(57)【要約】本発明は、変異ヘルペスウイルスおよび化学療法薬などの抗癌剤を使用した癌の治療法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者の癌を治療する方法であって、該患者に（ｉ）γ３４．５遺伝子をその中で不活化させる弱毒化ヘルペスウイルスおよび（ｉｉ）化学療法薬を患者に投与することを含む、方法。
【請求項２】
前記弱毒化ヘルペスウイルス中でリボヌクレオチドレダクターゼ遺伝子を不活化する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
弱毒化ヘルペスウイルス中で２つのγ３４．５遺伝子を不活化する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
弱毒化ヘルペスウイルスがＧ２０７である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
化学療法薬がアルキル化剤である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
アルキル化剤が、ブスルファン、カロプラチン、カルムスチン、クロラムブシル、シスプラチン、シクロホスファミド、ダカルバジン、イホスファミド、ロムスチン、メコラレサミン、メルファラン、プロカルバジン、ストレプトゾシン、およびチオテパからなる群より選択される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
化学療法薬が抗腫瘍性抗生物質である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
抗腫瘍性抗生物質が、ブレオマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、イダルビシン、マイトマイシン、ミトキサントロン、ペントスタチン、およびプリカマイシンからなる群より選択される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
抗腫瘍性抗生物質がマイトマイシンＣである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
化学療法薬が代謝拮抗薬である、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
代謝拮抗薬が、チミジル酸シンテターゼインヒビター、クラドリビン、シタラビン、フロクスウリジン、フルダラビン、フルオロウラシル、ゲムシタビン、ヒドロキシ尿素、メルカプトプリン、メトトレキセート、およびチオグアニンからなる群より選択される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
チミジル酸シンテターゼインヒビターがフルオロデオキシウリジンである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
癌が、星状細胞腫、希突起膠腫、髄膜腫、神経線維腫、膠芽細胞腫、上衣細胞腫、神経鞘腫、神経線維肉腫、神経芽細胞腫、下垂体腺腫、髄芽細胞腫、頭頸部癌、黒色腫、前立腺癌、腎細胞癌、膵臓癌、乳癌、肺癌、結腸癌、胃癌、膀胱癌、肝臓癌、骨癌、線維肉腫、扁平上皮細胞癌、神経外胚葉癌、甲状腺癌、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、肝臓癌、中皮腫、類表皮癌、および血液の癌からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
ヘルペスウイルスが異種遺伝子産物をコードする遺伝子を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
異種遺伝子産物がワクチン抗原を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
異種遺伝子産物が免疫調節タンパク質を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
患者の癌を治療する方法であって、該患者に（ｉ）リボヌクレオチドレダクターゼ遺伝子を不活化した弱毒化ヘルペスウイルスおよび（ｉｉ）化学療法薬を投与することを含む、方法。
【請求項１８】
化学療法薬がアルキル化剤である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
アルキル化剤が、ブスルファン、カロプラチン、カルムスチン、クロラムブシル、シスプラチン、シクロホスファミド、ダカルバジン、イホスファミド、ロムスチン、メコラレサミン、メルファラン、プロカルバジン、ストレプトゾシン、およびチオテパからなる群より選択される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
化学療法薬が抗腫瘍性抗生物質である、請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
抗腫瘍性抗生物質が、ブレオマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、イダルビシン、マイトマイシン、ミトキサントロン、ペントスタチン、およびプリカマイシンからなる群より選択される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
抗腫瘍性抗生物質がマイトマイシンＣである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
化学療法薬が代謝拮抗薬である、請求項１７に記載の方法。
【請求項２４】
代謝拮抗薬が、チミジル酸シンテターゼインヒビター、クラドリビン、シタラビン、フロクスウリジン、フルダラビン、フルオロウラシル、ゲムシタビン、ヒドロキシ尿素、メルカプトプリン、メトトレキセート、およびチオグアニンからなる群より選択される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
チミジル酸シンテターゼインヒビターがフルオロデオキシウリジンである、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
癌が、星状細胞腫、希突起膠腫、髄膜腫、神経線維腫、膠芽細胞腫、上衣細胞腫、神経鞘腫、神経線維肉腫、神経芽細胞腫、下垂体腺腫、髄芽細胞腫、頭頸部癌、黒色腫、前立腺癌、腎細胞癌、膵臓癌、乳癌、肺癌、結腸癌、胃癌、膀胱癌、肝臓癌、骨癌、線維肉腫、扁平上皮細胞癌、神経外胚葉癌、甲状腺癌、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、肝臓癌、中皮腫、類表皮癌、および血液の癌からなる群より選択される、請求項１７に記載の方法。
【請求項２７】
ヘルペスウイルスが異種遺伝子産物をコードする遺伝子を含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項２８】
異種遺伝子産物がワクチン抗原を含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
異種遺伝子産物が免疫調節タンパク質を含む、請求項２７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明は、癌の治療法に関する。
【０００２】
発明の背景
Ｇ２０７は、脳腫瘍治療のために設計され、悪性神経膠腫の新規の治療として現在臨床的に評価中のリボヌクレオチドレダクターゼ陰性単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）１型である（Ｍａｒｋｅｒｔら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．、７：８６７〜８７４、２０００；Ｍｉｎｅｔａら、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．、１：９８３〜９４３、１９９５）。最近、このＨＳＶ変異体は、結腸直腸癌細胞に対して高い腫瘍崩壊性も示した（Ｋｏｏｂｙら、ＦＡＳＥＢ Ｊ．、１３：１３２５〜１３３４、１９９９）。最近、このウイルスはまた、乳がん（Ｗｕら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、６１（７）：３００９〜３０１５、２００１）、前立腺癌（Ｏｙａｍａら、Ｊａｐａｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、９１（１２）：１３３９〜１３４４、２０００）、直腸結腸癌（Ｄｅｌｍａｎら、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １１ （１８）：２４６５〜２４７２、２０００）、胃癌（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、７８（３）：１６６〜１７４、２０００）、膀胱癌（Ｏｙａｍａら、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ、１１（１２）：１６８３〜１６９３、２０００）、卵巣癌（Ｃｏｕｋｏｓら、Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ、７（２）：２７５〜２８３、２０００）、頭頸部癌（Ｃａｒｅｗら、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ、１０（１０）：１５９９〜１６０６、１９９９）、および膵臓癌（Ｌｅｅら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ Ｓｕｒｇｅｒｙ、３（２）：１２７〜１３１、１９９９を含む多数の型の癌の実験的治療で有効であることが見出されている。
【０００３】
Ｇ２０７は、ウイルスリボヌクレオチドレダクターゼ（ＲＲ）およびγ１３４．５の欠失によって標的腫瘍細胞を特異的に標的化する、多くの候補腫瘍崩壊性ウイルスで使用される戦略の典型である。第１に、ＲＲの大型サブユニットをコードする感染細胞タンパク質６（ＩＣＰ６）遺伝子座への大腸菌 ｌａｃＺ遺伝子の挿入によってウイルスＲＲを不活化する。ＲＲは、リボヌクレオチドの対応するデオキシリボヌクレオチドへの還元を触媒するので、ＤＮＡの新規合成用の十分な前駆体が得られる。哺乳動物細胞では、ＲＲはＳ期中およびＤＮＡ損傷／修復条件下で高度に発現する（Ｂｊｏｒｋｌｕｎｄら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２９：２４５２〜５４５８、１９９０；Ｃｈａｂｅｓら、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．、２７５：１７７４７〜１７７５３：２０００；Ｅｎｇｓｔｏｍら、Ｊ． Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６０：９１１４〜９１１６、１９８５；Ｆｉｌａｔｏｖら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７０：２５２３９〜２５２４３、１９９５；Ｔａｎａｋａら、Ｎａｔｕｒｅ、４０４：４２〜４９、２０００）。ほとんどのヘルペスウイルスは、それ自体のＲＲをコードし、したがって、その複製は宿主細胞周期から独立している（Ｂｏｅｈｍｅｒら、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、６６：３４７〜３８４、１９９７；Ｒｏｉｚｍａｎら、Ｆｉｅｌｄｓ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、第３版、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、１９９６；Ｒｏｉｚｍａｎら、Ｆｉｅｌｄｓ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、第３版、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、１９９６）。