(57)【要約】本発明は、患者がＣＯＸ−２阻害剤またはその誘導体あるいは製薬的に許容しうるその塩、好ましくはジイソプロピルフルオロホスフェート、Ｌ−７４５３３７、ロフェコキシブ、ＮＳ ３９８、ＳＣ ５８１２５、 エトドラク、メロキシカム、セレコキシブまたはニメスリドを投与されることを特徴とする免疫不全（たとえばＨＩＶ）で特徴づけられる疾患の治療または予防の方法、それらの同一物を含む組成物および製品ならびに治療用医薬を製造する際のそれらの使用の方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
免疫不全で特徴づけられる疾患の治療用または予防用の医薬の調製において、ＣＯＸ−２阻害剤またはその誘導体あるいは製薬的に許容しうるその塩の使用方法。
【請求項２】
前記疾患が、ウィルスによって引き起こされる免疫不全疾患であることを特徴とする請求項１に記載の使用方法。
【請求項３】
前記疾患が、全般の多様な免疫不全、あるいはレトロウィルス、なるべくＨＩＶまたは関連するウィルスによる感染に起因するもの、あるいはその結果として生じるＡＩＤＳまたは関連する状態であることを特徴とする請求項１または２に記載の使用方法。
【請求項４】
前記医薬が、ヒトまたはヒトに添う動物または農業用動物に投与するためのものであることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の使用方法。
【請求項５】
前記ＣＯＸ−２阻害剤が、ＩＣ８０でのＷＨＭＡ アッセイによるＣＯＸ−１：ＣＯＸ−２の選択性の比として ＞５ 、好ましくは ＞５０を有することを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の使用方法。
【請求項６】
前記ＣＯＸ−２阻害剤が、メタンスルホンアミドエーテル、メタンスルホンアミドチオエーテルまたはジアリール複素環であることを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載の使用方法。
【請求項７】
前記ＣＯＸ−２阻害剤が、一般式Ａの化合物またはその誘導体あるいは製薬的に許容しうるその塩であることを特徴とする請求項１〜６のいずれかに記載の使用方法；
【化１】
2004510705.tif 000016
ここで、
Ｘは、酸素原子もしくは硫黄原子またはアルキル基、好ましくは−ＣＨ２−基を表し、
Ｒ１は、必要に応じて１以上の基または原子、好ましくは１以上のハロゲン原子で置換されていてもよいシクロアルキル基あるいはアリール基を表し、
Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５は、それぞれ独立に水素原子、ニトロ基、アシル基、または必要に応じて１以上の基もしくは原子で置換されていてもよいアルキル基、あるいはＲ２とＲ３、Ｒ３とＲ４、またはＲ４とＲ５とが互いに炭素原子を介してシクロペンタノン基を形成してもよい。
【請求項８】
Ｘが酸素原子であることを特徴とする請求項７に記載の使用方法。
【請求項９】
Ｒ１がアリール基、または１以上のフッ素原子で置換されたアリール基、あるいはシクロアルキル基であることを特徴とする請求項７または８に記載の使用方法。
【請求項１０】
Ｒ２およびＲ３が水素原子であり、Ｒ４が−ＮＯ２基または−ＣＯＣＨ３基であることを特徴とする請求項７〜９のいずれかに記載の使用方法。
【請求項１１】
Ｒ２が水素原子であり、Ｒ３とＲ４とがシクロペンタノン基を形成していることを特徴とする請求項７〜１０のいずれかに記載の使用方法。
【請求項１２】
前記ＣＯＸ−２阻害剤が、フロスリド（ｆｌｏｓｕｌｉｄｅ）、ＮＳ−３９８ 、ニメスリド、ＦＫ’ ３３１１、またはＬ−７４５ ３３７であることを特徴とする請求項７〜１１のいずれかに記載の使用方法。
【請求項１３】
前記ＣＯＸ−２阻害剤が、一般式Ｂの化合物またはその誘導体または製薬的に許容しうるその塩であることを特徴とする請求項１〜６のいずれかに記載の使用方法；
【化２】
2004510705.tif 000017
ここで、
Ｙは、
環状基を、好ましくは、オキサゾリル、イソキサゾリル、チエニル、ジヒドロフリル、フリル、ピロリル、ピラゾリル、チアゾリル、イミダゾリル、イソチアゾリル、シクロペンテニル、フェニルまたはピリジル基を表し、
ｎは、０〜３の整数であり、
ｍは、０〜４の整数であり、
Ｒ６は、環状ケト基（ｋｅｔｏｃｙｃｌｙｌ）、シクロアルキル基またはアリール基を表し、これらの基は、必要に応じて１以上の基または原子、好ましくは１以上のハロゲン原子で置換されていてもよく、
Ｒ７は、それぞれ独立に任意の官能基でもよい置換基を表し、好ましくは、水素原子またはハロゲン原子またはアルキル基であり、アルキル基は１以上の基または原子で置換されていてもよく、
Ｒ８は、アルキル基を表し、
Ｒ９は、ハロゲン原子を表し、
Ｒ１０は、水素原子、または必要に応じて１以上の基または原子で置換されたアルキル基、好ましくはアシル基で置換されたアルキル基を表す。
【請求項１４】
Ｒ８が−ＮＨ２または−ＣＨ３であることを特徴とする請求項１３に記載の使用方法。
【請求項１５】
Ｙがピラゾリル基、フリル基またはチエニル基であることを特徴とする請求項１３または１４に記載の使用方法。
【請求項１６】
Ｒ６が必要に応じて１以上のフッ素原子で置換されたアリール基であることを特徴とする請求項１３〜１５のいずれかに記載の使用方法。
【請求項１７】
ｎが１または２であることを特徴とする請求項１３〜１６のいずれかに記載の使用方法。
【請求項１８】
Ｒ７が、臭素原子、アシル基、または置換されたアルキル基であることを特徴とする請求項１３〜１７のいずれかに記載の使用方法。
【請求項１９】
前記ＣＯＸ−２阻害剤が、セレコキシブ、ロフェコキシブ、 ＤｕＰ−６９７、 ＳＣ−５８１２５、 ＤＦＰ、 ＤＦＵ、 ＣＧＰ ２８２３２ または ＭＦ ｔｒｉｃｙｃｌｉｃであることを特徴とする請求項１３〜１８のいずれかに記載の使用方法。
【請求項２０】
前記ＣＯＸ−２阻害剤が、非ステロイド系抗炎症剤（ＮＳＡＩＤ）誘導体であることを特徴とする請求項１〜６のいずれかに記載の使用方法。
【請求項２１】
前記ＣＯＸ−２阻害剤が、ジイソプロピルフルオロホスフェート、Ｌ−７４５３３７、ロフェコキシブ、ＮＳ ３９８、ＳＣ ５８１２５、 エトドラク、メロキシカム、セレコキシブまたはニメスリドであることを特徴とする請求項１〜２０のいずれかに記載の使用方法。
【請求項２２】
前記ＣＯＸ−２阻害剤が、ロフェコキシブであることを特徴とする請求項２１に記載の使用方法。
【請求項２３】
前記ＣＯＸ−２阻害剤が、セレコキシブであることを特徴とする請求項２１に記載の使用方法。
【請求項２４】
前記ＣＯＸ−２阻害剤が、メロキシカムであることを特徴とする請求項２１に記載の使用方法。
【請求項２５】
請求項１〜２４のいずれかに記載のＣＯＸ−２阻害剤またはその誘導体または製薬的に許容しうるその塩、ならびに製薬的に許容しうる希釈剤、担体、または賦型剤を含有する医薬組成物。
【請求項２６】
１以上の追加のＣＯＸ−２阻害剤、その誘導体、または製薬的に許容しうるその塩、および／または、１以上の追加の活性成分をさらに含有する請求項２５に記載の医薬組成物。
【請求項２７】
医薬として、好ましくは、請求項１〜４のいずれかに記載された疾患の治療または予防のために使用される請求項２５または２６に記載の医薬組成物。
【請求項２８】
請求項１〜２４のいずれかに記載のＣＯＸ−２阻害剤またはその誘導体あるいは製薬的に許容しうるその塩、ならびに１以上の追加のＣＯＸ−２阻害剤、その誘導体、または製薬的に許容しうるその塩、および／または１以上の追加の活性成分を含有し、請求項１〜４のいずれかに記載された疾患の治療または予防において、同時または別個または逐次に使用される混合製剤である製品。
【請求項２９】
請求項１〜４のいずれかに記載された疾患の治療または予防のための医薬の調製における請求項２５または２６に記載の医薬組成物の使用方法。
【請求項３０】
ヒトまたはヒト以外の動物に関し、前記動物に、請求項１〜２４のいずれかに記載のＣＯＸ−２阻害剤またはその誘導体または製薬的に許容しうる塩を投与するか、請求項２５または２６に記載の医薬組成物を投与することを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の疾患を治療する方法または予防の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、免疫不全およびウィルス感染の治療分野に属する。より詳しくは、本発明は、免疫不全およびウィルス性疾患、特にＨＩＶ感染およびＡＩＤＳおよび関連する状態の治療のための免疫調節における、シクロオキシゲナーゼ−２（ＣＯＸ−２）阻害剤またはその誘導体の使用に関する。
【０００２】
プロスタグランジンは、炎症過程で重要な役割を担うため、プロスタグランジンの形成阻害は、抗炎症剤開発のための一般的な標的となっている。非ステロイド系抗炎症剤（ＮＳＡＩＤ類）は、アラキドン酸からのプロスタグランジン中間体の生合成に関与する酵素であるシクロオキシゲナーゼ（ＣＯＸ）を阻害する。臨床用途に使われるいくつかのＮＳＡＩＤ類が存在し、たとえば、インドメタシン、ピロキシカム、テノキシカム、ジクロフェナク、メロキシカム、テニダップ（ｔｅｎｉｄａｐ）、イソキシカム（ｉｓｏｘｉｃａｍ）、 アセチルサリチル酸、ジフルニサル、スリンダク、イブプロフェン、ナプロキセンおよび ケトプロフェンなどの薬剤が挙げられる。
【０００３】
ＮＳＡＩＤ類は、今日、世界的に最も広く処方されている薬剤である。
これらＮＳＡＩＤ類は、臨床的に有効な薬剤であり、解熱性、抗炎症性、および抗血栓性作用を有する。この種の薬剤の主な適応症は、関節炎であり、たとえば、骨関節炎、リューマチ性関節炎、筋骨格の疼痛状態および一般的な疼痛状態が挙げられる。しかしながら、これらの薬剤には深刻な副作用がある。最も頻発する副作用は、胃腸の潰瘍化および出血、血小板凝集の阻害および他の薬剤との相互作用である。
【０００４】
１９９０年代初めに、前記酵素の第２のＣＯＸアイソフォーム（ＣＯＸ　ｉｓｏｆｏｒｍ）がクローニングされた。この新しいＣＯＸアイソフォームは、現在、ＣＯＸ−２として知られている（Ｖａｎｅら、１９９８年、Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． Ｔｏｘｉｃｏｌ．， ３８， ｐ９７−１２０）。
現在、よく知られた２つのＣＯＸのアイソフォームがある。ＣＯＸ−１とＣＯＸ−２である（最近、ＣＯＸ−３の存在も推定されている）。ＣＯＸ−１は、たいていの組織内に存在し、ハウスキーパー酵素としてみなすことができる。たとえば、ＣＯＸ−１酵素の活性は、消化管の内壁を保護する。これに対し、ＣＯＸ−２は、通常は存在せず、炎症の際に増加する。ＮＳＡＩＤ類のいくつかの副作用は、ＣＯＸ−１酵素の阻害に関係している。ＮＳＡＩＤ類は、ＣＯＸ−１およびＣＯＸ−２の双方を阻害する（表１−３参照）。
【０００５】
表１：　モルモットのマクロファージモデルにおける種々のＮＳＡＩＤ類のＩＣ５０値およびＣＯＸ−２／ＣＯＸ−１比（Ｅｎｇｅｌｈａｒｔら、Ｊ． Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ Ｒｅｓ．， ４４， ｐ４２２−４３， １９９５年からのＩＣ５０値）
【０００６】
【表１】
2004510705.tif 000002
【０００７】
表２：　ＣＯＸ−１（ウシ内皮細胞）およびＣＯＸ−２（刺激されたマクロファージ）に関して無傷細胞におけるＮＳＡＩＤ類のＩＣ５０値（Ｔａｋｅｔｏ， Ｊ． Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ， ９０， ｐ１５２９−１５３６， １９９８年 からのＩＣ５０値）
【０００８】
【表２】
2004510705.tif 000003
【０００９】
表３：　組換えヒトＰＧＨ合成の阻害（ＣＯＸ−１およびＣＯＸ−２）（Ｌａｎｅｕｖｉｌｌら、Ｊ． Ｐｈａｒｍ． Ｅｘｐ． Ｔｈｅｒ．， ２７１， ｐ９２７−３４，１９９４年からのＩＣ５０値）
【００１０】
【表３】
2004510705.tif 000004
【００１１】
この１０年間に、いくつかの新しい選択的なＣＯＸ−２阻害剤、いわゆる「選択的」ＣＯＸ−２阻害剤が確認された。これらのＣＯＸ−２阻害剤のいくつかは開発され、そのうちのいくつかは最近、市販にこぎつけた。このような新しいＣＯＸ−２阻害剤のあるものは、臨床的な用量でＣＯＸ−１の阻害を示さない。これらのＣＯＸ−２阻害剤の利用に関する広範な臨床的研究および臨床での実施により、この新しいＣＯＸ−２阻害剤は、非選択的なＮＳＡＩＤ類と比較して、安全性の点できわめて有利であることが示されている。ＣＯＸ−２阻害剤の概説については、たとえば、Ｇｏｌｄｅｎら，１９９９年， Ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ． ２５， ｐ３５９−３７９、 Ｍｉｔｃｈｅｌら，１９９９年， Ｂｒｉｔ． Ｊ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．， １２８， ｐ１１２１−１１３２、 Ｌｉｐｓｋｙ， １９９９年， Ａｍ． Ｊ． Ｍｅｄ．， １０６ （５Ｂ）， ｐ５１５−５７５、 Ｔａｋｅｔｏ， １９９８年， Ｊ． Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．， ９０， ｐ１５２９−１５３７、 Ｇｒｉｓｗｏｌｄら １９９６年， Ｍｅｄ． Ｒｅｓ． Ｒｅｖ．， １６， ｐ１８１−２０６ および Ｒｅｉｔｚら，１９９５年， Ａｎｎ． Ｒｅｐ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ．， ３０， ｐ１７９−１８８を参照されたい。
【００１２】
