(57)【要約】本発明は、或る化合物がＨＩＶ−１逆転写酵素を阻害するかどうかを決定する方法を提供する。本発明は、或る化合物がＨＩＶ−１逆転写酵素のｐ６６とｐ５１サブユニットポリペチドとの間の複合体形成を阻害するかどうかを決定する方法を提供する。本発明は、或る化合物がＨＩＶ−１逆転写酵素のｐ６６とｐ５１サブユニットポリペチドとの間の複合体形成を増大するかどうかを決定する方法を提供する。本発明は、或る化合物がＨＩＶ−１逆転写酵素の２つのｐ６６サブユニットポリペチド間の複合体形成を阻害するかどうかを決定する方法を提供する。本発明は、或る化合物がＨＩＶ−１逆転写酵素の２つのｐ６６サブユニットポリペチド間の複合体形成を増大するかどうか決定する方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
或る化合物がＨＩＶ−１逆転写酵素を阻害するかどうかを決定する方法であって：
（ａ）前記化合物に、（ｉ）ＨＩＶ−１逆転写酵素のｐ６６サブユニットポリペプチドを含む融合タンパク質を発現する第一のプラスミド、（ｉｉ）ＨＩＶ−１逆転写酵素のｐ５１サブユニットポリペプチドを含む融合タンパク質を発現する第二のプラスミド、および（ｉｉｉ）ｐ６６サブユニットポリペプチドおよびｐ５１サブユニットポリペプチドの複合体の存在下で活性化されるレポータ遺伝子を含む酵母細胞を接触させて、前記化合物の存在下での前記細胞中の前記レポータ遺伝子の活性レベルを決定することと；
（ｂ）工程（ａ）で決定された前記レポータ遺伝子の活性レベルを、前記化合物の非存在下で決定された前記レポータ遺伝子の活性レベルと比較することとを含み、前記工程（ａ）におけるレポータ遺伝子の減少した活性レベルは、前記化合物がＨＩＶ−１逆転写酵素のｐ５１サブユニットポリペプチドとＨＩＶ−１逆転写酵素のｐ６６サブユニットポリペプチドとの間の複合体の形成を阻害することを示し、それによって前記化合物はＨＩＶ−１逆転写酵素を阻害することが示される方法。
【請求項２】
或る化合物がＨＩＶ−１逆転写酵素のｐ５１サブユニットポリペプチドとＨＩＶ−１逆転写酵素のｐ６６サブユニットポリペプチドとの間の複合体の形成を阻害するかどうかを決定する方法であって：
（ａ）前記化合物に、（ｉ）ＨＩＶ−１逆転写酵素のｐ６６サブユニットポリペプチドを含む融合タンパク質を発現する第一のプラスミド、（ｉｉ）ＨＩＶ−１逆転写酵素のｐ５１サブユニットポリペプチドを含む融合タンパク質を発現する第二のプラスミド、および（ｉｉｉ）ｐ６６サブユニットポリペプチドおよびｐ５１サブユニットポリペプチドの複合体の存在下で活性化されるレポータ遺伝子を含む酵母細胞を接触させて、前記化合物の存在下での前記細胞中の前記レポータ遺伝子の活性レベルを決定することと；
（ｂ）工程（ａ）で決定された前記レポータ遺伝子の活性レベルを、前記化合物の非存在下で決定された前記レポータ遺伝子の活性レベルと比較することとを含み、前記工程（ａ）におけるレポータ遺伝子の減少した活性レベルによって、前記化合物がＨＩＶ−１逆転写酵素のｐ５１サブユニットポリペプチドとＨＩＶ−１逆転写酵素のｐ６６サブユニットポリペプチドとの間の複合体の形成を阻害することが示される方法。
【請求項３】
或る化合物がＨＩＶ−１逆転写酵素を阻害するかどうかを決定する方法であって：
（ａ）前記化合物に、（ｉ）ＨＩＶ−１逆転写酵素のｐ６６サブユニットポリペプチドを含む融合タンパク質を発現する第一のプラスミド、（ｉｉ）ＨＩＶ−１逆転写酵素のｐ５１サブユニットポリペプチドを含む融合タンパク質を発現する第二のプラスミド、および（ｉｉｉ）ｐ６６サブユニットポリペプチドおよびｐ５１サブユニットポリペプチドの複合体の存在下で活性化されるレポータ遺伝子を含む酵母細胞を接触させて、前記化合物の存在下での前記細胞中の前記レポータ遺伝子の活性レベルを決定することと；
（ｂ）工程（ａ）で決定された前記レポータ遺伝子の活性レベルを、前記化合物の非存在下で決定された前記レポータ遺伝子の活性レベルと比較することとを含み、前記工程（ａ）におけるレポータ遺伝子の増大した活性レベルは、前記化合物がＨＩＶ−１逆転写酵素のｐ５１サブユニットポリペプチドとＨＩＶ−１逆転写酵素のｐ６６サブユニットポリペプチドとの間での複合体形成の活性化剤であることを示し、それによって前記化合物はＨＩＶ−１逆転写酵素を阻害することが示される方法。
【請求項４】
或る化合物がＨＩＶ−１逆転写酵素のｐ５１サブユニットポリペプチドとＨＩＶ−１逆転写酵素のｐ６６サブユニットポリペプチドとの間の複合体の形成を増大するかどうかを決定する方法であって：
（ａ）前記化合物に、（ｉ）ＨＩＶ−１逆転写酵素のｐ６６サブユニットポリペプチドを含む融合タンパク質を発現する第一のプラスミド、（ｉｉ）ＨＩＶ−１逆転写酵素のｐ５１サブユニットポリペプチドを含む融合タンパク質を発現する第二のプラスミド、および（ｉｉｉ）ｐ６６サブユニットポリペプチドおよびｐ５１サブユニットポリペプチドの複合体の存在下で活性化されるレポータ遺伝子を含む酵母細胞を接触させて、前記化合物の存在下での前記細胞中の前記レポータ遺伝子の活性レベルを決定することと；
（ｂ）工程（ａ）で決定された前記レポータ遺伝子の活性レベルを、前記化合物の非存在下で決定された前記レポータ遺伝子の活性レベルと比較することとを含み、前記工程（ａ）におけるレポータ遺伝子の増大した活性レベルによって、前記化合物が、ＨＩＶ−１逆転写酵素のｐ５１サブユニットポリペプチドとＨＩＶ−１逆転写酵素のｐ６６サブユニットポリペプチドとの間での複合体形成の活性化剤であることが示される方法。
【請求項５】
或る化合物がＨＩＶ−１逆転写酵素を阻害するかどうかを決定する方法であって：
（ａ）前記化合物に、（ｉ）ＨＩＶ−１逆転写酵素の第一のｐ６６サブユニットポリペプチドを含む融合タンパク質を発現する第一のプラスミド、（ｉｉ）ＨＩＶ−１逆転写酵素の第二のｐ６６サブユニットポリペプチドを含む融合タンパク質を発現する第二のプラスミド、および（ｉｉｉ）前記第一のｐ６６サブユニットポリペプチドおよび前記第二のｐ６６サブユニットポリペプチドの複合体の存在下で活性化されるレポータ遺伝子を含む酵母細胞を接触させて、前記化合物の存在下での前記細胞中の前記レポータ遺伝子の活性レベルを決定することと；
（ｂ）工程（ａ）で決定された前記レポータ遺伝子の活性レベルを、前記化合物の非存在下で決定された前記レポータ遺伝子の活性レベルと比較することとを含み、前記工程（ａ）におけるレポータ遺伝子の減少した活性レベルは、前記化合物がＨＩＶ−１逆転写酵素の前記第一のｐ６６サブユニットポリペプチドとＨＩＶ−１逆転写酵素の前記第二のｐ６６サブユニットポリペプチドとの間の複合体の形成を阻害することを示し、それによって前記化合物はＨＩＶ−１逆転写酵素を阻害することが示される方法。
【請求項６】
或る化合物がＨＩＶ−１逆転写酵素の第一のｐ６６サブユニットポリペプチドとＨＩＶ−１逆転写酵素の第二のｐ６６サブユニットポリペプチドとの間の複合体の形成を阻害するかどうかを決定する方法であって：
（ａ）前記化合物に、（ｉ）ＨＩＶ−１逆転写酵素の第一のｐ６６サブユニットポリペプチドを含む融合タンパク質を発現する第一のプラスミド、（ｉｉ）ＨＩＶ−１逆転写酵素の第二のｐ６６サブユニットポリペプチドを含む融合タンパク質を発現する第二のプラスミド、および（ｉｉｉ）前記第一のｐ６６サブユニットポリペプチドおよび前記第二のｐ６６サブユニットポリペプチドの複合体の存在下で活性化されるレポータ遺伝子を含む酵母細胞を接触させて、前記化合物の存在下での前記細胞中の前記レポータ遺伝子の活性レベルを決定することと；
（ｂ）工程（ａ）で決定された前記レポータ遺伝子の活性レベルを、前記化合物の非存在下で決定された前記レポータ遺伝子の活性レベルと比較することとを含み、前記工程（ａ）におけるレポータ遺伝子の減少した活性レベルによって、前記化合物がＨＩＶ−１逆転写酵素の前記第一のｐ６６サブユニットポリペプチドとＨＩＶ−１逆転写酵素の前記第二のｐ６６サブユニットポリペプチドとの間の複合体の形成を阻害することが示される方法。
【請求項７】
或る化合物がＨＩＶ−１逆転写酵素を阻害するかどうかを決定する方法であって：
（ａ）前記化合物に、（ｉ）ＨＩＶ−１逆転写酵素の第一のｐ６６サブユニットポリペプチドを含む融合タンパク質を発現する第一のプラスミド、（ｉｉ）ＨＩＶ−１逆転写酵素の第二のｐ６６サブユニットポリペプチドを含む融合タンパク質を発現する第二のプラスミド、および（ｉｉｉ）前記第一のｐ６６サブユニットポリペプチドおよび前記第二のｐ６６サブユニットポリペプチドの複合体の存在下で活性化されるレポータ遺伝子を含む酵母細胞を接触させて、前記化合物の存在下での前記細胞中の前記レポータ遺伝子の活性レベルを決定することと；
（ｂ）工程（ａ）で決定された前記レポータ遺伝子の活性レベルを、前記化合物の非存在下で決定された前記レポータ遺伝子の活性レベルと比較することとを含み、前記工程（ａ）におけるレポータ遺伝子の増大した活性レベルは、前記化合物がＨＩＶ−１逆転写酵素の前記第一のｐ６６サブユニットポリペプチドとＨＩＶ−１逆転写酵素の前記第二のｐ６６サブユニットポリペプチドとの間での複合体形成の活性化剤であることを示し、それによって前記化合物はＨＩＶ−１逆転写酵素を阻害することが示される方法。
【請求項８】
或る化合物がＨＩＶ−１逆転写酵素の第一のｐ６６サブユニットポリペプチドとＨＩＶ−１逆転写酵素の第二のｐ６６サブユニットポリペプチドとの間の複合体の形成を増大するかどうかを決定する方法であって：
（ａ）前記化合物に、（ｉ）ＨＩＶ−１逆転写酵素の第一のｐ６６サブユニットポリペプチドを含む融合タンパク質を発現する第一のプラスミド、（ｉｉ）ＨＩＶ−１逆転写酵素の第二のｐ６６サブユニットポリペプチドを含む融合タンパク質を発現する第二のプラスミド、および（ｉｉｉ）前記第一のｐ６６サブユニットポリペプチドおよび前記第二のｐ６６サブユニットポリペプチドの複合体の存在下で活性化されるレポータ遺伝子を含む酵母細胞を接触させて、前記化合物の存在下での前記細胞中の前記レポータ遺伝子の活性レベルを決定することと；
（ｂ）工程（ａ）で決定された前記レポータ遺伝子の活性レベルを、前記化合物の非存在下で決定された前記レポータ遺伝子の活性レベルと比較することとを含み、前記工程（ａ）におけるレポータ遺伝子の増大した活性レベルによって、前記化合物がＨＩＶ−１逆転写酵素の前記第一のｐ６６サブユニットポリペプチドとＨＩＶ−１逆転写酵素の前記第二のｐ６６サブユニットポリペプチドとの間での複合体形成の活性化剤であることが示される方法。
【請求項９】
請求項１〜８の何れか１項に記載の方法であって、（ａ）前記第一のプラスミドによって発現された融合タンパク質は、ＤＮＡ結合ドメインを有するペプチドを含み、（ｂ）前記第二のプラスミドによって発現された融合タンパク質は、転写活性化ドメインを有するペプチドを含む方法。
【請求項１０】
請求項９に記載の方法であって、前記ＤＮＡ結合ドメインはＬｅｘＡ ＤＮＡ結合ドメインである方法。
【請求項１１】
請求項１０に記載の方法であって、前記ＤＮＡ結合ドメインを有するペプチドは、前記ＤＮＡ結合ドメインを有するペプチドは、ＬｅｘＡアミノ酸残基１〜８７を含む方法。
【請求項１２】
請求項１０に記載の方法であって、前記ＤＮＡ結合ドメインを有するペプチドは、ＬｅｘＡアミノ酸残基１〜２０２を含む方法。
【請求項１３】
請求項９に記載の方法であって、前記ＤＮＡ結合ドメインはＧＡＬ４ ＤＮＡ結合ドメインである方法。
【請求項１４】
請求項９に記載の方法であって、前記転写活性化ドメインはＧＡＬ４ 転写活性化ドメインである方法。
【請求項１５】
請求項１４に記載の方法であって、前記転写活性化ドメインを有するペプチドは、ＧＡＬ４アミノ酸残基７６８〜８８１を含む方法。
【請求項１６】
請求項９に記載の方法であって、前記転写活性化ドメインはＶＰ１６転写活性化ドメインを含む方法。
【請求項１７】
請求項１〜８の何れか１項に記載の方法であって、（ａ）前記第一のプラスミドによって発現された融合タンパク質は、転写活性化ドメインを有するペプチドを含み、また（ｂ）前記第二のプラスミドによって発現された融合タンパク質は、ＤＮＡ結合ドメインを有するペプチドを含む方法。
【請求項１８】
請求項１７に記載の方法であって、前記ＤＮＡ結合ドメインはＬｅｘＡ ＤＮＡ結合ドメインを含む方法。
【請求項１９】
請求項１８に記載の方法であって、前記ＤＮＡ結合ドメインを有するペプチドは、ＬｅｘＡアミノ酸残基１〜８７を含む方法。
【請求項２０】
請求項１８に記載の方法であって、前記ＤＮＡ結合ドメインをい有するペプチドは、ＬｅｘＡアミノ酸残基１〜２０２を含む方法。
【請求項２１】
請求項１７に記載の方法であって、前記転写活性化ドメインはＧＡＬ４ ＤＮＡ結合ドメインである方法。
【請求項２２】
請求項１７に記載の方法であって、前記転写活性化ドメインはＧＡＬ４転写活性化ドメインである方法。
【請求項２３】
請求項２２に記載の方法であって、前記転写活性化ドメインは、ＧＡＬ４アミノ酸残基７６８〜８８１を含む方法。
【請求項２４】
請求項１７に記載の方法であって、前記転写活性化ドメインはＶＰ１６転写活性化ドメインである方法。
【請求項２５】
請求項１〜８の何れか１項に記載の方法であって、前記第一のプラスミド、前記第二のプラスミド、またはその両方のプラスミドにより発現された前記融合タンパク質は、連続するアラニン残基を含むペプチドを含んでいる方法。
【請求項２６】
請求項２５に記載の方法であって、前記連続するアラニン残基を含んだペプチドは、少なくとも６個のアラニン残基を含んでいる方法。
【請求項２７】
請求項１〜８の何れか１項に記載の方法であって、前記融合タンパク質は、インフルエンザ赤血球凝集素（ＨＡ）エピトープタグを含む方法。
【請求項２８】
請求項１〜８の何れか１項に記載の方法であって、前記レポータ遺伝子はＬａｃＺレポータ遺伝子である方法。
【請求項２９】
請求項１〜４の何れか１項に記載の方法であって、（ａ）前記第一のプラスミドにより発現された融合タンパク質はＬｅｘＡタンパク質ＤＮＡ結合ドメインを含んだペプチドを含み、ここで前記ｐ６６サブユニットポリペプチドはそのＣ末端アミノ酸において前記ＬｅｘＡタンパク質ＤＮＡ結合ドメインを含むペプチドのＮ末端アミノ酸に結合しており；（ｂ）前記第二のプラスミドにより発現された融合タンパク質はＧａｌ４のアミノ酸７６８〜８８１に対応するＧａｌ４ペプチド、および前記インフルエンザ赤血球凝集素（ＨＡ）エピトープタグを含み、ここで前記Ｇａｌ４ペプチドはそのＣ末端アミノ酸において前記インフルエンザ赤血球凝集素（ＨＡ）エピトープタグのＮ末端アミノ酸に結合しており、該インフルエンザ赤血球凝集素（ＨＡ）エピトープタグはそのＣ末端において前記ｐ５１サブユニットポリペプチドのＮ末端アミノ酸に結合している方法。
【請求項３０】
請求項１〜４の何れか１項に記載の方法であって、（ａ）前記第一のプラスミドにより発現された融合タンパク質はＬｅｘＡタンパク質ＤＮＡ結合ドメインを含んだペプチドを含み、ここで前記ｐ６６サブユニットポリペプチドはそのＣ末端アミノ酸において前記ＬｅｘＡタンパク質ＤＮＡ結合ドメインを含むペプチドのＮ末端アミノ酸に結合しており；（ｂ）前記第二のプラスミドにより発現された融合タンパク質はＧａｌ４のアミノ酸７６８〜８８１に対応するＧａｌ４ペプチドを含み、該Ｇａｌ４ペプチドはそのＣ末端アミノ酸において前記ｐ５１サブユニットポリペプチドのＮ末端アミノ酸に結合している方法。
【請求項３１】
請求項１〜４の何れか１項に記載の方法であって、（ａ）前記第一のプラスミドにより発現された融合タンパク質はアミノ酸残基１〜８７に対応するＬｅｘＡペプチドを含み、ここで該ＬｅｘＡペプチドはそのＣ末端アミノ酸でｐ６６サブユニットポリペプチドのＮ末端アミノ酸に結合しており；（ｂ）前記第二のプラスミドにより発現された融合タンパク質はＧａｌ４のアミノ酸７６８〜８８１に対応するＧａｌ４ペプチド、およびインフルエンザ赤血球凝集素（ＨＡ）エピトープタグを含み、前記Ｇａｌ４ペプチドはそのＣ末端アミノ酸でインフルエンザ赤血球凝集素（ＨＡ）エピトープタグのＮ末端アミノ酸に結合され、該インフルエンザ赤血球凝集素（ＨＡ）エピトープタグはそのＣ末端アミノ酸で前記ｐ５１サブユニットポリペプチドのＮ末端アミノ酸に結合している方法。
【請求項３２】
請求項１〜４の何れか１項に記載の方法であって、（ａ）前記第一のプラスミドにより発現された融合タンパク質はアミノ酸残基１〜８７に対応するＬｅｘＡペプチドを含み、ここで該ＬｅｘＡペプチドはそのＣ末端アミノ酸でｐ６６サブユニットポリペプチドのＮ末端アミノ酸に結合しており；（ｂ）前記第二のプラスミドにより発現された融合タンパク質はＧａｌ４のアミノ酸７６８〜８８１に対応するＧａｌ４ペプチドを含み、該Ｇａｌ４ペプチドはそのＣ末端アミノ酸で前記ｐ５１サブユニットポリペプチドのＮ末端アミノ酸に結合している方法。
【請求項３３】
請求項１〜４の何れか１項に記載の方法であって、（ａ）前記第一のプラスミドにより発現された融合タンパク質はアミノ酸残基１〜２０２に対応するＬｅｘＡペプチド、および連続する６アラニン残基を含むペプチドを含み、ここで前記ＬｅｘＡペプチドはそのＣ末端アミノ酸で前記連続する６アラニン残基を含むペプチドのＮ末端アミノ酸に結合し、また前記連続する６アラニン残基を含むペプチドはそのＣ末端アミノ酸で前記ｐ６６サブユニットポリペプチドのＮ末端アミノ酸に結合しており；（ｂ）前記第二のプラスミドにより発現された融合タンパク質はＧａｌ４のアミノ酸７６８〜８８１に対応するＧａｌ４ペプチドを含み、該Ｇａｌ４ペプチドはそのＣ末端アミノ酸で前記ｐ５１サブユニットポリペプチドのＮ末端アミノ酸に結合している方法。
【請求項３４】
請求項１〜４の何れか１項に記載の方法であって、（ａ）前記第一のプラスミドにより発現された融合タンパク質はアミノ酸残基１〜２０２に対応するＬｅｘＡペプチド、および連続する６アラニン残基を含むペプチドを含み、ここで前記ＬｅｘＡペプチドはそのＣ末端アミノ酸で前記連続する６アラニン残基を含むペプチドのＮ末端アミノ酸に結合し、また前記連続する６アラニン残基を含むペプチドはそのＣ末端アミノ酸で前記ｐ６６サブユニットポリペプチドのＮ末端アミノ酸に結合しており；（ｂ）前記第二のプラスミドにより発現された融合タンパク質はＧａｌ４のアミノ酸７６８〜８８１に対応するＧａｌ４ペプチド、およびインフルエンザ赤血球凝集素（ＨＡ）エピトープタグを含み、前記Ｇａｌ４ペプチドはそのＣ末端アミノ酸でインフルエンザ赤血球凝集素（ＨＡ）エピトープタグのＮ末端アミノ酸に結合され、該インフルエンザ赤血球凝集素（ＨＡ）エピトープタグはそのＣ末端アミノ酸で前記ｐ５１サブユニットポリペプチドのＮ末端アミノ酸に結合している方法。
【請求項３５】
請求項１〜４の何れか１項に記載の方法であって、（ａ）前記第一のプラスミドにより発現された融合タンパク質はＧａｌ４のアミノ酸７６８〜８８１に対応するＧａｌ４ペプチド、インフルエンザ赤血球凝集素（ＨＡ）エピトープタグ、および連続する６アラニン残基を含むペプチドを含み、ここで前記Ｇａｌ４ペプチドはそのＣ末端アミノ酸で前記インフルエンザ赤血球凝集素（ＨＡ）エピトープタグのＮ末端アミノ酸に結合され、該インフルエンザ赤血球凝集素（ＨＡ）エピトープタグはそのＣ末端アミノ酸で前記連続する６アラニン残基を含むペプチドのＮ末端アミノ酸に結合され、また前記連続する６アラニン残基を含むペプチドはそのＣ末端アミノ酸で前記ｐ６６サブユニットペプチドのＮ末端アミノ酸に結合しており；（ｂ）前記第二のプラスミドにより発現された融合タンパク質はＬｅｘＡタンパク質ＤＮＡ結合ドメインを含んだペプチドを含み、ここで前記ｐ５１サブユニットポリペプチドがそのＣ末端アミノ酸において前記ＬｅｘＡタンパク質ＤＮＡ結合ドメインを含むペプチドのＮ末端アミノ酸に結合している方法。
【請求項３６】
請求項１〜４の何れか１項に記載の方法であって、（ａ）前記第一のプラスミドにより発現された融合タンパク質はＧａｌ４のアミノ酸７６８〜８８１に対応するＧａｌ４ペプチド、インフルエンザ赤血球凝集素（ＨＡ）エピトープタグ、および連続する６アラニン残基を含むペプチドを含み、ここで前記Ｇａｌ４ペプチドはそのＣ末端アミノ酸で前記インフルエンザ赤血球凝集素（ＨＡ）エピトープタグのＮ末端アミノ酸に結合され、該インフルエンザ赤血球凝集素（ＨＡ）エピトープタグはそのＣ末端アミノ酸で前記連続する６アラニン残基を含むペプチドのＮ末端アミノ酸に結合され、また前記連続する６アラニン残基を含むペプチドはそのＣ末端アミノ酸で前記ｐ６６サブユニットペプチドのＮ末端アミノ酸に結合しており；（ｂ）前記第二のプラスミドにより発現された融合タンパク質はＬｅｘＡタンパク質ＤＮＡ結合ドメインを含んだペプチドを含み、ここで前記ＬｅｘＡタンパク質ＤＮＡ結合ドメインを含むペプチドはそのＣ末端アミノ酸で前記ｐ５１サブユニットポリペプチドのＮ末端アミノ酸に結合している方法。
【請求項３７】
請求項１〜４の何れか１項に記載の方法であって、（ａ）前記第一のプラスミドにより発現された融合タンパク質はＧａｌ４のアミノ酸７６８〜８８１に対応するＧａｌ４ペプチド、インフルエンザ赤血球凝集素（ＨＡ）エピトープタグ、および連続する６アラニン残基を含むペプチドを含み、ここで前記Ｇａｌ４ペプチドはそのＣ末端アミノ酸で前記インフルエンザ赤血球凝集素（ＨＡ）エピトープタグのＮ末端アミノ酸に結合され、該インフルエンザ赤血球凝集素（ＨＡ）エピトープタグはそのＣ末端アミノ酸で前記連続する６アラニン残基を含むペプチドのＮ末端アミノ酸に結合され、また前記連続する６アラニン残基を含むペプチドはそのＣ末端アミノ酸で前記ｐ６６サブユニットペプチドのＮ末端アミノ酸に結合しており；（ｂ）前記第二のプラスミドにより発現された融合タンパク質はＧａｌ４タンパク質ＤＮＡ結合ドメインを含むペプチドを含んでおり、該Ｇａｌ４タンパク質ＤＮＡ結合ドメインを含むペプチドは、そのＣ末端アミノ酸で前記ｐ５１サブユニットポリペプチドのＮ末端アミノ酸に結合している方法。
【請求項３８】
請求項１〜４の何れか１項に記載の方法であって、（ａ）前記第一のプラスミドにより発現された融合タンパク質はＧａｌ４のアミノ酸７６８〜８８１に対応するＧａｌ４ペプチドを含み、ここで該Ｇａｌ４ペプチドはそのＣ末端アミノ酸で前記ｐ６６サブユニットペプチドのＮ末端アミノ酸に結合しており；（ｂ）前記第二のプラスミドにより発現された融合タンパク質はＬｅｘＡタンパク質ＤＮＡ結合ドメインを含んだペプチドを含み、ここで前記ｐ５１サブユニットポリペプチドはそのＣ末端アミノ酸で前記ＬｅｘＡタンパク質ＤＮＡ結合ドメインを含むペプチドのＮ末端アミノ酸に結合している方法。
【請求項３９】
請求項１〜４の何れか１項に記載の方法であって、（ａ）前記第一のプラスミドにより発現された融合タンパク質はＧａｌ４のアミノ酸７６８〜８８１に対応するＧａｌ４ペプチドを含み、ここで該Ｇａｌ４ペプチドはそのＣ末端アミノ酸で前記ｐ６６サブユニットペプチドのＮ末端アミノ酸に結合しており；（ｂ）前記第二のプラスミドにより発現された融合タンパク質はＬｅｘＡタンパク質ＤＮＡ結合ドメインを含むペプチドを含んでおり、該ＬｅｘＡタンパク質ＤＮＡ結合ドメインを含むペプチドはそのＣ末端アミノ酸で前記ｐ５１サブユニットポリペプチドのＮ末端アミノ酸に結合している方法。
【請求項４０】
請求項１〜４の何れか１項に記載の方法であって、（ａ）前記第一のプラスミドにより発現された融合タンパク質はＧａｌ４のアミノ酸７６８〜８８１に対応するＧａｌ４ペプチドを含み、ここで該Ｇａｌ４ペプチドはそのＣ末端アミノ酸で前記ｐ６６サブユニットペプチドのＮ末端アミノ酸に結合しており；（ｂ）前記第二のプラスミドにより発現された融合タンパク質はＧａｌ４タンパク質ＤＮＡ結合ドメインを含むペプチドを含んでおり、該Ｇａｌ４タンパク質ＤＮＡ結合ドメインを含むペプチドはそのＣ末端アミノ酸で前記ｐ５１サブユニットポリペプチドのＮ末端アミノ酸に結合している方法。
【請求項４１】
請求項５〜８の何れか１項に記載の方法であって、（ａ）前記第一のプラスミドによって発現された融合タンパク質は、ＬｅｘＡタンパク質ＤＮＡ結合ドメインを含むペプチドを含んでおり、ここで前記ｐ６６サブユニットポリペプチドはそのＣ末端アミノ酸で前記ＬｅｘＡタンパク質ＤＮＡ結合ドメインを含むペプチドのＮ末端アミノ酸に結合しており、（ｂ）前記第二のプラスミドにより発現された融合タンパク質はＧａｌ４のアミノ酸７６８〜８８１に対応するＧａｌ４ペプチド、インフルエンザ赤血球凝集素（ＨＡ）エピトープタグ、および連続する６アラニン残基を含むペプチドを含み、ここで前記Ｇａｌ４ペプチドはそのＣ末端アミノ酸で前記インフルエンザ赤血球凝集素（ＨＡ）エピトープタグのＮ末端アミノ酸に結合され、該インフルエンザ赤血球凝集素（ＨＡ）エピトープタグはそのＣ末端アミノ酸で前記連続する６アラニン残基を含むペプチドのＮ末端アミノ酸に結合され、また前記連続する６アラニン残基を含むペプチドはそのＣ末端アミノ酸で前記ｐ６６サブユニットペプチドのＮ末端アミノ酸に結合している方法。
【請求項４２】
薬学的組成物を製造する方法であって：
（ａ）請求項１〜８の何れかの方法により、或る化合物がＨＩＶ−１逆転写酵素を阻害するかどうかを決定することと；
（ｂ）前記化合物がＨＩＶ−１逆転写酵素を阻害すると決定されたときは、その化合物を回収することと；
（ｃ）前記化合物を薬学的に許容可能なキャリアと混合することとを含む方法。
【請求項４３】
ＨＩＶ−１逆転写酵素のｐ５１サブユニットポリペプチドと、ＨＩＶ−１逆転写酵素のｐ６６サブユニットポリペプチドとの間の複合体の形成を阻害する方法であって、（１）前記ｐ５１サブユニットポリペプチド、（２）前記ｐ６６サブユニットポリペプチド、または（３）前記ｐ５１サブユニットポリペプチドおよび前記ｐ６６サブユニットポリペプチドの両者の何れかを、請求項２の方法により阻害すると決定された化合物の有効量と接触させ、それによってＨＩＶ−１逆転写酵素のｐ５１サブユニットポリペプチドとＨＩＶ−１逆転写酵素のｐ６６サブユニットポリペプチドとの間の複合体の形成を阻害することを含む方法。
【請求項４４】
ＨＩＶ−１逆転写酵素のｐ５１サブユニットポリペプチドと、ＨＩＶ−１逆転写酵素のｐ６６サブユニットポリペプチドとの間の複合体の形成を増大する方法であって、（１）前記ｐ５１サブユニットポリペプチド、（２）前記ｐ６６サブユニットポリペプチド、または（３）前記ｐ５１サブユニットポリペプチドおよび前記ｐ６６サブユニットポリペプチドの両者の何れかを、請求項４の方法により増大すると決定された化合物の有効量と接触させ、それによってＨＩＶ−１逆転写酵素のｐ５１サブユニットポリペプチドとＨＩＶ−１逆転写酵素のｐ６６サブユニットポリペプチドとの間の複合体の形成を増大することを含む方法。
【請求項４５】
ＨＩＶ−１逆転写酵素の第一のｐ６６サブユニットポリペプチドと、ＨＩＶ−１逆転写酵素の第二のｐ６６サブユニットポリペプチドとの間の複合体の形成を阻害する方法であって、（１）前記第一のｐ６６サブユニットポリペプチド、（２）前記第二のｐ６６サブユニットポリペプチド、または（３）前記第一のｐ６６サブユニットポリペプチドおよび前記第二のｐ６６サブユニットポリペプチドの両者の何れかを、請求項６の方法により阻害すると決定された化合物の有効量と接触させ、それによってＨＩＶ−１逆転写酵素の第一のｐ６６サブユニットポリペプチドとＨＩＶ−１逆転写酵素の第二のｐ６６サブユニットポリペプチドとの間の複合体の形成を阻害することを含む方法。
【請求項４６】
ＨＩＶ−１逆転写酵素の第一のｐ６６サブユニットポリペプチドと、ＨＩＶ−１逆転写酵素の第二のｐ６６サブユニットポリペプチドとの間の複合体の形成を増大する方法であって、（１）前記第一のｐ６６サブユニットポリペプチド、（２）前記第二のｐ６６サブユニットポリペプチド、または（３）前記第一のｐ６６サブユニットポリペプチドおよび前記第二のｐ６６サブユニットポリペプチドの両者の何れかを、請求項８の方法により増大すると決定された化合物の有効量と接触させ、それによってＨＩＶ−１逆転写酵素の第一のｐ６６サブユニットポリペプチドとＨＩＶ−１逆転写酵素の第二のｐ６６サブユニットポリペプチドとの間の複合体の形成を増大することを含む方法。
【請求項４７】
請求項４３〜４６の何れか１項に記載の方法であって、前記ＨＩＶ−１逆転写酵素は患者の中に存在し、前記接触は前記化合物を前記患者に投与することにより行われる方法。
【請求項４８】
請求項４７に記載の方法であって、前記化合物は経口投与、静脈内投与、皮下投与、筋肉内投与、局所的投与、またはリポソーム媒介性デリバリーにより投与される方法。
【請求項４９】
請求項４７に記載の方法であって、前記患者は人間、霊長類、ウマ、オピン（ｏｐｉｎｅ）、鳥類、ブタ、イヌ、ネコまたはマウスである方法。
【請求項５０】
請求項４７に記載の方法であって、前記化合物の有効量は、前記患者の体重１ｋｇ当たり約１ ｍｇ〜約５０ ｍｇである方法。
【請求項５１】
請求項５０に記載の方法であって、前記化合物の有効量は、前記患者の体重１ｋｇ当たり約２ ｍｇ〜約４０ ｍｇである方法。
【請求項５２】
請求項５１に記載の方法であって、前記化合物の有効量は、前記患者の体重１ｋｇ当たり約３ ｍｇ〜約３０ ｍｇである方法。
【請求項５３】
請求項５２に記載の方法であって、前記化合物の有効量は、前記患者の体重１ｋｇ当たり約４ ｍｇ〜約２０ ｍｇである方法。
【請求項５４】
請求項５３に記載の方法であって、前記化合物の有効量は、前記患者の体重１ｋｇ当たり約５ ｍｇ〜約１０ ｍｇである方法。
【請求項５５】
請求項５４に記載の方法であって、前記化合物は１日当たり少なくとも１回投与される方法。
【請求項５６】
請求項４７に記載の方法であって、前記化合物は毎日投与される方法。
【請求項５７】
請求項４７に記載の方法であって、前記化合物は１日置きに投与される方法。
【請求項５８】
請求項４７に記載の方法であって、前記化合物は６〜８日毎に投与される方法。
【請求項５９】
請求項４７に記載の方法であって、前記化合物は週１回投与される方法。
【請求項６０】
請求項２に記載の方法により、ＨＩＶ−１逆転写酵素のｐ５１サブユニットポリペプチドと、ＨＩＶ−１逆転写酵素のｐ６６サブユニットポリペプチドとの間の複合体形成を阻害できると決定された化合物。
【請求項６１】
請求項４に記載の方法により、ＨＩＶ−１逆転写酵素のｐ５１サブユニットポリペプチドと、ＨＩＶ−１逆転写酵素のｐ６６サブユニットポリペプチドとの間の複合体形成を増大できると決定された化合物。
【請求項６２】
請求項６に記載の方法により、ＨＩＶ−１逆転写酵素の第一のｐ６６サブユニットポリペプチドと、ＨＩＶ−１逆転写酵素の第二のｐ６６サブユニットポリペプチドとの間の複合体形成を阻害できると決定された化合物。