Ｇ２０７中のＩＣＰ６の不活化により、ウイルスＤＮＡ複製が細胞酵素に完全に依存性となり、結果として、この変異体の複製は宿主細胞の状態に大幅に依存するようになる。したがって、細胞周期の変化またはＤＮＡ損傷／修復条件はこのヘルペスベクターの複製を調節し得ると考えることが妥当である。Ｇ２０７の第２の変異は、両方のγ１３４．５遺伝子座の欠失である。γ１３４．５遺伝子は、少なくとも２つの機能を有するタンパク質（ＩＣＰ３４．５）をコードする。１つの機能は、ＨＳＶを複製し、中枢神経系内に拡大させる（Ｃｈｏｕら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５０：１２６２〜１２６６、１９９０；Ｗｈｉｔｌｅｙら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．、９１：２８３７〜２８４３、１９９３）。第２の機能は、ＨＳＶにタンパク質合成の細胞遮断の防止によりウイルス感染に対する宿主防御機構を回避する能力を付与する（Ｃｈｏｕら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、９２：１０５１６〜１０５２０、１９９５；Ｈｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、９４：８４３〜８４８、１９９７）。この機能は、ＤＮＡ損傷によって誘導されるタンパク質である細胞成長停止およびＤＮＡ損傷タンパク質３４（ＧＡＤＤ３４）のＩＣＰ３４．５相同ドメインにより代替可能である（Ｈｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、９４：８４３〜８４８、１９９７）。
【０００４】
化学療法は、悪性腫瘍の治療において、確立された療法である。フルオロデオキシウリジン（ＦＵｄＲ）は、結腸直腸癌の治療に広くに使用されている化学療法薬である。これは、チミジンキナーゼを介したリン酸化によって活性な代謝産物２’−デオキシ−５−フルオロウリジン５’一リン酸（ＦｄＵＭＰ）に急速に転換される。ＦｄＵＭＰは、チミジル酸シンテターゼ（ＴＳ）のスルフヒドリル残基およびメチレンテトラヒドロフォレートの両者と共有結合複合体を形成することによって酵素ＴＳを阻害する。ＴＳの阻害により、デオキシチミジン５’三リン酸（ｄＴＴＰ）が欠失し、その後細胞内デオキシヌクレオチド三リン酸プールが不均等になる（Ｄａｎｅｂｅｒｇら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．、４３：４９〜５７、１９８２；Ｊａｃｋｓｏｎ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２５３：７４４０〜７４４６、１９７８；Ｙｏｓｈｉｏｋａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６２：８２３５〜８２４１、１９８７）。この阻害により、いくつかの機構を介して細胞傷害性が誘導される。ヌクレオチドプールの不均衡は、ＦＭ３Ａ細胞中の二本鎖破壊活性を有する特異的エンドヌクレアーゼを誘導することが示されている（Ｙｏｓｈｉｏｋａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６２：８２３５〜８２４１、１９８７）。他の研究により、過剰なｄＵＴＰ／ｄＴＴＰ比によりＤＮＡ鎖の破壊につながるウラシルの誤組み込みおよび誤修復を起こすことが示されている（Ａｙｕｓａｗａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２５８：１２４４８〜１２４５４、１９８３；Ｇｏｕｌｉａｎら、Ａｄｖ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．、１９５：８９〜９５、１９８６；Ｉｎｇｒａｈａｍら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２５：３２２５〜３２３０、１９８６）。ＦＵｄＲの新生ＤＮＡに組み込まれる能力が、別の細胞毒性作用機構として示唆されている（Ｄａｎｅｎｂｅｒｇら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．、１０２：６５４〜６５８、１９８１）。さらに、ＦＵｄＲは、初期のＳ期中の遮断、ヒストンＨ１の喪失、およびＤＮＡ伸長の遅延によって細胞周期およびＤＮＡ複製に深刻な影響を与える（Ｄ’Ａｎｎａら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２４：５０２０〜５０２６、１９８５）。
【０００５】
ＦＵｄＲおよび他のチミジル酸シンテターゼインヒビターは、細胞におけるヌクレオチド産生の均衡の破壊によって作用する化学療法薬の例である。ピリミジン類似体、プリン類似体、メトトレキセート、および５−ＦＵヒドロキシ尿素を含む追加の作用因子は、類似の効果を有する。別の型の化学療法薬である代謝拮抗薬は、ＤＮＡ合成の妨害によって作用する。アルキル化剤、いくつかの抗腫瘍性抗生物質、および挿入剤は、ＤＮＡとの直接的相互作用によって作用し、例えば、ＤＮＡ合成および／または転写を妨害することができ、おそらくＤＮＡを破壊に導く。マイトマイシンＣ（ＭＭＣ）は、抗腫瘍性抗生物質であり、広範な臨床的抗腫瘍活性範囲を有し、胃癌の標準的治療である（Ｋｅｌｓｅｎ、Ｓｅｍｉｎａｒｓ ｉｎ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ、２３：３７９〜３８９、１９９６）。ＭＭＣは、一官能性または二官能性アルキル化によってＤＮＡと結合し、ＤＮＡ鎖を架橋させてＤＮＡ合成を阻害する（Ｖｅｒｗｅｉｊら、Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇｓ、１：５〜１３、１９９０）。
【０００６】
発明の概要
本発明は、癌患者の治療法を提供する。これらの方法は、（ｉ）γ３４．５遺伝子および／またはリボヌクレオチドレダクターゼ遺伝子をその中で不活化させる弱毒化ヘルペスウイルスおよび（ｉｉ）化学療法薬を患者に投与する工程を含む。これらの方法で使用することができる弱毒化ヘルペスウイルスの一例は、Ｇ２０７である。化学療法薬は、例えば、ブスルファン、カロプラチン（ｃａｒｏｐｌａｔｉｎ）、カルムスチン、クロラムブシル、シスプラチン、シクロホスファミド、ダカルバジン、イホスファミド、ロムスチン、メコラレサミン（ｍｅｃｈｏｌａｒｅｔｈａｍｉｎｅ）、メルファラン、プロカルバジン、ストレプトゾシン、またはチオテパなどのアルキル化剤と、ブレオマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、イダルビシン、マイトマイシン（例えば、マイトマイシンＣ）、ミトキサントロン、ペントスタチン、またはプリカマイシンなどの抗腫瘍性抗生物質と、チミジル酸シンテターゼインヒビター（例えば、フルオロデオキシウリジン）、クラドリビン、シタラビン、フロクスウリジン、フルダラビン、フルオロウラシル、ゲムシタビン、ヒドロキシ尿素、メルカプトプリン、メトトレキセート、またはチオグアニンなどの代謝拮抗薬であり得る。
【０００７】
本発明の方法を使用して治療することができる癌には、星状細胞腫、希突起膠腫、髄膜腫、神経線維腫、膠芽細胞腫、上衣細胞腫、神経鞘腫、神経線維肉腫、神経芽細胞腫、下垂体腺腫、髄芽細胞腫、頭頸部癌、黒色腫、前立腺癌、腎細胞癌、膵臓癌、乳癌、肺癌、結腸癌、胃癌、膀胱癌、肝臓癌、骨癌、線維肉腫、扁平上皮細胞癌、神経外胚葉癌、甲状腺癌、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、肝臓癌、中皮腫、類表皮癌、および血液の癌が含まれる。本発明の方法で使用されるウイルスは、ワクチン抗原または免疫調節タンパク質などの異種遺伝子産物をコードする遺伝子も含み得る。
【０００８】
本発明は、さらに、癌治療において本明細書に記載のウイルスおよび抗癌化合物の使用ならびに癌治療薬の調製におけるこれらの作用因子の使用を含む。例えば、本発明は、本明細書に記載の抗癌化合物と組み合わせて患者へ投与する薬剤を調製するのに本明細書に記載のウイルスを使用することならびに本明細書に記載のウイルスと組み合わせて患者に投与する薬剤調製にするためにこのような抗癌化合物を使用することを含む。
【０００９】
本発明は、いくつかの利点を提供する。例えば、以下でさらに考察するように、本発明で使用する治療薬である変異ヘルペスウイルスおよび抗癌剤は、癌治療において相乗活性を有する。この相乗作用の結果として、治療効果を犠牲にすることなく、広範な薬剤効果レベルにおいて各薬剤の用量を減少させることができる。より少量の作用因子の使用は、治療患者への毒性の最小化およびコストの削減を含むいくつかの利点を有する。本方法のさらなる利点は、医療専門家は本発明で使用される多数の抗癌剤の使用に精通していることである。例えば、本発明で使用される薬剤の毒性を十分に認識しており、任意の関連する副作用を治療するための治療法が存在する。さらに、本発明で使用することができる変異ヘルペスウイルスは、分裂細胞（癌細胞など）中で複製してこれらを破壊する一方で体内の他の休止細胞に影響を与えない。これらのヘルペスウイルスは増殖変異するので、野生型へと逆戻りする可能性が除かれる。さらに、必要ならば、ヘルペスウイルスの複製を、ウイルス複製を遮断するアシクロビルなどの抗ウイルス薬の作用によって調節して、別の重要な防衛手段を得ることができる。最後に、本発明の方法のいくつかの例では、マイトマイシンＣなどの抗癌剤は、神経毒性増加の潜在的リスクを伴うことなく、一定のヘルペスウイルスベクターの減少した複製表現型γ３４．５遺伝子欠失に歯止めをかけるために使用される。
【００１０】
本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明、図面、および特許請求の範囲から明らかになるであろう。
【００１１】
詳細な説明
本発明は、抗癌剤と組み合わせた変異ヘルペスウイルスの投与を含む癌治療法を提供する。以下でさらに考察するように、このような組み合わせ手法により、癌治療において相乗効果を得ることができるので、実質的な治療上の利点（例えば、治療効果を損失することなく潜在的に有毒な化学療法薬の投与量の減少）が得られる。本発明で使用することができる変異ヘルペスウイルスおよび抗癌剤、ならびにその投与方法の例を以下に示す。本発明の方法を使用して治療することができる癌の例およびこれらの方法の有効性を示す実験結果もまた以下に提供する。
【００１２】
変異ヘルペスウイルス
本発明で使用することができる変異ヘルペスウイルスは、ヘルペスウイルス科のメンバーに由来し得る（例えば、ＨＳＶ−１、ＨＳＶ−２、ＶＺＶ、ＣＭＶ、ＥＢＶ、ＨＨＶ−６、ＨＨＶ−７、およびＨＨＶ−８）。本発明で使用することができる弱毒化ＨＳＶ変異体の具体例としては、Ｇ２０７（Ｙａｚａｋｉら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、５５（２１）：４７５２〜４７５６、１９９５）、ＨＦ（ＡＴＣＣ ＶＲ−２６０）、ＭａｃＩｎｔｙｒｅ（ＡＴＣＣ ＶＲ−５３９）、ＭＰ（ＡＴＣＣ ＶＲ−７３５）；ＨＳＶ−２Ｇ株（ＡＴＣＣ ＶＲ−７２４）、およびＭＳ（ＡＴＣＣ ＶＲ−５４０）ならびに以下の１つ以上の遺伝子に変異を有する変異体が含まれる：即時型遺伝子ＩＣＰ０、ＩＣＰ２２、およびＩＣＰ４７（米国特許第５，６５８，７２４号）；γ３４．５遺伝子；リボヌクレオチドレダクターゼ遺伝子；ＶＰ１６遺伝子（すなわち、Ｖｍｖ６５、国際公開公報第ＷＯ９１／０２７８８号；同第ＷＯ９６／０４３９５号；同第ＷＯ９６／０４３９４号）。米国特許第６，１０６，８２６号、同第６，１３９，８３４号に記載のベクターもまた使用することができる。
【００１３】
