(57)【要約】好高温性供給源からのα−ガラクトシダーゼは、動物飼料中に存在するガラクトースオリゴ糖を加水分解することにより動物飼料を処理するのに有用である。Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａからのα−ガラクトシダーゼは、動物飼料組成物中に一般的に見出される不消化性オリゴ糖であるラフィノース、スタキオースおよびベルバスコースを加水分解するのに有用である。高温でこれらの酵素を使用する能力、即ち典型的には動物飼料処方または加工処理に関連した工業過程で普通に遭遇される能力は、動物飼料に栄養価を、そして加工処理における柔軟性を付加するために有益である。好高温性α−ガラクトシダーゼは、ヒト食物のための食品添加物としても有用である。
2004504043.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
基質中に存在するガラクトース含有オリゴ糖の加水分解方法であって：
上記基質を好高温性α−ガラクトシダーゼと接触させ、そして
上記オリゴ糖を加水分解するのに十分な時間にわたり、上記好高温性α−ガラクトシダーゼが活性であるところの温度に上記基質を加熱する、
ことを含む前記方法。
【請求項２】
前記オリゴ糖がラフィノース、スタキオースおよびベルバスコースから成る群から選択される、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記基質が動物飼料、大豆ミールおよびヒトの食物からなる群から選択される、請求項１記載の方法。
【請求項４】
前記好高温性α−ガラクトシダーゼが、サーモトガ・マリチマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ）、サーモトガ・ネオポリタナ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｎｅｏｐｏｌｉｔａｎａ）およびサーモトガ・エルフィイ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｅｌｆｉｉ）ならびにサーモトガ・エスピーＴ２（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｓｐ． Ｔ２）からなる群から単離される、請求項１記載の方法。
【請求項５】
前記好高温性α−ガラクトシダーゼがＴｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａから単離される、請求項１記載の方法。
【請求項６】
前記好高温性α−ガラクトシダーゼがＴｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａＤＳＭ３１０９から単離される、請求項１記載の方法。
【請求項７】
前記オリゴ糖がガラクトース単量体に加水分解される、請求項１記載の方法。
【請求項８】
湿度７０％の条件下で実行される、請求項１記載の方法。
【請求項９】
湿度２５％の条件下で実行される、請求項１記載の方法。
【請求項１０】
前記加熱が８０℃、８５℃、９０℃または１００℃で起こる、請求項１記載の方法。
【請求項１１】
前記好高温性α−ガラクトシダーゼが、以下の：
（ａ）好高温性α−ガラクトシダーゼをコードするポリヌクレオチド配列を含有する発現ベクターを含む宿主細胞を培養し；
（ｂ）上記好高温性α−ガラクトシダーゼを発現させ；そして
（ｃ）上記宿主細胞培養物から上記好高温性α−ガラクトシダーゼを回収する；ことにより産生される、請求項１記載の方法。
【請求項１２】
前記ポリヌクレオチドが配列番号１の配列を有する、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
前記ポリヌクレオチドが、以下の：
（ａ）配列番号１のヌクレオチド配列を有するＤＮＡ；
（ｂ）好高温性α−ガラクトシダーゼをコードし、かつ、ストリンジェント条件下で上記（ａ）のＤＮＡとハイブリダイズするポリヌクレオチド；および
（ｃ） 好高温性α−ガラクトシダーゼをコードし、かつ、その遺伝子コードの縮重のために上記（ａ）または（ｂ）のＤＮＡとは異なるポリヌクレオチド
からなる群から選択される、請求項１１記載の方法。
【請求項１４】
前記ポリヌクレオチドが配列番号２のアミノ酸配列を有する好高温性α−ガラクトシダーゼをコードする、請求項１１記載の方法。
【請求項１５】
加水分解化されたガラクトース含有オリゴ糖を含む動物飼料組成物の製造方法であって：
上記動物飼料の加工処理中、上記動物飼料組成物の成分を、好高温性α−ガラクトシダーゼと、接触させることを含み、ここで、動物飼料加工処理における加熱過程の前に、上記好高温性α−ガラクトシダーゼをして上記ガラクトース含有オリゴ糖を加水分解せしめるのに十分な時間にわたり、上記好高温性α−ガラクトシダーゼを、上記動物飼料成分と接触させる、前記方法。
【請求項１６】
前記ガラクトース含有オリゴ糖がラフィノース、スタキオースおよびベルバスコースから成る群から選択される、請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
前記動物飼料が大豆ミールを含み、大豆フレークを含みまたはニワトリの飼料である、請求項１５記載の方法。
【請求項１８】
前記好高温性α−ガラクトシダーゼがＴｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｎｅｏｐｏｌｉｔａｎａおよびＴｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｅｌｆｉｉならびにＴｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｓｐ． Ｔ２からなる群から単離される、請求項１５記載の方法。
【請求項１９】
前記好高温性α−ガラクトシダーゼがＴｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａから単離される、請求項１５記載の方法。
【請求項２０】
前記好高温性α−ガラクトシダーゼがＴｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａＤＳＭ３１０９から単離される、請求項１５記載の方法。
【請求項２１】
前記オリゴ糖がガラクトース単量体に加水分解される、請求項１５記載の方法。
【請求項２２】
前記好高温性α−ガラクトシダーゼと前記動物飼料組成物の成分との接触が湿度７０％、湿度２５％または湿度４５％の条件下で実行される、請求項１５記載の方法。
【請求項２３】
前記加熱過程が８０℃、８５℃、９０℃または１００℃で起こる、請求項１５記載の方法。
【請求項２４】
前記動物飼料組成物の成分と前記好高温性α−ガラクトシダーゼとの接触が、前記動物飼料加工処理における最終ペレット化ステップ前に起こる、請求項１５記載の方法。
【請求項２５】
前記好高温性α−ガラクトシダーゼが：
（ａ）好高温性α−ガラクトシダーゼをコードするポリヌクレオチド配列を含有する発現ベクターを含む宿主細胞を培養し；
（ｂ）前記好高温性α−ガラクトシダーゼを発現させ；そして
（ｃ）前記宿主細胞培養物から前記好高温性α−ガラクトシダーゼを回収する；ことにより産生される請求項１５記載の方法。
【請求項２６】
前記ポリヌクレオチドが配列番号１の配列を有する、請求項２５記載の方法。
【請求項２７】
前記ポリヌクレオチドが、以下の：
（ａ）配列番号１のヌクレオチド配列を有するＤＮＡ、
（ｂ）好高温性α−ガラクトシダーゼをコードし、かつ、ストリンジェント条件下、上記（ａ）のＤＮＡとハイブリダイズするポリヌクレオチド；および
（ｃ）好高温性α−ガラクトシダーゼをコードし、かつ、遺伝子コードの縮重のために上記（ａ）または（ｂ）のＤＮＡとは異なるポリヌクレオチド；
からなる群から選択される、請求項２６記載の方法。
【請求項２８】
前記ポリヌクレオチドが配列番号２のアミノ酸配列を有する好高温性α−ガラクトシダーゼをコードする、請求項２６記載の方法。
【請求項２９】
前記好高温性α−ガラクトシダーゼが、動物飼料組成物の成分と接触されるとき、液体溶液中にあるか、乾燥形態にあるか、部分的精製形態または実質的精製形態にある、請求項１５記載の方法。
【請求項３０】
請求項１５記載の方法により製造される動物飼料。
【請求項３１】
好高温性α−ガラクトシダーゼを含む哺乳類における胃腸窮迫の低減のための食品添加物。
【請求項３２】
前記好高温性α−ガラクトシダーゼがＴｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｎｅｏｐｏｌｉｔａｎａおよびＴｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｅｌｆｉｉならびにＴｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｓｐ． Ｔ２からなる群から単離される、請求項３１記載の食品添加物。
【請求項３３】
前記好高温性α−ガラクトシダーゼがＴｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａから単離される、請求項３１記載の食品添加物。
【請求項３４】
前記好高温性α−ガラクトシダーゼがＴｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａＤＳＭ３１０９から単離される、請求項３１記載の食品添加物。
【請求項３５】
前記好高温性α−ガラクトシダーゼが、以下の：
（ａ）好高温性α−ガラクトシダーゼをコードするポリヌクレオチド配列を含有する発現ベクターを含む宿主細胞を培養し；
（ｂ）前記好高温性α−ガラクトシダーゼを発現させ；そして
（ｃ）上記宿主細胞培養物から前記好高温性α−ガラクトシダーゼを回収することにより産生される、請求項３１記載の食品添加物。
【請求項３６】
前記ポリヌクレオチドが配列番号１の配列を有する、請求項３５記載の食品添加物。
【請求項３７】
前記ポリヌクレオチドが以下の：
（ａ）配列番号１のヌクレオチド配列を有するＤＮＡ；
（ｂ）好高温性α−ガラクトシダーゼをコードし、かつ、ストリンジェント条件下で上記（ａ）のＤＮＡとハイブリダイズするポリヌクレオチド；および
（ｃ）前記好高温性α−ガラクトシダーゼをコードし、かつ、遺伝子コードの縮重のために上記（ａ）または（ｂ）のＤＮＡとは異なるポリヌクレオチド
からなる群から選択される、請求項３５記載の食品添加物。
【請求項３８】
前記ポリヌクレオチドが配列番号２のアミノ酸配列を有する好高温性α−ガラクトシダーゼをコードする、請求項３５記載の食品添加物。
【請求項３９】
哺乳動物における胃腸窮迫の予防方法であって、上記胃腸窮迫がラフィノース、スタキオースおよびベルバスコースから成る群から選択される少なくとも１つのオリゴ糖を含有する食物により引き起こされる方法であって、上記食物を好高温性α−ガラクトシダーゼと接触させ；次いで、上記好高温性α−ガラクトシダーゼをして上記オリゴ糖を加水分解せしめるのに十分な時間、食物をすることを包含する方法。
【請求項４０】
好高温性α−ガラクトシダーゼを含む食用大豆タンパク質の製造過程におけるガラクトース含有オリゴ糖の除去のための加工助剤。
【請求項４１】
食用大豆タンパク質を生成するために加工処理される大豆基質からのガラクトース含有オリゴ糖の除去方法であって、以下の：
上記大豆基質を好高温性α−ガラクトシダーゼと接触させ；
上記ガラクトース含有オリゴ糖を加水分解するのに十分な温度および時間で上記大豆基質を加熱し；そして
上記食用大豆タンパク質の最終抽出または分別前に上記大豆基質から上記の加水分解されたガラクトース含有オリゴ糖を除去する；
ことを含む前記方法。
【請求項４２】
前記加熱が大豆基質からの油の除去前に起こる、請求項４１記載の方法。
【請求項４３】
上記加熱が大豆基質からの油の除去後に起こる、請求項４１記載の方法。
【請求項４４】
上記大豆基質が大豆フレークである、請求項４１記載の方法。
【請求項４５】
請求項４１記載の方法により製造される単離食用大豆タンパク質。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、オリゴ糖を加水分解するために好高温性酵素を利用することによる動物飼料およびその他の複合基質の加工処理に関する。
【０００２】
α−ガラクトシダーゼ（本明細書中では互換的に、α−Ｄ−ガラクトシドガラクトヒドロラーゼ、ＥＣ３．２．１．２２、α−ｇａｌまたはＧａｌ３６とも呼ばれる）は、単純ガラクトース含有オリゴ糖の非還元性末端からのα−１→６連結α−Ｄ−ガラクトシル残基の加水分解を触媒する外作用性グリコシダーゼである。これらのオリゴ糖の例としては、ラフィノース、スタキオース、ベルバスコースおよびメリビオース、ならびにより複雑な多糖が挙げられる。
【０００３】
