(57)【要約】本発明は、２つのヒスチジン残基および２つのシステイン残基が中心の亜鉛イオンに配位結合している亜鉛フィンガードメインを含む、ＤＮＡ結合タンパク質に関する。より詳細には、本発明は、亜鉛フィンガードメインを設計するための状況独立性（ｃｏｎｔｅｘｔ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ）認識コードの同定に関する。このコードにより、４塩基対ヌクレオチド標的配列からの亜鉛フィンガードメインのαへリックス領域の−１位、２位、３位、および６位のアミノ酸が同定可能である。本発明は、この認識コードを使用して設計した亜鉛フィンガータンパク質（ＺＦＰ）、これらのＵＦＰをコードする核酸、ならびに、遺伝子発現を調整し、ゲノム構造を変化させ、ウイルス複製を阻害して、このようなタンパク質の結合部位における変化（例えば、ヌクレオチドの置換、欠失、または挿入）を検出するためのこのようなＺＦＰの使使用頻度を含む。さらに本発明は、３組の２５６個のヌクレオチドを使用した３つ以上の亜鉛フィンガードメインでのＺＦＰの迅速なアセンブリーの方法を提供し、ここで各組は、２５６個の異なる４塩基対標的を標的とし、全部で７６８個のオリゴヌクレオチド由来の全ての可能な３フィンガーＺＦＰ（すなわち、＞＞１０６）の産生を可能にするように設計されている。
2004519211.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
互いに０個〜１０個のアミノ酸残基で共有結合した少なくとも３つの亜鉛フィンガードメインを含む、標的核酸配列に結合するための単離された人工亜鉛フィンガータンパク質（ＺＦＰ）であって、ＺＦＰが配列番号：３〜１２のいずれか１つからなるアミノ酸配列を有さない場合、亜鉛フィンガーのαヘリックスの−１位、２位、３位、および６位のアミノ酸が以下のように選択される、単離された人工亜鉛フィンガータンパク質：
−１位のアミノ酸が、アルギニン、グルタミン、トレオニン、メチオニン、またはグルタミン酸であり；
２位のアミノ酸が、セリン、アスパラギン、トレオニン、またはアスパラギン酸であり；
３位のアミノ酸が、ヒスチジン、アスパラギン、セリン、またはアスパラギン酸であり；かつ
６位のアミノ酸が、アルギニン、グルタミン、トレオニン、チロシン、ロイシン、またはグルタミン酸である。
【請求項２】
少なくとも３つの亜鉛フィンガードメインを含む、標的核酸配列に結合するための単離された人工亜鉛フィンガータンパク質（ＺＦＰ）であって、各亜鉛フィンガードメインが独立して、式
2004519211.tif 000073
で示され、該ドメインが独立して互いに０個〜１０個のアミノ酸残基で共有結合している、単離された人工亜鉛フィンガータンパク質：
式中、タンパク質が配列番号：３〜１２のいずれか１つからなるアミノ酸配列を有さない場合、
Ｘは独立して、任意のアミノ酸であり、Ｘｎはポリペプチド鎖中のＸの出現（ｏｃｃｕｒｒｅｎｃｅ）数を示し；
Ｚ−１は、アルギニン、グルタミン、トレオニン、メチオニン、またはグルタミン酸であり；
Ｚ２は、セリン、アスパラギン、トレオニン、またはアスパラギン酸であり；
Ｚ３は、ヒスチジン、アスパラギン、セリン、またはアスパラギン酸であり；かつ
Ｚ６は、アルギニン、グルタミン、トレオニン、チロシン、ロイシン、またはグルタミン酸である。
【請求項３】
３個〜４０個の亜鉛フィンガードメインを含む、請求項１または２記載のＺＦＰ。
【請求項４】
３個〜１５個の亜鉛フィンガードメインを含む、請求項３記載のＺＦＰ。
【請求項５】
７個、８個、または９個の亜鉛フィンガードメインを含む、請求項１または２記載のＺＦＰ。
【請求項６】
６個の亜鉛フィンガードメインを含む、請求項１または２記載のＺＦＰ。
【請求項７】
本質的に３個の亜鉛フィンガードメインからなる、請求項１または２記載のＺＦＰ。
【請求項８】
少なくとも１つの亜鉛フィンガードメインがアミノ酸配列
2004519211.tif 000074
を含む、請求項１から７のいずれか一項記載のＺＦＰ。
【請求項９】
少なくとも１つの亜鉛フィンガードメインがアミノ酸配列
2004519211.tif 000075
を含む、請求項１から８のいずれか一項記載のＺＦＰ。
【請求項１０】
少なくとも１つの亜鉛フィンガードメインがアミノ酸配列
2004519211.tif 000076
を含む、請求項１から９のいずれか一項記載のＺＦＰ。
【請求項１１】
少なくとも１つの亜鉛フィンガードメインのＸ位がＺｉｆ２６８亜鉛フィンガードメイン由来の対応するアミノ酸を含む、請求項２から７のいずれか一項記載のＺＦＰ。
【請求項１２】
Ｚ−１が少なくとも１つの亜鉛フィンガードメインの中のメチオニンである、請求項１から１１のいずれか一項記載のＺＦＰ。
【請求項１３】
Ｚ−１が少なくとも１つの亜鉛フィンガードメインの中のグルタミン酸である、請求項１から１２のいずれか一項記載のＺＦＰ。
【請求項１４】
Ｚ２が少なくとも１つの亜鉛フィンガードメインの中のトレオニンである、請求項１から１３のいずれか一項記載のＺＦＰ。
【請求項１５】
Ｚ２が少なくとも１つの亜鉛フィンガードメインの中のセリンである、請求項１から１４のいずれか一項記載のＺＦＰ。
【請求項１６】
Ｚ２が少なくとも１つの亜鉛フィンガードメインの中のアスパラギンである、請求項１から１５のいずれか一項記載のＺＦＰ。
【請求項１７】
Ｚ６が少なくとも１つの亜鉛フィンガードメインの中のグルタミン酸である、請求項１から１６のいずれか一項記載のＺＦＰ。
【請求項１８】
Ｚ６が少なくとも１つの亜鉛フィンガードメインの中のトレオニンである、請求項１から１７のいずれか一項記載のＺＦＰ。
【請求項１９】
Ｚ６が少なくとも１つの亜鉛フィンガードメインの中のチロシンである、請求項１から１８のいずれか一項記載のＺＦＰ。
【請求項２０】
Ｚ６が少なくとも１つの亜鉛フィンガードメインの中のロイシンである、請求項１から１９のいずれか一項記載のＺＦＰ。
【請求項２１】
Ｚ２が少なくとも１つの亜鉛フィンガードメインの中のアスパラギン酸であるが、同一のドメイン中でＺ−１がアルギニンではない、請求項１から２０のいずれか一項記載のＺＦＰ。
【請求項２２】
各亜鉛フィンガードメインが式
2004519211.tif 000077
で示され、該ドメインが互いに直接結合している、３つの亜鉛フィンガードメインを含む、単離された人工亜鉛フィンガータンパク質（ＺＦＰ）：
式中、Ｚ−１が、アルギニン、グルタミン、トレオニン、メチオニン、またはグルタミン酸であり；
Ｚ２が、セリン、アスパラギン、トレオニン、またはアスパラギン酸であり；
Ｚ３が、ヒスチジン、アスパラギン、セリン、またはアスパラギン酸であり；かつ
Ｚ６が、アルギニン、グルタミン、トレオニン、チロシン、ロイシン、またはグルタミン酸である。
【請求項２３】
Ｚ−１が、アルギニン、グルタミン、トレオニン、またはグルタミン酸であり；
Ｚ２が、セリン、アスパラギン、トレオニン、またはアスパラギン酸であり；
Ｚ３が、ヒスチジン、アスパラギン、セリン、またはアスパラギン酸であり；
Ｚ６が、アルギニン、グルタミン、トレオニン、またはグルタミン酸である、請求項１から２２のいずれか一項記載のＺＦＰ。
【請求項２４】
請求項１から２３のいずれか一項記載のＺＦＰをコードするヌクレオチド配列を含む、核酸。
【請求項２５】
請求項２４記載の核酸を含む、発現ベクター。
【請求項２６】
請求項２５記載の発現ベクターを含む、宿主細胞。
【請求項２７】
（ａ）請求項２６記載の宿主細胞をＺＦＰを発現するための条件下で一定期間培養する段階；および
（ｂ）ＺＦＰを回収する段階
を含む、亜鉛フィンガータンパク質を調製する方法。
【請求項２８】
１つまたは複数の関心対象のタンパク質に融合した本発明の１つまたは複数のＺＦＰを含む、単離された融合タンパク質。
【請求項２９】
１つまたは複数のエフェクタードメインに融合した本発明の１つまたは複数のＺＦＰを含む、単離された融合タンパク質。
【請求項３０】
１個〜６個のＺＦＰおよび２個〜６個のエフェクタードメインを含む、請求項２記載の融合タンパク質。
【請求項３１】
以下を含む、単離された融合タンパク質：
（ａ）請求項１から２３のいずれか一項記載のＺＦＰである第１のセグメント；および
（ｂ）トランスポザーゼ、インテグラーゼ、リコンビナーゼ、レソルバーゼ（ｒｅｓｏｌｖａｓｅ）、インベルターゼ、プロテアーゼ、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ、ＤＮＡデメチラーゼ、ヒストンアセチラーゼ、ヒストンデアセチラーゼ、ヌクレアーゼ、転写抑制因子、転写活性化因子、一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質、転写因子漸増（ｒｅｃｒｕｉｔｉｎｇ）タンパク質、核局在化シグナル、または細胞取り込みシグナルを含む第２のセグメント。
【請求項３２】
以下を含む、単離された融合タンパク質：
（ａ）請求項１から２３のいずれか一項記載のＺＦＰである第１のセグメント；および
（ｂ）トランスポザーゼ活性、インテグラーゼ活性、リコンビナーゼ活性、レソルバーゼ活性、インベルターゼ活性、プロテアーゼ活性、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ活性、ＤＮＡデメチラーゼ活性、ヒストンアセチラーゼ活性、ヒストンデアセチラーゼ活性、ヌクレアーゼ活性、核局在化シグナル伝達活性、転写抑制因子活性、転写活性化因子活性、一本鎖ＤＮＡ結合活性、転写因子漸増活性、または細胞取り込みシグナル伝達活性を示すタンパク質ドメインを含む第２のセグメント。
【請求項３３】
以下を含む、単離された融合タンパク質：
（ａ）請求項１から２３のいずれか一項記載のＺＦＰである第１のセグメント；および
（ｂ）細胞によって取り込まれることができる、２価のリガンドの結合部分に特異的に結合できるタンパク質ドメインを含む、第２のセグメント。
【請求項３４】
第２のセグメントのタンパク質ドメインが、Ｓタンパク質、Ｓタグ、または抗体の一本鎖可変領域（ｓｃＦｖ）である、請求項３３記載の融合タンパク質。
【請求項３５】
以下を含む、単離された融合タンパク質：
（ａ）抗体の一本鎖可変領域をコードする第１のドメイン；
（ｂ）核局在化シグナルをコードする第２のドメイン；および
（ｃ）転写調節活性をコードする第３のドメイン。
【請求項３６】
請求項２８から３５のいずれか一項記載のＺＦＰをコードするヌクレオチド配列を含む、核酸。
【請求項３７】
請求項３６記載の核酸を含む、発現ベクター。
【請求項３８】
請求項３７記載の発現ベクターを含む、宿主細胞。
【請求項３９】
（ａ）請求項３８記載の宿主細胞を、ＺＦＰを発現するための条件下で一定期間培養する段階；および
（ｂ）ＺＦＰを回収する段階
を含む、亜鉛フィンガータンパク質を調製する方法。
【請求項４０】
１０個以下のアミノ酸によって互いに分離された３つの連続した亜鉛フィンガードメインを含む、亜鉛フィンガータンパク質（ＺＦＰ）をコードする核酸の作製法であって、以下の段階を含む方法：
（ａ）（ｉ）第１の亜鉛フィンガードメインをコードする第１の二本鎖オリゴヌクレオチド、
（ｉｉ）第２の亜鉛フィンガードメインをコードする第２の二本鎖オリゴヌクレオチド、
（ｉｉｉ）第３の亜鉛フィンガーをコードする第３の二本鎖オリゴヌクレオチド、    （ｉｖ）第１のオリゴヌクレオチドの５’末端に相補的な第１のＰＣＲプライマー、および
（ｖ）第３のオリゴヌクレオチドの３’末端に相補的な第２のＰＣＲプライマー
を含む混合物であって
第１のオリゴヌクレオチドの３’末端が、そこから第２のオリゴヌクレオチド合成を開始するために第２のオリゴヌクレオチドの５’末端に十分相補的であり、
第２のオリゴヌクレオチドの３’末端が、そこから第３のオリゴヌクレオチド合成を開始するために第３のオリゴヌクレオチドの５’末端に十分相補的であり、
第１のオリゴヌクレオチドの３’末端が第３のオリゴヌクレオチドの５’末端に相補的ではなく、第２のオリゴヌクレオチドの３’末端が第１のオリゴヌクレオチドの５’末端に相補的ではない
混合物を、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行う条件下で調製する段階；
（ｂ）混合物をＰＣＲに供する段階；ならびに
（ｃ）３つの亜鉛フィンガードメインをコードする核酸を回収して、ＺＦＰをコードする核酸を調製する段階。
【請求項４１】
各ドメインが独立して式
2004519211.tif 000078
で示され、該ドメインが独立して、０個〜１０個のアミノ酸残基で共有結合している、３つの亜鉛フィンガードメインを含む亜鉛フィンガータンパク質（ＺＦＰ）をコードする核酸の作製法であって、以下の段階を含む方法：
（ａ）（ｉ）第１の亜鉛フィンガードメインをコードする第１の二本鎖オリゴヌクレオチド、
（ｉｉ）第２の亜鉛フィンガードメインをコードする第２の二本鎖オリゴヌクレオチド、
（ｉｉｉ）第３の亜鉛フィンガーをコードする第３の二本鎖オリゴヌクレオチド、
（ｉｖ）第１のオリゴヌクレオチドの５’末端に相補的な第１のＰＣＲプライマー、および
（ｖ）第３のオリゴヌクレオチドの３’末端に相補的な第２のＰＣＲプライマー
を含む混合物であって、
第１のオリゴヌクレオチドの３’末端が、そこから第２のオリゴヌクレオチド合成を開始するために第２のオリゴヌクレオチドの５’末端に十分相補的であり、
第２のオリゴヌクレオチドの３’末端が、そこから第３のオリゴヌクレオチド合成を開始するために第３のオリゴヌクレオチドの５’末端に十分相補的であり、
第１のオリゴヌクレオチドの３’末端が第３のオリゴヌクレオチドの５’末端に相補的ではなく、第２のオリゴヌクレオチドの３’末端が第１のオリゴヌクレオチドの５’末端に相補的ではない
混合物を、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行う条件下で調製する段階；
（ｂ）混合物をＰＣＲに供する段階；ならびに
（ｃ）３つの亜鉛フィンガードメインをコードする核酸を回収して、ＺＦＰをコードする核酸を調製する段階。
【請求項４２】
第１および第２のＰＣＲプライマーが独立して制限エンドヌクレアーゼ認識部位を含む、請求項４０または４１記載の方法。
【請求項４３】
制限エンドヌクレアーゼ認識部位がＢｂｓＩ、ＢｓａＩ、ＢｓｍＢＩ、またはＢｓｐＭＩ用である、請求項４２記載の方法。
【請求項４４】
制限エンドヌクレアーゼ認識部位がＢｓａＩ用である、請求項４３記載の方法。
【請求項４５】
それぞれ１０個以下のアミノ酸によって互いに分離された、４つ以上の連続した亜鉛フィンガードメインを含む亜鉛フィンガータンパク質（ＺＦＰ）をコードする核酸の作製法であって、以下の段階を含む方法：
（ａ）第２のＰＣＲプライマーが第１の制限エンドヌクレアーゼ認識部位を含む、請求項４２記載の方法によって第１の核酸を調製する段階；
（ｂ）第１および第２のＰＣＲプライマーが、増幅のために選択された番号の亜鉛フィンガードメインの５’末端および３’末端にそれぞれ相補的であり、
第１のＰＣＲプライマーが、対応する制限エンドヌクレアーゼによる切断に供された場合に、段階（ａ）の第２のＰＣＲプライマーが対応する制限エンドヌクレアーゼによる切断に供された場合に産生される末端に相補的でありかつアニーリングできる配列を含む末端を産生する、制限エンドヌクレアーゼ認識部位を含み、
段階（ｂ）の第２のＰＣＲプライマーが、選択的に、切断に供された場合に第１の制限エンドヌクレアーゼ認識部位から産生された末端と異なりかつ相補的ではない末端を産生する、第２の制限酵素認識部を含む、請求項４２記載の方法によって第２の核酸を調製する段階；
（ｃ）前記第１および第２のＰＣＲプライマーが、増幅のために選択された番号の亜鉛フィンガードメインの５’末端および３’末端にそれぞれ相補的であり、
さらなる各核酸のための第１のＰＣＲプライマーが、対応する制限エンドヌクレアーゼによる切断に供された場合に、第２の核酸またはさらなる核酸のすぐ上流に存在するさらなる核酸の調製に使用される第２のＰＣＲプライマーが対応する制限エンドヌクレアーゼによる切断に供された場合に産生される末端に相補的でありかつアニーリングできる配列を有する末端を産生する制限エンドヌクレアーゼ認識部位を含み、
さらなる各核酸のための第２のＰＣＲプライマーが、選択的に、切断に供された場合に先に使用したいかなる末端とも異なりかつ相補的ではない末端を産生する制限エンドヌクレアーゼ認識部位を含む、
選択的に、請求項４２記載の方法によって１つまたは複数のさらなる核酸を調製する段階；
（ｄ）第１の核酸、第２の核酸、および調整されたならばさらなる核酸を、対応する制限エンドヌクレアーゼで切断して、切断された第１の、第２の、および調整されたならばさらなる核酸を産生する段階；ならびに
（ｅ）切断された第１の、第２の、および調整されたならばさらなる核酸をライゲーションして、４つ以上の亜鉛フィンガードメインを有する亜鉛フィンガータンパク質（ＺＦＰ）をコードする核酸を産生する段階。
【請求項４６】
各ドメインが独立して式
2004519211.tif 000079
で示され、該ドメインが独立して、０個〜１０個のアミノ酸残基で共有結合している、４つ以上の亜鉛フィンガードメインを有する亜鉛フィンガータンパク質（ＺＦＰ）をコードする核酸の作製法であって、以下の段階を含む方法：
（ａ）第２のＰＣＲプライマーが第１の制限エンドヌクレアーゼ認識部位を含む、請求項４２記載の方法によって第１の核酸を調製する段階；
（ｂ）第１および第２のＰＣＲプライマーが、増幅のために選択された番号の亜鉛フィンガードメインの５’末端および３’末端にそれぞれ相補的であり、
第１のＰＣＲプライマーが、対応する制限エンドヌクレアーゼによる切断に供された場合に、段階（ａ）の第２のＰＣＲプライマーが対応する制限エンドヌクレアーゼによる切断に供された場合に産生される末端に相補的でありかつアニーリングできる配列を含む末端を産生する、制限エンドヌクレアーゼ認識部位を含み、
段階（ｂ）の第２のＰＣＲプライマーが、選択的に、切断に供された場合に第１の制限エンドヌクレアーゼ認識部位から産生された末端と異なりかつ相補的ではない末端を産生する、第２の制限酵素認識部を含む、請求項４２記載の方法によって第２の核酸を調製する段階；
（ｃ）前記第１および第２のＰＣＲプライマーが、増幅のために選択された番号の亜鉛フィンガードメインの５’末端および３’末端にそれぞれ相補的であり、
さらなる各核酸のための第１のＰＣＲプライマーが、対応する制限エンドヌクレアーゼによる切断に供された場合に、第２の核酸またはさらなる核酸のすぐ上流に存在するさらなる核酸の調製に使用される第２のＰＣＲプライマーが対応する制限エンドヌクレアーゼによる切断に供された場合に産生される末端に相補的でありかつアニーリングできる配列を有する末端を産生する制限エンドヌクレアーゼ認識部位を含み、
さらなる各核酸のための第２のＰＣＲプライマーが、選択的に、切断に供された場合に先に使用したいかなる末端とも異なりかつ相補的ではない末端を産生する制限エンドヌクレアーゼ認識部位を含む、
選択的に、請求項４２記載の方法によって１つまたは複数のさらなる核酸を調製する段階；
（ｄ）第１の核酸、第２の核酸、および調整されたならばさらなる核酸を、対応する制限エンドヌクレアーゼで切断して、切断された第１の、第２の、および調整されたならばさらなる核酸を産生する段階；ならびに
（ｅ）切断された第１の、第２の、および調整されたならばさらなる核酸をライゲーションして、４つ以上の亜鉛フィンガードメインを有する亜鉛フィンガータンパク質（ＺＦＰ）をコードする核酸を産生する段階。
【請求項４７】
各制限エンドヌクレアーゼが独立して、ＢｂｓＩ、ＢｓａＩ、ＢｓｍＢＩ、またはＢｓｐＭＩであり、各エンドヌクレアーゼが切断可能でアニーリング可能な末端の固有の対を産生する、請求項４５または４６記載の方法。
【請求項４８】
制限エンドヌクレアーゼがＢｓａＩであり、その使用により切断可能でアニーリング可能な末端の固有の対が産生される、請求項４５または４６記載の方法。
【請求項４９】
段階（ｃ）を削除し、かつ亜鉛フィンガータンパク質（ＺＦＰ）をコードする核酸が４つ、５つ、または６つの亜鉛フィンガードメインを有する、請求項４５または５０記載の方法。
【請求項５０】
制限エンドヌクレアーゼが、ＢｂｓＩ、ＢｓａＩ、ＢｓｍＢＩ、またはＢｓｐＭＩである、請求項４９記載の方法。
【請求項５１】
制限エンドヌクレアーゼが、ＢｓａＩである、請求項４９記載の方法。
【請求項５２】
第２の核酸用のＰＣＲプライマーが、３つの亜鉛フィンガードメインを増幅するために選択され、１つのさらなる核酸を段階（ｃ）によって調製し、亜鉛フィンガータンパク質（ＺＦＰ）をコードする核酸が、７つ、８つ、または９つの亜鉛フィンガードメインを有する、請求項４５または４６記載の方法。
【請求項５３】
各制限エンドヌクレアーゼが独立して、ＢｂｓＩ、ＢｓａＩ、ＢｓｍＢＩ、またはＢｓｐＭＩであり、各エンドヌクレアーゼが切断可能でアニーリング可能な末端の固有の対を産生する、請求項５２記載の方法。
【請求項５４】
制限エンドヌクレアーゼがＢｓａＩであり、その使用により切断可能でアニーリング可能な末端の固有の対が産生される、請求項５２記載の方法。
【請求項５５】
オリゴヌクレオチドの配列が、生物の最適コドンを使用するために選択される、請求項４０から５４のいずれか一項記載の方法。
【請求項５６】
生物が、細菌、真菌、酵母、動物、昆虫、または植物である、請求項５５記載の方法。
【請求項５７】
細菌が大腸菌である、請求項５６記載の方法。
【請求項５８】
動物がヒトまたは市販の動物である、請求項５６記載の方法。
【請求項５９】
植物が穀類植物である、請求項５６記載の方法。
【請求項６０】
植物が、イネ、トマト、またはトウモロコシである、請求項５６記載の方法。
【請求項６１】
植物がトランスジェニック植物である、請求項５６、５９、または６０のいずれか一項記載の方法。
【請求項６２】
請求項４０から６１のいずれか一項記載の方法によって調製された核酸を含む、発現ベクター。
【請求項６３】
請求項６２記載の発現ベクターを含む、宿主細胞。
【請求項６４】
（ａ）請求項６３記載の宿主細胞をＺＦＰを発現するための条件下で一定期間培養する段階；および
（ｂ）ＺＦＰを回収する段階
を含む、亜鉛フィンガータンパク質を調製する方法。
【請求項６５】
４つの塩基を有する標的核酸配列を同定する段階；および亜鉛フィンガードメインのαヘリックスの−１位、２位、３位、および６位のアミノ酸の同一性を、以下のように決定する段階
を含む、１つまたは複数の亜鉛フィンガードメインを設計する方法：
（ａ）第１の塩基がＧの場合、Ｚ６はアルギニンまたはリジンであり、
第１の塩基がＡの場合、Ｚ６はグルタミンまたはアスパラギンであり、
第１の塩基がＴの場合、Ｚ６はトレオニン、チロシン、ロイシン、イソロイシン、またはメチオニンであり、
第１の塩基がＣの場合、Ｚ６はグルタミン酸またはアスパラギン酸であり、
（ｂ）第２の塩基がＧの場合、Ｚ３はヒスチジンまたはリジンであり、
第２の塩基がＡの場合、Ｚ３はアスパラギンまたはグルタミンであり、
第２の塩基がＴの場合、Ｚ３はセリン、アラニン、またはバリンであり、
第２の塩基がＣの場合、Ｚ３はアスパラギン酸またはグルタミン酸であり、
（ｃ）第３の塩基がＧの場合、Ｚ−１はアルギニンまたはリジンであり、
第３の塩基がＡの場合、Ｚ−１はグルタミンまたはアスパラギンであり、
第３の塩基がＴの場合、Ｚ−１はトレオニン、メチオニン、ロイシン、またはイソロイシンであり、
第３の塩基がＣの場合、Ｚ−１はグルタミン酸またはアスパラギン酸であり、
（ｉｖ）第４の塩基の相補物（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）がＧの場合、Ｚ２はセリンまたはアルギニンであり、
第４の塩基の相補物がＡの場合、Ｚ２はアスパラギンまたはグルタミンであり、かつ
第４の塩基の相補物がＴの場合、Ｚ２はトレオニン、バリン、またはアラニンであり、
第４の塩基の相補物がＣの場合、Ｚ２はアスパラギン酸またはグルタミン酸である。
【請求項６６】
１つまたは複数の亜鉛フィンガードメインを含むＺＦＰまたはＺＦＰをコードする核酸を調製する段階をさらに含む、請求項６５記載の方法。
【請求項６７】
複数の亜鉛フィンガードメインが設計される、請求項６５または６６記載の方法。
【請求項６８】
（ａ）第１の塩基がＧの場合、Ｚ６はアルギニンであり、
第１の塩基がＡの場合、Ｚ６はグルタミンであり、
第１の塩基がＴの場合、Ｚ６はトレオニン、チロシン、またはロイシンであり、
第１の塩基がＣの場合、Ｚ６はグルタミン酸であり、
（ｂ）第２の塩基がＧの場合、Ｚ３はヒスチジンであり、
第２の塩基がＡの場合、Ｚ３はアスパラギンであり、
第２の塩基がＴの場合、Ｚ３はセリンであり、
第２の塩基がＣの場合、Ｚ３はアスパラギン酸であり、
（ｃ）第３の塩基がＧの場合、Ｚ−１はアルギニンであり、
第３の塩基がＡの場合、Ｚ−１はグルタミンであり、
第３の塩基がＴの場合、Ｚ−１はトレオニンまたはメチオニンであり、
第３の塩基がＣの場合、Ｚ−１はグルタミン酸であり、
（ｄ）第４の塩基の相補物がＧの場合、Ｚ２はセリンであり、
第４の塩基の相補物がＡの場合、Ｚ２はアスパラギンであり、
第４の塩基の相補物がＴの場合、Ｚ２はトレオニンであり、かつ
第４の塩基の相補物がＣの場合、Ｚ２はアスパラギン酸である、請求項６５から６７のいずれか一項記載の方法。
【請求項６９】
（ａ）４つの塩基を有する標的核酸配列を同定する段階；
（ｂ）各Ｘの同一性を決定する段階；
（ｃ）Ｚ−１位、Ｚ２位、Ｚ３位およびＺ６位のアミノ酸の同一性を、以下のように決定する段階；ならびに
（ｄ）亜鉛フィンガードメインを含む亜鉛フィンガータンパク質を調製する段階を含む、式
2004519211.tif 000080
（式中、Ｘは独立して、任意のアミノ酸であり、Ｘｎはポリペプチド鎖中のＸの発生数を示す）の亜鉛フィンガードメインを設計する方法：
（ｉ）第１の塩基がＧの場合、Ｚ６はアルギニンまたはリジンであり、
第１の塩基がＡの場合、Ｚ６はグルタミンまたはアスパラギンであり、
第１の塩基がＴの場合、Ｚ６はトレオニン、チロシン、ロイシン、イソロイシン、またはメチオニンであり、
第１の塩基がＣの場合、Ｚ６はグルタミン酸またはアスパラギン酸であり、
（ｉｉ）第２の塩基がＧの場合、Ｚ３はヒスチジンまたはリジンであり、
第２の塩基がＡの場合、Ｚ３はアスパラギンまたはグルタミンであり、
第２の塩基がＴの場合、Ｚ３はセリン、アラニン、またはバリンであり、
第２の塩基がＣの場合、Ｚ３はアスパラギン酸またはグルタミン酸であり、
（ｉｉｉ）第３の塩基がＧの場合、Ｚ−１はアルギニンまたはリジンであり、
第３の塩基がＡの場合、Ｚ−１はグルタミンまたはアスパラギンであり、
第３の塩基がＴの場合、Ｚ−１はトレオニン、メチオニン、ロイシン、またはイソロイシンであり、
第３の塩基がＣの場合、Ｚ−１はグルタミン酸またはアスパラギン酸であり、
（ｉｖ）第４の塩基の相補物がＧの場合、Ｚ２はセリンまたはアルギニンであり、
第４の塩基の相補物がＡの場合、Ｚ２はアスパラギンまたはグルタミンであり、
第４の塩基の相補物がＴの場合、Ｚ２はトレオニン、バリン、またはアラニンであり、
第４の塩基の相補物がＣの場合、Ｚ２はアスパラギン酸またはグルタミン酸である。
【請求項７０】
（ａ）４つの塩基を有する標的核酸配列を同定する段階；
（ｂ）各Ｘの同一性を決定する段階；
（ｃ）Ｚ−１位、Ｚ２位、Ｚ３位およびＺ６位のアミノ酸の同一性を、以下のように決定する段階；ならびに
（ｄ）亜鉛フィンガードメインを含む亜鉛フィンガータンパク質を調製する段階を含む、式
2004519211.tif 000081
（式中、Ｘは独立して、任意のアミノ酸であり、Ｘｎはポリペプチド鎖中のＸの発生数を示す）の亜鉛フィンガードメインを設計する方法：
（ｉ）第１の塩基がＧの場合、Ｚ６はアルギニンであり、
第１の塩基がＡの場合、Ｚ６はグルタミンであり、
第１の塩基がＴの場合、Ｚ６はトレオニン、チロシン、またはロイシンであり、
第１の塩基がＣの場合、Ｚ６はグルタミン酸であり、
（ｉｉ）第２の塩基がＧの場合、Ｚ３はヒスチジンであり、
第２の塩基がＡの場合、Ｚ３はアスパラギンであり、
第２の塩基がＴの場合、Ｚ３はセリンであり、
第２の塩基がＣの場合、Ｚ３はアスパラギン酸であり、
（ｉｉｉ）第３の塩基がＧの場合、Ｚ−１はアルギニンであり、
第３の塩基がＡの場合、Ｚ−１はグルタミンであり、
第３の塩基がＴの場合、Ｚ−１はトレオニンまたはメチオニンであり、
第３の塩基がＣの場合、Ｚ−１はグルタミン酸であり、
（ｉｖ）第４の塩基の相補物がＧの場合、Ｚ２はセリンであり、
第４の塩基の相補物がＡの場合、Ｚ２はアスパラギンであり、
第４の塩基の相補物がＴの場合、Ｚ２はトレオニンであり、
第４の塩基の相補物がＣの場合、Ｚ２はアスパラギン酸である。
【請求項７１】
第１の塩基がＴの場合、Ｚ６はトレオニンであり、第３の塩基がＴの場合、Ｚ−１はトレオニンである、請求項６５から７０のいずれか一項記載の方法。
【請求項７２】
少なくとも１つの亜鉛フィンガードメインのＸ位がＳｐ１ＣまたはＺｉｆ２６８亜鉛フィンガードメイン由来の対応するアミノ酸を含む、請求項６５から７１のいずれか一項記載の方法。
【請求項７３】
ＺＦＰが組換えによって調製される、請求項６５から７２のいずれか一項記載の方法。
【請求項７４】
（ａ）Ｎが段階（ｂ）の重複４塩基対セグメントの数である、３Ｎ＋１塩基対長の標的核酸配列を同定する段階；
（ｂ）Ｎ−１セグメントまでの各セグメントの第４の塩基が、セグメントのすぐ後の第１の塩基である、標的核酸配列を重複４塩基対のセグメントに分割する段階；ならびに
（ｃ）亜鉛フィンガードメインのαへリックスの−１位、２位、３位、および６位のアミノ酸の同一性を以下のように決定することにより、各４塩基対セグメントに対する亜鉛フィンガードメインを設計する段階
を含む、マルチドメイン（ｍｕｌｔｉ−ｄｏｍａｉｎｅｄ）亜鉛フィンガータンパク質（ＺＦＰ）を設計する方法：
（ｉ）第１の塩基がＧの場合、Ｚ６はアルギニンまたはリジンであり、
第１の塩基がＡの場合、Ｚ６はグルタミンまたはアスパラギンであり、
第１の塩基がＴの場合、Ｚ６はトレオニン、チロシン、ロイシン、イソロイシン、またはメチオニンであり、
第１の塩基がＣの場合、Ｚ６はグルタミン酸またはアスパラギン酸であり、
（ｉｉ）第２の塩基がＧの場合、Ｚ３はヒスチジンまたはリジンであり、
第２の塩基がＡの場合、Ｚ３はアスパラギンまたはグルタミンであり、
第２の塩基がＴの場合、Ｚ３はセリン、アラニン、またはバリンであり、
第２の塩基がＣの場合、Ｚ３はアスパラギン酸またはグルタミン酸であり、
（ｉｉｉ）第３の塩基がＧの場合、Ｚ−１はアルギニンまたはリジンであり、
第３の塩基がＡの場合、Ｚ−１はグルタミンまたはアスパラギンであり、
第３の塩基がＴの場合、Ｚ−１はトレオニン、メチオニン、ロイシン、またはイソロイシンであり、
第３の塩基がＣの場合、Ｚ−１はグルタミン酸またはアスパラギン酸であり、
（ｉｖ）第４の塩基の相補物がＧの場合、Ｚ２はセリンまたはアルギニンであり、
第４の塩基の相補物がＡの場合、Ｚ２はアスパラギンまたはグルタミンであり、
第４の塩基の相補物がＴの場合、Ｚ２はトレオニン、バリン、またはアラニンであり、
第４の塩基の相補物がＣの場合、Ｚ２はアスパラギン酸またはグルタミン酸である。
【請求項７５】
亜鉛フィンガードメインを含むＺＦＰまたはＺＦＰをコードする核酸を調製する段階をさらに含む、請求項７４記載の方法。
【請求項７６】
ｉ）第１の塩基がＧの場合、Ｚ６はアルギニンであり、
第１の塩基がＡの場合、Ｚ６はグルタミンであり、
第１の塩基がＴの場合、Ｚ６はトレオニン、チロシン、またはロイシンであり、
第１の塩基がＣの場合、Ｚ６はグルタミン酸であり、
（ｉｉ）第２の塩基がＧの場合、Ｚ３はヒスチジンであり、
第２の塩基がＡの場合、Ｚ３はアスパラギンであり、
第２の塩基がＴの場合、Ｚ３はセリンであり、
第２の塩基がＣの場合、Ｚ３はアスパラギン酸であり、
（ｉｉｉ）第３の塩基がＧの場合、Ｚ−１はアルギニンであり、
第３の塩基がＡの場合、Ｚ−１はグルタミンであり、
第３の塩基がＴの場合、Ｚ−１はトレオニンまたはメチオニンであり、
第３の塩基がＣの場合、Ｚ−１はグルタミン酸であり、
（ｉｖ）第４の塩基の相補物がＧの場合、Ｚ２はセリンであり、
第４の塩基の相補物がＡの場合、Ｚ２はアスパラギンであり、
第４の塩基の相補物がＴの場合、Ｚ２はトレオニンであり、
第４の塩基の相補物がＣの場合、Ｚ２はアスパラギン酸である、
請求項７４または７５記載の方法。
【請求項７７】
各亜鉛フィンガードメインが独立して式
2004519211.tif 000082
（式中、Ｘは独立して、任意のアミノ酸であり、Ｘｎはポリペプチド鎖中のＸの発生数を示す）で示される、マルチドメイン亜鉛フィンガータンパク質（ＺＦＰ）を設計する方法であって、
（ａ）Ｎが段階（ｂ）の重複４塩基対セグメントの数である、３Ｎ＋１塩基対長の標的核酸配列を同定する段階；
（ｂ）Ｎ−１セグメントまでの各セグメントの第４の塩基が、セグメントのすぐ後の第１の塩基である、標的核酸配列を重複４塩基対のセグメントに分割する段階；
