(57)【要約】アルツハイマー病、パーキンソン病及びレヴィ小体病は、高齢者において最も一般的に見られる神経変性障害である。本発明は、上記の疾患において見られる、神経炎プラーク、レヴィ小体及び神経変性の形成を引き起こす二つの導入遺伝子、ヒトα−シヌクレイン及びヒトアミロイド前駆体タンパク質を含む遺伝子組換えマウスである。この遺伝子組換えマウスは、機能的及び病理学的アッセイの両者による、疾患の正確なモデルである。
2004538013.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下を包含する遺伝子組換えマウス：
前記マウスのゲノムに組み込まれ、第一のプロモータに作動可能なように結合されたヒトアミロイドの前駆タンパク質（ｈＡＰＰ）をコードする、第一の遺伝子組換えヌクレオチド配列；及び
前記マウスのゲノムに組み込まれ、第二のプロモータに作動可能なように結合されたヒト（ｈ）α−シヌクレインをコードする、第二の遺伝子組換えヌクレオチド配列；
第一及び第二の遺伝子組換えヌクレオチド配列が発現され、前記発現の結果、前記遺伝子組換えマウスが神経変性疾患を発生させている。
【請求項２】
前記第一のプロモータが、場合によりシミアンウイルス（ＳＶ）４０イントロン、Ｔｈｙ−１プロモータまたはプリオン（Ｐｒｐ）プロモータに作動可能なように結合された、血小板由来の増殖因子β（ＰＤＧＦ−β）プロモータを含んでなる、請求項１の遺伝子組換えマウス。
【請求項３】
前記第二のプロモータが、場合によりＳＶ４０イントロン、Ｔｈｙ−１プロモータまたはＰｒｐプロモータに作動可能なように結合された、ＰＤＧＦ−βプロモータを含んでなる、請求項１の遺伝子組換えマウス。
【請求項４】
同一種の非遺伝子組換えマウスに比べて、第一及び第二の遺伝子組換えヌクレオチド配列によりコードされたタンパク質が過剰発現する、請求項１の遺伝子組換えマウス。
【請求項５】
ｈＡＰＰのヌクレオチド配列が、ｈＡＰＰのエクソン６〜９の間のイントロンを含み、ｈＡＰＰ７７０、ｈＡＰＰ７５１またはｈＡＰＰ６９５をコードしている、請求項１の遺伝子組換えマウス。
【請求項６】
ｈＡＰＰが、アミノ酸（ａａ）６７０でのリジンからアスパラギンへの変更及びａａ６７１でのメチオニンからロイシンへの変更を含む二重変異、またはバリンからフェニルアラニンもしくはイソロイシンへの変更を含むａａ７１７での単一変異を含んでなる変異型ｈＡＰＰである、請求項１の遺伝子組換えマウス。
【請求項７】
ｈＡＰＰをコードしているヌクレオチド配列が、Ａβ１−４２を含んでなるＡＰＰの部分のみをコードしている、請求項１の遺伝子組換えマウス。
【請求項８】
α−シヌクレインのヌクレオチド配列がα−シヌクレインのコード配列を含んでなる、請求項１の遺伝子組換えマウス。
【請求項９】
ｈα−シヌクレインが、アラニンからプロリンへのａａ３０での変更またはアラニンからスレオニンへのａａ５３での変更を含むタンパク質をコードする変異型ｈα−シヌクレインｃＤＮＡを含んでなる変異型ｈα−シヌクレインである、請求項１の遺伝子組換えマウス。
【請求項１０】
以下を包含する遺伝子組換えマウス：
前記マウスのゲノムに組み込まれ、シミアンウイルス（ＳＶ）４０イントロンに作動可能なように結合された血小板由来の増殖因子β（ＰＤＧＦ−β）プロモータに作動可能なように結合されたヒトアミロイドの前駆タンパク質（ｈＡＰＰ）をコードする、第一の遺伝子組換えヌクレオチド配列；
前記マウスのゲノムに組み込まれ、ＳＶ４０イントロンに作動可能なように結合されたＰＤＧＦ−βプロモータに作動可能なように結合されたヒト（ｈ）α−シヌクレインをコードする、第二の遺伝子組換えヌクレオチド配列；
第一及び第二の遺伝子組換えヌクレオチド配列が発現され、前記発現の結果、前記遺伝子組換えマウスに神経変性疾患が発生する。
【請求項１１】
同一種の非遺伝子組換えマウスに比べて、第一及び第二の遺伝子組換えヌクレオチド配列によりコードされたタンパク質が過剰発現されている、請求項１０の遺伝子組換えマウス。
【請求項１２】
ｈＡＰＰがエクソン６〜９の間のイントロンを含むコード配列を含んでなる、請求項１０の遺伝子組換えマウス。
【請求項１３】
ｈＡＰＰが、アミノ酸７１７でのバリンからイソロイシンへの変異を含む、請求項１０の遺伝子組換えマウス。
【請求項１４】
ｈα−シヌクレインがｈα−シヌクレインのコード配列を含んでなる、請求項１０の遺伝子組換えマウス。
【請求項１５】
神経変性疾患が、レヴィ小体病に特有のニューロン内封入体の生成を含んでなる、請求項１０の遺伝子組換えマウス。
【請求項１６】
神経変性疾患が、繊維性レヴィ小体様封入体の生成、ニューロンの死または（及び？）運動欠陥の発生を含んでなる、請求項１０の遺伝子組換えマウス。
【請求項１７】
遺伝子組換えマウスに、治療的介入の投薬を含んでなる、神経疾患の予防または治療のための治療剤のスクリーニング方法であって、以下を包含する：
前記マウスのゲノムに組み込まれ、第一のプロモータに作動可能なように結合されたヒトアミロイドの前駆タンパク質（ｈＡＰＰ）をコードする、第一の遺伝子組換えヌクレオチド配列；
前記マウスのゲノムに組み込まれ、第二のプロモータに作動可能なように結合されたヒト（ｈ）α−シヌクレインをコードする、第二の遺伝子組換えヌクレオチド配列；
第一及び第二の遺伝子組換えヌクレオチド配列が発現され、前記発現の結果、前記遺伝子組換えマウスが神経変性疾患を発生させる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、神経変性疾患の研究において使用される遺伝子組換えマウスに関する。
【０００２】
（政府の利害）
本発明は、助成金番号ＡＧ１０８６９の下に、国立保健研究所からの政府援助でなされた。
【背景技術】
【０００３】
（背景）
アルツハイマー病（ＡＤ）、パーキンソン病（ＰＤ）及びレヴィ小体病（ＬＢＤ）は、高齢者において最も一般的に見られる神経変性障害である。それらの発生は増大し続け、重大な社会的な健康問題を引き起こしているが、今までのところこれらの病気は治癒も予防もできない。これらの疾患に対する遺伝要素はあるが、大部分の場合、突然変異なしで集団中で自然発生的に生じる。神経損傷は、脳で正常に発現したタンパク質からなるタンパク質凝集体の発生に起因する。本来は非毒性のタンパク質を、何がそれらの毒性状態へと変換させるのかは知られていない。
【０００４】
近年の疫学的研究によれば、アルツハイマー病患者の約３０％はＰＤをも有するとして、ＡＤとＰＤとの密接な臨床的関係が証明されている。他の高齢集団と比べて、ＡＤ患者は大概、合併ＰＤを発生させている。さらに痴呆になったＰＤ患者は、通常古典的なＡＤを発生させている。
【０００５】
各々の神経変性疾患は、特定の脳領域及び細胞集団に偏りを有するらしく、明確な病理像をもたらすが、ＰＤ、ＡＤ及びＬＢＤはまた、共通の特徴を共有する。家族性ＡＤ、ダウン症候群及び散発性ＡＤの患者は、ＰＤの典型的な神経病理学的特徴である、扁桃体上にレヴィ小体を増殖させる。さらに各々の疾患は、ニューロンの変性、ニューロン内のシナプス結合及び最終的には細胞死、神経伝達物質の減少、ならびにその前駆体は正常な中枢神経系機能に関与する異常折り畳み構造の蛋白質の異常な蓄積に関連する。
【０００６】
生化学的研究から、ＡＤ、ＰＤ及びＬＢＤ間の関連性が確認されている。レヴィ小体の中心成分は、ＮＡＣＰ（非アミロイド成分前駆体）としても知られている、α−シヌクレインである。ＮＡＣとして知られている、ＮＡＣＰのタンパク質分解性フラグメントは、ＡＤにおけるアミロイドプラークの重要な構成要素である。このことは、α−シヌクレインがＡＤとＰＤの両方の病因にある役割を果たしていることを示唆している。
【０００７】
これらの知見は、レヴィ小体病（ＬＢＤ）と呼ばれる神経変性障害の新規な分類の進展に導いた。ＬＢＤ患者は、痴呆、パーキンソン症候群、精神変化、アミロイドの沈着、線維状特徴を有するレヴィ小体（ＬＢ）の形成で特徴付けられる。ＬＢはＰＤ及びＬＢＤの病態の特徴である。ＡＤのある面を模倣するいくつかの動物モデル及びＰＤのある面を模倣する他の動物モデルが存在するが、ＬＢＤで見られるような、ＡＤとＰＤの特徴を組み合わせたモデルは存在しない。