細胞内および細胞外α−ｇａｌは、微生物、植物および動物中に広範に分布される。α−ｇａｌをコードする遺伝子は、ヒト、植物、酵母、糸状真菌および細菌を含めた種々の供給源からクローン化されてきた。一次構造および疎水性クラスター分析における類似性に基づいて、α−ｇａｌはグリコシルヒドロラーゼの一般的分類において３つの良好に保存されたファミリーに類別されている。細菌からのものは、ファミリー４および３６に、そして真核生物起源のものはファミリー２７に分類されている。
【０００４】
サーモトガ属細菌のＴｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａの単離は、Ｈｕｂｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ａｒｃｈ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． １４４， ３２４−３３３（１９８６）に記載されている。Ｔ． ｍａｒｉｔｉｍａは、厳密に好気性で、棒状形で、発酵性で、好高温性であり、そして５５℃〜９０℃で増殖し、約８０℃の最適増殖温度を有する真正細菌である。この真正細菌は、イタリアおよびアゾレスにおける地熱性加熱海底から単離されている。Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｎｅｏｐｏｌｉｔａｎａは、Ｔ． ｍａｒｉｔｉｍｅに関連した別の好高温性真正細菌である。Ｔ． ｍａｒｉｔｉｍｅおよびＴ． ｎｅｏｐｏｌｉｔａｎａの両方から単離された酵素としては、β−マンナナーゼ、β−マンノシダーゼ、α−ガラクトシダーゼおよびヘミセルラーゼが挙げられる。既知のα−ｇａｌのうち、好高温性細菌Ｔ． ｍａｒｉｔｉｍｅ（ＴｍＧａｌＡ）およびＴ． ｎｅｏｐｏｌｉｔａｎａ（ＴｎＧａｌＡ）のα−ｇａｌだけが活性を実証し、そして７５℃より高い温度で安定性を延長した。
【０００５】
動物飼料処方物は一般に、平衡化炭水化物およびタンパク質含量で作製され、特定動物のライフサイクルにおける種々の段階に適合するよう調整される。多数の動物飼料中で、大豆ミールは飼料の有意量を構成する。例えばブロイラー鶏餌中で、大豆ミールは約２０〜３０％のタンパク質含量を組成する。大豆は高タンパク質性であり、特にアミノ酸のリシンおよびトレオニンの含量が高いが、しかしメチオニンは低い。高タンパク質含量が、動物およびヒト食餌（即ち乳児用調合乳）中の大豆の広範な使用の理由である。大豆ミールの米国生産は６０億ドル産業であり、米国年間大豆ミール生産の約８０％が動物飼料に用いられている、と概算される。
【０００６】
大豆ミールの約１５％は単胃動物により消化可能でない。この１５％は、家禽餌中の食物繊維（不溶性繊維として）を構成する。一般に、この不溶性分画の約３〜５％はラフィノ−オリゴ糖である。他の飼料、例えばマメ類またはコムギベースであるものでは、ラフィノ−オリゴ糖含量は非常に高く、３５％のオーダーであり、そしてそれら特定種類の飼料中の非栄養性炭水化物の大部分を構成する。
【０００７】
不消化オリゴ糖の存在は、動物飼料の最適エネルギー利用に関して望ましくない結果である。動物飼料の酵素処理は、消化可能および可溶性炭水化物の利用可能性増大を可能にする。飼料の見かけの代謝可能エネルギー（ＡＭＥ）含量の小増加は、有意の経費節約を生じ得る。飼料消費を最小限にすることによって、非栄養因子（即ち非消化可能オリゴ糖）を除去し、利用可能炭水化物構成成分の消化可能性を改良し、そして不溶性分画の水溶性を改良することによりＡＭＥ増大が得られる。
【０００８】
一連の典型的大豆ミール加工処理の一般的計画は、概して動物飼料加工処理の典型である。動物飼料の、特に大豆ミールを含む動物飼料の加工処理中、飼料は煮沸ヘキサンで処理されて、大豆物質（即ちフレーク）中に存在する油を除去する。次にヘキサンが油から蒸発させられて、回収される。ヘキサン処理後、飼料は次に１〜２分間上記で処理されて、タンパク質を変性し、プロテアーゼ阻害剤を破壊する。熱処理は主に、ミール中に見出されるプロテアーゼ阻害剤を変性することを目指す。これは、過剰量のプロテアーゼおよびプロテアーゼ阻害剤を含有する大豆について特に言えることである。この過程中、含水量は約２０％に増大し、これは一般的に動物飼料加工処理のすべてにおける最高含水量過程である。残留ウレアーゼ活性は一般に、タンパク質変性の程度を確定するための尺度として用いられる。蒸気処理後、飼料は次に脱溶媒機／トースターに送られる。個々で、飼料は加熱または「調理」されて、任意の残りのヘキサンを蒸発させ、そして含水量を約１４％に低減する。さらにタンパク質変性がこの工程で起こる。トースター操作後、飼料は約１８０°Ｆ（８２℃）の温度でペレット化（例えば押出しにより）される。ペレット化または押出し過程は一般に、１０秒のオーダーで持続する。冷却後、含水量はさらに２％低減されて計約１２％の含水量になる。
【０００９】
動物飼料の酵素処理のための本発明の技法は一般に、中等温度好性供給源からの酵素を用いて、消化性および栄養価の改良を示す動物飼料を作製する。これらの酵素は一般に、酵素の相対的に低い熱安定性と、飼料加工処理に関与した高温とのために、ペレット化後の飼料処方物の最終加工処理過程に適用されねばならない。ペレット化の物理的方法は一般に、飼料を加熱し、そしてそれをダイに通して押し出すことを包含する。高温は、そうでなければペレットが一緒に留まるのを妨げる余分量の水分を蒸発させるために、そして飼料をペレットに「溶融」するのに必要である。ほとんどのペレット化装置は、およそ１，０００ ｋｇ／時の飼料を加工処理し得る。ペレットがペレット成形機から落ちて、空冷すると、酵素は新規生成ペレットに付加される。通常は酵素溶液は、落下飼料ペレットに垂直にノズルから噴霧される。この方式での酵素によるペレットの被覆は、（１）酵素適用速度が酵素溶液の含水量により限定され（ペレットが湿りすぎてそれらが崩壊し、ペレット中の高含水量が貯蔵時のカビおよび真菌増殖を促進する場合）、そして（２）この限定と生成される高率のペレットのために、飼料ペレットがしばしば酵素で不完全に被覆される、非効率的方法である。この技法を用いた場合、５個のペレット中約１個だけが実際に酵素で被覆される。
【００１０】
さらに中等温度好性酵素は一般に、動物内部の活性に関して標的化される（即ち消化後）。動物の消化管内部のｐＨおよびプロテアーゼの存在のために、外因的に適用される酵素はかなり低有効性にされる。
【００１１】
したがって動物による摂取前に不消化性オリゴ糖が単量体に分解される、そして酵素が飼料加工処理で用いられる高温で安定である動物飼料に酵素を適用する必要性が存在する。
【００１２】
ヒトおよび動物食餌中の見かけの代謝可能エネルギー（ＡＭＥ）含量を低減するほかに、ヒトおよび動物食餌中の不消化性オリゴ糖の存在は、オリゴ糖の存在により引き起こされる胃腸窮迫（例えば膨満およびその他の胃腸症状）のためにも望ましくない。鼓腸原性であるある種の食物としては、マメ類（例えば落花生、ソラマメ）、いくつかのアブラナ科植物（例えばキャベツ、メキャベツ）およびある種の果実（例えばレーズン、バナナ、アンズ）が挙げられる。前記の食物からの鼓腸の主因は、これらの食物内に含有されるある種の炭水化物（即ちラフィノース、スタキオースおよびベルバスコース）を身体が消化できないことである。これらの炭水化物を哺乳類が消化できないため、発酵により大腸内の腐敗細菌にこれらの炭水化物を分解させる。これは、過剰レベルの直腸ガス、主として二酸化炭素、メタンおよび水素の生成を引き起こす。ヒトおよびその他の単胃哺乳類は、それらの消化系がα−ガラクトシダーゼを産生しないかまたはそれを極わずかな量で産生するため、３つのオリゴ糖を消化してＤ−ガラクトースを遊離させることが難しい。
【００１３】
前記のオリゴ糖を消化可能にさせるためのアルファ−ガラクトシダーゼのｉｎ ｖｉｔｒｏ使用が既知である。米国特許第３，９６６，５５５号、第４，２４１，１８５号および第４，４３１，７３７号は各々、種々の微生物を培養することによりα−ガラクトシダーゼを産生および／または安定化する方法を開示し、そしてα−Ｄ−ガラクトシダーゼは食物加工処理においておよび／または１２時間までの期間の食料品への付加によりｉｎ ｖｉｔｒｏで用いられ得る、ということを示唆する。α−ガラクトシダーゼの付加によるα−Ｄ−ガラクトシド結合糖のｉｎ ｖｉｔｒｏ加水分解は、Ｒ． Ｃｒｕｚ， ｅｔ ａｌ．， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｆｏｏｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ ４６， １１９６−１２００（１９８１）に記載されている。
【００１４】
米国特許第５，４３６，００３号（Ｒｏｈｄｅ等）は、β−フルクトフラノシダーゼ、セルラーゼおよびヘミセルラーゼを含有する組成物による胃腸窮迫の軽減方法を記載する。ＡｋＰｈａｒｍａによりＢＥＡＮＯの商標で販売される液体製品は、ヘルシーな低脂肪高繊維食の重要商品である豆、ブロッコリー、ふすまならびにその他の野菜および穀物のような食物が食されると産生される腸内ガスを低減するかまたは排除する酵素または食品添加物として記載されていた。ＢＥＡＮＯ製品は、アスペルギルス属の黒色アスペルギルスＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒから得られる酵素α−ガラクトシダーゼを含有する。
【００１５】
残念ながら、それらを摂取している哺乳類における症状を低減するために、α−Ｄ−ガラクトシド結合糖を加水分解するためにα−ガラクトシダーゼによる食物の既知のｉｎ ｖｉｔｒｏ加工処理に関連したある種の問題が存在する。概して、酵素は、すでに調製（調理）された食物に適用される。酵素的手段による無傷の（即ち潰されたり、噛まれたりしていない）豆またはその他の野菜および果実の処理は、非効率的であり、経費が掛かる。これらの食物の固体性は、酵素が基質と外部接触のみを有する効率的な、均一の且つ完全に有効な酵素活性を妨げる。最後に、α−ガラクトシダーゼを用いるという本発明の方法は一般に、食物の消費の直前の酵素の適用を包含し、したがって酵素の活性は主に消費後および消化中に生じる。現在用いられている製品は、高温での中等温度好性α−ガラクトシダーゼの熱不安定性のために、食物の調製（即ち調理、加熱）前に食物に適用できない。高温で安定であるα−ガラクトシダーゼを用いる能力は、それが（１）望ましくないオリゴ糖を含有する食物の調製、ならびに（２）消化前に望ましくないオリゴ糖を加水分解する能力における付加的柔軟性を食物の消費者に提供する場合に望ましい。
【００１６】
本発明人等は、ある種の好高温性酵素が動物飼料およびヒト食物の品質を改良する加工処理添加物としての用途を有する、ということを発見した。本発明は、好高温性供給源からのα−ガラクトシダーゼ、例えばＴｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａＤＳＭ３１０９からのα−ガラクトシダーゼを利用して、動物飼料中に存在するガラクトース含有オリゴ糖を加水分解することにより動物飼料を直接的に処理する。酵素処理は、ガラクトース含有オリゴ糖を含む基質組成物（例えば大豆ミールを含有する動物飼料）への直接的な好高温性α−ガラクトシダーゼ調製物の付加により成し遂げられる。本発明の一利点は、高温で酵素を用いる能力であり、即ち、普通は、典型的には動物飼料処方または加工処理に関連する工業的方法において遭遇するものである。
【００１７】
さらに、これらのより高い温度で、基質はより完全に酵素に接近可能で、酵素が基質と完全に接触するようになるのを可能にする。酵素活性に関する水分要件は、一般的に酵素活性に必要な高温で低減される。基質に及ぼす酵素活性の程度は、混合物が高温で保持される時間を調整することによっても制御され得る。
【００１８】
したがって本発明の一局面は、ガラクトース含有オリゴ糖を含む複合基質（例えば動物飼料）に好高温性α−ガラクトシダーゼを接触させ、次に混合物を加熱して酵素媒介性加水分解を促進することにより、ガラクトース含有オリゴ糖を加水分解するための新規の方法である。
【００１９】
本発明の別の局面は、好高温性α−ガラクトシダーゼとガラクトース含有オリゴ糖を含む複合基質（例えば大豆ミール、大豆フレークまたは動物飼料）との混合物を含む組成物である。
【００２０】
本発明の第三の局面は、ヒトおよび動物における胃腸逼迫を低減するための食品添加物として用いられ得る好高温性供給源からのα−ガラクトシダーゼを含む組成物である。
【００２１】
さらに本発明の第四の局面は、例えば植物タンパク質（即ち大豆タンパク質）の単離において加工処理添加剤として用いられ得る好高温性供給源からのα−ガラクトシダーゼを含む組成物である。このような添加物は、タンパク質製品からのオリゴ糖およびガラクトース単量体の除去を促し、したがってヒトおよび動物における胃腸窮迫を防止しまたは低減するのに有用である。
【００２２】
