(57)【要約】（ｉ）不活性な担体中のリポーターコンバーターにより少なくとも部分的にコーティングされた第一のストリップ材料を含む第一のディップストリップと、（ｉｉ）リポーター前駆体により少なくとも部分的にコーティングされた第二のストリップ材料を含む第二のディップストリップとを含んでなる測定システムが提供される。また、単一の折りたたみ可能または脆弱なストリップを含む測定システムや、定量測定法も提供される。
2004524529.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）不活性な担体中のリポーターコンバーターによって少なくとも部分的にコーティングされた第一のストリップ材料を含む第一のディップストリップと、
（ｉｉ）リポーター前駆体によって少なくとも部分的にコーティングされた第二のストリップ材料を含む第二のディップストリップと
を含んでなる測定システム。
【請求項２】
前記リポーターコンバーター物質と前記リポーター前駆体が、それぞれディップストリップの末端に試薬の点または領域として予め形成されている請求項１記載の測定システム。
【請求項３】
前記リポーターコンバーター物質の量が１から１０％（ｗ／ｗ）である請求項１記載の測定システム。
【請求項４】
例えば、前記リポーター前駆体がアルカリホスファターゼである時、前記リポーターコンバーターがブロモクロロインドリルホスフェート／ニトロブルーテトラゾリウム塩が可能である（ＢＣＩＰ／ＮＢＴ）請求項１記載の測定システム。
【請求項５】
存在する前記不活性な担体の量が０．１から４％（ｗ／ｗ）である請求項１記載の測定システム。
【請求項６】
前記不活性な担体が高分子化合物である請求項１記載の測定システム。
【請求項７】
前記不活性な担体がタンパク質系物質である請求項１記載の測定システム。
【請求項８】
前記担体がゼラチンである請求項１記載の測定システム。
【請求項９】
前記担体が、ゼラチン、単糖類、二糖類、多糖類の群から選択される請求項１記載の測定システム。
【請求項１０】
前記リポーターコンバーターおよび前記リポーター前駆体の一方または両方が、酸化剤を含む請求項１記載の測定システム。
【請求項１１】
前記酸化剤がリポーターコンバーターの中に含まれている請求項１０記載の測定システム。
【請求項１２】
前記酸化剤が０．１から４％（ｗ／ｗ）の濃度で存在する請求項１１記載の測定システム。
【請求項１３】
前記酸化剤が過酸化水素である請求項１０記載の測定システム。
【請求項１４】
前記リポーターコンバーター物質を前記リポーター前駆体と接触または接近させることを可能にするために、前記第一のディップストリップと前記第二のディップストリップは、折りたたみ可能なまたは脆弱な単一のストリップを含むことができる請求項１記載の測定システム。
【請求項１５】
前記リポーターコンバーター物質を前記リポーター前駆体物質と接触または接近させることを可能にするために、前記単一のストリップには、折り畳み可能な領域が設けられている請求項１４記載の測定システム。
【請求項１６】
前記ストリップ材料が粘着性の表面を有する請求項１４記載の測定システム。
【請求項１７】
前記ストリップ材料が少なくとも部分的に粘着層でコーティングされている請求項１６記載の測定システム。
【請求項１８】
前記システムは必要な試薬の全てを単一のストリップに含んでいる請求項１４記載の測定システム。
【請求項１９】
その第一の末端にリポーターコンバーターと担体が設けられ、第二の末端にリポーターコンバーターと担体が設けられ、第二の末端に酵素で覆われたリポーター前駆体と担体が設けられた単一のストリップを含む請求項１８記載の測定システム。
【請求項２０】
請求項１記載の第一のディップストリップと第二のディップストリップを含む測定キット。
【請求項２１】
請求項１４記載の脆弱なまたは折りたたみ可能なディップストリップを含む測定キット。
【請求項２２】
前記キットがクランプシステムも含む請求項２０または２１記載の測定キット。
【請求項２３】