さらに、様々なＣＯＸ−２阻害剤に関する興味深い刊行物としては、たとえば、Ｌａｎｅ， １９９７年， Ｊ． Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．， ２４ （ｓｕｐｐｌ． ４９）， ｐ２０−２４、 Ｍｅｈｌｉｓｈら，１９９８年， Ｃｌｉｎ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． Ｔｈｅｒ．， ６３， ｐｌ−８、 Ｚｈａｏら，１９９７年， Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ．， ４０ （ｓｕｐｐｌ．）， Ｓ８８、 Ｅｈｒｉｃｈら，１９９７年， Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ．， ４０ （ｓｕｐｐｌ．）， Ｓ９３、 Ｍａｚｉａｓｚら，１９９７年， Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ．， ４０ （ｓｕｐｐｌ．）， Ｓ１９５、 Ｍｅｎｇｌｅ− Ｇａｗ ら，１９９７年， Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ．， ４０ （ｓｕｐｐｌ．）， Ｓ９３、 Ｍｏｒｒｉｓｏｎ， １９９９年， Ｃｌｉｎ． Ｔｈｅｒ．， ２１， ｐ９４３−９５３、Ｃｈａｎら，１９９５年， Ｊ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． Ｅｘｐ． Ｔｈｅｒ．， ２７４， ｐ１５３１−３７、 Ｒｉｅｎｄｅａｕら，１９９７年， Ｂｒ． Ｊ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．， １２１， ｐ１０５−１１７、 Ｂｌａｃｋら，１９９９年， Ｊ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ．， ４２， ｐ１２７４−８１、 Ｃｕｏら，１９９６年， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２７１， ｐ１９１３４−３９、 Ｇｅｉｓｓ， １９９９年， Ｓｃａｎｄ． Ｊ． Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．， １０９ （ｓｕｐｐｌ．）， ｐ３１−３７、 Ｗａｒｎｅｒら，１９９９年， ＰＮＡＳ ＵＳＡ， ９６， ｐ７５６３−６８、 Ｂｊａｒｎｓｏｎら，１９９７年， Ｓｃａｎｄ． Ｊ． Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．， ３２， ｐ１２６−１３０、 Ｄａｎｎｅｂｅｒｇ ら，１９９９年， Ｓｅｍｉｎ． Ｏｎｃｏｌ．， ２６， ｐ４９９−５０４、 Ｍｉｔｃｈｅｌｌら，１９９３年， ＰＮＡＳ ＵＳＡ， ９０， ｐ１１６９３−９７、 Ｆｕｔａｋｉら，１９９４年、 Ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎｓ， ４７， ｐ５５−９、 Ｆｕｔａｋｉら，１９９３年， Ｊ． Ｐｈａｒｍ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．， ４５， ｐ７５３−５、 Ｍａｓｆｅｒｒｅｒら，１９９４年， ＰＮＡＳ ＵＳＡ， ９１， ｐ３２２８−３２、 Ｋｌｅｉｎら，１９９４年， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．， ４８， ｐ１６０５−１０、 Ｒｅｉｔｚら，１９９４年， Ｊ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ．， ３７， ｐ３８７８−８１、 Ｓｅｉｂｅｒｔら，１９９４年， ＰＮＡＳ ＵＳＡ， ９１， ｐ１２０１３−１７、 Ｋｌｅｉｎら，１９９６年， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．， ５１， ｐ２８５−９０、 Ｎａｎｔａｌら，１９９８年，９ｔｈ Ｉｎｔｅｒｎ． Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ Ｉｎｆｌａｍｍ． Ｒｅｓ． Ａｓｓｏｃ．， Ｎｏｖ １−５、 Ｐｅｎｎｉｇ ら，１９９７年， Ｊ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ．， ４０， ｐ１３４７−６５ および Ｐｕｉｇら，２０００年， Ｊ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ．， ４３， ｐ２１４−２２３が挙げられる。
【００１３】
ＣＯＸ−２阻害剤は、化学構造の観点から見て比較的多様な化合物の集団である。選択的にＣＯＸ−２を阻害する化合物は、この１０年間の多くの特許文献に記載されている。いくつかを挙げると、ＷＯ ９４／２６７８１， ＷＯ ９４／２０４８０， ＷＯ ９４／１３６３５， ＷＯ ９５／００５０１， ＷＯ ９４／２７９８０， ＷＯ ９４／１５９３２， ＷＯ ９５／２１８１７， ＷＯ ９５／１５３１６， ＷＯ ９６／０６８４０， ＷＯ ９６／０３３８８， ＷＯ ９６／０３３８７， ＷＯ ９６／０３３９２， ＷＯ ９６／２５４０５， ＷＯ ９６／２４５８４， ＷＯ ９６／０３３８５， ＷＯ ９６／１６９３４， ＷＯ ９８／４１５１６， ＷＯ ９８／４３９６６， ＷＯ ９９／１２９３０， ＥＰＯ ６７３ ３６６， ＷＯ ９８／４１５１１， ＷＯ ９８／４７８７１， ＷＯ ９９／２０１１０， ＷＯ ９９／２３０８７， ＷＯ ９９／１４１９４， ＷＯ ９９／１４１９５， ＷＯ ９９／１５５１３ および ＷＯ ９９／１５５０３ および米国特許明細書５，３８０，７３８、５，３４４，９９１、５，３９３，７９０、５，４３４，１７８、５，４７４，９９５、５，４７５，０１８ および ５，５１０，３６８が挙げられる。
【００１４】
２つの化合物、ロフェコキシブ、すなわち（４−（４−メチルスルホニル）フェニル）−３−フェニル−２（５Ｈ）−フラノン）（Ｉ）が「Ｖｉｏｘｘ（Ｒ）」として、ならびにセレコキシブ、すなわち（４−（５−（４−メチルフェニル）−３−（トリフルオロメチル）−１Ｈ−ピラゾール−１−イル）−ベンゼンスルホンアミド）（ＩＩ）が「Ｃｅｌｅｂｒａ（Ｒ）」として、現在市販されている。
【００１５】
【化３】
2004510705.tif 000005
【００１６】
ロフェコキシブ（ｒｏｆｅｃｏｘｉｂ）は、Ｍｅｒｃｋ Ｆｒｏｓｓｔ Ｃａｎａｄａ のＷＯ ９３／０５００５０１、さらにＭｏｒｒｉｓｏｎ， １９９９年， Ｃｌｉｎ． Ｔｈｅｒ．， ２１， ｐ９４３−９５３、Ｃｈａｎら，１９９５年， Ｊ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． Ｅｘｐ． Ｔｈｅｒ．， ２７４， ｐ１５３１−３７ および Ｎａｎｔｅｌら，１９９８年， 上掲に記載されている。
セレコキシブ（ｃｅｌｅｃｏｘｉｂ）は、Ｇｅｉｓｓ， １９９９年， Ｓｃａｎｄ． Ｊ． Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．， １０９ （ｓｕｐｐｌ．）， ｐ３１−３７およびＰｅｎｎｉｎｇら，１９９７年， Ｊ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ．， ４０， ｐ１３４７−６５に記載されている。セレコキシブは、ＣＯＸ−１と比較して、ＣＯＸ−２に対して３７５倍選択的であると述べられている。
【００１７】
他のいくつかのＣＯＸ−２阻害剤は、生物学的なシステムにおいて評価されており、それらのあるものとは、ＢＦ ３８９ （ＩＩＩ）、 ＣＧＰ ２８２３２ （ＩＶ）、 ＤＦＰ、 ＤＦＵ （Ｖ）、 ＤｕＰ ６９７ （ＶＩ）、 エトドラク（ＶＩＩ）、 ＦＫ ３３１１ （ＶＩＩＩ）、 フロスリド（ｆｌｏｓｕｌｉｄｅ）（ＩＸ）、 Ｌ− ７４５，３３７ （Ｘ）、メロキシカム（「Ｍｏｂｉｃ（Ｒ）」，ＵＳ ４２３３２９９、４−ヒドロキシ−２−メチル−Ｎ−（５−メチル−２−チアゾリル）−１，１−ジオキシド−２Ｈ−１，２−ベンゾチアジン−３−カルボキサアミド）（ＸＩ）、 ＭＦ トリサイクリック （ＸＩＩ）、ニメスリド（ＸＩＩＩ）、 ＮＳ−３９８ （ＸＩＶ） および ＳＣ−５８１２５ （ＸＶ）である。
【００１８】
【化４】
2004510705.tif 000006
【００１９】
【化５】
2004510705.tif 000007
【００２０】
【化６】
2004510705.tif 000008
【００２１】
さらに、ＣＯＸ−２阻害剤として記載された化合物として、たとえば、Ｓ−２４７４ （Ｓｈｉｏｎｏｇｉ， ＥＰ ５９５５４６、５（Ｅ）−（３，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−ヒドロキシ）ベンジリデン−２−エチル−１，２−イソチアゾリジン−１，１−ジオキシド）（ＸＶＩ）、 ＪＴＥ−５２２ または ＲＷＫ−５７５０４ （４−（４−シクロヘキシル−２−メチル−５−オキサゾリル）−２−フルオロベンゼンスルホンアミド）（ＸＶＩＩ）、 メシル酸ダブフェロン（Ｄａｒｂｕｆｅｌｏｎｅ ｍｅｓｙｌａｔｅ）（Ｐｆｉｚｅｒ， ＷＯ ９４／０３４４８、２−アミノ−５−（（３，５−ビス（１，１−ジメチルエチル）−４−ヒドロキシフェニル）メチレン−４（５Ｈ）−チアゾロン）のモノメタンスルホン酸塩 ）（ＸＶＩＩＩ）、 ６０８９ （ Ｋｏｔｏｂｕｋｉ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌより）（ＸＩＸ）、ヴァルデコキシブ（Ｖａｌｄｅｃｏｘｉｂ）（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、４−（５−メチル−３−フェニル−４−イソキサゾリル）−ベンゼンスルホンアミド）（ＸＸ）、パラコキシブナトリウム（Ｐａｒａｃｏｘｉｂ ｓｏｄｉｕｍ）（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｎ−（（４−（５−メチル−３−フェニル−４−イソザゾリル）−フェニル）スルホニル−プロパンアミドのナトリウム塩 ）（ＸＸＩ）、４−（２−オキソ−３−フェニル−２，３−ジヒドロオキサゾル−４−イル）−ベンゼンスルホンアミド（Ａｌｍｉｒａｌｌ− Ｐｒｏｄｅｓｐｈａｒｍａ）（ＸＸＩＩ）および エトリコキシブ（Ｅｔｏｒｉｃｏｘｉｂ）（ＭＫ−６３３， Ｍｅｒｃｋ ａｎｄ Ｃｏ．）が挙げられる。
【００２２】
【化７】
2004510705.tif 000009
【００２３】
【化８】
2004510705.tif 000010
【００２４】
上述の化合物は、後述する方法に用いるのに好ましいＣＯＸ−２阻害剤を形成する。
ＣＯＸ−２阻害剤の適応症は、古典的なＮＳＡＩＤ類、たとえば、インドメタシン、ジクロフェナクおよびナプロキセンで治療されてきた、関節炎、筋骨格の疼痛状態、および一般的な疼痛である。最近、ＣＯＸ−２阻害剤をガン治療、さらにはおそらくガン予防にも使用することが提案されている。さらに、ＣＯＸ−２阻害剤を、アルツハイマー病や他の痴呆に関連する脳活動に関して使用できる可能性がある。
【００２５】
ＣＯＸ−２阻害剤の臨床的有用性の可能性は、たとえば、Ｎａｔｕｒｅ，３６７， ｐ２１５−２１６ （１９９４年）、 Ｄｒｕｇ Ｎｅｗｓ ａｎｄ Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ， ７， Ｐ５０１−５１２ （１９９４年）、 Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ ｉｎ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍ．， ３０， ｐ１７９−１８８ （１９９５年） および Ｏｎｃｏｇｅｎｅ， １８， ｐ７９０８−７９１６ （１９９９年）に述べられている。
抗ウィルス治療におけるＣＯＸ−２阻害剤の使用についての具体的な提案はなく、あるいはさらに具体的なＨＩＶ／ＡＩＤＳ治療についての提案はなく、ＣＯＸ−２阻害剤の抗ＨＩＶ作用についても試験されていない。さらに、ウィルスおよび非ウィルス起源の免疫不全症の治療において、免疫賦活性剤としてＣＯＸ−２阻害剤（または非選択的なＣＯＸ阻害剤）を使用することについての提案はない。
【００２６】
ＨＩＶ感染およびＡＩＤＳは、世界中で３３００万人を超える人々がウィルスに感染している主要な健康問題である。感染者の多くは、アフリカ（サハラ以南（ｓｕｂ−Ｓａｈａｒａ））およびアジアの一部に住んでいる。今日、臨床用途のために日常的に用いられる抗ＡＩＤＳ化合物には２つの種類がある。ＨＩＶ逆転写酵素阻害剤およびＨＩＶプロテアーゼ阻害剤である。ＨＩＶ逆転写酵素阻害剤は、非ヌクレオシド系の逆転写酵素阻害剤（ＮＮＲＴＩ）およびヌクレオシド系逆転写酵素阻害剤（ＮＲＴＩ）に分けられる。
【００２７】
最も頻繁に使用されるＮＮＲＴＩは、ネビラピン、デラビルジン、エファビレンツ、エミビリンおよびＴ１８０である。最も頻繁に使用されるＮＲＴＩとしては、たとえば、ジドブジン、ジダノシン、スタブジンおよびザルシタビンが挙げられる。臨床的に有用なＨＩＶプロテアーゼ阻害剤として、インクリナビル（ｉｎｃｌｉｎａｖｉｒ）、パリナビル（ｐａｌｉｎａｖｉｒ）およびサクイラビル（ｓａｑｕｉｒａｖｉｒ）が挙げられる。
【００２８】
現代のＨＩＶ感染およびＡＩＤＳの治療法は、いくつかの薬剤の組合せ、いわゆる逆転写酵素阻害剤とプロテアーゼ阻害剤との混合剤に基づいている。これらの組合せは、ＨＡＡＲＴ（高度に活性な抗レトロウィルス療法）と呼ばれ、極めて効果的であり、患者の血液中のウィルスを検出不能のレベルにまで減少させることができる。しかしながら、ＨＡＡＲＴは患者を治癒しない。ウィルスは依然として免疫細胞内に存在しており、その疾患がいつでも再発可能だからである。治療を中断することにより、ウィルス血症が頂点に達し、またＡＩＤＳへの急速な進行が度々観察される。さらに、免疫不全およびＨＩＶに特異的なＴ細胞機能不全が、ＨＡＡＲＴの間、持続する。この治療法は、生涯にわたる治療を必要とし、しかも極めて高価である。薬剤の費用だけでも、しばしば１５，０００ ＵＳドルを超える。加えて、この治療法に関係する他の問題がいくつか存在する。すなわち患者の服薬遵守の難しさ（複雑な薬剤投与計画）、耐性ウィルスの発生、理想的ではない薬物動態ならびに副作用、たとえば、骨髄の抑制および長期代謝効果の抑制などが挙げられる。
【００２９】
近年発行された、抗ＨＩＶ治療の総説については、下記を参照されたい：たとえば、Ｈｉｌｇｅｇｒｏｔｈ， １９９８年， Ｐｈａｒｍ． ｕｎｓ． Ｚｅｉｔ．， １９９８年，２７， ｐ２２−２５、 Ｈｉｌｇｅｇｒｏｔｈ， １９９８年， Ｐｈａｒｍ． ｕｎｓ Ｚｅｉｔ．， ７， ｐ１１１−１１６、 Ｓｔｅｌｌｂｒｉｎｋ， １９９７年， Ｄｋ Ａｒｚｔｅｂｌ．， ９４， ｐ２４９７−２５０３、 Ｒｅｔｔｌｅ ら，１９９８年， Ｉｎｔ． Ｊ． ＳＴＤ　ＡＩＤＳ， ９， ｐ８０−８７、 Ｄｅ− Ｃｌｅｒｃｑ， １９９８年， Ａｎｔｉｖｉｒａｌ Ｒｅｓ．， ３８， ｐ１５３−１７９、 Ｇａｉｔら，１９９５年， ＴＩＢＴＥＣＨ， １３， ｐ４３０−４３８ および Ｒｅｄｓｈａｗら，”Ｅｍｅｒｇｉｎｇ Ｄｒｕｇｓ： Ｔｈｅ Ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ ｏｆ Ｉｍｐｒｏｖｅｄ Ｍｅｄｉｃｉｎｅｓ“， Ｃｈａｐｔｅｒ ６， ｐ１２７−１５４， １９９７年が挙げられる。
【００３０】
要するに、ＨＡＡＲＴのような複数薬剤の組合せ併用は、ＨＩＶ感染に苦しむ患者の予後を著しく改善したが、ＨＩＶの抗ウィルス治療おける新規化合物、とりわけ免疫系を刺激する薬剤に対する医療上の必要性が存在している。本発明は、この必要性に焦点をあてるものである。
ＣＯＸ−２の発現は、通常は脳／脳活動、関節炎の滑膜、および損傷組織部位に限定されている。ＣＯＸ−２は、通常のリンパ節またはリンパ球内には見出されない。しかしながら今や驚くべきことに、免疫不全病ＭＡＩＤに感染したマウスのリンパ節細胞が、高レベルでＣＯＸ−２を発現していることが見出されている。さらに、ＭＡＩＤＳリンパ節からのＢ細胞ばかりでなく、正の選択をされたＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞もまた、高レベルのＣＯＸ−２を含んでいた（実施例２を参照のこと）。このＣＯＸ−２が、免疫不全疾患の徴候を緩和すべく、標的にされているだろうということが見出された。具体的には、免疫刺激を作用させること、たとえば、抗原特異的な免疫応答を生起させることによって、Ｔ細胞機能不全を緩和するためである。
