(57)【要約】本発明は、南京錠プローブを用いる核酸分子の迅速な指数増幅の方法およびキットを提供する。本発明は、偽陽性結果の原因となるアーチファクト生成物の出現をなくすかもしくは遅らせることにより南京錠プローブを増幅する既存の方法を改善し、そしてまたアッセイの感度および速度も増す。さらに提供するのは、非情報的塩基類似体を含有する核酸増幅プライマーである。
2004526442.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）反応混合物を形成するために閉環状南京錠プローブ分子；標的核酸分子；フォワードプライマー；リバースプライマー；ｄＮＴＰｓ；および第一のＤＮＡポリメラーゼを与えること；
（ｂ）多数の尾部の付いた（ｍｕｌｔｉ−ｔａｉｌｅｄ）複合体を生成せしめること；
（ｃ）第二のＤＮＡポリメラーゼを活性化すること、ここで、該第二のＤＮＡポリメラーゼは熱安定性である；ならびに
（ｄ）該多数の尾部の付いた複合体を熱循環させること（ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｉｎｇ）、
を含んでなる核酸増幅方法。
【請求項２】
該第一のＤＮＡポリメラーゼがＢｓｔＬＦである請求項１の方法。
【請求項３】
該第二のＤＮＡポリメラーゼが、サーマス・アクアティカス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ）、パイロコッカス種（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｅｃｉｅｓ）、サーモコッカス・リトラリス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｉｔｏｒａｌｉｓ）もしくはパイロコッカス・フリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ）から得られるポリメラーゼ酵素である請求項１の方法。
【請求項４】
該第二のＤＮＡポリメラーゼが組換え熱安定性ポリメラーゼである請求項１の方法。
【請求項５】
組換え熱安定性ポリメラーゼが抗体不活性化ポリメラーゼもしくは化学的不活性化ポリメラーゼである請求項４の方法。
【請求項６】
反応混合物がさらに鎖置換因子を含有する請求項１の方法。
【請求項７】
熱循環させる前に反応混合物を約５０〜約７０℃で約１〜約３０分間インキュベーションする請求項１の方法。
【請求項８】
熱循環させる前に反応混合物を約５０〜約７０℃で約３〜約２０分間インキュベーションする請求項１の方法。
【請求項９】
方法が：
（ｅ）該第一のＤＮＡポリメラーゼを変性させること、
をさらに含んでなる請求項１の方法。
【請求項１０】
該標的核酸分子が一本鎖ＤＮＡ分子もしくは二本鎖ＤＮＡ分子である請求項１の方法。
【請求項１１】
該標的核酸分子が一本鎖ＲＮＡ分子もしくは二本鎖ＲＮＡ分子である請求項１の方法。
【請求項１２】
該標的核酸がプラスミドもしくはそのフラグメント、ゲノムＤＮＡもしくはそのフラグメント、ウイルスＤＮＡもしくはそのフラグメント、ウイルスＲＮＡもしくはそのフラグメント、ｍＲＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡもしくはそのフラグメント、または染色体ＤＮＡもしくはそのフラグメントである請求項１の方法。
【請求項１３】
該フォワードもしくはリバースプライマーの５’末端領域が、尾部の付いた（ｔａｉｌｅｄ）プライマー分子である請求項１の方法。
【請求項１４】
フォワードプライマーもしくはリバースプライマーの少なくとも一つがヘアピンプライマーである請求項１の方法。
【請求項１５】
ヘアピンプライマーが、制限エンドヌクレアーゼ切断部位を含有するループ領域を有する請求項１４の方法。
【請求項１６】
該フォワードプライマーもしくはリバースプライマーの少なくとも一つを検出可能に標識する請求項１の方法。
【請求項１７】
検出可能に標識するプライマーが分子エネルギー転移機構を含有する請求項１６の方法。
【請求項１８】
該フォワードプライマーもしくはリバースプライマーの少なくとも一つが少なくとも一つの非情報的（ｎｏｎ−ｉｎｆｏｒｍａｔｉｖｅ）塩基類似体を含有する請求項１の方法。
【請求項１９】
該非情報的塩基類似体がニトロピロールもしくはニトロインドールである請求項１８の方法。
【請求項２０】
該フォワードプライマーもしくはリバースプライマーの少なくとも一つが少なくとも一つの極性スイッチを含有する請求項１の方法。
【請求項２１】
（ａ）フォワードプライマーおよびリバースプライマー；
（ｂ）リガーゼ酵素；
（ｃ）第一のポリメラーゼ酵素；
（ｄ）線状南京錠プローブ分子、ここで、南京錠プローブは３’末端領域、５’末端領域、およびスペーサー領域を含んでなり、ここで、スペーサー領域はフォワードプライマーおよびリバースプライマーの結合部位を含有する；ならびに
（ｅ）第二のポリメラーゼ酵素、ここで、第二のポリメラーゼ酵素は熱安定性酵素であり、そしてここで、第二のポリメラーゼ酵素は第一のポリメラーゼ酵素と同じ酵素ではない、
を含んでなる核酸分子増幅キット。
【請求項２２】
該第一のポリメラーゼ酵素がＢｓｔＬＦである請求項２１のキット。
【請求項２３】
該第二のポリメラーゼが、サーマス・アクアティカス、パイロコッカス種、サーモコッカス・リトラリスもしくはパイロコッカス・フリオサスから得られるポリメラーゼ酵素である請求項２１のキット。
【請求項２４】
該第二のポリメラーゼが組換え熱安定性ポリメラーゼである請求項２１のキット。
【請求項２５】
組換え熱安定性ポリメラーゼが抗体不活性化ポリメラーゼもしくは化学的不活性化ポリメラーゼである請求項２４のキット。
【請求項２６】
フォワードプライマーもしくはリバースプライマーの少なくとも一つがヘアピンプライマーである請求項２１のキット。
【請求項２７】
ヘアピンプライマーが、制限エンドヌクレアーゼ切断部位を含有するループ領域を有する請求項２６のキット。
【請求項２８】
該フォワードプライマーもしくはリバースプライマーの少なくとも一つを検出可能に標識する請求項２１のキット。
【請求項２９】
検出可能に標識するプライマーが分子エネルギー転移機構を含有する請求項２８のキット。
【請求項３０】
該フォワードプライマーもしくはリバースプライマーの少なくとも一つが少なくとも一つの非情報的塩基類似体を含有する請求項２１のキット。
【請求項３１】
該非情報的塩基類似体がニトロピロールもしくはニトロインドールである請求項３０のキット。
【請求項３２】
該フォワードプライマーもしくはリバースプライマーの少なくとも一つが少なくとも一つの極性スイッチを含有する請求項２１のキット。
【請求項３３】
（ａ）標的核酸分子、線状南京錠プローブ分子、リガーゼ酵素、フォワードプライマー、リバースプライマー、ｄＮＴＰｓ、および第一のＤＮＡポリメラーゼを与えること；
（ｂ）閉環状南京錠プローブ分子を生成せしめること；
（ｃ）該閉環状南京錠プローブ分子から多数の尾部の付いた複合体を生成せしめること；
（ｄ）第二のＤＮＡポリメラーゼを活性化すること；
（ｅ）該第二のＤＮＡポリメラーゼと共に該多数の尾部の付いた複合体を熱循環させること；ならびに
（ｆ）該多数の尾部の付いた複合体の増幅生成物を検出すること、
を含んでなるサンプルにおける標的核酸分子を検出する方法。
【請求項３４】
（ａ）標的核酸分子、該標的核酸分子にトポロジカルに連結される閉環状南京錠プローブ分子、フォワードプライマー、リバースプライマー、ｄＮＴＰｓ、および第一のＤＮＡポリメラーゼを与えること；
（ｂ）該閉環状南京錠プローブ分子から多数の尾部の付いた複合体を生成せしめること；
（ｃ）第二のＤＮＡポリメラーゼを活性化すること；
（ｄ）該第二のＤＮＡポリメラーゼと共に該多数の尾部の付いた複合体を熱循環させること；ならびに
（ｅ）該多数の尾部の付いた複合体の増幅生成物を検出すること、
を含んでなるサンプルにおける標的核酸分子を検出する方法。
【請求項３５】
（ａ）複数の標的核酸分子、複数の別個の標的核酸分子にアニールすることができる複数の線状南京錠プローブ分子、リガーゼ酵素、ｄＮＴＰｓ、および第一のＤＮＡポリメラーゼを与えること；
（ｂ）少なくとも二つの閉環状核酸分子を生成せしめること、ここで、該閉環状核酸分子の各々は別個の標的核酸分子にトポロジカルに連結される；
（ｃ）該少なくとも二つの閉環状核酸分子の各メンバーに、フォワードプライマーおよびリバースプライマーを与えること；
（ｄ）該別個の標的核酸分子の各々の多数の尾部の付いた複合体を生成せしめること；
（ｅ）第二のＤＮＡポリメラーゼを活性化すること；
（ｆ）該第二のＤＮＡポリメラーゼと共に該少なくとも二つの別個の多数の尾部の付いた複合体を熱循環させること；ならびに
（ｇ）該少なくとも二つの別個の多数の尾部の付いた複合体の増幅生成物を検出すること、
を含んでなるサンプルにおける複数の標的核酸分子を検出する方法。
【請求項３６】
多数の尾部の付いた複合体の増幅生成物の該検出を実時間検出機器によって行う請求項３５の方法。
【請求項３７】
該第一のＤＮＡポリメラーゼがＢｓｔＬＦである請求項３５の方法。
【請求項３８】
該第二のＤＮＡポリメラーゼが、サーマス・アクアティカス、パイロコッカス種、サーモコッカス・リトラリスもしくはパイロコッカス・フリオサスから得られるポリメラーゼ酵素である請求項３５の方法。
【請求項３９】
該第二のＤＮＡポリメラーゼが組換え熱安定性ポリメラーゼである請求項３５の方法。
【請求項４０】
組換え熱安定性ポリメラーゼが抗体不活性化ポリメラーゼもしくは化学的不活性化ポリメラーゼである請求項３９の方法。
【請求項４１】
反応混合物がさらに鎖置換因子を含有する請求項３５の方法。
【請求項４２】
熱循環させる前に反応混合物を約５０〜約７０℃で約１〜約３０分間インキュベーションする請求項３５の方法。
【請求項４３】
熱循環させる前に反応混合物を約５０〜約７０℃で約３〜約２０分間インキュベーションする請求項３５の方法。
【請求項４４】
方法が：
（ｅ）該第一のＤＮＡポリメラーゼを変性させること、
をさらに含んでなる請求項３５の方法。
【請求項４５】
該少なくとも二つの閉環状核酸分子の少なくとも一つで、該フォワードプライマーもしくはリバースプライマーの５’末端領域が閉環状核酸分子にハイブリダイズしない請求項３５の方法。
【請求項４６】
該少なくとも二つの閉環状核酸分子の少なくとも一つで、該フォワードプライマーもしくはリバースプライマーの少なくとも一つがヘアピンプライマーである請求項３５の方法。
【請求項４７】
ヘアピンプライマーが、制限エンドヌクレアーゼ切断部位を含有するループ領域を有する請求項４６の方法。
【請求項４８】
該少なくとも二つの閉環状核酸分子の少なくとも一つで、少なくとも一つのフォワードもしくはリバースプライマーを検出可能な標識で標識する請求項３５の方法。
【請求項４９】
検出可能な標識が区別できる検出可能な標識である請求項４８の方法。
【請求項５０】
該少なくとも二つの閉環状核酸分子の少なくとも一つで、該フォワードプライマーもしくはリバースプライマーの少なくとも一つが少なくとも一つの非情報的塩基類似体を含有する請求項３５の方法。
【請求項５１】
該改変された非情報的塩基類似体がニトロピロールもしくはニトロインドールである請求項５０の方法。
【請求項５２】
該少なくとも二つの閉環状核酸分子の少なくとも一つで、該フォワードプライマーもしくはリバースプライマーの少なくとも一つが少なくとも一つの極性スイッチを含有する請求項３５の方法。
【請求項５３】
（ａ）反応チューブに標的核酸分子、リガーゼ酵素；フォワードプライマー；リバースプライマー；ｄＮＴＰｓ；および第一のＤＮＡポリメラーゼを与えること；
（ｂ）該反応チューブを密閉すること；
（ｃ）閉環状南京錠プローブ分子を生成せしめること；
（ｄ）該閉環状南京錠プローブ分子から多数の尾部の付いた複合体を生成せしめること；
（ｅ）第二のＤＮＡポリメラーゼを活性化すること、ここで、該第二のＤＮＡポリメラーゼは熱安定性ＤＮＡポリメラーゼである；ならびに
（ｆ）該多数の尾部の付いた複合体を熱循環させること、
を含んでなる閉管核酸分子増幅方法。
【請求項５４】
リガーゼ酵素が非耐熱性リガーゼ酵素である請求項５３の方法。
【請求項５５】
少なくとも一つのｄＮＴＰがケージ化ｄＮＴＰである請求項５３の方法。
【請求項５６】
プライマーに含まれる少なくとも一つのヌクレオチド塩基が非情報的塩基類似体である、以下の配列：
５’−ａｃｔａｇａｇｃｔｇａｇａｃａ−３’；
５’−ａｃｔａｇａｇｔｔｃａｇａｃａ−３’；
５’−ａｃｔａｇａｇｃｔｇａｇａｃａｔｇａｃｇａ−３’；
５’−ａｃｔａｇａｇｔｔｃａｇａｃａｔｇａｃｇａ−３’；
５’−ａｃｔａｇａｇｃｔｇａｇａｃａｔｇａｃｇａｇｔｃ−３’；
５’−ａｃｔａｇａｇｔｔｃａｇａｃａｔｇａｃｇａｇｔｃ−３’；
５’−ａｃｔａｇａｇｃｔｇａｇａｃａｔｇａｃｇａｇｔｃｇｃａ−３’；もしくは
５’−ａｃｔａｇａｇｔｔｃａｇａｃａｔｇａｃｇａｇｔｃｇｃａ−３’
のいずれかを含んでなる南京錠プローブ増幅プライマー。
【請求項５７】
非情報的塩基類似体がニトロピロールもしくはニトロインドールである請求項５６の南京錠プローブ増幅プライマー。
【請求項５８】
非情報的塩基類似体が極性スイッチである請求項５６の南京錠プローブ増幅プライマー。
【請求項５９】
プライマーに含まれる少なくとも一つのヌクレオチド塩基が非情報的塩基類似体である１５〜７５ヌクレオチドの南京錠プローブ増幅プライマー。
【請求項６０】
非情報的塩基類似体がニトロピロールもしくはニトロインドールである請求項５９の南京錠プローブ増幅プライマー。
【請求項６１】
非情報的塩基類似体が極性スイッチである請求項５９の南京錠プローブ増幅プライマー。
【発明の詳細な説明】
【政府の権利の記述】
【０００１】
本発明は、国立アレルギー感染症研究所からのスモールビジネスイノベーション助成金（１Ｒ４３ＡＩ４２４８１−０１および５Ｒ４４ＡＩ４２４８１−０３）によって一部分援助された。政府は本発明にある種の権利を有する。
【技術分野】
【０００２】
本発明は、環状化核酸分子の指数増幅の方法および試薬に関する。本発明はさらに、サンプルから特定の核酸分子を検出しそして増幅する方法および試薬に関する。
【０００３】
核酸を増幅するためのいくつかの報告された方法がある。これらの方法は二つのカテゴリー、等温もしくは熱循環（ｔｈｅｒｍａｌ  ｃｙｃｌｉｎｇ）技術の一つに分類される。一般に、ＰＣＲは最も包括的熱循環技術と考えられる。非特許文献１、特許文献１および特許文献２、これらの全ては引用することにより本明細書に組み込まれる。核酸分子を増幅する他の熱循環技術には、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）（非特許文献２、引用することにより本明細書に組み込まれる）が包含される。
【０００４】
等温反応は、その名称が示すように、忠実度を向上するために通常は室温より高い、一定の温度で行われる。報告された等温法のいくつかには、鎖置換反応（ＳＤＡ）（非特許文献３；非常特許文献４、これらの両方とも引用することにより本明細書に組み込まれる）、核酸に基づく増幅（ＮＡＳＢＡ）（非特許文献５および特許文献３、これらの両方とも引用することにより本明細書に組み込まれる）、および転写による増幅（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）（ＴＭＡ）（非特許文献６、引用することにより本明細書に組み込まれる）が包含される。
【０００５】
ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）法は別の等温反応である。様々な形態のＲＣＡが報告されている。非特許文献７および非特許文献８、これらの両方とも引用することにより本明細書に組み込まれる。この技術は、一般に「南京錠プローブ」と呼ばれる環状ＤＮＡプローブの線形増幅である。南京錠プローブを用いる別の等温核酸増幅法は、指数ローリングサークル増幅法、カスケードローリングサークル増幅（ＣＲＣＡ）法である。
【０００６】
南京錠プローブは１９９４年に最初に導入され、そしてインサイチュー用途および溶液に基づくアッセイの両方で、これらのプローブを分子診断に利用する方法が開発されている。非特許文献９、引用することにより本明細書に組み込まれる。南京錠プローブは、３’および５’末端の２つの標的相補的領域ならびに包括的スペーサー領域からなる。３’および５’末端領域が標的ＤＮＡ配列上で並列すると、標的鎖とつながれる環状分子を生成せしめるためにプローブ末端をＤＮＡリガーゼで連結することができる。これらのプローブは標的配列に局在したままでありそして容易に洗い流すことができないので、それらは「南京錠プローブ」と命名された。
【０００７】
