(57)【要約】本発明は、安定化１α−ヒドロキシビタミンＤ（ＳＨＶＤ）、特に医薬製剤に適しているものに関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
純度が質量ベースのＨＰＬＣ分析によって９８％以上であり、残留溶媒が０．５％以下であり、合計不純物が１．５％以下であり、及び、０．５％より大きい単一の不純物を有しないことを特徴とする、安定化１α−ヒドロキシビタミンＤ（ＳＨＶＤ）。
【請求項２】
不純物が、１α−ヒドロキシビタミンＤ４である、請求項１に記載の安定化１α−ヒドロキシビタミンＤ。
【請求項３】
熱攻撃におけるビタミンＤ形態からプレビタミン形態への転換率が、同一条件下での非安定化１α−ヒドロキシビタミンＤ（非ＳＨＶＤ２）より低い、請求項１に記載の安定化１α−ヒドロキシビタミンＤ。
【請求項４】
請求項１のＳＨＶＤを含む医薬組成物。
【請求項５】
ソフトゼラチンカプセルである請求項４の組成物。
【請求項６】
溶液である、請求項４の組成物。
【請求項７】
単位投与形態であり、０．５μｇ〜２５μｇの活性成分を含む、請求項４の組成物。
【請求項８】
油中、請求項１のＳＨＶＤの効果的量の溶液を含み、該溶液が、ソフトゼラチンカプセルに含まれている組成物。
【請求項９】
油が分画されたココナッツ油である、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
請求項１のＳＨＶＤの効果的な量の固体医薬製剤を含み、該固体医薬製剤が、タブレット、カプセル、粒剤、粉体の形態である組成物。
【請求項１１】
活性成分としての請求項１のＳＨＶＤの効果的量を含む、カルシウム吸収、輸送または代謝、高増殖細胞活性、免疫応答不均衡または炎症応答不均衡の異常性が原因の病気の治療用薬剤。
【請求項１２】
活性成分としての請求項１のＳＨＶＤの効果的量を、治療が必要な被検者に投与することを含む、カルシウム吸収、輸送または代謝、高増殖細胞活性、免疫応答不均衡または炎症応答不均衡の異常性が原因の病気の治療方法。
【請求項１３】
病気が乾癬である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
熱攻撃のときの１α−ヒドロキシプレビタミンＤへの転化率が、同一条件下での非ＳＨＶＤと比較して減少することを特徴とする、安定化１α−ヒドロキシビタミンＤ（ＳＨＶＤ）。
【請求項１５】
熱攻撃が、約６０℃の一定温度で起こる、請求項１４に記載の安定化１α−ヒドロキシビタミンＤ。
【請求項１６】
実質的に純粋で、実質的に溶媒フリーで、かつ貯蔵安定性である、安定化１α−ヒドロキシビタミンＤ（ＳＨＶＤ）。
【請求項１７】
対応するプレビタミン形態と比較して実質的に減少した転換率によって特徴付けられる安定化１α−ヒドロキシプレビタミンＤを含む、医薬化合物。
【請求項１８】
（ａ）ビタミンＤ化合物である出発物質の３位のヒドロキシル基をトシル化してヒドロキシを１α位に加える工程；
（ｂ）トシル化形態をシクロビタミンに転換する工程；
（ｃ）１α位のシクロビタミンをヒドロキシル化する工程；
（ｄ）シクロビタミンをシス及びトランスビタミン形態に転換する工程；
（ｅ）トランスビタミン形態を照射してシス形態を生成する工程；
（ｆ）シス形態を、有機溶媒中で再結晶化し、再結晶化形態を７２〜１２０時間５５℃で真空オーブン乾燥してＳＨＶＤを生成する工程、
を含む、安定化１α−ヒドロキシビタミンＤ（ＳＨＶＤ）の製造方法。
【請求項１９】
請求項１８に記載の方法によって合成される、安定化１α−ヒドロキシビタミンＤ（ＳＨＶＤ）。
【請求項２０】
少なくとも３回、粗製のヒドロキシビタミンＤ製品を有機溶媒から連続的に再結晶化することを含む、安定化１α−ヒドロキシビタミンＤ（ＳＨＶＤ）の製造方法。
【請求項２１】
