(57)【要約】本発明は、目的のアミノ酸配列に結合した不安定化アミノ酸配列を含む融合タンパク質をコードする核酸（例えば、ＤＮＡ免疫プラスミド）に関する。目的のアミノ酸配列の免疫原性は、この不安定化アミノ酸配列の存在により増強される。本発明はまた、分泌融合タンパク質（例えば、ケモカインまたはサイトカインおよび結合した目的のアミノ酸配列を含む融合タンパク質）をコードする核酸に関する。目的のアミノ酸配列の免疫原性は、分泌配列が結合している結果として増強される。本発明はまた、ワクチンとしての使用および遺伝子治療における使用のための、コードされるタンパク質の免疫原性を増強する方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
目的の異種アミノ酸配列に共有結合した不安定化アミノ酸配列を含む融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸構築物であって、該目的のアミノ酸配列の免疫原性が該不安定化アミノ酸配列の存在により増強され、該不安定化アミノ酸配列は、ｃ−Ｍｙｃ  ２〜１２０アミノ酸；サイクリンＡ  １３〜９１アミノ酸；サイクリンＢ  １０〜９５アミノ酸；サイクリンＢ  １３〜９１アミノ酸；ＩｋＢａ  ２０〜４５アミノ酸；β−カテニン  １９〜４４アミノ酸；ｃ−Ｊｕｎ  １〜６７アミノ酸；およびｃ−Ｍｏｓ  １〜３５アミノ酸からなる群より選択されるアミノ酸配列中に存在する、核酸構築物。
【請求項２】
前記目的のアミノ酸配列が、疾患関連抗原である、請求項１に記載の核酸構築物。
【請求項３】
前記不安定化配列が、ｃ−Ｍｏｓ  １〜３５アミノ酸；サイクリンＢ  １０〜９５アミノ酸；β−カテニン  １９〜４４アミノ酸、およびβ−カテニン  １８〜４７アミノ酸からなる群より選択される、請求項１に記載の核酸構築物。
【請求項４】
前記疾患関連抗原が、腫瘍関連抗原、自己免疫疾患関連抗原、感染疾患関連抗原、ウイルス抗原、寄生生物抗原、および細菌抗原からなる群より選択される、請求項２に記載の核酸構築物。
【請求項５】
前記ウイルス抗原がＨＩＶ抗原である、請求項４に記載の核酸構築物。
【請求項６】
前記ＨＩＶ抗原が、Ｇａｇ、Ｅｎｖ、Ｐｏｌ、Ｎｅｆ、Ｖｐｒ、Ｖｐｕ、Ｖｉｆ、Ｔａｔ、およびＲｅｖからなる群より選択される、請求項５に記載の核酸構築物。
【請求項７】
前記疾患関連抗原が、連結してひとつになっているが、この順序である必要はないＨＩＶの抗原性フラグメントＧａｇ−Ｐｏｌ−Ｔａｔ−Ｒｅｖ−ＮｅｆまたはＴａｔ−Ｒｅｖ−Ｅｎｖ−Ｎｅｆを含む、請求項６に記載の核酸構築物。
【請求項８】
前記自己免疫疾患関連抗原が、Ｔ細胞レセプター由来のペプチドである、請求項４に記載の核酸構築物。
【請求項９】
請求項１に記載の核酸構築物を含む、ベクター。
【請求項１０】
請求項１に記載の核酸構築物を含む、宿主細胞。
【請求項１１】
請求項１に記載の核酸構築物および薬学的に受容可能なキャリアを含む、薬学的組成物。
【請求項１２】
目的のアミノ酸配列に対する免疫応答を刺激する方法であって、免疫応答を刺激するのに十分な量の請求項１１に記載の薬学的組成物を哺乳動物に投与する工程を包含する、方法。
【請求項１３】
哺乳動物において抗体を誘導する方法であって、請求項１１に記載の組成物を哺乳動物に投与する工程を包含し、ここで、前記核酸構築物は、該哺乳動物において該抗体を誘導するのに有効な量で存在する、方法。
【請求項１４】
哺乳動物において細胞傷害性Ｔリンパ球および／またはヘルパー−インデューサーＴリンパ球を誘導する方法であって、請求項１１に記載の組成物を哺乳動物に投与する工程を包含し、ここで、前記核酸構築物は、該哺乳動物において該細胞傷害性Ｔリンパ球および／またはヘルパー−インデューサーＴリンパ球を誘導するのに有効な量で存在する、方法。
【請求項１５】
哺乳動物においてＨＩＶ感染に対する免疫を誘導するためのワクチン組成物であって、治療有効量の請求項１に記載の核酸構築物および薬学的に受容可能なキャリアを含む、ワクチン組成物。
【請求項１６】
哺乳動物においてＨＩＶ感染に対する免疫を誘導する方法であって、治療有効量の請求項１５に記載のワクチン組成物を哺乳動物に投与する工程を包含する、方法。
【請求項１７】
請求項１に記載の核酸構築物によりコードされる、融合ポリペプチド。
【請求項１８】
請求項１に記載の核酸構築物を含む、ウイルス粒子。
【請求項１９】
請求項１８に記載のウイルス粒子を含む、薬学的組成物。
【請求項２０】
目的のアミノ酸配列に対する免疫応答を刺激する方法であって、免疫応答を刺激するのに十分な量の請求項１９に記載の薬学的組成物を哺乳動物に投与する工程を包含する、方法。
【請求項２１】
目的の異種アミノ酸配列に共有結合したケモカインＭＣＰ−３分泌リーダーアミノ酸配列を含む、分泌融合タンパク質をコードする核酸構築物であって、該目的のアミノ酸配列の免疫原性が、該分泌アミノ酸配列の存在により増強される、核酸構築物。
【請求項２２】
前記目的のアミノ酸配列が疾患関連抗原である、請求項２１に記載の核酸構築物。
【請求項２３】
前記ケモカインＭＣＰ−３分泌リーダー配列が、ＭＣＰ−３アミノ酸３３〜１０９または１〜１０９である、請求項２１に記載の核酸構築物。
【請求項２４】
前記構築物が、（ａ）ＨＩＶ  ｐ３７  ｇａｇ、ＭＣＰ−３分泌リーダー配列、およびＩＰ１０のリーダー配列をコードする配列を含む構築物、ならびに（ｂ）ＳＩＶ  ｐ３９  ｇａｇ、ＭＣＰ−３分泌リーダー配列、およびＩＰ１０のリーダー配列をコードする配列を含む構築物、からなる群より選択される、請求項２１に記載の核酸構築物。
【請求項２５】
前記疾患関連抗原が、腫瘍関連抗原、自己免疫疾患関連抗原、感染疾患関連抗原、ウイルス抗原、寄生生物抗原、および細菌抗原からなる群より選択される、請求項２２に記載の核酸構築物。
【請求項２６】
前記ウイルス抗原がＨＩＶ抗原である、請求項２５に記載の核酸構築物。
【請求項２７】
前記ＨＩＶ抗原が、Ｇａｇ、Ｅｎｖ、Ｐｏｌ、Ｎｅｆ、Ｖｐｒ、Ｖｐｕ、Ｖｉｆ、Ｔａｔ、およびＲｅｖからなる群より選択される、請求項２６に記載の核酸構築物。
【請求項２８】
前記疾患関連抗原が、連結してひとつになっているが、この順序である必要はないＨＩＶの抗原性フラグメントＧａｇ−Ｐｏｌ−Ｔａｔ−Ｒｅｖ−ＮｅｆまたはＴａｔ−Ｒｅｖ−Ｅｎｖ−Ｎｅｆを含む、請求項２５に記載の核酸構築物。
【請求項２９】
前記自己免疫疾患関連抗原が、Ｔ細胞レセプター由来のペプチドである、請求項２５に記載の核酸構築物。
【請求項３０】
請求項２１に記載の核酸構築物を含む、ベクター。
【請求項３１】
請求項２１に記載の核酸構築物を含む、宿主細胞。
【請求項３２】
請求項２１に記載の核酸構築物および薬学的に受容可能なキャリアを含む、薬学的組成物。
【請求項３３】
目的のアミノ酸配列に対する免疫応答を刺激する方法であって、免疫応答を刺激するのに十分な量の請求項３２に記載の薬学的組成物を哺乳動物に投与する工程を包含する、方法。
【請求項３４】
哺乳動物において抗体を誘導する方法であって、請求項３２に記載の組成物を哺乳動物に投与する工程を包含し、ここで、前記核酸構築物は、該哺乳動物において該抗体を誘導するのに有効な量で存在する、方法。
【請求項３５】
哺乳動物において細胞傷害性Ｔリンパ球および／またはヘルパー−インデューサーＴリンパ球を誘導する方法であって、請求項３２に記載の組成物を哺乳動物に投与する工程を包含し、ここで、前記核酸構築物は、該哺乳動物において該細胞傷害性Ｔリンパ球および／またはヘルパー−インデューサーＴリンパ球を誘導するのに有効な量で存在する、方法。
【請求項３６】
哺乳動物においてＨＩＶ感染に対する免疫を誘導するためのワクチン組成物であって、治療有効量の請求項２１に記載の核酸構築物および薬学的に受容可能なキャリアを含む、ワクチン組成物。
【請求項３７】
哺乳動物においてＨＩＶ感染に対する免疫を誘導する方法であって、治療有効量の請求項３６に記載のワクチン組成物を哺乳動物に投与する工程を包含する、方法。
【請求項３８】
請求項２１に記載の核酸構築物によりコードされる、融合ポリペプチド。
【請求項３９】
請求項２１に記載の核酸構築物を含む、ウイルス粒子。
【請求項４０】
請求項３９に記載のウイルス粒子を含む、薬学的組成物。
【請求項４１】
目的のアミノ酸配列に対する免疫応答を刺激する方法であって、免疫応答を刺激するのに十分な量の請求項４０に記載の薬学的組成物を哺乳動物に投与する工程を包含する、方法。
【請求項４２】
不安定化部分または分泌部分に共有結合した異なる形態の抗原を発現する１つ以上のベクターを含む、組成物。
【請求項４３】
少なくとも１つの前記ベクターが、目的の異種アミノ酸配列に共有結合した不安定化アミノ酸配列を含む融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸構築物であって、該目的のアミノ酸配列の免疫原性が該不安定化アミノ酸配列の存在により増強される、核酸構築物を含み、そして少なくとも１つの前記ベクターが、目的の異種アミノ酸配列に共有結合した分泌アミノ酸配列を含む分泌融合タンパク質をコードする核酸構築物であって、該目的のアミノ酸配列の免疫原性が、該分泌アミノ酸配列の存在により増強される、核酸構築物を含む、請求項４２に記載の組成物。
【請求項４４】
哺乳動物において抗体を誘導する方法であって、請求項４２に記載の組成物を哺乳動物に投与する工程を包含し、前記ベクターが、該哺乳動物において該抗体を誘導するのに有効な量で存在する、方法。
【請求項４５】
哺乳動物において細胞傷害性Ｔリンパ球および／またはヘルパー−インデューサーＴリンパ球を誘導する方法であって、請求項４２に記載の組成物を哺乳動物に投与する工程を包含し、ここで、前記ベクターは、該哺乳動物において該細胞傷害性Ｔリンパ球および／またはヘルパー−インデューサーＴリンパ球を誘導するのに有効な量で存在する、方法。
【請求項４６】
前記組成物を同一部位に投与する工程を包含する、請求項４４または４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記ベクターが、同じときに投与される、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記ベクターが、異なるときに投与される、請求項４６に記載の方法。
【請求項４９】
前記組成物を異なる部位に投与する工程を包含する、請求項４４または４５に記載の方法。
【請求項５０】
前記ベクターが、同じときに投与される、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記ベクターが、異なるときに投与される、請求項４９に記載の方法。
【請求項５２】
野生型ｇａｇ、ＭＣＰ３ｇａｇおよびＢ−ＣＡＴＥｇａｇをコードする核酸を含むベクターを含む、組成物。
【請求項５３】
ベクター野生型ｅｎｖ、ＭＣＰ３ｅｎｖおよびＢ−ＣＡＴＥｅｎｖを含む、組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（Ｉ．技術範囲）
本発明は、目的のアミノ酸配列に付着した不安定なアミノ酸配列を含有する融合タンパク質をコードする核酸（例えば、ＤＮＡ免疫プラスミド）に関し、ここで目的アミノ酸配列の免疫原性は、不安定なアミノ酸配列の存在によって増加される。本発明はまた、目的の付着したアミノ酸配列分泌型融合タンパク質（例えば、ケモカインまたはサイトカインおよび目的の付着したアミノ酸配列を含有するもの）をコードする核酸に関し、ここで目的アミノ酸配列の免疫原性は、分泌配列に付着している結果として、増加する。本発明はまた、ワクチンとしてまたは遺伝子治療における使用のために、コードされたタンパク質の免疫原性を増加させる方法に関する。
【０００２】
（ＩＩ．背景）
ヒト免疫不全ウイルス１型（ＨＩＶ−１）および関連するサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）に対する細胞性免疫応答は、ＨＩＶ−１およびＳＩＶ感染を制御する際、ならびに疾患の進行を遅らせる際に重要な役割を果たすことが示されている。感染した個体における初期のＨＩＶ−１感染の封じ込めは、ウイルス特異的細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）応答の出現と関連する（１，２，３）。慢性的に感染した個体において、ＨＩＶ−１に対する高頻度ＣＴＬ応答はまた、低いウイルス付加および緩慢な疾患の進行と関連する（４，５）。ＨＩＶ−１特異的ＣＴＬ応答はまた、特定の高度に強く曝露された血清陰性の個体において実証されている（６，７，８）。また、ＣＴＬ応答の維持に重要であり得る、ＨＩＶ特異的な強い増殖応答は、長期にわたり無症状のまま経過する個体（ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ  ｎｏｎｐｒｏｇｒｅｓｓｏｒ）において同定されている（９，１０）。
