(57)【要約】本発明は、対象生物における高血圧症発症の危険度の判定及び対象生物の高血圧症をターゲットとする治療のための方法であって、対象生物からＤＮＡを単離する工程、及びα2B−アドレノセプターポリペプチドの３番目の細胞内ループに存在する２９４番〜３１１番の１８個のアミノ酸残基からなる酸性領域の一部である２９８番〜３０９番のグルタミン酸残基１２個からなるグルタミン酸繰り返し部位において、少なくとも１個のグルタミン酸残基を欠失している変異α2B−アドレノセプタータンパク質をコードする塩基配列を包含するＤＮＡ配列を検出する工程を包含する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
変異α2B−アドレノセプターをコードする対立遺伝子のパターンの決定によって、対象生物における高血圧症発症の危険度を判定するための方法であって、
ａ）試験のための生物学的試料を対象生物から得るための工程、そして
ｂ）該生物学的試料をアッセイに付して、ヒトα2B−アドレノセプターの遺伝子型が
(i) 挿入／挿入（Ｉ／Ｉ）型又は欠失／挿入（Ｄ／Ｉ）型である、あるいは
(ii) 対象生物が高血圧症を発症する危険度が高いことを示す欠失／欠失（Ｄ／Ｄ）型である
ことを検出する工程
を包含する方法。
【請求項２】
該アッセイがＤＮＡアッセイであることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
該アッセイは、遺伝子、あるいはＤＮＡチップ、ＤＮＡマイクロアレイ、ＤＮＡストリップ又はＤＮＡパネル、あるいはアッセイの対象となる１つ以上の遺伝子、突然変異又はＲＮＡの発現を上記ＤＮＡと同様に組み合わせたものを使用して行うことを特徴とする、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
該対立遺伝子のパターンは、ポリメラーゼ連鎖反応を用いて決定することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
該生物学的試料は、血液試料又は頬の内側を掻いて得た試料であり、該試料からゲノムＤＮＡを単離してアッセイに付すことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
該アッセイは、１本鎖ｃＤＮＡを包含する捕捉用プローブを用いて行うものであり、該１本鎖ｃＤＮＡは変異α2B−アドレノセプタータンパク質をコードする塩基配列を包含し、変異α2B−アドレノセプタータンパク質は、α2B−アドレノセプターポリペプチドの３番目の細胞内ループに存在する２９４番〜３１１番の１８個のアミノ酸残基からなる酸性領域の一部である２９８番〜３０９番のグルタミン酸残基１２個からなるグルタミン酸繰り返し部位において、少なくとも１個のグルタミン酸残基を欠失していることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
該アッセイは、１本鎖ｃＤＮＡを包含する捕捉用プローブを用いて行うものであり、該１本鎖ｃＤＮＡはα2B−アドレノセプタータンパク質に対応する塩基配列からなり、α2B−アドレノセプタータンパク質は、その３番目の細胞内ループに存在する２９４番〜３１１番の１８個のアミノ酸残基からなる酸性領域の一部である２９８番〜３０９番のグルタミン酸残基１２個からなるグルタミン酸繰り返し部位において、グルタミン酸残基の欠失のないことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
対象生物におけるノルアドレナリン感受性又は交感神経活性に作用する化合物の治療薬としての有効性を判定するために用いることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
対象生物におけるα2B−アドレノセプター拮抗剤の治療薬としての有効性を判定するために用いることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
サブタイプ非選択的α2拮抗剤、利尿剤又はカルシウムチャンネル遮断剤の投与によって、対象生物で副作用を生じる可能性が高いか否かを判定するために用いることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
化合物の抗高血圧作用を試験するための臨床薬物治験に適したＤ／Ｄ型の対象生物を選択するために用いることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
該化合物が対象生物のノルアドレナリン感受性又は交感神経活性に作用する薬物であることを特徴とする、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
該化合物が、直接又は中枢神経系作用を介して対象生物の血管のα−又はβ−アドレナリン作用性レセプターを調節、阻害又は活性化する薬物であることを特徴とする、請求項８又は１１に記載の方法。
【請求項１４】
該化合物が、アンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害剤、アンジオテンシンＩＩ阻害剤又はアンジオテンシンレセプター阻害剤であることを特徴とする、請求項８又は１１に記載の方法。
【請求項１５】
該化合物が、α2B−選択的又はα2B−非選択的なα2−アドレノセプターの拮抗剤であることを特徴とする、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
変異α2B−アドレノセプターをコードする対立遺伝子のパターンを決定することによって、高血圧症を患う対象生物の高血圧症をターゲットとする治療のための方法であって、対象生物のヒトα2B−アドレノセプターの遺伝子型が欠失／欠失（Ｄ／Ｄ）型であるか否かを請求項１の方法で判定し、そして遺伝子型がＤ／Ｄ型の対象生物のノルアドレナリン感受性又は交感神経活性に作用する薬物を用いて該対象生物を治療する方法。
【請求項１７】
