(57)【要約】本発明は、宿主細胞における１つまたは複数のタンパク質の発現のための新規な調節因子およびベクターを提供する。本発明は、抗体などの１つまたは複数のタンパク質を宿主細胞内で発現させるための方法も提供する。これらの方法は、宿主細胞におけるタンパク質の発現のために本発明の新規な調節因子およびベクターを利用する。宿主細胞は、スクリーニングアッセイにおいて使用するために、および高速スクリーニングにおいて直接使用するために、医薬用タンパク質、抗体、タンパク質の変種を含むがこれらに限定されない、種々のタンパク質産物の産生に用いられる。
2004524807.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号：１および低ストリンジェンシー条件下で配列番号：１とハイブリダイズしうる配列からなる群より選択される、核酸配列を含む核酸であって、少なくとも２つの哺乳類供給源に由来する配列を含み、乳腺特異的な遺伝子発現を引き起こす核酸。
【請求項２】
請求項１記載の核酸配列を含むベクター。
【請求項３】
レトロウイルスベクターである、請求項２記載のベクター。
【請求項４】
請求項２記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項５】
配列番号：２および低ストリンジェンシー条件下で配列番号：２とハイブリダイズしうる配列からなる群より選択される、核酸配列を含む核酸であって、該ハイブリダイズしうる配列が、配列番号：２の核酸残基の４位、１１２位、１３１位および２３８位に対応する位置の、少なくとも１つで変異したＡＴＧ配列を含むような核酸。
【請求項６】
請求項５記載の核酸配列を含むベクター。
【請求項７】
レトロウイルスベクターである、請求項６記載のベクター。
【請求項８】
請求項６記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項９】
少なくとも１つのｍＲＮＡ前駆体プロセシングエンハンサー因子（Ｐｒｅ−ｍＲＮＡ Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ Ｅｎｈａｎｃｅｒ ｅｌｅｍｅｎｔ）を含む、レトロウイルスベクター。
【請求項１０】
ｍＲＮＡ前駆体プロセシングエンハンサー因子が、配列番号：２および中程度のストリンジェンシー条件下で配列番号：２とハイブリダイズしうる配列から選択される、請求項９記載のベクター。
【請求項１１】
ｍＲＮＡ前駆体プロセシングエンハンサー因子がＷＰＲＥ因子である、請求項９記載のベクター。
【請求項１２】
ＩＲＥＳコード配列およびシグナルペプチドコード配列をコードする核酸配列であって、該ＩＲＥＳおよびシグナルペプチドコード配列が互いに隣接している核酸配列。
【請求項１３】
シグナルペプチドが、α−カゼイン、ヒト成長ホルモンおよびα−ラクトアルブミンシグナルペプチドからなる群より選択される、請求項１２記載の核酸。
【請求項１４】
請求項１２記載の核酸配列を含むベクター。
【請求項１５】
レトロウイルスベクターである、請求項１４記載のベクター。
【請求項１６】
請求項１４記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項１７】
関心対象のタンパク質を産生するための方法であって、
ａ）ｉ）宿主細胞；および
ｉｉ）ウシ／ヒトハイブリッド型α−ラクトアルブミンプロモーターと機能的に結合したタンパク質をコードする、少なくとも１つの外因性遺伝子を含むベクターを提供する段階；ならびに
ｂ）該外因性遺伝子によってコードされる該タンパク質が発現されるような条件下で、該ベクターを宿主細胞に導入する段階
を含む方法。
【請求項１８】
ベクターが、配列番号：２を含む変異型ＲＮＡ移行因子（ｍｕｔａｎｔ ＲＮＡ ｅｘｐｏｒｔ ｅｌｅｍｅｎｔ）をさらに含む、請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
ベクターが少なくとも２つの外因性遺伝子を含む、請求項１７記載の方法。
【請求項２０】
少なくとも２つの外因性遺伝子が、リボソーム内部進入部位／ウシα−ラクトアルブミンシグナルペプチドによって隔てられた多シストロン性配列中に配置される、請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
免疫グロブリンを産生するための方法であって、
ａ）ｉ）宿主細胞；および
ｉｉ）第１の外因性遺伝子が第１の免疫グロブリン鎖をコードし、第２の外因性遺伝子が第２の免疫グロブリン鎖をコードし、該第１および該第２の遺伝子がリボソーム内部進入部位によって隔てられている、該第１の外因性遺伝子および該第２の外因性遺伝子を含むベクター
を提供する段階；ならびに
ｂ）該第１の免疫グロブリン鎖および該第２の免疫グロブリン鎖が発現されるような条件下で、該ベクターを該宿主細胞に導入する段階
を含む方法。
【請求項２２】
第１の免疫グロブリン鎖および第２の免疫グロブリン鎖の一方が免疫グロブリン軽鎖であり、該第１の免疫グロブリン鎖および該第２の免疫グロブリン鎖のもう一方が免疫グロブリン重鎖である、請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
重鎖がγ、α、μ、δおよびε重鎖からなる群より選択される、請求項２２記載の方法。
【請求項２４】
軽鎖がκおよびλ軽鎖からなる群より選択される、請求項２２記載の方法。
【請求項２５】
免疫グロブリンが分泌型免疫グロブリンである、請求項２１記載の方法。
【請求項２６】
ベクターがレトロウイルスベクターである、請求項２１記載の方法。
【請求項２７】
ベクターがウシα−ラクトアルブミンシグナルペプチドをさらに含む、請求項２１記載の方法。
【請求項２８】
ベクターがウシ／ヒトハイブリッド型α−ラクトアルブミンプロモーターをさらに含む、請求項２１記載の方法。
【請求項２９】
第１の抗体鎖および第２の抗体鎖が約０．９：１．１の比で発現される、請求項２１記載の方法。
【請求項３０】
請求項２１記載の方法によって産生される抗体。
【請求項３１】
ベクターがレトロウイルスベクターおよびプラスミドベクターからなる群より選択される、請求項２１記載の方法。
【請求項３２】
ベクターがレトロウイルスベクターである、請求項２１記載の方法。
【請求項３３】
レトロウイルスベクターが偽型の（ｐｓｅｕｄｏｔｙｐｅｄ）レトロウイルスベクターである、請求項３２記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明は、宿主細胞における１つまたは複数のタンパク質の発現のための新規な調節因子（ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｅｌｅｍｅｎｔ）およびベクターに関する。
【０００２】
発明の背景
細菌宿主における組換えタンパク質の発現のための方法は広く普及しており、組換え産物の使用および精製を容易にしている。しかし、これらの系を真核生物タンパク質の発現のために用いることは、不溶性ならびに転写後および翻訳後のプロセシングが正しく行われないという問題によってしばしば制限される（例えば、米国特許第５，７２１，１２１号参照、これは参照として本明細書に組み入れられる）。このため、真核生物タンパク質の発現のためには真核生物発現系が一般に用いられる。特に医薬・バイオテクノロジー産業は、哺乳類細胞における組換えタンパク質の産生に大きく依拠している。これらの組換え産生タンパク質は、多くの疾患および状態の治療的処置のために不可欠である。多くの場合、これらのタンパク質の市場は年間１０億ドルを上回る。哺乳類細胞における組み換え産生が行われているタンパク質の例には、エリスロポエチン、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子およびインスリンが含まれる。さらに、組換え抗体はしばしば治療薬として用いられる。組換え産生タンパク質、特に抗体の臨床適用にはしばしば、高度に精製されたタンパク質が大量に必要である。タンパク質は一般に、哺乳類細胞培養物またはトランスジェニック動物において産生される。
【０００３】
関心対象の遺伝子を哺乳類細胞内に導入するためのベクターは広く入手可能であり、これにはプラスミドベクター、レトロウイルスベクターおよびアデノウイルスベクターが含まれる。レトロウイルスベクターは、哺乳類細胞内への遺伝子の送達用媒体として広く用いられている（例えば、ＶｉｌｅおよびＲｕｓｓｅｌｌ、Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ、５１：１２［１９９５］を参照）。しかし、組換えタンパク質の発現用の哺乳類細胞系を作製するための現行の方法にはいくつか欠点がある（例えば、Ｍｉｅｌｋｅら、Ｂｉｏｃｈｅｍ． ３５：２２３９〜５２［１９９６］を参照）。エピソーム系は組換えタンパク質の高レベルの発現を可能にするが、短期的にのみ安定であることが多い（例えば、ＫｌｅｈｒおよびＢｏｄｅ、Ｍｏｌ． Ｇｅｎｅｔ．（Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ． Ａｄｖ．）７：４７〜５２［１９８８］を参照）。組み込まれた外因性遺伝子を含む哺乳類細胞系はそれよりも幾分安定しているが、安定性は外因性遺伝子の少数のコピー、場合によっては単一のコピーのみの存在に依存しているという知見が増えつつある。ベクターはしばしば不安定であり、その結果、時間の経過に伴ってタンパク質の発現レベルが低下することがある。
【０００４】
産物の全般的収率に基づけば、動物における組換えタンパク質の発現は細胞培養物における発現よりも高い収率をもたらす（例えば、Ｗｅｒｎｅｒら、Ａｒｚｎｅｉｍｉｔｔｅｌｆｏｒｓｈｃｕｎｇ、４８：８７０［１９９８］；Ｐｏｌｌｏｃｋら、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ、２３１：１４７［１９９９］を参照）。しかし、トランスジェニック動物における発現は、トランスジェニック哺乳類の作製方法、産生および純度のばらつき、ならびに動物の寿命によって制限される。
【０００５】
このため、この分野における継続的な努力にもかかわらず、宿主細胞における１つまたは複数のタンパク質の高レベルでの連続的発現のためのベクターは、当技術分野で依然として求められている。
【０００６】
発明の概要
本発明は、宿主細胞における１つまたは複数のタンパク質の発現のための新規な調節因子およびベクターに関する。
【０００７】
いくつかの態様において、本発明は、第１の哺乳類α−ラクトアルブミンプロモーターに由来する少なくとも１つの部分、および第２の哺乳類α−ラクトアルブミンプロモーターに由来する少なくとも１つの部分を含む、ハイブリッド型α−ラクトアルブミンプロモーターを提供する。本発明は、何らかの特定のα−ラクトアルブミンプロモーターに由来する部分には限定されない。実際には、ウシ、ヒト、ヒツジ、ヤギおよびマウスのα−ラクトアルブミンプロモーターを含むが、これらに限定されないさまざまなα−ラクトアルブミンプロモーターに由来する部分が考えられる。他の態様において、本発明は、配列番号：１および低ストリンジェンシー条件下で配列番号：１とハイブリダイズしうる配列からなる群より選択される核酸配列を含む核酸であって、少なくとも２つの哺乳類供給源に由来する配列を含み、乳腺特異的な遺伝子発現を引き起こす核酸を提供する。さらに他の態様において、本発明は、ハイブリッド型ウシ／ヒトα−ラクトアルブミン（αＬＡ）プロモーター／エンハンサーをコードする核酸配列（すなわち、配列番号：１）、および低〜高ストリンジェンシー条件下でハイブリッド型ウシ／ヒトα−ＬＡプロモーターとハイブリダイズしうる配列を提供する。好ましい態様において、これらの配列はトランスジェニック動物の乳腺における外因性遺伝子の発現を駆動する。いくつかの態様において、ハイブリダイズしうる配列は、ヒトおよびウシの因子を含む。他の態様において、本発明は、ハイブリッド型ウシ／ヒトα−ＬＡプロモーターの核酸配列を含むベクターを提供する。いくつかの態様において、ベクターはレトロウイルスベクターである。さらに別の態様において、本発明は、ハイブリッド型ウシ／ヒトα−ＬＡプロモーターを含むベクターを含む宿主細胞を提供する。
【０００８】
本発明は、変異型ＲＮＡ移行因子をコードする核酸（ＰＰＥ因子；配列番号：２）および変異型ＰＰＥ因子とハイブリダイズしうる配列も提供する。いくつかの態様において、変異型ＰＰＥ因子とハイブリダイズしうる配列は、野生型ＰＰＥ因子の核酸残基４位、１１２位、１３１位および２３８位に対応する位置の少なくとも１つで変異したＡＴＧ配列を含む。好ましい態様において、これらの配列は、それらと機能的に結合したＲＮＡの核外輸送を増強する。他の態様において、本発明は、変異型ＰＰＥ因子の核酸配列を含むベクターを提供する。いくつかの態様において、ベクターはレトロウイルスベクターである。さらに別の態様において、本発明は、変異型ＰＰＥ因子を含むベクターを含む宿主細胞を提供する。
【０００９】
本発明は、ＩＲＥＳコード配列およびシグナルペプチドコード配列をコードする核酸であって、前記ＩＲＥＳおよびシグナルペプチドのコード配列が互いに隣接しているような核酸を提供する。いくつかの態様において、ＩＲＥＳ／シグナルペプチド配列には、配列番号：３または配列番号：１２、ならびに低ストリンジェンシー条件下でこれらの配列とハイブリダイズしうる配列が含まれる。好ましい態様において、これらの配列はリボソームと相互作用し、それらと機能的に結合したタンパク質の分泌をもたらす。本発明は何らかの特定のシグナル配列ペプチドには限定されない。実際には、さまざまなシグナルペプチドを本発明に利用しうると考えられる。いくつかの態様において、シグナルペプチド配列はα−カゼイン、ヒト成長ホルモンまたはα−ラクトアルブミンのシグナルペプチド配列から選択される。他の態様において、本発明は、ＩＲＥＳ／シグナルペプチド配列の核酸配列を含むベクターを提供する。いくつかの態様において、ベクターはレトロウイルスベクターである。さらに別の態様において、本発明は、ＩＲＥＳ／シグナルペプチド配列を含むベクターを含む宿主細胞を提供する。
【００１０】
本発明は、関心対象のタンパク質を産生するための方法も提供する。いくつかの態様において、本方法は、宿主細胞、およびウシ／ヒトハイブリッド型α−ラクトアルブミンプロモーターと機能的に結合した少なくとも１つの外因性遺伝子を含むベクターを提供すること、ならびにそのベクターを外因性遺伝子によってコードされるタンパク質が発現されるような条件下で宿主細胞に導入することを含む。いくつかの態様において、ベクターはさらに変異型ＲＮＡ移行因子を含む。他の態様において、ベクターは少なくとも２つの外因性遺伝子を含む。さらに別の態様において、２つまたはそれ以上の外因性遺伝子は、リボソーム内部進入部位／ウシα−ラクトアルブミンシグナルペプチドによって隔てられた多シストロン性配列として配置される。
【００１１】
本発明は、多シストロン性配列中の少なくとも２つのタンパク質を発現させるための方法も提供する。いくつかの態様において、これらのタンパク質は無関係であるが、また別の態様では、タンパク質は多サブユニットタンパク質のサブユニットである。いくつかの好ましい態様において、本発明は、免疫グロブリンを産生するための方法であって、宿主細胞、ならびに第１の外因性遺伝子が第１の免疫グロブリン鎖をコードし、第２の外因性遺伝子が第２の免疫グロブリン鎖をコードし、第１および第２の遺伝子がリボソーム内部進入部位によって隔てられている第１の外因性遺伝子および第２の外因性遺伝子を含むベクターを提供すること、ならびにそのベクターを第１および第２の外因性遺伝子によってコードされる第１の免疫グロブリン鎖および第２の免疫グロブリン鎖が発現されるような条件下で宿主細胞に導入することを含む方法を提供する。いくつかの態様において、第１の免疫グロブリン鎖は免疫グロブリン軽鎖（例えば、λまたはκ）であり、第２の免疫グロブリン鎖は免疫グロブリン重鎖（例えば、γ、α、μ、δまたはε）である。他の態様において、第１の免疫グロブリン鎖は免疫グロブリン重鎖（例えば、γ、α、μ、δまたはε）であり、第２の免疫グロブリン鎖は免疫グロブリン 軽鎖（例えば、λまたはκ）である。いくつかの態様において、ベクターはレトロウイルスベクターである。他の態様において、ベクターはさらにウシα−ラクトアルブミンシグナルペプチドを含む。さらに別の態様において、ベクターはさらにウシ／ヒトハイブリッド型α−ラクトアルブミンプロモーターを含む。さらに他の態様において、第１の免疫グロブリン鎖および第２の免疫グロブリン鎖は約０．９：１．１〜１：１の比で発現される。本発明は、本明細書に記載の方法によって産生される免疫グロブリンも提供する。本発明は何らかの特定のベクターには限定されない。実際には、プラスミドベクターおよびレトロウイルスベクターを含むが、これらに限定されない種々のベクターを本発明に利用しうると考えられる。いくつかの好ましい態様において、レトロウイルスベクターは偽型化されたものである。
【００１２】
さらに別の態様において、本発明は、関心対象のタンパク質の発現を間接的に検出する方法であって、シグナルタンパク質およびＩＲＥＳと機能的に結合した関心対象のタンパク質を含む多シストロン性配列をコードするベクターによる形質導入またはトランスフェクションを行った宿主細胞を提供すること、ならびにシグナルタンパク質および関心対象のタンパク質が産生される条件下で宿主細胞を培養することを含み、シグナルタンパク質の存在によって関心対象のタンパク質の存在が示されるような方法を提供する。本発明の方法は、何らかの特定の関心対象のタンパク質には限定されない。実際には、Ｇタンパク質共役受容体を含むが、これらに限定されない、さまざまな関心対象のタンパク質の発現が考えられる。本発明は、何らかの特定のシグナルタンパク質には限定されない。実際には、免疫グロブリンの重鎖および軽鎖、β−ガラクトシダーゼ、β−ラクタマーゼ、緑色蛍光タンパク質およびルシフェラーゼを含むが、これらに限定されないさまざまなシグナルタンパク質の使用が考えられる。特に好ましい態様において、シグナルタンパク質および関心対象のタンパク質の発現は同一のプロモーターによって駆動され、シグナルタンパク質および関心対象のタンパク質は単一の転写単位として転写される。
【００１３】
定義
本発明の理解を容易にするために、数多くの用語を以下に定義する。
【００１４】
本明細書で用いる「宿主細胞」という用語は、インビトロまたはインビボのいずれにあるかを問わず、任意の真核生物細胞（例えば、哺乳類細胞、鳥類細胞、両生類細胞、植物細胞、魚類細胞および昆虫細胞）のことを指す。
【００１５】
本明細書で用いる「細胞培養」という用語は、細胞の任意のインビトロ培養物のことを指す。この用語には、連続継代細胞系（例えば、不死化した表現型を有するもの）、初代細胞培養物、有限継代性細胞系（例えば、非形質転換細胞）ならびに、卵母細胞および胚を含む、インビトロで維持される任意の他の細胞集団が含まれる。
【００１６】
本明細書で用いる「ベクター」という用語は、適切な制御因子を伴った場合に複製可能であり、細胞間の遺伝子配列の移行を可能とする、プラスミド、ファージ、トランスポゾン、コスミド、染色体、ウイルス、ビリオンなどの任意の遺伝因子のことを指す。このため、この用語には、クローニング用および発現用の媒体、さらにウイルスベクターも含まれる。
【００１７】
本明細書で用いる「組み込みベクター」という用語は、核酸（例えば、染色体）へのその組み込みまたは挿入がインテグラーゼを介して行われるベクターのことを指す。「組み込みベクター」の例には、レトロウイルスベクター、トランスポゾンおよびアデノ随伴ウイルスベクターが含まれるが、これらに限定されない。
【００１８】
本明細書で用いる「組み込まれた」という用語は、ゲノム中（すなわち、宿主細胞の染色体中）に安定的に挿入されたベクターのことを指す。
【００１９】
本明細書で用いる「感染多重度」または「ＭＯＩ」という用語は、宿主細胞のトランスフェクションまたは形質導入の際に用いられる組み込みベクター：宿主細胞の比のことを指す。例えば、１００，０００個の宿主細胞の形質導入に１，０００，０００個のベクターを用いる場合には、感染多重度は１０である。この用語の使用は形質導入を伴うイベントには限定されず、リポフェクション、マイクロジェクション、リン酸カルシウム沈殿および電気穿孔などの方法による宿主細胞へのベクターの導入も含まれる。
【００２０】
本明細書で用いる「ゲノム」という用語は、生物体の遺伝物質（例えば、染色体）のことを指す。
【００２１】
「関心対象のヌクレオチド配列」という用語は、その操作が何らかの理由（例えば、疾患の治療、質の改善、宿主細胞における関心対象のタンパク質の発現など）で望ましいと当業者が考える、任意のヌクレオチド配列（例えば、ＲＮＡまたはＤＮＡ）のことを指す。このようなヌクレオチド配列には、構造遺伝子のコード配列（例えば、レポーター遺伝子、選択マーカー遺伝子、癌遺伝子、薬剤耐性遺伝子、増殖因子など）、および、ｍＲＮＡまたはタンパク質産物をコードしない非コード性調節配列（例えば、プロモーター配列、ポリアデニル化配列、転写終結配列、エンハンサー配列など）が含まれるが、これらに限定されない。
【００２２】
本明細書で用いる「関心対象のタンパク質」とは、関心対象の核酸によってコードされるタンパク質のことを指す。
【００２３】
本明細書で用いる「シグナルタンパク質」という用語は、関心対象のタンパク質とともに発現され、適切なアッセイによって検出された場合に関心対象のタンパク質の発現の間接的な証拠となるタンパク質のことを指す。本発明において有用なシグナルタンパク質の例には、免疫グロブリンの重鎖および軽鎖、β−ガラクトシダーゼ、β−ラクタマーゼ、緑色蛍光タンパク質およびルシフェラーゼが含まれるが、これらに限定されない。
【００２４】
本明細書で用いる「外因性遺伝子」という用語は、宿主生物もしくは細胞に自然条件下では存在しない、または宿主生物もしくは細胞に人工的に導入された遺伝子のことを指す。
【００２５】
「遺伝子」という用語は、ポリペプチドまたは前駆物質（例えば、プロインスリン）の産生のために必要なコード配列を含む核酸（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）配列のことを指す。ポリペプチドは完全長コード配列によってコードされてもよく、または、完全長もしくは断片の必要な活性または機能的特性（例えば、酵素活性、リガンド結合、シグナル伝達など）が保たれている限り、コード配列の任意の部分によってコードされてもよい。この用語には構造遺伝子のコード領域も含まれ、遺伝子が完全長ｍＲＮＡの長さに対応するような、コード領域の５’および３’端に隣接して位置する約１ｋｂまたはそれ以上の範囲にわたる配列も含まれる。コード領域の５’側に位置し、ｍＲＮＡにも存在する配列は５’非翻訳配列と呼ばれる。コード領域の３’側または下流に位置し、ｍＲＮＡにも存在する配列は３’非翻訳配列と呼ばれる。「遺伝子」という用語は、遺伝子のｃＤＮＡおよびゲノム型の両方を含む。遺伝子のゲノム型またはクローンは、コード領域が「イントロン」または「介在領域」または「介在配列」と呼ばれる非コード配列によって分断されたものを含む。イントロンは、核ＲＮＡ（ｈｎＲＮＡ）へと転写される遺伝子の区域である；イントロンはエンハンサーなどの調節因子を含むことがある。イントロンは核内転写産物または一次転写産物から除去または「スプライスアウト（ｓｐｌｉｃｅ ｏｕｔ）」される；このため、イントロンはメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）転写産物中には存在しない。ｍＲＮＡは翻訳時に新生ポリペプチドにおけるアミノ酸の配列または順序を特定する働きをする。
【００２６】
本明細書で用いる「遺伝子発現」という用語は、遺伝子の「転写」により（すなわち、ＲＮＡポリメラーゼの酵素作用による）、遺伝子にコードされた遺伝情報がＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡまたはｓｎＲＮＡ）に変換されるプロセス、タンパク質をコードする遺伝子の場合には、ｍＲＮＡの「翻訳」によってタンパク質に変換される過程のことを指す。遺伝子発現はその過程における多くの段階で調節可能である。「上方制御（ｕｐ−ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ）」または「活性化」とは、遺伝子発現産物（すなわち、ＲＮＡまたはタンパク質）の産生を増加させる調節のことを指し、「下方制御（ｄｏｗｎ−ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ）」または「抑制」とは、産生を減少させる調節のことを指す。上方制御または下方制御に関与する分子（例えば、転写因子）はしばしば、それぞれ「活性化因子（ａｃｔｉｖａｔｏｒ）」および「抑制因子（ｒｅｐｒｅｓｓｏｒ）」と呼ばれる。
【００２７】
天然のタンパク質分子のアミノ酸配列に言及して本明細書に「アミノ酸配列」を詳述する場合、「アミノ酸配列」および類似の用語、例えば「ポリペプチド」または「タンパク質」は、アミノ酸配列を、詳述するタンパク質分子にみられる完全な天然型アミノ酸配列には限定しないものとする。
【００２８】
