(57)【要約】本発明は、炎症性疾患の予防、より詳しくは、関節リウマチの患者におけるタンパクへのＴ細胞寛容の誘導に有用なタンパクを示すものである。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２のアミノ酸番号１〜５９８から伸長しているアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項２】
該ポリヌクレオチドが、配列番号２、配列番号１９、配列番号２０又は配列番号２１のアミノ酸配列をコードする、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項３】
該ポリヌクレオチドが、配列番号１のヌクレオチド５９〜１８５２から伸長している配列を含む、請求項１又は２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項４】
該ポリヌクレオチドが、配列番号１、配列番号１６、配列番号１７もしくは配列番号１８の配列、又は、配列番号１のヌクレオチド５９〜２０１７、配列番号１６のヌクレオチド５９〜１９６９、配列番号１７のヌクレオチド５９〜１９１２もしくは配列番号１８のヌクレオチド５９〜１８９４から伸長している配列を含むものである、請求項１から３に記載のポリヌクレオチド。
【請求項５】
請求項１から４に記載のＤＮＡを含む組換え発現ベクター。
【請求項６】
請求項１から４に記載のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド、請求項５に記載の発現ベクター、又は配列番号２、配列番号１９、配列番号２０もしくは配列番号２１の免疫調節断片。
【請求項７】
請求項６に記載のポリペプチド、及び薬学的に許容できる担体を含む薬剤組成物。
【請求項８】
治療に用いるための請求項６に記載のポリペプチド。
【請求項９】
炎症性疾患に対する医薬製剤の製造のための請求項６に記載のポリペプチドの使用。
【請求項１０】
自己免疫疾患、より詳しくは関節リウマチの患者での、自己抗原に対して免疫寛容を誘導するための医薬製剤の製造のための請求項６に記載のポリペプチドの使用。
【請求項１１】
請求項１から４に記載のＤＮＡ又は請求項５に記載の発現ベクターでトランスフェクションされた細胞。
【請求項１２】
請求項６に記載のポリペプチドを発現する安定なトランスフェクションされた細胞である、請求項１１に記載の細胞。
【請求項１３】
請求項１から４に記載のＤＮＡ、又は請求項５に記載の発現ベクター、請求項１１もしくは１２に記載の細胞、又は請求項６に記載のポリペプチドの、免疫寛容原（ポリ）ペプチドの同定のためのスクリーニングアッセイにおける使用。
【請求項１４】
ａ）請求項１から４に記載のポリヌクレオチドの断片を適当な宿主細胞に導入するステップ；
ｂ）宿主細胞を、導入された配列の発現を可能にする条件下で培養するステップ；
ｃ）発現産生物をリンパ球と接触させるステップ；及び
ｄ）リンパ球活性を確立させるステップを含む方法である、免疫寛容原ペプチドを同定する方法。
【請求項１５】
ａ）請求項１から４に記載のポリヌクレオチドの断片を適当な宿主細胞に導入するステップ；
ｂ）宿主細胞を、導入されたＤＮＡ配列の発現を可能にする条件下で培養するステップ；
ｃ）発現産生物を単離するステップ；
ｄ）発現産生物を抗原提示細胞及びＴ細胞と接触させるステップ；及び
ｅ）Ｔ細胞を活性化させるステップを含む方法である、免疫寛容原ペプチドを同定する方法。
【請求項１６】
ａ）配列番号２、配列番号１９、配列番号２０又は配列番号２１の断片を化学的に合成するステップ；
ｂ）ペプチド断片を抗原提示細胞及びＴ細胞と接触させるステップ；及び
ｃ）Ｔ細胞を活性化させるステップを含む方法である、免疫寛容原ペプチドを同定する方法。
【請求項１７】
請求項１４から１６の方法及び同定されたペプチドを薬学的に許容できる担体と混合するステップを含む、薬剤組成物の調製方法。
【請求項１８】
免疫寛容原剤として適した製剤の調製のための、請求項１４から１６の方法で同定されたペプチドの使用。
【請求項１９】
１又は２以上の請求項６に記載のポリペプチド及び検出試薬を含む診断用組成物。
【請求項２０】
ａ）末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を個体の血液サンプルから単離するステップ、ｂ）該ＰＢＭＣを適当な条件下で培養するステップ、
ｃ）該ＰＢＭＣ培養物を、ＳＣＩＭ−１、その断片及び／又は１もしくは２以上の請求項６に記載のペプチドの存在下でインキュベートするステップ、及び
ｄ）個体中の活性化自己反応性Ｔ細胞の存在を指標する、Ｔ細胞の応答を検出するステップを含む、活性化自己反応性Ｔ細胞の検出のための診断方法。
【請求項２１】
試験キットがＳＣＩＭ−１又は１もしくは２以上の請求項６に記載のペプチドを含む、活性化自己反応性Ｔ細胞の検出のための試験キット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、新規細胞外マトリックスタンパク、すなわちＳＣＩＭ−１をコードする新規ポリヌクレオチド分子の分離に関するものである。コードされるタンパク又はその誘導体は、病状の診断、予防、又は治療に有用である。それらは、自己免疫疾患、より詳しくは関節リウマチの治療のための調節剤として使用することができる。
【０００２】
免疫系の主な機能的役割は、外来すなわち非自己の抗原を持つ病原体の侵入から個体を保護することである。この機能を安全かつ効果的な方法で果たすために、外来の抗原と個体自身の体から誘導される自己抗原とを識別するためのメカニズムが必要とされる。この自己−非自己識別の過程の機能不全、すなわち自己抗原に対する免疫寛容の喪失は、組織損傷及び器官の機能損失を伴う自己免疫疾患を引き起こす、自己抗原に対する免疫反応を導き得る。
【０００３】
自己免疫疾患は、ヒトの医療において主な問題である。いくつかの自己免疫疾患は、一つの抗原又は抗原複合体に対する免疫学的過程の結果生じている可能性があり、一方、他のものでは、自己免疫反応は、複数の器官に存在し得る多くの型の抗原を伴っている可能性がある。いくつかの一連の証拠によって、免疫系が自己免疫疾患の病状に関与することが示唆されている。第一に、個体において自己免疫疾患が進行する可能性は、その遺伝的背景に密接に関係している。ＭＨＣ−ペプチド複合体を認識する応答Ｔ細胞に（自己）抗原を提示する主要組織適合複合体（ＭＨＣ）クラスＩＩ分子をコードする遺伝子は、疾患感受性に対して強い遺伝的関連性を示す。第二に、単球／マクロファージ及びＴ細胞のような免疫系の細胞が標的器官に侵入する。第三に、自己免疫疾患の患者のＴ細胞は、インビトロで、潜在的に関連する自己抗原に応答して増殖する。第四に、自己免疫の動物モデルにおける研究は、単球／マクロファージ及びＴ細胞のような免疫系の細胞が疾患の活性の誘発及び発現に関与することを明白に実証している。
【０００４】
関節リウマチ（ＲＡ）のような疾患は、自己免疫疾患の場合に発生し得る免疫病理学を説明することができる。ＲＡは、一般的な臨床的症状が、滑膜細胞の増殖、パンヌスの形成、軟骨の破壊及び骨の侵食による持続的炎症性滑膜炎、及び究極的には機能不全を招く関節変形である、慢性多系統疾患として示される。
【０００５】
ＲＡのような免疫系が不要な、望ましくない炎症性応答を発生させる免疫不全疾患に対する従来の治療法は、不適当である。治療においては、その原因よりむしろ自己免疫疾患の症状の緩和に焦点が合わされてきた。自己免疫疾患の治療に用いる大部分の薬剤、例えばステロイド及び非ステロイド性抗炎症化合物は、非特異的であり、著しい毒性の副作用を有する。これは、自己免疫疾患が慢性の病状であり、長期にわたる薬剤の投与を必要とするために、特に問題である。
【０００６】