【０００３】
ＨＩＶ−１  Ｇａｇは、最も保存されたウイルスタンパク質の１つである。ＨＩＶ−１  Ｇａｇの保存されたエピトープを認識する、広範な、クレイドで交差する（ｃｒｏｓｓ−ｃｌａｄｅ）ＣＴＬ応答が、ＨＩＶ−１感染者において検出されており（１１，１２）、そして、安全で有効なＨＩＶ−１ワクチンの開発は、Ｇａｇのような保存されたＨＩＶ−１タンパク質に対する効果的なＣＴＬおよび／またはＴヘルパー応答の誘導に依存し得る。ＤＮＡワクチンは、動物モデルにおいて種々のウイルス、細菌、および寄生生物の病原体に対する効果的な細胞性免疫応答および防御を誘導することが示されている。しかしながら、ＨＩＶ−１  Ｇａｇに対する強力な細胞性免疫応答を誘導し得るＤＮＡワクチンは、まだ利用可能ではない。
【０００４】
本発明者らは、最近、ＨＩＶ−１  ｇａｇのコード領域における阻害性配列の破壊によって、霊長類細胞ならびにマウス細胞においてＧａｇタンパク質の発現を有意に増加し得（１３，１４，１５，１６）、そしてＤＮＡワクチンにより誘導される免疫応答を劇的に増強し得ること（１３）を実証した。この新しい、Ｇａｇ発現ベクターは、Ｒｅｖ／ＲＲＥ非依存性および種非依存性であるため、動物モデルにおいてＨＩＶ  Ｇａｇ分子に対する細胞性免疫応答の最大限の誘導を導き得る、ストラテジーを体系的に評価するための可能なアプローチを提供する。
【０００５】
ＤＮＡワクチンの筋肉内（ｉ．ｍ．）投与は、体液性免疫および細胞性免疫の両方を誘導する簡単で効果的な手段を提示する（１７）。ＤＮＡの筋肉内（ｉ．ｍ．）注入の後の抗原提示を担う３つの潜在的な経路が存在する。第１は、ＤＮＡをとり込み得る筋肉細胞が、コードされるタンパク質抗原を発現し、そしてこれを免疫細胞に提示する。最近のデータは、この経路がインビボではあまり起こりそうにないことを示唆する（１８）。第２は、注入部位に付着した抗原提示細胞（例えば、樹状細胞）が、ＤＮＡを取り込み、コードされるタンパク質を発現し、そしてそれをＴ細胞およびＢ細胞に提示し得る。第３は、筋肉細胞が、ＤＮＡを取りこみ、そしてタンパク質抗原を発現し得る経路であり、次いで抗原は、提示のために樹状細胞に送達される。第２の可能性の場合、樹状細胞の細胞質中で合成されそして分解されるタンパク質は、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）クラスＩ型の提示のための優れた標的となり、ＣＴＬ応答を誘導する。あるいは、第３のシナリオが、起こる場合、樹状細胞に対して効率的に標的化され得る筋肉細胞において合成されたタンパク質は、最もよくＣＴＬ応答を誘導する。
【０００６】
これらの異なる可能性を識別するために、異なる３つの形態のＨＩＶ−１  Ｇａｇ  ＤＮＡワクチンベクターを構築し、そして免疫応答の誘導について比較した。これらのＧａｇの異なる形態が以下に挙げられる：（ｉ）標準Ｇａｇ（Ｓｔ−Ｇａｇ）（本明細書中において、「ＷＴ」ｇａｇともよばれる）（これは、粒子へと会合し、細胞から効果的に放出され、そしてウイルスの出芽の間に獲得される宿主細胞由来の獲得脂質膜によって取り囲まれる）；（ｉｉ）Ｇａｇの細胞質形態（Ｃｙ−Ｇａｇ）（これは原形質膜を標的化できず、従って細胞質に留まる）；および（ｉｉｉ）Ｇａｇの分泌型形態（Ｓｃ−Ｇａｇ）（これは、粗面小胞体（ＥＲ）の細胞膜表面で合成され、ＥＲおよびゴルジ装置を通り輸送され、そして分泌型タンパク質として放出される（すなわち、脂質膜には取り囲まれない））（１９）。（原形質膜に対し効果的に標的化されず、そして主に細胞質内に留まる変異体Ｇａｇタンパク質は、ＨＩＶ−１  Ｇａｇのミリスチル化シグナルを破壊することにより作製された。Ｓｃ−Ｇａｇ分子は、ＨＩＶ−１  Ｇａｇ分子のＮ末端に対するｔ−ＰＡシグナルペプチド配列の付加により作製された。この配列は、ＥＲおよびゴルジ装置を通る輸送のため、およびＳｃ−Ｇａｇ分子の形態での放出のために、分泌型タンパク質をＥＲの管腔の中にトランスロケーションするためのシグナルを提供する。）（１９）。
【０００７】
上記に記載される研究において、ＨＩＶ−１  Ｇａｇの種々の亜細胞区画へのターゲッティングが、ＤＮＡ−免疫されたマウスにおける免疫応答の誘導に影響し得るか否かという問題に、取り組んだ。これらの結果は、ＨＩＶ−１  Ｇａｇ分子の異なる亜細胞区画へのターゲッティングが、筋肉内（ｉ．ｍ．）ＤＮＡワクチン接種により誘発される、体液性免疫応答および細胞性免疫応答の両方に実際に影響することを実証した。具体的には、これらの形態のＧａｇが、ＤＮＡワクチンとしてマウスに投与された場合、Ｓｃ−ＧａｇをコードするＤＮＡベクターは、Ｃｙ−ＧａｇをコードするＤＮＡベクターより良好な初期ＣＴＬ応答およびＴヘルパー応答を生じたことを見い出した。さらに、Ｓｃ−ＧａｇをコードするＤＮＡベクターはまた、Ｃｙ−ＧａｇをコードするＤＮＡベクターよりも、ＤＮＡ初回刺激（ＤＮＡ  ｐｒｉｍｉｎｇ）および組換えワクシニアウイルス−Ｇａｇ感染の後に、より高いレベルの２次ＣＴＬ応答を生じた。ワクシニアウイルスの力価は、コントロールＤＮＡベクターのみを受けたマウスの力価と比較すると、感染の１２５日よりも前からＧａｇ  ＤＮＡワクチンを用いて免疫化されたマウスの卵巣において、顕著に減じられた。これらのデータは、ＤＮＡワクチン接種により誘発されたＣＤ８＋Ｔ細胞記憶が、この系において機能的に関連し、そして防御免疫を提供することを示した。Ｓｃ−ＧａｇをコードするＤＮＡベクターは、組換えワクシニアウイルス−Ｇａｇに対しＣｙ−ＧａｇをコードするＤＮＡベクターより良好な防御を提供する（１９）。
【０００８】
別の研究は、ＤＮＡワクチンによるウシヘルペスウイルス１に由来する糖タンパク質Ｄ（ｇＤ）の細胞置の変更が、体液性免疫応答を調節することを示した。分泌形態ｇＤおよび細胞質ゾル形態ｇＤの両方ともＩｇＧ２ａ抗体応答を誘導したが、分泌形態ｇＤは、ＩｇＧ２ａ応答よりも強くＩｇＧ１応答を誘導した（２３）。上記に記載される研究において、Ｓｃ−ＧａｇおよびＣｙ−Ｇａｇについて同様の結果が、観察された。その一方で、ウイルス様粒子を形成するために適切な、Ｓｔ−Ｇａｇ（本明細書中において「ＷＴ」ｇａｇともよばれる）は、主にＩｇＧ２ａ抗体応答を誘導した。後者のデータは、ＤＮＡ免疫の後の抗原の位置が、体液性免疫応答の型および有効性に影響され得るという見解と一致する。
【０００９】
ＤＮＡワクチンのみでも、小動物において病原性チャレンジに対する防御を示したが（２４）、霊長類におけるその成績は、概して期待外れであった。追加免疫（ｂｏｏｓｔｉｎｇ）を繰り返して用いてさえ、ＤＮＡワクチンは、弱毒化生ワクチンまたは組換えウイルスワクチンと比較した場合、穏やかな免疫応答のみを誘導する。しかしながら、最近の研究は、ＤＮＡおよび組換え改変型ワクシニアウイルスアンカラ（Ａｎｋａｒａ）ベクターを使用する異種初回刺激追加免疫による免疫レジメンは、強い細胞性免疫応答ならびにマウスモデルにおけるマラリア（２５）、（２６）およびサルモデルにおけるＳＩＶｍａｃ（２７）、（２８）に対する防御を誘導し得ることを実証した。ＤＮＡ免疫により誘導されるＴ細胞免疫応答は、穏やかであるが、少数の他のエピトープはこの抗原送達系によって発現されるので、このＴ細胞免疫応答は、いくつかの特定のエピトープに高度に集中する。同一の抗原を発現する組換えワクシニアウイルスを用いる追加免疫は、この刺激された記憶Ｔ細胞の集団を恐らく刺激する。本発明者らのデータは、ｐＳｃ−ＧＡＧが、エキソビボＣＴＬ活性により測定される他のＧａｇ発現ベクターよりも高い記憶Ｔ細胞応答を誘導すること、ＭＨＣクラスＩ−制限型ＨＩＶ−１  Ｇａｇ特異的ペプチドを用いた刺激の後により多くのＣＤ８＋ＩＮＦ−ｙ−産生細胞を誘導すること、および組換えワクシニアウイルス−Ｇａｇ感染に対するより強い防御を誘導することを示した（１９）。これらのＧａｇ発現ベクターは、保護的な細胞免疫応答の誘導におけるＤＮＡおよびウイルスベクターを用いる異種初回刺激および追加免疫のさらなる評価のために有用であり得る。同様のストラテジーは、非ヒト霊長類モデルについても考慮され得、ここでＳＩＶまたはサル／ヒト免疫不全ウイルスによるチャレンジが評価され得る。
【００１０】
ＤＮＡワクチンにおけるｔ−ＰＡシグナルペプチドの使用に関するいくつかの報告がある。ＨＩＶ−１  Ｅｎｖ  ＤＮＡワクチンの場合（２０）、ｇｐ１６０の標準シグナルペプチドのｔ−ＰＡのシグナルペプチドとの置換は、Ｅｎｖタンパク質発現のためのＲｅｖ／ＲＲＥ要求を克服するために意図された（２１）。ＤＮＡベクターにおけるマイコバクテリアタンパク質のシグナルペプチドのｔ−ＰＡのシグナルペプチドとの置換は、マウスにおける結核チャレンジに対するさらなる防御と相関することが示されているが、ＣＴＬ応答は測定されていない（２２）。ｔ−ＰＡペプチドとＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｖｉｖａｘ抗原との融合物を含有するＤＮＡベクターは、マウスにおける抗体産生を有意な増加に示せず、そして細胞性免疫応答は、評価されなかった（３９）。ｔ−ＰＡシグナルペプチドが、通常ＤＮＡワクチンストラテジーにより細胞質の抗原に対する免疫応答の誘導を増強し得るか否かについては、さらなる調査が必要である。
【００１１】
他の報告は、潜在的な癌ワクチンに関し、イディオタイプワクチンを使用するヒト患者の能動免疫が、抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞応答および抗腫瘍効果を誘発したことを実証した（２９）。ワクチンを開発するための代替的ないくつかの前臨床ストラテジーは、以前から報告されており、これらとしては、腫瘍イディオタイプ由来単鎖Ｆｖ（「ｓｃＦｖ」）とサイトカインとの融合物ならびにインターロイキン（「ＩＬ」）−２、ＩＬ−４および顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（「ＧＭ−ＣＳＦ」）のような免疫原性ペプチドが挙げられる（３０、３１、３２）。これらのｓｃＦｖとサイトカインの融合物、トキシンフラグメントおよびウイルスペプチドは、主に体液性免疫を誘発し、細胞媒介免疫の活性化は検出できない（参考文献３３の表２を参照のこと）。異なるアプローチを用いて、モデル抗体は、その抗体をケモカイン部分に遺伝学的に融合することによって、マウスにおける免疫原性を与える（３３、３４、３５）。強力な抗腫瘍免疫は、特定の抗イディオタイプ抗体ならびにＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞の産生に依存した。これらの研究者らは、これらのワクチンを融合タンパク質としてかまたは裸のＤＮＡワクチンとして投与することが、インビボにおける抗原提示細胞の効果的なターゲッティングを可能にし得ると仮定する。彼らはまた、ケモカイン融合物が、臨床的に関係する抗原（例えば、既存または新しく同定された腫瘍抗原およびＨＩＶ抗原）（これらは強力なＣＤ８＋Ｔ細胞免疫を誘発する）をそれぞれ癌およびＡＩＤＳについてのワクチンに処方するための新規の、一般的なストラテジーを提示し得ることを提案する（３３）。ＨＩＶワクチンの開発に関して、ＨＩＶは、２つの型の細胞表面レセプター：ＣＤ４レセプターおよびケモカインレセプターへの、はじめの結合がなければ、ヒトの細胞に入ることはできないことが示されていることを、これらの研究者らはさらに、述べている。２つの主要な改変型刺激性（ｖａｒｉａｎｔｌｙ  ｔｒｏｐｉｃ）ＨＩＶウイルスは，ＣＣＲ５コレセプターまたはＣＸＣＲ４コレセプターを介して細胞に感染する。従って、研究者らは、Ｔ細胞およびＨＩＶに対する体液性応答を誘発するのみならず、おそらくＨＩＶのそれぞれのケモカインレセプターに対する結合を妨げ、従って感染を遮断し得るケモカイン融合ワクチンを想定し得る。最後に、研究者らはまた、彼らのストラテジーは、ケモカイン部分の改変および変異することによってか、またはケモカイン部位をウイルスケモカイン様遺伝子と置換することによって、ネイティブのケモカインに対する自己抗体を産生する危険性を減らすように、さらに改良され得ることを提案する。
