(57)【要約】新たに同定されたｍａｒ調節（ＮＩＭＲ）遺伝子およびポリペプチドについて記述する。さらに、ＮＩＭＲ活性を調節する物質を同定するためのスクリーニングアッセイ法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の段階を含む、ＮＩＭＲポリペプチド活性を調節する化合物を同定する方法：
化合物をポリペプチドと相互作用させる条件で、ＮＩＭＲポリペプチドを試験化合物に接触させる段階；
ＮＩＭＲポリペプチドの活性を調節する試験化合物の能力を決定する段階；および
ＮＩＭＲポリペプチドの活性を調節する化合物を選択し、それによってＮＩＭＲポリペプチド活性を調節する化合物を同定する段階。
【請求項２】
ＮＩＭＲポリペプチドが、ｂ０３５７、ｂ０４４７、ｂ０８５３、ｂ１４４８、ｂ２５３０、ｂ２８８９、ｂ２９４８、ｂ３４６９、ｍｄａＢ、ｙａｄＧ、ｙａｄＨ、ｙｂｊＣ、ｙｆａＥ、ｙｇｇＪ、およびｙｈｂＷからなる群より選択される、請求項１記載の方法。
【請求項３】
ＮＩＭＲポリペプチド活性が、環境チャレンジに対する微生物の抵抗能を促進することを含む、請求項１記載の方法。
【請求項４】
ＮＩＭＲポリペプチドが、ａｃｅＧ、ａｃｋＡ、ａｌｄＡ、ｃｏｂＵ、ｆａｂＢ、ｆｅｃＡ、ｇａｌＫ、ｇａｌＴ、ｇａｔＡ、ｇａｔＣ、ｇｌｐＤ、ｇｌｔＡ、ｇｓｈＢ、ｇｕａＢ、ｈｅｍＢ、ｍａｐ、ｍｇｌＢ、ｍｔｒ、ｎｄｈ、ｎｆｎＢ、ｐｆｌＢ、ｐｇｉ、ｐｕｒＡ、ｒｉｂＤ、ｒｉｍＫ、ｒｐｌＥ、ｓｒｌＡ＿２、ｔｎａＡ、ｔｎａＬ、ｔｐｘ、ａｃｎＡ、ｍｄａＡ、ｒｉｂＡ、およびｙｄｅＡからなる群より選択される、請求項３記載の方法。
【請求項５】
ＮＩＭＲポリペプチド活性が、微生物のビルレンスを促進することを含む、請求項１記載の方法。
【請求項６】
ＮＩＭＲポリペプチドが、ａｃｅＧ、ａｃｋＡ、ａｌｄＡ、ｃｏｂＵ、ｆａｂＢ、ｆｅｃＡ、ｇａｌＫ、ｇａｌＴ、ｇａｔＡ、ｇａｔＣ、ｇｌｐＤ、ｇｌｔＡ、ｇｓｈＢ、ｇｕａＢ、ｈｅｍＢ、ｍａｐ、ｍｇｌＢ、ｍｔｒ、ｎｄｈ、ｎｆｎＢ、ｐｆｌＢ、ｐｇｉ、ｐｕｒＡ、ｒｉｂＤ、ｒｉｍＫ、ｒｐｌＥ、ｓｒｌＡ＿２、ｔｎａＡ、ｔｎａＬ、ｔｐｘ、ａｃｎＡ、ｍｄａＡ、ｒｉｂＡ、およびｙｄｅＡからなる群より選択される、請求項５記載の方法。
【請求項７】
決定する段階が、細胞からの試験化合物またはマーカー化合物の流出を測定する段階を含む、請求項１、３、または５のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
決定する段階が、環境チャレンジの存在下で微生物が増殖または生存することができるか否かを測定する段階を含む、請求項１、３、または５のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
ＮＩＭＲポリペプチドが微生物細胞に存在する、請求項１、３、または５のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
ＮＩＭＲポリペプチドが、それが存在する細胞に対して異種である、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
以下の段階を含む、ＮＩＭＲポリペプチド活性を調節する化合物を同定する方法：
化合物をポリペプチドと相互作用させる条件で、ＮＩＭＲポリペプチドを試験化合物に接触させる段階；
ＮＩＭＲポリペプチドの活性を調節する試験化合物の能力を決定する段階；および
ＮＩＭＲポリペプチドの発現を調節する化合物を選択し、それによってＮＩＭＲポリペプチド活性を調節する化合物を同定する段階。
【請求項１２】
ＮＩＭＲポリペプチドが、ｂ０３５７、ｂ０４４７、ｂ０８５３、ｂ１４４８、ｂ２５３０、ｂ２８８９、ｂ２９４８、ｂ３４６９、ｍｄａＢ、ｙａｄＧ、ｙａｄＨ、ｙｂｊＣ、ｙｆａＥ、ｙｇｇＪ、およびｙｈｂＷからなる群より選択される、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
ＮＩＭＲポリペプチドが、ａｃｅＧ、ａｃｃＢ、ａｃｅＦ、ａｃｋＡ、ａｌｄＡ、ｃｏｂＵ、ｆａｂＢ、ｆｅｃＡ、ｇａｌＫ、ｇａｌＴ、ｇａｔＡ、ｇａｔＣ、ｇｌｐＤ、ｇｌｔＡ、ｇｓｈＢ、ｇｕａＢ、ｈｅｍＢ、ｍａｐ、ｍｇｌＢ、ｍｔｒ、ｎｄｈ、ｎｆｎＢ、ｐｆｌＢ、ｐｇｉ、ｐｕｒＡ、ｒｉｂＤ、ｒｉｍＫ、ｒｐｌＥ、ｓｒｌＡ＿２、ｔｎａＡ、ｔｎａＬ、ｔｐｘ、ａｃｎＡ、ｍｄａＡ、ｒｉｂＡ、およびｙｄｅＡからなる群より選択される、請求項１１記載の方法。
【請求項１４】
測定する段階が、細胞によって産生されるＲＮＡの量を測定する段階を含む、請求項１２または１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
測定する段階が、細胞によって産生されるレポーター遺伝子産物の量または活性を測定する段階を含む、請求項１２または１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
測定する段階が、レポーター遺伝子産物に対する抗体の結合能を検出する段階を含む、請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
ＮＩＭＲポリペプチドが細胞不含系に存在する、請求項１、３、または５のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
決定する段階が、ＮＩＭＲポリペプチドに対する化合物の結合能を測定する段階を含む、請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
環境チャレンジに対しておよびＮＩＭＲポリペプチドの活性を調節する物質に対して微生物を曝露する段階を含む、微生物のビルレンスを減少させる方法。
【請求項２０】
環境チャレンジに対しておよびＮＩＭＲポリペプチドの活性を調節する物質に対して微生物を曝露する段階を含む、ＮＩＭＲ遺伝子のｍａｒＡ媒介転写を減少させる方法。
【請求項２１】
以下の段階を含む、微生物におけるＮＩＭＲポリペプチドの活性を調節する化合物を同定する方法：
化合物を核酸分子と相互作用させる条件で、単離されたＮＩＭＲ核酸分子を試験化合物に接触させる段階；
単離されたＮＩＭＲ核酸分子に結合する試験化合物の能力を決定する段階；および
ＮＩＭＲ核酸分子に結合する化合物を選択し、それによってＮＩＭＲポリペプチドの活性を調節する化合物を同定する段階。
【請求項２２】
ＮＩＭＲポリペプチドが、ｂ０３５７、ｂ０４４７、ｂ０８５３、ｂ１４４８、ｂ２５３０、ｂ２８８９、ｂ２９４８、ｂ３４６９、ｍｄａＢ、ｙａｄＧ、ｙａｄＨ、ｙｂｊＣ、ｙｆａＥ、ｙｇｇＪ、およびｙｈｂＷからなる群より選択される、請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
ＮＩＭＲポリペプチド活性が、環境チャレンジに対する微生物の抵抗能を促進することを含む、請求項２１記載の方法。
【請求項２４】
ＮＩＭＲポリペプチドが、ａｃｃＢ、ａｃｅＦ、ａｃｅＧ、ａｃｋＡ、ａｌｄＡ、ｃｏｂＵ、ｆａｂＢ、ｆｅｃＡ、ｇａｌＫ、ｇａｌＴ、ｇａｔＡ、ｇａｔＣ、ｇｌｐＤ、ｇｌｔＡ、ｇｓｈＢ、ｇｕａＢ、ｈｅｍＢ、ｍａｐ、ｍｇｌＢ、ｍｔｒ、ｎｄｈ、ｎｆｎＢ、ｐｆｌＢ、ｐｇｉ、ｐｕｒＡ、ｒｉｂＤ、ｒｉｍＫ、ｒｐｌＥ、ｓｒｌＡ＿２、ｔｎａＡ、ｔｎａＬ、ｔｐｘ、ａｃｎＡ、ｍｄａＡ、ｒｉｂＡ、およびｙｄｅＡからなる群より選択される、請求項２２記載の方法。
【請求項２５】
ＮＩＭＲポリペプチド活性が、微生物のビルレンスを促進することを含む、請求項１９記載の方法。
【請求項２６】
ＮＩＭＲポリペプチドが、ａｃｅＧ、ａｃｋＡ、ａｌｄＡ、ｃｏｂＵ、ｆａｂＢ、ｆｅｃＡ、ｇａｌＫ、ｇａｌＴ、ｇａｔＡ、ｇａｔＣ、ｇｌｐＤ、ｇｌｔＡ、ｇｓｈＢ、ｇｕａＢ、ｈｅｍＢ、ｍａｐ、ｍｇｌＢ、ｍｔｒ、ｎｄｈ、ｎｆｎＢ、ｐｆｌＢ、ｐｇｉ、ｐｕｒＡ、ｒｉｂＤ、ｒｉｍＫ、ｒｐｌＥ、ｓｒｌＡ＿２、ｔｎａＡ、ｔｎａＬ、ｔｐｘ、ａｃｎＡ、ｍｄａＡ、ｒｉｂＡ、およびｙｄｅＡからなる群より選択される、請求項２５記載の方法。
【請求項２７】
環境チャレンジが抗生物質化合物である、請求項２１記載の方法。
【請求項２８】
環境チャレンジが非抗生物質化合物である、請求項２１記載の方法。
【請求項２９】
非抗生物質化合物が、候補消毒物質または候補防腐薬化合物である、請求項２８記載の方法。
【請求項３０】
少なくとも一つのＮＩＭＲ核酸分子またはＮＩＭＲポリペプチドと、薬学的に許容される担体とを含むワクチン。
【請求項３１】
ＮＩＭＲポリペプチドの活性を調節する少なくとも一つの化合物と、少なくとも一つの抗生物質とを含む組成物。
【請求項３２】
ＮＩＭＲポリペプチドの活性を調節する少なくとも一つの化合物と、少なくとも一つの非抗生物質化合物とを含む組成物。
【請求項３３】
微生物のビルレンスが減少するように、少なくとも一つのＮＩＭＲ調節物質を被験者に投与する段階を含む、微生物感染症を有する被験者における微生物のビルレンスを減少させる方法。
【請求項３４】
感染症が治療されるように、少なくとも一つのＮＩＭＲ調節物質を被験者に投与する段階を含む、被験者における微生物感染症を治療する方法。
【請求項３５】
微生物の感染性が減少するように、微生物を少なくとも一つのＮＩＭＲ調節物質に接触させる段階を含む、表面上の微生物の感染性を減少させる方法。
【請求項３６】
微生物がグラム陽性菌である、請求項３３、３４、または３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
微生物がグラム陰性菌である、請求項３３、３４、または３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
微生物が抗酸菌である、請求項３３、３４、または３５のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
関連出願情報
本出願は、２０００年３月１０日に提出された米国特許出願番号第６０／１８８，３６２号に対する優先権を主張する。この出願の全内容物が参照として本明細書に組み入れられる。
【０００２】
政府の資金援助
本研究は、米国公衆衛生局助成金番号ＧＭ５１６６１号によって一部助成を受けた。したがって、政府は本発明において特定の権利を有する。
【０００３】
発明の背景
微生物における多剤耐性は、一般的に、異なる耐性メカニズムの遺伝的決定要因を有する多数のトランスポゾンとプラスミドの獲得に帰因する（ゴールド（Ｇｏｌｄ）ら、１９９６、Ｎ． Ｅｎｇｌ． Ｊ． Ｍｅｄ． ３３５：１４４５）。しかし、多剤耐性を付与する内因性のメカニズムに関する記述が現れ始めた。これらの最初のものは、大腸菌において染色体によってコードされる多抗生物質耐性（ｍａｒ）座であった（ジョージおよびレビー（Ｇｅｏｒｇｅ ａｎｄ Ｌｅｖｙ）、１９８３、Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １５５：５３１；ジョージおよびレビー（Ｇｅｏｒｇｅ ａｎｄ Ｌｅｖｙ）、１９８３、Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １５５：５４１）。
【０００４】
多抗生物質耐性（ｍａｒ）座は、抗生物質およびその他の環境有害物質に対する適応性の反応を制御する、染色体によってコードされる座である（アレクシュンおよびレビー（Ａｌｅｋｓｈｕｎ， Ｍ．Ｎ． ａｎｄ Ｌｅｖｙ， Ｓ．Ｂ．）、１９９７、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ． Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ． １０：２０６７〜２０７５）。ｍａｒ座は、大腸菌およびネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）（アレクシュンおよびレビー（Ａｌｅｋｓｈｕｎ， Ｍ．Ｎ． ａｎｄ Ｌｅｖｙ， Ｓ．Ｂ．）、１９９７、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ． Ａｇｅｎｔｓ ａｎｄ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ． ４１：２０６７）、ならびにフレクスナー赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｆｌｅｘｎｅｒｉ）（バルボサおよびレビー（Ｂａｒｂｏｓａ ａｎｄ Ｌｅｖｙ）、１９９９、第９９回アメリカ微生物学会総会（シカゴ、イリノイ州）、抄録Ａ４２、９頁）において共通のプロモーター／オペレーター領域に隣接する、離れて存在する２つの転写単位からなる。一つの単位はＭａｒＣをコードし、これはまだ明確な機能を有しない推定の完全な内膜ポリペプチドであるが、いくつかの株においてＭａｒ表現型に関与するように思われる。もう一つの単位は、ｍａｒＯに結合して、ｍａｒＲＡＢの発現を負に調節するＭａｒリプレッサー（ＭａｒＲ）をコードするｍａｒＲＡＢオペロン（コーエン（Ｃｏｈｅｎ）ら、１９９４、Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １７５：１４８４；マーチンおよびロスナー（Ｍａｒｔｉｎ ａｎｄ Ｒｏｓｎｅｒ）、１９９５、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９２：５４５６；ソアンおよびレビー（Ｓｅｏａｎｅ ａｎｄ Ｌｅｖｙ）、１９９５、Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １７７：５３０）、ＭａｒＲＡＢの発現を活性化して、染色体上のその他の遺伝子、すなわちｍａｒレギュロン（コーエン（Ｃｏｈｅｎ）ら、１９９４、Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １７５：１４８４；ガンビーノ（Ｇａｍｂｉｎｏ）ら、１９９３、Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １７５：２８８８；ソアンおよびレビー（Ｓｅｏａｎｅ ａｎｄ Ｌｅｖｙ）、１９９５、Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １７７：５３０）の発現を制御する活性化因子（ＭａｒＡ）、および機能が未知で推定の小ポリペプチド（ＭａｒＢ）を含む。ＭａｒＡは、転写活性化因子のＸｙｌＳ／ＡｒａＣファミリーメンバーである（ガレゴス（Ｇａｌｌｅｇｏｓ）ら、１９９３、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２１：８０７）。
【０００５】
先行技術は、ａｃｒＡＢ、ｆｕｍＣ、ｉｎａＡ、ｍａｒＡ、ｍａｒＢ、ｍａｒＲ、ｏｍｐＦ、ｏｍｐＸ、ｓｏｄＡ、ｔｏｌＣおよびｚｗｆを含むとしてｍａｒレギュロンを同定した。環境ストレスに対する細菌反応の制御におけるｍａｒ座の役割を考慮すると、ＭａｒＡによって調節されるその他の遺伝子が同定されれば、微生物の制御において大きい利益となるであろう。
【０００６】
概要
本発明は、ｍａｒＡの高い構成的レベルまたは過剰発現に反応する新たに同定された遺伝子によって環境ストレスシグナルに対する微生物の適応を制御することにおいて重要な進歩であり、このように本発明は、微生物細胞の環境ストレスにおける耐性および生存を介することにおいて重要である。さらに、本発明は、微生物のビルレンスを調節するために重要であるとしてＭａｒＡ制御下の遺伝子を同定する。したがって、本発明は、ストレスおよび／またはビルレンスに対する微生物の適応を調節する化合物を同定するためのスクリーニングアッセイ法において用いられる新規標的（遺伝子およびポリペプチド）を提供する。
【０００７】
一つの局面において、本発明は、以下の段階を含む、ＮＩＭＲポリペプチドを調節する化合物を同定する方法を提供する：
化合物とポリペプチドとを相互作用させる条件でＮＩＭＲポリペプチドと試験化合物とを接触させる段階；
ＮＩＭＲポリペプチドの活性を調節する試験化合物の能力を決定する段階；および
ＮＩＭＲポリペプチドの活性を調節する化合物を選択し、それによってＮＩＭＲポリペプチド活性を調節する化合物を同定する段階。
【０００８】
一つの態様において、ＮＩＭＲポリペプチドは、ｂ０３５７、ｂ０４４７、ｂ０８５３、ｂ１４４８、ｂ２５３０、ｂ２８８９、ｂ２９４８、ｂ３４６９、ｍｄａＢ、ｙａｄＧ、ｙａｄＨ、ｙｂｊＣ、ｙｆａＥ、ｙｇｇＪ、およびｙｈｂＷからなる群より選択される。
【０００９】
もう一つの態様において、ＮＩＭＲポリペプチド活性は、微生物の環境チャレンジに対する抵抗能を促進することを含む。もう一つの態様において、ＮＩＭＲポリペプチドは、ａｃｅＧ、ａｃｋＡ、ａｌｄＡ、ｃｏｂＵ、ｆａｂＢ、ｆｅｃＡ、ｇａｌＫ、ｇａｌＴ、ｇａｔＡ、ｇａｔＣ、ｇｌｐＤ、ｇｌｔＡ、ｇｓｈＢ、ｇｕａＢ、ｈｅｍＢ、ｍａｐ、ｍｇｌＢ、ｍｔｒ、ｎｄｈ、ｎｆｎＢ、ｐｆｌＢ、ｐｇｉ、ｐｕｒＡ、ｒｉｂＤ、ｒｉｍＫ、ｒｐｌＥ、ｓｒｌＡ＿２、ｔｎａＡ、ｔｎａＬ、ｔｐｘ、ａｃｎＡ、ｍｄａＡ、ｒｉｂＡ、およびｙｄｅＡからなる群より選択される。
【００１０】
もう一つの態様において、ＮＩＭＲポリペプチド活性は、微生物のビルレンスを促進することを含む。一つの態様において、ＮＩＭＲポリペプチドは、ａｃｅＧ、ａｃｋＡ、ａｌｄＡ、ｃｏｂＵ、ｆａｂＢ、ｆｅｃＡ、ｇａｌＫ、ｇａｌＴ、ｇａｔＡ、ｇａｔＣ、ｇｌｐＤ、ｇｌｔＡ、ｇｓｈＢ、ｇｕａＢ、ｈｅｍＢ、ｍａｐ、ｍｇｌＢ、ｍｔｒ、ｎｄｈ、ｎｆｎＢ、ｐｆｌＢ、ｐｇｉ、ｐｕｒＡ、ｒｉｂＤ、ｒｉｍＫ、ｒｐｌＥ、ｓｒｌＡ＿２、ｔｎａＡ、ｔｎａＬ、ｔｐｘ、ａｃｎＡ、ｍｄａＡ、ｒｉｂＡ、およびｙｄｅＡからなる群より選択される。
【００１１】
一つの態様において、決定する段階は、細胞からの試験化合物またはマーカー化合物の流出を測定する段階を含む。
【００１２】
一つの態様において、決定する段階は、環境チャレンジの存在下での微生物の増殖能または生存能を測定する段階を含む。
【００１３】
一つの態様において、ＮＩＭＲポリペプチドは微生物細胞に存在する。
【００１４】
もう一つの態様において、ＮＩＭＲポリペプチドはそれが存在する細胞に対して異種である。
【００１５】
もう一つの局面において、本発明は、以下の段階を含む、ＮＩＭＲポリペプチド活性を調節する化合物を同定する方法に関する：
化合物とポリペプチドとを相互作用させる条件でＮＩＭＲポリペプチドと試験化合物とを接触させる段階；
ＮＩＭＲポリペプチドの発現を調節する試験化合物の能力を決定する段階；および
ＮＩＭＲポリペプチドの発現を調節する化合物を選択し、それによってＮＩＭＲポリペプチド活性を調節する化合物を同定する段階。
【００１６】
一つの態様において、ＮＩＭＲポリペプチドは、ｂ０３５７、ｂ０４４７、ｂ０８５３、ｂ１４４８、ｂ２５３０、ｂ２８８９、ｂ２９４８、ｂ３４６９、ｍｄａＢ、ｙａｄＧ、ｙａｄＨ、ｙｂｊＣ、ｙｆａＥ、ｙｇｇＪ、およびｙｈｂＷからなる群より選択される。
【００１７】
もう一つの態様において、ＮＩＭＲポリペプチドは、ａｃｅＧ、ａｃｋＡ、ａｌｄＡ、ｃｏｂＵ、ｆａｂＢ、ｆｅｃＡ、ｇａｌＫ、ｇａｌＴ、ｇａｔＡ、ｇａｔＣ、ｇｌｐＤ、ｇｌｔＡ、ｇｓｈＢ、ｇｕａＢ、ｈｅｍＢ、ｍａｐ、ｍｇｌＢ、ｍｔｒ、ｎｄｈ、ｎｆｎＢ、ｐｆｌＢ、ｐｇｉ、ｐｕｒＡ、ｒｉｂＤ、ｒｉｍＫ、ｒｐｌＥ、ｓｒｌＡ＿２、ｔｎａＡ、ｔｎａＬ、ｔｐｘ、ａｃｎＡ、ｍｄａＡ、ｒｉｂＡ、およびｙｄｅＡからなる群より選択される。
【００１８】
一つの態様において、測定する段階は、細胞によって産生されたＲＮＡの量を測定する段階を含む。
【００１９】
一つの態様において、測定する段階は、細胞によって産生されたレポーター遺伝子産物の量または活性を測定する段階を含む。もう一つの態様において、測定する段階は、レポーター遺伝子に対する抗体の結合能を検出する段階を含む。
【００２０】
一つの態様において、ＮＩＭＲポリペプチドは細胞不含系に存在する。
【００２１】
一つの態様において、決定する段階は、ＮＩＭＲポリペプチドに対する化合物の結合能を測定する段階を含む。
【００２２】
一つの局面において、本発明は、微生物を環境チャレンジに、およびＮＩＭＲポリペプチドの活性を調節する物質に曝露する段階を含む、微生物のビルレンスを減少させる方法に関する。
【００２３】
もう一つの局面において、本発明は、微生物を環境チャレンジに、およびＮＩＭＲポリペプチドの活性を調節する物質に曝露する段階を含む、ＮＩＭＲ遺伝子のｍａｒＡ媒介転写を減少させる方法に関する。
【００２４】
もう一つの局面において、本発明は、以下の段階を含む、微生物におけるＮＩＭＲポリペプチドの活性を調節する化合物を同定する方法に関する：化合物と核酸分子とを相互作用させる条件で、単離されたＮＩＭＲ核酸分子と試験化合物とを接触させる段階；単離されたＮＩＭＲ核酸分子に結合する試験化合物の能力を決定する段階；およびＮＩＭＲ核酸分子に結合する化合物を選択して、それによってＮＩＭＲポリペプチド活性を調節する化合物を同定する段階。
【００２５】
一つの態様において、ＮＩＭＲポリペプチドは、ｂ０３５７、ｂ０４４７、ｂ０８５３、ｂ１４４８、ｂ２５３０、ｂ２８８９、ｂ２９４８、ｂ３４６９、ｍｄａＢ、ｙａｄＧ、ｙａｄＨ、ｙｂｊＣ、ｙｆａＥ、ｙｇｇＪ、およびｙｈｂＷからなる群より選択される。
【００２６】
一つの態様において、ＮＩＭＲポリペプチド活性は、環境チャレンジに対する微生物の抵抗能を促進することを含む。
【００２７】
一つの態様において、ＮＩＭＲポリペプチドは、ａｃｅＧ、ａｃｋＡ、ａｌｄＡ、ｃｏｂＵ、ｆａｂＢ、ｆｅｃＡ、ｇａｌＫ、ｇａｌＴ、ｇａｔＡ、ｇａｔＣ、ｇｌｐＤ、ｇｌｔＡ、ｇｓｈＢ、ｇｕａＢ、ｈｅｍＢ、ｍａｐ、ｍｇｌＢ、ｍｔｒ、ｎｄｈ、ｎｆｎＢ、ｐｆｌＢ、ｐｇｉ、ｐｕｒＡ、ｒｉｂＤ、ｒｉｍＫ、ｒｐｌＥ、ｓｒｌＡ＿２、ｔｎａＡ、ｔｎａＬ、ｔｐｘ、ａｃｎＡ、ｍｄａＡ、ｒｉｂＡ、およびｙｄｅＡからなる群より選択される。
【００２８】
もう一つの態様において、ＮＩＭＲポリペプチド活性は、微生物のビルレンスを促進することを含む。
【００２９】
さらにもう一つの態様において、ＮＩＭＲポリペプチドは、ａｃｅＧ、ａｃｋＡ、ａｌｄＡ、ｃｏｂＵ、ｆａｂＢ、ｆｅｃＡ、ｇａｌＫ、ｇａｌＴ、ｇａｔＡ、ｇａｔＣ、ｇｌｐＤ、ｇｌｔＡ、ｇｓｈＢ、ｇｕａＢ、ｈｅｍＢ、ｍａｐ、ｍｇｌＢ、ｍｔｒ、ｎｄｈ、ｎｆｎＢ、ｐｆｌＢ、ｐｇｉ、ｐｕｒＡ、ｒｉｂＤ、ｒｉｍＫ、ｒｐｌＥ、ｓｒｌＡ＿２、ｔｎａＡ、ｔｎａＬ、ｔｐｘ、ａｃｎＡ、ｍｄａＡ、ｒｉｂＡ、およびｙｄｅＡからなる群より選択される。
【００３０】
一つの態様において、環境チャレンジは抗生物質化合物である。
【００３１】
もう一つの態様において、環境チャレンジは非抗生物質化合物である。
【００３２】
さらにもう一つの態様において、非抗生物質化合物は、候補消毒剤または候補防腐剤化合物である。
【００３３】
さらにもう一つの局面において、本発明は、ＮＩＭＲ核酸分子またはＮＩＭＲポリペプチドと薬学的に許容される担体とを含むワクチンに関する。
【００３４】
もう一つの局面において、本発明は、ＮＩＭＲポリペプチドの活性を調節する化合物と抗生物質とを含む組成物に関する。
【００３５】
なおもう一つの局面において、本発明は、ＮＩＭＲポリペプチドの活性を調節する化合物と非抗生物質化合物とを含む組成物に関する。
【００３６】
なおもう一つの局面において、本発明は、微生物のビルレンスが減少するように、被験者にＮＩＭＲ調節物質を投与することを含む、微生物感染症を有する被験者における微生物のビルレンスを減少させる方法に関する。
【００３７】
もう一つの局面において、本発明は、感染症が治療されるように被験者にＮＩＭＲ調節物質を投与する段階を含む、被験者における微生物感染症を治療する方法に関する。
【００３８】
もう一つの局面において、本発明は、微生物の感染性が減少するように、ＮＩＭＲ調節物質を微生物に接触させる段階を含む、表面上で微生物の感染性を減少させる方法に関する。
【００３９】
一つの態様において、微生物はグラム陽性細菌である。もう一つの態様において、微生物はグラム陰性細菌である。なおもう一つの態様において、微生物は抗酸菌である。
【００４０】
詳細な説明
ｍａｒレギュロンは、多剤耐性に関係すると既に同定されたが、本発明は、これまでに当技術分野で教示または示唆されたより多様な機能を有するより多くの遺伝子が、ｍａｒＡの直接または間接的な制御下であることを証明する。本発明は、ｍａｒＡの高い構成的発現または過剰発現に反応する新たに同定された遺伝子、本明細書において「新しく同定されたｍａｒＡ反応性（ＮＩＭＲ）遺伝子」と呼ばれる遺伝子による微生物のストレスに対する適応性および／またはビルレンスの制御において重要な進歩である。これらの遺伝子を同定することによって、環境ストレスに対する微生物反応を調節し、それによってその環境に対する微生物の適応および／または微生物のビルレンスを調節する化合物を同定するスクリーニングアッセイ法において用いられる新規標的、すなわち核酸およびポリペプチド標的が提供される。そのようなスクリーニングアッセイ法において同定された化合物は、例えば、抗生物質の活性を改善するため、非抗生物質（例えば消毒剤）の活性を改善するため、およびＮＩＭＲ遺伝子のＭａｒＡによる発現を防止するために用いることができる。
【００４１】
本発明についてさらに説明する前に、明細書、実施例、および添付の請求の範囲において用いられる特定の用語を便宜上、ここに集める。
【００４２】
Ｉ．定義
本明細書において用いられるように、「新たに同定されたＭａｒ反応性遺伝子（ＮＩＭＲ遺伝子）」という用語には、ＭａｒＡの高い構成的発現または過剰発現に反応するとして新たに同定された遺伝子が含まれる。好ましくは、これらの遺伝子の転写は、それらをｍａｒレギュロンに配置するＭａｒＡによって直接調節される。本明細書において用いられるように、「レギュロン」という用語には、その発現が共通の抑制因子または活性化因子タンパク質によって調節される二つまたはそれ以上の異なるオペロンにおける二つまたはそれ以上の座が含まれる。新たに同定されたｍａｒ反応性遺伝子は、その発現がＭａｒＡによって制御されるが、本発明の以前ではこの転写活性化因子の制御下であると同定されておらず、ｍａｒレギュロンの一部であることがこれまで同定されていなかった遺伝子である。ＮＩＭＲ遺伝子は、ＭａｒＡによって正または負に調節されることができ、ＭａｒＡに対して直接反応しうるか、またはＭａｒＡに対して間接的に、例えば、ＭａｒＡに対して直接反応するもう一つのタンパク質（例えば、転写調節因子）に反応しうる。
【００４３】
ＮＩＭＲ遺伝子には、「先行技術のｍａｒレギュロン」の一部であると同定された遺伝子が含まれない。本明細書において用いられるように、「先行技術のｍａｒレギュロン」という用語には、ａｃｒＡＢ、ｆｕｍＣ、ｉｎａＡ、ｍａｒＡ、ｍａｒＢ、ｍａｒＲ、ｏｍｐＦ、ｏｍｐＸ、ｓｏｄＡ、ｔｏｌＣ、およびｚｗｆが含まれる。好ましくは、ＮＩＭＲ遺伝子には、細菌におけるストレス反応にこれまで関連していなかった遺伝子が含まれる。例えば、好ましいＮＩＭＲ遺伝子は、これまでｓｏｘＲＳレギュロン（ａｃｎＡ、ａｃｒＡＢ、ｆｕｍＣ、ｉｎａＡ、ｍｄａＡ、ｏｍｐＦ、ｒｉｂＡ、ｓｏｄＡ、およびｚｗｆ遺伝子を含む）の一部であると同定されていない。特に好ましいＮＩＭＲ遺伝子は、本発明においてｍａｒレギュロンにそれらを配置する前までは既知の機能を有していなかった。例示的なＮＩＭＲ遺伝子を下記の表１に記載する。
【００４４】
【表１】
2004503212.tif 000002
大腸菌Ｋ−１２ゲノムプロジェクトからのアクセッション番号（国立バイオテクノロジーセンターＥｎｔｒｅｚデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／））を、各遺伝子の後の括弧内に示す。これらの例示的なＮＩＭＲ遺伝子の配列はゲンバンクで入手可能であり、明細書の配列表部分に示される。＊はＭａｒＡの過剰発現によって下方制御される遺伝子を示す。
【００４５】
本明細書において用いられるように、「ＮＩＭＲ遺伝子」という用語にはまた、上記のＮＩＭＲ遺伝子とのヌクレオチド配列類似性を有するＮＩＭＲ遺伝子が含まれる。例えば、そのような遺伝子は、他の生物に由来していてもよい。例えば、大腸菌の染色体において初めて記載された多抗生物質耐性（ｍａｒ）座もまた、他の属の腸内細菌に存在する（コーエン、ヤンおよびレビー（Ｃｏｈｅｎ， Ｓ．Ｐ．， Ｙａｎ， Ｗ． ａｎｄ Ｌｅｖｙ， Ｓ．Ｂ．）（１９９３）、Ｊ． Ｉｎｆｅｃｔ． Ｄｉｓ． １６８、４８４〜４８８）。この座の分子的特徴付けは、大腸菌（コーエン、ハクラーおよびレビー（Ｃｏｈｅｎ， Ｓ．Ｐ．， Ｈａｃｈｌｅｒ， Ｈ． ａｎｄ Ｌｅｖｙ， Ｓ．Ｂ．）（１９９３）、Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １７５、１４８４〜１４９２）、ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）（スラビック、デイザーおよびミラー（Ｓｕｌａｖｉｃｋ， Ｍ．Ｃ．， Ｄａｚｅｒ， Ｍ． ａｎｄ Ｍｉｌｌｅｒ， Ｐ．Ｆ．）（１９９７）、Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １７９、１８５７〜１８６６）およびごく最近フレクスナー赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｆｌｅｘｎｅｒｉ）において行われている。
【００４６】
ＮＩＭＲ遺伝子配列は、上記の表に記載したＮＩＭＲ遺伝子の一つまたはそれ以上に「構造的に関連している」。この構造的関連性は、二つのＮＩＭＲヌクレオチド配列または２つのＮＩＭＲポリペプチドのアミノ酸配列間の配列類似性によって証明することができる。本明細書において用いられるように、「ＮＩＭＲポリペプチド」という用語には、ＮＩＭＲ遺伝子によって明記されたポリペプチドが含まれる。ＮＩＭＲポリペプチドはＮＩＭＲ活性を有し、例えば環境ストレスに対する微生物の適応および／または微生物のビルレンスを調節する。
【００４７】
本明細書において用いられるように、ＮＩＭＲポリペプチドに関する「活性」という用語には、環境ストレスに対する微生物の適応能の調節および／またはビルレンスの調節が含まれる。さらに、ＮＩＭＲポリペプチドは、さらなる活性を有する可能性がある。本明細書において用いられるように、微生物の曝露に関連する「環境ストレス」または「環境チャレンジ」という用語には、微生物と接触すると、微生物においてストレス反応を誘発する物質が含まれる。そのような物質は、個々の感受性のある微生物細胞における増殖、生存率、および／またはビルレンスを減少させてもよいが、例えば、ストレスシグナルによって影響を受ける標的分子に突然変異を有する微生物に関する選択物質として作用することによって、他の微生物細胞が環境シグナルに適合するための刺激としての役割を有する。このように、環境ストレスに対処する能力が備わっている（例えば、ストレスシグナルによって生じる環境条件変化に反応して増殖させる表現型を有する）微生物において、細胞は適応する（例えば、環境ストレスシグナルに曝露した場合にそのビルレンスおよび／または増殖能および生存能を保持する）。「環境ストレス」または「環境チャレンジ」とは、微生物と接触することになる物質、または微生物が曝露され、微生物の生存にとってチャレンジとなる条件を意味する。微生物は、哺乳類の体内（その表面を含む）または体外でそのような環境ストレスシグナルと接触しうる。例えば、微生物（例えば、病原性微生物）は、生体内で環境チャレンジと接触し、または生体外の微生物（例えば、病原性微生物もしくは表面に存在する環境的に重要な微生物）は、生体外の環境チャレンジと接触して、環境ストレスを形成しうる。
【００４８】
一つの態様において、環境ストレスまたはチャレンジはヒトの介入、例えばヒトによってもたらされた薬物（非抗生物質または抗生物質のような）に対する微生物の曝露によって生じる。例えば、そのような物質には、抗生物質または非抗生物質化合物が含まれる。
【００４９】
もう一つの態様において、環境ストレスまたはチャレンジとは、自然の過程の結果であり、例えば、抗体のような天然の抗感染防御に対する微生物の曝露；温度上昇に対する微生物の曝露（例えば感染時）、または補因子もしくはビタミンを欠損する環境への微生物の曝露をもたらす、例えば感染の自然経過の結果である。
【００５０】
本明細書において用いられるように、「ビルレンス」という用語には、生物の病原性の程度が含まれる。ビルレンスという用語は生物の二つの特徴を含む：その感染性（宿主への定着能）および生じる疾患の重症度。本明細書において用いられるように、「生存率」という用語には、細胞増殖能が含まれる。生存細胞は、例えば能動的に複製しなくともよく、例えば、休止状態であってもよいが、増殖条件がより好ましい場合には増殖能を保持する。本明細書において用いられるように、「増殖」という用語には、複製能、すなわち細胞分裂または増殖による複製能が含まれる。
【００５１】
ＮＩＭＲポリペプチドは、ＭａｒＡによって調節されることが同定される前に、例えば下記の表２に記載するように一つまたはそれ以上の他の機能を有することがこれまでに判明していてもよい。
【００５２】
【表２】
2004503212.tif 000003
【００５３】
他のＮＩＭＲ分子を単離または同定する場合、例えば下記により詳細に説明するようにアライメントを行うことによって、配列類似性を示すことができる。
【００５４】
好ましくは、ＮＩＭＲポリペプチドは、上記の表に記載するＮＩＭＲ遺伝子によってコードされるポリペプチドと何らかのアミノ酸配列同一性を有する。上記の表に記載する例示的なＮＩＭＲ遺伝子の核酸配列およびそれらがコードするポリペプチドは、当技術分野で入手可能である。例えば、表１に記載する例示的なＮＩＭＲ遺伝子の核酸およびアミノ酸配列は、ＮＣＢＩ Ｅｎｔｒｅｚサイト（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）で表１に記載のアクセッション番号を用いて発見することができる。これらの配列もまた別紙Ａに示す。
【００５５】