本明細書中に開示された酵素の高熱安定性、ならびに酵素が活性である高温のために、本発明は、動物に当該物質を給餌する前の高温飼料加工処理中に動物飼料の酵素修飾を起こさせる。ペレット化後酵素適用がもはや必要でないので、含水量増大から生じる貯蔵問題は低減されるかまたは排除される。酵素効率増大は、より小型の粒子が処理される場合（即ち完成ペレット化製品と比較した場合）、物質移動抵抗低減のために実現される。最後に、ガラクトース含有オリゴ糖の加水分解は、最終的には飼料がより栄養的である（即ち動物に利用可能なより有用な食物エネルギーである）という意味での価値の増大をもたらす。
【００２３】
したがって本発明は、以下のものを提供する：
基質中に存在するガラクトース含有オリゴ糖の加水分解方法であって、基質を好高温性α−ガラクトシダーゼと接触させ、そしてオリゴ糖を加水分解するのに十分な期間、好高温性ガラクトシダーゼが活性である温度に基質を加熱することを包含する方法。好ましい実施態様では、オリゴ糖は、ラフィノース、スタキオースおよびベルバスコースから成る群から選択される。別の好ましい実施態様では、基質は動物飼料、大豆ミールおよびヒト食物である。別の好ましい実施態様では、好高温性α−ガラクトシダーゼは、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｎｅｏｐｏｌｉｔａｎａおよびＴｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｅｌｆｉｉならびにＴｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｓｐ． Ｔ２からなる群から単離される。好ましくは好高温性α−ガラクトシダーゼは、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａから、さらに好ましくはＴｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａＤＳＭ３１０９から単離される。別の好ましい実施態様では、オリゴ糖はガラクトース単量体に加水分解される。別の好ましい実施態様では、本方法は湿度７０％の条件下で、または湿度２５％の条件下で実行される。別の好ましい実施態様では、加熱は８０℃、８５℃、９０℃または１００℃で起こる。
【００２４】
さらに別の実施態様では、好高温性α−ガラクトシダーゼは：（ａ）好高温性α−ガラクトシダーゼをコードするポリヌクレオチド配列を含有する発現ベクターを含む宿主細胞を培養し、（ｂ）好高温性α−ガラクトシダーゼを発現し、そして（ｃ）宿主細胞培養から好高温性α−ガラクトシダーゼを回収することにより産生される。好ましくはポリヌクレオチドは配列番号１の配列を有する。別の好ましい実施態様では、ポリヌクレオチドは、（ａ）配列番号１のヌクレオチド配列を有するＤＮＡ、（ｂ）好高温性α−ガラクトシダーゼをコードし、緊縮条件下で前記（ａ）のＤＮＡとハイブリダイズするポリヌクレオチド、および（ｃ） 好高温性α−ガラクトシダーゼをコードし、そして遺伝暗号の縮重のために前記（ａ）または（ｂ）のＤＮＡとは異なるポリヌクレオチドからなる群から選択される。好ましくはポリヌクレオチドは、配列番号２のアミノ酸配列を有する好高温性α−ガラクトシダーゼをコードする。
【００２５】
本発明はさらに以下を提供する：
加水分解化ガラクトース含有オリゴヌクレオチドを含む動物飼料組成物の製造方法であって、以下の：動物飼料の加工処理中に動物飼料組成物の成分を好高温性α−ガラクトシダーゼと接触させることを包含する方法であって、動物飼料加工処理における加熱過程の前に好高温性α−ガラクトシダーゼにガラクトース含有オリゴ糖を加水分解させるのに十分な時間、好高温性α−ガラクトシダーゼが動物飼料成分と接触される方法。好ましい実施態様では、ガラクトース含有オリゴ糖は、ラフィノース、スタキオースおよびベルバスコースから成る群から選択される。別の好ましい実施態様では、動物飼料は大豆ミールを含み、大豆フレークを含みまたはニワトリ飼料である。別の好ましい実施態様では、好高温性α−ガラクトシダーゼは、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｎｅｏｐｏｌｉｔａｎａおよびＴｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｅｌｆｉｉならびにＴｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｓｐ． Ｔ２からなる群から単離される。好ましくは好高温性α−ガラクトシダーゼは、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ、さらに好ましくはＴｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａＤＳＭ３１０９から単離される。別の好ましい実施態様では、オリゴ糖は、ガラクトース単量体に加水分解される。別の好ましい実施態様では、好高温性α−ガラクトシダーゼと動物飼料組成物の成分との接触は、湿度７０％、湿度２５％または湿度４５％の条件下で実行される。別の好ましい実施態様では、加熱過程は、８０℃、８５℃、９０℃または１００℃で起こる。別の好ましい実施態様では、動物飼料組成物の成分と好高温性α−ガラクトシダーゼとの接触は、動物飼料加工処理における最終ペレット化過程前に起こる。
【００２６】
さらに別の好ましい実施態様では、好高温性α−ガラクトシダーゼは、以下の：（ａ）好高温性α−ガラクトシダーゼをコードするポリヌクレオチド配列を含有する発現ベクターを含む宿主細胞を培養し、（ｂ）好高温性α−ガラクトシダーゼを発現し、そして（ｃ）宿主細胞培養から好高温性α−ガラクトシダーゼを回収することにより産生される。好ましくは、ポリヌクレオチドは配列番号１の配列を有する。好ましくはポリヌクレオチドは、（ａ）配列番号１のヌクレオチド配列を有するＤＮＡ、（ｂ）好高温性α−ガラクトシダーゼをコードし、緊縮条件下で前記（ａ）のＤＮＡとハイブリダイズするポリヌクレオチド、および（ｃ） 好高温性α−ガラクトシダーゼをコードし、そして遺伝暗号の縮重のために前記（ａ）または（ｂ）のＤＮＡとは異なるポリヌクレオチドからなる群から選択される。好ましくはポリヌクレオチドは、配列番号２のアミノ酸配列を有する好高温性α−ガラクトシダーゼをコードする。
【００２７】
さらに別の好ましい実施態様では、好高温性α−ガラクトシダーゼは動物飼料組成物の成分と接触される場合、好高温性α−ガラクトシダーゼが液体溶液中であるか、乾燥形態であるか、部分的精製形態または実質的精製形態である。
【００２８】
本発明はさらに以下を提供する：
前記の方法のいずれかにより産生される動物飼料。
【００２９】
本発明はさらに以下を提供する：
好高温性α−ガラクトシダーゼを含む哺乳類における胃腸窮迫の低減のための食品添加物。好ましくは好高温性α−ガラクトシダーゼは、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｎｅｏｐｏｌｉｔａｎａおよびＴｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｅｌｆｉｉならびにＴｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｓｐ． Ｔ２からなる群から単離される。好ましくは好高温性α−ガラクトシダーゼは、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ、さらに好ましくはＴｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａＤＳＭ３１０９から単離される。
【００３０】
別の好ましい実施態様では、好高温性α−ガラクトシダーゼは、：（ａ）好高温性α−ガラクトシダーゼをコードするポリヌクレオチド配列を含有する発現ベクターを含む宿主細胞を培養し、（ｂ）好高温性α−ガラクトシダーゼを発現し、そして（ｃ）宿主細胞培養から好高温性α−ガラクトシダーゼを回収することにより産生される。好ましくはポリヌクレオチドは配列番号１の配列を有する。好ましくはポリヌクレオチドは、（ａ）配列番号１のヌクレオチド配列を有するＤＮＡ、（ｂ）好高温性α−ガラクトシダーゼをコードし、緊縮条件下で前記（ａ）のＤＮＡとハイブリダイズするポリヌクレオチド、および（ｃ） 好高温性α−ガラクトシダーゼをコードし、そして遺伝暗号の縮重のために前記（ａ）または（ｂ）のＤＮＡとは異なるポリヌクレオチドからなる群から選択される。好ましくはポリヌクレオチドは、配列番号２のアミノ酸配列を有する好高温性α−ガラクトシダーゼをコードする。
【００３１】
本発明はさらに以下を提供する：
哺乳類における胃腸窮迫の予防方法であって、胃腸窮迫が、ラフィノース、スタキオースおよびベルバスコースから成る群から選択される少なくとも１つのオリゴ糖を含有する食物により引き起こされる方法であって、食物を好高温性α−ガラクトシダーゼと接触させ、そして次に、好高温性α−ガラクトシダーゼにオリゴ糖を加水分解させるのに十分な期間、食物を加熱することを包含する方法。
【００３２】
本発明はさらに以下を提供する：
好高温性α−ガラクトシダーゼを含む食用大豆タンパク質の製造方法におけるガラクトース含有オリゴ糖の除去のための加工処理添加物。
【００３３】
本発明はさらに以下を提供する：
食用大豆タンパク質を生成するために加工処理されている大豆基質からのガラクトース含有オリゴ糖の除去方法であって、以下の：（ａ）
大豆基質を好高温性α−ガラクトシダーゼと接触させ、（ｂ）ガラクトース含有オリゴ糖を加水分解するのに十分な温度および時間で大豆基質を加熱し、そして（ｃ）食用大豆タンパク質の最終抽出または分別前に大豆基質から加水分解化ガラクトース含有オリゴ糖を除去することを包含する方法。好ましい実施態様では、加熱は大豆基質からの油の除去前に起こる。別の好ましい実施態様では、加熱は大豆基質からの油の除去後に起こる。別の好ましい実施態様では、大豆基質は大豆フレークである。
【００３４】
本発明はさらに以下を提供する：
前記の方法のいずれかにより産生される単離食用大豆タンパク質。
本発明の前記のおよびその他の局面を、下記の明細書中で詳細に説明する。
【００３５】
配列表の簡単な説明
配列番号１：Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍｅＤＳＭ３１０９ｇａｌＡまたはｇａｌ３６遺伝子のヌクレオチド配列。
配列番号２：配列番号１によりコードされるアミノ酸配列。
ヌクレオチド配列は、翻訳開始コドンＧＴＧで開始する。上流リボソーム結合部位配列は省かれている。本明細書中に記載したようなこの遺伝子のクローニング中、翻訳開始コドンＧＴＧは、リボソーム結合部位の直後のｐＥＴ２４ｄ＋中の独自のＮｃｏＩ部位中への挿入を促すためにＡＴＧに変えられた。
【００３６】
ここでは本発明の好ましい実施態様が示されている添付の図面を参照しながら、以後、本発明を詳細に説明する。しかしながら本発明は異なる形態で具体化され得るし、本明細書中に記述された実施態様に限定されると意図されるべきでない。むしろこれらの実施態様は、本開示が徹底的且つ完全であり、当業者に本発明の範囲を十分に伝えるよう、提供される。
【００３７】
本明細書中で本発明の説明に用いられる技法は、特定の実施態様のみを説明する目的のためであり、本発明を限定するものではない。本発明の説明および添付の特許請求の範囲で用いられる場合、単数形態「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、明白に別記しない限り、複数形態も同様に含むよう意図される。
【００３８】
別記しない限り、本明細書中で用いられる技術用語および科学用語はすべて、本発明が属する業界の当業者に一般的に理解されているのと同一の意味を有する。本明細書中に記述された出版物、特許出願、特許およびその他の参考文献はすべて、それらの記載内容が参照により本明細書中に含まれる。
【００３９】
別記された場合を除いて、本発明によるクローン化遺伝子、発現カセット、ベクター（例えばプラスミド）、タンパク質およびタンパク質断片の製造のためには、標準的方法が用いられ得る。このような技法は、当業者に既知である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ． ｅｄｓ．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， ＮＹ １９８９）；Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ． ｅｄｓ．， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ Ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｇｒｅｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ， Ｉｎｃ． ａｎｄ Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）参照）。