ＣＲＣＡを含む大部分の指数増幅法と関連する問題は、バックグラウンド増幅の発生である。バックグラウンド増幅は、２個のプライマーを用いる大部分の増幅法の問題および制限の両方に相当する。バックグラウンド増幅が望ましくない一つの理由は、それが偽陽性結果の原因であり得る点である。典型的に、ＲＣＡおよびＣＲＣＡ反応は、頭−尾縦列反復のマルチマーである生成物をもたらす。しかしながら、２つのプライマー結合部位、介在配列、およびプライマー結合部位に隣接する鋳型分子の追加配列を含む線状標的分子の反復からなるバックグラウンド生成物が報告されている。実時間検出機器はバックグラウンド増幅生成物によって生成される蛍光シグナルと意図する増幅生成物によって生成される蛍光シグナルとを区別することができないので、これらの機器にとってバックグラウンド増幅生成物は特に問題である。
【０００８】
バックグラウンド増幅の発生を減らすためのいくつかの報告された方法がある。一つのそのような方法は、増幅の前に環状核酸プローブの濃縮工程を用いる。特許文献４、引用することにより本明細書に組み込まれる。
【０００９】
本発明は、偽陽性結果の原因となるアーチファクト生成物の出現をなくすかもしくは遅らせそしてプローブの検出能を向上することによって南京錠プローブを増幅する既存の方法を改善する。本発明はまた、アッセイの感度および速度も増す。
【００１０】
これらおよび他の利点を成し遂げるために、そして本明細書に具体化し記述するとおりの本発明の原理に従って、本発明は、一つの態様として、（ａ）反応混合物を形成するために閉環状南京錠プローブ分子；標的核酸分子；フォワードプライマー；リバースプライマー；ｄＮＴＰｓ；および第一のＤＮＡポリメラーゼを与えること；（ｂ）多数の尾部の付いた複合体を生成せしめること；（ｃ）第二のＤＮＡポリメラーゼを活性化すること、ここで、第二のＤＮＡポリメラーゼは熱安定性である；ならびに（ｄ）多数の尾部の付いた複合体を熱循環させることを含んでなる核酸増幅方法を提供する。
【００１１】
本発明はまた、（ａ）フォワードプライマーおよびリバースプライマー；（ｂ）リガーゼ酵素；（ｃ）第一のポリメラーゼ酵素；（ｄ）線状南京錠プローブ分子、ここで、南京錠プローブは３’末端領域、５’末端領域およびスペーサー領域を含んでなり、ここで、スペーサー領域はフォワードプライマーおよびリバースプライマーの結合部位を含有する；ならびに（ｅ）第二のポリメラーゼ酵素、ここで、第二のポリメラーゼ酵素は熱安定性酵素であり、そしてここで、第二のポリメラーゼ酵素は第一のポリメラーゼ酵素と同じ酵素ではない、を含んでなる核酸分子増幅キットも提供する。
【００１２】
同様に本発明により提供されるのは、（ａ）標的核酸分子、線状南京錠プローブ分子、リガーゼ酵素、フォワードプライマー、リバースプライマー、ｄＮＴＰｓ、および第一のＤＮＡポリメラーゼを与えること；（ｂ）閉環状南京錠プローブ分子を生成せしめること；（ｃ）閉環状南京錠プローブ分子から多数の尾部の付いた複合体を生成せしめること；（ｄ）第二のＤＮＡポリメラーゼを活性化すること；（ｅ）第二のＤＮＡポリメラーゼと共に多数の尾部の付いた複合体を熱循環させること；ならびに（ｆ）多数の尾部の付いた複合体の増幅生成物を検出することを含んでなるサンプルにおける標的核酸分子を検出する方法である。
【００１３】
本発明はさらに、（ａ）標的核酸分子、標的核酸分子にトポロジカルに連結される閉環状南京錠プローブ分子、フォワードプライマー、リバースプライマー、ｄＮＴＰｓ、および第一のＤＮＡポリメラーゼを与えること；（ｂ）閉環状南京錠プローブ分子から多数の尾部の付いた複合体を生成せしめること；（ｃ）第二のＤＮＡポリメラーゼを活性化すること；（ｄ）第二のＤＮＡポリメラーゼと共に多数の尾部の付いた複合体を熱循環させること；ならびに（ｅ）多数の尾部の付いた複合体の増幅生成物を検出することを含んでなるサンプルにおける標的核酸分子を検出する方法を提供する。
【００１４】
本発明はさらに、（ａ）複数の標的核酸分子、複数の別個の標的核酸分子にアニールすることができる複数の線状南京錠プローブ分子、リガーゼ酵素、ｄＮＴＰｓ、および第一のＤＮＡポリメラーゼを与えること；（ｂ）少なくとも二つの閉環状核酸分子を生成せしめること、ここで、閉環状核酸分子の各々は別個の標的核酸分子にトポロジカルに連結される；（ｃ）少なくとも二つの閉環状核酸分子の各メンバーに、フォワードプライマーおよびリバースプライマーを与えること；（ｄ）別個の標的核酸分子の各々の多数の尾部の付いた複合体を生成せしめること；（ｅ）第二のＤＮＡポリメラーゼを活性化すること；（ｆ）第二のＤＮＡポリメラーゼと共に少なくとも二つの別個の多数の尾部の付いた複合体を熱循環させること；ならびに（ｇ）少なくとも二つの別個の多数の尾部の付いた複合体の増幅生成物を検出することを含んでなるサンプルにおける複数の標的核酸分子を検出する方法を提供する。
【００１５】
本発明はまた、（ａ）反応チューブに標的核酸分子、リガーゼ酵素；フォワードプライマー；リバースプライマー；ｄＮＴＰｓ；および第一のＤＮＡポリメラーゼを与えること；（ｂ）反応チューブを密閉すること；（ｃ）閉環状南京錠プローブ分子を生成せしめること；（ｄ）閉環状南京錠プローブ分子から多数の尾部の付いた複合体を生成せしめること；（ｅ）第二のＤＮＡポリメラーゼを活性化すること、ここで、第二のＤＮＡポリメラーゼは熱安定性ＤＮＡポリメラーゼである；ならびに（ｆ）多数の尾部の付いた複合体を熱循環させることを含んでなる閉管核酸分子増幅方法も提供する。
【００１６】
本発明はまた、プライマーに含まれる少なくとも一つのヌクレオチド塩基が非情報的塩基類似体である、以下の配列：５’−ａｃｔａｇａｇｃｔｇａｇａｃａ−３’；５’−ａｃｔａｇａｇｔｔｃａｇａｃａ−３’；５’−ａｃｔａｇａｇｃｔｇａｇａｃａｔｇａｃｇａ−３’；５’−ａｃｔａｇａｇｔｔｃａｇａｃａｔｇａｃｇａ−３’；５’−ａｃｔａｇａｇｃｔｇａｇａｃａｔｇａｃｇａｇｔｃ−３’；５’−ａｃｔａｇａｇｔｔｃａｇａｃａｔｇａｃｇａｇｔｃ−３’；５’−ａｃｔａｇａｇｃｔｇａｇａｃａｔｇａｃｇａｇｔｃｇｃａ−３’；もしくは５’−ａｃｔａｇａｇｔｔｃａｇａｃａｔｇａｃｇａｇｔｃｇｃａ−３’のいずれかを含んでなる南京錠プローブ増幅プライマーも提供する。
【００１７】
さらに本発明により提供されるのは、プライマーに含まれる少なくとも一つのヌクレオチド塩基が非情報的塩基類似体である１５〜７５ヌクレオチドの南京錠プローブ増幅プライマーである。
【特許文献１】
米国特許第４，６８３，１９５号明細書
【特許文献２】
米国特許第４，６８３，２０２号明細書
【特許文献３】
米国特許第５，４０９，８１８号明細書
【特許文献４】
ＷＯ  ００／３６１４１号明細書
【非特許文献１】
Ｓａｉｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３０：１３５０−１３５４（１９８５）
【非特許文献２】
Ｌａｎｄｅｒｇｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４１：１０７７−１０８０（１９８８）
【非特許文献３】
Ｗａｌｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）８９：３２−３９６（１９９２）
【非特許文献４】
Ｗａｌｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２０：１６９１−１６９６（１９９２）
【非特許文献５】
Ｋｉｅｖｉｔｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ３５：２７３−２８６（１９９１）
【非特許文献６】
Ｋｗｏｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（Ｕ．Ｓ．Ａ．）８６：１１７３−１１７７（１９８９）
【非特許文献７】
Ｌｉｚａｒｄｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １９：２２５−２３２（１９９８）
【非特許文献８】
Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  ２１１：２７７−８５（１９９８）
【非特許文献９】
Ｎｉｌｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６５：２０８５−２０８８（１９９４）
【発明の詳細な記述】
【００１８】
Ａ．ローリングサークル増幅
ローリングサークル複製（増幅）のプロセスは、多数のウイルスおよびプラスミドによってそれらのゲノムを複製するために用いられる。本発明において用いる場合、複製および増幅という用語は、互換的に用いるものとすると理解される。ウイルスのローリングサークル増幅中に、ＤＮＡポリメラーゼは、「娘」鎖尾部を置換するのを助けるヘリカーゼおよび／もしくは一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質のような補助因子と共に、数キロ塩基のサイズであることができる環状核酸分子の周りを繰り返し進む。これは、ゲノムの個々のもしくは縦列一本鎖コピーの生成をもたらし、それらは次に単位長の環を形成するように処理される。
【００１９】
ローリングサークル増幅は、１００塩基より小さいプライミングした（ｐｒｉｍｅｄ）合成環状一本鎖ＤＮＡ鋳型を用いてインビトロで行われている。Ｆｉｒｅ  ａｎｄ  Ｘｕ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）９２：４６４１−４６４５（１９９５）、米国特許第６，０９６，８８０号、第６，０７７，６６８号、第５，８５４，０３３号および第５，７１４，３２０号、これらの全ては引用することにより本明細書に組み込まれる。ＲＣＡはまた、環状ＲＮＡ鋳型を増幅するために用いることもできる。鋳型の何百もの縦列コピーを含有する長い一本鎖尾部はいくつかのポリメラーゼによって、あるものは補助因子なしに、生成することができる。このプロセスはローリングサークル増幅と呼ばれ、そして最初のＤＮＡ鋳型の等温線形増幅である。
【００２０】
ローリングサークル増幅を行うことができる任意のＤＮＡポリメラーゼは、ＲＣＡにおける使用に適している。ローリングサークル増幅を行うポリメラーゼの能力は、引用することにより本明細書に組み込まれるＦｉｒｅ  ａｎｄ  Ｘｕ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）９２：４６４１−４６４５（１９９５）に記述されているもののようなローリングサークル増幅アッセイにおいてポリメラーゼを用いることにより決定することができる。
【００２１】
鎖置換と呼ばれるプロセスである、鋳型鎖に相補的な鎖を置換することができるＤＮＡポリメラーゼを一般にローリングサークル増幅に用いる。鎖置換は、環状ベクターの多数の縦列コピーの合成を可能にする。時折、鎖置換を達成するために鎖置換因子をポリメラーゼと共に用いる。しかしながら、Ｂｓｔのような、少なくともあるポリメラーゼは、鎖置換因子なしに鎖置換する能力があると理解される。Ｂｓｔは、バシラス・ステアロサーモフィラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）Ｎ３４６８から得られる。Ａｌｉｏｔｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｔ．Ａｎａｌ．１２（５−６）：１８５−９５（１９９６）；Ｐｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  １６３（１）：６５−８（１９９５）、引用することにより本明細書に組み込まれる。
【００２２】
５’→３’エキソヌクレアーゼ活性は、存在する場合、合成された鎖を破壊するかもしれないので、典型的に、ＲＣＡに用いるポリメラーゼ酵素はそれを欠く。用いるＤＮＡポリメラーゼは非常に連続伸長的である（ｐｒｏｃｅｓｓｉｖｅ）こともまた典型的である。本明細書において用いる場合、「連続伸長的である」という用語は、鋳型鎖から解離せずに鎖合成を行うポリメラーゼ酵素の能力をさす。
【００２３】
ＲＣＡにおける使用に適当なポリメラーゼ酵素には、ＤＮＡポリメラーゼＩ、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメント、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ７  ＤＮＡポリメラーゼ、ＴａｑＴＭポリメラーゼ、ＶｅｎｔＴＭポリメラーゼ、Ｄｅｅｐ  ＶｅｎｔＴＭポリメラーゼ、φ２９ポリメラーゼ、Ｂｓｔポリメラーゼ、およびＢｓｔラージフラグメント（ＢｓｔＬＦ）が包含されるが、これらに限定されるものではない。ＢｓｔＬＦは、Ｌｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １１（４）：４６４−４６６（１９９１）、Ｒｉｇｇｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １３０７（２）：１７８−８６（１９９６）によって記述されており、これらの両方とも引用することにより本明細書に組み込まれる。ＢｓｔＬＦはまた、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓからも市販されている。
【００２４】
ローリングサークル増幅機構は、小さなＤＮＡ環もしくは連結した南京錠プローブを数千倍増幅することが以前に報告されている。Ｌｉｚａｒｄｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．１９（３）：２２５−２３２（１９９８）。これらの方法では、単一のプライマーを環状の鋳型にハイブリダイズさせ、そして環の周りにＤＮＡポリメラーゼによって伸長する。プライマーに到達すると、ポリメラーゼはプライマーを置換し、そして環の周りを繰り返し進み続けて長い一本鎖尾部の付いた生成物を生成する。本明細書において用いる場合、「尾部の付いた生成物」という用語は、図２Ａのもののような構造を有する核酸分子をさす。
【００２５】
第一のプライマーを用いるよりむしろ、標的配列自体をプライマーとして用いるＲＣＡ反応が記述されている。ハイブリダイゼーションおよびライゲーションの後、一本鎖核酸を一本鎖エキソヌクレアーゼ（例えば、ＤＮアーゼもしくはＲＮアーゼ）で分解し、残りの二本鎖部分をプライマーとして働かせることができる。該ＲＣＡ技術は、第二のプライマーを用いない。単一のプライマー増幅は線形プロセスであるので、それは典型的に細胞学的もしくは他の固相サンプル調製物を検出するために用いられる。Ｌｉｚａｒｄｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．１９（３）：２２５−２３２（１９９８）、引用することにより本明細書に組み込まれる。増幅するために用いるＤＮＡポリメラーゼにより、十分なエキソヌクレアーゼ活性が本質的に存在し、それによりＲＣＡにおけるプライマーの使用を不要にすることができる。
【００２６】
Ｂ．カスケードローリングサークル増幅（ＣＲＣＡ）
ＣＲＣＡはＲＣＡの技術、２個のプライマー増幅および南京錠プローブを組み合わせる。ＣＲＣＡ技術は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｔａｇｉｎｇ，Ｉｎｃ．（Ｎｅｗ  Ｈａｖｅｎ，ＣＴ）によりそのローリングサークル増幅技術（ＲＣＡＴＴＭ）を通して商業的に開発されている。
【００２７】
南京錠プローブは、標的配列に適切にアニールすると、２つの標的相補的末端が、標的にトポロジカルに連結される環状プローブを形成するようにＤＮＡリガーゼによって連結されるような、スペーサー領域によってつながれる３’および５’末端の２つの標的相補的領域からなる。これらのプローブは容易に洗い流すことができないので、それらは低いバックグラウンドを有する非常に特異的な検出技術を提供する。南京錠プローブの感度は、ユニークプライマーおよび鎖置換するＤＮＡポリメラーゼを加えてそれらをＲＣＡに供することにより数百倍高めることができる。次にＲＣＡ生成物は、標識の直接導入により、ＤＮＡ合成中に導入するハプテンに対する標識した抗体の使用により、もしくは標識した検出プローブへのハイブリダイゼーションにより検出することができる。引用することにより本明細書に組み込まれる米国特許第５，９１２，１２４号は、南京錠プローブを記述している。
【００２８】
