(57)【要約】本発明は、細胞内のＨ2Ｏ2濃度を測定し、試験化合物が活性酸素種（ＲＯＳ）を消去する能力を有しているか否かを判定する方法及びキットに関する。本発明の方法及び診断キットは、アグロバクテリウムツメファシエンスのＨ2Ｏ2誘導性KatAプロモータ等、ＲＯＳによって誘導可能なプロモータを含んだ細胞を使用し、このプロモータを利用してレポータ遺伝子の発現を促進させる。レポータ遺伝子の発現レベルは、細胞内のＲＯＳ、特にＨ2Ｏ2の濃度と関連がある。細胞が、細胞内であれ細胞外であれ、試験化合物にさらされたとき、レポータのＲＯＳ誘導性発現レベルが低下することは、その試験化合物がＲＯＳのスカベンジャーであることを意味する。また、本発明の方法は、ＲＯＳ誘導性プロモータに起因してレポータを発現させる細胞の内部にある試験スカベンジャーのライブラリを発現させ、レポータのＲＯＳ誘導性発現レベルを低下させる細胞を選択することによって、新たな或いは改良されたＲＯＳスカベンジャーを選択するために使用されてもよい。ＲＯＳ誘導性プロモータに起因してレポータを発現させる細胞は、それらが自然発生させるＲＯＳ消去能を低減させるよう調節された遺伝的背景を有していてもよい。
2004524025.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
化合物の、ＲＯＳを除去する能力を測定する方法であって、
（ａ）異種のレポータ遺伝子が作動可能に連結されたＲＯＳ誘導性プロモータを含有する細胞を提供することと、
（ｂ）上記細胞を上記ＲＯＳを潜在的に除去可能な化合物にさらすことと、
（ｃ）上記細胞が上記化合物にさらされたときに上記細胞内の上記レポータ遺伝子のＲＯＳ誘導性発現の変化を計測することとを備え、
上記レポータのタンパク質のＲＯＳ誘導性発現の低下によって、上記化合物が上記ＲＯＳを除去可能であることが示される方法。
【請求項２】
複数の核酸の中からＲＯＳを除去可能なタンパク質を符号化する核酸を選択する方法であって、
（ａ）異種のレポータ遺伝子が作動可能に連結されたＲＯＳ誘導性プロモータを含有する複数の細胞を提供することと、
（ｂ）上記細胞に、上記ＲＯＳを潜在的に除去可能なタンパク質を符号化する複数の核酸を含む発現ベクターを導入することと、
（ｃ）上記核酸が発現されたときの上記細胞内のレポータ遺伝子のＲＯＳ誘導性発現の変化を計測することと、
（ｄ）上記レポータ遺伝子のＲＯＳ誘導性発現が低下した細胞を選択することと、
（ｅ）上記レポータ遺伝子の発現が低下した細胞から核酸を単離することとを備え、
上記単離された核酸により、上記ＲＯＳを除去可能なタンパク質が符号化される方法。
【請求項３】
上記ステップ（ｃ）の前に、上記ＲＯＳの細胞内濃度を上昇させるステップをさらに備えている請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
上記細胞は、細胞内濃度が上昇したＲＯＳを含むように遺伝子改変されている請求項１又は２記載の方法。
【請求項５】
上記細胞は、少なくとも１つの自然発生するＲＯＳ除去活性を欠いている請求項１〜４のいずれか１つに記載の方法。
【請求項６】
上記細胞を上記化合物にさらすステップは、上記細胞に対して外部から上記化合物を供給することを備えている請求項１〜５のいずれか１つに記載の方法。
【請求項７】
上記細胞を上記化合物にさらすステップは、上記細胞の内部の核酸から上記化合物を発現させることを備えている請求項１〜５のいずれか１つに記載の方法。
【請求項８】
上記ＲＯＳ誘導性プロモータは、AhpCF、Bcp、Dps、gor、KatA、KatB/AnkB、KatG、TrxB、ヒトＭＡＰキナーゼホスファターゼ１（ＭＫＰ−１）遺伝子、哺乳類hic-5遺伝子、細菌iscオペロン、大腸菌のzwf、fpr、fumC、micF、nfo、soi28及びsodA遺伝子、アゾトバクタービネランジー(Azotobacter vinelandii) spr遺伝子、イネ白葉枯病菌(Xanthomonas oryzae pv oryzae) katX遺伝子、ラット及びヒトヘムオキシゲナーゼ−１（ＨＯ−１）、イースト菌２−デオキシグルコース−６−ホファーテホスファターゼ（ＤＯＧ２）、カタラーゼ、ヒトマンガンスーパーオキシドジスムターゼ（ＭｎＳＯＤ）、ラットグルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、ヒト間質コラゲナーゼ（ＭＭＰ−１）、ヒトグルタチオンペルオキシダーゼ（ＧＰＸ２）、魚類のメタロチオネイン（ＭＴ）、並びにラット多剤耐性型１（ｍｄｒ１）からなる群から選択された遺伝子に由来する請求項１〜７のいずれか１つに記載の方法。
【請求項９】
上記細胞は、カタラーゼ、スーパオキシドジスムターゼ、アルキルヒドロペルオキシダーゼ、及びグルタチオンレダクターゼからなる群から選択された活性酵素を符号化する遺伝子を欠いている請求項５記載の方法。
【請求項１０】
上記活性酵素は、カタラーゼである請求項９記載の方法。
【請求項１１】
上記ＲＯＳは、Ｈ2Ｏ2である請求項１〜１０のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１２】
上記Ｈ2Ｏ2誘導性プロモータは、AhpCF、Bcp、Dps、gor、KatA、KatB/AnkB、KatG、TrxB、ヒトＭＡＰキナーゼホスファターゼ１（ＭＫＰ−１）遺伝子、哺乳類hic-5遺伝子、iscオペロンからなる群から選択された遺伝子に由来する請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
上記細胞は、細菌細胞である請求項１〜１２のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１４】
上記レポータ遺伝子は、細菌内で機能するタンパク質を符号化する請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
上記ステップ（ｃ）の前に、上記細胞を酸性培養状態にさらすことによって上記Ｈ2Ｏ2誘導性プロモータを誘導させるステップをさらに備えている請求項１３又は１４に記載の方法。
【請求項１６】
上記細菌細胞は、アグロバクテリウムツメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens)である請求項１３〜１５のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１７】
遺伝子産物の、ＲＯＳを除去する能力を測定する診断キットであって、
（ａ）異種のレポータ遺伝子が作動可能に連結されたＲＯＳ誘導性プロモータを含有する細胞と、
（ｂ）該細胞に、遺伝子産物を符号化する核酸を導入する手段と、
（ｃ）上記核酸が発現されると、（ａ）の上記細胞内のレポータ遺伝子の発現の低下を測定する命令とを備え、
その命令により、上記遺伝子産物が上記ＲＯＳを除去可能であるか否かが判定される診断キット。
【請求項１８】
上記レポータ遺伝子は、レポータ産物を符号化し、
上記キットは、上記レポータ産物を計測する手段をさらに備えている請求項１７記載の診断キット。
【請求項１９】
上記細胞内のＲＯＳの細胞内濃度を上昇させる手段をさらに備えている請求項１７又は１８に記載のキット。
【請求項２０】
上記細胞は、細胞内濃度が上昇したＲＯＳを含むように遺伝子改変されている請求項１７〜１９のいずれか１つに記載のキット。
【請求項２１】
上記細胞は、少なくとも１つの自然発生するＲＯＳ除去活性を欠いている請求項１７〜２０のいずれか１つに記載のキット。
【請求項２２】
上記ＲＯＳ誘導性プロモータは、AhpCF、Bcp、Dps、gor、KatA、KatB/AnkB、KatG、TrxB、ヒトＭＡＰキナーゼホスファターゼ１（ＭＫＰ−１）遺伝子、哺乳類hic-5遺伝子、細菌iscオペロン、大腸菌のzwf、fpr、fumC、micF、nfo、soi28及びsodA遺伝子、アゾトバクタービネランジー(Azotobacter vinelandii) spr遺伝子、イネ白葉枯病菌(Xanthomonas oryzae pv oryzae) katX遺伝子、ラット及びヒトヘムオキシゲナーゼ−１（ＨＯ−１）、イースト菌２−デオキシグルコース−６−ホファーテホスファターゼ（ＤＯＧ２）、カタラーゼ、ヒトマンガンスーパーオキシドジスムターゼ（ＭｎＳＯＤ）、ラットグルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、ヒト間質コラゲナーゼ（ＭＭＰ−１）、ヒトグルタチオンペルオキシダーゼ（ＧＰＸ２）、魚類のメタロチオネイン（ＭＴ）、並びにラット多剤耐性型１（ｍｄｒ１）からなる群から選択された遺伝子に由来する請求項１７〜２１のいずれか１つに記載のキット。
【請求項２３】
上記細胞は、カタラーゼ、スーパオキシドジスムターゼ、アルキルヒドロペルオキシダーゼ、及びグルタチオンレダクターゼからなる群から選択された活性酵素を符号化する遺伝子を欠いている請求項２１記載のキット。
【請求項２４】
上記活性酵素は、カタラーゼである請求項２１記載の方法。
【請求項２５】
上記ＲＯＳは、Ｈ2Ｏ2である請求項１７〜２４のいずれか１つに記載のキット。
【請求項２６】
上記Ｈ2Ｏ2誘導性プロモータは、AhpCF、Bcp、Dps、gor、KatA、KatB/AnkB、KatG、TrxB、ヒトＭＡＰキナーゼホスファターゼ１（ＭＫＰ−１）遺伝子、哺乳類hic-5遺伝子、iscオペロンからなる群から選択された遺伝子に由来する請求項２５記載のキット。
【請求項２７】
上記細胞は、細菌細胞である請求項１７〜２６のいずれか１つに記載のキット。
【請求項２８】
上記レポータ遺伝子は、細菌内で機能するタンパク質を符号化する請求項２７記載のキット。
【請求項２９】
上記細菌細胞は、アグロバクテリウムツメファシエンスである請求項２７又は２８に記載のキット。
【請求項３０】
上記ＲＯＳ誘導性プロモータは、アグロバクテリウムツメファシエンスのKatA遺伝子に由来する請求項１〜２９のいずれか１つに記載の方法又はキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の参照）
本発明は、本明細書中に内容が引用の形で盛り込まれている、２００１年２月５日出願の米国仮出願第６０／２６６,６５７号の優先権を主張するものである。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、活性酸素消去機能を有する化合物の活性酸素消去能を確認及び／又は測定する方法及びキットに関する。
【０００３】
（発明の背景）
生体の好気的代謝は、ヒドロキシルラジカル、スーパーオキシドアニオン、過酸化水素、一酸化窒素等の活性酸素種（ＲＯＳ）を発生させる。ＲＯＳの生成は、様々な酵素及び非酵素の作用に起因している。好気性生物の場合、ＲＯＳは、酸化的代謝時の分子酸素の水への部分還元によって形成される。細菌細胞は、酸素が末端電子受容体として使用される際の呼吸鎖の産物として、超酸化物又はヒドロキシルラジカルの不均化により、内因性過酸化水素を生成する。腸内細菌（例えば、ネズミチフス菌や大腸菌）は、貪食時のマクロファージによって生成された有毒性のある過酸化水素に遭遇する。
【０００４】
正常な状態では、ＲＯＳは、様々な生体の過程で重要な役割を果たすことができる。しかしながら、一部の異常な状態でＲＯＳが過剰に生産されると、ＤＮＡ、タンパク質及び脂質に対して酸化による損傷を及ぼす虞れがある。
【０００５】
ＲＯＳは、有害な条件だけでなく、多数の様々な病態の病原に関与している。これらの中には、汚染物質や電離放射線に被曝することに加えて、老化、エイズ、アテローム動脈硬化、癌、白内障、うっ血性心不全、糖尿病、炎症性障害、関節リウマチや、アルツハイマー病、パーキンソン病、多発性硬化症、ダウン症候群等の神経変性疾病が含まれる。
【０００６】
生体は、ＲＯＳに対する様々な対処法を生み出している。酵素又は非酵素抗酸化物質のＲＯＳ除去能力は、細胞の酸化ストレスに対する防御を支援することができる。従って、抗酸化物質は、疾病防止に関与し、そのために使用されている。
【０００７】
抗酸化物質は、フェリチン、ラクトフェリチン、トランスフェリチン等のタンパク質や、スーパーオキシドジスムターゼ、カタラーゼ、グルタチオンペルオキシダーゼ等の酵素である。非酵素抗酸化物質は、アルブミン、銅結合セルロプラスミン、ヘモグロビン等の高分子や、ビタミンＣ、尿酸、ビリルビン等水溶性抗酸化物質、ビタミンＥ、カロテノイド、レチノイド、ユビキノール１０等脂溶性抗酸化物質等の小分子である。
【０００８】
しかしながら、これらの自然防御物は、多くの病態で対処することができておらず、酸化ストレスに対処するためには、より強力な抗酸化物質を補完する必要がある。強力な抗酸化物質を特定する選別及び検定方法が必要とされているが、現在の方法は、時間がかかり、費用が高くついている。さらに、生体上での適用により関連が深い細胞内抗酸化物質活性を計測することができない。従って、細胞内抗酸化物質活性を計測可能で、より優れた酸化物質消去分子を探索するために利用可能な単純な方法が、製薬分野及び栄養補助食品分野で非常に重要になっている。
【０００９】
抗酸化物質は、ＲＯＳが引き起こす酸化による損傷を防止することによって健康に役立つことから、栄養補助食品に含まれる自然の抗酸化物質に対する関心が高まっている。抗酸化物質の活性を評価し、様々な抗酸化物質を識別する検定方法を標準化することは有効である。そのような検定方法は、抗酸化物質製品を適正に評価し、特定するのに役立つ。また、そのような検定方法は、補助食品、天然産物及び薬品に使用される抗酸化物質の活性を計測する場合にも役立つ。
【００１０】
ファー(Farr)（米国特許第５，５８５，２５２号、５，８１１，２３１号及び５，５８９，３３７号）は、レポータ遺伝子に融合されたストレスプロモータを使用した毒性の測定を記載している。
【００１１】
カタラーゼは、タンパク質抗酸化物質である。カタラーゼは、過酸化水素の水及び酸素への不均化反応を触媒する。カタラーゼの主要な役割は、核酸、タンパク質、細胞膜等の細胞の成分に対して活性酸素種が引き起こす損傷から細胞を防御することである。カタラーゼは、多細胞生物の感染期間中及び一生の間でさえも一部の病原菌の生存に大きく関与している。
【００１２】
アグロバクテリウムツメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens)は、多数の植物種にクラウンゴール腫瘍を発生させる土壌植物病原体である。カタラーゼを符号化する染色体遺伝子katAは、アグロバクテリウム植物の相互作用中に放出されるＨ2Ｏ2の解毒作用に関連するものであることが確認されている（シュー(Xu)及びパン(Pan)、２０００年）。
【００１３】
（発明の概要）
本発明は、化合物の、ＲＯＳを除去する能力を測定する方法に関する。この方法は、（ａ）異種のレポータ遺伝子が作動可能に連結され、該レポータ遺伝子の発現を促進させるＲＯＳ誘導性プロモータ（ＲＩＰ）を含有する細胞を提供することと、（ｂ）上記細胞を上記ＲＯＳを潜在的に除去可能な化合物にさらすことと、（ｃ）上記細胞が上記化合物にさらされたときに上記細胞内の上記レポータ遺伝子のＲＯＳ誘導性発現レベルの変化を計測することとを備えている。レポータのタンパク質濃度が低下すれば、上記化合物がＲＯＳを除去可能であることを示したことになる。