【０００８】
ＡＤの典型的な病態の特徴である神経炎プラークは、主として、アルツハイマーアミロイド前駆タンパク質（ＡＰＰ）の３９〜４３アミノ酸（ａａ）タンパク質分解性生成物であるＡβ、及びＮＡＣＰタンパク質の３５ａａタンパク質分解性フラグメントであるＮＡＣで構成されている。ＡβとＮＡＣの両者は、完全長ｃＤＮＡが同定されクローン化されている、それらの完全長タンパク質のタンパク質分解性フラグメントとしてアミロイドプラーク中で最初に同定された。ＡＰＰのクローン化（Ｋａｎｇら、１９８７年）は、結果として研究の急増につながり、その中でＡＤにおける多数の変異が見出されており、Ｋ６７０Ｎ／Ｍ６７１Ｌ（スウェーデン変異）、Ｖ７１７Ｉ（ロンドン変異）、Ｖ７１７Ｆ（インディアナ変異）、プレセニリン１及びプレシニリン２を含む家族性型が関連付けられた。（注記：変異は、野生型アミノ酸、変異が見出されたアミノ酸の番号、及びタンパク質の変異型において見出されたアミノ酸で示される）。これらの変異は、ＡＰＰのプロセッシングを、病原性を有する凝集体を形成する傾向があるＡβ１−４２タンパク質分解性フラグメント優先へと変更すると思われる。しかしながら、そのような変異では、病気が自然発生的に生じる大部分のアルツハイマー患者を説明することはできない。
【０００９】
ＡＰＰは正常な状態でシナプスにおいて多く発現され、種を超えてよく保存されており、神経の柔軟性、学習、及び記憶に関係している。ＡＰＰは、完全長転写物から、エクソン７及び８（ｈＡＰＰ６９５）、エクソン８（ｈＡＰＰ７５１）または無エクソン（ｈＡＰＰ７７０）がスプライシングされた、３種の代替スプライシング変異型を有する。３種の型の比率は、脳の領域の間及び正常状態と病気の状態で異なるが、正常と異常の明確なパターンは決定されていない（Ｒｏｃｋｅｎｓｔｅｉｎら、１９９５年）。転写物の異なるスプライシングを調整するものが何であるかは知られていないが、証拠は、ニューロン中でのスプライシングはニューロンの分化及び活性に影響を及ぼす因子によって調整され得ることを示唆している。さらに、ＡＰＰは正常な状態で、タンパク質分解性フラグメントＡβ３９−４３にプロセッシングされる。疾患は、タンパク質分解性フラグメント、特に凝集体（すなわち、Ａβ１−４２）の形成を開始できるものの過剰産生に偏った、フラグメントの産生におけるアンバランスに起因する。
【００１０】
α−シヌクレインは、β−及びγ−シヌクレインならびにシノレチンを含む大きなファミリーのタンパク質の一部である。ＡＰＰと同様、α−シヌクレインは正常状態でシナプスで発現され、神経の柔軟性、学習、及び記憶においてある役割を果たすと考えられている。α−シヌクレインの凝集を促進する、ヒト（ｈ）α−シヌクレインにおける変異が同定されており（Ａ３０Ｐ及びＡ５３Ｔ）、そしてそれらはＰＤの常染色体の優性形の希少形に関係している。これらの変異が、α−シヌクレインの凝集する傾向を増大させるメカニズムは知られていない。
【００１１】
集団中に多数の変異をＡＰＰ及びα−シヌクレインに見出すことができるという事実にも拘わらず、ＡＤ及びＰＤの多くのケースは自然発生的に生じる。これらの病気のうち最も多い散発性型は、それぞれ、Ａβ及びα−シヌクレインの異常蓄積に関係している。しかしながら、これらタンパク質の過剰蓄積の理由は知られていない。Ａβはニューロンから分泌され、細胞外アミロイドプラーク中に蓄積する。さらに、Ａβはニューロン内部で検出される。α−シヌクレインは、レヴィ小体と呼ばれるニューロン内の封入体中に蓄積する。この二種のタンパク質は典型的には共に細胞外神経ＡＤプラーク中で見出されるが、それらはまた時々細胞内封入体中で一緒に見出される。
【００１２】
無毒性前駆体タンパク質の、それらのタンパク質分解性生成物へのプロセシングは、組織培養系中と精製タンパク質を用いての両方において、解析するために研究が行われている。α−シヌクレインの過剰発現により、凝集体が神経細胞培養において形成されうる。野生型ＡＰＰの過剰発現は、培養において細胞外タンパク質凝集体の形成を引き起こさないが、ＡＰＰ変異の最も病原性のものであるスウェーデン変異の過剰発現は引き起こす。凝集体はまた、α−シヌクレインを過剰発現している細胞中で、細胞培養における酸化的ストレスに対応して形成され、それが病気の発生において重要であることを示唆している。さらに、精製Ａβ及びＮＡＣペプチドは、単独であるいは混合されて、同一の温度及びｐＨ条件下で、生体外で凝集体を形成することができる。
【００１３】
ＡＤ、ＰＤ及びＬＢＤの動物モデルを構築する試みは期待はずれであった。当初は、遺伝子組換えＡＰＰを発現する動物は、広範なＡＤ型神経病態を示さなかった（Ｋａｍｍｅｓｈｅｉｄｔら、１９９２年；Ｌａｍｂら、１９９３年；Ｍｕｃｋｅら、１９９４年；Ｈｉｇｇｉｎｓら、１９９５年；Ａｎｄｒａａら、１９９６年）。これはおそらく、タンパク質の発現が低レベルであることが原因だろう。Ｇａｍｅｓら（１９９５年）は、ＰＤＧＦ−βプロモータで駆動される変異型ＡＰＰ（Ｖ７１７Ｆ）が高レベルで発現するため、あるＡＤ型病態を示す遺伝子組換えマウスを作成することができた。遺伝子組換え動物は、海馬、脳梁及び大脳皮質でのヒトＡβの沈着を示したが、脳の他の領域では示さなかった。プラークは観察されたが、神経原線維変化はなかった。著者は、神経原線維変化は齧歯動物には存在しないので、そのような結果が予想されたと述べた。
【００１４】
Ｔｈｙ１発現カセットの制御下で、スウェーデン型二重変異（６７０／６７１）、またはロンドン変異（Ｖ７１７Ｉ）と結合したスウェーデン型変異を発現する、遺伝子組換えマウスも作成された（Ｓｔｕｒｃｈｌｅｒ−Ｐｉｅｒｒａｔら、１９９７年）。プラークの発生する年齢は、各々のマウス種において、６ヶ月から２年以上の間で変動し、タンパク質の発現レベルによく相関しているようだった。スウェーデン型及びインディアナ型変異の両方を有する動物において、病気に関連する病理的変化を誘起するには、より低い発現レベルが必要だった。しかしながらいずれの動物も、病気を完全かつ正確には現さなかった。神経変化、ジストロフィーのコリン作動性線維及び炎症を伴うプラーク形成が海馬及び新皮質で観察されたが、他の脳領域では観察されなかった。ＰｒＰ−プロモータ下でＡＰＰのスウェーデン型変異を発現する遺伝子組換えマウスを用いた別の研究において（Ｈｓｉａｏら、１９９６年）、マウスは３ヶ月において正常な学習と記憶を有することが見出されたが、９ヶ月または１０ヶ月までに障害が現れた。プラークは、これらの遺伝子組換えマウスにおいて皮質及び辺縁系領域で観察され、Ａβ１−４２/４３の１４倍の増加が観察された。
【００１５】
Ａβ１−４２はＡＤにおける強い原因因子の一つであることが知られているので、Ｍｕｃｋｅら（２０００年）は、ＡＰＰの毒性フラグメント、Ａβ１−４２のみを発現する遺伝子組換えマウスを作成した。Ａβ１−４２フラグメントの発現は細胞毒であったが、プラークは形成されず、ＡＤの進行におけるＡβ１−４２に対するプラーク非依存的な役割を示唆している。
【００１６】
さらに、ＡＰＰを発現する遺伝子組換え動物は、学習欠損、障害のある挙動及び発作を含む種々の神経異常を示すことが見出された。再び、神経の機能不全の重篤さは、ＡＰＰタンパク質の発現レベルと結びついているように思われた。相違は、また、プロモータ、ゲノムへの統合等における相違による、ＡＰＰが発現される脳の領域に帰することができる。生理的な症状と同様に、これらの動物における神経機能不全は、ＡＤ、ＰＤ及びＬＢＤにおいてみられるそれらのある面で、ただしすべてではないが、類似していた。この病気に対する動物モデルがないことは、明らかに努力不足のためではなく、むしろ病気の状態において生じるすべての変化を誘起ことができないためである。
【００１７】