【００１２】
抗原特異的ＣＴＬ応答の誘導を増強するために設計された別のストラテジーは、ワクチン抗原を直接ＭＨＣクラスＩ抗原プロセシング経路へターゲッティングし、これによってＣＴＬ応答を引き起こす、さらに多くのペプチドエピトープを提供することに関する。プロテアソーム分解のためのタンパク質を標的化するシグナルは、標的タンパク質の接近可能なＬｙｓ残基に付着したポリユビキチン鎖の会合体である。ポリユビキチン化が起こる速度に影響する因子の１つは、２６Ｓプロテアソームによる急速な分解のための特定の非ｍｅｔ  Ｎ末端標的タンパク質との、標的タンパク質のＮ末端残基の同一性である。Ｔｏｗｎｓｅｎｄおよび他のものらは、「Ｎ末端則」のような抗原のターゲッティングが、インビトロ設定でのクラスＩ経路によって、そのプロセシングおよび提示を増強し得ることを示した。（参考文献３６を参照このと）
非Ｍｅｔ  Ｎ末端を有するタンパク質は、細胞内において、標的タンパク質のコード配列がユビキチンのコード配列のＣ末端に対してインフレームで融合される融合構成物を使用して発現されている。ユビキチンは、通常、細胞内でポリタンパク質としてとして産生され、これがユビキチン加水分解酵素によって各ユビキチンサブユニットのＣ末端で切断され、個々のユビキチン分子を生じる。これらの同一のユビキチン加水分解酵素はまた、ユビキチン標的融合タンパク質をユビキチンのＣ末端で切断し、標的のＮ末端を曝露する。最近の研究において、ＴｏｂｅｒｙおよびＳｉｌｉｃｉａｎｏは、ｎｅｆのＮ末端のＭｅｔまたはＡｒｇのいずれか（それぞれ、ＵｂＭＮｅｆおよびＵｂＲＮｅｆ）を用いてＨＩＶ−１  ｎｅｆへのユビキチン融合物を作製した（３７）。ＵｂＭＮｅｆおよびＵｂＲＮｅｆを発現するためのワクシニアウイルスを使用するインビトロ実験において、両方のベクターは、同程度の量のｎｅｆおよびＮ末端にＡｒｇ残基およびより短い半減期（ｔ１／２＝１５分と１０時間）を有する形態のｎｅｆの発現を誘導した。さらに、迅速に分解されるＵｂＲＮｅｆを発現するワクシニアウイルスを有するマウスの免疫化は、安定なＵｂＭＮｅｆを発現するワクシニアベクターを用いる免疫化よりもさらに活発なｎｅｆ特異的ＣＴＬ応答を誘導した。ＴｏｂｅｒｙおよびＳｉｌｉｃｉａｎｏは、迅速な細胞質における分解のための抗原のターゲッティングによるｎｅｆ特異的ＣＴＬ応答の増加は、ＨＩＶに対するワクチン接種のための魅力的なストラテジーを提示すると結論付けている（３７）。
【００１３】
さらなる最近の研究において、ＴｏｂｅｒｙおよびＳｉｌｉｃｉａｎｏは、マウスにおける新規のＣＴＬ応答の誘導を増強するための「Ｎ末端則」ターゲッティングストラテジーのインビボにおける効力を評価するために、腫瘍会合型抗原のモデルとしてウイルスタンパク質（ＨＩＶ−１  ｎｅｆ）を使用した。彼らは、彼らの結果は、「Ｎ末端則」ターゲッティングストラテジーが、抗原発現腫瘍細胞の致死量に対する保護を与えるのに十分である、ＣＴＬの誘導における増強を導き得ることを示唆すると述べている（３６）。
【００１４】
要約すると、これまでのところ、種々の抗原を発現するＤＮＡワクチンが、免疫応答を誘発するために使用されている。多くの場合、この応答は、実際のワクチン接種目的に関して、極性を示すかまたは最適以下である。本発明は、異なる形態の抗原を含有するＤＮＡワクチンの組み合わせ、ならびに異なる免疫部位へのＤＮＡワクチンの投与が、免疫応答を増大することを実証し、そしてそれ故、実用的なＤＮＡワクチン接種手順を提供することが期待される。
【００１５】
（発明の要旨）
本発明は、目的の異種アミノ酸配列に共有結合された不安定化アミノ酸を含む融合タンパク質をコードする核酸（ＤＮＡ免疫プラスミドが挙げられるが、これらに限定されない）に関する。ここで、この目的のアミノ酸配列の免疫原性は、この不安定化アミノ酸配列の存在により増大される。
【００１６】
本発明はまた、目的の異種アミノ酸配列に共有結合された分泌アミノ酸配列（例えば、ケモカインまたはサイトカインを含むもの）を含む分泌融合タンパク質をコードする核酸に関する。ここで、この目的のアミノ酸配列の免疫原性は、この分泌アミノ酸の存在により増大される。
【００１７】
本発明はまた、核酸により生成される生成物（例えば、ｍＲＮＡ、ポリペプチド、およびウイルス粒子）、ならびにこれらの核酸を含むベクターおよびベクター系に関する。本発明はまた、これらの核酸を含む宿主細胞、ベクター、ベクター系、および／またはそれらの生成物に関する。
【００１８】
本発明はまた、これらの核酸、ベクター、ベクター系、生成物および／または宿主細胞を含む組成物、ならびにこれらの組成物を使用して（単独で、または組み合わせてかのいずれかで）、改善された免疫応答を刺激する方法に関する。
【００１９】
本発明はまた、異なる部位において、同じ核酸または異なる核酸、同じベクターもしくは異なるベクター、同じベクター系もしくは異なるベクター系、同じ生成物もしくは異なる生成物、ならびに／または同じ宿主細胞もしくは異なる宿主細胞、あるいはこれらの組み合わせを使用して、免疫応答を増強する方法に関する。
【００２０】
本発明はまた、これらの核酸、ベクター、ベクター系、宿主細胞および／もしくは組成物を使用して、ｍＲＮＡ、ポリペプチド、および／もしくは感染性ウイルス粒子を生成するか、そして／あるいは抗体ならびに／または細胞傷害性Ｔリンパ球および／またはヘルパーＴリンパ球を誘導することに関する。
【００２１】
本発明はまた、遺伝子治療においてまたはワクチンとして、これらの核酸、ベクター、ベクター系、生成物および／または宿主細胞、あるいはこれらの組み合わせを使用することに関する。
【００２２】
例えば、本発明は、哺乳動物（好ましくは、ヒト）において、免疫療法および免疫予防における使用（例えば、ワクチンとして）のために、または発現後の遺伝子治療において、これらの核酸構築物、ベクター、ベクター系、および／または宿主細胞を使用することに関する。本発明の核酸構築物は、レンチウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、アデノウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、または他の発現ベクターに含まれ得るかまたは組み込まれ得、あるいは本発明の核酸構築物は、組織細胞に直接注入されて、コードされたタンパク質またはタンパク質フラグメントの効率的な発現を生じ得る。これらの構築物はまた、インビボまたはインビトロでの遺伝子置換のために、例えば、標的遺伝子とのインサイチュでの相同組換えにより使用され得る。これらの構築物はまた、細胞をエキソビボでトランスフェクトするために使用され得る。
【００２３】
（Ｖ．発明を実施する態様）
前述の一般的説明および以下の詳細な説明の両方は、単なる例示および説明であって、本願発明の限定でないことが理解されるべきである。添付の図面（本明細書中に組み込まれ、本明細書の一部を構成する）は、本発明の実施形態を示し、説明とともに本発明の原理を説明するために供される。
【００２４】
本発明は、目的の異種アミノ酸に共有結合された不安定化アミノ酸配列を含む融合タンパク質をコードする核酸（ＤＮＡ免疫プラスミドが挙げられるが、これらに限定されない）に関する。ここでこの目的のアミノ酸配列の免疫原性は、不安定化アミノ酸配列の存在により増大される。
【００２５】
本発明はまた、目的の異種アミノ酸配列に共有結合された分泌アミノ酸配列（例えば、ケモカインまたはサイトカインを含むもの）を含む分泌融合タンパク質をコードする核酸に関する。ここでこの目的のアミノ酸配列の免疫原性は、この分泌アミノ酸配列の存在により増大される。
【００２６】
本発明は、不安定化アミノ酸配列（結合されたアミノ酸配列の免疫原性を増大させる）を含む融合タンパク質をコードする配列を有する核酸、およびコードされたタンパク質の免疫原性を増大させるためにこれらの核酸を含む組成物を使用する方法、またはこれらの組み合わせに関する。本発明はまた、ＭＣＰ−３アミノ酸配列およびＨＩＶ  ｇａｇもしくはＨＩＶ  ｅｎｖ、またはＳＩＶ  ｇａｇもしくはＳＩＶ  ｅｎｖ、および非腫瘍関連抗原（例えば、病原体抗原）に対するワクチン接種に関するさらなるタンパク質を含む融合タンパク質をコードする核酸に関する。本発明はまた、異なる免疫部位を使用して、コードされたタンパク質の免疫原性を増大させる方法に関する。
【００２７】
本発明の１つの局面は、１以上の疾患関連抗原を含むアミノ酸配列に共有結合された不安定化配列を含む融合タンパク質をコードする核酸構築物に関する。好ましい不安定化配列は、この融合タンパク質をユビキチンプロテオソーム分解経路に標的化するものである。より好ましくは、この不安定化配列は、ｃ−Ｍｙｃ  ２〜１２０アミノ酸；サイクリンＡ  １３〜９１アミノ酸；サイクリンＢ  １３〜９１アミノ酸；ＩｋＢａ  ２０〜４５アミノ酸；β−カテニン  １９〜４４アミノ酸；ｃ−Ｊｕｎ  １〜６７アミノ酸；およびｃ−Ｍｏｓ  １〜３５アミノ酸、ならびにその機能的フラグメントからなる群より選択されるアミノ酸配列に存在する。
【００２８】
１つの実施形態において、本発明は、不安定化アミノ酸配列（不安定化アミノ酸がない場合の免疫原性と比較して、臨床的に関連する抗原（例えば、疾患関連抗原）を含む共有結合されたアミノ酸配列の免疫原性を増大させる）を含むポリペプチドをコードする配列を含む核酸に関する。
【００２９】
別の実施形態において、本発明は、分泌融合タンパク質（ＭＣＰ−３もしくはＩＰ−１０のような免疫刺激性ケモカイン、またはＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４もしくはＩＬ−２のような免疫刺激性サイトカイン）をコードする核酸に関する。好ましい実施形態において、本発明は、ＭＣＰ−３アミノ酸配列およびウイルス抗原（例えば、ＨＩＶ  ｇａｇおよびＨＩＶ  ｅｎｖまたはＳＩＶ  ｇａｇもしくはＳＩＶ  ｅｎｖ）を含む融合タンパク質に関する。
【００３０】
本発明の構築物の核酸配列は、合成であってもよいし（例えば、化学合成により合成される）、半合成であってもよいし（例えば、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、またはＰＣＲ増幅と、合成ＤＮＡの組み合わせ）、組換え生成されてもよい。この核酸配列はまた、必要に応じてイントロンを含んでいなくてもよい。不安定化アミノ酸をコードする核酸配列は、好ましくは、１以上の目的の抗原またはその免疫原性エピトープをコードする核酸配列のＮ末端にインフレームで連結される。これらの配列は、必要に応じて、１以上のリンカーアミノ酸をコードする別の配列により連結されてもよい。
【００３１】
さらに、目的の１を超える抗原をコードする核酸配列は、例えば、ピコルナウイルスＲＮＡ由来の内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）とインフレームで、またはこのＩＲＥＳを介して作動可能に連結され得る。ＩＲＥＳは、同じプロモーターから２つのタンパク質（または抗原）を発現することが所望される状況で使用される。ＩＲＥＳを使用すると、２つのタンパク質の発現が、調和して働く。さらなるポリペプチドをコードする配列はまた、別々のプロモーターの制御下で存在し得る。このような配列は、例えば、選択マーカー、または目的のさらなる抗原をコードし得る。この配列の発現は、構成的であり得る；例えば、選択マーカーの場合、これは、トランスフェクトされたパッケージング細胞、またはベクター粒子を特に高力価に生成しているパッケージング細胞を首尾よく選択するために有用であり得る。あるいはまたはさらに、この選択マーカーは、核酸に首尾よく感染し、その細胞のゲノムに配列が組み込まれた細胞を選択するために有用であり得る。
【００３２】
