(57)【要約】本発明は、活性物質を標的細胞に向けることができるターゲティング複合体に関し、前記複合体は、ＮＫｐ４６、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、またはこれらの機能的断片の１つを含む標的認識セグメントと、細胞傷害性部分や画像形成部分、Ｉｇ断片などの活性物質を含んだ活性セグメントを含むものである。本発明のターゲティング複合体は、ウイルス感染または癌に関連する病的な状態を治療するための、また癌を画像化し監視するための治療薬としての役割を果たす。【特許請求の範囲】
【請求項１】
活性物質を標的細胞に向けることができるターゲティング複合体であって、
ａ．ＮＫｐ４６、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、またはこれらの機能的断片の１つ
を含む標的認識セグメント、および
ｂ．細胞傷害性部分、
画像形成部分、および
Ｉｇ断片、からなる群から選択される前記活性物質を含む活性セグメント、
を含む前記複合体。
【請求項２】
前記ＮＫｐ４６断片が、ＮＫｐ４６分子のドメイン１とドメイン２の少なくとも一方を含む請求項１記載の複合体。
【請求項３】
前記ＮＫｐ４６断片が、ＮＫｐ４６分子のドメイン１とドメイン２を含み、実質的に配列番号４および配列番号１３のいずれか１つによって示されるアミノ酸配列を有する請求項２記載の複合体。
【請求項４】
前記ＮＫｐ４６断片が、ＮＫｐ４６分子のドメイン２を含み、実質的に配列番号２２および配列番号２３のいずれか１つによって示されるアミノ酸配列を有する請求項２記載の複合体。
【請求項５】
前記ＮＫｐ４４断片が、ＮＫｐ４４分子のドメイン１とドメイン２の少なくとも一方を含む請求項１記載の複合体。
【請求項６】
前記ＮＫｐ４４断片が、ＮＫｐ４４分子のドメイン１とドメイン２を含み、実質的に配列番号９によって示されるアミノ酸配列を有する請求項５記載の複合体。
【請求項７】
前記ＮＫｐ４４断片が、ＮＫｐ４４分子のドメイン２を含み、実質的に配列番号２４によって示されるアミノ酸配列を有する請求項５記載の複合体。
【請求項８】
前記複合体が前記活性セグメントとしてＩｇ断片を含む融合タンパク質であり、前記Ｉｇ断片がＩｇ分子のＦｃ部分であり、実質的に配列番号５により示されるアミノ酸配列によってコードされるものである請求項１〜７のいずれか一項に記載の複合体。
【請求項９】
前記複合体が、前記標的細胞を死滅させかつ／前記標的細胞の増殖または細胞分裂を抑制することができる細胞毒または抗細胞物質から選択される細胞傷害性部分を前記活性セグメントとして含む結合体である請求項１〜７のいずれか一項に記載の複合体。
【請求項１０】
前記細胞毒または抗細胞物質が、合成毒、および植物、真菌、または細菌由来の毒素のいずれか１つである請求項９記載の結合体。
【請求項１１】
前記毒素が、Ａ鎖毒素、リボソーム不活性化タンパク質、α−サルシン、アスペルギリン、レストリクトシン、リボヌクレアーゼ、ジフテリア毒素、シュードモナスエキソトキシン、エンドトキシン、またはエンドトキシンのリピドＡ部分からなる群から選択される請求項１０記載の結合体。
【請求項１２】
前記複合体が、常磁性物質、放射性物質、および蛍光原物質からなる群から選択される画像形成部分を前記活性セグメントとして含む結合体である請求項１〜７のいずれか一項に記載の複合体。
【請求項１３】
前記標的細胞が病的な細胞である請求項１記載の複合体。
【請求項１４】
前記病的な細胞が癌細胞である請求項１３記載の複合体。
【請求項１５】
前記癌細胞が、癌腫、メラノーマ、リンパ腫、および肉腫からなる群から選択される請求項１４記載の複合体。
【請求項１６】
前記標的細胞が病原性ウイルス感染細胞である請求項１記載の複合体。
【請求項１７】
前記病原性ウイルスが、インフルエンザウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、エプスタイン−バーウイルス、サイトメガロウイルス、ワクシニアウイルス、ＭＶＭ、ＥＣＭＶ、およびヘルペスウイルスのいずれか１つである請求項１６記載の複合体。
【請求項１８】
前記標的認識セグメントが、前記標的細胞の表面に発現したリガンドに結合することができ、前記結合がシアル酸を媒介している請求項１７記載の複合体。
【請求項１９】
ＮＫｐ４６−Ｉｇ融合タンパク質をコードするＤＮＡを含む発現ベクターであって、前記タンパク質が、
ａ．ＮＫｐ４６またはその機能的断片を含む標的認識セグメント、および
ｂ．Ｉｇ分子のＦｃ部分である活性セグメント、
を含む前記発現ベクター。
【請求項２０】
前記ＮＫｐ４６断片が、ＮＫｐ４６分子のドメイン１とドメイン２の少なくとも一方を含む請求項１９記載の発現ベクター。
【請求項２１】
前記ＮＫｐ４６断片が、実質的に配列番号１および配列番号１１のいずれか１つにより示される核酸配列でコードされたＮＫｐ４６分子のドメイン１および２を含み、Ｉｇ分子のＦｃ部分が実質的に配列番号２により示される核酸配列でコードされる請求項２０記載の発現ベクター。
【請求項２２】
前記ＮＫｐ４６断片が、実質的に配列番号１９および配列番号２０のいずれか１つにより示される核酸配列でコードされたＮＫｐ４６分子のドメイン２を含み、Ｉｇ分子のＦｃ部分が実質的に配列番号２により示される核酸配列でコードされる請求項２０記載の発現ベクター。
【請求項２３】
ＮＫｐ４４−Ｉｇ融合タンパク質をコードするＤＮＡを含む発現ベクターであって、前記タンパク質が、
ａ．ＮＫｐ４４またはその機能的断片を含む標的認識セグメント、および
ｂ．Ｉｇ分子のＦｃ部分である活性セグメント、
を含む前記発現ベクター。
【請求項２４】
前記ＮＫｐ４４断片が、ＮＫｐ４４分子のドメイン１とドメイン２の少なくとも一方を含む請求項２３記載の発現ベクター。
【請求項２５】
前記ＮＫｐ４４断片が、実質的に配列番号７により示される核酸配列でコードされたＮＫｐ４４分子のドメイン１および２を含み、Ｉｇ分子のＦｃ部分が実質的に配列番号２により示される核酸配列でコードされる請求項２４記載の発現ベクター。
【請求項２６】
前記ＮＫｐ４４断片が、実質的に配列番号２１により示される核酸配列でコードされたＮＫｐ４４分子のドメイン２を含み、Ｉｇ分子のＦｃ部分が実質的に配列番号２により示される核酸配列でコードされる請求項２４記載の発現ベクター。
【請求項２７】
請求項２１および２２のいずれか一項に記載の発現ベクターにより形質転換した宿主細胞。
【請求項２８】
請求項２５および２６のいずれか一項に記載の発現ベクターにより形質転換した宿主細胞。
【請求項２９】
実質的に配列番号３および配列番号１２により示される核酸配列によってそれぞれコードされた、実質的に配列番号６、配列番号１４のいずれか１つにより示されるアミノ酸配列を含むＮＫｐ４６−Ｉｇ融合タンパク質。
【請求項３０】
実質的に配列番号８により示される核酸配列によってコードされた、実質的に配列番号１０により示されるアミノ酸配列を含むＮＫｐ４４−Ｉｇ融合タンパク質。
【請求項３１】
請求項２９記載の融合タンパク質を特異的に認識しかつその融合タンパク質に結合する抗体。
【請求項３２】
請求項３０記載の融合タンパク質を特異的に認識しかつその融合タンパク質に結合する抗体。
【請求項３３】
タンパク質上のエピトープを特異的に認識しかつそのエピトープに結合する抗体であって、前記タンパク質が、ＮＫ細胞活性化受容体ＮＫｐ４６およびＮＫｐ４４のいずれか１つに対するリガンドである抗体。
【請求項３４】
前記リガンドが約７０Ｋｄの分子量を有するタンパク質である、１３５．７で示される請求項３３記載の抗体。
【請求項３５】
モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体からなる群から選択される、請求項３１〜３４のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項３６】
検出可能な部分に結合した請求項３５記載の抗体。
【請求項３７】
病的な状態を治療するための組成物であって、
ａ．前記病的な状態に関与する病的な標的細胞を特異的に認識しその標的細胞
に結合することができる標的認識セグメントであって、ＮＫｐ４６、ＮＫ
ｐ４４、ＮＫｐ３０、またはこれらの生物学的に機能的な断片の１つを含
む前記認識セグメント、および
ｂ．細胞傷害性部分およびＩｇ断片からなる群から選択される活性セグメント、
を含む複合体を活性成分として含む前記組成物。
【請求項３８】
前記病的な状態が、癌腫、メラノーマ、リンパ腫、および肉腫からなる群から選択された癌疾患である請求項３７記載の組成物。
【請求項３９】
前記病的な状態が、インフルエンザウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、エプスタイン−バーウイルス、サイトメガロウイルス、ワクシニアウイルス、ＭＶＭ、ＥＣＭＶ、およびヘルペスウイルスのいずれか１つによって引き起こされたウイルス感染である請求項３７記載の組成物。
【請求項４０】
ＮＫｐ４６、ＮＫｐ４４、またはこれらの機能的断片を含む標的認識セグメントが、前記標的細胞の表面に発現したリガンドに結合することができ、前記結合がシアル酸を媒介している請求項３９記載の組成物。
【請求項４１】
前記ＮＫｐ４６断片が、ＮＫｐ４６分子のドメイン１とドメイン２の少なくとも一方を含む請求項３７〜４０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４２】
前記ＮＫｐ４６断片が、ＮＫｐ４６分子のドメイン１および２を含み、実質的に配列番号４および配列番号１３のいずれか１つにより示されるアミノ酸配列を有する請求項４１記載の組成物。
【請求項４３】
前記ＮＫｐ４６断片が、ＮＫｐ４６分子のドメイン２を含み、実質的に配列番号２２および配列番号２３のいずれか１つにより示されるアミノ酸配列を有する請求項４１記載の組成物。
【請求項４４】
前記ＮＫｐ４４断片が、ＮＫｐ４４分子のドメイン１とドメイン２の少なくとも一方を含む請求項３７〜４０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４５】
前記ＮＫｐ４４断片が、ＮＫｐ４４分子のドメイン１および２を含み、実質的に配列番号９により示されるアミノ酸配列を有する請求項４４記載の組成物。
【請求項４６】
前記ＮＫｐ４４断片が、ＮＫｐ４４分子のドメイン２を含み、実質的に配列番号２４により示されるアミノ酸配列を有する請求項４４記載の組成物。
【請求項４７】
前記活性セグメントが、実質的に配列番号５により示されるアミノ酸配列でコードされたＩｇ分子のＦｃ部分であるＩｇ断片である請求項４２、４３、４５、および４６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４８】
前記活性セグメントが、前記標的細胞を死滅させかつ／または前記標的細胞の増殖および／または細胞分裂を抑制することができる細胞毒または抗細胞物質から選択された細胞傷害性部分である請求項４２、４３、４５、および４６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４９】
前記細胞毒または抗細胞物質が、合成毒、および植物、真菌、または細菌由来の毒素のいずれか１つである請求項４８記載の組成物。
【請求項５０】
前記毒素が、Ａ鎖毒素、リボソーム不活性化タンパク質、α−サルシン、アスペルギリン、レストリクトシン、リボヌクレアーゼ、ジフテリア毒素、シュードモナスエキソトキシン、エンドトキシン、またはエンドトキシンのリピドＡ部分からなる群から選択される請求項４９記載の組成物。
【請求項５１】
サンプル中の病的な細胞の存在を検出するための診断用組成物であって、
ａ．前記病的な状態に関与する病的な標的細胞を特異的に認識しその標的細胞
に結合することができる標的認識セグメントであって、ＮＫｐ４６、ＮＫ
ｐ４４、ＮＫｐ３０、またはこれらの生物学的に機能的な断片の１つを含
む前記認識セグメント、および
ｂ．常磁性物質、放射性物質、および蛍光原物質からなる群から選択される画
像形成部分である検出可能な画像形成セグメント、
を含む前記組成物。
【請求項５２】
前記ＮＫｐ４６断片が、ＮＫｐ４６分子のドメイン１とドメイン２の少なくとも一方を含む請求項５１記載の診断用組成物。
【請求項５３】
前記ＮＫｐ４６断片が、ＮＫｐ４６分子のドメイン１および２を含み、実質的に配列番号４および配列番号１３のいずれか１つにより示されるアミノ酸配列を有する請求項５２記載の診断用組成物。
【請求項５４】
前記ＮＫｐ４６断片が、ＮＫｐ４６分子のドメイン２を含み、実質的に配列番号２２および配列番号２３のいずれか１つにより示されるアミノ酸配列を有する請求項５２記載の診断用組成物。
【請求項５５】
前記ＮＫｐ４４断片が、ＮＫｐ４４分子のドメイン１とドメイン２の少なくとも一方を含む請求項５１記載の診断用組成物。
【請求項５６】
前記ＮＫｐ４４断片が、ＮＫｐ４４分子のドメイン１および２を含み、実質的に配列番号９により示されるアミノ酸配列を有する請求項５５記載の診断用組成物。
【請求項５７】
前記ＮＫｐ４４断片が、ＮＫｐ４４分子のドメイン２を含み、実質的に配列番号２４により示されるアミノ酸配列を有する請求項５５記載の診断用組成物。
【請求項５８】
標的認識セグメントが、前記標的細胞の表面に発現したリガンドに結合することができる請求項５１〜５７のいずれか一項に記載の診断用組成物。
【請求項５９】
前記標的細胞が癌細胞である請求項５８記載の診断用組成物。
【請求項６０】
前記癌が、癌腫、メラノーマ、リンパ腫、および肉腫からなる群から選択された癌疾患である請求項５９記載の診断用組成物。
【請求項６１】
治療上有効な量の複合体またはそれを含む医薬品を対象に投与することを含む、対象の病的な状態を治療するための方法であって、前記複合体が、
ａ．前記病的な状態に関与する病的な標的細胞を特異的に認識しその標的細胞
に結合することができる第１の標的認識セグメントであって、ＮＫｐ４６
、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、またはこれらの生物学的に機能的な断片の１
つを含む前記認識セグメント、および
ｂ．細胞傷害性部分およびＩｇ断片からなる群から選択される活性セグメント、
を含む前記方法。
【請求項６２】
前記病的な状態が、癌腫、メラノーマ、リンパ腫、および肉腫からなる群から選択される癌疾患である請求項６１記載の方法。
【請求項６３】
前記病的な状態が、インフルエンザウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、エプスタイン−バーウイルス、サイトメガロウイルス、ワクシニアウイルス、ＭＶＭ、ＥＣＭＶ、およびヘルペスウイルスのいずれか１つによって引き起こされるウイルス感染である請求項６１記載の方法。
【請求項６４】
標的認識セグメントＮＫｐ４６、ＮＫｐ４４、またはこれらの機能的断片が、前記標的細胞の表面に発現するリガンドに結合することができ、前記結合がシアル酸で媒介される請求項６３記載の方法。
【請求項６５】
前記ＮＫｐ４６断片が、ＮＫｐ４６分子のドメイン１とドメイン２の少なくとも一方を含む請求項６１〜６４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６６】
前記ＮＫｐ４６断片が、ＮＫｐ４６分子のドメイン１および２を含み、実質的に配列番号４および配列番号１３のいずれか１つにより示されるアミノ酸配列を有する請求項６５記載の方法。
【請求項６７】
前記ＮＫｐ４６断片が、ＮＫｐ４６分子のドメイン２を含み、実質的に配列番号２２および配列番号２３のいずれか１つにより示されるアミノ酸配列を有する請求項６５記載の方法。
【請求項６８】
前記ＮＫｐ４４断片が、ＮＫｐ４４分子のドメイン１とドメイン２の少なくとも一方を含む請求項６１〜６４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６９】
前記ＮＫｐ４４断片が、ＮＫｐ４４分子のドメイン１および２を含み、実質的に配列番号９により示されるアミノ酸配列を有する請求項６８記載の方法。
【請求項７０】
前記ＮＫｐ４４断片が、ＮＫｐ４４分子のドメイン２を含み、実質的に配列番号２４により示されるアミノ酸配列を有する請求項６８記載の方法。
【請求項７１】
前記活性セグメントが、実質的に配列番号５により示されるアミノ酸配列でコードされたＩｇ分子のＦｃ部分であるＩｇ断片である請求項６６、６７、６９、および７０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７２】
前記活性セグメントが、前記標的細胞を死滅させかつ／または前記標的細胞の増殖および／または細胞分裂を抑制することができる細胞毒または抗細胞物質から選択された細胞傷害性部分である請求項６６、６７、６９、および７０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７３】
前記細胞毒または抗細胞物質が、合成毒、および植物、真菌、または細菌由来の毒素のいずれか１つである請求項７２記載の方法。
【請求項７４】
前記毒素が、Ａ鎖毒素、リボソーム不活性化タンパク質、α−サルシン、アスペルギリン、レストリクトシン、リボヌクレアーゼ、ジフテリア毒素、シュードモナスエキソトキシン、エンドトキシン、またはエンドトキシンのリピドＡ部分からなる群から選択される請求項７３記載の方法。
【請求項７５】
対象の悪性細胞を診断し画像化するための方法であって、造影剤を前記対象の血流に導入するステップと、標的悪性細胞に発現したＮＫｐ４６リガンド、ＮＫｐ３０リガンド、およびＮＫｐ４４リガンドのいずれか１つに対する前記造影剤の結合を検出し定量するステップとを含み、前記造影剤が、
ａ．前記悪性細胞を特異的に認識しその悪性細胞に結合することができる第１
の標的認識セグメントであって、ＮＫｐ４６、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、
またはこれらの生物学的に機能的な断片の１つを含む前記認識セグメント
、および
ｂ．常磁性物質、放射性物質、および蛍光原性物質からなる群から選択される
画像形成部分である活性セグメント、
を有する複合体を含む前記方法。
【請求項７６】
前記ＮＫｐ４６断片が、ＮＫｐ４６分子のドメイン１とドメイン２の少なくとも一方を含む請求項７５記載の方法。
【請求項７７】