再結晶化方法が、２つの再結晶化を含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
有機溶媒が、ギ酸メチル、ギ酸エチル、酢酸エチル、アセトン、メチルエチルケトン、ヘキサン、２−プロパノール−ヘキサン、ペンタン、ヘプタン、ジエチルエーテル、ジイソプロピルエーテル、メタノール、エタノールアセトニトリル又はその組み合わせである、請求項２１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、安定化１α−ヒドロキシビタミンＤ（ＳＨＶＤ）、特に医薬製剤に適しているものに関する。
【０００２】
【従来の技術】
ヒドロキシ基を１α位に有するビタミンＤ化合物は、強いビタミンＤ活性のため、近年、かなり注目されてきた。しかしながら、これら活性化ビタミンＤ化合物は、また、特に光の曝露下及び酸素の存在下で化学的に不安定であるとして及びより高温で低い貯蔵安定性を有するとして知られている。活性化ビタミンＤの医薬製剤への調剤は、これら安定性の問題を悪化させる。
この問題の種々の態様の認識及び研究、並びに活性化ビタミンＤの医薬組成物を安定させる従来技術での試みにもかかわらず、先行技術は、医薬製剤に有用な安定化化合物を提供する特定の化学及び物理的性質を有する１α−ヒドロキシビタミンＤ形態についてほとんど示していない。これまで未知の技術的な特性を有する安定化１α−ヒドロキシビタミンＤは、活性化ビタミンＤの既知の形態と比較して意外にも安定していることがここで見出された。
【０００３】
【発明の実施の形態】
本発明は、優れた技術的特性及び優れた安定性を有する安定する１α−ヒドロキシビタミンＤ形態（ＳＨＶＤ）に関連する。ＳＨＶＤは、医薬組成物又は製剤における使用に特によく適応する。従って、本発明を、ここに詳細に、このような努力について記載する；しかしながら、発明のこのような説明は、例示目的のみを意味し、その全範囲に制限的に見られるべきでないことを当業者は認識するだろう。
【０００４】
以下の、発明の方法の説明において、他に特定しない限り、生産工程は、室温及び大気圧で行われる。
ここで使用する「ビタミンＤ」の語は、ビタミンＤ２、Ｄ３及びＤ４並びに関連する類似体を含むことを意図する。「１α−ヒドロキシビタミンＤ」の語は、少なくとも化合物のＡ環の炭素−１α位に、置換されたヒドロキシ基を有するビタミンＤ化合物又は類似体について言及する。１α位だけがヒドロキシに置換した化合物、例えば、１α−ヒドロキシビタミンＤ２及び１α−ヒドロキシビタミンＤ３は、更にヒドロキシル化を受けて代謝的に活性なビタミンＤ化合物を形成するようなプロドラッグである。２４又は２５位並びに１α位がヒドロキシル化されたこれらの化合物は、典型的に代謝的に活性なビタミンＤ化合物、即ち、１α，２４−ジヒドロキシビタミンＤ２及び１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３である。「活性（ａｃｔｉｖｅ）ビタミンＤ」又は「活性化（ａｃｔｉｖａｔｅｄ）ビタミンＤ」の語は、少なくとも、１α、２４又は２５の位においてヒドロキシル化されるビタミンＤ化合物をいう。ここで使用する、「安定化１α−ヒドロキシビタミンＤ」又は「ＳＨＶＤ」の語は、一定の市販のビタミンＤ化合物を含まないことを意味する、即ち、１α−ヒドロキシビタミンＤ３、１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３、１，２４−ジヒドロキシビタミンＤ３、２２−オキサ−１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３（ＯＣＴ）、パリカルシトール（ｐａｒｉｃａｌｃｉｔｏｌ）（１９−ｎｏｒ−ビタミンＤ２）及びカルシポトリオール（ｃａｌｃｉｐｏｔｒｉｏｌ）を除く。「非ＳＨＶＤ」の語は、純度プロフィール及びここでＳＨＶＤに対して記載された他の特性を満たさない１α−ヒドロキシビタミンＤ化合物をいう。