（ｃ）（ｉ）各Ｘの同一性を決定すること、ならびに
（ｉｉ）Ｚ−１位、Ｚ２位、Ｚ３位およびＺ６位のアミノ酸の同一性を以下のように決定すること
によって各４塩基対セグメントに対する亜鉛フィンガードメインを設計する段階；
（ｄ）Ｎ亜鉛フィンガードメインを含むＺＦＰを調製する段階
を含む方法：
（１）第１の塩基がＧの場合、Ｚ６はアルギニンまたはリジンであり、
第１の塩基がＡの場合、Ｚ６はグルタミンまたはアスパラギンであり、
第１の塩基がＴの場合、Ｚ６はトレオニン、チロシン、ロイシン、イソロイシン、またはメチオニンであり、
第１の塩基がＣの場合、Ｚ６はグルタミン酸またはアスパラギン酸であり、
（２）第２の塩基がＧの場合、Ｚ３はヒスチジンまたはリジンであり、
第２の塩基がＡの場合、Ｚ３はアスパラギンまたはグルタミンであり、
第２の塩基がＴの場合、Ｚ３はセリン、アラニン、またはバリンであり、
第２の塩基がＣの場合、Ｚ３はアスパラギン酸またはグルタミン酸であり、
（３）第３の塩基がＧの場合、Ｚ−１はアルギニンまたはリジンであり、
第３の塩基がＡの場合、Ｚ−１はグルタミンまたはアスパラギン酸であり、
第３の塩基がＴの場合、Ｚ−１はトレオニン、メチオニン、ロイシン、またはイソロイシンであり、
第３の塩基がＣの場合、Ｚ−１はグルタミン酸またはアスパラギン酸であり、
（４）第４の塩基の相補物がＧの場合、Ｚ２はセリンまたはアルギニンであり、
第４の塩基の相補物がＡの場合、Ｚ２はアスパラギンまたはグルタミンであり、
第４の塩基の相補物がＴの場合、Ｚ２はトレオニン、バリン、またはアラニンであり、
第４の塩基の相補物がＣの場合、Ｚ２はアスパラギン酸またはグルタミン酸である。
【請求項７８】
各亜鉛フィンガードメインが独立して式
2004519211.tif 000083
（式中、Ｘは独立して、任意のアミノ酸であり、Ｘｎはポリペプチド鎖中のＸの発生数を示す）で示される、マルチドメイン亜鉛フィンガータンパク質（ＺＦＰ）を設計する方法であって、
（ａ）Ｎが段階（ｂ）の重複４塩基対セグメントの数である、３Ｎ＋１塩基対長の標的核酸配列を同定する段階；
（ｂ）Ｎ−１セグメントまでの各セグメントの第４の塩基が、セグメントのすぐ後の第１の塩基である、標的核酸配列を重複４塩基対のセグメントに分割する段階；
（ｃ）（ｉ）各Ｘの同一性を同定すること、ならびに
（ｉｉ）Ｚ−１位、Ｚ２位、Ｚ３位およびＺ６位のアミノ酸の同一性を以下のように決定すること
によって各４塩基対セグメントの亜鉛フィンガードメインを設計する段階；ならびに
（ｄ）Ｎ亜鉛フィンガードメインを含むＺＦＰを調製する段階：
（１）第１の塩基がＧの場合、Ｚ６はアルギニンであり、
第１の塩基がＡの場合、Ｚ６はグルタミンであり、
第１の塩基がＴの場合、Ｚ６はトレオニン、チロシン、またはロイシンであり、
第１の塩基がＣの場合、Ｚ６はグルタミン酸であり、
（２）第２の塩基がＧの場合、Ｚ３はヒスチジンであり、
第２の塩基がＡの場合、Ｚ３はアスパラギンであり、
第２の塩基がＴの場合、Ｚ３はセリンであり、
第２の塩基がＣの場合、Ｚ３はアスパラギン酸であり、
（３）第３の塩基がＧの場合、Ｚ−１はアルギニンであり、
第３の塩基がＡの場合、Ｚ−１はグルタミンであり、
第３の塩基がＴの場合、Ｚ−１はトレオニンまたはメチオニンであり、
第３の塩基がＣの場合、Ｚ−１はグルタミン酸であり、
（４）第４の塩基の相補物がＧの場合、Ｚ２はセリンであり、
第４の塩基の相補物がＡの場合、Ｚ２はアスパラギンであり、
第４の塩基の相補物がＴの場合、Ｚ２はトレオニンであり、
第４の塩基の相補物がＣの場合、Ｚ２はアスパラギン酸である。
【請求項７９】
ＺＦＰのドメインが互いに０個〜１０個のアミノ酸残基で共有結合している、請求項７４から７８のいずれか一項記載の方法。
【請求項８０】
Ｎが３から４０である、請求項７４から７９のいずれか一項記載の方法。
【請求項８１】
Ｎが３から１５である、請求項８０記載の方法。
【請求項８２】
Ｎが７、８、または９である、請求項８１記載の方法。
【請求項８３】
Ｎが６である、請求項８１記載の方法。
【請求項８４】
Ｎが３である、請求項８１記載の方法。
【請求項８５】
第１の塩基がＴである場合、Ｚ６はトレオニンであり；かつ第３の塩基がＴである場合、Ｚ−１はトレオニンである、請求項７４から８４のいずれか一項記載の方法。
【請求項８６】
少なくとも１つの亜鉛フィンガードメインのＸ位がＳｐ１ＣまたはＺｉｆ２６８亜鉛フィンガードメイン由来の対応するアミノ酸を含む、請求項７４から８５のいずれか一項記載の方法。
【請求項８７】
ＺＦＰが組換えによって調製される、請求項７４から８６のいずれか一項記載の方法。
【請求項８８】
標的核酸を、請求項１から２３のいずれか一項記載のＺＦＰに、ＺＦＰが標的核酸に結合するのに十分な量および期間接触させる段階を含む、標的核酸を人工亜鉛フィンガータンパク質（ＺＦＰ）に結合させる方法。
【請求項８９】
Ｎが標的核酸中の重複４塩基対セグメントの数であり、Ｎ−１セグメントまでの各セグメントの第４の塩基がセグメント直後の第１の塩基である、３Ｎ＋１塩基対長の標的核酸を、請求項７４から８７のいずれか一項記載の方法によって調製した一定量のマルチドメインＺＦＰに、ＺＦＰが標的核酸に結合するのに十分な時間接触させる段階を含む、標的核酸をマルチドメイン亜鉛フィンガータンパク質（ＺＦＰ）に結合させる方法。
【請求項９０】
ＺＦＰをコードする核酸を介して、ＺＦＰを細胞に導入する、請求項８８または８９記載の方法。
【請求項９１】
標的核酸が植物遺伝子をコードする、請求項８８から９０のいずれか一項記載の方法。
【請求項９２】
植物遺伝子がトマト、トウモロコシ、またはイネ由来である、請求項９１記載の方法。
【請求項９３】
標的核酸がサイトカイン、インターロイキン、癌遺伝子、血管新生因子、または薬物耐性遺伝子をコードする、請求項８８から９０のいずれか一項記載の方法。
【請求項９４】
遺伝子の調節制御エレメントを、請求項１から２３のいずれか一項記載のＺＦＰに、ＺＦＰが遺伝子の発現を変化させるために十分な量および期間接触させる段階を含む、遺伝子発現を調整する方法。
【請求項９５】
遺伝子の調節制御エレメントを、請求項７４から８７のいずれか一項記載の方法によって調製した一定量のマルチドメイン亜鉛フィンガータンパク質（ＺＦＰ）に、ＺＦＰが遺伝子発現を変化させるために十分な時間接触させる段階を含む、遺伝子発現を調整する方法。
【請求項９６】
発現の調整が遺伝子の発現の活性化である、請求項９４または９５記載の方法。
【請求項９７】
発現の調整が遺伝子発現の抑制である、請求項９４または９５記載の方法。
【請求項９８】
ＺＦＰをコードする核酸を介してＺＦＰが細胞に導入される、請求項９４から９７のいずれか一項記載の方法。
【請求項９９】
遺伝子が植物遺伝子をコードする、請求項９４から９８のいずれか一項記載の方法。
【請求項１００】
植物遺伝子がトマト、トウモロコシ、またはイネ由来である、請求項９９記載の方法。
【請求項１０１】
遺伝子がサイトカイン、インターロイキン、癌遺伝子、血管新生因子、または薬物耐性遺伝子をコードする、請求項９４から９８のいずれか一項記載の方法。
【請求項１０２】
融合タンパク質を核酸に転写調節ドメインが遺伝子発現を変化させるために十分な量および期間接触させる、遺伝子発現を調整する方法であり、以下の段階を含む方法：
遺伝子に十分近位の標的核酸を、転写調節ドメインに融合した請求項１から２３のいずれか一項記載のＺＦＰの融合タンパク質に接触させる段階。
【請求項１０３】
融合タンパク質を核酸に転写調節ドメインが遺伝子発現を変化させるために十分な量および期間接触させる、遺伝子発現を調整する方法であり、以下の段階を含む方法：
遺伝子に十分近位の標的核酸を、配列転写調節ドメインに融合させかつ請求項７４から８７のいずれか一項記載の方法によって調製したマルチドメイン亜鉛フィンガータンパク質（ＺＦＰ）の融合タンパク質に接触させる段階。
【請求項１０４】
転写調節ドメインが遺伝子の発現を活性化する、請求項１０２または１０３記載の方法。
【請求項１０５】
転写調節ドメインが遺伝子の発現を抑制する、請求項１０２または１０３記載の方法。
【請求項１０６】
融合タンパク質をコードする核酸を介して、融合タンパク質を細胞に導入する、請求項１０２から１０５のいずれか一項記載の方法。
【請求項１０７】
遺伝子が植物遺伝子をコードする、請求項１０２から１０６のいずれか一項記載の方法。
【請求項１０８】
植物遺伝子がトマト、トウモロコシ、またはイネ由来である、請求項１０７記載の方法。
【請求項１０９】
遺伝子がサイトカイン、インターロイキン、癌遺伝子、血管新生因子、または薬物耐性遺伝子をコードする、請求項１０２から１０６のいずれか一項記載の方法。
【請求項１１０】
融合タンパク質を標的ゲノム部位に、部位中または付近のゲノム構造を変化させるために十分な量および時間接触させる、ゲノム構造を変化させる方法であり、以下の段階を含む方法：
標的ゲノム部位を、トランスポザーゼ活性、インテグラーゼ活性、リコンビナーゼ活性、レソルバーゼ活性、インベルターゼ活性、プロテアーゼ活性、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ活性、ＤＮＡデメチラーゼ活性、ヒストンアセチラーゼ活性、ヒストンデアセチラーゼ活性、またはヌクレアーゼ活性を示すタンパク質ドメインに融合された、請求項１から２３のいずれか一項記載のＺＦＰの融合タンパク質に接触させる段階。
【請求項１１１】
融合タンパク質を標的ゲノム部位に、部位中または付近のゲノム構造を変化させるために十分な量および時間接触させる、ゲノム構造を変化させる方法であり、以下の段階を含む方法：
標的ゲノム部位を、トランスポザーゼ活性、インテグラーゼ活性、リコンビナーゼ活性、レソルバーゼ活性、インテグラーゼ活性、プロテアーゼ活性、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ活性、ＤＮＡデメチラーゼ活性、ヒストンアセチラーゼ活性、ヒストンデアセチラーゼ活性、またはヌクレアーゼ活性を示すタンパク質ドメインに融合された、た請求項７４から８７のいずれか一項記載の方法によって調製したマルチドメイン亜鉛フィンガータンパク質（ＺＦＰ）の融合タンパク質に接触させる段階。
【請求項１１２】
融合タンパク質が核局在化シグナルをさらに含む、請求項１１０または１１１記載の方法。
【請求項１１３】
融合タンパク質をコードする核酸を介して、融合タンパク質を細胞に導入する、請求項１１０から１１２のいずれか一項記載の方法。
【請求項１１４】
融合タンパク質が細胞取り込みシグナルをさらに含む、請求項１１０または１１１の方法。
【請求項１１５】
標的ゲノム部位が、植物遺伝子をコードする遺伝子中または付近に存在する、請求項１１０から１１４のいずれか一項記載の方法。
【請求項１１６】
植物遺伝子がトマト、トウモロコシ、またはイネ由来である、請求項１１５記載の方法。
【請求項１１７】
標的ゲノム部位が、サイトカイン、インターロイキン、癌遺伝子、もしくは血管新生因子をコードする遺伝子、または薬物耐性に関する遺伝子の内部または付近に存在する、請求項１１０から１１４のいずれか一項記載の方法。
【請求項１１８】
（ａ）ＺＦＰがウイルス複製に必要な標的部位に結合する能力を有する、細胞に、請求項１から２３のいずれか一項記載のＺＦＰをコードする核酸を導入する段階；および
（ｂ）ウイルス複製を阻害するのに十分な、細胞中の融合タンパク質の発現を得る段階
を含む、ウイルス複製を阻害する方法。
【請求項１１９】
（ａ）ＺＦＰがウイルス複製に必要な標的部位に結合する能力を有する、細胞に、請求項７４から８７のいずれか一項記載の方法によって調製したマルチドメイン亜鉛フィンガータンパク質（ＺＦＰ）をコードする核酸を導入する段階；および
（ｂ）ウイルス複製を阻害するのに十分な、細胞中のＺＦＰの発現を得る段階
を含む、ウイルス複製を阻害する方法。
【請求項１２０】
（ａ）融合タンパク質がウイルス複製に必要な標的部位に結合する能力を有する、細胞に、一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質に融合した請求項１から２３のいずれか一項記載のＺＦＰの融合タンパク質をコードする核酸を導入する段階；および
（ｂ）ウイルス複製を阻害するのに十分な、細胞中の融合タンパク質の発現を得る段階
を含む、ウイルス複製を阻害する方法。
【請求項１２１】
（ａ）融合タンパク質がウイルス複製に必要な標的部位に結合する能力を有する、細胞に、一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質に融合した、請求項７４から８７のいずれか一項記載の方法によって調製したマルチドメイン亜鉛フィンガータンパク質（ＺＦＰ）の融合タンパク質をコードする核酸を導入する段階；および
（ｂ）ウイルス複製を阻害するのに十分な、細胞中の融合タンパク質の発現を得る段階
を含む、ウイルス複製を阻害する方法。
【請求項１２２】
植物ウイルス、動物ウイルス、またはヒトウイルスのウイルス複製を阻害する、請求項１１８から１２１のいずれか一項記載の方法。
【請求項１２３】
遺伝子の発現を調節する方法であり、以下の段階を含む方法：
（ａ）（ｉ）ＺＦＰが遺伝子に近位の標的部位に特異的である、第１のスイッチ部分に特異的に結合できるタンパク質ドメインに融合した請求項１から２３のいずれか一項記載のＺＦＰの第１の融合タンパク質を発現する、第１の核酸、ならびに
（ｉｉ）第２のスイッチ部分に特異的に結合できる第１のドメイン、核局在化シグナルである第２のドメイン、および転写調節ドメインである第３のドメインを含む第２の融合タンパク質を発現する第２の核酸を含む、
真核細胞を、細胞に侵入でき、かつ特異性の異なる第１および第２のスイッチ部分を含む、２価のリガンドに接触させる段階
（ｂ）十分な期間、細胞に２価のリガンド、第１の融合タンパク質、および第２の融合タンパク質を含む複合体を形成させ、細胞の核に複合体を転位（ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｅ）させ、標的部位に結合させ、それにより遺伝子の発現を変化させる段階。
【請求項１２４】
遺伝子の発現を調節する方法であり、以下の段階を含む方法：
（ａ）（ｉ）ＺＦＰが遺伝子に近位の標的部位に特異的である、第１のスイッチ部分に特異的に結合できるタンパク質ドメインに融合した請求項７４から８７のいずれか一項記載の方法により調製したマルチドメイン亜鉛フィンガータンパク質（ＺＦＰ）の第１の融合タンパク質を発現する、第１の核酸、ならびに
（ｉｉ）第２のスイッチ部分に特異的に結合できる第１のドメイン、核局在化シグナルである第２のドメイン、および転写調節ドメインである第３のドメインを含む第２の融合タンパク質を発現する第２の核酸を含む、
真核細胞を、細胞に侵入でき、かつ特異性の異なる第１および第２のスイッチ部分を含む、２価のリガンドに接触させる段階
（ｂ）十分な期間、細胞に２価のリガンド、第１の融合タンパク質、および第２の融合タンパク質を含む複合体を形成させ、細胞の核に複合体を転位させ、標的部位に結合させ、それにより遺伝子の発現を変化させる段階。
【請求項１２５】
転写調節ドメインが遺伝子の発現を活性化する、請求項１２３または１２４記載の方法。
【請求項１２６】
転写調節ドメインが遺伝子の発現を抑制する、請求項１２３または１２４記載の方法。
【請求項１２７】
第１のスイッチ部分に特異的に結合できるタンパク質ドメインが、Ｓタンパク質、Ｓタグまたは、抗体の一本鎖可変領域（ｓｃＦｖ）である、請求項１２３から１２６のいずれか一項記載の方法。
【請求項１２８】
第１のスイッチ部分がＳタンパク質、Ｓタグまたは抗体の一本鎖可変領域（ｓｃＦｖ）の抗原である、請求項１２３から１２７のいずれか一項記載の方法。
【請求項１２９】
第２のスイッチ部分に特異的に結合できる該ドメインが、Ｓタンパク質、Ｓタグまたは抗体の一本鎖可変領域（ｓｃＦｖ）である、請求項１２３から１２８のいずれか一項記載の方法。
【請求項１３０】
第２のスイッチ部分が、Ｓタンパク質、Ｓタグまたは抗体の一本鎖可変領域（ｓｃＦｖ）の抗原である、請求項１２３から１２９のいずれか一項記載の方法。
【請求項１３１】
ＺＦＰドメインが請求項１から２３のいずれか一項記載のＺＦＰである、触媒ドメイン、ペプチド二量体化ドメイン、およびＺＦＰドメインを含む、人工トランスポザーゼ。
【請求項１３２】
触媒ドメイン、ペプチド二量体化ドメイン、および、請求項７４から８７のいずれか一項記載の方法で調製されたマルチドメイン亜鉛フィンガータンパク質（ＺＦＰ）であるＺＦＰドメインを含む、人工トランスポザーゼ。
【請求項１３３】
末端逆方向反復結合ドメインをさらに含む、請求項１３１または１３２記載のトランスポザーゼ。
【請求項１３４】
外因性遺伝子を生物のゲノムに標的特異的に導入する方法であって、以下の段階を含む方法：
（ａ）ＺＦＰドメインが第１のゲノム標的に結合する、請求項１３３記載のトランスポザーゼをコードする第１の核酸、ＺＦＰドメインが第２のゲノム標的に結合する、請求項１３３記載のトランスポザーゼをコードする第２の核酸、および、トランスポザーゼの末端逆方向反復結合ドメインによって結合できる配列に外因性遺伝子が隣接する、外因性遺伝子をコードする第３の核酸を、細胞に導入する段階；ならびに
（ｂ）ゲノム、第３の核酸、および２つのトランスポザーゼの間で組換えが起こるのに十分な複合体を形成させ、それによって外因性遺伝子を生物のゲノムに導入する段階。
【請求項１３５】
外因性遺伝子を生物のゲノムから標的特異的に切り出す方法であって、以下の段階を含む方法：
（ａ）外因性遺伝子が第１および第２のゲノム標的に隣接する、ＺＦＰドメインが第１のゲノム標的に結合する、請求項１３１または１３２記載のトランスポザーゼをコードする第１の核酸、および、ＺＦＰドメインが第２のゲノム標的に結合する、請求項１３１または１３２記載のトランスポザーゼをコードする第２の核酸を、細胞に導入する段階；
（ｂ）ゲノムおよび２つのトランスポザーゼの間で組換えが起こるのに十分な複合体を形成させ、それにより生物ゲノム由来の外因性遺伝子を切り出す段階。
【請求項１３６】
変化した亜鉛フィンガー認識配列を検出する方法であり、以下の段階を含む方法：
（ａ）関心対象の亜鉛フィンガー認識配列を含む核酸を、配列に特異的であり、かつシグナル伝達部分に結合した請求項１から２３のいずれか一項記載のＺＦＰと接触させる段階であって、配列が変化しない場合、ＺＦＰを亜鉛フィンガー認識配列へ結合させるのに十分な量のＺＦＰが存在する段階；
（ｂ）ＺＦＰの亜鉛フィンガー認識配列への結合を検出し、それにより不変配列へのＺＦＰの結合と比べて結合が減少するまたは消滅する場合に亜鉛フィンガー認識配列が変化することを確認する段階。
【請求項１３７】
変化した亜鉛フィンガー認識配列を検出する方法であり、以下の段階を含む方法：
（ａ）関心対象の亜鉛フィンガー認識配列を含む核酸を、配列に特異的であり、かつシグナル伝達部分に結合した請求項７４から８７のいずれか一項記載の方法により調製したマルチドメイン亜鉛タンパク質（ＺＦＰ）と接触させる段階であって、配列が変化しない場合、ＺＦＰを亜鉛フィンガー認識配列へ結合させる量のＺＦＰが存在する段階；
（ｂ）ＺＦＰの亜鉛フィンガー認識配列への結合を検出し、それにより不変配列へのＺＦＰの結合と比べて結合が減少するまたは消滅する場合に亜鉛フィンガー認識配列が変化することを確認する段階。
【請求項１３８】
シグナル伝達部分が、色素、ビオチン、放射性標識、ストレプトアビジン、またはマーカータンパク質である、請求項１３６または１３７記載の方法。
【請求項１３９】
マーカータンパク質が、β−ガラクトシダーゼ、ＧＵＳ、緑色蛍光タンパク質もしくはその蛍光変異体、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、または抗体である、請求項１３８記載の方法。
【請求項１４０】
変化した亜鉛フィンガー認識部位が、部位中の１つまたは複数のヌクレオチドの変異、挿入、または欠失を含む、請求項１３６から１３９のいずれか一項記載の方法。
【請求項１４１】
変異が、一塩基多型（ＳＮＰ）を含む、請求項１４０記載の方法。
【請求項１４２】
異常なゲノム構造に関連する疾患を診断する方法であり、以下の段階を含む方法：
（ａ）被験者から細胞、血液、または組織試料を単離する段階；
（ｂ）細胞、血液、または試料由来の核酸を、請求項１から２３のいずれか一項記載のＺＦＰ、シグナル伝達部分、および選択的に細胞取り込みドメインを含むタンパク質に接触させる段階であって、ＺＦＰが疾患に関連する標的部位に結合する段階；ならびに
（ｃ）タンパク質の核酸への結合を検出し、それにより診断を行う段階。
【請求項１４３】
異常なゲノム構造に関連する疾患を診断する方法であり、以下の段階を含む方法：
（ａ）被験者から細胞、血液、または組織試料を単離する段階；
（ｂ）細胞、血液、または試料由来の核酸を、請求項７４から８７のいずれか一項記載のＺＦＰ、シグナル伝達部分、および選択的に細胞取り込みドメインを含むタンパク質に接触させる段階であって、ＺＦＰが疾患に関連する標的部位に結合する段階；ならびに
（ｃ）タンパク質の核酸への結合を検出し、それにより診断を行う段階。
【請求項１４４】
核酸に結合したタンパク質の量を定量する段階をさらに含む、請求項１４２または１４３記載の方法。
【請求項１４５】
核酸がインサイチューで存在する、請求項１４２から１４４のいずれか一項記載の方法。
【請求項１４６】
接触段階の前に核酸を細胞または該組織試料から抽出する、請求項１４２から１４４のいずれか一項記載の方法。
【請求項１４７】
亜鉛フィンガーのαヘリックスの−１位、２位、３位、および６位のアミノ酸が以下のように選択される、多数の異なるオリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドの組であって、各オリゴヌクレオチドが１つの亜鉛フィンガードメインをコードし、オリゴヌクレオチドの組が４塩基対標的配列の半分を上回るものに対して少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを含む、オリゴヌクレオチドの組：
−１位において、アミノ酸は、アルギニン、グルタミン、トレオニン、メチオニン、またはグルタミン酸であり、
２位において、アミノ酸は、セリン、アスパラギン、トレオニン、またはアスパラギン酸であり、
３位において、アミノ酸は、ヒスチジン、アスパラギン、セリン、またはアスパラギン酸であり、
６位において、アミノ酸は、アルギニン、グルタミン、トレオニン、チロシン、ロイシン、またはグルタミン酸であるように選択される。
【請求項１４８】
オリゴヌクレオチドの数が少なくとも１５０個である、請求項１４７記載の組。
【請求項１４９】
オリゴヌクレオチドの数が、約２００個から約２５６個の範囲である、請求項１４８記載の組。
【請求項１５０】
オリゴヌクレオチドの数が２５６個である、請求項１４９記載の組。
【請求項１５１】
各オリゴヌクレオチドが式
2004519211.tif 000084
によって示される２５６個の亜鉛フィンガードメインの１つをコードするヌクレオチド配列を含む、２５６個の異なるオリゴヌクレオチドの組：
式中、
Ｘは独立して、任意のアミノ酸であり、Ｘｎはポリペプチド鎖中のＸの出現数を示し、
Ｚ−１が、アルギニン、グルタミン、トレオニン、またはグルタミン酸であり、
Ｚ２が、セリン、アスパラギン、トレオニン、またはアスパラギン酸であり、
Ｚ３が、ヒスチジン、アスパラギン、セリン、またはアスパラギン酸であり、
Ｚ６が、アルギニン、グルタミン、トレオニン、またはグルタミン酸である。
【請求項１５２】
式中の所与の部位での各Ｘが２５６個の各亜鉛フィンガードメインそれぞれにおいて同一である、請求項１５１記載の組。
【請求項１５３】
亜鉛フィンガードメインのＸ位が、Ｓｐ１ＣまたはＺｉｆ２６８亜鉛フィンガードメイン由来の対応するアミノ酸を含む、請求項１５１または１５２記載の組。
【請求項１５４】
オリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列が、生物にとって最適なコドン使用頻度（ｕｓａｇｅ）が得られるように選択される、請求項１５１から１５３のいずれか一項記載の組。
【請求項１５５】
２５６個の異なるオリゴヌクレオチドの３つのサブセットを含む、３つ以上の亜鉛フィンガードメインを有する亜鉛フィンガータンパク質をコードする核酸を作製するためのオリゴヌクレオチドの組であって、各オリゴヌクレオチドが、式
2004519211.tif 000085
（式中、
Ｘは独立して、任意のアミノ酸であり、Ｘｎはポリペプチド鎖中のＸの出現数を示し、
Ｚ−１は、アルギニン、グルタミン、トレオニン、またはグルタミン酸であり、
Ｚ２は、セリン、アスパラギン、トレオニン、またはアスパラギン酸であり、
Ｚ３は、ヒスチジン、アスパラギン、セリン、またはアスパラギン酸であり、
Ｚ６は、アルギニン、グルタミン、トレオニン、またはグルタミン酸である）
によって示される２５６個の亜鉛フィンガードメインの１つをコードするヌクレオチド配列を含み、
第１のサブセットオリゴヌクレオチドの３’末端が、そこから第２のサブセットオリゴヌクレオチドの合成を開始するために第２のオリゴヌクレオチドの５’末端に十分相補的であり、
第２のサブセットオリゴヌクレオチドの３’末端が、そこから第３のサブセットオリゴヌクレオチドの合成を開始するために第３のオリゴヌクレオチドの５’末端に十分相補的であり、
第１のサブセットオリゴヌクレオチドの３’末端が第３のサブセットオリゴヌクレオチドの５’末端に相補的ではなく
第２のサブセットオリゴヌクレオチドの３’末端が第１のサブセットオリゴヌクレオチドの５’末端に相補的ではない、オリゴヌクレオチドの組。
【請求項１５６】
式中の所与の部位での各Ｘが２５６個の亜鉛フィンガードメインの１つのサブセットと同一である、請求項１５５記載の組。
【請求項１５７】
式中の所与の部位での各Ｘが２５６個の亜鉛フィンガードメインの２つのサブセットと同一である、請求項１５６記載の組。
【請求項１５８】
式中の所与の部位での各Ｘが２５６個の亜鉛フィンガードメインの３つのサブセット全てと同一である、請求項１５７記載の組。
【請求項１５９】
亜鉛フィンガードメインのＸ位が、Ｓｐ１ＣまたはＺｉｆ２６８亜鉛フィンガードメイン由来の対応するアミノ酸を含む、請求項１５５から１５８のいずれか一項記載の組。
【請求項１６０】
オリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列が、生物にとって最適なコドンが使用されるように選択される、請求項１５５から１５９のいずれか一項記載の組。
【請求項１６１】
請求項１４７から１６０のいずれか一項記載の組を含む、キット。
【請求項１６２】
約８４ヌクレオチドから約１３０ヌクレオチドであり、独立して式
2004519211.tif 000086
によって示される亜鉛フィンガードメインをコードする配列、および選択的に０個から１０個のアミノ酸残基のリンカーを含む、人工亜鉛フィンガータンパク質（ＺＦＰ）用の亜鉛フィンガードメインをコードする一本鎖または二本鎖のオリゴヌクレオチド：
式中、
Ｘは独立して、任意のアミノ酸であり、Ｘｎはポリペプチド鎖中のＸの出現数を示し、
Ｚ−１は、アルギニン、グルタミン、トレオニン、メチオニン、またはグルタミン酸であり、
Ｚ２は、セリン、アスパラギン、トレオニン、またはアスパラギン酸であり、
Ｚ３は、ヒスチジン、アスパラギン、セリン、またはアスパラギン酸であり、
Ｚ６は、アルギニン、グルタミン、トレオニン、チロシン、ロイシン、またはグルタミン酸である、オリゴヌクレオチド。
【請求項１６３】
Ｘ位がＳｐ１ＣまたはＺｉｆ２６８亜鉛フィンガードメイン由来の対応するアミノ酸を含む、請求項１６２記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１６４】
ヌクレオチド配列が、生物にとって最適なコドンが使用されるように選択される、請求項１６３記載のオリゴヌクレオチド。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、２つのヒスチジンおよび２つのシステイン残基が、中心の亜鉛イオンに配位した亜鉛フィンガードメインを含むＤＮＡ結合ドメインに関する。より詳細には、本発明は、亜鉛フィンガードメインを設計するための状況独立性（ｃｏｎｔｅｘｔ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ）認識コードの同定に関する。このコードにより４塩基対ヌクレオチド標的配列からの亜鉛フィンガードメインのαへリックス領域の−１位、２位、３位、および６位のアミノ酸を同定可能である。本発明は、この認識コードを使用して設計した亜鉛フィンガータンパク質（ＺＦＰ）、これらのＺＦＰをコードする核酸、ならびに遺伝子発現を調整し、ゲノム構造を変化させ、ウイルス複製を阻害し、変化（例えば、ヌクレオチドの置換、欠失、または挿入）を検出するためのこのようなＺＦＰの使使用頻度を含む。さらに本発明は、各組が２５６個の異なる４塩基対標的を標的とし、全部で７６８個のオリゴヌクレオチド由来の全ての可能な３フィンガーＺＦＰ（すなわち、＞＞１０６）が産生されるように設計された、３組の２５６個のヌクレオチドを使用した３つ以上の亜鉛フィンガードメインを有するＺＦＰの迅速アセンブル法を提供する。
【０００２】
選択的遺伝子発現は、遺伝子の調節領域内の転写因子のヌクレオチド配列との特異的相互作用によって調整される。亜鉛フィンガーは、遺伝子転写を制御する真核生物タンパク質で見出される構造ドメインである。ＺＦＰのＣｙｓ２Ｈｉｓ２クラスの亜鉛フィンガードメインは、結合した亜鉛イオンの周囲で折りたたまれたポリペプチド構造ドメインであり、式
2004519211.tif 000003
の配列を有する：
式中、Ｘは任意のアミノ酸である。亜鉛フィンガーは、αヘリックスに対する逆平衡βシートの封入を安定化するために亜鉛イオンを使用する独立した折りたたみドメインである。Ｘとして示されるアミノ酸中には多数の配列バリエーションが存在するが、２つのコンセンサスヒスチジンおよびシステイン残基は不変である。ほとんどのＺＦＰが類似の三次元構造を有するにもかかわらず、これらは広範な種々のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドに結合する。
【０００３】
いくつかの報告では、どのようにして亜鉛フィンガードメインがその標的ポリヌクレオチドを認識するのかを考察し、標的配列のヌクレオチドに結合する亜鉛フィンガー中のアミノ酸を説明する認識コードの作成を試みている。しかし、これらの研究のほとんどは、３つのヌクレオチド標的部位を強調している。しかし、現在利用可能な限られた配列認識情報は、主に状況特異的結合に関する。言い換えれば、亜鉛フィンガードメインの結合は、亜鉛フィンガードメイン内のアミノ酸に直接接触するもの以外のポリヌクレオチド配列に依存する。本発明は、これらの欠点に対処し、状況独立性の亜鉛フィンガー認識コードを提供する。
【０００４】
さらに、数百万の選択肢のうちから任意の１つを有効に選択するためのマルチフィンガーＺＦＰの設計および人工的に合成する能力は、当技術分野において制限されている。例えば、いくつかの既知のＺＦＰ構築法には、ファージディスプレイ、ランダム変異誘発、組み合わせライブラリー、コンピューター／合理的設計、親和性選択、ＰＣＲ、ｃＤＮＡもしくはゲノムライブラリーからのクローニング、合成構築などによるＺＦＰをコードする核酸の設計および構築が含まれる。（例えば、米国特許第５，７８６，５３８号；Ｗｕら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９２：３４４−３４８ （１９９５）；Ｊａｍｉｅｓｏｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３３： ５６８９−５６９５ （１９９４）；ＲｅｂａｒおよびＰａｂｏ、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６３： ６７１−６７３ （１９９４）；ＣｈｏｏおよびＫｌｕｇ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９１： １１１６８−１１１７２ （１９９４）；Ｄｅｓｊａｒｌａｉｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８９： ７３４５−５３４９ （１９９２）；Ｄｅｓｊａｒｌａｉｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９０： ２２５６−２２６０ （１９９３）；Ｄｅｓｊａｒｌａｉｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９１： １１０９９−１１１０３；Ｐｏｍｅｒａｎｔｚら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６７： ９３−９６ （１９９５）；Ｐｏｍｅｒａｎｔｚら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９２： ９７５２−９７５６ （１９９５）；ならびにＬｉｕら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９４： ５５２５−５５３０ （１９９７）；ＧｒｉｅｓｍａｎおよびＢｅｒｇ、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７５： ６５７−６６１ （１９９７）を参照のこと）。