該薬物が、直接又は中枢神経系作用を介して対象生物の血管のα−又はβ−アドレナリン作用性レセプターを調節、阻害又は活性化する薬物であることを特徴とする、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
該薬物が、ピンドロール、プロプラノロール、ソタロール、チモロール、アセブトロール、アテノール、ベタキソロール、ビソプロール、エスモロール、メトプロロール、セリプロール、カルベジロール、ラベタロール、クロニジン、モキソニジン、プラゾシン又はインダパミドであることを特徴とする、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
該薬物が、アンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害剤、アンジオテンシンＩＩ阻害剤又はアンジオテンシンレセプター阻害剤であることを特徴とする、請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
該薬物が、カプトプリル、シナプリル、エナラプリル、イミダプリル、リシノプリル、モエキシプリル、ペリンドプリル、ラミプリル、トランドラプリル、カンデサルタン、エプロサルタン、イルベサルタン、ロサルタン、バルサルタン又はテルミサルタンであることを特徴とする、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
該薬物が、α2B−選択的又はα2B−非選択的なα2−アドレノセプターの拮抗剤あるいはα−アドレノセプターの拮抗剤であることを特徴とする、請求項１７に記載の方法。
【請求項２２】
対象生物が高血圧症を発症する危険度の判定、抗高血圧症をターゲットとした治療が有効な対象生物の選択、及び化合物の抗高血圧作用を試験するための臨床薬物治験に適した対象生物の選択のいずれかに用いるためのキットであって、対象生物由来の生物学的試料に含まれるα2B−アドレノセプターをコードする対立遺伝子のパターンを決定するための手段を包含し、所望により該手段によって得られた結果を解析するためのソフトウェアも包含するキット。
【請求項２３】
請求項２２に記載のキットを用いて、対象生物が高血圧症を発症する危険度の判定、抗高血圧症をターゲットとした治療が有効な対象生物の選択、又は化合物の抗高血圧作用を試験するための臨床薬物治験に適した対象生物の選択を行うことを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、対象生物における、高血圧症発症の危険度又は高血圧症の素因を判定するか診断するための方法であって、対象生物の抗高血圧症をターゲットとする治療及び抗高血圧症治療剤の治験に適した対象生物の選択に用いるための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
本発明の背景技術、特に当業界の慣例である技術の詳細を提供するために本願明細書で使用した出版物及びその他の資料は、後述する参考文献によって本願に組み込まれているものとする。
【０００３】
α2−アドレノセプター（α2−ＡＲ）は、カテコールアミン類、例えばノルエピネフリン及びエピネフリン、の示す多くの生体作用を仲介する。ヒト及びその他の哺乳類においては、α2−アドレノセプターの３つの遺伝的サブタイプであるα2A−アドレノセプター、α2B−アドレノセプターおよびα2C−アドレノセプターが知られている、。これらのレセプターをコードするヒトの遺伝子は第１０染色体、第２染色体及び第４染色体にそれぞれ位置する。これらレセプター遺伝子にはイントロンがないので、スプライス変異体の存在は知られていない。レセプターサブタイプの組織分布及び生体的機能や薬理学的機能は、例えばMacDonaldetal. (1997)およびDocherty(1998)によって報告されている。遺伝子ターゲッティングマウスおよびトランスジェニックマウスを用いた最近の研究によると、α2A−アドレノセプターは、現在入手可能なα2−アドレノセプター作用薬の薬理学的作用の大部分（神経伝達物質の放出の阻害、中枢低血圧作用及び徐脈作用、鎮静及び感覚消失、並びに痛覚消失を含む）を仲介する。同様の研究によって、α2B−アドレノセプターは作用薬による活性化に対応した末梢血液の昇圧反応を仲介することから(Linketal., 1996, Macmillanetal., 1996)、α2B−アドレノセプターは高血圧症の発症開始に重要な役割を果たすことが判明した(Calzada and Artinano、2001)。他の生理的な又は薬理学的な作用については、レセプターサブタイプとの関連性が明確なものはない。α2C−アドレノセプターサブタイプは複雑な作用の制御に関連すると考えられる。このサブタイプについては、中枢神経系以外の末梢組織や心臓血管制御における重要な機能は知られていない。
【０００４】
高血圧症は、他の多くの一般的な疾患と同様に、遺伝因子と環境因子との間の複雑な相互作用によって発症する。従って、血管機能の制御に重要なメカニズムにおいて機能的に重要な遺伝子の多様性は、高血圧症の病因及び治療に関連すると想定することが妥当である。ヒトα2B−ＡＲ遺伝子の変異型(variant)は近年同定された(Heinonenetal., 1999)。この変異型対立遺伝子は、レセプターポリペプチドの細胞内ループに存在する１８個のアミノ酸残基（その内の１５個はグルタミン酸残基）からなる酸性領域の３個のグルタミン酸残基を欠失しているレセプタータンパク質をコードする。この酸性領域は、α2A−ＡＲ及びα2C−ＡＲには見られない、α2B−ＡＲの一次構造に特徴的な構造であり、このモチーフ(motif)はα2B−ＡＲの機能において独特な役割を担っていると示唆される。種々の哺乳類のα2B−ＡＲポリペプチドのアミノ酸配列の比較によって、酸性領域は哺乳類のα2B−ＡＲ間の保存性が高く、ヒトにおいてはその他の種と比較して酸性領域が長いことが判明した。これは、このモチーフがレセプターの機能にとって重要であり、ヒトの対立遺伝子に見られる短縮型（「欠失（deletion）」のＤ）はおそらく先祖型を表し、伸長型（「挿入（insertion）」のＩ）はより最近の変異型を表す可能性が高いことが示唆される。Jewell-Motz及びLiggett(1995)はこの領域の試験管内（invitro）における機能を、１６個のアミノ酸を置換するだけでなく、削除するために部位特異的突然変異誘発を用いて研究した。この研究は、作用薬促進性のレセプターの完全なリン酸化及び脱感作にはこの酸性モチーフが必要であることを示唆している。
