(57)【要約】乳房組織から転写されるＢＳ１０６と称されるポリペプチドを含む多量体ポリペプチド抗原を記載する。これらの配列は、個体における乳癌などの乳房の疾患または状態の検出、診断、病期分類、モニター、予後判定または素因の判定に有用である。ＢＳ１０６コード化ポリペプチドまたはタンパク質に特異的に結合する抗体も提供する。
2004503208.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つのＢＵ１０６ポリペプチドを含んでなる精製された多量体ポリペプチド抗原（ＭＰＡ）であって、該ポリペプチドが、配列番号２０〜３３中のポリペプチドに対して少なくとも５０％の同一性を有し、少なくとも他のポリペプチドが、一緒になって、少なくとも２００Ｋｄの分子量を形成していることを特徴とする精製された多量体ポリペプチド抗原（ＭＰＡ）。
【請求項２】
該ポリペプチドがジスルフィド結合により複合体を形成している、請求項１記載のＭＰＡ。
【請求項３】
少なくとも１つのＢＳ１０６ポリペプチドを含んでなる精製された多量体ポリペプチド抗原（ＭＰＡ）であって、該ポリペプチドが、配列番号２０〜３３中のポリペプチドに対して少なくとも５０％の同一性を有し、該ポリペプチドが、別のペプチドと複合体を形成して約１２０Ｋｄの分子量を有する還元できない複合体を形成していることを特徴とする精製された多量体ポリペプチド抗原（ＭＰＡ）。
【請求項４】
多量体ポリペプチド抗原（ＭＰＡ）を含有すると疑われる試験サンプル中の多量体ポリペプチド抗原（ＭＰＡ）の存在を検出する方法であって、該ＭＰＡが、少なくとも１つのＢＵ１０６ポリペプチドおよび、少なくとも、１つの他のポリペプチドを含み、該ＭＰＡが、２００Ｋｄを超える分子量を有し、該方法が、
（ａ）抗原／抗体複合体を形成させるのに十分な時間および条件下、該ＭＰＡのエピトープの少なくとも１つに特異的な少なくとも１つの抗体に該試験サンプルを接触させ、
（ｂ）該複合体を検出する工程を含み、該検出における該複合体の存在が、該試験サンプル中の該ＭＰＡの存在を示すことを特徴とする方法。
【請求項５】
多量体ポリペプチド抗原（ＭＰＡ）を含有すると疑われる試験サンプル中の多量体ポリペプチド抗原（ＭＰＡ）の存在を検出する方法であって、該ＭＰＡが、少なくとも１つのＢＵ１０６ポリペプチドおよび、少なくとも、１つの他のポリペプチドを含み、該ＭＰＡが、約１２０Ｋｄを超える分子量を有し、該方法が、
（ａ）抗原／抗体複合体を形成させるのに十分な時間および条件下、該ＭＰＡのエピトープの少なくとも１つに特異的な少なくとも１つの抗体に該試験サンプルを接触させ、
（ｂ）該複合体を検出する工程を含み、該複合体の検出が、該試験サンプル中の該ＭＰＡの存在を示すことを特徴とする方法。
【請求項６】
ＢＵＳ１０６ポリペプチドを含んでなる精製されたポリペプチド抗原であって、該ポリペプチドが、配列番号２０〜３３よりなる群から選ばれるポリペプチドに対して少なくとも５０％の同一性を有し、該ポリペプチドが、複数の部位において共有結合した少なくとも２つの炭水化物を有し、該部位が、セリン残基部位およびトレオニン残基部位よりなる群から選ばれることを特徴とする精製されたポリペプチド抗原。
【請求項７】
ＢＳ１０６ポリペプチドを含んでなる精製されたポリペプチド抗原であって、該ポリペプチドが、配列番号２０〜３３よりなる群から選ばれるポリペプチドに対する少なくとも５０％の同一性および少なくとも１つの炭水化物を有することを特徴とする精製されたポリペプチド抗原。
【請求項８】
少なくとも１つのＢＵ１０６ポリペプチドおよび少なくとも１つの他のポリペプチド（これらは一緒になって複合体を形成している）を含んでなる精製された多量体ポリペプチド抗原（ＭＰＡ）であって、該複合体が、約５０〜８０ｋＤの分子量を有することを特徴とする精製された多量体ポリペプチド抗原（ＭＰＡ）。
【請求項９】
請求項１記載のＭＰＡに特異的に結合する抗体。
【請求項１０】
請求項３記載のＭＰＡに特異的に結合する抗体。
【請求項１１】
請求項６記載の抗原に特異的に結合する抗体。
【請求項１２】
請求項７記載の抗原に特異的に結合する抗体。
【請求項１３】
請求項８記載の抗原に特異的に結合する抗体。
【請求項１４】
１０６Ｃ１と称される細胞系。
【請求項１５】
該複合体の検出が乳房疾患を示す、請求項４記載の方法。
【請求項１６】
該複合体の検出が乳房疾患を示す、請求項５記載の方法。
【請求項１７】
少なくとも１つのＢＳ１０６マーカーと少なくとも１つの他の乳房特異的マーカーとを含む乳房マーカーのパネルを含んでなる診断用キット。
【請求項１８】
ＢＵ１０６ポリペプチドに特異的に結合する抗体であって、該ＢＵ１０６ポリペプチドが配列番号２０〜３３に対して少なくとも５０％の同一性を有することを特徴とする抗体。
【請求項１９】
（ａ）患者のサンプルを準備し、
（ｂ）約２００Ｋｄおよび１２０Ｋｄよりなる群から選ばれる分子量を有するポリペプチドに関して該サンプルを分析し、
（ｃ）該分子量を有するポリペプチドの存在を検出することを含んでなるＢＵ１０６の検出方法。
【請求項２０】
ヒト患者からの組織サンプル中に癌細胞が存在する場合に該癌細胞を検出するための方法であって、患者からの組織サンプルをＢＵ１０６の認識剤と接触させ、調製したサンプル中のＢＵ１０６タンパク質への該認識剤の結合を、該組織サンプル中の癌細胞の存在の指標として検出することを含んでなる方法。
【請求項２１】
癌細胞の存在に関して試験する組織サンプルを患者から得、ＢＵ１０６タンパク質と反応する認識剤に該調製サンプルを接触させる前に、サンプル調製プロセスにおいて調製サンプルを作製する工程を含む、請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
サンプル中のＢＵ１０６タンパク質への該認識剤の結合を免疫組織化学的分析により検出する、請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
該サンプル調製プロセスが、該組織を固定剤と接触させ、免疫組織化学的分析に適した薄片を作製することを含む、請求項２２記載の方法。
【請求項２４】
該ＢＵ１０６が複合体形態である、請求項２０記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の背景）
本発明は、一般には、乳房の疾患の検出に関する。特に、本発明は、ポリヌクレオチド配列、それにコードされるポリペプチド配列などの試薬、およびこれらの配列を利用する方法に関する。これらは、乳癌などの乳房の疾患または状態の検出、診断、病期分類、モニター、予後判定、予防もしくは治療または素因の判定に有用である。
【０００２】
乳癌は、米国において女性に生じる癌の最も一般的な形態である。米国における乳癌の発生は、１９９９年の間に１７５，０００例が診断され、４３，３００例の乳癌関連死が生じたと推定されている（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｓｏｃｉｅｔｙの統計）。世界的にみて、乳癌の発生は、１９８５年の７００，０００件から１９９０年の約９００，０００件に増加している（Ｇ．Ｎ．Ｈｏｒｔｏｂａｇｙｉら，ＣＡ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｊ　Ｃｌｉｎ　４５：１９９−２２６（１９９５））。
【０００３】
乳癌などの乳房の疾患または状態の検出、診断、病期分類、モニター、予後判定、予防もしくは治療または素因の判定のための方法は、患者の成り行きに非常に重要である。例えば、初期乳癌と診断された患者は、９０％を超える５年相対生存率を有するが、遠隔転移乳癌と診断された患者の生存率は約２０％である（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｓｏｃｉｅｔｙの統計）。現在のところ、初期乳癌の最良の初期指標は、乳房の検診および乳房撮影である（Ｊ．Ｒ．Ｈａｒｒｉｓら，Ｃａｎｃｅｒ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ　ａｎｄ　Ｐｒａｃｔｉｃｅ　ｏｆ　Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，第４版，ｐｐ．１２６４−１３３２，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ：Ｊ／Ｂ．Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ　Ｃｏ．（１９９３））。乳房撮影は、乳癌が検診により検出されうる前に乳癌を検出することが可能であるが、それにも限界がある。例えば、乳房撮影の予測値は、観察者の技量と乳房Ｘ線像の質とに左右される。また、疑わしい乳房Ｘ線像の８０〜９３％は偽陽性であり、乳癌の女性の１０〜１５％が偽陰性の乳房Ｘ線像を有する（Ｃ．Ｊ．Ｗｒｉｇｈｔら，Ｌａｎｃｅｔ　３４６：２９−３２（１９９５））。より高感度であり初期乳癌の検出に特異的な新規診断方法が必要とされているのは明らかである。
【０００４】
乳癌患者は、療法に対する応答を判定し持続性もしくは再発性の疾患または初期遠隔転移を検出するために、初期療法後およびアジュバント療法中に綿密にモニターされる。乳癌をモニターするための現在の診断方法には、乳房撮影、骨スキャン、胸部Ｘ線写真、肝機能試験および血清マーカーに関する試験が含まれる。患者をモニターするために最も一般的に使用される血清腫瘍マーカーは、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）およびＣＡ　１５−３である。ＣＥＡの制約には、転移性疾患の女性の約４０％において血清レベルの上昇が認められないことが含まれる。さらに、アジュバント療法中のＣＥＡの上昇は、再発と関連せずに、臨床的に重要でない他の要因と関連している可能性がある。また、ＣＡ　１５−３は、かなりの数の進行性疾患患者において陰性となる可能性があり、したがって転移を予測するものではない。ＣＥＡおよびＣＡ　１５−３は共に、悪性でない良性状態において上昇することがあり、偽陽性結果を与えうる。したがって、癌再発の検出の際により高感度で特異的な乳関連マーカーを見出すことは、臨床的に有益であろう（Ｊ．Ｒ．　Ｈａｒｒｉｓら，前掲；Ｍ．Ｋ．Ｓｃｈｗａｒｔｚら，Ｃａｎｃｅｒ：　Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ　ａｎｄ　Ｐｒａｃｔｉｃｅ　ｏｆ　Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１，第４版，ｐｐ．５３１−５４２，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ：Ｊ／Ｂ．Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ　Ｃｏ．（１９９３））。
【０００５】
乳癌の処置におけるもう１つの重要な段階は、患者の病期を決定することである。なぜなら、それは、潜在的な予後的価値を有し、最適療法の設計のための基準を与えるからである。現在のところ、乳癌の病理学的病期分類が、臨床的病期分類より好ましい。なぜなら、前者は、より正確な予後判定を与えるからである（Ｊ．Ｒ．Ｈａｒｒｉｓら，前掲）。一方、臨床的病期分類が病理学的病期分類と少なくとも同程度の精度である場合には、臨床的病期分類が好ましいであろう。なぜなら、それは、病理学的評価用の組織を得るための侵襲的な方法に依存しないからである。異なる侵入段階を識別しうる血清中または尿中の新規マーカーを検出することにより、乳癌の病期分類を改善することが可能であろう。そのようなマーカーは、乳房中の原発性癌に由来するが血液、骨髄またはリンパ節中に存在する細胞により発現されるｍＲＮＡまたはタンパク質マーカーであることが可能であり、これらの遠位器官に対する転移に関する高感度の指標となる可能性がある。例えば、乳上皮細胞に関連した特異的なタンパク質抗原およびｍＲＮＡが、それぞれ免疫組織化学的技術およびＲＴ−ＰＣＲにより、乳癌患者の骨髄、リンパ節および血液中で検出されており、転移を示唆している（Ｋ．Ｐａｎｔｅｌら，Ｏｎｋｏｌｏｇｉｅ　１８：３９４−４０１（１９９５））。
【０００６】
また、そのような方法には、免疫学的方法により検出可能で侵襲性が可能な限り小さい方法により得られる血液、血漿、血清、尿などの試験サンプル中の種々の疾患マーカーの出現に基づくアッセイが含まれうるであろう。これらの方法は、乳房の疾患を有する患者を医師が処置するのを助ける情報を、患者に軽い負担で提供するであろう。前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）およびヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）などのマーカーが存在し、そのようなマーカーは、それぞれ前立腺癌および精巣癌に関して患者をスクリーニングするために臨床的に使用されている。例えば、ＰＳＡは、通常、前立腺から精液中に高レベルで分泌されるが、正常な前立腺を有する男性の血液中には非常に低レベルでしか存在しない。上昇したレベルの血清中ＰＳＡタンパク質は、無症候の男性における前立腺の癌または疾患の初期検出において用いることができる。例えば、Ｇ．Ｅ．Ｈａｎｋｓら，Ｃａｎｃｅｒ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ　ａｎｄ　Ｐｒａｃｔｉｃｅ　ｏｆ　Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１，第４版，　ｐｐ．１０７３−１１１３，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ：Ｊ．Ｂ．Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ　Ｃｏ．１９９３、Ｍ．Ｋ．Ｓｃｈｗａｒｚら，Ｃａｎｃｅｒ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ　ａｎｄ　Ｐｒａｃｔｉｃｅ　ｏｆ　Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１，第４版，ｐｐ．５３１−５４２，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ：Ｊ．Ｂ．Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ　Ｃｏ．１９９３を参照されたい。同様に、乳房中で正常に発現されるが、乳房の疾患の結果、不適当な身体画分中に、上昇した量で見出される新規マーカーを利用することにより、乳房疾患の処置を改善することが可能であろう。
【０００７】
また、初期乳癌の生物学的挙動を予想しうる新規マーカーも、非常に貴重であろう。患者の生命を脅かす又は脅かすことになる初期乳癌は、それを脅かさない又は脅かすことにならないものより臨床的に重要である（Ｇ．Ｅ．Ｈａｎｋｓ，前掲）。組織学的に陰性のリンパ節を有するいずれの患者に癌が再発するかを予想するために、また、上皮内導管癌のいずれの症例が侵襲性乳癌に進展するのかを予想するために、そのようなマーカーが必要とされている。より正確な予後マーカーは、積極的に治療しなければ進行し転移する乳房限局性初期癌を医師が正確に同定することを可能にするであろう。さらに、侵襲性癌に関するマーカーが患者に存在しないことを示すことができれば、患者は、高価で無益な治療を受けなくてすむであろう（Ｊ．Ｒ．Ｈａｒｒｉｓら，前掲、Ｅ．Ｒ．Ｆｒｙｋｂｅｒｇら，Ｃａｎｃｅｒ　７４：３５０−３６１（１９９４））。
【０００８】
したがって、乳房の疾患または状態の検出、診断、病期分類、モニター、予後判定、予防もしくは治療または素因の判定のための特異的な方法および試薬を提供することは有益であろう。そのような方法は、乳房に関連した疾患および状態（例えば、癌）において過剰発現される遺伝子の産物に関して試験サンプルをアッセイすることを含むであろう。また、そのような方法は、乳房に関連した疾患または状態（例えば、癌）により改変した遺伝子の産物に関して試験サンプルをアッセイすることを含みうる。例えば、これらのアッセイは、体内で生じうる可能な翻訳後修飾を考慮して遺伝子産物（タンパク質）を検出するための方法を含むであろう。そのような翻訳後修飾は、タンパク質分解プロセシング、鎖末端の改変、グリコシル化、脂質結合、硫酸化、γカルボキシル化、ヒドロキシル化、リン酸化、ＡＤＰ−リボシル化、ジスルフィド結合形成、トランスグルタミネーション（ｔｒａｎｓｇｌｕｔａｍｉｎａｔｉｏｎ）、ならびに多サブユニット複合体の形成における補因子、インヒビター（小分子およびタンパク質の両方）、アクチベーター（小分子およびタンパク質の両方）および他のタンパク質のような分子との複数の非共有的相互作用を含みうる。例えば、Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎら，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ　ａｎｄ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，第２版，ｐｐ．７８−１０２，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ，ＮＹ：Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ　ａｎｄ　Ｃｏ．１９９３を参照されたい。配列特異的であるため予測的である修飾もあれば、そうではなく実験的データのみにより観察されるものもある。そのような方法は更に、身体の種々の組織および画分中の分布が乳房関連疾患または状態（例えば、癌）により改変している遺伝子の産物に関して試験サンプルをアッセイすることを含みうる。そのような方法は、試験サンプル中のｍＲＮＡからｃＤＮＡを調製し、必要に応じて、該遺伝子またはその断片に対応するｃＤＮＡの一部を増幅し、癌などの疾患または状態の存在の指標としてｃＤＮＡ産物を検出し、または遺伝子配列を含むｍＲＮＡの翻訳産物を該疾患の存在の指標として検出することを含むであろう。有用な試薬には、生検組織、血液または他の試験サンプルから抽出したｍＲＮＡの逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）、ＰＣＲまたはハイブリダイゼーションアッセイなどの診断方法において使用しうるポリヌクレオチドまたはその断片；またはそのようなｍＲＮＡの翻訳産物であるタンパク質；またはこれらのタンパク質に対する抗体が含まれる。そのようなアッセイは、該遺伝子の産物に関してサンプルをアッセイし該産物を乳房の疾患の指標として検出するための方法を含むであろう。乳房の疾患および状態（例えば、癌）に対する薬物療法または遺伝子治療は、これらの同定された遺伝子配列またはそれらの発現されたタンパク質に基づくことが可能であり、いずれかの特定の療法の効力がモニターされうる。さらに、初期段階の乳房疾患（例えば、癌）を検出しうる代替的な非外科的診断方法が利用可能になれば、有益であろう。
【０００９】
（発明の概要）
本発明は、試験サンプル中の標的ＢＳ１０６ポリヌクレオチドを検出する方法であって、該試験サンプルを、少なくとも１つのＢＳ１０６特異的ポリヌクレオチドと接触させ、該試験サンプル中の標的ＢＳ１０６ポリヌクレオチドの存在を検出することを含んでなる方法を提供する。ＢＳ１０６特異的ポリヌクレオチドは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６およびそれらの断片または相補体よりなる群から選ばれるポリヌクレオチドに対して少なくとも５０％の同一性を有する。また、該方法を行なう前に、ＢＳ１０６特異的ポリヌクレオチドを固相に結合させることが可能である。
【００１０】
本発明はまた、試験サンプル中のＢＳ１０６　ｍＲＮＡを検出する方法であって、少なくとも１つのプライマーで逆転写（ＲＴ）を行なってｃＤＮＡを得、得られたｃＤＮＡを、ＢＳ１０６オリゴヌクレオチドをセンスプライマーおよびアンチセンスプライマーとして使用して増幅して、ＢＳ１０６アンプリコンを得、試験サンプル中のＢＳ１０６　ｍＲＮＡの存在の指標として該ＢＳ１０６アンプリコンの存在を検出することを含んでなり、該ＢＳ１０６オリゴヌクレオチドが、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６およびそれらの断片または相補体よりなる群から選ばれる配列に対して少なくとも５０％の同一性を有することを特徴とする方法を提供する。増幅は、ポリメラーゼ連鎖反応により行なうことができる。また、該方法を行なう前、増幅の前または検出の前に、該試験サンプルを固相と反応させることが可能である。この反応は、直接的または間接的な反応でありうる。さらに、該検出工程は、測定可能なシグナルを生成しうる検出可能な標識の使用を含みうる。この検出可能な標識は、固相に結合させることが可能である。
【００１１】
本発明は更に、標的ＢＳ１０６ポリヌクレオチドを含有する疑いのある試験サンプル中の標的ＢＳ１０６ポリヌクレオチドの検出方法であって、（ａ）該試験サンプルを、センスプライマーとしての少なくとも１つのＢＳ１０６オリゴヌクレオチドおよびアンチセンスプライマーとしての少なくとも１つのＢＳ１０６オリゴヌクレオチドと接触させ、それを増幅して第１段階反応産物を得、（ｂ）該第１段階反応産物を少なくとも１つの他のＢＳ１０６オリゴヌクレオチドと接触させて、第２段階反応産物を得（ただし、前記の、他のＢＳ１０６オリゴヌクレオチドは、工程（ａ）で使用したＢＳ１０６オリゴヌクレオチドの３’側に位置し、該第１段階反応産物に相補的である）、（ｃ）該試験サンプル中の標的ＢＳ１０６オリヌクレオチドの存在の指標として該第２段階反応産物を検出することを含んでなる方法を提供する。該方法において試薬として選択するＢＳ１０６オリゴヌクレオチドは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６およびそれらの断片または相補体よりなる群から選ばれる配列に対して少なくとも５０％の同一性を有する。増幅は、ポリメラーゼ連鎖反応により行なうことができる。また、該方法を行なう前、または増幅の前、または検出の前に、該試験サンプルを固相と直接的または間接的に反応させることが可能である。また、該検出工程は、測定可能なシグナルを生成しうる検出可能な標識の使用を含む。さらに、この検出可能な標識を固相に結合させることが可能である。また、試験サンプル中の標的ＢＳ１０６ポリヌクレオチドを検出するのに有用な試験キットであって、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６およびそれらの断片または相補体よりなる群から選ばれる少なくとも１つのＢＳ１０６特異的ポリヌクレオチドを含有する容器を含んでなる試験キットを提供する。これらの試験キットは更に、試験サンプル（例えば、血液、尿、唾液および糞便）を採集するのに有用な手段を有する容器を含む。そのような手段には、血液を採集し安定化するためのランセットおよび吸収紙または布、唾液を採集し安定化するためのスワブ、ならびに尿または糞便サンプルを採集し安定化するためのカップが含まれる。該サンプルの変性または不可逆的吸着を避けるために、所望により、紙、布、スワブ、カップなどの採集材料を処理することが可能である。また、試料の完全性を維持するのを助けるために、該採集材料を保存剤、安定剤または抗微生物剤で処理したり、該採集材料に保存剤、安定剤または抗微生物剤を含有させることが可能である。
【００１２】
本発明は、ＢＳ１０６遺伝子に由来する精製されたポリヌクレオチドまたはその断片を提供する。該精製ポリヌクレオチドは、ＢＳ１０６遺伝子またはその相補体の核酸に選択的にハイブリダイズしうる。該ポリヌクレオチドは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６およびそれらの断片または相補体よりなる群から選ばれるポリヌクレオチドに対して少なくとも５０％の同一性を有する。さらに、該精製ポリヌクレオチドは、組換えおよび／または合成技術により製造することができる。該精製組換えポリヌクレオチドは組換えベクター中に含有されうる。本発明はさらに、該ベクターでトランスフェクトされた宿主細胞を含む。
【００１３】
本発明は更に、ＢＳ１０６に由来するオープンリーディングフレームを含む核酸配列を含んでなる組換え発現系を提供する。該核酸配列は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６およびそれらの断片または相補体よりなる群から選ばれる配列に対して少なくとも５０％の同一性を有する。該核酸配列は、所望の宿主に和合性の制御配列に作動的に結合している。また、この組換え発現系でトランスフェクトされた細胞を提供する。
【００１４】
本発明はまた、ＢＳ１０６にコードされるポリペプチドを提供する。該ポリペプチドは、組換え技術により製造されたり、精製形態で提供されたり、あるいは合成技術により製造されうる。該ポリペプチドは、配列番号２０〜３３よりなる群から選ばれるアミノ酸配列に対して少なくとも５０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【００１５】
また、少なくとも１つのＢＳ１０６エピトープに特異的に結合する抗体を提供する。該抗体はポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体でありうる。該エピトープは、配列番号２０〜３３およびそれらの断片よりなる群から選ばれるアミノ酸配列に由来する。試験サンプル中のＢＳ１０６抗原または抗ＢＳ１０６抗体の存在を判定するためのアッセイキットも含まれる。１つの実施態様では、該アッセイキットは、配列番号２０〜３３およびそれらの断片よりなる群から選ばれるアミノ酸配列に対して少なくとも５０％の同一性を有する少なくとも１つのＢＳ１０６ポリペプチドを含有する容器を含む。さらに、該試験キットは、試験サンプル（例えば、血液、尿、唾液および糞便）を採集するのに有用な手段を有する容器を含みうる。そのような手段には、血液を採集し安定化するためのランセットおよび吸収紙または布、唾液を採集し安定化するためのスワブ、ならびに尿または糞便サンプルを採集し安定化するためのカップが含まれる。該サンプルの変性または不可逆的吸着を避けるために、所望により、紙、布、スワブ、カップなどの採集材料を処理することが可能である。また、試料の完全性を維持するのを助けるために、これらの採集材料を保存剤、安定剤または抗微生物剤で処理したり、該採集材料に保存剤、安定剤または抗微生物剤を含有させることが可能である。また、該ポリペプチドを固相に結合させることが可能である。
【００１６】
本発明のもう１つの実施形態においては、疾患または状態を検出または診断する目的に、患者における該抗原の局在化を検出またはイメージ化するために、該ＢＳ１０６抗原に対する抗体またはその断片（フラグメント）を使用することができる。そのような抗体はポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体であることが可能であり、あるいは分子生物学的技術により製造されることが可能であり、検出可能な種々の標識（放射性同位体および常磁性金属を含むが、これらに限定されるものではない）で標識されうる。さらに、抗体またはその断片は、モノクローナル抗体であるかポリクローナル抗体であるか又は分子生物学的技術により製造されたものであるかかかわらず、該ＢＳ１０６抗原の発現により特徴づけられる疾患の治療のための治療剤として使用することができる。治療用途の場合には、該抗体は、誘導体化することなく使用することが可能であり、あるいはそれを、放射性同位体、酵素、毒素、薬物、プロドラッグなどのような細胞傷害性剤で誘導体化することが可能である。
【００１７】
試験サンプル中のＢＳ１０６抗原または抗ＢＳ１０６抗体の存在を判定するためのもう１つのアッセイキットは、ＢＳ１０６抗原に特異的に結合する抗体を含有する容器を含み、該ＢＳ１０６抗原は、少なくとも１つのＢＳ１０６コード化エピトープを含む。該ＢＳ１０６抗原は、配列番号２０〜３３およびそれらの断片よりなる群から選ばれるＢＳ１０６コード化抗原の配列に対して少なくとも６０％の配列類似性を有する。これらの試験キットは更に、試験サンプル（例えば、血液、尿、唾液および糞便）を採集するのに有用な手段を有する容器を含みうる。そのような手段には、血液を採集し安定化するためのランセットおよび吸収紙または布、唾液を採集し安定化するためのスワブ、ならびに尿または糞便サンプルを採集し安定化するためのカップが含まれる。該サンプルの変性または不可逆的吸着を避けるために、所望により、紙、布、スワブ、カップなどの採集材料を処理することが可能である。また、試料の完全性を維持するのを助けるために、これらの採集材料を保存剤、安定剤または抗微生物剤で処理したり、該採集材料に保存剤、安定剤または抗微生物剤を含有させることが可能である。該抗体を固相に結合させることが可能である。
【００１８】
ＢＳ１０６のエピトープの少なくとも１つを含有するポリペプチドの製造方法であって、発現ベクターでトランスフェクトされた宿主細胞をインキュベートすることを含んでなる製造方法を提供する。このベクターは、配列番号２０〜３３およびそれらの断片よりなる群から選ばれるＢＳ１０６アミノ酸配列に対して少なくとも５０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む。
【００１９】
また、ＢＳ１０６抗原を含有する疑いのある試験サンプル中のＢＳ１０６抗原を検出する方法を提供する。該方法は、ＢＳ１０６抗原のエピトープの少なくとも１つに特異的に結合する抗体またはその断片と該試験サンプルとを、抗体／抗原複合体の形成に十分な時間および条件下で接触させ、該抗体を含有するそのような複合体の存在を、該試験サンプル中のＢＳ１０６抗原の存在の指標として検出することを含む。該抗体は、固相に結合させることが可能であり、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体でありうる。さらに、該抗体は、配列番号２０〜３３およびそれらの断片よりなる群から選ばれる少なくとも１つのＢＳ１０６抗原に特異的に結合する。
【００２０】
これらの抗体を含有する疑いのある試験サンプル中のＢＳ１０６抗原に特異的に結合する抗体を検出するもう１つの方法を提供する。該方法は、ＢＳ１０６ポリヌクレオチドにコードされるアミノ酸またはその断片に対して少なくとも５０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む少なくとも１つのＢＳ１０６エピトープを含有するポリペプチドと該試験サンプルとを接触させることを含む。接触は、抗原／抗体複合体の形成が可能となるのに十分な時間および条件下で行なう。該方法は更に、該ポリペプチドを含有する複合体を検出することを含む。該ポリペプチドは、固相に結合させることが可能である。さらに、該ポリペプチドは、配列番号２０〜３３およびそれらの断片よりなる群から選ばれるアミノ酸配列に対して少なくとも５０％の同一性を有する組換えタンパク質または合成ペプチドでありうる。
【００２１】
本発明は、ＢＳ１０６抗原のエピトープの少なくとも１つ又はその断片をコードするＢＳ１０６核酸配列でトランスフェクトされた細胞を提供する。該核酸配列は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６およびそれらの断片または相補体よりなる群から選ばれる。
【００２２】
また、ＢＳ１０６抗原に対する抗体の製造方法であって、免疫応答を引き起こすのに十分な量の少なくとも１つのＢＳ１０６エピトープを含む単離された免疫原性ポリペプチドまたはその断片を個体に投与することを含んでなる製造方法を提供する。この単離された免疫原性ポリペプチドは、配列番号２０〜３３およびそれらの断片よりなる群から選ばれるアミノ酸配列を含む。
【００２３】
ＢＳ１０６抗原に特異的に結合する抗体のもう１つの製造方法であって、配列番号２０〜３３およびそれらの断片よりなる群から選ばれるアミノ酸配列に由来する少なくとも１つのＢＳ１０６エピトープをコードする核酸配列を含むプラスミドを哺乳動物に投与することを含んでなる製造方法を開示する。該プラスミドは、該プラスミドが該個体内の細胞により取り込まれ免疫応答の生成に十分なレベルで発現される量にて投与する。
【００２４】
また、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６およびそれらの断片または相補体よりなる群から選ばれるポリヌクレオチドに対して少なくとも５０％の同一性を有する少なくとも約１０〜１２ヌクレオチドのＢＳ１０６ポリヌクレオチドを含んでなる組成物を提供する。ＢＳ１０６ポリヌクレオチドは、少なくとも１つのＢＳ１０６エピトープを有するアミノ酸配列をコードする。本発明が提供するもう１つの組成物は、約８〜１０アミノ酸のＢＳ１０６エピトープの少なくとも１つを有するポリペプチドを含む。該ポリペプチドは、配列番号２０〜３３およびそれらの断片よりなる群から選ばれるアミノ酸配列に対して少なくとも５０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。また、配列番号２０に対して少なくとも５０％の同一性を有するＢＳ１０６ポリペプチドをコードする遺伝子またはその断片、および配列番号５または配列番号６に対して少なくとも５０％の同一性を有するＤＮＡを含んでなる遺伝子またはその断片を提供する。
【００２５】
（図面の簡単な記載）
図１は、クローン１６６２８８５（配列番号１）、８９３９８８（配列番号２）、９０１４２９（配列番号３）、１２０９８１４（配列番号４）、クローン１６６２８８５の完全長配列［１６６２８８５ｉｎｈ（配列番号５）と称される］、およびそれらに由来するコンセンサス（Ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ）配列（配列番号６）のヌクレオチドアライメントを示す。
【００２６】
図２は、重複するクローン１６６２８８５（配列番号１）、８９２９８８（配列番号２）、９０１４２９（配列番号３）、１２０９８１４（配列番号４）、１６６２８８５ｉｎｈ（配列番号５）のヌクレオチドアライメントからのコンセンサスヌクレオチド配列（配列番号６）の形成を表すコンティグ地図を示す。
【００２７】
図３Ａは、ＲＮＡの、臭化エチジウムで染色されたアガロースゲルのスキャン、およびＢＳ１０６放射能標識プローブでのハイブリダイゼーション後のＲＮＡの対応ノーザンブロットを含む。サンプルは乳房組織および前立腺組織抽出物由来のものを含む。
【００２８】
図３Ｂは、ＲＮＡの、臭化エチジウムで染色されたアガロースゲルのスキャン、およびＢＳ１０６放射能標識プローブでのハイブリダイゼーション後のＲＮＡの対応ノーザンブロットを含む。サンプルは正常乳房組織および乳癌組織抽出物由来のものを含む。
【００２９】
図４は、７６個の異なるヒト組織からのポリＡ　ＲＮＡを含有するＣｌｏｎｔｅｃｈ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ．Ｉｎｃ．，Ｐａｌｏ　Ａｌｔｏ，ＣＡ）Ｍｕｌｔｉｐｌｅ　Ｔｉｓｓｕｅ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　Ａｒｒａｙ（商標）に対するＢＳ１０６プローブの結果を示す。
【００３０】
図５Ａは、ＢＳ１０６　ＲＮＡ特異的ＰＣＲ増幅産物の、ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎで染色されたアガロースゲルのスキャンである。それは、正常乳房組織サンプルおよび乳癌組織サンプル中のＢＳ１０６　ｍＲＮＡ特異的ＲＴ−ＰＣＲ産物を示す２０１塩基におけるＤＮＡバンドを示している。
【００３１】
図５Ｂは、ＢＳ１０６　ＲＮＡ特異的ＰＣＲ増幅産物の、ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎで染色されたアガロースゲルのスキャンである。ＢＳ１０６　ｍＲＮＡ特異的ＲＴ−ＰＣＲ産物を示す２０１塩基のバンドは、結腸組織サンプルおよび肺組織サンプル中には存在しない。
【００３２】
図６は、ＬＣｘ（登録商標）（Ａｂｂｏｔｔ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ａｂｂｏｔｔ　Ｐａｒｋ，ＩＬ）アッセイを用いてＭＤＡ　３６１細胞系からの１８ピコグラムのＲＮＡで該ＢＳ１０６アンプリコンが容易に検出されたことを示している。
【００３３】
図７は、ＬＣｘ（登録商標）系アッセイを用いた場合のＢＳ１０６マーカーに関する全組織分布を示す。
【００３４】
図８は、ＢＳ１０６抗ｍｙｃエピトープモノクローナル抗体でのＨＥＫ２９３細胞産物のウエスタンブロットを示す。
【００３５】
図９は、ｍｙｃエピトープを認識するモノクローナル抗体を使用してニッケルキレートカラムから集めた画分のドットブロットを示す。
【００３６】
図１０は、ＢＳ１０６　Ｍ／Ｈの存在に関して分析した、プールし透析し半精製した上清ウエスタンブロットを示す。
【００３７】
図１１は、パネルＡにおける抗ｍｙｃモノクローナル抗体およびパネルＢにおける抗Ｂ１０６ポリクローナル抗血清の両方を使用するウエスタンブロットにより分析した、プールし精製したＢＳ１０６　Ｍ／Ｈを示す。
【００３８】
図１２は、ＢＳ１０６ペプチド（配列番号２６）に対するモノクローナル抗体（Ｈ９Ｃ２９）を使用して組織抽出物のパネル上で行ったウエスタンブロットの結果を示す。図１２の各レーンは、異なる組織抽出物を含有する。
【００３９】
図１３は、アフィニティー精製されたウサギ抗ＢＳ１０６抗体に対する還元された及び還元されていない人乳画分のウエスタンブロットを示す。パネルＢは、ＢＳ１０６ペプチドの存在下での、パネルＡで認められたバンドの消失を伴う競合反応の結果を示す。
【００４０】
図１４は、ＢＳ１０６抗体での生物学的サンプルのウエスタンブロットを示す。
【００４１】
図１５Ａ〜Ｃは、アフィニティー精製されたウサギ抗ＢＳ１０６ならびにマウスＢＳ１０６モノクローナル抗体Ｈ３９Ｃ５１およびＨ９Ｃ２９で滴定したＢＳ１０６フルオレセイン共役体のサンプルを示す。
【００４２】
（発明の詳細な記載）
本発明は、配列番号２０に対して少なくとも約５０％の同一性を有するＢＳ１０６ポリペプチドをコードする遺伝子またはその断片を提供する。本発明は更に、配列番号５または配列番号６に対して少なくとも約５０％の同一性を有するＤＮＡを含んでなるＢＳ１０６遺伝子またはその断片を含む。
【００４３】
本発明は、ＢＳ１０６と称される乳房組織遺伝子の産物に関して試験サンプルをアッセイするための方法であって、該試験サンプル中のｍＲＮＡからｃＤＮＡを調製し、乳房組織遺伝子ＢＳ１０６の存在の指標として該ｃＤＮＡを検出することを含んでなる方法を提供する。該方法は、ＢＳ１０６に由来する、該遺伝子またはその断片に対応する１以上のｍＲＮＡ部分を増幅する増幅工程を含みうる。また、ＢＳ１０６の翻訳産物に関してアッセイするための方法を提供する。本発明で提供する方法によりアッセイしうる試験サンプルには、組織、細胞、体液および分泌物が含まれる。本発明はまた、これらの方法を実施するのに有用なオリゴヌクレオチドプライマー、ポリペプチドなどの試薬を提供する。
【００４４】
本明細書に開示する核酸配列の一部は、ＲＮＡの逆転写のための又はｃＤＮＡの増幅のためのプライマーとして、あるいは試験サンプル中の或るｍＲＮＡ配列の存在を判定するためのプローブとして有用である。また、診断用イムノアッセイにおける基準または試薬として、医薬スクリーニングアッセイの標的として、および／または種々の療法のための成分または標的部位として有用なコード化ポリペプチド配列の製造を可能にする核酸配列を開示する。これらのポリペプチド配列内に含有される少なくとも１つのエピトープに対するモノクローナル抗体およびポリクローナル抗体は、治療剤の運搬剤として有用であり、診断試験に有用であり、そしてＢＳ１０６に関連した疾患または状態（特に乳癌）のスクリーニングに有用である。関心のある遺伝子の他の部分の配列の単離は、これらの核酸配列に由来するプローブまたはＰＣＲプライマーを用いて行なうことができる。これは、確認すべき関心のあるｍＲＮＡまたはｃＤＮＡおよび対応するコード化ポリペプチド配列の追加的なプローブを可能にする。これらの追加的な分子は、本明細書に開示するＢＳ１０６により特徴づけられる乳房の疾患および状態（例えば、乳癌）の検出、診断、病期分類、モニター、予後判定、予防もしくは治療または素因の判定に有用である。
【００４５】
本明細書に記載の組成物および方法は、乳房組織の疾患または状態の指標としての或るマーカーの同定を可能にし、それから得られる情報は、ＢＳ１０６に関連した疾患および状態（特に乳癌）の検出、診断、病期分類、モニター、予後判定、予防もしくは治療または素因の判定の助けとなるであろう。試験方法には、例えば、本発明で提供する配列を利用し核酸増幅方法［例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼチェイン反応（ＬＣＲ）］およびハイブリダイゼーションをも利用しうるプローブアッセイが含まれる。
【００４６】
また、本発明で提供するヌクレオチド配列は、免疫原性エピトープが見出されうるオープンリーディングフレームを含有する。このエピトープは、ＢＳ１０６に関連した病態または状態に特有であると考えられる。また、ＢＳ１０６遺伝子によりコードされるポリヌクレオチドまたはポリペプチドおよびタンパク質は、マーカーとして有用であると考えられる。このマーカーは、乳癌などの疾患において上昇するか、乳癌などの疾患において変化するか、または正常なタンパク質として存在するが不適当な身体画分中に出現する。該エピトープの特有性は、ＢＳ１０６遺伝子にコードされるタンパク質およびポリペプチドに対する抗体に対するその免疫反応性および特異性、および（ｉｉ）他の任意の組織マーカーに対するその無反応性により測定することができる。免疫反応の測定方法は、よく知られており、例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、酵素結合抗体免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、赤血球凝集反応（ＨＡ）、蛍光偏光イムノアッセイ（ＦＰＩＡ）、化学発光イムノアッセイ（ＣＬＩＡ）などを含むが、これらに限定されるものではない。適当な方法のいくつかの例は、本明細書に記載されている。
【００４７】
特に示さない限り、以下の用語は以下の意義を有するものとする。アミノ酸配列の「類似性」を判定するための技術は、当技術分野でよく知られている。一般に、「類似性」は、適当な位置における２以上のポリペプチドの厳密なアミノ酸対アミノ酸の比較を意味し、この場合、アミノ酸は同一であるか、または類似した化学的および／または物理的特性（例えば、電荷または疎水性）を有する。したがって、いわゆる「類似性の割合（％）」は、比較するポリペプチド配列の間で決定することができる。核酸およびアミノ酸配列の同一性を判定するための技術も、当技術分野でよく知られており、その遺伝子に関するｍＲＮＡのヌクレオチド配列を決定し（通常は、ｃＤＮＡ中間体を介して）、それにコードされるアミノ酸配列を決定し、これともう１つのアミノ酸配列とを比較することを含む。一般に、「同一性」は、２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の、それぞれ、厳密なヌクレオチド対ヌクレオチドまたはアミノ酸対アミノ酸の一致を意味する。２以上のポリヌクレオチド配列は、それらの「同一性（％）」を決定することにより比較することができる。同様に、２以上のアミノ酸配列は、それらの「同一性（％）」を決定することにより比較することができる。２つの配列の同一性（％）は、核酸であるかペプチドであるかにかかわらず、２つの整列された配列間の厳密なマッチの数を、短い方の配列の長さで割り、１００を掛けたものである。核酸配列のおよそのアライメントは、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖａｎｃｅｓ　ｉｎ　Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ　２：４８２−４８９（１９８１）のローカルホモロジーアルゴリズムにより与えられる。このアルゴリズムは、Ｄａｙｈｏｆｆ（Ａｔｌａｓ　ｏｆ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ　ａｎｄ　Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｍ．Ｏ．Ｄａｙｈｏｆｆ編，５　ｓｕｐｐｌ．３：３５３−３５８，Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．，ＵＳＡ）により開発されＧｒｉｂｓｋｏｖ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．１４（６）：６７４５−６７６３（１９８６）により標準化されたスコアマトリックスを使用してペプチド配列での使用に拡張されうる。核酸およびペプチド配列に関するこのアルゴリズムの導入は、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　Ｃｏｍｐｕｔｅｒ　Ｇｒｏｕｐ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）により、それらのＢｅｓｔＦｉｔユーティリティアプリケーションにおいて行われる。この方法のためのデフォルトパラメーターは、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　Ａｎａｌｙｓｉｓ　Ｐａｃｋａｇｅ　Ｐｒｏｇｒａｍ　Ｍａｎｕａｌ，Ｖｅｒｓｉｏｎ　８（１９９５）（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　Ｃｏｍｐｕｔｅｒ　Ｇｒｏｕｐ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩから入手可能）に記載されている。配列間の同一性または類似性を計算するための他の同等に適したプログラムが、当技術分野において一般に公知である。