【０００５】
典型的には、タンパク質がＺＦＰ中のいくつかの同一のドメインまたはドメイン数を共有するかどうかに関係なく、所望の異なる各ＺＦＰについてＤＮＡを合成する。これは、巨大なマルチフィンガーＺＦＰの合成の相違が存在し得る。個々の亜鉛フィンガードメインをコードするＤＮＡ由来のＺＦＰの組換え作製法は、特にドメインが類似の配列を有する場合、正確な順序での各ＤＮＡの構築の困難さにより複雑になり得る。
【０００６】
したがって、当技術分野において、複数の亜鉛フィンガードメインを含むＺＦＰを有効に構築する方法が必要である。本発明は当技術分野の欠点に対処し、所望の順序でドメインが構築されるように設計した各ドメインをコードするオリゴヌクレオチドの３つの組からマルチフィンガーＺＦＰをアセンブルさせる方法を提供する。
【０００７】
本発明は、４塩基対標的配列を使用した亜鉛フィンガードメインを設計し、本明細書に記載の認識コード表の亜鉛フィンガードメインのαヘリックスの−１位、２位、３位、および６位でのアミノ酸の同一性を決定する方法に関する。特に、この方法は、４塩基対標的の最後の塩基が次の４塩基対標的の第１の塩基である、重複した４塩基対セグメントに分割できるより長い標的配列のマルチフィンガー（すなわち、マルチドメイン）ＺＦＰの設計に有用である。
【０００８】
特定の態様では、本発明は、式
2004519211.tif 000004
の亜鉛フィンガードメインを設計する方法を提供する：
式中、Ｘは任意のアミノ酸であり、Ｘｎはポリペプチド鎖中のＸの発生数を示し、従って、ＸはＣｙｓ２Ｈｉｓ２亜鉛フィンガードメインのフレームワークを示す。この方法を実施するために、（１）４つの塩基を有する標的核酸配列を同定し、（２）例えば、既知の亜鉛フィンガーフレームワーク、コンセンサスフレームワークを選択し、またはこれらのフレームワークを所望のように変更することによって各Ｘの同一性を決定し、（３）上記または本発明の認識コード表に基づいた亜鉛フィンガードメインのαへリックス部分中のＺ−１位、Ｚ２位、Ｚ３位、およびＺ６位でのアミノ酸の同一性を決定する。この設計したドメインを使用して、このドメインを含むＺＦＰまたは所望の任意の他のタンパク質を調製できる。ＺＦＰまたは他のタンパク質を、合成または組換えによって調製できるが、組換えが好ましい。
【０００９】
４塩基標的配列についての本発明の好ましい認識コード表は以下のとおりである：
（ｉ）第１の塩基がＧの場合、Ｚ６はアルギニンであり、
第１の塩基がＡの場合、Ｚ６はグルタミンであり、
第１の塩基がＴの場合、Ｚ６はトレオニン、チロシン、またはロイシンであり、
第１の塩基がＣの場合、Ｚ６はグルタミン酸であり、
（ｉｉ）第２の塩基がＧの場合、Ｚ３はヒスチジンであり、
第２の塩基がＡの場合、Ｚ３はアスパラギンであり、
第２の塩基がＴの場合、Ｚ３はセリンであり、
第２の塩基がＣの場合、Ｚ３はアスパラギン酸であり、
（ｉｉｉ）第３の塩基がＧの場合、Ｚ−１はアルギニンであり、
第３の塩基がＡの場合、Ｚ−１はグルタミンであり、
第３の塩基がＴの場合、Ｚ−１はトレオニンまたはメチオニンであり、
第３の塩基がＣの場合、Ｚ−１はグルタミン酸であり、
（ｉｖ）第４の塩基の相補物がＧの場合、Ｚ２はセリンであり、
第４の塩基の相補物がＡの場合、Ｚ２はアスパラギンであり、
第４の塩基の相補物がＴの場合、Ｚ２はトレオニンであり、
第４の塩基の相補物がＣの場合、Ｚ２はアスパラギン酸である。
上記の認識コードについてより好ましい態様では、第１の塩基がＴの場合、Ｚ６はトレオニンであり、第３の塩基がＴの場合、Ｚ−１はトレオニンである（表１）。
【００１０】
代替的かつそれほど好ましくない態様では、以下のような認識コード表が提供される：
（ｉ）第１の塩基がＧの場合、Ｚ６はアルギニンまたはリジンであり、
第１の塩基がＡの場合、Ｚ６はグルタミンまたはアスパラギンであり、
第１の塩基がＴの場合、Ｚ６はトレオニン、チロシン、ロイシン、イソロイシン、またはメチオニンであり、
第１の塩基がＣの場合、Ｚ６はグルタミン酸またはアスパラギン酸であり、
（ｉｉ）第２の塩基がＧの場合、Ｚ３はヒスチジンまたはリジンであり、
第２の塩基がＡの場合、Ｚ３はアスパラギンまたはグルタミンであり、
第２の塩基がＴの場合、Ｚ３はセリン、アラニン、またはバリンであり、
第２の塩基がＣの場合、Ｚ３はアスパラギン酸またはグルタミン酸であり、
（ｉｉｉ）第３の塩基がＧの場合、Ｚ−１はアルギニンまたはリジンであり、
第３の塩基がＡの場合、Ｚ−１はグルタミンまたはアスパラギンであり、
第３の塩基がＴの場合、Ｚ−１はトレオニン、メチオニン、ロイシン、またはイソロイシンであり、
第３の塩基がＣの場合、Ｚ−１はグルタミン酸またはアスパラギン酸であり、
（ｉｖ）第４の塩基の相補物がＧの場合、Ｚ２はセリンまたはアルギニンであり、
第４の塩基の相補物がＡの場合、Ｚ２はアスパラギンまたはグルタミンであり、
第４の塩基の相補物がＴの場合、Ｚ２はトレオニン、バリン、またはアラニンであり、
第４の塩基の相補物がＣの場合、Ｚ２はアスパラギン酸またはグルタミン酸である。
【００１１】
本発明はまた、各亜鉛フィンガードメインが独立して上記の式によって示される、マルチドメインＺＦＰを設計する方法を提供する。しかし、この場合、標的核酸配列は、３Ｎ＋１塩基対長（ここで、Ｎは標的核酸配列の重複４塩基対セグメントへの分割によって得られる標的中の重複４塩基対セグメントの数であり、Ｎ−１セグメントまでの各セグメントの第４の塩基はセグメント直後の第１の塩基である）を有する。設計方法の残りは、１ドメインの設計方法に従う。
【００１２】
本発明の別の局面は、互いに０個〜１０個のアミノ酸残基で共有結合した少なくとも３つの亜鉛フィンガードメインを含み、亜鉛フィンガーのαヘリックスの−１位、２位、３位、および６位のアミノ酸が本発明の認識コードにしたがって選択される、標的核酸配列に結合するための単離された人工的なＺＦＰを提供する。特定の態様では、これらのＺＦＰは、それぞれ独立して、式
2004519211.tif 000005
で示される少なくとも３つの亜鉛フィンガードメインおよび０個〜１０個のアミノ酸残基で互いに共有結合したドメインを含む：
式中、Ｘは任意のアミノ酸であり、Ｘｎはポリペプチド鎖中のＸの発生数を示し、このようなタンパク質が配列番号：３〜１２のいずれか１つによって得られるタンパク質ではない場合、Ｚ−１、Ｚ２、Ｚ３、およびＺ６は表１の認識コードによって決定される。上記のように、ＸはＣｙｓ２Ｈｉｓ２亜鉛フィンガードメインのフレームワークを示し、既知の亜鉛フィンガーフレームワーク、コンセンサスフレームワーク、これらのいかなるフレームワークによって得られるフレームワーク、または任意の人工的なフレームワークであり得る。好ましくは、既知のフレームワークを使用して、各Ｘの同一性を決定する。本発明のＺＦＰは、３個〜４０個の亜鉛フィンガードメイン、好ましくは３個〜１５個のドメイン、３個〜１２個のドメイン、３個〜９個のドメイン、または３個〜６個のドメインを含み、ＺＦＰは３個、４個、５個、６個、７個、８個、または９個のドメインを含む。好ましい態様では、Ｘを決定するためのフレームワークは、Ｓｐ１ＣまたはＺｉｆ２６８からのものである。１つの態様では、フレームワークはＳｐ１Ｃドメイン２の配列を有ｓｉ、配列は
2004519211.tif 000006
である。
【００１３】
さらに好ましいＺＦＰは、独立するか任意の組み合わせで、少なくとも１つの亜鉛フィンガードメイン中でＺ−１がメチオニンであり；少なくとも１つの亜鉛フィンガードメイン中でＺ−１がグルタミン酸であり；少なくとも１つの亜鉛フィンガードメイン中でＺ２がトレオニンであり；少なくとも１つの亜鉛フィンガードメイン中でＺ２がセリンであり；少なくとも１つの亜鉛フィンガードメイン中でＺ２がアスパラギンであり；少なくとも１つの亜鉛フィンガードメイン中でＺ６がグルタミン酸であり；少なくとも１つの亜鉛フィンガードメイン中でＺ６がトレオニンであり；少なくとも１つの亜鉛フィンガードメイン中でＺ６がチロシンであり；少なくとも１つの亜鉛フィンガードメイン中でＺ６がロイシンであり、かつ／または少なくとも１つの亜鉛フィンガードメイン中でＺ２がアスパラギン酸であるが、同一のドメイン中でＺ−１がアルギニンではないものである。
【００１４】
本発明のＺＦＰはまた、表３に示されている２３群のタンパク質を含む。１群〜１１群は、以下の種類のヌクレオチド標的配列にそれぞれ結合するタンパク質を示す
2004519211.tif 000007
式中、ＤはＧ、Ａ、またはＴであり；ＭはＧまたはＴであり；ＲはＧまたはＡであり；ＷはＡまたはＴであり；Ｎは任意のヌクレオチドである。１２群〜２３群のタンパク質は、一般に、式
2004519211.tif 000008
で示されるが、Ｎは任意のヌクレオチドではなく、むしろ表３に示される群に属するように指定されたタンパク質のヌクレオチドを示す。
【００１５】
本発明の他の局面は、本発明のＺＦＰをコードする単離された核酸、これらの核酸を含む発現ベクター、および発現ベクターで（任意の方法によって）形質転換された宿主細胞を提供する。他の使用のうち、このような宿主細胞を、一定期間およびＺＦＰを発現させる条件下で宿主細胞を培養し、ＺＦＰを回収することによりＺＦＰを調製する方法で使用することができる。
【００１６】
本発明のさらに別の局面は、本発明のＺＦＰである第１のセグメントおよびトランスポザーゼ、インテグラーゼ、リコンビナーゼ、レソルバーゼ、インベルターゼ、プロテアーゼ、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ、ＤＮＡデメチラーゼ、ヒストンアセチラーゼ、ヒストンデアセチラーゼ、ヌクレアーゼ、転写抑制因子、転写活性化因子、一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質、核局在化シグナル、転写タンパク質漸増タンパク質、または細胞取り込みドメインを含む第２のセグメントを有する融合タンパク質に関する。代替的な態様では、第２のセグメントは、トランスポザーゼ活性、インテグラーゼ活性、リコンビナーゼ活性、レソルバーゼ活性、インベルターゼ活性、プロテアーゼ活性、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ活性、ＤＮＡデメチラーゼ活性、ヒストンアセチラーゼ活性、ヒストンデアセチラーゼ活性、ヌクレアーゼ活性、核局在化活性、転写タンパク質漸増活性、転写抑制因子活性、または転写活性化因子活性を示すタンパク質ドメインを含み得る。
【００１７】
本発明のさらに別の局面は、本発明のＺＦＰである第１のセグメントおよび細胞によって取り込むことができる２価のリガンドの第１の部分に特異的に結合することができるタンパク質ドメインを含む第２のセグメントに関する。これらのタンパク質ドメインには、Ｓタンパク質、Ｓタグ、抗原、ハプテン、および／または抗体の一本鎖可変領域（ｓｃＦｖ）が含まれるが、これらに限定されない。別の種類の融合タンパク質には、抗体の一本鎖可変領域をコードする第１のドメイン、核局在化シグナルを封入する第２のドメイン、および転写調節活性をコードする第３のドメインを含むものがあげられる。
【００１８】
さらに本発明は、本発明の任意の融合タンパク質をコードする単離された核酸、これらの核酸を含む発現ベクター、および発現ベクターで（任意の方法によって）形質転換された宿主細胞を提供する。とりわけ使用において、このような宿主細胞は、宿主細胞を一定期間、融合タンパク質を発現させる条件下で培養し、融合タンパク質を回収することによりＺＦＰを調製する方法で使用されうる。
【００１９】
本発明のよりさらなる局面は、標的核酸を、本発明のＺＦＰまたは本発明によって設計したＺＦＰにＺＦＰが標的核酸に結合するのに十分な量および期間接触させる段階を含む、標的核酸を人工的なＺＦＰに結合させる方法に関する。好ましい態様では、ＺＦＰは、ＺＦＰをコードする核酸を通して細胞中に導入される。
【００２０】
本発明のよりさらなる局面は、遺伝子の調節制御エレメントを、本発明のＺＦＰまたは本発明によって設計されたＺＦＰにＺＦＰが遺伝子発現を変化させるために十分な量および期間接触させる段階を含む、遺伝子発現を調整する方法を提供する。遺伝子発現の調整には、関心対象の遺伝子の活性化および抑制が含まれ、１つの態様では、ＺＦＰをコードする核酸を介した細胞へのＺＦＰの導入によってこれを行うことができる。
【００２１】
本発明の別の局面は、遺伝子に十分近位の標的核酸を、転写調節ドメインに融合した本発明のＺＦＰの融合タンパク質または本発明によって設計されたＺＦＰに接触させる段階を含み、融合タンパク質は転写調節ドメインを遺伝子発現の変化させるために十分の量および期間核酸に接触する、遺伝子の発現を調整する方法に関する。遺伝子発現の調整には、関心対象の遺伝子の活性化および抑制が含まれ、１つの態様では、融合タンパク質をコードする核酸を介した細胞への所望の融合タンパク質の導入によってこれを行うことができる。
【００２２】
本発明のさらに別の局面は、標的ゲノム部位を、トランスポザーゼ活性、インテグラーゼ活性、リコンビナーゼ活性、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ活性、ＤＮＡデメチラーゼ活性、ヒストンアセチラーゼ活性、ヒストンデアセチラーゼ活性、またはエンドヌクレアーゼ活性を示すタンパク質ドメインに融合した本発明のＺＦＰの融合タンパク質または本発明によって設計されたＺＦＰに接触させる段階を含む、融合タンパク質を標的ゲノム部位に部位中または付近のゲノム構造を変化させるために十分な量および時間接触させ、ゲノム構造を変化させる方法を提供する。所望の場合、融合タンパク質を、核酸を介して細胞に導入することもできる。
【００２３】
本発明のさらに別の局面は、細胞に、本発明のＺＦＰまたは本発明によって設計されたＺＦＰをコードする核酸を導入することによりウイルス複製を阻害する方法を提供し、ＺＦＰはウイルス複製に必要な標的部位に結合する能力を有し、細胞中のＺＦＰを十分に発現させて、ウイルス複製を阻害する。１つの態様では、融合タンパク質は、一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質ドメインを有する。
【００２４】
本発明のさらに別の局面は、真核細胞を、細胞に取り込まれ、かつ特異性の異なる第１および第２のスイッチ部分を含むことができる２価のリガンドに接触させることによる、遺伝子発現を調整する方法を提供し、ここで細胞は、
（ｉ）第１のスイッチ部分に特異的に結合することができるタンパク質ドメインに融合した遺伝子に近位で標的部位に特異的な本発明のＺＦＰまたは本発明によって設計されたＺＦＰの融合タンパク質を発現する第１の核酸、ならびに
（ｉｉ）第２のスイッチ部分に特異的に結合できる第１のドメイン、核局在化シグナルである第２のドメイン、および転写調節ドメインである第３のドメインを含む第２の融合タンパク質を発現する第２の核酸
を含み、これにより、細胞が十分な時間２価のリガンド、第１の融合タンパク質、および第２の融合タンパク質を含む複合体を形成し、複合体を細胞の核に転位させ、標的部位に結合させ、それにより転写調節ドメインが遺伝子の発現を変えることが可能になる。遺伝子発現の調整は、当遺伝子の活性化および抑制の両方を含む。
【００２５】
第１のスイッチ部分に特異的に結合することができるタンパク質ドメインは、Ｓタンパク質、Ｓタグ、抗体の一本鎖可変領域（ｓｃＦｖ）、または各パートナーを小分子によって調整することができるようなこれらの誘導体であり得る。適切に選択されるように、第１のスイッチ部分は、Ｓタンパク質、Ｓタグ、または抗体の一本鎖可変領域（ｓｃＦｖ）の抗原であり得る。同様に、適切に選択されるように、第２のスイッチ部分に特異的に結合することができるドメインは、Ｓタンパク質、Ｓタグ、および抗体の一本鎖可変領域（ｓｃＦｖ）であり、第２のスイッチ部分は、Ｓタンパク質、Ｓタグ、または抗体の一本鎖可変領域（ｓｃＦｖ）の抗原であり得る。
【００２６】
本発明のさらなる局面は、触媒ドメイン、ペプチド二量体化ドメイン、および本発明のＺＦＰまたは本発明によって設計されたＺＦＰであるＺＦＰドメインを含む人工トランスポザーゼに関する。トランスポザーゼはまた、末端逆方向反復結合ドメインを含み得る。
【００２７】
本発明の別の局面は、以下の段階を含む、外因性遺伝子の生物のゲノムへの標的特異的導入法を提供する：
（ａ）細胞に、本発明のトランスポザーゼをコードし、トランスポザーゼのＺＦＰドメインが第１の標的に結合する第１の核酸と、本発明の第２のトランスポザーゼをコードし、トランスポザーゼのＺＦＰドメインが第２の標的に結合する第２の核酸と、２つのトランスポザーゼの末端逆方向反復ドメインによって結合することができる配列に隣接する外因性遺伝子をコードする第３の核酸とを導入する段階；ならびに
（ｂ）ゲノム、第３の核酸、および２つのトランスポザーゼの間で組換えが起こるのに十分な複合体を形成させ、それにより外因性遺伝子を生物組換えゲノムに導入する段階。第１の標的および第二の標的は、同一であっても異なってもよい。
【００２８】
本発明の別の局面は、以下の段階を含む、生物ゲノム由来の外因性遺伝子の標的特異的切り出し方法を提供する：
（ａ）細胞に、本発明のトランスポザーゼをコードし、ＺＦＰドメインが第１の標的に結合する第１の核酸と、本発明の第２のトランスポザーゼをコードし、ＺＦＰドメインが第２の標的に結合し、外因性遺伝子がトランスポザーゼのＺＦＰドメインに結合することができる配列に隣接する第２の核酸とを導入する段階；ならびに
（ｂ）ゲノムおよび２つのトランスポザーゼの間で組換えが起こるのに十分な複合体を形成させ、それにより生物のゲノムからの外因性遺伝子を切り出す段階。第１の標的および第二の標的は、同一であっても異なってもよい。
【００２９】
本発明のよりさらなる局面は、本発明のＺＦＰまたは本発明によって設計されたＺＦＰを使用する診断法に関する。１つの態様では、亜鉛フィンガー認識配列の変化を検出する方法は、以下の段階を含む：
（ａ）配列が変化しない場合、ＺＦＰがシグナル伝達部分に結合し、かつＺＦＰの亜鉛フィンガー認識配列への結合を可能にするのに十分な量の存在する、関心対象の亜鉛フィンガー認識配列を含む核酸を、認識配列に特異的である本発明のＺＦＰまたは本発明によって設計されたＺＦＰと接触させる段階；
（ｂ）ＺＦＰの認識配列への結合を検出することにより、不変配列へのＺＦＰの結合に対して結合が減少するまたは消滅する場合に認識配列が変化することを確認する段階。任意の検出またはシグナル伝達部分を使用することができ、色素、ビオチン、ストレプトアビジン、放射性同位元素など、またはＡＰ、β−ｇａｌ、ＧＵＳ、ＨＲＰ、ＧＦＰ、ルシフェラーゼなどが含まれるがこれらに限定されない。この方法により、その配列中の１つまたは複数のヌクレオチドの置換、挿入、または欠失を有する変化した亜鉛フィンガー認識部位の変化を検出することができる。好ましい態様では、この方法を使用して、一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）を検出する。
【００３０】
本発明のよりさらなる局面は、各オリゴヌクレオチドが式
2004519211.tif 000009
によって示される２５６個の亜鉛フィンガードメインの１つをコードするヌクレオチド配列を含む、２５６個の個別または個別でパッケージングされたオリゴヌクレオチドの組を提供する：
式中、Ｘは任意のアミノ酸であり、Ｘｎはポリペプチド鎖中のＸの出現数を示し；Ｚ−１が、アルギニン、グルタミン、トレオニン、またはグルタミン酸であり；Ｚ２が、セリン、アスパラギン、トレオニン、またはアスパラギン酸であり；Ｚ３が、ヒスチジン、アスパラギン、セリン、またはアスパラギン酸であり；Ｚ６が、アルギニン、グルタミン、トレオニン、またはグルタミン酸である。好ましい態様では、式中の所与の部位での各Ｘは各２５６個の亜鉛フィンガードメインにおいて同一であり、既知の亜鉛フィンガーフレームワークに由来し得る。オリゴヌクレオチドのコドン使用頻度を、このような情報を利用可能な任意の所望の生物（ヒト、マウス、イネ、および大腸菌などであるが、これらに限定されない）で最適化することもできる。
【００３１】
さらに本発明は、３つ以上の亜鉛フィンガードメインを有するＺＦＰをコードする核酸を作製するためのオリゴヌクレオチドの組であって、該組は、２５６個の個別または個別にパッケージングしたオリゴヌクレオチドの３つのサブセットを含み、各オリゴヌクレオチドが、式
2004519211.tif 000010
（式中、Ｘは任意のアミノ酸であり、Ｘｎはポリペプチド鎖中のＸの出現数を示し；
Ｚ−１が、アルギニン、グルタミン、トレオニン、またはグルタミン酸であり；
Ｚ２が、セリン、アスパラギン、トレオニン、またはアスパラギン酸であり；
Ｚ３が、ヒスチジン、アスパラギン、セリン、またはアスパラギン酸であり；
Ｚ６が、アルギニン、グルタミン、トレオニン、またはグルタミン酸である）によって示される２５６個の亜鉛フィンガードメインの１つをコードするヌクレオチド配列を含み；
第１の組のオリゴヌクレオチドの３’末端が、そこから第２の組のオリゴヌクレオチド合成を開始するために第２の組のオリゴヌクレオチドの５’末端に十分相補的であり、
第２の組のオリゴヌクレオチドの３’末端が、そこから第３の組のオリゴヌクレオチド合成を開始するために第３の組のオリゴヌクレオチドの５’末端に十分相補的であり、
第１の組のオリゴヌクレオチドの３’末端が第３の組のオリゴヌクレオチドの５’末端に相補的ではなく、第２の組のオリゴヌクレオチドの３’末端が第１の組のオリゴヌクレオチドの５’末端に相補的ではない、オリゴヌクレオチドの組を提供する。
【００３２】
上記段落の好ましい態様では、式中の所与の部位での各Ｘが２５６個の亜鉛フィンガードメインの１つ、２つ、または３つのサブセットで同一であり、既知の亜鉛フィンガーフレームワークに由来し得る。オリゴヌクレオチドのコドン使用頻度を、このような情報を利用可能な任意の所望の生物（ヒト、マウス、穀類、トマト、トウモロコシ、イネ、および大腸菌などであるが、これらに限定されない）で最適化することもできる。さらに、任意の上記の組はキット形態で提供され、これには本発明の方法を容易に実施可能な他の構成要素が含まれる。
【００３３】
本発明の別の局面は、人工ＺＦＰの亜鉛フィンガードメインをコードする一本鎖または二本鎖のオリゴヌクレオチドであって、該オリゴヌクレオチドは約８４塩基〜約１３０塩基であり、独立して式
2004519211.tif 000011
によって示される各亜鉛フィンガードメインをコードするヌクレオチド配列および選択的に０個〜１０個のアミノ酸残基のリンカーを含む、オリゴヌクレオチドに関する：
式中、Ｘは任意のアミノ酸であり、Ｘｎはポリペプチド鎖中のＸの出現数を示し；Ｚ−１が、アルギニン、グルタミン、トレオニン、メチオニン、またはグルタミン酸であり；Ｚ２が、セリン、アスパラギン、トレオニン、またはアスパラギン酸であり；Ｚ３が、ヒスチジン、アスパラギン、セリン、またはアスパラギン酸であり；Ｚ６が、アルギニン、グルタミン、トレオニン、チロシン、ロイシン、またはグルタミン酸である。
【００３４】
Ｉ．認識コードおよび設計方法
本発明は、亜鉛フィンガードメインが標的ポリヌクレオチド配列上の塩基に接触する状況独立性認識コードを提供する。この認識コードにより、高親和性の任意の所望のヌクレオチド配列を標的とすることができるＺＦＰを設計可能である。以前の認識データは主に状況依存性であり、ファージディスプレイ法および３塩基対配列の標的の使用によって作製されていた（Ｂｅｅｒｉｌら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ９５：１４６３１、１９９８；Ｗｕら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ９２：３４５、１９９５；Ｂｅｒｇら、Ｎａｔｕｒｅ Ｓｔｒｕｃｔ． Ｂｉｏｌ．、３：９４１、１９９６）。バーグ（Ｂｅｒｇ）らは、第１および第２が同一であり、第３が第１および第２と異なる３つの亜鉛フィンガードメインを使用していた。ウー（Ｗｕ）ら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９２， ３４４−３４８（１９９５））およびビーリル（Ｂｅｅｒｉｌ）ら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９５， １４６２８−１４６３３（１９９８））は、３つのフィンガーがそれぞれ異なる３つの亜鉛フィンガードメイン（Ｚｉｆ２６８）を使用していた。本発明は、特に、同一のフレーム中のフィンガー／フレームブロックの正確な反復に関し、選択的に同一のフィンガー領域が反復される。同一のフレームの反復の１つの利点は、各亜鉛フィンガードメインが４塩基対を規則正しく認識し、特に３つを超えるドメイン（例えば、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個のドメインまたはそれ以上、さらに３０個のドメインまで）が存在する場合に複数の亜鉛フィンガードメインを含むＺＦＰの高親和性標的が得られるという点である。
【００３５】
亜鉛フィンガードメイン中の４つの核酸が接触する残基は、主に、特異性および親和性の決定を担い、これは、第１のコンセンサスヒスチジンおよび第２のコンセンサスシステインに対して同一の位置で起こる。第１の残基は、第１のコンセンサスヒスチジンのＮ末端側の７つの残基および第２のコンセンサスシステインのＣ末端側の６つの残基である。以後これを「−１位」という。他の３つのアミノ酸は、−１位の残基のＣ末端から除去した２つ、３つ、および６つの残基であり、それぞれ「２位」、「３位」、および「６位」という。これらの位置は、交換可能にＺ−１位、Ｚ２位、Ｚ３位、およびＺ６位という。これらのアミノ酸残基を、「塩基接触アミノ酸」という。−１位とは、亜鉛フィンガードメイン中のαヘリックスの始点である。亜鉛フィンガードメイン中の−１位、２位、３位、および６位のアミノ酸の位置、ならびに４塩基対ＤＮＡ標的配列中で接触する塩基を、図１に概略的に示す。
【００３６】
亜鉛フィンガー核酸認識コードが表１に示されており、これは既知かつ可能な塩基−アミノ酸相互作用に基づく（図２）。図２に列挙したいくつかの相互作用は、Ｈ−Ｔ−４タンパク質、ｃｒｏ、およびλ抑制因子などの異なるタンパク質中でも同定される。４塩基対領域中の第１および第３のＤＮＡ塩基の認識のために、より長い側鎖を含むアミノ酸を選択した。第２および第４の塩基の認識のために、より短い側鎖を含むアミノ酸を選択した。例えば、グアニン塩基認識の場合、−１位および６位のアミノ酸としてアルギニンを選択し、３位のアミノ酸としてヒスチジンを選択し、２位のアミノ酸としてセリンを選択した。表１に示す全てのアミノ酸では、水素結合によって特定のＤＮＡ塩基と安定に相互作用する。チミジン塩基認識の場合、疎水性側鎖を有するアミノ酸も選択された（すなわち、第１のチミジン塩基についてはロイシン、第３のチミジン塩基にはメチオニン）。他のＤＮＡ塩基−アミノ酸相互作用も可能であるが、最も高い親和性を有するアミノ酸が選択された。例えば、リジンはグアニンに結合するにもかかわらず、さらなる水素結合のためにアルギニンが選択された。
【００３７】
【表１】
2004519211.tif 000012
【００３８】
２位のアミノ酸による４塩基対ＤＮＡ配列（３’トリプレットＤＮＡ付近の第１の塩基）中の４つの塩基の認識を図３に示す。亜鉛フィンガードメインの２位のＡｓｐ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、およびＳｅｒは、それぞれＣ、Ｔ、Ａ、およびＧに優先的に結合する。第４の塩基は、アンチセンス核酸鎖中に存在する。
【００３９】
表１（および標的配列の各４塩基対部分について）では、塩基は常に５’〜３’の順で得られる。しかし、表中の第４の塩基は、常に標的配列中で得られる第４の塩基の相補物である。例えば、標的配列をＡＴＣＣと記載する場合、５’−ＡＴＣＣ−３’のセンス鎖標的配列および３’−ＴＡＧＧ−５’のアンチセンス鎖を意味する。したがって、センス鎖配列ＡＴＣＣを上記の表からアミノ酸に翻訳する場合、第１の塩基Ａは６位にグルタミンがあることを意味し、第２の塩基Ｔは３位にセリンがあることを意味し、第３の塩基Ｃは−１位にグルタミンがあることを意味する。しかし、Ｃと記載される第４の塩基では、Ｃの相補物（すなわち、表中で見出され、２位のアミノ酸の同定に使用される、Ｇ）を意味する。この場合、２位のアミノ酸はセリンである。
【００４０】
本発明はまた、第１の塩基がＴである場合にＺ６がトレオニンであり、第３の塩基がＴである場合にＺ−１がトレオニンである好ましい認識コドン表を含む。さらに本発明は、表１の認識コード中に存在するもののさらなる保存的アミノ酸を一般的に示すように拡大した認識コード表を含む。より広範な認識コードを以下の表２に示す。表２では、各欄に列挙したアミノ酸の順序は、左から右にその位置での最も好ましいアミノ酸から最も好ましくないアミノ酸を示す。
【００４１】
【表２】
2004519211.tif 000013
【００４２】
本発明により、認識コード表から亜鉛フィンガードメインあたり４つのアミノ酸を選択し、各ドメインの組み合わせによって全ての可能なＤＮＡ塩基対を標的とするＺＦＰを迅速に設計可能である。このような完全な認識コード表は現在存在しない。本発明の認識コードの使用により、ファージディスプレイシステムのような時間のかかる選択の反復による可能な全変異体を選択する必要がない。設計において２位のアミノ酸を含むことにより、３つの代わりに４塩基対が標的されるので、高親和性のＺＦＰを作製し、ＤＮＡ配列を選択することができるようになる。現在のアプローチは、ファージ標的を使用したＺＦＰの設計であるか、３つの塩基対しか考慮していない。本発明は、特異性および結合親和性がともに増加したＺＦＰを提供する。
【００４３】
したがって、本発明は、亜鉛フィンガードメインを設計する方法を提供する。式
2004519211.tif 000014
で示した１つの亜鉛フィンガードメインを、表１、表２、または表１の好ましい態様の認識コードを使用した４塩基の標的核酸配列の同定、各Ｘの同一性の決定、およびドメイン中のＺ−１位、Ｚ２位、Ｚ３位、およびＺ６位のアミノ酸の同一性の決定によって設計することができる：
式中、Ｘは任意のアミノ酸であり、Ｘｎはポリペプチド鎖中のＸの出現数を示す。一度亜鉛フィンガーが設計されると、このドメインをいかなるポリペプチド鎖の全部または一部として含めることができる。例えば、設計されたドメインは、マルチフィンガーＺＦＰの１つのフィンガーであり得る。設計されたこのドメインもまた、ＺＦＰ中で２回以上得ることができ、本発明によって設計された他の亜鉛フィンガードメインと連続しているか分離し得る。本発明によって設計された亜鉛フィンガードメインもまた、非ＺＦＰタンパク質中のドメインまたは任意の型の融合タンパク質中のドメインとして含めることができる。好ましくは、設計したドメインを使用して、このドメインを含むＺＦＰを調製する。
【００４４】
Ｘの同一性によって決定されたフレームワークは、フレームワークの変化が亜鉛フィンガードメインの全構造を維持している場合、既知の亜鉛フィンガーフレームワーク、コンセンサスフレームワーク、またはこれらのフレームワークの任意の１つの変更形態であり得る。好ましいフレームワークは、Ｓｐ１ＣおよびＺｉｆ２６８由来である。より好ましいフレームワークは、Ｓｐ１Ｃ由来のドメイン２である。
【００４５】
設計した亜鉛フィンガードメインを含むタンパク質を、任意の多数の当技術分野において周知の技術を使用して合成または組換えのいずれか（好ましくは、組換え）で調製することができる。タンパク質を組換え（例えば、ＺＦＰをコードするＤＮＡによる）で調製した場合、ＺＦＰが発現する生物中で高発現するようにコドン使用頻度を最適化することができる。このような生物には、細菌、真菌、酵母、動物、昆虫、および植物が含まれる。より詳細には、生物には、ヒト、マウス、大腸菌、穀物、イネ、トマト、およびトウモロコシが含まれるが、これらに限定されない。
【００４６】