本明細書で用いる「コードする核酸分子」「コードするＤＮＡ配列」「コードするＤＮＡ」「コードするＲＮＡ配列」および「コードするＲＮＡ」という用語は、デオキシリボ核酸またはリボ核酸のストランドに沿って並んだデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドの順序または配列のことを指す。これらのデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドの順序が、ポリペプチド（タンパク質）鎖に沿って並ぶアミノ酸の順序を決定する。したがって、ＤＮＡ配列またはＲＮＡ配列はアミノ酸配列をコードする。
【００２９】
本明細書で用いる「変種」という用語は、タンパク質に言及して用いる場合、部分的に相同な核酸によってコードされるタンパク質のことを指し、このため、タンパク質のアミノ酸配列は異なる。本明細書で用いる「変種」という用語は、タンパク質の機能の変化を引き起こさない保存的および非保存的なアミノ酸置換を有する相同遺伝子によってコードされるタンパク質のほかに、タンパク質の機能の低下（例えば、ヌル変異）またはタンパク質の機能の上昇を引き起こすアミノ酸置換を有する相同遺伝子によってコードされるタンパク質も含む。
【００３０】
本明細書で用いる「相補的」または「相補性」という用語は、塩基対合則により関連づけられたポリヌクレオチド（すなわち、ヌクレオチドの配列）に言及して用いられる。例えば、配列「Ａ−Ｇ−Ｔ」は配列「Ｔ−Ｃ−Ａ」と相補的である。相補性は、核酸の塩基の一部のみが塩基対合則に従って合致するというように「部分的」でもよい。または、核酸の間に「完全」または「全体的」な相補性があってもよい。核酸鎖の間の相補性の程度は、核酸鎖の間のハイブリダイゼーションの効率および強度に大きな影響を及ぼす。これは核酸同士の結合に依存する増幅反応ならびに検出方法において特に重要である。
【００３１】
「相同性」および「一致率（ｐｅｒｃｅｎｔ ｉｄｅｎｔｉｔｙ）」という用語は、核酸に関して用いる場合、相補性の程度のことを指す。これは部分的な相同性（すなわち、部分的同一性）でもよく、完全な相同性（すなわち、完全な同一性）でもよい。部分的に相補的な配列とは、完全に相補的な配列が標的核酸配列とハイブリダイズするのを少なくとも部分的に阻害するもののことであり、これは「実質的に相同な」という機能的用語を用いて呼ばれる。完全に相補的な配列と標的配列とのハイブリダイゼーションの阻害は、ハイブリダイゼーションアッセイ（サザンまたはノーザンブロット法、溶液ハイブリダイゼーションなど）を低ストリンジェンシー条件下で用いて検討しうる。実質的に相同な配列またはプローブ（すなわち、関心対象の別のオリゴヌクレオチドとハイブリダイズしうるオリゴヌクレオチド）は、低ストリンジェンシー条件下で、完全に相同な配列と標的配列との結合（すなわち、ハイブリダイゼーション）と競合する、またはそれを阻害すると考えられる。低ストリンジェンシー条件は非特異的な結合が許容されるような条件という訳ではない；低ストリンジェンシー条件は、２つの配列の相互の結合が特異的な（すなわち、選択的な）相互作用であることを必要とする。非特異的結合がないことは、部分的な程度の相補性すらない（例えば、同一性が約３０％未満）第２の標的を用いることによって検証しうる；非特異的結合がないとプローブは第２の非相補的な標的とハイブリダイズしないと考えられる。
【００３２】
当技術分野では、さまざまな同等な条件を用いて低ストリンジェンシー条件を構成しうることが周知である；プローブの長さおよび性質（ＤＮＡ、ＲＮＡ、塩基組成物）ならびに標的の性質（ＤＮＡ、ＲＮＡ、塩基組成物、溶液中に存在する、または固定化されているなど）ならびに塩および他の成分の濃度（例えば、ホルムアミド、デキストラン硫酸、ポリエチレングリコールの有無）などの要因を考慮し、ハイブリダイゼーション溶液を変更して、上に挙げた条件とは異なるものの同等な低ストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件を得ることができる。さらに、高ストリンジェンシー条件下でのハイブリダイゼーションを促す条件（例えば、ハイブリダイゼーションおよび／または洗浄段階の温度を高める、ハイブリダイゼーション溶液中にホルムアミドを用いるなど）も当技術分野で周知である。
【００３３】
ｃＤＮＡまたはゲノムクローンなどの二本鎖核酸配列に言及して用いる場合、「実質的に相同な」という用語は、上記の低ストリンジェンシー条件下で二本鎖核酸配列の一方または両方のストランドとハイブリダイズしうる任意のプローブのことを指す。
【００３４】
一本鎖核酸配列に言及して用いる場合、「実質的に相同な」という用語は、上記の低ストリンジェンシー条件下で一本鎖核酸配列とハイブリダイズしうる（すなわち、その相補物である）任意のプローブのことを指す。
【００３５】
本明細書で用いる「ハイブリダイゼーション」という用語は、相補的核酸の対合を指して用いられる。ハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーションの強度（すなわち、核酸間の会合の強度）は、核酸間の相補性の程度、用いる条件のストリンジェンシー、形成されるハイブリッドのＴｍ、および核酸内部のＧ：Ｃ比などの要因による影響を受ける。単一の分子が構造の内部に相補的核酸の対合を含む場合には「自己ハイブリダイズした（ｓｅｌｆ−ｈｙｂｒｉｄｉｚｅｄ）」という。
【００３６】
本明細書で用いる「Ｔｍ」という用語は、核酸の「融解温度」を指して用いられる。融解温度とは、二本鎖核酸分子の集団の半分が一本鎖に解離する温度のことである。核酸のＴｍを算出するための式は当技術分野で周知である。標準的な参考文献に示されているように、核酸が１Ｍ ＮａＣｌ水溶液中にある場合、Ｔ値の単純な推定値は以下の式によって算出しうる：
Ｔｍ＝８１．５＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）
（例えば、ＡｎｄｅｒｓｏｎおよびＹｏｕｎｇ、定量的フィルターハイブリダイゼーション（Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ Ｆｉｌｔｅｒ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）、核酸ハイブリダイゼーション（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）［１９８５］中を参照）。その他の参考文献には、Ｔｍの算出に配列特性のほかに構造特性も考慮に入れた、より精巧な計算が含まれる。
【００３７】
本明細書で用いる「ストリンジェンシー」という用語は、核酸ハイブリダイゼーションを行う温度、イオン強度および有機溶媒などの他の化合物の存在といった条件を指して用いられる。「高ストリンジェンシー」条件では、相補的塩基配列の頻度が高い核酸断片の間のみで核酸塩基対合が起こると考えられる。このため、遺伝的に異なる生物に由来する核酸同士に対しては、相補的配列の頻度が通常低いことから、「弱」または「低」ストリンジェンシーの条件がしばしば必要となる。
【００３８】
「高ストリンジェンシー条件」は、核酸ハイブリダイゼーションに言及して用いる場合、約５００ヌクレオチド長のプローブを用いた際に、５×ＳＳＰＥ（４３．８ｇ／ｌ ＮａＣｌ、６．９ｇ／ｌ ＮａＨ２ＰＯ４・Ｈ２Ｏおよび１．８５ｇ／ｌ ＥＤＴＡ、ｐＨはＮａＯＨで７．４に調整）、０．５％ＳＤＳ、５×デンハルト試薬および１００μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡからなる４２℃の溶液中での結合またはハイブリダイゼーションの後に、０．１×ＳＳＰＥ、１．０％ＳＤＳを含む４２℃の溶液中で洗浄を行うことと同等な条件を含む。
【００３９】
「中程度のストリンジェンシー条件」は、核酸ハイブリダイゼーションに言及して用いる場合、約５００ヌクレオチド長のプローブを用いた際に、５×ＳＳＰＥ（４３．８ｇ／ｌ ＮａＣｌ、６．９ｇ／ｌ ＮａＨ２ＰＯ４・Ｈ２Ｏおよび１．８５ｇ／ｌ ＥＤＴＡ、ｐＨはＮａＯＨで７．４に調整）、０．５％ＳＤＳ、５×デンハルト試薬および１００μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡからなる４２℃の溶液中での結合またはハイブリダイゼーションの後に、１．０×ＳＳＰＥ、１．０％ＳＤＳを含む４２℃の溶液中で洗浄を行うことと同等な条件を含む。
【００４０】
「低ストリンジェンシー条件」は、核酸ハイブリダイゼーションに言及して用いる場合、約５００ヌクレオチド長のプローブを用いた際に、５×ＳＳＰＥ（４３．８ｇ／ｌ ＮａＣｌ、６．９ｇ／ｌ ＮａＨ２ＰＯ４・Ｈ２Ｏおよび１．８５ｇ／ｌ ＥＤＴＡ、ｐＨはＮａＯＨで７．４に調整）、０．１％ＳＤＳ、５×デンハルト試薬［５０×デンハルト試薬は５００ｍｌ当たり以下のものを含む：５ｇ Ｆｉｃｏｌｌ（４００型、Ｐｈａｒａｍｃｉａ）、５ｇ ＢＳＡ（第Ｖ画分；Ｓｉｇｍａ）］および１００μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡからなる４２℃の溶液中での結合またはハイブリダイゼーションの後に、５×ＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳを含む４２℃の溶液中で洗浄を行うことと同等な条件を含む。
【００４１】
１つの遺伝子から、ＲＮＡ一次転写産物の異なるスプライシングによって生成される多数のＲＮＡ種が生じてもよい。同一遺伝子のスプライス変種であるｃＤＮＡは、配列同一性または完全な相同性を有する領域（両方のｃＤＮＡに同じエクソンまたは同じエクソンの部分が存在することを表す）および完全に同一でない領域（例えば、ｃＤＮＡ １にエクソン「Ａ」が存在し、ｃＤＮＡ ２はその代わりにエクソン「Ｂ」を含むことを表す）を含む。２つのｃＤＮＡは配列同一性のある領域を含むため、それらはいずれも、両方のｃＤＮＡに認められる配列を含む遺伝子全体または遺伝子の部分に由来するプローブとハイブリダイズすると考えられる；このため、２つのスプライス変種はこのようなプローブおよびお互いと実質的に相同である。
【００４２】
「機能的な組み合わせにある（ｉｎ ｏｐｅｒａｂｌｅ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）」「機能的な順序にある（ｉｎ ｏｐｅｒａｂｌｅ ｏｒｄｅｒ）」および「機能的に結合した」という用語は、本明細書で用いる場合、所定の遺伝子の転写および／または望ましいタンパク質分子の合成を指令しうる核酸分子が生じる様式で複数の核酸配列が結び付いていることを指す。この用語は、機能的なタンパク質が生じる様式で複数のアミノ酸配列が結び付いていることも指す。
【００４３】
本明細書で用いる「選択マーカー」という用語は、通常であれば必須栄養素と考えられるものを含まない培地中での増殖能力を付与する酵素活性をコードする遺伝子（例えば、酵母細胞におけるＨＩＳ３遺伝子）のことを指す；さらに、選択マーカーは、選択マーカーが発現された細胞に抗生物質または薬剤に対する耐性を付与するものでもよい。選択マーカーは「優性」であってもよい；優性選択マーカーは、あらゆる真核生物細胞系で検出可能な酵素活性をコードする。優性選択マーカーの例には、薬剤Ｇ４１８に対する耐性を哺乳類細胞に付与する細菌アミノグリコシド３’リン酸転移酵素遺伝子（ｎｅｏ遺伝子とも呼ばれる）、抗生物質ハイグロマイシンに対する耐性を付与する細菌ハイグロマイシンＧリン酸転移酵素（ｈｙｇ）遺伝子、およびミコフェノール酸の存在下における増殖能を付与する細菌キサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子（ｇｐｔ遺伝子とも呼ばれる）が含まれる。他の選択マーカーには、関連する酵素活性を欠く細胞系とともに用いる必要があるという点で優性でないものがある。非優性選択マーカーの例には、ｔｋ−細胞系とともに用いられるチミジンキナーゼ（ｔｋ）遺伝子、ＣＡＤ欠損細胞とともに用いられるＣＡＤ遺伝子、およびｈｐｒｔ−細胞系とともに用いられる哺乳類ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ｈｐｒｔ）遺伝子が含まれる。哺乳類における選択マーカーの使用に関する総説は、サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｊ．）ら、「分子クローニング：実験マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８９）ｐｐ．１６．９〜１６．１５にある。
【００４４】
本明細書で用いる「調節因子」という用語は、核酸配列の発現の何らかの面を制御する遺伝因子のことを指す。例えば、プロモーターは、機能的に結合したコード領域の転写開始を促す調節因子である。他の調節因子には、スプライシングシグナル、ポリアデニル化シグナル、転写終結シグナル、ＲＮＡ移行因子、リボソーム内部進入部位などがある（以下に定義する）。
【００４５】
真核生物における転写制御シグナルには、「プロモーター」因子および「エンハンサー」因子が含まれる。プロモーターおよびエンハンサーは、転写に関与する細胞タンパク質と特異的に相互作用するＤＮＡの短い配列からなる（Ｍａｎｉａｔｉｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３６：１２３７［１９８７］）。プロモーター因子およびエンハンサー因子は、酵母、昆虫および哺乳類細胞の遺伝子を含む種々の真核生物供給源、ならびにウイルスから単離されている（類似の制御因子、すなわちプロモーターは原核生物にも認められる）。個々のプロモーターおよびエンハンサーの選択は、関心対象のタンパク質を発現させるためにどの細胞種を用いるかに依存する。真核生物プロモーターおよびエンハンサーの中には、宿主範囲が幅広いものもあり、限定的な細胞種のサブセットのみで機能するものもある（総説については、Ｖｏｓｓら、Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｓｃｉ．、１１：２８７［１９８６］；およびＭａｎｉａｔｉｓら、前記を参照）。例えば、ＳＶ４０初期遺伝子エンハンサーは、多くの哺乳類種に由来するさまざまな細胞種で高い活性を示し、哺乳類細胞におけるタンパク質の発現に広く用いられている（Ｄｉｊｋｅｍａら、ＥＭＢＯ Ｊ． ４：７６１［１９８５］）。広範囲の哺乳類種において活性のあるプロモーター／エンハンサー因子の他の２つの例は、ヒト伸長因子１α遺伝子（Ｕｅｔｓｕｋｉら、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．、２６４：５７９１［１９８９］；Ｋｉｍら、Ｇｅｎｅ ９１：２１７［１９９０］；ならびにＭｉｚｕｓｈｉｍａおよびＮａｇａｔａ、Ｎｕｃ． Ａｃｉｄｓ． Ｒｅｓ．、１８：５３２２［１９９０］）、ならびにラウス肉腫ウイルス（Ｇｏｒｍａｎら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７９：６７７７［１９８２］）およびヒトサイトメガロウイルス（Ｂｏｓｈａｒｔら、Ｃｅｌｌ ４１：５２１［１９８５］）の末端反復配列（ｌｏｎｇ ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｐｅａｔ）からのものである。
【００４６】
本明細書で用いる「プロモーター／エンハンサー」という用語は、プロモーターおよびエンハンサーの両方の機能（すなわち、プロモーター因子およびエンハンサー因子によって与えられる機能、これらの機能に関する考察については上記参照）を提供しうる配列を含むＤＮＡの区域のことを指す。例えば、レトロウイルスの末端反復配列はプロモーターおよびエンハンサーの両方の機能を含む。エンハンサー／プロモーターは「内因性」でもよく、「外因性」または「異種」でもよい。「内因性」エンハンサー／プロモーターは、ゲノム中で所定の遺伝子と自然条件下で結合しているものである。「外因性」または「異種」エンハンサー／プロモーターは、遺伝子の転写が結合したエンハンサー／プロモーターによって指令されるように、遺伝子操作（すなわち、クローニングおよび組換えなどの分子生物学の技法）によって遺伝子と並置されたものである。
【００４７】
調節因子は組織特異的または細胞特異的なものでもよい。「組織特異的」という用語は、調節因子に対して用いる場合、特定の種類の組織（例えば、肝臓）に対するヌクレオチド配列の選択的発現を指令し、異なる種類の組織（例えば、肺）における同じ関心対象のヌクレオチド配列の発現は相対的に引き起こさない調節因子のことを指す。
【００４８】
調節因子の組織特異性を、例えば、レポーター遺伝子をプロモーター配列（組織特異的でないもの）および調節因子と機能的に結合させてレポーター構築物を作製し、レポーター構築物を動物のゲノムに導入して、その結果得られるトランスジェニック動物の全組織にレポーター構築物を組み込んだ上で、トランスジェニック動物の種々の組織におけるレポーター遺伝子の発現を検出すること（例えば、レポーター遺伝子によってコードされるｍＲＮＡ、タンパク質またはタンパク質の活性を検出すること）によって評価してもよい。１つまたは複数の組織におけるレポーター遺伝子の発現レベルが他の組織におけるレポーター遺伝子の発現レベルよりも高いことを検出することにより、調節因子が、相対的に高い発現レベルが検出された組織に対して「特異的」であることが示される。したがって、本明細書で用いる「組織特異的「（例えば、肝特異的）」という用語は、発現の絶対的特異性を必要としない相対的な用語である。言い換えると、「組織特異的」という用語は、１つの組織の発現レベルが極めて高く、別の組織には全く発現がないことを要しない。１つの組織の発現が別のものよりも高いことで十分である。これに対して、「厳密な」または「絶対的な」組織特異的発現とは、単一の種類の組織（例えば、肝臓）における発現がみられ、他の組織における発現が検出不能であることを示すものとする。
【００４９】
「細胞種特異的」という用語は、調節因子に対して用いる場合、特定の種類の細胞に対するヌクレオチド配列の選択的発現を指令し、同じ組織中の異なる種類の細胞における同じ関心対象のヌクレオチド配列の発現は相対的に引き起こさない調節因子のことを指す。「細胞種特異的」という用語は、調節因子に対して用いる場合、単一組織中のある領域における関心対象のヌクレオチド配列の選択的発現を促しうる調節因子のことも意味する。
【００５０】
調節因子の細胞種特異性は、当技術分野で周知の方法（例えば、免疫組織化学的染色および／またはノーザンブロット分析）を用いて評価しうる。簡潔に述べると、免疫組織化学的染色のためには、組織切片をパラフィン中に包埋し、このパラフィン切片を、調節因子によって発現が調節される関心対象のヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド産物に対して特異的な一次抗体と反応させる。一次抗体に対して特異的な標識化した（例えば、ペルオキシダーゼを結合させた）二次抗体を切片化した組織と結合させ、特異的結合を顕微鏡によって検出する（例えば、アビジン／ビオチンを用いる）。簡潔に述べうると、ノーザンブロット分析のためには、ＲＮＡを細胞から単離し、アガロースゲル上で電気泳動を行ってＲＮＡをサイズ別に分画した後に、ＲＮＡをゲルから固体支持体（例えば、ニトロセルロースまたはナイロン膜）に移す。続いて、固定化したＲＮＡを標識化したオリゴデオキシリボヌクレオチドプローブまたはＤＮＡプローブにより検索し、用いたプローブに対して相補的なＲＮＡ種を検出する。ノーザンブロットは分子生物学者にとって標準的なツールである。
【００５１】
「プロモーター」「プロモーター因子」または「プロモーター配列」という用語は、本明細書で用いる場合、関心対象のヌクレオチド配列と連結した場合に関心対象のヌクレオチド配列のｍＲＮＡへの転写を制御しうるＤＮＡ配列のことを指す。プロモーターは、ｍＲＮＡへの転写を制御する関心対象のヌクレオチド配列の５’側（すなわち、上流）に位置し、転写開始のためにＲＮＡポリメラーゼおよび他の転写因子による特異的結合が起こる部位を備えることが、必然的ではないものの一般的である。
【００５２】
プロモーターは構成性でも調節性でもよい。「構成性」という用語は、プロモーターに言及する場合、プロモーターが、刺激（例えば、熱ショック、化学物質など）がなくとも、機能的に結合した核酸配列の転写を指令しうることを意味する。これに対して、「調節性」プロモーターとは、刺激（例えば、熱ショック、化学物質など）の存在下で、機能的に結合した核酸配列の、刺激の非存在下における機能的に結合した核酸配列の転写レベルとは異なるレベルの転写を指令しうるもののことである。
【００５３】
発現ベクターに「スプライシングシグナル」が存在すると、組換え転写産物の発現レベルの上昇がしばしば起こる。スプライシングシグナルはＲＮＡ一次転写産物からのイントロンの除去を媒介し、スプライスドナー部位およびアクセプター部位からなる（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、「分子クローニング：実験マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ［１９８９］、ｐｐ．１６．７〜１６．８）。よく用いられるスプライスドナー部位およびアクセプター部位は、ＳＶ４０の１６Ｓ ＲＮＡに由来するスプライス部位である。
【００５４】
真核生物細胞における組換えＤＮＡ配列の効率的発現には、効率的な転写終結およびその結果生じた転写産物のポリアデニル化を指令するシグナルの発現が必要である。転写終結シグナルは一般にポリアデニル化シグナルの下流に認められ、長さは数百ヌクレオチドである。本明細書で用いる「ポリＡ部位」または「ポリＡ配列」という用語は、転写終結および新生ＲＮＡ転写産物のポリアデニル化を指令するＤＮＡ配列のことを表す。ポリＡ尾部を持たない転写産物は不安定で急速に分解されるため、組換え転写産物が効率的にポリアデニル化されることが望ましい。発現ベクター中に用いるポリＡシグナルは「異種」でも「内因性」でもよい。内因性ポリＡシグナルとは、ゲノム中で所定の遺伝子のコード領域の３’端に天然に認められるもののことである。異種ポリＡシグナルとは、１つの遺伝子から単離され、別の遺伝子の３’側に配置されたもののことである。よく用いられる異種ポリＡシグナルはＳＶ４０ポリＡシグナルである。ＳＶ４０ポリＡシグナルは２３７ｂｐのＢａｍＨＩ／ＢｃｌＩ制限断片に含まれており、転写終結およびポリアデニル化の両方を指令する（Ｓａｍｂｒｏｏｋ、前記、１６．６〜１６．７）。
【００５５】
真核生物発現ベクターが「ウイルスレプリコン」または「ウイルス複製起点」を含んでいてもよい。ウイルスレプリコンは、適切な複製因子を発現する宿主細胞におけるベクターの染色体外複製を可能とするウイルスＤＮＡ配列である。ＳＶ４０またはポリオーマウイルスの複製起点を含むベクターは、適切なウイルスＴ抗原を発現する細胞内で高「コピー数」（最大１０４コピー／細胞）へと複製される。ウシパピローマウイルスまたはエプスタイン−バーウイルス由来のレプリコンを含むベクターは染色体外で「低コピー数」（ほぼ１００コピー／細胞）の複製が起こる。しかし、発現ベクターは何らかの特定のウイルス複製起点には限定されないものとする。
【００５６】
本明細書で用いる「末端反復配列」または「ＬＴＲ」とは、レトロウイルスゲノムの５’および３’側のＵ３領域に位置するか、またはそこから単離された転写制御因子のことを指す。当技術分野で知られている通り、末端反復配列をレトロウイルスベクター中の制御因子として用いてもよく、または、レトロウイルスゲノムから単離して他の種類のベクターからの発現を制御するために用いてもよい。
【００５７】
本明細書で用いる「分泌シグナル」という用語は、シグナルペプチドをコードする組換えＤＮＡ配列と機能的に結合させた場合に組換えポリペプチドの分泌を引き起こすことができる任意のＤＮＡ配列のことを指す。一般に、シグナルペプチドは一連の約１５〜３０個の疎水性アミノ酸残基を含む（例えば、Ｚｗｉｚｉｎｓｋｉら、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２５５（１６）：７９７３〜７７［１９８０］、Ｇｒａｙら、Ｇｅｎｅ ３９（２）：２４７〜５４［１９８５］およびＭａｒｔｉａｌら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２０５：６０２〜６０７［１９７９］を参照）。このような分泌シグナル配列は、組織特異的発現の標的となる細胞種から分泌されるポリペプチド（例えば、乳腺分泌細胞における発現およびそれからの分泌の目的には乳タンパク質）をコードする遺伝子に由来することが好ましい。しかし、分泌性ＤＮＡ配列はこのような配列には限定されない。多くの細胞種および生物体から分泌されるタンパク質に由来する分泌性ＤＮＡ配列を用いてもよい（例えば、ｔ−ＰＡ、血清アルブミン、ラクトフェリンおよび成長ホルモンに対する分泌シグナル、ならびに酵母、糸状菌および細菌などの分泌性ポリペプチドをコードする微生物遺伝子に由来する分泌シグナル）。
【００５８】
