(57)【要約】本発明は、オーファンＧＰＣＲのリガンドを同定する方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）Ｇａ／Ｃａ2+シグナル伝達経路に少なくとも１種のＧＰＣＲと共役するＧ−アルファタンパク質を含む細胞を用意し、
ｂ）ａ）からの細胞系を該細胞系中または細胞系上で上記ＧＰＣＲが発現されるように組換えＧＰＣＲ構築物で形質転換し、
ｃ）少なくとも１種の化合物を用意し、
ｄ）ｃ）からの化合物とｂ）からの細胞系とを接触させ、
ｅ）ｄ）に従って接触させた後、カルシウム感受性の蛍光染料によりＦＬＩＰＲで蛍光を測定し、
ｆ）ｅ）からの蛍光測定結果と、ａ）に記載の細胞とｃ）に記載の化合物とを接触させた後の蛍光測定結果とを比較することにより、測定結果を評価する、
ことを含む、Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）のリガンドを同定する方法。
【請求項２】
細胞が、ＨＥＫ２９３、ＣＨＯ、ＣＯＳ、マウス３Ｔ３、ＨｅＬａ細胞であるか、哺乳動物の臓器から調製され培養されたものであるか、または、酵母細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
Ｇ−アルファタンパク質が、リガンドに対して異なる特異性を有するＧＰＣＲをＧｑ／Ｃａ2+シグナル伝達経路に共役させる、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
これまで不可能であったＧＰＣＲのリガンドを同定する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
ＧＰＣＲが、哺乳動物またはヒトのＧＰＲ３、６および１２からなる群より選択される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
ラットＧＰＲ３が用いられる、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
化合物が、ペプチド、多糖類、脂肪酸化合物、ポリヌクレオチドまたは有機分子であり、該化合物の分子量が０.１〜２５ｋＤａである、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
分子量が０.１〜１０ｋＤａである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
請求項１〜８に記載の方法で同定することができるＧＰＣＲリガンド。
【請求項１０】
０.１〜２５ｋＤａの分子量を有する、請求項９に記載のリガンド。
【請求項１１】
タンパク質、多糖類、脂肪酸化合物またはポリヌクレオチドである、請求項９または１０に記載のリガンド。
【請求項１２】
ＬＰＡ、Ｓ１Ｐまたはスラミンからなる、請求項９〜１１のいずれかに記載のＧＰＲ３、６または１２のリガンド。
【請求項１３】
請求項９〜１２のいずれか一項に記載のリガンドと、該リガンドを安定化させるための添加物および／または薬剤を配合するための添加物とを含む薬剤。
【請求項１４】
初めにリガンドを添加物と混合し、薬剤を最終形態に加工し、続いて容器に入れ、説明
書を添え、パッケージングする、請求項１３に記載の薬剤の調製。
【請求項１５】
リガンドが結合するＧＰＣＲの不適切な機能により引き起こされる疾病を治療する薬剤を調製するための、請求項９〜１２のいずれか一項に記載のリガンドの使用。
【請求項１６】
心臓血管の障害を治療するための、請求項１６に記載のリガンドの使用。
【請求項１７】
配列番号１に記載のラットＧＰＲ３をコードするポリヌクレオチド配列。
【請求項１８】
配列番号２に記載のアミノ酸配列を含むラットＧＰＲ３タンパク質。
【請求項１９】
請求項１７に記載のポリヌクレオチド配列を含む発現ベクター。
【請求項２０】
請求項１９に記載の発現ベクターを含む細胞。
【請求項２１】
請求項１９に記載の発現ベクターで細胞を形質転換させることにより請求項１８に記載のタンパク質を発現する、請求項２０に記載の細胞の調製。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＦＬＩＰＲ（蛍光イメージングプレートリーダー）によりオーファンＧＰＣＲ（Ｇタンパク質共役受容体）に関するリガンドを同定する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）は、様々な生理学的なプロセスにおいて中心的な役割を果する。ヒトゲノムにおいて約１０００個の遺伝子がこの受容体ファミリーに関してコードされていると考えられる。処方箋を介して現在入手可能な薬剤の約６０％が、ＧＰＣＲアゴニストまたはアンタゴニストとして作用する。これは、薬剤リサーチ産業におけるこの受容体クラスの重要性を示す。当該タンパク質ファミリーのサイズと重要性のために、および、生理学的なリガンドが多くのＧＰＣＲ（オーファンＧＰＣＲ）に関して未だ知られていないという事実を考慮して、この受容体クラスが、将来的に、新規な医薬物質の探索における適切な標的タンパク質の最も重要な貯蔵庫の一つとなり得ることも考えられる。