前記ＮＫｐ４６断片が、ＮＫｐ４６分子のドメイン１および２を含み、実質的に配列番号４および配列番号１３のいずれか１つにより示されるアミノ酸配列を有する請求項７６記載の方法。
【請求項７８】
前記ＮＫｐ４６断片が、ＮＫｐ４６分子のドメイン２を含み、実質的に配列番号２２および配列番号２３のいずれか１つにより示されるアミノ酸配列を有する請求項７６記載の方法。
【請求項７９】
前記ＮＫｐ４４断片が、ＮＫｐ４４分子のドメイン１とドメイン２の少なくとも一方を含む請求項７５記載の方法。
【請求項８０】
前記ＮＫｐ４４断片が、ＮＫｐ４４分子のドメイン１および２を含み、実質的に配列番号９により示されるアミノ酸配列を有する請求項７９記載の方法。
【請求項８１】
前記ＮＫｐ４４断片が、ＮＫｐ４４分子のドメイン２を含み、実質的に配列番号２４により示されるアミノ酸配列を有する請求項７９記載の方法。
【請求項８２】
前記悪性細胞が、癌腫、メラノーマ、リンパ腫、および肉腫からなる群から選択される請求項７５〜８１のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、ウイルス感染または癌に伴う病状を治療するための、また癌を画像化し監視するための治療薬に関する。より詳細には、本発明は、治療薬または造影剤に結合された、ＮＫ細胞活性化タンパク質、ＮＫｐ４６およびＮＫｐ４４とその機能的断片を含む複合剤を使用することによって、様々なウイルス感染を治療し検出するための組成物および方法を提供する。
【０００２】
（発明の背景）
ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ならびに細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）は、それによって免疫応答により異種組織または感染組織が破壊される細胞のメカニズムに主要な成分である［Ｔｒｉｎｃｈｉｅｒｉ他、Ａｄｖ．ｉｎ　Ｉｍｍｕｎｏｌ．４７：１８７〜３７６（１９８９）］。クラスＩ　ＭＨＣ分子および適切な特異的ペプチドの存在下で活性化されるＣＴＬとは対照的に、ＮＫ細胞の１つの明確な機能は、ＭＨＣクラスＩタンパク質の発現が不十分な標的細胞を溶解することである。このようにＮＫ細胞は、異種抗原を直接検出するためではなく、「自分自身」のために免疫監視を実行する［Ｌｊｕｎｇｇｒｅｎ他、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ　１１：７〜１０（１９９０）］。
【０００３】
このため、一般に循環しているリンパ球の約１０〜１５％を占めるＮＫ細胞は、抗原に対して非特異的な手法でかつ事前の免疫感作なしで、ウイルス感染細胞および多くの悪性細胞を含む標的細胞に結合してこれを死滅させる、［Ｈｅｒｂｅｒｍａｎ他、Ｓｃｉｅｎｃｅ　２１４：２４〜２７（１９８１）］。
【０００４】
ヒトＮＫ細胞抑制受容体によるＨＬＡ分子上の多形性決定基の認識は、３タイプのクラスＩ　ＭＨＣ−結合受容体によって媒介されるが、このクラスＩ　ＭＨＣ−結合受容体は、ＮＫＩＲタンパク質［Ｃｏｌｏｎｎａ他、Ｓｃｉｅｎｃｅ　２６８：４０５〜４０８（１９９５）；Ｗａｇｔｍａｎｎ他、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ　２：４３９〜４４９（１９９５）；Ｄ’Ａｎｄｒｅ他、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ　１５５：２３０６〜２３１０（１９９５）］とＩＬＴ−２タンパク質［Ｃｏｌｏｎｎａ他、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８６：１８０９〜１８１８（１９９７）］の両方を含み、そのリガンドが様々なＨＬＡ−Ａ、−Ｂ、および−Ｃの各タンパク質であるＩｇスーパーファミリーの抑制受容体であり、さらにこのクラスＩ　ＭＨＣ−結合受容体は、ＨＬＡ−Ｅタンパク質に結合すると抑制シグナルを送出するムチン様ＣＤ９４／ＮＫＧ２複合体である［Ｂｏｒｒｅｇｏ他、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８７：８１３〜８１８（１９９８）；Ｂｒｎｕｄ他、Ｎａｔｕｒｅ、３９１：７９５〜７９９（１９９８）；Ｌｅｅ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９５：５１９９〜５２０４（１９９８）］。この様々なクラスＩ　ＭＨＣタンパク質に特異的な受容体は、これらの分子が、ＮＫ機能を調節する際に重要であることを示す。
【０００５】
しかし、標的細胞に対してＮＫ細胞毒性を引き起こすのに関係する溶解受容体については、ほとんどわかっていない。最近、溶解受容体として４つの候補、すなわちＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４［Ｃａｎｔｏｎｉ，Ｃ．他、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８９：７８７〜７９６（１９９９）］、ＮＫｐ４６［Ｐｅｓｓｉｎｏ他、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８８：９５３〜９６０（１９９８）］、およびＣＤ１６［Ｍａｎｄｅｌｂｏｉｍ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．９６：５６４０〜５６４４（１９９９）］が同定された。ＮＫｐ４６受容体は、活性化されてもまたは活性化されていなくても全てのＮＫ細胞上に発現するので、標的細胞の死滅に関与する主要な溶解受容体であることが認められている［Ｐｅｓｓｉｎｏ他、（１９９８）の同書］。本発明は、ＮＫｐ４４およびＮＫｐ４６に対する「溶解リガンド」の同定および特徴付けに一部基づいている。ＮＫｐ４４を除き、これら受容体の全ては活性化ＮＫ細胞および非活性化ＮＫ細胞の両方の表面に発現し、全てがＣＤ３ζ／ＦｃεＲＩγとの会合を介して活性化シグナルを伝達する［Ｂｏｔｔｉｎｏ，Ｃ．他、Ｈｕｍ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６１：１〜６（２０００）］。これとは対照的に、ＮＫｐ４４受容体は、活性化ＮＫ細胞の表面のみに発現し、その活性化シグナルを、ＤＡＰ１２との会合を介して送出する［Ｌａｎｉｅｒ　Ｌ．Ｌ．他、Ｎａｔｕｒｅ．３９１：７０３〜７０７（１９９８）］。これらの受容体によって認識される溶解リガンドは、知られていない。
【０００６】
本発明者等の発見によって、可溶性ＮＫｐ４４−Ｉｇ融合タンパク質および可溶性ＮＫｐ４６−Ｉｇ融合タンパク質が、インフルエンザウイルスの血球凝集素（ＨＡ）とパラインフルエンザウイルスの血球凝集素−ノイラミニダーゼ（ＨＮ）に結合し、これらのウイルスタンパク質に対するＮＫｐ４４およびＮＫｐ４６の結合が、対応する糖タンパク質を発現する細胞の溶解に必要であることが示される。この結合は、ウイルス糖タンパク質の既知のシアル結合能力に見合ったＮＫｐ４４オリゴ糖およびＮＫｐ４６オリゴ糖のシアリル化を必要とする。これらの発見によって、ＮＫｐ４４−発現細胞およびＮＫｐ４６−発現細胞が、インフルエンザウイルスおよびパラインフルエンザウイルスに感染した標的細胞を、標的細胞クラスＩ分子発現を大きく減少させることなくどのように認識できるかが説明される。シアル酸は、いくつかのその他のウイルスに関する受容体として利用されるので、ウイルス病原体のかなりのサブセットのＮＫ認識に関する一般的な方策を提示することができる。
【０００７】
（発明の概要）
第１の態様では、本発明は、活性物質を標的細胞に向けることが可能なターゲティング複合体に関する。この複合体は、少なくともＮＫｐ４６、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、またはこれらの機能的断片を含む標的認識セグメントと、細胞傷害性部分、画像形成部分、またはＩｇ断片でよい活性物質を含む活性セグメントを含む。
【０００８】
標的認識セグメントはＮＫｐ４６から得られ、ＮＫｐ４６分子のドメイン１とドメイン２の少なくとも１つを含むことが好ましく、ドメイン１とドメイン２の両方を含むことがより好ましい。別の特に好ましい実施形態では、このセグメントはＮＫｐ４６分子のドメイン２を含む。あるいは、標的認識セグメントはＮＫｐ４４から得られ、ＮＫｐ４４分子のドメイン１とドメイン２の少なくとも１つを含むことが好ましく、ドメイン１とドメイン２の両方を含むことがより好ましい。別の特に好ましい実施形態では、このセグメントはＮＫｐ４４分子のドメイン２を含む。
【０００９】
特に好ましい実施形態では、本発明の複合体は、Ｉｇ断片を活性セグメントとして含む融合タンパク質である。このＩｇ断片は、Ｉｇ分子のＦｃ部分であることが好ましい。
【００１０】
あるいは、本発明の複合体は、細胞傷害性部分を活性セグメントとして含む結合体である。この細胞傷害性部分は、標的細胞を死滅させることができ、かつ／または標的細胞の増殖または細胞分裂を抑制することが可能な、細胞毒または抗細胞物質でよい。
【００１１】
本発明の好ましい結合体は、細胞毒または抗細胞物質として、合成毒素、あるいは植物、真菌、または細菌から得られる毒素を含むことができる。この毒素は、Ａ鎖毒素、リボソーム不活性化タンパク質、α−サルシン、アスペルギリン、レストリクトシン、リボヌクレアーゼ、ジフテリア毒素、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）エキソトキシン、エンドトキシン、またはエンドトキシンのリピドＡ部分のいずれか１つから選択できることがより好ましい。
【００１２】
さらに別の代替の実施形態では、本発明の複合体は、活性セグメントが画像形成部分である結合体でよい。画像形成部分は、常磁性標識や放射性標識、蛍光原標識など、任意の検出可能な標識でよい。
【００１３】
特定の実施形態では、本発明の複合体は、固形腫瘍ならびに非固形腫瘍から得られた細胞、特に悪性腫瘍を特異的に標的とすることができる。
【００１４】
あるいは、本発明の複合体は、欠損細胞または病的な細胞を標的とする。そのような標的細胞は、病原性ウイルス感染細胞でよい。より具体的には、病原性ウイルスは、インフルエンザウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、エプスタイン−バー（Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ）ウイルス、サイトメガロウイルス、ワクシニアウイルス、およびヘルペスウイルスを含むがこれらに限定することのない様々なウイルスのいずれかでよい。
【００１５】
標的細胞がウイルス感染細胞である場合、本発明の複合体は、前記標的細胞の表面に発現したリガンドに結合することが可能な標的認識セグメントを有することが好ましく、この結合は、シアル酸によって媒介されるものである。
【００１６】
本発明の第２の態様は、ＮＫｐ４６−Ｉｇ融合タンパク質をコードするＤＮＡを含む発現ベクターに関する。このＤＮＡは、ＮＫｐ４６またはその機能的断片をコードするセグメントを含み、ＮＫｐ４６断片は、ＮＫｐ４６分子のドメイン１とドメイン２の少なくとも１つを含むことが好ましく、ＮＫｐ４６分子のドメイン１とドメイン２の両方を含むことがより好ましい。この発現ベクターは、Ｉｇ分子のＦｃ部分をコードするＤＮＡ配列を含んだ第２のセグメントをさらに含む。別の好ましい実施形態では、第１のセグメントは、ドメイン２だけの核酸配列を含めばよい。
【００１７】
本発明の別の実施形態では、本発明は、ＮＫｐ４４−Ｉｇ融合タンパク質をコードするＤＮＡを含む発現ベクターに関する。このＤＮＡは、ＮＫｐ４４またはその機能的断片をコードするセグメントを含み、ＮＫｐ４４断片は、ＮＫｐ４４分子のドメイン１とドメイン２の少なくとも１つを含むことが好ましく、ドメイン１とドメイン２の両方を含むことがより好ましい。別の好ましい実施形態では、第１のセグメントがドメイン２だけの核酸配列を含めばよい。本発明の発現ベクターに含まれるＤＮＡの第２のセグメントは、Ｉｇ分子のＦｃ部分をコードするＤＮＡ配列を含む。
【００１８】
また本発明は、本発明のＤＮＡまたは発現ベクターで形質転換した宿主細胞にも関する。
【００１９】
本発明の特に好ましい実施形態は、ＮＫｐ４６−Ｉｇ融合タンパク質に関する。この融合タンパク質は、配列番号６と配列番号１４のいずれか１つによって実質上示されるようなアミノ酸配列を含み、配列番号３と配列番号１２のいずれか１つによって実質上示されるような核酸配列によってコードされる。
【００２０】
さらに別の特に好ましい実施形態では、本発明は、ＮＫｐ４４−Ｉｇ融合タンパク質に関する。この融合タンパク質は、配列番号１０よって実質上示されるようなアミノ酸配列を含み、配列番号８によって実質上示されるような核酸配列によってコードされる。
【００２１】
本発明の別の態様は、本発明の融合タンパク質ＮＫｐ４６−ＩｇまたはＮＫｐ４４−Ｉｇを特異的に認識してそこに結合する抗体に関する。
【００２２】
さらに、本発明は、ＮＫ細胞活性化受容体ＮＫｐ４６またはＮＫｐ４４のリガンドであるタンパク質のエピトープを特異的に認識してそこに結合する抗体に関する。特に好ましい抗体は、１３５．７と指定された抗体である。本発明の抗体は、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体でよい。さらに、本発明の抗体は、検出可能な部分に結合することができる。
【００２３】
他の態様では、本発明は、病的な状態を治療するための組成物に関する。本発明の組成物は、標的認識セグメントおよび活性セグメントを含む複合体を活性成分として含む。標的認識セグメントは、前記病的な状態に関与する病的な標的細胞を特異的に認識してそこに結合することが可能である。この標的認識セグメントは、少なくともＮＫｐ４６、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、またはそれらの生物学的に機能的な断片を含む。複合体の活性セグメントは、細胞傷害性物質部分とＩｇ断片から選択することができる。
【００２４】
一実施形態では、本発明の組成物は、例えばメラノーマや癌腫、肉腫、リンパ腫などの悪性疾患を治療することを目的とする。
【００２５】
あるいは、本発明の組成物は、インフルエンザウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、エプスタイン−バーウイルス、サイトメガロウイルス、ワクシニアウイルス、ＥＣＭＶ、ＭＶＭ、およびヘルペスウイルスのいずれか１つによって引き起こされたウイルス感染を治療することを目的とする。
【００２６】
本発明の複合体および組成物に含まれるＮＫｐ４６、ＮＫｐ４４、またはこれらの断片は、標的細胞の表面に発現したリガンドに結合することが可能である。標的細胞がウイルス感染細胞である場合、その結合はシアル酸を介する。本発明の複合体はフリーウイルスに結合することができ、その結合もやはりシアル酸を介して行われる。
【００２７】
本発明の複合体および組成物中の標的認識セグメントは、好ましくはＮＫｐ４６分子のドメイン１とドメイン２の少なくとも１つを含んだＮＫｐ４６断片であって、好ましくはドメイン１とドメイン２の両方を含んだＮＫｐ４６断片を含む。別の好ましい実施形態では、断片はＮＫｐ４６のドメイン２のみを含む。あるいは、本発明の複合体および組成物中の標的認識セグメントは、ＮＫｐ４４分子のドメイン１とドメイン２の少なくとも１つを含んだＮＫｐ４４断片であって、好ましくはドメイン１とドメイン２の両方を含んだＮＫｐ４４断片を含む。別の好ましい実施形態では、断片はＮＫｐ４４のドメイン２のみを含む。
【００２８】
本発明の複合体または組成物の活性セグメントはＩｇ断片でよく、好ましくはＩｇ分子のＦｃ部分である。あるいは、活性断片は、標的細胞を死滅させかつ／または標的細胞の増殖および／または細胞分裂を抑制することが可能な細胞毒や抗細胞物質などの細胞傷害性部分でよい。
【００２９】
細胞毒または抗細胞薬は、合成物質、あるいは植物由来、真菌または細菌由来の毒素でよい。
【００３０】
より具体的には、毒素は、Ａ鎖毒素、リボソーム不活性化タンパク質、α−サルシン、アスペルギリン、レストリクトシン、リボヌクレアーゼ、ジフテリア毒素、シュードモナスエキソトキシン、エンドトキシン、またはエンドトキシンのリピドＡ部分からなる群から選択することができる。
【００３１】
本発明の代替の態様は、サンプル中に病的な細胞または欠損細胞が存在するかどうかを検出するための診断用組成物に関する。この診断用組成物は、病的な状態に関与する病的な標的細胞を特異的に認識してそこに結合することが可能な標的認識セグメントと、検出可能な部分を含んだ複合体を含む。認識セグメントは、ＮＫｐ４６、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、またはそれらの生物学的に機能的な断片を含む。検出可能な画像形成部分は、常磁性物質、放射性物質、または蛍光原物質でよい。
【００３２】
本発明の別の態様は、対象の病的な状態を治療する方法に関する。この方法は、病的な状態に関与する病的な標的細胞を特異的に認識してそこに結合することが可能な第１の標的認識セグメントと第２の治療活性セグメントを有する複合体を含んだ医薬品として有効な量の治療薬を、対象に投与するステップを含む。標的認識セグメントは、ＮＫｐ４６、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、またはそれらの生物学的に機能的な断片の少なくとも１つを含み、治療活性セグメントは、細胞傷害性部分またはＩｇ断片でよい。治療される病的な状態は、インフルエンザウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、エプスタイン−バーウイルス、サイトメガロウイルス、ワクシニアウイルス、およびヘルペスウイルスによって引き起こされるウイルス感染、またはメラノーマや癌腫、リンパ腫、肉腫などの悪性疾患でよい。
【００３３】
特に好ましい実施形態では、本発明の方法は、標的認識セグメントに含まれるＮＫｐ４６またはＮＫｐ４４が前記標的細胞の表面に発現したリガンドに結合することができる複合体を使用する。標的細胞がウイルスに感染した細胞の場合、この結合は、シアル酸によって媒介される。より具体的には、ＮＫｐ４６断片は、ＮＫｐ４６分子のドメイン１とドメイン２の少なくとも１つを含み、より好ましくはドメイン１とドメイン２の両方を含む。別の好ましい実施形態では、この断片はＮＫｐ４６分子のドメイン２のみを含む。あるいは、ＮＫｐ４４断片は、ＮＫｐ４４分子のドメイン１とドメイン２の少なくとも１つを含み、より好ましくはドメイン１とドメイン２の両方を含む。別の好ましい実施形態では、この断片はＮＫｐ４４分子のドメイン２のみを含む。
