(57)【要約】ＣＲＦ神経ペプチド系統に対してかなりの配列相同性を有するヒト・ウロコルチン関連ペプチドが確認された。明細書中ではウロコルチンＩＩと呼ばれる３８アミノ酸ペプチド蛋白質を含むマウスｃＤＮＡが総脳ポリ（Ａ＋）ＲＮＡから単離された。ヒト・ウロコルチン関連ペプチド及びマウス系列メンバー、ＣＲＦ及びウロコルチン（Ｕｃｎ）。これらのペプチドは基底及びストレス状態で視床下部下垂体副腎軸索の調節に関与しており、ＵＲＰ及びＵｃｎＩＩに対する同様の役割を示唆している。合成されたウロコルチンＩＩ及びウロコルチン関連ペプチドはＣＲＦ−Ｒ１ウロコルチンＩＩに対してより高い親和性でＣＲＦ−Ｒ２と結合し、このことはヒト・ウロコルチン関連ペプチドが体温と食欲の調節に関与していること、そしてその他のストレスに関連した現象で一定の役割を果たしていることを示唆している。これらの知見はウロコルチンＩＩとヒト・ウロコルチン関連ペプチドを中枢的に発現され、ＣＲＦ−Ｒ２と結合する神経ペプチドのＣＲＦ系列の新しいメンバーであることを示している。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）ウロコルチンＩＩ蛋白質をコードする単離精製されたＤＮＡと、
（ｂ）高度に厳しい条件の下で上記（ａ）の単離されたＤＮＡのアンチセンス補体にハイブリダイズする単離精製されたＤＮＡにおいて、前記高度に厳しい条件が機能的には６５℃で０．１　ｘ　ＳＳＣに相当する高温及び低塩濃度での膜洗浄として特徴付けられ、前記ＤＮＡがウロコルチンＩＩ蛋白質をコードすることを特徴とする、単離精製されたＤＮＡと、そして
（ｃ）遺伝子コードの変質によってコドン配列が上記（ａ）及び（ｂ）の単離されたＤＮＡと異なっており、ウロコルチンＩＩ蛋白質をコードする単離精製されたＤＮＡと
で構成される群から選択されるウロコルチンＩＩをコードするＤＮＡ。
【請求項２】
前記ＤＮＡが配列識別番号Ｎｏ．１０のアミノ酸配列のウロコルチンＩＩ蛋白質前駆体ペプチドをコードすることを特徴とする請求項１記載のＤＮＡ。
【請求項３】
前記ＤＮＡがウロコルチンＩＩ蛋白質をコードし、前記蛋白質が識別番号Ｎｏ．１１のアミノ酸配列を有していることを特徴とする請求項１記載のＤＮＡ。
【請求項４】
請求項１記載のＤＮＡを発現することができるベクターにおいて、前記ベクターが前記ＤＮＡと細胞内での前記ＤＮＡ発現に必要な調節要素を含んでいることを特徴とするベクター。
【請求項５】
前記ＤＮＡが配列識別番号Ｎｏ．１１に示される上記アミノ酸配列を有するウロコルチンＩＩ蛋白質をコードすることを特徴とする請求項４記載のベクター。
【請求項６】
ウロコルチンＩＩ蛋白質を発現する請求項４記載のベクターでトランスフェクトされたホスト細胞。
【請求項７】
前記細胞はバクテリア細胞、哺乳動物細胞、植物細胞、そして昆虫細胞で構成される群から選択されることを特徴とする請求項６記載のホスト細胞。
【請求項８】
前記バクテリア細胞が大腸菌であることを特徴とする請求項７記載のホスト細胞。
【請求項９】
（ａ）ウロコルチンＩＩ蛋白質をコードする単離精製されたＤＮＡと、
（ｂ）高度に厳しい条件で上記（ａ）の単離されたＤＮＡのアンチセンス補体にハイブリダイズする単離精製されたＤＮＡにおいて、前記高度に厳しい条件が機能的には６５℃で０．１　ｘ　ＳＳＣに相当する高温及び低塩濃度での膜洗浄として特徴付けられ、前記ＤＮＡがウロコルチンＩＩ蛋白質をコードすることを特徴とする、単離精製されたＤＮＡと、そして
（ｃ）遺伝子コードの変質によってコドン配列が上記（ａ）及び（ｂ）の単離されたＤＮＡと異なっており、ウロコルチンＩＩ蛋白質をコードする単離精製されたＤＮＡと
で構成される群から選択されるＤＮＡでコードされた単離精製されたウロコルチンＩＩ蛋白質。
【請求項１０】
配列識別番号Ｎｏ．１１に示されるアミノ酸配列を有する請求項９記載の単離精製されたウロコルチンＩＩ蛋白質。
【請求項１１】
請求項９記載のウロコルチンＩＩ蛋白質に対する抗体。
【請求項１２】
前記抗体がモノクローナル抗体であることを特徴とする請求項１１記載の抗体。
【請求項１３】
請求項９記載のウロコルチンＩＩ蛋白質と薬学的に許容される基剤で構成される医薬品組成物。
【請求項１４】
請求項１３記載の医薬品組成物をそうした治療を必要とする個人に投与するステップを含む病理生理状態を治療するための方法。
【請求項１５】
前記病理生理状態が高体温、食欲失調、鬱血性心不全、ストレス、不安症、望ましくない程度の低レベルのＡＣＴＨ分泌で構成される群から選択されることを特徴とする請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
（ａ）ヒト・ウロコルチン関連ペプチド蛋白質をコードする精製単離されたＤＮＡと、
（ｂ）高度に厳しい条件で上記（ａ）の単離されたＤＮＡのアンチセンス補体にハイブリダイズする単離精製されたＤＮＡにおいて、前記高度に厳しい条件が機能的には６５℃で０．１　ｘ　ＳＳＣに相当する高温及び低塩濃度での膜洗浄として特徴付けられ、前記ＤＮＡがヒト・ウロコルチン関連ペプチド蛋白質をコードすることを特徴とする、単離精製されたＤＮＡと、そして
（ｃ）遺伝子コードの変質によってコドン配列が上記（ａ）及び（ｂ）の単離されたＤＮＡと異なっており、ヒト・ウロコルチン関連ペプチド蛋白質をコードする単離精製されたＤＮＡと
で構成される群から選択されるヒト・ウロコルチン関連ペプチド蛋白質をコードするＤＮＡ。
【請求項１７】
前記ＤＮＡが配列識別番号Ｎｏ．１に示される配列を有していることを特徴とする請求項１６記載のＤＮＡ。
【請求項１８】
前記ＤＮＡが配列識別番号Ｎｏ．２のアミノ酸配列のヒト・ウロコルチン関連ペプチド蛋白質をコードすることを特徴とする請求項１６記載のＤＮＡ。
【請求項１９】
前記ＤＮＡがヒト・ウロコルチン関連ペプチド蛋白質をコードし、前記蛋白質が配列識別番号Ｎｏ．３のアミノ酸配列を有していることを特徴とする請求項１６記載のＤＮＡ。
【請求項２０】
請求項１６記載のＤＮＡを発現することができるベクターにおいて、前記ベクターが前記ＤＮＡと細胞内での前記ＤＮＡの発現に必要な調節要素で構成されていることを特徴とするベクター。
【請求項２１】
前記ＤＮＡが配列識別番号Ｎｏ．３に示されるアミノ酸配列を有するヒト・ウロコルチン関連ペプチド蛋白質をコードすることを特徴とする請求項２０記載のベクター。
【請求項２２】
請求項２０記載のベクターでトランスフェクトされたホスト細胞において、前記ベクターがヒト・ウロコルチン関連ペプチド蛋白質を発現することを特徴とするホスト細胞。
【請求項２３】
前記細胞がバクテリア細胞、哺乳動物細胞、植物細胞、及び昆虫細胞によって構成される群から選択されることを特徴とする請求項２２記載のホスト細胞。
【請求項２４】
前記バクテリア細胞が大腸菌であることを特徴とする請求項２３記載のホスト細胞。
【請求項２５】
（ａ）ヒト・ウロコルチン関連ペプチド蛋白質をコードする単離精製されたＤＮＡと、
（ｂ）高度に厳しい条件で上記（ａ）の単離されたＤＮＡのアンチセンス補体にハイブリダイズする単離精製されたＤＮＡにおいて、前記高度に厳しい条件が機能的には６５℃で０．１　ｘ　ＳＳＣに相当する高温及び低塩濃度での膜洗浄として特徴付けられ、前記ＤＮＡがヒト・ウロコルチン関連ペプチド蛋白質をコードすることを特徴とする、単離精製されたＤＮＡと、そして
（ｃ）遺伝子コードの変質によってコドン配列が上記（ａ）及び（ｂ）の単離されたＤＮＡと異なっており、ヒト・ウロコルチン関連ペプチド蛋白質をコードする単離精製されたＤＮＡと
で構成される群から選択されるＤＮＡによってコードされる単離精製されたヒト・ウロコルチン関連ペプチド蛋白質。
【請求項２６】
配列識別番号Ｎｏ．３に示されるアミノ酸配列を有する請求項２５記載の単離精製されたヒト・ウロコルチン関連ペプチド蛋白質。
【請求項２７】
請求項２５記載のヒト・ウロコルチン関連ペプチド蛋白質に向けられた抗体。
【請求項２８】
前記抗体がモノクローナル抗体であることを特徴とする請求項２７記載の抗体。
【請求項２９】
請求項２５記載のヒト・ウロコルチン関連ペプチド蛋白質と薬学的に許容される基剤で構成される医薬品組成物。
【請求項３０】
請求項２９記載の医薬品組成物をそうした治療を必要とする個人に投与するステップを含む病理生理状態を治療するための方法。
【請求項３１】
前記病理生理状態が高体温、食欲失調、鬱血性心不全、ストレス、不安症、望ましくない程度の低レベルのＡＣＴＨ分泌で構成される群から選択されることを特徴とする請求項３０記載の方法。
【請求項３２】
修飾蛋白質において、前記蛋白質がウロコルチンＩＩとヒト・ウロコルチン関連ペプチド蛋白質で構成される群から選択されることを特徴とする修飾蛋白質。
【請求項３３】
前記蛋白質がチロシン残基を含むように突然変異されていることを特徴とする請求項３２記載の蛋白質。
【請求項３４】
前記蛋白質が前記蛋白質Ｎ末端へのＴｙｒ−Ｇｌｙから構成される配列の追加によって修飾されていることを特徴とする請求項３２記載の蛋白質。
【請求項３５】
前記蛋白質がＮ末端欠失によって修飾されており、前記欠失が上記第１のアミノ酸、上記第１及び第２のアミノ酸、上記第１から第３までのアミノ酸、上記第１から第４までのアミノ酸、そして第１から第５までのアミノ酸によって構成される群から選択されることを特徴とする請求項３２記載の蛋白質。
【請求項３６】
前記蛋白質が配列識別番号Ｎｏ．３及び配列識別番号Ｎｏ．１１の配列で構成される群あるいは蛋白質から選択され、前記蛋白質の位置９に対応するイソロイシン残基が『Ｄ形』異性体アミノ酸によって置換されていることを特徴とする請求項３２記載の蛋白質。
【請求項３７】
上記『Ｄ形』異性体アミノ酸がＤ−イソロイシン、Ｄ−フェニルアラニン、及びＤ−ロイシンで構成される群から選択されることを特徴とする請求項３６記載の蛋白質。
【請求項３８】
前記蛋白質が配列識別番号Ｎｏ．１１の配列のウロコルチンＩＩと配列識別番号Ｎｏ．１１の配列のヒト・ウロコルチン関連蛋白質で構成される群から選択され、前記蛋白質の位置１７に対応するグルタミン酸残基がＤグルタミン酸で置換されていることを特徴とする請求項３２記載の蛋白質。
【請求項３９】
アミノ酸が先行技術で周知の非標準アミノ酸で置換されていることを特徴とする請求項３２記載の蛋白質。
【請求項４０】
上記非標準アミノ酸がＣα−メチル化ロイシン、Ｃα−メチル化アラニン、Ｎ−イムベンジルヒスチジン、４−ヒドロキシプロライン、５−ヒドロキシリシン、３−メチルヒスチジン、ホモセリン、及びオルニチンで構成される群から選択されることを特徴とする請求項３９記載の蛋白質。
【請求項４１】
前記蛋白質が前記蛋白質のＮ末端でアシル化されていることを特徴とする請求項３２記載の蛋白質。
【請求項４２】
前記蛋白質が脂肪酸でアシル化されていることを特徴とする請求項３２記載の蛋白質。
【請求項４３】
前記蛋白質が蛍光性ラベルを含むように修飾されている請求項３２記載の蛋白質。
【請求項４４】
毒素に結合されている請求項３２記載の蛋白質の接合体。
【請求項４５】
放射性核種に対する錯化剤と請求項３２記載の蛋白質の接合体。
【請求項４６】
放射性核種で錯体化された請求項４５記載の接合体。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（連邦政府からの資金援助について）
本発明は一部連邦政府からの資金援助第ＤＫ−２６７４１を用いて行われたものである。従って、本発明に対して連邦政府は一定の権利を有している。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は一般的には神経内分泌学及びストレスに関与するメカニズムの分野に関するものである。より具体的には、本発明はストレス反応に関与する新しいコルチコトロピン放出因子関連蛋白質、ウロコルチンＩＩ及びヒトのウロコルチン関連蛋白質に関するものである。
【０００３】
（関連技術の説明）
コルチコトロピン放出因子（ＣＲＦ）はタイプ１　ＣＲＦレセプタ（１）によって媒介される効果であるストレスに対する下垂体アドレナリン反応の開始における不可欠の役割で最も良く知られている４１アミノ酸ペプチドである。さらに、コルチコトロピン放出因子は脳において広範囲に分布しており、種々の脅迫状況に対する相補的自律神経系及び行動上の調節の起動に関与していることが繰り返し示されている（２、３）。このことがコルチコトロピン放出因子とその関連するペプチド系統が基底及びストレス状態での視床下部下垂体副腎軸（ＨＰＡ）の調節に重要な役割を果たしているという広く支持されている仮設を広めることとなった（４、５）。コルチコトロピン放出因子が多くの組織における他の神経内分泌及び傍分泌反応にも関与しているとも考えられている。ＣＲＦ系統のメンバーはストレス因子に対して内分泌性、自律神経性及び行動上の反応を一体化して示す。これらのペプチドは食欲、覚醒、及び認知機能の制御にも関与している可能性も考えられる。不安症、拒食症、及び鬱などのストレスの長期の影響の結果として重大な心理上、生理上の結果が起きる場合がある。
【０００４】