【０００３】
ＧＰＣＲは、細胞表面に位置する内在性膜タンパク質のファミリーである。それらは、細胞外シグナル伝達物質（例えばホルモン、神経伝達物質、ペプチド、脂質）からのシグナルを受容し、グアニンヌクレオチド結合タンパク質、すなわち「Ｇタンパク質」のファミリーを介してこれらシグナルを細胞内部に伝達する。受容体の特異性、活性化されたＧタンパク質および細胞型に応じて、それらは様々なシグナル伝達経路を活性化する。
【０００４】
全てのＧＰＣＲポリペプチド鎖は、細胞膜のリン脂質二重層を貫通する７個のα−ヘリックスに折りたたまれる。７回の膜貫通により細胞外および細胞内のループが形成され、該ループは細胞外のリガンドの結合とＧタンパク質の細胞内共役を許容する。この理由のために、ＧＰＣＲはまた、７回膜貫通受容体とも言われる。全てのＧタンパク質共役受容体は、共通の基本パターンに従って作用する：細胞外のリガンドの結合は、前記受容体タンパク質がＧタンパク質に接触できるように受容体タンパク質中で立体構造変化をもたらす。最終的に、細胞中のＧタンパク質介在シグナル伝達カスケードは、細胞の生物学的な応答をもたらす。Ｇタンパク質は、サブユニットα、βおよびγで構成されたヘテロ三量体タンパク質であり、脂質のアンカー（anchor）により細胞膜内部に位置する。活性化ＧＰＣＲがＧタンパク質に共役することにより、ＧαサブユニットでのＧＤＰ／ＧＴＰの交換、および、ヘテロ三量体のαおよびβγサブユニットへの解離が起こる。活性化αサブユニットとβγ複合体との双方は、細胞内のエフェクタータンパク質に作用することができる。Ｇαｓ型Ｇタンパク質による膜結合アデニレートシクラーゼ（ＡＣ）の活性化は、例えば、細胞内のｃＡＭＰレベルの増加をもたらし、または、Ｇαｉ型Ｇタンパク質による活性化の場合、それらの減少をもたらす。Ｇｑ型Ｇタンパク質は、イノシトール１,４,５−三リン酸（ＩＰ３）とジアシルグリセロール（ＤＡＧ）の形成を触媒するホスホリパーゼＣ（ＰＬＣ）を活性化する。これら分子は順に、細胞内の蓄積からのＣａ2+放出、または、タンパク質キナーゼＣ（ＰＫＣ）の活性化をもたらし、双方においてさらなる効果を伴う。
【０００５】
上述のＧタンパク質型（Ｇαｉ／ｓ，Ｇｑ）に加えて、Ｇ１６、Ｇ１２／１３などと表記される多数のその他の型が存在する。多種多様なＧタンパク質型は、多種多様の大きく異なるＧＰＣＲ機能を示す。
【０００６】
殆どのＧＰＣＲは、Ｇαサブユニットの一つの型のみに結合し、すなわちそれらは特定のシグナル伝達経路に選択的である。この狭い特異性は、ＧＰＣＲ依存性シグナル伝達経路を作動させる化合物が同定され得るような方法を開発する目的において大きな障害である。加えて、迅速かつ容易に分析可能な読み出し（read out）を提供するそれらのシグナル伝達経路のみが、例えばハイサンプルスループット（ハイスループットスクリーニング＝ＨＴＳ）を用いた工業的分析タイプに適している。ＧｑまたはＧ１６タンパク質による細胞内のＣａ2+レベル増加は、この要求に合う。近年、できるだけ多くのＧＰＣＲをＣａ2+経路に機能的に共役させることを目的として「乱交雑（promiscuous）」Ｇタンパク質がますます構築され、そうすることにより、ＨＴＳスクリーニングに関してそれらを利用可能にする。「乱交雑（promiscuity）」は、ＧＰＣＲに関するＧタンパク質の非選択性を意味する。ハイブリッドＧタンパク質から乱交雑Ｇタンパク質を調製することは、分子生物学的および生化学的方法、または、Ｇ１６ファミリーでの変異誘発により可能である。従って、例えば、Ｇαｉ受容体の認識領域とＧαｑエフェクター活性化領域とを融合させることによって、Ｇｉ共役受容体からシグナルを受容するが、Ｇαｑ−ＰＬＣ−βシグナル伝達経路を作動させるＧαｑ／ｉハイブリッドを調製することが可能である。この種のハイブリッドは、Ｇαｑの５Ｃ−末端アミノ酸が対応するＧαｉ配列（Ｇαｑｉ５）で置換されており、Ｃｏｎｋｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ.，Ｎａｔｕｒｅ  ３６３，２７４−２７６（１９９３）において初めて説明された。
【０００７】
受容体のこの「再共役（ｒｅｃｏｕｐｌｉｎｇ）」は、分析の終点（アデニレートシクラーゼ阻害と比較した細胞内Ｃａ2+濃度の増加）が、測定方法を通してよりわかりやすく、さらに、ハイスループットスクリーニングで用いることができる、という利点を有する。ＦＬＩＰＲ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）は、細胞内Ｃａ2+レベルを９６−ウェルおよび３８４−ウェルのフォーマットで測定できる装置である。
【０００８】
多くのＧＰＣＲに関して、天然リガンドは未だ知られていない。このようなＧＰＣＲは、オーファンＧＰＣＲと呼ばれている。
【０００９】