【００４８】
例えば、基準配列に対する特定のヌクレオチド配列の同一性（％）は、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎのホモロジーアルゴリズムを使用して、デフォルト・スコアリング・テーブルおよび６ヌクレオチド位のギャップ・ペナルティにより求めることができる。本発明の状況において同一性（％）を確認するためのもう１つの方法は、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｅｄｉｎｂｕｒｇｈが著作権を有しＪｏｈｎ　Ｆ．ＣｏｌｌｉｎｓおよびＳｈａｎｅ　Ｓ．Ｓｔｕｒｒｏｋにより開発されＩｎｔｅｌｌｉＧｅｎｅｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．（Ｍｏｕｎｔａｉｎ　Ｖｉｅｗ，ＣＡ）により頒布されたプログラムのＭＰＳＲＣＨパッケージを使用するものである。このパッケージ一式から、Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムを用いることが可能であり、この場合、該スコアリングテーブルにはデフォルトパラメーターを使用する（例えば、１２のギャップオープンペナルティ、１のギャップエクステンションペナルティ、および６のギャップ）。得られたデータからは、「Ｍａｔｃｈ」値が「配列同一性」を反映する。配列間の同一性または類似性を計算するための他の適当なプログラムが当技術分野において一般に知られており、例えば、同様にデフォルトパラメーターで使用されうるアライメントプログラムＢＬＡＳＴが挙げられる。例えば、ＢＬＡＳＴＮおよびＢＬＡＳＴＰは、以下のデフォルトパラメーターで使用することができる：遺伝暗号＝標準；フィルター＝無し；鎖＝両方；カットオフ＝６０；期待値（ｅｘｐｅｃｔ）＝１０；マトリックス＝ＢＬＯＳＵＭ６２；Ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎｓ＝５０配列；ソート＝ＨＩＧＨ　ＳＣＯＲＥ；Ｄａｔａｂａｓｅｓ＝非リダンダント、ＧｅｎＢａｎｋ＋ＥＭＢＬ＋ＤＤＢＪ＋ＰＤＢ＋ＧｅｎＢａｎｋ　ＣＤＳ翻訳＋Ｓｗｉｓｓタンパク質＋Ｓｐｕｐｄａｔｅ＋ＰＩＲ。これらのプログラムの詳細は以下のインターネットアドレスで知ることが可能である：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｇｏｖ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ＢＬＡＳＴ。
【００４９】
当業者は、前記プログラムにおいて所与配列に使用する適切な検索パラメーターを容易に決定することが可能である。例えば、該検索パラメーターは、問題の配列のサイズに基づいて様々となりうる。したがって、例えば、本発明の代表的な実施形態は、Ｘ個の連続したヌクレオチドを有する単離されたＢＳ１０６ポリヌクレオチドを含むであろう。ここで、（ｉ）前記のＸ個の連続したヌクレオチドは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６のいずれかに由来するＹ個の連続したヌクレオチドに対して少なくとも５０％の同一性を有し、（ｉｉ）ＸはＹに等しく、（ｉｉｉ）Ｘは、６ヌクレオチド以上から５０００ヌクレオチドまで、より好ましくは、１０〜１２ヌクレオチドから５０００ヌクレオチドまで、より一層好ましくは、１５〜２０ヌクレオチドから本明細書に記載の完全長ＢＳ１０６配列中に存在するヌクレオチド数（前記範囲内に含まれる全ての整数値を含む）までである。
【００５０】
示されている配列に「由来」する又は「特異的」なポリヌクレオチドは、示されているヌクレオチド配列の領域に対応する（すなわち、同一または相補的である）少なくとも約６ヌクレオチド、好ましくは少なくとも約８ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも約１０〜１２ヌクレオチド、より一層好ましくは少なくとも約１５〜２０ヌクレオチドの連続した配列を含むポリヌクレオチド配列を意味する。該配列は、当技術分野で公知の技術で判定した場合、ある特定のポリヌクレオチド配列に特有の配列と相補的または同一でありうる。示されている配列の特有性を判定する方法として、例えば、データバンク中の配列との比較を用いることができる。配列が由来しうる領域には、特異的エピトープをコードする領域、ならびに非翻訳および／または非転写領域が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００５１】
該由来ポリヌクレオチドは、必ずしも、研究中の関心のあるヌクレオチド配列に物理的に由来するわけではなく、該ポリヌクレオチドが由来する領域中の塩基配列から得られる情報に基づく化学合成、複製、逆転写または転写を含む（これらに限定されるものではない）任意の方法で得られうるであろう。そのような場合、それは、元のポリヌクレオチドのセンスまたはアンチセンス配向に相当しうる。さらに、示されている配列の領域に対応する領域の組合せを、意図する用途に適合するように、当技術分野で公知の方法で修飾することができる。
【００５２】
特定されているポリヌクレオチドの「断片」は、示されているヌクレオチド配列の領域に対応する（すなわち、同一または相補的である）少なくとも約６ヌクレオチド、好ましくは少なくとも約８ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも約１０〜１２ヌクレオチド、より一層好ましくは少なくとも約１５〜２０ヌクレオチドの連続した配列を含むポリヌクレオチド配列を意味する。
【００５３】
「プライマー」なる語は、標的ヌクレオチド配列に相補的であり該標的ヌクレオチド配列にハイブリダイズさせるのに使用される特異的なオリゴヌクレオチド配列を意味する。プライマーは、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼまたは逆転写酵素により触媒されるヌクレオチドの重合の開始点として働く。
【００５４】
「プローブ」なる語は、相補的配列を含有するサンプル中に存在する特異的なポリヌクレオチドを同定するために使用しうる一定の核酸セグメント（またはヌクレオチド類似体セグメント、例えば、後記で定義するＰＮＡ）を意味する。
【００５５】
「コード（される）」は、ポリペプチド配列をコードする核酸配列を指し、該ポリペプチドまたはその一部は、該核酸配列にコードされるポリペプチドからの少なくとも３〜５アミノ酸、より好ましくは少なくとも８〜１０アミノ酸、より一層好ましくは少なくとも１５〜２０アミノ酸のアミノ酸配列を含有する。また、該配列にコードされるポリペプチドで免疫学的に同定可能なポリペプチド配列が含まれる。したがって、「ポリペプチド」、「タンパク質」または「アミノ酸」配列は、ＢＳ１０６アミノ酸配列に対して少なくとも約５０％の同一性、好ましくは約６０％の同一性、より好ましくは約７５〜８５％の同一性、最も好ましくは約９０〜９５％以上の同一性を有する。さらに、該ＢＳ１０６「ポリペプチド」、「タンパク質」または「アミノ酸」配列は、ＢＳ１０６のポリペプチドまたはアミノ酸配列に対して少なくとも約６０％の類似性、好ましくは少なくとも約７５％の類似性、より好ましくは約８５％の類似性、最も好ましくは約９５％以上の類似性を有しうる。このアミノ酸配列は、配列番号２０〜３３およびそれらの断片よりなる群から選ばれうる。
【００５６】
本明細書で互換的に用いられうる「組換えポリペプチド」、「組換えタンパク質」または「組換え技術により製造されたポリペプチド」なる語は、由来により又は操作により、天然において伴っているポリペプチドの全部または一部を伴っていないポリペプチド、および／または、天然で結合しているポリペプチド以外のポリペプチドに結合しているポリペプチドを意味する。組換え又はコード化ポリペプチドまたはタンパク質は、必ずしも、示されている核酸配列から翻訳されるわけではない。それはまた、化学合成または組換え発現系の発現を含む任意の方法で得られうる。
【００５７】
本発明で用いる「合成ペプチド」なる語は、当業者によく知られた方法で化学的に合成されうる任意の長さのアミノ酸の重合形態を意味する。これらの合成ペプチドは、種々の用途において有用である。
【００５８】
本発明で用いる「ポリヌクレオチド」なる語は、リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドの、任意の長さのヌクレオチドの重合形態を意味する。この用語は、該分子の一次構造のみをさす。したがって、該用語は、二本鎖および一本鎖のＤＮＡならびに二本鎖および一本鎖のＲＮＡを含む。また、それは、該ポリヌクレオチドのメチル化体またはキャップ形成体などの修飾体、および非修飾形態を含む。「ポリヌクレオチド」、「オリゴマー」、「オリゴヌクレオチド」および「オリゴ」は本発明では互換的に用いられる。
【００５９】
「ｃＤＮＡに対応する配列」は、該配列が、示されているＤＮＡ中の配列と同一または相補的であるポリヌクレオチド配列を含有することを意味する。ｃＤＮＡに対する同一性または相補性の程度（または割合（％））は、約５０％以上、好ましくは少なくとも約７０％以上、より好ましくは少なくとも約９０％以上となろう。同定されたｃＤＮＡに対応する配列は、少なくとも約５０ヌクレオチド長、好ましくは少なくとも約６０ヌクレオチド長、より好ましくは少なくとも約７０ヌクレオチド長となろう。関心のある遺伝子または遺伝子断片と該ｃＤＮＡとの間の対応度は、当技術分野で公知の方法により決定することができ、それは、例えば、配列決定された物質と、記載されているｃＤＮＡとの直接比較、またはハイブリダイゼーション、ならびに一本鎖ヌクレアーゼによる消化およびそれに続く該消化断片のサイズの測定を含む。
【００６０】
「精製（された）ポリヌクレオチド」は、該ポリヌクレオチドが天然において伴っているタンパク質を実質的に含有しない（例えば、その約５０％以上、好ましくは約７０％以上、より好ましくは約９０％以上を含有しない）関心のあるポリヌクレオチドまたはその断片を意味する。関心のあるポリヌクレオチドを精製するための技術は当技術分野でよく知られており、例えば、ポリヌクレオチドを含有する細胞をカオトロピック試薬で破壊すること、およびイオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーおよび密度に応じた沈降によるポリヌクレオチドおよびタンパク質の分離を含む。
【００６１】
「精製（された）ポリペプチド」または「精製（された）タンパク質」は、関心のあるポリペプチドが天然において伴っている細胞成分を実質的に含有しない（例えば、その約５０％以上、好ましくは約７０％以上、より好ましくは約９０％以上を含有しない）関心のあるポリペプチドまたはその断片を意味する。関心のあるポリペプチドを精製するための方法は当技術分野で公知である。
【００６２】
「単離（された）」なる語は、該物質が、その元の環境（例えば、それが天然に生じるものである場合には天然環境）から取り出されていることを意味する。例えば、生きた動物中に存在する天然に生じるポリヌクレオチドまたはポリペプチドは単離されていないが、天然系中の共存物質の一部または全部から分離されている同じポリヌクレオチドまたはＤＮＡまたはポリペプチドは単離されている。そのようなポリヌクレオチドがベクターの一部となることが可能であり、および／または、そのようなポリヌクレオチドまたはポリペプチドが組成物の一部となることが可能であり、それらは尚も、該ベクターまたは組成物がその天然環境の一部でないため単離されている。
【００６３】
「ポリペプチド」および「タンパク質」は本発明では互換的に用いられ、共有結合および／または非共有結合で結合したアミノ酸の、少なくとも１つの分子鎖を示す。これらの用語は、特定の長さの該産物を意味するものではない。したがって、ポリペプチドの定義には、ペプチド、オリゴペプチドおよびタンパク質が含まれる。これらの用語は、該ポリペプチドの翻訳後修飾、例えばグリコシル化、アセチル化、リン酸化などを含む。また、タンパク質断片、類似体、突然変異または変異タンパク質、融合タンパク質などが、ポリペプチドの定義に含まれる。
【００６４】
特定されたポリペプチドの「断片」は、その特定されたポリペプチドに由来する少なくとも約３〜５アミノ酸、より好ましくは少なくとも約８〜１０アミノ酸、より一層好ましくは少なくとも約１５〜２０アミノ酸を含むアミノ酸配列を意味する。
【００６５】
「組換え宿主細胞」、「宿主細胞」、「細胞」、「細胞系」、「細胞培養」および単細胞体として培養された微生物または高等真核細胞系を示す他のそのような用語は、組換えベクターまたは他の導入ＤＮＡのレシピエントとして使用されうる又は使用されている細胞を意味し、トランスフェクトされた元の細胞の初代後代（ｏｒｉｇｉｎａｌ　ｐｒｏｇｅｎｙ）を含む。
【００６６】
本発明で用いる「レプリコン」は、細胞内でポリヌクレオチド複製の自律単位として挙動するプラスミド、染色体、ウイルスなどの任意の遺伝要素を意味する。
【００６７】
「ベクター」は、別のポリヌクレオチドセグメントが結合しているレプリコンであり、例えば該結合セグメントの複製および／または発現を引き起こす。
【００６８】
「制御配列」なる語は、それが結合しているコード配列の発現を引き起こすために必要なポリヌクレオチド配列を意味する。そのような制御配列の性質は宿主生物によって異なる。原核生物では、そのような制御配列は、一般に、プロモーター、リボソーム結合部位およびターミネーターを含み、真核生物では、そのような制御配列は、一般に、プロモーター、ターミネーター、およびいくつかの場合にはエンハンサーを含む。したがって、「制御配列」なる語は、発現するためには存在することが必要な全成分を最低限含むと意図され、また、存在すれば有利である追加的な成分（例えば、リーダー配列）をも含みうる。
【００６９】
「作動的に結合」は、記載されている成分が、それらの意図される様態で機能しうる関係で存在している状況を意味する。したがって、例えば、コード配列に「作動的に結合」している「制御配列」は、該制御配列に適した条件下で該コード配列の発現が達成される様態で連結されている。
【００７０】
「オープンリーディングフレーム」または「ＯＲＦ」なる語は、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列の領域を意味する。この領域は、コード配列の一部または全コード配列に相当しうる。２つの部分的に重複したリーディングフレームを単一ポリペプチドとしてリボソームが翻訳するのを可能にする、翻訳フレームシフトまたはプログラムされたフレームシフトと称される稀な誤りが、翻訳において生じうる（Ｉ．Ｐ．Ｉｖａｎｏｖら　ＲＮＡ　４（１０）：１２３０−１２３８（１９９８）；およびＰ．Ｊ．Ｆａｒａｂａｕｇｈ　Ａｎｎｕ　Ｒｅｖ　Ｇｅｎｅｔ　３０：５０７−５２８（１９９６））。
【００７１】
「コード配列」は、適当な調節配列の制御下に配置された場合にｍＲＮＡに転写されポリペプチドに翻訳されるポリヌクレオチド配列である。該コード配列の境界は、５’末端の翻訳開始コドンと、３’末端の翻訳終結コドンとにより定められる。コード配列には、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡおよび組換えポリヌクレオチド配列が含まれうるが、これらに限定されるものではない。
【００７２】
「免疫学的に同定可能」なる語は、示されているポリペプチド中に存在しそれに特有なエピトープおよびポリペプチドの存在を指す。免疫学的同一性は、抗体結合および／または結合における競合により判定することができる。これらの技術は当業者に公知であり、本明細書にも記載されている。また、エピトープの特有性は、エピトープをコードするポリヌクレオチド配列に関するＧｅｎＢａｎｋなどの公知データバンクのコンピューター検索により、また、他の公知タンパク質とのアミノ酸配列の比較により判定することができる。
【００７３】
本発明で用いる「エピトープ」は、ポリペプチドまたはタンパク質の抗原決定基を意味する。エピトープは、該エピトープに特有の空間コンホメーションにおいて３個のアミノ酸を含みうると考えられる。一般に、エピトープは、少なくとも５個のそのようなアミノ酸よりなり、通常、それは、少なくとも８〜１０個のアミノ酸よりなる。空間コンホメーションを調べる方法は当技術分野で公知であり、例えば、Ｘ線結晶解析および二次元核磁気共鳴を含む。
【００７４】
新規ペプチド配列中のエピトープの同定方法は良く知られており、科学的、商業的および特許文献に記載されている。例えば、Ｍ．Ｈ．Ｖａｎ　Ｒｅｇｅｎｍｏｒｔｅｌは、タンパク質の一次配列からエピトープを予測する方法を記載している（“Ｐｒｏｔｅｉｎ　ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ　ａｎｄ　ａｎｔｉｇｅｎｉｃｉｔｙ”，Ｉｎｔ　Ｊ　Ｒａｄ　Ａｐｐｌ　Ｉｎｓｔｒｕｍ　Ｂ．，１４（４）：２７７−８０，１９８７を参照されたい）。
【００７５】
ＤＮＡ配列決定およびペプチド合成装置の主要供給業者であるＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓは、タンパク質のエピトープを反映するペプチドの選択方法を記載した公開ウェブサイトを立ち上げている（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐｅｂｉｏ．ｃｏｍ／ｐａ／３４０９１３／ｈｔｍｌ／ｃｈａｐｔ２．ｈｔｍｌ＃Ｃｈｏｏｓｉｎｇ　ｔｈｅ　Ｅｐｉｔｏｐｅを参照されたい）。この電子的刊行物は１９９６年に公開され、本特許出願の発明者が用いた方法を記載している。
【００７６】
特許出願ＰＣＴ／ＵＳ９７／００４８５は、ペプチド配列からエピトープを同定する方法を詳細に記載している。該配列は、Ｈｏｐｐ，Ｐｒｏｇ．Ｃｌｉｎ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｓ．１７２Ｂ：３６７−３７７（１９８５）の方法またはＣｅａｓｅら，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６４：１７７９−１７８４（１９８６）の方法またはＳｐｏｕｒｇｅら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３８：２０４−２１２（１９８７）の方法により、疎水性および親水性値に関してスキャンされうる。これらの方法を実施する商業的なソフトウェアプログラムが入手可能である。
【００７７】
「コンホメーションエピトープ」は、免疫学的に認識可能な構造のアミノ酸の特異的な並置を含むエピトープであり、そのようなアミノ酸は、連続的または不連続的な順序で同一ポリペプチド上に存在するか又は異なるポリペプチド上に存在する。
【００７８】
ポリペプチド内に含有される特異的エピトープの抗体認識により該ポリペプチドが抗体に結合する場合、該ポリペプチドは抗体に対して「免疫反応性」である。免疫反応性は、抗体結合により、より詳しくは抗体結合の速度論により、および／または、該抗体に対するエピトープを含有する公知ポリペプチドを競合体として用いる結合における競合により測定することができる。ポリペプチドが抗体に対して免疫反応性であるか否かを判定する方法は当技術分野で公知である。
【００７９】
本発明で用いる「関心のあるエピトープを含有する免疫原性ポリペプチド」は、関心のある天然に生じるポリペプチドまたはその断片、および他の手段（例えば、化学合成、または組換え生物中での該ポリペプチドの発現）で製造されたポリペプチドを意味する。
【００８０】
「トランスフェクション」なる語は、原核性または真核性宿主細胞内に外因性ポリヌクレオチドを導入することを意味し、その導入に用いる方法には無関係である。「トランスフェクション」なる語は、ポリヌクレオチドの安定な導入および一過性の導入の両方を意味し、ポリヌクレオチドの直接取込み、形質転換、形質導入およびｆ接合を含む。外因性ポリヌクレオチドは、宿主細胞内に導入されたら、非組込みレプリコン（例えば、プラスミド）として維持されることが可能であり、あるいは宿主ゲノム内に組込まれることが可能である。
【００８１】
「治療」は、予防および／または療法を意味する。
【００８２】
本発明で用いる「個体」なる語は、脊椎動物、特に哺乳動物種のメンバーを意味し、家畜、競技用動物、霊長類およびヒトを含むが、これらに限定されるものではない。この用語は、特にヒトを意味する。
【００８３】
本発明で用いる「センス鎖」または「プラス鎖」（または「＋」）なる語は、該ポリペプチドをコードする配列を含有する核酸を意味する。「アンチセンス鎖」または「マイナス鎖」（または「−」）は、「プラス」鎖の配列に相補的な配列を含有する核酸を意味する。
【００８４】
「試験サンプル」なる語は、被検体（例えば、関心のある抗体または関心のある抗原）の起源である個体の身体の成分を意味する。これらの成分は当技術分野でよく知られている。試験サンプルは、典型的には、標的配列を含有する疑いのある任意のものである。試験サンプルは、当技術分野でよく知られた方法により、例えば、個体から試料を得、必要に応じて、それが含有するいずれかの細胞を破壊して標的核酸を遊離させることにより調製することができる。これらの試験サンプルには、本明細書に記載の本発明の方法により試験することができる生物学的サンプルが含まれ、ヒトおよび動物の体液、例えば、全血、血清、血漿、脳脊髄液、痰、気管支洗液、気管支吸引液、尿、リンパ液、および気道、腸管および尿生殖路の種々の外分泌物、涙、唾液、乳、白血球、骨髄腫など；生物学的流体、例えば、細胞培養上清；固定しうる組織試料；および固定しうる細胞試料が含まれる。
【００８５】
「精製（された）産物」は、該産物が通常結合している細胞構成成分から、また、関心のあるサンプル中に存在しうる他の型の細胞から単離された産物の調製物を意味する。
【００８６】
「ＰＮＡ」は、標的の存在を判定するための本明細書に記載のアッセイなどの方法で使用しうる「ペプチド核酸類似体」を意味する。「ＭＡ」は、標的の存在を判定するための本明細書に記載のアッセイなどの方法で使用しうる「モルホリノ類似体」を意味する。例えば、参照により本明細書に組み入れる米国特許第５，３７８，８４１号を参照されたい。ＰＮＡは、ＲＮＡ標的またはＤＮＡに指向しうる中性に荷電した部分である。例えば本発明のＤＮＡプローブの代わりにアッセイで使用するＰＮＡプローブは、ＤＮＡプローブを使用した場合には達成できない利点をもたらす。これらの利点には、製造可能性、大規模標識、再現性、安定性、イオン強度の変化に対する不感受性、およびＤＮＡまたはＲＮＡを用いる方法において存在する酵素分解に対する抵抗性が含まれる。これらのＰＮＡは、フルオレセイン、放射性ヌクレオチド、化学発光性化合物などのシグナル生成化合物で標識（「結合」）することができる。したがって、ＤＮＡまたはＲＮＡの代わりに、ＰＮＡまたは他の核酸類似体、例えばＭＡを、アッセイ方法において使用することができる。本明細書には、ＤＮＡプローブを使用するアッセイが記載されているが、ＲＮＡまたはＤＮＡの代わりにＰＮＡまたはＭＡを使用し、必要に応じて、アッセイ試薬における適当な変更を加えることは、当業者の認識範囲内に含まれる。
【００８７】
本発明で用いる「被検体」は、試験サンプル中に存在しうる検出すべき物質である。該被検体は、天然に生じる対応する特異的結合メンバー（例えば、抗体）が存在する物質、または対応する特異的結合メンバーが調製されうる任意の物質でありうる。したがって、被検体は、アッセイにおいて１以上の特異的結合メンバーに結合しうる物質である。また、「被検体」は、任意の抗原物質、ハプテン、抗体およびそれらの組合せを含む。該被検体は、天然に生じる特異的結合相手（ペア）を用いて（例えば、ビタミンＢ１２を測定するために特異的結合ペアのメンバーとして内因子タンパク質を使用して、あるいは葉酸を測定するために葉酸結合タンパク質を使用して、あるいは炭水化物を測定するために特異的結合ペアのメンバーとしてレクチンを使用して）、特異的結合ペアのメンバーとして検出されうる。該被検体には、タンパク質、ポリペプチド、アミノ酸、ヌクレオチド標的などが含まれうる。
【００８８】
本発明で用いる「乳房の疾患」または「乳房疾患」または「乳房の状態」は、異型過形成、線維腺腫、乳腺嚢胞症および癌を含む（これらに限定されるものではない）乳房の任意の疾患または状態を意味する。
【００８９】
本発明で用いる「乳癌」は、上皮内導管癌、上皮内小葉性癌、浸潤性導管癌、髄様癌、管状癌、粘液癌、浸潤性小葉性癌、浸潤性面皰癌および炎症様癌を含む（これらに限定されるものではない）乳房の任意の悪性疾患を意味する。
【００９０】
「発現しているタグ配列」または「ＥＳＴ」は、組織から抽出されたｍＲＮＡの逆転写およびそれに続くベクター内への挿入により作製されたｃＤＮＡ挿入断片の部分配列を意味する。
【００９１】
「転写産物イメージ」は、ライブラリー中のＥＳＴの量的分布を示す表または一覧を意味し、該ライブラリーが由来する組織内で活性な遺伝子を表す。
【００９２】
本発明は、特異的結合メンバーを使用するアッセイを提供する。本発明で用いる「特異的結合メンバー」は特異的結合ペアのメンバーである。すなわち、２つの異なる分子のうちの一方が、化学的または物理的手段により、もう一方の分子に特異的に結合する。したがって、一般的なイムノアッセイの抗原および抗体特異的結合ペアに加えて、他の特異的結合ペアとして、ビオチンおよびアビジン、炭水化物およびレクチン、相補的ヌクレオチド配列、エフェクターおよび受容体分子、補因子および酵素、酵素阻害剤および酵素などが含まれうる。さらに、特異的結合ペアには、元の特異的結合メンバーの類似体（例えば、被検体類似体）であるメンバーが含まれうる。免疫反応性特異的結合メンバーには、組換えＤＮＡ分子により形成されたものを含む、抗原、抗原断片、抗体および抗体断片（モノクローナルおよびポリクローナルの両方ならびにそれらの複合体）が含まれる。
【００９３】
特異的結合メンバーは「特異的結合分子」を含む。「特異的結合分子」は、いずれもの特異的結合メンバー、特に免疫反応性特異的結合メンバーを意図する。そのような場合、「特異的結合分子」なる語は、抗体分子（ポリクローナル調製物およびモノクローナル調製物の両方から得られたもの）、および以下のものを含む：ハイブリッド（キメラ）抗体分子（例えば、Ｗｉｎｔｅｒら，Ｎａｔｕｒｅ　３４９：２９３−２９９（１９９１）および米国特許第４，８１６，５６７号を参照されたい）；Ｆ（ａｂ’）２およびＦ（ａｂ）フラグメント；Ｆｖ分子（非共有結合性ヘテロ二量体、例えば、Ｉｎｂａｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　６９：２６５９−２６６２（１９７２）およびＥｈｒｌｉｃｈら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９：４０９１−４０９６（１９８０）を参照されたい）；一本鎖Ｆｖ分子（ｓＦｖ）（例えば、Ｈｕｓｔｏｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８５：５８７９−５８８３（１９８８）を参照されたい）；ヒト化抗体分子（例えば、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら，Ｎａｔｕｒｅ　３３２：３２３−３２７（１９８８）、Ｖｅｒｈｏｅｙａｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ　２３９：１５３４−１５３６（１９８８）および１９９４年９月２１日付け公開の英国特許公開番号２，２７６，１６９を参照されたい）；およびそのような分子から得られた、該親抗体分子の免疫学的結合特性を保有するいずれもの機能的フラグメント。
【００９４】
本発明で用いる「ハプテン」なる語は、抗体に結合する能力を有するが、担体タンパク質に結合しない限り抗体形成を惹起し得ない部分抗原または非タンパク質結合メンバーを意味する。
【００９５】
本発明で用いる「捕捉試薬」は、サンドイッチアッセイにおいては該被検体に特異的な、あるいは競合アッセイにおいては指示試薬に特異的な、あるいは間接アッセイにおいては補助的特異的結合メンバー（それ自体は該被検体に特異的である）に特異的な未標識の特異的結合メンバーを意味する。該アッセイの実施前または該アッセイの実施中に、該捕捉試薬を固相材料に直接的または間接的に結合させて、試験サンプルから固定化複合体を分離することが可能である。
【００９６】
「指示試薬」は、特異的結合メンバーと共役（「結合」）した、外的手段により検出可能な測定可能なシグナルを生成しうる及び生成する「シグナル生成化合物」（「標識」）を含む。該指示試薬は、特異的結合ペアの抗体メンバーであることに加えて、ハプテン−抗ハプテン系（例えば、ビオチンまたは抗ビオチン、アビジンまたはビオチン、炭水化物またはレクチン、相補的ヌクレオチド配列、エフェクターまたは受容体分子、酵素補因子および酵素、酵素阻害剤または酵素など）を含む任意の特異的結合ペアのメンバーでもありうる。免疫反応性である特異的結合メンバーは、サンドイッチアッセイにおける関心のあるポリペプチド、または競合アッセイにおける捕捉試薬、または間接アッセイにおける補助的特異的結合メンバーのいずれかに結合しうる抗体、抗原または抗体／抗原複合体でありうる。プローブおよびプローブアッセイを説明する場合に、「レポーター分子」なる語を用いることがある。レポーター分子は、カルバゾールまたはアダマンタンのような、特異的結合ペアの特異的結合メンバーに共役した前記のシグナル生成化合物を含む。
【００９７】
意図される種々の「シグナル生成化合物」（標識）には、発色性物質（ｃｈｒｏｍａｇｅｎｓ）、触媒（例えば、酵素）、発光性化合物（例えば、フルオレセインおよびローダミン）、化学発光性化合物（例えば、ジオキセタン、アクリジニウム、フェナントリジニウムおよびルミノール）、放射性元素および直接可視標識が含まれる。酵素の具体例には、アルカリホスファターゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼなどが含まれる。個々の標識の選択は、決定的に重要ではないが、それ自体で又は１以上の追加的物質と共にシグナルを生成しうるものでなければならない。
【００９８】
「固相」（「固体支持体」）は当業者に公知であり、反応トレーのウェル壁、試験管、ポリスチレンビーズ、磁性または非磁性ビーズ、ニトロセルロース小片、膜、微粒子（例えば、ラテックス粒子）、ヒツジ（または他の動物の）赤血球およびＤｕｒａｃｙｔｅｓ（登録商標）（Ａｂｂｏｔｔ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ａｂｂｏｔｔ　Ｐａｒｋ，ＩＬから入手可能な、ピルビン酸アルデヒドおよびホルムアルデヒドにより「固定」された赤血球）などを含む。「固相」は決定的に重要なものではなく、当業者により選択されうる。例えば、ラテックス粒子、微粒子、磁性または非磁性ビーズ、膜、プラスチック管、マイクロタイターウェルの壁、ガラスまたはシリコンチップ、ヒツジ（または他の適当な動物の）赤血球およびＤｕｒａｃｙｔｅｓ（登録商標）はすべて、適当な具体例である。ペプチドを固相上に固定化するための適当な方法には、イオン性、疎水性、共有結合相互作用などが含まれる。本発明で用いる「固相」は、不溶性であるか又は後続の反応で不溶性にされうる任意の材料を意味する。該固相は、該捕捉試薬を誘引し固定化するその固有能力に関して選択することができる。あるいは、該固相は、該捕捉試薬を誘引し固定化しうる追加的な受容体を保有しうる。その追加的な受容体には、該捕捉試薬自体とは反対に荷電した、あるいは該捕捉試薬に共役した荷電物質とは反対に荷電した荷電物質が含まれうる。あるいはまた、該受容体分子は、特異的結合反応により該捕捉試薬を固定化する能力を有し固相上に固定化（結合）された任意の特異的結合メンバーでありうる。該受容体分子は、アッセイの実施前またはアッセイの実施中に捕捉試薬が固相材料に間接的に結合するのを可能にする。したがって、該固相は、プラスチック、誘導体化プラスチック、磁性または非磁性金属、試験管のガラスまたはシリコン表面、マイクロタイターウェル、シート、ビーズ、微粒子、チップ、ヒツジ（または他の適当な動物の）赤血球、Ｄｕｒａｃｙｔｅｓ（登録商標）および当業者に公知の他の形態でありうる。
【００９９】
検出抗体の接近を許容するのに十分な多孔性と、抗原に結合する適当な表面親和性とを有する、適当な任意の多孔性材料を、該固相が含みうると意図され、そのような場合も本発明の範囲内に含まれる。多孔性構造体が一般に好ましいが、水和状態のゲル構造を有する材料も使用されうる。そのような有用な固体支持体には、ニトロセルロースおよびナイロンが含まれるが、これらに限定されるものではない。本明細書に記載のそのような多孔性固体支持体は、好ましくは、約０．０１〜０．５ｍｍ、好ましくは約０．１ｍｍの厚さのシートの形態であると意図される。該孔径は、広範囲の値を取ることが可能であり、好ましくは約０．０２５〜１５ミクロン、特に、約０．１５〜１５ミクロンである。そのような支持体の表面は、該支持体に対する該抗原または抗体の共有結合を引き起こす化学的方法により活性化されうる。しかしながら、一般には、十分には理解されていない疎水性力による多孔性材料上での吸着により、該抗原または抗体の不可逆的結合が得られる。他の適当な固体支持体は当技術分野で公知である。
【０１００】
試薬
本発明は、関心のある乳房組織に由来しＢＳ１０６と称されるポリヌクレオチド配列、それにコードされるポリペプチド、これらのポリペプチドに特異的な抗体などの試薬を提供する。本発明はまた、開示されているポリヌクレオチドに由来する及びこれらのポリヌクレオチドに相補的な核酸配列に由来するオリゴヌクレオチド断片などの試薬を提供する。本発明のポリヌクレオチド、ポリペプチドまたは抗体を使用して、乳房の疾患または状態（例えば、癌）の検出、診断、病期分類、モニター、予後判定、予防もしくは治療または素因の判定につながる情報を得ることができる。本明細書に開示の配列は、遺伝子転写活性の特異的プロフィールを得るために又はアッセイにおいて使用しうる特有のポリヌクレオチドを代表する。そのようなアッセイは、参照により本明細書に組み入れる欧州特許番号０３７３２０３Ｂ１および国際公開番号ＷＯ　９５／１１９９５に開示されている。
【０１０１】
選択したＢＳ１０６由来ポリヌクレオチドを、正常な又は改変された遺伝子発現の検出のために本明細書に記載の方法において使用することができる。そのような方法では、ＢＳ１０６ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド、それらの断片もしくは誘導体、またはそれらに相補的な核酸配列を使用することが可能である。
【０１０２】
本明細書に開示のポリヌクレオチド、それらに相補的な配列、またはそれらのいずれかの断片を、乳房組織の疾患またはそれに伴う状態に関連した遺伝子、核酸、ｃＤＮＡまたはｍＲＮＡの検出、増幅または定量のためのアッセイで使用することができる。また、それらを使用して、ＢＳ１０６ポリペプチドのコード領域の全部または一部を同定することができる。さらに、それらは、アッセイ用のキットの形態で個々の容器内で提供されたり、あるいは個々の組成物として提供されうる。アッセイ用のキットとして提供される場合には、緩衝液、共役体などの他の適当な試薬が含まれうる。
【０１０３】
該ポリヌクレオチドはＲＮＡまたはＤＮＡの形態でありうる。ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、核酸類似体および合成ＤＮＡの形態のポリヌクレオチドは、本発明の範囲内に含まれる。該ＤＮＡは、二本鎖または一本鎖であることが可能であり、一本鎖である場合には、コード（センス）鎖または非コード（アンチセンス）鎖であることが可能である。該ポリペプチドをコードするコード配列は、本発明で提供するコード配列と同一であることが可能であり、遺伝暗号の重複または縮重の結果、本発明で提供するＤＮＡと同じポリペプチドをコードする異なるコード配列であることが可能である。
【０１０４】
このポリヌクレオチドは、該ポリペプチドのコード配列のみを含んでいたり、あるいは該ポリペプチドのコード配列と追加的なコード配列（例えば、リーダーまたは分泌配列またはプロタンパク質配列）とを含んでいたり、あるいは該ポリペプチドのコード配列（および所望により追加的なコード配列）と非コード配列（例えば、該ポリペプチドのコード配列の５’および／または３’側の非コード配列）とを含んでいることが可能である。
【０１０５】
また、本発明は、ポリヌクレオチドの欠失、置換または付加などの修飾を含有する変異ポリヌクレオチドと、該変異ポリヌクレオチド配列から生じた任意のポリヌクレオチド修飾体を含む。また、本発明のポリヌクレオチドは、本発明で提供するコード配列の天然に生じる対立遺伝子変異体であるコード配列を有しうる。
【０１０６】
さらに、該ポリペプチドのコード配列は、宿主細胞からのポリペプチドの発現および分泌を補助するポリヌクレオチド配列（例えば、該細胞からのポリペプチドの輸送を制御するための分泌配列として機能するリーダー配列）に、同じリーディングフレームで融合させることができる。リーダー配列を有するポリペプチドはプレタンパク質であり、それは、該ポリペプチドを形成するために宿主細胞により切断されるリーダー配列を有しうる。また、該ポリヌクレオチドは、該タンパク質と追加的な５’アミノ酸残基とを含むプロタンパク質をコードしうる。プロ配列を有するタンパク質はプロタンパク質であり、場合によっては、該タンパク質の不活性形態でありうる。該プロ配列が切断されると、活性タンパク質が残される。したがって、本発明のポリヌクレオチドは、タンパク質をコードしたり、あるいはプロ配列を有するタンパク質をコードしたり、あるいはプレ配列（リーダー配列）とプロ配列とを有するタンパク質をコードしうる。
【０１０７】
また、本発明のポリヌクレオチドは、本発明のポリペプチドの精製を可能にするマーカー配列とインフレームで融合したコード配列を有しうる。該マーカー配列は、細菌宿主の場合には、該マーカーと融合したポリペプチドの精製をもたらすための、ｐＱＥ−９ベクターにより供給されるヘキサヒスチジンタグであることが可能であり、あるいは例えば、哺乳動物宿主（例えば、ＣＯＳ−７細胞系）を使用する場合には、該マーカー配列は赤血球凝集素（ＨＡ）タグであることが可能である。ＨＡタグは、インフルエンザ血球凝集素タンパク質に由来するエピトープに対応する。例えば、Ｉ．Ｗｉｌｓｏｎら，Ｃｅｌｌ　３７：７６７（１９８４）を参照されたい。
【０１０８】
ポリヌクレオチドと本発明で提供する配列との間で少なくとも５０％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも９０％の同一性があれば、該ポリヌクレオチドは該配列にハイブリダイズするとみなされると考えられる。
【０１０９】
２つの核酸分子の間の配列同一性の度合は、そのような分子間のハイブリダイゼーション事象の効率および強度に大きな影響を及ぼす。部分的に同一な核酸配列は、完全に同一な配列が標的分子にハイブリダイズするのを少なくとも部分的に阻害するものである。完全に同一な配列のハイブリダイゼーションの阻害は、当技術分野でよく知られたハイブリダイゼーションアッセイ（例えば、サザンブロット、ノーザンブロット、溶液ハイブリダイゼーション、ｉｎ　ｓｉｔｕハイブリダイゼーションなど；Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，第２版，（１９８９）Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ．を参照されたい）を用いて評価することができる。そのようなアッセイは、種々の度合の選択性を用いて、例えば、低いストリンジェンシーから高いストリンジェンシーまで変化する条件を用いて行うことができる。低いストリンジェンシーの条件を用いる場合には、非特異的結合の不存在は、部分的な度合の配列同一性でさえも欠く二次プローブ（例えば、約３０％未満の配列同一性を有するプローブ）を使用して評価することができ、非特異的結合事象の不存在下では、該二次プローブは該標的にハイブリダイズしない。
【０１１０】
ハイブリダイゼーションに基づく検出系を用いる場合、標的核酸配列に相補的な核酸プローブを選択する。ついで、適当な条件の選択により、該プローブおよび該標的配列はお互いに「選択的にハイブリダイズ」する又は結合して、ハイブリッド分子を形成する。本発明の１つの実施形態においては、核酸分子は、中等度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で標的配列に選択的ハイブリダイズしうる。本発明の場合、中等度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、選択した核酸プローブの配列に対して少なくとも約７０％の配列同一性を有する少なくとも１４ヌクレオチド長の標的核酸配列の検出を可能にする。もう１つの実施形態においては、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下、そのような選択的ハイブリダイゼーションを行う。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、選択した核酸プローブの配列に対して９０％を超える配列同一性を有する少なくとも１４ヌクレオチド長の標的核酸配列の検出を可能にする。該プローブおよび標的が特定の度合の配列同一性を有する場合には、プローブ／標的ハイブリダイゼーションに有用なハイブリダイゼーション条件は当技術分野で公知のとおりに決定することができる（例えば、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ　Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｂ．Ｄ．ＨａｍｅｓおよびＳ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編，（１９８５）　Ｏｘｆｏｒｄ；Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ；ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓを参照されたい）。ハイブリッド分子は、例えば、固体支持体上、溶液中および組織切片中で形成させることができる。ハイブリッドの形成は、典型的には該プローブ中にレポーター分子を含めることによりモニターすることができる。そのようなレポーター分子または検出可能な要素には、放射性元素、蛍光マーカー、および酵素共役リガンドが結合しうる分子が含まれる。
【０１１１】
ハイブリダイゼーションのストリンジェンシー条件に関しては、例えば以下の因子を変化させることにより特定のストリンジェンシーを確立するために多数の同等の条件が用いられうることが当技術分野でよく知られている：プローブおよび標的配列の長さ及び性質、種々の配列の塩基組成、塩および他のハイブリダイゼーション溶液成分の濃度、ハイブリダイゼーション溶液中のブロッキング剤（例えば、ホルムアミド、デキストラン硫酸、およびポリエチレングリコール）の存在または不存在、ハイブリダイゼーション反応温度および時間パラメーターならびに種々の洗浄条件。特定の組合せのハイブリダイゼーション条件の選択は当業者の技量の範囲内である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，第２版，（１９８９）Ｃｏｌｄ　ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．を参照されたい）。
【０１１２】
