(57)【要約】本発明は、ホスホリボシルピロリン酸合成酵素１の阻害剤を見つけ出すための、ホスホリボシルピロリン酸合成酵素１（Ｅ．Ｃ．２．７．６．１）活性を有するポリペプチドをコードする植物起原のＤＮＡ配列の使用に関する。ホスホリボシルピロリン酸合成酵素１が除草剤標的となることがアンチセンス技術により初めて示された。【特許請求の範囲】
【請求項１】
植物ホスホリボシルピロリン酸合成酵素１の阻害剤を同定する検定システムを作製するための、植物ホスホリボシルピロリン酸合成酵素１のコーディング領域を含む配列番号１、配列番号３又は配列番号５のＤＮＡ配列の使用。
【請求項２】
配列番号１、配列番号３若しくは配列番号５のＤＮＡ配列、又はその一部、又は置換、失欠若しくは挿入により該配列から誘導される誘導体とハイブリダイズし、かつ植物ホスホリボシルピロリン酸合成酵素１の生物学的活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ配列の、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
原核又は真核細胞への導入のために、前記ＤＮＡ配列が細胞での転写及び翻訳を保証する制御エレメントと場合により連結されていて、植物ホスホリボシルピロリン酸合成酵素１の合成を生じさせる翻訳可能なｍＲＮＡの発現をもたらす、請求項１又は２に記載の使用。
【請求項４】
植物ホスホリボシルピロリン酸合成酵素１を阻害する物質を同定する検定システムを作製するための、ホスホリボシルピロリン酸合成酵素１活性を有するタンパク質の使用。
【請求項５】
前記タンパク質が配列番号２、配列番号４又は配列番号６に示されたアミノ酸配列を含んでなる、請求項４に記載のホスホリボシルピロリン酸合成酵素１活性を有するタンパク質の使用。
【請求項６】
配列番号２又は配列番号４の少なくとも１００アミノ酸からなるアミノ酸部分配列を含んでなるホスホリボシルピロリン酸合成酵素１活性を有するタンパク質の、請求項５に記載の使用。
【請求項７】
植物ホスホリボシルピロリン酸合成酵素１の活性を阻害する物質を同定する方法であって、第１段階で、請求項１、２又は３に定義したＤＮＡ配列を使用してホスホリボシルピロリン酸合成酵素１を生成させ、第２段階で、試験物質の存在下に植物ホスホリボシルピロリン酸合成酵素１の活性を測定することを特徴とする、上記方法。
【請求項８】
植物ホスホリボシルピロリン酸合成酵素１の測定をハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）で行う、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
植物においてホスホリボシルピロリン酸合成酵素１活性を阻害する除草活性物質を同定する方法であって、
ａ）ホスホリボシルピロリン酸合成酵素１活性を有する酵素をコードする付加的ＤＮＡ配列を含み、酵素活性のあるホスホリボシルピロリン酸合成酵素１を過剰に発現することができる遺伝子導入した植物、植物組織又は植物細胞を作製し、
ｂ）遺伝子導入した植物、植物細胞、植物組織又は植物器官に、また、形質転換していない植物、植物細胞、植物組織又は植物器官に、化学物質を適用し、
ｃ）化学物質を適用した後の遺伝子導入した及び形質転換していない植物、植物細胞、植物組織又は植物器官の成長又は生存能力を判定し、
ｄ）化学物質を適用した後の遺伝子導入した及び形質転換していない植物、植物細胞、植物組織又は植物器官の成長又は生存能力を比較する、
ことを含んでなり、
その際、形質転換していない植物、植物細胞、植物組織又は植物器官の成長又は生存能力は抑制されるが、遺伝子導入した植物、植物細胞、植物組織又は植物器官の成長又は生存能力は実質的に抑制されないことにより、ｂ）の前記物質が除草活性を有し、植物においてホスホリボシルピロリン酸合成酵素１の酵素活性を阻害することが示される、上記方法。
【請求項１０】
請求項１、２又は３に定義した配列番号１、配列番号３又は配列番号５のＤＮＡ配列又はその一部又は誘導体の発現に基づいた、植物ホスホリボシルピロリン酸合成酵素１の阻害剤を同定するための検定システム。
【請求項１１】
検査すべき試験基質とともに該酵素をインキュベートし、適当な反応時間の後に、該酵素の酵素活性を非阻害酵素の活性と比較して測定することを含む、植物ホスホリボシルピロリン酸合成酵素１の阻害剤を同定するための請求項１０に記載の検定システム。
【請求項１２】
植物ホスホリボシルピロリン酸合成酵素１の阻害剤。
【請求項１３】
請求項１０又は１１に記載の検定システムを使用して同定された、植物ホスホリボシルピロリン酸合成酵素１の阻害剤。
【請求項１４】
除草剤として使用するための、請求項１２又は１３に記載の同定された阻害剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、除草活性成分に対して新規な標的となる植物ホスホリボシルピロリン酸合成酵素１（Ｅ．Ｃ．２．７．６．１）の同定に関する。また本発明は、除草活性を有するホスホリボシルピロリン酸合成酵素１の阻害剤を同定する検定システムを作製するための、ホスホリボシルピロリン酸合成酵素１活性を有するポリペプチドをコードする配列番号１、配列番号３及び配列番号５のＤＮＡ配列又はそれらの一部若しくは誘導体の使用に関する。また本発明は植物ホスホリボシルピロリン酸合成酵素１の活性を阻害する物質を同定するための方法又は検定システム、並びにこの方法又は検定システムを使用して同定される植物ホスホリボシルピロリン酸合成酵素１の阻害剤に関する。
【０００２】
植物は二酸化炭素、水及び無機塩から細胞成分を合成することができる。
【０００３】
このプロセスは、有機物合成のために生化学反応を巧みに利用することで初めて可能となるものである。ヌクレオチドは植物で新規に合成される。ヌクレオチドは核酸の成分として特に重要である。ヌクレオチドは共有結合されており、多糖の生合成のために炭水化物を活性化する。またヌクレオチドは、脂質の生合成のために頭部基を活性化する。ヌクレオチドはほとんどすべての代謝経路に組み込まれている。ヌクレオシド三リン酸とりわけＡＴＰは、細胞のエネルギー依存性反応の大部分を駆動する。さらにアデニンヌクレオチドは、多くの細胞反応に関与する補酵素Ａやニコチンアミド及びフラビン補酵素のような必須因子の１成分であることが判明した。グアノシン−５’−三リン酸（ＧＴＰ）の共役加水分解は、種々の細胞プロセス例えばタンパク質翻訳、微小管構築、小胞輸送、シグナルトランスダクション及び細胞分裂に対して反応の方向を規定する。ヌクレオチドはまた、アカネ科及びツバキ科の植物にあるカフェイン及びテオブロミンのようなメチルキサンチンの生合成のための出発代謝物を構成する。
【０００４】
植物は効率的なヌクレオチド代謝に依存しているから、ヌクレオチドの生合成に関与する酵素は、除草剤の好適な目標タンパク質であると仮定できる。植物の新規なプリン生合成を阻害する活性成分がすでに記載されている。言及しておくべき例として天然物質であるヒダントシジンがあるが、これは植物中でホスホリル化の後、アデニロコハク酸合成酵素（ＡＳＳ）を阻害する（Ｓｉｅｈｌら， Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ． １１０ （１９９６年） ７５３−７５８）。
【０００５】