請求項１または１４記載のディップストリップの使用を含む定量測定法。
【請求項２４】
リポーター前駆体のｐＨが８．５以上である請求項２３記載の方法。
【請求項２５】
請求項１または１４記載のディップストリップの使用と、その後の分光光度法による比色分析を含む定性測定法。
【請求項２６】
添付具体例を引用して十分に説明された測定システムまたは方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新しい分析方法と、そのような方法を実施するための新しい装置に関する。
【０００２】
特に、本発明は、新しい測定法と測定装置に関する。
【背景技術】
【０００３】
酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）は、１９７１年に初めて発表され、それ以来、診断ウィルス学、環境分析、司法分析を含む多くの分野において重要な技術となっている。ＥＬＩＳＡは、多くの煩わしい血清学的技術に取って代わった。一般に、ＥＬＩＳＡ技術は、適切な緩衝液に直接または抗体を介して抗原を可溶化し、次にこの溶液を、例えばポリスチレン表面のようなプラスチック表面にコーティングすることを含むものである。次に、血清を加えると、存在する抗体は全て抗原に付着することができ、これによって固相に結合される。抗体が存在するか否かは、例えば、抗ヒト免疫グロブリン複合体、あるいは適切な抗原に特異的な複合体を用いて確認できる。結合した複合体の量は、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰＯ）またはアルカリホスファターゼのような適切な基質を加えることにより測定できる。また、視覚的な方法または分光光度法を用いて、存在する抗原の定量分析を実施できる。
【０００４】
ＥＬＩＳＡ技術が最初に開発されて以来、ＥＬＩＳＡは現在、レクチンおよび核酸（ＲＮＡおよびＤＮＡ）のようなその他の一次結合物質の定量分析に利用されている。
【０００５】
分光光度法は、例えば、マイクロタイタープレートのウェルまたはディップストリップ装置を用いて実施できる。一般に、「リポーター物質」、例えば、スポット強度の直接の観察および／または検出を可能にするために必要なスペクトルまたは光反映特性を有する分子で標識した分子を用いて、発色または蛍光のスポット／ドットを生じることができる。このようなリポーター物質の例として、例えば、一次または二次抗体またはアビジンに結合された蛍光リポゾーム、金標識高分子、赤血球、ラテックス凝集が挙げられる。
【０００６】
あるいは、一次結合分子に付着させた酵素を使用することにより「リポーター物質」を生成できる。例えば、基質（「コンバーター基質」）をリポーター酵素などのリポーター前駆体に加え、リポーター前駆体を必要なスペクトル特性を有するリポーター物質に変換することができる。最も一般的に使用されているこのシステムの１つは、一旦形成されると、スポット内表面に存在する物質に付着して、着色スポットを生じる不溶性着色産物を生成する可溶性基質を使用している。
【０００７】
プロテアーゼ活性のような酵素活性の直接測定と組み合わせられた酵素により増幅される終点の利用、またはドットＥＬＩＳＡシステムにおけるその利用に基づく測定システムが発表されてきた。前者は、サブチリシン型酵素のオン−フィルター測定［１］に関して記述され、後者はβ−ラクタム抗生物質［２］およびエストロゲン様ステロイド［３］に関して記述されている。いずれの方式においても、終点は、アルカリホスファターゼとブロモクロロインドリルホスフェート／ニトロブルーテトラゾリウム塩（ＢＣＩＰ／ＮＢＴ）、すなわちドットストリップまたはディップストリップ表面の固定化酵素付近に付着する不溶性着色産物を生成する酵素−基質の組み合わせを利用している。その結果生じるスポットの強度に基づく測定法に関して視認可能な終点が提供される。
【０００８】