抗原駆動性、非毒性の免疫調節治療は、非特異的免疫抑制に代わる非常に魅力的な、手段をもたらす。この抗原特異的治療は、標的（自己）抗原、又は（自己）抗原から誘導される合成のＴ細胞反応性ペプチドを用いる患者の治療を含む。これらの合成のペプチドは、（自己）抗原のＴ細胞エピトープに相当し、それ自身及び（自己）抗原の両方に特異的Ｔ細胞寛容を誘導するために使用することができる。標的（自己）抗原の制御された投与は、免疫系の脱感作において非常に有効となり得る。免疫系の脱感作又は免疫寛容は、抗原もしくはエピトープを餌で与えられていたか又は吸入させられていた動物は、該抗原もしくはエピトープを全身性の経路を通じて導入するときに、該抗原もしくはエピトープに対する全身性免疫応答を発生させる能力がより少ないという、長期的に観察される現象に基づく。
【０００７】
免疫療法のための抗原の使用に関しては、ヒト軟骨（ＨＣ）ｇｐ−３９タンパクが関節炎の治療のための全身性免疫寛容の誘導に有効であることがごく最近報告されている（Ｊｏｏｓｅｎ等．Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ　Ｒｈｅｕｍ．４３：６４５−６５５，２０００）。経鼻投与上で、ＨＣ　ｇｐ−３９はマウスのＩＩ型コラーゲン誘導性関節炎の進行を妨げた。治療の結果として、疾患の活性及び関節の破壊の両方が改善された。
【０００８】
関節リウマチのような自己免疫疾患に関連するタンパクの探索において、新規遺伝子ＳＣＩＭ−１（滑膜／軟骨炎症関連メッセンジャー１）が同定された。ＳＣＡＭ−１ｍＲＮＡによってコードされるタンパクは、以前に報告されていない。ＳＣＡＭ−１ｍＲＮＡの同定上、ｍＲＮＡの断片のみが公開のドメインデーターベース中に発現配列タグ（ＥＳＴ）として存在することが認められた。公開のＥＳＴから、同定されたＳＣＩＭ−１ｃＤＮＡを再配列することは不可能であった。ＳＣＩＭ−１タンパクの最高の相同性は、フィブリン−１のＥＧＦ様ドメイン、すなわち９個のＥＧＦ様ドメインを含む細胞外タンパクで見出された。フィブリン−１は、フィブリノーゲンとの相互作用によって、血管壁の細胞外マトリックスを血小板上のインテグリン−αＩＩｂβ３と結合させ得る（Ｇｏｄｙｎａ等．Ｂｌｏｏｄ　８８：２５６９−２５７７，１９９６）。そのＥＧＦ様ドメインによって、フィブリン−１は、ニドゲン、フィブロネクチン、ラミニン、フィブリノーゲン、ＮＯＶＨ、アグリカン及びバーシカンと結合する（Ｔｒａｎ等．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：２２６００−２２６０６，１９９７；Ｐｅｒｂａｌ等．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９６：８６９−８７４，１９９９；Ｂａｒｔｈ等．Ｍａｔｒｉｘ　Ｂｉｏｌ．１７：６３５−６４６，１９９８）。フィブリン−１の高い発現は、腫瘍の形成及び転移を妨げると思われる（Ｑｉｎｇ等．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ　１５：２１５９−２１６８，１９９７）。ＳＣＩＭ−１は、ＥＧＦ様ドメインのそのＲＧＤモチーフに関与させることによって、同様の能力を持つと考えられる。
【０００９】
Ｓａｒｋｉｓｓｉａｎ及びＬａｆｙａｔｉｓの報告（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６２：１７７２−１７７９，１９９９）に基づいて、例えばＲＡ患者からの繊維芽細胞様滑膜細胞（ＦＬＳ）の増殖が、ＰＤＧＦといったマイトジェンサイトカインに加えてインテグリン結合細胞外マトリックスタンパクによって与えられるシグナルを必要とすることから、ＳＣＩＭ−１とインテグリンの推定上の相互関係は、ＲＡと関連しうる。Ｗａｎｇ等（Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ　Ｒｈｅｕｍ．４０：１２９８−１３０７，１９９７）は、αｖ、α４及びα５インテグリンが、ＲＡ−ＦＬＳによる関節軟骨のＩＬ−１β刺激性侵入に必要であることを示唆した。
【００１０】
ＳＣＩＭ−１遺伝子は、滑膜及び軟骨組織において比較的高く発現されることがわかった。ｃＤＮＡ部分配列に基づいて、全長のｃＤＮＡをヒト軟骨細胞から分離した。多組織ノーザンブロット探索によって、ＳＣＩＭ−１遺伝子は健康なヒトのドナーからの主要軟骨細胞において発現される一方、いくらかの発現は脳及び肺においても観察されたが、これらの組織におけるＳＣＩＭ−１ｍＲＮＡは長さが異なるようであった。心臓、胎盤、肝臓、骨格筋、脾臓、腎臓及び大腸のような他のヒト組織、又は、単球、動脈内皮細胞及び（培養された）滑膜繊維芽細胞の細胞株においては、低い発現が観察されたか又は発現が観察されなかった。
【００１１】
ＳＣＩＭ−１の発現は、発現が主要軟骨細胞のみで検出され、ＳＶ４０で形質転換されたヒト主要軟骨細胞では検出されなかったことから、分化した軟骨細胞の表現型と正の相関関係があるように思われる。さらに、ヒト軟骨細胞におけるＳＣＩＭ−１遺伝子の発現は、ＲＡに関連するサイトカインＴＮＦ−α及びＩＬβの存在下で促進されることが示された。軟骨細胞において、ＳＣＩＭ−１遺伝子の転写は、６５３個のアミノ酸のタンパクをコードする２．７ｋｂ　ｍＲＮＡを結果として生じる。多組織ノーザンブロットのデータ及び、インサイト及び公開のドメインデーターベースの配列に基づいて、ＳＣＩＭ−１の転写は、関節、脳及び肺において異なるスプライシングを受けることが見出された。
【００１２】
これらの予測されたタンパクモチーフに基づいて、ＳＣＩＭ−１タンパクは、細胞外マトリックスタンパク、又は、軟骨細胞及び滑膜細胞及びその他の可能ないくつかの細胞型の細胞表面に局在するタンパクであることが予測される。
【００１３】
（例えばＲＡのような）（自己）免疫疾患における主な問題は、免疫系が不利に反応している正確な標的又は抗原の大部分は知られておらず、このことから抗原特異的な方法で疾患の実体を調節することは不可能となり得るということである。
【００１４】
しかしながら、（自己）免疫応答における標的として関与する抗原の知識なしに抗原駆動性、非毒性の形態の免疫調節療法を用い得るならば、それは重要な利点となるであろう。このような抗原駆動性療法は、自己免疫過程の中で放出又は産生されることが期待される抗原の使用を伴った抗原特異的調節細胞の発生と関連する。このような抗原は、炎症又は組織破壊の間に使用できるようになるであろう。自己免疫疾患の場合において、局所的に産生される自己抗原は、その後該抗原により誘導される調節細胞を活性化又は再活性化させる。
【００１５】
Ｔ細胞媒介性の軟骨破壊を治療するために、寛容誘導療法を効果的に使用するためには、炎症過程を引き起こすＴ細胞を活性化させ、この自己抗原に対する患者を脱感作しうるＴ細胞反応性（ポリ）ペプチドを同定する必要が大いにある。
【００１６】
本発明の目的は、全身性の免疫寛容、より詳しくは特異的Ｔ細胞寛容を、好ましくはＴ細胞媒介性軟骨破壊の患者における応答性軟骨抗原に対して誘導する能力をもつ（ポリ）ペプチドを提供することである。ＳＣＡＭ−１は、前記の要求を満たし、及び、免疫系の調節における有効な寛容原として使用できることが見出された。
【００１７】
本発明において、全身性の免疫寛容の誘導下では、当然のことながら抗原特異的リンパ球は、リンパ球が抗炎症サイトカインを産生する状態となる方法で、抗原提示細胞（ＡＰＣ）によって刺激される。抗炎症サイトカインは、例えば、ＩＬ−４、ＩＬ−１０及び／又はＴＧＦ−βであってよい。ＡＰＣによって寛容となるリンパ球は、体の他の領域、例えば炎症が進行している領域を、抗炎症状態にすることができる。
【００１８】