オーファンＧＰＣＲの例は、ヒトＧＰＲ３、６および１２である。ＧＰＲとは、Ｇタンパク質共役受容体（Ｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ｃｏｕｐｌｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）の別の名称である。数字は、特定の型を意味する。全ての３種の受容体は、元来、中枢神経系で多く発現されることがわかっている。
【００１０】
しかしながら、それ以来、ＧＰＲ３、６および１２は、末梢血管系（内皮細胞および平滑筋細胞）でも発現されることが示されている。それゆえに、これら受容体は、内皮、従って全てのヒト血管系の生理学／病態生理学において主要な役割を有することが考えられる。
【００１１】
高血圧、アテローム性動脈硬化症またはその他の心臓血管の障害の進行は、これら受容体に関連する可能性がある。配列比較に基づき、脂質リガンドを有するＧＰＣＲとの高いホモロジーが見出された。配列類似性により、ＧＰＲ３、６および１２も同様に脂質受容体であり得ることが示されている。
【００１２】
その３種の受容体遺伝子に関する配列情報は、公的に入手可能である。配列受入番号は、ヒトＧＰＲ３遺伝子に関しては「Ｌ３２８３１」、ヒトＧＰＲ６遺伝子に関しては「Ｌ３６１５０」およびヒトＧＰＲ１２遺伝子に関しては「Ｕ１８５４８」である。情報は、例えばｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖから入手可能である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
ＧＰＣＲリガンドは、一般的に試行錯誤により室内実験で同定されている。この方法は、しばしば時間を浪費し、ランダムであるという不利益がある。それゆえに、本発明の一つの目的は、１またはそれ以上のＧＰＣＲに関するリガンドを同定する迅速で簡便な方法を提供することである。生理学的なリガンドの分析設計と特異的な探索に関して、バイオインフォマティクスからの結果を考慮することはここで不可欠である。
【００１４】
ヒトＧＰＲ３が構成的に活性な方法でαｓ型Ｇタンパク質を刺激し得ることは、文献で知られている（Ｅｇｇｅｒｉｃｋｘ  ｅｔ  ａｌ，１９９５）。しかしながら、ＧＰＲ３が本当の永続的に活性なＧＰＣＲであるのか、または、むしろ細胞培養液中の因子が構成的な活性化を引き起こすのかを明白にすることはできていない。配列比較により、ＧＰＲ３、６、１２受容体と、脂質様リガンドと結合する受容体との相関が明らかである。その上、脂質は、細胞培養液の主成分である。この理由のために、培養液中に存在する脂質が受容体活性化を引き起こすと推測することは、筋が通っているように思われる。
【００１５】
すでに最大限活性化された受容体は、それ以上刺激させることができないので細胞を飢餓に晒し（培養液中の、血清、従って脂質の減少）、潜在的刺激物質が見出される。飢餓した受容体を活性化剤の外的な添加により作動させることが可能なはずである。
【００１６】
本発明では、可能性のある脂質活性化剤により刺激した後、受容体を、ＨＴＳに適したＣａ2+経路に連結させることを試みた。
【００１７】
内因性の脂質受容体発現によるバックグラウンドを減少させるために、かつ、ＧＰＲ３、６、１２−介在シグナルを増加させるために、３００μＭスラミンの存在下で機能的な実験を行った。
【００１８】
同様に、ラットＧＰＲ３に関して、生理学的なリガンドは知られていない。この受容体部分的な配列のみが、公的に利用可能なデータベースに存在するだけである（受入番号：Ｌ３２８２９）。
【００１９】
これは、例えば薬剤に関する選択性の研究において、前記薬剤を調査するために前記受容体を用いることができないという不利益をもたらす。それゆえに、完全ラットＧＰＲ３遺伝子を提供することも、本発明の目的である。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
それゆえに、本発明は、Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）のリガンドを同定する方法に関し、当該方法は、
ａ）細胞の内因性シグナル伝達カスケードが、オーファンＧＰＣＲＧＰＲ３、６および１２またはｒＧＰＲ３をＣａ2+経路に共役させる細胞を提供すること、を含む。ここで、１％ＦＣＳ含有培養液で細胞（ＨＥＫ２９３）を培養すること、および、内因性の脂質により誘導されるバックグラウンドシグナルを減少させるために３００μＭスラミンを添加することが必要である。
【００２１】
ｂ）前記ＧＰＣＲが前記細胞系で過剰発現されるように、ａ）からの細胞系に組換えＧＰＣＲ構築物をトランスフェクトすること、
ｃ）バイオインフォマティクスおよび文献での検索（Ｅｇｇｅｒｉｃｋｘ  ｅｔ  ａｌ，１９９５）でサポートされた理論上予備的な考察により可能性のあるリガンドとみなされる少なくとも１種の化合物を提供すること、
ｄ）ｃ）からの化合物とｂ）からの細胞系とを接触させること、
ｅ）ｄ）に従って接触させた後、カルシウム感受性の蛍光染料によりＦＬＩＰＲ分析で蛍光を測定すること、