従来、ディップストリップシステムの場合、この終点は、抗原または抗体がコーティングされたストリップをコンバーター基質に浸すことにより、あるいはコンバーター基質を固定化酵素のドットに一滴加えることにより得られる。従って、このようなシステムは、システムを使用するたびに、リポーター基質溶液を調製し、使用しなくてはならない点で不利である。
【０００９】
免疫測定法は、例えば、血液、唾液、尿等の体液中に多様な分析対象が含まれる医学診断適用の場合の様に、サンプル中の標的分子を検出するために、抗体または抗原の特異的結合能を利用している。
【００１０】
個々の適用に有用な数種類の免疫測定法がすでに存在している。このような測定法はそれぞれ、抗体の結合部位が占有されているか否かを識別する方法を必要とする。典型的には、これは、抗体または分析対象若しくは分析対象の類似体に永久的に付着された原子、分子、酵素または粒子のような標識によって達成される。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
従って、測定法に必要な全ての試薬があらかじめ調製され、測定過程で自動的に供給されるという点で、「試薬のいらない」ディップストリップ測定法が必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
我々は驚くべきことに、この目的に適った新しい種類のディップストリップ方式を考え出した。
【００１３】
従って、本発明によれば、（ｉ）不活性な担体中のリポーターコンバーターによって少なくとも部分的にコーティングされた第一のストリップ材料を含む第一のディップストリップと、（ｉｉ）リポーター前駆体によって少なくとも部分的にコーティングされた第二のストリップ材料を含む第二のディップストリップとを含んでなる測定システムが提供される。
【００１４】
本発明のディップストリップにおいて、リポーターコンバーター物質およびリポーター前駆体は、それぞれディップストリップの一方の末端に試薬の点または領域として、あらかじめ形成されている。
【００１５】
使用時、リポーターコンバーターまたはリポーター前駆体は、タンパク質またはその他の物質などの分析対象と混合することができ、これら分析対象には、リポーターコンバーターとリポーター前駆体から得られる酵素触媒産物などのリポーター物質が付着する。
【００１６】
従来から知られているリポーターコンバーターのいずれでも利用でき、そのようなコンバーターの選択は、特にリポーター前駆体の性質によって変動する。従って、例えば、リポーター前駆体がアルカリホスファターゼの場合には、リポーターコンバーターはブロモクロロインドリルホスフェート／ニトロブルーテトラゾリウム塩（ＢＣＩＰ／ＮＢＴ）が可能である。存在するリポーターの量は、特にコンバーターなどの性質によって変動する可能性がある。しかし、コンバーターの量は、１から２０％（ｗ／ｖ）、好ましくは１０から２０％（ｗ／ｖ）、より好ましくは１５から２０％（ｗ／ｖ）で、特に１７％（ｗ／ｖ）である。
【００１７】
本発明の第一のディップストリップにおいて、リポーターコンバーターをスポット内に保持するために、またリポーターコンバーターをスポット内に安定化するために、また発色段階で着色スポットの強度を増幅するために、不活性な担体の存在が必要である。この方式において、リポーターコンバーターは、外界条件において数週間安定状態を維持できる。一般に、不活性な担体は、粘着性固定化物質である。不活性な担体はストリップ材料と共有結合できるが、不活性な担体はストリップ材料表面に選択的に吸着される。不活性な担体は、種々の物質から選択でき、あるいは物質の混合物を含む。このような物質には、糖、タンパク様物質の様な高分子化合物が含まれるが、これらに限定されない。このような物質の一例としてゼラチンが挙げられる。存在する不活性な担体の量は、特に担体の性質によって変動する可能性がある。しかし、好ましいタンパク質は、ショ糖の様な糖である。しかし、存在する不活性な担体の量は、特に担体の性質によって変動する可能性があり、０．１から１０％（ｗ／ｗ）であり、好ましくは０．５から１０％（ｗ／ｗ）、より好ましくは３から５％（ｗ／ｗ）で、特に５％（ｗ／ｗ）である。