【請求項６３】
請求項８に記載の方法により、ＨＩＶ−１逆転写酵素の第一のｐ６６サブユニットポリペプチドと、ＨＩＶ−１逆転写酵素の第二のｐ６６サブユニットポリペプチドとの間の複合体形成を増大できると決定された化合物。
【請求項６４】
請求項６０〜６３の何れか１項に記載の化合物と、キャリアとを含有する組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、一部継続であり、２０００年６月６日に出願した米国出願番号０９／５８８９３９の利益を主張し、該仮出願の開示を本明細書の一部として本願に援用する。
【０００２】
本願明細書において開示した発明は、一部をＮＩＨ助成金番号ＡＩ ２７６９０の政府支援のもとでなされた。したがって、米国政府は本発明に対し一定の権利を有する。
【０００３】
本出願の全体にわたって、種々の刊行物が括弧内にて参照される。本発明の属する技術をより完全に記載するために、これらの刊行物の開示を本明細書の一部として本願に援用する。これらの参照のための完全な書誌的な引用文献は、本願明細書の最後に提供される。
【０００４】
【発明の背景】
ＨＩＶ−１逆転写酵素（ＲＴ）は、ゲノムＲＮＡをｃＤＮＡに変換する触媒作用を及ぼす。該酵素は、ｐ６６およびｐ５１サブユニットのヘテロダイマーであり、最適な酵素活性のためには、これらのサブユニットの二量体化が必要である。遺伝的レベルでこのプロセスを解析するために、我々は、酵母ツーハイブリッドシステムでこれらのサブユニット間の相互作用の検出が可能な構築物を開発した。ヘテロ二量体化のために必要とされるＲＴサブドメインの遺伝的解析では、ｐ５１と相互作用するために必ずしもｐ６６のフィンガーおよびパームが必要ではないことが示された。しかし、ｐ５１のＣ末端のほんの２６アミノ酸ほどの欠失により、ｐ６６との二量体化が阻止された。また、ＲＴ二量体化を阻害することが、以前に生化学アッセイによって示されているプライマーグリップ変異（Ｌ２３４Ａ）でも、酵母ツーハイブリッドシステムにおけるＲＴ二量体化を阻止した。酵母においてＲＴ二量体化を回復させる第二部位変異（ｓｅｃｏｎｄ−ｓｉｔｅ ｍｕｔａｔｉｏｎ）をＬ２３４Ａ親株に対して行うと、ダイマー界面およびポリメラーゼ活性部位のトリプトファン繰り返し領域に回復があったことから、ＲＴ二量体化にこれらの部位が関与していることが示唆される。インビトロにでの結合実験において、２つのサブユニットの相互作用に対するＬ２３４Ａの変異およびサプレッサー変異の及ぼす効果を確かめた。ＲＴツーハイブリッドシステムアッセイは、ＲＴ二量体化の大規模な遺伝的解析を容易にするはずであり、この必須プロセスの潜在的阻害剤を迅速にスクリーニングすることを可能にするはずである。
【０００５】
ＨＩＶタイプ１（ＨＩＶ−１）逆転写酵素（ＲＴ）は、ゲノムＲＮＡを二本鎖プロウィルスＤＮＡに変換するために必要であり、この変換は、該酵素のＲＮＡ依存性およびＤＮＡ依存性ポリメラーゼ、並びにリボヌクレアーゼＨ活性よって触媒される。ＨＩＶ−１ ＲＴは、ｐ６６とｐ５１ポリペチドの会合よって形成される非対称ダイマーであり、該ウイルスのプロテアーゼよって、ビリオン集合の間にラージＰｒｌ６０ＧａｇＰｏｌ前駆体から切断される。ｐ５ｌは、ｐ６６と同一のＮ末端配列を含むが、Ｃ末端のリボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅ Ｈ）ドメインを欠いている（１）。ＨＩＶ−１ ＲＴの構造は、結合していない状態（２）、非ヌクレオシドＲＴ阻害剤と複合体を形成した状態（３）またはデオキシヌクレオチド三リン酸を有する（４）もしくは有しない（５，６）二本鎖ＤＮＡと複合体を形成した状態を含む様々な配位におけるＸ線結晶学よって解明された。このような解析により、ｐ６６がポリメラーゼおよびＲＮａｓｅ Ｈドメインに構造的に分割でき、該ポリメラーゼドメインは、さらにフィンガー、パーム、サム（ｔｈｕｍ）およびコネクションサブドメイン（６）に分割できることが示された。ｐ５１は、ｐ６６と同じポリメラーゼドメインを有するにもかかわらず、これらの個々のドメインの相対的な配向は著しく異なり、ｐ５１は閉じた構造をとっている。
【０００６】
ＲＴヘテロダイマーは、該酵素における生物学的に適切な形態の好例であり；単量体サブユニットでは、わずかに低い触媒活性を有する（７）。構造解析では、ｐ６６とｐ５１との間に３箇所の主要な接触があり、該相互作用界面の大部分は、主に疎水性であることを示している（８，９）。３箇所の接触は、ｐ６６のパームを伴うｐ５１のフィンガーサブドメイン、両サブユニットのコネクションサブドメインおよびｐ６６のＲＮａｓｅ Ｈドメインを伴うｐ５１のサムサブドメインを含む広範なダイマー界面から構成されている（９）。
【０００７】
ＨＩＶ−１ ＲＴにおけるいくつかの単一アミノ酸置換により、ヘテロダイマーの会合が抑制されることが示されている（１０−１２）。これらは、Ｌ２３４Ａ（１０，１１）、Ｇ２３１Ａ（１１）およびＷ２２９Ａ （１１）の変異およびサムサブドメインのＬ２８９Ｋ（１２）に位置する。注目すべきことに、これらの変異は、ダイマー界面には位置しておらず、おそらくｐ６６サブユニットのコンホメーション変化を介して間接的にその効果を媒介している。ＲＴ二量体化を特異的に測定するために、以前にいくつかの生化学的アッセイが使用されていた。そのいくつかは、分析用超遠心法（８）およびゲル濾過（７）によって測定されるモノマーとダイマーの物理的な分離に基づいている。その他のアッセイには、内因性のトリプトファン蛍光（１３）、化学的架橋（１４）、アフィニティータグの使用（１５）およびそれ自体のポリメラーゼ活性（７）を含む。これらの方法によっても二量体化を検出するが、これらの方法は特異性を欠いているか、または実施が容易ではない。さらに、これらのアッセイでは、生理学的条件下でタンパク質−タンパク質相互作用の迅速な遺伝的解析をおこなうことは容易ではなく、またこれらはＲＴ二量体化阻害剤のハイスループットスクリーニングに適していない。
【０００８】
酵母ツーハイブリッド（Ｙ２Ｈ）システム（１６）は、いくつかのレトロウイルスタンパク質におけるホモマーの相互作用（たとえば参考文献１７を参照）、およびウィルスタンパク質と種々の細胞のパートナーとの間のへテロマーの相互作用（たとえば参考文献１８を参照）を研究するために利用されている。ＲＴ二量体化決定因子の遺伝的解析を行うために、我々は、この系を使用した。加えて、我々は、非相互作用性変異体ｐ６６とのヘテロ二量体化を回復する二次部位変異を同定した。
【０００９】
【発明の要旨】
本発明は、或る化合物がＨＩＶ−１逆転写酵素を阻害するかどうかを決定する方法であって：
（ａ）前記化合物に、（ｉ）ＨＩＶ−１逆転写酵素のｐ６６サブユニットポリペプチドを含む融合タンパク質を発現する第一のプラスミド、（ｉｉ）ＨＩＶ−１逆転写酵素のｐ５１サブユニットポリペプチドを含む融合タンパク質を発現する第二のプラスミド、および（ｉｉｉ）ｐ６６サブユニットポリペプチドおよびｐ５１サブユニットポリペプチドの複合体の存在下で活性化されるレポータ遺伝子を含む酵母細胞を接触させて、前記化合物の存在下での前記細胞中の前記レポータ遺伝子の活性レベルを決定することと；
（ｂ）工程（ａ）で決定された前記レポータ遺伝子の活性レベルを、前記化合物の非存在下で決定された前記レポータ遺伝子の活性レベルと比較することとを含み、前記工程（ａ）におけるレポータ遺伝子の減少した活性レベルは、前記化合物がＨＩＶ−１逆転写酵素のｐ５１サブユニットポリペプチドとＨＩＶ−１逆転写酵素のｐ６６サブユニットポリペプチドとの間の複合体の形成を阻害することを示し、それによって前記化合物はＨＩＶ−１逆転写酵素を阻害することが示される方法を提供する。
【００１０】
本発明は、或る化合物がＨＩＶ−１逆転写酵素のｐ５１サブユニットポリペプチドとＨＩＶ−１逆転写酵素のｐ６６サブユニットポリペプチドとの間の複合体の形成を阻害するかどうかを決定する方法であって：
（ａ）前記化合物に、（ｉ）ＨＩＶ−１逆転写酵素のｐ６６サブユニットポリペプチドを含む融合タンパク質を発現する第一のプラスミド、（ｉｉ）ＨＩＶ−１逆転写酵素のｐ５１サブユニットポリペプチドを含む融合タンパク質を発現する第二のプラスミド、および（ｉｉｉ）ｐ６６サブユニットポリペプチドおよびｐ５１サブユニットポリペプチドの複合体の存在下で活性化されるレポータ遺伝子を含む酵母細胞を接触させて、前記化合物の存在下での前記細胞中の前記レポータ遺伝子の活性レベルを決定することと；
（ｂ）工程（ａ）で決定された前記レポータ遺伝子の活性レベルを、前記化合物の非存在下で決定された前記レポータ遺伝子の活性レベルと比較することとを含み、前記工程（ａ）におけるレポータ遺伝子の減少した活性レベルによって、前記化合物がＨＩＶ−１逆転写酵素のｐ５１サブユニットポリペプチドとＨＩＶ−１逆転写酵素のｐ６６サブユニットポリペプチドとの間の複合体の形成を阻害することが示される方法を提供する。
【００１１】
本発明は、或る化合物がＨＩＶ−１逆転写酵素を阻害するかどうかを決定する方法であって：
（ａ）前記化合物に、（ｉ）ＨＩＶ−１逆転写酵素のｐ６６サブユニットポリペプチドを含む融合タンパク質を発現する第一のプラスミド、（ｉｉ）ＨＩＶ−１逆転写酵素のｐ５１サブユニットポリペプチドを含む融合タンパク質を発現する第二のプラスミド、および（ｉｉｉ）ｐ６６サブユニットポリペプチドおよびｐ５１サブユニットポリペプチドの複合体の存在下で活性化されるレポータ遺伝子を含む酵母細胞を接触させて、前記化合物の存在下での前記細胞中の前記レポータ遺伝子の活性レベルを決定することと；
（ｂ）工程（ａ）で決定された前記レポータ遺伝子の活性レベルを、前記化合物の非存在下で決定された前記レポータ遺伝子の活性レベルと比較することとを含み、前記工程（ａ）におけるレポータ遺伝子の増大した活性レベルは、前記化合物がＨＩＶ−１逆転写酵素のｐ５１サブユニットポリペプチドとＨＩＶ−１逆転写酵素のｐ６６サブユニットポリペプチドとの間での複合体形成の活性化剤であることを示し、それによって前記化合物はＨＩＶ−１逆転写酵素を阻害することが示される方法を提供する。
【００１２】
本発明は、或る化合物がＨＩＶ−１逆転写酵素のｐ５１サブユニットポリペプチドとＨＩＶ−１逆転写酵素のｐ６６サブユニットポリペプチドとの間の複合体の形成を増大するかどうかを決定する方法であって：
（ａ）前記化合物に、（ｉ）ＨＩＶ−１逆転写酵素のｐ６６サブユニットポリペプチドを含む融合タンパク質を発現する第一のプラスミド、（ｉｉ）ＨＩＶ−１逆転写酵素のｐ５１サブユニットポリペプチドを含む融合タンパク質を発現する第二のプラスミド、および（ｉｉｉ）ｐ６６サブユニットポリペプチドおよびｐ５１サブユニットポリペプチドの複合体の存在下で活性化されるレポータ遺伝子を含む酵母細胞を接触させて、前記化合物の存在下での前記細胞中の前記レポータ遺伝子の活性レベルを決定することと；
（ｂ）工程（ａ）で決定された前記レポータ遺伝子の活性レベルを、前記化合物の非存在下で決定された前記レポータ遺伝子の活性レベルと比較することとを含み、前記工程（ａ）におけるレポータ遺伝子の増大した活性レベルによって、前記化合物が、ＨＩＶ−１逆転写酵素のｐ５１サブユニットポリペプチドとＨＩＶ−１逆転写酵素のｐ６６サブユニットポリペプチドとの間での複合体形成の活性化剤であることが示される方法を提供する。
【００１３】
本発明は、或る化合物がＨＩＶ−１逆転写酵素を阻害するかどうかを決定する方法であって：
（ａ）前記化合物に、（ｉ）ＨＩＶ−１逆転写酵素の第一のｐ６６サブユニットポリペプチドを含む融合タンパク質を発現する第一のプラスミド、（ｉｉ）ＨＩＶ−１逆転写酵素の第二のｐ６６サブユニットポリペプチドを含む融合タンパク質を発現する第二のプラスミド、および（ｉｉｉ）前記第一のｐ６６サブユニットポリペプチドおよび前記第二のｐ６６サブユニットポリペプチドの複合体の存在下で活性化されるレポータ遺伝子を含む酵母細胞を接触させて、前記化合物の存在下での前記細胞中の前記レポータ遺伝子の活性レベルを決定することと；
（ｂ）工程（ａ）で決定された前記レポータ遺伝子の活性レベルを、前記化合物の非存在下で決定された前記レポータ遺伝子の活性レベルと比較することとを含み、前記工程（ａ）におけるレポータ遺伝子の減少した活性レベルは、前記化合物がＨＩＶ−１逆転写酵素の前記第一のｐ６６サブユニットポリペプチドとＨＩＶ−１逆転写酵素の前記第二のｐ６６サブユニットポリペプチドとの間の複合体の形成を阻害することを示し、それによって前記化合物はＨＩＶ−１逆転写酵素を阻害することが示される方法を提供する。
【００１４】
本発明は、或る化合物がＨＩＶ−１逆転写酵素の第一のｐ６６サブユニットポリペプチドとＨＩＶ−１逆転写酵素の第二のｐ６６サブユニットポリペプチドとの間の複合体の形成を阻害するかどうかを決定する方法であって：
（ａ）前記化合物に、（ｉ）ＨＩＶ−１逆転写酵素の第一のｐ６６サブユニットポリペプチドを含む融合タンパク質を発現する第一のプラスミド、（ｉｉ）ＨＩＶ−１逆転写酵素の第二のｐ６６サブユニットポリペプチドを含む融合タンパク質を発現する第二のプラスミド、および（ｉｉｉ）前記第一のｐ６６サブユニットポリペプチドおよび前記第二のｐ６６サブユニットポリペプチドの複合体の存在下で活性化されるレポータ遺伝子を含む酵母細胞を接触させて、前記化合物の存在下での前記細胞中の前記レポータ遺伝子の活性レベルを決定することと；
（ｂ）工程（ａ）で決定された前記レポータ遺伝子の活性レベルを、前記化合物の非存在下で決定された前記レポータ遺伝子の活性レベルと比較することとを含み、前記工程（ａ）におけるレポータ遺伝子の減少した活性レベルによって、前記化合物がＨＩＶ−１逆転写酵素の前記第一のｐ６６サブユニットポリペプチドとＨＩＶ−１逆転写酵素の前記第二のｐ６６サブユニットポリペプチドとの間の複合体の形成を阻害することが示される方法を提供する。
【００１５】
本発明は、或る化合物がＨＩＶ−１逆転写酵素を阻害するかどうかを決定する方法であって：
（ａ）前記化合物に、（ｉ）ＨＩＶ−１逆転写酵素の第一のｐ６６サブユニットポリペプチドを含む融合タンパク質を発現する第一のプラスミド、（ｉｉ）ＨＩＶ−１逆転写酵素の第二のｐ６６サブユニットポリペプチドを含む融合タンパク質を発現する第二のプラスミド、および（ｉｉｉ）前記第一のｐ６６サブユニットポリペプチドおよび前記第二のｐ６６サブユニットポリペプチドの複合体の存在下で活性化されるレポータ遺伝子を含む酵母細胞を接触させて、前記化合物の存在下での前記細胞中の前記レポータ遺伝子の活性レベルを決定することと；
（ｂ）工程（ａ）で決定された前記レポータ遺伝子の活性レベルを、前記化合物の非存在下で決定された前記レポータ遺伝子の活性レベルと比較することとを含み、前記工程（ａ）におけるレポータ遺伝子の増大した活性レベルは、前記化合物がＨＩＶ−１逆転写酵素の前記第一のｐ６６サブユニットポリペプチドとＨＩＶ−１逆転写酵素の前記第二のｐ６６サブユニットポリペプチドとの間での複合体形成の活性化剤であることを示し、それによって前記化合物はＨＩＶ−１逆転写酵素を阻害することが示される方法を提供する。
【００１６】
本発明は、或る化合物がＨＩＶ−１逆転写酵素の第一のｐ６６サブユニットポリペプチドとＨＩＶ−１逆転写酵素の第二のｐ６６サブユニットポリペプチドとの間の複合体の形成を増大するかどうかを決定する方法であって：
（ａ）前記化合物に、（ｉ）ＨＩＶ−１逆転写酵素の第一のｐ６６サブユニットポリペプチドを含む融合タンパク質を発現する第一のプラスミド、（ｉｉ）ＨＩＶ−１逆転写酵素の第二のｐ６６サブユニットポリペプチドを含む融合タンパク質を発現する第二のプラスミド、および（ｉｉｉ）前記第一のｐ６６サブユニットポリペプチドおよび前記第二のｐ６６サブユニットポリペプチドの複合体の存在下で活性化されるレポータ遺伝子を含む酵母細胞を接触させて、前記化合物の存在下での前記細胞中の前記レポータ遺伝子の活性レベルを決定することと；
（ｂ）工程（ａ）で決定された前記レポータ遺伝子の活性レベルを、前記化合物の非存在下で決定された前記レポータ遺伝子の活性レベルと比較することとを含み、前記工程（ａ）におけるレポータ遺伝子の増大した活性レベルによって、前記化合物がＨＩＶ−１逆転写酵素の前記第一のｐ６６サブユニットポリペプチドとＨＩＶ−１逆転写酵素の前記第二のｐ６６サブユニットポリペプチドとの間での複合体形成の活性化剤であることが示される方法を提供する。
【００１７】
本発明は、医薬組成物を製造する方法であって：
（ａ）本明細書に記載の方法の一つの方法により、或る化合物がＨＩＶ−１逆転写酵素を阻害するかどうかを決定することと；
（ｂ）前記化合物がＨＩＶ−１逆転写酵素を阻害すると決定されたときは、その化合物を回収することと；
（ｃ）前記化合物を薬学的に許容可能なキャリアと混合することとを含む方法を提供する。
【００１８】
本発明は、ＨＩＶ−１逆転写酵素のｐ５１サブユニットポリペプチドと、ＨＩＶ−１逆転写酵素のｐ６６サブユニットポリペプチドとの間の複合体の形成を阻害する方法であって、（１）前記ｐ５１サブユニットポリペプチド、（２）前記ｐ６６サブユニットポリペプチド、または（３）前記ｐ５１サブユニットポリペプチドおよび前記ｐ６６サブユニットポリペプチドの両者の何れかを、請求項２の方法により阻害すると決定された化合物の有効量と接触させ、それによってＨＩＶ−１逆転写酵素のｐ５１サブユニットポリペプチドとＨＩＶ−１逆転写酵素のｐ６６サブユニットポリペプチドとの間の複合体の形成を阻害することを含む方法を提供する。
【００１９】
本発明は、ＨＩＶ−１逆転写酵素のｐ５１サブユニットポリペプチドと、ＨＩＶ−１逆転写酵素のｐ６６サブユニットポリペプチドとの間の複合体の形成を増大する方法であって、（１）前記ｐ５１サブユニットポリペプチド、（２）前記ｐ６６サブユニットポリペプチド、または（３）前記ｐ５１サブユニットポリペプチドおよび前記ｐ６６サブユニットポリペプチドの両者の何れかを、請求項４の方法により増大すると決定された化合物の有効量と接触させ、それによってＨＩＶ−１逆転写酵素のｐ５１サブユニットポリペプチドとＨＩＶ−１逆転写酵素のｐ６６サブユニットポリペプチドとの間の複合体の形成を増大することを含む方法を提供する。
【００２０】
本発明は、ＨＩＶ−１逆転写酵素の第一のｐ６６サブユニットポリペプチドと、ＨＩＶ−１逆転写酵素の第二のｐ６６サブユニットポリペプチドとの間の複合体の形成を阻害する方法であって、（１）前記第一のｐ６６サブユニットポリペプチド、（２）前記第二のｐ６６サブユニットポリペプチド、または（３）前記第一のｐ６６サブユニットポリペプチドおよび前記第二のｐ６６サブユニットポリペプチドの両者の何れかを、請求項６の方法により阻害すると決定された化合物の有効量と接触させ、それによってＨＩＶ−１逆転写酵素の第一のｐ６６サブユニットポリペプチドとＨＩＶ−１逆転写酵素の第二のｐ６６サブユニットポリペプチドとの間の複合体の形成を阻害することを含む方法を提供する。
【００２１】
本発明は、ＨＩＶ−１逆転写酵素の第一のｐ６６サブユニットポリペプチドと、ＨＩＶ−１逆転写酵素の第二のｐ６６サブユニットポリペプチドとの間の複合体の形成を増大する方法であって、（１）前記第一のｐ６６サブユニットポリペプチド、（２）前記第二のｐ６６サブユニットポリペプチド、または（３）前記第一のｐ６６サブユニットポリペプチドおよび前記第二のｐ６６サブユニットポリペプチドの両者の何れかを、請求項８の方法により増大すると決定された化合物の有効量と接触させ、それによってＨＩＶ−１逆転写酵素の第一のｐ６６サブユニットポリペプチドとＨＩＶ−１逆転写酵素の第二のｐ６６サブユニットポリペプチドとの間の複合体の形成を増大することを含む方法を提供する。
【００２２】
本発明は、ＨＩＶ−１逆転写酵素のｐ５１サブユニットポリペプチドと、ＨＩＶ−１逆転写酵素のｐ６６サブユニットポリペプチドとの間の複合体形成を阻害できると決定された化合物を提供する。
【００２３】
本発明は、ＨＩＶ−１逆転写酵素のｐ５１サブユニットポリペプチドと、ＨＩＶ−１逆転写酵素のｐ６６サブユニットポリペプチドとの間の複合体形成を増大できると決定された化合物を提供する。
【００２４】
本発明は、ＨＩＶ−１逆転写酵素の第一のｐ６６サブユニットポリペプチドと、ＨＩＶ−１逆転写酵素の第二のｐ６６サブユニットポリペプチドとの間の複合体形成を阻害できると決定された化合物を提供する。
【００２５】
本発明は、ＨＩＶ−１逆転写酵素の第一のｐ６６サブユニットポリペプチドと、ＨＩＶ−１逆転写酵素の第二のｐ６６サブユニットポリペプチドとの間の複合体形成を増大できると決定された化合物を提供する。
【００２６】
【発明の詳細な記述】
本発明は、或る化合物がＨＩＶ−１逆転写酵素を阻害するかどうかを決定する方法であって：
（ａ）前記化合物に、（ｉ）ＨＩＶ−１逆転写酵素のｐ６６サブユニットポリペプチドを含む融合タンパク質を発現する第一のプラスミド、（ｉｉ）ＨＩＶ−１逆転写酵素のｐ５１サブユニットポリペプチドを含む融合タンパク質を発現する第二のプラスミド、および（ｉｉｉ）ｐ６６サブユニットポリペプチドおよびｐ５１サブユニットポリペプチドの複合体の存在下で活性化されるレポータ遺伝子を含む酵母細胞を接触させて、前記化合物の存在下での前記細胞中の前記レポータ遺伝子の活性レベルを決定することと；
（ｂ）工程（ａ）で決定された前記レポータ遺伝子の活性レベルを、前記化合物の非存在下で決定された前記レポータ遺伝子の活性レベルと比較することとを含み、前記工程（ａ）におけるレポータ遺伝子の減少した活性レベルは、前記化合物がＨＩＶ−１逆転写酵素のｐ５１サブユニットポリペプチドとＨＩＶ−１逆転写酵素のｐ６６サブユニットポリペプチドとの間の複合体の形成を阻害することを示し、それによって前記化合物はＨＩＶ−１逆転写酵素を阻害することが示される方法を提供する。
【００２７】
本発明は、或る化合物がＨＩＶ−１逆転写酵素のｐ５１サブユニットポリペプチドとＨＩＶ−１逆転写酵素のｐ６６サブユニットポリペプチドとの間の複合体の形成を阻害するかどうかを決定する方法であって：
（ａ）前記化合物に、（ｉ）ＨＩＶ−１逆転写酵素のｐ６６サブユニットポリペプチドを含む融合タンパク質を発現する第一のプラスミド、（ｉｉ）ＨＩＶ−１逆転写酵素のｐ５１サブユニットポリペプチドを含む融合タンパク質を発現する第二のプラスミド、および（ｉｉｉ）ｐ６６サブユニットポリペプチドおよびｐ５１サブユニットポリペプチドの複合体の存在下で活性化されるレポータ遺伝子を含む酵母細胞を接触させて、前記化合物の存在下での前記細胞中の前記レポータ遺伝子の活性レベルを決定することと；
（ｂ）工程（ａ）で決定された前記レポータ遺伝子の活性レベルを、前記化合物の非存在下で決定された前記レポータ遺伝子の活性レベルと比較することとを含み、前記工程（ａ）におけるレポータ遺伝子の減少した活性レベルによって、前記化合物がＨＩＶ−１逆転写酵素のｐ５１サブユニットポリペプチドとＨＩＶ−１逆転写酵素のｐ６６サブユニットポリペプチドとの間の複合体の形成を阻害することが示される方法を提供する。
【００２８】
本発明は、或る化合物がＨＩＶ−１逆転写酵素を阻害するかどうかを決定する方法であって：
（ａ）前記化合物に、（ｉ）ＨＩＶ−１逆転写酵素のｐ６６サブユニットポリペプチドを含む融合タンパク質を発現する第一のプラスミド、（ｉｉ）ＨＩＶ−１逆転写酵素のｐ５１サブユニットポリペプチドを含む融合タンパク質を発現する第二のプラスミド、および（ｉｉｉ）ｐ６６サブユニットポリペプチドおよびｐ５１サブユニットポリペプチドの複合体の存在下で活性化されるレポータ遺伝子を含む酵母細胞を接触させて、前記化合物の存在下での前記細胞中の前記レポータ遺伝子の活性レベルを決定することと；
（ｂ）工程（ａ）で決定された前記レポータ遺伝子の活性レベルを、前記化合物の非存在下で決定された前記レポータ遺伝子の活性レベルと比較することとを含み、前記工程（ａ）におけるレポータ遺伝子の増大した活性レベルは、前記化合物がＨＩＶ−１逆転写酵素のｐ５１サブユニットポリペプチドとＨＩＶ−１逆転写酵素のｐ６６サブユニットポリペプチドとの間での複合体形成の活性化剤であることを示し、それによって前記化合物はＨＩＶ−１逆転写酵素を阻害することが示される方法を提供する。
【００２９】
本発明は、或る化合物がＨＩＶ−１逆転写酵素のｐ５１サブユニットポリペプチドとＨＩＶ−１逆転写酵素のｐ６６サブユニットポリペプチドとの間の複合体の形成を増大するかどうかを決定する方法であって：
（ａ）前記化合物に、（ｉ）ＨＩＶ−１逆転写酵素のｐ６６サブユニットポリペプチドを含む融合タンパク質を発現する第一のプラスミド、（ｉｉ）ＨＩＶ−１逆転写酵素のｐ５１サブユニットポリペプチドを含む融合タンパク質を発現する第二のプラスミド、および（ｉｉｉ）ｐ６６サブユニットポリペプチドおよびｐ５１サブユニットポリペプチドの複合体の存在下で活性化されるレポータ遺伝子を含む酵母細胞を接触させて、前記化合物の存在下での前記細胞中の前記レポータ遺伝子の活性レベルを決定することと；
（ｂ）工程（ａ）で決定された前記レポータ遺伝子の活性レベルを、前記化合物の非存在下で決定された前記レポータ遺伝子の活性レベルと比較することとを含み、前記工程（ａ）におけるレポータ遺伝子の増大した活性レベルによって、前記化合物が、ＨＩＶ−１逆転写酵素のｐ５１サブユニットポリペプチドとＨＩＶ−１逆転写酵素のｐ６６サブユニットポリペプチドとの間での複合体形成の活性化剤であることが示される方法を提供する。
【００３０】
本発明は、或る化合物がＨＩＶ−１逆転写酵素を阻害するかどうかを決定する方法であって：
（ａ）前記化合物に、（ｉ）ＨＩＶ−１逆転写酵素の第一のｐ６６サブユニットポリペプチドを含む融合タンパク質を発現する第一のプラスミド、（ｉｉ）ＨＩＶ−１逆転写酵素の第二のｐ６６サブユニットポリペプチドを含む融合タンパク質を発現する第二のプラスミド、および（ｉｉｉ）前記第一のｐ６６サブユニットポリペプチドおよび前記第二のｐ６６サブユニットポリペプチドの複合体の存在下で活性化されるレポータ遺伝子を含む酵母細胞を接触させて、前記化合物の存在下での前記細胞中の前記レポータ遺伝子の活性レベルを決定することと；
（ｂ）工程（ａ）で決定された前記レポータ遺伝子の活性レベルを、前記化合物の非存在下で決定された前記レポータ遺伝子の活性レベルと比較することとを含み、前記工程（ａ）におけるレポータ遺伝子の減少した活性レベルは、前記化合物がＨＩＶ−１逆転写酵素の前記第一のｐ６６サブユニットポリペプチドとＨＩＶ−１逆転写酵素の前記第二のｐ６６サブユニットポリペプチドとの間の複合体の形成を阻害することを示し、それによって前記化合物はＨＩＶ−１逆転写酵素を阻害することが示される方法を提供する。
【００３１】
本発明は、或る化合物がＨＩＶ−１逆転写酵素の第一のｐ６６サブユニットポリペプチドとＨＩＶ−１逆転写酵素の第二のｐ６６サブユニットポリペプチドとの間の複合体の形成を阻害するかどうかを決定する方法であって：
（ａ）前記化合物に、（ｉ）ＨＩＶ−１逆転写酵素の第一のｐ６６サブユニットポリペプチドを含む融合タンパク質を発現する第一のプラスミド、（ｉｉ）ＨＩＶ−１逆転写酵素の第二のｐ６６サブユニットポリペプチドを含む融合タンパク質を発現する第二のプラスミド、および（ｉｉｉ）前記第一のｐ６６サブユニットポリペプチドおよび前記第二のｐ６６サブユニットポリペプチドの複合体の存在下で活性化されるレポータ遺伝子を含む酵母細胞を接触させて、前記化合物の存在下での前記細胞中の前記レポータ遺伝子の活性レベルを決定することと；
（ｂ）工程（ａ）で決定された前記レポータ遺伝子の活性レベルを、前記化合物の非存在下で決定された前記レポータ遺伝子の活性レベルと比較することとを含み、前記工程（ａ）におけるレポータ遺伝子の減少した活性レベルによって、前記化合物がＨＩＶ−１逆転写酵素の前記第一のｐ６６サブユニットポリペプチドとＨＩＶ−１逆転写酵素の前記第二のｐ６６サブユニットポリペプチドとの間の複合体の形成を阻害することが示される方法を提供する。
【００３２】
本発明は、或る化合物がＨＩＶ−１逆転写酵素を阻害するかどうかを決定する方法であって：
（ａ）前記化合物に、（ｉ）ＨＩＶ−１逆転写酵素の第一のｐ６６サブユニットポリペプチドを含む融合タンパク質を発現する第一のプラスミド、（ｉｉ）ＨＩＶ−１逆転写酵素の第二のｐ６６サブユニットポリペプチドを含む融合タンパク質を発現する第二のプラスミド、および（ｉｉｉ）前記第一のｐ６６サブユニットポリペプチドおよび前記第二のｐ６６サブユニットポリペプチドの複合体の存在下で活性化されるレポータ遺伝子を含む酵母細胞を接触させて、前記化合物の存在下での前記細胞中の前記レポータ遺伝子の活性レベルを決定することと；
（ｂ）工程（ａ）で決定された前記レポータ遺伝子の活性レベルを、前記化合物の非存在下で決定された前記レポータ遺伝子の活性レベルと比較することとを含み、前記工程（ａ）におけるレポータ遺伝子の増大した活性レベルは、前記化合物がＨＩＶ−１逆転写酵素の前記第一のｐ６６サブユニットポリペプチドとＨＩＶ−１逆転写酵素の前記第二のｐ６６サブユニットポリペプチドとの間での複合体形成の活性化剤であることを示し、それによって前記化合物はＨＩＶ−１逆転写酵素を阻害することが示される方法を提供する。
【００３３】
本発明は、或る化合物がＨＩＶ−１逆転写酵素の第一のｐ６６サブユニットポリペプチドとＨＩＶ−１逆転写酵素の第二のｐ６６サブユニットポリペプチドとの間の複合体の形成を増大するかどうかを決定する方法であって：
（ａ）前記化合物に、（ｉ）ＨＩＶ−１逆転写酵素の第一のｐ６６サブユニットポリペプチドを含む融合タンパク質を発現する第一のプラスミド、（ｉｉ）ＨＩＶ−１逆転写酵素の第二のｐ６６サブユニットポリペプチドを含む融合タンパク質を発現する第二のプラスミド、および（ｉｉｉ）前記第一のｐ６６サブユニットポリペプチドおよび前記第二のｐ６６サブユニットポリペプチドの複合体の存在下で活性化されるレポータ遺伝子を含む酵母細胞を接触させて、前記化合物の存在下での前記細胞中の前記レポータ遺伝子の活性レベルを決定することと；
（ｂ）工程（ａ）で決定された前記レポータ遺伝子の活性レベルを、前記化合物の非存在下で決定された前記レポータ遺伝子の活性レベルと比較することとを含み、前記工程（ａ）におけるレポータ遺伝子の増大した活性レベルによって、前記化合物がＨＩＶ−１逆転写酵素の前記第一のｐ６６サブユニットポリペプチドとＨＩＶ−１逆転写酵素の前記第二のｐ６６サブユニットポリペプチドとの間での複合体形成の活性化剤であることが示される方法を提供する。
【００３４】
また、本願明細書に記載される方法は、酵母細胞に加えて他のタイプの細胞に用いられてもよい。その他の細胞タイプは、真核細胞、原核細胞、細菌細胞、大腸菌細胞、哺乳動物細胞およびヒト細胞を含むが、これに限定されるものではない。