【００１４】
さらに、本発明は、ＲＯＳを潜在的に除去可能なタンパク質を符号化する核酸を選択する方法に関する。この方法は、（ａ）異種のレポータ遺伝子が作動可能に連結され、該レポータ遺伝子の発現を促進させるＲＯＳ誘導性プロモータを含有する複数の細胞を提供することと、（ｂ）上記細胞に、ｃＤＮＡライブラリ又は核酸が突然変異誘発されたライブラリ内に存在するもの等、上記ＲＯＳを潜在的に除去可能なタンパク質を符号化する様々な核酸を含む発現ベクターを導入することと、（ｃ）上記核酸が発現されたときの上記細胞内のレポータ遺伝子のＲＯＳ誘導性発現の変化を計測することと、（ｄ）上記レポータ遺伝子のＲＯＳ誘導性発現が低下した細胞を選択することと、（ｅ）上記レポータ遺伝子のＲＯＳ誘導性発現が低下した細胞から核酸を単離することとを備えている。そのような手順で単離された核酸によっても、同様に、上記ＲＯＳを除去可能なタンパク質が符号化される。
【００１５】
１つの実施形態では、上記様々な核酸の全てがＲＯＳを除去するタンパク質を符号化する。レポータタンパク質の濃度低下度が最も大きい細胞を選択することにより、最も有効なＲＯＳ除去物質を特定することができる。
【００１６】
本発明の方法は、細胞が外部のＲＯＳ源にさらされることを必要としていない。寧ろ、ＲＯＳ誘導性プロモータを誘導するＲＯＳは、細胞内にあってもよい。１つの実施形態では、ＲＯＳの細胞内濃度が、当分野で公知の方法によって上昇されてもよい。また、Ｈ2Ｏ2等のＲＯＳの細胞内濃度が、酸性のｐＨによって、特に、アグロバクテリウムツメファシエンス等の細菌内の酸性ｐＨによって誘導されてもよい。別の実施形態では、ＲＯＳの細胞内濃度は、遺伝子改変された細胞を使用することで構成的に上昇される。
【００１７】
そのような遺伝子改変を含む細胞は、当分野で公知であり、例えば、細胞の酸化還元平衡を乱すように、呼吸鎖の遺伝子が改変されている。他の遺伝子改変には、カタラーゼ、スーパーオキシドジスムターゼ、アルキルヒドロペルオキシダーゼ、グルタチオンレダクターゼ等、細胞内でＲＯＳを分解又は除去するノックアウト機能の酵素が含まれる。
【００１８】
上記から明らかなように、本発明の方法は、潜在的なＲＯＳ除去用の化合物が細胞を外側からさらす必要もない。寧ろ、化合物、この場合には遺伝子産物は、細胞内の核酸から発現することができる。
【００１９】
好ましい実施形態では、ＲＩＰのレポータを発現させる細胞は、機能的に未変性の遺伝子産物、すなわち、レポータ遺伝子が作動可能に連結されたプロモータに起因して自然に発現を行う遺伝子産物を発現させない。生来の遺伝子機能の欠如により、帰還ループ等のいかなる複雑な機構によっても、化合物のＲＯＳ除去能とＲＩＰのレポータ発現レベルとの間の相関関係が確実に干渉されなくなる。
【００２０】
１つの実施形態では、ＲＯＳ誘導性プロモータは、AhpCF、Bcp、Dps、gor、KatA、KatB/AnkB、KatG、TrxB、ヒトＭＡＰキナーゼホスファターゼ１（ＭＫＰ−１）遺伝子、哺乳類hic-5遺伝子、細菌iscオペロン、大腸菌のzwf、fpr、fumC、micF、nfo及びsodA遺伝子、アゾトバクタービネランジー(Azotobacter vinelandii) spr遺伝子、イネ白葉枯病菌(Xanthomonas oryzae pv oryzae) katX遺伝子、ラット及びヒトヘムオキシゲナーゼ−１（ＨＯ−１）、イースト菌２−デオキシグルコース−６−ホファーテホスファターゼ（ＤＯＧ２）、カタラーゼ、ヒトマンガンスーパーオキシドジスムターゼ（ＭｎＳＯＤ）、ラットグルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、ヒト間質コラゲナーゼ（ＭＭＰ−１）、ヒトグルタチオンペルオキシダーゼ（ＧＰＸ２）、魚類のメタロチオネイン（ＭＴ）、並びにラット多剤耐性型１（ｍｄｒ１）からなる群から選択された遺伝子に由来する。
【００２１】
別の実施形態では、ＲＯＳはＨ2Ｏ2である。Ｈ2Ｏ2除去化合物を特定又は選別することが望ましい場合、Ｈ2Ｏ2誘導性プロモータが使用される。そのようなプロモータは、以下の遺伝子、すなわち、AhpCF、Bcp、Dps、gor、KatA、KatB/AnkB、KatG、TrxB、ヒトＭＡＰキナーゼホスファターゼ１（ＭＫＰ−１）遺伝子、哺乳類hic-5遺伝子、iscオペロンに由来する。
【００２２】
別の実施形態では、上述の方法に使用される細胞は、細菌細胞である。細菌細胞が使用される場合、ＲＯＳ応答性プロモータは細菌内部で機能するように機能する必要があり、レポータ遺伝子は細菌内で機能するタンパク質を符号化する必要があることが判る。同様に、植物細胞、イースト菌細胞又は哺乳類の細胞が使用される場合は、ＲＯＳ応答性プロモータ及びレポータタンパク質は選択された該当する細胞型において機能する必要がある。
【００２３】
また、本発明は、遺伝子産物の、ＲＯＳを除去する能力を測定する診断キットに関する。そのようなキットは、（ａ）異種であることが判っているレポータ遺伝子が作動可能に連結され、該レポータ遺伝子の発現を促進させるＲＯＳ誘導性プロモータを含有する細胞と、（ｂ）該細胞に、遺伝子産物を符号化する核酸を導入する手段と、（ｃ）上記核酸が発現されると、上記細胞内のレポータ遺伝子のＲＯＳ誘導性発現の低下を測定する命令とを備えている。これにより、上記遺伝子産物が上記ＲＯＳを除去可能であるか否かが示される。
【００２４】
本発明のキットは、本発明の方法を実行する構成部品を提供する。従って、１つの実施形態では、キットは、レポータ遺伝子の産物の濃度を計測する手段をさらに備えている。キットは、細胞内のＲＯＳの細胞内濃度を上昇させる手段をさらに備えていてもよい。キットに提供される細胞は、細胞内濃度が上昇したＲＯＳを含むように遺伝子改変されてもよいし、少なくとも１つの自然発生するＲＯＳ除去活性を欠いていてもよい。また、キットの細胞は、カタラーゼ、スーパオキシドジスムターゼ、アルキルヒドロペルオキシダーゼ、グルタチオンレダクターゼ等の活性酵素を符号化する遺伝子を欠いていてもよい。
【００２５】
キット内に含まれるＲＯＳ誘導性プロモータは、AhpCF、Bcp、Dps、gor、KatA、KatB/AnkB、KatG、TrxB、ヒトＭＡＰキナーゼホスファターゼ１（ＭＫＰ−１）遺伝子、哺乳類hic-5遺伝子、細菌iscオペロン、大腸菌zwf、fpr、fumC、micF、nfo、soi28、sodA遺伝子、アゾトバクタービネランジーspr遺伝子、イネ白葉枯病菌katX遺伝子、ラット及びヒトヘムオキシゲナーゼ−１（ＨＯ−１）、イースト菌２−デオキシグルコース−６−ホファーテホスファターゼ（ＤＯＧ２）、カタラーゼ、ヒトマンガンスーパーオキシドジスムターゼ（ＭｎＳＯＤ）、ラットグルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、ヒト間質コラゲナーゼ（ＭＭＰ−１）、ヒトグルタチオンペルオキシダーゼ（ＧＰＸ２）、魚類のメタロチオネイン（ＭＴ）、ラット多剤耐性型１（ｍｄｒ１）等の遺伝子に由来していてもよい。
【００２６】
１つの実施形態では、キットは、特定の化合物のＨ2Ｏ2除去能を測定するために使用される。好ましくは、キットは、AhpCF、Bcp、Dps、gor、KatA、KatB/AnkB、KatG、TrxB、ヒトＭＡＰキナーゼホスファターゼ１（ＭＫＰ−１）遺伝子、哺乳類hic-5遺伝子、iscオペロン等の遺伝子に由来するＨ2Ｏ2誘導プロモータを提供する。
【００２７】
別の実施形態では、上記キットによって提供される細胞は、細菌細胞であり、上記レポータ遺伝子は、細菌内で機能するタンパク質を符号化する。好ましい実施形態では、上記細菌細胞は、アグロバクテリウムツメファシエンスである。
【００２８】
本発明の方法又はキットの好ましい実施形態では、上記ＲＯＳ誘導プロモータは、アグロバクテリウムツメファシエンスのKatA遺伝子に由来する。
【００２９】
（実施形態の詳細な説明）
化合物がＲＯＳを除去可能か否かを判定するため、ＲＯＳ誘導性プロモータ（ＲＩＰ）がレポータ遺伝子に融合され、レポータ遺伝子の発現を促進させる。レポータ遺伝子は、作動可能に連結されるプロモータとは異種である。その後、ＲＩＰ−レポータコンストラクトが細胞に安定的に形質転換される。ある化合物がＲＯＳ除去物質であるか否かを試験するため、上記細胞がその細胞内から試験化合物にさらされる。必要に応じて、ＲＯＳの細胞内濃度が誘導され、細胞内のレポータ遺伝子のＲＯＳ誘導性発現レベルが計測される。細胞が化合物にさらされたときのレポータのタンパク質濃度が低下すれば、その化合物がＲＯＳを除去可能であることを示したことになる。
【００３０】
試験化合物は、ＲＩＰを含有する細胞から発現が起こるのではなく、隣接細胞内で発現が起こるように設けられてもよい。
【００３１】
本明細書中での使用に際し、「活性酸素種」（ＲＯＳ）及び「酸化物質」という表現は、置換え可能に使用され、ヒドロキシルラジカル、スーパーオキシドアニオン、過酸化水素、一酸化窒素等が含まれる。
【００３２】
ＲＯＳ除去化合物は、抗酸化物質又は酸化物質スカベンジャーである。すなわち、これらの化合物は、ＲＯＳを化学的に分解することによって、又はＲＯＳを溶液から隔絶することによって除去する能力を有している。公知のＲＯＳ除去化合物には、フェリチン、ラクトフェリチン、トランスフェリチン等のタンパク質や、スーパーオキシドジスムターゼ、カタラーゼ、グルタチオンペルオキシダーゼ等の酵素が含まれる。非酵素抗酸化物質は、アルブミン、銅結合セルロプラスミン、ヘモグロビン等の高分子や、水溶性抗酸化物質（ビタミンＣ、尿酸、ビリルビン等）、脂溶性抗酸化物質（ビタミンＥ、カロテノイド、レチノイド、ユビキノール１０等）等の小分子である。
【００３３】
好ましい実施形態では、潜在的なＲＯＳ除去能を有する試験化合物は、細胞内で発現されるタンパク質である。それらは、ＲＩＰ−レポータコンストラクトを含有する細胞に対して異種のタンパク質であることが多い。しかしながら、そのような細胞内に自然に存在するポリペプチドも、機能的なポリペプチドを符号化する遺伝子が細胞からノックアウトされている場合は、ＲＯＳ除去化合物として試験されてもよい。
【００３４】
「異種」という表現は、本発明の範囲内では、化合物同士が自然には共存しないことを意味する。例えば、連結されるプロモータと異種のレポータ遺伝子は、そのプロモータが由来する遺伝子の自然のコード配列ではない。
【００３５】
「ベクター」という表現は、特定の宿主細胞内で伝播可能であって、外来性の核酸の挿入断片を収容可能な核酸配列を指す。通常、ベクターは、インビトロで操作して外来性核酸を挿入することができ、そのベクターは、宿主細胞に導入して、挿入された核酸を宿主細胞に一時的又は安定的に存在させることができる。
【００３６】
「発現ベクター」という表現は、挿入された核酸配列を発現させるよう構成されたベクターを指す。そのようなベクターは、核酸挿入部位の上流側の位置に強力なプロモータを含んでいてもよい。
【００３７】
核酸に関連する「発現」という表現は、核酸のｍＲＮＡへの転写及び／又はタンパク質産物への翻訳を指す。
【００３８】
「発現ライブラリ」という表現は、発現ベクター内に挿入断片の形で含まれる核酸断片のライブラリを指す。
【００３９】
「安定的形質転換」という表現は、少なくとも本発明の方法を実行するのに必要な期間中は宿主細胞内に核酸配列が継続的に存在することを指す。安定的形質転換は、宿主細胞染色体へのコンストラクト組込みによって、或いは、宿主（すなわち、人工染色体）内で確実に複製と分離を続ける要素を有するようにコンストラクトを操作することによって達成することができる。或いは、選択的な条件下で（例えば、薬剤含有培地内で）宿主細胞を増殖させることによって細胞内でのコンストラクト持続性が確保されるように、コンストラクトが選択マーカ（例えば、薬剤耐性遺伝子）を含んでいてもよい。
【００４０】
本発明において「細胞」又は「宿主細胞」という表現は、導入されたベクターのレシピエントになることが可能な原核生物又は真核生物起源の細胞を指す。宿主細胞は、内部に存在するベクターの複製と分離を可能にすることが多い。しかしながら、ときには、複製及び／又は分離とは無関係で、ベクター又は挿入ＤＮＡの発現が目的である場合もある。一般的な細菌宿主細胞には、大腸菌、枯草菌、アグロバクテリウムツメファシエンスが含まれる。真菌宿主細胞には、出芽酵母、分裂酵母が含まれる。植物細胞には、シロイヌナズナ、トウモロコシから単離されたものが含まれる。昆虫宿主細胞には、キイロショウジョウバエ、ネッタイシマカ、ハスモントヨウ近似種(S. frugiperda)から単離されたものが含まれる。哺乳類細胞には、メラニン細胞（黒色腫）、大腸（癌腫）、前立腺（癌腫）、脳（神経膠腫、神経芽腫、星状腫）、肝臓（肝細胞腫）等のヒト組織や癌から単離されたものが含まれる。
【００４１】
ＲＯＳ誘導性プロモータは、細胞内のＲＯＳの存在に応答して発現を増大させるプロモータである。多数のＲＯＳ誘導性プロモータが当分野で知られている。それらの中には、AhpCF、Bcp、Dps、gor、KatA、KatB/AnkB、KatG、TrxB、ヒトＭＡＰキナーゼホスファターゼ１（ＭＫＰ−１）遺伝子、哺乳類hic-5遺伝子、iscオペロン、大腸菌zwf、fpr、fumC、micF、nfo、sodA遺伝子、アゾトバクタービネランジー(Azotobacter vinelandii) spr遺伝子、イネ白葉枯病菌(Xanthomonas oryzae pv oryzae) katX遺伝子、ラット及びヒトヘムオキシゲナーゼ−１（ＨＯ−１）、イースト菌２−デオキシグルコース−６−ホファーテホスファターゼ（ＤＯＧ２）、カタラーゼ、ヒトマンガンスーパーオキシドジスムターゼ（ＭｎＳＯＤ）、ラットグルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、ヒト間質コラゲナーゼ（ＭＭＰ−１）、ヒトグルタチオンペルオキシダーゼ（ＧＰＸ２）、魚類のメタロチオネイン（ＭＴ）、ラット多剤耐性型１（ｍｄｒ１）が含まれる。
【００４２】
上記のプロモータの大部分は、異種細胞型内でもある程度機能すると思われる。しかしながら、本発明の方法によれば、細菌内に自然に存在するプロモータは細菌内で使用され、イースト菌プロモータはイースト菌細胞内で使用され、哺乳類プロモータは哺乳類細胞内で使用されることが好ましい。
【００４３】
好ましい実施形態では、ＲＯＳはＨ2Ｏ2である。Ｈ2Ｏ2誘導性プロモータは、AhpCF、Bcp、Dps、gor、KatA、KatB/AnkB、KatG、TrxB、ヒトＭＡＰキナーゼホスファターゼ１（ＭＫＰ−１）遺伝子、哺乳類hic-5遺伝子、iscオペロン等の遺伝子に由来する。
【００４４】
ＲＩＰ−レポータベクターは、レポータの発現が宿主細胞のＲＯＳ濃度をできる限り厳密に反映するように調整される。従って、発現ベクターは、レポータ遺伝子が宿主細胞内で機能するＲＯＳ応答シス制御エレメントの制御下に置かれるように構成される。好ましくは、レポータは、ＲＯＳが存在しない状態では、低レベルに発現される。すなわち、ＲＯＳによる誘導が容易に検出可能であるように、プロモータの基礎活性が低いことが必要である。