【００３４】
代替の一実施形態では、本発明の方法は、活性セグメントとしてＩｇ断片を含有する複合体を使用する。このＩｇ断片は、特に、Ｉｇ分子のＦｃ部分である。
【００３５】
別の代替の実施形態では、本発明の方法は、活性セグメントとして細胞傷害性部分を含む。この細胞傷害性部分は、標的細胞を死滅させ、かつ／または標的細胞の増殖および／または細胞分裂を抑制することができる、細胞毒または抗細胞物質から選択することができる。より具体的には、細胞毒または抗細胞物質は、合成毒、あるいは植物、真菌、または細菌由来の毒素でよい。
【００３６】
この毒素は、Ａ鎖毒素、リボソーム不活性化タンパク質、α−サルシン、アスペルギリン、レストリクトシン、リボヌクレアーゼ、ジフテリア毒素、シュードモナスエキソトキシン、エンドトキシン、またはエンドトキシンのリピドＡ部分からなる群から選択することができる。
【００３７】
本発明の代替の態様は、病状、特に腫瘍を診断し画像化する方法に関する。この方法は、対象の血流に造影剤を導入するステップと、悪性細胞上に発現したＮＫｐ４６またはＮＫｐ４４のリガンドと造影剤との結合を検出して定量するステップを含む。造影剤は、悪性細胞を特異的に認識してそこに結合することが可能な第１の標的認識セグメントを有する複合体を含む。認識セグメントは、ＮＫｐ４６、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、またはこれらの生物学的に機能的な断片の少なくとも１つを含む。複合体は、画像形成部分である第２の活性セグメントも含み、これは常磁性物質、放射性物質、または蛍光原物質でよい。
【００３８】
（発明の詳細な説明）
分子生物学の技術に関するいくつかの方法は、当業者に周知であるので本明細書では詳述していない。そのような方法には、特定部位の突然変異誘発、ＰＣＲクローニング、ｃＤＮＡの発現、組換えタンパク質またはペプチドの分析、細菌細胞および酵母菌の形質転換、哺乳動物細胞のトランスフェクションなどが含まれる。そのような方法について記述している教科書は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ他のＭｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ；ＩＳＢＮ：０８７９６９３０９６、１９８９、Ｆ．Ｍ．ＡｕｓｕｂｅｌによるＣｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ、ＩＳＢＮ：０４７１５０３３８Ｘ、Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．１９８８、およびＦ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ他（編）によるＳｈｏｒｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ：第３版、Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ；ＩＳＢＮ：０４７１１３７８１２、１９９５である。これらの出版物の全体を参照により本明細書に組み込む。さらに、いくつかの免疫学的技法は当業者に周知であるので、どの場合にも本明細書では詳細に述べていない。例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｃｏｌｉｇａｎ他（編）、Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ．Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、ＮＹを参照されたい。
【００３９】
本発明は、ＮＫ細胞活性化受容体ＮＫｐ４６、ＮＫｐ４４、およびＮＫｐ３０により、腫瘍またはウイルス感染細胞上に発現した種々のリガンドの認識に基づいて腫瘍や病原性ウイルスなどの種々の疾患を治療しかつ／または診断（画像化）する新規な手法を提供する。
【００４０】
診断に関しては、本発明の方法は、検出可能な画像形成部分を含む本発明の複合体を用い、例えば核磁気共鳴映像法やＸ線映像法、コンピュータ・エミッション断層撮影法などを介して腫瘍の画像を提供することが可能になる。
【００４１】
治療に関しては、本発明の複合体は、所望の標的細胞の増殖または細胞分裂を抑制することによって、そのような細胞に細胞傷害性の作用または別のメカニズムによる抗細胞性の作用を及ぼすよう設計される。
【００４２】
このため第１の態様では、本発明は、標的細胞の表面に発現するリガンド分子を特異的に認識し、活性物質を標的細胞に向けることができる、ターゲティング複合体に関する。この複合体は、
ａ．ＮＫｐ４６、ＮＫｐ３０、およびＮＫｐ４４の各タンパク質、またはこれらの機能的断片の少なくとも１つを含む標的認識セグメントと、
ｂ．細胞傷害性部分、画像形成部分、またはＩｇ断片部分でよい活性物質を含む活性セグメントを含む。
【００４３】
特に好ましい実施形態では、標的認識セグメントは、ＮＫｐ４６分子のドメイン１とドメイン２の少なくとも１つを含むＮＫｐ４６断片である。標的認識セグメントは、ドメイン１とドメイン２の両方を含み、配列番号４により示されるアミノ酸配列またはそのアイソフォームのアミノ酸配列であって配列番号１３により示されるものを有することが好ましい。別の好ましい実施形態では、標的認識セグメントは配列番号２２および２３で示されるように、ＮＫｐ４６分子のドメイン２だけを含めばよい。
【００４４】
あるいは、標的認識セグメントは、ＮＫｐ４４分子のドメイン１とドメイン２の少なくとも１つを含むＮＫｐ４４断片である。標的認識セグメントは、ドメイン１とドメイン２の両方を含み、配列番号９により示されるアミノ酸配列を有することが好ましい。別の好ましい実施形態では、標的認識セグメントは配列番号２４で示されるようにＮＫｐ４４分子のドメイン２だけを含めばよい。あるいは標的認識セグメントは、配列番号１７により示されるＮＫ活性化分子ＮＫｐ３０を含むことができる。
【００４５】
本発明の認識セグメントは、ＮＫｐ４６、ＮＫｐ３０、およびＮＫｐ４４のいずれかのドメイン１および２の複数単位を含み、あるいはドメイン２のみを含めばよいことを理解すべきである。そのような複合単位セグメントを生成することにより、標的分子に対する認識セグメントの活性を増大させることができる。
【００４６】
「機能的断片」とは、分子の「断片」、「変異体」、「類似体」、または「誘導体」を意味する。本発明の核酸配列またはアミノ酸配列のいずれかのような分子の「断片」は、分子の任意のヌクレオチドまたはアミノ酸のサブセットを指すものである。このような分子の「変異体」は、その分子全体または断片に非常に類似する自然発生的な分子を指すものである。分子の「類似体」は、同じ種または異なる種から得られた同種の分子である。類似体または誘導体のアミノ酸配列は、少なくとも１つの残基が欠失し、挿入され、または置換される場合、本発明で使用される特定の分子、例えばＮＫｐ４６、ＮＫｐ３０、またはＮＫｐ４４の各分子と異なるものでよい。
【００４７】
「機能的」とは、同じ生物学的機能、例えばリガンドを認識しかつ／またはそこに結合する能力と全く同じ能力を有することを意味する。
【００４８】
別の特に好ましい実施形態は複合体に関し、本発明の複合体は、活性セグメントとしてＩｇ断片を含む融合タンパク質である。このＩｇ断片は、Ｉｇ分子のＦｃ部分であることが好ましく、配列番号５のアミノ酸配列によってコードされる。
【００４９】
補体系は、体液性免疫の主要なエフェクター・メカニズムの１つである。これは主として、第１の古典的経路成分Ｃ１が抗原複合抗体分子のＦｃ部分に結合することによって活性化される。したがって、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、またはＮＫｐ４６とＩｇ分子のＦｃ部分を含む融合タンパク質は、ｉｎ　ｖｉｖｏで補体系の標的として働くことができる。
【００５０】
あるいは、本発明の複合体は、活性セグメントとして細胞傷害性部分を含む結合体である。この細胞傷害性部分は、細胞毒または任意の抗細胞物質であって前記標的細胞を死滅させ、かつ／または前記標的細胞の増殖および／または細胞分裂を抑制することが可能なものでよい。
【００５１】
一般に治療を目的とした場合、本発明は、本発明の複合体のターゲティング・セグメントに結合することができ、かつ活性形態で標的細胞に送達させることができる任意の薬物の使用に関する。例示的な抗細胞物質には、化学療法薬、放射性同位元素、ならびに細胞毒が含まれる。化学療法薬には、ステロイドなどのホルモン、シトシンアラビノシドやフルオロウラシル、メトトレキサートまたはアミノプテリンなどの代謝拮抗物質；アントラサイクリン；マイトマイシンＣ；ビンカアルカロイド；デメコルチン；エトポシド；ミトラマイシン；またはクロラムブシルやマルファランなどの抗腫瘍アルキル化剤が含まれるが、これらに限定されない。
【００５２】
その他の実施形態は、細菌内毒素などの物質、またはそのような細菌内毒素のリピドＡ部分を含むことができる。どのような場合でも、このような物質は、既知の結合技法を使用して必要に応じて標的細胞に対して狙いを定め、インターナリゼーションを行い、放出し、または提示することが可能な手法で［例えば、Ｇｈｏｓｅ他、Ｃｒｉｔｉｃａｌ　Ｒｅｖｉｅｗｓ　ｉｎ　Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ　Ｄｒｕｇ　Ｃａｒｒｉｅｒ　Ｓｙｓｔｅｍｓ、３：２５６〜３５９（１９８７）］、本発明の複合体のターゲティング・セグメント（好ましくはＮＫｐ４６、ＮＫｐ４４、およびＮＫｐ３０のいずれか１つのドメイン１および２、またはドメイン１とドメイン２の少なくとも１つ、好ましくはドメイン２）にうまく結合できることが示される。
【００５３】
ある好ましい実施形態では、治療に利用される物質は一般に合成毒、または植物由来、真菌由来、または細菌由来の毒素を含むことになり、ほんの一例を挙げれば、そのような毒素は、例えばＡ毒素、リボソーム不活性化タンパク質、α−サルシン、アスペルギリン、レストリクトシン、リボヌクレアーゼ、ジフテリア毒素、シュードモナスエキソトキシン、エンドトキシン、またはエンドトキシンのリピドＡ部分である。本明細書に関連して使用される最も好ましい毒素部分は、ジフテリア毒素である。
【００５４】
本発明を治療に利用するそのほとんどは、毒素部分を腫瘍または病原性ウイルス感染細胞に向けようとするものである。これは、他の可能性ある物質に比べ、細胞を死滅させる作用を引き起こす毒素の能力が非常に大きいことに起因する。それにもかかわらず、ある状況下では、毒素を抗腫瘍薬やその他のサイトカイン、代謝拮抗物質、アルキル化剤、ホルモンなどの化学療法薬に代えることが可能な標的とされた毒素複合体による効率的な中毒に見合った経路を介してＮＫｐ４６、ＮＫｐ４４、またはＮＫｐ３０の標的リガンドを内在させることができない。
【００５５】
本願で使用するように、本発明の複合体の活性について述べるとき（特に、活性セグメントとして細胞傷害性部分が選択されるとき）に使用される「細胞傷害性」という用語と「細胞溶解性」という用語は同義とする。一般に、細胞傷害活性は、様々な生物学的、生化学的、または生物理学的メカニズムのいずれかによって標的細胞を死滅させることに関する。細胞溶解は、より具体的にはエフェクターが標的細胞の原形質膜を溶解し、それによってその物理的な完全性が破壊される活性を指す。その結果、標的細胞が死滅する。
【００５６】
さらに別の代替の実施形態では、本発明の複合体は、画像形成部分を活性セグメントとして含む結合体でよい。さらに、治療および／または診断に利用する放射性同位元素の場合、ヨウ素１３１、ヨウ素１２３、テクネシウム９９ｍ、インジウム１１１、レニウム１８８、レニウム１８６、ガリウム６７、銅６７、イットリウム９０、ヨウ素１２５、またはアスタチン２１１を挙げることができる。診断し監視するために腫瘍の画像を得ることが目的である場合、常磁性物質や放射性物質、蛍光原物質など、画像形成時に検出可能な物質を使用することが望ましい。多くの物質が画像形成に有用であることが、当技術分野で知られている。常磁性イオンは、例えばクロムやマンガン、鉄、コバルト、ニッケル、銅、ネオジム、サマリウム、ホルミウム、エルビウムなどのイオンでよい。ｘ線映像法などの場合に有用なイオンには、ランタン、金、鉛、およびビスマスが含まれるが、これらに限定されない。
【００５７】
本発明の画像形成複合体は、蛍光化合物などの検出可能な部分に結合することができる。蛍光標識した複合体を適正な波長の光に曝すと、その存在を蛍光によって検出することができる。最も一般的に使用される蛍光標識化合物には、フルオレセイン、イソチオシアネート、ローダミン、フィコエリトリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、ｏ−フタルアルデヒド、およびフルオレサミンがある。
【００５８】
複合体は、１５２Ｅやその他のランタニド系列など、蛍光発光金属を使用して検出可能に標識することもできる。これらの金属は、そのような金属キレート基をジエチレントリアミン五酢酸（ＥＴＰＡ）として使用して、ターゲティング・セグメントに結合することができる。
【００５９】
複合体は、化学発光化合物に結合することによって、検出可能に標識することもできる。次いで化学反応の過程で生じるルミネセンスの存在を検出することによって、化学発光標識されたターゲティング・セグメントが存在するかどうかを決定する。特に有用な化学発光標識化合物は、ルミノール、イソルミノール、セロマチックアクリジニウムエステル、イミダゾール、アクリジニウム塩、およびシュウ酸エステルがある。
【００６０】
同様に、生物発光化合物を、本発明の複合体中の標識として使用することができる。生物発光は、生体系に見られる化学発光の１つのタイプであり、触媒タンパク質によって化学発光反応の効率が高まるものである。生物発光タンパク質の存在は、ルミネセンスの存在を検出することによって決定される。標識を行うのに重要な生物発光化合物は、ルシフェリン、ルシフェラーゼ、およびエクオリンである。
【００６１】
本発明の複合体のターゲティング・セグメントを活性セグメント（細胞傷害性部分または画像形成部分）に結合させることができるが、これは脂質の主鎖または炭水化物の主鎖のいずれかにそれらのセグメントを直接的または間接的に結合する（ｃｏｎｊｕｇａｔｉｎｇまたはｃｏｕｐｌｉｎｇ）ことによってなされることを理解すべきである。
【００６２】
特定の実施形態では、本発明の複合体を病的な細胞に向けることができる。
【００６３】
本発明を記述するのに使用されるように、「標的細胞」は、本発明の複合体（活性セグメントが治療物質、例えば細胞傷害性部分またはＩｇを含む）の細胞傷害活性によって死滅する細胞であり、または本発明の複合体（活性セグメントが検出可能な画像形成部分を含む）によって検出される細胞である。標的細胞は、ＮＫｐ４６、ＮＫｐ４４、およびＮＫｐ３０の各分子のいずれか１つに対するリガンドを発現し、特に、悪性の細胞、または別の方法で固形腫瘍から、ならびに非固形腫瘍から得られた細胞が含まれる。
【００６４】
本発明を記述するために本明細書で使用されるように、「癌」、「腫瘍」、および「悪性腫瘍」は全て同等に、組織または器官の過形成に関する。組織がリンパ系または免疫系の一部である場合、悪性細胞は循環細胞の非固形腫瘍を含んでよい。その他の組織または器官の悪性腫瘍は、固形腫瘍をもたらす可能性がある。一般に、本発明の複合体、ならびに本発明の組成物および方法は、非固形腫瘍および固形腫瘍の治療に使用することができ、また固形腫瘍を監視し画像化するために使用することができる（選択された活性セグメントは画像形成部分である）。
【００６５】
あるいは、本発明の複合体は、ＨＩＶやＥＢＶ、ＣＭＶ、ワクシニア、ＭＶＭ、ＥＣＭＶ、ヘルペス、インフルエンザウイルスなどの病原性ウイルスに感染した細胞を対象とすることができる。
【００６６】
より具体的には、病原性ウイルスは、インフルエンザウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、エプスタイン−バーウイルス、サイトメガロウイルス、ワクシニアウイルス、ＭＶＭ、ＥＣＭＶ、およびヘルペスウイルスが含まれるがこれらに限定されない様々なウイルスのいずれか１つでよい。
【００６７】
本発明を記述するのに使用されるように、「病原性ウイルス」は、宿主に病気を引き起こすウイルスである。病原性ウイルスは宿主動物の細胞に感染し、そのような感染の結果、宿主の健康が衰える。本発明により考えられる病原性ウイルスには、ＨＩＶ、ＥＢＶ、ＣＭＶ、ワクシニア、ヘルペス、ＭＶＭ、ＥＣＭＶ、およびインフルエンザが含まれるが、これらに限定されない。
【００６８】
前記標的細胞が病原性ウイルスに感染した細胞である特に好ましい実施形態では、本発明の複合体は、前記ウイルスに感染した標的細胞の表面に発現したリガンドに結合することが可能な標的認識セグメントを有し、この結合はシアル酸によって媒介される。
【００６９】
あるいは、本発明の複合体はフリーウイルスにも結合することができる。この結合もやはりシアル酸によって媒介される。
【００７０】
実施例６および９に示すように、ＮＫｐ４６分子およびＮＫｐ４４分子とそれらのリガンド（ＨＡまたはＨＮ）とのそれぞれの相互作用は、シアル酸によって媒介された。さらに、シアル酸は相互作用に必要であるが十分ではないことが示された。
【００７１】
いくつかの哺乳動物のシアル酸受容体が明らかにされているが［Ｖａｒｋｉ，Ａ．他、ＦＡＳＥＢ　Ｊ．１１：２４８〜５５（１９９７）］、それらがＮＫｐ４６またはＮＫｐ４４との結合になぜ十分ではないのかという疑問が提起されている。細胞シアル酸受容体は、利用された標的細胞上に発現することができるが、その受容体は、ふんだんに発現するウイルスのＨＡのように機能するほど十分な量で発現することができない。使用に適した環境になるまで細胞レクチンを隔離し、または別の方法で不活性化することをも可能である。
【００７２】