【００１８】
本発明の第二のディップストリップにおいて、ディップストリップ材料の点または領域は、リポーター酵素、抗原または抗体などのリポーター前駆体に共有結合させた標的酵素の基質などの試薬でコーティングできる。このリポーター前駆体は、第一のディップストリップに固定化されたリポーターコンバーターの化学変化に特異的でなくてはならない。
【００１９】
使用時、分析対象としての標的酵素、または酵素標識抗体または抗原による直接処理後、第二のディップストリップを第一のディップストリップに接触させる。そこで、リポーター前駆体、例えば、リポーター酵素の基質はこの接触により濡れ、そのスポットから浸出し、別の表面に存在するリポーターコンバーターと接触する。ここで基質は不溶性産物に変換され、どちらの表面にも付着する。適当な時間の経過後、両方の面を分離し、得られたスポットの強度を視認または走査濃度計により測定する。
【００２０】
本発明の好ましい実施例において、表示物質を標的酵素／リポーター物質と接触または接近させるために、第一のディップストリップと第二のディップストリップは、折りたたみ可能または脆弱な単一のストリップを構成できる。
【００２１】
特に好ましい実施例において、表示物質を標的酵素／リポーター物質と接触または接近させるために、単一のストリップには、折りたたみ可能な領域が設けられている。
【００２２】
この好ましい実施例において、ストリップ材料は、選択的に粘着性の表面を有する。粘着性表面の接着によりディップストリップの折りたたみが可能となり、近接状態を保持でき、従って、末端を近接させることができるが、直接的に末端が接触することはない。粘着性表面は、ストリップ材料の本来の性質であってもよい。あるいはストリップ材料は、穏やかな接触を生じることができる粘着層によりコーティングまたは少なくとも部分的にコーティングされていてもよい。
【００２３】
本発明のこの態様の特別な一長所は、このようなストリップの形態により、スポットを発色させるために、ストリップの表面を強いて合わせるための装置が不要な点である。
【００２４】
一般に、例えば着色表示物質を産生するために、リポーターコンバーターとリポーター前駆体を組み合わせことによるリポーター物質の生成には酸化段階が含まれる。この酸化段階は、不利である。なぜならば、特に、酸化のために２枚のストリップを分離しなくてはならない本発明の試薬のいらないストリップの場合には、生成に４〜５分の時間がかかるからである。従って、本発明の更なる特徴に従って、我々は、リポーターコンバーターかリポーター前駆体のどちらかに酸化剤を含めることが有利であることを見いだした。
【００２５】
折り畳んだ末端は、少量の緩衝液を含むマイクロタイタープレートまたはその均等物のウェルの中に入れることができる。この溶液は、毛管作用により２つの面の間の間隙を満たす。１〜１５分後（典型的には、５分後）、ディップストリップを取り出し、生成されたスポットの強度を記録する。
【００２６】
従って、我々は更に、リポーター前駆体およびリポーターコンバーターの一方または両方に酸化剤が組み込まれた上記に説明されている測定システムを提供する。
【００２７】
好ましい実施例において、酸化剤はリポーターコンバーターに組み込まれており、従って、不活性な担体の中に固定化されている。
【００２８】
従来から知られている酸化剤または酸化剤の混合物を使用できる。しかし、好ましい酸化剤は過酸化水素である。存在する酸化剤の量は、特に酸化剤、リポーター物質、不活性な担体などの性質によって変動する。しかし、酸化剤の量は、０．１から４％（ｗ／ｗ）、好ましい０．５から２％（ｗ／ｗ）、特に１％（ｗ／ｗ）が好ましい。
【００２９】
本発明の更に好ましい実施例において、測定法に必要な試薬は全て、１つまたは１対のクリップストリップの中に含まれている。最も好ましい実施例において、全ての試薬は単一のディップストリップに含まれている。
【００３０】