ホスホリボシルピロリン酸（ＰＲＰＰ）は植物の代謝においては必須単位である。これは、プリン及びピリミジンのヌクレオチドで、またはピリジンヌクレオチドの補酵素ＮＡＤの新規合成で、あるいはすでに合成されたプリン、ピリミジン、及びピリジンの再利用で必要とされる。さらにＰＲＰＰはヒスチジン及びトリプトファンの合成で必要である（Ｋｒａｔｈ及びＨｏｖｅ−Ｊｅｎｓｅｎ， Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ １１９ （１９９９年） ４９７−５０５を参照）。ＰＲＰＰの合成に関与する酵素がＰＲＰＰシンセターゼであり、リボース−５−リン酸とＭｇＡＴＰをＡＭＰ及びＰＲＰＰに変換する。また幾つかの生物のホスホリボシルピロリン酸合成酵素はＭｇ２＋を必要とする。真核生物はしばしば１以上のホスホリボシルピロリン酸合成酵素をもつ。例えばヒトは重複機能をもつ３つのイソ型をもつ。植物ホスホリボシルピロリン酸合成酵素は、例えばホウレンソウでは４つのイソ型があり、これらは２種類に分類することができ、配置と機能に関して異なっている。さもなければ、植物細胞のまた別の生育依存型の調節の対象となる。例えば、ホスホリボシルピロリン酸合成酵素２は葉緑体に取り込まれる（Ｋｒａｔｈ及びＨｏｖｅ−Ｊｅｎｓｅｎ， Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ １１９ （１９９９年） ４９７−５０５）。このことはシロイヌナズナの葉緑体でプリン新規生合成の幾つかの酵素が検出されたという結果と一致する（Ｓｅｎｅｃｏｆｆ及びＭｅａｇｅｒ， Ｐｌａｎｔ Ｐｈｉｓｉｏｌｏｇｙ １０２ （１９９３年） ３８７−３９９；　Ｉｔｏら， Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２６ （１９９４年） ５２９−５３３； Ｓｃｈｎｏｒｒら， Ｐｌａｎｔ Ｊｏｕｒｎａｌ ６ （１９９４年） １１３−１２１）。酵母において、ホスホリボシルピロリン酸合成酵素の４つのイソ型は異なる機能をもつことが証明された（Ｃａｒｔｅｒら， Ｙｅａｓｔ １０ （１９９４年） １０３１−１０４４）。ヒト、他の高等真核生物及び酵母菌のホスホリボシルピロリン酸合成酵素とは対照的に、植物のホスホリボシルピロリン酸合成酵素はほとんど研究されていない。植物プリン代謝の阻害物質を同定するための一般的な方法が米国特許第５，７８０，２５３号及び第５，７８０，２５４号明細書に記載されている。
【０００６】
ホスホリボシルピロリン酸合成酵素１をコードする遺伝子が種々の生物から分離されている。植物については、シロイヌナズナ（アクセス番号Ｘ８３７６４）及びタバコ（Ｂａｄｕｒ博士、ゲッチンゲン大学、１９９８年）から完全長ＤＮＡ配列が分離されている。
【０００７】
除草剤の標的としての酵素の適合性の検証は、例えば形質転換植物におけるアンチセンス技術により、酵素活性を減少させることによって行うことができる。特定の遺伝子のアンチセンスＤＮＡを植物に導入することによって成長が減少するならば、これは活性が低下した酵素が、除草活性成分の作用部位として適していることを示唆する。
【０００８】
例えば、形質転換したジャガイモ植物でのアセト乳酸シンターゼ（ＡＬＳ）のアンチセンス阻害は、ＡＬＳ阻害除草剤による対照植物の処理のように、比較可能な表現型をもたらす（Ｈｏｅｆｇｅｎら， Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ １０７ （１９９５年） ４６９−４７７）。
【０００９】
本発明の課題は、植物のホスホリボシルピロリン酸合成酵素１が適当な除草剤標的であることを証明すること、及び阻害剤と酵素の結合研究を行うための効率的かつ簡便なホスホリボシルピロリン酸合成酵素１検定システムを作製することであった。
【００１０】
この課題は、植物の酵素であるホスホリボシルピロリン酸合成酵素１をコードする遺伝子を単離し、植物ホスホリボシルピロリン酸合成酵素１のアンチセンス構築物を作製し、植物においてそれを発現させること、並びに、細菌又は真核細胞において植物ホスホリボシルピロリン酸合成酵素１を機能的に発現させることによって解決される。
【００１１】
課題の解決のためにまず植物ホスホリボシルピロリン酸合成酵素１をコードするｃＤＮＡをタバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ）及びシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）から、また、その部分ｃＤＮＡをヒメツリガネゴケ（Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ ｐａｔｅｎｓ）から単離し、その塩基配列を決定した（実施例１及び実施例６、配列表の配列番号１、配列番号３及び配列番号５を参照）。
【００１２】
ホスホリボシルピロリン酸合成酵素１のセンス又はアンチセンス構築物をもつシロイヌナズナ植物及びＮｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ ｃｖ． Ｓａｍｓｕｎ ＮＮ系統のタバコ植物を詳しく特徴づけた。アンチセンス植物は様々な程度で成長の遅れを示す。遺伝子導入系統と第１及び第２世代の子孫は土壌で成長の低下を示した。成長が低下した植物では、ノーザンハイブリダイゼーションにより、野生型と比較して減少したホスホリボシルピロリン酸合成酵素１のＲＮＡ量を検出することができた（実施例５及び図３を参照）。また、遺伝子導入したアンチセンス系統では、酵素活性の測定により、野生型植物と比較して減少した量のホスホリボシルピロリン酸合成酵素１活性を検出することができた。発現レベル及びホスホリボシルピロリン酸合成酵素１活性の低下は成長の遅れと相関する。植物ではホスホリボシルピロリン酸合成酵素の幾つかのイソ型が存在する蓋然性が高いが、意外なことに、ホスホリボシルピロリン酸合成酵素のアンチセンス構築物を導入することによって植物の成長の低下が観察されることが判明した。この明瞭な関連は、ホスホリボシルピロリン酸合成酵素１が除草活性成分の好適な標的タンパク質であることを初めて明確に証明するものである。
【００１３】
本発明の別の目的は、ハイスループット法による植物ホスホリボシルピロリン酸合成酵素１の阻害剤の同定方法に関する。したがって、本発明は、植物ホスホリボシルピロリン酸合成酵素１、特にタバコ及びシロイヌナズナのホスホリボシルピロリン酸合成酵素１の適当な発現系での機能的発現、並びに、ホスホリボシルピロリン酸合成酵素１活性を測定するためのｉｎ ｖｉｔｒｏ検定システムでの、こうして調製された酵素の使用に関する。
【００１４】
植物ホスホリボシルピロリン酸合成酵素１の効果的な阻害物質を見つけ出すためには、阻害剤−酵素結合の研究を行うことができる適当な検定システムを提供することが必要である。このために、例えば、タバコ又はシロイヌナズナのホスホリボシルピロリン酸合成酵素１のｃＤＮＡ配列又はホスホリボシルピロリン酸合成酵素１のｃＤＮＡ配列の適当な断片を発現ベクター（ｐＱＥ，Ｑｉａｇｅｎ）にクローニングし、大腸菌において過剰発現させる。
【００１５】
あるいはまた、配列番号１若しくは配列番号３のＤＮＡ配列又はＤＮＡ部分配列又はこれらの配列の誘導体を含む発現カセットを、例えば他の細菌、酵母、真菌、藻類、植物細胞、昆虫細胞又は哺乳動物細胞において発現させることができる。
【００１６】
本発明の別の目的は、配列番号１又は配列番号３から誘導され、又はこれらの配列の１つとハイブリダイズし、かつホスホリボシルピロリン酸合成酵素１の生物学的活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ配列の使用である。
【００１７】
発現カセットにより発現された植物ホスホリボシルピロリン酸合成酵素１タンパク質は、特にホスホリボシルピロリン酸合成酵素１に特異的な阻害剤を見つけ出すのに適している。
【００１８】
そのために、植物ホスホリボシルピロリン酸合成酵素１を、例えば試験すべき活性成分の存在下又は不在下でホスホリボシルピロリン酸合成酵素１の活性を測定する酵素検定において使用することができる。２つの活性測定値の比較により、試験すべき活性成分の阻害挙動が定性的定量的に記録される（実施例７を参照）。