遺伝子組換え配列の発現効果は、また、変異遺伝子が発現されるマウスの系統に大きく依存した。例えば、異系交配遺伝子組換え系統においてプラークを産生するＡＰＰの濃度は、近交系のＦＶＢ／ＮまたはＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスにおいて致命的であることが見出された（Ｃａｒｌｓｏｎら、１９９７年）。生存可能な十分低いレベルのＡＰＰ６９５を発現するＦＶＢ／Ｎマウスの系統は、主に大脳におけるグルコース利用の減少及び星状細胞増加症と共に、新奇恐怖症、損傷された空間的交互変化を含むＣＮＳ障害を発生させることが見出された（Ｈｓｉａｏら、１９９５年）。同様の症候群が同一の種の非遺伝子組換えマウスの約２０％で発生することが知られており、ＡＰＰがその系統の中にすでに存在する傾向を促進することを示唆している。
【００１８】
遺伝子組換えマウスの系統を交配して病気の症状を変化させることにより、ＡＤのより正確なモデルを発生させる試みがなされた。ＡＰＰを過剰発現する遺伝子組換えマウスにおける線維芽細胞増殖因子２遺伝子（ＦＧＦ２）の過剰発現は、ＡＰＰをより致命的なものとするが、見られる症状を変えることはない。Ｈｏｌｔｚｍａｎら（２０００年）は、ＡＰＰのＶ７１７Ｆ変異型を発現する遺伝子組換えマウスと種々の形のアポリポタンパク質Ｅ（アポＥ）を発現するマウスとを交配することによって、多数の二遺伝子マウスを発生させた。アポＥのε４対立遺伝子は、散発性ＡＤ及び遅発型家族性ＡＤ（ＦＡＤ）に対して同定された最初の遺伝的危険因子であった（Ｓｔｒｉｔｔｍａｔｔｅｒら、１９９３年）。その後、アポＥのε３対立遺伝子は、その疾患に対するより弱い危険因子であることが見出された。マウスにおけるＡＰＰのＶ７１７Ｆ変異型バージョンと共に、アポＥ変異型、特にε４対立遺伝子の発現は、細線維沈着、神経プラーク及び神経変性の発生を増大させた。ＡＤの同様の病態的特徴は、ＡＰＰのＶ７１７Ｆ変異型のみを発現するマウスにおいて、単純に老齢期に観察された。導入遺伝子の発現の組み合わせは、病気の観察された病態を変化させることはなく、単純に病態が観察される時間枠を変化させた。アポＥノックアウトマウスにおけるＡＰＰのＶ７１７Ｆ変異型バージョンの発現は、神経変性をもたらさなかった。この研究は、ＡＤの病態におけるアポＥの明確な役割を示しているが、一重の遺伝子組換えマウスよりもより正確なその病気のモデルは提供しなかった。
【００１９】
ＰＤＧＦβプロモータの制御下でα−シヌクレインを発現する遺伝子組換えマウスはまた、ＰＤ及びＬＢＤのモデルとして使用されるために生み出されている（Ｍａｓｌｉａｈら、２０００年）。α−シヌクレインのニューロンでの発現は、α−シヌクレインの進行性の蓄積及び新皮質、海馬及び黒質におけるニューロン中の封入の発生をもたらした。さらに、電子が密な核内沈着及び細胞質内封入が観察された。そのマウスは、基底核中のドーパミン作用性の末端欠損に関連する運動障害を示した。しかしながら、アミロイドプラーク、線維変化または細胞死は観察されなかった。
【００２０】
多数のα−シヌクレイン遺伝子組換えマウスが、同様に、生成されている。しかし、α−シヌクレインの野生型及び変異型（Ａ３０Ｐ及びＡ５３Ｔ）の両方の使用はもとより、異なるプロモータ（例えば、ＰＤＧＦβ、Ｔｈｙ−１）も使用したにもかかわらず、どのマウスもＰＤの完全に的確なモデルをもたらさない。種々のＡＰＰ遺伝子組換えマウスと同じく、使用したプロモータとゲノムへの導入遺伝子の挿入部位に依存して、タンパク質の発現量及び発現位置に相違が見られた。例えば、ｈα−シヌクレイン導入遺伝子からの発現がＰＤＧＦβプロモータにより駆動された場合には、ｈα−シヌクレインの発現パターンは、正常な脳または広汎性ＬＢＤにおいて見られるものと最も酷似していた。Ｔｈｙ−１プロモータを用いたｈα−シヌクレインの発現は、ＰＤにおいて見られる発現パターンに最も酷似したパターンで、導入遺伝子のより高い発現をもたらした。より高い発現は、より重篤な病態をもたらした。ｈα−シヌクレインの変異型バージョンを発現するマウスは、タンパク質の野生型バージョンを発現するものよりも早く病気の特徴を明らかに示した。さらに、神経機能不全は、タンパク質が発現される脳の領域に依存する。
【００２１】
病気の状態は、しばしば、単一タンパク質または遺伝子内の単一変異の発現レベルにおける変化よりもむしろ、生物における多重変化の結果である。上記の遺伝子組換え動物の各々はＡＤ、ＰＤ及び／またはＬＢＤのある特徴を有しているが、それらはいずれもどの病気についても完全なモデルを与えることはできなかった。単一の動物で、ＡＤの典型的な指標である神経原線維変化を有するものは見出されなかった。ＡＤ、ＰＤ及びＬＢＤの病態と発生が重複していることを認識すると、病気の病態及び臨床的徴候のより完全なセットを示す動物モデルの必要性が強調される。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００２２】
（発明の要約）
本発明は、ヒトβ−アミロイドペプチドまたはｈＡＰＰ及びｈα−シヌクレインの発現用導入遺伝子を有する遺伝子組換えマウスモデルである。導入遺伝子は、遺伝子の野生型、変異型または切断型でありうる。導入遺伝子は、ＰＤＧＦ−β、Ｔｈｙ１及びプリオン（ＰｒＰ）プロモータを含む多数のプロモータのいずれかの下で、発現されうる。ＳＶ４０イントロンのようなイントロンは、導入遺伝子構築物またはプロモータに含まれていてもよく、Ｔｈｙ１プロモータの場合のように、プロモータのイントロンを用いてもよい。
【００２３】
本発明のマウスは、α−シヌクレインまたはｈＡＰＰに対する単一遺伝子を有するマウスの交配によって生成される。出願人は、ｈα−シヌクレインを過剰発現する遺伝子組換えマウス系統（Ｍａｓｌｉａｈら、２０００年）及び野生型または変異型のいずれかのｈＡＰＰ（Ｍｕｃｋｅら、２０００年）を多数生成して、ＡＤ、ＰＤ及びＬＢＤにおけるアミロイド生成の生体内メカニズムを解明している。さらに、参照されるように、入手可能な多数の他のｈＡＰＰ遺伝子組換えマウスが存在する。入手可能なマウスには、マウスまたはヒトＴｈｙ１プロモータの制御下でＡＰＰを発現するもの（Ａｎｄｒａａら、１９９６年）、ＳＶ４０イントロンを有するまたは有しないＰＤＧＦ−βプロモータ（Ｇａｍｅｓら、１９９５年）、及びＰｒＰ（Ｂｏｒｃｈｅｌｔら、１９９６年；Ｈｓｉａら、１９９９年）プロモータが含まれる。それらマウスはよく研究され、導入遺伝子が発現される脳の領域及び時間枠について特徴が明らかにされている。二遺伝子マウスは、所望によりＡＤ、ＰＤまたはＬＢＤによって最も達成される脳の領域においてｈＡＰＰまたはｈα−シヌクレインのいずれかを過剰発現する２頭のマウスを交配することにより、容易に生成することができる。理想的には、交配されたマウスは、両方の導入遺伝子を発現する、どちらかの導入遺伝子を発現する、またはいずれの導入遺伝子をも発現しない同腹子を互いに比較できるように、導入遺伝子のただ一つのコピーを有する必要がある。導入遺伝子の過剰発現は、それらに限定されるものではないが、リボヌクレアーゼ保護アッセイ（ＲＰＡ），ウエスタンブロット、免疫蛍光法、または他の分析法を含む当業者に周知の多数の方法のいずれかによって、検出することができ、そこにおいて、得られるシグナルは、非遺伝子組換え同腹子で見出されるマウスＲＮＡまたはタンパク質とのバックグラウンド交差反応性を超えるものである。
【００２４】
本発明の二遺伝子ＰＤＧＦ−β−α−シヌクレイン−ＰＤＧＦ−β−ｈＡＰＰマウスは、年齢及び脳領域特異的な形で形態的にＡＤにおいて見られる老年性プラークに類似の、細胞外アミロイドーシス及び神経原線維変化を示すことに加えて、適正にＡβフラグメントにプロセッシングされたＡＰＰを発現することが示されている。ｈα−シヌクレインの発現が、ｈＡＰＰの発現を変えるようにはみえなかった。しかし、単一のｈα−シヌクレインマウスに比べて、二遺伝子マウスにおいてｈα−シヌクレインの広範な蓄積が存在した。
【００２５】