コルチコトロピン放出因子系統のメンバーは高い親和性でＣＲＦレセプタに特異的に結合することによってそれらの生物学的作用を仲介する（６、７）。ＣＲＦレセプタはアデニレート・シクラーゼを通じて作用し、構造的にその分泌物系統に関係しているＧ蛋白質結合レセプタである。この系統はＧＲＦ、ＶＩＰ、ＰＴＨ、及びカルシトニン・レセプタも含んでいる。ＣＲＦレセプタ遺伝子は１３のエクソンを有しており、このレセプタのいくつかのスプライス変種が見つかっている。ＣＲＦ−Ｒ１レセプタは脳全体に分布しており、感覚及び運動中継サイトでも見られる（８）。ＣＲＦ−Ｒ２αは横隔膜、腹側中間視床下部、孤束の核、及び背部縫線核に分布しており、これらはＣＲＦ−Ｒ１がほとんど、あるいはまったく発現されない領域である（９）。ＣＲＦ−Ｒ２βはほとんどの場合、心臓、血管、胃腸管、精巣上体、肺及び皮膚を含む抹消サイトに見出される（７、１０）。これら２つのタイプのレセプタの薬学的特徴はコルチコトロピン放出因子がＣＲＦ−Ｒ２に対しては低い親和性（Ｋｉ＝１５−１００ｎＭ）を示し、ＣＲＦ−Ｒ１に対しては高い親和性（Ｋｉ＝１−２ｎＭ）を示す点である。コイ・ウロテンシン、カエル・ソウヴァジン（ｓａｕｖａｇｉｎｅ）、及びウロコルチンはＣＲＦ−Ｒ２に対して高い親和性を有している。ＣＲＦ−Ｒ２ノックアウト・マウスはストレス因子に対する過敏性によって引き起こされる不安症状挙動の増大傾向を示す（１１）。
【０００５】
ストレス上の自律神経性及び挙動反応の誘発におけるペプチド作用のサイトとして認められている多数の細胞グループは必要なリガンド、レセプタ、あるいはそれらの両方の発現を欠いている、あるいは貧弱であることが認められている（１２、１３）。このことはさらに別のＣＲＦ関連情報伝達分子を探す研究を加速させており、現段階では２つの異なった遺伝子（ＣＲＦ−Ｒ１とＣＲＦ−Ｒ２）から誘導されたＧ蛋白質結合レセプタと、その機能がまだ完全には解明されていない結合蛋白質の２つのリガンドが見つかっている（１４、１５）。
【０００６】
第２の哺乳動物ＣＲＦ関連神経ペプチドであるウロコルチン（Ｕｃｎ）が最近発見され（１６）、両方の知られているＣＲＦレセプタによって高い親和性で結合されるのに対して、ＣＲＦはＣＲＦ−Ｒ１によって高度に優先的に結合されることが示されている。主に投与されるウロコルチンは食欲抑制においてはＣＲＦより強力な作用を示すが、急性不安症状効果と一般的な挙動活性化の発生においてはそれ程でもない（１７）。このことはウロコルチンが少なくとも部分的にＣＲＦ−Ｒ２に対する内発性リガンドとして機能することで当初ＣＲＦの作用とされていた一部のストレスを媒介するのかもしれないと受け取れられている。しかしながら、この見解に対しては、脳におけるウロコルチン発現の主要細胞台座が中心的なストレス関連回路の不可分の構成要素としては認められないこと、そしてＣＲＦ−Ｒ２発現のほとんどのサイトがウロコルチン含有突起物によって刺激を受けることが少ないという観察結果に基づく反論も提出されている（１８）。これら及びその他の知見は哺乳動物の脳における１つ以上のさらに別のＣＲＦレセプタ・リガンドの存在の可能性を示唆している。
【０００７】
先行技術はさらに別のウロコルチン遺伝子及び蛋白質の認識が欠如している点で不十分である。本発明はこの技術分野における長年のニーズと願望を果たすものである。
【０００８】
（発明の要約）
ヒト及びマウス・ゲノム両方の配列データの蓄積が急激に進んだことから多くの蛋白質系列の新しいメンバーの識別が可能になってきている。新しいペプチド配列であるヒト・ウロコルチン関連ペプチド（ＵＲＰ）は公開されているヒト・ゲノム・データベースから識別されたものである。このウロコルチン関連ペプチド配列はヒト・ウロコルチン（４４％）、コイ・ウロコルチン（３９％）、そしてヒトＣＲＦ（３６％）との相同性を有している。合成されたウロコルチン関連ペプチドはＣＲＦ−Ｒ１（Ｋｉ＝７０ｎＭ）より高い親和性（Ｋｉ＝０．５ｎＭ）でＣＲＦ−Ｒ２に対してペプチド結合する。ヒト・ウロコルチン関連ペプチドはウロコルチンあるいはＣＲＦと比較してその程度はかなり低いがラット脳下垂体前葉細胞からのＡＣＴＨ分泌を促進する。配列相同性検索ツールを用いて、３８アミノ酸ペプチドをコードするマウス遺伝子も確認され、これは神経ペプチドのＣＲＦ系列の新しいメンバーである。ウロコルチンＩＩ（Ｕｃｎ ＩＩ）と命名されたこのペプチドはそれが高い選択性でＣＲＦ−Ｒ２と結合する点で他の知られている系列メンバーとは違っている。ラットの脳にウロコルチンＩＩが存在している証拠は免疫組織学研究とウロコルチンＩＩに対して高い特異性を示す抗体を用いたｉｎ　ｓｉｔｕでのハイブリダーゼーション研究の両方で示されている。
【０００９】
本発明の１つの実施の形態で、ウロコルチンＩＩをコードするＤＮＡ配列が提供される。この配列は単離精製されたウロコルチンＩＩをコードするＤＮＡ；単離精製された、（機能的には６５℃で０．１　ｘ　ＳＳＣに相当する高温及び低塩分濃度での膜洗浄と定義される）高度に厳しい条件でウロコルチンＩＩ　ＤＮＡのアンチセンス補体にハイブリダイズするＤＮＡ；ウロコルチンＩＩをコードするが、遺伝子コードの劣化の故に配列が異なっている単離精製されたＤＮＡで構成される群から選択される。このＤＮＡは配列識別番号Ｎｏ．１０に示されるアミノ酸配列を有する蛋白質前駆体をコードする。
【００１０】
本発明の別の好ましい実施の形態において、本発明はウロコルチンＩＩを発現することができるベクターに向けられている。そうしたベクターはウロコルチンＩＩをコードするＤＮＡと細胞内でのウロコルチンＩＩの発現に必要な調節要素で構成されている。１つの好ましい実施の形態で、このベクターは配列識別番号Ｎｏ．１１のアミノ酸配列の蛋白質をコードする。本発明はそうしたベクターによってトランスフェクトされ、それからのウロコルチンＩＩを発現するホスト細胞にも関係している。上記蛋白質はバクテリア細胞、哺乳動物細胞、植物細胞、そして昆虫細胞から選択される細胞タイプで発現されてもよい。１つの好ましい実施の形態で、上記蛋白質は大腸菌で発現される。
【００１１】
本発明のさらに別の実施の形態で、上に述べたようなＤＮＡからコードされ、単離精製されたヒト・ウロコルチンＩＩが提供される。好ましくは、上記精製ヒト・ウロコルチン関連ペプチドは配列識別番号Ｎｏ．１１に対応するアミノ酸配列を有している。
【００１２】
本発明の別の実施の形態で、上記ウロコルチンＩＩ蛋白質に対する抗体が提供される。この抗体はモノクローナル抗体である。
【００１３】
本発明のさらに別の実施の形態で、ウロコルチンＩＩ蛋白質で構成される医薬品組成物が提供される。そうした医薬品組成物は体温を低下させ、食欲を減退させ、鬱血性心臓疾患及び種々のストレス関連不全の治療あるいは予防のために用いることができる。
【００１４】
本発明のさらに別の実施の形態で、ヒト・ウロコルチン関連ペプチドをコードするＤＮＡ配列が提供される。この配列はヒト・ウロコルチン関連ペプチドをコードする単離精製されたＤＮＡ；（機能的には６５℃で０．１　ｘ　ＳＳＣに相当する高温及び低塩分濃度での膜洗浄として定義される）高度に厳しい条件で上記ヒト・ウロコルチン関連ペプチドＤＮＡのアンチセンス補体にハイブリダイズする単離精製されたＤＮＡ；そして、ウロコルチンＩＩをコードするが、遺伝子コードの変質の故に配列が異なっている単離精製されたＤＮＡで構成される群から選択される。このＤＮＡは好ましくは配列識別番号Ｎｏ．１に示される配列を有しており、そして配列識別番号Ｎｏ．２に示されるアミノ酸配列を有する蛋白質前駆体をコードする。
【００１５】
本発明の別の実施の形態で、本発明はヒト・ウロコルチン関連ペプチドを発現することができるベクターに関連している。こうしたベクターはこうしたベクターはヒト・ウロコルチン関連ペプチドをコードするＤＮＡと細胞内でのヒト・ウロコルチン関連ペプチドの発現に必要な調節要素で構成されている。１つの好ましい実施の形態で、このベクターは配列識別番号Ｎｏ．３のアミノ酸配列の蛋白質をコードする。この発明はそうしたベクターによってトランスフェクトされ、それからのヒト・ウロコルチン関連ペプチドを発現するホスト細胞にも関係している。この蛋白質はバクテリア細胞、哺乳動物細胞、植物細胞、そして昆虫細胞から選択される細胞タイプで発現されてもよい。１つの好ましい実施の形態で、上記蛋白質は大腸菌内で発現される。
【００１６】
本発明の１つの実施の形態で、上に述べたようなＤＮＡからコードされた、単離精製されたヒト・ウロコルチン関連ペプチド蛋白質が提供される。好ましくは、上記精製されたヒト・ウロコルチン関連ペプチドは配列識別番号Ｎｏ．３に対応するアミノ酸配列を有する。
【００１７】
本発明のさらに別の実施の形態で、上記ヒト・ウロコルチン関連ペプチドに対する抗体が提供される。この抗体はモノクローナル抗体である。
【００１８】
本発明のさらに別の実施の形態で、ヒト・ウロコルチン関連ペプチドで構成される医薬品組成物が提供される。そうした医薬品組成物は体温を低下させ、食欲を減退させ、鬱血性心臓疾患及び種々のストレス関連不全の治療あるいは予防のために用いることができる。
【００１９】
本発明の別の実施の形態で、配列及び蛋白質の個々のアミノ酸に対する修飾を含む上記ウロコルチンＩＩ及びヒト・ウロコルチン関連ペプチド蛋白質に対する種々の修飾について述べる。そうした修飾にはウロコルチンＩＩ及びヒト・ウロコルチン関連ペプチドの蛍光ラベル、錯体化放射性核種及び毒素との接合も含んでいる。
【００２０】
（本発明の詳細な説明）
本発明によれば、この技術分野の技術範囲内の通常の分子生物学、微生物学、そして組み換えＤＮＡ技術を用いることができる。こうした技術については文献に十分に説明されている。例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ， Ｆｒｉｔｓｃｈ ＆ Ｓａｍｂｒｏｏｋ， ”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ （１９８２）； ”ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，” Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ ａｎｄ ＩＩ （Ｄ．Ｎ． Ｇｌｏｖｅｒ ｅｄ． １９８５）； ”Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ” （Ｍ． Ｊ． Ｇａｉｔ ｅｄ． １９８４）； ”Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ” ［Ｂ． Ｄ． Ｈａｍｅｓ ＆ Ｓ． Ｊ． Ｈｉｇｇｉｎｓ Ｅｄｓ． （１９８５）； ”Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ” ［Ｂ．Ｄ． Ｈａｍｅｓ ＆ Ｓ． Ｊ． Ｈｉｇｇｉｎｓ Ｅｄｓ． （１９８４）］； ”Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ” ［Ｒ． Ｉ． Ｆｒｅｓｈｎｅｙ， ｅｄ． （１９８６）］； ”Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ Ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ” ［ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ， （１９８６）］； Ｂ． Ｐｅｒｂａｌ， ”Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ Ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ” （１９８４）参照。従って、本明細書で使われた場合、以下の用語は以下に述べるような定義を有するものとする。
【００２１】
本明細書で使われる場合、『ｃＤＮＡ』とは遺伝子のｍＲＮＡ転写のＤＮＡコピーを意味する。
【００２２】
本明細書で使われる場合、『誘導アミノ酸配列』とはｃＤＮＡ内のヌクレオチド塩基の三連配列を読み取ることで判定されるアミノ酸配列を意味するものとする。
【００２３】
本明細書で使われる場合、『ライブラリをスクリーニングする』という用語は、適切な条件下で、特定のＤＮＡライブラリ内に存在しているプローブに対して相補的な配列が存在しているかどうかを調べるためにラベルされたプローブを用いることを指している。さらに、『ライブラリをスクリーニングする』ことはＰＣＲによっても行うことができる。
【００２４】
本明細書で使われる場合、『ＰＣＲ』という用語はＭｕｌｌｉｓに対する米国特許第４，６８３，１９５及び４，６８３，２０２及びこの技術分野で周知の他の改良の主題であるポリメラーゼ鎖反応を指している。
【００２５】
すべてのアミノ酸残基配列は、本明細書においては、左から右への向きがアミノ末端からカルボキシ末端への向きを示す通常の方式で示されている。さらに、アミノ酸残基配列の開始点あるいは終点のダッシュは１つ以上のアミノ酸残基の別の配列へのペプチド結合を示している。