本発明はまた、精製されたＢＳ１０６ポリペプチドを使用して産生された抗体であって、該ポリペプチドの少なくとも一部が、本発明が提供するポリヌクレオチドから選ばれるＢＳ１０６ポリヌクレオチドにコードされることを特徴とする抗体を提供する。これらの抗体は、試験サンプル中のＢＳ１０６抗原の検出のために本発明で提供する方法において使用することができる。該試験サンプル中のＢＳ１０６抗原の存在は乳房の疾患または状態の存在を示す。該抗体はまた、治療目的に使用することが可能であり、例えば、改変した又は異常な発現に関連した状態におけるＢＳ１０６ポリペプチドの活性の中和において使用することができる。
【０１１３】
本発明はさらに、本発明で提供する推定アミノ酸配列を有するＢＳ１０６ポリペプチド、ならびにそのようなポリペプチドの断片、類似体および誘導体に関する。本発明のポリペプチドは、組換えポリペプチド、天然の精製ポリペプチドまたは合成ポリペプチドでありうる。ＢＳ１０６ポリペプチドの断片、誘導体または類似体は、該アミノ酸残基の１以上が同類または非同類アミノ酸残基（好ましくは、同類アミノ酸残基）で置換されたものでありうる。そのような置換アミノ酸残基は、遺伝暗号によりコードされていてもコードされていなくてもよい。あるいはそれは、該アミノ酸残基の１以上が置換基を含むものでありうる。あるいはそれは、該ポリペプチドが別の化合物（例えば、該ポリペプチドの半減期を増加させる化合物、例えばポリエチレングリコール）に融合したものでありうる。あるいはそれは、追加的なアミノ酸（例えば、リーダーもしくは分泌配列、または該ポリペプチドの精製のために使用する配列、またはプロタンパク質配列）が該ポリペプチドに融合したものでありうる。そのような断片、誘導体および類似体は本発明の範囲内に含まれる。本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオチドは、好ましくは、単離（好ましくは精製）された形態で提供される。
【０１１４】
したがって、本発明のポリペプチドは、天然に生じるポリペプチドのアミノ酸配列と同じであるか又は１以上のアミノ酸置換による軽微な変異により異なるアミノ酸配列を有しうる。該変異は、典型的には、約１〜５アミノ酸の範囲の「同類変化」であることが可能であり、この場合、該置換アミノ酸は、類似した構造的または化学的特性を有する（例えば、ロイシンからイソロイシンへの置換またはトレオニンからセリンへの置換）。一方、変異には、非同類変化（例えば、グリシンからトリプトファンへの置換）が含まれうる。また、類似した軽微な変異には、アミノ酸の欠失または挿入またはそれらの両方も含まれうる。生物学的または免疫学的活性の変化を引き起こすことなく置換、挿入または欠失されうるアミノ酸の種類および個数を決定する際の指針は、当技術分野でよく知られたコンピュータープログラム、例えばＤＮＡＳＴＡＲソフトウェア（ＤＮＡＳＴＡＲ　Ｉｎｃ．，Ｍａｄｉｓｏｎ　ＷＩ）を用いて得ることができる。
【０１１５】
本発明のポリヌクレオチド配列に従い構築したプローブを、種々のタイプの分析を行なうための種々のアッセイ方法で使用することができる。例えば、そのようなプローブは、染色体分析を行なうために蛍光ｉｎ　ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）技術において使用することが可能であり、また、染色体の広がりから認められるか又はＰＣＲ産生および／または対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプローブ、対立遺伝子特異的増幅を用いて又は直接シークエンス法により検出されうる欠失または転座などの染色体中の癌特異的構造改変を同定するために使用することができる。また、プローブは、放射性同位体、直接的または間接的に検出可能なハプテン、または蛍光性分子で標識することができ、組織試料または細胞中のポリヌクレオチドを含む遺伝子のｍＲＮＡ発現を評価するためのｉｎ　ｓｉｔｕハイブリダイゼーション研究で使用することができる。
【０１１６】
また、本発明は、本発明で提供するポリヌクレオチドおよびポリペプチドの製造に関する教示を提供する。
【０１１７】
プローブアッセイ
試験サンプル中の核酸の検出のためのアッセイにおいて使用しうるプローブを得るために、本発明で提供する配列を使用することができる。該プローブは、関心のあるポリヌクレオチドの保存ヌクレオチド領域から、または関心のあるポリヌクレオチドの非保存ヌクレオチド領域から設計することができる。アッセイの最適化のためのそのようなプローブの設計は、当業者の技量の範囲内である。一般には、最大の特異性を望む場合には、非保存領域またはユニーク領域から核酸プローブを得、例えば多遺伝子ファミリーの異なるメンバーに密接に関連したヌクレオチド領域またはマウスおよびヒトなどの関連種におけるヌクレオチド領域に関してアッセイする場合には、保存領域から核酸プローブを得る。
【０１１８】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、核酸中またはその混合物中に含有された所望の核酸配列（標的）を増幅するための技術である。ＰＣＲでは、一対のプライマーを過剰に使用して、標的核酸の相補鎖とハイブリダイズさせる。標的核酸を鋳型として使用して、該プライマーのそれぞれをポリメラーゼにより伸長させる。該伸長産物は、元の標的鎖から解離した後、それ自体が標的配列となる。ついで新たなプライマーをハイブリダイズさせ、ポリメラーゼにより伸長させ、このサイクルを繰返して、標的配列分子の数を幾何級数的に増加させる。ＰＣＲは、参照により本明細書に組み入れる米国特許第４，６８３，１９５号および第４，６８３，２０２号に開示されている。
【０１１９】
リガーゼチェイン反応（ＬＣＲ）は、核酸の増幅のためのもう１つの方法である。ＬＣＲでは、２個の一次（第１および第２）プローブと２個の二次（第３および第４）プローブとを含むプローブペアを使用し、それらはすべて、標的に対して過剰モルで使用する。第１プローブは標的鎖の第１セグメントにハイブリダイズし、第２プローブは標的鎖の第２セグメントにハイブリダイズする。該一次プローブが５’リン酸−３’ヒドロキシルの関係で互いに隣接するよう、また、リガーゼがそれらの２個のプローブを融合産物に共有的に融合またはライゲーションしうるよう、第１セグメントと第２セグメントとは隣接している。さらに、第３（二次）プローブは第１プローブの一部にハイブリダイズすることが可能であり、第４（二次）プローブは、同様の隣接様態で第２プローブの一部にハイブリダイズすることが可能である。勿論、該標的が最初に二本鎖である場合は、二次プローブは、最初の標的の相補体にもハイブリダイズすることになる。一次プローブのライゲーション鎖が標的鎖から分離すると、それは第３および第４プローブにハイブリダイズし、それらはライゲーションされて相補的な二次ライゲーション産物を形成しうる。該ライゲーション産物は標的またはその相補体のいずれかと機能的に等価であると認識することが重要である。ハイブリダイゼーションとライゲーションとの反復サイクルにより、標的配列の増幅が達成される。この技術は、１９８９年６月１６日付け公開のＫ．ＢａｃｋｍａｎのＥＰ−Ａ−３２０　３０８および１９９１年７月３１日付け公開のＫ．ＢａｃｋｍａｎらのＥＰ−Ａ−４３９　１８２に更に詳しく記載されている。
【０１２０】
ｍＲＮＡの増幅の場合には、ｍＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写し、ついでポリメラーゼ連鎖反応を行なうこと（ＲＴ−ＰＣＲ）、あるいは参照により本明細書に組み入れる米国特許第５，３２２，７７０号に記載されているとおり、両工程で単一の酵素を使用すること、あるいは同様に参照により本明細書に組み入れるＲ．Ｌ．Ｍａｒｓｈａｌｌら，ＰＣＲ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ａｎｄ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ　４：８０−８４（１９９４）に記載のとおり、ｍＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写し、ついで不斉ギャップリガーゼチェイン反応を行なうこと（ＲＴ−ＡＧＬＣＲ）が、本発明の範囲内に含まれる。
【０１２１】
本発明で使用しうる他の公知増幅方法には、Ｊ．Ｃ　Ｇｕａｔｅｌｌｉら，ＰＮＡＳ　ＵＳＡ　８７：１８７４−１８７８（１９９０）およびＪ．Ｃｏｍｐｔｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ　３５０（Ｎｏ　６３１３）：９１−９２（１９９１）に記載のいわゆる「ＮＡＳＢＡ」または「３ＳＲ」技術、欧州特許出願公開（ＥＰＡ）第４５４４６１０号に記載のＱ−β増幅、鎖置換増幅（ｓｔｒａｎｄ　ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）（Ｇ．Ｔ．Ｗａｌｋｅｒら，Ｃｌｉｎ．　Ｃｈｅｍ．４２：９−１３（１９９６）および欧州特許出願第６８４３１５号に記載）、および国際公開ＷＯ　９３／２２４６１に記載の標的媒介増幅（ｔａｒｇｅｔ　ｍｅｄｉａｔｅｄ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【０１２２】
ＢＳ１０６の検出は、当技術分野で現在よく知られた検出方法および将来現れうる検出方法を含む適当な任意の検出方法を用いて行なうことができる。前記の現在公知の検出方法の具体例を、参照により本明細書に組み入れることとする。例えば、Ｃａｓｋｅｙら，米国特許第５，５８２，９８９号、Ｇｅｌｆａｎｄら，米国特許第５，２１０，０１５号を参照されたい。そのような検出方法の具体例には、標的増幅方法およびシグナル増幅技術が含まれる。現在公知の検出方法の具体例には、ＰＣＲ、ＬＣＲ、ＮＡＳＢＡ、ＳＤＡ、ＲＣＲおよびＴＭＡと称される核酸増幅技術が含まれるであろう。例えば、Ｃａｓｋｅｙら，米国特許第５，５８２，９８９号、Ｇｅｌｆａｎｄら，米国特許第５，２１０，０１５号を参照されたい。前記のすべてを参照により本明細書に組み入れることとする。また、Ｓｎｉｔｍａｎら，米国特許第５，２７３，８８２号などに開示されているシグナル増幅を用いて、検出を行なうことができる。標的またはシグナルの増幅が現在では好ましいが、増幅を必要としない超高感度の検出方法が本発明で使用されうると考えられ、本発明の範囲内に含まれる。
【０１２３】
種々の不均一または均一な検出様式を用いて、増幅型または非増幅型の両方の検出を（組合せて）行なうことができる。不均一検出様式の具体例は、Ｓｎｉｔｍａｎら，米国特許第５，２７３，８８２号、Ａｌｂａｒｅｌｌａら，ＥＰ−８４１１４４４１．９、Ｕｒｄｅａら，米国特許第５，１２４，２４６号、Ｕｌｌｍａｎら，米国特許第５，１８５，２４３号およびＫｏｕｒｉｓｋｙら，米国特許第４，５８１，３３３号に開示されている。前記のすべてを参照により本明細書により組み入れることとする。均一検出様式の具体例は、参照により本明細書に組み入れるＣａｓｋｅｙら，米国特許第５，５８２，９８９号、Ｇｅｌｆａｎｄら，米国特許第５，２１０，０１５号に開示されている。また、ハイブリダイゼーションアッセイにおける複数のプローブの使用（その使用により、ＢＳ１０６シグナルの感度および増幅が改善される）が考えられ、本発明の範囲内に含まれる。例えば、参照により本明細書に組み入れるＣａｓｋｅｙら，米国特許第５，５８２，９８９号、Ｇｅｌｆａｎｄら，米国特許第５，２１０，０１５号を参照されたい。
【０１２４】
１つの実施態様では、本発明は、一般に、標的ポリヌクレオチド配列を含有する疑いのある試験サンプルを、アンプリコン配列の内部領域にハイブリダイズしうる検出プローブと増幅プライマーとを含む増幅反応試薬と接触させる工程を含む。本発明で提供する方法に従い使用するプローブおよびプライマーは、捕捉標識および検出標識で標識し、この場合、プローブは１つのタイプの標識で標識し、プライマーは別のタイプの標識で標識する。さらに、プライマーおよびプローブは、該プローブ配列が、該プライマー配列より低い融解温度を有するように選択する。増幅試薬、検出試薬および試験サンプルは、標的配列の存在下で該標的配列のコピー（アンプリコン）を産生させる増幅条件下に配置する。通常の場合、プライマーは標的配列とその相補的鎖とを増幅するように与えられるため、該アンプリコンは二本鎖である。ついで該二本鎖アンプリコンを熱変性させて、一本鎖アンプリコンメンバーを得る。該一本鎖アンプリコンメンバーが形成したら、該プローブと一本鎖アンプリコンメンバーとの複合体の形成が可能となるように該混合物を冷却する。
【０１２５】
該一本鎖アンプリコン配列およびプローブ配列を冷却するにつれて、該プローブ配列は該一本鎖アンプリコンメンバーに優先的に結合する。該プローブ配列が、一般に、該プライマー配列より短くなるように選択され、したがって該プライマーより低い融解温度を有すると仮定すると、この知見は反直観的なものである。したがって、該プライマーにより産生されるアンプリコンの融解温度はまた、該プローブより高い融解温度を有していなければならない。したがって、該混合物が冷却するにつれて、二本鎖アンプリコンの再形成が予想されるであろう。しかしながら、前記のとおり、それはこの場合には当てはまらない。該プローブは、該一本鎖アンプリコンメンバーに優先的に結合することが判明している。さらに、このようなプローブ／一本鎖アンプリコン結合の優先性は、該プライマー配列を該プローブに対して過剰に加えた場合でさえも存在する。
【０１２６】
該プローブ／一本鎖アンプリコンメンバーのハイブリッドが形成した後、それらを検出する。該プライマーおよびプローブ上に存在する検出標識および捕捉標識を使用して該ハイブリッドを検出するには、標準的な不均一アッセイ様式が適している。該ハイブリッドを、該捕捉標識により固相試薬に結合させ、該検出標識により検出することが可能である。該検出標識が直接的に検出可能な場合には、検出可能なシグナルを該標識に生成させ、必要に応じて該シグナルを検出することにより、該固相上のハイブリッドの存在を検出することができる。該標識が直接的に検出されない場合には、直接的に検出可能な標識に結合した結合メンバーを一般に含む共役体と該捕捉ハイブリッドとを接触させることが可能である。該共役体が該複合体に結合するようになり、該複合体上の共役体の存在を、その直接的に検出可能な標識で検出することができる。このようにして、固相試薬上のハイブリッドの存在を判定することができる。ハイブリダイズしていないアンプリコンまたはプローブおよび未結合共役体を洗い落とすために洗浄工程を用いることができると当業者に認識されるであろう。
【０１２７】
１つの実施形態においては、該不均一アッセイは、核酸分子のアレイを保持する固相支持体を使用して簡便に行うことができる。そのようなアレイは、ハイスループットおよび／またはマルチプレックスアッセイ様式に有用である。そのようなアレイを予備形成核酸分子から形成させるための種々の方法、またはｉｎ　ｓｉｔｕ合成技術を用いて該アレイを製造するための方法は、概ね、当技術分野で公知である（例えば、Ｄａｔｔａｇｕｐｔａら，欧州公開番号０　２３４，７２６Ａ３；Ｓｏｕｔｈｅｒｎ，米国特許第５，７００，６３７号；Ｐｉｒｒｕｎｇら，米国特許第５，１４３，８５４号；ＰＣＴ国際公開番号ＷＯ９２／１００９２およびＦｏｄｏｒら，Ｓｃｉｅｎｃｅ　２５１：７６７−７７７（１９９１）を参照されたい）。
【０１２８】
該標的配列は一本鎖として記載されているが、標的配列が実際には二本鎖であり、増幅プライマー配列とのハイブリダイゼーションの前に、該標的配列がその相補体から単に分離される場合も含むと意図される。この方法においてＰＣＲを用いる場合には、通常は、標的配列の末端が既知である。好ましい方法においてＬＣＲまたはその変法を用いる場合には、通常は、全標的配列が既知である。典型的には、標的配列は、ＲＮＡ、ＤＮＡなどの核酸配列である。
【０１２９】
本発明で提供する方法は、熱サイクル反応混合物を含む良く知られた増幅反応において、特にＰＣＲおよびギャップＬＣＲ（ＧＬＣＲ）において用いることができる。増幅反応では、典型的には、標的核酸配列（該標的配列は、通常、より一層大きな核酸配列の小さな領域である）のコピーを反復的に産生させるためにプライマーを使用する。プライマー自体は、標的配列の領域に相補的な核酸配列である。増幅条件下、これらのプライマーは、標的配列の相補的領域にハイブリダイズまたは結合する。標的配列のコピーは、典型的には、該ハイブリダイゼーションプライマーにヌクレオチドを付加し及び／又は隣接プローブ対をライゲーションするためにポリメラーゼまたはリガーゼ活性を有する酵素を別々に又は組合せて用いるプライマー伸長および／またはライゲーションの過程により生じる。単量体または予め生成したオリゴマーとしてプライマーまたはプローブに加えるヌクレオチドもまた、標的配列に相補的である。プライマーまたはプローブが、十分に伸長し及び／又はライゲーションしたら、例えば、相補的核酸鎖が解離する温度である「融解温度」まで該反応混合物を加熱することにより、それらを標的配列から分離する。このようにして、標的配列に相補的な配列が形成する。
【０１３０】
ついでいずれかの二本鎖配列を分離して、プライマーまたはプローブがそれらの各々の標的にハイブリダイズするのを可能にし、ハイブリダイズしたプライマーまたはプローブを伸長および／またはライゲーションさせ、再分離することにより、標的配列数を更に増幅するために、新たな増幅サイクルを行なうことができる。増幅サイクルにより産生される相補的配列は、標的配列数を更に増幅するために、プライマーを伸長させるための又は２個のプローブのギャップを埋めるための鋳型として働きうる。典型的には、反応混合物を２０〜１００サイクルに付す。より典型的には、反応混合物を２５〜５０サイクルに付す。サイクル数は当業者により決定されうる。このようにして、多コピーの標的配列およびその相補的配列を得る。したがって、プライマーが増幅条件下に存在する場合には、該プライマーが標的配列の増幅を開始させる。
【０１３１】
一般には、ＰＣＲにおいては、標的鎖の一部とその相補体とに相補的な２個のプライマーを使用する。ＬＣＲでは、一般に、４個のプローブ（そのうちの２個は標的配列に相補的であり、残りの２個は、同様に、標的の相補体に相補的である）を使用する。前記のプライマーセットおよび酵素に加えて、核酸増幅反応混合物は、よく知られた他の試薬を含むことも可能であり、それらには、酵素補因子、例えばマンガン；マグネシウム塩；ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）；およびデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）、例えばデオキシアデニン三リン酸、デオキシグアニン三リン酸、デオキシシトシン三リン酸およびデオキシチミン三リン酸が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【０１３２】
増幅プライマーは標的配列の増幅を開始させるが、検出（またはハイブリダイゼーション）プローブは増幅に関与しない。検出プローブは、一般に、核酸配列または非荷電核酸類似体、例えば、国際公開ＷＯ　９２／２０７０２に開示されているペプチド核酸、米国特許第５，１８５，４４４号、第５，０３４，５０６号および第５，１４２，０４７号などに記載されているモルホリノ類似体などである。該プローブが担持する標識のタイプに応じて、増幅反応により生じるアンプリコンの捕捉または検出に、該プローブを使用する。該プローブは標的配列の増幅には関与せず、したがって、「伸長不可能」にされる必要があるかもしれない。なぜなら、追加的なｄＮＴＰは該プローブに付加され得ないからである。通常、類似体自体はもともと伸長不可能である。核酸プローブは、該プローブの３’末端を修飾してヒドロキシル基がもはや伸長に関与できなくなるようにすることにより、伸長不可能にすることが可能である。例えば、該プローブの３’末端を捕捉または検出標識で官能基化して、ヒドロキシル基を消費させるか又は保護する。あるいは、３’ヒドロキシル基を単に切断し、置換し又は修飾することが可能である。参照により本明細書に組み入れる１９９３年４月１９日付け出願の米国特許出願第０７／０４９，０６１号には、プローブを伸長不可能にするのに使用しうる修飾が記載されている。
【０１３３】
プローブに対するプライマーの比は重要ではない。したがって、プローブまたはプライマーのいずれかを過剰に反応混合物に加えて、一方の濃度を他方の濃度より大きくすることが可能である。あるいは、プライマーおよびプローブを同等の濃度で使用することができる。しかしながら、好ましくは、プローブに対して過剰のプライマーを反応混合物に加える。したがって、プライマー対プローブの比は、例えば５：１であり、２０：１が好ましい。
【０１３４】
プライマーおよびプローブの長さは様々となることが可能であるが、プローブ配列がプライマー配列より低い融解温度を有するように、プローブ配列を選択する。したがって、プライマー配列は、一般に、プローブ配列より長い。典型的には、プライマー配列は２０〜５０ヌクレオチド長の範囲であり、より典型的には、２０〜３０ヌクレオチド長の範囲である。典型的なプローブは、１０〜２５ヌクレオチド長の範囲である。
【０１３５】
プライマーおよびプローブを合成するための種々の方法が当技術分野でよく知られている。同様に、プライマーまたはプローブに標識を結合させるための方法も当技術分野でよく知られている。例えば、通常のヌクレオチドホスホルアミジット化学と、Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．（Ｆｏｓｔｅｒ　Ｃｉｔｙ，ＣＡ）、ＤｕＰｏｎｔ（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＤＥ）または、Ｍｉｌｌｉｇｅｎ（Ｂｅｄｆｏｒｄ　ＭＡ）から入手可能な装置とを用いて、所望の核酸プライマーまたはプローブを合成するのが、常套手段である。本発明のプライマー、プローブなどのオリゴヌクレオチドを標識するための多数の方法が、既に記載されている。Ｅｎｚｏ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ（Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ，ＮＹ）およびＣｌｏｎｔｅｃｈ（Ｐａｌｏ　Ａｌｔｏ，ＣＡ）は共に、プローブ標識技術を記載し、商業化している。例えば、３’−Ａｍｉｎｅ−ＯＮ　ＣＰＧ（商標）（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ　Ａｌｔｏ，ＣＡ）を使用して、第一級アミンを３’オリゴ末端に結合させることができる。同様に、Ａｍｉｎｏｍｏｄｉｆｉｅｒ　ＩＩ（登録商標）（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を使用して、第一級アミンを５’オリゴ末端に結合させることができる。通常の活性化および結合の化学的方法を用いて、該アミンを種々のハプテンと反応させることができる。また、参照により本明細書に組み入れる１９９０年１２月１１日付け出願の同時係属米国特許出願第６２５，５６６号および１９９０年１２月２０日付け出願の第６３０，９０８号は、それぞれそれらの５’および３’末端でプローブを標識するための方法を教示している。１９９２年６月２５日付け公開の国際公開ＷＯ９２／１０５０５および１９９２年７月９日付け公開のＷＯ９２／１１３８８は、それぞれそれらの５’および３’末端でプローブを標識するための方法を教示している。オリゴヌクレオチドを標識するための１つの公知方法では、標識−ホスホルアミジット試薬を調製し使用して、該標識をオリゴヌクレオチドに、その合成中に付加する。例えば、Ｎ．Ｔ　Ｔｈｕｏｎｇら，Ｔｅｔ．　Ｌｅｔｔｅｒｓ　２９（４６）：５９０５−５９０８（１９８８）またはＪ．Ｓ．Ｃｏｈｅｎら，公開米国特許出願第０７／２４６，６８８号（ＮＴＩＳ　ＯＲＤＥＲ　Ｎｏ．ＰＡＴ−ＡＰＰＬ−７−２４６，６８８）（１９８９）を参照されたい。好ましくは、プローブは、その３’および５’末端で標識される。
【０１３６】
捕捉標識は、プライマーまたはプローブに結合させる。該捕捉標識は、固相試薬の特異的結合メンバーと結合ペアを形成する特異的結合メンバーでありうる。プライマーまたはプローブ自体が捕捉標識として機能しうると理解されるであろう。例えば、固相試薬の結合メンバーが核酸配列である場合には、それは、プライマーまたはプローブの相補的部分に結合して該プライマーまたはプローブを固相に固定化するように選ばれうる。プローブ自体が結合メンバーとして機能する場合には、該プローブは、一本鎖アンプリコンメンバーに相補的でない配列または「テイル」を含有する、と当業者に認識されるであろう。プライマー自体が捕捉標識として機能する場合には、該プライマーの少なくとも一部は、固相上の核酸に自由にハイブリダイズしうるであろう。なぜなら、該プローブは、プライマー配列に対して完全には相補的とならないように選ばれるからである。
【０１３７】
一般に、不均一系イムノアッセイを行なうために一般的に用いる技術を用いて、プローブ／一本鎖アンプリコンメンバー複合体を検出することができる。好ましくは、この実施態様では、商業的に入手可能なＡｂｂｏｔｔ　ＬＣｘ装置（登録商標）（Ａｂｂｏｔｔ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ａｂｂｏｔｔ　Ｐａｒｋ，ＩＬ）で用いるプロトコールに従い、検出を行なう。
【０１３８】
試験サンプルを一対のプライマーと接触させ、増幅を行ない、ハイブリダイゼーションプローブを加え、検出を行なう典型的なＰＣＲアッセイにおいて、本明細書に開示するプライマーおよびプローブは有用である。
【０１３９】
本発明が提供するもう１つの方法は、試験サンプルを複数のポリヌクレオチド（少なくとも１つのポリヌクレオチドは、本明細書に記載のＢＳ１０６分子である）と接触させ、該試験サンプルを複数のポリヌクレオチドにハイブリダイズさせ、ハイブリダイゼーション複合体を検出することを含む。ハイブリダイゼーション複合体を同定し、定量して、乳房組織の疾患（例えば、乳癌）を示すプロフィールを集める。さらに、発現されたＲＮＡ配列を、逆転写と、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）などの当技術分野でよく知られた方法によるＤＮＡの増幅とにより検出することができる。
【０１４０】
薬物のスクリーニングおよび遺伝子治療
本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドなどのアンチセンスＢＳ１０６由来分子を、乳房組織の疾患または状態（特に、乳癌）に関連したポリヌクレオチドの異常な発現に関連した状態を有する患者内に導入するための、遺伝子治療方法の用途を含む。アンチセンスＲＮＡおよびＤＮＡ断片ならびにリボザイムを含むこれらの分子は、ＢＳ１０６−ｍＲＮＡの翻訳を抑制するように設計され、ＢＳ１０６ポリヌクレオチドの改変された又は異常な発現に関連した状態の治療において治療的に使用されうる。
【０１４１】
あるいは、前記のオリゴヌクレオチドを、当技術分野で公知の方法で細胞に運搬して、該アンチセンスＲＮＡまたはＤＮＡをインビボで発現させて、前記のとおりにＢＳ１０６ポリペプチドの産生を抑制することが可能である。したがって、ＢＳ１０６ポリヌクレオチドに対するアンチセンス構築物は、ＢＳ１０６転写産物の作用を逆転させ、乳房組織の病態（例えば、乳癌）の治療に使用することができる。また、これらのアンチセンス構築物は、腫瘍転移を治療するために使用することができる。
【０１４２】
本発明はまた、ＢＳ１０６ポリペプチドに特異的に結合する少なくとも１つの化合物を同定するために、ＢＳ１０６ポリペプチドまたはその任意の断片に対する特異的結合に関して複数の化合物をスクリーニングする方法を提供する。そのような方法は、少なくとも１つの化合物を準備し、結合を可能にするのに十分な時間、適当な条件下でＢＳ１０６ポリペプチドと各化合物とを一緒にし、各化合物に対する該ＢＳ１０６ポリペプチド結合を検出する工程を含む。
【０１４３】
そのような試験で使用するポリペプチドまたはペプチド断片は、溶液中で遊離していることも、固相に固定されていることも、細胞表面上に担持されていることも、あるいは細胞内に局在していることも可能である。１つのスクリーニング方法では、該ポリペプチドまたはペプチド断片を発現しうる組換え核酸で安定にトランスフェクトされた真核性または原核性宿主細胞を使用する。競合結合アッセイにおいて、そのようなトランスフェクト化細胞に対して薬物、化合物または他の任意の物質をスクリーニングすることができる。例えば、ポリペプチドと被検体との複合体の形成は、生存細胞または固定細胞のいずれかにおいて測定することができる。
【０１４４】
したがって、本発明は、ＢＳ１０６に関連した疾患を治療するために使用しうる薬物、化合物または他の任意の物質に関してスクリーニングする方法を提供する。これらの方法は、該物質をポリペプチドまたはその断片と接触させ、該物質と該ポリペプチドとの複合体の存在に関して、または該ポリペプチドと該細胞との複合体の存在に関してアッセイすることを含む。競合的結合アッセイにおいては、典型的には、該ポリペプチドを標識する。適当なインキュベーションの後、遊離（または未複合体化）したポリペプチドまたはその断片を、結合形態で存在するものから分離し、遊離または未複合体化標識の量を、その個々の物質が該ポリペプチドに結合する又はポリペプチド／細胞複合体を妨害する能力の尺度として用いる。
【０１４５】
本発明はまた、ポリペプチドに結合する能力を有する中和抗体を、該ポリペプチドまたはその断片に対する結合に関して試験剤と特異的に競合させる競合的スクリーニングアッセイの用途を含む。このようにして、本発明で提供するＢＳ１０６ポリペプチドと１以上の抗原決定基を共有する、試験サンプル中のいずれかのポリペプチドの存在を検出するために、該抗体を使用することができる。
【０１４６】
もう１つの物質スクリーニング方法は、本明細書に開示するＢＳ１０６の少なくとも１つのポリペプチドに対して適当な結合親和性を有する化合物に関するハイスループットスクリーニングをもたらす。簡単に説明すると、多数の異なる小さなペプチド試験化合物を、固相（例えば、プラスチックピンまたは他の何らかの表面）の固相上で合成する。該ペプチド試験化合物を、ポリペプチドと反応させ、洗浄する。そのように固相に結合したポリペプチドを、当技術分野でよく知られた方法で検出する。また、本明細書に記載のスクリーニング方法で使用するために、精製ポリペプチドをプレート上に直接コーティングすることができる。さらに、非中和抗体を使用して、該ポリペプチドを捕捉し、それを固相上に固定化することができる。例えば、１９８４年９月１３日付け公開のＥＰ　８４／０３５６４を参照されたい。
【０１４７】
合理的な薬物設計の目標は、関心のある生物学的に活性なポリペプチドの又は小分子の構造類似体（それらが相互作用するアゴニスト、アンタゴニストまたは阻害剤を含む）を得ることである。また、そのような構造類似体を使用して、該ポリペプチドのより活性な又は安定な形態である又はポリペプチドの機能をインビボで増強または阻害する薬物を設計することができる（参照により本明細書に組み入れるＪ．Ｈｏｄｇｓｏｎ，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　９：１９−２１（１９９１））。
【０１４８】
例えば、１つのアプローチでは、ポリペプチドまたはポリペプチド−阻害剤複合体の三次元構造を、Ｘ線結晶解析、コンピューターモデリングまたは最も一般的にはそれらの２つのアプローチの組合せにより決定する。該ポリペプチドの構造を解明し、その活性部位を決定するためには、該ポリペプチドの形状および電荷の両方を確認しなければならない。該ポリペプチドの構造に関する有用な情報が、同種タンパク質の構造に基づくモデリングにより得られることは、それほど多くない。どちらの場合も、関連した構造情報を用いて、類似したポリペプチド様分子を設計したり、あるいは効率的な阻害剤を同定する。
【０１４９】
合理的な薬物設計の有用な具体例は、Ｓ．Ｂｒａｘｔｏｎら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　３１：７７９６−７８０１（１９９２）に示されているとおり、改善された活性または安定性を有する分子、またはＳ．Ｂ．Ｐ．Ａｔｈａｕｄａら，Ｊ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．（Ｔｏｋｙｏ）１１３（６）：７４２−７４６（１９９３）に示されているとおり、天然ペプチドの阻害剤、アゴニストまたはアンタゴニストとして作用する分子を含みうる。
【０１５０】
また、前記のアッセイにより選択された標的特異的抗体を単離し、ついでその結晶構造を決定することが可能である。原則として、このアプローチは、後続の薬物設計の基礎となりうるファーマコフォア（ｐｈａｒｍａｃｏｐｈｏｒｅ）を与える。さらに、機能的な薬理学的に活性な抗体に対する抗イディオタイプ抗体（「抗ｉｄ」）を産生させることにより、タンパク質の結晶解析を行なわないで済ませることが可能である。抗ｉｄの結合部位は、鏡像の鏡像として、もとの受容体の類似体となる。したがって、抗ｉｄを使用して、化学的または生物学的に得られたペプチドのバンクからペプチドを同定し、単離することができる。ついで、単離されたペプチドは、ファーマコフォア（すなわち、原型（ｐｒｏｔｏｔｙｐｅ）医薬）として機能することが可能である。
【０１５１】
Ｘ線結晶解析などの分析的研究を行なうために十分な量の本発明の組換えポリペプチドを入手可能とすることができる。さらに、本発明で提供する核酸配列から導き出すことができる該ポリペプチドのアミノ酸配列の知見は、Ｘ線結晶解析の代わりに又はそれに加えてコンピューターモデリング技術を用いる者に指針を与えるであろう。
【０１５２】
さらに、ＢＳ１０６ポリペプチドに特異的な抗体（例えば、抗ＢＳ１０６抗体）を使用して、該ポリペプチドに対する結合により該ポリペプチドの生物学的作用を阻害することができる。このようにして、該抗体を、例えば、乳癌およびその転移を含む乳房組織疾患を治療するための療法において使用することができる。
【０１５３】
さらに、そのような抗体は、試験サンプル中のＢＳ１０６ポリペプチドの存在または不存在を検出することができ、したがって乳房組織の疾患または状態（特に、乳癌）の診断のための診断マーカーとして有用である。また、そのような抗体は、乳房組織の病態（例えば、乳癌）に関する診断マーカーとして機能しうる。
【０１５４】
本発明はまた、本発明のポリペプチドのアンタゴニストおよび阻害剤に関する。該アンタゴニストおよび阻害剤は、該ポリペプチドの機能を阻害または除去するものである。したがって、例えば、アンタゴニストは、本発明のポリペプチドに結合し、その機能を阻害または除去しうる。該アンタゴニストは、例えば、ＢＳ１０６ポリペプチドに結合することによりＢＳ１０６ポリペプチドの活性を除去するポリペプチドに対する抗体であることが可能であろう。場合によっては、該アンタゴニストは、オリゴヌクレオチドでありうる。小分子阻害剤の具体例には、小さなペプチドまたはペプチド様分子が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【０１５５】
該アンタゴニストおよび阻害剤は、食塩水、緩衝食塩水、デキストロース、水、グリセロール、エタノールおよびそれらの組合せを含む（これらに限定されるものではない）医薬上許容される担体と共に組成物として使用することができる。ＢＳ１０６ポリペプチド阻害剤の投与は、好ましくは、全身投与である。本発明はまた、そのようなポリペプチドの作用を阻害する抗体を提供する。
【０１５６】
アンチセンス技術を用いて、三重らせんの形成またはアンチセンスＤＮＡもしくはＲＮＡを介して遺伝子発現を減少させることができ、それらの方法は共に、ＤＮＡまたはＲＮＡに対するポリヌクレオチドの結合に基づく。例えば、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列の５’コード部分を用いて、１０〜４０塩基対長のアンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドを設計する。ＤＮＡオリゴヌクレオチドは、転写に関与する遺伝子の領域に相補的であることにより転写およびＢＳ１０６ポリペプチドの産生を妨げるように設計する。三重らせんに関しては、例えば、Ｌｅｅら，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ，６：３０７３（１９７９）；Ｃｏｏｎｅｙら，Ｓｃｉｅｎｃｅ　２４１：４５６（１９８８）およびＤｅｒｖａｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ　２５１：１３６０（１９９１）を参照されたい。該アンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドは、インビボでｍＲＮＡにハイブリダイズし、ｍＲＮＡ分子からＢＳ１０６ポリペプチドへの翻訳を遮断する。アンチセンスに関しては、例えば、Ｏｋａｎｏ，Ｊ．　Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ，５６：５６０（１９９１）および“Ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ　ａｓ　Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ　Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ　ｏｆ　Ｇｅｎｅ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ”，ＣＲＣ　Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ　Ｒａｔｏｎ，Ｆｌａ．（１９８８）を参照されたい。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ヌクレオチド切断に対して該分子を抵抗性にする人工的ヌクレオチド間結合を含有するように修飾されている場合に、より大きな効力で作用する。そのような人工的ヌクレオチド間結合には、メチルホスホナート、ホスホロチオラートおよびホスホロアミダートヌクレオチド間結合が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【０１５７】
組換え技術
本発明は、本発明のＢＳ１０６ポリヌクレオチドを含んでなる宿主細胞および発現ベクター、およびそれがコードするポリペプチドの製造方法を提供する。そのような製造方法は、ＢＳ１０６ポリヌクレオチドの発現に適した条件下で該宿主細胞を培養し、該細胞培養からＢＳ１０６ポリヌクレオチドを回収することを含む。
【０１５８】
本発明はまた、本発明のＢＳ１０６ポリヌクレオチドを含むベクター、本発明のベクターで遺伝的に操作された宿主細胞、および組換え技術による本発明のポリペプチドの製造を提供する。
【０１５９】
宿主細胞は、クローニングベクターまたは発現ベクターでありうる本発明のベクターで遺伝的に操作される（トランスフェクト、形質導入または形質転換される）。該ベクターは、プラスミド、ウイルス粒子、ファージなどの形態でありうる。操作された宿主細胞は、プロモーターを活性化しトランスフェクト化細胞を選択し又はＢＳ１０６遺伝子を増幅するために必要に応じて改変された通常の栄養培地中で培養することができる。温度、ｐＨなどの培養条件は、発現用に選択された宿主細胞で既に用いられているものであり、当業者には明らかなものである。
【０１６０】
本発明のポリヌクレオチドは、組換え技術によるポリペプチドの製造に使用することができる。したがって、ポリペプチドを発現させるためのいずれか１つの種々の発現ビヒクル（特に、ベクターまたはプラスミド）中に該ポリヌクレオチド配列を含めることが可能である。そのようなベクターには、染色体配列、非染色体配列および合成ＤＮＡ配列、例えば、ＳＶ４０の誘導体、細菌プラスミド、ファージＤＮＡ、酵母プラスミド、プラスミドおよびファージＤＮＡの組合せに由来するベクター、ウイルスＤＮＡ（例えば、ワクシニア、アデノウイルス、鶏痘ウイルスおよび仮性狂犬病ウイルス）が含まれる。しかしながら、宿主内で増殖可能かつ生存可能である限り、他の任意のプラスミドまたはベクターを使用することができる。
【０１６１】
適当なＤＮＡ配列を、種々の方法によりベクター中に挿入することができる。一般には、該ＤＮＡ配列を、当技術分野で公知の方法により、適当な制限エンドヌクレアーゼ部位内に挿入する。そのような方法および他の方法は、当業者の技量の範囲内であると考えられる。該発現ベクター中のＤＮＡ配列は、ｍＲＮＡ合成を指令する適当な発現制御配列（プロモーター）に作動的に連結される。そのようなプロモータの代表例には、ＬＴＲまたはＳＶ４０プロモーター、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｌａｃまたはｔｒｐ、ファージλＰ　ｓｕｂＬプロモーター、および原核性もしくは真核性細胞またはそれらのウイルス内で遺伝子の発現を制御することが知られている他のプロモーターが含まれるが、これらに限定されるものではない。発現ベクターはまた、翻訳の開始のためのリボソーム結合部位および転写ターミネーターを含有する。該ベクターはまた、配列の増幅のための適当な配列を含みうる。さらに、該発現ベクターは、好ましくは、トランスフェクト化宿主細胞の選択のための表現型形質（例えば、真核細胞培養におけるジヒドロ葉酸レダクターゼまたはネオマイシン耐性、または大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）におけるテトラサイクリンまたはアンピシリン耐性）を与える遺伝子を含有する。
【０１６２】
前記の適当なＤＮＡ配列と適当なプロモーターまたは制御配列とを含有するベクターを使用して、適当な宿主にトランスフェクトして、該宿主が該タンパク質を発現できるようにすることが可能である。適当な宿主の代表例としては、細菌細胞、例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、サルモネラ・ティフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）；ストレプトマイセス・エスピー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｓｐ）；真菌細胞、例えば酵母；昆虫細胞、例えばショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）およびＳｆ９；動物細胞、例えばＣＨＯ、ＣＯＳまたはＢｏｗｅｓ黒色腫；植物細胞などが挙げられうる。適当な宿主の選択は、本明細書の教示に基づけば当業者の技量の範囲内に含まれると考えられる。
【０１６３】
より詳しくは、本発明はまた、前記で広く記載されている配列の１以上を含んでなる組換え構築物を含む。該構築物は、本発明の配列が順配向または逆配向で挿入されたベクター（例えば、プラスミドまたはウイルスベクター）を含む。この実施態様の好ましい態様では、該構築物はさらに、該配列に作動的に結合した調節配列（例えば、プロモーターなど）を含む。多数の適当なベクターおよびプロモーターが当業者に公知であり、商業的に入手可能である。以下のベクターが例示される：細菌性：ｐＩＮＣＹ（Ｉｎｃｙｔｅ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ　Ｉｎｃ．，Ｐａｌｏ　Ａｌｔｏ，ＣＡ）、ｐＳＰＯＲＴ１（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）、ｐＱＥ７０、ｐＱＥ６０、ｐＱＥ−９（Ｑｉａｇｅｎ）ｐＢｓ、ｐｈａｇｅｓｃｒｉｐｔ、ｐｓｉＸ１７４、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＳＫ、ｐＢｓＫＳ、ｐＮＨ８ａ、ｐＮＨ１６ａ、ｐＮＨ１８ａ、ｐＮＨ４６ａ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）；ｐＴｒｃ９９Ａ、ｐＫＫ２２３−３、ｐＫＫ２３３−３、ｐＤＲ５４０、ｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）；真核性：ｐＷＬｎｅｏ、ｐＳＶ２ｃａｔ、ｐＯＧ４４、ｐＸＴ１、ｐＳＧ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）ｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧ、ｐＳＶＬ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）。しかしながら、宿主内で複製可能で生存可能である限り、他の任意のプラスミドまたはベクターを使用することができる。
【０１６４】