【００１９】
本発明に係る検定システムによって多数の化学物質の除草特性を迅速かつ簡単に試験することができる。この方法を用いると、多数の物質の中から強力な作用を示す物質を的確に再現可能に選択することができ、続いて、この物質を用いて当業者が熟知する別の綿密な試験を実施する。
【００２０】
本発明の別の課題は、植物ホスホリボシルピロリン酸合成酵素１の遺伝子をクローニングし、それを適当な発現カセット（例えば昆虫細胞）で過剰発現させ、細胞を破砕し、細胞抽出物を直接に、又はホスホリボシルピロリン酸合成酵素１の濃縮又は単離後に、低分子化学物質の存在下で酵素活性を測定する検定システムにおいて使用することによって、潜在的除草効果をもつ植物ホスホリボシルピロリン酸合成酵素１阻害剤を同定する方法である。
【００２１】
本発明の別の課題は、植物においてホスホリボシルピロリン酸合成酵素１活性を阻害する除草活性物質を同定する方法であり、その方法は、
ａ）ホスホリボシルピロリン酸合成酵素１活性を有する酵素をコードする付加的ＤＮＡ配列を含み、酵素活性のあるホスホリボシルピロリン酸合成酵素１を過剰に発現することができる遺伝子導入した植物、植物組織又は植物細胞を作製し、
ｂ）遺伝子導入した植物、植物細胞、植物組織又は植物器官に、また、形質転換していない植物、植物細胞、植物組織又は植物器官に、化学物質を適用し、
ｃ）化学物質を適用した後の遺伝子導入した及び形質転換していない植物、植物細胞、植物組織又は植物器官の成長又は生存能力を判定し、
ｄ）化学物質を適用した後の遺伝子導入した及び形質転換していない植物、植物細胞、植物組織又は植物器官の成長又は生存能力を比較する、
ことを含んでなり、
その際、形質転換していない植物、植物細胞、植物組織又は植物器官の成長又は生存能力は抑制されるが、遺伝子導入した植物、植物細胞、植物組織又は植物器官の成長又は生存能力は実質的に抑制されないことにより、ｂ）の前記物質が除草活性を有し、植物においてホスホリボシルピロリン酸合成酵素１の酵素活性を阻害することが示されることを特徴とする。
【００２２】
本発明の別の課題は、上記の検定システムで同定することができる除草活性化合物である。
【００２３】
除草活性を有するホスホリボシルピロリン酸合成酵素１阻害剤は枯葉剤、乾燥剤、殺草剤、特に雑草撲滅剤として使用することができる。最も広い意味で雑草とは、望ましくない場所で成長するすべての植物を意味するものとして理解すべきである。本発明に係る検定システムにより見出された活性物質が総合的除草剤又は選択的除草剤のいずれとして作用するかは、とりわけ施用量による。
【００２４】
除草活性を有するホスホリボシルピロリン酸合成酵素１阻害剤は例えば次の雑草に使用することができる。
【００２５】
下記の属の双子葉雑草：
カラシ、Ｌｅｐｉｄｉｕｍ、ヤエムグラ、ハコベ、Ｍａｔｒｉｃａｒｉａ、カミツレ、Ｇａｌｉｎｓｏｇａ、アカザ、イラクサ、キオン、ヒユ、スベリヒユ、オナモミ、ヒルガオ、サツマイモ、タデ、Ｓｅｓｂａｎｉａ、ブタクサ、アザミ、アザミ、Ｓｏｎｃｈｕｓ、ナス、Ｒｏｒｉｐｐａ、Ｒｏｔａｌａ、Ｌｉｎｄｅｒｎｉａ、オドリコソウ、イヌノフグリ、Ａｂｕｔｉｌｏｎ、Ｅｍｅｘ、チョウセンアサガオ、スミレ、Ｇａｌｅｏｐｓｉｓ、ケシ、ヤグルマギク、クローバ、キンポウゲ、タンポポ。
【００２６】
下記の属の単子葉雑草：
ヒエ、アワ、キビ、メヒシバ、Ｐｈｌｅｕｍ、イネ、Ｆｅｓｔｕｃａ、オヒシバ、Ｂｒａｃｈｉａｒｉａ、ドクムギ、イヌムギ、カラスムギ、カヤツリグサ、モロコシ、カモジグサ、Ｃｙｎｏｄｏｎ、ミズアオイ、テンツキ、オモダカ、ハリイ、フトイ、Ｐａｓｐａｌｕｍ、Ｉｓｃｈａｅｍｕｍ、Ｓｐｈｅｎｏｃｌｅａ、Ｄａｃｔｙｌｏｃｔｅｎｉｕｍ、ヌカボ、Ａｌｏｐｅｃｕｒｕｓ、Ａｐｅｒａ。
【００２７】
また本発明の目的は、シロイヌナズナ又はタバコのホスホリボシルピロリン酸合成酵素１又はその機能的等価物をコードする配列を有する発現カセットを、除草活性化合物を見つけ出す検定システムの作製のために使用することである。その場合の核酸配列は例えばＤＮＡ又はｃＤＮＡ配列である。
【００２８】
またこのような発現カセットは宿主細胞でのコーディング配列の発現を制御する調節核酸配列を含む。好ましい実施形態によれば、本発明に係る発現カセットは上流、即ちコーディング配列の５’末端にプロモーターを、下流、即ち３’末端にポリアデニル化シグナル及び場合によっては介在するホスホリボシルピロリン酸合成酵素１遺伝子のコーディング配列と機能し得る形で連結されたその他の調節エレメントを含む。機能し得る形の連結とは、コーディング配列の発現の際に各調節エレメントが機能を遂行し得るような、プロモーター、コーディング配列、ターミネーター及び場合によってはその他の調節エレメントの配列を意味する。
【００２９】
本発明のこのような発現カセットの作製は、例えば、Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ， Ｅ．Ｆ． Ｆｒｉｔｓｃｈ及びＪ． Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， ＮＹ （１９８９年）及びＴ．Ｊ． Ｓｉｈａｖｙ， Ｍ．Ｌ．Ｂｅｒｍａｎ及びＬ．Ｗ． Ｅｎｑｕｉｓｔ， Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｗｉｔｈ Ｇｅｎｅ Ｆｕｓｉｏｎｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， ＮＹ （１９８４年）及びＦ．Ｍ． Ａｕｓｕｂｅｌら， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｇｒｅｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃ． ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ （１９８７年）に記載されているように通常の組換え技術及びクローニング技術により適当なプロモーターを適当なホスホリボシルピロリン酸合成酵素１ＤＮＡ配列及びポリアデニル化シグナルと融合することによって行われる。
【００３０】
また本発明の目的は、ホスホリボシルピロリン酸合成酵素１遺伝子をコードし、ＤＮＡ配列の全長に関して配列番号１、配列番号３又は配列番号５のＤＮＡ配列と４０〜１００％の配列相同性を示す機能的に等価のＤＮＡ配列の使用である。
【００３１】
本発明の好ましい目的は、ホスホリボシルピロリン酸合成酵素１遺伝子をコードし、ＤＮＡ配列の全長に関して配列番号１、配列番号３又は配列番号５のＤＮＡ配列と６０〜１００％の配列相同性を示す機能的に等価のＤＮＡ配列の使用である。
【００３２】
本発明の特に好ましい目的は、ホスホリボシルピロリン酸合成酵素１遺伝子をコードし、ＤＮＡ配列の全長に関して配列番号１、配列番号３又は配列番号５のＤＮＡ配列と８０〜１００％の配列相同性を示す機能的に等価のＤＮＡ配列の使用である。
【００３３】
ホスホリボシルピロリン酸合成酵素１遺伝子をコードする機能的に等価な配列とは、ヌクレオチド配列が異なるにもかかわらず所望の機能を有する本発明の配列である。従って機能的等価物は本明細書に記載の配列の天然の変異型ばかりでなく、例えば化学合成によって得られるもの、また、植物のコドン利用に合うように適合させたものなど人工的ヌクレオチド配列も包含する。
【００３４】
また機能的等価物とは特に、ホスホリボシルピロリン酸合成酵素１をコードする初めに単離された配列の天然又は人工突然変異であって、所望の機能を示しつづけるものを意味する。突然変異は１以上ののヌクレオチド残基の置換、付加、失欠、交換又は挿入を包含する。従って、ヌクレオチド配列の修飾によって得られるようなヌクレオチド配列も本発明に含まれる。このような修飾の目的は、例えばそこに含まれるコーディング配列の一層の制限又は例えば別の制限酵素切断部位の導入である。
