(57)【要約】本明細書では、酵母からアスコルビン酸を生成する方法を開示する。一態様では、酵母はアスコルビン酸前駆体を含んでなる培地で培養したＺｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓまたは Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ種である。第二の態様では、酵母はアスコルビン酸前駆体を含んでなる培地で増殖する組換え酵母である。好ましくは、組換え酵母は、Ｌ−ガラクトースデヒドロゲナーゼ（ＬＧＤＨ）、Ｌ−ガラクトノ−１，４−ラクトンデヒドロゲナーゼ（ＡＧＤ）、Ｄ−アラビノースデヒドロゲナーゼ（ＡＲＡ）、Ｄ−アラビノノ−１，４−ラクトンオキシダーゼ（ＡＬＯ）、Ｌ−グロノ−１，４−ラクトンオキシダーゼ（ＧＬＯ）、およびアルドノラクトナーゼ（ＡＬ）から選択される酵素をコードするコード領域によって形質転換されている。アスコルビン酸前駆体は、好ましくはＤ−グルコース、Ｌ−ガラクトース、Ｌ−ガラクトノ−１，４−ラクトン、Ｌ−グロノ−１，４−ラクトン、またはＬ−グロン酸である。もう一つの好ましい態様では、アスコルビン酸はバックグラウンドより高い濃度で培地に蓄積される。好ましくは、酵母はアスコルビン酸前駆体の約２５％をＬ−アスコルビン酸に転換することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１種類のアスコルビン酸前駆体を含んでなる培地でＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ種またはＺｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ種の酵母を培養してアスコルビン酸またはその塩を産生させ、アスコルビン酸またはその塩を単離することを含んでなる、アスコルビン酸またはその塩の生成方法。
【請求項２】
酵母がＺ． ｂａｉｌｉｉまたはＫ． ｌａｃｔｉｓである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
酵母がＺ． ｂａｉｌｉｉ ＡＴＣＣ ６０４８３株、Ｚ． ｂａｉｌｉｉ ＡＴＣＣ ３６９４７株、またはＫ． ｌａｃｔｉｓ ＰＭ６−７Ａ株である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
アスコルビン酸前駆体がＬ−ガラクトース、Ｄ−グルコース、Ｌ−ガラクトノ−１，４−ラクトン、Ｌ−グロン酸、およびＬ−グロノ−１，４−ラクトンから選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
単離工程が酵母のリーシスを含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
単離工程が遠心分離、濾過、精密濾過、限外濾過、ナノ濾過、液−液抽出、結晶化、ヌクレアーゼまたはプロテアーゼを用いる酵素処理、またはクロマトグラフィーをも含んでなる、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
アスコルビン酸を生成する方法であって、
ａ） アスコルビン酸前駆体をアスコルビン酸に転換することができる組換え酵母を得て、
ｂ） アスコルビン酸前駆体を含んでなる培地中で組換え酵母を培養することによってアスコルビン酸を形成し、
ｃ） アスコルビン酸を単離すること、
を含んでなる、方法。
【請求項８】
酵母がＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｃａｎｄｉｄａ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ、Ｄｅｂａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｎａｄｓｏｎｉａ、Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ、Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ、Ｋｌｏｅｃｋｅｒａ、Ｐｉｃｈｉａ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｔｒｉｇｏｎｏｐｓｉｓ、Ｂｒｅｔｔａｎｏｍｙｃｅｓ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ、Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ、Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ、Ｐｈａｆｆｉａ、Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ、Ｙａｒｒｏｗｉａ、またはＳｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ属に属する、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
酵母がＳ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｋ． ｌａｃｔｉｓ、またはＺ． ｂａｉｌｉｉ種に属する、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
酵母がＳ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＧＲＦ１８Ｕ株、Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ Ｗ３０３１Ｂ株、Ｋ． ｌａｃｔｉｓ ＰＭ６−７Ａ株、Ｚ． ｂａｉｌｉｉ ＡＴＣＣ ６０４８３株、またはＺ． ｂａｉｌｉｉ ＡＴＣＣ ３６９４７株から選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
酵母がＬ−ガラクトースデヒドロゲナーゼ（ＬＧＤＨ）、Ｌ−ガラクトノ−１，４−ラクトンデヒドロゲナーゼ（ＡＧＤ）、Ｄ−アラビノースデヒドロゲナーゼ（ＡＲＡ）、Ｄ−アラビノノ−１，４−ラクトンオキシダーゼ（ＡＬＯ）、Ｌ−グロノ−１，４−ラクトンオキシダーゼ（ＧＬＯ）、およびアルドノラクトナーゼ（ＡＬ）から選択される第一の酵素をコードするコード領域により機能的に形質転換されている、請求項７に記載の方法。
【請求項１２】
ＬＧＤＨ酵素が配列番号：１１と少なくとも約７０％の類似性を有し、ＡＧＤ酵素が配列番号：１または配列番号：３と少なくとも約７０％の類似性を有し、ＡＲＡ酵素が配列番号：２０と少なくとも約７０％の類似性を有し、ＡＬＯ酵素が配列番号：５または配列番号：７と少なくとも約７０％の類似性を有し、ＧＬＯ酵素が配列番号：９と少なくとも約７０％の類似性を有し、ＡＬ酵素が配列番号：２９と少なくとも約７０％の類似性を有する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
ＬＧＤＨ酵素が配列番号：１１と少なくとも約７０％の同一性を有し、ＡＧＤ酵素が配列番号：１または配列番号：３と少なくとも約７０％の同一性を有し、ＡＲＡ酵素が配列番号：２０と少なくとも約７０％の同一性を有し、ＡＬＯ酵素が配列番号：５または配列番号：７と少なくとも約７０％の同一性を有し、ＧＬＯ酵素が配列番号：９と少なくとも約７０％の同一性を有し、ＡＬ酵素が配列番号：２９と少なくとも約７０％の同一性を有する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
ＬＧＤＨ酵素をコードするコード領域が配列番号：１２と少なくとも約７０％の同一性を有し、ＡＧＤ酵素をコードするコード領域が配列番号：２または配列番号：４のヌクレオチド５６〜１８５８と少なくとも約７０％の同一性を有し、ＡＲＡ酵素をコードするコード領域が配列番号：２１のヌクレオチド２８５〜１３１９と少なくとも約７０％の同一性を有し、ＡＬＯ酵素をコードするコード領域が配列番号：６または配列番号：８のヌクレオチド４〜１５８４と少なくとも約７０％の同一性を有し、ＧＬＯ酵素をコードするコード領域が配列番号：１０のヌクレオチド２４〜１３４６と少なくとも約７０％の同一性を有し、ＡＬ酵素をコードするコード領域が配列番号：３０と少なくとも約７０％の同一性を有する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
酵母がＡＬＯ酵素をコードするコード領域により機能的に形質転換されている、請求項１１に記載の方法。
【請求項１６】
酵母がＬＧＤＨ酵素をコードするコード領域により機能的に形質転換されている、請求項１１に記載の方法。
【請求項１７】
酵母がＡＧＤ酵素をコードするコード領域により機能的に形質転換されている、請求項１１に記載の方法。
【請求項１８】
ＡＧＤ酵素がシグナル形成ペプチドを含んでなる、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
ＡＧＤ酵素がシグナル形成ペプチドを含まない、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
酵母がＧＬＯ酵素をコードするコード領域により機能的に形質転換されている、請求項１１に記載の方法。
【請求項２１】
酵母がＡＬ酵素をコードするコード領域により機能的に形質転換されている、請求項１１に記載の方法。
【請求項２２】
酵母がＡＲＡ酵素をコードするコード領域により機能的に形質転換されている、請求項１１に記載の方法。
【請求項２３】
ＡＲＡ酵素がアミノ酸配列ＧＸＲＸＸＤＸＡＸＸＸＸＸＥＸＸＸＧ（配列番号：１３）およびＧＸＸＮ（配列番号：２６）を含んでなる、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
コード領域が酵母で活性なプロモーターに結合している、請求項１１に記載の方法。
【請求項２５】
プロモーターがＳ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅトリオースホスフェートイソメラーゼ（ＴＰＩ）プロモーターである、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
コード領域がＡ． ｔｈａｌｉａｎａ、Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｒ． ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ、またはＺ． ｍｏｂｉｌｉｓから単離された、請求項１１に記載の方法。
【請求項２７】
ＬＧＤＨ酵素をコードするコード領域がＡ． ｔｈａｌｉａｎａから単離され、ＡＬＯ酵素をコードするコード領域がＳ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅから単離され、ＡＧＤ酵素をコードするコード領域がＡ． ｔｈａｌｉａｎａから単離され、ＡＲＡ酵素をコードするコード領域がＳ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅから単離され、ＧＬＯ酵素をコードするコード領域がＲ． ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓから単離され、ＡＬ酵素をコードするコード領域がＺ． ｍｏｂｉｌｉｓから単離された、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
酵母が第一の酵素を除く第二の酵素をコードするコード領域により機能的に形質転換されており、第二の酵素がＬＧＤＨ、ＡＧＤ、ＡＲＡ、ＡＬＯ、ＧＬＯ、およびＡＬから選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項２９】
第二の酵素をコードするコード領域が酵母中で活性なプロモーターに結合している、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
プロモーターがＳ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅトリオースホスフェートイソメラーゼ（ＴＰＩ）プロモーターである、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
組換え酵母が炭素供給源のＬ−ガラクトース、Ｌ−グロノ−１，４−ラクトン、またはＬ−グロン酸への転換と関連した酵素をコードする少なくとも１個のコード領域をも含んでなる、請求項１１に記載の方法。
【請求項３２】
酵母が第一の酵素をコードするコード領域によって機能的に形質転換されており、コード領域が配列番号：１２に記載のポリヌクレオチドの相補性鎖にハイブリダイズするＬＧＤＨ酵素をコードするコード領域、配列番号：２に記載のポリヌクレオチドまたは配列番号：４のヌクレオチド５６〜１８５８の相補性鎖にハイブリダイズするＡＧＤ酵素をコードするコード領域、配列番号：２１のヌクレオチド２８５〜１３１９に記載のポリヌクレオチドの相補性鎖にハイブリダイズするＡＲＡ酵素をコードするコード領域、配列番号：６に記載のポリヌクレオチドまたは配列番号：８のヌクレオチド４〜１５８４の相補性鎖にハイブリダイズするＡＬＯ酵素をコードするコード領域、配列番号：１０のヌクレオチド２４〜１３４６に記載のポリヌクレオチドの相補性鎖にハイブリダイズするＧＬＯ酵素をコードするコード領域、または配列番号：３０に記載のポリヌクレオチドの相補性鎖にハイブリダイズするＡＬ酵素をコードするコード領域から選択され、コード領域が緊縮ハイブリダイゼーション条件下でポリヌクレオチドの相補性鎖にハイブリダイズする、請求項７に記載の方法。
【請求項３３】
酵母が第一の酵素をコードするコード領域によって機能的に形質転換され、第一の酵素が、配列番号：１１を有する酵素の免疫学的特性を有するＬＧＤＨ酵素、配列番号：１または配列番号：３を有する酵素の免疫学的特性を有するＡＧＤ酵素、配列番号：２０を有する酵素の免疫学的特性を有するＡＲＡ酵素、配列番号：５または配列番号：７を有する酵素の免疫学的特性を有するＡＬＯ酵素、配列番号：９を有する酵素の免疫学的特性を有するＧＬＯ酵素、および配列番号：２９を有する酵素の免疫学的特性を有するＡＬ酵素から選択される、請求項７に記載の方法。
【請求項３４】
アスコルビン酸前駆体が単糖類、オリゴ糖類、多糖類、Ｃ１〜Ｃ６アルコール、Ｃ２〜Ｃ６ポリオール、有機酸、およびＣ５〜Ｃ６ラクトンからなる群から選択される、請求項７に記載の方法。
【請求項３５】
アスコルビン酸前駆体がトレハロース、ラフィノース、エタノール、キシロース、キシルロース、マルトース、グリセロール、フルクトース、アラビノース、Ｄ−グルコース−６−Ｐ、Ｄ−グルコース−１−Ｐ、ＵＤＰ−Ｄ−グルコース、ＵＤＰ−グルクロン酸、Ｄ−グルクロン酸−１−Ｐ、Ｄ−グルクロン酸、Ｄ−グルクロノラクトン、Ｌ−グロン酸、Ｄ−フルクトース−６−Ｐ、Ｄ−マンノース−６−Ｐ、Ｄ−マンノース−１−Ｐ、ＧＤＰ−Ｄ−マンノース、ＧＤＰ−Ｌ−ガラクトース、Ｌ−ガラクトース−１−Ｐ、ラクトース、スクロース、澱粉、セルロース、クエン酸塩、メタノール、ホルムアルデヒド、ギ酸塩、メチルアミン、アラニン、オレイン酸、Ｌ−ガラクトノ−１，４−ラクトン、Ｄ−グルコース、Ｌ−グロノ−１，４−ラクトン、Ｌ−ガラクトース、およびＬ−グロン酸からなる群から選択される、請求項７に記載の方法。
【請求項３６】
アスコルビン酸前駆体がＬ−ガラクトノ−１，４−ラクトン、Ｄ−グルコース、Ｌ−グロノ−１，４−ラクトン、Ｌ−ガラクトース、およびＬ−グロン酸から選択される、請求項７に記載の方法。
【請求項３７】
アスコルビン酸前駆体が組換え酵母の炭素供給源でもある、請求項７に記載の方法。
【請求項３８】
単離工程が酵母のリーシスを含んでなる、請求項７に記載の方法。
【請求項３９】
単離工程が遠心分離、濾過、精密濾過、限外濾過、ナノ濾過、液−液抽出、結晶化、ヌクレアーゼまたはプロテアーゼを用いる酵素処理、またはクロマトグラフィーをも含んでなる、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
培養工程がバックグラウンドより高い濃度で培地中にアスコルビン酸を蓄積することを含んでなる、請求項７に記載の方法。
【請求項４１】
単離工程がクロマトグラフィー、活性炭、精密濾過、限外濾過、ナノ濾過、液−液抽出、または結晶化を含んでなる、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
培養工程が少なくとも約２０ｍｇ／ｌの最終濃度で培地中にアスコルビン酸を蓄積することを含んでなる、請求項７に記載の方法。
【請求項４３】
培養工程が少なくとも約４０ｍｇ／ｌの最終濃度で培地中にアスコルビン酸を蓄積することを含んでなる、請求項７に記載の方法。
【請求項４４】
培養工程が少なくとも約７０ｍｇ／ｌの最終濃度で培地中にアスコルビン酸を蓄積することを含んでなる、請求項７に記載の方法。
【請求項４５】
組換え酵母が前駆体の少なくとも約２５％をアスコルビン酸に転換することができる、請求項７に記載の方法。
【請求項４６】
組換え酵母が前駆体の少なくとも約３５％をアスコルビン酸に転換することができる、請求項７に記載の方法。
【請求項４７】
組換え酵母が前駆体の少なくとも約４０％をアスコルビン酸に転換することができる、請求項７に記載の方法。
【請求項４８】
アスコルビン酸またはその塩を含んでなる培地中で酵母を培養することを含んでなる、アスコルビン酸またはその塩を培地中で安定化する方法。
【請求項４９】
アスコルビン酸またはその塩を培地に添加する、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
培地中のアスコルビン酸を酵母によって産生させ、酵母が少なくとも１種類のアスコルビン酸前駆体をアスコルビン酸に転換することによってアスコルビン酸を産生し、培地はアスコルビン酸前駆体を含んでなる、請求項４８に記載の方法。
【請求項５１】
Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅであって、Ｌ−ガラクトースデヒドロゲナーゼ（ＬＧＤＨ）をコードするコード領域によって機能的に形質転換されていることを特徴とする、Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ。
【請求項５２】
Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅであって、Ｄ−アラビノースデヒドロゲナーゼ（ＡＲＡ）をコードするコード領域によって機能的に形質転換されていることを特徴とする、Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ。
【請求項５３】
Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅであって、Ｌ−ガラクトノ−１，４−ラクトンデヒドロゲナーゼ（ＡＧＤ）をコードするコード領域によって機能的に形質転換されていることを特徴とする、Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ。
【請求項５４】
Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅであって、Ｄ−アラビノノ−１，４−ラクトンオキシダーゼ（ＡＬＯ）をコードするコード領域によって機能的に形質転換されていることを特徴とする、Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ。
【請求項５５】
Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅであって、Ｌ−グロノ−１，４−ラクトンオキシダーゼ（ＧＬＯ）をコードするコード領域によって機能的に形質転換されていることを特徴とする、Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ。
【請求項５６】
Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅであって、Ｌ−ガラクトノ−１，４−ラクトンデヒドロゲナーゼ（ＡＧＤ）をコードするコード領域およびＬ−ガラクトースデヒドロゲナーゼ（ＬＧＤＨ）をコードするコード領域によって機能的に形質転換されていることを特徴とする、Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ。
【請求項５７】
Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅであって、Ｄ−アラビノノ−１，４−ラクトンオキシダーゼ（ＡＬＯ）をコードするコード領域およびＬ−ガラクトースデヒドロゲナーゼ（ＬＧＤＨ）をコードするコード領域によって機能的に形質転換されていることを特徴とする、Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ。
【請求項５８】
Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅであって、Ｄ−アラビノノ−１，４−ラクトンオキシダーゼ（ＡＬＯ）をコードするコード領域およびＤ−アラビノースデヒドロゲナーゼ（ＡＲＡ）をコードするコード領域によって機能的に形質転換されていることを特徴とする、Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ。
【請求項５９】
Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅであって、アルドノラクトナーゼ（ＡＬ）をコードするコード領域によって機能的に形質転換されていることを特徴とする、Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ。
【請求項６０】
Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅであって、アルドノラクトナーゼ（ＡＬ）をコードするコード領域およびＬ−グロノ−１，４−ラクトンオキシダーゼ（ＧＬＯ）をコードするコード領域によって機能的に形質転換されていることを特徴とする、Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ。
【請求項６１】
Ｚ． ｂａｉｌｉｉであって、Ｌ−ガラクトースデヒドロゲナーゼ（ＬＧＤＨ）をコードするコード領域によって機能的に形質転換されていることを特徴とする、Ｚ ｂａｉｌｉｉ。
【請求項６２】
Ｚ ｂａｉｌｉｉであって、Ｄ−アラビノースデヒドロゲナーゼ（ＡＲＡ）をコードするコード領域によって機能的に形質転換されていることを特徴とする、Ｚ ｂａｉｌｉｉ。．
【請求項６３】
Ｚ． ｂａｉｌｉｉであって、Ｌ−ガラクトノ−１，４−ラクトンデヒドロゲナーゼ（ＡＧＤ）をコードするコード領域によって機能的に形質転換されていることを特徴とする、Ｚ ｂａｉｌｉｉ。
【請求項６４】
Ｚ． ｂａｉｌｉｉであって、Ｄ−アラビノノ−１，４−ラクトンオキシダーゼ（ＡＬＯ）をコードするコード領域によって機能的に形質転換されていることを特徴とする、Ｚ ｂａｉｌｉｉ。
【請求項６５】
Ｚ． ｂａｉｌｉｉであって、Ｌ−グロノ−１，４−ラクトンオキシダーゼ（ＧＬＯ）をコードするコード領域によって機能的に形質転換されていることを特徴とする、Ｚ ｂａｉｌｉｉ。
【請求項６６】
Ｚ． ｂａｉｌｉｉであって、Ｌ−ガラクトノ−１，４−ラクトンデヒドロゲナーゼ（ＡＧＤ）をコードするコード領域およびＬ−ガラクトースデヒドロゲナーゼ（ＬＧＤＨ）をコードするコード領域によって機能的に形質転換されていることを特徴とする、Ｚ ｂａｉｌｉｉ。
【請求項６７】
Ｚ． ｂａｉｌｉｉであって、Ｄ−アラビノノ−１，４−ラクトンオキシダーゼ（ＡＬＯ）をコードするコード領域およびＬ−ガラクトースデヒドロゲナーゼ（ＬＧＤＨ）をコードするコード領域によって機能的に形質転換されていることを特徴とする、Ｚ ｂａｉｌｉｉ。
【請求項６８】
Ｚ． ｂａｉｌｉｉであって、Ｄ−アラビノノ−１，４−ラクトンオキシダーゼ（ＡＬＯ）をコードするコード領域およびＤ−アラビノースデヒドロゲナーゼ（ＡＲＡ）をコードするコード領域によって機能的に形質転換されていることを特徴とする、Ｚ ｂａｉｌｉｉ。
【請求項６９】
Ｚ． ｂａｉｌｉｉであって、アルドノラクトナーゼ（ＡＬ）をコードするコード領域によって機能的に形質転換されていることを特徴とする、Ｚ ｂａｉｌｉｉ。
【請求項７０】
Ｚ． ｂａｉｌｉｉであって、アルドノラクトナーゼ（ＡＬ）をコードするコード領域およびＬ−グロノ−１，４−ラクトンオキシダーゼ（ＧＬＯ）をコードするコード領域によって機能的に形質転換されていることを特徴とする、Ｚ ｂａｉｌｉｉ。
【請求項７１】
組換え酵母であって、Ｌ−ガラクトースデヒドロゲナーゼ（ＬＧＤＨ）、Ｌ−ガラクトノ−１，４−ラクトンデヒドロゲナーゼ（ＡＧＤ）、Ｄ−アラビノースデヒドロゲナーゼ（ＡＲＡ）、Ｄ−アラビノノ−１，４−ラクトンオキシダーゼ（ＡＬＯ）、Ｌ−グロノ−１，４−ラクトンオキシダーゼ（ＧＬＯ）、およびアルドノラクトナーゼ（ＡＬ）からなる群から選択される酵素活性を有するタンパク質をコードする少なくとも１個のコード領域によって機能的に形質転換されており、該酵母を少なくとも１種類のアスコルビン酸前駆体を含んでなる培地で培養するときに少なくとも約２５％のアスコルビン酸前駆体をアスコルビン酸に転換することができることを特徴とする、酵母。
【請求項７２】
酵母が培地中で少なくとも約２０ｍｇ／ｌのアスコルビン酸を産生することができる、請求項７１に記載の組換え酵母。
【請求項７３】
酵母が培地中で少なくとも約４０ｍｇ／ｌのアスコルビン酸を産生することができる、請求項７１に記載の組換え酵母。
【請求項７４】
酵母が培地中で少なくとも約７０ｍｇ／ｌのアスコルビン酸を産生することができる、請求項７１に記載の組換え酵母。
【請求項７５】
酵母が少なくとも約３５％の前駆体をアスコルビン酸に転換することができる、請求項７１に記載の組換え酵母。
【請求項７６】
酵母が少なくとも約４０％の前駆体をアスコルビン酸に転換することができる、請求項７１に記載の組換え酵母。
【請求項７７】
酵母がＬ−ガラクトースデヒドロゲナーゼ（ＬＧＤＨ）活性を有するタンパク質をコードするコード領域によって機能的に形質転換されている、請求項７１に記載の組換え酵母。
【請求項７８】
酵母がＬ−ガラクトノ−１，４−ラクトンデヒドロゲナーゼ（ＡＧＤ）活性を有するタンパク質をコードするコード領域によって機能的に形質転換されている、請求項７１に記載の組換え酵母。
【請求項７９】
酵母がＤ−アラビノースデヒドロゲナーゼ（ＡＲＡ）活性を有するタンパク質をコードするコード領域によって機能的に形質転換されている、請求項７１に記載の組換え酵母。
【請求項８０】
酵母がＤ−アラビノノ−１，４−ラクトンオキシダーゼ（ＡＬＯ）活性を有するタンパク質をコードするコード領域によって機能的に形質転換されている、請求項７１に記載の組換え酵母。
【請求項８１】
酵母がＬ−グロノ−１，４−ラクトンオキシダーゼ（ＧＬＯ）活性を有するタンパク質をコードするコード領域によって機能的に形質転換されている、請求項７１に記載の組換え酵母。
【請求項８２】
酵母がアルドノラクトナーゼ（ＡＬ）活性を有するタンパク質をコードするコード領域によって機能的に形質転換されている、請求項７１に記載の組換え酵母。
【請求項８３】
酵母がＤ−アラビノノ−１，４−ラクトンオキシダーゼ（ＡＬＯ）活性を有するタンパク質をコードするコード領域によって機能的に形質転換されており、且つ更にＬ−ガラクトースデヒドロゲナーゼ（ＬＧＤＨ）活性を有するタンパク質をコードするコード領域によって機能的に形質転換されている、請求項７１に記載の組換え酵母。
【請求項８４】
酵母がＤ−アラビノノ−１，４−ラクトンオキシダーゼ（ＡＬＯ）活性を有するタンパク質をコードするコード領域およびＤ−アラビノースデヒドロゲナーゼ（ＡＲＡ）活性を有するタンパク質をコードするコード領域によって機能的に形質転換されている、請求項７１に記載の組換え酵母。
【請求項８５】
酵母がＬ−グロノ−１，４−ラクトンオキシダーゼ（ＧＬＯ）活性を有するタンパク質をコードするコード領域およびアルドノラクトナーゼ（ＡＬ）活性を有するタンパク質をコードするコード領域によって機能的に形質転換されている、 請求項７１に記載の組換え酵母。
【請求項８６】
酵母がＬ−ガラクトノ−１，４−ラクトンデヒドロゲナーゼ（ＡＧＤ）活性を有するタンパク質をコードするコード領域によって機能的に形質転換されており、且つ更にＬ−ガラクトースデヒドロゲナーゼ（ＬＧＤＨ）活性を有するタンパク質をコードするコード領域によって機能的に形質転換されている、請求項７１に記載の組換え酵母。
【請求項８７】
酵母がＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｃａｎｄｉｄａ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ、Ｄｅｂａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｎａｄｓｏｎｉａ、Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ、Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ、Ｋｌｏｅｃｋｅｒａ、Ｐｉｃｈｉａ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｔｒｉｇｏｎｏｐｓｉｓ、Ｂｒｅｔｔａｎｏｍｙｃｅｓ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ、Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ、Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ、Ｐｈａｆｆｉａ、Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ、Ｙａｒｒｏｗｉａ、およびＳｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓからなる群から選択される属に属する、請求項７１に記載の組換え酵母。
【請求項８８】
酵母がＳ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｋ ｌａｃｔｉｓ、またはＺ． ｂａｉｌｉｉ種に属する、請求項８７に記載の組換え酵母。
【請求項８９】
Ｌ−ガラクトースデヒドロゲナーゼ（ＬＧＤＨ）活性を有するタンパク質が配列番号：１１と少なくとも約７０％の類似性を有するアミノ酸配列を有し、Ｌ−ガラクトノ−１，４−ラクトンデヒドロゲナーゼ（ＡＧＤ）活性を有するタンパク質が配列番号：１または配列番号：３と少なくとも約７０％の類似性を有するアミノ酸配列を有し、Ｄ−アラビノースデヒドロゲナーゼ（ＡＲＡ）活性を有するタンパク質が配列番号：２０と少なくとも約７０％の類似性を有するアミノ酸配列を有し、Ｄ−アラビノノ−１，４−ラクトンオキシダーゼ（ＡＬＯ）活性を有するタンパク質が配列番号：５または配列番号：７と少なくとも約７０％の類似性を有するアミノ酸配列を有し、Ｌ−グロノ−１，４−ラクトンオキシダーゼ（ＧＬＯ）活性を有するタンパク質が配列番号：９と少なくとも約７０％の類似性を有するアミノ酸配列を有し、アルドノラクトナーゼ（ＡＬ）活性を有するタンパク質が配列番号：２９と少なくとも約７０％の類似性を有するアミノ酸配列を有する、請求項７１に記載の組換え酵母。
【請求項９０】
Ｌ−ガラクトースデヒドロゲナーゼ（ＬＧＤＨ）活性を有するタンパク質が配列番号：１１と少なくとも約７０％の同一性を有するアミノ酸配列を有し、Ｌ−ガラクトノ−１，４−ラクトンデヒドロゲナーゼ（ＡＧＤ）活性を有するタンパク質が配列番号：１または配列番号：３と少なくとも約７０％の同一性を有するアミノ酸配列を有し、Ｄ−アラビノースデヒドロゲナーゼ（ＡＲＡ）活性を有するタンパク質が配列番号：２０と少なくとも約７０％の同一性を有するアミノ酸配列を有し、Ｄ−アラビノノ−１，４−ラクトンオキシダーゼ（ＡＬＯ）活性を有するタンパク質が配列番号：５または配列番号：７と少なくとも約７０％の同一性を有するアミノ酸配列を有し、Ｌ−グロノ−１，４−ラクトンオキシダーゼ（ＧＬＯ）活性を有するタンパク質が配列番号：９と少なくとも約７０％の同一性を有するアミノ酸配列を有し、アルドノラクトナーゼ（ＡＬ）活性を有するタンパク質が配列番号：２９と少なくとも約７０％の同一性を有するアミノ酸配列を有する、請求項７１に記載の組換え酵母。
【請求項９１】
Ｌ−ガラクトースデヒドロゲナーゼ（ＬＧＤＨ）活性を有するタンパク質をコードするコード領域が配列番号：１２と少なくとも約７０％の同一性を有するヌクレオチド配列を有し、Ｌ−ガラクトノ−１，４−ラクトンデヒドロゲナーゼ（ＡＧＤ）活性を有するタンパク質をコードするコード領域が配列番号：２または配列番号：４のヌクレオチド５６〜１８５８と少なくとも約７０％の同一性を有するヌクレオチド配列を有し、Ｄ−アラビノースデヒドロゲナーゼ（ＡＲＡ）活性を有するタンパク質をコードするコード領域が配列番号：２１のヌクレオチド２８５〜１３１９と少なくとも約７０％の同一性を有するヌクレオチド配列を有し、Ｄ−アラビノノ−１，４−ラクトンオキシダーゼ（ＡＬＯ）活性を有するタンパク質をコードするコード領域が配列番号：６または配列番号：８のヌクレオチド４〜１５８４と少なくとも約７０％の同一性を有するヌクレオチド配列を有し、Ｌ−グロノ−１，４−ラクトンオキシダーゼ（ＧＬＯ）活性を有するタンパク質をコードするコード領域が配列番号：１０のヌクレオチド２４〜１３４６と少なくとも約７０％の同一性を有し、アルドノラクトナーゼ（ＡＬ）活性を有するタンパク質をコードするコード領域が配列番号：３０と少なくとも約７０％の同一性を有するヌクレオチド配列をする、請求項７１に記載の組換え酵母。
【請求項９２】
コード領域が、配列番号：１２に記載のポリヌクレオチドの相補性鎖にハイブリダイズするＬＧＤＨ活性を有するタンパク質をコードするコード領域、配列番号：２に記載のポリヌクレオチドまたは配列番号：４のヌクレオチド５６〜１８５８に記載のポリヌクレオチドの相補性鎖にハイブリダイズするＡＧＤ活性を有するタンパク質をコードするコード領域、 配列番号：２１のヌクレオチド２８５〜１３１９に記載のポリヌクレオチドの相補性鎖にハイブリダイズするＡＲＡ活性を有するタンパク質をコードするコード領域、配列番号：６に記載のポリヌクレオチドまたは配列番号：８のヌクレオチド４〜１５８４に記載のポリヌクレオチドの相補性鎖にハイブリダイズするＡＬＯ活性を有するタンパク質をコードするコード領域、配列番号：１０のヌクレオチド２４〜１３４６に記載のポリヌクレオチドの相補性鎖にハイブリダイズするＧＬＯ活性を有するタンパク質をコードするコード領域、および配列番号：３０に記載のポリヌクレオチドの相補性鎖にハイブリダイズするＡＬ活性を有するタンパク質をコードするコード領域から選択され、該コード領域が緊縮ハイブリダイゼーション条件下でポリヌクレオチドの相補性鎖にハイブリダイズする、請求項７１に記載の組換え酵母。
【請求項９３】
タンパク質が、ＬＧＤＨ活性および配列番号：１１を有する酵素の免疫学的特性を有する酵素、ＡＧＤ活性および配列番号：１または配列番号：３を有する酵素の免疫学的特性を有する酵素、ＡＲＡ活性および配列番号：２０を有する酵素の免疫学的特性を有する酵素、ＡＬＯ活性および配列番号：５または配列番号：７を有する酵素の免疫学的特性を有する酵素、ＧＬＯ活性および配列番号：９を有する酵素の免疫学的特性を有する酵素、ＡＬ活性および配列番号：２９を有する酵素の免疫学的特性を有する酵素から選択される、請求項７１に記載の組換え酵母。
【請求項９４】
酵母がＤ−アラビノースデヒドロゲナーゼ（ＡＲＡ）活性を有するタンパク質をコードするコード領域によって機能的に形質転換されており、該タンパク質がアミノ酸配列ＧＸＲＸＸＤＸＡＸＸＸＸＸＥＸＸＸＧ（配列番号：１３）およびＧＸＸＮ（配列番号：２６）を含んでなるアミノ酸配列を有する、請求項７１に記載の組換え酵母。
【請求項９５】
コード領域が酵母で活性なプロモーターに機能的に結合している、請求項７１に記載の組換え酵母。
【請求項９６】
プロモーターがＳ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅトリオースホスフェートイソメラーゼ（ＴＰＩ）プロモーターである、請求項９５に記載の組換え酵母。
【請求項９７】
酵母が炭素供給源のＬ−ガラクトース、Ｌ−グロノ−１，４−ラクトン、またはＬ−グロン酸への転換と関連した酵素活性を有するタンパク質をコードする少なくとも１個のコード領域によって更に機能的に形質転換されている、請求項７１に記載の組換え酵母。
【請求項９８】
アスコルビン酸またはその塩を生成する方法であって、
少なくとも１種類のアスコルビン酸前駆体を含んでなる培地中で、アスコルビン酸前駆体の少なくとも約２５％をアスコルビン酸またはその塩に転換することができる組換え酵母を培養することによって、アスコルビン酸またはその塩を形成させ、
アスコルビン酸またはその塩を単離する
ことを含んでなる、方法。
【請求項９９】
アスコルビン酸前駆体が単糖類、オリゴ糖類、多糖類、 Ｃ１〜Ｃ６アルコール、Ｃ２〜Ｃ６ポリオール、有機酸、およびＣ５〜Ｃ６ラクトンからなる群から選択される、請求項９８に記載の方法。
【請求項１００】
アスコルビン酸前駆体がトレハロース、ラフィノース、エタノール、キシロース、キシルロース、マルトース、グリセロール、フルクトース、アラビノース、Ｄ−グルコース−６−Ｐ、Ｄ−グルコース−１−Ｐ、ＵＤＰ−Ｄ−グルコース、ＵＤＰ−グルクロン酸、Ｄ−グルクロン酸−１−Ｐ、Ｄ−グルクロン酸、Ｄ−グルクロノラクトン、Ｌ−グロン酸、Ｄ−フルクトース−６−Ｐ、Ｄ−マンノース−６−Ｐ、Ｄ−マンノース−１−Ｐ、 ＧＤＰ−Ｄ−マンノース、ＧＤＰ−Ｌ−ガラクトース、Ｌ−ガラクトース−１−Ｐ、ラクトース、スクロース、澱粉、セルロース、 クエン酸塩、メタノール、ホルムアルデヒド、ギ酸塩、メチルアミン、アラニン、オレイン酸、Ｌ−ガラクトノ−１，４−ラクトン、Ｄ−グルコース、Ｌ−グロノ−１，４−ラクトン、Ｌ−ガラクトース、およびＬ−グロン酸からなる群から選択される、請求項９８に記載の方法。
【請求項１０１】
アスコルビン酸前駆体がＬ−グロン酸、Ｌ−ガラクトノ−１，４−ラクトン、Ｄ−グルコース、Ｌ−グロノ−１，４−ラクトン、およびＬ−ガラクトースからなる群から選択される、請求項９８に記載の方法。
【請求項１０２】
単離工程が酵母のリーシスを含んでなる、請求項９８に記載の方法。
【請求項１０３】
単離工程が、更に遠心分離、濾過、精密濾過、限外濾過、ナノ濾過、液−液抽出、結晶化、ヌクレアーゼまたはプロテアーゼを用いる酵素処理、またはクロマトグラフィーを含んでなる、請求項１０２に記載の方法。
【請求項１０４】
培養工程がアスコルビン酸を培地中にバックグラウンドより高い濃度で蓄積することを含んでなる、請求項９８に記載の方法。
【請求項１０５】
単離工程がクロマトグラフィー、活性炭、精密濾過、限外濾過、ナノ濾過、液−液抽出、または結晶化を含んでなる、請求項１０４に記載の方法。
【請求項１０６】
培養工程がアスコルビン酸を培地中に少なくとも約２０ｍｇ／Ｌの最終濃度で蓄積することを含んでなる、請求項９８に記載の方法。
【請求項１０７】
培養工程がアスコルビン酸を培地中に少なくとも約４０ｍｇ／Ｌの最終濃度で蓄積することを含んでなる、請求項９８に記載の方法。
【請求項１０８】
培養工程がアスコルビン酸を培地中に少なくとも約７０ｍｇ／Ｌの最終濃度で蓄積することを含んでなる、請求項９８に記載の方法。
【請求項１０９】
組換え酵母が前駆体の少なくとも約３５％をアスコルビン酸に転換することができる、請求項９８に記載の方法。
【請求項１１０】
組換え酵母が前駆体の少なくとも約４０％をアスコルビン酸に転換することができる、請求項９８に記載の方法。
【請求項１１１】
酵母がＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｃａｎｄｉｄａ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ、Ｄｅｂａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｎａｄｓｏｎｉａ、Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ、Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ、Ｋｌｏｅｃｋｅｒａ、Ｐｉｃｈｉａ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｔｒｉｇｏｎｏｐｓｉｓ、Ｂｒｅｔｔａｎｏｍｙｃｅｓ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ、Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ、Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ、Ｐｈａｆｆｉａ、Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ、Ｙａｒｒｏｗｉａ、およびＳｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓからなる群から選択される属に属する、請求項９８に記載の方法。
【請求項１１２】
酵母がＳ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｋ ｌａｃｔｉｓ、またはＺ． ｂａｉｌｉｉ種に属する、請求項１１１に記載の方法。
【請求項１１３】
組換え酵母がＬ−ガラクトースデヒドロゲナーゼ（ＬＧＤＨ）、Ｌ−ガラクトノ−１，４−ラクトンデヒドロゲナーゼ（ＡＧＤ）、Ｄ−アラビノースデヒドロゲナーゼ（ＡＲＡ）、Ｄ−アラビノノ−１，４−ラクトンオキシダーゼ（ＡＬＯ）、Ｌ−グロノ−１，４−ラクトンオキシダーゼ（ＧＬＯ）、およびアルドノラクトナーゼ（ＡＬ）からなる群から選択される酵素活性を有するタンパク質をコードする少なくとも１個のコード領域によって機能的に形質転換されている、請求項９８に記載の方法。
【請求項１１４】
酵母がＤ−アラビノノ−１，４−ラクトンオキシダーゼ（ＡＬＯ）活性を有するタンパク質をコードするコード領域によって機能的に形質転換されており、且つ更にＬ−ガラクトースデヒドロゲナーゼ（ＬＧＤＨ）活性を有するタンパク質をコードするコード領域によって機能的に形質転換されている、請求項１１３に記載の方法。
【請求項１１５】
酵母がＤ−アラビノノ−１，４−ラクトンオキシダーゼ（ＡＬＯ）活性を有するタンパク質をコードするコード領域およびＤ−アラビノースデヒドロゲナーゼ（ＡＲＡ）活性を有するタンパク質をコードするコード領域によって機能的に形質転換されている、請求項１１３に記載の方法。
【請求項１１６】
酵母がＬ−グロノ−１，４−ラクトンオキシダーゼ（ＧＬＯ）活性を有するタンパク質をコードするコード領域およびアルドノラクトナーゼ（ＡＬ）活性を有するタンパク質をコードするコード領域によって機能的に形質転換されている、請求項１１３に記載の方法。