従って、本発明の更なる態様によれば、第一の末端にリポーターコンバーターが設けられ、第二の末端にリポーター前駆体が設けられ、この前駆体は酵素でコーティングまたは部分的にコーティングされている折りたたみ可能なストリップ材料を含む単一のＥＬＩＳＡストリップが提供される。従って、例えば、一方の先端には、細いストリップにキャプチャー抗体のスポットが付けられ、この上の細いストリップには５％（ｗ／ｗ）のショ糖溶液にあらかじめ混合しておいたキャッピング抗体とアルカリホスファターゼ標識タンパク質Ａの溶液を浸透させてある。このストリップの遠位先端は、発色剤（酵素基質）でコーティングされている。
【００３１】
酸化剤は、リポーターコンバーターおよび／またはリポーター前駆体との親密な混合物として存在してもよい。あるいは、酸化剤は、リポゾームなどのマイクロカプセルに入れることができ、例えば、圧力をかけられた場合や、または表面がもう一方の表面を濡らす緩衝液中の界面活性剤に曝露された場合や、または２枚のディップストリップが近接することにより、表面がもう一方の表面を濡らす緩衝液中の界面活性剤に曝露された場合に限り、酸化剤が放出される様にすることができる。
【００３２】
本発明のこの好ましい実施例での使用時には、分析対象である標的酵素、または酵素標識抗体もしくは抗原による直接処理後、ディップストリップは折り畳まれ、ディップストリップの両端は共に第一のディップストリップと接触する。上記に説明されているように、リポーター酵素の基質はこの接触により濡れ、そのスポットから浸出し、別の表面に存在するリポーター酵素と接触し、基質は不溶性産物に変換され、どちらの面にも付着する。
【００３３】
ストリップ材料そのものは、従来使用されているストリップ材料のいずれでも含むことができる。
【００３４】
本発明の更なる特徴によれば、上記に説明されている第一のディップストリップと第二のディップストリップを含む測定キットが提供される。
【００３５】
あるいは、上記に説明されている脆弱なあるいは折りたたみ可能なディップストリップを含む測定キットが提供される。
【００３６】
本発明の測定キットは、例えば、本発明の１対のストリップを合わせた状態に保持できる様に適合されたクランプシステムを含むことができる。好ましい実施例において、クランプシステムは、ディップストリップの複数の対の列を保持する様に適合することができる。
【００３７】
本発明の更なる特徴によれば、上記に説明されているディップストリップの使用を含む定量分析方法が提供される。
【００３８】
本発明の方法において、リポーター前駆体のｐＨを変えることができる。しかし、リポーター前駆体のｐＨは、ｐＨ８．５以上、好ましくはｐＨ８．５から１０．５、特にｐＨ９．５であることが好ましい。
【００３９】
本発明の方法によれば、定性分析には、比色分析、または好ましくは分光光度分析が含まれる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４０】
本発明は、具体例としてのみ説明され、以下の添付図面を引用して説明される。
【００４１】
図１ａと１ｂに示すように、ディップストリップ（１）は、例えば、セルロース材料を含む。ストリップ（１）は、第一の末端（２）と、第二の遠位末端（３）と、折りたたみ可能な領域（４）とを含む。第一の末端（２）において、ディップストリップ（１）には、不活性な担体（６）中のリポーターコンバーター（５）が設けられており、第二の末端（３）において、ディップストリップ（１）にはリポーター前駆体（７）が設けられている。
【００４２】
使用時、リポーター前駆体（７）を分析対象と接触させ、次に、リポーターコンバーター（５）とリポーター前駆体（７）を互いに接触させるために、ディップストリップを折り畳み可能な領域（４）で折り畳む。
【実施例１】
【００４３】
［固定化リポーター前駆体］
リポーター前駆体組成物を以下の配合により調製した。
過酸化水素          ５０μｌ
ＢＣＩＰ／ＮＢＴ    ２００μｌ
ゼラチン            ５０μｌ
これら成分を混合し、水（５ｍｌ）に溶解する。
【実施例２】
【００４４】