【００３５】
また機能的等価物は、出発遺伝子又は遺伝子断片と比較して機能が弱められ又は強化された変異型である。
【００３６】
さらに、十分な量の酵素、ホスホリボシルピロリン酸合成酵素１を産生するために、細菌、ラン藻、酵母、糸状菌及び藻類の形質転換のために本発明の発現カセットを使用することもできる。
【００３７】
本発明の別の目的は、ホスホリボシルピロリン酸合成酵素１活性を有し、配列番号２、配列番号４のアミノ酸配列を特徴とするタバコもしくはシロイヌナズナのタンパク質又はこのタンパク質の誘導体もしくはその一部を、除草活性化合物を見つけ出す検定システムの作製のために使用することである。
【００３８】
また本発明の目的は、ホスホリボシルピロリン酸合成酵素１活性を有し、配列番号２、配列番号４又は配列番号６のタバコ、シロイヌナズナ又はヒメツリガネゴケ（Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ ｐａｔｅｎｓ）のホスホリボシルピロリン酸合成酵素１と２０〜１００％の同一性でアミノ酸配列相同性を有する植物タンパク質を、除草活性化合物を見つけ出す検定システムの作製のために使用することである。
【００３９】
またホスホリボシルピロリン酸合成酵素１活性を有し、配列番号２、配列番号４又は配列番号６のタバコ、シロイヌナズナ又はヒメツリガネゴケ（Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ ｐａｔｅｎｓ）のホスホリボシルピロリン酸合成酵素１と５０〜１００％の同一性でアミノ酸配列相同性を有する植物タンパク質を、除草活性化合物を見つけ出す検定システムの作製のために使用することが好ましい。
【００４０】
ホスホリボシルピロリン酸合成酵素１活性を有し、配列番号２、配列番号４又は配列番号６のタバコ、シロイヌナズナ又はヒメツリガネゴケ（Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ ｐａｔｅｎｓ）のホスホリボシルピロリン酸合成酵素１と８０〜１００％の同一性でアミノ酸配列相同性を有する植物タンパク質を、除草活性化合物を見つけ出す検定システムの作製のために使用することが特に好ましい。
【００４１】
ホスホリボシルピロリン酸合成酵素１をコードする配列番号１又は配列番号３の遺伝子配列を植物に過剰発現させることによって、ホスホリボシルピロリン酸合成酵素１阻害剤に対する高い耐性が得られる。このようにして作られた遺伝子導入した植物も本発明の目的である。
【００４２】
組換え発現させたホスホリボシルピロリン酸合成酵素１遺伝子の発現効率は、例えばシュート分裂組織増殖又は出芽試験によりｉｎ ｖｉｔｒｏで決定することができる。さらに、ホスホリボシルピロリン酸合成酵素１遺伝子の、様態と程度の異なる発現及びホスホリボシルピロリン酸合成酵素１阻害物質に対する耐性へのその影響を温室試験で被検植物を用いて検定することができる。
【００４３】
また本発明の目的は、配列番号１又は配列番号３のＤＮＡ配列を含む本発明の発現カセットにより形質転換され、配列番号１又は配列番号３のＤＮＡ配列をさらに発現することによりホスホリボシルピロリン酸合成酵素１阻害剤に対して耐性をもつようになった遺伝子導入植物並びにこのような植物の遺伝子導入した細胞、組織、器官及び増殖物質である。その場合特に好適なのは遺伝子導入した栽培植物、例えばオオムギ、コムギ、ライムギ、トウモロコシ、ダイズ、イネ、ワタ、テンサイ、カノラ、ヒマワリ、アマ、アサ、ジャガイモ、タバコ、トマト、アブラナ、アルファルファ、チシャ及び様々な種類の樹木、堅果、ブドウ及びマメ科植物である。
【００４４】
アポプラスト、プラスチド、液胞、ミトコンドリア、小胞体（ＥＲ）へのターゲッティングを保証する配列か、又は適切な機能的配列の欠如により、発現産物が形成される細胞内器官である、細胞質ゾルへの残留を保証する配列が特に好ましい（Ｋｅｒｍｏｄｅ， Ｃｒｉｔ． Ｒｅｖ． Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉ． １５， ４ （１９９６年） ２８５−４２３）。
【００４５】
例えば植物の発現カセットを植物形質転換ベクターｐＢｉｎＡＲに組込むことができる。
【００４６】
植物での外部遺伝子の発現を制御することができるプロモーターは原則としてすべて発現カセットのプロモーターとして適している。特に植物プロモーター又は植物ウイルスに由来するプロモーターを使用することが好ましい。特に好ましいのはカリフラワーモザイクウイルスのＣａＭＶ３５Ｓプロモーターである（Ｆｒａｎｃｋら， Ｃｅｌｌ ２１ （１９８０年） ２８５−２９４）。このプロモーターは、導入された遺伝子の永久的かつ構成的発現を全体として生じる種々の転写エフェクター認識配列を含む（Ｂｅｎｆｅｙら， ＥＭＢＯ Ｊ． ８ （１９８９年） ２１９５−２２０２）。
【００４７】
また発現カセットは、外因的ホスホリボシルピロリン酸合成酵素１遺伝子の植物での発現を特定の時期に制御できる化学的誘導プロモーターを含むことができる。このようなプロモーター例えばＰＲＰＰ１プロモーター（Ｗａｒｄら， Ｐｌａｎｔ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２２ （１９９３年） ３６１−３６６）、サリチル酸誘導プロモーター（国際出願公開ＷＯ ９５／１９４４３号明細書）、ベンゼンスルホンアミド誘導プロモーター（欧州特許第３８８１８６号明細書）、テトラサイクリン誘導プロモーター（Ｇａｔｚら， Ｐｌａｎｔ Ｊ． ２ （１９９２年） ３９７−４０４）、アブシジン酸誘導プロモーター（欧州特許第０３３５５２８号明細書）もしくはエタノール又はシクロヘキサン誘導プロモーター（国際出願公開ＷＯ ９３／２１３３４号明細書）が文献に記載されており、とりわけ使用することができる。
【００４８】
さらにプリン又はその前駆体の生合成が行われる組織又は植物器官での発現を保証するプロモーターが特に好ましい。特に葉特異的発現を保証するプロモーターが挙げられる。ジャガイモの細胞質ゾルＦＢＰａｓｅ又はジャガイモのＳＴ−ＬＳ１プロモーターが挙げられる（Ｓｔｏｃｋｈａｕｓら， ＥＭＢＯ Ｊ．， ８ （１９８９年） ２４４５−２４５）。
【００４９】
種子特異的プロモーターによって異種タンパク質を遺伝子導入したタバコ植物の種子に全可溶性種子タンパク質の０．６７％の割合まで安定的に発現させることができる（Ｆｉｅｄｌｅｒ及びＣｏｎｒａｄ， Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０ （１９９５年） １０９０−１０９４）。従って本発明に係る発現カセットは例えば種子特異的プロモーター（とりわけファゼオリンプロモーター、ＵＳＰプロモーター又はＬＥＢ４プロモーター）、ＬＥＢ４シグナルペプチド、発現させようとする遺伝子及びＥＲ保持シグナルを含むことができる。
【００５０】
ホスホリボシルピロリン酸合成酵素１をコードする挿入ヌクレオチド配列は合成的に作るかもしくは天然に得ることができ、又は合成及び天然ＤＮＡ成分の混合物を含むことができる。一般に合成ヌクレオチド配列は植物が好むコドンで作られる。この植物が好むコドンは、最も興味のある植物種において発現される最も高いタンパク質出現頻度のコドンから決定することができる。発現カセットの作製の際に、適正な読取り枠を備え、正しい方向に適宜に読取るヌクレオチド配列を得るために、種々のＤＮＡ断片を操作することができる。ＤＮＡ断片を互いに結合するために、断片にアダプター又はリンカーを付けることができる。
【００５１】