ｆ）ｅ）での蛍光測定結果と、ａ）に記載の細胞とｃ）に記載の化合物とを接触させた後の蛍光測定結果とを比較することにより、測定結果を評価すること。
【００２２】
本発明のＧＰＣＲ（ＧＰＲ３、６および１２）は、特に、Ｇタンパク質αサブユニットのＧαｉクラスと相互作用する。Ｇαｉの活性化は、アデニレートシクラーゼ阻害を引き起こす。加えて、それに関するβγ複合体は、細胞内での貯蔵細胞器官からのＣａ2+放出をもたらすことができる。Ｇαｉ−またはαｓ−共役ＧＰＣＲを用いたＦＬＩＰＲ分析に関して、様々なリガンド特異性のＧＰＣＲとＣａ2+シグナル伝達経路とを共役させるＧアルファタンパク質が用いられる。「Ｇα１６」タンパク質は、上述の本発明の方法を実施するのに特に適切である。ＤＥ１００３３３５３．２は、前記方法の実施に用いることができるさらなるＧαタンパク質を開示する。
【００２３】
組換え技術は、細胞系における様々なＧＰＣＲを結合させ、分析するのに用いることができる。生理学的なリガンドが未だ知られていないＧＰＣＲを用いる方法を実施することが好ましい。生理学的なリガンドは、生物（特に哺乳動物）で形成され、前記ＧＰＣＲに結合し、それにより下流のＧ−アルファタンパク質を活性化する分子を意味するものと理解される。
【００２４】
また、ＧＰＲ３、６および１２からなる群よりのＧＰＣＲが、本方法を実施するのに好ましく、適切である。完全ラットＧＰＲ３受容体が特に好ましく、適切である。
【００２５】
適切で好ましい細胞は、哺乳動物の細胞である。これら細胞は、初代細胞でも細胞系でもよい。このような細胞の例は、哺乳動物の臓器（例えば脳、筋肉、脂肪組織、心臓、肺、肝臓、腎臓、血管、ホルモンの腺など）からの初代細胞である。適切で好ましい細胞系は、ＣＨＯ、ＨＥＫ２９３、ＣＯＳ、マウス３Ｔ３、ＨｅＬａなどの細胞である。また、酵母細胞を用いることも好ましい。
【００２６】
細胞を提供することは、その調製、培養およびさらなる加工を含む。細胞は、例えば、臓器または組織から適切な細胞材料を調製することにより、または、適切な細胞系または微生物を増殖させることにより、提供される。様々な適切な培養液を培養に用いることができる。細胞は生物にとって最適な温度で維持される。必要に応じて、防腐剤、抗生物質、ｐＨ指示薬、血清成分、血清、添加剤またはその他の物質が、各場合において用いられる増殖培地に加えられる。調製、培養およびさらなる加工のためのプロセスは、標準的な教本（例：Ｂａｓｉｃ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ；Ｅｄ．Ｊ．Ｍ．Ｄａｖｉｓ；ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ；１９９４）に記載されている。
【００２７】
組換え技術の適用により、細胞で発現することができ、熟練者がその人の専門知識の援助により決まった手順で調製することができるポリヌクレオチド配列の形態で存在し得る構築物が提供される。分子生物学／生化学の熟練者は、これに関する専門知識を、例えばＦ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．；Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ；Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ；Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋで見出すことができる。ベクター構築物は、例えばＧＰＣＲのアミノ酸配列をコードしたポリヌクレオチドを発現ベクターに取り入れることにより調製される。発現ベクターは、ポリヌクレオチド配列が宿主細胞にトランスフェクトされ、宿主細胞で発現できるベクターを意味することと理解される。ベクターは、プラスミド、ウイルスまたはコスミドから誘導することができ、自発的な複製が可能でなければならない。それらは概して、複製起点、制限酵素の開裂部位、および、マーカー遺伝子（例えば抗生物質耐性遺伝子）を含む。発現ベクターにおいて、増殖しようとするポリヌクレオチド配列、または、外部から導入されたポリヌクレオチド配列は、プロモーターの機能的な制御下である。プロモーターは、可変的な長さの機能的なポリヌクレオチド配列であり、転写、すなわち前記プロモーターの３’に近接したポリヌクレオチド配列のｍＲＮＡの合成を制御するのに用いられる。原核生物でのみ活性なプロモーター（例えばｌａｃ、ｔａｃおよびｔｒｃプロモーター）、または、真核生物でのみ活性なプロモーター（例えばＣＭＶ、ＴおよびＡＤＨプロモーター）である。従って、原核性の発現ベクターは、真核性の発現ベクターとは異なる。
【００２８】