免疫系は、Ｔ−及びＢ−リンパ球のような特異的細胞の活性化、及びインターロイキン、抗体及び補足因子といった可溶性因子の産生によって、外来の抗原から個体を保護し、且つ外来の抗原への露出に応答する。免疫系が応答する抗原は抗原提示細胞（ＡＰＣｓ）によって分解され、抗原の断片は主要組織適合複合体（ＭＨＣ）クラスＩＩ糖タンパクによって細胞表面上に示される。ＭＨＣ糖タンパク−抗原−断片複合体は、Ｔ細胞に提示されて、そのＴ細胞受容体の効力によって、それが結合するＭＨＣクラスＩＩタンパクと連携して抗原断片を認識する。Ｔ細胞は活性化、すなわち増殖及び／又はインターロイキンを産生して、攻撃下の抗原に向けられる活性化リンパ球の拡大を生じる（Ｇｒｅｙ等．，Ｓｃｉ．Ａｍ．，２６１：３８−４６，１９８９）。
【００１９】
自己抗原はまた、連続的に処理されて、ＭＨＣ糖タンパクによって抗原断片としてＴ細胞に提示される（Ｊａｒｄｅｔｓｋｙ等．，Ｎａｔｕｒｅ　３５３：３２６−３２９，１９９１）。このように自己認識は免疫系に固有のものである。正常な環境下では、免疫系は自己抗原に寛容であり、これらの自己抗原による免疫応答の活性化は避けられる。自己抗原に対する寛容が失われるとき、免疫系は１もしくは２以上の自己抗原に対して活性化し、結果として自己反応性Ｔ細胞の活性化を、そして時には自己抗体の産生をも生じる。この現象を、自己免疫と呼ぶ。一般的に免疫応答は破壊的であり、すなわち侵入性の外来抗原を破壊することから、自己免疫応答は体自身の組織の破壊を引き起こしうる。
【００２０】
このようにＳＣＩＭ−１タンパクの断片がＡＰＣによって発現され、それゆえＳＣＩＭ−１の断片もまた免疫応答を誘発する能力をもつことは明らかである。
類似の機能を有するか、又は少なくともヒトＳＣＩＭ−１タンパクと構造的に密接に関連している他の種のタンパクもまた、同様の寛容効果を果たし得る。従って、相同ポリペプチド又はその一部もまた本発明に含まれる。
【００２１】
本発明のタンパクは、配列番号２を含むポリペプチドだけではなく、７０％、好ましくは９０％、より好ましくは９５％、９８％、最も好ましくは９９％の類似性を持つポリペプチドも含む。さらに寛容効果を与える能力をもつこのようなポリペプチドの一部分も含まれる。このような部分は、それ自体が例えば可溶化された形態で機能を持っていてもよく、又は、キメラタンパクを得るための既知のバイオテクノロジー的方法か化学合成のいずれかによって、他のポリペプチドと関連してもよい。
【００２２】
本明細書で使用される類似性という用語は、ＮＣＢＩ−ＢＬＡＳＴ２．０．１０［１９９９年８月２６日］で定義される（Ａｌｔｓｃｈｕｌ等．，Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２，１９９７）。
【００２３】
ＳＣＩＭ−１タンパクの断片又は相同ポリペプチドは、当然のことながらタンパクの部分配列である。これらの部分配列は、リンパ球機能を調節しうる。それらは以下の機能的免疫調節特性を持つことが好ましい：ｉ）ペプチドは、疾患関連性ＭＨＣ分子、好ましくはＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０１０１、ＤＲＢ１＊０４０１、ＤＲＢ１＊０４０４、ＤＲＢ１＊０４０８、ＤＲＢ１＊０４０５、ＤＱＢ＊０３０１、又はＤＱＢ＊０３０２によって結合することができる、及び、ｉｉ）ペプチドは、ヒト、好ましくは自己免疫の患者、より好ましくはＲＡの患者において、Ｔ細胞応答を誘発し得なければならない。このような応答は、例えばインビトロでのＴ細胞増殖アッセイにおいて又はＴ細胞サイトカイン産生検出アッセイ（例えばエライザもしくはエリスポット）において測定することができる（Ｃｏｌｉｇａｎ等．，Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，１９９８）。好ましくは、ペプチドはまた、相当する前記のヒトＭＨＣクラスＩＩ分子を遺伝子導入された動物のＴ細胞、及びＳＣＩＭ−１（ポリ）ペプチドにて免疫化されたヒトＣＤ４によって認識される必要がある。
【００２４】
これらの部分配列の長さは、相当するＭＨＣ分子によって認識されるエピトープを含むならば重要ではない。好ましくは、これらのペプチドは、９−５５個のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を持つ。より好ましくは、ペプチドは、９−３５個、特に９−２５個のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を持つ。さらにより好ましくは、９−１５個のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列をもつペプチドである。最も好ましくは、１３もしくは１４個のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を持つペプチドである。
【００２５】
特により小さいペプチドの配列において発生する変異は、全配列でのアミノ酸の差異によって、又は、該配列内のアミノ酸の欠失、置換、挿入、逆転もしくは付加によって説明することができる。生物学的及び免疫学的活性を本質的に変えないと思われるアミノ酸置換は説明してある。関連するアミノ酸の間でのアミノ酸交換、又は進化において頻繁に発生したアミノ酸交換は、とりわけＳｅｒ／Ａｌａ、Ｓｅｒ／Ｇｌｙ、Ａｓｐ／Ｇｌｙ、Ａｓｐ／Ａｓｎ、Ｉｌｅ／Ｖａｌである（Ｄａｙｈｏｆ，Ｍ．Ｄ．，Ａｔｌａｓ　ｏｆ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ａｎｄ　ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｎａｔ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｒｅｓ．Ｆｏｕｎｄ．，ワシントンＤ．Ｃ．，１９７８，第５巻，補遺３を参照）。この情報に基づいて、Ｌｉｐｍａｎ及びＰｅａｒｓｏｎは、迅速かつ高感度なタンパクの比較（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２７：１４３５−１４４１，１９８５）及び相同ポリペプチド間の機能的類似性の決定方法を開発した。
【００２６】
例えば本発明のペプチドの二量体もしくは三量体のようなペプチドの多量体もまた、本発明の範囲内である。本発明の多量体は、多数の同一ペプチドからなるホモマー又は異なるペプチドからなるヘテロマーのいずれかであり得る。
【００２７】
（ポリ）ペプチドは、ペプチドの片側又は両側のいずれかで伸長されても、さらに同じ免疫学的機能を発揮することは、当業者に明らかである。伸長した部分は、タンパクの生来の配列に類似のアミノ酸配列であってもよい。しかしながら、（ポリ）ペプチドは、人工の配列によって伸長されてもよい。（ポリ）ペプチドはその本来の機能を発揮する必要はなく、それ自体は不活性でもよいが、本発明の免疫学的機能をなお果たしていることは、明らかであろう。本発明の（ポリ）ペプチドはＭＨＣ分子に結合することができ、その結合溝は該ペプチドに占められる。また、好ましくはアミノ酸配列からなる可変のリンカー分子は、ペプチドに結合できる。ＭＨＣ分子は、定常ドメインを持つ必要がなく、可変ドメインのみから構成されていてもよく、お互いに直接結合するか可変リンカー分子を通して結合するかのいずれかである。このような複合体の利点は、それが可溶形態で存在でき、したがってＴ細胞に直接認識され得ることである。
【００２８】