以下でさらに考察するように、本発明の方法での使用に好ましい変異ヘルペスウイルスは、一方もしくは両方のγ３４．５遺伝子および／またはリボヌクレオチドレダクターゼ遺伝子の不活化変異、欠失、または挿入を有する。このような変異ヘルペスウイルスの１つの例は、上記のようにγ３４．５遺伝子の両方のコピーに欠失を有する、ＨＳＶ神経毒性の主要な決定基をコードするＧ２０７である。Ｇ２０７はまた、このウイルスのリボヌクレオチドレダクターゼの大型サブユニット、感染細胞タンパク質６（ＩＣＰ６）をコードする遺伝子であるＵＬ３９に不活化挿入を含む。
【００１４】
本発明で使用することができるヘルペスウイルス変異体のさらなる例は、非必須α４７遺伝子内の３１２塩基対が欠失したＧ２０７由来の多変異の複製コンピテントＨＳＶ−１ベクターであるＧ４７Δである（Ｍａｖｒｏｍａｒａ−Ｎａｚｏｓら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、６０：８０７〜８１２、１９８６）。ＨＳＶ中のＩＣＰ４７およびＵＳ１１をコードする転写物の重複により、α４７の欠失は、γ３４．５−変異体の成長特性を向上させる即時型α４７プロモーターの調節下で後期ＵＳ１１遺伝子に存在する。リボヌクレオチドレダクターゼが欠損したｈｒＲ３と呼ばれるＨＳＶ−１変異体もまた、本発明で使用することができる（Ｓｐｅａｒら、Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．、７（７）：１０５１〜１０５９、２０００）。
【００１５】
ウイルスが１つ以上の治療産物（例えば、細胞毒、免疫調節タンパク質（すなわち、抗原に対する宿主免疫応答を増大または抑制するタンパク質）、腫瘍抗原、アンチセンスＲＮＡ分子、またはリボザイム）をコードする異種核酸配列も含む場合、本発明の方法で使用されるウイルスの効果を増大させることができる。免疫調節タンパク質の例には、例えば、サイトカイン（例えば、任意のインターロイキン１〜１５などのインターロイキン、α、β、またはγインターフェロン、腫瘍壊死因子、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、ケモカイン（例えば、好中球活性化タンパク質（ＮＡＰ）、マクロファージ化学誘引物質および活性化因子（ＭＣＡＦ）、ＲＡＮＴＥＳ、およびマクロファージ炎症ペプチドＭＩＰ−１ａおよびＭＩＰ−１ｂ）と、補体成分およびその受容体と、免疫系アクセサリー分子（例えば、Ｂ７．１およびＢ７．２）と、接着分子（例えば、ＩＣＡＭ−１、２、および３）と、接着受容体分子が含まれる。本発明の方法を使用した結果として産生することができる腫瘍抗原の例には、例えば、ヒト乳頭腫ウイルスのＥ６抗原およびＥ７抗原、ＥＢＶ由来タンパク質（Ｖａｎ ｄｅｒ Ｂｒｕｇｇｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５４：１６４３〜１６４７、１９９１）、ＭＵＣ１（Ｂｕｒｃｈｅｌｌら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ、４４：６９１〜６９６、１９８９）などのムチン（Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎら、Ｃｕｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎ．、４（５）：６２４〜６２９、１９９２）、黒色腫チロシナーゼ、およびＭＺ２−Ｅ（Ｖａｎ ｄｅｒ Ｂｒｕｇｇｅｎら、前述）が含まれる。（腫瘍抗原またはサイトカインをコードする遺伝子を含ませるためのウイルスベクターの改変についてのさらなる説明については、国際公開公報第ＷＯ９４／１６７１６号も参照のこと。）
【００１６】
上記のように、異種治療産物は、ハイブリッド形成相互作用によって細胞、また病原体ｍＲＮＡの発現の遮断に使用することができるアンチセンスＲＮＡ分子などのＲＮＡ分子でもよい。あるいは、ＲＮＡ分子は、欠失細胞ＲＮＡを修復するか、好ましくない細胞、また病原体コードＲＮＡを破壊するように設計されたリボザイム（例えば、ハンマーヘッドまたはヘアピンベースのリボザイム）でもよい（例えば、Ｓｕｌｌｅｎｇｅｒ、Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．、２（５）：２４９〜２５３、１９９５；Ｃｚｕｂａｙｋｏら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．、４（９）：９４３〜９４９、１９９７；Ｒｏｓｓｉ、Ｃｉｂａ Ｆｏｕｎｄ．ｓｙｍｐ．、２０９：１９５〜２０４、１９９７；Ｊａｍｅｓら、Ｂｌｏｏｄ、９１（２）：３７１〜３８２、１９９８；Ｓｕｌｌｅｎｇｅｒ、Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．、２（３）：２０１〜２０５、１９９６；Ｈａｍｐｅｌ、Ｐｒｏｇ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．、５８：１〜３９、１９９８；Ｃｕｃｉｏら、Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ．、７４（３）：３１７〜３３２、１９９７を参照のこと）。
【００１７】
異種核酸配列を本発明で使用するために、ウイルスの調節配列の制御下におかれる位置でウイルスに挿入することができる。あるいは、異種核酸配列を、プロモーターまたはエンハンサーなどの調節エレメントを含む発現カセットの一部として挿入することができる。当業者は、適切な調節エレメントを、例えば、所望の組織特異性および発現レベル基づいて選択することができる。例えば、細胞型特異的または腫瘍特異的プロモーターを使用して、遺伝子産物の特定の細胞型への発現を制限することができる。これは、例えば細胞傷害性、免疫調節、または腫瘍抗原性遺伝子産物がその破壊を促進するために腫瘍細胞中で産生される場合、特に有用である。組織特異的プロモーターの使用に加えて、本発明のウイルスの局所投与により、局所発現および効果を得ることができる。
【００１８】
本発明で使用することができる非組織特異的プロモーターの例には、初期サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター（米国特許第４，１６８，０６２号）およびラウス肉腫ウイルスプロモーター（Ｎｏｒｔｏｎら、Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．、５：２８１、１９８５）が含まれる。また、ＨＳＶプロモーター（ＨＳＶ−１ ＩＥおよびＩＥ ４／５プロモーターなど）も、使用することができる。
【００１９】
本発明で使用することができる組織特異的プロモーターの例には、前立腺細胞に特異的な前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）プロモーター、筋細胞に特異的なデスミンプロモーター（Ｌｉら、Ｇｅｎｅ、７８：２４３、１９８９；Ｌｉら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６６：６５６２、１９９１；Ｌｉら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６８：１０４０３、１９９３）；ニューロンに特異的なエノラーゼプロモーター（Ｆｏｓｓ−Ｐｅｔｔｅｒら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｒｅｓ．、１６（１）：１４１〜１５６、１９８６）；赤血球に特異的なβグロビンプロモーター（Ｔｏｗｎｅｓら、ＥＭＢＯ Ｊ．、４：１７１５、１９８５）；同様に赤血球に特異的なτ−グロビンプロモーター（Ｂｒｉｎｓｔｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ、２８３：４９９、１９８０）；下垂体細胞に特異的な成長ホルモンプロモーター（Ｂｅｇｈｒｉｎｇｅｒら、Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．、２：４５３、１９８８）；膵臓β細胞に特異的なインスリンプロモーター（Ｓｅｌｄｅｎら、Ｎａｔｕｒｅ、３２１：５４５、１９８６）；星状細胞に特異的なグリア線維酸性タンパク質プロモーター（Ｂｒｅｎｎｅｒら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．、１４：１０３０、１９９４）；カテコールアミン作動性ニューロンに特異的なチロシンヒドロキシラーゼプロモーター（Ｋｉｍら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６８：１５６８９、１９９３）；ニューロンに特異的なアミロイド前駆体タンパク質プロモーター（Ｓａｌｂａｕｍら、ＥＭＢＯ Ｊ．、７：２８０７、１９８８）；ノルアドレナリン作動性およびアドレナリン作動性ニューロンに特異的なドーパミンβ−ヒドロキシラーゼプロモーター（Ｈｏｙｌｅら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．、１４：２４５５、１９９４）；セロトニン／松果体細胞に特異的なトリプトファンプロモーター（Ｂｏｕｌａｒａｎｄら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７０：３７５７、１９９５）；コリン作動性ニューロンに特異的なコリンアセチルトランスフェラーゼプロモーター（Ｈｅｒｓｈら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．、６１：３０６、１９９３）；カテコールアミン作動性／５−ＨＴ／Ｄ型細胞に特異的な芳香族Ｌ−アミノ酸デカルボキシラーゼ（ＡＡＤＣ）プロモーター（Ｔｈａｉら、Ｍｏｌ．Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．、１７：２２７、１９９３）；ニューロン／精子形成精巣上体細胞に特異的なプロエンケファリンプロモーター（Ｂｏｒｓｏｏｋら、Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．、６：１５０２、１９９２）；結腸および直腸腫瘍に特異的なｒｅｇ（膵石タンパク質）プロモーター（Ｗａｔａｎａｂｅら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６５：７４３２、１９９０）；および肝臓癌および盲端癌、ならびに神経鞘腫、腎臓、膵臓、および副腎細胞に特異的な副甲状腺ホルモン関連ペプチド（ＰＴＨｒＰ）プロモーター（Ｃａｍｐｏｓら、Ｍｏｌ．Ｒｎｆｏｖｔｉｎｏｌ．、６：１６４２、１９９２）が含まれる。
【００２０】