本明細書で用いる「ＲＮＡ移行因子」または「ｍＲＮＡ前駆体プロセシングエンハンサー（ＰＰＥ）」とは、核からのＲＮＡの輸送を増強する３’および５’シス作用性転写後調節因子のことを指す。「ＰＰＥ」因子には、メルツ（Ｍｅｒｔｚ）配列（米国特許第５，９１４，２６７号および第５，６８６，１２０号に記載、これらはすべて参照として本明細書に組み入れられる）およびウッドチャックｍＲＮＡプロセシングエンハンサー（ＷＰＲＥ；国際公開公報第９９／１４３１０号および米国特許第６，１３６，５９７号、これらはそれぞれ参照として本明細書に組み入れられる）が含まれるが、これらに限定されない。
【００５９】
本明細書で用いる「多シストロン性」と言う用語は、複数のポリペプチド鎖をコードするｍＲＮＡのことを指す（例えば、国際公開公報第９３／０３１４３号、国際公開公報第８８／０５４８６号および欧州特許第１１７０５８号を参照、これらはすべて参照として本明細書に組み入れられる）。同様に「多シストロン性配列中に配置された」という用語は、単一のｍＲＮＡ中に２つの異なるポリペプチド鎖をコードする遺伝子の配置のことを指す。
【００６０】
本明細書で用いる「リボソーム内部進入部位」または「ＩＲＥＳ」という用語は、二シストロン性ｍＲＮＡの翻訳の内部開始によって第２の遺伝子から生じる発現産物の産生を可能とする、多シストロン性遺伝子の間に位置する配列のことを指す。リボソーム内部進入部位には、口蹄疫ウイルス（ＦＤＶ）、脳心筋炎ウイルス、ポリオウイルスおよびＲＤＶに由来するものが含まれるが、これらに限定されない（Ｓｃｈｅｐｅｒら、Ｂｉｏｃｈｅｍ． ７６：８０１〜８０９［１９９４］；Ｍｅｙｅｒら、Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６９：２８１９〜２８２４［１９９５］；Ｊａｎｇら、１９８８、Ｓ． Ｖｉｒｏｌ． ６２：２６３６〜２６４３［１９９８］；Ｈａｌｌｅｒら、Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６６：５０７５〜５０８６［１９９５］）。ＩＲＥＳが組み入れられたベクターは当技術分野で知られた通りに構成しうる。例えば、多シストロン性配列を含むレトロウイルスベクターは、機能的に結び付いた以下の因子を含みうる：ヌクレオチドポリリンカー、関心対象の遺伝子、リボソーム内部進入部位および哺乳類選択マーカーまたは関心対象の別の遺伝子。多シストロン性カセットは、５’ ＬＴＲプロモーターからの転写によって多シストロン性メッセージカセットが転写されるような、レトロウイルスベクター内部の５’ ＬＴＲと３’ ＬＴＲとの間の位置に置かれる。多シストロン性メッセージカセットの転写を、用途に即して好ましいと思われる内部プロモーター（例えば、サイトメガロウイルスプロモーター）または誘導性プロモーターによって駆動させてもよい。多シストロン性メッセージカセットはさらに、機能的に結び付いたｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）配列をポリリンカー内部に含みうる。任意の哺乳類選択マーカーを、多シストロン性メッセージカセットの哺乳類選択マーカーとして用いることができる。このような哺乳類選択マーカーは当業者に周知であり、これにはカナマイシン／Ｇ４１８、ハイグロマイシンＢまたはミコフェノール酸耐性マーカーが含まれるが、これらに限定されない。
【００６１】
本明細書で用いる「レトロウイルス」という用語は、細胞内に侵入し、レトロウイルスゲノム（二本鎖プロウイルスとして）を宿主細胞のゲノムに組み込むことができるレトロウイルス粒子のことを指す（すなわち、この粒子は、宿主細胞表面と結合して宿主細胞の細胞質へのウイルス粒子の侵入を促進しうる、外被タンパク質またはウイルスＧ糖タンパク質などの膜関連タンパク質を含む）。「レトロウイルス」という用語には、オンコウイルス亜科（例えば、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭｏＭＯＬＶ）、モロニーマウス肉腫ウイルス（ＭｏＭＳＶ）およびマウス乳腺癌ウイルス（ＭＭＴＶ））、スプマウイルス亜科およびレンチウイルス亜科（例えば、ヒト免疫不全ウイルス、サル免疫不全ウイルス、ウマ伝染性貧血ウイルスおよびヤギ関節炎脳炎ウイルスが含まれる；例えば、米国特許第５，９９４，１３６号および第６，０１３，５１６号を参照。これらはいずれも参照として本明細書に組み入れられる）。
【００６２】
本明細書で用いる「レトロウイルスベクター」という用語は、関心対象の遺伝子を発現するように改変されたレトロウイルスのことを指す。レトロウイルスベクターは、ウイルスの感染プロセスを利用することにより、宿主細胞に遺伝子を効率的に導入するために用いることができる。レトロウイルスゲノム中にクローニングされた（すなわち、分子生物学の技法を用いて挿入された）外来遺伝子または異種遺伝子を、レトロウイルス感染に対する感受性のある宿主細胞に効率的に送達することができる。よく知られた遺伝子操作により、レトロウイルスゲノムの複製能を消失させることが可能である。この結果得られる複製能欠損ベクターは新たな遺伝物質を細胞に導入するために用いうるが、自らは複製を行えない。ヘルパーウイルスまたはパッケージング細胞系を、ベクター粒子の集合および細胞からの流出を可能にするために用いることができる。このようなレトロウイルスベクターは、少なくとも１つの関心対象の遺伝子をコードする核酸配列（多シストロン性核酸配列は複数の関心対象の遺伝子をコードしうる）、５’レトロウイルス末端反復配列（５’ ＬＴＲ）；および３’レトロウイルス末端反復配列（３’ ＬＴＲ）を含む複製能欠損レトロウイルスのゲノムを含む。
【００６３】
「偽型のレトロウイルスベクター」という用語は、異種膜タンパク質を含むレトロウイルスベクターのことを指す。「膜関連タンパク質」という用語は、ウイルス粒子を取り囲む膜に付随するタンパク質のことを指す（例えば、ＶＳＶ、ピリー（Ｐｉｒｙ）、チャンディプラ（Ｃｈａｎｄｉｐｕｒａ）およびモコラ（Ｍｏｋｏｌａ）などのラブドウイルス科のウイルスのウイルス外被糖タンパク質またはＧタンパク質）；これらの膜関連タンパク質はウイルス粒子の宿主細胞への侵入を媒介する。レトロウイルス外被タンパク質の場合のように膜関連タンパク質が特異的な細胞表面タンパク質受容体と結合する場合もあり、またはラブドウイルス科のメンバーに由来するＧタンパク質の場合のように膜関連タンパク質が宿主細胞の原形質膜のリン脂質成分と相互作用する場合もある。
【００６４】
「異種膜関連タンパク質」という用語は、ベクター粒子のヌクレオキャプシドタンパク質の由来である同じウイルス綱または科のメンバーではないウイルスに由来する膜関連タンパク質のことを指す。「ウイルス綱または科」とは、国際ウイルス分類委員会（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｎ Ｔａｘｏｎｏｍｙ ｏｆ Ｖｉｒｕｓ）により指定された網または科という分類学上の等級を指す。
【００６５】
「ラブドウイルス科」という用語は、ヒトを含む動物および植物を感染させる、外被を有するＲＮＡウイルスの科のことを指す。ラブドウイルス科は、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、コカル（Ｃｏｃａｌ）ウイルス、ピリー（Ｐｉｒｙ）ウイルス、チャンディプラ（Ｃｈａｎｄｉｐｕｒａ）ウイルスおよびコイ春ウイルス病ウイルスを含むベシクロウイルス属を含む（コイ春ウイルス病ウイルスをコードする配列はＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｕ１８１０１で入手可能）。ベシクロウイルス属のウイルスのＧタンパク質はウイルスにコードされた内在性膜タンパク質であり、受容体結合および膜融合に必要な、外側に突出したホモ三量体棘状糖タンパク質複合体を形成する。ベシクロウイルス属のウイルスのＧタンパク質には、共有結合したパルミチン酸（Ｃ１６）部分がある。ベシクロウイルス由来のＧタンパク質のアミノ酸配列はかなりよく保存されている。例えば、ピリーウイルスのＧタンパク質とＶＳＶのＧタンパク質の同一性は約３８％であり、類似性は約５５％である（ＶＳＶにはＩｎｄｉａｎａ株、Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ株、Ｏｒｓａｙ株、Ｓａｎ Ｊｕａｎ株などの複数の株が知られており、それらのＧタンパク質の相同性は高い）。チャンディプラウイルスのＧタンパク質とＶＳＶ Ｇタンパク質の同一性は約３７％であり、類似性は５２％である。ベシクロウイルスのＧタンパク質の保存性（アミノ酸配列）が高度であり、機能特性（例えば、合胞体形成を含む、ウイルスの宿主細胞との結合および膜融合）が類似していることを考えると、ウイルス粒子の偽型化のために、ＶＳＶ以外のベシクロウイルス由来のＧタンパク質をＶＳＶ Ｇタンパク質の代わりに用いうると考えられる。リサウイルス（ラブドウイルス科に属する別の属）のＧタンパク質も、ＶＳＶ Ｇタンパク質との間に高度の保存性があり、同様の様式で作用するため（例えば、膜融合を媒介する）、ウイルス粒子の偽型化のためにＶＳＶ Ｇタンパク質の代わりに用いうる。リサウイルスには、モコラ（Ｍｏｋｏｌａ）ウイルスおよび狂犬病ウイルスが含まれる（狂犬病ウイルスには複数の株が知られており、それらのＧタンパク質はクローニングおよび配列決定がなされている）。モコラウイルスのＧタンパク質にはＶＳＶ Ｇタンパク質と相同な領域があり（特に細胞外ドメインおよび膜貫通ドメイン）、ＶＳＶ Ｇタンパク質との同一性は約３１％、類似性は４８％である。好ましいＧタンパク質は、ＶＳＶ Ｇタンパク質と少なくとも２５％の同一性、好ましくは少なくとも３０％の同一性、最も好ましくは少なくとも３５％の同一性を有するものである。ニュージャージー株からのＶＳＶ Ｇタンパク質（このＧタンパク質の配列はＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｍ２７１６５およびＭ２１５５７に示されている）を、基準ＶＳＶ Ｇタンパク質として用いる。
【００６６】
本明細書で用いる「レンチウイルスベクター」という用語は、レンチウイルス亜科（例えば、ヒト免疫不全ウイルス、サル免疫不全ウイルス、ウマ伝染性貧血ウイルスおよびヤギ関節炎脳炎ウイルス）に由来する、非分裂細胞への組み込みが可能なレトロウイルスベクターのことを指す（例えば、米国特許第５，９９４，１３６号および第６，０１３，５１６号を参照。これらはいずれも参照として本明細書に組み入れられる）。
【００６７】
「偽型のレンチウイルスベクター」という用語は、異種膜タンパク質（例えば、ＶＳＶ、ピリー、チャンディプラおよびモコラなどのラブドウイルス科のウイルスのウイルス外被糖タンパク質またはＧタンパク質）を含むレンチウイルスベクターのことを指す。
【００６８】
本明細書で用いる「トランスポゾン」という用語は、ゲノム中の１つの位置から別の位置への移動または転位が可能な転位因子（例えば、Ｔｎ５、Ｔｎ７およびＴｎ１０）のことを指す。一般に、転位はトランスポザーゼによって制御される。本明細書で用いる「トランスポゾンベクター」という用語は、関心対象の核酸がトランスポゾンの末端と隣接したものをコードするベクターのことを指す。トランスポゾンベクターの例には、米国特許第６，０２７，７２２号；第５，９５８，７７５号；第５，９６８，７８５号；第５，９６５，４４３号および第５，７１９，０５５号（これらはすべて参照として本明細書に組み入れられる）に記載されたものが含まれるが、これらに限定されない。
【００６９】
本明細書で用いる「アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター」という用語は、ＡＡＶ−１、ＡＡＶ−２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ−４、ＡＡＶ−５、ＡＡＶＸ７などを含むが、これらに限定されない血清型のアデノ随伴ウイルスに由来するベクターのことを指す。ＡＡＶベクターは、全体または一部、好ましくはｒｅｐおよび／もしくはｃａｐ遺伝子が欠失しているものの機能的なフランキングＩＴＲ配列は保持している、１つまたは複数のＡＡＶ野生型遺伝子を有しうる。
【００７０】
ＡＡＶベクターは、当技術分野で知られた組換え技術を用いて、機能的なＡＡＶ ＩＴＲが両端（５’および３’）に隣接した１つまたは複数の異種ヌクレオチド配列を含むように構築することができる。本発明の実施に際して、ＡＡＶベクターは少なくとも１つのＡＡＶ ＩＴＲ、異種ヌクレオチド配列の上流に位置する適したプロモーター配列、および異種配列の下流に位置する少なくとも１つのＡＡＶ ＩＴＲを含みうる。「組換えＡＡＶベクタープラスミド」とは、ベクターがプラスミドを含む、ある種の組換えＡＡＶベクターのことを指す。一般的なＡＡＶベクターの場合と同じく、５’および３’ ＩＴＲが選択した異種ヌクレオチド配列に隣接する。
【００７１】
ＡＡＶベクターは、ポリアデニル化部位などの転写配列のほか、選択マーカーまたはレポーター遺伝子、エンハンサー配列、および転写の誘導を可能とする他の制御因子を含むこともできる。このような制御因子については上に述べた。
【００７２】
本明細書で用いる「ＡＡＶビリオン」という用語は、完全なウイルス粒子のことを指す。ＡＡＶビリオンは野生型ＡＡＶウイルス粒子（線状の一本鎖ＡＡＶ核酸ゲノムを含み、ＡＡＶキャプシド、すなわちタンパク質外被を伴う）でもよく、組換えＡＡＶウイルス粒子（以下に述べる）でもよい。この点に関して、一本鎖ＡＡＶ核酸分子（センス／コード鎖またはアンチセンス／アンチコード鎖のいずれか。これらの用語は一般的な定義による）はＡＡＶビリオンへのパッケージングが可能である；センス鎖およびアンチセンス鎖には同じ感染性がある。
【００７３】
本明細書で用いる「組換えＡＡＶビリオン」または「ｒＡＡＶ」という用語は、５’および３’側にＡＡＶ ＩＴＲが隣接した異種ヌクレオチド配列がＡＡＶタンパク質外殻でキャプシド化された（すなわち、タンパク質外被で囲まれた）ものから構成される、感染性のある複製能欠損ウイルスのことを指す。組換えＡＡＶビリオンを構築するための技法は当技術分野で数多く知られている（例えば、米国特許第５，１７３，４１４号；国際公開公報第９２／０１０７０号；国際公開公報第９３／０３７６９号；Ｌｅｂｋｏｗｓｋｉら、Ｍｏｌｅｃ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． ８：３９８８〜３９９６［１９８８］；Ｖｉｎｃｅｎｔら、Ｖａｃｃｉｎｅｓ ９０［１９９０］（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）；Ｃａｒｔｅｒ、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｎｈｎｏｌｏｇｙ ３：５３３〜５３９［１９９２］；Ｍｕｚｙｃｚｋａ、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５８：９７〜１２９［１９９２］；Ｋｏｔｉｎ、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ５：７９３〜８０１［１９９４］；ＳｈｅｌｌｉｎｇおよびＳｍｉｔｈ、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １：１６５〜１６９［１９９４］；ならびにＺｈｏｕら、Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １７９：１８６７〜１８７５［１９９４］を参照。これらはすべて参照として本明細書に組み入れられる）。
【００７４】
ＡＡＶベクター（実際には、本明細書に記載のすべてのベクター）中に用いるのに適したヌクレオチド配列には、機能的に適切な任意のヌクレオチド配列が含まれる。このため、本発明のＡＡＶベクターは、標的細胞ゲノムでは欠陥があるもしくは欠失しているタンパク質をコードする、または望ましい生物的もしくは治療的効果（例えば、抗ウイルス作用）を有する非天然タンパク質をコードする任意の望ましい遺伝子を含むことができ、または、配列がアンチセンスもしくはリボザイムの機能を有する分子に対応してもよい。適した遺伝子には、以下の疾患の治療のために用いられるものが含まれる：ＡＩＤＳ、癌、神経疾患、心血管疾患、高コレステロール血症などの疾患を含む炎症性疾患、自己免疫疾患、慢性疾患および感染症；種々の貧血、サラセミアおよび血友病を含む種々の血液疾患；嚢胞性線維症、ゴーシェ病、アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）欠損症、肺気腫などの遺伝的欠損。癌およびウイルス性疾患に対するアンチセンス療法において有用な、さまざまなアンチセンスオリゴヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡの翻訳開始部位（ＡＵＧコドン）の周りの配列に対して相補的な短いオリゴヌクレオチド）が当技術分野では記載されている（例えば、Ｈａｎら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８８：４３１３〜４３１７［１９９１］；Ｕｈｌｍａｎｎら、Ｃｈｅｍ． Ｒｅｖ． ９０：５４３〜５８４［１９９０］；Ｈｅｌｅｎｅら、Ｂｉｏｃｈｉｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ． １０４９：９９〜１２５［１９９０］；Ａｇａｒｗａｌら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８５：７０７９〜７０８３［１９８９］；およびＨｅｉｋｋｉｌａら、Ｎａｔｕｒｅ ３２８：４４５〜４４９［１９８７］を参照）。適したリボザイムに関する考察については、例えば、チェック（Ｃｅｃｈ）ら（１９９２）Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６７：１７４７９〜１７４８２および米国特許第５，２２５，３４７号（これらは参照として本明細書に組み入れられる）を参照されたい。
【００７５】
「アデノ随伴ウイルス逆方向末端反復配列」または「ＡＡＶ ＩＴＲ」とは、ＤＮＡ複製起点およびウイルスに対するパッケージングシグナルとしてシス的に協同作用する、ＡＡＶゲノムの両端に存在する当技術分野で認知されているパリンドローム領域を意味する。本発明に用いるためには、選択した１つまたは複数の異種ヌクレオチド配列の５’および３’側にフランキングＡＡＶ ＩＴＲを配置し、これをｒｅｐコード領域またはＲｅｐ発現産物と併用することにより、選択した配列の標的細胞ゲノム中への組み込みが得られる。
【００７６】
ＡＡＶ ＩＴＲ領域のヌクレオチド配列は知られている（例えば、ＡＡＶ−２配列に関しては、Ｋｏｔｉｎ、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ５：７９３〜８０１［１９９４］；Ｂｅｒｎｓ， Ｋ．Ｉ． 「パルボウイルスおよびその複製（Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ）」、「基礎ウイルス学（Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）」、第２版（Ｂ．Ｎ． ＦｉｅｌｄｓおよびＤ．Ｍ． Ｋｎｉｐｅ編）を参照）。本明細書で用いる「ＡＡＶ ＩＴＲ」は、示された野生型ヌクレオチド配列を有する必要はなく、例えばヌクレオチドの挿入、除去または置換によって改変してもよい。さらに、ＡＡＶ ＩＴＲは、ＡＡＶ−１、ＡＡＶ−２、ＡＡＶ−３、ＡＡＶ−４、ＡＡＶ−５、ＡＡＶＸ７などを含むが、これらに限定されない複数のＡＡＶ血清型のいずれに由来してもよい。選択した異種ヌクレオチド配列に隣接する５’および３’ ＩＴＲは、意図した通りに機能する限り、すなわちｒｅｐ遺伝子が（同じまたは異なるベクター上に）存在する場合またはＲｅｐ発現産物が標的細胞内に存在する場合に、付随する異種配列の標的細胞ゲノム中への組み込みを行える限り、必ずしも同一である必要はなく、同じＡＡＶ血清型または分離株に由来する必要もない。
【００７７】
本明細書で用いる「インビトロ」という用語は、人工的環境、および人工的環境で起こるプロセスまたは反応のことを指す。インビトロ環境は、試験管および細胞培養物から非制限的に構成される。「インビボ」という用語は、自然環境（例えば、動物または細胞）、および自然環境内で起こるプロセスまたは反応のことを指す。
【００７８】
本明細書で用いる「クローン由来である（ｃｌｏｎａｌｌｙ ｄｅｒｉｖｅｄ）」とは、単一細胞に由来する細胞系のことを指す。
【００７９】
本明細書で用いる「非クローン由来である」とは、複数の細胞に由来する細胞系のことを指す。
【００８０】
本明細書で用いる「継代」という用語は、特定の密度または集密度（例えば、７０％または８０％の集密度）まで増殖した細胞の培養物を希釈し、希釈した細胞を再び望ましい特定の密度または集密度へと増殖させるプロセスのことを指す（例えば、細胞の再プレーティング、または細胞を用いて新たな回転びん培養物を樹立することによる）。
【００８１】
本明細書で用いる「安定な」という用語は、ゲノムに言及して用いる場合、ゲノムの情報内容が１つの世代から次の世代に、または細胞系という特定の場合には、１つの継代物から次の継代物へと安定的に維持されることを指す。したがって、ゲノムに大きな変化（例えば、遺伝子の欠失または染色体転座）が起こっていなければゲノムは安定であるとみなす。「安定な」という用語は、ゲノムに点変異などのわずかな変化が起こっている可能性を否定するものではない。
【００８２】
本明細書で用いる「反応（ｒｅｓｐｏｎｓｅ）」という用語は、アッセイに言及して用いる場合、検出可能なシグナル（例えば、レポータータンパク質の蓄積、イオン濃度の上昇、検出可能な化学生成物の蓄積）の発生のことを指す。
【００８３】
本明細書で用いる「膜受容体タンパク質」という用語は、リガンド（例えば、ホルモンまたは神経伝達物質）が結合する膜貫通タンパク質のことを指す。当技術分野で知られているように、タンパク質のリン酸化は、調節シグナルを細胞外から核へと運ぶタンパク質を選択的に修飾するために細胞が用いる一般的な調節機構である。これらの生化学的修飾を遂行するタンパク質は、プロテインキナーゼとして知られる一群の酵素である。それらはさらに、リン酸化の標的とする基質残基によっても定義しうる。プロテインキナーゼの１つの群に、標的タンパク質のチロシン残基を選択的にリン酸化するチロシンキナーゼ（ＴＫ）がある。チロシンキナーゼの一部は膜結合型受容体（ＲＴＫ）であり、これらはリガンドによって活性化されると基質の修飾に加えて自己リン酸化も行いうる。リガンド刺激による連続的リン酸化の開始は、例えば上皮増殖因子（ＥＧＦ）、インスリン、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）および線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）などの、この種のエフェクターの作用の基盤を成すパラダイムである。これらのリガンドに対する受容体はチロシンキナーゼであり、これらはリガンド（ホルモン、増殖因子）の標的細胞との結合、および１つまたは複数の生化学的経路の活性化によるシグナルの細胞内への伝達のインターフェースとなる。受容体チロシンキナーゼに対するリガンドの結合により、その固有の酵素活性が活性化される（例えば、ＵｌｌｒｉｃｈおよびＳｃｈｌｅｓｓｉｎｇｅｒ、Ｃｅｌｌ ６１：２０３〜２１２［１９９０］を参照）。チロシンキナーゼは細胞質の非受容体型酵素のこともあり、これはシグナル伝達経路の下流成分として作用する。
【００８４】
本明細書で用いる「シグナル伝達タンパク質」という用語は、膜受容体タンパク質に対するリガンド結合または何らかの他の刺激により、活性化または別の様式の影響を受けるタンパク質のことを指す。シグナル伝達タンパク質の例には、アデニルシクラーゼ、ホスホリパーゼＣおよびＧタンパク質が含まれる。多くの膜受容体タンパク質はＧタンパク質と共役している（すなわち、Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）；総説については、Ｎｅｅｒ、１９９５、Ｃｅｌｌ ８０：２４９〜２５７［１９９５］を参照）。一般に、ＧＰＣＲは７つの膜貫通ドメインを含む。既知のＧＰＣＲとの配列相同性に基づいて、ＧＰＣＲと推定されるものを同定することが可能である。
【００８５】
ＧＰＣＲは、ＧＰＣＲの細胞外部分に対するリガンドの結合によって生じる、細胞膜を介したシグナル伝達を媒介する。ＧＰＣＲの細胞内部分はＧタンパク質と相互作用し、細胞の外側から内側へのシグナル伝達の調節を行う。このため、ＧＰＣＲはＧタンパク質と「共役している」という。Ｇタンパク質は、ＧＴＰと結合してそれを加水分解するαサブユニットおよび二量体のβγサブユニットという３つのポリペプチドサブユニットから構成される。活性化されていない基底状態では、Ｇタンパク質はαおよびβγサブユニットのヘテロ三量体として存在する。Ｇタンパク質が活性化されると、グアノシン二リン酸（ＧＤＰ）がＧタンパク質のαサブユニットと会合する。ＧＰＣＲがリガンドと結合して活性化されると、ＧＰＣＲはＧタンパク質ヘテロ三量体と結合し、ＧαサブユニットのＧＤＰに対する親和性を低下させる。活性化状態では、ＧサブユニットはＧＤＰをグアニン三リン酸（ＧＴＰ）と交換し、活性型Ｇａサブユニットが受容体および二量体βγサブユニットの両方から解離する。解離した活性型Ｇαサブユニットは、細胞内のＧタンパク質シグナル伝達経路の「下流」にあるエフェクターにシグナルを伝達する。最終的に、Ｇタンパク質の内因性ＧＴＰアーゼ活性により、活性型ＧサブユニットはＧＤＰおよび二量体βγサブユニットと会合した不活性状態に復帰する。