よって本発明に従って、（ポリ）ペプチド、すなわち配列番号２のポリペプチドを含む抗原上に存在するＭＨＣクラスＩＩ制限Ｔ細胞エピトープ又はこれらのエピトープを含む断片に類似した（ポリ）ペプチドは、哺乳動物、より具体的には、リンパ球もしくはＴ細胞媒介性軟骨破壊、例えば関節炎、より具体的には関節リウマチを患うヒトにおいて、該抗原に対する全身性の免疫寛容を誘導する療法における使用に非常に適している。このような治療は、場合によって、ＤＭＡＲＤｓ（疾患緩和性抗リウマチ薬、例えばスルファサラジン、抗マラリア薬（クロロキン、ヒドロキシクロロキン）、注射用もしくは経口用の金、メトトレキサート、Ｄ−ペニシラミン、アザチオプリン、シクロスポリン、マイコフェノレート）、ＮＳＡＩＤｓ（非ステロイド性抗炎症薬）、コルチコステロイドのような他の薬剤、又は自己免疫患者における疾患の治療過程に作用することが知られている他の薬物の投与と併用することができる。
【００２９】
本発明のポリペプチドはまた、配列番号２のポリペプチドを含むタンパクもしくはその一部分である抗原と同じ組織に存在するが、該抗原以外の抗原に反応性をもつリンパ球の調節に使用されてもよい。抗原特異的Ｔ細胞寛容の誘導によって、自己免疫疾患を、全身性免疫寛容により治療することができる。より一般的には、調節される細胞は造血細胞である。一般的に、寛容原として機能するためにはペプチドは少なくとも２つの条件を満たす必要がある、すなわち免疫調節能力を有する必要があり、及びたいていはより大きいタンパクの一部として局所的に発現される必要がある。
【００３０】
従って本発明は、本発明の（ポリ）ペプチドを含む製剤を投与することによる、炎症性自己免疫疾患の患者を治療する方法を提供するものである。この（ポリ）ペプチドは、自己反応性Ｔ細胞によって認識され且つこれを刺激する能力をもつＴ細胞エピトープを含む。これらのＴ細胞は、例えば炎症性の疾患の患者の血中に見いだすことができる。該患者は、例えば、バセドウ病、若年性関節炎、原発性糸球体腎炎、多発性関節炎、骨関節炎、シェーグレン症候群、重症筋無力症、関節リウマチ、アジソン病、原発性胆管硬化症、ぶどう膜炎、全身性エリテマトーデス、炎症性腸疾患、多発性硬化症、又は糖尿病の患者である。それゆえ本発明のポリペプチドは、炎症性疾患を予防する医薬品製剤として用いることができる。ＳＣＩＭ−１の投与は全身性寛容を誘導する。より具体的には、ポリペプチドは、炎症性疾患、好ましくは免疫細胞介在性軟骨破壊を患う患者において特異的免疫寛容を誘導する医薬品製剤として使用することができる。好ましくは、免疫細胞はＴ細胞である。最も好ましい疾患は関節炎であり、より好ましくは関節リウマチである。
【００３１】
本発明のポリペプチドを用いた自己免疫疾患の治療は、全身性免疫寛容が、非関連性であるが共局限性である抗原を生じるという事実を利用するものである。免疫応答を下方に調節し得るサイトカインのような抗原特異型多面性タンパクにおいて、調節細胞は分泌する。
【００３２】
本発明のポリペプチドは、組替えＤＮＡ技術によって調製され得る。
【００３３】
本発明は、本発明のタンパク又はポリペプチドをコードするようなＤＮＡ配列を提供するものである。
【００３４】
本発明はまた、その一部が配列番号１で表される完全なｍＲＮＡ配列を含むものである。完全なコーティングＤＮＡ配列は、配列番号１のヌクレオチド５９−２０１７に示される。さらに、コドンの可変性に対応するために、本発明はまた、本明細書に開示される配列と同じアミノ酸配列をコードする配列を含む。同じ免疫学的機能を持つ個々のポリペプチドをコードするコード配列の一部もまた、その対立遺伝子もしくは種の変化形と同様に、本発明の一部である。遺伝子は、時には特定の組織においてスプライシング変異体として発現し、結果として、変化した５’もしくは３’ｍＲＮＡ、又は追加のエクソン配列の包含を生じる。これらの配列によってコードされたタンパクと同様に、これらの配列は、全て、同一又は類似の機能を果たすことが期待され、また本発明の一部に含まれる。
【００３５】
詳しくは、配列番号１６、配列番号１７及び配列番号１８は、配列番号１のヌクレオチド１８５２の下流の配列において配列番号１と異なる特異的スプライス変異体を示す。このスプライス変異体の翻訳は、配列番号１９、配列番号２０及び配列番号２１それぞれに示すように、配列番号２におけるタンパクのトランケート体を導く。これらの後者の核酸のコード配列は、それぞれ５９−１９６９、５９−１９１２及び５９−１８９４の位置から作動し、一般的に、配列番号２の最初の５９８個のアミノ酸を持つ。好ましくは、完全なタンパクは成熟したタンパクである。シグナル配列は、たいがい１９個のアミノ酸であるが、長さはわずかに異なる。
【００３６】
本明細書で与えられる配列情報は、誤って同定された塩基を含める必要があるほど狭義に解釈されるべきではない。本明細書で開示される特異的な配列は、次いでさらなる配列分析が容易にされ、それにより配列を誤って同定し得る完全な遺伝子を分離するために容易に用いることができる。
【００３７】
従って、本発明はまた、ＳＣＩＭ−１をコードする分離されたポリヌクレオチド、その不完全な翻訳、又はその断片を提供するものである。
【００３８】
本発明のＤＮＡは、ｃＤＮＡから得られてもよい。好ましくは、組織はヒト由来のものである。好ましくは、リボ核酸は、胎児の脳、胎児の肝臓、胎児の脾臓、胎盤、又はその他の組織から分離される。あるいは、コード配列は、ゲノムＤＮＡであるか、ＤＮＡ合成法を用いて調製される。ポリヌクレオチドはまた、ＲＮＡの形態であってもよい。ポリヌクレオチドがＤＮＡである場合、一本鎖又は二本鎖の形態であってよい。一本鎖は、コード鎖又は非コード（アンチセンス）鎖であってよい。
【００３９】
さらに本発明は、わずかな変異又は多型性領域を有するポリヌクレオチドに関するものである。わずかな変異を有するポリヌクレオチドは、生来の成熟タンパクと同じ生物学的機能もしくは活性を持つポリペプチドをコードする。多型性領域は、診断目的として有用である。該ポリヌクレオチドは、好ましくは高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズすることにより同定することができる。本発明に従って、「ストリンジェンシー」という用語は、６５℃の温度、１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳでの洗浄条件を意味し；高ストリンジェンシーは、ＳＳＣを０．３×ＳＳＣに、より好ましくは０．１×ＳＳＣに減らすことを指す。好ましくは、最初の２回の洗浄は、１５〜３０分間ごとに２回続けて行われる。高ストリンジェンシー条件下で洗浄する必要がある場合は、０．１％ＳＳＣでさらに１回１５分間行う。ハイブリダイズは、例えばｐＨ７．５の０．５Ｍリン酸緩衝液／７％ＳＤＳ中、６５℃で、一晩中行われる。
【００４０】
あるいは、同じ免疫学的機能を持つポリペプチドをコードする前記のポリヌクレオチドの断片もまた、本発明において具体的に示される。コードされたタンパク又はタンパクから誘導されたポリペプチドもまた、本発明の一部を形成する。
【００４１】
本発明のタンパク、ペプチド、該ペプチドの多量体又はキメラペプチドをコードする核酸配列は、発現ベクターに挿入される。適当な発現ベクターは、複製及び発現に必要な制御領域を持つ。発現ベクターは宿主細胞において発現を起こす。適当な宿主細胞は、例えば、細菌、酵母菌、及び哺乳類細胞である。このような手法は当該技術分野において良く知られており、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ，１９８９を参照されたい。
【００４２】
本発明の（より小さい）（ポリ）ペプチドはまた、例として、例えばＪ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５：２１４９（１９６３）及びＩｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｒｅｓ．３５：１６１−２１４（１９９０）に記載された固相ペプチド合成のような、ペプチド合成のための周知の有機化学的方法により調製することができる。