【００４５】
遺伝子、その起源の生体、及びジェンバンク(Genbank)受入番号(accession number) の一覧の一部を以下に示す。これらの遺伝子の一部に関する簡単な説明と参照刊行物も示す。
【００４６】
(1)  ミュータンス連鎖球菌(Streptococcus mutans) のアルキルヒドロペルオキシダーゼahpC遺伝子及びＮＡＤＨオキシダーゼ／アルキルヒドロペルオキシダーゼ還元酵素nox1遺伝子、ACCESSION AB010712
(2)  プール肉芽腫(Mycobacterium marinum)のアルキルヒドロペルオキシド還元酵素(ahpC)遺伝子、ACCESSION AF034861
(3)  バクテロイデスフラジリス(Bacteroides fragilis)のアルキルヒドロペルオキシド還元酵素サブユニットＣ(ahpC)遺伝子及びアルキルヒドロペルオキシド還元酵素サブユニットＦ(ahpF)遺伝子、ACCESSION AF129406
(4)  ネズミチフス菌(Salmonella typhimurium)のアルキルヒドロペルオキシド還元酵素(ahpC)及び(ahpF)遺伝子、ACCESSION J05478
(5)  マイコバクテリウムアビウム(Mycobacterium avium)のアルキルヒドロペルオキシダーゼＣ(ahpC)遺伝子、ACCESSION U18263
(6)  結核菌(Mycobacterium tuberculosis)のアルキルヒドロペルオキシダーゼＣ(ahpC)遺伝子、ACCESSION U18264
(7)  マイコバクテリウムスメグマチス(Mycobacterium smegmatis)のアルキルヒドロペルオキシド還元酵素Ｃ(ahpC)遺伝子、ACCESSION U43719
(8)  マイコバクテリウムイントラセルラーレ(Mycobacterium intracellulare)のアルキルヒドロペルオキシダーゼＣ(ahpC)、ACCESSION U71061
(9)  黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)のアルキルヒドロペルオキシド還元酵素サブユニットＣ(ahpC)及びサブユニットＦ(ahpF)遺伝子、ACCESSION U92441 X85029
(10)  大腸菌バクテリオフェリチンコミグラトリータンパク質(bacterioferritin comigratory protein)(bcp)、ACCESSION M63654 M37689
(11)  大腸菌ＤＮＡ結合タンパク質Ｄｐｓ(dps)遺伝子、ACCESSION AF140030
(12)  バクテロイデスフラジリス(Bacteroides fragilis)の非特異的ＤＮＡ結合タンパク質Ｄｐｓ(dps)、ACCESSION AF206033
(13)  シネココックス種(Synechococcus sp.)の栄養ストレス誘導性ＤＮＡ結合タンパク質(dpsA)遺伝子、ACCESSION U19762
(14)  乳酸連鎖球菌(Streptococcus thermophilus)のグルタチオン還元酵素(gor)遺伝子、ACCESSION L27672
(15)  グルタチオン還元酵素を符号化する大腸菌gor遺伝子、ACCESSION M13141
(16)  緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)のグルタチオン還元酵素gor遺伝子（ＥＣ１．６．４．２）、ACCESSION X54201
(17)  アグロバクテリウムツメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens)カタラーゼ(KatA)、SEQ ID NO:1
(18)  Vibrio fischeriカタラーゼ(KatA)遺伝子、ACCESSION AF011784
(19)  緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)カタラーゼイソ酵素Ａ(KatA)遺伝子、ACCESSION AF047025
(20)  アクチノバチラスアクチノミセテムコミタンス(Actinobacillus actinomycetemcomitans)カタラーゼ(KatA)遺伝子、ACCESSION AF162654
(21)  レジオネラニューモフィラ(Legionella pneumophila)カタラーゼ−ペルオキシダーゼ(KatA)遺伝子、ACCESSION AF276752
(22)  黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)カタラーゼ遺伝子、菌株ATCC12600、ACCESSION AJ000472
(23)  ラクトバチルスサケ(Lactobacillus sake)カタラーゼ(KatA)遺伝子、ACCESSION M84015
(24)  根粒菌(Rhizobium meliloti)カタラーゼ(KatA)遺伝子、ACCESSION U59271
(25)  蛍光菌(Pseudomonas fluorescens)プラスミドｐＡＭ１０．６カタラーゼイソ酵素(KatA)、ACCESSION U72068
(26)  ピロリ菌(H.pylori)KatA遺伝子、ACCESSION Z70679
(27)  枯草菌(B.subtilis)２５ｋｂゲノムＤＮＡセグメント（sspEからKatAまで）、ACCESSION Z82044
(28)  緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)パラコート誘導性カタラーゼイソ酵素Ｂ(KatB)、アンキリン(ankB)、ACCESSION U89384
(29)  出芽細菌(Caulobacter crescentus)カタラーゼ−ペルオキシダーゼ(KatG)遺伝子、ACCESSION AF027168
(30)  マイコバクテリウムスメグマチス(Mycobacterium smegmatis)カタラーゼ−ペルオキシダーゼ(KatG)遺伝子、ACCESSION AF196484
(31)  シネココックスＰＣＣ６３０１カタラーゼ−ペルオキシダーゼ遺伝子、ACCESSION AF197161
(32)  カタラーゼ−ペルオキシダーゼ用ライ菌(Mycobacterium leprae)ＤＮＡ、ACCESSION D89336
(33)  カタラーゼＨＰ１を符号化する大腸菌KatG遺伝子、ACCESSION M21516
(34)  ネズミチフス菌(Salmonella typhimurium)ヒドロペルオキシダーゼＩKatG遺伝子、ACCESSION X53001
(35)  結核菌(M.tuberculosis)カタラーゼ−ペルオキシダーゼKatG遺伝子、ACCESSION X68081 S42739
(36)  マイコプラズマボビス(M.bovis)KatG遺伝子、ACCESSION X83277
(37)  マイコバクテリウムスメグマチス(Mycobacterium smegmatis)KatG遺伝子、ACCESSION X98718
(38)  マイコバクテリウムホルツイツム(M.fortuitum)KatGI遺伝子、ACCESSION Y07865
(39)  マイコバクテリウムホルツイツム(M.fortuitum)KatGII遺伝子、ACCESSION Y07866
(40)  マイコバクテリウムスメグマチス(Mycobacterium smegmatis)チオレドキシン還元酵素(trxB)遺伝子及びチオレドキシン(trxA)遺伝子、ACCESSION AF023161
(41)  放線菌(Streptomyces coelicolor)sigT、trxB及びtrxA遺伝子、ACCESSION AJ007313
(42)  クロストリジウムリトラーレ(Clostridium litorale)チオレドキシン還元酵素(trxB)遺伝子及びチオレドキシン(trxA)遺伝子、ACCESSION U24268
(43)  肺炎マイコプラズマ(Mycoplasma pneumoniae)チオレドキシン還元酵素K04_orf315(trxB)遺伝子、ACCESSION U51988
(44)  SodA遺伝子は、スーパーオキシドジムスターゼを符号化し、細胞がパラコート、プラムバギン(plumbagin)、メナジオン、ストレプトニグリン(streptonigrin)、メチレンブルー、メチル硫酸フェナジン等、細胞内にスーパーオキシドラジカルを産生する化学物質にさらされる際に、強く誘導される。SodA遺伝子の誘導は、スーパーオキシドが引き起こす細胞の損傷に必ずしも依存せず、定常状態のスーパーオキシド濃度の増加に依存する。
(45)  soi28遺伝子は、ピルビン酸フラボドキシン酸化還元酵素を符号化する。この遺伝子は、スーパーオキシド産生試薬にのみ誘導される。すなわち、soi28遺伝子は、２個の小さなチオール含有タンパク質であるフラボドキシンとフェレドキシンが酸化したときに誘導される。
(46)  ahp遺伝子は、共に外来性で、共にタンパク質及び脂肪酸の過酸化によって形成された過酸化水素と有機ヒドロペルオキシドとによって誘導される。
(47)  soi17及びsoi19は、スーパーオキシドに応答する（Ｔ．コゴマ(Kogoma)他、１９８８年）。
(48)  zwfは、グルコース−６−ヒドロゲナーゼを符号化し、スーパーオキシド産生化合物と一酸化窒素によって誘導される（グリーンバーグ(Greenberg)他、１９９０年）。
(49)  micFは、耳点遺伝子ompFの翻訳を停止させるアンチセンスＲＮＡを符号化し、スーパーオキシドによって誘導される（グリーンバーグ(Greenberg)他、１９９０年）。
(50)  nfo遺伝子は、ＤＮＡ修復酵素を符号化し、パラコート、メナジオン等の酸化還元活性剤によって特異的に誘導される（ファー(Farr)他、１９９１年）。
【００４７】
ＲＯＳ誘導性遺伝子のヌクレオチド配列が既知であれば、ポリメラーゼ連鎖反応を利用してプロモータとの融合物を生成してもよい。具体的には、遺伝子のＲＯＳ誘導性プロモータ部分の５′端及び３′端に相補性のプライマーを合成し、これらプライマーを変性された全ＤＮＡに適切な条件の下で交雑させ、ＰＣＲを実行する。このようにして、クローニング可能量のあらゆるプロモータの配列を得ることができる。プロモータＤＮＡが得られると、lacZ遺伝子の直上流にポリクローニングサイトを含んだ、大腸菌のｐＲＳ４１５等、適切なベクター内のレポータ遺伝子を符号化するＤＮＡに連結される。レポータ遺伝子を発現させる多数のベクターが当分野で知られており、市販されている。ＰＣＲ法も当分野で公知である。
【００４８】
本発明で使用されるレポータ遺伝子は、所定の細胞内で発現可能でかつ検定可能及び検出可能な遺伝子産物を主として符号化する。レポータ遺伝子は、プロモータに作動可能に結合できるように十分に特徴付けられている必要がある。当分野で使用されるレポータ遺伝子には、大腸菌由来のLacZ遺伝子（シャピロ(Shapiro)、Ｓ．Ｋ．，シュー(Chou)、Ｊ．他、ジーン(Gene)１１月２５日：７１−８２（１９８３））、細菌由来のCAT遺伝子（ティール(Thiel)、Ｇ．，ペーターゾーン(Petersohn)、Ｄ．及びショッホ(Schoch)、Ｓ．、ジーン(Gene)２月１２日；１６８：１７３−１７６（１９９６））、ホタル由来のルシフェラーゼ遺伝子（グールド(Gould)、Ｓ．Ｊ．及びスブラマニ(Subramani)、Ｓ．、１９８８）、クラゲ由来のGFP遺伝子（チャルフィー(Chalfie)、Ｍ．及びプラシュナー(Prashner)、Ｄ．Ｃ．、米国特許第５，４９１，０８４号）、（galK遺伝子によって符号化された）ガラクトースキナーゼ、（gus遺伝子によって符号化された）β−グルコシダーゼが含まれる。これらのレポータ遺伝子は、細胞質内部での遺伝子の発現を監視するために主として使用されている。細胞表面での発現を監視するため、細胞表面マーカに結合した標識抗体（例えば、ＣＤ２０）を使用して、レポータの濃度を定量化してもよい（コー(Koh)、Ｊ．，エンダース(Enders)、Ｇ．Ｈ．他、１９９５）。
【００４９】
これらのレポータのうち、自己蛍光タンパク質（例えば、ＧＦＰ）及び細胞表面レポータは、「生体染料」として作用することから、生細胞の監視用に好ましい。それらの発現は生細胞で評価することができ、その細胞はその後の分析のために無傷で修復させることができる。しかしながら、生体染料は、本発明の方法が特別に必要とするものではない。発現を急速かつ高感度で定量化可能なレポータを採用することも非常に有効である。従って、蛍光レポータ（又はフロオロフォアで直接又は間接的に標識可能なレポータ）が特に好ましい。この特性により、蛍光標示式セルソータ（ＦＡＣＳ）等のフローソータ機によって高スループットのスクリーニングが可能になる。
【００５０】
ＧＦＰは、自然発生の蛍光タンパク質群の一員であり、その蛍光は、主としてスペクトルの緑領域内である。ＧＦＰは、レポータとして使用するために広く開発されており、このタンパク質のいくつかの突然変異型は、改変されたスペクトル特性を持つことを特徴としている。イースト菌からヒト細胞まで及ぶ細胞において、高レベルのＧＦＰ発現が得られている。ＧＦＰは、ＦＡＣＳ等のフローソータ機を用いて、細胞質内での発現を定量的に計測可能な、ロバストで多目的のレポータである。
【００５１】
本発明の診断キット及び方法は、特異なＲＯＳ誘導性プロモータの誘導に依存してレポータ遺伝子の発現を変化させる。この発現レベルの変化は、定性的及び定量的に計測される。本発明のキット及び方法において有用であるためには、当該ストレスプロモータが、レポータ産物を符号化する遺伝子に作動可能に連結される必要がある。
【００５２】
「作動可能連結」という表現は、遺伝子の転写がプロモータによって調節されるように、レポータ産物を符号化する遺伝子に対してプロモータを位置付けることを指す。そのような位置付けは、当分野で公知であり、転写が外来の停止信号によって妨げられないように、かつ、プロモータの開始部位とプロモータの調節配列との間の間隔が転写にとって最適となる遺伝子上流側（５′）にプロモータを位置付けることを必要とする。
【００５３】
未変性遺伝子産物、すなわち、レポータが融合されるプロモータの遺伝子産物のＮ末端部分とレポータ産物が融合したコンストラクトも本発明の範囲内に含まれる。未変性遺伝子産物のレポータに融合された部分が未変性遺伝子産物全長の機能を保持していないことが重要である。
【００５４】
当該ＲＩＰ−レポータコンストラクトを発現させる、従って、本発明の発明及びキットに有効な細菌株の選択は、株が機能レポータを生成可能であることと、株が未形質転換状態でレポータを合成できないことによってのみ制限される。最も好ましくは、使用される株が、ＲＯＳを細胞内で内因的に除去する遺伝子を欠いている必要がある。そのような遺伝子には、カタラーゼ、スーパーオキシドジムスターゼ、アルキルヒドロペルオキシダーゼ、グルタチオン還元酵素を符号化する遺伝子が含まれる。例えば、Ｈ2Ｏ2誘導性プロモータが使用される場合、内生のカタラーゼ遺伝子が細胞内でノックアウト又は突然変異させられて、その細胞がＨ2Ｏ2を内因的に分解する能力を失っているか、或いは低下させていることが好ましい。
