(57)【要約】本願発明は細胞死をin vivoにおいて画像化する方法および組成物、ならびに腫瘍の放射線療法の方法および組成物を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
造影剤に結合させたアネキシンを含む磁気共鳴画像法の組成物。
【請求項２】
請求項１に記載の組成物であって、当該組成物において前記造影剤が常磁性物質である、組成物。
【請求項３】
請求項２に記載の組成物であって、当該組成物において前記造影剤がガドリニウム-キレート基錯体である、組成物。
【請求項４】
請求項３に記載の組成物であって、当該組成物において前記造影剤がガドリニウム-ジエチレントリアミンペンタ酢酸である、組成物。
【請求項５】
請求項１に記載の組成物であって、当該組成物において前記造影剤が超常磁性物質である、組成物。
【請求項６】
請求項５に記載の組成物であって、当該組成物において前記造影剤が酸化金属である、組成物。
【請求項７】
請求項６に記載の組成物であって、当該組成物において前記造影剤が酸化金属である、組成物。
【請求項８】
請求項６に記載の組成物であって、当該組成物において前記造影剤がポリマーでコーティングされた酸化金属である、組成物。
【請求項９】
請求項８に記載の組成物であって、当該組成物において前記造影剤がデキストランでコーティングされた酸化鉄である、組成物。
【請求項１０】
請求項１に記載の組成物であって、当該組成物において前記アネキシンはアネキシンVである、組成物。
【請求項１１】
造影剤および放射性同位体に結合させたアネキシンを含む組成物。
【請求項１２】
請求項１１に記載の組成物であって、当該組成物において前記放射性同位体が治療用の放射性同位体である、組成物。
【請求項１３】
請求項１２に記載の組成物であって、当該組成物において前記の治療用の放射性同位体が103 Pd、 186Re、188 Re、90Y、153Sm、159Gd、および166Hoからなるグループから選択される、組成物。
【請求項１４】
請求項１１に記載の組成物であって、当該組成物において前記アネキシンがアネキシンVである、組成物。
【請求項１５】
請求項１１に記載の組成物であって、当該組成物において前記造影剤がポリマーでコーティングされた酸化金属である、組成物。
【請求項１６】
哺乳類対象のin vivoにおいて細胞死を画像化する方法であって、
造影剤に結合させたアネキシンを含む磁気共鳴画像法用の組成物を前記対象に投与するステップと、
磁気共鳴画像であって、当該画像が前記哺乳類対象における細胞死を表す画像を得るステップと、
からなる方法。
【請求項１７】
請求項１６に記載の方法であって、当該方法において前記磁気共鳴画像が、前記磁気共鳴画像用組成物の投与後、約5分乃至約2時間の間に得られる、方法。
【請求項１８】
請求項１６に記載の方法であって、当該方法において前記磁気共鳴画像が、前記磁気共鳴画像用組成物の投与後、約12乃30時間の間に得られる、方法。
【請求項１９】
請求項１６に記載の方法であって、当該方法において前記細胞死がアポトーシスによって引き起こされる、方法。
【請求項２０】
請求項１６に記載の方法であって、複数の時点において磁気共鳴画像を得ることによって細胞死を迎えている細胞の数の変化を監視するステップをさらに含む、方法。
【請求項２１】
請求項１６に記載の方法であって、複数の時点において磁気共鳴画像を得ることによって細胞死を迎えている細胞の位置の変化を監視するステップをさらに含む、方法。
【請求項２２】
請求項１６に記載の方法であって、当該方法において前記の磁気共鳴画像法用の組成物をタンパク質1乃至500μg/kgの濃度で投与する、方法。
【請求項２３】
請求項１６に記載の方法であって、当該方法において前記の磁気共鳴画像法用の組成物をタンパク質1乃至400μg/kgの濃度で投与する、方法。
【請求項２４】
請求項１６に記載の方法であって、当該方法において前記の磁気共鳴画像法用の組成物をタンパク質1乃至200μg/kgの濃度で投与する、方法。
【請求項２５】
請求項１６に記載の方法であって、当該方法において前記の磁気共鳴画像法用の組成物を静脈内に投与する方法。
【請求項２６】
請求項１６に記載の方法であって、当該方法において前記の磁気共鳴画像法用の組成物が、腹腔内、鞘内、胸腔内、リンパ管内、および筋肉内からなるグループから選択される方法によって投与される、方法。
【請求項２７】
請求項１６に記載の方法であって、当該方法において細胞死が対象の器官の中、またはその部分で画像化される、方法。
【請求項２８】
請求項１６に記載の方法であって、当該方法において細胞死が対象の脳の中、またはその部分で画像化される、方法。
【請求項２９】
請求項１６に記載の方法であって、当該方法において細胞死が対象の心臓の中、またはその部分で画像化される、方法。
【請求項３０】
請求項１６に記載の方法であって、当該方法において細胞死が対象の肝臓の中、またはその部分で画像化される、方法。
【請求項３１】
光学的に活性な分子に結合させたアネキシンを含む、光学的画像法用の組成物。
【請求項３２】
請求項３１に記載の組成物であって、当該方法において前記の光学的に活性な分子が蛍光色素である、組成物。
【請求項３３】
請求項３２に記載の組成物であって、当該方法において前記蛍光色素がフルオレセインである、組成物。
【請求項３４】
請求項３１に記載の組成物であって、当該方法において前記の光学的に活性な分子が発光分子である、組成物。
【請求項３５】
請求項３４に記載の組成物であって、当該方法において前記発光分子がルミノールである、組成物。
【請求項３６】
請求項３１に記載の組成物であって、当該組成物において前記の光学的に活性な分子が生物発光分子である、組成物。
【請求項３７】
請求項３６に記載の組成物であって、当該組成物において前記生物発光分子が、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、およびエクオリンからなるグループから選択される、組成物。
【請求項３８】
請求項３１に記載の組成物であって、前記組成物において前記アネキシンがアネキシンVである、組成物。
【請求項３９】
哺乳類対象のin vivoにおいて細胞死を画像化する方法であって、
光学的に活性な分子と結合させたアネキシンを含む光学的画像法用の組成物を前記対象に投与するステップと、
前記対象を光源で照射するステップと、
前記対象における前記光学的画像法用の組成物の存在を視覚的に監視することによって、画像を得るステップであって、当該画像が前記哺乳類対象における細胞死を表す画像である、ステップと、
を含む、方法。
【請求項４０】
請求項３９に記載の方法であって、当該方法において前記画像が、前記光学的画像法の組成物の投与後、約5分乃至約2時間の間に得られる、方法。
【請求項４１】
請求項３９に記載の方法であって、当該方法において前記画像が、前記光学的画像法の組成物の投与後、約12乃至30時間の間に得られる、方法。
【請求項４２】
請求項３９に記載の方法であって、当該方法において前記細胞死がアポトーシスによって引き起こされる、方法。
【請求項４３】
請求項３９に記載の方法であって、複数の時点において画像を得ることによって細胞死を迎えている細胞の数の変化を監視するステップをさらに含む、方法。
【請求項４４】
請求項３９に記載の方法であって、複数の時点において画像を得ることによって細胞死を迎えている細胞の位置の変化を監視するステップをさらに含む、方法。
【請求項４５】
請求項３９に記載の方法であって、当該方法において前記光学的画像法用の組成物をタンパク質1乃至500μg/kgの濃度で投与する、方法。
【請求項４６】
請求項３９に記載の方法であって、当該方法において前記光学的画像法用の組成物をタンパク質1乃至400μg/kgの濃度で投与する、方法。
【請求項４７】
請求項３９に記載の方法であって、当該方法において前記光学的画像法用の組成物をタンパク質1乃至200μg/kgの濃度で投与する、方法。
【請求項４８】
請求項３９に記載の方法であって、当該方法において前記の磁気共鳴画像法の組成物が、腹腔内、鞘内、胸腔内、リンパ管内、および筋肉内からなるグループから選択される方法によって投与される、方法。
【請求項４９】