【０００５】
本発明のＳＨＶＤは、結晶性であり、実質的に溶媒フリーであり、貯蔵安定性であり及び現代治療製剤に適している。研究は、本発明において見いだされる技術的な特性を有するＳＨＶＤは、意外にも安定しており、特に、熱攻撃（ｃｈａｌｌｅｎｇｅ）又は上昇した温度において、対応するプレビタミン形態への転換率が減少することを示した。本発明のＳＨＶＤは、実質的に６年間−７０℃で貯蔵の後で分解しない。これは、医薬投与形態、例えばソフトゼラチンカプセルに処方される場合、優れた貯蔵安定性に対応する。本発明のＳＨＶＤは、いくらかの先行技術の安定化製剤によってすすめられていたような、貯蔵のための低酸素又は不活性雰囲気を必要としない。
本発明のＳＨＶＤは、さらに、モル吸光係数で約２６５ｎｍでの紫外スペクトルピーク最大値（λｍａｘ）、１７４９０のΣ２６５ｎｍ、及び、約２２７ｎｍでの最小値（λｍｉｎ）を有し、並びに特定の純度プロフィールを有する点で特徴付けられる。ＳＨＶＤは、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって質量ベースで９８％以上の純度（すなわち少なくとも９８％）、０．５％以下の残留溶媒、１．５％以下の合計不純物を有し、及び、ＨＰＬＣによって０．５％より大きい単一の不純物を有しない。不純物は、シス−１α−ＯＨ−Ｄ４及びｃｉｓ−１β−ＯＨ−Ｄ２を含む。いかなる特定の理論によって束縛されることを望まないが、ＳＨＶＤの注目すべき安定性は、それが実質的に溶媒フリーであること及び実質的に不純物がないことに関連すると思われる。
【０００６】
本発明のＳＨＶＤは、同じ非ＳＨＶＤと比較した場合、熱攻撃における対応するプレビタミンへの転換率の実質的な減少によって更に特徴づけられる。対応するプレビタミンＤへの転換に関するＳＨＶＤのこの安定性は、特に驚くべきである。１α−ヒドロキシビタミンＤ化合物は、そのプレビタミン形態と熱平衡にある、すなわち、これらは、お互いに熱異性体である。
例えば、１α−ＯＨ−Ｄ２に対する均衡を、以下に示す。
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１α−ヒドロキシプレビタミンＤ２は、２５９ｎｍにおいて特徴ある紫外スペクトルピーク最大値（λｍａｘ）を有する。溶液中で又は上昇した温度での１α−ヒドロキシビタミンＤ形態の貯蔵は、１α−ヒドロキシプレビタミンＤ形態を生じる。異性体は、室温であっても、お互いに平衡である。増大した温度は、この平衡をプレビタミンの形成にシフトする。
【０００７】
本発明のＳＨＶＤは、同一条件、例えば熱攻撃下で、対応する非ＳＨＶＤと比較して、１α−ヒドロキシプレビタミンＤへの減少した転換率を示す。熱攻撃は、好ましくは、継続した期間、空中に保持される上昇した温度であり、その期間は、１０日までであってもよい。上昇した温度は、好ましくは、約６０℃である。このような熱攻撃において、本発明のＳＨＶＤは、同じ条件下の非ＳＨＶＤ化合物と比較して、より低い転換率を有する。
１α−ヒドロキシビタミンＤ化合物は、いかなる既知の合成方法によって調製されてもよい。一定の合成の経路は、精製において、本発明のＳＨＶＤの優れた技術的な特性を有し得る化合物を提供する事が見出された。例示的な合成のスキームを、１α−ヒドロキシビタミンＤ２（ドキセルカルシフェロール（ｄｏｘｅｒｃａｌｃｉｆｅｒｏｌ）として公知である）の合成を例示する図１に示す。一般的に、合成は、出発物質ビタミンＤ（すなわち１α位がヒドロキシル化された化合物）の、シクロビタミン形態への転換、シクロビタミンの１α位におけるヒドロキシル化、ヒドロキシル化したシクロビタミンの、ビタミンのシス及びトランス形態への再転換、及びトランス形態の、シス形への転換を含む。３位のヒドロキシ基は、好ましくは、合成の第１工程としてトシラートへ転換することによって保護される。