【００３５】
本願明細書に記載される方法の一態様において、（ａ）前記第一のプラスミドによって発現された融合タンパク質は、ＤＮＡ結合ドメインを有するペプチドを含み、（ｂ）前記第二のプラスミドによって発現された融合タンパク質は、転写活性化ドメインを有するペプチドを含む。
【００３６】
本願明細書に記載される方法の一態様において、（ａ）前記第一のプラスミドによって発現された融合タンパク質は、転写活性化ドメインを有するペプチドを含み、また（ｂ）前記第二のプラスミドによって発現された融合タンパク質は、ＤＮＡ結合ドメインを有するペプチドを含む。
【００３７】
本願明細書に記載される融合タンパク質の一態様において、ＤＮＡ結合ドメインを有するペプチドは、ｐ６６またはｐ５１サブユニットポリペチドに関するＮ末端である。もう一つの態様において、ＤＮＡ結合ドメインを有するペプチドは、ｐ６６またはｐ５１サブユニットポリペチドに関するＣ末端である。ＤＮＡ結合ドメインを有するペプチドは、融合タンパク質においてｐ５１またはｐ６６サブユニットポリペチドに結合されてもよい。一つの態様において、それらはペプチド結合よって結合される。あるいは、また、融合タンパク質は、ペプチドリンカーおよび／またはエピトープタグなどの一以上のさらなる成分を含んでいてもよい。これらのさらなる成分は、ペプチドをｐ５１またはｐ６６サブユニットポリペチドから分離してもよい。種々の成分は、たがいにペプチド結合よって結合されてもよい。
【００３８】
本願明細書に記載される融合タンパク質の一態様において、転写活性化ドメインを有するペプチドは、ｐ６６またはｐ５１サブユニットポリペチドに関するＮ末端である。もう一つの態様において、転写活性化ドメインを有するペプチドは、ｐ６６またはｐ５１サブユニットポリペチドに関するＣ末端である。転写活性化ドメインを有するペプチドは、融合タンパク質においてｐ５１またはｐ６６サブユニットポリペチドに結合されてもよい。一つの態様において、それらはペプチド結合よって結合される。あるいは、また、融合タンパク質は、ペプチドリンカーおよび／またはエピトープタグなどの一以上のさらなる成分を含んでいてもよい。これらのさらなる成分は、ペプチドをｐ５１またはｐ６６サブユニットポリペチドから分離してもよい。種々の成分は、たがいにペプチド結合よって結合されてもよい。
【００３９】
本願明細書に記載される発明は、種々のＨＩＶ−１株の中からのｐ５１およびｐ６６サブユニットを使用してもよい。一つには、いずれのＨＩＶ−１株に由来するｐ６６およびｐ５１の逆転写酵素をコードする領域を使用してもよい。たとえば、ＨＩＶ−１ ＮＬ４−３株では、そのアミノ酸および核酸配列は、Ｇｅｎｂａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ番号Ｍ１９９２１として寄託されたｐＮＬ４−３クローンに見出されるであろう。ｐ５１およびｐ６６サブユニットは、同じＮ末端配列を共有するが、ｐ５１は、Ｃ末端のリボヌクレアーゼＨ領域を有しない。したがって、ｐ６６は、該ＲＴ遺伝子のコドン１−５６０と一致し、ｐ５１は、該ＲＴ遺伝子のコドン１−４４０と一致する。
【００４０】
本発明は、以下などの、その他のＨＩＶ−１株を使用してもよい：
ＨＩＶＨＸＢ２Ｇ（Ｇｅｎｂａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ番号Ｋ０３４５５）、ＨＩＶＢＲＵＣＧ（Ｇｅｎｂａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ番号Ｋ０２０１３）、ＨＩＶＭＮＣＧ（Ｇｅｎｂａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ番号Ｍ１７４４９）、ＨＩＶＮＹ５ＣＧ（Ｇｅｎｂａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ番号Ｍ３８４３１））；ＨＩＶＪＲＣＣＳＦ（Ｇｅｎｂａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ番号Ｍ３８４２９）およびＨＩＶＳＦ２ＣＧ（Ｇｅｎｂａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ番号Ｋ０２００７）。
【００４１】
本願明細書に記載される融合タンパク質の一態様において、ＤＮＡ結合ドメインはＬｅｘＡ ＤＮＡ結合ドメインである。ＬｅｘＡのアミノ酸配列および核酸配列は、Ｇｅｎｂａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ番号Ｊ０１６４３に見出される。本願明細書に記載される方法の一態様において、ＤＮＡ結合ドメインを有するペプチドは、ＤＮＡ結合ドメインを有するペプチドは、ＬｅｘＡアミノ酸残基１〜８７を含む。アミノ酸残基１−８７に対応するＬｅｘＡ部分は、ＬｅｘＡタンパク質ＤＮＡ結合ドメインを含んでいてもよい。本願明細書に記載される方法の一態様において、ＤＮＡ結合ドメインを有するペプチドは、ＬｅｘＡのアミノ酸残基１〜２０２を含む。アミノ酸残基１−２０２に対応するＬｅｘＡ部分は、ＬｅｘＡタンパク質ＤＮＡ結合ドメインを含んでいてもよい。
【００４２】
本願明細書に記載される融合タンパク質の一態様において、ＤＮＡ結合ドメインは、ＧＡＬ４ ＤＮＡ結合ドメインである。Ｇａｌ４のアミノ酸配列および核酸配列は、Ｇｅｎｂａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ番号Ｋ０１４８６に見出される。
【００４３】
本願明細書に記載される融合タンパク質の一態様において、転写活性化ドメインは、ＧＡＬ４ 転写活性化ドメインである。一態様において、転写活性化ドメインを有するペプチドは、ＧＡＬ４アミノ酸残基７６８〜８８１を含む。アミノ酸残基７６８−８８１に態様するＧａｌ４部分は、Ｇａｌ４活性化ドメインを含んでいてもよい。
【００４４】
本願明細書に記載される融合タンパク質の一態様において、転写活性化ドメインは、ＶＰ１６転写活性化ドメインである。ＶＰ１６のアミノ酸配列および核酸配列は、Ｇｅｎｂａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ番号Ｕ８９９６３に見出される。
【００４５】
本願明細書に記載される融合タンパク質の一態様において、第一のプラスミド、第二のプラスミド、またはその両方のプラスミドにより発現された融合タンパク質は、連続するアラニン残基を含むペプチドを含んでいる。連続するアラニン残基を含む上記ペプチドを、アラニンリンカーと称してもよい。このようなリンカー配列は、アラニン以外の一連の連続するアミノ酸残基であってもよい。このようなリンカー配列は、種々の長さのものであってもよい。たとえば、リンカーは２つのアミノ酸、３つのアミノ酸、４つのアミノ酸、５つのアミノ酸、６つのアミノ酸、７つのアミノ酸、８つのアミノ酸、９つのアミノ酸または１０のアミノ酸を含んでもよい。また、ペプチドリンカーは、より長い長さのもので、たとえば約１０のアミノ酸から約２０のアミノ酸であってもよい。一つの態様において、連続するアラニン残基を含むペプチドは、少なくとも６つのアラニン残基を含む。
【００４６】
ここで使用するものとして、以下の標準的省略記号が、特定のアミノ酸を示すために明細書の全体にわたって使用される：Ａ＝ａｌａ＝アラニン；Ｒ＝ａｒｇ＝アルギニン；Ｎ＝ａｓｎ＝アスパラギン；Ｄ＝ａｓｐ＝アスパラギン酸；Ｃ＝ｃｙｓ＝システイン；Ｑ＝ｇｌｎ＝グルタミン；Ｅ＝ｇｌｕ＝グルタミン酸；Ｇ＝ｇｌｙ＝グリシン；Ｈ＝ｈｉｓ＝ヒスチジン；Ｉ＝ｉｌｅ＝イソロイシン；Ｌ＝ｌｅｕ＝ロイシン；Ｋ＝ｌｙｓ＝リジン；Ｍ＝ｍｅｔ＝メチオニン；Ｆ＝ｐｈｅ＝フェニルアラニン；Ｐ＝ｐｒｏ＝プロリン；Ｓ＝ｓｅｒ＝セリン；Ｔ＝ｔｈｒ＝スレオニン；Ｗ＝ｔｒｐ＝トリプトファン；Ｙ＝ｔｙｒ＝チロシン；Ｖ＝ｖａｌ＝バリン；Ｂ＝ａｓｘ＝アスパラギンまたはアスパラギン酸；Ｚ＝ｇｌｘ＝グルタミンまたはグルタミン酸。
【００４７】
ここで使用するものとして、以下の標準的省略記号が、特定のヌクレオチドを示すために明細書の全体にわたって使用される：Ｃ＝シトシン；Ａ＝アデノシン；Ｔ＝チミジン；Ｇ＝グアノシン；およびＵ＝ウラシル。
【００４８】
本願明細書に記載される融合タンパク質の一態様において、融合タンパク質は、インフルエンザ赤血球凝集素（ＨＡ）エピトープタグを含む。インフルエンザ赤血球凝集素（ＨＡ）エピトープ配列は、Ｇｅｎｂａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ番号Ｕ２９８９９のプラスミドｐＡＣＴ２のヌクレオチド塩基５０４２−５０６８に見出されるであろう。また、本発明は、当業者に既知のその他のタイプのエピトープタグを含んでもよい。
【００４９】
本願明細書に記載される融合タンパク質の一態様において、リポータ遺伝子は、ＬａｃＺリポータ遺伝子である。ＬａｃＺのアミノ酸配列および核酸配列は、Ｇｅｎｂａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ番号Ｕ８９６７１に見出されるであろう。
【００５０】
本願明細書に記載される融合タンパク質の一態様において、（ａ）第一のプラスミドにより発現された融合タンパク質はＬｅｘＡタンパク質ＤＮＡ結合ドメインを含んだペプチドを含み、ここでｐ６６サブユニットポリペプチドはそのＣ末端アミノ酸においてＬｅｘＡタンパク質ＤＮＡ結合ドメインを含むペプチドのＮ末端アミノ酸に結合しており；（ｂ）第二のプラスミドにより発現された融合タンパク質はＧａｌ４のアミノ酸７６８〜８８１に対応するＧａｌ４ペプチド、およびインフルエンザ赤血球凝集素（ＨＡ）エピトープタグを含み、ここでＧａｌ４ペプチドはそのＣ末端アミノ酸においてインフルエンザ赤血球凝集素（ＨＡ）エピトープタグのＮ末端アミノ酸に結合しており、該インフルエンザ赤血球凝集素（ＨＡ）エピトープタグはそのＣ末端においてｐ５１サブユニットポリペプチドのＮ末端アミノ酸に結合している。
【００５１】
本願明細書に記載される融合タンパク質において、互いに関連する種々の成分の位置は、変更されてもよい。たとえば上記記載の態様において、ＬｅｘＡタンパク質ＤＮＡ結合ドメインを含んだペプチドは、そのＣ末端アミノ酸においてｐ６６サブユニットポリペプチドのＮ末端アミノ酸に結合している。ｐ５１サブユニットポリペプチドは、Ｇａｌ４ペプチドＮ末端に結合している。当業者であれば、本明細書に記載した種々のベクターおよびプラスミドの作製方法および使用方法を知っているであろう。
【００５２】
本願明細書に記載される融合タンパク質の一態様において、（ａ）前記第一のプラスミドにより発現された融合タンパク質はＬｅｘＡタンパク質ＤＮＡ結合ドメインを含んだペプチドを含み、ここで前記ｐ６６サブユニットポリペプチドはそのＣ末端アミノ酸において前記ＬｅｘＡタンパク質ＤＮＡ結合ドメインを含むペプチドのＮ末端アミノ酸に結合しており；（ｂ）前記第二のプラスミドにより発現された融合タンパク質はＧａｌ４のアミノ酸７６８〜８８１に対応するＧａｌ４ペプチドを含み、該Ｇａｌ４ペプチドはそのＣ末端アミノ酸において前記ｐ５１サブユニットポリペプチドのＮ末端アミノ酸に結合している。
【００５３】
本願明細書に記載される融合タンパク質の一態様において、（ａ）前記第一のプラスミドにより発現された融合タンパク質はアミノ酸残基１〜８７に対応するＬｅｘＡペプチドを含み、ここで該ＬｅｘＡペプチドはそのＣ末端アミノ酸でｐ６６サブユニットポリペプチドのＮ末端アミノ酸に結合しており；（ｂ）前記第二のプラスミドにより発現された融合タンパク質はＧａｌ４のアミノ酸７６８〜８８１に対応するＧａｌ４ペプチド、およびインフルエンザ赤血球凝集素（ＨＡ）エピトープタグを含み、前記Ｇａｌ４ペプチドはそのＣ末端アミノ酸でインフルエンザ赤血球凝集素（ＨＡ）エピトープタグのＮ末端アミノ酸に結合され、該インフルエンザ赤血球凝集素（ＨＡ）エピトープタグはそのＣ末端アミノ酸で前記ｐ５１サブユニットポリペプチドのＮ末端アミノ酸に結合している。
【００５４】
本願明細書に記載される融合タンパク質の一態様において、（ａ）前記第一のプラスミドにより発現された融合タンパク質はアミノ酸残基１〜８７に対応するＬｅｘＡペプチドを含み、ここで該ＬｅｘＡペプチドはそのＣ末端アミノ酸でｐ６６サブユニットポリペプチドのＮ末端アミノ酸に結合しており；（ｂ）前記第二のプラスミドにより発現された融合タンパク質はＧａｌ４のアミノ酸７６８〜８８１に対応するＧａｌ４ペプチドを含み、該Ｇａｌ４ペプチドはそのＣ末端アミノ酸で前記ｐ５１サブユニットポリペプチドのＮ末端アミノ酸に結合している。
【００５５】
本願明細書に記載される融合タンパク質の一態様において、（ａ）前記第一のプラスミドにより発現された融合タンパク質はアミノ酸残基１〜２０２に対応するＬｅｘＡペプチド、および連続する６アラニン残基を含むペプチドを含み、ここで前記ＬｅｘＡペプチドはそのＣ末端アミノ酸で前記連続する６アラニン残基を含むペプチドのＮ末端アミノ酸に結合し、また前記連続する６アラニン残基を含むペプチドはそのＣ末端アミノ酸で前記ｐ６６サブユニットポリペプチドのＮ末端アミノ酸に結合しており；（ｂ）前記第二のプラスミドにより発現された融合タンパク質はＧａｌ４のアミノ酸７６８〜８８１に対応するＧａｌ４ペプチドを含み、該Ｇａｌ４ペプチドはそのＣ末端アミノ酸で前記ｐ５１サブユニットポリペプチドのＮ末端アミノ酸に結合している。
【００５６】
本願明細書に記載される融合タンパク質の一態様において、（ａ）前記第一のプラスミドにより発現された融合タンパク質はアミノ酸残基１〜２０２に対応するＬｅｘＡペプチド、および連続する６アラニン残基を含むペプチドを含み、ここで前記ＬｅｘＡペプチドはそのＣ末端アミノ酸で前記連続する６アラニン残基を含むペプチドのＮ末端アミノ酸に結合し、また前記連続する６アラニン残基を含むペプチドはそのＣ末端アミノ酸で前記ｐ６６サブユニットポリペプチドのＮ末端アミノ酸に結合しており；（ｂ）前記第二のプラスミドにより発現された融合タンパク質はＧａｌ４のアミノ酸７６８〜８８１に対応するＧａｌ４ペプチド、およびインフルエンザ赤血球凝集素（ＨＡ）エピトープタグを含み、前記Ｇａｌ４ペプチドはそのＣ末端アミノ酸でインフルエンザ赤血球凝集素（ＨＡ）エピトープタグのＮ末端アミノ酸に結合され、該インフルエンザ赤血球凝集素（ＨＡ）エピトープタグはそのＣ末端アミノ酸で前記ｐ５１サブユニットポリペプチドのＮ末端アミノ酸に結合している。
【００５７】
本願明細書に記載される融合タンパク質の一態様において、（ａ）前記第一のプラスミドにより発現された融合タンパク質はＧａｌ４のアミノ酸７６８〜８８１に対応するＧａｌ４ペプチド、インフルエンザ赤血球凝集素（ＨＡ）エピトープタグ、および連続する６アラニン残基を含むペプチドを含み、ここで前記Ｇａｌ４ペプチドはそのＣ末端アミノ酸で前記インフルエンザ赤血球凝集素（ＨＡ）エピトープタグのＮ末端アミノ酸に結合され、該インフルエンザ赤血球凝集素（ＨＡ）エピトープタグはそのＣ末端アミノ酸で前記連続する６アラニン残基を含むペプチドのＮ末端アミノ酸に結合され、また前記連続する６アラニン残基を含むペプチドはそのＣ末端アミノ酸で前記ｐ６６サブユニットペプチドのＮ末端アミノ酸に結合しており；（ｂ）前記第二のプラスミドにより発現された融合タンパク質はＬｅｘＡタンパク質ＤＮＡ結合ドメインを含んだペプチドを含み、ここで前記ｐ５１サブユニットポリペプチドがそのＣ末端アミノ酸において前記ＬｅｘＡタンパク質ＤＮＡ結合ドメインを含むペプチドのＮ末端アミノ酸に結合している。
【００５８】
本願明細書に記載される融合タンパク質の一態様において、（ａ）前記第一のプラスミドにより発現された融合タンパク質はＧａｌ４のアミノ酸７６８〜８８１に対応するＧａｌ４ペプチド、インフルエンザ赤血球凝集素（ＨＡ）エピトープタグ、および連続する６アラニン残基を含むペプチドを含み、ここで前記Ｇａｌ４ペプチドはそのＣ末端アミノ酸で前記インフルエンザ赤血球凝集素（ＨＡ）エピトープタグのＮ末端アミノ酸に結合され、該インフルエンザ赤血球凝集素（ＨＡ）エピトープタグはそのＣ末端アミノ酸で前記連続する６アラニン残基を含むペプチドのＮ末端アミノ酸に結合され、また前記連続する６アラニン残基を含むペプチドはそのＣ末端アミノ酸で前記ｐ６６サブユニットペプチドのＮ末端アミノ酸に結合しており；（ｂ）前記第二のプラスミドにより発現された融合タンパク質はＬｅｘＡタンパク質ＤＮＡ結合ドメインを含んだペプチドを含み、ここで前記ＬｅｘＡタンパク質ＤＮＡ結合ドメインを含むペプチドはそのＣ末端アミノ酸で前記ｐ５１サブユニットポリペプチドのＮ末端アミノ酸に結合している。
【００５９】
本願明細書に記載される融合タンパク質の一態様において、（ａ）前記第一のプラスミドにより発現された融合タンパク質はＧａｌ４のアミノ酸７６８〜８８１に対応するＧａｌ４ペプチド、インフルエンザ赤血球凝集素（ＨＡ）エピトープタグ、および連続する６アラニン残基を含むペプチドを含み、ここで前記Ｇａｌ４ペプチドはそのＣ末端アミノ酸で前記インフルエンザ赤血球凝集素（ＨＡ）エピトープタグのＮ末端アミノ酸に結合され、該インフルエンザ赤血球凝集素（ＨＡ）エピトープタグはそのＣ末端アミノ酸で前記連続する６アラニン残基を含むペプチドのＮ末端アミノ酸に結合され、また前記連続する６アラニン残基を含むペプチドはそのＣ末端アミノ酸で前記ｐ６６サブユニットペプチドのＮ末端アミノ酸に結合しており；（ｂ）前記第二のプラスミドにより発現された融合タンパク質はＧａｌ４タンパク質ＤＮＡ結合ドメインを含むペプチドを含んでおり、該Ｇａｌ４タンパク質ＤＮＡ結合ドメインを含むペプチドは、そのＣ末端アミノ酸で前記ｐ５１サブユニットポリペプチドのＮ末端アミノ酸に結合している。
【００６０】
本願明細書に記載される融合タンパク質の一態様において、（ａ）前記第一のプラスミドにより発現された融合タンパク質はＧａｌ４のアミノ酸７６８〜８８１に対応するＧａｌ４ペプチドを含み、ここで該Ｇａｌ４ペプチドはそのＣ末端アミノ酸で前記ｐ６６サブユニットペプチドのＮ末端アミノ酸に結合しており；（ｂ）前記第二のプラスミドにより発現された融合タンパク質はＬｅｘＡタンパク質ＤＮＡ結合ドメインを含んだペプチドを含み、ここで前記ｐ５１サブユニットポリペプチドはそのＣ末端アミノ酸で前記ＬｅｘＡタンパク質ＤＮＡ結合ドメインを含むペプチドのＮ末端アミノ酸に結合している。
【００６１】
本願明細書に記載される融合タンパク質の一態様において、（ａ）前記第一のプラスミドにより発現された融合タンパク質はＧａｌ４のアミノ酸７６８〜８８１に対応するＧａｌ４ペプチドを含み、ここで該Ｇａｌ４ペプチドはそのＣ末端アミノ酸で前記ｐ６６サブユニットペプチドのＮ末端アミノ酸に結合しており；（ｂ）前記第二のプラスミドにより発現された融合タンパク質はＬｅｘＡタンパク質ＤＮＡ結合ドメインを含むペプチドを含んでおり、該ＬｅｘＡタンパク質ＤＮＡ結合ドメインを含むペプチドはそのＣ末端アミノ酸で前記ｐ５１サブユニットポリペプチドのＮ末端アミノ酸に結合している。
【００６２】
本願明細書に記載される融合タンパク質の一態様において、（ａ）前記第一のプラスミドにより発現された融合タンパク質はＧａｌ４のアミノ酸７６８〜８８１に対応するＧａｌ４ペプチドを含み、ここで該Ｇａｌ４ペプチドはそのＣ末端アミノ酸で前記ｐ６６サブユニットペプチドのＮ末端アミノ酸に結合しており；（ｂ）前記第二のプラスミドにより発現された融合タンパク質はＧａｌ４タンパク質ＤＮＡ結合ドメインを含むペプチドを含んでおり、該Ｇａｌ４タンパク質ＤＮＡ結合ドメインを含むペプチドはそのＣ末端アミノ酸で前記ｐ５１サブユニットポリペプチドのＮ末端アミノ酸に結合している。
【００６３】
本願明細書に記載される融合タンパク質の一態様において、（ａ）前記第一のプラスミドによって発現された融合タンパク質は、ＬｅｘＡタンパク質ＤＮＡ結合ドメインを含むペプチドを含んでおり、ここで前記ｐ６６サブユニットポリペプチドはそのＣ末端アミノ酸で前記ＬｅｘＡタンパク質ＤＮＡ結合ドメインを含むペプチドのＮ末端アミノ酸に結合しており、（ｂ）前記第二のプラスミドにより発現された融合タンパク質はＧａｌ４のアミノ酸７６８〜８８１に対応するＧａｌ４ペプチド、インフルエンザ赤血球凝集素（ＨＡ）エピトープタグ、および連続する６アラニン残基を含むペプチドを含み、ここで前記Ｇａｌ４ペプチドはそのＣ末端アミノ酸で前記インフルエンザ赤血球凝集素（ＨＡ）エピトープタグのＮ末端アミノ酸に結合され、該インフルエンザ赤血球凝集素（ＨＡ）エピトープタグはそのＣ末端アミノ酸で前記連続する６アラニン残基を含むペプチドのＮ末端アミノ酸に結合され、また前記連続する６アラニン残基を含むペプチドはそのＣ末端アミノ酸で前記ｐ６６サブユニットペプチドのＮ末端アミノ酸に結合している。
【００６４】
本発明は、薬学的組成物を製造する方法であって：
（ａ）請求項１〜８の何れかの方法により、或る化合物がＨＩＶ−１逆転写酵素を阻害するかどうかを決定することと；
（ｂ）前記化合物がＨＩＶ−１逆転写酵素を阻害すると決定されたときは、その化合物を回収することと；
（ｃ）前記化合物を薬学的に許容可能なキャリアと混合することとを含む方法を提供する。
【００６５】
ここで使用するものとして、「阻害」は、本化合物を伴わないコントロールサンプルにおいて生じるであろう量と比較して、その量が減少されることを意味する。ここで使用するものとして、「増大」は、本化合物を伴わないコントロールサンプルにおいて生じるであろう量と比較して、その量が増加されることを意味する。
【００６６】
ここで使用するものとして、「化合物」の用語は、タンパク質部分および非タンパク部分の両者を含む。一つの態様において、該化合物は、小分子である。もう一つの態様において、該化合物は、タンパク質である。タンパク質は、一例として、ｐ５１またはｐ６６サブユニットの一部に対する抗体であってもよい。薬剤は、低分子量化合物ライブラリーまたは植物またはその他の生物からの抽出物ライブラリーに由来してもよい。一つの態様において、薬剤は既知である。別の態様において、薬剤はこれまでに知られていない。本発明の薬剤は、ペプチドなどの化合物または分子的実体、ポリペチド、並びにその他の有機または無機分子およびその組合せを含むが、これに限定されるものではない。
【００６７】
本願明細書に記載される方法の一態様において、化合物は、抗体または抗体の一部である。抗体の一態様において、抗体はモノクローナル抗体である。抗体の一態様において、抗体はポリクローナル抗体である。抗体の一態様において、抗体はヒト化された抗体である。抗体の一態様において、抗体はキメラ抗体である。抗体の部分は、抗体のＬ鎖を含んでいてもよい。抗体の部分は、抗体のＨ鎖を含んでいてもよい。抗体の部分は、抗体のＦａｂ部分を含んでいてもよい。抗体の部分は、抗体のＦ（ａｂ’）２部分を含んでいてもよい。抗体の部分は、抗体のＦｖ部分を含んでいてもよい。抗体の部分は、抗体のＦｖ部分を含んでいてもよい。抗体の部分は、抗体の可変ドメインを含んでいてもよい。抗体の部分は、一以上の抗体のＣＤＲドメインを含んでいてもよい。
【００６８】
本願明細書に記載される方法の一態様において、化合物は、ポリペチドである。本願明細書に記載される方法の一態様において、化合物は、オリゴペプチドである。本願明細書に記載される方法の一態様において、化合物は、非ペプチジル剤である。一つの態様において、非ペプチジル剤は、５００ダルトン未満の分子量を有する化合物である。
【００６９】
本願明細書に記載される方法の一態様において、ＨＩＶ−１逆転写酵素またはそのｐ５１およびｐ６６サブユニットは、患者に存在し、かつ接触は、該患者に化合物を投与することによって効果が及ぼされる。したがって、本発明は、ＨＩＶに苦しむ患者の治療などのＨＩＶ治療を含む種々の適用法を有する。ここで使用するものとして、「ＨＩＶに苦しむ」とは、ＨＩＶに感染した少なくとも一つの細胞を有する患者を意味する。ここで使用するものとして、「治療」とは、ＨＩＶ疾患の進行を遅くする、止める、または逆転させることのいずれかを意味する。好ましい態様において、「治療」は、該疾患の除去される程度まで進行を逆転させることを意味する。また、ここで使用するものとして、「治療」は、ウイルス感染数の減少、感染性ウイルス粒子数の減少、ウイルス感染細胞数の減少、またはＨＩＶに付随する症状の改善を意味する。本発明のもう一つの適用は、患者がＨＩＶにかかるのを防止することである。ここで使用するものとして、「ＨＩＶにかかる」とは、ＨＩＶに感染し、その遺伝情報が複製され、および／または宿主細胞に組み込まれることを意味する。本発明のもう一つの適用は、ＨＩＶに感染した患者を治療することである。ここで使用するものとして、「ＨＩＶ感染」とは、ＨＩＶまたはＨＩＶエンベロープ糖タンパク質＋細胞と標的細胞膜との融合などによりＨＩＶ遺伝情報が標的細胞に導入されることを意味する。標的細胞は、患者の身体の細胞であってもよい。好ましい態様において、標的細胞は、ヒト患者の身体の細胞である。本発明のもう一つの適用は、ＨＩＶ感染を抑制することである。ここで使用するものとして、「ＨＩＶ感染を抑制すること」とは、前記組成物なしで導入されるであろう遺伝情報量と比較して、標的細胞群に導入されるＨＩＶの遺伝情報量を減少することを意味する。
【００７０】
本発明は、ＨＩＶに苦しむ患者を治療する方法であって、本願明細書に記載した組成物の薬剤の有効な用量を患者に投与することを含む方法を提供する。一つの態様において、薬剤または組成物は、患者のウイルス負荷を減少させるのに十分であろう。ここで使用するものとして、「治療」とは、ＨＩＶ疾患の進行を遅くする、止める、または逆転させることのいずれかを意味する。好ましい態様において、「治療」は、該疾患の除去される程度まで進行を逆転させることを意味する。また、ここで使用するものとして、「治療」は、ウイルス感染数の減少、感染性ウイルス粒子数の減少、ウイルス感染細胞数の減少、またはＨＩＶに付随する症状の改善を意味する。ここで使用するものとして、「ＨＩＶに苦しむ」とは、ＨＩＶに感染した少なくとも一つの細胞を有する患者を意味する。
【００７１】
本発明は、患者がＨＩＶにかかるのを防止する方法であって、本願明細書に記載した薬剤または組成物の有効な用量を患者に投与することを含む方法を提供する。本発明の薬剤または組成物の用量は、患者によりおよび、使用される投与の特定の経路によって変更されるであろう。用量は、０．１〜１００，０００μｇ／ｋｇで変動することができる。組成物に基づいて、用量は、連続ポンプなどによって連続的に、または周期的間隔で送達することができる。たとえば、一以上の別の機会にである。特定の組成物を多回投与する所望の時間間隔は、当業者よって過度の実験を伴わずに決定することができる。
【００７２】
ここで使用するものとして、「有効な用量」とは、患者を治療するため、または患者がＨＩＶに感染するのを防止するためのいずれかに充分量の量を意味する。当業者は、患者を治療するために必要とされる量を決定するために、簡単な滴定実験を行うことができる。ここで使用するものとして、「ＨＩＶにかかる」とは、ＨＩＶに感染し、その遺伝情報が複製され、および／または宿主細胞に組み込まれることを意味する。一つの態様において、有効な量の薬剤または組成物は、患者の体重の約０．０００００１ｍｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重までを含む。
【００７３】
ここで使用するものとして、「患者」とは、ＨＩＶに感染することができるいずれの動物または人工的に修飾された動物を意味する。患者は、人間、霊長類、ウマ、オピン（ｏｐｉｎｅ）、鳥類、ブタ、イヌ、ネコまたはマウスを含むが、これに限定されるものではない。人工的に修飾された動物は、ヒト免疫系をもつＳＣＩＤマウスを含むが、これに限定されるものではない。動物は、マウス、ラット、イヌ、モルモット、白イタチ、ウサギおよび霊長目動物を含むが、これに限定されるものではない。好ましい態様において、患者は、ヒトである。患者は、彼自身のまたは彼女自身の細胞のうちの少なくとも１つにＨＩＶが侵入した細胞を有する患者である「ＨＩＶ感染患者」であってもよい。好ましい態様において、ＨＩＶ感染患者は、ヒトである。彼自身のまたは彼女自身の細胞のうちのいずれにもＨＩＶが侵入していない細胞を有する患者である「非ＨＩＶ感染患者」であってもよい。好ましい態様において、非ＨＩＶ感染患者は、ヒトである。
【００７４】
ここで使用するものとして、「投与」は、当業者に既知の方法のいずれを使用して効果を及ぼし、または行なわれてもよく、この方法は、病巣内、腹腔内、筋肉内、皮下、静脈内、リポソーム媒介性デリバリー、経粘膜、腸管、局所的、経鼻、経口、肛門、眼または耳のデリバリーを含む。
【００７５】
一つの態様において、投与される化合物の量は、患者の体重ｋｇ当たり約１ ｍｇ〜約５０ ｍｇである。一つの態様において、投与される化合物の量は、患者の体重ｋｇ当たり約２ｍｇ〜約４０ｍｇである。一つの態様において、投与される化合物の量は、患者の体重ｋｇ当たり約３ ｍｇ〜約３０ ｍｇである。一つの態様において、投与される化合物の量は、患者の体重ｋｇ当たり約４ ｍｇ〜約２０ ｍｇである。一つの態様において、投与される化合物の量は、患者の体重１ｋｇ当たり約５ ｍｇ〜約１０ ｍｇである。
本願明細書に記載される方法の一態様において、化合物は、１日当たり少なくとも１回投与される。本願明細書に記載される方法の一態様において、薬剤は、毎日投与される。本願明細書に記載される方法の一態様において、薬剤は、１日置きに投与される。本願明細書に記載される方法の一態様において、薬剤は、６〜８日毎に投与される。本願明細書に記載される方法の一態様において、薬剤は、は週１回投与される。
【００７６】
本発明は、ＨＩＶ−１逆転写酵素のｐ５１サブユニットポリペプチドと、ＨＩＶ−１逆転写酵素のｐ６６サブユニットポリペプチドとの間の複合体の形成を阻害する方法であって、（１）前記ｐ５１サブユニットポリペプチド、（２）前記ｐ６６サブユニットポリペプチド、または（３）前記ｐ５１サブユニットポリペプチドおよび前記ｐ６６サブユニットポリペプチドの両者の何れかを、請求項２の方法により阻害すると決定された化合物の有効量と接触させ、それによってＨＩＶ−１逆転写酵素のｐ５１サブユニットポリペプチドとＨＩＶ−１逆転写酵素のｐ６６サブユニットポリペプチドとの間の複合体の形成を阻害することを含む方法を提供する。
【００７７】