プラスミドｐＩＮＣＹは、一般には、それがポリリンカー（マルチクローニング部位）中に２つの修飾を有することを除きプラスミドｐＳＰＯＲＴ１（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤから入手可能）と同一である。これらの修飾は、（１）それがＨｉｎｄＩＩＩ制限部位を欠き、（２）そのＥｃｏＲＩ制限部位が、異なる位置に存在することである。ｐＳＰＯＲＴ１をＨｉｎｄＩＩＩとＥｃｏＲＩとの両方で切断し、該ポリリンカーの切り出された断片を合成ＤＮＡ断片（配列番号７および配列番号８）で置換することにより、ｐＩＮＣＹをｐＳＰＯＲＴ１から作製する。この置換は、当業者に公知の任意の方法で行なうことができる。例えば、それらの２つのヌクレオチド配列（配列番号７および配列番号８）を、５’末端リン酸を有するように合成的に生成させ、共に混合し、ついで、ＨｉｎｄＩＩＩとＥｃｏＲＩとで切断されたｐＳＰＯＲＴ１プラスミド中に、付着末端のライゲーションを行なうための標準的な条件下でライゲーションすることができる。ついで適当な宿主細胞（例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ５∝細胞）を、そのライゲーションされたＤＮＡでトランスフェクトし、アンピシリン耐性に関して組換えクローンを選択する。ついで個々のクローンからプラスミドＤＮＡを調製し、制限酵素分析またはＤＮＡ配列決定に付して、挿入配列が適切な配向で存在することを確認する。当業者に公知の他のクローニング方法を用いることも可能である。
【０１６５】
プロモーター領域は、ＣＡＴ（クロラムフェニコールトランスフェラーゼ）ベクターまたは選択マーカーを有する他のベクターを使用して、所望の任意の遺伝子から選択することができる。２つの適当なベクターとして、ｐＫＫ２３２−８およびｐＣＭ７が挙げられる。挙げられる個々の細菌性プロモーターには、ｌａｃＩ、ｌａｃＺ、Ｔ３、ＳＰ６、Ｔ７、ｇｐｔ、λＰ　ｓｕｂ　Ｒ、Ｐ　ｓｕｂ　Ｌ、およびｔｒｐが含まれる。真核性プロモーターには、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）前初期、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）チミジンキナーゼ、初期および後期ＳＶ４０、レトロウイルス由来のＬＴＲ、およびマウスメタロチオネインＩが含まれる。適当なベクターおよびプロモーターの選択は、当業者の水準の範囲内に十分に含まれるものである。
【０１６６】
もう１つの実施態様では、本発明は、前記構築物を含有する宿主細胞を提供する。該宿主細胞は、哺乳動物細胞などの高等真核細胞、または酵母細胞などの下等動物細胞であることが可能であり、あるいは該宿主細胞は、細菌細胞などの原核細胞であることが可能である。該宿主細胞内への該構築物の導入は、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介性トランスフェクションまたはエレクトロポレーション（Ｌ．Ｄａｖｉｓら，“Ｂａｓｉｃ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ”，第２版，Ａｐｐｌｅｔｏｎ　ａｎｄ　Ｌａｎｇ，Ｐａｒａｍｏｕｎｔ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｅａｓｔ　Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴ（１９９４））により行なうことができる。
【０１６７】
宿主細胞内の構築物は、該組換え配列によりコードされる遺伝子産物を産生させるために常法で使用することができる。あるいは、本発明のポリペプチドは、通常のペプチド合成装置により合成的に製造することができる。
【０１６８】
組換えタンパク質は、適当なプロモーターの制御下、哺乳動物細胞、酵母、細菌または他の細胞内で発現させることができる。また、本発明のＤＮＡ構築物に由来するＲＮＡを使用してそのようなタンパク質を製造するために、無細胞翻訳系を使用することができる。原核性または真核性宿主と共に使用するための適当なクローニングおよび発現ベクターは、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，第２版（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８９）（これを参照により本明細書に組み入れることとする）に記載されている。
【０１６９】
本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡの高等真核生物による転写は、該ベクター中にエンハンサー配列を挿入することにより増強される。エンハンサーは、プロモーターに作用してその転写を増強する、通常約１０〜３００ｂｐのシス作用性要素である。具体例には、ＳＶ４０エンハンサー（複製起点の後期側、ｂｐ１００〜２７０）、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、ポリオーマエンハンサー（複製起点の後期側）およびアデノウイルスエンハンサーが含まれる。
【０１７０】
一般には、組換え発現ベクターは、複製起点、宿主細胞のトランスフェクションを可能にする選択マーカー、例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のアンピシリン耐性遺伝子およびエス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＴＲＰ１遺伝子、ならびに下流の構造配列の転写を指令する高発現遺伝子由来のプロモーターを含むであろう。そのようなプロモーターは、とりわけ３−ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）、α因子、酸性ホスファターゼまたは熱ショックタンパク質などの解糖酵素をコードするオペロンに由来しうる。該異種構造配列を、翻訳開始配列および終結配列、および好ましくは、周辺腔または細胞外培地中への翻訳タンパク質の分泌を指令しうるリーダー配列と、適当な段階で合体させる。場合によっては、該異種配列は、所望の特性（例えば、発現された組換え産物の安定化または簡便な精製）を付与するＮ末端同定ペプチドを含む融合タンパク質をコードしうる。
【０１７１】
細菌において使用するための有用な発現ベクターは、機能しうる読取りが機能的プロモーターと合致するよう適当な翻訳開始および終結シグナルと共に所望のタンパク質をコードする構造ＤＮＡ配列を挿入することにより構築される。該ベクターは、該ベクターの維持を保証し所望により該宿主内での増幅をもたらす１以上の形質選択マーカーと複製起点とを含むであろう。トランスフェクションのための適当な原核性宿主には、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、バシラス・サチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、サルモネラ・ティフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、およびシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属およびスタヒロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）属内の種々の種が含まれるが、その他の原核性宿主を通常の選択物として使用することも可能である。
【０１７２】
細菌において使用するための有用な発現ベクターは、よく知られたクローニングベクターｐＢＲ３２２（ＡＴＣＣ３７０１７）の遺伝要素を含むプラスミドに由来する細菌性複製起点および選択マーカーを含む。他のベクターには、ＰＫＫ２２３−３（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｆｉｎｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）およびＧＥＭ１（Ｐｒｏｍｅｇａ　Ｂｉｏｔｅｃ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）が含まれるが、これらに限定されるものではない。これらのｐＢＲ３２２「バックボーン」切片を、適当なプロモーターおよび発現させる構造配列と合体させる。
【０１７３】
適当な宿主にトランスフェクトし、該宿主を適当な細胞密度まで増殖させた後、選択されたプロモーターを適当な手段（例えば、温度変化または化学的誘導）により抑制解除し、細胞を更に一定期間培養する。細胞は、典型的には、遠心分離により収穫し、物理的または化学的手段により破壊し、得られた粗抽出物を更なる精製のために保存する。タンパク質の発現において使用した微生物細胞は、凍結融解サイクル、音波処理、機械的破壊または細胞溶解剤の使用を含む簡便な任意の方法で破壊することができる。そのような方法は、当業者によく知られている。
【０１７４】
組換えタンパク質を発現させるためには、種々の哺乳類細胞培養系を使用することができる。哺乳類発現系には、例えば、Ｇｌｕｚｍａｎ，Ｃｅｌｌ　２３：１７５（１９８１）に記載のサル腎線維芽細胞のＣＯＳ−７系、および和合性ベクターを発現しうる他の細胞系（例えば、Ｃ１２７、ＨＥＫ−２９３、３Ｔ３、ＣＨＯ、ＨｅＬａおよびＢＨＫ細胞系）が含まれる。哺乳類発現ベクターは、複製起点、適当なプロモーターおよびエンハンサーならびに必要な任意のリボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライス供与および受容部位、転写終結配列および５’フランキング非転写配列を含むであろう。ＳＶ４０ウイルスゲノムに由来するＤＮＡ配列（例えば、ＳＶ４０起点、初期プロモーター、エンハンサー、スプライスおよびポリアデニル化部位）を使用して、必要な非転写遺伝要素を得ることが可能である。代表的で有用なベクターには、ｐＲｃ／ＣＭＶおよびｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ，ＣＡから入手可能）が含まれる。
【０１７５】
アフィニティークロマトグラフィー、硫安沈殿、エタノール沈殿、酸抽出、陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーまたはレクチンクロマトグラフィーなどの公知方法により、ＢＳ１０６ポリペプチドを組換え細胞培養から回収し、精製する。精製中に存在するカルシウムイオンを低濃度（約０．１〜５ｍＭ）にするのが好ましい（Ｐｒｉｃｅら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４４：９１７（１９６９））。該ポリペプチドの立体配置を完全なものにする際に、必要に応じて、タンパク質のリフォールディング工程を行なうことが可能である。最後に、最終精製工程として高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を行なうことができる。
【０１７６】
このように、本発明のポリペプチドは、高発現細胞系から発現された天然に精製された産物、または化学方法により又は原核性もしくは真核性宿主から（例えば、培養内の細菌、酵母、高等植物、昆虫および哺乳動物細胞により）組換え技術で得られた産物でありうる。組換え製造方法で使用する宿主に応じて、本発明のポリペプチドを哺乳動物または他の真核生物の炭水化物でグリコシル化したり、あるいは非グリコシル化形態とすることが可能である。また、本発明のポリペプチドは開始メチオニンアミノ酸残基を含みうる。
【０１７７】
出発プラスミドは、入手可能なプラスミドから、公開されている公知方法に従い構築することができる。さらに、記載されているものと同等のプラスミドが、当技術分野において公知であり、当業者には明らかであろう。
【０１７８】
以下は、ｃＤＮＡクローンの単離および分析のための一般的な方法である。本明細書に開示する特定の実施態様においては、ｍＲＮＡを乳房組織から単離し、ｃＤＮＡライブラリーの作製のために使用した。乳房組織を、患者から外科的切除により得、それが病理学者により腫瘍または非腫瘍組織に分類された。
【０１７９】
該乳房組織ライブラリーのランダム単離物からのｃＤＮＡインサートを、部分的に配列決定し、実施例に記載のとおりに詳細に分析した。それは、配列番号１、配列番号２、配列番号３および配列番号４として配列表に開示されている。これらの挿入断片のコンセンサス配列は、配列番号６として記載されている。これらのポリヌクレオチドは、ある特定の遺伝子に関する関連調節配列を有する又は有さない全オープンリーディングフレームを含有することが可能であり、あるいはそれらは、関心のある遺伝子の一部のみをコードすることが可能である。これは、多数の遺伝子が数百塩基長、時には数千塩基長であり、現在の技術では、ベクターの制約、第１鎖の不完全な逆転写または第２鎖の不完全な複製のため、その全体をクローニングできないということに起因する。追加的なヌクレオチド配列を含有する連続的な二次クローンは、当業者に公知の種々の方法を用いて得ることができる。
【０１８０】
ＤＮＡ配列決定の方法は当技術分野でよく知られている。通常の酵素法では、関心のあるＤＮＡ鋳型にアニーリングしたオリゴヌクレオチドプライマーからＤＮＡ鎖を伸長するために、ＤＮＡポリメラーゼ、クレノウ断片、Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ（ＵＳ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｒｐ，Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，ＯＨ）またはＴａｑポリメラーゼを使用する。一本鎖および二本鎖の両方の鋳型を使用するための方法が開発されている。チェインターミネーション反応生成物を、尿素／ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動し、オートラジオグラフィー（放射性ヌクレオチド標識前駆体の場合）または蛍光（蛍光標識前駆体の場合）により検出することができる。蛍光検出方法を用いる機械化された反応調製、配列決定および分析における最近の改良は、Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　３７７　ＤＮＡ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ，Ｆｏｓｔｅｒ　Ｃｉｔｙ，ＣＡ）などの装置を使用して１日当たりに測定しうる配列数の拡大を可能にした。
【０１８１】
ヌクレオチド配列のリーディングフレームは、いくつかのタイプの分析で確認することができる。第１に、コード配列内に含有されるリーディングフレームは、開始コドンＡＴＧおよび終結コドンＴＧＡ、ＴＡＡまたはＴＡＧの存在に関して分析することができる。典型的には、１つのリーディングフレームが、ｃＤＮＡ配列の主要部分にわたって続き、他のリーディングフレームは、多数の終結コドンを含有する傾向にある。そのような場合には、リーディングフレームの決定は直接的である。それより困難な他の場合には、さらなる分析が必要となる。
【０１８２】
各推定コドントリプレットにおける個々のヌクレオチド塩基の出現頻度を分析するためのアルゴリズムが作製されている。例えば、Ｊ．Ｗ．Ｆｉｃｋｅｔｔ，Ｎｕｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ　１０：５３０３（１９８２）を参照されたい。特定の生物（細菌、植物および動物）に関するコードＤＮＡは、あるトリプレット周期性内で或るヌクレオチドを含有する傾向にある（例えば、第３コドン位にピリミジンの優先性が有意に認められる）。これらの優先性は、所定のＤＮＡ伸長のコード可能性（ｃｏｄｉｎｇ　ｐｏｔｅｎｔｉａｌ）（およびフレーム）を判定するために使用しうる広く利用可能なソフトウェアに組み込まれている。アルゴリズム由来の情報を開始／終結コドンの情報と一緒に使用して、適切なフレームを高い確実性で決定することができる。そしてこれは、正確なリーディングフレーム内の配列を適当な発現ベクター中にクローニングするのを容易に可能にする。
【０１８３】
本明細書に開示する核酸配列は、十分に確立された組換えＤＮＡ技術により、関心のある他の種々のポリヌクレオチド配列およびベクターに結合させることが可能である。Ｊ　Ｓａｍｂｒｏｏｋら，前掲を参照されたい。関心のあるベクターには、プラスミド、コスミド、ファージ誘導体、ファジミドなどのクローニングベクターならびに配列決定、複製および発現ベクターなどが含まれる。一般に、そのようなベクターは、少なくとも１つの生物において機能的な複製起点、簡便な制限エンドヌクレアーゼ消化部位、および個々の宿主細胞に適した選択マーカーを含有する。該ベクターは、当業者に公知の種々の手段により、所望のＤＮＡ、ＲＮＡまたはポリペプチドを産生する適当な宿主細胞内に導入することができる。
【０１８４】
時には、配列決定またはランダム逆転写の誤りのために、適当なオープンリーディングフレームまたは調節要素の存在が隠されてしまう。そのような場合には、ポリペプチドの発現を試み、標準的なペプチドマッピングおよび配列決定技術によりアミノ酸配列を決定することにより、正確なリーディングフレームを決定することが可能である。Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら，Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ，ＮＹ（１９８９）を参照されたい。さらに、ある与えられたヌクレオチド配列の実際のリーディングフレームは、合計３個の潜在的リーディングフレームを含有するベクターで宿主細胞をトランスフェクトすることより決定することができる。正しいリーディングフレームのヌクレオチド配列を有する細胞だけが、予想される長さのペプチドを産生することになる。
【０１８５】
本発明で提供するヌクレオチド配列は、現在の最高水準の自動化された方法で製造されており、それ自体は、未同定のヌクレオチドを含有している可能性がある。このことは、本発明を実施することを望む当業者に問題を提議することにはならないであろう。Ｊ　Ｓａｍｂｒｏｏｋら（前掲）またはその定期的最新版に記載されている標準的な組換え技術を用いるいくつかの方法を用いて、欠けている配列情報を完全なものにすることができる。本明細書に記載の完全長配列を得るために用いるのと同じ技術を、ヌクレオチド配列を得るために用いることができる。
【０１８６】
ｃＤＮＡを適当な発現ベクター中にサブクローニングし、このベクターを適当な発現宿主中にトランスフェクトすることにより、ある特定のｃＤＮＡの発現を行なうことができる。乳房組織のｃＤＮＡライブラリーの作製に使用するクローニングベクターは、ある特定のｃＤＮＡのｍＲＮＡの転写に使用することができ、β−ガラクトシダーゼに関するプロモーター、アミノ末端のｍｅｔおよびそれに続くβ−ガラクトシダーゼの７アミノ酸残基を含有する。これらの８残基の直後に、人工的なプライミングおよび転写に有用な操作されたバクテリオファージプロモーターならびにクローニング用の多数のユニーク制限部位（例えば、ＥｃｏＲＩ）が存在する。該ベクターは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の適当な宿主株内にトランスフェクトすることができる。
【０１８７】
単離された細菌株を標準的な方法によりイソプロピルチオガラクトシド（ＩＰＴＧ）で誘導することにより、β−ガラクトシダーゼの最初の７残基、リンカーの約１５残基、および該ｃＤＮＡ内にコードされるペプチドを含有する融合タンパク質が得られるであろう。ｃＤＮＡクローンインサートは、実質的にランダムな方法で作製されるため、含まれるｃＤＮＡが適切な翻訳のための正確なフレームで存在するのは、３回のうちの１回である。該ｃＤＮＡが適切なリーディングフレームにない場合は、インビトロ突然変異誘発、エキソヌクレアーゼＩＩＩもしくはヤエナリヌクレアーゼでの消化またはオリゴヌクレオチドリンカーの取込みなどの良く知られた方法による適当な数の塩基の欠失または挿入により、正しいフレームを得ることができる。
【０１８８】
該ｃＤＮＡは、特定の宿主内でのタンパク質の発現に有用であることが知られている他のベクターに対して往復（シャトル）させることができる。クローニング部位と標的ＤＮＡの両端の伸長にハイブリダイズするのに十分なＤＮＡセグメントとを含有するオリゴヌクレオチドプライマーは、標準的な方法で化学的に合成することができる。ついでこれらのプライマーを使用して、ＰＣＲにより所望の遺伝子セグメントを増幅することができる。得られた新たな遺伝子セグメントは、標準的な条件下、適当な制限酵素で消化し、ゲル電気泳動により単離することができる。あるいは、該ｃＤＮＡを適当な制限酵素で消化し、欠けている遺伝子セグメントを、化学的に合成されたオリゴヌクレオチドで埋めることにより、同様の遺伝子セグメントを得ることができる。複数の遺伝子に由来するコード配列のセグメントを共にライゲーションし、適当なベクター中にクローニングして、組換え配列の発現を最適化することができる。
【０１８９】
そのようなキメラ分子のための適当な発現宿主には、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）、ヒト胎児腎（ＨＥＫ）２９３細胞などの哺乳類細胞、Ｓｆ９細胞などの昆虫細胞、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）などの酵母細胞および大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）などの細菌が含まれるが、これらに限定されるものではない。これらの各細胞系に関しては、有用な発現ベクターはまた、細菌内での増殖を可能する複製起点と、細菌内での選択を可能にする選択マーカー（例えば、β−ラクタマーゼ抗生物質耐性遺伝子）とを含みうる。さらに、該ベクターは、トランスフェクトされた真核性宿主細胞における選択を可能にするもう１つの選択マーカー（例えば、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子）を含みうる。真核性発現宿主において使用するためのベクターでは、関心のある配列がポリＡを欠く場合には、３’ポリＡテイルの付加が必要かもしれない。
【０１９０】
さらに、該ベクターは、遺伝子発現を増強するプロモーターまたはエンハンサーを含有しうる。そのようなプロモーターは、宿主特異的であり、ＣＨＯ細胞の場合にはＭＭＴＶ、ＳＶ４０またはメタロチオニンプロモーター、細菌宿主の場合にはｔｒｐ、ｌａｃまたはＴ７プロモーター、あるいは酵母の場合にはα因子、アルコールオキシダーゼまたはＰＧＨプロモーターを含むが、これらに限定されるものではない。転写エンハンサー（例えば、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）エンハンサー）を有する又は有さないアデノウイルスベクターを使用して、哺乳類細胞系におけるタンパク質の発現を駆動することができる。組換え細胞の均一培養が得られたら、多量の組換え産生タンパク質を、馴らし培地から回収し、当技術分野でよく知られたクロマトグラフィー法で分析することができる。多量の分泌タンパク質のもう１つの製造方法は、哺乳類胚のトランスフェクション、およびトランスジェニックウシ、ヤギ、ヒツジなどが産生する乳から該組換えタンパク質を回収することを含む。ポリペプチド、および密接に関連した分子は、タンパク質の精製を容易にするような方法で組換え的に発現させることができる。１つのアプローチは、ヒトポリペプチド上に天然には存在しない１以上の追加的ポリペプチドドメインを含むキメラタンパク質の発現を含む。精製を容易にするそのようなドメインには、固定化金属上での精製を可能にする金属キレート化ペプチド（例えば、ヒスチジン−トリプトファンドメイン）、固定化免疫グロブリン上での精製を可能にするプロテインＡドメイン、およびＦＬＡＧＳ伸長／アフィニティー精製系（Ｉｍｍｕｎｅｘ　Ｃｏｒｐ，Ｓｅａｔｔｌｅ，ＷＡ）で使用されるドメインが含まれるが、これらに限定されるものではない。切断可能なリンカー配列、例えばＸＡ因子またはエンテロキナーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ，ＣＡから入手可能）を該ポリペプチド配列と該精製ドメインとの間に含有させることは、該ポリペプチドの回収に有用かもしれない。
【０１９１】
イムノアッセイ
ＢＳ１０６ポリペプチド（その断片、誘導体および類似体を含む）またはそのようなポリペプチドを発現する細胞は、乳房組織に対する抗体の検出のための種々のアッセイ（そのうちの多数が本明細書に記載されている）で使用することができる。また、それらを免疫原として使用して、抗体を産生させることができる。これらの抗体は、例えば、ポリクローナルもしくはモノクローナル抗体、キメラ、一本鎖およびヒト化抗体およびＦａｂフラグメント、またはＦａｂ発現ライブラリーの産物であることが可能である。そのような抗体およびフラグメントの産生のためには、当技術分野で公知の種々の方法を用いることができる。
【０１９２】
例えば、本発明の配列を含むポリペプチドに対して産生される抗体は、該ポリペプチドを動物に直接注入することにより、あるいは該ポリペプチドを動物（例えば、マウス、ウサギ、ヤギまたはヒト）に投与することにより得ることができる。マウス、ウサギまたはヤギが好ましい。該ポリペプチドは、配列番号２０〜３３およびそれらの断片よりなる群から選ばれる。ついで、そのようにして得た抗体が、該ポリペプチド自体に結合することとなる。このように、該ポリペプチドの断片だけをコードする配列でさえ、天然ポリペプチドに結合する抗体を産生させるために使用することができる。ついで、そのような抗体を使用して、そのポリペプチドを含有する疑いのある組織などの試験サンプルから該ポリペプチドを単離することができる。モノクローナル抗体の製造には、連続継代細胞培養により産生される抗体を与える任意の技術を用いることができる。具体例には、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ　２５６：４９５−４９７（１９７５）に記載のハイブリドーマ技術、トリオーマ技術、Ｋｏｚｂｏｒら，Ｉｍｍｕｎ．Ｔｏｄａｙ　４：７２（１９８３）に記載のヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術、およびＣｏｌｅら，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　ａｎｄ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ　Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ，ＮＹ，ｐｐ．７７−９６（１９８５）に記載のヒトモノクローナル抗体を産生させるためのＥＢＶ−ハイブリドーマ技術が含まれる。一本鎖抗体の産生に関して記載されている技術を、本発明の免疫原性ポリペプチド産物に対する一本鎖抗体を産生させるために適用することができる。例えば、参照により本明細書に組み入れる米国特許第４，９４６，７７８号を参照されたい。
【０１９３】
本発明の抗体は、「サンドイッチ」イムノアッセイおよびプローブアッセイを含む種々のアッセイ様式において使用することができる。例えば、本発明の抗体またはその断片（フラグメント）は、試験サンプル中のＢＳ１０６抗原の存在を判定するための種々のアッセイ系で使用することができる。例えば、第１のアッセイ様式では、固相上にコーティングされた、ポリクローナルもしくはモノクローナル抗体またはその断片、またはこれらの抗体の組合せを、試験サンプルと接触させて、第１混合物を形成させる。この第１混合物を、抗原／抗体複合体の形成に十分な時間および条件下でインキュベートする。ついで、シグナル生成化合物が結合しているモノクローナルもしくはポリクローナル抗体またはその断片、またはこれらの抗体の組合せを含む指示試薬を、該抗原／抗体複合体と接触させて、第２混合物を形成させる。ついで、この第２混合物を、抗体／抗原／抗体複合体の形成に十分な時間および条件下でインキュベートする。シグナル生成化合物により生成した測定可能なシグナルを検出することにより、固相上に捕捉され試験サンプル中に含まれうるＢＳ１０６抗原の存在を判定する。試験サンプル中に存在するＢＳ１０６抗原の量は、生成したシグナルに比例する。
【０１９４】
もう１つのアッセイ様式では、（１）ＢＳ１０６抗原に特異的に結合するポリクローナル抗体、モノクローナル抗体もしくはその断片、または固体支持体に結合したそのような抗体の組合せ、（２）試験サンプル、および（３）シグナル生成化合物が結合している、異なるＢＳ１０６抗原に特異的に結合するモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体もしくはその断片（またはこれらの抗体の組合せ）を含む指示試薬を接触させることにより、混合物を得る。この混合物を、抗体／抗原／抗体複合体の形成に十分な時間および条件下でインキュベートする。該シグナル生成化合物により生成した測定可能なシグナルを検出することにより、試験サンプル中に存在し固相上に捕捉されたＢＳ１０６抗原の存在を判定する。試験サンプル中に存在するＢＳ１０６抗原の量は、生成したシグナルに比例する。
【０１９５】
もう１つのアッセイ様式では、本発明の少なくとも２つのモノクローナル抗体の１つまたは組合せを、ＢＳ１０６抗原に対する抗体の検出のための競合プローブとして使用することができる。例えば、ＢＳ１０６ポリペプチド（例えば、本明細書に開示の組換え抗原）を、単独で又は組合せて、固相上にコーティングする。ついで、ＢＳ１０６抗原に対する抗体を含有する疑いのある試験サンプルを、シグナル生成化合物と本発明の少なくとも１つのモノクローナル抗体とを含む指示試薬と共に、固相に結合している試験サンプルおよび指示試薬の又は固相に結合している指示試薬の抗原／抗体複合体の形成に十分な時間および条件下でインキュベートする。固相に対するモノクローナル抗体の結合の減少を定量的に測定することができる。
【０１９６】
さらにもう１つの検出方法では、本発明のモノクローナルまたはポリクローナル抗体のそれぞれを、免疫組織化学的分析による組織切片中または細胞中のＢＳ１０６抗原の検出において使用することができる。これらの抗体を直接的に標識（例えば、フルオレセイン、金コロイド、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼなどでの標識）したり又は二次標識化抗種抗体を使用して（本明細書に例示する種々の標識で）標識して疾患の組織病理を追跡する細胞化学的分析も、本発明の範囲内に含まれる。
【０１９７】
さらに、これらのモノクローナル抗体を、ＣＮＢｒ活性化セファロースに類似したマトリックスに結合させて、細胞培養または生物学的組織からの特異的ＢＳ１０６ポリペプチドのアフィニティー精製（例えば、組換え及び天然ＢＳ１０６タンパク質の精製）に使用することができる。
【０１９８】
また、本発明のモノクローナル抗体は、治療用途または他の同様の用途のためのキメラ抗体の産生に使用することができる。
【０１９９】
モノクローナル抗体またはその断片は、ＢＳ１０６抗原を検出するために個々に提供されうる。また、本発明で提供するモノクローナル抗体（およびその断片）の組合せを、他のＢＳ１０６領域に特異的に結合する抗体（各抗体は、異なる結合特異性を有する）と共に、本発明の少なくとも１つのＢＳ１０６抗体の混合物または「カクテル」中の成分として一緒に使用することができる。したがって、このカクテルは、本明細書に開示のＢＳ１０６ポリペプチドに対する本発明のモノクローナル抗体と、ＢＳ１０６抗原または他の関連タンパク質の他の抗原決定基に特異的な他のモノクローナル抗体とを含みうる。
【０２００】
該アッセイ様式で使用しうるポリクローナル抗体またはその断片は、ＢＳ１０６ポリペプチドまたは該アッセイで追加的に使用する他のＢＳ１０６ポリペプチドに特異的に結合すべきである。好ましく使用されるポリクロナール抗体は、ＢＳ１０６ポリペプチドに結合する、ヒト、ヤギ、ウサギまたはヒツジポリクローナル抗体などの哺乳動物に由来するものである。最も好ましくは、該ポリクローナル抗体は、ウサギに由来するものである。該アッセイで使用するポリクローナル抗体は、単独で又はポリクローナル抗体のカクテルとして使用することができる。該アッセイ様式で使用するカクテルは、ＢＳ１０６ポリペプチドに対する異なる結合親和性を有するモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体を含むため、それらは、乳癌などの乳房の疾患または状態の検出、診断、病期分類、モニター、予後判定、予防もしくは治療または素因の判定に有用である。
【０２０１】
組換え抗原の使用により、あるいは合成ペプチドまたは精製ペプチド（該ペプチドは、ＢＳ１０６のアミノ酸配列を含む）の使用により、アッセイにおいてＢＳ１０６抗原が検出可能でありうると考えられ、そのような場合も本発明の範囲内に含まれる。そのようなポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号２０〜３３およびそれらの断片よりなる群から選ばれる。また、ＢＳ１０６の異なるエピトープを定める異なる合成、組換えまたは精製ペプチドを、乳癌などの乳房の疾患または状態の検出、診断、病期分類、モニター、予後判定、予防もしくは治療または素因の判定のためのアッセイにおいて併用することも、本発明の範囲内に含まれる。この場合、これらのペプチドのすべてを固相上にコーティングしたり、あるいはそれぞれ分離したペプチドを、分離した固相（例えば、微粒子）上にコーティングし、ついで、後にアッセイにおいて使用しうるペプチド混合物を形成するように組合せることが可能である。さらに、乳癌などの乳房の疾患または状態の検出、診断、病期分類、モニター、予後判定、予防もしくは治療または素因の判定のために、異なる抗原からのエピトープを定める複数のペプチドを使用することができると考えられる。ついで、固相上にコーティングされた又は検出可能な標識で標識されたペプチドを、一定量の抗体に関して、患者のサンプル中に存在する（存在する場合）ペプチドと競合させる。該抗体に対する該合成、組換えまたは精製ペプチドの結合の減少は、患者のサンプル中のＢＳ１０６抗原の存在の指標となる。ＢＳ１０６抗原の存在は、患者における乳房組織の疾患、特に乳癌の存在を示す。アッセイ様式の変形は当業者に公知であり、本明細書において後に検討する。
【０２０２】
もう１つのアッセイ様式では、以下のとおり、抗ＢＳ１０６抗体および／またはＢＳ１０６抗原の存在を同時に検出することができる。試験サンプルを、同時に、第１被検体の捕捉試薬（該捕捉試薬は、固相に結合した第１被検体に特異的な第１結合メンバーを含む）および第２被検体の捕捉試薬（該捕捉試薬は、第２固相に結合した第２被検体に対する第１結合メンバーを含む）と接触させて、混合物を得る。この混合物を、捕捉試薬／第１被検体および捕捉試薬／第２被検体複合体の形成に十分な時間および条件下でインキュベートする。ついで、そのようにして形成したこれらの複合体を、シグナル生成化合物で標識された第１被検体に特異的な結合ペアのメンバーとシグナル生成化合物で標識された第２被検体に特異的な結合ペアのメンバーとを含む指示試薬に接触させて、第２混合物を得る。この第２混合物を、捕捉試薬／第１被検体／指示試薬複合体および捕捉試薬／第２被検体／指示試薬複合体の形成に十分な時間および条件下でインキュベートする。いずれかの又は両方の固相上で形成した複合体に関して生成したシグナルを、試験サンプル中の１以上の被検体の存在の指標として検出することにより、１以上の被検体の存在を判定する。このアッセイ様式では、本明細書に開示する発現系に由来する組換え抗原、および本明細書に開示の発現系に由来するタンパク質から産生したモノクローナル抗体を使用することができる。例えば、このアッセイ系では、ＢＳ１０６抗原を第１被検体とすることが可能である。そのようなアッセイ系は、ＥＰ公開第０４７３０６５号に、より詳しく記載されている。
【０２０３】
さらにもう１つのアッセイ様式では、本明細書に開示するポリペプチドを使用して、試験サンプル中のＢＳ１０６抗原に対する抗体の存在を検出することができる。例えば、試験サンプルを、少なくとも１つのポリペプチド（例えば、組換えタンパク質または合成ペプチド）が結合している固相と共にインキュベートする。該ポリペプチドは、配列番号２０〜３３およびそれらの断片よりなる群から選ばれる。これらを、抗原／抗体複合体の形成に十分な時間および条件下で反応させる。インキュベーション後、該抗原／抗体複合体を検出する。選択するアッセイ系に応じて、検出を容易にするために、指示試薬を使用することができる。もう１つのアッセイ様式では、試験サンプルを、本明細書に記載のとおりに産生させた組換えタンパク質が結合している固相と接触させ、また、指示試薬で好ましくは標識されている、該タンパク質に特異的なモノクローナルまたはポリクローナル抗体と接触させる。抗体／抗原複合体の形成に十分な時間および条件下でインキュベーションした後、固相を遊離相から分離し、該標識をＢＳ１０６抗原に対する抗体の存在の指標として該固相中または該遊離相中で検出する。本明細書に開示する組換え抗原を使用する他のアッセイ様式が予想される。これらは、第１起源からの少なくとも１つの抗原が結合している固相と試験サンプルとを接触させ、抗原／抗体複合体の形成に十分な時間および条件下で該固相と試験サンプルとをインキュベートし、ついで該固相を標識抗原（該抗原は、第１起源とは異なる第２起源に由来する）と接触させることを含む。例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）などの第１起源に由来する組換えタンパク質を、固相上の捕捉抗原として使用し、そのように調製された固相に試験サンプルを加え、必要に応じて標準的なインキュベーションおよび洗浄工程の後、異なる起源（すなわち、非大腸菌）に由来する組換えタンパク質を、後に検出する指示試薬の一部として使用する。同様に、固相上の組換え抗原と合成ペプチド（指示相中）との組合せも可能である。第１起源から産生した又はそれに由来するＢＳ１０６に特異的な捕捉抗原としての抗原と、異なる第２起源からのＢＳ１０６に特異的な抗原とを使用する任意のアッセイ様式が予想される。このように、組換え抗原の種々の組合せ、および合成ペプチド、精製タンパク質などの使用が、本発明の範囲内に含まれる。このアッセイおよび他のアッセイは、参照により本明細書に組み入れられ本出願と同一所有権を享受する米国特許第５，２５４，４５８号に記載されている。
【０２０４】
また、種々の他の固相を使用する他の実施態様も予想され、本発明の範囲内に含まれる。例えば、速い液相免疫化学的反応を行なうために、負に荷電した重合体との固定化可能反応複合体を固定化するためのイオン捕捉法（ＥＰ公開第０３２６１００号およびＥＰ公開第０４０６４７３号に記載されている）を本発明で用いることができる。固定化可能な免疫複合体は、その負に荷電したポリ−アニオン／免疫複合体と、予め処理された正に荷電した多孔性マトリックスとの間のイオン相互作用により該反応混合物の残部から分離され、既に記載されている種々のシグナル生成系（例えば、ＥＰＯ公開第０２７３，１１５号に記載の化学発光シグナルの測定において記載されているもの）を用いて検出される。
【０２０５】
また、固相が微粒子（磁性または非磁性）を含む微粒子技術を用いる系（例えば、自動化系および半自動化系）での使用に、本発明の方法を適合させることが可能である。そのような系には、例えば、公開されているＥＰＯ出願ＥＰ　０　４２５　６３３およびＥＰ　０　４２４　６３４にそれぞれ記載されている系が含まれる。
【０２０６】
イムノアッセイにおける走査型プローブ顕微鏡検査法（ｓｃａｎｎｉｎｇ　ｐｒｏｂｅ　ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）（ＳＰＭ）の使用も、本発明のモノクローナル抗体が容易に応用されうる技術である。走査型プローブ顕微鏡検査法、特に原子間力顕微鏡検査法においては、捕捉相、例えば、本発明のモノクローナル抗体の少なくとも１つを固相に付着させ、走査型プローブ顕微鏡を使用して、固相の表面上に存在しうる抗原／抗体複合体を検出する。通常、多数のイムノアッセイ系においては、抗原／抗体複合体を検出するために標識を使用しなければならないが、走査型トンネル顕微鏡検査法を使用すると、そのような標識が不要になる。特異的結合反応をモニターするためのＳＰＭの使用は、多数の様態で行われうる。１つの実施態様では、特異的結合パートナーのメンバーの１つ（本発明のモノクローナル抗体である被検体特異的物質）を、走査に適した表面に結合させる。該被検体特異的物質の結合は、当業者に公知の方法に従うプラスチックまたは金属表面の固相を含む試験片に対する吸着によるものでありうる。あるいは、誘導体化プラスチック、金属、シリコン（ケイ素）またはガラスの固相を含む試験片に対する特異的結合パートナー（被検体特異的物質）の共有結合を用いることが可能である。共有結合方法は、当業者に公知であり、特異的結合パートナーを試験片に不可逆的に結合させるための種々の手段を含む。該試験片がシリコンまたはガラスである場合には、特異的結合パートナーを結合させる前に、該表面を活性化する必要がある。また、特異的結合パートナーを試験片の表面上に化学的方法で固定化するために、混成電極相互作用を用いることができる。好ましい結合方法は、共有的手段によるものである。特異的結合メンバーの結合の後、非特異的結合を最小限に抑えるために、該表面を血清、タンパク質または他のブロッキング剤などの物質で更に処理することができる。また、アッセイ目的に対する適合性を確認するために、該表面を、製造部位または使用点において走査することができる。走査過程は、試験片の特異的結合特性を改変しないと考えられる。
【０２０７】
本発明は、主として固相の使用に関して開示されているが、本発明の抗体、タンパク質、ペプチドなどの試薬は、非固相アッセイ系においても使用可能であると考えられる。これらのアッセイ系は、当業者に公知であり、本発明の範囲内に含まれるとみなされる。
【０２０８】
アッセイに使用する試薬は、バイアル、ボトルなどの１以上の容器を有する試験キットの形態で提供されうると考えられる。その各容器は、該アッセイで使用するプローブ、プライマー、モノクローナル抗体、またはモノクローナル抗体のカクテル、またはポリペプチド（例えば、組換え的、合成的に製造または精製されたもの）などの別個の試薬を含有する。該ポリペプチドは、配列番号２０〜３３およびそれらの断片よりなる群から選ばれる。当業者に公知の他の成分（例えば、バッファー、対照など）が、そのような試験キットに含まれうる。また、利用可能な体液（例えば、血液、尿、唾液および糞便）を含む試験サンプルを採集するための手段を有する試験キットを提供することも意図される。採集に有用なそのような手段（「採集材料」）には、血液を採集し安定化するためのランセットおよび吸収紙または布、唾液を採集し安定化するためのスワブ、尿または糞便サンプルを採集し安定化するためのカップが含まれる。該サンプルの変性または不可逆的吸着を避けるために、所望により、採集材料、紙、布、スワブ、カップなどを処理することが可能である。また、試料の完全性を維持するのを助けるために、該採集材料を保存剤、安定剤または抗微生物剤で処理したり、該採集材料に保存剤、安定剤または抗微生物剤を含有させることが可能である。手術または針生検により得た試験試料の採集、安定化および保存のために設計された試験キットも有用である。すべてのキットは、別個に提供されうる２つの成分（その一方の成分は、試料の採集および運搬のためのものであり、もう一方は、試料の分析のためのものである）に構成されうると考えられる。例えば、採集成分は、公開市場の消費者に提供することが可能であり、一方、分析用成分は、被検体の存在、不存在または量の測定のために研究者などに提供することが可能である。さらに、試験試料の採集、安定化および保存のためのキットは、未熟練者による使用を意図して構成されることが可能であり、家庭で使用された後、該試験サンプルの分析のために研究室に運搬されることを意図して、公開市場において入手可能とされうる。
【０２０９】
インビボでの抗体の使用