【０００８】
例えば、図１に示すように、ビタミンＤ２（又はエルゴカルシフェロール）が出発物質である。ビタミンＤ２は、まず、３位においてトシル化されて、ビタミンＤ２ ３−トシラートを形成する。その後、このトシラートは、シクロビタミンに転換されて、その後１α−ヒドロキシル化される。ヒドロキシル化シクロビタミンは、その後、シス及びトランス１α−ヒドロキシビタミンＤ２に転換される。トランス異性体は、紫外線に照射され、シス異性体、すなわち１α−ヒドロキシビタミンＤ２に転換する。
得られる製品は、カラムクロマトグラフィによって精製される。カラム精製された１α−ヒドロキシビタミンＤ２は、その後、有機溶剤、例えばギ酸メチルから再結晶される。再結晶された結晶は、その後、＜０．５％の残留溶媒含量まで真空オーブン乾燥され、ＳＨＶＤを与える。連続して（一般的に少なくとも２回）再結晶が行われる場合、本発明のＳＨＶＤは、特に良好である。好適な溶媒は、ギ酸メチルに加えて、ギ酸エチル、酢酸エチル、アセトン、メチルエチルケトン、ヘキサン、２−プロパノール−ヘキサン、ペンタン、ヘプタン、ジエチルエーテル、ジイソプロピルエーテル、メタノール、エタノールアセトニトリル及びその組み合わせを含む。
【０００９】
本発明のＳＨＶＤは、経口使用のような医薬製剤、例えば、ソフトゼラチンカプセル、溶液、タブレットに好適に使用される。便利な単位投与形態の活性成分の濃度は、１μｇ〜１００μｇ／週の週間用量で、０．５μｇ〜２５μｇである。ソフトゼラチン製剤において、カプセル充填材は、好適な医薬上許容できる油、例えば分画されたココナッツ油に溶解された本発明のＳＨＶＤを含み、及び、酸化防止剤を含み、これは、例えば、ブチルヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ブチルオキシトルエン（ＢＨＴ）又はビタミンＥであってもよい。カプセルシェルは、好ましくは、ゼラチン、グリセリン、二酸化チタン及び着色剤を含む。充填材は、典型的に全体のカプセルの質量の約５８〜５９％である。
【００１０】
本発明は、更に以下の例によって説明されるが、本発明の範囲を制限するように解釈されるべきでない。
例において、ＵＶスペクトルを島津（Ｓｈｉｍａｄｚｕ）ＵＶ １６０Ｖで、ＩＲスペクトルをＡｎａｌｅｃｔ ＤＳ−２０で、及びＮＭＲをＳＥＯＬ ＮＭＲスペクトロメータで４００ＭＨ３で操作して、又は公知技術の機器で取った。
【００１１】
【実施例】
安定化１α−ヒドロキシビタミンＤ２（ＳＨＶＤ２）の調製
実施例１：１α−ヒドロキシビタミンＤ２粗製薬剤の調製
（１）エルゴカルシフェロールトシラート（２）の調製
エルゴカルシフェロール（ビタミンＤ２）１００ｇに対し、４−ジメチルアミノピリジン３．１ｇ、１００ｍＬ無水ピリジン、及び３４０ｍＬ無水ジクロロメタンに加えた。フラスコの内容物を内部の反応温度が≦５℃になるまで撹拌した。その後、ｐ−トルエンスルホニルクロライド１２２．６ｇを加え、すべての固体が溶解するまで混合物を撹拌した。反応をゆっくりと撹拌しながら、アルゴン下で進めた。３２時間後、反応の完了を、ＴＬＣ（シリカゲルプレート；ヘキサン中酢酸エチル；エタノール中２０％ホスホモリブデン酸）によってモニターした。
約２０分間にわたり、反応混合物を、飽和炭酸水素ナトリウムを含む冷却したビーカーに滴下した。反応混合物を分液ロートに入れて９００ｍＬイソプロピルエーテルですすいだ。混合物を振とうすることによってイソプロピルエーテルで抽出し、有機層及び水層を分離した。イソプロピルエーテル抽出物を希塩酸、飽和炭酸水素ナトリウム、及び飽和塩化ナトリウムで洗浄した。混合したイソプロピルエーテル抽出物を無水硫酸マグネシウム２５０ｇで乾燥し、濾過した。イソプロピルエーテル抽出物を混合し、真空中で濃縮した。粗製のトシラートは、以下の加溶媒分解に使用するのに好適であった。