【００３１】
一方、理論により拘束されることを望まないが、ＣＯＸ−２活性は、ＰＧＥ２産生を増加させると信じられている。このことにより、ｃＡＭＰのレベルを増加させ、次に、ｃＡＭＰ はＰＫＡシグナル経路を活性化し、結果的にリンパ球機能を減退させる。ＭＡＩＤＳのマウスにインビボで実施した研究は、ＣＯＸ−２阻害剤がＴ細胞の免疫機能を改善することを説明している（実施例６参照）。
【００３２】
本発明は、免疫不全の治療または予防、特にＨＩＶおよびＡＩＤＳの治療または予防のための新規な方法を提供するものである。その方法は治療上有効な量のＣＯＸ−２阻害剤またはその誘導体あるいは製薬的に許容されるその塩により、患者を治療することを含むものである。
したがって、本発明の最初の面は、ヒトまたはヒト以外の動物において上昇したＣＯＸ−２活性によって特徴づけられる疾患、具体的には、（たとえば、ＣＯＸ−２発現の増加を通じて）免疫機能の減退により特徴づけられる疾患の治療方法または予防方法を提供することである。その方法は、前記動物に治療上有効な量のＣＯＸ−２阻害剤またはその誘導体またはその製薬的に許容される塩を投与することを特徴としている。
【００３３】
本明細書において、増加したＣＯＸ−２活性とは、より多くのＣＯＸ−２分子の産生（たとえば、増大した発現）および／または、より活性な分子（たとえば、不活性型から活性型への転換あるいは活性型に対する阻害の除去）のいずれかを通して、上昇した活性のレベルを意味する。なるべくなら、前記疾患は、免疫機能の減退によって特徴づけられる。すなわち、免疫不全の状態、たとえば、リンパ球の機能不全を示す。なお、本明細書において、「免疫不全」とは、通常の免疫応答に関わる細胞、とりわけＢ細胞およびＴ細胞の機能障害を意味する。したがって、本明細書に記載された化合物は、免疫刺激効果を達成して免疫応答を増強するように使用してもよい。このように、ＣＯＸ−２阻害剤は、免疫調節作用を有すると考えられる。好ましくは治療の対象となる状態として、ウィルスによって引き起こされる免疫不全の疾患が挙げられる。
【００３４】
かくして上記の方法は、これに限定されるものではないが、患者のＨＩＶまたはＡＩＤＳ関連疾患の治療に有用である。たとえば、一般の多様な免疫不全を有する患者の約５０％は、ＨＩＶ感染の場合と同様のＴ細胞機能障害を有しており、免疫刺激療法の恩恵を受け得るかもしれない。本発明によれば、いずれかのＣＯＸ−２阻害剤をＨＩＶ／ＡＩＤＳ治療を必要とする患者に投与することができる。したがって、本発明による治療に好適な状態としては、たとえば、レトロウィルスによる感染、具体的にはＨＩＶによる感染（および他の動物における関連ウィルス、たとえばＳＩＶ、ＦＩＶ、ＭＡＩＤＳの感染）ならびにその結果として生じるＡＩＤＳ、さらには一般の様々な免疫不全および前記状態に関連する状態の治療が挙げられる。
【００３５】
治療できる患者としては、好ましくは哺乳類、より好ましくはヒトおよびヒトに添う動物または農業用動物、たとえば、イヌ、ネコ、サル、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ウシ、ウサギ、ラットおよびマウスが挙げられる。
換言的に述べるならば、本発明は、上述したように増加したＣＯＸ−２活性によって特徴づけられる疾患を治療または予防するためのＣＯＸ−２阻害剤またはその誘導体またはその製薬的に許容しうる塩を提供するか、あるいは上述したように増加したＣＯＸ−２活性によって特徴づけられる疾患を治療または予防するための医薬を調製する際において、ＣＯＸ−２阻害剤またはその誘導体またはその製薬的に許容しうる塩の使用の方法を与える。なお、本明細書において、「治療」とは、前記疾患、たとえば感染の１つ以上の徴候を、好ましくは通常のレベルまで、軽減または緩和、あるいは免疫機能障害の減少または緩和を意味する。「予防」とは、絶対的な予防、すなわち、検出可能な感染性因子（たとえば、ウィルス）が存在しないこと、および／または特定の徴候（たとえば、ＣＯＸ−２活性）について正常ベルの保持、またはそうした徴候発症の程度の減少または軽減もしくは時期調整（たとえば、遅延）を意味する。
【００３６】
シクロオキシゲナーゼ２酵素は、ＨＩＶ／ＡＩＤＳ治療の新しい標的である。「ＣＯＸ−２阻害剤」という用語は、ある特定の濃度で投与した場合に、シクロオキシゲナーゼ１を有意に阻害することなく、シクロオキシゲナーゼ２酵素を阻害することができる化合物を意味する。その化合物は、好ましくはシクロオキシゲナーゼ２の阻害について、シクロオキシゲナーゼ１阻害と比較した場合、少なくとも１０、より好ましくは少なくとも５０、さらに好ましくは少なくとも１００の選択性（たとえば、ＷＨＡＭ試験によって、ＣＯＸ−１：ＣＯＸ−２ ＩＣ８０比として測定される、下記参照）を有する化合物が挙げられる（一つの特定化合物に対する選択性の比率は、生物学的なアッセイならびにそれが表現される方式によって変化する（好ましくは、ＣＯＸ−１：ＣＯＸ−２　 ＩＣ５０またはＩＣ８０の比として表現される）、表１〜４を参照）。本明細書で述べる比は、１以上の適切な、公知のＣＯＸアッセイ、好ましくは精製したヒト由来の酵素を使用して得られたデータを意味しており、たとえば、Ｅｎｇｅｌｈａｒｔら（１９９５年、上掲）によって測定されたＩＣ５０値の比を意味する。しかしながら、前記試験は、後述するようにＷＨＡＭ試験が好ましい。
【００３７】
ＣＯＸ−１およびＣＯＸ−２の力価比に関する多数の分析が、単離精製された酵素から様々な種からの無傷の（ｉｎｔａｃｔ）細胞および細胞モデルまでわたる広範囲のアッセイシステムを用いて行われてきた。しかしながら、現在では、最も広く受け容れられているモデルは、ヒト全血アッセイ（ＷＢＡ）ならびにＷｉｌｌｉａｍ Ｈａｒｖｅｙ変更ヒト全血アッセイ（ＷＨＭＡ）修正版であり、好ましいアッセイである。これらのアッセイは、ヒトに使用する前記化合物に対し好適である試験のために、容易に入手できるヒト細胞を利用している。また、ＮＳＡＩＤ類の血漿タンパク質への結合をも考慮に入れている。さらに、選択性の評価は、ＩＣ５０よりもむしろＩＣ８０で行うことが好ましい。ＣＯＸ−２およびＣＯＸ−１の阻害に関する両濃度曲線が平行ではなく、また多くの化合物は、８０％阻害に近い阻害となる定常状態血漿濃度を与える用量で使用されるからである（Ｗａｒｎｅｒら， １９９９年， ＰＮＡＳ ＵＳＡ， ９６， ｐ７５６３−７５６８）。
【００３８】
ＷＢＡアッセイでは、ＣＯＸ−１分析のために、血液を試験試薬で処理し、６０分後にカルシウムイオノフォアで処置し、３０分間インキュベートした後、血漿を回収する。ＣＯＸ−２分析については、血液をアスピリンで処理してＣＯＸ−１を阻害し、６時間後にリポ多糖と試験試薬で処理し、１８時間インキュベートした後、血漿を回収する。引き続き、血漿中のトロンボキサンＢ２含量を、ＣＯＸ活性の尺度として、ラジオイムノアッセイで評価する。
【００３９】
ＷＨＭＡアッセイでは、ＣＯＸ−１分析を上記のようにして実施する。ＣＯＸ−２分析については、インターロイキン１βに２４時間曝したヒト気道上皮細胞（Ａ５４９）の培養物から調節した培地で、血液を処理し、この培地と試験試薬で６０分間インキュベートした後に、カルシウムイオノフォアを加えて、３０分後にジクロフェナクを添加して、プロサノイド（ｐｒｏｓａｎｏｉｄ）産生を停止させる。その後、血漿を回収し、ＣＯＸ−２活性の尺度として、血漿中のプロスタグランジンＥ２含量をラジオイムノアッセイで分析する。ＣＯＸ−１およびＣＯＸ−２活性の評価に関して、インキュベートの回数は、この最後のアッセイと同様であるが、これにより活性をより比較できるものとし、またＷＨＭＡを好ましいアッセイとする。
【００４０】
このアッセイを使用して、ＩＣ８０でのＣＯＸ−２／ＷＨＭＡ−ＣＯＸ−１に基づく選択性を表４に示す。ここで、０．２および０．０２は、それぞれＣＯＸ−２についての５倍および５０倍の選択性を表している。
表４：（Ｗａｒｎｅｒら（上掲）からのＷＨＭＡ試験によるＩＣ８０でのＣＯＸ−２／ＣＯＸ−１比）
【００４１】
【表４】
2004510705.tif 000011
【００４２】
このため好ましい態様では、選択比（ｓｅｌｅｃｔｉｖｉｔｙ ｒａｔｉｏ）はＷＨＭＡアッセイによりＩＣ８０で決定され、ＣＯＸ−２：ＣＯＸ−１選択比が０．２未満、好ましくは０．０５未満、たとえば０．０２未満、好ましくは０．０１未満、具体的には ＜０．００５の選択比を有する化合物が本発明の方法での使用にとりわけ好ましい。別の表現をすれば、上述したように、好ましい化合物は、２より大、好ましくは５より大、特に好ましくは５０もしくは１００より大であるＣＯＸ−１：ＣＯＸ−２選択比（ＩＣ８０でのＷＨＭＡアッセイによる）を有する。
【００４３】
ここでいう「阻害」とは、測定可能なシクロオキシゲナーゼ−２活性の減少を意味する。これは、転写、翻訳、翻訳後の修飾またはＣＯＸ−２の活性に影響することにより達成されることができる。しかしながら好ましくは、阻害が酵素活性を阻害することにより達成され、すなわち既に存在する活性ＣＯＸ−２分子の活性部位への干渉である。
【００４４】
望ましくは、免疫不全またはウィルス感染、とりわけＨＩＶ感染およびＡＩＤＳの治療のためのＣＯＸ−２阻害剤が、約０．５μｍｏｌ／リットル未満、より好ましくは約０．２μｍｏｌ／リットル未満のＣＯＸ−２ ＩＣ５０を有する。
本発明で提供される方法は、免疫不全およびウィルス感染、とりわけＨＩＶおよびＡＩＤＳを含むさまざまな症状の予防および治療における、ＣＯＸ−２阻害剤またはその誘導体の使用方法に関する。
【００４５】
本発明のひとつの好ましい態様では、本発明に基づく治療のためのＣＯＸ−２阻害剤は、酸性スルホンアミド類（ａｃｉｄｉｃ ｓｕｌｆｏｎａｍｉｄｅｓ）から選択される。
本発明のひとつの好ましい態様において、本発明で用いるＣＯＸ−２阻害剤は、メタンスルホンアミドエーテル類およびメタンスルホンアミドチオエーテル類を含む下記一般式Ａで表される化合物、またはこれらの誘導体あるいはこれらの製薬的に許容しうる塩から選択される：
【００４６】
【化９】
2004510705.tif 000012
【００４７】
ここで、
Ｘは、酸素原子または硫黄原子またはアルキル基、好ましくは−ＣＨ２−基を表し、
Ｒ１は、必要に応じて１以上の基または原子、好ましくは１以上のフッ素などのハロゲン原子で置換されていてもよいシクロアルキル基あるいはアリール基を表し、
Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５は、それぞれ独立に、水素原子、ニトロ基、アシル基、または必要に応じて１以上の基（たとえばアシル基）または原子で置換されていてもよいアルキル基、あるいはＲ２とＲ３、Ｒ３とＲ４、または、Ｒ４とＲ５とが互いに炭素原子を介在させてシクロペンタノン基を形成してもよい。
【００４８】
好ましくは該化合物中において、Ｘは酸素原子である。またさらに好ましい化合物では、Ｒ１は、アリール基、または１以上のフッ素原子で置換されたアリール基、またはシクロアルキル基である。
より好ましい化合物中においては、Ｒ２およびＲ３が水素原子であり、Ｒ４が−ＮＯ２基または−ＣＯＣＨ３基である。代わりの好ましい化合物は、そのＲ２が水素原子であり、Ｒ３とＲ４が一緒にシクロペンタノン基を形成するものを含む。
【００４９】
特に好ましくは、本発明で用いる式Ａの化合物は、本明細書に記載の名称の化合物であるフロスリド（ｆｌｏｓｕｌｉｄｅ）、ＮＳ−３９８ 、ニメスリド、ＦＫ’ ３３１１およびＬ−７４５ ３３７である。
本発明の別の好ましい態様では、本発明に用いるＣＯＸ−２阻害剤は、ジアリール複素環から選択される。
【００５０】
本発明でＣＯＸ−２阻害剤として用いることのできるジアリール複素環の仲間の一例には、下記一般式Ｂで示される化合物、またはそれらの誘導体もしくはそれらの製薬的に許容しうる塩が含まれる。
【００５１】
【化１０】
2004510705.tif 000013
【００５２】
ここで、
Ｙは、環状基、好ましくはオキサゾリル、イソキサゾリル、チエニル、ジヒドロフリル、フリル、ピロリル、ピラゾリル、チアゾリル、イミダゾリル、イソチアゾリル、シクロペンテニル、フェニルまたはピリジル基を表し、
ｎは、０〜３の整数であり、
ｍは、０〜４の整数であり、
Ｒ６は、環状ケト基（ｋｅｔｏｃｙｃｌｙｌ）、シクロアルキル基またはアリール基を表し、これらの基は、必要に応じて１以上の基または原子、好ましくはフッ素といった１以上のハロゲン原子で置換されていてもよく、
Ｒ７は、それぞれ独立に任意の官能基であり得る置換基を表し、好ましくは、水素原子またはハロゲン原子、より好ましくはフッ素または臭素であり、あるいはアルキル基（好ましくは −ＣＨ３）であり、そのアルキル基は１以上の基または原子、好ましくは、たとえば −ＣＦ３などのように１以上のフッ素原子で置換されていてもよく
Ｒ８は、アルキル基、好ましくは −ＣＨ３またはＮＨＲ１０、好ましくは −ＮＨ２を表し、
Ｒ９は、ハロゲン原子、好ましくはフッ素を表し、
Ｒ１０は、水素原子、または必要に応じて１以上の基または原子で置換されたアルキル基、好ましくはアシル基で置換されたアルキル基を表す。
【００５３】
この部類の化合物は、米国特許第６，０２５，３５３号における抗脈管形成剤として、請求されており、さらに、本発明による好ましい置換基および化合物の記載は、米国特許第６，０２５，３５３号明細書に記載のものと同じである。
このような化合物において、Ｒ８は −ＮＨ２または −ＣＨ３が望ましい。より好ましい化合物において、Ｙはピラゾリル基、フリル基またはチエニル基である。好ましくは、Ｒ６は必要に応じて１以上のフッ素原子で置換されたアリール基である。好ましくは、ｎは１または２である。Ｒ７は、臭素原子、アシル基または −ＣＦ３などの置換されたアルキル基であることが好ましくい。
【００５４】
本発明で用いる、式Ｂの特に好ましい化合物は、本明細書に記載された、セレコキシブ、ロフェコキシブ、 ＤｕＰ−６９７、 ＳＣ−５８１２５、 ＤＦＰ、 ＤＦＵ、 ＣＧＰ ２８２３２ および三環ＭＦ（ＭＦ ｔｒｉｃｙｃｌｉｃ）という化合物である。
本明細書で使用される用語「アルキル」は、特に他に言及のない限り、長鎖または短鎖、直鎖、分枝または環状の、必要に応じて水酸基、アルコキシ基、アシルオキシ基、ニトロ基、アルコキシカルボニルオキシ基、アミノ基、アリール基、オキソ基またはハロ基により、一置換または多置換されていてもよい脂肪族の飽和もしくは不飽和炭化水素基を含む。不飽和アルキル基は、一不飽和または多不飽和でもあってよく、アルケニル基およびアルキニル基の両方を含む。これらの基は４０個まで、好ましくは１〜１０個の炭素原子を含むことができる。
【００５５】
本明細書で用いられる環式の環は、好ましくはＣ５−７であって、必要に応じて酸素、窒素および硫黄から選ばれる１以上のヘテロ原子を含有していてもよい。