【請求項１１７】
酵母がＬ−ガラクトノ−１，４−ラクトンデヒドロゲナーゼ（ＡＧＤ）活性を有するタンパク質をコードするコード領域によって機能的に形質転換されており、且つ更にＬ−ガラクトースデヒドロゲナーゼ（ＬＧＤＨ）活性を有するタンパク質をコードするコード領域によって機能的に形質転換されている、請求項１１３に記載の方法。
【請求項１１８】
（ＡＧＤ）活性を有するタンパク質がシグナル形成ペプチドを含んでなる、請求項１１３に記載の方法。
【請求項１１９】
（ＡＧＤ）活性を有するタンパク質がシグナル形成ペプチドを含まない、請求項１１３に記載の方法。
【請求項１２０】
Ｌ−ガラクトースデヒドロゲナーゼ（ＬＧＤＨ）活性を有するタンパク質が配列番号：１１と少なくとも約７０％の類似性を有するアミノ酸配列を有し、Ｌ−ガラクトノ−１，４−ラクトンデヒドロゲナーゼ（ＡＧＤ）活性を有するタンパク質が配列番号：１または配列番号：３と少なくとも約７０％の類似性を有するアミノ酸配列を有し、Ｄ−アラビノースデヒドロゲナーゼ（ＡＲＡ）活性を有するタンパク質が配列番号：２０と少なくとも約７０％の類似性を有するアミノ酸配列を有し、Ｄ−アラビノノ−１，４−ラクトンオキシダーゼ（ＡＬＯ）活性を有するタンパク質が配列番号：５または配列番号：７と少なくとも約７０％の類似性を有するアミノ酸配列を有し、Ｌ−グロノ−１，４−ラクトンオキシダーゼ（ＧＬＯ）活性を有するタンパク質が配列番号：９と少なくとも約７０％の類似性を有するアミノ酸配列を有し、アルドノラクトナーゼ（ＡＬ）活性を有するタンパク質が配列番号：２９と少なくとも約７０％の類似性を有するアミノ酸配列を有する、請求項１１３に記載の方法。
【請求項１２１】
Ｌ−ガラクトースデヒドロゲナーゼ（ＬＧＤＨ）活性を有するタンパク質が配列番号：１１と少なくとも約７０％の同一性を有するアミノ酸配列を有し、Ｌ−ガラクトノ−１，４−ラクトンデヒドロゲナーゼ（ＡＧＤ）活性を有するタンパク質が配列番号：１または配列番号：３と少なくとも約７０％の同一性を有するアミノ酸配列を有し、Ｄ−アラビノースデヒドロゲナーゼ（ＡＲＡ）活性を有するタンパク質が配列番号：２０と少なくとも約７０％の同一性を有するアミノ酸配列を有し、Ｄ−アラビノノ−１，４−ラクトンオキシダーゼ（ＡＬＯ）活性を有するタンパク質が配列番号：５または配列番号：７と少なくとも約７０％の同一性を有するアミノ酸配列を有し、Ｌ−グロノ−１，４−ラクトンオキシダーゼ（ＧＬＯ）活性を有するタンパク質が配列番号：９と少なくとも約７０％の同一性を有するアミノ酸配列を有し、アルドノラクトナーゼ（ＡＬ）活性を有するタンパク質が配列番号：２９と少なくとも約７０％の同一性を有するアミノ酸配列を有する、請求項１１３に記載の方法。
【請求項１２２】
Ｌ−ガラクトースデヒドロゲナーゼ（ＬＧＤＨ）活性を有するタンパク質をコードするコード領域が配列番号：１２と少なくとも約７０％の同一性を有するヌクレオチド配列を有し、Ｌ−ガラクトノ−１，４−ラクトンデヒドロゲナーゼ（ＡＧＤ）活性を有するタンパク質をコードするコード領域が配列番号：２または配列番号：４のヌクレオチド５６〜１８５８と少なくとも約７０％の同一性を有するヌクレオチド配列を有し、Ｄ−アラビノースデヒドロゲナーゼ（ＡＲＡ）活性を有するタンパク質をコードするコード領域が配列番号：２１のヌクレオチド２８５〜１３１９と少なくとも約７０％の同一性を有するヌクレオチド配列を有し、Ｄ−アラビノノ−１，４−ラクトンオキシダーゼ（ＡＬＯ）活性を有するタンパク質をコードするコード領域が配列番号：６ または配列番号：８のヌクレオチド４〜１５８４と少なくとも約７０％の同一性を有するヌクレオチド配列を有し、Ｌ−グロノ−１，４−ラクトンオキシダーゼ（ＧＬＯ）活性を有するタンパク質をコードするコード領域が配列番号：１０のヌクレオチド２４〜１３４６と少なくとも約７０％の同一性を有し、アルドノラクトナーゼ（ＡＬ）活性を有するタンパク質をコードするコード領域が配列番号：３０と少なくとも約７０％の同一性を有するヌクレオチド配列を有する、請求項１１３に記載の方法。
【請求項１２３】
コード領域が、配列番号：１２に記載のポリヌクレオチドの相補性鎖にハイブリダイズするＬＧＤＨ活性を有するタンパク質をコードするコード領域、配列番号：２に記載のポリヌクレオチドまたは配列番号：４のヌクレオチド５６〜１８５８に記載のポリヌクレオチドの相補性鎖にハイブリダイズするＡＧＤ活性を有するタンパク質をコードするコード領域、配列番号：２１のヌクレオチド２８５〜１３１９に記載のポリヌクレオチドの相補性鎖にハイブリダイズするＡＲＡ活性を有するタンパク質をコードするコード領域、配列番号：６に記載のポリヌクレオチドまたは配列番号：８のヌクレオチド４〜４５８４に記載のポリヌクレオチドの相補性鎖にハイブリダイズするＡＬＯ活性を有するタンパク質をコードするコード領域、配列番号：１０のヌクレオチド２４〜１３４６に記載のポリヌクレオチドの相補性鎖にハイブリダイズするＧＬＯ活性を有するタンパク質をコードするコード領域、および配列番号：３０に記載のポリヌクレオチドの相補性鎖にハイブリダイズするＡＬ活性を有するタンパク質をコードするコード領域から選択され、該コード領域が緊縮ハイブリダイゼーション条件下でポリヌクレオチドの相補性鎖にハイブリダイズする、請求項１１３に記載の方法。
【請求項１２４】
タンパク質が、ＬＧＤＨ活性および配列番号：１１を有する酵素の免疫学的特性を有する酵素、ＡＧＤ活性および配列番号：１または配列番号：３を有する酵素の免疫学的特性を有する酵素、ＡＲＡ活性および配列番号：２０を有する酵素の免疫学的特性を有する酵素、ＡＬＯ活性および配列番号：５または配列番号：７を有する酵素の免疫学的特性を有する酵素、ＧＬＯ活性および配列番号：９を有する酵素の免疫学的特性を有する酵素、およびＡＬ活性および配列番号：２９を有する酵素の免疫学的特性を有する酵素から選択される、請求項１１３に記載の方法。
【請求項１２５】
酵母がＤ−アラビノースデヒドロゲナーゼ（ＡＲＡ）活性を有するタンパク質をコードするコード領域によって機能的に形質転換されており、該タンパク質がアミノ酸配列ＧＸＲＸＸＤＸＡＸＸＸＸＸＥＸＸＸＧ（配列番号：１３）およびＧＸＸＮ（配列番号：２６）を含んでなるアミノ酸配列を有する、請求項１１３に記載の方法。
【請求項１２６】
コード領域が酵母中で活性なプロモーターに機能的に結合している、請求項１１３に記載の方法。
【請求項１２７】
プロモーターがＳ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅトリオースホスフェートイソメラーゼ（ＴＰＩ）プロモーターである、請求項１２６に記載の方法。
【請求項１２８】
酵母が、炭素供給源のＬ−ガラクトース、Ｌ−グロノ−１，４−ラクトン、またはＬ−グロン酸への転換に関連した酵素活性を有するタンパク質をコードする少なくとも１個のコード領域によって更に機能的に形質転換されている、請求項１１３に記載の方法。
【請求項１２９】
アスコルビン酸を生成する方法であって、
Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ種またはＺｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ種の酵母をアスコルビン酸前駆体を含んでなる培地で培養することによってアスコルビン酸を形成させ、
アスコルビン酸を単離する、方法。
【請求項１３０】
組換え酵母であって、Ｌ−ガラクトースデヒドロゲナーゼ（ＬＧＤＨ）、Ｌ−ガラクトノ−１，４−ラクトンデヒドロゲナーゼ（ＡＧＤ）、Ｄ−アラビノースデヒドロゲナーゼ（ＡＲＡ）、Ｄ−アラビノノ−１，４−ラクトンオキシダーゼ（ＡＬＯ）、Ｌ−グロノ−１，４−ラクトンオキシダーゼ（ＧＬＯ）、およびアルドノラクトナーゼ（ＡＬ）からなる群から選択される酵素活性を有するタンパク質をコードする少なくとも１個のコード領域によって機能的に形質転換されており、且つ酵母を少なくとも１種類のアスコルビン酸前駆体を含んでなる培地中で培養するとき、少なくとも約２０ｍｇのアスコルビン酸／リットル培地を産生することができることを特徴とする、酵母。
【請求項１３１】
アスコルビン酸またはその塩を生成する方法であって、
少なくとも１種類のアスコルビン酸前駆体を含んでなる培地でアスコルビン酸前駆体をアスコルビン酸またはその塩に転換することができる組換え酵母を培養することによってアスコルビン酸またはその塩を形成させ、酵母が少なくとも約２０ｍｇのアスコルビン酸／リットル培地を産生することができ、
アスコルビン酸またはその塩を単離する
ことを含んでなる、方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の背景
１．発明の分野
本発明は、一般的にはアスコルビン酸生産の分野に関する。更に詳細には、本発明は、組換え酵母などの酵母からＬ−アスコルビン酸を産生する方法に関する。
【０００２】
２．関連技術の説明
Ｌ−アスコルビン酸（ビタミンＣ）は、ヒトのあらゆる種類の組織の成長および維持に極めて重要な、強力な水溶性の酸化防止剤である（Ｐａｄｈ Ｈ．， １９９０， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． ６８， １１６６−１１７３）。アスコルビン酸の重要な役割は、結合組織、筋肉、腱、骨、歯および皮膚の本質的な細胞成分であるコラーゲンの産生に関与していることである。コラーゲンは、血管、打撲傷および骨折の修復にも必要とされる。アスコルビン酸は血圧の調節を助け、コレステロール濃度の減少に寄与し、動脈壁からコレステロール付着物の除去を促進する。アスコルビン酸はまた、葉酸の代謝を促進し、鉄の摂取を調節し、アミノ酸であるＬ−チロシンおよびＬ−フェニルアラニンのノルアドレナリンへの転換に必要である。睡眠、苦痛の制御および安寧に関与する神経ホルモンであるセロトニンへのトリプトファンの転換でも、アスコルビン酸の適度な供給が必要とされる。
【０００３】
Ｌ−アスコルビン酸が欠乏すると、コラーゲンの産生が損なわれて、関節痛、貧血症、神経質および成長の遅れが生じる可能性がある。他の影響は、免疫応答が減少し、感染症への羅病性が増加することである。アスコルビン酸欠損の最も極端な形態は、関節の腫脹、歯ぐきの出血、および皮膚表面下の毛細血管の出血によって証明される疾患である壊血病である。
【０００４】
腸はアスコルビン酸を容易に吸収するが、これは摂取から２〜４時間以内に尿中に排泄される。従って、これを体内に蓄積することはできない。Ｌ−アスコルビン酸はあらゆる高等植物およびほとんどの高等動物の肝臓または腎臓で産生されるが、ヒト、コウモリ、ある種の鳥類、および様々な魚類では産生されない。従って、ヒトは、健康を最適に維持するために適当な食事供給源または栄養補助食品から十分な量のアスコルビン酸を摂取しなければならない。
【０００５】
アスコルビン酸の食物供給源としては、柑橘系果物、ジャガイモ、胡椒類、緑葉野菜、トマト、およびイチゴ類が挙げられる。アスコルビン酸は、丸剤、錠剤、散剤、カシェ剤、およびシロップのような形態の栄養補助食品としても市販されている。
【０００６】
Ｌ−アスコルビン酸は、アメリカ合衆国食品医薬品局によって食事栄養補助食品および防腐剤化合物としての使用が承認されており、安全であると一般に認められている物質のＦＤＡリストに載っている。Ｌ−アスコルビン酸は、香味料成分の酸化防止剤として清涼飲料に、保存処理およびピックリングのために食肉および食肉含有製品に、ベーキング品質を向上させる目的で小麦粉に、安定剤としてビールに、酸化防止剤として油脂に、およびアスコルビン酸強化の目的で多種多様な食物に用いることができる。Ｌ−アスコルビン酸は、染み抜き剤、ヘアケア製品、プラスチック製造、写真、および水処理に用いることもできる。
【０００７】
アスコルビン酸を生じる生合成経路の酵素は、未だ完全には同定されていない。植物および動物での生理学的経路の現在明らかになっているものを、図１に示す。
【０００８】
動物では、Ｄ−グルコースが第一の前駆体として働き、最終段階はミクロソームのＬ−グロノ−１，４−ラクトンオキシダーゼによって触媒される。この酵素は、様々な供給源から単離され、特性決定されている。ラット由来のその遺伝子はクローニングされ、配列決定されている（Ｋｏｓｈｉｚａｋａ Ｔ． ｅｔ ａｌ．， １９８８， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６３， １６１９−１６２１）。
【０００９】
植物でのアスコルビン酸合成について、２種類の別個な経路が報告されている。一つの経路では、Ｌ−アスコルビン酸は、Ｄ−グルコースからＬ−ソルボソンを介して合成される（Ｌｏｅｗｕｓ Ｍ． Ｗ． ｅｔ ａｌ．， １９９０， Ｐｌａｎｔ． Ｐｈｙｓｉｏｌ． ９４， １４９２−１４９５）。現在明らかになっている事実は、主要な生理学的経路がＤ−グルコースからＬ−ガラクトースおよびＬ−ガラクトノ−１，４−ラクトンを経てＬ−アスコルビン酸へ進行することを示唆している（Ｗｈｅｅｌｅｒ Ｇ． Ｌ． ｅｔ ａｌ． １９９８， Ｎａｔｕｒｅ， ３９３， ３６５−３６９）。最後の２段階は、酵素Ｌ−ガラクトースデヒドロゲナーゼおよびＬ−ガラクトノ−１，４−ラクトンデヒドロゲナーゼによって触媒される。またこの場合には、最後の酵素が単離されて特性決定されており、またＢｒａｓｓｉｃａ ｏｌｅｒａｃｅａ由来のその遺伝子がクローニングされ、配列決定されている（Ｏｓｔｅｒｇａａｒｄ Ｊ． ｅｔ ａｌ． １９９７， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２７２， ３０００９−３００１６）。
【００１０】
食事栄養補助食品として使用する目的で、アスコルビン酸は天然供給源から単離しまたはＲｅｉｃｈｓｔｅｉｎ法の変法におけるようにＬ−ソルボースの酸化によって化学的に合成することができる（米国特許第２，２６５，１２１号明細書）。
【００１１】
適切なプロセスによるアスコルビン酸の製造方法を得ることが依然として望まれている。アスコルビン酸の生産における２つの主要な要件は、アスコルビン酸のＬ−鏡像異性体のみ生物学的に活性があるので合成は鏡像異性体選択的（ｅｎａｎｔｉｏｓｅｌｅｃｔｉｖｅ）であるべきであるということ、およびアスコルビン酸は極めて容易に酸化されるので工程の最終段階の環境は非酸化的であるべきであることである。
【００１２】
一つの可能性のある方法として、微生物からのＬ−アスコルビン酸の産生がある。微生物は、工業的規模で容易に増殖させることができる。微生物および真菌からのＬ−アスコルビン酸の生産はこれまでに報告されてきたが、最近証明された事実によればＬ−アスコルビン酸ではなくＬ−アスコルビン酸類似体が産生されることが明らかになっている（Ｈｕｈ Ｗ． Ｋ． ｅｔ ａｌ． １９９８， Ｍｏｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ３０， ８９５−９０３） （Ｈａｎｃｏｃｋ Ｒ． Ｄ． ｅｔ ａｌ．， ２０００， ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｌｅｔ． １８６， ２４５−２５０） （Ｄｕｍｂｒａｖａ Ｖ． Ａ． ｅｔ ａｌ． １９８７， ＢＢＡ ９２６， ３３１−３３８）。酵母（ＣａｎｄｉｄａおよびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ種）では、エリトロアスコルビン酸の産生が報告されている（Ｈｕｈ Ｗ． Ｋ． ｅｔ ａｌ．， １９９４， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ， ２２５， １０７３−１０７９） （Ｈｕｈ Ｗ． Ｋ． ｅｔ ａｌ．， １９９８， Ｍｏｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ３０， ４， ８９５−９０３）。このような酵母では、Ｄ−グルコースからＤ−アラビノースおよびＤ−アラビノノ−１，４−ラクトンを経てエリトロアスコルビン酸へと進行する生理学的経路が提案されている（Ｋｉｍ Ｓ． Ｔ． ｅｔ ａｌ．， １９９６， ＢＢＡ， １２９７， １−８）。Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ並びにＳ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来の酵素Ｄ−アラビノースデヒドロゲナーゼおよびＤ−アラビノノ−１，４−ラクトンオキシダーゼが特性決定されている。興味深いことには、Ｌ−ガラクトースおよびＬ−ガラクトノ−１，４−ラクトンが、イン・ビトロでのこれらの活性の基質である。
【００１３】
Ｌ−アスコルビン酸のイン・ビボ産生は、野生型Ｃａｎｄｉｄａ細胞にＬ−ガラクトノ−１，４−ラクトンを供給することによって達成された（国際特許出願ＷＯ８５／０１７４５号明細書）。最近、野生型のＳ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞は、Ｌ−ガラクトース、Ｌ−ガラクトノ−１，４−ラクトン、またはＬ−グロノ−１，４−ラクトンとインキュベーションすると細胞内にＬ−アスコルビン酸を蓄積することが示された（Ｈａｎｃｏｃｋ ｅｔ ａｌ．， ２０００， ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｌｅｔｔ． １８６， ２４５−２５０） （Ｓｐｉｃｋｅｔｔ Ｃ． Ｍ． ｅｔ ａｌ．， ２０００， Ｆｒｅｅ Ｒａｄ． Ｂｉｏｌ． Ｍｅｄ． ２８， １８３−１９２）。
【００１４】
Ｌ−ガラクトノ−１，４−ラクトンとインキュベーションした野生型Ｃａｎｄｉｄａ細胞は培地にＬ−アスコルビン酸を蓄積し、この酵母は細胞内に蓄積されたＬ−アスコルビン酸を放出する生物学的機構を有することを示唆しており、実際にＬ−アスコルビン酸は複雑な分子であり、培地中でのその蓄積は単純な拡散工程には関係せず、促進または能動輸送に依存していると考えるのが化学的に合理的である。この結論は、高等真核（哺乳類）細胞におけるＬ−アスコルビン酸輸送体の同定および特性決定によって支持されている（Ｄａｒｕｗａｌａ Ｒ． ｅｔ ａｌ．， １９９９， ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ． ４６０， ４８０−４８４）。しかしながら、Ｌ−アスコルビン酸塩輸送体は酵母属では報告されていない。それにも拘わらず、Ｌ−ガラクトノ−１，４−ラクトンを含む培地で成長するＣａｎｄｉｄａ細胞は培地にＬ−アスコルビン酸を蓄積する一方、アスコルビン酸前駆体の存在下でインキュベーションしたＳ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞由来のＬ−アスコルビン酸の培地中での蓄積は意外なことには報告されていない。
【００１５】
アスコルビン酸の大規模生産の有望な方法は、遺伝子工学処理した微生物（すなわち、組換え微生物）の使用を含んでなる。原核および真核微生物のいずれもが、今日では異種タンパク質の産生および異種代謝物の産生に容易に用いられ、好結果をもたらしている。原核生物では、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉおよびＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓが用いられることが多い。真核生物では、酵母Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅおよびＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓが用いられることが多い。これらの宿主の際立った成功にも拘わらず、形質転換微生物細胞によるＬ−アスコルビン酸の産生については一例しか報告されていない。真核細胞だけが天然Ｌ−アスコルビン酸プロデューサーであるので、Ｌ−アスコルビン酸の細胞内蓄積を生じるのに原核生物の形質転換した微生物宿主しか報告されていないことは更に意外なことである。Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ． （Ａｐｐｌ． Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．， １９９９， ６５， ４６８５−４６８７）は、Ｄ−アラビノノ−１，４−ラクトンオキシダーゼをコードするＳ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ遺伝子をＥ． ｃｏｌｉにクローニングすることにより、Ｌ−ガラクトノ−１，４−ラクトンとインキュベーションしたＥ． ｃｏｌｉからＬ−アスコルビン酸を産生することができることを示した。Ｌ−アスコルビン酸の蓄積は、細胞内レベルでのみ観察された。
【００１６】
形質転換した真核微生物からのＬ−アスコルビン酸の産生については、文献には実験データーは記載されていない。Ｏｓｔｅｒｇａａｒｄ ｅｔ ａｌ．は、カリフラワー由来のＬ−ガラクトノ−１，４−ラクトンデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子を酵母Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅでクローニングした（Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， １９９７， ２７２， ３０００９−３００１６）。イン・ビトロでは、その著者らは酵母細胞抽出物中にＬ−ガラクトノ−１，４−ラクトンデヒドロゲナーゼ活性を見出したが（シトクロムｃ分析法、Ｏｓｔｅｒｇａａｒｄ ｅｔ ａｌ．を参照）、Ｌ−アスコルビン酸の産生はイン・ビボでは立証されなかった。