いくつかのＤＮＡポリメラーゼがＲＣＡ反応に対応することができるが、Ｂｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼ（ラージフラグメント）（ＢｓｔＬＦ）は、ＣＲＣＡ反応において最もよく用いられるＤＮＡポリメラーゼである。ＢｓｔＬＦは、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ（Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）もしくはＥｐｉｃｅｎｔｒｅ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）のようないくつかの商業的製造供給元から市販されている。ＣＲＣＡ反応における使用に適していると報告される他のポリメラーゼ酵素には、ＶｅｎｔＴＭ、Ｄｅｅｐ  ＶｅｎｔＴＭおよびφ２９が包含されるが、これらに限定されるものではない。
【００２９】
南京錠プローブを製造するために、線状開環プローブをライゲーションが起こるように標的配列にハイブリダイズさせる。南京錠プローブの基本構造を図１に示す。プローブは、増幅プライマーの結合部位を含有するスペーサー領域によってつながれる３’および５’末端領域における２つの標的相補的領域からなる。プローブは、末端の３’ヒドロキシルおよび５’リン酸基が標的上で並列すると環状化することができる。末端の３’ヒドロキシルおよび５’リン酸基のライゲーションは、例えば、ＤＮＡリガーゼ酵素を用いて酵素的に行うことができ、もしくはそれを化学的に行うことができる。一般に、ライゲーション反応は、ＤＮＡリガーゼ酵素を用いて行う。
【００３０】
ライゲーション後に、閉環状核酸が形成される。次に、第一の（フォワード）プライマーを環状化プローブにおけるフォワードプライマー結合領域にアニールさせることができる。第二の（リバース）プライマーは第一のプライマーが伸長されるまでアニールしないので、増幅反応の開始から存在することができ、もしくは任意の時点で加えることができる。フォワードプライマーは、一般に少なくとも１０塩基の長さである。より一般的には、フォワードプライマーは、１５〜３０塩基の長さである。リバースプライマーは、一般に少なくとも１０塩基の長さである。より一般的には、リバースプライマーは、１５〜３０塩基の長さである。
【００３１】
鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼは、プライマー伸長を触媒する。典型的には、ＤＮＡポリメラーゼはＢｓｔＬＦ  ＤＮＡポリメラーゼである。ＤＮＡポリメラーゼ酵素は、標的配列の多数の縦列反復および結果的に第二のリバースプライマーの多数のプライマー結合部位の尾部の付いた生成物を生成する。ＤＮＡポリメラーゼに加えて、他の反応成分を加える。これらの他の反応成分の添加は、この反応を最適化する目的で当業者に既知である。これらの他の反応成分には、ｄＮＴＰｓ、バッファー、塩類（例えば、硫酸マグネシウム、塩化カリウムもしくは硫酸アンモニウム）および界面活性剤（例えばＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（ｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール）のような非イオン性界面活性剤）が包含される。
【００３２】
Ｃ．ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）
ＰＣＲは、別の標的増幅方法である。Ｓａｉｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３０：１３０５−１３５４（１９８０）。この方法では、核酸の特定の断片を、ポリメラーゼ酵素による選択的鎖増幅を導くために用いる２個のプライマー、各鎖につき１個を用いて増幅する。米国特許第４，６８３，２０２号および第４，６８３，１９５号、これらの両方とも引用することにより本明細書に組み込まれる。各プライマーが伸長されるにつれて、それは元の鋳型のコピーを生成する。元の鋳型からのこれらのコピーの熱変性は、次のサイクルにおいて複製することができる４本の鎖をもたらす。
【００３３】
現在、ＰＣＲ反応は熱安定性ポリメラーゼ酵素を用いて行われる。これらの酵素、それらの使用およびそれらを得るための起源は、当業者に既知である。最もよく用いられる熱安定性ポリメラーゼ酵素には、ＶｅｎｔＴＭ、Ｄｅｅｐ  ＶｅｎｔＴＭ、Ｐｆｕ、ならびにＡｍｐｌｉＴａｑＴＭ、ＡｍｐｌｉＴａｑＴＭ  Ｇｏｌｄ、Ｐｌａｔｉｎｕｍ  ＴａｑＴＭおよびＥｘＴａｑＴＭのようなＴａｑＴＭのバージョンが包含される。
【００３４】
Ｄ．環状プローブ増幅（ＣＰＡ）
本発明の環状プローブ増幅（ＣＰＡ）法は、超指数増幅反応を成し遂げるためにＣＲＣＡおよびＰＣＲの工程を組み合わせる。この反応では、線状南京錠プローブを環状化し、そして鎖置換する能力がある第一のＤＮＡポリメラーゼ、最も典型的にはＢｓｔＬＦを用いて２個のプライマーの存在下で短時間増幅する。
【００３５】
本明細書において用いる場合、「プローブ」という用語は、標的核酸分子にハイブリダイズする（アニールする）がポリメラーゼ酵素によってそれ自体伸長されない核酸分子をさす。「プローブ」は、１つもしくはそれ以上のタイプの化学結合によって、相補的塩基対合によって、または水素結合形成によって相補的配列の標的核酸に結合することができるオリゴヌクレオチドである。プローブは、天然の（すなわち、Ａ、Ｇ、ＣもしくはＴ）もしくは改変された塩基（７−デアザグアノシン、イノシンなど）を含むことができる。さらに、プローブにおける塩基は、ハイブリダイゼーションを妨げない限り、リン酸ジエステル結合以外の結合によって連結されることができる。従って、オリゴヌクレオチドプローブは、リン酸ジエステル結合よりむしろペプチド結合によって連結される構成塩基を有することができる。しかしながら、「プライマー」は、本明細書において用いる場合、プローブ分子にハイブリダイズする（アニールする）だけでなく、ポリメラーゼ酵素によって伸長される。
【００３６】
増幅期間は、多数の新しいプライマー部位を生成するのに十分な長さであるが、検出可能な生成物を生成するのに十分な長さではない。この後に第一のポリメラーゼ酵素を変性させる工程を続けることができる。増幅生成物を第二の、典型的には熱安定性のポリメラーゼ酵素および熱循環工程を用いてさらに増幅する。工程の循環期は、特異なサイズのアンプリコンが生成されず、むしろ最初のローリングサークル増幅期中に生成される長い縦列反復上に存在する多数のプライマー部位のために各種の生成物が生成されるという意味では古典的なＰＣＲではない。標的ＤＮＡではなく、プローブ分子のみが増幅されるので、これは、標準的なＰＣＲおよびＤＮＡ診断に用いられる他の標的増幅技術とさらに対照的である。
【００３７】
南京錠プローブを製造するために、線状開環プローブをライゲーションが起こるように標的配列にハイブリダイズさせる。本明細書において用いる場合、「標的核酸」という用語は、南京錠プローブがハイブリダイズする核酸分子をさす。標的核酸はＲＮＡもしくはＤＮＡ、一本鎖もしくは二本鎖であることができる。標的核酸は、プラスミドもしくはそのフラグメント、ゲノムＤＮＡもしくはそのフラグメント、ウイルスＤＮＡもしくはそのフラグメント、ウイルスＲＮＡもしくはそのフラグメント、メッセンジャーＲＮＡもしくはそのフラグメント、ミトコンドリアＤＮＡもしくはそのフラグメント、染色体ＤＮＡもしくはそのフラグメントなどが包含されるがこれらに限定されるものではない任意の形態の核酸分子であることができる。標的核酸が二本鎖である場合、典型的に、南京錠プローブを標的核酸にハイブリダイズさせるために標的核酸を変性させる。
【００３８】
南京錠プローブの基本構造を図１に示す。ＣＲＣＡプローブの特徴を有するプローブは、増幅プライマーの結合部位を含有するスペーサー領域によってつながれる３’および５’末端領域における２つの標的相補的領域からなる。プローブは、末端の３’ヒドロキシルおよび５’リン酸基が標的上で並列すると環状化することができる。末端の３’ヒドロキシルおよび５’リン酸基のライゲーションは、例えば、ＤＮＡリガーゼ酵素を用いて酵素的に行うことができ、もしくはそれを化学的に行うことができる。通常、ライゲーション反応は、ＤＮＡリガーゼ酵素を用いて行う。
【００３９】
南京錠プローブの環状化は、ギャップ充填もしくはスペーサーオリゴヌクレオチドライゲーションが包含されるがこれらに限定されるものではない多数の方法の任意の一つにより行うことができると理解される。本明細書において用いる場合、ギャップ充填は、開環核酸プローブの末端を連結するためのヌクレオチド配列の合成による開環核酸プローブの環状化をさす。その際、開環核酸プローブを必要なｄＮＴＰｓ、リガーゼおよびＤＮＡポリメラーゼと反応させる。本明細書において用いる場合、「スペーサーオリゴヌクレオチドライゲーション」は、開環核酸プローブの５’および３’末端間のギャップへの１個もしくはそれ以上の前もって合成したオリゴヌクレオチド配列の挿入をさす。次に、例えば、リガーゼ酵素もしくは化学反応を用いてスペーサーの末端を開環核酸プローブの末端と連結する。１個もしくはそれ以上のスペーサーオリゴヌクレオチドを利用する場合、開環核酸プローブの５’および３’末端間のギャップを埋めるために例えばそれらを縦列に連結することができる。
【００４０】
本明細書において用いる場合、ｄＮＰＴｓという用語はｄＡＴＰ（デオキシ−アデノシン三リン酸）、ｄＧＴＰ（デオキシ−グアニン三リン酸）、ｄＣＴＰ（デオキシ−シトシン三リン酸）、ｄＴＴＰ（デオキシ−チミン三リン酸）ならびにｄＩＰＴ（デオキシ−イノシン三リン酸）、ｄＵＴＰ（デオキシ−ウラシル三リン酸）および他のプリンおよびピリミジン塩基誘導体のような塩基誘導体をさす。
【００４１】
５’末端領域は、比較的強いそして特異的なアニーリングを与えるために十分な長さである。一般に、２０塩基が本発明における使用に十分な長さである。しかしながら、強いそして特異的なアニーリングは、わずか１０塩基程度を有する５’末端領域で達成することができる。最も包括的態様の下で、５’末端領域は少なくとも２０塩基である。
【００４２】
核酸ハイブリダイゼーションにおけるストリンジェンシー条件は、例えば、核酸の長さおよび組成に基づいて当業者によって容易に決定されることができる。一つの態様として、適度のストリンジェンシーは、本発明の南京錠プローブの配列のいずれかと同一である１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６もしくは１７個の連続したヌクレオチドを有する核酸もしくはその相補物と本明細書において定義する。同様に、高いストリンジェンシーは、１８、１９、２０、２１、２２個もしくはそれ以上の連続した同一のヌクレオチドを有する核酸、または本発明の南京錠プローブの配列のいずれかと少なくとも８０、８５、９０、９５もしくは９９パーセントの同一性を有するさらに長い核酸と本明細書により定義し；少なくとも５０、１００、１５０、２００もしくは２５０ヌクレオチドの配列では、高いストリンジェンシーは、少なくとも６０、６５、７０もしくは７５パーセントの全体的同一性を含んでなることができる。
【００４３】
一般に、核酸ハイブリダイゼーションは、単に、プローブおよびその相補的な標的が相補的塩基対合によって安定なハイブリッド二本鎖を形成することができる条件下で、変性したヌクレオチド分子もしくはプローブおよび標的核酸を与えることを含む。次に、ハイブリッド二本鎖を実質的に形成しない核酸を洗い流し、典型的には結合した検出可能な標識の検出によって、ハイブリダイズした核酸が検出されるようにする。さらに、核酸は、温度を上げることもしくは核酸を含有するバッファーの塩濃度を下げることによって変性されることが一般に認められている。より低いストリンジェンシー条件下（例えば、低い温度および／もしくは高い塩）では、アニールした配列が完全に相補的ではない場合でさえハイブリッド二本鎖（例えば、ＤＮＡ：ＤＮＡ、ＲＮＡ：ＲＮＡもしくはＲＮＡ：ＤＮＡ）が生じる。従って、ハイブリダイゼーションの特異性は、より低いストリンジェンシーで下げられる。逆に、より高いストリンジェンシー（例えば、より高い温度もしくはより低い塩）で、成功するハイブリダイゼーションは、いっそう少ないミスマッチを必要とする。当業者は、任意の程度のストリンジェンシーを与えるようにハイブリダイゼーション条件を選択できることを認識する。
【００４４】
本明細書において用いる場合、本明細書に提供する配列のいずれかおよびハイブリダイズする可能性がある変異体間の同一性パーセントは、例えば、Ｄｅｖｅｒｅｕｘ  ｅｔ  ａｌ．（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１２：３８７，１９８４）によって記述されておりそしてＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ（ＵＷＧＣＧ）から入手可能なＧＡＰコンピュータープログラム、バージョン６．０を用いて配列情報を比較することにより決定することができる。ＧＡＰプログラムは、Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ（Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ  ２：４８２，１９８１）によって修正されるように、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３，１９７０）の整列方法を利用する。ＧＡＰプログラムの好ましいデフォルトパラメーターには：（１）ヌクレオチドの単項比較マトリックス（同一性には１そして非同一性には０の値を含有する）、およびＳｃｈｗａｒｔｚ  ａｎｄ  Ｄａｙｈｏｆｆ（ｅｄｓ．，Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，ｐｐ．３５３−３５８，１９７９）により記述されているような、Ｇｒｉｂｓｋｏｖ  ａｎｄ  Ｂｕｒｇｅｓｓ（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１４：６７４５，１９８６）の加重比較マトリックス；（２）各ギャップの３．０のペナルティーおよび各ギャップにおける各記号の追加の０．１０のペナルティー；ならびに（３）末端ギャップのペナルティーなしが包含される。
【００４５】
あるいはまた、ハイブリダイゼーションストリンジェンシーを実験的に決定する基本プロトコルは、Ｆ．Ａ．Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（１９８７）によって編集されるＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙの２．１０節に記載されている。ストリンジェンシー条件は、当業者によって容易に決定されることができる。適度のストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件の例は、４２℃で０．２Ｘ  ＳＳＣおよび０．１％  ＳＤＳの洗浄条件を有する４２℃で５Ｘ  ＳＳＣ、５Ｘデンハルト溶液、５０％（ｗ／ｖ）ホルムアミドおよび１％  ＳＤＳにおけるハイブリダイゼーションである。高いストリンジェンシー条件の例は、上記のような、そして０．１Ｘ  ＳＳＣおよび０．１％  ＳＤＳにおける約６８℃での洗浄を有するハイブリダイゼーション条件と定義することができる。当業者は、プローブの長さのような因子に従って必要に応じて温度および洗浄溶液塩濃度を調整できることを認識する。
【００４６】
１つより多くのコドンが同じアミノ酸をコードすることができる遺伝暗号の縮重のために、複数のＤＮＡ配列が同じポリペプチドをコードすることができる。そのような変異体ＤＮＡ配列は、遺伝的浮動もしくは人為的操作（例えば、ＰＣＲ増幅中にもしくは天然の配列の故意の突然変異誘発の生成物として起こること）に起因することができる。
【００４７】
天然の配列の故意の突然変異誘発は、当該技術分野において周知である多数の技術を用いて行うことができる。例えば、特に既定の制限ヌクレオチドもしくはコドンが置換、欠失もしくは挿入によって改変されるように遺伝子を突然変異させることが所望される場合、オリゴヌクレオチド指定部位特異的突然変異誘発方法を用いることができる。そのような改変を行う典型的な方法は、Ｗａｌｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（Ｇｅｎｅ  ４２：１３３，１９８６）；Ｂａｕｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（Ｇｅｎｅ  ３７：７３，１９８５）；Ｃｒａｉｋ（ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１月  １２−１９，１９８５）；Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．（Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，１９８１）；Ｋｕｎｋｅｌ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２：４８８，１９８５）；Ｋｕｎｋｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５４：３６７，１９８７）；ならびに米国特許第４，５１８，５８４号および第４，７３７，４６２号によって開示されており、これらの全ては引用することにより組み込まれる。