【００１２】
（２）６（Ｒ）−メトキシ−３，５−シクロビタミンＤ２（３）の調製
乾燥メチルアルコール１９５０ｍＬと炭酸水素ナトリウム５００ｇとの撹拌混合物に対し、２５０ｍＬジクロロメタンに溶解しかつすすいだ工程１からのエルゴカルシフェロールトシラートを加えた。撹拌混合物を、アルゴン雰囲気下、１８〜２２時間、約５６℃の内部温度で還流した。約２０時間後、反応の程度をＴＬＣ（シリカゲル；溶媒　エタノール中２０％ホスホモリブデン酸）によってモニターした。
反応混合物を２５〜３０℃に冷却し、炭酸水素ナトリウムを濾過によって除去した。反応フラスコ、濾過した炭酸水素ナトリウム及び濾過フラスコを１０００ｍＬのイソプロピルエーテルですすいだ。有機濾液を真空中で濃縮し、浴槽の温度を５０℃に維持した。半固体残渣をイソプロピルエーテルで希釈した。このイソプロピルエーテル溶液を水で３回、飽和塩化ナトリウムで１回洗浄し、その後硫酸マグネシウムで乾燥した。硫酸マグネシウムを濾過して除去し、イソプロピルエーテルですすいだ。混合した有機濾液及び濾過フラスコのイソプロピルエーテルすすぎ液を真空中で４〜１８時間濃縮し、６（Ｒ）−メトキシシクロビタミンを得た。
【００１３】
（３）１αヒドロキシ−６（Ｒ）−メトキシ−３，５−シクロビタミンＤ２（４）の調製
１，２−ジクロロエタン１５００ｍＬ中、挽きたての二酸化セレン１２．３ｇの撹拌懸濁液に対し、８１ｍＬの無水ｔ−ブチルヒドロペルオキシド（デカン中５−６Ｍ）を加えた。正のアルゴン雰囲気下、３〜４時間、周囲温度で撹拌した後、ピリジン１８ｍＬを加えた。１，２−ジクロロエタンに溶解した、工程２からの６（Ｒ）−メトキシ−３，５−シクロビタミンＤ２を冷却した反応フラスコ中に滴下して加え、その後１，２−ジクロロエタンですすいだ。反応を、撹拌しながら＜５℃の内部温度で続け、反応の進行を１５分おきにＴＬＣによってモニターした。反応は、出発の６（Ｒ）−メトキシ−３，５−シクロビタミンＤ２がもはや見えなくなるか、又は２つの連続モニタリング薄層クロマトグラムの間に変化が現れなくなったときに完了したと考えた。
反応を、１０％水酸化ナトリウムで停止した。水層及び有機層を分離し、水層をイソプロピルエーテルで抽出した。このイソプロピルエーテル抽出物を反応混合物からの有機層に加えた。混合した抽出物を無水硫酸マグネシウムで乾燥し、濾過した。フラスコ及び残りの硫酸マグネシウムをイソプロピルエーテルですすぎ、混合したイソプロピルエーテル抽出物及び濾過フラスコのイソプロピルエーテルすすぎ液を真空中で濃縮した。
生産物をヘキサン中５％酢酸エチル５００ｍＬに溶解し、カラム（７５ｍｍＩ．Ｄ．）に入ったシリカゲル（６０／２３０〜４００メッシュ）で精製し、ヘキサン中５％酢酸エチル約４０００ｍＬ、次いで正のアルゴン圧力下、ヘキサン中２０％酢酸エチル８０００ｍＬで溶出した。各約２００ｍＬの画分を溶出中に集めた。画分をシリカゲルＴＬＣで分析した。１α−ヒドロキシ−６（Ｒ）−メトキシ−３，５−シクロビタミンＤ２を含む画分が確認され、混合され及び真空中で濃縮された。
【００１４】
（４）　シス−及びトランス−１α−ヒドロキシビタミンＤ２（５及び６）の調製