本明細書において用いられるように、「核酸分子」という用語には、非改変ＲＮＡもしくはＤＮＡ、または改変ＲＮＡもしくはＤＮＡであってもよいポリリボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌクレオチドが含まれる。そのため、「核酸分子」には、一本鎖ＤＮＡおよび二本鎖ＤＮＡ、一本鎖領域と二本鎖領域との、もしくは一本鎖領域、二本鎖領域、および三本鎖領域の混合物であるＤＮＡ、一本鎖ＲＮＡおよび二本鎖ＲＮＡ、ならびに一本鎖領域と二本鎖領域との混合物であるＲＮＡ、一本鎖領域、より典型的には二本鎖領域、もしくは三本鎖領域であってもよい、または一本鎖と二本鎖領域の混合物であってもよいＤＮＡとＲＮＡとを含むハイブリッド分子が含まれるがこれらに限定されない。さらに、本明細書において用いられるように「核酸分子」という用語は、ＲＮＡもしくはＤＮＡ、またはＲＮＡとＤＮＡとの双方を含む三本鎖領域を意味する。そのような領域における鎖は、同じ分子に由来していてもよく、または異なる分子に由来していてもよい。領域には、一つまたはそれ以上の分子の全てが含まれていてもよいが、より典型的には分子のいくつかの領域のみを含んでいてもよい。本明細書において用いられるように、「核酸分子」という用語にはまた、一つまたはそれ以上の改変塩基を含む上記のＤＮＡまたはＲＮＡが含まれる。このように、安定性またはその他の理由のために改変された骨格を有するＤＮＡまたはＲＮＡは、本明細書において意図される「核酸分子」である。その上、単に二例を挙げれば、イノシンのような珍しい塩基またはトリチル化塩基のような改変塩基を含むＤＮＡまたはＲＮＡも、本明細書において用いられる核酸分子である。ＤＮＡおよびＲＮＡには、当業者に既知の多くの有用な目的にかなう多様な改変を行ってもよいと認識される。本明細書において用いられるように「核酸分子」という用語には、核酸分子のそのような化学的手段による、酵素による、または代謝による改変型と共に、例えば単純および複雑な細胞を含むウイルスおよび細胞に特徴的なＤＮＡおよびＲＮＡの化学型を含む。「核酸分子」という用語はまた、オリゴヌクレオチドとしばしば呼ばれる短い核酸分子を含む。
【００５６】
好ましいＮＩＭＲ核酸分子は単離される。「単離された」核酸分子は、核酸の天然起源に存在する他の核酸分子とは分離されている核酸分子である。例えば、ゲノムＤＮＡ（例えば染色体またはエピソーム）に関して、「単離された」という用語には、ＤＮＡが本来会合している隣接ＤＮＡ配列から分離されている核酸分子が含まれる。好ましくは、「単離された」核酸分子は、核酸分子が由来する生物のＤＮＡ（例えば染色体またはエピソーム）において、核酸分子に本来隣接している配列（すなわち核酸分子の５’および３’末端に存在する配列）を含まない。そのため、単離されたＤＮＡは、その本来の状態ではない（下記により詳細に説明するように、その配列はその天然型から変化していない（例えば突然変異していない）という意味において自然界に存在するが）。例えば、様々な態様において、単離されたＮＩＭＲ核酸分子は、核酸が由来する細胞のＤＮＡにおいて核酸分子に本来隣接する約５ｋｂ、４ｋｂ、３ｋｂ、２ｋｂ、１ｋｂ、０．５ ｋｂ、０．１ ｋｂまたは０．０５ ｋｂ未満のヌクレオチド配列を含みうる。その上、ｃＤＮＡ分子のような「単離された」核酸分子は、組換え技法によって産生される場合、他の細胞材料もしくは培養培地を実質的に含まず、または化学合成される場合には、化学前駆体もしくは他の化学物質を実質的に含まない。しかし、「単離された」ＮＩＭＲ核酸分子は、ゲノムＤＮＡにおいてＮＩＭＲ配列に通常隣接しない他のヌクレオチド配列に結合してもよい（例えば、ＮＩＭＲヌクレオチド配列はベクター配列に結合していてもよい）。特定の好ましい態様において、ｃＤＮＡ分子のような「単離された」核酸分子はまた、他の細胞材料を含まなくてもよい。しかし、ＮＩＭＲ核酸分子は、「単離された」と見なされるために、他の細胞材料を含まない状態である必要はない（例えば、他の染色体ＤＮＡから分離されたＮＩＭＲ遺伝子分子は、別の細菌細胞に挿入されたＮＩＭＲ ＤＮＡ分子もなお「単離された」と見なされるであろう）。
【００５７】
本明細書において用いられるように、「ポリペプチド」とは、ペプチド結合または改変ペプチド結合によって互いに結合した二つまたはそれ以上のアミノ酸を含む如何なるペプチドまたはタンパク質も意味する。「ポリペプチド」は、普通、ペプチド、オリゴペプチド、およびオリゴマーと呼ばれる短い鎖と、一般的にタンパク質と呼ばれるより長い鎖の双方を意味する。ポリペプチドは、２０個の遺伝子コードアミノ酸以外のアミノ酸を含んでいてもよい。「ポリペプチド」には、プロセシングおよびその他の翻訳後改変のような自然の過程によって改変されたものと、化学改変技術によって改変されたものとが含まれる。そのような改変は基礎テキストおよびより詳細な研究書に十分に記載されていると共に、多量の研究文献に記載され、それらは当業者に周知である。同じ種類の改変が、所定のポリペプチドにおけるいくつかの部位で同じ程度または多様な程度で存在する可能性が認識される。同様に、所定のポリペプチドは多くの種類の改変を含んでいてもよい。改変は、ペプチド骨格、アミノ酸側鎖、およびアミノまたはカルボキシル末端を含む、ポリペプチドのいずれにも起こりうる。改変には、例えば、アセチル化、アシル化、ＡＤＰ−リボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質または脂質誘導体の共有結合、ホスファチジルイノシトールの共有結合、クロスリンク、環状化、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、共有結合クロスリンクの形成、システインの形成、ピログルタメートの形成、ホルミル化、γカルボキシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨウ化、メチル化、ミリストイル化、酸化、タンパク質分解プロセシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、グリコシル化、脂質結合、硫酸化、グルタミン酸残基のγカルボキシル化、ヒドロキシル化およびＡＤＰリボシル化、セレノイル化、硫酸化、アルギニル化のような、トランスファーＲＮＡによるタンパク質へのアミノ酸付加、ならびにユビキチン化が含まれる。例えば、「タンパク質−構造と分子特性（Ｐｒｏｔｅｉｎｓ−Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ Ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ）」、第二版、クレイトン（Ｔ．Ｅ． Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ）編、Ｗ．Ｈ．フリーマン＆カンパニー、ニューヨーク（１９９３）、およびウォルド（Ｗｏｌｄ， Ｆ．）、「翻訳後タンパク質改変：展望と期待（Ｐｏｓｔｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ：Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ）」、１〜１２頁、「タンパク質の翻訳後共有結合改変（Ｐｏｓｔｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｖａｌｅｎｔ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ）」、ジョンソン（Ｂ．Ｃ． Ｊｏｈｎｓｏｎ）編、アカデミック出版、ニューヨーク（１９８３）；セイフター（Ｓｅｉｆｔｅｒ）ら、Ｍｅｔｈ． Ｅｎｚｙｍｏｌ． １８２：６２６〜６４６（１９９０）、およびラッタン（Ｒａｔｔａｎ）ら、「タンパク質合成：翻訳後改変と老化（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ｐｏｓｔｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ ａｎｄ Ａｇｉｎｇ）」、Ａｎｎ． Ｎ．Ｙ�� Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ６６３：４８〜６２（１９９２）を参照のこと。ポリペプチドは、分岐であっても、分岐を有するまたは有しない環状であってもよい。環状、分岐、および分岐環状ポリペプチドは、翻訳後の自然の過程から生じるのであっても、同様に完全に合成法によって作製するのであってもよい。
【００５８】
本明細書において用いられるように、「単離されたポリペプチド」または「単離されたタンパク質」とは、細胞から単離される場合もしくは組換えＤＮＡ技術によって産生される場合に、他のポリペプチド、タンパク質、細胞材料および培養培地を実質的に含まない、または化学合成される場合には化学前駆体もしくは他の化学物質を実質的に含まないポリペプチドまたはタンパク質を意味する。「単離された」または「精製された」ポリペプチドまたはその生物活性断片は、ＮＩＭＲポリペプチドが由来する細胞もしくは組織起源からの細胞材料もしくはその他の混入ポリペプチドを実質的に含まない、または化学合成される場合には、化学前駆体もしくはその他の化学物質を実質的に含まない。「細胞材料を実質的に含まない」という用語には、ポリペプチドを単離するまたはポリペプチドを組換え的に産生する細胞の細胞成分からはポリペプチドが分離しているＮＩＭＲポリペプチド調製物が含まれる。一つの態様において、「細胞材料を実質的に含まない」という用語には、非ＮＩＭＲポリペプチド（本明細書において「混入ポリペプチド」とも呼ばれる）を約３０％未満（乾燥重量で）、より好ましくは非ＮＩＭＲポリペプチドを約２０％未満、さらにより好ましくは非ＮＩＭＲポリペプチドを約１０％未満、および最も好ましくは非ＮＩＭＲポリペプチドを約５％未満有するＮＩＭＲポリペプチドの調製物が含まれる。ＮＩＭＲポリペプチドまたはその生物活性部分が組換え的に産生される場合、同様に培養培地を好ましくは実質的に含まない、すなわち培養培地はポリペプチド調製物の容積の約２０％未満、より好ましくは約１０％未満、および最も好ましくは約５％未満である。
【００５９】
「化学前駆体またはその他の化学物質を実質的に含まない」という用語には、ポリペプチドの合成に関係する化学前駆体または他の化学物質からはポリペプチドが分離しているＮＩＭＲポリペプチド調製物が含まれる。一つの態様において、「化学前駆体またはその他の化学物質を実質的に含まない」という用語には、化学前駆体または非ＮＩＭＲ化学物質を約３０％未満（乾燥重量で）有する、より好ましくは化学前駆体または非ＮＩＭＲ化学物質を約２０％未満有する、さらにより好ましくは化学前駆体または非ＮＩＭＲ化学物質を約１０％未満有する、および最も好ましくは化学前駆体または非ＮＩＭＲ化学物質を約５％未満有する、ＮＩＭＲポリペプチドの調製物が含まれる。
【００６０】
好ましいＮＩＭＲ核酸分子およびポリペプチドは、「自然界に存在する」。本明細書において用いられるように、「自然界に存在する」分子は、自然界に存在するヌクレオチド配列を有するＮＩＭＲ分子を意味する（例えば、天然のＮＩＭＲポリペプチドをコードする）。さらに、同じ機能的活性、例えば微生物においてストレスに対する適応および／またはビルレンスを調節する能力を保持するこれらのポリペプチドおよび核酸分子の自然界に存在する変異型または自然界に存在しない変異型も意味する。そのような変異型は、例えば、当技術分野で既知の技術を用いて突然変異によって調製することができる。または、変異型は化学合成することができる。
【００６１】
本明細書において用いられるように、「変異型（ｖａｒｉａｎｔ）」という用語には、参照核酸分子またはポリペプチドとは配列が異なるがその本質的特性を保持している核酸分子またはポリペプチドが含まれる。変異型のヌクレオチド配列の変化は、参照核酸分子によってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列を変化させても、変化させなくてもよい。ヌクレオチドの変化によって、下記に考察するように、参照配列によってコードされるポリペプチドにおいてアミノ酸の置換、付加、欠失、融合および切断が起こっていてもよい。ポリペプチドの典型的な変異型はもう一つのポリペプチドである参照ポリペプチドとはアミノ酸配列が異なる。一般的に、参照ポリペプチドおよび変異型の配列は全体的には密接に類似であって、多くの領域で同一となるように、差異は制限される。変異型および参照ポリペプチドは、一つまたはそれ以上の置換、付加、および／または欠失によってアミノ酸配列が如何なる組み合わせで異なっていてもよい。核酸分子またはポリペプチドの変異型は、対立遺伝子変異型のように自然界に存在してもよく、または自然界に存在することが知られていない変異型であってもよい。核酸分子およびポリペプチドの自然界に存在しない変異型は、当業者に周知の突然変異誘発技術、直接合成、およびその他の組換え方法によって作製してもよい。
【００６２】
例えば、本明細書に記載のＮＩＭＲポリペプチドには、その同等物が含まれることをまた意味するとも理解される。そのような変異型は、例えば、当技術分野で既知の技術を用い、突然変異によって作製することができる。または、変異型は化学合成することができる。例えば、機能的に同等であるＮＩＭＲポリペプチドの変異体型（例えば、ＤＮＡとの結合能およびオペロンからの転写の調節能を有する）は、当技術分野で周知の技術を用いて作製することができる。突然変異には、例えば置換を生じうる不連続な少なくとも一つの点突然変異、または少なくとも一つの欠失もしくは挿入が含まれうる。例えば、ランダム突然変異誘発を用いることができる。突然変異は、ランダム突然変異誘発またはカセット突然変異誘発を用いて作製することもできる。前者の場合、ある分子の完全なコード領域をいくつかの方法の一つによって突然変異誘発し（化学物質、ＰＣＲ、濃厚液で処理したオリゴヌクレオチド合成）、ランダムに突然変異誘発した分子の集合体に選択またはスクリーニング技法を行う。後者の場合、明確な構造または機能決定因子のいずれかに対応するポリペプチドの不連続な領域に、飽和または半ランダム突然変異誘発を行い、そうでなくともこれらの突然変異誘発したカセットを野生型の対立遺伝子に再導入する。一つの態様において、ＰＣＲ突然変異誘発を用いることができる。例えば、メガプライマーＰＣＲを用いることができる（ランド（Ｏ．Ｈ． Ｌａｎｄｔ）、１９９０、Ｇｅｎｅ ９６：１２５〜１２８）。
【００６３】
特定の態様において、そのような変異型は、自然界に存在するＮＩＭＲポリペプチドと少なくとも約２５、３０、３５、４０、４５、５０、もしくは６０％またはそれ以上のアミノ酸同一性を有する。好ましい態様において、そのような変異型は、自然界に存在するＮＩＭＲポリペプチドと少なくとも約７０％のアミノ酸同一性を有する。より好ましい態様において、そのような変異型は、自然界に存在するＮＩＭＲポリペプチドと少なくとも約８０％のアミノ酸同一性を有する。特に好ましい態様において、そのような変異型は、自然界に存在するＮＩＭＲポリペプチドと少なくとも約９０％のアミノ酸同一性、および好ましくは少なくとも約９５％のアミノ酸同一性を有する。
【００６４】
さらに他の態様において、ＮＩＭＲポリペプチドの変異型をコードする核酸分子は、自然界に存在するＮＩＭＲポリペプチドをコードする核酸分子とストリンジェントな条件でハイブリダイズすることができる。
【００６５】
好ましいＮＩＭＲ核酸分子およびＮＩＭＲポリペプチドは、「自然界に存在する」。本明細書において用いられるように、「自然界に存在する」分子とは、自然界に存在するヌクレオチド配列によってコードされるＮＩＭＲポリペプチドを意味する（例えば、天然のＮＩＭＲポリペプチドをコードする）。そのような分子は、例えば本明細書に記載するＮＩＭＲ分子とのその配列類似性に基づいて、他の微生物から得ることができる。
【００６６】
さらに、同じ機能的活性を保持する、例えば環境ストレスに対して微生物反応を調節する能力、それによって微生物のストレスに対する適応および／または微生物ビルレンスを調節する能力を保持するこれらのポリペプチドおよび核酸分子の自然界に存在する変異型、または自然界に存在しない変異型も、本発明の範囲に含まれる。そのような変異型は、例えば、当技術分野で既知の技術を用いて突然変異によって作製することができる。または、変異型は化学合成することができる。
【００６７】
本明細書において用いられるように、「異種ＤＮＡ」または「異種核酸」には、それが存在する細胞に（ゲノムの一部として）本来存在しないか、それが本来存在するゲノムとは異なるゲノムのある一つの位置もしくは複数の位置に認められるＤＮＡ、または自然界では通常結合していないＤＮＡに機能的に結合している（すなわち、異種プロモーターに機能的に結合している遺伝子）ＤＮＡが含まれる。異種ＤＮＡは、１）特定の位置（例えば、ゲノムにおける特定の位置）に本来存在しない、または２）それが導入される細胞にとって内因性ではないが、別の細胞から得られる。異種ＤＮＡは、同じ種または異なる種に由来しうる。当業者が、発現される細胞において異種または異物として認識または見なすであろう如何なるＤＮＡも、本明細書において異種ＤＮＡという用語に含まれる。
【００６８】
「異種タンパク質」、「組換えタンパク質」、および「外因性タンパク質」という用語は、明細書を通して互換的に用いられ、一般的に、ポリペプチドをコードするＤＮＡが適した発現ベクターに挿入されて、それを用いて異種タンパク質を産生するように宿主細胞を形質転換する、組換えＤＮＡ技術によって産生されたポリペプチドを意味する。すなわち、ポリペプチドは、異種核酸分子から発現される。
【００６９】
「相互作用する」という用語には、例えば相互作用に関係する分子の少なくとも一つの立体構造および／または活性に対して測定可能な作用が起こる、分子間の密な接触が含まれる。例えば、第一の分子は、それに対して第二の分子が通常結合する標的（例えば、ＤＮＡまたはポリペプチド標的）に対する第二の分子の結合を阻害する場合に、または例えば、その活性を媒介する第二の分子のドメインとの立体的相互作用によって、第二の分子の活性を変化させる場合に、第二の分子と相互作用すると言うことができる。例えば、化合物はＮＩＭＲポリペプチドと相互作用して（例えば、結合によって）ＮＩＭＲポリペプチドの活性を変化させることができ、またはＮＩＭＲ核酸分子と相互作用して（例えば、結合によって）その核酸分子からのＮＩＭＲポリペプチドの転写を変化させることができる。
【００７０】
本明細書において用いられるように、「ＮＩＭＲ結合ポリペプチド」という用語には、細胞において生理的条件で、ＮＩＭＲ核酸分子またはＮＩＭＲポリペプチドと正常に相互作用し、ＮＩＭＲ核酸分子の転写またはＮＩＭＲポリペプチドの活性を変化させるポリペプチドが含まれる。
【００７１】
本明細書において用いられるように、「薬物」という用語には、抗生物質および非抗生物質が含まれる。「薬物」という用語には、静菌または殺菌作用を有する抗感染化合物、例えば微生物の増殖および／または生存を阻害する抗菌化合物が含まれる。好ましい抗感染化合物は、抗生物質に対する微生物の感受性を増加させるか、または微生物の感染性もしくはビルレンスを減少させる。「薬物」という用語には、消毒剤のような抗菌剤、防腐剤、および表面輸送化合物が含まれる。例えば、抗生物質、または酸化的ストレスを誘導する物質を含む他の種類の抗菌化合物、および有機溶媒がこの用語に含まれる。「薬物」という用語には殺虫剤も含まれる。「殺虫剤」という用語は当技術分野で認識され、標的特異的であることが知られている薬物（例えば、トリクロサン）のみならず、「非特異的に」殺すと考えられる物質、またはその作用機序が不明である広範囲の物質が含まれる。殺虫剤の例には、パラベン、クロルブタノール、フェノール、エチレンオキサイドおよびホルムアルデヒドのようなアルキル化剤、ハロゲン化物、水銀化合物、ならびにその他の重金属、洗浄剤、酸、アルカリ、およびクロルヘキシジンが含まれる。その他の殺虫剤には、パイン油、塩化アルキルジメチルベンジルアンモニウムのような４級アミン化合物、クロロキシロール、クロルヘキシジン、シクロヘキシジン、トリクロカーボン、および消毒剤が含まれる。「殺菌」という用語は、細菌を殺すことができる物質を意味し、「静菌」とは細菌の増殖を阻害する物質を意味する。
【００７２】
「抗生物質」という用語は当技術分野で認識され、これには、自然界の生物によって合成された抗菌物質、この天然起源から単離された抗菌物質、および化学合成された薬物が含まれる。この用語には、モネンシンおよびニゲリシンのようなポリエーテルイオノフォア；エリスロマイシンおよびタイロシンのようなマクロライド系抗生物質；ストレプトマイシンおよびカナマイシンのようなアミノグリコシド系抗生物質；ペニシリンおよびセファロスポリンのようなβラクタム系抗生物質（βラクタム環を有する）；ならびにスブチリシンおよびネオスポリンのようなポリペプチド系抗生物質が含まれるがこれらに限定されない。抗生物質の半合成誘導体、および化学的方法によって作製された抗生物質も同様にこの用語に含まれる。イソニアジド、トリメトプリム、キノロン、フルオロキノロン、およびサルファ剤のような化学的に由来する抗微生物剤は、抗細菌剤であると見なされ、抗生物質という用語にはこれらが含まれる。天然物に由来する化合物および化学合成された化合物を含めることは、本発明のスクリーニングの範囲内である。
【００７３】
「非抗生物質」という用語には、当技術分野において抗生物質でないと認識される物質が含まれる。例示的な非抗生物質には、例えば、殺虫剤、消毒剤または抗感染剤が含まれる。非抗生物質には、消費者の製品に組み入れられる化合物、例えば被験者への局所使用、または洗剤として用いられる化合物が含まれる。「殺虫剤」という用語とは対照的に、抗生物質または「ヒトでの使用が承認された抗菌剤」は、微生物細胞において特異的分子標的を有すると考えられる。好ましくは、抗生物質または薬物の被験者に及ぼす副作用が最小となる治療を必要とする被験者において、治療物質の微生物標的はその生理的相対物とは有意に異なる。
【００７４】
「微生物」という用語には、ＮＩＭＲポリペプチドを発現する微生物または発現するように作製された微生物が含まれる。「微生物」は、経済学的に重要であり、例えば環境的に重要であり、またはヒト病原体として重要である。例えば、一つの態様において、微生物は環境的な問題、例えば汚損もしくは腐敗を引き起こし、または植物物質の分解のような有用な機能を行う。もう一つの態様において、微生物は、哺乳類の内部または哺乳類上で生存する生物であり、医学的に重要である。好ましくは、微生物は、単細胞であり、細菌、真菌、または原虫が含まれる。もう一つの態様において、本発明において用いるために適している微生物は、多細胞、例えば寄生虫または真菌である。好ましい態様において、微生物はヒト、動物、または植物に対して病原性である。微生物は、本明細書に記載のように、無傷の細胞として、または細胞不含アッセイ法の材料源として用いてもよい。
【００７５】
本明細書において用いられるように、「レポーター遺伝子」という用語には、プロモーターに機能的に結合している容易に検出可能な産物をコードする如何なる遺伝子も含まれる。機能的に結合しているとは、適当な条件において、ＲＮＡポリメラーゼが調節領域のプロモーターに結合して、レポーター遺伝子のヌクレオチド配列を転写するように進行しうることを意味する。しかし、特定の態様において、レポーター遺伝子構築物に他の配列、例えば転写調節配列を含めることが望ましい可能性がある。例えば、プロモーターの活性の調節は、プロモーター領域に結合するＲＮＡポリメラーゼを変化させることによって、またはｍＲＮＡの転写もしくは伸長の開始を妨害することによって、影響を受ける可能性がある。このように、本明細書中で集合的に転写調節エレメントまたは配列と呼ぶ配列を同様に、レポーター遺伝子構築物に含めてもよい。さらに、構築物は、得られたｍＲＮＡの翻訳を変化させ、それによってレポーター遺伝子産物の量を変化させるヌクレオチド配列を含んでいてもよい。
【００７６】
本明細書において用いられるように、「試験化合物」という用語には、ＮＩＭＲポリペプチドの活性または発現をそれらが調節するか否かを決定するために本発明のアッセイ法を用いて試験される物質が含まれる。スクリーニングアッセイ法において、一つ以上の化合物、例えば複数の化合物を、ＮＩＭＲポリペプチド配列の活性または発現能に関して同時に試験することができる。
【００７７】
本発明のアッセイ法においてアッセイすることができる試験化合物には、抗生物質および非抗生物質化合物が含まれる。一つの態様において、試験化合物には、候補となる洗浄剤または消毒剤化合物が含まれる。活性に関してスクリーニングすることができる例示的な化合物には、ペプチド、非ペプチド化合物、核酸、炭水化物、有機低分子（例えば、ポリケチド）、および天然産物抽出物ライブラリが含まれるが、これらに限定されない。「非ペプチド化合物」という用語には、天然のペプチド結合によって結合した自然界に存在するＬ−アミノ酸残基とは異なる分子構造を少なくとも部分的に含む化合物が含まれると解釈される。しかし、「非ペプチド化合物」には、天然のペプチド結合によって結合した自然界に存在するＬ−アミノ酸残基とは無関係な分子構造によって全体または部分的に構成される化合物と共に、Ｄ−アミノ酸、自然界に存在しないＬ−アミノ酸、改変ペプチド骨格等のようなペプチド模倣構造によって全体または部分的に構成される化合物が含まれると解釈される。「非ペプチド化合物」にはまた、天然物が含まれると解釈される。
【００７８】
本明細書において用いられるように、「抗体」という用語は、免疫グロブリン分子および免疫グロブリン分子の免疫学的活性部分、すなわち、Ｆａｂ、およびＦ（ａｂ’）２断片、一本鎖抗体、細胞内抗体、ｓｃＦｖ、Ｆｄ、またはその他の断片のような、抗原に結合する（すなわち、免疫反応する）抗原結合部位を含む分子が含まれると解釈される。好ましくは、本発明の抗体は、ＮＩＭＲ分子に特異的または実質的に特異的に結合する。本明細書において用いられるように、「モノクローナル抗体」および「モノクローナル抗体組成物」という用語は、抗原の特定のエピトープに免疫反応することができるただ一種の抗原結合部位を含む抗体分子の集団を意味するのに対し、「ポリクローナル抗体」および「ポリクローナル抗体組成物」とは、特定の抗原と相互作用することができる複数種の抗原結合部位を含む抗体分子の集団を意味する。このように、モノクローナル抗体組成物は典型的に、それが免疫反応する特定の抗原に対する単一の結合親和性を示す。
【００７９】
抗体の結合、認識、または反応性に関連して「特異的」という句は、自然界に存在するＮＩＭＲ分子に結合するが、その他の無関係な分子には実質的に反応しない抗体が含まれる。好ましくは、そのような抗体は、ＮＩＭＲ分子（または別の種からのその相同体）に結合し、非ＮＩＭＲ分子（または無関係なＮＩＭＲ分子）に対する結合はバックグラウンドの結合に過ぎない。一つの起源からのＮＩＭＲファミリー分子に対して特異的な抗体は、異なる種からのＮＩＭＲ分子に反応してもよく、または反応しなくてもよい。自然界に存在するＮＩＭＲ分子に対して特異的な抗体はそのような分子の変異体型に結合しても結合しなくてもよい。競合的および非競合的アッセイ法を含む、結合の親和性および特異性を決定するためのアッセイ法は、当技術分野で既知である。関係するアッセイ法には、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、フローサイトメトリー等が含まれる。
【００８０】
ＩＩ．抗生物質耐性を調節する組成物
Ａ．核酸分子
一つの局面において、本発明は、本質的にＮＩＭＲヌクレオチド配列を含む、またはそれらからなる単離核酸分子を提供する。もう一つの局面において、本発明はＮＩＭＲヌクレオチド配列からなる核酸分子を提供する。例示的なＮＩＭＲ分子を表１に示す。
【００８１】
ＮＩＭＲ遺伝子は、（例えば、表１に示す配列と）構造的類似性を有し、好ましくは、ＮＩＭＲポリペプチド活性を有するＮＩＭＲポリペプチドをコードする。例えば、一つの態様において、ＮＩＭＲポリペプチドは、環境ストレスに対する微生物の反応を調節することができ、それによって、ストレスに対する微生物の適応および／または微生物のビルレンスを調節することができる。好ましくは、ＮＩＭＲポリペプチドは、薬物に対する耐性を調節する。一つの態様において、ＮＩＭＲポリペプチドは、非抗生物質化合物に対する耐性を調節する。もう一つの態様において、ＮＩＭＲポリペプチドは抗生物質に対する耐性を調節する。
【００８２】
遺伝子コードによって定義されるように（下記に示す）、特定のタンパク質のアミノ酸配列と、タンパク質をコードすることができるヌクレオチド配列との間には既知の明確な対応がある。同様に、遺伝子コードによって定義されるように、特定の核酸分子のヌクレオチド配列とその核酸分子によってコードされるアミノ酸配列との間には既知の明確な対応がある。
【００８３】
2004503212.tif 000004
遺伝子コードの重要かつ周知の特徴は、その冗長性であり、それによってタンパク質を作製するために用いられるアミノ酸の多くに関して、２つ以上のコードヌクレオチドトリプレットを用いてもよい（上記）。したがって、多くの異なるヌクレオチド配列が所定のアミノ酸配列をコードする可能性がある。そのようなヌクレオチド配列は、全ての生物において同じアミノ酸配列の産生が得られることから、機能的に同等であると見なされる（もっとも、特定の生物は、他の配列より効率的にいくつかの配列を翻訳する可能性があるが）。その上、時に、プリンまたはピリミジンのメチル化変異型を、所定のヌクレオチド配列に認めることがある。そのようなメチル化は、トリヌクレオチドコドンおよび対応するアミノ酸の間のコード関係に影響を及ぼさない。
【００８４】
上記を考慮すると、本発明のＮＩＭＲポリペプチド（またはその一部）をコードするＤＮＡまたはＲＮＡ分子のヌクレオチド配列は、ＤＮＡまたはＲＮＡ分子をアミノ酸配列に翻訳するために遺伝子コードを用いて、ＮＩＭＲアミノ酸配列を誘導するために用いることができる。同様に、如何なるＮＩＭＲアミノ酸配列に関しても、ＮＩＭＲタンパク質をコードすることができる対応するヌクレオチド配列を、遺伝子コードから推定することができる（その冗長性のために、所定のアミノ酸配列に関して多数の核酸配列を生じるであろう）。このように、ＮＩＭＲ関連ヌクレオチド配列に関する説明および／または本明細書における開示は、ヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列の説明および／または開示も含まれると見なすべきである。同様に、本明細書におけるＮＩＭＲアミノ酸配列の説明および／または開示は、アミノ酸配列をコードすることができる可能性がある全てのヌクレオチド配列の説明および／または開示も含まれると見なすべきである。
【００８５】
本発明の一つの局面は、ＮＩＭＲタンパク質またはその生物活性部分をコードする単離された核酸分子と共に、ＮＩＭＲコード核酸を同定するためのハイブリダイゼーションプローブとして用いるために十分な核酸断片（例えばＮＩＭＲ ｍＲＮＡ）およびＮＩＭＲ核酸分子の増幅または突然変異のためのＰＣＲプライマーとして用いられる断片に関する。ＮＩＭＲ核酸分子の使用を検討する場合、例えば表１に示すように、完全長のＮＩＭＲ核酸分子だけでなくそのような核酸分子の断片を用いることができると理解すべきである。
【００８６】
本発明の核酸分子、例えば、表１に示すＮＩＭＲ分子のヌクレオチド配列を有する核酸分子、またはその一部は、標準的な分子生物学技術および本明細書に提供される配列情報を用いて単離することができる。例えば、ＮＩＭＲ核酸配列の全てまたは一部をハイブリダイゼーションプローブとして用いて、ＮＩＭＲ核酸分子を標準的なハイブリダイゼーションおよびクローニング技術を用いて単離することができる（例えば、サムブルック、フリッチュ、およびマニアティス（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．， Ｆｒｉｔｓｈ， Ｅ．Ｆ．， ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ， Ｔ．）らの「分子のクローニング：実験マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」第二版、コールドスプリングハーバー研究所、コールドスプリングハーバー研究所出版、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク州、１９８９年に記載されているように）。その上、ＮＩＭＲヌクレオチド配列の全てまたは一部を含む核酸分子は、ＮＩＭＲヌクレオチド配列に基づいて設計された合成オリゴヌクレオチドプライマーを用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって単離することができる（例えば異なる種の微生物から）。
【００８７】
本発明の核酸分子は、標準的なＰＣＲおよび／またはＲＴ ＰＣＲ増幅技術に従って、鋳型としてｃＤＮＡ、ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡを用い、そして適当なオリゴヌクレオチドプライマーを用いて増幅することができる。そのように増幅された核酸を適当なベクターにクローニングしてＤＮＡ配列分析によって特徴を調べる。さらに、ＮＩＭＲヌクレオチド配列に対応するオリゴヌクレオチドは、標準的な合成技術、例えば自動ＤＮＡ合成機を用いて調製することができる。
【００８８】
もう一つの好ましい態様において、本発明の単離された核酸分子は、表１に示すＮＩＭＲ遺伝子のヌクレオチド配列またはこのヌクレオチド配列の一部の相補体である核酸分子を含む。表１に示すＮＩＭＲ遺伝子のヌクレオチド配列と相補的である核酸分子は、それが表１に示すＮＩＭＲ遺伝子のヌクレオチド配列とハイブリダイズして、それによって安定な二本鎖を形成することができるように、表１に示すＮＩＭＲ遺伝子のヌクレオチド配列と十分に相補的である分子である。
【００８９】