［ディップストリップ測定法を用いるサブチリシンの定量］
３−ブロモ−４−クロロインドリルホスフェート（ＢＣＰ）基質を、１％（ｗ／ｖ）のゼラチンに溶解し、ニトロセルロースで覆ったディップストリップの先端をこの溶液に浸す。ストリップを直ちに取り出し、１５分間表面を風乾した。これを、使用するまで、蓋付きのプラスチックの箱に保存した。第二のディップストリップを、少量のアルカリホスファターゼ標識抗ロバ抗ウサギ抗体試薬を用いて調製した。これを１００ｎｇのサブチリシン酵素を添加したか（＋）、あるいは酵素を全く添加しない（−）クエン酸緩衝液（５００μｌの０．１Ｍ、ｐＨ９．５の溶液）に浸した。外界温度で１５分後、ディップストリップを取り出し、抗体と基質の２つのスポットが接触する様に、基質ドットの付いた第一のディップストリップを第二の濡れたストリップと接触させた。５分後、ストリップを分離し、各表面のスポットの強度を視認およびオプティカルスキャナで検査した。
【００４５】
ストリップ表面のスポットの強度を、基質を最初に固定化したストリップに関してオプティカルスキャナを用いて定量した。これは、１００ｎｇのサブチリシンと接触させた３枚のストリップの対応するスポット［２４６±１０．６（ｎ＝３）］よりも、サブチリシンを接触させたストリップ［強度１２７±３６．１（ｎ＝３）］の方が小さかった。発色させたストリップのオプティカルスキャニング後のスポットを下記に示す。
【００４６】
表面接触中のスポット発色は不完全で、その後表面を空気に接触させると発色が促進されることが観察された。このような酸化剤を促進するために、固定化リポーターを付着させた表面を浸す溶液に、過酸化水素と過酸化尿素を加えるか、あるいはコーティング過程でそれらをリポーター前駆体の溶液中に組み入れた。この方法を用いて、着色スポットの完全な発色が、接触させた２つの面を分離するときに観察された。この方式において、アルカリホスファターゼとＢＣＩＰ／ＮＢＣとの終点はｐＨ依存性であり、ｐＨが８．５以上の場合に限り発色することも見いだされた。
【実施例３】
【００４７】
［１７−β−エストラジオール（ＥＤ）のディップストリップ免疫測定法］
セルロースストリップに付着させた小さな四角のニトロセルロースの中央に、コーティング緩衝液に含めた濃度１μｇ／ｍｌの１７−β−エストラジオール−ウシ血清アルブミン（ＥＤ−ＢＳＡ）溶液を１μｌスポッティングすることにより、１組のディップストリップを調製した［３］。２組目の同様のストリップを、１％容量の過酸化水素（５０μｌ）、４％（ｗ／ｖ）のＢＣＩＰ／ＮＢＴと１％水性ゼラチン（最終濃度）から成る溶液に１０秒間浸してから、取り出した。これらを外界温度で１０分間乾燥させ、再度コーティング液に浸した。この工程を繰り返し、３回コーティングした。１組目のチップの先端を、ＩＯＭ型パーソナルモニタ内に設置したウサギ抗ＥＤ（１０００μｌ）の溶液に浸した［３］。濾紙を１５分間振とう後、ストリップを取り出し、水道水で洗浄し、アルカリホスファターゼ標識抗ウサギ二次抗体に１５分間浸した。次に、ストリップを再び水道水で洗浄し、ｐＨ７．５、８．５または９．５のリン酸緩衝液またはグリシン緩衝液に浸した。次に、２組目のコーティングした先端を、第一のストリップの濡れた表面と接触させた。これは、これらをガラス板に載せ、それらをもう１枚のガラス板で覆うことにより達成された。１０分後、ストリップを分離し、ＥＤ−ＢＳＡコーティングストリップのスポットの色の強度を記録した。強度は、ｐＨ８．５（値２５４）とｐＨ７．５（値２５５）よりも、ｐＨ９．５の緩衝液が値２１９と有意に（Ｐ＜０．００１）濃かったが、ｐＨ８．５の緩衝液でも薄い色が視認できた。
【００４８】
実験を、ｐＨ９．５のグリシン緩衝液のみを用いて繰り返したが、ゼラチンコーティング内部に過酸化水素を含むストリップと、この酸化剤を含まないストリップと比較した。過酸化水素が存在する場合には、分離された２枚のストリップに青いスポットが存在するが、過酸化水素が存在しない場合には、対応するスポットがまず観察されるが、５〜１０分後に発色することが示された。更なる実験により、過酸化水素の活性は、ゼラチン基質によるストリップのコーティング後数日間持続することが証明された。