【００４０】
本明細書中に開示されたアミノ酸配列は、左から右に、アミノからカルボキシ方向に示されている。アミノおよびカルボキシ基は、配列中に示されない。ヌクレオチド配列は、左から右に、５’から３’方向に、一本鎖のみにより本明細書中では示される。ヌクレオチドおよびアミノ酸は、本明細書中では、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎに推奨された方式で、または（アミノ酸に関しては３７ＣＦＲ§１．８２２にしたがって三文字暗号および確立された用法により示される（例えばＰａｔｅｎｔ Ｉｎ Ｕｓｅｒ Ｍａｎｕａｌ， ９９−１０２（Ｎｏｖ． １９９０）（米国特許および商標庁）参照）。
【００４１】
Ａ．定義
「タンパク質」または「酵素」とは、本明細書中では、少なくとも２つの共有的に結合されたアミノ酸を意味し、これらの例としては、タンパク質、ポリペプチド、オリゴペプチドおよびペプチドが挙げられる。タンパク質は、天然アミノ酸およびペプチド結合または合成ペプチド模倣構造から作製され得る。したがって「アミノ酸」または「ペプチド残基」とは、本明細書中では、天然および合成アミノ酸の両方を意味する。「アミノ酸」は、イミノ酸残基、例えばプロリンおよびヒドロキシプロリンも含む。側鎖は、（Ｒ）または（Ｓ）形状のいずれかであり得る。非天然側鎖が用いられる場合、例えばｉｎ ｖｉｖｏ分解を防止するかまたは遅延するために、非アミノ酸置換基が用いられ得る。化学遮断基またはその他の化学置換基も付加され得る。
【００４２】
「アミノ酸配列」とは、本明細書中で用いる場合、オリゴペプチド、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質配列およびそれらの断片を指し、ならびに天然または合成分子を指す。α−ガラクトシダーゼの断片は、好ましくはα−ガラクトシダーゼの生物学的活性を保持する。「アミノ酸配列」が天然タンパク質分子のアミノ酸配列を指すために本明細書中で記述される場合、アミノ酸配列および同様の用語は、記述されたタンパク質分子に関連した完全なネイティブのアミノ酸配列にアミノ酸配列を限定することを意味しない。
【００４３】
「増幅」とは、本明細書中で用いる場合、核酸配列の付加的コピーの産生を指し、一般的に当業界で周知のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技法を用いて実行される（Ｄｉｅｆｆｅｎｂａｃｈ， Ｃ．Ｗ． ａｎｄ Ｇ．Ｓ． Ｄｖｅｋｓｌｅｒ （１９９５） ＰＣＲ Ｐｒｉｍｅｒ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ， Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ， Ｎ．Ｙ．）。
【００４４】
「核酸誘導体」という用語は、本明細書中で用いる場合、α−ガラクトシダーゼをコードするかまたはそれと相補的な核酸の化学修飾またはコード化α−ガラクトシダーゼを指す。このような修飾としては、例えばアルキル、アシルまたはアミノ基による水素の置換が挙げられる。核酸誘導体は、天然分子の生物学的または免疫学的機能を保持するポリペプチドをコードする．誘導体ポリペプチドは、グリコシル化、ペギル化、またはそれが由来するポリペプチドの生物学的または免疫学的機能を保持する任意の同様の方法により修飾されるものである。
【００４５】
「相同」という用語は、本明細書中で用いる場合、相補性の一程度を示す。部分的相同または完全相同（即ち同一性）が存在し得る。同一配列が標的核酸とハイブリダイズするのを少なくとも部分的に抑制する部分的相補配列は、「実質的に相同の」という機能的用語を用いて言及される。完全相補配列と標的配列とのハイブリダイゼーションの抑制は、低緊縮条件下でハイブリダイゼーション検定（サザンまたはノーザンブロット、溶液ハイブリダイゼーション等）を用いて検査され得る。実質的相同配列またはハイブリダイゼーションプローブは、低緊縮条件下での標的配列との完全相同配列の結合に対して競合するかまたはそれを抑制する。これは、低緊縮の条件が非特異的結合が許されるようなものである、というわけではない。低緊縮条件は２つの配列の互いとの結合が特異的（即ち選択的）相互作用であることを要する。非特異的結合の非存在は、部分的程度の相補性さえ欠いた（例えば約３０％未満同一性）二次標的配列の使用により試験され得る。非特異的結合の非存在においては、プローブは二次非相補的標的配列とハイブリダイズしない。
【００４６】
「核酸」または「オリゴヌクレオチド」または文法的等価物とは、本明細書中では、一緒に共有結合された少なくとも２つのヌクレオチドを意味する。本発明の核酸は一般にホスホジエステル結合を含有するが、しかしいくつかの場合には、当業界で既知の代替的主鎖（例えばホスホルアミド；ホスホロチオエート；ホスホロジチオエート；Ｏ−メチルホスホロアミダイト結合およびペプチド核酸主鎖および結合）を有し得る核酸類似体が含まれる。
【００４７】
「核酸配列」および「ポリヌクレオチド」とは、本明細書中では、オリゴヌクレオチド、ヌクレオチドまたはポリヌクレオチドおよびそれらの断片を、ならびに一本鎖または二本鎖であり得るゲノムまたは合成起源のＤＮＡまたはＲＮＡを指すために互換的に用いられ、そしてセンスまたはアンチセンス鎖を表す。
【００４８】
本明細書中で用いる場合、「加水分解」という用語は、ガラクトース単位を含むオリゴ糖の非還元末端からのα−Ｄ−ガラクトシル残基の酵素活性による除去をさす。オリゴ糖において、オリゴ糖の加水分解とは、オリゴ糖の重合度（ＤＰ）が低減されることを意味する。重合度の低減は、オリゴ糖がより小さいオリゴ糖に加水分解されることを意味し、好ましくはオリゴ糖がその単量体であるガラクトース単位に完全に加水分解されることを意味し得る。
【００４９】
「基質」という用語は、本明細書中で用いる場合、オリゴ糖、特にオリゴ糖であるスタキオース、ラフィノースおよびベルバスコースを含む化合物または混合物を指す。本出願中に特に記載された例示的基質としては、あらゆる形態の脂肪種子ミール（即ち大豆ミール、カノーラミール）、植物タンパク質フレーク、動物飼料およびヒト食物が挙げられる。
【００５０】
大豆またはグリシンマックスＧｌｙｃｉｎｅ ｍａｘは本発明のための基質の例示的供給源として用いられるが、しかしその他の基質供給源、例えばカノーラ、菜種、ヒマワリ種子、亜麻仁、ベニバナ種子、ゴマ種子および綿種子も本発明の基質の供給源であり得る。したがって、大豆に関して定義される「ミール」、「油」、「フレーク」、「飼料」、「タンパク質」および「製品」といった用語は、他の基質供給源にも適用可能である。概して基質の適切な供給源は好ましくは脂肪種子であるが、しかし本発明は基質の他の供給源と協力しても有用である。
【００５１】
本明細書中で用いる場合、「大豆製品」という用語は、その天然供給源として大豆を有する、食用のまたはそれとは違う任意の製品である。したがって「大豆製品」とは、大豆ミール、大豆油、大豆フレーク、粗挽き大豆、大豆タンパク質およびタンパク質濃縮物、大豆レシチン、大豆外皮、大豆単離物または濃縮物、大豆凝乳、あるいは大豆ミールのような大豆製品を含む任意の動物飼料またはヒト食物を包含し得る。
【００５２】
概して「大豆ミール」とは、大豆からの大豆油の抽出後に残存する高タンパク質残渣（通常タンパク質４０％以上）と定義される。大豆ミールを調製するための大豆の種々の加工処理方法の例は、米国特許第４，１０３，０３４号（Ｒｏｎａｉ等）（この記載内容は、参照により本明細書中に含まれる）に記述されている。大豆ミールは、動物飼料の調製における普通のそして一般的に好ましいタンパク質供給源であり、そして溶媒抽出または搾油機抽出される完全または脱外皮化大豆ミールであり得る氏、あるいは当業界で既知のその他の方法で加工処理され得る。
【００５３】
「動物飼料」は一般に、脂肪種子ミール（即ち大豆ミール）のような少なくとも１つのタンパク質供給源、少なくとも１つの炭水化物供給源、ならびにその他の構成成分、例えば充填剤、増量物質、付加栄養物質および本明細書中にさらに記載されたその他の構成成分を含めた有機物質の混合物を包含する。動物飼料は当業界で周知であり、高品質タンパク質飼料ならびに低タンパク質品質のその他の飼料を含む。飼料としては、大豆ミール、綿実ミール、フェザー（ｆｅａｔｈｅｒ）ミール、血液ミール、サイレージ、肉および骨ミール、ヒマワリ種子ミール、カノーラミール、落花生ミール、ベニバナミール、亜麻仁ミール、ゴマミール、早咲き豆科植物、魚製品、蒸留所および醸造所穀粒のような副産物タンパク質飼料、乳製品、家禽製品、干草、トウモロコシ、コムギ、アルファルファ、オオムギ、マイロ、もろこしおよびそれらの混合物が挙げられ得る。動物飼料に含まれ得るその他の構成成分は、以下でさらに説明される。
【００５４】
Ｂ．好高温性α−ガラクトシダーゼの特性
好熱性生物からの単離α−ガラクトシダーゼ（本明細書中では、「好高温性酵素」または「好高温性α−ガラクトシダーゼ」とも呼ばれる）は、本発明において有用である。単離α−ガラクトシダーゼが単離される好熱性生物としては、細菌のサームス属Ｔｈｅｒｍｕｓ（即ちＴｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）およびサーモトガ属Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａが挙げられる。好ましい好高温性生物としては、サーモトガ属Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａの生物、例えばＴｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍｅ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｎｅｏｐｏｌｉｔａｎａおよびＴｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｅｌｆｉｉならびにＴｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｓｐ．Ｔ２が挙げられ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍｅが特に好ましい。好ましい単離α−ガラクトシダーゼとしては、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍｅＤＳＭ３１０９およびＴｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｎｅｏｐｏｌｉｔａｎａ５０６８およびそれらの突然変異体または変異体から単離されるものが挙げられる（例えばＷ． Ｌｉｅｂｅｌ ｅｔ ａｌ．， Ｓｙｓｔｅｍ． Ａｐｐｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ２１， １−１１（１９９８）およびＧ． Ｄｕｆｆａｕｄ ｅｔ ａｌ．， Ａｐｐｌ． Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ６３， １６９−１７７（１９９７）参照）。
【００５５】
α−ガラクトシダーゼは、当業界で既知の、そして本明細書中に記載された技法にしたがって好高温性生物から単離され得る。好高温性生物から酵素が単離され得る方法の説明は、Ｇ． Ｄｕｆｆａｕｄ ｅｔ ａｌ．， Ａｐｐｌ． Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ６３， １６９−１７７（１９９７）にも見出され得る。本発明で用いられる場合、α−ガラクトシダーゼは、天然、合成、半合成または組換え体であり得る。好ましい一実施態様では、本発明の好高温性α−ガラクトシダーゼは、配列番号２として本明細書中に記述されたアミノ酸配列を有する。本発明の好高温性α−ガラクトシダーゼは、単離ポリヌクレオチドによりコードされ、その好ましい実施態様は、配列番号１として本明細書中に記述されたヌクレオチド配列を有するｃＤＮＡである。本発明の酵素は、以下でより完全に説明されるように、天然精製産物または化学合成手法の生成物であり得るし、あるいは原核生物または真核生物宿主からの組換え技法により（例えば培養中の細菌、酵母、高等植物、昆虫および哺乳類細胞により）産生され得る。組換え産生手法に用いられる宿主によって、本発明の酵素はグリコシル化され得るか、または非グリコシル化され得る。本発明の酵素は、最初のメチオニンアミノ酸残基を含み得るし、あるいは含み得ない。
【００５６】