また上記で例示したように、ホスホリボシルピロリン酸合成酵素１遺伝子の発現に所望の性質を介在させるかぎり、人工的ＤＮＡ配列が適当である。このような人工的ＤＮＡ配列は、例えば、ホスホリボシルピロリン酸合成酵素１活性を有するタンパク質の逆翻訳、又はｉｎ ｖｉｔｒｏ選択により確かめることができる。特に適当なのは、宿主−植物間で特異的なコドン利用に基づきポリペプチド配列の逆翻訳によって得たコーディングＤＮＡ配列である。植物遺伝学的方法に精通する当業者は、形質転換される植物の他の既知遺伝子のコンピューター解析により特異的コドン利用をたやすく決定することができる。
【００５２】
本発明の別の適当な等価核酸配列として、融合タンパク質をコードする配列が挙げられる。その場合融合タンパク質の成分は植物ホスホリボシルピロリン酸合成酵素１ポリペプチド又は機能的に等価なその一部である。融合タンパク質の第２の部分は例えば酵素活性を有する別のポリペプチド又は抗原性のポリペプチド配列であり、これによってホスホリボシルピロリン酸合成酵素１発現の検証が可能である（例えばｍｙｃ標識又はｈｉｓ標識）。しかしそれは調節タンパク質配列、例えばホスホリボシルピロリン酸合成酵素１タンパク質を所望の作用部位に導くシグナルペプチド又はトランジットペプチドであることが好ましい。
【００５３】
プロモーター及びターミネーター領域に、この配列の挿入に対する１以上の制限部位を含むリンカー又はポリリンカーを転写方向に適宜に設けなければならない。通常リンカーは１〜１０、多くの場合１〜８、好ましくは２〜６の制限部位を有する。一般に調節領域内のリンカーは１００ｂｐ未満、しばしば６０ｂｐ未満、但し少なくとも５ｂｐの大きさを有する。本発明に係るプロモーターは宿主植物に対して未変性又は相同であることも、異種又は異型であることも可能である。本発明に係る発現カセットは５’−３’−転写方向に本発明に係るプロモーター、任意の配列及び転写終結領域を含む。種々の終結領域を相互に任意に交換することができる。
【００５４】
また適当な制限切断部位を設け、又は過剰のＤＮＡもしくは制限切断部位を取り除く操作を行うことができる。挿入、失欠又は置換、例えば転移及びトランスバージョンが適当な場合には、ｉｎ ｖｉｔｒｏ突然変異誘発、プライマー修復、制限又は連結を使用することができる。適当な操作、例えば制限、チューイングバック（ｃｈｅｗｉｎｇ−ｂａｃｋ）、又は、平滑末端のオーバハングの埋め込みで、断片の相補的末端を連結のために利用することができる。
【００５５】
好ましいポリアデニル化シグナルは植物ポリアデニル化シグナル、特にアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）のＴ−ＤＮＡポリアデニル化シグナル、特にＴｉプラスミドｐＴｉＡＣＨ５のＴ−ＤＮＡ（オクトピン合成酵素）の遺伝子３のＴ−ＤＮＡポリアデニル化シグナルに実質的に相当するポリアデニル化シグナル（Ｇｉｅｌｅｎら， ＥＭＢＯ Ｊ．， ３ （１９８４年） ８３５）又は機能的等価物である。
【００５６】
ホスホリボシルピロリン酸合成酵素１をコードするＤＮＡで宿主植物を形質転換するために、本発明の発現カセットがインサートとして組換えベクターに組込まれる。そのベクターＤＮＡはさらに機能的調節シグナル、例えば複製又は組込みのための配列を含む。適当なベクターがとりわけ“Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ”（植物分子生物学及び生物工学の方法）（ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ， ６／７章， ７１−１１９）に記載されている。
【００５７】
植物のゲノムへの異種遺伝子の移入は形質転換と呼ばれる。その場合植物の形質転換及び植物組織又は植物細胞による植物の再生のための上記の方法が一過性又は安定的形質転換のために利用される。適当な方法はポリエチレングリコール誘導ＤＮＡ取込みによる原形質体形質転換、遺伝子砲によるバイオリスティック法、エレクトロポレーション、ＤＮＡ含有溶液中の乾燥胚のインキュベーション、マイクロ注入及びアグロバクテリウム菌介在型遺伝子移入である。上記の方法は例えばＢ．Ｊｅｎｅｓら， Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ ｆｏｒ Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ， Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｐｌａｎｔｓ， １巻， Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ａｎｄ Ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ、 Ｓ．Ｄ．Ｋｕｎｇ及びＲ．Ｗｕ監修、 Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ （１９９３年） １２８−１４３及びＰｏｔｒｙｋｕｓ Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ． Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃ． Ｂｉｏｌ． ４２ （１９９１年） ２０５−２２５に記載されている。発現される構築物は、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）を形質転換するのに適したベクター、例えばｐＢｉｎ１９中にクローニングされる（Ｂｅｖａｎら， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １２ （１９８４年） ８７１１）。
【００５８】
本発明の発現カセットで形質転換したアグロバクテリウム菌も周知のように例えば傷つけた葉又は葉片をアグロバクテリウム懸濁液にひたし、続いて適当な培地で培養することによって、植物特に栽培植物、例えば穀物、トウモロコシ、ダイズ、イネ、ワタ、テンサイ、カノラ、ヒマワリ、アマ、アサ、ジャガイモ、タバコ、トマト、ナタネ、アルファルファ、チシャ及び様々な種類の樹木、堅果及びブドウ並びにマメ科植物の形質転換のために使用することができる。
【００５９】
プリンの生合成部位は一般に葉組織であるから、ホスホリボシルピロリン酸合成酵素１遺伝子の葉特異的発現は有意義である。しかしプリン生合成は必ずしも葉組織に限定されず、植物のその他のすべての部分（例えば脂肪含有種子）でも組織特異的に行われることは明白である。
【００６０】
さらに、外因的ホスホリボシルピロリン酸合成酵素１遺伝子の構成性発現が有利である。他方では誘導性発現も望ましいようである。
【００６１】
上記で引用した組換え及びクローニング技術を使用して、本発明の発現カセットを例えば大腸菌で増殖させることが可能な適当なベクターにクローニングすることができる。適当なクローニングベクターはとりわけｐＢＲ３３２、ｐＵＣシリーズ、Ｍ１３ｍｐシリーズ及びｐＡＣＹＣ１８４である。特に適当なのは、大腸菌にもアグロバクテリウム菌にも複製できるバイナリーベクターである。
【００６２】
発明の別の目的は植物、植物細胞、植物組織又は植物器官の形質転換のための本発明の発現カセットの使用に関する。好ましい使用目的は植物のホスホリボシルピロリン酸合成酵素１含量を増加することである。
【００６３】
プロモーターの選択に応じて、発現を葉、種子又は植物のその他の部分に特異的に生じさせることができる。このような遺伝子導入した植物、ならびにその繁殖物質および植物細胞、植物組織又は植物器官が本発明の別の目的である。
【００６４】
本発明を下記の実施例で説明するが、これに限定されるものではない。
【００６５】
実施例の基礎をなす組換え法：
一般的クローニング法