腫瘍細胞で特異的に機能するプロモーターの例には、乳癌細胞に特異的なストロメリシン３プロモーター（Ｂａｓｓｅｔら、Ｎａｔｕｒｅ、３４８：６９９、１９９０）；非小細胞肺癌細胞に特異的なサーファクタントタンパク質Ａプロモーター（Ｓｍｉｔｈら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．、５：２９〜３５、１９９４）；分泌性ロイコプロテアーゼインヒビター（ＳＬＰＩ）発現癌に特異的なＳＬＰＩプロモーター（Ｇａｒｖｅｒら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．、１：４６〜５０、１９９４）；黒色腫細胞に特異的なチロシナーゼプロモーター（Ｖｉｌｅら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ、１：３０７、１９９４；国際公開公報第ＷＯ９４／１６５５７号；同第ＷＯ９３／ＧＢ１７３０号）；線維肉腫／腫瘍形成細胞に特異的なストレス誘導性ｇｒｐ７８／ＢｉＰプロモーター（Ｇａｚｉｔら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、５５（８）：１６６０、１９９５）；含脂肪細胞に特異的なＡＰ２脂肪エンハンサー（Ｇｒａｖｅｓ、Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．、４９：２１９、１９９２）；肝細胞に特異的なα−１抗トリプシントランスサイレチンプロモーター（Ｇｒａｙｓｏｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３９：７８６、１９８８）；多形性膠芽腫細胞に特異的なインターロイキン−１０プロモーター（Ｎｉｔｔａら、Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．、６４９：１２２、１９９４）；膵臓、乳房、胃、卵巣、および非小細胞肺癌細胞に特異的なｃ−ｅｒｂＢ−２プロモーター（Ｈａｒｒｉｓら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．、１：１７０、１９９４）；脳腫瘍細胞に特異的なα−Ｂ−クリスタリン／熱ショックタンパク質２７プロモーター（Ａｏｙａｍａら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ、５５：７６０、１９９３）；神経膠腫および髄膜腫細胞に特異的な塩基性線維芽細胞成長因子プロモーター（Ｓｈｉｂａｔａら、Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔ．、４：２７７、１９９１）；扁平上皮細胞癌、神経膠腫、および乳癌細胞に特異的な上皮増殖因子受容体プロモーター（Ｉｓｈｉｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、９０：２８２、１９９３）；乳癌細胞に特異的なムチン様糖タンパク質（ＤＦ３、ＭＵＣ１）プロモーター（Ａｂｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、９０：２８２、１９９３）；転移性腫瘍に特異的なｍｔｓ１プロモーター（Ｔｕｌｃｈｉｎｓｋｙら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、８９：９１４６、１９９２）；小細胞肺癌細胞に特異的なＮＳＥプロモーター（Ｆｏｒｓｓ−Ｐｅｔｔｅｒら、Ｎｅｕｒｏｎ、５：１８７、１９９０）；小細胞肺癌細胞に特異的なソマトスタチン受容体プロモーター（Ｂｏｍｂａｒｄｉｅｒｉら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ、３１Ａ、１８４、１９９５；Ｋｏｈら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ、６０：８４３、１９９５）；乳癌細胞に特異的なｃ−ｅｒｂＢ−３プロモーターおよびｃ−ｅｒｂＢ−２プロモーター（Ｑｕｉｎら、Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ、２５：２４７、１９９４）；乳癌細胞および胃癌細胞に特異的なｃ−ｅｒｂＢ４プロモーター（Ｒａｊｋｕｍａｒら、Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．Ｔｒｅｎｄｓ、２９：３、１９９４）；甲状腺癌細胞に特異的なサイログロブリンプロモーター（Ｍａｒｉｏｔｔｉら、Ｊ．Ｃ���ｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．、８０：４６８、１９９５）；肝臓癌細胞に特異的なαフェトプロテインプロモーター（Ｚｕｉｂｅｌら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｐｈｙｓ．、１６２：３６、１９９５）；胃癌細胞に特異的なビリンプロモーター（Ｏｓｂｏｒｎら、Ｖｉｒｃｈｏｗｓ Ａｒｃｈ．Ａ．Ｐａｔｈｏｌ．Ａｎａｔ．Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌ．、４１３：３０３、１９８８）；および肝臓癌細胞に特異的なアルブミンプロモーター（Ｈｕｂｅｒ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、８８：８０９９、１９９１）が含まれる。
【００２１】
ウイルスを、医薬で使用される任意の従来の経路で、抗癌剤と同時または下記のように抗癌剤投与の直前または直後に投与することができる。また、ウイルスを、当業者が適切と判断することが出来るならば、抗癌剤と同一または異なる経路で投与することができる。
【００２２】
本発明の方法で使用されるウイルス（または抗癌剤）を、例えば、直接注射または外科的方法（例えば、脳腫瘍への定位注射：Ｐｅｌｌｅｇｒｉｎｏら、「精神生物学の方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｐｓｙｃｈｏｂｉｏｌｏｇｙ）」、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、６７〜９０、１９７１）によって、例えば、細胞死滅および／または治療遺伝子発現などのある効果が、所望される組織に直接投与することができる。脳へのウイルス投与に使用することができる方法としてさらに、Ｂｏｂｏら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、９１：２０７６〜２０８０、１９９４）およびＭｏｒｒｉｓｏｎら（Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．、２６６：２９２〜３０５、１９９４）によって記載された対流法がある。腫瘍治療の場合、直接腫瘍注射の代わりに、手術を行って腫瘍を除去し、任意の残存する腫瘍細胞の破壊を確実にするために切除した腫瘍床にウイルスを接種することができる。あるいは、ウイルスを、非経口経路（例えば、静脈内、動脈内、脳室内、皮下、腹腔内、皮内、表皮内または筋肉内）または粘膜表面（例えば、眼球、鼻腔内、肺内、口腔内、腸内、直腸内、膣内、または尿路表面）を介して投与することができる。
【００２３】
ウイルスベクターを哺乳動物（例えば、ヒト）の細胞に移入するために、任意の多数の周知の処方物を本発明で使用することができる。（例えば、「レミントン薬学（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）」、第１８版、Ａ．Ｇｅｎｎａｒｏ編、１９９０、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡを参照のこと）。しかし、ウイルスを、アジュバントまたは担体を使用する、あるいは使用しないで生理学的に適合性のある溶液、滅菌食塩水または滅菌緩衝化食塩水などの中に簡単に希釈することができる。
【００２４】
ベクターの投与量は、例えば、達成すべき特定の目的、ベクターで使用される任意のプロモーターの強度、投与される哺乳動物（例えば、ヒト）の状態（例えば、哺乳動物の体重、年齢、および身体全体の健康）、投与様式、および処方の型に依存する。一般に、治療または予防有効量は、例えば、約１０１〜１０１０プラーク形成単位（ｐｆｕ）、例えば、約５×１０４〜１×１０６ｐｆｕ、例えば、約１×１０５〜約４×１０５ｐｆｕであるが、ほとんどの有効範囲は宿主によって変化し、当業者はこの範囲を容易に決定することができる。また、当業者が適切に決定することができるように単回用量または間隔を置いて反復して投与することができる。
【００２５】
抗癌剤
本発明の方法ではあらゆる任意の多数の抗癌剤（すわなち、化学療法薬）を使用することができる。これらの化合物はいくつかの異なるカテゴリーに分類され、例えば、アルキル化剤、抗腫瘍性抗生物質、代謝拮抗薬、および自然源の誘導体が含まれる。本発明で使用することができるアルキル化剤の例には、ブスルファン、カロプラチン、カルムスチン、クロラムブシル、シスプラチン、シクロホスファミド（すなわち、シトキサン）、ダカルバジン、イホスファミド、ロムスチン、メコラレサミン、メルファラン、プロカルバジン、ストレプトゾシン、およびチオテパが含まれる、また、抗腫瘍性抗生物質の例には、ブレオマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、イダルビシン、マイトマイシン（例えば、マイトマイシンＣ）、ミトキサントロン、ペントスタチン、およびプリカマイシンが含まれる、また、代謝拮抗薬の例には、フルオロデオキシウリジン、クラドリビン、シタラビン、フロクスウリジン、フルダラビン、フルオロウラシル（例えば、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ））、ゲムシタビン、ヒドロキシ尿素、メルカプトプリン、メトトレキセート、およびチオグアニンが含まれる、そして自然源の誘導体の例には、ドセタキセル、エトポシド、イリノテカン、パクリタキセル、テニポシド、トポテカン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンオレルビン、タキソール、プレドニゾン、およびタモキシフェンが含まれる。本発明で使用することができるさらなる化学療法薬の例には、アスパラギナーゼおよびミトタンが含まれる。
【００２６】
化学療法薬の投与法は当該分野で周知であり、例えば、選択した特定の薬剤（または薬剤の組み合わせ）、癌の型および位置、ならびに治療を受ける患者についての他の要因（例えば、患者の年齢、体重、および身体全体の健康）に依存して変化する。上記に列挙した任意の薬剤または当該分野で公知の他の化学療法薬を、本明細書に記載の変異ヘルペスウイルスと併せて投与する。
【００２７】
ウイルスおよび抗癌剤を、例えば、同日に（０〜１２時間内（例えば、１〜８または２〜６時間内））投与するか、異なる日（例えば、２４、４８、または７２時間以内、または１週間以内）に任意の順序で投与することができる。さらに、これらを同一または異なる経路（当業者が適切に決定することができる）で投与することができる（例えば上記を参照のこと）。本発明で使用することができる経路の具体例には、静脈内注入、経口経路、皮下もしくは筋肉内注射、ならびにカテーテルもしくは手術を使用した局所投与が含まれる。適切な薬剤投与量を当業者は容易に決定することができ、例えば、１μｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ体重、例えば、１０μｇ〜１ｍｇ／ｋｇ体重、２５μｇ〜０．５ｍｇ／ｋｇ体重、または５０μｇ〜０．２５ｍｇ／ｋｇ体重）の範囲であり得る。薬剤を、任意の適切な薬学的担体または希釈剤（生理食塩水または徐放性処方物など）と共に投与することができる。
【００２８】
本発明の方法で治療することができる癌の例には、神経系の癌、例えば、星状細胞腫、乏突起膠腫、髄膜腫、神経線維腫、膠芽細胞腫、上衣細胞腫、神経鞘腫、神経線維肉腫、神経芽細胞腫、下垂体腫瘍（例えば、下垂体腺腫）、および髄芽細胞腫が含まれる。本発明の方法で治療することができる他の癌の種類の例には、頭頸部癌、黒色腫、前立腺癌、腎細胞癌、膵臓癌、乳癌、肺癌、結腸癌、胃癌、膀胱癌、肝臓癌、骨癌、線維肉腫、扁平上皮細胞癌、神経外胚葉癌、甲状腺癌、リンパ腫（ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫）、肝臓癌、中皮腫、類表皮癌、および血液の癌（例えば白血病）ならびに本明細書に記載の他の癌が含まれる。
【００２９】
実験結果
本発明は、癌治療における変異ヘルペスウイルス（Ｇ２０７）および２つの抗癌剤、フルオロデオキシウリジン（Ｉ）およびマイトマイシンＣ（ＩＩ）の相乗活性を示す、以下の実験結果に一部基づく。
【００３０】
Ｉ．フルオロデオキシウリジン誘導性細胞変化とリボヌクレオチドレダクターゼ陰性単純ヘルペスウイルスの複製との間の機能的相互作用