本発明の酵素が活性である最適温度は、各酵素ならびに酵素が最初に単離された各生物によって変わる。概して本発明の酵素は、約７５℃より高い温度で、さらに好ましくは約８０℃より高い、最も好ましくは約８５℃より高い温度で活性である。本発明の酵素は、９０℃という高い温度で、あるいは１００℃でさえ活性であり得る。もっとも好ましい実施態様では、本発明の酵素は普通の周囲温度または室温で（即ち約２５℃で）ほとんどまたはまったく活性を有さない。概して本発明の酵素は、それらの最適温度で最大半減期を有し、それは一般に約８０℃〜９８℃、さらに好ましくは約８５℃〜９８℃である。これらの酵素は一般に１００℃で活性であるが、しかしこれらの温度での酵素の半減期は一般により短い。
【００５７】
本発明の好高温性α−ガラクトシダーゼは、種々のならびに広範な程度の含水量を有する環境で活性である。例えば本発明の好高温性α−ガラクトシダーゼは、約７０％の含水量で、約４５％の含水量で、約２５％の含水量で、そしてそれ以下でさえ活性である。
【００５８】
本発明の酵素の有用な変異体は、「指向性進化」または代謝工学処理技法、例えば米国特許第５，８３７，４５８号（Ｍｉｎｓｈｕｌｌ等）、米国特許第５，８３７，５００号（Ｌａｄｎｅｒ等）および米国特許第５，８１１，２３８号（Ｓｔｅｍｍｅｒ等）（これらの記載内容は、参照により本明細書中に含まれる）に記述されたものを用いて特定の基質または条件に関する最適活性のために設計され得る、と当業者は認識する。
【００５９】
Ｃ．好高温性α−ガラクトシダーゼの産生
一実施態様では、好高温性α−ガラクトシダーゼは、当業界で既知の技法にしたがってそれらのネイティブ好高温性生物から単離され、そして任意に精製され得る。天然好高温性α−ガラクトシダーゼがそれらのネイティブ好高温性生物ならびにそれらの適切な条件および試薬から単離され得る方法についての例示的説明は、Ｇ． Ｄｕｆｆａｕｄ ｅｔ ａｌ．， Ａｐｐｌ． Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ６３， １６９−１７７（１９９７）に見出され得る。
【００６０】
別の実施態様では、好高温性α−ガラクトシダーゼをコードするポリヌクレオチド（好ましくはＤＮＡ）は、本発明に有用な酵素を産生するためにクローン化され、発現（または過剰発現）される。発現タンパク質は次に単離され、本発明の方法および化合物に用いられる。この方法で産生された好高温性酵素は次に任意に精製され得るが、しかし酵素は、非精製または部分的精製形態で本発明の方法に用いられ得る。
【００６１】
α−ガラクトシダーゼを発現するために用いられるポリヌクレオチド配列は、ゲノム、ｃＤＮＡの、または合成起源の、あるいはそれらの任意の組合せのものであり得る。ポリヌクレオチド配列は、任意の一般的方法により、例えば、適切なベクター、任意の好高温性α−ガラクトシダーゼ産生株からのｃＤＮＡライブラリー中でクローニングし；前記のベクターを用いて適切な宿主細胞の形質転換し；適切な条件下で宿主細胞を培養してｃＤＮＡライブラリー中のクローンによりコードされる酵素を発現し；このようなクローンにより産生される酵素の任意の好高温性α−ガラクトシダーゼ活性を確定することにより陽性クローンに関してスクリーニングし；そしてこのようなクローンから酵素コードＤＮＡを単離することを包含することによってもクローン化され得る。
【００６２】
α−ガラクトシダーゼを発現するために用いられるポリヌクレオチドは、周知の手法にしたがって、配列番号１として示されるＤＮＡ配列またはその任意の適切な亜配列を基礎にして、あるいは配列番号２として示されるアミノ酸配列を基礎にして調製される合成オリゴヌクレオチドプローブを用いて、ハイブリダイゼーションにより任意の好高温性α−ガラクトシダーゼ産生生物から便利にクローン化され得る。あるいはＤＮＡ配列は、本明細書中に開示されたＤＮＡ配列を基礎にして調製されるＰＣＲプライマーの使用によりクローン化され得る。
【００６３】
前記のように、本発明は、単離されそして任意に精製された好高温性α−ガラクトシダーゼを利用する。このようなタンパク質は、既知の技法にしたがって同一物を発現する宿主細胞から単離され得るし、あるいは合成的に製造さえされ得る。本発明の核酸、同一物を含有する構築物およびコード化タンパク質を発現する宿主細胞は、本発明の酵素を製造するために有用である。好高温性α−ガラクトシダーゼをコードする配列のより効率的な翻訳を達成するためには、特定の開始シグナルも用いられ得る。このようなシグナルは、開始コドンおよび隣接配列を包含する。好高温性α−ガラクトシダーゼをコードする配列、その開始コドンおよび上流配列が適切な発現ベクター中に挿入される場合には、付加的転写または翻訳制御シグナルは必要とされ得ない。しかしながらコード配列またはその断片のみが挿入される場合には、開始コドンを含む外因性翻訳制御シグナルが提供されるべきである．さらに開始コドンは、全挿入物の翻訳を保証するために、正しいリーディングフレーム内にあるべきである。外因性翻訳素子および開始コドンは、天然および合成の両方の種々の起源のものであり得る。発現の効率は、文献に記載されたもののような、用いられる特定の細胞系に適切であるエンハンサーの含入により強化され得る（例えばＤ． Ｓｃｈａｒｆ ｅｔ ａｌ．， Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｐｒｏｂｌ． Ｃｅｌｌ Ｄｉｆｆｅｒ． ２０， １２５−１６２（１９９４）参照）。
【００６４】
本発明の好高温性α−ガラクトシダーゼをコードするポリヌクレオチドとしては、本明細書中に開示されたタンパク質と相同な、そしてそれと本質的に同一の生物学的特性を有するタンパク質をコードするもの、特に配列番号１として本明細書中に開示され、そして配列番号２として本明細書中に提示された好高温性α−ガラクトシダーゼをコードするＤＮＡが挙げられる．この定義は、その天然対立遺伝子配列を包含するよう意図される。したがって、配列番号１として本明細書中に開示されたＤＮＡ（または以下で考察されるようなハイブリダイゼーションプローブとして役立つその断片または誘導体）とハイブリダイズする、そして本発明のタンパク質（例えば配列番号２によるタンパク質）に関する発現をコードするポリヌクレオチドも、本発明の実施に有用である。
【００６５】
本発明のタンパク質に関する発現をコードするその他のポリヌクレオチドに本明細書中に開示された配列番号１のＤＮＡとハイブリダイズさせる条件は、既知の技法にしたがって確定され得る。例えば標準ハイブリダイゼーション検定における本明細書中に開示された配列番号１のＤＮＡとのこのような配列のハイブリダイゼーションは、低緊縮、中緊縮の条件下で、または緊縮条件（例えばそれぞれ、３７℃で５ｘデンハート溶液、０．５％ＳＤＳおよび１ｘＳＳＰＥを用いる３５〜４０％ホルムアミドの洗浄緊縮性により示される条件；４２℃で５ｘデンハート溶液、０．５％ＳＤＳおよび１ｘＳＳＰＥを用いる４０〜４５％ホルムアミドの洗浄緊縮性により示される条件；ならびに４２℃で５ｘデンハート溶液、０．５％ＳＤＳおよび１ｘＳＳＰＥを用いる５０％ホルムアミドの洗浄緊縮性により示される条件；）下でさえ実行され得る。概して本発明のタンパク質をコード氏、そして本明細書中に開示された配列番号１のＤＮＡとハイブリダイズする配列は、それぞれ配列番号１と少なくとも７５％相同、８５％相同ならびに９５％またはそれ以上相同でさえある。さらに、本発明のタンパク質をコードするポリヌクレオチド、または配列番号１のようなものとハイブリダイズするが、しかし遺伝暗号の縮重のために配列番号１とは暗号配列が異なるポリヌクレオチドも、本発明の実施に有用である。異なる核酸配列が同一タンパク質またはペプチドをコードするのを可能にする遺伝暗号の縮重は、文献で周知である（例えば米国特許第４，７５７，００６号（Ｔｏｏｌｅ等）、カラム２、表１参照）。
【００６６】
好高温性α−ガラクトシダーゼをコードするヌクレオチド配列およびその変異体は、好ましくは、緊縮性の適切に選定された条件下で天然好高温性α−ガラクトシダーゼのヌクレオチド配列とハイブリダイズし得るが、しかし実質的に異なる暗号用法を保有する好高温性α−ガラクトシダーゼまたはその誘導体を生成するのは有益であり得る。暗号は、ペプチドの発現が、特定の暗号が宿主により利用される頻度にしたがって特定の原核生物または真核生物宿主中で起こる率を増大するために選定され得る。コード化アミノ酸配列を変えずに、好高温性α−ガラクトシダーゼまたはその誘導体をコードするヌクレオチド配列を実質的に変更するその他の理由としては、天然配列から生成される転写体より望ましい特性、例えばより長い半減期を有するＲＮＡ転写体の産生が挙げられる。本発明は、完全に合成的化学により、好高温性α−ガラクトシダーゼおよびその誘導体をコードするＤＮＡ配列またはその断片の生成も包含する。生成後、合成配列は、当業界で周知である試薬を用いて、多数の利用可能な発現ベクターおよび細胞系のいずれかに挿入され得る。さらに合成化学を用いて、好高温性α−ガラクトシダーゼをコードする配列またはその任意の断片中に突然変異を導入し得る。
【００６７】
配列番号１で本明細書中に開示されたようなヌクレオチド配列は、本発明のタンパク質の増幅または過剰発現の存在を確定するために本発明のポリヌクレオチド（即ちｃＤＮＡ）と、またはｍＲＮＡと特異的に結合するハイブリダイゼーションプローブを生成するために用いられ得る。
【００６８】
遺伝子工学処理によるクローン化遺伝子、組換えＤＮＡ、ベクター、形質転換化宿主細胞、タンパク質およびタンパク質断片の生成は周知である（例えば米国特許第４，７６１，３７１号（Ｂｅｌｌ等、６カラム３行〜９カラム６５行）；米国特許第４，８７７，７２９号（Ｃｌａｒｋ等、４カラム３８行〜７カラム６行）；米国特許第４，９１２，０３８号（Ｓｃｈｉｌｌｉｎｇ、３カラム２６行〜１４カラム１２行）；および米国特許第４，８７９，２２４号（Ｗａｌｌｎｅｒ、６カラム８行〜８カラム５９行）参照）（出願人は特に、これらの記載内容すべてが本明細書中に援用されることを意図する）。
【００６９】
ベクターは、複製可能核酸（好ましくはＤＮＡ）構築物である。ベクターは、本発明のタンパク質をコードするＤＮＡを増幅するために、または本発明のタンパク質を発現するために、本明細書中に用いられ得る。発現ベクターは、本発明の酵素をコードする核酸配列が、適切な宿主中で本発明の酵素の発現を実行し得る適切な制御配列と操作可能的に連結される複製可能核酸構築物である。このような制御配列の必要性は、選定される宿主および選択される形質転換方法によって変わる。一般的に、制御配列としては、転写プロモーター、転写を制御するための任意のオペレーター、適切なｍＲＮＡリボソーム結合部位をコードする配列、ならびに転写および翻訳の終結を制御する配列が挙げられる。増幅ベクターは、発現制御ドメインを必要としない。必要とされるすべては、通常は複製の起点、ならびに形質転換体の認識を促進するための選択遺伝子により付与される宿主中で複製する能力である。ベクターとしては、プラスミド、ウイルス（例えばアデノウイルス、サイトメガロウイルス）、ファージ、レトロウイルスおよび一体化可能ＤＮＡ断片（即ち組換えにより宿主ゲノム中に一体化可能な断片）が挙げられるが、これらに限定されない。ベクターは、宿主ゲノムと別個に複製し、機能するか、あるいはいくつかの場合には、ゲノムそれ自体に一体化し得る。発現ベクターは、好ましくは、宿主生物中で発現され、そして操作可能である遺伝子に操作可能的に連結されるプロモーターおよびＲＮＡ結合部位を含有する。
【００７０】
核酸領域は、それらが機能的に互いに関連する場合、操作可能的に連結されるかまたは操作可能的に会合される。例えばプロモーターは、それが配列の転写を制御する場合、コード配列と操作可能的に連結され；リボソーム結合部位は、それが翻訳を可能にするよう配置される場合、コード配列と操作可能的に連結される。一般に、操作可能的に連結されるとは、連続的であることを意味し、そしてリーダー配列の場合には、連続的で且つ読取相であることを意味する。本発明の好高温性α−ガラクトシダーゼをコードするポリヌクレオチドを含有するベクターで形質転換またはトランスフェクトされた形質転換化宿主細胞は、好高温性α−ガラクトシダーゼを発現する必要はないが、しかし好ましくは発現する。適切な宿主細胞としては、原核生物、酵母細胞または高等真核生物細胞が挙げられる。原核生物宿主細胞としては、グラム陰性またはグラム陽性生物、例えば大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）またはバシラス菌が挙げられ、大腸菌が好ましい。大腸菌は、典型的にはｐＢＲ３２２から最初に得られたプラスミド （Ｂｏｌｉｖａｒ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅ ２， ９５ （１９７７）参照）またはそれから得られるベクターを用いて形質転換される。
【００７１】