本明細書で用いられる用語「アシル」は、カルボン酸基および炭酸基の両方を含み、よって、たとえば、アルキルカルボニルオキシアルキルなどのアシルオキシ置換アルキル基が挙げられる。そうした基において、いずれのアルキレン部分も、好ましくは上記でアルキル基に対し定義した炭素原子数を含む。好ましいアリール基として、フェニル基および単環の５〜７員複素環式芳香族、とりわけ必要に応じ置換されていてもよいフェニル基および単環５〜７員複素環式芳香族基が挙げられる。
【００５６】
代表的な置換アルキル基Ｒ１として、アルコキシアルキル、ヒドロキシアルコキシアルキル、ポリヒドロキシアルキル、ヒドロキシポリアルキレンオキシアルキルなどの基、具体的には、アルコキシメチル、アルコキシエチルおよびアルコキシプロピル基、または、アシルオキシメチル、アシルオキシエチルおよびアシルオキシプロピル基、たとえばピバロイルオキシメチル（ｐｉｖａｌｏｙｌｏｘｙｅｔｈｙｌ）が挙げられる。
【００５７】
本明細書で用いられる、「置換された基」としては、特に他に言及のない限り、水酸基、アルコキシ基、アシルオキシ基、ニトロ基、アルコキシカルボニルオキシ基、アミノ基、アリール基、オキソ基またはハロ基によって、一置換または多置換されたものであってもよい。
本発明の他の好ましい態様において、ＣＯＸ−２阻害剤は、古典的なＮＳＡＩＤ類の修飾物、たとえばそれらのプロドラッグ類、エステル類または塩類から選択される。
【００５８】
古典的なＮＳＡＩＤ類の化学構造に基づいて、さらに新規な選択的ＣＯＸ−２阻害剤が調製されてきた。このような化合物は、オキセカム（よく知られたピロキシカムのＣＯＸ−２特異的アナログ）のひとつであるメロキシカム（ｍｅｌｏｘｉｃａｍ）、または、エトドラック（ジクロフェナックのＣＯＸ−２特異的アナログ）などの酢酸誘導体であってもよい。この部類におけるいくつかの最も好ましい化合物のあるものの例は、ＣＯＸ−２活性インドメタシン誘導体およびゾメピラックである。
【００５９】
本発明に係る化合物のファミリーまたはサブファミリーに関するさらなる列挙は、ＣＯＸ−２阻害剤に関する特許および特許出願に見受けられ、たとえば、本明細書で先に掲げた特許文献中にある。これらの特許文献はまた、特定の化合物を例示および列挙しており、それらはまた本発明による最も好ましいＣＯＸ−２阻害剤でもある。
【００６０】
特に好ましい化合物としては：
ジイソプロピルフルオロホスフェート、Ｌ−７４５３３７、ロフェコキシブ、ＮＳ ３９８、ＳＣ ５８１２５、 エトドラク、メロキシカム、セレコキシブまたはニメスリドである。
本発明に基づいて使用するＣＯＸ−２阻害剤の製造方法は、当該技術分野でよく知られた方法であり、上記の文献中に具体的に記載されている。
【００６１】
本明細書で記載する疾患、たとえば、免疫不全およびウィルス感染、特にＨＩＶ ／ ＡＩＤＳの治療および予防に用いる、本発明によるＣＯＸ−２阻害剤は、１個以上の不斉中心および／または１個以上の二重結合を有していてもよい。すなわち、本発明は、本明細書が開示する化合物の異性体およびラセミ体の使用にも及ぶ。これらすべての可能な異性体は、本発明の範囲に含まれる。ＣＯＸ−２阻害剤は、化合物の異性体混合物の形態、より好ましくは精製した異性体またはその製薬的に許容される塩の形態であってもよい。
【００６２】
本発明による症状の治療、たとえば免疫不全およびウィルス感染の治療のためのＣＯＸ−２阻害剤の医薬組成物は、製薬的に許容される塩として製剤されてもよく、さらに当該技術分野でよく知られ、製薬上許容される担体もまた含んでもよい。
このように、本発明は、ＣＯＸ−２阻害剤またはその誘導体あるいはその製薬的に許容される塩ならびに製薬的に許容される希釈剤、担体または賦型剤を含有する医薬組成物にも及ぶ。「製薬的に許容される」とは、成分が組成物中で他の原料成分と適合し、かつ、投与される者にとり生理的に許容しうるものであることを意味する。
【００６３】
さらなる態様において本発明は、後述するように、このような組成物の使用、ならびにこのような組成物を用いた予防／治療の方法にもまた及ぶ。
ＣＯＸ−２阻害剤が塩基性である場合には、塩は、製薬的に許容される非毒性の無機酸および有機酸を含む酸とから調製することができる。特に好ましい塩は、塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、硫酸塩、クエン酸塩、マレイン酸塩、クエン酸塩および酒石酸塩である。
【００６４】
ＣＯＸ−２阻害剤が酸性である場合には、塩は、製薬的に許容される非毒性の無機塩基および有機塩基を含む塩基とから調製することができる。特に好ましい塩は、ナトリウム塩、カリウム塩およびマグネシウム塩である。
本明細書に記載の疾患、たとえばＨＩＶ／ＡＩＤＳを含む免疫不全またはウィルス疾患などの、治療および予防のためには、ＣＯＸ−２阻害剤は、経口的に、経直腸的（坐薬）に、局所的に、舌下剤として、吸入、あるいは注射または注入の形態で非経口的（たとえば、筋肉内、皮下、腹腔内または静脈内）に投与することができる。好ましい投与形態は、経口、経直腸および注射または注入による投与であろう。最も好ましい投与形態は、経口投与に適したものである。
【００６５】
すべての投与形態において、ＣＯＸ−２阻害剤は、通常、製薬的に許容される公知のキャリヤー、助剤および担体を含有する投薬単位の剤形で投与される。このようにして、活性成分は、錠剤、丸薬、散剤、トローチ剤、小袋剤、カシェ剤、エリキシル剤、懸濁剤、乳化剤、溶液剤、シロップ、煙霧剤（固体としてまたは液体媒体中で）、軟膏、軟質および硬質のゼラチンカプセル、坐剤、無菌注射剤、無菌包装粉剤およびその類似物を製造するために、必要に応じて配合調剤としての他の活性物質、１以上の通常の担体、希釈剤および／または賦形剤とともに一体化してもよい。生分解性ポリマー（ポリエステル、ポリ酸無水物（ｐｏｌｙａｎｈｙｄｒｉｄｅｓ）、ポリ乳酸またはポリグリコール酸など）もまた、固体インプラントに用いることができる。この組成物は、凍結乾燥、過冷法あるいはパーマザイム（Ｐｅｒｍａｚｙｍｅ）を用いることにより安定化させることができる。
【００６６】
適切な賦形剤、担体または希釈剤は、ラクトース、Ｄ型グルコース、ショ糖、ソルビトール、マンニトール、デンプン類、アラビアゴム、リン酸カルシウム、アグリネート、トラガカント、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微結晶セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水シロップ、水、水／エタノール、水／グリコール、水／ポリエチレン、グリコール、プロピレングリコール、メチルセルロース、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、タルク、ステアリン酸マグネシウム、鉱油、または固い脂肪などの脂肪類、これらの適切な混合物である。この組成物は、必要に応じて、潤滑剤、湿潤剤、乳化剤、懸濁剤、保存剤、甘味剤、香料、たとえば点鼻用（胆汁酸塩、レシチン、界面活性剤、脂肪酸、キレート化剤）などの吸着促進剤などを含んでもよい。本発明の組成物は、当業界で周知の方法を用いることにより、患者への投与後、活性成分を即時の放出、持続的または遅延的な放出するように製剤することができる。
【００６７】
投与する活性成分は、医薬組成物での利用のために、適切に修飾されてもよい。たとえば、活性成分は、塩類または非電解質、酢酸塩、ＳＤＳ、ＥＤＴＡ、クエン酸塩または酢酸緩衝液、マンニトール、グリシン、ＨＡＳまたはポリソルビン酸塩などの適切な添加剤を用いることなどにより安定化されてもよい。
結合物は、改善した親油性を与え、細胞輸送を増加させ、溶解性の向上またはターゲティングを可能とするように形成されてもよい。これらの結合は、切断可能であってもよく、このため該結合物が薬剤前駆体（プロドラッグ）のように作用する。安定性はまた、たとえばＺｎ、ＣａまたはＦｅとの適切な金属錯体を用いることにより与えることができる。
【００６８】
この活性成分は、送達のため、または特定の細胞、器官または組織をターゲティングするために、適切な媒体中で処方してもよい。このため、該医薬組成物では、活性物質が吸収、吸着、取り込みまたは結合されてもよい、ミクロエマルジョン、リポソーム、ニオソームまたはナノ粒子の形態をとることができ、これらに生成物を効果的に不溶性の形態に変換することができる。
【００６９】
これらの粒子は、循環時間を向上するため適切な表面分子（たとえば、血清成分、界面活性剤、ポリオキサミン９０８、ＰＥＧなど）、または、たとえば特定細胞に担われている選択的レセプターに対するリガンドなど、部位特異的ターゲティングのための部分を持つことができる。ドラッグデリバリーのための、またターゲティングのための適切な技術は、当該技術分野で知られているが、たとえば、ドラッグターゲティングに関する、Ｋｒｅｕｔｅｒ， １９９４年， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂ． Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔ．， ３，ｐ２５３−２５６、Ｓｈｅｎ， １９９７年， Ｊ． Ｄｒｕｇ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ， ５（１）， ｐ１１−１３、Ｍｒｓｎｙ， １９９７年， Ｊ． Ｄｒｕｇ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ， ５（１）， ｐ５−９、Ｐｅｔｉｔ ＆ Ｇｏｍｂｏｚ， １９９８年， ＴＩＢＴＥＣＨ， １６， ｐ３４３−３４９、およびＤｕｎｃａｎ， １９９７年， Ｊ． Ｄｒｕｇ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ， ５（１）， ｐ１−４、および、ペプチドおよび核酸分子デリバリーに関する、Ｓｉｍａｒｉ ＆ Ｎａｂｅｌ， １９９６年， Ｓｅｍｉｎ． Ｉｎｔｅｒｖｅｎｔ． Ｃａｒｄｉｏｌ．， １， ｐ７７−８３、Ｔｏｒｃｈｉｌｉｎ， １９９８年， Ｊ． Ｍｉｃｒｏｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ， １５（１）， ｐ１−１９、Ｋｌｙａｓｈｃｈｉｔｓｋｙ ＆ Ｏｗｅｎ， １９９８年， Ｊ． Ｄｒｕｇ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ， ５（６）， ｐ４４３−４５８、Ｋｒｅｕｔｅｒ， １９９６年， Ｊ． Ａｎａｔ．， １８９， ｐ５０３−５０５、Ｆａｓａｎｏ， １９９８， ＴＩＢＴＥＣＨ， １６， ｐ１５２−１５７、Ｋａｔａｏｋａら， １９９３， ２４， ｐ１１９−１３２、Ａｎｄｅｒｓｏｎ， １９９８年， Ｎａｔｕｒｅ， ３９２（ｓｕｐｐｌ）， ｐ２５−３０、Ｌａｎｇｅｒ， １９９８年， Ｎａｔｕｒｅ， ３９２ （ｓｕｐｐｌ）， ｐ５−１０、Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ， １９９５年， ＴＩＢＴＥＣＨ， １３， ｐ５２７−５３６、Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ ら， １９９７年， ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．， ４０２， ｐ１０７−１１０、Ｒｏｌｌａｎｄ， １９９８年， Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ， １５ （２）， ｐｌ４３−１９８、Ｈｏｐｅ ら， １９９８年， Ｍｏｌｅｃ． Ｍｅｍｂ． Ｂｉｏｌ．， １５， ｐ１−１４、および Ｓｃｈｅｒｍａｎ ら， １９９８年， Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎｉｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ．， ９ （５）， ｐ４８０−４８５ が挙げられる。特定部位指向ターゲティングの例としては、たとえば、ナノ粒子がＨＩＶ感染マクロファージ内に蓄積される、Ｓｃｈａｅｆｅｒ ら，１９９２年， Ｐｈａｒｍ． Ｒｅｓ．， ９， ｐ５４１−５４６を参照。明らかにこれらの方法は、本明細書に記載の本発明の方法における具体的な適用例を明確に有する。
【００７０】
これらの誘導体化または結合された活性成分は、本発明により用いられる阻害分子の定義の範囲に収まることを意味する。
このため経口的に使用される該医薬組成物は、たとえば活性成分の他に錠剤、カプセル剤、溶液剤、懸濁剤またはその他経口投与用として周知の剤形を形成するための生理学的に許容しうる適切な剤を含む。このような組成物は、経口医薬組成物の製造方法として知られたいずれの方法によっても調製することができる。このような組成物は、１以上の生物活性物質および保存剤、不活性希釈剤、増粘剤、着色剤、甘味剤、造粒剤、崩壊剤、結合剤、浸透性活性剤、湿潤剤、懸濁剤、遅延剤形の調製用物質、油類および水よりなる群から選ばれる１以上の剤を含むことができる。
【００７１】
たとえば、直腸投与用の坐剤または注射もしくは注入用の溶液剤といった、経口使用以外の医薬組成物は、よく知られている方法およびそうした剤形のための添加剤を用いて調製できる。注射および注入用のすべての製剤は、無菌製剤であるべきである。
このような組成物中の活性成分は、製剤重量の約０．０１％から約９９％、好ましくは約０．１から約５０％、たとえば１０％含まれる。
【００７２】
本発明によれば、たとえば免疫不全およびウィルス感染などの疾患の治療のために、ＣＯＸ−２阻害剤の一日あたりの用量水準は、０．００５ｍｇから約１５０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲である。その投与量は、ＣＯＸ−２阻害剤化合物の選択、臨床的状態（ウィルスの種類、感染の進行状況および患者の状態）、患者の年齢および体重、投与の経路、および、患者の治療過程の長さを含め、薬剤の総使用量に大きく依存する。より好ましい投与量は、通常、一日あたり０．０１ｍｇ〜５０ｍｇ／ｋｇ体重の間、より好ましくは、一日あたり０．０５ｍｇ〜２０ｍｇ／ｋｇ体重である。よってたとえば、一日あたりロフェコキシブ２５ｍｇまたはセレコキシブ２００ｍｇが、経口投与でヒト成人１人に投与され得る。
【００７３】
投与単位は、通常、活性成分１ｍｇから５００ｍｇの間である。
本発明の一つの見地によれば、たとえば免疫不全またはウィルス感染などの本明細書に記載された疾患を治療するために、一つのＣＯＸ−２阻害剤に、さらに１以上のその他のＣＯＸ−２阻害剤を併用することができる。
本発明の別の見地によれば、免疫不全、ＨＩＶ感染、またはＡＩＤＳなどの疾患の治療のために、ＣＯＸ−２阻害剤は１以上のさらなるＣＯＸ−２阻害剤、または異なる作用様式の１以上のさらなる薬剤と併用することができる。このような組み合わせの例としては、ＣＯＸ−２阻害剤と、１以上のＮＮＲＴＩとの組み合わせ、または１以上のＮＲＴＩ類との組み合わせ、または１以上のＨＩＶプロテアーゼ阻害剤との組み合わせ、または、１以上のＨＡＡＲＴとＣＯＸ−２阻害剤との組み合わせが挙げられる。
【００７４】