本発明は、ＨＩＶ−１逆転写酵素のｐ５１サブユニットポリペプチドと、ＨＩＶ−１逆転写酵素のｐ６６サブユニットポリペプチドとの間の複合体の形成を増大する方法であって、（１）前記ｐ５１サブユニットポリペプチド、（２）前記ｐ６６サブユニットポリペプチド、または（３）前記ｐ５１サブユニットポリペプチドおよび前記ｐ６６サブユニットポリペプチドの両者の何れかを、請求項４の方法により増大すると決定された化合物の有効量と接触させ、それによってＨＩＶ−１逆転写酵素のｐ５１サブユニットポリペプチドとＨＩＶ−１逆転写酵素のｐ６６サブユニットポリペプチドとの間の複合体の形成を増大することを含む方法を提供する。
【００７８】
本発明は、ＨＩＶ−１逆転写酵素の第一のｐ６６サブユニットポリペプチドと、ＨＩＶ−１逆転写酵素の第二のｐ６６サブユニットポリペプチドとの間の複合体の形成を阻害する方法であって、（１）前記第一のｐ６６サブユニットポリペプチド、（２）前記第二のｐ６６サブユニットポリペプチド、または（３）前記第一のｐ６６サブユニットポリペプチドおよび前記第二のｐ６６サブユニットポリペプチドの両者の何れかを、請求項６の方法により阻害すると決定された化合物の有効量と接触させ、それによってＨＩＶ−１逆転写酵素の第一のｐ６６サブユニットポリペプチドとＨＩＶ−１逆転写酵素の第二のｐ６６サブユニットポリペプチドとの間の複合体の形成を阻害することを含む方法を提供する。
【００７９】
本発明は、ＨＩＶ−１逆転写酵素の第一のｐ６６サブユニットポリペプチドと、ＨＩＶ−１逆転写酵素の第二のｐ６６サブユニットポリペプチドとの間の複合体の形成を増大する方法であって、（１）前記第一のｐ６６サブユニットポリペプチド、（２）前記第二のｐ６６サブユニットポリペプチド、または（３）前記第一のｐ６６サブユニットポリペプチドおよび前記第二のｐ６６サブユニットポリペプチドの両者の何れかを、請求項８の方法により増大すると決定された化合物の有効量と接触させ、それによってＨＩＶ−１逆転写酵素の第一のｐ６６サブユニットポリペプチドとＨＩＶ−１逆転写酵素の第二のｐ６６サブユニットポリペプチドとの間の複合体の形成を増大することを含む方法を提供する。
【００８０】
上記方法の一つの態様において、ＨＩＶ−１逆転写酵素は患者の中に存在し、接触は化合物を患者に投与することにより行われる方法を提供する。化合物は、当業者に既知の種々の経路で投与されてもよく、化合物は、経口的に、静脈内に、皮下に、筋肉内に、局所的に、またはリポソームを媒介したデリバリーよって投与することを含むが、これに限定されない。患者は、いずれの患者であってもよく、人間、霊長類、ウマ、オピン（ｏｐｉｎｅ）、鳥類、ブタ、イヌ、ネコまたはマウスを含むが、これに限定されるものではない。一つの態様において、化合物は毎日投与される。一つの態様において、化合物は１日置きに投与される。一つの態様において、化合物はは６〜８日毎に投与される。一つの態様において、化合物は、週１回投与される。
【００８１】
本発明は、ＨＩＶ−１逆転写酵素のｐ５１サブユニットポリペプチドと、ＨＩＶ−１逆転写酵素のｐ６６サブユニットポリペプチドとの間の複合体形成を阻害できると決定された化合物を提供する。
【００８２】
本発明は、ＨＩＶ−１逆転写酵素のｐ５１サブユニットポリペプチドと、ＨＩＶ−１逆転写酵素のｐ６６サブユニットポリペプチドとの間の複合体形成を増大できると決定された化合物を提供する。
【００８３】
本発明は、ＨＩＶ−１逆転写酵素の第一のｐ６６サブユニットポリペプチドと、ＨＩＶ−１逆転写酵素の第二のｐ６６サブユニットポリペプチドとの間の複合体形成を阻害できると決定された化合物を提供する。
【００８４】
本発明は、ＨＩＶ−１逆転写酵素の第一のｐ６６サブユニットポリペプチドと、ＨＩＶ−１逆転写酵素の第二のｐ６６サブユニットポリペプチドとの間の複合体形成を増大できると決定された化合物を提供する。
【００８５】
本発明は、本明細書に記載のいずれか一つの化合物と、キャリアとを含有する組成物を提供する。ここで使用するものとして、「組成物」とは、混合物を意味する。組成物は、経口、直腸、膣内、局所、鼻、眼、または非経口的、静脈内、皮下、筋肉内、および腹膜内で患者に投与を含むが、これに限定されるものではない。ここで使用するものとして、「非経口的」は、皮下、静脈内、筋肉内もしくは胸内への注射または注入技術を含むが、これに限定されるものではない。
【００８６】
本発明は、本明細書に記載の薬剤または化合物と、キャリアとを含有する組成物を提供する。このようなキャリアは、薬学的に許容可能なキャリアであってもよい。薬学的に許容可能なキャリアは、当業者に周知である。このような薬学的に許容可能なキャリアは、水系または非水系溶液、懸濁液および乳剤を含んでももよいが、これに限定されるものではない。非水系溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油などの植物油およびオレイン酸エチルなどの注射可能な有機エステルである。水性のキャリアは、水、アルコール性／水性溶液、乳剤または懸濁液、塩類溶液および緩衝液を含む。非経口的な媒体は、塩化ナトリウム溶液、リンゲルデキストロース、デキストロースおよび塩化ナトリウム、リンゲル 乳酸塩または不揮発性油を含む。経静脈媒体は、液および栄養源補充液、リンゲルデキストロースに基づくものなどの電解質補充液、その他同種のものを含む。また、防腐剤およびその他の添加剤が存在してもよく、たとえば抗菌物質、抗酸化剤、キレート剤、不活性ガスその他同種のものなどである。
【００８７】
本願明細書に記載された薬剤の一つの態様において、化合物は、抗体または抗体の一部である。ここで使用するものとして、「抗体」とは、２本のＨ鎖および２本のＬ鎖を含んでいる免疫グロブリン分子を意味し、この分子は抗原を認識する。免疫グロブリン分子は、通常知られるいずれのクラスに由来してもよく、ＩｇＡ、分泌型ＩｇＡ、ＩｇＧおよびＩｇＭを含むが、これに限定されない。また、ＩｇＧサブクラスは、当業者に周知であり、ヒトＩｇＧＩ、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４を含むが、これに限定されるものではない。抗体には、一例として、天然に生じた抗体および天然に生じない抗体の両者を含む。特に、「抗体」は、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体、並びにその一価および二価の断片を含む。さらに、「抗体」は、キメラ抗体、全合成抗体、一本鎖抗体およびその断片を含む。任意に、抗体は、検出可能なマーカーでラベルすることができる。検出可能なマーカーは、たとえば放射性マーカーまたは蛍光マーカーを含む。抗体は、ヒトまたは非ヒト抗体であってもよい。非ヒト抗体は、組換え法によってヒト化して、ヒトに対するその免疫原性を減らしてもよい。抗体をヒト化するための方法は、当業者に既知である。ここで使用するものとして、「モノクローナル抗体」は、ｍＡｂとしても示され、一次配列が本質的に同一であり、同じ抗原特異性を示す抗体分子を表すために使用される。モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ、組換え体、トランスジェニックまたはその他の当業者に既知の技術によって製造されてもよい。「抗体」の用語は、天然に存在する抗体および天然に存在しない抗体の両者を含む。特に、「抗体」の用語は、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体、並びにその抗原結合断片を含む。さらに、「抗体」の用語は、キメラ抗体、全合成抗体、およびその抗原結合断片を含む。したがって、一つの態様において、抗体はモノクローナル抗体である。一つの態様において、抗体はポリクローナル抗体である。一つの態様において、抗体はヒト化された抗体である。一つの態様において、抗体はキメラ抗体である。このようなキメラ抗体は、１つの供与源に由来する抗体の一部およびもう一つの供与源に由来する抗体の一部を含んでいてもよい。
【００８８】
一つの態様において、抗体の部分は、抗体のＬ鎖を含む。ここで使用するものとして、「Ｌ鎖」は、１つの可変ドメイン（ＶＬ）および１つの不変ドメイン（ＣＬ）、またはその断片から成るより小さい抗体分子のポリペチドを意味する。一つの態様において、抗体の部分は、抗体のＨ鎖を含む。ここで使用するものとして、「Ｈ鎖」は、１つの可変ドメイン（ＶＨ）および３または４つの不変ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３およびＣＨ４）、またはその断片から構成されるより大きい抗体分子のポリペチドを意味する。一つの態様において、抗体の部分は、抗体のＦａｂ部分を含む。ここで使用するものとして、「Ｆａｂ」とは、１つのＬ鎖とＨ鎖の一部からなる免疫グロブリンの一価の抗原結合性断片を意味する。これは、簡単なパパイン消化よって、または組換え法によって得ることができる。一つの態様において、抗体の部分は、抗体のＦ（ａｂ’）２部分を含む。ここで使用するものとして、「Ｆ（ａｂ’）２断片」とは、両方のＬ鎖と両方のＨ鎖の一部からなる免疫グロブリンの二価抗原結合性断片を意味する。これは、簡潔なペプシン消化または組換え法によって得ることができる。一つの態様において、抗体の部分は、抗体のＦｄ部分を含む。一つの態様において、抗体の部分は、抗体のＦｖ部分を含む。一つの態様において、抗体の部分は、抗体の変化領域を含む。一つの態様において、抗体の部分は、抗体の不変領域を含む。一つの態様において、抗体の部分は、抗体の一以上のＣＤＲドメインを含む。ここで使用するものとして、「ＣＤＲ」または「相補性決定領域」とは、抗体の可変ドメインにおける非常に変化しやすいアミノ酸配列を意味する。
【００８９】
本発明は、本願明細書において記載される抗体のヒト化された形態を提供する。
【００９０】
ここで使用するものとして、「ヒト化された」とは、抗体であって、抗体の、ＣＤＲ領域の外側のアミノ酸の一部、ほとんどまたは全てが、ヒト免疫グロブリン分子に由来する対応するアミノ酸と置換された抗体を表す。ヒト化された形態の抗体の一つの態様においてＣＤＲ領域の外側のアミノ酸の一部、ほとんどまたは全てが、ヒト免疫グロブリン分子由来のアミノ酸と置換されているが、一以上のＣＤＲ領域内の一部、ほとんどまたは全てのアミノ酸は変更されていない。
【００９１】
小さな付加、欠失、挿入、置換またはアミノ酸の改変は、所与の抗原に抗体が結合する機能を、これらが抑止しない限り認められる。適切なヒト免疫グロブリン分子は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡおよびＩｇＭ分子を含むであろう。「ヒト化された」抗体は、もとの抗体と同様の抗原特異性を保持しているであろう。
【００９２】
当業者であれば、本発明のヒト化された抗体の作製方法を知っているであろう。また、種々の刊行物（いくつか）において、ヒト化された抗体の作製方法が記載していおり、いずれも本願明細書によって本出願に援用される。たとえば、米国特許第４，８１６，５６７号に記載される方法は、１つの抗体の可変領域ともう一つの抗体の定常領域を有するキメラ抗体の産生を含む。
【００９３】
米国特許第５，２２５，５３９号は、ヒト化された抗体の産生のためのもう一つのアプローチを記載する。この特許には、ヒト化された抗体を製造するための組換えＤＮＡ技術の使用であって、該ヒト化抗体は所望の標的を認識するが、ヒト患者の免疫系によって有意に認識されないように、１つの免疫グロブリンの可変領域のＣＤＲｓが種々の特異性を有する免疫グロブリンから該ＣＤＲｓと置換される使用が記載されている。特に、ＣＤＲｓをフレームワークに移植するために、部位特異的変異誘発が使用される。
【００９４】
ヒト化免疫グロブリンを製造するためのその他のアプローチは、米国特許番号５，５８５，０８９および５，６９３，７６１およびＷＯ９０／０７８６１に記載されており、これらには、ヒト化抗体を製造するための方法が記載されている。これらは、一以上のＣＤＲｓと、ドナー免疫グロブリン由来の適切なさらなるアミノ酸と、適切なヒト免疫グロブリン由来のフレームワーク領域とを有する。これらの特許には、所望の抗原に対する抗体のアフィニティを増加するための方法が記載されている。フレームワークにおける一部のアミノ酸は、アクセプターよりむしろドナーにおけるそれらの部位のアミノ酸と同じとなるように選択される。特に、これらの特許では、ヒト免疫グロブリンフレームワークおよび定常領域を有するマウスモノクローナル抗体のＣＤＲｓを結合することよって受容体に結合するヒト化抗体の製造が記載されている。ヒトのフレームワーク領域は、マウス配列との相同性が最大となるように選択することができる。ＣＤＲｓまたは特定の抗原と相互作用しそうなフレームワーク領域内のアミノ酸を同定するために、コンピュータモデルを使用することができ、次いでヒト化抗体を製造するために、これらの部位でのマウスアミノ酸を使用することができる。
【００９５】
また、上記の特許５，５８５，０８９および５，６９３，７６１およびＷＯ９０／０７８６１では、ヒト化抗体をデザインするために使用可能な、４つの実行可能な判定基準を提供する。第一の提案は、アクセプターのためのものであり、ヒト化されるドナー免疫グロブリンと非常に相同的な特定のヒト免疫グロブリン由来のフレームワークの使用または多くのヒト抗体由来のコンセンサスフレームワークの使用である。第二の提案は、ヒト免疫グロブリンのフレームワークのアミノ酸がまれであり、かつその位置のドナーアミノ酸がヒト配列では典型的である場合、アクセプターよりむしろドナーアミノ酸が選択されてもよいということであった。第三の提案は、ヒト化免疫グロブリン鎖の３つのＣＤＲｓとすぐ隣接する位置において、アクセプターアミノ酸よりむしろドナーアミノ酸が選択されてもよいということであった。第四の提案は、フレームワーク領域に、抗体の３次元モデルにおいてＣＤＲｓの３Å内に側鎖原子を有すると予測され、かつＣＤＲｓと相互作用することが可能であると予測されるアミノ酸が存在するドナーアミノ酸を使用することであった。上記の方法は、単に、当業者がヒト化抗体を作製するために使用することができる一部の方法を例示したけである。
【００９６】
本発明は、本願明細書に記載される抗体またはそれらのヒト化された変形形態をコードする単離された核酸を提供する。核酸は、ＲＮＡ、ＤＮＡまたはｃＤＮＡであることができる。一つの態様において、核酸はＬ鎖をコードする。一つの態様において、核酸はＨ鎖をコードする。一つの態様において、核酸はＨ鎖およびＬ鎖の両者をコードする。一つの態様において、一以上の核酸は、Ｆａｂ部をコードする。一つの態様において、一以上の核酸は、ＣＤＲ部をコードする。一つの態様において、核酸は可変ドメインをコードする。
【００９７】
本願明細書に記載される薬剤の一態様において、該薬剤は、ポリペチドである。
【００９８】
本願明細書に記載される薬剤の一態様において、該薬剤は、オリゴペプチドである。ここで使用されるものとして、「ポリペプチド」とは、ペプチド結合で連結された２以上のアミノ酸を意味する。
【００９９】
本願明細書に記載される核酸、ポリペプチドおよび抗体は、単離されていてもよくておよび／または精製されていてもよい。当業者であれば、それらを単離しておよび／または精製する方法を知っているだろう。方法は、Ｓａｍｒｏｏｋ、ＦｒｉｔｓｃｈおよびＭａｎｉａｔｉｓによる「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ」などのいずれかの実験マニュアルにおいて提供される。
【０１００】
本願明細書に記載される薬剤の一態様において、化合物は非ペプチド性薬剤である。ここで使用するものとして、「非ペプチジル薬剤」とは、その全体が、ペプチド結合によって連結されたアミノ酸の直鎖状配列と一致しない薬剤を意味する。しかし、非ペプチジル分子は、一以上のペプチド結合を含んでいてもよい。一つの態様において、非ペプチド性薬剤は、５００のダルトン未満の分子量を有する化合物である。ここで使用するものとして、「小分子」とは、５００ダルトン未満の分子量を有するものである。
【０１０１】
本願明細書に記載されるポリペチドは、当業者に既知のどのような手段よって作製されてもよい。たとえば、該タンパク質は、コードする核酸を含むプラスミドまたはベクター（該プラスミドまたはベクターは、適切な宿主細胞内にある、すなわち感興のポリペチドを産生するための宿主‐ベクター系である）などの核酸から組換え体を発現することによって作製してもよい。適切なベクターは、エンハンサーおよびプロモーターなどの適切な調節配列ベクターから作製すればよい。宿主細胞は、どのようなタイプのものであってもよく、哺乳類細胞、細菌細胞および酵母細胞を含むがこれらに限定されない。適切な細菌細胞は、大腸菌細胞を含む。適切な哺乳類細胞は、ヒト胎生期腎臓２９３Ｔ（ＨＥＫ）細胞、ＨｅＬａ細胞、ＮＩＨ ３Ｔ３細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、およびＣＯＳ細胞を含むが、これらに限定されない。
【０１０２】
本発明は、ＨＩＶ−１逆転写酵素のｐ６６サブユニットポリペプチドとＨＩＶ−１逆転写酵素のｐ５１サブユニットポリペプチドとの複合体形成の阻害剤であるかどうかを決定するために化合物を試験する方法であって：（ａ）ＨＩＶ−１逆転写酵素のｐ６６サブユニットポリペプチドを含む融合タンパク質を細胞に発現する第一のプラスミドおよびＨＩＶ−１逆転写酵素のｐ５１サブユニットポリペプチドを含む融合タンパク質を発現する第二のプラスミドが同時形質転換された酵母細胞を、前記化合物と接触させることと、前記細胞はさらにｐ６６サブユニットポリペプチドおよびｐ５１サブユニットポリペプチドの複合体の存在下で活性化されるレポータ遺伝子を含み；（ｂ）前記化合物の存在下での前記細胞中の前記レポータ遺伝子の活性レベルを決定することと；（ｃ）工程（ｂ）で決定された前記レポータ遺伝子の活性レベルを、前記化合物の非存在下で決定された前記レポータ遺伝子の活性レベルと比較することとを含み、前記レポータ遺伝子の減少した活性レベルによって前記化合物がＨＩＶ−１逆転写酵素のｐ５１サブユニットポリペプチドとＨＩＶ−１逆転写酵素のｐ６６サブユニットポリペプチドとの間の複合体形成の阻害剤であることが示される方法を提供する。
【０１０３】
上記記載のＨＩＶ−１逆転写酵素のｐ６６サブユニットポリペプチドとＨＩＶ−１逆転写酵素のｐ５１サブユニットポリペプチドの複合体形成の阻害剤であるかどうかを決定するために化合物を試験する方法の一つの態様において、前記第一のプラスミドにより発現された融合タンパク質は、全長細菌タンパク質ＬｅｘＡのＮ末端アミノ酸配列のアミノ酸部位１で前記ＨＩＶ−１逆転写酵素のｐ６６サブユニットポリペプチドに融合された全長細菌タンパク質ＬｅｘＡをさらに含み、前記第二のプラスミドにより発現された融合タンパク質は、Ｇａｌ４ＡＤのＣ末端アミノ酸配列の部位７６８〜８８１のアミノ酸をさらに含み、ここで前記Ｇａｌ４ＡＤのＣ末端アミノ酸配列は、アミノ酸部位８８１においてインフルエンザ赤血球凝集素（ＨＡ）エピトープタグの一方の末端に融合し、ここでｐ５１サブユニットポリペプチドは、インフルエンザ赤血球凝集素（ＨＡ）エピトープタグの第二の末端に融合している方法である。
【０１０４】
上記記載のＨＩＶ−１逆転写酵素のｐ６６サブユニットポリペプチドとＨＩＶ−１逆転写酵素のｐ５１サブユニットポリペプチドの複合体形成の阻害剤であるかどうかを決定するために化合物を試験する方法のもう一つの態様において、前記第一のプラスミドにより発現された融合タンパク質は、全長細菌タンパク質ＬｅｘＡのＮ末端アミノ酸配列のアミノ酸部位１で前記ＨＩＶ−１逆転写酵素のｐ６６サブユニットポリペプチドに融合された全長細菌タンパク質ＬｅｘＡをさらに含み、前記第二のプラスミドにより発現された融合タンパク質は、ＨＩＶ−１逆転写酵素のｐ５１サブユニットポリペプチドに部位８８１で融合されたＧａｌ４ＡＤのＣ末端アミノ酸配列の部位７６８〜８８１におけるアミノ酸をさらに含む方法である。
【０１０５】
上記記載のＨＩＶ−１逆転写酵素のｐ６６サブユニットポリペプチドとＨＩＶ−１逆転写酵素のｐ５１サブユニットポリペプチドの複合体形成の阻害剤であるかどうかを決定するために化合物を試験する方法のさらにもう一つの態様において、前記第一のプラスミドにより発現された融合タンパク質は、前記ＨＩＶ−１逆転写酵素のｐ６６サブユニットポリペプチドにアミノ酸部位８７で融合されたＬｅｘＡのＤＮＡ結合ドメインのアミノ酸１−８７をさらに含み、前記第二のプラスミドにより発現された融合タンパク質は、Ｇａｌ４ＡＤのＣ末端アミノ酸配列の部位７６８〜８８１のアミノ酸をさらに含み、ここで前記Ｇａｌ４ＡＤのＣ末端アミノ酸配列は、インフルエンザ赤血球凝集素（ＨＡ）エピトープタグの一方の末端にアミノ酸部位８８１で融合され、ここでｐ５１サブユニットポリペプチドは、インフルエンザ赤血球凝集素（ＨＡ）エピトープタグの第二の末端に融合されている方法を提供する。
【０１０６】
上記記載のＨＩＶ−１逆転写酵素のｐ６６サブユニットポリペプチドとＨＩＶ−１逆転写酵素のｐ５１サブユニットポリペプチドの複合体形成の阻害剤であるかどうかを決定するために化合物を試験する方法のさらなる態様において、前記第一のプラスミドにより発現された融合タンパク質は、前記ＨＩＶ−１逆転写酵素のｐ６６サブユニットポリペプチドにアミノ酸部位８７で融合されたＬｅｘＡのＤＮＡ結合ドメインのアミノ酸１−８７をさらに含み、前記第二のプラスミドにより発現された融合タンパク質は、前記ＨＩＶ−１逆転写酵素のｐ５１サブユニットポリペプチドにアミノ酸部位８８１で融合されたＧａｌ４ＡＤのＣ末端アミノ酸配列の部位７６８〜８８１のアミノ酸をさらに含む方法である。
【０１０７】
上記記載のＨＩＶ−１逆転写酵素のｐ６６サブユニットポリペプチドとＨＩＶ−１逆転写酵素のｐ５１サブユニットポリペプチドの複合体形成の阻害剤であるかどうかを決定するために化合物を試験する方法のさらなる態様において、前記第一のプラスミドにより発現された融合タンパク質は、アミノ酸部位２０２で６アラニンリンカーの第一の末端に融合された全長細菌タンパク質ＬｅｘＡをさらに含み、ここで前記ｐ６６サブユニットポリペプチドは、アミノ酸部位１で前記６アラニンリンカーの第二の末端に融合され、前記融合タンパク質は、アミノ酸部位８８１で前記ＨＩＶ−１逆転写酵素のｐ５１サブユニットポリペプチドに融合されたＧａｌ４ＡＤのＣ末端アミノ酸配列の部位７６８〜８８１のアミノ酸をさらに含む第二のプラスミドにより発現された方法である。
【０１０８】
上記記載のＨＩＶ−１逆転写酵素のｐ６６サブユニットポリペプチドとＨＩＶ−１逆転写酵素のｐ５１サブユニットポリペプチドの複合体形成の阻害剤であるかどうかを決定するために化合物を試験する方法のさらにもう一つの態様において、前記第一のプラスミドにより発現された融合タンパク質は、アミノ酸部位２０２で６アラニンリンカーの第一の末端に融合された全長細菌タンパク質ＬｅｘＡをさらに含み、前記ｐ６６サブユニットポリペプチドは、アミノ酸部位１で前記６アラニンリンカーの他方の末端に融合され、前記融合タンパク質は、Ｇａｌ４ＡＤのＣ末端アミノ酸配列の部位７６８〜８８１のアミノ酸をさらに含む前記第二のプラスミドにより発現され、ここで前記Ｃ末端アミノ酸配列は、アミノ酸部位８８１でインフルエンザ赤血球凝集素（ＨＡ）エピトープタグの一末端に融合された方法である。
【０１０９】
上記記載のＨＩＶ−１逆転写酵素のｐ６６サブユニットポリペプチドとＨＩＶ−１逆転写酵素のｐ５１サブユニットポリペプチドの複合体形成の阻害剤であるかどうかを決定するために化合物を試験する方法のもう一つの態様において、前記第一のプラスミドにより発現された融合タンパク質は、インフルエンザ赤血球凝集素（ＨＡ）エピトープの第一の末端に融合されたＧａｌ４ＡＤのＣ末端アミノ酸配列の部位７６８〜８８１のアミノ酸と、第一の末端で前記インフルエンザ赤血球凝集素（ＨＡ）エピトープの第一の末端に融合された６アラニンリンカーとを含み、ここで前記ＨＩＶ−１逆転写酵素のｐ６６サブユニットポリペプチドは、アミノ酸部位１で前記６アラニンリンカーの第二の末端に融合され、前記融合タンパク質はアミノ酸部位１で前記ＨＩＶ−１逆転写酵素のｐ５１サブユニットポリペプチドに融合された全長細菌タンパク質ＬｅｘＡをさらに含む方法である。
【０１１０】
上記記載のＨＩＶ−１逆転写酵素のｐ６６サブユニットポリペプチドとＨＩＶ−１逆転写酵素のｐ５１サブユニットポリペプチドの複合体形成の阻害剤であるかどうかを決定するために化合物を試験する方法のさらなる態様において、前記第一のプラスミドにより発現された融合タンパク質は、インフルエンザ赤血球凝集素（ＨＡ）エピトープの第一の末端に融合されたＧａｌ４ＡＤのＣ末端アミノ酸配列の部位７６８〜８８１のアミノ酸と、第一の末端で前記インフルエンザ赤血球凝集素（ＨＡ）エピトープの前記第二の末端に融合された６アラニンリンカーとを含み、ここで前記ＨＩＶ−１逆転写酵素のｐ６６サブユニットポリペプチドは、アミノ酸部位１で前記６アラニンリンカーの第二の末端に融合され、前記融合タンパク質はアミノ酸部位１で前記ＨＩＶ−１逆転写酵素のｐ５１サブユニットポリペプチドに融合されたＬｅｘＡのＤＮＡ結合ドメインをさらに含む方法である。
【０１１１】
上記記載のＨＩＶ−１逆転写酵素のｐ６６サブユニットポリペプチドとＨＩＶ−１逆転写酵素のｐ５１サブユニットポリペプチドの複合体形成の阻害剤であるかどうかを決定するために化合物を試験する方法のさらなる態様において、前記第一のプラスミドにより発現された融合タンパク質は、インフルエンザ赤血球凝集素（ＨＡ）エピトープの第一の末端に融合されたＧａｌ４ＡＤのＣ末端アミノ酸配列の部位７６８〜８８１のアミノ酸と、第一の末端で前記インフルエンザ赤血球凝集素（ＨＡ）エピトープの前記第二の末端に融合された６アラニンリンカーとを含み、ここで前記ＨＩＶ−１逆転写酵素のｐ６６サブユニットポリペプチドは、アミノ酸部位１で前記６アラニンリンカーの第二の末端に融合され、前記融合タンパク質はアミノ酸部位１で前記ＨＩＶ−１逆転写酵素のｐ５１サブユニットポリペプチドに融合されたＧａｌ４ＡＤタンパク質ＤＮＡ結合ドメインをさらに含む方法である。
【０１１２】
上記記載のＨＩＶ−１逆転写酵素のｐ６６サブユニットポリペプチドとＨＩＶ−１逆転写酵素のｐ５１サブユニットポリペプチドの複合体形成の阻害剤であるかどうかを決定するために化合物を試験する方法のもう一つの態様において、前記第一のプラスミドにより発現された融合タンパク質は、Ｇａｌ４ＡＤのＣ末端アミノ酸配列の部位７６８〜８８１におけるアミノ酸をさらに含み、ここで前記Ｇａｌ４ＡＤのＣ末端アミノ酸配列は、アミノ酸部位８８１で前記ＨＩＶ−１逆転写酵素のｐ６６サブユニットポリペプチドに融合され、前記第二のプラスミドにより発現された融合タンパク質はアミノ酸部位１で前記ＨＩＶ−１逆転写酵素のｐ５１サブユニットポリペプチドに融合された全長ＬｅｘＡ細菌タンパク質ＬｅｘＡをさらに含む方法である。
【０１１３】
上記記載のＨＩＶ−１逆転写酵素のｐ６６サブユニットポリペプチドとＨＩＶ−１逆転写酵素のｐ５１サブユニットポリペプチドの複合体形成の阻害剤であるかどうかを決定するために化合物を試験する方法のもう一つの態様において、前記第一のプラスミドにより発現された融合タンパク質は、アミノ酸部位８８１で前記ＨＩＶ−１逆転写酵素のｐ６６サブユニットポリペプチドに融合されたＧａｌ４ＡＤのＣ末端アミノ酸配列の部位７６８〜８８１のアミノ酸をさらに含み、前記第二のプラスミドにより発現された融合タンパク質は、前記ＨＩＶ−１逆転写酵素のｐ５１サブユニットポリペプチドのアミノ酸部位１に融合されたＬｅｘＡのＤＮＡ結合ドメインをさらに含む方法である。
【０１１４】
上記記載のＨＩＶ−１逆転写酵素のｐ６６サブユニットポリペプチドとＨＩＶ−１逆転写酵素のｐ５１サブユニットポリペプチドの複合体形成の阻害剤であるかどうかを決定するために化合物を試験する方法のさらなる態様において、前記第一のプラスミドにより発現された融合タンパク質は、アミノ酸部位８８１で前記ＨＩＶ−１逆転写酵素のｐ６６サブユニットポリペプチドに融合されたＧａｌ４ＡＤのＣ末端アミノ酸配列の部位７６８〜８８１のアミノ酸をさらに含み、前記第二のプラスミドにより発現された融合タンパク質は、前記ＨＩＶ−１逆転写酵素のｐ５１サブユニットポリペプチドのアミノ酸部位１に融合されたＧａｌ４ＡＤタンパク質ＤＮＡ結合ドメインをさらに含む方法である。
【０１１５】
当業者であれば、既知のＨＩＶ−１逆転写酵素の核酸配列を使用して、本明細書に記載されたプラスミドを容易に作製または使用することができ、発現ベクターに含まれたそのｐ６６サブユニットポリペプチドまたはそのｐ５１サブユニットポリペプチドは、通常の技術のうちの一つにより作製され；全長ＬｅｘＡタンパク質またはその切断部分（すなわち、ＬｅｘＡのＤＮＡ結合ドメイン、Ｇａｌ４のＤＮＡ結合ドメイン、Ｇａｌ４活性化ドメイン（Ｇａｌ４ＡＤ）および該（Ｇａｌ４ＡＤ）とポリリンカーとの間にＨＡエピトープタグを有するもの）を含む本明細書で使用したベクターを作製または購入することができるであろう。
【０１１６】
上記記載の方法によって決定された阻害剤は、ＨＩＶ−１ウイルスを死滅させ、またはこれを不活性化し、またはヒト患者を含む患者の細胞に感染できないようにＨＩＶ−１逆転写酵素のｐ６６サブユニットポリペプチドとＨＩＶ−１逆転写酵素のｐ５１サブユニットポリペプチドとの複合体形成を遮断する医薬組成物としての薬を製造するために有用である。
【０１１７】
また、本発明は、ＨＩＶ−１逆転写酵素のｐ６６サブユニットポリペプチドとＨＩＶ−１逆転写酵素のｐ５１サブユニットポリペプチドとの複合体形成の阻害剤を含む医薬組成物を製造する方法であって：
（ａ）（ｉ）ＨＩＶ−１逆転写酵素のｐ６６サブユニットポリペプチドを含む融合タンパク質を細胞に発現する第一のプラスミドとＨＩＶ−１逆転写酵素のｐ５１サブユニットポリペプチドを含む融合タンパク質を発現する第二のプラスミドとが同時形質転換された酵母細胞を、前記化合物に接触させることと、ここで前記細胞はさらにｐ６６サブユニットポリペプチドおよびｐ５１サブユニットポリペプチドの複合体の存在下で活性化されるレポータ遺伝子を含み；（ｉｉ）前記化合物の存在下での前記細胞中の前記レポータ遺伝子の活性レベルを決定することと；（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）で決定された前記レポータ遺伝子の活性レベルを、前記化合物の非存在下で決定された前記レポータ遺伝子の活性レベルと比較することとを含み、前記レポータ遺伝子の減少した活性レベルによって、前記化合物がＨＩＶ−１逆転写酵素のｐ５１サブユニットポリペプチドとＨＩＶ−１逆転写酵素のｐ６６サブユニットポリペプチドとの間の複合体形成の阻害剤であることが示される工程を含む方法に従って、或る化合物がＨＩＶ−１逆転写酵素のｐ５１サブユニットポリペプチドとＨＩＶ−１逆転写酵素のｐ６６サブユニットポリペプチドとの間の複合体の形成を阻害するかどうかを決定することと；並びに