【０００５】
マウスα2B−ＡＲの血管収縮特性及び上記酸性領域のレセプターの脱感作メカニズムへの関与に基づき、欠失変異体はレセプター脱感作の減少を引き起こし、その結果として、高血圧症と関連する体血管収縮を増加するという仮説を立てた。この仮説を立証するために、９１２人の中年のフィンランド人男性からなる個体群について、集団遺伝学的研究を行った。
【０００６】
発明の概要
本発明の目的は、α2B−アドレノセプター遺伝子の遺伝子型に基づき、対象生物に対してスクリーニングを行い、該対象生物が高血圧症を発症する危険度を判定するための方法及び血圧降下をターゲットとした治療方法を提供することである。本発明のさらなる目的の一つは、薬物の抗高血圧作用の治験対象となるヒトを選択する方法を提供することである。
【０００７】
本発明は、変異α2B−アドレノセプターをコードする対立遺伝子のパターンの決定によって、対象生物における高血圧症発症の危険度を判定するための方法であって、該対象生物のヒトα2B−アドレノセプターの遺伝子型が欠失／欠失（Ｄ／Ｄ）型か否かを決定するために、
ａ）試験のための生物学的試料を対象生物から得るための工程、そして
ｂ）該生物学的試料をアッセイに付して、ヒトα2B−アドレノセプターの遺伝子型が
(i) 挿入／挿入（Ｉ／Ｉ）型又は欠失／挿入（Ｄ／Ｉ）型である、あるいは
(ii) 対象生物が高血圧症を発症する危険度が高いことを示す欠失／欠失（Ｄ／Ｄ）型である
ことを検出する工程
を包含する方法に関する。
【０００８】
本発明によると、上記方法によって対象生物の遺伝子型がＤ／Ｄ型であるか否かを確定することが可能となり、生物学的試料（例えば、血液試料又は頬の内側を掻いて得た試料）中のＤ／Ｄ型の存在は、対象生物が高血圧症を発症する危険度が高いこと、及び／又はα2B−選択的又はα2B−非選択的なα2−アドレノセプターの拮抗剤などによる治療が必要であることを意味する。
【０００９】
従って、上記の方法は、高血圧症を発症する危険度が高い対象生物及び／又は、α2B−選択的又はα2B−非選択的なα2−アドレノセプターの拮抗剤などによる高血圧症の治療を必要とする対象生物を同定する工程を含んでもよい。
【００１０】
本発明は、上記の方法であって、さらに次の工程を包含する方法に関する。
ｃ）該対象生物の遺伝子型がＤ／Ｄ型か否かに基づいて、
(i) 該対象生物が高血圧症を発症する危険度、及び
(ii) 該対象生物がα2B−選択的又はα2B−非選択的なα2−アドレノセプター等の拮抗剤を用いた高血圧症の治療が必要か
の少なくとも一方を判定する工程。
【００１１】
本発明の更なる目的の一つは、変異α2B−アドレノセプターをコードする対立遺伝子のパターンを決定することによって、高血圧症を患う対象生物の高血圧症を治療するか選択的に（ターゲットとして）治療するための方法であって、対象生物のヒトα2B−アドレノセプターの遺伝子型が欠失／欠失（Ｄ／Ｄ）型であるか否かを上記の方法で判定し、そして遺伝子型がＤ／Ｄ型の対象生物のノルアドレナリン感受性又は交感神経活性に作用する薬物を用いて該対象生物を治療する方法を提供することである。
【００１２】
さらに本発明は、対象生物が高血圧症を発症する危険度の判定、抗高血圧症をターゲットとした治療が有効な対象生物の選択、及び化合物の抗高血圧作用を試験するための臨床薬物治験に適した対象生物の選択のいずれかに用いるためのキットであって、生物学的試料に含まれるα2B−アドレノセプターをコードする対立遺伝子のパターンを決定するための手段を包含し、所望により該手段によって得られた結果を解析するためのソフトウェアも包含するキット、並びに該キットの用途に関する。
【００１３】
本発明は、α2B−アドレノセプターポリペプチドの３番目の細胞内ループに存在する２９４番〜３１１番の１８個のアミノ酸残基からなる酸性領域の一部である２９８番〜３０９番のグルタミン酸残基１２個からなるグルタミン酸繰り返し部位において少なくとも１個のグルタミン酸残基を欠失している変異α2B−アドレノセプタータンパク質をコードする塩基配列を包含するＤＮＡ配列も提供する。
【００１４】
更に本発明は、α2B−アドレノセプターポリペプチドの３番目の細胞内ループに存在する２９４番〜３１１番の１８個のアミノ酸残基からなる酸性領域の一部である２９８番〜３０９番のグルタミン酸残基１２個からなるグルタミン酸繰り返し部位において、少なくとも１個のグルタミン酸残基を欠失している変異α2B−アドレノセプタータンパク質を提供する。
【００１５】
発明の詳細の説明
本発明は、変異ヒトα2B−アドレノセプターをコードするＤＮＡ分子、該変異ヒトα2B−アドレノセプタータンパク質、並びに哺乳類において個体が高血圧症を発症する危険度を判定するための方法及び高血圧症をターゲットとした治療方法に関する。
【００１６】
本発明において、「治療」という用語には、「予防」という意味も含まれるものとする。
【００１７】
「グルタミン酸残基１２個からなるグルタミン酸繰り返し部位において、少なくとも１個のグルタミン酸残基を欠失している」という概念においては、α2B−アドレノセプターポリペプチドの３番目の細胞内ループに存在する２９４番〜３１１番の１８個のアミノ酸残基からなる酸性領域の一部である２９８番〜３０９番（配列番号４）のグルタミン酸残基１２個からなる該繰り返し部位の中で１個〜１２個のグルタミン酸残基が欠失しており、欠失の位置や数は関係ない。
【００１８】