【００８６】
ヘテロ三量体Ｇタンパク質ファミリーのメンバーは数多くクローニングされており、これには種々のＧαサブユニットをコードする２０種を上回る遺伝子が含まれる。これらの種々のＧサブユニットは、アミノ酸配列および機能的相同性に基づいて４つのファミリーに分類されている。これらの４つのファミリーはＧαｓ、Ｇαｉ、ＧαｑおよびＧα１２と命名されている。機能的には、これらの４つのファミリーは、活性化する細胞内シグナル伝達経路および共役するＧＰＣＲの点で異なる。
【００８７】
例えば、ある種のＧＰＣＲは通常Ｇαｓと共役しており、これらのＧＰＣＲはＧαｓを介してアデニリルシクラーゼ活性を刺激する。他のＧＰＣＲは通常ＧＧαｑと共役しており、これらのＧＰＣＲはＧＧαｑを介して、ホスホリパーゼＣのβアイソフォーム（すなわちＰＬＣβ、ＳｔｅｒｍｗｅｉｓおよびＳｍｒｃｋａ、Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｓｃｉ． １７：５０２〜５０６［１９９２］）などのホスホリパーゼＣ（ＰＬＣ）を活性化することができる。
【００８８】
本明細書で用いる「免疫グロブリン」という用語は、特異的抗原と結合するタンパク質のことを指す。免疫グロブリンには、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体およびヒト化抗体、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片が含まれるが、これらに限定されず、以下のクラスの免疫グロブリンが含まれる：ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｂＥおよび分泌型免疫グロブリン（ｓＩｇ）。免疫グロブリンは一般に、２つの同一な重鎖（γ、α、μ、δまたはε）および２つの軽鎖（κまたはλ）を含む。
【００８９】
本明細書で用いる「抗原結合タンパク質」という用語は、特異的抗原と結合するタンパク質のことを指す。「抗原結合タンパク質」には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体およびヒト化抗体を含む免疫グロブリン；Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片およびＦａｂ発現ライブラリー；ならびに一本鎖抗体が含まれるが、これらに限定されない。当技術分野で知られたさまざまな手順がポリクローナル抗体の作製のために用いられる。抗体の産生のためには、望ましいエピトープに対応するペプチドの注射による免疫処置を、ウサギ、マウス、ラット、ヒツジ、ヤギなどを含むが、これらに限定されない種々の宿主動物に行うとよい。１つの好ましい態様では、ペプチドを免疫原性担体（例えば、ジフテリアトキソイド、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）またはキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ））と結合させる。免疫応答を高めるために、フロイントアジュバント（完全および不完全）、水酸化アルミニウムなどの無機質ゲル、リゾレシチン、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油性乳剤、キーホールリンペットヘモシアニン、ジニトロフェノールなどの表面活性物質、ならびにＢＣＧ（カルメット−ゲラン菌）およびコリネバクテリウムパルブム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ）などの有用と考えられるヒトアジュバントを含むが、これらに限定されない種々のアジュバントを宿主種に応じて用いる。
【００９０】
モノクローナル抗体の調製のためには、培養下にある連続継代細胞系による抗体分子の産生を用いうる（例えば、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、「抗体：実験マニュアル（Ａｎｔｉｂｏｄｙ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹを参照）。これらには、ケーラー（Ｋｏｈｌｅｒ）およびミルシュタイン（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ）によって最初に開発されたハイブリドーマ法（ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ、Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５〜４９７［１９７５］）のほか、トリオーマ（ｔｒｉｏｍａ）法、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ法（例えば、Ｋｏｚｂｏｒら、Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｔｏｄａｙ ４：７２［１９８３］参照）、ならびにヒトモノクローナル抗体の産生を目的とするＥＢＶ−ハイブリドーマ法（Ｃｏｌｅら、モノクローナル抗体および癌治療（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ）、Ａｌａｎ Ｒ． Ｌｉｓｓ， Ｉｎｃ．、ｐｐ．７７〜９６［１９８５］）が含まれるが、これらに限定されない。
【００９１】
本発明によれば、一本鎖抗体の作製を目的として記載された技法（米国特許第４，９４６，７７８号；参照として本明細書に組み入れられる）を、必要な特異的一本鎖抗体を作製するために適合化することができる。本発明のもう１つの態様では、望ましい特異性を備えたモノクローン性Ｆａｂ断片の迅速かつ容易な同定が可能となるように、Ｆａｂ発現ライブラリーの構築を目的とする当技術分野で知られた技法を用いる（Ｈｕｓｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４６：１２７５〜１２８１［１９８９］）。
【００９２】
抗体分子のイディオタイプ（抗原結合領域）を含む抗体断片は、既知の技法によって作製することができる。例えば、このような断片には以下のものが含まれるが、これらに限定されない：抗体分子のペプシン消化によって作製しうるＦ（ａｂ’）２断片；Ｆ（ａｂ’）２断片のジスルフィド結合の還元によって作製しうるＦａｂ’断片、ならびに抗体分子をパパインおよび還元剤で処理することによって作製しうるＦａｂ断片。
【００９３】
抗原結合タンパク質をコードする遺伝子は、当技術分野で知られた方法によって単離することができる。抗体の作製に際しては、当技術分野で知られた技法により、望ましい抗体に関するスクリーニングを実施しうる（例えば、ラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ（固相酵素免疫アッセイ）、「サンドイッチ」イムノアッセイ、免疫放射定量アッセイ、ゲル拡散沈降反応、免疫拡散アッセイ、インサイチューイムノアッセイ（例えば、コロイド金、酵素標識または放射性同位体標識を用いる）、ウエスタンブロット法、沈殿反応、凝集アッセイ（例えば、ゲル凝集アッセイ、赤血球凝集アッセイなど）、補体結合アッセイ、免疫蛍光アッセイ、プロテインＡアッセイおよび免疫電気泳動アッセイなど）。
【００９４】
本明細書で用いる「レポーター遺伝子」という用語は、アッセイしうるタンパク質をコードする遺伝子のことを指す。レポーター遺伝子の例には、ルシフェラーゼ（例えば、ｄｅＷｅｔら、Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． ７：７２５［１９８７］ならびに米国特許第６，０７４，８５９号；第５，９７６，７９６号；第５，６７４，７１３号；および第５，６１８，６８２号；これらはすべて参照として本明細書に組み入れられる）、緑色蛍光タンパク質（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｕ４３２８４；さまざまなＧＦＰ変種がクロンテックラボラトリーズ社（ＣＬＯＮＴＥＣＨ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、ＣＡ）から販売されている）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、アルカリホスファターゼおよび西洋ワサビペルオキシダーゼが含まれるが、これらに限定されない。
【００９５】
本明細書で用いる「精製された」という用語は、自然環境から採取、単離または分離された、核酸配列またはアミノ酸配列のいずれかである分子のことを指す。このため、「単離された核酸配列」は精製された核酸配列である。「実質的に精製された」分子は、自然条件下で付随する他の成分を少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも９０％含まない。
【００９６】
発明の詳細な説明
本発明は、発現ベクター中に用いるための新規調節配列を提供する。いくつかの態様において、本発明は、新規調節因子を含むレトロウイルス発現ベクターを提供する。加えてさらに他の態様において、本発明は、宿主細胞内で関心対象のタンパク質を発現させるための方法を提供する。特に好ましい態様において、本発明は、多サブユニットタンパク質（例えば、免疫グロブリンの重鎖および軽鎖、卵胞刺激ホルモンの複数のサブユニット）の２つの鎖をほぼ等しい比で発現させるための方法を提供する。これらの方法は、先行技術における問題点を解決するために本発明の新規調節配列およびベクターを利用する。
【００９７】
Ｉ．レトロウイルス発現ベクターの構成要素
特に好ましい態様において、本発明のレトロウイルスベクターは、機能的に結び付いた以下の因子を含む：ａ）５’ ＬＴＲ；ｂ）パッケージングシグナル；ｃ）３’ ＬＴＲ、ならびにｄ）５’および３’ ＬＴＲの間に位置する関心対象のタンパク質をコードする核酸核酸。さらに、いくつかの好ましい態様では、関心対象のタンパク質の発現、分泌および精製を補助するために、以下に記載するものを含むが、これらに限定されない新規組成物を発現ベクターに含める。以下の新規因子についてさらに詳細に説明する：ウシ／ヒトハイブリッド型α−ラクトアルブミン（α−ＬＡ）プロモーター（Ａ）；変異型ＲＮＡ移行因子（Ｂ）；およびリボソーム内部進入部位（Ｃ）。
【００９８】
Ａ．ウシ／ヒトハイブリッド型α−ラクトアルブミンプロモーター
いくつかの態様において、本発明は、ハイブリッド型α−ラクトアルブミン（α−ＬＡ）プロモーターを提供する。本ハイブリッド型プロモーターは、任意の２つまたはそれ以上の哺乳類α−ラクトアルブミンプロモーターの部分から構築しうると考えられる（例えば、ヒト、ウシ、ヤギ、ヒツジ、ウサギまたはマウスのα−ラクトアルブミンプロモーター；例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ１２４２５７；ＡＦ１２３８９３；ＡＸ０６７５０４；Ｓｏｕｌｉｅｒら、Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｒｅｓ． ８（１）：２３〜３１（１９９９）；ＭｃＫｅｅら、Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈ． １６（７）：６４７〜５１（１９９８）；Ｌｕｂｏｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｊ． ２５６（２）：３９１〜６（１９８８）；および米国特許第５，５３０，１７７号を参照）。いくつかの態様において、ハイブリッドを構成するプロモーターのうち少なくとも１つの一部は少なくとも５０ヌクレオチド長であり、好ましい態様において、ハイブリッドを構成するプロモーターのうち少なくとも１つの一部は少なくとも１００ヌクレオチド長であり、特に好ましい態様において、ハイブリッドを構成するプロモーターのうち少なくとも１つの一部は少なくとも５００ヌクレオチド長であり、ハイブリッドを構成する少なくとも１つの他のプロモーターの部分は同程度またはより長い長さである。ひとたび構築した後に、本ハイブリッド型プロモーターの機能性を、プロモーターをβ−ガラクトシダーゼ、緑色蛍光タンパク質またはルシフェラーゼなどのレポーター遺伝子と機能的に結合させることにより、その結果得られた構築物を含むトランスジェニック性マウスまたはウシなどのトランスジェニック動物を作出することにより、および、ハイブリッド型プロモーターからの発現の特異性を判定するためにその結果得られたトランスジェニック動物の種々の組織をアッセイすることにより、アッセイすることができる。好ましい態様において、ハイブリッド型プロモーターからの発現は乳腺、特に乳腺上皮細胞に対して実質的に特異的であり、他の組織における発現は皆無またはわずかに過ぎない。
【００９９】
特に好ましい態様において、ハイブリッド型プロモーターはウシ／ヒトハイブリッド型α−ラクトアルブミン（α−ＬＡ）プロモーターである（配列番号：１）。本プロモーターのヒト部分はヒトゲノムＤＮＡに由来し、転写開始点を基準として＋１５から転写開始点を基準として−６００までの塩基を含む。ウシ部分はヒト部分の末端に結合しており、転写開始点を基準として−５５０〜−２０００の塩基に対応する。
【０１００】
本発明において好ましく用いられるハイブリッド型プロモーターは、内部ポリアデニル化シグナルを含んでいたヒトプロモーターの領域を利用している。内部ポリアデニル化シグナルは変異によって除去した。変異は塩基２０１２位にあり、ＡからＴへの変化が生じた。本発明は何らかの特定の作用機序には限定されない。実際には、機序の理解は本発明の実施に必要ではない。しかしながら、ポリアデニル化シグナルの除去によってｍＲＮＡ早期転写終結の問題がなくなることでレトロウイルスＲＮＡの産生は改善されると考えられる。さらに、ヒトには別のエンハンサー領域が存在するが、ウシ配列には存在しないと考えられる。ハイブリッド型プロモーターはこれらの別の配列を利用するように構築した。同様に、ハイブリッド型プロモーターは、ヒトプロモーターに存在する可能性も存在しない可能性もあるウシ因子を含む。
【０１０１】
Ｂ．ＲＮＡ移行因子
いくつかの態様において、本発明は、変異型ＲＮＡ移行因子（ｍＲＮＡ前駆体プロセシング因子（ＰＰＥ）、メルツ配列またはＷＰＲＥ；例えば、米国特許第５，９１４，２６７号および第５，６８６，１２０号ならびにＰＣＴ公報・国際公開公報第９９／１４３１０号を参照。これらはすべて参照として本明細書に組み入れられる）。本発明は何らかの特定の作用機序には限定されない。実際には、機序の理解は本発明の実施に必要ではない。しかしながら、ＲＮＡ移行因子の使用により、関心対象のタンパク質をコードする核酸配列にスプライスシグナルまたはイントロンを組み入れなくても、関心対象のタンパク質の高レベルの発現を得ることが可能または容易になると考えられる。
【０１０２】
いくつかの態様においては、変異型ＰＰＥ因子を用いる。いくつかの特に好ましい態様では、内部ＡＴＧ配列を除去するためにＰＰＥ配列を変異させる。本発明は何らかの特定の作用機序には限定されない。実際には、機序の理解は本発明の実施に必要ではない。しかしながら、内部開始配列の除去によって望ましくない翻訳開始が起こるのを防げると考えられる。変異型ＰＰＥ配列を用いるいくつかの態様では、配列番号：２の塩基４位、１１２位、１３１位および２３８位をＧからＴに変更する。いずれの場合も、これらの変化はＡＴＧ開始コドンをＡＴＴコドンに変異させる。いくつかの態様では、変異型ＰＰＥ配列を、関心対象の遺伝子をコードするｍＲＮＡの５’非翻訳領域（ＵＴＲ）内に配置する。他の態様では、変異型ＰＰＥ配列を、関心対象の遺伝子をコードするｍＲＮＡの３’ ＵＴＲ内に配置する。いくつかの好ましい態様では、リンカーによって隔てられた２つの変異型ＰＰＥ配列を頭−尾配列（ｈｅａｄ ｔｏ ｔａｉｌ ａｒｒａｙ）として配置する（例えば、配列番号：２を参照）。この配列の２つのコピーはｍＲＮＡ移行にさらに劇的な影響を及ぼすことが示されている。他の態様では、変異型ＰＰＥ配列の２〜２０個のコピーを、関心対象の遺伝子をコードするｍＲＮＡ中に配置する。
【０１０３】
上記の配列の機能的変種は、変種配列をベクター中で被験遺伝子と機能的に結合させること、宿主細胞にベクターをトランスフェクトすること、および宿主細胞を被験遺伝子の発現に関して分析することにより、容易に同定される。適した被験遺伝子、宿主細胞およびベクターは実施例の項で開示する。
【０１０４】
Ｃ．リボソーム内部進入部位
いくつかの態様において、本発明は、リボソーム内部進入部位（ＩＲＥＳ）／シグナルペプチド配列（例えば、配列番号：３および１２）を含む。本発明は、種々のシグナル配列を種々のＩＲＥＳ配列と融合させうると考えている。適したシグナル配列には、α−ラクトアルブミン、カゼイン、組織プラスミノーゲン活性化因子、血清アルブミン、ラクトフェリンおよびラクトフェリンに由来するものが含まれる（例えば、Ｚｗｉｚｉｎｓｋｉら、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２５５（１６）：７９７３〜７７［１９８０］、Ｇｒａｙら、Ｇｅｎｅ ３９（２）：２４７〜５４［１９８５］およびＭａｒｔｉａｌら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２０５：６０２〜６０７［１９７９］を参照）。このような分泌シグナル配列は、組織特異的発現の標的となる細胞種から分泌されるポリペプチド（例えば、乳腺分泌細胞における発現およびそれからの分泌の目的には乳タンパク質）をコードする遺伝子に由来することが好ましい。適したＩＲＥＳ配列には、口蹄疫ウイルス（ＦＤＶ）、脳心筋炎ウイルス、ポリオウイルスおよびＲＤＶに由来するものが含まれる（Ｓｃｈｅｐｅｒら、Ｂｉｏｃｈｅｍ． ７６：８０１〜８０９［１９９４］；Ｍｅｙｅｒら、Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６９：２８１９〜２８２４［１９９５］；Ｊａｎｇら、１９８８、Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６２：２６３６〜２６４３［１９９８］；Ｈａｌｌｅｒら、Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６６：５０７５〜５０８６［１９９５］）。機能的なＩＲＥＳ／シグナルペプチド配列は、２つの遺伝子を配列および適切なプロモーターと機能的に結合させること、宿主細胞に構築物をトランスフェクトすること、ならびに宿主細胞を２つの遺伝子によってコードされるタンパク質の産生に関してアッセイすることによって同定しうる。このようなスクリーニングに適した遺伝子、ベクター構築物および宿主細胞は実施例の項に提示する。好ましい態様では、ＩＲＥＳおよびシグナルペプチドのコード配列は互いに隣接しており、介在コード配列は存在しない（すなわち、場合によっては非コード配列によって隔てられることはある）。
【０１０５】
本発明は、何らかの特定の作用機序には限定されない。実際には、機序の理解は本発明の実施に必要ではない。ＩＲＥＳは遺伝子の翻訳をＩＲＥＳ配列のところで開始させ、それにより、同一の構築物中にある関心対象の２つの遺伝子の発現をもたらす。ウシα−ラクトアルブミンシグナルペプチドまたはカゼインシグナルペプチドは、発現されたタンパク質産物の細胞外分泌を引き起こす。
【０１０６】
いくつかの態様では、ＩＲＥＳからの翻訳開始が最も効率的になるように、シグナルペプチドの最初のＡＴＧをＩＲＥＳと結合させる。いくつかの態様では、シグナルペプチドの第２のコドンをＡＴＧからＧＣＣに変異させ、α−ラクトアルブミンシグナルペプチドの第２のアミノ酸をメチオニンからアラニンに変化させる。本発明は何らかの特定の作用機序には限定されない。実際には、機序の理解は本発明の実施に必要ではない。しかしながら、この変異によってＩＲＥＳによる翻訳開始はより効率的化されると考えられる。いくつかの態様では、（ＩＲＥＳ）／シグナルペプチドをベクター中の関心対象の２つの遺伝子の間に挿入する。これらの態様において、（ＩＲＥＳ）／シグナルペプチドは第２の翻訳開始部位を形成し、同一の発現ベクターからの２つのポリペプチドの発現を可能にする。言い換えると、２つの異なるポリペプチド（例えば、免疫グロブリンの重鎖および軽鎖）をコードする単一の転写産物が産生される。
【０１０７】
いくつかの態様において、シグナルペプチドはα−ラクトアルブミンに由来する。他の態様において、本発明は、リボソーム内部進入部位（ＩＲＥＳ）／改変型（ｍｏｄｉｆｉｅｄ）ウシα−Ｓ１カゼインシグナルペプチド融合タンパク質（配列番号：１２）を含む。本発明は何らかの特定の作用機序には限定されない。実際には、機序の理解は本発明の実施に必要ではない。ＩＲＥＳは遺伝子の翻訳をＩＲＥＳ配列のところで開始させ、同一の構築物中にある関心対象の２つの遺伝子の発現を可能とする。ウシα−Ｓ１カゼインシグナルペプチドは、発現されたタンパク質産物の分泌を引き起こす。
【０１０８】
いくつかの態様では、ウシα−Ｓ１カゼインシグナルペプチドの第２のコドンをＡＡＡからＧＣＣに変異させる。この変異により、シグナルペプチドの第２のコドンはアラニンからリジンに変化する。いくつかの態様では、シグナルペプチドの第３のコドンをＣＴＴからＴＴＧに変化させるが、この変化はアミノ酸置換を引き起こさない。本発明は何らかの特定の作用機序には限定されない。実際には、機序の理解は本発明の実施に必要ではない。しかしながら、この変異によってＩＲＥＳによる翻訳開始はより効率化されると考えられる。
【０１０９】
ＩＩ．レトロウイルス発現ベクター
いくつかの態様において、本発明はレトロウイルス発現ベクターを含む。レトロウイルス（レトロウイルス科）は一般に以下の３つの群に分けられる：スプマウイルス（例えば、ヒト泡沫状ウイルス）；レンチウイルス（例えば、ヒト免疫不全ウイルスおよびヒツジビスナウイルス）およびオンコウイルス（例えば、ＭＬＶおよびラウス肉腫ウイルス）。
【０１１０】
レトロウイルスは、動物細胞を感染させる、外被を有する（すなわち、宿主細胞由来の脂質二重層膜に囲まれた）一本鎖ＲＮＡウイルスである。レトロウイルスに細胞が感染すると、そのＲＮＡゲノムは線状二本鎖ＤＮＡ形態に変換される（すなわち、逆転写される）。次に、ＤＮＡ形態のウイルスはプロウイルスとして宿主細胞ゲノムに組み込まれる。プロウイルスはさらにウイルスゲノムおよびウイルスｍＲＮＡを産生するためのテンプレートの役割を果たす。ゲノムＲＮＡの２つのコピーを含む成熟ウイルス粒子が感染細胞の表面から出芽する。ウイルス粒子は、ゲノムＲＮＡ、逆転写酵素および他のｐｏｌ遺伝子産物をウイルスキャプシド（ウイルスｇａｇ遺伝子産物を含む）の内部に含み、これがさらにウイルス外被糖タンパク質（膜関連タンパク質とも呼ばれる）を含む宿主細胞由来の脂質二重層膜によって囲まれている。
【０１１１】
さまざまなレトロウイルスのゲノム構成が当技術分野では知られており、これにより、レトロウイルスベクターの作製を目的とするレトロウイルスゲノムの適合化が可能となった。関心対象の遺伝子を有する組換えレトロウイルスベクターの作製は一般に、２つの段階で行われる。
【０１１２】
第１に、関心対象の遺伝子を、関心対象の遺伝子の効率的な発現のために必要な配列（プロモーターおよび／またはエンハンサー因子を含む。これはウイルス末端反復配列（ＬＴＲ）、または内部プロモーター／エンハンサーおよび適切なスプライシングシグナルによって提供してもよい）、ウイルスＲＮＡの感染性ビリオンへの効率的なパッケージングに必要な配列（例えば、パッケージングシグナル（Ｐｓｉ）、ｔＲＮＡプライマー結合部位（−ＰＢＳ）、逆転写のために必要な３’調節配列（＋ＰＢＳ））およびウイルスＬＴＲを含むレトロウイルスベクター中に挿入する。ＬＴＲは、ウイルスゲノムＲＮＡの会合、逆転写酵素およびインテグラーゼの機能に必要な配列、ならびにウイルス粒子へのパッケージングを行おうとするゲノムＲＮＡの発現の指令に関与する配列を含む。安全面の理由から、多くの組換えレトロウイルスベクターはウイルス複製に必須な遺伝子の機能的コピーを持たない（これらの必須遺伝子は除去または無効化されている）；このため、この結果得られるウイルスは「複製能に欠損がある」と呼ばれる。
【０１１３】