さらなる見地では本発明は、１以上のＣＯＸ−２阻害剤と、特に長期の治療の間に活性成分の耐性を向上させる化合物とを組み合わせる方法および／または組成物を提供する。その典型的な化合物として、抗ヒスタミンおよびプロトンポンプ阻害剤が挙げられる。
よって本発明は、前記のＣＯＸ−２阻害剤を、１以上の追加的なＣＯＸ−２阻害剤および／または１以上の追加的な活性成分とともに含む組成物にも及ぶ。本発明は、さらに前述のそのような組成物の使用ならびにそのような組成物を使用する方法にも及ぶ。本発明はまた上述した症状もしくは疾患の治療または予防において、同時または別個または逐次に使用される、混合製剤として上記の成分を含有する製品にも及ぶ。
【００７５】
【実施例】
本発明は、以下の図を参照して以下の限定されない実施例でさらに詳述される。
【００７６】
【実施例１】
げっ歯類後天性免疫不全症候群（ＭＡＩＤＳ）のマウスはＴ細胞機能障害を誘発するｃＡＭＰ／ＰＫＡタイプＩを有する
ＭＡＩＤＳ（げっ歯類の後天性免疫不全症候群）
多数の研究からＭＡＩＤＳ（Ｍｕｒｉｎｅ Ａｃｑｕｉｒｅｄ Ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ Ｓｙｎｄｒｏｍｅ）をヒトのＨＩＶによる可能な感染モデルとして考えられている。この症候群は、変異したＰｒ６０ｇａｇポリタンパク質をコード化する複製−欠陥のレトロウィルスを用いる感染後に、進行する（Ｃｈａｔｔｏｐａｄｈｙａｙ ら， １９９１年， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．， ６５， ｐ４２３２−４２４１； Ｊｏｌｉｃｏｅｕｒ， １９９１年， ＦＡＳＥＢ Ｊ．， ５， ｐ２３９８−２４０５）。本症候群は、脾臓およびリンパ節における進行性リンパ増殖および重症免疫不全と関係している。ＭＡＩＤＳの原因となる欠陥レトロウィルスは、主としてＢ細胞に感染する（Ａｚｉｚ， １９８９年， Ｎａｔｕｒｅ， ３３８， ｐ５０５−５０８）が、ＣＤ４＋ Ｔ細胞は、有糸分裂誘発因子のインビトロ刺激に対して、深在性の機能障害およびアネルギー（ａｎｅｒｇｙ）を示す。感染マウスのＣＤ４＋ Ｔ細胞（ＣＤ８＋ Ｔ細胞ではなく）の大部分もまた、異常なＴｈｙ−１のネガティブ表現型により特徴づけられる（Ｈｏｌｍｅｓ ら， １９９０年， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， ２０， ｐ２７８３−２７８７； Ｍｏｕｔｓｃｈｅｎ ら， １９９４年， Ｓｃａｎｄ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， ３９， ｐ２１６−２２４ （ＭＡＩＤＳ））。正常な感染していないマウスにおいては、ＣＤ４＋ Ｔｈｙ−１− Ｔ細胞は、胚中心（該細胞はそこでは新しい抗原特異的な移出細胞に相当する）で選択的に認められる。
【００７７】
変異したＰｒ６０ｇａｇタンパク質がＴ細胞異常を誘発する機構は知られていない。感染細胞によって分泌される「溶性因子」が、距離をおいてＴ細胞の機能に影響を及ぼすことが主張されているが（Ｓｉｍａｒｄ， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．， ６８， ｐ１９０３−１９１２）、そのような媒介物（ｍｅｄｉａｔｏｒ）の本性は決して解明されて来なかった。他の研究は、ＣＤ４＋ Ｔ細胞と抗原提示細胞との間の直接的で同種の相互作用がＴ細胞欠陥の誘発に対して必要であることを提案している（Ｇｒｅｅｎ， ２００１， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．， ７０， ｐ２５６９−２５７５； ｄｅ Ｌｅｖａｌ， １９９８年， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．， ７２， ｐ５２８５−５２９０）。
【００７８】
アデニル酸シクラーゼ−ｃＡＭＰ−プロテインキナーゼＡ経路は、免疫応答の調節において重要な役割を果たす（Ｋａｍｍｅｒ， １９９１年， Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｔｏｄａｙ， ９， ｐ２２２−２２９）。増加したｃＡＭＰの濃度は、抗ＣＤ３ ｍＡｂおよびインターロイキン−２といった種々の刺激に対するＴ細胞の増殖応答を阻害することが知られている。最近の報告は、ＪＡＫ３チロシンキナーゼの下方制御が、ｃＡＭＰによるＴ細胞増殖阻害の機構を表しているかもしれないということを提案している（Ｋｏｌｅｎｋｏ， １９９９年， Ｂｌｏｏｄ， ９３， ｐ２３０８−２３１８）。ノルエピネフリンといった、ｃＡＭＰ誘導性の作用物質に暴露された、げっ歯類の胸腺細胞または胸腺腫細胞は、ｍＲＮＡの不安定化を含むメカニズムによってＴｈｙ−１発現を下方制御するため、環状ＡＭＰもまた膜タンパク質の下方制御を誘発できた（Ｗａｊｅｍａｎ−Ｃｈａｏ， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， １６１， ｐ４８２５−４８３３）。
【００７９】
プロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）、すなわちｃＡＭＰの強力な誘導物質は、主に単球、マクロファージおよび活性化されたＴ細胞によって分泌される。ＰＧＥ２は、ＩＬ−２を阻害することとＩＬ−４産生を促進することによって、Ｔ−ヘルパー・タイプ１細胞からＴ−ヘルパー・タイプ２細胞の方へと釣合いを移動させる（Ｂｅｔｚ および Ｆｏｘ， １９９１年， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， １４６， ｐ１０８−１１３； Ｍｅｙａａｒｄ， １９９７年， Ｂｌｏｏｄ， ８９， ｐ５７０−５７６）。それは、またＢ細胞の分化をＩｇＥ産生の方へと偏らせる（Ｆｅｄｙｋ および Ｐｈｉｐｐｓ， １９９６年， ＰＮＡＳ ＵＳＡ， ９３， ｐ１Ｏ９７８−１０９８３）。プロスタグランジン合成は、シクロオキシゲナーゼ−１および−２（ＣＯＸ−１およびＣＯＸ−２）と特異的ＰＧシンターゼとの逐次的な作用に由来する（Ｓｍｉｔｈ および ＤｅＷｉｔｔ， １９９６年， Ａｄｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， ６２， ｐｌ６７−２１５）。ＣＯＸ−１発現は、主として構成的かつ普遍的であるのに対し、ＣＯＸ−２はある細胞タイプ（マクロファージ、繊維芽細胞、平滑筋細胞）において、ＩＬ−１およびＴＮＦ−αといった炎症性サイトカインおよびＮＯによって誘導されるのみである。
【００８０】
ＭＡＩＤＳにおけるＴ細胞機能障害のもととなる機構は、まだ充分に理解されていない。ＣＤ４＋ Ｔ細胞は優先的に関わるが、ＣＤ８＋ Ｔ細胞の変化は、充分なＣＤ４＋ Ｔ細胞支援の欠如によるのみであるといくつかの報告は示唆している。反対に、Ｂ細胞応答の阻害は固有のものであり、欠陥のあるＣＤ４＋リンパ球によってだけでは説明できない。したがって、ｃＡＭＰの選択的な増加がＢ細胞およびＣＤ４＋ Ｔ細胞中にあり、しかもＣＤ８＋ Ｔ細胞中にはないという本発明者の観察は、ＭＡＩＤＳに関係するアネルギープロセス（ａｎｅｒｇｉｃ ｐｒｏｃｅｓｓ）へのｃＡＭＰの関与と矛盾しない。
【００８１】
発明者が知る限り、これは疾患モデルにおける、サブセット選択的なｃＡＭＰの増加についての最初の実証である。プロスタグランジンＥ２などの溶性因子が本当にｃＡＭＰ誘導を招いたとすると、何がその作用のサブセット選択性を説明できるであろうか。かつての研究は、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋ Ｔ細胞における様々なプロスタノイドレセプター（ｐｒｏｓｔａｎｏｉｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）の発現を比較して、両方のサブセットにおいて同じ発現パターンを結論づけた。通常のＣＤ８＋ Ｔ細胞は、ｃＡＭＰが誘導するＰＧＥ２の効果に対して充分に感受性がある。可能な説明はポストレセプターレベル（ｐｏｓｔ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｌｅｖｅｌ）でできた。記憶／活性化されたＴ細胞は、無垢な（ｎａｉｖｅ）Ｔ細胞よりもＰＧＥ２に対して感受性がある。ＭＡＩＤＳにおいて、ＭＨＣクラスＩＩ−依存性プロセスが関係しているところでは、ＣＤ４＋ Ｔ細胞は、活性化の特別の状態を獲得することができ、それにより該細胞は、任意の濃度のＰＧＥ２の効果をより受けやすくなった。プロスタノイド効果についてのポストレセプター変更は、対応する膜レセプターからプロテインＧを分離するＧレセプターキナーゼ（ＧＲＫ）によって主に媒介される。リューマチ性関節炎などの炎症性状態は、ＧＲＫの下方制御により特徴づけられる。したがって、それは、カテコールアミンといった、ｃＡＭＰ誘発物質に対するリンパ球の増加した感受性によって特徴づけられる。感染マウスのＣＤ４＋およびＣＤ８＋ Ｔ細胞におけるＧＲＫ活性のレベルは知られていない。
実施例１および２で用いられた方法
マウスおよび細胞懸濁液
雄性Ｃ５７ＢＬ／６マウスを発明者の施設で飼育した。４および５週齢において、マウスに０．２５ｍｌの無細胞ウィルス抽出液を２回腹腔内に注射した。週齢が一致した対照マウスには、０．２５ｍｌのリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）を２回腹腔内に注射した。感染後の異なった時点で、マウスを炭酸ガス窒息により犠死させた。末梢リンパ節（鼠径部、腋窩および頸部）を、シリンジを用いて分離して単一細胞の懸濁液を得て、これをナイロンの細胞染色用具（ｃｅｌｌ ｓｔａｉｎｅｒ）に通し、ＲＰＭＩ１６４０完全培地で３回洗浄し、トリパンブルーの排除後にトーマ（Ｔｈｏｍａ）血球計算器上でカウントした。
【００８２】
ウィルス
ウィルス抽出液を、前述したようにＲａｄＬＶ−Ｒを２ヶ月前に注射したマウスのリンパ節から調製した。リンパ節を集めてＰＢＳ中ですりつぶし、１．５×１０４ｇで３０分間遠心分離した。上澄み液を再度３０分間１．５×１０４ｇで回転させた。この無細胞性のウィルス抽出液を液体窒素中で保管した。ＸＣプラーク（ｐｌａｑｕｅ）アッセイを、ウィルス粒子を定量するために用いた。ウィルス標品は、１０３粒子形成単位（ＰＦＵ）／ｍｌの狭宿主性（ｅｃｏｔｒｏｐｉｃ）ウイルスを含んでいた。
【００８３】
抗体
以下のポリクロナール抗体をウエスタンブロット実験に用いた。第一：ポリクロナールウサギ抗ＣＯＸ−１またはウサギ抗ＣＯＸ−２抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）。第二段階：を共役させたセイヨウワサビ・ペルオキシダーゼ結合抗ウサギ抗体をＴｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， 英国）から購入した。フローサイトメトリーのために、用いたｍｏＡｂは以下の通りである。ＰＥ−共役ＣＤ４／Ｌ３Ｔ４（ＹＴＳ．１９１．１）、ＦＩＴＣ−共役ＣＤ４５Ｒ／Ｂ２２０（ＲＡ３−６Ｂ２）、ＦＩＴＣ−共役ＣＤ１１ｂ／Ｍａｃ−１（Ｍ１／７０）、ＦＩＴＣ−共役ＣＤ１６１／ＮＫ−１．１（ＰＫ１３６）、ＦＩＴＣ−共役ＣＤ８ａ（Ｌｙ−２）およびＣＤ１６／ＣＤ３２（ＦｃγＩＩＩ／ＩＩレセプター）（２．４Ｇ２）（すべてＰｈａｒｍｉｎｇｅｎから入手：Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， カルフォルニア州， 米国）。ＣＤ３ ｍｏＡｂ（１４５−２Ｃ１１）を発明者の研究室で精製した。コンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）をＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａから、およびフィトヘマグルチニン−Ｍ（ＰＨＡ）をＤｉｆｃｏから購入した。
【００８４】
フローサイトメトリーおよびセルソーティング（細胞選別）
分析は、セルクエスト（Ｃｅｌｌｑｕｅｓｔ）ソフトウェア付きのＦＡＣＳｔａｒプラス（ＦＡＣＳｔａｒ−ｐｌｕｓ）フローセルソーター（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を使用することによって行った。前方及び側方散乱を、生存リンパ球をゲート（ｇａｔｅ）するために用いた。ＦＩＴＣ（緑）およびＰＥ（橙）の二色分析のために、４８８ｎｍでの青色励起光をアルゴンイオンレーザー（Ａｉｒ−ｔｏ−Ｗａｔｅｒ ｃｏｏｌｅｄ ｍｏｄｅｌ Ｓｐｉｎｎａｋｅｒ １１６１； Ｓｐｅｃｔｒａ Ｐｈｙｓｉｃｓ， Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ， カリフォルニア州）により供給した。セルソーティングのために、６０×１０６個の細胞を、非特異的な相互作用を避けるために抗ＦｃγＲＩＩ（Ｆｃ Ｂｌｏｃｋ）とともにインキュベートした後に、蛍光色素−結合抗体を用いて氷上で２０分間標識した。ＣＤ４＋ Ｔ細胞を、ＣＤ８＋ Ｂ２２０＋ ＣＤ１１ｂ＋細胞を枯渇させることによってネガティブに選択した。同様に、ＣＤ８＋ Ｔ細胞を、ＣＤ４＋ Ｂ２２０＋ ＣＤ１１ｂ＋細胞を枯渇させることによって、およびＢ細胞を、ＣＤ８＋ ＣＤ４＋ ＣＤ１１ｂ＋細胞を枯渇させることによってネガティブに選択した。各ソーティングについて、選別された画分を、フローサイトメトリーによって再分析し、純度を評価したところ、常に９７％より高い純度であった。
【００８５】
環状ＡＭＰの定量
リンパ節の単一細胞の懸濁液を上述したように調製し、ＲＰＭＩ１６４０を用いて２回洗浄し、１５００×ｇで３分間遠心分離した。その後、細胞を超音波によって粉砕し、細胞内ｃＡＭＰを抽出溶液（０．０１Ｎ ＨＣｌ、９５％エタノール）中に容易に遊離させた。細胞溶解物を含む溶液を、１３×１０４×ｇで１５分間遠心分離し、上澄み液を新しい試験管に移した。抽出物を４５℃でＳｐｅｅｄ Ｖａｃ濃縮装置中で蒸発濃縮し、ペレットを−２０℃で保管した。使用直前に、ペレットをアッセイ用緩衝液中に再懸濁し、ｃＡＭＰレベルを、１２５Ｉ−標識ｃＡＭＰアッセイシステム（Ａｍｅｒｓｈａｍ， 英国）を用いてラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）により測定した。試験サンプル中のｃＡＭＰの濃度を、曲った直線形の検量線との比較によって求めた。正の対照および負の対照として、リンパ節細胞（１×１０６）を、１ｍＭのｄジブチリル−ｃＡＭＰおよび０．５ｍＭのＤＤＡ（アデニル酸シクラーゼ阻害剤）を用いて３０分間３７℃で、加湿した５％ＣＯ２空気の培養器中で、それぞれイキュベートし、ｃＡＭＰ濃度を測定した。
【００８６】
細胞ホモジナイゼーションおよび免疫ブロット