本発明の構築物は、さらなる免疫刺激分子（例えば、本明細書中に例示されるケモカインＭＣＰ−３）およびその機能的フラグメントをコードし得る。これらの免疫刺激分子は、融合タンパク質発現ユニットの一部として核酸配列によりコードされてもよいし、別々の発現ユニットの一部として核酸配列によりコードされてもよい。これらの分子はまた、異なる核酸構築物、ベクターなどに存在する配列によりコードされ得る。免疫刺激性分子（例えば、サイトカイン、ケモカイン、またはリンホカイン）は、当該分野で周知である。例えば、米国特許第６，１００，３８７号（本明細書中に参考として援用される）を参照のこと。例えば、ＢｉｒａｇｙｎおよびＫｗａｃｋ（１９９９）（参考文献３４）もまた参照のこと。
【００３３】
ＨＩＶ抗原またはＳＩＶ抗原がコードされる場合、本発明の核酸はまた、所望の機能を保持する遺伝子（例えば、ＧａｇもしくはＰｏｌの抗原性について、粒子形成（Ｇａｇ）または酵素活性（Ｐｏｌ）について）のＲｅｖ非依存性フラグメントを含んでいてもよいし、本発明の核酸はまた、コードされたタンパク質が特定の状況において所望でない機能を喪失するように変異されたＲｅｖ非依存性改変体を含んでいてもよい。後者の場合、例えば、この遺伝子は、逆転写酵素またはインテグラーゼタンパク質の活性部位における変異（アミノ酸レベルで）をコードして、逆転写または組み込みを防止するように改変され得る。ｇａｇ遺伝子およびｅｎｖ遺伝子のＲｅｖ非依存性フラグメントは、米国特許第５，９７２，５９６号、同第５，９６５，７２６号（これらは、本明細書中に参考として援用される）に記載される。ｇａｇ遺伝子についてはＰＣＴ／ＵＳ００／３４９８５（２０００年１２月２２日出願（ＷＯ０１／４６４０８として２００１年６月２８日に公開））ならびにＳＩＶ  ｅｎｖ遺伝子については本明細書中の図６および７もまた参照のこと。
【００３４】
細胞にトランスフェクトされた後のこれらの核酸構築物またはベクターによりコードされるタンパク質の発現は、ＲＮＡおよびタンパク質生成の両方のレベルでモニターされ得る。ＲＮＡレベルは、当該分野で公知の方法（例えば、ノーザンブロット、Ｓ１マッピングまたはＰＣＲ法）により定量される。タンパク質レベルはまた、当該分野で公知の方法（例えば、ウェスタンブロットまたはＥＬＩＳＡまたは蛍光検出法）により定量され得る。迅速な非放射活性ＥＬＩＳＡプロトコルは、ｇａｇタンパク質を検出するために使用され得る（ＤＵＰＯＮＴまたはＣＯＵＬＴＥＲのｇａｇ抗原捕捉アッセイ）。
【００３５】
種々のベクターが当該分野で公知である。例えば、米国特許第６，１００，３８７号（本明細書中に参考として援用される）を参照のこと。遺伝子治療においておよび／またはワクチンベクターとして有用であると思われる好ましいベクターは、所望の状況に依存して、以下を有するレンチウイルスである：
ａ）複製が１回もない（すなわち、ゼロ複製系）
ｂ）１回の複製、または
ｃ）完全な複製系。
【００３６】
このようなベクターは、例えば、ＰＣＴ／ＵＳ００／３４９８５（２０００年１２月２２日出願（ＷＯ０１／４６４０８として２００１年６月２８日に公開））；および米国特許出願第０９／８７２，７３３号（２００１年６月１日）に記載され、本明細書中に参考として援用される。
【００３７】
好ましい実施形態において、本発明において有用なＨＩＶベースまたはＳＩＶベースのレンチウイルス系は、以下の３つの成分を含む：
１）ベクターパッケージングに必要なエレメント（例えば、ベクター粒子を生成するために必要な構造タンパク質（ＨＩＶ  ｅｎｖを除く）および酵素）をコードする核酸配列を含むパッケージングベクター（このパッケージングベクターは、少なくとも１つの変異したＲｅｖ非依存性ＨＩＶ  ｇａｇ／ｐｏｌ遺伝子またはＳＩＶ  ｇａｇ／ｐｏｌ遺伝子を含む）；
２）ベクターが標的細胞に感染し、目的の治療剤もしくはレポーターもしくは他の遺伝子の移入のために必要な遺伝的シス作用性配列を含む移入ベクター（この移入ベクターは、キャプシド化シグナルおよび目的の遺伝子または目的の遺伝子を挿入するためのクローニング部位を含む）；および
３）ウイルス粒子を意図されたレシピエント細胞に標的化するために必要なエレメントをコードする配列を含むベクター（好ましくは、遺伝子は、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ−Ｇ）または両栄養性ＭｕＬＶまたはレンチウイルスｅｎｖのＧ糖タンパク質．をコードする）。
【００３８】
このようなベクターにおいて、ＣＭＶプロモーターまたは他の強力で高効率のプロモーターが、パッケージングベクター中のＨＩＶ−１  ＬＴＲプロモーターの代わりに使用される場合、ｇａｇ、ｐｏｌまたはｇａｇ／ｐｏｌの高発現は、任意の他のウイルスタンパク質の完全な非存在下で達成され得る。ＨＩＶ−１  ＬＴＲプロモーターの他のプロモーターとの交換は、構成的な発現が所望される場合に、そしてまた、ＨＩＶ−１  ＬＴＲプロモーターが弱いヒト以外の哺乳動物細胞（例えば、マウスの細胞）における発現のために、パッケージングベクターまたは他のベクターにおいて有益である。特定の実施形態において、異種プロモーターの存在はまた、移入ベクターおよびエンベロープをコードするベクターが使用される場合、それらのベクター内に所望される。
【００３９】
目的の抗原、特に臨床上関連する抗原は、達成されることを求められる効果に従って選択される。好ましくは、その抗原は、抗体、あるいはヘルパーＴ細胞または細胞傷害性Ｔ細胞を誘導する。
【００４０】
本発明の目的の有用な核酸構築物のアミノ酸または抗原は、例えば、米国特許第５，８９１，４３２号に記載されており、これは本明細書中で参考として援用される（例えば、１３列２０行から１７列６７行を参照のこと）。これらの抗原としては、腫瘍関連抗原のような疾患関連抗原、自己免疫疾患関連抗原、感染性疾患関連抗原、ウイルス抗原、寄生生物抗原および細菌抗原が挙げられるが、それらに限定されない。腫瘍関連抗原としては、ｐ５３およびその変異体、Ｒａｓおよびその変異体、Ｂｃｒ／Ａｂｌ中断点（ｂｒｅａｋｐｏｉｎｔ）ペプチド、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ、ＨＰＶ２、Ｅ６、ＨＰＶ  Ｅ７、癌胎児性抗原、ＭＵＣ−１、ＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−３、ＢＡＧＥ、ＧＡＧＥ−１、ＧＡＧＥ−２、Ｎ−アセチルグルコサミントランスフェラーゼ−Ｖ、ｐ１５、ｇｐ１００、ＭＡＲＴ−１／ＭｅｌａｎＡ、チロシナーゼ、ＴＲＰ−１、β−カテニン、ＭＵＭ−１およびＣＤＫ−４、Ｎ−アセチルグルコサミントランスフェラーゼ−Ｖ、ｐ１５、ｇｐ１００、ＭＡＲＴ−１／ＭｅｌａｎＡ、チロシナーゼ、ＴＲＰ−１、β−カテニン、ＭＵＭ−１およびＣＤＫ−４が挙げられるが、それらに限定されない。ＨＩＶ抗原またはＳＩＶ抗原としては、Ｇａｇ、Ｅｎｖ、Ｐｏｌ、Ｎｅｆ、Ｖｐｒ、Ｖｐｕ、Ｖｉｆ  ＴａｔおよびＲｅｖが挙げられるが、それらに限定されない。本発明の好ましい実施形態において、ＨＩＶのＧａｇ−Ｐｏｌ−Ｔａｔ−Ｒｅｖ−Ｎｅｆ抗原またはＴａｔ−Ｒｅｖ−Ｅｎｖ−Ｎｅｆ抗原は、一緒に連結されているが、ＨＩＶ成分としては活性ではない。
【００４１】
本発明の核酸構築物およびこのような核酸構築物を含むベクター、ベクター系またはウイルス粒子、あるいはコードされるタンパク質は、インビボでの遺伝子治療（例えば、高力価のベクターの非経口接種）、またはエキソビボでの遺伝子治療（例えば、患者細胞のインビトロ形質導入の後の、患者へのその形質導入された細胞の再注入）のために使用される。これらの手順は、様々の承認された遺伝子治療のプロトコルにおいて既に使用されている。
【００４２】
遺伝子治療を実施する１つの方法は、患者から細胞を抽出し、抽出された細胞をベクター（例えば、レンチウイルスベクター）またはウイルス粒子を用いて感染させ、そしてその細胞を患者に再導入して戻すことである。患者に細胞を再導入する前に、選択マーカーが、感染細胞または形質導入された細胞を富化するため、あるいは感染されているかまたは形質導入されているそれら細胞のみをポジティブ選択するための、手段を提供するために使用され得る。この手順は、治療の成功の機会を増し得る。選択マーカーは、例えば、薬剤耐性遺伝子、代謝酵素遺伝子、または当該分野で公知の任意の他の選択マーカーであり得る。代表的な選択遺伝子は、抗生物質および他の毒性物質（例えば、ヒスチジノール、ピューロマイシン、ハイグロマイシン、ネオマイシン、メトトレキセートなど）に対する耐性を付与するタンパク質および細胞表面マーカーをコードする。
【００４３】
しかし、ベクター（例えば、レンチウイルスベクター）の多くの遺伝子治療の適用にとって、マーカー遺伝子発現の選択が可能でなくても必要でなくてもよいことは、明らかである。選択マーカーの実際の発現は、インビトロ研究にとって便利であるが、外来マーカータンパク質に対する細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）の不適切な誘導に起因して、インビボにおいては有害であり得る。また、インビボでの適用のためには、内部プロモーターを全く持たないベクターが好ましいことがあり得る。内部プロモーターの存在は、例えば、パッケージング細胞株から得られ得る形質導入の力価およびその組み込まれたベクターの安定性に影響し得る。従って、１つまたは２つ以上の治療的遺伝子をコードする、ジシストロンまたはポリシストロンであり得る、１つの転写ユニットのベクターは、インビボでの使用のために設計された好ましいベクターであり得る。例えば、ＷＯ９８／１７８１６を参照のこと。
【００４４】
本発明の核酸配列、ポリペプチド、ウイルス粒子、ベクター、ベクター系、あるいは形質導入された宿主細胞またはトランスフェクトされた宿主細胞のうちの少なくとも１つ、および生理学的に受容可能なキャリアを含む、ワクチンおよび薬学的組成物もまた、本発明の一部である。
【００４５】
本明細書中で使用される場合、用語「形質導入」とは、一般的に、感染を介した（例えば、この場合では、レンチウイルスベクターによる）宿主への遺伝物質の移入をいう。用語「トランスフェクション」とは、一般的に、細胞膜を横断し、そして遺伝物質のいくらかを細胞核内に送達する、特定のトランスフェクション剤（例えば、リン酸カルシウム、ＤＥＡＥデキストラン、脂質製剤、金粒子、および他の微小粒子）の使用を介した、単離された遺伝物質の細胞への移入をいう。
【００４６】
（薬学的組成物）
本発明の薬学的組成物は、薬学的および／または治療的に有効な量の、本発明の核酸構築物、ポリペプチド、ベクター、ベクター系、ウイルス粒子／ウイルスストックまたは宿主細胞（すなわち、薬剤）のうちの少なくとも１つを、含む。所望される場合、本発明の核酸構築物、ポリペプチド、ウイルス粒子、ベクター、ベクター系、ウイルス粒子／ウイルスストックまたは宿主細胞は、当該分野で公知の方法によって、単離および／または精製され得る。
【００４７】
本発明の１つの実施形態において、単位用量当たりの本発明の薬剤の有効量とは、目的の抗原の検出可能な発現を生じさせるのに十分な量である。本発明の別の実施形態において、単位用量当たりの薬剤の有効量とは、処置される状態の有害な影響（症状の重症度、持続期間または程度を含む）に対して予防、処置または保護するのに十分な量である。当該分野で周知であるように、単位用量当たりの薬剤の有効量は、とりわけ、接種される哺乳動物種、哺乳動物の体重および選択された接種レジメンに依存する。予防または処置に最も適切な治療薬剤の投薬量はまた、投与形式、選択される特定の薬剤、および処置中の特定の患者の生理学的特徴に伴い、変化する。この用量は、少なくとも１回投与される。その後の用量は、示されるように投与され得る。
【００４８】
本発明の組成物を投与された個体の応答をモニターするために、ｍＲＮＡまたはタンパク質発現のレベルが測定され得る。多くの例において、そのような個体から得られた血清または血漿中の発現レベルを測定することで十分である。さらなる用量を投与するか否かまたは個体に投与される組成物の量を変更するか否かに関する決定は、少なくとも部分的に、発現レベルに基づき得る。
【００４９】
用語「単位用量」とは、接種に関する場合、哺乳動物に対する１単位の投薬量として適切な、物理学的な別々の単位をいい、各々の単位は、必要な希釈剤に関連して所望の効果を生成するように計算された、予め定められた量の活性材料（例えば、核酸、ウイルスストックまたは宿主細胞）を含む。細胞または動物に投与されるウイルスストックの力価は、適用および送達型（インビボまたはエクソビボ）に依存する。ウイルスストックは、遠心分離のような操作を使用して濃縮され得る。エクソビボで投与される力価は、好ましくは１細胞当たり０．００１〜１感染単位の範囲にある。ウイルスストックを調製する別の方法は、ウイルスを発現する安定な細胞株を、その標的細胞と一緒に共培養することである。この方法は、伝統的なレトロウイルスベクターを用いる場合、細胞がより長い期間の時間にわたり感染され得、そして細胞が複数コピーのベクターに感染される機会を有するので、より良い結果を達成するために使用されている。