特にドメインが連続していない場合、マルチドメイン（すなわち、マルチフィンガー）ＺＦＰを設計するために、上記の１ドメインを設計する方法に従うことができる。しかし、４塩基対を超える標的配列の複数の連続するドメイン（または本明細書中に記載のリンカーによって分離しているドメイン）を有するＺＦＰのために、特にＺＦＰ中に３つを超える亜鉛フィンガードメインが存在する場合、標的配列を、重複４塩基対セグメントへ分割することによって設計されたＺＦＰにより、ＺＦＰ、典型的には高結合親和性のＺＦＰを産生するための状況独立性亜鉛フィンガー認識コードが得られることが発見された。
【００４７】
この方法において、標的配列は、３Ｎ＋１塩基対長を有する：
式中、Ｎは標的中の重複４塩基対セグメントの数であり、標的配列の重複４塩基対セグメントへの分割によって決定され、Ｎ−１セグメントまでの各セグメントの第４の塩基がセグメント直後の第１の塩基である。各４塩基対セグメントの残りの設計方法は、各Ｘ、Ｚ−１、Ｚ２、Ｚ３、およびＺ６の同一性の決定に関する１ドメインの設計方法に従う。この方法は、３個〜１５個のドメイン（すなわち、Ｎは３〜１５の任意の数）、より好ましくは３個〜１２個のドメイン、３個〜９個のドメイン、または３個〜６個のドメインを有するＺＦＰの設計に有用である。４０個を超えるドメインを有するＺＦＰが当技術分野において既知であり、所望であれば、Ｎは少なくとも４０までの範囲であり得る。
【００４８】
本発明によって設計された亜鉛フィンガードメインを、互いに直接共有結合させるか、１個〜１０個のアミノ酸のリンカー領域によって分離することができる。リンカーアミノ酸により、柔軟性または幾らかの構造剛性を得ることができる。同族標的配列に対するＺＦＰの所望の親和性によってリンカーの選択を予想することができるが、必ずしも必要ではない。同族標的配列に対するＺＦＰの結合親和性を改良するために種々のリンカー配列を試験および最適化することは当業者の範囲内である。ＺＦＰとその標的との間の結合親和性の測定法は周知である。典型的には、ゲルシフトアッセイを使用する。１つの態様では、３つの各フィンガードメインがその標的配列に独立して結合して互いの結合の立体障害を回避するようにアミノ酸リンカーが柔軟であることが好ましい。
【００４９】
認識コード表は、４つのアミノ酸位置を有し、各アミノ酸が標的とすることができる４つの異なる塩基が存在する。異なる４塩基対標的の総数は、好ましくは４４すなわち２５６で示される。表１の認識コードからの好ましい選択を使用して、４つ全ての可能な塩基対標的配列についての亜鉛フィンガードメイン中の−１位、２位、３位、および６位のアミノ鎖の組み合わせを表３に示す。
【００５０】
【表３】表１の好ましい認識コードについての２５６個の亜鉛フィンガードメイン
2004519211.tif 000015
2004519211.tif 000016
2004519211.tif 000017
2004519211.tif 000018
2004519211.tif 000019
2004519211.tif 000020
2004519211.tif 000021
2004519211.tif 000022
2004519211.tif 000023
2004519211.tif 000024
【００５１】
「特異的結合」とは、非標的核酸配列への結合よりも高い検出程度（少なくともバックグラウンドの１．５倍）でありかつ非標的核酸を実質的排除する程度の亜鉛フィンガータンパク質核酸結合ドメインの特異的な核酸標的配列への結合基準を意味し、かつ含む。
【００５２】
マルチフィンガーＺＦＰがポリヌクレオチド二重鎖（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、またはその任意のハイブリッド）に結合する場合、典型的には、そのフィンガーは、ヌクレオチド配列の３塩基あたり約１つのフィンガーの周期でポリヌクレオチド二重鎖に沿って並べられる。各亜鉛フィンガー（またはそのサブユニット）の結合部位は、典型的には、３塩基〜４塩基にわたり、隣接するフィンガーのサブサイトは通常１塩基が重複する。したがって、３つのフィンガーＺＦＰであるＸＹＺは、１０塩基対部位ａｂｃｄｅｆｇｈｉｊ（これらの文字は二重鎖ＤＮＡの１つを示す）に結合し、フィンガーＸのサブサイトはｇｈｉｊであり、フィンガーＹはｄｅｆｇであり、フィンガーＺはａｂｃｄである。少なくとも３つのフィンガーが野生型亜鉛フィンガーと異なるマルチフィンガータンパク質は本発明の範囲内である。すべてのフィンガー中のアミノ酸配列が変化したマルチフィンガータンパク質もまた含まれ、これには、組み合わせ化学または他のタンパク質設計、および結合アッセイ（しかし、表１の認識コードからのＺＦＰに対応する）によって設計されたものが含まれる。
【００５３】
４つを超える塩基が変化した標的化ポリヌクレオチドに結合するようにＺＦＰを設計することも可能である。この場合、結合タンパク質の１つを超えるフィンガーを変化させる。例えば、１０塩基配列ＸＸＸｄｅｆｇＸＸＸでは、フィンガーＸおよびＺが野生型フィンガーの対応するフィンガーと異なる一方で、フィンガーＹがサブサイトｄｅｆｇに結合する野生型フィンガー中の対応するフィンガーと同一のポリペプチド配列を有する、３つのフィンガー結合タンパク質を設計することができる。より長い塩基配列のための３つを超えるフィンガーを有する結合タンパク質もまた設計することができる。例えば、４つのフィンガータンパク質は選択的に１３個の塩基配列に結合する一方で、５個のフィンガータンパク質は選択的に１６個の塩基配列に結合する。いくつかのフィンガーが、選択したＤＮＡへの結合に関連しないマルチフィンガータンパク質も設計することができる。フィンガーおよびフレームワークの間隔におけるわずかな変異もまた可能である。
【００５４】
驚いたことに、標的の最後のクアドルプレット以外の第１の９個の塩基中の少なくとも３つのグアニン（３つのＧ）を有する任意の１０連続塩基を標的とするＺＦＰを良好に結合できることを見出した。このような標的が２つ以下のシトシンを有することも好ましい。
【００５５】
ＩＩ．人工ＺＦＰ
本発明はまた、標的核酸配列に結合するための単離された人工ＺＦＰに関する。
【００５６】
「亜鉛フィンガータンパク質」、「亜鉛フィンガーポリペプチド」、または「ＺＦＰ」とは、亜鉛によって安定化され、かつ本発明によって設計されたＤＮＡ結合ドメインを有するポリペプチドを意味するが、タンパク質は配列番号：３〜１２（表４）のタンパク質または表１の認識コードによって設計された３つ以上の亜鉛フィンガードメインを有する任意の他のＺＦＰを含まないことを条件とし、これらのドメインは０個〜１０個のアミノ酸で結合している。各ＤＮＡ結合ドメインを、典型的には、ＺＦＰまたはペプチドが少なくとも１つのフィンガー、より典型的には２つのフィンガー、より好ましくは３つのフィンガー、さらにより好ましくは４つまたは５つのフィンガー、少なくとも６つ以上のフィンガーを有するような「フィンガー」という。各フィンガーは３つまたは４つのＤＮＡ塩基対に結合する。ＺＦＰは、標的核酸配列と呼ばれる核酸配列に結合する。各フィンガーは、通常、約３０個のアミノ酸の亜鉛キレート化ＤＮＡ結合サブドメインを含む。代表的なモチーフの一種であるＣｙｓ２−Ｈｉｓ２とは、−ＣＹＳ−（Ｘ）２−４−ＣＹＳ−（Ｘ）１２−Ｈｉｓ−（Ｘ）３−５−Ｈｉｓ（式中、Ｘは任意のアミノ酸である）であり、この種類の１つの亜鉛フィンガーは２つの不変のヒスチジン残基を含むαヘリックスからなり、１つのβターンの２つのシステイン残基（例えば、Ｂｅｒｇら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７１：１０８１−１０８５ （１９９６）を参照のこと）は亜鉛カチオンに結合する。
【００５７】
本発明のＺＦＰには、表１の認識コードによって得られる−１位、２位、３位、および６位の１つまたは複数のアミノ酸の組み合わせを有する任意のＺＦＰが含まれる（ＺＦＰが当技術分野において存在しない場合）。２５６個のＺＦＰの４塩基対標的配列ならびに−１位、２位、３位、および６位の対応するアミノ酸を、本発明の好ましい認識コード表に関する表３に示されている（すなわち、第１の塩基がＴの場合にＺ６はトレオニンであり、第３の塩基がＴの場合にＺ−１はトレオニンである、表１の好ましい認識コード）。好ましくは、ＺＦＰは、３個〜１５個、３個〜１２個、３個〜９個、または３個〜６個のドメインならびに３個、４個、５個、または６個の亜鉛フィンガードメインを含むが、４０個までのドメインを有するＺＦＰが既知であるので、本発明にはこのようなＺＦＰが含まれる。
【００５８】
【表４】請求項１以外のＺＦＰ
2004519211.tif 000025
2004519211.tif 000026
2004519211.tif 000027
【００５９】
本発明の態様では、ＺＦＰが少なくとも３つの亜鉛フィンガードメインを含み、各ドメインが独立して、式
2004519211.tif 000028
によって示され、該ドメインが０個〜１０個のアミノ酸残基で互いに共有結合し、Ｘが任意のアミノ酸であり、Ｘｎがポリペプチド鎖中のＸの発生数を示し、Ｚ−１、Ｚ２、Ｚ３、およびＺ６が表１の認識コードによって決定され、このようなタンパク質は配列番号：３〜１２（表４）のいずれか１つによって得られるタンパク質でも表１の認識コードによって設計された３つ以上の亜鉛フィンガードメインを有する任意の他のＺＦＰでもなく、これらのドメインが０個〜１０個のアミノ酸で結合していることを条件とする、標的核酸配列への結合のために設計された単離人工ＺＦＰである。上記のように、ＸはＣｙｓ２Ｈｉｓ２亜鉛フィンガードメインのフレームワークを示し、既知の亜鉛フィンガーフレームワーク、コンセンサスフレームワーク、種々の配列によって得られたフレームワーク、これらの任意のフレームワーク、または任意の人工フレームワークであり得る。好ましくは、既知のフレームワークを使用して、各Ｘの同一性を決定する。本発明のＺＦＰは、３個〜４０個の亜鉛フィンガードメイン、好ましくは３個〜１５個のドメイン、３個〜１２個のドメイン、３個〜９個のドメイン、または３個〜６個のドメインを含み、かつＺＦＰは３個、４個、５個、６個、７個、８個、または９個のドメインを含む。好ましい態様では、Ｘの決定のためのフレームワークは、Ｓｐ１ＣまたはＺｉｆ２６８由来のものである。１つの態様では、フレームワークは、配列が、式
2004519211.tif 000029
である、Ｓｐ１Ｃのドメイン２を有する。
【００６０】
さらに、好ましいＺＦＰは、独立してまたは任意の組み合わせで、少なくとも１つの亜鉛フィンガードメイン中でＺ−１がメチオニンであり；少なくとも１つの亜鉛フィンガードメイン中でＺ−１がグルタミン酸であり；少なくとも１つの亜鉛フィンガードメイン中でＺ２がトレオニンであり；少なくとも１つの亜鉛フィンガードメイン中でＺ２がセリンであり；少なくとも１つの亜鉛フィンガードメイン中でＺ２がアスパラギンであり；少なくとも１つの亜鉛フィンガードメイン中でＺ６がグルタミン酸であり；少なくとも１つの亜鉛フィンガードメイン中でＺ６がトレオニンであり；少なくとも１つの亜鉛フィンガードメイン中でＺ６がチロシンであり；少なくとも１つの亜鉛フィンガードメイン中でＺ６がロイシンであり、かつ／または少なくとも１つの亜鉛フィンガードメイン中でＺ２がアスパラギン酸であるが、同一のドメイン中でＺ−１がアルギニンではないものである。
【００６１】
本発明のＺＦＰはまた、表３に示される２３群のタンパク質を含む。１群〜１１群は、以下の種類のヌクレオチド標的配列
2004519211.tif 000030
に結合するタンパク質をそれぞれ示す：
式中、ＤはＧ、Ａ、またはＴであり；ＭはＧまたはＴであり；ＲはＧまたはＡであり；ＷはＡまたはＴであり；Ｎは任意のヌクレオチドである。１２群〜２３群のタンパク質は、一般に、式
2004519211.tif 000031
で示されるが、Ｎは任意のヌクレオチドではなく、むしろ表３に示される群に属するように指定されたタンパク質のヌクレオチドを示す。
【００６２】
本発明のＺＦＰに関するさらなる情報は、本明細書全体で示される。
【００６３】
本発明の別の局面は、本発明のＺＦＰをコードする単離された核酸、これらの核酸を含む発現ベクター、および発現ベクターで（任意の方法によって）形質転換された宿主細胞を提供する。その使用の中でも、このような宿主細胞を、一定期間およびＺＦＰを発現させる条件下での培養およびＺＦＰの回収によるＺＦＰの調製方法で宿主細胞を使用することができる。このような態様（すなわち、核酸、宿主細胞、発現方法）は、本発明によって設計された任意のタンパク質ならびに下記の融合タンパク質に含まれる。
【００６４】
ＩＩＩ．融合タンパク質
本発明の１つの態様では、ＺＦＰ融合タンパク質は、少なくとも２つのＤＮＡ結合ドメインを含むことができ、そのうちの１つは自在リンカーを介して他のドメインに結合した亜鉛フィンガーポリペプチドである。２つのドメインは、同一であっても異種でもよい。本発明の好ましい態様では、これらのドメインの少なくとも一方は亜鉛フィンガーであり、他方のドメインは転写活性化因子などの別のＤＮＡ結合タンパク質である。
【００６５】
本発明はまた、関心対象のタンパク質（ＰＯＩ）または関心対象の活性を有するタンパク質ドメインに融合した本発明のＺＦＰを有する融合タンパク質を含む。所望の活性を有するこのようなタンパク質ドメインを、エフェクタードメインとも呼ぶ。
【００６６】
さらに本発明は、トランスポザーゼ、インテグラーゼ、リコンビナーゼ、レソルバーゼ、インベルターゼ、プロテアーゼ、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ、ＤＮＡデメチラーゼ、ヒストンアセチラーゼ、ヒストンデアセチラーゼ、ヌクレアーゼ、転写抑制因子、転写活性化因子、一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質、転写因子漸増タンパク質、核局在化シグナル、または細胞取り込みシグナルである第２のドメイン（エフェクタードメイン）に融合した本発明のＺＦＰを含む単離された融合タンパク質を含む。代替的な態様では、第２のドメインは、トランスポザーゼ活性、インテグラーゼ活性、リコンビナーゼ活性、レソルバーゼ活性、インベルターゼ活性、プロテアーゼ活性、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ活性、ＤＮＡデメチラーゼ活性、ヒストンアセチラーゼ活性、ヒストンデアセチラーゼ活性、ヌクレアーゼ活性、核局在化シグナル伝達活性、転写抑制因子活性、転写活性化因子活性、一本鎖ＤＮＡ結合活性、転写因子漸増活性、または細胞取り込みシグナル伝達活性を示すタンパク質ドメインである。
【００６７】
本発明のさらなる融合タンパク質には、細胞によって取り込むことができる２価のリガンドの結合部分に特異的に結合することができるタンパク質ドメインに融合した本発明のＺＦＰが含まれる。能動輸送、受動輸送、または拡散が含まれるがこれらに限定されない任意の機構によって、このような細胞取り込みを行うことができる。これらの融合タンパク質のタンパク質ドメインは、Ｓタンパク質、Ｓタグ、抗原、ハプテン、または抗体の一本鎖可変領域（ｓｃＦｖ）であり得る。
【００６８】
本発明はまた、抗体の一本鎖可変領域をコードする第１のドメイン；核局在化シグナルをコードする第２のドメイン；および転写調節活性をコードする第３のドメインを含む単離された融合タンパク質を含む。
【００６９】
ＩＶ．マルチフィンガーＺＦＰの合成のためのモジュラーアセンブリーの方法
本発明のさらなる局面は、所望の個々の亜鉛フィンガードメインをコードする３組のオリゴヌクレオチドからの多数のマルチフィンガーＺＦＰをアセンブルさせるための迅速なモジュラー方法の提供に関する。したがって、この方法は、マルチフィンガーＺＦＰをコードするＤＮＡの高処理産生法を提供する。実際、ロボットを使用して、本発明の方法を自動化してこれらのＤＮＡ分子の並行アセンブリーを行うことができる。
【００７０】
表３で示されるように、２５６個の異なる４塩基対標的が存在する。４つの各ヌクレオチドについての４つの各変形可能なドメイン位置について１つのアミノ酸を特定することができる表１の好ましいバージョンなどの認識コードを使用する場合、２５６個の各標的配列について１つの固有の亜鉛フィンガードメインを構築することができる。これらのドメインを使用して３つのフィンガーＺＦＰを作製する場合、可能なＺＦＰ数を、２５６３すなわち１．６８×１０７と計算することができる。本発明は、７６８個のオリゴヌクレオチド（すなわち、３組の２５６個のオリゴヌクレオチド）からのこれらの全てのＺＦＰの合成法を提供する。実際、本発明の方法を、各新規の組の２５６個のオリゴヌクレオチドのために、１つのフィンガーを含むＺＦＰについての可能な各ＺＦＰを作製することができるように適用することができる。
【００７１】
したがって、３つの亜鉛フィンガードメインを含み、各ドメインが独立して式
2004519211.tif 000032
で示され、該ドメインが独立して、０個〜１０個のアミノ酸残基で共有結合している亜鉛フィンガータンパク質（ＺＦＰ）をコードする核酸の作製法は、以下の段階を含む：
（ａ）（ｉ）第１の亜鉛フィンガードメインをコードする第１の二本鎖オリゴヌクレオチド、
（ｉｉ）第２の亜鉛フィンガードメインをコードする第２の二本鎖オリゴヌクレオチド、
（ｉｉｉ）第３の亜鉛フィンガーをコードする第３の二本鎖オリゴヌクレオチド、
（ｉｖ）第１のオリゴヌクレオチドの５’末端に相補的な第１のＰＣＲプライマー、および
（ｖ）第３のオリゴヌクレオチドの３’末端に相補的な第２のＰＣＲプライマー
を含む混合物であって、
第１のオリゴヌクレオチドの３’末端が、そこから第２のオリゴヌクレオチド合成を開始するために第２のオリゴヌクレオチドの５’末端に十分相補的であり、
第２のオリゴヌクレオチドの３’末端が、そこから第３のオリゴヌクレオチド合成を開始するために第３のオリゴヌクレオチドの５’末端に十分相補的であり、
第１のオリゴヌクレオチドの３’末端が第３のオリゴヌクレオチドの５’末端に相補的ではなく、第２のオリゴヌクレオチドの３’末端が第１のオリゴヌクレオチドの５’末端に相補的ではない
混合物を、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行う条件下で調製する段階；
（ｂ）混合物をＰＣＲに供する段階；および
（ｃ）ＺＦＰをコードする核酸を回収する段階。
【００７２】
加熱、アニーリング、および合成の複数のサイクルのための標準的または典型的ＰＣＲ条件下で、ＰＣＲ反応が行われる。ＰＣＲ増幅プライマーは、好ましくは、制限エンドヌクレアーゼ認識部位を含む。このような部位は、クローニングを容易にすることができるか、下記のように、４つまたはそれ以上の亜鉛フィンガードメインのアセンブリーを容易にすることができる。有用な制限酵素には、ＢｂｓＩ、ＢｓａＩ、ＢｓｍＢＩ、またはＢｓｐＭＩが含まれ、ＢｓａＩが最も好ましい。
【００７３】
４つ以上の亜鉛フィンガードメインを含み、各ドメインが独立して式
2004519211.tif 000033
で示され、該ドメインが独立して、０個〜１０個のアミノ酸残基で共有結合している亜鉛フィンガータンパク質（ＺＦＰ）をコードする核酸を合成するために、その方法は、以下の段階を含む：
（ａ）第２のＰＣＲプライマーが第１の制限エンドヌクレアーゼ認識部位を含む、上記の方法によって第１の核酸を調製する段階；
（ｂ）第１および第２のＰＣＲプライマー（この第２の合成において）が、増幅のために選択された番号の亜鉛フィンガードメインの５’末端および３’末端にそれぞれ相補的であり、
第１のＰＣＲプライマーが対応する制限エンドヌクレアーゼによる切断に供された場合に、段階（ａ）の第２のＰＣＲプライマーが対応する制限エンドヌクレアーゼによる切断に供された場合に産生される末端に相補的でありかつアニーリングすることができる配列を含む末端を産生する、制限エンドヌクレアーゼ認識部位を含み、
段階（ｂ）の第２のＰＣＲプライマーが、選択的に、切断に供された場合に第１の制限エンドヌクレアーゼ認識部位から産生された末端と異なりかつ相補的ではない末端を産生する、第２の制限酵素認識部位を含む、
上記の方法によって第２の核酸を調製する段階；
（ｃ）さらなる各核酸のための第１のＰＣＲプライマーが、対応する制限エンドヌクレアーゼによる切断に供された場合に、第２の核酸またはさらなる核酸のすぐ上流に存在するさらなる核酸の調製に使用される第２のＰＣＲプライマーが対応する制限エンドヌクレアーゼによる切断に供された場合に産生される末端に相補的でありかつアニーリングすることができる配列を有する末端を産生する制限エンドヌクレアーゼ認識部位を含み、さらなる各核酸のための第２のＰＣＲプライマーが、選択的に、切断に供された場合に先に使用した任意の末端と異なりかつ相補的ではない末端を産生する制限エンドヌクレアーゼ認識部位を含む、
前記第１および第２のＰＣＲプライマー（このさらなる合成の）が、増幅のために選択された番号の亜鉛フィンガードメインの５’末端および３’末端にそれぞれ相補的であり、選択的に、上記の方法によって１つまたは複数のさらなる核酸を調製する段階；
（ｄ）第１の核酸、第２の核酸、および調整されたならばさらなる核酸を、対応する制限エンドヌクレアーゼで切断して、切断された第１の、第２の、および調整されたならばさらなる核酸を産生する段階；ならびに
（ｅ）切断された第１の、第２の、および調整されたならばさらなる核酸をライゲーションして、４つ以上の亜鉛フィンガードメインを有する亜鉛フィンガータンパク質（ＺＦＰ）をコードする核酸を産生する段階。有用かつ好ましい制限酵素が上記に示され、それぞれ１つを選択して固有の切断アニーリング末端対が得られる。
【００７４】
段階（ｃ）を省略する場合、４つ、５つ、または６つの亜鉛フィンガードメインを有するＺＦＰを作製することができる。３フィンガーＺＦＰをコードする核酸が段階（ｂ）で産生され、かつ１つのさらなる核酸が段階（ｃ）で調製される場合、７つ、８つ、または９つの亜鉛フィンガードメインを作製することができる。
【００７５】
適切な設計により、オリゴヌクレオチドは細菌、真菌、酵母、動物、昆虫、または植物などの生物にとって最適なコドン使用頻度を提供することができる。好ましい態様では、大腸菌、ヒト、もしくはマウス、穀類、イネ、トマト、もしくはトウモロコシの最適なコドン使用頻度（生物の発現を最大にするため）が得られる。本方法を、トランスジェニック植物を使用して実施する。
【００７６】
本発明によって作製される核酸を、発現ベクターおよび宿主細胞に組み込むことができる。次いで、これらのベクターおよび宿主を使用して、当技術分野において周知の方法によってＺＦＰを組換え発現することができる。
【００７７】
本発明は、４塩基対標的の認識コードからのアミノ酸の任意の組み合わせを使用するように設計した多数の異なるオリゴヌクレオチドを含み、
（ａ）第１の塩基がＧの場合、Ｚ６はアルギニンまたはリジンであり、
第１の塩基がＡの場合、Ｚ６はグルタミンまたはアスパラギンであり、
第１の塩基がＴの場合、Ｚ６はトレオニン、チロシン、ロイシン、イソロイシン、またはメチオニンであり、
第１の塩基がＣの場合、Ｚ６はグルタミン酸またはアスパラギン酸であり、
（ｂ）第２の塩基がＧの場合、Ｚ３はヒスチジンまたはリジンであり、
第２の塩基がＡの場合、Ｚ３はアスパラギンまたはグルタミンであり、
第２の塩基がＴの場合、Ｚ３はセリン、アラニン、またはバリンであり、
第２の塩基がＣの場合、Ｚ３はアスパラギン酸またはグルタミン酸であり、
（ｃ）第３の塩基がＧの場合、Ｚ−１はアルギニンまたはリジンであり、
第３の塩基がＡの場合、Ｚ−１はグルタミンまたはアスパラギンであり、
第３の塩基がＴの場合、Ｚ−１はトレオニン、メチオニン、ロイシン、またはイソロイシンであり、
第３の塩基がＣの場合、Ｚ−１はグルタミン酸またはアスパラギン酸であり、
（ｉｖ）第４の塩基の相補物がＧの場合、Ｚ２はセリンまたはアルギニンであり、
第４の塩基の相補物がＡの場合、Ｚ２はアスパラギンまたはグルタミンであり、
第４の塩基の相補物がＴの場合、Ｚ２はトレオニン、バリン、またはアラニンであり、
第４の塩基の相補物がＣの場合、Ｚ２はアスパラギン酸またはグルタミン酸である、オリゴヌクレオチドの組を含む。
【００７８】
好ましくは、これは４塩基対の標的を示すので、オリゴヌクレオチド数は２５６である。表１の好ましい認識コードについて設計された組が好ましい。
【００７９】
Ｖ．その他
本明細書で使用される「生物」には、細菌、真菌、酵母、動物、鳥類、昆虫類、植物などが含まれる。動物には、哺乳動物（ヒト、霊長類など）、家畜（魚類、ニワトリ、乳牛、畜牛、ブタ、ヒツジ、ヤギ、シチメンチョウなど）、実験動物（マウス、ラット、ウサギなど）、およびペット（イヌ、ネコ、小鳥、および他のペット用鳥類、魚類など）が含まれるが、これらに限定されない。本明細書で意図されるように、特定の動物は、複数の動物群の構成要素であり得る。植物を本明細書の中でより詳細に記載する。
【００８０】
いくつかの例では、生物の細胞を本発明の方法で使用することが可能である。細胞を本発明の局面とみなす場合、本明細書で示されている発現した任意の動物、生物、または植物由来のさらなる細胞では、細胞には、このような生物および動物から単離した細胞ならびに研究所または他の実験施設で使用される細胞株（初代および第２世代の細胞株などを含む）が含まれる。
【００８１】
細胞形質転換技術および遺伝子送達法（遺伝子を送達させるためのインビボでの使用のための方法）は当技術分野において周知である。このような任意の技術を使用して、本発明のＺＦＰまたはＺＦＰ融合タンパク質をコードする核酸をそれぞれ細胞または被験者に送達させることができる。
【００８２】
本明細書で使用される「発現カセット」という用語は、終結シグナルに作動可能に連結された関心対象のヌクレオチド配列に作動可能に連結されたプロモーターを含む、適切な宿主中で特定のヌクレオチド配列の発現を指示することができるＤＮＡ配列を意味する。これはまた、典型的には、ヌクレオチド配列の適切な翻訳に必要な配列を含む。コード領域は、通常、関心対象のタンパク質をコードするが、センスまたはアンチセンス方向で関心対象の機能的ＲＮＡ（例えば、アンチセンスＲＮＡまたは非翻訳ＲＮＡ）もコードすることができる。関心対象のヌクレオチド配列を含む発現カセットは、キメラであってよく、これは、その成分の少なくとも１つが少なくとも１つの他の成分に関して異種であることを意味する。本発明の亜鉛フィンガーエフェクター融合物は、キメラである。発現カセットはまた、天然に存在するが、異種発現に有用な組換え形態で得られたものであり得る。しかし、典型的には、発現カセットは宿主に関して異種である（すなわち、発現カセットの特定のＤＮＡ配列は宿主細胞中に天然に存在せず、宿主細胞または宿主細胞の先祖に形質転換によって導入されていなければならない）。発現カセット中のヌクレオチド配列の発現は、構成性プロモーターまたは宿主細胞がいくらかの特定の外的刺激にさらされた場合のみに転写が開始される誘導プロモーターの調節下にあり得る。植物などの多細胞生物の場合、プロモーターはまた、特定の組織もしくは器官または発達段階に特異的であり得る。プラスチド発現カセットの場合、プラスチドゲノムからのヌクレオチド配列のために、さらなるエレメント（すなわち、リボソーム結合部位）が必要であり得る。
【００８３】
「異種」ＤＮＡ分子または配列とは、天然に存在するＤＮＡ配列の天然に存在しない複数のコピーを含む、挿入される宿主細胞と天然には関連しないＤＮＡ分子または配列を意味する。
【００８４】
「相同性」ＤＮＡ分子または配列とは、宿主細胞に天然に関連するＤＮＡ分子または配列を意味する。
【００８５】
「最小プロモーター」とは、上流が活性化していない場合に不活性であるかプロモーター活性が非常に減少するプロモーターエレメント、特にＴＡＴＡエレメントを意味する。適切な転写因子の存在下では、最小プロモーターは、転写するように機能する。
【００８６】
「植物」とは、任意の発達段階（種子、懸濁培養液、胚、成長点、カルス組織、葉、根、茎頂、配偶体、胞子体、花粉、小胞子、およびその子孫を含む）の任意の植物または植物の一部を指す。切片、細胞、または組織培養もまた含まれる。本発明との関連で使用されるように、「植物組織」という用語には、植物全体、植物細胞、植物器官（例えば、葉、茎、根、成長点）植物の種子、プロトプラスト、カルス、細胞培養物、ならびに構造および／または機能単位に組織化される任意の植物細胞群が含まれるが、これらに限定されない。
【００８７】
本発明を使用して、例えば、広範な植物型、好ましくは形質転換技術に反応し得る高等植物クラス（特に、単子葉植物および双子葉植物）の遺伝子発現を調整し、ゲノム構造などを変化させることができる。ソルガムおよびトウモロコシを含むイネ科の種などの単子葉植物が特に好ましい。本発明の単離された核酸およびタンパク質を、以下の属由来の種でも使用することができる：カボチャ（Ｃｕｃｕｒｂｉｔａ）、バラ（Ｒｏｓａ）、ブドウ（Ｖｉｔｉｓ）、クルミ（Ｊｕｇｌａｎｓ）、イチゴ（Ｆｒａｇａｒｉａ）、ハス（Ｌｏｔｕｓ）、ウマゴヤシ（Ｍｅｄｉｃａｇｏ）、オノブリキス（Ｏｎｏｂｒｙｃｈｉｓ）、ジャジクソウ（Ｔｒｉｆｏｌｉｕｍ）、トリゴネラ（Ｔｒｉｇｏｎｅｌｌａ）、ビベナ（Ｖｉｇｎａ）、ミカン（Ｃｔｒｕｓ）、リナム（Ｌｉｎｕｍ）、フウロソウ（Ｇｅｒａｎｉｕｍ）、マニボット（Ｍａｎｉｂｏｔ）、ニンジン（Ｄａｕｃｕｓ）、アラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）、アブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ）、ダイコン（Ｒａｐｈａｎｕｓ）、カラシ（Ｓｉｎａｐｉｓ）、ロウトウ（Ａｔｒｏｐａ）、トウガラシ（Ｃａｐｓｉｃｕｍ）、チョウセンアサガオ（Ｄａｔｕｒａ）、ヒヨス（Ｈｙｏｓｃｙａｍｕｓ）、トマト（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ）、タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ）、ナス（Ｓｏｌａｎｕｍ）、ペチュニア（Ｐｅｔｕｎｉａ）、ジギタリス（Ｄｉｇｉｔａｌｉｓ）、マジョラム（Ｍａｊｏｒａｎａ）、チコリ（Ｃｉｃｈｏｒｉｕｍ）、ヒマワリ（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ）、レタス（Ｌａｃｔｕｃａ）、ブロムグラス（Ｂｒｏｍｕｓ）、アスパラガス（Ａｓｐａｒａｇｕｓ）、キンギョソウ（Ａｎｔｉｒｒｈｉｕｍ）、ヘテロカリス（Ｈｅｔｅｒｏｃａｌｌｉｓ）、ネメシス（Ｎｅｍｅｓｉｓ）、ペラルゴニウム（Ｐｅｌａｒｇｏｎｉｕｍ）、パニエウム（Ｐａｎｉｅｕｍ）、チカラシバ（Ｐｅｎｎｉｓｅｔｕｍ）、キンポウゲ（Ｒａｎｕｎｃｕｌｕｓ）、キオン（Ｓｅｎｅｃｉｏ）、サプリグロッシス（Ｓａｐｌｉｇｌｏｓｓｉｓ）、キュウリ（Ｃｕｃｕｍｉｓ）、ルリマガリバナ（Ｂｒｏｗａａｌｉａ）、グリシン（Ｇｌｙｃｉｎｅ）、エンドウ（Ｐｉｓｕｍ）、インゲンマメ（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ）、ライグラス（Ｌｏｌｉｕｍ）、イネ（Ｏｒｙｚａ）、カラスムギ（Ａｖｅｎａ）、オオムギ（Ｈｏｒｄｅｕｍ）、ライムギ（Ｓｅｃａｌｅ）、およびコムギ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ）。
【００８８】
好ましい植物細胞には、トウモロコシ（Ｚｅａ ｍａｙｓ）、アブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ、Ｂｒａｓｓｉｃａ ｒａｐａ種）、アルファルファ（Ｍｅｄｉｃａｇｏ ｓａｔｉｖａ）、イネ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ）、ライ麦（Ｓｅｃａｌｅ ｃｅｒｅａｌｅ）、モロコシ（Ｓｏｒｇｈｕｍ ｂｉｃｏｌｏｒ、Ｓｏｒｇｈｕｍ ｖｕｌｇａｒｅ）、ヒマワリ（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ ａｎｎｕｕｓ）、コムギ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ）、ダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ）、タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ）、ジャガイモ（Ｓｏｌａｎｕｍ ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ）、ピーナッツ（Ａｒａｃｈｉｓ ｈｙｐｏｇａｅａ）、ワタ（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ ｂａｒｂａｄｅｎｓｅ、Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ ｈｉｒｓｕｔｕｍ）、サツマイモ（Ｉｐｏｍｏｅａ ｂａｔａｔｕｓ）、キャッサバ（Ｍａｎｉｈｏｔ ｅｓｃｕｌｅｎｔａ）、コーヒー（Ｃｏｆｆｅａ属）、ココナッツ（Ｃｏｃｏｓ ｎｕｃｉｊｒａ）、パイナップル（Ａｎａｎａｓ ｃｏｍｏｓｕｓ）、カンキツ属（Ｃｉｔｒｕｓ種）、ココア（Ｔｈｅｏｂｒｏｍａ ｃａｃａｏ）、チャ（Ｃａｍｅｌｌｉａ ｓｉｎｅｎｓｉｓ）、バナナ（Ｍｕｓａ種）、アボカド（Ｐｅｒｓｅａ ａｍｅｒｉｃａｎａ）、イチジク（Ｆｉｃｕｓ ｃａｓｉｃａ）、グァバ（Ｐｓｉｄｉｕｍ ｇｕａｊａｖａ）、マンゴー（Ｍａｎｇｉｆｅｒａ ｉｎｄｉｃａ）、オリーブ（Ｏｌｅａ ｅｕｒｏｐａｅａ）、パパイア（Ｃａｒｉｃａ ｐａｐａｙａ）、カシュー（Ａｎａｃａｒｄｉｕｍ ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｅ）、マカダミア（Ｍａｃａｄａｍｉａ ｉｎｔｅｇｒｉｆｏｌｉａ）、アーモンド（Ｐｒｕｎｕｓ ａｍｙｇｄａｌｕｓ）、テンサイ（Ｂｅｔａ ｖｕｌｇａｒｉｓ）、サトウキビ（Ｓａｃｃｈａｒｕｍ種）、ウキクサ（Ｌｅｍｎａ種）、エンバク、オオムギ、野菜類、観賞植物、および針葉樹由来のものが含まれる。