ＰＤＧＦ−β−α−シヌクレイン−ＰＤＧＦ−β−ｈＡＰＰ二遺伝子マウスにおける機能的及び形態的な変化は、ＡＤのレヴィ小体変異型に似ていた。二遺伝子マウスは、生理的かつ病理的特徴を生み出し、そして単一遺伝子組換えマウスに比べて、ヒトの病気状態により酷似して、運動機能を低下させた。両方の遺伝子の発現の組み合わせの効果は、相乗的である。それ以前には齧歯動物では観察されなかったがＰＤ及びＬＢＤの標準的な特徴である、線維α−シヌクレイン封入体の発生が見られた。シナプスの変性が単一遺伝子組換えマウスの両方で観察されていたが、二遺伝子マウスでは見られた、ニューロン細胞の死は観察されていなかった。二遺伝子マウスは、学習及び記憶において重篤な欠損を有し、運動欠損症が生じたとしても軽微なものを示すのみであるＰＤＧＦ−β−α−シヌクレイン単一遺伝子組換えマウスより先に、運動欠陥が発生した。運動欠陥の発症は、ＰＤＧＦ−β−ｈＡＰＰマウスで典型的に見られる１２ヶ月ではなくて、二遺伝子マウスでは６ヶ月で始まった。二遺伝子マウスは、単一遺伝子組換え同腹子または非遺伝子組換え同腹子に比べて、コリン作動性ニューロン及びシナプス前末端の最も顕著な年齢依存性変性を示した。シナプス変性は単一遺伝子組換えマウスにおいて観察されたが、ニューロン細胞死は単一遺伝子組換え同腹子では観察されなかった。ｈＡＰＰ−α−シヌクレインマウスは同じく、大量のβ−アミロイドプラークを有し、そしてむしろより多数のα−シヌクレイン−免疫反応性ニューロン封入体を有した。超微細構造的に、これらの封入体は、しばしば、二重遺伝子組換えマウスにおいて線維状であるが、単一遺伝子組換えα−シヌクレインマウスでは不定形であった。これは、以前には、齧歯動物には存在しないと考えられていた線維状レヴィ小体様封入体の存在の最初の実証である。
【００２６】
さらに、本発明は、α−シヌクレインとＡＰＰとの組み合わせの、アミロイド生成及び神経変性に対する生体内での効果を評価する方法である。病気の発生及び進行におけるタンパク質の効果の評価は、機能的、病理的、または生化学的アッセイにより、理想的には、α−シヌクレインまたはｈＡＰＰのいずれかに対する単一の導入遺伝子のみを有するかあるいは導入遺伝子を有しない同腹子と比較して、評価しうる。二遺伝子α−シヌクレイン−ｈＡＰＰマウスでの研究は、ｈα−シヌクレイン及びｈＡＰＰ／Ａβが脳の統合性及び機能に対して明確な、そして重複する病原性の効果を有することを示している。ｈα−シヌクレインは脳におけるＡβ依存性の神経プラークの発生または全体としてのＡβ含有量に影響を与えないが、特定の脳の領域において、ｈＡＰＰ／Ａβ依存性の認識欠如及び神経変性を悪化させる。これらの知見は、ｈα−シヌクレインがプラーク非依存性メカニズムを通してＡβの毒性を増強できることを示している。それらは、ＡＤのレヴィ小体変異を持つ人々は、純粋なＡＤを持つ人々よりも、急激な認知減退を有することが示唆される、臨床所見とよく相関している。ｈＡＰＰ／Ａβの過剰発現は、今度は、遺伝子組換えマウスにおいてｈα−シヌクレインのニューロン内蓄積を促進し、運動欠陥の発生を加速した。Ａβとｈα−シヌクレインとの間のこれら病原性相互作用の観点から、Ａβまたはｈα−シヌクレインの蓄積を阻止することを目的とする医薬は、以前に予期されていたよりも広いスペクトルの神経変性障害に利益をもたらすことになるであろう。さらに、二遺伝子マウスは患者に対して有用である介入の可能性についてのよりよい予見モデルを提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２７】
（詳細な説明及び好ましい態様）
α−シヌクレインまたはＡＰＰの変化した発現及びプロセッシングがＡＤ、ＰＤ及びＬＢＤのような神経変性障害をもたらすメカニズムは多少不明のままである。異常なタンパク質凝集がこれらの障害における共通の特徴であり、そして完全長α−シヌクレインまたはそのタンパク質フラグメントのいずれか及びＡβがこれらのタンパク質凝集体の主な成分であることが一般に理解されている。多くの病的状態において、多重変化が完全な病状の発生に必要である。ＡＰＰまたはα−シヌクレインのいずれかに単一の変異を持つ動物モデルは、ＡＤ、ＰＤまたはＬＢＤの正確なモデルをもたらしていない。しかしながら、二遺伝子ＰＤＧＦ−β−α−シヌクレイン−ＰＤＧＦ−β−ｈＡＰＰマウスは、単一遺伝子組換え動物のいずれにおいても以前には観察されなかったこれらの病気の特徴を示す。両方のタンパク質を発現することによって、病気の正確なモデルが得られる。異なるレベルの各々のタンパク質を発現するマウスの使用により、病気の発生及び重篤度の割合が異なる種々のモデルを得ることができる。これらは、ヒトにおいて見られる差異の模倣であろう。
【００２８】
ｈＡＰＰまたはα−シヌクレインを発現する遺伝子組換えマウスは、低発現系統及び高発現系統の二つの一般的カテゴリーに分けることができる。この分類はさらに変異タンパク質よりも低毒性である野生型タンパク質を発現するマウスに再分割できる。例えば、ＡＰＰを発現するすべてのマウスは、最終的には、いくらかのプラークといくらかの病気を発生するだろう。しかしながら、プラークの発生及び生じる病気の速度は、ａａ６７０／６７１でのスウェーデン二重変異を発現するマウスで最も速いだろう。ａａ７１７での単一変異でのｈＡＰＰの発現は、年齢が合致した動物においてより少ないプラークで病気をもたらすであろう。同様に、異なる変異及びプロモータは、α−シヌクレイン遺伝子組換えマウスにおいて病気の種々の重篤度を示すことになろう。Ｔｈｙ−１プロモータの制御下でｈα−シヌクレインを発現するマウスは、視床、基底核、黒質及び脳幹を含む、脳全体にシナプス及びニューロン中にタンパク質を蓄積する。ＰＤＧＦ−βの制御下でα−シヌクレインを発現するマウスの１系統は、神経皮質のより深い層中のニューロンの封入体中と同様に、新皮質、辺縁系及び嗅覚部におけるシナプス中にタンパク質を蓄積する。他の系統は、多重系萎縮を模倣して、グリア細胞中でのα−シヌクレイン発現を示した。
【００２９】
単一遺伝子組換えマウスにおいて見られなかった病態を生じさせるべくタンパク質が相乗的に働くためには、同一の脳領域でそれらのタンパク質を発現させるマウスの系統を番にする必要がある。Ａβ１−４２の産生は、明らかに、二遺伝子マウスにおけるＬＢＤ様状態の発生における駆動力である。ｈＡＰＰの発現は、ｈα−シヌクレインの蓄積を増大させる。それはまた、病気の重篤度を増し、そしてｈα−シヌクレイン遺伝子組換えマウスにおいて早い年齢での病気の発症をもたらす。明白な病気を持たないｈα−シヌクレイン遺伝子組換えマウスは、ＡＰＰのアミロイド生成バージョンを発現する遺伝子組換えマウスと交配すると、病気を発生させる。明白な病気を持たないｈα−シヌクレインマウスとｈＡＰＰの非アミロイド生成バージョンを発現する遺伝子組換えマウスとの交配は、病気の発生プロセスを悪化させない。ＡＤ、ＰＤ及びＬＢＤの自然発生形は、相対的に緩慢な発症を有し、低レベルの変異タンパク質発現を示唆しているので、有意な病気を示さない二つの系統の交配だけでは、ヒトでしばしば見られる病気の自然発生的発症に対するモデルを提供しない。同様に、α−シヌクレインよりも早期にＡＰＰを発現する遺伝子組換え動物は、後で痴呆になるＡＤ患者を模倣する。両方のタンパク質を低レベルで発現する遺伝子組換え動物は、ＡＤ、ＰＤ及びＬＢＤでは遅い、それらの病気の自然発生的発症を模倣する。発現の脳領域はまた、特定の遺伝子組換え系統を交配するという動機を与える。例えば、ＬＢＤにおいて最も重篤にもたらされる脳の領域においてｈＡＰＰとｈα−シヌクレインを発現するマウスは、ＬＢＤに対するモデルを与えるために交配させることができた。
【００３０】
存在する遺伝子組換えマウスは、タンパク質発現のレベルと脳領域、症状の発生する年齢、神経障害及びバックグラウンド系統の効果等の基準に基づいて選択される。多数の表現型をもたらすことができるマウス胚に構築物を挿入することにより発生させられた遺伝子組換えマウスとは異なり、本発明のマウスは、周知の特徴を持つマウスの組み合わせによって生み出された二遺伝子マウスである。モデルは、上で列挙した中の基準に基づいて、対象の病気に最もよく適合するようにデザインされる。一つのタンパク質の発現は、他の発現によって妨害されない。ｈＡＰＰの共発現によるα−シヌクレインの病態の悪化は知られていない。当業者は、対象の病気の状態を最も近く模倣する二遺伝子系統を作成するために、マウスの既知系統の組み合わせにおいて合理的な決定をなしうる。
【実施例１】
【００３１】