第２に、組換えベクターを構築した後に、ベクターＤＮＡをパッケージング細胞系に導入する。パッケージング細胞系は、望ましい宿主範囲を有するウイルス粒子へのウイルスゲノムＲＮＡのパッケージングのためにトランス的に必要なウイルスタンパク質を提供する（すなわち、ウイルスにコードされたｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖタンパク質）。宿主範囲は一部には、ウイルス粒子の表面に発現される外被遺伝子産物の種類によって調節される。パッケージング細胞系が同種指向性、両種指向性または異種指向性の外被遺伝子産物を発現してもよい。または、パッケージング細胞にウイルス外被（ｅｎｖ）タンパク質をコードする配列がなくてもよい。この場合には、パッケージング細胞系は膜関連タンパク質（例えば、ｅｎｖタンパク質）を含まない粒子中へのウイルスゲノムのパッケージングを行うと考えられる。ウイルスの細胞内への侵入を可能にすると考えられる膜関連タンパク質を含むウイルス粒子を作製するためには、レトロウイルス配列を含むパッケージング細胞系に、膜関連タンパク質（例えば、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）のＧタンパク質）をコードする配列をトランスフェクトすることが一般的である。トランスフェクトされたパッケージング細胞は、トランスフェクトされたパッケージング細胞系によって発現された膜関連タンパク質を含むウイルス粒子を産生すると考えられる；別のウイルスの外被タンパク質によるキャプシド形成がなされたウイルスに由来するウイルスゲノムＲＮＡを含むこのようなウイルス粒子を「偽型のウイルス粒子」という。
【０１１４】
本発明のレトロウイルスベクターは、追加的な調節配列を含むようにさらに改変することができる。上記の通り、本発明のレトロウイルスベクターは機能的に結び付いた以下の因子を含む：ａ）５’ ＬＴＲ；ｂ）パッケージングシグナル；ｃ）３’ ＬＴＲ；およびｄ）５’および３’ ＬＴＲの間に位置する、関心対象のタンパク質をコードする核酸。本発明のいくつかの態様において、内部プロモーターからの転写が望ましい場合には、関心対象の核酸を５’ ＬＴＲに対して反対の向きに配置してもよい。適した内部プロモーターには、α−ラクトアルブミンプロモーター、ＣＭＶプロモーターおよびチミジンキナーゼプロモーター含まれるが、これらに限定されない。
【０１１５】
本発明の他の態様において、関心対象のタンパク質の分泌が望ましい場合には、関心対象のタンパク質と機能的に結び付いたシグナルペプチド配列を含めることにより、ベクターを改変する。組織プラスミノーゲン活性化因子、ヒト成長ホルモン、ラクトフェリン、αＳ１−カゼインおよびα−ラクトアルブミンに由来するものを含むが、これらに限定されないいくつかの適したシグナルペプチドの配列が当技術分野で知られている。
【０１１６】
本発明の他の態様では、ＲＮＡ移行因子、ＰＰＥ因子およびＩＲＥＳ／ウシα−ラクトアルブミンシグナル配列を含むが、これらに限定されない上記の因子の１つまたは複数を組み入れることにより、ベクターを改変する。
【０１１７】
本発明のレトロウイルスベクターに、形質転換細胞の選択を容易にする選択マーカーをさらに含めてもよい。薬剤Ｇ４１８に対する耐性を哺乳類細胞に付与する細菌アミノグリコシド３’リン酸転移酵素遺伝子（ｎｅｏ遺伝子とも呼ばれる）、抗生物質ハイグロマイシンに対する耐性を付与する細菌ハイグロマイシンＧリン酸転移酵素（ｈｙｇ）遺伝子、およびミコフェノール酸の存在下における増殖能を付与する細菌キサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子（ｇｐｔ遺伝子とも呼ばれる）を含むが、これらに限定されない当技術分野で知られたさまざまな選択マーカーを本発明に用いうる。いくつかの態様において、選択マーカー遺伝子は、関心対象のタンパク質をもコードする多シストロン性配列の一部として提供される。
【０１１８】
本発明のさらに他の態様において、レトロウイルスベクターは組換え系によって認識される組換え因子を含んでもよい（例えば、ｃｒｅ／ｌｏｘＰまたはｆｌｐリコンビナーゼ系を参照：例えば、Ｈｏｅｓｓら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、１４：２２８７［１９８６］、Ｏ’Ｇｏｒｍａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５１：１３５１［１９９１］、ｖａｎ Ｄｅｕｒｓｅｎら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９２：７３７６［１９９５］および米国特許第６，０２５，１９２号を参照。これらは参照として本明細書に組み入れられる）。宿主細胞のゲノム中へのベクターの組み込みの後に、組み込まれたベクター中に関心対象の核酸配列が挿入されるように、リコンビナーゼ酵素（例えば、Ｃｒｅリコンビナーゼ）、またはリコンビナーゼ酵素をコードする核酸配列、および組換え酵素によって認識される配列が隣接した関心対象のタンパク質をコードする１つもしくは複数の核酸配列を、宿主細胞に一時的にトランスフェクトすることができる（例えば、エレクトロポレーション、リポフェクションまたはマイクロインジェクションによる）。
【０１１９】
組換えレトロウイルスベクターを含むウイルスベクターは、リン酸カルシウム−ＤＮＡ共沈、ＤＥＡＥ−デキストランによるトランスフェクション、エレクトロポレーションまたは核酸のマイクロインジェクションなどの他の技法に比べて、遺伝子を細胞内に導入するより効率的な手段となる。しかし、本発明は何らかの特定の機序には限定されない。実際には機序の理解は本発明の実施に必要ではない。しかしながら、ウイルス導入の効率は一部には、核酸の移行は受容体を介する過程である（すなわち、ウイルスは標的細胞の表面にある特異的な受容体タンパク質と結合する）という事実によると考えられている。さらに、ひとたび細胞内に入った後も、ウイルスにより導入された核酸は制御の下で組み込まれる。これは、再配列および分解を被ることが一般的な、他の手段（例えば、リン酸カルシウム−ＤＮＡ共沈）によって導入された核酸とは対照的である。
【０１２０】
以下の実施例１には、本発明のレトロウイルスベクターの例証となる実例を記載している。しかし、本発明は実施例１に記載したベクターには限定されないものとする。実際には、本発明の新規因子を含む任意の適したレトロウイルスベクターを考えている。さらに、上記の因子は、ＡＡＶベクター、トランスポゾンベクター、プラスミド、細菌人工染色体および酵母人工染色体などの他のベクターにも用いうる。
【０１２１】
ＩＩＩ．タンパク質の発現
本発明のいくつかの態様では、上記のベクターおよび調節因子を１つまたは複数のタンパク質の発現に利用する。本発明は何らかの特定のタンパク質の産生には限定されない。実際には、以下のものを含むが、これらに限定されない非常にさまざまなタンパク質の産生を考えている：エリスロポエチン、α−インターフェロン、α−１プロテイナーゼ阻害剤、アンジオゲニン、アンチトロンビンＩＩＩ、β酸デカルボキシラーゼ、ヒト成長ホルモン、ウシ成長ホルモン、ブタ成長ホルモン、ヒト血清アルブミン、β−インターフェロン、仔ウシ腸アルカリホスファターゼ、嚢胞性線維症膜貫通調節タンパク質、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、インスリン、ラクトフェリン、組織プラスミノーゲン活性化因子、ミエリン塩基性タンパク質、インスリン、プロインスリン、プロラクチン、Ｂ型肝炎抗原、免疫グロブリン、モノクローナル抗体ＣＴＬＡ４ Ｉｇ、Ｔａｇ ７２モノクローナル抗体、Ｔａｇ ７２一本鎖抗原結合タンパク質、プロテインＣ、サイトカインおよびその受容体（例えば、腫瘍壊死因子αおよびβ）、成長ホルモン放出因子、副甲状腺ホルモン、甲状腺刺激ホルモン、リポタンパク質、α−１−アンチトリプシン、卵胞刺激ホルモン、カルシトニン、黄体形成ホルモン、グルカゴン、フォンビルブラント因子、心房性ナトリウム利尿因子、肺サーファクタント、ウロキナーゼ、ボンベシン、トロンビン、造血系増殖因子、エンケファリナーゼ、ヒトマクロファージ炎症性タンパク質（ＭＩＰ−１−α）、血清アルブミン（例えば、ミューラー管抑制物質）、リラキシンＡ鎖、リラキシンＢ鎖、プロリラキシン、マウスゴナドトロピン関連ペプチド、β−ラクタマーゼ、ＤＮＡ分解酵素、インヒビン、アクチビン、血管内皮増殖因子（ＶＢＧＦ）、ホルモンまたは増殖因子の受容体、インテグリン、プロテインＡまたはＤ、リウマトイド因子、神経栄養因子（例えば、骨由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ））、ニューロトロフィン−３、−４、−５または−６（ＮＴ−３、ＮＴ−４、ＮＴ−５またはＮＴ−６）、神経成長因子（例えば、ＮＧＦ−β）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（例えば、ａＦＧＦおよびｂＦＧＦ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）（例えば、ＴＧＦ−α、およびＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３、ＴＧＦ−β４またはＴＧＦ−β５を含むＴＧＦ−β）、インスリン様増殖因子−Ｉおよび−ＩＩ（ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩ）、デス（１−３）−ＩＧＦ−Ｉ（脳ＩＧＦ−Ｉ）、インスリン様増殖因子結合タンパク質；ＣＤタンパク質（例えば、ＣＤ−３、ＣＤ−４、ＣＤ−８およびＣＤ−１９）、骨誘導因子、イムノトキシン、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）；インターフェロン（例えば、インターフェロン−α、−βおよび−γ）、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）（例えば、ＭＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦおよびＧ−ＣＳＦ）、インターロイキン（ＩＬ）（例えば、ＩＬ−１〜ＩＬ−１０）、スーパーオキシドジスムターゼ、Ｔ細胞受容体、表面膜タンパク質、崩壊促進因子、ウイルス抗原（例えば、ＡＩＤＳ外被の一部）、輸送タンパク質、ホーミング受容体、アドレッシン、調節タンパク質、抗体、キメラタンパク質（例えば、イム��アドヘシン）、ならびに以上に挙げた任意のものの断片。当業者は、これらのタンパク質およびそれらの相同体に関する核酸配列を公開データベース（例えば、Ｇｅｎ Ｂａｎｋ）から入手しうることを認識している。
【０１２２】
いくつかの態様では、本発明のベクターを、複数の外因性タンパク質を発現させるために用いる。例えば、宿主細胞に複数の異なる関心対象のタンパク質をコードするベクターによるトランスフェクション（例えば、第１の関心対象のタンパク質をコードする１つのベクターおよび第２の関心対象のタンパク質をコードする第２のベクターによる同時トランスフェクション）を行ってもよい。他の態様では、多シストロン性配列（例えば、二シストロン性または三シストロン性配列）として複数の異なる関心対象のタンパク質をコードする核酸を配置することにより、複数のタンパク質を発現させる。この配置は、異なる関心対象のタンパク質の発現が１：１のモル比であることが望ましい場合に特に有用である（例えば、免疫グロブリン分子の軽鎖および重鎖の発現）。
【０１２３】
Ａ．細胞培養下でのタンパク質の発現
本発明のいくつかの態様では、細胞培養下でタンパク質を発現させる。いくつかの態様では、レトロウイルスベクターを用いて、ラット線維芽細胞、ウシ腎細胞およびヒト腎細胞を含むが、これらに限定されない哺乳類組織培養宿主細胞においてタンパク質を発現させ、いくつかの好ましい態様では、タンパク質をウシ乳腺細胞において発現させる。宿主細胞は当技術分野で知られた方法に従って培養する；哺乳類細胞に適した培養条件は当技術分野で周知である（例えば、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ ５６：２２１［１９８３］、「動物細胞の培養：実践的アプローチ（Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ）」、第２版、Ｒｉｃｋｗｏｏｄ， Ｄ．およびＨａｍｅｓ， Ｂ． Ｄ．編、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ［１９９２］を参照）。
【０１２４】
本発明は、組み込みベクターによる種々の宿主細胞のトランスフェクションを考えている。当技術分野では数多くの哺乳類宿主細胞系が知られている。一般に、これらの宿主細胞は、以下により詳細に述べる適切な栄養素および増殖因子を含む培地中での単層培養または懸濁培養下においた場合に生育および生存が可能である。典型的な場合、細胞は関心対象の特定のタンパク質を大量に発現し、培地中に分泌する。適した哺乳類宿主細胞の例には、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ−Ｋ１、ＡＴＣＣ ＣＣ１−６１）；ウシ乳腺上皮細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １０２７４；ウシ乳腺上皮細胞）；ＳＶ４０により形質転換されたサル腎臓ＣＶ１系（ＣＯＳ−７、ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５１）；ヒト胚腎細胞系（２９３細胞または懸濁培養下での生育用にサブクローニングされた２９３細胞；例えば、グラハム（Ｇｒａｈａｍ）ら、Ｊ． Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ．、３６：５９［１９７７］参照）；ベビーハムスター腎細胞（ＢＨＫ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ １０）；マウスセルトリ細胞（ＴＭ４、Ｍａｔｈｅｒ、Ｂｉｏｌ． Ｒｅｐｒｏｄ． ２３：２４３〜２５１［１９８０］）；サル腎細胞（ＣＶ１ ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７０）；アフリカミドリザル腎細胞（ＶＥＲＯ−７６、ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１５８７）；ヒト子宮頸癌細胞（ＨＥＬＡ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ２）；イヌ腎細胞（ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ３４）；バッファローラット肝細胞（ＢＲＬ ３Ａ、ＡＴＣＣ ＣＲＬ １４４２）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７５）；ヒト肝細胞（Ｈｅｐ Ｇ２、ＨＢ ８０６５）；マウス乳腺癌（ＭＭＴ ０６０５６２、ＡＴＣＣ ＣＣＬ５１）；ＴＲＩ細胞（Ｍａｔｈｅｒら、Ａｎｎａｌｓ Ｎ．Ｙ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．、３８３：４４〜６８［１９８２］）；ＭＲＣ ５細胞；ＦＳ４細胞；ラット線維芽細胞（２０８Ｆ細胞）；ＭＤＢＫ細胞（ウシ腎細胞）；およびヒト肝細胞癌株（Ｈｅｐ Ｇ２）が含まれるが、これらに限定されない。
【０１２５】
哺乳類細胞系に加えて、本発明は、組み込みベクターによる低いまたは高い感染多重度での植物プロトプラストのトランスフェクションも考えている。例えば、本発明は、少なくとも１つの組み込みベクター、好ましくはレトロウイルスベクター、最も好ましくは偽型のレトロウイルスベクターが組み込まれた植物細胞または全植物体を考えている。プロトプラストからの再生による産生が可能な植物はすべて、本発明による過程を用いてトランスフェクトすることができる（例えば、ナス属、タバコ属、アブラナ属、トウジシャ属、エンドウ属、インゲンマメ属、ダイズ属、ヒマワリ属、ネギ属、カラスムギ属、オオムギ属、イネ属、エノコログサ属、ライムギ属、モロコシ属、コムギ属、トウモロコシ属、バショウ属、ヤシ属、マルメロ属、ナシ属、リンゴ属、ナツメヤシ属、アブラヤシ属、クサイチゴ属、ヘビイチゴ属、サクラ属、ラッカセイ属、キビ属、サトウキビ属、コーヒー属、ツバキ属、アナナス属、ブドウ属またはカンキツ属の栽培植物）。一般に、プロトプラストは従来の方法に従って作製する（例えば、米国特許第４，７４３，５４８号；第４，６７７，０６６号、第５，１４９，６４５号；および第５，５０８，１８４号；これらはすべて参照として本明細書に組み入れられる）。植物組織を適切な浸透ポテンシャル（例えば、３〜８重量％の糖ポリオール）および１つまたは複数の多糖ヒドロラーゼ（例えば、ペクチナーゼ、セルラーゼなど）を有する適切な培地中に分散させ、プロトプラストが得られるのに十分な時間をかけて細胞壁を分解させてもよい。濾過後にプロトプラストを遠心処理によって分離し、続いて以降の処理または使用のために再懸濁してもよい。培養下に保ったプロトプラストの全植物体への再生は、当技術分野で知られた方法によって行われる（例えば、Ｅｖａｎｓら、「植物細胞培養のハンドブック（Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ）」、１：１２４〜１７６、ＭａｃＭｉｌｌａｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ［１９８３］；Ｂｉｎｄｉｎｇ、植物プロトプラスト（Ｐｌａｎｔ Ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔ）、ｐ．２１〜３７、ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ、Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ［１９８５］）ならびにＰｏｔｒｙｋｕｓおよびＳｈｉｌｌｉｔｏ、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌ． １１８、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ａ．およびＨ． Ｗｅｉｓｓｂａｃｈ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｏｒｌａｎｄｏ［１９８６］を参照）。
【０１２６】
本発明は、両生類宿主細胞系および昆虫宿主細胞系の使用も考えている。適した昆虫宿主細胞系の例には、蚊細胞系（例えば、ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１６６０）が含まれるが、これらに限定されない。適した両生類宿主細胞系の例には、ヒキガエル細胞系（例えば、ＡＴＣＣ ＣＣＬ−１０２）が含まれるが、これらに限定されない。
【０１２７】
本発明の好ましい態様では、宿主細胞培養物を培養する特定の細胞に適した培地中で調製する。栄養液の例には、ハムＦ１０培地（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）、最小必須培地（ＭＥＭ、Ｓｉｇｍａ）、ＲＰＭＩ−１６４０（Ｓｉｇｍａ）およびダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ、Ｓｉｇｍａ）などの市販の培地がある。適した培地は、米国特許第４，７６７，７０４号；第４，６５７，８６６号；第４，９２７，７６２号；第５，１２２，４６９号および米国特許第４，５６０，６５５号；ならびにＰＣＴ公報・国際公開公報第９０／０３４３０号；および国際公開公報第８７／００１９５号にも記載されている（これらはそれぞれ参照として本明細書に組み入れられる）。これらのいずれかの培地に対して、必要に応じて、ホルモンおよび／または他の増殖因子（例えば、インスリン、トランスフェリンまたは上皮増殖因子）、塩類（例えば、塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウムおよびリン酸）、緩衝液（例えば、ＨＥＰＥＳ）、ヌクレオシド（例えば、アデノシンおよびチミジン）、抗生物質（例えば、ゲンタマイシン）、微量元素（すなわち、通常、最終濃度がμＭの範囲で存在する無機化合物）、脂質（例えば、リノール酸または他の脂肪酸）およびそれらの適した担体、ならびにグルコースまたは同等のエネルギー源を補充してもよい。任意の他の必要な補充成分を当業者に知られた適切な濃度で含めてもよい。哺乳類細胞培養の場合、培地の重量モル浸透圧濃度は一般に約２９０〜３３０ｍＯｓｍである。
【０１２８】
本発明は、宿主細胞の生育用および発現用の種々の培養システム（例えば、ペトリ皿、９６穴プレート、回転瓶およびバイオリアクター）の使用も考えている。例えば、宿主細胞を灌流システム中で培養することができる。灌流培養とは、高い細胞密度で維持している培養物に培地の連続流を与えることを指す。細胞は浮遊状態とし、生育のための固体支持体は必要でない。一般に、新たな栄養素を連続的に供給し、同時に有害代謝産物の除去、さらに理想的には死細胞の選択的除去を行う必要がある。濾過、捕捉（ｅｎｔｒａｐｍｅｎｔ）およびマイクロカプセル化の方法はいずれも培養環境を十分な速度で回復させるのに適している。
【０１２９】
代替的な態様では、流加培養法を用いる。好ましい流加培養法では、哺乳類宿主細胞および培地を最初に培養容器に供給し、追加用の培養栄養成分を培養中の培養物に連続的または不連続的に加え、培養終了までそのままおくか、または細胞および／もしくは細胞の定期的な収穫を行う。いくつかの態様において、流加培養は、培養物全体（細胞および培地を含む）を生育容器から取り出し、新たな培地と交換する半連続的流加培養である。流加培養は、培養過程の開始時に細胞培養のためのすべての成分（細胞およびすべての培養栄養成分を含む）を培養容器に供給するという点で、単純なバッチ培養とは区別される。流加培養はさらに、過程の最中に上清を培養容器から取り出さない限りにおいては、灌流培養とも区別しうる（灌流培養では、細胞を培養下に拘束し（例えば、濾過、カプセル封入、微粒子担体への付着など）、培地を連続的または間欠的に導入して、培養容器から取り出す）。
【０１３０】
さらに、培養物の細胞を、個々の宿主細胞および個々の産生計画に適した任意の方式または定型的手順に従って増殖させてもよい。したがって、本発明は一段階ならびに多段階の培養手順を考えている。一段階培養では、宿主細胞を培養環境に接種し、細胞培養物の単一の産生相の間に本発明の過程を用いる。多段階培養手順では、細胞を多数の工程または相で培養する。例えば、細胞をおそらくは貯蔵物から取り出し、生育および高い生存性を促すのに適した培地中に接種するという第１の工程または生育相の培養で細胞を生育させてもよい。宿主細胞培養物に対する新たな培地の添加により、細胞を適切な期間にわたって生育相に維持してもよい。
【０１３１】
流加培養または連続細胞培養の条件は、細胞培養物の生育相にある哺乳類細胞の生育が増強されるように考慮する。生育相では、生育のために最適化された条件および期間の下で細胞を生育させる。温度、ｐＨ、溶存酸素（ｄＯ２）などの培養条件は個々の宿主に用いられるものであり、当業者には明らかである。一般に、ｐＨは酸（例えば、ＣＯ２）または塩基（例えば、Ｎａ２ＣＯ３またはＮａＯＨ）を用いて約６．５〜７．５のレベルに調整する。哺乳類細胞（例えば、ＣＨＯ細胞）の培養に適した温度の範囲は約３０〜３８℃であり、適したｄＯ２は空気中飽和量の５〜９０％である。
【０１３２】
ポリペプチド産生相に続いて、関心対象のポリペプチドを、十分に確立された技法を用いて培地から回収する。関心対象のタンパク質を分泌型ポリペプチドとして培地から回収することが好ましい（例えば、関心対象のタンパク質の分泌はシグナルペプチド配列によって導かれる）が、宿主細胞の可溶化物から回収してもよい。第１の段階として、粒状細胞片を除去するために培地または可溶化物を遠心処理にかける。続いて、ポリペプチドを混入性の可溶性タンパク質およびポリペプチドから任意の適した方法を用いて精製する。適した精製法には、免疫親和性またはイオン交換カラムによる分画；エタノール沈殿；逆相ＨＰＬＣ；シリカ、またはＤＥＡＥなどの陽イオン交換樹脂によるクロマトグラフィー；クロマトフォーカシング；ＳＤＳ−ＰＡＧＥ；硫酸アンモニウム沈殿；（例えば、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−７５）を用いるゲル濾過；およびＩｇＧなどの混入物を除去するためのプロテインＡセファロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）カラムが含まれるが、これらに限定されない。フェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）などのプロテアーゼ阻害剤も精製時のタンパク質分解を抑制するには有用と思われる。さらに、関心対象のタンパク質を、関心対象のタンパク質の精製を可能にするマーカー配列とインフレーム形式で融合させることもできる。マーカー配列の非制限的な例には、ベクター、好ましくはｐＱＥ−９ベクターによって供給しうるヘキサヒスチジンタグ、およびヘマグルチニン（ＨＡ）タグが含まれる。ＨＡタグは、インフルエンザヘマグルチニンタンパク質に由来するエピトープに対応する（例えば、Ｗｉｌｓｏｎら、Ｃｅｌｌ、３７：７６７［１９８４］参照）。当業者は、関心対象のポリペプチドに適した精製法に、組換え細胞培養物における発現時のポリペプチドの特性の変化に対応するために修正を要する場合があることを理解している。
【０１３３】
Ｂ．動物におけるタンパク質の発現