【００５５】
本発明の方法及びキットに有用な真核生物細胞には、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(the American Type Culture Collection)（ＡＴＣＣ、メリーランド州ロックヴィル）から入手可能な細胞系及び細胞培養は勿論のこと、初代組織から樹立された細胞系も含まれる。
【００５６】
本発明の方法及びキットは、ＲＯＳ誘導性レポータ発現の低下が検出可能であることに依存して、化合物がＲＯＳを除去可能であるか否かを検定する。これには、発現の低下が検出可能になるように、ＲＯＳ除去化合物が存在しない場合のレポータの発現レベルが十分に高いことが必要である。一部の実施形態では、本発明の方法は、ＲＯＳの細胞内濃度を上昇させることを含んでいる。様々な細胞内ＲＯＳの濃度を上昇させるための方法が公知である。
【００５７】
細菌の場合、グルコース又はグルコース酸化酵素（ＧＯＸ）或いは還元型グルタチオン（ＧＳＨ）をＨ2Ｏ2産生系として用いてＨ2Ｏ2の細胞内濃度を上昇させてもよい（サリーム(Saliim)他、２００１）。アグロバクテリウムの場合、酸性状態によってＨ2Ｏ2の細胞内濃度を上昇させてもよい。哺乳類細胞及びイースト菌の場合、細胞内グルタチオンを枯渇させることで、細胞内ＲＯＳが増加する。少なくとも哺乳類細胞の場合は、ブチオニンスルフォキシミン(buthionine sulfoximine)を投与することによって、グルタチオンを枯渇させることができる。インシュリンによる刺激によっても、インシュリン感受性の肝臓ガン細胞及び脂肪細胞に細胞内Ｈ2Ｏ2が爆発的に発生する（マハデフ(Mahadev)他、２００１）。シロイヌナズナの場合、デキサメタゾンを投与することによってＭＡＰキナーゼが活性化し、Ｈ2Ｏ2が産生される（レン(Ren)他、２００２）。
【００５８】
他の実施形態では、本発明の方法は、細胞内のＲＯＳ濃度が上昇するように遺伝子が改変された細胞を使用することを含んでいる。細菌の場合、大腸菌株では、スーパーオキシドジムスターゼの発現を調節することにより、細胞内のスーパーオキシドが調節される（ゴート(Gort)及びイムレー(Imlay)、１９９８）。イースト菌の場合、チトクロム過酸化酵素、スーパーオキシドジムスターゼ又はＧＳＨ１遺伝子の発現を調節することができる。線維芽細胞の場合、安定的にＮｏｘ１を発現させる細胞が、スーパーオキシド濃度を幾分上昇させるだけでなく、細胞内Ｈ2Ｏ2の産生も著しく増加させる。
【００５９】
代表的な実施形態では、化合物のＨ2Ｏ2除去能についての評価検定が以下の道筋に沿って進行することになる。潜在的なＨ2Ｏ2除去物質を発現させる発現コンストラクトが、アグロバクテリウムツメファシエンス株ＡＧ６等、Ｈ2Ｏ2誘導性プロモータの制御下でレポータ遺伝子を含んだ細胞系に導入される。例えば、細胞を低ｐＨの培地にさらすことにより、細胞内Ｈ2Ｏ2の産生を誘発させることができる。レポータがＧＦＰである場合の蛍光レベルによって示されるように、化合物が存在しない対照細胞と比較して、Ｈ2Ｏ2除去化合物を発現させる細胞内では、レポータタンパク質の濃度が低下することになる。
【００６０】
本発明の一局面は、ＲＯＳを潜在的に除去可能なタンパク質を符号化する核酸を選択する方法に関する。この方法では、上述したＲＩＰ−レポータ遺伝子コンストラクトを含んだ細胞が提供される。ｃＤＮＡライブラリ内の核酸又は核酸を突然変異させたライブラリ内に存在する核酸等、様々な核酸を含有する発現ベクターを使用して細胞が形質転換される。これらの核酸は、ＲＯＳを潜在的に除去可能なタンパク質を符号化する。上述したように、核酸が発現されると、レポータ遺伝子のＲＯＳ誘導性発現の低下が計測される。その後、レポータ遺伝子のＲＯＳ誘導性発現が低下した細胞が選択され、細胞を形質転換させるのに使用される核酸が単離される。この核酸が、恐らくＲＯＳ除去タンパク質を符号化することになる。
【００６１】
「ライブラリ」という表現は、大きさが塩基対数個から約１００万個まで及ぶ核酸断片の集まりを指す。これらの断片は、細菌細胞、真菌細胞、植物細胞、昆虫細胞、哺乳類細胞等、特定の宿主細胞内で伝播可能なベクターに挿入断片として含まれる。
【００６２】
「複数の核酸」という表現は、何らかの源に由来する核酸分子の集合を指す。例えば、複数の核酸には、完全ゲノムＤＮＡ、１つ以上の染色体に由来するゲノムＤＮＡ、完全細胞ＲＮＡ又はメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）から逆転写されたｃＤＮＡ、完全細胞ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、或いは個別に又は方法の組合せによってインビトロで合成された核酸分子の集合が含まれる。複数の核酸は、例えば、１個の発現ライブラリを含んでいると理解される。
【００６３】
セルソータに関して「明るい」及び「薄暗い」という表現は、当該細胞が示す蛍光（又は他の発光形態）の強度レベルを指す。明るい細胞は、細胞の個体群全体に対して相対的に発光強度が高く、推論して、レポータ遺伝子の発現レベルが高い。薄暗い細胞は、個体群全体に対して相対的に発光強度が低い。
【００６４】
「フローソータ」という表現は、細胞又は他の対象からの発光強度を解析し、発光強度等のパラメータに従ってこれら細胞又は対象を分離する機器を指す。
【００６５】
１つの実施形態では、ＧＦＰをレポータタンパク質として用いてＲＯＳ除去タンパク質を選択する方法は以下のとおりである。ＲＯＳ誘導性プロモータ−ＧＦＰ発現コンストラクトが、選択された宿主細胞に導入され、安定した発現体が選択される。このＧＦＰ発現系は、クローニングによって増殖され、明るい緑色の個体群を発生させる。潜在的なＲＯＳ除去物質を符号化するライブラリが宿主細胞に導入され、ＧＦＰ含有細胞の個体群が発生される。その個体群の一部は、さらにＲＯＳ除去物質を発現させる。この個体群がフローソータ装置を用いて検査され、細胞が２個の個体群に分別される。すなわち、ライブラリ挿入断片の導入前の細胞と同じレベルでＧＦＰを継続して発現させる細胞と、ＧＦＰ発現レベルが低下した細胞である。そのような「薄暗い」細胞からＲＯＳ除去物質を符号化する挿入断片が単離され、それら挿入断片は、そのＤＮＡ配列を求めるために使用されるか、或いは別の選択濃縮サイクルのために、ＧＦＰ含有宿主細胞に再導入される。
【００６６】
上述した選択手順について、フローソータ分布図を想定してもよい。選択前のライブラリ挿入断片含有宿主細胞の個体群の蛍光強度は、正規分布となる。この予めソートされた個体群を用いて分布の左端の細胞群が選択される。分布の左側の薄暗い細胞群が選択され、これら細胞の挿入断片が最初の宿主細胞に再導入される。そのような下位ライブラリの配列と形質転換された細胞から発生する蛍光強度分布は、左よりに傾斜する（すなわち、平均蛍光強度が低下する）ことになる。
【００６７】
本発明は、ＦＡＣＳや同等の装置等のフローソータを用いて、潜在的なＲＯＳ除去タンパク質を符号化する発現ライブラリ挿入断片を含有する多数の宿主細胞をスクリーニングし、ＲＯＳを除去可能な細胞、すなわち、レポータ分子の発現レベルが低下した細胞を特定してもよい。ＲＯＳの濃度が高く、ＲＯＳ誘導性プロモータの制御下で存在するレポータ（例えば、ＧＦＰ）を有する宿主細胞は、レポータの発現レベルが本質的に高い。発現ライブラリ挿入断片がこれらの細胞内で発現されると、ＦＡＣＳによって解析される細胞の大多数が、この高いレベルを保持していることが予想される。しかしながら、少数は、発現の低下を示し、ＦＡＣＳにより、細胞蛍光分布の薄暗い側に入る細胞として検出される。これらの薄暗い細胞は、他の細胞から単離して採集し、成長させることができる。そのような手順により、誘導物質ＲＯＳの濃度を効果的に低下させるＲＯＳ除去物質を含んだ細胞が起始細胞個体群から濃縮され、レポータの発現レベルを低下させる。これら選択された薄暗い細胞を利用し、ライブラリ挿入断片と隣接するプライマー部位を用いたＰＣＲによってパーターベイジャン断片を再単離して、レポータ発現を低下させる細胞用に濃縮されたライブラリ挿入断片の下位ライブラリを構築することができる。下位ライブラリの断片を、（例えば、同じ発現ベクターを用いて）再クローニングし、宿主細胞に再導入することができ、スクリーニング又は選択処理を必要な回数だけ繰り返すことができる。
【００６８】
十分な回数のサイクルの後、起始のレポータ含有宿主細胞の蛍光強度分布を、濃縮されたＲＯＳ除去下位ライブラリ挿入断片を宿す宿主細胞と比較し、実質的な差異を観測する必要がある。その手順は、好ましくは、これら２つの蛍光強度分布の間に最小限の重なりが観察されるまで繰り返される必要がある。最終的には、ＦＡＣＳの分別及び循環プロセスにより、レポータの発現を抑止するＲＯＳ除去物質を符号化する核酸の個体群が得られるはずである。これらの核酸を単離し、分子クローニング及びＤＮＡ配列解析によって個別に研究してもよい。
【００６９】
本明細書に記載した発明をより深く理解するため、以下の実施例が示される。これら実施例は例示を目的とするだけであって、本発明をいかなる形にも限定するものとして解釈されるべきではないことを理解されるべきである。
【００７０】
（実施例１）  材料、技術及び検定条件
［株、プラスミド及び成長条件］  この研究に使用される株及びプラスミドを表１に列挙し、説明する。アグロバクテリウムツメファシエンス株は、ＭＧ／Ｌ、ＩＢ又はＡＢ培地（カンゲローシ(Cangelosi)他、１９９１）内で２８℃で成長させ、必要に応じて、カナマイシン１００μｇ／ｍｌ、テトラサイクリン５μｇ／ｍｌ又はカルベニシリン１００μｇ／ｍｌを補充した。大腸菌株は、ＬＢ(Luria-Bertani)培地（サンブルック(Sambrook)他、１９８９）で３７℃で成長させ、必要に応じて、カナマイシン５０μｇ／ｍｌ、テトラサイクリン１０μｇ／ｍｌ又はアンピシリン５０μｇ／ｍｌを補充した。記載どおりに（スアレス(Suarez)他、１９９７）、アグロバクテリウムツメファシエンス株Ａ３４８のmini-Tn5トランスポゾン突然変異誘発をｐＡＧ４０８により実行した。
【００７１】
［サザン分析］  上述したように（チャールズ(Charles)及びネスター(Nester)、１９９３）、アグロバクテリウムツメファシエンス突然変異体ＡＧ６から完全ＤＮＡを抽出した。約１μｇの完全ＤＮＡをClaI又はNruIで消化させた後、０．９％アガロースゲル上で電気泳動させた。その後、そのＤＮＡ断片を転移装置PosiBlot（ストラタジーン(Stratagene)社）を用いてナイロン膜Zeta-Probe GT（バイオラッド(Bio-Rad)社）上に転移させた。拡張化学発光キット（アマシャム(Amersham)社）による無作為の準備刺激により、プラスミドｐＡＧ４０８をプローブとして標識した。標識、交雑及び信号検出は製造者に従って実行された。
【００７２】
［カタラーゼイソ酵素検定］  アグロバクテリウムツメファシエンス株Ａ３４８、ＡＧ６、ＡＧ６（ｐＸＱ２３）、ＡＧ６（ｐＸＱ２６）、ＡＧ６（ｐＸＱ２７）、ＡＧ６（ｐＸＱ１１）及びＡＧ６（ｐＸＱ２２）をＭＧ／Ｌ液体培地内で２８℃で一晩成長させ、濃度１．４ＯＤ600にした。４℃で１０分間４０００ｒｐｍの遠心分離により細胞を収集した。細胞のペレットを洗浄し、燐酸塩０．０５ｍＭ及びＥＤＴＡ０．４ｍＭを含有する５ｍｌの抽出緩衝液（ｐＨ７．８）に再懸濁させた。その細胞を、氷の上で３０秒間６回超音波処理した。その際、超音波処理と超音波処理の各間に氷上で２分間冷却した。４℃で１０分間１１００ｒｐｍの遠心分離により細胞片を除去した。細胞のない上澄みを抽出緩衝液で２倍に希釈し、２０μｌの各希釈抽出物を７．５％未変性ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動させた。分離用ゲル緩衝液をｐＨ８．９ではなく、ｐＨ８．１で調製した。電気泳動を１５０Ｖで３時間実行した。クレア(Clare)他（１９８４）に従った活性染色ステップによって、カタラーゼイソ酵素を可視化した。
【００７３】
［タンパク質解析］  ＳＤＳ／ＰＡＧＥを１０％又は１５％ポリアクリルアミドゲルで実行し、KatA発現とＧＦＰ発現をそれぞれ解析した。タンパク質をImmobilon-P膜（ミリポア(Millipore)社）上に転移させた。KatAタンパク質又はＧＦＰタンパク質を、製造者（アマシャム(Amersham)社）の推奨に従って拡張化学発光（ＥＣＬ）ウェスタンブロット検出装置で可視化した。
【００７４】
【表１】
2004524025.tif 000003
【００７５】
［細胞内Ｈ2Ｏ2濃度計測］  Ｈ2Ｏ2の細胞内濃度を、上述した手順（ゴンザレス−フレッチャ(Gonzalez-Flecha)及びデンプル(Demple)、１９９５；１９９７）に変更を加えて計測した。
【００７６】
手短に言えば、アグロバクテリウムツメファシエンス株Ａ３４８、ＡＧ６及びＡＧ６（ｐＸＱ９）をＡＢ又はＩＢの寒天プレート上で２８℃で２４時間成長させた。その細胞を収集して洗浄し、５０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ７．４）にＯＤ600＝１．０で再懸濁させた。細胞内に発生したＨ2Ｏ2を膜に通し、緩衝液で平衡化した。検定（ゴンザレス−フレッチャ(Gonzalez-Flecha)及びデンプル(Demple)、１９９７）では、１０分以内に、細胞内Ｈ2Ｏ2濃度と細胞外Ｈ2Ｏ2濃度の完全平衡が達成された。平衡から２０分後、細胞懸濁液を４℃、６００ｒｐｍで１分間遠心分離した。
【００７７】
その後、Ｈ2Ｏ2に対して高感受性かつ特定蛍光発生的なプローブ（Ｎ−アセチルー３，７−ジヒドロキシフェノキサジン）と西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）（モハンティ(Mohanty)他、１９９７）を含んだAmplex Red Hydrogen Peroxide Assay Kit（モレキュラー・プローブス・インコーポレーテッド(Molecular Probes Inc.)、ＵＳＡ）で上澄みのＨ2Ｏ2濃度を計測した。手短に言えば、ＨＲＰ１００μＭ及び１Ｕ／ｍｌにおいて、上澄み１００μｌをプローブ１００μｌと混合させた。９６穴のマイクロプレートで蛍光発生検定を実行し、発光分光計ＬＳ５０Ｂ（パーキン・エルマー(Perkin Elmer)）により計測した。励起波長は５４０ｎｍであり、発光波長は５９０ｎｍであった。検定は４回行った。その後、同時に作成されたＨ2Ｏ2検量線に基づいて濃度を算出した。
【００７８】
［カタラーゼ活性検定］  Amplex Red Catalase Assay Kit（モレキュラー・プローブス・インコーポレーテッド(Molecular Probes Inc.)、ＵＳＡ）を用いること以外は上述のとおりに（マシバー(Maciver)及びハンセン(Hansen)、１９９６）、全ての細菌細胞のカタラーゼ活性を求めた。手短に言えば、アグロバクテリウムツメファシエンス株をＩＢプレート上で２８℃で２４時間成長させた。その細胞を収集して洗浄し、５０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ７．４）にＯＤ600＝１．０で再懸濁させた。野生型KatAを有する株（Ａ３４８、ＡＧ６（ｐＸＱ９）及びＡＧ６（ｐＸＱ２３））については、各サンプルの細胞懸濁液１００μｌを０秒、３０秒、１分及び２分の時間間隔で５０μｌ、４０μＭのＨ2Ｏ2で培養した。