遺伝子組換えα−シヌクレイン及びｈＡＰＰマウスの創出。遺伝子組換えマウスは、Ｌｅｄｅｒらに発行された米国特許第４，７３６，８６６号に記載され、Ｂ．Ｈｏｇａｎら（１９８６年）によって提供された、マイクロインジェクション法を用いて、当業界で日常的に作製されている。Ｊｏｌｉｃｏｅｕｒに発行された米国特許第５，５７４，２０６号では特に、機能的ＨＩＶ遺伝子を有する遺伝子組換えマウスの作成及びＨＩＶ介在疾病のモデリング及び研究におけるそれらの使用が記載されている。これらの文献は、ここに引用して援用する。
【実施例２】
【００３２】
ｈα−シヌクレイン及びｈＡＰＰの生体内での共発現。ｈα−シヌクレイン（Ｍａｓｌｉａｈら、２０００年）またはＦＡＤ−変異ｈＡＰＰ（Ｍｕｃｋｅら、２０００年）のニューロン発現がＰＤＧＦβ鎖プロモータにより導かれる遺伝子組換えマウスは記載されている。さらに、本出願に記載のものを含めて多数の他のＡＰＰマウスが記載されているが、それらに限定されるものではない。高レベルのニューロン性ｈα−シヌクレイン（系統Ｄ）またはＡβ（系統Ｊ９）産生系統が選択された。これらの系統からの異型接合ｈα−シヌクレインと異型接合ｈＡＰＰマウスの間での交配は、４群の同腹子：ｈα−シヌクレインマウス（ｎ＝２６）、ｈＡＰＰマウス（ｎ＝３２）、ｈα−シヌクレイン／ｈＡＰＰマウス（ｎ＝２１）、及び非遺伝子組換え対照（ｎ＝３１）を与えた。脳での導入遺伝子由来のｍＲＮＡのレベルは、単一遺伝子組換えマウス及び二重遺伝子組換えマウスにおいて同様であり、ｈα−シヌクレイン及びｈＡＰＰの共発現は導入遺伝子発現を変えないことを示した（図２）。タンパク質レベルにおいて、ｈα−シヌクレインの発現は、二重遺伝子組換えマウスでのｈＡＰＰ発現に影響を与えなかった。しかしながら、脳のｈα−シヌクレインレベルは、ｈα−シヌクレインマウスよりもｈα−シヌクレイン／ｈＡＰＰマウスにおいてより高い傾向があり、Ａβのｈα−シヌクレイン蓄積への効果を反映していると思われる。
【実施例３】
【００３３】
二遺伝子マウスにおけるヒトα−シヌクレインの過剰発現はアルツハイマー病様の神経病態を悪化させる。α−シヌクレインとＮＡＣの両方はアルツハイマー病の生体外モデルにおいて形成されるプラークの統合成分であることが立証されている。これらの分子が生体内で、特にＰＤＡＰＰ二遺伝子マウスモデルで、アミロイド生成にどのように寄与しているかを確定するために、得られた二遺伝子マウスからの脳切片をギ酸で処理し、α−シヌクレイン及びＮＡＣに対する抗体で免疫染色した。結果の解析から、アルツハイマー病の生体外モデルとして、ＰＤＡＰＰ二遺伝子マウスにおいて、ＮＡＣがアミロイドコアに存在し、一方α−シヌクレインはジストロフィーの神経突起で見出されることが確認される。さらに、α−シヌクレインを過剰発現するＰＤＡＰＰ二遺伝子マウスの神経病理学的検討から、アミロイド沈着の増加を伴う新皮質及び海馬における広範囲にわたる星状グリオーシスが解明され、α−シヌクレインの発現増加がアミロイド生成に関連する神経変性状態の病原性に重要な役割を果たすことが再度確認された。したがって、α−シヌクレインは生体内プラーク形成にきわめて重要であり、それ自体で、アルツハイマー病及びアミロイド生成を含んでいる他の神経変性状態の生体内治療に有用な抗アミロイド生成化合物の設計に対する合理的なターゲットを構成することが、最終的に実証された。
【実施例４】
【００３４】
ｈα−シヌクレイン／ｈＡＰＰマウスにおける神経欠損。運動欠陥は回転棒試験で評価された（図１）。以前の観察と一致して、ｈα−シヌクレインマウスは年齢依存性運動欠陥を生じた。月齢６ヶ月で、ｈα−シヌクレイン／ｈＡＰＰマウスは既に非遺伝子組換え対照に対して欠損を示したが（反復測定ＡＮＯＶＡによると、Ｐ＜０．０３）、ｈα−シヌクレインマウスは依然として正常に実行した。月齢１２ヶ月で、ｈα−シヌクレインマウスとｈα−シヌクレイン／ｈＡＰＰマウスの両方が、非遺伝子組換え対照（反復測定ＡＮＯＶＡによると、Ｐ＜０．００１）に比較して、この試験で欠損を示した。ｈＡＰＰマウスは、いずれの年齢でも、有意な運動欠陥を有しなかった。運動欠陥の重篤度は、６月齢のｈα−シヌクレイン／ｈＡＰＰマウスと１２月齢のｈα−シヌクレインマウス及びｈα−シヌクレイン／ｈＡＰＰマウスで同様であり、ｈＡＰＰ／Ａβがｈα−シヌクレイン依存性運動欠陥の発生を促進することを示唆している。
【００３５】
ＰＤＧＦ−ｈＡＰＰマウスは、以前から認知欠損を発生することが示されている。ｈα−シヌクレイン及びｈＡＰＰ／Ａβの空間学習及び記憶に対する効果を確定するために、マウスを水迷路試験（Ｍｏｒｒｉｓ、１９８４年）で評価した。目標のプラットフォームが目に見えるセッションでは、すべての群のマウスは等しくうまくプラットフォームを探し出すことができ、ｈα−シヌクレイン／ｈＡＰＰの運動欠陥は、水迷路試験において正常な動作を妨げないことを示していた。プラットフォームが隠されたセッションでは、マウスは、迷路外の見える手掛かりとプラットフォームとの空間的関係の記憶を用い、沈んだプラットフォームを探し出さなければならない。これらのセッションでは、ｈα−シヌクレイン／ｈＡＰＰマウスは、最も有意な学習欠損を示し、一方、ｈα−シヌクレインマウスと非遺伝子組換え対照は正常に実行した。ｈＡＰＰマウスは、隠されたプラットフォームのセッションで、ｈα−シヌクレイン／ｈＡＰＰマウスよりも良好に実行する傾向があったが、その差は、統計的に有意ではなかった。その間にプラットフォームを移動する精査試験は、空間記憶保持力の推定尺度を提供する。精査試験では、ｈα−シヌクレイン／ｈＡＰＰマウス及びｈＡＰＰマウスは、非遺伝子組換え対照よりも目的の象限への有意により少ない実行を示して記憶保持力の障害を示唆したが、一方、ｈα−シヌクレインマウスに障害性はなかった。
【００３６】
これらの結果は、ｈα−シヌクレイン／ｈＡＰＰマウスの運動欠陥は主にｈα−シヌクレインにより引き起こされるが、空間学習及び記憶における欠損は、主にｈＡＰＰ／Ａβにより引き起こされることを示している。ｈα−シヌクレイン及びｈＡＰＰの同様の効果は、同じく運動欠陥及び認知欠損が組み合わさった、レヴィ小体病の原因となるだろう。
【実施例５】
【００３７】
年齢依存性神経変性。マイネルト基底核におけるコリン作動性ニューロンの変性は、齧歯動物における水迷路試験での重大な獲得欠損をもたらす。それはまた、ＡＤ及びレヴィ小体病における認知減退の潜在的に重要な決定因子である。コリンアセチルトランスフェラーゼ（ＣｈＡＴ）は、アセチルコリンの合成に介在し、コリン作動性ニューロンのマーカーとして役立つ。遺伝子組換えモデル（ｎ＝１２〜１３頭／遺伝子型、月齢範囲：４〜２０ヶ月）の基底核中のＣｈＡＴ免疫反応性ニューロンの密度を測定した。ｈα−シヌクレイン／ｈＡＰＰマウスでは、単純な回帰分析から、加齢とコリン作動性ニューロンの数との間の高い有意な逆相関関係が見出された（Ｒ＝０．８２８、Ｐ＝０．０００５）。そのような相関関係への傾向は、ｈα−シヌクレインマウス（Ｒ＝０．５３８、Ｐ＝０．０７１）及びｈＡＰＰマウス（Ｒ＝０．５１１、Ｐ＝０．０８９）においても存在するが、非遺伝子組換え対照（Ｒ＝０．１２７、Ｐ＝０．６９５）においては存在しない。コリン作動性ニューロンの最大の損失は、ｈα−シヌクレイン／ｈＡＰＰマウスにおいて観察され、その一方では、より穏やかな損失が加齢ｈＡＰＰマウスで見出された。これらの結果は、コリン作動性欠損はＡＤのレヴィ小体変異型を持つヒトの場合に、純粋なＡＤを持つ場合よりも重篤であるという所見と一致する。ｈα−シヌクレイン／ｈＡＰＰマウス及びｈＡＰＰマウスは同様に、尾状核／被殻でのコリン作動性ニューロンの有意な損失を有し、これはレヴィ小体を持つまたは持たないＡＤ患者の尾状核でのＣｈＡＴ活性の減少と一致する。
【００３８】