本発明のいくつかの態様において、関心対象のタンパク質の発現に利用する宿主細胞は哺乳類の部分である。好ましい態様において、哺乳類はトランスジェニックウシである。トランスジェニックウシは任意の適した方法によって作出しうる（例えば、Ｃｈａｎら、ＰＮＡＳ、９５：１４０２８［１９９８］；米国特許第５，７４１，９５７号（参照として本明細書に組み入れられる）；およびＰｕｒｓｅｌら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４４：１２８１［１９８９］を参照）。特に好ましい態様において、タンパク質はウシの乳腺で発現されてウシの乳汁中に分泌される。タンパク質をウシの乳汁中に発現させる態様では、ウシ／ヒトα−ラクトアルブミンプロモーターおよびウシα−ラクトアルブミンシグナル配列を含むが、これらに限定されない、組織特異的な発現および分泌のためのタンパク質およびシグナル配列を用いる。関心対象のタンパク質は、細胞培養物からのタンパク質の回収に関して上に述べたものを含むが、これらに限定されない任意の適した方法を用いて、ウシ乳汁から回収しうる。
【０１３４】
当業者は、本発明のベクターを、マウス、ヤギ、ブタ、鳥類およびウサギを含むがこれらに限定されない他のトランスジェニック動物の作出にも用いうると思われることを認識している（例えば、米国特許第５，５２３，２２６号；第５，４５３，４５７号；第４，８７３，１９１号；第４，７３６，８６６号を参照；これらはそれぞれ参照として本明細書に組み入れられる）。
【０１３５】
Ｃ．抗体の発現
本発明のいくつかの態様では、単一のベクターを、多サブユニットタンパク質の個々のサブユニットを含む、２種またはそれ以上のタンパク質の発現のために用いる。いくつかの態様では、ＩＲＥＳ配列によって隔てられた免疫グロブリンの２つまたはそれ以上の鎖（例えば、１つの重鎖（γ、α、μ、δまたはε）および１つの軽鎖（κまたはλ）を、単一の転写単位として同一のベクターから発現させる。本発明は何らかの特定のベクターには限定されない。実際には、プラスミド、コスミド、細菌人工染色体、酵母人工染色体、アデノ随伴ウイルスベクターおよびアデノウイルスベクターを含むが、これらに限定されない種々のベクターの使用を考えている。多数の適したベクターが当技術分野で知られており、販売されている。このようなベクターには、以下のベクターが含まれるが、これらに限定されない：１）細菌用―ｐＱＥ７０、ｐＱＥ６０、ｐＱＥ−９（Ｑｉａｇｅｎ）、ｐＢＳ、ｐＤ１０、ファージスクリプト（ｐｈａｇｅｓｃｒｉｐｔ）、ｐｓｉＸ１７４、ｐブルースクリプト（ｐｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ）ＳＫ、ｐＢＳＫＳ、ｐＮＨ８Ａ、ｐＮＨ１６ａ、ｐＮＨ１８Ａ、ｐＮＨ４６Ａ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）；ｐｔｒｃ９９ａ、ｐＫＫ２２３−３、ｐＫＫ２３３−３、ｐＤＲ５４０、ｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）；および２）真核生物用―ｐＷＬＮＥＯ、ｐＳＶ２ＣＡＴ、ｐＯＧ４４、ＰＸＴ１、ｐＳＧ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧ、ｐＳＶＬ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）。宿主内で複製および生存が可能である限り、任意の他のプラスミドまたはベクターも用いうる。本発明のいくつかの好ましい態様において、哺乳類発現ベクターは複製起点、適したプロモーターおよびエンハンサー、ならびに任意の必要なリボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライスドナー部位およびアクセプター部位、転写終結配列および５’隣接非転写配列を含む。他の態様において、ＤＮＡ配列はＳＶ４０スプライス部位に由来し、必要な非転写性遺伝因子を得るためにポリアデニル化部位を用いてもよい。
【０１３６】
本発明のある種の態様において、発現ベクター中のＤＮＡ配列は、ＲＮＡ合成を指令するための適切な発現制御配列（プロモーター）と機能的に結合している。本発明において有用なプロモーターには、ＬＴＲまたはＳＶ４０プロモーター、大腸菌ｌａｃまたはｔｒｐプロモーター、ファージλＰＬおよびＰＲプロモーター、Ｔ３およびＴ７プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）最初期プロモーター、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）チミジンキナーゼプロモーター、マウスメタロチオネイン−Ｉプロモーター、ならびに原核もしくは真核生物細胞またはそれらのウイルスにおける遺伝子の発現を制御することが知られた他のプロモーターが含まれるが、これらに限定されない。本発明の他の態様において、組換え発現ベクターは、複製起点、および宿主細胞の形質転換を可能にする選択マーカー（例えば、真核生物細胞培養の場合にはジヒドロ葉酸レダクターゼまたはネオマイシン耐性、大腸菌の場合にはテトラサイクリン耐性またはアンピシリン耐性）が含まれる。
【０１３７】
本発明のいくつかの態様では、エンハンサー配列をベクター中に挿入することにより、高等真核生物における、本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡの転写を増強させる。エンハンサーはＤＮＡのシス作用性因子であり、通常は約１０〜３００ｂｐで、プロモーターに作用してその転写を増強させる。本発明において有用なエンハンサーには、複製起点の後期側ｂｐ １００〜２７０にあるＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側にあるポリオーマエンハンサー、およびアデノウイルスエンハンサーが含まれるが、これらに限定されない。
【０１３８】
他の態様において、発現ベクターは、翻訳開始のためのリボソーム結合部位および転写ターミネーターも含む。本発明のさらに他の態様において、ベクターは発現増幅のための適切な配列も含んでよい。
【０１３９】
いくつかの特に好ましい態様では、免疫グロブリンを発現させるためにレトロウイルスベクターを用いる。いくつかの態様において、免疫グロブリンの発現用のレトロウイルスベクターは調節因子を含む。本発明のいくつかの好ましい態様では、ＩＲＥＳ配列によって隔てられた２つの免疫グロブリン鎖を同一のレトロウイルスベクター構築物にて発現させる。いくつかの特に好ましい態様では、２種類の鎖はＩＲＥＳ／α−ＬＡシグナル配列によって隔てられている。他の態様において、ベクターはさらにＲＮＡ移行因子を含む。さらなる態様において、、ＲＮＡ移行因子はＷＰＲＥである。さらに他の態様において、ＰＰＥ因子は少なくとも１つのメルツ配列である。いくつかの好ましい態様では、開始シグナルを除去するためにＰＰＥ因子を変異させる。他の好ましい態様では、２つのＰＰＥ因子をリンカーによって隔てられた頭−尾配列として配置する。
【０１４０】
好ましい態様において、本発明のベクターによる免疫グロブリンの発現はプロモーターによって制御される。いくつかの態様では、発現はＣＭＶプロモーターによって制御され、また別の態様では、発現はＭＭＴＶプロモーターによって制御される。いくつかの好ましい態様において、発現はハイブリッド型ウシ／ヒトα−ＬＡプロモーターによって制御される。
【０１４１】
本発明のいくつかの態様において、重鎖および軽鎖は本発明のベクターによって約０．７：１．３の比で発現される。好ましい態様において、重鎖および軽鎖は約０．８：１．２の比で発現される。特に好ましい態様において、重鎖および軽鎖は約０．９：１．１の比として発現される。さらにより好ましい態様において、重鎖および軽鎖は約１：１の比として発現される。特に好ましい態様において、重鎖および軽鎖の大半（例えば、９０％を上回る、好ましくは９５％を上回る、最も好ましくは約９９％を上回る）は１：１の比で正しく会合し、機能的な（例えば、抗原と結合しうる）抗体を形成する。
【０１４２】
本発明の例示的な実例では、上記のベクターおよび因子を含む宿主細胞内で免疫グロブリンを発現させる。いくつかの例示的な実例では（例えば、実施例６、８および１２）、実施例１に記載したベクターを用いて、種々の細胞系でさまざまな免疫グロブリンを発現させている。概ね、この発現によって機能的な四量体免疫グロブリンの形成が得られた。
【０１４３】
Ｄ．他のタンパク質の発現
本発明のベクターは、Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）および他の膜貫通タンパク質を発現させるためにも有用である。これらのタンパク質を発現させると、それらは膜の内部に本来のコンフォメーションで正しく挿入されると考えている。このため、当技術分野で知られた方法により、ＧＰＣＲおよび他の膜貫通タンパク質を膜画分の部分として精製しうる、または膜から精製しうると思われる。
【０１４４】
さらに、本発明のベクターは、アッセイが存在しない、またはアッセイが困難な、関心対象のタンパク質を共発現させる目的にも有用である。このシステムでは、関心対象のタンパク質およびシグナルタンパク質を多シストロン性配列として配置する。ＩＲＥＳ配列がシグナルタンパク質と関心対象のタンパク質（例えば、ＧＰＣＲ）を隔て、シグナルタンパク質および関心対象のタンパク質をコードする遺伝子が単一の転写単位として発現されることが好ましい。本発明は何らかの特定のシグナルタンパク質には限定されない。実際いは、容易なアッセイが存在するさまざまなシグナルタンパク質の使用を考えている。これらのシグナルタンパク質には、緑色蛍光タンパク質、ルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼおよび抗体重鎖または軽鎖が含まれるが、これらに限定されない。シグナルタンパク質および関心対象のタンパク質を多シストロン性配列から発現させる場合には、シグナルタンパク質の存在によって関心対象のタンパク質の存在が示されると考えられる。したがって、いくつかの態様において、本発明は、関心対象のタンパク質の発現を間接的に検出するための方法であって、ＩＲＥＳによって機能的に結合したシグナルタンパク質および関心対象のタンパク質を含む多シストロン性配列をコードするベクターによるトランスフェクションを行った宿主細胞を提供すること、ならびにシグナルタンパク質および関心対象のタンパク質が産生される条件下で宿主細胞を培養することを含み、シグナルタンパク質の存在によって関心対象のタンパク質の存在が示されるような方法を提供する。
【０１４５】
実施例
以下の実施例は、本発明のいくつかの好ましい態様および面を例示するためのものであり、その範囲を制限するものとみなされるべきではない。
【０１４６】
以下の実験の開示においては、以下の略号を用いる：Ｍ（モル濃度）；ｍＭ（ミリモル濃度）；μＭ（マイクロモル濃度）；ｎＭ（ナノモル濃度）；ｍｏｌ（モル）；ｍｍｏｌ（ミリモル）；μｍｏｌ（マイクロモル）；ｎｍｏｌ（ナノモル）；ｇｍ（グラム）；ｍｇ（ミリグラム）；μｇ（マイクログラム）；ｐｇ（ピコグラム）；Ｌ（リットル）；ｍｌ（ミリリットル）；μｌ（マイクロリットル）；ｃｍ（センチメートル）；ｍｍ（ミリメートル）；μｍ（マイクロメートル）；ｎｍ（ナノメートル）；℃（摂氏温度）；ＡＭＰ（アデノシン５’−一リン酸）；ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）；ｃＤＮＡ（コピーＤＮＡまたは相補的ＤＮＡ）；ＣＳ（子ウシ血清）；ＤＮＡ（デオキシリボ核酸）；ｓｓＤＮＡ（一本鎖ＤＮＡ）；ｄｓＤＮＡ（二本鎖ＤＮＡ）；ｄＮＴＰ（デオキシリボヌクレオチド三リン酸）；ＬＨ（黄体形成ホルモン）；ＮＩＨ（米国国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ）、Ｂｅｓｔｈｅｓｄａ、ＭＤ）；ＲＮＡ（リボ核酸）；ＰＢＳ（リン酸緩衝食塩水）；ｇ（重力）；ＯＤ（光学密度）；ＨＥＰＥＳ（Ｎ−［２−αヒドロキシエチル］ピペラジン−Ｎ−［２−エタンスルホン酸］）；ＨＢＳ（ＨＥＰＥＳ緩衝食塩水）；ＰＢＳ（リン酸緩衝食塩水）；ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）；Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（トリス［ヒドロキシメチル］アミノメタン−塩酸）；クレノー（Ｋｌｅｎｏｗ）（ＤＮＡポリメラーゼＩラージ（クレノー）フラグメント）；ｒｐｍ（毎分回転数）；ＥＧＴＡ（エチレングリコール−ビス（β−アミノエチルエーテル）Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸）；ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）；ｂｌａ（β−ラクタマーゼまたはアンピシリン耐性遺伝子）；ＯＲＩ（プラスミド複製起点）；ｌａｄ（ｌａｃ抑制因子）；Ｘ−ｇａｌ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドイル−Ｄ−ガラクトシド）；ＡＴＣＣ（米国菌培養収集所（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）；ギブコ社（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ）（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ、Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）；パーキンエルマー社（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ、Ｎｏｒｗａｌｋ、ＣＴ）；およびシグマ社（Ｓｉｇｍａ）（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）。
【０１４７】
実施例１
ベクターの構築
下記の実施例には、以下の実験に用いるベクターの構築について述べる。
【０１４８】
Ａ．ＣＭＶ ＭＮ１４
ＣＭＶ ＭＮ１４ベクター（配列番号：４；ＭＮ１４抗体は米国特許第５，８７４，５４０号に記載されている。これは参照として本明細書に組み入れられる）は、５’側から３’側の順に以下の因子を含む：ＣＭＶプロモーター；ＭＮ１４重鎖シグナルペプチド、ＭＮ１４抗体重鎖；脳心筋炎ウイルス由来のＩＲＥＳ；ウシα−ラクトアルブミンシグナルペプチド；ＭＮ１４抗体軽鎖；および３’ ＭｏＭｕＬＶ ＬＴＲ。ＣＭＶ ＭＮ１４ベクターは、配列番号：４に記載された配列に加えて、５’ ＭｏＭｕＬＶ ＬＴＲ、ＭｏＭｕＬＶ伸長型ウイルスパッケージングシグナルおよびネオマイシンリン酸転移酵素遺伝子をさらに含む（これらの追加的な因子は配列番号：７に示されている；本明細書に記載の構築物のそれぞれにおいて５’ ＬＴＲはモロニーマウス肉腫ウイルスに由来するが、これは組み込まれるとＭｏＭｕＬＶ ５’ ＬＴＲに変換される）。
【０１４９】
この構築物は、ネオマイシンリン酸転移酵素遺伝子の産生を制御するために５’ ＭｏＭｕＬＶ ＬＴＲを用いる。ＭＮ１４抗体の発現はＣＭＶプロモーターによって制御される。ＭＮ１４重鎖遺伝子および軽鎖遺伝子はＩＲＥＳ配列によって結合している。ＣＭＶプロモーターは、ＩＲＥＳによって結合した重鎖遺伝子および軽鎖遺伝子を含むｍＲＮＡの産生を駆動する。リボソームはｍＲＮＡのＣＡＰ部位およびＩＲＥＳ配列と結合する。これにより、重鎖および軽鎖タンパク質の両方が単一のｍＲＮＡから産生される。ＬＴＲならびにＣＭＶプロモーターからのｍＲＮＡ発現は３’ ＬＴＲで終結し、そこでポリアデニル化される。構築物は以下のセクションＢに述べるものと同様の方法によってクローニングした。
【０１５０】
ＩＲＥＳ配列（配列番号：３）は、プラスミドｐＬＸＩＮ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）由来のＩＲＥＳとウシα−ラクトアルブミンシグナルペプチドとの融合物を含む。ＩＲＥＳからの翻訳開始が最も効率化されるように、シグナルペプチドの最初のＡＴＧをＩＲＥＳと結合した。シグナルペプチドの３’末端は、関心対象の任意のタンパク質が容易に結合して、シグナルペプチドとの融合タンパク質が作製されるようにマルチクローニングサイトを備えている。このＩＲＥＳ配列は翻訳エンハンサーとして作用することに加えて、単一のｍＲＮＡから２つのタンパク質が産生されるようにする第２の翻訳開始部位を形成する。
【０１５１】
ＩＲＥＳ−ウシα−ラクトアルブミンシグナルペプチドは以下の通りに構築した。ＥＣＭＶ ＩＲＥＳを含むプラスミドｐＬＸＩＮ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、ＣＡ）の部分を、以下のプライマーを用いてＰＣＲ増幅した。
2004524807.tif 000003
【０１５２】
プライマー２は、ウシα−ラクトアルブミンシグナルペプチドコード領域の開始部に対応する尾部をＩＲＥＳ配列と結合させる。さらに、ＩＲＥＳ配列からの翻訳を効率化するために、ラクトアルブミンシグナルペプチドの第２のトリプレットコドンをＡＴＧからＧＣＣに変異させた。この変異により、タンパク質配列にメチオニンからアラニンへの変化が生じた。この変異を導入した理由は、ＩＲＥＳがタンパク質鎖の第２のアミノ酸としてアラニンを好むためである。この結果得られたＩＲＥＳ ＰＣＲ産物は断片の５’末端（上記のプライマー１のすぐ下流）にＥｃｏＲＩ部位を含む。
【０１５３】
次に、α−ラクトアルブミンシグナルペプチドを含む配列を、以下のプライマーを用いてα−ＬＡシグナルペプチドベクター構築物からＰＣＲ増幅した。
2004524807.tif 000004
【０１５４】
プライマー３は、ＩＲＥＳ配列の３’末端に対応する尾部をα−ラクトアルブミンシグナルペプチドコード領域と結合させる。上記の通り、ＩＲＥＳ配列からの翻訳が効率化されるように、ウシα−ラクトアルブミンシグナルペプチドの第２のトリプレットコドンを変異させた。この結果得られたシグナルペプチドのＰＣＲ断片は、３’末端にＮａｅＩ、ＮｃｏＩ、ＥｃｏＲＶ、ＸｂａＩ、ＢｇｌＩＩおよびＸｈｏＩ部位を含む。
【０１５５】
ＩＲＥＳおよびシグナルペプチドを上記のプライマーを用いて個別に増幅した後に、２つの反応産物を混合し、プライマー１およびプライマー４を用いてＰＣＲを行った。この反応の結果として得られた産物は、ＩＲＥＳが完全長α−ラクトアルブミンシグナルペプチドと結合したものを含むスプライス断片である。シグナルペプチドの開始部をコードするＡＴＧを、ベクターｐＬＸＩＮ中に存在するネオマイシンリン酸転移酵素遺伝子をコードするＡＴＧと同じ位置に置かれている。この断片は、５’末端にＥｃｏＲＩ部位、３’末端にＮａｅＩ、ＮｃｏＩ、ＥｃｏＲＶ、ＸｂａＩ、ＢｇｌＩＩおよびＸｈｏｌ部位も含む。
【０１５６】
このスプライシングを受けたＩＲＥＳ／α−ラクトアルブミンシグナルペプチドＰＣＲ断片をＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩで消化した。α−ＬＡシグナルペプチドベクター構築物も同じくＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩで消化した。これらの２つの断片を連結してｐＩＲＥＳ構築物を得た。
【０１５７】
ｐＩＲＥＳベクターのＩＲＥＳ／α−ラクトアルブミンシグナルペプチド部分の配列決定を行ったところ、ＩＲＥＳの５’末端を変異を含んでいないことが明らかになった。これらの変異はＣの長い連鎖として存在し、単離したすべてのクローンに認められた。
【０１５８】
この問題点を修復するために、ｐＬＸＩＮ ＤＮＡをＥｃｏＲＩおよびＢｓｍＦＩで消化した。ＩＲＥＳ配列の一部に対応する５００ｂｐのバンドが単離された。変異型ＩＲＥＳ／α−ラクトアルブミンシグナルペプチド構築物もＥｃｏＲＩおよびＢｓｍＦＩで消化し、変異型ＩＲＥＳ断片を取り出した。続いて、変異型ＩＲＥＳ／α−ラクトアルブミンシグナルペプチド構築物のＩＲＥＳ断片をｐＬＸＩＮからのＩＲＥＳ断片によって置換した。この結果得られたプラスミドのＩＲＥＳ／α−ＬＡシグナルペプチド部分をＤＮＡ配列決定によって確認した。
【０１５９】
この結果得られた構築物の配列には、クロンテック社（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）から入手した予想されるｐＬＸＩＮ配列とは多くの違いがあることが判明した。本発明者らは、クロンテック社から購入したｐＬＸＩＮのＩＲＥＳ部分の配列決定も配列を確認するために行った。予想された配列との違いは、本発明者らがクロンテック社から入手したｐＬＸＩＮプラスミドにも存在すると思われた。配列には以下の４つの違いが同定された：
ｂｐ ３４７ Ｔは、ｐＬＸＩＮ配列ではＧであった。
ｂｐ ７８６〜７８８ ＡＣＧは、ＬＸＩＮ配列ではＧＣであった。
【０１６０】
Ｂ．ＣＭＶ ＬＬ２
ＣＭＶ ＬＬ２（配列番号：５；ＬＬ２抗体は米国特許第６，１８７，２８７号に記載されている。これは参照として本明細書に組み入れられる）構築物は、５’側から３’側の順に以下の因子を含む：５’ ＣＭＶプロモーター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、ＬＬ２重鎖シグナルペプチド、ＬＬ２抗体重鎖；脳心筋炎ウイルス由来のＩＲＥＳ；ウシα−ＬＡシグナルペプチド；ＬＬ２抗体軽鎖；および３’ ＭｏＭｕＬＶ ＬＴＲ。ＣＭＶ ＬＬ２ベクターは、配列番号：５に記載された配列に加えて、５’ ＭｏＭｕＬＶ ＬＴＲ、ＭｏＭｕＬＶ伸長型ウイルスパッケージングシグナルおよびネオマイシンリン酸転移酵素遺伝子をさらに含む（これらの追加的な因子は配列番号：７に示されている）。
【０１６１】
この構築物は、ネオマイシンリン酸転移酵素遺伝子の産生を制御するために５’ ＭｏＭｕＬＶ ＬＴＲを用いる。ＬＬ２抗体の発現はＣＭＶプロモーター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）によって制御される。ＬＬ２重鎖遺伝子および軽鎖遺伝子はＩＲＥＳ配列によって結合している。ＣＭＶプロモーターは、ＩＲＥＳによって結合した重鎖遺伝子および軽鎖遺伝子を含むｍＲＮＡの産生を駆動する。リボソームはｍＲＮＡのＣＡＰ部位およびＩＲＥＳ配列と結合する。これにより、重鎖および軽鎖タンパク質の両方が単一のｍＲＮＡから産生される。ＬＴＲならびにＣＭＶプロモーターからのｍＲＮＡ発現は３’ ＬＴＲで終結し、そこでポリアデニル化される。
【０１６２】
ＩＲＥＳ配列（配列番号：３）は、プラスミドｐＬＸＩＮ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）由来のＩＲＥＳとウシα−ラクトアルブミンシグナルペプチドとの融合物を含む。ＩＲＥＳからの翻訳開始が最も効率化されるように、シグナルペプチドの最初のＡＴＧをＩＲＥＳと結合した。シグナルペプチドの３’末端は、関心対象の任意のタンパク質が容易に結合して、シグナルペプチドとの融合タンパク質が作製されるようにマルチクローニングサイトを備えている。このＩＲＥＳ配列は翻訳エンハンサーとして作用することに加えて、単一のｍＲＮＡから２つのタンパク質が産生されるようにする第２の翻訳開始部位を形成する。
【０１６３】
ＬＬ２軽鎖遺伝子を以下の通りにＩＲＥＳα−ラクトアルブミンシグナルペプチドと結合させた。ＬＬ２軽鎖を以下のプライマーを用いてベクターｐＣＲＬＬ２からＰＣＲ増幅した。
2004524807.tif 000005
【０１６４】
これらのプライマーは、成熟ＬＬ２軽鎖のコード領域の開始部にＨｉｎｃＩＩ部位を付加する。ＰＣＲ産物をＨｉｎｃＩＩで消化すると、成熟ＬＬ２をコードする最初のＧＡＣから始まる平滑末端断片が５’末端に得られる。プライマー２は、遺伝子の３’末端の停止コドンの直後にＢｇｌＩＩ部位を付加する。この結果得られた ＰＣＲ産物をＨｉｎｃＩＩおよびＢｇｌＩＩで消化し、ＮａｅＩおよびＢｇｌＩＩで消化したＩＲＥＳ−シグナルペプチドプラスミド中に直接クローニングした。
【０１６５】
続いて、ＬＬ２重鎖遺伝子のコザック配列を改変した。ベクターｐＣＲＭＮ１４ＨＣをＸｈｏＩおよびＡｖｒＩＩで消化し、約４００ｂｐの断片を取り出した。続いてＰＣＲを用いて、ＸｈｏＩ−ＡｖｒＩＩ消化によって取り出したＬＬ２重鎖構築物の同じ部分を増幅した。この増幅によって遺伝子の５’末端の変異も生じ、より優れたコザック配列がクローンに付加された。典型的なＩｇＧコザック配列に類似させるためにコザック配列を改変した。ＰＣＲプライマーを以下に示す。
2004524807.tif 000006
【０１６６】
このＰＣＲ産物をＸｈｏＩおよびＡｖｒＩＩで消化し、以前に消化しておいたプラスミド骨格中に挿入し直した。
【０１６７】
続いて、この「優れた」コザック配列を軽鎖遺伝子に付加した。「優れた」コザックＬＬ２重鎖遺伝子構築物をＥｃｏＲＩで消化し、重鎖遺伝子を含む断片を単離した。ＩＲＥＳ−αラクトアルブミンシグナルペプチドＬＬ２軽鎖遺伝子構築物も同じくＥｃｏＲＩで消化した。続いて重鎖遺伝子をＩＲＥＳ軽鎖構築物のＥｃｏＲＩ部位にクローニングした。これにより、重鎖遺伝子がＩＲＥＳ配列の５’端に配置された。
【０１６８】