上記のように、Ｇ２０７は、ウイルスリボヌクレオチドレダクターゼ（ＲＲ）の不活化および両γ１３４．５遺伝子の欠失によって弱毒化された腫瘍崩壊性単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）である。ウイルスＲＲおよびＩＣＰ３４．５のカルボキシル末端ドメインを機能的に置換することができる細胞相対物は、それぞれ細胞ＲＲならびに成長停止およびＤＮＡ損傷タンパク質３４（ＧＡＤＤ３４）の対応する相同ドメインである。チミジル酸シンテターゼ（ＴＳ）インヒビターであるフルオロデオキシウリジン（ＦＵｄＲ）は、細胞ＲＲおよびＧＡＤＤ３４の発現を変化させることができるので、本発明者らはＦＵｄＲ誘導性細胞変化によりウイルス増殖および細胞傷害性を変化させると仮定されるＧ２０７生物活性に対するＦＵｄＲの効果を試験した。１０ｎＭＦＵｄＲの存在下で野生型ＨＳＶ−１の複製が阻害されたが、同一の条件下でＧ２０７は複製が増加した。ＦＵｄＲとＧ２０７とを組み合わせて使用すると相乗的な細胞傷害性を示した。ＦＵｄＲ曝露により、１０ｎＭおよび１００ｎＭでＲＲ活性が増加したが、ＧＡＤＤ３４は１００ｎＭのみで誘導された。ＦＵｄＲによるウイルス複製の増加効果は、ヒドロキシ尿素（公知のＲＲインヒビター）によって抑制された。これらの結果は、ＦＵｄＲ処理細胞におけるＧ２０７成長の利点は、主にＲＲ依存性機構に基づくことを示す。本発明者らが見出したことは、ＴＳ阻害がウイルス複製を減少させることを示すにもかかわらず、ＦＵｄＲ誘導性ＲＲの上昇は、Ｇ２０７複製を増加させるというこの欠点を克服することができる。これらのデータにより、癌治療におけるＲＲ陰性ＨＳＶ変異体とチミジル酸シンテターゼインヒビターとの組み合わせ使用のための細胞の基礎が得られる。本発明者らの実験結果を、以下にさらに詳細に記載する。
【００３１】
材料と方法
細胞株および培養
５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）およびＦＵｄＲに対して２つの異なる感受性を示すＨＣＴ８細胞を本研究で使用した。ＨＣＴ８細胞を、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＣＣＬ−２２４、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ、ＵＳＡ）から得た。耐性細胞株を、既に記載のように（Ａｓｃｈｅｌｅら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、５２：１８５５〜１８６４、１９９２）、１５μＭ ５−ＦＵへの７日間（ＨＣＴ８／ＦＵ７ｄＲ）の曝露後にＨＣＴ８細胞からクローン化した。両細胞株を、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）、１００μｇ／ｍｌペニシリン、および１００μ／ｍｌストレプトマイシンを補足したＲＰＭＩ１６４０培地に維持した。ベロ細胞（アフリカミドリザル腎臓）を、１０％ＦＣＳを補足したイーグル最小必須培地（ＭＥＭ）中で増殖させた。
【００３２】
ウイルス
多変異複製コンピテント１型ヘルペスウイルスＧ２０７の作製は、既に記載されている（Ｍｉｎｅｔａら、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．、１：９８３〜９４３、１９９５）。野生型ＨＳＶ−１Ｆ株に基づいて、Ｒ３６１６変異体からＧ２０７を構築した。この変異体は、γ１３４．５遺伝子座のコードドメイン由来の１ｋｂ欠失およびリボヌクレオチドレダクターゼの大型サブユニットをコードするＩＣＰ６遺伝子への大腸菌ｌａｃＺ遺伝子の挿入を含む。ＨＳＶ−１（Ｆ）はＧ２０７の親野生型ウイルスであり、ＫＯＳは異なる株の野生型ＨＳＶ−１である。ベロ細胞上でウイルスを増殖させた。Ｇ２０７は、Ｓ．Ｄ．ＲａｂｋｉｎおよびＲ．Ｌ．Ｍａｒｔｕｚａから贈与された。ＨＳＶ−１（Ｆ）およびＫＯＳは、ＭｅｄｉＧｅｎｅ，Ｉｎｃ．（Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ、Ｃａｎａｄａ）から得た。
【００３３】
ｐ５３変異分析
ゲノムＤＮＡを、ＨＣＴ８およびＨＣＴ８／７ｄＲ細胞から抽出した。ｐ５３遺伝子のエクソン５〜９をポリメラーゼ連鎖反応によって増幅し、一本鎖ＤＮＡ高次構造多型によって変異について分析した。
【００３４】
細胞傷害性アッセイ法
Ｇ２０７およびＦＵｄＲ（フロクスウリジン、Ｒｏｃｈｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．、Ｎｕｔｌｅｙ、ＮＪ）の細胞傷害性を、細胞質乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）活性の測定（Ｃｙｔｏ Ｔｏｘ ９６ノンラジオアクティブ・サイトトキシアッセイ、Ｐｒｏｍｅｇａ， Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩ）によって評価した。全ての細胞傷害性アッセイ法を、２×１０４細胞／ウェルから出発する２４ウェルプレートで行った。処理開始後の種々の測定点で、接着細胞をＰＢＳで洗浄し、細胞質ＬＤＨを溶菌緩衝液（ＰＢＳ，１．２％ｖ／ｖ ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）によって放出させた。テトラゾリウム塩を赤色ホルマザン生成物に変換する酵素結合反応を使用して溶解物の活性を測定した。マイクロプレートリーダー（ＥＬ ３１２ｅ、Ｂｉｏ−Ｔｅｋ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｗｉｎｏｏｓｋｉ、ＶＴ）を使用して４５０ｎｍの吸光度を測定した。細胞傷害性が、未処理細胞（対照）と比較した処理細胞の最大ＬＤＨ放出の割合として示された。
【００３５】
ウイルス滴定
Ｅ−ＭＥＭ、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、１０％ＦＣＳを含む少なくとも１つの継代培養にベロ培養を移した。培養物を６ウェルプレートのウェルあたり１×１０６細胞の密度でプレートし、加湿インキュベーターにて３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートした。翌日、培養物をＰＢＳで２回洗浄し、細胞溶解物の連続希釈物（０．８ｍｌ／ウェル）を、３枚の皿に３７℃で４時間吸着させた。細胞溶解物を、４回の凍結融解サイクルで調製した。吸着後、接種物を除去し、培養物を寒天含有培地に重層した。接種から２日後に培養物をニュートラルレッドで染色し、翌日にプラーク形成を評価した。
【００３６】
β−ガラクトシダーゼ活性
β−ガラクトシダーゼ活性を、ｏ−ニトロフェニルガラクトシド（ＯＮＰＧ）のｏ−ニトロフェノールとガラクトースへの変換のモニタリングによって決定した（β−ガラクトシダーゼレポーターアッセイ、Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）。細胞を溶解し、ＯＮＰＧと３７℃で３０分間インキュベートした。λ＝４０５ｎｍでのｏ−ニトロフェノールの分光光度測定によって反応速度を決定した。ｏ−ニトロフェノールについてのモル減衰係数（ελ＝４．５×１０３Ｍ−１ｃｍ−１）を使用して、１単位のβ−ガラクトシダーゼ活性を、３７℃で１分間の１ｎｍｏｌのＯＮＰＧのｏ−ニトロフェノールおよびガラクトースへの切断と定義した。
【００３７】
β−ガラクトシダーゼの組織化学染色
細胞をトリプシン処理し、培地に再懸濁し、ＰＢＳで洗浄した。サイトスピンスライドを、１×１０５細胞を含む１ｍｌの細胞懸濁液の１０００ｒｐｍで６分間の遠心分離によって調製した。スライドをＸ−ｇａｌ（５−ブロモ−４ークロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド）で染色し、３７℃で４時間インキュベートした。ＰＢＳでの洗浄後、スライドを０．１％核ファーストレッドで対比染色する。
【００３８】
細胞周期分析
既に記載のフローサイトメトリー（Ｎｕｓｓｅら、Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ、１１：８１３〜８２１、１９９０）によって核調製物に対して細胞周期分析を行った。簡単に述べれば、細胞単層をＰＢＳで注意深く洗浄し、細胞破片を除去した。トリプシン処理後、細胞をＰＢＳで洗浄し、ＮＰ４０溶液（１０ｍＭ ＮａＣｌ、３．４ｍＭ クエン酸ナトリウム、０．０３％ＮＰ−４０、６３μＭ臭化エチジウム、１０μｇ／ｍｌ ＲＮａｓｅＡ）に再懸濁した。室温で１時間の接種後、同体積の高スクロース溶液（０．２５Ｍスクロース、７８ｍＭクエン酸、１００μＭ臭化エチジウム）を加えた。臭化エチジウム染色核のＤＮＡ含有量を、ＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒにて決定した。データを、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェア（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｓｏｎ， Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）を実施するＦＡＣＳｔａｔｉｏｎで分析した。
【００３９】
リボヌクレオチドレダクターゼの細胞抽出
２５０ｃｍ２フラスコで増殖させた細胞をトリプシン処理し、氷冷ＰＢＳで２回洗浄した。細胞を３００×ｇ、４℃で５分間遠心分離し、３倍体積の低塩抽出緩衝液（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．２、２ｍＭ ＤＴＴ）に再懸濁した。再懸濁物中の生細胞数を、トリパンブルー色素排除法によって決定した。氷上で３０分間の接種後、細胞懸濁物を２８Ｇ１／２ニードルにて１０回抜き取った。粗ホモジネートを、１００，０００×ｇ、４℃で６０分間遠心分離して、細胞破片を除去した。上清画分を、１，０００倍体積の低塩抽出緩衝液に対して４時間透析し、２時間後に分子量カットオフ１０，０００の透析カセット（Ｓｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ透析カセット、Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）を使用して一定量の緩衝液を交換した。透析した抽出物を液体窒素中で急速冷凍し、分析まで−８０℃で保存した。全ての抽出手順を４℃で行った。
【００４０】
ＣＤＰレダクターゼ活性のアッセイ法
リボヌクレオチドレダクターゼ活性を、ＳｔｅｅｐｅｒおよびＳｔｕａｒｔの変法（Ｓｔｅｅｐｅｒら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、３４：１２３〜１３０、１９７０）によって決定した。ＣＤＰのｄＣＤＰへの変換を、［１４Ｃ］ＣＤＰ（５３ｍＣｉ／ｍｍｏｌ、Ｍｏｖａｒｅｋ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．）を基質として、ヌクレオチドのヌクレオシドへの加水分解のためにトウブダイヤガラガラヘビ由来のガラガラヘビ毒（Ｓｉｇｍａ）を使用してモニターした。反応混合物は、１５０μｌの最終体積中に以下の濃度の成分を含んでいた、すなわち、４０μＭ ＣＤＰ、１０μＭ［１４Ｃ］ＣＤＰ（０．０８μＣｉ）、６ｍＭ ＤＴＴ、４ｍＭ酢酸マグネシウム、２ｍＭ ＡＴＰ、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．２）、および１００μｌ抽出物（０．２〜０．７ｍｇタンパク質）。３７℃で３０分間酵素反応を行い、１００℃で４分間の接種によって反応を停止させた。５０μｌキャリアｄＣＭＰ（６ｍＭ ｄＣＭＰ、２ｍＭ ＭｇＣｌ２、６ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．８））および２５μｌヘビ毒懸濁液（５０ｍｇ／ｍｌ）の添加によってヌクレオチドを加水分解した。３７℃で３時間の接種後、反応混合物を４分間沸騰させて熱不活化させた。室温で１０分間の１４，０００×ｇでの遠心分離によって熱沈殿物質を除去した。［１４Ｃ］デオキシシトシンを、フェニルボロン酸カラム（ＢｏｎｄＥｌｕｔ ＰＢＡ、Ｖａｒｉａｎ、Ｈａｒｂｏｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ）を使用した共有結合性クロマトグラフィーによって［１４Ｃ］シトシンから分離した。トリエタノールアミン緩衝液（ｐＨ１０）を最終濃度０．４Ｍまで上清画分に加え、この混合物１ｍｌをカラムに供した。画分を回収し、液体シンチレーション分光測定法（ＬＳ６０００ＩＣ液体シンチレーションシステム、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ，Ｉｎｃ．、Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ、ＣＡ）によって放射能を測定した。酵素活性１単位は、３７℃で１時間での１ｎｍｏｌのＣＤＰの生成物ｄＣＤＰへの変換と定義した。