【００４８】
３’末端領域は５’末端領域と同程度の長さであることができるが、一つの態様によれば、３’末端領域の方が短い（１０−１５塩基の長さ）。より短い３’末端領域によって提供される特異的であるが、より弱いアニーリングは、リガーゼ識別能を向上する。リガーゼ識別能はまた、３’末端もしくは５’末端での塩基ミスマッチによっても向上される。しかしながら、３’末端での塩基ミスマッチは、５’末端でのものよりライゲーションに対して抑制的である。Ｌｕｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２４（１５）：３０７１−８（１９９６）、引用することにより本明細書に組み込まれる。塩基ミスマッチは、末端領域における任意の位置であることができる。しかしながら、塩基突然変異の検出を行っている場合、ミスマッチは塩基突然変異の位置である。結合および識別能を高める技術、従って総合的な感度は、例えば、引用することにより本明細書に組み込まれる米国特許第５，４９４，８１０号に記載されている。
【００４９】
スペーサー領域は、必要とされないが、様々な長さであることができる。スペーサー領域は、用いる場合には、２つの末端領域を標的核酸に効率よくハイブリダイズさせるために十分な長さである。スペーサー領域は、少なくとも５４塩基の長さであることができる。１５０塩基対未満の小さな二本鎖ＤＮＡ環では、これらの小さな環状ＤＮＡ分子と関連する歪みのために、尾部のポリメラーゼ置換は大きい鋳型と比較して高められると報告されている。Ｂａｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２６（２２）：５０７３−５０７８（１９９８）、引用することにより本明細書に組み込まれる。
【００５０】
典型的に、スペーサー領域は、少なくとも一つのプライマー、フォワードプライマーの結合部位を含有する。スペーサー領域は、リバースプライマーの配列をさらに含有することができる。一つの態様として、フォワードプライマーの結合部位は、０塩基〜上限なしの「プライマー−末端スペーシング領域」を含有することができる。本明細書において用いる場合、「プライマー−末端スペーシング領域」という用語は、プライマー領域および末端領域間のヌクレオチド塩基の含有をさす。同様に、リバースプライマー配列および３’末端領域は、０塩基〜上限なしのプライマー−末端スペーシング領域を含有することができる。
【００５１】
プライマーは、プローブにおいて反対の向きである。図１に示すように、フォワードプライマーの結合部位およびリバースプライマーの配列は、「プライマー−スペーシング領域」で隔てられることができる。本明細書において用いる場合、「プライマー−スペーシング領域」は、フォワードおよびリバースプライマー領域間のヌクレオチド塩基の含有をさす。このプライマー−スペーシング領域は、一般に０〜１０塩基である。しかしながら、さらに長いプライマー−スペーシング領域を使用できることが理解される。
【００５２】
一つの態様として、スペーサー領域に結合するプライマーは、異なる開環プローブのプライマーおよびスペーサー領域と同一であり、従って、南京錠プローブの少なくとも一部のＣＲＣＡ期およびＰＣＲ期増幅に包括的プライマーを用いることを可能にする。
【００５３】
ライゲーションは、ＡｍｐｌｉｇａｓｅＴＭ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）もしくはＴａｑＴＭ  ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）のような好熱性リガーゼによって触媒することができる。しかしながら、非耐熱性リガーゼを包含する他のリガーゼは、本発明において有効である。リガーゼ反応は、選択する特定のリガーゼにより追加の成分を必要とし得ることが理解される。２つの主要なタイプのリガーゼ、ＡＴＰ依存性であるものおよびＮＡＤ依存性であるものがある。例えば、ＮＡＤは、ＡｍｐｌｉｇａｓｅＴＭ、エシェリキア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）リガーゼおよびＴａｑＴＭ  ＤＮＡリガーゼのリガーゼ反応に加えられる。大部分のリガーゼはＭｇ＋＋を用いる。商業的製造供給元は、たいてい、リガーゼ反応が起こるために必要な成分の全てを含有する濃縮した反応バッファーとともにリガーゼ酵素を供給する。リガーゼおよびライゲーション条件は、一本鎖末端のライゲーションの頻度を制限するように最適化することができる。一つの態様として、製造供給元が供給する反応バッファーを用いる。別の態様として、特に閉管系を用いる場合、製造供給元が供給する反応バッファーは、リガーゼ酵素およびポリメラーゼ酵素の両方が反応混合物において活性であることを可能にするために必要な成分の全てを含有し得るとは限らないので、使用に適していない可能性がある。この状況において、リガーゼおよび増幅反応の両方が進むことを可能にする反応成分の選択は、当業者の技量の十分に範囲内である。
【００５４】
ライゲーション後に、閉環状核酸分子が形成される。次に、本発明はフォワードプライマーを加え、それは環状化プローブにおけるフォワードプライマー結合領域にアニールする。フォワードプライマーは１０塩基の長さ、１５〜３０塩基の長さ、もしくはそれ以上の長さであることができる。
【００５５】
一つの態様として、フォワードプライマーもしくはリバースプライマーは、少なくとも一つの非情報的塩基を含有する。本明細書において用いる場合、「非情報的塩基」という用語は、それがＤＮＡポリメラーゼの停止部位として働くように改変されているヌクレオチド塩基をさす。従って、非情報的塩基は、ＣＰＡ中に増幅アーチファクトをなくすかもしくは減らすために用いることができる。そのような使用に適当な非情報的塩基には、ニトロピロールおよびニトロインドールが包含されるが、これらに限定されるものではない。これらの非情報的部位は、フォワードもしくはリバースプライマーにおける任意の位置に導入することができ、そして組み合わせて用いることができる。例えば、フォワードもしくはリバースプライマーは、２個もしくはそれ以上のニトロピロール塩基、２個もしくはそれ以上のニトロインドール塩基、または１個もしくはそれ以上のニトロピロール塩基と１個もしくはそれ以上のニトロインドール塩基を含有することができる。本発明において用いることができる代わりの非情報的塩基は、極性スイッチである。本明細書において用いる場合、「極性スイッチ」という用語は、通常の５’−３’リン酸ジエステル結合の代わりに３’−３’および５’−５’リン酸ジエステル結合で連結される２個の塩基をさす。極性スイッチは、プライマーにおける任意の塩基間で起こることができる。そのような改変は、ＢｓｔＬＦを包含するポリメラーゼの強力な停止部位である。
【００５６】
非情報的塩基はＤＮＡ合成もしくは増幅を効果的に止めるので、従来、それらはハイブリダイゼーションプローブ分子においてのみ用いられ、増幅プライマー分子では用いられない。しかしながら、本発明のＣＰＡ反応において、ＤＮＡ増幅は、多数の尾部の付いた複合体上に存在する多数のプライマー開始部位のために非情報的塩基を含有するプライマーを用いてもなお可能である。
【００５７】
フォワードプライマーは、プライマー伸長を触媒する鎖置換活性を有する第一のＤＮＡポリメラーゼによって伸長される。フォワードプライマーが伸長されるにつれて、第二の（リバース）プライマー結合部位が形成される。
【００５８】
ローリングサークル増幅を行うことができる任意のＤＮＡポリメラーゼ酵素は、ＣＰＡにおける使用に適している。ローリングサークル増幅を行うポリメラーゼの能力は、Ｆｉｒｅ  ａｎｄ  Ｘｕ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）９２：４６４１−４６４５（１９９５）に記述されているもののようなローリングサークル増幅アッセイにおいてポリメラーゼを用いることにより決定することができる。一つの態様として、ＣＰＡに用いるポリメラーゼ酵素は、合成された鎖の破壊の機会を減らすためもしくはそれをなくすために５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を欠く。ＤＮＡポリメラーゼは非常に連続伸長的であることができる。
【００５９】
ＣＰＡの第一の増幅工程における使用に適当なポリメラーゼ酵素には、ＤＮＡポリメラーゼＩ、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメント、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ７  ＤＮＡポリメラーゼ、ＴａｑＴＭポリメラーゼ、ＶｅｎｔＴＭポリメラーゼ、Ｄｅｅｐ  ＶｅｎｔＴＭポリメラーゼ、φ２９ポリメラーゼ、ＢｓｔポリメラーゼおよびＢｓｔＬＦポリメラーゼが包含されるが、これらに限定されるものではない。第一のＤＮＡポリメラーゼには、ＢｓｔＬＦ  ＤＮＡポリメラーゼが最もよく用いられるポリメラーゼ酵素である。
【００６０】
溶液に基づく診断アッセイおよび単一コピーの固相に基づく診断アッセイにおける十分な感度を達成するために、本発明は、第一の（フォワード）プライマーの伸長によって生成されるリバースプライマー結合領域にアニールする第二の（リバース）プライマーを用いる。図２（Ｂ）。リバースプライマーは第一のプライマーが伸長されるまでアニールしないので、増幅反応の開始から存在することができ、もしくは任意の時点で加えることができる。リバースプライマーは１０塩基の長さから１５〜３０塩基の長さまで、もしくはそれ以上の長さであることができる。
【００６１】
第二の（リバース）プライマーは、フォワードプライマー伸長生成物によって生み出される第二の（リバース）プライマー結合部位にアニールする。第二の（リバース）プライマーは、第一のＤＮＡポリメラーゼの作用によって伸長される。これらの伸長された第二のプライマーが相補的配列を形成し、そして相互に置換するにつれて、フォワード（第一の）プライマー結合部位を含有するさらなる５’尾部が形成される。次にこれらの二次的な５’尾部は、第一の（フォワード）プライマーの鋳型を提供する。フォワードおよびリバースプライマーは両方とも前の回の合成からの置換された鎖上で合成を開始し続け、線状形態の元の南京錠プローブおよびその相補物の縦列コピーの大きな複合体である「多数の尾部の付いた複合体」をもたらす。多数の尾部の付いた複合体の概略図を図２（Ｂ）に与える。この概略図に示すように、「多数の尾部の付いた複合体」は何百もしくは何千の個々のフォワードおよびリバースプライマー結合部位を含有し、これらの全ては一つの複合体の一部であり、そしてこれらの全ては元の閉環状核酸プローブ分子から生じる。
【００６２】
フォワードおよびリバースプライマーのプライマー濃度は、約１００ｎＭ〜約１μＭであることができ、そして約２５０〜約５００ｎｍであることができる。高濃度のプライマーを用いることは有益であることができるが、高すぎるプライマー濃度により、反応が許容できないレベルの偽シグナルをもたらす可能性がある。一般に、少なくとも一つのプライマーを検出可能に標識する。
【００６３】
第一のＤＮＡポリメラーゼに加えて、他の反応成分を加える。これらの他の反応成分の添加は当業者に既知であり、そしてｄＮＴＰｓ、バッファー、塩類（例えば、硫酸マグネシウム、塩化カリウムもしくは硫酸アンモニウム）および界面活性剤（例えば、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００のような非イオン性界面活性剤）が包含される。
【００６４】
鎖置換は、ヘリカーゼおよび／もしくは一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質のような鎖置換因子の使用により促進することができる。ＲＣＡに有用な鎖置換因子には、ＢＭＲＦ１ポリメラーゼ補助サブユニット（Ｔｓｕｒｕｍｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ６７（１２）：７６４８−７６５３（１９９３）、引用することにより本明細書に組み込まれる）、アデノウイルスＤＮＡ結合タンパク質（Ｚｉｊｄｅｒｖｅｌｄ  ａｎｄ  ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｖｌｉｅｔ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ６８（２）：１１５８−１１６４（１９９４）、引用することにより本明細書に組み込まれる）、単純ヘルペスウイルスタンパク質ＩＣＰ８（Ｂｏｅｈｍｅｒ  ａｎｄ  Ｌｅｈｍａｎ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ６７（２）：７１１−７１５（１９９３）；Ｓｋａｌｉｔｅｒ  ａｎｄ  Ｌｅｈｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）９１（２２）：１０６６５−１０６６９（１９９４）、これらの両方とも引用することにより本明細書に組み込まれる）、一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質（ＳＳＢ；Ｒｉｇｌｅｒ  ａｎｄ  Ｒｏｍａｎｏ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：８９１０−８９１９（１９９５）、引用することにより本明細書に組み込まれる）、および仔牛胸腺ヘリカーゼ（Ｓｉｅｇｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：１３６２９−１３６３５（１９９２）、引用することにより本明細書に組み込まれる）が包含される。
【００６５】
第一のＤＮＡポリメラーゼを用いる増幅期間は、通常、多数の尾部の付いた複合体における多数の新しいプライマー部位を生成するのに十分な長さであるが、典型的に、検出可能な生成物を生成するのに十分な長さではない。本明細書において用いる場合、「検出可能な生成物」という用語は、例えば臭化エチジウムで染色したアガロースゲル上での直接視覚化によって検出可能な増幅生成物をさし（典型的には、臭化エチジウムで染色したアガロースゲルにおいて１０ｎｇ未満を検出することはできない）、そうでなければ、増幅生成物が機器により測定されている場合、増幅生成物シグナルはバックグラウンドを測定可能に超えない。検出可能な生成物は、通常、増幅が対数（もしくは指数）期になるまで生成されない。一般に、約５０〜約７０℃で約１〜約３０分間のインキュベーション期間は、本発明の十分な数の新しいプライマー部位を生成するのに十分な長さである。インキュベーション期間はまた、約５０〜約７０℃で約３〜約２０分、もしくは約６５℃で約１０分であることもできる。本発明において用いる場合、「約」という用語を第一のパラメーターもしくは範囲を修飾するために用いるが別のパラメーターもしくは範囲を修飾するために用いない場合、第二のパラメーターもしくは範囲は、約という用語によって修飾されるものとしたことが理解される。本発明に用いる時間、温度、濃度、体積および質量の全ては絶対値ではなく、むしろそれらは当業者によって操作されることができそして日常的に操作される値である。
【００６６】
インキュベーション期間の温度は、十分なプライマー部位を生成するために必要な時間の長さに影響を及ぼすことができると理解される。一般に、ポリメラーゼ酵素は、それらが作用する、温度を包含する最適な一組の条件を有する。例えば、ＢｓｔＬＦは約６３〜約６７℃で最高効率で作用する。ＢｓｔＬＦは熱安定性であるが、それは適度に熱安定性の酵素である。約７５℃より高い温度で、ＢｓｔＬＦは変性される。
【００６７】
当業者は、反応を減速するかもしくはさらに加速するために本発明の反応条件を操作できることが理解される。例えば、バッファー条件もしくはプライマー濃度におけるわずかな変動もまた、反応に影響を及ぼすことができる。さらに、当業者は、ポリメラーゼ酵素の特性を改変するためにポリメラーゼ酵素に遺伝子的もしくは化学的改変を行うことができる。そのような改変は、本発明の範囲内である。
【００６８】
第一のポリメラーゼを用いる一回限りの増幅でさえ、各サイクルが標的配列のコピー数の倍加に限定されるＰＣＲ複製もしくは他の増幅技術の単一サイクルより大きい桁数の、環状化プローブ分子の多数の増幅をもたらす。