次に、ＬＮＣＸレトロウイルス骨格のプラスミド中にマルチクローニングサイトを付加した。ＬＮＣＸプラスミドをＨｉｎｄＩＩＩおよびＣｌａＩで消化した。２つのオリゴヌクレオチドプライマーを作製して互いにアニーリングさせ、二本鎖ＤＮＡマルチクローニングサイトを作製した。以下のプライマーを互いにアニーリングさせた。
2004524807.tif 000007
【０１６９】
アニーリングの後に、マルチクローニングサイトをＬＮＣＸ中に連結し、ＬＮＣ−ＭＣＳを作製した。
【０１７０】
次に、二重鎖遺伝子断片をレトロウイルス骨格の遺伝子構築物中に連結した。上記の通りに作製した二重鎖遺伝子構築物をＳａｌＩおよびＢｇｌＩＩで消化し、二重鎖を含む断片を単離した。レトロウイルス発現プラスミドＬＮＣ−ＭＣＳをＸｈｏＩおよびＢｇｌＩＩで消化した。続いて二重鎖断片をＬＮＣ−ＭＣＳレトロウイルス発現骨格中にクローニングした。
【０１７１】
次に構築物におけるＲＮＡスプライシングの問題を修正した。構築物をＮｓｉＩで消化した。この結果得られた断片をＥｃｏＲＩで部分消化した。この部分消化によって得られた約９３００塩基対のサイズの断片をゲル精製した。ＬＬ２重鎖遺伝子の３’端のスプライスドナー部位を変異させるためにリンカーを作製した。さらに、２つのオリゴヌクレオチドプライマーのアニーリングによって二本鎖ＤＮＡリンカーを形成させることによってリンカーを再び作製した。リンカーの作製に用いた２つのプライマーを以下に示す。
2004524807.tif 000008
【０１７２】
アニーリングの後に、部分消化の際に除去された当初のＮｓｉＩ／ＥｃｏＲＩ断片の部分をこのリンカーで置換した。
【０１７３】
Ｃ．ＭＭＴＶ ＭＮ１４
ＭＭＴＶ ＭＮ１４（配列番号：６）構築物は、５’側から３’側の順に以下の因子を含む：５’ ＭＭＴＶプロモーター；二重変異型ＰＰＥ配列；ＭＮ１４抗体重鎖；脳心筋炎ウイルス由来のＩＲＥＳ；ウシαＬＡシグナルペプチド；ＭＮ１４抗体軽鎖；ＷＰＲＥ配列；および３’ ＭｏＭｕＬＶ ＬＴＲ。ＭＭＴＶ ＭＮ１４ベクターは、配列番号：６に記載された配列に加えて、ＭｏＭｕＬＶ ＬＴＲ、ＭｏＭｕＬＶ伸長型ウイルスパッケージングシグナル；ＭＭＴＶプロモーターの５’側に位置するネオマイシンリン酸転移酵素遺伝子をさらに含む（これらの追加的な因子は配列番号：７に示されている）。
【０１７４】
この構築物は、ネオマイシンリン酸転移酵素遺伝子の産生を制御するために５’ ＭｏＭｕＬＶ ＬＴＲを用いる。ＭＮ１４抗体の発現はＭＭＴＶプロモーターによって制御される。ＭＮ１４重鎖遺伝子および軽鎖遺伝子はＩＲＥＳ／ウシα−ＬＡシグナルペプチド配列（配列番号：３）によって結合している。ＭＭＴＶプロモーターは、ＩＲＥＳ／ウシα−ＬＡシグナルペプチド配列によって結合した重鎖遺伝子および軽鎖遺伝子を含むｍＲＮＡの産生を駆動する。リボソームはｍＲＮＡのＣＡＰ部位およびＩＲＥＳ／ウシα−ＬＡシグナルペプチド配列と結合する。これにより、重鎖および軽鎖タンパク質の両方が単一のｍＲＮＡから産生されるようになる。さらに、ｍＲＮＡの核から細胞質への輸送を補助し、ｍＲＮＡのポリアデニル化を補助する２つの遺伝因子がｍＲＮＡには含まれる。ＰＰＥ配列はＲＮＡ ＣＡＰ部位とＭＮ１４タンパク質コード領域の開始部との間に含まれ、ＷＰＲＥはＭＮ１４タンパク質コード部位の終末部とポリアデニル化部位との間に含まれる。ＬＴＲならびにＣＭＶプロモーターからのｍＲＮＡ発現は３’ ＬＴＲで終結し、そこでポリアデニル化される。
【０１７５】
望ましくない翻訳開始が起こるのを防ぐために、ＰＰＥ因子（配列番号：２）内部のＡＴＧ配列を変異させた。この変異配列の２つのコピーを頭−尾配列として用いた。この配列をプロモーターのすぐ下流で、コザック配列およびシグナルペプチド−コード領域の上流に配置した。ＷＰＲＥはウッドチャック肝炎ウイルスから単離したものであり、同じくｍＲＮＡの移行を補助するとともに、ｍＲＮＡに安定性をもたらす。この配列がＲＮＡの３’非翻訳領域に含まれると、このＲＮＡからのタンパク質発現レベルは最大１０倍に上昇する。
【０１７６】
Ｄ．α−ＬＡ ＭＮ１４
α−ＬＡ ＭＮ１４（配列番号：７）構築物は、５’側から３’側の順に以下の因子を含む：５’ ＭｏＭｕＬＶ ＬＴＲ、ＭｏＭｕＬＶ伸長型ウイルスパッケージングシグナル、ネオマイシンリン酸転移酵素遺伝子、ウシ／ヒトα−ラクトアルブミンハイブリッド型プロモーター、二重変異型ＰＰＥ因子、ＭＮ１４重鎖シグナルペプチド、ＭＮ１４抗体重鎖、脳心筋炎ウイルス由来のＩＲＥＳ／ウシαＬＡシグナルペプチド、ＭＮ１４抗体軽鎖、ＷＰＲＥ配列；および３’ ＭｏＭｕＬＶ ＬＴＲ。
【０１７７】
この構築物は、ネオマイシンリン酸転移酵素遺伝子の産生を制御するために５’ ＭｏＭｕＬＶ ＬＴＲを用いる。ＭＮ１４抗体の発現はハイブリッド型α−ＬＡプロモーター（配列番号：１）によって制御される。ＭＮ１４重鎖遺伝子および軽鎖遺伝子はＩＲＥＳ配列／ハイブリッド型α−ＬＡプロモーター（配列番号：３）によって結合している。α−ＬＡプロモーターは、ＩＲＥＳによって結合した重鎖遺伝子および軽鎖遺伝子を含むｍＲＮＡの産生を駆動する。リボソームはｍＲＮＡのＣＡＰ部位およびＩＲＥＳ配列と結合する。これにより、重鎖および軽鎖タンパク質の両方が単一のｍＲＮＡから産生される。
【０１７８】
さらに、ｍＲＮＡの核から細胞質への輸送を補助し、ｍＲＮＡのポリアデニル化を補助する２つの遺伝因子がｍＲＮＡには含まれる。この変異型ＰＰＥ配列（配列番号：２）はＲＮＡ ＣＡＰ部位とＭＮ１４タンパク質コード領域の開始部との間に含まれる。望ましくない翻訳開始が起こるのを防ぐために、ＰＰＥ因子（配列番号：２）内部のＡＴＧ配列を変異させた。この変異配列の２つのコピーを頭−尾配列として用いた。この配列をプロモーターのすぐ下流で、コザック配列およびシグナルペプチド−コード領域の上流に配置した。ＷＰＲＥはウッドチャック肝炎ウイルスから単離したものであり、同じくｍＲＮＡの移行を補助するとともに、ｍＲＮＡに安定性をもたらす。この配列がＲＮＡの３’非翻訳領域に含まれると、このＲＮＡからのタンパク質発現レベルは最大１０倍に上昇する。ＷＰＲＥはＭＮ１４タンパク質コード部位の終末部とポリアデニル化部位との間に含まれる。ＬＴＲならびにウシ／ヒトα−ラクトアルブミンハイブリッド型プロモーターからのｍＲＮＡ発現は３’ ＬＴＲで終結し、そこでポリアデニル化される。
【０１７９】
ウシ／ヒトα−ラクトアルブミンハイブリッド型プロモーター（配列番号：１）は、ヒトおよびウシのα−ラクトアルブミンプロモーター配列に由来するモジュール型プロモーター／エンハンサー因子である。プロモーターのヒト部分は、転写開始点（ｔｓｐ）を基準として＋１５からｔｓｐを基準として−６００までの範囲である。続いてウシ部分をヒト部分の末端に結合するが、これはｔｓｐを基準として−５５０〜−２０００に対応する。このハイブリッドは、ウシプロモーターに存在するポリアデニル化シグナルを除去し、レトロウイルスＲＮＡの産生を妨げる目的で開発した。また、ヒト遺伝子には存在するがウシには存在しない遺伝制御因子を含めることも目的として開発した。
【０１８０】
ウシ／ヒトα−ラクトアルブミンプロモーターの構築のために、ヒトゲノムＤＮＡを単離して精製した。ヒトα−ラクトアルブミンプロモーターの部分を以下の２つのプライマーを用いてＰＣＲ増幅した。
2004524807.tif 000009
【０１８１】
この２つのプライマーにより、ＰＣＲ断片の５’末端にＮｄｅＩ部位が作製され、ＰＣＲ断片の３’末端にＥｃｏＲＩ部位が作製された。
【０１８２】
上記のプライマーを用いて作製したヒトＰＣＲ断片を制限酵素ＮｄｅＩおよびＥｃｏＲＩで二重消化した。プラスミドｐＫＢａＰ−１も同じくＮｄｅＩおよびＥｃｏＲＩで二重消化した。プラスミドｐＫＢａＩＰ−１は、ウシα−ラクトアルブミン５’隣接領域にマルチクローニングサイトが結合したものを含む。このプラスミドにより、種々の遺伝子をウシα−ラクトアルブミンプロモーターと結合させることが可能になる。
【０１８３】
次に、二重消化の際にｐＫＢａＰ−１プラスミドから除去されたプロモーターのウシ断片の部分をヒト断片で置換した。この結果得られたプラスミドはウシおよびヒトのα−ラクトアルブミンプロモーター／調節領域のハイブリッドであることがＤＮＡ配列決定によって確認された。
【０１８４】
ＭＮ１４軽鎖遺伝子のＩＲＥＳα−ラクトアルブミンシグナルペプチドとの結合は以下の通りに行った。ＭＮ１４軽鎖を、以下のプライマーを用いてベクターｐＣＲＭＮ１４ＬＣからＰＣＲ増幅した。
2004524807.tif 000010
【０１８５】
これらのプライマーは、成熟ＭＮ１４軽鎖のコード領域の開始部にＨｉｎｃＩＩ部位を付加する。ＰＣＲ産物をＨｉｎｃＩＩで消化すると、成熟ＭＮ１４をコードする最初のＧＡＣから始まる平滑末端断片が５’末端に得られる。プライマー２は遺伝子の３’末端の停止コドンの直後にＢｇｌＩＩ部位を付加する。この結果得られた ＰＣＲ産物をＨｉｎｃＩＩおよびＢｇｌＩＩで消化し、ＮａｅＩおよびＢｇｌＩＩで消化したＩＲＥＳ−シグナルペプチドプラスミド中に直接クローニングした。
【０１８６】
次に、ベクターｐＣＲＭＮ１４ＨＣをＸｈｏＩおよびＮｒｕＩで消化し、約５００ｂｐの断片を取り出した。続いてＰＣＲを用いて、ＸｈｏＩ−ＮｒｕＩ消化によって取り出したＭＮ１４重鎖構築物の同じ部分を増幅した。この増幅によって遺伝子の５’末端の変異も生じ、より優れたコザック配列がクローンに付加された。典型的なＩｇＧコザック配列に類似させるためにこのコザック配列を改変した。ＰＣＲプライマーを以下に示す。
2004524807.tif 000011
【０１８７】
このＰＣＲ産物をＸｈｏＩおよびＮｒｕＩで消化し、以前に消化しておいたプラスミド骨格中に挿入しなおした。
【０１８８】
次に、この「優れた」コザックＭＮ１４重鎖遺伝子構築物をＥｃｏＲＩで消化し、重鎖遺伝子を含む断片を単離した。ＩＲＥＳ−αラクトアルブミンシグナルペプチドＭＮ１４軽鎖遺伝子構築物も同じくＥｃｏＲＩで消化した。続いて重鎖遺伝子をＩＲＥＳ軽鎖構築物のＥｃｏＲＩ部位にクローニングした。これにより、重鎖遺伝子がＩＲＥＳ配列の５’端に配置された。
【０１８９】
続いて、ＬＮＣＸレトロウイルス骨格のプラスミド中にマルチクローニングサイトを付加した。ＬＮＣＸプラスミドをＨｉｎｄＩＩＩおよびＣｌａＩで消化した。２つのオリゴヌクレオチドプライマーを作製して互いにアニーリングさせ、二本鎖ＤＮＡマルチクローニングサイトを作製した。以下のプライマーを互いにアニーリングさせた。
2004524807.tif 000012
アニーリングの後に、マルチクローニングサイトをＬＮＣＸ中に連結し、ＬＮＣ−ＭＣＳを作製した。
【０１９０】
続いて、二重鎖遺伝子断片をレトロウイルス骨格の遺伝子構築物中に連結した。段階３において作製した二重鎖遺伝子構築物をＳａｌＩおよびＢｇｌＩＩで消化し、二重鎖を含む断片を単離した。レトロウイルス発現プラスミドＬＮＣ−ＭＣＳをＸｈｏＩおよびＢｇｌＩＩで消化した。続いて二重鎖断片をＬＮＣ−ＭＣＳレトロウイルス発現骨格中にクローニングした。
【０１９１】
次に、構築物におけるＲＮＡスプライシングの問題を修正した。構築物をＮｓｉＩで消化した。この結果得られた断片を次にＥｃｏＲＩで部分消化した。この部分消化によって得られた約９３００塩基対のサイズの断片をゲル精製した。ＭＮ１４重鎖遺伝子の３’端のスプライスドナー部位を変異させるためにリンカーを作製した。さらに、２つのオリゴヌクレオチドプライマーのアニーリングによって二本鎖ＤＮＡリンカーを形成させることによってリンカーを再び作製した。リンカーの作製に用いた２つのプライマーを以下に示す。
2004524807.tif 000013
【０１９２】
アニーリングの後に、部分消化の際に除去された当初のＮｓｉＩ／ＥｃｏＲＩ断片の部分をこのリンカーで置換した。
【０１９３】
次に、変異型二重鎖断片をα−ラクトアルブミン発現性レトロウイルス骨格のＬＮα−ＬＡ−Ｍｅｒｔｚ−ＭＣＳ中に挿入した。上記の通りに作製した遺伝子構築物ＢａｒｎＨＩおよびＢｇｌＩＩで消化し、変異型二重鎖遺伝子を含む断片を単離した。このＬＮ α−ＬＡ−Ｍｅｒｔｚ−ＭＣＳレトロウイルス骨格プラスミドをＢｇｌＩＩで消化した。続いてＢａｒｎＨＩ／ＢｇｌＩＩ断片をレトロウイルス骨格プラスミド中に挿入した。
【０１９４】
続いてＷＰＲＥ因子を遺伝子構築物中に挿入した。ＷＰＲＥ因子を取り出すためにプラスミドＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ＳＫ＋ ＷＰＲＥ−Ｂ１１をＢａｍＨＩおよびＨｉｎｃＩＩで消化し、この因子を単離した。上記の通りに作製したベクターをＢｇｌＩＩおよびＨｐａＩで消化した。ＷＰＲＥ断片をＢｇｌＩＩおよびＨｐａＴ部位と連結し、最終的な遺伝子構築物を作製した。
【０１９５】
Ｅ．α−ＬＡ Ｂｏｔ
α−ＬＡ Ｂｏｔ（配列番号：８、ボツリヌス毒素抗体）構築物は、５’側から３’側の順に以下の因子を含む：ウシ／ヒトα−ラクトアルブミンハイブリッド型プロモーター、変異型ＰＰＥ因子、ｃｃ４９シグナルペプチド、ボツリヌス毒素抗体軽鎖、脳心筋炎ウイルス由来のＩＲＥＳ／ウシα−ＬＡシグナルペプチド、ボツリヌス毒素抗体重鎖、ＷＰＲＥ配列および３’ ＭｏＭｕＬＶ ＬＴＲ。加えて、αＬＡボツリヌス毒素抗体ベクターは５’ ＭｏＭｕＬＶ ＬＴＲ、ＭｏＭｕＬＶ伸長型ウイルスパッケージングシグナル、およびネオマイシンリン酸転移酵素遺伝子を含む（これらの追加的な因子は配列番号：７に示されている）。
【０１９６】
この構築物は、ネオマイシンリン酸転移酵素遺伝子の産生を制御するために５’ ＭｏＭｕＬＶ ＬＴＲを用いる。ボツリヌス毒素抗体の発現はハイブリッド型α−ＬＡプロモーターによって制御される。ボツリヌス毒素重鎖遺伝子および軽鎖遺伝子はＩＲＥＳ／ウシα−ＬＡシグナルペプチド配列（配列番号：３）によって結合している。ウシ／ヒトα−ラクトアルブミンハイブリッド型プロモーターは、ＩＲＥＳによって結合した重鎖遺伝子および軽鎖遺伝子を含むｍＲＮＡの産生を駆動する。リボソームはｍＲＮＡのＣＡＰ部位およびＩＲＥＳ配列と結合する。これにより、重鎖および軽鎖タンパク質の両方が単一のｍＲＮＡから産生されるようになる。
【０１９７】
さらに、ｍＲＮＡの核から細胞質への輸送を補助し、ｍＲＮＡのポリアデニル化を補助する２つの遺伝因子がｍＲＮＡに含まれる。変異型ＰＰＥ配列（配列番号：２）はＲＮＡ ＣＡＰ部位とＭＮ１４タンパク質コード領域の開始部との間に含まれる。望ましくない翻訳開始が起こるのを防ぐために、ＰＰＥ因子（配列番号：２）内部のＡＴＧ配列を変異させた。この変異配列の２つのコピーを頭−尾配列として用いた。この配列をプロモーターのすぐ下流で、コザック配列およびシグナルペプチド−コード領域の上流に配置した。ＷＰＲＥはウッドチャック肝炎ウイルスから単離したものであり、同じくｍＲＮＡの移行を補助するとともに、ｍＲＮＡに安定性をもたらす。この配列がＲＮＡの３’非翻訳領域に含まれると、このＲＮＡからのタンパク質発現レベルは最大１０倍に上昇する。ＷＰＲＥはＭＮ１４タンパク質コード部位の終末部とポリアデニル化部位との間に含まれる。ＬＴＲならびにウシ／ヒトα−ラクトアルブミンハイブリッド型プロモーターからのｍＲＮＡ発現は３’ ＬＴＲで終結し、そこでポリアデニル化される。
【０１９８】
ウシ／ヒトα−ラクトアルブミンハイブリッド型プロモーター（配列番号：１）は、ヒトおよびウシのα−ラクトアルブミンプロモーター配列に由来するモジュール型プロモーター／エンハンサー因子である。プロモーターのヒト部分は、転写開始点（ｔｓｐ）を基準として＋１５からｔｓｐを基準として−６００までの範囲である。続いてウシ部分をヒト部分の末端に結合するが、これはｔｓｐを基準として−５５０〜−２０００に対応する。このハイブリッドは、ウシプロモーターに存在するポリアデニル化シグナルを除去し、レトロウイルスＲＮＡの産生を妨げる目的で開発した。また、ヒト遺伝子には存在するがウシには存在しない遺伝制御因子を含めることも目的として開発した。同様に、この構築物はウシには存在するがヒトには存在しない制御因子を含む。
【０１９９】
Ｆ．ＬＳＲＮＬ
ＬＳＲＮＬ（配列番号：９）構築物は、５’側から３’側の順に以下の因子を含む：５’ ＭｏＭｕＬＶ ＬＴＲ、ＭｏＭｕＬＶウイルスパッケージングシグナル；Ｂ型肝炎表面抗原；ＲＳＶプロモーター；ネオマイシンリン酸転移酵素遺伝子；および３’ ＭｏＭｕＬＶ ＬＴＲ。
【０２００】
この構築物は、Ｂ型肝炎表面抗原遺伝子の産生を制御するために５’ ＭｏＭｕＬＶ ＬＴＲを用いる。ネオマイシンリン酸転移酵素遺伝子の発現はＲＳＶプロモーターによって制御される。ＬＴＲならびにＲＳＶプロモーターからのｍＲＮＡ発現は３’ ＬＴＲで終結し、そこでポリアデニル化される。
【０２０１】
Ｇ．α−ＬＡ ｃｃ４９ＩＬ２
α−ＬＡ ｃｃ４９ＩＬ２（配列番号：１０；ｃｃ４９抗体は米国特許第５，５１２，４４３号；第５，９９３，８１３号；および第５，８９２，０１９号に記載されている；これらはそれぞれ参照として本明細書に組み入れられる）構築物は、５’側から３’側の順に以下の因子を含む：５’ウシ／ヒトα−ラクトアルブミンハイブリッド型プロモーター；ｃｃ４９−ＩＬ２コード領域；および３’ ＭｏＭｕＬＶ ＬＴＲ。この遺伝子構築物は、一本鎖抗体ｃｃ４９がインターロイキン−２と結合した融合タンパク質を発現する。融合タンパク質の発現はウシ／ヒトα−ラクトアルブミンハイブリッド型プロモーターによって制御される。
【０２０２】
ウシ／ヒトα−ラクトアルブミンハイブリッド型プロモーター（配列番号：１）は、ヒトおよびウシのα−ラクトアルブミンプロモーター配列に由来するモジュール型プロモーター／エンハンサー因子である。プロモーターのヒト部分は、転写開始点（ｔｓｐ）を基準として＋１５からｔｓｐを基準として−６００までの範囲である。続いてウシ部分をヒト部分の末端に結合するが、これはｔｓｐを基準として−５５０〜−２０００に対応する。このハイブリッドは、ウシプロモーターに存在するポリアデニル化シグナルを除去し、レトロウイルスＲＮＡの産生を妨げる目的で開発した。また、ヒト遺伝子には存在するがウシには存在しない遺伝制御因子を含めることも目的として開発した。同様に、この構築物はウシには存在するがヒトには存在しない制御因子を含む。３’ウイルスＬＴＲはｍＲＮＡのポリアデニル化配列を提供する。
【０２０３】
Ｈ．α−ＬＡ ＹＰ
α−ＬＡ ＹＦ（配列番号：１１）構築物は、５’側から３’側の順に以下の因子を含む：５’ウシ／ヒトα−ラクトアルブミンハイブリッド型プロモーター；二重変異型ＰＰＥ配列；ウシαＬＡシグナルペプチド；ペスト菌（Ｙｅｒｓｅｎｉａ ｐｅｓｔｉｓ）抗体重鎖Ｆａｂコード領域；ＥＭＣＶ ＩＲＥＳ／ウシα−ＬＡシグナルペプチド；ペスト菌抗体軽鎖Ｆａｂコード領域；ＷＰＲＥ配列；３’ ＭｏＭｕＬＶ ＬＴＲ。
【０２０４】
この遺伝子構築物は、ペスト菌マウスＦａｂ抗体の発現を引き起こすと考えられる。遺伝子構築物の発現はウシ／ヒトα−ラクトアルブミンハイブリッド型プロモーターによって制御される。ＰＰＥ配列およびＷＰＲＥ配列はｍＲＮＡの核から細胞質への移動を補助する。ＩＲＥＳ配列により、重鎖および軽鎖遺伝子の両方が同一のｍＲＮＡから翻訳されるようになる。３’ウイルスＬＴＲはｍＲＮＡのポリアデニル化配列を提供する。
【０２０５】
さらに、ｍＲＮＡの核から細胞質への輸送を補助し、ｍＲＮＡのポリアデニル化を補助する２つの遺伝因子がｍＲＮＡに含まれる。変異型ＰＰＥ配列（配列番号：２）はＲＮＡ ＣＡＰ部位とＭＮ１４タンパク質コード領域の開始部との間に含まれる。望ましくない翻訳開始が起こるのを防ぐために、ＰＰＥ因子（配列番号：２）内部のＡＴＧ配列を変異させた（配列番号：２の塩基４位、１１２位、１３１位および２３８位をＧからＴに変更した）。この変異配列の２つのコピーを頭−尾配列として用いた。この配列をプロモーターのすぐ下流で、コザック配列およびシグナルペプチド−コード領域の上流に配置した。ＷＰＲＥはウッドチャック肝炎ウイルスから単離したものであり、同じくｍＲＮＡの移行を補助するとともに、ｍＲＮＡに安定性をもたらす。この配列がＲＮＡの３’非翻訳領域に含まれると、このＲＮＡからのタンパク質発現レベルは最大１０倍に上昇する。ＷＰＲＥはＭＮ１４タンパク質コード部位の終末部とポリアデニル化部位との間に含まれる。ＬＴＲならびにウシ／ヒトα−ラクトアルブミンハイブリッド型プロモーターからのｍＲＮＡ発現は３’ ＬＴＲで終結し、そこでポリアデニル化される。
【０２０６】
ウシ／ヒトα−ラクトアルブミンハイブリッド型プロモーター（配列番号：１）は、ヒトおよびウシのα−ラクトアルブミンプロモーター配列に由来するモジュール型プロモーター／エンハンサー因子である。プロモーターのヒト部分は、転写開始点（ｔｓｐ）を基準として＋１５からｔｓｐを基準として−６００までの範囲である。続いてウシ部分をヒト部分の末端に結合するが、これはｔｓｐを基準として−５５０〜−２０００に対応する。このハイブリッドは、ウシプロモーターに存在するポリアデニル化シグナルを除去し、レトロウイルスＲＮＡの産生を妨げる目的で開発した。また、ヒト遺伝子には存在するがウシには存在しない遺伝制御因子を含めることも目的として開発した。同様に、この構築物はウシには存在するがヒトには存在しない制御因子を含む。
【０２０７】
実施例２
ＭｏＭＬＶ ｇａｇおよびｐｏｌタンパク質を安定的に発現する細胞系の作製
実施例２〜５では、偽型のレトロウイルスベクターの作製について述べる。これらの方法は、上記のベクターの作製に一般的に適用可能である。融合誘導性ＶＳＶ Ｇタンパク質が細胞表面に発現されると合胞体形成および細胞死が起こる。このため、ＶＳＶ Ｇタンパク質を膜関連タンパク質として含むレトロウイルス粒子を作製するために二段階アプローチを採用した。第１に、ＭｏＭＬＶ由来のｇａｇおよびｐｏｌタンパク質を高レベルで発現する安定的な細胞系を作製した（例えば、２９３ＧＰＳＤ細胞）。ｇａｇおよびｐｏｌタンパク質を発現する安定的な細胞系は、膜関連タンパク質（例えば、外被タンパク質）を含まない非感染性ウイルス粒子を産生する。続いて、安定的な細胞系に対して、リン酸カルシウム沈殿を用いてＶＳＶ−Ｇおよび関心対象の遺伝子プラスミドＤＮＡによる共トランスフェクションを行った。作製した偽型ベクター遺伝子を用いて２９３ＧＰＳＤ細胞を感染させ、安定的な形質転換細胞系を作製した。安定的な細胞系には、ＶＳＶ Ｇタンパク質の高レベルの発現を指令しうるプラスミドを一時的にトランスフェクトしうる（以下参照）。この一時的トランスフェクト細胞はＶＳＶ Ｇ−偽型レトロウイルスベクターを産生し、合胞体形成の結果として産生細胞が死滅するまでの３〜４日の期間にわたり、これを細胞から収集することが可能である。
【０２０８】
ＶＳＶ Ｇ−偽型レトロウイルスベクターの作製における第１の段階である、ＭｏＭＬＶ ｇａｇおよびｐｏｌタンパク質を発現する安定的な細胞系の作製について以下に述べる。ヒトアデノウイルスＡｄ−５によって形質転換された胚腎細胞系２９３（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １５７３）に対して、ｐＣＭＶｇａｇ−ｐｏｌ、およびフレオマイシンをコードする遺伝子による共トランスフェクションを行った。ｐＣＭＶ ｇａｇ−ｐｏｌは、ＣＭＶプロモーターの制御下にあるＭｏＭＬＶ ｇａｇおよびｐｏｌ遺伝子を含む（ｐＣＭＶ ｇａｇ−ｐｏｌはＡＴＣＣから入手しうる）。
【０２０９】
リン酸カルシウム共沈法（ＧｒａｈａｍおよびＶａｎ ｄｅｒ Ｅｂ、Ｖｉｒｏｌ． ５２：４５６［１９７３］）を用いて、プラスミドＤＮＡを２９３細胞に導入した。ＤＮＡ共沈物を添加する前日に、約５×１０５個の２９３細胞を１００ｍｍ組織培養プレートにプレーティングした。１０％ＦＣＳおよび１０μｇ／ｍｌフレオマイシンを含むＤＭＥＭ−高グルコース培地（選択培地）中で生育させることにより、安定的な形質転換体を選択した。選択培地中で生育したコロニーを細胞外逆転写酵素活性（Ｇｏｆｆら、Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ３８：２３９［１９８１］）および細胞内ｐ３０ｇａｇ発現に関してスクリーニングした。ｐ３０ｇａｇ発現の存在は、ヤギ抗ｐ３０抗体（ＮＣＩ抗血清 ７７Ｓ００００８７）を用いるウエスタンブロット法によって判定した。レトロウイルス遺伝子の安定的な発現を呈したクローンを選択した。このクローン２９３ＧＰＳＤ（２９３ｇａｇ−ｐｏｌ−Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ）と命名した。ヒトＡｄ−５で形質転換された胚腎細胞系２９３の派生物であるこの２９３ＧＰＳＤ細胞系を、１０％ＦＣＳを含むＤＭＥＭ−高グルコース培地中で生育させた。
【０２１０】
実施例３
ＶＳＶのＧ糖タンパク質を保有する偽型レトロウイルスベクターの調製
ＶＳＶ Ｇタンパク質偽型レトロウイルスを作製するために以下の手順を用いた。２９３ＧＰＳＤ細胞系に対して、ＶＳＶ−Ｇプラスミドおよび関心対象のＤＮＡプラスミドによる共トランスフェクションを行った。この共トランスフェクションにより、２９３ＧＰＳＤ細胞を感染させてパッケージング細胞系を作製するために用いる感染性粒子が作製される。本実施例では、偽型ＬＮＢＯＴＤＣウイルスの作製について述べる。この一般的な方法を、実施例１に記載したベクターの任意のものを作製するために用いてもよい。
【０２１１】
ａ）細胞系およびプラスミド