【００４１】
ノザンブロットハイブリッド形成
全細胞ＲＮＡを、グアニジンチオシアネート−フェノール−クロロホルム抽出によって単離した（Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１６２：１５６〜１５９、１９８７）。ＲＮＡを変性させ、１．２％ホルムアルデヒド−アガロースゲルにて電気泳動し、標準的な方法によってニトロセルロース膜にブロットした。予備ハイブリッド形成後、膜を、４０℃で５０％のホルムアミド中で、ランダムプライマー法によって［３２Ｐ］ｄＣＴＰで標識した全長ＧＡＤＤ３４およびβ−アクチンｃＤＮＡプローブにハイブリッド形成させた。膜を洗浄し、−８０℃でハイパーフィルム（Ａｍｅｒｓｈａｍ ｐｈａｒｍａｃｉａ ｂｉｏｔｅｋ）に曝露した。ＮＩＨ画像ソフトウェアを使用してスキャンフィルムの濃度分析を行った。相対ＧＡＤＤ３４レベルを、ＧＡＤＤ３４／β−アクチン比として計算した。
【００４２】
結果
Ｇ２０７およびＦＵｄＲの相乗的細胞傷害性
低ＬＤＨ放出およびサブＧ１画分のより高い割合によって示されるように、ＨＣＴ８細胞は、ＨＣＴ８／７ｄＲと比較してＦＵｄＲに対して感受性が高かった（図１Ａ、図５Ａ、および図５Ｂ）。両細胞株は、類似のウイルス細胞傷害性プロフィールを示した。感染多重度（ＭＯＩ）が１．０または０．１でのウイルス感染により、６日目で細胞が完全に死滅する一方で、ＭＯＩ ０．０１でのＧ２０７は、細胞毒性作用は低かった（図１Ｂおよび図１Ｃ）。ＦＵｄＲはウイルス細胞傷害性を増加させることができるという仮説を試験するために、本発明者らは、ＭＯＩ １．０およびＭＯＩ ０．１のウイルス細胞傷害性が過剰に高いので、ＭＯＩ ０．０１でＧ２０７を使用することを決定した。１０ｎＭまたは１００ｎＭ ＦＵｄＲと組みあせたＧ２０７（ＭＯＩ ０．０１）により、６日目までにＨＣＴ８細胞がほぼ完全に死滅した（図１Ｄ）。この効果は、それぞれ１種類での処理による計算された相加効果よりも高く、これは組み合わせ治療の相乗効果を示す。さらに、相乗効果の程度は、ＦＵｄＲ低感受性細胞株ＨＣＴ８／７ｄＲよりもＨＣＴ８細胞においてより明白であった（図１Ｄおよび図１Ｅ）。
【００４３】
ＦＵｄＲの存在下でのβ−ガラクトシダーゼ発現の増加
ウイルス感染性に対するＦＵｄＲの効果を評価するために、Ｇ２０７におけるｌａｃＺレポーター遺伝子産物としてβ−ガラクトシダーゼ活性を測定した。ＭＯＩ ０．０１のＧ２０７を感染させ、１０ｎＭ ＦＵｄＲで処理した細胞は、感染後（ｐｉ）３日目に最も高い総β−ガラクトシダーゼ発現を示したが、生細胞数に換算した場合、１００ｎＭ ＦＵｄＲの曝露により、Ｇ２０７のみでの処理よりもβ−ガラクトシダーゼ活性が高かった（図２Ａおよび２Ｂ）。ＦＵｄＲ曝露細胞のβ−ガラクトシダーゼについての組織化学染色は、より高い染色強度およびより高いＸ−ｇａｌ染色陽性細胞の割合を示した（図２Ｃ）。ＦＵｄＲによる感染増大の程度は、ＨＣＴ８／７ｄＲ細胞よりもＨＣＴ８でより明白であった。
【００４４】
ＦＵｄＲの存在下で、Ｇ２０７の複製は増加するが、野生型ＨＳＶ−１の複製は減少する
一工程の成長分析により、ＨＣＴ８細胞においてＧ２０７と比較して野生型ＨＳＶ（ＨＳＶ−１（Ｆ）、ＫＯＳ）のウイルス収量は２−ｌｏｇ倍高いことが示された。興味深いことに、ＦＵｄＲの存在下でのＧ２０７の放出量は、Ｇ２０７のみの接種から３６時間後に３倍になったが、親野生型ウイルスＨＳＶ−１（Ｆ）の複製は、同一の条件下でいくらか阻害された。本発明者らは、別の野生型ＨＳＶ−１（ＫＯＳ株）を試験し、１０ｎＭ ＦＵｄＲの存在下で類似の複製の減少が認められた（表１）。多工程成長分析により、Ｇ２０７感染のみと比較して両方の細胞株で１０ｎＭ ＦＵｄＲの存在下で有意に高いウイルス産生が認められた。Ｇ２０７のピークの力価および総産生量は、ＨＣＴ８／７ｄＲ細胞と比較して親細胞株ＨＣＴ８で高かった（図３）。
【００４５】
ウイルス複製およびβ−ガラクトシダーゼ発現に対するヒドロキシ尿素の効果
ＲＲインヒビターであるヒドロキシ尿素（ＨＵ）は、ＨＣＴ８細胞のウイルス複製を９０％抑制した。さらに、ＨＵは、Ｇ２０７のＦＵｄＲによって誘導された複製増加を消去することができた。阻害度は、ＨＵのみで処理した細胞（１．９±０．５×１０４ｐｆｕ）およびＨＵおよびＦＵｄＲで処理した細胞（２．１±０．５×１０４ｐｆｕ）で同様であった。ウイルス産生と対照的に、ＦＵｄＲおよびＨＵは共にβ−ガラクトシダーゼ発現に対して有意な効果を示した（図４）。
【００４６】
ＦＵｄＲによる細胞周期の変化
ＦＵｄＲへの増殖細胞の時期の異なる曝露により、Ｓ期の画分が増加し、Ｇ１／Ｇ０期の画分が減少したが、この効果は、薬剤濃度および細胞株に依存していた。１０ｎＭの低濃度ＦＵｄＲにより、Ｓ期中の画分は２４時間までにＨＣＴ８で７５％、ＨＣＴ８／７ｄＲで３７％増加した。４８時間では両細胞株は、１００ｎＭでの処理後ほとんどがＳ期中の細胞であった。１００ｎＭ ＦＵｄＲでＳ期中レベルが完全に遮断されたＨＣＴ８細胞と対照的に、ＨＣＴ８／７ｄＲ細胞はＳ期中の一過性増加のみを示し、見かけ上Ｇ２／Ｍ期に移行することができた。さらに、１０〜２０％のＨＣＴ８／７ｄＲ細胞は、１００ｎＭ ＦＵｄＲの存在下でＧ２／Ｍへの移行の代わりにＳ期中でＤＮＡ核内倍加することが認められた。Ｇ２／Ｍにおけるこれらの細胞の蓄積は、この核内倍加に起因する４Ｎ Ｇ１細胞の存在による（図５Ａおよび図５Ｂ）。
【００４７】
ＦＵｄＲの存在下でのリボヌクレオチドレダクターゼ活性の増加
Ｇ２０７の複製は細胞ＲＲに依存するので、本発明者らは、チミジル酸シンテターゼインヒビターＦＵｄＲがこの細胞酵素に対していかなる効果を有するかどうかを試験した。指数増殖細胞の基準の活性は、化学療法抵抗性細胞株ＨＣＴ８／７ｄＲと比較してＨＣＴ８細胞では約３．２倍高かった。図６は、ＦＵｄＲ曝露の際のＲＲ活性の時間依存性経時変化を示す。ＦＵｄＲ処理により、両細胞株のＲＲ活性が増加した。この増加は一過性であり、ピークの活性は、処理の開始から２４時間後にＦＵｄＲ誘導Ｓ期中の増加と同時に認められた（図５Ａおよび５Ｂ）。しかし、活性誘導度は、ＨＣＴ８／７ｄＲ細胞と比較してＨＣＴ８でより明白であった。１０ｎＭ ＦＵｄＲで処理したＨＣＴ８のＲＲ活性は、ピークの活性後も増加しつづけた。
【００４８】
リボヌクレオチドレダクターゼ活性に対するＦｄＵＭＰの効果
ＦｄＵＭＰは、ＦＵｄＲの活性な代謝産物であり、ＴＳを阻害する。哺乳動物ＲＲ活性は、デオキシヌクレオチドのフィードバック阻害によって大きく制御される；したがって、本発明者らは、ＦｄＵＭＰ（ｄＵＭＰのフッ素化形態）がＲＲ活性を阻害してＧ２０７の複製を妨害し得るという着想について試験した。表２は、酵素活性の用量依存性減少を示す。０．００１〜０．１ｍＭのＦｄＵＭＰ濃度ではＲＲの阻害は中程度であり、約８０〜７０％の活性が残存している。１ｍＭ ＦｄＵＭＰの存在下で実質的な酵素阻害を測定し、本研究では最大ＦＵｄＲ濃度の約１０，０００倍を使用した。
【００４９】
ＦＵｄＲに応答したＧＡＤＤ３４の発現
ＧＡＤＤ３４タンパク質は、ＤＮＡ損傷に応答して発現する。ＧＡＤＤ３４およびウイルスγ１３４．５タンパク質は、ストレス条件下でのタンパク質合成を機能的に維持することができる類似のカルボキシル末端ドメインを含む。したがって、本発明者らは、ＤＮＡ損傷因子としてのＦＵｄＲがＧ２０７におけるγ１３４．５欠失を完全にすることができるＧＡＤＤ３４の発現を誘導することができるかどうかを調査した。１００ｎＭのＦＵｄＲは両細胞株でＧＡＤＤ３４を誘導するが、１０ｎＭではほとんど効果はなかった。未処理細胞と比較した場合、濃度測定により、ＨＣＴ８については２４時間および４８時間でｍＲＮＡがそれぞれ１．９倍および１．６倍となり、ＨＣＴ８／７ｄＲ細胞については４８時間で１．９倍に増加した（図７）。
【００５０】
【表１】
2004515461.tif 000002
ａＨＣＴ８細胞を、ＭＯＩが２のＨＳＶ−１（Ｆ）、ＫＯＳ、およびＧ２０７に感染させた。３７℃で１時間の吸着後、接種物を除去し、細胞をＰＢＳで洗浄し、１０ｎＭ ＦＵｄＲを含む培地またはＦＵｄＲを含まない対照培地を添加した。接種から３６時間後、細胞および上清を回収し、標準的なプラークアッセイ法によって溶菌物をベロ細胞に対して滴定した。データを、３つの独立した測定の平均±ＳＥＭとして示す。
【００５１】
【表２】
2004515461.tif 000003
ａリボヌクレオチドレダクターゼを、以下の「実験手順」に記載のように指数増殖ＨＣＴ８細胞から抽出した。抽出物を、漸増濃度のＦｄＵＭＰとインキュベートし、リボヌクレオチドレダクターゼ活性を測定した。データを、３つの独立したリボヌクレオチドレダクターゼ活性決定の平均±ＳＥＭとして示す。
ｂ１００μｌの透析細胞抽出物は、０．６５ｍｇのタンパク質を含んでいた。
【００５２】
ＩＩ．マイトマイシンＣおよびγ３４．５欠失腫瘍崩壊性ヘルペスウイルス（Ｇ２０７）の相乗的抗癌活性は、ＧＡＤＤ３４の上方制御によって媒介される
遺伝子治療に使用される腫瘍崩壊性ウイルスは、一般に、標的腫瘍ウイルスを選択的に標的化する一方で正常な宿主組織を容赦するように改変されている。上記のように、多変異ウイルスＧ２０７は、ウイルスリボヌクレオチドレダクターゼの不活化およびウイルスγ３４．５遺伝子の欠失によって弱毒化されている。Ｇ２０７は実験モデルの多数の腫瘍型を有効に死滅されるにもかかわらず、γ３４．５変異体はこの遺伝子を維持するウイルスと比較した場合に抗腫瘍効率を顕著に減少させることが十分に立証されている。γ３４．５遺伝子産物に対する哺乳動物相同体は、ＧＡＤＤ３４タンパク質である。このタンパク質は、γ３４．５遺伝子を機能的に置換することができ、またＤＮＡ損傷の際に上方制御する。化学療法薬マイトマイシンＣをＧ２０７と組み合わせて使用して、ＧＡＤＤ３４を上方制御し、ウイルス毒性および抗腫瘍効果を増大させるためにγ３４．５遺伝子欠失を完全にした。アイソボログラム法およびＣｈｏｕ−Ｔａｌａｌｅｙの組み合わせインデックス法を使用して、マイトマイシンＣとＧ２０７との間でインビトロおよびインビボでの胃癌治療に有意な相乗効果を示した。このような相乗効果の結果として、腫瘍細胞死滅を犠牲にすることなく、広範な薬剤効果レベルを保ちながら各薬剤の用量減少を達成することができる。ノザンブロット分析によって決定されるように、ＧＡＤＤ３４ ｍＲＮＡ発現は、マイトマイシンＣ処理により増加した。これらのデータは、マイトマイシンＣを使用して、Ｇ２０７中の有毒なγ３４．５遺伝子表現型を選択的に修復し、癌治療におけるＤＮＡ損傷剤とγ３４．５ＨＳＶ変異体との組み合わせ使用の細胞での基本も得られることを示す。本発明者らの実験結果を、以下でさらに詳述する。
【００５３】
材料と方法
細胞培養
ヒト胃癌細胞株ＯＣＵＭ−２ＭＤ３を、日本の大阪市立大学医学部のヤシロマサカズ（Ｍａｓａｋａｚｕ Ｙａｓｈｉｒｏ）博士から寄贈され、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、０．５ｍＭ ピルビン酸ナトリウム、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）、１％ペニシリン、および１％ストレプトマイシンを補足したＤＭＥＭ ＨＧ中で維持した。ヒト胃癌細胞株ＭＫＮ−４５−Ｐを、日本の神奈川大学のヨネムラユタカ（Ｙｕｔａｋａ Ｙｏｎｅｕｍｕｒａ）博士から寄贈され、１０％ＦＣＳ、１％ペニシリン、および１％ストレプトマイシンを補足したＲＰＭＩ中で維持した。ヒト肺癌細胞株Ａ５４９をＡＴＣＣから入手し、１０％ＦＣＳ、１％ペニシリン、および１％ストレプトマイシンを補足したＦ−１２中で維持した。細胞は、全て５％ＣＯ２加湿インキュベーター中で維持した。
【００５４】
ウイルス