好ましい実施形態において、組換えベクター構築物は、真核生物および／または原核生物で用いることができる発現ベクターを含む。発現ベクターは、生物（例えば細菌、真菌または真核細胞系細胞）で前記ポリヌクレオチド配列によりコードされたタンパク質が合成されるようにポリヌクレオチド配列に機能的に連結することができるプロモーターを含む。プロモーターは、例えばトリプトファンにより誘導され得るものか、または、構成的に活性であるものであり得る。発現ベクターの例は、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ、ｐｃＤＮＡ３．１などである。
【００２９】
トランスフェクションは、外来ポリヌクレオチド配列をベクターにより宿主細胞へ導入させることと、それに続く前記ポリヌクレオチド配列をいくらでも同一なコピーに増殖させることを意味することと理解される。
【００３０】
細胞系は、決まった方法で一時的に組換え構築物でトランスフェクトされるが、この決まった方法は、熟練者により上述のＪｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓに（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）より出版されたＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、または、Ｓａｍｂｒｏｏｋ等のＡ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＩＳＢＮ０−８７９６９−３０９−６で見出すことができる。このような決まった方法の例は、エレクトロポレーション、Ｃａ2+リン酸塩での共沈、および、リポゾームを用いたトランスフェクションである。トランスフェクトされた遺伝子の宿主細胞中での発現は、免疫検出方法と組み合わせた、トランスフェクトされた細胞の細胞溶解物のウェスタンブロッティングにより証明することができる。
【００３１】
また、これに関して、必要とされる実験方法は、熟練者により上記マニュアル中に見出すことができる。本発明の方法を実施するのに適切なＧＰＣＲ受容体の免疫検出に特異的な抗体（例えばＥＤＧ１〜８）は、一部市販されている。多数の供給業者の一つとして、Ｅｘａｌｐｈａ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ社（ｗｗｗ．ｅｘａｌｐｈａ．ｃｏｍ）が挙げられる。特異的抗体を生産するために、ウサギがＧＰＲ３、６および１２に対して免疫化される。
【００３２】
特に化学合成または生物学的材料からの化学物質単離により、化合物が提供される。生物学的材料は、生細胞もしくは非生細胞またはその成分が含まれる。
【００３３】
熟練者は、化合物の化学合成または生物学的な細胞のからの物質の単離について決まった方法を用いることができる。このような方法は、Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｗｏｒｋｂｏｏｋ；１９９５；Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ；ＩＳＢＮ３−５２７−３０１８７−９、Ｔｈｅ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｄｒｕｇ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ；１９９８；Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ；ＩＳＢＮ０−４７１−２４５１０−０、または、Ｂｉｏａｃｔｉｖｅ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄ  ｆｒｏｍ  Ｎａｔｕｒａｌ  Ｓｏｕｒｃｅｓ；２００１；Ｔａｙｌｏｒ＆Ｆｒａｎｃｉｓ；ＩＳＢＮ０−７４８４−０８９０−８のような教本において熟練者に利用可能である。
【００３４】
合成または単離で得られた化合物は、適切な溶媒に溶解させることができる。適切な溶媒としては、水、緩衝物質（例えばＴｒｉｓ、ＨＥＰＥＳ、ＭＯＰＳなど）、一価および／または二価イオン（例えばＫ+、Ｎａ+、Ｍｇ2+、Ｃａ2+など）、酸（例えばＨＣｌ、Ｈ2ＳＯ4、ギ酸、酢酸など）、塩基（例えばＮａＯＨなど）、アルコール（例えばメタノール、エタノール、グリセロール）、界面活性剤（例えばドデシル硫酸Ｎａなど）、有機溶媒（例えばホルムアミド、アセトン、ジメチルスルホキシドなど）、および、その他の成分、特に可溶化剤や安定剤が挙げられる。
【００３５】
本発明の方法のための化合物は、ＧＰＣＲリガンドとして適切であるべきであり、同様に、ＧＰＲ３、６および１２の脂質ＧＰＣＲへの類似性のために、脂質でもよい。
【００３６】
このような化合物は、特に、哺乳動物の組織または臓器、例えば内皮細胞組織、心臓組織、脳組織、血液、血清または血漿から得ることができる。本発明の方法を実施するのに適切な好ましい化合物は、天然のＧＰＣＲリガンドである。
【００３７】