クローニング法、例えば制限切断、ＤＮＡ単離、アガロースゲル電気泳動、ＤＮＡ断片の精製、ニトロセルロース及びナイロン膜への核酸の転写、ＤＮＡ断片の連結、大腸菌細胞の形質転換、細菌培養、および組換えＤＮＡの配列決定分析をＳａｍｂｒｏｏｋら， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ （１９８９年）； ＩＳＢＮ ０−８７９６９−３０９−６に記載されているように行った。アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）の形質転換はＨｏｆｇｅｎ及びＷｉｌｌｍｉｔｚｅｒの方法（Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄ Ｒｅｓ． １６ （１９８８年）， ９８７７）に従って行った。アグロバクテリウム菌はＹＥＢ培地（Ｖｅｒｖｌｉｅｔら， Ｇｅｎ． Ｖｉｒｏｌ． ２６ （１９７５年）， ３３）において増殖させた。
【００６６】
組換えＤＮＡの配列決定分析
ＡＢＩ社のレーザー蛍光ＤＮＡシークエンサーを使用してＳａｎｇｅｒの方法（Ｓａｎｇｅｒら， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ７４ （１９７７年）， ５４６３−５４６７）に従って、組換えＤＮＡ分子を配列決定した。発現される構築物のポリメラーゼ・エラーを避けるために、ポリメラーゼ連鎖反応から生じる断片を配列決定し、検査した。
【００６７】
植物組織由来の全ＲＮＡの分析
植物の全ＲＮＡをＬｏｇｅｍａｎｎらの方法（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ． １６３ （１９８７年）， １６）で単離し、ホルムアルデヒド含有アガロースゲルで分離した（Ｌｅｈｒａｃｈら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．１６（１９７７年）， ４７４３）。ナイロン膜（Ｇｅｎｅ Ｓｃｒｅｅｎ、ＮＥＮ）へのキャピラリー転写（ｔｒａｎｓｆｅｒ）を２０ｘＳＳＣ（１．５Ｍ ＮａＣｌ、１５０ｍＭクエン酸ナトリウム）中で一晩行った。ハイブリダイゼーション緩衝液（５００ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．２）、７％ＳＤＳ、０．５％ウシ血清アルブミン、１ｍＭ ＥＤＴＡ）における２時間のプレハイブリダイゼーションの後、放射標識したＮｔＰｒｓ１プローブを用いて６５℃で１６時間にわたりハイブリダイゼーションを行った。続いてフィルターを次の条件で洗浄した：６ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで６５℃、１０分及び４ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで６５℃、５分。
【００６８】
別段触れない限り、使用した薬品は、分析級のもので、Ｆｌｕｋａ（ノイウルム）、Ｍｅｒｃｋ（ダルムシュタット）、Ｒｏｔｈ（カールスルーエ）、Ｓｅｒｖａ（ハイデルベルク）及びＳｉｇｍａ（ダイゼンホーフェン）から入手した。溶液はＭｉｌｌｉ−Ｑ ｗａｔｅｒ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、エッシュボルン）による発熱物質を含まない純水（以下の本文ではＨ２Ｏと称する）で作製した。制限エンドヌクレアーゼ、ＤＮＡ修飾酵素及び分子生物学的キットはＡＧＳ（ハイデルベルク）、Ａｍｅｒｓｈａｍ（ブラウンシュヴァイク）、Ｂｉｏｍｅｔｒａ（ゲッチンゲン）、Ｒｏｃｈｅ（マンハイム）、Ｇｅｎｏｍｅｄ（バートエインハウゼン）、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（シュヴァルバッハ／タウナス）、Ｎｏｖａｇｅｎ（米国ウイスコン州マジソン）、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ（ワイターシュタット）、Ｐｈａｒｍａｃｉａ（フライブルク）、Ｑｉａｇｅｎ（ヒルデン）及びＳｔｒａｔａｇｅｎｅ（ハイデルベルク）から入手した。これらは別段触れない限り製造元の指示に従って使用した。
【００６９】
大腸菌（ＸＬ−１ Ｂｌｕｅ）はＳｔｒａｔａｇｅｎｅ社から入手した。植物の形質転換に使用されるアグロバクテリウム菌株（プラスミドｐＧＶ３８５０ｋａｎを有するＣ５８Ｃ１）はＤｅｂｌｅａｒｅら（Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄ Ｒｅｓ． １３ （１９８５年） ４７７７）が説明した。
【００７０】
実施例１
タバコ及びシロイヌナズナの５−ホスホリボシル−１−ピロリン酸合成酵素１（Ｐｒｓ１）をコードするｃＤＮＡクローンの単離
シロイヌナズナのＰｒｓ１をコードするｃＤＮＡ配列（登録番号Ｘ８３７６４；Ｋｒａｔｈ及びＨｏｖｅ−Ｊｅｎｓｅｎ，１９９５年）を使用して次の配列のオリコヌクレオチドを導き出した。
2004503210.tif 000002
【００７１】
これらのオリゴヌクレオチドを使用してシロイヌナズナ（品種Ｌａｎｄｓｂｅｒｇ ｅｒｅｃｔａ）の葉のｃＤＮＡのｃＤＮＡ断片を増幅し（９４℃で３０秒、４５℃で４５秒、７２℃で２分、３５サイクル）、続いてＥｃｏＲＶによって、ｐＧＥＭ−Ｔベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）に平滑末端クローニングした（ｂｌｕｎｔ−ｃｌｏｎｅｄ）。配列決定によってシロイヌナズナＰｒｓ１ ｃＤＮＡクローンの同一性を確認することができた（配列番号３を参照）。
【００７２】
λＺＡＰＩＩ中のタバコ品種Ｓａｍｓｕｎ ＮＮ由来のソース（ｓｏｕｒｃｅ）である葉のｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングのためにこのクローンを使用した。ｃＤＮＡライブラリーを２．５ｘ１０５プラーク形成単位の力価で平板培養し、プラークスクリーニング法により分析した（Ｔ． Ｍａｎｉａｔｉｓ， Ｅ．Ｆ． Ｆｒｉｔｓｃｈ及びＪ． Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ ＮＹ １９８９年）。１２個のファージ集団が単離され、これを用いて第２のスクリーニングステップを行った。こうして遺伝的に一様なファージ集団が単離され、これをｉｎ ｖｉｔｒｏ切除のために使用した。制限分析によっては、ｃＤＮＡクローン間の相違が見出されなかった。最大の挿入を有する４つのクローンを配列決定のために選んだ。配列データは、これらが５−ホスホリボシル−１−ピロリン酸合成酵素１をコードするｃＤＮＡクローンであることを示す。
【００７３】
ｃＤＮＡクローンＮｔＰｒｓ１（配列番号１を参照）は１２５１ｂｐの長さがあり、位置２１に開始コドン、位置１０８９に終止コドンＴＡＧを有する。オープンリーディングフレームは３５６個のアミノ酸を含む分子量３８．３ＫＤａのタンパク質をコードする。１５２ｂｐからなる３’−非翻訳領域はポリアデニル化シグナルを含まない。ｃＤＮＡクローンＮｔＰｒｓ１から推定されるタンパク質配列（配列番号２を参照）の分析で、コンピューター解析により初めの３６個のアミノ酸の中に１個の葉緑体輸送ペプチドが同定された。
【００７４】
実施例２
タバコ植物の形質転換のためのバイナリーベクターの生成