【００２６】
ここに述べられているアミノ酸は好ましくは『Ｌ』異性体形態である。しかしながら、『Ｄ』異性体形態の残基も、ポリペプチドによって免疫グロブリン結合の望ましい機能的特性が保持される限り、いずれかのＬアミノ酸残基で置換することができる。ＮＨ２とはポリペプチドのアミノ末端に存在している遊離アミノ基を指している。ＣＯＯＨはポリペプチドのカルボキシ末端に存在する遊離カルボキシ基である。
【００２７】
既存のアミノ酸の化学的修飾あるいは蛋白質の人為的合成によって非標準的なアミノ酸を蛋白質に組み込むことができる。非標準的アミノ酸とは、化学構造が遺伝子コードでコードされる２０種類の標準的なアミノ酸とは異なっているアミノ酸を指している。転写後のｉｎ　ｖｉｖｏでの翻訳による修飾も蛋白質内での非標準的なアミノ酸あるいはアミノ酸誘導体の存在をもたらす場合がある。１つの蛋白質のＮ末端ＮＨ２基とＣ末端ＣＯＯＨ基は蛋白質の自然の、あるいは人為的翻訳後修飾によって修飾される場合もある。
【００２８】
蛋白質はアミノ酸置換によっても修飾できる。多くの場合、なんらかの変化が蛋白質の活性の大幅な変化につながる場合があるが、逆にほとんど、あるいはまったく影響を及ぼさない場合もある。保存性置換が蛋白質の活性を劇的に変えることはほとんどない。『保存性アミノ酸置換』とは１つのアミノ酸を化学的に類似したアミノ酸と取り替えること、つまり、非極性アミノ酸を他の非極性アミノ酸と置換すること、極性アミノ酸を他の極性アミノ酸と置換したり、酸性残基を他の酸性アミノ酸と置換したりすることなどを意味する。好ましい保存性置換の例を表１に示す。
【００２９】
【表１】
2004505640.tif 000002
【００３０】
『化学的誘導体』とは、官能側基の反応によって化学的に誘導された１つ以上の残基を有するポリペプチドを指している。こうした誘導ポリペプチドには、例えば、遊離アミノ基が誘導体化されてアミン塩酸塩、ｐ−トルエン・スルホニル基、カルボベンゾキシ基、ｔ−ブチロシカルボニル基、クロロアセチル基、あるいはホルミル基を形成しているものである。遊離カルボキシル基を誘導体化して、塩類、メチル及びエチル・エステルあるいはその他のタイプのエステル又はヒドラジドを形成している場合もある。化学的誘導体は上記２０の標準的アミノ酸の１種以上の天然アミノ酸の誘導体を含むペプチドを含んでいる場合もある。例えば、４−ヒドロキシプロリンをセリンで置換してもよく、オルニチンをリシンと置換してもよい。本発明の範囲に含まれるペプチドはその修飾ペプチドが必要な生物学的活性を維持している限り、その配列がここに示されているような特定のペプチドに関して１つ以上の残基が追加されていたり、あるいは欠失しているペプチドも含んでいる。
【００３１】
『レプリコン』とは、ｉｎ　ｖｉｖｏでのＤＮＡ複製の自立的単位として機能する、つまりそれ自体の制御下で複製を行なうことができるすべての遺伝子要素（例えば、プラスミド、クロモソーム、ウィルス）である。
【００３２】
『ベクター』とは、別のＤＮＡセグメントを取り付けて、その取り付けられたセグメントの複製を起こさせることができるプラスミド、ファージ、あるいはコスミドなどのレプリコンである。
【００３３】
『ＤＮＡ分子』とは、１本鎖あるいは２重鎖らせんのいずれかのデオキシリボヌクレオチド（アデニン、グアニン、チミン、またはシトシン）の重合体の形状をとったものを意味する。この用語はその分子の一次及び二次構造のみについて言い、特定のどんな三次的形状にも限定するものではない。従って、この用語は、特に線状ＤＮＡ分子（例えば、制限酵素断片）、ウィルス、プラスミド、及びクロモソーマに見られる２重鎖ＤＮＡを含む。本明細書における上記構造に関する議論では、ＤＮＡの非転写鎖（例えば、ｍＲＮＡに相同な配列を有するストランド）に沿って５’から３’の方向の配列のみを与える標準的な慣例に従う。
【００３４】
『複製開始点』とは、ＤＮＡ合成に関与するＤＮＡ配列を意味する。
【００３５】
ＤＮＡの『コード配列』とは２重鎖ＤＮＡ配列であり、適切な調節塩基配列の制御下に置かれたとき、ｉｎ　ｖｉｖｏでポリベプチドに転写され、翻訳される。コード配列の境界は５’（アミノ）末端の開始コドン及び３’（カルボキシル）末端の翻訳終止コドンによって決定される。コード配列には原核生物配列、真核生物のｍＲＮＡ起源のｃＤＮＡ、真核生物（例えば、哺乳類）のＤＮＡ起源のゲノムＤＮＡ配列、そして合成ＤＮＡ配列さえも含まれ得るが、それだけに限定されるものではない。ポリアデニル酸化シグナル及び転写終結配列は通常コード配列に対して３’の方向に位置するであろう。
【００３６】
転写及び翻訳制御塩基配列は、ホスト細胞でコード配列発現を提供するプロモータ、エンハンサ、ポリアデニル酸化シグナル、ターミネータ等のＤＮＡ調節配列である。
【００３７】
『プロモータ配列』とは、細胞内でＲＮＡポリメラーゼと結合し、下流（３’方向）のコード配列転写を開始することができるＤＮＡ調節領域である。本発明を明示する目的で、上記プロモータ塩基配列は転写開始部位によってその３’末端で結合され、バックグランドを超える検出可能なレベルで転写を開始するために必要な塩基あるいは成分の最低限数を含めるため上流（５’方向）に伸長される。プロモータ配列には転写開始部位はもちろん、ＲＮＡポリメラーゼ結合を担うタンパク質束縛領域（コンセンサス配列）も見られるであろう。真核生物のプロモ−タは常にではないが、しばしば『ＴＡＴＡ』ボックス及び『ＣＡＴ』ボックスを含んでいる。原核生物のプロモ−タは−１０及び−３５のコンセンサス配列に加え、ＳＤ配列を含んでいる。
【００３８】
『発現制御配列』とは、別のＤＮＡ配列の転写及び翻訳を制御、調整するＤＮＡ配列である。ＲＮＡポリメラーゼがコード配列をｍＲＮＡに転写するとき、コード配列は細胞内で転写及び翻訳制御配列の『制御下』にあり、その後上記コード配列によってコードされるタンパク質に翻訳される。
【００３９】
『シグナル配列』とは、コード配列に近似したものに含めることができる。この配列はシグナル・ペプチドのＮ末端をポリペプチドにコードし、シグナル・ペプチドはポリペプチドを細胞表面に導くか、またはポリペプチドを媒体に分泌するようホスト細胞に伝達し、このシグナル・ペプチドはタンパク質が細胞を離脱する前にホスト細胞によって切り取られる。シグナル配列は原核生物及び真核生物が生来持つ各種タンパク質に関連して見られる。
【００４０】
『オリゴヌクレオチド』とは、ここで使われているように本発明のプローブに関し、２つ以上、より好ましくは３つ以上のリボヌクレオチドからなる分子として定義される。その厳密な大きさは多くの要因に左右されるが、一方で最終的な機能及びオリゴヌクレオチドの利用にも左右される。
【００４１】
『プライマー』とは、本明細書で使われているように、精製された制限消化物のように自然発生するものであれ、人工的に生成されたものであれ、核酸ストランドが相補的なプライマー伸長生成物の合成が誘導される条件下、すなわちヌクレオチド及びＤＮＡポリメラーゼのような誘導体の存在下で、適切な温度及びｐＨにあるときに合成開始点として作用することができるオリゴヌクレオチドを意味している。プライマーは１本鎖あるいは２重鎖のいずれでもよいが、誘導体の存在下で好ましい伸長生成物の合成をプライムするために十分な長さでなければならない。プライマーの厳密な長さは温度、プライマーの供給源及び使用法など多くの要因に左右される。例えば、分析に適用するときはターゲット配列の複雑性にもよるが、オリゴヌクレオチド・プライマーは通例１５から２５あるいはそれ以上のヌクレオチドを含み、それより少ないヌクレオチドを含む場合もある。
【００４２】
本明細書におけるプライマーは特定のターゲットＤＮＡ配列の異なるストランドに対して『実質的に』相補的であるよう選択される。このことはプライマーがその各々のストランドとハイブリダイズするため十分相補的でなければならないことを意味している。従って、プライマー配列がテンプレート配列を正確に反映する必要はない。例えば、非相補的なヌクレオチド断片はプライマーの５’末端に付着され、プライマー配列の残り部分はストランドに相補的であるかもしれない。もしプライマー配列がその配列に十分相補的であるか、またはその配列にハイブリダイズされ、それによって伸長生成物合成のためのテンプレートを形成するならば、二者択一的に非相補的塩基あるいはより長い配列がプライマーに散在させることができる。
【００４３】
本明細書で使われているように、『制限エンドヌクレアーゼ』及び『制限酵素』とは、そのいずれも２重鎖ＤＮＡを特定のヌクレオチド配列で、あるいはその近傍で切断する酵素を意味する。
【００４４】
外来性または異種由来のＤＮＡが細胞内に導入されたとき、そのようなＤＮＡによって細胞は『形質転換』される。形質転換ＤＮＡは細胞のゲノム内に組み込まれる（共有結合される）ことも、組み込まれないこともある。例えば、原核生物、イースト菌、及び哺乳類の細胞では、形質転換ＤＮＡはプラスミドのようなエピソーム因子上に維持されるかもしれない。真核生物の細胞に関しては、安定的に形質転換した細胞は、クロモソーム複製を介して娘細胞によって受け継がれるように形質転換ＤＮＡがクロモソームに組み込まれたものである。この安定性は形質転換ＤＮＡを含む娘細胞群から成る細胞系またはクローンを確立する真核生物細胞の能力によって示される。『クローン』とは、単一の細胞または有糸分裂による原種に由来する細胞群である。『細胞系』とは、ｉｎ　ｖｉｔｒｏで何代にもわたって安定して成長できる第１次細胞のクローンである。
【００４５】
２つのＤＮＡ配列は、ヌクレオチドの少なくとも約７５％（好ましくは少なくとも約８０％、最も好ましくは少なくとも約９０％または約９５％）がＤＮＡ配列の規定された長さを超えて一致するとき『実質的に相同』である。実質的に相同な配列は塩基配列データバンクで利用できる標準的なソフトウェアを用いるか、または例えばその特定のシステムのために規定された厳格な条件下でのサザン・ハイブリダイゼーション実験で配列を比較することによって同定できる。適切なハイブリダイゼーション条件の定義はこの技術分野の技術範囲内にある。例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ．， ｓｕｐｒａ； ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ｖｏｌｓ． Ｉ ＆ ＩＩ， ｓｕｐｒａ； Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ， ｓｕｐｒａ参照。
【００４６】
ＤＮＡ構成の『非相同』領域は、自然界のより大きな分子に関連して見られない、より大きなＤＮＡ分子内の同定可能なＤＮＡセグメントである。従って、非相同領域が哺乳類の遺伝子をコードするとき、その遺伝子は通常そのもとの生物体のゲノム内の哺乳類ゲノムＤＮＡをフランクしないＤＮＡによってフランクされるであろう。他の実施例では、コード配列はそのコード配列自体が自然界に見られない構成である（例えば、ゲノムコード配列が自然界の遺伝子とは異なるコドンを有するイントロンまたは合成配列を含むｃＤＮＡ）。対立性変異個体あるいは自然発生の突然変異体には本明細書で明示されるＤＮＡの非相同領域が生じない。
【００４７】
これらの研究のために最も一般的に使われるラベルは放射性元素、酵素、紫外線にあたると蛍光を発する化学物質などである。数多くの蛍光性物質が周知であり、ラベルとして用いることができる。それらは例えば、フルオレセイン、ローダミン、オーラミン、テキサス・レッド、ＡＭＣＡブルー、ルシフェル・イエローなどである。特殊な検出用素材としてはヤギを使ってつくられ、イソチオシアン酸塩を介してフルオレセインと接合される抗ウサギ抗体がある。
【００４８】
この技術分野で開発され用いられる特殊な分析方法はレセプタ分析として周知である。レセプタ分析において、分析される物質は適切にラベル付けされ、その後一定の細胞テストコロニーは多数のｂｏｔｈ ｔｈｅ ｌａｂｅｌが植え付けられ、その後ラベル付けされた物質がどの程度細胞レセプタと結合しているかを測定するために結合試験が行なわれる。この方法によって、物質間の親和性の違いが確かめられる。
【００４９】
本明細書で使われているように、『ホスト』とは、原核生物だけでなく、イースト菌、植物、及び動物の細胞など真核生物も含まれている。当業者に通例周知の技術のいずれかを使って、本発明によるタンパク質をコードする組み換え体のＤＮＡ分子または遺伝子をホストを形質転換させるために用いることができる。原核生物のホストは大腸菌、 Ｓ． ｔｙｍｐｈｉｍｕｒｉｕｍ， Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓそしてＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓなどである。真核細胞のホストはＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓなどのイースト菌、哺乳類細胞及び昆虫細胞などである。
【００５０】