【００７９】
KatA突然変異体を有する株（ＡＧ６、ＡＧ６（ｐＸＱ１１）、ＡＧ６（ｐＸＱ２２）、ＡＧ６（ｐＸＱ２６）及びＡＧ６（ｐＸＱ２７））については、各サンプルの細胞懸濁液１００μｌを０分、１分、２分及び６分までの時間間隔で５０μｌ、５μＭのＨ2Ｏ2で培養した。上記キットが供給する２５μＭ、０．４Ｕ／ｍｌの西洋わさびペルオキシドについてAmplex Red試薬Ｎ−アセチルー３，７−ジヒドロキシフェノキサジン５０μｌを加えることによって、細菌カタラーゼによる分解後に残ったＨ2Ｏ2量を求めた。細胞内Ｈ2Ｏ2の計測に関する上記の記述と同じ手順で蛍光定量検定を行った。Ｈ2Ｏ2が添加されていない細胞懸濁液をブランクとして使用した。結晶性ウシカタラーゼ（シグマ(Sigma)社）の溶液を用いてこの検定を標準化した。
【００８０】
（実施例２）  アグロバクテリウム由来カタラーゼを符号化するKatA遺伝子のクローニング、塩基配列決定及び特徴決定
KatA遺伝子にmini-Tn5を挿入させたＡＧ６から完全ＤＮＡを抽出した。サザン分析により、KatA遺伝子のmini-Tn5挿入位置の下流に配列を有する６ｋｂClaIＤＮＡ断片と、上記挿入位置の上流に配列を有する５ｋｂNruIＤＮＡ断片とが明らかになった。これらのＤＮＡ断片をアガロースゲルから抽出し、GENECLEAN II Kit  (BIO 101)を用いて洗浄した。ClaIＤＮＡ断片をClaI部位でpBluescript II KS(-)にクローニングし、NruIＤＮＡ断片をSmaI部位でpTZ19Rにクローニングした。
【００８１】
その結果得られたプラスミドをそれぞれｐＸＱ６及びｐＸＱ７とした。mini-Tn5特異プライマー、Ｍ１３逆プライマー及び−４０汎用プライマーを用いて、ｐＸＱ６及びｐＸＱ７の塩基配列決定を行った。その後、得られた配列データを利用してさらに塩基配列決定を行うためのプライマーを生成した。ＡＢＩ社の PRISM 377 ＤＮＡシーケンサを用いてＤＮＡの塩基配列決定を行った。
【００８２】
全長KatA遺伝子をクローニングするため、KatA遺伝子の上流側配列と下流側配列に対してそれぞれ再アニーリング可能なプライマーｐ８３（５′−ＧＧＴＧＣＧＣＴＡＧＣＣＡＡＡＴＴＣＧＴＣＡＣＣＡＡＧＣ−３′）及びｎ８４（５′−ＣＡＡＴＣＧＣＴＡＧＣＧＴＴＣＧＧＣＣＣＴＣＴＧ−３′）を設計した。両プライマー共に、その後のクローニングを容易にするNheI部位を有していた。アグロバクテリウムツメファシエンス株Ａ３４８由来の完全ＤＮＡをＰＣＲ用のテンプレートとして使用し、２．９ｋｂＤＮＡ断片を増幅させた。ＰＣＲ産物をNheIで消化させ、XbaIで消化させたｐＳＷ１７２（チェン(Chen)及びウィナンス(Winans)、１９９１）に結合させた。結果得られたプラスミドｐＸＱ９を両方向にそれぞれ配列し、明白な配列データを得た。プラスミドｐＸＱ９をmini-Tn5突然変異体ＡＧ６に導入し、カナマイシン１００μｇ／ｍｌとテトラサイクリン５μｇ／ｍｌを補充したＭＧ／Ｌ培地上での選択に基づく三親性交配（ディッタ(Ditta)他、１９８０）によってＡＧ６（ｐＸＱ９）を生成した。
【００８３】
以下は、アグロバクテリウム由来カタラーゼを符号化するKatAの特性である。アグロバクテリウムツメファシエンスＡ３４８に対して、紫外線光下で明るい緑色の蛍光を発する緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）変異体を符号化するプロモータなし遺伝子を含むmini-Tn5トランスポゾンで突然変異を誘発させた。mini-Tn5トランスポゾンをプラスミドｐＡＧ４０８（スアレス(Suarez)他、１９９７）に保有させた。突然変異体ＡＧ６のうちの１つは、最小培地上のｐＨによって差動的に誘発された遺伝子にトランスポゾンを挿入させていた。
【００８４】
カランコエ植物の葉に、この突然変異株ＡＧ６を接種し、親株Ａ３４８と比較した。ＡＧ６は、Ａ３４８と比較して植物に腫瘍を発生させる能力が非常に低下した。mini-Tn5含有ＤＮＡ断片を単離するため、サザン分析を実行してそれらの大きさを測定した。トランスポゾン挿入部位の下流に配列を有する６ｋｂClaIＤＮＡ断片、及び上記挿入部位の上流に配列を有する５ｋｂNruIＤＮＡ断片をベクターにクローニングし、それぞれプラスミドｐＸＱ６及びｐＸＱ７を得た。ｐＸＱ６及びｐＸＱ７の塩基配列解析により、カタラーゼを符号化する細菌遺伝子に相同的な遺伝子にトランスポゾンが挿入されたことが明らかになった。この遺伝子をKatAとした。
【００８５】
上記遺伝子の完全な配列を求めるため、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により、Ａ３４８からＤＮＡ断片を増幅させた。KatAの上流側配列と下流側配列の両方を含んだ２．９ｋｂの断片が得られた。得られた断片をｐＳＷ１７２（チェン(Chen)及びウィナンス(Winans)、１９９１）にクローニングし、プラスミドｐＸＱ９を生成した。ｐＸＱ９をＡＧ６に導入すると、突然変異体の腫瘍発生能力を完全に回復させることができた。これは、ｐＸＱ９が全長KatA遺伝子を保有していることを示す。塩基配列解析により、KatA遺伝子座が分子量７８．７ｋＤａで７２３個のアミノ酸からなる推定上のタンパク質を符号化する１個の読取り枠（ＯＲＦ）を有していることが判った。
【００８６】
KatA遺伝子が機能カタラーゼを符号化するか否かを判定するため、カタラーゼ活性染色方法を用いて、突然変異体、親株及び相補性株のカタラーゼイソ酵素パターンを分析した。図２Ａに示すように、親株Ａ３４８及び相補性株ＡＧ６（ｐＸＱ９）共に、識別可能な３個のカタラーゼ活性帯（I，II，III）を有する一方、突然変異体ＡＧ６は、活性帯を１つのみ（I）有していた。これにより、ＡＧ６のKatA遺伝子のトランスポゾン挿入により、２つのカタラーゼ活性帯がノックアウトされたことが判った。
【００８７】
これら２つのカタラーゼ活性帯が同じKatA遺伝子に由来するか否かを調査するため、様々な量の細菌細胞抽出物をカタラーゼ活性染色用のポリアクリルアミドゲル上に添加した。少量の細胞抽出物が添加された場合のＡ３４８でさえ、カタラーゼ活性帯IIIが消失したことが判った（図２Ｂ）。このことは、カタラーゼ活性帯II及びIIIが同じKatA遺伝子産物に由来することを示している。十分な量の細胞抽出物が添加されたときにのみ、カタラーゼ活性帯IIIが出現した。このことは、活性帯IIIがカタラーゼ活性帯IIの凝集形であることを示している。
【００８８】
このKatA遺伝子が、カタラーゼ遺伝子の一部（レーヴェン(Loewen)、１９９７）と同様に、カタラーゼ活性と過酸化酵素活性の両方を有するタンパク質を符号化するか否かを判定することは重要であった。同じ細胞抽出物による過酸化酵素活性が染色された場合に（グレゴリー(Gregory)及びフリドヴィッチ(Fridovich)、１９７４）、いかなる過酸化酵素活性もカタラーゼ活性帯との関連が見出せなかった。総合すれば、これらのことは、KatA遺伝子がアグロバクテリウムツメファシエンス細胞内のカタラーゼイソ酵素を符号化することを示している。
【００８９】
（実施例３）  ＧＦＰに基づくKatA-gfp発現の測定
様々な成長条件でのKatA遺伝子の発現を研究するため、アグロバクテリウムツメファシエンス株Ａ３４８及びＡＧ６を、ＭＧ／Ｌ、ＡＢ、ＩＢの寒天プレート（カンゲローシ(Cangelosi)他、１９９１）上で、及びＭＳ培地上に無菌状態で置かれたカランコエの新鮮な葉と茎の組織の断片（ムラシゲ(Murashige)及びスクーグ(Skoog)、１９６２）上で２８℃で２４時間成長させた。その細胞を収集して洗浄し、略ＯＤ600＝０．５の濃度まで希釈した。Ａ３４８をブランクとして使用し、発光分光計ＬＳ５０Ｂ（パーキン・エルマー(Perkin Elmer)）によって、各細胞懸濁液の蛍光を計測した。励起波長は４２３ｎｍであり、発光波長は５０９ｎｍであった。蛍光レベルは、対応するＯＤ600によって除算された蛍光値の形で表現された。
【００９０】
様々な遺伝的背景のKatA遺伝子の発現を研究するため、アグロバクテリウムツメファシエンス株Ａ３４８、ＡＧ６、ＡＧ６（ｐＳＷ１７２）、ＡＧ６（ｐＸＱ９）、Ａ６１３、ＣＧＩ１及びＣＧＩ１（ｐＸＱ９）を、ＩＢ（ｐＨ５．５）寒天プレート上で２８℃で２４時間成長させた。各株の蛍光を上記のとおりに測定した。
【００９１】
Ｈ2Ｏ2がKatA発現を誘導可能であるか否かを判定するため、ＡＧ６をＭＧ／Ｌ液体培地内で２８℃で一晩成長させた。その細胞を収集し、新たなＭＧ／Ｌ液体培地内でＯＤ600＝０．５の最終濃度まで再懸濁させた。一定分量（２ｍｌ）の各培養物を無菌管に転移させ、その各管に、３０μＭ、６０μＭ及び１２０μＭの最終濃度までＨ2Ｏ2を加えた。細胞懸濁液を２８℃で２４時間培養した。その後、各細胞懸濁液１ｍｌを遠心分離し、洗浄し、レムリ（１９７０）サンプル緩衝液に再懸濁させ、後述するウェスタンブロットにかけた。
【００９２】
（実施例４）  突然変異誘発
KatAのＣ末端をＰＣＲによって欠失させ、ｐＸＱ１１及びｐＸＱ２２を生成した。オーバラッピング伸長ＰＣＲ（ホー(Ho)他、１９８９）により、KatAの部位特異的突然変異誘発を実行した。４個のオリゴヌクレオチドが、KatAタンパク質の１個のアミノ酸を突然変異させるよう設計された。推定されるカタラーゼモチーフ内の２個の残留物Ａｒｇ９４とＨｉｓ９８が多く保存される。Ｈｉｓ９８がＡｓｐに変化したか、或いは、Ａｒｇ９４がＧｌｎに変化し、Ｈｉｓ９８がＡｓｐに変化した。Ｈｉｓ９８での１個の突然変異又はＨｉｓ９８及びＡｒｇ９４での２個の突然変異を含む４５０ｂｐのNsiI-AatIIＰＣＲ断片を使用して、野生型KatAを含むｐＸＱ１３の対応するNsiI-AatII断片を置換し、ｐＸＱ２４又はｐＸＱ２５をそれぞれ生成した。ＡＢＩ社の PRISM 377 ＤＮＡシーケンサを用いたＤＮＡ塩基配列決定により、NsiI-AatII断片の予想された点で突然変異が存在することが確認された。同様に、Ｓｅｒ５に導入された停止コドン又はKatAＯＲＦの第２コドンでのフレームシフト欠失を含む６７０ｂｐMfeI-AatIIＰＣＲ断片を利用して、野生型KatAを含むｐＸＱ１３の対応するMfeI-AatII断片を置換し、ｐＸＱ２８又はｐＸＱ２９をそれぞれ生成した。
【００９３】
（実施例５）  His-KatA融合タンパク質の精製とKatA抗体の精製
(HIS)6-KatA融合コンストラクトを生成するため、KatAＯＲＦの始点と相補性の（XhoI部位を含む）オリゴマーと、（KphI部位を含む）オリゴマートを使用して、KatAＯＲＦ断片を増幅させた。２．１７ｋｂのXhoI-KpnI断片を、ｐＲＳＥＴＡに宿された(HIS)6の下流にインフレームに挿入した。その結果得られたｐＸＱ１５を、形質転換によりＢＬ２１に導入した。ＢＬ２１（ｐＸＱ１５）を、１００μｇ／ｍｌのカルベニシリンが存在するＬＢ培地内で３７℃で一晩成長させた。細胞培養物を収集した。製造者（クローンテック(Clontech)）に従って、TALON金属親和性樹脂を使用して(HIS)6-KatAの精製を行った。精製されたタンパク質をウサギに注入し、一次抗体を生成した。KatAのタンパク質解析又はＧＦＰを上記のとおりに実行した。
【００９４】
（実施例６）  相補性
プラスミドｐＸＱ１３、ｐＸＱ２４、ｐＸＱ２５、ｐＸＱ２８及びｐＸＱ２９をClaIで消化し、ClaIで消化されたｐＳＷ１７２と連結させてｐＸＱ２３、ｐＸＱ２６、ｐＸＱ２７、ｐＸＱ３０及びｐＸＱ３１を生成した。プラスミドｐＳＷ１７２、ｐＸＱ１１、ｐＸＱ２２、ｐＸＱ２３、ｐＸＱ２６、ｐＸＱ２７、ｐＸＱ３０及びｐＸＱ３１を、三親性交配法（ディッタ(Ditta)他、１９８０）又は電気穿孔法（カンゲローシ(Cangelosi)他、１９９１）により、mini-Tn5突然変異体ＡＧ６に導入した。プラスミドｐＸＱ１３を電気穿孔法によりＡＧ６に導入した後、カルベニシリンの存在下で選択を行った。その結果、KatA遺伝子座で１回の交叉による相同組換えを起こした株ＡＧ６１３が得られた。それは、サザン分析によって確認された。これらの形質転換株を、ＧＦＰ発現レベル及びKatA発現レベルに関して解析した。
【００９５】
Ｈ2Ｏ2の細胞内濃度を、実施例１に上述した技術（細胞内Ｈ2Ｏ2濃度計測）に従って計測した。
【００９６】
細菌細胞全体のカタラーゼ活性を、実施例１に上述したとおりに（カタラーゼ活性検定）測定した。
【００９７】
（実施例７）  KatA-gfp発現の細胞内抑制
ある細菌細胞のカタラーゼ活性が別の細胞のKatA-gfp遺伝子発現に影響を及ぼし得るか否かを判定するため、カタラーゼ活性を含む他の細菌とＡＧ６を共培養させた。一晩成長させた両細菌細胞をＩＢ液に懸濁させ、ＯＤ600＝１．０に調整した。ＡＧ６細胞懸濁液を他の細菌懸濁液と１対１の比率で混合させた。１菌株又は２つの菌株の混合物の細菌懸濁液一定分量１２μｌをＩＢプレート上に滴下した。それらプレートを２８℃で一晩培養させた。
【００９８】
紫外線光下での細菌の蛍光を写真撮影し、ＧＦＰ発現の強度を上述した手順で計測した。共培養混合物内の各菌株の成長生存度を調査するため、各共培養混合物の一部を収集し、（全生存細胞数に対する）ＭＧ／Ｌ上の生存細胞数と、（ＡＧ６生存細胞数に対する）１００μｇ／ｍｌカナマイシンを補充したＭＧ／Ｌ上での生存細胞数を検査した。
【００９９】
（実施例８）  KatAは酸性ｐＨによって誘導可能
アグロバクテリウムツメファシエンス突然変異体ＡＧ６に、プロモータのない緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）変異体を含有するmini-Tn5トランスポゾンを含ませた。すなわち、mini-Tn5トランスポゾンを、KatAの開始コドンより９９５ｂｐ下流の位置に挿入した。gfp遺伝子がKatAプロモータの制御下にあった（KatA-gfpとする）ので、KatA発現はＧＦＰの蓄積となり、紫外線光の下で明るい緑色の蛍光の形で視覚化することができた。従って、アグロバクテリウムツメファシエンス内のKatAの発現差を、様々な条件での突然変異体ＡＧ６のＧＦＰ発現を計測することによって求めることができた。
【０１００】
新鮮なカランコエの葉及び茎の組織断片上のみならず、様々な成長培地、すなわち、ＭＧ／Ｌ（リッチな培地；ｐＨ７．０）、ＡＢ（最小培地；ｐＨ７．０）及びＩＢ（最小培地；ｐＨ５．５）上でＡＧ６を成長させることによって、KatA-gfp発現を調べた。図３に示すように、ＩＢ上で成長させた細菌の蛍光レベルは、ＡＢやＭＧ／Ｌ等の中性ｐＨの培地上の細菌の蛍光レベルよりも約１０〜２０倍高かった。カランコエの葉及び茎の組織断片上での蛍光レベルは、中性ｐＨの培地上の蛍光レベルよりも約５〜１０倍高かった。このことは、植物組織も酸性ｐＨと最小限の栄養を有しているので、KatAが酸性ｐＨによって誘導される可能性があることを示している（リー(Li)他、１９９９）。
【０１０１】