表１に示す核酸分子の他に、本発明のその他のＮＩＭＲヌクレオチド配列が、表１に記載したＮＩＭＲ分子のＮＩＭＲヌクレオチド配列と「構造的に関連している」（すなわち配列同一性を有する）。そのような配列類似性は、例えば、比較目的のためのアライメントプログラムを用いてＮＩＭＲヌクレオチド配列を推定のＮＩＭＲヌクレオチド配列と選択的に並置して、対応する位置を比較することによって示すことができる。好ましい態様において、本発明の単離された核酸分子は表１に記載する分子の一つのヌクレオチド配列を含む。
【００９０】
さらに別の好ましい態様において、本発明の単離された核酸分子は、自然界に存在するＮＩＭＲポリペプチドと少なくとも約２５、３０、３５、４０、４５、５０、もしくは６０％またはそれ以上相同であるヌクレオチド配列を含む。もう一つの態様において、本発明の単離された核酸分子は、自然界に存在するＮＩＭＲポリペプチドと少なくとも約２５、３０、３５、４０、４５、５０、もしくは６０％またはそれ以上のアミノ酸同一性を有するヌクレオチド配列を含む。もう一つの態様において、本発明の単離された核酸分子は、表１に示すＮＩＭＲ分子またはその一部のヌクレオチド配列（例えば、完全長のヌクレオチド配列）と少なくとも約６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、またはそれ以上相同であるヌクレオチド配列を含む。
【００９１】
他の態様において、本発明の核酸分子は、以下を含む核酸分子と少なくとも２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、または７０％の同一性、より好ましくは８０％の同一性、およびさらにより好ましくは９０％の同一性を有する：表１に記載のＮＩＭＲ分子の少なくとも約１００、２００、３００、４００、５００、６００、または約７００ヌクレオチド。
【００９２】
配列類似性は、例えば、アライメントプログラムを用いて比較目的のためにＮＩＭＲヌクレオチドまたはアミノ酸配列を最適に並置して、その配列の対応する位置を比較することによって示すことができる。配列間の類似性を決定するために、それらを最適な比較目的のために並置することができる（例えば、比較される他のポリペプチドまたは核酸分子との最適なアライメントのために一つのポリペプチドまたは核酸分子の配列にギャップを導入してもよい）。次に、所定の位置でのアミノ酸残基または塩基を、それらが比較される配列における対応するアミノ酸残基または塩基と比較する。一つの配列における位置が他の配列における対応する位置と同じアミノ酸残基または同じ塩基で占有されている場合、配列はその位置で同一である。アミノ酸残基が同一でなくても、それらは類似である可能性がある。本明細書において用いられるように、２つのアミノ酸残基が、類似の側鎖を有する同じファミリーの残基のメンバーであれば、アミノ酸残基はもう一つのアミノ酸残基と「類似」である。塩基性側鎖（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β分岐側鎖（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）、および芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン）を含む、類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当技術分野で定義されている（例えば、アルトシュル（Ａｌｔｓｃｈｕｌ）ら、１９９０、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２１５：４０３を参照のこと）。したがって、配列間の類似性の程度（百分率）は、２つの配列によって共有される同一または類似の位置の数の関数である（すなわち、％相同性＝同一または類似の位置の数／位置の総数×１００）。アライメント戦略は当技術分野で周知である；例えば、最適な配列アライメントに関しては上記のアルトシュル（Ａｌｔｓｃｈｕｌ）らを参照のこと。
【００９３】
活性な機能的単位として存在する核酸分子、例えばｍＲＮＡ分子は、相同体においてより高い程度の構造的同一性を有すると予想される。多様な生物において、機能的相同体をコードする核酸分子では構造的関連性の程度はより低いであろうと理解される。
【００９４】
好ましくはＮＩＭＲポリペプチドは、表１に記載した分子のＮＩＭＲ遺伝子によってコードされるポリペプチドと何らかのアミノ酸配列類似性を有する。ＮＩＭＲ遺伝子またはポリペプチドの核酸および／またはアミノ酸配列（例えば、先に提供したような）は、例えば関連配列を有する他のＮＩＭＲ遺伝子（またはポリペプチド）を同定するために、データベース（例えば公共またはｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｔｉｇｒ．ｏｒｇのような私的なデータベース）に対して検索を行うための「問い合わせ（ｑｕｅｒｙ）配列」として用いることができる。例えば、そのような検索は、アルトシュルら（Ａｌｔｓｃｈｕｌ、（１９９０）、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２１５：４０３〜１０）のＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラム（バージョン２．０）を用いて行うことができる。ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索は、上記のＮＩＭＲ核酸分子と相同なヌクレオチド配列を得るために、ＮＢＬＡＳＴプログラムによって、スコア＝１００、ワード長＝１２を用いて行うことができる。ＢＬＡＳＴポリペプチド検索は、本発明のＮＩＭＲポリペプチド分子と相同なアミノ酸配列を得るために、ＸＢＬＡＳＴプログラムによって、スコア＝５０、ワード長＝３を用いて行うことができる。比較目的のためにギャップを導入したアライメントを得るために、アルトシュルら（Ａｌｔｓｃｈｕｌ、（１９９７）、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２５（１７）：３３８９〜３４０２）において記載されるように、ギャップド（Ｇａｐｐｅｄ）ＢＬＡＳＴを利用することができる。ＢＬＡＳＴおよびギャップドＢＬＡＳＴプログラムを利用する場合、それぞれのプログラム（例えば、ＸＢＬＡＳＴおよびＮＢＬＡＳＴ）のデフォルトパラメータを用いることができる。ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ．を参照のこと。
【００９５】
しかし、微生物遺伝子における配列同一性のレベルは、同じファミリーのメンバーであっても、必ずしも高くないと理解すべきである。これは、配列同一性のレベルが低い、例えば２０％未満である多様なゲノムの場合に特に当てはまる（Ｂ．ブルグドルフェリ（Ｂ． ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）を例えば枯草菌（Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ）と比較するとき）。したがって、ＮＩＭＲ分子における構造類似性はまた、アミノ酸残基の「三次元一致」に基づいて決定することができる。本明細書において用いられるように、「三次元一致」という用語は、空間的に対応する、例えば、Ｘ線結晶学によって決定したＮＩＭＲポリペプチドメンバーの同じ機能的位置に存在するが、直線アライメントプログラムを用いて並置すると一致しない可能性がある残基が含まれることを意味する。「三次元一致」という用語にはまた、同じ機能を実行する、例えば、変異分析によって決定した場合に、例えばＤＮＡに結合するまたは同じ補因子に結合する残基が含まれる。
【００９６】
核酸分子は、遺伝子コードの縮重のために表１に記載のＮＩＭＲ分子とはヌクレオチド配列が異なるが、同じＮＩＭＲタンパク質をコードする核酸分子は、本発明に含まれる。したがって、もう一つの態様において、本発明の単離された核酸分子は、表１に記載のＮＩＭＲ分子のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を有する。
【００９７】
表１に示すＮＩＭＲ分子のヌクレオチド配列の他に、所定のＮＩＭＲポリペプチドのアミノ酸配列の変化を生じるＤＮＡ配列多型が生物の集団内に存在する可能性があることを当業者は認識するであろう。天然の対立遺伝子変異型の結果であって、ＮＩＭＲポリペプチドの機能的活性を変化させないそのようなヌクレオチド変異型および得られるアミノ酸多型は、本発明の範囲内であると解釈される。
【００９８】
その上、機能的ＮＩＭＲポリペプチドをコードするが表１に記載の分子のＮＩＭＲヌクレオチド配列とは異なるヌクレオチド配列を有する核酸分子は、本発明の範囲内であると解釈される。例えば、異なる種からの、表１に記載のＮＩＭＲタンパク質の機能的相同体をコードするが、表１に記載のＮＩＭＲ分子のＮＩＭＲ配列とは異なるヌクレオチド配列を有する核酸分子は、本発明の範囲内であると解釈される。表１に示すＮＩＭＲ遺伝子の一覧を考慮すると、ＮＩＭＲ相同体は、標準的な技術によって提供されるＮＩＭＲヌクレオチド配列との構造的類似性によって、当業者によって容易に同定することができる。
【００９９】
例えば、ＮＩＭＲ核酸分子は、ストリンジェントな条件で表１に記載の核酸分子とのハイブリダイゼーション能力に基づいて、本明細書に記載の例示的なＮＩＭＲ遺伝子と構造的に類似であると同定されうる。例えば、表１からのＮＩＭＲ分子のヌクレオチド配列の全てまたは一部をハイブリダイゼーションプローブとして、標準的なハイブリダイゼーション技術を用いて、ＮＩＭＲ ＤＮＡをＤＮＡライブラリから単離することができる（サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｊ．）らの「分子のクローニング：実験マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」第二版、コールドスプリングハーバー研究所、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク州、１９８９年；コーエン（Ｃｏｈｅｎ）ら、１９９３、Ｊ． ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓ １６８：４８４に記載されるように）。
【０１００】
本明細書において用いられるように、「ストリンジェントな条件でハイブリダイズする」という用語は、互いに少なくとも３０％、４０％、５０％、または６０％相同であるヌクレオチド配列が、典型的に互いにハイブリダイズしたままであるハイブリダイゼーションおよび洗浄の条件を記述すると解釈される。好ましくは、条件は、互いに少なくとも約７０％、より好ましくは少なくとも約８０％、さらにより好ましくは少なくとも約８５％、または９０％相同である配列が典型的に互いにハイブリダイズしたままであるような条件である。好ましくは、表１からの分子の配列またはその相補体とストリンジェントな条件でハイブリダイズする本発明の単離された核酸分子は、自然界に存在する核酸分子に対応する。そのようなストリンジェントな条件は、当業者に既知であり、例えば「分子生物学の最新プロトコール（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、ジョン・ウィリー＆サンズ、ニューヨーク、（１９８９）、６．３．１〜６．３．６に見ることができる。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の好ましい非制限的な例は、６×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）で約４５℃でのハイブリダイゼーションの後、０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで５０〜６５℃での１回またはそれ以上の洗浄である。ハイブリダイゼーション条件は、二本鎖核酸の実質的に純粋な集団の分子の半数に認められる融解温度Ｔｍに大きく左右される。Ｔｍは、所定の配列の分子が融解するか、または一本鎖となる摂氏（℃）での温度である。塩基数が１１〜２３個の配列の核酸の場合、Ｔｍは、２（Ａ＋Ｔ残基の数）＋４（Ｃ＋Ｇ残基の数）としての℃で推定することができる。核酸分子のハイブリダイゼーションまたはアニーリングは、Ｔｍより低い温度、例えば、１５℃、２０℃、２５℃、または３０℃で行うべきである。塩濃度（ＮａＣｌにおけるモル濃度）の影響も同様に計算することができる。例えば、ブラウン（Ｂｒｏｗｎ， Ａ．）、「ハイブリダイゼーション（Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）」、５０３〜５０６頁、「分子生物学専門辞典（Ｔｈｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｍｏｌｅｃ． Ｂｉｏｌ．）」、ケンドリュー（Ｊ． Ｋｅｎｄｒｅｗ）編、ブラックウェル、オックスフォード（１９９４）を参照のこと。
【０１０１】
さらに、ＮＩＭＲ遺伝子は、本発明の実施例に記載の技術と類似の技術を用いて、他の微生物におけるＭａｒＡに関連した転写活性因子を過剰発現させ、ＭａｒＡ相同体の過剰発現によってその発現が制御される遺伝子を同定することによって、同定することができる。
【０１０２】
その上、本発明の核酸分子は、完全長のＮＩＭＲ核酸配列の一部のみを含みうる。例えば、ある断片をＮＩＭＲタンパク質の生物活性部分をコードするプローブまたはプライマーまたは断片として用いることができる。ＮＩＭＲ遺伝子のヌクレオチド配列によって、他のＮＩＭＲポリペプチドと共に他の種からのＮＩＭＲ相同体の同定および／またはクローニングに用いられるように設計されたプローブおよびプライマーの作製が可能となる。プローブ／プライマーは、典型的には実質的に精製されたオリゴヌクレオチドを含む。一つの態様において、オリゴヌクレオチドは、表１からのＮＩＭＲ分子のセンス配列または自然界に存在する対立遺伝子変異型もしくはその変異体の少なくとも約１２もしくは１５、好ましくは約２０もしくは２５、より好ましくは約３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７５、または１００連続ヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするヌクレオチド配列の領域を含む。もう一つの態様において、本発明の核酸分子は、長さが少なくとも約２００、３００、４００、５００、６００、または７００ヌクレオチドであって、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件で表１の核酸分子またはその相補体とハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む。
【０１０３】
その上、ＮＩＭＲ遺伝子の全てまたは一部を含む核酸分子は、表１に記載のＮＩＭＲ分子の配列に基づいて設計されたオリゴヌクレオチドプライマーを用いてポリメラーゼ連鎖反応によって単離することができる。例えば、ＲＮＡは細胞から単離することができ（例えば、チャーギン（Ｃｈｉｒｇｗｉｎ）ら（１９７９）、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １８：５２９４〜５２９９のグアニジニウム−チオシアネート抽出法によって）、ｃＤＮＡは逆転写酵素によって調製することができる（例えば、ギブコ／ＢＲＬ社、ベセスダ、メリーランド州から入手可能なモロニーＭＬＶ逆転写酵素；またはセイカガクアメリカ社、セントピータースバーグ、フロリダ州から入手可能なＡＭＶ逆転写酵素）。ＰＣＲ増幅のための合成オリゴヌクレオチドプライマーは、ＮＩＭＲヌクレオチド配列に基づいて設計することができる。本発明の核酸分子は、ｃＤＮＡまたはもう一つの方法としてゲノムＤＮＡを鋳型とし、標準的なＰＣＲ増幅技術に従って適当なオリゴヌクレオチドプライマーを用いて増幅することができる。そのように増幅された核酸は、直接シークエンシングするか、または適当なベクターにクローニングして、ＤＮＡ配列分析によって特徴を調べることができる。さらに、標準的な合成技術、例えば自動ＤＮＡ合成機を用いてＮＩＭＲヌクレオチド配列に対応するオリゴヌクレオチドを調製することができる。
【０１０４】
集団で存在する可能性があるＮＩＭＲ配列の自然界に存在する対立遺伝子変異型の他に、当業者はさらに、突然変異によって、例えば表１に記載の分子のＮＩＭＲヌクレオチド配列に軽微な変化を導入し、それによってＮＩＭＲポリペプチドの機能的活性を変化させることなく、コードされたポリペプチドのアミノ酸配列に変化を生じてもよいと認識するであろう。例えば、「非必須」アミノ酸残基でのアミノ酸置換に至るヌクレオチド置換を、表１のＮＩＭＲ分子の配列に実施してもよい。「非必須」アミノ酸残基は、ＮＩＭＲ分子の機能的活性を変化させずに、ＮＩＭＲ核酸分子の野生型配列（例えば、表１に記載のＮＩＭＲ分子の配列）から変化させうる残基である。非必須であって、したがって置換を受けやすい例示的な残基は、例えばＮＩＭＲ分子（例えば、異なる種からのＮＩＭＲ相同体）のアミノ酸アライメントを実施して、保存されていない残基を決定することによって、またはアラニンスキャン突然変異誘発によって、当業者によって同定されうる。そのような残基は、それらが保存されていないために、置換をより受けやすい可能性がある。
【０１０５】
したがって、本発明のもう一つの局面は、ＮＩＭＲ活性にとって必須でないアミノ酸残基の変化を含むＮＩＭＲタンパク質をコードする核酸分子に関する。そのようなＮＩＭＲタンパク質は、表１に記載のＮＩＭＲ分子とはアミノ酸配列が異なるが、なおも固有のＮＩＭＲ活性を保持している。ＮＩＭＲポリペプチドの非天然変異型をコードする単離された核酸分子は、一つまたはそれ以上のアミノ酸置換、負荷、または欠失がコードされるポリペプチドに導入されるように、一つまたはそれ以上のヌクレオチド置換、付加、または欠失を表１のＮＩＭＲ分子のヌクレオチド配列に導入することによって作製することができる。突然変異は、部位特異的突然変異誘発およびＰＣＲ媒介突然変異誘発のような標準的な技術によってＮＩＭＲ分子に導入することができる。好ましくは、保存的アミノ酸置換は、一つまたはそれ以上の非必須アミノ酸残基で行われる。「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が、類似の側鎖を有するアミノ酸残基に置換される置換である。塩基性側鎖（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β分岐側鎖（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）、および芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を含む、類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーが当技術分野で定義されている。したがって、ＮＩＭＲポリペプチドにおける非必須アミノ酸残基は、好ましくは同じ側鎖のファミリーからのもう一つのアミノ酸残基に置換される。
【０１０６】
または、もう一つの態様において、突然変異は、飽和突然変異誘発によって行うように、ＮＩＭＲコード配列の全てまたは一部に沿って無作為に導入することができ、機能的活性を保持する変異体を同定するために得られた変異体を活性に関してスクリーニングすることができる。突然変異誘発の後、コードされるＮＩＭＲ変異体ポリペプチドを宿主細胞において組換え的に発現することができ、変異体ポリペプチドの機能的活性は、ＮＩＭＲ活性を評価するために当技術分野で利用可能なアッセイ法を用いて決定することができる。
【０１０７】
本発明のさらにもう一つの局面は、ＮＩＭＲ融合ポリペプチドをコードする単離された核酸分子に関する。非ＮＩＭＲタンパク質、ポリペプチド、またはペプチドをコードする第二のヌクレオチド配列に機能的に結合した、ＮＩＭＲ活性を有する完全長の（全体の）ＮＩＭＲタンパク質、ポリペプチド、またはペプチドをコードする少なくとも第一のヌクレオチド配列を含むそのような核酸分子を、標準的な組換えＤＮＡ技術によって調製することができる。
【０１０８】
上記のＮＩＭＲタンパク質をコードする核酸分子の他に、本発明のもう一つの局面は、それに対してアンチセンスである単離された核酸分子に関する。「アンチセンス」核酸は、ポリペプチドをコードする「センス」核酸と相補的な、例えば二本鎖ｃＤＮＡ分子のコード鎖と相補的、またはｍＲＮＡ配列と相補的なヌクレオチド配列を含む。したがって、アンチセンス核酸は、センス核酸に水素結合することができる。アンチセンス核酸は完全なＮＩＭＲコード鎖またはその一部のみと相補的となりうる。一つの態様において、アンチセンス核酸分子は、ＮＩＭＲをコードするヌクレオチド配列のコード鎖の「コード領域」に対してアンチセンスである。「コード領域」という用語は、アミノ酸残基に翻訳されるコドンを含むヌクレオチド配列の領域を意味する。もう一つの態様において、アンチセンス核酸分子は、ＮＩＭＲをコードするヌクレオチド配列のコード鎖の「非コード領域」に対してアンチセンスである。「非コード領域」という用語は、コード領域に隣接して、アミノ酸に翻訳されない５’および３’配列を意味する。
【０１０９】
本明細書に開示のＮＩＭＲ分子をコードするコード鎖配列によって、本発明のアンチセンス核酸は、ワトソンおよびクリック（Ｗａｔｓｏｎ ａｎｄ Ｃｒｉｃｋ）の塩基対形成の法則に従って設計することができる。アンチセンス核酸分子は、ＮＩＭＲ ｍＲＮＡの完全なコード領域と相補的となりうるが、ＮＩＭＲ ｍＲＮＡのコードまたは非コード領域の一部のみに対してアンチセンスであるオリゴヌクレオチドがより好ましい。例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＮＩＭＲ ｍＲＮＡの翻訳開始部位周辺の領域と相補的となりうる。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、例えば、長さが約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、または５０ヌクレオチドとなりうる。本発明のアンチセンス核酸は、当技術分野で既知の技法を用いて、化学合成および酵素的ライゲーション反応を用いて構築することができる。例えば、アンチセンス核酸（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド）は、自然界に存在するヌクレオチド、または分子の生物学的安定性を増加するために、もしくはアンチセンスとセンス核酸との間に形成された二本鎖の物理的安定性を増加させるために設計された様々な改変ヌクレオチドを用いて化学合成することができ、例えばホスホロチオエート誘導体およびアクリジン置換ヌクレオチドを用いることができる。アンチセンス核酸を生じるために用いることができる改変ヌクレオチドの例には、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４−アセチルシトシン、５−（カルボキシヒドロキシメチル）ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、β−Ｄ−ガラクトシルケオシン、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−アデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、β−Ｄ−マンノシルケオシン、５’−メトキシカルボキシメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、ワイブトキソシン、シュードウラシル、ケオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、５−メチル−２−チオウラシル、３−（３−アミノ−３−Ｎ−２−カルボキシプロピル）ウラシル、（ａｃｐ３）ｗ、および２，６−ジアミノプリンが含まれる。または、アンチセンス核酸は、その中で核酸がアンチセンス方向にサブクローニングされている発現ベクターを用いて生物学的に産生することができる（すなわち、挿入された核酸から転写されるＲＮＡは、関係する標的核酸に対してアンチセンス方向となると思われる）。
【０１１０】
本発明のアンチセンス核酸分子は、典型的に、それらが細胞の核酸分子とハイブリダイズまたは結合して、それによってポリペプチドの発現を阻害する、例えば転写および／または翻訳を阻害するように、被験者に投与されるか、またはインサイチューで作製される。ハイブリダイゼーションは、安定な二本鎖を形成するために従来のヌクレオチド相補性によって行うことができ、または例えばＤＮＡ二本鎖に結合するアンチセンス核酸分子の場合、二重らせんの主溝での特異的相互作用を通して行うことができる。本発明のアンチセンス核酸分子の投与経路の例には、組織部位での直接注入が含まれる。または、アンチセンス核酸分子は、選択した細胞をターゲティングするように改変して、その後全身投与することができる。例えば、全身投与の場合、アンチセンス核酸分子は、それらが選択された細胞表面上で発現される受容体または抗原に対して特異的に結合するように、例えば、細胞表面受容体または抗原に対して結合するペプチドまたは抗体にアンチセンス核酸分子を結合させることによって、改変することができる。アンチセンス核酸分子は、本明細書に記載のベクターを用いて細胞に輸送することも可能である。アンチセンス分子の細胞内濃度が十分となるように、アンチセンス分子が強いｐｏｌ ＩＩまたはｐｏｌ ＩＩＩプロモーターの制御下に置かれたベクター構築物が好ましい。
【０１１１】
さらにもう一つの態様において、本発明のアンチセンス核酸分子は、αアノマー核酸分子である。αアノマー核酸分子は、通常のβユニットとは対照的に、鎖が互いに平行に走るよう、相補的ＲＮＡとの特異的二本鎖ハイブリッドを形成する（ゴールティエ（Ｇａｕｌｔｉｅｒ）ら、（１９８７）、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ． Ｒｅｓ． １５：６６２５〜６６４１）。アンチセンス核酸分子はまた、２’−ｏ−メチルリボヌクレオチド（イノウエ（Ｉｎｏｕｅ）ら、（１９８７）、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １５：６１３１〜６１４８）またはキメラＲＮＡ−ＤＮＡ類似体を含みうる（イノウエ（Ｉｎｏｕｅ）ら、（１９８７）、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ． ２１５：３２７〜３３０）。
【０１１２】
なおもう一つの態様において、本発明のアンチセンス核酸分子はリボザイムである。リボザイムは、相補的領域を有し、ｍＲＮＡのような一本鎖核酸を切断することができるリボヌクレアーゼ活性を有した触媒性ＲＮＡ分子である。このように、リボザイム（例えば、ハンマーヘッドリボザイム（ヘーゼルホフおよびゲルラック（Ｈａｓｅｌｈｏｆｆ ａｎｄ Ｇｅｒｌａｃｈ、１９８８、Ｎａｔｕｒｅ ３３４：５８５〜５９１）に記載される）を用いて、ＮＩＭＲ ｍＲＮＡ転写物を触媒的に切断して、それによってＮＩＭＲ ｍＲＮＡの翻訳を阻害することができる。ＮＩＭＲコード核酸に対して特異性を有するリボザイムは、配列番号：１のヌクレオチド配列に基づいて設計することができる。例えば、活性部位のヌクレオチド配列がＮＩＭＲコードｍＲＮＡにおいて切断されるヌクレオチド配列と相補的であるテトラヒメナＬ−１９ ＩＶＳ ＲＮＡの誘導体を構築することができる。例えば、セック（Ｃｅｃｈ）らの米国特許第４，９８７，０７１号；およびセック（Ｃｅｃｈ）らの米国特許第５，１１６，７４２号を参照のこと。または、ＮＩＭＲ ｍＲＮＡを用いて、ＲＮＡ分子のプールからの特異的リボヌクレアーゼ活性を有する触媒性ＲＮＡを選択することができる。例えば、バーテルおよびスゾスタック（Ｂａｒｔｅｌ， Ｄ． ａｎｄ Ｓｚｏｓｔａｋ， Ｊ．Ｗ．、（１９９３）、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６１：１４１１〜１４１８）を参照のこと。
【０１１３】
または、遺伝子発現は、ＮＩＭＲの調節領域（例えば、ＮＩＭＲプロモーターおよび／またはエンハンサー）に対して相補的なヌクレオチド配列をターゲティングして、標的細胞におけるＮＩＭＲ遺伝子の転写を防止する三重らせん構造を形成することによって阻害することができる。一般的に、ヘレン（Ｈｅｌｅｎｅ， Ｃ．、１９９１、Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓ． ６；５６９〜８４）；アレクシュンおよびレビー（Ａｌｅｋｓｈｕｎ， Ｍ．Ａ．， ａｎｄ Ｌｅｖｙ， Ｓ．Ｂ．、（１９９９）、Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １８１、４６６９〜４６７２））；ヘレンら（Ｈｅｌｅｎｅ， Ｃ．、（１９９２）、Ａｎｎ． Ｎ．Ｙ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ６６０：２７〜３６；ならびにマヘール（Ｍａｈｅｒ， Ｌ．Ｊ．、（１９９２）、Ｂｉｏａｓｓａｙｓ １４（１２）：８０７〜１５）を参照のこと。
【０１１４】
さらにもう一つの態様において、本発明のＮＩＭＲ核酸分子は、例えば分子の安定性、ハイブリダイゼーション、または溶解性を改善するために塩基部分、糖部分、またはリン酸骨格で改変することができる。例えば、核酸分子のリン酸デオキシリボース骨格を改変して、ペプチド核酸を作製することができる（ハイルップら（Ｈｙｒｕｐ， Ｂ．、（１９９６）、Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ ＆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４：５〜２３）；ジョージおよびレビー（Ｇｅｏｒｇｅ， Ａ．Ｍ． ａｎｄ Ｌｅｖｙ， Ｓ．Ｂ．（１９８３）、Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １５５：５４１〜５４８）を参照のこと）。本明細書において用いられるように、「ペプチド核酸」または「ＰＮＡ」という用語は、リン酸デオキシリボース骨格が偽ペプチド骨格に置換され、本来の核酸塩基４個が保持されているに過ぎない核酸模倣体、例えばＤＮＡ模倣体を意味する。ＰＮＡの中性骨格は、イオン強度が低い条件でＤＮＡおよびＲＮＡと特異的にハイブリダイズすることが示されている。ＰＮＡオリゴマーの合成は、ハイルップら（Ｈｙｒｕｐ， Ｂ．、（１９９６）、上記）；ペリー・オキーフェら（Ｐｅｒｒｙ−Ｏ’Ｋｅｅｆｅ、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９３：１４６７０〜６７５）に記載のような標準的な固相ペプチド合成プロトコールを用いて行うことができる。
【０１１５】
ＮＩＭＲ核酸分子のＰＮＡは、治療および診断応用において用いることができる。例えば、ＰＮＡは、例えば転写もしくは翻訳の停止、または複製の阻害をもたらすことによって遺伝子発現の配列特異的調節のためのアンチセンスまたは抗遺伝子物質として用いることができる。ＮＩＭＲ核酸分子のＰＮＡは、遺伝子における一塩基対突然変異の分析においても用いることができ（例えば、ＰＮＡ方向ＰＣＲクランピング）、他の酵素（例えば、Ｓ１ヌクレアーゼ（ハイルップら（Ｈｙｒｕｐ， Ｂ．、（１９９６）、上記）））と組み合わせて用いる場合の「人工制限酵素」として；またはＤＮＡシークエンシングもしくはハイブリダイゼーションのためのプローブもしくはプライマーとして（ハイルップら（Ｈｙｒｕｐ， Ｂ．、（１９９６）、上記）；ペリー・オキーフェ（Ｐｅｒｒｙ−Ｏ’Ｋｅｅｆｅ）ら、上記）用いることができる。
【０１１６】
もう一つの態様において、ＮＩＭＲ分子のＰＮＡは、ＰＮＡに親油性基もしくはその他のヘルパー基を結合させることによって、ＰＮＡ−ＤＮＡキメラを形成することによって、またはリポソームもしくは当技術分野で既知の薬物輸送に関する他の技術を用いることによって改変する（例えば、その安定性または細胞取り込みを増強するために）ことができる。例えば、ＰＮＡおよびＤＮＡの都合のよい特性を組み合わせたＰＮＡ−ＤＮＡキメラを作製することができる。そのようなキメラでは、ＤＮＡ認識酵素（例えば、ＲＮａｓｅＨおよびＤＮＡポリメラーゼ）がＤＮＡ部分と相互作用することができ、ＰＮＡ部分は高い結合親和性および特異性を提供するであろう。ＰＮＡ−ＤＮＡキメラは、塩基のスタッキング、核酸塩基間の結合数、および方向に関して選択される適当な長さのリンカーを用いて結合させることができる（ハイルップら（Ｈｙｒｕｐ， Ｂ．）、（１９９６）、上記）。ＰＮＡ−ＤＮＡキメラの合成は、ハイルップら（Ｈｙｒｕｐ， Ｂ．、（１９９６）、上記）およびフィンら（Ｆｉｎ， Ｐ．Ｊ．、（１９９６）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２４：３３５７〜６３）；ハミルトン、アルデア、ウォッシュバーン、バビツケおよびクシュナー（Ｈａｍｉｌｔｏｎ， Ｃ．Ｍ．， Ａｌｄｅａ， Ｍ．， Ｗａｓｈｂｕｒｎ， Ｂ．Ｋ．， Ｂａｂｉｔｚｋｅ， Ｐ． ＆ Ｋｕｓｈｎｅｒ， Ｓ．Ｒ．）、（１９８９）、Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １７１、４６１７〜４６２２））に記載のように行うことができる。例えば、ＤＮＡ鎖は標準的なホスホロアミダイトカップリング化学を用いて、固相支持体上で合成することができ、および改変ヌクレオシド類似体、例えば５’−（４−メトキシトリチル）アミノ−５’−デオキシ−チミジンホスホロアミダイトをＰＮＡとＤＮＡの５’末端との間に用いることができる（マグら（Ｍａｇ， Ｍ．）、（１９８９）、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ． １７：５９７３〜８８）。次に、ＰＮＡモノマーを段階的にカップリングさせると、５’ＰＮＡセグメントと３’ＤＮＡセグメントとを有するキメラ分子が得られる（フィンら（Ｆｉｎ， Ｐ．Ｊ．）、（１９９６）、上記）。または、５’ＤＮＡセグメントと３’ＰＮＡセグメントとを有するキメラ分子を合成することができる（ピーターサー（Ｐｅｔｅｒｓｅｒ， Ｋ．Ｈ．）ら、（１９７５）、Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． Ｌｅｔｔ． ５：１１１９〜１１１２４）。
