(57)【要約】本発明は、高分子量ポリビニルピロリドンを使用し、したがって、アルブミンの使用を排除することによる液体状態で維持されているワクチン組成物の安定化に関する。本発明は、特に、ポリオに対する経口ワクチンのような弱毒生ウイルスを含むワクチン組成物に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
液体状態のワクチン組成物の安定化方法であって、該ワクチン組成物に高分子量ポリビニルピロリドンを添加することを含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
分子量が１００，０００またはそれ以上であることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３】
ポリビニルピロリドンの濃度が少なくとも０．１％である請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
ポリビニルピロリドンの濃度が５％またはそれ以下であることを特徴とする請求項３記載の方法。
【請求項５】
ワクチン組成物にさらに実質的に１モル濃度の塩化マグネシウムを添加することを含むことを特徴とする請求項１〜４いずれか１項記載の方法。
【請求項６】
ワクチン組成物にさらに０．００７％またはそれ以下の濃度の少なくとも１種類の界面活性剤を添加することを含むことを特徴とする請求項１〜５いずれか１項記載の方法。
【請求項７】
ワクチン組成物に０．００４％の濃度のＰｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ ８０を添加することを含むことを特徴とする請求項６記載の方法。
【請求項８】
ワクチン組成物が弱毒生ウイルスからなる少なくとも１種類の抗原を含むことを特徴とする請求項１〜７いずれか１項記載の方法。
【請求項９】
ワクチン組成物が３種類の血清型のポリオウイルスを含むことを特徴とする請求項８記載の方法。
【請求項１０】
少なくとも１種類のウイルス抗原および少なくとも高分子量のポリビニルピロリドンを含むことを特徴とする経時的に安定な液体ワクチン組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明はワクチンの技術分野に関する。特に、本発明は液体ワクチンの安定化に関する。
【０００２】
ワクチンの技術分野における主な課題の１つは、それらの安定性、すなわち、それらの経時的な効力の保持である。安定性の課題を解決するために提案された解決法の１つは凍結乾燥である。この解決法は技術的な観点からは満足できるものであるにもかかわらず欠点を有している：それは、一方では、製造業者にとっては製造コストおよび製造期間を増大させる付加的工程を課し、他方では、使用者にとっては凍結乾燥品を元に戻すという製品の投与前の操作を含む。
【０００３】
経時的にワクチンの効力を保持するために従来技術において提案されたもう１つの解決法は、一般に、アルブミンを含む安定化処方を使用することである。しかしながら、ヒトまたは動物起源のアルブミンの使用によりもたらされる汚染の危険性および組換えアルブミンの使用に関連する非常に高いコストのために、液体ワクチンを安定化するためのアルブミンの代替品の探索が行われた。
【０００４】
アルブミンの代替品は、他の医薬用途についてはすでに研究されている。米国特許第３９１５７９４号には、細胞からウイルスを抽出する段階および次に起こる凍結乾燥段階の間にアルブミンまたはカゼインのような動物タンパク質の代わりに低分子量ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）を用いることが提案されている。
しかしながら、その機能のいくつかにおいてアルブミンの代わりに用いることができる生成物が必ずしも他の用途に有効であるとは限らず、したがって、それがアルブミンの万能代替品であるとは考えられない。
【０００５】
経時的に液体ワクチンを安定化するための試験が上記米国特許に記載されている低分子量ＰＶＰを用いて行われたが；これらの試験は満足できる結果ではなかった。
【０００６】
したがって、アルブミンを含まず、かつ、液体ワクチン組成物、特に、ウイルスを含む組成物、特に、弱毒生ウイルスを含む組成物を安定化することができる処方物を見出すことが必要とされている。
【０００７】
この目的を達成するために、本発明はワクチン組成物に高分子量ポリビニルピロリドンを添加することを特徴とする液体状態のワクチン組成物を安定化するための方法を提案する。
【０００８】
本発明の主題は、また、少なくとも１種類のウイルス抗原および少なくとも高分子量のポリビニルピロリドンを含むことを特徴とする経時的に安定な液体ワクチン組成物である。
【０００９】
本発明の特定の特徴によると、ＰＶＰの分子量は１００，０００ダルトンまたはそれ以上である。
【００１０】