先の実験は、ＩＢ培地が細菌が感染過程中に植物組織内で遭遇するという成長条件を代表していることを実証した（リー(Li)他、１９９９）。酸性ｐＨがKatA発現を誘導可能であることを確認するため、ＩＢ（ｐＨ５．５）の蛍光レベルを、同じＩＢ成分を有するがｐＨ値がｐＨ７．０に調整された培地（ＩＢｐＨ７．０）の蛍光レベルと比較した。図３に示すように、ＩＢ（ｐＨ７．０）上の蛍光レベルは、ＡＢやＭＧ／Ｌ等の他の中性培地と同様のレベルまで低下した。このことは、酸性ｐＨがKatA発現を誘導可能であることを示している。
【０１０２】
（実施例９）  KatAによるKatA-gfp発現の抑制
先に示したように、完全長KatA遺伝子を保有するプラスミドｐＸＱ９は、KatA突然変異を完全に補完することができた。相補性株ＡＧ６（ｐＸＱ９）内の蛍光レベルを解析すると、驚くべきことに、この株が蛍光度を非常に低下させたこと（図４に示すように、６０〜７０倍の低下）が判った。野生型KatAがKatA-gfp発現を抑制可能であるように思われた。
【０１０３】
KatAがKatA-gfp発現を特異的に抑制可能であるか否かを判定するため、ｐＸＱ９を、染色体遺伝子aopBの位置にmini-Tn5トランスポゾンを含有し、紫外線光の下で明るい緑色の蛍光を発生可能な別のmini-Tn5トランスポゾン突然変異株ＣＧＩ１に導入した。図４に示すように、このKatA遺伝子はaopB-gfp発現を抑制しなかった。このことは、KatAがKatA-gfp発現を特異的に抑制可能であることを示している。
【０１０４】
KatAのコピー数及び位置がその抑制能に影響を及ぼし得るか否かを判定することは重要なことであった。KatAを、１回の交叉による相同組換えにより、ＡＧ６の染色体に組み込んだ。その結果得られた株ＡＧ６１３は、サザン分析による検証によると、野生型KatAの１個のコピーとKatA-gfp融合物の１個のコピーを含んでいた。ＡＧ６１３のKatA-gfp発現は、KatA遺伝子をプラスミドに宿したＡＧ６（ｐＸＱ９）（図４）と同様に、非常に低いレベルであった。このことは、KatA-gfp発現を抑制するには、KatAの１個のコピーで十分であり、KatAがプラスミド上に位置するか染色体上に位置するかは問題ではないことを示している。
【０１０５】
（実施例１０）  KatA-gfp発現の要件
KatAによる抑制がｍＲＮＡレベルで発生するのか或いはタンパク質レベルで発生するのかを判断することは重要であった。部位特異的突然変異誘発を行って、KatAタンパク質を発生しない、或いは切断型KatAタンパク質を発生する突然変異体を生成した。KatA読取り枠（ＯＲＦ）内のヌクレオチド位置１４のＣをＧに変更した。これにより、Ｓｅｒ５に停止コドンを作成した（ΔKatA(*5)で表した）。結果得られたプラスミドを（ｐＸＱ３１）と名付けた（図５；表１）。その後、KatAＯＲＦの第２コドンのＧを欠失させる（ΔKatA(~2)で表した）ことによって、KatAのフレームシフト欠失を発生させた。結果得られたプラスミドをｐＸＱ３０と名付けた（図５）。
【０１０６】
図６に示すように、ｐＸＱ３１コンストラクトはいかなるKatAタンパク質も発生させなかった。ｐＸＱ３０は、恐らくは開始コドンより下流の他の代わりの翻訳部位から作成され、稀にはリボゾームのフレームシフトによって作成される微量のKatA状タンパク質を発生させ、それにより、タンパク質の翻訳を修復することができた。これら２つのコンストラクトは、ＧＦＰに対する抗体を用いてＧＦＰ蛍光及びウェスタン分析の両方によって測定されたときに、KatA-gfp発現を抑制しなかった（図７）。このことは、上記抑制にはKatAタンパク質の生成が必要であることを示している。
【０１０７】
その場合、抑制にとって完全長KatAポリペプチドが必要であるか否かを判断することが重要であった。KatA のＣ末端で８６アミノ酸（KatAΔ86と表す）と５０アミノ酸（KatAΔ50）が欠失されて、それぞれｐＸＱ１１とｐＸＱ２２が生成された（図５）。これらのコンストラクトは、予想どおり、サイズの小さいKatAタンパク質を生成した（図６Ｂ、レーン３及び４）。しかしながら、これら切断型KatAタンパク質は、（ｐＸＱ９に宿された）野生型KatA（レーン２）よりも遙かに量が少なかった。このことは、これら切断型タンパク質が不安定であることを示している。これら切断型タンパク質は、恐らくは、有意なカタラーゼ活性を示さなかったので（図８；表２）、KatA-gfp発現を有意なレベルで抑制することはなかった（図７、レーン９及び１０）。
【０１０８】
【表２】
2004524025.tif 000004
【０１０９】
切断型KatAタンパク質がイソ酵素染色法によって検出されるカタラーゼ活性を有していなかったので（図８）、このフィードバック抑制にとって機能的カタラーゼ活性が必要であるか否かを知ることが重要となった。アグロバクテリウムツメファシエンスカタラーゼKatAのアミノ酸配列をモチーフ検索プログラム(http://www.motif.genome.ad.jp) によって分析した。開始コドンから８９番目のアミノ酸から１００番目のアミノ酸までに位置する１２個のアミノ酸（ＶＧＭＭＡＲＶＴＷＨＡＡ）のモチーフが過酸化酵素の活性部位に必要な資格を得た。このモチーフは、カタラーゼ活性に関与している可能性がある。
【０１１０】
部位特異的突然変異誘発を行い、カタラーゼ活性を不活性化させた。コンピュータ分析により、KatAに保存されたモチーフのＡｒｇ９４とＨｉｓ９８がカタラーゼ活性にとって重要であることが明らかになった。先の研究は、大腸菌相同体ＨＰＩの対応する残留物Ａｒｇ１０２とＨｉｓ１０６がカタラーゼ活性にとって重要であることを示している（ヒラー(Hillar)他、２０００）。Ｈｉｓ９８をＡｓｐに変更した（KatA(98H/D)と表す）。Ａｒｇ９４をＧｌｎに変更するとともに、Ｈｉｓ９８をＡｓｐに変更した（KatA(94R/Q)(98H/D)と表す）。結果得られたプラスミドをそれぞれｐＸＱ２６及びｐＸＱ２７と名付けた。
【０１１１】
図８に示すように、野生型株Ａ３４８と相補性株ＡＧ６（ｐＸＱ２３）が共にKatAカタラーゼ活性帯を有している一方、突然変異体ＡＧ６、ＡＧ６（ｐＸＱ２６）及びＡＧ６（ｐＸＱ２７）には、それらが欠けていた。このことは、KatAに保存されたモチーフにおけるＨｉｓ９８の変更又はＡｒｇ９４及びＨｉｓ９８両方の変更が染色法によって検出されるKatAカタラーゼ活性を取り除いたことを意味する。ウェスタンブロット分析を実行し、突然変異タンパク質の安定性を調べた。図６Ａに示すように、ＡＧ６（ｐＸＱ２６）及びＡＧ６（ｐＸＱ２７）は、野生型と同じサイズのKatAタンパク質を生成し、高濃度の点変異タンパク質が細胞内に蓄積した。図７に示すように、これら２つの点変異タンパク質は、KatA-gfp発現を僅かに抑制することができた。ＧＦＰ発現は、ＡＧ６（ｐＸＱ２３）内で実質的に検出不可能であったが（レーン４）、タンパク質KatAを全く発現しない、或いは切断型タンパク質KatAを発現する株（レーン７、８、９、１０）と比較すると、ＡＧ６（ｐＸＱ２６）及びＡＧ６（ｐＸＱ２７）内では低下した（レーン５及び６）。
【０１１２】
突然変異KatAタンパク質が微量のカタラーゼ活性を有しているか否かを判断することは重要であった。突然変異タンパク質を符号化する遺伝子を、KatAを欠いたＡＧ６に導入した。その後、恐らくは細胞分解プロセスによるカタラーゼ活性の不活性化を回避できることから、細菌細胞全体のカタラーゼ活性を計測した。
【０１１３】
表２に示すように、突然変異タンパク質KatAΔ86、KatA(94R/Q)(98H/D)又はKatAΔ50を含有する細菌内のカタラーゼ活性はＡＧ６内のカタラーゼ活性よりも僅かに高かったが、統計的に有意なレベルではなかった。このことは、これらの突然変異KatAタンパク質が有意なカタラーゼ活性を有していなかったことを意味している。（KatAを欠いた）ＡＧ６がカタラーゼ活性を有していたことから（図８及び表２）、これらの細菌に関する細胞全体の活性がKatA以外のカタラーゼの所為であることが明らかになった。ＡＧ６（ｐＸＱ２６）のカタラーゼ活性はＡＧ６のカタラーゼ活性よりも統計的に高かった。これは、KatA(98H/D)が低レベルのカタラーゼ活性を有していたことを示している。この低活性は、恐らく、KatA-gfpの低抑制に寄与している（図７）。
【０１１４】
KatA(94R/Q)(98H/D)タンパク質の活性は統計的に有意ではなく、（もし、あるとしても）KatAΔ86の活性よりも低く（表２）、KatA-gfp発現を有意なレベルでは抑制しなかったので（図７）、（株ＡＧ６（ｐＸＱ２７）内の）KatA(94R/Q)(98H/D)がKatA-gfp発現を低レベルで抑制したことに注意することが重要である（図７）。このことは、KatAカタラーゼ活性とそのタンパク質自体が、KatA-gfpの抑制に関与したことを意味している。
【０１１５】
要約すると、KatA-gfp発現の抑制は、カタラーゼ活性を有する機能的KatAタンパク質の生成を必要とする。さらに、突然変異KatAタンパク質の中で、KatA(98H/D)及びKatA(94R/Q)(98H/D)のみが野生型KatAよりも遙かに低レベルでKatA-gfp発現を有意に抑制可能であった（図７）。因みに、これら２つの突然変異KatAタンパク質のみが非常に低濃度で細菌内に蓄積した（図６）。恐らくは突然変異KatAタンパク質がさらにＨ2Ｏ2に結合して細胞内Ｈ2Ｏ2のKatA-gfp発現誘発能を低下させることが可能であるので、このことは、細胞内に存在するKatAタンパク質の真の量が抑制に寄与することを意味している。KatA(98H/D)は、恐らくはその低いカタラーゼ活性の所為でKatA(94R/Q)(98H/D)よりも僅かに高いレベルでKatA-gfp発現を抑制し（図７）、KatA(94R/Q)(98H/D)は、推定される活性部位の２つの重要な残留物が変更されたために（図５）、有意のカタラーゼ活性を有さなかった（表２）。
【０１１６】
（実施例１１）  KatAは過酸化水素によって誘発可能
その場合、カタラーゼ活性がどのようにしてKatA-gfp発現を抑制させるかを求めることが重要であった。可能性の１つは、カタラーゼが細胞内Ｈ2Ｏ2濃度を低下させることにより、KatA-gfp発現を抑制することである。他の細菌カタラーゼの一部と同様に（レーベン(Loewen)、１９９７）、KatAの発現がＨ2Ｏ2によって誘発可能であるか否かを判断するため、ＡＧ６を液体ＭＧ／Ｌ培地内の低濃度のＨ2Ｏ2（３０〜１２０μＭ）で処理した後、KatA-gfp発現レベルを測定した。
【０１１７】
図９に示すように、Ｈ2Ｏ2の存在下では、KatA-gfp発現レベルが大幅に上昇した。これは、KatAの発現がＨ2Ｏ2によって誘発可能であることを示す。このことは、カタラーゼ活性がKatA-gfp発現を抑制可能である理由が、カタラーゼがKatA誘発物質濃度を枯渇させ得るからであることを意味する。これは、内在するＨ2Ｏ2がアグロバクテリウムツメファシエンス細胞内でKatA発現の細胞内誘発物質として働き、酸性ｐＨによるKatAの誘発が細胞内Ｈ2Ｏ2濃度の増加に関与していることを意味している。
【０１１８】
（実施例１２）  酸性ｐＨは、KatA-細胞内の細胞内Ｈ2Ｏ2の蓄積を向上させることが可能
KatAがＨ2Ｏ2によって誘発可能であったので、酸性ｐＨによるKatA誘発が本当に細菌細胞に内在するＨ2Ｏ2の濃度上昇によるものであるのか否かを判断することが重要であった。酸性のＩＢプレート（ｐＨ５．５）上又は中性ｐＨ（ｐＨ７．０）のＡＢプレート上で成長させた細菌に関して、ＩＢ又はＡＢ上で成長させた後に燐酸緩衝液（ｐＨ７．４）に再懸濁させ、細菌細胞の細胞内Ｈ2Ｏ2濃度と細胞外Ｈ2Ｏ2濃度を完全に均衡にすることを基礎とする上述した手順（ゴンザレス−フレッチャ(Gonzalez-Flecha)及びデンプル(Demple)、１９９５；１９９７）に従って、細胞内Ｈ2Ｏ2濃度を計測した（ザ・マテリアルズ・アンド・メソッズ(the Materials and Methods)参照）。
【０１１９】
表３に示すように、ＩＢ上に成長させたＡＧ６細胞の細胞内Ｈ2Ｏ2濃度は、野生型KatAを含む細菌細胞（Ａ３４８及びＡＧ６（ｐＸＱ９））の細胞内Ｈ2Ｏ2濃度よりも約１０倍高かった。ＡＢ上に成長させたＡＧ６細胞の濃度は、野生型KatAを含む細菌の濃度よりも約４倍高かった。ＡＧ６細胞をｐＨ７．０からｐＨ５．５に切り替えると、細胞内Ｈ2Ｏ2濃度が約３倍上昇した。細胞内Ｈ2Ｏ2濃度は、野生型KatAを含む細菌に関しては略一定であり、その成長がＡＢプレート上であるかＩＢプレート上であるかは無関係であった。これらのことは、KatAでの突然変異が酸性ｐＨで成長させた細菌の細胞内Ｈ2Ｏ2の蓄積を向上させたことを示す。機能KatAが欠如している場合に酸性ｐＨによって起こる細胞内Ｈ2Ｏ2濃度の上昇は、KatA-gfpの発現を誘発した。
【０１２０】
【表３】
2004524025.tif 000005
【０１２１】
（実施例１３）  細胞内Ｈ2Ｏ2消去検定技術
研究は、KatAでの突然変異が酸性ｐＨで成長させた細菌細胞での細胞内Ｈ2Ｏ2の蓄積を向上させることができることを示している。機能KatAが欠如している場合に酸性ｐＨによって起こる細胞内Ｈ2Ｏ2の濃度上昇は、KatA-gfpの発現を誘発することができる。機能カタラーゼを符号化するKatA遺伝子がKatA遺伝子を欠く細胞内に導入されると、KatA-gfp発現が劇的に抑制される（図４、図７、図８及び図１０）。
【０１２２】
Ｃ末端で切断された２つの突然変異KatAタンパク質は、細胞内での非常に低濃度の蓄積と無有意のカタラーゼ活性を示し、どちらの突然変異体も有意なレベルでKatA-gfp発現を抑制しなかった（図７及び図８；表２）。これらのことは、KatA-gfp発現レベルが細胞の細胞内Ｈ2Ｏ2消去能を反映できることを示している。細胞に、細胞内Ｈ2Ｏ2濃度を低減可能な分子が大小に関らず導入されると、KatA-gfp発現が抑制されることになる。従って、KatA-gfp発現を計測することにより、細胞内に導入される分子の細胞内Ｈ2Ｏ2消去能を監視することができる。
【０１２３】
最近の研究では、完全な機能カタラーゼ遺伝子KatAが、KatA-gfp発現を最高レベルで抑制しており、従って、最も高い細胞内Ｈ2Ｏ2消去能を有している（図４、図７及び図１０）。Ｃ末端で切断された２つの突然変異KatAタンパク質は、細胞内での非常に低濃度の蓄積と無有意のカタラーゼ活性を示し、どちらの突然変異体も有意なレベルでKatA-gfp発現を抑制しなかった（図７及び図８；表２）。従って、それらの突然変異体は有意の細胞内Ｈ2Ｏ2消去能を有していない。他の２つの突然変異KatAタンパク質KatA(98H/D)及びKatA(94R/Q)(98H/D)は、野生型KatAよりは遙かに低いレベルであるが、KatA-gfp発現を有意に抑制することができた（図７）。
【０１２４】
因みに、これら２つの突然変異KatAタンパク質のみが非常に低い濃度で細菌内に蓄積した（図６）。恐らくは突然変異KatAタンパク質がさらにＨ2Ｏ2に結合して細胞内Ｈ2Ｏ2の利用能を低下させることが可能であるので、このことは、細胞内に存在するKatAタンパク質の真の量が抑制に貢献することを意味している。KatA(98H/D)は、恐らくはその低いカタラーゼ活性の所為でKatA(94R/Q)(98H/D)よりも僅かに高いレベルでKatA-gfp発現を抑制し（図７）、KatA(94R/Q)(98H/D)は、有意のカタラーゼ活性を有さなかった（表２）。これらのこと全ては、この検定技術が様々な分子の細胞内Ｈ2Ｏ2消去能を求める際に非常に感度がよく、この検定によって、細胞内Ｈ2Ｏ2を直接的又は間接的に消去可能な分子を分析することが可能であることを示している。