【０１１７】
他の態様において、オリゴヌクレオチドには、ペプチド（例えば、インビボで宿主細胞受容体をターゲティングするため）などの他の付属基、または細胞膜（例えば、レチンガー（Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ）ら、（１９８９）、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８６：６５５３〜６５５６；レマイター（Ｌｅｍａｉｔｒｅ）ら、（１９８７）、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８４：６４８〜６５２；国際公開公報第８８／０９８１０号を参照のこと）もしくは血液脳関門（例えば、国際公開公報第８９／１０１３４号を参照のこと）を通じる輸送を促進する物質などの他の付属基が含まれていてもよい。さらに、オリゴヌクレオチドは、ハイブリダイゼーション誘発切断物質（例えば、クロル（Ｋｒｏｌ）ら、（１９８８）、Ｂｉｏ−Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ６：９５８〜９７６）、または挿入物質（ｉｎｔｅｒｃａｌａｔｉｎｇ）（例えばゾン（Ｚｏｎ）（１９８８）、Ｐｈａｒｍ． Ｒｅｓ． ５：５３９〜５４９を参照のこと）によって改変することができる。この目的のため、オリゴヌクレオチドは、もう一つの分子（例えば、ペプチド、ハイブリダイゼーション誘発クロスリンク物質、輸送物質、またはハイブリダイゼーション誘発切断物質）に結合してもよい。
【０１１８】
Ｂ．ＮＩＭＲポリペプチド、その断片、および抗ＮＩＭＲ抗体
本発明の一つの局面は、単離されたＮＩＭＲポリペプチドおよびその生物活性部分と共に、抗ＮＩＭＲ抗体を作製するための免疫原として用いるのに適したポリペプチド断片に関する。
【０１１９】
一つの態様において、本来のＮＩＭＲポリペプチドは、標準的なポリペプチド精製技術を用いて適当な精製スキームによって細胞または組織起源から単離することができる。もう一つの態様において、ＮＩＭＲポリペプチドは、組換えＤＮＡ技術によって産生される。組換え発現の代わりに、ＮＩＭＲポリペプチドまたはポリペプチドは、標準的なペプチド合成技術を用いて化学合成することができる。例えば、表１に示すように、ＮＩＭＲポリペプチドを用いることを検討する場合、完全長のＮＩＭＲポリペプチドと共に完全長ではないＮＩＭＲポリペプチドの断片を用いることができると理解される。
【０１２０】
好ましくは、ＮＩＭＲポリペプチドは、ＮＩＭＲ分子またはその一部のヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列を含む。もう一つの好ましい態様において、ポリペプチドは、表１に記載のＮＩＭＲ分子またはその一部のアミノ酸配列を含む。
【０１２１】
好ましいＮＩＭＲポリペプチドは自然界に存在する。他の態様において、ポリペプチドは、自然界に存在するＮＩＭＲポリペプチドと少なくとも約２５、３０、３５、４０、４５、５０、または６０％またはそれ以上のアミノ酸同一性を有する。好ましくは、ポリペプチドは、表１に示すＮＩＭＲ分子のアミノ酸配列またはその一部と少なくとも約７０％のアミノ酸同一性、より好ましくは８０％、およびさらにより好ましくは９０％または９５％のアミノ酸同一性を有する。ＮＩＭＲポリペプチド分子の好ましい部分は生物学的に活性であり、すなわち環境ストレスに対して微生物反応を調節し、そしてそれによって微生物のストレスに対する適応および／または微生物ビルレンスを調節する能力を有するＮＩＭＲポリペプチドの一部をコードする。
【０１２２】
さらに、同じ機能的活性、例えば細胞における薬物耐性の調節能を保持する、これらのポリペプチドおよび核酸分子の、自然界に存在するまたは存在しない変異型も同様に、本発明の範囲に含まれる。そのような変異型は、例えば、当技術分野で既知の技術を用いる突然変異によって作製することができる。または、変異型は化学合成することができる。
【０１２３】
例えば、本明細書に記載のＮＩＭＲポリペプチドはまたその同等物を含むと理解される。例えば、機能的に同等である（例えば、環境チャレンジに対する抵抗性を調節する）ＮＩＭＲポリペプチドの変異体型を、当技術分野で周知である技術を用いて作製することができる。突然変異には、例えば、置換を生じうる少なくとも一つの明確な点突然変異、または少なくとも一つの欠失もしくは挿入が含まれうる。例えば、ランダム突然変異誘発を用いることができる。突然変異は、ランダム突然変異誘発によって、またはカセット突然変異誘発を用いることによって作製することができる。前者の場合、ある分子の完全なコード領域をいくつかの方法の一つによって突然変異誘発し（化学物質、ＰＣＲ、濃厚液で処理したオリゴヌクレオチド合成）、無作為に突然変異誘発した分子の集合体に選択またはスクリーニング技法を行う。後者の場合、明確な構造または機能決定因子のいずれかに対応するポリペプチドの不連続な領域に、飽和または半ランダム突然変異誘発を行い、そうでなくともこれらの突然変異誘発したカセットを野生型の対立遺伝子に再導入する。一つの態様において、ＰＣＲ突然変異誘発を用いることができる。例えば、メガプライマーＰＣＲを用いることができる（ランド（Ｏ．Ｈ． Ｌａｎｄｔ）、１９９０、Ｇｅｎｅ ９６：１２５〜１２８）。
【０１２４】
完全長のＮＩＭＲポリペプチドの他に、ＮＩＭＲポリペプチドの断片およびその使用も同様に、本発明の範囲内である。本明細書において用いられるように、ＮＩＭＲポリペプチドの断片は、ＮＩＭＲポリペプチドの生物活性を調節する（例えば、ＮＩＭＲポリペプチドの微生物における薬物耐性に影響を及ぼす能力を変化させる）化合物を同定するためのスクリーニングアッセイ法において有用な完全長のＮＩＭＲポリペプチドの一部を意味する。したがって、本発明のスクリーニングアッセイ法において用いられる単離されたＮＩＭＲポリペプチドは、完全長のＮＩＭＲポリペプチドまたはその断片となりうる。このように、単離されたＮＩＭＲポリペプチドは、それがＮＩＭＲポリペプチド活性を保持する限り、ＮＩＭＲの完全長のアミノ酸配列に由来するアミノ酸配列を含みうる、本質的にそれらのアミノ酸配列からなりうる、またはそれらのアミノ酸配列からなりうる。
【０１２５】
その機能（例えば、薬物耐性の調節能、細胞からの薬物流出の調節能、または他の分子（ＤＮＡ、タンパク質、もしくは化合物のような）との結合にとって重要である機能）を保持している部分のような、特許請求のアッセイ法において用いるのに適している上記のポリペプチドの一部は、例えば、標準的な切断、または突然変異誘発技術を用いて、当業者によって容易に決定することができ、かつ本アッセイ法において用いることができる。例示的な技術は、ガレゴスら（Ｇａｌｌｅｇｏｓ、１９９６、Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １７８：６４２７）によって記載されている。さらに、ＮＩＭＲポリペプチドの生物活性部分には、ＮＩＭＲポリペプチドのアミノ酸配列と十分に相同な、またはそれらに由来するアミノ酸配列を含み、完全長のＮＩＭＲポリペプチドより少ないアミノ酸を含むペプチドで、ＮＩＭＲポリペプチドの少なくとも一つの活性を示すペプチドが含まれ、同様に本発明の主題である。
【０１２６】
その他の断片には、例えば、表１に示すＮＩＭＲ分子のアミノ酸配列の一部を有する切断型のポリペプチド、またはアミノ末端が含まれる一連の残基、またはカルボキシ末端が含まれる一連の残基のようなその変異型が含まれる。宿主細胞における本発明のポリペプチドの分解型も同様に好ましい。αヘリックスおよびαヘリックス形成領域、βシートおよびβシート形成領域、ターンおよびターン形成領域、コイルおよびコイル形成領域、親水性領域、疎水性領域、α両親媒性領域、β両親媒性領域、可撓性領域、表面形成領域、基質結合領域、および高抗原性指標領域を含む断片のような、構造的または機能的属性を特徴とする断片がさらに好ましい。
【０１２７】
２つのアミノ酸配列または２つの核酸配列の％同一性を決定するために、配列を最適な比較目的のために並置する（例えば、最適なアライメントを得るために第一および第二のアミノ酸または核酸配列の一つまたは双方にギャップを導入することができる）。好ましい態様において、比較目的のために並置する参照配列の長さは、参照配列の長さの少なくとも３０％、好ましくは少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも５０％、さらにより好ましくは少なくとも６０％、およびさらにより好ましくは少なくとも７０％、８０％、または９０％である。次に、対応する位置での残基を比較して、一つの配列における位置が、他の配列における対応する位置と同じ残基によって占有されている場合、分子はその位置で同一である。２つの配列間の％同一性は、２つの配列によって共有される同一の位置の数の関数である（すなわち、％同一性＝同一の位置の数／位置の総数×１００）。２つの配列間の％同一性は、２つの配列の最適なアライメントのために導入する必要があるギャップの数、各ギャップの長さを考慮に入れた、配列間で共有される同一の位置の数の関数である。本明細書において用いられるように、アミノ酸または核酸の「同一性」は、アミノ酸または核酸の「相同性」と同等である。
【０１２８】
２つの配列間の配列の比較と％同一性の決定は、数学的アルゴリズムを用いて行うことができる。配列を比較するために用いられる数学的アルゴリズムの非制限的な例は、カーリンおよびアルトシュル（Ｋａｒｌｉｎ ａｎｄ Ａｌｔｓｃｈｕｌ、１９９０、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８７：２２６４）のアルゴリズム、カーリンおよびアルトシュル（Ｋａｒｌｉｎ ａｎｄ Ａｌｔｓｃｈｕｌ、１９９３、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９０：５８７３）の改変版である。そのようなアルゴリズムは、アルトシュルら（Ａｌｔｓｃｈｕｌ、（１９９０）、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２１５：４０３〜１０）のＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラム（バージョン２．０）に組み入れられている。ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索は、本発明の核酸分子と相同なヌクレオチド配列を得るためにＮＢＬＡＳＴプログラムによって、スコア＝１００、ワード長＝１２を用いて行うことができる。ＢＬＡＳＴタンパク質検索は、本発明のポリペプチド分子と相同なアミノ酸配列を得るために、ＸＢＬＡＳＴプログラムによって、スコア＝５０、ワード長＝３を用いて行うことができる。比較目的のためのギャップを導入したアライメントを得るために、アルトシュルら（Ａｌｔｓｃｈｕｌ、（１９９７）、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ． ２５：３３８９）；ハミルトン、アルデア、ウォッシュバーン、バビツケおよびクシュナー（Ｈａｍｉｌｔｏｎ， Ｃ．Ｍ．， Ａｌｄｅａ， Ｍ．， Ｗａｓｈｂｕｒｎ， Ｂ．Ｋ．， Ｂａｂｉｔｚｋｅ， Ｐ． ＆ Ｋｕｓｈｎｅｒ， Ｓ．Ｒ．）、（１９８９）、Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １７１、４６１７〜４６２２））において記載されるように、ギャップドＢＬＡＳＴを利用することができる。ＢＬＡＳＴおよびギャップドＢＬＡＳＴプログラムを利用する場合、それぞれのプログラム（例えばＸＢＬＡＳＴおよびＮＢＬＡＳＴ）のデフォルトパラメータを用いることができる。ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ．を参照のこと。配列の比較のために用いられるもう一つの好ましい非制限的なアルゴリズムは、マイヤースおよびミラー（Ｍｙｅｒｓ ａｎｄ Ｍｉｌｌｅｒ、ＣＡＢＩＯＳ（１９８８））のアルゴリズムである。そのようなアルゴリズムはＧＣＧ配列アライメントソフトウェアパッケージの一部であるＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み入れられている。アミノ酸配列を比較するためにＡＬＩＧＮプログラムを用いる場合、ＰＡＭ１２０加重残基表、ギャップ長ペナルティ１２、およびギャップペナルティ４を用いることができる。
【０１２９】
ポリペプチド配列を並置するために用いられる数学的アルゴリズムのもう一つの非制限的な例は、リップマン−ペアソンのアルゴリズム（リップマンおよびペアソン（Ｌｉｐｍａｎ ａｎｄ Ｐｅａｒｓｏｎ）、（１９８５）、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２７：１４３５）である。リップマン−ペアソンのアルゴリズムを用いる場合、ＰＡＭ２５０加重残基表、ギャップ長ペナルティ１２、ギャップペナルティ４、およびＫｔｕｐｌｅ２を用いることができる。核酸配列のアライメントのために用いられる数学的アルゴリズムの好ましい非制限的な例は、ウィルブル−リップマンアルゴリズム（ウィルブルおよびリップマン（Ｗｉｌｂｕｒ ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ）、（１９８３）、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８０：７２６）である。ウィルブル−リップマンアルゴリズムを用いる場合、ウィンドウ２０、ギャップペナルティ３、Ｋｔｕｐｌｅ３を用いることができる。リップマン−ペアソンのアルゴリズムとウィルブル−リップマンアルゴリズムとはいずれも例えば、ＤＮＡＳＴＡＲ配列分析ソフトウェアパッケージの一部であるＭＥＧＡＬＩＧＮプログラム（例えば、バージョン３．１．７）に組み入れられている。
【０１３０】
配列分析のためのさらなるアルゴリズムは当技術分野で既知であり、トレリおよびロボッティ（Ｔｏｒｅｌｌｉ ａｎｄ Ｒｏｂｏｔｔｉ、（１９９４）、Ｃｏｍｐｕｔ． Ａｐｐｌ． Ｂｉｏｓｃｉ． １０：３）において記載されるＡＤＶＡＮＣＥおよびＡＤＡＭ、ならびにペアソンおよびリップマン（Ｐｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ、（１９８８）、ＰＮＡＳ ８５：２４４４）において記載されるＦＡＳＴＡが含まれる。
【０１３１】
好ましい態様において、２つのアミノ酸配列間の％同一性は、ブロッサム（Ｂｌｏｓｕｍ）６２行列またはＰＡＭ２５０行列のいずれか、ならびにギャップ加重１６、１４、１２、１０、８、６、または４、および長さ加重１、２、３、４、５、または６を用いて、ＧＣＧソフトウェアパッケージのＧＡＰプログラムを用いて決定される。さらにもう一つの好ましい態様において、２つのヌクレオチド配列間の％同一性は、ＮＷＳｇａｐｄｎａ．ＣＭＰ行列ならびにギャップ加重４０、５０、６０、７０、または８０、および長さ加重１、２、３、４、５、または６を用いて、ＧＣＧソフトウェアパッケージのＧＡＰプログラムを用いて決定される。
【０１３２】
タンパク質のアライメントは、ジーンワークスグローバルポリペプチドアライメントプログラム（例えば、バージョン２．５．１）を用いて、開始ギャップコスト５、伸長ギャップコスト５、最小対角長４、最大対角オフセット値１３０、コンセンサスカットオフ値５０％の設定で、Ｐａｍ ２５０行列を用いて行うことができる。
【０１３３】
本明細書に記述した核酸およびタンパク質配列は、例えば他のメンバーまたは関連配列を同定するために公共のデータベースの検索を行う「問い合わせ配列」としてさらに用いることができる。そのような検索は、アルトシュルら（Ａｌｔｓｃｈｕｌ、（１９９０）、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２１５：４０３〜１０）のＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラム（バージョン２．０）を用いて行うことができる。ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索は、本発明のＮＩＭＲ核酸分子と相同なヌクレオチド配列を得るために、ＮＢＬＡＳＴプログラムによって、スコア＝１００、ワード長＝１２を用いて行うことができる。ＢＬＡＳＴポリペプチド検索は、本発明のＮＩＭＲポリペプチド分子と相同なアミノ酸配列を得るために、ＸＢＬＡＳＴプログラムによって、スコア＝５０、ワード長＝３を用いて行うことができる。比較目的のためのギャップを導入したアライメントを得るために、アルトシュルら（Ａｌｔｓｃｈｕｌ、（１９９７）、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２５：３３８９〜３４０２）；ハミルトン、アルデア、ウォッシュバーン、バビツケおよびクシュナー（Ｈａｍｉｌｔｏｎ， Ｃ．Ｍ．， Ａｌｄｅａ， Ｍ．， Ｗａｓｈｂｕｒｎ， Ｂ．Ｋ．， Ｂａｂｉｔｚｋｅ， Ｐ． ＆ Ｋｕｓｈｎｅｒ， Ｓ．Ｒ．、（１９８９）、Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １７１、４６１７〜４６２２）において記載されるように、ギャップドＢＬＡＳＴを利用することができる。ＢＬＡＳＴおよびギャップドＢＬＡＳＴプログラムを利用する場合、それぞれのプログラム（例えばＸＢＬＡＳＴおよびＮＢＬＡＳＴ）のデフォルトパラメータを用いることができる。例えば、本発明のヌクレオチド配列は、ギャップペナルティを以下のように設定したデフォルトＢｌａｓｔｎ行列１−３を用いて分析することができる：存在１１および伸長１。本発明のアミノ酸配列は、以下のデフォルト設定を用いて分析することができる：ギャップペナルティを存在１１および伸長１に設定したＢｌｏｓｕｍ６２行列。ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖを参照のこと。
【０１３４】
本発明はまた、ＮＩＭＲキメラまたは融合ポリペプチドを提供する。本明細書において用いられるように、ＮＩＭＲ「キメラポリペプチド」、または「融合ポリペプチド」は、非ＮＩＭＲポリペプチドに機能的に結合したＮＩＭＲポリペプチドを含む。「ＮＩＭＲポリペプチド」とはＮＩＭＲポリペプチドに対応するアミノ酸配列を有するポリペプチドを意味するのに対し、「非ＮＩＭＲポリペプチド」とは、ＮＩＭＲポリペプチドとは実質的に相同でないポリペプチド、例えばＮＩＭＲポリペプチドとは異なり、同じまたは異なる生物に由来するポリペプチドに対応するアミノ酸配列を有するポリペプチドを意味する。ＮＩＭＲ融合ポリペプチドにおいて、ＮＩＭＲポリペプチドは、ＮＩＭＲポリペプチドの全てまたは一部に対応しうる。好ましい態様において、ＮＩＭＲ融合ポリペプチドは、ＮＩＭＲポリペプチドの少なくとも一つの生物活性部分を含む。融合ポリペプチドにおいて、「機能的に結合した」という用語は、ＮＩＭＲポリペプチドと非ＮＩＭＲポリペプチドとが互いにインフレームで融合することを示すと解釈される。非ＮＩＭＲポリペプチドは、ＮＩＭＲポリペプチドのＮ末端またはＣ末端に融合することができる。
【０１３５】
例えば、一つの態様において、融合ポリペプチドは、ＮＩＭＲメンバー配列がＧＳＴ配列のＣ末端に融合されるＧＳＴ−ＮＩＭＲメンバー融合ポリペプチドである。もう一つの態様において、融合ポリペプチドは、ＮＩＭＲメンバー配列がインフルエンザの血液凝集素エピトープタグにインフレームで融合するように、ＮＩＭＲメンバーヌクレオチド配列がｐＣＥＰ４−ＨＡベクターのようなベクターに挿入されるＮＩＭＲ−ＨＡ融合ポリペプチドである（ヘレスケルら（Ｈｅｒｒｅｓｃｈｅｒ， Ｒ．Ｆ．、（１９９５）Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ． ９：３０６７〜３０８２））。そのような融合ポリペプチドは、組換えＮＩＭＲポリペプチドの精製を容易にしうる。
【０１３６】
組換え技法によって産生された融合ポリペプチドおよびペプチドは、ポリペプチドまたはペプチドを含む細胞および培地の混合物から分泌および単離されてもよい。または、ポリペプチドもしくはペプチドは、細胞質に保持されていてもよく、細胞を採取して、溶解し、そしてポリペプチドを単離してもよい。細胞培養物には典型的に、宿主細胞、培地およびその他の副産物が含まれる。細胞培養のための適した培地は、当技術分野で周知である。ポリペプチドは、細胞培養培地、宿主細胞、またはその両者から、ポリペプチドおよびペプチドを精製するための当技術分野で既知の技術を用いて単離することができる。宿主細胞をトランスフェクトしてポリペプチドおよびペプチドを精製する技術は、当技術分野で既知である。
【０１３７】
好ましくは、本発明のＮＩＭＲ融合ポリペプチドは、標準的な組換えＤＮＡ技術によって産生される。例えば、異なるポリペプチド配列をコードするＤＮＡ断片を、例えば、ライゲーションのための平滑末端または付着末端、適当な末端を提供するための制限酵素消化、適当であれば付着末端の充填、望ましくない結合を防止するためのアルカリホスファターゼ処理、および酵素的ライゲーションを用いる従来の技術に従って、インフレームで共にライゲーションする。もう一つの態様において、融合遺伝子は、自動ＤＮＡ合成機を含む従来の技術によって合成することができる。または、２つの連続する遺伝子断片の間に相補的オーバーハングを生じるアンカープライマーを用いて、遺伝子断片のＰＣＲ増幅を行うことができ、その後これらをアニーリングして、再増幅するとキメラ遺伝子配列を作製することができる（例えば、「分子生物学の最新プロトコール（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）、アウスユベール（Ａｕｓｕｂｅｌ）ら編、ジョンウィリー＆サンズ、１９９２を参照のこと）。その上、既に融合部分をコードする（例えば、ＧＳＴポリペプチドまたはＨＡエピトープタグ）多くの発現ベクターが市販されている。ＮＩＭＲコード核酸分子は、融合部分がＮＩＭＲポリペプチドとインフレームで結合するように、そのような発現ベクターにクローニングすることができる。
【０１３８】
もう一つの態様において、融合ポリペプチドは、そのＮ末端で異種シグナル配列を含むＮＩＭＲポリペプチドである。特定の宿主細胞において（例えば、哺乳類の宿主細胞）、ＮＩＭＲの発現および／または分泌は、異種シグナル配列を用いることによって増加させることができる。本発明のＮＩＭＲ融合ポリペプチドは、薬学的組成物に組み入れることができ、インビボで被験者に投与することができる。ＮＩＭＲ融合ポリペプチドを用いることは、感染症の治療にとって治療的に有用となる可能性がある。その上、本発明のＮＩＭＲ融合ポリペプチドは、被験者において抗ＮＩＭＲ抗体を生じるための免疫原として用いることができる。
【０１３９】
好ましくは、本発明のＮＩＭＲキメラまたは融合ポリペプチドは、標準的な組換えＤＮＡ技術によって産生される。例えば、異なるポリペプチド配列をコードするＤＮＡ断片を、例えば、ライゲーションのための平滑末端または付着末端、適当な末端を提供するための制限酵素消化、適当であれば付着末端の充填、望ましくない結合を防止するためのアルカリホスファターゼ処理、および酵素的ライゲーションを用いる従来の技術に従って、インフレームで共にライゲーションする。もう一つの態様において、融合遺伝子は、自動ＤＮＡ合成機を含む従来の技術によって合成することができる。または、２つの連続する遺伝子断片の間に相補的オーバーハングを生じるアンカープライマーを用いて、遺伝子断片のＰＣＲ増幅を行うことができ、その後これらをアニーリングして、再増幅するとキメラ遺伝子配列を作製することができる（例えば、「分子生物学の最新プロトコール（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）、アウスユベール（Ａｕｓｕｂｅｌ）ら編、ジョンウィリー＆サンズ、１９９２を参照のこと）。その上、既に融合部分（例えば、ＧＳＴポリペプチド）をコードする多くの発現ベクターが市販されている。ＮＩＭＲコード核酸は、融合部分がＮＩＭＲポリペプチドとインフレームで結合するように、そのような発現ベクターにクローニングすることができる。
【０１４０】
本発明はまた、ＮＩＭＲアゴニスト（模倣体）またはＮＩＭＲアンタゴニストのいずれかとして機能するＮＩＭＲポリペプチドの変異型にも関する。ＮＩＭＲポリペプチドの変異型は、突然変異誘発、例えばＮＩＭＲポリペプチドの不連続な点突然変異、または切断によって作製することができる。ＮＩＭＲポリペプチドのアゴニストは、ＮＩＭＲポリペプチドの自然界に存在する型と実質的に同じまたはサブセットの生物活性を保持しうる。ＮＩＭＲポリペプチドのアンタゴニストは、例えば、ＮＩＭＲポリペプチドの細胞活性を競合的に調節することによって、ＮＩＭＲポリペプチドの天然型の一つまたはそれ以上の活性を阻害することができる。このように、限られた機能の変異型によって処理することによって、特異的生物効果を誘発することができる。一つの態様において、ポリペプチドの天然型の生物活性のサブセットを有する変異型によって被験者を処置すると、ＮＩＭＲポリペプチドの天然型による処置と比較して被験者における副作用がより少ない。
【０１４１】
一つの態様において、本発明は、当技術分野で既知の酸化、還元、またはその他の誘導体形成過程によって、ＮＩＭＲの少なくとも一つのアミノ酸残基を改変することにより、形成されうるＮＩＭＲの誘導体に関する。
【０１４２】
一つの態様において、ＮＩＭＲアゴニスト（模倣体）またはＮＩＭＲアンタゴニスト活性のいずれかとして機能するＮＩＭＲポリペプチドの変異型は、ＮＩＭＲアゴニストまたはアンタゴニスト活性に関してＮＩＭＲポリペプチドの変異体、例えば切断変異体の組み合わせライブラリをスクリーニングすることによって同定することができる。一つの態様において、ＮＩＭＲ変異型の多様なライブラリは、核酸レベルでの組み合わせ突然変異誘発によって作製し、多様な遺伝子ライブラリによってコードされる。ＮＩＭＲ変異型の多様なライブラリは、例えば、潜在的ＮＩＭＲ配列の縮重セットが、そこにＮＩＭＲ配列のセットを含む個々のポリペプチドとして、またはより大きい融合ポリペプチドセット（例えば、ファージディスプレイ）として発現可能であるように、遺伝子配列に合成オリゴヌクレオチドの混合物を酵素的にライゲーションすることによって作製することができる。潜在的ＮＩＮＲ変異型のライブラリを縮重オリゴヌクレオチド配列から作製するために用いることができる多様な方法がある。縮重遺伝子配列の化学合成は自動ＤＮＡ合成機において行うことができ、次に合成遺伝子を適当な発現ベクターにライゲーションする。遺伝子の縮重セットを用いることによって、可能性があるＮＩＭＲ配列の所望のセットをコードする配列の全てが一つの混合物中に提供されうる。縮重オリゴヌクレオチドを合成する方法は、当技術分野で既知である（例えば、ナラン（Ｎａｒａｎｇ， Ｓ．Ａ．）、（１９８３）、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ ３９：３；イタクラ（Ｉｔａｋｕｒａ）ら、（１９８４）、Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ５３：３２３；イタクラ（Ｉｔａｋｕｒａ）ら、（１９８４）、Ｓｃｉｅｎｃｅ １９８：１０５６；イケ（Ｉｋｅ）ら、（１９８３）、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ． １１：４７７を参照のこと）。
【０１４３】
一つの態様において、コード配列断片のライブラリは、ニッキングが分子１個あたり約１回限り起こる条件で、ＮＩＭＲコード配列の二本鎖ＰＣＲ断片をヌクレアーゼによって処理する段階、二本鎖ＤＮＡを変性させる段階、ＤＮＡを復元させて異なるニックを有する産物からのセンス／アンチセンス対を含みうる二本鎖ＤＮＡを形成する段階、Ｓ１ヌクレアーゼによる処理によって再形成された二本鎖から一本鎖部分を除去し、そして得られた断片ライブラリを発現ベクターにライゲーションする段階によって作製することができる。この方法によって、ＮＩＭＲポリペプチドの様々な大きさのＮ末端、Ｃ末端、および内部断片をコードする発現ライブラリを誘導することができる。
【０１４４】
点突然変異または切断によって作製された組み合わせライブラリの遺伝子産物をスクリーニングするため、および選択された特性を有する遺伝子産物のｃＤＮＡライブラリをスクリーニングするために、いくつかの技術が当技術分野で既知である。そのような技術は、ＮＩＭＲポリペプチドの組み合わせ突然変異誘発によって作製された遺伝子ライブラリの迅速なスクリーニングに適合させることができる。大きい遺伝子ライブラリをスクリーニングするためのハイスループット分析が行いやすい最も広く用いられている技術には、典型的に、複製可能な発現ベクターに遺伝子ライブラリをクローニングする段階、得られたベクターのライブラリによって適当な細胞を形質転換する段階、および検出される産物の遺伝子をコードするベクターの単離が所望の活性の検出によって容易となる条件で、組み合わせ遺伝子を発現させる段階が含まれる。ライブラリにおける機能的変異体の頻度を増加させる技術である帰納的集合突然変異誘発（ＲＥＭ）を、ＮＩＭＲ変異型を同定するためにスクリーニングアッセイ法と共に用いることができる（アーキンおよびヨーバン（Ａｒｋｉｎ ａｎｄ Ｙｏｕｒｖａｎ）、（１９９２）、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８９：７８１１〜７８１５；デルグレーブ（Ｄｅｌｇｒａｖｅ）ら、（１９８３）、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ６：３２７〜３３１；コーエン、ハクラーおよびレビー（Ｃｏｈｅｎ， Ｓ．Ｐ．， Ｈａｃｈｌｅｒ， Ｈ． ａｎｄ Ｌｅｖｙ， Ｓ．Ｂ．）、（１９９３）、Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １７５：１４８４〜１４９２）。
【０１４５】
一つの態様において、細胞に基づくアッセイ法は、多様なＮＩＭＲライブラリを分析するために用いることができる。例えば、ＮＩＭＲを通常は合成して分泌する細胞株に発現ベクターのライブラリをトランスフェクトすることができる。次に、トランスフェクトした細胞をＮＩＭＲおよび特定の変異体ＮＩＭＲが分泌されるように、そして細胞上清中のＮＩＭＲに及ぼす変異体発現の影響が、例えば多くのいかなる酵素的アッセイ法によっても検出されうるように培養する。次に、プラスミドＤＮＡを、ＮＩＭＲ活性の阻害または増強に関して採点する細胞から回収して、個々のクローンの特徴をさらに調べた。
【０１４６】
天然のアミノ酸のみを含むＮＩＭＲポリペプチドの他に、ＮＩＭＲペプチド模倣体も同様に提供される。ペプチド様物質は、鋳型ペプチドの特性と類似の特性を有する非ペプチド薬として製薬工業において一般的に用いられる。これらの種類の非ペプチド化合物は、「ペプチド模倣体（ｐｅｐｔｉｄｅ ｍｉｍｅｔｉｃｓ）」または「ペプチド様物質（ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃｓ）」と呼ばれ（参照として本明細書に組み入れられる、フォーシェル（Ｆａｕｃｈｅｒｅ， Ｊ．）、（１９８６）、Ａｄｖ． Ｄｒｕｇ． Ｒｅｓ． １５：２９；ベベルおよびフライジンガー（Ｖｅｂｅｒ ａｎｄ Ｆｒｅｉｄｉｎｇｅｒ）、（１９８５）、ＴＩＮＳ、３９２頁；ならびにエバンス（Ｅｖａｎｓ）ら、（１９８７）、Ｊ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． ３０：１２２９）、通常、コンピューター化分子モデリングを援用して開発される。
【０１４７】