アンチセンス配向のプラスミドｐＢｉｎＡＲ−ＮｔＰｒｓ１を生成するために、バイナリーベクターｐＢｉｎＡＲ（Ｈｏｆｇｅｎ及びＷｉｌｌｍｉｔｚｅｒ，Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉｅｎｃｅ ６６（１９９０年）， ２２１−２３０）を、ＢａｍＨｌを用いてポリリンカーにおいて切断した。プラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ−ＮｔＰｒｓ１（図１）から１２２６ｂｐのＮｔＰｒｓ１ ｃＤＮＡ断片（配列番号１）をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫプラスミドのポリリンカーのＢａｍＨｌ切断部位及びＮｔＰｒｓ１ ｃＤＮＡ（１２０８ｂｐ）のＢａｍＨＩ切断部位で単離した。この断片をＢａｍＨｌ切断ベクターｐＢｉｎＡＲに連結した。連結されたＮｔＰｒｓ１ ｃＤＮＡ断片の配向をＨｉｎｄＩＩＩによる制限で検査した。生じた３００ｂｐのＨｉｎｄＩＩＩ断片はアンチセンス配向を証明した。プラスミドｐＢｉｎＡＲ−ＮｔＰｒｓ１−アンチセンス（図２）は３つの断片Ａ、Ｂ及びＣからなる。断片ＡはベクターｐＢｉｎＡＲの構成部分として、遺伝子導入した植物における構成的発現を生じさせるカリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）の３５Ｓプロモーターを含む。この断片はＣａＭＶのヌクレオチド６９０９〜７４３７を含む（Ｆｒａｎｋ，Ｃｅｌｌ ２１（１９８０年）， ２８５）。断片Ｂは、プラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ−ＮｔＰｒｓ１からＢａｍＨＩ断片として単離され、ベクターｐＢｉｎＡＲのポリリンカーのＢａｍＨＩ部位にクローニングされた１２２６ｂｐのＮｔＰｒｓ１ ｃＤＮＡ断片を含む。断片Ｃは、ヌクレオチド１１７４９〜１１９３９を含むＴｉプラスミドｐＴｉＡＣＨ５（Ｇｉｅｌｅｎら、 ＥＭＢＯ Ｊ． ３ （１９８４年）， ８３５）のＴ−ＤＮＡの遺伝子３（オクトピン合成酵素、ＯＣＳ）のポリアデニル化シグナルを含む。
【００７５】
図１に示したように、ｃＤＮＡライブラリーの生成には、個々の断片にＥｃｏＲＩ／Ｎｏｔｌリンカーを配し、続いてｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔのポリリンカーのＥｃｏＲＩ制限部位にクローニングすることが含まれた。従ってＮｏｔＩ切断部位はｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔのポリリンカーの当初の構成部分ではない。
Ａ　プラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫの多重クローニング部位
Ｂ　ＮｔＰｒｓ１ ｃＤＮＡ １２５１ｂｐ
Ｃ　プラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫの多重クローニング部位
【００７６】
図２は遺伝子導入したタバコ植物にアンチセンス配向でＮｔＰｒｓ１ ｃＤＮＡ（１２２６ｂｐ）を発現するための発現カセットを示す。
Ａ： カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）の３５Ｓプロモーター、５２９ｂｐ、ＣａＭＶのヌクレオチド６９０９〜７４３７
Ｂ： ＢａｍＨＩ断片としてプラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ−ＮｔＰｒｓ１から単離され、ＮｔＰｒｓ１のコーディング領域の塩基１〜１２０８を含むアンチセンス配向のＮｔＰｒｓ１ ｃＤＮＡ（１２２６ｂｐ）
Ｃ： ＴｉプラスミドｐＴｉＡＣＨ５（１９２ｂｐ）のＴ−ＤＮＡの遺伝子３（オクトピン合成酵素、ＯＣＳ）のポリアデニル化シグナル
【００７７】
実施例３
アグロバクテリウム・ツメファシエンスによるタバコ植物の形質転換
タバコ植物の形質転換をＲｏｓａｈｌ， Ｓ．， Ｓｃｈｅｌｌ， Ｊ．及びＷｉｌｌｍｉｔｚｅｒ， Ｌ．， （ＥＭＢＯ Ｊ． ６ （１９８７年）， １１５５−１１５９）の方法で行った。プラスミドｐＢｉｎＡＲ−ＮｔＰｒｓ１アンチセンス（図２）をプラスミドｐＧＶ３８５０ｋａｎを有するアグロバクテリウム・ツメファシエンスＣ５８Ｃ１（Ｄｅｂｌｅａｒｅら、Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄ Ｒｅｓ． １３ （１９８５年）， ４７７７）に形質転換した。タバコ植物（タバコ品種Ｓａｍｓｕｎ ＮＮ）の形質転換のために、ＹＥＢ培地（Ｖｅｒｖｌｉｅｔら、 Ｇｅｎ． Ｖｉｒｏｌ． ２６ （１９７５年）， ３３）での陽性の形質転換アグロバクテリウム菌コロニーの一晩培養物１０ｍｌを使用した。無菌の植物の葉のディスク（約１ｃｍ２ずつ）をペトリ皿でこの溶液とともに５〜１０分間インキュベートした。これに続いて、０．８％ＢｉＴｅｋＴＭ寒天（ＤＩＦＣＯ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を有するＭＳ培地（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ−Ｓｋｏｏｇ培地、Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ及びＳｋｏｏｇ，Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ， １５ （１９６２年）， ４７３）で２５℃の暗所で２日間のインキュベーションを行った。２日の後に明所１６時間／暗所８時間で培養を続け、５００ｍｇ／ｌ Ｃｌａｆｏｒａｎ（セホタキシム−ナトリウム）、１００ｍｇ／ｌカナマイシン、１ｍｇ／ｌベンジルアミノプリン（ＢＡＰ）、０．２ｍｇ／ｌナフチル酢酸及び１．６ｇ／ｌグルコースを有するＭＳ培地で１週間サイクルで続けた。成長するシュートを２％スクロース、２５０ｍｇ／ｌ Ｃｌａｆｏｒａｎ及び０．８％ ＢｉＴｅｋＴＭ寒天を有するＭＳ培地に移した。根づいた後、シュートを土壌に移し、制御環境キャビネットで明所１６時間、暗所８時間で２週間成長させた後、大型の植木鉢に植え替えて温室に入れた。
【００７８】
実施例４
遺伝子導入した植物の分析
構築物ｐＢｉｎＡＲ−ＮｔＰｒｓ１アンチセンスで形質転換される遺伝子導入した植物は、形質転換していない野生型植物と比較して、葉の白化区域が大きく、葉の退色が激しいのが特徴である。一般に遺伝子導入したｐＢｉｎＡＲ−ＮｔＰｒｓ１−アンチセンス植物は成長が著しく阻害された植物を含む。
【００７９】
このデータはホスホリボシルピロリン酸合成酵素１発現の減少とタバコ植物の成長の低下との直接的関連を構成し、従ってホスホリボシルピロリン酸合成酵素１が除草活性物質の適当な標的タンパク質であることが確認される。
【００８０】
実施例５
ノーザン分析によるＮｔＰｒｓ１アンチセンス遺伝子発現の検証
ＮｔＰｒｓ１ ｃＤＮＡ断片の鎖特異的標識によりＲＮＡ分析を行った。鎖特異的放射標識を行うために、プラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ−ＮｔＰｒｓ１をＥｃｏＲＩで切断し、ＮｔＰｒｓ１遺伝子のコーディング領域を有する１２５１ｂｐの断片を単離した。反応において、次の配列：５’ＣＴＴ ＣＡＡ ＧＴＴ ＣＣＡ ＧＡＣ ＡＡＣ ＡＧＴ ＧＴＣ−３’の３’−オリゴヌクレオチドを使用した。反応にＦｉｎｎｚｙｍｅｓ Ｏｙ社のキットを使用し、その取扱説明書を使用した。反応混合物は約１０ｎｇのＤＮＡ断片、０．１ｍＭのオリゴヌクレオチド、５ｍｌの１０ｘ緩衝液、１．５ｍＭのＭｇＣｌ２、５ｍＭのデオキシヌクレオチド（ｄＧＴＰ，ｄＡＴＰ，ｄＴＴＰ）、５０ｍＣｉのａ−３２Ｐ−ｄＣＴＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）及び１ｍｌのＤｙＮａｚｙｍｅポリメラーゼを含んでいた。増幅条件を次のように選定した：
変性温度：　　　　　　　９５℃、５秒
アニーリング温度：　　　４５℃、３０秒
伸長温度：　　　　　　　７２℃、１分
サイクル数：　　　　　　４０
【００８１】