本発明の抗体は、インビボで使用することができる。すなわち、それを、診断用または治療用に、乳房の疾患を有する疑いがある又はそれを有する患者に注射することができる。インビボ診断のための抗体の使用は当技術分野でよく知られている。Ｓｕｍｅｒｄｏｎら，Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ　１７：２４７−２５４（１９９０）は、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）を発現する腫瘍の、インジウム−１１１を標識として使用する放射性免疫シントグラフィーイメージング（ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏｓｃｉｎｔｏｇｒａｐｈｉｃ　ｉｍａｇｉｎｇ）のための最適化された抗体−キレーターを記載している。Ｇｒｉｆｆｉｎら，Ｊ　Ｃｌｉｎ　Ｏｎｃ　９：６３１−６４０（１９９１）は、再発性結腸直腸癌を有する疑いのある患者の腫瘍の検出におけるこの物質の使用を記載している。磁気共鳴コンピュータ断層撮影用の標識として常磁性イオンを有する同様の物質の使用が、当技術分野で公知である（Ｒ．Ｂ．Ｌａｕｆｆｅｒ，Ｍａｇｎｅｔｉｃ　Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ　ｉｎ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ　２２：３３９−３４２（１９９１））。患者の病態を診断または病期分類するために、ＢＳ１０６抗原に対する抗体を、乳癌などの乳房の疾患を有する疑いのある患者に注射することができると予想される。使用する標識は、選択するイメージング様式に左右される。インジウム−１１１、テクネチウム−９９ｍ、ヨウ素−１３１などの放射能標識を、プレーナスキャン（ｐｌａｎａｒ　ｓｃａｎｓ）またはシングルフォトンエミッションコンピュータ断層撮影（ＳＰＥＣＴ）に用いることができる。また、フッ素−１９などの陽電子放射標識を、ポジトロンエミッショントモグラフィー（ＰＥＴ）に用いることができる。ＭＲＩには、ガドリニウム（ＩＩＩ）、マンガン（ＩＩ）などの常磁性イオンを使用することができる。乳房の内部また乳房の外部の該標識の局在化は、該疾患の広がりの判定を可能にしうる。乳房内の標識の量は、乳癌の存在または不存在の判定を可能にしうる。
【０２１０】
乳房の疾患を有することが判明している患者の場合には、ＢＳ１０６抗原に対する抗体の注射が治療上有益かもしれない。該抗体は、該組織または器官の表面または内部に発現したＢＳ１０６抗原に結合することにより、結合試薬を使用しなくても効果を発揮しうる。あるいは、該抗体を薬物、毒素、放射性核種などの細胞傷害性因子と共役させて、その治療効果を増強することが可能である。ＧａｒｎｅｔｔおよびＢａｌｄｗｉｎ，Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　４６：２４０７−２４１２（１９８６）は、薬物−モノクローナル抗体共役体の製造を記載している。Ｐａｓｔａｎら，Ｃｅｌｌ　４７：６４１−６４８（１９８６）は、モノクローナル抗体と共役させた毒素を種々の癌の治療に使用することについて概説している。ＧｏｏｄｗｉｎおよびＭｅａｒｅｓ，Ｃａｎｃｅｒ　Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ　８０：２６７５−２６８０　（１９９７）は、正常組織に対する毒性を抑制しつつ腫瘍に対する線量を最大にするための種々の方法において、イットリウム−９０で標識されたモノクローナル抗体を使用することを記載している。他の公知の細胞傷害性放射性核種には、銅−６７、ヨウ素−１３１およびレニウム−１８６が含まれ、これらはすべて、乳癌の治療用にＢＳ１０６抗原に対するモノクローナル抗体を標識するために使用することができる。
【０２１１】
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（クローン１６６２８８５）は、Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．）、１０８０１　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｂｌｖｄ．，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡに１９９６年１１月２０日に寄託されている。該寄託はブダペスト条約の条項に基づいてなされた。該寄託は、寄託の日から３０年間または寄託に関する最終請求後５年間または該米国特許の存続期間のうち最も遅い時まで保管されることとなる。該寄託および本明細書に記載の他の任意の寄託物質は、便宜上与えられているにすぎず、本明細書の教示を考慮して本発明を実施することは必ずしも要求されない。それらの全寄託物質におけるｃＤＮＡ配列を、参照により本明細書に組み入れるものとする。クローン１６６２８８５には、Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．受託第９８２５６号が付与されている。
【０２１２】
つぎに、実施例により本発明を説明するが、これらの実施例は例示にすぎず、本発明の範囲を限定するものではない。
【０２１３】
（実施例）
実施例１：乳房組織ライブラリーＢＳ１０６遺伝子特異的クローンの同定
Ａ．発現しているタグ配列（ＥＳＴ）または転写イメージの、ライブラリーにおける比較
ｃＤＮＡクローンインサートの部分配列、いわゆる「発現しているタグ配列」（ＥＳＴ）を、乳房腫瘍組織、乳房非腫瘍組織および多数の他の組織（腫瘍および非腫瘍の両方）から作製したｃＤＮＡライブラリーから誘導し、遺伝子転写イメージとしてデータベース（Ｉｎｃｙｔｅ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｐａｌｏ　Ａｌｔｏ，ＣＡから入手可能なＬＩＦＥＳＥＱ（商標）データベース）に入力した。国際公開番号ＷＯ　９５／２０６８１を参照されたい（転写イメージは、ある与えられた組織ライブラリーにおける代表遺伝子のそれぞれに関するＥＳＴ数の一覧である。相互配列重複の領域を共有するＥＳＴは、クラスターに分類される。クラスターには、代表的５’ＥＳＴからのクローン番号が割り当てられる。しばしば、関心のあるクラスターは、そのコンセンサス配列と、自動化クラスタリングの基準を満足しなかった他のＥＳＴの配列との比較により伸長されうる。入手可能な全クラスターおよび単一ＥＳＴのアライメントは、コンセンサス配列が導かれるコンティグを表す）。ついで該転写イメージを評価して、主として乳房組織ライブラリーを代表するＥＳＴクラスターを同定した。ついで、これらの標的クローンを、該標的ライブラリー中のそれらの存在量（出現頻度）と、バックグラウンドライブラリーにおけるそれらの不存在とに基づきランク付けした。低いバックグラウンド出現頻度を有する、より高い存在量のクラスターには、より高い研究優先度を与えた。ＢＳ１０６のコンセンサス配列に対応するＥＳＴは、乳房組織ライブラリーの５０．８％（５９例中３０例）で見出された。コンセンサス配列配列番号６（またはその断片）に対応するＥＳＴは、該データベースのその他の非乳房組織ライブラリーの０．５０９％（９８３例中５例）で見出されたにすぎなかった。したがって、該コンセンサス配列またはその断片は、乳房組織においては非乳房組織の場合の１００倍以上多く見出された。重複クローン１６６２８８５（配列番号１）、８９３９８８（配列番号２）、９０１４２９（配列番号３）、１２０９８１４（配列番号４）をそれぞれ、さらなる研究のために同定した。これらは、本明細書に記載のコンセンサス配列（配列番号６）を誘導するもとになった、（クローン１６６２８８５の完全長配列［１６６２８８５ｉｎｈ（配列番号５）と称される］と共に）該コンティグを形成するのに必要であった最小数のクローンを代表した。
【０２１４】
Ｂ．コンセンサス配列の作製
クローン１６６２８８５（配列番号１）、８９３９８８（配列番号２）、９０１４２９（配列番号３）、１２０９８１４（配列番号４）のヌクレオチド配列、およびクローン１６６２８８５の完全長配列［１６６２８８５ｉｎｈ（配列番号５）と称される］を、Ｓｅｑｕｅｎｃｈｅｒ（商標）Ｐｒｏｇｒａｍ（Ｇｅｎｅ　Ｃｏｄｅｓ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ａｎｎ　Ａｒｂｏｒ，ＭＩから入手可能）に入力して、ヌクレオチドアライメント（コンティグ地図）を得、ついでそれらのコンセンサス配列（配列番号６）を得た。図１は、これらのクローンのヌクレオチド配列アライメント、および得られたそれらのヌクレオチドコンセンサス配列（配列番号６）を示す。図２は、クローン１６６２８８５（配列番号１）、８９３９８８（配列番号２）、９０１４２９（配列番号３）、１２０９８１４（配列番号４）、およびクローン１６６２８８５の完全長配列［１６６２８８５ｉｎｈ（配列番号５）と称される］［これらは、ＢＳ１０６遺伝子とこれらのクローンの得られたコンセンサスヌクレオチド配列（配列番号６）との重複領域を形成するものである］を示すコンティグ地図を図式的に表している。この後、該コンセンサス配列（配列番号６）上で３フレーム翻訳を行なった。第１フォワードフレームは、９０残基のアミノ酸配列をコードするオープンリーディングフレームを有することが判明し、これを配列番号２０として示す。該オープンリーディングフレームは配列番号６のヌクレオチド５５−３２４に対応する。
【０２１５】
ＬＩＦＥＳＥＱ（商標）データベースの分析は、コンセンサスヌクレオチド配列（配列番号６）の４５位における考えられうるＴ／Ｇ多型を示している。
【０２１６】
実施例２：ＢＳ１０６　ＥＳＴ特異的クローンの配列決定
ＢＳ１０６遺伝子コンティグのクローン１６６２８８５ｉｎｈのＤＮＡ配列（配列番号５）を、公知方法に従い、色素ターミネーターを使用するジデオキシターミネーション配列決定法で決定した［Ｆ　Ｓａｎｇｅｒら，ＰＮＡＳ　Ｕ．Ｓ．Ａ．７４：５４６３（１９７７）］。
【０２１７】
ｐＳＰＯＲＴ１（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）およびｐＩＮＣＹ（Ｉｎｃｙｔｅ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｐａｌｏ　Ａｌｔｏ，ＣＡから入手可能）のようなベクターは、該インサートの３’および５’ライゲーション結合部に直接隣接した普遍的プライミング部位を含有するため、普遍的プライマー（配列番号９および配列番号１０）（それぞれ、Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡおよびＡｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　Ｉｎｃ，Ｆｏｓｔｅｒ　Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を使用して、該インサートを両方向に配列決定した。該配列決定反応は、ポリアクリルアミド変性ゲル上で行ない、該配列は、Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　３７７　Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ　Ｃｉｔｙ，ＣＡから入手可能）により決定した。追加的な配列決定プライマー配列番号１１および配列番号１２を、コンセンサス配列配列番号６の配列情報から設計した。ついで、これらのプライマーを使用して、既に記載されているとおりに、各ＤＮＡ鎖からのクローン化インサートの残りのＤＮＡ配列を決定した。
【０２１８】
実施例３：核酸
Ａ．組織からのＲＮＡの抽出
乳房組織または非乳房組織から全ＲＮＡを単離した。当技術分野で公知でありＫａｔｏら（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．　６１：２１８２−２１９１，１９８７）により記載されている塩化リチウム／尿素法およびＴＲＩｚｏｌ（商標）（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ，Ｇｒａｎｄ　Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）を含む（これらに限定されるものではない）種々の方法を用いた。
【０２１９】
簡単に説明すると、組織を氷上の無菌円錐管中に配置し、１０〜１５容量の３Ｍ　ＬｉＣｌ、６Ｍ尿素、５ｍＭ　ＥＤＴＡ、０．１Ｍ　２−メルカプトエタノールおよび５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）を加えた。該組織を、氷上でＰｏｌｙｔｒｏｎ（登録商標）ホモジナイザー（Ｂｒｉｎｋｍａｎ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ．，Ｗｅｓｔｂｕｒｙ，ＮＹ）で３０〜５０秒間ホモジナイズした。該溶液を１５ｍｌ　プラスチック遠心管に移し、−２０℃で一晩放置した。該管を９，０００×ｇ、０〜４℃で９０分間遠心し、該上清を直ちにデカントした。ついで１０ｍｌの３Ｍ　ＬｉＣｌを加え、該管を５秒間ボルテックスした。該管を１１，０００×ｇ、０〜４℃で４５分間遠心した。これらのデカント、ＬｉＣｌへの再懸濁および遠心分離を繰返し、最終ペレットを風乾し、２ｍｌの１ｍＭ　ＥＤＴＡ、０．５％　ＳＤＳ、１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）に再懸濁した。２０μｌのプロテイナーゼＫ（２０ｍｇ／ｍｌ）を加え、該溶液を、時々混合しながら３７℃で３０分間インキュベートした。１０分の１容量（０．２２〜０．２５ｍｌ）の３Ｍ　ＮａＣｌを加え、該溶液をボルテックスした後、２ｍｌのフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール（ＰＣＩ）を含有する別の管に移した。該管を１〜３秒間ボルテックスし、３，０００×ｇ、１０℃で２０分間遠心した。該ＰＣＩ抽出を繰返し、ついでクロロホルム／イソアミルアルコール（ＣＩ）での同様の抽出を２回行なった。該最終水溶液を、６ｍｌの無水エタノールを含有する予め冷却した１５ｍｌ　コレックスガラス管に移した。該管をパラフィンで覆い、−２０℃で一晩放置した。該管を１０，０００×ｇ、０〜４℃で３０分間遠心し、該エタノール上清を直ちにデカントした。該ＲＮＡペレットを１０ｍｌの７５％　氷冷エタノールで４回洗浄し、該最終ペレットを室温で１５分間風乾した。該ＲＮＡを０．５ｍｌの１０ｍＭ　ＴＥ（１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．６，１ｍＭ　ＥＤＴＡ）に懸濁し、その濃度を分光光度的に測定した。ＲＮＡサンプルをアリコート化し、エタノール沈殿物として−７０℃で保存した。
【０２２０】
該ＲＮＡの量を、アガロースゲル電気泳動（実施例５を参照されたい）および０．５μｇ／ｍｌの臭化エチジウムでの１時間の染色により測定した。無傷リボソームＲＮＡを含有しないＲＮＡサンプルを、該研究から除外した。
【０２２１】
別法として、ＲＴ−ＰＣＲ分析のために、１ｍｌのＵｌｔｒａｓｐｅｃ　ＲＮＡ試薬を、２．０ｍｌ　ポリプロピレンミクロ遠心管中の１２０ｍｇの微粉砕組織に加え、Ｐｏｌｙｔｒｏｎ（登録商標）ホモジナイザー（Ｂｒｉｎｋｍａｎ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ．，Ｗｅｓｔｂｕｒｙ，ＮＹ）で５０秒間ホモジナイズし、氷上に５分間放置した。ついで０．２ｍｌのクロロホルムを各サンプルに加え、ついで１５秒間ボルテックスした。該サンプルを氷中に更に５分間放置し、ついで１２，０００×ｇ、４℃で１５分間遠心した。該上層を集め、ＲＮアーゼを含まない別の２．０ｍｌ　ミクロ遠心管に移した。等容量のイソプロパノールを各サンプルに加え、該溶液を氷上に１０分間放置した。該サンプルを１２，０００×ｇ、４℃で１０分間遠心し、該上清を捨てた。残ったペレットを冷７５％　エタノールで２回洗浄し、ボルテックスにより再懸濁し、ついで該再懸濁物質を７，５００×ｇ、４℃で５分間の遠心分離によりペレット化した。最後に、該ＲＮＡペレットをＳｐｅｅｄｖａｃ（Ｓａｖａｎｔ，Ｆａｒｍｉｎｇｄａｌｅ，ＮＹ）中で５分間乾燥し、ＲＮアーゼを含まない水中で再構成した。
【０２２２】
Ｂ．血液単核細胞からのＲＮＡ抽出
単核細胞を、以下のとおりＦｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅを使用する遠心分離により、患者からの血液サンプルから単離した。１０ｍｌ容量の全血を、等容量のＲＰＭＩ培地（Ｇｉｂｃｏ　ＢＲＬ，Ｇｒａｎｄ　Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）と混合した。ついでこの混合物の下に１０ｍｌのＦｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を配置し、２００×ｇで３０分間遠心分離した。該単核細胞を含有するバフィーコートを取り出し、ダルベッコのＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ　ＢＲＬ，Ｇｒａｎｄ　Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）で５０ｍｌまで希釈し、該混合物を２００×ｇで１０分間遠心分離した。２回の洗浄の後、得られたペレットをダルベッコのＰＢＳに再懸濁して、１ｍｌの最終容量とした。
【０２２３】
ＴＲＩＺＯＬ（登録商標）Ｒｅａｇｅｎｔにより、該製造業者（Ｇｉｂｃｏ　ＢＲＬ，Ｇｒａｎｄ　Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）の指示に従い、その単離した単核細胞からＲＮＡを調製した。簡単に説明すると、該ペレット化細胞をＴＲＩＺＯＬ（登録商標）Ｒｅａｇｅｎｔに再懸濁し、ピペッティングの繰返しにより細胞溶解した。該混合物をホモジナイズし、１５〜３０℃で５分間インキュベートした。クロロホルムを該ホモジネートに加え、該管を１５秒間にわたり手で激しく振とうさせ、ついで１５〜３０℃で２〜３分間インキュベートした。該サンプルを１２，０００×ｇ、２〜８℃で１５分間遠心分離し、該ＲＮＡを含有する水相を新鮮な管に入れた。該ＲＮＡを、イソプロパノールとの混合により沈殿させ、１５〜３０℃で１０分間インキュベートし、１２，０００×ｇ、２〜８℃で１０分間遠心分離した。該上清を除去し、該ＲＮＡペレットを７５％　エタノールで１回洗浄した。該ペレットを短時間乾燥させ、該溶液をピペットの先端に通過させ５５〜６０℃で１０分間インキュベートすることにより、ＲＮＡアーゼを含まない水に再懸濁した。該ＲＮＡをＵＶ分光光度計により定量した。
【０２２４】
Ｃ．ポリソームからのＲＮＡ抽出
組織を、４℃、食塩水中で細かく刻み、６ｍＭ　２−メルカプトエタノールを含有するＴＫ１５０Ｍ（１５０ｍＭ　ＫＣｌ、５ｍＭ　ＭｇＣｌ２、５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４）溶液中、２．５容量の０．８Ｍ　ショ糖と混合する。該組織を、Ｔｅｆｌｏｎ−ガラスＰｏｔｔｅｒホモジナイザー中、１００〜２００ｒｐｍ、５往復で、ついでＤｏｕｎｃｅホモジナイザー中、６往復でホモジナイズする（Ｂ．Ｍｅｃｈｌｅｒ，Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　１５２：２４１−２４８（１９８７）に記載のとおり）。ついで該ホモジネートを、１２，０００×ｇ、４℃で１５分間遠心して、該核を沈降させる。２ｍｌの該上清を、ＴＫ１５０Ｍ中の２．５Ｍ　ショ糖６ｍｌと混合し、この混合物を３８ｍｌポリアロマー管内のＴＫ１５０Ｍ中の４ｍｌの２．５Ｍ　ショ糖の上に重層することにより、該ポリソームを単離する。追加的な２つのショ糖ＴＫ１５０Ｍ溶液を、該抽出画分の上に順次重層する（１３ｍｌの２．０５Ｍ　ショ糖の第１層およびそれに続く６ｍｌの１．３Ｍ　ショ糖の第２層）。該勾配を９０，０００×ｇ、４℃で５時間遠心することにより、該ポリソームを単離する。ついで該画分をシリコーン化パスツールピペットで１．３Ｍ　ショ糖／２．０５Ｍ　ショ糖界面から取り、等容量のＴＥ（１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、１ｍＭ　ＥＤＴＡ）中に希釈する。等容量の９０℃のＳＤＳバッファー（１％ＳＤＳ、２００ｍＭ　ＮａＣｌ、２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４）を加え、該溶液を沸騰水浴中で２分間インキュベートする。つぎにタンパク質をプロテイナーゼＫ消化（５０ｍｇ／ｍｌ）で３７℃で１５分間消化する。３等容量のフェノール／クロロホルムで抽出し、ついで０．１容量の２Ｍ　酢酸ナトリウム（ｐＨ５．２）および２容量の１００％　エタノールで−２０℃で一晩沈殿させることにより、該ｍＲＮＡを精製する。その沈殿したＲＮＡを、１２，０００×ｇ、４℃で１０分間の遠心分離により回収する。該ＲＮＡを乾燥し、ＴＥ（１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、１ｍＭ　ＥＤＴＡ）または蒸留水に再懸濁する。ついで該再懸濁化ＲＮＡをスロットブロットまたはドットブロットハイブリダイゼーションアッセイにおいて使用して、ＢＳ１０６　ｍＲＮＡの存在に関して確認することができる（実施例６を参照されたい）。
【０２２５】
核酸およびタンパク質の量は、用いる調製方法に左右される。該標的分子の単離効率を最大にするためには、各サンプルは、異なる調製技術を必要とするかもしれない。これらの調製技術は当業者の技量の範囲内である。
【０２２６】
実施例４：リボヌクレアーゼ保護アッセイ
Ａ．標識化相補的ＲＮＡ（ｃＲＮＡ）ハイブリダイゼーションプローブおよび未標識センス鎖の合成
対抗するＳＰ６およびＴ７ポリメラーゼプロモーターに隣接するＢＳ１０６遺伝子のｃＤＮＡ配列インサート（クローン１６６２８８５）を含有するｐＩＮＣＹプラスミドを、Ｑｉａｇｅｎ　Ｐｌａｓｍｉｄ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ，ＣＡ）を使用して精製した。ついで１０μｇの該プラスミドを、１０ＵのＤｄｅＩ制限酵素で３７℃で１時間にわたり切断した。その切断されたプラスミドを、ＱＩＡｐｒｅｐキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ，ＣＡ）を使用して精製した。Ｒｉｂｏｐｒｏｂｅ（登録商標）ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を該供給業者の説明書の記載のとおりに使用して、１０μＭ（α３２Ｐ）ＣＴＰ（８００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ　Ｈｅｉｇｈｔｓ，ＩＬ）で標識されたアンチセンス転写産物をＴ７プロモーターから合成するために、該精製プラスミドを使用した。該センス鎖を得るために、１０μｇの該精製プラスミドを、１０ＵのＸｂａＩおよび１０ＵのＮｏｔＩ制限酵素で切断し、２５０ｎｇをＳＰ６プロモーターから未標識ＣＴＰで転写させた。センスおよびアンチセンスの両方の鎖を、スピンカラムクロマトグラフィーにより単離した。未標識センス転写鎖を、２６０ｎｍのＵＶ吸収により定量した。
【０２２７】
Ｂ．標的に対する標識プローブのハイブリダイゼーション
凍結組織を液体窒素下で粉砕して粉末にし、１００〜５００ｍｇを１ｍｌの細胞溶解バッファー［ＲＮＡｑｕｅｏｕｓ（商標）ＲＮＡ　Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ，Ｉｎｃ．，Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）の一成分として入手可能］に溶解した。組織ホモジナイザーを使用して更なる溶解を行ない、該供給業者の説明書の記載のとおりにＲＮＡを単離した。また、陽性対照として使用するために、酵母ＲＮＡ中の既知量のセンス鎖の希釈系列を作製した。最後に、５．０μｇまでの精製組織ＲＮＡまたは希釈されたセンス鎖を、酢酸アンモニウムおよびエタノール中の１×１０５ｃｐｍの放射能標識プローブ（１．５×１０９ｃｐｍ／μｇ）で共沈させた。ペレットを風乾し、ついで２０μｌのハイブリダイゼーションバッファー［ＲＰＡ　ＩＩ（商標）Ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ　Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ　Ａｓｓａｙ　Ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ，Ｉｎｃ．，Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）の一成分として供給される］に再懸濁させた。９０℃で５分間の熱変性後、ハイブリダイゼーションを４５℃で一晩進行させた。
【０２２８】
Ｃ．ＲＮアーゼ消化
ＲＰＡ　ＩＩ（商標）のプロトコールに従い、ＲＮアーゼＡおよびＲＮアーゼＴ１の溶液を３７℃で３０分間使用して、プローブにハイブリダイズしていないＲＮＡを該反応から除去した。ついで、消化されないように保護されたハイブリダイズした断片を、該供給業者の指示に従い及び１２，０００×ｇで１５分間の遠心分離により沈殿させた。
【０２２９】
Ｄ．断片の分析
該沈殿物を、変性ゲルローディング色素（８０％　ホルムアミド、１０ｍＭ　ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）、１ｍｇ／ｍｌ　キシレンシアノール、１ｍｇ／ｍｌ　ブロモフェノールブルー）に溶解し、熱変性させ、６％　ポリアクリルアミドＴＢＥ、８Ｍ　尿素変性ゲル中で電気泳動した。ＳＴＯＲＭ（商標）貯蔵蛍りん光体（ｓｔｏｒａｇｅ　ｐｈｏｓｐｈｏｒ）オートラジオグラフィー系（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｄｙｎａｍｉｃｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）を使用して、該ゲルをイメージングし、分析した。試験サンプルから得たピーク面積を、陽性対照センス鎖の既知希釈物からのものと比較することにより、フェムトグラム（ｆｇ）単位で表される保護断片バンドの定量を行なった（前記Ｂ節を参照されたい）。結果を、表１にイメージ評価得点として表す。検出可能な保護断片を有さないサンプルは「−」と評価し、標準曲線内のｆｇ値を有する検出可能な保護断片を有するサンプルは「＋」と評価した。
【０２３０】
【表１】
2004503208.tif 000003
【０２３１】
実施例５：ノーザンブロット法
ノーザンブロット法は、当技術分野でよく知られた技術である。ゲル電気泳動および核酸ハイブリダイゼーションによりＲＮＡの複合体集団からの特定のサイズのＲＮＡ断片を同定するために、ノーザンブロット法を用いた。簡単に説明すると、４０ｍＭ　モルホリノプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）（ｐＨ７．０）、１０ｍＭ　酢酸ナトリウム、１ｍＭ　ＥＤＴＡ、２．２Ｍ　ホルムアルデヒド、５０％　ｖ／ｖ　ホルムアミドを含有する１５μｌの溶液中、５〜１０μｇの全ＲＮＡ（実施例３を参照されたい）を６５℃で１５分間インキュベートした。該変性ＲＮＡを２μｌのローディングバッファー（５０％　グリセロール、１ｍＭ　ＥＤＴＡ、０．４％　ブロモフェノールブルー、０．４％　キシレンシアノール）と混合し、４０ｍＭ　ＭＯＰＳ（ｐＨ７．０）、１０ｍＭ　酢酸ナトリウム、１ｍＭ　ＥＤＴＡおよび２．２Ｍ　ホルムアルデヒドを含有する変性１．０％　アガロースゲル中にローディングした。該ゲルを６０Ｖで１．５時間にわたり電気泳動し、ＲＮアーゼを含まない水中でリンスした。下向性アルカリキャピラリートランスファー法（ｄｏｗｎｗａｒｄ　ａｌｋａｌｉｎｅ　ｃａｐｉｌｌａｒｙ　ｔｒａｎｓｆｅｒ　ｍｅｔｈｏｄ）（Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．　２０１：１３４−１３９，１９９２）を用いて、ＲＮＡを該ゲルからナイロンメンブレン（Ｂｒｉｇｈｔｓｔａｒ−Ｐｌｕｓ，Ａｍｂｉｏｎ，Ｉｎｃ．，Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）に１．５時間にわたりトランスファーした。該フィルターを１×ＳＳＣでリンスし、Ｓｔｒａｔａｌｉｎｋｅｒ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｉｎｃ．，Ｌａ　Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を自動架橋（ａｕｔｏｃｒｏｓｓｌｉｎｋｉｎｇ）モードで使用してＲＮＡを該フィルターに架橋し、１５分間乾燥した。ついで該メンブレンを、予め加熱した２０ｍｌのプレハイブリダイゼーション溶液（５×ＳＳＣ、５０％　ホルムアミド、５×デンハルト液、１００ｇ／ｍｌ　変性サケ精子ＤＮＡ）を含有するハイブリダイゼーション管に入れ、４２℃のハイブリダイゼーションオーブン中で少なくとも３時間インキュベートした。該ブロットがプレハイブリダイズしている間に、Ｒａｎｄｏｍ　Ｐｒｉｍｅｒ　ＤＮＡ　Ｌａｂｅｌｉｎｇ　Ｓｙｓｔｅｍ（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を該製造業者の指示に従い使用しＢＳ１０６挿入断片（クローン６０３１４８Ｈ１をＸｂａＩおよびＮｏｔＩで消化することにより得たもの）を使用して、３２Ｐ標識ランダムプライムドプローブを作製した。該プローブの半分を１０分間煮沸し、氷上で急冷し、該ハイブリダイゼーション管内に加えた。ハイブリダイゼーションを４２℃で少なくとも１２時間行なった。該ハイブリダイゼーション溶液を捨て、該フィルターを３０ｍｌの３×ＳＳＣ、０．１％　ＳＤＳ中、４２℃で１５分間洗浄し、ついで３０ｍｌの０．３×ＳＳＣ、０．１％　ＳＤＳ中、４２℃で１５分間洗浄した。該フィルターをプラスチック・ラップで包み、Ｋｏｄａｋ　ＸＡＲ−Ｏｍａｔフィルムに８〜９６時間さらし、該フィルムを現像し分析した。
【０２３２】
臭化エチジウム染色アガロースゲルを使用したＲＮＡの質の分析、ならびに乳房組織および前立腺組織からの及び正常乳房および乳癌組織からのＲＮＡにハイブリダイズしたＢＳ１０６プローブを使用する対応ノーザンブロットの結果を、それぞれ図３ＡおよびＢに示す。ＲＮＡサイズ標準の位置（ｋｂ単位）が各パネルの左側に示されている。図３Ａに示すとおり、正常乳房組織３個中３個（レーン１〜３）および前立腺癌組織３個中１個（レーン７）において、該ＢＳ１０６プローブは約０．７ｋｂのＲＮＡバンドにハイブリダイズした。該ＲＮＡバンドは、３個の正常前立腺組織（レーン４〜６）においても、前立腺または乳癌細胞系（レーン１０および１１）においても検出されなかった。図３Ｂは、正常乳房ＲＮＡサンプル６個中５個（レーン１〜４および６）ならびに乳癌ＲＮＡサンプル６個中２個（レーン７および１１）において、該ＢＳ１０６プローブが約０．７ｋｂのＲＮＡにハイブリダイズしたことを示している。
【０２３３】
配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６およびそれらの断片または相補体よりなる群から選ばれる配列を含む産物の検出は、ＢＳ１０６　ｍＲＮＡの存在を示し、乳癌などの乳房組織の疾患または状態の診断を示唆する。
【０２３４】
実施例６：ドットブロット／スロットブロット
ドットおよびスロットブロットアッセイは、複雑な核酸混合物中の特異的核酸配列の存在を評価するための迅速な方法である。商業的に入手可能なキットは、これらのアッセイを特に魅力的なものとする。
【０２３５】
異なる７６個のヒト組織からのポリＡ　ＲＮＡを含有するＣｌｏｎｔｅｃｈ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｐａｌｏ　Ａｌｔｏ，ＣＡ）Ｍｕｌｔｉｐｌｅ　Ｔｉｓｓｕｅ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　Ａｒｒａｙ（商標）を使用して、ドットブロット分析を行った。ＢＳ１０６プラスミドＤＮＡを、［３２Ｐ］ｄＣＴＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ）でニックトランスレーションにより１０８　ｃｐｍ／ｇの比活性まで標識した。約６３ｎｇの３２Ｐ標識プローブを使用して、該Ｃｌｏｎｔｅｃｈアレイ上でドットをハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーションは、該Ｃｌｏｎｔｅｃｈキットと共に供給された説明書に従って行った。簡単に説明すると、標識プローブを、該発現アレイメンブレンに６５℃で１５時間ハイブリダイズさせた。該メンブレンを６５℃で２×ＳＣ、１％　ＳＤＳで５回洗浄し、ついで５５℃で０．１×ＳＳＣ、０．５％　ＳＤＳで２回洗浄した。Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｄｙｎａｍｉｃｓ　ＳＴＯＲＭ　８４０　Ｐｈｏｓｐｈｏｒ　Ｉｍａｇｉｎｇ系（商標）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｄｙｎａｍｉｃｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）を使用して、該ハイブリダイゼーションイメージを分析した。
【０２３６】
該分析の結果を図４に示す。該ドットの同定は該キットによりもたらされた。ヒト唾液腺および乳腺から単離したｍＲＮＡでは陽性シグナルが検出され、残りの７４個のヒト組織から単離したｍＲＮＡでは陽性シグナルは検出されなかった。また、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＮＡおよびヒトゲノムＤＮＡに関して、陽性シグナルが得られた。ＢＳ１０６プラスミドは、残留大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＮＡを除去する後続のいずれの精製も行うことなく大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）から直接単離されたため、該大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＮＡに対するハイブリダイゼーションは予想されたものであった。ヒトゲノムＤＮＡに対するハイブリダイゼーションは、ＢＳ１０６が多遺伝子ファミリーに属しうることを示しうるであろう。
【０２３７】
実施例７：Ｉｎ　Ｓｉｔｕハイブリダイゼーション
この方法は、検出可能な核酸ハイブリダイゼーションプローブを使用して細胞中の特異的標的核酸配列を直接検出するのに有用である。
【０２３８】
細胞ＲＮＡの保持を最大にするためのパラホルムアルデヒド、グルタルアルデヒドなどの架橋固定剤を用いて、組織を調製する。Ｌ．Ａｎｇｅｒｅｒら，Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ．　３５：３７−７１（１９９１）を参照されたい。簡単に説明すると、該組織を、５０ｍＭ　リン酸ナトリウム（ｐＨ７．５）中の５容量以上の１％グルタルアルデヒド中に４℃で３０分間配置する。該溶液を、新鮮なグルタルアルデヒド溶液（１％グルタルアルデヒド、５０ｍＭリン酸ナトリウム中（ｐＨ７．５））と交換して、さらに３０分間固定する。該固定溶液は、約０．３７５％　ＮａＣｌの浸透圧モル濃度を有するべきである。該組織を等張ＮａＣｌ中で１回洗浄して、該ホスファートを除去する。
【０２３９】
ついで該固定化組織を、以下のとおり、パラフィン中に包埋する。５０％（２回）、７０％（２回）、８５％、９０％、ついで１００％（２回）の一連のエタノール濃度により、それぞれ１５分間、該組織を脱水する。つぎに、該組織をキシレン（２回交換）に、室温でそれぞれ２０分間漬ける。ついで該組織を、キシレンおよびパラフィンの１：１混合物（２回交換）に６０℃でそれぞれ２０分間、ついでパラフィン（３回の最終交換）にそれぞれ１５分間漬ける。
【０２４０】
つぎに、該組織を、標準的なミクロトームを使用して５μｍの切片に切断し、３−アミノプロピルトリエトキシシランなどの組織接着剤で予め処理されたスライド上に配置する。
【０２４１】
キシレンに１０分間にわたり２回漬けることにより、該組織からパラフィンを除去し、９９％（２回）、９５％、８５％、７０％、５０％、３０％の一連のエタノール濃度中、ついで蒸留水（２回）中で再水和化する。該切片を、０．２Ｍ　ＨＣｌで１０分間、前処理し、３７℃で１５分間、２μｇ／ｍｌ　プロテイナーゼＫで透過性を上昇させる。
【０２４２】
ＢＳ１０６遺伝子プラスミドから転写された標識リボプローブ（実施例４を参照されたい）を、その調製された組織切片にハイブリダイズさせ、３×標準食塩水抽出物および５０％　ホルムアミド中、５６℃で一晩インキュベートする。２×標準クエン酸食塩水および５０％　ホルムアミド中で洗浄し、ついで１００μｇ／ｍｌ　ＲＮアーゼＡで３７℃で３０分間消化することにより、過剰なプローブを除去する。蛍光プローブを、顕微鏡下での紫外（ＵＶ）光による照明により可視化する。細胞質中の蛍光はＢＳ１０６　ｍＲＮＡを示す。別法として、該切片をオートラジオグラフィーで可視化することができる。
【０２４３】
実施例８：逆転写ＰＣＲ
Ａ．一工程ＲＴ−ＰＣＲアッセイ
当技術分野で公知の方法を用いる逆転写ＰＣＲにより前記標的配列を検出するために、標的特異的プライマーを設計する。一工程ＲＴ−ＰＣＲは、ＲＴおよびＰＣＲの両方を単一反応混合物中で行なう逐次的方法である。該方法は、５０ｍＭ　（Ｎ，Ｎ−ビス［２−ヒドロキシエチル］グリシン）（ｐＨ８．１５）、８１．７ｍＭ　ＫＯＡｃ、３３．３３ｍＭ　ＫＯＨ、０．０１ｍｇ／ｍｌ　ウシ血清アルブミン、０．１ｍＭ　エチレンジアミン四酢酸、０．０２ｍｇ／ｍｌ　ＮａＮ３、８％　ｗ／ｖ　グリセロール、１５０μＭの各ｄＮＴＰ、０．２５μＭの各プライマー、５Ｕ　ｒＴｔｈポリメラーゼ、３．２５ｍＭ　Ｍｎ（ＯＡｃ）２および５μｌの標的ＲＮＡ（実施例３を参照されたい）を含有する２００μｌの反応混合物中で行なう。ＲＮＡおよび該ｒＴｔｈポリメラーゼ酵素は、Ｍｎ（ＯＡｃ）２の存在下では不安定であるため、該Ｍｎ（ＯＡｃ）２は、標的の添加の直前に加えるべきである。当業者であれば、ｃＤＮＡ合成および熱的（サーマル）サイクリングのための最適条件を容易に決定することが可能である。該反応を、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ　Ｔｈｅｒｍａｌ　Ｃｙｃｌｅｒ　４８０中でインキュベートする。有用だと考えられうる条件は、６０℃〜７０℃で１５〜４５分間のｃＤＮＡ合成、および９４℃で１分間、５５〜７０℃で１分間、７２℃で２分間の３０〜４５サイクルの増幅を含む。また、一工程ＲＴ−ＰＣＲは、Ｔａｑポリメラーゼと逆転写酵素（例えば、ＭＭＬＶ（モロニーマウス白血病ウイルス）またはＡＭＶ（トリ骨髄芽球症ウイルス）ＲＴ（逆転写酵素）酵素）とを使用する二重酵素法を用いて行なうことができる。
【０２４４】
Ｂ．伝統的なＲＴ−ＰＣＲ
別法として、伝統的な二工程ＲＴ−ＰＣＲ反応を、Ｋ．Ｑ．Ｈｕら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　１８１：７２１−７２６（１９９１）に記載のとおりに行なった。簡単に説明すると、０．５μｇの抽出されたｍＲＮＡ（実施例３を参照されたい）を、１×ＰＣＲ　ＩＩバッファー（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）、５ｍＭ　ＭｇＣｌ２、１ｍＭ　ｄＮＴＰ、２０Ｕ　ＲＮａｓｉｎ、２．５μＭ　ランダムヘキサマーおよび５０Ｕ　ＭＭＬＶ（モロニーマウス白血病ウイルス）逆転写酵素（ＲＴ）を含有する２０μｌの反応混合物中で逆転写した。逆転写は、ＭＪ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｃｙｃｌｅｒ　Ｍｏｄｅｌ　ＰＴＣ−２００中、４２℃で６０分間行ない、ついで９５℃で５分間、さらにインキュベートして、該ＲＴを不活性化した。ＰＣＲは、１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、５０ｍＭ　ＫＣｌ、２ｍＭ　ＭｇＣｌ２、２００μＭ　ｄＮＴＰ、０．５μＭの各センスおよびアンチセンスプライマー（それぞれ配列番号１３および配列番号１４）および２．５ＵのＴａｑポリメラーゼを含有する５０μｌの最終ＰＣＲ反応容量中、２μｌの該ｃＤＮＡ反応液を使用して行なった。該反応を、ＭＪ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｍｏｄｅｌ　ＰＴＣ−２００中で以下のとおりにインキュベートした：４０サイクルの増幅（９４℃で２０秒間、５８℃で３０秒間、７２℃で３０秒間）、最終伸長（７２℃で１０分間）および４℃での浸漬。
【０２４５】
Ｃ．ＰＣＲ断片の分析
正しい産物を、ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ　Ｉ　核酸ゲル染色（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）によるゲル電気泳動を用いるサイズの決定により確認した。ゲルは、１×ＴＢＥ中の１：１０，０００希釈のＳＹＢＲ　Ｇｒｅｅｎ　Ｉで４５分間染色した。ついでゲルを１×ＴＢＥ中で３０分間脱染し、ＳＴＯＲＭイメージング系を用いてイメージングした（図５Ａおよび５Ｂを参照されたい）。図５Ａは、ＢＳ１０６　ｍＲＮＡ特異的ＲＴ−ＰＣＲ産物を示す２０１塩基の位置のＤＮＡバンドを示す。このバンドは、正常乳房組織５個中５個（レーン３〜７）におけるＲＮＡおよび乳癌組織サンプル５個中４個（レーン８〜１１）におけるＲＮＡ中に存在する。それは胎盤ＤＮＡ（レーン２）中には存在しない。図５Ｂに示すとおり、結腸組織（レーン１〜５）、肺組織（レーン６〜１０）から単離されたＲＮＡを用いた場合にも胎盤ＤＮＡ（レーン１１）中にも、該産物は検出されなかった。
【０２４６】
配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６およびそれらの断片または相補体よりなる群から選ばれる配列を含む産物の検出はＢＳ１０６　ｍＲＮＡの存在を示し、乳癌などの乳房組織の疾患または状態の診断を示唆する。
【０２４７】
実施例９：ＯＨ−ＰＣＲ
Ａ．プローブの選択および標識
オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションＰＣＲにより前記標的配列を検出するために、標的特異的プライマー（配列番号１５および配列番号１６）およびプローブ（配列番号１７）を設計した。１９９２年６月２５日付け公開の国際公開ＷＯ　９２／１０５０５および１９９２年７月９日付け公開のＷＯ　９２／１１３８８は、それぞれそれらの５’末端および３’端でオリゴヌクレオチドを標識するための方法を開示している。標識−ホスホルアミジット試薬を調製し、それを使用して、該標識を該オリゴヌクレオチドに、その合成中に付加した［Ｎ．Ｔ．Ｔｈｕｏｎｇら，Ｔｅｔ．Ｌｅｔｔｅｒｓ　２９（４６）：５９０５−５９０８（１９８８）；Ｊ．Ｓ．Ｃｏｈｅｎら，公開されている米国特許出願第０７／２４６，６８８号（ＮＴＩＳ　ＯＲＤＥＲ　Ｎｏ．ＰＡＴ−ＡＰＰＬ−７−２４６，６８８）（１９８９）を参照されたい］。プローブを、その３’末端で標識して、ＰＣＲへの関与および望ましくない伸長産物の形成を妨げた。一工程ＯＨ−ＰＣＲでは、該プローブは、該プライマーのＴＭより少なくとも１５℃低いＴＭを有していた。当技術分野でよく知られた標準的なホスホルアミジット化学および／または合成後標識法を用いて、該プライマーおよびプローブを、検出可能な標識を有する又は有さない特異的結合メンバーとして使用する。
【０２４８】
Ｂ．一工程オリゴハイブリダイゼーションＰＣＲ
該ｃＤＮＡは、４２℃で３０分間、ついで９９℃で５分間および４℃で５分間、５０ｍＭ　ＫＣｌ、１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、５ｍＭ　ＭｇＣｌ２、１ｍＭ　ｄＧＴＰ、１ｍＭ　ｄＡＴＰ、１ｍＭ　ｄＣＴＰ、１ｍＭ　ｄＴＴＰ、１．０Ｕ　ＲＮアーゼ阻害剤、２．５μＭ　Ｏｌｉｇｏ　ｄ（Ｔ）１６のバッファー中で２．５Ｕ　ＭＭＬＶ　Ｒｅｖｅｒｓｅ　Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅを使用して全ＲＮＡ（実施例３を参照されたい）から調製した。ついで、調製したｃＤＮＡを、１９０μｌの５０ｍＭ　Ｎ，Ｎ−ビス［２−ヒドロキシエチル］グリシン（ｐＨ８．１５）、８１．７ｍＭ　ＫＯＡｃ、３３．３３ｍＭ　ＫＯＨ、０．０１ｍｇ／ｍｌ　ウシ血清アルブミン、０．１ｍＭ　エチレンジアミン四酢酸、０．０２ｍｇ／ｍｌ　ＮａＮ３、８％　ｗ／ｖ　グリセロール、１５０μＭの各ｄＮＴＰ、０．３３５μＭ　フォワードプライマー（配列番号１５）、０．５８６μＭ　リバースプライマー（配列番号１６）、２０．０ｎＭ　プローブ（配列番号１７）、５Ｕ　ｒＴｔｈポリメラーゼおよび３．２５ｍＭ　ＭｎＣｌ２を含有するＯＨ−ＰＣＲ反応に加えた。ｒＴｔｈポリメラーゼ酵素は、ＭｎＣｌ２の存在下では不安定であるため、該ＭｎＣｌ２は、標的の添加の直前に加えた。あるいは、標的として、ｃＤＮＡの代わりに全ＲＮＡ（実施例３を参照されたい）を使用することが可能である。該反応を、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ　Ｔｈｅｒｍａｌ　Ｃｙｃｌｅｒ　４８０中でインキュベートした。当業者であれば、ｃＤＮＡ合成および熱的（サーマル）サイクリングのための最適条件を容易に決定することが可能である。有用だと考えられうる条件は、ＲＮＡから開始した場合のｃＤＮＡ合成（６０℃、３０分間）、および３７サイクルの増幅（９４℃で４０秒間、６２℃で８０秒間）を含んでいた。増幅（９７℃で５分間、１２℃で５分間、１２℃での浸漬）の後、オリゴハイブリダイゼーションを行った。正しい反応産物は、内部でハイブリダイズしたプローブおよび該ＰＣＲ産物の鎖の少なくとも１つを含有していた。