【００８９】
好ましい野菜類には、トマト（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ）、レタス（例えば、Ｌａｃｔｕｃａ ｓａｔｉｖａ）、インゲン（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ ｖｕｌｇａｒｉｓ）、ライマメ（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ ｌｉｍｅｎｓｉｓ）、エンドウ（Ｌａｔｈｙｒｕｓ種）、およびキュウリ（Ｃ． ｓａｔｉｖｕｓ）、カンタロープ（Ｃ． ｃａｎｔａｌｕｐｅｎｓｉｓ）、およびマスクメロン（Ｃ． ｍｅｌｏ）などのＣｕｃｕｍｉｓ属のメンバーが含まれる。
【００９０】
好ましい観賞植物には、アザレア（Ｒｈｏｄｏｄｅｎｄｒｏｎ種）、アジサイ（Ｍａｃｒｏｐｈｙｌｌａ ｈｙｄｒａｎｇｅａ）、ハイビスカス（Ｈｉｂｉｓｃｕｓ ｒｏｓａｓａｎｅｎｓｉｓ）、バラ（Ｒｏｓａ種）、チューリップ（Ｔｕｌｉｐａ種）、ラッパスイセン（Ｎａｒｃｉｓｓｕｓ種）、ペチュニア（Ｐｅｔｕｎｉａ ｈｙｂｒｉｄａ）、カーネーション（Ｄｉａｎｔｈｕｓ ｃａｒｙｏｐｈｙｌｌｕｓ）、ポインセチア（Ｅｕｐｈｏｒｂｉａ ｐｕｌｃｈｅｒｒｉｍａ）、およびキクが含まれる。
【００９１】
本発明の実施で使用することができる針葉樹には、例えば、テーダマツ（Ｐｉｎｕｓ ｔａｅｄａ）、スラッシュパイン（Ｐｉｎｕｓ ｅｌｌｉｏｔｉｉ）、ポンデローサマツ（Ｐｉｎｕｓ ｐｏｎｄｅｒｏｓａ）、ヨレハマツ（Ｐｉｎｕｓ ｃｏｎｔｏｒｔａ）、モントレーマツ（Ｐｉｎｕｓ ｒａｄｉａｔａ）などのマツ；アメリカトガサワラ（Ｐｓｅｕｄｏｔｓｕｇａ ｍｅｎｚｉｅｓｉｉ）；アメリカツガ（Ｉｓｕｇａ ｃａｎａｄｅｎｓｉｓ）；ベイトウヒ（Ｐｉｃｅａ ｇｌａｕｃａ）；セコイア（Ｓｅｑｕｏｉａ ｓｅｍｐｅｒｖｉｒｅｎｓ）；ヨーロッパモミ（Ａｂｉｅｓ ａｍａｂｉｌｉｓ）およびバルサムモミ（Ａｂｉｅｓ ｂａｌｓａｍｅａ）などのマツ；ならびにベイスギ（Ｔｈｕｊａ ｐｌｉｃａｔａ）およびアラスカヒノキ（Ｃｈａｍａｅｃｙｐａｒｉｓ ｎｏｏｔｋａｔｅｎｓｉｓ）などのシーダーが含まれる。
【００９２】
最も好ましくは、本発明の植物は、穀物類（例えば、トウモロコシ、アルファルファ、ヒマワリ、ナノハナ、ダイズ、ワタ、ピーナッツ、モロコシ、コムギ、タバコなど）、さらにより好ましくはトウモロコシおよびダイズ植物、さらにより好ましくはトウモロコシ植物である。
【００９３】
本明細書で使用される「トランスジェニック植物」または「遺伝的に改変した植物」には、そのゲノム内に異種ポリヌクレオチドを含む植物についての参照が含まれる。一般的そして好ましくは、ポリヌクレオチドが代々受け継がれるように異種ポリヌクレオチドをゲノム内に安定に組み込む。異種ポリヌクレオチドを、ゲノムのみに組み込んでも組換えカセットの一部としても組み込むことができる。本明細書で使用される「トランスジェニック」には、任意の細胞、細胞株、カルス、組織、植物の一部もしくは植物が含まれ、その遺伝子型が異種核酸の存在によって変化しており、これにはこのようにして最初に変化したトランスジェニックおよび最初のトランスジェニックからの有性生殖または無性生殖によって作製されたトランスジェニックが含まれる。本明細書で使用される「トランスジェニック」という用語は、従来の植物交配法または天然に存在する事象（無作為他家受精、非組換えウイルス感染、非組み合え細菌形質転換、非組換え転位、または自発的変異など）によるゲノム（染色体または染色体外）の変化を含まない。
【００９４】
本明細書で使用される「標的ポリヌクレオチド」、「標的核酸」、「標的部位」、または他の類似の技術とは、亜鉛フィンガードメインが結合する二本鎖ポリヌクレオチド（ＤＮＡ、ＲＮＡ、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、およびその組み合わせを含む）の一部を指す。１つの好ましい態様では、標的ポリヌクレオチドは、遺伝子の転写制御エレメントの全部または一部であり、亜鉛フィンガードメインは結合してその発現の程度を調整する（活性化または抑制する）ことができる。転写制御エレメントは、以下の１つ以上を含み得る：プロモーター、エンハンサー、他の応答エレメント（例えば、ステロイド応答エレメント、熱ショック応答エレメント、または金属応答エレメント）などの正または負の調節エレメント、抑制因子結合部位、オペレーター、およびサイレンサー。転写制御エレメントは、ウイルス、真核生物、または原核生物であり得る。「標的ヌクレオチド配列」とはまた、タンパク質に結合して発現を調節し、典型的には転写を防止または活性化することができる下流配列を指す。
【００９５】
ＶＩ．使用
本発明の亜鉛フィンガー−ヌクレオチド塩基認識コードの発見により、任意の標的ヌクレオチド配列に結合してその発現を調整することができるＺＦＰおよびＺＦＰ融合タンパク質の設計が可能である。標的ヌクレオチド配列は、標的遺伝子内の任意の位置に存在し、発現の制御に適切な位置でその発現が調節されている。標的ヌクレオチド配列は、コード領域またはその上流もしくは下流内に存在し得るが、いくらか離れていてもよい。例えば、エンハンサーは、遺伝子から非常に離れて作用してその発現を調整することが既知である。活性化のためには、ＡＴＧ翻訳開始コドンから上流の標的が好ましく、翻訳開始コドンから約１００ｂｐ以内のＴＡＴＡボックスの上流が最も好ましい。抑制のためには、ＡＴＧ翻訳開始コドンから上流も好ましいが、ＴＡＴＡボックスから下流が好ましい。
【００９６】
プロモーター領域中の転写制御エレメントに結合する１つまたは複数の亜鉛フィンガードメインを含むタンパク質は、通常遺伝子発現を刺激する転写因子の結合の遮断によって遺伝子発現を減少させることができる。他の例では、特定のタンパク質の発現を増加させることが望ましい。転写活性化因子を含むＺＦＰを使用して、このような発現を増加させる。
【００９７】
本発明の別の態様では、ＺＦＰを酵素と融合してゲノム中の特異的部位に酵素を標的とする。これらの融合タンパク質は、酵素を特異的部位に指示し、ゲノムおよびクロマチンを改変する。このような改変は、ゲノムのいかなる場所（例えば、ゲノム中またはゲノムから遠位）にも存在し得る。例えば、インテグラーゼまたはトランスポザーゼを使用した標準的な分子生物学技術を使用して本発明の認識コドンに基づいて設計した亜鉛フィンガードメインの融合によってゲノムを特異的に操作して、特異的ゲノム部位への外因性遺伝子の組み込みを促進するか（トランスポザーゼまたはインテグラーゼ）、特異的内因性遺伝子を消失させるか（ノックアウト）（トランスポザーゼ）、１つまたは複数のＤＮＡ断片（強力プロモーター／エンハンサー、組織特異的プロモーター／エンハンサー、インシュレーター、またはサイレンサー）の挿入によってプロモーターを操作することができる。他の例では、ＺＦＰは、特定の配列を有するポリヌクレオチドに結合する。他の態様では、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ、ＤＮＡデメチラーゼ、ヒストンアセチラーゼ、およびヒストンデアセチラーゼなどの酵素を、クロマチン構造操作のために本発明の認識コードに基づいて調製したＺＦＰに結合する。
【００９８】
例えば、特異的ゲノム部位でのＤＮＡのメチル化／脱メチル化は、メチル化パターンの変化により後生的状態が操作され（遺伝子サイレンシング）、特異的ゲノム部位でのヒストンのアセチル化／脱アセチル化は、クロマチン上のヌクレオソームの移動性および／または分布の変化により遺伝子発現を操作して、ＤＮＡへの転写因子のアクセスを増加させる。プロテアーゼは、同様にＤＮＡ上のヌクレオソームの移動性および分布に影響を与えて遺伝子発現を調整することができる。
【００９９】
ヌクレアーゼは、標的部位のニッキングおよび消化によってゲノム構造を変化させ、これらの部位での外因性遺伝子の導入を可能にする。インベルターゼは、ＤＮＡ断片方向の交換によってゲノム構造を変化させることができる。レソルバーゼは、ＤＮＡの結合状態の変化（例えば、コンカテマーの放出）によってゲノム構造を変化させることができる。
【０１００】
上記のいくつかの調節タンパク質の例には、トランスポザーゼ：Ｔｃ１トランスポザーゼ、Ｍｏｓ１トランスポザーゼ、Ｔｎ５トランスポザーゼ、Ｍｕトランスポザーゼ；インテグラーゼ：ＨＩＶインテグラーゼ、λインテグラーゼ；リコンビナーゼ：Ｃｒｅリコンビナーゼ、Ｆｌｐリコンビナーゼ、Ｈｉｎリコンビナーゼ；ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ：ＳｓｓＩメチラーゼ、ＡｌｕＩメチラーゼ、ＨａｅＩＩＩメチラーゼ、ＨｈａＩメチラーゼ、ＨｐａＩＩメチラーゼ、ヒトＤｎｍｔ１メチルトランスフェラーゼ；ＤＮＡデメチラーゼ：ＭＢＤ２Ｂ、候補デメチラーゼ；ヒストンアセチラーゼ：ヒトＧＣＮ５、ＣＢＰ（ＣＲＥＢ結合タンパク質）；ヒストンデアセチラーゼ：ＨＤＡＣ１；ヌクレアーゼ：単球菌ヌクレアーゼ、スタフィロコッカスヌクレアーゼ、ＤＮａｓｅＩ、Ｔ７エンドヌクレアーゼ；レソルバーゼ：Ｒｕｖ Ｃレソルバーゼ、ホリデージャンクションレソルバーゼＨｊｃ；およびインベルターゼ：Ｈｉｎインベルターゼが含まれるが、これらに限定されない。
【０１０１】
別の態様では、核局在化ペプチドを、ＺＦＰまたはＺＦＰ融合ＺＦＰに結合して核区画に亜鉛フィンガーを標的とする。さらに、ＺＦＰは、単独または上記の調節ドメインなどの他の部分と組み合わせて、結合した細胞取り込みシグナルを有し得る。このような細胞取り込みシグナルには、ヒト免疫不全ウイルスＴａｔタンパク質の残基４７位〜５７位（ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号：１８））である最小Ｔａｔタンパク質形質導入ドメインが含まれるが、これらに限定されない。
【０１０２】
野生型トランスポザーゼ２ホモ二量体（図４の左のパネル）は、触媒（切断）ドメイン４、二量体化ドメイン６、および末端逆反復（ＴＩＲ）結合ドメイン８を含む。本発明の１つの態様では、亜鉛フィンガードメインを、ＴＩＲドメインと交換して、本発明の認識コードによる亜鉛フィンガードメインによって標的されたゲノム部位の切断を促進する。人工トランスポザーゼヘテロ二量体１０（図４、右のパネル）を、ヘテロ二量体ペプチド（ｊｕｎ−ｆｏｓおよび酸性−塩基性ヘテロ二量体ペプチドが含まれるが、これらに限定されない）を含むリンカー１４を介した亜鉛フィンガードメイン１２への触媒ドメイン４の結合によって作製する。例えば、酸性ペプチド
2004519211.tif 000034
および塩基性ペプチド
2004519211.tif 000035
をリンカーとして使用して、ヘテロ二量体化を行う。ヘテロ二量体は、触媒ドメインによってＤＮＡ切断後にＤＮＡ末端を引く。亜鉛フィンガードメイン１２は、本発明の認識コードに従ってゲノム中の同一または異なる部位を標的とすることができる。任意の所望のゲノム部位を、これらの人工トランスポザーゼを使用して標的とすることができる。細胞系は、人工トランスポザーゼに極めて接近して存在する場合、ＤＮＡの切断末端を修復（ライゲーション）する。
【０１０３】
上記の操作トランスポザーゼの別の態様では、ＴＩＲの特異性を変化させ、ヘテロ二量体の使用と組み合わせて、関心対象の遺伝子の部位特異的ノックアウト（ＫＯ）を得ることができる。あるいは、ＴＩＲの亜鉛フィンガードメイン、特に、（上の段落に記載の）異なる特異性のドメインとの置換により、部位特異的ＫＯに有用な別の種類のタンパク質が得られる。
【０１０４】
さらに、ＺＦＰとの融合により、トランスポザーゼ（触媒ドメイン、二量体化ドメイン、およびＴＩＲ結合ドメインを有する）を、ヘテロ二量体の使用と組み合わせた特異的ゲノム部位に補充してＤＮＡ結合特異性が変化したトランスポザーゼを得て、その結果関心対象の遺伝子の部位特異的ノックイン（ＫＩ）を得ることができる。例えば、亜鉛フィンガードメインを、亜鉛フィンガー−リンカー−Ｔｃ１またはＴｃ１−リンカー−亜鉛フィンガーのいずれかとして自在リンカー（例えば、（ＧＧＧＧＳ）４（配列番号：２１）、式中、Ｇ＝グリシン、Ｓ＝セリン）を介して線虫トランスポゾンＴｃ１に結合することができる。任意のトランスポザーゼ、亜鉛フィンガードメイン、またはリンカーペプチドをこれらの構築に使用できることが認識される。
【０１０５】
部位特異的ＫＯおよびＫＩの戦略を、図５にまとめる。トランスポザーゼ２０は、ホモ二量体またはヘテロ二量体タンパク質ドメインリンカー２６によって結合した触媒ドメイン２２およびＴＩＲ結合ドメイン２４を含む。ＴＩＲ結合ドメイン２４を、同一または異なり得る標的特異性を変化させるために標準的技術によって操作して、変化したＴＩＲ結合ドメイン２５を有するトランスポザーゼ２３を得る。これらのＴＩＲは、欠失すべき遺伝子３０に隣接したゲノム配列２８および２９を標的とする。ＴＩＲのその相補性ゲノム配列２８および２９への結合後、遺伝子３０を含むＤＮＡループ３２が形成され、触媒ドメイン２２はＤＮＡループ３２を切断し、遺伝子３０のＫＯが得られる。好ましくは、触媒ドメインは、切断のみを行い、再ライゲーション活性を有さない。好ましくは、細胞によってライゲーションを行ってＤＮＡの切断末端を連結する。
【０１０６】
本発明の別の態様では、操作トランスポザーゼを使用して、外因性遺伝子の部位特異的ＫＩを行う。この態様では、トランスポザーゼ２０を、特異性が同一であるか異なり得る亜鉛フィンガードメイン３４に結合して、亜鉛フィンガー融合物３６を得る。別の態様では、トランスポザーゼ２３を特異性が同一であるか異なり得る亜鉛フィンガードメイン３５に結合して、ＤＮＡ配列特異性が変化したＴＩＲ２４および２５を含むトランスポザーゼ４０を得る。ＴＩＲ２４および２５を、ゲノム領域４２および４３にそれぞれ接触させ、亜鉛フィンガードメインは標的配列４６および４７に結合し、その後ループＤＮＡ４８を切断し、亜鉛フィンガー標的配列４６と４７との間の遺伝子５０を組み込む。ＫＩの態様のために、トランスポザーゼの触媒ドメインは、切断およびライゲーション活性の両方を有することが好ましい。
【０１０７】
本発明のＺＦＰおよび認識コードを使用して、任意の生物（特に、植物）の遺伝子発現を調整することができる。ＺＦＰおよび構築物の植物への適用が特に好ましい。遺伝子が発現の調節に適切である領域中に適切な標的ヌクレオチド配列を含む場合、本発明の方法で使用した調節因子は、外因性ヌクレオチド配列を標的とすることができる。しかし、標的遺伝子が適切な固有のヌクレオチド配列を欠くか調節因子への結合が発現の調節に無効である位置のみにこのような配列を含む場合、「異種」標的ヌクレオチド配列を得る必要があり得る。「異種」標的ヌクレオチド配列は、標的とすべき遺伝子に対して完全に外来の配列または遺伝子自体に存在するが標的として挿入される位置とは異なる位置に存在する配列のいずれかを意味する。したがって、標的ヌクレオチド配列の性質および位置を完全に制御可能である。
【０１０８】
１つの態様では、本発明の亜鉛フィンガーポリペプチドを使用して、疾患関連遺伝子の発現を阻害する。好ましくは、亜鉛フィンガーポリペプチドは天然に存在するタンパク質ではないが、遺伝子発現を阻害するように特異的に設計する。亜鉛フィンガーポリペプチドを、表１に示すアミノ酸−塩基接触を使用して、疾患関連遺伝子の調節領域に結合するように設計することにより、転写因子のこれらの部位への結合および遺伝子転写の刺激を防止する。１つの例では、疾患関連遺伝子は、ＢＣＲ−ＡＢＬ融合癌遺伝子またはｒａｓ癌遺伝子などの癌遺伝子であり、亜鉛フィンガーポリペプチドをＤＮＡ配列ＧＣＡＧＡＡＧＣＣ（配列番号：２２）に結合するように設計し、これはＢＣＲ−ＡＢＬ融合癌遺伝子の発現を阻害することができる。
【０１０９】
関心対象の核酸配列を、本発明の亜鉛フィンガーポリペプチドを使用して、亜鉛フィンガーが結合する標的配列を含むポリヌクレオチドへの亜鉛フィンガーの結合によって改変することもできる。亜鉛フィンガーの標的ポリヌクレオチドへの結合を、種々の方法（ゲルシフトアッセイならびに標的配列への結合後に検出することができる放射性標識、蛍光、または酵素標識亜鉛フィンガーの使用が含まれる）で検出することができる。亜鉛フィンガーポリペプチドを、診断試薬として使用して、遺伝子配列の変異を検出するか、溶液から制限断片を精製するか、ゲルのＤＮＡ断片を視覚化することもできる。
【０１１０】
本明細書で使用される「エフェクター」または「エフェクタータンパク質」とは、活性化または抑制のいずれかによって遺伝子発現を調整することができるか、標的核酸に対する他の効果を発揮する構築物またはそれによってコードされる産物を指す。エフェクタータンパク質は、亜鉛フィンガー結合領域のみを含み得るが、より一般的には「調節ドメイン」などの「機能ドメイン」も含む。調節ドメインは、遺伝子発現を増強または抑制するエフェクタータンパク質またはエフェクターの一部であり（転写調節ドメインともいう）、これは、ヌクレアーゼ、リコンビナーゼ、インテグラーゼ、またはＺＦＰが結合するポリヌクレオチドに対する生物学的効果を有する他のタンパク質もしくは酵素であり得る。
【０１１１】
ＤＮＡ結合ドメイン（すなわち、ＺＦＰ）に束縛（例えば、融合）する場合、エフェクタードメインは、転写調節または調整活性、ＤＮＡ改変活性、タンパク質改変活性などの活性を有する。調節ドメインの例には、タンパク質またはタンパク質のエフェクタードメイン（例えば、転写因子）および補因子（例えば、ＫＲＡＢ、ＭＡＤ、ＥＲＤ、ＳＩＤ、核因子κＢサブユニットｐ６５、初期成長応答因子１、ならびに核ホルモン受容体ＶＰ１６、ＶＰ６４）、エンドヌクレアーゼ、インテグラーゼ、リコンビナーゼ、メチラーゼ、メチルトランスフェラーゼ、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ、ヒストンデアセチラーゼなどが含まれる。
【０１１２】
活性化因子および抑制因子には、同時活性化因子および同時抑制因子が含まれる（Ｕｔｌｅｙら、Ｎａｔｕｒｅ ３９４： ４９８−５０２ （１９９８）；国際公開公報第００／０３０２６号）。エフェクタードメインには、ＺＦＰではないタンパク質由来のＤＮＡ結合ドメイン（制限酵素など）、核ホルモン受容体、ホメオドメインタンパク質（波形縁またはアンテノペディア）、細菌ヘリックス−ターン−ヘリックスモチーフタンパク質（λ抑制因子およびｔｅｔ抑制因子など）、Ｇａｌ４、ＴＡＴＡ結合タンパク質、ヘリックス−ループ−ヘリックスモチーフタンパク質（ｍｙｃおよびｍｙｏＤ）、ロイシンジッパータンパク質（ｆｏｓおよびｊｕｎなど）、βシートモチーフタンパク質（ｍｅｔ、ａｒｃ、およびｍｎｔ抑制因子など）を含み得るが、これらに限定されない。トウモロコシのＣ１活性化因子ドメインが特に好ましい。
【０１１３】
同様に、エフェクタードメインには、トランスポザーゼ、インテグラーゼ、リコンビナーゼ、レソルバーゼ、インベルターゼ、プロテアーゼ、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ、ＤＮＡデメチラーゼ、ヒストンアセチラーゼ、ヒストンデアセチラーゼ、ヌクレアーゼ、転写抑制因子、転写活性化因子、一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質、核局在化シグナル、転写因子漸増タンパク質、または細胞取り込みシグナルを含み得るが、これらに限定されない。エフェクタードメインは、トランスポザーゼ活性、インテグラーゼ活性、リコンビナーゼ活性、レソルバーゼ活性、インベルターゼ活性、プロテアーゼ活性、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ活性、ＤＮＡデメチラーゼ活性、ヒストンアセチラーゼ活性、ヒストンデアセチラーゼ活性、ヌクレアーゼ活性、核局在化活性、転写タンパク質漸増活性、転写抑制因子活性、または転写活性化因子活性を示すタンパク質ドメインをさらに含む。
【０１１４】
好ましい態様では、エフェクタードメインを有するＺＦＰは、リガンドに応答性のＺＦＰである。エフェクタードメインは、このような応答に影響を与え得る。このようなリガンド応答ドメインの例は、ホルモン受容体リガンド結合ドメインであり、例えば、エストロゲン受容体ドメイン、エクジソン受容体系、糖質コルチコステロイド受容体などが含まれる。好ましいインデューサーは、小型の無機生分解性分子である。ＺＦＰエフェクター融合を誘導可能なリガンドの使用は、一般に遺伝子スイッチとして既知である。
【０１１５】
ＺＦＰを、１つまたは複数の調節ドメイン、あるいは２つ以上の調節ドメインと共有結合または非共有結合することができ、２つ以上のドメインは同一のドメインまたは異なるドメインの２つのコピーである。調節ドメインを、融合タンパク質の一部として例えばアミノ酸リンカーを介してＺＦＰ核酸結合ドメインに共有結合することができる。ＺＦＰを、非共有結合二量体化ドメイン（例えば、ロイシンジッパー、ＳＴＡＴタンパク質Ｎ末端ドメイン、またはＦＫ５０６結合タンパク質）を介して調節ドメインに結合することができる（例えば、Ｏ’Ｓｈｅａ、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５４： ５３９ （１９９１）、Ｂａｒａｈｍａｎｄ−Ｐｏｕｒら、Ｃｕｒｒ． Ｔｏｐ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２１１： １２１−１２８ （１９９６）；Ｋｌｅｍｍら、Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １６： ５６９−５９２ （１９９８）；Ｋｌｅｍｍら、Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １６： ５６９−５９２ （１９９８）；Ｈｏら、Ｎａｔｕｒｅ ３８２： ８２２−８２６ （１９９６）；およびＰｏｍｅｒａｎｚら、Ｂｉｏｃｈｅｍ． ３７： ９６５ （１９９８）を参照のこと）。調節ドメインを、ＺＦＰのＣ末端またはＮ末端を含む任意の適切な位置でＺＦＰドメインに結合することができる。
【０１１６】
本発明の方法を使用して作製したＺＦＰへの添加のための一般的調節ドメインには、例えば、転写因子由来のＤＮＡ結合ドメイン、転写因子由来のエフェクタードメイン（活性化因子、抑制因子、同時活性化因子、同時抑制因子）、サイレンサー、核ホルモン受容体、およびクロマチン関連タンパク質、および変更因子（例えば、メチラーゼ、キナーゼ、アセチラーゼ、およびデアセチラーゼ）が含まれる。
【０１１７】
調節ドメインを得ることができる転写因子ポリペプチドには、転写の調節および基本的転写に関連するものが含まれる。このようなポリペプチドには、転写因子、そのエフェクタードメイン、同時活性化因子、サイレンサー、核ホルモン受容体が含まれる（例えば、転写に関連するタンパク質および核酸エレメントの概説については、Ｇｏｏｄｒｉｃｈら、Ｃｅｌｌ ８４： ８２５−３０ （１９９６）を参照のこと；転写因子は、一般に、ＢａｍｅｓおよびＡｄｃｏｃｋ、Ｃｌｉｎ． Ｅｘｐ．Ａｌｌｅｒｇｙ ２５、別冊２： ４６−９（１９９５）およびＲｏｅｄｅｒ、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．、２７３： １６５−７１ （１９９６）で概説されている）。転写因子を示すデータベースもまた既知である（例えば、Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２６９： ６３０ （１９９５）を参照のこと）。核ホルモン受容体転写因子は、例えば、Ｒｏｓｅｎら、Ｊ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． ３８： ４８５５−７４ （１９９５）に記載されている。転写因子のＣ／ＥＢＰファミリーは、ウェーデル（Ｗｅｄｅｌ）ら、Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ １９３： １７１−８５ （１９９５）に概説されている。核ホルモン受容体によって転写調節を媒介する同時活性化因子および同時抑制因子は、例えば、マイヤー（Ｍｅｉｅｒ）、Ｅｕｒ． Ｊ． Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ． １３４ （２）： １５８−９ （１９９６）；カイサー（Ｋａｉｓｅｒ）ら、Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｓｃｉ． ２１： ３４２−５ （１９９６）；およびウトレイ（Ｕｔｌｅｙ）ら、Ｎａｔｕｒｅ ３９４： ４９８−５０２ （１９９８）に概説されている。造血調節に関連するＧＡＴＡ転写因子は、例えば、サイモン（Ｓｉｍｏｎ）、Ｎａｔ． Ｇｅｎｅｔ． １１： ９−１１（１９９５）；ワイス（Ｗｅｉｓｓ）ら、Ｅｘｐ． Ｈｅｍａｔｏｌ． ２３： ９９−１０７に記載されている。ＴＡＴＡボックス結合タンパク質（Ｔ１３Ｐ）およびその関連するＴＡＦポリペプチド（ＴＡＦ３０、ＴＡＦ５５、ＴＡＦ８０、ＴＡＦ１１０、ＴＡＦＩ５０、およびＴＡＦ２５０を含む）は、グッドリッチおよびティジャン（ＧｏｏｄｒｉｃｈおよびＴｊｉａｎ）、Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． ６： ４０３−９ （１９９４）およびハーレイ（Ｈｕｒｌｅｙ）、Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｓｔｒｕｃｔ． Ｂｉｏｌ． ６： ６９−７５ （１９９６）に記載されている。転写因子のＳＴＡＴファミリーは、例えば、バラフマンド−ポー（Ｂａｒａｈｍａｎｄ−Ｐｏｕｒ）ら、Ｃｕｒｒ． Ｔｏｐ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２１１： １２１−８ （１９９６）に概説されている。疾患に関連する転写因子は、アソ（Ａｓｏ）ら、Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． ９７： １５６１−９ （１９９６）に概説されている。
【０１１８】
１つの態様では、ヒトＫＯＸ−Ｉタンパク質由来のＫＲＡＢ抑制ドメインを、転写抑制因子として使用する（Ｔｈｉｅｓｅｎら、Ｎｅｗ Ｂｉｏｌｏｇｉｓｔ ２： ３６３−３７４ （１９９０）；Ｍａｒｇｏｌｉｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、９１： ４５０９−４５１３ （１９９４）；Ｐｅｎｇｕｅら、Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２２： ２９０８−２９１４ （１９９４）；Ｗｉｔｚｇａｌｌら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、９１： ４５１４−４５１８ （１９９４））。別の態様では、ＫＲＡＢと共に、ＫＲＡＢ同時抑制因子であるＫＡＰ−１を使用する（Ｆｒｉｅｄｍａｎら、Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ． １０： ２０６７−２０７８ （１９９６））。あるいは、ＫＡＰ−Ｉを、ＺＦＰと共に使用することができる。転写抑制因子として作用する他の好ましい転写因子および転写因子ドメインには、ＭＡＤ（例えば、Ｓｏｍｍｅｒら、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７３： ６６３２−６６４２ （１９９８）；Ｇｕｐｔａら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ １６： １１４９−１１５９ （１９９８）；Ｑｕｅｖａら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ １６： ９６７−９７７ （１９９８）；Ｌａｒｓｓｏｎら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ： ７３７−７４８ （１９９７）；Ｌａｈｅｒｔｙら、Ｃｅｌｌ ８９： ３４９−３５６ （１９９７）；を参照のこと）；およびＣｕｌｔｒａｒｏら、Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． １７： ２３５３−２３５９ （１９９７７）；ＦＫＨＲ（縫線肉腫遺伝子中のフォークヘッド；Ｇｉｎｓｂｅｒｇら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． １５： ３５４２−３５４６ （１９９８）；Ｅｐｓｔｅｉｎら、Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． １８： ４１１８−４１３０ （１９９８））；ＥＧＲ−Ｉ（初期成長応答遺伝子産物−１；Ｙａｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、９５： ８２９８−８３０３ （１９９８）；およびＬｉｕら、Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． ５： ３−２８ （１９９８））；ｅｔｓ２抑制因子因子抑制因子ドメイン（ＥＲＤ；Ｓｇｏｕｒａｓら、ＥＭ８０ Ｊ １４： ４７８１−４７９３ （１９０９５））およびＭＡＤ ｓｍＳＩＮ３相互作用ドメイン（ＳＩＤ；Ａｙｅｒら、Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． １６： ５７７２−５７８１ （１９９６））が含まれる。
【０１１９】
１つの態様では、ＨＳＶ ＶＰ １６活性化ドメインを、転写活性化因子として使用する（例えば、Ｈａｇｍａｎｎら、Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７１：５９５２−５９６２ （１９９７）を参照のこと）。活性化ドメインを供給することができる他の好ましい転写因子には、ＶＰ６４活性化ドメイン（Ｓｅｌｐｅｌら、ＥＭＢＯ Ｊ． １１： ４９６１−４９６８ （１９９６））；核ホルモン受容体（例えば、Ｔｏｒｃｈｉａら、Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． １０： ３７３−３８３ （１９９８）を参照のこと）；核因子κＢのｐ６５サブユニット（ＢｉｔｋｏおよびＢａｒｉｋ、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ． ７２： ５６１０−５６１８ （１９９８）ならびにＤｏｙｌｅおよびＨｕｎｔ、Ｎｅｕｒｏｒｅｐｏｒｔ ８： ２９３７−２９４２ （１９９７））；ならびにＥＧＲ−Ｉ（初期成長応答遺伝子産物−１；Ｙａｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、９５： ８２９８−８３０３ （１９９８）；およびＬｉｕら、Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． ５： ３−２８ （１９９８）））が含まれる。
【０１２０】