本発明の別の特徴によると、ＰＶＰは少なくとも０．１重量％の濃度、好ましくは、５％またはそれ以下の濃度で使用される。
【００１１】
本発明の別の特徴によると、当該ワクチン組成物は弱毒生ウイルスを含む。特に、経口投与が意図されている、ポリオに対するワクチン組成物であってよい。
【００１２】
本発明の別の特徴によると、ワクチン組成物は、さらに、塩または糖および少なくとも１種類の界面活性剤を含む。これらの条件下で得られた安定性の結果は、特に満足できるものである。
【００１３】
以下に本発明の他の特徴を詳細に記載する。
【００１４】
経時的安定性が提供されるべきであるワクチン組成物はウイルスからなる少なくとも１種類の抗原を含むワクチン組成物である。かかる組成物の安定性は、種々の規制機関により規定された基準に従って、抗原として使用されるウイルスが細胞に感染する能力を保持していることを意味するワクチン組成物の感染力価の経時的な保持により評価される。
【００１５】
本発明の方法に従って使用することができるワクチン組成物には、弱毒生ウイルスを含むワクチン、特に、ポリオに対するワクチンが挙げられる。これは、単価ワクチン組成物、すなわち、（例えば、ポリオおよびデングの場合のように、それらはいくつかのタイプの同一結合価を含んでよいが）単一の疾患に対して防御することが意図されるワクチン組成物、または少なくとも１つの結合価が上記弱毒生ウイルスからなる多価組成物、すなわち、いくつかの疾患に対して防御することが意図されるワクチンを含み得る。
【００１６】
本発明の方法は、３種類のポリオウイルスを含む弱毒生ウイルスワクチンである、ポリオに対する経口ワクチンを安定化することにおいてその十分な価値を示した。
【００１７】
本発明によると、当該ワクチン組成物は、高分子量ポリビニルピロリドン（またはＰＶＰ）、特に、ＭＷが３６０，０００ダルトンであるＰＶＰ３６０の添加により安定化される。実際、全ての予想に反して、ウイルスを抽出する段階ならびに凍結乾燥段階および凍結乾燥品を貯蔵する段階の間の安定化因子として従来技術に記載されている低分子量ＰＶＰは液体状態のワクチン組成物を満足に安定化することができなかったが、高分子量ＰＶＰは液体ワクチン組成物用の安定化処方物において通常用いられるアルブミンの代わりに非常に有利に用いることができた。得られた結果の良好な質は、ＭＷが３６０，０００であるＰＶＰ Ｋ９０を用いたウイルス懸濁液の安定化が不満足であるという米国特許第３９１５７９４号の教示に相反するので、いっそう予想外のことである。
【００１８】
ＰＶＰは、合成化学物質である；その起源は本発明に関して重要なことではないが、ただし、それは医薬上許容される質を有するものである。シグマ（ＳＩＧＭＡ）により提供されるＰＶＰ３６０は本発明に従って使用するのに申し分なく好適である。
【００１９】
ＰＶＰの濃度は、少なくとも０．１重量／容量％である。しかしながら、媒質の粘性に関連する問題がないようにするために、５％の濃度を超えないことが望ましい。１％の濃度で良好な結果が得られた。
【００２０】
有利には、本発明のワクチン組成物は、また、ある量の、ポリエチレングリコール（またはＰＥＧ）のような界面活性剤を含む。また、ＴｗｅｅｎＴＭ ８０またはＰｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ ８０を使用することもできる。使用される界面活性剤の量は、好ましくは、０．００７重量／容量％未満の量である。０．００４％の量のＴｗｅｅｎＴＭ ８０から特に良好な結果が得られた。
【００２１】
本発明の１つの特徴によると、当該ワクチン組成物は、さらに、実質的に１モル濃度の塩化マグネシウムＭｇＣｌ２のような塩を含む；ワクチン組成物は、また、約２０％から約４０％に及ぶ濃度のグルコースおよびスクロースのような糖を含んでもよい；しかしながら、これらの糖の存在は安定化効果に重要ではない。
【００２２】
当該ワクチン組成物は、また、保存剤および／またはアジュバントのようなワクチンにおいて通常使用されるいずれもの他の成分を含んでもよい。特に、約２０ｍＭの濃度のＨｅｐｅｓバッファーのような緩衝物質を含むことができる。
【００２３】
以下の実施例は、本発明の特定の実施態様を例示する。
【００２４】
実施例１
３種類のポリオのウイルス懸濁液を以下の方法で生産する：
Ｐａｒｋｅｒ １９９培地中、１４２継代目のＶｅｒｏ細胞を含有するバイオジェネレーターにポリオウイルスの１種類を接種する。約３４℃の温度でウイルス培養を行う。細胞溶解が完了する９６時間を超えない期間の後、上清を回収することによりウイルスの収集を行う。収集物を１００，０００のカットオフを有する膜にて濾過し、次いで、予め４０ｍＭリン酸緩衝液にてｐＨ７に平衡化したＤＥＡＥ Ｓｐｈｅｒｏｄｅｘカラムに通すことにより精製する。これらの条件下にて、不純物はカラムに保持されるが、ウイルスは該カラムを自由に通過する。
カラムを通過したウイルス懸濁液を１０，０００のカットオフを有する膜にて濾過し、次いで、ショ糖密度勾配でのゾーン超遠心分離に付す；目的のフラクションは４５〜５５％のショ糖に存在するものである。