【０２４９】
Ｃ．ＯＨ−ＰＣＲ産物の分析
増幅反応産物を、ＬＣｘ（登録商標）Ａｎａｌｙｚｅｒ系（Ａｂｂｏｔｔ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ａｂｂｏｔｔ　Ｐａｒｋ，ＩＬから入手可能）上で検出した。簡単に説明すると、抗体で標識された微粒子により、該ハイブリダイゼーションプローブ上の捕捉可能部位で、該特異的反応産物を捕捉し、該ＰＣＲ産物への検出可能な抗体共役体の結合により該複合体を検出した。該内部プローブにハイブリダイズしたＰＣＲ鎖を含有する複合体だけが、検出可能であった。図６は、ＭＤＡ　３６１細胞系からの１８ピコグラムのＲＮＡで、ＢＳ１０６アンプリコンが容易に検出されたことを示している。ＭＤＡ−３６１細胞系（＃ＨＴＢ２７）は転移性ヒト乳腺癌（Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．，１０８０１　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｂｌｖｄ．，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）に由来するものであった。陰性対照としてポリＡ　ＲＮＡを使用し、それは４００ナノグラムでも検出不可能であった。
【０２５０】
ＬＣｘ（登録商標）系を使用して、種々の組織からの１０ピコグラムのＲＮＡをＢＳ１０６活性に関してアッセイした。図７は、ＢＳ１０６マーカーに関する全組織分布を示している。全５個の正常乳房（柱状グラフ１〜５）および６個中３個の乳癌組織ＲＮＡ（柱状グラフ６、９および１１）はＢＳ１０６　ＬＣｘ（登録商標）アッセイにおいて反応性であったが、肺癌、正常結腸および結腸癌組織ＲＮＡ（柱状グラフ１３〜１５）は無反応性であった。正常肺組織ＲＮＡ（柱状グラフ１２）は僅かに反応性であった。
【０２５１】
この複合体の検出はＢＳ１０６　ｍＲＮＡの存在を示し、乳癌などの乳房の疾患または状態の診断を示唆する。
【０２５２】
増幅された又は増幅されていないＢＳ１０６由来核酸配列の存在を検出するために当業者により使用および／または修飾されうる多数の他の検出様式が存在し、それらには、リガーゼチェイン反応（ＬＣＲ，Ａｂｂｏｔｔ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ａｂｂｏｔｔ　Ｐａｒｋ，ＩＬ）；Ｑβレプリカーゼ（Ｇｅｎｅ−Ｔｒａｋ（商標），Ｎａｐｅｒｖｉｌｌｅ，Ｉｌｌｉｎｏｉｓ）、ブランチトチェイン（ｂｒａｎｃｈｅｄ　ｃｈａｉｎ）反応（Ｃｈｉｒｏｎ，Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ，ＣＡ）および鎖置換（ｓｔｒａｎｄ　ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ）アッセイ（Ｂｅｃｔｏｎ　Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｔｒｉａｎｇｌｅ　Ｐａｒｋ，ＮＣ）が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【０２５３】
実施例１０：合成ペプチドの製造
それぞれ配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０で表される合成ペプチドを、ＢＳ１０６ポリペプチドコンセンサス配列（実施例１を参照されたい）の推定アミノ酸配列に基づきモデリングし、ついで製造した。特に、配列番号２１〜３３のペプチドを含む、配列番号２０に由来するいくつかのＢＳ１０６ペプチドを製造した。すべてのペプチドは、ＦＭＯＣ化学、標準的なサイクルおよびｉｎ　ｓｉｔｕ　ＨＢＴＵ活性化を用いてＳｙｍｐｈｏｎｙ　Ｐｅｐｔｉｄｅ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ（Ｒａｉｎｉｎ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ　Ｃｏ，Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ　Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａから入手可能）上で合成した。切断および脱保護の条件は以下のとおりであった：２．５ｍｌの容量の切断試薬（７７．５％　ｖ／ｖ　トリフルオロ酢酸、１５％　ｖ／ｖ　エタンジチオール、２．５％　ｖ／ｖ　水、５％　ｖ／ｖ　チオアニソール、１〜２％　ｗ／ｖ　フェノール）を該樹脂に加え、室温で２〜４時間攪拌した。ついで該濾液を取り出し、該ペプチドを冷ジエチルエーテルで該切断試薬から沈殿させた。ついで各ペプチドを濾過し、水／アセトニトリル／０．１％　ＴＦＡ勾配を用いる逆相分取ＨＰＬＣで精製し、凍結乾燥した。該産物を質量分析により確認した（データは示していない）。
【０２５４】
ついで該精製ペプチドをアジュバントと混合し、ウサギに注射した（実施例１４を参照されたい）。別法として、該精製ペプチドを、グルタルアルデヒドでキーホールリンペットヘモシアニンに共役させ、アジュバントと混合し、ウサギに注射することが可能である（実施例１４を参照されたい）。
【０２５５】
実施例１１ａ：プラスミド５７７を使用する、細胞系内でのタンパク質の発現　Ａ．ＢＳ１０６発現プラスミドの構築
参照により本明細書に組み入れる１９９５年６月７日付け出願の米国特許出願第０８／４７８，０７３号に記載のプラスミド５７７は、永久細胞系内での分泌抗原の発現用に構築されている。このプラスミドは、以下のＤＮＡセグメントを含有する：（ａ）細菌性β−ラクタマーゼとＤＮＡ複製起点とを含有するｐＢＲ３２２の２．３ｋｂの断片、（ｂ）ＨＳＶ−１チミジンキナーゼプロモーターおよびポリＡ付加シグナルの制御下でネオマイシン耐性遺伝子の発現を指令する１．８Ｋｂのカセット、（ｃ）シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）プロモーターおよびポリＡ付加シグナルの制御下でのジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子の発現を指令する１．９Ｋｂのカセット、（ｄ）シミアンウイルス４０　Ｔ−Ａｇプロモーターおよび転写エンハンサー、Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原（ＨＢｓＡｇ）エンハンサーＩおよびそれに続くポリＡ付加シグナルを与える単純ヘルペスウイルス１（ＨＳＶ−１）ゲノムの断片の制御下で、修飾Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）Ｅ２タンパク質に融合したウサギ免疫グロブリン重鎖シグナル配列の発現を指令する３．５Ｋｂのカセット、および（ｅ）このプラスミド内で機能しないＳＶ４０ゲノム後期領域の、残りの０．７Ｋｂ断片。該ベクターの全セグメントを、分子生物学の当業者に公知の標準的な方法で合体させた。
【０２５６】
選択可能なＢＳ１０６タンパク質の発現のためのプラスミドは、プラスミド５７７中のＣ型肝炎ウイルスＥ２タンパク質コード配列を、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６およびそれらの断片または相補体よりなる群から選ばれるＢＳ１０６ポリヌクレオチド配列で以下のとおりに置換することにより構築する。ＸｂａＩでのプラスミド５７７の消化は、Ｃ型肝炎ウイルスＥ２遺伝子断片を遊離する。得られたプラスミドバックボーンは、発現されたタンパク質を該細胞の分泌経路に導くウサギ免疫グロブリン重鎖シグナル配列の下流のＢＳ１０６　ｃＤＮＡ挿入断片の挿入を可能にする。該ＢＳ１０６　ｃＤＮＡ断片は、標準的な方法を用いるＰＣＲにより得る。該センスＰＣＲプライマー配列内にコードされているのは、ＸｂａＩ部位であり、その直後には、シグナルプロテアーゼのプロセシング、効率的な分泌および培養流体内の最終産物の安定性を向上させるアミノ酸配列Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ（「ＳＮＥＬ」）をコードする１２ヌクレオチドの配列が続く。該プライマーは、この１２ヌクレオチドの配列の直後に、ＢＳ１０６遺伝子のアミノ酸をコードする鋳型配列に相補的なヌクレオチドを含有する。該アンチセンスプライマーは、以下の８アミノ酸をコードする配列を、終結コドンの直前に取込む：Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ（配列番号３４）。この配列内に、ＢＳ１０６タンパク質産物の分析および精製を容易にするための認識部位が取込まれる。抗ＦＬＡＧ　Ｍ２（Ｅａｓｔｍａｎ　Ｋｏｄａｋ，Ｃｏ．，Ｎｅｗ　Ｈａｖｅｎ，ＣＴ）と称される商業的に入手可能なモノクローナル抗体に認識される認識部位（「ＦＬＡＧ」と称される）ならびに他の比較しうる配列およびそれらの対応抗体を使用することが可能である。例えば、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ−Ｃｅｔｕｓから入手されるＧｅｎｅＡｍｐ（登録商標）試薬を該供給業者の指示に従い使用して、ＰＣＲを行なう。ＰＣＲプライマーは、０．５μＭの最終濃度で使用する。ＰＣＲは、ＢＳ１０６プラスミド鋳型上、１００μｌの反応液中、３５サイクル（９４℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、７２℃で９０秒間）、ついで７２℃で１０分間の伸長サイクルで行なう。
【０２５７】
Ｂ．ジヒドロ葉酸レダクターゼ欠損チャイニーズハムスター卵巣細胞へのトランスフェクション
前記プラスミドをＣＨＯ／ｄｈｆｒ細胞［ＤＸＢ−１１１，Ｕｒｉａｃｉｏら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　７７：４４５１−４４６６（１９８０）］中にトランスフェクトする。これらの細胞は、Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．，１０８０１　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｂｌｖｄ．，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡから受託番号ＣＲＬ９０９６で入手可能である。トランスフェクションは、Ｐ．Ｌ．Ｆｅｌｇｎｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８４：７４１３−７４１４（１９８７）に記載のカチオニックリポソーム媒介法を用いて行なう。特に、ＣＨＯ／ｄｈｆｒ細胞を、１０％　ウシ胎仔血清、Ｌ−グルタミン（１ｍＭ）で補足されたＨａｍ　Ｆ−１２培地内で培養し、フラスコ内に５〜８×１０５細胞／フラスコの密度で新たに播く。トランスフェクションのために、６０〜８０％のコンフルエンシーになるまで該細胞を増殖させる。２０マイクログラム（２０μｇ）のプラスミドＤＮＡを１．５ｍｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭ　Ｉ培地に加え、１００μｌのＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎ　Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ；Ｇｒａｎｄ　Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）を、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ　Ｉ培地のもう１つの１．５ｍｌ部分に加える。それらの２つの溶液を混合し、室温で２０分間インキュベートする。該培地を該細胞から除いた後、該細胞を５ｍｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭ　Ｉ培地で３回リンスする。ついで該Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ　Ｉ−　Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ−プラスミドＤＮＡ溶液を該細胞上に重層する。該細胞を３７℃で３時間インキュベートし、ついで該Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ　Ｉ−Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ−ＤＮＡ溶液を、選択前に更に２４時間、培地と交換する。
【０２５８】
Ｃ．選択および増幅
トランスフェクションの１日後に、細胞を１：３継代し、ｄｈｆｒ／Ｇ４１８選択培地（以下、「Ｆ−１２マイナス培地Ｇ」と称する）と共にインキュベートする。選択培地は、Ｌ−グルタミンを含有しヒポキサンチン、チミジンおよびグリシンを含有しないＨａｍ　Ｆ−１２（ＪＲＨ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｌｅｎｅｘａ，Ｋａｎｓａｓ）ならびに３００μｇ／ｍｌのＧ４１８（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ；Ｇｒａｎｄ　Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）である。培地の容量対表面積比を、５ｍｌ／２５ｃｍ２に維持する。約２週間後、Ｆ−１２マイナス培地Ｇ内での継代および連続的維持が可能となるようにＤＨＦＲ／Ｇ４１８細胞を増殖させる。
【０２５９】
トランスフェクトしたＢＳ１０６　ｃＤＮＡ配列のそれぞれの増幅は、メトトレキセートによるＤＨＦＲ＋、Ｇ４１８＋細胞の逐次的選択により行なう（Ｒ．Ｓｃｈｉｍｋｅ，Ｃｅｌｌ　３７：７０５−７１３［１９８４］に概説されている）。耐性コロニーが出現するまで、１５０ｎＭ　メトトレキセート（ＭＴＸ）（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を含有するＦ−１２マイナス培地Ｇと共に細胞を約２週間インキュベートする。さらに、遺伝子増幅を、５μＭ　ＭＴＸによる１５０ｎＭ　適合細胞の選択により行なう。
【０２６０】
Ｄ．抗原の産生
５μＭ　ＭＴＸで補足されたＦ−１２マイナス培地Ｇを、ちょうどコンフルエントとなった単層上に５％　ＣＯ２中３７℃で１２〜２４時間重層する。該増殖培地を除き、該細胞をダルベッコ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ）リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）（カルシウムおよびマグネシウムを含有）（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ：Ｇｌａｎｄ　Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）で３回リンスして、存在しうる残りの培地／血清を除く。ついで細胞を、ＶＡＳ特注（ｃｕｓｔｏｍ）培地（ＨＥＰＥＳと共にＬ−グルタミンを含有しフェノールレッドを含有しないＶＡＳ特注製剤、ＪＲＨ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ；Ｌｅｎｅｘａ　ＫＳから入手可能、製品番号５２−０８６７８Ｐ）と共に、５％　ＣＯ２中３７℃で１時間インキュベートする。ついで細胞を、５ｍｌ／Ｔフラスコでの製造のためにＶＡＳで覆う。７日間のインキュベーションの後、培地を除去し、維持し、ついで収穫物２、３および４と共に精製するまで凍結する。３回の７日間の収穫のために、該単層をＶＡＳで覆う。
【０２６１】
Ｅ．乳房組織遺伝子ＢＳ１０６抗原の発現の分析
ＢＳ１０６タンパク質構築物を発現する細胞からのＶＡＳ上清のアリコートを、標準的な方法および当技術分野で公知の試薬（Ｌａｅｍｍｌｉ不連続ゲル）を用いるＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により、または質量分析により分析する。
【０２６２】
Ｆ．精製
ヒドラジン結合でアガロースに共有結合している抗ＦＬＡＧ　Ｍ２モノクローナル抗体を含むアフィニティーマトリックス（Ｅａｓｔｍａｎ　Ｋｏｄａｋ　Ｃｏ．，Ｎｅｗ　Ｈａｖｅｎ，ＣＴ）を使用するイムノアフィニティークロマトグラフィーにより、ＦＬＡＧ配列を含有するＢＳ１０６タンパク質の精製を行なう。アフィニティー精製の前に、ローラーボトルからのプール化ＶＡＳ培地収穫物中のタンパク質を、Ｓｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ−２５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ　Ｉｎｃ．，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）カラムを使用して５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ　ＮａＣｌバッファー中に交換する。このバッファー中のタンパク質を、抗ＦＬＡＧ　Ｍ２抗体アフィニティーカラムに適用する。該カラムを５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ　ＮａＣｌバッファーで洗浄することにより、未結合タンパク質を溶出する。５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ　ＮａＣｌ中の過剰のＦＬＡＧペプチドを使用して、結合タンパク質を溶出する。その過剰のＦＬＡＧペプチドは、ゲル電気泳動またはＨＰＬＣにより該精製ＢＳ１０６タンパク質から除去することができる。
【０２６３】
この実施例ではプラスミド５７７を使用しているが、比較しうる他の発現系（例えば、ＣＭＶ）を、試薬および／または技術に適当な改変を加えて本発明で使用しうることが当業者に公知であり、当業者の技量の範囲内に含まれる。
【０２６４】
ついで、ＢＳ１０６遺伝子のコード領域を含有する最大のクローン化インサートを、（ｉ）例えばサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターおよび／またはタンパク質融合可能配列（タンパク質の発現および検出を助けるもの）を含有しうる真核発現ベクター、または（ｉｉ）スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）およびＣＭＰ−ＫＤＯシンターゼ（ＣＫＳ）または他のタンパク質融合遺伝子（該タンパク質配列の発現のためのもの）を含有する細菌性発現ベクター中にサブクローニングする。ＳＯＤの融合配列を含有するポリペプチドの製造に有用な方法およびベクターは、参照により本明細書に組み入れる１９８６年１０月１日付け公開のＥＰＯ　０１９６０５６に記載されており、ＣＫＳの融合配列を含有するものは、１９８９年９月１３日付け公開のＥＰＯ公開第０３３１９６１号（この公開物も参照により本明細書に組み入れることとする）に記載されている。この精製タンパク質は、動物の免疫研究、固相イムノアッセイなどを含む（これらに限定されるものではない）種々の技術において使用することができる。
【０２６５】
実施例１１ｂ：ｐｃＤＮＡ３．１／Ｍｙｃ−Ｈｉｓを使用する、細胞系内でのタンパク質の発現
Ａ．ＢＳ１０６発現プラスミドの構築
プラスミドｐｃＤＮＡ３．１／Ｍｙｃ−Ｈｉｓ（Ｃａｔ．＃　Ｖ８５５−２０，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ．ＣＡ）は、過去に、ほとんどの哺乳動物細胞系による分泌抗原の発現用に構築されている。発現されるタンパク質インサートは、ｍｙｃ−ｈｉｓペプチドタグと融合している。該ｍｙｃ−ｈｉｓタグ（配列番号３５）は、抗ｍｙｃもしくは抗ｈｉｓアフィニティーカラムまたは金属タンパク質結合カラムを使用する発現融合タンパク質の精製に有用なｃ−ｍｙｃ腫瘍タンパク質エピトープおよびポリヒスチジン配列を含む。
【０２６６】
分泌可能なＢＳ１０６タンパク質の発現用のプラスミドは、クローン１６６２８８５由来のＢＳ１０６ポリヌクレオチド配列（配列番号５）をｐｃＤＮＡ３．１／Ｍｙｃ−Ｈｉｓベクター中に挿入することにより構築した。該ＢＳ１０６発現プラスミドを構築する前に、まず該ＢＳ１０６　ｃＤＮＡ配列をｐＣＲ（登録商標）−Ｂｌｕｎｔベクター中にクローニングした。該ＢＳ１０６　ｃＤＮＡ断片は、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅから入手されるＳｔｒａｔａｇｅｎｅ（登録商標）試薬を該供給業者の指示に従い使用して行なうＰＣＲにより作製させた。ＰＣＲプライマーは、０．５μＭの最終濃度で使用する。５Ｕのｐｆｕポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ　Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を使用するＰＣＲを、ＢＳ１０６プラスミド鋳型（実施例２）上、５０μｌの反応液中、３０サイクル（９４℃で１分間、６５℃で１．５分間、７２℃で３分間）およびそれに続く７２℃で８分間の伸長サイクルで行なった。該センスＰＣＲプライマー配列（配列番号１８）は、該ＢＳ１０６遺伝子挿入断片の直ぐ上流のｐＩＮＣＹベクターと同一のヌクレオチドを含む。該アンチセンスプライマー（配列番号１９）は、５’ＮｏｔＩ制限配列と、最も３’側のインフレーム終結コドンの直ぐ上流のＢＳ１０６　ｃＤＮＡ挿入断片の３’末端に相補的な配列とを取込む。得られた平滑末端化ＰＣＲ産物の５マイクロリットル（５μｌ）を、２５ｎｇの線状化ｐＣＲ（登録商標）−Ｂｌｕｎｔベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）中に連結して、該ベクターの致死ｃｃｄＢ遺伝子を遮断した。Ｏｎｅ　Ｓｈｏｔ（商標）形質転換キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を該供給業者の指示に従い使用して、得られた連結ベクターをＴＯＰ１０大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）中に形質転換した。該形質転換細胞を、ＬＢ−Ｋａｎ（５０μｇ／ｍｌ　カナマイシン）選択プレート上、３７℃で増殖させた。遮断されたｃｃｄＢ遺伝子を有するプラスミドを含有する細胞だけが、形質転換後に増殖した（Ｇｒａｎｔ，Ｓ．Ｇ．Ｎ．，ＰＮＡＳ　８７：４６４５−４６４９　（１９９０））。形質転換されたコロニーを拾い、３ｍｌのＬＢ−Ｋａｎブロス中、３７℃で増殖させた。ＱＩＡｐｒｅｐ（登録商標）（Ｑｉａｇｅｎ　Ｉｎｃ．，Ｓａｎｔａ　Ｃｌａｒｉｔａ，ＣＡ）方法を該製造業者の指示に従い使用して、プラスミドＤＮＡを単離した。該ＤＮＡをＥｃｏＲＩおよびＮｏｔＩ制限酵素で消化して、ＢＳ１０６挿入断片を遊離させた。該断片を１％　Ｓｅａｋｅｍ（登録商標）ＬＥアガロース（ＦＭＣ，Ｒｏｃｋｌａｎｄ，ＭＥ）／０．５μｇ／ｍｌ　臭化エチジウム／ＴＥゲル上で電気泳動し、ＵＶ照明により可視化し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ（商標）（Ｑｉａｇｅｎ　Ｉｎｃ，Ｓａｎｔａ　Ｃｌａｒｉｔａ，ＣＡ）法を該供給業者の指示に従い使用して切り出し精製した。
【０２６７】
ｐｃＤＮＡ３．１／Ｍｙｃ−ＨｉｓプラスミドＤＮＡを、該プラスミドＤＮＡのポリリンカー領域中に存在するＥｃｏＲＩおよびＮｏｔＩ部位での消化により線状化した。前記のＢＳ１０６精製断片を、ＣＭＶプロモーターの下流の、得られたプラスミドＤＮＡにライゲーションし、ＤＨ５アルファ（商標）細胞（ＧｉｂｃｏＢＲＬ　Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）中に該供給業者の指示に従い形質転換した。簡単に説明すると、ＢＳ１０６インサートを含有する１０ｎｇのｐｃＤＮＡ３．１／Ｍｙｃ−Ｈｉｓを、５０μｌのコンピテントＤＨ５アルファ細胞に加え、該含有物を穏やかに混合した。該混合物を氷上で３０分間インキュベートし、３７℃で２０秒間加熱し、氷上に更に２分間放置した。０．９５ｍｌのＬＢ培地を加えたら、２２５ｒｐｍで振とうしながら該混合物を３７℃で１時間インキュベートした。ついで該形質転換細胞を１００ｍｍ　ＬＢ／Ａｍｐ（５０μｇ／ｍｌ　アンピシリン）プレート上にプレーティングし、３７℃で増殖させた。コロニーを拾い、３ｍｌのＬＢ／アンピシリンブロス中で増殖させた。ＱＩＡｐｒｅｐキットを使用して、プラスミドＤＮＡを精製した。該インサートの存在を、制限酵素消化およびゲル分析（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋら，前掲）により確認した。
【０２６８】
Ｂ．ヒト胎児腎２９３細胞のトランスフェクション
前記Ａ節に記載のＢＳ１０６発現プラスミドを、ＤＨ５アルファ細胞中に再形質転換し、ＬＢ／アンピシリン寒天上にプレーティングし、１０ｍｌのＬＢ／アンピシリンブロス中で増殖させた（前記のとおり）。該プラスミドを、ＱＩＡｆｉｌｔｅｒ（商標）Ｍａｘｉキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ，ＣＡ）を使用して精製し、ＨＥＫ２９３細胞（Ｆ．Ｌ．Ｇｒａｈａｍら，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒ．３６：５９−７２（１９７７））中にトランスフェクトした。これらの細胞は、Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．，１０８０１　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｂｌｖｄ．，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡから受託番号ＣＲＬ　１５７３として入手可能である。Ｐ．Ｈａｗｌｅｙ−Ｎｅｌｓｏｎら，Ｆｏｃｕｓ　１５：７３（１９９３）に記載のカチオニックリポフェクタミン媒介法を用いて、トランスフェクションを行なった。特に、ＨＥＫ２９３細胞を、１０％　ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、Ｌ−グルタミン（２ｍＭ）で補足された１０ｍｌ　ＤＭＥＭ培地内で培養し、１２×１００ｍｍ　培養プレート内に８×１０６細胞／プレートの密度で新たに播いた。トランスフェクションのために、７０〜８０％のコンフルエンシーになるまで該細胞を３７℃で増殖させた。８マイクログラム（８μｇ）のプラスミドＤＮＡを８００μｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭ　Ｉ（登録商標）培地（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ，Ｇｒａｎｄ　Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）に加え、４８〜９６μｌのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ；Ｇｒａｎｄ　Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）を、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ　Ｉ培地のもう１つの８００μｌ部分に加えた。それらの２つの溶液を混合し、室温で１５〜３０分間インキュベートした。該培地を該細胞から除いた後、該細胞を１０ｍｌの無血清ＤＭＥＭ培地で１回洗浄した。ついで該Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ　Ｉ−Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ−プラスミドＤＮＡ溶液を、６．４ｍｌの無血清ＤＭＥＭ中に希釈し、該細胞上に重層した。該細胞を３７℃で５時間インキュベートし、ついで２０％ＦＢＳを含有する追加的な８ｍｌのＤＭＥＭを加えた。１８〜２４時間後、その古い培地を吸引し、該細胞に、５％　ＦＢＳを含有する５ｍｌの新鮮なＤＭＥＭを重層した。トランスフェクションの７２時間後に、上清および細胞抽出物を、ＢＳ１０６遺伝子活性に関して分析した。
【０２６９】
Ｃ．安定細胞系ＨＥＫ２９３−１０６Ｃ１の産生
前記Ａ節に記載のＢＳ１０６発現プラスミドを、ＤＨ５アルファ細胞中に再形質転換し、ＬＢ／アンピシリン寒天上にプレーティングし、１０ｍｌのＬＢ／アンピシリンブロス中で増殖させた。該プラスミドを、ＱＩＡｆｉｌｔｅｒ（商標）Ｍａｘｉ　Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ，ＣＡ）を使用して精製し、ＨＥＫ２９３細胞［Ｆ．Ｌ．Ｇｒａｈａｍら，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒ．３６：５９−７２（１９７７）］中にトランスフェクトした。
【０２７０】
前記の精製発現プラスミドを、ＨＥＫ２９３細胞［Ｆ．Ｌ．Ｇｒａｈａｍら，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒ．３６：５９−７２（１９７７）］中にトランスフェクトした。これらの細胞は、Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．，１０８０１　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｂｌｖｄ．，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡから受託番号ＣＲＬ　１５７３として入手可能である。該発現プラスミドのトランスフェクションは、Ｐ．Ｈａｗｌｅｙ−Ｎｅｌｓｏｎら，Ｆｏｃｕｓ　１５：７３（１９９３）に記載のカチオニックリポフェクタミン媒介法を用いて行なった。特に、ＨＥＫ２９３細胞を、１０％　ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、Ｌ−グルタミン（２ｍＭ）、ピルビン酸ナトリウム（１ｍＭ）および必須アミノ酸で補足された１０ｍｌ　ＤＭＥＭ培地内で培養し、６０ｍｍ培養プレート内に９×１０６細胞／プレートの密度で新たに播いた。トランスフェクションのために、７０〜８０％のコンフルエンシーになるまで該細胞を３７℃で増殖させた。２マイクログラム（２μｇ）のプラスミドＤＮＡを８００μｌの未補足ＤＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ，Ｇｒａｎｄ　Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）に加えた。８マイクロリットル（８μｌ）のＰｌｕｓ　Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ，Ｇｒａｎｄ　Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）をこの溶液に加え、ついでそれを手短に混合した。１２マイクロリットル（１２μｌ）のＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（ＬＴＩ）を、未補足ＤＭＥＭ培地のもう１つの８００μｌ部分に加えた。１５分間のインキュベーションの後、それらの２つの溶液を混合し、室温で更に１５〜３０分間インキュベートした。この時間の途中に、該ＨＥＫ２９３細胞を含有するプレートから該培地を除去した。ついで、該Ｐｌｕｓ試薬：Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ：プラスミドＤＮＡ複合体を含有するＤＭＥＭを該細胞上に重層した。該細胞を３７℃、５％　ＣＯ２中で５時間インキュベートし、ついで、２０％　ＦＢＳを含有する更に２〜８ｍｌのＤＭＥＭを加えた。１８〜２４時間後、その古い培地を吸引し、該細胞に、４００μｇ／ｍｌ　Ｇ４１８および５％　ＦＢＳを含有する５ｍｌの新鮮なＤＭＥＭを重層し、７２時間が経過するまで該インキュベーションを継続した。上清を、ウエスタンブロット分析によりＢＳ１０６　Ｍ／Ｈ（Ｍｙｃ／Ｈｉｓ）ポリペプチド発現に関して分析した。
【０２７１】
トランスフェクションの７２時間後、該細胞を、限定（ｌｉｍｉｔｅｄ）トリプシン処理により該皿から遊離させ、１００ｍｍ　培養皿内のＤＭＥＭ、１０％　ＦＢＳならびに１：１００、１：１０００および１：１００００の希釈度の４００μｇ／ｍｌ　Ｇ４１８中に再び播いた。十分に分離した細胞フォーカスが顕微鏡検査により同定されるまで、これらの培養を５〜７日間増殖させた。これらのフォーカスを、クローニングシリンダーにより単離し、それらの細胞を限定トリプシン処理により遊離させ、個々のフォーカスを２４ウェル皿中の別々のウェル内の同様にＤＭＥＭ、１０％　ＦＢＳ、４００μｇ／ｍｌ　Ｇ４１８中に移した。７〜１０日間の増殖後、各ウェルの上清を、後記のとおりに、ウエスタンブロット分析によりＢＳ１０６　Ｍ／Ｈ発現に関して分析した。１０６Ｃ１と称される該クローン系は該上清中でＢＳ１０６　Ｍ／Ｈを発現することが判明した。この系を７５ｃｍ２　フラスコ中で増殖させ、ついで、該挿入事象の安定性を保証するために、ＢＳ１０６　Ｍ／Ｈの発現の後、１：３０で３回継代した。この方法の最終産物は、ＢＳ１０６　Ｍ／Ｈを発現するＨＥＫ２９３細胞系由来の細胞系であり、本発明者らはこれを１０６Ｃ１（ＨＥＫ２９３−１０６Ｃ１）と命名した。
【０２７２】
Ｄ．乳房組織遺伝子ＢＳ１０６抗原の発現の分析
該培養上清（実施例１１ｂ、Ｂ小節）を、低温チューブ（ｃｒｙｏｔｕｂｅ）に移し、氷上で保存した。ＨＥＫ２９３細胞を、１０ｍｌの冷ダルベッコ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ）ＰＢＳで２回洗浄し１．５ｍｌのＣＡＴ細胞溶解バッファー（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｎ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）を加えて細胞溶解することにより収穫し、ついで室温で３０分間インキュベートした。ライセートを１．７ｍｌ　ポリプロピレンミクロ遠心管に移し、１０００×ｇで１０分間遠心した。該上清を新たな低温チューブに移し、氷上で保存した。該細胞からの上清のアリコートと、該ＢＳ１０６タンパク質構築物を発現する細胞のライセートとを、ＢＳ１０６組換えタンパク質の存在に関して分析した。当技術分野で公知の標準的な方法および試薬を用いるＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）上で、該アリコートを泳動させた（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋら，前掲を参照されたい）。ついでこれらのゲルをニトロセルロース上にブロッティングし、該ＢＳ１０６タンパク質バンドを、抗ｍｙｃエピトープモノクローナル抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ　Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を使用するウエスタンブロット法により可視化した。図８は、得られたウエスタンブロットを示す。レーン１はビオチン化分子量マーカーを含有する。レーン２は着色分子量マーカーを含有する。レーン３は、一過性にトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞の細胞ライセートを含有する。レーン４は、一過性にトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞からの上清を含有する。レーン５は陰性対照（一過性にトランスフェクトされていないＨＥＫ２９３細胞）の細胞ライセートを含有する。レーン６は陰性対照（一過性にトランスフェクトされていないＨＥＫ２９３細胞）の上清を含有する。レーン４は、ＢＳ１０６　Ｍ／Ｈを約４０ｋＤの広い（ブロードな）バンドとして示す。レーン３は、ＢＳ１０６　Ｍ／Ｈを約１７ｋＤの鋭い（シャープな）バンドとして示す。それらの２つのサンプル間の分子量の相違はグリコシル化に起因する。特に、レーン３内のＢＳ１０６　Ｍ／Ｈは該細胞内に見出され、これは、未だ完全には翻訳後修飾されていない。レーン４のＢＳ１０６　Ｍ／Ｈは、該細胞から分泌されており、より成熟した、より完全に修飾されたタンパク質である。グリコシル化における不均一性は、レーン４で観察されるバンドの広さに寄与する分子間の分子量の相違をもたらす。
【０２７３】
Ｅ．精製
ポリヒスチジン残基に特異的に結合するニッケルが充填されたＣｈｅｌａｔｉｎｇ　Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　Ｆａｓｔ　Ｆｌｏｗ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を使用して、ｍｙｃ−ｈｉｓ配列を含有するＢＳ１０６組換えタンパク質の精製を行なった。小節Ｂで前記したとおりに調製した一過性トランスフェクト化ＨＥＫ２９３細胞からの３５０ミリリットル（３５０ｍｌ）の上清をプールし、４０ｍｌ　ニッケル充填カラムに通過させた。該カラムを１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）／５００ｍＭ　ＮａＣｌバッファーで洗浄することにより、非結合タンパク質を溶出した。ついで、イミダゾール勾配を用いて、結合ＢＳ１０６組換えタンパク質を該カラムから溶出した。該流速は２ｍｌ／分、該勾配はバッファー１ミリリットル当たり３．１ｍＭ　イミダゾールであり、溶出時間は８０分間であり、０〜５００ｍＭ　イミダゾールに及ぶ溶出プロフィールを得た。
【０２７４】
各２ｍｌ画分をサンプリングした。１００マイクロリットルの各画分をドットブロット装置のウェルに適用し、該容量をニトロセルロース片を介して吸わせた。ついで該ニトロセルロースフィルターを、ｍｙｃエピトープを認識するモノクローナル抗体を使用する前記のウエスタンブロットを展開するのと同じ方法で展開した。図９は、展開されたドットブロットを示し、これは、抗ｍｙｃモノクローナル抗体による画分２０〜３１中の物質の免疫認識を示している。これらの画分は、該ニッケルカラムへのヒスチジンタグ化タンパク質の結合およびヒスチジン類似体でのそれらの溶出の成功を示す１２５〜２００ｍＭ　イミダゾールの溶出条件に対応する。画分２０〜３１をプールし、Ｓｌｉｄｅ−ａ−Ｌｙｓｅｒｓ（３５００　ＭＷＣＯ）を使用して、２×４Ｌのリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ，５０ｍＭ　リン酸塩，１５０ｍＭ　塩化ナトリウム，ｐＨ７．４）に対して、それぞれ少なくとも４時間透析した。
【０２７５】
そのプールし透析し半精製した上清を、Ｄ節に記載したとおり、ウエスタンブロットにより、ＢＳ１０６　Ｍ／Ｈ組換えタンパク質の存在に関して分析した。図１０に示すブロットにおいて、レーン１は着色分子量マーカーを含有し、レーン２はクロマトグラフィー前の上清を含有し、レーン３はサンプルのローディング中のフロースルー（ｆｌｏｗ　ｔｈｒｏｕｇｈ）物質を含有し、レーン４はカラム洗浄中に溶出した物質を含有し、レーン５は、そのプールし透析し溶出した物質を含有する。ＢＳ１０６　Ｍ／Ｈは、１０．７ｋＤのペプチドバックボーンの理論分子量より大きな４０ｋＤの見掛け分子量の広いバンドとしてレーン５（および僅かにレーン２）に現れた。該分泌タンパク質産物の追加分子量はグリコシル化に起因する。
【０２７６】
同様にして、１０６Ｃ１細胞の培養からの４００ｍｌの上清を、ニッケルキレート化クロマトグラフィーを用いて精製した。簡単に説明すると、１．６ｃｍ×２０ｃｍ　Ｈｉ−Ｔｒａｐ　Ｃｈｅｌａｔｅカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）に５０ｍｌの塩化ニッケルを充填し、バッファー１５ｍＭ　Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）／４５０ｍＭ　ＮａＣｌで平衡化した。該カラムへの適用の前に、ＮａＣｌ（３００ｍＭ）を該粗上清に加えた。サンプルの適用後、該カラムを、２５ｍＭ　イミダゾールを含有するバッファーで洗浄した。ついで該ｍｙｃ／ｈｉｓタグ化タンパク質を、３００ｍＭ　イミダゾールを含有するバッファーで溶出した。８ミリリットル（８ｍｌ）画分を集めた。これらの画分を、ウエスタンブロットによりｍｙｃエピトープの存在に関して試験し、陽性であると判明した画分をプールした。
【０２７７】
そのプールし精製したＢＳ１０６　Ｍ／Ｈを、抗ｍｙｃモノクローナル抗体（図１１パネルＡ）および抗ＢＳ１０６ポリクローナル抗血清（図１１パネルＢ）の両方を使用するウエスタンブロットにより分析した。パネルＡおよびＢにおいては、レーン１は未反応タンパク質を含有し、レーン２は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）内で発現されたＢＳ１０６を含有し、レーン３はビオチン化分子マーカーを含有し、レーン４は着色分子マーカーを含有し、レーン５は、１０６Ｃ１細胞からのプールし精製したＢＳ１０６　Ｍ／Ｈを含有し、レーン６は着色分子マーカーを含有し、レーン７はビオチン化分子マーカーを含有する。該１０６Ｃ１細胞からのＢＳ１０６　Ｍ／Ｈは、抗ｍｙｃモノクローナル抗体（レーン５、パネルＡ）および抗ＢＳ１０６ポリクローナル抗血清（レーン５、パネルＢ）により認識され、ＨＥＫ２９３細胞の一過性トランスフェクションから得られた物質に合致する４０ｋＤの見掛け分子量を有していた。
【０２７８】
Ｆ．ＢＳ１０６発現タンパク質によるマイクロタイタープレートのコーティング
前記１００ｍｍプレートからの上清を、適当な容量のＰＢＳ中に希釈する。ついで、得られた混合物の１００μｌを、Ｒｅａｃｉ−Ｂｉｎｄ（商標）金属キレートマイクロタイタープレート（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）の各ウェル中に配置し、振とうしながら室温でインキュベートし、ついで０．０５％　Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０を含有するそれぞれ２００μｌのＰＢＳで３回洗浄する。ついで、その調製されたマイクロタイタープレートを使用して、抗ＢＳ１０６抗体の存在に関してポリクローナル抗血清をスクリーニングすることができる（実施例１７を参照されたい）。
【０２７９】
この実施例ではｐｃＤＮＡ３．１／Ｍｙｃ−Ｈｉｓを使用しているが、他の比較しうる発現系を、試薬および／または技術に適当な改変を加えて本発明で使用しうることが当業者に公知であり、当業者の技量の範囲内に含まれる。該ＢＳ１０６遺伝子のコード領域を含有する最大のクローン化インサートを、（ｉ）例えばサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターおよび／またはタンパク質融合可能配列（タンパク質の発現および検出を助けるもの）を含有しうる真核発現ベクター、または（ｉｉ）スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）およびＣＭＰ−ＫＤＯシンターゼ（ＣＫＳ）または他のタンパク質融合遺伝子（該タンパク質配列の発現のためのもの）を含有する細菌性発現ベクター中にサブクローニングする。ＳＯＤの融合配列を含有するポリペプチドの製造に有用な方法およびベクターは、参照により本明細書に組み入れる１９８６年１０月１日付けで公開された欧州特許出願ＥＰ　０　１９６　０５６に記載されており、ＣＫＳの融合配列を含有するベクターは、同様に参照により本明細書に組み入れる１９８９年９月１３日付けで公開された欧州特許出願ＥＰ　０　３３１　９６１号に記載されている。該精製タンパク質は、動物の免疫研究、固相イムノアッセイなどを含む（それらに限定されるものではない）種々の技術において使用することができる。
【０２８０】
実施例１１ｃ：ｐｃＤＮＡ３．１を使用する、細胞系内でのタンパク質の発現
Ａ．ＢＳ１０６発現プラスミドの構築