ノーザン分析を行うために、約０．５〜１．０ｃｍの大きさのシンク（ｓｉｎｋ）葉から全ＲＮＡを単離し、ホルムアルデヒド含有アガロースゲルで２０μｇのＲＮＡを分離し、キャピラリーブロッティングによりナイロン膜に断片を転写した。ナイロン膜を、鎖特異的標識ＮｔＰｒｓ１遺伝子プローブとハイブリダイズさせた。図３は野生型（ＷＴ）と遺伝子導入した植物に対するハイブリダイゼーションシグナルを示す。
【００８２】
次にハイブリダイゼーションシグナルをホスホイメージャー（Ｐｈｏｓｐｈｏ−Ｉｍａｇｅｒ）で定量した。植物の表現型に応じて４５−１系統でＮｔＰｒｓ１合成酵素ｍＲＮＡの転写物蓄積が劇的に減少した。植物３３．４、１４．５及び３０．４はｍＲＮＡ蓄積の減少と、それに類似してあまり鮮明でない成長表現型を示すだけである。
【００８３】
実施例６
ヒメツリガネゴケ（Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ ｐａｔｅｎｓ）由来のｃＤＮＡライブラリーの生成
本研究のために、ハンブルク大学遺伝学部門の公然のコレクションのヒメツリガネゴケ（Ｈｅｄｗ．）Ｂ．Ｓ．Ｇ．種の植物を利用した。使用した株１６／１４はＨ．Ｌ．Ｋ． Ｗｈｉｔｅｈｏｕｓｅ（英国ハンティンドンシャー、Ｇｒａｎｓｄｅｎ Ｗｏｏｄ）が収集し、Ｅｎｇｅｌの方法（Ａｍ． Ｊ． Ｂｏｔ． ５５ （１９６８年）， ４３８−４４６）により胞子から継代培養された。胞子及びガメトフォア再生によってコケ植物の増殖を行った。半数体胞子から発育する原糸体組織は葉緑体に富むクロロネマと葉緑体が乏しいカウロネマからなり、約１２日後にカウロネマに芽が形成される。これらの芽はガメトフォアへと成長し、造精器と造卵器を備えている。受精の後に二倍胞子体、短い子嚢柄（ｓｅｔａ）と胞子嚢（ｓｐｏｒｅ ｃａｐｓｕｌｅ）が生じ、胞子嚢内で成熟胞子が発育する。
【００８４】
ｃＤＮＡライブラリーを生成するために、９日齢の原糸体から単離したポリＡ＋−ＲＮＡから開始して、マウス白血病ウイルス逆転写酵素（Ｒｏｃｈｅ、ドイツ国マンハイム）とオリゴ−ｄ（Ｔ）プライマーにより第１鎖合成を行った。１２℃（２時間）、１６℃（１時間）及び２２℃（１時間）でＤＮＡポリメラーゼＩ、クレノウ酵素とのインキュベーション、ＲＮａｓｅＨ消化により第２鎖合成を行った。６５℃（１０分）でインキュベーションして反応を停止し、氷に移した。３７℃（３０分）でＴ４−ＤＮＡポリメラーゼ（Ｒｏｃｈｅ、マンハイム）により２本鎖ＤＮＡを満たし、ヌクレオチドをフェノール／クロロホルム抽出及びセファデックスＧ５０でのクロマトグラフィーにより分離した。ＥｃｏＲＩアダプター（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、ドイツ国フライブルク）をＴ４−ＤＮＡリガーゼ（Ｒｏｃｈｅ、１２℃、１６時間）によりｃＤＮＡ末端に連結し、ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｒｏｃｈｅ、３７℃、３０分）によりリン酸化した。ＤＮＡをゲル電気泳動で分離し、３００塩基対より大きい断片をフェノール抽出により分離し、Ｅｌｕｔｉｐ−Ｄカラムを用いて濃縮した（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ及びＳｃｈｕｅｌｌ、ドイツ国ダッセル）。Ｇｉｇａｐａｃｋ Ｇｏｌｄ Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、オランダ国アムステルダム）を用いて製造元の指示に従って、得られた２本鎖ＤＮＡをλＺＡＰＩＩに連結した。ｉｎ ｖｉｖｏ切除により、大腸菌ＸＬＩ ｂｌｕｅ細菌の形質転換に使用されるプラスミドＤＮＡを得た。単一コロニーからクローンを液体培養で増殖させ、プラスミドＤＮＡを単離し、これを連続反応のために使用した。相同性比較により５−ホスホリボシル−１−ピロリン酸合成をコードするＥＳＴを同定した（配列番号５を参照）。
【００８５】
実施例７
５−ホスホリボシル−１−ピロリン酸合成酵素１検定システム
ハイスループットスクリーニング法用の活性のあるシロイヌナズナ５−ホスホリボシル−１−ピロリン酸合成酵素１を得るために、ベクターｐＧＥＭ−Ｔ ＡｔＰｒｓ１（図２）から制限酵素ＢａｍＨＩ及びＥｃｏＲＩ（プライマーＲＢＰＲＰＰ３及びＲＢＰＲＰＰ４によって挿入された切断部位）を用いてシロイヌナズナのＰｒｓ１断片を得て、同様に切断した導入ベクターｐＦａｓｔＢａｃＨＴｂ（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）にクローニングした。得られた構築物ｐＦＡＳＴＢＡＣ ＨＴｂ−ＡｔＰｒｓ１を製造元の指示（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）に従って、組換えバキュロウイルスの生成のために使用した。活性のある５−ホスホリボシル−１−ピロリン酸合成酵素１の酵素を生成するために、このウイルスを製造元の指示（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）に従ってＳｆ２１昆虫細胞の感染のために使用した。細胞を超音波処理した後にホスホリボシルピロリン酸合成酵素１の特異的酵素活性を測光法で測定した。バッチ９０μｌにつき下記の成分を使用した：
１６．４ｍＭ ＮａＨ２Ｐ緩衝液、ｐＨ７．８；０．３ｍＭホスホエノールピルビン酸塩（Ｓｉｇｍａ Ｐ−７１２７９）；０．３ｍＭ ＭｇＣｌ２；０．１５ｍＭ ＡＴＰ（Ｓｉｇｍａ Ａ−３３７７）；０．０６ｍＭ ＮＡＤＨ（Ｓｉｇｍａ Ｎ−８１２９）；０．３単位ピルビン酸キナーゼ（Ｓｉｇｍａ Ｐ−９１３６）；０．２単位ミオキナーゼ（Ｓｉｇｍａ Ｍ−５５２０）；０．３単位Ｌ乳酸脱水素酵素（Ｂｏｈｒｉｎｇｅｒ／Ｒｏｃｈｅ １２７２３０）；阻害剤検定用に０．５〜５ｍＭコルジセピン５’−三リン酸（Ｓｉｇｍａ Ｃ−９１３７）；６４ｍＭリボース−５−リン酸（Ｓｉｇｍａ Ｒ−７７５０）。
【００８６】
溶解緩衝液（５０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、３００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．８）中で細胞を超音波処理した後、１８μｇの全タンパク質を使用する。製造元の指示（Ｑｉａｇｅｎ）に従って、ベクターにより導入されたＨｉｓタグのアフィニティークロマトグラフィーによりさらなる精製を達成することができる。タンパク質の緩衝を変えるためにＰＤ−１０カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）と標準濃縮法（例えば、硫酸アンモニウム沈殿法）を使用する。測定されるものは、３４０ｎｍでのＮＡＤＨの減少である。コルジセピン−５’−三リン酸（他の高等真核生物の５−ホスホリボシル−１−ピロリン酸合成酵素の阻害剤）は、植物の５−ホスホリボシル−１−ピロリン酸合成酵素１の酵素活性も阻害することが示された。
【図面の簡単な説明】
【図１】
アンチセンスプラスミドｐＢｉｎＡＲ−ＮｔＰｒｓ１を作るためのプラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ−ＮｔＰｒｓ１の図である。
【図２】
形質転換したタバコ植物にアンチセンス方向にＮｔＰｒｓ１ ｃＤＮＡ（１２２６ｂｐ）を発現させるための発現カセットの図である。
【図３】
野生型（ＷＴ）及び遺伝子導入植物のハイブリダイゼーションシグナルの図である。
【図４】
シロイヌナズナの活性５−ホスホリボシル−１−ピロリン酸合成酵素１を得るためのベクターｐＧＥＭ−Ｔ−ＡｔＰｒｓ１の図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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