請求項３９に記載の方法であって、当該方法において細胞死が対象の器官の中、またはその部分で画像化される、方法。
【請求項５０】
請求項３９に記載の方法であって、当該方法において細胞死が対象の頭部の中、またはその部分で画像化される、方法。
【請求項５１】
請求項３９に記載の方法であって、当該方法において細胞死が対象の心臓の中、またはその部分で画像化される、方法。
【請求項５２】
請求項３９に記載の方法であって、当該方法において細胞死が対象の肝臓の中、またはその部分で画像化される、方法。
【請求項５３】
請求項３９に記載の方法であって、当該方法において細胞死が対象の眼の中、またはその部分で画像化される、方法。
【請求項５４】
腫瘍の放射線療法の方法であって、
腫瘍を有する対象に光学的に活性な分子に結合させたアネキシンを含む光学的画像法用の組成物を投与するステップと、
酸素の存在下において光源で前記対象を照射することによって、腫瘍を破壊する能力がある有毒な形態の酸素を生じさせるステップと、
を含む、方法。
【請求項５５】
請求項５４に記載の方法であって、当該方法において前記の光学的に活性な分子が、PHOTOFRIN（登録商標）、ルトリン、ANTRIN（登録商標）、FOSCAN（登録商標）、アミノレブリン酸、フタロシアニンテトラスルホン酸アルミニウム（III）、ハイペリシン、ベルテポルフィン、およびメチレンブルー色素からなるグループから選択される、方法。
【請求項５６】
請求項５４に記載の方法であって、当該方法において前記の有毒な形態の酸素が一重項酸素である、方法。
【請求項５７】
請求項５４に記載の方法であって、当該方法において前記腫瘍が脳腫瘍、頭部腫瘍、頸部腫瘍、乳腫瘍、食道腫瘍、肺腫瘍、胸腔部腫瘍、卵巣腫瘍、腹腔部腫瘍、膀胱腫瘍、前立腺腫瘍、子宮頸部腫瘍、および皮膚腫瘍からなるグループから選択される、方法。
【発明の詳細な説明】
【関連出願】
【０００１】
本出願は、引用をもって内容全体を本出願に援用するものとする2001年4月3日に出願された米国特許仮出願第60/281,277号の優先権を主張する。
【０００２】
発明の背景
アポトーシスと壊死
アポトーシスとは、細胞が「細胞の自殺」プログラムを実行する「プログラムされた細胞死」を意味する。アポトーシスプログラムは、実質的にすべての多細胞生物および特定の生物のすべての細胞に、進化の過程を通して保存されていると考えられている。さらに、多くの場合、アポトーシスは、健全に生き延びている細胞において積極的に阻害されなければならない「デフォルト」のプログラムであるとも考えられている。
【０００３】
細胞がアポトーシスに従うと決定するには、さまざまな調節刺激および環境因子が影響すると考えられる（Tompson, 1995）。アポトーシスの生理学的なアクチベータには、腫瘍壊死因子（TNF）、Fasリガンド、トランスフォーミング成長因子β、神経伝達物質グルタミン酸塩、ドーパミン、N-メチル-D-アスパル酸塩、成長因子の消退、基質結合の消失、カルシウムおよびグルココルチコイドが含まれる。アポトーシスの損傷に関連する誘導因子には、熱ショック、ウイルス感染、細菌毒素、発癌性myc、relおよびE1A、腫瘍抑制因子p53、細胞溶解性T細胞、酸化物質、フリーラジカル、および栄養欠損（代謝拮抗物質）が含まれる。治療に関連するアポトーシス誘導因子には、ガンマ線、紫外線、ならびにシスプラチン、ドキソルビシン、ブレオマイシン、シトシンアラビノシド、窒素マスタード、メトトレキセート、およびビンクリスチンを含むさまざまな化学療法薬が含まれる。毒素に関連する誘導因子またはアポトーシスには、エタノールおよびd-アミロイドペプチドが含まれる。
【０００４】
アポトーシスは、ニューロンなどの通常は再生しない細胞中に病理学的に生じる場合、特に壊滅的な結果をもたらすことがある。このような細胞は死滅すると置換されないために、罹患した器官を衰弱させ、時に致命的な機能不全を引き起こすこともある。このような機能不全は、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、網膜色素変性症、および小脳変性症を含む、大量のアポトーシスに伴う数々の神経変性疾患に明らかである。
【０００５】
望ましくないアポトーシスがもたらす結果は、心筋梗塞、再灌流障害、および脳卒中などの場合に典型的に生じる虚血性障害を含むそのほかの病変にも同様に壊滅的である可能性がある。特に、アポトーシスは、軽度の病巣虚血後、長時間経過してから生じる梗塞の中心的な役割を果たしていると考えられている（Du, et al. 1996）。大量のアポトーシスに随伴するさらなる疾患には、AIDS、再生不良性貧血などの骨髄異形成症候群、および過剰なアルコール摂取に起因する損傷を含む肝疾患を引き起こす毒素が、それらに限定されずに含まれる。
【０００６】
壊死は、アポトーシス以外（つまり細胞に固有の自殺プログラムの実行以外）の原因による細胞または組織の局所的な死滅である。壊死は外傷性損傷、細菌感染、および急性低酸素症などによって生じることがある。これら2種類の細胞死にはいくらかの重複があり、損傷の重症度によって、いくらかの刺激が壊死もしくはアポトーシスのいずれか、または部分的に両方ともを生じることがある。
【０００７】
生物学的な膜の非対称性
一般に、生物学的な膜は特異的膜リン脂質に関して非対称であると考えられている。特に、真核細胞の細胞膜の外層は主にスフィンゴミエリンおよびホスファチジルコリン（PC）などのコリンリン脂質で形成されているが、内層は主にホスファチジルセリン（PS）およびホスファチジルエタノールアミン（PE）などのアミノリン脂質で形成されている。この非対称性は、二重の層の間をPEとPSを選択的に輸送するアデノシン３リン酸（ATP）依存性アミノリン脂質トランスロカーゼの活性によって維持されていると考えられている（Seigneuret and Devaux, 1984）。層間のリン脂質の輸送に関与すると考えられているそのほかの酵素には、ATP依存性フロッパーゼ（Connor, et al., 1992）および脂質スクランブラーゼ（Zwaal, et al., 1993）が含まれる。
【０００８】
正常な細胞にとっては非対称性が標準のようであるが、このような非対称性の消失はいくつかの生理学的および病理学的なプロセスに関連する。たとえば、細胞膜の外層上へのPSの出現（「PS露出」）として検出される膜の非対称性は、DNAの断片化、細胞膜の水疱化、および膜の統合性の消失に先立つ、アポトーシスの最も初期の徴候の１つであると認識されている(Martin, et al., 1995; Fadok, et al., 1992)。
【０００９】
同様の再配向は、鎌形赤血球病(Lane, et al., 1994)、「B-サラセミア」(Borenstain-Ben Yashar, et al., 1993)、血小板活性化、およびPS輸送に障害があるいくつかの突然変異腫瘍細胞株に認められる。外層へのPSの漸次的な出現も、老化した赤血球に生じることが認められている(Tait and Gibson, 1994)。このような細胞上へのPSの露出が閾値に達すると、その細胞はマクロファージによって循環から除外される(Pak and Fidler, 1991)。上述の症状すべてにおいて、大半が罹患細胞（すなわち顕著なPS露出を伴う細胞）の死滅に終わる。
【００１０】
PS露出はアポトーシスおよび壊死の両方の構成要素であると理解されよう。アポトーシスの初期段階でのその役割は上に要約されている。アポトーシス細胞がアポトーシスの最終段階に達すれば、細胞膜の両層の中にあるPSが細胞外環境に「露出」されるものと理解されよう。壊死による細胞死にも同様の状況が存在し、その場合には膜の統合性の消失は、壊死細胞の死滅プロセスの開始要因となるか、または壊死細胞の死滅プロセスの初期に生じる。したがって、このような壊死細胞も、原形質膜の両方の小葉が「露出」しているため、「露出した」PSを有する。
【００１１】
アネキシン
アネキシンVは、通常、胎座、リンパ球、単球、胆管および腎尿細管（皮層）上皮を含む、多数の細胞の細胞質に大量に認められる。アネキシンの生理学的な機能は完全に解明されているわけではないが、アネキシンのいくつかの特性のために、アネキシンは診断および／または治療物質として有用である。特に、アネキシンは、ホスファチジルセリン（PS）が露出した表面を有する膜層など、アニオン性のリン脂質の表面に非常に高い親和性があることが明らかになっている。