【００４３】
（ポリ）ペプチドは、エキソペプチダーゼが触媒する加水分解を減らす、Ｃ及び／又はＮ末端修飾により安定化されていてもよい。修飾は、Ｃ末端のアシル化、（例えば、アシル化＝Ａｃ−ペプチド）、Ｎ末端のアミド導入（例えば、ペプチド−ＮＨ２）、アシル化とアミド導入の併用（例えば、Ａｃ−ペプチド−ＮＨ２）及び、Ｌ−アミノ酸のかわりにＤ−アミノ酸の導入を含んでもよい（Ｐｏｗｅｌｌ等．，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．，８１：７３１−７３５，１９９２）。
【００４４】
他の修飾は、エンドペプチダーゼによる加水分解の抑制に焦点を合わせたものである。これらの修飾の例は、Ｌ−アミノ酸のかわりにＤ−アミノ酸の導入、アミノ酸の修飾、ペプチド間での環化、例えば減少したペプチド結合ψ［ＣＨ２ＮＨ］及び例えばペプトイド（Ｎ−アルキル化グリシン誘導体）といった修飾されたペプチド結合の導入である（Ａｄａｎｇ等．，Ｒｅｃｌ．Ｔｒａｖ．Ｃｈｉｍ．Ｐａｙｓ−Ｂａｓ，１１３：６３−７８，１９９４及び、Ｓｉｍｏｎ等．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：９３６７−９３７１，１９９２）。
【００４５】
本発明の寛容原ペプチドは、以下
ａ）ＳＣＩＭ−１ペプチド断片をコードするＤＮＡ断片を適当な宿主細胞に導入するステップ；
ｂ）宿主細胞を、導入されたＤＮＡ配列の発現を可能にする条件下で培養するステップ；
ｃ）発現産生物をリンパ球と接触させるステップ；及び
ｄ）リンパ球活性を確立するステップ
を含む方法を用いて同定することができる。
【００４６】
好ましくは発現産生物を、インビボで、例えば産生物を動物に投与することによってリンパ球と接触させる。リンパ球活性は、例えば抗炎症性サイトカインの決定により測定することができる。
【００４７】
あるいは、ステップｂにおける宿主細胞の発現産生物は、分離されて順次に抗原提示細胞及びＴ細胞に接触させられてもよく、Ｔ細胞活性は確立されてもよい。
【００４８】
前記のスクリーニング方法において、試験されるペプチドは化学的に合成されていてもよいことは明らかである。
【００４９】
このように同定されるペプチドは、ペプチドと薬学的に許容できる担体との混合物を含む薬剤組成物の調製に使用することができる。
【００５０】
本発明に従って、Ｔ細胞媒介性の関節軟骨の破壊を患う患者を、１又は２以上の本発明のペプチド及び薬学的に許容できる担体を含む治療組成物を用いて治療することができる。本発明の薬剤組成物の投与は、全身性の免疫寛容、特に１もしくは２以上の本発明のペプチドのアミノ酸配列によって特徴づけられるもしくは模倣される、同定されたＭＨＣクラスＩＩ結合Ｔ細胞エピトープを示す、攻撃下の関節軟骨の自己抗原性タンパク及び他の自己抗原に対して、これらの患者の特異的自己反応性Ｔ細胞の寛容を誘導する。誘導寛容は、このように攻撃下の関節軟骨において局所的炎症性応答の低減を導く。
【００５１】
本発明の（ポリ）ペプチドは、自己反応性Ｔ細胞において特異的な効果を持つため、非特異的抑制効果を持つ免疫抑制剤と比較して、免疫系の他の構成成分を損なわないという利点を有する。
【００５２】
全身性免疫寛容は、高用量もしくは低用量の本発明のペプチドの投与によって獲得することができる。ペプチドの量は、投与経路、投与時間、患者の年齢、同様に全般的な健康状態及び食事に依存する。
【００５３】
一般的に、体重１ｋｇあたり０．０１から１００００μｇの用量のペプチド、好ましくは０．０５から５００μｇ、より好ましくは０．１から１００μｇのペプチドを使用することができる。
【００５４】
薬学的に許容できる担体は当業者に既知のものであり、例えば、滅菌生理食塩水、乳糖、ショ糖、リン酸カルシウム、ゼラチン、デキストリン、寒天、ペクチン、ピーナツ油、オリーブ油、ゴマ油及び水を含む。他の担体は、例えば所望により、リポソームに包埋されるＭＨＣクラスＩＩ分子であってもよい。
【００５５】
さらに本発明の薬剤組成物は、１又は２以上のアジュバンドを含んでいてもよい。適当なアジュバンドは、数ある中でも、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、アンフィジェン、トコフェロール、モノリン酸リピッドＡ、ムラミールジペプチド、及びクイルＡのようなサポニンを含んでいてもよい。好ましくは、本発明の寛容療法に使用されるアジュバンドは、粘膜上皮に結合するコレラトキシンＢサブユニットもしくはカルボマーのような、粘膜性のアジュバンドである。アジュバンドの量はアジュバンドそのものの性質に依存する。
【００５６】
さらに本発明の薬剤組成物は、１又は２以上の、例えば、ソルビトール、マンニトール、デンプン、ショ糖デキストリン及びブドウ糖を含む糖質、アルブミンもしくはカゼインといったタンパクのような安定化剤、又は、アルカリフォスファターゼのような緩衝剤を含んでいてもよい。
【００５７】
適当な投与経路は、例えば、筋肉内注射、皮下注射、静脈注射又は腹腔内注射、経口投与、及び、スプレーのような経鼻投与である。
【００５８】
（ポリ）ペプチドの（自己）免疫応答に対する能力を試験するために好ましい。マウス膠原誘導関節炎（ＣＩＡ）、ラットアジュバント関節炎、マウス実験的アレルギー性脳脊髄炎、及び、マウスもしくは遺伝子導入マウス非肥満性糖尿病（ＮＯＤ）のような、いくつかのネズミモデルが示されている。このようなモデルにおいて、抗原は、静脈内、腹腔内、経口又は経鼻で投与されてもよい（Ｌｉｂａｕ等．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ　１８：５９９−６０３，１９９７による再考）。これらのモデルにおける解読を容易にするためには、信頼区間を増やすことが重要である。本発明に従って、関節炎モデルにおける発生率及び臨床スコアを、関節炎の元要因、例えばＣＩＡにおけるＩＩ型膠原と、細胞外マトリックスタンパクアグリカンから誘導されるペプチドを合わせることによって改善できることが見出された。このペプチドは、好ましくは元要因と同時に投与され得るが、個別での投与も可能である。
【００５９】
ＳＣＩＭ−１又は本発明のペプチドは、関節軟骨の慢性炎症を伴う活性化自己反応性Ｔ細胞の存在を検出する診断方法における使用にも非常に適している。
【００６０】
本発明の診断方法は、以下の：
ａ）末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を個体の血液サンプルから分離するステップ、
ｂ）該ＰＢＭＣを適当な条件下で培養するステップ、
ｃ）該ＰＢＭＣ培養物を、自己抗原、又は、本発明に従って自己抗原から誘導される１もしくは２以上のペプチドの存在下でインキュベートするステップ、及びｄ）個体中の活性化自己反応性Ｔ細胞の存在を指標して、Ｔ細胞の応答、例えば増殖応答を検出するステップを含む。
【００６１】
活性化Ｔ細胞の増殖応答を測定することにより応答を検出する場合、例えば３Ｈ−チミジンのような放射性同位体の取込みが増殖の目安となる。ＰＢＭＣに存在する自己反応性Ｔ細胞の応答はまた、サイトカイン特異的エライザを用いてサイトカイン放出を測定する、又は５１クロム放出を用いて細胞毒性を測定することによって検出することもできる。他の検出方法は、例えばＩＩ−２ＲのＦＡＣＳ分析による、活性化マーカーの発現の測定である。よって、１もしくは２以上の本発明のペプチド及び適当な検出試薬を含む診断用組成物は、本発明の一部を形成する。検出法に依存して、検出試薬は、放射性同位体、酵素、又は、細胞表面もしくは活性化マーカーに特異的な抗体であってよい。
【００６２】
１もしくは２以上の本発明のペプチドを含む試験キットもまた、本発明の範囲に含まれる。これらの試験キットは、本発明の診断方法において使用することができる。