（ｂ）工程（ａ）（ｉｉｉ）において阻害剤であると決定された化合物を薬学的に許容可能なキャリアと混合することとを含む方法を提供する。当業者であれば本明細書の実施例で使用したレポータ遺伝子を周知のレポータ遺伝子に置換することは容易であるので、或る化合物がＨＩＶ−１逆転写酵素のｐ５１サブユニットポリペプチドとＨＩＶ−１逆転写酵素のｐ６６サブユニットポリペプチドとの間の複合体の形成を阻害するかどうかを決定するための上記記載のいずれの方法も、測定した阻害剤化合物を含む医薬組成物を製造する方法に使用してもよい。さらに、当業者は、本明細書の上記記載の方法のいずれかにおいて例示した酵母細胞を使用することに限定されず、その他の真核生物細胞、哺乳類細胞または２９８Ｔ細胞などの細胞株を使用するために該方法を修飾変更してもよい。
【０１１８】
本発明は、さらに、ＨＩＶ−１逆転写酵素のｐ６６サブユニットポリペプチドとＨＩＶ−１逆転写酵素のｐ５１サブユニットポリペプチドとの複合体形成の活性化剤であるかどうかを決定するために化合物を試験する方法であって：（ａ）ＨＩＶ−１逆転写酵素のｐ６６サブユニットポリペプチドを含む融合タンパク質を細胞に発現する第一のプラスミドおよびＨＩＶ−１逆転写酵素のｐ５１サブユニットポリペプチドを含む融合タンパク質を発現する第二のプラスミドが同時形質転換された酵母細胞を、前記化合物と接触させることと、前記細胞はさらにｐ６６サブユニットポリペプチドおよびｐ５１サブユニットポリペプチドの複合体の存在下で活性化されるレポータ遺伝子を含み；（ｂ）前記化合物の存在下での前記細胞中の前記レポータ遺伝子の活性レベルを決定することと；（ｃ）工程（ｂ）で決定された前記レポータ遺伝子の活性レベルを、前記化合物の非存在下で決定された前記レポータ遺伝子の活性レベルと比較することとを含み、前記レポータ遺伝子の増加した活性レベルによって前記化合物がＨＩＶ−１逆転写酵素のｐ５１サブユニットポリペプチドとＨＩＶ−１逆転写酵素のｐ６６サブユニットポリペプチドとの間の複合体形成の阻害剤であることが示される方法を提供する。
【０１１９】
上記記載のＨＩＶ−１逆転写酵素のｐ６６サブユニットポリペプチドとＨＩＶ−１逆転写酵素のｐ５１サブユニットポリペプチドの複合体形成の活性化剤であるかどうかを決定するために化合物を試験する方法の一つの態様において、前記第一のプラスミドにより発現された融合タンパク質は、全長細菌タンパク質ＬｅｘＡのＮ末端アミノ酸配列のアミノ酸部位１で前記ＨＩＶ−１逆転写酵素のｐ６６サブユニットポリペプチドに融合された全長細菌タンパク質ＬｅｘＡをさらに含み、前記第二のプラスミドにより発現された融合タンパク質は、Ｇａｌ４ＡＤのＣ末端アミノ酸配列の部位７６８〜８８１のアミノ酸をさらに含み、ここで前記Ｇａｌ４ＡＤのＣ末端アミノ酸配列は、アミノ酸部位８８１においてインフルエンザ赤血球凝集素（ＨＡ）エピトープタグの一方の末端に融合し、ここでｐ５１サブユニットポリペプチドは、インフルエンザ赤血球凝集素（ＨＡ）エピトープタグの第二の末端に融合している方法である。
【０１２０】
上記記載のＨＩＶ−１逆転写酵素のｐ６６サブユニットポリペプチドとＨＩＶ−１逆転写酵素のｐ５１サブユニットポリペプチドの複合体形成の活性化剤であるかどうかを決定するために化合物を試験する方法のもう一つの態様において、前記第一のプラスミドにより発現された融合タンパク質は、全長細菌タンパク質ＬｅｘＡのＮ末端アミノ酸配列のアミノ酸部位１で前記ＨＩＶ−１逆転写酵素のｐ６６サブユニットポリペプチドに融合された全長細菌タンパク質ＬｅｘＡをさらに含み、前記第二のプラスミドにより発現された融合タンパク質は、ＨＩＶ−１逆転写酵素のｐ５１サブユニットポリペプチドに部位８８１で融合されたＧａｌ４ＡＤのＣ末端アミノ酸配列の部位７６８〜８８１におけるアミノ酸をさらに含む方法である。
【０１２１】
上記記載のＨＩＶ−１逆転写酵素のｐ６６サブユニットポリペプチドとＨＩＶ−１逆転写酵素のｐ５１サブユニットポリペプチドの複合体形成の活性化剤であるかどうかを決定するために化合物を試験する方法のさらなる態様において、前記第一のプラスミドにより発現された融合タンパク質は、前記ＨＩＶ−１逆転写酵素のｐ６６サブユニットポリペプチドにアミノ酸部位８７で融合されたＬｅｘＡのＤＮＡ結合ドメインのアミノ酸１−８７をさらに含み、前記第二のプラスミドにより発現された融合タンパク質は、Ｇａｌ４ＡＤのＣ末端アミノ酸配列の部位７６８〜８８１のアミノ酸をさらに含み、ここで前記Ｇａｌ４ＡＤのＣ末端アミノ酸配列は、インフルエンザ赤血球凝集素（ＨＡ）エピトープタグの一方の末端にアミノ酸部位８８１で融合され、ここでｐ５１サブユニットポリペプチドは、インフルエンザ赤血球凝集素（ＨＡ）エピトープタグの第二の末端に融合されている方法を提供する。
【０１２２】
上記記載のＨＩＶ−１逆転写酵素のｐ６６サブユニットポリペプチドとＨＩＶ−１逆転写酵素のｐ５１サブユニットポリペプチドの複合体形成の活性化剤であるかどうかを決定するために化合物を試験する方法のもう一つの態様において、前記第一のプラスミドにより発現された融合タンパク質は、前記ＨＩＶ−１逆転写酵素のｐ６６サブユニットポリペプチドにアミノ酸部位８７で融合されたＬｅｘＡのＤＮＡ結合ドメインのアミノ酸１−８７をさらに含み、前記第二のプラスミドにより発現された融合タンパク質は、前記ＨＩＶ−１逆転写酵素のｐ５１サブユニットポリペプチドにアミノ酸部位８８１で融合されたＧａｌ４ＡＤのＣ末端アミノ酸配列の部位７６８〜８８１のアミノ酸をさらに含む方法である。
【０１２３】
上記記載のＨＩＶ−１逆転写酵素のｐ６６サブユニットポリペプチドとＨＩＶ−１逆転写酵素のｐ５１サブユニットポリペプチドの複合体形成の活性化剤であるかどうかを決定するために化合物を試験する方法のさらなる態様において、前記第一のプラスミドにより発現された融合タンパク質は、アミノ酸部位２０２で６アラニンリンカーの第一の末端に融合された全長細菌タンパク質ＬｅｘＡをさらに含み、ここで前記ｐ６６サブユニットポリペプチドは、アミノ酸部位１で前記６アラニンリンカーの第二の末端に融合され、前記融合タンパク質は、アミノ酸部位８８１で前記ＨＩＶ−１逆転写酵素のｐ５１サブユニットポリペプチドに融合されたＧａｌ４ＡＤのＣ末端アミノ酸配列の部位７６８〜８８１のアミノ酸をさらに含む第二のプラスミドにより発現された方法である。
【０１２４】
上記記載のＨＩＶ−１逆転写酵素のｐ６６サブユニットポリペプチドとＨＩＶ−１逆転写酵素のｐ５１サブユニットポリペプチドの複合体形成の活性化剤であるかどうかを決定するために化合物を試験する方法のさらにもう一つの態様において、前記第一のプラスミドにより発現された融合タンパク質は、アミノ酸部位２０２で６アラニンリンカーの第一の末端に融合された全長細菌タンパク質ＬｅｘＡをさらに含み、前記ｐ６６サブユニットポリペプチドは、アミノ酸部位１で前記６アラニンリンカーの他方の末端に融合され、前記融合タンパク質は、Ｇａｌ４ＡＤのＣ末端アミノ酸配列の部位７６８〜８８１のアミノ酸をさらに含む前記第二のプラスミドにより発現され、ここで前記Ｃ末端アミノ酸配列は、アミノ酸部位８８１でインフルエンザ赤血球凝集素（ＨＡ）エピトープタグの一末端に融合された方法である。
【０１２５】
上記記載のＨＩＶ−１逆転写酵素のｐ６６サブユニットポリペプチドとＨＩＶ−１逆転写酵素のｐ５１サブユニットポリペプチドの複合体形成の活性化剤であるかどうかを決定するために化合物を試験する方法のさらなる態様において、前記第一のプラスミドにより発現された融合タンパク質は、インフルエンザ赤血球凝集素（ＨＡ）エピトープの第一の末端に融合されたＧａｌ４ＡＤのＣ末端アミノ酸配列の部位７６８〜８８１のアミノ酸と、第一の末端で前記インフルエンザ赤血球凝集素（ＨＡ）エピトープの第一の末端に融合された６アラニンリンカーとを含み、ここで前記ＨＩＶ−１逆転写酵素のｐ６６サブユニットポリペプチドは、アミノ酸部位１で前記６アラニンリンカーの第二の末端に融合され、前記融合タンパク質はアミノ酸部位１で前記ＨＩＶ−１逆転写酵素のｐ５１サブユニットポリペプチドに融合された全長細菌タンパク質ＬｅｘＡをさらに含む方法である。
【０１２６】
上記記載のＨＩＶ−１逆転写酵素のｐ６６サブユニットポリペプチドとＨＩＶ−１逆転写酵素のｐ５１サブユニットポリペプチドの複合体形成の活性化剤であるかどうかを決定するために化合物を試験する方法のもう一つの態様において、前記第一のプラスミドにより発現された融合タンパク質は、インフルエンザ赤血球凝集素（ＨＡ）エピトープの第一の末端に融合されたＧａｌ４ＡＤのＣ末端アミノ酸配列の部位７６８〜８８１のアミノ酸と、第一の末端で前記インフルエンザ赤血球凝集素（ＨＡ）エピトープの前記第二の末端に融合された６アラニンリンカーとを含み、ここで前記ＨＩＶ−１逆転写酵素のｐ６６サブユニットポリペプチドは、アミノ酸部位１で前記６アラニンリンカーの第二の末端に融合され、前記融合タンパク質はアミノ酸部位１で前記ＨＩＶ−１逆転写酵素のｐ５１サブユニットポリペプチドに融合されたＬｅｘＡのＤＮＡ結合ドメインをさらに含む方法である。
【０１２７】
上記記載のＨＩＶ−１逆転写酵素のｐ６６サブユニットポリペプチドとＨＩＶ−１逆転写酵素のｐ５１サブユニットポリペプチドの複合体形成の活性化剤であるかどうかを決定するために化合物を試験する方法のさらにもう一つの態様において、前記第一のプラスミドにより発現された融合タンパク質は、インフルエンザ赤血球凝集素（ＨＡ）エピトープの第一の末端に融合されたＧａｌ４ＡＤのＣ末端アミノ酸配列の部位７６８〜８８１のアミノ酸と、第一の末端で前記インフルエンザ赤血球凝集素（ＨＡ）エピトープの前記第二の末端に融合された６アラニンリンカーとを含み、ここで前記ＨＩＶ−１逆転写酵素のｐ６６サブユニットポリペプチドは、アミノ酸部位１で前記６アラニンリンカーの第二の末端に融合され、前記融合タンパク質はアミノ酸部位１で前記ＨＩＶ−１逆転写酵素のｐ５１サブユニットポリペプチドに融合されたＧａｌ４ＡＤタンパク質ＤＮＡ結合ドメインをさらに含む方法である。
【０１２８】
上記記載のＨＩＶ−１逆転写酵素のｐ６６サブユニットポリペプチドとＨＩＶ−１逆転写酵素のｐ５１サブユニットポリペプチドの複合体形成の活性化剤であるかどうかを決定するために化合物を試験する方法のさらなる態様において、前記第一のプラスミドにより発現された融合タンパク質は、Ｇａｌ４ＡＤのＣ末端アミノ酸配列の部位７６８〜８８１におけるアミノ酸をさらに含み、ここで前記Ｇａｌ４ＡＤのＣ末端アミノ酸配列は、アミノ酸部位８８１で前記ＨＩＶ−１逆転写酵素のｐ６６サブユニットポリペプチドに融合され、前記第二のプラスミドにより発現された融合タンパク質はアミノ酸部位１で前記ＨＩＶ−１逆転写酵素のｐ５１サブユニットポリペプチドに融合された全長ＬｅｘＡ細菌タンパク質ＬｅｘＡをさらに含む方法である。
【０１２９】
上記記載のＨＩＶ−１逆転写酵素のｐ６６サブユニットポリペプチドとＨＩＶ−１逆転写酵素のｐ５１サブユニットポリペプチドの複合体形成の活性化剤であるかどうかを決定するために化合物を試験する方法のもう一つの態様において、前記第一のプラスミドにより発現された融合タンパク質は、アミノ酸部位８８１で前記ＨＩＶ−１逆転写酵素のｐ６６サブユニットポリペプチドに融合されたＧａｌ４ＡＤのＣ末端アミノ酸配列の部位７６８〜８８１のアミノ酸をさらに含み、前記第二のプラスミドにより発現された融合タンパク質は、前記ＨＩＶ−１逆転写酵素のｐ５１サブユニットポリペプチドのアミノ酸部位１に融合されたＬｅｘＡのＤＮＡ結合ドメインをさらに含む方法である。
【０１３０】
上記記載のＨＩＶ−１逆転写酵素のｐ６６サブユニットポリペプチドとＨＩＶ−１逆転写酵素のｐ５１サブユニットポリペプチドの複合体形成の活性化剤であるかどうかを決定するために化合物を試験する方法のさらなる態様において、前記第一のプラスミドにより発現された融合タンパク質は、アミノ酸部位８８１で前記ＨＩＶ−１逆転写酵素のｐ６６サブユニットポリペプチドに融合されたＧａｌ４ＡＤのＣ末端アミノ酸配列の部位７６８〜８８１のアミノ酸をさらに含み、前記第二のプラスミドにより発現された融合タンパク質は、前記ＨＩＶ−１逆転写酵素のｐ５１サブユニットポリペプチドのアミノ酸部位１に融合されたＧａｌ４ＡＤタンパク質ＤＮＡ結合ドメインをさらに含む方法である。
【０１３１】
上記記載の方法によって決定された活性化剤は、ＨＩＶ−１ウイルスを死滅させ、またはＨＩＶ−１ウイルスを不活性化し、またはヒト患者を含む患者の細胞に感染できないように（すなわち、感染したＨＩＶ−１ウイルスの機能をなくすこと）、ＨＩＶ−１逆転写酵素のｐ６６サブユニットポリペプチドとＨＩＶ−１逆転写酵素のｐ５１サブユニットポリペプチドとの複合体形成を、早期にまたは不適当に増大する医薬組成物としての薬を製造するために有用である。
【０１３２】
また、本発明は、ＨＩＶ−１逆転写酵素のｐ６６サブユニットポリペプチドとＨＩＶ−１逆転写酵素のｐ５１サブユニットポリペプチドとの複合体形成の活性化剤を含む医薬組成物を製造する方法であって：
（ａ）（ｉ）ＨＩＶ−１逆転写酵素のｐ６６サブユニットポリペプチドを含む融合タンパク質を細胞に発現する第一のプラスミドとＨＩＶ−１逆転写酵素のｐ５１サブユニットポリペプチドを含む融合タンパク質を発現する第二のプラスミドとが同時形質転換された酵母細胞を、前記化合物に接触させることと、ここで前記細胞はさらにｐ６６サブユニットポリペプチドおよびｐ５１サブユニットポリペプチドの複合体の存在下で活性化されるレポータ遺伝子を含み；（ｉｉ）前記化合物の存在下での前記細胞中の前記レポータ遺伝子の活性レベルを決定することと；（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）で決定された前記レポータ遺伝子の活性レベルを、前記化合物の非存在下で決定された前記レポータ遺伝子の活性レベルと比較することとを含み、前記レポータ遺伝子の増加した活性レベルによって、前記化合物がＨＩＶ−１逆転写酵素のｐ５１サブユニットポリペプチドとＨＩＶ−１逆転写酵素のｐ６６サブユニットポリペプチドとの間の複合体形成の活性化剤であることが示される工程を含む方法に従って、或る化合物がＨＩＶ−１逆転写酵素のｐ５１サブユニットポリペプチドとＨＩＶ−１逆転写酵素のｐ６６サブユニットポリペプチドとの間の複合体の形成を阻害するかどうかを決定することと；並びに
（ｂ）工程（ａ）（ｉｉｉ）において活性化剤であると決定された化合物を薬学的に許容可能なキャリアと混合することとを含む方法を提供する。当業者であれば本明細書の実施例で使用したレポータ遺伝子を周知のレポータ遺伝子に置換することは容易であるので、或る化合物がＨＩＶ−１逆転写酵素のｐ５１サブユニットポリペプチドとＨＩＶ−１逆転写酵素のｐ６６サブユニットポリペプチドとの間の複合体の形成を阻害するかどうかを決定するための上記記載のいずれの方法も、測定した活性化剤化合物を含む医薬組成物を製造する方法に使用してもよい。さらに、当業者は、本明細書の上記記載の方法のいずれかにおいて例示した酵母細胞を使用することに限定されず、その他の真核生物細胞、哺乳類細胞または２９８Ｔ細胞などの細胞株を使用するために該方法を修飾変更してもよい。
【０１３３】
ＨＩＶ−１に感染した患者を治療する方法には、上記記載の医薬組成物のいずれかであって：ＨＩＶ−１逆転写酵素のｐ６６サブユニットポリペチド間の複合体形成の阻害剤；ＨＩＶ−１逆転写酵素のｐ６６サブユニットポリペチドとＨＩＶ−１逆転写酵素のｐ５１サブユニットポリペチドとの間の複合体形成の活性化剤；第一のＨＩＶ−１逆転写酵素のｐ６６サブユニットポリペチドと第二のＨＩＶ−１逆転写酵素のｐ６６サブユニットポリペチドとの間の複合体形成の阻害剤；および／または第一のＨＩＶ−１逆転写酵素のｐ６６サブユニットポリペチドと第二のＨＩＶ−１逆転写酵素のｐ６６サブユニットポリペチドとの間の複合体形成の活性化剤、を投与することを含む。当業者であれば、本願明細書において記載された方法によって提供される医薬組成物とともに、その他の医薬組成物をＨＩＶ−１に感染した患者に投与してもよいことが認識できるであろう。
【０１３４】
また、本発明は、上記記載の阻害剤のいずれかと、薬学的に許容可能なキャリアの有効な量とを含む医薬組成物を提供する。また、本発明は、上記記載の活性化剤のいずれかと、薬学的に許容可能なキャリアの有効な量とを含む医薬組成物を提供する。本発明において、「有効な量」とは、阻害剤または活性化剤が、疾患または異常に苦しむ患者に投与されたとき、該阻害剤または活性化剤が患者に対して有効で、該疾患または異常の減少、寛解または退行を引き起こすいずれかの量である。本発明の実施において、「薬学的に許容可能なキャリア」とは、医薬組成物を処方する際に有用な、当業者に既知のいずれかの生理学的なキャリアである。
【０１３５】
１つの好ましい態様において、医薬キャリアは液体であってもよく、医薬組成物は溶液の形態であるかもしれない。同時にもう一つの好ましい態様において、薬学的に許容可能なキャリアは固体であり、組成物は粉末またはタブレットの形態である。さらなる態様において、医薬キャリアはゲルであり、組成物は坐薬またはクリームの形態である。さらなる態様において、化合物または組成物は、薬学的に許容可能な経皮パッチの一部として処方されてもよい。
【０１３６】
固体キャリアは、香味剤、滑沢剤、可溶化剤、懸濁剤、充填剤、滑沢剤（ｇｌｉｄａｎｔｓ）、打錠補助剤（ｃｏｍｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｉｄｓ）、結合剤またはタブレット崩壊剤として機能する一以上の物質を含むこともでき；また、カプセル化された物質であることもできる。粉末では、該キャリアは細かく割られた活性成分との混合物である細かく割られた固体である。タブレットでは、該活性成分は必要な打錠性質を有するキャリアと適切な比率で混合され、所望の形状および大きさに成形される。粉末およびタブレットは、好ましくは最高９９％の活性成分を含む。適切な固体キャリアは、たとえばリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、タルク、糖、ラクトース、デキストリン、デンプン、ゼラチン、セルロース、ポリビニルピロリジン、低融点ろうおよびイオン交換樹脂を含む。
【０１３７】
液体キャリアは、溶液、懸濁液、乳剤、シロップ、エリキシルおよび加圧された組成物を調製するために使用される。活性成分は、水、有機溶媒、両者の混合液または薬学的に許容可能な油もしくは脂肪などの薬学的に許容可能な液状キャリアに溶解または懸濁することができる。液状キャリアは、可溶化剤、乳化剤、バッファ、防腐剤、甘味料、香料、懸濁剤、糊料、着色剤、粘性調節剤、安定剤または浸透圧調節剤などのその他の適切な医薬品添加物を含むことができる。経口および非経口的な投与に適した液体キャリアの例には、水（好ましくは上記添加剤を含み、たとえばセルロース誘導体溶液、好ましくはナトリウムカルボキシメチルセルロース溶液）、アルコール（一価アルコールおよび多価アルコール（たとえばグリコール）を含む）およびそれらの誘導体、並びに油（たとえば、分取されたヤシ油および落花生油）を含む。非経口投与については、キャリアは、オレイン酸エチルおよびミリスチン酸イソプロピルなどの油性のエステルであることもできる。非経口投与のためには、滅菌液状キャリアが滅菌液状形態の組成物に有用である。加圧された組成物のための液状キャリアは、ハロゲン化炭化水素、またはその他の薬学的に許容可能な推進剤であることができる。
【０１３８】
無菌溶液または懸濁液である液体医薬組成物は、たとえば筋肉内、クモ膜下、硬膜外、腹腔内または皮下への注射剤に利用することができる。無菌溶液は、静脈内に投与することもできる。化合物は、滅菌固体組成物として調製してもよく、投与時に滅菌水、塩類溶液またはその他の適切な滅菌の注射可能媒体を使用して溶解または懸濁してもよい。キャリアは、不活性結合剤、懸濁剤、滑沢剤、香味剤、甘味料、防腐剤、色素および被覆剤を含む必要が想定される。
【０１３９】
上記方法よって決定される阻害剤（ｓ）または活性化剤（ｓ）は、滅菌溶液またはその他の溶液もしくは懸濁剤を含む懸濁液（たとえば、等張溶液を作製するために十分な塩類溶液またはグルコース、胆汁酸塩、アカシア、ゼラチン、モノオレイン酸ソルビタン、ポリソルベート８０（ソルビトールのオレアートエステルおよびエチレンオキサイドと共重合したその無水物）、その他同種のものの形態で投与することができる。
【０１４０】
また、阻害剤（ｓ）または活性化剤（ｓ）は、液状または固形のいずれかで経口投与することもできる。経口投与に適したその他の組成物には、ピル、カプセル、顆粒、タブレットおよび粉末などの固体形態、並びに溶液、シロップ、エリキシルおよび懸濁液などの液状形態を含む。非経口投与に有用な形態は、無菌液、乳剤および懸濁液を含む。
【０１４１】
投与すべき最適の用量は、当業者よって決定されてもよく、使用の際に特定の阻害剤（ｓ）または活性化剤（ｓ）により、製剤の力価により、投与の型式および疾患条件または異常の進行により、変化するであろう。患者の年齢、体重、性、食餌制限および投与の時間を含む、治療される特定の患者によるさらなる因子により、用量を調整する必要が生じるであろう。
【０１４２】
本発明は、以下の実施例によって、よりよく理解されるだろう。しかし、当業者であれば、請求項の記載をより完全にするものとして、特定の方法および議論した結果が単に本発明を図示するだけであることを容易に認めるであろう。
【０１４３】
【実施例の詳細】
実施例の第一のシリーズ
（材料および方法）
（細菌性のして酵母株）
Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株ＣＴＹ１０−５ｄ（ＭＡＴａ ａｄｅ２ ｔｒｐｌ−９０１ ｌｅｕ２−３，１１２ ｈｉｓ３−２００ ｇａｌ４−ｇａｌ８０ ＵＲＡ３：ｌｅｘＡ−ｌａｃＺ）は、ｌｅｘＡオペレータに組み込まれたＧＡＬｌ−ｌａｃＺ遺伝子（Ｓｔａｎｌｅｙ Ｆｉｅｌｄｓ， Ｓｔａｔｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｓｔｏｎｙ Ｂｒｏｏｋより贈与）を含む。酵母株ＨＦ７ｃは、３コピーのＧＡＬ４応答性ＵＡＳＧ １７−ｍｅｒオペレータ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）を伴うＣＹＣｌ−ｌａｃＺ遺伝子を含む。大腸菌突然変異誘発遺伝子株ＸＬｌ−Ｒｅｄ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）は、ランダム突然変異生成に使用し、一方、ＸＬｌ−Ｂｌｕｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）は、突然変異ライブラリを増幅するために使用した。栄養要求性ｌｅｕＢ、ｔｒｐＣおよびｈｉｓＢ大腸菌株であるＫＣ８（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）を、酵母から単離したプラスミドに使用した。大腸菌株Ｍ１５およびＢＬ２１は、それぞれｐ６６−Ｈｉｓを発現するために、およびグルタチオンＳ−トランスフェラーゼタグのｐ５１（ＧＳＴ−ｐ５１）を発現させるために使用した（下記参照）。
【０１４４】
（酵母法）
酵母の形質転換および定量的β−ガラクトシダーゼ（β−ｇａｌ）コロニーリフトアッセイは、公開されたものである（１９）。タンパク質−タンパク相互作用の定量は、β−ｇａｌ液体アッセイを使用して決定し、基質としてオルトニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシドを使用して、３回の独立した形質転換体の培養した透過化処理酵母において行った（１９）。
【０１４５】
（タンパク質発現およびＲＴ活性）
酵母における融合タンパク質発現は、Ｇａｌ４ＡＤポリクローナル抗体（Ｕｐｓｔａｔｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｌａｋｅ Ｐｌａｃｉｄ， ＮＹ）、抗ｌｅｘＡポリクローナル抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）およびＨＩＶ−１ ＲＴポリクローナル（Ｉｎｔｒａｃｅｌ， Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ， ＭＡ）または５Ｂ２モノクロナール抗体による可溶化液のウエスタンブロットによって決定した（２０）。免疫検出は、ＥＣＬ−Ｐｌｕｓ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）で行った。ＲＴ活性を測定するために、酵母可溶化液をガラスビーズ分解によって調製し（１９）、酵素活性を外因性アッセイ（２１）によって決定して、ホスホイメージャー（ｐｈｏｓｐｈｏｉｍａｇｅｒ）解析によって定量した。
【０１４６】
（酵母シャトルベクター）
ｐＳＨ２−１（２２）およびｐＬｅｘ２０２−ＰＬ（２３）は、それぞれｌｅｘＡのＤＮＡ結合ドメイン（ｌｅｘＡ８７）および全長ｌｅｘＡタンパク質（ｌｅｘＡ２０２）を発現する。ｐＧＢＴ９およびｐＡＳ２−１は、両方ともＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメイン（ＧＡＬ４ ＢＤ）を含み、ＣＬＯＮＴＥＣＨから購入した。ｐＮＬｅｘＡは、全長ｌｅｘＡ２０２のＮ末端に融合されたタンパク質の発現を可能にする（ＯｒｉＧｅｎｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）。ｐＧＡＤＮＯＴ （１８）およびｐＡＣＴＩＩ（２４）は、Ｇａｌ４活性化ドメインに融合されたタンパク質の発現を可能にする（ＧＡＬ４ ＡＤ）。また、ｐＡＣＴＩＩは、ＧＡＬ４ＡＤとポリリンカーとの間に位置するインフルエンザ赤血球凝集素（ＨＡ）エピトープタグを含む。
【０１４７】
（酵母ベクターでのＨＩＶ−１ ＲＴ融合体の構築）
構築物および発現された融合タンパク質を図１に記載する。以下の発現ベクターを構築するためのＲＴ配列は、ＨＩＶ−１分子クローンｐＮＬｅｎｖ−１（ＨＩＶＮＬ４３配列を含む）から増幅した（２５）。ｐ６６アンプリマーは、ｐＧＢＴ９、ｐＳＨ２−１、ｐＬｅｘ２０２−ＰＬ、ｐＡＣＴＩＩおよびｐＧＡＤＮＯＴのＢａｍＨＩ−ＳａｌＩ部位；ｐＡＣＴＩＩのＢａｍＨ１−ＸｈｏＩ部位；およびｐＮＬｅｘＡのＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ部位にクローン化した。ｐ５１アンプリマーは、ｐＡＣＴＩＩのＢａｍＨ１−ＸｈｏＩ部位を使用してクローン化したことを除いては、これらのベクターのＢａｍＨＩ−ＳａｌＩ部位にクローン化した。ｐＨＸＢ２ｇｐｔ（２６）由来のＨＸＢ２ ＲＴ配列は、ｐ６６ＨＸＡｌａＬｅｘ２０２およびｐ５ＩＨＸＧＡＤＮＯＴを構築するために使用した。
【０１４８】
（ＨＩＶ−１ ＲＴ欠失変異体の構築）
全てのｐ６６欠失変異体は、ＰＣＲ アンプリマーをｐＳＨ２−１のＢａｍＨＩ−ＳａｌＩ部位にクローン化することよって調製した。ＨＩＶ−１ ＲＴのフィンガー、パーム、コネクション、サムおよびＲＮａｓｅ Ｈドメインは、それぞれＦ、Ｐ、Ｃ、ＴおよびＲで示してある。ｐＴ＋Ｃ＋ＲＳＨ２−１（ｌｅｘＡ８７−Ｔ＋Ｃ＋Ｒをコードする）は、ＲＴコドン２３６−５６０（ＨＩＶＮＬ４３由来）を含む。ｐＣ＋ＲＳＨ２−１（ｌｅｘＡ８７−Ｃ＋Ｒをコードする）は、コドン３２２−５６０を含むと共に、ｐＲＳＨ２−１（ｌｅｘＡ８７−Ｒをコードする）は、コドン４２５−５６０を含む。全てのｐ５１欠失変異体は、ＰＣＲ アンプリマーをｐＡＣＴＩＩのＢａｍＨＩ−ＸｈｏＩ部位にクローン化して調製した。ｐＦ＋Ｐ−ＡＣＴＩＩ（Ｇａｌ４ＡＤ−ＨＡ Ｆ＋Ｐをコードする）は、ＲＴコドン１−３２５を含み、ｐＦ＋Ｐ＋Ｔ−ＡＣＴＩＩ（Ｇａｌ４ＡＤ−ＨＡ Ｆ＋Ｐ＋Ｔをコードする）は、コドン１−２４４を有する。ｐ５１Δ１３ＡＣＴＩＩ（Ｇａｌ４ＡＤ−ＨＡ ５１Δ１３をコードする）は、ＲＴコドン１−４２６を含む。ｐ５１Δ２６ＧＡＤＮＯＴ（Ｇａｌ４ＡＤ−５１Δ２６をコードする）は、ＸＬｌ−Ｒｅｄにおいてｐ５１ＧＡＤＮＯＴのランダム突然変異生成することによって得た。
【０１４９】
（Ｌ２３４Ａ変異を伴う融合物の構築およびｐ６６Ａｌａ２３４Ｌｅｘ２０２の突然変異生成および復帰変異体の選択）
ｐ６６Ａｌａ２３４Ｌｅｘ２０２（ｌｅｘＡ２０２−Ａｌａ−６６Ｌ２３４Ａをコードする）は、ｐ６ＨｐｒｏｔＬ２３４Ａ（Ｖｉｎａｙａｋａ Ｐｒａｓａｄ， Ａｌｂｅｒｔ Ｅｉｎｓｔｅｉｎ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ， Ｂｒｏｎｘ ＮＹから贈与）由来のｐ６６を、ｐＬｅｘ２０２−ＰＬのＢａｍＨＩ／ＳａｌＩ部位に挿入することによって作製した。ｐ５１２３４ＧＡＤＮＯＴ（Ｇａｌ４ＡＤ−５１Ｌ２３４Ａをコードする）は、ｐ６ＨｐｒｏｔＬ２３４Ａ由来のｐ５１をｐＧＡＤＮＯＴのＢａｍＨＩ−ＳａｌＩ部位に挿入することによって作製した。ｌｅｘＡ２０２−Ａｌａ−６６Ｌ２３４Ａとの二量体化を回復する第二部位変異は、ＸＬ１−Ｒｅｄ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）中でｐ６６Ａｌａ２３４Ｌｅｘ２０２を増殖することによって作製した。２つの独立したプールを調製した。ＣＴＹ１０−５ｄを変異誘発ライブラリおよびｐ５１２３４ＧＡＤＮＯＴまたはｐ５１ＧＡＤＮＯＴのいずれかで同時形質転換した。β−ｇａｌコロニーリフトアッセイからブルーコロニーを拾い上げて、クローンとして精製した。単離したプラスミド由来のｐ６６ ＤＮＡを、非変異ｐＬｅｘ２０２−ＰＬバックボーンに再びクローン化し、ＣＴＹ１０−５ｄに再び導入して表現型を確かた。ｐ６６に存在する変異を、自動化ヌクレオチドシーケンシングよって決定した。
【０１５０】
（部位特異的突然変異誘発）
遺伝子型Ｄ１１０Ｇを有するｐ６６は、コドン２３４の野生型への逆突然変異によるランダム突然変異生成によって得られたＤ１１０ＧおよびＬ２３４Ａの両者を含むｐ６６クローンから調製した。Ｗ４０２ＲまたはＷ４０６Ｒ置換のいずれかを伴うｐ６６は、ｐ６６ＨＸＡｌａＬｅｘ２０２由来の野性型ＢａｍＨＩ−Ｂｓｐｌ２８６Ｉ断片（１，０８０ｂｐ）をもつＬ２３４Ａをランダム突然変異生成することによって得たクローン由来のＢｓｐｌ２８６Ｉ−ＳａｌＩ断片（６００ｂｐ）を、ｐＬｅｘ２０２−ＰＬにサブクローニングすることによって調製した。