【実施例４】
【００４９】
［サビナーゼの自蔵式ディップストリップ測定法］
〈必要な材料〉
アセテートプレートシーラー（カタログ番号３５０１、Ｄｙｎｅｘ）
ウサギにおいて産生されたφ−サビナーゼ抗体（社内作製、Ｒ１−Ｂ４）
ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（Ｓｉｇｍａ  Ａ−７９０６）
１．０μｍニトロセルロース濾紙、直径４７ｍｍ（Ｗｈａｔｍａｎ，カタログ番号７１９０−００４）
コーティング緩衝液
脱イオン水
ディップストリップ基質緩衝液（具体例５参照）
層状のゼラチン様沈殿物を保持するための硬い堅牢な濾紙／「Ｆｉｌｔｅｒ  Ｐａｐｅｒ５４」（Ｗｈａｔｍａｎ，カタログ番号９０９０４）
マイクロタイタープレート（ｉｍｍｕｌｏｎ  ４ＨＢＸ，Ｄｙｎｅｘ）
アジドを含むリン酸緩衝液
プロテインＡ（Ｓｉｇｍａ  Ｐ−６０３１）
プロテインＡ−アルカリホスファターゼ複合体（Ｓｉｇｍａ  Ｐ−９６３０）
Ｔｗｅｅｎ  ２０（ＳｉｇｍａＰ−７９４９）
ショ糖（ＳｉｇｍａＳ−９３７８）
サビナーゼ（Ｎｏｖｏ  Ｎｏｒｄｉｓｋ、バッチ番号１５−１１９５）
【００５０】
〈緩衝液〉
〈０．１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｅｎ  ２０と０．１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡを含むリン酸緩衝食塩水（アジドを含む）（１ｌ）、ｐＨ７．２〜７．４（ＰＢＳＴ＋０．１％ＢＳＡ）の調製法〉
１．１ｍｌのＴｗｅｅｎ２０を１ｌのリン酸緩衝食塩水に加える。
２．１ｇのＢＳＡを１の溶液に加える。
３．ｐＨが７．２〜７．４の間に確実にあることをチェックする。
【００５１】
〈５％（ｗ／ｖ）ショ糖緩衝液の調製法〉
１．１０ｍｌの５％ショ糖緩衝液を作製するために、５００ｍｇのショ糖を１０ｍｌの脱イオン水に溶解する。
【００５２】
〈方法〉
以下の様に溶液を調製する。
〈プレミックス（標準曲線のための３２枚のディップストリップ用）の調製（１：１００、１：２５０Ｋ）〉
１．５μｌのＲ１−Ｂ４（ウサギ抗血清）と２μｌのプロテインＡ−アルカリホスファターゼ複合体を５００μｌのＰＢＳＴ＋０．１％ＢＳＡに希釈し、十分混合する。
２．室温で少なくとも２時間置き、平衡化する。
【００５３】
〈基質ディップストリップの作製〉
１．アセテートプレートシーラーを切断し、長さ約３．５ｃｍのストリップを作製する。
２．アセテートプレートシーラーの下の部分から１．３ｃｍの裏張りを外す（残った部分はラベルとして使用する）。
３．層状のゼラチン様沈殿を保持するための硬く堅牢な濾紙／Ｆｉｌｔｅｒ  Ｐａｐｅｒ  ５４を幅０．５ｃｍのストリップに切る。
４．濾紙のストリップをアセテートストリップの下部に配置する。
５．長いアセテートストリップを切り、０．５ｃｍ幅のストリップを作製する。
６．１４０μｌのディップストリップ基質を２８０μｌの５％ショ糖緩衝液に加えることにより自蔵式ディップストリップ測定用基質を調製し、１０秒間ボルテックスする。
７．７μｌの基質混合物を、各ディップストリップの表面にピペッティングし、室温で少なくとも２時間乾燥させる。
【００５４】
〈抗体コーティングディップストリップの作製〉
１．アセテートプレートシーラーを切断し、長さ約３．５ｃｍのストリップを作製する。
２．アセテートプレートシーラーの下の部分から１．３ｃｍの裏張りを外す（残った部分はラベルとして使用する）。
３．ニトロセルロース濾紙を幅０．３ｃｍのストリップに切断する。
４．ニトロセルロースのストリップをアセテートストリップの下部に沿って配置する。
５．層状のゼラチン様沈殿を保持するためのもう１組の硬く堅牢な濾紙／Ｆｉｌｔｅｒ  Ｐａｐｅｒ  ５４’を幅０．３ｃｍのストリップに切る。