【００５０】
核酸構築物、ベクター、ベクター系、ウイルス粒子、またはエクソビボで形質導入もしくはトランスフェクトされた細胞のインビボ投与のために、その用量は、用量の段階的増加により決定されるべきであり、受け入れられない有害な影響の発生によって上方用量は制限されている。予備的な開始用量は、当該分野で公知の方法による、動物モデルにおけるレンチウイルスベクターを使用する実験から推定され得るか、または公知のレトロウイルス（例えば、アデノウイルス）の用量との比較から推定され得る。一般的に、少ない投薬量を、初期に使用し、そして必要であれば、その状況下で最適な効果に到るまで、小さな増加量ずつ増加される。例示的な投薬量としては、１０８〜約５×１０１５粒子までの範囲内にある。
【００５１】
ワクチン接種のために、ＤＮＡは、リポソーム中でのこれまでに記載されたようなＰＢＳ中の筋肉内注射（ＩＭ）、皮内接種、電気注入または他の方法のいずれかによって投与される。例として、いくつかの異なる部位に注射されたマカクにおける５ｍｇ／用量のＩＭ（１ｍｇ／ｍｌのＤＮＡ）が、良好な免疫応答を生成することが見出された。
【００５２】
接種材料は、典型的に、水性の薬学的組成物を形成するように、生理食塩水、リン酸緩衝液生理食塩水などのような生理学的に受容可能なキャリア中の水溶液として調製される。
【００５３】
本発明の薬剤は、一般的に、それに対する生理学的に受容可能なキャリアまたはそのビヒクルと共に投与される。生理学的に受容可能なキャリアは、投与の際に有害な身体的反応を生じないキャリアであり、そして本発明の核酸または他の薬剤が十分に溶解して、それらの液性を保持して、薬学的または治療的に有効量の化合物を送達するキャリアである。本発明の薬剤の薬学的または治療的に有効な量およびその投与方法は、個々の患者、処置される症状、そして当業者に明らかな他の基準の基づいて変化し得る。本発明の構築物は、好ましくは、抗体ならびに／あるいは細胞傷害性Ｔリンパ球および／またはヘルパーＴリンパ球を誘導するのに有効な量でのそのコードされるタンパク質の発現し得る量で存在する。本発明の、治療的に有効な量の核酸は、有意な有害な副作用を生じずに、処置される状態の有害な影響の重症度、程度または持続時間を、予防または緩和するのに十分な量である。特定の適用に有用な投与経路は、当業者に明らかである。
【００５４】
本発明の薬剤の投与経路としては、非経口、および患部への直接注入が挙げられるが、その限りではない。投与の非経口経路には、静脈内、筋肉内、腹腔内および皮下が挙げられるが、その限りではない。本発明の薬剤の投与経路は、代表的に非経口であり、そして好ましくは骨髄内、ＣＳＦ筋肉内、皮下、皮内、眼内、頭蓋内、鼻腔内などである。処方物および投与経路の例として、例えばＷＯ９９／０４０２６を参照のこと。
【００５５】
本発明は、薬学的に受容可能な滅菌の等張性溶液を含むがこれらに限定されない、非経口投与に適切な上記の薬剤の組成物を包含する。そのような溶液としては、鼻内、静脈内、筋肉内、腹腔内、皮下あるいは関節または他の部位への直接的な注入のための、生理食塩水およびリン酸緩衝液生理食塩水が挙げられるが、その限りではない。
【００５６】
本発明の薬剤をレシピエント哺乳動物（好ましくは、ヒト）に対して提供される場合、投与される投薬量は、その哺乳動物の年齢、体重、全長、性別、全身的な医療状態、これまでの病歴などのような因子に依存して変化する。
【００５７】
本発明の薬学的組成物の投与は、「予防的」目的または「治療的」目的のどちらかのためであり得る。予防的に提供された場合、その組成物は、任意の症状に先立って提供される。組成物の予防的な投与は、処置される状態の任意のその後の有害な影響（症状の重症度、持続時間または程度を含む）を予防し、または回復させるために役立つ。治療的に提供される場合、その組成物は、処置される状態の症状の発症時（または直後に）で提供される。
【００５８】
全ての治療的な使用、予防的な使用そして診断的な使用のために、本発明の１つ以上の薬剤、ならびに抗体および他の必要な試薬および適切なデバイスおよび付属品は、容易に使用可能なように、そして容易に使用されるようにキット形式で提供され得る。
【００５９】
免疫アッセイが関係する場合、このようなキットは固体支持体（例えば、膜（例えばニトロセルロース）、ビーズ、球、試験管、棒など）を含み得、それに対して標的分子に特異的な抗体のようなレセプターが結合する。このようなキットはまた、第２のレセプター（例えば、標識した抗体）を含み得る。このようにキットは、トキシンを検出するためのサンドイッチアッセイのために使用され得る。競合アッセイのためのキットもまた想定される。
【００６０】
（ＶＩ．産業上利用性）
本発明の核酸は、ネイティブ宿主細胞または生物において発現され得るか、あるいは異なる細胞または生物において発現され得る。変異を加えた遺伝子は、プラスミド、コスミド、ファージ、ウイルスまたはミニクロモソームのようなベクターに導入され得、そして当該分野で周知の方法によって、宿主細胞内または生物内に挿入される。一般的に、構築物は、真核生物細胞または原核生物細胞のいずれかの、任意の細胞（哺乳動物細胞（例えば、ヒト（例えば、ＨｅＬａ）、サル（例えば、Ｃｏｓ）、ウサギ（例えば、ウサギ網状赤血球）、ラット、ハムスター（例えば、ＣＨＯおよび新生児ハムスター腎臓細胞）またはマウス細胞（例えば、Ｌ細胞）、植物細胞、酵母細胞、昆虫細胞または細菌細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）が挙げられる）において利用され得る。本発明の核酸配列をクローン化、および／または発現するために利用され得るベクターは、そのコード配列が複製され、そして／または発現されることが所望される宿主細胞内で、そのコード配列を複製し得、そして／または発現し得るベクターである。種々の型の宿主細胞に対する適切なベクターの例として、Ｆ．Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  ＡｓｓｏｃｉａｔｅｓおよびＷｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ（１９９２）、およびＳａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）を参照のこと。そのようなコード配列についてネイティブなプロモーターは、そのコード配列が挿入される宿主に適合性のある強力なプロモーターに置換され得る。これらのプロモーターは、誘導性であり得る。これらのコード配列を含む宿主細胞は、酵素の調製、医薬品、診断試薬、ワクチンおよび治療薬において有用な、多量のタンパク質を発現させるために、使用され得る。
【００６１】
本発明の構築物はまた、インビボまたはインビトロの遺伝子治療のために使用され得る。例えば、本発明の構築物は、発現されるポリペプチドを極限まで増加させるために、ｍＲＮＡをインサイチュで生成する。そのようなポリペプチドは、ウイルス抗原および／または細胞抗原を含む。このような構築物およびこれらの発現生成物は、例えば、ワクチンおよび／または遺伝子治療の開発において有用であることが見込まれる。
【００６２】
これらの構造物および／または目的の抗原をコードする構築物を使用することによって生成される生成物は、例えば、疾患（例えば、ＡＩＤＳおよびＡＩＤＳ関連疾患）の診断剤、ワクチン、および治療剤の産性において使用され得る。
【００６３】
例えば、高レベルのＧａｇを発現するベクターは、ヒトにおける発現の後、免疫治療および免疫予防において使用され得る。このようなベクターとしては、レトロウイルスベクターが挙げられ、そしてまた、例えば、Ｗｏｌｆｆら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４７：１４６５−１４６８（１９９０）、Ｗｏｌｆｆら、Ｈｕｍａｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １（６）：３６３−３６９（１９９２）およびＵｌｍｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５９：１７４５−１７４９（１９９３）に記載された技術を使用して、筋肉細胞または他の受容性細胞内へのＤＮＡの直接導入も含み、ｇａｇの効率的な発現を生じる。さらに、これらのｇａｇ構築物は、ヒトへの導入後、ＨＩＶの発現のトランス優性（ｔｒａｎｓｄｏｍｉｎａｎｔ）阻害において使用され得る。この適用のために、例えば、高レベルのｐ５５ｇａｇまたはｐ３７ｇａｇを発現する適切なベクターまたはＤＮＡ分子は、例えば、Ｔｒｏｎｏら、Ｃｅｌｌ  ５９：１１３−１２０（１９８９）に記載されるように、トランス優性のｇａｇ変異体を生成するように改変される。これらのベクターはヒトに導入され、生成されたｇａｇタンパク質の、ｇａｇのトランス優性阻害および免疫刺激の組み合わせの機構に起因してＨＩＶ生成の阻害を生じる。さらに、本発明のｇａｇをコードする構築物は、レンチウイルスのｇａｇタンパク質の発現に基づいた、新規のレトロウイルスベクターの生成に使用され得る。レンチウイルスは、非分裂細胞の標的化および効率的な感染を可能にし得る、独特な特徴を有する。同様の適用が、高レベルのｅｎｖを発現するベクターについて見込まれる。
【００６４】
以下の実施例は、本発明の特定の実施形態を例示するが、本発明の範囲を制限するものと解釈されるべきではない。特定の改変およびバリエーションは、前記の開示および以下の実施例の教示から当業者に明らかであり、そしてこれらは、本発明の精神および範囲に包含されることが意図される。
【００６５】
（実施例１）
（ベクター）
ＨＩＶ−１またはＳＩＶの抗原を発現するＤＮＡベクターが、本明細書中の実施例において用いられる。
【００６６】
本明細書中に例示される、ＨＩＶ  Ｇａｇの形態をコードする異なる３種類の型のプラスミドは、以下のとおりである：
１）全長ｇａｇを発現するプラスミド（ｐ５５）またはｇａｇの一部を発現するプラスミド（ｐ３７）あるいはｇａｇおよびプロテアーゼを発現するプラスミド（ｐ５５ｇａｇｐｒｏ）。Ｐ５５は、細胞より部分的に放出されるｇａｇ粒子を産生する。Ｐ３７は、細胞より部分的に放出されるが、粒子を形成しない。Ｐ５５ｇａｇｐｒｏはまた、プロテアーゼを産生し、従って、そのｇａｇは、プロセシングされて、ｐ１７、ｐ２４、ｐ６およびｐ７を形成する。
【００６７】
２）ｐ５５ｇａｇのＮ末端に融合されたケモカインＭＣＰ−３を発現するプラスミド。ＭＣＰ−３が分泌タンパク質であるので、産生された融合タンパク質もまた、シグナルペプチドの切断の後、哺乳動物細胞より分泌される；および
３）プロテアソームの効率的な分解を与える配列へのｇａｇの融合物を発現するプラスミド。
【００６８】
ＨＩＶ  ｅｎｖタンパク質（例えば、図８〜９を参照の事）、ならびにＳＩＶ  ｇａｇタンパク質におよびＳＩＶ  ｅｎｖタンパク質についての類似するＤＮＡ発現ベクターを作製した。そのＨＩＶ  ｅｎｖプラスミドを、ＨＩＶ分枝群（ｃｌａｄｅ）Ｂ  ｅｎｖ配列に基いて構築し、そしてその発現について試験した。Ｒｅｖの非存在下での発現は、高かった（図１０を参照のこと）。特定のベクター、およびその組合せを、以下により詳細に記載する。本発明者らはまた、リンカーアミノ酸を含まないか、またはＣＡＴＥＮＩＮなど（それらは、本明細書中に特には例示しない）の少数のアミノ酸を含む、ベクターのバリエーションを有する。いくつかの場合において、本明細書中に例示される配列よりも小さい、分泌配列フラグメント、または不安定化配列フラグメント（それらは、所望の機能を維持する）は、存在することが知られているか、または慣用的実験によって同定され得る。これらの配列はまた、本発明において有用である。
ｐ３７ｇａｇは、前に記載されるＨＩＶプラスミドである。
ＭＣＰ３ｐ３７ｇａｇは、上記のプラスミドようなものであり、かつｉｐ１０のリーダー配列も含む。
【００６９】