【０１５１】
（インビトロヘテロ二量体化）
野生型およびＣ末端にヒスチジンタグをもつｐ６６変異体（ｐ６６−Ｈｉｓ）を発現するプラスミドは、ｐＱＥ−７０（Ｑｉａｇｅｎ、Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ、ＣＡ）のＳｐｈＩ−ＢｇｌＩＩ部位にｐ６６コード領域をクローン化することよって構築した。Ｃ末端タグは、以前に記載したように追加した［クローン３（２７）］。グルタチオンＳ−トランスフェラーゼタグを付けたｐ５１（ＧＳＴ−ｐ５１）は、ｐ５１ＨＸＧＡＤＮＯＴ由来のＢａｍＨＩ−ＳａｌＩ断片をｐＧＥＸ５Ｘ−３（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ）にサブクローニングすることによって調製した。
【０１５２】
細胞を誘導して、次いで１ｍｇ／ｍｌのリソチームを１ｍｌの細胞溶解バッファ［５０ｍＭリン酸ナトリウムバッファ（ｐＨ ７．８）、５００ｍＭ ＮａＣｌ、０．５％ Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ−４０、５ｍＭ ＤＴＴ、並びに各１μｇ／ｍｌのペプスタチンＡ、アプロチニンおよびロイペプチン］を添加することによって溶解して浄化した。可溶化液を合わせて、４℃において１６時間インキューベートした。ヘテロダイマーをグルタチオンセファロース４Ｂビーズで捕らえ、未結合のサブユニットを細胞溶解バッファで洗浄することによって除去した。ビーズに結合したヘテロダイマーをＳＤＳ／ＰＡＧＥ電気泳動よって分離した。ＲＴ活性の定量のために、１０ｍＭの還元グルタチオンの５０ｍＭトリス（ｐＨ ８．０）溶液でダイマーをビーズから溶出した。種々の時間におけるホモポリマーのテンプレート−プライマーのＤＮＡポリメラーゼ活性についてサンプルをアッセイし、時間経過の直線段階の初期の勾配から活性を決定した。ウエスタンブロットでは、それぞれのサンプルにおけるＧＳＴ−５１タンパク質が同等に回収されることを確かめた。
【０１５３】
（結果）
（ＲＴ融合タンパク質の発現およびＲＴ活性）
ｐ６６の安定発現を、Ｇａｌ４ＢＤまたはＬｅｘＡ融合体のいずれかとして、かつその融合パートナーからｐ６６を分離するために６アラニンリンカーを使用して、いくつかの環境で試験した。ｌｅｘＡ８７のＣ末端、ｌｅｘＡ２０２のＣまたはＮ末端に（６アラニンスペーサを伴って、または伴わずに）融合されたｐ６６は、Ｇａｌ４ＡＤに対する様々な環境において全て安定して発現した（図１）。対照的に、Ｇａｌ４ＢＤ（Ｇａｌ４ＢＤ−６６）のＣ末端に融合されたｐ６６は、酵母において検出可能なレベルで発現されなかった（図１）。より小さいＲＴサブユニットであるｐ５１は、Ｇａｌ４ＢＤ、Ｇａｌ４ＡＤ、並びにｌｅｘＡ８７およびｌｅｘＡ２０２両者との融合物としてうまく発現された。我々は、ｐ６６ＳＨ２−１、ｐ６６ＡｌａＬｅｘ２０２およびｐ６６ＮＬｅｘＡによってコードされるベイト融合体が酵母においてＲＴ活性を示すかどうかを調べた。空ベクターで形質転換した酵母由来のタンパク質可溶化液と比較して、３つ全ての融合タンパク質において、高レベルのＲＴ活性を示した（データ示さず）。これらのデータは、ｐ６６融合タンパク質が機能的で、かつ測定可能な触媒活性を有する安定したコンホメーションであることを示唆する。
【０１５４】
（ツーハイブリッドシステムにおけるトランス活性化によるｐ６６とｐ５１ヘテロマーの相互作用）
Ｙ２Ｈ系によってｐ６６／ｐ５１ヘテロダイマーの相互作用を検出することができるどうかを試験するために、我々は、ｐ６６ＤＮＡ ＢＤおよびｐ５１ＤＮＡ ＡＤの融合タンパク質を発現しているプラスミドで酵母リポータ株を同時形質転換した（表１）。酵母で発現されたβ−ｇａｌ活性は、融合タンパク質間の相互作用強度を示し、定性的および定量的アッセイの両者によって評価した。ｐ６６ＳＨ２−１、ｐ６６ＡｌａＬｅｘ２０２およびｐ６６ＮＬｅｘＡから発現されたｐ６６ベイト融合体は、Ｇａｌ４ＡＤ−ｐ５１ドメイン融合体と相互作用するが（表１）、Ｇａｌ４ＡＤ単独とは相互作用しなかった（表１）。最も強い相互作用は、ｐ６６ベイトｌｅｘＡ２０２−Ａｌａ−６６および６６−ｌｅｘＡ２０２において観察された。さらに、ｐＡＣＴＩＩに発現されたｐ５１は、ｐ６６融合ベイトと同時発現されたときに、ｐ５１ＧＡＤＮＯＴより強いシグナルを与えた。ｐ６６融合タンパク質（ｌｅｘＡ２０２−６６）の安定した発現にもかかわらず、ｐ５１では有意な相互作用が検出されなかった（図１）。さらに、ｌｅｘＡ２０２−６６では、空のＧａｌ４ＡＤベクターであるｐＧＡＤＮＯＴと同様の弱いシグナルを生じたことから、このバージョンのｐ６６は、パートナーが存在しない場合でさえ弱い自己活性化をしていることが示される。
【０１５５】
表１　Ｙ２Ｈ系におけるｐ５１活性化ドメイン融合体とｐ６６結合ドメイン融合体の相互作用
【０１５６】
【表１】
2004509614.tif 000002
酵母株ＣＴＹ１０−５ｄまたは＃ＨＦ７ｃは、ｐ６６ベイトおよびｐ５１プレイ融合体をコードするプラスミドで変質転換した。プラスミドよってコードされる融合タンパク質は、材料および方法、並びに図１に記載されている。
【０１５７】
＊形質転換体をニトロセルロースにリフトして、β−ｇａｌコロニーリフトアッセイにかけて産生された青色の強さを決定した；＋＋＋（１ｈにおける強いブルー）；＋＋（１ｈにおけるブルー）；＋／−（３ｈにおける弱いブルー）；−（白）；ＮＤ（検出されない）。
【０１５８】
また、我々は、ｐ６６とｐ５１との間のヘテロマーの相互作用が、ｐ５１はＬｅｘＡまたはＧａｌ４ＢＤ融合体として、ｐ６６はＧａｌ４ＡＤ融合体として、相反する構成で検出され得ることを示した（表２）。種々の環境においてｐ６６とｐ５１のヘテロマーの二量体化が示されたことは、相互作用が特異的であることを強く示唆する。５つの無関係なタンパク質との相互作用試験では、シグナルが示されなかった（データ示さず）ことは、酵母におけるＲＴヘテロ二量体化の特異性についてのさらなる証拠を提供する。
【０１５９】
表２　Ｙ２Ｈ系におけるｐ６６活性化ドメイン融合体とｐ５１結合ドメイン融合体の相互作用
【０１６０】
【表２】
2004509614.tif 000003
酵母株ＣＴＹ１０−５ｄまたは＃ＨＦ７ｃは、ｐ６６ベイトおよびｐ５１プレイ融合体をコードするプラスミドで変質転換した。プラスミドによってコードされる融合タンパク質は、材料および方法、並びに図１に記載されている。
【０１６１】
＊表１に定義したとおりである。
【０１６２】
＃表１に定義したとおりである。
【０１６３】
（ホモダイマーの相互作用）
ＲＴヘテロダイマーｐ６６／ｐ５１の相互作用は、１０−９Ｍの解離定数を有するが、ｐ６６およびｐ５１のホモダイマーの解離定数は、それぞれ１０−６Ｍおよび１０−５Ｍである（９）。我々は、ＣＴＹ１０−５ｄをｐ５１ＳＨ２−１またはｐ５１Ｌｅｘ２０２ベイトおよびｐ５１ＡＣＴＩＩプレイで同時形質転換したときに、ｐ５１ホモ二量体化を検出することができなかった（データ示さず）。対照的に、酵母をｐ６６ＮｌｅｘＡベイトおよびｐ６６ＡｌａＡＣＴＩＩプレイで同時形質転換したときに、ｐ６６ホモ二量体化を検出することができる（β−ｇａｌ活性０．３Ｍｉｌｌｅｒ ｕｎｉｔｓ）。これらの２つの構築物によるｐ６６ホモ二量体化は、ｐ５１ＡＣＴＩＩとｐ６６ＮｌｅｘＡの相互作用と比較して、１００倍弱いかった（表１）。インビボで観察される相互作用強度は生化学なデータと一致している。
【０１６４】
（ｐ５１と相互作用するｐ６６ドメイン）
我々は、Ｙ２Ｈ ＲＴ二量体化アッセイを使用して、ｐ５１と結合するために必要な領域をマップした（図２）。ポリメラーゼサブドメインにおけるシーケンシャルな欠失を有する一連の変異体は、ｌｅｘＡ８７とのＣ末端融合体として調製した。フィンガーおよびパームサブドメインの欠失（ｌｅｘＡ８７−Ｔ＋Ｃ＋Ｒ）は、Ｇａｌ４ＡＤ−ＨＡ−５１に対する結合に有意な影響を及ぼさなかった。サムサブドメインのさらなる欠失（ｌｅｘＡ８７−Ｃ＋Ｒ）は、β−ｇａｌ活性の減少を生じた（図２）。ＲＮａｓｅ Ｈドメイン単独の発現では、ｐ５１との相互作用に充分ではなかった。この相互作用の欠如は、異常なＲＮａｓｅ Ｈコンホメーションに起因するものではなく、また、ｌｅｘＡ８７−Ｒは、細胞タンパク質のジアホラーゼとｌｅｘＡ８７−６６との場合と同様に強力に相互作用することから、我々は、Ｙ２Ｈ系においてＲＴのＲＮａｓｅ Ｈドメインとの相互作用を見出した（結果示さず）。ベイト融合体は、いずれもＧａｌ４ＡＤ−ＨＡ単独で同時形質転換したときに、ｌａｃＺリポータ遺伝子の活性化を示さなかったことから、ベイト融合体による非特異的な自己活性化の可能性は除外される（結果示さず）。これらのデータは、ｐ６６のコネクションサブドメインおよびＲＮａｓｅ Ｈサブドメインが、ｐ５１との相互作用に充分であることを示唆する。
【０１６５】
（ｐ５１のＣ末端は、ｐ６６との相互作用に必要である）
ｐ５１のＣ末端からわずか２５アミノ酸の欠失がｐ６６との二量体化を阻止できることが、生化学的に以前に明らかにされていた（１５）。この効果をＹ２Ｈ系における生理学的条件の下で観察することができるかどうかを確認するために、我々は、一連のｐ５１プレイ融合体のＣ末端欠失変異体を構築して、ｐ６６ベイトとの相互作用をアッセイした。ｐ５１のＣ末端から１３アミノ酸の欠失では、ｐ６６との二量体化に対して少しの効果（１．８倍の減少）しかなかった（図３）。しかし、２６アミノ酸およびそれ以上の欠失によってＲＴ二量体化が抑制されたことから、これらの相互作用におけるｐ５１のＣ末端の２６アミノ酸の重要性が示される。また、これらの結果は、系が、インビトロにおいて研究した酵素の挙動を忠実に再現していることを示唆している。
【０１６６】
（ｐ６６サブユニットにおけるＬ２３４Ａが、ＲＴ二量体化を抑制する）
Ｙ２Ｈ ＲＴ二量体化アッセイは、ヘテロマーの相互作用に影響を及ぼす単一アミノ酸置換の解析に適用した場合に最も有用であろう。該系を試験するために、我々は、両方のＲＴサブユニットにＬ２３４Ａプライマーグリップ変異（生化学的に、ｐ６６／ｐ５１の結合を抑制することが以前に示されている（１０））を導入した。ｐ６６およびｐ５１の両者にＬ２３４Ａが存在することにより、ＲＴ二量体化が抑制され、野生型タンパク質と比較してβ−ｇａｌシグナルが５３分の一に減少して観察された（図４）。個々のサブユニットにおけるＬ２３４Ａの効果を評価するために、ｐ６６変異体ベイトおよび野性型ｐ５１プレイ、またはｐ５１変異体ベイトおよび野性型ｐ６６プレイのどちらかを発現している構築物でＣＴＹｌＯｄ−５を同時形質転換した。Ｌ２３４Ａ変異体ｐ５１（Ｇａｌ４ＡＤ−５１Ｌ２３４Ａ）が野性型融合体ｌｅｘＡ２０２−Ａｌａ−６６で同時形質転換されたときに、野生型融合体と比較して、二倍未満のシグナルの減少が観察された（図４）。しかし、野生型Ｇａｌ４ＡＤ−５１と変異体ｌｅｘ２０２−Ａｌａ−６６Ｌ２３４Ａとの相互作用については、３２倍の阻害が観察された。これらのデータは、以前に報告されているように、Ｌ２３４Ａが主にｐ６６を介して二量体化に影響を与えていることを示唆する（１０）。ウエスタンブロット解析による酵母における融合タンパク質発現解析では、Ｌ２３４Ａ変異体を含む全ての融合タンパク質が安定して発現されたことを示した（結果示さず）。
【０１６７】
（ｐ６６Ｌ２３４Ａ変異体に対してヘテロ二量体化およびＲＴ活性回復させる第二部位変異）
Ｌ２３４ＡによるＲＴ二量体化阻害の機構についての洞察を得るために、我々は、ｐ５１との二量体化を回復させるｐ６６の第二部位サプレッサー突然変異を選択しようと考えた。二量体化が回復したｐ６６変異体を選択するために、ＣＴＹ１０−５ｄを、ｐ６６ＡｌａＬ２３４ＡＬｅｘ２０２の突然変異生成よって作製したライブラリと、Ｇａｌ４ＡＤ−５１またはＧａｌ４ＡＤ−５１−Ｌ２３４Ａ変異体のいずれかを発現しているプラスミドとで、同時形質転換した。２種の独立した変異ライブラリのそれぞれに由来する合計２５，０００のコロニーをスクリーニングした。ｌｅｘ２０２−Ａｌａ−６６Ｌ２３４ＡをＧａｌ４ＡＤ−５１およびＧａｌ４ＡＤ−５１−Ｌ２３４Ａで同時形質転換したときに、それぞれ６および５個のブルーコロニーが得られた。ＣＴＹ１０−５ｄを、それぞれの単離したライブラリプラスミドで、およびｐ５１ＨＸＧＡＤＮＯＴまたはｐ５１Ｌ２３４ＡＧＡＤＮＯで再び形質転換し；回収されたクローンは、両方のｐ５１融合タンパク質との結合活性が回復していることを示した。５つの型の変異が観察された（表３）。Ｌ２３４Ａの変化を保持したクローンにおける単一アミノ酸変化には、Ｄ１１０Ｇ、Ｄ１８６Ｖ、Ｗ４０２ＲおよびＷ４０６Ｒを含んだ。残りの３つのクローンでは、コドン２３４が野生型に戻っていた（表３）。
【０１６８】
表３　ｌｅｘＡ２０２６６ＨＸＬ２３４Ａにおいて、ｐ５１に対して二量体化を回復させる第二部位変異
【０１６９】
【表３】
2004509614.tif 000004
酵母株ＣＴＹ１０−５ｄを、ｐ５１ＨＸＧＡＤＮＯＴと、示した通りにｐ６６に変異を有するｌｅｘＡ２０２−Ａｌａ−６６ＨＸ融合体を発現する種々のクローンとで同時形質転換した。ＮＡ、評価不可。
【０１７０】
＊表１に定義したとおりである。
【０１７１】
＃表１に定義したとおりである。
【０１７２】
変化のうちの２つは、触媒的に必須のアスパラギン酸残基Ｄ１１０およびＤ１８６である。これらの残基は、ダイマー界面には位置しておらず、これらの残基の変異により不活性なＲＴが生じる（２８）（図５）。Ｌ２３４Ａを伴わずにＤ１１０Ｇを単独で含むバリアントｐ６６では、ヘテロ二量体化において野生型ｐ６６より２倍強いβ−ｇａｌシグナルを与え、Ｌ２３４ＡとＤ１１０Ｇとの両者を含んでいるクローンと比較して４．６倍強かった。Ｄ１１０Ｇによる二量体化の部分的な回復は、活性部位のコンホメーション変化が、Ｌ２３４Ａによって媒介される構造変化を補っていることを示唆する。
【０１７３】
変異の第二のセットであるＷ４０２ＲおよびＷ４０６Ｒは、ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２および密接に関連したサルの免疫不全ウイルスＲＴｓ（２９）間で非常に保存されたトリプトファン繰り返し領域のダイマー界面に位置する（図５）。Ｌ２３４Ａの遺伝的背景において、これらの変異は、親株を越えたβ−ｇａｌシグナルの劇的な増加を生じ、野性型ＲＴ融合体と比較して、２倍高いヘテロ二量体化シグナルを得た（表３）。野性型の遺伝的背景におけるＷ４０２ＲおよびＷ４０６Ｒは、保存された変異体のものと同様の増大されたβ−ｇａｌ活性を有していた（表３）。したがって、トリプトファン繰り返しモチーフにおける変異は、Ｌ２３４Ａ媒介性の欠損とは独立して、ＧＡＬ４ＡＤ−５１との相互作用を増大するのかもしれない。
【０１７４】
第二部位変異がＬ２３４Ａ親株に対するヘテロ二量体化を回復し得ることを他のアッセイでも確認するために、我々は、これらのｐ６６変異体のｐ５１に対する結合をインビトロにおいて検討した。ＧＳＴ−ｐ５１、または野生型および変異体ｐ６６−Ｈｉｓを含んでいる細菌可溶化液を一緒にインキューベートして、グルタチオンセファロース４Ｂビーズでヘテロダイマーを捕獲した。予想したとおり、野生型ｐ６６はＧＳＴ−ｐ５１と二量体化したのに対し、ｐ６６Ｌ２３４Ａ変異体では二量体化しなかった（図６Ａ）。Ｌ２３４Ａ親株におけるＤ１１０Ｇ、Ｗ４０２ＲまたはＷ４０６Ｒによる二量体化の回復が観察され（図６Ａ）、したがって、Ｙ２Ｈアッセイにおける我々の観測が確認された。
ヘテロ二量体化の回復がＤＮＡポリメラーゼ活性の増大に関連しているかどうかを決定するために、ビーズから溶出したヘテロダイマーについて、ＲＴ活性をアッセイした（図６Ｃ）。ＧＳＴ−ｐ５１は、野生型酵素と比較して有意な基礎的活性を有していた。ｐ６６Ｌ２３４Ａとのインキュベーションによって生じる酵素では、同様の基礎的活性を有した。予想したとおり、活性部位変異Ｄ１１０Ｇを含んでいるｐ６６Ｌ２３４Ａを含むヘテロダイマーでも、基礎的活性のみを有していた。面白いことに、Ｗ４０２ＲおよびＷ４０６Ｒの両方の変異では、Ｌ２３４Ａ親株とのヘテロ二量体化を回復するだけでなく、野性型コントロールのレベルより上にまでもＲＴ活性を増加した（図６Ｃ）。
【０１７５】
（考察）
本研究において、我々は、ｐ６６とｐ５１の融合体が安定して酵母で発現することができ、相反する配置でヘテロに量体化することができることを明らかにした。アラニンの形態のスペーサまたはＨＡタグの存在は、Ｙ２Ｈアッセイにおいてより強い相互作用のための重要な側面であったかもしれない。さらに、我々は、先に述べたｐ５１欠失およびヘテロ二量体化におけるＬ２３４Ａ置換の効果を比較することにより、Ｙ２Ｈアッセイを確証した。また、我々は、ＲＴ二量体化を回復する第二部位変異の同定によって、このアッセイではさらにどのくらいＨＩＶ−１ ＲＴの構造−機能の研究ができるかを示した。
【０１７６】
ｐ６６のパーム、コネクションおよびＲＮａｓｅ Ｈドメインは、ｐ５１と主要な接触なしている。ｐ６６のパームサブドメインとｐ５１のフィンガーサブドメインのβ７−β８ループとの間の相互作用によるｐ６６／ｐ５１ヘテロダイマーが、非ヌクレオシドＲＴインヒビターである２’，５−ビス−Ｏ−（ｔｅｒｔ−ブチリジメチルシリル）−３’−スピロ−５’’−４’’−アミノ−１’’，２’’−オキソチオール−２’’，２’’−ジオキシド）］−ｂ−Ｄペントフラノシル（ＴＳＡＯ）によって不安定化する（３０，３１）ことは、パーム領域が重要であるという指標である。我々のインビトロ結合実験におけるＴＳＡＯ添加の予備試験では、該薬剤がヘテロ二量体化機能を減少することを確認している（データ示さず）。関連構造薬ＴＳＡＯｅ３Ｔの試験では、変性剤の存在下においてのみ検出可能な、より適度の不安定化を示した（３１）。ｐ５１との相互作用に必要なｐ６６ドメインの欠失マップは、コネクションおよびＲＮａｓｅ Ｈドメインの存在が、Ｙ２Ｈ系におけるｐ５１との相互作用に充分なことを示唆する。このｐ６６サブドメインは、ｐ５１との主要な接触を提供するので（９）、パームドメインの欠失がｐ５１に対する結合にわずかな効果しか有しなかったことは驚くべきことである；しかし、コネクションおよびＲＮａｓｅ Ｈドメインは、酵母におけるシグナルを飽和させるには充分な界面を提供しているかもしれない。
【０１７７】
Ｙ２Ｈアッセイに示したように、ｐ５１のＣ末端のトランケーションにより、１３アミノ酸欠失では、ｐ６６との二量体化に対してわずかな効果しか有しないが、２６アミノ酸欠失では、ヘテロ二量体化を阻止することが示された。これらのデータは、以前のインビトロ実験と一致している（１５）。全てのＣ末端のトランケーション変異体が、酵母で安定して発現され、発現の減少がシグナルに影響を及ぼしている可能性は除外された。これらのＣ末端の残基が二量体化に直接の役割を有しているかもしれないこと；またはこれらの残基の欠失は、構造エレメントα−Ｌおよびβ−２０の構造保全もしくは正確な位置決めに影響を及ぼしているかもしれないことは、あり得る（５，１５）。これらのエレメントは、ＨＩＶ−１二量体化において重要な役割を演ずることが提案されている（２９，３２）トリプトファン繰り返しモチーフを含む。
【０１７８】
我々は、以前にインビトロにおいて示したように（１０）、ＨＩＶ−１ ＲＴのｐ６６サブユニットが存在する場合に、Ｌ２３４Ａ置換が酵母におけるＲＴ二量体化を最も劇的に抑制することを示した。Ｌ２３４Ａは、ｐ６６のプライマーグリップ領域に位置し（５）、鳥類、霊長類およびマウスＲＴｓにおいて非常に保存されている（３３）。Ｌ２３４Ａがヘテロ二量体化に影響を及ぼす機構の決定を補助するために、我々は、ｐ６６／ｐ５１の会合を回復する第二部位変異を選択した。野性型Ｌ２３４に戻ったクローンを除いて、我々は２分類の変異体を観察した：トリプトファン繰り返しに変化があるもの、またはポリメラーゼ活性部位における変化があるもののいずれか（図５）である。また、両分類のサプレッサーは、インビトロ結合実験での測定で、ｐ５１に対するｐ６６サブユニットの結合を回復することが示された（図６Ａ）。Ｌ２３４Ａはダイマー界面ではなく、これが、ｐ６６のパームにおけるＰ９５とｐ５１のβ７−β８ループの残基との間の接触に間接的に影響を与えることによって二量体化に影響を及ぼすことが提案された（１１）。Ｗ４０２ＲおよびＷ４０６Ｒの変異は、この領域から離れており、ヘテロダイマーのｐ５１コネクションドメインと接触するコネクションサブドメインに位置している。コドン４０２および４０６の両者における塩基性残基の出現は、ｐ５１の酸性残基との電荷相互作用、あるいはコネクションドメイン界面における界面間の静電ポテンシャルの増加を示唆する。
【０１７９】
触媒的に必須のアスパラギン酸残基の第二部位サプレッサー変異による回復は、二量体化と活性部位残基との間に関係があることを示唆する。Ｄ１８６ＶもＤ１１０Ｇも、どちらもＬ２３４Ａとは明らかに接触を形成しないが、両方とも同じパームサブドメインにある（図５）（２）。ＮＮＲＴＩ結合部位（これにはＬ２３４を含む）とＲＴ触媒部位との間の相互作用は、構造上および酵素的なデータによって示唆されており、ＮＮＲＴＩｓ耐性の機構を説明する（３４，３５）。Ｄ１１０ＧまたはＤ１８６Ｖの変化は、おそらく活性部位に結合した２つのマグネシウムイオンのうち１つに欠失を生じさせるのであろう（３６）。１１０のグリシンの変化に加えて、キレート化されたマグネシウムの欠失は、この領域における柔軟性の増加を引き起こしているかもしれず、これにより二量体化に影響を及ぼしている。Ｄ１１０Ｇ ＲＴ変異体の結晶構造の測定は、これらの問題を解決する助けとなるだろう。
【０１８０】
ＨＩＶ−１のヘテロ二量体化は、化学療法介入の標的として提案されていた（７）。現在まで、臨床で使用されているＨＩＶ−１ ＲＴ二量体化インヒビターはない。それにもかかわらず、ＲＴの保存されたトリプトファン繰り返し領域を表すペプチドに基づいた、ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２ ＲＴ二量体化インヒビターについていくつかの報告がある（３２，３７）。これらのペプチドは、ｐ６６／ｐ５１の会合を阻止することが示されており（３２）、インビトロにおいて抗ＨＩＶ−１活性を有することが証明されている（３７）。ＴＳＡＯは、ｐ６６／ｐ５１ヘテロダイマーを不安定化することが示されており、非ペプチド性のＲＴ二量体化阻害剤となるかもしれない（３０）。この薬剤のＹ２Ｈ系におけるヘテロ二量体化に対するその効果の予備試験において、我々は、β−ｇａｌ活性の阻害を見ることはなかった（データ示さず）。しかし、該薬剤が酵母に取り込まれないという可能性を除外することはできない。ＲＴ二量体化におけるＹ２Ｈアッセイの有用性は、本願明細書に記載される方法に従ったこのプロセスで、その他のこのような阻害剤のスクリーニングが容易になることであろう。
【０１８１】
（実施例の第二のシリーズ）
非ヌクレオシド逆転写酵素インヒビター（ＮＮＲＴＩｓ）は、ヒト免疫不全ウイルス１型（ＨＩＶ−１）逆転写酵素（ＲＴ）のアロステリック阻害剤である。これらの多くの薬剤の存在下で培養された酵母は、酵母ツーハイブリッドアッセイによって報告したとおり、ＨＩＶ１ ＲＴのｐ６６とｐ５１サブユニットとの結合に劇的な増加を示す。該増大は、ＲＴに薬剤が結合することを必要とし；ｐ６６構築物への薬剤耐性変異の導入は、増大効果を打ち消した。また、該薬剤は、二量体化欠失変異体のヘテロ二量体化を誘導することもできる。酵母可溶化液由来のＲＴサブユニットの免疫共沈降により、薬剤によるヘテロダイマー形成の誘導を確かめた。インビトロにおける結合研究では、ＮＮＲＴＩｓはｐ６６にしっかりと結合してヘテロ二量体化を媒介することができるが、ｐ５１はできないことを示している。本研究では、ＲＴサブユニットの構築におけるＮＮＲＴＩｓの新しい効果を示す。
【０１８２】
ヒト免疫不全ウイルス１型（ＨＩＶ−１）逆転写酵素（ＲＴ）は、細胞侵入後、ゲノムＲＮＡの二本鎖プロウィルスＤＮＡへの変換に触媒作用を及ぼし（１）、該酵素のＲＮＡ−およびＤＮＡ−依存性ポリメラーゼ並びにリボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅ Ｈ）活性を利用する。ＨＩＶ−１ ＲＴは、ｐ６６およびｐ５１ポリペチドからなる非対称ダイマーである（２，３）。ｐ５１サブユニットは、ｐ６６と同一のＮ末端配列を含むが、Ｃ末端のＲＮａｓｅ Ｈドメインを欠いている。ＨＩＶ−１ ＲＴの構造は、未結合酵素（４）、非ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤（ＮＮＲＴＩｓ）（５，６）との複合体、テンプレート−プライマに結合したもの（７）またはｄＮＴＰ基質を伴わないもの（８）を含むいくつかの形態におけるＸ線結晶学よって解明されている。ｐ６６サブユニットのポリメラーゼドメインは、右手に似ているおり、フィンガー、パーム、サムおよびコネクションのサブドメインを含み、後者は、ポリメラーゼとＲＮａｓｅ Ｈ領域間のつなぎとして作用している（５，８）。ｐ５１は、ｐ６６と同様のポリメラーゼドメインを有するにもかかわらず、これらの個々のドメインの相対的な配向は著しく異なる（５，８）。構造解析では、ｐ６６とｐ５１との間に３つの主要な接触があることを示しており、相互作用界面の大部分は疎水性である（９、１０）。
【０１８３】
ＮＮＲＴＩｓは、化学的に多種多様であり、主に３０以上の種々の分類を含む疎水性化合物である（１１、１２）。ＮＮＲＴＩｓは、活性のために細胞内物質代謝を必要とせず、ｄＮＴＰ基質およびテンプレート／プライマーに関するＲＴ活性の非競合的阻害剤であり、比較的毒性がない（１１）。ＮＮＲＴＩｓは、ｐ６６サブユニットのポリメラーゼ活性部位からは近いが、異なった疎水性ポケットに結合して（１３，１４）、ＲＴのアロステリック変化を媒介して酵素活性を抑制する（１５，１６）。単一療法としてのＮＮＲＴＩｓの初期臨床用途で、および細胞培養における薬剤耐性変異型の選別では、薬剤結合に直接影響を及ぼすＮＮＲＴＩ結合ポケット（１３，１４）で単一アミノ酸が変化すること（１７，１８）によって、非常に薬剤耐性な変異型が迅速に出現する結果となる。非常に活性な抗レトロウイルス治療法に使用するために現在承認されているＮＮＲＴＩｓは、ネビラピン（ｎｅｖｉｒａｐｉｎｅ）（１９）、デラビルジン（ｄｅｌａｖｉｒｄｉｎｅ）（２０）およびエファビレンズ（ｅｆａｖｉｒｅｎｚ）（２１）を含む。
【０１８４】
我々は、以前にＨＩＶ−１ ＲＴヘテロ二量体化が、適切に設計された構築物を使用した酵母ツーハイブリッド（Ｙ２Ｈ）系において、効果的にモニターすることができることを示した（２２）。
【０１８５】
我々は、酵母におけるβ−ガラクトシダーゼ（β−ｇａｌ）読み出しに対するＮＮＲＴＩｓの効果を評価するためにこの系を使用した。いくつかのＮＮＲＴＩｓ誘導は、β−ｇａｌ活性の劇的な増加を誘導し、この増加は、ｐ６６サブユニットと薬剤との特異的相互作用の結果としてＲＴサブユニット間の結合が強力になったためであった。これらのデータは、ＨＩＶ−１ ＲＴ二量体化に対するＮＮＲＴＩｓの新しい効果を実証しており、これらの薬剤が二量体化（ＣＩＤ）の化学物質インデューサ（標的タンパク質に結合してもう一つのタンパク質との相互作用を促進する化合物（２３））と同様の態度でふるまうことを示す。
【０１８６】
（材料および方法）
（抗ウイルス薬）
本研究において使用した薬剤は、以下の通りであった：カルボキシアニリドＵＣ７８１、ＵＣ１０、ＵＣ３８、ＵＣ８４（２４，２５）、 Ｕｎｉｒｏｙａｌ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｌｔｄ （Ｍｉｄｄｌｅｂｕｒｙ， ＣＴ）；エファビレンズ（ＥＦＶ）（２１）ＤｕＰｏｎｔ Ｍｅｒｃｋ （Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ Ｄｅｌ．）；デラビルジン（ＢＨＡＰ）（２６）、 Ｐｈａｒｍａｃｉａ ａｎｄ Ｕｐｊｏｈｎ （Ｋａｌａｍａｚｏｏ， Ｍｉｃｈ）；ネビラピン（１９）、 Ｒｏｘａｎｎｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ （Ｒｅｄｄｉｎｇ Ｃｏｎｎ）；ＨＢＹ ０９７（２７）Ｈｏｅｃｈｓｔ−Ｂａｙｅｒ （Ｆｒａｎｋｆｕｒｔ， Ｇｅｒｍａｎｙ）；８−クロルＴＩＢＯ（８−Ｃｌ−ＴＩＢＯ）（２８）およびａ−ＡＰＡ（２９）、Ｊａｎｓｓｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ （Ｂｅｅｒｓｅ， Ｂｅｌｇｉｕｍ）。全ての薬剤は、Ｙ２ＨおよびインビトロアッセイためにＤＭＳＯに１０ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解した。
【０１８７】
（酵母株および細菌株および酵母方法）
酵母株および細菌株は以前に記載したとおりである（２２）。
【０１８８】
酵母の形質転換、定性的β−ｇａｌコロニーリフトアッセイおよび定量的β−ｇａｌ液状アッセイは、以前に記載したとおりである（２２）。
【０１８９】
（酵母発現ベクターにおけるＨＩＶ−１ ＲＴ融合体の構築）
野生型ｐ６６およびｐ５１融合タンパク質ｌｅｘＡ８７−６６、ｌｅｘＡ８７−５１、Ｇａｌ４ＡＤ−６６、Ｇａｌ４ＡＤ−５１およびＧａｌ４ＡＤ−ＨＡ−５１をそれぞれ発現するｐ６６ＳＨ２−１、ｐ５１ＳＨ２−１、ｐ６６ＧＡＤＮＯＴ、ｐ５ｌＧＡＤＮＯＴおよびｐ５ＩＡＣＴＩＩの構築は、以前に記載したとおりである（２２）。ｐ６６Ｌ２３４ＡＳＨ２−１（ｌｅｘＡ８７−６６Ｌ２３４Ａをコードする）は、ｐ６６ＡｌａＬ２３４ＡＬｅｘ２０２（２２）のＲＴ領域に由来するＰＣＲ増幅産物を、ｐＳＨ２−１のＢａｍＨＩ−ＳａｌＩ部位にクローン化することよって作製した。ｐ５１２３４ＡＣＴＩＩ（Ｇａｌ４ＡＤ−ＨＡ ５１Ｌ２３４Ａをコードする）は、ｐ５１２３４ＧＡＤＮＯＴ（２２）由来のｐ５１ ＢａｍＨＩ−ＳａｌＩ断片を、ｐＡＣＴＩＩにサブクローニングすることによって構築した。ｐ６６Ｗ４０１ＡＳＨ２−１（ｌｅｘＡ８７−６６Ｗ４０１Ａをコードする）、ｐ５１Ｗ４０１ＡＡＣＴＩＩ（Ｇａｌ４ＡＤ−ＨＡ ５１Ｗ４０１Ａをコードする）およびｐ５１Ｗ４０１ＡＧＡＤＮＯＴ（Ｇａｌ４ＡＤ−５１Ｗ４０１Ａをコードする）は、プラスミドｐＡＬＲＴ−７８Ｓ（Ａ４０２）（Ｊｏｈｎ ＭｃＣｏｙからの贈与）由来のＲＴ領域をＰＣＲ増幅して、ｐＳＨ２−１のＢａｍＨＩ−ＳａｌＩ部位、ｐＧＡＤＮＯＴまたはｐＡＣＴＩＩのＢａｍＨＩ−ＸｈｏＩ部位にクローン化することによって作製した。ｐ６６のｌｅｘＡ８７−６６の融合タンパク質にＹ１８１Ｃ変異を含むｐ６６Ｙ１８１ＣＳＨ２−１は、Ｇｅｎｅ Ｅｄｉｔｏｒ Ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ， Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩ）を使用して、製造業者のプロトコールに従って部位特異的突然変異よって調製した。