ジメチルスルホキシド１２０ｍＬ及び氷酢酸１３０ｍＬ中の工程３からの１α−ヒドロキシ−６（Ｒ）−メトキシ−３，５−シクロビタミンＤ２撹拌溶液を、約６０℃に加熱し、この温度、アルゴン雰囲気下で６０分間撹拌した。反応は、シリカゲルＴＬＣで反応物１α−ヒドロキシ−６（Ｒ）−メトキシ−３，５−シクロビタミンＤ２の消費について周期的にモニターした。終了したら、反応を２０〜２５℃に冷却した。反応を、混合物とイソプロピルエーテルリンス液を飽和炭酸水素ナトリウム及び温度≦１０℃に維持された水に注ぐことによって停止した。イソプロピルエーテルを加え、混合物を撹拌した。この混合物は、その後、９５０ｍＬイソプロピルエーテルで別々に漏斗に通し、振とうして抽出した。水層及び有機層を分離した。水層をイソプロピルエーテルで抽出した。反応混合物からの有機層をこのイソプロピルエーテル抽出物と混合し、飽和塩化ナトリウムで３回、水で３回、及び飽和塩化ナトリウムで１回洗浄した。有機抽出物を、硫酸マグネシウムで乾燥し、濾過し、及びケーキ硫酸マグネシウム及び濾過フラスコをイソプロピルエーテルですすいだ。混合したイソプロピルエーテル濾液を真空中で濃縮し、浴槽の温度を３５℃に維持した。残りの溶媒を残りの残渣から真空で除去した。
ジクロロメタン３５０ｍＬに溶解した生産物を、カラム（７５ｍｍＩ．Ｄ．） に入ったシリカゲル（６０／２３０〜４００メッシュ）で精製し、アルゴン下のヘキサン中４０％酢酸エチルで溶出した。約１２５ｍＬの画分を集めた。画分を、ヘキサン中４０％酢酸エチルで溶出したシリカゲルＴＬＣで分析した。シス−及びトランス−１α−ＯＨ−Ｄ２を含む画分が確認され、混合され及び真空中で濃縮された。
【００１５】
（５）シス−１α−ヒドロキシビタミンＤ２（５）の調製
工程４からのシス−及びトランス−１α−ＯＨ−Ｄ２及び９−アセチルアントラセン１．１ｇを２０００ｍＬメチルアルコールに溶解し、メチルアルコールすすぎ液全量２０００ｍＬとともに光分解チャンバーに移し、追加のメチルアルコールで１３．７Ｌの全量まで溶解した。光分解を終了まで、約２〜６時間行った。生成溶液及び４００ｍＬメチルアルコールすすぎ液を真空中で濃縮し、浴槽の温度を３５℃に維持した。
残りの溶液を高真空下で除去した。ジクロロメタンに溶解した生産物を、カラム（７５ｍｍＩ．Ｄ．） に入ったシリカゲル（６０／２３０〜４００メッシュ）で精製し、アルゴン下のヘキサン中４０％酢酸エチル並びに酢酸エチルで溶出した。画分（１２５ｍＬ）の画分をヘキサン中４０％酢酸エチル溶出で集め、その後、画分（２００ｍＬ）を１００％酢酸エチル溶出で集めた。画分をヘキサン中４０％酢酸エチルで溶出したシリカゲルＴＬＣで分析した。シス−１α−ＯＨ−Ｄ２を含む画分が確認され、混合され及び真空中で濃縮された。残りの溶液を高真空下で除去した。この工程の典型的な収量は、１５〜３０ｇ（出発物質、エルゴカルシフェロールからの全体の収量の１５〜３０％）だった。
【００１６】
実施例２：ＳＨＶＤ２を得るための粗製薬剤物質の精製
カラム精製シス−１α−ヒドロキシビタミンＤ２（粗製薬剤物質）をギ酸メチルから連続的に再結晶化した。
各再結晶に対し、カラム精製粗製薬剤物質（通常、１５〜３０ｇ）を丸底フラスコ中の３５００ｍＬギ酸メチルに再懸濁した。このフラスコは、冷却コンデンサーを有するロータリーエバポレーターを備え、固体が溶解するまで４０℃の水浴中をゆっくりと回転させた。溶液をロータリーエバポレーター中で濃縮し、結晶が形成し始めるまで、４０℃に維持した。結晶が観察されたとき、フラスコを−２０℃のフリーザーに置き、４８〜７２時間冷却した。
再結晶から得られた結晶を５〜１０分間空気乾燥した後、結晶を粉末までひき、その後、結晶化皿に移した。結晶の入った皿を約５５℃にセットした真空オーブンに７２〜１２０時間置いた。得られた薬剤物質（ＳＨＶＤ２）の量は、通常５〜１０ｇであり、これは、出発物質、エルゴカルシフェロールの５〜１０％の収量を意味する。
精製手順が粗製薬剤物質の精製を改善する証拠は、図２のＨＰＬＣクロマトグラムによって説明される。最初のクロマトグラム（Ａ）は、カラム精製した粗製の薬剤物質で得られたものである。クロマトグラム（Ｂ）は、最終製品を示す。図２に示すように、約３７．７及び４１分の反応時間における不純物のレベルが、再結晶によって減少した。
【００１７】