細胞（５０×１０６）を、２５０ｍＭスクロース、１ｍＭＥＤＴＡ、０．１％トリトンＸ−１００およびキモスタチン（ｃｈｙｍｏｓｔａｔｉｎ）、ロイペプチン、ペプスタチンＡおよびアンチパイン（ａｎｔｉｐａｉｎ）のプロテアーゼ阻害剤、各々１０μｇ／ｍｌ、１０ｍＭリン酸カリウムを含む緩衝液（ｐＨ７．１）中、氷上で超音波（２×１５秒）によってホモジナイズし（Ｔａｓｋｅｎら， １９９３年， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２６８， ｐ２１２７６−２１２８３）、３０分間（１５，０００×ｇ）遠心分離して不溶性物質を除去した。タンパク質濃度をＢｒａｄｆｏｒｄアッセイ法（ＢｉｏＲａｄ）により求めた。免疫ブロットのために、４０μｇのタンパク質を１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離してＰＶＤＦ膜に移し、５％の非脂肪粉乳および０．１％ＢＳＡ（Ｂｌｏｔｔｏ）を含むＴＢＳ／Ｔｗｅｅｎ中の抗体とともにインキュベートした。一次抗体をＨＲＰ−結合二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ／Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）およびＥＣＬ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）により検出した。
【００８７】
ＰＫＡのホスホトランスフェラーゼ活性
ＰＫＡの触媒活性を、［γ−３２Ｐ］ＡＴＰ（比活性０．２５Ｃｉ／ｍＭｏｌ、Ａｍｅｒｓｈａｍ）を用いて、Ｒ． Ｒｏｓｋｏｓｋｉによって記載（Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．， １９８３年， ９９， ｐ３６）されたアッセイ混合物中で、ＰＫＡ−特異的基質（Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ）（Ｋｅｍｐ ら， １９７６年， ＰＮＡＳ ＵＳＡ， ７３， ｐ１０３８−１０４２）、Ｋｅｍｐｔｉｄｅ（Ｐｅｎｉｎｓｕｌａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ ＩＮＣ．）をリン酸化することにより定量した。ホスホトランスフェラーゼ活性を、ｃＡＭＰ（５μＭ）およびＰＫＩ（１μＭ）の存在下および非存在下の両方について測定し、ＰＫＩによって阻害されない低レベルの活性を差し引くことにより、ＰＫＡ−比活性を求めた。
【００８８】
環状ＡＭＰ結合の測定
可溶化されたＰＫＡ調節サブユニットの特異的［３Ｈ］ｃＡＭＰ結合の定量化を、ＣｏｂｂとＣｏｒｂｉｎによって記載（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ， １５９， ｐ２０２−２０８， １９８８年）されたように、［２，８−３Ｈ］ｃＡＭＰ（２．２５μＭ；比活性５Ｃｉ／ｍＭｏｌ；Ｄｕ Ｐｏｎｔ−Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｎｕｃｌｅａｒ）を含む混合物中で行った。Ｒサブユニットのモル比を各調節サブユニットモノマー上の２つのｃＡＭＰ結合サイトに基づいて計算した。
【００８９】
免疫細胞化学
対照および感染リンパ節のリンパ球を、冷アセトンで５分間固定し、それぞれ０．１％のサポニンＰＢＳ中で５分間２回洗浄した。内因性ペルオキシターゼを、０．１％サポニンＰＢＳ中の０．３％過酸化水素を用いて、１５分間インキュベートすることによりブロッキングした。サポニン／ＰＢＳ中でリンスした後、スライドグラスをブロッキング緩衝液（０．１％サポニン／ＰＢＳ中、１．５％の通常のヤギ血清）を用いて３０分間室温でインキュベートし、次いで一次抗体溶液を用いて加湿室中、室温で６０分間インキュベートした。Ｃａに対する抗体はサンタクルス（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）から入手し、０．１％のサポニンおよび０．５％の通常のヤギ血清を含むＰＢＳ中に１：１０００で希釈した。その後、スライドグラスを前述の通り洗浄し、ビオチン化ヤギ抗ウサギ抗体を用いてインキュベートした。その後これをＡＢＣ複合体（Ｎｏｖａｓｔａｉｎ Ｓｕｐｅｒ ＡＢＣ Ｋｉｔ， Ｎｏｖｏｃａｓｔｒａ）により検出した。ペルオキシターゼを、Ｈ２Ｏ２の存在下で褐色の沈殿を与えるジアミノベンジジン（ｄｉａｍｉｎｏｂｅｎｚｉｄｉｎｅ）（ＤＡＢ）（Ｄａｋｏ）を用いて、目に見えるようにした。スライドグラスを、ヘマトキシリン−エオシン（Ｓｉｇｍａ）を用いて対比染色した。特異性は、ＰＫＡ−Ｃαサブユニットに対する特異的ペプチドとともにサイトスピン（ｃｙｔｏｓｐｉｎ）をインキュベートすることにより検証した。
【００９０】
免疫組織化学
免疫組織化学を、固定された４％のパラホルムアルデヒド中で処理された２μｍ厚の組織切片および成形して埋め込まれた組織（ＪＢ４−ＪＢポリサイエンス（ＪＢＰｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅ））について実施した。切片をトリプシン（０．２４％）用いて１分間３７℃で透過処理し、その後、Ｔｗｅｅｎ２０（２％）を用いて３０分間３７℃で処理した。内因性ペルオキシターゼは、Ｈ２Ｏ２（１％）を用いて３０分間、室温でインキュベートすることによりクエンチした。不特定部位（ａｓｐｅｃｉｆｉｃ ｓｉｔｅｓ）を通常のヤギ血清（１．５％）を用いて３７℃で１時間の間に飽和させた。その後、切片を、一晩４℃で一次ポリクロナールウサギ抗ＣＯＸ−１またはウサギ抗ＣＯＸ−２抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を用いてインキュベートした後、ビオチン化ヤギ抗ウサギ抗体を用いて２時間インキュベートした。この後のものをＡＢＣ複合体（Ｎｏｖａｓｔａｉｎ Ｓｕｐｅｒ ＡＢＣ Ｋｉｔ， Ｎｏｖｏｃａｓｔｒａ）により検出した。ペルオキシターゼを、Ｈ２Ｏ２の存在下で褐色沈殿を与えるジアミノベンジジン（ｄｉａｍｉｎｏｂｅｎｚｉｄｉｎｅ）（ＤＡＢ）（Ｄａｋｏ）を用いて、目に見えるようにした。切片を、ヘマトキシリン−エオシン（Ｓｉｇｍａ）を用いて対比染色した。特異性を、一次抗体の代わりに通常のウサギ血清用いて切片をインキュベートすることにより分析した。
【００９１】
ＭＡＩＤＳマウスについての増殖アッセイ
増殖アッセイを１００μｌ容積の平坦底面９６穴ミクロタイタープレート中で、１ｍｌ当たり０．１×１０６個のＣＤ３＋ Ｔ細胞のインキュベートにより行った。引き続き、活性化を、ヒツジ抗マウスＩｇＧ（Ｄｙｎａｌ， ｃａｔ． ｎｏ． １１０．０２）を細胞：ビーズ比として１：１でコートした単分散磁性ビーズを添加し、次いで、提示された実験について４μｇ／ｍｌの最終希釈度で抗ＣＤ３（クローン２Ｃ１１）を添加することにより達成した。抗体の最適濃度を初期設定の段階で慎重に滴定し、いくつかの異なった抗体希釈度での並行実験を常に行った。増殖は、７２時間細胞をインキュベートすることにより分析したが、その間において、［３Ｈ］−チミジン（０．４μＣｉ）を最後の４時間において含有させ、細胞回収器（ｃｅｌｌ ｈａｒｖｅｓｔｅｒ， Ｓｋａｔｒｏｎ， Ｓｔｅｒｌｉｎｇ， ヴァージニア州， 米国）を用いてガラス繊維フィルター上に捕集した。
【００９２】
取り込まれた前駆物質をシンチレーション分析器（Ｔｒｉ−Ｃａｒｂ， Ｐａｃｋａｒｄ， Ｍｅｒｉｄｅｎ，コネティカット、米国）でカウントした。ｃＡＭＰ類似化合物を使用した場合、その添加後３０分してから、抗ＣＤ３抗体の添加により活性化した。８−ＣＰＴ−ｃＡＭＰはＳｉｇｍａ（Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ミズーリ州）から入手し、ＳＰ−およびＲＰ−８−Ｂｒ−ｃＡＭＰはＢｉｏＬｏｇ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｂｒｅｍｅｎ， ドイツ）から入手し、すべて４〜１０ｍＭの濃度までＰＢＳに溶解し、濃度は、供給メーカーにより与えられる吸光係数を用いて計算した。インドメタシンを水に溶解し、５０ｎｇ／ｍｌの濃度で用いた。
【００９３】
ＰＧＥ２定量
対照および感染マウス由来のリンパ節細胞について、４８時間−培養の上澄み液５００μｌをピペットで１．５ｍｌのポリプロピレン製試験管に採取し、５００μｌの水：エタノール（１．４）および１０μｌの氷冷酢酸を加えた。試験管を穏やかに混合し、５分間室温で放置した。この後、２５００×ｇで２分間遠心分離した。上澄み液を回収し、２カラム容積分の１０％エタノールで詰めたＡｍｐｒｅｐ Ｃ１８ミニカラムに通した。その後、カラムを１容積分のＨ２Ｏおよび１カラム容積分のヘキサンで洗浄した。その後、ＰＧＥ２を２×０．７５ｍｌの酢酸エチルで溶出した。溶出画分を集め、窒素下で乾燥するまで蒸発させた。最終的に、各画分を１００μｌのアッセイ緩衝液に再び戻して、ＰＧＥ２を、メーカーによって推奨されているＡｍｅｒｓｈａｍ ＥＩＡキットを用いてアッセイした。
【００９４】
統計解析
２群の個体の比較のために、Ｍａｎｎ−ＷｈｉｔｎｅｙのＵ検定（両側の）を用いた。相関係数（ｒ）をスピアマン（Ｓｐｅａｒｍａｎ）の順位検定により計算した。統計的解析および曲線適合（ｃｕｒｖｅ−ｆｉｔ）解析を、それぞれスタティスティカ（Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａ）（Ｓｔａｔｓｏｆｔ Ｉｎｃ．， Ｔｕｌｓａ， ＯＫ）およびシグマプロット（Ｓｉｇｍａ Ｐｌｏｔ）（Ｊａｎｄｅｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ， Ｅｒｋｒａｔｈ， ドイツ）ソフトウェアパッケージを用いて行った。結果は中央値（ｍｅｄｉａｎ）および２５位−７５位の百分位数として与えられ、特にことわらない限り、ｐ値は両側であり、０．０５より小さい時には有意と見なされる。
実験
ＭＡＩＤＳ感染は、ＣＤ４＋ Ｔ細胞において上昇したｃＡＭＰを誘導する−
ＭＡＩＤＳ発症の原因となる、ＲａｄＬＶ−Ｒとして知られたレトロウィルスの混合物を接種したマウスを、感染後異なった時点で犠死せしめ、リンパ節細胞を、フローサイトメーター／セルソーター装置を用いて、ネガティブな選択により純粋なＢ細胞ならびにＣＤ４＋およびＣＤ８＋ Ｔ細胞に選別した。細胞内のｃＡＭＰレベルを感染後の様々な細胞集団群で評価した。図１に見られるように、ｃＡＭＰレベルは、感染して数週間後のＣＤ４＋ Ｔ細胞中において顕著に増大した（２０倍以上）。後の段階でもＢ細胞のｃＡＭＰレベルも増大したが、これに対しＣＤ８＋ Ｔ細胞では僅かな変化が観察されただけであった。さらに、ＣＤ４＋ Ｔ細胞をポジティブなソーティングによりＴｈｙ−１．２＋およびＴｈｙ−１．２−細胞に分離すると、Ｔｈｙ−１．２−細胞ではｃＡＭＰレベルの大きな変化があることが明らかになった（図２、６倍）。両細胞集団群を非感染マウスから集めて来ると、この正常には「低」が多い集団群も、Ｔｈｙ−１．２＋のそれらに匹敵するよりも高いｃＡＭＰ基底レベルを示した。
【００９５】
界面活性剤で可溶化した抽出物の細胞核の後の（ｐｏｓｔｎｕｃｌｅａｒ）上澄み液におけるＰＫＡホスホトランスフェラーゼ活性の分析により、ｃＡＭＰ依存キナーゼ活性の全レベルはＭＡＩＤＳリンパ節細胞において減少したが、ｃＡＭＰが存在しない場合には活性の僅かな変化が観察されただけであることが明らかとなった（図３Ａ）。これは、慢性的な活性化、およびＣサブユニットの分解またはＣの転移のいずれかをもたらすＰＫＡの分離と矛盾しない。ｃＡＭＰ結合の評価（図３Ｂ）は、ＰＫＡ Ｒサブユニットの全レベルの変化はないことを明らかにした。ＭＡＩＤＳおよび対照マウスのリンパ節細胞の免疫細胞化学は、細胞核における免疫反応性ＰＫＡ Ｃサブユニットレベルの上昇を明らかにした（図４）。これも、ＭＡＩＤＳにおけるｃＡＭＰ−ＰＫＡ経路の活性化と矛盾しない。
【００９６】
ＰＫＡタイプＩアンタゴニストはＭＡＩＤＳ Ｔ細胞のＴ細胞増殖を向上させる−
ＴＣＲ／ＣＤ３−誘導Ｔ細胞増殖の阻害に与える、上昇したｃＡＭＰおよびＰＫＡの活性化の効果を調べるために、ＰＫＡタイプＩに対して充分なアンタゴニストとして作用する、硫黄置換したｃＡＭＰ類似化合物（Ｒｐ−８Ｂ−Ｂｒ−ｃＡＭＰＳ）を使用した（Ｇｊｅｒｔｓｅｎ， Ｍｅｌｌｇｒｅｎ， ら １９９５年 １６６５／ｉｄ）。図５Ａは、ＭＡＤＩＳ感染マウス由来のＴ細胞において、ＴＣＲ／ＣＤ３刺激による増殖が、非感染対照マウスＴ細胞（図５Ｂ）のそれの１０％未満であることを示す。さらに、ＰＫＡタイプＩアンタゴニストの効果をＭＡＩＤＳ Ｔ細胞で評価すると、より高い濃度では４倍を超えるというＴＣＲ／ＣＤ３誘導性の増殖について、濃度依存性の増加が観察された（図５Ａ）。しかしながら、対照Ｔ細胞の処理では刺激は観察されなかった（図５Ｂ）。１１匹のＭＡＩＤＳ感染マウスを見ると、対照と比較して、すべてＴ細胞増殖を著しく減少させており（ｐ＜０．００１）、１１匹のうち１０匹のマウスで、ＰＫＡタイプＩアンタゴニストはＴ細胞増殖を改善させた（ｐ＜０．０１； 中央値 ２．２倍， 表５）。ｃＡＭＰアンタゴニストの刺激効果は使用した最も高濃度においても飽和していない（表５のすべてのマウスについて、図５Ａおよび同様のデータ（未表示）を得た）。このことは、化合物の溶解性、細胞に対する親和力または利用可能性が、観察された効果に対する制限因子であるかもしれないということを示す。したがって、より透過性でしかも強力であるＰＫＡタイプＩアンタゴニストが入手できるならば、ＭＡＩＤＳ Ｔ細胞のＴＣＲ／ＣＤ３誘導性増殖をさらに改善させるかもしれない。
【００９７】
次に、ＴＣＲ／ＣＤ３−誘導のＴ細胞増殖に与える、ｃＡＭＰアゴニストの効果を、５匹のＭＡＩＤＳ感染マウスおよび４匹の対照で検討した。ＭＡＩＤＳ感染マウス由来のＴ細胞は、外部から添加した８−ＣＰＴ−ｃＡＭＰにより、細胞増殖阻害に対する感受性において明らかな変化を示した（図５Ｃおよび表５）。さらに、ＭＡＩＤＳ感染マウス由来のＴ細胞および対照Ｔ細胞の最大増殖速度を１００％に正規化すると（図５Ｃおよびデータ未表示）、左方にシフトしたｃＡＭＰ阻害曲線に加えて、それらの曲線の傾きが著しく異なった（正常のＴ細胞についてのＨｉｌｌ係数２．２（１．９〜２．５）に対して、ＭＡＩＤＳマウス由来のＴ細胞についてのＨｉｌｌ係数０．６（０．５４〜１．５２）、表５、ｐ＜０．０５）。
ｃＡＭＰ類似化合物によって阻害への感受性が上昇したことは、外から加えたｃＡＭＰ類似化合物に対するＡサイト親和性が後に上昇することとともに、ＰＫＡタイプＩのｃＡＭＰ結合サイトＢを初回刺激（ｐｒｉｍｅ）することにおいて、増加した内因性ｃＡＭＰからの寄与を示唆する。
【００９８】
曲線の傾きが、８−ＣＰＴ−ｃＡＭＰにより、協同的な２−リガンドサイト結合（２−ｌｉｇａｎｄｓｉｔｅ ｂｉｎｄｉｎｇ）の状況から、見かけの非協同的な阻害曲線へシフトすることも、又、増加した内因性ｃＡＭＰによるＢサイトの占有を示している。
【００９９】
【表５】
2004510705.tif 000014
【０１００】
【実施例２】
環状ＡＭＰが誘発したＭＡＩＤＳのＴ細胞機能不全は、ＣＯＸ‐２レベルの増加とともにＣＤ１１ｂ−陽性細胞による増大したＰＧＥ２産生による
ＭＡＤＩＳにおけるＰＧＥ２の増大した産生−
混合リンパ節細胞集団群をＭＡＩＤＳ感染マウスおよび対照マウスから分離し、インビトロで培養した。ＰＧＥ２の分泌レベルを４８時間培養後の培地上澄み液で評価すると、ＭＡＩＤＳ感染細胞が対照細胞の７〜８倍も多いＰＧＥ２を分泌することが明らかとなった。
【０１０１】