【００１２】
発明の概要
本願発明はin vivoにおける細胞死の画像化のための方法および組成物、ならびに腫瘍の放射線療法および光線療法のための方法および組成物を提供する。本願発明は、アネキシンと造影剤を組み合わせると、磁気共鳴画像法を用いて細胞死を迎えている細胞を効率的および効果的に検出することが可能になるという発見に少なくとも部分的に基づいている。本願発明はまた、アネキシンと蛍光色素のような光学的に活性な分子を組み合わせると、光学的画像法によって細胞死を迎えている細胞を効率的および効果的に検出することが可能になるという発見に部分的に基づいている。最後に、本願発明は、化学療法剤で処理されている腫瘍を有する対象に、治療用放射性同位体と結合させたアネキシンを含む組成物を投与すると、アネキシン-治療用放射性同位体組成物による腫瘍部位への放射線の特異的および促進された輸送を可能にするという発見に少なくとも部分的に基づいている。
【００１３】
したがって、本願発明は、常磁性物質（たとえばガドリニウム-ジエチレントリアミン5酢酸などのガドリニウムキレート基錯体もしくはランタンキレート基錯体）、または超常磁性物質（たとえば酸化Fe、Co、Ni、Cu、Zn、As、Se、Mo、Tc、Ru、Rh、Pd、Ag、Cd、In、Sn、Re、Os、Ir、Pt、Au、Hg、Tl、Pb、Bi、Po、または Atなどの酸化金属）などの造影剤に結合させたたとえばアネキシンVなどのアネキシンを含む、磁気共鳴画像法の組成物を提供する。酸化金属は、好ましくは、たとえばデキストランまたはその変種などのポリマーでコーティングされている。アネキシンは、造影剤と直接的または間接的に結合していてよい。
【００１４】
別の局面では、本願発明は、ポリマーでコーティングされた酸化金属などの造影剤、およびたとえば診断用または治療用の放射性同位体などの放射性同位体を含む組成物を提供する。このような組成物は、MRIおよび核医療画像法の両方に好適である。たとえば、その組成物は造影剤および放射性同位体に結合させたアネキシンV（ヒドラジノニコチンアミド（HYNIC）でアネキシンと結合させる）を含んでもよい。ある実施態様では、前記アネキシンは望ましい経路によって排出または代謝される担体と結合させてもよい。このような担体の例には、デキストラン粒子またはコロイド状粒子または超常磁性酸化鉄粒子などの酸化金属粒子（一般に肝臓で貪食される）が、これらに限定されずに含まれる。
【００１５】
別の局面では、本願発明は、たとえば哺乳類対象の器官もしくはその部分（たとえば脳、心、肝、肺、膵、結腸など）、または哺乳類対象の腺もしくはその部分（たとえば前立腺または乳腺）など、哺乳類対象における、たとえばアポトーシスによって引き起こされた細胞死などの細胞死のin vivo画像化の方法を提供する。前記方法には、造影剤に結合させたアネキシンを含む磁気共鳴画像法用の組成物を対象に投与するステップ、磁気共鳴画像を入手するステップであって、当該画像が哺乳類対象における細胞死を表す画像であるステップが含まれる。ある実施態様では、前記磁気共鳴画像を、対象に磁気共鳴画像法用の組成物を投与してから5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、または120分後に得る。別の実施態様では、前記磁気共鳴画像を、対象に磁気共鳴画像法用の組成物を投与してから約12乃至30、15乃至25、20乃至25、または20乃至30時間後に得る。上述の値の中間にある範囲も本願発明の部分であることを意図する。たとえば、任意の上述の値を上限および／または下限として組み合わせた範囲も含まれることが意図される。好ましい実施例では、磁気共鳴画像を複数の時間点において入手し、細胞死を迎えている細胞の数の変化を監視するか、または細胞死を迎えている細胞の位置の変化を監視する。
【００１６】
前記の磁気共鳴画像法用の組成物は、タンパク質1乃至1000 μg/kg、タンパク質1乃至900 μg /kg、タンパク質1乃至800 μg /kg、タンパク質1乃至700 μg /kg、タンパク質1乃至600 μg /kg、タンパク質1乃至500 μg /kg、タンパク質1乃至400 μg /kg、タンパク質1乃至300 μg /kg、タンパク質1乃至200 μg /kg、タンパク質1乃至100 μg /kg、タンパク質1乃至50 μg /kg、またはタンパク質1乃至20 μg /kgの濃度で投与してよい。別の実施態様では、前記の磁気共鳴画像法用の組成物は静脈内、腹腔内、鞘内、胸腔内、リンパ腺内、または筋肉内に投与する。
【００１７】
さらなる局面では、本願発明は、内視鏡検査、気管支鏡検査、腹腔鏡検査、直接可視化、外科的顕微鏡検査、および検影法などの光学的評価の間に可視化することができる、フルオレセインなどの蛍光色素など、生物学的に適合であり光学的に活性な分子に結合させた、たとえばアネキシンVなどのアネキシンを含む、光学画像法用の組成物を提供する。さらに、光学的に活性な分子を適切に選択することによって、アネキシンと光学的に活性な分子の組み合わせは、主要または補助療法の様相として用いられることがある癌および黄斑変性症などそのほかの疾患の治療への新規のアプローチである光学力学療法（PDT）に有用であると考えられる。本願発明では、PDTは、光感受性がある薬物と結合させたアネキシン分子を酸素の存在下において特定の波長の光で照射することによって作用する。この反応が起きる場合、通常無害である光感受性分子が、「一重項酸素」として知られる酸素の活性種によって細胞傷害性を持つようになる。腫瘍細胞のアポトーシス部位に局在化するというアネキシンの能力によって、腫瘍細胞のアポトーシスまたは壊死を引き起こす抗癌剤と組み合わせると、アネキシンは理想的な薬物になる。腫瘍細胞のアポトーシスまたは壊死を誘導した後にアネキシン-光感受性薬物を一時的に導入すると、アネキシン-光感受性分子の組み合わせを腫瘍部位に区別的に局在化させる環境を作り出し、好適な光照射を用いることによってさらなる腫瘍細胞の死滅の機会を提供する。典型的に、レーザーエネルギーをたとえば癌組織などの病変組織に直接的にまたは光ファイバー装置で送達すると、前記薬物を化学的に活性化させて、有毒な形態の酸素を生じ、健康な細胞への損傷を最小に抑えて癌細胞を破壊する。アネキシンに結合させた場合にPDTに用いることができる光学的に活性な物質の例には、PHOTOFRIN（登録商標）、ルトリン、ANTRIN（登録商標）、FOSCAN（登録商標）、アミノレブリン酸、テトラスルホン酸フタロシアニンアルミニウム(III)、ハイペリシン、ベルテポルフィン、およびメチレンブルー色素が含まれる。考えられるPDTの標的の中には、脳、頭頸部、胸部、食道、肺、胸膜、子宮、腹腔、膀胱、前立腺、子宮頸管、皮膚、腹膜腔、眼、および気道系の腫瘍がある。
【００１８】
さらに別の局面では、本願発明は、対象に光学的に活性な分子に結合させたアネキシンを含む光学画像法の組成物を投与するステップと、前記対象を光源で照射するステップと、前記対象における光学画像法の組成物を視覚的に監視することによって画像を入手するステップであって当該画像が哺乳類対象における細胞死を表すステップによって、in vivoにおいて哺乳類対象の細胞死を画像化する方法を提供する。
【００１９】
別の態様では、本願発明は、たとえば103 Pd、186Re、188 Re、90Y、153Sm、159Gd、または166Hoなどの治療用の放射性同位体と結合させた、たとえばアネキシンVなどのアネキシンを含む組成物を提供する。治療用の放射性同位体および前記アネキシンは、1:1、1.1:1、1.2:1、1.3:1、1.4:1、1.5:1、1.6:1、1.7:1、1.8:1、1.9:1、または2:1の割合（治療用の放射性同位体：アネキシン）で結合させてよい。任意の上述の値を上限および／または下限として組み合わせて用いる値の範囲も本願発明に含まれることを意図する。
【００２０】