熟練者は、決まった実験方法を用いて化合物と前記細胞系とを接触させることができる。接触は、例えば、Ｅｒｉｅｎｍｅｙｅｒ管、チューブ、エッペンドルフ管中で、または、マイクロタイタープレート上で行ってもよい。一定温度（例えば３０℃または３７℃）および一定ＣＯ2または湿度条件を設定することができる温度制御されたインキュベーターを前記接触のために用いることができる。また、接触は特に、そのために提供された実験ロボット装置（ＦＬＩＰＲ）で実施することもできる。接触は、数秒〜数分から、数時間までの様々な時間が可能である。各場合で選択される条件は、受容体、細胞系および化合物による。
【００３８】
接触させたあと、蛍光は、ＦＬＩＰＲにより測定される。ＦＬＩＰＲは、フルオメトリックイメージングプレートリーダー（Ｆｌｕｏｍｅｔｒｉｃ  ｉｍａｇｉｎｇ  ｐｌａｔｅ  ｒｅａｄｅｒ）を意味する。当該システムは、細胞内のＣａ2+シグナルを測定するのに適切である。測定は、９６または３８４ウェルを有するマイクロタイタープレートで実施される。リガンドがＧＰＣＲへ結合することにより、細胞内でＣａ2+が放出される。放出されたＣａ2+の量は、カルシウム感受性の蛍光染料（例えばｆｌｕｏ−４）により測定することができる。細胞のＣａ2+シグナルと、ＧＰＲ３、６または１２を過剰発現する細胞のＣａ2+シグナルとの比較により、前記ＧＰＣＲのリガンドを決定することが可能になる。このようなリガンドは、機能的にＧＰＣＲを過剰発現する細胞においてより良好にＣａ2+放出を活性化する。Ｃａ2+を測定するための試薬を含むＦＬＩＰＲシステムの技術的な器具は、市販である。１つの特定の供給業者は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ社である（特に、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ（ＣＡ）、Ｉｓｍａｎｉｎｇ（Ｇｅｒｍａｎｙ）およびＡｓｈｉｙａ（Ｊａｐａｎ）に支社を有する）。
【００３９】
本発明はまた、上述の方法により同定されたリガンドに関する。Ｓ１ＰおよびＤＨＳ１Ｐは、ＨＥＫ２９３細胞でＣａ2+放出を引き起こす。本分析では内因性の脂質バックグラウンドを減らすためにスラミンが用いられた。
【００４０】
生物、例えば脊椎動物は、その生物の環境内で便宜上ＧＰＣＲを活性化するために天然リガンドを形成する。その目的は、特に、生化学的な機能（例えば、感覚刺激を処理するために活動電位を作動させること、構造タンパク質またはメッセンジャーとして作用するタンパク質の遺伝子の合成を作動させること、メッセンジャーを放出すること、代謝機能を調節すること、臓器の機能、例えば心臓の鼓動、血圧、または類似の生物学的プロセスを調節すること）を誘発させることである。ＧＰＣＲのリガンドとして適切な化合物は、前記ＧＰＣＲに結合する。リガンドの結合により、前記受容体の活性化が引き起こされる。本発明の方法において、ＧＰＣＲ活性化は、細胞中で細胞内Ｃａ2+放出をもたらす。
【００４１】
その上、本発明は、上述のリガンドと、前記リガンドを安定化させるための添加物および／または薬剤を配合するための添加物とを含む薬剤に関する。本発明はまた、薬剤の調製に関する。この目的のために、上述のリガンドは、添加物と混合され、続いて薬剤を最終形態に加工し、容器に入れ、説明書を添え、パッケージングする。薬剤の最終形態は、例えば錠剤、顆粒、スプレー、溶液、軟膏、チンキまたはその他の剤形のような最終的な製剤に関する。最終形態への加工は、特定の製剤の調製を意味する。
【００４２】
本発明はまた、前記リガンドが結合するＧＰＣＲの不適切な機能により生じる病気を治療するのに適切な薬剤を調製するための、上述したようなリガンドの使用に関する。心臓血管の障害およびＣＮＳ障害を治療する薬剤を調製するためのリガンドを用いることが好ましい。
【００４３】
該リガンドは、好ましくは、医薬組成物の形態で、許容できる担体と共に存在する。担体は、もちろん、組成物の他の成分に適合するという点で許容可能でなければならず、患者に無害である。担体は、固体もしくは液体、または、その両方でよく、好ましくは単回投与として、例えば活性物質が０.０５重量％〜９５重量％で含まれ得る錠剤として化合物と共に配合される。本発明の医薬組成物は、既知の製剤方法のいずれかに従って製造することができ、このような製剤方法は、成分を薬理学的に許容できる担体および／または賦形剤と共に混合することを本質的に含む。
【００４４】
本発明の医薬組成物は、口、直腸、局所的、経口（例えば舌下）、および、非経口（例えば皮下、筋肉内、皮内または静脈内）投与に適切なものである。
【００４５】
望ましい生物学的効果を得るために必要な上述のリガンドの量は、例えば選択された特定の化合物、意図した使用、投与タイプ、および、患者の臨床状態のようなファクターの数に依存する。以下に示す量は、単一のリガンドについて言及されている。
【００４６】
