのインキュベーションによって誘導されている。（Ｄ）は、照射ＨＰＢＬｓの染色体１のＦＩＳＨ分析を示す顕微鏡写真であり、早発性染色体凝縮は、ｐ３４ｃｄｃ２／サイクリンＢキナーゼ及びＯＡの存在下でのインキュベーションによって誘導されている。
【図３】種々のインキュベーション時間及びＯＡ濃度が、有糸分裂促進剤刺激ＨＰＢＬｓのＰＣＣインデックスに及ぼす効果を示す図である。
【図４】種々のｐ３４ｃｄｃ２／サイクリンＢキナーゼ濃度が、ｐ３４ｃｄｃ２／サイクリンＢキナーゼ処理ＨＰＢＬｓのＰＣＣインデックスに及ぼす効果を示す図である。
【図５】放射線で誘導された染色体異常を持つ細胞についての線量−反応曲線を示す図である。
【図６】放射線に晒された患者から単離された細胞において、２つ以上の蛍光スポットを持つ細胞の割合が、正常コントロール細胞と比較して増加していることを示す図である。
【図１】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
2004529628.tif 000082
2004529628.tif 000083
2004529628.tif 000084