一般的に、挿入されたＤＮＡフラグメントを効率的に転写できるようにするプロモータ配列を含む発現ベクターがホストとの関連で用いられる。発現ベクターは通常複製の発生源、プロモータ、ターミネータ、及び形質転換細胞内で表現形選択を提供することができる特殊な遺伝子を含んでる。形質転換されたホストはこの技術分野で知られている手段によって細胞成長がもっともうまくいくように発酵、培養される。
【００５１】
適切な転写性及び翻訳性制御信号を含む発現ベクター構成するために、当業者に周知の方法を用いることができる。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ら １９８９， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ （２ｎｄ Ｅｄ．）， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ， Ｎ． Ｙ．参照。１つの遺伝子とその転写制御配列は、その転写制御配列がその遺伝子の転写を効果的に制御する場合、『操作可能に結合されている』と定義される。本発明によるベクターはプラスミド・ベクターとウィルス性ベクターなどを含んでいるが、これらに限定されない。
【００５２】
本発明はウロコルチンＩＩをコードするＤＮＡ配列を対象にしている。この配列はウロコルチンＩＩをコードする単離精製されたＤＮＡであってもよい。あるいは、（機能的には６５℃で０．１　ｘ　ＳＳＣに相当する高温度及び低塩分濃度での膜洗浄として定義される）高度に厳しい条件下でウロコルチンＩＩＤＮＡのアンチセンス相補体とダイブリダイズする単離精製されたＤＮＡであってもよい。最後に、このＤＮＡはウロコルチンＩＩをコードするが、その遺伝子コードの劣化の故に配列が違っている単離精製されたＤＮＡであってもよい。このＤＮＡは好ましくは配列識別番号Ｎｏ．１０のアミノ酸及び配列識別番号Ｎｏ．１１のアミノ酸をコードする。
【００５３】
本発明はウロコルチンＩＩを発現することができるベクターも対象にしている。こうしたベクターはウロコルチンＩＩを発現するＤＮＡと細胞内でのウロコルチンＩＩの発現に必要な調節要素で構成されている。１つの好ましい実施の形態においては、このベクターは配列識別番号Ｎｏ．１０あるいはＮｏ．１１のアミノ酸の蛋白質をコードする。本発明はそうしたベクターからのウロコルチンＩＩによってトランスフェクトされ、それを発現するホスト細胞も対象にしている。この蛋白質はバクテリア細胞、哺乳動物細胞、植物細胞、そして昆虫細胞から選択された細胞タイプ内で発現することもできる。１つの好ましい実施の形態においては、上記蛋白質は大腸菌内で発現される。
【００５４】
本発明は上に述べたようなＤＮＡからコードされた単離精製ウロコルチンＩＩ蛋白質も対象にしている。好ましくは、上記精製されたウロコルチンＩＩは配列識別番号Ｎｏ．１０あるいは配列識別番号Ｎｏ．１１に対応するアミノ酸配列を有している。
【００５５】
本発明はまた、上記ウロコルチンＩＩ蛋白質に対する抗体も対象にしている。この抗体は好ましくはモノクローナル抗体である。
【００５６】
さらに、本発明は上記ウロコルチンＩＩ蛋白質と薬学的に許容される基質で構成される医薬品組成物を対象にしている。こうした医薬品組成物は体温を低下させたり、食欲を抑えたり、鬱血性心臓不全を治療あるいは予防したり、ストレス及び不安感を治療したり、そして望ましくない程度の低レベルのＡＣＴＨ分泌を改善するために用いることができる。
【００５７】
本発明はヒト・ウロコルチン関連ペプチドも対象にしている。この配列はヒト・ウロコルチン関連ペプチドをコードする単離精製されたＤＮＡであってもよい。あるいは、（機能的には６５℃で０．１　ｘ　ＳＳＣに相当する温度及び低塩分濃度と定義される）高度に厳しい条件下で上記ヒト・ウロコルチン関連ペプチドＤＮＡのアンチセンス相補体にハイブリダイズする単離精製されたＤＮＡであってもよい。最後に、このＤＮＡはヒト・ウロコルチン関連ペプチドをコードするが、遺伝子コード劣化の故に配列が異なっている単離精製されたＤＮＡであってもよい。このＤＮＡは好ましくは配列識別番号Ｎｏ．１に示される配列を有しており、そして好ましくは蛋白質分解酵素によって配列識別番号Ｎｏ．３のアミノ酸配列の蛋白質に変えられる配列識別番号Ｎｏ．２のアミノ酸配列の前駆体蛋白質をコードする。
【００５８】
本発明は上記ヒト・ウロコルチン関連ペプチドを発現することができるベクターも対象にしている。こうしたベクターはウロコルチン関連ペプチドと細胞内でのヒト・ウロコルチン関連ペプチドの発現に必要な調節要素で構成されている。１つの好ましい実施の形態においては、このベクターは配列識別番号Ｎｏ．３のアミノ酸配列の蛋白質をコードする。本発明はそうしたベクターからのヒト・ウロコルチン関連ペプチドによってトランスフェクトされ、それを発現するホスト細胞も対象としている。この蛋白質はバクテリア細胞、哺乳動物細胞、植物細胞、そして昆虫細胞から選択された細胞タイプ内で発現することもできる。１つの好ましい実施の形態においては、上記蛋白質は大腸菌内で発現される。
【００５９】
本発明は上に述べたようなＤＮＡからコードされる単離精製されたヒト・ウロコルチン関連ペプチド蛋白質も対象としている。好ましくは、上記精製されたウロコルチン関連ペプチドは配列識別番号Ｎｏ．３に相当するアミノ酸配列を有している。
【００６０】
本発明は上記ヒト・ウロコルチン関連ペプチド蛋白質に対する抗体も対象としている。この抗体は好ましくはモノクローナル抗体である。
【００６１】
さらに、本発明は上記ヒト・ウロコルチン関連ペプチド蛋白質と薬学的に許容される基質で構成される医薬品組成物も対象としている。そうした医薬品組成物は体温を低下させたり、食欲を抑えたり、鬱血性心臓不全を治療あるいは予防したり、ストレス及び不安感を治療したり、そして望ましくない程度の低レベルのＡＣＴＨ分泌を改善するために用いることができる。
【００６２】
本発明は蛋白質の放射性ヨード化のために用いられるチロシン残基を含むように突然変異されたウロコルチンＩＩあるいはヒト・ウロコルチン関連ペプチドも対象としている。１つの特殊な修飾はＴｒｙ−Ｇｌｙで構成される配列のウロコルチンＩＩ又はヒト・ウロコルチン関連ペプチドのＮ末端への添加である。
【００６３】
本発明はウロコルチンＩＩ又はヒト・ウロコルチン関連ペプチドの欠失突然変異体も対象にしている。特に有益な欠失は上記蛋白質のＮ末端からの１−５個のアミノ酸の欠失である。
【００６４】
本発明は、その内部で標準的『Ｌ形』異性体アミノ酸が『Ｄ形』異性体アミノ酸と置換されているウロコルチンＩＩ又はヒト・ウロコルチン関連ペプチドも対象としている。ヒト・ウロコルチン関連蛋白質の場合、配列識別番号Ｎｏ．３の位置９に対応するイソロイシン残基のＤ−イソロイシン、Ｄ−フェニルアラニン、及びＤ−ロイシン、あるいはその他のＤ形アミノ酸との置換が特に有益である。もうひとつの有益な置換は、配列識別番号Ｎｏ．３又は１１の位置１７のグルタミン酸残基のＤグルタミン酸との置換である。
【００６５】
本発明は、その内部で種々のアミノ酸が非標準的なアミノ酸と置き換えられているウロコルチンＩＩ又はヒト・ウロコルチン関連ペプチドも対象としている。Ｃα−メチル化ロイシン、Ｃα−メチル化アラニン、Ｎ−ｉｍ−ベンジルヒスチジン、４−ヒドロキシプロリン、５−ヒドロキシリシン、３−メチルヒスチジン、ホモセリン、及びオリニチンはそうした非標準的アミノ酸の例である。
【００６６】
本発明はアクリル化されたＮ末端を有するウロコルチンＩＩ又はヒト・ウロコルチン関連ペプチドも対象にしている。この蛋白質アクリル化は、酵素による劣化からウロコルチンＩＩ又はウロコルチン関連ペプチドを保護したり、その親水性／疎水性などその蛋白質の種々の特性を変化させるために、その蛋白質のＮ末端の脂肪酸などの分子と結合するために用いられる。これらの修飾は、ｉｎ　ｖｉｖｏで上記蛋白質の持続性や生物学的利用能を変化させるために用いることができる。
【００６７】
本発明は画像化あるいは生物学的アッセイで利用するための蛍光性ラベルを含むように修飾されたウロコルチンＩＩ又はヒト・ウロコルチン関連ペプチド蛋白質もその対象としている。
【００６８】
本発明は放射性核種のための錯化剤と接合されたウロコルチンＩＩ又はヒト・ウロコルチン関連ペプチド蛋白質も対象にしている。放射性核種に錯体化されたウロコルチンＩＩもシンチグラフィあるいは種々のアッセイで有用である。
【００６９】
本発明は１つの毒素に接合されたウロコルチンＩＩ又はヒト・ウロコルチン関連ペプチドも対象にしている。得られた毒素接合体はＣＲＦレセプタ担持細胞の標的を定めた破壊のために用いることができる。
【００７０】
【実施例】
以下の実施例は本発明の種々の実施の形態を示すことのみを目的としており、いかなる意味でも本発明の限定は意図していない。
【００７１】
実施例１
ヒト・ウロコルチン関連蛋白質の同定
新しいＣＲＦ−Ｒリガンドを同定する努力において、ＨＭＭＥＲソフトウエア・パッケージ（Ｓｅａｎ Ｅｄｄｙ， Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ， Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｓｔ， Ｌｕｏｉｓ， ＭＯ、参考文献１９参照）を用いて、ラット／ヒトＣＲＦ、ラット・ウロコルチン、ヒト・ウロコルチン、カエル・ソウバジン、及びシロコバンザメ・ウロテンシンＩを含む周知のＣＲＦ蛋白質系統のクラスター性Ｗアラインメントから非顕マルコフ・モデル（ＨＭＭ）を構成した。このＨＭＭを用いて公開されているヒト・ゲノム・データベースを調査し、かなりの配列相同性を示しているが、これまでに同定されている遺伝子の一部ではない１０９塩基対領域を含むクロモソーム　３ｐ２１．３−４から誘導されたＢＡＣ（Ｇｅｎｂａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ． ＡＣ００５９０３）が同定された。この領域は６２１塩基対にわたって広がっており、この配列（Ｇｅｎｂａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＢＥ６２２２７６）と重なったヒトＥＴＳクローンとの同一性を有していた。しかしながら、このヒトの遺伝子配列はそのペプチドのＣ末端処理を可能にするコンセンサス蛋白質分解性切断部分を含んでいない。従って、この蛋白質はヒト・ウロコルチン関連ペプチド（ｈＵＲＰ）配列と命名された。図１はこのヒトＵＲＰ蛋白質の予想されたオープン・リーディング・フレームのヌクレオチド配列（配列識別番号Ｎｏ．１）を示している。この遺伝子はアミノ酸配列（配列識別番号Ｎｏ．２）のペプチドをコードする。
【００７２】
ヒト・ウロコルチン関連ペプチド遺伝子の存在とその配列を確認するために、そのゲノム性クローンから上記ヒト・ウロコルチン関連ペプチド配列を増幅するために用いられたものと同様のオリゴヌクレオチド・プライマーを用いて、ヒト膵臓島ｃＤＮＡライブラリからＰＣＲによってｃＤＮＡフラグメントを単離した。このフラグメントもｐＧＥＭベクター内にサブクローニングして、配列決定した。このｃＤＮＡ配列は上記ゲノム配列の一部に対応する。この部分的ｃＤＮＡ配列は図２の下線を付した配列と対応している。図１と２に示されている配列はヒト・ウロコルチン関連ペプチドのポリペプチド前駆体をコードする。ヒト・ウロコルチン関連ペプチドの最初の１９個のヌクレオチドはその蛋白質の翻訳後修飾中に切断されてアミノ酸配列の成熟したヒト・ウロコルチン関連ペプチドをつくりだす信号ペプチドをコードする。
Ｉ Ｖ Ｌ Ｓ Ｌ Ｄ Ｖ Ｐ Ｉ Ｇ Ｌ Ｌ Ｑ Ｉ Ｌ Ｌ Ｅ Ｑ Ａ Ｒ Ａ Ｒ Ａ Ａ Ｒ Ｅ Ｑ Ａ Ｔ Ｔ Ｎ Ａ Ｒ Ｉ Ｌ Ａ Ｒ Ｖ Ｇ Ｈ Ｃ−ＮＨ２ （配列識別番号Ｎｏ．３）
図３はヒト・ウロコルチン関連ペプチドのアミノ酸７２−１０９間とヒト・ウロコルチン、ヒト・ウロテンシンＩ、ヒト・コルチコトロピン放出因子（ＣＲＦ）、カエル・ソーバジン、そしてサメＣＲＦ／Ｕｒｏの相当するセグメント間の相同性比較の結果を示している。この領域の相同性は２６％から４２％の範囲である。
【００７３】
実施例２
マウス・ウロコルチンＩＩの同定
ヒト遺伝子配列に基づくフラグメント性ｃＤＮＡプローブをラットの組織（脳）と特殊な方法でクロスハイブリダイズさせたところ、これら２つの種の間にかなりの程度の相同性が存在することが示唆された。このヒト配列に基づいて、ｃＤＮＡ末端急速増幅（ＲＡＣＥ）法で相同性マウス遺伝子を同定するためのプライマーを設計した。ＲＡＣＥ−レディｃＤＮＡを、ＳＭＡＲＴ　ＲＡＣＥ　ｃＤＮＡ増幅キット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いてマウス全脳ポリ（Ａ＋）ＲＮＡから作成した。最大の異種プライミングを行なわせるようにするために、ＰＣＲ反応を低刺激性（低温　Ｔｍ）条件で実施した。一回目の増幅はタッチダウン方式（９４℃、３０秒間；７０℃から５５℃へのインクリメント、３０秒間；７２℃、３分間）で行い、次いで、ネストされたプライマの複数の組み合わせを用いた二回目の増幅を行なった（９４℃、２０秒間；５５℃、２０秒間；７２℃、３分間）。候補となるＰＣＲ生成物をｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングして、両方のストランドの配列決定を行なった。候補となる５’及び３’反応生成物をそれらの（ヒトの配列から推定された）予想サイズに基づいて同定し、クローニングし、さらに配列決定した。