さらなる局面では、本願発明は、腫瘍を有する哺乳類対象に治療用の放射性同位体に結合させたアネキシンを含む組成物を腫瘍を減少させるのに効果的な量投与することによる腫瘍の放射線療法の方法を提供する。前記の方法は、全身照射、または標的化外部照射、および／または少なくとも１種類の化学療法剤（たとえばジメチルビスルファン、シクロホスファミド、ビスクロロエチルニトロソウレア、シトシンアラビノシド、または6-チオグアニン）を用いた治療法と組み合わせて用いてもよい。さらに、本願方法は生物学的に活性な抗癌剤およびTNF、TRAIL、もしくはFasなどのアポトーシス誘導物質、またはこの受容体に結合してアポトーシスを誘導する抗体、小分子、もしくはファルマコフォアとともに用いてもよい。
【００２１】
別の局面では、本願発明は、腫瘍を有する対象を化学療法剤で処理するステップと、それに続いて治療用の放射性同位体に結合させたアネキシンを含む組成物を腫瘍を減少させるのに効果的な量投与するステップを含む、腫瘍の放射線療法の方法を特徴とする。
【００２２】
治療用の物質と結合させたアネキシンの投与のタイミングは、治療介入の有効性を左右する。修飾したアネキシンは、標的組織のアポトーシスまたは壊死の時点でのバイオアベイラビリティを確保できる時点に投与されるべきである。放射標識したアネキシンVを用いた診断用の画像化研究によると、治療用に修飾したアネキシンの投与は、損傷を受けた腫瘍におけるアネキシンの局在化の有用度を最適にするために、好ましくは複数の代謝拮抗薬（いわゆるCHOPまたはMOPP療法）を用いたリンパ腫の化学療法の経過が完了してから24時間以内に行うべきであるということを示唆している。投与に最適な時間は、患者における画像化研究によって示されたとおり、乳癌、肺癌、または肉腫などの充実性腫瘍の化学療法による治療から72時間以内であってよい。アポトーシスの程度を決定するための放射標識されたアネキシンなどの診断用の画像化剤の使用は、治療用に修飾されたアネキシンの投与に適格な患者の選定、および治療用に修飾されたアネキシンの最適な投与量を決定するために用いてよい。
【００２３】
本願発明のそのほかの特性および利点は、以下の発明の詳細な説明および特許請求の範囲から明らかになるであろう。
【００２４】
発明の詳細な説明
本願発明はin vivoにおける細胞死の画像化のための方法および組成物、ならびに腫瘍の放射線療法のための方法および組成物を提供する。本願発明は、アネキシンと造影剤を組み合わせると、磁気共鳴画像法を用いて細胞死を迎えている細胞を効率的および効果的に検出することが可能になるという発見に少なくとも部分的に基づいている。本願発明はまた、アネキシンと蛍光色素のような光学的に活性な分子を組み合わせると、光学的画像法によって細胞死を迎えている細胞を効率的および効果的に検出することが可能になるという発見に部分的に基づいている。
【００２５】
最後に、本願発明は、化学療法剤で処理されている腫瘍を有する対象に、治療用放射性同位体と結合させたアネキシンを含む組成物を投与すると、アネキシン-治療用放射性同位体組成物による腫瘍部位への放射線の特異的および促進された輸送を可能にするという発見に少なくとも部分的に基づいている。機序によって制限されることを意図することなく、化学療法剤の投与が腫瘍部位のアポトーシスまたは壊死を引き起こし、その結果、アネキシン-治療用放射性同位体複合体によって前記腫瘍部位を特異的に狙うことが可能となり、および放射線を送達してアネキシンが結合する細胞とともに近隣の細胞を死滅させることができると考えられている。
【００２６】
したがって、本願発明は造影剤に結合させた（直接的または間接的のいずれか）、たとえばアネキシンVなどのアネキシンを含む磁気共鳴画像法用組成物を提供する。
【００２７】
本願明細書で用いられる「造影剤」には、生理学的に許容されるものであって、磁気共鳴画像法のためのコントラストの促進を提供できる、任意の物質が含まれることを意図する。造影剤は、典型的には、磁場に対する組織の応答を変化させることが可能である。造影剤には、たとえばガドリニウム-ジエチレントリアミン5酢酸などのガドリニウムキレート基錯体もしくはマンガンキレート基錯体などの常磁性物質、または酸化鉄などの生物学的に適合な超常磁性物質が含まれる。米国特許第4,687,658号、米国特許第5,314,680号、および米国特許第4,976,950号などに記載の造影剤が、本願発明の組成物を調製するために用いられることが意図される。造影剤は市販されている（たとえばガドリニウムキレートProhanceTMはSquibb社から入手でき、ガドリニウムキレートDotaremTMはGuerbet社から入手できる）。
【００２８】
好適な造影剤は、好ましくは、たとえば無毒で、化学的に安定で、体に吸収されないかまたは組織と反応せず、短時間で体内から排出されるなど、生体適合性がなければならない。ある実施態様では、前記造影剤は望ましい経路によって排出または代謝される担体と結合していてよい。このような担体の例には、デキストラン粒子、またはコロイド状粒子（典型的に肝臓で貪食される）が、それらに限定されずに含まれる。
【００２９】
別の局面では、本願発明は、哺乳類対象における、たとえばアポトーシスによって引き起こされる細胞死などの細胞死のin vivo画像化の方法を提供する。前記方法には、造影剤に結合させたアネキシンを含む磁気共鳴画像化用の組成物を対象に投与するステップと、磁気共鳴画像を入手し当該画像が哺乳類対象の細胞死を表す画像であるステップが含まれる。
【００３０】
本願明細書に用いられる「細胞死」という用語には、哺乳類細胞を死滅させるプロセスが含まれる。このようなプロセスには、アポトーシス（可逆的および非可逆的の両方）およびアポトーシスに関与すると考えられるプロセス（たとえば細胞の老化）、ならびに壊死が含まれる。本願明細書で用いられる「細胞死」は、有核細胞（たとえばニューロン、心筋細胞、および肝細胞など）の死または切迫した死、または無核細胞（たとえば赤血球、および血小板など）の死または切迫した死を意味する。典型的には、細胞膜の外層上にPSが露出することで細胞死が明らかとなる。
【００３１】
本願明細書に記載の「対象」には、温血動物であって、好ましくはヒトを含む哺乳類が含まれる。好ましい実施態様では、前記対象は霊長類である。さらに好ましい実施態様では、前記対象はヒトである。細胞死は、たとえば対象の器官（たとえば脳、心、肝、肺、膵、大腸）またはその部分もしくは検体、または対象の腺（たとえば前立腺、下垂体、または乳腺）もしくはその部分において、画像化または検出されることがある。たとえば、細胞死は、アネキシンを対象に投与した後で、外科的または針生検を用いるか、または対象の血管内で放射線を検出することができるカテーテルを使用することによって、画像化または検出してよい。
【００３２】
本願明細書に用いられる対象に「投与する」という用語には、非経口または経口経路のいずれか、筋肉内注射、皮下／皮内注射、静脈内注射、舌下投与、経皮送達、および直腸、結腸、膣、鼻内、または呼吸管経路による投与を含む、対象における望ましい位置への本願発明の組成物送達のために、前記組成物を任意の望ましい経路によって対象に投与、送達、または適用するステップが含まれる。
【００３３】
本願発明の組成物は、望ましい結果を達成するために有効な量を、必要な投与量および期間、対象に投与してよい。本願発明の組成物の有効な量は、患者のたとえば腫瘍期などの病期、年齢、および体重、ならびに組成物が対象において望ましい応答を発現する能力などの因子によって変化してもよい。有効な量はまた、前記組成物の任意の有毒または有害な作用（たとえば副作用）を治療上または診断上の有益な作用が上回る量である。本願発明の組成物はたとえばタンパク質1乃至1000 μg/kg、タンパク質1乃至900 μg/kg、タンパク質1乃至800 μg/kg、タンパク質1乃至700 μg/kg、タンパク質1乃至600 μg/kg、タンパク質1乃至500 μg/kg、タンパク質1乃至400 μg/kg、タンパク質1乃至300 μg/kg、タンパク質1乃至200 μg/kg、タンパク質1乃至100 μg/kg、タンパク質10乃至100 μg/kg、タンパク質10乃至80 μg/kg、タンパク質10乃至60 μg/kg、タンパク質10乃至40 μg/kg、またはタンパク質10乃至20 μg/kgの濃度で投与してよい。
【００３４】