【００６３】
従って本発明は、ＳＣＩＭ−１に反応性を持つ自己攻撃性Ｔ細胞が、Ｔ細胞媒介性軟骨破壊、例えば関節炎、詳しくは関節リウマチを患う患者に存在するかどうかを検出する方法を提供するものである。ＳＣＩＭ−１特異的Ｔ細胞が存在する場合、ＳＣＩＭ−１又は本発明のペプチド又はその組み合わせを含む薬剤組成物を用いたこれらのＴ細胞の寛容化は、関節炎の進行を遅らせるか又は抑制することができる。
【００６４】
以下の実施例は本発明を説明するためのものであって、決して本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。
【００６５】
図面の説明
図１
ＳＣＩＭ−１及びＧＡＰＤＨに特異的なオリゴヌクレオチドを用いたヒト軟骨ｃＤＮＡ上のＲＴ−ＰＣＲ。ＳＣＩＭ−１遺伝子発現の検出は、健康な軟骨（膝、男性；交通事故；レーン１）、及び４人のＲＡ患者の軟骨（膝／腰、女性３人、男性１人；レーン２−５）に見られる。同じ４人のＲＡサンプルにおけるＧＡＰＤＨ遺伝子発現の検出は、レーン７−１０に見られる。ＤＮＡ断片長マーカーとしての１００ｂｐラダー（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）は、レーン６において平行に流した（レーンの中間の主要バンドは６００ｂｐに相当する）。
【００６６】
図２
ＳＣＩＭ−１プローブ（配列番号１のｎｔ５６０−１０４８）は、カスタムメードの結合ノーザンブロットにおいてハイブリダイズされた（上部パネル）。表示されるヒト細胞／組織：Ｕ９３７単球＋ＰＭＡ−イオノマイシン（レーン１）、ＨＡＥＣ内皮細胞−／＋ＴＮＦ−α（それぞれレーン２−３）、ＳＣＲＯ１４．ＳＦ主要滑膜繊維芽細胞＋ＴＮＦα（レーン４）、ＰＣＧ　ＳＶ４０．０４形質転換軟骨細胞−／＋ＴＮＦα（それぞれレーン５−６）、及び主要軟骨細胞−／＋ＴＮＦα（それぞれレーン７−８）。レーンごとに、１−２ｕｇのポリ（Ａ＋）ＲＮＡが入れられた。対照として、ブロットは、ヒトβ−アクチン遺伝子から誘導された３２Ｐ−標識ｃＤＮＡを用いてプローブされた（下部パネル）。
【００６７】
図３
４つの異なるＳＣＩＭ−１ｍＲＮＡ種によってコードされる選択的カルボキシ末端、すなわち変異体Ａ−Ｄ。コードされるＣ−末端が表示され、及びアミノ酸は１文字コードで表される。配列はアミノ酸５９９番から異なる。変異体Ａ−Ｄのコードされたアミノ酸配列は配列番号２０−２３によってそれぞれ表わされ、相当する核酸は配列番号１６−１９によってそれぞれ表される。
【００６８】
図４
トランスフェクトＣＨＯ細胞におけるＳＣＩＭ−１変異体Ａ／Ｈｉｓ６発現の検出。ｐＮＧＶ１（レーン１）又はｐＮＧＶ１．ＳＣＩＭ．変異体Ａ（Ｈｉｓ６）（レーン２及びレーン３）を用いて形質導入したＣＨＯ細胞の培養上清のサンプルを、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上で分離して、ウエスタンブロットを行った。抗（Ｈｉｓ６）−タグモノクローナル抗体（Ｄｉａｎｏｖａ　ＧＭＢＨ）を用いて、（Ｈｉｓ６）−末端を含むタンパクを検出した。タンパク分子量マーカーは、レーン４（Ｍ）に流した。
【００６９】
実施例
実施例１：ＳＣＩＭ−１遺伝子の同定
ＬｉｆｅＳｅｑデーターベース（Ｉｎｃｙｔｅ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）から入手可能なｃＤＮＡライブラリーを、関節組織のようなＲＡ関連組織を表すカスタムメードの組織カテゴリーを定義するために、それらの遺伝子の内容に基づいてクラスター化させた。ｃＤＮＡライブラリー間の距離は、平方ユークリッド距離の測定によって算出され、及び、結果は平均連鎖法を用いて系図にクラスター化させた（Ｆｒｙ　１９９３，Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｄａｔａ　Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｏｘｆｏｒｄ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｐｒｅｓｓ，ニューヨーク）。結果として得られた２つの集団は、それぞれ非腫瘍性の滑膜又は軟骨組織から誘導された５ライブラリーのｃＤＮＡを含んでいた。それぞれの４０３８から５６２７配列反応の滑膜ｃＤＮＡライブラリーデータは利用可能であり、及び、それぞれの軟骨ｃＤＮＡライブラリーの１５５４から７２３１配列反応のデータも利用可能である。これらの配列データは、その発現が比較的これらのクラスターに制限されると思われる遺伝子としてプローブされた。それぞれインサイト−エスト配列及び配列番号１の一部が重複して構成されている２つのｃＤＮＡ部分断片を、陽性のヒットとして同定した。それらの発現パターンが類似しているように見られたことから、それらが同じ遺伝子から派生したと推測された。
【００７０】
実施例２：ＲＡの軟骨におけるＳＣＩＭ−１遺伝子発現
疾患組織におけるＳＣＩＭ−１遺伝子の発現を、ＳＣＩＭ−１特異的オリゴヌクレオチド（配列番号３，５’ＴＴＧＣＣＡＡＴＴＡＣＧＣＣＴＡＣＧＧＴ及び配列番号４，５’ＣＣＴＧＧＴＣＡＴＴＧＴＣＡＡＡＧＴＣＧＧ）を用いたＲＴ−ＰＣＲによって、４人のＲＡ患者及び１人の健康なドナーの軟骨サンプルから誘導されたｃＤＮＡ上で検出した。関節軟骨は、膝の関節交換手術の中で得られた。軟骨から軟骨細胞を酵素的に分離し、トリゾール（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）もしくはＲＮＡｚｏｌ　Ｂ（Ｃａｍｐｒｏ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いてＲＮＡを分離した。（Ｃｏｒｎｅｌｉｓｓｅｎ等．，１９９３，Ｊ．Ｔｉｓｓ．Ｃｕｌｔ．Ｍｅｔｈ．１５：１３９−１４６）。全量２０μｌのスーパースクリプト（登録商標）ＩＩ（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）を用いて、１μｇの全ＲＮＡからｃＤＮＡの合成を行った。陽性対照として、ＳＣＩＭ−１上の及びハウスキーピング遺伝子ＧＡＰＤＨ上のＲＴ−ＰＣＲにおいて、反応ごとに０．５μｌのｃＤＮＡを使用した。ＰＣＲは、パーキンエルマー９６００において：１サイクル５分９４℃、３５サイクル３０秒９４℃／３０秒５５℃／１分７２℃、１サイクル５分７２℃で、５０ｎｇ／プライマー、２００μＭｄＮＴＰｓ、及び２．５ｕＴａｑポリメラーゼ（ファルマシア、＃２７−０７９９）を使用して行った。ＧＡＰＤＨ特異的オリゴヌクレオチドは、配列番号５（５’ＣＣＣＴＴＣＡＴＴＧＡＣＣＴＣＡＡＣＴＡＣＡＴＧＧ）及び配列番号６（５’ＧＧＴＣＣＡＣＣＡＣＣＣＴＧＴＴＧＣＴＧＴＡＧＣＣ）であった。ＰＣＲサンプルをアガロースゲル上で分析した（図１）。レーン１−５は、健康な軟骨（巨視的に）及び４／４人の関節炎患者において期待される長さのＳＣＩＭ−１ｃＤＮＡ増幅産生物の明瞭なシグナルを示し、一方、ＧＡＰＤＨ特異的増幅シグナルは、ＲＡｃＤＮＡ標本間で同じ大きさである（レーン７−１０）。ＲＴ−ＰＣＲデータは、ＳＣＩＭ−１遺伝子が疾患組織、すなわち試験された４／４人のＲＡ患者の苦痛を伴う膝軟骨において発現されることを示す。ＳＣＩＭ−１遺伝子が、実際は少なくとも相当のパーセンテージのＲＡ患者の疾患関節軟骨において発現される可能性がある。したがって、ＳＣＩＭ−１タンパクがＲＡ患者の疾患軟骨において合成されることが予想される。
【００７１】
実施例３：関節関連細胞におけるＳＣＩＭ−１遺伝子の発現