プラスミドｐｃＤＮＡ３．１（Ｃａｔ．＃　Ｖ７９０−２０，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ．ＣＡ）は、過去に、ほとんどの哺乳動物細胞系による分泌抗原の発現用に使用されている。分泌可能なＢＳ１０６タンパク質の発現用のプラスミドは、クローン１６６２８８５ｉｎｈ由来のＢＳ１０６ポリヌクレオチド配列をｐｃＤＮＡ３．１ベクター中に挿入することにより構築した。該ＢＳ１０６発現プラスミドを構築するために、該ＢＳ１０６　ｃＤＮＡ断片をＥｃｏＲＩおよびＮｏｔＩ制限酵素で切り出した。該断片を１％　Ｓｅａｋｅｍ（登録商標）ＬＥアガロース（ＦＭＣ，Ｒｏｃｋｌａｎｄ，ＭＥ）／０．５μｇ／ｍｌ　臭化エチジウム／ＴＥゲル上で電気泳動し、ＵＶ照明により可視化し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ（商標）（Ｑｉａｇｅｎ　Ｉｎｃ，Ｓａｎｔａ　Ｃｌａｒｉｔａ，ＣＡ）法を該供給業者の指示に従い使用して切り出し精製した。
【０２８１】
ｐｃＤＮＡ３．１プラスミドＤＮＡを、該プラスミドＤＮＡのポリリンカー領域中に存在するＥｃｏＲＩおよびＮｏｔＩ部位での消化により線状化した。該ＢＳ１０６精製断片を、得られたプラスミドＤＮＡにライゲーションし、ＤＨ５アルファ（商標）細胞（ＧｉｂｃｏＢＲＬ　Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）中に該供給業者の指示に従い形質転換した。簡単に説明すると、該ＢＳ１０６インサートを含有する１０ｎｇのｐｃＤＮＡ３．１を、５０μｌのコンピテントＤＨ５アルファ細胞に加え、該含有物を穏やかに混合した。該混合物を氷上で３０分間インキュベートし、３７℃で２０秒間加熱し、氷上に更に２分間放置した。０．９５ｍｌのＬＢ培地を加えたら、２２５ｒｐｍで振とうしながら該混合物を３７℃で１時間インキュベートした。ついで該形質転換細胞を１００ｍｍ　ＬＢ／Ａｍｐ（５０μｇ／ｍｌ　アンピシリン）プレート上にプレーティングし、３７℃で増殖させた。コロニーを拾い、３ｍｌのＬＢ／アンピシリンブロス中で増殖させた。ＱＩＡｐｒｅｐキットを使用して、プラスミドＤＮＡを精製した。該インサートの存在を、制限酵素消化およびゲル分析（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋら，前掲）により確認した。
【０２８２】
Ｂ．ヒト胎児腎２９３細胞のトランスフェクション
前記Ａ節に記載のＢＳ１０６発現プラスミドを、ＤＨ５アルファ細胞中に再形質転換し、ＬＢ／アンピシリン寒天上にプレーティングし、１００ｍｌのＬＢ／アンピシリンブロス中で増殖させた（前記のとおり）。該プラスミドを、ＱＩＡｆｉｌｔｅｒ（商標）Ｍａｘｉ　Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ，ＣＡ）を使用して精製し、ＨＥＫ２９３細胞［Ｆ．Ｌ．Ｇｒａｈａｍら，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒ．３６：５９−７２（１９７７）］中にトランスフェクトした。これらの細胞は、Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．，１０８０１　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｂｌｖｄ．，Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖｉｒｇｉｎｉａ　２０１１０−２２０９から受託番号ＣＲＬ　１５７３として入手可能である。トランスフェクションは、カチオニックリポフェクタミン媒介法を用いて行なった［Ｐ．Ｈａｗｌｅｙ−Ｎｅｌｓｏｎら，Ｆｏｃｕｓ　１５：７３（１９９３）］。特に、ＨＥＫ２９３細胞を、１０％　ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、Ｌ−グルタミン（２ｍＭ）で補足された１０ｍｌ　ＤＭＥＭ培地内で培養し、１００ｍｍ　培養プレート内に、７２時間のインキュベーションには２×１０６細胞／プレートの密度で、あるいは２４時間のインキュベーションには７×１０６細胞／プレートの密度で新たに播いた。トランスフェクションのために、７０〜８０％のコンフルエンシーになるまで該細胞を３７℃で増殖させた。８マイクログラム（８μｇ）のプラスミドＤＮＡを８００μｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭ　Ｉ（登録商標）培地（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ，Ｇｒａｎｄ　Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）に加え、４８μｌのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ；Ｇｒａｎｄ　Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）を、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ　Ｉ培地のもう１つの８００μｌ部分に加えた。それらの２つの溶液を穏やかに混合し、室温で１５〜３０分間インキュベートした。該培地を該細胞から除いた後、該細胞を１０ｍｌの無血清ＤＭＥＭ培地で１回洗浄した。ついで該Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ　Ｉ−Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ−プラスミドＤＮＡ溶液を、６．４ｍｌの無血清ＤＭＥＭで希釈し、ついで該細胞上に重層した。該細胞を３７℃で５時間インキュベートし、ついで２０％　ＦＢＳを含有する追加的な８ｍｌのＤＭＥＭを加えた。１８〜２４時間後、その古い培地を吸引し、該細胞に、５％　ＦＢＳを含有する５ｍｌの新鮮なＤＭＥＭを重層した。トランスフェクションの７２時間後に、上清および細胞抽出物を、ＢＳ１０６遺伝子活性に関して分析した。
【０２８３】
Ｃ．乳房組織遺伝子ＢＳ１０６抗原の発現の分析
前記培養上清を、低温チューブ（ｃｒｙｏｔｕｂｅ）に移し、氷上で保存する。ＨＥＫ２９３細胞を、１０ｍｌの冷ダルベッコ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ）ＰＢＳで２回洗浄することにより収穫し、１．５ｍｌのＣＡＴ細胞溶解バッファー（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｎ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）の添加により細胞溶解し、ついで室温で３０分間インキュベートする。ライセートを１．７ｍｌ　ポリプロピレンミクロ遠心管に移し、１０００×ｇで１０分間遠心する。該上清を新たな低温チューブに移し、氷上で保存する。該細胞からの上清のアリコートと、該ＢＳ１０６タンパク質構築物を発現する細胞のライセートとを、ＢＳ１０６組換えタンパク質の存在に関して分析する。当技術分野で公知の標準的な方法および試薬を用いるＳＤＳポリアクリルアミドゲル（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）上で、該アリコートを電気泳動することができる（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋら，前掲を参照されたい）。ついでこれらのゲルをニトロセルロース、ニトランなどのような固体媒体上にブロッティングし、該ＢＳ１０６タンパク質バンドを、抗ｍｙｃエピトープもしくは抗ヒスチジンモノクローナル抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ　Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）または抗ＢＳ１０６ポリクローナル血清（実施例１４を参照されたい）を使用するウエスタンブロット法により可視化することができる。あるいは、該発現ＢＳ１０６組換えタンパク質はマススペクトロメトリーにより分析することができる（実施例１２を参照されたい）。
【０２８４】
実施例１１ｄ：ｐＧＥＸ４Ｔ／Ｍｙｃ−Ｈｉｓを使用する、細胞系内でのタンパク質の発現
Ａ．ＢＳ１０６発現プラスミドの構築
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）内での融合タンパク質としてのタンパク質ＢＳ１０６の製造に適したプラスミドを作製した。該融合タンパク質の相手（パートナー）はグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼであり、該ベクターは、該融合タンパク質がトロンビンでの限定的タンパク質分解により遊離されうるように設計した。すべてのクローニング修飾は、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋら（前掲）の方法で行った。
【０２８５】
細菌発現ベクターｐＧＥＸ４Ｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）およびｐｃＤＮＡ３．１　ｍｙｃ／ｈｉｓベクターからのＢＳ１０６ポリヌクレオチド配列［クローン１６６２８８５ｉｎｈ（配列番号５）］から、プラスミドｐＧ４−ＢＳ１０６を構築した。ｍｙｃ／ｈｉｓタグを含むＢＳ１０６ポリヌクレオチド配列［クローン１６６２８８５ｉｎｈ（配列番号５）］は、ｐｃＤＮＡ３．１／Ｍｙｃ−Ｈｉｓベクター構築物（実施例１１ｂ、小節Ａ）から得た。ＢａｍＨＩ制限部位をＢＳ１０６　ｐｃＤＮＡ３．１　ｍｙｃ／ｈｉｓベクター構築物内に挿入して、該タンパク質シグナル配列のコード配列と該成熟タンパク質のコード配列とを分離した。ｍｙｃ／ｈｉｓタグを含むＢＳ１０６ポリヌクレオチド配列［クローン１６６２８８５ｉｎｈ（配列番号５）］を、ＢａｍＨＩおよびＰｍｅＩでこの修飾ベクター構築物から切り出した。
【０２８６】
オリゴヌクレオチドプライマーを使用してＰｍｅＩ部位（配列番号３７）を挿入することにより、ｐＧＥＸ４Ｔベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を修飾した。ｍｙｃ／ｈｉｓタグを含むＢＳ１０６ポリヌクレオチド配列［クローン１６６２８８５ｉｎｈ（配列番号５）］を、該修飾ｐＧＥＸ４ＴベクターのＢａｍＨＩ／ＰｍｅＩ部位内にクローニングした。ついで、該遊離融合タンパク質産物に天然アミノ酸配列を回復させるために、配列番号３６のオリゴヌクレオチドを使用して該ＢａｍＨＩ部位を除去した。得られたｐＧ４−ＢＳ１０６ベクターを、ＤＨ５α（商標）細胞（ＧｉｂｃｏＢＲＬ　Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）中に、該供給業者の指示に従い形質転換した。
【０２８７】
Ｂ．ＧＳＴ−ＢＳ１０６　Ｍ／Ｈの発現
ベクターｐＧ４−１０６を含有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ５α細胞を定常増殖期まで増殖させた２００ｍｌのＬＢ培地を、１００μｇ／ｍｌ　アンピシリンを含有する４リットルのＳｕｐｅｒ　Ｂｒｏｔｈ培地（２４ｇ／ｌ　酵母抽出物、１２ｇ／ｌ　トリプトン、５ｇ／ｌ　グリセロール、１００ｍＭ　Ｋホスファート　ｐＨ７．４）に接種した。ついでこの混合物を、通気（１０　ｌｐｍの空気）および攪拌（３００ｒｐｍ）を行いながら３７℃で３時間培養した。ＩＰＴＧを１００μＭまで加え、培養を更に３時間継続した。細胞（〜１００ｇ）を遠心分離（〜５０００×ｇ）により収穫し、リン酸緩衝食塩水中の２５０ｍｌの１％　Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００中、氷上での超音波処理（４５分間）により細胞溶解した。細胞残渣を遠心分離によりペレット化した後、該細胞ライセートからの発現タンパク質を含有する上清を保存した。
【０２８８】
Ｃ．ＢＳ１０６　Ｍ／Ｈの精製
該ライセート上清をグルタチオン−アガロースカラム（５０ｍｌ）に通過させた。２８０ｎｍでの吸光度により検出した場合にベースラインが安定になるまで（〜３００ｍｌ）、該カラムをリン酸緩衝食塩水で洗浄した。ついで該ＧＳＴ−ＢＳ１０６　Ｍ／Ｈ融合タンパク質をリン酸緩衝食塩水中の０．１５％　グルタチオンで溶出した。
【０２８９】
２５ｍＭ　Ｔｒｉｓバッファー（ｐＨ８．８）および０〜１０００ｍＭのＮａＣｌの直線勾配と共にＭｏｎｏ　Ｑ　１０／１０カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を使用して、この物質を更に精製した。ｍｙｃ特異的モノクローナル抗体を使用するウエスタンブロット法により検出したところ、２００〜３００ｍＭ　ＮａＣｌで溶出する画分は完全長融合タンパク質を含有することが判明した。これらの画分をプールし、融合タンパク質１モル当たり５０Ｕ（Ａ２８０　１％　〜１および分子量〜５０ｋＤを使用して計算した）のトロンビンの比率のウシトロンビンで３７℃で４時間にわたり処理した。ＰＭＳＦを１ｍＭまで加え、同一条件下のイオン交換クロマトグラフィーにより該サンプルを再び精製した。ＢＳ１０６　Ｍ／Ｈは約１００ｍＭ　ＮａＣｌで溶出した。該画分をプールし、リン酸緩衝食塩水に対して透析した。
【０２９０】
この調製物を、ｍｙｃ特異的抗体およびＢＳ１０６特異的抗体の両方を使用するウエスタンブロット分析に付した。実施例１１ｂ、小節Ｅに記載した図１１、パネルＡおよびＢのレーン２は、このプール中の物質を示している。該抗ｍｙｃモノクローナル抗体（パネルＡ）は、約１３〜２０ｋＤの主要バンド、および他の２つの、より高い分子量種を認識した。該抗ＢＳ１０６ポリクローナル抗体は、より多数のバンドを認識した。余分のバンドは、該ｍｙｃ−ｈｉｓタグを欠くいくつかの融合タンパク質（なぜなら、これらのバンドは該ｍｙｃ特異的ブロット中で検出されなかったから）、該ｍｙｃ−ｈｉｓタグを欠く非融合タンパク質、およびトロンビン切断からのいくつかの分解産物に起因する。
【０２９１】
実施例１２：乳房組織タンパク質の化学的分析
Ａ．ＭＳを用いるトリプシンペプチド断片の分析
乳癌などの乳房疾患を有する患者からの血清、乳房疾患を有さない患者からの血清、乳癌などの乳房疾患を有する患者からの乳房組織または細胞の抽出物、乳房疾患を有さない患者からの乳房組織または細胞の抽出物、および患者の他の非罹患または罹患器官からの組織または細胞の抽出物を、標準的な方法を用いてポリアクリルアミドゲル上で移動させ、クーマシーブルーで染色する。該未知ポリペプチドを含有する疑いのあるゲルの切片を切り出し、ゲル内還元、アセトアミド化およびトリプシン消化に付す（Ｐ．Ｊｅｎｏら，Ａｎａｌ．Ｂｉｏ．２２４：４５１−４５５（１９９５）およびＪ．Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら，Ａｎａｌ．Ｂｉｏ．２０３：１７３−１７９（１９９２））。該ゲル切片を１００ｍＭ　ＮＨ４ＨＣＯ３およびアセトニトリルで洗浄する。収縮したゲル片を、消化バッファー（５０ｍＭ　ＮＨ４ＨＣＯ３、５ｍＭ　ＣａＣｌ２および１２．５μｇ／ｍｌ　トリプシン）中、４℃で４５分間膨潤させる。該上清を吸引し、トリプシンを含有しない５〜１０μｌの消化バッファーで置換し、３７℃で一晩インキュベートする。ペプチドを、５％　ギ酸およびアセトニトリルの３回の交換により抽出し、蒸発乾固させる。該ペプチドを、延伸したガスクロマトグラフィー毛管の先端に捕捉された約０．１μｌのＰＯＲＯＳ　Ｒ２吸着剤（Ｐｅｒｓｅｐｔｉｖｅ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）に、それらを１０μｌの５％　ギ酸に溶解しそれを該毛管に通すことにより吸着させる。吸着したペプチドを水洗し、６０％　メタノール中の５％　ギ酸で溶出する。ナノエレクトロスプレー・マススペクトロメトリーによる分析のために、該溶出液をＡＰＩ　ＩＩＩ質量分析計（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ　Ｓｃｉｅｘ，Ｔｈｏｒｎｈｉｌｌ，Ｏｎｔａｒｉｏ，Ｃａｎａｄａ）の噴霧毛管中に直接通過さる（Ｍ．Ｗｉｌｍら，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｍａｓｓ　Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．Ｉｏｎ　Ｐｒｏｃｅｓｓ　１３６：１６７−１８０（１９９４）およびＭ．Ｗｉｌｍら，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．６６：１−８（１９９４））。該トリプシン処理ペプチドの質量を、第１四極子から得た質量スペクトルから測定する。さらに、予想されるペプチドに対応する質量をＭＳ／ＭＳモードで分析して、該ペプチドのアミノ酸配列を得ることができる。
【０２９２】
Ｂ．ＬＣ／ＭＳを用いるペプチド断片の分析
また、増殖性疾患組織中で見出されたｍＲＮＡ配列から推定されるポリペプチドの存在を、液体クロマトグラフィー／タンデムマススペクトロメトリー（ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ）を用いて確認することができる（Ｄ．Ｈｅｓｓら，ＭＥＴＨＯＤＳ，Ａ　Ｃｏｍｐａｎｉｏｎ　ｔｏ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　６：２２７−２３８（１９９４））。該患者からの血清試料または腫瘍抽出物をＳＤＳで変性させ、ジチオトレイトール（１．５ｍｇ／ｍｌ）で９０℃で３０分間還元し、ついでヨードアセトアミド（４ｍｇ／ｍｌ）で２５℃で１５分間にわたりアルキル化する。アクリルアミド電気泳動の後、該ポリペプチドをカチオンメンブレン上にエレクトロブロットし、クーマシーブルーで染色する。染色後、該メンブレンを洗浄し、該未知ポリペプチドを含有すると考えられる切片を切断し、小片に切断する。該メンブレンを５００μｌ　ミクロ遠心管中に配置し、１０〜２０μｌのタンパク質分解消化バッファー（０．１Ｍ　ＮａＣｌ、１０％アセトニトリル、２ｍＭ　ＣａＣｌ２および５μｇ／ｍｌ　トリプシンを含有する１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．２）（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）に漬ける。３７℃で１５時間後、３μｌの飽和尿素および１μｌの１００μｇ／ｍｌ　トリプシンを加え、さらに３７℃で５時間インキュベートする。該消化混合物を３μｌの１０％　トリフルオロ酢酸で酸性化し、遠心して、上清をメンブレンから分離する。該上清をミクロボア逆相ＨＰＬＣカラム上に直接注入し、０．０５％　トリフルオロ酢酸中のアセトニトリルの直線勾配で溶出する。該溶出液を、物質の容量を調節するために必要に応じて流動スプリッターに通した後、エレクトロスプレー質量分析計に直接的に送り込む。実施例１２　Ａ節に記載の方法に従い、データを分析する。
【０２９３】
実施例１３：遺伝子免疫化プロトコール
Ａ．インビトロでの抗原の発現
遺伝子免疫化（ｇｅｎｅ　ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ）は、適当な発現ベクターの接種後に抗原をインビボで直接的に発現させることにより、タンパク質の精製工程を不要にする。また、この方法による抗原の産生は、正しいタンパク質フォールディングおよびグリコシル化を可能にしうる。なぜなら、該タンパク質は、哺乳動物組織内で産生されるからである。該方法では、ＣＭＶプロモーターを含有するプラスミド内への該遺伝子配列の挿入、該プラスミドの増殖および精製、ならびに動物の筋肉組織内への該プラスミドＤＮＡの注入を行なう。好ましい動物にはマウスおよびウサギが含まれる。例えば、Ｈ．Ｄａｖｉｓら，Ｈｕｍａｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　２：１８４７−１８５１（１９９３）を参照されたい。１回または２回のブースター免疫化の後、該動物を出血させたり、腹水液を集めたり、あるいはハイブリドーマの産生のために該動物の脾臓を採取することができる。
【０２９４】
Ｂ．プラスミドの調製および精製
実施例１１に記載の方法に従い、適当な５’制限部位を含有する適当なＰＣＲプライマーを使用して、ＢＳ１０６　ｃＤＮＡ含有ベクターからＢＳ１０６　ｃＤＮＡ配列を作製する。該ＰＣＲ産物を適当な制限酵素で切断し、ＣＭＶプロモーターを含有するベクター（例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ，ＣＡからのｐＲｃ／ＣＭＶまたはｐｃＤＮＡ３ベクター）内に挿入する。ついでこのプラスミドを適当な細菌株内で増殖させ、ＣｓＣｌ勾配またはＱｉａｇｅｎプラスミドＤＮＡ精製カラムを使用して該細胞ライセートから精製する。これらのすべての技術は、分子生物学の当業者に良く知られたものである。
【０２９５】
Ｃ．免疫化プロトコール
麻酔した動物を、ＰＢＳまたは他のＤＮＡ取込み増強剤（Ｃａｒｄｉｏｔｏｘｉｎ、２５％　ショ糖）中に希釈された０．１〜１００μｇの該精製プラスミドで筋肉内に免疫する。例えば、Ｈ．Ｄａｖｉｓら，Ｈｕｍａｎ　Ｇｅｎｅ　Ｔｈｅｒａｐｙ　４：７３３−７４０（１９９３）およびＰ．Ｗ．Ｗｏｌｆｆら，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　１１：４７４−４８５（１９９１）を参照されたい。１回または２回のブースター注射を１ヵ月間隔で行なう。
【０２９６】
Ｄ．抗血清の試験および使用
動物を出血させ、得られた血清を、当技術分野で公知の技術（例えば、ウエスタンブロット法またはＥＩＡ技術）により、公知遺伝子配列から合成されたペプチド（実施例１６を参照されたい）を使用して抗体に関して試験する。ついで、この方法により産生した抗血清を使用して、患者の組織もしくは細胞抽出物中または患者の血清中の該抗原の存在をＥＬＩＳＡまたはウエスタンブロット法（例えば、実施例１５〜１８に記載のもの）で検出することができる。
【０２９７】
実施例１４：ＢＳ１０６に対する抗体の製造
Ａ．ポリクローナル抗血清の製造
ＢＳ１０６コンセンサスヌクレオチド配列（配列番号６）の推定アミノ酸配列に由来する配列を有するペプチドをウサギに注射することにより、ＢＳ１０６に対する抗血清を調製した。ペプチド（配列番号２１〜３３）の合成は、実施例１０に記載されている。免疫原として使用したペプチドは、キーホールリンペットヘモシアニン、ＫＬＨのような担体タンパク質に共役させるか、または担体に共役させなかった（すなわち、それらは非共役体であった）。
【０２９８】
１．ペプチドの共役化
マレイミド活性化キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ、Ｉｍｊｅｃｔ（登録商標）として商業的に入手可能、Ｐｉｅｒｃｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬから入手可能）にペプチドを共役させた。Ｉｍｊｅｃｔ（登録商標）は、ヘモシアニン１モル当たり約２５０モルの反応性マレイミド基を含有する。該活性化ＫＬＨを、約７．７ｍｇ／ｍｌの濃度でリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ８．４）溶解した。該ペプチドは、該ペプチド配列中に存在するシステインを介して共役させるか、または結合点を付与するために該合成ペプチドに予め付加されたシステインに共役させた。該ペプチドをジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ，Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）に溶解し、該ＫＬＨに結合している反応性マレイミド１モル当たりペプチド約１．５モルのモル比で該活性化ＫＬＨと反応させた。ペプチド配列番号２３、配列番号２５、配列番号２６および配列番号２８〜３２の共役化のための方法は、後記で説明する。ペプチドの共役化を最適化するために、そのような方法における量、時間および条件が種々に改変されうることが、当業者に公知である。
【０２９９】
後記の共役反応は、約０．７７μモルの反応性マレイミド基を含有する３ｍｇのＫＬＨペプチド共役体（「共役ペプチド」）の入手に基づく。ペプチド共役体のこの量は、通常、ポリクローナル抗血清をウサギに産生させるための１回の初回注射および４回のブースター注射に適していた。簡単に説明すると、該ペプチド（配列番号２３、配列番号２５、配列番号２６および配列番号２８〜３２）をＤＭＳＯに、ＤＭＳＯ　１００μｌ当たり１．１６μモルの濃度で溶解した。１００マイクロリットル（１００μｌ）の該ＤＭＳＯ溶液を、前記のとおりに調製した活性化ＫＬＨ溶液３８０μｌに加え、２０μｌのＰＢＳ（ｐＨ８．４）を加えて容量を５００μｌにした。該反応を、攪拌しながら室温で一晩インキュベートした。該反応混合物中の未反応チオールの量を測定することにより、反応の度合を判定した。チオールの出発濃度と最終濃度との差が、該活性化ＫＬＨに共役したペプチドの濃度と考えられた。残存チオールの量を、Ｅｌｌｍａｎ試薬（５，５’−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）、Ｐｉｅｒｃｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）を使用して測定した。３５ｍｇのシステインＨＣｌ（Ｐｉｅｒｃｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）を１０ｍｌのＰＢＳ（ｐＨ７．２）に溶解し、該ストック溶液を所望の濃度まで希釈することにより、システイン標準物を０、０．１、０．５、２、５および２０ｍＭの濃度で作製した。Ｉｍｍｕｌｏｎ　２（登録商標）マイクロウェルプレート（Ｄｙｎｅｘ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃｈａｎｔｉｌｌｙ，ＶＡ）の各ウェル内に２００μｌのＰＢＳ（ｐＨ８．４）を配置することにより、チオール濃度の光度的測定を行なった。つぎに、１０μｌの標準物または反応混合物を各ウェルに加えた。最後に、ＰＢＳ（ｐＨ８．４）中１ｍｇ／ｍｌの濃度のＥｌｌｍａｎ試薬２０μｌを各ウェルに加えた。該ウェルを室温で１０分間インキュベートし、全ウェルの吸光度をマイクロプレートリーダー（例えば、ＢｉｏＲａｄ　Ｍｏｄｅｌ　３５５０，ＢｉｏＲａｄ，Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＣＡ）で４１５ｎｍにて読取る。該標準物の吸光度を用いて標準曲線を作成し、該反応混合物のチオール濃度を該標準曲線から求めた。遊離チオールの濃度の減少は、成功した共役反応を示した。未反応ペプチドを、ＰＢＳ（ｐＨ７．２）に対して室温で６時間透析することにより除去した。該共役体は、直ちに使用する場合には２〜８℃で保存し、そうでない場合には−２０℃以下で保存した。
【０３００】
２．動物の免疫化
雌の白色Ｎｅｗ　Ｚｅａｌａｎｄウサギ（体重２ｋｇ以上）を使用して、ポリクローナル抗血清を産生させた。共役ペプチド（配列番号２３、配列番号２５、配列番号２６および配列番号２８〜３２）または非共役ペプチド（配列番号２１〜２４）当たり１匹の動物を免疫した。初回免疫の１週間前に、採血前の非免疫サンプルとして、該動物から５〜１０ｍｌの血液を得た。
【０３０１】
共役ペプチド（配列番号２３、配列番号２５、配列番号２６および配列番号２８〜３２）または非共役ペプチド（配列番号２１〜２４）を使用し、０．５ｍｌの該共役または非共役ペプチドを、０．５ｍｌの完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）（Ｄｉｆｃｏ，Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ）を含有するＰＢＳ（ｐＨ７．２）中、２ｍｇ／ｍｌの濃度で乳化することにより、一次免疫原を調製した。該免疫原を、皮下、腹腔内および筋肉内の投与経路により該動物のいくつかの部位に注射した。該初回免疫の４週間後、ブースター免疫を投与した。ブースター免疫投与に使用した免疫原は、該ペプチドまたはペプチド／担体複合体が０．５ｍｌの不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）（Ｄｉｆｃｏ，Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ）で１ｍｇ／ｍｌまで希釈されている以外は一次免疫原で使用したのと同じ０．５ｍｌのペプチドまたは該一次免疫原に使用した非共役ペプチドを乳化することにより調製した。ここでもまた、該ブースター量を、皮下、腹腔内および筋肉内の注射様式により、いつくかの部位に投与した。該ブースター免疫の２週間後、該動物から採血（５ｍｌ）し、後記のペプチドに対する免疫反応性に関して各血清を試験した。適当な力価が得られるまで、該ブースターおよび採血の手順を４週間隔で繰返した。抗血清の力価または濃度は、後記実施例１７に記載のマイクロタイターＥＩＡにおいて非共役ペプチドを使用することにより測定した。１：５００以上の抗体力価を、さらなる使用および研究に適した力価とみなした。以下の表２は、該ペプチドで免疫したウサギで得られた力価を示す。
【０３０２】
【表２】
2004503208.tif 000004
【０３０３】
Ｂ．モノクローナル抗体分子の製造
１．免疫化プロトコール
マウスにおけるモノクローナル抗体の産生のための共役ペプチドの量がウサギにおけるポリクローナル抗血清の産生のために使用した量の１０分の１となる以外は［前記のとおりに調製した］ＫＬＨなどの担体に共役したペプチド（配列番号２３、配列番号２６および配列番号２９）を使用して、マウスを免疫した。したがって、該一次免疫原は、０．１ｍｌのＣＦＡエマルション中の１００μｇの共役ペプチドよりなり、一方、ブースター免疫化に使用する免疫原は、０．１ｍｌのＩＦＡ中の５０μｇの共役ペプチドよりなるものであった。標準的な技術を用いて、モノクローナル抗体産生用のハイブリドーマを調製し、スクリーニングする。モノクローナル抗体産生に用いた方法は、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ　２５６：４９４（１９７５）に詳細に記載されておりＪ．Ｇ．Ｒ．Ｈｕｒｒｅｌ編，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　ａｎｄ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ＣＲＣ　Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ，Ｂｏｃａ　Ｒａｔｏｎ，ＦＬ（１９８２）に概説されているような当技術分野で公知の手順に従った。ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎの方法に基づくモノクローナル抗体産生のためのもう１つの方法は、参照により本明細書に組み入れるＬ．Ｔ．Ｍｉｍｍｓら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　１７６：６０４−６１９（１９９０）の方法である。
【０３０４】
該免疫化方式（マウス１匹当たり）は、追加的ブースター免疫化を伴う一次免疫化よりなるものであった。一次免疫化に使用する一次免疫原は、５０μｌのＣＦＡ中に予め乳化された５０μｌのＰＢＳ（ｐＨ７．２）中の１００μｇの共役ペプチドよりなるものであった。一次免疫化の約２週間および４週間後に行なうブースター免疫化は、５０μｌのＩＦＡで乳化された５０μｌのＰＢＳ（ｐＨ７．２）中の５０μｇの共役ペプチドよりなるものであった。合計１００μｌのこの免疫原を各マウスの腹腔内および皮下に接種した。該三次免疫化の約４週間後に、実施例１７に記載のマイクロタイタープレート酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）により、免疫応答に関して個々のマウスをスクリーニングした。該三次免疫化の約１５週間後に、ＰＢＳ（ｐＨ７．２）中の５０μｇの共役ペプチドをマウスの静脈内に接種した。
【０３０５】
この静脈内ブースト（追加抗原刺激）の３日後に、脾細胞を、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）法により例えばＳｐ２／０−Ａｇ１４骨髄腫細胞（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｅｎｇｌａｎｄ）と融合させた。該融合体を、Ｌ−グルタミン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−アルギニン、葉酸が添加され１０％　ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）＋１％　ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジン（ＨＡＴ）を含有するダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で培養した。実施例１７のプロトコールに従いマイクロタイタープレートＥＩＡにより、バルク培養をスクリーニングした。免疫原として使用したペプチドには反応性であり他のペプチド（すなわち、該免疫原として使用していないＢＳ１０６のペプチド）には無反応性であるクローンを、最終増殖のために選択した。該最終増殖からの上清を回収し、更なる特徴づけに使用した。該増殖培養からのハイブリドーマ細胞を回収し、アリコート化し、１０％　ＦＣＳおよび１０％　ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含有するＤＭＥＭ中で凍結させた。
【０３０６】
２．モノクローナル抗体を含有する腹水液の製造
前記のとおりに調製した凍結ハイブリドーマ細胞を融解し、増殖培養内に配置する。生存可能なハイブリドーマ細胞を、Ｐｒｉｓｔａｎｅ処理マウスの腹腔内に接種する。腹水液を該マウスから取り出し、プールし、０．２μ　フィルターで濾過し、免疫グロブリンクラスＧ（ＩｇＧ）分析に付して、該精製に必要なプロテインＡカラムの容量を測定する。
【０３０７】
３．腹水液または細胞培養上清からのモノクローナル抗体の精製
モノクローナル抗体は、プロテインＡ、プロテインＧおよびプロテインＬカラムクロマトグラフィーまたは沈殿を含む種々の方法を用いて、腹水液または細胞培養上清から精製することができる。簡単に説明すると、濾過し融解した腹水液を等容量のプロテインＡセファロース結合バッファー（１．５Ｍ　グリシン、３．０Ｍ　ＮａＣｌ、ｐＨ８．９）と混合し、０．２μ　フィルターで再濾過する。該プロテインＡカラムの容量を、該腹水液中に存在するＩｇＧの量から求める。ついで該溶出液を、２〜８℃で一晩、ＰＢＳ（ｐＨ７．２）に対して透析する。透析されたモノクローナル抗体を滅菌濾過し、アリコートに分注する。該精製モノクローナル抗体の免疫反応性は、該免疫原として使用するペプチドにそれが特異的に結合する能力を実施例１７のＥＩＡマイクロタイタープレートアッセイ法で測定することにより確認される。該精製モノクローナル抗体の特異性は、それが無関係なペプチド（例えば、該免疫原として使用していないＢＳ１０６のペプチド）に結合しないことを判定することにより確認される。このようにして調製し特徴づけした精製抗ＢＳ１０６モノクローナルを、短期保存には２〜８℃、長期保存には−８０℃で配置する。
【０３０８】
４．モノクローナル抗体の更なる特徴づけ
前記のとおりに製造したモノクローナル抗体のイソタイプおよびサブタイプを、ＥＩＡマイクロタイターアッセイを用いて決定した。簡単に説明すると、該ペプチド免疫原を、５０ｍＭ　カルボナート（ｐＨ９．６）中２μｇ／ｍｌ　で調製し、１００μｌをＩｍｍｕｎｌｏｎ　２　Ｈｉｇｈ　Ｂｉｎｄｉｎｇマイクロタイタープレート（Ｄｙｎｅｘ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃｈａｎｔｉｌｌｙ，ＶＡ）の各ウェル中に配置した。該プレートを室温で１４〜１８時間インキュベートし、ついで脱イオン水で４回洗浄した。各ウェルにＳｕｐｅｒｂｌｏｃｋ（Ｐｉｅｒｃｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）を加え次いで直ちに該溶液を捨てることにより、該ウェルをブロッキングした。このブロッキング方法を３回行った。１００マイクロリットル（１００μｌ）の培養上清を、３％　Ｓｕｐｅｒｂｌｏｃｋ、０．０５％　Ｔｗｅｅｎ　２０（モノラウラート　ポリオキシエチレン　エーテル）（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）および０．０５％　アジ化ナトリウムを含有するＰＢＳのタンパク質ブロッキング剤中で１：２希釈し、該コート化マイクロタイタープレートの各ウェル中に配置した。該ウェルを室温で１時間インキュベートした。各ウェルを脱イオン水で４回洗浄した。３％　Ｓｕｐｅｒｂｌｏｃｋ、０．０５％　Ｔｗｅｅｎ　２０および０．０５％　アジ化ナトリウムを含有するＰＢＳ中で１：２０００希釈した１００マイクロリットル（１００μｌ）のアルカリホスファターゼ共役ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）またはＩｇＧ１またはＩｇＧ２ａまたはＩｇＧ２ｂまたはＩｇＧ３（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ　Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，ＡＬ）を、それらの適当なウェルに加えた。該ウェルを室温で１時間インキュベートした。ついで、各ウェルを脱イオン水で４回洗浄した。ついで１００マイクロリットル（１００μｌ）のパラ−ニトロフェニルホスファート基質（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ　ａｎｄ　Ｐｅｒｒｙ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を各ウェルに加えた。該ウェルを室温で３０分間インキュベートし、４０５ｎｍでの吸光度を読み取った。該イソタイプ決定の結果を表３に示す。
【０３０９】
【表３】
2004503208.tif 000005
【０３１０】
また、該モノクローナル抗体のアリコートを２〜８℃の連続的保存に配置し、与えられた時間の経過の全体にわたり光学密度（ＯＤ）値をアッセイすることにより、該モノクローナル抗体に関して安定性試験を行うことができる。
【０３１１】
Ｃ．免疫原としての組換えタンパク質の使用
本明細書に記載のとおりに製造した組換えタンパク質を、当業者に公知の試薬および技術に付随的変更を加えて、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体の製造における免疫原として使用することは、本発明の範囲内に含まれる。
【０３１２】
実施例１５：ＢＳ１０６ペプチドに特異的に結合する血清抗体の精製
Ａ．ウサギ抗ＢＳ１０６の精製のためのアフィニティーカラムの調製
前記実施例１４に記載のとおりに得た免疫血清を、実施例１０に記載のとおりに調製した固定化合成ペプチドを使用してアフィニティー精製した。配列番号２６をＳｕｌｆｏＬｉｎｋ（商標）ゲル（Ｐｉｅｒｃｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）に、該製造業者の指示に従い共役させた。簡単に説明すると、２．０ｍｌの共役バッファーに溶解した２．０ｍｌのペプチドを、１０ｍｌの共役バッファーで予め洗浄した２ｍｌのＳｕｌｆｏＬｉｎｋ（商標）ゲル中に注いだ。室温で１８時間後、該ゲルを４ｍｌの共役バッファーで洗浄し、ついで２．０ｍｌの共役バッファー中の１０ｍｇのＬ−システイン塩酸でブロッキングした。３０分後、該ゲルを、８ｍｌの共役バッファー、ついでＰＢＳ中の７ｍｌの０．２％　ＢＳＡ、ついで７ｍｌのＰＢＳで洗浄した。該ゲルを、７ｍｌの１００ｍＭ　グリシン（ｐＨ２．０８）、ついで１５ｍｌのＰＢＳで洗浄することにより調整した。
【０３１３】
Ｂ．ウサギ抗ＢＳ１０６抗血清のアフィニティー精製
１０ミリリットル（１０ｍｌ）のウサギ抗ＢＳ１０６抗血清を、２ｍｌの前記アフィニティーゲルを含有するカラムに通した。２８０ｎｍでの吸光度が０．０５未満になるまで該ゲルをＰＢＳで洗浄し、ついで該結合抗体を１００ｍＭ　グリシン（ｐＨ２．０８）で溶出した。該溶出物質を、３０μｌの１．０Ｍ　Ｔｒｉｓ塩基を含有する管中に５００μｌの画分として集めた。画分４〜９を合わせ、１０ｍｌ　ゲル濾過カラム（Ｐｉｅｒｃｅ　Ｋｗｉｋ（商標）カラム）に通し、該バッファーをＰＢＳと交換した。このカラムから集めた画分を３．０ｍｇ／ｍｌでは３．０ｍｌの容量に、０．３２ｍｇ／ｍｌでは１．５ｍｌの容量にプールした。
【０３１４】
実施例１６：組織サンプルのウエスタンブロット法
Ａ．組織特異性
０．１Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１５％（ｗ／ｖ）　グリセロール、０．２ｍＭ　ＥＤＴＡ、１．０ｍＭ　１，４−ジチオトレイトール、１０μｇ／ｍｌ　ロイペプチンおよび１．０ｍＭ　フェニルメチルスルホニルフルオリド（Ｋａｉｎら，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１７：９８２（１９９４））中で組織サンプルをホモジナイズすることにより、組織抽出物を調製した。該ホモジネートを４℃で５分間遠心して、上清を残渣から分離した。タンパク質の定量のために、３〜１０μｌの上清を１．５ｍｌのビシンコニン酸（ｂｉｃｉｎｃｈｏｎｉｎｉｃ　ａｃｉｄ）試薬（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）に加え、５６２ｎｍにおける得られた吸光度を測定した。
【０３１５】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥのために、サンプルを、Ｔｒｉｃｉｎｅ　Ｂｕｆｆｅｒ（Ｎｏｖｅｘ，Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）で所望のタンパク質濃度に調節し、等容量の２×Ｔｒｉｃｉｎｅサンプルバッファー（Ｎｏｖｅｘ，Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）と混合し、サーマルサイクラー中１００℃で５分間加熱した。ついでサンプルを、電気泳動のために、Ｎｏｖｅｘ　１０〜２０％　Ｐｒｅｃａｓｔ　Ｔｒｉｃｉｎｅ　Ｇｅｌに適用した。電気泳動後、サンプルを該ゲルからＮｏｖｅｘ　Ｔｒｉｓ−Ｇｌｙｃｉｎｅ　Ｔｒａｎｓｆｅｒバッファー中のニトロセルロースメンブレンにトランスファーした。ついでメンブレンを、１μｇ／ｍｌのプロテインＧ精製抗ペプチドモノクローナル抗体Ｈ９Ｃ２９でプローブした。ついで該ブロットを、商業的に入手した抗マウスアルカリホスファターゼ（Ｔｒｏｐｉｘ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）と共にインキュベートした。５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスファート（ＢＣＩＰ）を加えることにより、該バンドを該メンブレン上で直接的に可視化した。この色素産生溶液は、１００ｍＭ　ＮａＣｌ、５ｍＭ　ＭｇＣｌ２および１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．５）を含有する溶液中に０．０１６％　ＢＣＩＰを含有する。予め染色された分子量標準（Ｎｏｖｅｘ，Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を使用して、分子量の測定を行った。
【０３１６】
また、該ニトロセルロースメンブレンにさらす前に該一次抗体（抗ペプチドモノクローナル抗体）を１．３μＭ、０．４３μＭおよび０．１４μＭのＢＳ１０６ペプチド（配列番号２６）と共に冷蔵庫内で一晩プレインキュベートする以外は前記と同様の方法で、競合実験を行なった。
【０３１７】
図１２は、ＢＳ１０６ペプチド（配列番号２６）に対するモノクローナル抗体（Ｈ９Ｃ２９）を使用して組織抽出物のパネル上で行ったウエスタンブロットの結果を示す。図１２の各レーンは、異なる組織抽出物、すなわち、１，精巣癌；２，子宮内膜癌；３，卵巣癌；４，膀胱；５，結腸；６，前立腺；７，肺；８，乳癌；９，ブランクおよび１０，分子量マーカー（ｋＤ）を含有する。該乳癌組織からの抽出物（レーン８）は、約４０ｋＤの糖タンパク質に合致した強くて広いバンドを示しており、その他の組織は陰性である。７個の他の乳癌組織および６個の正常組織からの抽出物を含むいくつかの他の乳房組織試料を分析した。総合すると、それらの８個中５個の乳癌およびそれらの６個中２個の正常体はＢＳ１０６に陽性であった。ＢＳ１０６ペプチド（配列番号２６）との競合実験は、乳癌組織で認められるバンドの完全な阻害を示した。