実施例３：ＳＨＶＤ２の残りの溶液の測定
残りの溶液をトルエンで定量化する方法を使用した。分析ターゲットは、メタノール、ギ酸メチル、塩化メチレン、ヘキサン、ジイソプロピルエーテル、１，１−ジクロロエタン及び酢酸エチルを含む。
ガスクロマトグラフ法を、ヘリウムをキャリアガスとし、スプリットインジェクション／ラン、及びシングルイオンモード（ＳＩＭモード）のランで使用した。これは、６０ｍ×０．２５ｍｍＩＤ、フィルム厚１．４μｍを有するＤＢ−６２４キャピラリーカラム、スプリット／スプリットレスインジェクター、５０℃〜２５０℃の立ち上がりが可能なガスクロマトグラフ、及び質量選択性検出器を要求する。クロマトグラフは、３１，３２、４３，４５，４９，６０，６１，６２，８４，８６及び８７のイオンをイオン当たり２５ｍｓの滞留時間（ｄｗｅｌｌ ｔｉｍｅ）で検出するようにセットした。
外部較正を使用し、これは、ブランク、マトリックスブランク、及び４点曲線からなる。曲線は、１μｇ／ｇ、１０μｇ／ｇ及び５０μｇ／ｇの濃度で作成した。シス−１α−ＯＨ−Ｄ２の１０ｍｇサンプルをトルエン中で調製した。このサンプルからの結果を上記作成した線状曲線を使用して算出した。すべての分析物に対する下限は１００μｇ／ｇである。この結果は、シス−１α−ＯＨ−Ｄ２（ＳＨＶＤ２）中の残りの溶液の量は、≦０．５％であることを示した。
【００１８】
実施例４：ＳＨＶＤ２の貯蔵安定性試験
４ロットのＳＨＶＤ２からのサンプルの安定性を、−７０℃での長期間貯蔵の間に６月おきに実験した。すべてのロットは、薬剤物質用の包装として選択された容器密栓システム中に貯蔵した。安定性を（１）質量パーセント　１α−ＯＨ−Ｄ２含量、（２）パーセント　関連物質含量、及び（３）不純物プロフィールの変化につき、ＨＰＬＣを使用してサンプルを試験することによって評価した。加えて、すべてのロットをＵＶ分光法によってＵＶスペクトルの変化について試験した。
この研究の結果は、ベースラインと６分または１２分との間に、１α−ＯＨ−Ｄ２含量の平均質量％について、大きな違いを示さなかった。実験したすべてのロットに対する１α−ＯＨ−Ｄ２含量の質量％は、すべての時点で、＞９８．０％であった。クロマトグラフィーの不純物プロフィールは、６ヵ月または１２ヵ月でベースラインと比べて新しいピークは測定されなかった。関連物質のパーセントは、＜２．０％残っていた。
【００１９】
実施例５：ＳＨＶＤ２ソフトゼラチンカプセル充填材の調製
ＢＨＡを、分画されたココナッツ油（ＦＣＯ）に加え、加熱し、及びＢＨＡが完全に溶解するまで撹拌した。この溶液をその後冷却した。ＳＨＶＤ２を好適な容器に入れて正確に秤量し、脱水アルコールを加え、及び溶液を、ＳＨＶＤ２が溶解するまで撹拌した。ＦＣＯをステンレス混合タンクに入れて秤量した。ＢＨＡ／ＦＣＯ溶液を、撹拌しながらＦＣＯに加えた。その後、ＳＨＶＤ２／脱水アルコール溶液を加え、及び溶液を均一になるまで撹拌した。ＳＨＶＤ２／脱水アルコール溶液を含む容器を脱水アルコールですすぎ、すすぎ液をＦＣＯ／ＳＨＶＤ２／脱水アルコールミックスに加えた。このミックスを含む混合タンクを塞ぎ、真空にし、内容物を混合（脱気）した。得られた溶液をフィルターを通して受け器に移動し、窒素でガスシールした。
【００２０】
実施例６：　安定性試験：ＳＨＶＤ２対非ＳＨＶＤ２
約１ｍｇのＳＨＶＤ２または非安定化１α−ヒドロキシビタミンＤ２（非ＳＨＶＤ２）をそれぞれ９つの（１２×７５ｍｍ）試験チューブに置いた。試験チューブを約６０℃のオーブンに置いた。各２つのビタミンＤ２製剤の１つの試験チューブを０，３，６，９，１２，１８，２４，３６及び４８時間のインキュベーションで除去した。各試験チューブ中の内容物を、エタノールに溶解して１ｍｇ／ｍＬ溶液を生成した。各溶液（１０μＬ）を以下のＨＰＣＬ条件で分析した：アセトニトリル：メタノール：水（６０：２０：２０）の移動相を有するＹＭＣパックＣ８カラム（４．６×２５０ｍｍ、５μｍ）、流速１．０ｍＬ／分。１α−ヒドロキシビタミンＤ２ピークと比較して約０．９相対保持時間移動したピークの出現率は、ＳＨＶＤ２よりも非ＳＨＶＤ２で大きかった。