実施例６および９は、ＮＫｐ４６およびＮＫｐ４４に対するＨＡの結合の分析について述べている。シアル酸に対するＨＡの解離定数はｍＭ範囲内にあってモノマー相互作用をもたらすには低すぎるものであり、その結果、フロー・サイトメトリーによって検出されるＮＫｐ４６−Ｉｇの結合が安定になり（解離定数は０．１μＭ未満であることが必要である）またはＮＫｐ４６−Ｉｇによってウイルス性血球凝集反応を阻止することができるようになる。これは、ＨＡとＮＫｐ４６との多量体による相互作用、またはシアル酸結合によって接触し始めた後にＮＫｐ４６がＨＡとより緊密に相互に作用することを示している。前者の場合でさえ、末端シアル残基がＮ結合型オリゴ糖上に遍在するので、ＮＫｐ４６はこれを他の細胞糖タンパク質と区別する特殊な性質を必要とすると考えられる。１つの可能性は、シアル酸と単一のＨＡ複合体との多価相互作用が可能になって、三量体として３つのシアル酸結合部位を持つような方法で、ＮＫｐ４６（単一のＮ結合型オリゴ糖を有すると考えられる）を多量体にすることである。組換えＮＫｐ４６−ＩｇおよびＮＫｐ４４−Ｉｇは２価の分子であることが予想されるが、細胞ＮＫｐ４６または細胞ＮＫｐ４４のオリゴマー状態は知られていない。
【００７３】
第２の態様では、本発明は、ＮＫｐ４６−Ｉｇ融合タンパク質をコードする核酸配列を含んだ発現ベクターに関する。この核酸は、
ａ．標的認識セグメントをコードするＤＮＡ配列であって、そのセグメントがＮＫｐ４６またはその機能的断片を含むもの。このＮＫｐ４６分子断片は、ＮＫｐ４６分子のドメイン１とドメイン２の少なくとも１つを含むことが好ましい。標的認識セグメントは、ＮＫｐ４６分子のドメイン１とドメイン２の両方を含み、配列番号１により示される核酸配列によって、または配列番号１１により示されるＮＫｐ４６アイソフォームによってコードされることが最も好ましく、あるいは、配列番号１９および配列番号２０のいずれか１つによって示されるようにドメイン２だけを含み、
ｂ．Ｉｇ分子のＦｃ部分である活性セグメントをコードするＤＮＡ配列であって、前記ＤＮＡが配列番号２により示される核酸配列を有するもの
を含む。
【００７４】
代替の実施形態では、本発明の発現ベクターはＮＫｐ４４−Ｉｇ融合タンパク質をコードする核酸配列を含む。この核酸配列は、
ａ．標的認識セグメントをコードするＤＮＡ配列であって、そのセグメントがＮＫｐ４４またはその機能的断片を含むもの。このＮＫｐ４４分子断片は、ＮＫｐ４４分子のドメイン１とドメイン２の少なくとも１つを含むことが好ましい。標的セグメントは、ドメイン１とドメイン２の両方を含み、配列番号７により示される核酸配列によってコードされることが最も好ましく、あるいは、配列番号２１によって示されるようにドメイン２だけを含み、
ｂ．Ｉｇ分子のＦｃ部分である活性セグメントをコードするＤＮＡ配列であって、前記ＤＮＡが配列番号２により示される核酸配列を有するもの
を含む。
【００７５】
ＮＫｐ３０−Ｉｇ融合タンパク質をコードする発現ベクターは本発明の範囲内である。そのような発現ベクターは、ＮＫｐ３０のドメイン１および２の核酸配列を含み、配列番号１５によって示される核酸配列を有する。
【００７６】
本明細書で使用される「核酸」という用語は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）などのポリヌクレオチドを指し、適切な場合にはリボ核酸（ＲＮＡ）を指す。これらの用語には、均等物としてヌクレオチド類似体から形成されたＲＮＡまたはＤＮＡの類似体と、記述された実施形態に適用可能であるように一本鎖および二本鎖のポリヌクレオチドも含まれることを理解されたい。
【００７７】
本発明の発現ベクターは、動作可能に結合する調節要素をさらに含むことができる。「動作可能に結合」という文言は、本明細書において、第１の核酸配列が第２の核酸配列と機能的な関係を保った状態で配置されるときに第１の核酸配列が第２の核酸配列に動作可能に結合することを示すために使用される。例えばプロモーターは、プロモーターがコード配列の転写または発現に影響を及ぼす場合、コード配列に動作可能に結合している。一般に、動作可能に結合しているＤＮＡ配列は連続しており、２つのタンパク質コード領域を接合する必要がある場合は、同じ読み枠内にある。
【００７８】
したがって、制御要素および調節要素という用語には、プロモーター、ターミネーター、およびその他の発現制御要素が含まれる。そのような調節要素はＧｏｅｄｄｅｌによって記述されている［Ｇｏｅｄｄｅｌ、Ｇｅｎｅ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　１８５、Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．（１９９０）］。
【００７９】
本明細書で使用される「ベクター」は、プラスミド、ウイルス、バクテリオファージ、組込み可能なＤＮＡ断片、およびその他のビークルであってＤＮＡ断片を宿主のゲノムに組み込むことが可能なものを包含する。発現ベクターは、一般に、所望の遺伝子またはその断片を含有する自己複製ＤＮＡ構成または自己複製ＲＮＡ構成であり、適切な宿主細胞内で認識されかつ所望の遺伝子の発現をもたらす遺伝子制御要素に動作可能に結合している。これらの制御要素は、適切な宿主内で発現をもたらすことができる。一般に遺伝子制御要素は、原核プロモーター系または真核プロモーター発現調節系を含むことができる。これは一般に、転写プロモーター、転写の開始を制御する任意選択のオペレーター、ＲＮＡ発現のレベルを上昇させる転写エンハンサー、適切なリボソーム結合部位をコードする配列、ＲＮＡスプライス部位、転写および翻訳を終了させる配列などを含む。発現ベクターは通常、複製の開始点、すなわちそのベクターによって宿主細胞を独立に複製することが可能な開始点を含有する。
【００８０】
ベクターは追加として、適切な制限部位、抗生物質抵抗性、またはベクター含有細胞を選択するためのその他のマーカーを含むことができる。プラスミドは、最も一般的に使用される形のベクターであるが、同等の機能を果たして当技術分野で知られているかまたは知られるようになるその他の形のベクターも、本明細書で使用するのに適している。例えば、参照により本明細書に組み込むＰｏｕｗｅｌｓ他のＣｌｏｎｉｎｇ　Ｖｅｃｔｏｒｓ：ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ（１９８５および補遺）、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、Ｎ．Ｙ．；およびＲｏｄｒｉｑｕｅｚ他（編）のＶｅｃｔｏｒｓ：ａ　Ｓｕｒｖｅｙ　ｏｆ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｖｅｃｔｏｒｓ　ａｎｄ　ｔｈｅｉｒ　Ｕｓｅｓ、Ｂｕｔｔｅｒｓｗｏｒｔｈ、Ｂｏｓｔｏｎ、Ｍａｓｓ（１９８８）を参照されたい。
【００８１】
また、本発明の特定の実施形態は、本発明の発現ベクターにより形質転換された宿主細胞に関する。適切な宿主細胞には、原核生物、低級真核生物、および高級真核生物が含まれる。原核生物には、グラム陰性有機体およびグラム陽性有機体、例えばＥ．ｃｏｌｉおよびＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓが含まれる。低級真核生物には、酵母、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅおよびピチア属と、Ｄｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍ属の種が含まれる。高級真核生物には、非哺乳動物由来、例えば昆虫細胞および鳥類と、哺乳動物由来、例えばヒトやその他の霊長類の両方と、げっ歯類由来の動物細胞から確立された組織培養細胞系が含まれる。
【００８２】
特に好ましい実施形態は、ＮＫｐ４６−Ｉｇ融合タンパク質に関する。この融合タンパク質は、配列番号３および配列番号１２により示される核酸配列でそれぞれコードした、配列番号６により示されるアミノ酸配列または配列番号１４によって示されるそのアイソフォームを有する。
【００８３】
別の実施形態では、本発明は、実施例１１で述べるＮＫｐ４６Ｄ２−Ｉｇ融合タンパク質に関する。
【００８４】
別の特に好ましい実施形態は、ＮＫｐ４４−Ｉｇ融合タンパク質に関する。この融合タンパク質は、配列番号８により示される核酸配列でコードした、配列番号１０により示されるアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、本発明はＮＫｐ４４Ｄ２−Ｉｇ融合タンパク質に関する。
【００８５】
あるいは、本発明の融合タンパク質は、ターゲティング・セグメントとしてＮＫｐ３０分子（配列番号１８により示される）を含んでよい。
【００８６】
異種融合タンパク質は、同様に普通に融合したのではなくもともと融合した状態のセグメントで形成された融合タンパク質である。このため、ＮＫｐ４６、ＮＫｐ３０、またはＮＫｐ４４（特にドメイン１および２、またはドメイン１とドメイン２の少なくとも１つ）分子とＩｇ分子のＦｃ部分との融合生成物は連続的なタンパク質分子であって、典型的なペプチド結合によって融合した配列を有し、一般に単一の翻訳生成物として形成され、かつ各原料ペプチドから得られた性質を示す分子である。
【００８７】
本発明の別の態様は、本発明の融合タンパク質ＮＫｐ４６−Ｉｇを特異的に認識してそこに結合する抗体に関する。
【００８８】
本発明のさらに別の実施形態では、本発明は、本発明の融合タンパク質ＮＫｐ４４−Ｉｇを特異的に認識してそこに結合する抗体に関する。
【００８９】
さらに本発明は、タンパク質上のエピトープを特異的に認識してそこに結合する抗体に関し、前記タンパク質は、ＮＫ細胞活性化受容体ＮＫｐ４６に対するリガンドである。実施例３で述べるように、ＮＫｐ４６推定リガンドを識別するため、ＳＶ感染細胞でマウスを免疫化し、異なる抗体について試験を行って、ＳＶ感染細胞に対するＮＫｐ４６−Ｉｇの結合を阻止する能力について調べた。ＳＶ感染細胞に対するＮＫｐ４６−Ｉｇの結合を効果的に阻止するそのような１つの抗体を１３５．７で示す。
【００９０】
したがって特に好ましい実施形態では、本発明は、１３５．７で示される抗体に関する。この抗体は、ＮＫｐ４６リガンドを特異的に認識してそこに結合する。実施例３で述べるように、このリガンドは、分子量が約７０Ｋｄのタンパク質である。このタンパク質は、ＨＮ糖タンパク質であることがわかった。
【００９１】
本発明の好ましい実施形態は、ＮＫｐ４６−Ｉｇ融合タンパク質およびＮＫｐ４４−Ｉｇ融合タンパク質に対する抗体と、ＮＫｐ４６リガンドおよびＮＫｐ４４リガンドに対する抗体に関する。これらの抗体は、モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体からなる群から選択され、モノクローナル抗体が好ましい。
【００９２】
タンパク質に対するポリクローナル抗体の発生については、Ｗｉｌｅｙ　ａｎｄ　Ｓｏｎｓ　Ｉｎｃ．によるＣｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　ＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙのＣｈａｐｔｅｒ　２に記載されている。
【００９３】
モノクローナル抗体は、雑種細胞の増殖に好都合な条件下での不死化Ｂ細胞との融合によって免疫化した動物、特にラットまたはマウスの脾臓またはリンパ節から得られたＢ細胞から調製することができる。ネズミＢ細胞の融合では、細胞系Ａｇ−８が好ましい。
【００９４】
モノクローナル抗体を発生させる技法は、上記Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　ＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙのＣｈａｐｔｅｒ　２など、多くの論文および教科書に記載されている。そのＣｈａｐｔｅｒ　２に記載されているように、モノクローナル抗体を発生させるには、これらの動物の脾臓またはリンパ節細胞を、タンパク質で免疫化された動物の脾臓またはリンパ節細胞と同じ方法で使用することができる。モノクローナル抗体を発生させる際に使用する技法は、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎによるＮａｔｕｒｅ　２５６：４９５〜４９７（１９７５）と米国特許第４，３７６，１１０号にさらに記載されている。
【００９５】
「抗体」という用語は、無傷の分子、ならびにその断片の両方を含むことを意味し、例えば、抗原に結合することが可能なＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２が含まれる。ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２断片は、無傷の抗体のＦｃ断片に乏しく、循環からより急速になくなり、無傷の抗体よりも非特異的組織結合が少ない可能性がある［Ｗａｈｌ他、Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．２４：３１６〜３２５、（１９８３）］。本発明に有用な抗体のＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２とその他の断片は、無傷の抗体分子に関する本明細書に開示された方法に従って、本発明の複合体に対するリガンドを検出し定量するのに使用できることが理解されよう。そのような断片は、一般に、パパイン（Ｆａｂ断片生成用）やペプシン（Ｆ（ａｂ’）２断片生成用）などの酵素を使用したタンパク質分解によって生成される。
【００９６】
抗体は、分子と特異的に反応してそれによって分子と抗体とを結合させることができる場合、分子に「結合することができる」と言う。「エピトープ」という用語は、抗体に結合することができる任意の分子の部分であって、その抗体が認識することのできる部分を指すものである。エピトープまたは「抗原決定基」は、通常、アミノ酸や糖側鎖などの分子の化学的に活性な表面のグループからなり、特異的三次元構造特性ならびに特異的荷電特性を有する。
【００９７】
「抗原」は、抗体に結合することができる分子または分子の一部であり、これはさらに、その抗原のエピトープに結合することができる抗体を動物に生成させることができるものである。抗原は、１つまたは複数のエピトープを有することができる。前述の特異的反応は、抗原が、高度に選択的な手法でその抗原に対応する抗体と反応し、その他の抗原によって誘発される可能性がある多数のその他の抗体とは反応しないことを示すものである。
【００９８】
本発明に有用な、抗体の断片も含めた抗体は、サンプル中の本発明の複合体に対するリガンドを定量的かつ／または定性的に検出するのに使用することができる。これは、蛍光または色素で標識した抗体を、光学顕微鏡、フロー・サイトメトリー、または蛍光による検出と併せて使用する免疫蛍光法によって実現することができる。
【００９９】
別の特に好ましい実施形態は、検出可能な部分に結合された本発明の抗体に関する。本発明による抗体を検出可能に標識することができる方法の１つは、その抗体を酵素に結合することによるもので、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）で使用される。この酵素は、後に適切な基質に曝されるとき、例えば分光光度法や蛍光光度法によって、または視覚的手段によって、検出可能な化学的部分が生成されるような方法で基質と反応することになる。抗体を検出可能に標識するのに使用することができる酵素には、リンゴ酸脱水素酵素、ブドウ球菌のヌクレアーゼ、δ−５−ステロイドイソメラーゼ、酵母アルコール脱水素酵素、α−グリセロリン酸デヒドロゲナーゼ、トリオースホスフェートイソメラーゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、アスパラギナーゼ、ブドウ糖酸化酵素、β−ガラクトシダーゼ、リボヌクレアーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、グルコアミラーゼ、およびアセチルコリンエステラーゼが含まれるが、これらに限定されない。検出は、酵素用の色素基質を使用する比色法によって行うことができる。検出は、基質の酵素反応の程度を、同様に調製された標準と目視比較することによって行うこともできる。
【０１００】
検出は、様々なその他の免疫測定法のいずれかを使用することによって行うことができる。例えば、抗体または抗体断片を放射性標識することにより、放射免疫測定法（ＲＩＡ）を用いて受容体チロシンホスファターゼ（Ｒ−ＰＴＰａｓｅ）を検出することが可能である。Ｃｈａｒｄ，Ｔ．による「Ａｎ　Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ｔｏ　Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｅ　Ａｓｓａｙ　ａｎｄ　Ｒｅｌａｔｅｄ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ」という表題の章に特に関連したＷｏｒｋ，Ｔ．Ｓ．他によるＬａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　ａｎｄ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｎｏｒｔｈ　Ｈｏｌｌａｎｄ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ｃｏｍｐａｎｙ、ＮＹ（１９７８）には、ＲＩＡに関する優れた記述が見られ、これを本明細書に参照による組み込む。放射性同位元素は、ｇカウンタまたはシンチレーション・カウンタを使用するような手段によって、またはオートラジオグラフィによって検出することができる。
【０１０１】
本発明による抗体を、蛍光化合物、蛍光発光金属、化学発光化合物、または生物発光化合物で標識することも可能である。
【０１０２】
第４の態様では、本発明は、病的な状態を治療するための組成物に関する。この組成物は、活性成分として本発明による複合体、すなわち活性セグメントが細胞傷害性部分および／またはＩｇ断片である複合体と、医薬品として許容されるキャリアを含む。
【０１０３】