【００６９】
環状プローブの最初の増幅後に、これは任意であるが、第一のＤＮＡポリメラーゼを変性させることができる。通常、第一のＤＮＡポリメラーゼを熱変性させる。しかしながら、フェノール：クロロホルム抽出のような化学変性もまた行うことができる。別の手段として、増幅生成物を、例えばエタノール沈殿を用いて第一のＤＮＡポリメラーゼから離して精製することができる。
【００７０】
次に、多数の尾部の付いた複合体を増幅するために第二のＤＮＡポリメラーゼを用いる。第二のＤＮＡポリメラーゼは、熱安定性（ｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｌｅ）（熱に安定な（ｔｈｅｒｍａｌ  ｓｔａｂｌｅ）とも呼ばれる）ポリメラーゼ酵素であることができる。これらの酵素、それらの使用およびそれらを得るための起源は当業者に既知である。適当な熱安定性ポリメラーゼ酵素には、ＴａｑＴＭ、ＡｍｐｌｉＴａｑＴＭ、ＡｍｐｌｉＴａｑＴＭ  Ｇｏｌｄ、Ｐｌａｔｉｎｕｍ  ＴａｑＴＭおよびＥｘＴａｑＴＭのようなサーマス・アクアティカス、Ｄｅｅｐ  ＶｅｎｔＴＭのようなパイロコッカス種、ＶｅｎｔＴＭのようなサーモコッカス・リトラリス、ならびにＰｆｕおよびＰｆｕＴｕｒｂｏのようなパイロコッカス・フリオサスから得られるポリメラーゼ酵素が包含される。本明細書において用いる場合、ポリメラーゼ酵素自体が生物体から精製されている場合に、ポリメラーゼ酵素は生物体から得られると考えられる。また、得られるという定義の範囲内であるのは、ポリメラーゼ酵素をコードする遺伝子が生物体から単離され、別の生物体にクローン化されそしてその組換え酵素が精製されている場合である。遺伝子操作によってさらに改変されているそのような組換えポリメラーゼもまた、指定生物体から得られると考えられる。
【００７１】
別の態様の下で、第二のＤＮＡポリメラーゼは抗体不活性化ポリメラーゼもしくは化学的不活性化ポリメラーゼである。ＰｆｕＴｕｒｂｏおよびＰｌａｔｉｎｕｍ  ＴａｑＴＭのような抗体不活性化ポリメラーゼは、それらがポリメラーゼ酵素の製造業者によって設定される温度に加熱されるまで不活性である。この活性化工程中に、例えば、Ｐｌａｔｉｎｕｍ  ＴａｑＴＭは、ポリメラーゼからの不活性化抗体の解離によって活性になる。例えばＡｍｐｌｉＴａｑＴＭ  Ｇｏｌｄのような化学的不活性化ポリメラーゼは、酵素がポリメラーゼ酵素の製造業者によって設定される温度に加熱されるまで不活性である。米国特許第５，５４５，５２２号、引用することにより本明細書に組み込まれる。この温度で、ポリメラーゼ酵素がＤＮＡ合成を行うのを通常は妨げる化学結合が壊され、そしてポリメラーゼ酵素は活性になる。
【００７２】
一つの態様の下で、第一のポリメラーゼを変性させた後に第二のポリメラーゼを反応混合物に加える。本明細書において用いる場合、「変性させる」という用語は、熱変性、化学変性などのような機構による第一のポリメラーゼの不活性化をさす。あるいはまた、第一および第二のポリメラーゼ酵素を最初の反応混合物の一部として加える。しかしながら、一般に、第二のポリメラーゼは、第一のポリメラーゼを変性させるまで活性ではない。
【００７３】
次に、第二のポリメラーゼは、第一のポリメラーゼによって生成される多数の尾部の付いた複合体を指数的に増幅するために同じフォワードおよびリバースプライマーを用いる。多数の尾部の付いた複合体は多数のプライマー結合部位を含有するので、熱循環反応を用いて増幅する場合、反応生成物は様々な長さである。この反応はまた、任意の既定のアンプリコンの反応において２つのプライマー結合部位のみを用いる従来のＰＣＲよりはるかに速くもある。
【００７４】
一つの態様として、第一のプライマーは「縁のある（ｌｉｐｐｅｄ）プライマー」である。本明細書において用いる場合、「縁のあるプライマー」という用語は、５’末端配列が南京錠プローブにハイブリダイズしないプライマー分子をさす。そのような縁のあるプライマーは、プライマーの５’末端を不安定にすることによってＤＮＡポリメラーゼ置換をさらに高める。いったん開始されると、絶えず伸長する尾部は同じ機能を提供するように働く。縁はまた、プライマーが置換される代わりに分解されるのを減らすかもしくは防ぐ。そのような縁のあるプライマーの使用は、ＤＮＡポリメラーゼが５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する場合に特に有用である。
【００７５】
本発明は、標的配列の代わりにプローブ配列を増幅するために包括的プライマーを用いる。包括的プライマーは、効率のよい増幅および南京錠プローブのスペーサー領域内のプライマー結合のために設計され、そして標的結合アームにおいてのみ異なる多数の南京錠プローブを増幅するために用いることができる。従って、各プローブに同じ組のプライマーおよび条件を用いそして最適化することができる。これらの領域の配列が効率に影響することが可能であるが、これは非常にわずかである。包括的プローブを用いると、不十分にアニールするプライマーを有することによって偽陰性結果を得る機会が少ない。ヘテロ接合体および多型を含有するサンプルもまた、従来のＰＣＲプライマーでのアニーリングを妨害し得る。本発明の包括的プライマーは、交差反応しないようにあらかじめ決定することにより偽陽性結果の可能性を減らす。
【００７６】
一つの態様の下で、本発明は、核酸分子を検出するために蛍光エネルギー転移（ＦＲＥＴ）（米国特許第５，５６５，３２２号、第５，５３２，１２９号、第４，９９６，１４３号、これらの全ては引用することにより本明細書に組み込まれる）、ＴＡＱＭＡＮＴＭアッセイ（Ｈｏｌｌａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）８８：７２７６−７２８０（１９９１），Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２１：３７６１−３７６６（１９９３）、これらの両方とも引用することにより本明細書に組み込まれる）、エネルギーシンクオリゴヌクレオチド（米国特許第５，３４８，８５３号およびＷａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．６７：１１９７−１２０３（１９９５）、これらの両方とも引用することにより本明細書に組み込まれる）、分子ビーコンプローブ（米国特許第５，３１２，７２８号および第５，１１９，８０１号、ならびにＴａｇａｉ  ａｎｄ  Ｋｒａｍｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．１４：３０３−３０９（１９９６）、これらの全ては引用することにより本明細書に組み込まれる）、スコーピオン（Ｓｃｏｒｐｉｏｎ）プローブ（Ａｓｔｒａ  Ｚｅｎｅｃａ）、もしくは分子エネルギー転移プライマー（米国特許第６，１１７，６３５号、第６，０９０，５５２号および第５，８６６，３３６号、これらの全ては引用することにより本明細書に組み込まれる）のような分子エネルギー転移機構を用いる。これらの技術の全ては、ＰｒｉｓｍＴＭ  ７７００（ＡＢＩ／Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）、ＰｒｉｓｍＴＭ  ５５００（ＡＢＩ／Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）、Ｉ  ＣｙｃｌｅｒＴＭ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）、およびＬｉｇｈｔ  ＣｙｃｌｅｒＴＭ（Ｉｄａｈｏ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．，Ｉｄａｈｏ  Ｆａｌｌｓ，ＩＤ）のような実時間検出機器で用いることができる。実時間検出機器は、経時的に蛍光強度の変化を測定する。核酸分子を検出する他の技術には、標識の直接導入、ＤＮＡ合成中に導入するハプテンに対する標識した抗体の使用、標識した検出プローブへのハイブリダイゼーションが包含される。
【００７７】
市販されているＢＥＡＣＯＮＴＭプローブ（Ｍａｒｒａｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｔ．Ａｎａｌ．１４（５−６）：１５１−６（１９９９）、引用することにより本明細書に組み込まれる）およびＡｍｐｌｉｆｌｕｏｒＴＭプライマー（Ｉｎｔｅｒｇｅｎ，Ｐｕｒｃｈａｓｅ，ＮＹ）（Ｎｕｏｖｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．４７（３）：２７３−８０（１９９９、引用することにより本明細書に組み込まれる）は、本発明において用いることができる。ＢＥＡＣＯＮＴＭプローブおよびＡｍｐｌｉｆｌｕｏｒＴＭプライマーは、標的分子の数に直接関係する蛍光を出すことによって増幅生成物の存在を検出するために用いる。
【００７８】
分子ビーコンプローブは蛍光成分で標識した検出プローブであり、ここで、蛍光成分は、検出プローブがハイブリダイズされると蛍光を発する。ハイブリダイズしていない検出プローブはシグナルを生成しないので、そのようなプローブの使用は、標識検出の前のハイブリダイズしていないプローブの除去の必要をなくす。これは多重アッセイにおいて特に有用である。
【００７９】
ＣＰＡは多重化することが容易であり、様々な病原体もしくは突然変異の同時スクリーニングを可能にする。一つの態様として、本発明は、異なる波長で蛍光を発するかもしくは異なって着色されるいずれかの標識の使用を伴う多重検出系を用いる。そのような系を用いて、いくつかの標的を同じサンプルにおいて同時に視覚化することができる。組み合わせ戦略を用いて、分析できる発蛍光団の数よりさらに多くの標的を識別することができる。プローブの蛍光はないかあるかのいずれかであるので、組み合わせ標識化は、多重にプローブを標識する最も簡単な方法を提供する。本明細書において用いる場合、「組み合わせ標識化」という用語は、任意の既定のプローブ分子実例における標識の組み合わせの使用をさす（例として、３種の異なる標識（例えば、Ａ、Ｂ、Ｃ）のセットを用いて、当業者は異なって標識される９種の異なるプローブ分子を製造することができる。９種の異なるプローブ分子で、９種の異なる標的分子を識別することができる。同様に、各々異なる標識を含有する３種の異なるプライマー分子のセットを用いて、当業者は９種の異なる標的分子を識別することができる。プライマーおよびプローブは両方とも同じ検出系において用いることができると理解される。従って、画像分析は自動化がいっそう容易にでき、そして示差光退色のような多数の実験アーチファクトを防ぐことができる。
【００８０】
さらなる例として、そしてＨＩＶを例として用いて、当業者は、各々異なる治療薬に対する治療耐性と関連する突然変異を検出することができる３種の異なるプローブ分子を設計することができる。従って、当業者は９種の異なる遺伝子型のＨＩＶ（例えば、ＡＺＴ耐性もしくは感受性、スタブジン耐性もしくは感受性、ＡＺＴ耐性およびスタブジン耐性、ＡＺＴ感受性およびスタブジン耐性など）を識別することができる。なおさらなる例として、そしてウイルス感染を例として用いて、当業者は、各々異なるウイルスを検出することができる３種の異なるプローブ分子を設計することができる。従って、バッテリーテストを行う当業者は、既定のサンプルが例えばＨＩＶ、ＨＣＶもしくはＨＢＶまたはその任意の組み合わせを含有するかどうかを決定することができる。これらの実例は、決して本発明を限定するものではないことが理解される。３種のプライマーもしくはプローブが記述されているが、当業者は任意の数のプライマーもしくはプローブを使用できることおよび識別することができる標的の組み合わせの唯一の制限は、当業者が利用できる識別可能なシグナルの数であることが理解される。
【００８１】
多重化することの一つの態様の下で、本発明は、標的核酸分子の混合物および複数の線状核酸プローブ分子を含んでなる反応混合物を提供し、ここで、複数の線状核酸分子の各メンバーは、別個の標的核酸分子にアニールすることができる。一つの態様の下で、複数の線状核酸分子の各メンバーは、独自の標的核酸分子にアニールする。次に線状核酸分子は連結され、そして閉環状核酸分子になる。一般に、フォワードプライマー結合領域にアニールすることができる別個のフォワードプライマーを複数の閉環状核酸分子の各メンバーに与える。同様に、リバースプライマー結合領域にアニールすることができる別個のリバースプライマーを複数の閉環状核酸分子の各メンバーに反応混合物において与える。同様に反応混合物に加えるのは、ｄＮＴＰｓおよび第一のＤＮＡポリメラーゼである。少なくとも二つの別個の標的核酸分子の多数の尾部の付いた複合体をもたらすために反応混合物をインキュベーションする。反応混合物における第二の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを活性化する。本明細書において用いる場合、「活性化する」という用語は、反応混合物への第二のポリメラーゼの添加、もしくは第二のポリメラーゼが最初の反応混合物に存在した場合には、第二のポリメラーゼの活性化のいずれかをさす。Ｐｌａｔｉｎｕｍ  ＴａｑＴＭ、ＰｆｕＴｕｒｂｏもしくはＡｍｐｌｉＴａｑＴＭ  Ｇｏｌｄのような抗体不活性化もしくは化学的不活性化ＤＮＡポリメラーゼの場合、反応混合物をポリメラーゼ酵素の製造業者によって設定される温度に加熱するとＤＮＡポリメラーゼは活性化される。この温度で、不活性化因子は遊離され、もしくは不活性化化学結合の場合には、結合が壊される。次に、少なくとも二つの別個の多数の尾部の付いた複合体を増幅するために反応混合物を熱循環させ、そして多数の尾部の付いた複合体の増幅生成物を実時間検出機器を用いて検出する。
【００８２】
本発明をさらに多重化するために、どの南京錠プローブが増幅されているかを示し、それにより複数の標的核酸配列の各々の存在もしくは量を推定するために、異なる色を出す異なる蛍光標識を異なるプライマー上に用いることができる。従って、複数の閉環状核酸分子の各メンバーに対して、少なくとも一つの別個のフォワードもしくは少なくとも一つの別個のリバースプライマーを示差的に標識する。例えば、可視のもしくは検出可能なフルオレセイン標識は特定の感染体を示すことができ、一方、検出可能なローダミン標識は別のものを、そしてテキサスレッドはさらに別のものを示すことができる。このリストは、有限数の別個の蛍光剤が存在する限りにおいてのみ限定されると理解される。そのような組み合わせは、多数の病原体のいずれが患者の症状の特定の一組の原因となっているかを決定するために用いることができる。あるいはまた、多数の色は、異なる抗生物質に対する抗生物質感受性もしくは耐性を各々示すことができる。各色は、対応する独自の南京錠プローブ分子にアニールする独自のプライマー分子に対応する。
【００８３】
固定化した開環プローブは、サンプル核酸標的もしくは単一ヌクレオチド多型を検出するためのマイクロアレイに特に有用である。マイクロアレイは、マイクロアレイの固体支持体上の特定の位置に各々固定される何百もしくは何千の異なる開環プローブを含有することができる。あるいはまた、マルチウェルもしくは「マイクロタイター」プレートのような区分化されたプレートは、懸濁したまたはビーズもしくはプレートウェルの側面に固定される別個の開環プローブを保持することができる。これらの配置は、上記の用途の全て、ならびに核酸標的の迅速な塩基配列決定ならびに何百もしくは何千の多型および突然変異を同時に決定することを有する。マイクロアレイはまた、ローリングサークルを最初に増幅し続いて相補的オリゴヌクレオチドを結合した固相マイクロアレイにそれをハイブリダイズさせることによりＣＰＡの後に製造することもできる。ＣＰＡ複合体は標的ＤＮＡの多数の縦列コピーを含有するので、それは固相および他の核酸の両方に結合することができる。
【００８４】
核酸を固相基質に固定化する方法は、当業者に周知である。例として、適当な結合方法は、Ｇｕｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２２：５４５６−５４６５（１９９４）、Ｐｅａｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）９１（１１）：５０２２−５０２６（１９９４）およびＫｒａｐｋｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（Ｍｏｓｋ）（ＵＳＳＲ）２５：７１８−７３０（１９９１）により記述されており、これらの全ては引用することにより本明細書に組み込まれる。
【００８５】
核酸分子の多重画像解析の方法は、引用することにより本明細書に組み込まれる米国特許第６，００７，９９４号に記述されている。この方法および同様の方法に従って、複数の示差的に標識したオリゴヌクレオチドを用いる。示差的に標識したオリゴヌクレオチドの使用により、実行者は多数の核酸サンプルを同時に特性化することができる。