治療的に有用なペプチドと構造的に類似であるペプチド模倣体を用いて、同等の治療的または予防的作用を得てもよい。一般的に、ペプチド様物質は、ＮＩＭＲのような典型的なポリペプチド（すなわち、生物または薬理活性を有するポリペプチド）と構造的に類似であるが、以下の参照文献にさらに記述されている当技術分野で既知の方法によって、−ＣＨ２ＮＨ−、ＣＨ２Ｓ−、−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＣＨ＝ＣＨ−（シスおよびトランス）、−ＣＯＣＨ２−、−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２−、および−ＣＨ２ＳＯ−からなる群より選択される結合によって選択的に置換される一つまたはそれ以上のペプチド結合を有する：スパトラ（Ｓｐａｔｏｌａ， Ａ．Ｆ．、「アミノ酸、ペプチド、およびタンパク質の化学と生化学（Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ， Ｐｅｐｔｉｄｅｓ， ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ）」、ワインスタイン（Ｂ． Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ）編、マーセル・デッカー、ニューヨーク州、２６７頁（１９８３））；スパトラ（Ｓｐａｔｏｌａ， Ａ．Ｆ．、Ｖｅｇａ Ｄａｔａ（１９８３年３月号）、第１巻３号、「ペプチド骨格の改変（Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｂａｃｋｂｏｎｅ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ）」、（総説））；モーレイ（Ｍｏｒｌｅｙ， Ｊ．Ｓ．、Ｔｒｅｎｄｓ Ｐｈａｒｍ． Ｓｃｉ．（１９８０）、４６３〜４６８頁（総説））；ハドソンら（Ｈｕｄｓｏｎ， Ｄ．、Ｉｎｔ Ｊ． Ｐｅｐｔ． Ｐｒｏｔ． Ｒｅｓ．（１９７９）、１４：１７７〜１８５（−ＣＨ２ＮＨ−、ＣＨ２ＣＨ２−））；スパトラら（Ｓｐａｔｏｌａ， Ａ．Ｆ．、Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ． （１９８６）３８：１２４３〜１２４９（−ＣＨ２−Ｓ））；ハン（Ｈａｎｎ， Ｍ．Ｍ．、Ｊ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． Ｐｅｒｋｉｎ Ｔｒａｎｓ Ｉ（１９８２）３０７〜３１４（−ＣＨ−ＣＨ−、シスおよびトランス））；アルムキストら（Ａｌｍｑｕｉｓｔ， Ｒ．Ｇ．、Ｊ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ．（１９８０）、２３：１３９２〜１３９８（−ＣＯＣＨ２−））；ジェニングス−ホワイトら（Ｊｅｎｎｉｎｇｓ−Ｗｈｉｔｅ， Ｃ．、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ． （１９８２）２３：２５３３（−ＣＯＣＨ２−））；ゼルケら（Ｓｚｅｌｋｅ， Ｍ．、欧州特許出願第４５６６５号（１９８２）ＣＡ；９７：３９４０５（１９８２）（−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２−））；ホラディら（Ｈｏｌｌａｄａｙ， Ｍ．Ｗ．、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．（１９８３）２４：４４０１〜４４０４（−Ｃ（ＯＨ）ＣＨ２−））；およびルビー（Ｈｒｕｂｙ， Ｖ．Ｊ．、Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ．（１９８２）３１：１８９〜１９９（−ＣＨ２−Ｓ−）；そのそれぞれが参照として本明細書に組み入れられる。特に好ましい非ペプチド結合は−ＣＨ２ＮＨ−である。
【０１４８】
そのようなペプチド模倣体は、例えば、以下を含むポリペプチドの態様に対して有意な長所を有する可能性がある：より経済的な生産、より大きな化学的安定性、薬理学的特性の増強（半減期、吸収、効力、有効性等）、特異性の変化（例えば、広範囲の生物活性）、抗原性の減少、およびその他。ペプチド模倣体の標識は通常、定量的構造−活性データおよび／または分子モデリングによって予想されるペプチド様物質上の非妨害位置に直接、またはスペーサー（例えば、アミド基）を通して一つまたはそれ以上の標識を共有結合させることを含む。そのような非妨害位置は、一般的に、ペプチド様物質が結合して治療効果を生じる高分子との直接接触を形成しない位置である。ペプチド様物質の誘導体化（例えば、標識）は、ペプチド様物質の所望の生物または薬理活性を実質的に妨害してはならない。
【０１４９】
ＮＩＭＲアミノ酸配列の一つまたはそれ以上のアミノ酸を同じ種類のＤ−アミノ酸（例えば、Ｌ−リジンの代わりにＤ−リジン）に置換するという系統的な置換を用いて、より安定なペプチドを形成してもよい。さらに、ＮＩＭＲアミノ酸配列または実質的に同一の配列変化を含む拘束されたペプチドは、当技術分野で既知の方法によって（リゾおよびギエラシュ（Ｒｉｚｏ ａｎｄ Ｇｉｅｒａｓｃｈ）、（１９９２）、Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ６１：３８７、参照として本明細書に組み入れられる）、例えば、ペプチドを環状化させる分子内ジスルフィド架橋を形成することができる内部システイン残基を付加することによって、作製してもよい。
【０１５０】
本明細書において同定されたＮＩＭＲポリペプチドのアミノ酸配列によって、当業者はＮＩＭＲペプチド配列およびその配列変異型に対応するポリペプチドを産生することができる。そのようなポリペプチドは、ＮＩＭＲペプチド配列をコードするポリヌクレオチドの発現によって、しばしばより大きいポリペプチドの一部として原核生物または真核生物宿主細胞において産生されてもよい。または、そのようなペプチドは化学的方法によって合成してもよい。組換え宿主において異種ポリペプチドを発現させる方法、ポリペプチドの化学合成、およびインビトロ翻訳は当技術分野で周知であり、マニアティスら（Ｍａｎｉａｔｉｓ、「分子のクローニング：実験マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」（１９８９）、第２版、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク州）；ベルガーおよびキンメル（Ｂｅｒｇｅｒ ａｎｄ Ｋｉｍｍｅｌ、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、第１５２巻、「分子クローニング技術のガイド（Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｈｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）」、（１９８７）、アカデミック出版社、サンジエゴ、カリフォルニア州）；メリフィールド（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ， Ｊ．、（１９６９）、Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． ９１：５０１）；シャイケン（Ｃｈａｉｋｅｎ， Ｉ．Ｍ．、（１９８１）、ＣＲＣ Ｃｒｉｔ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． １１：２５５）；カイザーら（Ｋａｉｓｅｒ、（１９８９）、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４３：１８７）；メリフィールド（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ， Ｂ．、（１９８６）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３２：３４２）；ケント（Ｋｅｎｔ， Ｓ．Ｂ．Ｈ．、（１９８８）Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ５７：９５７）；およびオフォード（Ｏｆｆｏｒｄ， Ｒ．Ｅ．）（１９８０）「半合成タンパク質（Ｓｅｍｉｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ）」、ウィリー出版社、参照として本明細書に組み入れられる）に記載されている。
【０１５１】
ペプチドは、典型的に直接化学合成によって産生することができ、例えばＮＩＭＲ分子のアゴニストまたはアンタゴニストとして、例えばＮＩＭＲポリペプチドと、それが通常相互作用する分子との結合を調節するために用いることができる。ペプチドは、非ペプチド部分がＮ末端および／またはＣ末端との共有結合によって結合された改変ペプチドとして産生することができる。特定の好ましい態様において、カルボキシ末端またはアミノ末端のいずれかまたはその双方を化学的に改変する。末端のアミノ基およびカルボキシル基の最も一般的な改変はそれぞれ、アセチル化およびアミド化である。アシル化（例えば、アセチル化）、またはアルキル化（例えば、メチル化）のようなアミノ末端の改変およびアミド化のようなカルボキシ末端の改変は、環状化を含むその他の末端の改変と共に、本発明の様々な態様に組み入れてもよい。コア配列に対する特定のアミノ末端および／またはカルボキシ末端の改変および／またはペプチドの伸長は、安定性の増加、効力および／または有効性の増加、血清プロテアーゼに対する抵抗性、所望の薬物動態特性、およびその他のような有利な物理、化学、生化学、および薬理学的特性を提供しうる。ペプチドは、治療的に、例えば感染症を治療するために用いてもよい。
【０１５２】
単離されたＮＩＭＲポリペプチドまたはその一部もしくは断片もまた、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体調製の標準的な技術を用いて、ＮＩＭＲに結合する抗体を作製するための免疫原として用いることができる。完全長のＮＩＭＲポリペプチドを用いることができ、または本発明は、免疫原として用いるためのＮＩＭＲの抗原性ペプチド断片を提供する。ＮＩＭＲの抗原性ペプチドは、好ましくは、ペプチドに対して作製された抗体がＮＩＭＲと特異的免疫複合体を形成するように、少なくとも８個のアミノ酸残基を含み、ＮＩＭＲのエピトープを含む。より好ましくは、抗原性ペプチドは少なくとも１０個のアミノ酸残基を含み、さらにより好ましくは少なくとも１５個のアミノ酸残基、さらにより好ましくは少なくとも２０個のアミノ酸残基、および最も好ましくは少なくとも３０個のアミノ酸残基を含む。
【０１５３】
または、ＮＩＭＲポリペプチドの抗原性ペプチド断片は、免疫原として用いることができる。ＮＩＭＲポリペプチドの抗原性ペプチド断片は典型的に、表１のＮＩＭＲ分子のアミノ酸配列の少なくとも８個のアミノ酸残基を含み、ペプチドに対して作製された抗体がＮＩＭＲ分子と免疫複合体を形成するように、ＮＩＭＲポリペプチドのエピトープを含む。抗原性ペプチドによって含まれる好ましいエピトープは、ポリペプチドの表面上に存在するＮＩＭＲの領域、例えば親水性領域である。一つの態様において、抗体は、ＮＩＭＲポリペプチドに対して実質的に特異的に結合する。もう一つの態様において、抗体はＮＩＭＲポリペプチドに対して特異的に結合する。
【０１５４】
一つの態様において、そのようなエピトープは、一つの種からのＮＩＭＲポリペプチドに対して特異的でありうる（すなわち、種を超えては保存されないＮＩＭＲポリペプチドの領域に及ぶ抗原性ペプチドを免疫原として用いる；そのような非保存残基は、本明細書に提供されるようなアライメントを用いて決定することができる）。ポリペプチドの標準的な疎水性分析は、親水性領域を同定するために行うことができる。
【０１５５】
したがって、本発明のもう一つの局面は、抗ＮＩＭＲ抗体を用いることに関する。ポリクローナル抗ＮＩＭＲ抗体は、適した被験者をＮＩＭＲ免疫原によって免疫することによって上記のように調製することができる。免疫した被験者における抗ＮＩＭＲ抗体力価は、固定されたＮＩＭＲポリペプチドを用いる酵素結合免疫吸着アッセイ法（ＥＬＩＳＡ）のような標準的な技術によって経時的にモニターすることができる。望ましければ、ＮＩＭＲポリペプチドに対して作製された抗体分子は哺乳類から（例えば、血液から）単離することができ、ＩｇＧ分画を得るためにポリペプチドＡクロマトグラフィーのような周知の技術によってさらに精製することができる。免疫後の適当な時期、例えば抗ＮＩＭＲ抗体力価が最高である時期に、抗体産生細胞を被験者から得て、当初コーラーおよびミルスタイン（Ｋｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ、１９７５、Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５〜４９７）によって記述されたハイブリドーマ技術（同様に、ブラウン（Ｂｒｏｗｎ）ら、（１９８１）、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １２７：５３９〜４６；ブラウン（Ｂｒｏｗｎ）ら、（１９８０）、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２５５：４９８０〜８３；イェ（Ｙｅ）ら、（１９７６）、ＰＮＡＳ ７６：２９２７〜３１；およびイェ（Ｙｅｈ）ら、（１９８２）、Ｉｎｔ． Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ ２９：２６９〜７５）、より最近のヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（コズバー（Ｋｏｚｂｏｒ）ら、（１９８３）Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｔｏｄａｙ ４：７２）、ＥＢＶ−ハイブリドーマ技術（コール（Ｃｏｌｅ）ら、（１９８５）、「モノクローナル抗体と癌治療（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒｑａｐｙ）」、アランＲ．リスインク、７７〜９６頁）、またはトリオーマ技術のような標準的な技術によってモノクローナル抗体を調製するために用いることができる。
【０１５６】
モノクローナル抗体分泌ハイブリドーマを調製する代用法として、組換え型組み合わせ免疫グロブリンライブラリ（例えば、抗体ファージディスプレイライブラリ）をＮＩＭＲによってスクリーニングして、それによって、ＮＩＭＲポリペプチドに結合する免疫グロブリンライブラリメンバーを単離することによって、モノクローナル抗ＮＩＭＲ抗体を同定し、単離することができる。ファージディスプレイライブラリを作製およびスクリーニングするためのキットは、市販されている（例えば、ファルマシア社の組換えファージ抗体システム、カタログ番号２７−９４００−０１；およびストラタジーン社のＳｕｒｆＺＡＰ（商標）ファージディスプレイキット、カタログ番号２４０６１２）。さらに、抗体ディスプレイライブラリを作製およびスクリーニングするために用いるのに特に従順な方法および試薬の例は、例えば、ラドナー（Ｌａｄｎｅｒ）らの米国特許第５，２２３，４０９号；カング（Ｋａｎｇ）らの国際公開公報第９２／１８６１９号；ダウアー（Ｄｏｗｅｒ）らの国際公開公報第９１／１７２７１号；ウィンター（Ｗｉｎｔｅｒ）らの国際公開公報第９２／２０７９１号；マークランド（Ｍａｒｋｌａｎｄ）らの国際公開公報第９２／１５６７９号；ブレイトリング（Ｂｒｅｉｔｌｉｎｇ）らの国際公開公報第９３／０１２８８号；マカファーティ（ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ）の国際公開公報第９２／０１０４７号；ガラード（Ｇａｒｒａｒｄ）らの国際公開公報第９２／０９６９０号；ラドナー（Ｌａｄｎｅｒ）らの国際公開公報第９０／０２８０９号；フクスら（Ｆｕｃｈｓ、（１９９１）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９：１３７０〜１３７２）；ヘイら（Ｈａｙ、（１９９２）、Ｈｕｍ． Ａｎｔｉｂｏｄ． Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ ３：８１〜８５）；ヒューズ（Ｈｕｓｅ）ら（１９８９）、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４６：１２７５〜１２８１）；グリフィスら（Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ、（１９９３）、ＥＭＢＯ Ｊ． １２：７２５〜７３４）；ホーキンスら（Ｈａｗｋｉｎｓ、（１９９２）、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２２６：８８９〜８９６）；クラークソンら（Ｃｌａｒｋｓｏｎ、（１９９１）、Ｎａｔｕｒｅ ３５２：６２４〜６２８）；グラムら（Ｇｒａｍ、（１９９２）、ＰＮＡＳ ８９：３５７６〜３５８０）；ガラードら（Ｇａｒｒａｒｄ、（１９９１）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９：１３７３〜１３７７）；フーゲンブームら（ＨｏｏｇｅｎＢｏｏｍ、（１９９１）、Ｎｕｃ． Ａｃｉｄ Ｒｅｓ． １９：４１３３〜４１３７；バーバスら（Ｂａｒｂａｓ、（１９９１）ＰＮＡＳ ８８：７９７８〜７９８２）；およびマカファーティら（ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ、Ｎａｔｕｒｅ（１９９０）３４８：５５２〜５５４）に見ることができる。
【０１５７】
さらに、標準的な組換えＤＮＡ技術を用いて作製することができる、ヒトおよびヒト以外の部分の双方を含むキメラおよびヒト化モノクローナル抗体のような組換え抗ＮＩＭＲ抗体は、本発明の範囲である。そのようなキメラおよびヒト化モノクローナル抗体は、例えば、ロビンソン（Ｒｏｂｉｎｓｏｎ）らの国際特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ８６／０２２６９号；アキラ（Ａｋｉｒａ）らの欧州特許出願第１８４，１８７号；タニグチ（Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ， Ｍ．）の欧州特許出願第１７１，４９６号；モリソン（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ）らの欧州特許出願第１７３，４９４号；ニューバーガー（Ｎｅｒｂｅｒｇｅｒ）らの国際公開公報第８６／０１５３３号；カビリー（Ｃａｂｉｌｌｙ）らの米国特許第４，８１６，５６７号；カビリー（Ｃａｂｉｌｌｙ）らの欧州特許出願第１２５，０２３号；ベターら（Ｂｅｔｔｅｒ、（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０：１０４１〜１０４３）；リウら（Ｌｉｕ、（１９８７）ＰＮＡＳ ８４：３４３９〜３４４３）；リウら（Ｌｉｕ、（１９８７）Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １３９：３５２１〜３５２６）；サンら（Ｓｕｎ、（１９８７）、ＰＮＡＳ ８４：２１４〜２１８）；ニシムラら（Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ、（１９８７）、Ｃａｎｃ． Ｒｅｓ． ４７：９９９〜１００５；ウッドら（Ｗｏｏｄ、（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ ３１４：４４６〜４４９）；およびシャウら（Ｓｈａｗ、（１９８８）Ｊ． Ｎａｔｌ． Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ． ８０：１５５３〜１５５９）；モリソン（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ， Ｓ．Ｌ．、（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９：１２０２〜１２０７）：オイら（Ｏｉ、（１９８６）、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ４：２１４；ウィンター（Ｗｉｎｔｅｒ）の米国特許第５，２２５，５３９号；ジョーンズら（Ｊｏｎｅｓ、（１９８６）、Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５５２〜５２５；フェルホイヤンら（Ｖｅｒｈｏｅｙａｎ、（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：１５３４）；およびベイドラーら（Ｂｅｉｄｌｅｒ、（１９８８）、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １４１：４０５３〜４０６０）に記載される方法を用いて、当技術分野で既知の組換えＤＮＡ技術によって産生することができる。
【０１５８】
抗ＮＩＭＲ抗体（例えば、モノクローナル抗体）を用いて、アフィニティクロマトグラフィーまたは免疫沈降のような標準的な技術によってＮＩＭＲポリペプチドを単離することができる。抗ＮＩＭＲ抗体により、細胞からの天然のＮＩＭＲポリペプチドの精製および宿主細胞において発現される組換え的に産生されたＮＩＭＲポリペプチドの精製を容易にすることができる。その上、抗ＮＩＭＲ抗体を用いて、ＮＩＭＲポリペプチドを検出することができる（例えば、細胞溶解物または細胞上清において）。検出は、検出可能な基質に抗体をカップリングさせる（すなわち物理的に結合させる）ことによって容易にしてもよい。したがって、一つの態様において、本発明の抗ＮＩＭＲ抗体は検出可能な物質によって標識される。検出可能な物質の例には、様々な酵素、補欠分子団、蛍光材料、発光材料および放射活性材料が含まれる。
【０１５９】
ＩＩＩ．微生物
様々な異なる微生物が、例えばＮＩＭＲポリペプチドの活性および／または核酸を調節する化合物を調べるために、ＮＩＭＲ核酸分子またはポリペプチドの起源として、宿主細胞として用いるために、および本明細書に記載のスクリーニングアッセイ法において化合物を調べるために適している。「微生物」という用語には、ＮＩＭＲポリペプチドを有する微生物、またはスクリーニングアッセイ法を開発する目的のためにそのような分子を発現するように操作することができる微生物が含まれる。好ましくは、「微生物」とは、細菌、真菌、または原虫を含む単細胞の原核細胞または真核細胞微生物を意味する。もう一つの態様において、本発明で用いるのに適した微生物は、多細胞、例えば寄生虫または真菌である。好ましい態様において、微生物はヒト、動物、または植物に対して病原性である。他の態様において、環境問題、例えば汚損または腐敗を引き起こす微生物、または植物物質の分解のような有用な機能を行う微生物も同様に好ましい。そのため、これらの開示の微生物のいかなるものも、本明細書に記載の細胞不含アッセイ法のための材料源として用いうる。
【０１６０】
好ましい態様において、請求の方法において用いられる微生物は、グラム陰性またはグラム陽性細菌のうちいずれかの細菌である。好ましい態様において、薬物、好ましくは抗生物質に対して耐性となることが示されている如何なる細菌も請求の方法において用いるために適当である。
【０１６１】
好ましい態様において、微生物は、腸内細菌科（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）の細菌である。より好ましい態様において、以下からなる群より選択される属の細菌である：大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、プロテウス（Ｐｒｏｔｅｕｓ）、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、プロビデンシア（Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ）、エンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、ブルクホルデリア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、アシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、アエロモナス（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ）、ヘモフィルス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ）、エルシニア（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）、ナイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）、およびエルウィニア（Ｅｒｗｉｎｉａ）、ロドシュードモナス（Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、またはブルクホルデリア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）。
【０１６２】
さらに他の態様において、微生物はグラム陽性菌であり、ラクトバシラス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、アゾリゾビウム（Ａｚｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、放線菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、ペデイオコツカス（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ）、フォトバクテリウム（Ｐｈｏｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、腸球菌（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ブチリビブリオ（Ｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ）、スフィンゴモナス（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ）、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）、または放線菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）からなる群より選択される属の微生物である。
【０１６３】
さらに他の態様において、微生物は、抗酸菌、例えば、マイコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属の細菌である。
【０１６４】
さらに他の態様において、微生物は、例えばメタノバクテリウム（Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、スルホロブス（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ）、アーカエオグロブ（Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕ）、ロドバクター（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ）、またはシノリゾビウム（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）からなる群より選択される属から選択される。
【０１６５】
他の態様において、微生物は真菌である。好ましい態様において、真菌は、ムコール（Ｍｕｃｏｒ）またはカンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属、例えば、ムコール・ラセモサス（Ｍｕｃｏｒ ｒａｃｅｍｏｓｕｓ）、またはカンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）である。
【０１６６】
さらに他の態様において、微生物は原虫である。好ましい態様において、微生物は、マラリアまたはクリプトスポリジウム（ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）寄生虫である。
【０１６７】
ＩＶ．ベクターと宿主細胞
スクリーニングアッセイ法において用いるために好ましいＮＩＭＲポリペプチドは、「単離された」または組換えポリペプチドである。一つの態様において、ＮＩＭＲポリペプチドは、単離された核酸分子から作製することができる。ＮＩＭＲポリペプチドをコードする核酸分子は、スクリーニングに用いることができ、または本発明のアッセイ法において用いられるＮＩＭＲポリペプチドを産生するために用いることができる。例えば、ＮＩＭＲポリペプチドをコードする核酸分子は単離することができ（例えば、染色体において本来それに隣接する配列または細胞成分から単離される）、ＮＩＭＲポリペプチドを産生するために用いることができる。一つの態様において、例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によってインビトロで増幅されている（ジョージおよびレビー（Ｇｅｏｒｇｅ， Ａ．Ｍ． ａｎｄ Ｌｅｖｙ， Ｓ．Ｂ．）、１９８３、Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １５５、５４１〜５４８）、クローニングによって組換え的に産生された（コーエン、ヤン、レビー（Ｃｏｈｅｎ， Ｓ．Ｐ．， Ｙａｎ， Ｗ，　ａｎｄ Ｌｅｖｙ， Ｓ．Ｂ．）、（１９９３）、Ｊ． Ｉｎｆｅｃｔ， Ｄｉｓ． １６８、４８４〜４８８）、または切断およびゲル分離によって精製された（コーエン、ハクラーおよびレビー（Ｃｏｈｅｎ， Ｓ．Ｐ．， Ｈａｃｈｌｅｒ， Ｈ． ａｎｄ Ｌｅｖｙ， Ｓ．Ｂ．）、（１９９３）Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １７５、１４８４〜１４９２）、または例えば化学合成によって合成された（スラビック、デイザー、およびミラー（Ｓｕｌａｖｉｃｋ， Ｍ．Ｃ．， Ｄａｚｅｒ， Ｍ． ａｎｄ Ｍｉｌｌｅｒ， Ｐ．Ｆ．）、（１９９７）、Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １７９、１８５７〜１８６６）核酸分子を用いて、ＮＩＭＲポリペプチドを産生することができる。
【０１６８】
ＮＩＭＲポリペプチドを改変型で発現することができる。例えば、小胞体内腔、ペリプラスム間隙、または細胞外環境への翻訳されたポリペプチドを分泌するために、発現されたポリペプチドに適当な分泌シグナルを組み入れてもよい。これらのシグナルは、ポリペプチドに対して内因性であってもよく、または異種シグナルであってもよい。本発明のポリペプチドは、硫酸アンモニウムまたはエタノール沈殿、酸抽出、陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、およびレクチンクロマトグラフィーを含む周知の方法によって組換え細胞培養から回収および精製することができる。より好ましくは、精製のために高速液体クロマトグラフィーを用いる。ポリペプチドが単離および／または精製の際に変性する場合には、タンパク質のリフォールディングのための周知の技術を用いて活性な立体構造を再現してもよい。
【０１６９】
組換え産生の場合、宿主細胞は、本発明の核酸分子を組み入れるように遺伝子改変されうる。一つの態様において、ＮＩＭＲポリペプチドを明記する核酸分子をベクターに入れることができる。「ベクター」という用語は、それが結合されているもう一つの核酸分子を輸送することができる核酸分子を意味する。「発現ベクター」または「発現系」という用語には、細胞による発現に適した形（例えば、プロモーターに結合している）の遺伝子構築物を含む如何なるベクター（例えば、プラスミド、コスミド、またはファージ染色体）も含まれる。本明細書において、「プラスミド」または「ベクター」は、互換的に用いられ、プラスミドはベクターの一般的に用いられる形である。その上、本発明には、同等の機能を示す他のベクターも含まれると解釈される。非常に多様な発現系を用いて本発明のポリペプチドを産生することができる。そのようなベクターには、中でも、染色体、エピソーム、およびウイルス由来ベクター、例えば細菌プラスミド、バクテリオファージ、トランスポゾン、酵母エピソーム、挿入エレメント、酵母染色体エレメント、バキュロウイルス、ＳＶ４０のようなパポバウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、偽狂犬病ウイルス、およびレトロウイルスのようなウイルスに由来するベクター、ならびにコスミドおよびファージミドのような、プラスミドとバクテリオファージ遺伝子エレメントに由来するベクターのような、それらの組み合わせに由来するベクターが含まれる。
【０１７０】
適当なベクターは、広く市販されており、所定の宿主細胞において用いるために適しているベクターを選択することは、当業者の知識および裁量の範囲内である。ＮＩＭＲポリペプチドをコードする配列は、自己複製ベクター上で細胞に導入することができ、または相同的組換えまたはトランスポゾンのような挿入エレメントを用いて、微生物の染色体に導入してもよい。
【０１７１】
発現系構築物は、発現を調節する制御領域を含んでもよい。「転写調節配列」とは、機能的に結合しているポリペプチドコード配列の転写を誘導または制御する開始シグナル、エンハンサー、オペレーター、およびプロモーターのようなＤＮＡ配列を意味する遺伝子用語である。同様に、ＮＩＭＲポリペプチドをコードする組換え遺伝子は、自然界に存在するＮＩＭＲ遺伝子の転写を制御する配列と同じまたは異なる転写調節配列の制御下となりうると理解される。例示的な調節配列は、ゴエッデル（Ｇｏｅｄｄｅｌ）、「遺伝子発現技術（Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）」、Ｍｅｄｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １８５、アカデミック出版、サンジエゴ、カリフォルニア州（１９９０）に記載されている。例えば、本発明のＮＩＭＲポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を発現させるために、それに機能的に結合するとＤＮＡ配列の発現を制御する任意の極めて多様な発現制御配列をこれらのベクターにおいて用いてもよい。
【０１７２】
一般的に、宿主において核酸分子を維持、増殖、または発現させるためにおよび／またはポリペプチドを発現するために適した如何なる系またはベクターをこの点において発現のために用いてもよい。例えばサムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、「分子のクローニング：実験マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」第二版（上記）に記載のような、任意の多様な周知およびルーチンの技術を用いて、適当なＤＮＡ配列を発現系に挿入してもよい。