本明細書で使用される「医薬品として許容されるキャリア」には、溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤、抗真菌剤などのいずれかまたは全てが含まれる。そのような媒質および薬剤を医薬品として活性な物質に使用することは、当技術分野では周知である。任意の従来の媒質または薬剤は、それらが活性成分に対して非相容性である場合を除いて、治療用組成物に使用することが考えられる。
【０１０４】
本発明の組成物は、インフルエンザウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、エプスタイン−バーウイルス、サイトメガロウイルス、ワクシニアウイルス、ＭＶＭ、ＥＣＭＶ、およびヘルペスウイルスの治療に使用することができる。
【０１０５】
本発明の組成物は、メラノーマや癌腫、肉腫、リンパ腫などの癌疾患、好ましくはメラノーマの治療にも使用することができる。
【０１０６】
本発明の代替の態様は、サンプル中の異常細胞の存在を検出するための診断用組成物であって、活性セグメントが常磁性や放射性、または蛍光原性の物質または部分などの検出可能な画像形成部分である本発明の複合体を含む組成物に関する。
【０１０７】
本発明の別の態様は、対象の病的な状態を治療する方法であって、医薬品として有効な量の治療薬を対象に投与するステップを含み、前記治療薬が本発明の複合体または組成物を含むものである方法に関する。
【０１０８】
病的な状態は、インフルエンザウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、エプスタイン−バーウイルス、サイトメガロウイルス、ワクシニアウイルス、ＭＶＭ、ＥＣＭＶ、およびヘルペスウイルスのいずれか１つによって引き起こされるウイルス感染でよい。
【０１０９】
あるいは本発明の方法は、メラノーマや癌腫、肉腫、リンパ腫などの悪性疾患、好ましくはメラノーマの治療に使用することができる。
【０１１０】
本発明の方法は、本発明の複合体であって、活性セグメントがＩｇ断片を含む複合体、特に配列番号５に示されるアミノ酸配列によって示されるＩｇ分子のＦｃ部分を含む複合体を使用することが好ましい。あるいは本発明の方法は、活性セグメントが細胞傷害性部分を含む複合体を使用する。この細胞傷害性部分は、前記標的細胞を死滅させ、かつ／または前記標的細胞の増殖および／または細胞分裂を抑制することができる細胞毒または抗細胞物質から選択することができる。より具体的には、細胞毒または抗細胞物質は、合成毒、あるいは植物、真菌、または細菌由来の毒素でよい。例えば毒素は、Ａ鎖毒素、リボソーム不活性化タンパク質、α−サルシン、アスペルギリン、レストリクトシン、リボヌクレアーゼ、ジフテリア毒素、シュードモナスエキソトキシン、エンドトキシン、またはエンドトキシンのリピドＡ部分でよい。
【０１１１】
上述の治療方法の他、本発明は、癌性細胞または何らかの原因で欠陥のある細胞であってその表面にＮＫｐ４６、ＮＫｐ４４、およびＮＫｐ３０のいずれか１つを発現する細胞を本発明の複合体で治療する、ｅｘ　ｖｉｖｏ治療を包含する。そのようなｅｘ　ｖｉｖｏプロトコルでは、ヒト対象などの対象の身体から生体サンプルを得ることができる。
【０１１２】
このサンプルは、血液、骨髄細胞、あるいは癌になった器官からの同様の組織または細胞でよい。そのようなサンプルを得るための方法は、腫瘍学および外科の分野の当業者に周知である。そのような方法には、周知の方法で血液をサンプリングすること、あるいは骨髄またはその他の組織または器官から生検材料を得ることが含まれる。サンプルに含有される癌細胞（またはウイルス感染細胞）は、本発明の複合体の細胞傷害活性により効果的になくすことができる。次いでこのサンプルを提供した対象の身体に、このサンプルを戻すことができる。
【０１１３】
本明細書で使用される「有効な量」とは、選択された結果をもたらすのに必要な量を意味する。例えば、本発明の組成物の有効な量は、前記病的な状態の治療に有用である。
【０１１４】
好ましい実施形態では、本発明の方法は、哺乳動物である対象、好ましくはヒトを治療することを目的とする。したがって、「患者」または「治療を必要とする対象」とは、ヒト、ウシ、ウマ、イヌ、およびネコの各被験体を含めた遺伝子治療が望ましい任意の哺乳動物、好ましくはヒトの患者を意味する。
【０１１５】
本発明によるｉｎ　ｖｉｖｏ治療では、本発明の複合体または組成物を様々な方法で投与することができる。非限定的な例として、細胞は、静脈内を通して送り出し、または固形腫瘍の位置に隣接する腹腔内などの体腔内に送り出すことができ、あるいは固形腫瘍に直接注射しまたは固形腫瘍に隣接した部分に注射することができる。例えば静脈内投与は、白血病、リンパ腫、およびこれと同等のリンパ系悪性腫瘍の治療、ならびにウイルス感染の治療に有利である。
【０１１６】
注射としての使用に適する医薬品の形態には、注射可能な滅菌溶液または分散液をその場で調製するための滅菌水溶液または分散液と滅菌粉末が含まれる。全ての場合において、その形態は滅菌された状態でなければならず、容易に注射できる程度まで流体でなければならない。医薬品の形態は、製造および保存の条件下で安定でなければならず、細菌や真菌などの微生物の汚染作用から保護されなければならない。
【０１１７】
微生物の作用は、様々な抗菌剤および抗真菌剤、例えばパラベンやクロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどによって妨げることができる。たいていの場合、等張剤、例えば糖や塩化ナトリウムを含むことが好ましい。注射可能な組成物は、吸収を遅らせる薬剤組成物、例えばモノステアリン酸アルミニウムやゼラチンを使用することにより、長時間にわたって吸収させることができる。
【０１１８】
滅菌溶液は、必要な量の活性化合物を、必要に応じて上記列挙した様々なその他の成分を含む適切な溶媒に混ぜ、その後、滅菌ろ過することによって調製する。一般に分散液は、様々な滅菌済みの活性成分を、基本的な分散媒および上記列挙したものからの必要とされるその他の成分を含有する滅菌賦形剤に混ぜることによって調製する。
【０１１９】
注射可能な滅菌溶液を調製するための滅菌粉末の場合、好ましい調製方法は、活性成分および任意の追加の所望の成分の粉末であって予め滅菌ろ過されたその溶液から得られたものをもたらす真空乾燥および凍結乾燥技法である。
【０１２０】
本発明の複合体および組成物は、治療を受ける対象に直接投与することができ、または投与前に、化合物（細胞傷害性部分または画像形成部分）のサイズに応じてそれらをオボアルブミンや血清アルブミンなどのキャリアタンパク質に結合させることが望ましい。治療用製剤は、任意の従来の投薬処方で投与することができる。製剤は、典型的な場合、上記定義された少なくとも１種の活性成分を、１種または複数のその許容されるキャリアと共に含む。
【０１２１】
各キャリアは、その他の成分に対して相溶性を有しかつ患者に無害であるという意味で、医薬品としてかつ生理学的に許容されるべきである。製剤には、口、直腸、鼻、または腸管外（皮下、筋肉内、静脈内、および皮内を含む）による投与に適するものが含まれる。製剤は、単位投与形態で都合よく与えることができ、医薬品の技術分野で周知の任意の方法によって調製することができる。
【０１２２】
本発明の別の態様は、病的な状態、特に腫瘍を診断し画像化する方法に関する。この方法は、対象の血流に造影剤を導入するステップと、病的な標的細胞に発現したＮＫｐ４６、ＮＫｐ４４、またはＮＫｐ３０のリガンドのいずれか１つに対する造影剤の結合を検出して定量するステップを含む。造影剤は、本発明の複合体であって、その活性セグメントが、例えば常磁性物質、放射性物質、または蛍光原物質でよい画像形成部分を含む、本発明の複合体を含む。
【０１２３】
特に好ましい実施形態では、本発明の診断方法を、腫瘍、例えばメラノーマや癌腫、肉腫、リンパ腫などの病的な状態の診断に使用することができる。
【０１２４】
これまで開示し記述してきたが、本発明に開示した特定のプロセス・ステップおよび材料には若干の変更を加えることができるので、本発明は、本明細書に開示した特定の実施例、プロセス・ステップ、および材料に限定されないことを理解されたい。また、本発明の範囲は上述の特許請求の範囲とその均等物によってのみ限定されるので、本明細書で使用される用語は特定の実施形態のみを記述するために使用するのであってそれに限定するものではないことも理解されたい。
【０１２５】
他に特に明示しない限り、この明細書および上述の特許請求の範囲で使用される単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」には複数形も含まれることに留意しなければならない。
【０１２６】
他に特に明示しない限り、この明細書および上述の特許請求の範囲の全体を通して「含む」という単語「ｃｏｍｐｒｉｓｅ」とその変形例である「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ」や「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」などは、述べられている整数またはステップあるいは述べられている整数またはステップの群を含むことを意味するものであって、任意のその他の整数またはステップあるいは整数またはステップの群を除外することを意味するものではないことを理解されたい。
【０１２７】
以下の実施例は、本発明の態様を実施する際に本発明で使用される技法の代表例である。これらの技法は、本発明を実施するための好ましい実施形態の例示であるが、本発明の開示に照らして本発明の精神および意図される範囲から逸脱することなく非常に数多くの変更を加えることが可能であることが当業者ならわかるであろう、ということを理解されたい。
【０１２８】
（実施例）
材料および方法
細胞およびウイルス
細胞系統：
＊７２１．２２１−クラスＩ　ＭＨＣ陰性のヒトＥＢＶで形質転換したＢ細胞系。
＊１１０６ｍｅｌ−クラスＩ　ＭＨＣ陰性ヒトメラノーマ細胞系。
＊２９３Ｔ−アデノウイルスで形質転換し、ＳＶ−ラージＴ抗原でトランスフェクトしたヒト線維芽腎臓細胞系。
＊ヒトＮＫ細胞単離キットおよび自動ＭＡＣＳ機器（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ　Ｂｉｏｔｅｃ　Ｉｎｃ）を使用して、ＮＫ細胞（系およびクローン）を抹消血リンパ球（ＰＢＬ）から単離し、ＮＫ細胞を前述のように培養中に保持した［Ｍａｎｄｅｌｂｏｉｍ，Ｏ．他、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８４：９１３〜９２２（１９９６）］。
【０１２９】
ウイルス：
センダイウイルス（ＳＶ）、マウスパラミクソウイルス、およびインフルエンザウイルス（ＩＶ）　Ａ／ＰＲ／８／３４（Ｈ１Ｎ１）を、Ｓｐａｆａｓ（Ｐｒｅｓｔｏｎ　Ｃｉｔｙ、ＣＴ、ＵＳＡ）から購入した。
【０１３０】
モノクローナル抗体
センダイウイルスに特異的なｍＡｂについては前に述べた［Ｐｅｔｅｒｈａｎｓ，Ｅ．他、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　１２８：３６６〜３７６（１９８３）；Ｙｅｗｄｅｌｌ，Ｊ．Ｗ．他、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２８：２６７０〜２６７５（１９８２）］。
【０１３１】
インフルエンザウイルスに特異的なｍＡｂについては前に述べた［Ｙｅｗｄｅｌｌ，Ｊ．Ｗ．、他、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．４８：２３９〜２４８（１９８３）］。
【０１３２】
抗ＣＤ９９ｍＡｂ１２Ｅ７は、Ａ．Ｂｅｒｎａｒｄ（Ｈｏｐｉｔａｌ　ｄｅ　Ｌ’Ａｒｃｈｅｔ、Ｎｉｃｅ、フランス）の厚意により贈られたものである。
【０１３３】
抗ＫＩＲ２ＤＬ１（ＮＫＡＴ１）ｍＡＢ　ＨＰ３Ｅ４は、Ｄｒ．Ｌｏｐｅｚ−Ｂｏｔｅｔ（Ｈｏｓｐｉｔａｌ　ｄｅ　ｌａ　Ｐｒｉｎｃｅｓａ、Ｍａｄｒｉｄ、スペイン）の厚意により贈られたものである。ハイブリドーマを生成するｍＡｂ　３Ｇ８は、Ｊａｙ　Ｕｎｋｅｌｅｓｓ（Ｍｔ．Ｓｉｎａｉ　Ｓｃｈｏｏｌ　ｏｆ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、ＵＳＡ）の厚意により与えられた。汎抗クラスＩ　ｍＡｂ　１４７は、ＥｘＢｉｏ（チェコ共和国）から購入した。
【０１３４】
ハイブリドーマを生成するｍＡｂ　３Ｇ８は、Ｊａｙ　Ｕｎｋｅｌｅｓｓ（Ｍｔ．Ｓｉｎａｉ　Ｓｃｈｏｏｌ　ｏｆ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、ＵＳＡ）から寄贈された。
【０１３５】
分子生物学における一般的な方法：
一般に、Ｍａｎｉａｔｉｓ他、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ（１９８９、１９９２）に記載されているような当技術分野で知られており具体的には記述されていない標準的な分子生物学的技法に従った。
【０１３６】
ＳＶに感染した７２１．２２１細胞を認識するｍＡｂの生成
ＳＶに感染した７２１．２２１細胞（５×１０６）を洗浄し、ＢＡＬＢ／ｃマウスに対して１４日間ごとに３回、腹腔内に注射した。免疫化したマウスから血清を採取し、感染細胞に対する抗体の存在について試験を行った。そのような抗体を生成するマウスに対して再び追加免疫を行い、４日後に脾臓を採取して、脾細胞を前述のようにＳＰ２／０細胞に融合させた［Ｐｏｒｇａｄｏｒ，Ａ．他、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ　６：７１５〜７２６（１９９７）］。
【０１３７】
増殖細胞融合体が入っているウェルから得られた上澄みを、初めにＥＬＩＳＡにより結合している７２１．２２１、ＳＶに感染した７２１．２２１または１１０６ｍｅｌ細胞についてスクリーニングした。次いで感染した７２１．２２１および／または１１０６ｍｅｌ陽性の上澄みをフロー・サイトメトリーによってスクリーニングし、ＳＶに感染した７２１．２２１細胞に対するＮＫｐ４６−Ｉｇ結合の阻止について調べた。
【０１３８】
血球凝集阻止試験
微量滴定プレートでは、１血球凝集単位（ＨＡＵ）のＩＶを、連続した２倍希釈のＮＫｐ４６−Ｉｇと共に５０μＬのＰＢＳ中４℃で３０分間インキュベートした。次いで１％の濃縮ヒツジＲＢＣ懸濁液５０μｌを添加し、血球凝集のパターンを３０分後に室温でカウントした。
【０１３９】
細胞毒性アッセイ
様々な標的に対するＮＫ系およびクローンの細胞傷害活性について、前述のように５時間の３５Ｓ放出アッセイで評価した［Ｐｏｒｇａｄｏｒ，Ａ．Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ．ＵＳＡ　９４：１３１４０〜１３１４５（１９９７）］。
【０１４０】
ｍＡｂを含む実験では、初めにＮＫ細胞を５０％のヒト血清と共にインキュベートし（ヒトＮＫ細胞の表面に発現した様々なＦｃ受容体に対するｍＡｂの結合を防止するため）、洗浄した。最終のｍＡｂ濃度は２０μｇ／ｍｌであり、またはハイブリドーマを産出するマウスから得られた血清中にｍＡｂが存在する場合は、１：１００の希釈率であった。示される全ての実験において、自発的な放出は最大放出の２５％未満であった。各ポイントは、２回行って得た値の平均を表す。２回行って得た値の範囲は常にその平均の５％以内であった。
【０１４１】
Ｉｇ融合タンパク質
ＣＤ１６−Ｉｇ融合タンパク質の生成については前に述べた［Ｍａｎｄｅｌｂｏｉｍ，Ｏ．他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　９６：５６４０〜５６４４（１９９９）］。
【０１４２】
ＮＫｐ３０（受託番号ＡＪ２２３１５３）、ＮＫｐ４４（受託番号ＮＭ＿００４８２８）、ＮＫｐ４６（使用したアイソフォームの受託番号はＡＪ００６１２１である）、ＫＩＲ−１（受託番号Ｌ４１２６７）、およびＮＫＡＴ−８（ＮＭ＿０１２３１４）の細胞外部分をコードする配列を、ヒトＮＫクローンから単離したｃＤＮＡからのＰＣＲによって増幅させた。これらのＰＣＲで生成した断片をクローニングして、ヒトＩｇＧ１のＦｃ部分を含有する哺乳動物の発現ベクターにし、Ｉｇ融合タンパク質を既に述べたように生成した［Ｍａｎｄｅｌｂｏｉｍ，Ｏ．他、（１９９９）同書］。構造の配列決定により、全てのＩｇ融合タンパク質のｃＤＮＡがヒトＦｃゲノムＤＮＡと共に枠内にあり、報告された配列と同一であることを確認した。
【０１４３】
この操作で使用した全てのＩｇ融合タンパク質は、標準的な非還元性のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上の単一のバンドとして移行し、それぞれに関し定期的にＳＤＳ−ＰＡＧＥによりアッセイを行って、タンパク質が分解していないことを確認した。
【０１４４】
Ｉｇ融合タンパク質によるＦＡＣＳ染色手順については前に述べた［Ｍａｎｄｅｌｂｏｉｍ，Ｏ．他、（１９９９）同書］。
【０１４５】
抗ＮＫｐ４６−ＩｇおよびＮＫｐ４４−Ｉｇ血清の生成
ＢＡＬＢ／ｃマウスの足蹠に、ＣＦＡ中で乳化させたＮＫｐ４６−Ｉｇ、ＮＫｐ４４−Ｉｇ、またはＫＩＲ−１−Ｉｇの融合タンパク質４０μｇを注射した。６週間後、マウスに追加免疫を行い、１２日後に血清を採取した。
【０１４６】
対照血清の場合、ＣＦＡ中で乳化させたＰＢＳを用いてマウスを上述のように免疫化した。血清に関し、ＹＴＳ、ＫＩＲ−１でトランスフェクトしたＹＴＳ細胞、および様々なＮＫ系およびクローンに対するＮＫｐ４６およびＮｋｐ４４抗原の特異性について試験した。
【０１４７】