【００１７】
Ｂｅｒｒｙ ｅｔ ａｌ．は国際特許出願ＷＯ９９／６４６１８号明細書でアスコルビン酸の植物生合成経路の使用の可能性について検討しており、ＧＤＰ−Ｄ−マンノースのＧＤＰ−Ｌ−ガラクトースへの転換を触媒する活性に特に力点が置かれている。しかしながら、この段階を触媒する酵素の特性決定は、詳細には示されていない。過剰発現したＥ． ｃｏｌｉ同族体は不活性であることが分かった。
【００１８】
Ｓｍｉｒｎｏｆｆ ｅｔ ａｌ．はＷＯ９９／３３９９５号明細書で、アスコルビン酸の産生を目的としたＬ−ガラクトースデヒドロゲナーゼの使用を検討している。この酵素をエンドウの種苗から精製し、Ｎ−末端タンパク質配列を決定した。完全な配列は知られておらず、また未だ報告されていない。Ｌ−ガラクトースデヒドロゲナーゼ酵素の部分配列は、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ受入れ番号３５４９６６９由来の未確認推定コード配列のアミノ酸５〜２２と７２％同一であった。
【００１９】
Ｒｏｌａｎｄ ｅｔ ａｌ．は米国特許第４，５９５，６５９号明細書および第４，９１６，０６８号明細書で、Ｌ−ガラクトン基質をＬ−アスコルビン酸に転換する目的で非組換えＣａｎｄｉｄａ株の使用を検討している。Ｒｏｌａｎｄ ｅｔ ａｌ．は、原因酵素をＬ−ガラクトノ−１，４−ラクトンオキシダーゼとして記載した。
【００２０】
ＫｕｍａｒはＷＯ００／３４５０２号明細書で、２−ケト−Ｌ−グロン酸をアスコルビン酸の産生における唯一の炭素供給源として用いることができるＣａｎｄｉｄａ ｂｌａｎｋｉｉおよびＣｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｄｉｍｅｎｎａｅ酵母におけるＬ−アスコルビン酸の産生を検討している。Ｋｕｍａｒは、とりわけＬ−ガラクトノラクトンオキシダーゼを含む経路またはＬ−ガラクトン前駆体の転換による酵母からの産生を除外している。
【００２１】
適切な発酵工程によるアスコルビン酸の生産方法を得ることが依然として望まれている。
【００２２】
発明の概要
一態様では、本発明は、（ｉ）少なくとも１種類のアスコルビン酸前駆体を含んでなる培地でＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ種またはＺｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ種の酵母を培養してアスコルビン酸またはその塩を形成させ、（ｉｉ）アスコルビン酸またはその塩を単離することを含んでなる、アスコルビン酸またはその塩の生成方法に関する。
【００２３】
第二の態様では、本発明は、
アスコルビン酸またはその塩を生成する方法であって、（ｉ）アスコルビン酸前駆体を含んでなる培地で組換え酵母を培養することによってアスコルビン酸またはその塩を形成させ、（ｉｉ）アスコルビン酸またはその塩を単離することを含んでなる、方法に関する。好ましくは、組換え酵母は、アスコルビン酸を培地中でバックグラウンドより高い濃度で蓄積する。また、好ましくは、組換え酵母は、アスコルビン酸を前駆体から約３５％より高い収率で産生する。
【００２４】
第三の態様では、本発明は、培地に加えたまたは酵母によって産生されたアスコルビン酸またはその塩を安定化する方法であって、酵母を培地で培養することを含んでなる、方法に関する。
【００２５】
もう一つの態様は、Ｌ−ガラクトースデヒドロゲナーゼ（ＬＧＤＨ）、Ｌ−ガラクトノ−１，４−ラクトンデヒドロゲナーゼ（ＡＧＤ）、Ｄ−アラビノースデヒドロゲナーゼ（ＡＲＡ）、Ｄ−アラビノノ−１，４−ラクトンオキシダーゼ（ＡＬＯ）、Ｌ−グロノ−１，４−ラクトンオキシダーゼ（ＧＬＯ）、およびアルドノラクトナーゼ（ＡＬ）からなる群から選択される酵素活性を有するタンパク質をコードする少なくとも１個のコード領域によって機能的に形質転換されている組換え酵母に関する。好ましくは、コード領域によって機能的に形質転換されている組換え酵母は、少なくとも（ａ）この酵母を少なくとも１種類のアスコルビン酸前駆体を含んでなる培地で培養するときに少なくとも約２５％のアスコルビン酸前駆体をアスコルビン酸に転換することができ、または（ｂ）この酵母を少なくとも１種類のアスコルビン酸前駆体を含んでなる培地で培養するときに少なくとも約２０ｍｇアスコルビン酸／リットル培地を産生することができる。組換え酵母は、好ましくはＳ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｋ ｌａｃｔｉｓ、またはＺ ｂａｉｌｉｉ種に属する。
【００２６】
更にもう一つの態様は、少なくとも１種類のアスコルビン酸前駆体を含んでなる培地で組換え酵母を培養することによってアスコルビン酸またはその塩を形成させ、アスコルビン酸または組成物の塩を単離することによるアスコルビン酸またはその塩の生成方法に関する。好ましくは、組換え酵母は、（ａ）アスコルビン酸前駆体の少なくとも約２５％をアスコルビン酸またはその塩に転換し、または（ｂ）培養で少なくとも約２０ｍｇのアスコルビン酸／リットル培地を生成することの少なくとも一方を行うことができる。
【００２７】
本発明は、適切な発酵工程によってアスコルビン酸を産生する方法を提供する。
【００２８】
例示態様の説明
一態様では、本発明は、アスコルビン酸またはその塩の生成方法であって、（ｉ）Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ種またはＺｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ種の酵母を少なくとも１種類のアスコルビン酸前駆体を含んでなる培地で培養することによってアスコルビン酸またはその塩を形成させ、（ｉｉ）アスコルビン酸またはその塩を単離することを含んでなる、方法に関する。この方法は、ＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓまたはＺｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属の野生型酵母がアスコルビン酸経路前駆体を含む培地で培養するとき、Ｌ−アスコルビン酸を生成することができるという科学的観察に基づいている。好ましくは、酵母はＺ． ｂａｉｌｉｉまたはＫ． ｌａｃｔｉｓである。更に好ましくは、酵母はＺ． ｂａｉｌｉｉ ＡＴＣＣ ６０４８３、Ｚ． ｂａｉｌｌｉ ＡＴＣＣ ３６９４７、またはＫ． ｌａｃｔｉｓ ＰＭ６−７Ａである。
【００２９】
酵母を培養する培地は、この目的に適している当該技術分野で知られている任意の培地であってよい。培養手法および培地は、当該技術分野で周知である。典型的には、培養は適当な容器中で水性醗酵によって行われるが、これに限定されない。酵母発酵用の典型的な容器の例は、振盪フラスコまたはバイオリアクターを含む。
【００３０】
培地は、酵母の増殖に必要な任意成分およびアスコルビン酸を産生する１種類以上の前駆体を含んでなる。酵母の増殖用の成分およびアスコルビン酸を産生する前駆体は、同一であってもまたは同一でなくともよい。
【００３１】
培地は、グルコースまたは他の炭水化物（例えば、特にスクロース、フルクトース、アラビノース、ラクトース、ガラクトース、マルトース、ラフィノース、エタノール、メタノール、グリセロール、または植物体の加水分解生成物）のような炭素供給源を含んでなる。典型的には、培地は、有機または無機窒素供給源をも含んでなり、培地は、特にアミノ酸、プリン、ピリミジン、コーンスティープリカー、酵母抽出物、タンパク質加水分解生成物、Ｂ複合ビタミンのような水溶性ビタミン、またはＣａ、Ｍｇ、Ｎａ、Ｋ、Ｆｅ、Ｎｉ、Ｃｏ、Ｃｕ、Ｍｎ、ＭｏまたはＺｎの塩化物、塩酸塩、ホスフェートまたは硫酸塩などの無機塩のような成分をも含んでなる。酵母の培養または発酵に有用であることが当業者に知られている他の成分を包含することもできる。培地は、緩衝していてもまたはしていなくともよい。
【００３２】
培地は、アスコルビン酸前駆体をも含んでなる。アスコルビン酸前駆体は、酵母で直接または中間段階を経てＬ−アスコルビン酸に転換することができる任意の化合物である。アスコルビン酸前駆体は、単糖類、オリゴ糖類、多糖類、Ｃ１〜Ｃ６アルコール、Ｃ２〜Ｃ６ポリオール、アミノ酸および脂肪酸などの有機酸、およびＣ５〜Ｃ６ラクトンからなる群から選択することができる。糖類および有機酸は、ホスホリル化しおよび／またはＵＤＰまたはＧＤＰで修飾した糖類および有機酸を含んでなることができる。好ましくは、アスコルビン酸前駆体は、特にトレハロース、キシロース、キシルロース、ラフィノース、エタノール、マルトース、グリセロール、フルクトース、アラビノース、Ｄ−グルコース−６−Ｐ、Ｄ−グルコース−１−Ｐ、 ＵＤＰ−Ｄ−グルコース、ＵＤＰ−グルクロン酸、Ｄ−グルクロン酸−１−Ｐ、Ｄ−グルクロン酸、Ｄ−グルクロノラクトン、Ｌ−グロン酸、 Ｄ−フルクトース−６−Ｐ、Ｄ−マンノース−６−Ｐ、Ｄ−マンノース−１−Ｐ、ＧＤＰ−Ｄ−マンノース、ＧＤＰ−Ｌ−ガラクトース、Ｌ−ガラクトース−１−Ｐ、ラクトース、スクロース、澱粉、セルロース、クエン酸塩、メタノール、ホルムアルデヒド、ギ酸塩、メチルアミン、アラニン、オレイン酸、Ｌ−ガラクトノ−１，４−ラクトン、Ｄ−グルコース、Ｌ−グロノ−１，４−ラクトン、Ｌ−ガラクトース、およびＬ−グロン酸からなる群から選択される。更に好ましくは、アスコルビン酸前駆体は、Ｌ−ガラクトノ−１，４−ラクトン、Ｄ−グルコース、Ｌ−グロノ−１，４−ラクトン、Ｌ−ガラクトース、およびＬ−グロン酸から選択される。２種類以上のアスコルビン酸前駆体を用いることもできる。更に、ある態様では、アスコルビン酸前駆体は酵母を培養するための炭素供給源として働くこともできる。発酵過程中に、酵母はアスコルビン酸前駆体を１以上の段階を介してＬ−アスコルビン酸に転換する。野生型Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ種またはＺｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ種の酵母によって産生されるＬ−アスコルビン酸は、酵母内に蓄積することができる。好ましい培地は、グルコース、ＹＮＢ（酵母窒素ベース）、およびＬ−グロン酸、ガラクトノ−１，４−ラクトン、Ｌ−グロノ−１，４−ラクトンまたはＬ−ガラクトースの少なくとも一つを含んでなる。
【００３３】
培養が所望な濃度のＬ−アスコルビン酸を酵母、培地または両方で産生するのに十分な時間進行した後、Ｌ−アスコルビン酸を単離する。本明細書でアスコルビン酸に関して用いる「単離する」とは、酵母または培地の少なくとも１種類の非アスコルビン酸成分からアスコルビン酸を分離することによって一層高い純度の状態にすることを意味する。好ましくは、単離したアスコルビン酸は、少なくとも約９５％の純度であり、更に好ましくは、少なくとも約９９％の純度である。
【００３４】
Ｌ−アスコルビン酸を酵母から単離するには、酵母を培地から分離した後の単離の第一段階は、典型的には、化学的または酵素処理、ガラスビーズを用いる処理、超音波処理、凍結／融解サイクリング、または他の既知の手法による酵母のリーシスである。Ｌ−アスコルビン酸は、特に遠心分離、濾過、精密濾過、限外濾過、ナノ濾過、液−液抽出、結晶化、ヌクレアーゼまたはプロテアーゼを用いる酵素処理、またはクロマトグラフィーのような適当な手法によって酵母溶解物の膜、タンパク質、核酸および他の画分から精製することができる。
【００３５】
培地に蓄積したＬ−アスコルビン酸を単離するには、単離は培地からのアスコルビン酸の精製を含んでなる。精製は、特にイオン交換樹脂、活性炭、精密濾過、限外濾過、ナノ濾過、液−液抽出、結晶化、またはクロマトグラフィーの使用などの既知の手法によって行うことができる。
【００３６】
Ｌ−アスコルビン酸、酵母および培地の両方から単離することができる。
【００３７】
酵母が培養工程中に培地にＬ−アスコルビン酸を蓄積する場合には、好ましくは、Ｌ−アスコルビン酸の濃度を安定化しまたは増加させる。更に一層好ましくは、培地のＬ−アスコルビン酸は、生育可能な酵母の存在によって安定化される。
【００３８】
第二の態様では、本発明は、アスコルビン酸の生成方法であって、（ｉ）少なくとも１種類のアスコルビン酸前駆体を含んでなる培地で組換え酵母を培養することによってアスコルビン酸を形成させ、（ｉｉ）アスコルビン酸を単離することを含んでなる、方法に関する。
【００３９】
「組換え」酵母とは、酵母には天然に存在しない核酸配列、または内在核酸配列の単数若しくは複数の追加のコピーを含む酵母であって、核酸配列がヒトの作用によって酵母または原種細胞に導入されるものである。組換えＤＮＡ技術は周知であり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，「分子クローニング：実験室便覧（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓに記載されており、当該技術分野で知られており本明細書で検討される様々な技術に関するなお一層の情報が提供される。この態様では、相同および／または異種遺伝子のコード領域を、この遺伝子を有する生物から単離する。この生物は細菌、原核生物、真核生物、微生物、真菌、植物、または動物であることができる。
【００４０】
コード領域を含んでなる遺伝子材料は、任意の既知手法によって生物の細胞から抽出することができる。その後、コード領域は、任意の適当な手法によって単離することができる。一つの既知手法では、第一にゲノムＤＮＡライブラリーまたはｃＤＮＡライブラリーを調製し、第二にコード領域と少なくとも部分的に相同となるように選択された、若しくは相同であると仮定された標識ヌクレオチドプローブでそのライブラリーをプローブし、コード領域を含んでなるライブラリー微生物に、コード領域の発現によって検出可能な表現型が付与されるかどうかを決定し、またはＰＣＲにより所望な配列を増幅することなどにより、ゲノムＤＮＡライブラリーまたはｃＤＮＡライブラリー中のコード領域を同定することによって、コード領域は単離される。コード領域を単離するための他の既知手法を用いることもできる。
【００４１】
組換え酵母は、酵母の任意の既知の属および種に属することができる。酵母は、Ｎ． Ｊ． Ｗ． Ｋｒｅｇｅｒ−ｖａｎ Ｒｉｊ， 酵母の生物学（Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｙｅａｓｔｓ）の第１巻， 「酵母（Ｔｈｅ Ｙｅａｓｔｓ）」，第２章， Ａ． Ｈ． Ｒｏｓｅ ａｎｄ Ｊ． Ｓ． Ｈａｒｒｉｓｏｎ監修， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， ロンドン， １９８７年に記載されている。例えば、酵母属は特にＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｃａｎｄｉｄａ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ、Ｄｅｂａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｎａｄｓｏｎｉａ、Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ、Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ、Ｋｌｏｅｃｋｅｒａ、Ｐｉｃｈｉａ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｔｒｉｇｏｎｏｐｓｉｓ、Ｂｒｅｔｔａｎｏｍｙｃｅｓ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ、Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ、Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ、Ｐｈａｆｆｉａ、Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ、Ｙａｒｒｏｗｉａ、またはＳｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓであることができる。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ種が好ましい。更に好ましくは、酵母はＳ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｚ ｂａｉｌｉｉおよびＫ． ｌａｃｔｉｓである。更に一層好ましくは、酵母Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＧＲＦ１８ＵまたはＷ３０３１Ｂ株、Ｚ． ｂａｉｌｉｉ ＡＴＣＣ ６０４８３、Ｚ． ｂａｉｌｉｉ ＡＴＣＣ ３６９４７、またはＫ． ｌａｃｔｉｓ ＰＭ６−７Ａである。
【００４２】
好ましくは、 本発明の組換え酵母は、２−ケト−Ｌ−グロン酸．からＬ−アスコルビン酸を産生することができない。
【００４３】
好ましくは、組換え酵母は、酵素をコードする少なくとも１個のコード領域を含んでなり、組換え酵母が機能的に形質転換されており、１以上の段階でアスコルビン酸前駆体をアスコルビン酸塩に転換することができるようになっている。
【００４４】
組換え酵母を培養する培地は、この目的に適することが当該技術分野で知られている任意の培地であることができる。培養技術および培地は、当該技術分野で周知である。典型的には、培養は適当な容器中で水性発酵によって行われるが、これに限定されない。酵母発酵用の典型的な容器の例は、振盪フラスコまたはバイオリアクターを含んでなる。
【００４５】
培地は、酵母の増殖に必要な任意成分およびアスコルビン酸を産生する１種類以上の前駆体を含んでなる。酵母の増殖用の成分およびアスコルビン酸を産生する前駆体は、同一であってもまたは同一でなくともよく、適当な培地成分およびアスコルビン酸前駆体は上記されている。発酵の過程中に、アスコルビン酸前駆体は組換え酵母によってインターナリゼーションされ、１以上の段階を経てＬ−アスコルビン酸に転換される。組換え酵母によって産生されるＬ−アスコルビン酸は酵母内に包含させることができ、または培地にバックグラウンドより高い濃度で蓄積させることができる。
【００４６】
培養が所望な濃度のＬ−アスコルビン酸を酵母、培地または両方で産生するのに十分な時間進行した後、Ｌ−アスコルビン酸を上記のようにして単離する。Ｌ−アスコルビン酸は、酵母および培地のいずれからも単離することができる。上記のように、酵母が培養工程中に培地にＬ−アスコルビン酸を蓄積する場合には、好ましくは、Ｌ−アスコルビン酸の濃度を安定化しまたは増加させる。更に一層好ましくは、培地のＬ−アスコルビン酸は、生育可能な酵母の存在によって安定化される。
【００４７】
本発明の好ましい態様では、組換え酵母に導入された１以上のコード領域が、Ｌ−ガラクトースデヒドロゲナーゼ（ＬＧＤＨ）、Ｌ−ガラクトノ−１，４−ラクトンデヒドロゲナーゼ（ＡＧＤ）、Ｄ−アラビノースデヒドロゲナーゼ（ＡＲＡ）、Ｄ−アラビノノ−１，４−ラクトンオキシダーゼ（ＡＬＯ）、Ｌ−グロノ−１，４−ラクトンオキシダーゼ（ＧＬＯ）、およびアルドノラクトナーゼ（ＡＬ）から選択される少なくとも１種類の酵素をコードする。更に好ましい態様では、Ｌ−ガラクトースデヒドロゲナーゼ（ＬＧＤＨ）、Ｌ−ガラクトノ−１，４−ラクトンデヒドロゲナーゼ（ＡＧＤ）、Ｄ−アラビノースデヒドロゲナーゼ（ＡＲＡ）、Ｄ−アラビノノ−１，４−ラクトンオキシダーゼ（ＡＬＯ）、Ｌ−グロノ−１，４−ラクトンオキシダーゼ（ＧＬＯ）、またはアルドノラクトナーゼ（ＡＬ）のコード領域は、Ａ． ｔｈａｌｉａｎａ、Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｒａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ、またはＺｙｍｏｍｏｎａｓ ｍｏｂｉｌｉｓから単離される。核酸配列に関して本明細書で用いられる「単離される」という用語は、コード領域の直接的供給源ではなく、究極的供給源を表すことに留意すべきである。すなわち、コード領域が生物の細胞から精製した同じタンパク質と実質的に同一のタンパク質配列をコードする場合には、コード領域は生物から「単離される」。更に一層好ましい態様では、ＬＧＤＨおよびＡＧＤをコードするコード領域はＡ． ｔｈａｌｉａｎａから単離され、ＡＬＯおよびＡＲＡをコードするコード領域はＳ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅから単離され、ＧＬＯをコードするコード領域はＲ． ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓから単離され、ＡＬをコードするコード領域はＺ． ｍｏｂｉｌｉｓから単離される。
【００４８】
もう一つの態様は、アスコルビン酸またはその塩の生成方法に関する。この方法は、組換え酵母を少なくとも１種類のアスコルビン酸前駆体を含んでなる培地で培養することによってアスコルビン酸またはその塩を形成させ、アスコルビン酸またはその塩を培養物からを単離することを含んでなる。組換え酵母は、（ａ）アスコルビン酸前駆体の少なくとも約２５％をアスコルビン酸またはその塩に転換し、または（ｂ）少なくとも約２０ｍｇアスコルビン酸／リットル培地を培養物に産生することの少なくとも一方を行うことができる。
【００４９】