「ヒトα2B−アドレノセプターの遺伝子が欠失／欠失（Ｄ／Ｄ）型」、すなわち「遺伝子型がＤ／Ｄ型である」という概念においては、α2B−アドレノセプターの対立遺伝子の両方が変異α2B−アドレノセプターをコードする個体の遺伝子型であって、変異α2B−アドレノセプターは、α2B−アドレノセプターポリペプチドの３番目の細胞内ループに存在する２９４番〜３１１番（配列番号４）の１８個のアミノ酸残基からなる酸性領域の一部である２９８番〜３０９番のグルタミン酸残基１２個からなるグルタミン酸繰り返し部位において少なくとも１個のグルタミン酸残基の欠失が存在する。同様に、「遺伝子型が欠失／挿入（Ｄ／Ｉ）型である」という表現は、対立遺伝子の一方は欠失のあるα2B−アドレノセプターをコードし、他方は欠失のないもの、すなわち対応箇所の挿入を有するα2B−アドレノセプターをコードする個体の遺伝子型を意味する。さらに、「遺伝子型が挿入／挿入（Ｉ／Ｉ）型である」という表現は、対立遺伝子の両方が欠失のないα2B−アドレノセプターをコードする個体の遺伝子型を意味する。
【００１９】
ヒトα2B−ＡＲ遺伝子（配列番号３）の一般的な変異型（配列番号１）は、近年同定された(Heinonenetal., 1999)。この変異型遺伝子は、α2B−アドレノレセプターポリペプチド（配列番号４）の３番目の細胞内ループに存在する２９４番〜３１１番の１８個のアミノ酸残基からなる酸性領域の一部である２９８番〜３０９番のグルタミン酸残基１２個からなるグルタミン酸（Ｇｌｕ）繰り返し部位において、３０７番〜３０９番の３個のグルタミン酸残基が欠失しているレセプタータンパク質（配列番号２）をコードする。この変異型遺伝子（配列番号１）は肥満体のフィンランド人対象者のグループに見られる基礎代謝率（ＢＭＲ）の減少と関連付けられている(Heinonenetal., 1999)。１６６人の肥満体の対象者のうち、４７人（２８％）はグルタミン酸残基１２個からなる長いグルタミン酸繰り返し部位がホモ接合（Ｇｌｕ12／Ｇｌｕ12）であるのに対し、９０人（５４％）はヘテロ接合（Ｇｌｕ12／Ｇｌｕ9）であり、２９人（１７％）は短縮型がホモ接合（Ｇｌｕ9／Ｇｌｕ9）だった。
【００２０】
後述する結果によると、９１２人の中年フィンランド人男性からなる個体群においては、α2B−アドレノセプターの遺伝子型が欠失／欠失（Ｄ／Ｄ）型である上記の短縮型がホモ接合（Ｇｌｕ9／Ｇｌｕ9）の対象者は、高血圧症の危険度が有意に高いことが判明した。これらの結果及び上記の先行文献に基づき、遺伝子型がＤ／Ｄ型であることは、レセプター活性が維持されている間に見られる、α2B−アドレノセプターの機能抑制の減少と関連すると仮定した。このような改変されたα2B−アドレノセプターの機能は高血圧症の病因との関連が考えられるので、遺伝子型が挿入／欠失（Ｉ／Ｄ）型（ヘテロ接合であるＧｌｕ12／Ｇｌｕ9）や挿入／挿入（Ｉ／Ｉ）型（ホモ接合であるＧｌｕ12／Ｇｌｕ12）の対象生物においても、高血圧症の他の危険因子が存在する場合に同様の関連性が存在すると考えた。さらに、α2B−アドレノセプターポリペプチドの３番目の細胞内ループに存在する２９４番〜３１１番の１８個のアミノ酸残基からなる酸性領域の一部である２９８番〜３０９番のグルタミン酸残基１２個からなるグルタミン酸繰り返し部位における３個のグルタミン酸残基の特異的な欠失は、高血圧症との関連が見られるので、その他の欠失、即ち、２９８番〜３０９番のグルタミン酸残基１２個からなるグルタミン酸繰り返し部位における少なくとも１個のグルタミン酸残基の欠失、も高血圧症の病因と関連があると考えられる。これは、α2B−アドレノセプターポリペプチドの３番目の細胞内ループはα2B−アドレノセプターの抑制において重要な役割を果たすと考えられることにも支持されている。このように、遺伝子型がＤ／Ｄ型であるヒトは慢性的にα2B−アドレノセプターが活性化されており、その結果、全身性血圧上昇が生じる。
【００２１】
α2B−アドレノセプターは動脈の収縮を仲介するので、α2B−アドレノセプター遺伝子に存在する遺伝子の多型によって、ある対象生物は他の対象生物よりも動脈（細動脈）の抵抗を制御するα2B−アドレノセプター仲介血管収縮やそれと関連した臨床疾患（例えば高血圧症）を患う可能性が高くなる。このような対象生物は、特にα2B−アドレノセプター拮抗剤を用いた治療が有効であり、サブタイプ非選択的α2−拮抗剤を投与した場合には、副作用の可能性が高くなる。したがって、α2B−アドレノセプターの欠失変異型を有する対象生物を認識するための遺伝子試験は診断や、特定の治療方法を用いる患者の選択及び臨床薬物治験において有用である。α2B−アドレノセプターの遺伝子型がＤ／Ｄ型であることを認識する遺伝子試験は、ある個体の遺伝子型がＤ／Ｄ型であることに関連して高血圧症を発症する危険度を判定する際に有用である。この遺伝子試験は、この遺伝子による病因論に基づいて、高血圧症の特定の前診断（subdiagnosis）を行うために用いてもよい。
【００２２】
さらに、α2B−アドレノセプターの遺伝子型がＤ／Ｄ型であることを認識する遺伝子試験は、高血圧症の患者のための薬物治療法を選択する際に有用である。このような治療に用いる薬物は、直接又は中枢神経系作用を介して対象生物の血管のα−又はβ−アドレナリン作用性レセプターを調節、阻害又は活性化する薬物であり、例えば、（α2B−選択的又は非選択的な）α−アドレノセプターの拮抗剤である、ピンドロール、プロプラノロール、ソタロール、チモロール、アセブトロール、アテノール、ベタキソロール、ビソプロール、エスモロール、メトプロロール、セリプロール（seliprol）、カルベジロール、ラベタロール、クロニジン、モキソニジン、プラゾシンやインダパミドが挙げられる。
【００２３】
例えば、アンジオテンシンＩＩはノルアドレナリン感受性を高め、この作用は少なくとも部分的にα−アドレノセプターによって仲介される(Datteetal., 2000)。従って、アンジオテンシンＩＩの阻害によって血圧降下を達成する薬物、例えばアンジオテンシン（ＡＴ）レセプター遮断剤、の血圧降下作用は、α2B−アドレノセプター遺伝子型がＤ／Ｄ型である個人においては増強されると考えられる。このような薬物の例としては、カプトプリル、シナプリル（cinapril）、エナラプリル、イミダプリル、リシノプリル、モエキシプリル、ペリンドプリル、ラミプリル、トランドラプリル、カンデサルタン、エプロサルタン、イルベサルタン、ロサルタン、バルサルタンやテルミサルタンが挙げられる。