Ｇ２０７は、γ１３４．５神経ビルレンス遺伝子およびＵＬ３９での大腸菌ｌａｃＺ挿入の両方を欠損させて構築した多変異複製コンピテントＨＳＶであり、またＵＬ３９はリボヌクレオチドレダクターゼの大型サブユニットをコードしている。Ｇ２０７の構築は他のところで記載されている。
【００５５】
動物
無胸腺ヌードマウス（４〜６週齢）を、全ての動物実験で使用した。動物研究は、メモリアルスローンケタリング癌センター動物ケアと使用委員会で承認されており、厳格なガイドラインの下で実施した。麻酔にはメトキシフルラン吸入を使用して実験を行った。
【００５６】
腹膜散在性胃癌の作製
以前に記載のように、胃癌の確立したネズミ移植モデルを使用した（Ｂｅｎｎｅｔｔら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、７８：１６６〜１７４、２０００；Ｙａｓｈｉｒｏら、Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ、１４：４３〜５４，１９９６）。２×１０６ＯＣＵＭ−２ＭＤ３細胞の腹腔内（ｉ．ｐ．）注射により、網、小腸間膜および大腸間膜、横隔膜、性腺脂肪、および肝門に見られる散在性腹膜腫瘍が容易に発症した。注射から３日後に巨視的小結節が存在し、過剰な全身腫瘍組織量、観血性腹水症、および悪液質が注射から４週間で認められる。全身腫瘍組織量を評価するために、既に記載のように動物を屠殺して内臓を摘出し、腹腔腫瘍を関連する腹部器官から取り出した。全身腫瘍組織量を、重量で評価した。
【００５７】
ＭＭＣおよびＧ２０７のインビトロ細胞傷害性
９６ウェルアッセイプレート（Ｃｏｓｔａｒ、Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｉｎｃ．、ＮＹ）に１×１０４細胞／ウェルでのプレーティングによって細胞傷害アッセイを行った。ＭＫＮ−４５−ＰおよびＯＣＵＭ−２ＭＤ３細胞を、培地のみ（対照ウェル）、マイトマイシンＣのみ（Ｂｒｉｓｔｏｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ、ＮＪ）、Ｇ２０７のみ、Ｇ２０７とＭＭＣの両方を使用した併用療法のいずれかを使用して処理した。ＯＣＵＭ−２ＭＤ３細胞株については１：１０およびＭＫＮ−４５−Ｐ細胞株については１：２５の比のＭＭＣおよびＧ２０７の連続希釈物を使用して併用療法を行った。これらの比を、最初の実験での各薬剤についてのＥＤ５０の評価および併用療法の比を決定するためのこれらの用量の使用によって決定した。各群の細胞生存率（％）（対対照）を、標準ＭＴＴ（３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニル−２Ｈテトラゾリウムブロミド）バイオアッセイ法を使用して治療から５日後に計算した。マイクロプレートリーダーを使用して、５５０ｎｍでＭＴＴ−ホルマザン産物の存在について評価した。全サンプルのＯＤ値からバックグラウンド光学密度（ＯＤ）を引き算した。次いで、処理ウェルの平均吸光度（ＯＤ）（ｎ＝６）を未処理（対照）ウェルの平均吸光度（ＯＤ）（ｎ＝６）で割り算することによって細胞生存度を計算した。
【００５８】
ＭＭＣとＧ２０７との間の相乗効果についての薬理学的分析
Ｃｈｏｕ及びＴａｌａｌａｙの多剤効果分析を使用して、Ｇ２０７とＭＭＣとの間の薬理学的相互作用を決定した。この方法は、２つの薬剤の推定される相加効果を定義し、組み合わせ効果が予想される相加効果とどれぐらい異なるかを決定することによって相乗効果または拮抗作用を定量する。データ分析に使用した方程式およびコンピュータソフトウェアは、他で詳述されている（Ｃｈｏｕ，Ｔ．編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、６１〜１０２、１９９１；Ｃｈｏｕら、Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｅ Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ、２２：２７〜５５、１９８４；Ｃｈｏｕら、「ＩＢＭ−ＰＣのマニュアルおよびソフトウェア」；Ｃｈｏｕ，Ｊ．、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、２２３〜２４４、１９９１）。組み合わせインデックス方程式を使用して、２薬剤組み合わせを正確に分析する。ＣＩ＝１が相加効果を示し、ＣＩ＜１およびＣＩ＞１がそれぞれ相乗効果および拮抗作用を示すようにＣＩ値を解釈する。上記実験で得た細胞傷害性データを、Ｃｈｏｕ−Ｔａｌａｌａｙ分析で使用した。これらのデータから、各用量および対応する効果レベル（影響画分（ｆｒａｃｔｉｏｎ ａｆｆｅｃｔｅｄ）（Ｆａ）という）についてのＣＩ値が得られた。実際の実験データに基づいて、コンピュータソフトウェアを使用して、５〜５９％の全効果レベル範囲（Ｆａ）から連続ＣＩ値を計算した。次いで、これらのデータを使用して、Ｆａ−ＣＩプロット（効果優先データ提示手段）を作成する。用量優先のアイソボログラム技術によってもデータを分析した。アイソボログラム上の軸は、各薬剤の用量を示す。任意の所与のＦａ値について、所与のＦａ値を得るために必要な各薬剤の用量に対応するｘ軸およびｙ軸上の２つのポイントを選択する。これら２つのポイントの間に引いた直線は、同一のＦａ値を得るために必要な可能な組み合わせ用量に対応し、これは、２つの薬剤間の相互作用が厳密に付加的であると考えられる。所与のＦａを達成するために実際に必要な認められた実験濃度を、プロットに加える。これらのポイントが直線上に存在する場合、そのＦａ値で効果は付加的である。ポイントが直線の左側に存在する場合、効果は相乗的であり、ポイントが直線の右側に存在する場合、そのＦａ値で効果は拮抗的である。組み合わせインデックス法を使用して利用可能な別の計算は、容量減少インデックス（ＤＲＩ）である。ＤＲＩは、相乗的組み合わせで得られる場合、同一の効果レベルの達成に必要な単一薬剤治療の濃度と比較した、各薬剤の倍率−用量減少の決定要因である。ＤＲＩ＞１は、毒性を好ましく減少しながら治療効果を維持することを示す。
【００５９】
インビトロウイルス増殖分析
ＭＭＣの存在下で、Ｇ２０７のＯＣＵＭ−２ＭＤ３細胞内で複製する能力を、ウイルス増殖分析によって評価した。１．５×１０５ＯＣＵＭ−２ＭＤ３細胞／ウェルを、６ウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ、Ｃｏｒｎｉｎ Ｉｎｃ．、Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＮＹ）にプレートした。次いで、細胞をＭＯＩ＝０．０１のＧ２０７のみ、または０．０１μｇ／ｃｃ、０．０２μｇ／ｃｃ、または０．０４μｇ／ｃｃのＭＭＣと組み合わせたＭＯＩ＝０．０１のＧ２０７のいずれかに感染させた。細胞および培地を、感染後０時間、２４時間、４８時間、７２時間、および１２０時間で回収した。３回の凍結融解による溶菌の後、ベロ細胞に対して標準的なプラークアッセイ法を行い、ウイルス力価を評価した。全てのサンプルについて、３回行った。
【００６０】
インビトロでＭＭＣ処理した細胞におけるＧＡＤＤ３４のノザンハイブリッド形成分析
０μｇ／ｍｌ（未処理）、０．００５μｇ／ｍｌ（低用量）、または０．０４μｇ／ｍｌ（高用量）のマイトマイシンＣ（Ｂｒｉｓｔｏｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ、ＮＪ）を含む１２ｃｃの培養培地で細胞を培養した。２４時間および４８時間でトリプシン処理によって細胞を回収した。ＲＮＡ単離システム（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を使用して全ＲＮＡを調製し、ＲＮＡ含有量を２６０ｎｍでの光学密度によって測定した。サンプルあたり７μｇのＲＮＡを変性１．２％アガロースゲルに加えた。標準的技術によって、電気泳動分離、ニトロセルロース膜（Ｉｎｔｅｒｇｅｎ、Ｐｕｒｃｈａｓｅ、ＮＹ）へのＲＮＡの移動、ハイブリッド形成（４０℃で５０％ホルムアミド）、およびオートラジオグラフィーでの同定を行った。２．４ｋｂインサートを含むｃＤＮＡクローンＧＡＤＤ３４をＡ．Ｆｏｒｎａｃｅ，Ｊｒ．博士から入手し、１．１ｋｂインサートを含むｃＤＮＡクローンα−アクチンを、ＡＴＣＣから入手した（Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）（Ｈｏｌｌａｎｄｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７２：１３７３１〜１３７３７、１９９７）。プラスミドベクターから切り出したｃＤＮＡを、ランダムプライマー標識法によって［３２Ｐ］ｄＣＴＰで標識した（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）。
【００６１】
腹腔内Ｇ２０７およびＭＭＣでの胃癌腫症の治療
Ｇ２０７およびＭＭＣのインビボでの全身腫瘍組織量を減少する能力を、胃癌腫症モデルで評価した。動物は全て２×１０６ＯＣＵＭ−２ＭＤ３細胞で腹腔内注射し、３日後に治療した。実験群（ｎ＝７）を、無血清培地（対照）、１×１０６ｐｆｕのＧ２０７、５×１０６ｐｆｕのＧ２０７、０．１ｍｇ／ｋｇ ＭＭＣ、あるいは０．１ｍｇ／ｋｇ ＭＭＣと１×１０６ｐｆｕのＧ２０７、または０．１ｍｇ／ｋｇ ＭＭＣと５×１０６ｐｆｕのＧ２０７の併用療法として腹腔内注射によって治療した。４週間後に動物を屠殺し、全身腫瘍組織量を記載のように評価した（Ｂｅｎｎｅｔｔら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，７８：１６６〜１７４、２０００）。
【００６２】
結果
ＭＭＣおよびＧ２０７のインビトロ細胞傷害性
Ｇ２０７およびＭＭＣは共にＯＣＵＭ−２ＭＤ３およびＭＫＮ−４５−Ｐ胃癌細胞に対して用量依存性の細胞傷害を示す。併用療法は、いずれか１つの薬剤よりも多数の腫瘍細胞を死滅させ、予想される相加効果よりも有効性が高い。データは、ＯＣＵＭ−２ＭＤ３細胞（図８Ａ）およびＭＫＮ−４５−Ｐ細胞（図８Ｂ）についての対照に対する平均（±ＳＥＭ）細胞生存として示す。
【００６３】
ＭＭＣとＧ２０７との間の相乗効果の薬理学的分析
以下の２つの方法を使用して、Ｇ２０７とＭＭＣとの間の相乗効果を同定した、すなわち、組み合わせインデックス法およびアイソボログラム法。Ｃｈｏｕ−Ｔａｌａｌｅｙ分析は、ＯＣＵＭ−２ＭＤ３（図９Ａ）およびＭＫＮ−４５−Ｐ（図９Ｂ）の全範囲のＦａ値に対してＣＩ値が１未満を維持することを示す。ＯＣＵＭ−２ＭＤ３細胞株は中程度の相乗効果を示す一方で、ＭＫＮ−４５−Ｐ細胞株は強力な相乗効果を示した。各Ｆａ値について用量減少インデックス（ＤＲＩ）を計算した。ＯＣＵＭ−２ＭＤ３細胞株について、ＭＭＣおよびＧ２０７の用量は、併用療法で投与した場合は１／２〜１／３に減少しうる（表３）。ＭＫＮ−４５−Ｐ細胞株では、併用療法で投与した場合は、ＭＭＣの用量は、１／２〜１／９に減少し、Ｇ２０７の用量は、１／２〜１／４に減少し得る（表４）。１を超えるＤＲＩ値は、効果を喪失することなく毒性の低減を達成することができることを示す。９０％の細胞死滅（ＥＤ９０）、７０％の細胞死滅（ＥＤ７０）、および５０％の細胞死滅（ＥＤ５０）に必要なＭＭＣおよびＧ２０７の用量についてアイソボログラムを構築した（図１０Ａおよび１０Ｂ）。これらの各Ｆａ値（０．５、０．７、および０．９）についてのさらなる推定効果ラインの十分に下の薬剤およびウイルス濃度で実験組み合わせデータポイントが存在した。これらの研究により、両細胞株についてのＭＭＣとＧ２０７との間の相乗効果が確認された。
【００６４】
インビトロウイルス増殖分析
ＯＣＵＭ−２ＭＤ３細胞におけるＧ２０７の複製は、高用量のＭＭＣの存在下でのウイルス収量の減少を示した。ウイルス力価の１５５倍増加は、ＯＣＵＭ−２ＭＤ３細胞のＧ２０７での感染から５日後に認められた。０．０１μｇ／ｃｃ ＭＭＣの存在下で、感染から５日後に２４倍増加したウイルス力価が認められた。０．０２μｇ／ｃｃおよび０．０４μｇ／ｃｃ ＭＭＣの存在下で、ウイルス収量がそれぞれ８倍および２倍増加した。併用化学療法で測定したより低いウイルス収量は、特に併用療法の相乗的細胞傷害性が与えられた場合、細胞基質の有意な喪失の次に起こり得る。