ＡＤまたはＡＤのレヴィ小体変異型を持つ人々は、典型的に新皮質中の有意なシナプス損失をも生じ、それがシナプトフィシンの免疫反応性の低下に反映する。４〜２０ヶ月齢のマウス（ｎ＝１５〜１９／遺伝子型）の新皮質中の、定められたシグナル強度のシナプトフィシン免疫活性シナプス前終末（ＳＩＰＴ）を測定した。ｈＡＰＰマウス（Ｒ＝０．７４４、Ｐ＝０．０００６）及びｈα−シヌクレイン／ｈＡＰＰマウス（Ｒ＝０．５２４、Ｐ＝０．０２１）において、加齢と新皮質ＳＩＰＴレベルとの間に有意な逆相関関係があったが、ｈα−シヌクレインマウス（Ｒ＝０．４７９、Ｐ＝０．０７１）または非遺伝子組換え対照（Ｒ＝０．１５１、Ｐ＝０．５６４）においてはなかった。月齢２０ヶ月では、新皮質におけるＳＩＰＴレベル（占有面積％、平均±ＳＤ、ｎ＝３〜４頭／遺伝子型）は、非遺伝子組換え対照（２５．６±０．９）において最も高く、ｈα−シヌクレイン／ｈＡＰＰマウス（１８．３±４．８、チューキー・クレーマー検定でｐ＜０．０５）において最も低く、ｈＡＰＰマウス（２０．９±１．７）及びｈα−シヌクレインマウス（２３±０．９）に対する値は中間に位置した。対照的に、尾部／被殻でのＳＩＰＴレベルは、２０ヶ月齢（平均±ＳＤ、ｎ＝３〜４頭／遺伝子型）では、非遺伝子組換えマウス（２７．１±１．５）及びｈＡＰＰマウス（２５．１±３．６）において正常であるが、ｈα−シヌクレインマウス（２１．０±０．９）及びｈα−シヌクレイン／ｈＡＰＰマウス（２０．１±１．７）（チューキー・クレーマー検定で非遺伝子組換え対照に対してＰ＜０．０５）において減少した。
【００３９】
これらの結果は、ｈα−シヌクレイン／ｈＡＰＰマウスにおけるコリン作動性ニューロンの年齢依存性の損失は、基底核においていくつかの付加的効果を有するｈα−シヌクレインと共に、主にｈＡＰＰ／Ａβに依存することを示唆している。これらのマウスの新皮質でのＳＩＰＴの年齢依存性の損失は、ｈα−シヌクレインの少しの寄与と共に、主としてｈＡＰＰ／Ａβにもよるものであるのに対して、基底核におけるＳＩＰＴの損失は、ほとんど全くｈα−シヌクレインによるものである。
【実施例６】
【００４０】
Ａβはｈα−シヌクレインの蓄積を助長する。ニューロン内でのｈα−シヌクレインの蓄積は、ＡＤのレヴィ小体変異型を含む、レヴィ小体病の特徴である。ｈα−シヌクレイン単一遺伝子組換えマウスのニューロン中におけるｈα−シヌクレインの年齢依存性蓄積は、既に観察されている（Ｍａｓｌｉａｈ、２０００年）。月齢４〜２０ヶ月の間で、新皮質中でのニューロンの封入体の数は、ｈα−シヌクレイン／ｈＡＰＰマウスにおいて、年齢が合致するｈα−シヌクレインマウスよりも平均して１．６倍高かった（ｍｍ２あたり１５．３±１．１対９．５±０．９、平均±ＳＥＭ、不対両側スチューデントｔ検定でＰ＝０．０００２、ｎ＝２８〜３２頭／遺伝子型）。これは１２月齢のマウスで例証される。封入体の数は、ｈα−シヌクレインマウス及びｈα−シヌクレイン／ｈＡＰＰマウスの両方で加齢と共に増加した。これらの結果は、ｈＡＰＰ／Ａβがニューロンでのｈα−シヌクレインの蓄積を促進することを示している。
【００４１】
超構造解析により、ｈα−シヌクレインマウスにおけるすべてのニューロン内封入体は非晶質で電子稠密なのに対し、ｈα−シヌクレイン／ｈＡＰＰにおけるニューロン内封入体の多くは線維状で、典型的に線維状要素を含むヒトの病気でのレヴィ小体との類似性が増していた。ニューロン細胞質中の線維状の封入体は、ｈα−シヌクレイン／ｈＡＰＰマウスの脳切片が抗ｈα−シヌクレインまたは抗Ａβを用いた免疫金電子顕微鏡による分析において、金粒子で装飾された。これらの結果は、Ａβが直接的な相互作用によって、ｈα−シヌクレインの生体内線維化を促進することを示唆している。さらに、この可能性を支持して、Ａβ−免疫反応性顆粒状沈着物が、ｈα−シヌクレイン／ｈＡＰＰマウスにおけるｈα−シヌクレイン−陽性ニューロン内封入体中で共焦点顕微鏡分析により検出された。
【００４２】
ｈα−シヌクレイン／ｈＡＰＰマウスにおいて観察された変化が本当にＡβとｈα−シヌクレインとの間の病原性相互作用から生じたものであるかどうかをさらに評価するために、生体内分析を二つの生体外モデルに拡張した。無細胞系では、新たに溶解した場合と想定される凝集した（加齢）場合の両方のヒトＡβ１−４２が、以前の観察と一致して、ｈα−シヌクレインの高分子量ポリマーの生成を強く促進した。対照的に、より線維質の少ないＡβ１−４０はｈα−シヌクレインの生体外での凝集に影響を及ぼさなかった。明らかに、Ａβ１−４２とＡβ１−４０はまた、培養培地に加えたときに、ニューロンの細胞培養において、α−シヌクレインの細胞内蓄積に対するそれらの効果が異なっていた。Ａβ１−４２はα−シヌクレインの細胞内蓄積を強く増大させたが、Ａβ１−４０は増大させなかった。
【００４３】
小胞体及び中間コンパートメント内でのＡβ１−４２の過剰産生は、その蓄積を促進するｈα−シヌクレインのプロセッシングを妨害しうる。しかしながら、細胞培養データは、Ａβ１−４２への細胞外暴露は、ｈα−シヌクレインの細胞内蓄積を誘起するのに十分なのに対し、Ａβ１−４０への暴露はそうではないことを示している。この意味において、細胞の細胞外Ａβ１−４２へのインキュベーションは、リソソーム膜の完全性を乱すのに対し、Ａβ１−４０への細胞のインキュベーションではそうならないことは興味深い。また、溶解性ｈα−シヌクレインと平面状脂質二重層との会合は、広範な二重層の崩壊をもたらす。Ａβ１−４２とｈα−シヌクレインとの組み合わせ作用は、エンドソーム−リソソーム膜の漏れを招き、細胞基質でのＡβ１−４２とｈα−シヌクレインとの間での直接的な相互作用を可能にする。そのような相互作用は、ｈα−シヌクレインの細胞内蓄積を促進する。Ａβ１−４２のｈα−シヌクレインに対するこの効果には、おそらく、これらの分子間の直接的な線維質相互作用で、あるいはフリーラジカルによって仲介される。Ａβは酸化的ストレスを与え、研究により、ｈα−シヌクレインの酸化的架橋がレヴィ小体の形成に寄与することを示された（Ｈａｓｈｉｍｏｔｏら、１９９９年；Ｌｅｅら、２０００年）。
【００４４】
ｈα−シヌクレイン−関連病態におけるｈＡＰＰ／Ａβの顕著な効果とは対照的に、ｈα−シヌクレイン発現は、Ａβからプラークへの細胞外沈着、あるいは８−、１２−及び２０−月齢のｈα−シヌクレイン／ｈＡＰＰマウスにおけるプラーク関連神経突起ジストロフィーの発生を、年齢が合致したｈＡＰＰマウス（１遺伝型及び月齢あたり、ｎ＝３〜４頭）と比べて有意には変えなかった。１２月齢のｈＡＰＰ及びｈα−シヌクレイン／ｈＡＰＰマウスは、ＥＬＩＳＡ（ｍｇ／ｇ脳半球、平均±ＳＤ，ｎ＝４〜１１頭／遺伝子型）により測定では、類似の大脳レベルのＡβ１−４０（４．３±０．８８対４．６±０．６）及びＡβ１−４２（２４８±４８対２７５±４１）を有していた。
【実施例７】
【００４５】
脳半球からあるいは切開した脳領域からの全ＲＮＡを単離し、その後、溶液ハイブリダイゼーションＲＮアーゼ保護アッセイで分析し、そしてアクリルアミド／尿素／トリス／ホウ酸塩／ＥＤＴＡゲル上で分離した（図２）。レーンＵは、α−シヌクレイン遺伝子（α−ｓｙｎ）、Ａβ前駆体遺伝子（ＡＰＰ）及びアクチン（ａｃｔｉｎ）の未消化転写物を表す。図の右手側の注記は、消化試料のサイズを示す。試料レーンは、３つの別々のマウスの分析を表し、それぞれ、非Ｔｇ、非遺伝子組換えマウス（すなわち、対照）；Ｔｈｙ１−ｈＡＰＰｔｇ、マウス（ｍ）Ｔｈｙ−１遺伝子の調節制御下でヒト（ｈ）ＡＰＰ７５１ｃＤＮＡを発現する遺伝子組換えマウス；Ｔｈｙ１−α−ｓｙｎ’ｔｇ、マウス（ｍ）Ｔｈｙ−１遺伝子の調節制御下でヒトα−シヌクレインを発現する遺伝子組換えマウス；ならびに二重ｔｇ、マウス（ｍ）Ｔｈｙ−１遺伝子の調節制御下でヒト（ｈ）ＡＰＰ７５１及びα−シヌクレイン遺伝子の両方を含む遺伝子組換えマウスである。
【実施例８】
【００４６】
ｈα−シヌクレインまたはＰＤＡＰＰ−Ｊ９Ｍｔｇマウスとｍα−またはｍβ−シヌクレインＫＯマウスとの交雑育種。二遺伝子マウスにおいてα−シヌクレインの欠失がＡβ沈着の抑制をもたらす一方、β−シヌクレインの欠失がＡβ沈着を刺激することをさらに確認するために、α−シヌクレインまたはβ−シヌクレインの欠失をコードする遺伝子を有するノックアウト（ＫＯ）マウス（Ｌｅｘｉｃｏｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｉｎｃ．，Ｔｈｅ  Ｗｏｏｄｌａｎｄｓ，テキサス州）を異型接合ＰＤＡＰＰ−Ｊ９Ｍｔｇマウスと交配した。以下の系統が作成された：１）（ＰＤＡＰＰ−／−；ｍα−ｓｙｎ＋／＋）、２）（ＰＤＡＰＰ−／−；ｍα−ｓｙｎ＋／−）、３）（ＰＤＡＰＰ＋／−；ｍα−ｓｙｎ＋／＋）、４）（ＰＤＡＰＰ＋／−；ｍα−ｓｙｎ＋／−）、及び５）（ＰＤＡＰＰ−／−；ｍα−ｓｙｎ−／−）。マウス遺伝子型は末端ＤＮＡを用いてＰＣＲにより決定した。続いて、その（ＰＤＡＰＰ＋／−；ｍα−ｓｙｎ＋／−）を交雑させ、以下の子孫を産出した：１）（ＰＤＡＰＰ＋／＋；ｍα−ｓｙｎ＋／＋）、２）（ＰＤＡＰＰ＋／＋；ｍα−ｓｙｎ＋／−）、及び３）（ＰＤＡＰＰ＋／＋；ｍα−ｓｙｎ−／−）。同じ交配プロトコルを、二遺伝子ｈα−シヌクレインまたはＰＤＡＰＰ−Ｊ９Ｍ及びｍβ−シヌクレインＫＯマウス作成のために続けた。