ある態様では、組換え酵母は、酵母を培養する培地中でアスコルビン酸前駆体の少なくとも２５％をアスコルビン酸に転換することができる。更に好ましくは、培養した組換え酵母は、培地中の少なくとも１種類のアスコルビン酸前駆体の少なくとも約３５％をアスコルビン酸に転換することができ、最も好ましくは、酵母アスコルビン酸前駆体の少なくとも約４０％をアスコルビン酸に転換することができる。
【００５０】
好ましくは、アスコルビン酸は、少なくとも約２０ｍｇ／リットル培地の最終濃度で、更に好ましくは、少なくとも約４０ｍｇ／リットル培地の最終濃度で、最も好ましくは、少なくとも約７０ｍｇアスコルビン酸／リットル培地の最終濃度で、培地に蓄積される。
【００５１】
組換え酵母は、好ましくは、Ｌ−ガラクトースデヒドロゲナーゼ（ＬＧＤＨ）、Ｌ−ガラクトノ−１，４−ラクトンデヒドロゲナーゼ（ＡＧＤ）、Ｄ−アラビノースデヒドロゲナーゼ（ＡＲＡ）、Ｄ−アラビノノ−１，４−ラクトンオキシダーゼ（ＡＬＯ）、Ｌ−グロノ−１，４−ラクトンオキシダーゼ（ＧＬＯ）、およびアルドノラクトナーゼ（ＡＬ）からなる群から選択される酵素活性を有するタンパク質をコードする少なくとも１個のコード領域によって機能的に形質転換されている。
【００５２】
ある態様では、組換え酵母は、第一の酵素以外の第二の酵素であって、ＬＧＤＨ、ＡＧＤ、ＡＲＡ、ＡＬＯ、ＧＬＯ、およびＡＬから選択される第二の酵素をコードするコード領域によって機能的に形質転換されている。
【００５３】
従って、好ましい態様では、酵母はＡＬＯ酵素をコードするコード領域によって機能的に形質転換されている。もう一つの態様では、酵母はＬＧＤＨ酵素をコードするコード領域によって機能的に形質転換されている。更にもう一つの態様では、酵母はＡＧＤ酵素をコードするコード領域によって機能的に形質転換されている。更にもう一つの態様では、酵母はＧＬＯ酵素をコードするコード領域によって機能的に形質転換されているか、または酵母はＡＬ酵素をコードするコード領域によって機能的に形質転換されている。あるいは、酵母はＡＲＡ酵素をコードするコード領域によって機能的に形質転換されている。
【００５４】
好ましい態様では、酵母はＤ−アラビノノ−１，４−ラクトンオキシダーゼ（ＡＬＯ）活性を有するタンパク質をコードするコード領域によって機能的に形質転換され、且つＬ−ガラクトースデヒドロゲナーゼ（ＬＧＤＨ）活性を有するタンパク質をコードするコード領域によって更に機能的に形質転換されている。
【００５５】
更にもう一つの好ましい態様では、酵母はＤ−アラビノノ−１，４−ラクトンオキシダーゼ（ＡＬＯ）活性を有するタンパク質をコードするコード領域およびＤ−アラビノースデヒドロゲナーゼ（ＡＲＡ）活性を有するタンパク質をコードするコード領域によって機能的に形質転換されている。
【００５６】
更にもう一つの好ましい態様では、酵母はＬ−ガラクトノ−１，４−ラクトンデヒドロゲナーゼ（ＡＧＤ）活性を有するタンパク質をコードするコード領域およびＤ−アラビノースデヒドロゲナーゼ（ＡＲＡ）活性を有するタンパク質をコードするコード領域によって機能的に形質転換されている。ＡＧＤ活性を有するタンパク質は、ある態様ではシグナル形成ペプチドを含んでなることができるが、他の態様ではこれを含まない。
【００５７】
更にもう一つの好ましい態様では、酵母はＬ−ガラクトノ−１，４−ラクトンデヒドロゲナーゼ（ＡＧＤ）活性を有するタンパク質をコードするコード領域およびＬ−ガラクトースデヒドロゲナーゼ（ＬＧＤＨ）活性を有するタンパク質をコードするコード領域によって機能的に形質転換されている。ＡＧＤ活性を有するタンパク質はある態様ではシグナル形成ペプチドを含んでなることができるが、他の態様ではこれを含まない。
【００５８】
もう一つの好ましい態様では、酵母はＬ−グロノ−１，４−ラクトンオキシダーゼ（ＧＬＯ）活性を有するタンパク質をコードするコード領域およびアルドノラクトナーゼ（ＡＬ）活性を有するタンパク質をコードするコード領域によって機能的に形質転換されている。
【００５９】
更に好ましい態様では、組換え酵母は炭素供給源のＬ−ガラクトースへの転換に関連した酵素をコードする少なくとも１個のコード領域をも含んでなる。この酵素は、好ましくはヘキソキナーゼ、グルコース６−ホスフェートイソメラーゼ、マンノース−６−ホスフェートイソメラーゼ、ホスホマンノムターゼ、マンノース−１−ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼ、ＧＤＰ−マンノース−３，５−エピメラーゼ、ＧＤＰ−Ｌ−ガラクトースヒドロラーゼ、およびＬ−ガラクトースホスフェートホスファターゼからなる群から選択される。
【００６０】
更に好ましい態様では、組換え酵母は炭素供給源のＬ−グロン酸への転換に関連した酵素をコードする少なくとも１個のコード領域をも含んでなる。この酵素は、好ましくはヘキソキナーゼ、ホスホグルコムターゼ、ＵＴＰ−グルコース−１−ホスフェートウリジリルトランスフェラーゼ、ＵＤＰ−Ｄ−グルコースデヒドロゲナーゼ、グルクロネート−１−ホスフェートウリジリルトランスフェラーゼ、Ｄ−グルクロノキナーゼ、およびＤ−グルクロネートレダクターゼからなる群から選択される。
【００６１】
もう一つの好ましい態様では、組換え酵母は炭素供給源のＬ−グロノ−１，４−ラクトンへの転換に関連した酵素をコードする少なくとも１個のコード領域をも含んでなる。この酵素は、好ましくはヘキソキナーゼ、ホスホグルコムターゼ、ＵＴＰ−グルコース−１−ホスフェートウリジリルトランスフェラーゼ、ＵＤＰ−Ｄ−グルコースデヒドロゲナーゼ、グルクロネート−１−ホスフェートウリジリルトランスフェラーゼ、Ｄ−グルクロノキナーゼ、ウロノラクトナーゼ、Ｄ−グルクロネートレダクターゼ、およびグルクロノラクトンレダクターゼからなる群から選択される。
【００６２】
もう一つの更に好ましい態様では、ＬＧＤＨ酵素またはＬＧＤＨ活性タンパク質を有するタンパク質のアミノ酸配列は配列番号：１１と少なくとも約７０％、更に好ましくは約８０％、最も好ましくは約９０％の類似性を有し、ＡＧＤ酵素またはＡＧＤ活性を有するタンパク質のアミノ酸配列は配列番号：１または配列番号：３と少なくとも約７０％、更に好ましくは約８０％、最も好ましくは約９０％の類似性を有し、ＡＲＡ酵素またはＡＲＡ活性を有するタンパク質のアミノ酸配列は配列番号：２０と少なくとも約７０％、更に好ましくは約８０％、最も好ましくは約９０％の類似性を有し、ＡＬＯ酵素またはＡＬＯ活性を有するタンパク質のアミノ酸配列は配列番号：５または配列番号：７と少なくとも約７０％、更に好ましくは約８０％、最も好ましくは約９０％の類似性を有し、ＧＬＯ酵素またはＧＬＯ活性を有するタンパク質のアミノ酸配列は配列番号：９と少なくとも約７０％、更に好ましくは約８０％、最も好ましくは約９０％の類似性を有し、ＡＬ酵素またはＡＬ活性を有するタンパク質のアミノ酸配列は配列番号：２９と少なくとも約７０％、更に好ましくは約８０％、最も好ましくは約９０％の類似性を有し、「類似性」はＣＬＵＳＴＡＬプログラムを用いて行われる配列整列によって決定される。
【００６３】
もう一つの更に好ましい態様では、ＬＧＤＨ酵素またはＬＧＤＨ活性を有するタンパク質のアミノ酸配列は配列番号：１１と少なくとも約７０％、更に好ましくは約８０％、最も好ましくは約９０％の同一性を有し、ＡＧＤ酵素またはＡＧＤ活性を有するタンパク質のアミノ酸配列は配列番号：１または配列番号：３と少なくとも約７０％、更に好ましくは約８０％、最も好ましくは約９０％の同一性を有し、ＡＲＡ酵素またはＡＲＡ活性を有するタンパク質のアミノ酸配列は配列番号：２０と少なくとも約７０％、更に好ましくは約８０％、最も好ましくは約９０％の同一性を有し、ＡＬＯ酵素またはＡＬＯ活性を有するタンパク質のアミノ酸配列は配列番号：５または配列番号：７と少なくとも約７０％、更に好ましくは約８０％、最も好ましくは約９０％の同一性を有し、ＧＬＯ酵素ＧＬＯ活性を有するタンパク質のアミノ酸配列は配列番号：９と少なくとも約７０％、更に好ましくは約８０％、最も好ましくは約９０％の同一性を有し、ＡＬ酵素またはＡＬ活性を有するタンパク質のアミノ酸配列は配列番号：２９と少なくとも約７０％、更に好ましくは約８０％、最も好ましくは約９０％の類似性を有し、「同一性」はＣＬＵＳＴＡＬプログラムを用いて行われる配列整列によって決定される。
【００６４】
もう一つの更に好ましい態様では、ＬＧＤＨ酵素またはＬＧＤＨ活性を有するタンパク質をコードするコード領域は配列番号：１２と少なくとも約７０％、更に好ましくは約８０％、最も好ましくは約９０％の同一性を有し、ＡＧＤ酵素またはＡＧＤ活性を有するタンパク質をコードするコード領域は配列番号：２または配列番号：４のヌクレオチド５６〜１８５８と少なくとも約７０％、更に好ましくは約８０％、最も好ましくは約９０％の同一性を有し、ＡＲＡ酵素またはＡＲＡ活性を有するタンパク質をコードするコード領域は配列番号：２１のヌクレオチド２８５〜１３１９と少なくとも約７０％、更に好ましくは約８０％、最も好ましくは約９０％の同一性を有し、ＡＬＯ酵素またはＡＬＯ活性を有するタンパク質をコードするコード領域は配列番号：６または配列番号：８のヌクレオチド４〜１５８４と少なくとも約７０％、更に好ましくは約８０％、最も好ましくは約９０％の同一性を有し、ＧＬＯ酵素またはＧＬＯ活性を有するタンパク質をコードするコード領域は配列番号：１０のヌクレオチド２４〜１３４６と少なくとも約７０％、更に好ましくは約８０％、最も好ましくは約９０％の同一性を有し、ＡＬ酵素またはＡＬ活性を有するタンパク質コードするコード領域は配列番号：３０と少なくとも約７０％、更に好ましくは約８０％、最も好ましくは約９０％の同一性を有し、「同一性」はＣＬＵＳＴＡＬプログラムを用いて行われる配列整列によって決定される。
【００６５】
本発明はまた、配列番号：１２、配列番号：２、配列番号：４のヌクレオチド５６〜１８５８、配列番号：２１のヌクレオチド２８５〜１３１９、配列番号：６、配列番号：８のヌクレオチド４〜１５８４、配列番号：１０のヌクレオチド２４〜１３４６、および配列番号：３０、並びにそれらの相補的鎖またはそれらのサブ配列に記載されている核酸配列と同一条件下でハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブと標準条件下でハイブリダイズすることができる核酸配列によってコードされるポリペプチドに関する（Ｊ． Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｅ． Ｆ． Ｆｒｉｔｓｃｈ， ａｎｄ Ｔ． Ｍａｎｉａｔｕｓ， １９８９， 分子クローニング、実験室便覧（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）， 第２版， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， ニューヨーク）。オリゴヌクレオチドプローブは、コード領域自身またはそのサブ配列からなることができる。ハイブリダイゼーションは、プローブを行う配列、および配列番号：１２、配列番号：２、配列番号：４のヌクレオチド５６〜１８５８、配列番号：２１のヌクレオチド２８５〜１３１９、配列番号：６、配列番号：８のヌクレオチド４〜１５８４、配列番号：１０のヌクレオチド２４〜１３４６、および配列番号：３０、またはそれらのサブ配列に示されるヌクレオチド配列のいずれにも類似ヌクレオチド配列が存在することを示している。
【００６６】
従って、もう一つの好ましい態様では、組換え酵母は、配列番号：１２に記載のポリヌクレオチドの相補性鎖にハイブリダイズするＬＧＤＨ活性を有するタンパク質をコードするコード領域、配列番号：２、または配列番号：４のヌクレオチド５６〜１８５８に記載のポリヌクレオチドの相補性鎖にハイブリダイズするＡＧＤ活性を有するタンパク質をコードするコード領域、配列番号：２１のヌクレオチド２８５〜１３１９に記載のポリヌクレオチドの相補性鎖にハイブリダイズするＡＲＡ活性を有するタンパク質をコードするコード領域、配列番号：６、または配列番号：８のヌクレオチド４〜１５８４に記載のポリヌクレオチドの相補性鎖にハイブリダイズするＡＬＯ活性を有するタンパク質をコードするコード領域、配列番号：１０のヌクレオチド２４〜１３４６に記載のポリヌクレオチドの相補性鎖にハイブリダイズするＧＬＯ活性を有するタンパク質をコードするコード領域、および配列番号：３０に記載のポリヌクレオチドの相補性鎖にハイブリダイズするＡＬ活性を有するタンパク質をコードするコード領域から選択されるコード領域によって機能的に形質転換されており、コード領域は緊縮ハイブリダイゼーション条件下でポリヌクレオチドの相補性鎖にハイブリダイズする。緊縮ハイブリダイゼーション条件は、中または高緊縮性のものであることができる。中緊縮条件下では、例えば、プレハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーションは、標準的なサザンブロット法に続いて４２℃で５×ＳＳＰＥ、０．３％ＳＤＳ、２００μｇ／ｍＬの剪断を加えて変性したサケ精子ＤＮＡ、および３５％ホルムアミド中で起こる。高緊縮条件下では、例えば、プレハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーションは、４２℃で５×ＳＳＰＥ、０．３％ＳＤＳ、２００μｇ／ｍＬの剪断を加えて変性したサケ精子ＤＮＡ、および５０％ホルムアミド中で起こる。
【００６７】
配列番号：１２、配列番号：２、配列番号：４のヌクレオチド５６〜１８５８、配列番号：２１のヌクレオチド２８５〜１３１９、配列番号：６、配列番号：８のヌクレオチド４〜１５８４、配列番号：１０のヌクレオチド２４〜１３４６、および配列番号：３０に記載の核酸配列、またはそれらのサブ配列を用いて、当該技術分野で周知の方法によりアスコルビン酸の産生に用いることができる様々な属または種の他の菌株から相同タンパク質をコードするＤＮＡを同定し、クローニングすることができる。従って、このような他の生物から調製したゲノムまたはｃＤＮＡライブラリーを、配列番号：１２、配列番号：２、配列番号：４のヌクレオチド５６〜１８５８、配列番号：２１のヌクレオチド２８５〜１３１９、配列番号：６、配列番号：８のヌクレオチド４〜１５８４、配列番号：１０のヌクレオチド２４〜１３４６、および配列番号：３０、またはそれらのサブ配列とハイブリダイズするＤＮＡについてスクリーニングすることができる。
【００６８】
このような他の生物由来のゲノムまたは他のＤＮＡは、アガロースまたはポリアクリルアミドゲル電気泳動や他の分離手法によって分離することができる。ライブラリーからのＤＮＡまたは分離したＤＮＡを、ニトロセルロースまたは他の適当なキャリヤー材料に移し、固定することができる。配列番号：１２、配列番号：２、配列番号：４のヌクレオチド５６〜１８５８、配列番号：２１のヌクレオチド２８５〜１３１９、配列番号：６、配列番号：８のヌクレオチド４〜１５８４、配列番号：１０のヌクレオチド２４〜１３４６、および配列番号：３０、またはそれらのサブ配列と相同性のクローンまたはＤＮＡを同定するため、固定したＤＮＡをこれらの配列の一つにハイブリダイズするプローブとハイブリダイズさせる。ハイブリダイゼーションに続いて、キャリヤー材料を洗浄する。例えば、プローブをＤＮＡにハイブリダイズさせたサザンブロットでは、これをそれぞれ０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳを用いて４０℃、更に好ましくは４５℃以下、更に好ましくは５０℃以下、更に好ましくは５５℃以下、更に好ましくは６０℃以下、特には６５℃以下で３０分間３回洗浄することによってこれに固定した。プローブがこれらの条件下でハイブリダイズする分子は、当該技術分野で知られている方法を用いて検出される。次に、これらの分子をクローニングして機能的に形質転換し、それらが所望な酵素活性を有することを決定し、且つ配列番号：１２、配列番号：２、配列番号：４のヌクレオチド５６〜１８５８、配列番号：２１のヌクレオチド２８５〜１３１９、配列番号：６、配列番号：８のヌクレオチド４〜１５８４、配列番号：１０のヌクレオチド２４〜１３４６、および配列番号：３０とのヌクレオチド配列同一性を決定することができる。
【００６９】
もう一つの好ましい態様では、組換え酵母は、ＬＧＤＨ活性および配列番号：１１を有する酵素の免疫学的特性を有するタンパク質をコードするコード領域、ＡＧＤ活性および配列番号：１または配列番号：３を有する酵素の免疫学的特性を有する酵素をコードするコード領域、ＡＲＡ活性および配列番号：２０を有する酵素の免疫学的特性を有する酵素をコードするコード領域、ＡＬＯ活性および配列番号：５または配列番号：７を有する酵素の免疫学的特性を有する酵素をコードするコード領域、ＧＬＯ活性および配列番号：９を有する酵素の免疫学的特性を有する酵素をコードするコード領域、およびＡＬ活性および配列番号：２９を有する酵素の免疫学的特性を有する酵素をコードするコード領域によって機能的に形質転換されている。
【００７０】
従って、本発明はまた、（１） ＬＧＤＨ、ＡＧＤ、ＡＲＡ、ＡＬＯ、ＧＬＯまたはＡＬ活性、および（２） アミノ酸配列（ａ） 配列番号：１１、配列番号：１、配列番号：３、配列番号：２０、配列番号：５、配列番号：７、配列番号：９、または配列番号：２９および（ｂ）類似の酵素活性を有するポリペプチドに対する免疫化学的同一性または部分的免疫化学的同一性を有するポリペプチドに関する。特定の配列番号を有する酵素の免疫学的特性を有するポリペプチドとは、特定の配列番号を有する本来のポリペプチドの抗原に対する抗体を含む抗血清は、特異的な免疫化学的手法を用いて沈澱の完全な融合、同一の沈澱の形態、および／または同一の電気泳動移動度であるような同一様式での異なるアミノ酸配列を除き、類似の酵素活性を有する他のタンパク質の抗原と反応することを意味する。免疫化学的同一性の更に詳細な説明は、Ａｘｅｌｓｅｎ， Ｂｏｃｋ， および Ｋｒｏｌｌの、Ｎ． Ｈ． Ａｘｅｌｓｅｎ， Ｊ． Ｋｒｏｌｌ， および Ｂ． Ｗｅｅｋｓ監修「定量的免疫電気泳動便覧（Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ Ｉｍｍｕｎｏｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）， Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ， １９７３年， １０章に記載されている。
【００７１】
部分的免疫化学的同一性とは、本来の酵素（例えば、配列番号：１１、配列番号：１、配列番号：３、配列番号：２０、配列番号：５、配列番号：７、配列番号：９、および配列番号：２９のアミノ酸配列を有する酵素）の抗原に対する抗体を含む抗血清が特異的な免疫化学的手法を用いて沈澱の部分的融合、部分的に同一な沈澱形態、および／または部分的に同一な電気泳動移動度であるような部分的同一様式で本来の酵素に対する類似酵素活性を有するポリペプチドの抗原と反応することを意味する。部分的免疫化学的同一性の更に詳細な説明は、Ｂｏｃｋ および Ａｘｅｌｓｅｎの、Ｎ． Ｈ． Ａｘｅｌｓｅｎ， Ｊ． ＫｒＯｌｌ， および Ｂ． Ｗｅｅｋｓ監修「定量的免疫電気泳動便覧（Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ Ｉｍｍｕｎｏｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）， Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ， １９７３年， １１章に記載されている。
【００７２】
免疫学的特性は、周知のＯｕｃｈｔｅｒｌｏｎｙ二重免疫拡散法による免疫学的交差反応同一性試験によって決定される。具体的には、本発明のポリペプチドに対する抗血清を、ウサギ（または他の齧歯類、Ｈａｒｂｏｅ および ＩｎｇｉｌｄのＮ． Ｈ． Ａｘｅｌｓｅｎ， Ｊ． ＫｒＯｌｌ， ａｎｄ Ｂ． Ｗｅｅｋｓ監修「定量的免疫電気泳動便覧（Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ Ｉｍｍｕｎｏｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）， Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ， １９７３年， ２３章、またはＪｏｈｎｓｔｏｎｅ および Ｔｈｏｒｐｅ，「実践免疫化学（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｉｎ Ｐｒａｃｔｉｃｅ）」， Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ， １９８２年（更に具体的には２７〜３１頁））を免役することによって生成させる。モノクローナル抗体は、例えば、Ｅ． Ｈａｒｌｏｗ および Ｄ． Ｌａｎｅ監修，１９８８年，「抗体、実験室便覧（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ， コールドスプリングハーバー， ニューヨークに記載の方法に準じて調製することができる。精製した免疫グロブリンは、抗血清から、例えば硫酸アンモニウム沈澱に続いて、透析およびイオン交換クロマトグラフィー（例えば、ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｄｅｘ）によって得ることができる。相同ポリペプチドおよび同一または部分的同一の免疫学的特性を有するポリペプチドは、任意の属の微生物、好ましくは植物、動物または真菌供給源から得ることができる。
【００７３】
酵素がＡＲＡであるもう一つの好ましい態様では、この酵素はアルド−ケトレダクターゼ（ＡＫＲ）スーパーファミリーのモティーフＩおよびモティーフＩＩ、具体的にはそれぞれアミノ酸配列ＧＸＲＸＸＤＸＡＸＸＸＸＸＥＸＸＸＧ（配列番号：１３）およびＧＸＸＮ（配列番号：２６）を含んでなる（Ｋｉｍ Ｓ． Ｔ． ｅｔ ａｌ． １９９８， ＢＢＡ， １４２９， ２９−３９）。