以下は、ＭＣＰ３ｐ３７ｇａｇの例である：
ベクターｐＣＭＶｋａｎＭＣＰｇａｇｐ３７Ｍ１−１０は、以下のＭＣＰ３−ｇａｇ融合タンパク質（配列番号１）を発現する。
【００７０】
【化１】
2004528012.tif 000002
ＣＹＢｐ３７ｇａｇは、サイクリンＢ不安定化配列を含む。
【００７１】
ＣＡＴＥｐ３７ｇａｇは、βカテニン不安定化配列を含む。
【００７２】
ＭＯＳｐ３７ｇａｇは、ｍｏｓ不安定化配列を含む。
【００７３】
ＳＩＶＭＣＰ３ｐ３９は、ＨＩＶについての上記のようなものである。
【００７４】
ＳＩＶＣＡＴＥｐ３９は、ＨＩＶについての上記のようなものである。
【００７５】
ＳＩＶｇａｇＤＸは、Ｒｅｖ独立ＳＩＶｇａｇ分子クローンである。このベクターは、２０００年１２月２２日に出願されたＰＣＴ／ＵＳ００／３４９８５（２００１年６月２８日にＷＯ０１／４６４０８として公開された）に記載される（これは、本明細書中に参考として援用される）。Ｐ３９は、ＳＩＶ  Ｇａｇ  ｐ３９（ＳＩＶ  ｐ１７＋ｐ２５）をコードするＤＮＡ配列を示す。Ｐ５７は、完全なＳＩＶ  Ｇａｇ  ｐ５７をコードするＤＮＡ配列を示す。
【００７６】
「Ｇａｇ」は、Ｇａｇタンパク質をコードするＤＮＡ配列を示し、これは、ビリオンコアの成分を産生し、「Ｐｒｏ」は、「プロテアーゼ」を示す。このプロテアーゼ遺伝子、逆転写酵素遺伝子、およびインテグラーゼ遺伝子は、「ｐｏｌ」遺伝子を含む。これらの構築物において、「ＭＣＰ３」とは、前に示されたＩＰ−１０分泌ペプチドに連結されたＭＣＰ−３アミノ酸３３〜１０９を示し（あるいは、それは、自身の天然の分泌ペプチドまたは任意の他の機能的分泌シグナル（例えば、前に述べられたｔＰＡシグナルに連結され得る）、「ＣＹＢ」とは、サイクリンＢアミノ酸１０〜９５を示し、「ＭＯＳ」とは、Ｃ−Ｍｏｓアミノ酸１〜３５を示し、そして「ＣＡＴＥ」とは、β―カテニンアミノ酸１８〜４７を示す。
【００７７】
本明細書中に例示される構築物で使用される、サイクリンＢ核酸配列およびコードされたアミノ酸：
【００７８】
【化２】
2004528012.tif 000003
。
【００７９】
本明細書中に例示される構築物において用いられるｃ−Ｍｏｓ核酸配列およびコードされたアミノ酸：
【００８０】
【化３】
2004528012.tif 000004
（実施例２）
（ベクターの構築）
「Ｇａｇ不安定化」構築物を設計するための、タンパク質をユビキチン−プロテアソーム分解経路に対する標的化し得る特徴付けられた配列についての文献調査は、以下の、必ずしも代表的でない列挙を与えた：
ｃ−Ｍｙｃ          ２〜１２０アミノ酸
サイクリン  Ａ      １３〜９１アミノ酸
サイクリン  Ｂ      １３〜９１アミノ酸  ＊本発明者らは、本明細書中の実施例においてベクター中の１０〜９５を用いた。
ＩｋＢａ            ２０〜４５アミノ酸
ｂ−カテニン        １９〜４４アミノ酸  ＊本発明者らは、本明細書中の実施例においてベクター中の１８〜４７を用いた。
ｃ−Ｊｕｎ          １〜６７アミノ酸
ｃ−Ｍｏｓ          １〜３５アミノ酸
本発明者らは、ＰＣＲを用いて、Ｊｕｒｋａｔ  ｃＤＮＡからのそれらの分解配列のサブセット（すなわち、サイクリンＢ、β−カテニン、およびｃ−Ｍｏｓからのシグナル）をクローニングした。サイクリンプライマーおよびカテニンプライマーの両方は、予想される長さのフラグメントを与えた。このフラグメントを、切断し、そしてベクターｐＣＭＶ３７（Ｍ１−１０）ｋａｎのＳａｌＩ部位、またはｐＣＭＶ５５（Ｍ１−１０）ｋａｎのＳａｌＩ部位にクローニングし、そして（Ｂａｍ  バージョンでは）ｐＦＲＥＤｌａｃＺのＢａｍＨＩ部位にクローニングした（ｐ３７プラスミドおよびｐ５５プラスミドは、ＩＮＳ−ｇａｇ配列を含む特許（例えば、米国特許第５，９７２，５９６号および同第５，９６５，７２６号を参照のこと（これらは、本明細書中に参考として援用される））に開示される、同じｐ３７配列およびｐ５５配列を有するが、これらの配列は、カナマイシンを発現する異なるプラスミド骨格を有する。ｐＦＲＥＤｌａｃＺは、Ｅ．ｃｏｌｉのβ−ガラクトシダーゼを発現するＩＥ  ＣＭＶプロモーターを含む）。
【００８１】
対応するプラスミドは、以下のように呼ぶ：
ＳａｌＩ部位にサイクリンＢ配列を有するｐＣＭＶ３７（Ｍ１−１０）ｋａｎ  ｐＳ１９４
ＳａｌＩ部位にβーカテニン配列を有するｐＣＭＶ３７（Ｍ１−１０）ｋａｎ  ｐＳ１９５
ＳａｌＩ部位にサイクリンＢ配列を有するｐＣＭＶ５５（Ｍ１−１０）ｋａｎ  ｐＳ１９９
ＳａｌＩ部位にβーカテニン配列を有するｐＣＭＶ５５（Ｍ１−１０）ｋａｎ  ｐＳ２００
ＢａｍＨＩ部位にサイクリンＢ配列を有するｐＦＲＥＤｌａｃＺ    ｐＳ２０１
ＢａｍＨＩ部位にβーカテニン配列を有するｐＦＲＥＤｌａｃＺ    ｐＳ２０２。
【００８２】
Ｍｏｓの場合、分解シグナルは、５つのＮ−末端アミノ酸および約３０アミノ酸離れたリジンからなる。同様に位置するリジンが、ＨＩＶｇａｇにおいて存在するが、ｌａｃＺには存在しない。この理由のために、５つ全ての不安定化アミノ酸をｃｏｖｅｒするオリゴを合成し（両方の鎖）、アニーリングし、そしてｇａｇのＮ末端に連結したが、ｌａｃＺには連結されなかった。以下の３種類のＭＯＳ配列が存在した：
ＭＯＳＮ５ｗｔＵＰおよびＭＯＳＮ５ｗｔＤＮは、リン酸化された場合に分解を引き起こすことが示されたセリンを有する。
【００８３】
ＭＯＳＮ５ａｓｐＵＰおよびＭＯＳＮ５ａｓｐＤＮは、Ｓｅｒに代わるＡｓｐ置換を有し、構成的作用についてのリン酸化を模倣する。
【００８４】
ＭＯＳＮ５ａｒｇＵＰおよびＭＯＳＮ５ａｒｇＤＮは、Ｓｅｒに代わるＡｒｇ置換を有し、分解シグナルを不活性にすると主張されている。
【００８５】
計画された６種類のプラスミドのうちで、本発明者らは、以下のもののみを試験した：
ｐＳ１９１（これは、野生型（「ＷＴ」）Ｍｏｓ配列を有するｐＣＭＶ３７（Ｍ１−１０）ｋａｎを有するが、このインサートは意図されるより長く、合成配列のさらなるコピーが逆である）；
ｐＳ１９２（これは、ＳａｌＩ部位に「Ａｓｐ」Ｍｏｓ配列を有するｐＣＭＶ３７（Ｍ１−１０）ｋａｎを有する）；および
ｐＳ１９７（これは、ＳａｌＩ部位に「Ａｓｐ」Ｍｏｓ配列を有するｐＣＭＶ５５（Ｍ１−１０）ｋａｎを有する）。
【００８６】
（実施例３）
（ベクターにおける分解シグナルの予備的特徴づけ）
以下の実験を、上記の核酸構築物中の分解シグナルの予備的な特徴づけのために実施した。
【００８７】
β−ガラクトシダーゼ活性を、ｐＦＲＥＤｌａｃＺまたはそのサイクリンＢ改変バージョンもしくはβ−カテニン改変バーション（ｐＳ２０１およびｐＳ２０２）のいずれかでの一過性のトランスフェクションの後、トランスフェクトしたＨｅＬａ細胞および２９３細胞において測定した。ｌａｃＺ活性の見かけの損失を、ユビキチン化シグナル誘導性タンパク質分解を示すと解釈した。
【００８８】
改変Ｇａｇを用いて、以下の実験を行い、分解シグナルがｇａｇ状況においても作用することを確認した。第一に、ｐ２４−ｇａｇを、改変されたＧａｇ構築物を用いてトランスフェクトした細胞抽出物および細胞上清におけるＥＬＩＳＡによって測定した。本発明者らは、不安定化の証拠を得たが、いくつかの場合において、総ｐ２４抗原のレベルを測定するこの実験は、決定的でなかった。これは、恐らく、前に示したように、ｇａｇのフラグメントがなお、抗原捕捉アッセイ手順において陽性を示し得ることに起因する。従って、本発明者らは、産生されたタンパク質がどの程度インタクトであるかを研究した。
【００８９】
異なるｇａｇプラスミドを用いて一過性トランスフェクトしたＨｅＬａ細胞または２９３細胞のタンパク質抽出物を、アクリルアミドトリスグリシンゲル上で泳動し、Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ  Ｐメンブランに移し、そして抗ＨＩＶ抗体で染色してＧａｇを明らかにした。これらの実験は、ＨｅＬａ細胞の分解の兆候を示さなかったが、サイクリン改変バージョンまたは鎖β−カテニン改変バージョンのＧａｇで形質転換した２９３細胞は、全長の改変Ｇａｇより小さい分子量の染色バンドの明らかなＧａｇの存在を、明らかに示した。このような非全長バンドは、野生型Ｇａｇトランスフェクト細胞において観察されなかった。これらの知見は、シグナル誘導性Ｇａｇ分解と一致する。
【００９０】
Ｎ末端改変がＧａｇの分解を誘導するか否かをさらに試験するために、本発明者らは、一過性トランスフェクトした２９３細胞を用いて、パルスチェイス試験を実施した。トランスフェクションの１日後に、この細胞を、メチオニンを含まない培地中でインキュベートして、細胞のプールを使い尽くし、同じ培地中の３５Ｓ−メチオニンで標識し、そして１０００倍過剰の冷メチオニンを添加することによってチェイスした。２種類の実験を行った。一方は約１時間のパルスおよび１２時間のチェイスで行い、そして他方は、３０分間のパルスおよび１．５時間のチェイスで行った。この実験は、改変Ｇａｇが、野生型Ｇａｇより迅速に分解することを示した。サイクリンＢ由来シグナルおよびβ−カテニン由来シグナルの両方は、Ｇａｇの不安定化において、類似する程度に作用した。さらなる実験を、ｅｎｖ構築物−βカテニン融合物を用いて実施し、そしてヒト細胞における発現後にこの融合物がかなりより不安定であったことを確認した。
【００９１】
（実施例４）
（ベクターの増殖応答およびベクターの組み合わせ）
これらのベクターを、哺乳動物細胞におけるトランスフェクション後のインビトロでのタンパク質発現について、ならびにマウスおよび霊長類（マカク）における免疫原性について試験した。
【００９２】
（方法）
ＤＮＡを、Ｑｉａｇｅｎの内毒素フリーＤＮＡ精製キットを使用して精製した。内毒素レベルを、日常的に測定し、そしてこれは、非常に低かった（反応速度論的ＱＣＬ試験、Ｂｉｏ−Ｗｈｉｔｔａｋｅｒは、これらの調製物において１ｍｇのＤＮＡ当たり約１内毒素ユニットを与えた）。
【００９３】
マウスに、１００μｌ  ＰＢＳ中の１００μｇのＤＮＡを筋内注射した。ＤＮＡの３回の注射を、０日目、１４日目および２８日目に与えた。３５日目に、マウスを屠殺し、そしてこれらの脾細胞を、特定のｇａｇ抗原の存在下での増殖についてアッセイした。さらに、細胞傷害性応答を、標準的な細胞傷害性アッセイを行うことによって評価した。このワクチン接種したマウスの抗体応答もまた、これらの動物から得られた血清を使用して評価する。
【００９４】
サルの実験について、５ｍｌ  リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）中の５ｍｇのＭＣＰ３  ｇａｇ  ＨＩＶ  ＤＮＡを、アカゲザルを鎮静させた後に、これらの動物のいくつかのスポットに筋内注射した。４回の注射を、０週目、２週目、４週目および８週目に与えた。これらの動物を、いくつかのアッセイで追跡し、細胞性免疫応答および体液性免疫応答を評価した。本発明者らの以前の特許において記載したｇａｇ  ｐ３７Ｍ１−１０での以前の免疫は、低レベルの抗体のみしか与えなかった。この以前のｇａｇ構築物は、細胞性免疫を十分に刺激したが、抗体産生を十分に刺激しなかった。
【００９５】
図１は、ＨＩＶポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を含む、以下に示されたベクターまたはこれらのベクターの組み合わせ、あるいはポリペプチドコントロールを注射したマウスにおける、増殖応答（刺激指数、ＳＩとして示される）を示す。
ｐ３７ｇａｇ
ＭＣＰ３ｐ３７ｇａｇ
ＣＹＢｐ３７ｇａｇ
ＣＡＴＥｐ３７ｇａｇ
ＭＯＳｐ３７ｇａｇ＝＊本発明者らは、本実施例においてＷＴ  Ｍｏｓを使用した
ＣＡＴＥ＋ＭＣＰ３＝＊２つの構築物、上記を参照のこと；これらは、単独または組み合わせで使用した同じプラスミドである
ＣＡＴＥ＋ＭＣＰ３＋ｐ３７＝＊３つの構築物、上記を参照のこと。
【００９６】
図２は、その示されたＳＩＶ発現プラスミドまたは組み合わせを２回注射したマウスにおける増殖応答（刺激指数、ＳＩとして示される）を示す。一緒に（Ｔｏｇｅｔｈｅｒ）＝同じ部位での３つのＤＮＡの注射；３部位（３ｓｉｔｅ）＝別々の部位での同じＤＮＡの注射。「同じ部位」を使用する場合、全てのＤＮＡを混合し、そして同じ身体部位で筋肉に注射した。「別々の部位」を使用する場合、ＤＮＡを別々にし、そして別々の解剖学的部位に注射した。このことは、本発明者らがマウスを免疫する際に毎回行った（すなわち、これらの３つのＤＮＡを別々にし、そして互いに異なる部位で注射し；かつ異なる注射部位を、各ワクチン接種に使用した）。