発現ベクターは、好ましくは宿主生物により認識されるプロモーターを含有する。これは一般に、意図された宿主から得られるプロモーターを意味するが、しかし必ずしもそうではない。プロモーターおよびシャイン−ダルガーノ配列（原核生物発現のための）は、本発明のＤＮＡと操作可能的に連結される。即ちそれらはＤＮＡからのメッセンジャーＲＮＡの転写を促すために配置される。本発明においては、好ましいプロモーターとしては既知のλｐＬ、Ｔ７およびＰｍプロモーターが挙げられる。組換え微生物発現ベクターに用いられるその他のプロモーターとしては、ベータ−ラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）およびラクトースプロモーター系（Ｃｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ２７５， ６１５（１９７８）；およびＧｏｅｄｄｅｌ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ２８１， ５４４（１９７９））；トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系（Ｇｏｅｄｄｅｌ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ８， ４０５７（１９８０）およびＥＰＯ Ａｐｐ． Ｐｕｂｌ． Ｎｏ． ３６，７７６）；ならびにｔａｃプロモーター（Ｈ．Ｄｅ Ｂｏｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８０， ２１ （１９８３））が挙げられる。前記が一般に用いられるが、しかしその他の微生物プロモーターが適切である。多数のヌクレオチド配列に関する詳細が発表されており、熟練従業者はプラスミドまたはウイルスベクター中のタンパク質をコードするＤＮＡにそれらを操作可能的に結繋することができる（Ｓｉｅｂｅｎｌｉｓｔ ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ ２０， ２６９ （１９８０））。
【００７２】
真核生物微生物、例えば酵母クラスターも、適切な好高温性α−ガラクトシダーゼコードベクターで形質転換され得る（例えば米国特許第４，７４５，０５７号参照）。ビール酵母菌Ｓａｃｃａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅは、下等真核生物宿主微生物の中でもっとも一般的に用いられるが、しかし多数のその他の菌株が一般的に利用可能である。酵母ベクターは、２ミクロン酵母プラスミドからの複製の起点、あるいは自立性複製配列（ＡＲＳ）、プロモーター、所望のタンパク質をコードするＤＮＡ、ポリアデニル化および転写終結のための配列、ならびに選択遺伝子を含有し得る。例示的プラスミドは、ＹＲｐ７である（Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ２８２， ３９ （１９７９）； Ｋｉｎｇｓｍａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅ ７， １４１ （１９７９）； Ｔｓｃｈｅｍｐｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅ １０， １５７（１９８０））。このプラスミドはｔｒｐ１遺伝子を含有し、これはトリプトファン中で増殖する能力を欠く酵母の突然変異株、例えばＡＴＣＣＮｏ．４４０７６またはＰＥＰ４−１のための選択マーカーを提供する（Ｊｏｎｅｓ， Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ８５， １２（１９７７））。酵母宿主細胞ゲノムにおけるｔｒｐ１損傷の存在は次に、トリプトファンの非存在中での増殖により形質転換を検出するための有効な環境を提供する。
【００７３】
酵母ベクター中の適切なプロモーティング配列としては、メタロチオネイン、３−ホスホ−グリセレートキナーゼ（Ｈｉｔｚｅｍａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２５５， ２０７３（１９８０））またはその他の解糖酵素（Ｈｅｓｓ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ａｄｖ． Ｅｎｚｙｍｅ Ｒｅｇ． ７， １４９ （１９６８）；およびＨｏｌｌａｎｄ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １７， ４９００（１９７８））、例えばエノラーゼ、グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルベートデカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース−６−ホスフェートイソメラーゼ、３−ホスホグリセレートムターゼ、ピルベートキナーゼ、トリオセホスフェートイソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼおよびグルコキナーゼのためのプロモーターが挙げられる。酵母発現に用いるための適切なベクターおよびプロモーターはさらに、Ｒ． Ｈｉｔｚｅｍａｎ ｅｔ ａｌ．， ＥＰＯ Ｐｕｂｌｎ． Ｎｏ．７３，６５７に記載されている。
【００７４】
多細胞生物由来の細胞の培養は、組換えタンパク質合成のためにも用いられ得る。原則として、任意の高等真核生物細胞培養は、脊椎動物培養であろうがまたは昆虫細胞を含めた無脊椎動物培養であろうが、実行可能である。細胞培養中でのこのような細胞の増殖は、ルーチン手法になっている（Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ （Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｋｒｕｓｅ ａｎｄ Ｐａｔｔｅｒｓｏｎ， ｅｄｓ．）（１９７３）参照）。このような細胞のための発現ベクターは普通は、（必要な場合には）複製の起点、発現される遺伝子から上流に位置するプロモーターを、リボソーム結合部位、ＲＮＡスプライス部位（イントロン含有ゲノムＤＮＡが用いられる場合）、ポリアデニル化部位および転写終結配列とともに含む。
【００７５】
宿主細胞、例えば昆虫細胞（例えば培養Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞）および発現ベクター、例えばバキュロウイルス発現ベクターも、米国特許第４，７４５，０５１号および第４，８７９，２３６号（Ｓｍｉｔｈ等）に記載されているように、本発明を実施するのに有用なタンパク質を作製するために用いられ得る。概して、バキュロウイルス発現ベクターは、ポリヘドリン転写開始シグナルからＡＴＧ開始部位までの範囲の位置で、そしてバキュロウイルスポリヘドリンプロモーターの転写制御下で、ポリヘドリン遺伝子中に挿入される発現去るべき遺伝子を含有するバキュロウイルスゲノムを含む。
【００７６】
さらに、宿主細胞株は、挿入配列の発現を調整する、または所望の様式で発現タンパク質をプロセシングするその能力に関して選択され得る。ポリペプチドのこのような修飾としては、アセチル化、カルボキシル化、グリコシル化、リン酸化、脂質化およびアシル化が挙げられるが、これらに限定されない。タンパク質の「プレプロ」形態を切断する翻訳後プロセシングも、正確な挿入、フォールディングおよび／または機能を促すために用いられ得る。翻訳後活性のための特定の細胞機構および特徴的メカニズムを有する異なる宿主細胞（例えばＣＨＯ、ＨｅＬａ、ＭＤＣＫ、ＨＥＫ２９３およびＷＩ３８）は、アメリカ培養細胞コレクション（ＡＴＣＣ；Ｂｅｔｈｅｓｄａ， Ｍｄ．）から利用可能であり、そして外来タンパク質の正確な修飾およびプロセシングを保証するために選択され得る。
【００７７】
組換えタンパク質の長期高収量産生のためには、安定発現が好ましい。例えば好高温性α−ガラクトシダーゼを安定的に発現する細胞株は、同一ベクター上のまたは別個のベクター上に複製のウイルス起点および／または内因性発現素子および選択可能マーカー遺伝子を含有し得る発現ベクターを用いて形質転換され得る。ベクターの導入後、細胞は、それらが選択培地に切り替えられる前に、濃化培地中で１〜２日間増殖させられ得る。選択可能マーカーの目的は、選択に対する耐性を付与することであり、その存在は、導入された配列を首尾よく発現する細胞の増殖および回収を可能にする。安定的に形質転換された細胞の耐性クローンは、細胞方に適した組織培養技術を用いて増殖され得る。
【００７８】
好高温性α−ガラクトシダーゼをコードするヌクレオチド配列で形質転換された宿主細胞は、細胞培養からのタンパク質の発現および回収に適した条件下で培養され得る。形質転換細胞により産生される酵素は、用いられる配列および／またはベクターによって、分泌されるかまたは細胞内に含入され得る。当業者に理解されるように、好高温性α−ガラクトシダーゼをコードするポリヌクレオチドを含有する発現ベクターは、原核生物または真核生物細胞膜を通しての好高温性α−ガラクトシダーゼの分泌を指図するシグナル配列を含有するよう設計され得る。その他の構築を用いて、好高温性α−ガラクトシダーゼをコードする配列を、可溶性タンパク質の精製を促すポリペプチドドメインをコードするヌクレオチド配列と連結し得る。
【００７９】
硫酸アンモニウムまたはエタノール沈降、酸抽出、陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィーおよびレクチンクロマトグラフィーを含めた方法により、組換え細胞培養から酵素が回収され、精製され得る。成熟タンパク質の立体配置を完成するに際して、必要な場合、タンパク質再フォールディング過程が用いられる。最後に、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）が最終精製過程のために用いられ得る。
【００８０】
概して、その活性に過度に悪影響を及ぼすことなく、本発明のペプチドのアミノ酸配列に対して小欠失または置換が作製され得る、と当業者は理解する。したがってこのような欠失または置換を含有するペプチドは、本発明のさらなる一局面である。アミノ酸の置換または置き換えを含有するペプチドにおいては、ペプチド配列の１つまたはそれ以上のアミノ酸は１つまたはそれ以上のその他のアミノ酸により置き換わられ得るが、この場合、このような置き換えはその配列の機能に影響しない。このような変化は、物理的特徴、例えば電荷密度、疎水性／親水性、サイズおよび立体配置におけるアミノ酸間の既知の類似性により左右され、したがってそのアミノ酸は、本質的に同一機能特性を有するその他のアミノ酸で置換される。例えば、Ａｌａは、ＶａｌまたはＳｅｒで置き換えられ得る；Ｖａｌは、Ａｌａ、Ｌｅｕ、ＭｅｔまたはＩｌｅで、好ましくはＡｌａまたはＬｅｕで置き換えられ得る；Ｌｅｕは、Ａｌａ、ＶａｌまたはＩｌｅで、好ましくはＶａｌまたはＩｌｅで置き換えられ得る；Ｇｌｙは、ＰｒｏまたはＣｙｓで、好ましくはＰｒｏで置き換えられ得る；Ｐｒｏは、Ｇｌｙ、Ｃｙｓ、ＳｅｒまたはＭｅｔで、好ましくはＧｌｙ、ＣｙｓまたはＳｅｒで置き換えられ得る；Ｃｙｓは、Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、ＳｅｒまたはＭｅｔで、好ましくはＰｒｏまたはＭｅｔで置き換えられ得る；Ｍｅｔは、ＰｒｏまたはＣｙｓで、好ましくはＣｙｓで置き換えられ得る；Ｈｉｓは、ＰｈｅまたはＧｌｎで、好ましくはＰｈｅで置き換えられ得る；Ｐｈｅは、Ｈｉｓ、ＴｙｒまたはＴｒｐで、好ましくはＨｉｓまたはＴｙｒで置き換えられ得る；Ｔｙｒは、Ｈｉｓ、ＰｈｅまたはＴｒｐで、好ましくはＰｈｅまたはＴｒｐで置き換えられ得る；Ｔｒｐは、ＰｈｅまたはＴｙｒで、好ましくはＴｙｒで置き換えられ得る；Ａｓｎは、ＧｌｎまたはＳｅｒで、好ましくはＧｌｎで置き換えられ得る；Ｇｌｎは、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ｇｌｕ、ＡｓｎまたはＳｅｒで、好ましくはＡｓｎまたはＳｅｒで置き換えられ得る；Ｓｅｒは、Ｇｌｎ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、ＣｙｓまたはＡｌａで置き換えられ得る、Ｔｈｒは、ＧｌｎまたはＳｅｒで、好ましくはＳｅｒで置き換えられ得る；Ｌｙｓは、ＧｌｎまたはＡｒｇで置き換えられ得る；Ａｒｇは、Ｌｙｓ、ＡｓｐまたはＧｌｕで、好ましくはＬｙｓまたはＡｓｐで置き換えられ得る；Ａｓｐは、Ｌｙｓ、ＡｒｇまたはＧｌｕで、好ましくはＡｒｇまたはＧｌｕで置き換えられ得る；Ｇｌｕは、ＡｒｇまたはＡｓｐで、好ましくはＡｓｐで置き換えられ得る。一旦作製されれば、変化はルーチンにスクリーニングされて、酵素に伴う機能に及ぼすそれらの作用を確定し得る。組換え的産生のほかに、好高温性アルファ−ガラクトシダーゼの断片は、固相技法を用いる直接ペプチド合成により産生され得る（Ｊ． Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ， Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． ８５， ２１４９−２１５４ （１９６３））。タンパク質合成は、手動技法により、または自動化により実施され得る。自動化合成は、例えばＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ４３１Ａペプチド合成機（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を用いて達成され得る。好高温性α−ガラクトシダーゼの種々の断片は、別々に化学的に合成さ��、そして全長分子を産生するための化学的方法を用いて併合され得る。