６．アセテートディップストリップの上にすでに重ねたニトロセルロース濾紙上部の０．１ｃｍ上に、硬く堅牢な濾紙を配置する。
７．長いアセテートストリップを切り、０．５ｃｍ幅のストリップを作製する。
８．コーティング緩衝液中に１０μｇ／ｍｌの濃度でプロテインＡ溶液を調製する。
９．各ディップストリップの濾紙の上に１０μｇ／ｍｌプロテインＡの１μｌのスポットを付ける。
１０．室温で１０分間インキュベートする。
１１．脱イオン水の中で５秒間、ディップストリップの濾紙をリンスし、室温で１５分間乾燥させる。
１２．（１：２Ｋ）φサビナーゼ抗体溶液を調製し、室温で３０分間インキュベートする。
１３．濾紙が乾燥したら直ちに、ディップストリップを２５０μｌの１：２Ｋφサビナーゼ抗体溶液に浸し、室温で３０分間インキュベートする。
１４．脱イオン水の中で５秒間、ディップストリップの濾紙をリンスし、室温で１５分間乾燥させる。
１５．濾紙が十分乾燥したら直ちに、ディップストリップの硬く堅牢な濾紙部分に４μｌのプレミックス溶液をピペッティングし、室温で３０分間乾燥させる。
【００５５】
〈サビナーゼの自蔵式測定法〉
１．４２．６ｍｇのサビナーゼを計り、１ｍｌの脱イオン水に溶解し、１ｍｇ／ｍｌの原液を調製する。
２．ＰＢＳＴ＋０．１ＢＳＡの中にこの原液から標準液を調製する（典型的には、２００ｎｇ／ｍｌ−２ｎｇ／ｍｌ）。
３．抗体コーティングディップストリップを２５０μｌの適切なサビナーゼ標準液に入れ、室温で３０分間インキュベートし、脱イオン水の中でリンスする。
４．ディップストリップがまだ濡れている間に、基質ディップストリップを基質緩衝液の中に浸し、濾紙を濡らす。
５．濾紙が互いに向かい合うように、２枚のディップストリップを固着させ、それを２５μｌの基質緩衝液を含むマイクロタイタープレートのウェルの中に入れる。これによって、２μｌのディップストリップの間の液相を確実に発色させることができる。
６．スポットが発色するまで１０−１５分間インキュベートし、脱イオン水で洗浄する。
７．暗所において室温で乾燥させる。
８．濾紙が乾燥したら直ちに、ディップストリップをＰａｉｎｔＳｈｏｐ  Ｐｒｏの中にスキャンし、＊．ｂｍｐ  ｆｉｌｅとして保存する。
９．ＰＣソフトウェアパッケージＢＡＮＤＬＥＡＤＥＲを使用してスポットの強度を記録する（スポットの中に四角形が描かれる。）。
【００５６】
この具体例の方法により調製されたディップストリップを図３に示す（数字の単位はｎｇ／ｍｌ）。
【実施例５】
【００５７】
［ディップストリップ基質の調製］
〈必要な材料〉
５−ブロモ−４−クロロ−３−インドイルホスフェート（Ｓｉｇｍａ  Ｂ−８５０３）
ジメチルホルムアルデヒド（ＤＭＦ）
脱イオン水
ニトロブルーテトラゾリウム（Ｓｉｇｍａ  Ｎ−６８７６）
基質緩衝液
【００５８】
〈緩衝液〉
〈ディップストリップ基質の調製〉
１．５０ｍｇの５−ブロモ−４−クロロ−３−インドイルホスフェートと７５ｍｇのニトロブルーテトラゾリウムを１ｍｌのジメチルホルムアルデヒドに溶解する。
２．脱イオン水を２−４滴加える。
３．１０分間超音波処理する。
４．暗所において４℃で保存する。
５．必要な場合には、基質緩衝液で希釈する。１対３０（ＢＣＩＰ／ＮＢＴ原液：基質緩衝液）。（注意：必要時１０分前に調製すること）。
【図面の簡単な説明】
【００５９】
【図１】図１ａおよび図１ｂは、本発明の折りたたみ可能なディップストリップの断面図である。
【図２】実施例１の方法に従い、固定化されたＢＣＩＰ／ＮＢＴによる発色後のディップストリップを示す。右から左の順に、最初の３枚のストリップは１００ｎｇサブチリシンを加え、次の３枚のストリップはサブチリシンを加えていない。
【図３】実施例４の方法により調製されたディップストリップを示す。
【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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2004524529.tif 000028