キナーゼ、ホスファターゼ、および遺伝子調節に関連するポリペプチドを改変する他のタンパク質はまた、ＺＦＰの調節ドメインとして有用である。このような改変因子は、例えばホルモンによって媒介される転写のスイッチオンまたはオフにしばしば関連する。転写調節に関連するキナーゼは、デイビス（Ｄａｖｉｓ）、Ｍｏｌ． Ｒｅｐｒｏｄ． Ｄｅｖ． ４２： ４５９−６７ （１９９５）、ジャクソン（Ｊａｃｋｓｏｎ）ら、Ａｄｖ． Ｓｅｃｏｎｄ Ｍｅｓｓｅｎｇｅｒ Ｐｈｏｓｐｈｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓ． ２８： ２７９−８６ （１９９３）、およびボウリカス（Ｂｏｕｌｉｋａｓ）、Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｅｕｋａｙｏｔ． Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒ． ５： １−７７ （１９９５）において示されており、ホスファターゼは、例えば、ションタールおよびセミン（ＳｃｈｏｎｔｈａｌおよびＳｅｍｉｎ）、Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｌ． ６： ２３９−４８ （１９９５）において示されている。核チロシンキナーゼは、ワン（Ｗａｎｇ）、Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｓｃｉ． １９： ３７３−６ （１９９４）に記載されている。
【０１２１】
記載したように、有用なドメインを、癌遺伝子（例えば、ｍｙｃ、ｊｕｎ、ｆｏｓ、ｍｙｂ、ｍａｘ、ｍａｄ、ｒｅｌ、ｅｔｓ、ｂｃｌ、ｍｙｂ、ｍｏｓファミリーメンバー）ならびにその関連因子および改変因子から得ることもできる。癌遺伝子は、例えば、クーパー（Ｃｏｏｐｅｒ）、「癌遺伝子（ｏｎｃｏｇｅｎｅ）」、第２版、Ｔｈｅ ＪｏｎｅｓおよびＢａｒｔｌｅｔｔ Ｓｅｒｉｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｂｏｓｔｏｎ， ＭＡ， ＪｏｎｅｓおよびＢａｒｔｌｅｔｔ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、１９９５に記載されている。ｅｔｓ転写因子は、ワスリルク（Ｗａｓｌｙｌｋ）ら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２１１： ７−１８ （１９９３）において示されている。Ｍｙｃ癌遺伝子は、ライアン（Ｒｙａｎ）ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｊ． ３１４： ７１３−２１ （１９９６）において示されている。Ｊｕｎおよびｆｏｓ転写因子は、例えば、「転写因子のＦｏｓおよびＪｕｎファミリー（Ｔｈｅ ＦｏｓおよびＪｕｎ Ｆａｍｉｌｉｅｓ ｏｆ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒｓ）」、エンジェルおよびハーリック（ＡｎｇｅｌおよびＨｅｒｒｌｉｃｈ編） （１９９４）に記載されている。ｍａｘ癌遺伝子は、ハーリン（Ｈｕｒｌｉｎ）ら、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ． Ｓｙｍｐ． Ｑｕａｎｔ． Ｂｉｏｌ． ５９： １０９−１６に概説されている。ｍｙｂ遺伝子ファミリーは、カネイ−イシイ（Ｋａｎｅｉ−Ｉｓｈｉｉ）ら、Ｃｕｒｒ． Ｔｏｐ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２１１： ８９−９８ （１９９６）において示されている。ｍｏｓファミリーは、ユウ（Ｙｅｗ）ら、Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｇｅｎｅｔ． Ｄｅｖ． ３： １９−２５ （１９９３）において示されている。
【０１２２】
別の態様では、ヒストンアセチルトランスフェラーゼを、転写活性化因子として使用する（例えば、ＪｉｎおよびＳｃｏｔｔｏ、Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． １８： ４３７７−４３８４ （１９９８）；Ｗｏｌｆｆｌｅ、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７２： ３７１−３７２ （１９９６）；Ｔａｕｎｔｏｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７２： ４０８−４１１ （１９９６）；およびＨａｓｓｉｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ． ９５： ３５１９−３５２４ （１９９８）を参照のこと）。別の態様では、ヒストンアセチラーゼを、転写抑制因子として使用する（例えば、ＪｉｎおよびＳｃｏｔｔｏ、Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． １８： ４３７７−４３８４ （１９９８）；ＳｙｎｔｉｃｈａｋｉおよびＴｈｉｒｅｏｓ、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７３： ２４４１４−２４４１９ （１９９８）；Ｓａｋａｇｕｃｈｉら、Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ． １２： ２８３１−２８４１ （１９９８）；およびＭａｒｔｉｎｅｚら、Ｊ．Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７３： ２３７８１−２３７８５ （１９９８）を参照のこと）。
【０１２３】
調節ドメインに加えて、ＺＦＰは、精製、発現のモニタリング、または細胞および細胞内局在化のモニタリングの簡素化のための融合タンパク質（マルトース結合タンパク質（「ＭＢＰ」）、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、ヘキサヒスチジン、ｃ−ｍｙｃ、およびＦＬＡＧエピトープなど）として発現される。
【０１２４】
ＺＦＰをコードする核酸配列を、コドン優先度の使用によって植物中でのＺＦＰの発現を改良するように改変することができる。核酸を調製するか合成によって変化する場合、核酸が発現される意図する植物宿主の既知のコドン優先度を活用することができる。例えば、本発明の核酸配列が単子葉植物種および双子葉植物種の両方で発現することができるにもかかわらず、優先度が異なることが示されているので、単子葉植物または双子葉植物の特異的コドン優先度およびＧＣ含量の優先度を明らかにするように配列を改変することができる（Ｍｕｒｒａｙら、Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １７：４７７−４９８ （１９８９））。したがって、特定のアミノ酸のトウモロコシの好ましいコドンは、トウモロコシからの既知の遺伝子配列由来であり得る。トウモロコシ植物からの２８個の遺伝子のトウモロコシコドン使用頻度は、ミューレイ（Ｍｕｒｒａｙ）ら、前記の表４に列挙されている。
【０１２５】
標的配列は、相補的ＺＦＰが設計された関心対象の任意の所与の配列であり得る。標的遺伝子は、標的制御活性またはエフェクター活性が調節制御を介して直接または間接的のいずれかで得られるように、構造および調節遺伝子の両方が含まれる。したがって、１つの遺伝子または遺伝子ファミリーを制御することができる。
【０１２６】
標的遺伝子は、トウモロコシＭＩＰＳ遺伝子およびＡＰ３遺伝子と同様に、発現が調節されている植物細胞または植物に対して内因性であるか、所望のタンパク質の産生系を得るために細胞または植物に挿入されているか、植物または植物細胞の代謝を調整するために遺伝子相補物に添加している導入遺伝子であり得る。
【０１２７】
いくつかの例で、例えば、代謝経路を示す導入遺伝子ファミリーで植物細胞または植物を改変することが望ましい。これらの例では、例えば、エフェクタータンパク質のＺＦＰ部分に類似または同一の標的を使用してファミリーメンバーの制御領域を設計することによってファミリー全体を調節することができるように構築物を設計することが望ましい。このような遺伝子ファミリー内の標的遺伝子の共有は、内因的に産生された代謝配列において自然に起こり得る。
【０１２８】
ほとんどの例では、植物の所望の部分中の所望の遺伝子が選択的に調節することができるように調節配列を含むエフェクタータンパク質の発現系を得ることが望ましい。例えば、ＭＩＰＳ発現を抑制するために、種子中で選択的に有効な調節配列を有するエフェクタータンパク質を得ることが望ましい。ＡＰ３遺伝子に関しては、配列調節用のエフェクタータンパク質を、植物の開花部分で選択的に発現するように設計する。しかし、いくつかの場合、例えば、昆虫耐性遺伝子が標的である場合、全ての組織中で発現可能な遺伝子調節を有することが好ましい。このような場合、同様に、インデューサーが必要時のみに昆虫耐性遺伝子の活性化を植物に供給することができるように誘導プロモーターの調節下でエフェクタータンパク質の発現系を置くことが望ましい。
【０１２９】
１つの態様では、ＺＦＰを使用して、標的遺伝子発現の抑制または活性化によって宿主細胞または植物中に「遺伝子ノックアウト」および「機能亢進」を得ることができる。抑制または活性化は、構造遺伝子（例えば酵素活性を有するタンパク質をコードする遺伝子）または調節遺伝子（言い換えれば、構造遺伝子の発現を調節するタンパク質をコードする遺伝子）に由来し得る。負の調節タンパク質の発現により、その調節下で１つまたは複数の遺伝子の機能的遺伝子のノックアウトを得ることができる。逆に、負の調節ドメインを有する亜鉛フィンガーは、正の調節タンパク質の調節下で１つまたは複数の遺伝子発現をノックアウトするか防止するように正の調節タンパク質を抑制することができる。
【０１３０】
本発明のＺＦＰおよび本発明の融合タンパク質（特に、遺伝子発現の調整に有用なもの）を、機能的ゲノミクスへの適用および標的確認への適用に使用することができる（Ｃａｓｅら、国際公開公報第０１／１９９８１号に記載の適用など）。
【０１３１】
本発明はまた、本発明のＺＦＰコード核酸を含む組換え発現カセットを提供する。本発明の所望のポリヌクレオチドをコードする核酸配列を使用して、所望の宿主細胞に導入することができる組換え発現カセットを構築することができる。組換え発現カセットは、典型的には、意図する宿主細胞（形質転換植物組織など）中でポリヌクレオチドの転写を指示する転写開始調節配列に作動可能に連結された本発明のポリヌクレオチドを含む。
【０１３２】
例えば、植物発現ベクターは、（１）５’調節配列および３’調節配列の転写調節下でクローン化された植物遺伝子ならびに（２）優性選択マーカーを含み得る。このような植物発現ベクターはまた、所望する場合、プロモーター調節領域（例えば、誘導もしくは構成性発現、環境的もしくは発達的に調節された発現、または細胞もしくは組織特異的／選択的発現を付与する領域）、転写開始部位、リボソーム結合部位、ＲＮＡプロセシングシグナル、転写終結部位、および／またはポリアデニル化シグナルを含み得る。
【０１３３】
再生植物の全ての組織中で本発明のポリヌクレオチドの発現を指示する植物プロモーター断片を使用することができる。このようなプロモーターを、本明細書で「構成性」プロモーターといい、ほとんどの環境条件下および発達または細胞分化状態で活性である。構成性プロモーターの例には、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）３５Ｓ転写開始領域、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）のＴ−ＤＮＡ由来のＰプロモーターまたは２’プロモーター、ユビキチンＩプロモーター、Ｓｍａｓプロモーター、シンナミルアルコールデヒドロゲナーゼプロモーター（米国特許第５，６８３，４３９号）、Ｎｏｓプロモーター、ｐＥｍｕプロモーター、ｒｕｂｉｓｃｏプロモーター、ＧＲＰ１−８プロモーター、および当業者に既知の種々の植物遺伝子由来の他の転写開始領域が含まれる。
【０１３４】
あるいは、植物プロモーターは、特異的組織中で本発明のポリヌクレオチド発現を指示することができ、そうでなければより正確な環境または発達制御下に置かれ得る。このようなプロモーターを、本明細書では「誘導可能」プロモーターという。誘導可能プロモーターによって転写が影響を受け得る環境条件には、病原体の攻撃、嫌気性条件、または光の存在が含まれる。誘導可能プロモーターの例には、低酸素または冷ストレスによって誘導可能なＡｄｈＩプロモーター、熱ショックで誘導可能なＨｓｐ７０プロモーター、および光によって誘導可能なＰＰＤＫプロモーターが含まれる。環境調節下でのプロモーターの例には、一定の組織（葉、根、果実、種子、または花など）中で転写のみを開始するプロモーターが含まれる。プロモーターの例は、葯特異的プロモーター５１２６（米国特許第５，６８９，０４９号、第５，６８９，０５１号）である。プロモーターの操作はまた、そのゲノム中での位置に依存して変化し得る。したがって、誘導性プロモーターは、一定の位置で全部または一部が構成性となり得る。
【０１３５】
異種および非異種（すなわち、内因性）のプロモーターの両方を使用して、本発明の核酸発現を指示することができる。これらのプロモーターを、例えば、組換え発現カセットと組み合わせて使用して、所望の組織中で本発明のタンパク質の濃度および／または組成を減少、増加、または変化させるようにアンチセンス核酸の発現を駆動することもできる。したがって、いくつかの態様では、核酸構築物は、本発明のポリヌクレオチドの作動可能に連結された植物細胞（Ｚｅａ ｍａｙｓなど）中で機能的なプロモーターを含む。これらの態様で有用なプロモーターには、本発明のポリペプチド発現を駆動する内因性プロモーターが含まれる。
【０１３６】
いくつかの態様では、プロモーターまたはエンハンサーエレメントとして作用する単離核酸を、ポリヌクレオチドの非異種形態の適切な位置（一般に、上流）に導入して、その発現を上方制御または下方制御することができる。例えば、内因性プロモーターを、変異、欠失、および／または置換によってインビボで変化させることができるか（米国特許第５，５６５，３５０号；ＰＣＴ／ＵＳ９３／０３８６８）、単離プロモーターを本発明の遺伝子から適切な方向および距離で植物細胞に導入して、遺伝子発現を制御することができる。遺伝子発現を植物の生長に適切な条件下で調整して、植物細胞中の本発明のポリペプチドの全濃度および／または組成を変化させることができる。
【０１３７】
種々のプロモーターは、本発明で、特にＺＦＰおよびＺＦＰエフェクター融合物の発現の制御に有用であり、その選択は、存在するならば植物細胞中での所望のタンパク質発現レベルおよび所望の組織特異的、一過性特異的、または環境特異的調節に一部依存する。構成性および組織特異的プロモーターが特に興味深い。このような構成性プロモーターには、例えば、Ｒｓｙｎ７のコアプロモーター、コアＣａＭＶ３５Ｓプロモーター（Ｏｄｅｌｌら（１９８５） Ｎａｔｕｒｅ ３１３： ８１０−８１２）、イネアクチン（ＭｃＥｌｒｏｙら （１９９０） ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ２： １６３−１７１）；ユビキチン（Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎら （１９８９） ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １２： ６１９−６３２およびＣｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎら （１９９２） ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １８： ６７５−６８９）、ｐＥＭＵ（Ｌａｓｔら（１９９１） Ｔｈｅｏｒ． Ａｐｐｌ． Ｇｅｎｅｔ． ８１： ５８１−５８８）、ＭＡＳ（Ｖｅｌｔｅｎｅｔら（１９８４） ＥＭＢＯ Ｊ． ３： ２７２３−２７３０）、および、例えば、米国特許第５，６０８，１４９号、同第５，６０８，１４４号、同第５，６０４，１２１号、同第５，５６９，５９７号、同第５，４６６，７８５号、同第５，３９９，６８０号、同第５，２６８，４６３号、および同第５，６０８，１４２号に記載の構成性プロモーターが含まれる。
【０１３８】
組織特異的プロモーターを利用して、特定の植物組織内での発現の増強を標的とすることができる。組織特異的プロモーターには、ヤマモト（Ｙａｍａｍｏｔｏ）ら（１９９７） Ｐｌａｎｔ Ｊ． １２（２）２５５−２６５、カワマタ（Ｋａｗａｍａｔａ）ら（１９９７） Ｐｌａｎｔ ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ． ３８（７）： ７９２−８０３、ハンセン（Ｈａｎｓｅｎ）ら（１９９７） Ｍｏｌ． Ｇｅｎ． Ｇｅｎｅｔ． ２５４（３）： ３３７、ラッセル（Ｒｕｓｓｅｌｌ）ら（１９９７） Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｒｅｓ． ６（２）： １５７−１６８、ラインハルト（Ｒｉｎｅｈａｒｔ）ら（１９９６） Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ． １１２（３）： １３３１、バン・カンプ（Ｖａｎ Ｃａｍｐ）ら（１９９６） Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ． １１２（２）： ５２５−５３５、カネバシニ（Ｃａｎｅｖａｓｃｉｎｉ）ら（１９９６） Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ． １１２（２）： ５１３−５２４、ヤマモト（Ｙａｍａｍｏｔｏ）ら（１９９４） Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ． ３５（５）： ７７３−７７８、ラム（Ｌａｍ）（１９９４）Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｐｒｏｂｌ．Ｃｅｌｌ Ｄｉｆｆｅｒ． ２０： １８１−１９６、オロスコ（Ｏｒｏｚｃｏ）ら（１９９３） ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２３（６）： １１２９−１１３８、マツオカ（Ｍａｔｓｕｏｋａ）ら（１９９３） Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０（２０）： ９５８６−９５９０、およびグエバラ−ガルシア（Ｇｕｅｖａｒａ−Ｇａｒｃｉａ）ら（１９９３） Ｐｌａｎｔ Ｊ．４（３）： ４９５−５０５に記載のものが含まれる。必要ならば、このようなプロモーターを発現を弱めるように改変することができる。
【０１３９】
葉特異的プロモーターは当技術分野において既知であり、例えば、ヤマモト（Ｙａｍａｍｏｔｏ）ら（１９９７） Ｐｌａｎｔ Ｊ． １２（２）： ２５５−２６５、クウォン（Ｋｗｏｎ）ら（１９９４） Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ． １０５： ３５７−６７、ヤマモト（Ｙａｍａｍｏｔｏ）ら（１９９４） Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ． ３５（５）： ７７３−７７８、ゴトール（Ｇｏｔｏｒ）ら（１９９３） Ｐｌａｎｔ Ｊ． ３： ５０９−１８、オロスコ（Ｏｒｏｚｃｏ）ら（１９９３） Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２３（６）： １１２９−１１３８、およびマツオカ（Ｍａｔｓｕｏｋａ）ら（１９９３） Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０（２０）： ９５８６−９５９０に記載のものが含まれる。
【０１４０】
構成性または誘導性および非組織特異的または組織特異的の任意の組み合わせを使用して、ＺＦＰ発現を制御することができる。所望の制御は、適切なプロモーターを使用して一過性、発達、または環境的に制御することができる。環境制御されたプロモーターは、病原体、病原体毒素、または他の外来化合物（例えば、意図的に適用された小分子インデューサー）によって攻撃に応答するプロモーターである。一過性または発達プロモーターの例は、果実成熟依存性プロモーターである。誘導性ＰＲ１プロモーター、トウモロコシユビキチンプロモーター、およびＯＲＳが特に好ましい。
【０１４１】
したがって、本発明は、本発明のＺＦＰおよびＺＦＰエフェクター融合をコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結された異種プロモーターおよび／またはエンハンサーの組成物および作製法を提供する。
【０１４２】
例えば、組織型、細胞型、発達段階、および／または環境条件に関して特定の発現パターンを有するプロモーターを同定する方法は、当技術分野において既知である。例えば、「トウモロコシハンドブック（Ｔｈｅ Ｍａｉｚｅ Ｈａｎｄｂｏｏｋ）」、第１１４章〜第１１５章、フリーリングおよびワルボット（ＦｒｅｅｌｉｎｇおよびＷａｌｂｏｔ）編、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （１９９４）；「トウモロコシおよびトウモロコシの改良（ＣｏｒｎおよびＣｏｒｎ Ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ）」、Ｐｅｄｉｔｉｏｎ，第６章、シュプラーグおよびダドレー（ＳｐｒａｇｕｅおよびＤｕｄｌｅｙ）編、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ａｇｒｏｎｏｍｙ， Ｍａｄｉｓｏｎ， Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ（１９８８）を参照のこと。
【０１４３】
特定の環境条件もしくはストレス下、特異的組織中、または特定の発達段階で発現したプロモーターの単離方法では、所望の環境下、所望の組織中、または所望の段階で発現した多数の遺伝子を同定する。さらなる分析により、植物の１つまたは複数の他の組織中での各特定の遺伝子の発現が明らかとなる。所望の組織中または条件で活性を有するが、他のいかなる共通の組織で活性を示さないプロモーターを同定することができる。このような遺伝子は、本発明の方法による調節のための良好な候補であり得る。
【０１４４】
植物では、ＴＡＴＡボックスからさらに上流（−８０位〜−１００位）で、典型的には、トリヌクレオチドＧ（またはＴ）ＮＧを取り囲む一連のアデニンを有するプロモーターエレメント（すなわち、ＣＡＡＴボックス）が存在する。メッシング（Ｍｅｓｓｉｎｇ）ら、「植物の遺伝子操作（Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｉｎ Ｐｌａｎｔｓ）」、コセイジ、メレディス、およびホーレンダー（Ｋｏｓａｇｅ， ＭｅｒｅｄｉｔｈおよびＨｏｌｌａｅｎｄｅｒ）編、２２１−２２７、１９８３。トウモロコシでは、十分に保存されたＣＡＡＴボックスは存在しないが、ＴＡＴＡボックスの上流にいくつかの短い保存タンパク質結合モチーフが存在する。これらには、各遺伝子に適切なように、光調節、嫌気性誘導、ホルモン調節、またはアントシアニン生合成に関連するトランス活性化転写因子のモチーフが含まれる。
【０１４５】
植物形質転換プロトコールならびにヌクレオチド配列の植物の導入プロトコールは、形質転換のために標的化した植物または植物細胞（すなわち、単子葉植物または双子葉植物）に依存して変化し得る。ヌクレオチド配列の植物細胞への適切な導入およびその後の挿入法には、微量注入（Ｃｒｏｓｓｗａｙら（１９８６） Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ４： ３２０−３３４）、エレクトロポレーション（Ｒｉｇｇｓら（１９８６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８３： ５６０２−５６０６）、アグロバクテリウム媒介性形質転換（Ｔｏｗｎｓｅｎｄらに付与された米国特許第５，５６３，０５５号）、直接遺伝子トランスファー（Ｐａｓｚｋｏｗｓｋｉら（１９８４） ＥＭＢＯ Ｊ． ３： ２７１７−２７２２）、および衝撃粒子加速（例えば、Ｓａｎｆｏｒｄらに付与された米国特許第４，９４５，０５０号；Ｔｏｍｅｓら（１９９５）、「植物細胞、組織、および器官培養：基本的方法（Ｐｌａｎｔ ｃｅｌｌ， Ｔｉｓｓｕｅ， ａｎｄ Ｏｒｇａｎ Ｃｕｌｔｕｒｅ： Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ）」における「微粒子銃による無傷の植物細胞への直接ＤＮＡトランスファー（Ｄｉｒｅｃｔ ＤＮＡ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ｉｎｔｏ Ｉｎｔａｃｔ Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌｓ ｖｉａ Ｍｉｃｒｏｐｒｏｊｅｃｔｉｌｅ Ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ）」、ＧａｍｂｏｒｇおよびＰｈｉｌｌｉｐｓ編（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ， Ｂｅｒｌｉｎ）；およびＭｃＣａｂｅら（１９８８）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６： ９２３−９２６を参照のこと）が含まれる。ウェイシンガー（Ｗｅｉｓｓｉｎｇｅｒ）ら（１９８８） Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｇｅｎｅｔ． ２２： ４２１−４７７；サンフォード（Ｓａｎｆｏｒｄ）ら（１９８７） Ｐａｒｔｉｃｕｌａｔｅ ＳｃｉｅｎｃｅおよびＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ５： ２７−３７（タマネギ）；キリストウ（Ｃｈｒｉｓｔｏｕ）ら（１９８８） Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ． ８７： ６７１−６７４（ダイズ）；マクケイブ（ＭｃＣａｂｅ）ら（１９８８）ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６： ９２３−９２６（ダイズ）；ファイナーおよびマクマレン（ＦｉｎｅｒおよびＭｃＭｕｌｌｅｎ）（１９９１） Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｃｅｌｌ Ｄｅｖ． Ｂｉｏｌ． ２７Ｐ： １７５−１８２（ダイズ）；シン（Ｓｉｎｇｈ）ら（１９９８） Ｔｈｅｏｒ． Ａｐｐｌ． Ｇｅｎｅｔ． ９６： ３１９−３２４（ダイズ）；ダッタ（Ｄａｔｔａ）ら（１９９０） Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ８： ７３６−７４０（イネ）；クライン（Ｋｌｅｉｎ）ら（１９８８） Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５： ４３０５−４３０９（トウモロコシ）；クライン（Ｋｌｅｉｎ）ら（１９８８） Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６： ５５９−５６３（トウモロコシ）；トムズ（Ｔｏｍｅｓ）らに付与された米国特許第５，２４０，８５５号；ブイシング（Ｂｕｉｓｉｎｇ）らに付与された米国特許第５，３２２，７８３号および同第５，３２４，６４６号；トムズ（Ｔｏｍｅｓ）ら（１９９５）、「植物細胞、組織、および器官培養：基本的方法（Ｐｌａｎｔ ｃｅｌｌ， Ｔｉｓｓｕｅ， ａｎｄ Ｏｒｇａｎ Ｃｕｌｔｕｒｅ： Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ）」における「微粒子銃によ���無傷の植物細胞への直接ＤＮＡトランスファー（Ｄｉｒｅｃｔ ＤＮＡ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ｉｎｔｏ Ｉｎｔａｃｔ Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌｓ ｖｉａ Ｍｉｃｒｏｐｒｏｊｅｃｔｉｌｅ Ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ）」、ガムボルグ（Ｇａｍｂｏｒｇ）編（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ， Ｂｅｒｌｉｎ）（トウモロコシ）；クライン（Ｋｌｅｉｎ）ら（１９８８） Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ． ９１： ４４０−４４４（トウモロコシ）；フロム（Ｆｒｏｍｍ）ら（１９９０） Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ８： ８３３−８３９（トウモロコシ）；ホーイカース−バンスログテレン（Ｈｏｏｙｋａｓｓ−Ｖａｎ Ｓｌｏｇｔｅｒｅｎ）ら（１９８４） Ｎａｔｕｒｅ （Ｌｏｎｄｏｎ） ３１１： ７６３−７６４；ボーウェン（Ｂｏｗｅｎ）らに付与された米国特許第５，７３６，３６９号（穀類）；バイテビアー（Ｂｙｔｅｂｉｅｒ）ら（１９８７） Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４： ５３４５−５３４９（ユリ）；ド・ウェット（Ｄｅ Ｗｅｔ）ら（１９８５） 「胚珠組織の実験操作（Ｔｈｅ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｍａｎｉｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｏｖｕｌｅ Ｔｉｓｓｕｅｓ）」内、チャプマン（Ｃｈａｐｍａｎ）ら編（Ｌｏｎｇｍａｎ、Ｎｅｙ Ｙｏｒｋ）、ｐｐ．１９７−２０９（花粉）；ケプラー（Ｋａｅｐｐｌｅｒ）ら（１９９０） Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ ９： ４１５−４１８およびケプラー（Ｋａｅｐｐｌｅｒ）ら（１９９２） Ｔｈｅｏｒ． Ａｐｐｌ． Ｇｅｎｅｔ． ８４： ５６０−５６６（ウィスカー媒介形質転換）；ディー・ハルイン（Ｄ’Ｈａｌｌｕｉｎ）ら（１９９２） Ｐｌａｎｔ ｃｅｌｌ ４： １４９５−１５０５（エレクトロポレーション）；リ（Ｌｉ）ら（１９９３） Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ １２： ２５０−２５５およびクリストウおよびフォード（ＣｈｒｉｓｔｏｕおよびＦｏｒｄ）（１９９５） Ａｎｎａｌｓ ｏｆ Ｂｏｔａｎｙ ７５： ４０７−４１３（イネ）；オスジョダ（Ｏｓｊｏｄａ）ら（１９９６） Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １４： ７４５−７５０（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓを介したトウモロコシ）（これらの全てが参照として本明細書に組み入れられる）もまた参照のこと。
【０１４６】
最適なエフェクタードメインを有するＺＦＰを、植物細胞内の特定の器官に標的化することができる。ＺＦＰに適切な標的化ペプチド配列（分泌シグナルペプチド（分泌、細胞壁、または膜標的化用）、プラスチド移行ペプチド、クロロプラスト移行ペプチド、ミトコンドリア標的ペプチド、小胞標的化ペプチド、または核標的化ペプチドなど）を提供することによって標的化を行うことができる。プラスチドオルガネラ標的配列の例は、国際公開公報第００／１２７３２号を参照のこと。プラスチドは、プロトプラスト由来の植物オルガネラのクラスであり、葉緑体、白色体、澱粉体、および有色体が含まれる。プラスチドは、植物の生合成の主要な部位である。葉緑素における光合成に加えて、プラスチドはまた脂質生合成、硝酸塩のアンモニウムへの還元、および澱粉貯蔵部位である。プラスチドがそれ自体の環状ゲノムを含む一方で、プラスチドに局在しているほとんどのタンパク質は核のゲノムによってコードされ、原形質からオルガネラに輸送される。
【０１４７】
従来の方法によって、改変植物を植物体に生長させることができる。例えば、マックコーミック（ＭｃＣｏｒｍｉｃｋ）ら（１９８６） Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ：８１−８４を参照のこと。これらの植物を生長させ、同一の形質転換株または異なる株で授粉し、得られた所望の表現型の特徴を有するハイブリッドを同定することができる。２世代以上生長させて、この表現型の特徴が安定に維持および遺伝しているかを確認し、種子を採取して所望の表現型または他の性質が得られているかを確認することができる。
【０１４８】