【００４７】
アミロイド沈着に対するα−シヌクレインとβ−シヌクレインの影響は、先の実施例で用いた同一の回転棒及び神経病理学的分析を用いて、同型接合ＫＯマウス（ＰＤＡＰＰ＋／＋；ｍα−ｓｙｎ−／−）及びシヌクレインについて半接合のマウス（ＰＤＡＰＰ＋／＋；ｍα−ｓｙｎ＋／−）の両方で評価した。
【実施例９】
【００４８】
ｈα−シヌクレインまたはＰＤＡＰＰ−Ｊ９Ｍｔｇマウスとｈβ−シヌクレインを過剰発現するマウスとの交雑育種。その内容をここに引用して援用する、標準的な交雑育種プロトコル（Ｍｕｃｋｅら、１９９５年）に従い、高発現異型接合β−シヌクレインマウスを異型接合α−シヌクレインまたはＰＤＡＰＰ−Ｊ９Ｍｔｇマウスと交配して、１）非ｔｇ同腹子（ＰＤＡＰＰ−／−；ｈα−またはβｓｙｎ−／−）、２）二遺伝子（ＰＤＡＰＰ＋／−及びｈβ−シヌクレイン＋／−）、３）二遺伝子（ｈα−シヌクレイン＋／−及びｈβ−シヌクレイン＋／−）、４）単一ｔｇ  ｈＡＰＰ、及び５）単一ｔｇ  ｈα−シヌクレインまたはβ−シヌクレインの発生がもたらされた。マウスの遺伝子型は末端ＤＮＡを用いてＰＣＲにより決定した。
【００４９】
回転棒に処されたとき、α−シヌクレインｔｇマウスの原系統は運動欠陥を示したため、二遺伝子交配体は同様の方法で評価した。回転棒行動の解析から、β−シヌクレインの過剰発現は、α−シヌクレインｔｇマウスにおける運動欠陥を減少させることが明らかとなった。続いての神経病理学的解析から、β−シヌクレインの過剰発現は、ニューロンの封入体の減少をもたらすことが示された。β−シヌクレインの過剰発現は、また、α−シヌクレインｔｇマウスにおけるニューロン損失の減少をもたらすことが示された。これらの結果はさらに、β−シヌクレインは生体内で活性であること、ならびにそれは抗パーキンソン及び抗アルツハイマー治療薬として可能性のある物質を構成することを確認するものである。
【００５０】
ｈα−シヌクレイン／ｈＡＰＰ二遺伝子マウスは、認知及び運動変性、コリン作動性ニューロン及びＳＩＰＴの損失、広範なアミロイドプラーク、ならびにｈα−シヌクレイン免疫反応性ニューロン内線維状封入体を有する。これらすべての特徴は、ＡＤのレヴィ小体変異型においても見出される。集合的には、レヴィ小体病は、ＡＤのみを除いて第２位の、一般的な神経変性疾患である。それらは、ＰＤ，広汎性レヴィ小体病、及びＡＤのレヴィ小体変異型を含む、異種構造群の病気を含んでなる。レヴィ小体病の患者は、典型的には、レヴィ小体、パーキンソン症候群及び認知損傷を有する。ＡＤを持つ患者の約２５％が、明らかなパーキンソン症候群を発生し、そしてｈα−シヌクレイン免疫反応性レヴィ小体様封入体が、早発性ＡＤと関連するダウン症候群におけると同様に、散発性ＡＤ及びＦＡＤの大部分の場合に発生する。また、レヴィ小体はｈＡＰＰを含む。これらの関連性は、ｈＡＰＰ／Ａβがレヴィ小体の形成及びレヴィ小体病の発生において、ある役割を果たしていることを示している。
【００５１】
ｈＡＰＰ／ｈα−シヌクレインマウスでの研究は、ｈα−シヌクレイン及びｈＡＰＰ／Ａｂが、脳の完全性及び機能に対して、集中的であるだけでなく明確な、病原性効果を持つことを示している。ｈα−シヌクレインはＡβ依存性の神経炎プラークの発生または脳におけるＡβ含有量全体には影響を与えないが、ｈＡＰＰ／Ａβ依存性認知欠損及び特定の脳領域において神経変性を悪化させた。これらの知見は、ｈα−シヌクレインがプラーク非依存性メカニズムを通して、Ａβの毒性を増強することを示している。これらのデータは、ＡＤのレヴィ小体変異型をもつ人々は純粋なＡＤをもつ人々よりも急速に認知減退を示すということを示唆する臨床所見を説明するものである。ｈＡＰＰ／Ａβの過剰発現は次に、遺伝子組換えマウスにおいてｈα−シヌクレインのニューロン内蓄積を促進し、運動欠陥の発生を加速した。これらの効果は、Ａβまたは他のｈＡＰＰ産物により仲介されることが最もありうることであり、生体外での研究は、Ａβがその犯人であることを示している。Ａβとｈα−シヌクレインの間のこれら病原性相互作用の観点から、Ａｂまたはｈα−シヌクレインの蓄積の阻止を目的とする薬剤が、以前に予期されていたよりも広範囲の神経変性疾患に利益をもたらすであろう。
【００５２】
（参照文献）
Ａｎｄｒａａ，Ｋ．，Ａｂｒａｍｏｗｓｋｉ，Ｄ．，Ｄｕｋｅ，Ｍ．，Ｐｒｏｂｓｔ，Ａ．，Ｗｉｅｄｅｒｈｏｌｄ，Ｋ．−Ｈ．，Ｂｕｕｒｋｉ，Ｋ．，Ｇｏｅｄｅｒｔ，Ｍ．，Ｓｏｍｍｅｒ，Ｂ．及びＳｔａｕｆｅｎｂｉｅｌ，Ｍ．１９９６年，Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．Ａｇｉｎｇ  １７，１８３−１９０．
Ｂｏｒｃｈｅｌｔ  ＤＲ，Ｄａｖｉｓ  Ｊ，Ｆｉｓｃｈｅｒ  Ｍ，Ｌｅｅ  ＭＫ，Ｓｌｕｎｔ  ＨＨ，Ｒａｔｏｖｉｔｓｋｙ  Ｔ，Ｒｅｇａｒｄ  Ｊ，Ｃｏｐｅｌａｎｄ  ＮＧ，Ｊｅｎｋｉｎｓ  ＮＡ，Ｓｉｓｏｄｉａ  ＳＳ，Ｐｒｉｃｅ  ＤＬ．１９９６年，遺伝子組換えマウスの脳及び心臓において外来遺伝子を発現するベクター。Ｇｅｎｅｔ．Ａｎａｌ．１３：１５９−６３．
Ｃａｒｌｓｏｎ，Ｇ．Ａ．，Ｂｏｒｃｈｅｌｔ，Ｄ．Ｒ．，Ｄａｋｅ，Ａ．，Ｔｕｒｎｅｒ，Ｓ．，Ｄａｎｉｅｌｓｏｎ，Ｖ．，Ｃｏｆｆｉｎ，Ｊ．Ｄ．，Ｅｃｋｍａｎ，Ｃ．，Ｍｅｉｎｅｒｓ，Ｊ．，Ｎｉｌｓｅｎ，Ｓ．Ｐ．，Ｙｏｕｎｋｉｎ，Ｓ．Ｇ．及びＨｓｉａｏ，１９９７年，Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．６：１９５１−９．
Ｇａｍｅｓ，Ｄ．，Ａｄａｍｓ，Ｄ．，Ａｌｅｓｓａｎｄｒｉｎｉ，Ｒ．，Ｂａｒｂｏｕｒ，Ｒ．，Ｂｅｒｔｈｅｌｅｔｔｅ，Ｐ．，ら，１９９５年，Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ）３７３，５２３−５２８．
Ｇｉａｓｓｏｎ，Ｂ．Ｉ．，Ｄｕｄａ，Ｊ．Ｅ．，Ｍｕｒｒａｙ，Ｉ．Ｖ．，Ｃｈｅｎ，Ｑ．，Ｓｏｕｚａ，Ｊ．Ｍ．，Ｈｕｒｔｉｇ，Ｈ．Ｉ．，Ｉｓｃｈｉｒｏｐｏｕｌｏｓ，Ｈ．，Ｔｒｏｊａｎｏｗｓｋｉ，Ｊ．Ｑ．，Ｌｅｅ，Ｖ．Ｍ．２０００年，シヌクレイノパシー病変における選択的アルファ−シヌクレインニトロ化による神経変性にリンクした酸化的損傷．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９０：９８５−９．
Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ，Ｍ．，Ｈｓｕ，Ｌ．Ｊ．，Ｘｉａ，Ｙ．，Ｔａｋｅｄａ，Ａ．，Ｓｉｓｋ，Ａ．，Ｓｕｎｄｓｍｏ，Ｍ．及びＭａｓｌｉａｈ，Ｅ．１９９９年，酸化的ストレスは生体外でＮＡＣＰ／α−シヌクレインのアミロイド様凝集体形成を誘起する．Ｎｅｕｒｏｒｅｐｏｒｔ  １０：７１７−２１．
Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｌ．Ｓ．，Ｒｏｄｅｍｓ，Ｊ．Ｍ．，Ｃａｔａｌａｎｏ，Ｒ．，Ｑｕｏｎ，Ｄ．及びＣｏｒｄｅｌｌ，Ｂ．１９９５年，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９２，４４０２−４４０６．
Ｈｏｇａｎ，Ｂ．ら、１９８６年，マウス胚の操作：実験室マニュアル，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ニューヨーク、アメリカ．