【００８６】
従来のマイクロアレイは固定化したオリゴヌクレオチドを有し、それにより大量の並行逆ドットブロットアッセイを行う。シグナル対ノイズ比は、５：１程度の高さであると報告されている。そのような系は、多量の正常配列におけるまれな突然変異を検出するのに有用ではない。それに反して、南京錠プローブはそれが形成されるために識別酵素を必要とし、従って、大過剰の正常標的配列におけるまれな突然変異の検出が可能である。
【００８７】
ストレプトアビジンを被覆した磁気ビーズは、ビオチン標識したｄＮＴＰｓをプライマー伸長中に用いる場合にＣＰＡ複合体を濃縮しそして局在させるのに有用である。同様に、異なるリガンドで標識したｄＮＴＰによって形成されるＣＰＡ複合体を結合するために、異なる色もしくは検出可能な標識を有することができる，異なる受容体を被覆した磁気もしくは非磁気ビーズを用いることができる。
【００８８】
ＰＣＲ増幅生成物は拡散するので、ＰＣＲは、同時に増幅することができる異なる標的の数に関して固有の限界を有する。それに反して、ＲＣＡ複合体は一緒に連結され、そしてそのようなものとしてマイクロアレイ上の異なるアドレスに局在する。マイクロアレイのセル間に仕切りを用いることにより、ＣＰＡもまた用いることができる。これは、同じ試薬での同時に何百〜何千の異なる標的の同時検出を可能にする。
【００８９】
増幅に標識したプライマーを利用する分子エネルギー転移に基づく検出技術もまた、プライマーが増幅生成物に取り込まれる場合にのみ蛍光シグナルが生成されるように用いることができる。Ｎａｚａｒｅｎｋｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５（１２）：２５１６−２５２１（１９９７）、Ｎｕｏｖｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．４７（３）：２７３−８０（１９９９）、およびＵｅｈａｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ２６（３）：５５２−８（１９９９）、これらの全ては引用することにより本明細書に組み込まれる。そのようなプライマーの使用は、シグナルが、プローブハイブリダイゼーションのような、二次的事象の効率によって影響を受ける他の系と異なり、増幅されたＤＮＡの直接蛍光検出を可能にする。
【００９０】
本発明の一つの態様の下で、増幅プライマーは分子エネルギー転移プライマーである。分子エネルギー転移プライマーは、プライマーが増幅生成物に取り込まれると蛍光シグナルを生成する。Ｎａｚａｒｅｎｋｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５（１２）：２５１６−２５２１（１９９７）、Ｎｕｏｖｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．４７（３）：２７３−８０（１９９９）、およびＵｅｈａｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ２６（３）：５５２−８（１９９９）、これらの全ては引用することにより本明細書に組み込まれる。そのようなプライマーの使用は、ＰＣＲ、ＣＲＣＡおよび本発明のＣＰＡのような増幅系を閉鎖系において均質な蛍光検出で行うことを可能にする。増幅後の処理の必要が除かれるので、検出シグナルを実時間で直接もしくは増幅工程が完了するとすぐに読み取ることができる。
【００９１】
ＰＣＲおよびＣＲＣＡにおけるように、ＣＰＡは２個のプライマーによって推進される。本発明の一つの態様の下で、これらのプライマーの一方もしくは両方は、蛍光剤−消光剤の一対で標識したヘアピンプライマーであることができる。ヘアピンプライマーは、それが増幅生成物に取り込まれない限り、バックグラウンド蛍光シグナルを生成する。増幅生成物への取り込みにより、はるかに高い蛍光シグナルが生成する。、蛍光剤−消光剤の一対で標識したヘアピンプライマーおよび核酸増幅生成物の検出におけるそれらの使用は、米国特許第６，１１７，６３５号、第６，０９０，５５２号および第５，８６６，３３６号に記述されており、これらの全ては引用することにより本明細書に組み込まれる。
【００９２】
ヘアピンプライマーは５’から３’に以下の構造、第一の自己結合領域、ループ領域、第一の自己結合領域に少なくとも部分的に相補的な第二の自己結合領域、およびプライマー領域を有する。第一および第二の自己結合領域は、一般に、室温で安定な二本鎖構造を生成するのに十分な長さである。一つの態様として、これらの領域は部分的にのみ相補的であり、それにより二本鎖構造の解離温度を下げる。ポリメラーゼ伸長反応に用いる温度のような、より高い温度で、二本鎖構造は不安定になる。次に、プライマーをポリメラーゼで伸長する。部分的にのみ相補的な領域の使用はまた、プライマーが二本鎖反応生成物を解離させるのも防ぐ。
【００９３】
約６０−６５℃より高い温度で、ヘアピンは不安定であり、反応混合物に蛍光を生じさせることができる。しかしながら、混合物を冷却すると、ヘアピン立体配置は戻り、全ての取り込まれていないプライマーの消光をもたらす。増幅が起こらない場合、バックグラウンド蛍光シグナルが検出される全てである。
【００９４】
リバースプライマーは、蛍光剤−消光剤の一対を有する唯一のヘアピンプライマーであることが多い。この態様の下で、ヘアピンプライマーに対する相補鎖が合成されると、ヘアピンは置換中に伸び、それにより蛍光および消光成分を分離し、蛍光をもたらす。標識したプライマー（１個もしくは複数）は、通常、それらのそれぞれの鋳型ＤＮＡ（１個もしくは複数）への完全で且つ迅速なアニーリングを保証するために過剰に存在する。一般に、１μＭの標識したプライマーを含有する溶液は、十分に過剰のプライマーを与える。しかしながら、別の態様の下で、限られた量のプライマーを用いることができる。
【００９５】
蛍光および消光成分をさらに分離するために、制限エンドヌクレアーゼ切断部位をヘアピンプライマーのループ領域に導入することができる。複合体が形成される前もしくは後に、それに制限エンドヌクレアーゼを加えることによって、二本鎖複合体を切断し、それにより消光成分から蛍光成分をさらに分離する。消光成分から蛍光成分をさらに分離することによって、蛍光レベルは増加される。そのような改変は、閉管系においてもしくはヘアピンプライマーの引き伸ばしが蛍光および消光成分を十分に分離しないヘアピンプライマーで用いることができる。
【００９６】
別個のフォワードおよびリバースプライマーを用いるよりむしろ、両方のプライミング活性を有する単一の分子を用いることができる。例えば、フォワードおよびリバースプライマーの両方の５’末端を相互に化学的に連結した場合に二機能性もしくはキメラプライマーを用いることができる。そのようなキメラプライマーの検出は、プライマーに対する相補物がＣＰＡにおいて形成されるとエネルギー転移標識が分離され検出可能なシグナルをもたらすようなヘアピンループおよび２つのエネルギー転移標識の導入を包含する多数の方法によって行うことができる。ＤＮＡポリメラーゼは、一般に、非天然の結合を含有するキメラ分子の部分を越えて進むことはできない。
【００９７】
フォワードおよびリバースプライマーは両方ともキメラプライマー上の機能性成分であるので、キメラプライマーはまた、フォワードおよびリバースプライマーとして本発明において用いることもできる。さらに、増幅領域は、相補的な相手を欠く非天然の３’尾部を含有するので、二機能性プライマーが大過剰でない場合に独特な複合体が熱循環増幅の後期に生じることができる。例えば、変性および再アニーリングの際に、２本の（＋）鎖はそれらの末端でアニールすることができ、その結果、もう一方によって伸長することができない一方の３’末端が伸長されて増幅配列のダイマーを形成することができる。この工程は何度も繰り返し、様々なマルチマーを生じることができる。「マルチマー」は、本明細書において用いる場合、端と端を連結されるオリゴマーの多数のコピーを含有する核酸配列をさす。また、２つの非天然の３’末端を有する一本鎖は、１つの伸長可能な３’末端を有するらせんに自己アニールし、増幅する配列およびその相補物のダイマーを形成することができる。この工程は、前の自己アニールするダイマーと一緒に繰り返し、非常に大きな複合体をもたらすことができる。そのような技術は、インサイチューＰＣＲおよびアレイのような大きな複合体が望ましい場合に用途を有する。増幅における周知の問題であるプライマーダイマーもまた、キメラプライマーを用いて制御することができる。
【００９８】
また、プライマーのモル比を制御することが有用であり得る、ある状況において、キメラプライマーを用いることができる。あるいはまた、分枝状ＤＮＡを用いることができる。分枝状ＤＮＡは、ＤＮＡバックボーンに多数の分枝状オリゴヌクレオチドをそれらの３’末端が遊離しているように付加する様々な連結剤および反応を用いて作製する。米国特許第５，９１６，７５０号、第５，１２４，２４６号；第４，９２５，７８５号、これらの全ては引用することにより本明細書に組み込まれる。プライマーの結合関係はモル比を制御し、そしてプライマーダイマーの形成を減らすことに役立つことができる。例として、引用することにより本明細書に組み込まれるＢｈａｔｎａｇａｒ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許第５，５９３，８４０号に記述されている３プライマー増幅系において３プライマーキメラプライマーが用いられた。
【００９９】
いったんマルチマーが本発明の方法を用いて形成されると、単位長のオリゴマーを生成するためにそれを多数の方法のいずれかにより切断することができる。切断は、マルチマーが形成されるにつれて行うことができ、もしくは反応が終了した後に行うことができる。次に、所望に応じて、得られるオリゴマーの精製を行うことができる。
【０１００】
一つの態様の下で、制限酵素認識部位を３’末端領域および５’末端領域のライゲーション連結部に、これら２つの末端領域が連結されると制限部位が形成されるように設計する。増幅後に、ライゲーション連結部を制限酵素で切断することにより単位長のモノマーを生成することができる。これはまた、視覚化する反応生成物が、アーチファクトではなく成功したライゲーション反応の生成物であることも裏付ける。
【０１０１】
切断反応に用いることができるいくつかの技術がある。例えば、マルチマーに存在する特定の配列を切断するために制限エンドヌクレアーゼを用いることができる。それらは単独で、もしくはある場合には反応を助ける短いＤＮＡ鎖を加えて用いることができる。切断反応はまた、化学物質を用いて行うこともできる。例えば、各オリゴマー間で１回存在する塩基で鎖を切断するためにマクサム・ギルバート切断試薬を用いることができる。
【０１０２】
ＲＮＡマルチマーの切断には、酵素的もしくは化学的技術を用いることができる。酵素ＲＮアーゼＨをＤＮＡオリゴマーの添加と一緒に用いることができ、もしくは塩基特異的ＲＮアーゼを用いることができる。あるいはまた、マルチマーを切断するために触媒リボザイムを用いることができ、もしくは所望の部位で自分自身を切断する自己切断配列をマルチマーにコード化することができる。
【０１０３】
ＣＰＡにおけるフォワードおよびリバースプライマーの別のバリエーションは、ＰＣＲ生成物を検出することにおける使用のために既知の技術である「ユニプライマー（ｕｎｉｐｒｉｍｅｒ）」を用いることである。Ｎｕｏｖｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．４７（３）：２７３−８０（１９９９）、引用することにより本明細書に組み込まれる。そのような系においてフォワードプライマーもリバースプライマーも検出可能な標識を含有する必要はない。むしろ、プライマーの一方もしくは両方は、次の回の合成において伸ばされるエネルギー転移標識したヘアピンプライマーのような、標識を含有する第三の化合物の標的である「尾部」を含有する。ユニプライマーは、任意の標的特異的プライマー対と組み合わせて用いるユニバーサルなエネルギー転移標識したプライマーである。標的特異的プライマーは各々５’尾部配列を有し、それは今度は５’末端上にヘアピン構造を有するユニプライマーの３’末端と相同である。ヘアピン構造は、プライマーが溶液中に遊離している場合に発蛍光団および消光剤をごく接近させ、効率のよい消光をもたらす。プライマーが増幅生成物に取り込まれると、ヘアピン構造はほどかれ、そして蛍光シグナルを検出することができる。
【０１０４】
本発明における使用に適当な蛍光成分には、クマリン、フルオレセイン、５−カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）、２’，７’−ジメトキシ−４’，５’−ジクロロ−６−カルボキシフルオレセイン（ＪＯＥ）、ローダミン、６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン（ＲＯＸ）、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−６−カルボキシローダミン（ＴＡＭＲＡ）、５−（２’−アミノエチル）アミノナフタレン−１−スルホン酸（ＥＤＡＮＳ）、テキサスレッド、蛍光グリーンタンパク質および無機化合物が包含されるが、これらに限定されるものではない。本発明における使用に適当な消光剤成分には、４−（４’−ジメチルアミノフェニルアゾ）安息香酸（ＤＡＢＣＹＬ）、アシッドオレンジ（Ａｃｉｄ  Ｏｒａｎｇｅ）１２、アシッドオレンジ６、アシッドレッド（Ａｃｉｄ  Ｒｅｄ）１５１、モルダントブラック（Ｍｏｒｄａｎｔ  Ｂｌａｃｋ）１７、キシリジルブルー（Ｘｙｌｉｄｙｌ  Ｂｌｕｅ）１７およびＭＡＮＡＭＢＳＡが包含されるが、これらに限定されるものではない。これらの蛍光標識は、Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ（Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）およびＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｏｒｇａｎｉｃｓ（Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，ＯＨ）を包含する多数の商業的製造業者から入手することができる。当業者は、最適なもしくは適切な対を選択するために様々な既知の蛍光剤および消光剤をそれらの吸光および発光スペクトルに基づいて混合しそして合わせることができると理解される。標識したｄＮＴＰを用いることによりまたは標識するＤＳ−ＤＮＡにプローブもしくは抗体をハイブリダイズさせることによりＣＰＡ複合体に任意の標識を導入することができる。適当な標識には、放射性、蛍光、化学発光（例えば、ルシフェリンおよびルミノール）、酵素（例えば、ペルオキシダーゼ、グルコシダーゼ、ホスファターゼおよびエステラーゼ）、リガンド、補因子、スピンラベル、磁気、重金属、無機ラジカル、キレート成分、固相（例えば、ラテックスビーズ、ポリスチレンビースおよび金属ゾル）および間接的標識が包含される。間接的標識は、ビオチン、ジゴキシゲニン、配列尾部およびハプテンのような標識物質と直接的もしくは間接的に結合するかもしくは相互作用する物質である。
【０１０５】
蛍光および消光成分以外の相互作用する標識の対もまた用いることができる。相互作用する標識のそのような対には、酵素もしくは酵素フラグメントと基質、補因子、補酵素、阻害剤、活性剤または他のモジュレーターが包含されるが、これらに限定されるものではない。特に不安定な化合物と、近接する場合に異なって相互作用する２つの酵素のある種の組み合わせを用いることができる。標識化および標識の選択は、核酸結合アッセイ、免疫アッセイおよびリガンド／受容体アッセイの当業者に周知である。リガンド／受容体アッセイには、酵素／基質もしくは阻害剤の組み合わせ、細胞受容体／結合リガンド、ホルモン受容体／ホルモンなどが包含される。説明のために、一つのリガンド／受容体アッセイは、甲状腺機能のアッセイとしてのチロキシン受容体へのチロキシン結合もしくはコルチゾール／受容体である。
【０１０６】
本発明の一つの態様として、反応容器を開けることなしに増幅の検出を可能にするために閉管系を用い、それにより汚染の危険を最低限に抑え、そして本発明の自動化を容易にする。Ｔｙａｇｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．１４：３０３−３０９（１９９５）、Ｈｏｌｌａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）８８：７２７６−７２８０（１９９１）、Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２１：３７６１−３７６６（１９９３）、これらの全ては引用することにより本明細書に組み込まれる。閉管系は、分子エネルギー転移機構を都合よく用いることができる。