【００２４】
α2B−アドレノセプターの遺伝子型がＤ／Ｄ型であることを認識する遺伝子試験は、α2−アドレナリン様作用薬による副作用の可能性が高い患者のための薬物治療法を選択する際に有用である。このような患者に対しては、α2−作用薬の使用を避けたり、治療方法に特定のα2B−拮抗剤を取り入れることもできる。
【００２５】
一方、Ｄ／Ｄ型以外の遺伝子型の患者においては、他の抗高血圧症薬物の方が有効であると考えられる。
【００２６】
ＤＮＡ配列は、対象生物が変異遺伝子を保有するか否かを判定するためのスクリーニングに用いることができる。このような判定は、公知のＤＮＡ分析法（正常遺伝子及び変異遺伝子の直接ＤＮＡシークエンシング法や、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いた対立遺伝子の特異的増幅による正常または変異遺伝子の検出が含まれる）あるいは種々の分子生物学的手法による正常又は変異遺伝子の間接的な検出（例えば、ＰＣＲ−一本鎖ＤＮＡ高次構造多型（ＳＳＣＰ）法や、変性勾配ゲル電気泳動（ＤＧＧＥ）法が含まれる）によって行うことができる。遺伝子が正常か変異体かの判定には、多数のサンプルの遺伝子型の同定に特に適した制限フラグメント断片長多型（ＲＦＬＰ）法を用いることもできる。同様に、遺伝子チップ又は遺伝子アレイ技術に基づいた試験方法も、一本鎖ヌクレオチド多型を検出するために現在用いられている多くの試験からの類推により容易に開発することができる。
【００２７】
上述のような判定は、ＲＮＡレベルで行うこともでき、種々の方法で組織レベルで発現するＲＮＡを分析すればよい。対立遺伝子特異的プローブをハイブリダイゼーションで用いるために設計することができる。ハイブリダイゼーションは、例えばノーザンブロット法、リボヌクレアーゼアッセイ又はin situ ハイブリダイゼーション法を用いて行うことができる。正常又は変異遺伝子より誘導されたＲＮＡは、組織ＲＮＡをｃＤＮＡに変換し、対立遺伝子特異的ＰＣＲ法でｃＤＮＡを増幅することによって分析することもできる。
【００２８】
本発明の方法を実施するためのキットは、本発明の方法を実施するための種々の成分を別々の容器及び／又はバイアルに納められたものと、本発明の方法を実施するための指示書を含むことが好ましい。したがって、判定を実施するために必要ないくつかの又は全ての試薬や材料、例えば、緩衝液、プライマー、酵素、対照サンプル又は標準物質などを別々に梱包したものが、使用できるように同じ箱に入れて提供される。本発明の方法を実施するための指示書もこの箱の中に添付されるが、それは独立した挿入物として収められていてもよいし、箱及び／又は個々のバイアルのラベルとして収められていてもよい。キットには、このキットを用いて得た結果を解析したり、本発明の方法で使用する遺伝子チップから得た結果を利用するためのソフトウェアを含んでいてもよい。
【００２９】
以下の発明を実施するための最良の形態において、本発明をさらに詳細に説明する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３０】
α2B−アドレノセプターをコードする対立遺伝子の特定
ＰＣＲ−ＳＳＣＡ解析
α2B−アドレノセプターをコードする対立遺伝子を同定するために用いたポリメラーゼ連鎖反応−一本鎖ＤＮＡ高次構造解析（ＰＣＲ−ＳＳＣＡ）は次のように実施した。α2B−アドレナリンのレセプターをコードするゲノムＤＮＡは、イントロンのないα2B−アドレノセプター遺伝子配列に特異的な二つの部分として増幅した(Lomasneyetal., 1990)。ＰＣＲ増幅に使用するＰＣＲプライマーペアは次の通りである。ペア１：5'-GGGGCGACGCTCTTGTCTA-3' (配列番号５) 及び5'-GGTCTCCCCCTCCTCCTTC-3' (配列番号６)(ＰＣＲ産物のサイズ：８７８ｂｐ)；並びにペア２：5'-GCAGCAACCGCAGAGGTC-3' (配列番号７) 及び5'-GGGCAAGAAGCAGGGTGAC-3' (配列番号８)(ＰＣＲ産物のサイズ：８１４ｂｐ)。プライマーはKeboLab社（フィンランド国、ヘルシンキ）に受注したものを使用した。ＰＣＲによる増幅は、１００ｎｇの（全血から単離した）ゲノムＤＮＡ、２．５ｍｍｏｌ／ｌの各プライマー、１．０ｍｍｏｌ／ｌのｄＮＴＰ、３０ｎｍｏｌ／ｌの33Ｐ−ｄＣＴＰ及び０．２５ＵのAmpliTaq ＤＮＡポリメラーゼ（米国、コネティカット州、ノーウォーク、Perkin Elmer Cetus社製）を含む５μｌ容量の反応系で行った。ＰＣＲの条件は、PCR OptimizerTMキット（米国、カルフォルニア州、サンディエゴ、Invitrogen社製）を用いて最適化した。サンプルは、GeneAmp PCR System 9600（Perkin Elmer Cetus社製）を用いて増幅した。ＰＣＲ産物をＳＳＣＡ解析用の制限酵素で消化した。プライマーペア１のＰＣＲ産物はDde I及びDra III（米国、ウィスコンシン州、マディソン、Promega社製）で消化した。プライマーペア２のＰＣＲ産物はAlu I及びHinc II（Promega社製）で消化した。消化したサンプルを９５％ホルムアミド、１０ｍｍｏｌ／ｌのＮａＯＨ、０．０５％のキシレンシアノール及び０．０５％のブロモフェノールブルーを含むＳＳＣＡ緩衝液（合計量は２５μｌ）と混合した。泳動に付す前に、消化したサンプルを９５℃で５分間変性し、氷上に５分間保持した。３μｌの各サンプルをＭＤＥTM高分解能ゲル（米国、マサチューセッツ州、ロックランド、FMC BioProducts社製）にロードした。電気泳動は２種の異なる泳動条件で行った：＋４℃において６％ＭＤＥゲルを用いるか、室温で３％ＭＤＥゲルを用い、いずれも４Ｗの一定電圧で１６時間電気泳動を行った。ゲルはそれぞれ乾燥し、オートラジオグラフィーはKodak社製のBioMax MRフィルムを並置し、室温で２４時間行った。