磁気共鳴画像は、たとえばPicker Corp社製全身超伝導システムを0.26T（10.08MHz）にチューニングした30cmトランスミッタコイルを用いて0.3Tで操作するか、または0.05テスラ乃至4.0テスラの範囲内の磁場強度を有するそのほかのMRI装置を用いるなど、当業に公知の任意の技術を用いて入手してもよい。典型的には、前記対象を強力で高度に均一化している静磁場におく。対象の体内にある磁化した陽子（水素核）が、この場の中で小さい磁石のように整列する。次いで、高周波パルスを用いて主磁場に垂直な振動磁場を作り出す。この磁場から核がエネルギーを吸収して静磁場の配列から抜け出し、励起状態になる。この核が励起状態から平衡状態へ戻る時、核の磁化によって装置のレシーバコイルに誘導されたシグナルが、一連のアルゴリズムによって画像に転換される。異なる組織の特徴に基づく画像は、その組織の磁気緩和特性を利用するためにパルス高周波場の数および列を変化させることによって得ることができる。
【００３５】
たとえば、細胞死の分布および／または位置に処理が及ぼす影響を記録するために、経時的に位置および／またはシグナルを追跡することが望ましい場合には、特定の時間間隔をおいて画像化を繰り返し一連の画像を作成することができる。その間隔は、分といった短いもの或いは、日、週、月、または年といった長いものであってよい。本願発明の方法によって作成された画像は、様々な方法で分析してよい。目視検査、心理的検査および／またはハードコピーへの印刷という単純なものから、高度なデジタル画像解析まである。
【００３６】
磁気共鳴画像は、磁気共鳴画像法用の組成物を対象に投与してから5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、または120分後に得ることもできる。別の実施態様では、磁気共鳴画像は、磁気共鳴画像法用の組成物を対象に投与してから約10-30、15-25、20-25、または20-30時間後に入手することもできる。好ましい実施例では、磁気共鳴画像を複数の時間点において入手し、細胞死を迎えている細胞の数の変化を監視するか、または細胞死を迎えている細胞の位置の変化を監視する。
【００３７】
本願発明はまた、光学的に活性な分子に結合させた、たとえばアネキシンVなどのアネキシンを含む光学画像用組成物も提供する。
【００３８】
本願明細書に用いられる「光学的に活性な分子」には、内視鏡、気管支鏡、および解剖学的な構造物を光学的に検出するために用いる侵襲性が最小の外科的装置などの、医療用として入手可能な可視化装置を使用することによって、光学的に検出される能力を有する任意の分子が含まれる。光学的に検出可能な分子には、フルオレセインおよびメチレンブルーが含まれる。光学的に活性な分子にはまた、光学力学療法（PDT）に有用な物質も含まれる。PDTは、光感受性がある薬物と結合させたアネキシン分子を酸素の存在下において特定の波長の光で照射することによって作用する。この反応が起きる場合、通常無害である光感受性分子が、「一重項酸素」として知られる酸素の活性種によって細胞傷害性を持つ。アネキシンに結合させた場合にPDTに用いることができる光学的に活性な物質の例には、PHOTOFRIN（登録商標）、ルトリン、ANTRIN（登録商標）、FOSCAN（登録商標）、アミノレブリン酸、テトラスルホン酸フタロシアニンアルミニウム(III)、ハイペリシン、ベルテポルフィン、およびメチレンブルー色素が含まれる。
【００３９】
別の局面では、本願発明は、治療用の放射性同位体に結合させた、たとえばアネキシンVなどのアネキシンを含む組成物を提供する。本願明細書で用いられる「治療用の放射性同位体」とは、治療を適用するために患者に注射するために有用であって好適であると認識される放射性同位体である。本願明細書に用いられる治療用の放射性同位体は、好ましくはアルファ（α）またはベータ（β）線を放射する放射性同位体である。ある実施態様では、治療用の放射性同位体は、ガンマ（γ）線を放射する放射性同位体ではない。治療用の放射性同位体の例には103 Pd、186Re、188 Re、90Y、153Sm、159Gd、または166Ho、131I、123I、126I、133I、111In、および113Inが含まれる。
【００４０】
治療用の放射性同位体およびアネキシンは、1:1、1.1:1、1.2:1、1.3:1、1.4:1、1.5:1、1.6:1、1.7:1、1.8:1、1.9:1、または2:1の割合（治療用の放射性同位体：アネキシン）で結合させてよい。任意の上述の値を上限および／または下限として組み合わせて用いる値の範囲も本願発明に含まれることを意図する。
【００４１】
さらなる局面では、本願発明は、腫瘍を有する哺乳類対象に治療用の放射性同位体に結合させたアネキシンを含む組成物を腫瘍を減少させるのに効果的な量投与することによる腫瘍の放射線療法の方法を提供する。前記の方法は、全身照射、または標的化外部照射、および／または少なくとも１つの化学療法剤を用いた処理（たとえばジメチルビスルファン、シクロホスファミド、ビスクロロエチルニトロソウレア、シトシンアラビノシド、または6-チオグアニン）と組み合わせて用いてもよい。アネキシン-治療用同位体組成物の投与の適切なタイミングは、本願明細書に記載の任意の画像化技術、または引用によりその内容を本願明細書に援用する米国特許第6,197,278 B1号に記載の画像化技術を用いて決定してよい。
【００４２】
本願発明のさまざまな局面を、以下のサブセクションにさらに詳述する。
【００４３】
本願発明のアネキシンを含有する化合物の合成
本願発明は、精製された野生型、組換え、または合成的に調製したアネキシンを用いて実施することができる。たとえばアネキシンVは、ヒト胎座から便利に精製することができる(引用によりその内容を本願明細書に援用するFunakoshi, et al. (1987) Biochemistry 26:5572に記載の通り)。しかし、組換えアネキシンには、調製の容易さや経済的な効率を含むいくつかの利点がある。数多くの異なるアネキシンがヒトおよびそのほかの生物からクローニングされている。その配列は、GenBankを含む配列データベースで入手することができる。
【００４４】
本願発明は、いくつかの理由により、アネキシンVを用いて実施することが好ましい。第１に、アネキシンVは最も豊富なアネキシンの１種である、（ii）天然または組換え供給源から産生するのが簡単である、および（iii）リン脂質膜への親和性が高い。ヒトアネキシンVは、分子量が36kdであって、ホスファチジルセリン（PS）への親和性が高い（kd=7 nmol/L）。ヒトアネキシンVの配列はGenBankから登録番号U05760-U05770として入手することができる。
【００４５】
本願発明で使用するためのアネキシンを作成するために好適な例示的な発現系は、E.コリのpET12a発現ベクター（ノバジェン社、ウイスコンシン州マジソン）を用いる（引用により本願明細書に援用するWood, et al. (1996) Blood 88:1873-1880に記載）。
【００４６】
その他の細菌発現ベクターも使用してよい。それらには、たとえばプラスミドpGEX（Smith, et al. (1988) Gene 67:31）およびその誘導体（たとえばファルマシアバイオテック社（ニュージャージー州ピスカタウェイ）のpGEXシリーズ）が含まれる。これらのベクターは、グルタチオン-S-トランスフェラーゼとインフレームで融合したクローニングされたインサートのポリペプチド配列を発現する。組換えpGEXプラスミドは、適切なE.コリ株にトランスフォームすることができ、融合タンパク質の産生はIPTG（イソプロピル-チオガラクトピラノシド）の添加によって誘導することができる。可溶化した組換え融合タンパク質を、標準の方法（たとえばAusubel, et al. Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley and Sons, Inc.,Media, PA)に記載）に従って、グルタチオンアガロースアフィニティクロマトグラフィを用いて、誘導した培養液の細胞ライセートから精製することができる。そのほかの市販の発現系には、インビトロジェン社（カリフォルニア州サンディエゴ）のPichia発現キットなどの酵母発現系、バキュロウイルス発現系（Reilly, et al. in Baculovirus Expression Vectors: A Laboratory Manual (1992)、クローンテック社、カリフォルニア州パロアルト）、および哺乳類細胞発現系（クローンテック社、カリフォルニア州パロアルト、ギブコ-BRL社、メリーランド州ガイザーズバーグ）が含まれる。