【００７４】
マウス・ウロコルチンＩＩに関して予想されたアミノ酸配列を図４Ａに示す。この遺伝子は１１２アミノ酸前駆体をコードし、そしてＣ末端配列はボックス内領域（図４Ａ）に示されている推定３８アミノ酸成熟ペプチドに対するコード領域を含んでいる。このコード配列のＣ末端部分の後に、グリシン及び対になった塩基性配列（Ｒ−Ｒ）が続いており、これがそれぞれアミド化及び前駆体からの切断と関与していると考えられる。
【００７５】
他の２つの推定あるいは知られているウロコルチン関連ペプチドが存在しており、１つはそのペプチド配列が公表されているヒトＥＳＴから推定されたヒトのもので、他方は最近クローンされた（２０）（タキフグからの）フグＵＲＰである。これらヒト及びサカナ・ウロコルチン関連ペプチド、ラット・ウロコルチン、及びラット／ヒトＣＲＦとのアラインメントを図４Ｂに示す。アミノ酸レベルでは、マウス・ウロコルチンＩＩのコード領域はヒト及びサカナ・ウロコルチン関連ペプチドとそれぞれ７７％及び４５％の相同性を示す。マウス・ウロコルチンＩＩはこのペプチド系列の知られているメンバーと比較的関係が深く、ラットＣＲＦ及びラットＵＣＮとそれぞれ３６％及び４４％の相同性を有している。保存性置換を可能にすれば、関連性は６２％（ＣＲＦと）及び５９％（ウロコルチンと）に増大する。
【００７６】
実施例３
ペプチド合成
マウス・ウロコルチンＩＩ及びヒト・ウロコルチン関連ペプチドを固体相方式、メチルベンズヒドリル・アミン樹脂、及びＢｏｃ方式（２１）を用いて手作業で合成した。ジクロロメタン内に６０％の割合で溶かしたトリフルオロ酢酸を用いて、Ｂｏｃ基を除去した。主鎖集合はジイソプロピルカルボジイミドで媒介された。これらのペプチドを切断して、フッ化水素酸内で脱保護化し、ＲＰ−ＨＰＬＣ及び３つの溶媒システム（ｐＨ２．２５及び６．５のリン酸トリエチルアンモニウム及び／又は０．１％ＴＦＡ）（２２）を用いて精製した。それぞれ独立のＨＰＬＣ及びＣＺＥ基準を用いて調べたところ、これらのペプチドは９５％以上の純度であった。質量スペクトルを用いて、これらの製剤の組成を確認した。
【００７７】
実施例４
ウロコルチンＩＩによるレセプタ活性化
ウロコルチンＩＩのＣＲＦ−Ｒ１及びＣＲＦ−Ｒ２レセプタに対する親和性を放射性レセプタ・アッセイで評価した。粗膜画分をクローンされたＣＲＦ−Ｒ１又はＣＲＦ−Ｒ２βを安定的に発現するＣＨＯ細胞から調製した。テスト・ペプチド及び放射性リガンド、１２５Ｉ−［Ｔｙｒ０、Ｇｌｕ１、Ｎｌｅ１７］ソーバジンをアッセイ緩衝剤（２０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ、２ｍＭ　ＥＧＴＡ、０．１％ＢＳＡ、１０％サクロース、ｐＨ７．６）内に希釈させ、０．１％ポリエチレン・イミンで前もってコーティングしたＭＡＧＶマイクロタイター・プレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）内でレセプタ膜調製物と結合させた。反応混合物を室温で９０分間培養してから、アッセイ緩衝剤で急速洗浄を２回行なって、その後ろ過した。この放射性リガンド錯体はガンマ放射カウンティングで定量した。抑制的結合定数をＰｒｉｓｍソフトウエアを用いて判定した。その結果を表２に要約して示した。
【００７８】
【表２】
2004505640.tif 000003
【００７９】
これらの値は、各テスト・ペプチドに対して安定的にトランスフェクトされたＣＨＯ細胞あるいはそれらの細胞膜を用いて３−６回の実験を繰り返して得られたものである。ＥＣ５０とＫｉ値はＰｒｉｓｍソフトウエアを用いて判定された。それらの常用対数値（ｌｏｇ１０）の平均を取った（γ）。平均ＥＣ５０あるいはＫｉは１０γと取られた。常用対数値の標準偏差を計算した（δ）。示されている範囲は［（１０γ）１０δ又は１０γ／１０δ］であった。
【００８０】
ウロコルチンと比較して、ウロコルチンＩＩはラベルされたソーバジンをＣＲＦ−Ｒ１に結合させる競合においては少なくとも１０００分の１以下の効果であったが、ＣＲＦ−Ｒ２に結合させる競合においてはウロコルチンとほぼ同様であった。タイプ２レセプタに対するこのかなりの選択性は細胞内ｃＡＭＰの蓄積によって測定したレセプタ活性化においても認められた。安定的にトランスフェクトされたＣＨＯ細胞（ＤＭＥＭ／１０％　ＦＢＳ内で培養されたもの）を４８ウェル組織培養皿（Ｃｏｓｔａｒ）に入れて、２４時間にわたって取り出された。この培養液は措置の少なくとも２時間前にＤＭＥＭ／０．１％　ＦＢＳに変更された。これらの細胞を０．１ｍＭ３−イソブチル−１−メチルキサンチンで３０分間予備培養して、その後、３７℃の温度で２０分間ペプチドに露出させた。細胞内ｃＡＭＰを抽出して、ＲＩＡキット（Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて３組ウェルからの２つのサンプルで測定した。ｃＡＭＰアッセイにおいて、ウロコルチンＩＩはＣＲＦ−Ｒ２に対してはウロコルチンとほぼ同様の有効性を示した（表２）。ウロコルチンＩＩのＣＲＦ−Ｒ１に対する極端に低い親和性の故にこのレセプタに対する有効性についての判定は不可能であった。
【００８１】
実施例５
結合は真空ろ過多重スクリーン・アッセイ・システム（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて９６ウェル　０．２μｍ　Ｄｕｒａｐｏｒｅプレートで行われた。各ウェルは総体積２００μｌで、５０μｌの結合緩衝液（１０％サクロース、０．１％ＢＳＡ、２ｍＭ　ＥＧＴＡ、２０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ緩衝液、ｐＨ７．５）；５０μｌの非ラベル競合物（ウロコルチン又はヒト・ウロコルチン関連ペプチド）を結合緩衝液内に種々の希釈度で溶かしたもの；　５０μｌの１２５Ｉ−ソーバジンを１ウェルあたり１５０，０００ｃｐｍ入れたもの；及び５０μｌの細胞膜で構成されていた。プレートを室温で１時間培養してから、真空ろ過して、結合緩衝液で２度洗浄し、その後乾燥させた。個々のフィルターをパンチ・アウトして、ガンマ・カウンタを用いてカウントした。
【００８２】
ヒト・ウロコルチン関連ペプチドが媒介するＣＨＯ細胞内で安定的に発現されたＣＲＦ−Ｒ１とＣＲＦ−Ｆ２βへの１２５Ｉ−ソーバジン結合の置き換えを図５に示す。このデータから、ヒト・ウロコルチン関連ペプチドはＣＲＦ−Ｒ１に対しては７８ｎＭ、ＣＲＦ−Ｒ２βに対しては０．２３ｎＭの解離定数（Ｋｉ）を有していることが分かった。一方、ウロコルチンはＣＲＦ−Ｒ１に対しては０．１３ｎＭ、ＣＲＦ−Ｒ２βに対しては０．１５ｎＭの解離定数を有していた。従って、ヒト・ウロコルチン関連ペプチドはコルチコトロピン放出因子タイプＩＩレセプタに対してウロコルチンよりずっと強い特性を示す。
【００８３】
実施例６
ウロコルチンＩＩ　ｍＲＮＡの発現
マウス及びラットの脳内でのウロコルチンＩＩ　ｍＲＮＡ発現のパターンを分析するために、ハイブリダイゼーションに関する組織化学的研究を行った。動物を抱水クローラル（３５０ｍｇ／ｋｇ、ｉｐ）で深く麻酔にかけ、上行大動脈を介して食塩水で潅流培養を行い、その後、氷冷４％パラホルムアルデヒドを０．１％ホウ酸緩衝液ｐＨ９．５内に溶かしたもので潅流培養を行った。脳を１６時間ポストフィックスして、１０％サクロースを０．１Ｍリン酸緩衝液内に溶かしたものの中にいれて凍結防止した。４つ（マウス）あるいは６つ（ラット）の３０μｍ厚凍結断片を摺動マイクロトームを用いて切り取り、低温エチレン・グリコールを主体とする凍結防止剤内に回収し、組織化学的処理を行うまで、−２０℃の温度で保存した。
【００８４】
最初にマウスｃＤＮＡを含んでいるＴＯＰＯ−ＩＩプラスミドを直線化して構成された３５Ｓラベル・アンチセンス及びセンス（比較対照）ｃＲＮＡプローブ（２３）を用いてｉｎ　ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを行った。プローブを１−３ｘ１０９ｄｐｍ／μｇの特定の活性を示すようにラベルして、約１０７ｃｐｍ／ｍｌの濃度でスライド上に置いて、高度に厳しい条件（５０％ホルムアルデヒド）下で５６℃の温度で一昼夜ハイブリダイゼーションさせた。最終的な洗浄を６５−６８℃の温度下で、１５ｍＭ　ＮａＣｌ／１．５ｍＭシュウ酸ナトリウム内で行った。その後スライドを脱水して、１６時間Ｘ線フィルム（β−Ｍａｘ； Ｋｏｄａｋ）に露出させ、そしてＫｏｄａｋ ＮＴＢ−２液体エマルジョンで被覆して、４℃の温度下に２１−２８日間放置した。
【００８５】
ハイブリダイゼーションに関する組織化学的研究は、マウス及びラットの脳内でウロコルチンＩＩ　ｍＲＮＡ発現の一貫し、限定されたパターンが発現されることを明らかにした。アンチセンス・プローブとして同様の特異活性にラベルされたセンス−ストランド流出液はバックグランド以上のハイブリダイゼーション信号をつくりだすことはできなかった。観察されたウロコルチンＩＩ　ｍＲＮＡの分布は圧倒的に皮質下であることが認められ、主な発現サイトは視床下部の傍室核、視索上核、そして弓状核などのストレスに関連した細胞群、そして、吻側橋の遺伝子配座などであった（図６）。脳幹の運動核（三叉、顔面、及び舌下）、及び脊髄腹壁角もウロコルチンＩＩ　ｍＲＮＡ発現のサイトとして確認された。非神経要素の間では、硬腹静脈上ではポジティブなハイブリダイゼーション信号が観察されたが、脈絡叢と上衣においてはそれは認められなかった。グリア細胞要素によるウロコルチンＩＩ　ｍＲＮＡ発現のはっきりした兆候はなかった。
【００８６】
実施例７
霊長類の脳におけるウロコルチン関連ペプチドの発現
霊長類の脳におけるヒト・ウロコルチン関連ペプチドの発現をｉｎ　ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによって調べた。このｉｎ　ｓｉｔｕハイブリダイゼーションはヒト・ウロコルチン関連ペプチドの約４００個の塩基対に対応する３５Ｓラベル・アンチセンスｃＲＮＡプローブを用いて、マカカファスシキュラリス（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）から得られた脳組織の断片上で行った。このプローブを１０７　ｃｍｐ／ｍｌの濃度でスライド上に置いて、一昼夜ハイブリダイゼーションが進行するようにした。ハイブリダイゼーション後、スライドを２０μｇ／ｍｌのリボヌクレアーゼＡで３７℃の温度下で３０分間処理して、７０℃の温度で１５ｎＭ　ＮａＣｌ／１．５ｍＭシュウ酸ナトリウム／５０％ホルムアミド内で洗浄した。スライドを脱水して、Ｘ線フィルム（ＢｅｔａＭａｘ； Ｋｏｄａｋ）に２４時間露出させた。そのオートラジオグラムを図７で示す。ウロコルチン関連ペプチドに関するポジティブ信号は霊長類視床下部の傍室核（ＰＶＨ）、視索上核で観察された。
【００８７】
実施例８
ウロコルチンＩＩが誘発するＦｏｓ発現
集中ウロコルチンＩＩ投与に反応を示す細胞群を確認し、これらがＣＲＦ−Ｒ２発現のサイトに一致する程度を評価するために、ｉｃｖペプチド投与によって誘発された中間初期遺伝子生成物、Ｆｏｓの発現について観察した。成長した雄Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（実験開始時に２５０−３００ｇ）及びＣ５７ＢＬ／６マウス（２５−４０ｇ）をコロニー室に入れて、１２：１２明暗サイクルで飼育し、実験開始前には水と食物に自由にアクセスできるようにしておいた。脳内血管内（ｉｃｖ）注射の場合、ラットをケタミン／キセラジン／アセプロマジンで麻酔にかけ、側脳室内で終端している２６ｇａガイド・カニューラで定位固定的に埋め込んだ。ペプチドを静脈注射（ｉｖ）する場合、動物には内在頚静脈血管カテーテルが固定された。ｉｃｖ注射を受けたラットにも腹部内にトランスミッタ（Ｍｉｎｉ−Ｍｉｔｔｅｒ）を埋め込んで、全体的活性レベルと体温をリモート方式でモニターした。手術後、すべての実験を開始する前に動物に７日間の体力回復期を用意し、その間、それらの動物は日常的に取り扱われた。すべての手順はＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｓａｌｋ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅによって承認を受けたものであった。
【００８８】