かくして、ポリオウイルスの所定の種類（Ｉ、ＩＩまたはＩＩＩ）の単価懸濁液が得られる。
【００２５】
実施例２
１００ｍｌの容量で各株について６．３ ｌｏｇ１０ＣＣＩＤ５０／用量の力価を得ることを可能にする量で
Ｉ型ウイルス懸濁液、
ＩＩ型ウイルス懸濁液
ＩＩＩ型ウイルス懸濁液
を混合することにより、実施例１において調製した単価組成物からワクチン組成物を調製し、それに以下の混合物の１つを添加して安定性を試験するのが望まれる組成物を得る：
１％アルブミン、１Ｍ ＭｇＣｌ２、２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓバッファー、０．００２％ＴｗｅｅｎＴＭ ８０、
ＰＶＰ３６０、１Ｍ ＭｇＣｌ２、２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓバッファー、
種々の濃度のＰＶＰ３６０、１Ｍ ＭｇＣｌ２、２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓバッファー、および種々の濃度のＴｗｅｅｎＴＭ ８０、
種々の濃度のＰＶＰ３６０、２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓバッファー、０．００２％ＴｗｅｅｎＴＭ ８０および種々の濃度の糖（グルコースおよびスクロース）、
種々の濃度のＰＶＰ１０、１Ｍ ＭｇＣｌ２、２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓバッファー、および０．００２％ＴｗｅｅｎＴＭ ８０、または
種々の濃度のＰＶＰ４０、１Ｍ ＭｇＣｌ２、２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓバッファー、および０．００２％ＴｗｅｅｎＴＭ ８０。
種々の組成物を、３７℃で５日間、すなわち、得られた組成物の安定性を評価することができる促進老化条件である条件下にて維持する。
【００２６】
実施例３
経時的な感染力価の低下を評価することにより、調製したウイルス組成物の安定性を評価する。感染力価の測定は以下の方法で行われるＣＣＩＤ５０技法により行われる：
力価測定は９６ウェルマイクロプレートにて行われる。
試料を、ポリオに対する抗体を含有しないウシ胎仔血清２％（容量／容量）、フェノールレッドを含まない５．６％（容量／容量）重炭酸ナトリウム４％（容量／容量）、およびペニシリン−ジドロマイシン（ｄｉｄｒｏｍｙｃｉｎ）抗生物質４００×Ｃの溶液０．２％（容量／容量）を含有するＭＥＭ培地１×Ｃにて−１〜−６または−７（ｌｏｇ１０として）に希釈する。各希釈液について、５０μｌを１０ウェルの４列に分配する：
１列目では、希釈培地５０μｌを添加し（全体的な力価）、
２列目では、ＭＥＭ培地にて希釈された抗ポリオ２型抗血清＋抗ポリオ３型抗血清を５０μｌ添加して、ワクチン組成物に含有される２型および３型ポリオウイルスを中和し（Ｉ型の力価測定）、
３列目では、ＭＥＭ培地にて希釈された抗ポリオ１型抗血清＋抗ポリオ３型抗血清を５０μｌ添加して、ワクチン組成物に含有される１型および３型ポリオウイルスを中和し（ＩＩ型の力価測定）、
４列目では、ＭＥＭ培地にて希釈された抗ポリオ１型抗血清＋抗ポリオ２型抗血清を５０μｌ添加して、ワクチン組成物に含有される１型および２型ポリオウイルスを中和する（ＩＩ型の力価測定）。
【００２７】
各プレートの最後の行の８ウェルを対照細胞として供する：１ウェルあたりＭＥＭ培地１００μｌを添加する。
プレートにカバーをかける；それらを横向きに振盪し、培地を３７℃で１時間接触させる。
この接触時間の後、各ウェルにＨｅｐＩＩ細胞懸濁液１００μｌを５０，０００細胞／ｍｌで添加する。該プレートを３６℃のインキュベーター中に９日間置く。
細胞懸濁液を調製するために、以下の方法を行う：トリプシンの作用により細胞を分離し、計数し、細胞懸濁液を希釈して５０，０００細胞／ｍｌの濃度を得る。
【００２８】
対照細胞の完全性をチェックした後、各ウェルにて病原性効果を記録する。
該データを陽性ウェルの割合の根を逆正弦転換した後、種々の希釈液についての直線回帰を使用して力価の算出を行う。
Ｔ０および３７℃で５日後、調製した各ウイルス組成物についてアッセイを行う。Ｔ０での力価と３７℃で５日間の促進老化後の力価との差異として表される得られた結果を下記表にまとめる；それらは、従来技術のワクチン組成物、すなわち、１％アルブミンで安定化されたワクチン組成物について得られたものと実質的に同等であるかまたはそれよりも低い場合に満足できるものであるとみなされる。
【００２９】
【表１】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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