【００８１】
Ｄ．好高温性α−ガラクトシダーゼを利用する方法および組成物
単離α−ガラクトシダーゼは、ガラクトース含有オリゴ糖、ならびに同一物を含む化合物、基質および複合混合物の加水分解に有用である。本発明のα−ガラクトシダーゼにより加水分解されるオリゴ糖としては、ラフィノース、スタキオース、ベルバスコースおよびＰＮＰ−ガラクトースが挙げられるが、これらに限定されない。
【００８２】
好ましい一実施態様では、本発明のα−ガラクトシダーゼは、動物飼料の調製に有用である。動物としては、哺乳類、鳥類、魚類およびは虫類が揚げられ、哺乳類および鳥類が特に好ましい。動物が哺乳類である場合、家畜類、例えばウシ、ブタ、ウマおよびヤギが好ましい。動物が鳥類である場合、好ましい動物はニワトリおよびシチメンチョウである．動物が魚類である場合、好ましい動物はナマズである。動物飼料（例えばニワトリおよびその他の家禽飼料、家畜用飼料、家庭内動物飼料）は一般的に、必要であることが判明している異なる成分または構成成分（即ち「活性成分」」を、所望の形態を飼料に提供するために不可欠な担体物質と混合することにより調製される。飼料または飼料成分は、必要とされる任意の成分、好ましくは例えばタンパク質および炭水化物供給源であり得る。活性成分の選択は、栄養価に、または成分の活性により得られるある種の特性によっている。酵素またはタンパク質、アミノ酸、色素、ビタミン、酸化防止剤、抗生物質、着色剤およびカロテノイドも飼料に付加され得る。明らかに、これらの成分の組合せは、同時にまたは引き続いて、付加され得る。
【００８３】
動物飼料のタンパク質構成成分は、好ましくは何らかの種類のタンパク質ミール（即ち大豆ミール）の形態である。タンパク質ミールの適切な形態は、前記で詳細に記載されている。タンパク質のその他の例示的供給源としては、単一細胞タンパク質またはタンパク質の加水分解産物、例えば酵母、藻類または細菌からのもの；単離動物タンパク質、ペプチドまたはタンパク質の加水分解産物、例えばヘモグロビン、ミオシン、血漿またはその他の血清タンパク質、コラーゲン、カゼイン、アルブミンまたはケラチン；複合タンパク質供給源またはタンパク質の加水分解産物、例えば乳汁、血液、乳清、血液ミール、肉ミール、フェザー（ｆｅａｔｈｅｒ）ミール、魚ミール、肉および骨ミール、家禽オファル、家禽副産物ミール、孵化場副産物、卵オファル、卵白、卵黄および殻以外の卵；植物タンパク質またはタンパク質の加水分解産物、例えば単離大豆タンパク質、コムギタンパク質、コムギ胚芽、蒸留所穀粒およびグルテンが挙げられる。本発明の好ましい一実施態様では、動物飼料のタンパク質供給源は植物タンパク質供給源であり、さらに好ましい実施態様では、大豆のいずれかの使用可能形態での大豆、例えば大豆ミール、大豆フレーク、粗挽き大豆等である。
【００８４】
動物飼料に含入される炭水化物は、動物のための栄養源を提供し、さらに、固体飼料の生成に役立ち得る．有用な炭水化物としては、コーンスターチ、ジャガイモデンプン、コムギデンプン、コメデンプン、セルロース、ペクチン、アガロースおよびゴム；生物学的利用可能な糖、例えばグルコース、フルクトースおよびスクロース；化学的改質デンプン、例えば改質コーンスターチ、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースおよびデキストリン；保湿剤、例えばグリセロールまたはプロピレングリコール；転化糖；ならびに粉砕複合炭水化物、例えば全、粉砕、分解、微粉砕、ロール、押出し、ペレット化、脱脂、脱水、溶媒抽出またはその他の加工処理形態でのトウモロコシ、コメ、オートムギ、オオムギ、コムギ、モロコシ、ライムギ、キビ、キャッサバ、ライコムギおよびタピオカが挙げられる。
【００８５】
動物飼料は、水分（即ち水）を成分の組合せとともに含有し得る氏、好ましくは含有する。一実施態様では、動物飼料は水中に溶解されたゴムを含有するコロイド溶液から生成され得る。この目的のために用いられ得るゴムは一般に、適切な溶媒中ではゲルを生成し得る、通常はコロイド特性を有する、植物または動物起源の高分子量分子、例えば海草から得られる寒天、アルギンおよびカラジーナン、植物浸出物、例えばアラビアゴム、ガッティおよびトラガカントゴム、植物抽出物、例えばペクチン、植物種子、例えばクラスタマメ、イナゴマメ、ならびに動物進出物、例えば血漿、血清アルブミン、卵アルブミン、キチンおよびゼラチンである。その他のゴムとしては、アミロースおよびアミロペクチン、ならびに細菌起源のゴムが挙げられる。
【００８６】
動物飼料は、好ましくは微生物増殖に対して安定化される。即ち、適正に処理されれば、密封され、室温で少なくとも約８週間という長期間保存された場合、動物飼料は微生物増殖を示さない。当該飼料は、例えば滅菌、微生物増殖阻害剤、例えばメチルパラベンまたはそのソルビン酸塩を付加し、あるいは飼料が生成される混合物のｐＨを調整することにより、安定化され得る。
長期給餌といったいくつかの用途のためにその栄養価を増大するためには、飼料は、好ましくはアミノ酸供給源、例えばタンパク質（単数または複数）、アミノ酸、アミノ酸の前駆体または類似体ならびにそれらの混合物を含む。例示的アミノ酸は、必須アミノ酸、例えばメチオニン、トリプトファン、トレオニン、アルギニンおよびリシンである。例示的アミノ酸前駆体は、例えばアリメットＡｌｉｍｅｔ（登録商標）の商標でＮｏｖｕｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ （Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， Ｍｏ．）から販売されている２−ヒドロキシ−４−（メチルチオ）ブタン酸、ならびに２−ヒドロキシ−４−（メチルチオ）ブタン酸の塩、例えばカルシウムおよびナトリウム塩である。
ある種の用途のためには好ましくないが、しかし脂肪または脂質も、相対的に小比率で資料中に含まれ得る。適切な脂肪としては、脂肪酸、例えばリノール酸；単離植物油、例えばヒマワリ、ベニバナ、大豆、落花生、カノーラ、トウモロコシ、菜種、オリーブ、亜麻仁およびパーム；脂肪ミール、例えば綿実、落花生、菜種、パームミールおよびナッツミール；ならびに動物起源の脂肪、例えば卵黄、ラード、バター、家禽脂肪、獣脂および魚油が挙げられる。
動物飼料は、ビタミンおよびミネラルを付加的に含有し得る。ビタミン添加物は、例えばビタミンＡ、Ｂ１２、ビオチン、コリン、フォラシン、ナイアシン、パントテン酸、ピリドキシン、リボフラビン、チアミン、Ｃ、Ｄ、２５−ヒドロキシＤ、ＥおよびＫから選択され得る。ミネラル添加物は、例えばカルシウム、リン、セレン、塩素、マグネシウム、カリウム、ナトリウム、銅、ヨウ素、鉄マンガンおよびクロムピコリン酸塩から選択され得る。
動物飼料は、他の種類の化合物、例えばタンパク質、非デンプン多糖、脂質等を標的にするその他の非α−ガラクトシダーゼ酵素、例えばヒドロラーゼも含み得る。本発明に用いられ得る酵素、ホルモン、抗生物質、着色剤、安定剤、アミノ酸供給源および酵素のより完全なリストは、米国特許第５，９８５，３３６号（Ｉｖｅｙ等）（この記載内容は、参照により本明細書中に含まれる）に記述されている。
【００８７】
動物飼料の構成成分（例えば大豆ミール）および動物飼料それ自体の加工処理は、高温で（即ち６０℃以上、７０℃以上または８０℃以上でさえ）実行されるいくつかの過程を包含し得る。特に動物飼料の構成成分は、例えば溶媒を除去するためにあるいはある種の栄養特性を得るためにミールを「調理する」ために、加工処理中に蒸気処理に曝露され得る。一般的に、動物飼料の加工処理は、動物消費のためにペレットまたはその他の所望の形態に飼料が生成される押出しまたは生成過程とともに完了する。所望の形態は、粉末、ペレット、溶液または懸濁液であり得る。好ましい形態は、適用条件、組成および最終ユーザー目的地への輸送方法によっている。
【００８８】
本発明においては、本明細書中に記載した好高温性α−ガラクトシダーゼは、例えば大豆、その他のマメ類、マメ科植物、トウモロコシ、コムギ、オートムギ、サトウダイコン、カノーラ、コメまたはその他の穀類、あるいはタンパク質供給源からの外皮、殻または皮の除去後の飼料またはミール加工処理における、動物飼料のペレット化または押出しまでのまたはそれを含めた任意の時点で、動物飼料に付加され得る。例えば好高温性アルファ−ガラクトシダーゼは、飼料の種々の成分が併合されるときに付加され得る。飼料加工処理におけるどの時点で好高温性α−ガラクトシダーゼが付加され得るかに関する唯一の制限は、高温（即ち６０℃、７０℃、７５℃または８０℃より高い）条件下で囲う処理過程が実行される前に、酵素が付加されねばならないことである。好ましくは好高温性α−ガラクトシダーゼは、動物飼料の構成成分または動物飼料が加工処理中に受ける任意の蒸気処理前に付加される。
【００８９】
好高温性α−ガラクトシダーゼは、任意の適切な形態で、例えば液体形態（即ち、酵素が溶液中または培養中である）または乾燥粉末で、動物飼料の構成成分または動物飼料に付加され得る。乾燥形態で付加される場合、好高温性α−ガラクトシダーゼは、噴霧乾燥され、凍結乾燥され、フリーズドライされ、あるいは当業界で既知の任意のその他の適切な方法により乾燥され得る。好高温性α−ガラクトシダーゼは、粗製形態で、部分精製形態で、実質的精製形態でまたは精製形態で付加され得る。
【００９０】
飼料の加工処理中の好高温性α−ガラクトシダーゼの付加は、従来技術を上回るある種の利点を提供する。好高温性α−ガラクトシダーゼは、動物飼料加工処理に用いられる高温で活性であり、したがってペレット化または押出し過程後に酵素を適用する必要性を排除する。好高温性α−ガラクトシダーゼでの処理後、動物飼料は、動物のための使用可能なおよび消化可能なエネルギー源としてガラクトースおよびスクロース単量体を保持する。抗栄養因子（即ち不消化性オリゴ糖）は酵素により除去されるため、ガラクトースおよびスクロース利用可能性のためにエネルギー値は増大するが、しかしタンパク質の利用は増大しない。最後に、酵素は動物によるミールの消化前に活性であり、したがってオリゴ糖の分解により提供される任意の栄養的利点が動物により実現されることを保証する。
【００９１】
本発明の別の実施態様では、好高温性α−ガラクトシダーゼはヒト食物のための食品添加物として用いられる。本発明の好高温性α−ガラクトシダーゼを用いることの利点は、酵素の高温活性に存する。即ち当該酵素は、調理または加熱により食物に適用される高温が酵素を活性化するため、調理のような調製前に付加され得る。この実施態様では、好高温性α−ガラクトシダーゼは、食物の包装前に食物中に（例えば加熱されるべき豆乳の場合）、あるいは調理前に食物上に組入れられる。不消化性オリゴ糖を分解する好高温性α−ガラクトシダーゼの活性は、したがって、前記のように胃腸窮迫を低減するために作用する。
【００９２】
食品添加物として用いられる場合、好高温性α−ガラクトシダーゼは、液体または粉末を含めたいくつかの形態のいずれかで用いられ得る。酵素の粉末化形態は、粉末が調理前に食物上に振掛けられ得る「塩振出容器」またはその他の種類の粉末ディスペンサー容器中に包装されるかまたは保持され得る。粉末化形態の場合、好高温性α−ガラクトシダーゼは、粉末化形態または乾燥形態であり得る１つまたはそれ以上の賦形剤と併合され得る。食品等級α−ガラクトシダーゼと併合され得る乾燥成分の代表例としては、デキストロース、リン酸二カルシウム、微晶質セルロース、改質セルロースおよび改質デンプンが挙げられるが、これらに限定されない。これらの賦形剤は、既知の市場供給元から入手可能である。これらの賦形剤を選定するための判定基準は、α−ガラクトシダーゼの摂食可能非毒性担体としてのそれらの機能のほかに、それらの味のよさおよび易流動性である。
【００９３】
液体形態の場合、酵素は瓶からまたはその他の容器から、食物に付加され得る。濃縮（高純度）液体α−ガラクトシダーゼは、乾燥または粉末形態の酵素を溶媒、例えば水で溶解するかまたは混合することにより生成され得る。液体形態の酵素は、その他の適切な希釈液または賦形剤で希釈され得る。希釈の程度は、意図された用途によっている。液体賦形剤の代表例としては、水、グリセロールおよびソルビトールが挙げられるが、これらに限定されない。適正液体賦形剤の選択判定基準としては、混和性、安定化品質および味が挙げられる。