【００４７】
培養培地への発現した配列の分泌を促進するリーダー配列など、多数の特性を発現ベクターに組み込むことができる。組換え的に産生されたポリペプチドは、典型的には溶解細胞または培養培地から単離する。
【００４８】
上述の通り産生した単離された組換えポリペプチドは、ディファレンシャル沈降、分子ふるいクロマトグラフィ、イオン交換クロマトグラフィ、等電点分離法、ゲル電気泳動法、およびアフィニティクロマトグラフィを含む、標準のタンパク質精製手順によって精製してよい。タンパク質調製物も、たとえば濾過によって濃縮することができる（アミコン社、マサチューセッツ州ダンバーズ）。
【００４９】
上述の通り生成したアネキシンは、次いで、造影剤、光学的に活性な分子、または治療用の放射性同位体と結合させてよい。特定の造影剤、光学的に活性な分子、または治療用の放射性同位体は、使用を意図する当業者の特定の用途によって選択されるであろう。
【００５０】
アネキシンの放射標識
アネキシンは当業に公知のさまざまな方法によって放射標識されてよい（たとえば、引用によりその内容全体を本願明細書に援用する米国特許第5,985,240号、米国特許第4,361,544号、米国特許第4,427,646号に記載）。アネキシンは、反応性芳香族アミノ酸の求電子置換によって、直接放射ヨウ素標識してよい。ヨウ素標識はまた、予め標識された試薬であって当該試薬がヨウ素標識され精製されている試薬をアネキシンに結合させて、行ってもよい。ヨウ素標識はまた、たとえば米国特許第4,986,979号、米国特許第4,479,930号、米国特許第4,668,503号に記載の、たとえばDTPAおよびEDTAなどのキレートを用いて行ってもよい。
【００５１】
好適な治療用の放射性同位体を選択する場合、当業者は典型的に、（i）最小の粒子放出、（ii）一次光子エネルギーが約50乃至500 kEv、（iii）投与する物質の調製に必要な時間よりも長い物理学的な半減期（ヨウ素123（半減期〜13.2時間）、ヨウ素131（半減期〜8日間）、ガリウム67（半減期〜78時間）、およびインジウム111（半減期〜2.8日間））、（iv）検査時間よりも長い有効半減期、好適な化学形態および反応性、低い毒性、およびその放射性同位体で標識したアネキシンの安定または安定に近い状態、をこれらに限定せずに含む因子について考慮するであろう。
【００５２】
アネキシンの造影剤へのカップリング
アネキシンの造影剤へのカップリングは、たとえば化学キレート化技術などの当業に公知の任意の技術を用いて行ってよい。
【００５３】
アネキシンの酸化金属へのカップリングは、引用によりその内容を本願明細書に援用する、Chelating Agents and Metal Chelates, Dwyer & Mellor, Academic Press (1964), Chapter 7 および米国特許第5,443,816号に記載の通り行ってよい。イオン状の鉄、コバルト、ニッケル、銅、亜鉛、ヒ素、セレン、テクネチウム、ルテニウム、パラジウム、銀、カドミウム、インジウム、アンチモン、レニウム、オスミウム、イリジウム、白金、金、水銀、タリウム、鉛、ビスマス、ポロニウムおよびアスタチン元素を用いてよい。
【００５４】
たとえば、アネキシンは第１の還元剤とともに、ジスルフィド結合をチオラート基に還元するのに十分でありながらアネキシンの過剰な断片化防ぐだけのインキュベーション時間の間インキュベートしてよく、前記の第１の還元剤をチオラート含有アネキシンから実質的に除去してよく、次いで、Sn(II)剤の供給源を、Sn(II)含有および硫黄含有錯体を形成するのに十分な量、チオラート含有アネキシンに加えてよく、Sn(II)含有および硫黄含有錯体を酸化金属を加えて標識してよく、それによって前記酸化金属がSn(II)剤を置換して前記酸化金属およびチオラート含有アネキシンが錯体を形成する。上述のステップの順序は変えてもよい。たとえば、Sn(II)を加えてSn(II)含有および硫黄含有錯体を形成してから、チオラート含有アネキシンから過剰な還元剤を除去することは可能であり、場合によっては有益である。このように、チオラート基の酸化またはジスルフィド結合およびそのほかの架橋結合の再形成を最小にすることができる。
【００５５】
本願発明の化合物は、アネキシンを酸化鉄などの生分解性超常磁性酸化金属と結合させることによって生成してよい。超常磁性または常磁性造影剤と結合させたアネキシンは、磁気共鳴造影剤をアポトーシス性または壊死性の細胞に方向付けるという利点を提供する。たとえば、アネキシンおよび生分解性の超常磁性酸化鉄から調製した化合物は、fas処理によってアポトーシスを迎えた肝細胞と結合する。本願発明の化合物を対象に投与した後に行われた磁気共鳴実験または画像化手順は、したがって、向上した磁気共鳴画像とともに生物の中の損傷した細胞の分布に関する貴重な情報を得るための方法を提供する。
【００５６】
生物分子の結合のための磁性粒子の使用は、Molday(引用によりその内容全体を本願明細書に援用する米国特許第4,452,773号)によって記述されている。簡単に説明すると、デキストランでコーティングした磁性粒子をつくってから、過ヨウ素酸塩で処理してアルデヒド基をつくる。そのアルデヒドを生物学的分子上でアミノ基と反応させ、シッフ塩基をつくる。そのシッフ塩基を水素化ホウ素ナトリウムなどの還元剤で処理して安定化してよい。還元剤で処理した後、メチレンアミノリンカーが生物分子とナノ粒子を結合させる。
【００５７】
Rembaum and Owenの方法（表１参照）を含む、アルデヒド基の反応性を用いる生物分子をナノ粒子に結合させるその他の方法も、用いてもよい。
【００５８】
アミンで官能化した架橋された酸化鉄ナノ粒子の作製は、アネキシンを酸化鉄粒子に結合するために用いられてよい磁性粒子-生物分子複合体の合成の、別の方法である。アミノ-CLIOの調製は、まずデキストランでコーティングした磁性ナノ粒子を合成し、次いでデキストランとエピクロロヒドリンを架橋する。アミン基は、デキストランとアンモニアを反応させて組み込む。
【００５９】
表１（下記）に、たとえばアネキシンVなどのアネキシンの結合に用いてよい磁性粒子の種類をまとめる。
【００６０】
【表１】
2004535375.tif 000002
【００６１】
アネキシンと磁性分子の複合体は、磁気アフィニティクロマトグラフィ、磁気細胞選別、磁気免疫アッセイなどのさまざまな分野において、およびMR画像化造影剤として使用することができる物質となる。その粒子の必要条件は、意図される用途によって大きく変化する。画像化に用いるためには、磁性粒子は以下の特性を含む一連の特性を有していなければならない。
（１）  サイズおよびサイズの均一性。毛細血管床を詰まらせないように、磁性粒子は好ましくは赤血球のサイズ（約10ミクロン）より小さい。標的細胞または器官への注射後のターゲティングを効率的にするために、磁性粒子は好ましくはナノ粒子サイズの範囲（1乃至500nm）でなければならない。より大きな粒子は細網内皮系の貪食細胞によって血管区画から急速に消退し、望ましい標的上の限定された数の部位と反応する能力が制限される。磁性粒子のサイズ分布は狭いことが好ましく、つまり、毛細管を閉塞する可能性がある大きい粒子が少しでもあってはいけない。
【００６２】
（２）  生分解性。臨床診断用のツールとして有用であるために、磁性粒子は好ましくは崩壊して排出されるか、崩壊して体内で使用されなければならない。ポリスチレンなどの物質は、細胞選別用の磁性粒子の合成には有用であるが、非経口の臨床用途に用いることはできない。画像化の用途に用いる粒子の最も一般的なタイプは、ポリマーでコーティングされた酸化鉄であって、デキストランまたは修飾デキストランが最も頻繁に利用されている(Anzai (1994) Radiology 192, 709-15; Reimer (1995) Radiology 195, 489; Stark (1988) Radiology 168, 297)。