一般的に、一日量は、０.３ｍｇ〜１００ｍｇ（一般的には３ｍｇ〜５０ｍｇ）／日／体重ｋｇ、例えば３〜１０ｍｇ／ｋｇ／日の範囲である。静脈内の用量は、例えば０.３ｍｇ〜１.０ｍｇ／ｋｇの範囲でよく、最も適切には、１０ｎｇ〜１００ｎｇ／ｋｇ／分の点滴で投与することができる。この目的に適切な点滴用溶液は、例えば０.１ｎｇ〜１０ｍｇ、一般的には１ｎｇ〜１０ｍｇ／ｍｌで含み得る。単回投与は、活性物質を、例えば１ｍｇ〜１０ｇで含み得る。従って、注射用アンプルの場合、例えば１ｍｇ〜１００ｍｇを含ませることが可能であり、経口投与が可能な単回投与製剤（例えば錠剤またはカプセル）の場合、例えば１.０〜１０００ｍｇ、一般的には１０〜６００ｍｇを含ませることが可能である。
【００４７】
本発明はまた、ラットＧＰＲ３をコードする、配列番号１に記載のポリヌクレオチド配列に関する。その上、本発明は、配列番号２に記載の少なくとも１種のアミノ酸配列を含むラットＧＰＲ３に関するタンパク質を含む。
【００４８】
本発明はまた、配列番号１に記載のラットＧＰＲ３の上記ポリヌクレオチド配列が組み込まれた発現ベクターを含む。その上、本発明は、少なくとも配列番号２に記載のアミノ酸配列を含むラットＧＰＲ３を発現する細胞の調製に関し、前記細胞は、上述の発現ベクターによりトランスフェクトされている。発現ベクターと細胞に関して、上記の章で示された本発明の説明が参照される。熟練者であれば、配列番号１に記載のポリヌクレオチド配列、少なくとも配列番号２に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質、発現ベクターおよび細胞を調製し特徴付ける方法を、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ；ＩＳＢＮ０−４７１−５０３３８−ｘ、および、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ；Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ；ＩＳＢＮ０−８７９６９−３０９−６のようなマニュアルに見出すことができる。
【実施例１】
【００４９】
ヒトＧＰＲ３、６および１２のクローニング
ＧＰＲ３、６および１２のヒト遺伝子はイントロンを含まず、それゆえにＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）によりヒトゲノムＤＮＡから増幅することができる。コーディング配列は、ｐｃＤＮＡ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のＨｉｎｄＩＩＩ／ＸｂａＩ部位でクローニングされた。
【実施例２】
【００５０】
ラットＧＰＲ３のクローニング
完全ラットＧＰＲ３遺伝子の配列は、５’プライマー５’−ＡＴＧ  ＣＴＴ  ＧＣＣ  ＡＴＧ  ＧＣＣ  ＴＧＧ  ＴＴＣ  ＴＣＡ  ＧＣＣ  ＧＣＣ  ＴＣＡ−３’（配列番号３）および３’プライマー（マウス）５’−ＴＣＴ  ＡＧＡ  ＣＴＡ  ＧＡＣ  ＡＴＣ  ＡＣＴ  ＡＧＧ  ＧＧＡ  ＣＣＧ  ＧＧＡ−３’（配列番号４）を用いたＰＣＲ増幅によりラット脳のｃＤＮＡから増幅させた。その上、５’プライマーはＨｉｎｄＩＩＩ部位を提供し、開始コドンの前にＫｏｚａｃ配列を生じさせる。３’プライマーにおいては、ＸｂａＩ部位も考慮される。９９０ｂｐの増幅産物をｐｃＤＮＡ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のＨｉｎｄＩＩＩ／ＸｂａＩ部位にクローニングし、続いて配列解析した。
【実施例３】
【００５１】
ＧＰＲ遺伝子の発現
ＨＥＫ２９３細胞（ヒト胎児の腎臓細胞系）を、ＤＭＥＭ（１０％ウシ胎仔血清、１０,０００ＩＵ／ｍｌペニシリン、１０,０００μｇ／ｍｌストレプトマイシンおよび２５ｍＭのＨＥＰＥＳが添加されたもの；ｐＨ７.０）で培養した。ＣＨＯ−Ｋ１細胞（チャイニーズハムスター卵巣細胞系）を、Ｉｓｃｏｖｅ培地（１０％ウシ胎仔血清、１０,０００ＩＵ／ｍｌペニシリン、１０,０００μｇ／ｍｌストレプトマイシン、ゲンタマイシンおよび２ｍＭのＬ−グルタミンが添加されたもの）で培養した。Ｉｓｃｏｖｅ培地は市販されている（例えばＢｉｏｃｈｒｏｍから）。
【００５２】
５×１０5個のＨＥＫ２９３細胞または２×１０5個のＣＨＯ−Ｋ１細胞を６−ウェルプレートで３７℃で２４時間インキュベートすることにより、一時的なトランスフェクションを行った。次に、ＧＰＲ３、６または１２が真核性ＣＭＶプロモーターの制御下にクローニングされたベクター、または、相当するクローン化インサートを含まないコントロールプラスミドの１〜２μｇを、細胞にトランスフェクトさせた。ＦｕＧｅｎｅ６トランスフェクション試薬（例えばＲｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓから市販されている）によりＨＥＫ２９３細胞をトランスフェクトさせ、リポフェクトアミン試薬（例えばＧＩＢＣＯ−ＢＲＬから市販されている）によりＣＨＯ細胞をトランスフェクトさせた（いずれの場合も使用説明書に従った）。
【実施例４】
【００５３】
蛍光イメージングプレートリーダー（ＦＬＩＰＲ）分析