Ｆｏｓ発現の誘発パターンをモニターするために、合成ウロコルチンＩＩ（ｉｃｖ注射の場合、動物１匹あたり２μｌ生理食塩水あたり１、５又は１０μｇを溶かしたもの、ｉｖ投与の場合は２００μｌ）あるいは媒体だけを用いて、ラットに午前１０時にｉｃｖあるいはｉｖ注射し、２時間後に潅流培養した。食物摂取に対するペプチド投与の効果をモニターするために、動物に対して、消灯時間の３０分前に合成マウス・ウロコルチンＩＩ、ラット・ウロコルチン、あるいはラット／ヒトＣＲＦをｉｃｖで注射した。その後、６時間の間１時間毎の摂取量と１２時間の時の摂取量を測定した。変動の反復測定分析（ＡＮＯＶＡ）を用いて分析し、多重比較を行うためのＢｏｎｆｅｒｏｎｉ補正を適用した。
【００８９】
免疫組織化学的調査を行うために、細胞組織を０．３％過酸化水素と１％ホウ化水素ナトリウムで連続的に予備処理した。その後、ＰＢＳ／０．２％トリトンＸ−１００で浸透可能にし、ＰＢＳ／２％ブロッキング血清内で４８時間、一次抗血清で培養した。Ｆｏｓ免疫活性をヒトＦｏｓ蛋白質（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１：５Ｋ）のＮ末端合成フラグメントに対してウサギ内に発生したポリクローナル抗血清を用いてその場所を特定した。場所の特定は参考資料（２４）に述べられている方法でニッケルを増強した通常のアビジン−ビオチン免疫パーオキシダーゼ法を用いて行われた。
【００９０】
１μｇの合成ウロコルチンＩＩを注射すると、中枢自立制御に関与している相互連関構造の群の中で最も顕著な活性応答が発生した（２５、２６）。これらには分界条の基底核、小扁桃の中枢核、視床下部の傍室核（ＰＶＨ）、傍小脳脚核、及び孤束核（ＮＴＳ、図８）などで個別の発生形態が含まれていた。もちろん、ＮＴＳだけがＣＲＦ−Ｒ２発現の座として述べられてきている（２７）。側方隔膜、中脳縫線核、及び視床下部の腹側正中核（２７、２８）を含むＣＲＦ−Ｒ２発現の他の重要なサイトでのＦｏｓ誘発は食塩水を注射した比較対照群におけるそれと区別できなかった。ペプチドの投与量を大きくすると（５あるいは１０μｇ）、同様の分布のより強い活性応答が誘発された。
【００９１】
ｉｃｖ注射の潜在的な全身的影響を制御するために、同様の量のウロコルチンＩＩをラットの別の群に対して静脈注射で与えた。最も高い（１０μｇ）の用量の場合だけ、比較対照レベルをはっきり上回るＦｏｓ誘発が認められた。パターンは中枢注入に対する反応で見られるものと同様であったが、ラベルされた細胞の数やその染色強度も１μｇのウロコルチンＩＩをｉｃｖ注射した後に安定してみられるものには及ばなかった。
【００９２】
実施例９
脳におけるウロコルチン関連ペプチドによって刺激されたＦＯＳ発現
ヒト・ウロコルチン関連ペプチドによる中枢ストレス関連細胞群の活性化について、ヒト・ウロコルチン関連ペプチドを注射した後のそれら細胞におけるＦｏｓ遺伝子生成物を検出することで調べた。ラットに実験を開始する７日前に、側方脳内血管内にガイド・カニューレを埋め込んだ。テストを実施した日に、それらのラットに５μｇの合成ヒト・ウロコルチン関連ペプチドを５μｌの無菌食塩水に溶かしたものを注射した。ラットを２時間後に致死させ、種々の脳断片のスライドを作成した。これらのスライドをウサギ内でヒトＦｏｓ蛋白質の残基３−１６に対して発生されたポリクローナル血清を用いて、Ｆｏｓ免疫反応性の免疫パーオキシダーゼ局所化によって染色した。
【００９３】
図９に示されているように、Ｆｏｓ免疫反応性は分界条基底（ＢＳＴ）、視床下部の傍室核（ＰＶＨ）、小扁桃中枢核（ＣｅＡ）、側方傍小脳脚核（ＰＢＩ）、青斑（ＬＣ）、及び孤束核（ＮＴＳ）において検出された。これらのサイトのそれぞれはＣＲＦ関連ペプチド活性のサイトとして上に述べられている。
【００９４】
実施例１０
ウロコルチンＩＩの挙動影響
ＣＲＦ及びウロコルチンと同様、ウロコルチンＩＩは主に食物摂取を抑制するように機能することもできる（図１０Ａ）。昼夜サイクルの夜間フェーズの開始時にこれらのペプチドの注射（１μｇ、ｉｃｖ）を受けたラットの個別群からの測定値は、措置と時間との間のかなりの相互関係を明らかにしており［Ｆ（１８，９５）＝４．２２，Ｐ＜０．０００１］，両方の主な効果も安定的に示された。これらの３つのペプチドのすべては１２時間の時間間隔で食物摂取量をかなり減少させ、抑制範囲は３０％（ＣＲＦ）から３５％（ウロコルチンＩＩ）、さらに７０％（ウロコルチン）であった。これらの効果は時間の経過に伴って異なって示される傾向があり、ウロコルチントとＣＲＦで措置した動物の食物摂取量はテスト期間の初期（４−５時間）において、食塩水を注射した比較対象群に対して、ウロコルチンＩＩで措置したラット（６時間）と比較してかなり低下した。
【００９５】
これら同じ固体で、総運動量と体温を遠隔測定で観察した（図１０Ｂ）。活性データの分析は、薬と時点との間にかなりの相互関係があることを示し［Ｆ（３３，１１０）＝１．９４、ｐ＜０．００６］、両方の主要効果も有意であった。ポストホック比較はＣＲＦを投与された動物は注射後２−６時間にわたって媒体で処理したラットをかなり上回る活性を示した（Ｐ＜０．００１）。ウロコルチンとウロコルチンＩＩによる措置は、いずれも注射後のいずれの時点においても、安定した変化は示さなかった。中核体温についても記録したが、それぞれのペプチドは比較的軽度（０．５−１℃）で一過性（２時間）の体温低下反応を示しただけであった（データ示さず）。
【００９６】
実施例１１
ラット下垂体前葉細胞に対するヒト・ウロコルチン関連ペプチドの効果のｉｎ　ｖｉｔｒｏバイオアッセイ
前葉活動に関連して、これまでに述べられている（３０）方法に従って、ラット下垂体前葉細胞の一次培養体において、ヒト・ウロコルチン関連ペプチドに対するＡＣＴＨ分泌反応を測定した。ＡＣＴＨレベルはＮｉｃｈｏｌｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ製のＡＣＴＨ免疫アッセイ・キットを用いて判定した。ラット下垂体前葉細胞をラット・ウロコルチンあるいはヒト・ウロコルチン関連ペプチドのいずれかで処理して、分泌されたＡＣＴＨのレベルをキット（Ｎｉｃｈｏｌｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を用いて測定した。ウロコルチン及びヒト・ウロコルチン関連ペプチドのＡＣＴＨ分泌に対する影響を図１１に示す。下垂体前葉細胞内でのＡＣＴＨ分泌の刺激のヒト・ウロコルチン関連ペプチドに対する感度はウロコルチンの場合と比較して低いことが分かった。
【００９７】
実施例１２
Ａ７Ｒ５細胞に対するヒト・ウロコルチン関連ペプチドの影響のｉｎ　ｖｉｔｒｏバイオアッセイ
天然のＣＲＦ−Ｒ２βを発現するＡ７Ｒ５細胞におけるｃＡＭＰレベルに対するヒト・ウロコルチン関連ペプチドの影響について調べた。Ａ７Ｒ５細胞株を１０％ウシ胎児血清、２ｍＭ　Ｌグルタミン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンで補強されたＤＭＥＭ内に保持した。細胞を１０，０００細胞／ｃｍ２の割合で播種し、６日間成長させた。血清枯渇細胞を０．１ｍＭ　３−イソブチル−１−メチルキサンチンを用いてアッセイ培地内で２０分間予備培養して、指示された濃度のペプチドで３０分間措置した。ｃＡＭＰレベルをＲＩＡ（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）によって測定し、その結果を図１２に示す。ヒト・ウロコルチン関連ペプチドはｃＡＭＰ生産に関してウロコルチンと同様に効果を示す。
【００９８】
実施例１３
全体的活性に対するヒト・ウロコルチン関連ペプチドの影響
ヒト・ウロコルチン関連ペプチドがストレス反応の発生に一定の役割を果たしているかどうかを調べるために、ラットの総運動活性に対するヒト・ウロコルチン関連ペプチドの影響について調べた。カニューレを右側脳室内に外科的に入れて、総運動活性を継続的にモニターできるように遠隔測定装置を腹部内に埋め込んだ。これらの動物を手術後７日間は体力回復させた。この期間中、それらの動物に対しては注射手順に順化させるように毎日処理した。注射を行った日に、基底活性を４時間記録した。消灯が行われる午後６時に、それらの動物に５μｌの食塩水か、全部で５μｇのヒト・ウロコルチン関連ペプチドを含んでいる食塩水５μｌを投与した。活性カウントを４時間期間毎に合計した。それらの結果を図１３に示す。比較対照と比べて、ヒト・ウロコルチン関連ペプチドを注射した動物において、全体的な運動活性において有意な変化は認められなかった。
【００９９】
実施例１４
体温に対するヒト・ウロコルチン関連ペプチドの影響
ヒト・ウロコルチン関連ペプチドのラットの体温に対する影響について調べた。ヒト・ウロコルチン関連ペプチド注入のためのカニューレを右側脳室に入れた。体温をひそかに継続的に分析するための遠隔測定装置を腹部内に埋め込んだ。これらの動物に７日間の術後回復期間を設定した。この期間に、被験動物に対して注射手順に慣れるように毎日措置した。注射を行なった当日、基底体温を３時間にわたって記録した。午後６時（消灯時）、それら被験動物に対して５μｌの生理食塩水、あるいは１μｇ／μｌの割合でヒト・ウロコルチン関連ペプチドを塩水に溶かしたもの５μｌを注射した。体温を１２時間にわたって５分間毎にモニターした。図１４に示されているように、ヒト・ウロコルチン関連ペプチドを注射された被験動物の体温は、注射直後と７時間後に低下している。
【０１００】
実施例１５
食欲に対するヒト・ウロコルチン関連ペプチドの影響
食欲に対するヒト・ウロコルチン関連ペプチドの影響についてもラットで調べた。ヒト・ウロコルチン関連ペプチドを注入するためのカニューレを外科的に右側脳室内に入れて、それら被験動物に７日間の体力回復期間を設定した。この期間に、これらの被験動物に注入手順に慣れさせるための措置を毎日行なった。注入の当日、それらの被験動物に５μｌの生理食塩水かあるいは１μｇ／μｌの割合でヒト・ウロコルチン関連ペプチドを生理食塩水に溶かしたもの５μｌを注射した。各動物が食べた餌の量を６時間にわたって１時間ごとに記録すると同時に１４時間目にも記録した。
【０１０１】
実験の全期間を通じて摂取された餌の総量を各期間ごとに図１５Ａに示してある。ヒト・ウロコルチン関連ペプチドを注射された被験動物は比較対照動物より摂取量がかなり低かった。図１５Ｂは期間毎に摂取された餌の量をまとめて示している。ヒト・ウロコルチン関連ペプチドで措置した動物は注射後１時間と、２時間目から３時間目の間、そして実験の最後の８時間に摂取量が特に低下した。
【０１０２】
実施例１６
有益なウロコルチンＩＩ及びヒト・ウロコルチン関連ペプチド修飾及び誘導体
ここに開示されているウロコルチンＩＩ及びヒト・ウロコルチン関連ペプチドはこれらの蛋白質のプロホルモン形態を示している可能性が高い。ホルモンの活性化は蛋白質分解処理とそれら蛋白質の非アミド化形態をもたらす修飾などそれら蛋白質に対する他の修飾が関係していることが考えられる。
【０１０３】
他のＣＲＦレセプタに関するリガンドを用いたこれまでの研究は、それらリガンドのレセプタに結合する能力あるいは生物学的活性を失わずに、それらリガンドに対していろいろなアミノ酸置換を行なうことができることを示している。ウロコルチンを用いたこれまでの多数の研究は、１つ、２つ、あるいは３つまでもの置換でも容易に行なえることを示している。いくつかの例では、ウロコルチンに対する修飾はより望ましい薬学的特性を有する蛋白質をもたらした。ウロコルチンＩＩ及びヒト・ウロコルチン関連ペプチドは小型の蛋白質であるから、そうした修飾はこの技術分野の当業者に周知のペプチド合成方法によって非常に容易に組み込むことができる。これらには、固相法、部分固相法、フラグメント濃縮法、そして古典的な溶液添加などの方法がある。ウロコルチンＩＩやヒト・ウロコルチン関連ペプチドに組み込まれるアミノ酸が非標準的なものである場合、これらの方法が特に好ましい。また、これらの修飾がまったく天然のアミノ酸だけを用いて行なわれる場合には、修飾されたウロコルチンＩＩあるいはヒト・ウロコルチン関連ペプチドの突然変位及び事後的な発現のために組み換えＤＮＡ技術を用いることもできる。
【０１０４】
ヒト・ウロコルチン関連ペプチドはチロシン残基を含んでいない。チロシン残基は蛋白質の放射性ヨード化に用いられるので、ヒト・ウロコルチン関連ペプチドに対する１つの可能な修飾はそれら蛋白質内の別のアミノ酸をチロシンと置換する方法であろう。これまで、Ｔｒｙ−Ｇｌｙで構成される配列のウロコルチンのＮ末端に対する付加については述べられている。得られた蛋白質は結合能力と生物学的活性を有するＣＲＦレセプタを含んでいるが、蛋白質の放射性ヨード化には有益であろう。本発明による蛋白質の他のＮ末端延長はラベリングやその他の方法にも適用できるであろう。
【０１０５】