【００９４】
本発明のさらに別の実施態様では、好高温性α−ガラクトシダーゼは、食用植物タンパク質製品（本明細書中では互換的に、食用タンパク質単離物または食用タンパク質濃縮物とも呼ばれる）、例えば食用大豆製品の製造に有用な加工処理添加物として用いられ得る。特に本発明の好高温性α−ガラクトシダーゼは、タンパク質製品から望ましくないオリゴ糖およびガラクトース単量体を除去する過程に役立ち、したがって部分的、実質的または完全にガラクトースまたはオリゴ糖構成成分を欠く植物タンパク質製品の製造を可能にし得る。
【００９５】
単離大豆タンパク質およびその他の植物性タンパク質の製造方法は既知である（例えば米国特許第５，９３６，０６９号（Ｊｏｈｎｓｏｎ等）およびウエブサイトｗｗｗ．ｃｅｎｔｒａｌｓｏｙａ．ｃｏｍ参照）。単離タンパク質製品からのオリゴ糖および炭水化物の除去は、時としては栄養的理由のために望ましい。タンパク質単離物からオリゴ糖を除去する本発明の方法は、しばしば時間が掛かり、経費が掛かり、そして難しい。
【００９６】
一例として単離大豆タンパク質の加工処理を用いる場合、本発明の方法においては、好高温性α−ガラクトシダーゼは、食用大豆タンパク質の加工処理中に大豆基質（例えば大豆フレーク混合物）に付加される。大豆基質および好高温性α−ガラクトシダーゼを含有する混合物は次に、前記のように好高温性α−ガラクトシダーゼが活性である温度に、そして大豆混合物中のオリゴ糖を加水分解するのに十分な時間の長さで加熱される。好高温性α−ガラクトシダーゼの付加は、大豆基質からの油の除去の前または後に起こり得るが、しかし好ましくはその単離形態の大豆タンパク質の抽出またはさらなる分別の前に起こる。一旦加水分解されれば、当業界で既知の方法により、例えば水または水性アルコールでタンパク質を洗浄することにより、あるいは等電浸出により、オリゴ糖は単離大豆タンパク質から除去され得る。したがってガラクトース含有オリゴ糖を部分的にまたは完全に欠く大豆加工処理から得られる食用植物タンパク質製品が生成され得る。この方法では、前記のような胃腸窮迫は、単離大豆タンパク質の消費者においては低減または防止され得るが、この場合、望ましくないオリゴ糖は彼等から除去されていた。
以下の実施例は本発明を説明するために提示されるものであり、本発明を限定するよう意図されるべきでない。
【００９７】
実施例１
Ｔｍ　ｇａｌＡクローニングおよび発現
Ｔｍ総ＤＮＡのゲノム調製物からＰＣＲにより、Ｔｍ　ｇａｌＡをクローン化した。３５サイクル後、約１．６５ ｋｂ長の単一ＰＣＲ産物を得た。ＢａｍＨＩ、ＸｈｏＩ、ＮｄｅＩ、ＫｐｎＩおよびＨｉｎｄＩＩＩを用いた制限マッピングは、公表済ＤＮＡ配列から作成された制限マップと比較した場合、的確な帯域パターンおよび正確なサイズのＤＮＡ断片を生じた。配列番号１は、ＧｅｎＢａｎｋデータベース（寄託番号２６６０６４０）で発表されたＴｍ　ｇａｌＡヌクレオチド配列を示す。この配列を用いて、この遺伝子のクローニングに用いられるＰＣＲプライマーを生成した。
【００９８】
発現ベクターとしてｐＥＴ２４ｄ＋を用いて、大腸菌ＢＬ２１（λＤＥ３）中でＴｍ　ｇａｌＡを発現させた（Ｎｏｖａｇｅｎ， Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩ；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ， Ｌａ Ｊｏｌｌａ， ＣＡ）。Ｆｒｅｎｃｈ Ｐｒｅｓｓｅｄ細胞抽出物（１単位の酵素活性が、ＰＮＰ−ガラクトースからのＰＮＰ１μｍｏｌ／分を遊離するのに必要な酵素の量と定義される）の加熱処理（８０℃、３０分）後に、４ Ｌの培養から、約３３０単位の可溶性Ｔｍ　ＧａｌＡ活性を回収した。約６４ｋＤａの単一タンパク質帯域が、１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上に明白に同定可能であった。この帯域は、Ｗ． Ｌｉｅｂｌ ｅｔ ａｌ．， Ｓｙｓｔｅｍ． Ａｐｐｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ２１， １−１１（１９９８）に過去に示されているように、Ｔｍ　ＧａｌＡの単一単量体に対応する。
【００９９】
実施例２
Ｔｍ　ＧａｌＡ活性
１０分後に４０５ ｎｍで遊離ＰＮＰの放出を測定する終点検定における基質としてＰＮＰ−ガラクトースを用いて、温度およびｐＨ最適条件を確定した。要するに、１ ｍＬ中に、本検定は１ｍＭのＰＮＰ−ガラクトース、ならびに１ｍＭＮａＣｌを含有する酢酸Ｎａ緩衝液５０ｍＭ中に適切に希釈された酵素を含有した。１０分後、１００ μＬの１ ＭＮａ２ＣＯ３の付加により反応を停止させ、反応混合物を氷上に置いた。図１および図２は、それぞれｐＨおよび温度の一関数としての酵素の活性（％）を示す。これらの図から、反応最適条件はおよそｐＨ４．５および温度８５℃であることが明らかである。
【０１００】
表１に示したように、Ｔｍ　ＧａｌＡ活性は、基質重合度（ＤＰ）が増大すると低減する。基質としてＰＮＰ−ガラクトースを用いて最大Ｔｍ　ＧａｌＡ活性を達成したが、これは次に、ラフィノース（ＤＰ３）に関しては約２．５分の１に、そして次にスタキオース（ＤＰ４）およびベルバスコース（ＤＰ５）に関しては２０分の１に低減した。特異的活性の更なる低減が、スタキオースからベルバスコースに進むにつれて観察される、と理解される。しかしながら、用いた検定技術（ソモジ−ネルソン技法）の誤差内で、この観察は見られない。ソモジ−ネルソン技法は、総還元性糖の生成に関して検定する。したがってベルバスコースから、またはベルバスコースからのガラクトース除去の産物であるスタキオースから遊離したガラクトース間で、区別はなされない。
【表１】
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【０１０１】
実施例３
ニワトリ飼料のＴｍ　ＧａｌＡ消化
可溶性ニワトリ飼料組成物に及ぼすＴｍ　ＧａｌＡ消化の陽性作用を、飼料の直接酵素処理および再可溶化エタノール抽出構成成分の処理の両方で示した。エタノール抽出は、飼料マトリックスから飼料の水溶性炭水化物分画を引き出すことにより、ニワトリ飼料構成成分のＴｍ　ＧａｌＡ消化のより詳細な分析を実行する手段を提供する。この技法により抽出される炭水化物は、一般にＤＰ＜８に限定される。完全灌流下で２時間、沸騰８０％エタノール２５０ｍＬで飼料２５ ｇを抽出した。エタノール蒸発時に、橙色残渣が残留した。この残渣は、５分間混合し、８５℃で３０分間加熱後に、１０容積の水中に部分的に溶解され得た。可溶性分画のＨＰＬＣ分析は、約３７、４２および４６分での３つの別個のピークを明示した。約３７および４２分で出現するピークは、既知の標準との比較における保持時間に基づいて、それぞれスタキオースおよびスクロースと推定的に同定し得た。１５単位のＴｍ　ＧａｌＡで１時間可溶性分画を処理後、「スタキオース」ピークの完全消失が観察され得る。この特定実験における初期スタキオース濃度は、約５．６ｍＭと概算される。さらに、スタキオースの消失に対して、約４７分でのガラクトースピークの出現が観察され、ならびにｔ＝０での４．７７ ｘ １０７面積総計から１時間後の５．４４ ｘ １０７面積総計までのスクロースピークの同時増大が観察され得る。
【０１０２】
５０単位のＴｍ　ＧａｌＡによる飼料（１００ ｍｇ／ｍｌ）の直接処理は、抽出可溶性分画の消化に関する結果と同様の結果を生じた。これらの実験では、酵素の付加前に飼料を９８℃で２時間予熱した。前記の試験の場合と同様に、最初の１時間内に、ＨＰＬＣクロマトグラムにおけるスタキオースピークの完全消失が、ガラクトースピークの同時出現を伴って観察され得る。
【０１０３】
実施例４
大豆ミールおよび大豆フレークのＴｍ　ＧａｌＡ消化に及ぼす温度および含水量の作用
大豆ミールおよび大豆フレークの直接Ｔｍ　ＧａｌＡ消化に及ぼす温度の影響を、表２に示す。４グラムの大豆ミールまたは大豆フレーク、５０ Ｕのα−Ｇａｌ／５００ ｍｇのミールまたはフレーク、ならびに７０％水分レベルを用いて、実験を実施した。大豆ミール／フレーク−α−Ｇａｌ混合物を、表２に列挙した温度で合計４５分間インキュベートした。実験中５分間隔で、混合物の飼料を氷上に載せ、次に直ちに８０％エタノールで抽出し、さらに実施例３に記載したように加工処理した。次に、ＨＰＬＣにより、再懸濁化分画を分析した。約３５、３９および４２分で出現するピークは、それぞれスタキオース、ラフィノースおよびスクロースと同定され得た。マルトヘキサオースまたはマルトペンタオースを、内部標準として用いた。残留スタキオースおよびラフィノース濃度の時間点の線状回帰を実施して、表２の速度を得た。データから、温度が下がると、スタキオースおよびラフィノースがミールおよびフレークから除去される速度も低減する。これは、酵素の温度／活性プロフィールが示されれば、予測されることである。
【表２】
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【０１０４】
大豆ミールおよび大豆フレークの直接Ｔｍ　ＧａｌＡ消化に及ぼす含水量の作用を、表３に示す。前記と同様の条件下で実験を実施したが、但し、温度は９０℃に固定し、水分レベルは表３に示すように変化させた。９０℃でのインキュベーション前に、適切な水分レベルが得られるまで、真空下で４５℃での大豆ミール／フレーク−α−Ｇａｌ混合物のインキュベーションにより、水分レベルの変化を達成した。この処理後、前記と同様に実験を実施した。表３のデータから、含水量は、おそらくは何らかの臨界水分レベルに達するまで、大豆ミールおよび大豆フレークのα−Ｇａｌ消化の速度に大きく影響を及ぼさないことは明らかである。
【表３】
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【０１０５】
実施例５
結果の要約
Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍｅ（Ｔｍ）ＤＳＭ３　１０９からのα−ガラクトシダーゼ（ＧａｌＡ）は首尾よくクローン化され、予備的に特性化されている。本酵素は、約４．５〜５．０の最適ｐＨおよび約８５〜９０℃の温度最適条件を有する。本酵素は、ＰＮＰ−ガラクトース、ラフィノース（ＤＰ３）、スタキオース（ＤＰ４）およびベルバスコース（ＤＰ５）に関して活性である。種々の基質に関するＴｍ　ＧａｌＡ特異的活性を、表１に示す。さらに本酵素は、ｐＨ７および９０℃で７０分の半減期を有することが示されたが、これは、飼料加工処理中の蒸気処理過程を生き残る能力を示す。さらにＴｍ　ＧａｌＡは２５℃（ｐＨ４．５）でＰＮＰ−ガラクトースに及ぼす最大活性の３％のみを示したが、これは、ラフィノ−オリゴ糖のより高度の重合に及ぼす室温Ｔｍ　ＧａｌＡ活性が最小であり得ることを示唆する。高タンパク質含量および高炭水化物含量ニワトリ飼料の初期Ｔｍ　ＧａｌＡ消化物は、陽性結果を生じた。可溶化エタノール抽出ニワトリ飼料構成成分のＴｍ　ＧａｌＡ消化は、飼料からのスタキオースとわれわれが推定的に同定したものを除去するのに当該酵素が有効であることを示した。生の、未処理ニワトリ飼料からの可溶性スタキオースの除去も観察された。
【０１０６】
前記は本発明の説明であり、本発明を限定すると解釈されるべきでない。本発明は、以下の特許請求の範囲、ならびに本発明に包含される特許請求の範囲の均等物により画される。
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は、ｐＨの一関数としてのＰＮＰ−ガラクトースに及ぼすＴｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍｅＧａｌＡ活性のグラフである。以下の緩衝液を用いた：ｐＨ範囲２．５〜３．５に関しては、５０ｍＭクエン酸塩；ｐＨ範囲４〜６に関しては、５０ｍＭ酢酸ナトリウム；ｐＨ範囲６．５〜８に関しては、５０ｍＭリン酸ナトリウム。
【図２】
図２は、温度の一関数としてのＰＮＰ−ガラクトースに及ぼすＴｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍｅＧａｌＡ活性のグラフである。以下の緩衝液を検定はすべて、５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液、０．１ ＭＮａＣｌおよび１ｍＭＰＮＰ−ガラクトースを用いて実行した。
【図１】
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【図２】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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2004504043.tif 000056
【国際調査報告】
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