【００７４】
好ましくは、所望の酵素が酵母に産生するように所望の酵素をコードするコード領域を酵母に組み入れて、実質的に機能するようにする。このような酵母は、本明細書では「機能的に形質転換されている」と表すことができる。
【００７５】
コード領域を単離してしまったならば、これを本発明で有用な酵母に形質転換して発現させるように調製することができる。最小限でも、これは、ベクターおよびこのベクター上に見出され且つターゲット生物（すなわち、本発明では、酵母）で活性なプロモーターに対する操作可能な結合へのコード領域の挿入を含んでいる。任意のベクター（組込み、染色体またはエピソーム性）を用いることができる。
【００７６】
ターゲット宿主で活性な任意のプロモーター（相同または異種、構成的、誘導的または抑制的）を用いることができる。このような挿入は、プロモーターへ操作可能に結合することができる所望な点でベクターを「開き」、続いてコード領域を所望な点に連結する目的で制限エンドヌクレアーゼを使用することを包含する場合が多い。所望ならば、ベクターに挿入する前に、コード領域をターゲット生物で使用する目的で調製することができる。これは、当該技術分野で知られている他の可能な調製物の中では、ターゲット生物のコドン使用に更に完全に調和するようにコード領域で用いるコドンを変更し、コード領域の転写または翻訳またはコード領域のｍＲＮＡ転写体の安定性を損なう可能性があるコード領域の配列を変化させ、シグナル形成ペプチドをコードする部分（タンパク質を特異的部位（例えば、細胞小器官、細胞または細胞小器官の膜、または細胞外分泌）に指示するコード領域によってコードされるタンパク質の領域）を加えまたは除去することを含むことができる。
【００７７】
本発明の一態様では、Ｌ−ガラクトノ−１，４−ラクトンデヒドロゲナーゼタンパク質（ＡＧＤ）はシグナル形成ペプチドを含んでなり、Ｌ−ガラクトノ−１，４−ラクトンデヒドロゲナーゼをコードするコード領域はこのシグナル形成ペプチドもコードする。本発明のもう一つの態様では、Ｌ−ガラクトノ−１，４−ラクトンデヒドロゲナーゼタンパク質（ＡＧＤ）シグナル形成ペプチドを含んでおらず、Ｌ−ガラクトノ−１，４−ラクトンデヒドロゲナーゼをコードするコード領域はまた、シグナル形成ペプチドをコードしない。具体的には、配列番号：１で示されるＡＧＤ配列は、アミノ酸１〜１００のシグナル形成ペプチドを含んでなり、配列番号：２で示されるＡＧＤ配列はアミノ酸１〜９０のシグナル形成ペプチドを含んでなる。当業者であれば判るであろうが、所望の酵素をコードする一層長い核酸配列からシグナル形成ペプチドをコードする核酸配列を欠失するには、インフレームのＡＴＧコドンを添加して所望の酵素の翻訳を適正に開始させることが必要なことがある。
【００７８】
コード領域が修飾されているかどうかには関係なく、コード領域をベクターに挿入するときには、これを酵母で活性なプロモーターに操作可能に結合する。プロモーターは、知られているように近接コード領域の転写を指示することができるＤＮＡ配列である。上記のように、プロモーターは構成的、誘導的または抑制的であることができる。誘導的プロモーターは、培地に適当なインデューサー分子を添加することによって、またはプロモーターの同一性によって決定される化学的または物理的増殖環境（例えば、温度、ｐＨ値）を適当に変化させることによって誘導することができる。抑制的プロモーターは、培地に適当なリプレッサー分子を添加することによって、またはプロモーターの同一性によって決定される化学的または物理的増殖環境（例えば、温度、ｐＨ値）を適当に変化させることによって抑制することができる。インデューサーまたはリプレッサー分子の使用または化学的または物理的増殖環境の変化が必要ないので、構成的プロモーターは好ましい。好ましい構成的プロモーターは、Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅトリオースホスフェートイソメラーゼ（ＴＰＩ）プロモーターである。
【００７９】
プロモーターに操作可能に結合したコード領域を含んでなるベクターは、酵母属で使用するのに適当であることが当該技術分野で知られているものの中では、特にプラスミド、コスミド、または酵母の人工染色体であることができる。プロモーターに操作可能に結合したコード領域の他に、ベクターは他の遺伝子要素を含んでなることもできる。例えば、ベクターが酵母ゲノムへの組込みが予想されない場合には、ベクターは望ましくはベクターを含んでなる酵母の子孫細胞へベクターを伝えることができる複製起源を含んでなる。ベクターの酵母ゲノムへの組込みが所望な場合には、ベクターは酵母ゲノムに見られる配列に相同な配列を含んでなることができ、組込みを促進することができるコード領域を含んでなることもできる。どの酵母細胞が形質転換されているかを決定するには、ベクターは好ましくは選択可能なマーカーまたはスクリーニング可能なマーカーであって酵母を非形質転換酵母から識別する酵母に対する表現型を付与するものを含んでなり、例えば、他の表現型の中では、これは非形質転換酵母には致死的な抗生物質を含んでなる培地で生存し、または非形質転換酵母は代謝しない培地の一成分を生成物に代謝する。更に、ベクターは、制限エンドヌクレアーゼ部位および典型的にはベクターで見られるその他の部位のような他の遺伝子要素を含んでなることができる。
【００８０】
ベクターをプロモーターに操作可能に結合したコード領域により調製した後、酵母をベクターを用いて形質転換する（すなわち、ベクターを酵母個体群の細胞の少なくとも１個に導入する）。酵母形質転換の手法は十分に確立されており、とりわけ電気穿孔、マイクロプロジェクタイル衝撃（ｍｉｃｒｏｐｒｏｊｅｃｔｉｌｅ ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ）、およびＬｉＡｃ／ｓｓＤＮＡ／ＰＥＧ法が挙げられる。形質転換した酵母細胞を、次にベクターについてスクリーニング可能なまたは選択可能なマーカーを用いて検出することができる。「形質転換した酵母」という用語は、上記で定義したように、「組換え酵母」と本質的に同じ意味を有することに留意すべきである。。形質転換した酵母は、形質転換においてベクターを受け取ったものであることができ、またはこのような酵母の子孫であることができる。
【００８１】
ある態様では、上記のように、Ｌ−ガラクトースデヒドロゲナーゼ（ＬＧＤＨ）、Ｌ−ガラクトノ−１，４−ラクトンデヒドロゲナーゼ（ＡＧＤ）、Ｄ−アラビノースデヒドロゲナーゼ（ＡＲＡ）、Ｄ−アラビノノ−１，４−ラクトンオキシダーゼ（ＡＬＯ）、Ｌ−グロノ−１，４−ラクトンオキシダーゼ（ＧＬＯ）、およびアルドノラクトナーゼ（ＡＬ）からなる群から選択される酵素活性を有するタンパク質をコードする少なくとも１個のコード領域で機能的に形質転換されている組換え酵母に関する。
【００８２】
組換え酵母を得た後、酵母を培地で培養する。培地は、上記の通りである。
【００８３】
好ましい培地は、グルコース、ＹＮＢ、およびＬ−ガラクトノ−１，４−ラクトンを含んでなる。この培地で培養することができる好ましい組換え酵母としては、Ａ． ｔｈａｌｉａｎａ のＬ−ガラクトノ−１，４−ラクトンデヒドロゲナーゼ（ＡＧＤ）をコードするコード領域に操作可能に結合したＳ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＴＰＩプロモーターを有するＳ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株（好ましくは、ＧＲＦ１８Ｕ）、およびＳ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ のＤ−アラビノノ−１，４−ラクトンオキシダーゼ（ＡＬＯ）をコードするコード領域に操作可能に結合したＳ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＴＰＩプロモーターを有するＳ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株（好ましくは、ＧＲＦ１８Ｕ）が挙げられる。この培地で培養することができる他の好ましい組換え酵母としては、Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ のＤ−アラビノノ−１，４−ラクトンオキシダーゼ（ＡＬＯ）をコードするコード領域に操作可能に結合したＳ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅＴＰＩプロモーターを有するＺ． ｂａｉｌｉｉ株（好ましくは、ＡＴＣＣ ３６９４７）、およびＳ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ のＬ−ガラクトノ−１，４−ラクトンデヒドロゲナーゼ（ＡＧＤ）をコードするコード領域に操作可能に結合したＳ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＴＰＩプロモーターを有するＺ． ｂａｉｌｉｉ株（好ましくは、ＡＴＣＣ ３６９４７）が挙げられる。もう一つの好ましい培地は、グルコース、ＹＮＢ、およびＬ−グロノ−１，４−ラクトンを含んでなる。この培地で培養することができる特に好ましい組換え酵母は、Ｒ． ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓのＬ−グロノ−１，４−ラクトンオキシダーゼ （ＲＧＬＯ）をコードするコード領域に操作可能に結合したＳ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＴＰＩプロモーターを有するＳ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株（好ましくは、ＧＲＦ１８Ｕ）である。
【００８４】
この培地で培養することができる他の特に好ましい組換え酵母は、Ｒ． ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓのＬ−グロノ−１，４−ラクトンオキシダーゼ （ＲＧＬＯ）をコードするコード領域に操作可能に結合したＳ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＴＰＩプロモーターを有するＺ． ｂａｉｌｉｉ株（好ましくは、ＡＴＣＣ ３６９４７または６０４８３である。
【００８５】
もう一つの好ましい培地は、グルコース、ＹＮＢ、およびＬ−ガラクトースを含んでなる。この培地で培養することができる特に好ましい酵母は、（ｉ）Ａ． ｔｈａｌｉａｎａ のＬ−ガラクトノ−１，４−ラクトンデヒドロゲナーゼ（ＡＧＤ）をコードするコード領域に操作可能に結合したＳ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＴＰＩプロモーターおよび（ｉｉ）Ａ． ｔｈａｌｉａｎａのＬ−ガラクトースデヒドロゲナーゼ（ＬＧＤＨ）をコードするコード領域に操作可能に結合したＴＰＩプロモーターを有するＳ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株（好ましくは、ＧＲＦ１８ＵまたはＺ． ｂａｉｌｉｉ株（好ましくは、ＡＴＣＣ ３６９４７）である。この培地で培養することができる第二の特に好ましい形質転換酵母は、（ｉ）Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ のＤ−アラビノノ−１，４−ラクトンオキシダーゼ（ＡＬＯ）をコードするコード領域に操作可能に結合したＴＰＩプロモーターおよび（ｉｉ）Ａ． ｔｈａｌｉａｎａのＬ−ガラクトースデヒドロゲナーゼ（ＬＧＤＨ）をコードするコード領域に操作可能に結合したＴＰＩプロモーターを含んでなるＳ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株（好ましくは、ＧＲＦ１８Ｕ）またはＺ． ｂａｉｌｉｉ株（好ましくは、ＡＴＣＣ ３６９４７）である。この培地で培養することができる第三の特に好ましい形質転換酵母は、（ｉ）Ｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＤ−アラビノノ−１，４−ラクトンオキシダーゼ（ＡＬＯ）をコードするコード領域に操作可能に結合したＴＰＩプロモーターおよび（ｉｉ）Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ のＤ−アラビノースデヒドロゲナーゼ（ＡＲＡ）をコードするコード領域に操作可能に結合したＴＰＩプロモーターを含んでなるＳ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株（好ましくは、ＧＲＦ１８Ｕ）またはＺ． ｂａｉｌｉｉ株（好ましくは、ＡＴＣＣ ３６９４７）である。この培地で培養することができる第四の特に好ましい酵母は、（ｉ）Ａ． ｔｈａｌｉａｎａ Ｌ−ガラクトノ−１，４−ラクトンデヒドロゲナーゼ（ＡＧＤ）をコードするコード領域に操作可能に結合したＴＰＩプロモーターおよび（ｉｉ）Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ のＤ−アラビノースデヒドロゲナーゼ（ＡＲＡ）をコードするコード領域に操作可能に結合したＴＰＩプロモーターを含んでなるＳ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株（好ましくは、ＧＲＦ１８Ｕ）または Ｚ． ｂａｉｌｉｉ株（好ましくは、ＡＴＣＣ ３６９４７）である。この培地で培養することができるもう一つの好ましい組換え酵母は、Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ のＤ−アラビノースデヒドロゲナーゼ（ＡＲＡ）をコードするコード領域に操作可能に結合したＳ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＴＰＩプロモーターを有するＳ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株（好ましくは、 ＧＲＦ１８Ｕ）またはＺ． ｂａｉｌｉｉ株（好ましくは、 ＡＴＣＣ ３６９４７）である。この培地で培養することができる更にもう一つの好ましい組換え酵母は、Ａ． ｔｈａｌｉａｎａのＬ−ガラクトースデヒドロゲナーゼ（ＬＧＤＨ）をコードするコード領域に操作可能に結合したＳ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＴＰＩプロモーターを有するＳ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株（好ましくは、ＧＲＦ１８Ｕ）またはＺ． ｂａｉｌｉｉ株（好ましくは、ＡＴＣＣ ３６９４７）である。
【００８６】
もう一つの好ましい培地は、グルコース、ＹＮＢ、およびＬ−グロン酸を含んでなる。この培地で培養することができる特に好ましい組換え酵母は、Ｚ ｍｏｂｉｌｉｓのアルドノラクトナーゼ（ＡＬ）をコードするコード領域に操作可能に結合したＳ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＴＰＩプロモーターを有するＳ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株（好ましくは、 ＧＲＦ１８Ｕ）または Ｚ ｂａｉｌｉｉ株（好ましくは、 ＡＴＣＣ ３６９４７）である。この培地で培養することができるもう一つの好ましい組換え酵母は、（ｉ） Ｒ． ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓのＬ−グロノ−１，４−ラクトンオキシダーゼ （ＲＧＬＯ）をコードするコード領域に操作可能に結合したＳ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＴＰＩプロモーターおよび（ｉｉ） Ｚ． ｍｏｂｉｌｉｓのアルドノラクトナーゼ（ＡＬ）をコードするコード領域に操作可能に結合したＴＰＩプロモーターを有するＳ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株（好ましくは、 ＧＲＦ１８Ｕ）または Ｚ ｂａｉｌｉｉ株（好ましくは、 ＡＴＣＣ ３６９４７）である。
【００８７】
上記にて、非形質転換酵母について説明したように、発酵の経過中に、アスコルビン酸前駆体は一以上の段階を経てＬ−アスコルビン酸に転換される。
【００８８】
同様な培地でインキュベーションした（上記の）非形質転換酵母細胞は、典型的には培地にバックグラウンドレベルを上回るアスコルビン酸を蓄積しないが、意外なことには、本明細書に記載した特に好ましい組換え菌株の幾つかはバックグラウンドレベルを上回るかなりの量のＬ−アスコルビン酸を蓄積することができる。第一の例外は、ＬＧＤＨのみで形質転換した酵母に関するものであり、これはバックグラウンドレベルを上回るＬ−アスコルビン酸を蓄積しない。第二の例外は、ＲＧＬＯおよび／またはＡＬで形質転換した酵母に関するものであり、これはバックグラウンドレベルを上回るＬ−アスコルビン酸を蓄積しない。従って、好ましい態様では、組換え酵母はＬ−アスコルビン酸をバックグラウンドを上回るレベルで培地に蓄積する。
【００８９】
培地からのアスコルビン酸の単離は、上記で記載した通りである。約２５％および３５％を上回るアスコルビン酸の収率が、下記の例で説明されるように見られている。従って、更に好ましい態様では、組換え酵母はアスコルビン酸を前駆体の２５％より高い収率で生成する。「収率」という用語は、生成したアスコルビン酸の量（モルおよび重量／容積）を消費した前駆体の量（モルおよび重量／容積）で割って、１００を乗じたものを表す。
【００９０】
下記の定義は、当業者が本発明の詳細な説明を理解しやすくする目的で提供される。
【００９１】
「バックグラウンドレベルを上回るアスコルビン酸の蓄積」という用語は、本明細書に記載の手法を用いて決定した検出不能レベルを上回るアスコルビン酸の蓄積を表す。
【００９２】
本明細書で用いる「アスコルビン酸」および「アスコルビン酸塩」とは、ビタミンＣ、Ｌ−アスコルビン酸、およびそれらの塩またはイオンを表す。
【００９３】
「アスコルビン酸前駆体」は、本発明の酵母によって直接または１以上の中間体を介してＬ−アスコルビン酸またはその塩に転換することができる化合物である。
【００９４】
「増幅」とは、所望な核酸分子のコピー数を増加させ、または何らかの手段によって酵素の活性を増加させることを表す。
【００９５】
「炭素供給源」とは、培養において新規なバイオマスを生成するための炭素供給源として、および細胞代謝において酵母によって用いられる有機化合物を表す。
【００９６】
「コドン」とは、特定のアミノ酸を定義する３個のヌクレオチドの配列を表す。
【００９７】
「ＤＮＡリガーゼ」とは、二本鎖ＤＮＡの２つの部分を共有結合する酵素を表す。
【００９８】
「電気穿孔」とは、異種ＤＮＡを細胞中に導入する方法であって、宿主細胞を透過するために短時間の高電圧ＤＣ電荷を用いて染色体外ＤＮＡを細胞に吸収させる方法を表す。
【００９９】
「エンドヌクレアーゼ」とは、二本鎖ＤＮＡを内部部位で加水分解する酵素を表す。
【０１００】
酵素１．１．３．３７であるＤ−アラビノノ−１，４−ラクトンオキシダーゼとは、Ｄ−アラビノノ−１，４−ラクトン＋Ｏ２のＤ−エリスロアスコルビン酸塩＋Ｈ２Ｏ２への転換を触媒するタンパク質を表す。同酵素は基質範囲が広いため、Ｌ−ガラクトノ−１，４−ラクトン＋Ｏ２のＬ−アスコルビン酸＋Ｈ２Ｏ２への転換を触媒する。誤用であるが、同じ酵素はＬ−ガラクトノ−１，４−ラクトンオキシダーゼ（酵素１．１．３．２４）と表される（Ｈｕｈ， Ｗ． Ｋ． ｅｔ ａｌ， １９９８， Ｍｏｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ３０， ８９５−９０３）（Ｎｉｓｈｉｋｉｍｉ， Ｍ．， ｅｔ ａｌ．， １９７８， Ａｒｃｈ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． １９１， ４７９−４８６）（Ｂｌｅｅｇ， Ｈ． Ｓ． ａｎｄ Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ， Ｆ．， １９８２， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． １２７， ３９１−９６を参照されたい）。
【０１０１】
酵素１．３．２．３であるＬ−ガラクトノ−１，４−ラクトンデヒドロゲナーゼは、Ｌ−ガラクトノ−１，４−ラクトン＋２フェリシトクロムＣのＬ−アスコルビン酸＋２フェロシトクロムＣへの転換を触媒するタンパク質を表す。
【０１０２】
酵素１．１．３．８であるＬ−グロノ−１，４−ラクトンオキシダーゼは、Ｌ−グロノ−１，４−ラクトンのＬ−キシロ−ヘクスロノラクトンへの酸化を触媒し、後者は自発的にＬ−アスコルビン酸へ異性化するタンパク質を表す。
【０１０３】
目的とする他の酵素およびそれらの分類番号は、下記の通りである。
ヘキソキナーゼ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　２．７．１．１
グルコース−６−Ｐイソメラーゼ　　　　　　　　　　　　 ５．３．１．９
マンノース−６−Ｐイソメラーゼ　　　　　　 　 　　　　 ５．３．１．８
ホスホノマンノムターゼ　　　　　　　　　　　　　　　　５．４．２．８
マンノース−１−Ｐグアニリルトランスフェラーゼ　　　　 ２．７．７．２２