【０１２５】
（実施例１４）  周辺細菌細胞によるKatA-gfp発現の抑制
KatA-gfp発現の抑制が細胞内で発生し得るか否かを調査するため、ＡＧ６を野生型株Ａ３４８と共培養した（実施例７参照）。図１０に示すように、Ａ３４８をＡＧ６と混合させると、Ａ３４８が周辺ＡＧ６細胞のKatA-gfp発現を実際に抑制することができた（上部パネル）。Ａ３４８＋ＡＧ６混合物の蛍光レベルは、ＡＧ６単独の蛍光レベルと比較すると、約２０倍低減された（下部パネル）。ＡＧ６＋Ａ３４８混合物の生存細胞数を算定することにより、ＡＧ６が予想された総細胞数の５０％であることが判った。これは、混合物内での抑制が細胞内で発生したものであって、単純に非蛍光のＡ３４８細胞による希釈効果の所為で発生したのではないことを示している。
【０１２６】
この細胞内抑制現象は、ＡＧ６を、カタラーゼ遺伝子を含み（エルアール(Herouart)他、１９９６；レーベン(Loewen)、１９９７）、カタラーゼ活性検定によって計測されるカタラーゼ活性を有している根粒菌や大腸菌と共培養させた場合にも観察された。根粒菌及び大腸菌は、生存細胞数実験によって示されるように、恐らくはＩＢプレート上のＡＧ６よりもゆっくりと成長するために、根粒菌及び大腸菌によるKatA-gfp発現の抑制が、Ａ３４８による抑制よりも弱くなった（図１０）。これらのことは、ＡＧ６で発生したＨ2Ｏ2が細菌の細胞膜を通過してKatAと同等なカタラーゼ活性を有する周辺細胞内に侵入できたことを示す。KatA-gfp発現の抑制は、他の細菌種に由来するカタラーゼによって実現することができた。このことは、細胞内Ｈ2Ｏ2スカベンジャーを、酸化ストレス下の細胞の外側にかつその細胞に隣接して、酸化ストレス下の隣接細胞からＨ2Ｏ2を受け取ることができる生細胞又は非生物系の形で適用可能であることを意味する。
【０１２７】
興味深いことに、ＡＧ６細胞の培地に添加された活性カタラーゼは、KatA-gfp発現を抑制しなかった。シグマ(Sigma)社から購入したカタラーゼを１ｍｌあたり１又は５マイクログラムの最終濃度でＩＢプレートに添加した。その後、（KatA-gfp融合を保有する）ＡＧ６細胞をＩＢプレート上で成長させた。その細菌細胞は、カタラーゼのない状態で成長させたＡＧ６細胞と同じＧＦＰ発現レベルを示した。ＩＢ培地内のカタラーゼをさらに活性状態に保つため、カタラーゼ含有プレート上に過酸化水素を滴下させた。カタラーゼ含有プレート内には瞬時に気泡が見られたが、対照の無カタラーゼＩＢプレート内には気泡が見られなかった。これにより、培地内のカタラーゼが活性であったことが実証された。従って、細胞外カタラーゼが細胞内過酸化水素を除去できなかったと結論付けることができる。
【０１２８】
（参照文献）
(1)  アーノルド(Arnold)他（２００１）プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシーズ・オブ・ザ・ユナイテッド・ステーツ・オブ・アメリカ(Proc.Natl.Acad.Sci.USA),９８（１０）：５５５０−５５
(2)  カンゲローシ(Cangelosi)、Ｇ．Ａ．、ベスト(Best)、Ｅ．Ａ．、マルチネッティ(Martinetti)、Ｇ及びネスター(Nester)、Ｅ．Ｗ．（１９９１）「アグロバクテリウムの遺伝子解析(Genetic analysis of Agrobacterium)」メソッズ・イン・エンジモロジー(Methods Enzymol)２０４：３８４−３９７
(3)  チャルフィー(Chalfie)、Ｍ．及びプラシュナー(Prashner)、Ｄ．Ｃ．、米国特許第５，４９１，０８４号
(4)  チャールズ(Charles)、Ｔ．Ｃ．及びネスター(Nester)、Ｅ．Ｗ．（１９９３）「アグロバクテリウムツメファシエンスの毒性には染色体が符号化された２成分感覚伝達系が必要である(A chromosomally encoded two-component sensory transduction system is required for virulence of Agrobacterium tumefaciens)」ジャーナル・オブ・バクテリオロジー(J Bacteriol)１７５：６６１４−６６２５
(5)  チェン(Chen)、Ｃ．Ｙ．及びウィナンス(Winans)、Ｓ．Ｃ．（１９９１）「大腸菌Lacプロモータを用いたアグロバクテリウムツメファシエンスの転写活性化遺伝子VirGの制御された発現(Controlled expression of the transcriptional activator gene VirG in Agrobacterium tumefaciens by using the Escherichia coli lac promoter)」ジャーナル・オブ・バクテリオロジー(J Bacteriol)１７３：１１３９−１１４４
(6)  クレール(Clare)、Ｄ．Ａ．，デュオン(Duong)、Ｍ．Ｎ．，ダール(Darr)、Ｄ．，アーチボルド(Archibald)、Ｆ．及びフリドヴィッチ(Fridovich)、Ｉ．（１９８４）「ニトロブルーテトラゾリウムを用いたスーパーオキシドラジカルの検出とカタラーゼ用活性染色に対する分子酸素の影響(Effects of molecular oxygen on detection of superoxide radical with nitroblue tetrazolium and on activity stains for catalase)」アナリティカル・バイオケミストリー(Anal Biochem)１４０：５３２−５３７
(7)  ディッタ(Ditta)、Ｇ．，スタンフィールド(Stanfield)、Ｓ．，コルビン(Corbin)、Ｄ．及びヘリンスキー(Helinski)、Ｄ．Ｒ．（１９８０）「グラム陰性細菌の広宿主域ＤＮＡクローニングシステム：根粒菌の遺伝子バンクの構成(Broad host range DNA cloning system for gram-negative bacteria:construction of a gene bank of Rhizobium melioti)」プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシーズ(Proc.Natl.Acad.Sci.)７７：７３４７−７３５１
(8)  ファー(Farr)他、マイクロバイオロジカル・レヴューズ(Microbiol.Rev.)５５、５６１−８５ページ（１９９１）
(9)  ファー(Farr)米国特許第５,５８５,２５２号
(10)  ファー(Farr)米国特許第５,８１１,２３１号
(11)  ファー(Farr)米国特許第５,５８９,３３７号
(12)  ゴンザレス−フレッチャ(Gonzalez-Flecha)、Ｂ．及びデンプル(Demple)、Ｂ．（１９９５）「好気性大腸菌内の過酸化水素の代謝源(Metabolic sources of hydrogen peroxide in aerobically growing Escherichia coli.)」ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー(J Biol Chem)２７０：１３６８１−１３６８７
(13)  ゴンザレス−フレッチャ(Gonzalez-Flecha)、Ｂ．及びデンプル(Demple)、Ｂ．（１９９７）「好気性大腸菌の細胞内過酸化水素濃度の恒常性制御(Homeostatic regulation of intracellular hydrogen peroxide concentration in aerobically growing Escherichia coli.)」ジャーナル・オブ・バクテリオロジー(J Bacteriol)１７９：３８２−３８８
(14)  ゴート(Gort)及びイムレー(Imlay)（１９９８）、ジャーナル・オブ・バクテリオロジー(J Bacteriol)１９９８年３月、１８０（６）：１４０２−１０
(15)  グールド(Gould)、Ｓ．Ｊ．及びスブラマニ(Subramani)、Ｓ．、アナリティカル・バイオケミストリー(Anal Biochem)１９８８年１１月１５日；１７５（１）：５−１３
(16)  グリーンバーグ(Greenberg)他、プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシーズ・オブ・ザ・ユナイテッド・ステーツ・オブ・アメリカ(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)８７、６１８１−８５ページ（１９９０）
(17)  グレゴリー(Gregory)、Ｅ．Ｍ．及びフリドヴィッチ(Fridovich)、Ｉ．（１９７４）「アクリルアミドゲル上でのカタラーゼの可視化(Visualization of catalase on acrylamide gels)」アナリティカル・バイオケミストリー(Anal Biochem)５８：５７−６２
(18)  エルアール(Herouart)、Ｄ．，シゴー(Sigaud)、Ｓ．，モロー(Moreau)、Ｓ．，フレンド(Frendo)、Ｐ．，トゥアチ(Touati)、Ｄ．及びプッポ(Puppo)、Ａ．（１９９６）「過酸化水素誘導カタラーゼを符号化する根粒菌のKatA遺伝子のクローニングと特徴付け(Cloning and characterization of the KatA gene of Rhizobium meliloti encoding a hydrogen peroxide-inducible catalase)」ジャーナル・オブ・バクテリオロジー(J Bacteriol)１７８：６８０２−６８０９
(19)  ヒラー(Hillar)、Ａ．，ピータース(Peters)、Ｂ．，パウルス(Pauls)、Ｒ．，ロボダ(Loboda)、Ａ．，チャン(Zhang)、Ｈ．，モーク(Mauk)、Ａ．Ｇ．及びレーヴェン(Loewen)、Ｐ．Ｃ．（２０００）「部位特異的突然変異誘発による大腸菌のカタラーゼ−過酸化酵素ＨＰＩの活性の調節(Modulation of the activities of catalase-peoxidase HPI of Escherichia coli by site-directed mutagenesis)」バイオケミストリー(Biochemistry)３９：５８６８−５８７５
(20)  ホー(Ho)、Ｓ．Ｎ．，ハント(Hunt)、Ｈ．Ｄ．，ホートン(Horton)、Ｒ．Ｍ．，プーレン(Pullen)、Ｊ．Ｋ．及びピース(Pease)、Ｌ．Ｒ．（１９８９）「ポリメラーゼ連鎖反応を用いたオーバラッピング伸長による部位特異的突然変異誘発(Site-directed mutagenesis by overlap extension using the polymerase chain reaction)」ジーン(Gene)７７：５１−５９
(21)  コゴマ(Kogoma)他、プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシーズ・オブ・ザ・ユナイテッド・ステーツ・オブ・アメリカ(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)８５、４７９９−４８０３ページ（１９８８）
(22)  コー(Koh)、Ｊ．，エンダース(Enders)、Ｇ．Ｈ．他、ネイチャー(Nature)６月８日；３７５（６５３１）：５０６−５１０（１９９５）
(23)  レムリ(Laemmli)、Ｕ．Ｋ．（１９７０）「バクテリオファージＴ４の頭部の構築時の構成タンパク質の分解(Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4)」ネイチャー(Nature)２２７：６８０−６８５
(24)  リー(Li)、Ｌ．Ｐ．，リー(Li)、Ｙ．，リン(Lim)、Ｔ．Ｍ．及びパン(Pan)、Ｓ．Ｑ．（１９９９）「ＧＦＰ支援共焦点レーザ顕微鏡法はアグロバクテリウムツメファシエンス細胞の形態と感染に伴う遺伝子発現とを監視することができる(GFP-aided confocal laser scanning microscopy can monitor Agrobacterium tumefaciens cell morphology and gene expression associated with infection)」ＦＥＭＳマイクロバイオロジー・レターズ(FEMS Microbiol Lett)１７９：１４１−１４６
(25)  レーヴェン(Loewen)、Ｐ．Ｃ．（１９９７）「細菌カタラーゼ」、スカンダリオス(Scandalios)、Ｊ．Ｇ．編「酸化ストレスと抗酸化物質防御の分子生物学」コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス(Cold Spring Harbor Laboratory Press)、２７３−３０８ページ
(26)  マシバー(Maciver)、Ｉ．及びハンセン(Hansen)、Ｅ．Ｊ．（１９９６）「インフルエンザ菌の包括制御因子OxyRの発現欠如は成長表現型に大きな影響を及ぼす(Lack of expression of the global regulator OxyR in Haemophilus influenzae has a profound effect on growth phenotype.)」インフェクション・アンド・インミュニティ(Infect Immun)６４：４６１８−４６２９
(27)  マハデフ(Mahadev)他（２００１）、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー(J Biol Chem)１５；２７６（２４）：２１９３８−４２
(28)  モハンティ(Mohanty)、Ｊ．，ジョナサン(Jonathan)、Ｇ．，ジャッフェ(Jaffe)、Ｓ．，シュルマン(Schulman)、Ｅ．Ｓ．及びレイブル(Raible)、Ｄ．Ｇ．（１９９７）「ジヒドロキシフェノキサジン誘導体を用いた活性ヒト白血球からのＨ2Ｏ2放出の高感度蛍光微量検定法(A highly sensitive fluorescent microassay of H2O2 release from activated human leukocytes using a dihydroxyphenoxazine derivative.)」ジャーナル・オブ・イミュノロジカル・メソッズ(J Immunol Methods)２０２：１３３−１４１
(29)  ムラシゲ(Murashige)、Ｔ．及びスクーグ(Skoog)、Ｆ．（１９６２）「タバコ組織培養物を用いた急速成長及び生物検定用修正培地(A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures.)」フィジオロジー・プラント(Physiol Plat)１５：４７３−４９７