【００６５】
インビトロでＭＭＣで処理した細胞におけるＧＡＤＤ３４についてのノザンハイブリッド形成分析
ＭＭＣで処理していない細胞から抽出したＲＮＡを陰性対照（レーン１）として使用し、陽性対照（レーン６）は、２．４ｋｂでの推定ＧＡＤＤ３４バンドを示した（図１１）。全ての条件下で、ほぼ同量の細胞α−アクチン遺伝子を発現した。低用量のマイトマイシンＣ（０．００５μｇ／ｃｃ）での処理から２４時間後（レーン２）に回収したＯＣＵＭ細胞は、予想されるサイズでいかなるバンドも示さない一方で、高用量ＭＭＣ（０．０４μｇ／ｃｃ）で処理した細胞は、有意な２．４ｋｂバンド（レーン３）を示した。高用量処理から２４時間後、陰性対照と比較した場合、強度が２．４９倍増加したＧＡＤＤ３４バンドが測定された。低用量ＭＭＣでの処理から４８時間後に回収したＯＣＵＭ細胞はいかなるＧＡＤＤ３４バンドも認められなかったが（レーン４）、高用量治療は、２．４ｋｂに不連続のバンドが認められた（レーン５）（図１１）。高用量処理から４８時間後、３．２１倍の強度の増加が認められた（図１１）。
【００６６】
腹腔内Ｇ２０７およびＭＭＣでの胃癌腫症の治療
胃癌腫症マウスを、Ｇ２０７、ＭＭＣ、またはこれらの薬剤の組み合わせで腹腔内治療を行った。治療効果を、屠殺時点でのマウスの腹腔内全身腫瘍組織量の秤量によって評価した。平均腹腔内全身腫瘍組織量（±ＳＥＭ）は、対照マウスで２４７０（±３３０）ｍｇ、１×１０６ｐｆｕのＧ２０７で治療したマウスで１２１０（±３００）ｍｇ（対照に対してＰ＝０．０２）、および０．１ｍｇ／ｋｇ ＭＭＣで治療したマウスで１４９０（±３１０）ｍｇ（対照に対してＰ＝０．０６）であった（図１２）。１×１０６ｐｆｕのＧ２０７および０．１ｍｇ／ｋｇ ＭＭＣを使用した併用療法の平均全身腫瘍組織量は３５０（±１５０）ｍｇ（対照に対してＰ＜０．００１）であり、これは１×１０６ｐｆｕのＧ２０７のみ（Ｐ＝０．０３）およびＭＭＣ治療のみ（Ｐ＝０．０１）とは統計的に異った（図５）。５×１０６ｐｆｕのＧ２０７でのウイルス治療により、平均全身腫瘍組織量は９９０（±３２０）ｍｇ（対照に対してＰ＜０．０１）であった（データ示さず）。５×１０６ｐｆｕのＧ２０７および０．１ｍｇ／ｋｇ ＭＭＣを使用した併用療法の平均全身腫瘍組織量は１００（±６０）ｍｇ（対照に対してＰ＜０．０１）であり、これは５×１０６ｐｆｕのＧ２０７のみ（Ｐ＝０．０４）およびＭＭＣ治療のみ（Ｐ＜０．０１）とは統計的に異なった（図５）。
【００６７】
【表３】
2004515461.tif 000004
【００６８】
【表４】
2004515461.tif 000005
【００６９】
上記で引用した全ての引例は、その全体が参考として組み込まれる。他の態様は添付の特許請求の範囲の範囲内である。
【図面の簡単な説明】
【図１】Ｇ２０７およびＦＵｄＲの細胞傷害効果を示す実験結果を示す。細胞生存度を、細胞内ＬＤＨの最大放出の関数として評価した。上の図のパネル：Ｇ２０７およびＦＵｄＲの細胞傷害性。ＨＣＴ８（●）およびＨＣＴ８／７ｄＲ（○）を、漸増濃度のＦＵｄＲ（５、１０、５０、１００ｎＭ）に曝露し、治療開始から６日後に生存度を決定した（Ａ）。感染３日後および６日後のＨＣＴ８（Ｂ）およびＨＣＴ８／７ｄＲ（Ｃ）のウイルス細胞傷害性。細胞を、１．０（△）、０．１（□）、および０．０１（○）のＭＯＩのＧ２０７に感染させた。下の図のパネル：ＨＣＴ８（Ｄ）およびＨＣＴ８／７ｄＲ（Ｅ）中で単独（Ｇ２０７またはＦＵｄＲ）およびＨＣＴ８（Ｄ）およびＨＣＴ８／７ｄＲ（Ｅ）の組み合わせ治療から６日目の細胞生存度。細胞を、ＭＯＩ ０．０１でＧ２０７に感染させる（白抜きのバー）または、ＦＵｄＲに曝露する（灰色のバー）または、Ｇ２０７（ＭＯＩ＝０．０１）およびＦＵｄＲ（１０ｎＭまたは１００ｎＭ）を組み合わせて（黒のバー）治療した。相加効果を各単独治療から積として計算した（斜線のバー）。全てのアッセイを、各条件について４回行った（平均±ＳＥＭ）。
【図２】Ｇ２０７での感染後のβ−ガラクトシダーゼ発現に対するＦｕｄＲの影響を示す実験結果を示す。細胞（２×１０４）を、２４ウェルプレートにプレートし、ＦＵｄＲの存在下（１０ｎＭ、斜線；１００ｎＭ、黒）および非存在下（白）でＭＯＩ ０．０１のＧ２０７を感染させた。感染から３日後、細胞を溶解し、細胞溶解物の全β−ガラクトシダーゼ活性を測定した（Ａ）。各条件についての細胞数を、追加のウェルにおいてトリパンブルー色素排除法によって決定し、総活性を生細胞数に参照することによって活性を計算した（Ｂ）。全アッセイを３回行った（平均±ＳＥＭ）。ｌａｃＺ染色のために、３×１０５細胞を、２５ｃｍ２のフラスコ上にプレートした。１２時間後、細胞を、上記と同一の条件下でＦＵｄＲの存在下および非存在下でＧ２０７に感染させた。３日後、サイトスピンスライドを調製し、ｌａｃＺ発現についてＸ−ｇａｌで染色した。図２のパネルＣは、異なる治療条件についての代表的な２００倍のフィールドを示す。
【図３】ウイルス複製に対するＦＵｄＲの効果を示す実験結果を示す。ウイルス力価を決定して、ウイルス複製に対するＦＵｄＲの影響を評価した。１２ウェルプレートの１ウェルあたり５×１０４細胞をプレートした。１２時間後、細胞を、ＦＵｄＲの存在下（△１０ｎＭ；○１００ｎＭ）および非存在下（□対照）でＭＯＩ ０．０１感染させた。上清および細胞を感染のその後７日間毎日回収し、溶解物を、標準的なプラークアッセイ法によってベロ細胞に対して滴定した。全アッセイを、各条件について３回行った（平均±ＳＥＭ）。
【図４】ウイルス複製に対するＦＵｄＲおよびＨＵの効果を示す実験結果を示す。ＨＣＴ８細胞を、細胞あたり２ｐｆｕのＧ２０７に感染させた。３７℃で１時間接種物の吸着を除去した後、細胞をＰＢＳで洗浄し、１０ｎＭ ＦＵｄＲを含む培地またはＦＵｄＲを含まない対照培地を添加した。感染８時間後、ＦＵｄＲの存在下および非存在下の感染細胞を、１ｍＭ ＨＵに曝露した。感染３６時間後、上清を回収し、３回の凍結融解によって溶解物を調製した。溶解物のウイルス力価（Ａ）およびβ−ガラクトシダーゼ活性（Ｂ）を決定した。全アッセイを各条件について３回行った（平均±ＳＥＭ）。
【図５】細胞周期に対するＦＵｄＲの効果を示す実験結果を示す。非同期的に増殖させた細胞（１×１０６）を、２０ｍｌの培地中の７５ｃｍ２にプレートした。１２時間後、１０ｎＭおよび１００ｎＭの最終濃度になるようにＦＵｄＲを培地に添加した。未処理細胞を対照として使用した。処理開始から２４時間後、４８時間後、および７２時間後にＦＡＣＳ分析によって臭化エチジウム染色核のＤＮＡ含有量を測定した。側方散乱ヒストグラムに基づいてＨＣＴ８（Ａ）およびＨＣＴ８／７ｄＲ（Ｂ）の細胞周期分析を行った。ヒストグラムは、サブＧ１画分（ＤＮＡ＜Ｇ１／Ｇ０）およびＤＮＡ＞Ｇ２／Ｍでゲートをかけられた。
【図６】細胞リボヌクレオチドレダクターゼ活性に対するＦＵｄＲの効果を示す実験結果を示す。１×１０７細胞を、２２５ｃｍ２のフラスコにプレートした。９時間後、１０ｎＭおよび１００ｎＭの最終濃度になるようにＦＵｄＲを培地に添加した。未処理細胞を対照として使用した。ＦＵｄＲの存在下（△１０ｎＭ；○１００ｎＭ）および非存在下（□対照）での種々の測定点で細胞抽出物中のリボヌクレオチドレダクターゼ活性を測定した。活性は、細胞数を参照した。全アッセイを各時点で各条件について３回行った（平均±ＳＥＭ）。
【図７】ＦＵｄＲに反応するＧＡＤＤ３４発現を示す実験結果を示す。ＦＵｄＲの非存在下ならびに１０ｎＭおよび１００ｎＭのＦＵｄＲの存在下、２４時間および４８時間増殖させた、ＨＣＴ８（Ａ）およびＨＣＴ８／７ｄＲ（Ｂ）細胞中のＧＡＤＤ３４ ｍＲＮＡのノザンブロット。細胞をプレートし、ＲＲ測定実験にしたがってＦＵｄＲで処理した（図５の凡例を参照のこと）。β−アクチンは、ＧＡＤＤ３４のローディングコントロールとして使用した。
【図８】胃癌細胞を死滅させるための併用化学療法および腫瘍崩壊性ウイルス療法が１つの薬剤のみでの治療と比較して効果が高いことを示す実験結果を示す。ＯＣＵＭ−２ＭＤ３（Ａ）ＭＫＮ−４５−Ｐ（Ｂ）胃癌細胞を、異なる用量のマイトマイシンＣ（μｇ／ｃｃ）またはＧ２０７（ＭＯＩ）で処理した。ＯＣＵＭ−２ＭＤ３細胞については１：１０、ＭＫＮ−４５−Ｐ細胞については１：２５のＭＭＣ：Ｇ２０７比を一定に維持することで併用療法を行った。標準的なＭＴＴアッセイ法を使用して、各処理群の細胞傷害性を評価し、結果を対照と比較した生存率（％）で示す。
【図９】マイトマイシンＣとＧ２０７とを使用した併用療法が、評価した全用量範囲で相乗的相互作用することを示す実験結果を示す。相乗性を評価するＣｈｏｕ−Ｔａｌａｌｅｙ組み合わせインデックス法を、方法（本文を参照のこと）に記載のように行った。実験データポイント（●）を使用し、ＣａｌｃｕＳｙｎソフトウェアを使用して５〜９５％（実線）全範囲のＦａ値からＣＩ値を決定しＣＩ−Ｆａプロットを構築した。Ｇ２０７およびＭＭＣの相加効果を、ＣＩ＝１で示す（点線）。Ｇ２０７およびＭＭＣ併用療法により、全ての効果レベルでＯＣＵＭ−２ＭＤ３細胞株については中程度の相乗性（Ａ）を示し、ＭＫＮ−４５−Ｐ細胞株については強い相乗性を示す。
【図１０】ＯＣＵＭ−２ＭＤ３細胞株（Ａ）およびＭＫＮ−４５−Ｐ（Ｂ）細胞株の両方におけるＧ２０７とＭＭＣとの併用療法による相乗作用および用量の減少を示すアイソボログラムを示す。９０％の細胞死滅（△）、７０％の細胞死滅（□）、および５０％（○）の細胞死滅を達成するために必要なＭＭＣおよびＧ２０７の用量を、座標軸にプロットし、つないだ実線は、併用療法についての予想される相加効果を示す。下の値を９０％（点を打った△）、７０％（点を打った□）、および５０％（点を打った○）とするための療法の実験用量は、全て対応する線の左下にあることから、相乗作用が示唆される。併用療法を使用した用量減少はまた、両細胞株についての３つのすべてのＦａ値で明らかである。
【図１１】ＭＭＣに曝露したＯＣＵＭ細胞中のＧＡＤＤ３４ ｍＲＮＡレベルを示す実験結果を示す。未処理ＯＣＵＭ細胞から抽出したｍＲＮＡを、ＧＡＤＤ３４の陰性対照として使用し（レーン１）、陽性対照（レーン６）は、２．４ｋｂで強いバンドを示し、ＧＡＤＤ３４ ｍＲＮＡの大きさである。ＯＣＵＭ細胞を、低用量（０．００５μｇ／ｍｌ）または高用量（０．０４μｇ／ｍｌ）のＭＭＣのいずれかで２４時間および４８時間処理した。２４時間後、低用量療法では、ＧＡＤＤ３４ ｍＲＮＡの上方制御は認められなかったが（レーン２）、高用量療法では陰性対照と比較してｍＲＮＡが２．４９倍増加した（レーン３）。４８時間後、低用量療法では、ＧＡＤＤ３４ ｍＲＮＡの存在は示されなかったが（レーン４）、高用量療法では、ｍＲＮＡが３．２１倍増加した（レーン５）。
【図１２】腹腔内化学療法およびウイルス療法は胃癌腫症において組み合わせられた場合、腫瘍死滅を向上させる実験結果を示す。無胸腺症マウスへのＯＣＵＭ−２ＭＤ３細胞の腹腔内注射によって腫瘍負荷を作製し、３日後から治療を開始した。マウスに、媒質（対照）、１×１０６ｐｆｕのＧ２０７、０．１μｇ／ｋｇのＭＭＣ、または両作用因子を組み合わせて腹腔内に注射した。腫瘍細胞接種から４週間後の重量によって腫瘍負荷を評価した。Ｇ２０７療法を対照と比較した場合、腫瘍負荷は有意に減少したが（Ｐ＝０．０２）、ＭＭＣ療法は、この用量で（対照に対して）腫瘍負荷の減少傾向のみを示した（Ｐ＝０．０６）。併用療法により、対照と比較して腫瘍負荷が最も減少し（Ｐ＜０．００１）、Ｇ２０７療法（Ｐ＝０．０３）またはＭＭＣ療法（Ｐ＝０．０１）のみと比較した場合にも有意な減少を示した。両側スチューデントｔ検定を使用して統計分析を行った。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１】
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【図１２】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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