ウロコルチンの最初の７つから１０個の残基を欠失させると有効なウロコルチン拮抗物が形成されることが分かっている。これらの蛋白質はＣＲＦレセプタに対して結合することはできるが、それらのレセプタを有意に刺激、あるいは活性化させるには至らなかった。ウロコルチンＩＩあるいはヒト・ウロコルチン関連ペプチドの最大５つのアミノ酸を欠失させても同様に有力な拮抗物が形成されるであろう。他のウロコルチンＩＩあるいはヒト・ウロコルチン関連ペプチド・フラグメントからも拮抗物をつくりだすことが可能であるかもしれない。これらの拮抗物は通常はＣＲＦ結合蛋白質によって除去される内生的ペプチドのレベルを向上させる上で有効である。ＣＲＦ結合蛋白質と結合して、その同じ蛋白質に結合するＣＲＦ、ウロコルチン、ウロコルチンＩＩ、及びヒト・ウロコルチン関連ペプチドをブロックすることにより、内発性ＣＲＦ、ウロコルチン、及びウロコルチンＩＩの有効なｉｎ　ｖｉｖｏ濃度が増大する。こうした拮抗物はその効果を増大させるためにＣＲＦ、ウロコルチン、ウロコルチンＩＩあるいはウロコルチン関連ペプチドのその他の促進物あるいは拮抗物と共に投与することができる。
【０１０６】
他のＣＲＦレセプタ結合蛋白質に関する広範な分析は、通常のアミノ酸をＤ異性体アミノ酸あるいは環化アミノ酸と置換することで、ＣＲＦレセプタに対する親和性が増大することを示している。特に有益な置換は配列識別番号Ｎｏ．３あるいは配列識別番号Ｎｏ．１１の位置９に対応するイソロイシン残基の『Ｄ形』異性体アミノ酸、好ましくはＤ−イソロイシン、Ｄ−フェニルアラニン、及びＤ−ロイシンとの置換である。同様に、配列識別番号Ｎｏ．３あるいは配列識別番号Ｎｏ．１１の位置１７に対応するグルタミン酸残基をＤグルタミン酸と置換することも可能である。環化アミノ酸は２つ以上の残基の側鎖間の化学結合によっても形成することができる。例えば、隣接するグルタミン酸とリシン残基を反応させてラクタム環をつくりだすアミド結合を形成することができる。Ｃα−メチル化ロイシン、Ｃα−メチル化アラニン、Ｎ−ｉｍ−ベンジルヒスチジン、４−ヒドロキシプロリン、５−ヒドロキシリシン、３−メチルヒスチジン、ホモセリン、そしてオルニチンなどの非標準的アミノ酸との置換もヒト・ウロコルチン関連ペプチドの促進物あるいは拮抗物を形成するために用いることができる。
【０１０７】
ここに開示されているウロコルチンＩＩ及びヒト・ウロコルチン関連ペプチドに対する修飾は実行可能な修飾を示すためであって、いかなる意味でも本発明の範囲の限定は意図していない。
【０１０８】
検討
神経ペプチドのＣＲＦ系統の新しいメンバーを同定するためにゲノム全体にわたる相同性調査が行なわれた。新しいリガンドの１つであるウロコルチンＩＩはＣＲＦ−Ｒ２と選択的に結合し、ラットＣＮＳの個々の領域で発現され、そして、内臓感覚情報の処理と自律性流出物の調節に関与する中枢ニューロンを活性化させる。さらに、ウロコルチンＩＩは総運動活性にはまったく影響を及ぼさずに食物摂取を抑制する。
【０１０９】
ＣＲＦ系統メンバーに期待される構造的、結合性、活性及び発現特性を示すマウスのペプチドに加えて、（一般に利用できるＥＳＴ配列に基づいて）ヌクレオチド・レベルでマウス配列と８０％同一のヒト・ウロコルチン関連ペプチドが同定された。しかしながら、ヒトのペプチドにはっきり示されている重要な相違点はヒトの相同体のＣ末端処理をおこなうであろういずれの明白な蛋白質分解性切断サイトが存在しないことである。この蛋白質からいずれかの相同性ヒト・ペプチドが発生されるかどうか、発生されるとしたらどのように発生されるのかは依然として検討課題である。しかしながら、ウロコルチンはＣＲＦ−Ｒ１及びＣＲＦ−Ｒ２の両方を通じての信号によって高い親和性で結合される（１４−１６）。マウス・ウロコルチンＩＩ及びヒト・ウロコルチン関連ペプチドはこれらの測定で高度のＣＲＦ−Ｒ２選択性を示し、これら２つのレセプタ・タイプによって媒介される解離機能において疑いもなく一定の役割を果たすであろう。図１６はウロコルチンＩＩがＣＲＦ−Ｒ１及びＣＲＦ−Ｒ２にどのように作用するかに関するモデルを示している。ウロコルチンＩＩは高い親和性でＣＲＦ−Ｒ２と結合するが、ＣＲＦ−Ｒ１には結合しない。ウロコルチンは両方のレセプタに結合するが、ＣＲＦは高い親和性でＣＲＦ−Ｒ１には結合するものの、ＣＲＦ−Ｒ２に対しては結合しない。
【０１１０】
ウロコルチンＩＩ　ｍＲＮＡはＣＲＦ（傍室核、例えば参考文献３１参照）及びウロコルチン（脳幹及び脊髄運動核、例えば参考文献１８参照）のものと部分的に重なり合っているように見えるが、ネズミの脳内で一定の皮質下分布を示す。特に興味深いのは、その転写物がストレスに関連した生理学的及び行動上の機能に関与している細胞に発現されることである（参考文献１３参照）。これには皮質膜に広く分布した突起をもたらしており、種々のレベルの覚醒及び不安感の発生に関与していることが示されている青斑（参考文献３２参照）、複数の関連神経分泌性群及び中枢自律神経回路内の感覚及び運動トラフィックを調節するＣＮＳ内への突起を内包している傍室核（参考文献３３参照）、そして、食物摂取とエネルギー・バランスの調節に役立っている広範なシステムの中核的構成要素としての弓状核（参考文献３４参照）などが含まれている。こうした関連性における新しいペプチドの位置に関する解剖学的及び機能的データは未だ不足しているが、中枢ウロコルチンＩＩ系はより広い中枢ＣＲＦネットワークの領域としてこれまで長い間示唆されてきたストレス関連機能に関与している可能性がある。これは、その主な細胞発現の場所が脳のエディンジャー・ウェストファル核内にあり、前脳に対する文献化された考察の少なさも手伝ってこの点での可能性に制約があるウロコルチンとは対照的である（１６、１８）。
【０１１１】
その結合特性と活性を考慮に入れれば、中枢ウロコルチンＩＩによって誘発される細胞活性のパターンがＣＲＦ−Ｒ２分布を密接に模倣することができない点は予想外であった。ｉｃｖ　ＣＲＦあるいはＵＣＮによって誘発されるＦｏｓ発現の分布を比較した最近の研究で、２つの知られている遺伝子によってコードされるＣＲＦ−Ｒｓに対するこれらペプチドの結合親和性と大まかにではあるが同様の活性化パターンが文献化された（３５）。つまり、ここで述べられているのと同様の用量のＣＲＦは高度に優先的な形態でＣＲＦ−Ｒ１発現のサイトを活性化させたのに対して、ＵＣＮの方は主に各レセプタを発現する細胞群の下位集合でＦｏｓ誘発を引き起こした。しかしながら、さらに、両方のペプチド共、本明細書で示されているようにラットの脳のウロコルチンＩＩ誘発活性化反応の優勢的な場所であると思われる中枢自律神経構造のまったく同じ集合を補強した。これは中枢自律神経系の要素がＣＲＦ状ペプチドがストレス関連の自律性あるいは行動性反応を誘発するために働きかけることができるサイトで最もよく文献資料化されたものの中に含まれているという点で意味がある。これらの知見は、タイプ１と同様タイプ２レセプタ活性化が、その根拠は不明であるにしてもこのシステムに関与することができることを示唆するものであろう。中枢自律神経系網の結節点の中で、傍室核（Ｒ１）とＮＴＳ（Ｒ２）だけがＣＲＦ−Ｒ発現サイト（２７、２８、３５）として確認されており、これらのいずれか、あるいは両方のレセプタに媒介された活性化がそのシステム全体の協力を得る上で十分なのかどうかについては検討の余地がある。合成ウロコルチンＩＩを全身的に注入しても、ｉｃｖ注射による研究で用いられたのと同じ範囲の用量で中枢自律神経細胞群に強力な活性化反応を起こすことができなかったことに留意しておくことは重要である。これは重要な比較対照である。というのは、末梢ＣＲＦ−Ｒ２の活性化が血圧の顕著で一貫した低下をもたらす（１６、１７）ことができ、顕著な血液低下性刺激は中枢ウロコルチンＩＩ投与に対する反応とまったく同じように中枢自律神経構造を活性化できるからである（３６、３７）。
【０１１２】
食物摂取及び活性に対するｉｃｖによるウロコルチンＩＩ投与の効果に関する初期的な特徴づけはストレス関連挙動における個々のＣＲＦ−Ｒｓの役割を明らかにしようとする最近の研究努力を補完するものである。例えば、いずれかのレセプタにも変異が認められないマウスは通常の基底食物摂取を示すが、ＣＲＦ−Ｒ１欠失動物は注射を受けた直後の期間には拒食作用には耐えるが、時間が経過するとその傾向がなくなるのに対して、ＣＲＦ−Ｒ２変異体マウスでは逆の傾向が見られることが示されている（１１、３８、３９）。これは、ウロコルチンが媒介する給餌抑制作用の初期及び後期のそれぞれＣＲＦ−Ｒ１とＣＲＦ−Ｒ２に媒介された事象であることを示唆している。異なったパラダイム（剥奪−誘導再給餌ではなく、夜間は自由に餌を接種させる）を用いたところ、Ｒ２固有リガンドが初期の時点においては食物摂取を安定的には抑制しなかったのに対して、注射から６時間以降経過すると抑制したので、そうした解析を裏付けるデータが提供された。
【０１１３】
運動活性の測定もこうしたパラメータにはＣＲＦ−Ｒが関与していないことを裏付けている。自発運動活性化がＣＲＦ−Ｒ１に媒介された事象であることを示すノックアウト・マウスで最近得られた証拠（４０）に沿って、Ｒ１選択性促進物、ＣＲＦが全体的運動活性をかなり増大させたのに対して、ウロコルチンＩＩを投与してもそうした傾向は認められないことが分かった。興味深いことに、両方のレセプタによって高い親和性で結合されるウロコルチンによる措置が活動増大の方向に有意な傾向を示さず、測定値はＣＲＦに対する反応で見られるものより一貫して低かった。このことは最近増大しつつあるこれら２つの知られているレセプタ・タイプ間での機能的拮抗作用を裏付ける証拠とおおよそ一致している。ＣＲＦ−Ｒ１欠失マウスはストレスに対してエンドクリン及び不安状反応の低下を示すが（４１）、ＣＲＦ−Ｒ２変異体系統ではこれらのパラメータの増大傾向が示されており（１１、３９、４２）、このことはＣＲＦ−Ｒ２の基底的活性化が反対方向のＣＲＦ−Ｒ１駆動ストレス反応に一定の役割を果たしている可能性を示唆している。
【０１１４】
内発性ＣＲＦ−Ｒ２選択性リガンドの確認はストレスに関連した生理的、行動的機能における個々のＣＲＦ関連信号発生分子の役割についてのさらに詳しい分析を可能にしてくれるであろう。ウロコルチンＩＩ　ｍＲＮＡの中枢発現はペプチドの中枢投与に反応する細胞群を示し、ＣＲＦ−Ｒ２活性化に関してこれまで想定されていた結果と一貫した行動上の反応を裏付けた。ストレスの生物学に関するこのペプチドの位置づけに関するさらなる洞察を行なうためには、ウロコルチンＩＩ含有細胞の中枢突起をはっきりさせることと、遺伝子発現及びペプチド放出を調節する因子及び状況についての確認が必要であろう。
【０１１５】
本明細書には以下の文献が引用されている。
１．　 Ｖａｌｅ． Ｗ．， Ｓｐｉｅｓｓ， Ｊ．， Ｒｉｖｉｅｒ， Ｃ． ＆ Ｒｉｖｉｅｒ， Ｊ． （１９８１） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２１３，　　　 １３９４−７
２．　 Ｍｅｎｚａｇｈｉ， Ｆ．， Ｈｅｉｎｒｉｃｈｓ， Ｓ． Ｃ．， Ｐｉｃｈ， Ｅ． Ｍ．， Ｗｅｉｓｓ， Ｒ． ＆ Ｋｏｏｂ， Ｇ．　　　 Ｆ．（１９９３） Ａｎｎ． Ｎ． Ｙ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ６９７， １４２−１５４
３．　 Ｓａｗｃｈｅｎｋｏ， Ｐ．Ｅ．， Ｉｍａｋｉ， Ｔ．， Ｐｏｔｔｅｒ， Ｅ．， Ｋｏｖａｃｓ， Ｋ．， Ｉｍａｋｉ， Ｊ． ＆ Ｖａｌ　　 ｅ， Ｗ． （１９９３）　Ｃｉｂａ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ １７２， ５−２１
４．　 Ｒｉｖｉｅｒ， Ｃ． ａｎｄ Ｖａｌｅ Ｗ． （１９８３）　Ｎａｔｕｒｅ， １９８３． ３０５ ３２５−３２７
５．　 Ｒｉｖｉｅｒ， Ｊ．， Ｃ． Ｒｉｖｉｅｒ， ａｎｄ Ｖａｌｅ Ｗ． （１９８４） ｎ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｍｐｏｄ　　 ｉｕｍ， Ｄｊｕｒｏｎａｓｅｔ， Ｓｗｅｄｅｎ． Ｐ． １０４
６．　 Ｃｈｅｎ， Ｒ．， ｅｔ ａｌ．， （１９９３） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， １９９３． ９０， ８９６７　　 −８９７１
７．　 Ｐｅｒｒｉｎ， Ｍ． Ｈ．， ｅｔ ａｌ．， （１９９５） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ９２， ２９６９−　　 ２９７３
８．　 Ｐｏｔｔｅｒ， Ｅ．， ｅｔ ａｌ． （１９９４） ｉｎ ７６ｔｈ Ａｎｎｕａｌ Ｍｅｅｔｉｎｇ ｏｆ Ｔｈｅ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ　　　 Ｓｏｃｉｅｔｙ， Ａｎａｈｅｉｍ， ＣＡ， ｐ． ２１７
９．　 Ｌｏｖｅｎｂｅｒｇ， Ｔ． Ｗ．， ｅｔ ａｌ． （１９９５） Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ， １３６， ３３５１−３３５５
１０．　Ｒｏｈｄｅ， Ｅ．， ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ， ５２ （６）， ８２９−３３
１１．　Ｂａｌｅ， Ｔ． Ｌ．， ｅｔ ａｌ． （１９９９） Ｎａｔ． Ｇｅｎｅｔ．， ２４ （４）， ｐ．４１０−４１４