【０３１８】
Ｂ．人乳の分析
実施例２２Ｄと同様に分離した人乳のサンプルの水性および脂肪部分を、以下の表４に示すとおりに電気泳動用に調製した。電気泳動のための調製の前に、乳脂肪を等容量のＰＢＳで希釈した。ＴＣＥＰ（Ｔｒｉｓ−カルボキシエチルホスフィン塩酸）の添加後に、該サンプルを室温で１０分間インキュベートした。ついでＰＢＳおよび２×ＳＤＳ　Ｓａｍｐｌｅ　Ｂｕｆｆｅｒ（Ｎｏｖｅｘ，Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を加えた。該混合物を１００℃で５分間加熱し、ついで炭酸ナトリウムを加えて、該ＴＣＥＰの酸性を中和した。１２マイクロリットル（１２μｌ）の該調製サンプルを１０〜２０％　Ｔｒｉｓ−グリシンゲル（Ｎｏｖｅｘ，Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）のウェルに加えた。該サンプルを、２組のサンプルの間で分子量マーカーと共に二重に泳動させた。電気泳動が完了した後、実施例１６Ａに記載のとおりに、該ゲルをニトロセルロースにブロッティングした。該ニトロセルロースフィルターをＩｂｌｏｃｋ（商標）（Ｔｒｏｐｉｘ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）（０．１％　Ｔｗｅｅｎ−２０を含有するＰＢＳ中０．２％）で６０分間にわたりブロッキングした。ついで該ブロットを切断して該転移サンプルを分離した。両方のブロット（ＡおよびＢと称される）を、２．５μｌのアフィニティー精製ウサギ抗ＢＳ１０６．６を含有する１０ｍｌのＩｂｌｏｃｋ（商標）溶液と共に６０分間インキュベートした。しかし、該Ｂブロット抗体溶液は、１００μｌの０．１ｍＭ　ＢＳ１０６．６ペプチドを含んでおり、該ブロットに加える前にそれを該抗体と混合した。室温で振とうしながら６０分間インキュベートした後、０．１％　Ｔｗｅｅｎ　２０を含有する２０ｍｌのＰＢＳで該ブロットを３回洗浄した。ついで該ブロットを、振とうしながら、５ｍｌの１：１００００希釈のアルカリホスファターゼ抗ウサギ共役体（Ｔｒｏｐｉｘ，Ｂｅｄｆｏｒｄ　ＭＡ）と共に６０分間インキュベートした。該ブロットを２ｍｌのＮＢＴ／ＢＣＩＰ基質（Ｐｉｅｒｃｅ　Ｏｎｅ　Ｓｔｅｐ（商標），Ｐｉｅｒｃｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）で現像した。
【０３１９】
【表４】
2004503208.tif 000006
【０３２０】
図１３は、該アフィニティー精製ウサギ抗ＢＳ１０６抗体が、いくつかの分子量のバンドを検出すること、およびこれらのバンドのすべてがＢＳ１０６ペプチド（配列番号２６）の存在下では消失することを示しており、乳の水性画分および脂肪画分の両方に存在する複数のタンパク質が、ＢＳ１０６ペプチド（配列番号２６）と同一の又は強く関連したアミノ酸配列を含有することを示唆している。還元剤の不存在下では、該水性および脂肪画分は、高分子量のバンド（＞２００ｋＤ）および約１２０ｋＤのもう１つのバンド（Ａ，レーン２および４）を示す。還元すると、１２０ｋＤのバンドは残存するが、該高分子量バンド（＞２００ｋＤ）は消失し、８０ｋＤ、６５ｋＤおよび４０ｋＤのバンドが出現する（Ａ，レーン３および５）。競合のためのペプチドを含有するサンプルをブロットＢ上で泳動させた。該８０ｋＤおよび６５ｋＤバンドがそこに出現し（Ｂ，レーン３）、したがって、それらは、該４０ｋＤバンドとは異なりＢＳ１０６に特異的ではないとみなされる。
【０３２１】
４０ｋＤのバンドは、（実施例１１ｂに記載したとおりの）その配列から予想されるとおりのＯ結合グリコシル化を含有する一本鎖ＢＳ１０６タンパク質分子に合致する。該配列中の唯一のシステイン残基およびその最後から２番目の位置は、それが、その生物学的機能の過程で他のタンパク質とジスルフィド結合を形成することを示唆している。これは、該ジスルフィド結合を還元する条件にさらした後の該高ＭＷバンド（＞２００ｋＤ）の消失および該４０ｋＤバンドの出現に符合する。
【０３２２】
しかし、該１２０ｋＤバンドは還元による影響を受けない。ＢＳ１０６タンパク質は、乳中に存在する他のタンパク質と還元抵抗性結合を形成するらしい。１つの示唆は、該Ｃ末端のリシンの一方または両方がトランスグルタミン化により他のタンパク質に結合しうるというものである。
【０３２３】
Ｃ．ＢＳ１０６抗体での生物学的サンプルのウエスタンブロット法
種々の生物学的サンプルを、還元および非還元条件下、ウエスタンブロットにより分析した。人乳の水性および脂肪画分を、実施例２２Ｄに記載のとおりに調製した。６μｌの該乳水性画分に、５％　ジチオトレイトールの存在下および不存在下で２４μｌのＰＢＳおよび３０μｌの２×ＳＤＳ　Ｓａｍｐｌｅ　Ｂｕｆｆｅｒ（Ｎｏｖｅｘ，Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を加えた。該乳脂肪画分（ＰＢＳ中の６％分散液）および乳癌組織の抽出物（実施例１６Ａからのもの）を同様に処理した。
【０３２４】
唾液のサンプルを１８μｌのＰＢＳに加え、１５，０００×ｇで１０分間遠心分離した。１２マイクロリットル（１２μｌ）の該上清を、５％　ジチオトレイトールの存在下および不存在下で３０μｌの２×Ｓａｍｐｌｅ　Ｂｕｆｆｅｒ（Ｎｏｖｅｘ，Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）に加えた。前記唾液調製物（その元の容積のＰＢＳ中のもの）からの沈降物の上清１２マイクロリットル（１２μｌ）を同様に処理した。実施例２２Ｄに記載のとおりに人乳からアフィニティー精製したＢＳ１０６タンパク質のサンプル３μｌに、５％　ジチオトレイトールの存在下および不存在下で２７μｌのＰＢＳおよび３０μｌの２×ＳＤＳ　Ｓａｍｐｌｅ　Ｂｕｆｆｅｒ（Ｎｏｖｅｘ，Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を加えた。
【０３２５】
すべてのサンプルを１００℃で５分間加熱し、実施例１６Ａに記載のとおりに電気泳動した。電気泳動後、製造業者の指示に従い該ゲルをニトロセルロースにブロッティングした。該ブロットをＩｂｌｏｃｋ（商標）（０．１％　Ｔｗｅｅｎ−２０を含有するＰＢＳ中０．２％）で６０分間にわたりブロッキングした。該ブロットを、Ｈ２４Ｃ１６モノクローナル抗体を含有する２８０μｌの該培養上清または実施例１５Ｂからの８．５μｌのアフィニティー精製ウサギ抗ＢＳ１０６ペプチド（配列番号２６）を含有する１０ｍｌのＩｂｌｏｃｋ（商標）溶液［共に、該抗体に関して競合させるために加えた５０μｇのＢＳ１０６ペプチド（配列番号２６）の存在下または不存在下］と共に６０分間インキュベートした。室温で振とうしながら６０分間インキュベートした後、０．１％　Ｔｗｅｅｎ　２０を含有する２０ｍｌのＰＢＳで該ブロットを３回洗浄した。ついでそれらを、振とうしながら、５ｍｌの１：１００００希釈のアルカリホスファターゼ抗ウサギまたは抗マウス共役体（Ｔｒｏｐｉｘ，Ｂｅｄｆｏｒｄ　ＭＡ）と共に６０分間インキュベートし、２ｍｌのＮＢＴ／ＢＣＩＰ基質（Ｐｉｅｒｃｅ　Ｏｎｅ　Ｓｔｅｐ（商標），Ｐｉｅｒｃｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）で現像した。
【０３２６】
結果を図１４に示す。該製造業者によれば、該着色ＭＷマーカーは、Ｔｒｉｃｉｎｅゲル上では、実施例１６Ａで使用したＴｒｉｓ−グリシンゲルとは異なって移動し、それらに起因する異なる分子量を与える。該＞２００ｋＤバンドは、該アフィニティー精製ウサギ抗体および該モノクローナル抗体Ｈ２４Ｃ１６の両方により認識される。該バンドは、該水性乳画分、乳癌、唾液上清、およびＢＳ１０６タンパク質（乳からアフィニティー精製されたもの）中に（非還元性条件下で）存在する。
【０３２７】
該１２０ｋＤバンドはまた、該アフィニティー精製ウサギ抗体および該モノクローナル抗体Ｈ２４Ｃ１６により認識される。該バンドは、該水性乳画分、該脂肪画分および該ＢＳ１０６タンパク質（乳からアフィニティー精製されたもの）を含む乳サンプルにおいて観察される。しかし、それは、該唾液サンプル中には存在しないらしく、強力な染色による該乳癌サンプル中のその存在を結論づけることは困難である。該乳癌試料および該ＢＳ１０６タンパク質（乳からアフィニティー精製したもの）は更に、両方の抗体により認識される４５〜７０ｋＤの分子量範囲のいくつかの物質を含有する。
【０３２８】
還元すると、該高分子量バンド（＞２００ｋＤ）および４５〜７５ｋＤの分子量のバンドが消失し、４０ｋＤのバンドが生じる。これは、乳からアフィニティー精製されたＢＳ１０６タンパク質で最も良く観察される。なぜなら、該サンプルは、より純粋であり、より濃縮されているからである。該１２０ｋＤバンドは該還元による影響を受けない。
【０３２９】
これらの結果は、２００ｋＤを超える分子量を有するＢＳ１０６が関与するジスルフィド結合複合体の存在と合致する。ＢＳ１０６はまた、約１２０ｋＤの分子量を有する非還元複合体に関与しているらしい。
【０３３０】
実施例１７：ＥＩＡマイクロタイタープレートアッセイ
実施例１４に記載のとおりにウサギまたはマウスから得たモノクローナル抗体または抗血清の免疫反応性を、以下のとおり、マイクロタイタープレートＥＩＡにより測定した。マイクロタイタープレートを、合成ペプチドまたは半精製発現タンパク質物質（実施例１１ｂ、Ｅ部に記載のとおりに精製したもの）でコートした。簡単に説明すると、実施例１０に記載のとおりに調製した合成ペプチド配列番号２１〜３３を、最終濃度２μｇ／ｍｌまで、炭酸バッファー（５０ｍＭ，ｐＨ９．６）に溶解した。半精製発現タンパク質をＰＢＳ中で１：２０希釈した。つぎに、１００μｌの該ペプチドまたはタンパク質溶液を、Ｉｍｍｕｌｏｎ２（登録商標）マイクロタイタープレート（Ｄｙｎｅｘ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃｈａｎｔｉｌｌｙ，ＶＡ）の各ウェル中に配置した。該プレートを室温で一晩インキュベートし、ついで脱イオン水で４回洗浄した。リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ，　ｐＨ７．４）中の１２５μｌの適当なタンパク質ブロッキング剤（例えば、Ｓｕｐｅｒｂｌｏｃｋ（登録商標）（Ｐｉｅｒｃｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ））を各ウェルに加え、ついで直ちに該溶液を捨てることにより、該ウェルをブロッキングした。このブロッキング手順を３回行なった。既に記載されているとおりに調製した免疫化ウサギまたはマウスから得たモノクローナル抗体または抗血清を、０．０５％　Ｔｗｅｅｎ−２０（登録商標）（モノラウラートポリオキシエチレンエーテル）（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）と０．０５％　アジ化ナトリウムとを含有するＰＢＳ中のタンパク質ブロッキング剤（例えば、３％　Ｓｕｐｅｒｂｌｏｃｋ（登録商標）溶液）中に１：１００、１：５００、１：２５００、１：１２，５００および１：６２，５００（ポリクローナル抗血清）または１：１０、１：１００、１：１０００および１：１０，０００（ハイブリドーマ上清）の希釈度で希釈し、該コート化マイクロタイタープレートの各ウェル内に配置した。ついで該ウェルを室温で３時間インキュベートした。各ウェルを脱イオン水で４回洗浄した。０．０５％　Ｔｗｅｅｎ−２０（登録商標）と０．０５％　アジ化ナトリウムとを含有するリン酸緩衝食塩水中の３％　Ｓｕｐｅｒｂｌｏｃｋ（登録商標）溶液中１：２０００に希釈した１００μｌのアルカリホスファターゼ共役ヤギ抗ウサギＩｇＧまたはヤギ抗マウスＩｇＧ抗血清（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ　Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，ＡＢ）を、各ウェルに加えた。該ウェルを室温で２時間インキュベートした。つぎに、各ウェルを脱イオン水で４回洗浄した。ついで１００μｌのパラニトロフェニルホスファート基質（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ　ａｎｄ　Ｐｅｒｒｙ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を各ウェルに加えた。該ウェルを室温で３０分間インキュベートした。各ウェルの４０５ｎｍにおける吸光度を読取った。該試験ウェル中の４０５ｎｍでの吸光度が、非免疫血清（陰性対照）から得られる吸光度に比べて増加することにより、陽性反応を同定した。陽性反応は、検出可能な抗ＢＳ１０６抗体の存在を示した。抗ペプチド抗血清またはモノクロ��ナル抗体の力価を、抗血清の既に記載されている希釈度から求め、算出希釈度と定義した（ここで、Ａ４０５ｎｍ＝０．５　ＯＤ）。表５は、合成ペプチド（免疫原として使用したペプチド）または該半精製発現タンパク質物質（ＢＳ１０６　Ｍ／Ｈ）を使用して調製したモノクローナル抗体培養上清の力価を示す。
【０３３１】
【表５】
2004503208.tif 000007
2004503208.tif 000008
【０３３２】
力価の他に、見掛けアフィニティー［Ｋｄ（ａｐｐ）］も、該抗体のいくつかに関して求めた。この場合、プールし透析した半精製発現タンパク質物質（実施例１１ｂ、Ｅ部に記載のとおりに精製したもの）を、ＰＢＳ中で１：３、１：９、１：２７、１：８１、１：２４３、１：７２９、１：２１８７、１：６５６１および１：１９６８３の希釈度で調製し、１００μｌを、Ｉｍｍｕｌｏｎ２（登録商標）Ｈｉｇｈ　Ｂｉｎｄｉｎｇマイクロタイタープレート（Ｄｙｎｅｘ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃｈａｎｔｉｌｌｙ，ＶＡ）の各ウェル中に配置した。該プレートを室温で１４〜１８時間インキュベートし、ついで脱イオン水で４回洗浄した。リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ，　ｐＨ７．４）中の１２５μｌのＳｕｐｅｒｂｌｏｃｋ（登録商標）（Ｐｉｅｒｃｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）を各ウェルに加え、ついで直ちに該溶液を捨てることにより、該ウェルをブロッキングした。このブロッキング手順を３回行なった。前記実施例１４に記載のとおりにハイブリドーマ培養上清から得たモノクローナル抗体または免疫化ウサギまたはマウスから得た抗血清を、０．０５％　Ｔｗｅｅｎ−２０（モノラウラートポリオキシエチレンエーテル）（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）と０．０５％　アジ化ナトリウムとを含有するＰＢＳ中のタンパク質ブロッキング剤（すなわち、３％　Ｓｕｐｅｒｂｌｏｃｋ（登録商標）溶液）中に適当な希釈度で希釈し、該コート化マイクロタイタープレートの各ウェル内に配置した。ついで該ウェルを室温で１時間インキュベートした。各ウェルを脱イオン水で４回洗浄した。３％　Ｓｕｐｅｒｂｌｏｃｋ（登録商標）溶液中１：２０００に希釈した１００μｌのアルカリホスファターゼ共役ヤギ抗マウスＩｇＧまたはヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ　Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，ＡＢ）を、各ウェルに加えた。該ウェルを室温で１時間インキュベートした。つぎに、各ウェルを脱イオン水で４回洗浄した。ついで１００μｌのパラニトロフェニルホスファート基質（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ　ａｎｄ　Ｐｅｒｒｙ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を各ウェルに加えた。該ウェルを室温で３０分間インキュベートした。各ウェルにおける４０５ｎｍでの吸光度を読取った。ＥＩＡマイクロタイタープレートアッセイの結果を用いて、以下のミカエリス−メンテン式の類似式（Ｖ．Ｖａｎ　Ｈｅｙｎｉｎｇｅｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１２１，ｐ．４７２（１９８６）、さらにＸ　Ｑｕｉら，Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１５６，ｐ．３３５０（１９９６）に記載されている）に基づき、見掛け解離定数（Ｋｄ）を導くことができる。
【数１】
2004503208.tif 000009
（式中、［Ａｇ−Ａｂ］は抗原−抗体複合体の濃度を、［Ａｇ−Ａｂ］ｍａｘは最大複合体濃度を、［Ａｂ］は抗体濃度を、Ｋｄは解離定数であった）。曲線の当てはめの際に、［Ａｇ−Ａｂ］を、所与Ａｂ濃度におけるＯＤ４０５ｎｍの、バックグラウンドを差し引いた値で置換する。に対応するＫｄ、および［Ａｇ−Ａｂ］ｍａｘに対応する［ＯＤ４０５ｎｍ］ｍａｘは共に、適合（ｆｉｔｔｅｄ）パラメーターとして処理した。曲線の当てはめには、ソフトウェアプログラムＯｒｉｇｉｎを使用した。半精製発現タンパク質物質（ＢＳ１０６　Ｍ／Ｈ）を使用して、該モノクローナル抗体（表６）および該ウサギポリクローナル抗体（表５）に関して、見掛けアフィニティー［Ｋｄ（ａｐｐ）］を求めた。
【０３３３】
【表６】
2004503208.tif 000010
【０３３４】
実施例１８：固相粒子のコーティング
Ａ．ＢＳ１０６抗原に特異的に結合する抗体による微粒子のコーティング
１００μｌのカルボキシメチルラテックスミクロスフェア（Ｉｎｔｅｒｆａｃｉａｌ　Ｄｙｎａｍｉｃｓ　１．０ミクロン径，４．２％固体）を、０．１％　Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ１００を含有する１．０ｍｌの５ｍＭ　モルホリノエタンスルホン酸（ＭＥＳ）バッファー（ｐＨ５．６）に懸濁した。該混合物をボルテックスし、ついで約５００×ｇで１分間遠心分離して、該ミクロスフェアを沈降させた。該上清を捨て、該ミクロスフェアを含有するペレットを１．０ｍｌの該ＭＥＳバッファーに再懸濁させた。４０μｌの抗体（ＰＢＳ中３ｍｇ／ｍｌのアフィニティー精製ウサギ抗ＢＳ１０６抗体）および２０μｌの１．０ｍＭ　１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＡＣ）を該再懸濁ミクロスフェアに加えた。該混合物をボルテックスし、室温で５時間にわたり回転させた。該混合物に、４００μｌのＢＳＡバッファー（ＭＥＩＡバッファー（Ａｂｂｏｔｔ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ａｂｂｏｔｔ　Ｐａｒｋ，ＩＬ）中の０．２％　ウシ血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ　Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）および０．０８％　Ｔｗｅｅｎ−２０（登録商標）（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ　Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ））を加えた。該混合物をボルテックスし、前記のとおりに遠心分離し、該上清を捨てた。該ペレットを１．０ｍｌの該ＢＳＡバッファーで２回洗浄した後、４００μｌの同じバッファーに再懸濁させた。
【０３３５】
Ｂ．１／４インチのビーズのコーティング
また、ＢＳ１０６抗原に特異的に結合する抗体を、当技術分野で公知の常法（参照により本明細書に組み入れるＳｎｉｔｍａｎら，米国特許第５，２７３，８８２号）により１／４インチのポリスチレンビーズの表面上にコーティングし、競合結合またはＥＩＡサンドイッチアッセイにおいて使用することができる
【０３３６】
まず、ポリスチレンビーズを、１０ｍＭ　炭酸バッファー（ｐＨ８．０）中で約１５秒間の超音波処理に付すことにより清浄化する。ついで、すべての細粒が除去されるまで、該ビーズを脱イオン水で洗浄する。ついでビーズを、１０ｍＭ　炭酸バッファー（ｐＨ８〜９．５）中の抗体溶液に漬ける。該抗体溶液は、高親和性モノクローナル抗体の場合には１μｇ／ｍｌと同程度に薄くてもよく、あるいはアフィニティー精製されていないポリクローナル抗体の場合には約５００μｇ／ｍｌの濃度と同程度に濃くてもよい。ビーズを、室温で少なくとも１２時間コーティングし、ついで脱イオン水で洗浄する。ビーズは、風乾するか、または湿ったまま保存（ＰＢＳ，ｐＨ７．４中）することができる。また、それらは、タンパク質安定剤（例えば、ショ糖）、または非特異的結合ブロッカー（例えば、無関係なタンパク質、Ｃａｒｎａｔｉｏｎ脱脂乳，Ｓｕｐｅｒｂｌｏｃｋ（登録商標）など）として使用されるタンパク質ブロッキング剤でオーバーコーティングすることができる。
【０３３７】
実施例１９：微粒子酵素イムノアッセイ（ＭＥＩＡ）
標準的な抗原競合ＥＩＡまたは抗体サンドイッチＥＩＡを行ない微粒子（ＭＥＩＡ）などの固相を使用することにより、患者の試験サンプル中のＢＳ１０６抗原を検出する。該アッセイは、ＩＭｘ（Ｒ）　Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｂｂｏｔｔ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ａｂｂｏｔｔ　Ｐａｒｋ，ＩＬ）などの自動分析装置上で行なうことができる。
【０３３８】
Ａ．抗体サンドイッチＥＩＡ
簡単に説明すると、抗原／抗体複合体を形成させるために、ＢＳ１０６抗原を含有する疑いのあるサンプルを、抗ＢＳ１０６抗体でコーティングされた微粒子（実施例１８に記載のとおりに調製したもの）の存在下でインキュベートする。ついで該微粒子を洗浄し、シグナル生成化合物（すなわち、アルカリホスファターゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼなどの酵素）に共役した抗体を含む指示試薬を該抗原／抗体複合体または該微粒子に加え、インキュベートする。該微粒子を洗浄し、該シグナル生成化合物と反応して測定可能なシグナルを生成する基質（例えば、それぞれ４−メチルウンベリフェリルホスファート（ＭＵＰ）またはＯＰＤ／ペルオキシド）を加えることにより該結合抗体／抗原／抗体複合体を検出する。陰性対照から生じたシグナルと比べて上昇した試験サンプル中のシグナルにより、ＢＳ１０６抗原の存在が検出される。該試験サンプル中のＢＳ１０６抗原の存在は、乳癌などの乳房の疾患または状態の診断を示す。
【０３３９】
Ｂ．競合結合アッセイ
該競合結合アッセイでは、抗ペプチド抗体でコーティングされた微粒子に標識ペプチドを接触させた場合に測定可能シグナルを生成するペプチドまたはタンパク質を使用する。このアッセイは、ＩＭｘ（登録商標）Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｂｂｏｔｔ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ａｂｂｏｔｔ　Ｐａｒｋ，ＩＬ）上で行なうことができる。該標識ペプチドを、ＢＳ１０６抗原を含有する疑いのある試験サンプルの存在下、ＢＳ１０６抗体でコーティングされた微粒子（実施例１８に記載のとおりに調製したもの）に加え、標識ＢＳ１０６ペプチド（または標識タンパク質）／結合抗体複合体および／または患者のＢＳ１０６抗原／結合抗体複合体の形成に十分な時間および条件下でインキュベートする。該試験サンプル中のＢＳ１０６抗原は、該微粒子上の結合部位に関して標識ＢＳ１０６ペプチド（またはＢＳ１０６タンパク質）と競合する。該アッセイにおいて、該試験サンプル中のＢＳ１０６抗原は、標識ペプチドまたは抗体でコーティングされた微粒子の結合を低下させる。なぜなら、該試験サンプル中の抗原と、該ＢＳ１０６ペプチドまたはＢＳ１０６タンパク質とが、抗体結合部位に関して競合するからである。低下したシグナル（対照と比べた場合）は、該試験サンプル中のＢＳ１０６抗原の存在を示す。ＢＳ１０６抗原の存在は、乳癌などの乳房の疾患または状態の診断を示唆する。
【０３４０】
本発明で提供し前記で検討したＢＳ１０６ポリヌクレオチドおよびそれにコードされるタンパク質は、乳房組織の疾患、特に乳癌のマーカーとして有用である。血液、血漿、血清などの試験サンプルにおけるこのマーカーの出現に基づく試験は、安価かつ非侵襲的に診断情報を提供して、医師が癌の診断を行なったり療法プロトコールを選択したり又は選択した療法の達成度をモニターするのを助けうる。このマーカーは、血液、尿、糞便などの容易に利用可能な体液中に、免疫学的方法により検出可能な罹患組織由来の抗原として出現しうる。このマーカーは、病態において上昇することが可能であり、病態において変化することが可能であり、あるいは不適当な身体画分中に出現する乳房の正常タンパク質であることが可能である。
【０３４１】
実施例２０：ＢＳ１０６タンパク質の免疫組織学的検出
前記実施例１４に記載のコンセンサスペプチド配列（配列番号２０）に由来するＢＳ１０６合成ペプチドに対する抗血清を使用して、標準的な方法により種々の正常および罹患組織を免疫組織化学的に染色する。簡単に説明すると、組織の凍結ブロックを６ミクロンの切片に切断し、顕微鏡スライド上に載せる。冷アセトン中で固定した後、該切片を室温で乾燥させ、ついでリン酸緩衝食塩水で洗浄し、ブロッキングする。該スライドを、１：５００の希釈度のコンセンサスＢＳ１０６ペプチド配列（配列番号２０）に由来する合成ペプチドに対する抗血清と共にインキュベートし、洗浄し、ビオチン化ヤギ抗ウサギ抗体と共にインキュベートし、再び洗浄し、ホースラディッシュペルオキシダーゼで標識されたアビジンと共にインキュベートする。最終洗浄の後、該スライドを、赤色染色を与える３−アミノ−９−エチルカルバゾール基質と共にインキュベートする。該スライドをヘマトキシリンで対比染色し、マウントし、顕微鏡下で検査する（これは病理学者が行なう）。
【０３４２】
実施例２１：ＢＳ１０６の蛍光偏光イムノアッセイ
Ａ．フルオレセイン誘導体へのＢＳ１０６ペプチドの共役
以下の方法を用いて、配列番号２６のペプチドをフルオレセイン−５−マレイミドに共役させた。１．１ｍｇのＴｒｉｓ−カルボキシエチルホスフィン塩酸および０．３μモルのフルオレセイン−５−マレイミド（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）を１７μｌのジメチルホルムアミドに溶解した。該混合物を、５０μｌの６００ｍＭ　トリエタノールアミンバッファー（ｐＨ７．６）中の０．７５μモルの配列番号２６のペプチドに加えた。該反応を室温で３０分間進行させ、ついで該混合物をＢｉｏｇｅｌ　Ｐ２カラム（８ｍｌ）に通して、より高分子量の共役体を未反応フルオレセインから分離した。該カラムを水中の１０倍希釈のＰＢＳで平衡化した。第１の着色バンドを集めて、５００μｌの黄色溶液を得た。
【０３４３】
以下の方法を用いて、配列番号２６のペプチドを５−カルボキシフルオレセインに共役させた。０．３μモルの５−カルボキシフルオレセインＮＨＳエステル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）を２１μｌのジメチルホルムアミドに溶解した。この混合物を、５０μｌの６００ｍＭ　トリエタノールアミンバッファー（ｐＨ７．６）中の０．７５μモルの配列番号２６のペプチドに加えた。該反応を室温で３０分間進行させ、ついで該混合物をＢｉｏｇｅｌ　Ｐ２カラム（８ｍｌ）に通して、より高分子量の共役体を未反応フルオレセインから分離した。該カラムを水中の１０倍希釈のＰＢＳで平衡化した。第１の着色バンドを集めて、５００μｌの黄色溶液を得た。
【０３４４】
Ｂ．ＢＳ１０６フルオレセイン共役体の精製
Ｎｏｖｅｘ（Ｎｏｖｅｘ，Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）からの調製されたゲルおよびバッファーを使用して、等電点電気泳動により、前記生成物中の異性体共役体を分離した。１．５ｍｇのジチオトレイトールを含有する１５０μｌのＩＥＦサンプルバッファーを、前記共役反応の生成物１５０μｌに加えた。各ゲルに単一のウェルを与えるようにレーン・ディバイダー（ｄｉｖｉｄｅｒ）が除去されたＩＥＦゲルのサンプル区画内に、該混合物を配置した。該ゲルを１００Ｖで６０分間、ついで２００Ｖで６０分間にわたり電気泳動した。その間、該サンプルのそれぞれは、いくつかの狭いバンドに視覚的に分離された。該ゲルカセットを開き、該主要バンドを剃刀刃で切り出し、１．０ｍｌのＰＢＳを含有する培養チューブに移した。室温で３時間インキュベートした後、該色素のほとんどが溶解しているようであった。吸光係数を７３０００Ｍ−１ｃｍ−１と仮定して、各サンプルのフルオレセイン濃度を４９２ｎｍでの吸光度により測定した。
【０３４５】
ＩＭｘ（登録商標）Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｂｂｏｔｔ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ａｂｂｏｔｔ　Ｐａｒｋ，ＩＬ）の蛍光偏光形態を使用して、該共役体の蛍光強度および偏光を測定した。各共役体を１０ｎＭに希釈し、該測定を行い、ついで１．０μｌの該３．０ｍｇ／ｍｌ　アフィニティー精製ウサギ抗ＢＳ１０６を加えた。該混合物をボルテックスし、該測定を繰返した。結果を表７に示す。
【０３４６】
表７に、各共役体のおおよその等電点（ｐＩ）、吸光度測定値（Ａ４９２）、蛍光強度（強度）ならびに正（Ｐｏｌ＋）および負（Ｐｏｌ−）の偏光値を列挙する。共役体Ｎ１−Ｎ５は５−カルボキシフルオレセイン由来であり、Ｍ１−Ｍ３はフルオレセイン−５−マレイミド由来であった。等電ｐＨ標準は使用しなかった。したがって、列挙されているｐＩは、公開されているチャート（Ｎｏｖｅｘ，Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）との比較から推定したものであり、近似値にすぎない。Ａ４９２は、該未希釈溶液の吸光度を意味し、該方法の収量の尺度である。強度は、任意蛍光単位である。Ｐｏｌ−は、抗ＢＳ１０６抗体の不存在下のｍＰ単位の蛍光偏光であり、Ｐｏｌ＋は、該抗体の添加後の偏光である。
【０３４７】
共役体Ｎ５およびＭ３（最低のｐＩを有するものである）が、該抗体の添加に際して蛍光偏光における変化を示さないことが、まず注目される。これらの化合物は、非共役蛍光誘導体に属すると考えられる。共役体Ｍ１およびＭ２は共に、抗体の存在下での蛍光偏光の有意な上昇を示し、該ペプチド中の２つのシステインのいずれかにおける誘導体化に符合する。Ｎ１〜Ｎ４に関する状況は、それほど明らかではない。配列番号２６のペプチドは、該フルオレセイン誘導体との反応に利用可能な３個のアミン（２個のリシン＋Ｎ末端）を含有するため、３個の主要共役体のみが存在するはずである。しかし、全４個が該抗体への有意な結合を示している。
【０３４８】
【表７】
2004503208.tif 000011
【０３４９】
これらの共役体は、ＢＳ１０６のＣ末端に対する抗体の試験、および生物学的流体中のＢＳ１０６濃度を測定する競合イムノアッセイにおいて有用であった。図１５においては、２．０ｎＭの該共役体を含有する１．０ｍｌのサンプルを、該アフィニティー精製ウサギ抗ＢＳ１０６および該マウスモノクローナル抗体Ｈ３９Ｃ５１およびＨ９Ｃ２９で滴定（力価測定）した。該偏光は、抗体の添加と共に急速に増加し、該溶液が飽和するにつれて横ばいになった。最大偏光は、該複合体中のフルオレセイン部分の環境に依存する該共役体および該抗体に特徴的なものである。興味深いことに、該ウサギ抗体で最高限界（ｌｉｍｉｔｉｎｇ）偏光を示した共役体Ｎ２は、それらの両方のモノクローナル抗体では最低の１つを示した。それらは別々の融合体に由来したが、それらの２つのモノクローナル抗体は、すべての共役体に関してほぼ同一の滴定プロットを示し、このことは、該結合部位の強い類似性を示唆している。
【０３５０】
Ｃ．フルオレセイン共役体を使用するＢＳ１０６の蛍光偏光イムノアッセイ
配列番号２６ペプチド−フルオレセイン共役体（Ｍ１）を競合体として使用して、競合アッセイを行った。使用した抗体はモノクローナル抗体Ｈ２４Ｃ１６であった。該抗体［４００μｌのＦＰＩＡ希釈剤（Ａｂｂｏｔｔ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ａｂｂｏｔｔ　Ｐａｒｋ，ＩＬ）中０．４μｇ／ｍｌ］および該サンプルまたは標準を混合し、室温で２０分間インキュベートするように、該アッセイを設計した。ついで該競合体（共役体Ｍ１）を加え、該偏光を測定した。既知量の配列番号２６のペプチドを使用して、標準曲線を得た。示されている試験サンプルは、人乳のアフィニティー精製の産物であった（実施例２２Ｄ）。結果を表８に示す。
【０３５１】
【表８】
2004503208.tif 000012
【０３５２】
４パラメーター・ログ−ロジット曲線フィッティング法を用いて、該偏光結果を評価して、該キュベット中の被検体のｐｍｏｌを得、それを添加サンプルの容量で割り算して、μＭ単位のその濃度を得た。該結果は、乳から単離したＢＳ１０６タンパク質と配列番号２６ペプチド−フルオレセイン共役体（これは、該抗体上の結合部位に関してそれと競合する）との間の相違に該アッセイが不感受性であると仮定して算出されている。明白な手段によるＢＳ１０６タンパク質の単離およびその濃度の測定は、信頼されうる程度に正確な未知サンプル濃度を得るためにこのイムノアッセイ形態で使用されうる標準を与えるであろう。
【０３５３】
実施例２２：ＢＳ１０６のアフィニティー精製
Ａ．ＢＳ１０６の精製のためのＡｍｉｎｏ−Ｌｉｎｋ（商標）アフィニティーカラムの調製
アフィニティー精製ウサギ抗ＢＳ１０６抗体をＡｍｉｎｏ−Ｌｉｎｋ（商標）ゲル（Ｐｉｅｒｃｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）に、該製造業者の指示に従い共役させた。簡単に説明すると、６．５ｍｇのアフィニティー精製ウサギ抗ＢＳ１０６抗体（４．５ｍｌのＰＢＳ中）を、クエン酸塩／炭酸塩バッファー（ｐＨ１０）で平衡化した脱塩カラムに通した。該溶出物を、クエン酸塩／炭酸塩バッファーで平衡化した２．０ｍｌのＡｍｉｎｏＬｉｎｋゲルを含有するカラム上に配置した。該抗体およびゲルを含有するカラムを室温で４時間にわたり回転させ、排液し、５ｍｌのＰＢＳで洗浄した。該カラムを排液した後、２．０ｍｌのＰＢＳおよび４０μｌの５Ｍ　シアノホウ水素化ナトリウムを加えた。該カラムを室温で４時間にわたり回転させ、排液し、５ｍｌのＰｉｅｒｃｅ洗浄バッファーで洗浄した。該カラムを使用する準備が整った。
【０３５４】
Ｂ．ＢＳ１０６の精製のためのＳｕｌｆｏ−Ｌｉｎｋ（商標）アフィニティーカラムの調製
アフィニティー精製ウサギ抗ＢＳ１０６抗体をＳｕｌｆｏ−Ｌｉｎｋ（商標）ゲル（Ｐｉｅｒｃｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）に、該製造業者の指示に従い共役させた。簡単に説明すると、８．６ｍｇのアフィニティー精製ウサギ抗ＢＳ１０６抗体（２ｍｌの１００ｍＭ　リン酸ナトリウム、５ｍＭ　ＥＤＴＡ（ｐＨ６．０）中）を、１４ｍｇのメルカプトエチルアミン塩酸で３７℃で９０分間にわたり還元した。該反応混合物を１０ｍｌのＫｗｉｋ（商標）カラム上で脱塩し、真空脱気された共役バッファー中に配置した。該還元タンパク質を、脱気共役バッファーで予め洗浄された２ｍｌのＳｕｌｆｏ−Ｌｉｎｋ（商標）カラムに移した。該ゲル−タンパク質混合物を、室温で１５分間の反転により混合し、３０分間沈降させた。非共役タンパク質を含有するバッファーを集め、該カラムを６ｍｌの共役バッファーで洗浄した。１５．８ｍｇの塩酸システインを含有する２．０ｍｌの共役バッファーと共に該ゲルを１５分間攪拌することにより、該カラム上の残存結合部位をブロッキングした。該ゲルを３０分間沈降させ、ついで排液し、１０ｍｌのＰＢＳで洗浄した。該カラムを使用する準備が整った。
【０３５５】
Ｃ．一過性トランスフェクションからのＢＳ１０６のアフィニティー精製
ＢＳ１０６の一過性トランスフェクション（実施例１１ｃに記載のとおり）からの１５ｍｌの培養上清を、該ウサギ抗ＢＳ１０６　Ａｍｉｎｏ−Ｌｉｎｋ（商標）カラムに通した。該カラムを５ｍｌのＰＢＳで洗浄し、該タンパク質を４ｍｌの１００ｍＭ　グリシン（ｐＨ２．１）で洗浄した。中和用の３００μｌの１．０Ｍ　Ｔｒｉｓ塩基を含有するチューブ中に、該溶出タンパク質を集めた。
【０３５６】
Ｏ結合型糖に結合するレクチンを使用して、該タンパク質を更に精製した。Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）のＰＢＳ中で平衡化した５．０ｍｌのジャカリン（ｊａｃａｌｉｎ）アガロースを含有するカラムに該溶出液を通して、該グリコシル化タンパク質を結合させた。該カラムを２０ｍｌのＰＢＳで洗浄し、該産物をＰＢＳ中の１０％　メリビオース（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）で溶出した。該産物を４．０〜７．０ｍｌの画分に濃縮し、ＰＢＳで平衡化した１０ｍｌの脱塩カラムに通した。該脱塩産物を、Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ　１０　遠心濃縮器（Ａｍｉｃｏｎ，Ｂｅｖｅｒｌｙ　ＭＡ）を使用して０．５ｍｌに濃縮して、２８０ｎｍで０．９１の吸光度値を得た。
【０３５７】
Ｄ．人乳からのＢＳ１０６のアフィニティー精製
１００ｍｌの凍結人乳を融解し、２個の５０ｍｌ　円錐チューブに移し、２０００×ｇで６０分間遠心分離した。該チューブの底付近に穴をあけて、最上部の脂肪層からの濁った水性部分および底部の少量の固体を排出した。５０ｍｌの該水性部分を該ウサギ抗ＢＳ１０６　Ａｍｉｎｏ−Ｌｉｎｋ（商標）カラムに通した。２８０ｎｍでの吸光度が０．００５未満になるまで、該カラムをＰＢＳで洗浄した。該タンパク質を１００ｍＭ　グリシン（ｐＨ２．１５）で溶出した。該溶出液を４００μｌの画分中に集め、それを５０μｌの１．０Ｍ　Ｔｒｉｓ塩基で中和した。２８０ｎｍで少なくとも０．０３の吸光度値を有する画分を合わせ、ＰＢＳで平衡化した０．５ｍｌのジャカリン（ｊａｃａｌｉｎ）アガロース（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を含有するカラムに通した。このカラムを５ｍｌのＰＢＳで洗浄し、該産物をＰＢＳ中の１０％　メリビオースで溶出した。４００μｌ〜１４００μｌで溶出する画分をＰＢＳと共に脱塩カラムに通し、ついでＭｉｃｒｏｃｏｎ　１０　遠心濃縮器（Ａｍｉｃｏｎ，Ｂｅｖｅｒｌｙ　ＭＡ）で２５０μｌに濃縮した。該溶液の２８０ｎｍでの吸光度は０．０８０であった。
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は、クローン１６６２８８５（配列番号１）、８９３９８８（配列番号２）、９０１４２９（配列番号３）、１２０９８１４（配列番号４）、クローン１６６２８８５の完全長配列［１６６２８８５ｉｎｈ（配列番号５）と称される］、およびそれらに由来するコンセンサス（Ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ）配列（配列番号６）のヌクレオチドアライメントを示す。
【図２】
図２は、重複するクローン１６６２８８５（配列番号１）、８９２９８８（配列番号２）、９０１４２９（配列番号３）、１２０９８１４（配列番号４）、１６６２８８５ｉｎｈ（配列番号５）のヌクレオチドアライメントからのコンセンサスヌクレオチド配列（配列番号６）の形成を表すコンティグ地図を示す。
【図３Ａ】
図３Ａは、ＲＮＡの、臭化エチジウムで染色されたアガロースゲルのスキャン、およびＢＳ１０６放射能標識プローブでのハイブリダイゼーション後のＲＮＡの対応ノーザンブロットを示す。
【図３Ｂ】
図３Ｂは、ＲＮＡの、臭化エチジウムで染色されたアガロースゲルのスキャン、およびＢＳ１０６放射能標識プローブでのハイブリダイゼーション後のＲＮＡの対応ノーザンブロットを示す。
【図４】
図４は、７６個の異なるヒト組織からのポリＡ　ＲＮＡを含有するＣｌｏｎｔｅｃｈ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ．Ｉｎｃ．，Ｐａｌｏ　Ａｌｔｏ，ＣＡ）Ｍｕｌｔｉｐｌｅ　Ｔｉｓｓｕｅ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　Ａｒｒａｙ（商標）に対するＢＳ１０６プローブの結果を示す。
【図５Ａ】
図５Ａは、ＢＳ１０６　ＲＮＡ特異的ＰＣＲ増幅産物の、ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎで染色されたアガロースゲルのスキャンである。
【図５Ｂ】
図５Ｂは、ＢＳ１０６　ＲＮＡ特異的ＰＣＲ増幅産物の、ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎで染色されたアガロースゲルのスキャンである。
【図６】
図６は、ＬＣｘ（登録商標）（Ａｂｂｏｔｔ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ａｂｂｏｔｔ　Ｐａｒｋ，ＩＬ）アッセイを用いてＭＤＡ　３６１細胞系からの１８ピコグラムのＲＮＡで該ＢＳ１０６アンプリコンが容易に検出されたことを示している。
【図７】
図７は、ＬＣｘ（登録商標）系アッセイを用いた場合のＢＳ１０６マーカーに関する全組織分布を示す。
【図８】
図８は、ＢＳ１０６抗ｍｙｃエピトープモノクローナル抗体でのＨＥＫ２９３細胞産物のウエスタンブロットを示す。
【図９】
図９は、ｍｙｃエピトープを認識するモノクローナル抗体を使用してニッケルキレートカラムから集めた画分のドットブロットを示す。
【図１０】
図１０は、ＢＳ１０６　Ｍ／Ｈの存在に関して分析した、プールし透析し半精製した上清ウエスタンブロットを示す。
【図１１Ａ】
図１１Ａは、パネルＡにおける抗ｍｙｃモノクローナル抗体およびパネルＢにおける抗Ｂ１０６ポリクローナル抗血清の両方を使用するウエスタンブロットにより分析した、プールし精製したＢＳ１０６　Ｍ／Ｈを示す。
【図１１Ｂ】
図１１Ｂは、パネルＡにおける抗ｍｙｃモノクローナル抗体およびパネルＢにおける抗Ｂ１０６ポリクローナル抗血清の両方を使用するウエスタンブロットにより分析した、プールし精製したＢＳ１０６　Ｍ／Ｈを示す。
【図１２】
図１２は、ＢＳ１０６ペプチド（配列番号２６）に対するモノクローナル抗体（Ｈ９Ｃ２９）を使用して組織抽出物のパネル上で行ったウエスタンブロットの結果を示す。
【図１３Ａ】
図１３Ａは、アフィニティー精製されたウサギ抗ＢＳ１０６抗体に対する還元された及び還元されていない人乳画分のウエスタンブロットを示す。
【図１３Ｂ】
図１３Ｂは、アフィニティー精製されたウサギ抗ＢＳ１０６抗体に対する還元された及び還元されていない人乳画分のウエスタンブロットを示す。
【図１４】
図１４は、ＢＳ１０６抗体での生物学的サンプルのウエスタンブロットを示す。
【図１５Ａ】
図１５Ａは、アフィニティー精製されたウサギ抗ＢＳ１０６ならびにマウスＢＳ１０６モノクローナル抗体Ｈ３９Ｃ５１およびＨ９Ｃ２９で滴定したＢＳ１０６フルオレセイン共役体のサンプルを示す。
【図１５Ｂ】
図１５Ｂは、アフィニティー精製されたウサギ抗ＢＳ１０６ならびにマウスＢＳ１０６モノクローナル抗体Ｈ３９Ｃ５１およびＨ９Ｃ２９で滴定したＢＳ１０６フルオレセイン共役体のサンプルを示す。
【図１５Ｃ】
図１５Ｃは、アフィニティー精製されたウサギ抗ＢＳ１０６ならびにマウスＢＳ１０６モノクローナル抗体Ｈ３９Ｃ５１およびＨ９Ｃ２９で滴定したＢＳ１０６フルオレセイン共役体のサンプルを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１５Ｃ】
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【国際公開パンフレット】
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2004503208.tif 000190
2004503208.tif 000191
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004503208.tif 000192
【国際調査報告】
2004503208.tif 000193
2004503208.tif 000194
2004503208.tif 000195
2004503208.tif 000196