(30)  レン(Ren)他（２００２）、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー(J Biol Chem)２７７（１）：５５９−６５
(31)  サリーム(Saliim)及びアブ−シャクラ(Abu-Shakra)（２００１）、テラトジェネシス、カルシノジェネシス・アンド・ムタジェネシス(Teratog Carcinog Mutagen)２１（５）：３４９−５９
(32)  サンブルック(Sambrook)、Ｊ．Ｆ．，フリッチュ(Fritsch)、Ｅ．Ｆ．及びマニアティス(Maniatis)、Ｔ（１９８９）「分子クローニング：実験室マニュアル(Molecular Cloning: a laboratory manual)第２版」コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー(Cold Spring Harbor Laboratory)、ニューヨーク州コールドスプリングハーバー
(33)  シャピロ(Shapiro)、Ｓ．Ｋ．，シュー(Chou)、Ｊ．他、ジーン(Gene)１１月２５日：７１−８２（１９８３）
(34)  スアレス(Suarez)、Ａ．，ギュトラー(Guttler)、Ａ．，シュトラッツ(Stratz)、Ｍ．，シュテンドナー(Staendner)、Ｌ．Ｈ．，ティミス(Timmis)、Ｋ．Ｎ．及びグスマン(Guzman)、Ｃ．Ａ．（１９９７）「モノコピー用途を含む細菌の遺伝子解析用緑色蛍光タンパク質レポータ系(Green fluorescent protein-based reporter systems for genetic analysis of bacteria including monocopy applications)」ジーン(Gene)１９６：６９−７４
(35)  ティール(Thiel)、Ｇ．，ペーターゾーン(Petersohn)、Ｄ．及びショッホ(Schoch)、Ｓ．、ジーン(Gene)２月１２日；１６８：１７３−１７６（１９９６）
(36)  シュー(Xu)、Ｘ．Ｑ．及びパン(Pan)、Ｓ．Ｑ．（２０００）「腫瘍形成に関与する病原性因子としてのアグロバクテリウムカタラーゼ(An Agrobacterium catalase as a virulence factor involved in tumorigenesis)」モレキュラー・マイクロバイオロジー(Mol Microbiol)２：４０７−１４
【０１２９】
複数の実施形態を提示したが、その基本構成を、本発明の方法及びキットを利用する他の実施形態に備えて変更可能であることは明らかである。本発明の範囲は、本明細書に例示の形で示す特定の実施形態にではなく、本明細書の特許請求の範囲によって規定されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【０１３０】
【図１】アグロバクテリウムツメファシエンスKatA遺伝子産物のアミノ酸配列と相同カタラーゼ配列の配列比較を示す図である。ＤＮＡｓｉｓプログラムを利用して配列比較を達成した。Atu KatAは、アグロバクテリウムツメファシエンスKatA遺伝子産物を表し、Lpn KatBは、レジオネラニューモフィラ(Legionella pneumophila)KatB遺伝子産物を表し、Bst Catは、バチルスステアロサーモフィラス(Bacillus stearothermophilus)カタラーゼを表す。
【図２】カタラーゼイソ酵素検定を示す図である。図２Ａ：アグロバクテリウムツメファシエンス株Ａ３４８（レーン１）、ＡＧ６（ｐＸＱ９）（レーン２）及びＡＧ６（レーン３）を、ＭＧ／Ｌ液体培地内に温度２８℃で一晩成長させた。「ザ・マテリアルズ・アンド・メソッズ(the Materials and Methods)」に記載されているとおりに、粗製細胞抽出物を調製した。各株につき、粗製細胞抽出物２０μｌを７．５％非変性ゲル上に添加し、電気泳動させた。図２Ｂ：（「ザ・マテリアルズ・アンド・メソッズ」に記載されている希釈の後、さらに２倍希釈させた）Ａ３４８細胞粗製抽出物４０μｌ（レーン１）と２０μｌ（レーン２）を添加し、電気泳動させた。クレア(Clare)他（１９８４）に従った活性染色法により、カタラーゼイソ酵素を可視化した。
【図３】様々な増殖培地におけるKatA-gfp発現を示す図である。アグロバクテリウムツメファシエンス株Ａ３４８及びＡＧ６を、ＭＧ／Ｌ、ＡＢ、ＩＢ（ｐＨ５．５）及びＩＢ（ｐＨ７．０）の寒天プレート上並びに新鮮なカランコエの葉組織切片及び茎組織切片上に、２８℃で２４時間成長させた。その細胞を収集した後、ｄＨ2Ｏ中に再懸濁させた。Ａ３４８をブランクとして使用し、「ザ・マテリアルズ・アンド・メソッズ」に記載されている発光分光計LS50B（パーキン・エルマー(Perkin Elmer)）によって、各細胞懸濁液の蛍光度を計測した。
【図４】様々な遺伝的背景におけるKatA-gfp発現の比較を示す図である。アグロバクテリウムツメファシエンス株Ａ３４８、ＡＧ６、ＡＧ６（ｐＳＷ１７２）、ＡＧ６（ｐＸＱ９）、ＡＧ６１３、ＣＧＩ１及びＣＧＩ１（ｐＸＱ９）を、ＩＢ（ｐＨ５．５）の寒天プレート上に、２８℃で２４時間成長させた。その細胞を収集した後、ｄＨ2Ｏ中に再懸濁させた。Ａ３４８をブランクとして使用し、「ザ・マテリアルズ・アンド・メソッズ」に記載されている発光分光計LS50B（パーキン・エルマー(Perkin Elmer)）によって、各細胞懸濁液の蛍光度を計測した。
【図５】野生型及び突然変異型KatA遺伝子の概略図である。直線は、ＤＮＡ配列を表し、箱型は、KatA読取り枠（ＯＲＦ）を表す。垂直方向の線は、制限酵素の部位とアミノ酸の位置を示す。ひし形は、mini-Tn5トランスポゾン挿入位置を示す。使用される主要な制限エンドヌクレアーゼ部位とプライマーが図示されている。三角形の下方のＤＮＡ配列は、部位特異的突然変異誘発に関するＯＲＦ配列である。〜は、第２コドンのＧが欠失していることを表す。＊は、第５コドンに導入された停止コドンを表す。ｐＸＱ９の野生型KatA並びにKatAΔ50及びKatAΔ86を符号化する突然変異KatA遺伝子は、KatAプロモータによって促進された。ｐＸＱ２３の野生型KatA並びにKatA(98H/D)、KatA(94R/Q)(98H/D)、ΔKatA(〜2)及びΔKatA(*5)を符号化する突然変異KatA遺伝子は、KatA及びLacプロモータによって促進された。
【図６】KatAタンパク質安定性に対するKatA突然変異の影響を示す図である。アグロバクテリウムツメファシエンス株Ａ３４８（パネルＡレーン２及びパネルＢレーン１）、ＡＧ６（パネルＡレーン３）、ＡＧ６（ｐＸＱ２３）（パネルＡレーン４）、ＡＧ６（ｐＸＱ２６）（パネルＡレーン５）、ＡＧ６（ｐＸＱ２７）（パネルＡレーン６）、ＡＧ６（ｐＸＱ３０）（パネルＡレーン７）、ＡＧ６（ｐＸＱ３１）（パネルＡレーン８）、ＡＧ６（ｐＸＱ９）（パネルＢレーン２）、ＡＧ６（ｐＸＱ１１）（パネルＢレーン３）及びＡＧ６（ｐＸＱ２２）（パネルＢレーン４）を、ＩＢプレート上に２８℃で一晩成長させた。その細胞を収集して洗浄し、ＯＤ600＝０．３の濃度まで希釈した。細胞懸濁液５００μｌから、遠心分離によって細胞を収集し、レムリ（１９７０）サンプル緩衝液に再懸濁させた。２μｌの一定分量の各サンプルをＳＤＳ／１０％ＰＡＧＥゲル上に電気泳動させた。タンパク質をImmobilon-P膜上に移し替え、(His)6-KatA抗体によって可視化した。対照として精製(His)6-KatAを使用した。
【図７】KatA-gfp融合のＧＦＰタンパク質発現の検出を示す図である。アグロバクテリウムツメファシエンス株Ａ３４８（レーン１）、ＡＧ６（レーン２）、ＡＧ６（ｐＳＷ１７２）（レーン３）、ＡＧ６（ｐＸＱ２３）（レーン４）、ＡＧ６（ｐＸＱ２６）（レーン５）、ＡＧ６（ｐＸＱ２７）（レーン６）、ＡＧ６（ｐＸＱ３０）（レーン７）、ＡＧ６（ｐＸＱ３１）（レーン８）、ＡＧ６（ｐＸＱ１１）（レーン９）及びＡＧ６（ｐＸＱ２２）（レーン１０）を、ＩＢプレート上に、２８℃で一晩成長させた。その細胞を収集した後、ｄＨ2Ｏ中に再懸濁させた。Ａ３４８をブランクとして使用し、「ザ・マテリアルズ・アンド・メソッズ」に記載されている発光分光計LS50B（パーキン・エルマー(Perkin Elmer)）によって、各細胞懸濁液の一部を使用してその蛍光度を計測した（上方のパネル）。各細胞懸濁液の別の一部をＯＤ600＝０．３の濃度まで希釈した。細胞懸濁液５００μｌから、遠心分離によって細胞を収集し、レムリ（１９７０）サンプル緩衝液に再懸濁させた。２μｌの一定分量の各サンプルをＳＤＳ／１５％ＰＡＧＥゲル上に電気泳動させた。タンパク質をImmobilon-P膜上に転移させ、ＧＦＰ抗体によってＧＦＰを可視化した（下方のパネル）。
【図８】カタラーゼ活性帯の検定を示す図である。アグロバクテリウムツメファシエンス株Ａ３４８（レーン１）、ＡＧ６（レーン２）、ＡＧ６（ｐＸＱ２３）（レーン３）、ＡＧ６（ｐＸＱ２６）（レーン４）、ＡＧ６（ｐＸＱ２７）（レーン５）、ＡＧ６（ｐＸＱ１１）（レーン６）及びＡＧ６（ｐＸＱ２２）（レーン７）を、ＭＧ／Ｌ液体培地に２８℃で一晩成長させた。粗製細胞抽出物のサンプルを調製し、上述のとおりに（シュー(Xu)及びパン(Pan)、２０００）、７．５％非変性ゲル上で電気泳動させた。カタラーゼイソ酵素をクレア(Clare)他（１９８４）に従った活性染色法により可視化した。ＡＧ６（ｐＸＱ２３）は、KatAを過剰に発現させていたので、このサンプルを添加前に８倍希釈した。
【図９】Ｈ2Ｏ2によるKatA-gfp融合の誘導を示す図である。ＭＧ／Ｌ（ＯＤ600＝０．５）中で成長させたアグロバクテリウムツメファシエンスＡＧ６の細胞を、０μＭ、３０μＭ、６０μＭ及び１２０μＭのＨ2Ｏ2にさらした。細胞懸濁液を２８℃で２時間培養した。１ミリｌの一定分量の細胞培養液を遠心分離によって収集し、レムリ（１９７０）サンプル緩衝液に再懸濁させた。１０μｌの一定分量の各サンプルをＳＤＳ／１５％ＰＡＧＥゲル上で電気泳動させた。タンパク質をImmobilon-P膜上に転移させ、ＧＦＰ抗体によってＧＦＰを可視化した。
【図１０】周辺細菌細胞によるKatA-gfp発現の抑制を示す図である。ＡＧ６細胞を、細菌株Ａ３４８由来の細胞、根粒菌(Rhizobium meliloti)ＲＣＲ２０１１由来の細胞又は大腸菌ＤＨ５α由来の細胞と１対１の比率で混合させ、その混合物をＩＢプレート上に滴下させた。Ａ３４８単一株、ＡＧ６（ｐＸＱ９）単一株、根粒菌(Rhizobium meliloti)ＲＣＲ２０１１単一株、大腸菌ＤＨ５α単一株にそれぞれ由来する同量の細菌細胞についても、ＩＢプレート上に滴下させた。これらのプレートを２８℃で一晩培養させた。紫外線光の下での細菌の蛍光状態を写真撮影した（上方のパネル）。「ザ・マテリアルズ・アンド・メソッズ」に記載されたとおりに、蛍光の強度を計測した（下方のパネル）。
【図１】
2004524025.tif 000006
【図２】
2004524025.tif 000007
【図３】
2004524025.tif 000008
【図４】
2004524025.tif 000009
【図５】
2004524025.tif 000010
【図６】
2004524025.tif 000011
【図７】
2004524025.tif 000012
【図８】
2004524025.tif 000013
【図９】
2004524025.tif 000014
【図１０】
2004524025.tif 000015
【国際公開パンフレット】
2004524025.tif 000016
2004524025.tif 000017
2004524025.tif 000018
2004524025.tif 000019
2004524025.tif 000020
2004524025.tif 000021
2004524025.tif 000022
2004524025.tif 000023
2004524025.tif 000024
2004524025.tif 000025
2004524025.tif 000026
2004524025.tif 000027
2004524025.tif 000028
2004524025.tif 000029
2004524025.tif 000030
2004524025.tif 000031
2004524025.tif 000032
2004524025.tif 000033
2004524025.tif 000034
2004524025.tif 000035
2004524025.tif 000036
2004524025.tif 000037
2004524025.tif 000038
2004524025.tif 000039
2004524025.tif 000040
2004524025.tif 000041
2004524025.tif 000042
2004524025.tif 000043
2004524025.tif 000044
2004524025.tif 000045
2004524025.tif 000046
2004524025.tif 000047
2004524025.tif 000048
2004524025.tif 000049
2004524025.tif 000050
2004524025.tif 000051
2004524025.tif 000052
2004524025.tif 000053
2004524025.tif 000054
2004524025.tif 000055
2004524025.tif 000056
2004524025.tif 000057
2004524025.tif 000058
2004524025.tif 000059
2004524025.tif 000060
2004524025.tif 000061
2004524025.tif 000062
2004524025.tif 000063
2004524025.tif 000064
2004524025.tif 000065
2004524025.tif 000066
2004524025.tif 000067
2004524025.tif 000068
2004524025.tif 000069
2004524025.tif 000070
2004524025.tif 000071
2004524025.tif 000072
2004524025.tif 000073
2004524025.tif 000074
2004524025.tif 000075
2004524025.tif 000076
2004524025.tif 000077
2004524025.tif 000078
2004524025.tif 000079
2004524025.tif 000080
2004524025.tif 000081
2004524025.tif 000082
2004524025.tif 000083
【国際調査報告】
2004524025.tif 000084
2004524025.tif 000085