ＨＥＫ２９３細胞を、一時的なトランスフェクションの２４時間後、９６−ウェルマイクロタイタープレートに移した。細胞密度は、８０,０００細胞／ウェルであった。マイクロタイタープレートをポリ−Ｄ−リシンでコーティングした。細胞を１％ＦＣＳ（ウシ胎仔血清）を含む培養液で１８〜２４時間維持した。トリプシン処理後、ＤＭＥＭ（ダルベッコ改変イーグル培地）［２５ｍＭのＨＥＰＥＳ（Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−２−エタンスルホン酸）（ｐＨ７.０）、１％ＦＣＳ、１０,０００ＩＵ／ｍｌペニシリン、１０,０００μｇ／ｍｌストレプトマイシンおよび４μＭの染料ｆｌｕｏ４（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ社製の蛍光性のカルシウム指示薬）をさらに含む］］に細胞を懸濁し、続いて、３７℃で、５％ＣＯ2で、１時間インキュベートした。続いてその細胞を、ＰＢＳ（リン酸緩衝食塩水）［１ｍＭのＭｇＣｌ2、１ｍＭのＥＤＴＡおよび０.４ｍｇ／ｍｌのＦＡＦ−ＢＳＡ（脂肪酸非含有ウシ血清アルブミン）を含む］で３回洗浄した。最後の洗浄工程の後、量は、１００μｌ／ウェルであった。ほとんどの場合、分析される化合物は、ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）中の２ｍＭストック溶液として存在した。これらストック溶液を１ｍＭのＭｇＣｌ2、１ｍＭのＥＤＴＡおよび０.４ｍｇ／ｍｌのＦＡＦ−ＢＳＡを含むＰＢＳ溶液で１：５００に希釈した。脂質は、分析前には、３倍濃縮溶液の形態で存在した。スラミン（Ｓｉｇｍａ）を、１ｍＭのＭｇＣｌ2、１ｍＭのＥＤＴＡおよび０.４ｍｇ／ｍｌのＦＡＦ−ＢＳＡを含むＰＢＳでの３倍濃縮溶液の形態に調製した。
【００５４】
５０μｌの３倍濃縮スラミンストック溶液が細胞に添加され、最終スラミン濃度が３００μＭになるようにＦＬＩＰＲをプログラミングした。最初の３分は３秒のインターバルで、最後の２分は１０秒のインターバルで、蛍光を測定した。リガンドのＣａ2+シグナルを同様に測定した。
【００５５】
１８〜３７秒のタイムインターバルの蛍光データを用いて、アゴニスト活性を決定した。
【００５６】
装置それ自体は、内部でゼロ値を比較する。
【実施例５】
【００５７】
ＧＰＣＲ３、６および１２に関するリガンドの同定
ＧＰＣＲ３、６および１２は、ＧＰＣＲタンパク質ファミリーのオーファン受容体である。遺伝子バンク検索（ＥＭＢＬ）を用いて、ＧＰＲ３、６および１２の構造的に最も近い近縁物として脂質受容体ＥＤＧ（内皮の分化遺伝子）ＧＰＣＲとカンナビノイドＧＰＣＲとを同定することができた。１つの種間でのホモロジーは、ヌクレオチド配列に関して６５〜６８％である。ヒトの配列では、ラットの配列と比較して、それぞれ８７％（ＧＰＲ３）、８３％（ＧＰＲ６）および８８％（ＧＰＲ１２）のホモロジーを示す。
【００５８】
ＲＴ−ＰＣＲ分析（ＲＴ  ＰＣＲ＝逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応）によれば、大脳組織および心臓血管の臓器（例えば心臓、腎臓）において、ｈＧＰＲ３、６および１２の適合する発現が示される。この結果に基づき、単離された内皮細胞および平滑筋細胞における発現を確認できた。ＨＥＫ２９３細胞でＣａ2+ＦＬＩＰＲ分析を用いることによって、ｈＧＰＲ３、６および１２の生理学的なリガンドとして脂質スフィンゴシン１−リン酸塩（Ｓ１Ｐ）およびジヒドロスフィンゴシン１−リン酸塩（ＤＨＳ１Ｐ）を同定することができた。Ｓ１ＰおよびＤＨＳ１ＰのＥＣ50値は、１００ｎＭ未満であった。２００個の生物活性脂質からなる脂質ライブラリーを用いても、さらなるリガンドは生産されず、加えて、カンナビノイドが効果が無いことが示された。新たにクローニングされたｒＧＰＲ３（Ｌ３２８２９，３３ｂｐの部分配列）、同様に、そのヒト相同体は、Ｃａ2+ＦＬＩＰＲ分析においてＳ１Ｐ／ＤＨＳ１Ｐにより作動させることができる。
【００５９】
ＨＥＫ２９３細胞において、ＧＰＲ３、６および１２は、Ｇ１６またはその他のキメラ乱交雑Ｇαサブユニットのコトランスフェクションなしに、Ｃａ2+シグナル伝達経路に共役される。ＨＥＫ２９３細胞におけるＳ１Ｐ／ＤＨＳ１Ｐにより誘導されたＣａ2+放出は百日咳毒素感受性であり、すなわちシグナル伝達カスケードは、Ｇαｉ型Ｇタンパク質を介して行われる。その上、Ｃａ2+放出は、ある程度、スフィンゴシンキナーゼ阻害剤に感受性である。
【００６０】
それらが、Ｓ１Ｐ／ＤＨＳ１Ｐと共に、ＥＤＧファミリーメンバーと同じリガンドを有し、さらにそれらの発現パターンも概ねＥＤＧの発現パターンと同一であるため、それらが、匹敵する生理学的機能（アポトーシスからの防御、血管新生、増殖の促進および阻害、血小板活性化、血管作動作用、化学走性、細胞分化など）を発揮する、ということが考えられる。
【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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