【０１９０】
（細菌性の発現ベクターにおけるＨＩＶ−１ ＲＴ融合体の構築）
野生型およびｐ６６変異体（Ｌ２３４ＡまたはＷ４０１Ａのいずれか）は、ｐＱＥ−７０（Ｑｉａｇｅｎ、Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ、ＣＡ）（２２）のＳｐｈＩ−ＢｇｌＩＩ部位にクローン化した。グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ−タグを付けたｐ５１（ＧＳＴ−ｐ５１）およびＷ４０１ＡまたはＬ２３４Ａ置換を含む変異体は、ｐ５１をコードする断片をｐＧＥＸ５Ｘ−３（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）（２２）のＢａｍＨＩ−ＳａｌＩ部位にクローン化することよって構築した。
【０１９１】
（ＮＮＲＴＩｓのβ−ｇａｌ活性に対する効果を測定するためのＹ２Ｈ ＲＴヘテロ二量体化アッセイ）
ｐ６６ベイトとｐ５１プレイ融合体を発現する構築物で形質転換されたＣＴＹ１０−５ｄを、ヒスチジンおよびロイシンを含まない２％グルコースを含む合成完全培地（ＳＣ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ）において、定常状態まで一晩培養した。薬剤の有無にかかわらず２．５ｍｌの培地に０．０１２５−０．２５ ＯＤ６００ユニットのＣＴＹ１０−５ｄを添加した。酵母を３０℃において、通気してＯＤ６００＝０．５まで培養した。１ＯＤ６００ユニットと同量を、各処理のためにペレットにし、定量的β−ｇａｌ液状アッセイにかけた。
【０１９２】
（酵母可溶化液におけるｐ６６およびｐ５１の免疫共沈降）
薬剤を含んでいない培養液、エファビレンズまたはＵＣ７８１を含む培養液（３０ｍｌ）と、０．１ ＯＤ６００ユニット／ｍｌのｐ６６ベイトおよびｐ５１プレイ融合体を発現するＣＴＹ１０−５ｄとを、ＳＣ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ中で３０℃においてＯＤ６００ ＝０．５まで培養した。細胞を１２ ＯＤ６００ユニットに標準化して、１０ｍｌのＴＥ（１０ｍＭトリス ｐＨ ７．５；１ｍＭのＥＤＴＡ）バッファで洗浄した。タンパク質抽出物および免疫沈降物の調製は、抗ＨＡ１１モノクロナール抗体（ｃｌｏｎｅ １６Ｂ１２ ； Ｃｏｖａｎｃｅ， Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ， ＮＪ）およびＰｒｏｔｅｉｎ Ｇ−ＰＬＵＳアガロースビーズ （Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ； Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ， ＣＡ）の使用したことを除いて、以前に記載したとおりである（３０）。サンプルは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離した。ｌｅｘＡ８７−６６融合タンパク質を、ｐ６６を特異的に検出するモノクロナール抗体７Ｅ５（３１）を使用してプロービングした。
【０１９３】
（ＮＮＲＴＩｓ存在下におけるインビトロにおけるヘテロ二量体化）
細菌に発現した野生型ｐ６６−ＨｉｓとＧＳＴ−ｐ５１（または変異体）のヘテロ二量体化は、以前に記載したとおり（２２）、細菌可溶化液で評価した。エファビレンズが特定のＲＴサブユニットに結合する容量を決定するために、５００μｌ反応物の溶解バッファ溶液（ＮＰ−４０なしで）（２２）、５μｇのｐ６６−Ｈｉｓ、５μｇのＧＳＴ−ｐ５１または組換え体タンパク質なし（総タンパク質濃度は、各反応において０．８μｇ／ｍｌであった）を、エファビレンズ濃度を増加して４℃において一晩インキュベートした。ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ−ＹＭ ５０の濾過器装置（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ， Ｂｅｄｆｏｒｄ， ＭＡ）を使用して可溶化液を細胞溶解バッファで４回洗浄し、未結合の薬剤を除去した。対応するＲＴサブユニット５μｌを、洗浄した可溶化液（５００μｌ中）に投与して４℃において１．５時間インキュベートした。ヘテロダイマーをビーズに捕獲して（２２）ＳＤＳ／ＰＡＧＥによって分離し、ＲＴ抗体（モノクローナル抗体５Ｂ２）を使用して検出した（３１）。
【０１９４】
（結果）
（ＮＮＲＴＩｓによるβ−ｇａｌ活性の増大）
ＲＴポリペチドの結合に対するＮＮＲＴＩｓの効果を試験するために、我々は、ＲＴヘテロ二量体化を測定する酵母遺伝的アッセイを使用した（２２）。このアッセイにおいて、ｌｅｘＡ８７のＣ末端に融合したＨＩＶ−１ ＲＴのｐ６６サブユニット（ｌｅｘＡ８７−６６）およびＧａｌ４ＡＤ（Ｇａｌ４ＡＤ５１）に融合したｐ５１サブユニットを発現している酵母は、恒常的に相互作用し、組み込まれたＬａｃ Ｚリポータ遺伝子に由来する発現の活性化を生じる。この相互作用に対するＮＮＲＴＩｓの効果を試験するために、７つの異なったＮＮＲＴＩ分類を示す１０の薬剤を、酵母の増殖時に培地に添加して、β−ｇａｌレベルを決定した。試験した１０のＮＮＲＴＩｓの中で、９つでは、薬剤で処理していない細胞と比較して、濃度−依存的にβ−ｇａｌ活性の劇的な増加を示した（図７Ａおよび７Ｂ）。増殖速度によって測定した毒性は、非処理のコントロールと比較して、試験した薬剤濃度において有意な毒性は観察されなかった（結果は示さず）。エファビレンズは、最も強力な化合物であり、試験した最も高い薬剤濃度において、β−ｇａｌ活性の４０倍増加を媒介した（図７Ａ）。カルボキシアニリドＵＣ７８１は、二番目によく効く薬剤であり、ＵＣ１０およびキノキサリン、ＨＢＹ ０９７が続いた（図７Ａおよび７Ｂ）。残りのＮＮＲＴＩｓは、ほとんど効ず、試験した最も高い濃度で、β−ｇａｌ活性の８−１０倍増加までを示した（図７Ａおよび７Ｂ）。対照的に、デラビリジンは、β−ｇａｌ増大活性が欠いていた（図７Ａ）。
【０１９５】
（ＮＮＲＴＩｓによるβ−ｇａｌ活性の増大は、ＲＴヘテロ二量体化に特異的である）
ＮＮＲＴＩｓによるβ−ｇａｌ増大の特異性を調査した。空ベクターｐＳＨ２−１とｐＧＡＤＮＯＴ（それぞれｌｅｘＡｇ７およびＧａｌ４ＡＤを発現する）で形質転換された酵母に、最も強力なβ−ｇａｌ増大薬のエファビレンズを階段希釈して処理した。我々は、１５μＭの薬剤（示されないデータ）の存在下でさえ、β−ｇａｌ活性の増加を観察しなかった。また、エファビレンが、いくつかの無関係なタンパク質−タンパク相互作用対（伸長因子終結因子１（Ｍ．Ｏ．未発表）とモロニーマウス白血病ウィルス逆転写酵素を含む）のβ−ｇａｌ活性を増大する容量は検討したが、β−ｇａｌ活性の増大または阻害は観察されなかった。
【０１９６】
ＨＩＶ−１ ＲＴのｐ６６サブユニットにおけるＹ１８１Ｃ変異は、ネビラピンに対する耐性に１００倍以上の増加を与える（１７）。この変異は、薬剤の結合に直接影響を及ぼす（１３，１４）。ＮＮＲＴＩｓによるβ−ｇａｌ増大の特異性をさらに証明するために、Ｙ１８１Ｃを、ｌｅｘＡ８７−６６融合タンパク質をコードするプラスミドに導入した。酵母を種々のプラスミド対で同時形質転換して、ネビラピンの存在下で培養した。ｐ６６ベイトにＹ１８１Ｃの変化が存在すると、ネビラピンによる増大効果を全く打ち消した（図８）。対照的に、Ｙ１８１Ｃよって与えらる非常に低レベルのこの薬剤に対する耐性と一致して、有意なレベルのβ−ｇａｌの増大が、エファビレンズの存在下でなお保持された（結果示さず）。これらのデータは、β−ｇａｌ増大効果が、ＨＩＶ−１ ＲＴのｐ６６サブユニットとネビラピンとの特異的相互作用によるという動かぬ証拠を提供する。
【０１９７】
（ＮＮＲＴＩｓは二量体化欠失変異体のβ−ｇａｌ活性を増大することができる）
以前の研究において、ＨＩＶ−１ ＲＴのＬ２３４Ａ変異がＲＴ二量体化を阻止することが示されている（２２、３２）。また、両サブユニットの結合サブドメインに存在するトリプトファン繰り返しモチーフ（コドン３９８−４１４）の役割についてのその他の研究では、Ｗ４０１Ａ変異もＹ２ＨアッセイにおけるＲＴ二量体化を減少させることを示した（Ｇ．Ｔ．未発表データ）。我々は、これらの二量体化欠失ＲＴ変異体におけるβ−ｇａｌ増大効果に対するＮＮＲＴＩｓ、エファビレンズおよびＵＣ７８１の効果を調査した。面白いことに、エファビレンズで処理し、かつ一方または両方のサブユニットにＷ４０１Ａ変化を発現する酵母では、薬剤なしと比較してβ−ｇａｌ活性に劇的な増加を示した（図９Ａ）。両方のサブユニットにＷ４０１Ａ変異を発現している酵母のβ−ｇａｌ活性は、薬剤なしと比較して、１．６μＭエファビレンズの存在下で１００倍強力であった（図９Ａ）。また、ＵＣ７８１は、両サブユニットにＷ４０１Ａを発現している酵母のβ−ｇａｌ活性を増大することができる（結果示さず）。変異体ではβ−ｇａｌ活性の多大な増加を示すが、エファビレンズの存在下で培養した野生型ＲＴで観察される実際の活性（それぞれのバーの上に示した）は、それを上回らなかった点に留意する必要がある。
【０１９８】
また、二量体化欠損変異体Ｌ２３４Ａに対するエファビレンズの効果を検討した。エファビレンズは、一方または両方のサブユニットにＬ２３４ＡをもつＲＴベイトおよびプレイ融合体を発現する酵母におけるβ−ｇａｌ活性を増大した（図９Ｂ）。しかし、β−ｇａｌの増加する倍数は、Ｗ４０１Ａ変異体より少なかった（図９Ａ）。対照的に、ＵＣ７８１では、Ｌ２３４Ａ変異体を発現している酵母に対し増大をあたえなかった（結果示さず）。残基２３４は、ＮＮＲＴＩ結合部位であり（１３）、ＵＣ７８１と接触しているかもしれない（３３）ので、ＵＣ７８１がＬ２３４Ａ変異体に結合しないことが起こりうる。また、これらのデータは、ＮＮＲＴＩｓがこれらの変異酵素に結合することができるときに、ＮＮＲＴＩｓは、２つの変異よって引き起こされる会合の欠陥を抑制できることを示す。
【０１９９】
（酵母可溶化液からのヘテロダイマーの免疫共沈降は、薬剤の存在下でダイマー形成の増加を示す）
酵母におけるベイト−プレイ融合体の定常状態タンパク質レベルの増加または薬剤−ヘテロダイマー複合体の核移行の増加はいずれも、ＮＮＲＴＩｓよってβ−ｇａｌな活性の増加が観察されることの説明とはならないことが、実験により示唆される（結果示さず）。ＮＮＲＴＩｓ誘導ヘテロ二量体化を直接的に試験するために、我々は、二量体化欠損変異体を発現している酵母の可溶化液を免疫共沈降にかけた。Ｗ４０１Ａ変異（ｌｅｘＡ８７−６６Ｗ４０１ＡおよびＧａｌ４ＡＤ−ＨＡ ５１Ｗ４０１Ａ）またはＬ２３４Ａ変化（ｌｅｘＡ８７−６６Ｌ２３４ＡおよびＧａｌ４ＡＤ−ＨＡ ５１Ｌ２３４Ａ）を含んでいるｐ６６ベイトおよびｐ５１プレイ融合体を発現する酵母を、エファビレンズ（１．６μＭ）、ＵＣ７８１（１６μＭ）の存在下または薬剤の非存在下で培養した。赤血球凝集素（ＨＡ）抗体を使用して、ｐ５１プレイと結合したｐ６６ベイトのいずれかを免疫沈降し、次いで抗ｐ６６特異抗体を使用して検出した。ｐ６６ベイト融合体の免疫共沈降については、サンプルを２つに分割して、１部をＮＮＲＴＩ添加せずに処理し、一方もう１つを酵母増殖の間に使用したものと同じ濃度の薬剤中で維持した。また、薬剤の非存在下で培養した酵母を、薬剤の非存在下で、または１．６μＭのエファビレンズの存在下で処理した。エファビレンズの存在下で培養した酵母では、薬剤なしと比較して、ｐ５１プレイに結合したｌｅｘＡ８７−６６Ｗ４０１ＡおよびｌｅｘＡ８７−６６Ｌ２３４Ａの量に明らかな増加が観察された（４Ａ図および４Ｂ）。ＵＣ７８１中で培養した酵母についての同様の実験では、Ｗ４０１Ａ変異体を発現する酵母におけるヘテロダイマー形成を示すが、Ｌ２３４Ａ変異体では示されず；これらのデータは、細胞におけるβ−ｇａｌ活性レベルと一致する（４Ａ図および４Ｂ）。
【０２００】
薬剤の非共存下または存在下で免疫共沈降されたｐ６６ベイトの量に有意な差が観察されなかったことは、本アッセイの条件下でヘテロダイマーが安定していたことを示している。面白いことに、薬剤の非存在下で培養した細胞から得られた酵母可溶化液（Ｗ４０１Ａ変異体の免疫共沈降手順の間にエファビレンズを添加した酵母可溶化液）では、さらに有意にヘテロダイマーが存在する（図１０Ａ）。これらのデータは、一部のヘテロダイマー形成がインビトロにおいて生じ得ることを示唆する。薬剤の非存在下および存在下で培養した酵母のオリジナルの可溶化液に存在する変異体ｐ６６ベイトおよびｐ５１プレイ融合体のレベルが同じであることは、薬剤の存在下で免疫共沈降したｐ６６ベイトの増加は、融合タンパク質の増加レベルによらないことを示している。これらの実験から、試験したＮＮＲＴＩｓは、Ｙ２Ｈアッセイにおいてｐ６６とｐ５１のヘテロ二量体化を誘導することよって作用すること、および増加したダイマー形成は、β−ｇａｌ活性の増加と互いに関連することが明らかである。
【０２０１】
（インビトロにおいて、エファビレンズは、可溶化液中の野生型および変異体ｐ６６とｐ５１との結合を増大する）
ＮＮＲＴＩｓがインビトロにおける二量体化を増加することができるかどうかを調査するために、ｐ６６−ＨｉｓまたはＧＳＴ−ｐ５１のいずれかを含んでいる細菌可溶化液を調製して、エファビレンズの濃度増加をしながら組み合わせた。インヒビターの非存在下で少量のダイマーが存在し、これは検出可能な量のｐ６６−Ｈｉｓによって示された。ダイマー形成の濃度依存的な増加は、エファビレンズ（図１１）の濃度を増加する場合に観察された。また、Ｌ２３４ＡおよびＷ４０１Ａ変異体に対してエファビレンズが及ぼす増大効果を評価した。ｐ６６Ｌ２３４ＡとＧＳＴ−ｐ５１Ｌ２３４Ａまたはｐ６６Ｗ４０１Ａ−ＨｉｓとＧＳＴ−ｐ５１Ｗ４０１Ａを別々に発現している細菌可溶化液を上記の通りに組み合わせて、エファビレンズ濃度を増加してインキュベートした。Ｗ４０１Ａ変異体において、１０倍モル過剰のエファビレンズが存在する場合に、ダイマー形成に有意な増加が観察された（図１１）。Ｌ２３４Ａ変異体に検出可能な二量体化の増大を誘導するためには、ＲＴ以上の１００倍モラー過剰のエファビレンズを必要とした（図１１）。これらのデータは、免疫共沈降実験と一致しており、エファビレンズによる二量体化の増大が、そのＨＩＶ−１ ＲＴとの特異的相互作用によるものであり、Ｙ２Ｈアッセイに使用した融合タンパク質、またはインビボにおける酵母細胞に存在する成分に依存したものでないことを示す。
【０２０２】
（インビトロにおけるＲＴサブユニットのヘテロ二量体化を増大するその他のＮＮＲＴＩｓ）
我々は、残りのＮＮＲＴＩｓがインビトロにおいてＧＳＴｐ５１とｐ６６−Ｈｉｓの二量体化を増大するその能力を試験することにより、我々のインビトロでの研究を拡張した。我々のＹ２Ｈデータと一致して、我々は、エファビレンズが最も強力な二量体化のエンハンサであることを観察した。その他のＮＮＲＴＩｓの相対的なインビトロにおける作用強度は、酵母におけるそれらのβ−ｇａｌ増大効果とよく相関していた（図７および１２）。対照的に、ＵＣ７８１およびＵＣ１０は、それらのβ−ｇａｌ増大活性と比較して、細菌可溶化液では弱い二量体化インデューサであった。これらの薬剤の低い二量体化増大活性は、それらが溶解性に乏しいことと、およびインビトロアッセイの条件（アッセイは、４℃で行われた）との両者の作用によるかもしれない。対照的に、酵母アッセイの条件（アッセイは、３０℃で攪拌して行った）が、ＵＣ７８１およびＵＣ１０の可溶化を容易にしたのかもしれない。面白いことに、デラビルジンは、インビトロで不活性であることから、酵母における効果の欠如は、この薬剤が細胞を透過できないためではないことも示している。
【０２０３】
（エファビレンズは、ＧＳＴ−ｐ５１ではなく、ｐ６６−Ｈｉｓに結合することよってヘテロ二量体化を強化する）
エファビレンズがヘテロ二量体化を増大する機構の解明を補助するために、我々は、この薬剤がｐ６６−ＨｉｓまたはＧＳＴ−ｐ５１どちらに結合することができるかどうかを評価した。ｐ６６−Ｈｉｓ、ＧＳＴ−ｐ５１を発現しているまたは組換え体タンパク質を発現していない細菌可溶化液を、エファビレンズの非存在下または濃度を増大して、プレインキュベートした。未結合薬剤を、一連の洗浄で除去して、同族のＲＴサブユニットを添加することによって、あらゆる残留薬剤の存在をアッセイした。ｐ６６−ＨｉｓおよびＧＳＴ−ｐ５１を添加して模擬細菌可溶化液を洗浄し、エファビレンズ除去の効率を評価した。ｐ６６−Ｈｉｓをエファビレンズとプレインキュベートしたときに、我々は、全ての薬剤濃度において、その後に添加されたＧＳＴ−ｐ５１との二量体化が増大されることを観察した（図１３）。この増大は、ｐ６６−ＨｉｓおよびＧＳＴ−ｐ５１を同時に種々の薬剤濃度で混合した場合のコントロールと同様であった（図１２）。エファビレンズとプレインキュベートしたｐ６６−Ｈｉｓと比較して、ヘテロ二量体化の作用強度の１００倍の減少が、洗浄した模擬細菌可溶化液において観察された（図１３）。薬剤とプレインキュベートして、洗浄し、次いで機能的ヘテロ二量体化アッセイにかけたＧＳＴ−ｐ５１では、薬剤処理した模擬細菌可溶化液で観察されたヘテロ二量体化と同じパターンを示した。これらのデータは、エファビレンズが、ＧＳＴ−ｐ５１ではなくｐ６６−Ｈｉｓにしっかりと結合すること、および次いでこの結合が、その後に添加されるＧＳＴ−ｐ５１とのヘテロ二量体化を促進することを示す。
【０２０４】
（考察）
本研究は、特定のＮＮＲＴＩｓの以前に記されていない性質−これらがＨＩＶ−１ ＲＴのｐ６６およびｐ５１サブユニットのヘテロ二量体化を増大する能力を報告する。この効果は、読み出しとしてβ−ｇａｌ活性を使用したｐ６６とｐ５１の二量体化を検出するＹ２Ｈ系で、および免疫共沈降実験における確認の両者で観察された。また、該現象は、細菌に発現されたＧＳＴ−ｐ５１およびｐ６６−Ｈｉｓを使用してインビトロで観察されたことから、これが酵母に特異的でないことを示している。また、ＮＮＲＴＩｓは、相互作用欠損変異体Ｌ２３４ＡおよびＷ４０１Ａの二量体化を誘導することが可能であった。さらに、エファビレンズは、ｐ６６−Ｈｉｓにしっかりと結合することができ、次いで続いて、ヘテロ二量体化を促進することができる。データは、ＮＮＲＴＩｓが２つのタンパク質間の相互作用を増大するという従来のＣＩＤｓのその能力と同様の性質を有することを示している。ｐ６６とｐ５１間の相互作用は、自然に生じるので、ＮＮＲＴＩｓの効果は、この相互作用を増大することであり、これらの小分子は二量体化の化学物質エンハンサとして記載される最高の分子である。
【０２０５】
（ＮＮＲＴＩｓによるヘテロ二量体化のインビトロとインビボとにおける増大の間の相関）
Ｙ２Ｈ ＲＴ二量体化アッセイにおける最も強力なβ−ｇａｌ増大ＮＮＲＴＩｓは、エファビレンズ、ＵＣ７８１およびＨＢＹ ０９７であった。これらの薬剤は、インビトロにおけるＨＩＶ−１複製の非常に強力な阻害剤である第二世代ＮＮＲＴＩｓでもある（２１，２５，２７）。エファビレンズおよびＵＣ７８１は、これらが非常にしっかりとＲＴヘテロダイマーに結合して非常に遅い解離速度（ｋｏｆｆ）を示すという点で（３４、３５）、その他のＮＮＲＴＩｓと異なる。エファビレンズおよびＵＣ７８１がしっかりと結合する性質は、酵母におけるヘテロ二量体化のエンハンサとして、部分的にその強度に貢献しているかもしれない。インビトロおよび酵母との間のＮＮＲＴＩｓによる二量体化の誘導の相対強度は、ＵＣ７８１およびＵＣ１０を除いては、一般に非常に良好な相関があった。
【０２０６】
（薬剤誘導性二量体化の増大、ＨＩＶ−１ ＲＴの構造変化、およびＲＴ阻害活性との間の関係）
ＮＮＲＴＩｓは、ポリメラーゼ活性とは異なるが、近位（〜ｌ０Å）のｐ６６サムサブドメインの塩基の疎水性ポケットに結合する。ポケットに結合しているＮＮＲＴＩの大きさは、大規模なダイマー界面と比較して小さいことが明らかである（図１４）。いくつかのＮＮＲＴＩｓとの複合体におけるＨＩＶ−１ ＲＴの構造内のｐ６６／ｐ５１界面の範囲と、β−ｇａｌ活性の５倍増大を媒介する薬剤濃度との間には、強い相関は見出されなかった（３６，３７）。したがって、ヘテロ二量体化に対してＮＮＲＴＩが及ぼす影響は、界面に埋まった表面積の単一の機能ではなく、ＮＮＲＴＩｓは、接触範囲を調整することに加えて、その他の機構よって二量体化に影響を及ぼしているかもしれない。ポケットにおける薬剤の位置およびＮＮＲＴＩがｐ５１サブユニットと相互作用する程度は、種々のＲＴ／ＮＮＲＴＩ複合体間で有意に変化していることが見出され（図９）、結合したＮＮＲＴＩｓ近くの変化は、ヘテロダイマー形成にも役割を演じているかもしれない。
【０２０７】
ＲＴとエファビレンズの結合は、結合ポケット領域のコンホメーション変化を伴っており、これらの変化（Ｌｅｕ２３４を含む）が、（３８）ダイマー形成にも影響しているかもしれない。デラビルジンは、最も長いＮＮＲＴＩ阻害剤であり、その一部がＮＮＲＴＩ結合部位の外側で隆起して、現在までに研究された多くのＮＮＲＴＩｓのなかでｐ６６サブユニットに最大の歪みを引き起こしている（３９）。デラビルジンは、ｐ６６／ｐ５１界面から最も離れて結合する（ＵＣ７８１の３．８Åと比較して、デラビルジンとｐ５１の間の最も近い距離は５．１Åである）（図１５）。ＨＩＶ−１ ＲＴとデラビルジンとの相互作用に特有の特性から、このＮＮＲＴＩは、二量体化の増大に有利な特徴的な方法でｐ６６に結合しているかもしれないことを示唆する。
【０２０８】
外因性ＲＴアッセイにおけるＮＮＲＴＩｓのＲＴ阻害活性（５０％抑制濃度）と、Ｙ２Ｈアッセイにおいてβ−ｇａｌ活性の５倍増加を媒介する薬剤の濃度との間の相関を比較した。エファビレンズは、両方のアッセイにおいて最も強力であったが、ＵＣ３８は最少の活性であった（結果示さず）。データの検討により、これらの２つのパラメータ間にかなりの相関（ｒ＝ ０．６）が示され、インビトロにおけるβ−ｇａｌ増大効果とＲＴ阻害活性との間の相関が示唆される。
【０２０９】
（ＮＮＲＴＩｓによるヘテロ二量体化の潜在的機構）
ＮＮＲＴＩは、どのように二量体化を増大するのか？１つの起こりうるモデルは、ＮＮＲＴＩが直接ｐ６６モノマーに結合することを含む。単量体ｐ６６に対する薬剤の結合は、ヘテロダイマー形成伝導性のコンホメーションをより安定化させるのかもしれず、より強力なＮＮＲＴＩが二量体化を効果的に促進するコンホメーションのｐ６６濃度を増加するのかもしれない。あるいは、エファビレンズは、ｐ６６モノマーに対し、このサブユニットがより容易に二量体化に必要な構造変化を受けるようなコンホメーション柔軟性を持たせるのかもしれない。第二のモデルは、ＮＮＲＴＩｓはヘテロダイマーにのみ結合する必要があり、その結果としてダイマーを安定化させているのだろう。結合により、平衡をダイマーの方へ移すことができる。データは、エファビレンズがｐ６６にしっかりと結合することを示唆している。しかし、細菌に発現されたｐ６６は、モノマーおよびホモダイマーの集合を含むので、ＧＳＴ−ｐ５１が直接薬剤と複合体を形成した単量体ｐ６６に結合しているのか、または薬剤が結合したホモダイマーｐ６６サブユニットの１つと置換されているのかは不明である。ＮＮＲＴＩで誘導される二量体化増大の正確な機構の解明は、さらなる研究を必要とするだろう。
【０２１０】
本所見は、ウイルス複製に対する効果に関して生物学的な有意性を有するであろう。ｐ６６に対する薬剤の結合は、潜在的にＰｒｌ６０ＧａｇＰｏ１前駆体間の相互作用を調整することができる。該ポリタンパク質は、このポリタンパク質のＨＩＶ−１プロテアーゼ特異的な切断の調節に影響を及ぼしているであろう。さらに、Ｙ２Ｈ ＲＴ二量体化アッセイは、ＮＮＲＴＩｓが結合し、かつｐ５１への結合の増大を生じるｐ６６サブユニットの適切なコンホメーション変化を媒介する能力をスクリーニングするために潜在的に使用することができる。このアッセイを使用してＲＴの新しいアロステリック阻害剤が選択されるかもしれない。
【０２１１】
【参照文献】
実施例の第一のシリーズの参照文献
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３． Ｒｅｎ， Ｊ．， Ｅｓｎｏｕｆ， Ｒ．， Ｇａｒｍａｎ， Ｅ．， Ｓｏｍｅｒｓ， Ｄ．， Ｒｏｓｓ， Ｃ．， Ｋｉｒｂｙ， Ｉ．， Ｋｅｅｌｉｎｇ， Ｊ．， Ｄａｒｂｙ， Ｇ．， Ｊｏｎｅｓ， Ｙ．， Ｓｔｕａｒｔ， Ｄ．， ｅｔ ａｌ． （１９９５） Ｎａｔ． Ｓｔｒｕｃｔ． Ｂｉｏｌ． ２，２９３−３０２．
４． Ｈｕａｎｇ， Ｈ．， Ｃｈｏｐｒａ， Ｒ．， Ｖｅｒｄｉｎｅ， Ｇ． Ｌ． ＆ Ｈａｒｒｉｓｏｎ， Ｓ． Ｃ． （１９９８） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８２，１６６９−１６７５．
５． Ｊａｃｏｂｏ−Ｍｏｌｉｎａ， Ａ．， Ｄｉｎｇ， Ｊ．， Ｎａｎｎｉ， Ｒ． Ｇ．， Ｃｌａｒｋ， Ａ． Ｄ．， Ｊｒ．， Ｌｕ， Ｘ．， Ｔａｎｔｉｌｌｏ， Ｃ．， Ｗｉｌｌｉａｍｓ， Ｒ． Ｌ．， Ｋａｍｅｒ， Ｇ．， Ｆｅｒｒｉｓ， Ａ． Ｌ．， Ｃｌａｒｋ， Ｐ．， ｅｔ ａｌ． （１９９３） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９０，６３２０−６３２４．
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８． Ｂｅｃｅｒｒａ， Ｓ． Ｐ．， Ｋｕｍａｒ， Ａ．， Ｌｅｗｉｓ， Ｍ． Ｓ．， Ｗｉｄｅｎ， Ｓ． Ｇ．，　Ａｂｂｏｔｔｓ， Ｊ．， Ｋａｒａｗｙａ， Ｅ． Ｍ．， Ｈｕｇｈｅｓ， Ｓ． Ｈ．， Ｓｈｉｌｏａｃｈ， Ｊ． ＆ Ｗｉｌｓｏｎ， Ｓ． Ｈ． （１９９１） Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３０， １１７０７−１１７１９．
９． Ｗａｎｇ， Ｊ．， Ｓｍｅｒｄｏｎ， Ｓ． Ｊ．， Ｊａｇｅｒ， Ｊ．， Ｋｏｈｌｓｔａｅｄｔ， Ｌ． Ａ．， Ｒｉｃｅ， Ｐ． Ａ．， Ｆｒｉｅｄｍａｎ， Ｊ． Ｍ． ＆ Ｓｔｅｉｔｚ， Ｔ． Ａ． （１９９４） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９１，７２４２−７２４６．
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１１． Ｗｏｈｒｌ， Ｂ． Ｍ．， Ｋｒｅｂｓ， Ｒ．， Ｔｈｒａｌｌ， Ｓ． Ｈ．， Ｌｅ Ｇｒｉｃｅ， Ｓ． Ｆ． Ｊ．， Ｓｃｈｅｉｄｉｇ， Ａ． Ｊ． ＆ Ｇｏｏｄｙ， Ｒ． Ｓ． （１９９７） Ｊ． Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２７２，１７５８１−１７５８７．
１２． Ｇｏｅｌ， Ｒ．， Ｂｅａｒｄ， Ｗ． Ａ．， Ｋｕｍａｒ， Ａ．， Ｃａｓａｓ−Ｆｉｎｅｔ， Ｊ． Ｒ．，Ｓｔｒｕｂ， Ｍ． Ｐ．， Ｓｔａｈｌ， Ｓ． Ｊ．， Ｌｅｗｉｓ， Ｍ． Ｓ．， Ｂｅｂｅｎｅｋ， Ｋ．，Ｂｅｃｅｒｒａ， Ｓ． Ｐ．， Ｋｕｎｋｅｌ， Ｔ． Ａ．， ｅｔ ａｌ． （１９９３）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３２，１３０１２−１３０１８．
１３． Ｄｉｖｉｔａ， Ｇ．， Ｒｅｓｔｌｅ， Ｔ． ＆ Ｇｏｏｄｙ， Ｒ． Ｓ． （１９９３） ＦＥＢＳＬｅｔｔ． ３２４，１５３−１５８．
１４． Ｄｅｂｙｓｅｒ， Ｚ． ＆ Ｄｅ Ｃｌｅｒｃｑ， Ｅ． （１９９６） Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ． ５，２７８−２８６．
１５． Ｊａｃｑｕｅｓ， Ｐ． Ｓ．， Ｗｏｈｒｌ， Ｂ． Ｍ．， Ｈｏｗａｒｄ， Ｋ． Ｊ． ＆ ＬｅＧｒｉｃｅ， Ｓ． Ｆ． （１９９４） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６９，１３８８−１３９３．
１６． Ｆｉｅｌｄｓ， Ｓ． ＆ Ｓｏｎｇ， ０． （１９８９） Ｎａｔｕｒｅ （Ｌｏｎｄｏｎ） ３４０，２４５−２４６．
１７． Ｋａｌｐａｎａ， Ｇ． Ｖ． ＆ Ｇｏｆｆ， Ｓ． Ｐ． （１９９３） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９０， １０５９３−１０５９７．
１８． Ｌｕｂａｎ， Ｊ．， Ｂｏｓｓｏｌｔ， Ｋ． Ｌ．， Ｆｒａｎｋｅ， Ｅ． Ｋ．， Ｋａｌｐａｎａ， Ｇ．Ｖ． ＆ Ｇｏｆｆ， Ｓ． Ｐ． （１９９３） Ｃｅｌｌ ７３，１０６７−１０７８．
１９． Ｒｏｓｅ， Ｍ． Ｄ．， Ｗｉｎｓｔｏｎ， Ｆ． ＆ Ｈｉｅｔｅｒ， Ｐ． （１９９０） Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｙｅａｓｔ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｃｏｕｒｓｅ Ｍａｎｕａｌ （ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）， ２０． Ｓｚｉｌｖａｙ， Ａ． Ｍ．， Ｎｏｒｎｅｓ， Ｓ．， Ｈａｕｇａｎ， Ｉ． Ｒ．， Ｏｌｓｅｎ， Ｌ．，Ｐｒａｓａｄ， Ｖ． Ｒ．， Ｅｎｄｒｅｓｅｎ， Ｃ．， Ｇｏｆｆ， Ｓ． Ｐ． ＆ Ｈｅｌｌａｎｄ， Ｄ．Ｅ． （１９９２） Ｊ． Ａｃｑｕｉｒｅｄ Ｉｍｍｕｎｅ Ｄｅｆｉｃ． Ｓｙｎｄｒ． ５，６４７−６５７．
２１． Ｔｅｌｅｓｎｉｔｓｋｙ， Ａ．， Ｂｌａｉｎ， Ｓ． ＆ Ｇｏｆｆ， Ｓ． Ｐ． （１９９５） Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． ２６２，３４７−３６２．
２２． Ｈａｎｅｓ， Ｓ． Ｄ． ＆ Ｂｒｅｎｔ， Ｒ． （１９８９） Ｃｅｌｌ ５７，１２７５−１２８３．
２３． Ｒｕｄｅｎ， Ｄ． Ｍ．， Ｍａ， Ｊ．， Ｌｉ， Ｙ．， Ｗｏｏｄ， Ｋ． ＆ Ｐｔａｓｈｎｅ， Ｍ． （１９９１） Ｎａｔｕｒｅ （Ｌｏｎｄｏｎ） ３５０，２５０−２５２．