【００６３】
（３）  安全性。磁性粒子は無毒性でなければならない。典型的には、安全性因子（画像化に用いた投与量を動物群の50%を死滅させる投与量で割った値）は、100よりも大きく、好ましくは1000よりも大きい。毒性には、可逆的または不可逆的な組織の損傷の生成だけでなく、その調製物を服用する特定の対象（ヒトなど）における一時的であるが問題となる生理学的な反応の誘導も含む。これらには、発熱、蕁麻疹、軽度の疼痛、および嘔吐などが含まれる。MR画像法剤などの臨床診断用の物質として有用にするためには、前記磁性粒子は好ましくは、調剤物を服用する個人において、望ましい診断情報以外の認識可能な生理学的応答を生じてはならない。
【００６４】
（４）  安定性。非経口物質として用いるために、前記粒子のサイズ分布は好ましくは保存期間中において維持されなければならず、実際の市販上の理由から、その期間は典型的には６ヶ月以上であり、好ましくは最高２年間である。前記調製物の大きな粒子の数が増加するにつれて不安定性が明らかになると、粒子が毒性を誘導する結果となり、前記製品の市販用の利用に突然の中止を招くことになる。
【００６５】
多様な複合化戦略がタンパク質を相互に結合させるために利用されており、当業者には明らかであるように、たとえばアネキシンVなどのアネキシンを磁性粒子に結合させるために適合させることができる。これらの試薬の多くは、アミンと反応するN-ヒドロキシスクシンイミドエステル、およびスルフヒドリル基と反応する第２の基からなる。SPDP、SMCC、SATA、およびSlAtなど、広い選択肢がある２官能性複合化試薬がピースケミカル社から入手できる。それらの使用についての詳細な手順は、ピースケミカル社のウェブサイトから入手することができる（http://www.piercenet.com参照）。
【００６６】
アネキシンと光学的に活性な分子のカップリング
アネキシンと光学的に活性な分子のカップリングは、引用によってその内容全体を本願明細書に援用する米国特許第5,312,922号、米国特許第5,928,627号、米国特許第6,096,289号、Weir, ed., Handbook of Experimental Immunology, Vol. 1, Chapter 28, pp. 28.1-28.21, Oxford, Blackwell Scientific, 1986に記載の技術など、当業に公知の任意の技術を用いて行ってよい。
【００６７】
本願発明のアネキシン含有化合物の投与
本願発明のアネキシン含有化合物は、放射標識化合物の投与のプロトコルなど、標準のプロトコルを用いて対象に投与してよい。
【００６８】
本願発明の組成物は、望ましい結果を達成するために有効な量を必要な投与量および期間、対象に投与してよい。本願発明の組成物の有効な量は、対象の腫瘍期、年齢、および体重、ならびに組成物が対象において望ましい応答を誘導する能力に従って変化してよい。有効な量はまた、前記組成物の任意の有毒または有害な作用（たとえば副作用）を治療上または診断上の有益な作用が上回る量である。本願発明の組成物はたとえばタンパク質10乃至1000 μg/kg、タンパク質10乃至900 μg/kg、タンパク質10乃至800 μg/kg、タンパク質10乃至700 μg/kg、タンパク質10乃至600 μg/kg、タンパク質10乃至500 μg/kg、タンパク質10乃至400 μg/kg、タンパク質10乃至300 μg/kg、タンパク質10乃至200 μg/kg、またはタンパク質10乃至100 μg/kgの濃度で投与してよい。
【００６９】
アネキシンVは、約300μg/kgを超える投与量で薬理学的な作用（抗凝固作用）を有し始める。したがって、本願発明の診断方法は、好ましくは300μg/kg未満の投与量、典型的には約50μg/kg未満の投与量で行われる。このように微量な投与量（10μg/kg乃至50μg/kg）では、動物またはヒト対象における薬理学的なまたは有毒な副作用は報告されていない。
【００７０】
本願発明の化合物は典型的には、滅菌食塩水など、好適な輸送媒体に懸濁する。媒体はまた、当業に認識される安定化物質、担体、賦形剤、安定剤、および乳化剤などを含んでもよい。
【００７１】
本願発明の化合物は、任意の好適な投与経路で対象に投与してよい。投与の好ましい方法は静脈（i.v.）注射である。この方法は、十分に血管新生している、心、肝、および脾などの体内器官の画像化に特に好適である。たとえば放射性医薬品などの静脈注射の方法が知られている。たとえば、放射標識された医薬品は典型的には、オルデンドルフ／止血器法または静脈内プッシュ法(たとえば Mettler and Guierbteau, (1985) Essentials Of Nuclear Medicine Imaging, Second Edition, W.B. Saunders Company, Philadelphia, PAを参照)を用いたボーラス注射として投与することが認識されている。
【００７２】
脳を画像化するために、本願発明の化合物を鞘内に投与することもできる。鞘内投与は、脳脊髄液（CSF）を含有するくも膜下腔に直接化合物を送達する。脊髄領域への送達はまた、くも膜外の脊髄領域への硬膜外注射によって実現することもできる。
【００７３】
気管支鏡検査に使用するには、本願発明のアネキシン化合物は、吸入によって投与してよい。たとえば、前記アネキシン化合物は、たとえば二酸化炭素などの気体など好適な推進剤を入れた加圧容器もしくはディスペンサ、またはネブライザからエアロゾルスプレー状で送達してもよい。
【００７４】
その他の投与形態には、腹腔内（たとえば腎臓透析患者のための）および胸腔内投与が含まれる。特定の用途のために、本願発明は、筋肉内注射、皮下、リンパ管内、吸入法、および経口、膣内および／または直腸投与を含むさらなる送達形態を意図する。
【００７５】
本願発明のアネキシン含有化合物の局在化
本願発明の化合物を投与後、その化合物は標的組織または器官に局在化させることができる。この文脈における局在化とは、対象の体内において結合状態の「局在化」化合物と非結合状態の「遊離」化合物との間の平衡状態または疑似安定状態の関係性のいずれかが達成された場合の状態を意味する。このような局在化に要する時間は、典型的には数分間から数十分間で、本化合物の血清半減期によって推定することもできる。局在化時間はまた、本化合物の標的組織への到達性にも依存する。これは、当業に認識されるとおり、投与形態に依存する。
【００７６】
画像化は好ましくは、本化合物の大半がその標的に局在化した後に開始する。Tc99m-標識されたアネキシンVを静脈内投与する場合、半減期の数倍の時間の経過後にこの状態になる。半減期の約10倍の時間（アネキシン／Tc99m複合体の場合は約30乃至240分）が、基本的に完全な局在化が達成されるのに十分な時間だと考えられる。しかし当業者は、上述の半減期の〜10倍の時間よりも短い、または長い時間が経過した時点で、画像化を行うことが望ましいこともあることを理解するだろう。たとえば、血管損傷による細胞死を画像化する場合、標的組織への到達性は非常に高く、特に低用量の標識されたアネキシンを徐々に投与して循環する標識からのシグナルを最小にする場合には、数分で標的部位から強いシグナルを得ることができる。
【００７７】
上述のすべての場合において、当業者は局在化が達成される時間を妥当に推測することができる。さらに、局在化を時間の関数で表した後で、本願発明の方法に従って、標識されたアネキシンからのガンマ線シグナルを画像化してもよい。
【００７８】
用途
本願発明のアネキシン含有化合物の主な用途には、たとえば狼瘡、移植片拒絶反応などの免疫疾患などの疾患状態、または重度の虚血に陥った細胞における発生すべきではない不適切なアポトーシスの検出、およびたとえば腫瘍またはウイルスに感染している細胞など、発生すべき時に不十分なアポトーシスの検出が含まれる。
【００７９】