１２．　Ｈｅｒｋｅｎｈａｍ， Ｍ． （１９８７）　Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ ２３， １−３８
１３．　Ｂｉｔｔｅｎｃｏｕｒｔ， ｅｔ ａｌ． （２０００） Ｊ． Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． ２０， １１４２−５６．
１４．　Ｂｅｈａｎ， ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ｍｏｌｅｃ． Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ １， ２６５−２７７
１５．　Ｔｕｒｎｂｕｌｌ， ｅｔ ａｌ． （１９９７） Ｐｒｏｃ． Ｓｏｃ． Ｅｘｐ． Ｂｉｏｌ． Ｍｅｄ． ２１５， １−１０
１６．　Ｖａｕｇｈａｎ， ｅｔ ａｌ． （１９９５） Ｎａｔｕｒｅ ３７８， ２８７−９２
１７．　Ｓｐｉｎａ， ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７３， １５６１−４
１８．　Ｂｉｔｔｅｎｃｏｕｒｔ， ｅｔ ａｌ． （１９９９） Ｊ． Ｃｏｍｐ． Ｎｅｕｒｏｌ． ４１５， ２８５−３１２
１９．　Ｅｄｄｙ， Ｓ． Ｒ． （１９９６） Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎｉｏｎ Ｓｔｒｕｃｔ． Ｂｉｏｌ． ６， ３６１−３６５
２０．　Ｂｒｕｎｎｅｒ， ｅｔ ａｌ． （２０００） Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ Ｒｅｓ． ８， ４６５−４７６
２１．　Ｍｉｒａｎｄａ， ｅｔ ａｌ． （１９９４） Ｊ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． ３７， １４５０−９． ９４２３８６４１
２２．　Ｍｉｌｌｅｒ， Ｃ． ＆ Ｒｉｖｉｅｒ， Ｊ． （１９９６） Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ ４０， ２６５−３１７
２３．　Ｓｉｍｍｏｎｓ， ｅｔ ａｌ． （１９８９） Ｊ． Ｈｉｓｔｏｔｅｃｈｎｏｌ， １２， １６８−１８１
２４．　Ｓａｗｃｈｅｎｋｏ， ｅｔ ａｌ． （１９９０） Ｍｅｔｈ． Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． ３， ２４７−２６０
２５．　Ｓａｗｃｈｅｎｋｏ， Ｐ． Ｅ． （１９８３） Ｊ． Ａｕｔｏｎ． Ｎｅｒｖ． Ｓｙｓｔ． ９， １３−２６
２６．　Ｓａｐｅｒ， Ｃ． （１９９５） ｉｎ Ｔｈｅ Ｒａｔ Ｎｅｒｖｏｕｓ Ｓｙｓｔｅｍ （２ｎｄ ｅｄ）， ｅｄ．
Ｇ． Ｐａｘｉｎｏｓ， （Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ） ｐｐ． １０７−１２８
２７．　Ｖａｎ Ｐｅｔｔ， ｅｔ ａｌ． （２０００）， Ｊ． Ｃｏｍｐ． Ｎｅｕｒｏｌ． ４２８， １９１−２１２
２８．　Ｃｈａｌｍｅｒｓ， ｅｔ ａｌ． （１９９５） Ｊ． Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． １５， ６３４０−６３５０
２９．　Ｇｒａｙ， Ｐ．Ｃ．， ｅｔ ａｌ． （２０００） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２７５（５）： ｐ． ３２０６−３２１２
３０．　Ｖａｌｅ， Ｗ．， ｅｔ ａｌ． （１９８３） Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ： Ｎｅｕｒｏｅｎｄｏｃｒｉｎｅ Ｐｅｐｔｉ　　 ｄｅｓ， Ｐ． Ｍ． Ｃｏｎｎ， Ｅｄｉｔｏｒ． Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ： ＮＹ． ｐ． ５６５−５７７． Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ　　 Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．
【０１１６】
本明細書で取上げたすべて特許あるいは刊行物は本発明が関係する分野の当業者のレベルを示している。これらの特許及び刊行物は引用によって、それぞれ個々の刊行物が具体的、個別的に引用によって組み込まれるのと同様に全体としても本明細書に組み込まれる。
【０１１７】
当業者であれば、本発明が上に述べた、及びそれに本質的に付随している目的を実行し、課題と利点を達成するのに適していることは自明であろう。ここに示されている実施例は、本明細書に述べられている方法、手順、措置、分子、及び具体的な化合物も含めて現時点での好ましい実施の形態を示すものであり、例示的なものであって、本発明の範囲の限定を意図するものではない。請求項の範囲で定義されている本発明の範囲内で当業者はその変更や他の利用法を想起するであろう。
【図面の簡単な説明】
上に述べた、及び以下に明らかにされる本発明の特徴、利点及び目的を達成し、より詳細に理解できるようにするために、上に要約的に述べた発明について添付図面に示すいくつかの実施の形態を参照して以下に詳しく説明する。これらの図面は本明細書の一部を構成する。しかしながら、添付図面は本発明の好ましい実施の形態を示すものであって、その範囲の限定を意図するものではない。
【図１】
新しいウロコルチン関連ペプチドとＣＲＦの存在を予見するヒト・ゲノム性ＤＮＡ配列を示す図。ゲノム配列は公共データベースに示されており、ヒト・ウロコルチン関連ペプチドの新しい配列を予見するために用いられた。推定開始サイトは位置１であり、成熟したペプチド配列を太字で示す。予想された信号ペプチド切断サイトを矢印で示す。
【図２】
ヒト・ウロコルチン関連ペプチド前駆体と推定されるものを示す図。下線を付した領域はヒト膵島ｃＤＮＡライブラリからＰＣＲによって分離されたｃＤＮＡ配列部分を示す。
【図３】
ヒト・ウロコルチン関連ペプチド（ＵＲＰ）とヒトＵｃｎ、ウロテンシンＩ、ＣＲＦ、カエル・ソーバジン（ｓａｕｖａｇｉｎｅ）、及びサメＣＲＦ／Ｕｒｏとの比較を示す図。相同性が最も高い領域は白いボックス内である。保存されたアミノ酸の数を示してある。
【図４】
図４ＡはＵｃｎＩＩの予想されたアミノ酸配列を示している。太字で示された開始メチオニンはボックス内に示されているペプチド・コード領域の上流に位置している。完全なヌクレオチド配列はＧｅｎｂａｎｋにデポジットされている（登録番号第ＡＦ３３１５１７）。図４Ｂは、マウスＵｃｎ ＩＩと相同性ヒト及びサカナ・ペプチド（ＵＲＰｓ）及びラットＵｃｎ及びラット／ヒトＣＲＦとの位置的整合を示している。マウスＵｃｎ ＩＩ配列と同じ残基をボックスに入れて示してある。■はアミド化サイトを示す。
【図５】
ＣＲＦＲ１とＣＲＦＲ２βに結合する１２５Ｉ−ソーバジンのヒト・ウロコルチン関連ペプチド媒介置換を示す図。ＣＨＯ細胞内で安定的に発現されるＣＲＦＲ１とＣＲＦＲ２βに対するＵｃｎ及びＵＲＰペプチドの親和性は１２５Ｉ−ソーバジンの競合的置換によって判定された。このデータは３つの実験の結果を示しており、抑制的解離定数（Ｋ１）値（９５％信頼限界）はプリズム・プログラマを用いて計算された。
【図６】
図６Ａ−６Ｃはラットの脳におけるウロコルチンＩＩ ｍＲＮＡ発現を示している。マウス・ウロコルチンＩＩ　ｃＤＮＡから発生した同位体でラベルされたアンチセンスｃＲＮＡプローブを用いて選択領域で観察されたラベリング（白い斑点）を示す暗視野顕微鏡写真。ポジティブ・ハイブリダイゼーション信号が視床下部核上（図６Ａ）、主にそのマグノ細胞分割部分（ｐｍ）上に観察され、よりぼんやりした信号は小細胞性側面（ｍｐ）上に見られ、そして青斑点上（ＬＣ；図６Ｂ）、顔面運動核（ＶＩＩ、図６Ｃ）、さらに脳の腹面の脳膜髄膜（ｍｅｎ）上に観察される。他の略語：ＣＢＬ、小脳；ｖ３、第３心室；ｖ４、第４心室。倍率：図６Ａと６Ｂ、７５倍；図６Ｃ、５０倍。
【図７】
霊長類視床下部内でのヒト・ウロコルチン関連ペプチド発現のオートラジオグラムを示す図。ＰＶＨ、傍室核；ＳＯ、視索上核；ＣＮ、尾状核；ｏｃｈ，視交叉；ｍｅ、正中隆起；ａｃ、前交連；ｉｃ、内包；Ｓｅｐｔ、隔膜。
【図８】
図８Ａ−８Ｆは中枢ウロコルチンＩＩ微量注入に対する反応における細胞活性化パターンを示す図である。図８Ａ−８Ｃ及び８Ｅ：１μｇ合成マウス・ウロコルチンＩＩのｉｃｖ注射から２時間後に致死させたラットで誘発されたＦｏｓ発現を示す免疫パーオキシダーゼの明視顕微鏡写真。図８Ｃと８Ｅに示すものに対応する領域のＣＲＦ−Ｒ２　ｍＲＮＡのハイブリダイゼーション組織化学的位置測定を示す暗視野顕微鏡写真を図８Ｄと８Ｆにそれぞれ示す。中枢ウロコルチンＩＩ注入は、主に、小細胞核の小細胞区分（図８Ａ）、小脳扁桃の中枢核（図８Ｂ）、そして孤束の核（ＮＴＳ、図８Ｃ）を含む中枢自律神経及び神経内分泌制御に関与する一連の相互につながった構造におけるＦｏｓ誘発を引き起こした。これらのうちで、ＮＴＳだけがＣＲＦ−Ｒ２発現のサイトである（図８Ｄ）。視床下部の腹側正中核（図８Ｆ）を含むＣＲＦ−Ｒ２発現の他の主要なサイトは検査されたペプチド用量（１−１０μｇ）の範囲ではウロコルチンＩＩに誘発されたＦｏｓ発現は示さなかった。すべての顕微鏡写真の倍率は７５倍である。
【図９】
図９は分界条末端（ＢＳＴ）、視床下部小細胞核（ＰＶＨ）、小脳扁桃（ＣｅＡ）の中枢核、外側傍小脳脚核（ＰＢＩ）、青斑（ＬＣ）、そして孤束核（ＮＴＳ）における核ＦＯＳ発現の刺激を検査することで、ヒト・ウロコルチン関連ペプチドの中枢注入の後の中枢ストレス関連細胞群の活性化を示す。ＢＳＴｏｖ、分界条末端の層状核（卵形核子構成要素）；ｉｃ、内包；ＣＰ、コード果核（ｃａｕｄｏｐｕｔａｍｅｎ）；ａｃ、前交連；Ｖ３、第３心室；ＡＨＡ、前視床下部；ｐｍ、後マグノ細胞部（小細胞核）；ｆｘ、円蓋；ＣｅＡｍ、小脳扁桃中枢核（中間部分）；ＢＬＡ、小脳扁桃の基底外側核；ｓｃｐ、上小脳脚；ＰＢｅｌ、傍小脳脚核（外側部分）；Ｖ４、第４心室；ｅｐ、上衣；ＡＰ、最後野；ＤＭＸ、迷走神経の背側運動核；ｔｓ、孤束；及びｃｃ、中心管。
【図１０】
図１０Ａ及び１０Ｂは食物摂取及び総運動活性に対する中枢ウロコルチンＩＩの影響を示している。図１０Ａは１μｇ　ＣＲＦ、ウロコルチン又はウロコルチンＩＩのｉｃｖ投与後の平均（±ＳＥＭ；ｎ＝１グループあたり３−６）累積夜間食物摂取（ｇ）を示す。ＣＲＦとウロコルチンの両方とも、注入後４時間目から食塩注入比較対象群と比較して食物摂取量をかなり低下させたが、ウロコルチンＩＩの効果は治療から６時間後まで明らかには示されなかった。＊Ｐ＜０．００２（ＣＲＦ及びＵｃｎ：食塩水）、＊＊Ｐ＜０．００２（ＣＲＦ、ウロコルチン、及びウロコルチンＩＩ：食塩水）。図１０ＢはＣＲＦのｉｃｖ注入を受けた動物においてかなり上昇した総運動活性の遠隔測定結果を示している。ウロコルチンとウロコルチンＩＩのいずれも運動活性に対して大きな影響を及ぼすことはなかった。＊Ｐ＜０．００１（ＣＲＦ：食塩水）。
【図１１】
ウロコルチン及びヒト・ウロコルチン関連ペプチドによるラット前下垂体細胞からのＡＣＴＨ分泌の刺激を示す図。ラット前下垂体細胞を培養して、ラット・ウロコルチンあるいはヒト・ウロコルチン関連ペプチドのいずれかで処理した。分泌されたＡＣＴＨはキット（Ｎｉｃｈｏｌｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を用いて測定した。
【図１２】
天然のＣＲＦ−Ｒ２βを発現するＡ７Ｒ５細胞内でのｃＡＭＰレベルに対するヒト・ウロコルチン関連ペプチドの影響を示している。ｃＡＭＰ生成に対する３０分間のウロコルチン（白丸）あるいはヒト・ウロコルチン関連ペプチド（黒丸）による培養の用量依存効果。ｃＡＭＰはＲＩＡ（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）によって測定した。
【図１３】
ラットにおける総運動活性に対するヒト・ウロコルチン関連ペプチド（ｈＵＲＰ）の影響を示す図。
【図１４】
ラットの体温に対するヒト・ウロコルチン関連ペプチド（ＵＲＰ）の脳室内注射の影響を示す図。
【図１５】
ラットの夜間食物摂取に対するヒト・ウロコルチン関連ペプチド（ｈＵＲＰ）の脳室内注射の影響を示す図。
【図１６】
ヒト・ウロコルチン関連ペプチドがＣＲＦ−Ｒ１及びＣＲＦ−Ｒ２にどのように作用するかのモデルを示す図。ヒト・ウロコルチン関連ペプチドはＣＲＦ−Ｒ２に対しては高い親和性で結合するが、ＣＲＦ−Ｒ１に対しては結合せず、一方、ウロコルチンは両方のレセプタに対して結合する。ＣＲＦはＣＲＦ−Ｒ１に対して高い親和性で結合するが、ＣＲＦ−Ｒ２に対しては結合しない。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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