ＳＣＩＭ−１遺伝子発現の組織分布を決定するために、多組織ノーザンブロットをＳＣＩＭ−１ｃＤＮＡ断片を用いてプローブした。プローブは、Ｒｅａｄｙ−Ｔｏ−Ｇｏビーズ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）及び３２Ｐ−α−ｄＣＴＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を用いて、ランダムプライマー法でＳＣＩＭ−１ｃＤＮＡ断片ｎｔ（５６０−１０４８）及び（１９８３−２４２７）（配列番号１による番号付け）を標識し産生された。標識されたプローブは、１ｍｌセファデックスＧ５０−媒体カラム上で遊離のヌクレオチドから分離され、及び、約３×１０６ｃｐｍ／ｍｌの標識プローブを、ハイブリダイゼーション混合物（０．５Ｍリン酸緩衝液　ｐＨ７．０、７％ＳＤＳ、１ｍＭ　ＥＤＴＡ）に添加し、１６時間、〜６５℃で、ノーザンブロットにハイブリダイズした。ブロットを、最大０．５×ＳＳＣ、６５℃で洗浄し、及び、ＳＴＯＲＭ（登録商標）８４０リン酸スクリーンに暴露した。配列番号１に関連したプローブｎｔ５６０−１０４８は、脳の〜２．４ｋｂｍＲＮＡ及び肺の〜３．０ｋｂｍＲＮＡに弱くハイブリダイズした（クローンテックヒト多組織ノーザンブロットＨ２及びＨ１、それぞれｃａｔ＃７７５９−１及び７７６０−１）。主要軟骨細胞における〜２．６ｋｂの明瞭なシグナル（図２、上部パネルレーン７−８）を除き、他の関節関連培養細胞におけるシグナルを検出されなかった。ハウスキーピング遺伝子対照としての（図２、下部パネル）β−アクチンハイブリダイゼーションシグナルを補正したところ、ＳＣＩＭ−１ｍＲＮＡのシグナルは、ＴＮＦα（２４時間、１０ｎｇ／ｍｌ）の因子３−４によって、増幅されたようであった。他のＳＣＩＭ−１プローブ、すなわちｎｔ（１９８３−２４２７）では、クローンテック多組織ノーザンブロットＨ３（ｃａｔ＃７７６７−１）及びＨ２上でシグナルは検出されなかった。主要軟骨細胞のＲＮＡ上でのプローブｎｔ（１９８３−２４２７）のハイブリダイゼーションは、ＴＮＦ−αによる３−４倍のＳＣＩＭ−１遺伝子発現の上方調節（発現の増加）を含み、プローブｎｔ（５６０−１０４８）と同じ２．６ｋｂｍＲＮＡのシグナルを得た（表示なし）。軟骨細胞をＩＬ−１と共にもしくは無しでインキュベートし誘導したプローブを用いたｃＤＮＡマイクロアレイのハイブリダイゼーションは、３倍のＳＣＩＭ−１を発現し、ＩＬ−１依存的上方調節を示した。また、プローブｎｔ（１９８３−２４２７）のシグナルは、脱分化細胞を示すらしいＳＶ−４０形質転換ヒト軟骨細胞のノーザンブロットでは得られなかった。このことによって、ｉ）ＳＣＩＭ−１遺伝子発現は、限定的な組織分布を示す、ｉｉ）脳、肺及び軟骨細胞で検出された、異なる長さのｍＲＮＡは、スプライス変異体を示し得る、及び、ｉｉｉ）ＳＣＩＭ−１遺伝子発現は、ＴＮＦ及びＩＬ−１のような炎症促進因子によって高められることが結論づけられた。
【００７２】
実施例４：全長ＳＣＩＭ−１ｃＤＮＡの分離
ヒトＳＣＩＭ−１の完全コード配列を、ＳＭＡＲＴ−ＲＡＣＥ（＃Ｋ１８１１−１、クローンテック）によって、１μｇのＴＮＡ−α刺激性主要ヒト軟骨細胞の全ＲＮＡから産生されるＲＡＣＥ−ｃＤＮＡ上のＳＣＩＭ−１特異的オリゴヌクレオチドを用いて同定した。軟骨細胞を、健康な軟骨（膝）から酵素的（コラゲナーゼ）に分離し、単層培養（Ｈａｍｍ’ｓ／Ｆ１２、１０％ＦＣＳ）で、約３週間培養して、その後１０ｎｇ／ｍｌＴＮＦ−αで２４時間刺激した。オリゴヌクレオチドを、インサイトデーターベースから同定される２つの遺伝子断片（実施例１）に使用できる配列に基づいて設計した。一番目の遺伝子断片プライマーは、５’ＲＡＣＥプライマー配列番号７（５’ＧＧＧＴＣＣＡＴＴＧＴＡＣＣＣＣＧＣＣＡＣＧＡＣＧ）、及び入れ子プライマー配列番号８（５’ＣＴＣＡＡＡＧＴＣＣＣＣＡＴＣＡＴＧＧＴＣＣ）、３’ＲＡＣＥプライマー配列番号９（５’ＣＴＣＡＧＣＣＧＣＴＧＴＣＣＧＴＣＴＴＣＣＧＧ）、及び入れ子プライマー配列番号１０（５’ＧＣＴＴＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＴＧＧＣＴＧＣＧ）であった。二番目の遺伝子断片プライマーは、５’ＲＡＣＥプライマー配列番号１１（５’ＧＧＡＴＧＧＧＣＴＴＧＧＧＧＡＧＧＧＴＣＴＡＧＣＴＣ）、及び入れ子プライマー配列番号１２（５’ＧＣＡＧＣＡＧＣＡＣＡＡＧＣＣＣＡＣＴＴＴＣ）、３’ＲＡＣＥプライマー配列番号１３（５’ＧＴＧＣＣＣＡＧＧＧＡＧＧＴＧＧＴＧＴＣＡＣＴＧ）、及び入れ子プライマー配列番号１４（５’ＧＣＡＣＡＧＧＡＡＧＴＡＴＧＡＧＧＡＣＴＴＴＡＧＴＧ）であった。ＳＭＡＲＴ−ＲＡＣＥ　ＰＣＲは、クローンテックマニュアルＰＴ３２６９−１（１９９９年３月）に従って実施された。ＲＡＣＥｃＤＮＡクローンの番号を配列することにより、実施例１で同定された２つの遺伝子断片を示唆する配列番号１のコンティグｃＤＮＡを得た。これは、同じ遺伝子に対応し、ＳＣＩＭ−１を示す。翻訳開始コドンはｎｔ５９に見られ、オープンリーティングフレームは、６５３アミノ酸にエンコードされていた。軟骨細胞において測定された２．６ｋｂの長さのｍＲＮＡに関しては、同定された２５８９ｂｐのＳＣＩＭ−１ｃＤＮＡが、相当する遺伝子の完全コード領域を含む可能性が非常に高いと考えられた。
【００７３】
完全ＳＣＩＭ−１ｃＤＮＡが利用可能になると、ブラスト検索（ＮＣＢＩ−ＢＬＡＳＴ２．０．１０　１９９９年８月２６日；Ａｌｔｓｃｈｕｌ等．，Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２，１９９７）によって、インサイト及び公開データーベースにおいて核酸及びタンパク配列とのと比較がなされた。いくつかの公開エスト配列、及び特許出願ＷＯ９９／５８６６０に記載の〜１１００ｂｐｃＤＮＡは、ＳＣＩＭ−１ｃＤＮＡの一部と一致することが見出された。不完全な重複の結果、完全ＳＣＩＭ−１遺伝子を、これらの公開のｃＤＮＡ断片から再構成することはできなかった。本発明の完全にコードされたＳＣＩＭ−１アミノ酸配列（配列番号２）に基づいて、ＳＣＩＭ−１の機能的タンパクドメインに関して予測がされた。シグナル配列はアミノ酸　１−１９又は１−２１で、インテグリン結合ＲＧＦモチーフは２６３−２６５アミノ酸で、カルシウム結合ＥＧＦ様ドメインは５５１−５９８アミノ酸で、推定上の疎水領域は６１４−６３５アミノ酸で、及び、ＭＨＣクラスＩＩＤＲ４Ｄｗ４結合モチーフは１２−２０、３９−４７、１４９−１５７及び３２３−３３１アミノ酸で同定された。
【００７４】
実施例５：ＳＣＩＭ−１スプライス変異体及びそれらの組織分布
全長ＳＣＩＭ−１ｃＤＮＡ及び、ＳＣＩＭ−１ｃＤＮＡと一致する配列を含む全てのインサイト及び公開ｃＤＮＡを含む複数配列比較（ＤＮＡｍａｍ　４．１１版）から、ｃＤＮＡの集団は、ヌクレオチド１８５２（配列番号１による番号付け）の下流の混成で不均質であることが見出された。この下流領域は、直接ＥＧＦ様ドメインに続く、タンパクのＣ末端をコードする。４つの異なるＣ末端領域を、ＳＣＩＭ−１、すなわち変異体Ａ−Ｄ（表１；それぞれ配列番号１９−２１、Ｃ末端の差異はアミノ酸位置５９９から開始）として同定し、異なる組織（それぞれ配列番号１６−１８；３’末端がヌクレオチド位置１８５３から異なる）から誘導されたｃＤＮＡから推定して、及び、選択的スプライシング事象の結果生じることが期待される。変異体Ａ、Ｂ及びＣにおいて、配列番号１６−１８は、それぞれが推定上のポリ−アデニル化シグナルＡＡＴＡＡＡに先導される３’ポリ（Ａ）末端を含むために、それぞれ相当するｍＲＮＡの３’末端を含む可能性が最も高い。変異体Ａ及びＢの３’ＵＴＲ領域の異なる長さは、それぞれ軟骨及び脳組織のノーザンブロット上で検出されるＳＣＩＭ−１ｍＲＮＡの長さに一致する（実施例３を参照）。