【０１７３】
ＮＩＭＲポリペプチドをコードし、細菌、例えばグラム陽性菌、グラム陰性菌のような細菌、または酵母菌（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、もしくはピチア（Ｐｉｃｈｉａ）のような単純な真核細胞真菌の細胞、または昆虫、鳥、哺乳類、もしくは植物のような真核細胞生物の細胞において複製することができる遺伝子を発現させるための例示的な発現ベクターは、当技術分野で既知である。そのようなベクターは、発現のための宿主、例えば酵母菌（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ならびに遺伝子操作およびベクター構築のための宿主、例えば大腸菌の双方にとって機能的な複製明記配列（レプリコン）を有してもよい。例えば、米国特許第４，７４５，０５６号を参照のこと。多様な生物にとって適したベクターは、アウスユベール（Ａｕｓｕｂｅｌ， Ｆ．）ら、「分子生物学のプロトコール短編（Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、ウィリー、ニューヨーク（１９９５）において記載され、例えば、ピチア（Ｐｉｃｈｉａ）に関しては、インビトロゲン社（カールスバッド、カリフォルニア州）から入手できる。
【０１７４】
有用な発現制御配列には、例えばＳＶ４０の初期および後期プロモーター、アデノウイルスまたはサイトメガロウイルス早初期プロモーター、ｌａｃ系、ｔｒｐ系、ＴＡＣまたはＴＲＣ系、その発現がＴ７ ＲＮＡポリメラーゼによって指示されるＴ７プロモーター、ファージラムダの主要なオペレータおよびプロモーター領域、ｆｄ外皮ポリペプチドの制御領域、３−ホスホグリセレートキナーゼまたはその他の糖分解酵素のプロモーター、酸ホスファターゼのプロモーター、例えばＰｈｏ５、酵母のα接合因子のプロモーター、バキュロウイルス系のポリへドロンプロモーター、ならびに原核もしくは真核細胞またはそれらのウイルスの遺伝子の発現を制御することが知られている他の配列、ならびにそれらの様々な組み合わせが含まれる。有用な翻訳エンハンサー配列は、米国特許第４，８２０，６３９号に記載されている。
【０１７５】
発現ベクターの設計は、形質転換される宿主細胞の選択および／または発現されることが望ましいポリペプチドの種類などの要因に依存する可能性があると理解すべきである。適当な宿主の代表的な例には、グラム陽性菌、グラム陰性菌のような細菌細胞；酵母細胞およびアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）細胞のような真菌細胞；ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）Ｓ２およびスポドプテラ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ）Ｓｆ９細胞のような昆虫細胞；ＣＨＯ、ＣＯＳ、ＨｅＬａ、Ｃ１２７、３Ｔ３、ＢＨＫ、２９３、Ｂｏｗｅｓ黒色腫細胞のような動物細胞；ならびに植物細胞が含まれる。
【０１７６】
好ましい態様において、精製またはスクリーニングアッセイ法において用いるためにＮＩＭＲポリペプチドを発現するために用いられる細胞、例えば宿主細胞は、任意の内因性のＮＩＭＲポリペプチドを非機能的にする、または内因性のポリペプチドが発現されないようにする突然変異を含む。他の態様において、突然変異は、宿主細胞の他の関連する遺伝子において、内因性の宿主座からの妨害がないように作製してもよい。
【０１７７】
宿主細胞に核酸分子を導入すること（「形質転換」）は、デービス（Ｄａｖｉｓ）ら「分子生物学の基本方法（Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）」（１９８６）、およびサムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、「分子のクローニング：実験マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」第二版、コールドスプリングハーバー研究所出版、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク州（１９８９）のような、多くの標準的な実験マニュアルに記載の方法によって実施できる。例として、電気穿孔、リン酸塩トランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、トランスベクション、マイクロインジェクション、陽イオン脂質媒介トランスフェクション、電気穿孔、形質導入、スクレイプローディング、衝撃による導入、および感染が含まれる。
【０１７８】
ＮＩＭＲポリペプチド、例えば組換え的に発現されたポリペプチドの精製は、当技術分野で既知の技術によって達成できる。例えば、ＮＩＭＲポリペプチドが細胞から分泌された形で発現される場合、培地を回収することができる。または、ＮＩＭＲポリペプチドが細胞によって保持される形で発現される場合、宿主細胞を溶解してＮＩＭＲポリペプチドを放出させることができる。そのような使用済み培地または細胞溶解物を用いて、ＮＩＭＲポリペプチドを濃縮および精製することができる。例えば、培地または溶解物をカラム、例えばＮＩＭＲポリペプチドに対して特異的な抗体が結合されているカラムに通過させることができる。または、そのような抗体は、ＮＩＭＲポリペプチドの精製を促進するために、ＮＩＭＲポリペプチドに融合されている非ＮＩＭＲポリペプチド（例えば、タグとして）に対して特異的となりうる。ＮＩＭＲポリペプチドを精製する他の手段は、当技術分野で公知である。
【０１７９】
Ｖ．ＮＩＭＲ組成物の利用
ＮＩＭＲ調節物質（例えば、核酸分子、ポリペプチド、変異型、ポリペプチド相同体、ＮＩＭＲアゴニストまたはアンタゴニスト、および本明細書に記載の抗体）を、以下の方法の一つまたはそれ以上において用いることができる：ａ）治療方法、例えば、ａ）感染の治療および表面の消毒；ｂ）スクリーニングアッセイ法；ｃ）ワクチンにおける使用；ｄ）診断アッセイ法等。本発明の単離された核酸分子は、例えば、ＮＩＭＲポリペプチドを発現するため（例えば、遺伝子治療適用時の宿主細胞において）、ＮＩＭＲ ｍＲＮＡ（例えば、生体試料において）またはＮＩＭＲ遺伝子における遺伝的変化を検出するため、および下記にさらに詳しく記述するように、ＮＩＭＲ活性を調節するために、用いることができる。さらに、ＮＩＭＲポリペプチドは、例えば自然界に存在するＮＩＭＲ結合ポリペプチドをスクリーニングするため、ＮＩＭＲ活性を調節する薬物または化合物をスクリーニングするため（例えば、ＮＩＭＲ活性のアゴニストまたはアンタゴニスト）のみならず、ＮＩＭＲの調節によって利益が得られる障害、例えば微生物による感染症を治療するために用いることができる。ＮＩＭＲ調節物質は、感染症を治療するために（例えば、単独もしくは第二の薬物、例えば抗生物質と併用して）、または汚染を減少させるために（単独もしくは非抗生物質と併用して）用いることができる。ＮＩＭＲ調節物質はまた、ＮＩＭＲ遺伝子のＭａｒＡ調節を変化させるために用いることもできる。例えば、そのような物質は、ＭａｒＡによって通常上方制御される遺伝子を下方制御するため、またはＭａｒＡによって通常下方制御される遺伝子を上方制御するために用いることができる。その上、本発明の抗ＮＩＭＲ抗体は、ＮＩＭＲ活性を調節するため、およびＮＩＭＲポリペプチドを検出および単離し、ＮＩＭＲポリペプチドの生物学的利用率を調節するため、ならびにＮＩＭＲ活性を調節するために用いることができる。
【０１８０】
Ａ．治療方法
本発明の組成物は、ＮＩＭＲポリペプチド活性の調節によって利益が得られる障害を治療するため、例えば、微生物による感染を有する被験者を治療するために用いることができる。
【０１８１】
本明細書において用いられるように、「感染症」という用語は、その増殖が阻害されれば、被験者に対する利益となる、被験者におけるまたは被験者上での微生物の存在が含まれる。そのため、「感染症」という用語には、病原体の存在を意味することの他に、例えば火傷患者の皮膚または免疫無防備患者の消化管における望ましくない正常細菌叢が含まれる。本明細書において用いられるように、「治療する」という用語は、予防および／または治療目的のために、被験者に化合物を投与することを意味する。「投与」という用語には、例えば感染部位への薬物の輸送のために役立つ適当な方法によって被験者に輸送することが含まれる。薬物の投与は、例えば経口、静脈内、または局所（下記にさらに詳細に説明するように）投与となりうる。薬物はまた、体内に存在しないが、環境、例えば表面上に存在する微生物と接触させることができる。
【０１８２】
微生物細胞におけるＮＩＭＲポリペプチドの発現および／または活性を調節する方法は、例えば、環境ストレスに対する微生物の適応の調節および／または微生物のビルレンスの調節において有用である。一般的に、ＭａｒＡの過剰発現によって下方調節される遺伝子の発現および／または活性を増加させ、ＭａｒＡの過剰発現によって上方調節される遺伝子の発現および／または活性を減少させることが望ましい。
【０１８３】
例示的なＮＩＭＲ下方調節物質には：アンチセンスＮＩＭＲ核酸分子、抗ＮＩＭＲ抗体、ドミナントネガティブＮＩＭＲ変異体、ＮＩＭＲアンタゴニスト、または本発明のスクリーニングアッセイ法を用いて同定されたＮＩＭＲ活性を下方調節する化合物が含まれる。さらにもしくはまたは、ＮＩＭＲ活性を下方調節する化合物は、当技術分野で公知のアプローチを用いて設計することができる。
【０１８４】
例示的なＮＩＭＲ刺激物質には、活性ＮＩＭＲポリペプチド分子、および細胞におけるＮＩＭＲ活性を増加させるために細胞に導入されるＮＩＭＲをコードする核酸分子が含まれる。
【０１８５】
本発明の調節方法は、インビトロまたはインビボで実施できる。
【０１８６】
ＮＩＭＲ調節物質は、単独、他のＮＩＭＲ調節物質（例えば、同じまたは異なるＮＩＭＲ分子を調節する）またはその他の薬物（例えば、抗生物質もしくは非抗生物質）と組み合わせて用いることができる。
【０１８７】
一つの態様において、ＮＩＭＲ調節物質は、抗生物質の有効性を増加させるために、例えば抗生物質を投与する前に被験者に単独で投与することができる。一つの態様において、ＮＩＭＲ調節物質は、抗生物質の有効性を増加させるために抗生物質と組み合わせて被験者に投与することができる。
【０１８８】
もう一つの態様において、ＮＩＭＲ調節物質または物質群は、表面を消毒するために、例えば、非抗生物質の効力を増加させるために、殺虫剤のような非抗生物質と併用して用いることができる。
【０１８９】
一つの態様において、ＮＩＭＲ調節物質と非抗生物質を含む「複合産物」、例えば、表面の汚染除去のための消毒剤または消費者製品（例えば、洗剤、石鹸、脱臭剤、マウスウォッシュ、歯磨き、またはローション）を調製することができる。
【０１９０】
Ｂ．ＮＩＭＲアゴニストおよびアンタゴニストの同定における使用
本発明は、ＮＩＭＲポリペプチドまたは核酸分子の作用を調節（増強（アゴニスト）、または遮断（アンタゴニスト））する物質、特に殺菌および／または静菌性である化合物、または感染の過程を予防する化合物を同定するための方法（本発明において「スクリーニングアッセイ法」とも呼ばれる）を提供する。本発明のスクリーニングアッセイ法は、調節物質、すなわちＮＩＭＲポリペプチドを調節する、すなわち、例えばＮＩＭＲポリペプチド発現またはＮＩＭＲポリペプチド活性に対して刺激または阻害作用を有する候補物質、試験化合物、または物質（例えば、ペプチド、ペプチド模倣体、低分子、またはその他の薬物）を同定するために用いることができる。試験化合物は、天然の基質およびリガンドであってもよく、または構造的もしくは機能的模倣化合物であってもよい。例えば、コリガン（Ｃｏｌｉｇａｎ）らの「免疫学の最新プロトコール（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）」１（２）：第５章（１９９１）を参照のこと。
【０１９１】
ＮＩＭＲポリペプチドアゴニストおよびアンタゴニストは、様々な方法でアッセイすることができる。例えば、一つの態様において、本発明は、例えば、化合物のＮＩＭＲ核酸分子またはＮＩＭＲポリペプチドとの相互作用能、または化合物のＮＩＭＲポリペプチドの活性または発現の調節能を測定することによって、ＮＩＭＲ分子を調節する化合物を同定する方法を提供する。さらに、ＮＩＭＲポリペプチドまたはＮＩＭＲ核酸分子の、それらが通常結合する分子、例えばＮＩＭＲ結合ポリペプチドとの結合を調節する化合物の能力を調べることができる。
【０１９２】
本方法において試験をするための化合物は、異なる多様な起源に由来することができ、既知または新規でありうる。好ましくは、スクリーニングアッセイ法は、試験する活性を有することがこれまでに知られていない化合物の活性について試験を実施する。本明細書に提供したＮＩＭＲのそれぞれの配列は、抗菌化合物の発見および開発に用いることができる。ＮＩＭＲポリペプチドまたはその一部は、発現されると、抗菌剤のスクリーニングのための標的として用いることができる。もう一つの態様において、アンチセンス核酸分子またはドミナントネガティブＮＩＭＲ変異体をコードする核酸分子も同様に、本アッセイ法において調べることができる。
【０１９３】
一つの態様において、化合物のライブラリを本方法において調べる。もう一つの態様において、既知の化合物を本方法において調べる。もう一つの態様において、環境保護局から一般的に安全であると見なされる化合物（ＧＲＡＳ）のリストに記載の化合物を本方法において調べる。
【０１９４】
一つの態様において、化合物のライブラリを本アッセイ法においてスクリーニングすることができる。医薬品化学における最近の傾向には、ライブラリと呼ばれる化合物の混合物を作製することが含まれる。ペプチドライブラリを用いることは当技術分野で十分に確立されているが、ベンゾジアゼピン（ブニン（Ｂｕｎｉｎ）ら、１９９２、Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． １１４：１０９８７；デウィット（ＤｅＷｉｔｔ）ら、１９９３、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９０：６９０９）、ペプトイド（ｐｅｐｔｏｉｄ）（ズッカーマン（Ｚｕｃｋｅｒｍａｎｎ）、１９９４、Ｊ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． ３７：２６７８）、オリゴカルバメート（チョ（Ｃｈｏ）ら、１９９３、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６１：１３０３）、およびヒダントイン（デウィット（Ｄｅ Ｗｉｔｔ）ら、上記）のような他の化合物の混合物を産生させる新しい技術が開発されている。レベック（Ｒｅｂｅｋ）らは、１０４〜１０５個の多様性を有する有機低分子の分子ライブラリを合成するためのアプローチを記述した（カレル（Ｃａｒｅｌｌ）ら、１９９４、Ａｎｇｒｅｗ． Ｃｈｅｍ． Ｉｎｔ． Ｅｄ． Ｅｎｇｌ． ３３：２０５９；カレル（Ｃａｒｅｌｌ）ら、Ａｎｇｒｅｗ． Ｃｈｅｍ． Ｉｎｔ． Ｅｄ． Ｅｎｇｌ． １９９４、３３：２０６１）。
【０１９５】
本発明のアッセイ法を実施する際のスクリーニング用化合物は、生物ライブラリ；空間的に位置特定可能な平行固相または液相ライブラリ、逆重畳積分を必要とする合成ライブラリ法、「１ビーズ１化合物」ライブラリ法、およびアフィニティクロマトグラフィー選択を用いる合成ライブラリ法を含む、当技術分野で既知の組み合わせライブラリ法における多数の任意のアプローチを用いて得ることができる。生物ライブラリアプローチは、ペプチドライブラリに限定されるが、他の４つのアプローチはペプチド、非ペプチドオリゴマー、または化合物の低分子ライブラリに応用可能である（ラム（Ｌａｍ， Ｋ．Ｓ．）、Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓ． １９９７、１２：１４５）。
【０１９６】
活性に関してスクリーニングすることができる例示的な化合物には、ペプチド、核酸、炭水化物、有機低分子（例えば、ポリケチド）（ケイン（Ｃａｎｅ）ら、１９９８、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８２：６３）、および天然物抽出ライブラリが含まれるが、これらに限定されない。一つの態様において、試験化合物はペプチドまたはペプチド模倣体である。もう一つの好ましい態様において、化合物は、低分子の有機非ペプチド化合物である。
【０１９７】
分子ライブラリを合成するための他の例示的な方法は、当技術分野において、例えば；エルブら（Ｅｒｂ、１９９４、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９１：１１４２２）；ホーウェルら（Ｈｏｒｗｅｌｌ、１９９６、Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ３３：６８）；およびギャロップら（Ｇａｌｌｏｐ、１９９４、Ｊ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． ３７：１２３３）に認められる。化合物のライブラリは、溶液（例えば、ホーテン（Ｈｏｕｇｈｔｅｎ）、１９９２、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １３：４１２〜４２１）、またはビーズ（ラム（Ｌａｍ）、１９９１、Ｎａｔｕｒｅ ３５４：８２〜８４）、チップ（フォドー（Ｆｏｄｏｒ）、１９９３、Ｎａｔｕｒｅ ３６４：５５５〜５５６）、細菌（ラドナー（Ｌａｄｎｅｒ）、米国特許第５，２２３，４０９号）、胞子（ラドナー（Ｌａｄｎｅｒ）、米国特許第’４０９号）、プラスミド（カル（Ｃｕｌｌ）ら、１９９２、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８９：１８６５〜１８６９）またはファージ（スコットおよびスミス（Ｓｃｏｔｔ ａｎｄ Ｓｍｉｔｈ）、１９９０、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：３８６〜３９０；デブリン（Ｄｅｖｌｉｎ）、１９９０、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：４０４〜４０６；クワーラ（Ｃｗｉｒｌａ）ら、１９９０、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８７：６３７８〜６３８２；フェリチ（Ｆｅｌｉｃｉ）、１９９１、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２２２：３０１〜３１０；ラドナー（Ｌａｄｎｅｒ）、上記）の形であってもよい。他の種類のペプチドライブラリ、例えば、米国特許第５，２７０，１８１号および第５，２９２，６４６号にみられるように発現させてもよい。なおもう一つの態様において、組み合わせポリペプチドはｃＤＮＡライブラリから作製することができる。
【０１９８】
アゴニストまたはアンタゴニストの有効性は、試験調節物質の様々な濃度を用いて得られたデータから用量反応曲線を作製することによって評価することができる。その上、比較のための基準値を提供するために対照アッセイ法も同様に実施できる。以下に詳細に説明するように、細胞全体または細胞不含アッセイ系のいずれかを用いることができる。
【０１９９】
１．細胞全体のアッセイ法
本発明の一つの態様において、本スクリーニングアッセイ法は、細胞全体を用いて行うことができる。本発明の一つの態様において、化合物が、ＮＩＭＲポリペプチドの活性または発現を減少させるか否かを決定する段階は、ＮＩＭＲポリペプチドを発現する細胞を化合物に接触させる段階、およびＮＩＭＲポリペプチドの活性または発現を調節する化合物の能力を測定する段階を含む。
【０２００】
もう一つの態様において、ＮＩＭＲポリペプチド発現の調節物質は、細胞を候補化合物と接触させて、細胞におけるＮＩＭＲポリペプチドｍＲＮＡまたはタンパク質の発現を決定する方法において同定される。候補化合物の存在下でのＮＩＭＲポリペプチドｍＲＮＡまたはタンパク質の発現レベルを、候補化合物の非存在下でのＮＩＭＲポリペプチドｍＲＮＡまたはポリペプチドの発現レベルと比較する。次に、この比較に基づいて、候補化合物はＮＩＭＲポリペプチド発現の調節物質であると同定することができる。例えば、ＮＩＭＲポリペプチドｍＲＮＡまたはタンパク質の発現が候補化合物の非存在下より存在下において大きい場合（例えば、統計学的に有意に大きい場合）、候補化合物は、ＮＩＭＲポリペプチドｍＲＮＡまたはタンパク質発現の刺激物質として同定される。または、ＮＩＭＲポリペプチドｍＲＮＡまたはタンパク質の発現が候補化合物の存在下において非存在下より小さい場合（例えば、統計学的に有意に小さい場合）、候補化合物はＮＩＭＲ ｍＲＮＡまたはタンパク質発現の阻害物質であると同定される。細胞におけるＮＩＭＲ ｍＲＮＡまたはタンパク質発現レベルは、ＮＩＭＲ ｍＲＮＡまたはタンパク質を検出するために本発明に記載した方法によって決定することができる。
【０２０１】
ＮＩＭＲポリペプチドの発現を測定するために、ＮＩＭＲ核酸分子遺伝子の転写を、化合物によって処置していない対照細胞において測定して、化合物によって処置した試験細胞の転写と比較することができる。例えば、内因性のＮＩＭＲポリペプチドを発現する細胞、または組換えＮＩＭＲポリペプチドを発現もしくは過剰発現するように操作された細胞に、試験物質によって媒介される標的細胞によるＮＩＭＲポリペプチド反応の調節に関して採点するアッセイ法によって、関心対象の試験調節物質の存在下および非存在下で組換えＮＩＭＲポリペプチドを発現または過剰発現させることができる。例えば、細胞不含アッセイ法と同様に、変化、例えばＮＩＭＲポリペプチド依存的反応における統計学的に有意な変化（増加または減少のいずれか）を生じる調節物質を同定することができる。
【０２０２】
ＮＩＭＲポリペプチドの発現のために用いることができる組換え発現ベクターは当技術分野で既知である（上記のように）。一つの態様において、発現ベクターにおいて、指標細胞（複数）においてＮＩＭＲポリペプチドを構成的または誘導的に発現させる調節配列に、ＮＩＭＲポリペプチドコード配列を機能的に結合させる。細胞においてＮＩＭＲポリペプチドを構成的または誘導的に発現させる組換え発現ベクターを用いることは、ＮＩＭＲポリペプチドの活性を増強または阻害する化合物を同定するために好ましい。もう一つの態様において、発現ベクターにおいて、ＮＩＭＲポリペプチドコード配列を、内因性のＮＩＭＲポリペプチド遺伝子の調節配列（すなわち、内因性遺伝子に由来するプロモーター調節領域）に機能的に結合する。ＮＩＭＲポリペプチド発現が内因性の調節配列によって制御される組換え発現ベクターを用いることは、ＮＩＭＲポリペプチドの転写発現を増強または阻害する化合物を同定するために好ましい。
【０２０３】
一つの態様において、転写レベルは、細胞が産生したＲＮＡ量を測定することによって決定することができる。例えば、ＮＩＭＲポリペプチドを発現し、化合物の存在下または非存在下でインキュベートされた細胞からＲＮＡを単離することができる。次に、検出される配列に対して特異的なプローブを用いるノザンブロットを、当技術分野で既知の技術を用いて実施できる。他の多数の当技術分野で認められた技術を用いることができる。例えば、ウェスタンブロット分析を用いてＮＩＭＲに関して調べることができる。例えば、もう一つの態様において、特異的ＲＮＡ分子の転写は、例えば、測定されるＲＮＡ転写物のｃＤＮＡコピーを作製して、それらを増幅および測定することによって、ポリメラーゼ連鎖反応を用いて検出することができる。もう一つの態様において、Ｓ１ヌクレアーゼマッピングまたはＲＮａｓｅマッピングのようなＲＮＡアーゼ保護アッセイ法を用いて、遺伝子の転写レベルを検出することができる。もう一つの態様において、プライマー伸長を用いることができる。
【０２０４】
さらに他の態様において、ＮＩＭＲポリペプチドの転写または翻訳に変化を誘導する化合物の能力は、細胞が産生したＮＩＭＲポリペプチドの量を測定することによって達成することができる。検出することができるポリペプチドには、例えば、内因性の配列およびレポーター遺伝子配列の双方を含む、ＮＩＭＲ反応性プロモーターの活性化の際に産生される如何なるポリペプチドも含まれる。一つの態様において、細胞が産生するポリペプチドの量は、そのポリペプチドに対する抗体を用いて検出することができる。他の態様において、そのようなポリペプチドの活性を測定することができる。
【０２０５】
一つの態様において、ＮＩＭＲプロモーターによって調節される他の配列（例えば、表１に示すＮＩＭＲ遺伝子の発現を調節するプロモーターと配列同一性を有するプロモーター）を検出することができる。一つの態様において、ＮＩＭＲプロモーターによって通常調節されない配列を、それらをＮＩＭＲポリペプチドの転写を調節するプロモーターに結合させることによってアッセイすることができる。
【０２０６】
好ましい態様において、ＮＩＭＲプロモーターからの転写の従来の読み出しを提供するために、そのようなプロモーターを、その転写が容易に検出されるレポーター遺伝子に結合させる。例えば、細菌細胞、例えば大腸菌細胞をコーエンら（Ｃｏｈｅｎ、１９９３、Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １７５：７８５６）に教示されるように形質転換することができる。
【０２０７】
レポーター遺伝子の例には、ＣＡＴ（クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ）（アルトンおよびバプネック（Ａｌｔｏｎ ａｎｄ Ｖａｐｎｅｋ）、１９７９、Ｎａｔｕｒｅ ２８２：８６４〜８６９）、ルシフェラーゼ、およびβ−ガラクトシダーゼ；蛍のルシフェラーゼ（デウェットら（ｄｅ Ｗｅｔ、１９８７、Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． ７：７２５〜７３７）；細菌のルシフェラーゼ（エンゲブレヒトおよびシルバーマン（Ｅｎｇｅｂｒｅｃｈｔ ａｎｄ Ｓｉｌｖｅｒｍａｎ）、１９８４、ＰＮＡＳ １：４１５４〜４１５８；ボルディンら（Ｂａｌｄｗｉｎ）、１９８４、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２３：３６６３〜３６６７）；アルカリホスファターゼのＰｈｏＡ（トウら（Ｔｏｈ）、１９８９、Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． １８２：２３１〜２３８；ホールら（Ｈａｌｌ）、１９８３、Ｊ． Ｍｏｌ． Ａｐｐｌ． Ｇｅｎ． ２：１０１）、ヒト胎盤分泌アルカリホスファターゼ（カレンおよびマリム（Ｃｕｌｌｅｎ ａｎｄ Ｍａｌｉｍ）、１９９２、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ． ２１６：３６２〜３６８）、および緑色蛍光ポリペプチド（米国特許第５，４９１，０８４号；国際公開公報第９６／２３８９８号）のようなその他の酵素検出系が含まれるがこれらに限定されない。
【０２０８】
さらにもう一つの態様において、ＮＩＭＲポリペプチド活性を調節する（例えば、環境ストレスに対する微生物の反応を調節し、それによってストレスに対する微生物の適応および／または微生物のビルレンスを調節する）化合物の能力は、化合物の、薬物に対する微生物の適応能に影響を及ぼす能力を測定することによって（例えば薬物の存在下で微生物が増殖する能力を試験することによって）、調べることができる。例えば、指標化合物の最小生育阻止濃度（ＭＩＣ）を調節する試験化合物の能力を調べることができる。そのようなアッセイ法は、標準的な方法を用いて、例えば抗生物質ディスクアッセイ法または自動増殖アッセイ法、例えばバイテック社から販売されているような系を用いて実施できる。一つの態様において、方法は、一つまたはそれ以上の非抗生物質の存在下で微生物の増殖を調節する化合物の能力を検出する段階を含む。もう一つの態様において、方法は、一つまたはそれ以上の抗体の存在下で微生物の増殖を調節する化合物の能力を検出する段階を含む。
【０２０９】
もう一つの態様において、細胞からの薬物の流出を調節する試験化合物の能力を調べることができる。この方法において、微生物を指標化合物（指標化合物は細胞によって通常搬出される化合物である）の存在下、または非存在下で試験化合物に接触させる。流出ポンプの活性を阻害する試験化合物の能力は、試験化合物または指標化合物（例えば薬物または色素）の細胞内濃度が、試験化合物の存在下で上昇するか否かを決定することによって証明される。指標化合物の細胞内濃度が試験化合物の非存在下での細胞内濃度と比較して試験化合物の存在下で増加すれば、試験化合物は流出ポンプの阻害剤であると同定することができる。このように、微生物に存在する流出ポンプが指標化合物を輸出する能力に試験化合物が影響を及ぼすことを示すことによって、試験化合物が流出ポンプの阻害剤であるか否かを決定することができる。
【０２１０】
指標化合物の「細胞内濃度」には、微生物の最も外側の膜の内部の指標化合物の濃度が含まれる。微生物の最も外側の膜は、例えば細胞質膜でありうる。グラム陰性菌の場合、関連する「細胞内濃度」は、指標化合物が局在する細胞空間、例えば指標化合物の標的を含む細胞空間における濃度である。
【０２１１】
一つの態様において、方法は、微生物における抗生物質耐性を減少させる化合物の能力を検出することを含む。例えば、一つの態様において、指標化合物は抗生物質を含み、微生物における抗生物質の細胞内濃度に及ぼす試験化合物の影響を測定する。一つの態様において、抗生物質の細胞内濃度の増加は、例えば微生物細胞の抽出物中で直接測定することができる。例えば、放射標識抗生物質の蓄積は、標準的な技術を用いて決定することができる。例えば、微生物は、試験化合物の存在下および非存在下で指標組成物である放射標識抗生物質に接触させることができる。細胞内部の抗生物質濃度は、２つの群から細胞を採取して（試験化合物を含む群と含まない群）、液体シンチレーションカウンターによって細胞関連放射活性を測定することによって、平衡時に測定することができる。もう一つの態様において、抗生物質の細胞内濃度の増加は、例えば、微生物に接触させた場合に抗生物質の所定の濃度が試験化合物の存在下で微生物の増殖を阻害するために十分であるが、試験化合物の非存在下では十分でないことを示すことによって、間接的に測定することができる。
【０２１２】
もう一つの態様において、指標化合物の細胞内濃度の測定は、分光的手段によって容易に検出可能な指標化合物を用いることによって促進することができる。そのような化合物は、例えば塩基性色素などの色素、または蛍光体であってもよい。例示的な指標化合物には、アクリジン、エチジウムブロマイド、ゲンチアナバイオレット、マラカイトグリーン、メチレンブルー、ビーンジン（ｂｅｅｎｚｙｎ）ビオロゲン、ブロモチモールブルー、トルイジンブルー、メチレンブルー、ローズベンガル、アリューシャンブルー、ルテニウムレッド、ファストグリーン、アニリンブルー、キシレンシアノール、ブロモフェノールブルー、クーマシーブルー、ブロモクレゾールパープル、ブロモクレゾールグリーン、トリパンブルー、およびフェノールレッドが含まれる。
【０２１３】
そのようなアッセイ法において、試験化合物が細胞の指標化合物排出能に及ぼす影響は、分光的に測定することができる。例えば、色素または蛍光体の細胞内濃度は、浮遊培地中の指標化合物の濃度を決定することによって、または細胞における指標化合物の濃度を決定することによって、間接的に決定することができる。これは、例えば、細胞から指標化合物を抽出することによって、または細胞自身の肉眼的検査によって実施できる。
【０２１４】
もう一つの態様において、微生物における指標化合物の存在は、指標化合物の存在に対して感受性があるレポーター遺伝子を用いて検出することができる。例示的なレポーター遺伝子は、当技術分野で既知である。例えば、レポーター遺伝子によって指標化合物の存在の比色法（ｃｏｌｏｒｏｍｅｔｒｉｃ）による読出し、または酵素的読出しを提供できる。さらにもう一つの態様において、その発現が微生物における薬物の存在によって誘導されるレポーター遺伝子を用いることができる。例えば、微生物は、推定の試験化合物の存在下で、または非存在下で試験化合物の存在下で増殖することができる。流出ポンプが阻害されている細胞では、薬物の濃度は増加して、レポーター遺伝子構築物が発現されるであろう。この方法では、薬物の流出速度の阻害能、ゆえに、レポーター遺伝子発現の誘導能によって流出ポンプ阻害剤を同定する。
【０２１５】
もう一つの態様において、抗生物質を含まない指標化合物を用いる一次スクリーニングアッセイ法を用いる。一つの態様において、試験化合物の細胞内濃度を増加させる試験化合物が同定されると、関係薬物に対する感受性、例えば抗生物質耐性に及ぼす同じ試験化合物の作用を測定する二次スクリーニングアッセイ法を行う。
【０２１６】
なおもう一つの態様において、ＮＩＭＲ結合ポリペプチドに対するＮＩＭＲポリペプチドの結合を調節する化合物の能力を決定することができる。ＮＩＭＲ結合ポリペプチドは、当技術分野で既知の技術を用いて同定することができる。例えば、ＮＩＭＲポリペプチドと相互作用する結合ポリペプチドの場合、相互作用トラップアッセイ法または二重ハイブリッドスクリーニングアッセイ法を用いることができる。
【０２１７】