２４． Ｌｅｇｒａｉｎ， Ｐ．， Ｄｏｋｈｅｌａｒ， Ｍ． Ｃ． ＆ Ｔｒａｎｓｙ， Ｃ． （１９９４） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２２，３２４１−３２４２．
２５． Ｍａｌｄａｒｅｌｌｉ， Ｆ．， Ｍａｒｔｉｎ， Ｍ． Ａ． ＆ Ｓｔｒｅｂｅｌ， Ｋ． （１９９１） Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６５，５７３２−５７４３．
２６． Ｒａｔｎｅｒ， Ｌ．， Ｈａｓｅｌｔｉｎｅ， Ｗ．， Ｐａｔａｒｃａ， Ｒ．， Ｌｉｖａｋ， Ｋ． Ｊ．， Ｓｔａｒｃｉｃｈ， Ｂ．， Ｊｏｓｅｐｈｓ， Ｓ． Ｆ．， Ｄｏｒａｎ， Ｅ． Ｒ．， Ｒａｆａｌｓｋｉ， Ｊ． Ａ．， Ｗｈｉｔｅｈｏｒｎ， Ｅ． Ａ．， Ｂａｕｍｅｉｓｔｅｒ， Ｋ．， ｅｔ ａｌ． （１９８５） Ｎａｔｕｒｅ （Ｌｏｎｄｏｎ） ３１３，２７７−２８４．
２７． Ｍａｉｅｒ， Ｇ．， Ｄｉｅｔｒｉｃｈ， Ｕ．， Ｐａｎｈａｎｓ， Ｂ．， Ｓｃｈｒｏｄｅｒ， Ｂ．， Ｒｕｂｓａｍｅｎ−Ｗａｉｇｍａｎｎ， Ｈ．　Ｃｅｌｌａｉ， Ｌ．， Ｈｅｒｍａｎｎ， Ｔ． ＆　Ｈｅｕｍａｎｎ， Ｈ． （１９９９） Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２６１，１０−１８．
２８． Ｌａｒｄｅｒ， Ｂ． Ａ．， Ｐｕｒｉｆｏｙ， Ｄ． Ｊ．， Ｐｏｗｅｌｌ， Ｋ． Ｌ． ＆ Ｄａｒｂｙ， Ｇ． （１９８７） Ｎａｔｕｒｅ （Ｌｏｎｄｏｎ） ３２７，７１６−７１７．
２９． Ｂａｉｌｌｏｎ， Ｊ． Ｇ．， Ｎａｓｈｅｄ， Ｎ． Ｔ．， Ｋｕｍａｒ， Ａ．， Ｗｉｌｓｏｎ， Ｓ． Ｈ． ＆ Ｊｅｒｉｎａ， Ｄ． Ｍ． （１９９１） Ｎｅｗ Ｂｉｏｌ． ３，１０１５−１０１９．
３０． Ｈａｒｒｉｓ， Ｄ．， Ｌｅｅ， Ｒ．， Ｍｉｓｒａ， Ｈ． Ｓ．， Ｐａｎｄｅｙ， Ｐ． Ｋ． ＆　Ｐａｎｄｅｙ， Ｖ． Ｎ． （１９９８） Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３７，５９０３−５９０８．
３１． Ｓｌｕｉｓ−Ｃｒｅｍｅｒ， Ｎ．， Ｄｍｉｔｒｉｅｎｋｏ， Ｇ． Ｉ．， Ｂａｌｚａｒｉｎｉ， Ｊ．， Ｃａｍａｒａｓａ， Ｍ． Ｊ． ＆ Ｐａｒｎｉａｋ， Ｍ． Ａ． （２０００） Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３９，１４２７−１４３３．
３２． Ｄｉｖｉｔａ， Ｇ．， Ｒｅｓｔｌｅ， Ｔ．， Ｇｏｏｄｙ， Ｒ． Ｓ．， Ｃｈｅｒｍａｎｎ， Ｊ． Ｃ． ＆ Ｂａｉｌｌｏｎ， Ｊ． Ｇ． （１９９４） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６９， １３０８０−１３０８３．
３３． Ｇｅｏｒｇｉａｄｉｓ， Ｍ． Ｍ．， Ｊｅｓｓｅｎ， Ｓ． Ｍ．， Ｏｇａｔａ， Ｃ． Ｍ．， Ｔｅｌｅｓｎｉｔｓｋｙ， Ａ．， Ｇｏｆｆ， Ｓ． Ｐ． ＆ Ｈｅｎｄｒｉｃｋｓｏｎ， Ｗ． Ａ． （１９９５） Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ （Ｌｏｎｄｏｎ） ３，８７９−８９２．
３４． Ｅｓｎｏｕｆ， Ｒ．， Ｒｅｎ， Ｊ．， Ｒｏｓｓ， Ｃ．， Ｊｏｎｅｓ， Ｙ．， Ｓｔａｍｍｅｒｓ， Ｄ． ＆ Ｓｔｕａｒｔ， Ｄ． （１９９５） Ｎａｔ． Ｓｔｒｕｃｔ． Ｂｉｏｌ． ２，３０３−３０８．
３５． Ｓｐｅｎｃｅ， Ｒ． Ａ．， Ｋａｔｉ， Ｗ． Ｍ．， Ａｎｄｅｒｓｏｎ， Ｋ． Ｓ． ＆ Ｊｏｈｎｓｏｎ， Ｋ． Ａ． （１９９５） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６７，９８８−９９３．
３６． Ｐａｔｅｌ， Ｐ． Ｈ．， Ｊａｃｏｂｏ−Ｍｏｌｉｎａ， Ａ．， Ｄｉｎｇ， Ｊ．， Ｔａｎｔｉｌｌｏ， Ｃ．， Ｃｌａｒｋ， Ａ． Ｄ．， Ｊｒ．， Ｒａａｇ， Ｒ．， Ｎａｎｎｉ， Ｒ． Ｇ．， Ｈｕｇｈｅｓ， Ｓ． Ｈ． ＆ Ａｒｎｏｌｄ， Ｅ． （１９９５） Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３４，５３５１−５３６３．
３７． Ｍｏｒｒｉｓ， Ｍ． Ｃ．， Ｒｏｂｅｒｔ−Ｈｅｂｍａｎｎ， Ｖ．， Ｃｈａｌｏｉｎ， Ｌ．， Ｍｅｒｙ， Ｊ．， Ｈｅｉｔｚ， Ｆ．， Ｄｅｖａｕｘ， Ｃ．， Ｇｏｏｄｙ， Ｒ． Ｓ． ＆ Ｄｉｖｉｔａ， Ｇ． （１９９９） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７４，２４９４１−２４９４６．
３８． Ｋｒａｕｌｉｓ， Ｐ． Ｊ． （１９９１） Ｊ． Ａｐｐｌ． Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ． ２４， ９４６−９５０．
３９． Ｍｅｒｒｉｔ， Ｅ． Ａ． ＆ Ｂａｃｏｎ， Ｄ． Ｊ． （１９９７） Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． ２７７，５０５−５２４．
４０． Ｋａｂｓｃｈ， Ｗ． ＆ Ｓａｎｄｅｒ， Ｃ． （１９８３） Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ ２２， ２５７７−２６３７．
実施例の第二のシリーズの参照文献
３１． Ｇｏｆｆ， Ｓ． Ｐ． （１９９０） Ｊ． Ａｃｑｕｉｒ． Ｉｍｍｕｎｅ Ｄｅｆｉｃ． Ｓｙｎｄｒ． ３， ８１７−８３１．
３２． ｄｉ Ｍａｒｚｏ Ｖｅｒｏｎｅｓｅ， Ｆ．， Ｃｏｐｅｌａｎｄ， Ｔ． Ｄ．， ＤｅＶｉｃｏ， Ａ． Ｌ．， Ｒａｈｍａｎ， Ｒ．， Ｏｒｏｓｚｌａｎ， Ｓ．， Ｇａｌｌｏ， Ｒ． Ｃ． ＆ Ｓａｒｎｇａｄｈａｒａｎ， Ｍ． Ｇ． （１９８６） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３１，１２８９−１２９１．
３３． Ｌｅ Ｇｒｉｃｅ， Ｓ． Ｆ． Ｊ． （１９９３） ｉｎ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ， ｅｄｓ． Ｓｋａｌｋａ， Ａ． Ｍ． ＆ Ｇｏ ｆ， Ｓ． Ｐ． （Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ）， ｐｐ． １６３−１９１．
３４． Ｈｓｉｏｕ， Ｙ．， Ｄｉｎｇ， Ｊ．， Ｄａｓ， Ｋ．， Ｃｌａｒｋ， Ａ． Ｄ．， Ｊｒ．， Ｈｕｇｈｅｓ， Ｓ． Ｈ． ＆ Ａｒｎｏｌｄ， Ｅ． （１９９６） Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ４， ８５３ ８６０．
３５． Ｋｏｈｌｓｔａｅｄｔ， Ｌ． Ａ．， Ｗａｎｇ， Ｊ．， Ｆｒｉｅｄｍａｎ， Ｊ． Ｍ．， Ｒｉｃｅ， Ｐ． Ａ． ＆ Ｓｔｅｉｔｚ， Ｔ． Ａ． （１９９２） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５６，１７８３−１７９０．
３６． Ｄａｓ， Ｋ．， Ｄｉｎｇ， Ｊ．， Ｈｓｉｏｕ， Ｙ．， Ｃｌａｒｋ， Ａ． Ｄ．， Ｊｒ．， Ｍｏｅｒｅｅｌｓ， Ｈ．， Ｋｏｙｍａｎｓ， Ｌ．， Ａｎｄｒｉｅｓ， Ｋ．， Ｐａｕｗｅｌｓ， Ｒ．， Ｊａｎｓｓｅｎ， Ｐ． Ａ．， Ｂｏｙｅｒ， Ｐ． Ｌ． ＆ ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２６４，１０８５−１１００．
３７． Ｈｕａｎｇ， Ｈ．， Ｃｈｏｐｒａ， Ｒ．， Ｖｅｒｄｉｎｅ， Ｇ． Ｌ． ＆ Ｈａｒｒｉｓｏｎ， Ｓ． Ｃ． （１９９８） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８２， １６６９−１６７５．
３８． Ｊａｃｏｂｏ−Ｍｏｌｉｎａ， Ａ．， Ｄｉｎｇ， Ｊ．， Ｎａｎｎｉ， Ｒ． Ｇ．， Ｃｌａｒｋ， Ａ． Ｄ．， Ｊｒ．， Ｌｕ， Ｘ．， Ｔａｎｔｉｌｌｏ， Ｃ．， Ｗｉｌｌｉａｍｓ， Ｒ． Ｌ．， Ｋａｍｅｒ， Ｇ．， Ｆｅｒｒｉｓ， Ａ． Ｌ．， Ｃｌａｒｋ， Ｐ． ＆ ｅｔ ａｌ． （１９９３） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ Ｓ Ａ ９０，６３２０−６３２４．
３９． Ｂｅｃｅｒｒａ， Ｓ． Ｐ．， Ｋｕｍａｒ， Ａ．， Ｌｅｗｉｓ， Ｍ． Ｓ．， Ｗｉｄｅｎ， Ｓ． Ｇ．， Ａｂｂｏｔｔｓ， Ｊ．， Ｋａｒａｗｙａ， Ｅ． Ｍ．， Ｈｕｇｈｅｓ， Ｓ． Ｈ．， Ｓｈｉｌｏａｃｈ， Ｊ． ＆ Ｗｉｌｓｏｎ， Ｓ． Ｈ． （１９９１） Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３０，１１７０７ １１７１９．
４０． Ｗａｎｇ， Ｊ．， Ｓｍｅｒｄｏｎ， Ｓ． Ｊ．， Ｊａｇｅｒ， Ｊ．， Ｋｏｈｌｓｔａｅｄｔ， Ｌ．　Ａ．， Ｒｉｃｅ， Ｐ． Ａ．， Ｆｒｉｅｄｍａｎ， Ｊ． Ｍ． ＆ Ｓｔｅｉｔｚ， Ｔ． Ａ． （１９９４） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９１， ７２４２−７２４６．
４１． Ｄｅ Ｃｌｅｒｃｑ， Ｅ． （１９９８） Ａｎｔｉｖｉｒａｌ Ｒｅｓ． ３８，１５３−１７９．
４２． Ｐｅｄｅｒｓｅｎ， Ｏ． Ｓ． ＆ Ｐｅｄｅｒｓｅｎ， Ｅ． Ｂ． （１９９９） Ａｎｔｉｖｉｒ．　Ｃｈｅｍ． Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ． １０，２８５−３１４．
４３． Ｓｍｅｒｄｏｎ， Ｓ． Ｊ．， Ｊａｇｅｒ， Ｊ．， Ｗａｎｇ， Ｊ．， Ｋｏｈｌｓｔａｅｄｔ， Ｌ． Ａ．， Ｃｈｉｒｉｎｏ， Ａ． Ｊ．， Ｆｒｉｅｄｍａｎ， Ｊ． Ｍ．， Ｒｉｃｅ， Ｐ． Ａ． ＆　Ｓｔｅｉｔｚ， Ｔ． Ａ． （１９９４） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ Ｓ Ａ ９１， ３９１１−３９１５．
４４． Ｔａｎｔｉｌｌｏ， Ｃ．， Ｄｉｎｇ， Ｊ．， Ｊａｃｏｂｏ−Ｍｏｌｉｎａ， Ａ．， Ｎａｎｎｉ， Ｒ． Ｇ．， Ｂｏｙｅｒ， Ｐ． Ｌ．， Ｈｕｇｈｅｓ， Ｓ． Ｈ．， Ｐａｕｗｅｌｓ， Ｒ．， Ａｎｄｒｉｅｓ， Ｋ．， Ｊａｎｓｓｅｎ， Ｐ． Ａ． ＆ Ａｒｎｏｌｄ， Ｅ． （１９９４） Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２４３，３６９−３８７．
４５． Ｄｉｎｇ， Ｊ．， Ｄａｓ， Ｋ．， Ｔａｎｔｉｌｌｏ， Ｃ．， Ｚｈａｎｇ， Ｗ．， Ｃｌａｒｋ， Ａ． Ｄ．， Ｊｒ．， Ｊｅｓｓｅｎ， Ｓ．， Ｌｕ， Ｘ．， Ｈｓｉｏｕ， Ｙ．， Ｊａｃｏｂｏ−Ｍｏｌｉｎａ， Ａ．， Ａｎｄｒｉｅｓ， Ｋ． ＆ ｅｔ ａｌ． （１９９５） Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ３，３６５−３７９．
４６． Ｅｓｎｏｕｆ， Ｒ．， Ｒｅｎ， Ｊ．， Ｒｏｓｓ， Ｃ．， Ｊｏｎｅｓ， Ｙ．， Ｓｔａｍｍｅｒｓ， Ｄ． ＆ Ｓｔｕａｒｔ， Ｄ． （１９９５） Ｎａｔ． Ｓｔｒｕｃｔ． Ｂｉｏｌ． ２，３０３−３０８．
４７． Ｒｉｃｈｍａｎ， Ｄ．， Ｓｈｉｈ， Ｃ． Ｋ．， Ｌｏｗｙ， Ｉ．， Ｒｏｓｅ， Ｊ．， Ｐｒｏｄａｎｏｖｉｃｈ， Ｐ．， Ｇｏｆｆ， Ｓ． ＆ Ｇｒｉｆｆｉｎ， Ｊ． （１９９１） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ Ｓ Ａ ８８，１１２４１−１１２４５．
４８． Ｒｉｃｈｍａｎ， Ｄ． Ｄ．， Ｈａｖｌｉｒ， Ｄ．， Ｃｏｒｂｅｉｌ， Ｊ．， Ｌｏｏｎｅｙ， Ｄ．， Ｉｇｎａｃｉｏ， Ｃ．， Ｓｐｅｃｔｏｒ， Ｓ． Ａ．， Ｓｕｌｌｉｖａｎ， Ｊ．， Ｃｈｅｅｓｅｍａｎ， Ｓ．， Ｂａｒｒｉｎｇｅｒ， Ｋ．， Ｐａｕｌｅｔｔｉ， Ｄ． ＆ ｅｔ ａｌ． （１９９４） Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６８，１６６０−１６６６．
４９． Ｍｅｒｌｕｚｚｉ， Ｖ． Ｊ．， Ｈａｒｇｒａｖｅ， Ｋ． Ｄ．， Ｌａｂａｄｉａ， Ｍ．， Ｇｒｏｚｉｎｇｅｒ， Ｋ．， Ｓｋｏｏｇ， Ｍ．， Ｗｕ， Ｊ． Ｃ．， Ｓｈｉｈ， Ｃ． Ｋ．，　Ｅｃｋｎｅｒ， Ｋ．， Ｈａｔｔｏｘ， Ｓ．， Ａｄａｍｓ， Ｊ． ＆ ｅｔ ａｌ． （１９９０） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５０，１４１１−１４１３．
５０． Ｒｏｍｅｒｏ， Ｄ． Ｌ．， Ｂｕｓｓｏ， Ｍ．， Ｔａｎ， Ｃ． Ｋ．， Ｒｅｕｓｓｅｒ， Ｆ．， Ｐａｌｍｅｒ， Ｊ． Ｒ．， Ｐｏｐｐｅ， Ｓ． Ｍ．， Ａｒｉｓｔｏｆｆ， Ｐ． Ａ．， Ｄｏｗｎｅｙ， Ｋ． Ｍ．， Ｓｏ， Ａ． Ｇ．， Ｒｅｓｎｉｃｋ， Ｌ． ＆ ｅｔ ａｌ． （１９９１） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ Ｓ Ａ ８８，８８０６−８８１０．
５１． Ｙｏｕｎｇ， Ｓ． Ｄ．， Ｂｒｉｔｃｈｅｒ， Ｓ． Ｆ．， Ｔｒａｎ， Ｌ． Ｏ．， Ｐａｙｎｅ， Ｌ． Ｓ．， Ｌｕｍｍａ， Ｗ． Ｃ．， Ｌｙｌｅ， Ｔ． Ａ．， Ｈｕｆｆ， Ｊ． Ｒ．， Ａｎｄｅｒｓｏｎ， Ｐ． Ｓ．， Ｏｌｓｅｎ， Ｄ． Ｂ．， Ｃａｒｒｏｌｌ， Ｓ． Ｓ． ＆ ｅｔ ａｌ． （１９９５） Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ． Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ． ３９，２６０２−２６０５．
５２． Ｔａｃｈｅｄｊｉａｎ， Ｇ．， Ａｒｏｎｓｏｎ， Ｈ． Ｅ． ＆ Ｇｏｆｆ， Ｓ． Ｐ． （２０００） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ Ｓ Ａ ９７，６３３４−６３３９．
５３． Ｃｒａｂｔｒｅｅ， Ｇ． Ｒ． ＆ Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒ， Ｓ． Ｌ． （１９９６） Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｓｃｉ． ２１，４１８−４２２．
５４． Ｂａｌｚａｒｉｎｉ， Ｊ．， Ｂｒｏｕｗｅｒ， Ｗ． Ｇ．， Ｆｅｌａｕｅｒ， Ｅ． Ｅ．， Ｄｅ Ｃｌｅｒｃｑ， Ｅ． ＆ Ｋａｒｌｓｓｏｎ， Ａ． （１９９５） Ａｎｔｉｖｉｒａｌ Ｒｅｓ． ２７， ２１９−２３６．
５５． Ｂａｌｚａｒｉｎｉ， Ｊ．， Ｂｒｏｕｗｅｒ， Ｗ． Ｇ．， Ｄａｏ， Ｄ． Ｃ．， Ｏｓｉｋａ， Ｅ． Ｍ． ＆ Ｄｅ Ｃｌｅｒｃｑ， Ｅ． （１９９６） Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ． Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ． ４０，１４５４−１４６６．
５６． Ｄｕｅｗｅｋｅ， Ｔｏ Ｊ．， Ｐｏｐｐｅ， Ｓ． Ｍ．， Ｒｏｍｅｒｏ， Ｄ． Ｌ．， Ｓｗａｎｅｙ， Ｓ． Ｍ．， Ｓｏ， Ａ． Ｇ．， Ｄｏｗｎｅｙ， Ｋ． Ｍ．， Ａｌｔｈａｕｓ， Ｉ． Ｗ．， Ｒｅｕｓｓｅｒ， Ｆ．， Ｂｕｓｓｏ， Ｍ．， Ｒｅｓｎｉｃｋ， Ｌ． ＆ ｅｔ ａｌ． （１９９３） Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ． Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ． ３７，１１２７−１１３１．
５７． Ｋｌｅｉｍ， Ｊ． Ｐ．， Ｂｅｎｄｅｒ， Ｒ．， Ｋｉｒｓｃｈ， Ｒ．， Ｍｅｉｃｈｓｎｅｒ， Ｃ．， Ｐａｅｓｓｅｎｓ， Ａ．， Ｒｏｓｎｅｒ， Ｍ．， Ｒｕｂｓａｍｅｎ−Ｗａｉｇｍａｎｎ， Ｈ．， Ｋａｉｓｅｒ， Ｒ．， Ｗｉｃｈｅｒｓ， Ｍ．， Ｓｃｈｎｅｗｅｉｓ， Ｋ． Ｅ． ＆ ｅｔ ａｌ． （１９９５） Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ． Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ． ３９，２２５３−２２５７．
５８． Ｈｏ， Ｗ．， Ｋｕｋｌａ， Ｍ． Ｊ．， Ｂｒｅｓｌｉｎ， Ｈ． Ｊ．， Ｌｕｄｏｖｉｃｉ， Ｄ． Ｗ．， Ｇｒｏｕｓ， Ｐ． Ｐ．， Ｄｉａｍｏｎｄ， Ｃ． Ｊ．， Ｍｉｒａｎｄａ， Ｍ．， Ｒｏｄｇｅｒｓ， Ｊ． Ｄ．， Ｈｏ， Ｃ． Ｙ．， Ｄｅ Ｃｌｅｒｃｑ， Ｅ． ＆ ｅｔ ａｌ． （１９９５） Ｊ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． ３８，７９４−８０２．
５９． Ｐａｕｗｅｌｓ， Ｒ．， Ａｎｄｒｉｅｓ， Ｋ．， Ｄｅｂｙｓｅｒ， Ｚ．， Ｖａｎ Ｄａｅｌｅ， Ｐ．， Ｓｃｈｏｌｓ， Ｄ．， Ｓｔｏｆｆｅｓ， Ｐ．， Ｄｅ Ｖｒｅｅｓｅ， Ｋ．， Ｗｏｅｓｔｅｎｂｏｒｇｈｓ， Ｒ．， Ｖａｎｄａｍｍｅ， Ａ． Ｍ．， Ｊａｎｓｓｅｎ， Ｃ． Ｇ． ＆ ｅｔ ａｌ． （１９９３） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ Ｓ Ａ ９０，１７１１ １７１５．
６０． Ｋｕｃｈｉｎ， Ｓ．， Ｔｒｅｉｃｈ， Ｉ． ＆ Ｃａｒｌｓｏｎ， Ｍ． （２０００） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ Ｓ Ａ ９７，７９１６−７９２０．
６１． Ｓｚｉｌｖａｙ， Ａ． Ｍ．， Ｎｏｒｎｅｓ， Ｓ．， Ｈａｕｇａｎ， Ｉ． Ｒ．， Ｏｌｓｅｎ， Ｌ．， Ｐｒａｓａｄ， Ｖ． Ｒ．， Ｅｎｄｒｅｓｅｎ， Ｃ．， Ｇｏｆｆ， Ｓ． Ｐ． ＆ Ｈｅｌｌａｎｄ， Ｄ． Ｅ． （１９９２） Ｊ． Ａｃｑｕｉｒ． Ｉｍｍｕｎｅ Ｄｅｆｉｃ． Ｓｙｎｄｒ． ５，６４７−６５７．
＊６２． Ｇｈｏｓｈ， Ｍ．， Ｊａｃｑｕｅｓ， Ｐ． Ｓ．， Ｒｏｄｇｅｒｓ， Ｄ． Ｗ．， Ｏｔｔｍａｎ， Ｍ．， Ｄａｒｌｉｘ， Ｊ． Ｌ． ＆ Ｌｅ Ｇｒｉｃｅ， Ｓ． Ｆ． （１９９６） Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３５， ８５５３−８５６２．
６３． Ｅｓｎｏｕｆ， Ｒ． Ｍ．， Ｓｔｕａｒｔ， Ｄ． Ｉ．， Ｄｅ Ｃｌｅｒｃｑ， Ｅ．， Ｓｃｈｗａｒｔｚ， Ｅ． ＆ Ｂａｌｚａｒｉｎｉ， Ｊ． （１９９７） Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ． ２３４，４５８−４６４．
６４． Ｂａｒｎａｒｄ， Ｊ．， Ｂｏｒｋｏｗ， Ｇ． ＆ Ｐａｒｎｉａｋ， Ｍ． Ａ． （１９９７） Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３６，７７８６−７７９２．
６５． Ｍａｇａ， Ｇ．， Ｕｂｉａｌｉ， Ｄ．， Ｓａｌｖｅｔｔｉ， Ｒ．， Ｐｒｅｇｎｏｌａｔｏ， Ｍ． ＆　Ｓｐａｄａｒｉ， Ｓ． （２０００） Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ． Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ． ４４， １１８６−１１９４．
６６． Ａｒｎｏｌｄ， Ｅ． ＆ Ｒｏｓｓｍａｎｎ， Ｍ． Ｇ． （１９９０） Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２１１， ７６３−８０１．
６７． Ｌｅｅ， Ｂ． ＆ Ｒｉｃｈａｒｄｓ， Ｆ． Ｍ． （１９７１） Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ５５， ３７９−４００．
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【図面の簡単な説明】
【図１】
ＲＴ融合構築物、コードされた融合タンパク質および酵母リポータ株における融合体の発現。６−アラニンリンカーは、斜線の箱によって、およびＨＡエピトープは、黒い影をつけた領域によって示される。ｐ６６およびｐ５１は、それぞれＨＩＶ−１ ＲＴの６６ｋＤａおよび５１ｋＤａサブユニットを示す。融合タンパク質の発現は、ｐ６６ＧＢＴ９およびｐ５１ＡＳ２−１をＨＦ７ｃに導入したことを除いて、示されたプラスミドをＣＴＹ１０−５ｄに導入することによって決定した。融合タンパク質の発現は、材料および方法に記載したとおり、抗ＲＴ抗体で酵母タンパク質可溶化液をプロービングすることによって検出した。＋＋は、高い；＋は、中間；＋／−、低い、および−は、検知されないタンパク質発現である。ＮＤは、行っていない。
【図２】
Ｇａｌ４ＡＤ−ＨＡ ５１の融合タンパク質とｐ６６欠失変異体の相互作用。ｐ６６のポリメラーゼドメインをｐＳＨ２−１のｌｅｘＡ８７のＣ末端に融合した。ＣＴＹ１０−５ｄを適切な構築物とともに同時形質転換した。形質転換体をニトロセルロース上に乗せてβ−ｇａｌコロニーリフトアッセイを行って、表１および２において定義したように産生された青色の強度を決定した。液体アッセイに由来するβ−ｇａｌ活性をミラーユニット（Ｍｉｌｌｅｒ Ｕｎｕｔｓ）で表す。ＣＴＹ１０−５ｄにおけるｐ６６融合タンパク質の発現は、抗ｌｅｘＡポリクローナル抗体を使用して検出した。発現量は、図１の説明文のように定義される。
【図３】
ｌｅｘＡ２０２−Ａｌａ−６６とＣ末端欠失変異体のｐ５１との相互作用。ｐ５１ドメインをｐＡＣＴＩＩのＧａｌ４ＡＤのＣ末端に融合した。Ｃ末端の欠失は、ｐ５１の末端から欠けたアミノ酸数よって示される。β−ｇａｌ活性は、図１の説明文に記載したとおりに決定した。ＣＴＹ１０−５ｄにおけるｐ５１融合タンパク質の発現は、抗ＧＡＬ４ＡＤ抗体を使用して検出し、および発現量は、図１の説明文に示したように検出した。
【図４】
Ｌ２３４Ａは、Ｙ２ＨアッセイにおけるＲＴ二量体化を抑制する。ＣＴＹ１０−５ｄを、発現構築物で同時形質転換して、酵母パッチをβ−ｇａｌコロニーリフトアッセイおよび液体アッセイにかけた。緑色は加水分解されたＸ−ｇａｌであり、β−ｇａｌ活性を反映している。ｐ６６ｗｔおよびｐ５１ｗｔは、それぞれ野生型のｌｅｘ２０２−Ａｌａ−ＨＸ６６およびＧａｌ４ＡＤ−ＨＸ５１融合タンパク質を示す。ｐＡＤは、ｐＧＡＤＮＯＴを意味する。ｐ６６ｍｕｔおよびｐ５１ｍｕｔは、それぞれＲＴ融合タンパク質ｌｅｘ２０２−Ａｌａ−６６−Ｌ２３４ＡおよびＧａｌ４ＡＤ−５１−Ｌ２３４Ａを示す。
【図５】
Ｌ２３４Ａプライマーグリップ変異の部位およびサプレッサーの位置（黒に影をつけた）を示す未結合ＨＩＶ−１ ＲＴのリボンダイアグラム。図は、Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ（ＲＣＳＢ）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ（ＰＤＢ） （ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ． ｒｃｓｂ． ｏｒｇ／ｐｄｂ， ＰＤＢ ＩＤ： １ＨＭＶ． ｐｄｂ）のＲｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｏｒｙから検索したＭＯＬＳＣＲＩＰＴ（３８）およびＲＡＳＴＥＲ３Ｄ（３９）によって作製した。ドメインは、（３）のように、フィンガー、青；パーム、緑；サム、黄色；結合、赤；およびＲＮａｓｅ Ｈ、紫で定義する。ｐ６６のドメインは、色で完全に飽和されているが、ｐ５１では、色の飽和が減少された。二次構造は、ＤＳＳＰ（４０）を使用して割り当てた。らせんは、α−ヘリックスを表し、矢印はβ−ストランドを示す。
【図６】
ＧＳＴ−ｐ５１とｐ６６との結合による活性型ＲＴヘテロダイマー形成についてのインビトロアッセイ。パネルＡ：ＧＳＴ−ｐ５１と表示した種々のｐ６６タンパク質とを含む細菌可溶化液を一晩インキューベートしてグルタチオンビーズで捕獲した。複合体を溶出してＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、膜にブロットしてモノクローナル抗ＲＴ抗体で検出した。Ｍｏｃｋ、ＧＳＴ−ｐ５１単独。パネルＢ：投入タンパク質を反映するそれぞれのインキュベーション混合物の一定分量を、Ｐａｎｅｌ ＡのようにＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロットより直接解析した。Ｐａｎｅｌ Ｃ：結合したタンパク質をグルタチオンで溶出して、ホモポリマーテンプレート−プライマーでＲＴ活性をアッセイした。値は、野性型コントロールについて標準化されている。
【図７】
ｌｅｘＡ８７−６６およびＧａｌ４ＡＤ５１で同時形質転換した酵母におけるβ−ｇａｌ活性の、ＮＮＲＴＩｓによる増大を示す用量応答曲線。β−ｇａｌ活性の増加倍数は、それぞれの薬剤濃度におけるβ−ｇａｌ活性（Ｍｉｌｌｅｒ Ｕｎｉｔｓにより）と、阻害剤の非存在下で培養した細胞のβ−ｇａｌ活性とを分けることよって算出した。データは、２回の独立した実験の平均値結果を表す。β−ｇａｌ活性の５倍の増加を媒介する薬剤濃度を括弧で示す。Ａ：ＮＮＲＴＩｓ、エファビレンズ、ＨＢＹ ０９７、ａ−ＡＰＡ、ネビラピン、８−Ｃｌ−ＴＩＢＯおよびデラビルジンのβ−ｇａｌ増大活性。Ｂ：ＮＮＲＴＩｓのカルボキシアニリド類のβ−ｇａｌ増大活性。
【図８】
ネビラピンによる酵母でのβ−ｇａｌ活性の増大に対するＹ１８１Ｃ変異の効果。野生型ｌｅｘＡ８７−６６とＧａｌ４ＡＤ−５１、または変異型ｌｅｘＡ８７−６６Ｙ１８１Ｃと野生型Ｇａｌ４ＡＤ−５１を発現している酵母をネビラピンの存在下で培養してβ−ｇａｌ活性をアッセイした。結果は、未処置細胞に対するβ−ｇａｌ活性の増加倍数として表している。それぞれの棒の最上部の値は、β−ｇａｌ活性（Ｍｉｌｌｅｒ Ｕｎｉｔｓによる）＋／−標準偏差を示す。
【図９】
二量体化欠損変異体Ｌ２３４ＡおよびＷ４０１Ａを発現している酵母でのβ−ｇａｌ活性に対するエファビレンズの効果。野性型ｐ６６ベイトとｐ５１プレイの融合体、変異型ｐ６６ベイトと野生型ｐ５１プレイの融合体、並びに変異型ｐ６６ベイトと変異型ｐ５１プレイの融合体を発現している酵母のβ−ｇａｌ活性をアッセイした。結果は、未処置細胞に対するβ−ｇａｌ活性の増加倍数として表している。それぞれの棒の最上部の値は、Ｍｉｌｌｅｒ Ｕｎｉｔｓによるβ−ｇａｌ活性を示す。Ｗ４０１Ａ変化（Ａ）またはＬ２３４Ａ変化（Ｂ）を伴うプレイとベイトの融合体を発現している酵母に対するエファビレンズの効果。
【図１０】
ＮＮＲＴＩｓの存在下において増殖させた酵母におけるヘテロダイマー形成を検出する免疫共沈降アッセイ。（Ａ）：Ｗ４０１Ａ変異を含むｐ６６ベイトとｐ５１プレイの融合体を発現している酵母をエファビレンズ（ＥＦＶ）、ＵＣ７８１の存在下または薬剤なしで培養した。増殖後、酵母を添加した薬剤（ｉｐ内の薬剤）の存在下または非存在下において処理した。可溶化液のヘテロダイマーを、抗ＨＡ抗体でＧａｌ４ＡＤ−ＨＡ ５１Ｗ４０１Ａを免疫沈降した後に、免疫共沈降されたｐ６６を免疫検出することによって検出した。各処置におけるβ−ｇａｌ活性を決定して、Ｍｉｌｌｅｒ Ｕｎｉｔｓで表した。（Ｂ）。Ｌ２３４Ａ変異を含むｐ６６ベイトとｐ５１プレイの融合体を発現している酵母。
【図１１】
インビトロにおいてエファビレンズ（ＥＦＶ）の存在下で形成されたＨＩＶ−１ ＲＴヘテロダイマーのウエスタンブロット解析。野性型ｐ６６−ＨｉｓおよびＧＳＴ−ｐ５１、または二量体化欠損変異体のどちらかを発現している細菌を誘発して、可溶化液を調製した。可溶化液を混合して、薬剤の存在下または非存在下において４℃で一晩インキューベートし、グルタチオンセファロース４Ｂビーズに結合することによって捕獲した。ビーズに結合したヘテロダイマーを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離して抗ＲＴモノクローナル抗体でプロービングすることよってタンパク質を検出した。
【図１２】
インビトロにおいてＮＮＲＴＩｓの存在下で形成されたＨＩＶ−１ ＲＴヘテロダイマーのウエスタンブロット解析。細菌に発現したタンパク質ｐ６６−ＨｉｓおよびＧＳＴ−ｐ５１を、１−１０００倍モラー過剰の薬剤の存在下で混合して、一晩インキューベートした。ヘテロダイマーを、図１１の説明文に記載したとおりに捕獲して検出した。
【図１３】
エファビレンズでサブユニットの一つを処理した後のヘテロダイマー形成のウエスタンブロット解析。ｐ６６−Ｈｉｓ、ＧＳＴ−ｐ５１およびＭ１５細菌可溶化液を、１０−１０００倍モラー過剰のエファビレンズの非存在下または存在下においてプレインキュベートした。可溶化液を洗浄して、残留エファビレンズの存在を、ＧＳＴ−ｐ５１、ｐ６６−Ｈｉｓまたは両方のサブユニットを添加することによってアッセイした。ヘテロダイマーは、図１１の説明文に記載したとおりに捕獲して検出した。
【図１４】
ＨＩＶ−１ ＲＴのｐ６６とｐ５１サブユニットとの分子界面の提示。黄色（ｐ６６）またはマジェンタ（ｐ５１）に塗られた残基は、ヘテロダイマー形態のその他のサブユニットの存在下で溶媒にアクセスできないアミノ酸である。ＮＮＲＴＩ結合ポケットを赤で示す。黄色およびマジェンタに塗られた表面積の合計が、２つのサブユニット界面において覆われた合計の表面積である。
【図１５】
ＨＩＶ−１ ＲＴサブユニットのｐ６６（マジェンタ）ｐ５１（黄色）の界面におけるデラビルジン（ＢＨＡＰ）（Ａ）およびＵＣ７８１（Ｂ）の結合。大きな阻害剤であるデラビルジンは、ｐ６６／ｐ５１界面からさらに離れて結合する。ＮＮＲＴＩ結合ポケットにおける阻害剤の相対的な向きを（Ｃ）に示す。ＮＮＲＴＩ結合部を含む一部の残基は、明解にするために省略した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
2004509614.tif 000186
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