【００２１】
実施例７：安定性試験：ＳＨＶＤ２対市販の１α−ＯＨ−Ｄ２
約１ｍｇのＳＨＶＤ２または市販の１α−ヒドロキシビタミンＤ２をそれぞれ２つの（１２×７５ｍｍ）試験チューブに置いた。各２つの製剤から１つの試験チューブを約６０℃のオーブンに置いた。分析のため、各試験チューブ中の内容物を、エタノールに溶解して１ｍｇ／ｍＬ溶液を生成した。各溶液（１０μＬ）を以下のＨＰＬＣ条件で分析した：アセトニトリル：メタノール：水（６０：２０：２０）の移動相を有するＹＭＣパックＣ８カラム（４．６×２５０ｍｍ、５μｍ）、流速１．０ｍＬ／分。１α−ヒドロキシビタミンＤ２ピークと比較して約０．９相対保持時間移動したピークの出現率は、ＳＨＶＤ２よりも市販の１α−ヒドロキシビタミンＤ２で大きかった。
【００２２】
実施例８：ＳＨＶＤ２対非ＳＨＶＤ２の安定性試験
約１ｍｇの安定化１αヒドロキシビタミンＤ２（ドキセルカルシフェロール）（ＳＨＶＤ２）をそれぞれ２つの試験チューブ（１２×７５ｍｍ）に置いた。１つのサンプルをエタノール蒸気の雰囲気を含むデシケーターに置き、物質の残りの溶液を増加して、非安定化ドキセルカルシフェロール（非ＳＨＶＤ２）を得た。このデシケーター内の物質を６０℃に４８時間加熱した。他方のサンプルは、エタノール雰囲気にせず、安定化形態を保持したが、６０℃に４８時間加熱した。各試験チューブの内容物を、エタノールに溶解して１ｍｇ／ｍＬ溶液を生成した。各溶液（１０μＬ）を以下のＨＰＬＣ条件で分析した：アセトニトリル：メタノール：水（６０：２０：２０）の移動相を有するＹＭＣパックＣ８カラム（４．６×２５０ｍｍ、５μｍ）、流速１．０ｍＬ／分。ドキセルカルシフェロールピークと比較して約０．９相対保持時間移動したピークの出現率は、ＳＨＶＤ２よりも非ＳＨＶＤ２で大きかった。
【００２３】
実施例９：安定性試験：＞０．５％残渣溶液を含む１α，２４（Ｓ）−ジヒドロキシビタミンＤ２（非ＳＨＶＤ２）
＞０．５％残渣溶液を含む１α，２４（Ｓ）−ジヒドロキシビタミンＤ２（非ＳＨＶＤ） 約１ｍｇを、キャップしたバイアルに置き、約６０℃で４８時間加熱した。バイアルの内容物を、エタノールに溶解して１ｍｇ／ｍＬ溶液を生成した。溶液（１０μＬ）を以下のＨＰＬＣ条件で分析した：アセトニトリル：水（５０：５０）の移動相を有するＹＭＣパックプロＣ１８カラム（４．６×１５０ｍｍ、５μｍ）、流速１．０ｍＬ／分。非ＳＨＶＤを加熱した後、標準１α，２４（Ｓ）−ジヒドロキシビタミンＤ２と比較して約０．８５相対保持時間を有する化合物を観察した。
【００２４】
結果、本発明は、優れた技術的特性及び優れた安定性を有するＳＨＶＤ、安定化１α−ヒドロキシビタミンＤ形態を提供する。本発明の新規形態は、結晶性、実質的に溶液フリー、安定、かつ現代の治療製剤に良好に適合するものである。
本発明は、いくらか特異性をもってここで開示され、かつ例示されているが、当業者であれば、記載されている事項からなされる変化、追加、及び省略を含む種々の改変を理解できるだろう。従って、これらの改変も、本発明に包含され、本発明の範囲は、請求の範囲と合法的に合致し得る最も広い解釈によってもっぱら限定されることを意図している。
【図面の簡単な説明】
【図１】１α−ＯＨ−Ｄ２の合成のための例示的な反応スキームである。
【図２】本発明のＳＨＶＤの製剤を示すＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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