ＭＡＩＤＳにおいてＰＧＥ２産生の阻害は、Ｔ細胞の増殖を回復させる−
次に、混合リンパ節細胞を抗ＣＤ３抗体によって活性化し、Ｔ細胞の増殖を誘導した。［３Ｈ］−チミジンの取り込みを７２時間後に調べた。ＭＡＩＤＳ感染マウス由来の細胞の増殖もまた非感染細胞のＴ細胞増殖の１０〜２０％だけであった。しかしながら、混合培養においてインドメタシンを培地に添加してＰＧＥ２の産生を阻害すると、これは、ＭＡＩＤＳ感染マウス（５匹）由来の細胞の増殖を、対照マウスに匹敵するレベルまで強力に増大させた（図６）。１０匹の追加したＭＡＩＤＳ感染マウスを見ると（表６）、混合リンパ球培養のＴ細胞の増殖に与えるインドメタシンの効果は、極めて有意であった（ｐ＜０．０１）。対照的に、インドメタシンで対照培養を処置しても、増殖を変えなかった。
【０１０２】
ＣＯＸ−２がＭＡＩＤＳ感染マウスのリンパ節において高レベルで発現する−
構成的に発現されるＣＯＸ−１は、ＰＧＥ２を産生するシクロオキシゲナーゼ活性の通常の源である。しかしながら、ＣＯＸ−１の増加が、ＰＧＥ２の増大したレベルを説明し得るほどにＭＡＩＤＳマウス中では見られなかった（データ未表示）。ＣＯＸ−２の発現は、通常、脳／脳プロセス、関節炎滑液および組織の損傷部分に限定される。ＣＯＸ−２は、たとえば、対照リンパ球について図８（上の図）に示されたように、リンパ節またはリンパ球では見出されない。驚くことに、ＭＡＩＤＳ感染マウス由来の粗リンパ節細胞は、高レベルにＣＯＸ−２を発現することが分かった（図８、下の図）。さらに、ＭＡＩＤＳリンパ節から、Ｂ細胞と同様、ポジティブに選択されたＣＤ４＋およびＣＤ８＋ Ｔ細胞は、高いレベルのＣＯＸ−２を含有していた。対照的にネガティブに選択されたＣＤ１１ｂ−細胞は、低レベルのＣＯＸ−２だけしか含有しなかった。
【０１０３】
ＭＡＩＤＳ感染マウスおよび対照マウス由来のＣＤ４＋およびＣＤ８＋ Ｔ細胞ならびにＢ細胞（Ｂ２２０マーカー）をフローサイトメトリーにより調べると、ＣＤ１１ｂマーカーは、通常ＴまたはＢ細胞上には発現されないことが明らかであった。しかしながら、ＭＡＩＤＳ感染マウス由来のＣＤ４＋ Ｔ細胞とＢ細胞との両方の正確な分画は、ＣＤ１１ｂ明（ｂｒｉｇｈｔ）（標識Ｒ１を“ゲート（ｇａｔｅ）”する）であり、ＣＤ８＋ Ｔ細胞のみならずＣＤ４＋ Ｔ細胞とＢ細胞の追加プールは、ＣＤ１１ｂの暗（ｄｉｍ）（標識Ｒ２を“ゲート”する）であった。このことは、これらの細胞が有意ではあるが低レベルのＣＤ１１ｂ発現を有することを示している。したがって、ＭＡＩＤＳ感染ＣＤ４＋およびＣＤ８＋ Ｔ細胞の部分集団は、それぞれＣＤ１１ｂ明、および暗（ｂｒｉｇｈｔ ａｎｄ ｄｉｍ）であるが、これに対しＢ細胞の大部分は陽性であった。ＣＤ１１ｂ＋細胞はＣＯＸ−２を発現し、ＣＤ１１ｂ−細胞は発現しないという事実とを考え合わせると、これは、ＭＡＩＤＳ感染マウスに由来するリンパ節のＢ細胞とＴ細胞との両方がＣＯＸ−２を発現するということを示す。
【０１０４】
ＭＡＩＤＳ感染マウス由来の無処置のリンパ節を免疫組織化学により調べると、ＭＡＩＤＳ（感染後１９週）において、全体の構造は、対照マウスと比較すると胚中心の喪失でもって変更されていることが明らかである（図１０、ｃ対ａ）。ＣＯＸ−２について免疫染色したスライドグラスを高倍率で見れば、対照動物由来のリンパ節は、マクロファージに取り込まれた物質における、褐色ＨＲＰ染色（偽りの陽性「薄染色できる実体」、図１０ｂ）を示すだけであるのに対し、ＭＡＩＤＳにおけるリンパ節細胞の大部分は、ＣＯＸ−２に対して陽性に染色することは明らかである（図１０ｄ）。
【０１０５】
【表６】
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【０１０６】
【実施例３】
ＨＩＶ患者は、インビボで非選択的なＣＯＸ阻害剤で治療されると、効果をかろうじて示すだけである
方法
ＨＩＶ患者由来の末梢血ＣＤ３＋ Ｔ細胞のネガティブな選択
末梢血ＣＤ３＋ Ｔ細胞を、健常者ドナーからのバフィーコート（ｂｕｆｆｙｃｏａｔｓ）からネガティブ選択により精製した（Ｕｌｌｅｖａａｌ 大学病院血液センター、 オスロ、 ノルウェー）。随時、末梢血の単核細胞を密度勾配（Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ， ＮｙｃｏＭｅｄ， オスロ， ノルウェー）遠心分離法により分離し、次いで、ＣＤ１４およびＣＤ１９に対する抗体で直接コートした単分散の磁気ビーズと、ＣＤ５６に対する抗体でコートしたラット抗マウスＩｇＧビーズと磁石とを用いてネガティブ選択した。磁気ビーズはすべてＤｙｎａｌ（オスロ， ノルウェー、それぞれｃａｔ． ｎｏ． １１１．１２， １１１．０４， および１１０．１１）から入手し、抗ＣＤ５６抗体はＰｈａｒｍｉｎｇｅｎ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， カルフォルニア州， ｃａｔ． ｎｏ． ３１６６０．ｄ）から入手した。すべての工程は４℃で実施した。細胞懸濁液をフローサイトメトリーにより分析し、９０％を超える細胞がＣＤ３＋細胞からなることを示された。
【０１０７】
ＨＩＶ患者のＴ細胞を用いた増殖アッセイ
増殖アッセイを１００μｌ容積の平坦底面９６穴ミクロタイタープレート中で０．７５×１０６個／ｍｌのＣＤ３＋ Ｔ細胞のインキュベーションにより実施した。引き続き、活性化は、ヒツジ抗マウスＩｇＧ（Ｄｙｎａｌ， ｃａｔ． ｎｏ． １１０．０２）を細胞：ビーズを１：１の比率でコートした単分散磁性ビーズを添加することにより達成され、次いで、抗ＣＤ３（クローンＳｐｖＴ３ｂ）を、示された実験について最終希釈度１：１２５０００で添加した。抗体の最適濃度を初期設定の段階で慎重に滴定し、いくつかの異なった抗体希釈度での並行実験を常に実施した。増殖は、細胞を７２時間、インキュベートすることにより分析したが、その間の最後の１６時間［３Ｈ］−チミジンを含有させた。細胞を洗浄し、ガラスフィルター上に捕集し、次いでβ−シンチレーションカウンティングにより分析した。ｃＡＭＰ類似化合物を使用する場合には、抗ＣＤ３抗体の添加により活性化する３０分前に加えた。８−ＣＰＴ−ｃＡＭＰはＳｉｇｍａ（Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ミズーリ州）から入手した。
実験
進行中である第ＩＩ相の臨床試験は、非選択的なＣＯＸ阻害剤（インドメタシン）を用いる短期治療の免疫賦活効果を、ＨＩＶ感染患者由来のＴ細胞上の代理パラメーター（ｓｕｒｒｏｇａｔｅ ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ）に関してテストしている。認可された手順によると、患者は５０ｍｇのインドメタシンを１日に３回（全投与量１５０ｍｇ／日）２週間、０日、１４日、２８日（中止後２週間目）にサンプリングしながら、受けることになっていた。しかしながら、上腹部痛および消化不良などの有害事象、ならびに初期患者間の研究の中断により、この投与量を２５ｍｇのインドメタシンを１日に３回にカットしなければならなかった（全投与量７５ｍｇ／日）。図１１は、研究をこれまで完了した３人の患者（患者１〜患者３）のＴ細胞免疫機能（活性化後の増殖として測定）を示す。
【０１０８】
上の図は開始時（０日）、インドメタシン治療の終了時（１４日）、その２週間後（２８日）におけるＴ細胞活性化後の増殖レベルを示す。見て分かるように、患者１および２は、インビボで投与された非選択的ＣＯＸアンタゴニストによっては免疫機能を増加しなかった。しかしながら患者３におけるＴ細胞の応答は、約２．５倍に増加し、インドメタシン中止後２週間まで持続した。図１１ｂ、下図は、細胞培養においてＰＫＡ−Ｉ選択的ｃＡＭＰアンタゴニスト、Ｒｐ−８−Ｂｒ−ｃＡＭＰとをインビトロでインキュベートした後のＴ細胞の増殖を示す。ｃＡＭＰ媒介によるＴ細胞機能不全の程度は、アンタゴニストによって得られた増殖の逆転から明らかである（上図と下図を比較。すべての時点で、増殖が入院患者１および３で約２倍増加、患者２では効果なし）。インドメタシンが納得できる効果を有しなかったことは図１１から明らかであり、このことは有害事象による投与量の制限のみならず、ＣＯＸ−２選択性の欠如によるものかもしれない。
【０１０９】
【実施例４】
ＨＩＶ患者はインビボで非選択的ＣＯＸ阻害剤の投与した後、かろうじて効果を示す（実施例３の実験の続き）。
方法
使用した方法は実施例３で記載した方法であった。
実験
３剤の併用治療に加えて、インドメタシン２５ｍｇを１日に３回経口的に１４日間受けた進行中の第ＩＩ相臨床試験（実施例３の続き）における７人の患者の結果を図１２に示す。患者１〜３は実施例３で述べた患者に相当する。インドメタシン投与に関わる問題は、上述（実施例３）したように、その投与量を１日３回２５ｍｇまでに制限される有害事象である。この許容される用量で、この非選択的ＣＯＸ阻害剤の効果は限界にある。治療の１４日後、７人の患者のうち２人のみにおいて、Ｔ細胞免疫機能（Ｔ細胞活性化後の増殖として測定した）が明らかに上昇したが、１人の患者は免疫機能が減少し、４人の患者は僅かな変化であった。インドメタシンを中止して２週間後、７人の患者のうち５人は０日目と比べて免疫応答性が上昇した。しかしながら、２人の患者が２倍を超えるＴ細胞増殖の増加を示しただけであった。
【０１１０】
【実施例５】
ＣＯＸ−２阻害剤はインビトロでＭＡＩＤＳ Ｔ細胞の免疫機能を向上させる
方法
増殖アッセイで使用した方法は、実施例１に記載の方法であった。ＰＧＥ２アッセイは実施例１に記載したとおりである。
実験
増殖アッセイ
混合リンパ節細胞を感染後１７週目のＭＡＩＤＳマウスから分離した。細胞を抗ＣＤ３抗体により活性化してＴ細胞の増殖を誘導し、免疫機能の尺度として、［３Ｈ］−チミジンの取り込みを７２時間後に試験した。ＭＡＩＤＳ感染マウス由来の細胞の増殖もまた、非感染細胞のＴ細胞増殖の５〜２０％だけであった（ＭＡＩＤＳの細胞において、２０００〜１２０００ｃｐｍに対して、非感染マウス由来の細胞における平均５５０００ｃｐｍ）。しかしながら、ロフェコキシブ（ｒｏｆｅｃｏｘｉｂ）（図１３）またはセレコキシブ（ｃｅｌｅｃｏｘｉｂ）（図１４）を培養中に添加すると、これにより濃度依存的な様式で、ＭＡＩＤＳ感染マウス由来の細胞増殖は２〜３倍に増加した。これと対照的に、ロフェコキシブまたはセレコキシブを用いる非感染マウス由来の対照培養の処置は、その増殖を増加させなかった（ＣＯＸ−２阻害剤の存在下で、０．８〜１．０倍の増加、すなわち増加しない。表示せず。）。ＭＡＩＤＳマウス由来のＴ細胞において、最大効果の半分（ＥＤ５０）を示すロフェコキシブおよびセレコキシブの濃度は、ロフェコキシブについて約０．０１μＭ、セレコキシブについて約０．０３μＭであった。マイクロモル濃度より下の濃度が効果的であるという事実は、明らかに、観察された免疫応答の増加がＣＯＸ−２の阻害を介しており、ロフェコキシブおよびセレコキシブのマイクロモル濃度においてのみ阻害されるＣＯＸ−１ではないことを示す（Ｗａｒｎｅｒ らの値， １９９９年， ＰＮＡＳ ＵＳＡ， ９６， ｐ７５６３−７５６８）。したがって、阻害されたＴ細胞免疫機能のロフェコキシブおよびセレコキシブによる反転は、混合培養における減少したＰＧＥ２産生となり、それによってＣＯＸ−２の阻害を介してＴ細胞ｃＡＭＰレベルの低下をもたらす。
【０１１１】
ＰＧＥ２産生
ＰＧＥ２レベルに与えるＣＯＸ−２阻害剤ロフェコキシブおよびセレコキシブの効果も分析した。図１５に見られるように、ＭＡＩＤＳマウス由来の粗リンパ節細胞は、健常マウス由来のリンパ節細胞よりも５〜６倍のＰＧＥ２を分泌した（図６も参照）。さらに、感染マウスではＬＰＳに応答したＰＧＥ２レベルは、非感染マウスでの約２倍と対照的に８〜１０倍に増加した。細胞をＣＯＸ−２阻害剤、ロフェコキシブおよびセレコキシブの存在下で培養すると、ＭＡＩＤＳリンパ節細胞のＰＧＥ２分泌は、非感染細胞と同様であった。インドメタシンの効果（図７の増殖との比較）を対照として含める。
【０１１２】
【実施例６】
ＣＯＸ−２阻害剤はインビボでＭＡＩＤＳ Ｔ細胞の免疫機能を向上させる
方法および実験
感染マウス（感染後１７週目）を、経口的に（すなわち口から）１週間、ヒトへの使用に対して推奨される用量に相当する（ネズミでは７倍高いクリアランスを考慮して）ロフェコキシブの投与量で処置した。ＭＡＩＤＳマウスは通常、拡大されたリンパ節および脾臓とともに免疫増殖症候群を発生する。これによると、未治療の感染動物は、平均脾臓重量１．３ｇおよび集めたリンパ節の平均重量１．７ｇを有していた。対照的に、ロフェコキシブを７日間受けたＭＡＩＤＳマウスは、平均脾臓重量０．８ｇおよび集めたリンパ節の平均重量０．３ｇを有していて、リンパ球増殖の反転を示した。
【０１１３】
結果を図１６に示す。Ｔ細胞免疫機能を、感染した治療および未治療のマウスに由来する粗リンパ節細胞で評価した場合、未治療の感染動物は、抗ＣＤ３誘導性増殖を２０００〜１００００ｃｐｍの範囲（平均７３００ｃｐｍ）で有していたが、これに対して１週間ロフェコキシブを受けた感染マウスは、感染した未治療のマウスと比較して２．７〜５．６倍に増加した、抗ＣＤ３に対するＴ細胞応答を有することは明らかであった。さらに、感染した未治療のマウスは、Ｒｐ−８Ｂｒ−ｃＡＭＰＳの存在下で、抗ＣＤ３誘導性のＴ細胞増殖を増加させたが、この２〜３倍の効果は、ロフェコキシブを用いて処置されたマウスでは失われた。このことは、インビボでロフェコキシブを用いる治療が、ＰＧＥ２レベルを低下させ、Ｔ細胞機能のｃＡＭＰ媒介による阻害を反転させたことを示した。
【０１１４】
【実施例７】
インビボでロフェコキシブまたはセレコキシブを用いたＭＡＩＤＳマウスの治療は抗ＣＤ３に対するＴ細胞応答および免疫応答を増加させる
方法および実験
感染マウスを、ヒトへの使用に対して推奨される用量に相当する投与量で（ネズミでは７倍高いクリアランスを考慮して、それぞれ３および２０ｍｇ／ｋｇ／日）、ロフェコキシブおよびセレコキシブを用いて処置した。非経口的投与を、イントラリピッド中で処方されるＣＯＸ−２阻害剤を腹膜内に注射することにより実施した。結果を図１７に示す。
【０１１５】
Ｔ細胞の免疫機能を、感染して１８〜２０日後の治療および未治療の感染マウスに由来する粗リンパ節細胞で評価すると、未治療の感染動物は抗ＣＤ３誘導性の増殖を１００００ｃｐｍの範囲で有していたが、ロフェコキシブを１８〜２０日間受けた感染マウスは、感染した未治療マウスと比較して、約２倍に増加した抗ＣＤ３に対するＴ細胞応答を有することが明らかであった。同様にセレコキシブは、注射された多くのマウス群由来の細胞において、免疫応答を、未治療の非感染マウスの約３倍を超えるまで向上させた。
【０１１６】
【実施例８】
ＭＡＩＤＳマウスのメロキシカム（ｍｅｌｏｘｉｃａｍ）を用いたインビボ治療はＴ細胞免疫機能を向上させる
方法および実験
感染および健康マウスを２．８ｍｇ／ｋｇ／日のメロキシカムを用いて治療した。このメロキシカムの投与量は、ネズミでは７倍高いクリアランスを考慮すると、ヒトへの使用に対して推奨される用量に相当する。非経口的投与は、水溶性メロキシカム注入化合物で満たされた浸透ポンプを皮下移植することにより実施された。Ｔ細胞機能を評価し、その結果を図１８に示す。
【０１１７】