【００３１】
シークエンシング及び遺伝子型決定
ＳＳＣＡにおいて異なる移動度で移動したＤＮＡサンプルをThermo SequenaseTMサイクルシークエンシングキット（米国、オハイオ州、クリーブランド、Amersham Life Science社製）を用いてシークエンシングした。
【００３２】
同定された３個のグルタミン酸残基の欠失を有する遺伝子型を検出するために、標準的な方法を用いてＤＮＡを末梢血から抽出した。α2B−ＡＲのＩ／Ｄ遺伝子型は、ＰＣＲで増幅したＤＮＡ断片を電気泳動で分離することによって決定した。伸長型及び短縮型の同定は、Ｉ／Ｄ変異型の性質に基づき、９ｂｐのサイズの違いによって生じる電気泳動時の移動度の違いによって行った。
【００３３】
問題となる領域を、センスプライマーとして5'-AGG-GTG-TTT-GTG-GGG-CAT-CT-3'（配列番号９）及びアンチセンスプライマーとして5'-CAA-GCT-GAG-GCC-GGA-GAC-ACT-3'（配列番号１０）（いずれもOligold）（ベルギー国、Eurogentec社製）を用いて増幅し、産物サイズが１１２ｂｐの伸長型対立遺伝子（Ｉ）及び１０３ｂｐの短縮型対立遺伝子（Ｄ）を得た。ＰＣＲによる増幅は、１００ｎｇ以下のゲノムＤＮＡ、１×Ｇ緩衝液（米国、カルフォルニア州、サンディエゴ、Invitrogen社製）、０．８ｍＭのｄＮＴＰ、０．３μＭの各プライマー及び０．２５単位のAmpliTaqＤＮＡポリメラーゼ（米国、コネティカット州、ノーウォーク、Perkin Elmer Cetus社製）を含む、１０μＬ容量の反応系で行った。サンプルはGeneAmp PCR System 9600（Perkin Elmer Cetus社製）を用いて増幅した。９４℃で２分間の初期変性の後、サンプルは３５サイクルを越える回数増幅した。ＰＣＲ増幅の条件は９６℃（４０秒）、６９℃（３０秒）及び７２℃（３０秒）であり、最後に７２℃で６分間の最終伸長を行った。延長及び短縮型の対立遺伝子を示すＰＣＲ産物を次の２種のいずれかの方法によって同定した。１）増幅サンプルを４μｌの停止液（Thermo SequenaseTMサイクルシークエンシングキット）と混合して９５℃で２分間加熱し、暖かいままシークエンシングゲル（FMC社製のLong RangerTM）にロードした。ゲルを乾燥し、前述したようにオートラジオグラフィーを行った。２）増幅したＰＣＲ産物の分離は、分解能の高い４％Metaphorアガロースゲル（米国、メイン州、ロックランド、FMC Bioproducts社製）を用いた電気泳動で行い、エチジウムブロマイド染色でバンドを視覚化した。いずれの方法においても、伸長型（Ｇｌｕ12）対立遺伝子及び短縮型（Ｇｌｕ9）対立遺伝子は、異なる電気泳動移動度によって同定した。
【００３４】
集団遺伝学的研究
前述した集団遺伝学的研究、即ち、α2B−アドレノセプターの遺伝子型に見られる特徴的な欠失／欠失（Ｄ／Ｄ）型を有する１９２人の対象者を含む９１２人のフィンランド人中年男性を対象者とした研究について、以下により詳細に述べる。
【００３５】
α2B−ＡＲはマウスにおいて血管収縮特性を示すこと及び研究した酸性領域がレセプターの脱感作メカニズムに関与する可能性があることに基づき、検出した挿入／欠失の対立遺伝子の多様性は高血圧症と関連すると仮定した。この仮定を立証するために、冠動脈性心疾患の病歴のない９１２人のフィンランド人中年男性の集団遺伝学的研究を実施した。この研究は、クオピオ虚血性心疾患危険因子研究（Kuopio Ischemic Heart Disease Risk Factor Study）(KIHD)の一部として行われ、ＫＩＨＤはフィンランド東部の男性における心臓血管疾患及びそれに伴うその他の症状の危険因子を調査するために進行中の集団病理学的研究である(Salonen 1988)。この地域は、個体群が均質であること(Sajantilaetal., 1996)と心疾患罹患率及び致死率が高いことで知られる(Keys 1980)。
【００３６】
９１２人の対象者のうち、１９２人（２１％）の遺伝子型はＤ／Ｄ型であり、２５６人（２８％）の遺伝子型はＩ／Ｉ型であり、そして４６４人（５１％）の遺伝子型はヘテロ接合、すなわちＩ／Ｄ型だった。この遺伝子型の分布はハーディーワインバーグ平衡（ｐ＝０．４６）にある。
【００３７】
４１７人の男性は高血圧症の家族歴はなく、４９５人はその家族（親又は兄弟又はその両方）に高血圧症の発症者がいた。高血圧症の家族歴のある対象者においては、遺伝的形質と高血圧症との間に強い関連性が存在すると考えられるので、α2B−アドレノセプター遺伝子型と高血圧症との関連性は、高血圧症の家族歴のある男性といない男性とを別々に分析した（表１及び２）。多変量線形回帰モデルにおいては、遺伝子型がＤ／Ｄ型の男性の場合、高血圧症の家族歴のある男性の平均収縮期血圧（ＢＰ）は、他の遺伝子型の男性と比べて概して高い（ｐ＝０．０２１）（表１）。高血圧症の家族歴のある男性の中でＤ／Ｄ型であるホモ接合の男性は、多変量ロジスティックモデルにおいて、高血圧症（収縮期血圧が少なくとも１６５ｍｍＨｇであるか、拡張期血圧が少なくとも９５ｍｍＨｇであるか、抗高血圧症薬物療法を必要とする）（表２）を発症する確率（罹患率）が２．０４倍（９５％信頼区間：１．０６〜３．９３、ｐ＝０．０３２）だった。
【００３８】