抗ＮＫｐ４４および４６血清は、１：１００の希釈率、すなわちフロー・サイトメトリーで測定した結合が飽和する濃度で使用した。報告されたＮＫｐ４４およびＮＫｐ４６の発現パターンに合わせ［Ｃａｎｔｏｎｉ　Ｃ，Ｃ．他、Ｊ．Ｅｘｐ　Ｍｅｄ．１８９：７８７〜７９６（１９９９）、Ｐｅｓｓｉｎｏ　Ａ，Ｓ．他、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８８：９５３〜９６０（１９９８）］、ＮＫ細胞のみを抗ＮＫｐ４４血清および抗ＮＫｐ４６血清で陽性染色し、対照細胞７２１．２２１、ＲＰＭＩ　８８６６、Ｊｕｒｋａｔおよびその他のものは染色しないままにした。この血清を用いて、全てのＮＫ細胞（６系統および１５０を超えるクローン）を様々な程度に染色した。報告されたＮＫｐ４４の発現パターンに合わせ［Ｃａｎｔｏｎｉ　Ｃ，Ｃ．他の同書（１９９９）］、活性化ＮＫ細胞の表面のみでＮＫｐ４４の発現を検出した。さらに、細胞を抗ＮＫｐ４４および４６血清で被覆して様々なＮＫ系およびクローンと共にインキュベートした場合、リディレクトされたＰ８１５細胞溶解を引き起こすことができた。抗ＮＫｐ４４および４６血清は、Ｅ：Ｔ比が高い（２０：１よりも高い）感染していない１１０６ｍｅｌ細胞および２９３Ｔ細胞の溶解も含めたいくつかの非感染標的細胞の溶解を、部分的に阻止した。他のＮＫトリガー受容体に対する細胞リガンドの存在は［Ｂｏｔｔｉｎｏ，Ｃ．他、Ｈｕｍ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６１：１〜６（２０００）に概説されるように］、部分的な阻止を説明していると考えられた。
【０１４８】
ウイルス感染細胞に対するＮＫｐ４６−Ｉｇ融合タンパク質およびＮＫｐ４４−Ｉｇ融合タンパク質の結合の阻止
細胞（７２１．２２１および１１０６ｍｅｌ）を、ＳＶの上澄み１００μｌ（７２１．２２１の場合）に、またＩＶ　１０００ｕ／ｍｌ（１１０６ｍｅｌの場合）に感染させた。一晩インキュベートした後、感染細胞を洗浄し、様々なｍＡｂと共に氷上で１時間インキュベートした。次に、細胞を洗浄し、アッセイにかけて適切なＩｇ融合タンパク質１０μｇで前述のように染色を行った［Ｍａｎｄｅｌｂｏｉｍ，Ｏ．他、（１９９９）の同書］。
【０１４９】
精製済みＨＡを使用したＮＫｐ４４−Ｉｇ結合の阻止
様々なＩｇ融合タンパク質１０マイクログラムを、最終体積１００μｌのＰＢＳ−ＢＳＡ−Ａｚｉｄで精製済みのＨＡタンパク質［Ｂｒａｎｄ，Ｃ．Ｍ．およびＳｋｅｈｅｌ，Ｊ．Ｊ．　Ｎａｔ．Ｎｅｗ　Ｂｉｏｌ．２３８：１４５〜１４７（１９７２）］４０μｇと共に氷上で２時間インキュベートした。次いでこれらの混合物を、細胞と共に氷上で２時間インキュベートし、前に述べたものと同じ染色手段を使用して染色し、Ｉｇ融合タンパク質の存在について調べた［Ｍａｎｄｅｌｂｏｉｍ，Ｏ．，Ｐ．他の同書（１９９９）］。
【０１５０】
一時的なトランスフェクション
Ｆｕｇｅｎｅトランスフェクション試薬（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を使用して、２９３Ｔ細胞を、対照ＰＣＤＮＡ３プラスミドで一時的にトランスフェクトし（２９３Ｔ／ＭＯＣＫ）、またはセンダイウイルスのＨＮをコードするｃＤＮＡで一時的にトランスフェクトした（２９３Ｔ／ｐｃａ−ｓｖｈｎ）。
【０１５１】
実施例１
ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、およびＣＤ１６リガンドの検出。
ＮＫ認識におけるＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、およびＣＤ１６の役割を、ＮＫＰ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、およびＣＤ１６の細胞外ドメインがヒトＩｇＧ１のＦｃ部分と融合している融合タンパク質を生成することによって、調査した。ヒトＩｇＧ１　ＤＮＡのＦｃに融合しているＣＤ９９の細胞外ドメインを対照として使用した。これらの構造をＣＯＳ−７細胞に一時的にトランスフェクトし、分泌された融合タンパク質をプロテインＧカラムで精製した。Ｉｇ融合タンパク質を、様々な標的細胞と共にインキュベートし、前述のように間接的な免疫染色によって結合について分析した［Ｍａｎｄｅｌｂｏｉｍ，Ｏ．他の同書（１９９９）］。一般に、試験を行った全てのＩｇ融合タンパク質の中で、最も効率的な結合は、ＮＫｐ４４−Ｉｇ融合タンパク質の場合であることが観察された（表１）。対照のＣＤ９９−Ｉｇ融合タンパク質は、試験を行った標的細胞のいずれとも結合しなかった。先の報告は、ＮＫｐ４６が、ＣＤ１６受容体ではなくＮＫｐ４４活性化受容体と共に［Ｍａｎｄｅｌｂｏｉｍ，Ｏ．他の同書（１９９９）］、クラスＩ陰性７２１．２２１細胞の分解に関与することを示していた［Ｃａｎｔｏｎｉ　Ｃ，Ｃ．他の同書（１９９９）、Ｂｉａｓｓｏｎｉ　Ｒ，Ａ．他、Ｅｕｒ　Ｊ　Ｉｍｍｕｎｏｌ．２９：１０１４〜１０２０（１９９９）、Ｐｅｓｓｉｎｏ　Ａ，Ｓ．他、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８８：９５３〜９６０（１９９８）；Ｓｉｖｏｒｉ　Ｓ，Ｄ．他、Ｅｕｒ　Ｊ　Ｉｍｍｕｎｏｌ．２９：１６５６〜６６（１９９９）］。
【０１５２】
実際に、細胞をＮＫｐ３０−Ｉｇ、ＮＫｐ４４−Ｉｇ、またはＮＫｐ４６−Ｉｇの各融合タンパク質と共にインキュベートした場合、７２１．２２１細胞の染色はほんのわずかしか観察されず、７２１．２２１細胞をＣＤ１６−Ｉｇ融合タンパク質と共にインキュベートした場合には染色が全く観察されなかった（表１）。ＥＢＶで形質転換した別のＢ細胞系、ＲＰＭＩ８８６６の場合にも同様の結果が観察された。これらの結果によれば、ＮＫｐ３０−Ｉｇ、ＮＫｐ４４−Ｉｇ、およびＮＫｐ４６−Ｉｇの結合が低いこと、すなわちこれらのタンパク質に対するリガンドの発現が低いことを示すそのような結合は、それにもかかわらずこれらの細胞の溶解を引き起こすのに十分であり、あるいは、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、またはＣＤ１６とは異なるその他の溶解受容体に対する別の溶解リガンドの存在を示している。ＮＫｐ３０−Ｉｇ、ＮＫｐ４４−Ｉｇ、ＮＫｐ４６−Ｉｇ、またはＣＤ１６−Ｉｇと、ラージＴ抗原でトランスフェクトした２９３Ｔ腎臓細胞系、１１０６ｍｅｌ−メラノーマ細胞系、およびサルＣＯＳ−７細胞系との結合が観察された（表１）。実際に、これらの標的細胞の全ては、ＮＫ細胞で媒介される死滅に対して様々な程度で感受性がある［Ｍａｎｄｅｌｂｏｉｍ，Ｏ．Ｐ他の同書（１９９９）］。ＣＯＳ−７細胞上のＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、およびＣＤ１６に対するリガンドの存在は、これらの受容体に対するリガンドがいくつかの霊長類の中で保たれていることを示している。ＬＢ３３ＭＥＬＡ１メラノーマ細胞系に対するＮＫｐ３０およびＮＫｐ４４−Ｉｇ融合タンパク質の染色はほんのわずかしか観察されず（表１）、細胞系は、ＮＫ細胞により死滅させることができないものである（データは記載せず）。最後に、ＮＫｐ３０−、ＮＫｐ４４−、ＮＫｐ４６−、またはＣＤ１６−Ｉｇ融合タンパク質の、マウスｐ８１５細胞または健康なドナーから得たＰＢＬに対する結合はほんのわずかしか観察されず、または全く観察されず（表１）、したがって最も重要なこととして、溶解受容体に対するリガンドはヒトとマウスでは異なることを示しており、また２番めに重要なこととして、少なくともＰＢＬから得た「正常」細胞はＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、およびＣＤ１６に対する溶解リガンドを発現しないことを示している。
【０１５３】
2004504065.tif 000002
【０１５４】
細胞は、実験手順で述べたように様々なＩｇ融合タンパク質と共にインキュベートし、ＰＥ結合したヤギ抗ヒトＦｅで染色した。ＭＦＩは中央蛍光強度を示しており、ＭＦＩ数は、最も近い整数に丸めた。結果は、２つの独立した実験の代表的なものを表す。
【０１５５】
実施例２
ウイルス感染細胞に対するＮＫｐ４６−Ｉｇ融合タンパク質の結合
以前に公表されているように［Ｔｒｉｎｃｈｉｅｒｉ他、Ａｄｖ．ｉｎ　Ｉｍｍｕｎｏｌ．４７：１８７〜３７６（１９８９）］、ＮＫ細胞はウイルス感染細胞を効果的に溶解することができ、したがって、センダイウイルス（ＳＶ）（マウスパラミクソウイルス）による感染によってＮＫｐ４６−Ｉｇの結合が増加したかどうかという問題について、次に試験を行った。特に著しいのは、ＮＫｐ４６−Ｉｇの結合による染色が１０倍になったことが観察された点である（表２）。この効果はＮＫｐ４６の場合に特有のものであるが、それは、ＳＶ感染によって、試験を行った他のＮＫ受容体Ｉｇ融合タンパク質の結合が変化しないためである（ＣＤ１６−Ｉｇ、ＫＩＲ−１−Ｉｇ、またはＮＫＡＴ−８−Ｉｇ　データは記載せず）。
【０１５６】
2004504065.tif 000003
【０１５７】
１００μｌ／ｍｌのＳＶを含有する上澄みと共に、７２１．２２１細胞（１０６／ｍｌ）を一晩インキュベートした。細胞（感染したもの、または感染していないもの）を洗浄し、様々なｍＡｂと共にインキュベートし、ＦＩＴＣ標識したヤギ抗マウスＩｇで、またはＮＫｐ４６−Ｉｇ融合タンパク質で染色し、その後、ＰＥ結合したヤギ抗ヒトＦｃで染色した。ＭＦＩは中央蛍光強度（Ｍｅｄｉａｎ　Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　Ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ）を示しており、ＭＦＩ数は、最も近い整数に丸めた。ＳＶ感染した７２１．２２１細胞、および７２１．２２１細胞の、ＰＥ結合した抗ヒトＦｃによるバックグラウンド染色は、それぞれ４および２であった。結果は、５つの独立した実験の代表例を示す。別のＢ細胞系、ＲＰＭＩ　８８６６でも同様の結果が得られた。
【０１５８】
種々のウイルスによる感染
観察されたＳＶ感染７２１．２２１細胞に対するＮＫｐ４６−Ｉｇ融合タンパク質の結合がウイルス特異か細胞特異であるかを見出すため、種々のウイルスに感染したＡ９線維芽細胞を使用して同様の感染実験を行った。図１に示すように、感染していないＡ９細胞を、ＥＭＣＶ、ＭＶＭ、アデノウイルス、またはワクシニアウイルスに感染した同様の細胞と比較した場合、ＮＫｐ４６−Ｉｇ結合の著しい増大が観察された。
【０１５９】
実施例３
ＳＶ　ＨＮ糖タンパク質に対するＮＫｐ４６−Ｉｇの結合
ＳＶ感染７２１．２２１細胞上の推定のＮＫｐ４６−リガンドを確認するため、ＳＶ感染７２１．２２１細胞でマウスを免疫化し、脾臓から得られたＢ細胞ハイブリドーマの上澄みをスクリーニングして、非感染細胞に対するウイルス感染細胞の染色の増大について調べた。試験を行ったハイブリドーマクローンの１つの上澄み（１３５．７）は、ＳＶ感染細胞に対するＮＫｐ４６−Ｉｇの結合を効果的に阻止した（表２）。したがってｍＡｂ１３５．７は、ＳＶまたは宿主細胞でコードしたタンパク質を認識することができる。
【０１６０】
免疫吸着剤としてＳＶを使用したＥＬＩＳＡアッセイでは、ｍＡｂ１３５．７がウイルス遺伝子生成を認識することを示した（データは記載せず）。
【０１６１】
１２５Ｉで細胞表面を標識したＳＶ感染７２１．２２１細胞の界面活性剤溶解物から回収した１３５．７−反応性タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によれば、１３５．７は、報告されたＨＮ糖タンパク質の移動度と同様に、見かけの分子量が７０ｋＤａのタンパク質に結合することが明らかになった。
【０１６２】
したがって、十分に特徴付けされた抗ＳＶ　ｍＡｂも、ＳＶ感染細胞に対するＮＫｐ４６−Ｉｇの結合を阻止するかどうかという問題について、次に試験を行った。実際に、表２に示すように、感染細胞を最初に抗ＨＮ　ｍＡｂ　ＴＣ−１Ｄ６またはＴＣ−９Ｃ１と共にインキュベートした場合にＮＫｐ４６−Ｉｇ結合は阻止されたが、他の主なＳＶ糖タンパク質、融合（Ｆ）タンパク質に特異的なｍＡｂ　ＴＣ−９Ａ１の場合には阻止されなかった。
【０１６３】
実施例４
ＨＮでトランスフェクトした２９３Ｔ細胞溶解におけるＨＮのＮＫｐ４６認識の役割
ＳＶ感染７２１．２２１細胞に対するＮＫｐ４６−ＩｇのＨＮ依存結合にもかかわらず、ＳＶ感染に伴うＮＫ媒介型溶解に対するこれらの細胞の感受性の増大の検出はうまくいかなかったが（データは記載せず）、これはおそらく、これらの細胞がすでに、ＮＫ媒介型の溶解の影響を非常に受けやすいためと考えられる。このため、ＮＫ溶解におけるＨＮのＮＫｐ４６認識の役割に関する直接的な試験ができなかった。
【０１６４】
しかしこれは、ＨＮをコードするプラスミドで一時的にトランスフェクトした２９３Ｔ細胞を使用することにより可能であった。トランスフェクトした４８時間後、ＴＣ−１Ｄ６　ｍＡｂ（図２Ａ）または１３５．７（図示せず）を使用することによって、細胞表面のＨＮ発現が確認された。
【０１６５】
図２Ａに示すように、トランスフェクションによって、ＮＫｐ４６−Ｉｇ以外のＩｇ融合タンパク質、ＫＩＲ−１−Ｉｇ、ＮＫＡＴ−８−Ｉｇ、またはＣＤ１６−Ｉｇによる染色を高めることなくＮＫｐ４６−Ｉｇ染色が２倍に増大したことが重要である。さらに、ＮＫ−ＧＡＬ、健康なドナーのＰＢＬから得られたＮＫ系は、トランスフェクトしていない細胞またはｍｏｃｋでトランスフェクトした細胞よりも少なくとも４倍効率的に、ＨＮでトランスフェクトした２９３Ｔ細胞を溶解した（図２Ｂ、Ｃ）。
【０１６６】
ＮＫｐ４６−Ｉｇに対するマウス抗血清と共にＮＫ　ＧＡＬを事前にインキュベートすると、ＨＮでトランスフェクトした２９３Ｔ細胞の死滅の増大が抑制されたが、対照血清と共に行ったインキュベーションではほとんど効果がなかった（図２Ｂ）。同じ実験によれば、３種のＨＮに特異的なｍＡｂのそれぞれはＮＫで媒介される溶解を阻止できるが、ＣＤ９９に特異的な対照ｍＡｂでは著しい効果がないことが明らかになった（図２Ｃ）。
【０１６７】
実施例５
ＮＫｐ４６は、ＮＫ細胞によるＨＡ発現細胞の認識に必要である
ＮＫ認識の顕著な特徴の１つは、その抗原特異性が不十分であることである。ＮＫｐ４６は、ＮＫ媒介型の溶解において物理的かつ機能的にＳＶ　ＨＮと相互に作用することを示したが、本発明者らは次に、インフルエンザウイルス（ＩＶ）ＨＡとも相互に作用するかどうかについて試験を行った。１１０６ｍｅｌ細胞のＩＶ感染（クラスＩ欠損細胞系）により、ＮＫｐ４６−Ｉｇ結合が４倍増大した（表３）。上述のように、結合が高まるという特定の性質は、他のＩｇ融合タンパク質の一定の結合によって示される（データは記載せず）。
【０１６８】
ＮＫｐ４６−Ｉｇ結合の増大は、ＨＡに特異的なｍＡＢ　Ｈ２８−Ｅ２３およびＨ１７−Ｌ２によってそれぞれ完全にまたは部分的に阻止されたことが重要である（表３）。これとは対照的に、ＨＮに特異的なｍＡｂ　ＴＣ−１Ｄ６、ＴＣ−９Ｃ１、または１３５．７は、結合に影響を与えなかった（データは記載せず）。
【０１６９】
次に、１１０６細胞をＩＶに感染させた。図３Ａに示すように、この感染によってＮＫ　ＧＡＬ媒介型の溶解が高まり、抗ＮＫｐ４６血清と共に細胞を事前にインキュベートすることによって死滅の増大が阻止されるが、対照の血清、またはＣＤ９９およびＣＤ１６にそれぞれ特異的なｍＡｂ　１２Ｅ７および３Ｇ８との場合は阻止されない。
【０１７０】
ＩＶ感染した１１０６ｍｅｌ細胞を、ｍＡｂ　Ｈ２８−Ｅ２３と共にインキュベーションすることにより、溶解の増大が完全に抑制されたが、Ｈ１７−Ｌ２には部分的な抑制効果があり、阻止実験の結果を反映している（図３Ｂ、表３）。
【０１７１】
2004504065.tif 000004
【０１７２】
１１０６ｍｅｌ細胞（１０６／ｍｌ）を、１０００ｕ／ｍｌのインフルエンザウイルスと共にＯ．Ｎ．インキュベートした。細胞（感染したもの、または感染していないもの）を洗浄し、様々なｍＡｂと共にインキュベートし、ＦＩＴＣ結合したヤギ抗マウスＩｇで、またはＮＫｐ４６−Ｉｇ融合タンパク質で染色し、その後、ＰＥ結合したヤギ抗ヒトＦｃで染色した。ＭＦＩは中央蛍光強度を示し、ＭＦＩ数は最も近い整数に丸めた。ＩＶ感染した１１０６細胞と、１１０６細胞の、ＰＥ結合した抗ヒトＦｃによるバックグラウンド染色はそれぞれ７および６であった。結果は、８つの独立した実験の代表例である。
【０１７３】
ＮＫ　ＧＡＬから調製したクローンによるＩＶ感染１１０６ｍｅｌ細胞の認識について、限定希釈によって試験を行った。試験を行った２８のクローン全てについて、抗ＮＫｐ４６血清で陽性染色した。これらのうち２１のクローンは、ＩＶ感染していない細胞よりもＩＶ感染した細胞の認識が高まることを示しており（図３Ｃ）、２１のクローン全てをＨＡに特異的なｍＡｂ　Ｈ２８−Ｅ２３と共に事前にインキュベートすることによって、ＩＶにより増大した溶解が完全に抑制された（データは記載せず）。ＮＫクローンを抗ＮＫｐ４６血清と共に事前にインキュベートすることにより、これらのクローンのうち１３のクローンのＩＶ強化型の溶解が完全に抑制され（例えばクローン６、図３Ｃ）、一方、６個のクローンについては部分的に抑制された（例えばクローン１５、図３Ｃ）。これら２つのグループに関し、抗ＮＫｐ４６血清で染色した平均ＭＦＩは、それぞれ２８．９および３２．８であった。ＩＶ感染細胞の溶解が増大したことを示す２つのクローンは、ＮＫｐ４６抗血清の影響を受けなかった（例えばクローン１７、図３Ｃ）。２つのクローンのこのグループに対する抗ＮＫｐ４６染色に関する平均ＭＦＩは、１７．５であった。
【０１７４】
最後に、試験を行ったクローンのうち７つのクローンに関しては、ＩＶに関連する溶解の増大は観察されず（例えばクローン５、図３Ｃ）、このグループの抗ＮＫｐ４６染色に関するＭＦＩは３１．３であった。ＨＮでトランスフェクトした２９３Ｔ細胞を用いて同じＮＫクローンを試験した場合、同様の結果が得られた（データは記載せず）。
【０１７５】
ＮＫクローンは、より少ない量のＮＫｐ４６受容体を発現する他のＮＫ系からも生成された（例えば、ＮＫ　ＧＡＬにおけるＭＦＩが４１．４であるのに比べてＮＫｐ４６染色のＭＦＩが１５．５のＮＫ系）。このＮＫ系から生成されたクローンの約３分の１で、ＩＶ感染した１１０６ｍｅｌ溶解の増大の抑制（部分的にまたは完全に）が観察され、溶解の程度はＮＫｐ４６染色と相互に関連していた（データは記載せず）。
【０１７６】
これらの所見は、第１に、ＮＫ細胞の実質上のサブセットによるＨＡ−およびＨＮ−発現細胞の認識にＮＫｐ４６が必要であり、第２に、ＮＫ細胞のその他の集団は、これらの細胞をＮＫｐ４６とは独立の手法により溶解できることを示している。
【０１７７】
実施例６
ＮＫｐ４６とＨＡおよびＨＮとの相互作用におけるシアル酸の関与