治療された感染マウスおよび対照の（ＰＢＳ処置された）感染マウスに由来する粗リンパ節細胞において、処置して２週間後にＴ細胞免疫機能を評価すると、ＰＢＳ処置された感染動物は、抗ＣＤ３誘導性の増殖を５００ｃｐｍの範囲で有していたが、メロキシカムを１４日間受けた感染マウスは、ＰＢＳのみを受けた感染マウスと比較して、抗ＣＤ３に対するＴ細胞の免疫応答が有意に増加していることが明らかであった（図１８ａ、１０倍を超える；ｐ＜０．０５）。
【０１１８】
メロキシカムによるインビボ阻害からの解除およびそれによるＣＯＸ−２の再活性化を防止するために、３日のＴ細胞増殖インビトロアッセイ中、メロキシカムを細胞培養に再び添加したとき、メロキシカム治療群の免疫応答は、インビトロでメロキシカムを添加しないもの（ｐ＝０．００５）よりも２倍高く、さらにＰＢＳをインビボで受けたＭＡＩＤＳマウスと比較しても、その効果は有意であった（図１８ｂ、ｐ＜０．０５）。
【０１１９】
対照的に、ＰＢＳをインビボで受け、メロキシカム治療を受けなかったＭＡＩＤＳマウスのみが、ＰＫＡタイプＩ選択性ｃＡＭＰアンタゴニスト、Ｒｐ−８−Ｂｒ−ｃＡＭＰを、抗ＣＤ３刺激混合リンパ節培養にインビトロで添加した場合に、上昇した免疫応答を示した（図１８ｃ）。メロキシカム治療したＭＡＩＤＳマウスにはｃＡＭＰアンタゴニストの効果がないという事実は、インビボのメロキシカム治療がＭＡＩＤＳのｃＡＭＰ誘導の免疫不全を減少させまたは除去し、免疫機能を復原することを示すものである。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、ＭＡＩＤＳ感染後においてＣＤ８＋ （Ａ）、ＣＤ４＋ （Ｂ）およびＢ（Ｃ）細胞におけるサイクリックＡＭＰレベルを示す。単核細胞が、ＭＡＩＤＳで感染したマウスのリンパ節から種々の経過時間で分離され、ＦＡＣＳ−セルソーターを用いるネガティブな選択（ｎｅｇａｔｉｖｅ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）により、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋ およびＢ細胞に単離された。細胞内のｃＡＭＰレベルは、超音波処理およびラジオイムノアッセイにより測定された。バーは、平均値±ＳＤ（ｎ＝３、個々のマウス）を示す。
【図２】図２は、ＣＤ４＋ 集団、Ｔｈｙ−１．２ 陰性および陽性の集団におけるＭＡＩＤＳ ｃＡＭＰ レベルを示す。感染マウス３匹と週齢をマッチさせた対照マウス３匹とからのリンパ節細胞は、ＦＡＣＳ−ソートされ、ＣＤ４＋、Ｔｈｙ−１．２＋（白のバー）およびＣＤ４＋、Ｔｈｙ−１．２−（濃いバー）の集団とし、細胞内ｃＡＭＰレベルは図１と同様に測定した。バーは平均値±ＳＤ（ｎ＝３）を示す。
【図３】図３は、ＭＡＩＤＳマウス 対 野生型マウスについてプロテインキナーゼＡ活性のレベルを示す。（Ａ）マウス脾臓から精製したリンパ節細胞の界面活性剤で可溶化した抽出物におけるキナーゼ活性は、基質として５μＭ ｃＡＭＰの存在（総活性、ハッチバー）または非存在（フリー活性、濃いバー）のＫｅｍｐｔｉｄｅを用いて、分析された。ＰＫＡ特異的プロテインキナーゼ阻害剤（ＰＫＩ， １μＭ）により阻害されないホスホトランスフェラーゼ活性は、ＰＫＡ特異的活性のみを示すために差し引かれた。感染マウス（ＭＡＩＤＳ、ｎ＝４）における活性は、野生型の同腹子のものとの比較で示される。（Ｂ）［３Ｈ−ｃＡＭＰ］ 結合は、（Ａ）と同じ抽出物中で測定し、Ｒモノマーのモル量を算出した。
【図４】図４は、ＭＡＩＤＳおよび野生型マウスの細胞におけるＲＫＡ Ｃ−サブユニットの免疫学的所在決定を示す。対照マウス（上パネル）およびＭＡＩＤＳ感染マウス（下の２個のパネル）からの単核細胞は、サイトスピン（４００×ｇ）によりガラススライドに付着させ、固定してから、非ＰＫＡ−Ｃポリクローナル抗体およびＨＲＰ−結合二次抗体（茶色染色）で免疫染色した。対比染色はヘマトキシリン（クロマチン上で青色染色）による。
【図５】図５は、ＭＡＩＤＳおよび野生型マウスのＴ細胞機能への、ＰＫＡタイプＩアンタゴニスト（抑制因子）、ＲＰ−８−ブロモ−ｃＡＭＰ−ホスホロチオエート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ）（Ｒｐ−８−Ｂｒ−ｃＡＭＰＳ）の効果を示す。ＴＣＲ／ＣＤ刺激したＴ細胞増殖は、ＭＡＩＤＳマウス（Ａ）および非感染の対照マウス（Ｂ）から分離したＴ細胞を用いて評価した。
ＭＡＩＤＳマウス（白丸、点線）および対照マウス（黒丸、実線）から分離したＣＤ３＋ Ｔ細胞のＴＣＲ／ＣＤ３刺激した増殖に対するｃＡＭＰ作動薬（８−ＣＴＰ−ｃＡＭＰ）の濃度増加効果は、同じ実験（Ｃ）で個別に試験した。３つの測定の平均値±ＳＤを示す。表４に取りまとめたデータ（ｎ＝１１）を示す。注：ＣではｃＡＭＰ作動薬の非存在下で引き起こされたＴＣＲ／ＣＤ３増殖が、ＭＡＩＤＳおよび対照の両方のＴ細胞について１００％正規化されたのに対して、ＡおよびＢでは尺度が異なる。
【図６】図６は、インビトロでの、正常およびＭＡＩＤＳリンパ節細胞によるＰＧＥ２の分泌を示す。感染後２０週でのＭＡＩＤＳ感染マウス（濃いバー、ｎ＝９）および、週齢をマッチさせた対照マウス（陰影バー、ｎ＝４）からのソートしていないリンパ節細胞を、完全培地中で４８時間培養し、その後ＥＬＩＳＡにより上清中でのＰＧＥ２の分泌レベルを測定した。
【図７】図７は、正常およびＭＡＩＤＳ感染マウス中の、Ｔ細胞免疫機能に対する非選択的ＣＯＸ阻害剤の効果を示す。カラム１−対照マウス＋抗ＣＤ３、カラム２−対照マウス＋抗ＣＤ３＋インドメタシン、カラム３−ＭＡＩＤＳマウス＋抗ＣＤ３、カラム４−ＭＡＩＤＳマウス＋抗ＣＤ３＋インドメタシン。Ｔ細胞増殖応答は、ソートしていないリンパ節単核細胞の混合集団において、非選択的ＣＯＸ阻害剤であるインドメタシン（５０ｎｇ／ｍｌ）の非存在および存在下で、［３Ｈ］−チミジン取り込みにより評価した。Ｔ細胞活性化は、抗ＣＤ３（ｍＡｂ ２Ｃ１１； ４ｍｇ）の交差連結（ｃｒｏｓｓ−ｌｉｇａｔｉｏｎ）により達成される。バーは、対照（ｎ＝３）およびＭＡＩＤＳ感染（ｎ＝５）マウスによる平均値±ＳＤを示し、表５に付加的データを示す。細胞は、７２時間培養し、その間最後の４時間［３Ｈ］−チミジンを含んだ。
【図８】図８は、正常（Ａ）およびＭＡＩＤＳ感染（Ｂ）マウスにおける、リンパ節リンパ球の異なるサブセットによるＣＯＸ−２の発現を示す。ＣＤ４＋ Ｔ、ＣＤ８＋ ＴおよびＢ細胞は、それぞれＣＤ４、ＣＤ８およびＢ２２０分子の発現に基づいて、ポジティブ選択（ｐｏｓｉｔｉｖｅ　ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）によりＦＡＣＳソートした。ＣＤ１１ｂ−細胞は、ネガティブ選択（ＣＤ１１ｂ不存在に基づく）によりソートした。ＭＡＩＤＳ感染および正常マウスからの細胞は、次いで溶解させ、各サンプルからのタン白質１０μｇをＣＯＸ−２の発現の免疫ブロット分析に供した。対照としてブロットは、アクチンに対する抗体と同時に反応させた。
【図９】図９は、ＭＡＩＤＳおよび野生型リンパ節細胞中でのＣＤ１１ｂの発現を示す。ＭＡＩＤＳ感染および対照マウスからの、リンパ節リンパ球（ＣＤ４＋、ＣＤ８＋ Ｔ細胞、および、Ｂ２２０＋ Ｂ細胞）の異なるサブセットリンパ球によるＣＤ１１ｂの発現を示す（フローサイトメトリーによる）。Ｒ１：ＣＤ１１ｂ高、Ｒ２：ＣＤ１１ｂはっきりしない、Ｒ３：ＣＤ１１ｂ−。
【図１０】図１０は、ＭＡＩＤＳ感染マウスおよび野生型マウスのリンパ節におけるＣＯＸ−２の発現のレベルを示す。リンパ節は、凍結切片を作成し、ＣＯＸ−２免疫組織化学染色（茶色染色）に供した。（ａ）ＣＯＸ−２について染色された胚中心を有する正常な対照リンパ節。（ｂ）高い倍率で拡大した正常なリンパ節。ＨＲＰ−発色反応で陽性に染色される細胞は、取り込まれた物質を有する「染色できる実体」のマクロファージ（矢印）である。ｃ． ＭＡＩＤＳ感染マウス（感染後２０週）からのリンパ節。注：変形した形態と構造　ｄ． ＣＯＸ−２について染色されたＭＡＩＤＳリンパ節の高倍率拡大。注：細胞質が茶色に染色した細胞多数および多数の有糸分裂像。
【図１１】図１１は、ＨＩＶ感染患者のＴ細胞免疫機能への、非選択的ＣＯＸ阻害剤のインビボ投与の効果を示す。Ｔ細胞増殖応答は、第ＩＩ相の臨床試験に参加しており３剤併用治療に加えて、インドメタシン２５ｍｇを１日３回、１４日間経口的に摂取した患者３名（ｐａｔ． １から３）について、ＣＤ３＋ Ｔ細胞中における［３Ｈ］−チミジン取り込みで評価した。上のパネルは、０日、１４日（２週間の処置後）および２８日（中止して２週間後）におけるＴ細胞免疫機能を、カラム１、２および３としてそれぞれ標識して示す。Ｔ細胞活性化は、抗ＣＤ３（ｍＡｂ　ＳｐＶＴ３ｂ）の交差連結（ｃｒｏｓｓ−ｌｉｇａｔｉｏｎ）により達成される。Ａ：Ｔ細胞活性化後の基底増殖；　Ｂ：Ｒｐ−８−Ｂｒ−ｃＡＭＰ（１ｍＭ）存在下での増殖；　注：ｃＡＭＰ仲介免疫欠損の程度は、上と下のパネルの比較から明らかである。バーは、３回の測定の平均値±ＳＤを示す。細胞は７２時間培養し、その間、最後の１６時間は［３Ｈ］−チミジンを含ませた。
【図１２】図１２は、図１１と同様であるが７人のＨＩＶ感染患者の、Ｔ細胞増殖への、非選択的ＣＯＸ阻害剤インドメタシンのインビボ投与の効果を示し、患者１から７はそれぞれ、黒丸、白丸、黒三角、白三角、黒正方形、白正方形、および黒菱形により表示する。３回測定の平均値がプロットされ、結合線は各患者の進展を示す。
【図１３】図１３は、ＣＯＸ−２特異的阻害剤であるロフェコキシブの、ＭＡＩＤＳ感染マウスにおけるＴ細胞免疫機能への効果を示す。Ｔ細胞増殖応答は、ソートしていないリンパ節単核細胞の混合集団において、ＣＯＸ−２選択的阻害剤であるロフェコキシブの非存在下および濃度が増加する（１．９から５００ｎＭ）存在の条件下で、［３Ｈ］−チミジン取り込みにより評価した。Ｔ細胞活性化は、抗ＣＤ３（ｍＡｂ ２Ｃ１１； ４μｇ／ｍｌ）の交差連結反応により達成される。３回測定の平均値は、Ｓ字型適合曲線とともに示される。細胞は、７２時間培養し、その間、最後の４時間は［３Ｈ］−チミジンを含ませた。
【図１４】図１４は、ロフェコキシブに係る図１３の記載のように、ＣＯＸ−２特異的阻害剤であるセレコキシブの、ＭＡＩＤＳ感染マウス中でのＴ細胞免疫機能への効果を示す。
【図１５】図１５は、対照マウス（１）またはＭＡＩＤＳマウス（２）について、生体外での（ｅｘ ｖｉｖｏ）リンパ節（ＬＮ）細胞によるＰＧＥ２分泌に対するロフェコキシブおよびセレコキシブの効果（インドメタシンと比較した）を示す。ソートしていないＬＮ細胞を、完全培地中で、ＰＧＥ２誘導剤であるリポポリサッカライド（ＬＰＳ；４μｇ／ｍｌ）、非選択的シクロオキシゲナーゼ阻害剤であるインドメタシン（５０ｎｇ／ｍｌ）およびＣＯＸ−２特異的阻害剤であるロフェコキシブ（０．１２５μＭ）およびセレコキシブ（０．１２５μＭ）の存在下または非存在下で培養した。４８時間後、上清におけるＰＧＥ２の濃度をＥＩＡにより測定した。感染マウス（２０週）３個体と、週齢をマッチさせた対照の３個体のプールとを分析した。平均±標準偏差を示す。
【図１６】図１６は、ロフェコキシブを用いたＭＡＩＤＳ感染マウスのインビボ処置の、Ｔ細胞免疫機能に対する効果を示す。ＭＡＩＤＳマウスは、非処置のままであるか（非処置１から３）、あるいはロフェコキシブを心室に挿入した管を経由して、経口で７日間投与して処置した（３ｍｇ／ｋｇ／日、１日１回投与、処置１および２）。続いてＴ細胞増殖応答を、処置および非処置動物からの、ソートしていないリンパ節単核細胞の混合集団について、Ｒｐ−８−Ｂｒ−ｃＡＭＰの非存在下（カラムＡ）および存在下（０．５または１．０ｍＭ、それぞれカラムＢおよびＣ）で、［３Ｈ］−チミジン取り込みによりインビトロで評価した。Ｔ細胞活性化は、全サンプルにおいて、抗ＣＤ３（ｍＡｂ ２Ｃ１１； ４μｇ／ｍｌ）の交差連結（ｃｒｏｓｓ−ｌｉｇａｔｉｏｎ）により達成された。対照は、非感染マウスでのＴ細胞増殖を示す。３回測定からの平均値を示す。細胞は、７２時間培養し、その間、最後の４時間は［３Ｈ］−チミジンを含ませた。
【図１７】図１７は、ロフェコキシブまたはセレコキシブを用いた、ＭＡＩＤＳ感染マウスのインビボ処置のＴ細胞免疫機能に対する効果を示す。ＭＡＩＤＳマウスには、媒体（イントラリピッド）とともに注射した。すなわち、腹腔内注射（３ｍｇ／ｋｇ／日、１日１回投与、ｎ＝６）によりイントラリピッド中のロフェコキシブで、あるいは腹腔内注射（２０ｍｇ／ｋｇ／日、１日１回投与、ｎ＝５）によりセレコキシブで、１８から２０日間処置した。続いて、Ｔ細胞増殖応答を、Ｒｐ−８−Ｂｒ−ｃＡＭＰを用いないこと除き、他は図１６について記載されたようにしてインビトロで評価した。対照は、非感染マウス中のＴ細胞増殖を示す。２５から７５％パーセンタイル値（囲まれた領域）およびメジアン（囲み中の線）とともに、３回測定からの平均値を示す（黒丸）。バーはレンジを示す。
【図１８】図１８は、メロキシカムを用いた、ＭＡＩＤＳ感染マウスのインビボ処置のＴ細胞免疫機能に対する効果を示す。メロキシカム（７０μｇ／動物／日での放出速度）またはリン酸緩衝化生理的食塩水（ＰＢＳ）を有する浸透ポンプ（Ａｌｚｅｔ、１００μｌ）を、ＭＡＩＤＳマウス（感染後１４週）および健康なマウスに１４日間皮下に埋め込んだ。ａ）次いで、Ｔ細胞増殖応答は、図１７に記載のようにインビトロで評価した。各グループにおける平均値±該平均の標準誤差（ｓ．ｅ．ｍ．）を示す。ＭＡＩＤＳマウス（濃いバー）からの細胞の、抗ＣＤ３刺激した増殖へのメロキシカム処置の効果は、ＰＢＳを受けたＭＡＩＤＳマウス（白バー）のものと比較すると有意性がある（ｐ＜０．０５）。ｂ）インビボでメロキシカムまたはＰＢＳで処置したａ）のマウスのグループからの混合リンパ節培養物に、インビトロでメロキシカム（２．５μｇ／ｍｌ）を細胞培養中に再び添加し、抗ＣＤ３誘導Ｔ細胞増殖をａ）のように評価し、そしてインビトロで再度添加したメロキシカムの効果（白バー）をインビトロでの添加のない細胞の応答（濃いバー）と比較した（ｐ＝０．００５）。ｃ）ａ）においてメロキシカムまたはＰＢＳでインビボ処置したマウスグループからの混合リンパ節細胞のインビトロ細胞培養物にＲｐ−８−Ｂｒ−ｃＡＭＰＳ（０．５ｍＭ）を添加し、抗ＣＤ３誘導Ｔ細胞増殖をａ）のように評価した。そして、インビトロでのＲｐ−８−Ｂｒ−ｃＡＭＰＳの効果（白バー）は、インビトロでの添加を受けていない細胞（濃いバー）を超える倍数（ｆｏｌｄ）誘導として表わされた。統計値は、２グループの動物の比較ではＭａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ検定により、また２つの異なる処置をした同一グループの比較ではＷｉｌｃｏｘｏｎ ペアマッチ検定により分析した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004510705.tif 000112
【国際調査報告】
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2004510705.tif 000114
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