パッケージング細胞系２９３ＧＰＳＤを、１０％ＦＣＳを含むα−ＭＥＭ−高グルコース培地中で生育させた。偽型ウイルスの力価は２０８Ｆ細胞（Ｑｕａｄｅ、Ｖｉｒｏｌ． ９８：４６１［１９７９］）またはＮＩＨ／３Ｔ３細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５８）を用いて判定しうる；２０８ＦおよびＮＩＨ／３Ｔ３細胞は１０％ＣＳを含むＤＭＥＭ−高グルコース培地中で生育させる。
【０２１２】
プラスミドＬＮＢＯＴＤＣは、サイトメガロウイルス最初期プロモーターの転写制御下にあるＢＯＴＤをコードする遺伝子を含み、ＬＴＲプロモーターの転写制御下にあるネオマイシンリン酸転移酵素（Ｎｅｏ）をコードする遺伝子がこの後に続く。プラスミドｐＨＣＭＶ−Ｇは、ヒトサイトメガロウイルス最初期プロモーターの転写制御下にあるＶＳＶ Ｇ遺伝子を含む（Ｙｅｅら、Ｍｅｔｈ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． ４３：９９［１９９４］）。
【０２１３】
ｂ）安定的なパッケージング細胞系、偽型ベクターの作製、および偽型ＬＮＢＯＴＤＣベクターの力価判定
ＬＮＢＯＴＤＣ ＤＮＡ（配列番号：１３）をｐＨＣＭＶ−Ｇ ＤＮＡとともにパッケージング細胞系２９３ＧＰＳＤに共トランスフェクトして、ＬＮＢＯＴＤＣウイルスを作製した。次に、この結果得られたＬＮＢＯＴＤＣウイルスを用いて２９３ＧＰＳＤ細胞を感染させ、細胞の形質転換を行った。偽型ＬＮＢＯＴＤＣウイルスの作製のための手順は記載の通りに行った（Ｙｅｅら、Ｍｅｔｈ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． ４３：９９［１９９４］。
【０２１４】
これは、感染性のある複製能欠損レトロウイルスベクターの生成に伴い、関心対象の細胞内への上記の配列の挿入が引き起こされると考えられるレトロウイルス遺伝子構築物である。挿入が起こると、ＣＭＶ調節配列がボツリヌス毒素抗体重鎖および軽鎖遺伝子の発現を制御する。ＩＲＥＳ配列により、重鎖および軽鎖遺伝子の両方が同一のｍＲＮＡから翻訳されるようになる。３’ウイルスＬＴＲはｍＲＮＡのポリアデニル化配列を提供する。
【０２１５】
ボツリヌス毒素抗体の重鎖および軽鎖タンパク質の両方がこのシグナルｍＲＮＡから産生される。この２つのタンパク質が会合すると活性のあるボツリヌス毒素抗体が形成される。また、重鎖および軽鎖タンパク質は互いに等しいモル比で形成されるように思われる。
【０２１６】
簡潔に述べると、第１日に約５×１０４個の２９３ＧＰＳＤ細胞を７５ｃｍ２組織培養フラスコに播いた。その翌日（第２日）に、標準的なリン酸カルシウム共沈法（ＧｒａｈａｍおよびＶａｎ ｄｅｒ Ｅｂ、Ｖｉｒｏｌ． ５２：４５６［１９７３］）を用いて、２９３ＧＰＳＤ細胞に２５μｇのｐＬＮＢＯＴＤＣプラスミドＤＮＡおよび２５μｇのＶＳＶ−ＧプラスミドＤＮＡをトランスフェクトした。１０〜４０μｇの範囲のプラスミドＤＮＡを用いうる。２９３ＧＰＳＤ細胞が組織培養プレートに固着するには２４時間以上を要する場合があるため、２９３ＧＰＳＤ細胞をトランスフェクションの４８時間前に７５ｃｍ２フラスコに入れておくとよい。トランスフェクトされた２９３ＧＰＳＤ細胞は、偽型のＬＮＢＯＴＤＣウイルスを生じる。
【０２１７】
第３日に、トランスフェクトされた２９３ＧＰＳＤ細胞から偽型ウイルスを収集する２４時間前に、約１×１０５個の２９３ＧＰＳＤ細胞を７５ｃｍ２組織培養フラスコに入れた。第４日に、ｐＬＮＢＯＴＤＣおよびＶＳＶ−Ｇ ＤＮＡの適用から４８時間後にトランスフェクトされた２９３ＧＰＳＤ細胞から、培地を採取した。培地を０．４５μｍフィルターで濾過し、ポリブレンを添加して最終濃度を８μｇ／ｍｌとした。ＬＮＢＯＴＤＣウイルスを含む培地を用いた２９３ＧＰＳＤ細胞の感染は以下の通りに行った。培地を２９３ＧＰＳＤ細胞から除去し、ＬＮＢＯＴＤＣウイルスを含む培地に交換した。細胞に対する添加後にポリブレンを培地に加えた。ウイルスを含む培地中に２９３ＧＰＳＤ細胞を２４時間保った。感染時期から１６時間後（第５日）に培地を２９３ＧＰＳＤから除去し、４００μｇ／ｍｌ Ｇ４１８（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ）を含む新たな培地に交換した。培地をほぼ３日毎に交換したところ、約２週間後にＧ４１８耐性コロニーが出現した。
【０２１８】
このＧ４１８耐性２９３コロニーを単細胞として９６個のウェルにプレーティングした。高生産性クローンを同定するために、６０〜１００個のＧ４１８耐性コロニーをＢＯＴＤＣ抗体の発現に関してスクリーニングした。９６穴プレート中の上位１０種のクローンを６穴プレートに移し、集密に達するまで生育させた。
【０２１９】
この上位１０種のクローンを高力価産生に関してスクリーニングした。タンパク質発現および力価産生に基づいて５つのクローン細胞系を選択した。１つの細胞系をマスター細胞バンクに指定し、他の４つを予備細胞系とした。偽型ベクターは以下の通りに作製した。約１×１０６個の２９３ＧＰＳＤ／ＬＮＢＯＴＤＣ細胞を７５ｃｍ２組織培養フラスコに播いた。２４時間後にリン酸カルシウム共沈法を用いて細胞に２５μｇのｐＨＣＭＶ−ＧプラスミドＤＮＡをトランスフェクトした。６〜８時間後にカルシウム−ＤＮＡ沈殿物を細胞に適用し、ＤＮＡ溶液を新たな培地（Ｇ４１８を含まないもの）に交換した。トランスフェクション時間の長い方（一晩）では、２９３ＧＰＳＤ／ＬＮＢＯＴＤＣ細胞の大半がプレートから剥離したことが判明したため、これは用いていない。トランスフェクトされた２９３ＧＰＳＤ／ＬＮＢＯＴＤＣ細胞は偽型ＬＮＢＯＴＤＣウイルスを産生した。
【０２２０】
トランスフェクトされた２９３ＧＰＳＤ／ＬＮＢＯＴＤＣ細胞から生じた偽型ＬＮＢＯＴＤＣウイルスは、トランスフェクションから２４〜９６時間の間は少なくとも１日１回収集することができる。最も高いウイルス力価は最初のｐＨＣＭＶ−Ｇトランスフェクションから約４８〜７２時間後に得られた。トランスフェクションから約４８時間後に合胞体形成がトランスフェクト細胞の大半に認められるようになったが、細胞は組織培養プレートに付着し続ける限り、少なくともさらに４８時間にわたって偽型ウイルスの産生を続けた。ＶＳＶ Ｇ−偽型ＬＮＢＯＴＤＣウイルスを含む収集した培地をプールし、０．４５μｍフィルターで濾過した上で、−８０℃で保存するか、または直ちに濃縮した後に−８０℃で保存した。
【０２２１】
続いて、ＶＳＶ Ｇ−偽型ＬＮＢＯＴＤＣウイルスの力価を以下の通りに判定した。約５×１０４個のラット２０８Ｆ線維芽細胞を６穴プレートにプレーティングした。プレーティングから２４時間後に、８μｇ／ｍｌ ポリブレンの存在下で、ＬＮＢＯＴＤＣウイルス含有培地を連続希釈したものによって細胞を感染させた。ウイルスによる感染から２４時間後に、培地を４００μｇ／ｍｌのＧ４１８を含む新たな培地に交換し、Ｇ４１８耐性コロニーが認められるようになるまで１４日間にわたって選別を続けた。ウイルス力価は一般に約０．５〜５．０×１０６コロニー形成単位（ｃｆｕ）／ｍｌであった。以下に述べる通り、ウイルスストックの力価が１０９ｃｆｕ／ｍｌを上回るまで濃縮することが可能であった。
【０２２２】
実施例４  偽型レトロウイルスベクターの濃縮
超遠心分離を１サイクル行うことにより、ＶＳＶ Ｇ−偽型ＬＮＢＯＴＤＣウイルスを濃縮して高力価とした。しかし、さらに濃縮するために２サイクルを行うことが可能である。実施例２に記載した通りに収集した、偽型ＬＮＢＯＴＤＣウイルスを含む凍結培地を３７℃水浴中で解凍し、あらかじめオートクレーブによって滅菌しておいたオークリッジ型遠心管（密封蓋付きの５０ｍｌオークリッジ型遠心管、Ｎａｌｇｅ Ｎｕｎｃ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）に移した。ＪＡ２０ローター（Ｂｅｃｋｍａｎ）により４８，０００×ｇ（２０，０００ｒｐｍ）、４℃で１２０分間遠心してウイルスを沈殿させた。次に、バイオセーフティーフード内で培地をチューブから採取し、チューブ内に残った培地を吸引して上清を採取した。ウイルスペレットを最初の容量の０．５〜１％のＤＭＥＭ培地中に再懸濁した。再懸濁したウイルスペレットを４℃で一晩、攪拌せずにインキュベートした。一晩インキュベートした後には、感染性ウイルスを大きく失うことなく、ウイルスペレットを丁寧なピペッティングで分散させることができた。ウイルスストックの力価は通常、超遠心を１回行った後には１００〜３００倍に上昇した。感染性ウイルスの回収効率は３０〜１００％の範囲でさまざまであった。
【０２２３】
続いて、視認しうる細胞片、または以上の条件下で再懸濁されなかった凝集ビリオンを除去するために、ウイルスストックを微量遠心管に入れ、低速遠心を４℃で５分間行った。ウイルスストックを卵母細胞または胚への注入に用いる予定がなければ、この遠心段階を省いてもよい。
【０２２４】
ウイルスストックをさらに濃縮するためにこのウイルスストックに超遠心をさらにもう１回行うことができる。１回目の遠心後に再懸濁したウイルスをプールし、２回目の超遠心を上記と同じく行うことによってペレット化する。２回目の超遠心後にはウイルス力価は約２０００倍に上昇する（偽型ＬＮＢＯＴＤＣウイルスの力価は、第２回目の超遠心後には一般に１×１０９ｃｆｕ／ｍｌとなる）。
【０２２５】
遠心前および遠心後の液体の力価を２０８Ｆ細胞の感染によって判定した後（ＮＩＨ ３Ｔ３またはウシ乳腺上皮細胞も用いうる）、上記の実施例２の通りにＧ４１８耐性コロニーを選択した。
【０２２６】
実施例５
宿主細胞の感染用の偽型レトロウイルスの調製
濃縮した偽型のレトロウイルスを０．１×ＨＢＳ（２．５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ ７．１２、１４ｍＭ ＮａＣｌ、７５μＭ Ｎａ２ＨＰＯ４・Ｈ２Ｏ）中に再懸濁し、１８μｌのアリコートを０．５ｍｌバイアル（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）に入れた上で、使用時まで−８０℃で保存した。１μｌの濃縮ウイルスを０．１×ＨＢＳで１０−７または１０−８倍に希釈することにより、濃縮ベクターの力価を判定した。続いて、希釈したウイルス溶液を用いて２０８Ｆおよびウシ乳腺上皮細胞を感染させ、ウイルス力価を実施例２に記載した通りに判定した。
【０２２７】
実施例６
宿主細胞によるＭＮ１４の発現
本実施例では、多数の組み込みベクターをトランスフェクトした細胞からの抗体ＭＮ１４の産生について述べる。以下のベクターに関して、偽型ベクターをパッケージング細胞系から作製した：ＣＭＶ ＭＮ１４、α−ＬＡ ＭＮ１４およびＭＭＴＶ ＭＮ１４。ラット線維芽細胞（２０８Ｆ細胞）、ＭＤＢＫ細胞（ウシ腎細胞）およびウシ乳腺上皮細胞に感染多重度１０００でトランスフェクションを行った。１０００個の細胞をＴ２５フラスコに播き、培地３ｍｌ中にて１０６コロニー形成単位（ＣＦＵ）のベクターを細胞とともにインキュベートした。感染時間は２４時間とし、その後に培地を交換した。トランスフェクション後は細胞を増殖させ、集密化させた。
【０２２８】
細胞系をＴ２５フラスコ内で集密化するまで増殖させ、培地５ｍｌを毎日交換した。ＭＮ１４の存在に関して培地を毎日アッセイした。産生されたＭＮ１４はすべて活性があり（ヒトＩｇＧの検出を目的としたＥＬＩＳＡで、ＣＥＡ結合ＥＬＩＳＡと全く同じ値が得られた）、ウエスタンブロット法により、重鎖および軽鎖が１：１と思われる比で産生されることが示された。さらに非変性ウエスタンブロットにより、抗体複合体の１００％と思われる割合が正しく形成されたことが示された（図１参照：レーン１、８５ｎｇ対照Ｍｎ１４；レーン２、ウシ乳腺細胞系、α−ＬＡプロモーター；レーン３、ウシ乳腺細胞系、ＣＭＶプロモーター；レーン４、ウシ腎細胞系、α−ＬＡプロモーター；レーン５、ウシ腎細胞系、ＣＭＶプロモーター；レーン６、２０８細胞系、α−ＬＡプロモーター；レーン７、２０８細胞系、ＣＭＶプロモーター）。
【０２２９】
図２は、４種の細胞系に関してＭＮ１４産生の時間的推移を示したグラフである。Ｙ軸は培地１ｍｌ当たりのＭＮ１４産生量をｎｇ単位で示している。Ｘ軸は実験用の培地収集日を示している。グラフ上には４組のデータが示されている。比較はＣＭＶとα−ＬＡプロモーターとの間および２０８細胞とウシ乳腺細胞との間で行っている。ウシ乳腺細胞系は発現が最も高度であり、次いで２０８Ｆ細胞およびＭＤＢＫ細胞であった。構築物に関しては、ＣＭＶ駆動性の構築物が最も高い発現レベルを示し、次いでα−ＬＡ駆動性遺伝子構築物およびＭＭＴＶ構築物であった。第２週の時点で、ＣＭＶ構築物の１日産生レベルは４．５μｇ／培地ｍｌであった（Ｔ２５フラスコ内で２２．５ｍｇ／日）。発現レベルはその後、以降の週で細胞が極めて高密度に集密化するに伴って徐々に上昇し、４０μｇ／日となった。α−ｌａｃ−ＭＮ１４パッケージング細胞系から収集した２．７Ｌの培地を親和性クロマトグラフィーにより処理し、ＭＮ１４の精製ストックを得た。
【０２３０】
図３は、ＭＮ１４抗体の重鎖および軽鎖を分離するために変性条件下で泳動を行った１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルのウエスタンブロットである。レーン１はウシ乳腺細胞系、ハイブリッド型α−ＬＡプロモーターによるＭＮ１４を示している；レーン２はウシ乳腺細胞系、ＣＭＶプロモーターによるＭＮ１４を示している；レーン３はウシ腎細胞系、ハイブリッド型αＬＡプロモーターによるＭＮ１４を示している；レーン４はウシ腎細胞系、ＣＭＶプロモーターによるＭＮ１４を示している；レーン５はラット線維芽細胞系、ハイブリッド型α−ＬＡプロモーターによるＭＮ１４を示している；レーン６はラット線維芽細胞、ＣＭＶプロモーターによるＭＮ１４を示している。上の図１と一致して、これらの結果は重鎖および軽鎖が約１：１の比で産生されることを示している。
【０２３１】
実施例７
細胞１個当たりの産生タンパク質の定量
本実施例では、本発明に従って作製した細胞培養物における細胞１個当たりの産生タンパク質量の定量について述べる。種々の細胞（２０８Ｆ細胞、ＭＤＢＫ細胞およびウシ乳腺細胞）を２５ｃｍ２培養皿に１０００個／培養皿の密度でプレーティングした。この３つの細胞種を感染させるために３種の異なるベクター（ＣＭＶ−ＭＮ１４、ＭＭＴＶ−ＭＮ１４およびα−ＬＡ−ＭＮ１４）をＭＯＩ １０００で用いた（力価：それぞれ２．８×１０６、４．９×１０６および４．３×１０６）。すべての培養物から培地をほぼ２４時間毎に収集した。培地収集を１カ月間行った後に、２０８Ｆ細胞およびＭＤＢＫ細胞は状態が悪くＭＮ１４発現も弱かったため廃棄した。細胞をＴ２５フラスコに継代し、ウシ乳腺細胞からの培地の収集を約２カ月行ったが、Ｍ１４の発現は継続していた。Ｔ２５フラスコ内で２カ月培養した後、ＣＭＶプロモーターを用いた細胞は２２．５ｐｇ／細胞／日、α−ＬＡプロモーターを用いた細胞は２．５ｐｇ／細胞／日のＭＮ１４を産生した。
【０２３２】
Ｔ２５フラスコ内で２カ月培養した後に、生産規模を拡大するため、および多回継代後もＭＮ１４発現が安定しているかどうかを判定するために、回転瓶（８５０ｃｍ２）への播種を行った。２本の回転瓶にＣＭＶプロモーターからＭＮ１４を発現しているウシ乳腺細胞を播種し、２つの回転瓶にα−ＬＡプロモーターからＭＮ１４を発現しているウシ乳腺細胞を播種した。培養物は約２週後に集密状態に達し、ＭＮ１４を発現し続けた。回転瓶での発現を以下の表１に示す。
【０２３３】
【表１】
2004524807.tif 000014
【０２３４】
実施例８
ＬＬ２抗体の発現
本実施例には、ウシ乳腺細胞および２９３ヒト腎臓線維芽細胞による抗体ＬＬ２の発現を示す。ウシ乳腺細胞にベクターＣＭＶ ＬＬ２（７．８５×１０７ＣＦＵ／ｍｌ）をＭＯＩ １０００および１０，０００で感染させ、２５ｃｍ２培養皿にプレーティングした。ＭＯＩ １０，０００でのトランスフェクションでは生存した細胞はなかった。集密度２０％の時点で、２５０ｎｇ／ｍｌのＬＬ２が培地中に存在した。活性のあるＬＬ２抗体がいずれの細胞種からも産生された。非変性および変性条件下でのウエスタン分析により、産生されたすべての抗体に活性があり、重鎖：軽鎖が約１：１の比で正しく会合していることが示された。
【０２３５】
実施例９
ウシ乳腺細胞によるＢｏｔ抗体の発現
本実施例には、ウシ乳腺細胞におけるボツリヌス毒素抗体の発現を示す。ウシ乳腺細胞にベクターα−ＬＡ Ｂｏｔ（２．２×１０２ＣＦＵ／ｍｌ）を感染させ、２５ｃｍ２培養皿にプレーティングした。集密度１００％の時点で、６ｎｇ／ｍｌのボツリヌス毒素抗体が培地中に存在した。
【０２３６】
実施例１０
ウシ乳腺細胞によるＢ型肝炎表面抗原の発現
本実施例には、ウシ乳腺細胞におけるＢ型肝炎表面抗原抗体の発現を示す。ウシ乳腺細胞にベクターＬＳＲＮＬ（３５０ＣＦＵ／ｍｌ）を感染させ、２５ｃｍ２培養皿にプレーティングした。集密度１００％の時点で、２０ｎｇ／ｍｌのＢ型肝炎表面抗原が培地中に存在した。
【０２３７】
実施例１１
ｃｃ４９ＩＬ２抗原結合タンパク質の発現
本実施例には、ウシ乳腺細胞およびヒト腎臓線維芽細胞におけるｃｃ４９ＩＬ２の発現を示す。ウシ乳腺細胞にベクターＬＳＲＮＬ（３．１×１０５ＣＦＵ／ｍｌ）をＭＯＩ １０００で感染させ、２５ｃｍ２培養皿にプレーティングした。集密度１００％の時点で、１０μｇ／ｍｌのｃｃ４９ＩＬ２が培地中に存在した。ヒト腎臓線維芽細胞（２９３）細胞にはα−ＬＡ ｃｃ４９ＩＬ２ベクターを感染させた。活性のあるｃｃ４９−ＩＬ２融合タンパク質が細胞によって産生された。
【０２３８】
実施例１２
ＹＰ抗体の産生
本実施例には、ウシ乳腺上皮細胞およびヒト腎臓線維芽細胞（２９３細胞）によるペスト菌抗体の産生を示す。細胞系にα−ＬＡ ＹＰベクターを感染させた。いずれの細胞系もＹＰ抗体を産生した。抗体のすべてに活性があり、重鎖および軽鎖はほぼ１：１の比で産生される。
【０２３９】
実施例１３
ウシ乳腺細胞による複数のタンパク質の産生
本実施例には、ウシ乳腺細胞における複数のタンパク質の産生を示す。ＭＮ１４を産生する乳腺細胞（ＣＭＶ−ＭＮ１４ベクターに感染したもの）にｃｃ４９ＩＬ２ベクター（３．１×１０５ＣＦＵ／ｍｌ）をＭＯＩ １０００で感染させ、細胞１０００個を２５ｃｍ２培養プレートにプレーティングした。集密度１００％の時点で細胞はＭＮ１４を２．５μｇ／ｍｌ、ｃｃ４９ＩＬ２を５μｇ／ｍｌ発現した。
【０２４０】
実施例１４
ウシ乳腺細胞による複数のタンパク質の発現
本実施例には、ウシ乳腺細胞における複数のタンパク質の発現を示す。ＭＮ１４を産生する乳腺細胞（ＣＭＶ−ＭＮ１４ベクターに感染したもの）にＬＳＮＲＬベクター（１００ＣＦＵ／ｍｌ）をＭＯＩ １０００で感染させ、細胞１０００個を２５ｃｍ２培養プレートにプレーティングした。集密度１００％の時点で細胞はＭＮ１４を２．５μｇ／ｍｌ、肝炎表面抗原を１５０ｎｇ／ｍｌ発現した。
【０２４１】
実施例１５
ウシ乳腺細胞による複数のタンパク質の発現
本実施例には、ウシ乳腺細胞における複数のタンパク質の発現を示す。Ｂ型肝炎表面抗原を産生する乳腺細胞（ＬＳＮＲＬベクターに感染したもの）にｃｃ４９ＩＬ２ベクターをＭＯＩ １０００で感染させ、細胞１０００個を２５ｃｍ２培養プレートにプレーティングした。集密度１００％の時点で細胞はＭＮ１４を２．４、Ｂ型肝炎表面抗原を１３で発現した。
【０２４２】
実施例１６
ウシ乳腺細胞におけるＢ型肝炎表面抗原およびＢｏｔ抗体の発現
本実施例には、回転瓶培養におけるトランスフェクト細胞の培養を示す。２０８Ｆ細胞およびウシ乳腺細胞を２５ｃｍ２培養皿に１０００個／２５ｃｍ２の密度でプレーティングした。ＬＳＲＮＬまたはα−ＬＡ Ｂｏｔベクターを用いて各細胞系をＭＯＩ １０００で感染させた。培養および培地収集を１カ月間行った後に、２０８Ｆ細胞は生育および培養状態が悪かったため廃棄した。同様に、α−ＬＡ Ｂｏｔに感染させたウシ乳腺細胞もタンパク質発現が弱かったため廃棄した。ＬＳＲＮＬに感染させたウシ乳腺細胞を継代して回転瓶（８５０ｃｍ２）に播種した。約２０ｎｇ／ｍｌのＢ型肝炎表面抗原が回転瓶培養物中に産生された。
【０２４３】
実施例１７
Ｇタンパク質共役受容体の発現およびアッセイ
本実施例では、レトロウイルスベクターからのＧタンパク質共役受容体タンパク質（ＧＰＣＲ）の発現について述べる。本実施例では、ＧＰＣＲなどのようにアッセイが難しいタンパク質またはアッセイが存在しないタンパク質の発現のマーカーとしての、ＩＲＥＳからのシグナルタンパク質の発現についても述べる。遺伝子構築物（配列番号：３４；図１７）は、Ｇタンパク質共役受容体にＩＲＥＳ−シグナルペプチド−抗体軽鎖が続く形で、ｐＬＢＣＸレトロウイルス骨格のＭＣＳ中にクローニングされたものを含む。簡潔に述べると、ＧＰＣＲ−ＩＲＥＳ−抗体軽鎖を含むＰｖｕＩＩ／ＰｖｕＩＩ断片（３０５７ｂｐ）をｐＬＢＣＸのＳｔｕＩ部位にクローニングした。ｐＬＢＣＸは、ＥＭ７（Ｔ７）プロモーター、ブラスチシジン遺伝子およびＳＶ４０ポリＡを、ｐＬＮＣＸからのネオマイシン耐性遺伝子に代わって含む。
【０２４４】
この遺伝子構築物を用いて複製能欠損レトロウイルスパッケージング細胞系を作製し、この細胞系を用いて複製能欠損レトロウイルスベクターを作製した。続いて、この細胞系から産生されたベクターを用いて２９３ＧＰ細胞（ヒト胚腎細胞）を感染させた。感染後に細胞をブラスチシジン選択条件下に置き、単細胞性ブラスチシジン耐性クローンを単離した。これらのクローンを抗体軽鎖の発現に関してスクリーニングした。上位１２種の軽鎖発現性クローンを選択した。続いて、これらの１２種の軽鎖発現性クローンを、リガンド結合アッセイを用いてＧＰＣＲの発現に関してスクリーニングした。１２種の試料はすべて受容体タンパク質も発現した。クローン細胞系およびそれらの発現を表２に示す。
【０２４５】
【表２】
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【０２４６】
上記の明細書中に引用したすべての刊行物および特許は参照として本明細書に組み入れられる。当業者には、発明の範囲および趣旨を逸脱することなく、本発明に記載の方法およびシステムに対するさまざまな修正および変更が明らかであると考えられる。本発明をその特定の態様とともに説明してきたが、請求する本発明がこのような特定の態様に過度に制限されるべきではないことが理解される必要がある。実際には、本発明の実施に関して説明した態様のさまざまな修正が、分子生物学、タンパク質発酵、生化学または関連分野の当業者には明らかであり、それらも発明の範囲に含まれるものとする。
【図面の簡単な説明】
【図１】変性条件下で泳動させ、抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ）および抗ヒトＩｇＧ（κ）によりプローブ検索を行った１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルのウエスタンブロットである。
【図２】経時的なＭＮ１４発現に関するグラフである。
【図３】非変性条件下で泳動させ、抗ヒトＩｇＧ（Ｆｅ）および抗ヒトＩｇＧ（κ）によりプローブ検索を行った１５％ＰＡＧＥのウエスタンブロットである。
【図４】ハイブリッド型ヒト−ウシα−ラクトアルブミンプロモーターの配列を提示したものである（配列番号：１）。
【図５】変異型ＰＰＥ配列の配列を提示したものである（配列番号：２）。
【図６】ＩＲＥＳ−シグナルペプチド配列の配列を提示したものである（配列番号：３）。
【図７Ａおよび７Ｂ】ＣＭＶ ＭＮ１４ベクターの配列を提示したものである（配列番号：４）。
【図８Ａおよび８Ｂ】ＣＭＶ ＬＬ２ベクターの配列を提示したものである（配列番号：５）。
【図９Ａ−Ｃ】ＭＭＴＶ ＭＮ１４ベクターの配列を提示したものである（配列番号：６）。
【図１０Ａ−Ｄ】α−ラクトアルブミンＭＮ１４ベクターの配列を提示したものである（配列番号：７）。
【図１１Ａ−Ｃ】α−ラクトアルブミンＢｏｔベクターの配列を提示したものである（配列番号：８）。
【図１２Ａ−Ｂ】ＬＳＲＮＬベクターの配列を提示したものである（配列番号：９）。
【図１３Ａ−Ｂ】α−ラクトアルブミンｃｃ４９ＩＬ２ベクターの配列を提示したものである（配列番号：１０）。
【図１４Ａ−Ｃ】α−ラクトアルブミンＹＰベクターの配列を提示したものである（配列番号：１１）。
【図１５】ＩＲＥＳ−カゼインシグナルペプチド配列の配列を提示したものである（配列番号：１２）。
【図１６Ａ−Ｃ】ＬＮＢＯＴＤＣベクターの配列を提示したものである（配列番号：１３）。
【図１７Ａ−Ｄ】Ｇタンパク質共役受容体および抗体軽鎖を発現するレトロウイルスベクターの配列を提示したものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１０Ｄ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【図１５】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１６Ｃ】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１７Ｃ】
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【図１７Ｄ】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
2004524807.tif 000203
2004524807.tif 000204
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