ＮＩＭＲ結合ポリペプチドは、ＮＩＭＲポリペプチドに結合または相互作用して、ＮＩＭＲ活性に関与する他のタンパク質（「ＮＩＭＲ−結合ポリペプチド」）を同定するために、例えば、二重ハイブリッドアッセイ法または三重ハイブリッドアッセイ法において本発明のＮＩＭＲポリペプチドまたはその一部を「ベイト（ｂａｉｔ）タンパク質」として用いることによって（例えば、米国特許第５，２８３，３１７号；ゼルボス（Ｚｅｒｖｏｓ）ら（１９９３）Ｃｅｌｌ ７２：２２３〜２３２；マデュラら（Ｍａｄｕｒａ）、（１９９３）、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６８：１２０４６〜１２０５４；バーテルら（Ｂａｒｔｅｌ）、（１９９３）、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １４：９２０〜９２４；イワブチ（Ｉｗａｂｕｃｈｉ）ら（１９９３）、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ８：１６９３〜１６９６；およびブレント（Ｂｒｅｎｔ）の国際公開公報第９４／１０３００号を参照のこと）、同定することができる。そのようなＮＩＭＲファミリー結合ポリペプチドはまた、ＮＩＭＲポリペプチドによるシグナルの伝達に関係する、またはＮＩＭＲポリペプチドに会合してその活性を増強もしくは阻害する可能性がある。
【０２１８】
二重ハイブリッドシステムは、分離可能なＤＮＡ結合および活性化ドメインからなるほとんどの転写因子のモジュラー特性に基づいている。簡単に説明すると、アッセイ法は２つの異なるＤＮＡ構築物を利用する。一つの構築物において、ＮＩＭＲポリペプチドをコードする遺伝子を、既知の転写因子（例えば、ＧＡＬ−４）のＤＮＡ結合ドメインをコードする遺伝子に融合する。他の構築物において、同定されていないタンパク質（「プレイ（ｐｒｅｙ）」または「試料」）をコードするＤＮＡ配列のライブラリからのＤＮＡ配列を、既知の転写因子の活性化ドメインをコードする遺伝子に融合させる。「バイト」および「プレイ」タンパク質がインビボで相互作用して、ＮＩＭＲポリペプチド依存性複合体を形成することができれば、転写因子のＤＮＡ結合ドメインおよび活性化ドメインはより近位に近づく。この近位性によって、転写因子に反応性の転写調節部位に機能的に結合しているレポーター遺伝子（例えば、ＬａｃＺ）が転写しうる。レポーター遺伝子の発現を検出することができ、機能的転写因子を含む細胞コロニーを単離して、これを用いてＮＩＭＲポリペプチドと相互作用するポリペプチドをコードするクローニングされた遺伝子を得ることができる。
【０２１９】
ＮＩＭＲ結合ポリペプチドはまた、他の方法で同定してもよい。例えば、分子のライブラリをＮＩＭＲ結合ポリペプチドの存在に関して調べることができる。一つの態様において、分子のライブラリは、それらを発現ベクター、例えばバクテリオファージで発現させることによって調べることができる。バクテリオファージは、それぞれのポリペプチド配列がバクテリオファージ内に含まれる核酸によってコードされる、複数のポリペプチド配列をその表面に提示することができる。これらの候補ＮＩＭＲ結合ポリペプチドを発現するファージは、ＮＩＭＲポリペプチドに対して親和性を有するポリペプチドを得るために、固定されたＮＩＭＲポリペプチドとの結合能に関して調べることができる。例えば、方法には、ＮＩＭＲポリペプチドが異なるポリペプチド配列と相互作用し、ＮＩＭＲポリペプチドに対して親和性を有するポリペプチドに結合して、固定されたＮＩＭＲポリペプチドと結合したバクテリオファージとからなる複合体のセットを形成することができるように、ＮＩＭＲポリペプチドをバクテリオファージのライブラリの試料に接触させる段階が含まれうる。複合体を形成しない複合体を分離することができる。ＮＩＭＲポリペプチドと結合したバクテリオファージとの複合体を、結合したバクテリオファージを複合体から解離させる物質に接触させることができ、およびＮＩＭＲポリペプチドに対して親和性を有する提示されたポリペプチドのアミノ酸配列が得られるように、解離したバクテリオファージを単離して、提示されたポリペプチドをコードする核酸分子の配列を得ることができる。
【０２２０】
ＮＩＭＲ核酸分子の場合、ＮＩＭＲ結合ポリペプチドは、例えば、抽出物の成分をＮＩＭＲヌクレオチド配列と相互作用させる条件で、ＮＩＭＲヌクレオチド配列を候補ＮＩＭＲ結合ポリペプチド（例えば、微生物抽出物の形で）に接触させることによって、同定することができる。次に、成分と相互作用するＮＩＭＲヌクレオチド配列の能力を測定して、それによってＮＩＭＲヌクレオチド配列に結合するポリペプチドを同定することができる。
【０２２１】
２．細胞不含アッセイ法
本発明のスクリーニング方法は、例えばハイスループット技術を用いるような細胞不含アッセイ法を含みうる。例えば、アゴニストまたはアンタゴニストに関してスクリーニングするために、ＮＩＭＲ分子とそのようなポリペプチドの標識基質またはリガンドとを含む合成反応混合物を、アゴニストまたはアンタゴニストとなる可能性がある候補分子の非存在下または存在下でインキュベートする。一つの態様において、反応混合物はさらに、膜、細胞エンベロープ、または細胞壁のような細胞分画、またはその組み合わせを含みうる。ＮＩＭＲポリペプチドに対してアゴニストまたはアンタゴニストとして作用する試験化合物の能力は、ＮＩＭＲ結合ポリペプチドに対するＮＩＭＲポリペプチドの結合が減少すること、またはＮＩＭＲポリペプチド活性が減少することに反映される。
【０２２２】
調節物質および天然抽出物の試験ライブラリに関する多くの薬物スクリーニングプログラムにおいて、所定の期間内に調べる調節物質の数を最大限にするためにはハイスループットアッセイ法が望ましい。精製または半精製タンパク質に由来するような、細胞不含系において行われるアッセイ法はしばしば、試験調節物質によって媒介される分子標的における変化が迅速に展開し、比較的容易に検出しうるという点において、「一次」スクリーニングとして好ましい。その上、試験調節物質の細胞毒性および／または生物学的利用能の影響は、インビトロ系において一般的に無視されうる。
【０２２３】
一つの態様において、化合物のＮＩＭＲポリペプチド活性の調節能は、細胞不含系において単離されたＮＩＭＲポリペプチドまたはＮＩＭＲ核酸分子を用いて得られる。そのようなアッセイ法において、ＮＩＭＲポリペプチドの活性を調節する化合物の能力を測定する段階は、例えば、ＮＩＭＲポリペプチドもしくはＮＩＭＲ核酸分子に対する化合物の直接結合を測定することによって、またはＮＩＭＲポリペプチドが通常結合する分子（例えば、タンパク質またはＤＮＡ）に対するＮＩＭＲポリペプチドの結合能を変化させる化合物の能力を測定することによって行われる。
【０２２４】
さらにもう一つの態様において、本発明のアッセイ法は、ＮＩＭＲポリペプチドまたはその一部を試験化合物に接触させて、試験化合物がＮＩＭＲポリペプチドまたはその生物活性断片に対する試験化合物の結合能を決定する細胞不含アッセイ法である。ＮＩＭＲポリペプチドの活性を調節する試験化合物の能力を決定することは、例えば、直接結合を決定するために先に記述した方法の一つによってＮＩＭＲ標的分子に対するＮＩＭＲポリペプチドの結合能を決定することによって行うことができる。ＮＩＭＲ標的分子に対するＮＩＭＲポリペプチドの結合能を決定することはまた、リアルタイムの生体分子相互作用分析（ＢＩＡ）のような技術を用いて行うこともできる。シェランダーおよびウルバニクスキー（Ｓｊｏｌａｎｄｅｒ， Ｓ． ａｎｄ Ｕｒｂａｎｉｃｚｋｙ， Ｃ．、（１９９１）、Ａｎａｌ． Ｃｈｅｍ． ６３：２３３８〜２３４５）およびスザボら（Ｓｚａｂｏ、（１９９５）、Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｓｔｒｕｃｔ． Ｂｉｏｌ． ５：６９９〜７０５）。本明細書において用いられるように、「ＢＩＡ」は、如何なる相互作用物質も標識せずに、リアルタイムでの生体特異的相互作用を調べるための技術（例えばＢＩＡコア）である。表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）の光学的現象の変化を、生体分子間のリアルタイム相互作用の指標として用いることができる。
【０２２５】
さらにもう一つの態様において、細胞不含アッセイ法は、ＮＩＭＲポリペプチドに結合してアッセイ混合物を形成する既知の化合物に、ＮＩＭＲポリペプチドまたはその生物活性部分を接触させる段階、アッセイ混合物を試験化合物に接触させる段階、およびＮＩＭＲポリペプチドと相互作用する試験化合物の能力を決定する段階が、ＮＩＭＲ標的分子に選択的に結合するまたはＮＩＭＲ標的分子の活性を調節するＮＩＭＲポリペプチドの能力を決定する段階を含めた、ＮＩＭＲポリペプチドと相互作用する試験化合物の能力を決定する段階を含む。
【０２２６】
本発明の細胞不含アッセイ法では、タンパク質の可溶性および／または膜結合型の双方（例えば、ＮＩＭＲポリペプチドまたはＮＩＭＲ結合ポリペプチド）を用いることができる。ポリペプチドの膜結合型を用いる細胞不含アッセイ法の場合、ポリペプチドの膜結合型が溶液中に維持されるように可溶化剤を利用することが望ましい場合がある。そのような可溶化剤の例には、ｎ−オクチルグルコシド、ｎ−ドデシルグルコシド、ｎ−ドデシルマルトシド、オクタノイル−Ｎ−メチルグルカミド、デカノイル−Ｎ−メチルグルカミド、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１１４、Ｔｈｅｓｉｔ（登録商標）、イソトリデシポリ（エチレングリコールエーテル）ｎ、３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアミニオ］−１−プロパンスルホネート（ＣＨＡＰＳ）、３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアミニオ］−２−ヒドロキシ−１−プロパンスルホネート（ＣＨＡＰＳＯ）、またはＮ−ドデシル＝Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホネートのような非イオン性洗剤が含まれる。
【０２２７】
例えば、化合物は、例えば、標識化合物、例えば放射活性標識化合物を用いることによって、ＮＩＭＲ核酸分子もしくはＮＩＭＲポリペプチドまたはその一部に直接結合するか否かに関して調べることができる。例えば、ＮＩＭＲポリペプチド配列は、バクテリオファージによって発現させることができる。この態様において、ＮＩＭＲポリペプチドを提示するファージを、ポリペプチドが化合物と相互作用しておそらく化合物との複合体を形成するように、化合物に接触させるであろう。次に、化合物と複合体を形成したファージを、複合体を形成していないファージから分離することができる。次に、ポリペプチドと化合物との複合体を、バクテリオファージを化合物から解離させる物質に接触させることができる。ポリペプチドに結合した如何なる化合物も単離および同定することができる。
【０２２８】
もう一つの態様において、ＮＩＭＲ核酸分子に対する化合物の結合能を測定することができる。例えば、ゲルシフトアッセイ法または制限酵素保護アッセイ法を用いることができる。ゲルシフトアッセイ法は、非変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動によってポリペプチド−ＤＮＡ複合体を遊離のＤＮＡから分離する。そのような実験において、ＤＮＡに対する化合物の結合レベルを決定して、化合物の非存在下でのレベルと比較することができる。この結合レベルを変化させる化合物は、ＮＩＭＲポリペプチドの活性を調節するとしてスクリーニングにおいて選択される。
【０２２９】
ＤＮＡに対するタンパク質の結合能をアッセイする他の方法、例えばＤＮＡフットプリンティング、およびヌクレアーゼ保護もまた、当技術分野で周知であり、ＮＩＭＲヌクレオチド配列に対する化合物の結合能を調べるために用いることができる。
【０２３０】
もう一つの態様において、本発明は、例えばＮＩＭＲ核酸分子に結合し遺伝子転写を妨害する試験化合物に関してアッセイすることにより、抗生物質耐性を調節する化合物を同定する方法を提供する。
【０２３１】
もう一つの態様において、ＮＩＭＲ核酸分子とＮＩＭＲ結合ポリペプチドとの相互作用を遮断する化合物を同定するために、ＮＩＭＲ核酸分子およびそのヌクレオチド配列に通常結合するＮＩＭＲ結合ポリペプチドを試験化合物と接触させる。例えば、一つの態様において、ＮＩＭＲヌクレオチド配列および／またはＮＩＭＲ結合ポリペプチドは、化合物を少なくとも一つのＮＩＭＲ核酸分子およびＮＩＭＲ結合ポリペプチドと相互作用させる条件で接触させる。化合物がＮＩＭＲヌクレオチド配列とＮＩＭＲ結合ポリペプチドとの相互作用を調節する能力は、ＮＩＭＲポリペプチド活性の調節能の指標とされる。
【０２３２】
ＮＩＭＲポリペプチドのＮＩＭＲ結合ポリペプチドに結合する、または相互作用する能力を決定することは、例えば、直接結合によって行うことができる。直接結合アッセイ法において、ＮＩＭＲポリペプチドは、ＮＩＭＲポリペプチド標的分子に対するＮＩＭＲポリペプチドの結合が、複合体における標識したＮＩＭＲポリペプチドの検出によって検出することができるように、放射性同位元素または酵素標識にカップリングさせることができる。例えば、ＮＩＭＲポリペプチドは、１２５Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃ、または３Ｈによって直接または間接的に標識することができ、放射性同位元素は、放射線放出の直接計数またはシンチレーション計数によって検出することができる。または、ＮＩＭＲポリペプチド分子は、例えば、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、またはルシフェラーゼによって酵素的に標識することができ、酵素標識は、適当な基質の産物への変換を測定することによって検出することができる。
【０２３３】
典型的に、ＮＩＭＥポリペプチド、ＮＩＭＲ結合ポリペプチド、または非複合体からの複合体の分離を容易にする化合物のいずれかを固定すると共に、アッセイ法を自動化することが望ましいと思われる。候補物質の存在下および非存在下での上流または下流の結合ポリペプチドに対するＮＩＭＲポリペプチドの結合は、反応物質を含むのに適している如何なる血管においても行うことができる。例には、マイクロタイタープレート、試験管、および微量遠心管が含まれる。一つの態様において、ポリペプチドをマトリクスに結合させるドメインを付加した融合タンパク質を提供することができる。例えば、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ／ＮＩＭＲポリペプチド（ＧＳＴ／ＮＩＭＲポリペプチド）融合タンパク質をグルタチオンセファロースビーズ（シグマケミカル社、セントルイス、ミズーリ州）またはグルタチオン誘導マイクロタイタープレートに吸着させ、これを次に例えば３５Ｓ−標識した細胞溶解物および試験調節物質と合わせて、混合物を、複合体が形成される条件、わずかによりストリンジェントな条件が望ましいが、例えば塩およびｐＨに関して生理的条件でインキュベートすることができる。インキュベーションの後、ビーズを洗浄して標識未結合のビーズを除去し、固定され、放射標識されたマトリクスを直接（例えば、シンチラント中のビーズ）または複合体をその後解離させた後の上清において測定する。または、複合体をマトリクスから解離させ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、ビーズ分画に認められるＮＩＭＲポリペプチド結合ポリペプチドのレベルを標準的な電気泳動技術を用いて、ゲルから定量する。
【０２３４】
タンパク質をマトリクス上に固定する他の技術もまた、本発明のアッセイ法において用いることができる。例えば、ＮＩＭＲポリペプチドまたはそれが結合するポリペプチドのいずれかにビオチンおよびストレプトアビジン結合させて固定することができる。例えば、ビオチン結合ＮＩＭＲポリペプチド分子は、当技術分野で周知の技術を用いて（例えば、ビオチン化キット、ピアスケミカルズ社、ロックフォード、イリノイ州）ビオチン−ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシ−スクシニミド）から調製して、ストレプトアビジンをコートした９６ウェルプレートのウェルに固定することができる。または、ＮＩＭＲポリペプチドに反応するが、上流または下流のエレメントの結合を妨害しない抗体をプレートのウェルに誘導体化することができ、抗体結合によってＮＩＭＲポリペプチドをウェルに捕獲する。上記のように、ＮＩＭＲポリペプチド結合ポリペプチドおよび試験調節物質の調製物を、プレートのＮＩＭＲポリペプチド提示ウェルにおいてインキュベートして、ウェルに捕獲された複合体の量を定量することができる。そのような複合体を検出するための例示的な方法は、ＧＳＴ固定複合体に関して先に述べた方法の他に、ＮＩＭＲ結合ポリペプチドと反応する抗体またはＮＩＭＲポリペプチドと反応して結合ポリペプチドと競合する抗体を用いた複合体の免疫学的検出が含まれると共に、内因性または外因性活性であれ、結合ポリペプチドに関連した酵素活性の検出に依存する酵素結合アッセイ法が含まれる。後者の場合、酵素は化学的に結合させるか、またはＮＩＭＲ結合ポリペプチドとの融合タンパク質として提供することができる。説明すると、ＮＩＭＲポリペプチドは、ホースラディッシュペルオキシダーゼと化学的にクロスリンクさせるか、または遺伝子的に融合させることができ、複合体に捕獲されたタンパク質の量は、酵素の発色原基質、例えば３，３’−ジアミノ−ベンザジン四塩酸、または４−クロロ−１−ナフトールによって評価することができる。同様に、タンパク質とグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼとを含む融合タンパク質を提供することができ、１−クロロ−２，４−ジニトロベンゼンを用いてＧＳＴ活性を検出することによって複合体形成を定量することができる（ハビグ（Ｈａｂｉｇ）ら（１９７４）、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２４９：７１３０）。
【０２３５】
複合体に捕獲されたタンパク質の一つを定量するために免疫検出に依存する過程に関して、抗ＮＩＭＲポリペプチド抗体のようなポリペプチドに対する抗体を用いることができる。または、複合体において検出されるポリペプチドは、ＮＩＭＲポリペプチド配列の他に、それに対する抗体が容易に入手できる（例えば、販売元から）第二のポリペプチドを含む融合タンパク質の形で「エピトープによるタグをつける」ことができる。例えば、上記のＧＳＴ融合タンパク質はまた、ＧＳＴ部分に対する抗体を用いて結合を定量するために用いることができる。その他の有用なエピトープタグには、ｃ−ｍｙｃからの１０残基配列が含まれるｍｙｃ−エピトープ（例えば、エリソン（Ｅｌｌｉｓｏｎ）ら、（１９９１）、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６６：２１１５０〜２１１５７を参照のこと）と共にｐＦＬＡＧシステム（インターナショナルバイオテクノロジーズインク）、またはｐＥＺＺ−プロテインＡシステム（ファルマシア、ニュージャージー州）が含まれる。
【０２３６】
如何なる相互作用物質も標識せずに、ＮＩＭＲポリペプチドとその標的分子との間の相互作用を調節する化合物の能力を決定することも本発明の範囲内である。例えば、ＮＩＭＲポリペプチドまたは標的分子のいずれかを標識することなく、ミクロフィジオメーターを用いてＮＩＭＲポリペプチドとその標的分子との相互作用を検出することができる（マコネル（ＭｃＣｏｎｎｅｌ， Ｈ． Ｍ．）ら、（１９９２）、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５７：１９０６〜１９１２）。本明細書において用いられるように、「ミクロフィジオメーター」（例えば、サイトセンサー）は、光によって位置特定可能な電位差測定センサー（ＬＡＰＳ）を用いて、細胞がその環境を酸化させる速度を測定する分析機器である。この酸化速度の変化を、化合物と受容体との相互作用の指標として用いることができる。
【０２３７】
本発明はさらに、上記のスクリーニングアッセイ法によって同定される新規物質に関する。したがって、例えばインビボまたはエクスビボで微生物における薬物耐性を減少させる方法において、本明細書に記載のように同定された物質をさらに用いることも本発明の範囲内である。例えば、本明細書に記載のように同定される物質（例えば、アンチセンスＮＩＭＲ核酸分子のようなＮＩＭＲ調節物質、ＮＩＭＲアゴニストもしくはＮＩＭＲアンタゴニスト、またはＮＩＭＲ特異的抗体）を動物モデルに用いて、そのような物質による処置の有効性、毒性、または副作用を決定することができる。または、本明細書に記載のように同定された物質は、そのような物質の作用機序を決定するために動物モデルに用いることができる。さらに、そのような物質は、治療方法（インビボもしくはエクスビボ）において、または環境における薬物耐性を減少させる方法において用いることができる。さらに、本発明は、本明細書に記載された治療に対して、上記のスクリーニングアッセイ法により同定された新規物質を用いることに関する。
【０２３８】
Ｃ．ワクチン
本発明のもう一つの局面は、ＮＩＭＲポリペプチドを含む微生物による感染症を改善もしくは防止するために、免疫応答を生じるため、および／または免疫応答を増強するために（例えば、抗体および／またはＴ細胞免疫応答）適当な、ＮＩＭＲ調節物質、またはその断片もしくは変異型を個体に接種することを含む、個体、特に哺乳類に免疫応答を誘導する方法に関する。本発明はまた、抗体および／または、例えばサイトカイン産生Ｔ細胞または細胞障害性Ｔ細胞を含むＴ細胞免疫応答を産生するような免疫応答を誘導するため、進行中の感染症を改善するため、または感染症を予防するために、ＮＩＭＲ分子、またはその断片もしくは変異型をインビボで発現させるために、ＮＩＭＲ分子またはその断片もしくは変異型の発現を指示する核酸ベクターをそのような個体に輸送することを含む、個体における免疫応答を誘導する方法にも関する。遺伝子を投与する一つの方法は、粒子へのコーティングまたはそれ以外の方法として望ましい細胞中に加速することによって行われる。そのような核酸ベクターは、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、改変核酸、またはＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドを含んでもよい。
【０２３９】
本発明のもう一つの局面は、個体に導入されると免疫応答を誘導する免疫学的組成物に関する。そのような組成物は、例えば、単離されたＮＩＭＲポリペプチドまたはＮＩＭＲ核酸分子を含みうる。免疫学的組成物は、治療的または予防的に用いてもよく、液性応答または細胞性免疫応答のいずれかが優勢であってもよい。
【０２４０】
一つの態様において、それ自身抗体は産生しないが第一のポリペプチドを安定化させて免疫原性および保護的特性を増強することができる第二のポリペプチドに、ＮＩＭＲポリペプチドまたはその断片を融合してもよい。このように、融合した組換えポリペプチドには、好ましくは、インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）からのリポタンパク質Ｄのような抗原性補助タンパク質、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）またはβ−ガラクトシダーゼ、比較的大きなタンパク質であって、ポリペプチドを可溶化し、かつＮＩＭＲ分子の産生および精製を促進し、ＮＩＭＲ分子と融合する第二のタンパク質がさらに含まれる。その上、第二のポリペプチドは、免疫系の全身的な刺激を提供するという意味においてアジュバントとして作用しうる。第二のポリペプチドは、ＮＩＭＲポリペプチドのアミノまたはカルボキシ末端のいずれかに結合しうる。
【０２４１】
本発明の核酸分子を遺伝的免疫に用いるには、好ましくは、筋肉へのプラスミドＤＮＡの直接注入（ウルフ（Ｗｏｌｆｆ）ら、Ｈｕｍ． Ｍｏｌ． Ｇｅｎｅｔ． １９９２、１：３６３；マンソープ（Ｍａｎｔｈｏｒｐｅ）ら、Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． １９６３：４、４１９）、特異的ポリペプチド担体と複合体を形成したＤＮＡの輸送（ウ（Ｗｕ）ら、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． １９８９：２６４、１６９８５）、リン酸カルシウムとＤＮＡとの共沈殿（ベンベニスティおよびレシェフ（Ｂｅｎｖｅｎｉｓｔｙ ａｎｄ Ｒｅｓｈｅｆ）、ＰＮＡＳ ＵＳＡ １９８６、８３：９５５１）、様々な形のリポソームへのＤＮＡの封入（カネダ（Ｋａｎｅｄａ）ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ １９８９：２４３、３７５）、粒子衝突（タン（Ｔａｎｇ）ら、Ｎａｔｕｒｅ １９９２、３５６：１５２）、アイゼンブラウン（Ｅｉｓｅｎｂｒａｕｎ）ら、ＤＮＡ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． １９９３、１２：７９１）ならびにクローニングしたレトロウイルスベクターを用いるインビボ感染（シーガー（Ｓｅｅｇｅｒ）ら、ＰＮＡＳ ＵＳＡ １９８４：８１、５８４９）のような適した輸送方法を用いることが考えられる。
【０２４２】
一つの態様において、サトウら（Ｓａｔｏ， Ｙ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７３：３５２（１９９６））によって記載されたような免疫刺激ＤＮＡ配列を、本発明と共に用いることができる。
【０２４３】
一つの態様において、ワクチン製剤は、本発明の免疫原性組換えポリペプチドを適した担体と共に含む。好ましくは、そのようなワクチンは、例えば、皮下、筋肉内、静脈内、または皮内投与である投与を含む、非経口的に投与される。非経口投与に適した製剤には、抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤および製剤を個体の体液、好ましくは血液と等張にする溶質を含みうる、水性および非水性滅菌注射液；ならびに懸濁剤または濃化剤を含みうる水性および非水性滅菌懸濁剤が含まれる。製剤は、単位用量または複数回投与容器、例えば密封アンプルおよびバイアルに入れてもよく、使用直前に滅菌液体担体を加えることのみを要する凍結乾燥状態で保存してもよい。ワクチン製剤にはまた、水中油型系、ミョウバン、または当技術分野で既知の他の系のような、製剤の免疫原性を増強するためのアジュバント系が含まれてもよい。用量はワクチンの比活性および患者の状態に依存して、日常的な実験によって容易に決定することができる。
【０２４４】
ＶＩ．ＮＩＭＲ調節物質を含む組成物
本発明の組成物は、少なくとも一つのＮＩＭＲ調節物質と、一つまたはそれ以上の薬学的に許容される担体（添加剤）および／または希釈剤とを含みうる。組成物にはまた、第二の抗菌剤、例えば抗菌剤化合物、好ましくは抗生物質または非抗生物質が含まれうる。
【０２４５】
下記により詳細に説明するように、組成物は、以下のために適合したものを含む、固体または液体の形で投与するために製剤化することができる：（ジョージおよびレビー（Ｇｅｏｒｇｅ， Ａ．Ｍ．， ａｎｄ Ｌｅｖｙ， Ｓ．Ｂ．）（１９８３）、Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １５５、５４１〜５４８）経口投与、例えば水薬（水性または非水性溶液または懸濁液）、錠剤、巨丸剤、粉剤、顆粒剤、ペースト；（コーエン、ヤンおよびレビー（Ｃｏｈｅｎ， Ｓ．Ｐ．， Ｙａｎ， Ｗ． ａｎｄ Ｌｅｖｙ， Ｓ．Ｂ．）（１９９３）、Ｊ． Ｉｎｆｅｃｔ． Ｄｉｓ． １６８、４８４〜４８８）例えば、滅菌溶液または懸濁液としての例えば皮下、筋肉内、または静脈内による非経口投与；（コーエン、ハクラーおよびレビー（Ｃｏｈｅｎ， Ｓ．Ｐ．， Ｈａｃｈｌｅｒ， Ｈ．， ａｎｄ Ｌｅｖｙ， Ｓ．Ｂ．）（１９９３）、Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １７５、１４８４〜１４９２）例えば、クリーム、軟膏、または皮膚に適用されるスプレーとしての局所適用；（スラビック、デイザーおよびミラー（Ｓｕｌａｖｉｃｋ， Ｍ．Ｃ．， Ｄａｚｅｒ， Ｍ．， ａｎｄ Ｍｉｌｌｅｒ， Ｐ．Ｆ．）（１９９７）、Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １７９、１８５７〜１８６６）例えば、ペッサリー、クリーム、フォーム、または坐剤としての膣内または直腸内；または（コーエン、レビー、フォールズおよびロスナー（Ｃｏｈｅｎ， Ｓ．Ｐ．， Ｌｅｖｙ， Ｓ．Ｂ．， Ｆｏｕｌｄｓ， Ｊ． ａｎｄ Ｒｏｓｎｅｒ， Ｊ．Ｌ．）（１９９３）、Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １７５：７８５６〜７８６２）例えば、化合物を含む水性エアロゾル、リポソーム調製物、または固体粒子としてのエアロゾル。
【０２４６】
本明細書において用いられる「薬学的に許容される担体」という句は、その生物学的作用に影響を及ぼさずに、本発明の抗菌剤または化合物を一つの臓器または体の一部から別の臓器または体の一部に運ぶまたは輸送することを含む、液体もしくは固体増量剤、希釈剤、賦形剤、溶媒、または封入材料のような薬学的に許容される材料、組成物または媒体を意味する。それぞれの担体は、組成物の他の成分と適合性で、被験者に対して有害でないという意味において「許容される」べきである。薬学的に許容される担体として作用しうるいくつかの例の材料には：（ジョージおよびレビー（Ｇｅｏｒｇｅ， Ａ．Ｍ．， ａｎｄ Ｌｅｖｙ， Ｓ．Ｂ．）（１９８３）、Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １５５、５４１〜５４８）乳糖、ブドウ糖、およびショ糖のような糖；（コーエン、ヤンおよびレビー（Ｃｏｈｅｎ， Ｓ．Ｐ．， Ｙａｎ， Ｗ． ａｎｄ Ｌｅｖｙ， Ｓ．Ｂ．）（１９９３）、Ｊ． Ｉｎｆｅｃｔ． Ｄｉｓ． １６８、４８４〜４８８）コーンスターチおよびジャガイモデンプンのようなデンプン；（コーエン、ハクラーおよびレビー（Ｃｏｈｅｎ， Ｓ．Ｐ．， Ｈａｃｈｌｅｒ， Ｈ．， ａｎｄ Ｌｅｖｙ， Ｓ．Ｂ．）（１９９３）、Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １７５、１４８４〜１４９２）カルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロース、および酢酸セルロースのようなセルロースおよびその誘導体；（スラビック、デイザーおよびミラー（Ｓｕｌａｖｉｃｋ， Ｍ．Ｃ．， Ｄａｚｅｒ， Ｍ．， ａｎｄ Ｍｉｌｌｅｒ， Ｐ．Ｆ．）（１９９７）、Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １７９、１８５７〜１８６６）粉末トラガカント；（コーエン、レビー、フォールズおよびロスナー（Ｃｏｈｅｎ， Ｓ．Ｐ．， Ｌｅｖｙ， Ｓ．Ｂ．， Ｆｏｕｌｄｓ， Ｊ．， ａｎｄ Ｒｏｓｎｅｒ， Ｊ．Ｌ．）（１９９３）、Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １７５：７８５６〜７８６２）麦芽；（アレクシュンおよびレビー（Ａｌｅｋｓｈｕｎ， Ｍ．Ａ．， ａｎｄ Ｌｅｖｙ， Ｓ．Ｂ．）（１９９９）、Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １８１：４６６９〜４６７２）ゼラチン；（ジョージおよびレビー（Ｇｅｏｒｇｅ， Ａ．Ｍ．， ａｎｄ Ｌｅｖｙ， Ｓ．Ｂ．）（１９８３）、Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １５５、５３１〜５４０）タルク；（オエシンガー、ポドグリャン、ケルンおよびレビー（Ｏｅｔｈｉｎｇｅｒ， Ｍ．， Ｐｏｄｇｌａｊｅｎ， Ｉ．， Ｋｅｒｎ， Ｗ．Ｖ． ａｎｄ Ｌｅｖｙ， Ｓ．Ｂ．）（１９９８）Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ． Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ． ４２：２０８９〜２０９４）カカオバターおよび坐剤用ロウのような賦形剤；（アサコ、ナカジマ、コバヤシ、コバヤシおよびアオノ（Ａｓａｋｏ， Ｈ．， Ｎａｋａｊｉｍａ， Ｋ．， Ｋｏｂａｙａｓｈｉ， Ｋ．， Ｋｏｂａｙａｓｈｉ， Ｍ． ａｎｄ Ａｏｎｏ， Ｒ．）（１９９７）Ａｐｐｌ． Ｅｎｖｉｒｏｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ６３：１４２８〜１４３３）ピーナッツ油、綿実油、サフラワー油、ゴマ油、オリーブ油、トウモロコシ油、および大豆油のような油；（ホワイト、ゴールドマン、デンプルおよびレビー（Ｗｈｉｔｅ， Ｄ．Ｇ．， Ｇｏｌｄｍａｎ， Ｊ．Ｄ．， Ｄｅｍｐｌｅ， Ｂ． ａｎｄ Ｌｅｖｙ， Ｓ．Ｂ．）（１９９７）Ｊ． Ｂａｃ���ｅｒｉｏｌ． １７９：６１２２〜６１２６）プロピレングリコールのようなグリコール；（アリザ、コーエン、バクバワット、レビーおよびデンプル（Ａｒｉｚａ， Ｒ．Ｒ．， Ｃｏｈｅｎ， Ｓ．Ｐ．， Ｂａｃｈｂａｗａｔ， Ｎ．， Ｌｅｖｙ， Ｓ．Ｂ． ａｎｄ Ｄｅｍｐｌｅ， Ｂ．）（１９９４）Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １７６：１４３〜１４８）グリセリン、ソルビトール、マンニトールおよびポリエチレングロコールのようなポリオール；（マクムリー、オエシンガーおよびレビー（ＭｃＭｕｒｒｙ， Ｌ．Ｍ．， Ｏｅｔｈｉｎｇｅｒ， Ｍ． ａｎｄ Ｌｅｖｙ， Ｓ．Ｂ．）（１９８８）ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｌｅｔｔ． １６６：３０５〜３０９）オレイン酸エチルおよびラウリル酸エチルのようなエステル；（モケン、マクムリーおよびレビー（Ｍｏｋｅｎ， Ｍ．Ｃ．， ＭｃＭｕｒｒｙ， Ｌ．Ｍ．， ａｎｄ Ｌｅｖｙ， Ｓ．Ｂ．）（１９９７）Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ． Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ． ４１：２７７０〜２７７２）寒天；（マーチン、ギレット、リーおよびロスナー（Ｍａｒｔｉｎ， Ｒ．Ｇ．， Ｇｉｌｌｅｔｔｅ， Ｗ．Ｋ．， Ｒｈｅｅ， Ｓ． ａｎｄ Ｒｏｓｎｅｒ， Ｊ．Ｌ．）（１９９９）Ｍｏｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ３４：４３１〜４４１）水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウムのような緩衝剤；（マニーワナクルおよびレビー（Ｍａｎｅｅｗａｎｎａｋｕｌ， Ｋ． ａｎｄ Ｌｅｖｙ， Ｓ．Ｂ．）（１９９６）Ａｎｔｉｍｉｒｏｂ． Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ． ４０：１６９５〜１６９８）アルギン酸；（セオアンおよびレビー（Ｓｅｏａｎｅ， Ａ．Ｓ． ａｎｄ Ｌｅｖｙ， Ｓ．Ｂ．）（１９９５）Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １７７：５３０〜５３５）発熱物質不含水；（ハミルトン、アルデア、ウォッシュバーン、バビツケおよびクシュナー（Ｈａｍｉｌｔｏｎ， Ｃ．Ｍ．， Ａｌｄｅａ， Ｍ．， Ｗａｓｈｂｕｒｎ， Ｂ．Ｋ．， Ｂａｂｉｔｚｋｅ， Ｐ． ａｎｄ Ｋｕｓｈｎｅｒ， Ｓ．Ｒ．）（１９８９）Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １７１：４６１７〜４６２２）等張生理食塩液；（サムブルック、フリッチュおよびマニアティス（Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｊ．， Ｆｒｉｔｓｃｈ， Ｅ．Ｆ． ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ， Ｔ．）ら、「分子のクローニング：実験マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ． Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」コールドスプリングハーバー研究所出版編、（コールドスプリングハーバー、ニューヨーク州）リンゲル液；（ブラトナー、プランケット、ブロック、ペルナ、バーランド、リレー、コラド・ビデス、グラスナー、ロード、グレコール、デービス、カークパトリック、ゴーデン、ローズ、マウおよびシャオ（Ｂｌａｔｔｎｅｒ， Ｆ．Ｒ．， Ｐｌｕｎｋｅｔｔ， Ｇ．Ｉ．Ｉ．Ｉ．， Ｂｌｏｃｈ， Ｃ．Ａ．， Ｐｅｒｎａ， Ｎ．， Ｂｕｒｌａｎｄ， Ｖ．， Ｒｉｌｅｙ， Ｍ．， Ｃｏｌｌａｄｏ−Ｖｉｄｅｓ， Ｊ．， Ｇｌａｓｎｅｒ， Ｊ．Ｄ．， Ｒｏｄｅ， Ｃ．Ｋ．Ｍ．， Ｇ．Ｆ．， Ｇｒｅｇｏｒ， Ｊ．， Ｄａｖｉｓ， Ｎ．Ｗ．， Ｋｉｒｋｐａｔｒｉｃｋ， Ｈ．Ａ．， Ｇｏｅｄｅｎ， Ｍ．Ａ．， Ｒｏｓｅ， Ｄ．Ｊ．， Ｍａｕ， Ｂ． ａｎｄ　Ｓｈａｏ， Ｙ）（１９９７）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７７：１４５３〜１４６２）エチルアルコール；（タオ、バウシュ、リッチモンド、ブラトナーおよびコンウェイ（Ｔａｏ， Ｈ．， Ｂａｕｓｃｈ， Ｃ．， Ｒｉｃｈｍｏｎｄ， Ｃ．， Ｂｌａｔｔｎｅｒ， Ｆ．Ｒ． ａｎｄ Ｃｏｎｗｅｙ， Ｔ．）（１９９９）Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １８１：６４２５〜６４４０）リン酸緩衝生理食塩液；ならびに（アレクシュンおよびレビー（Ａｌｅｋｓｈｕｎ， Ｍ．Ｎ．， ａｎｄ Ｌｅｖｙ， Ｓ．Ｂ．）（１９９９）、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ． Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ． ４１：２０６７〜２０７５）薬学的組成物において用いられるその他の非毒性適合性物質が含まれる。例えば、レシチンのようなコーティング材料を用いることによって、分散剤の場合には必要な粒子径を維持することによって、および界面活性剤を用いることによって、適当な流動性を維持することができる。