変異体Ａ−Ｄそれぞれをコードする多様なデーターベースに見られるｃＤＮＡクローンの数は、ＳＣＩＭ−１変異体Ａが、関節組織（軟骨／滑膜）において、及び多少は腫瘍及びいくつかの他の組織において優勢に発現される一方、変異体Ｂの発現が、中枢神経系の組織（主に脳）に限定して起こることを強く示唆する。示唆された組織限定的発現は、ＳＣＩＭ−１変異体Ｂ（配列番号９及び１５）に特異的なオリゴヌクレオチドを用いた、全脳のｃＤＮＡ（クローンテックヒト脳クイック−クローンｃＤＮＡ、ｃａｔ．７１８７−１／ロット　９０７０８４３）上での、及び主要軟骨細胞のｃＤＮＡ（ＴＮＦ−αと共に２４時間培養、実施例４を参照）上でのＲＴ−ＰＣＲによって裏付けられた。ｃＤＮＡの合成及びＰＣＲの条件は、実施例２の記載通りである。対照として、ハウスキーピング遺伝子ＧＡＰＤＨ（配列番号５及び６）特異的オリゴヌクレオチドを用いてＰＣＲを実行した。脳組織においてＳＣＩＭ−１変異体Ｂとして期待される長さの強力な増幅シグナルが見られたのに対して、軟骨細胞内の発現は、ほとんど検出できなかった。ＧＡＰＤＨ遺伝子発現上の対照ＰＣＲによって、両組織に同様のシグナルが得られ、このことは、ＰＣＲにおいて相当するｃＤＮＡの投入量が類似していたことを示す。変異体Ｂの発現は、〜２．４ｋｂｍＲＮＡによって示され、主要軟骨細胞（２４時間／ＴＮＦ−α）においてほとんど検出することができなかったという発見は、実施例３及び４のデータと一致する。ノーザンブロット上で、〜２．６ｋｂの一本鎖のＳＣＩＭ−１ｍＲＮＡ変異体のみが、主要軟骨細胞（２４時間／ＴＮＦ−α）において検出され（図２、レーン８）、このことによって、変異体Ａは、変異体Ａの配列（配列番号１を参照）のみが得られる軟骨細胞ｃＤＮＡ上の３’ＲＡＣＥ増幅として表わされると結論づけられた。
【００７５】
実施例６：組換えＳＣＩＭ−１の発現
ＳＣＩＭ−１（変異体Ａ）ｃＤＮＡを、クローニングベクターｐＣＲ２．１ＴＯＰＯ（インビトロジェン）中にクローニングして、Ｅｃｏ　ＲＩ断片として真核発現ベクターｐＮＧＶ１（ＥＭＢＬ　カタログ番号Ｘ９９２７４）中にサブクローニングした。その結果、ｃＤＮＡは、ＳＶ４０初期プロモータ及びコザック翻訳開始配列の後方に位置する。翻訳停止コドンの上流に、１８個のヌクレオチドが挿入され、Ｈｉｓ６−タグをコードした。真核細胞において組換えＳＣＩＭ−１（Ｈｉｓ６）タンパクを産生するために、ＣＨＯ細胞（ＡＴＣＣ　ＣＣＬ６１）を、５％ＦＣＳ（Ｈａｒｌａｎ　ｓｅｒａ　ｌａｂ）を含むＤＭＥＭ／Ｈａｍｍ’ｓＦ１２中で培養した。トランスフェクタム（プロメガ）及び、選択培地である５％ＦＣＳ及び０．８ｍｇ／ｍｌネオマイシン（Ｇ４１８　スルフェート　Ｇｉｂｃｏ　ＢＲＬ　Ｌｉｆｅ　ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、フィルターは０．２２μＭミリポアＳＬＧＶ０２５ＢＳフィルターを用いて殺菌）を含むＤＭＥＭ／Ｈａｍｍ’ｓＦ１２を用いて、ｐＮＧＶ１−ＳＣＩＭ−１（Ｈｉｓ６）作成物を、ＣＨＯ−Ｋ１細胞にトランスフェクションした。組換えタンパクを検出するために、細胞を、血清が入っていない培地（０．８ｍｇ／ｍｌネオマイシン含有）で一晩中培養して、一日間継続して発現させた。血清が入っていない培地の上清を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で分析して、その後ウエスタンブロットを行い、続けて抗Ｈｉｓ６モノクローナル抗体を用いて検出した。ブロットを、ＰＢＳ中５％スキムミルク／０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０でブロックし、マウス−抗（Ｈｉｓ６）−タグ抗体を用いて発色させた（Ｄｉａｎｏｖａ　ＧＭＢＨ　ｃａｔ．ｎｏ　Ｄｉａ９００．室温でＰＢＳＴを用いて５分間の洗浄を３回行った後、ブロットを、抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰ（プロメガ　ｃａｔｎｏ　３６２４５１２）を用いてインキュベートした。室温でＰＢＳＴを用いて５分間の洗浄を３回行った後、ＨＲＰに対する発色基質、すなわち、ＰＢＳ中ジアミノベンジジン四塩酸塩、２．５ｍＭＣｏＣｌ２及び０．００６％Ｈ２Ｏ２を用いて検出を行った。）。
【図面の簡単な説明】
【図１】
ＳＣＩＭ−１及びＧＡＰＤＨに特異的なオリゴヌクレオチドを用いたヒト軟骨ｃＤＮＡ上のＲＴ−ＰＣＲ。
【図２】
ＳＣＩＭ−１プローブ（配列番号１のｎｔ５６０−１０４８）は、カスタムメードの関節ノーザンブロットにおいてハイブリダイズされた（上部パネル）。
【図３】
４つの異なるＳＣＩＭ−１ｍＲＮＡ種によってコードされる選択的カルボキシ末端、すなわち変異体Ａ−Ｄ。
【図４】
核酸導入されたＣＨＯ細胞におけるＳＣＩＭ−１変異体Ａ／Ｈｉｓ６発現の検出。
【図１】
2004504030.tif 000002
【図２】
2004504030.tif 000003
【図３】
2004504030.tif 000004
【図４】
2004504030.tif 000005
【国際公開パンフレット】
2004504030.tif 000006
2004504030.tif 000007
2004504030.tif 000008
2004504030.tif 000009
2004504030.tif 000010
2004504030.tif 000011
2004504030.tif 000012
2004504030.tif 000013
2004504030.tif 000014
2004504030.tif 000015
2004504030.tif 000016
2004504030.tif 000017
2004504030.tif 000018
2004504030.tif 000019
2004504030.tif 000020
2004504030.tif 000021
2004504030.tif 000022
2004504030.tif 000023
2004504030.tif 000024
2004504030.tif 000025
2004504030.tif 000026
2004504030.tif 000027
2004504030.tif 000028
2004504030.tif 000029
2004504030.tif 000030
2004504030.tif 000031
2004504030.tif 000032
2004504030.tif 000033
2004504030.tif 000034
2004504030.tif 000035
2004504030.tif 000036
2004504030.tif 000037
2004504030.tif 000038
2004504030.tif 000039
2004504030.tif 000040
2004504030.tif 000041
2004504030.tif 000042
2004504030.tif 000043
2004504030.tif 000044
2004504030.tif 000045
2004504030.tif 000046
2004504030.tif 000047
2004504030.tif 000048
2004504030.tif 000049
2004504030.tif 000050
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004504030.tif 000051
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004504030.tif 000052
【国際調査報告】
2004504030.tif 000053
2004504030.tif 000054
2004504030.tif 000055
2004504030.tif 000056