Ｈｏｌｔｚｍａｎ，Ｄ．Ｍ．，Ｂａｌｅｓ，Ｋ．Ｒ．，Ｔｅｎｋｏｖａ，Ｔ．，Ｆａｇａｎ，Ａ．Ｍ．，Ｐａｒｓａｄａｎｉａｎ，Ｍ．，Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ，Ｌ．Ｊ．，Ｍａｃｋｅｙ，Ｂ．Ｍ．，Ｏｌｎｅｙ，Ｊ．，ＭｃＫｅｅｌ，Ｄ．，Ｗｏｚｎｉａｋ，Ｄ．及びＰａｕｌ，Ｓ．Ｍ．２０００年，アルツハイマー病のマウスモデルにおけるアポリポタンパク質Ｅイソ型依存性アミロイド沈着及び神経突起変性．９７：２８９２−７．
Ｈｓｉａ，Ａ．Ｙ．，Ｍａｓｌｉａｈ，Ｅ．，ＭｃＣｏｎｌｏｇｕｅ，Ｌ．，Ｙｕ，Ｇ．−Ｑ．，Ｔａｔｓｕｎｏ，Ｇ．，Ｈｕ，Ｋ．，Ｋｈｏｌｏｄｅｎｋｏ，Ｄ．，Ｍａｌｅｎｋａ，Ｒ．Ｃ．，Ｎｉｃｏｌｌ，Ｒ．Ａ．及びＭｕｃｋｅ，Ｌ．１９９９年，アルツハイマー病マウスモデルにおけるプラーク非依存性神経回路破壊．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９６：３２２８−３３．
Ｈｓｉａｏ  ＫＫ，Ｂｏｒｃｈｅｌｔ  ＤＲ，Ｏｌｓｏｎ  Ｋ，Ｊｏｈａｎｎｓｄｏｔｔｉｒ  Ｒ，Ｋｉｔｔ  Ｃ，Ｙｕｎｉｓ  Ｗ，Ｘｕ  Ｓ，Ｅｃｋｍａｎ  Ｃ，Ｙｏｕｎｋｉｎ  Ｓ，Ｐｒｉｃｅ  Ｄ，ら．１９９５年，アルツハイマーアミロイド前駆体タンパク質を過剰発現する遺伝子組換えＦＶＢ／Ｎマウスにおける年齢関連性ＣＮＳ障害及び早期死亡ｒｏｎ  １５：１２０３−１８．
Ｈｓｉａｏ，Ｋ．，Ｃｈａｐｍａｎ，Ｐ．，Ｎｉｌｓｅｎ，Ｓ．，Ｅｃｋｍａｎ，Ｃ．，Ｈａｒｉｇａｙａ，Ｙ．，Ｙｏｕｎｋｉｎ，Ｓ．，Ｙａｎｇ，Ｆ．及びＣｏｌｅ，Ｇ．１９９６年，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７４，９９−１０２
Ｋａｍｍｅｓｈｅｉｄｔ，Ａ．，Ｂｏｙｃｅ，Ｆ．Ｍ．，Ｓｐａｎｏｙａｎｎｉｓ，Ａ．Ｆ．，Ｃｕｍｍｉｎｇｓ，Ｂ．Ｊ．，Ｏｒｔｅｇｏｎ，Ｍ．，Ｃｏｔｍａｎ，Ｃ．，Ｖａｕｇｈｔ，Ｊ．Ｌ．及びＮｅｖｅ，Ｒ．Ｌ．１９９２年，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９，１０８５７−１０８６１．
Ｋａｎｇ  Ｊ，Ｌｅｍａｉｒｅ  ＨＧ，Ｕｎｔｅｒｂｅｃｋ  Ａ，Ｓａｌｂａｕｍ  ＪＭ，Ｍａｓｔｅｒｓ  ＣＬ，Ｇｒｚｅｓｃｈｉｋ  ＫＨ，Ｍｕｌｔｈａｕｐ  Ｇ，Ｂｅｙｒｅｕｔｈｅｒ  Ｋ，Ｍｕｌｌｅｒ−Ｈｉｌｌ  Ｂ．１９８７年，アルツハイマー病のアミロイドＡ４タンパク質の前駆体は細胞表面受容体に似る．Ｎａｔｕｒｅ  ３２５：７３３−６．
Ｌａｍｂ，Ｂ．Ｔ．，Ｓｉｓｏｄｉａ，Ｓ．Ｓ．，Ｌａｗｌｅｒ，Ａ．Ｍ．，Ｓｌｕｎｔ，Ｈ．Ｈ．，Ｋｉｔｔ，Ｃ．Ａ．，Ｋｅａｒｎｓ，Ｗ．Ｇ．，Ｐｅａｒｓｏｎ，Ｐ．Ｌ．，Ｐｒｉｃｅ，Ｄ．Ｌ．及びＧｅａｒｈａｒｔ，Ｊ．Ｄ．１９９３年，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．５，２２−３０．
Ｍａｓｌｉａｈ，Ｅ．，Ｒｏｃｋｅｎｓｔｅｉｎ，Ｅ．Ｍ．，Ｖｅｉｎｂｅｒｇｓ，Ｉ．，Ｍａｌｌｏｒｙ，Ｍ．，Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ，Ｍ．，Ｔａｋｅｄａ，Ａ．，Ｓａｇａｒａ，Ｙ．，Ｓｉｓｋ，Ａ．，Ｍｕｃｋｅ，Ｌ．２０００年，アルファ−シヌクレインマウスにおけるドーパミン作動性損失及び封入体形成：神経変性障害のための意味．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８７：１２６５−９．
Ｍｏｒｒｉｓ  Ｒ．１９８４年，ラットにおける空間学習の研究のための、水迷路法の開発．Ｊ．  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｍｅｔｈ．１１：４７−６０．
Ｍｕｃｋｅ，Ｌ．，Ｍａｓｌｉａｈ，Ｅ．，Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｗ．Ｂ．，Ｒｕｐｐｅ，Ｍ．Ｄ．，Ａｌｆｏｒｄ，Ｍ．，Ｒｏｃｋｅｎｓｔｅｉｎ，Ｅ．Ｍ．，Ｆｏｒｓｓ−Ｐｅｔｔｅｒ，Ｓ．，Ｐｉｅｔｒｏｐａｏｌｏ，Ｍ．，Ｍａｌｌｏｒｙ，Ｍ．及びＡｂｒａｈａｍ，Ｃ．Ｒ．１９９４年，Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．６６６，１５１−１６７．
Ｍｕｃｋｅ，Ｌ．，Ａｂｒａｈａｍ，ｃ．Ｒ．，ｒｕｐｐｅ，Ｍ．Ｄ．，Ｒｏｃｋｅｎｓｔｅｉｎ，Ｅ．Ｍ．，Ｔｏｇｇａｓ，Ｓ．Ｍ．，Ｍａｌｌｏｒｙ．Ｍ．，  Ａｌｆｏｒｄ，Ｍ．及びＭａｓｌｉａｈ，Ｅ．１９９５年，ヒトアミロイド前駆体タンパク質（ｈＡＰＰ）のニューロン過剰発現によるＨＩＶ−１  ｇｐ１２０誘起脳損傷からの保護作用．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ  １８１：１５５１−５６．
Ｍｕｃｋｅ，Ｌ．，Ｍａｓｌｉａｈ．Ｅ．，Ｙｕ，Ｇ．−Ｑ．，Ｍａｌｌｏｒｙ，Ｍ．，Ｒｏｃｋｅｎｓｔｅｉｎ，Ｅ．Ｍ．，Ｔａｔｓｕｎｏ，Ｇ．，Ｈｕ，Ｋ．，Ｋｈｏｌｏｄｅｎｋｏ，Ｄ．，Ｊｏｈｎｓｏｎ−Ｗｏｏｄ，Ｋ．及びＭｃＣｏｎｌｏｇｕｅ，Ｌ．２０００年，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２０：４０５０−８．
Ｑｕｏｎ，Ｄ．，Ｗａｎｇ，Ｙ．，Ｃａｔａｌａｎｏ，Ｒ．，Ｓｃａｒｄｉｎａ，Ｊ．Ｍ．，Ｍｕｒａｋａｍｉ，Ｋ．及びＣｏｒｄｅｌｌ，Ｂ．１９９１年，Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ）３５２：２３９−２４１．
Ｒｏｃｋｅｎｓｔｅｉｎ  ＥＭ，ＭｃＣｏｎｌｏｇｕｅ  Ｌ，Ｔａｎ  Ｈ，Ｐｏｗｅｒ  Ｍ，Ｍａｓｌｉａｈ  Ｅ，Ｍｕｃｋｅ  Ｌ，１９９５年，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：２８２５７−２８２６７．
Ｓｔｒｉｔｔｍａｔｔｅｒ，Ｗ．Ｊ．，Ｓａｕｎｄｅｒｓ，Ａ．Ｍ．，Ｓｃｈｍｅｃｈｅｌ，Ｄ．，Ｐｅｒｉｃａｋ−Ｖａｎｃｅ，Ｍ．，Ｅｎｇｈｉｌｄ，Ｊ．，Ｓａｌｖｅｓｅｎ，Ｇ．Ｓ．及びＲｏｓｅｓ，Ａ．Ｄ．１９９３年，アポリポタンパク質Ｅ：β−アミロイドへの高結合活性結合、及び遅発性家族性アルツハイマー病における４型対立遺伝子の頻度の増大．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：１９７７−８１．
Ｓｔｕｒｃｈｌｅｒ−Ｐｉｅｒｒａｔ，Ｃ．，Ａｍｂｒａｍｏｗｓｋｉ，Ｄ．，Ｄｕｋｅ，Ｍ．，Ｗｉｅｄｅｒｈｏｌｄ，Ｋ．Ｈ．，ら．１９９７年，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９４：１３２８７−９２．
（実施例３中）Ｍｕｃｋｅら．１９９５年，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８１：１５５１−６．
【図面の簡単な説明】
【００５３】
【図１】回転棒におけるｈＳＹＮ及びｈＡＰＰｔｇマウスでの運動欠陥の性質決定。非遺伝子組換え同腹子に比べて、単一ｔｇｈＳＹＮマウスは有意な運動欠陥を示した。同様に、二遺伝子ｈＳＹＮ／ｈＡＰＰマウスは、単一ｔｇｈＳＹＮマウスと同様に、機能障害のレベルを示した。ｈＡＰＰのみを発現するマウスは、非ｔｇ対照と違いがなかった。１遺伝子型あたりＮ＝６〜８。月齢１２ヶ月。
【図２】遺伝子組換え及び非遺伝子組換えマウスの脳からの全ＲＮＡのＲＮアーゼ保護アッセイ。レーンＵは、未消化転写物を示す。図の右手側の注記は、消化試料のサイズを示す。試料レーンは、３つの別々のマウスの分析を表し、それぞれ、非Ｔｇ、非遺伝子組換えマウス（すなわち、対照）；Ｔｈｙ１−ｈＡＰＰｔｇ、遺伝子組換えマウス；Ｔｈｙ１−α−ｓｙｎ’ｔｇ、遺伝子組換えマウス；ならびに二重ｔｇ、ヒト（ｈ）ＡＰＰ７５１及びα−シヌクレイン遺伝子の両方を含む遺伝子組換えマウスである。
【図１】
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【図２】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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