【０１０７】
本発明の一つの閉管系の下で、全てのプライマー、およびリガーゼを包含する全ての酵素を反応混合物の一部として反応チューブに加える。次に反応チューブを密閉し、そして蛍光発光が測定されるまで再び開かない。この態様の下では、Ｔ４リガーゼのような非耐熱性リガーゼ酵素を用いることが多い。これらのリガーゼ酵素は、約４℃〜約２０℃の温度で作用する。これらの温度で、使用するポリメラーゼ酵素、ＢｓｔＬＦおよび熱安定性ポリメラーゼは、効果的ではないにしても、比較的不活性である。あるいはまた、熱安定性リガーゼ酵素を一つもしくはそれ以上のケージ化ヌクレオチドの存在下で用いることができる。Ｋａｐｌａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．１７（１０）：１９２９−１９３５（１９７８）；ＭｃＣｒａｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）７７（１２）：７２３７−７２４１（１９８０）、これらの両方とも引用することにより本明細書に組み込まれる。典型的には２−ニトロベンジルリン酸誘導体もしくは１−（２−ニトロ）フェニルエチルリン酸誘導体であるケージ化ヌクレオチドは、蛍光シグナルが「ケージ」からヌクレオチドを遊離させるまでＤＮＡポリメラーゼ酵素に利用できない。
【０１０８】
南京錠プローブの対立遺伝子識別の高い特異性および潜在能力は、ＲＣＡタイプの方法論によって増幅されるそれらの能力と一緒に、溶液に基づく単一の（もしくはまれな）標的コピーの固相診断アッセイに本発明により用いられる。ＲＣＡは線形増幅スキームであるので、それは一般にそのような用途に不適当であると考えられる。
【０１０９】
注意深く設計した南京錠プローブは、標的核酸サンプルにおける単一のヌクレオチド変異を識別することができる。そのようなプローブを製造する方法論は既知であり、そして当業者によって設計されることができる。これらのプローブの全潜在能力を利用するために、それらの検出の非常に高感度の方法もまた用いられる。溶液に基づくアッセイに用いる分析技術は、ＣＲＣＡ、ＰＣＲもしくはＣＰＡのような方法によって非常に高いレベルまでプローブを等比級数的に増幅することを含む。
【０１１０】
大部分のＤＮＡリガーゼは、開環プローブとのミスマッチを識別する能力を有する。この能力は、ＣＰＡと組み合わせる場合に、遺伝子タイピング、薬理遺伝学（ｐｈａｒｍｏｇｅｎｅｔｉｃｓ）、特定の点突然変異を検出すること、多型を検出すること、癌細胞におけるようなまれな事象を検出すること、アロタイピング、遺伝病を検出すること、異数性を検出すること、マイクロサテライト変異を検出することおよび感染性微生物もしくは核酸含有組成を検出することを包含する多数の用途を有する。本発明の方法は、標的核酸（ＤＮＡもしくはＲＮＡ）が固相上に固定されるかもしくは溶液中に遊離しているいずれかの様々なサンプルに診断的に用いることができる。
【０１１１】
多種多様な感染症を本発明の方法により検出することができる。典型的に、これらは細菌、ウイルス、寄生虫および真菌感染体によって引き起こされる。薬剤に対する様々な感染体の耐性もまた本発明を用いて決定することができる。
【０１１２】
本発明により検出することができる細菌感染体には、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、シゲラ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、マイコバクテリウム・ツベルクローシス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、マイコバクテリウム・アビウムイントラセルラーレ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｖｉｕｍｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ）、エルジニア（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）、フランシセラ（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ）、パスツレラ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ）、ブルセラ（Ｂｒｕｃｅｌｌａ）、クロストリジア（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ）、ボルデテラ・ペルツッシス（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）、バクテロイデス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）、ストレプトコッカス・ニューモニア（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）、β−溶血性ストレプトコッカス（Ｂ−Ｈｅｍｏｌｙｔｉｃ  ｓｔｒｅｐ．）、コリネバクテリア（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉａ）、レジオネラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ）、マイコプラズマ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）、ウレアプラズマ（Ｕｒｅａｐｌａｓｍａ）、クラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ）、ナイセリア・ゴノロエエ（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｅａ）、ナイセリア・メニンギチデス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ）、ヘモフィルス・インフルエンザ（Ｈｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ）、エンテロコッカス・フェカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ）、プロテウス・ブルガリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｖｕｌｇａｒｉｓ）、プロテウス・ミラビリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｍｉｒａｂｉｌｉｓ）、ヘリコバクター・ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ）、トレポネ−マ・パラジウム（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｐａｌｌａｄｉｕｍ）、ボレリア・ブルグドルフェリ（Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）、ボレリア・リカレンチス（Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｒｅｃｕｒｒｅｎｔｉｓ）、リケッチア病原体（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａｌ  ｐａｔｈｏｇｅｎｓ）、ノカルジア（Ｎｏｃａｒｄｉａ）およびアクチノマイセート（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓ）が包含される。
【０１１３】
本発明により検出することができる真菌感染体には、クリプトコッカス・ネオフォルマンス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ）、ブラストミセス・デルマティティジス（Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｓ  ｄｅｒｍａｔｉｔｉｄｉｓ）、ヒストプラズマ・カプスラタム（Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｍ）、コクシジオイデス・イミチス（Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ  ｉｍｍｉｔｉｓ）、パラコクシジオイデス・ブラジリエンシス（Ｐａｒａｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ  ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）、アスペルギルス・フミガーツス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｕｔｕｓ）、フィコマイセート（Ｐｈｙｃｏｍｙｃｅｔｅｓ）（リゾプス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ））、スポロトリックス・シェンキイ（Ｓｐｏｒｏｔｈｒｉｘ  ｓｃｈｅｎｃｋｉｉ）、クロモミコーシス（Ｃｈｒｏｍｏｍｙｃｏｓｉｓ）およびマズロミコーソス（Ｍａｄｕｒｏｍｙｃｏｓｉｓ）が包含される。
【０１１４】
本発明により検出することができるウイルス感染体には、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ヒトＴ細胞リンパ球向性ウイルス、肝炎ウイルス（例えば、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）およびＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ））、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、ヒト肉腫ウイルス（ＨＳＶ）、オルトミクソウイルス、パラミクソウイルス、アデノウイルス、コロナウイルス、ラブドウイルス、ポリオウイルス、トガウイルス、ブンヤウイルス、アレナウイルス、風疹ウイルスおよびレオウイルスが包含される。
【０１１５】
本発明により検出することができる寄生虫因子には、プラスモジウム・ファルシパルム（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）、プラスモジウム・マラリア（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｍａｌａｒｉａ）、プラスモジウム・ビバックス（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｖｉｖａｘ）、プラスモジウム・オーバル（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｏｖａｌｅ）、オンコセルカ・ボルブレス（Ｏｎｃｈｏｖｅｒｖａ  ｖｏｌｖｕｌｕｓ）、リーシュマニア（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ）、トリパノソーマ種（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｓｐｐ．）、シストソーマ種（Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ  ｓｐｐ．）、エントアメーバ・ヒストリチカ（Ｅｎｔａｍｏｅｂａ  ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ）、クリプトスポリジウム（Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｕｍ）、ジアルジア種（Ｇｉａｒｄｉａ  ｓｐｐ．）、トリコモナス種（Ｔｒｉｃｈｉｍｏｎａｓ  ｓｐｐ．）、バラチジウム・コリ（Ｂａｌａｔｉｄｉｕｍ  ｃｏｌｉ）、ブケレリア・バンクロフト（Ｗｕｃｈｅｒｅｒｉａ  ｂａｎｃｒｏｆｔｉ）、トキソプラズマ種（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ  ｓｐｐ．）、エンテロビウス・ヴェルミクラリス（Ｅｎｔｅｒｏｂｉｕｓ  ｖｅｒｍｉｃｕｌａｒｉｓ）、アスカリス・ルンブリコイデス（Ａｓｃａｒｉｓ  ｌｕｍｂｒｉｃｏｉｄｅｓ）、トリキュリス・トリキウラ（Ｔｒｉｃｈｕｒｉｓ  ｔｒｉｃｈｉｕｒａ）、ドラクンクルス・メジネンシス（Ｄｒａｃｕｎｃｕｌｕｓ  ｍｅｄｉｎｅｓｉｓ）、トレマトーデス（ｔｏｒｅｍａｔｏｄｅｓ）、ジフィロボトリウム・ラツム（Ｄｉｐｈｙｌｌｏｂｏｔｈｒｉｕｍ  ｌａｔｕｍ）、タエニア種（Ｔａｅｎｉａ  ｓｐｐ．）、ニューモシスティス・カリニ（Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ  ｃａｒｉｎｉ）およびネカター・アメリカヌス（Ｎｅｃａｔｏｒ  ａｍｅｒｉｃａｎｉｓ）が包含される。
【０１１６】
本発明はまた、感染体による薬剤耐性の検出にも有用である。例えば、バンコマイシン耐性エンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ）、メチシリン耐性スタフィロコッカス・アウレウス、ペニシリン耐性ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、多剤耐性マイコバクテリウム・ツベルクローシス、およびＡＺＴ耐性ヒト免疫不全ウイルスは全て本発明で同定することができる。
【０１１７】
遺伝病もまた本発明の方法により検出することができる。これは、染色体および遺伝子異常に関するもしくは遺伝病に関する出生前もしくは出生後スクリーニングによって行うことができる。検出可能な遺伝病の例には：２１ヒドロキシラーゼ欠損症、嚢胞性線維症、ぜい弱Ｘ症候群、ターナー症候群、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、ダウン症候群もしくは他のトリソミー、心疾患、単一遺伝子病、ＨＬＡタイピング、フェニルケトン尿症、鎌状赤血球貧血、テイ−サックス病、サラセミア、クラインフェルター症候群、ハンチントン病、自己免疫疾患、リピドーシス、肥満障害（ｏｂｅｓｉｔｙ  ｄｅｆｅｃｔｓ）、血友病、先天性代謝異常、および糖尿病が包含される。
【０１１８】
本発明の方法により検出することができる癌は、一般に、癌遺伝子、癌抑制遺伝子、またはＤＮＡ増幅、複製、組換えもしくは修復に関与する遺伝子を伴う。これらの例には：ＢＲＣＡ１遺伝子、ｐ５３遺伝子、ＡＰＣ遺伝子、Ｈｅｒ２／Ｎｅｕ、Ｂｃｒ／Ａｂ１、Ｋ−ｒａｓ遺伝子、ＲＡＲＡ、ｃ−ｍｙｃおよびＮ−ｍｙｃが包含される。以下の包括的ヒト癌：白血病、結腸癌、乳癌、肺癌、前立腺癌、脳腫瘍、中枢神経系腫瘍、膀胱腫瘍、黒色腫、肝臓癌、骨肉腫および他の骨肉腫、精巣および卵巣癌、頭頸部癌、ならびに頸部新生物における上記の遺伝子の増幅、大きな欠失ならびに点突然変異および小さな欠失／挿入を同定するために本発明の様々な態様を用いることができる。
【０１１９】
いくつかの癌およびいくつかの遺伝病は、塩基メチル化と関連する。Ｅｓｔｅｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｊ．Ｍｅｄ．３４３（１９）：１３５０−１３５４（２０００），Ｈｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）９３：９８２１−９８２６（１９９６），Ｈｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）９１：９７００−９７０４（１９９４），Ｍｅｒｌｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１：６８６−６９２（１９９５），Ｈｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５６：７２２−７２７（１９９６），Ｇｒａｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５５：５１９５−５１９９（１９９５），Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ，Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ  ＆  Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ  ６：４４３−４５０（１９９７）、これらの全ては引用することにより本明細書に組み込まれる。本発明は、これらの遺伝子突然変異を検出することができる。この態様の下で、全てのメチル化されていないシトシンをウラシルに転化する重亜硫酸ナトリウムのような化学薬品で標的核酸分子を処理する。次に、これらの塩基変異を検出することができるプライマーを用いる。