ＧＤＰ−マンノース３，５−エピメラーゼ　　　　　　　　　 ５．１．３．１８
糖ホスファターゼ　　　　　　　　　　　　 　　　　　　 ３．１．３．２３
Ｌ−ガラクトース−デヒドロゲナーゼ　　　　　　　　　　＊）
Ｌ−ガラクトノ−１，４−ラクトンデヒドロゲナーゼ 　　 １．３．２．３
Ｄ−マンノースキナーゼ　　　　　　　　　　　　　　　　２．７．１．１
ホスホグルコムターゼ　　　　　　　　　　　　　　　　　５．４．２．２
ＵＴＰ−グルコース−１−Ｐウリジリルトランスフェラーゼ 　　２．７．７．９
ＵＤＰ−Ｄ−グルコースデヒドロゲナーゼ　　　　　　　　　　１．１．１．２２
ＵＤＰ−グルクロネート４−エピメラーゼ　　　　　　　　　 ５．１．３．６
グルクロネート−１−Ｐウリジリルトランスフェラーゼ 　　２．７．７．４４
Ｄ−グルクロノキナーゼ　　　　　　　　　　　　　　　　２．７．１．４３
Ｄ−グルクロネートレダクターゼ　　　　　　　　　　　　１．１．１．１９
アルドノラクトナーゼ　　　　　　　　　　　　　　　　　３．１．１．１７
Ｌ−グロノ−１，４−ラクトンオキシダーゼ　　　　　　　１．１．３．８
ウロノラクトナーゼ　　　　　　　　　　　　　　　　　　３．１．１．１９
グルクロノラクトンレダクターゼ活性　　　　　　　　　　１．１．１．２０
Ｌ−ガラクトノ−１，４−ラクトン３−エピメラーゼ　　　＊）
ガラクツロネート−１−Ｐウリジリルトランスフェラーゼ　 ＊）
ガラクツロノキナーゼ　　　　　　　　　　　　　　　　　２．７．１．４４
ヘキソウロネート（Ｄ−ガラクツロネート）レダクターゼ　＊）
ミオイノシトール１−Ｐシンターゼ　　　　　　　　　　　５． ５．１．４
ミオイノシトール１−Ｐモノホスファターゼ　　　　　　　３．１．３．２５
ミオイノシトールオキシゲナーゼ　　　　　　　　　　　　１．１３．９９．１
Ｄ−ガラクトキナーゼ　　　　　　　　　　　　　　　　　２．７．１．６
ＵＴＰ−ヘキソース１−Ｐウリジリルトランスフェラーゼ　　 ２．７．７．１０
ＵＤＰ−グルコース４−エピメラーゼ　　　　　　　　　　　 ５．１．３．２
Ｓｕｃシンターゼ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 ２．４．１．１３
フルクトキナーゼ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　２．７．１．４
＊） データーベースで利用できない分類番号
【０１０４】
「発現」という用語は、相当するｍＲＮＡを生成するための遺伝子の転写、および相当する遺伝子生成物、すなわちペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質を生成するためのこのｍＲＮＡの翻訳を表す。
【０１０５】
「機能的に結合した」または「操作可能に結合した」という用語は、コードまたは構造配列の転写をプロモーターまたはプロモーター領域によって指示することができるような配置および距離でのプロモーターまたはプロモーター領域、およびコードまたは構造配列を表す。
【０１０６】
「遺伝子」という用語は、染色体ＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡ、またはペプチド、ポリペプチド、タンパク質またはＲＮＡ分子、および発現の調節に関与するコード配列のフランキング領域をコードする他のＤＮＡを表す。
【０１０７】
「ゲノム」という用語は、宿主細胞内の染色体およびプラスミドを両方とも包含する。従って、宿主細胞に導入される本発明のＤＮＡのコード化は、染色体への組込みまたはプラスミドの局在化をすることができる。
【０１０８】
「異種ＤＮＡ」とは、宿主細胞とは異なる供給源由来のＤＮＡを表す。
【０１０９】
「相同ＤＮＡ」とは、宿主細胞と同一供給源由来のＤＮＡを表す。
【０１１０】
「ハイブリダイゼーション」とは、核酸の鎖が塩基対を介して相補的鎖と結合する能力を表す。ハイブリダイゼーションは、２本の核酸鎖における相補的配列が互いに結合するときに起こる。
【０１１１】
「培地」という用語は、酵母または組換え酵母の増殖に必要な任意成分とアスコルビン酸の産生のための１種類以上の前駆体を含んでなる酵母の化学的環境を表す。酵母の増殖のための成分およびアスコルビン酸の産生のための前駆体は、同一であってもまたは同一でなくてもよい。
【０１１２】
「オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）」とは、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質をコードするＤＮＡまたはＲＮＡの領域を表す。
【０１１３】
「プラスミド」とは、ＤＮＡの環状をした染色体外の複製可能な部分を表す。
【０１１４】
「ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）」とは、一つの核酸配列の多数のコピーを作製するための酵素的手法を表す。ＤＮＡ配列のコピーは、ＤＮＡポリメラーゼをアンプリマーの間で往復させることによって調製される。この増幅法の基本は、複数サイクルの温度変化であり、アンプリマーを変性した後、再アニールし、続いて伸長して、フランキングアンプリマー間にある領域で新規なＤＮＡ鎖を合成することである。
【０１１５】
「プロモーター」または「プロモーター領域」という用語は、通常はコード配列の上流（５′）に見られ、ＲＮＡポリメラーゼおよび／または正確な位置で転写を開始するのに必要な他の因子についての認識部位を提供することによってメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の産生を制御することによりコード配列の発現を制御するＤＮＡ配列を表す。
【０１１６】
「組換え細胞」または「形質転換細胞」は、細胞中に天然には存在しない核酸配列または内在性核酸配列の追加コピーまたは複数のコピーを含む細胞であって、核酸配列がヒトの作用によって細胞またはその祖先に導入されるものである。
【０１１７】
「組換えベクター」または「組換えＤＮＡまたはＲＮＡ構築物」という用語は、プラスミド、コスミド、ウイルス、自律複製配列、ファージ、または任意の供給源由来であり、ゲノム組込みまたは自律複製が可能であり、１以上の配列が機能的に操作可能な方法で結合している核酸分子を含んでなる、線状または環状の一本鎖または二本鎖のＤＮＡまたはＲＮＡヌクレオチド配列のような任意の物質を表す。このような組換え構築物またはベクターはＤＮＡ配列を機能的ｍＲＮＡに転写するような方法で５′調節配列またはプロモーター領域、および選択された遺伝子産物のＤＮＡ配列を細胞に導入して、これらが翻訳、さらには発現され、またはされないことがあるようにすることができる。
【０１１８】
「制限酵素」とは、二本鎖ＤＮＡにおけるヌクレオチドの特異配列を認識し、両方の鎖を開裂し、制限エンドヌクレアーゼとも呼ばれる酵素を表す。開裂は、典型的には制限部位内またはその附近で起こる。
【０１１９】
「選択可能マーカー」とは、核酸配列であって、その発現によりこの核酸配列を含む細胞の同定を促進する表現型が付与されるものを表す。選択可能マーカーとしては、毒性化合物（例えば、アンピシリン、カナマイシン、Ｇ４１８、ハイグロマイシン）に対する耐性を付与し、または栄養不足（例えば、ウラシル、ヒスチジン、ロイシン）を補完するものが挙げられる。
【０１２０】
「スクリーニング可能マーカー」とは、核酸配列であって、その発現によって視覚的に顕著な特徴（例えば、色の変化、蛍光）が付与されるものを表す。
【０１２１】
「転写」とは、ＤＮＡ鋳型からＲＮＡコピーを生成する過程を表す。
【０１２２】
「形質転換」とは、外来核酸配列（例えば、ベクター、プラスミド、または組換え核酸分子）を、外来核酸を染色体に組込み、または自律複製することができる細胞に導入する過程を表す。形質転換を行った細胞またはこのような細胞の子孫は、「形質転換されている」または「組換え体」である。外来核酸が所望なタンパク質をコードするコード領域を含んでなり、所望なタンパク質が形質転換酵母で産生され、且つ実質的に機能的であるときには、このような形質転換酵母は「機能的に形質転換されている」。
【０１２３】
「翻訳」とは、メッセンジャーＲＮＡからタンパク質の生成を表す。
【０１２４】
「収率」という用語は、生成したアスコルビン酸の量（モルまたは重量／容積）を消費した前駆体の量（モルまたは重量／容積）で割って、１００を乗じたものを表す。
【０１２５】
酵素の「単位」とは、酵素活性を表し、１分間当たりの全細胞タンパク質１ｍｇ当たりの転換した基質のマイクロモル量を示す。
【０１２６】
「ベクター」とは、核酸配列を宿主細胞に運ぶＤＮＡまたはＲＮＡ分子（例えば、特にプラスミド、コスミド、バクテリオファージ、酵母人工染色体、またはウイルス）を表す。ベクターまたはその一部分を、宿主細胞のゲノムに挿入することができる。
【０１２７】
略語のリスト：
Ａｓｃ 　　　Ｌ−アスコルビン酸（ビタミンＣ）またはその塩
ＡＧＤ　　　 Ｌ−ガラクトノ−１，４−ラクトンデヒドロゲナーゼ
ＡＬ　　　　アルドノラクトナーゼ
ＡＬＯ　　　 Ｄ−アラビノノ−１，４−ラクトンオキシダーゼ
ＡＲＡ　　　 Ｄ−アラビノースデヒドロゲナーゼ
Ｇａｌ　　　 Ｌ−ガラクトノ−１，４−ラクトン
Ｇｕｌ　　　 Ｌ−グロノ−１，４−ラクトン
ＬＧＤＨ　　　Ｌ−ガラクトースデヒドロゲナーゼ
ＧＬＯ　　　 Ｌ−グロノ−１，４−ラクトンオキシダーゼ
ＲＧＬＯ　　　Ｒ． ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓから単離したＬ−グロノ−１，４−ラクトンオキシダーゼ
ＴＣＡ　　　 トリクロロ酢酸
ＴＰＩ　　　 トリオースホスフェートイソメラーゼ
ＯＤ６６０　　 ６６０ｎｍにおける光学密度
酵素活性についての略語はそれぞれの活性を表し、特異酵素を表さない点に留意すべきである。
【０１２８】
【実施例】
下記の例は、本発明の好ましい態様を説明する目的で包含される。下記の例に開示される手法は本発明の実施において良好に機能することが本発明者らによって見出された手法であり、従ってその実施のための好ましい様式を構成すると考えることができることを当業者であれば理解すべきである。しかしながら、当業者は、本発明の開示内容を考慮すれば、開示されている特定の態様において多くの変更を行うことができ、しかも発明の精神および範囲から離反することなく同様のまたは類似の結果が得られることを理解すべきである。
【０１２９】
材料および方法
１．アスコルビン酸の測定
アスコルビン酸は、Ｓｕｌｌｉｖａｎ ｅｔ ａｌ．の方法に従って分光光度法によって測定した（１９５５， Ａｓｓｏｃ． Ｏｆｆ． Ａｇｒ． Ｃｈｅｍ．， ３８， ５１４−５１８）。試料１３５μＬを、セル中でＨ３ＰＯ４（８５％）４０μＬと混合した。次に、，−Ｂｉｐｙｒｉｄｙｌ（０．５％）６７５μＬとＦｅＣｌ３（１％）１３５μＬを加えた。１０分後に、吸光度を５２５ｎｍで測定した。アスコルビン酸の同一性は、純粋なＬ−アスコルビン酸（Ａｌｄｒｉｃｈ， Ａ９， ２９０−２）を標準として用いてＨＰＬＣ（Ｔｒａｃｅｒ Ｅｘｔｒａｓｉｌ Ｃｏｌｕｍｎ Ｃ８， ５μＭ， １５×０．４６ｃｍ， Ｔｅｋｎｏｋｒｏｍａ， Ｓ． Ｃｏｏｐ． Ｃ． Ｌｔｄａ． ＃ ＴＲ−０１６０７７； 溶離剤：５μＭ臭化セチルトリメチルアンモニウム，５０ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４，９５／５Ｈ２Ｏ／アセトニトリル中；流速：１ｍＬ・分−１，検出：ＵＶ，２５４ｎｍ）によって確認した。
【０１３０】
２．タンパク質濃度の測定
タンパク質濃度は、Ｌｏｗｒｙの方法に従って（Ｌｏｗｒｙ Ｏ． Ｈ． ｅｔ ａｌ．， １９５１， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． １９３， ２６５−２７５）ＢＳＡを標準として用いＢｉｏ−Ｒａｄ ＤＣ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ ＩＩ （Ｃａｔ． Ｎｒ． ５００−０１１２）を用いて測定した。
【０１３１】
３．特異的遺伝子配列の増幅
特異的遺伝子配列を増幅するため、ＰｆｕＴｕｒｂＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ ＃６００２５２）をＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ ９７００ （ＰＥ Ａｐｐｌ． Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ， Ｉｎｃ．）で用いた。標準的条件は、４００μＭ ｄＮＴＰ、０．５μＭプライマー、０．５μＭ ＭｇＣｌ２（緩衝剤の他に）、および３．７５Ｕ Ｐｆｕ／１００μＬ反応であった。
【０１３２】
用いた遺伝子の配列は、Ｇｅｎｂａｎｋを介して下記の通りに公表されている。
【表１】
2004504850.tif 000002
【０１３３】
ＡＧＤの増幅については、下記のプログラムを用いた。
【表２】
2004504850.tif 000003
【０１３４】
ＡＬの増幅については、下記のプログラムを用いた。
【表３】
2004504850.tif 000004
【０１３５】
ＡＬＯの増幅については、下記のプログラムを用いた。
【表４】
2004504850.tif 000005
【０１３６】
ＡＲＡの増幅については、下記のプログラムを用いた。
【表５】
2004504850.tif 000006
【０１３７】
ＬＧＤＨの増幅については、下記のプログラムを用いた。
【表６】
2004504850.tif 000007
【０１３８】
ＲＧＬＯの増幅については、下記のプログラムを用いた。
【表７】
2004504850.tif 000008
【０１３９】
ＡＧＤおよびＬＧＤＨの鋳型ＤＮＡ：５０ｎｇプラスミドｃＤＮＡライブラリー ｐＦＬ６１ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ（ＡＴＣＣ ＃７７５００ （Ｍｉｎｅｔ Ｍ． ｅｔ ａｌ， １９９２， Ｐｌａｎｔ Ｊ．， ２， ４１７−４２２））。ＲＧＬＯの鋳型ＤＮＡ：０．５ｎｇラット肝マラソン−レディー（ｍａｒａｔｈｏｎ−ｒｅａｄｙ）ｃＤＮＡライブラリー （Ｃｌｏｎｔｅｃｈ ＃７４７１−１）。ＡＬの鋳型ＤＮＡ：５０ｎｇのＺｙｍｏｍｏｎａｓ ｍｏｂｉｌｉｓ由来のゲノムＤＮＡ（ＡＴＣＣ ＃１０９８８）、標準的方法を用いて抽出。ＡＬＯおよびＡＲＡの鋳型ＤＮＡ：５０ｎｇのＳ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＧＲＦ１８Ｕ由来のゲノムＤＮＡ、標準的方法を用いて抽出。ＰＣＲ生成物は、Ｎｏｖａｇｅｎ Ｉｎｃ． （＃７０１９１−４）製の完全平滑クローニングキットを用いてｐＳＴＢｌｕｅ−１のＥｃｏＲＶ部位に平滑末端クローニングした。
【０１４０】
2004504850.tif 000009
【０１４１】
４．プラスミドの構築
本明細書で用いられる命名法では、例えば、多重クローニング部位（ＭＣＳ）に関してセンス方向のＡＧＤを含むｐＳＴＢｌｕｅ−１はｐＳＴＢ ＡＧＤ−１と命名された。別の例では、ＭＣＳに関してアンチセンス方向のＡＧＤを含むｐＳＴＢｌｕｅ−１はｐＳＴＢ ＡＧＤ−２などと命名された。
【０１４２】
総てのクローニングの目的には、標準的方法を用いた（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，「分子クローニング：実験室便覧（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）。
【０１４３】
【表８】
2004504850.tif 000010
【０１４４】
発現プラスミドの構築
ｐＹＸプラスミドは、一連の市販酵母発現ベクター（Ｒ ＆ Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ， Ｉｎｃ．）である。
【０１４５】
ｐＡＧ２６ＴＰＩ：
ｐＹＸ０２２由来の発現カセット（ＴＰＩプロモーター、多重クローニング部位、およびターミネーターからなる）を制限酵素ＡａｔＩＩ／ＰｖｕＩＩで切断し、平滑末端処理し、制限酵素 ＡｐａＩで切断して平滑末端を有するようにしたｐＡＧ２６ （Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ Ａ． Ｌ． および ＭｃＣｕｓｋｅｒ Ｊ． Ｈ．， １９９９， Ｙｅａｓｔ １５， １５４１−１５５３）にクローニングした。
【０１４６】
ｐＺ３：
ＹＣｐｌａｃ３３ （Ｇｉｅｔｚ Ｒ． Ｄ． および Ｓｕｇｉｎｏ Ａ，， １９８８， Ｇｅｎｅ ７４， ５２７−５３４）を制限酵素 ＣｌａＩで切断し、末端を平滑にし、制限酵素ＳｐｅＩで切断することによってＡＲＳ／ＣＥＮ領域を切り出し、制限酵素ＤｒａＩＩＩで切断したｐＹＸ０２２にクローニングし、末端を平滑にし、制限酵素ＳｐｅＩで切断した。生成するプラスミドを制限酵素ＫｐｎＩで開いて、平滑末端処理を行い、ｐＦＡ６−ＫａｎＭＸ４ （Ｗａｃｈ ｅｔ ａｌ．， １９９４， Ｙｅａｓｔ １０， １７９３−１８０８）から制限酵素ＳｐｈＩ／ＳａｃＩで切断して平滑末端処理を行ったＧ４１８耐性カセットを収容した。
【０１４７】
５．酵母の培養および検査
用いた酵母の菌株はＳ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＧＲＦ１８Ｕ、Ｗ３０３１Ｂ、Ｚ． ｂａｉｌｉｉ ＡＴＣＣ ６０４８３、Ｚ． ｂａｉｌｉｉ ＡＴＣＣ ３６９４７、およびＫ． ｌａｃｔｉｓ ＰＭ６−７Ａ （Ｗｅｓｏｌｏｗｓｋｉ−Ｌｏｕｖｅｌ， Ｍ． ｅｔ ａｌ．， １９９２， Ｙｅａｓｔ ８， ７１１−７１９）であった。ＧＲＦ１８ＵはＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎに寄託されており、下記のカタログ番号ＮＲＲＬ Ｙ−３０３２０を有する。総ての菌株は振盪フラスコで最小培地（０．６７％（ｗ／ｖ）ＹＮＢ （Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，デトロイト，ＭＩ，＃９１９−１５）、２％（ｗ／ｖ）グルコース、それぞれ適当なアミノ酸、アデニンまたはウラシルを加えて５０ｍｇ・ｌ−１とする）中で標準的条件下で培養した（３０℃で振盪）。６６０ｎｍの初期光学密度は、０．０５であった。
【０１４８】
Ｌ−ガラクトースとのインキュベーションについては、細胞を一晩増殖させた後、Ｌ−ガラクトース２５０ｍｇ・ｌ−１を加え、細胞を２４時間インキュベーションした。Ｌ−ガラクトース以外の基質とのインキュベーションについては、特に断らない場合には、細胞をそれぞれの基質５０ｍＭまたは１００ｍＭの存在下にて７２時間増殖させた。細胞内アスコルビン酸を測定するため、細胞を下記の通り処理した。すなわち、細胞を４℃、４０００ｒｐｍで５分間遠心分離することによって回収し、冷蒸留Ｈ２Ｏで１回洗浄し、約３倍のペレット容積の冷１０％ＴＣＡに再懸濁し、激しく攪拌し、氷上に約２０分間保持した後、上清を遠心分離によって細胞破片を除いて透明にした。
【０１４９】
６．酵母の形質転換
酵母細胞の形質転換は、標準的ＬｉＡｃ／ｓｓ−ＤＮＡ／ＰＥＧ法に従って行った（Ａｇａｔｅｐ， Ｒ．， ｅｔ ａｌ．， １９９８）。Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＧＲＦ １８Ｕおよび様々な形質転換酵母がＮＲＲＬに寄託された。下表に、菌株とそれらのＮＲＲＬ番号を示す。
【０１５０】
【表９】
2004504850.tif 000011
【０１５１】
これらの菌株は、Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ， １８１５ Ｎｏｒｔｈ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｓｔｒｅｅｔ， Ｐｅｏｒｉａ， Ｉｌｌｉｎｏｉｓ ６１６０４，米国に寄託した。この寄託は、特許手続きを目的とする微生物の寄託の国際承認についてのブダペスト条約の規定およびその規則（ブダペスト条約）によって行った。酵母菌株は、関連の特許請求の範囲を有する米国特許明細書が発行された時点でブダペスト条約の条件下でＮＲＲＬによって利用可能となるであろう。寄託酵母の有効性は、特許法に従い、あらゆる政府の認可により付与された権利に違反して発明を実施する認可と解釈すべきではない。
【０１５２】
実験結果
１．Ｌ−アスコルビン酸の安定性
培養条件下でのアスコルビン酸の安定性を測定するため、アスコルビン酸を本発明者らの標準培地（２％グルコース、０．６７％ＹＮＢ）に加え、溶液を振盪フラスコ中で３０℃で振盪しながらインキュベーションした。図２は、それぞれの結果を示す。無菌培地では、アスコルビン酸は速やかに分解したが（パネルＢ参照）、生育可能な酵母が含まれている場合には完全に安定であった（パネルＡ参照）。この結果は、培地での酵母の培養がアスコルビン酸を安定化する一つの方法であることを示している。
【０１５３】
従って、酵母によって産生される可能性のあるアスコルビン酸は酵母の存在によって安定化され、本発明の方法がアスコルビン酸の生成に適するものとなる。
【０１５４】
２．非形質転換酵母からアスコルビン酸の産生