ＳＶ　ＨＮとＩＶ　ＨＡは共に、Ｇａｌに結合した末端Ｎアセチルノイラミン酸残基（シアル酸）を認識し、ＮＫｐ４６に結合する一般的なメカニズムを示している。ＮＫｐ４６とＨＡとの相互作用におけるシアル酸の関与は、発見の数によって示される。第１に、ＮＫｐ４６−Ｉｇは、タンパク質の濃度が２μＭという低い濃度でヒツジ赤血球のＩＶ媒介型凝集を完全に阻止することができる。第２に、ＩＶノイラミニダーゼの酵素活性を阻止するｍＡｂ（ＮＡ２−１Ｃ２１）と共にＩＶ感染細胞を事前にインキュベートすることによって、ＩＶ感染細胞に対するＮＫｐ４６−Ｉｇ結合が著しく増大する（表３）。最後に、そして最も直接的なことは、細菌性のノイラミニダーゼでＮＫｐ４６−Ｉｇを処理することによって、ＩＶに感染していない細胞に対する結合を減少させることなくＩＶ感染細胞に対する結合を減少させた（図４）。
【０１７８】
脱シアリル化が、受容体−リガンド対の負の電荷の反発力を減少させることによって相互作用をしばしば増大させる限り［Ｖａｒｋｉ，Ａ．他、ＦＡＳＥＢ　Ｊ．１１：２４８〜５５（１９９７）］、これは強力に、ＮＫｐ４６とＨＡのシアル結合部位との直接的な相互作用をサポートする。
【０１７９】
これらの発見は、２つのタイプのリガンドを介してＮＫｐ４６が標的細胞に結合することを示すと解釈することができ、その第１は、ＮＫｐ４６に関連するシアル酸とウイルス性シアル酸受容体との相互作用に基づき、第２は、明らかにされていない細胞リガンドとの、シアル酸とは無関係な相互作用に基づく。前者は、調査を行ったＮＫ細胞によるＩＶ感染細胞の死滅の増大の明らかな原因である。ＮＫの活性化に対する第２の相互作用の関与は依然として証明されていないが、おそらく、標的細胞とその他の因子によって同様に発現したリガンドの性質により様々であると考えられる。ＮＫｐ４６とウイルスＨＡとの相互作用が、その他の細胞リガンドとの相互作用を引き起こすのに十分であるかどうか、またはその他の細胞リガンドとの相互作用も必要とするかどうかは、依然として将来の研究の重要な課題である。
【０１８０】
ＮＫｐ４６とは無関係な手法でＩＶ感染細胞を認識するＮＫクローン（例えばＮＫ　ＧＡＬクローン１７、図３Ｃ）が存在することは、ウイルス感染細胞の認識に関与するその他の溶解受容体が存在することを示す。ウイルス感染に伴う溶解の増大は抗ＨＡ　ｍＡｂによって完全に阻止されるので、これらの受容体もおそらくＨＡを認識する。これらの受容体の誘発はやはり活性化受容体とシアル酸との相互作用に基づく可能性がある。少なくとも７つのウイルス科（ｆａｍｉｌｙ）のメンバーが、ウイルスを宿主に入れるための受容体としてシアル酸を利用するとすれば、これは、ウイルスの実質上のサブセットのＮＫ細胞認識に関する一般的な方策を提示している。
【０１８１】
実施例７
ＳＶ感染７２１．２２１細胞に対するＮＫｐ４４−Ｉｇ結合のアップレギュレーションは、抗ＨＮ　ｍＡｂによって阻止される。
本明細書で前に述べたように、ウイルスＨＡは、ＮＫｐ４６受容体のリガンドとして識別された。ＮＫｐ４４受容体もウイルスＨＡに結合できるかどうかを試験するため、７２１．２２１細胞をＳＶに感染させて、ＮＫｐ４４−Ｉｇの結合が増大するかどうか試験を行った。ＮＫｐ４４−Ｉｇによる染色が１０倍増加したことが観察された（表４）。この作用は、ＮＫｐ４４−ＩｇおよびＮＫｐ４６に特有のものであるが（表２も参照）、それはＳＶ感染によって、試験を行ったその他のＮＫ受容体Ｉｇ融合タンパク質の結合が変化しなかったためである（ＮＫｐ３０−Ｉｇ、ＣＤ１６−Ｉｇ、ＫＩＲ−１−Ｉｇ、またはＮＫＡＴ−８−Ｉｇ（データは記載せず））。ＮＫｐ４４−Ｉｇ結合は、ＳＶ−ＨＮ、ＴＣ−１Ｄ６、ＴＣ−９Ｃ１［Ｐｅｔｅｒｈａｎｓ，Ｅ．他、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．１２８：３６６〜３７６（１９８３）］、または１３５．７に対して向けられたｍＡｂによって部分的に阻止されたが、その他の主なＳＶ糖タンパク質、融合（Ｆ）タンパク質に特異的なｍＡｂ　ＴＣ−９Ａ１［Ｐｅｔｅｒｈａｎｓ，Ｅ．他の同書（１９８３）］の場合は阻止されなかった（表４）。これは、ＮＫｐ４４−ＩｇがＳＶからのＨＮと相互に作用できることを示している。
【０１８２】
ＳＶ−ＨＮ　ｃＤＮＡでトランスフェクトした２９３Ｔ細胞に対するＮＫｐ４４−Ｉｇ結合の上昇
センダイＨＮに対するＮＫｐ４４−Ｉｇの直接的な結合をさらに実証するため、センダイＨＮ　ｃＤＮＡをコードする発現プラスミド（ｐｃａ−ｓｖｈｎ、Ｄｒ．Ａｌｌｅｎ　Ｐｏｒｔｎｅｒから寄贈）で一時的に２９３Ｔ細胞をトランスフェクトした。トランスフェクトした４８時間後、抗ＨＮ　ｍＡｂを使用したときに効率的なＨＮ染色が観察された（ＴＣ−１Ｄ６、図５）。同様のレベルの発現が１３５．７　ｍＡｂで染色した場合にも観察されたが、対照ｍＡｂの場合は観察されなかった（インフルエンザの抗ＨＡ、データは記載せず）。重要なことに、ｐｃａ−ｓｖｈでトランスフェクトした２９３Ｔ細胞のＮＫｐ４４−Ｉｇ染色が２倍に増大したことも観察され（図５）、増大した特異性はＮＫｐ４４に対するリガンドであることが確認された。その他のＩｇ融合タンパク質（ＫＩＲ−１−Ｉｇ、ＮＫＡＴ−８−Ｉｇ、またはＣＤ１６）を使用した場合は、試験を行った全ての細胞の染色に何の変化も観察されなかった。
【０１８３】
2004504065.tif 000005
【０１８４】
７２１．２２１細胞（１０６／ｍｌ）を、１００μｌ／ｍｌのセンダイウイルスを含有する上澄みと共に一晩インキュベートした。細胞（感染したものまたは感染していないもの）を洗浄し、様々なｍＡｂと共にインキュベートし、ＦＩＴＣ標識したヤギ抗マウスＩｇまたはＮＫｐ４６−Ｉｇ融合タンパク質で染色し、その後、ＰＥ結合したヤギ抗ヒトＦｃで染色した。ＭＦＩは中央蛍光強度を示し、ＭＦＩ数は、最も近い整数に丸めた。センダイウイルスに感染した７２１．２２１細胞と７２１．２２１細胞の、ＰＥ結合した抗ヒトＦｃによるバックグラウンド染色は、それぞれ４および３であった。結果は、４つの独立した実験の代表例である。
【０１８５】
実施例８
７２１．２２１／Ｃｗ６細胞のＳＶ感染によって、高レベルのＮＫｐ４４タンパク質を発現するＮＫクローンで媒介される抑制が停止する
次に、ＳＶに細胞が感染することによってＮＫ媒介型の溶解が増大する可能性について調査した。ＳＶ感染した７２１．２２１細胞と感染していない細胞との間には、ＮＫ媒介型の死滅に何の変化も観察されなかった（データは記載せず）。この現象についていくつかの説明をすることができる。その１つに、ＮＫ細胞が７２１．２２１細胞を効率的に溶解するという考えがあり、したがって別の溶解リガンド（ＳＶ血球凝集素）を添加することによって死滅を増加させないことが可能である。したがって本発明者等は、次に、クラスＩ　ＭＨＣタンパク質を発現する７２１．２２１細胞をＳＶに感染させた場合にＮＫクローンの死滅パターンに何らかの変化が観察されるかどうかについて試験を行った。ＮＫクローンを様々なドナーから調製し、初めにスクリーニングをして、ＨＬＡ−Ｃｗ３、−Ｃｗ４、−Ｃｗ６、または−Ｃｗ７クラスＩ　ＭＨＣタンパク質でトランスフェクトした７２１．２２１細胞により媒介される溶解の阻害について調査した。これらのトランスフェクタントの生成についてはＯ．Ｍａｎｄｅｌｂｏｉｍにより記述されている［Ｍａｎｄｅｌｂｏｉｍ，Ｏ．他、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８４：９１３〜９２２（１９９６）］。次に、クラスＩ　ＭＨＣタンパク質を発現する７２１．２２１細胞により阻害されることがわかったＮＫクローンについて、ＳＶに感染した同じ標的細胞に対し、試験を行った。７２１．２２１細胞がＳＶに感染すると阻害が停止し、その結果、試験を行ったＮＫクローンの約７５％だけ溶解した。これらのクローンの全てが、ＮＫｐ４４タンパク質とＮＫｐ４６タンパク質の両方を高レベルで発現した（データは記載せず）。１つの代表的なクローンを図６に示す。ＮＫクローン６６は、Ｃｗ６を発現する７２１．２２１細胞（７２１．２２１／Ｃｗ６）によって阻害される。ＮＫクローン６６を抗ＫＩＲ２ＤＬ１　ｍＡｂ　ＨＰ３Ｅ４と共にインキュベートしたときには阻害の停止が観察されたが、細胞を対照ｍＡｂ　１２Ｅ７と共にインキュベートしたときには観察されなかった。（図６Ａ）。７２１．２２１／Ｃｗ６細胞をＳＶに感染させた場合、可逆阻害も観察された。７２１．２２１／Ｃｗ６細胞を汎抗クラスＩ　ｍＡｂ１４７と共にインキュベートしたときに阻害の阻止が観察されるので、阻害は、ＫＩＲ２ＤＬ１受容体とＨＬＡ−Ｃｗ６との相互作用によって可能になった（６Ｂ）。感染細胞を抗ＨＡ　ｍＡｂ１３５．７と共にインキュベートしたときに阻害が回復するので、可逆阻害は、感染細胞上でのＨＡの発現に依存するものであった（図６Ｂ）。ＮＫクローン６６を、７２１．２２１／Ｃｗ４細胞と共に、あるいは７２１．２２１／Ｃｗ３または７２１．２２１／Ｃｗ７によって阻害されるＫＩＲ２ＤＬ２を発現するその他のＮＫクローンと共にインキュベートしたときに、同様の結果が得られた（データは記載せず）。ＮＫｐ４４タンパク質を低レベルで発現する試験済みのＮＫクローンの約２５％では、標的細胞をＳＶに感染させた場合、阻害パターンに何の変化も見られなかった。このためＮＫｐ４４とＳＶのＨＡとの相互作用はおそらく、クラスＩ　ＭＨＣタンパク質を発現するＳＶ感染標的細胞によって媒介される阻害を克服することが必要と考えられる。
【０１８６】
実施例９
精製したＨＡは、ウイルス感染細胞に対する融合タンパク質ＮＫｐ４６−Ｉｇ結合およびＮＫｐ４４−Ｉｇの結合を阻止する
感染した７２１．２２１細胞（野生型およびトランスフェクタント）の死滅に対するＮＫｐ４４とＮＫｐ４６の両方の関与については、７２１．２２１細胞の溶解がＮＫｐ４４およびＮＫｐ４６に依存するので、抗ＮＫｐ４４およびＮＫｐ４６血清を使用するこの系では直接試験をすることができない［Ｃａｎｔｏｎｉ　Ｃ，Ｃ．他の同書（１９９９）、Ｂｉａｓｓｏｎｉ　Ｒ，Ａ．他の同書（１９９９）、Ｐｅｓｓｉｎｏ　Ａ，Ｓ．他の同書（１９９８）、Ｓｉｖｏｒｉ　Ｓ，Ｄ．他の同書（１９９９）］。したがって、種々の細胞型を使用してＮＫｐ４４−Ｉｇ融合タンパク質がその他のウイルスの血球凝集素に結合できるかどうかについて、次に試験を行った。１１０６ｍｅｌ細胞（ＣＤ１６陽性ヒトＮＫ細胞によってほんの適量だけ溶解する細胞系［Ｍａｎｄｅｌｂｏｉｍ，Ｏ．他の同書（１９９９）］）をＩＶに感染させ、染色してＮＫｐ４４−Ｉｇ染色が上昇するかどうか調査した。１１０６ｍｅｌ細胞がＩＶに感染すると、ＮＫｐ４４−Ｉｇ染色が増大（約４倍）することが観察された（表５）。ＩＶ感染した１１０６ｍｅｌ細胞に対するその他のＩｇ融合タンパク質、すなわちＮＫｐ３０、ＣＤ１６−Ｉｇ、ＫＩＲ−１−Ｉｇ、およびＮＫＡＴ−８−Ｉｇを含めたタンパク質の結合の増大が観察されなかったので、このＮＫｐ４４−Ｉｇ染色は特異的なものであった（データは記載せず）。ＮＫｐ４４−Ｉｇ結合の増大は、Ｈ２８−Ｅ２３　ｍＡｂおよびＨ１７−Ｌ２　ｍＡｂによって完全に阻止されたことが重要である（表５）。どちらのｍＡｂも共にインフルエンザウイルスのＨＡに対して向けられる。ＳＶから得られたＨＮに対して向けられるｍＡｂ（ＴＣ−１Ｄ６、ＴＣ−９Ｃ１、および１３５．７）を添加しても、何の影響もなかった（データは記載せず）。
【０１８７】
精製したＨＡが、感染細胞に対するＮＫｐ４４またはＮＫｐ４６の結合を阻止できるかどうかを見極めるため、他の部分で述べたように、ＰＢＳ−ＢＳＡ−Ａｚｉｄ中の最終体積１００μｌで、様々なＩｇ融合タンパク質１０マイクログラムを精製済みのＨＡタンパク質４０μｇと共に氷上で２時間インキュベートした［Ｂｒａｎｄ，Ｃ．Ｍ他、Ｎａｔ．Ｎｅｗ　Ｂｉｏｌ．２３８：１４５〜１４７（１９７２）］。図７は、精製したＨＡタンパク質４０μｇと共に、またはそのタンパク質なしで、ＮＫｐ４４−Ｉｇ（Ａ）またはＮＫｐ４６−Ｉｇ（Ｂ）をインキュベートした状態を示す（精製したＨＡタンパク質４０μｇ未満を使用した場合、ＮＫｐ４６−ＩｇまたはＮＫｐ４４−Ｉｇの結合は阻止されないことが明らかであった）。次に混合物を、ＩＶに感染しまたは感染していない１１０６ｍｅｌ細胞と共に氷上で２時間インキュベートし、前述と同じ染色手順を使用して［Ｍａｎｄｅｌｂｏｉｍ，Ｏ．他の同書（１９９９）］、ＰＥ結合したヤギ抗ヒトＦｃで染色し、Ｉｇ融合タンパク質の存在について調査した。図７は、２回実施した実験のうち１つの代表例を示す。ＳＶ感染７２１．２２１細胞を使用した場合に同様の結果が得られた。これらの結果は、ウイルスタンパク質ＨＡとナチュラルキラー細胞活性化受容体ＮＫｐ４４およびＮＫｐ４６との直接的な相互作用を示す。
【０１８８】
さらに、ＥＬＩＳＡアッセイにおけるＮＫｐ４６−ＩｇおよびＮＫｐ４４−Ｉｇと血球凝集素タンパク質との直接的な相互作用（図示せず）。
【０１８９】
インフルエンザウイルスに感染した細胞に対するＮＫｐ４４−Ｉｇの結合は、ＮＫｐ４４のシアリル化に依存する
ＳＶ　ＨＮとＩＶ　ＨＡの両方は、Ｇａｌに結合した末端Ｎアセチルノイラミン酸残基（シアル酸）を認識し、ＮＫｐ４４に対する結合が、ＮＫｐ４６に対するＨＡの結合（実施例６で述べた）と同様にＮＫｐ４４上に発現したシアル酸残基を介して生じる可能性があることを示している。実際にＩＶ感染細胞を、ＩＶノイラミニダーゼ（感染細胞の表面に発現したその他の主なＩＶ糖タンパク質）の酵素活性を阻止するｍＡｂ（ＮＡ２−１Ｃ２１）と共に事前にインキュベートすることにより、ＩＶ感染細胞に対するＮＫｐ４４−Ｉｇの結合が著しく高まる（表５）。さらにＮＫｐ４４−Ｉｇは、ＨＡがシアル酸に結合しないはしか（ｍｅａｓｌｅｓ）［Ｍａｉｓｎｅｒ，Ａ．およびＨｅｒｒｌｅｒ，Ｇ．　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　２１０：４７９〜４８１（１９９５）］に感染した標的細胞を、染色しなかった（データは記載せず）。最後に、かつ最も直接的なことには、ＮＫｐ４４−Ｉｇを細菌性ノイラミニダーゼで処理すると、ＩＶ感染していない細胞に対する結合が減少することなくＩＶ感染した細胞に対する結合が減少する（図８）。ＮＫｐ４４−Ｉｇの処理は、フロー・サイトメトリーで測定した場合、感染していない１１０６ｍｅｌ細胞の染色に影響を与えず（図８）、ＳＤＳ／ＰＡＧＥ分析によって試験を行ったタンパク質の完全性にも変化を与えなかった（データは記載せず）。脱シアリル化では、受容体−リガンド対の負の電荷の反発力を減ずることによってしばしば相互作用が増大するので［Ｖａｒｋｉ，Ａ．、ＦＡＳＥＢ　Ｊ．１１：２４８〜５５（１９９７）］、これはＮＫｐ４４とＨＡのシアル結合部位との直接的な相互作用を強力にサポートする。
【０１９０】
2004504065.tif 000006
【０１９１】
１１０６ｍｅｌ細胞（１０６／ｍｌ）を、１０００ｕ／ｍｌのＡ／ＰＲ／８／３４インフルエンザウイルスと共にＯ．Ｎ．インキュベートした。細胞（感染したもの、または感染していないもの）を洗浄し、様々なｍＡｂと共にインキュベートし、ＦＩＴＣ結合したヤギ抗マウスＩｇで、またはＮＫｐ４６−Ｉｇ融合タンパク質で染色し、その後、ＰＥ結合したヤギ抗ヒトＦｃで染色した。ＭＦＩは中央蛍光強度を示し、ＭＦＩ数は最も近い整数に丸めた。インフルエンザに感染した１１０６ｍｅｌ細胞と、１１０６ｍｅｌ細胞の、ＰＥ結合した抗ヒトＦｃによるバックグラウンド染色はそれぞれ８および６であった。結果は、３つの独立した実験の代表例である。
【０１９２】
実施例１０
ＩＶ感染した１１０６ｍｅｌ細胞の溶解の増大は、ＮＫｐ４４に対するポリクローナルｍＡｂによって阻止される
上述の結果は、ＮＫｐ４４がＩＶとＳＶの両方の血球凝集素と結合できることを示していた。実施例５で実証されたように、１１０６ｍｅｌ細胞がＩＶに感染することによって、ＨＡに対するｍＡｂによって完全に阻止された１１０６ｍｅｌ細胞の溶解が増大した。しかし、抗ＮＫｐ４６血清がアッセイに含まれる場合、試験を行ったＮＫクローンの中で、いくつかの死滅表現型（完全阻害、部分阻害、または阻害なし）を観察することができた。１つの可能な説明とは、ＨＡに結合することができる別の受容体が存在することである。したがってＩＶに感染した１１０６ｍｅｌの溶解について調べるため、ＮＫクローンと、抗ＮＫｐ４４血清および抗ＮＫｐ４６血清の組合せを使用するアッセイにかけた。ＮＫクローンは、限定希釈によってドナーＭＢから得られたＰＢＬから調製した。試験を行った全てのクローン（合計で６４）を、抗ＮＫｐ４４血清と抗ＮＫｐ４６血清の両方で陽性染色した。ＩＶに感染した１１０６ｍｅｌ細胞（１１０６ｍｅｌ／Ｆｌｕ）の死滅の増大が、試験を行ったＮＫクローンの５７％で観察された（図９）。１１０６ｍｅｌ／Ｆｌｕ溶解の増大の完全な阻害は、試験を行ったＮＫクローン、すなわち抗ＮＫｐ４６血清と共に、または抗ＮＫｐ４４およびＮＫｐ４６血清の組合せと共に、事前にインキュベートしたＮＫクローンの２６％で観察された（例えばクローン１、図９）。試験を行ったクローンの１４％は、抗ＮＫｐ４４血清と抗ＮＫｐ４６血清の両方を独立に使用したときに部分阻害を示し、抗ＮＫｐ４４血清と抗ＮＫｐ４６血清の両方を組み合せたときに完全な阻害を示した（例えばクローン４６、図９）。１１０６ｍｅｌ／Ｆｌｕ溶解の増大は、試験を行ったクローンの１７％で阻止できなかった（例えばクローン８、図９）。最後に、このドナーから得られた試験を行ったクローンの４３％で溶解の増大が観察されなかった（例えばクローン４、図９）。このような細胞のパーセンテージは、本明細書で前に示したように、それぞれのドナーによってかなり変わる可能性がある。１１０６ｍｅｌ／Ｆｌｕ細胞の増大の完全阻害は、抗ＮＫｐ４４血清のみがアッセイに含まれる場合、決して実現されなかった（データは記載せず）。１１０６ｍｅｌの効率的な溶解がより高いＥ：Ｔ比で観察された場合、抗ＣＤ１６ｍＡｂと共に、または抗ＮＫｐ４４血清および抗ＮＫｐ４６血清と共に細胞をインキュベートすることによって、溶解の部分阻害が生じた（データは記載せず）。全ての抗体を組み合せた場合、１１０６ｍｅｌ溶解の効率的な阻害が観察された（データは記載せず）。
【０１９３】
このため、ＮＫｐ４６受容体と同様に、ＮＫｐ４４は、センダイウイルスとインフルエンザウイルスの両方の血球凝集素に結合することができ、この結合によって、感染細胞のＮＫ細胞溶解が引き起こされる。ここで試験を行ったクローンの４３％が、１１０６ｍｅｌ／Ｆｌｕ細胞の死滅の増大を示さない理由は、完全に理解されていない。１つの可能な説明は、感染が原因でアップレギュレートされまたはダウンレギュレートされ、またＮＫの死滅を調節するのに重要なその他のタンパク質に対する受容体を、これらのクローンが発現する可能性があることである。
【０１９４】
実施例１１
ウイルスＨＡとの相互作用の原因としてのＮＫｐ４６のドメイン２の識別
ウイルスＨＡとの相互作用におけるＮＫｐ４６分子の種々のドメインの役割について、種々の欠失融合タンパク質を生成することによって調査をした。