ＳＩＶｇａｇＤＸ
ＳＩＶＭＣＰ３ｐ３９
ＳＩＶＣＡＴＥｐ３９
ＭＣＰ３＋ＣＡＴＥ＋Ｐ５７（一緒に）
ＭＣＰ３＋ＣＡＴＥ＋Ｐ５７（３部位）。
【００９７】
図３は、サルにおける抗体応答を示す。２匹の動物（＃５８５、５８７）に、５ｍｇのＭＣＰ３ｐ３７ｇａｇ発現ベクターを、４回筋内（ＩＭ）注射した。２匹の動物（＃６２６、６２８）に、同じＤＮＡをリポソーム−ＤＮＡ調製物として粘膜投与した。力価を、抗ＨＩＶ  ｐ２４  Ｅｌｉｚａ試験において陽性をスコアする、血清希釈度の逆数としてプロットした。
【００９８】
（結果）
本発明者らは、ｇａｇに対するＭＣＰ−３融合が、非改変ｇａｇベクター（上記のような１型）と比較して、ｇａｇに対する免疫応答を劇的に増加することを見出した（図を参照のこと）。この特性は、これらの細胞からのより効率的なｇａｇ分泌の結果の一部であり得る。なぜなら、本発明者らは、ｔＰＡのリーダー配列を有する分泌されたｇａｇが、分泌および免疫原性においてより効率的であることを、最近示したからである（Ｑｉｕら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．２０００）。
【００９９】
さらに、この効果は、ＭＣＰ−３分子の機能によって媒介され得る。この応答の程度は、腫瘍抗原に対する免疫原性の誘導におけるＭＣＰ−３の報告された効果と一致と一致して、ＭＣＰ−３のさらなる効果を示唆する。マカクにおけるこのＭＣＰ３ｐ３７ｇａｇの筋内注射は、高力価の抗ｇａｇ抗体の産生を導いた。これは、以前に試験されたｇａｇ発現ベクターを用いた場合と異なり、これは、ＤＮＡワクチン接種のみによって、霊長類において効率的な抗体応答を誘発することが可能であることを示す。さらに、これらの結果は、マウスにおける改善された免疫原性が、霊長類における免疫原性の増加を予測するための満足な方法であることを示唆する。従って、本発明者らは、霊長類における引き続く実験のための最良の組み合わせを同定するために、マウスにおいていくつかのベクターまたはベクターの組み合わせを試験した。
【０１００】
本発明者らはまた、プロテアソーム分解およびＭＨＣ−Ｉクラスの分子を介する細胞表面上での効率的な提示に対してその発現されるＨＩＶ抗原を指向するベクターの発現および免疫原性を研究した。ＭＨＣ−Ｉ拘束免疫は、抗ウイルス防御に重要であることが公知である。ＭＨＣ−Ｉは、細胞表面に細胞内で産生された短いペプチドを提示する。細胞によって露出されるペプチドの組成における変化は、その細胞が、異常であり（例えば、ウイルスに感染された）、そして破壊されるべきであることを、免疫系にシグナル伝達する。このＭＨＣ−Ｉ露出ペプチドは、細胞タンパク質のプロテアソーム分解から生じる。本発明者らは、ＨＩＶ抗原に、プロテアソーム分解に対してこの抗原を標的化する、強力な付加的なユビキチン化シグナルを供給することが、その抗原が表面提示のために処理される機会を増加するという仮説を試験した。
【０１０１】
本発明者らは、公知のタンパク質内で同定されている、いくつかのユビキチン化シグナルを、それらをＨＩＶ  ＧａｇのＮ末端に連結させた後の迅速な分解の付与について試験した。並行して、同じユビキチン化シグナルを、β−ガラクトシダーゼに融合し、その酵素活性の低下によって、分解効力についてチェックした。このアッセイは、全ての選択されたシグナルが、β−ガラクトシダーゼ分解を増強することを示した。
【０１０２】
これらの実験によって同定された最も効果的な配列は、β−カテニンのアミノ酸１８〜４７に対応し、β−カテニンは、Ｗｎｔシグナル伝達および細胞間接着に関与するタンパク質であり、その量は、分解によって制御される。
【０１０３】
β−カテニン（１８〜４７）の３０アミノ酸：
2004528012.tif 000005
開始ＡＵＧ  ＭｅｔをＨＩＶ抗原のＮ末端に付加したβ−カテニン（１８〜４７）：
2004528012.tif 000006
【０１０４】
ＨＩＶ−Ｉ  Ｇａｇ、またはβ−カテニン不安定化ドメインと融合したＧａｇのいずれかを発現するＤＮＡ構築物をマウスに注射して、後者の構築物がより免疫原性であることが示された。Ｇａｇ単独と比較して、β−カテニン−Ｇａｇ融合物は、より高いＨＩＶ特異的増殖応答、ＣＴＬ応答の上昇、およびより高いレベルのＣＤ８＋ＩＦＮγ＋の分泌細胞を惹起した。
【０１０５】
他の不安定化配列との直接的な比較は、β−カテニン−Ｇａｇ融合物の全体的なより高い効力を示した。従って、１つの驚くべき結論は、いくつかの配列が、プロテアソームプロセシングおよびタンパク質不安定化を増加したが、β−カテニン配列が、免疫応答の増加の誘導においてはるかに良好であったことである。これらの研究の実際的な結果は、ワクチン接種手順の改善であるので、本発明者らは、抗原を分解へと標的化するのに使用するために、好ましくは、本明細書中で同定されたβ−カテニン配列を使用することを提案する。
【０１０６】
別の重要な結論は、異なる形態の抗原を発現するベクターの組み合わせの研究から得られた。組み合わせは、特に、同じマウスの異なる部位に注射した場合に、同じ部位にＤＮＡベクターの混合物を注射した場合と比較して、改善された免疫原性を示すことが見出された。
【０１０７】
本発明者らは、異なる形態の抗原が、異なる免疫応答を定性的に誘発することを提唱する。従って、異なる部位で、そしてまた異なる回数で適用する抗原の組み合わせは、防御免疫応答を増加し得る。これまでの結果は、異なる形態のＤＮＡを、連続的または組み合わせであるが、異なる部位で適用して使用することが、他の初回刺激−追加免疫のワクチンの組み合わせから得られた良好な免疫原性を再現し得るという結論を支持する。これは、体液性免疫の刺激に特に非効率的であることが示されている、霊長類におけるＤＮＡワクチン接種のための既存の手順を超える、劇的な改善である。
【０１０８】
（実施例５）
（マカクにおけるＳＩＶ  ＧａｇおよびＳＩＶ  Ｅｎｖ  ＤＮＡベクターの免疫原性）
ＨＩＶ抗原およびＳＩＶ抗原の改変された形態が、ＤＮＡワクチン接種後に異なる免疫応答を示すことを示唆する以前のデータに基づいて、本発明者らは、１２匹のマカクにおけるＳＩＶ  ｇａｇおよびＳＩＶ  ｅｎｖについての３つの異なるＤＮＡワクチンベクターの免疫原性を研究した。使用したＤＮＡを、以下の表１に示す：
【０１０９】
【表１】
2004528012.tif 000007
ＳＩＶ  ｇａｇベクターは、上記の先の実施例に記載されるマウス実験において使用したベクターと同じである。ＳＩＶ  ｅｎｖ親ベクターは、高レベルの発現を有するベクターの例として、２００１年６月１日に出願された親出願番号０９／８７２，７３３（本明細書中で参考として援用される）に記載されている。このベクターの模式図および配列を、それぞれ、本願の図６および７に示される。ＭＣＰ３とＣＡＴＥとの融合ベクターは、ｇａｇベクターについて記載したＭＣＰ３とＣＡＴＥと同じ配列を含む。
【０１１０】
４つのナイーブマカクの３つのグループ（グループ１、２、３）を、表２に示されるように、ＰＢＳ中の精製ＤＮＡ調製物で筋内免疫した。
【０１１１】
【表２】
2004528012.tif 000008
これらの動物に、その示されたＤＮＡを注射した。１匹の動物あたりに各回で注射したＤＮＡの総量は、ｇａｇについて３ｍｇで、そしてｅｎｖについて３ｍｇで、一定に維持した。動物に、異なるＤＮＡを異なる部位に注射した。注射は、１ｍｇ／ｍｌでＰＢＳ中に溶解したＤＮＡを用いて筋内に行った。注射部位は、異なるＤＮＡについて解剖学的に異なった。
【０１１２】
さらに、４匹の動物（グループ４）を、ＤＮＡ５および６（すなわち、ＳＩＶ  ＣＡＴＥ  ｇａｇおよびＳＩＶ  ＣＡＴＥ  ｅｎｖ）で初回免疫し、その後、１２週目および２４週目に、ＤＮＡ３および４（すなわち、ＳＩＶ  ＭＣＰ３  ｇａｇおよびＳＩＶ  ＭＣＰ３  ｅｎｖ）で免疫した。グループ５の２匹の動物は、ｇａｇおよびｅｎｖについて、未改変の野生型抗原を発現するＤＮＡを受けた（１および２）。グループ４および５の動物は、ＨＩＶ  ＤＮＡに先に曝露されていたが、これらは、ＳＩＶ抗原についてナイーブであり、これを、免疫学的アッセイ（特異的抗原刺激に対する抗体測定およびリンパ球増殖応答）によって確認した。にもかかわらず、グループ４および５の動物は、ＳＩＶ  ＤＮＡ注射に早期応答を示し、これは、ＳＩＶ抗原に対する既往性応答を示す。従って、グループ４および５についての実験は、最終的な結論のためにナイーブな動物で繰り返される必要がある。
【０１１３】
ワクチン接種中の一連の時点で、血液サンプルを採取し、そして抗体、リンパ球増殖応答および細胞傷害性Ｔ細胞の存在について分析した。
【０１１４】
ｇａｇについて得られた抗体力価を、表３に示す。Ｅｌｉｓａアッセイにおいて陽性をスコアする最も高い希釈度の逆数を、示す。空のセルは、１：５０希釈未満の抗体反応性を示す。
【０１１５】
これらの結果は、ＭＣＰ３ｇａｇベクターの投与が、強力な抗体応答と関連することを示した。なぜなら、ＭＣＰ３ｇａｇを受けた動物のうち８匹中８匹（１００％）（群１および３）が、高いｇａｇ抗体を発生したからである。対照的に、ＭＣＰｇａｇを受けていない動物のうち６匹中３匹（５０％）（群２および５）が、抗体を発生した。
【０１１６】
ｇａｇおよびｅｎｖに対する特異的細胞傷害性Ｔ細胞応答を、ｇａｇまたはｅｎｖの合成ペプチドプール（１５マー重複する）の存在下で細胞内ＩＦＮγまたはＴＮＦαを産生するＣＤ８細胞の数を測定することによって、評価した。３つのＤＮＡワクチン接種後に得られた値を、図４および５に示す。３つのベクターの組み合わせが、ペプチド刺激の際に特異的なＩＮＦγ産生細胞の数を増大したことは、興味深い。これは、３つ全ての形態の抗原を受けた動物が、細胞性免疫応答を減少することなく、増大した抗体応答を示したと結論付けるられる。実際、細胞性免疫応答もまた、増大した細胞性免疫応答を示し、そしてこの結果は、統計学的に有意な差異を示した。
【０１１７】
これらのデータは、マカークザルにおけるＤＮＡワクチン接種によって以前に予期されたよりも優れた、異なる抗原形態の組み合わせによるよりバランスのとれた免疫応答の発生を示す。
【０１１８】
群４の応答（上記に示していない）もまた、評価した（それぞれ、１．１１％および０．８８％のｇａｇおよびｅｎｖ）が、これは、ナイーブ動物のワクチン接種によって反復される必要がある。
【０１１９】
ＤＮＡベクターの組み合わせによる増大した免疫原性の機構を、さらに調べる必要がある。ＭＣＰ−３抗原キメラの発現および分泌は、体液性免疫応答を効果的に刺激する増大したタンパク質レベルを導き得る。異なる抗原形態の組合わせもまた、エフェクター細胞の良好な活性化および協調を促進し得る。
【０１２０】
表３は、全ての群につての最初に免疫したときからのＳＩＶｇａｇ応答を示す。
【０１２１】
【表３】
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（実施例６）
（免疫予防または免疫治療における本発明の核酸の使用）
生後遺伝子治療において、新規遺伝子形成は、間接的な手段（例えば、標的細胞を体から取り出し、次いで新規遺伝子情報を保有するウイルスベクターを用いてこの標的細胞を感染させ、次いでこの標的細胞をその体に再移植すること）；または、直接的な手段（例えば、ＤＮＡ処方物をリポソームにカプセル化すること；ウイルスエンベロープレセプタータンパク質を含むタンパク質リポソームにＤＮＡを捕捉すること；ＤＮＡのリン酸カルシウム共沈殿；およびＤＮＡをポリリジン−糖タンパク質キャリア複合体に結合すること）によって、組織に導入される。さらに、リン酸カルシウム共沈殿物の形成の有りまたは無しでの直接的な肝臓内注射後での、クローン化したウイルスＤＮＡ配列のインビボ感染性もまた、記載されている。安定性を増強するエレメントを含有するｍＲＮＡ配列もまた、陽イオン性脂質小胞の使用によって、Ｘｅｎｏｐｕｓ  ｌａｅｖｉｓ胚において効率的に翻訳されることが示されている。例えば、Ｊ．Ａ．Ｗｏｌｆｆら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４７：１４６５−１４６８（１９９０）およびその中に引用される参考文献を参照のこと。