文献によれば、野生型（ｗｔ）酵母は、広汎な基質特異性を有するＤ−アラビノノ−１，４−ラクトンオキシダーゼ活性を含んでなる（Ｈｕｈ Ｗ． Ｋ． ｅｔ ａｌ．， １９９４， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２２５， １０７３−１０７９）。このような活性は、イン・ビトロで示されている。基質または生成物が細胞膜を横断することができるかどうかを決定するため、３種類の酵母菌株（Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＧＲＦ１８ＵおよびＷ３０３１Ｂ、並びにＺ． ｂａｉｌｉｉ ＡＴＣＣ ６０４８３）をＬ−ガラクトノ−１，４−ラクトン（アスコルビン酸を生じる植物生合成経路の最後の前駆体）またはＬ−グロノ−１，４−ラクトン（動物代謝経路の最後の前駆体）と共にインキュベーションした。図３に示されるように、これらの物質はいずれも酵母細胞中にインターナリゼーションさせることができ、アスコルビン酸に転換することができる。アスコルビン酸は培養液（図示せず）には蓄積されなかったが、かなりの量が総細胞抽出物で測定された。
【０１５５】
植物経路におけるもう一つ前の前駆体は、Ｌ−ガラクトースである。図４は、酵母細胞をこの基質と共にインキュベーションした結果を示している。Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｚ． ｂａｉｌｉｉ、およびＫ． ｌａｃｔｉｓはこの化合物からアスコルビン酸を産生することができ、この場合には、アスコルビン酸は細胞内部にかなりの量で蓄積する（図４）。
【０１５６】
３．形質転換酵母からのアスコルビン酸産生および培地での蓄積
本発明者らは、Ｄ−アラビノノ−１，４−ラクトンオキシダーゼ（ＡＬＯ）、Ｄ−アラビノースデヒドロゲナーゼ（ＡＲＡ）、Ｌ−ガラクトノ−１，４−ラクトンデヒドロゲナーゼ（ＡＧＤ）、Ｌ−ガラクトースデヒドロゲナーゼ（ＬＧＤＨ）、Ｌ−グロノ−１，４−ラクトンオキシダーゼ（ＲＧＬＯ）、およびアルドノラクトナーゼ（ＡＬ）をコードする遺伝子をクローニングした。これらの遺伝子は、材料および方法に概略を述べたように、入手可能な酵母発現ベクターにクローニングした。簡単に説明すれば、Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの本来的に強力且つ構成的プロモーターであるＴＰＩプロモーターが、当該遺伝子を発現させるのである。ＡＧＤまたはＡＬＯで形質転換したＳ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＧＲＦ１８ＵをＬ−ガラクトノ−１，４−ラクトンと共にインキュベーションしたところ、細胞は細胞内にアスコルビン酸を蓄積しただけでなく（図示せず）、意外なことには、かなりの量のアスコルビン酸を培養液にも蓄積した（図５）。このことは、同じ形質転換細胞をＬ−ガラクトースと共にインキュベーション場合にも事実であった（図６）。Ｌ−ガラクトースデヒドロゲナーゼまたはＤ−アラビノースデヒドロゲナーゼの同時形質転換により、それぞれの酵母菌株がＬ−ガラクトースをアスコルビン酸に転換する能力がかなり増加した（図６）。（ａ） ＡＬＯ、（ｂ） ＬＧＤＨおよびＡＬＯ、または（ｃ） ＡＲＡおよびＡＬＯを発現し、Ｌ−ガラクトースを含んでなる培地で培養した組換えＧＲＦ１８Ｕについて上記したのと同様な結果が、相当する酵素を発現し、Ｌ−ガラクトースを含んでなる培地で培養した組換えＳ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ Ｗ３０３１Ｂで見られた（結果は図示せず）。図７は、Ｌ−ガラクトースをアスコルビン酸に転換する高密度培養のデータを示している。それぞれの酵母菌株を、標準的最小培地で一晩生育した。翌日、細胞を無菌的に遠心分離し、ペレットを１／１０容の上清に再懸濁し、細胞を１０倍に濃縮した。次に、Ｌ−ガラクトース２５０ｍｇ・ｌ−１を加え、培養物を標準的条件下で６日間インキュベーションした。６日後、ＡＬＯおよびＬＧＤＨで形質転換した菌株は、培地１リットル当たり７０ｍｇを上回るアスコルビン酸を蓄積した。３０ｍｇ・ｌ−１のアスコルビン酸が、細胞内に蓄積した（図示せず）。これら２つの値をまとめる
と、添加したＬ−ガラクトースの約４０％が転換したことに相当する。
【０１５７】
異なる酵母からアスコルビン酸を産生する能力を試験するために、Ｚ． ｂａｉｌｉｉ ＡＴＣＣ ３６９４７をＡＬＯおよび／またはＬＧＤＨで形質転換した。形質転換細胞を、形質転換Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅについて記載したのと同一条件下でＬ−ガラクトースと共にインキュベーションした（図８）。上記のＳ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅに関する例と同様に、アスコルビン酸塩の蓄積が培養液で観察された。野生型Ｚ． ｂａｉｌｉｉ細胞は、Ｌ−ガラクトースと共にインキュベーションしたところ、少量のアスコルビン酸を蓄積することができた。抗生物質Ｇ４１８またはハイグロマイシンに対する耐性を付与するプラスミドにより細胞を形質転換し、細胞をそれぞれの抗生物質と共にインキュベーションすると、この内在能力は破壊されてしまうと思われる。ＡＬＯ、またはＡＬＯおよびＬＧＤＨの機能的発現により、培養液にアスコルビン酸が顕著に蓄積される。Ｇ４１８のみとインキュベーションしたＡＬＯを発現する細胞と比較して、両方の抗生物質とインキュベーションしたＡＬＯを発現する細胞によるアスコルビン酸塩の蓄積が低いことは、ハイグロマイシンの存在またはハイグロマイシン耐性遺伝子の発現がアスコルビン酸の蓄積／または検出をかなり妨げることを示している。ＡＬＯのみを発現する細胞の培養物でのアスコルビン酸塩濃度と比較してＡＬＯおよびＬＧＤＨを発現する細胞の培養物でのアスコルビン酸塩の蓄積が高くなり、いずれの場合にも細胞はＧ４１８およびハイグロマイシンの存在下で培養するときには、ＬＧＤＨがＺ． ｂａｉｌｉｉで機能的に発現することを示している。
【０１５８】
Ｌ−グロノ−１，４−ラクトンの存在下でＲＧＬＯにより形質転換したＳ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＧＲＦ１８Ｕをインキュベーションしたところ、細胞はアスコルビン酸を細胞内に蓄積したが（図９）、培養液には蓄積しなかった（データは示さず）。未形質転換細胞は、上記のように内在ＡＬＯの交差反応により幾らかの量のＬ−グロノ−１，４−ラクトンを転換した。細胞中でＲＧＬＯを発現させたところ、アスコルビン酸の蓄積量はかなり増加した。更にＡＬを発現させたところ、低濃度のアスコルビン酸が蓄積した。加水分解のため、Ｌ−グロノ−１，４−ラクトンは、水性環境にあるときには、Ｌ−グロン酸と平衡状態になっている。この平衡は遊離酸に強く傾いているが、平衡に達するのは極めて遅い（数日）。Ｌ−グロノ−１，４−ラクトンと共にインキュベーションした細胞は、化合物をインターナリゼーションして、これをアスコルビン酸に転換することができる。ＡＬと、酵素ＲＧＬＯおよびＡＬＯの両方とを機能的同時発現を行ったところ、３種類総ての酵素がＬ−グロノ−１，４−ラクトンとＬ−グロン酸との間の同じ平衡反応からの基質について競合している。ＡＬＯまたはＲＧＬＯについての基質ではないＬ−グロン酸はずっと速やかに平衡に到達するので、ＡＬＯ／ＲＧＬＯによってアスコルビン酸に転換されるラクトンの量は減少する。逆反応（Ｌ−グロン酸のＬ−グロノ−１，４−ラクトンへのラクトン化）は酵素による触媒なしでは水性環境では起こり難く、起こったとしても僅かである。従って、タンパク質を過剰発現しないＳ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＧＲＦ１８ＵまたはＲＧＬＯを発現するＬ−グロン酸とインキュベーションしたＧＲＦ１８Ｕは、細胞内（図９）にもまたは細胞外にも（データーは示さず）アスコルビン酸を全く蓄積しなかった。Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＧＲＦ１８Ｕ中でＡＬを発現させると、少量のＬ−グロン酸がＬ−グロノ−１，４−ラクトンに転換され、これはＡＬＯまたはＡＬＯおよびＲＧＬＯの基質として適していた。従って、これらの細胞は、Ｌ−グロン酸をアスコルビン酸に転換することができた。これにより、ＡＬＯおよび／またはＲＧＬＯに加えてＡＬ酵素も酵母からアスコルビン酸の産生に有用となった。
【０１５９】
ＲＧＬＯによって形質転換したＺ． ｂａｉｌｉｉ ＡＴＣＣ３６９４７またはＡＴＣＣ６０４８３をＬ−グロノ−１，４−ラクトンと共にインキュベーションしたところ、細胞はアスコルビン酸を細胞内に蓄積したが（図１０）、培養液には蓄積しなかった（データは示さず）。従って、これらのＺ． ｂａｉｌｉｉ酵母菌株から得たデータは、酵母Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅで観察されたデータに匹敵した。
【０１６０】
下表に、本発明で報告した主要な例をまとめてある。下表における「Ｎｏｔ ｄｅｔｅｒｍ．」は「測定されない」ことを示すことを意味している点に留意されたい。
【表１０】
2004504850.tif 000012
【０１６１】
本発明の組成物および方法および酵母菌株を好ましい態様について説明してきたが、当業者であれば発明の概念、精神および範囲から離反することなく変更を適用することができることは明らかであろう。
【０１６２】
参考文献
下記の参考文献の内容は、本明細書に記載したものを補足する典型的な手続き、またはその他の詳細を提供する範囲まで、その開示の一部として本明細書に引用されている。
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［２］ Ａｘｅｌｓｅｎ， Ｂｏｃｋ， ａｎｄ Ｋｒｏｌｌ，Ｎ． Ｈ． Ａｘｅｌｓｅｎ， Ｊ． Ｋｒｏｌｌ， ａｎｄ Ｂ． Ｗｅｅｋｓ監修「定量的免疫電気泳動便覧（Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ Ｉｍｍｕｎｏｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）」，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ， １９７３年， １０章。
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【図面の簡単な説明】
【図１】
それぞれ植物または動物でＤ−グルコースからＬ−アスコルビン酸への生理学的生合成経路の現在明らかになっていることの略図である。下記の酵素が関与している：Ａ，Ｌ−ガラクトノ−１，４−ラクトンデヒドロゲナーゼ（１．３．２．３）；Ｂ，Ｌ−ガラクトースデヒドロゲナーゼ；Ｃ，糖ホスファターゼ（３．１．３．２３，推定的）；Ｄ，ヒドロラーゼ（推定的）；Ｅ，ＧＤＰ−マンノース−３，５−エピメラーゼ（５．１．３．１８）；Ｆ，マンノース−１−ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼ（２．７．７．２２）；Ｇ，ホスホマンノムターゼ（５．４．２．８）；Ｈ，マンノース−６−ホスフェートイソメラーゼ（５．３．１．８）；Ｉ，グルコース−６−ホスフェートイソメラーゼ（５．３．１．９）；Ｊ，ヘキソキナーゼ（２．７．１．１）；１，Ｌ−グロノ−１，４−ラクトンオキシダーゼ（１．１．３．８）；２，アルドノラクトナーゼ（３．１．１．１７）；２ａ，グルクロノラクトンレダクターゼ（１．１．１．２０）；３，Ｄ−グルクロネートレダクターゼ（１．１．１．１９）；３ａ，ウロノラクトナーゼ（３．１．１．１９）または自発的；４，Ｄ−グルクロノキナーゼ（２．７．１．４３）；５，グルクロネート−１−ホスフェートウリジリルトランスフェラーゼ（２．７．７．４４）；６，ＵＤＰ−Ｄ−グルコースデヒドロゲナーゼ（１．１．１．２２）；７，ＵＴＰ−グルコース−１−ホスフェートウリジリルトランスフェラーゼ（２．７．７．９）；８，ホスホグルコムターゼ（５．４．２．２）；９，ヘキソキナーゼ（２．７．１．１）。しかしながら、Ｌ−アスコルビン酸を製造するための本発明の範囲において、有用な酵素は生理学的経路の酵素に限定されないことを強調しなければならない。
【図２】
培養条件下でのアスコルビン酸の安定性を示す。アスコルビン酸を無機培地（２％グルコース，０．６７％ＹＮＢ）に添加し、標準培養条件下で７日間インキュベーションした。パネルＡのフラスコに時間０にＳ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＧＲＦ１８Ｕを初期ＯＤ６６０が０．０５となるまで接種し、一方、パネルＢのフラスコは無菌状態に保った。試料は指示された時間に採取し、アスコルビン酸濃度を測定した。生育可能な酵母が含まれているときにはアスコルビン酸はこの培地で安定であったが、これは無菌培地では７日以内に完全に分解した。これは、アスコルビン酸を含んでなる培地で生育可能な酵母のインキュベーションは、アスコルビン酸を安定化する方法として用いることができることを示している。
【図３】
前駆体Ｌ−ガラクトノ−１，４−ラクトン（Ｇａｌ）またはＬ−グロノ−１，４−ラクトン（Ｇｕｌ）をアスコルビン酸に転換する酵母の内在能力を示す。非形質転換酵母細胞（Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＧＲＦ１８Ｕ、Ｗ３０３１Ｂ、およびＺ． ｂａｉｌｉｉ ＡＴＣＣ ６０４８３）はそれぞれ１００ｍＭのＬ−ガラクトノ−１，４−ラクトンまたはＬ−グロノ−１，４−ラクトンの存在下、無機培地（２％グルコース，０．６７％ＹＮＢ）にて７２時間増殖させた（初期ＯＤ６６０は０．０５であった）。「−」は、前駆体を全く加えなかったことを意味する。アスコルビン酸は細胞内に蓄積したが、培養液中には検出されなかった。
【図４】
Ｌ−ガラクトースをアスコルビン酸に転換する酵母の内在能力を示す。非形質転換Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（ＧＲＦ１８ＵおよびＷ３０３１Ｂ）、Ｚ ｂａｉｌｉｉ ＡＴＣＣ ６０４８３、およびＫ ｌａｃｔｉｓ ＰＭ６−Ａを無機培地（２％グルコース，０．６７％ＹＮＢ）上でＯＤ６６０が０．０５から出発して一晩増殖させた。次に、２５０ｍｇ ｌ−１のＬ−ガラクトースを加え、培養物をアスコルビン酸を測定する前に標準条件下、更に２４時間保持した。これら総ての株は細胞内にアスコルビン酸を蓄積したが、培養液中ではアスコルビン酸はＺ． ｂａｉｌｉｉで少量蓄積されたのを除き、測定されなかった。（Ｋ． ｌａｃｔｉｓでのバックグラウンドが高いのは、この酵母種にＳ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅで見られるより高濃度で天然に存在するエリトロアスコルビン酸によると考えられる）。
【図５】
組換え酵母によるＬ−ガラクトノ−１，４−ラクトンのアスコルビン酸への転換を示す。Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＧＲＦ１８Ｕ ｗｔ（対照）またはそれぞれＡＧＤまたはＡＬＯをコードするコード領域によって形質転換したものはそれぞれ、無機培地（２％グルコース，０．６７％ＹＮＢ）にてＯＤ６６０が０．０５から出発して、５０ｍＭのＬ−ガラクトノ−１，４−ラクトン（Ｇａｌ）の存在下７２時間増殖させた。対照細胞は培地にアスコルビン酸を蓄積しなかったが、ＡＧＤまたはＡＬＯをコードするコード領域によって形質転換した細胞は予想外にかなりの量の（すなわち、バックグラウンドレベルより高い）アスコルビン酸を培地に蓄積した。アスコルビン酸は、Ｌ−ガラクトノ−１，４−ラクトンを添加しない培養物（−印を付けたもの）では検出されなかった。
【図６】
組換え酵母によるＬ−ガラクトースのアスコルビン酸への転換を示す。Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＧＲＦ１８Ｕ ｗｔ（対照）、またはＬＧＤＨ、ＡＧＤ、ＡＬＯ、ＡＧＤおよびＬＧＤＨ、ＡＬＯおよびＬＧＤＨ、またはＡＲＡおよびＡＬＯをコードする１コード領域または複数のコード領域によって形質転換したものはそれぞれ、無機培地（２％グルコース，０．６７％ＹＮＢ）上でＯＤ６６０が０．０５から出発して一晩増殖させた。次に、２５０ｍｇ ｌ−１のＬ−ガラクトースを加え、アスコルビン酸を測定する前に培養物を標準条件下に更に２４時間保持した。対照細胞またはＬＧＤＨをコードするコード領域のみによって形質転換した細胞は、培地にアスコルビン酸を蓄積しなかった。ＬＧＤＨとＡＧＤまたはＡＬＯをコードするコード領域によって形質転換した細胞、およびＡＲＡおよびＡＬＯをコードするコード領域によって形質転換した細胞は、かなりの量の（すなわち、バックグラウンドレベルより高い）アスコルビン酸を培地に蓄積した。
【図７】
組換え酵母の高細胞密度培養におけるＬ−ガラクトースのアスコルビン酸への転換を示す。Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＧＲＦ１８Ｕ ｗｔ（対照）、またはＡＬＯをコードするコード領域またはＬＧＤＨとＡＬＯをコードする複数のコード領域によって形質転換したＧＲＦ１ ８Ｕはそれぞれ、無機培地（２％グルコース，０．６７％ＹＮＢ）にてＯＤ６６０が０．０５から出発して一晩増殖させた。時間０で、細胞を１０倍に濃縮し、２５０ｍｇ ｌ−１のＬ−ガラクトースを加え、培養物を標準条件下に６日間保持した。指示された時間に、試料を採取し、培養液中のアスコルビン酸濃度を測定した。対照細胞は培地にアスコルビン酸を蓄積しなかったが、ＡＬＯのみをコードするコード領域によって形質転換したまたはＡＬＯおよびＬＧＤＨをコードする複数のコード領域によって形質転換した細胞は、かなりの量の（すなわち、バックグラウンドレベルより高い）アスコルビン酸を培地に蓄積した。
【図８】
組換え酵母によるＬ−ガラクトースのアスコルビン酸への転換を示す。 Ｚ． ｂａｉｌｉｉ ＡＴＣＣ ３６９４７ ｗｔ（対照）、空ベクター（ｐＺ３）、ＬＧＤＨをコードするコード領域、ＡＬＯをコードするコード領域、またはＡＬＯとＬＧＤＨをコードする複数のコード領域で形質転換したＺ． ｂａｉｌｉｉはそれぞれ、無機培地（２％グルコース，０．６７％ＹＮＢ）にてＯＤ６６０が０．０５から出発して適当な選択的抗生物質の存在下にて（ｐＺ３に対してＧ４１８、ｐＡＧ２６ＴＰＩに対してハイグロマイシン、または両方）一晩増殖させた。次に、２５０ｍｇ ｌ−１のＬ−ガラクトースを加え、アスコルビン酸を測定する前に培養物を標準条件下に更に２４時間保持した。Ｗｔ細胞Ｚ． ｂａｉｌｉｉ ＡＴＣＣ ３６９４７はＬ−ガラクトースとインキュベーションしたところ培地に少量のアスコルビン酸を蓄積した。空ベクターまたはＬＧＤＨをコードするコード領域を含んでなるベクターによって形質転換した細胞は、培地にアスコルビン酸を蓄積しなかった。ＡＬＯをコードするコード領域のみまたはＬＧＤＨとＡＬＯをコードする複数のコード領域によって形質転換した細胞は、かなりの量の（すなわち、バックグラウンドレベルより高い）アスコルビン酸を培地に蓄積した。プラスミド選択に用いる抗生物質耐性の発現またはこのような選択に用いる抗生物質は、培養物中でのアスコルビン酸の蓄積または測定を妨げることがある。これは、ＡＬＯを発現し、ハイグロマイシン耐性を示さず且つ培地にハイグロマイシンを含まない細胞は、ハイグロマイシン耐性と共にＡＬＯを発現する細胞であって、ハイグロマイシンを含んでなる培地で増殖した細胞より多量のアスコルビン酸を蓄積したという事実と対応している。
【図９】
組換えＳ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＧＲＦ１８ＵによるＬ−グロン酸およびＬ−グロノ−１，４−ラクトンのアスコルビン酸への転換を示す。ＧＲＦ１８Ｕ細胞を、空プラスミド（ｐＬ、対照）、プラスミドｐＬ−ＲＧＬＯ 、プラスミドｐＬおよびｐＨ−ＡＬ、またはプラスミドｐＬ−ＲＧＬＯ（ＲＧＬＯはＲ． ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓから単離されたＧＬＯである）およびｐＨ−ＡＬによってそれぞれ形質転換した。組換え酵母を、無機培地（２％グルコース，０．６７％ＹＮＢ）上でＯＤ６６０が０．０５から出発して一晩増殖させた。次に、６６ｍＭのＬ−グロン酸またはＬ−グロノ−１，４−ラクトンを加えた。４８時間後、細胞を回収して、細胞内アスコルビン酸濃度を測定した。アスコルビン酸は、上清では検出されなかった（図示せず）。ＡＬをコードするコード領域によって形質転換した細胞は、基質として含まれるＬ−グロン酸によるバックグラウンドレベルより高濃度でアスコルビン酸を蓄積した。ＲＧＬＯのみで形質転換した細胞は、基質としてＬ−グロノ−１，４−ラクトンを有する対照（例えば、ＧＲＦ１８Ｕ／ｐＬ）で見られたアスコルビン酸の量の約３倍を蓄積した。
【図１０】
組換えＺ． ｂａｉｌｉｉの培養物におけるＬ−グロノ−１，４−ラクトン（例えば、ｇｕｌ）のアスコルビン酸への細胞内転換を示す。Ｚ． ｂａｉｌｉｉ ＡＴＣＣ ３６９４７およびＺ． ｂａｉｌｉｉ ＡＴＣＣ ６０４８３を、空Ｚ． ｂａｉｌｉｉ発現プラスミドｐＺ３またはｐＺ３−ＲＧＬＯ（ＲＧＬＯはＲ． ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓから単離したＧＬＯである）で形質転換した。酵母を、無機培地（２％グルコース，０．６７％ＹＮＢ）にてＯＤ６６０が０．０５から出発してＧ４１８の存在下にて一晩増殖させた。次に、１００ｍＭのＬ−グロン酸−１，４−ラクトンを加え、アスコルビン酸を測定する前に培養物を標準条件下に更に４８時間保持した。ＲＧＬＯを発現する両Ｚ． ｂａｉｌｉｉ株は、Ｌ−グロノ−１，４−ラクトンの存在下にて比較的高い細胞内濃度のアスコルビン酸を産生した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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