【０１９５】
第１のＮＫｐ４６細胞外ドメイン（ａ．ａ．＃１〜１２０から−配列番号２６により示される）ならびに第２の細胞外ドメイン（ａ．ａ．＃１２１〜２３４−配列番号２２により示される）をヒトＩｇＧ１のＦｃ部分に融合させ、ＮＫｐ４６Ｄ１−ＩｇおよびＮＫｐ４６Ｄ２−Ｉｇをそれぞれ生成した。これらの構成をＣＯＳ−７細胞に一時的にトランスフェクトし、分泌した融合タンパク質をプロテインＧカラムで精製した。ウイルスＨＡに対する結合がこれら２つのドメインの一方によって特に媒介されるかどうかを試験するため、両方の欠失融合タンパク質ならびに対照の完全融合タンパク質ＮＫｐ４６−ＩｇおよびＮＫｐ４４−Ｉｇに関し、ウイルス感染細胞に対する結合について試験を行った。したがって、７２１．２２１細胞をＳＶに感染させ、ＮＫｐ４６Ｄ１−ＩｇまたはＮＫｐ４６Ｄ２−Ｉｇの結合の増大について試験を行った。ＮＫｐ４６Ｄ２−Ｉｇ融合タンパク質による染色は約１０倍増大したことが観察され（図１０）、一方、７２１．２２１細胞のＳＶ感染は、ＮＫｐ４６Ｄ１−Ｉｇ融合タンパク質のいかなる著しい結合も増大させなかった。この観察されたＮＫｐ４６Ｄ２−Ｉｇ結合は、ＳＶ−ＨＮに対して向けられた１３５．７ｍＡｂによってかなり阻止されたが、その他の主なＳＶ糖タンパク質、融合（Ｆ）タンパク質に特異的なｍＡｂ　ＴＣ−９Ａ１［Ｐｅｔｅｒｈａｎｓ，Ｅ．他の同書（１９８３）］の場合、または対照の１２Ｅ７抗体によっては阻止されなかった（図１０Ｄ）。これらの結果は、ＮＫｐ４６中のＨＡ相互作用部分がドメイン２であることを示している。インフルエンザウイルスに感染した１１０６ｍｅｌで同様の実験を行ったが、ＮＫｐ４６のドメイン２は、観察されたウイルスＨＡとの相互作用を担うドメインであることが示された（図１１）。このため、ＮＫｐ４６Ｄ１ではなくＮＫｐ４６Ｄ２がウイルス感染細胞に結合することができ、さらに、この結合は抗ＨＮｍＡｂで阻止することができる。
【０１９６】
本明細書の実施例６および９で述べたように、ＮＫｐ４６およびＮＫｐ４４のそれぞれに対するＳＶ　ＨＮおよびＩＶ　ＨＡの結合は、両方の受容体に発現するシアル酸残基を介して生じる。観察されたウイルスタンパク質に対するＮＫｐ４６Ｄ２の結合もシアル残基によって媒介されるかどうかを見出すため、融合タンパク質を細菌のノイラミニダーゼで処理し、その後、感染細胞（ＳＶに感染した７２１．２２１細胞およびＩＶに感染した１１０６細胞）と共にインキュベートした。図１２に示すように、ノイラミニダーゼ（ＮＡ）を使用してシアル酸残基を除去すると、融合タンパク質の結合能力が著しく低下した。これらの結果は、ＩＶ感染した１１０６ｍｅｌ細胞またはＳＶ感染した７２１．２２１細胞に対するＮＫｐ４６Ｄ２−Ｉｇの結合がシアル酸に依存することを示している。
【０１９７】
実施例１２
ヒトメラノーマ細胞での様々な溶解リガンド、特にＮＫｐ３０の発現
メラノーマの患者を腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）で治療することによって、メラノーマの患者の４０％にクラスＩ　ＭＨＣ消失変異体が生じることが、前に報告されている［Ｒｅｓｔｉｆｏ，Ｎ．Ｐ．他、Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ　Ｉｎｓｔ．８８：１００〜１０８（１９９６）］。これは、腫瘍細胞中のβ２−ミクログロブリン発現のダウンレギュレーションに起因する。同じ腫瘍系は、ＮＫ細胞で媒介される死滅に対して様々な程度で影響を受けやすいことが、後に示された［Ｐｏｒｇａｄｏｒ，Ａ．他、Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ．９４：１３１４０〜１３１４５（１９９７）］。さらに、これらのメラノーマ系の１つ、１１０６ｍｅｌは、試験を行ったＣＤ１６陰性ＮＫクローンの多くによって非効率的に死滅することが示された［Ｍａｎｄｅｌｂｏｉｍ，Ｏ．他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９６：５６４０〜５６４４（１９９９）］。
【０１９８】
クラスＩ　ＭＨＣ発現が不十分な様々なメラノーマ細胞（対照として使用するＬＢ３３ｍｅｌＡ１を除く）のＮＫ認識におけるＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、およびＣＤ１６の各受容体の役割を、本発明のＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、およびＣＤ１６　Ｉｇ融合タンパク質を使用した実験を行うことによって、調査した。ヒトＩｇＧ１　ＤＮＡに融合したＣＤ９９の細胞外ドメインをコードするｃＤＮＡを、対照として使用した。Ｉｇ融合タンパク質を、様々なメラノーマ細胞と共にインキュベートし、前述のように［Ｍａｎｄｅｌｂｏｉｍ，Ｏ．の同書（１９９９）］間接的な免疫染色により結合について分析した。一般に、ＮＫｐ３０−ＩｇおよびＮＫｐ４４−Ｉｇ融合タンパク質の場合に最高のメラノーマ細胞の染色が観察された（表６）。ＬＢ３３ｍｅｌＡ１細胞では全てのＩｇ融合タンパク質の染色はほとんど観察されず、細胞系はＮＫ細胞によって死滅させることが困難なものであった（データは記載せず）。ＮＫ細胞によって死滅させることができる全てのその他の細胞系を、Ｉｇ融合タンパク質で様々な程度に染色した（表６）。
【０１９９】
2004504065.tif 000007
【０２００】
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【図面の簡単な説明】
【図１】
様々なウイルスに感染した後の、ＮＫｐ４６リガンド発現のアップレギュレーション
７２１．２２１細胞（１０６／ｍｌ）を、センダイウイルスを含有する上澄み１００μｌ／ｍｌと共に一晩インキュベートした。Ａ９細胞（２４時間前に継代した半集密的な培養びん）を、ＭＶＭ（１．５×１０７単位／ｍｌ）、ＥＭＣＶ（ＥＭＣＶを含有する上澄み２５０μｌ／ｍｌ）、アデノウイルス（５×１０６単位／ｍｌ）、またはワクシニア（ワクシニアを含有する上澄み４ｍｌ）のいずれかと共に３時間インキュベートした。Ａ９細胞を異なるウイルスと共にインキュベートした後、ウイルスを含有する媒質を除去して、培地を添加した。感染から１８〜２４時間後、細胞（感染しまたは感染していないもの）を採取し、洗浄し、ＮＫｐ４６−Ｉｇ融合タンパク質（太線）または対照のＣＤ９９−Ｉｇ（普通線）で染色し、その後、ＰＥ結合抗ヒトＦｃで染色した。パネル内の数はＮＫｐ４６−Ｉｇ染色のＭＦＩを表す。結果は、２回実施した実験の代表的なものを示す。略語：Ｃｏｕはカウントの略である。
【図２】
ＮＫｐ４６Ｉｇによって促進される、センダイＨＮｃＤＮＡでトランスフェクトした２９３Ｔ細胞の溶解
Ａ：センダイＨＮｃＤＮＡでトランスフェクトした２９３Ｔ細胞に対するＮＫｐ４６−Ｉｇの結合。２９３Ｔ細胞を一時的に、対照（ｃｏｎｔ）ＰＣＤＮＡ３プラスミドでトランスフェクトし（２９３Ｔ／ＭＯＣＫ）、またはセンダイウイルスのＨＮをコードするｃＤＮＡでトランスフェクトした（２９３Ｔ／ｐｃａ−ｓｖｈｎ）。４８時間後、細胞を、ＴＣ−１Ｄ６　ｍＡｂで、またはＫＩＲ−１、ＮＫＡＴ−８、ＣＤ１６、およびＮＫｐ４６　Ｉｇ融合タンパク質で染色した。ＭＦＩは中央蛍光強度を示す。対照は、ＦＩＴＣ結合抗マウス（抗＝α）抗体（ｍＡｂなし）で、またはＰＥ結合抗ヒトＦｃ抗体（Ｉｇ融合タンパク質なし）で染色した同じ細胞であった。結果は、３回実施した実験の代表的なものを示す。
ＢおよびＣ：センダイＨＮｃＤＮＡでトランスフェクトした２９３Ｔ細胞の溶解促進は、抗ＮＫｐ４６および抗ＨＮｍＡｂによって阻止される。トランスフェクションの４８時間後、２９３Ｔ細胞、２９３Ｔ／ＭＯＣＫ細胞、および２９３Ｔ／ｐｃａ−ｓｖｈｎ細胞を３５Ｓ−Ｍｅｔで標識し、洗浄した。次いで標識した細胞を、示したエフェクターと標的の比（Ｅ：Ｔ）で、対照血清（ｃｏｎｔ　ｓｅｒ）または抗ＮＫｐ４６血清（ｓｅｒ）と共に事前にインキュベートしたＮＫ　ＧＡＬと共にインキュベートした（Ｂ）。あるいは、標識細胞を、様々なｍＡｂと共に氷上で１時間インキュベートし、洗浄し、次いでＮＫ　ＧＡＬと共にインキュベートした（Ｃ）。全ての実験で、ＮＫ細胞を５０％のヒト血清（ｓｅｒ）と共に氷上で１時間、事前にインキュベートし、次いで洗浄してＦｃ受容体をブロックした。結果は、３回実施した実験の代表的なものを示す。略語：Ｐｒｏｔ（タンパク質）、特異的溶解（ｓｐ　ｌｙ）、比（ｒａ）、ＭＯ（ｍｏｃｋ）。
【図３】
ＮＫ　ＧＡＬおよび誘導されたクローンによる、ＩＶに感染した１１０６ｍｅｌ細胞の溶解
Ａ：ＮＫ細胞を、抗体なしで、または対照（ｃｏｎｔ）抗ＣＤ９９ｍＡｂと共に（１２Ｅ７）、抗ＣＤ１６ｍＡｂ（抗＝α）と共に（３Ｇ８）、対照血清（ｃｏｎｔ　ｓｅｒ）と共に、抗ＮＫｐ４６血清と共に、氷上で１時間インキュベートした。次いでＮＫ細胞を洗浄し、次いで１１０６ｍｅｌ細胞と共に、またはＩＶに感染した１１０６ｍｅｌ細胞と共に、示したＥ：Ｔの比（＝ｒａ）でインキュベートした。
Ｂ：ＩＶに感染した１１０６ｍｅｌ細胞を、様々なｍＡｂと共に氷上で１時間インキュベートし、次いでＮＫ　ＧＡＬと共に、示したＥ：Ｔの比でインキュベートした。結果は、３回実施した実験の代表的なものである。
Ｃ：限定希釈によって、ＮＫ　ＧＡＬから２８のＮＫクローンを誘導した。ポリクローナル抗体を含有する血清を用いたブロッキング実験を、図１に関する説明文で述べたように実施した。Ｅ：Ｔの比は５：１であった。図に示すパーセンテージは、現れる１つのＮＫクローンと同様に振る舞ったクローンの％である。結果は、２回実施した実験の代表的なものである。全ての実験で、ＮＫ細胞を、５０％のヒト血清と共に氷上で１時間、事前にインキュベートし、次いで洗浄して、Ｆｃ受容体をブロックした。略語：ｓｐ　ｌｙは特異的溶解の略であり、ｃｏｎｔ（対照）、ｓｅｒ（血清）であり、ｃｌはクローンの略である。
【図４】
ＩＶに感染し、また感染していない１１０６細胞に対するＮＫｐ４６−Ｉｇの結合に、ＮＡ処理が及ぼす影響
ＮＫｐ４６−Ｉｇを、ビーズ状アガロース（Ｎ―５２５４、ＳＩＧＭＡ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、Ｍｉｓｓｏｕｒｉ）に結合した０．０１Ｕの不溶性ノイラミニダーゼと共に、またはＰＢＳ（ｍｏｃｋ処理したもの、ＭＯ−ｔｒｅａ）と共に、ローラ上で１時間、１７℃でインキュベートした。ＩＶに感染し、または感染していない１１０６細胞（Ｃｅ）を洗浄し、ＮＡ処理し（ｔｒｅａ）またはｍｏｃｋ処理したＮＫｐ４６−Ｉｇで染色し、その後、ＰＥ結合抗ヒトＦｃで染色した。ＭＦＩは中央蛍光強度を示す。ＡおよびＢのパネルは、８回実施した実験のうち代表的な２つを示す。ＮＡの活性は、ＮＡ処理したフェツイン、高度にシアリル化したタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により確認した。
【図５】
センダイＨＮｃＤＮＡでトランスフェクトした２９３Ｔ細胞に対するＮＫｐ４４−Ｉｇの結合
Ｆｕｇｅｎｅトランスフェクション試薬（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を使用して、２９３Ｔ細胞を一時的に対照ＰＣＤＮＡ３プラスミドでトランスフェクトし（２９３Ｔ／ＭＯＣＫ）、またはＳＶのＨＮをコードするｃＤＮＡでトランスフェクトした（２９３Ｔ／ｐｃａ−ｓｖｈ）。４８時間後、細胞を、ＴＣ−１Ｄ６　ｍＡｂで、またはＫＩＲ−１、ＮＫＡＴ−８、ＣＤ１６、およびＮＫｐ４６　Ｉｇ融合タンパク質で染色した。ＭＦＩは中央蛍光強度を示す。対照は、ＦＩＴＣ結合抗マウス抗体（ｍＡｂなし）で、またはＰＥ結合抗ヒトＦｃ抗体（Ｉｇ融合タンパク質なし）で染色した同じ細胞であった。結果は、２回実施した実験の代表的なものを示す。略語：ｓｐ　ｌｙは特異的溶解の略であり、ＭＯ（ＭＯＣＫ）、ｐｒｏｔ（タンパク質）である。
【図６】
抑制が妨げられるクラス１　ＭＨＣタンパク質を発現する７２１．２２１のＳＶ感染
自動ＭＡＣＳ機器（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ　Ｂｉｏｔｅｃ　Ｉｎｃ．）を使用して、様々なドナーからＮＫクローンを誘導した。ＮＫｐ４４タンパク質およびＮＫｐ４６タンパク質の存在に関しては抗ＮＫｐ４４およびＮＫｐ４６血清を使用してクローンを染色し、ＮＫ抑制受容体の存在に関してはＨＰ３Ｅ４　ｍＡｂを使用してクローンを染色した。現れるＮＫクローンのＥ：Ｔの比は約３：１であった。結果は、２回実施した実験の代表的なものを示す。
Ａ：初めにＮＫクローンを、指示されるｍＡｂと共に１時間インキュベートし、次いで標識した標的細胞と共にインキュベートしたことを示す。
Ｂ：初めに、指示されるｍＡｂと共に氷上で１時間インキュベートし、次いでＮＫ細胞と共にインキュベートした、標識された標的細胞を示す。
略語：ｓｐ　ｌｙは特異的溶解の略である。
【図７】
ＩＶに感染し、また感染していない１１０６ｍｅｌ細胞に対するＮＫｐ４６−ＩｇおよびＮＫｐ４４−Ｉｇの結合に、ＨＡブロッキングが及ぼす影響
ＮＫｐ４４−Ｉｇ（上部パネル）またはＮＫｐ４６−Ｉｇ（下部パネル）を、４０μｇの精製されたＨＡタンパク質なしで、またはそのような４０μｇの精製されたＨＡタンパク質と共に、インキュベートした。次に混合物を、ＩＶに感染しまたは感染していない１１０６ｍｅｌ細胞と共にインキュベートし、ＰＥ結合ヤギ抗ヒトＦｃで染色した。ＭＦＩは中央蛍光強度を示す。
【図８】
ＩＶに感染し、また感染していない１１０６ｍｅｌ細胞に対するＮＫｐ４４−Ｉｇの結合に、ＮＡ処理が及ぼす影響
ＭＦＩは中央蛍光強度を示す。ＮＫｐ４４−Ｉｇを、ビーズ状アガロース（Ｎ―５２５４、ＳＩＧＭＡ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、Ｍｉｓｓｏｕｒｉ）に結合した０．０１Ｕの不溶性ノイラミニダーゼと共に、またはＰＢＳ（対照として）と共に、ローラ上で１時間、１７℃でインキュベートした。ＩＶに感染し、または感染していない１１０６ｍｅｌ細胞を洗浄し、ＮＡ処理しまたはｍｏｃｋ処理したＮＫｐ４４−Ｉｇで染色し、その後、ＰＥ結合抗ヒトＦｃで染色した。図は、２回実施した実験のうち代表的な１つを示す。ＮＡの活性は、ＮＡ処理したフェツイン、高度にシアリル化したタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により確認した。略語：Ｎｏ　ｐｒ（タンパク質なし）、ＮＡ　ｔｒｅａ（ＮＡ処理）
【図９】
ＮＫクローンによるＩＶ感染１１０６ｍｅｌ細胞の溶解
限定希釈によって、ＮＫ系統のＭＢから６４のＮＫクローンを誘導した。ポリクローナル抗体を含有する血清を用いたブロッキング実験を、実験手順で述べたように実施した。Ｅ：Ｔの比は２：１であった。図に示すパーセンテージは、現れる１つのＮＫクローンと同様に振る舞ったクローンの％である。１１０６ｍｅｌ／Ｆｌｕ＋Ｃは、対照血清とのインキュベーションを示す。結果は、２回実施した実験の代表的なものである。全ての実験で、ＮＫ細胞を、５０％のヒト血清と共に氷上で１時間、事前にインキュベートし、次いで洗浄して、Ｆｃ受容体をブロックした。略語：ｓｐ　ｌｙ（特異的溶解）、ｃｌ（クローン）、α（抗）。
【図１０】
ドメイン２は、ＳＶのＨＶウイルスタンパクとの相互作用を引き起こす
７２１．２２１細胞を、ＳＶ上澄み１００μｌに感染させた。一晩インキュベートした後、感染した細胞を洗浄し、様々なｍＡｂと共に氷上で１時間インキュベートした。次に細胞を洗浄し、アッセイにかけて前述のように適切なＩｇ融合タンパク質１０μｇで染色し［Ｍａｎｄｅｌｂｏｉｍ，Ｏ．他、（１９９９）の同書］、ＭＦＩは中央蛍光強度を示す。
【図１１】
ドメイン２は、ＩＶのＨＡウイルスタンパクとの相互作用を引き起こす
１１０６ｍｅｌ細胞を、ＩＶ　１０００ｕ／ｍｌに感染させた。一晩インキュベートした後、感染細胞を洗浄し、様々なｍＡｂと共に氷上で１時間インキュベートした。次に細胞を洗浄し、アッセイにかけて前述のように適切なＩｇ融合タンパク質１０μｇで染色した［Ｍａｎｄｅｌｂｏｉｍ，Ｏ．他、（１９９９）の同書］。ＭＦＩは中央蛍光強度を示す。
【図１２】
感染細胞および感染していない細胞に対するＮＫｐ４６ｄ２−Ｉｇの結合に、ＮＡ処理が及ぼす影響
指示される様々な融合タンパク質を、ビーズ状アガロース（Ｎ―５２５４、ＳＩＧＭＡ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、Ｍｉｓｓｏｕｒｉ）に結合した０．０１Ｕの不溶性ノイラミニダーゼと共に、またはＰＢＳ（ｍｏｃｋ処理したもの）と共に、ローラ上で１時間、１７℃でインキュベートした。ＩＶに感染し、または感染していない１１０６細胞、ならびにＳＶに感染し、または感染していない７２１．２２１細胞を洗浄し、ＮＡ処理し（ｔｒｅａ）またはＰＢＳ処理した融合タンパク質で染色し、その後、ＰＥ結合抗ヒトＦｃで染色した。ＭＦＩは中央蛍光強度を示す。ＮＡの活性は、ＮＡ処理したフェツイン、高度にシアリル化したタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により確認した。
Ａ：ＮＫｐ３０−Ｉｇ融合タンパク質とのインキュベーションを示す。
Ｂ：ＮＫｐ４４−Ｉｇ融合タンパク質とのインキュベーションを示す。
Ｃ：ＮＫｐ４６−Ｉｇ融合タンパク質とのインキュベーションを示す。
Ｄ：ＮＫｐ４６Ｄ１−Ｉｇ融合タンパク質とのインキュベーションを示す。
Ｅ：ＮＫｐ４６Ｄ２−Ｉｇ融合タンパク質とのインキュベーションを示す。
【図１】
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【図２】
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【図５】
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【図６】
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【図１０】
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【図１１】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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