関心対象の標的遺伝子またはタンパク質が調整される効率を決定するアッセイは既知である。簡単に述べれば、１つの態様では、Ｐ−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、または緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）などのレポーター遺伝子を、標的遺伝子配列調節プロモーターに作動可能に連結し、形質転換ベクターにライゲーションし、植物または植物細胞に形質転換する。
【０１４９】
本発明で有用なＺＦＰは、リンカー（好ましくは、自在リンカー）を介して選択的に第２の亜鉛フィンガーポリペプチドである少なくとも第２のＤＮＡ結合ドメインに連結された少なくとも１つの亜鉛フィンガーポリペプチドを含む。ＺＦＰは、２つを超えるＤＮＡ結合ドメインおよび１つまたは複数のレギュレータードメインを含み得る。本発明の亜鉛フィンガーポリペプチドを、選択した遺伝子中の選択した標的部位を認識するように操作することができる。典型的には、任意の適切なＣｙｓ２Ｈｉｓ２−ＺＦＰ（ＳＰＡ、ＳＰＩＣ、またはＺＩＦ２６８など）由来の骨格を、操作される亜鉛フィンガーポリペプチドの足場として使用する（例えば、Ｊａｃｏｂｓ ＥＭＢＯ Ｊ． １１： ４５ ０７（１９９２）；ＤｅｓｊａｒｌａｉｓおよびＢｅｒｇ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０： ２２５６−２２６０ （１９９３）を参照のこと）。次いで、多数の方法を使用して、その標的に対して高親和性を示す亜鉛フィンガーポリペプチドを設計および選択することができる。亜鉛フィンガーポリペプチドを、標的遺伝子中で任意の適切な標的が高親和性で結合するように設計または選択することができる。
【０１５０】
アミノ酸および核酸配列に関して、１つのアミノ酸もしくはヌクレオチドまたは配列中の割合の低いアミノ酸もしくはヌクレオチドを変化、付加、または欠失する各置換、欠失、または付加により「保存的に改変された変異体」が得られ、これは変化によってアミノ酸が化学的に類似のアミノ酸に置換されている。機能的に類似のアミノ酸を提供する保存的置換の表は当技術分野において既知である。このような保存的改変変異体が追加されたが、本発明の多型変異体および対立遺伝子は排除していない。
【０１５１】
以下の群は、互いに保存的置換であるアミノ酸をそれぞれ含む：１）アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）；２）セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）；３）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；４）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；５）システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）；６）アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）、ヒスチジン（Ｈ）；７）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、バリン（Ｖ）；および８）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）（例えば、アミノ酸の性質の考察についてはＣｒｅｉｇｈｔｏｎ、「タンパク質（Ｐｒｏｔｅｉｎｓ）」（１９８４）を参照のこと）。
【０１５２】
したがって、本発明は、組織特異的であるか特異的でない、誘導性であるかそうでない、培養物中または無傷の植物中の植物細胞中で起こり得る遺伝子調節を意図する。有用な活性化または抑制レベルは、どのようにして標的遺伝子が厳格に調節されるかどうか、調節の低レベルの変化の影響、および類似の因子に依存して変化し得る。望ましくは、遺伝子発現の変化は約１．５倍〜２倍、より望ましくは約３倍〜５倍、好ましくは約８倍〜１０倍〜１５倍、より好ましくは２０倍〜２５倍〜３０倍、最も好ましくは４０倍、５０倍、７５倍または１００倍またはそれ以上改変される。これにより、発現レベルの修正は、活性化因子／抑制因子の不在下で、遺伝子発現の正規水準の活性化あるいは抑制のどちらかを参照する。特定のＺＦＰエフェクター融合物の活性の測定値は、ＺＦＰエフェクター構築物の染色体上の組み込み位置の影響の結果として、植物ごとにいくらかばらつきがあった。
【０１５３】
高等植物における遺伝子発現に有用な典型的なベクターは当技術分野において既知であり、ロジャーズ（Ｒｏｇｅｒｓ）ら、Ｍｅｔｈ． ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．、１５３： ２５３−２７７ （１９８７）に記載のアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）の腫瘍誘導性（Ｔｉ）プラスミド由来のベクターを含む。これらのベクターは形質転換の際の植物組み込みベクターであり、ベクターにより宿主植物ゲノムにベクターＤＮＡの一部が組み込まれる。例として、本明細書で有用なＡ．ツメファシエンス（ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）ベクターは、シャードル（Ｓｃｈａｒｄｌ）ら、Ｇｅｎｅ， ６１： １−１１ （１９８７）およびバーガー（Ｂｅｒｇｅｒ）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８６： ８４０２−８４０６ （１９８９）のプラスミドｐＫＹＬＸ６およびｐＫＹＬＸ７である。別の有用なベクターはプラスミドｐＢＩ１０１．２である。
【０１５４】
本発明の方法は、商業的な価値もある所望の表現型の種の開発に必要な交配レベルを最小にする優性形質が得られる効果があるので、特に植物生産者に魅力的である。典型的には、従来の方法による植物ゲノムの改変により、改変遺伝子の表現型が劣性なヘテロ接合体が得られる。表現型に劣性の特徴が認められた場合、ホモ接合体を得るために交配する必要がある。この交配は、手間がかかり、かつ時間がかかる。すぐに表現型の影響が得られる本発明の場合、このような交配が必要ない。
【０１５５】
１つの態様では、ＺＦＰを、非連続標的配列に結合するように設計することができる。例えば、６フィンガーＺＦＰの標的配列は、第２の１０塩基対配列（３つのフィンガーの第２の組によって認識される）の間に介在塩基（亜鉛フィンガー核酸結合部位に接触しない）を有する１０塩基対の配列（３つのフィンガーによって認識される）であり得る。介在塩基の数は変化し得るので、ＺＦＰの２つの３フィンガー部分の間のこの介在距離を適切に設計したアミノ酸リンカーで埋め合わせることができる。標的結合部位中の介在核酸塩基の範囲は、好ましくは２０塩基以下、より好ましくは１０塩基以下、さらにより好ましくは６塩基以下である。当然ながら、リンカーは、ＺＦＰタンパク質のリンカー部分の間のリーディングフレームを維持する。
【０１５６】
リンカーの最短の長さは、２つの亜鉛フィンガードメインがドメインまたはリンカーと立体障害を起こさないように連結される長さである。最短の長さを超えるリンカーは、「自在リンカー」である。最小リンカーおよび自在リンカーの長さを、当技術分野において既知の各標的部位に結合したＤＮＡ結合タンパク質の物理的またはコンピュータモデルを使用して測定することができる。
【０１５７】
６フィンガーの亜鉛フィンガーペプチドは、従来の「ＴＧＥＫＰ」リンカーを使用して、２つの３フィンガー亜鉛フィンガーペプチドに接続するか３フィンガータンパク質にさらなるフィンガーを付加することができる。天然および合成のいずれの他の亜鉛フィンガーペプチドもまた適切である。このようなリンカーに加えて、ドメインを１個〜１０個のさらなるアミノ酸と共有結合することができる。マルチフィンガーＺＦＰ中の各第３の亜鉛フィンガードメインの後で使用した場合、このようなさらなるアミノ酸は、最も有益であり得る。
【０１５８】
有用な亜鉛フィンガーフレームワークは、バーグ（Ｂｅｒｇ）（Ｋｉｍら、Ｎａｔｕｒｅ Ｓｔｒｕｃｔ． Ｂｉｏｌ． ３： ９４０−９４５、１９９６；Ｋｉｍら、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２５２： １−５、１９９５；Ｓｈｉら、ＣｈｅｍｉｓｔｒｙおよびＢｉｏｌｏｇｙ， ２： ８３−８９、１９９５を参照のこと）のものであるが、他のものも適切である。亜鉛フィンガーヌクレオチド結合モチーフを含むヌクレオチド配列の機能を変化させるために本発明にしたがって短縮、拡大、および／または変異誘発することができる既知の亜鉛フィンガーヌクレオチド結合ポリペプチドの例には、ＴＦＩＩＩＡおよびＺｉｆ２６８が含まれる。他の亜鉛フィンガーヌクレオチド結合タンパク質は、当業者に既知である。ネズミＣｙｓ２−Ｈｉｓ２ ＺＦＰ Ｚｉｆ２６８は、構造的に最も十分に特徴付けられたＺＦＰである（ＰａｖｌｅｔｉｃｈおよびＰａｂｏ、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５２： ８０９−８１７（１９９１）、Ｅｌｒｏｄ−Ｅｒｉｃｋｓｏｎら（１９９６） Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ） ４， １１７１−１１８０、Ｓｗｉｒｎｏｆｆら（１９９５） Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． １５： ２２７５−２２８７）。このタンパク質の３つの各亜鉛フィンガードメイン中のＤＮＡ認識は、ＤＮＡの一本鎖上の主に３つのヌクレオチドを含むαヘリックスのＮ末端中の残基によって媒介される。この３つのフィンガータンパク質のオペレーター結合部位は、５’−ＧＣＧＴＧＧＧＣＧ−３’である。Ｚｉｆ２６８および他の関連する亜鉛フィンガー−ＤＮＡ複合体の構造研究（Ｅｌｒｏｄ−Ｅｒｉｃｋｓｏｎ，Ｍ．、Ｂｅｎｓｏｎ， Ｔ．Ｅ．およびＰａｂｏ， Ｃ．Ｏ．（１９９８） Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ （Ｌｏｎｄｏｎ） ６， ４５１−４６４、ＫｉｍおよびＢｅｒｇ（１９９６） Ｎａｔｕｒｅ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ３， ９４０−９４５、ＰａｖｌｅｔｉｃｈおよびＰａｂｏ（１９９３） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６１， １７０１−７、Ｈｏｕｂａｖｉｙら（１９９６） Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９３， １３５７７−８２、Ｆａｉｒａｌｌら（１９９３） Ｎａｔｕｒｅ （Ｌｏｎｄｏｎ） ３６６， ４８３−７、Ｗｕｔｔｋｅら（１９９７） Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２７３， １８３−２０６、Ｎｏｌｔｅら（１９９８） Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９５， ２９３８−２９４３、Ｎａｒａｙａｎら（１９９７） Ｊ．Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７２， ７８０１−７８０９）により、αヘリックス上の３つの主要な位置（−１位、３位、および６位）からの残基が特異的塩基接触に関連することが示された。典型的には、αヘリックスの−１位残基はフィンガーのサブサイトの３’塩基に接触する一方で、３位および６位は中央の塩基および５’塩基にそれぞれ接触する。
【０１５９】
当業者に既知の任意の適切なタンパク質精製法を使用して、本発明のＺＦＰを精製することができる（Ａｕｓｕｂｅｌ、前記、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、前記を参照のこと）。さらに、任意の適切な宿主（例えば、細菌細胞、昆虫細胞、酵母細胞、哺乳動物細胞など）を使用することができる。
【０１６０】
一つの態様では、自在（ｆｌｅｘｉｂｌｅ）リンカー（ＧＧＧＧＳ、ＧＧＧＳ、およびＧＧＳ（これらの配列は、本発明のＺＦＰ中の１個〜１０個のさらなるアミノ酸の一部であり得る；それぞれ配列番号：２３、配列番号：２３の２残基〜５残基；および配列番号：２３の３残基〜５残基）が含まれるが、これらに限定されない）を使用した他のマルチフィンガーＺＦＰに連結したマルチフィンガーＺＦＰを使用して、より長いゲノム配列を標的とする。酸性および塩基性ペプチドなどの二量体化ペプチドを使用し、選択的に自在リンカーと組み合わせて非回文配列を標的とすることができ、このときＺＦＰは酸性および塩基性ペプチドに結合する（エフェクタードメイン−酸性または塩基性のペプチド−ＺＦＰ）。酸性および塩基性ペプチドの他の末端は、エフェクターペプチド（活性化ドメイン）である。これらのドメインを、任意の順序でアセンブルさせることができる。例えば、ＺＦＰエフェクタードメイン−酸性または塩基性のペプチドの配置もまた本発明の範囲内である。さらに、亜鉛フィンガーペプチドが酸性および塩基性ペプチドの両方に結合することは必要なく、その一方または他方のまたは両方が本発明の範囲内である。２つのＺＦＰに対する必要性は、第１のＺＦＰの親和性に依存する。これらの構築物を、上記のヘテロ二量体を使用した組み合わせ転写調節（Ｂｒｉｇｇｓら）に使用することができる。タンパク質は半分の両方が発現した場合のみ二量体を形成する。したがって、タンパク質の半分の両方が同一の細胞中で同時に発現した場合のみ、遺伝子発現が活性化または阻害される。例えば、２つのプロモーターを植物中での発現に使用することができ、一方が組織特異的であり、他方が一過性である。ヘテロ二量体の半分の両方が発現した場合のみ、遺伝子発現が活性化される。
【０１６１】
本発明はまた、本発明の認識コードによって作製したＺＦＰの核への転位を促進して、関心対象の遺伝子の転写を促進するために使用する「分子スイッチ」または「化学スイッチ」に関する。分子スイッチは、１つの態様では、操作受容体（ステロイドホルモン受容体など）に結合し、操作ＺＦＰにも結合する２価の化学リガンドである（図６）。ＺＦＰをその標的部位に結合する場合、受容体−リガンド−亜鉛フィンガー複合体は核に侵入する。例は、エフェクタードメイン（活性化ドメイン（ＡＤ）または抑制ドメイン（ＲＤ）など）に作動可能に連結された核局在化シグナルに部分ＡおよびＢを有する２価の化学リガンドによって連結したＺＦＰを含む複合体である。ＺＦＰおよび部分Ａに特異的な抗体（またはこのような抗体の活性断片）をコードする構築物が、細胞中に発現する。操作した核局在化シグナル／エフェクタードメインおよび部分Ｂに特異的な抗体（またはこのような抗体の活性断片）をコードする第２の構築物が、同一の細胞中に発現する。互いに連結した部分Ａおよび部分Ｂを含む２価の化学物質の細胞への添加の際、部分Ａまたは部分Ｂのいずれかに対するそれぞれ個別に発現した融合タンパク質の親和性は、操作したＺＦＰが核局在化ドメインおよびエフェクタードメインに物理的に結合している複合体の形成を媒介する。この態様により、細胞への２価の化学物質の投与により核への複合体の特異的局在化が誘導される。部分ＡおよびＢには、多数の可能性がある。この基準は、この部分が、この部分に特異的なモノクローナル抗体を選択するために十分に抗原性を示し、互いに結合した２つの部分が細胞内に侵入し、そこで作用して複合体形成を媒介することができるということである。１つの態様では、部分Ａは、例えば、以下の構造
2004519211.tif 000036
を有し得り、部分Ｂは、例えば、以下の構造
2004519211.tif 000037
を有し得り、かつ部分Ａおよび部分Ｂは任意の適切な長さのリンカーによって結合することができ、以下の単位
2004519211.tif 000038
などの単位を有する。
【０１６２】
細胞に侵入することができ、かつ抗体を惹起することができる部分を有する任意の化合物が、本発明の局面に適切である。本発明のこの態様により、選択したプロモーターに対して作用するようにエフェクタードメインが配列特異的に局在化して、細胞中の遺伝子発現が変化し、例えば所望の表現型を得ることができる。２価の化学物質の不在下では、ＺＦＰによって付与された部位特異性核局在化および操作エフェクタータンパク質のエフェクター活性につながらないので、このような表現型は出現しない。したがって、部位特異的エフェクター活性は、２価の化学物質の添加によって誘導される。
【０１６３】
好ましい態様では、２つの結合化合物を含む２価の化学物質である化学的スイッチを使用する。これらの化合物は、短いリンカー（例えば、ＣＨ２ＣＨ２）によって連結される、抗体を惹起することができる任意の化合物であり得る。１つの好ましい態様では、一本鎖抗体（例えば、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ））は２価の化学物質の１つの部分に結合し、これがＺＦＰに連結する。２価の化学物質の他の部分は、第２の一本鎖抗体（例えば、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ））に結合し、エフェクタードメイン（好ましくは、活性化因子または抑制因子ドメイン）に作動可能に連結された核標的配列（例えば、核局在化シグナル）を認識して結合する（図６）。したがって、ＺＦＰの核への転位は、２価の化学物質の存在下でのみ起こる。代替的な態様では、エフェクタードメインをＺＦＰに結合し、その後一本鎖抗体に結合する。しかし、エフェクター−ＺＦＰ抗体複合体は２価の化学物質の不在下で核内で拡散し得るので、ＺＦＰおよびエフェクターは、異なるタンパク質上に存在することが好ましい。ＺＦＰ抗体が核内に拡散する場合でも、最悪な場合で化学物質が存在するまで負のレギュレーターになるが、活性化因子にはならない。ＺＦＰおよびエフェクタードメインの両方の転位を操作することがより好ましいので、これもまたあまり好ましくない。本発明の化学的スイッチの態様はまた、他の有用な誘導性遺伝子発現系の操作に適用可能である。例えば、このアプローチを使用して、植物内で人工防御機構を操作することができる。植物が病原体に感染した場合、小分子「誘発物質」もまた産生される。したがって、分子スイッチ系中の抗体は、このような誘発物質に特異的であり、これは誘発物質の存在下のみで形成された誘導性遺伝子発現複合体であり、病原体感染に対する応答を操作する。このようにしてでは、植物防御遺伝子は、病原体が植物に感染した場合に、病原体によって産生された「サプレッサー」の影響を受けることなく直接および即座に活性化することができる。好ましい態様では、２つのｓｃＦｖ（ｓｃＦｖ−１およびｓｃＦｖ−２）が産生される。各ｓｃＦｖは、誘発物質の異なる部分（すなわち、誘発分子上の異なるエピトープ）を認識する。亜鉛フィンガー／ｓｃＦｕ−１融合タンパク質およびＮＬＳ−ＡＤ−ｓｃＦｖ−２融合タンパク質が誘発物質に結合し、核に局在化することができる遺伝子活性化複合体が得られ、植物防御遺伝子は、ＺＦＰの設計に基づいて選択的に活性化される。このアプローチにより、植物防御遺伝子は、病原体の存在下でのみ活性化される。
【０１６４】
組み合わせ転写調節に関する本発明の別の態様は、Ｓタグ、Ｓタンパク質の系を含む。Ｓタグは短いペプチド（１５アミノ酸）であり、Ｓタンパク質は小さなタンパク質である（１０４アミノ酸）。ＳタグおよびＳタンパク質複合体の親和性は高い（Ｋｄ＝１ｎＭ）。化学的スイッチ系で、Ｓタグ／Ｓタンパク質系を使用することができる。この態様では、ＳタグはＺＦＰに結合し、Ｓタンパク質は活性化ドメイン（ＡＤ）または抑制因子に結合する核局在化ドメイン（ＮＬＳ）に結合する。Ｓ−タグ−亜鉛フィンガーおよびＳタンパク質−ＮＬＳ−ＡＤ構築物を２つの異なるプロモーターを使用して発現させ、亜鉛フィンガー−Ｓタグ−Ｓタンパク質−ＮＬＳ−ＡＤ複合体の形態が得られる。化学的スイッチは、ＳタグおよびＳタンパク質を共に連結させるための小分子または化学物質が存在する限り、相互作用することができないＳタグおよびＳタンパク質の使用を含む。これらの小分子を使用して、野生型Ｓタグ−Ｓタンパク質相互作用を破壊することもできる。
【０１６５】
本発明の別の態様では、ＺＦＰまたは亜鉛フィンガードメインおよび一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質（ＳＳＢ）を含む融合タンパク質を使用して、ウイルス複製を阻害する。ジェミニウイルス中に保存された「直接反復」配列または「ステムループ」構造に標的化され、ウイルスゲノムのローリングサークル複製のためのプライマーを得るためにニックを入れた亜鉛フィンガードメインまたは亜鉛フィンガー−ＳＳＢ融合タンパク質を使用して、ジェミニウイルスの複製を阻害することができる。例えば、ＡＬ１は、ＴＭＶ上の特異的部位に結合するタバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）部位特異的エンドヌクレアーゼである。結合後、ＡＬ１はステム−ループ中のウイルスＤＮＡを切断して、ローリングサークルウイルス複製が開始される。ＳＳＢ部分が切断部位に結合し、この部位に隣接する亜鉛フィンガードメインが結合するように、本発明の認識コードを使用してＺＦＰまたは亜鉛フィンガー−ＳＳＢ融合タンパク質を操作する。あるいは、ＡＬ１結合部位または切断部位に結合するように設計したＺＦＰのみを使用し、それによりＡＬ１がその結合部位またはステム−ループ構造への結合を防止する。したがって、ＺＦＰはＡＬ１のその標的部位への結合を競合により阻害する。これらのＺＦＰまたは亜鉛フィンガーＳＳＢ融合タンパク質の型を、ウイルス複製に関連する任意のＤＮＡまたはＲＮＡウイルス中の所望の任意の結合部位を標的とするように設計することができる。さらに、ステム−ループ構造は全てのジェミニウイルスで保存されているので、全てのこのようなウイルスのニック部位を、類似のＺＦＰまたは亜鉛フィンガー−ＳＳＢ融合物を使用して遮断することができる。
【０１６６】
本発明の別の態様は、亜鉛フィンガー認識配列の変化を検出する方法に関する。この方法では、関心対象の亜鉛フィンガー認識配列を含む核酸を、配列に特異的でかつシグナル伝達部分に結合した本発明のＺＦＰに接触させ、配列が変化していない場合、ＺＦＰはＺＦＰのその認識（すなわち、標的）配列への結合に十分な量の存在する。次いで、ＺＦＰの結合範囲を、シグナル伝達部分の検出および亜鉛フィンガー認識配列への正常な結合レベルが変化したかどうかを確認することによって決定する。不変配列へのＺＦＰの結合と比較して結合が減少するまたは消滅する場合に亜鉛フィンガー認識配列が変化する。この方法は、１つまたは複数のヌクレオチドが変異（置換）、挿入、または欠失した、亜鉛フィンガー認識部位の変化を検出することができる。この方法は、一塩基多型（ＳＮＰ）の検出に有用である。
【０１６７】
任意の都合のよいシグナル伝達部分または系を使用することができる。シグナル伝達部位の例には、色素、ビオチン、放射性標識、ストレプトアビジン、およびマーカータンパク質が含まれるが、これらに限定されない。多数のマーカータンパク質が既知であり、β−ガラクトシダーゼ、ＧＵＳ（β−グルクロニダーゼ）、スペクトルの性質が変化する（すなわち、青色または黄色蛍光を示す）緑色蛍光タンパク質（その蛍光変異体を含む）、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、抗体、抗原などが含まれるが、これらに限定されない。
【０１６８】
さらに本発明は、ゲノム構造の異常に関連する疾患の診断法を意図する。このような疾患の例は、特定の核酸配列のコピー数が増加する疾患である。例えば、健常な個体におけるコピー数に対して示された疾患を罹患した患者で高コピー数の表示の配列が見出された：ハンチントン病、フリードリッヒ運動失調では（ＣＡＧ）ｎ；脆弱Ｘ部位Ａでは（ＣＧＧ）ｎ；脆弱Ｘ部位Ｅでは（ＣＣＧ）ｎ；および筋緊張性ジストロフィーでは（ＣＴＧ）ｎ。
【０１６９】
この方法は、（ａ）被験者から細胞、血液、または組織試料を単離する段階；（ｂ）細胞、血液、または該組織試料由来の核酸をシグナル伝達部分に連結し、選択的に細胞取り込みドメインに融合した本発明のＺＦＰ（関心対象の疾患の標的に特異性を有する）に接触させる段階；および（ｃ）タンパク質の核酸への結合を検出し、それにより診断を行う段階を含む。必要ならば、結合量を定量することができ、これは役に立ち、いくつかの場合、疾患の重症度または進行を評価する。核酸がインサイチューで検出されるような細胞、血液、または組織の適切な固定、細胞、血液、または組織からの核酸の抽出、検出、および選択的な定量段階の実施によってこの方法を行うことができる。
【０１７０】
ＶＩＩ．薬学的製剤
保存用のＺＦＰ、融合タンパク質、または本発明のこれらのＺＦＰもしくは融合タンパク質をコードする核酸の治療製剤を、所望の純度のこれらの物質の選択的な生理学的に許容可能な担体、賦形剤、または安定剤（「レミントンの薬科学（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ）」、第１６版、Ｏｓｏｌ，Ａ編、（１９８０））との混合によって凍結乾燥製剤または水溶液の形態で調製する。許容可能な担体、賦形剤、または安定剤は、使用した投薬量および濃度でレシピエントに無毒であり、これらには、リン酸、クエン酸、および他の有機酸などの緩衝液；アスコルビン酸およびメチオニンを含む抗酸化剤；防腐剤（オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンズアルコニウム、塩化ベンズエトニウム；フェノール、ブチルまたはベンジルアルコール；アルキルパラベン（メチルまたはプロピルパラベンなど）；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；およびｍ−クレゾールなど）；低分子量（約１０残基未満）のポリペプチド；タンパク質（血清アルブミン、ゼラチン、免疫グロブリンなど）；親水性ポリマー（ポリビニルピロリドン）；アミノ酸（グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、リジンなど）；単糖類、二糖類、および他の炭水化物（グルコース、マンノース、またはデキストリンを含む）；キレート剤（ＥＤＴＡなど）；糖類（スクロース、マンニトール、トレハロース、またはソルビトールなど）；塩形成対イオン（ナトリウムなど）；金属複合体（例えば、亜鉛−タンパク質複合体）；および／または非イオン性界面活性剤（ＴＷＥＥＮ（商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標）、またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ））が含まれる。
【０１７１】
本発明の製剤はまた、治療される特定の適応症に必要で、好ましくは、互いに悪影響を与えない相補的活性を有する１つを超える活性化合物、を含み得る。このような分子は、意図する目的に有効な量で組み合わせて安定に存在する。
【０１７２】
有効成分を、例えば、コアセルベーション技術または界面重合によって調製されたマイクロカプセル（例えば、それぞれヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチン−マイクロカプセルまたはポリ（メチルメタクリレート）マイクロカプセル）、コロイド状の薬物送達系（例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子、およびナノカプセル）、またはマクロエマルジョンに封入することができる。このような技術は、「レミントンの薬科学（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ）」、第１６版、オソール（Ｏｓｏｌ），Ａ編、（１９８０）に開示されている。
【０１７３】
インビボでの投与に使用される製剤は、無菌でなければならない。滅菌濾過膜を使用してこれを容易に行うことができる。
【０１７４】
徐放性製剤を調製することができる。徐放性製剤の適切な例には、ポリペプチド変異体を含む固体疎水性ポリマーの半透性基質が含まれ、この基質は成形した物品（例えば、フィルムまたはマイクロカプセル）である。徐放性基質の例には、ポリエステルヒドロゲル（例えば、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）またはポリ（ビニルアルコール）、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号）、Ｌ−グルタミン酸とＬ−グルタミン酸エチルのコポリマー、非分解性エチレン−ビニルアセテート、分解性乳酸−グリコール酸のコポリマー（ＬＵＰＲＯＮ ＤＥＰＯＴ（商標）（乳酸−グリコール酸のコポリマーおよび酢酸ロイプロリドで構成される注射用ミクロスフェア）など）、およびポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸が含まれる。エチレン−酢酸ビニルおよび乳酸−グリコール酸などのポリマーは、１００日間にわたって分子を放出することができるが、一定のヒドロゲルでは短時間タンパク質を放出する。カプセル化抗体が体内に長期間とどまる場合、３７℃での水分の曝露の結果として変性するか凝集し、それにより生物活性が喪失し、免疫原性が変化する可能性がある。関連機構に依存して安定化する合理的戦略を案出することができる。例えば、チオ−ジスルフィド相互交換による細胞間Ｓ−Ｓ結合形成である凝集機構を発見した場合、スルフヒドリル残基の改変、酸性溶液からの凍結乾燥、適切な添加物を使用した水分含量の調節、および特異的ポリマー基質組成物の開発によって安定化することができる。
【０１７５】
当業者は、任意の薬学的組成物中に含まれるＺＦＰ、融合タンパク質、またはこれらのＺＦＰまたは融合タンパク質をコードする核酸の量、およびこれを使用するための適切な投薬量を容易に決定することができる。
【０１７６】
本出願を通して、種々の刊行物、特許、および特許出願を言及してきた。これらの刊行物、特許、および特許出願の教示および開示は、その全てが本出願の参照として本明細書に組み入れられる。
【０１７７】
例示的態様で開示された本明細書における発明の原理の変法を当業者が実施できることを理解および予想すべきであり、このような修正、変更、置換は本発明の範囲内に含まれることが意図される。
【０１７８】
実施例１
認識コードを使用したＺＦＰの設計
表１に示されるアミノ酸−塩基接触を確認するために、トマトゴールデンモザイクウイルスゲノム中のＡＬ１結合部位を標的とするＺＦＰを設計した。図７に示すように、標的部位
2004519211.tif 000039
を、それぞれ４つのＤＮＡ塩基対を有する３つの領域に分割した（段階１）。これらの領域は、第１の領域の第４の塩基が第２の領域の第１の塩基となり、第２の領域の第４の塩基が第３の領域の第１の塩基となるという点で重複していた。したがって、３つの亜鉛フィンガーを使用して、核酸の１０塩基対領域を標的化する。次に、バーグ（Ｂｅｒｇ）により記載されたＳｐ１Ｃドメイン２フレームワークで使用するための４つのＤＮＡ塩基対あたり４つのアミノ酸を表から選択した（段階２）。−１位、２位、３位、および６位以外の位置のアミノ酸は改変しなかった。ペプチド配列に対応したＤＮＡオリゴマーを、ＤＮＡ合成機を使用する標準的方法によって合成した（段階３）。次いで、これら３つの亜鉛フィンガードメインを、１つのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によってアセンブルさせて、ＡＬ１部位を標的とするＺＦＰを構築した（段階４）。ＤＮＡ断片を、ｐＥＴ２１−ａベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）のＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ部位にクローン化した。得られたプラスミドを、タンパク質過剰発現のために大腸菌ＢＬ２１ （ＤＥ３） ｐＬｙｓＳに導入し、陽イオン交換カラムクロマトグラフィーで精製した（段階５）。培養物６０ｍＬを３７℃でＯＤ６００＝０．７５まで成長させ、１ｍＭ ＩＰＴＧで３時間誘導し、冷溶解緩衝液（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１Ｍ ＮａＣｌ、５ｍＭ ジチオトレイトール（ＤＴＴ）、１ｍＭ ＺｎＣｌ２）中で凍結融解によって溶解した。ポリエチレンイミン（ｐＨ７、０．６％）での処理および４０％（ＮＨ４）２ＳＯ４での沈殿後、得られたペレットを、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１００ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＤＴＴ、０．１ｍＭ ＺｎＣｌ２中に再溶解し、０．３ｍＭ ＮａＣｌ緩衝液で溶出するＢｉｏ−Ｒｅｘ７０陽イオン交換カラムを使用して精製した。ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）で判定したところ、全ての精製タンパク質は９５％を超えて均一であった。