α−アドレノセプターの拮抗剤（例えばプラゾシン）の使用と高血圧症との関連をＤ／Ｄ型であるホモ接合の男性とその他の遺伝子型の男性とで別々に分析した。抗高血圧症作用は、特定の薬物型とその他の薬物との間に見られる血圧変化の差として評価した。遺伝子型がＤ／Ｄ型の男性においては、他の遺伝子型の男性では見られなかったものの、α−アドレノセプターの拮抗剤の使用は収縮期血圧及び拡張期血圧の両方の低下と共に、副作用の自己申告数の減少とも関連が見られた。１１年間の追跡調査において高血圧症の（収縮期血圧が１６５ｍｍＨｇ以上である、又は拡張期血圧が９５ｍｍＨｇ以上である、又は抗高血圧症の治療を受けている）４４０人の男性のうち、α2B−アドレノセプター遺伝子型がＤ／Ｄ型である男性の平均収縮期血圧は、α遮断剤による治療を受けた場合は１１１ｍｍＨｇであり、他の薬物で治療した場合には１３７ｍｍＨｇだった。一方、他の遺伝子型の男性においては、平均収縮期血圧は１５０ｍｍＨｇと１３８ｍｍＨｇだった。これと同様の傾向がβ−アドレノセプターの拮抗剤（β遮断剤）、例えばアテノロール、メトプロロール及びピンドロールや、アンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害剤、例えばカプトプリル、エナラプリル及びリシノプリル、にも見られた。例えば、ＫＩＨＤ基準検査で高血圧症と診断された３４４人の男性のうち、遺伝子型がＤ／Ｄ型の男性の１１年後の平均収縮期血圧は、β遮断剤による治療を受けた対象者では１３４ｍｍＨｇであり、他の薬物による治療を受けた対象者では１４１ｍｍＨｇだったのに対し、他の遺伝子型の男性では１３７ｍｍＨｇ及び１３８ｍｍＨｇだった。１１年間の追跡調査の間、高血圧症だった４４０人の男性のうち、Ｄ／Ｄ型の男性がβ遮断剤による治療を受けた場合、平均収縮期血圧は１３３ｍｍＨｇであり、他の薬物による治療を受けた場合には１３９ｍｍＨｇだったのに対し、他の遺伝子型の男性では平均収縮期血圧はそれぞれ１３９ｍｍＨｇ及び１３８ｍｍＨｇだった。β遮断剤による治療を受けた男性のうち、遺伝子型がＤ／Ｄ型の男性の平均収縮期血圧は１２８．８ｍｍＨｇ（標準偏差１６．２）であり、他の遺伝子型の男性では１３５．５ｍｍＨｇ（標準偏差１９．３）だった（差に対するｐ＝０．０４）。年齢及びボディーマス指数(kg/m2)に適合させた線形共分散において、遺伝子型−β遮断剤の相互作用は統計的に有意だった（片側相対度数ｐ＝０．０４）。
【００３９】
アドレノセプター又はノルアドレナリンの感受性の調節機構以外のメカニズムを介して作用する抗高血圧症薬物は、Ｄ／Ｄ型以外の遺伝子型の男性において、より高い抗高血圧作用を示した。例えば、利尿剤及びカルシウムチャンネル遮断剤は、α2B−ＡＲ遺伝子型がＤ／Ｄ型以外の遺伝子型の男性においてより高い血圧降下作用を示した。遺伝子型がＤ／Ｄ型の男性は副作用を生じる可能性が高く、例えばクロニジン等のα2−アドレノセプター作用薬を用いた治療に対する抗高血圧症反応が低い。
【００４０】
α2B−ＡＲについて既に知られている生物学的特性、フィンランド人個体群の均質性、研究計画、代表研究個体群が比較的大きいこと及び高血圧症がある形質と関連付けられたことを総合的に考慮すると、Ｄ／Ｄ型のレセプター対立遺伝子は高血圧症の病因となる遺伝的危険因子であることが示唆された。
【００４１】
本発明の方法は、ここで開示したわずかな態様だけでなく、種々の態様が組み込まれうることを御理解いただきたい。他の態様が存在し、それらは本発明の精神から外れぬことは当業者には明らかである。従って、本願明細書に記載した態様は具体例であり、本発明を制限するものではない。
【００４２】
【表１】
2004528830.tif 000002
【００４３】
【表２】
2004528830.tif 000003
【００４４】
参考文献
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Datte J-Y, Gohlke P, Pees C, Ziegler A. Short treatments of normotensive and hypertensive rats by angiotensin II and nitric oxide inhibitor induce and increase of noradrenaline sensitivity in isolated vena portae preparations.Pharmacol.Res. 2000;41:641-648.
Docherty JR: Subtypes of functional α1- and α2-receptors.Eur.J.Pharmacol. 1998;361:1-15.
Heinonen P, Koulu M, Pesonen U, Karvonen M, Rissanen A, Laakso M, Valve R, Uusitupa M, Scheinin M: Identification of a three amino acid deletion in the alpha-2B-adrenergic receptor which is associated with reduced basal metabolic rate in obese subjects.  J.Clin.Endocrinol.Metab. 1999;84:2429-2433.
Jewell-Motz E, Liggett SB: An acidic motif within the third intracellular loop of the alpha2C2 adrenergic receptor is required for agonist- promoted phosphorylation and desensitization.  Biochemistry1995;34:11946-11953.
Keys A:SevenCountries:AMultivariateAnalysisofDeathandCoronaryHeartDisease. Cambridge, Mass, Harvard University Press, 1980.
Link RE, Desai K, Hein L, Stevens ME, Chruscinski A, Bernstein D, Barsh GS, Kobilka BK: Cardiovascular regulation in mice lacking alpha2-adrenergic receptor subtypes b and c.  Science1996;273:803-805.