【０１２０】
環境モニタリングの分野において、本発明は、地方自治体の排水精製系および貯水池おけるもしくはバイオリメディエーションを受けている汚染地域におけるような自然および人工的に作り出された生態系および微小生態系における病原性および常在微生物の検出、同定およびモニタリングに用いることができる。生体異物を代謝することができる遺伝子を含有するプラスミドを検出すること、人口動態研究における特定の標的微生物をモニターすること、または環境におけるおよび工場における遺伝子的に改変された微生物を検出、同定もしくはモニターすることもまた可能である。
【０１２１】
本発明はまた、軍人および犯罪捜査の人間同定、父子鑑定および家族関係分析、ＨＬＡ適合性タイピング、ならびに血液、精子もしくは移植臓器を汚染に関してスクリーニングすることを包含する様々な法医学分野において用いることもできる。
【０１２２】
農業において、本発明は多種多様な用途を有する。例えば、ビール、ワイン、チーズ、ヨーグルト、パンなどの製造のための酵母のような生産生物体の同定および特性化に用いることができる。用途の別の領域は、汚染物質に関する製品およびプロセス（例えば、家畜、滅菌、および食肉加工）の品質管理および保証に関する。他の用途には、育種目的の植物、球根および種子の特性化、植物特異的病原体の存在の同定、ならびに家畜感染の検出および同定が包含される。
【０１２３】
培養することができないかもしくは培養するのが難しい生物体さえ本発明により検出することができる。さらに、生物体を培養する必要なしに治療薬感受性を決定することができる。これは、ＨＩＶ、ＨＣＶ、ＨＰＶ、ＨＳＶ、ＣＭＶ、結核、ハンセン病、クラミジア、他の培養するのが難しい微生物、ならびに多種多様な真核生物および多細胞寄生虫に特に有用である。これらの生物体のいくつかは、細胞内もしくは細胞上で単一コピーのみとして存在することができる。
【０１２４】
以下の実施例は例示のために提供され、そして本発明を限定するものではない。
【実施例】
【０１２５】
実施例Ｉ
オリゴヌクレオチドおよび標的ＤＮＡｓ：５’リン酸基を含有する南京錠プローブを標準的なホスホラミダイト化学により化学的に合成し、そして尿素を含有する変性ポリアクリルアミドゲル上で精製した。実施例の全てに用いるプローブは、位置２７６−３１１でクラミジア・トラコマチス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）血液型亜型Ｌ１（Ｈａｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１６（９）：４０５３−６７（１９８８）、引用することにより本明細書に組み込まれる）の潜在性プラスミドに対する標的アームを有する、８９ｍｅｒ（５’ＰＯ４−ｇｃｔｔｇｃａｃｇａａｇｔａｃｔｃｔｇｇｔｔｃｔｇａｃｔｃｇｔｃａｔｇｔｃｔｃａｇｃｔｃｔａｇｔａｃｇｃｔｇａｔｃｔｔａｇｔｇｔｃａｇｇａｔａｃｇｇｔａａａｔｇａａｔｃａａａｇｃ−３’ＯＨ（配列番号：１））であった。プローブのライゲーション連結部は、位置２９６でＨｉｎＰ１制限エンドヌクレアーゼ部位内に位置する。
【０１２６】
クラミジア研究の標的ＤＮＡは、標的ＤＮＡの５’末端から２７０塩基に位置するプローブライゲーション連結部を有する、クラミジア・トラコマチス血液型亜型Ｌ１の潜在性プラスミド配列を含有するプラスミドベクターから生成されるＰＣＲ生成物（６７７ｂｐ）であった。ＰＣＲ生成物は、２０ｍｅｒのフォワードプライマー（５’−ｇｔｃｔｔｔｇｃｇｃａｃａｇａｃｇａｔｃ−３’（配列番号：２））および２１ｍｅｒのリバースプライマー（５’−ｃｇｃｃｃｇｃａｃｇｔｔｃｔｃｔｃａａｇｃ−３’（配列番号：３））を用いて製造した。増幅は、変性工程（９５℃で５分）、続いて７２℃で５分の最終伸長工程を有する３０ＰＣＲサイクル（９４℃で３０秒；５５℃で１分；７２℃で３分）で行った。標的ＤＮＡは、０．５μｇ／ｍｌの臭化エチジウムを含有する１％アガロースにおけるゲル電気泳動後にＬｏｗ  ＤＮＡ  Ｍａｓｓ  Ｌａｄｄｅｒ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）に対して定量し、そして分光光度測定によって確かめた。ＰＣＲプライマーは、エシェリキア・コリエキソヌクレアーゼＩで３７℃で１５分間の処理によって取り除き、続いてエキソヌクレアーゼを不活性化するために８０℃でインキュベーションした。
【０１２７】
ＣＲＣＡ、ＰＣＲおよびＣＰＡ実施例において連結した南京錠プローブの増幅に同じ２７ｍｅｒのフォワードプライマーを用いた（５’−ａｃｔａｇａｇｃｔｇａｇａｃａｔｇａｃｇａｇｔｃａｇａ−３’（配列番号：３））。上記のプライマーの全てを５’−ＯＨで化学的に合成し、そして脱塩することを除いてさらに精製せずに用いた。全ての実施例において連結した南京錠プローブの増幅に用いるリバースプライマー（３６ｍｅｒ）は、エネルギー転移プライマー（５’Ｆ−ａｔｃａｇｃａｃｃｃｔｇｇｃｔｇａｔ（ｄ）ｃｔｔａｇｔｇｔｃａｇｇａｔａｃｇｇ−３’（配列番号：４））であり、５’末端にフルオレセイン（Ｆ）そして内部のＴ残基にＤＡＢＳＹＬ（Ｄ）を含有するように化学的に合成し、そしてＨＰＬＣにより精製した。下線を引いた塩基は、プライマーの結合部位を構成する。
【０１２８】
ライゲーション反応：変性した標的ＤＮＡに南京錠プローブをハイブリダイズさせ、そして熱安定性ＤＮＡリガーゼでの処理により環状化した。２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ  ７．６）；２５ｍＭ酢酸カリウム；１０ｍＭ酢酸マグネシウム；１．０ｍＭ  ＮＡＤ；１０ｍＭ  ＤＴＴ（ジチオスレイトール）、０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００；１００ｍＭ南京錠プローブおよび５００ｎＭクラミジア標的ＤＮＡを含有する３０μｌの反応混合物に４０ユニットのＴａｑＴＭ  ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を加えた。標的ＤＮＡを変性させる９５℃で２分間の最初のインキュベーションの後、ライゲーションを９５℃で１分間の変性ならびに５０℃で４分間のプローブアニーリングおよびライゲーションの８サイクルの間に行った。連結したプローブ生成物の検出は、ライゲーション反応の希釈物をＣＲＣＡ、ＰＣＲもしくはＣＰＡに供することによりモニターした（以下参照）。コントロール反応物は、ＴａｑＴＭ  ＤＮＡリガーゼを省くことを除いて上記のように調製した。
【０１２９】
ＣＲＣＡによる南京錠プローブの検出：ライゲーション反応の連続希釈物のアリコート（１μｌ）を、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ  ８．８）；１０ｍＭ  ＫＣｌ；１０ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４；２ｍＭ  ＭｇＳＯ４、０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００；２００ｍＭ  ｄＮＴＰｓ；５００ｎＭフォワードおよびリバースプライマー；ならびに４ユニットのＢｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼ（ラージフラグメント）（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を含有する反応混合物（２５μｌ）に加えた。連続希釈物は、１０６、１０５、１０４、１０３、１０２、１０１の連結したプローブ分子の概算数をもたらした。反応は、経時的に蛍光の増加をモニターするためにＰｒｉｓｍＴＭ  ７７００配列検出システム（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ）を用いて行った。６３℃で５０回の２分間隔にわたるインキュベーション中に、フルオレセイン／ＤＡＢＳＹＬエネルギー対を含有するリバースプライマーがＣＲＣＡ生成物に取り込まれるにつれて蛍光が増加するのをモニターするために各間隔の後に温度を５０℃に１５秒間下げた。図３は、この反応で測定される経時的な蛍光の変化の概略図を与える。
【０１３０】
ＰＣＲによる南京錠プローブの検出：ライゲーション反応の連続希釈物のアリコート（１μｌ）を、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ  ８．８）；１０ｍＭ  ＫＣｌ；１０ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４；２ｍＭ  ＭｇＳＯ４、０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００；２００μＭ  ｄＮＴＰｓ；５００ｎＭフォワードおよびリバースプライマー；ならびに２．５ユニットのＤｅｅｐ  ＶｅｎｔＴＭポリメラーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）もしくは１．２５ユニットのＰｌａｔｉｎｕｍ  ＴａｑＴＭポリメラーゼ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）のいずれかを含有するＰＣＲ反応混合物（２５μｌ）に直接加えた。連続希釈物は、１０６、１０５、１０４、１０３、１０２、１０１の連結したプローブ分子の概算数をもたらした。ＰｒｉｓｍＴＭ  ７７００における最初の加熱工程（６３℃で２０分）の後、９４℃に２分間加熱することによりＤＮＡを変性させた。これはＰｌａｔｉｎｕｍ  ＴａｑＴＭを活性化し、一方、Ｄｅｅｐ  ＶｅｎｔＴＭポリメラーゼはすでに活性である。この後に４０ＰＣＲサイクル（９４℃で１５秒；６０℃で１分）を続けた。蛍光は、６０℃の工程中にモニターした。生成物の品質を調べるために、アリコート（２μｌ）を上記のようにアガロースゲル上で分析した。図４Ａおよび図５Ａは、それぞれ、Ｄｅｅｐ  ＶｅｎｔＴＭおよびＰｌａｔｉｎｕｍ  ＴａｑＴＭでの反応で測定される経時的な蛍光の変化の概略図を与える。
【０１３１】
ＣＰＡによる南京錠プローブの検出：反応条件は、４ユニットのＢｓｔＬＦを反応混合物に含みそしてフォワードプライマーを位置６および１５でニトロインドールを含むように改変したことを除いて、ＰＣＲの上記のものと同一であった。ＢｓｔＬＦポリメラーゼは、６３℃での最初のインキュベーションの後に温度を９４℃に上げると不活性化され、Ｐｌａｔｉｎｕｍ  ＴａｑＴＭは同時に活性化される。上記のように蛍光をモニターし、そして生成物を分析した。図４Ｂおよび図５Ｂは、それぞれ、Ｄｅｅｐ  ＶｅｎｔＴＭおよびＰｌａｔｉｎｕｍ  ＴａｑＴＭでの反応で測定される経時的な蛍光の変化の概略図を与える。
【０１３２】
これらの結果により示されるように、ＣＰＡはＰＣＲもしくはＣＲＣＡより速く検出可能なシグナルを与えるだけでなく、ＣＰＡはまたＰＣＲもしくはＣＲＣＡを用いてバックグラウンドを超えて検出可能ではない核酸分子のわずかな量の検出も可能にする。
実施例ＩＩ
オリゴヌクレオチドおよび標的ＤＮＡｓ：５’リン酸基を含有する以下の南京錠プローブを標準的なホスホルアミダイト化学により化学的に合成し、そして尿素を含有する変性ポリアクリルアミドゲル上で精製した：
５’ＰＯ４−ｃｃｔｇｃａｔｇｃａｃｔｇｇａｔｇｃａｃｔｔｃｔｇａｃｔｃｇｔｃａｔｇｔｃｔｃａｇｃｔｃｔａｇｔａｃｇｃｔｇａｔｃｔｔａｇｔｇｔｃａｇｇａｔａｃｇｇｃｔｇｇｔｇｃａａｔａｇｇｃ−３’ＯＨ、これは、ＨＩＶのｇａｇ遺伝子に対する８８ｍｅｒである；
５’ＰＯ４−ｃｇｇｔｔｃｔｇｃｔｔｇｔｃｃａｇｃｔｔｇｃｇａｃｔｃｇｔｃａｔｇｔｃｔｇａａｃｔｃｔａｇｔａｃｇｃｔｇａｔｃｔｔａｇｔｇｔｃａｇｇａｔａｃｇｇｇｔａａｔｇｇｇｃｔｃｔｇｔｃ−３’ＯＨ、これは、ＨＰＶのＥ７遺伝子に対する８７ｍｅｒである；
５’ＰＯ４−ｔｃｇｔａｔｇａｇｔａｇａａｇｇｔｇａｇｔｔｃｔｇａｃｔｃｇｔｃａｔｇｔｃｔｃａｇｃｔｃｔａｇｔａｃｇｃｔｇａｔｃｔｔａｇｔｇｔｃａｇｇａｔａｃｇｇａｇｔｔｃａｔｃａｇｔｔ−３’ＯＨ、これは、クリプトスポリジウム・パルバムに対する８６ｍｅｒである；
５’ＰＯ４−ｃｃａａｇｇａｇｃａｇａｇｇａｇｇｔｔｃｔｇａｃｔｃｇｔｃａｔｇｔｃｔｃａｇｃｔｃｔａｇｔａｃｇｃｔｇａｔｃｔｔａｇｔｇｔｃａｇｇａｔａｃｇｇａｇｇｔｔａｇｇｔｇａａｇｇａ−３’ＯＨ、これは、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ乳癌遺伝子に対する８６ｍｅｒである；
５’ＰＯ４−ｃｃａａｃｃａｃｔｃｔｔｃｔａｔｔｃｔｇａｃｔｃｇｔｃａｔｇｔｃｔｃａｇｃｔｃｔａｇｔａｃｇｃｔｇａｔｃｔｔａｇｔｇｔｃａｇｇａｔａｃｇｇｔａｃｔａａａｔｃａｃａａｃａ−３’ＯＨ、これは、ＧｓｔＰｉ遺伝子のメチル化されていないバージョンを検出するために設計した８４ｍｅｒである（前立腺癌のマーカー遺伝子におけるメチル化状態をモニターするため）；および
５’ＰＯ４−ｃｃｇａｃｃｇｃｔｃｔｔｃｔａｔｔｃｔｇａｃｔｃｇｔｃａｔｇｔｃｔｃａｇｃｔｃｔａｇｔａｃｇｃｔｇａｔｃｔｔａｇｔｇｔｃａｇｇａｔａｃｇｇｔａｃｔａａａｔｃａｃｇａｃｇ−３’ＯＨ、これは、ＧｓｔＰｉ遺伝子のメチル化されたバージョンを検出するために設計した８４ｍｅｒである（前立腺癌のマーカー遺伝子におけるメチル化状態をモニターするため）。
【０１３３】
上記に特定する配列の各々の下線を引いた配列は、南京錠プローブ分子の標的相補的領域を示す。２つの標的相補的領域間のスペーサー領域は、ＨＰＶ南京錠プローブ分子を除いて南京錠プローブ分子の全てで同じである。その南京錠プローブ分子は、バックグラウンド増幅を減らすことが見出されているスペーサー領域におけるいくつかの変異を含有する。
【０１３４】
本明細書に引用する全ての参考文献、特許および特許出願は、引用することによりそれらの全部が組み込まれる。
【０１３５】
本発明の他の態様は、本明細書に開示する本発明の明細および実施の考察から当業者に明らかである。明細および実施例は例としてのみ考えられ、本発明の真の範囲および精神は以下の請求項によって示されるものとする。
【図面の簡単な説明】
【０１３６】
本明細書に組み込まれそしてその一部を構成する添付の図面は、本発明の様々な態様および／もしくは特徴を例示し、そして本発明の記述と一緒に、本発明の原理を説明するのに役立つ。
【図１】図１Ａは、標的核酸分子にアニールする南京錠プローブの概略図を与える。図１Ｂは、閉環状核酸分子を形成するように連結されている南京錠プローブの概略図を与える。
【図２】図２Ａはローリングサークル増幅の概略図を与え、図２Ｂはカスケードローリングサークル増幅の概略図を与え、そして図２Ｃはカスケードローリングサークル増幅からの生成物のポリメラーゼ連鎖反応増幅の概略図を与える。
【図３】図３は、異なる濃度の南京錠プローブのカスケードローリングサークル増幅で経時的に測定される蛍光シグナルの変化の実例を与える。
【図４】図４Ａは、Ｄｅｅｐ  ＶｅｎｔＴＭポリメラーゼを用いる異なる濃度の南京錠プローブのポリメラーゼ連鎖反応増幅で経時的に測定される蛍光シグナルの変化の実例を与える。図４Ｂは、Ｄｅｅｐ  ＶｅｎｔＴＭポリメラーゼおよびＢｓｔＬＦを用いる異なる濃度の南京錠プローブの環状プローブ増幅で経時的に測定される蛍光シグナルの変化の実例を与える。
【図５】図５Ａは、Ｐｌａｔｉｎｕｍ  ＴａｑＴＭを用いる異なる濃度の南京錠プローブのポリメラーゼ連鎖反応増幅で経時的に測定される蛍光シグナルの変化の実例を与える。図５Ｂは、Ｐｌａｔｉｎｕｍ  ＴａｑＴＭ  ＤＮＡポリメラーゼおよびＢｓｔＬＦを用いる異なる濃度の南京錠プローブの環状プローブ増幅で経時的に測定される蛍光シグナルの変化の実例を与える。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004526442.tif 000059
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004526442.tif 000060
【国際調査報告】
2004526442.tif 000061
2004526442.tif 000062
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