【０１２２】
純粋なＲＮＡまたはＤＮＡを直接骨格筋に注入することが、筋細胞内での遺伝子の有意な発現をもたらすこともまた、示されている。Ｊ．Ａ．Ｗｏｌｆｆら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４７：１４６５−１４６８（１９９０）。粒子加速法（Ｎ．−Ｓ．Ｙａｎｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：９５６８−９５７２（１９９０）；Ｓ．Ｒ．Ｗｉｌｌｉａｍｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：２７２６−２７３０（１９９１））またはウイルス形質導入もしくはインビボエレクトロポレーションなどの他の手段によってＲＮＡまたはＤＮＡを筋細胞に導入させることもまた、ＤＮＡまたはＲＮＡが安定に維持されかつ発現されることを可能にする。Ｗｏｌｆｆらによって報告される実験において、ＲＮＡまたはＤＮＡベクターは、マウス骨格筋細胞（特に、四頭筋の細胞）においてレポーター遺伝子を発現するために使用された。タンパク質発現は、容易に検出され、そして特別な送達系はこれらの効果に対して必要とされない。注射流体の組成および容量ならびに注射方法が記載されるプロトコルから改変された場合、ポリヌクレオチド発現がまた得られた。例えば、レポーター酵素活性は、低張性、等張性、および高張性のスクロース溶液（Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ）または２ｍＭ  ＣａＣｌ２  を含むスクロース溶液の１０〜１００μｌを用いて観察され、そしてまた１０〜１００μｌの注射が１分間以内ではなくポンプを用いて２０分にわたって実施される場合に観察されたことが、報告されている。
【０１２３】
レポーター遺伝子によってコードされるタンパク質からの酵素活性もまた、ＲＮＡまたはＤＮＡベクターを用いて注射した腹筋において検出され、このことは、他の筋肉がポリヌクレオチドを取り込み得、そして発現し得ることを示す。少量のレポーター酵素が、ＲＮＡおよびＤＮＡベクターを用いて注射した他の組織（肝臓、脾臓、皮膚、肺、脳、および血液）でも検出された。筋内注射したプラスミドＤＮＡもまた、非ヒト霊長類の筋肉中で安定して発現されることが実証されている。Ｓ．Ｊｉａｏら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ３：２１−３３（１９９２）。
【０１２４】
遺伝子のヒト筋肉へのインサイチュでの直接移入が、いくつかの可能性のある臨床適用を有し得ることが考えられた。筋肉は、筋肉が主として関与する疾患に加え、筋肉が主として関与するわけではない疾患状態を改変する導入遺伝子の異種発現に対して、潜在的に適した組織である。例えば、筋組織は、免疫され得、血液に分泌され得るか、または循環している毒性代謝産物を清澄し得るタンパク質の異種発現に対して使用され得る。ＲＮＡおよび反復して利用し得る組織の使用は、従来の薬学的処置に非常に類似して投与される、可逆的な型の遺伝子移入に有用であり得る。Ｊ．Ａ．Ｗｏｌｆｆら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４７：１４６５−１４６８（１９９０）およびＳ．Ｊｉａｏら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ３：２１−３３（１９９２）を参照のこと。
【０１２５】
Ｊ．Ａ．Ｗｏｌｆｆら（前出）によって、抗原をコードする遺伝子の細胞内発現は、ワクチン開発に対して代替的なアプローチを提供し得ることが提唱されている。この仮説は、ＢＡＬＢ／ｃマウスの四頭筋に注射されたインフルエンザＡ核タンパク質をコードするプラスミドＤＮＡが、減少したウイルス肺力価によって測定されるような、インフルエンザＡ核タンパク質特異的細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）の生成および異種系統のインフルエンザＡウイルスでのその後のチャレンジからの防御、体重低下の阻害、ならびに生存率の増大をもたらしたという近年の報告によって支持されている。Ｊ．Ｂ．Ｕｌｍｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５９：１７４５−１７４９（１９９３）。
【０１２６】
従って、ウイルス抗原をコードするＲＮＡまたはＤＮＡベクターの直接注射を、抗原の内因性発現のために使用して、自己複製剤またはアジュバントを必要とせずに免疫系に対する提示のためにウイルス抗原を生成し得、抗原特異的ＣＴＬの生成および同種系統のウイルスまたは異種系統のウイルスでのその後のチャレンジからの防御をもたらすようである。
【０１２７】
マウスおよびヒトの両方におけるＣＴＬは、保存された内部ウイルスタンパク質に由来するエピトープを認識し得、そしてウイルスに対する免疫応答に重要であると考えられる。保存されたウイルスタンパク質に由来するエピトープの認識によって、ＣＴＬは系統間（ｃｒｏｓｓ−ｓｔｒａｉｎ）保護を提供し得る。保存されたウイルス抗原に対して特異的なＣＴＬは、一般的に系統特異的である抗体と対照的に、異なる系統のウイルスに対して応答し得る。
【０１２８】
従って、ウイルス抗原をコードするＲＮＡまたはＤＮＡの直接注射は、直接ペプチド送達またはウイルスベクターのいくつかの限定を伴なわない、利点を有する。Ｊ．Ａ．Ｕｌｍｅｒら（前出）およびその中の考察および参考文献を参照のこと。さらに、ＤＮＡ注射後に発現されたタンパク質に対する高力価抗体の生成は、これが、保存された抗原に対して標的化されたＣＴＬワクチンと別々にかまたは組み合わせてかのいずれかで、保存された抗原または保存されていない抗原に対する抗体ベースのワクチンの、容易かつ有効な作製手段であり得ることを示す。これらはまた、コンビネーションワクチンの生成のために、従来のペプチドワクチンと共に使用され得る。さらに、タンパク質発現はＤＮＡ注入後の維持されるので、Ｂ細胞記憶およびＴ細胞記憶の持続性は、増強され得、それによって長期の体液性免疫および細胞媒介免疫を発生させる。
【０１２９】
（ＨＩＶ−１に対する免疫予防または免疫治療のためのベクター）
本発明の１つの実施形態において、本発明の核酸を、強力な構成性プロモーター（例えば、ＣＭＶまたはＲＳＶ）または誘導性プロモーター（例えば、ＨＩＶ−１）を用いて、ＲＥＶ非依存性発現カセットを含む発現ベクターに挿入する。
【０１３０】
このベクターを、いくつかの技術（例えば、ヒト組織への直接的なＤＮＡの注射；エレクトロポレーション（インビボまたはエキソビボ）もしくは培養中の初代ヒト細胞へのＤＮＡのトランスフェクション（エキソビボ）、所望の特性についての細胞の選択、および体へのそのような細胞の再導入（この選択は、適切な予め選択されたゲノム領域への導入ＤＮＡの好首尾な相同組換えのためのものであり得る）；ｇａｇ遺伝子を含む感染性粒子の生成、エキソビボでの細胞の感染およびこのような細胞の体への再導入；またはインビボでのこのような粒子による直接的な感染）のうちの１つを使用して、薬学的に受容可能なキャリア中にて動物またはヒトに導入する。
【０１３１】
実質的なレベルのタンパク質が産生され（そして刺激の際に急速に分解され、ここで不安定化配列はコードタンパク質の一部である）、免疫系の有効な刺激を導く。
【０１３２】
本発明の別の実施形態において、記載された構築物はウイルス粒子形成に関与し得ない変異Ｇａｇタンパク質を発現するように改変される。このようなＧａｇタンパク質は、野生型Ｇａｇタンパク質と同程度に免疫系を刺激するが、ＨＩＶ−１産生の増大には寄与し得ないことが予想される。この改変は、免疫治療および免疫予防のためのより安全なベクターを生じるはずである。
【０１３３】
（参考文献）
【０１３４】
【表４】
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当業者は、阻害／不安定配列を含むｍＲＮＡをコードする遺伝子のいずれもが、例示された本発明の方法またはそれらの機能的に等価な方法に従って改変され得ることを認識している。
【０１３５】
遺伝子工学分野、ウイルス学分野、免疫学分野、医学分野、および関連分野の当業者に明らかな、本発明を実施するための上記様式の変更は、上記の特許請求の範囲の範囲内であることが意図される。
【０１３６】
本出願を通してこれまでに列挙された全ての参考文献は、その全体が本明細書中で参考として援用される。
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は、示されたベクターまたはその組み合わせを用いて注射したマウスにおける増殖応答（刺激指数（ＳＩ）として示す）である。ベクターは、実施例に記載される。
【図２】
図２は、示されたＳＩＶ発現プラスミドまたはその組み合わせを用いて２回注射したマウスにおける増殖応答（刺激指数（ＳＩ）として示す）である。一緒＝同じ部位に３つのＤＮＡを注射；３部位＝別々の部位に同じＤＮＡを注射。ベクターは、実施例に記載される。
【図３】
図３は、サルにおける抗体応答である。２匹の動物（＃５８５、＃５８７）に、ＭＣＰ３ｐ３７ｇａｇ発現ベクターを５ｍｇ、筋肉内に（「ｉ．ｍ．」）４回注射した。２匹の動物（＃６２６、＃６２８）には、リポソーム−ＤＮＡ調製物として同じＤＮＡを粘膜に与えた。力価を、血清希釈の逆数としてプロットし、ＨＩＶ  ｐ２４  ＥＬＩＳＡ試験における陽性をスコア付けした。
【図４】
図４は、ＷＴ＋ＭＣＰ３；ＷＴ＋ＣＡＴＥ；ＷＴ＋ＭＣＰ３＋ＣＡＴＥ；ＷＴのいずれかを用いた３回のワクチン接種；またはワクチン接種なし（「未処置（Ｎａｉｖｅ）」）の後に、マカクにおける、ｇａｇペプチドプールを用いてインビトロ刺激した後のＣＤ８集団中のＩＦＮγ＋細胞の割合を示す。（註：ＷＴは、野生型ｇａｇ（本明細書中、標準的ｇａｇ（Ｓｔｇａｇ）ともいわれる）を意味し；ＭＣＰ３は、ＭＣＰ３−ｇａｇ融合物を意味し；ＣＡＴＥは、β−カテニン−ｇａｇ融合物を意味する）。
【図５】
図５は、ＷＴ＋ＭＣＰ３；ＷＴ＋ＣＡＴＥ；ＷＴ＋ＭＣＰ３＋ＣＡＴＥ；ＷＴのいずれかを用いた３回のワクチン接種；または注射なし（「未処置」）の後に、マカクにおける、ｅｎｖペプチドプールを用いてインビトロで刺激した後のＣＤ８集団のＩＦＮγ＋細胞の割合を示す。（註：ＷＴは、野生型ｅｎｖを意味し；ＭＣＰ３は、ＭＣＰ３−ｅｎｖ融合物を意味し；ＣＡＴＥは、β−カテニン−ｅｎｖ融合物を意味する）。
【図６】
図６は、ＳＩＶエンベロープコードベクターＣＭＶｋａｎ／Ｒ−Ｒ−ＳＩＶｇｐ１６０ＣＴＥの模式図である。
【図７】
図７は、変異したＳＩＶ  ｅｎｖ遺伝子を含むＳＩＶエンベロープコードベクターＣＭＶｋａｎ／Ｒ−Ｒ−ＳＩＶｇｐ１６０ＣＴＥのＤＮＡ配列である。
【図８】
図８は、ＭＣＰ３−ｇｐ１６０  ｅｎｖ（ＨＩＶ）融合物のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列である。
【図９】
図９は、β−カテニン−ｇｐ１６０  ｅｎｖ（ＨＩＶ）融合物のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列である。
【図１０】
図１０は、ＨＩＶ  ｅｎｖ発現ベクターのウェスタンブロットである。ｇｐ１６０の野生型配列（レーン１、２、３）またはＭＣＰ−３との融合物（レーン６、９）、ｔＰＡリーダーペプチド（レーン４、７）およびβ−カテニン（レーン５、８）について最適化したベクターを示す。精製プラスミドを用いたトランスフェクションを、ヒト２９３細胞において行い、細胞抽出物（細胞内）または細胞上清（細胞外）のいずれかをＳＤＳ−アクリルアミドゲルにロードし、転写し、抗ＨＩＶ  ｅｎｖ抗体を用いてプローブした。ｇｐ１２０およびｇｐ４１の位置を示す。白抜きの矢印は、レーン５において検出された分解産物を示す。ＣＴＥおよびＲＴＥは、いくつかのベクターに存在するそれぞれのさらなる転写後制御エレメントを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図１０】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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