【０１７９】
実施例２
標的配列に対するＺＦＰの親和性の決定
標的配列に対する合成ＺＦＰの親和性を試験するために、ＡＬ１標的ポリヌクレオチド
2004519211.tif 000040
を使用してゲルシフト実験を行った。正の対照として、ＺＦＰ Ｚｉｆ２６８およびこのタンパク質の標的ポリヌクレオチド
2004519211.tif 000041
も使用した。各ＺＦＰの標的部位に下線が付されている。アッセイにおけるＡＬ１ ＺＦＰの濃度は、０ｍＭ、１４ｍＭ、２１ｍＭ、２８ｍＭ、３５ｍＭ、７０ｍＭ、および８８ｍＭであった。Ｚｉｆ２６８の濃度は、２．６μＭ、３．３μＭ、６．６μＭ、１３μＭ、および２０μＭであった。アッセイ前に、標的ポリヌクレオチドを、５’末端で［γ−３２Ｐ］ＡＴＰで標識した。ＺＦＰを、末端標識プローブ（１ｐｍｏｌ）を含む１０μＬの１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．１ｍＭ ＺｎＣｌ２、１ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ、１０％グリセロールを含む溶液中、氷上で４０分間予備インキュベーションを行った。ポリ（ｄＡ−ｄＴ）２を加え、インキュベーションを２０分間継続し、その後６％未変性ポリアクリルアミドゲル（０．５×ｔｒｉｓ−ホウ酸緩衝液）にて、４℃で２時間１４０Ｖで電気泳動を行った。１８ｎＭおよび４ｎＭでそれぞれＡＬ１およびＺｉｆ２６８ ＺＦＰの半最大結合が認められた。その標的配列に対するＡＬ１ ＺＦＰの親和性も、ファージディスプレイ（３０ｎＭ〜４０ｎＭ、国際公開公報第９５／１９４３１号；Ｌｉｕら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ． ９４： ５５２５−５５３０、１９９７）を使用して選択したＺＦＰと匹敵している。
【０１８０】
実施例３
ＤＮＡ塩基特異性の決定
ＤＮＡ塩基特異性を決定するために、以下の研究を行った。図３に基づいて、第１の亜鉛フィンガードメイン中の２位のアスパラギン酸を、４塩基対領域の３’末端のシトシンに結合させる。ＡＬ１ ＺＦＰ（濃度１４ｎＭ、２１ｎＭ、および３５ｎＭ）および以下の末端標識ポリヌクレオチド
2004519211.tif 000042
を使用して、上記のようにゲルシフトアッセイを行った。配列番号：２４は、１０塩基対配列の３’末端にＧを有する野生型標的配列である。他の３つのポリヌクレオチドは、この位置（それぞれ配列番号：２７、２８、および２９中の塩基Ａ、Ｔ、およびＣに下線を付す）に点変異を有する。タンパク質を配列番号：２７とインキュベートした場合のみＡＬ１ ＺＦＰの有意な結合が起った。配列番号：２７、２８、または２９への結合はほとんど認められなかったので、２位のアスパラギン酸と４塩基対領域の３’末端グルタミンとの特異的相互作用が確認された。
【０１８１】
実施例４
認識コード
ＺＦＰの−１位、２位、３位、および６位のアミノ酸のそれぞれのスクリーニングによって、完全な認識コードが確認される。例えば、２位のアミノ酸のスクリーニングでは、３つの亜鉛フィンガードメイン
2004519211.tif 000043
を、スクリーニングに使用する（２位で下線を付しているＸは変異している）。ドメイン（それぞれ−１位、３位、および６位のＡｓｐ、Ａｌａ、およびＡｒｇ）はＤＮＡに無作為に結合することが既知であるので、第１の亜鉛フィンガードメインを使用して、２位でのＤＮＡ塩基の特異性を同定する。変性ＤＮＡプローブ
2004519211.tif 000044
（Ｎ＝Ｇ、Ａ、Ｔ、またはＣの等モル混合物；Ｙ＝Ｇ、Ａ、Ｔ、またはＣ、配列番号：３１）を使用して、他の位置でＤＮＡ塩基−アミノ酸相互作用の影響を受けることなく２位でのアミノ酸のＤＮＡ塩基特異性を同定する。
【０１８２】
ＡｓｐおよびＧｌｙ変異タンパク質を調製し、ゲルシフトアッセイを使用してＤＮＡ塩基特異性を調査した。以下の３２Ｐ標識二重鎖を使用した。
2004519211.tif 000045
図８に示すように、Ａｓｐ変異体は、
2004519211.tif 000046
に優先的に結合した。図８に示すように、ＡｓｐからＧｌｙへの変異により、選択性が喪失した。これは、２位のアスパラギン酸が独立してＤＮＡ標的中の第４の位置でシトシン塩基を認識することを示す。表１で予測されている２位のアスパラギン酸による第４の位置のシトシン塩基の認識が、実験で確認された。他のアミノ酸を使用した類似の実験の繰り返しにより、完全な認識コードが確認される。
【０１８３】
実施例５
トランスポザーゼの操作および転位アッセイ
線虫トランスポザーゼＴｃ１は、Ｔｃ１に融合したＺＦＰを使用した部位特異的遺伝子ノックインの作製の証明に有用である。転位法が図９にまとめて示されている。ＴＩＲの間に選択マーカー遺伝子（例えば、カナマイシン耐性）を含む均一なＴＩＲを含むマーカー断片またはプラスミドを使用する。標的領域（例えば、１つまたは２つのＺｉｆ２６８結合部位）、正常な複製起点、およびアンピシリン耐性を含むアクセプターベクターを、ＴＩＲ−カナマイシン−ＴＩＲ線状断片またはこの構築物、テトラサイクリン耐性、およびｐＳＣ１０１ＴＳｏｒｉ温度感受性複製起点を含むドナーベクターと組み合わせる。この場合、ＴＩＲは同一であるが（ホモアッセイ）、異なるＴＩＲおよび異なるＴＩＲ結合ドメイン（線虫トランスポザーゼＴＣ３０など）を使用して類似のアッセイを行うことができる（ヘテロアッセイ）。ＺＦＰ−トランスポザーゼ融合タンパク質を使用して転位反応を行い、その後大腸菌形質転換を行い、ドナーベクターの場合、熱処理を行って未反応のドナーベクターを除去し、ＴＩＲ−カナマイシン−ＴＩＲ構築物がアクセプターベクターのＺｉｆ２６８標的部位に挿入されたベクターが得られる。アンピシリン耐性大腸菌とアンピシリン−カナマイシン耐性大腸菌の力価の比較により、転位効率が決定される。
【０１８４】
実施例６
３フィンガーＺＦＰを作製する一般的スキーム
ＺＦＰの各フィンガーを、同一のフレームワーク配列
2004519211.tif 000047
を有するように設計した：
式中、−１位、２位、３位、および６位のＸは、表１の亜鉛フィンガー認識コードおよび所望の標的配列にしたがって決定される。各フィンガーのＤＮＡを、ＰＣＲによって正確な方向で３つの亜鉛フィンガードメインをコードするＤＮＡがアセンブルすることができるように設計した。３つのＤＮＡオリゴヌクレオチド対を合成し、各対は以下の１つの特異的フィンガードメインをコードする２つの重複オリゴマーである。
第１の亜鉛フィンガードメイン（Ｚｉｆ−１）
Ｚｉｆ−１、センスオリゴマー（プライマー１）
2004519211.tif 000048
Ｚｉｆ−１、アンチセンスオリゴマー（プライマー２）
2004519211.tif 000049
第２の亜鉛フィンガードメイン（Ｚｉｆ−２）
Ｚｉｆ−２、センスオリゴマー（プライマー３）
2004519211.tif 000050
Ｚｉｆ−２、アンチセンスオリゴマー（プライマー４）
2004519211.tif 000051
第３の亜鉛フィンガードメイン（Ｚｉｆ−３）
Ｚｉｆ−３、センスオリゴマー（プライマー５）
2004519211.tif 000052
Ｚｉｆ−３、アンチセンスオリゴマー（プライマー６）
2004519211.tif 000053
これらの各ＤＮＡコードフィンガードメインにおいて、Ｎは、Ｇ、Ａ、Ｔ、またはＣである。
【０１８５】
各対中の各ＤＮＡオリゴヌクレオチドの３’末端の１８個のヌクレオチドは、互いに相補的である。各対の第１の２つのＤＮＡオリゴヌクレオチド配列をアニーリングし、クレノウ断片を満たして１つのフィンガーをコードするＤＮＡ断片を作製する。さらに、亜鉛フィンガードメインの方向を確実に正確にするために、Ｚｉｆ−２ ＤＮＡ断片の５’末端の１８ｂｐは、Ｚｉｆ−１の３’末端の１８ｂｐおよびＺｉｆ−２の３’末端の１８ｂｐからＺｉｆ−３の５’末端の１８ｂｐに相補的である。したがって、これら３つのフィンガーＤＮＡを、特異的プライマーＯＴＳ−００７およびＯＴＳ−００８によって正確な方向でアセンブルさせることができる。
ＯＴＳ−００７：
2004519211.tif 000054
ＯＴＳ−００８：
2004519211.tif 000055
【０１８６】
実施例７
ビートカーリートップウイルス（ＢＣＴＶ）のＬ１部位の３フィンガーＺＦＰ
ＢＣＴＶの標的ＤＮＡ配列５’−ＴＴＧＧＧＴＧＣＴＣ−３’（配列番号：４４）に基づいて、３フィンガータンパク質をコードするＤＮＡを設計した。以下の６つのオリゴヌクレオチドを合成した。
Ｚｉｆ−１、センスオリゴマー（ＯＴＳ−２５４）
2004519211.tif 000056
Ｚｉｆ−１、アンチセンスオリゴマー（ＯＴＳ−２５５）
2004519211.tif 000057
Ｚｉｆ−２、センスオリゴマー（ＯＴＳ−２５６）
2004519211.tif 000058
Ｚｉｆ−２、アンチセンスオリゴマー（ＯＴＳ−２５７）
2004519211.tif 000059
Ｚｉｆ−３、センスオリゴマー（ＯＴＳ−２５８）
2004519211.tif 000060
Ｚｉｆ−３、アンチセンスオリゴマー（ＯＴＳ−２５９）
2004519211.tif 000061
【０１８７】
１）アニーリング
ＯＴＳ−２５４およびＯＴＳ−２５６の両方、ＯＴＳ−２５６およびＯＴＳ−２５７の両方、ならびにＯＴＳ−２５８およびＯＴＳ−２５９の両方（全て、１００ｐｍｏｌ／μｌ）５μｌを、それぞれＴＥＮ緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）／２ｍＭ ＥＤＴＡ／２００ｍＭ ＮａＣｌ）１０μｌに添加し、９５℃で５分間インキュベートし、室温に達するまで室温の加熱ブロック中に静置した。
【０１８８】
各アニーリング試料１μｌを、５単位のクレノウ断片および０．２５ｍＭのｄＮＴＰ混合物を含む反応緩衝液２０μｌ中、３７℃で１時間インキュベートした。インキュベーション後、５μｌのＨ２Ｏを各反応混合物に添加して、ＤＮＡ濃度を１ｐｍｏｌ／μｌに調整した。
【０１８９】
２）ＰＣＲアセンブリー
以下を混合し、ＰＣＲを行った。
2004519211.tif 000062
【０１９０】
反応産物を、２％アガロースゲルで分析し、１つの主要なバンドとして推定３００ｂｐのＤＮＡ断片が得られた。この産物をｐＥＴ−２１ａベクターにクローニングした後、ＤＮＡ配列決定により、これら３つのＤＮＡ断片が正確な方向でアセンブルされてＢＣＴＶのＬ１結合部位を標的とする人工ＺＦＰが産生されたことを確認した。無作為にアセンブルされた産物は観察されなかった。
【０１９１】
実施例８
５フィンガードメインのアセンブリー
５フィンガーＺＦＰを、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ＤＲＥＢ１Ａ遺伝子のプロモーターの１６ｂｐ配列を標的とするように設計した。
【０１９２】
１）ＢｓａＩ制限部位を含むＰＣＲプライマーを使用した３フィンガーＺＦＰおよび２フィンガーＺＦＰをコードするＤＮＡの調製
ＤＲＥＢ１Ａプロモーター中の配列
2004519211.tif 000063
を人工ＺＦＰによって標的ＤＮＡとして選択し、これを２つの１０ｂｐのＤＮＡ
2004519211.tif 000064
および
2004519211.tif 000065
に分割した。実施例７に記載のように、標的Ｂの２フィンガーＺＦＰ（ＺｉｆＡ）および標的Ａの３フィンガーＺＦＰ（ＺｉｆＢ）を調製した。ＺｉｆＡ ＤＮＡの３’末端をＺｉｆＢ ＤＮＡの５’末端にライゲーションしているので、ＺｉｆＡ ＤＮＡをプライマーＯＴＳ−００７およびＯＴＳ−４３０を用いたＰＣＲを用いて増幅し、ＺｉｆＢ ＤＮＡをＯＴＳ−４３１およびＯＴＳ−００８を用いて増幅させた。反応物を２％アガロースゲルで分析し、ＺｉｆＡおよびＺｉｆＢについてそれぞれ２フィンガーＺＦＰおよび３フィンガーＺＦＰの推定ＤＮＡが得られた。
【０１９３】
２）ＢｓａＩ消化
両ＰＣＲ産物（それぞれ０．５μｇ）を、２０単位のＢｓａＩエンドヌクレアーゼ酵素を含む反応緩衝液６０μｌ中、５０℃で１時間消化した。ＣｈｒｏｍａＳｐｉｎ＋ＴＥ−１００カラムを用いた精製後、フェノール抽出を行って、ＢｓａＩを除去した。２つの消化ＤＮＡ断片を、ＤＮＡリガーゼ酵素を使用して直接ライゲーションに供した（１６℃で一晩）。反応を２％アガロースゲルで分析し、８０％を超える産物が、推定ライゲーション産物であった。混合物を、ｐＥＴ−２１ａベクターへのクローニングに使用し、配列決定により、５フィンガードメインが正確な方向で構築されたことを確認した。
ＯＴＳ−４３０：
2004519211.tif 000066
（下線を付したヌクレオチドはＢｓａＩ部位である）
ＯＴＳ−４３１：
2004519211.tif 000067
（下線を付したヌクレオチドはＢｓａＩ部位である）
【０１９４】
実施例９
６フィンガーＺＦＰのモジュラーアセンブリー
図１０は、６フィンガーＺＦＰのアセンブリの方法を示す。例えば、３フィンガーＤＮＡを、ＰＣＲプライマーＯＴＳ−００７およびＯＴＳ−４２９によって３フィンガータンパク質Ｚｉｆ−ＡのＤＮＡから増幅し、第２の３フィンガーＤＮＡを、ＯＴＳ−４３１およびＯＴＳ−００８によって３フィンガータンパク質Ｚｉｆ−ＢのＤＮＡから増幅する。
ＯＴＳ−４２９：
2004519211.tif 000068
（下線を付したヌクレオチドはＢｓａＩ部位である）
【０１９５】
増幅後、ＤＮＡ断片をＢｓａＩで消化して、ＺｉｆＡおよびＺｉｆＢからそれぞれ５’−ＣＧＧＣ−３’および５’−ＧＣＣＧ−３’付着末端が産生される（図１０）。これらの付着末端は互いに相補的であり、２つの消化ＤＮＡ断片を、ＤＮＡリガーゼ酵素（例えば、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ）によって正確な方向でアセンブルすることができる。異なるプライマー組の使用により、４および５フィンガータンパク質を調製する。
【０１９６】
実施例１０
６フィンガードメインのＺＦＰへのアセンブリー
６フィンガーＺＦＰを、ＢＣＴＶの全Ｌ１部位を標的とするように設計した（クローン５、表５）。
【０１９７】
１）２つの３フィンガーＤＮＡの調製
Ｌ１標的部位は、
2004519211.tif 000069
であり、ＺＦＰ設計のために２つの１０ｂｐのＤＮＡ
2004519211.tif 000070
に分割した。３フィンガータンパク質標的化標的Ｂ（ＺｉｆＡ）および標的Ａに結合する別の３フィンガータンパク質（ＺｉｆＢ）のＤＮＡを、ＺｉｆＡについてはプライマーＯＴＳ−００７およびＯＴＳ−４２９を使用し、ＺｉｆＢについてはプライマーＯＴＳ−４３１およびＯＴＳ−００８を使用したＰＣＲを使用し、実施例７に記載の方法に従って調製した。反応物を２％アガロースゲルで分析し、推定ＤＮＡ断片を得た。
【０１９８】
２）ＢｓａＩ消化
両ＰＣＲ産物（それぞれ０．５μｇ）を、２０単位のＢｓａＩエンドヌクレアーゼ酵素を含む反応緩衝液６０μｌ中、５０℃で１時間消化した。ＣｈｒｏｍａＳｐｉｎ＋ＴＥ−１００カラムを用いた精製後、フェノール抽出を行って、ＢｓａＩを除去した。２つの消化ＤＮＡ断片を、ＤＮＡリガーゼ酵素を使用して直接ライゲーションを行った（１６℃で一晩）。反応を２％アガロースゲルで分析し、８０％を超える産物が、推定されたライゲーション産物であった。混合物を、ｐＥＴ−２１ａベクターへのクローニングに使用し、６フィンガードメインが正確な方向でアセンブルされたことが確認された。
【０１９９】
実施例１１
高親和性６フィンガーＺＦＰ
実施例１０に記載のように、クローン５のＤＮＡを、ｐＥＴ−２１ａの大腸菌発現ベクターのＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ部位にクローン化した。大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ株での発現後、ＳＤＳ／ＰＡＧＥによって判定したところ、タンパク質は９５％を上回る均一性で精製されていた。
【０２００】
人工ＺＦＰクローン５の親和性を決定するために、放射性標識Ｌ１標的ＤＮＡ二重鎖
2004519211.tif 000071
を使用してゲルシフトアッセイを行った。クローン５の濃度は、０ｎＭ、０．００３ｎＭ、０．０１ｎＭ、０．０３ｎＭ、０．１ｎＭ、および１ｎＭであった。ＺＦＰを、放射性標識プローブ（緩衝液１０μｌあたり０．０３ｆｍｏｌ）を含む１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）／１００ｍＭ ＮａＣｌ／１ｍＭ ＭｇＣｌ２／０．１ｍＭ ＺｎＣｌ２／１ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ／１０％グリセロールを含む溶液１０μＬ中、氷上に４０分間予備インキュベーションを行った。ポリ（ｄＡ−ｄＴ）２を１μｇ加え、インキュベーションを２０分間継続し、その後６％未変性ポリアクリルアミドゲル（０．５×ＴＢ）にロードし、４℃で２時間１４０Ｖで電気泳動を行った。放射性シグナルを、Ｘ線フィルムに感光した。
【０２０１】
クローン５について、大多数のＤＮＡプローブが３ｐＭにおいてさえもタンパク質に結合する。したがって、解離定数は３ｐＭ未満である。２つのさらなるＺＦＰを合成し（クローン６および７；表４）、類似の高親和性のタンパク質を産生した。
【０２０２】
実施例１２
さらなるＺＦＰの設計、産生、および分析
Ｓｐ１Ｃドメイン２フレームワークおよび、表２に示す−１位、２位、３位、６位のアミノ酸を使用し、実施例７および９の戦略にしたがって、さらなるマルチフィンガーＺＦＰを設計および合成した。各ＺＦＰの標的配列およびＺＦＰのその標的に対する解離定数を表４に示す。
【０２０３】
トマトゴールデンモザイクウイルス（ＴＧＭＶ）およびビートカーリートップウイルス（ＢＣＴＶ）ゲノムでは、標的部位は、ジェミニウイルス複製の重要な部位である（クローン１および２）。他の標的部位は、植物遺伝子シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）ＤＲＥＢ１Ａ（耐乾燥性遺伝子；クローン３）およびＮＩＭ１（浸透移行性獲得耐性；クローン４）のプロモーター中のＴＡＴＡボックスからおよそ５０ｂｐ〜１００ｂｐ上流で見出された配列である。
【０２０４】
これらの実験では、設計したＺＦＰのコード領域を、発現ベクターｐＥＴ−２１ａ（Ｎｏｖａｇｅｎ）のＥｃｏＲＩ部位およびＨｉｎｄＩＩＩ部位にクローン化した。次いで、タンパク質過剰発現のために、得られたプラスミドを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳに導入した。培養物６０ｍＬを３７℃でＯＤ６００＝０．６〜０．７５まで成長させ、１ｍＭ ＩＰＴＧで３時間誘導し、溶解緩衝液１０ｍｌあたり１錠のＥＤＴＡ非含有Ｃｏｍｐｌｅｔｅ， Ｍｉｎｉ（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）を含む冷溶解緩衝液（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）／１Ｍ ＮａＣｌ／１ｍＭ ＺｎＣｌ２／５ｍＭ ジチオトレイトール）中で超音波処理機を使用して溶解した。ポリエチレンイミン（ｐＨ７．０、０．６％）での処理および４０％（ＮＨ４）２ＳＯ４での沈殿後、得られたペレットを、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）／１００ｍＭ ＮａＣｌ／０．１ｍＭ ＺｎＣｌ２／５ｍＭジチオトレイトール緩衝液中に溶解し、３００ｍＭ ＮａＣｌ緩衝液で溶出するＢｉｏ−Ｒｅｘ７０カラムでのクロマトグラフィーによって精製した。ＳＤＳ／ＰＡＧＥで判定したところ、全ての精製タンパク質は９５％をを上回る均一性を有していた。タンパク質濃度を、プロテインアッセイＥＳＬ（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）を使用して決定した。
【０２０５】
ＤＮＡ結合アッセイのために、５’末端を［γ−３２Ｐ］ＡＴＰで標識した２６塩基対の合成オリゴヌクレオチドを、ゲル遅延アッセイで使用した。５つを超えるフィンガードメインを有するＺＦＰのプローブを、クレノウ断片ならびに［α−３２Ｐ］ｄＡＴＰおよび［α−３２Ｐ］ｄＴＴＰで標識して、高放射能を得た。ＺＦＰを、放射性標識プローブ（緩衝液１０μｌあたり１ｆｍｏｌ）を含む１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）／１００ｍＭ ＮａＣｌ／１ｍＭ ＭｇＣｌ２／０．１ｍＭ ＺｎＣｌ２／１ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ／１０％グリセロール１０μＬ中、氷上で４０分間予備インキュベーションを行った。ポリ（ｄＡ−ｄＴ）２を１μｇ添加し、インキュベーションを２０分間継続し、その後６％未変性ポリアクリルアミドゲル（０．５×ＴＢ）にロードし、４℃で２時間１４０Ｖで電気泳動を行った。マルチフィンガータンパク質のために、０．０３ｆｍｏｌの放射性標識プローブを使用した。放射能シグナルをＰｈｏｓｐｈｏｒＩｍａｇｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ）で定量し、Ｘ線フィルムに感光した。ＫＡＬＥＩＤＡＧＲＡＰＨプログラム（Ｓｙｎｅｒｇｙ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）でのカーブフィッティングによって解離定数を計算した。
【０２０６】
設計した３フィンガータンパク質および６フィンガータンパク質を使用してゲルシフトアッセイを行い、Ｋｄ値を計算した。クローン１〜４のＫｄの測定値は、それぞれ１８ｎＭ、１５ｎＭ、１１ｎＭ、および２３ｎＭであった。クローン５〜７について、Ｋｄは全て３ｐＭ未満であった。
【０２０７】
【表５】
2004519211.tif 000072
【０２０８】
クローン１〜７の標的配列を、それぞれ配列番号：６１〜６７と呼ぶ。
【図面の簡単な説明】
【図１】亜鉛フィンガードメイン１単位の、４塩基対ＤＮＡ標的部位への結合を示す概略図である。−１位、２位、３位、および６位の残基は、それぞれ独立して１つの塩基に接触している。−１位とは、亜鉛フィンガードメイン中のαヘリックスの始点である。
【図２】アミノ酸との、既知および可能な塩基相互作用を示す。グアニンとヒスチジンとの間で示されるものに類似した相互作用を、水素結合を提供する他のアミノ酸（セリンおよびリジン）を用いて作製することができる。チミジンとトレオニンとの間で示されるものに類似した相互作用を、他の疎水性アミノ酸を用いて作製することができる。チミジンとトレオニン／セリンとの間で示されるものに類似した相互作用を、水素結合を提供する他のアミノ酸を使用して作製することができる。
【図３】亜鉛フィンガードメインの２位のアミノ酸による、４塩基対ＤＮＡ標的配列中の第４の塩基の認識を示す。
【図４】野生型トランスポザーゼ（左）および操作型（人工）トランスポザーゼ（右）の概略図である。
【図５】ＺＦＰを使用して部位特異的ゲノムノックアウトおよびゲノムノックインを行う方法を示す概略図である。
【図６】小分子を使用した、ＺＦＰの核への転位を操作するための分子スイッチ法を示す略図である。
【図７】トマトゴールデンモザイクウイルス中のＡＬ１結合部位を標的とするＺＦＰの設計を示す概略図である。ＡＬ１標的部位は配列番号：１４であり、Ｚｉｆ１は配列番号：１５であり、Ｚｉｆ２は配列番号：１６であり、Ｚｉｆ３は配列番号：１７である。Ｚｉｆは亜鉛フィンガードメインである。
【図８】示された亜鉛フィンガードメインの２位でのＡｓｐ（左）およびＧｌｙ（右）変異体のＤＮＡ塩基選択性を示す棒グラフを示す。
【図９】ドナーベクター由来のカナマイシン耐性遺伝子（ＫａｎＲ）の、アクセプターベクター内の標的配列への転位を示す概略図である。
【図１０】６フィンガーＺＦＰのアセンブリーを示す概略図である。
【図１】
2004519211.tif 000087
【図２】
2004519211.tif 000088
【図３】
2004519211.tif 000089
【図４】
2004519211.tif 000090
【図５】
2004519211.tif 000091
【図６】
2004519211.tif 000092
【図７】
2004519211.tif 000093
【図８】
2004519211.tif 000094
【図９】
2004519211.tif 000095
【図１０】
2004519211.tif 000096
【国際公開パンフレット】
2004519211.tif 000097
2004519211.tif 000098
2004519211.tif 000099
2004519211.tif 000100
2004519211.tif 000101
2004519211.tif 000102
2004519211.tif 000103
2004519211.tif 000104
2004519211.tif 000105
2004519211.tif 000106
2004519211.tif 000107
2004519211.tif 000108
2004519211.tif 000109
2004519211.tif 000110
2004519211.tif 000111
2004519211.tif 000112
2004519211.tif 000113
2004519211.tif 000114
2004519211.tif 000115
2004519211.tif 000116
2004519211.tif 000117
2004519211.tif 000118
2004519211.tif 000119
2004519211.tif 000120
2004519211.tif 000121
2004519211.tif 000122
2004519211.tif 000123
2004519211.tif 000124
2004519211.tif 000125
2004519211.tif 000126
2004519211.tif 000127
2004519211.tif 000128
2004519211.tif 000129
2004519211.tif 000130
2004519211.tif 000131
2004519211.tif 000132
2004519211.tif 000133
2004519211.tif 000134
2004519211.tif 000135
2004519211.tif 000136
2004519211.tif 000137
2004519211.tif 000138
2004519211.tif 000139
2004519211.tif 000140
2004519211.tif 000141
2004519211.tif 000142
2004519211.tif 000143
2004519211.tif 000144
2004519211.tif 000145
2004519211.tif 000146
2004519211.tif 000147
2004519211.tif 000148
2004519211.tif 000149
2004519211.tif 000150
2004519211.tif 000151
2004519211.tif 000152
2004519211.tif 000153
2004519211.tif 000154
2004519211.tif 000155
2004519211.tif 000156
2004519211.tif 000157
2004519211.tif 000158
2004519211.tif 000159
2004519211.tif 000160
2004519211.tif 000161
2004519211.tif 000162
2004519211.tif 000163
2004519211.tif 000164
2004519211.tif 000165
2004519211.tif 000166
2004519211.tif 000167
2004519211.tif 000168
2004519211.tif 000169
2004519211.tif 000170
2004519211.tif 000171
2004519211.tif 000172
2004519211.tif 000173
2004519211.tif 000174
2004519211.tif 000175
2004519211.tif 000176
2004519211.tif 000177
2004519211.tif 000178
2004519211.tif 000179
2004519211.tif 000180
2004519211.tif 000181
2004519211.tif 000182
2004519211.tif 000183
2004519211.tif 000184
2004519211.tif 000185
2004519211.tif 000186
2004519211.tif 000187
2004519211.tif 000188
2004519211.tif 000189
2004519211.tif 000190
2004519211.tif 000191
2004519211.tif 000192
2004519211.tif 000193
2004519211.tif 000194
2004519211.tif 000195
2004519211.tif 000196
2004519211.tif 000197
2004519211.tif 000198
2004519211.tif 000199
2004519211.tif 000200
2004519211.tif 000201
2004519211.tif 000202
2004519211.tif 000203
2004519211.tif 000204
2004519211.tif 000205
2004519211.tif 000206
2004519211.tif 000207
2004519211.tif 000208
2004519211.tif 000209
2004519211.tif 000210
2004519211.tif 000211
2004519211.tif 000212
2004519211.tif 000213
2004519211.tif 000214
2004519211.tif 000215
2004519211.tif 000216
2004519211.tif 000217
2004519211.tif 000218
2004519211.tif 000219
2004519211.tif 000220
2004519211.tif 000221
2004519211.tif 000222
2004519211.tif 000223
2004519211.tif 000224
2004519211.tif 000225
2004519211.tif 000226
2004519211.tif 000227
2004519211.tif 000228
2004519211.tif 000229
2004519211.tif 000230
2004519211.tif 000231
2004519211.tif 000232
2004519211.tif 000233
2004519211.tif 000234
2004519211.tif 000235
2004519211.tif 000236
2004519211.tif 000237
2004519211.tif 000238
2004519211.tif 000239
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004519211.tif 000240
2004519211.tif 000241
【国際調査報告】
2004519211.tif 000242
2004519211.tif 000243
2004519211.tif 000244
2004519211.tif 000245
2004519211.tif 000246
2004519211.tif 000247
2004519211.tif 000248
2004519211.tif 000249
2004519211.tif 000250
2004519211.tif 000251
2004519211.tif 000252
2004519211.tif 000253
2004519211.tif 000254
2004519211.tif 000255
2004519211.tif 000256