Lomasney JW, Lorenz W, Allen LF, King K, Regan JW, Yang-Feng  TL, Caron MC, Lefkowitz RJ: Expansion of the alpha-2 adrenergic receptor family: cloning and characterization of a human alpha-2 adrenergic receptor subtype, the gene for which is located on chromosome 2.Proc.Natl.Acad.Sci. USA. 1990;87:5094-5098.
MacDonald E, Kobilka BK, Scheinin M: Gene targeting - homing in on α2-adrenoceptor subtype function.TrendsPharmacol.Sci. 1997;18:211-219.
MacMillan LB, Hein L, Smith MS, Piascik MT, Limbird LE: Central hypotensive effects of the alpha2a-adrenergic receptor subtype.  Science1996;273:801-803.
Sajantila A, Salem AH, Savolainen P, Bauer K, Gierig C, Paabo S: Paternal and maternal DNA lineages reveal a bottleneck in the founding of the Finnish population.  Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.1996;93:12035-12039.
Salonen JT: Is there a continuing need for longitudinal epidemiologic research? The Kuopio Ischaemic Heart Disease Risk Factor Study.  Ann.Clin.Res. 1988;20:46-50.
【配列表フリーテキスト】
【００４５】
配列番号１    変異型ヒトα2Bアドレノセプタータンパク質をコードする塩基配列
配列番号３    ヒトα2Bアドレノセプタータンパク質をコードする塩基配列
配列番号４    ヒトα2Bアドレノセプタータンパク質をコードするアミノ酸配列
配列番号５    人工的な塩基配列の記載: ＰＣＲプライマーペア
配列番号６    人工的な塩基配列の記載: ＰＣＲプライマーペア
配列番号７    人工的な塩基配列の記載: ＰＣＲプライマーペア
配列番号８    人工的な塩基配列の記載: ＰＣＲプライマーペア
配列番号９    人工的な塩基配列の記載: ＰＣＲプライマーペア
配列番号１０  人工的な塩基配列の記載: ＰＣＲプライマーペア
【国際公開パンフレット】
2004528830.tif 000004
2004528830.tif 000005
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004528830.tif 000036
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004528830.tif 000037
【手続補正書】
【提出日】平成15年4月15日(2003.4.15)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項１】
変異α2B−アドレノセプターをコードする対立遺伝子のパターンの決定によって、対象生物の高血圧症発症の危険度を判定するための方法であって、対象生物から得た試験のための生物学的試料をアッセイに付して、ヒトα2B−アドレノセプターの遺伝子型が
(i) 挿入／挿入（Ｉ／Ｉ）型又は欠失／挿入（Ｄ／Ｉ）型である、あるいは
(ii) 欠失／欠失（Ｄ／Ｄ）型である
ことを検出する工程を包含する方法であり、
Ｄ／Ｄ型遺伝子の存在は該対象生物が高血圧症を発症する危険度が高いことを示し、該欠失（Ｄ）型とは、変異型α2B−アドレノセプタータンパク質をコードする対立遺伝子に見られる遺伝子型であって、α2B−アドレノセプターポリペプチドの３番目の細胞内ループに存在する２９４番〜３１１番の１８個のアミノ酸残基からなる酸性領域の一部である２９８番〜３０９番のグルタミン酸残基１２個からなるグルタミン酸繰り返し部位において、３０７番〜３０９番の３個のグルタミン酸残基が欠失しており、該挿入（Ｉ）型とは、該欠失の存在しないα2B−アドレノセプタータンパク質をコードする対立遺伝子に見られる遺伝子型である。
【手続補正２】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項６】
該アッセイは、１本鎖ｃＤＮＡを包含する捕捉用プローブを用いて行うものであり、該１本鎖ｃＤＮＡは変異α2B−アドレノセプタータンパク質をコードする塩基配列を包含し、変異α2B−アドレノセプタータンパク質は、α2B−アドレノセプターポリペプチドの３番目の細胞内ループに存在する２９４番〜３１１番の１８個のアミノ酸残基からなる酸性領域の一部である２９８番〜３０９番のグルタミン酸残基１２個からなるグルタミン酸繰り返し部位において、３０７番〜３０９番の３個のグルタミン酸残基を欠失していることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【手続補正３】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項７】
該アッセイは、１本鎖ｃＤＮＡを包含する捕捉用プローブを用いて行うものであり、該１本鎖ｃＤＮＡはα2B−アドレノセプタータンパク質に対応する塩基配列からなり、α2B−アドレノセプタータンパク質は、その３番目の細胞内ループに存在する２９４番〜３１１番の１８個のアミノ酸残基からなる酸性領域の一部である２９８番〜３０９番のグルタミン酸残基１２個からなるグルタミン酸繰り返し部位において、３０７番〜３０９番の３個のグルタミン酸残基が欠失せずに存在することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【手続補正４】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項２２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項２２】
対象生物が高血圧症を発症する危険度の判定、抗高血圧症をターゲットとした治療が有効な対象生物の選択、及び化合物の抗高血圧作用を試験するための臨床薬物治験に適した対象生物の選択のいずれかに用いるためのキットであって、対象生物由来の生物学的試料に含まれるα2B−アドレノセプターをコードする対立遺伝子のパターンを決定するための手段と、所望により、該手段によって得られた結果を解析するためのソフトウェアを包含するキットであり、該手段は、対象生物のヒトα2B−アドレノセプターの対立遺伝子の両方が、α2B−アドレノセプターポリペプチドの３番目の細胞内ループに存在する２９４番〜３１１番の１８個のアミノ酸残基からなる酸性領域の一部である２９８番〜３０９番のグルタミン酸残基１２個からなるグルタミン酸繰り返し部位において、３０７番〜３０９番のグルタミン酸残基３個を欠失している変異α2B−アドレノセプタータンパク質をコードする欠失／欠失（Ｄ／Ｄ）型であるか否かを決定するための手段である。
【国際調査報告】
2004528830.tif 000038
2004528830.tif 000039
2004528830.tif 000040