本願発明のアネキシン含有化合物は、臓器および骨髄移植拒絶反応または損傷、感染性および非感染性炎症性疾患、自己免疫性疾患、脳および心筋梗塞および虚血、心筋症、アテローム性疾患、神経および神経筋変性疾患、鎌状赤血球病、β-サラセミア、癌療法、AIDS、骨髄異形成症候群、および毒素誘導肝疾患などをこれらに限定せずに、アポトーシスおよび／または壊死細胞死に監視が必要な、さまざまな臨床背景に用いてよい。本願発明のアネキシン含有化合物はまた、正常な免疫系、発生工学的な発達、ならびに免疫寛容およびアレルギーを研究するための臨床研究用ツールとしても有用であってよい。
【００８０】
本願発明の化合物は、たとえば、処理を受けている正常および悪性組織中のアポトーシス細胞死を画像化および定量化するために用いることができる。これらの化合物を用いた一連の画像化研究によるアポトーシスの監視は、さまざまな疾患の新薬および療法の迅速な試験および開発に使用することができる。さらに、本願方法は処理の進行の監視、疾患の進行の監視、またはそれらの両方を行うために用いてよい。さらに、本願方法はいくつかの疾患の早期検出を促進するために用いてよい。
【００８１】
上述の方法の利点は、特定の間隔で画像化することによって、本願方法を用いて、細胞死を迎えている細胞の数の変化を反映している対象からの放射強度の変化を経時的に追跡することができる。このようなアプローチを用いて、細胞死を迎えている細胞の分布の変化を反映している、対象における本願発明の化合物の局在化の変化を経時的に追跡してもよい。
【００８２】
本願発明の組成物および方法はまた、たとえば網膜疾患または緑内障などの眼疾患を罹患する対象の診断および／または処理に用いてもよい。
【００８３】
本願明細書に開示された光学力学療法（PDT）は、癌および加齢性黄斑変性症（AMD）など異常な血管の形成を含む急速に増殖する組織によって特徴づけられるある範囲の疾患の処理に、特に有用である。PDTに用いられる光源の種類は、処理される症状によって異なる。たとえば、眼科学的な用途の場合、ダイオードレーザー光を顕微鏡の細隙灯を通して対象の眼に照射する。癌／内科的疾患の場合、光ファイバーを用いて、光を肺、消化管、および食道などの内部腔に送達してよく、皮膚癌の場合には発光ダイオードを用いてよい。
【００８４】
要約すると、本願発明の組成物および方法は、臨床上および診断上の利点を数多く提供する。たとえば、本願発明の方法を用いて、確立した抗癌治療計画に対する個々の患者の応答を、効率よく適時に評価することもでき、新規の抗癌薬の抗新生物活性を評価することもでき、新規の抗癌薬の最適な用量および投薬計画を特定することもでき、および既存の抗癌薬および薬物の組み合わせの最適な用量および投与計画を特定することもできると考えられる。さらに、本願発明の方法を用いて、臨床試験中の癌患者を、治療計画に応答を示すか示さないかについて効率的に分類してもよい。
【００８５】
本願発明の方法は、とりわけ、化学療法に対する個々の患者の腫瘍の初期応答を評価するための非侵襲的な技術を提供する。これにより、副作用が、期待される効果と均衡がとれていない可能性がある、非効率的な処理の迅速な判別を可能にすることによって、効率的な処理の選択を容易にする。
【００８６】
本願発明は、以下の実施例によってさらに具体化されるが、それらは本願発明を制限するものと解釈されてはならない。本願明細書全体に引用されたすべての参考文献、係属中の特許出願、および発行済特許は、引用によりここに明白に援用される。
【実施例】
【００８７】
例１：過ヨウ素酸塩を用いた、デキストランでコーティングされた磁性酸化鉄へのアネキシンVの結合
デキストランでコーティングされた磁性粒子を過ヨウ素酸塩で処理するとアルデヒドを生成し、アネキシンVのアミンを有するシッフ塩基を形成する。その錯体をホウ水素化ナトリウムで処理して安定化させる。
【００８８】
デキストランでコーティングされた超常磁性酸化鉄ナノ粒子を、Molday (1982) J.  J.  Immunol. Metho 52, 353の方法に従って合成した。酸化鉄（Fe 10mgを水1mLに入れる）および精製したアネキシンVを酢酸ナトリウム（0.01M、pH6）に対して透析した。アネキシンVをWood (1996) Blood 88, 1873の方法で精製した。アネキシンVの量は、タンパク質1乃至約50mg、好ましくは5乃至10mgの範囲内で変化させることができる。量が少ない場合、得られた磁性ナノ粒子上での鉄に対するタンパク質の割合は低くなるであろうが、提供されたタンパク質はより効率的に結合するだろう。タンパク質の量が多い場合には、得られた磁性ナノ粒子上での鉄に対するタンパク質の割合は高くなるであろうが、結合するタンパク質の割合は低くなるだろう。
【００８９】
新たに調製した過ヨウ素酸ナトリウム（50mg/mL、0.2mL）を酸化鉄に加えた。この混合物を室温で暗所において30分間インキュベートし、0.15MのNaGIに対して透析した。酸化させた磁性酸化鉄をアネキシンVと混合し、0.2M重炭酸ナトリウムを100μl加えてpHを9.5に調整した。その混合物を撹拌しながら３時間インキュベートした。新たに調製したシアノホウ水素化ナトリウムを加え（25mg/mL、0.2mL）、その混合物を室温で６時間インキュベートした。アネキシンV-磁性ナノ粒子は、さまざまな大きさに基づいた分離方法によって未反応のアネキシンから分離することができる。これらには、ゲル濾過法、限外濾過法、磁気分離法が含まれる。
【００９０】
例２：スルフヒドリル基を有するアネキシンVのアミノCLIOへの結合
アミノ-CLIOナノ粒子をJosephson (1999) Bioconjug. Chem. 10, 186に記載の通り作製した。変異原性によってスルフヒドリル基を付加させたアネキシンV(Tait (2000) Bioconjug Chem 11, 918)を用いた。1.2mLのアミノ-CLIO（Fe 30mg）に、1.2 mL の0.1 M リン酸塩バッファ、pH 7.4、およびDMSO に入れた2 mL の N- スクシンイミジル 3-(2-ピリジルジチオ)プロピオナート (SPDP, 25 mM) (モレキュラーバイオ-サイエンシズ社、コロラド州ボルダー) を加えた。その混合物を60分間室温に放置した。低分子の不純物を、0.01 M Tris および0.02 M クエン酸塩pH 7.4 バッファで平衡化させたPD-10カラム（シグマケミカル社、ミズーリ州セントルイス）によって除去した。
【００９１】
その後、2乃至50mgのアネキシンVをSPSD活性化ナノ粒子のFe 10mgに室温で加え、その混合物を一晩放置した。アネキシンV-磁性ナノ粒子は、さまざまな大きさに基づいた分離方法によって、未反応のアネキシンから分離することができる。
【００９２】
例３：スルフヒドリル基を付加させるためのアネキシンの反応と、その後のアミノCLIOとの反応
ピアスケミカル社製のSATA試薬を使用し製造者の説明書に従って、スルフヒドリル基をアネキシン（例１で得られた）に付加させた。アミノ-CLIOを例２に記載のSPDPと反応させてから、SATAと反応させたアネキシンと反応させた。
【００９３】
例４： BSAコーティングされた磁性粒子へのアネキシンVの結合
BSAコーティングされた磁性粒子を米国特許第4,795,698号に記載の通り作製した。前記磁性粒子のBSAコーティングのアミン基の一部を、SPDP試薬を使用してスルフィドリル基に転換する（例２参照）。SPDPまたはSATAを用いて、アネキシンVに１つ以上のスルフィドリル基を付加させることができる。アネキシンVをDTTで処理した後、スルフヒドリル基を露出させるために、前記タンパク質を前記磁性粒子と反応させる。
【００９４】
等価物
当業者であれば、ごく普通の実験を用いるのみで、ここに説明した本願発明の特定の実施態様の等価物を数多く認識し、または確認できることであろう。このような等価物は、以下の請求の範囲の包含するところである。
【図面の簡単な説明】
【００９５】
【図１】非ポリマーDMSAでコーティングされた酸化鉄へのアネキシンVの結合を表す。
【図２】ポリマーでコーティングされた磁性酸化鉄へのアネキシンVの結合を表す。
【図１】
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【図２】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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