【０２４７】
これらの組成物は、保存剤、湿潤剤、乳化剤および分散剤のようなさらなる物質を含んでいてもよい。微生物の作用の予防は、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノールソルビン酸等の様々な抗菌剤および抗真菌剤を含めることによって確実にしてもよい。同様に、糖、塩化ナトリウム等のような等張物質を組成物に含めることも望ましいであろう。さらに、注射可能な薬剤の持続的な吸収は、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンのような吸収を遅らせる物質を含めることによって得てもよい。
【０２４８】
いくつかの場合において、薬物の作用を持続的にするために、皮下または筋肉内注射からの薬物の吸収を遅らせることが望ましい。これは、水溶性の低い結晶またはアモルファス材料の液体懸濁液を用いることによって行ってもよい。薬物の吸収速度は、その溶解速度に依存し、そしてまた溶解速度は結晶の大きさおよび結晶型に依存しうる。または、非経口投与した薬剤の吸収の遅延は、薬物を油性媒体に溶解または懸濁することによって行われる。
【０２４９】
本発明の組成物は、経口、非経口、局所、直腸内、鼻腔内、膣内、大槽内投与によって体の上皮表面に投与してもよい。それらは当然、各投与経路にとって適した形で投与される。例えば、それらは錠剤またはカプセル剤、注射、注入、吸入、眼科用ローション、軟膏等；注射、注入、または吸入による投与；ローションまたは軟膏による局所投与；および直腸または膣坐剤による投与である。
【０２５０】
「非経口投与」および「非経口的に投与される」という句は、本明細書において用いられるように通常、注射による腸内および局所投与以外の投与様式を意味し、これらには、静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管支、皮下、表皮下、動脈内、嚢下、くも膜下、脊髄内、および大槽内注射ならびに注入が含まれるがこれらに限定されない。
【０２５１】
本明細書において用いられるように、「全身投与」、「全身的に投与する」、「末梢投与」および「末梢的に投与する」という句は、それが被験者の全身に入り、このように、代謝および他の同様の過程を受けるように、八硫酸ショ糖および／または抗菌剤または避妊薬、薬物またはその他の材料を中枢神経系に直接以外の方法で投与することを意味し、例えば皮下投与を意味する。
【０２５２】
いくつかの方法において、本発明の組成物は、上皮表面に局所投与することができる。本発明の「上皮表面」とは、体の外表面を覆う、または中空構造に沿って並ぶ組織領域として定義され、皮膚および粘膜表面が含まれるがこれらに限定されない。そのような上皮表面には、口腔、咽頭、食道、肺、眼、耳、鼻孔、頬、舌、膣、子宮頚部、尿生殖器、消化管、および肛門直腸表面が含まれる。
【０２５３】
組成物は、局所投与のために用いられる多様な従来の剤形に製剤化することができる。これらには、例えば、液体溶液または懸濁剤、坐剤、潅注、浣腸、ゲル、クリーム、乳剤、ローション、スラリー、粉剤、スプレー、リップスティック、フォーム、ペースト、歯磨き用ペースト、軟膏、軟膏（ｓａｌｖｅ）、香膏、潅注、点滴、トローチ、チューインガム、ロゼンジ、マウスウオッシュ、リンスのような半固体および液体投与剤形が含まれる。
【０２５４】
局所応用のために従来から用いられる担体には、ペクチン、ゼラチンおよびその誘導体、ポリ乳酸、またはポリグリコール酸ポリマーもしくはそのコポリマー、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、もしくは酸化セルロースのようなセルロース誘導体、ガーゴム、アラビアゴム、カラヤゴム、トラガカントゴム、ベントナイト、寒天、カルボマー、ブラッダーラック、セラトニア、デキストランおよびその誘導体、ガッチゴム、ヘクトライト、イスパグラ・ハスク（ｉｓｐａｇｈｕｌａ ｈｕｓｋ）、ポリビニルピロリドン、シリカおよびその誘導体、キサンタンガム、カオリン、タルク、デンプンおよびその誘導体、パラフィン、水、植物性および動物性油、ポリエチレン、ポリエチレンオキサイド、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、グリセロール、エタノール、プロパノール、プロピレングリコール（グリコール、アルコール）、固定油、ナトリウム、カリウム、アルミニウム、マグネシウム、またはカルシウム塩（塩化、炭酸、重炭酸、クエン酸、グルコン酸、乳酸、酢酸、グルセプテート、または酒石酸塩のような）が含まれる。
【０２５５】
そのような組成物は、口唇ヘルペスを含む例えば口腔の望ましくない感染症、眼、皮膚、および下位消化管の感染症を治療または予防するために特に有用となりうる。薬物の持続および残留期間を増強するため、そして得られる予防的有効性を改善するために、局所投与物質のための標準的な組成物戦略を、抗菌剤、またはその薬学的に許容される塩に適用することができる。
【０２５６】
下位消化管または膣において用いられる局所適用の場合、直腸坐剤、適した浣腸、ゲル、軟膏、溶液、懸濁液、または挿入物を用いることができる。局所経皮パッチも同様に用いてもよい。経皮パッチは、本発明の組成物の体へ輸送が制御されるというさらなる長所を有する。そのような投与剤形は、物質を適当な媒体に溶解または分散させることによって作製することができる。
【０２５７】
本発明の組成物は、直腸または膣内投与のための坐剤の形で投与することができる。これらは、室温では固体であるが直腸温では液体であり、したがって直腸または膣内で融解して薬物を放出する、適した非刺激性の担体と物質とを混合することによって調製することができる。そのような材料には、カカオバター、蜜ロウ、ポリエチレングリコール、坐剤用ロウ、またはサリチレートが含まれ、それらは室温では固体であるが、体温では液体となり、したがって、直腸または膣腔において融解して、活性薬を放出する。
【０２５８】
膣内投与に適した組成物には、適当であれば当技術分野で既知である担体を含むペッサリー、タンポン、クリーム、ゲル、ペースト、フォーム、フィルム、またはスプレー組成物が含まれる。八硫酸ショ糖／避妊薬において用いられる担体は、膣内投与および／または避妊装置のコーティングに適合可能でなければならない。配合剤は、隔膜、ゼリー、潅注、フォーム、フィルム、軟膏、クリーム、香膏、ゲル、軟膏（ｓａｌｖｅ）、ペースト、スラリー、膣坐剤、膣内潤滑剤のような半固体および液体投与剤形、ならびにコンドーム、避妊用スポンジ、頚部キャップ、および隔膜のような装置のコーティングとなりうる。
【０２５９】
眼科での適用に関して、薬学的組成物は、等張、ｐＨ調節滅菌生理食塩液における微小懸濁液として、または好ましくは、塩化ベンジルアルコニウムのような保存剤を含む、または含まない等張ｐＨ調節滅菌生理食塩液として調製することができる。または、眼科での使用に関して、組成物は、石油のような軟膏において調製することができる。例示的な眼科用組成物には、眼科用軟膏、粉剤、溶液等が含まれる。
【０２６０】
粉剤およびスプレーは、八硫酸ショ糖および／または抗生物質または避妊薬の他に、乳糖、タルク、ケイ酸、水酸化アルミニウム、ケイ酸カルシウム、およびポリアミド粉末、またはこれらの物質の混合物を含みうる。スプレーは、クロロフルオロヒドロカーボン、ならびにブタンおよびプロパンのような揮発性非置換炭化水素のような従来の噴射剤をさらに含みうる。
【０２６１】
通常、水性エアロゾルは、従来の薬学的に許容される担体および安定化剤と共に物質の水溶液または懸濁液を調製することによって作製される。担体および安定化剤は、特定の化合物の要件によって変化するが、典型的に非イオン性界面活性剤（ツイーン、プルロニクス、またはポリエチレングリコール）、血清アルブミンのような無害なタンパク質、ソルビタンエステル、オレイン酸、レシチン、グリシンのようなアミノ酸、緩衝剤、塩、糖、または糖アルコールが含まれる。エアロゾルは一般的に、等張溶液から調製される。
【０２６２】
本発明の組成物はまた、それぞれが八硫酸ショ糖および／または活性成分として抗生物質または抗避妊薬の既定量を含む、カプセル剤、カシェ剤、丸剤、錠剤、ロゼンジ（芳香基剤、通常ショ糖とアラビアゴムまたはトラガカントゴムを用いる）、粉剤、顆粒剤を含むがこれらに限定されない如何なる経口で許容される投与剤形で、または水性もしくは非水性液体の溶液または懸濁液として、または水中油型もしくは油中水型液体乳剤、またはエリキシル剤もしくはシロップ、または香錠（ゼラチンとグリシン、またはショ糖とアラビアゴムのような不活性基剤を用いる）、および／またはマウスウォッシュ等として経口投与することができる。化合物はまた、巨丸剤、し剤、またはペーストとして投与してもよい。経口で用いる錠剤の場合、一般的に用いられる担体には、乳糖およびコーンスターチが含まれる。ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤も同様に典型的に加えられる。カプセル剤の経口投与に関して、有用な希釈剤には、乳糖および乾燥コーンスターチが含まれる。経口で用いるために水性懸濁液を必要とする場合、活性成分を乳化剤および懸濁剤と配合する。望ましければ、特定の甘味料、着香料、または着色剤を加えてもよい。
【０２６３】
錠剤、および糖衣錠、カプセル、丸剤、および顆粒剤のような他の固体投与剤形は、刻み目を入れてもよく、または製剤の技術分野で周知の腸溶コーティングおよびその他のコーティングのようなコーティングおよびシェルによって調製してもよい。それらはまた、例えば、所望の放出プロフィールを提供するために様々な比率のヒドロキシプロピルメチルセルロース、他のポリマーマトリクス、リポソームおよび／またはミクロスフェアを用いて、その中の活性成分の緩徐な、または制御された放出を提供するために製剤化してもよい。それらは例えば、細菌除去フィルターを通しての濾過、または使用直前に滅菌水または他のいくつかの滅菌注射用媒体に溶解することができる滅菌固体組成物の形で滅菌剤を組み入れることによって、滅菌してもよい。これらの組成物はまた、選択的に不透明化物質を含んでもよく、胃腸管の特定の部分に限って、または選択的に遅れて活性成分（複数）を放出する組成物であってもよい。用いることができる包埋化合物の例には、ポリマー物質およびロウが含まれる。活性成分はまた、適当であれば一つまたはそれ以上の上記の賦形剤を含む微小封入型となりうる。
【０２６４】
経口投与のための液体投与剤形には、薬学的に許容される乳剤、微小乳剤、溶液、懸濁液、シロップおよびエリキシル剤が含まれる。活性成分の他に、液体投与剤形は、例えば、水、またはエチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、油（特に、綿実油、落花生油、トウモロコシ油、胚芽油、オリーブ油、ヒマシ油、およびゴマ油）、グリセロール、テトラヒドロフリルアルコール、ポリエチレングリコール、およびソルビタンの脂肪酸エステル、ならびにその混合物のような他の溶媒、可溶化剤、および乳化剤のような当技術分野で一般的に用いられる不活性希釈剤を含んでもよい。
【０２６５】
不活性希釈剤の他に、経口組成物は、湿潤剤、乳化剤および懸濁剤、甘味料、着香料、着色剤、香料、ならびに保存剤のような補助剤を含みうる。
【０２６６】
懸濁剤は、抗菌剤の他に、例えば、エトキシル化ステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビトール、およびソルビタンエステル、微結晶セルロース、メタ水酸化アルミニウム、ベントナイト、寒天およびトラガカント、ならびにその混合物のような懸濁剤を含んでもよい。
【０２６７】
本発明の組成物の滅菌注射剤形は、水性または油性懸濁液となりうる。これらの懸濁液は、適した分散剤または湿潤剤および懸濁剤を用いて当技術分野で既知の技術に従って調製してもよい。湿潤剤、乳化剤、およびラウリル硫酸ナトリウムおよびステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤は、着色剤、放出剤、コーティング剤、甘味料、着香料および香料、保存剤、および抗酸化剤と共に組成物に存在しうる。
【０２６８】
滅菌注射用調製物はまた、例えば、１，３−ブタンジオールにおける溶液のように、非毒性の非経口的に許容される希釈剤または溶媒における滅菌注射用溶液または懸濁液であってもよい。用いてもよい許容される媒体または溶媒は、水、リンゲル液、等張塩化ナトリウム溶液である。さらに、滅菌の固定油を溶媒または懸濁媒質として従来のように用いてもよい。この目的のため、合成モノまたはジグリセリドを含む如何なる無刺激性の固定油を用いてもよい。オレイン酸およびそのグリセリド誘導体のような脂肪酸は、オリーブ油またはヒマシ油、特にそのポリオキシエチレン化物のような天然の薬学的に許容される油と同様に、注射剤の調製において有用である。これらの油性溶液または懸濁液はまた、長鎖アルコール希釈剤または分散剤を含んでいてもよい。
【０２６９】
核酸分子であるＮＩＭＲ分子の活性および／または発現の調節剤の場合、オリゴマーの最適な投与経路は、所望の結果または処置される被験者に応じて変化する可能性がある。この意味において、「投与」とは、例えばインビボまたはエクスビボで細胞をオリゴマーに接触させることを意味する。核酸分子の用量は、例えばＲＮＡ安定性の読み出しによって測定した場合、または不適当な実験を行うことなく治療反応によって、標的ｍＲＮＡから翻訳されたタンパク質の発現を選択的に調節するように調節してもよい。例えば、核酸によってコードされるタンパク質の発現を測定して、それに従って投与計画を調節する必要があるか否かを決定することができる。さらに、細胞における、または細胞によって産生されたＲＮＡおよび／またはタンパク質レベルの増加または減少は、当技術分野で認識された技術を用いて測定することができる。転写が減少しているか否かを決定することによって、分子の有効性を決定することができる。
【０２７０】
本明細書において用いられるように、「薬学的に許容される担体」には、適当な溶媒、分散媒体、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張および吸収遅延剤等が含まれる。そのような媒体および物質を薬学的に活性な物質のために用いることは、当技術分野で周知である。如何なる従来の媒体または物質も活性成分と不適合である場合を除いて、治療的組成物において用いることができる。補助活性成分もまた、組成物に組み入れることができる。
【０２７１】
組成物はリポソーム、またはポリエチレングリコールによって改変した、もしくは非経口投与のために陽イオン脂質と混合したリポソームまたは複数のリポソームに組み入れてもよい。さらなる物質、例えば特異的標的微生物上に認められる膜タンパク質に対して反応する抗体をリポソームに組み入れれば、特異的な細胞の種類に対して分子をターゲティングするために役立ちうる。
【０２７２】
その上、本発明は、ラタイクザックら（Ｒａｔａｉｃｚａｋ、（１９９２）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８９：１１８２３〜１１８２７）に記載されるように、組成物の持続的な注入を提供する浸透圧ポンプによって本発明の組成物を投与することを提供する。そのような浸透圧ポンプは、例えばアルゼインク（パロアルト、カリフォルニア州）より市販されている。陽イオン脂質担体における局所投与および非経口投与が好ましい。
【０２７３】
インビボ適用に関して、本発明の製剤は、選択された投与経路、すなわち、非経口、経口、腹腔内に適合するように多様な剤形で患者に投与することができる。好ましい非経口投与には、以下の経路による投与が含まれる：静脈内；筋肉内；間質内；動脈内；皮下；眼球内（ｉｎｔｒａ ｏｃｕｌａｒ）；滑液内；経皮を含む経上皮；吸入による肺内；眼内（ｏｐｈｔｈａｌｍｉｃ）；舌下および頬；眼内を含む局所；皮膚；眼球；直腸；および吸入による鼻腔内吸入。非経口投与経路の中では静脈内投与が好ましい。
【０２７４】
非経口投与のための薬学的調製物には、活性化合物の水溶性または水分散性の水溶液が含まれる。さらに、適当な油性注射懸濁液としての活性化合物の懸濁剤を投与してもよい。適した親油性溶媒または媒体には、脂肪酸、例えばゴマ油、または合成脂肪酸エステル、例えば、オレイン酸エチルもしくはトリグリセリドが含まれる。水性注射用懸濁剤は、懸濁剤の粘度を増加させる物質を含んでもよく、例えば、カルボキシメチルセルロース、ソルビトール、および／またはデキストランを含んでいてもよく、選択的に懸濁剤はまた、安定化剤を含んでいてもよい。
【０２７５】
薬物輸送媒体は、例えばインビトロ、全身、または局所投与に関して選択することができる。これらの媒体は、徐放性リザーバーとして役立つように、または標的細胞に直接その内容物を輸送するように設計することができる。いくつかの直接輸送薬物媒体を用いる長所は、一回の取り込みによって多数の分子が輸送される点である。そのような媒体は、そうでなければ血流から迅速に消失するであろう薬物の循環半減期を増加させることが示されている。この範疇に入るそのような特殊な薬物輸送媒体のいくつかの例は、リポソーム、ヒドロゲル、シクロデキストリン、生体分解性ナノカプセル、および生体接着性ミクロスフェアである。
【０２７６】
本発明の組成物は、ポリエチレングリコールによって改変した、または非経口投与のために陽イオン脂質と混合したリポソームまたは複数のリポソームに組み入れてもよい。さらなる物質、例えば特異的標的微生物上に認められる膜タンパク質に対して反応する抗体をリポソームに組み入れることは、特異的な細胞の種類に組成物をターゲティングするために役立ちうる。
【０２７７】
その上、本発明は、例えば、ラタイクザックら（Ｒａｔａｉｃｚａｋ、（１９９２）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８９：１１８２３〜１１８２７）に記載されるように、組成物の持続的な注入を提供する浸透圧ポンプによって本発明の組成物を投与することを提供する。そのような浸透圧ポンプは、例えばアルゼインク（パロアルト、カリフォルニア州）より市販されている。陽イオン脂質担体における局所投与および非経口投与が好ましい。
【０２７８】
インビボ適用に関して、本発明の製剤は、選択された投与経路、すなわち、非経口、経口、腹腔内投与に適合するように多様な剤形で患者に投与することができる。好ましい非経口投与には、以下の経路による投与が含まれる：静脈内；筋肉内；間質内；動脈内；皮下；眼球内（ｉｎｔｒａ ｏｃｕｌａｒ）；滑液内；経皮を含む経上皮；吸入による肺内；眼内（ｏｐｈｔｈａｌｍｉｃ）；舌下および頬；眼内を含む局所；皮膚；眼球；直腸；および吸入による鼻腔内吸入。非経口投与経路の中では静脈内投与が好ましい。
【０２７９】
非経口投与のための薬学的調製物には、活性化合物の水溶性または水分散性の水溶液が含まれる。さらに、適当な油性注射懸濁液として活性化合物の懸濁剤を投与してもよい。適した親油性溶媒または媒体には、脂肪酸、例えばゴマ油、または合成脂肪酸エステル、例えば、オレイン酸エチルもしくはトリグリセリドが含まれる。水性注射用懸濁剤は、懸濁剤の粘度を増加させる物質を含んでいてもよく、例えば、カルボキシメチルセルロース、ソルビトール、および／またはデキストランを含んでいてもよく、選択的に懸濁剤はまた、安定化剤を含んでもよい。
【０２８０】
薬物輸送媒体は、例えばインビトロ、全身、または局所投与に関して選択することができる。これらの媒体は、徐放性リザーバーとして役立つように、または標的細胞に直接その内容物を輸送するように設計することができる。いくつかの直接輸送薬物媒体を用いる長所は、一回の取り込みによって多数の分子が輸送される点である。そのような媒体は、そうでなくとも血流から迅速に消失するであろう薬物の循環半減期を増加させることが示されている。この範疇に入るそのような特殊な薬物輸送媒体のいくつかの例は、リポソーム、ヒドロゲル、シクロデキストリン、生体分解性ナノカプセル、および生体接着性ミクロスフェアである。
【０２８１】
記述の組成物は、被験者に全身投与してもよい。全身吸収とは、血流に薬物が入って全身への分布が起こることを意味する。全身吸収が起こる投与経路には、静脈内、皮下、腹腔内、および鼻腔内が含まれる。これらの投与経路のそれぞれは、到達しうる疾患細胞に組成物を送達する。皮下投与の後、治療物質は局所リンパ節に入り、リンパ管のネットワークを通して循環中に入る。循環への流入速度は、分子量およびサイズの関数であることが示されている。リポソームまたは他の薬物担体を用いると、組成物がリンパ節で局在する。核酸分子は、細胞内で拡散するように改変することができ、またはリポソームは、組成物の細胞への輸送に直接関与しうる。
【０２８２】
予防的適用のため、本発明の薬学的組成物は、微生物に物理的に接触する前に適用することができる。物理的接触前の適用の時期は、化合物の予防的有効性を最大限にするように最適にすることができる。適用時期は投与様式、それが適用される上皮表面、表面積、用量、上皮表面のｐＨでの組成物の安定性および有効性、適用回数、例えば単回適用または多数回適用に応じて変化するであろう。好ましくは、適用時期を、組成物の単回適用で十分であるように決定することができる。当業者は、化合物の予防的有効性を最大限にするために必要な最も適当な投与間隔を決定することができるであろう。
【０２８３】
当業者は必要な薬学的組成物の有効量を決定して処方することができる。例えば、所望の治療効果を得るために必要な用量より低いレベルで投与を開始して、所望の効果が得られるまで用量を徐々に増加することができる。一般的に、本発明の組成物の適切な一日量は、治療効果を生じるために有効な最低用量の組成物量であると思われる。そのような有効量は一般的に上記の要因に依存するであろう。投与は静脈内、冠動脈内、筋肉内、腹腔内、または皮下であることが好ましい。
【０２８４】
本発明のもう一つの局面は、本発明のスクリーニングアッセイ法または調節方法を行うためのキットに関する。例えば、本発明のスクリーニングアッセイ法を行うためのキットには、ＮＩＭＲポリペプチドを含む細胞、ＮＩＭＲポリペプチド活性を測定するための手段、およびＮＩＭＲ活性の調節物質を同定するためのキットの使用説明書が含まれうる。
【０２８５】
もう一つの態様において、本発明は、本発明の調節方法を行うためのキットを提供する。キットには、例えば、適切な担体中に本発明の調節物質（例えば、ＮＩＭＲ阻害または刺激物質）が含まれ、ＮＩＭＲ発現または活性を調節するための調節物質の使用説明書と共に適切な容器に包装されうる。
【０２８６】
本発明の実践は、特に明記していない限り、当業者の範囲内である、細胞生物学、細胞培養、分子生物学、遺伝子学、微生物学、組み換えＤＮＡ、および免疫学の従来の技術を用いる。そのような技術は文献に十分に説明されている。例えば、サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｊ．）らの「遺伝子学：分子のクローニング：実験マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」第二版、コールドスプリングハーバー研究所出版（１９８９））；アウスユベール（Ａｕｓｕｂｅｌ， Ｆ．）らの「分子生物学のプロトコール短編（Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、第三版、（ウィリー、ニューヨーク（１９９５））；「ＤＮＡクローニング（ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ）」、第Ｉ巻および第ＩＩ巻（グローバー（Ｄ．Ｎ． Ｇｌｏｖｅｒ）編、（１９８５）；「オリゴヌクレオチド合成（Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）」、ゲイト（Ｍ．Ｊ． Ｇａｉｔ）編（１９８４））；マリス（Ｍｕｌｌｉｓ）らの米国特許第４，６８３，１９５号；「核酸ハイブリダイゼーション（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）」、ハームスおよびヒギンス（Ｂ．Ｄ． Ｈａｍｅｓ ａｎｄ Ｓ． Ｊ． Ｈｉｇｇｉｎｓ）編（１９８４））；学術論文、「酵素学における方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）」（アカデミック出版、ニューヨーク）；「細胞および分子生物学における免疫化学的方法（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｃｅｌｌ Ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、メイヤーおよびウォーカー（Ｍｅｙｅｒ ａｎｄ Ｗａｌｋｅｒ）編、アカデミック出版、ロンドン（１９８７））；「実験免疫学ハンドブック（Ｈａｎｄｂｏｏｋ Ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）」、第Ｉ〜ＩＶ巻、ワイアおよびブラックウェル（Ｄ．Ｍ． Ｗｅｉｒ ａｎｄ Ｃ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ）編（１９８６））；およびミラー（Ｍｉｌｌｅｒ， Ｊ．）「分子遺伝子学実験（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）」、（コールドスプリングハーバー研究所出版、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク（１９７２））を参照のこと。
【０２８７】
本出願全体を通して引用される全ての引用文献、出願中の特許の内容は、本明細書において特に参照として組み入れられる。本明細書に開示したそれぞれの引用文献は、その全文が参照として本明細書に組み入れられる。本出願が優先権を主張する如何なる特許出願もその全文が参照として本明細書に組み入れられる。
【０２８８】
本発明は、以下の実施例によってさらに説明するが、それらをさらなる制限として解釈すべきではない。
【０２８９】
実施例
実施例１
以下の材料および方法を実施例において用いた。
【０２９０】
細菌株、プラスミド、および増殖条件
大腸菌Ｋ−１２株ＡＧ１００（ジョージ（Ｇｅｏｒｇｅ， Ａ．Ｍ． ａｎｄ Ｌｅｖｅ， Ｓ．Ｂ．）（１９８３）、Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １５５：５４１〜５４８）を、特異的ＤＮＡプローブのＰＣＲ増幅のために用いた。ｍａｒ座の代わりに１．２ ｋｂカナマイシン耐性カセットを含むＡＧ１００の同質遺伝子株である大腸菌ＡＧ１００Ｋａｎ（マニーワナクルおよびレビー（Ｍａｎｅｅｗａｎｎａｋｕｌ， Ｋ． ａｎｄ Ｌｅｖｙ， Ｓ．Ｂ．）（１９９６）Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ． Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ． ４０：１６９５〜１６９８）を、記載の全ての実験に用いた。温度感受性ｐＭＡＫ７０５（Ｃｈ１Ｒ）に由来するｐＡＳ１０（セオアン（Ｓｅｏａｎｅ， Ａ．Ｓ． ａｎｄ Ｌｅｖｙ， Ｓ．Ｂ．）（１９９５）、Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １７７：５３０〜５３５）（ハミルトン、アルデア、ウォッシュバーン、バビツケおよびクシュナー（Ｈａｍｉｌｔｏｎ， Ｃ．Ｍ．， Ａｌｄｅａ， Ｍ．， Ｗａｓｈｂｕｒｎ， Ｂ．Ｋ．， Ｂａｂｉｔｚｋｅ， Ｐ． ａｎｄ Ｋｕｓｈｎｅｒ， Ｓ．Ｒ．）（１９８９）Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １７１：４６１７〜４６２２）は、ｍａｒＲ５突然変異を有するｍａｒＣＯＲＡＢ配列を含む２．５ ｋｂ ＰＣＲ増幅断片を有し、これはＭａｒＲを産生せず、このように構成的ＭａｒＡ発現を媒介しない。
【０２９１】
細菌株を、ルリア・ベルタニ（ＬＢ）培地（１Ｌあたりの組成物：トリプトン１０ ｇ、ＮａＣｌ １０ ｇ、酵母抽出物５ｇ）において３０℃で強く通気しながら増殖させた。大腸菌ＡＧ１００Ｋａｎ細胞は、標準的なＣａＣｌ２法（サムブルック、フリッチュ、およびマニアティス（Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｊ．， Ｆｒｉｔｓｃｈ， Ｅ．Ｆ．， ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ， Ｔ．）ら、（１９８９）「分子のクローニング：実験マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」第二版、コールドスプリングハーバー研究所出版編（コールドスプリングハーバー、ニューヨーク州））によってコンピテントにして、プラスミドｐＭＡＫ７０５またはｐＡＳ１０を含む形質転換体を、２５ μｇ／ｍｌクロラムフェニコール（シグマ社、セントルイス、ミズーリ州）の存在下で維持した。
【０２９２】
ＲＮＡ抽出
総ＲＮＡは、熱酸性フェノール抽出法（シグマ−ゲノシスバイオテクノロジーズインク、ウッドランド、テキサス州）の改変によって単離した。一晩培養物を新鮮なＬＢ培地において２５０倍に希釈して、対数増殖期中期まで増殖させた（Ａ５３０＝０．３５〜０．４０）。５ｍｌ細胞培養からの細菌ペレットを４℃で採取して、氷冷再浮遊緩衝液（０．３ Ｍショ糖−１０ ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ ４．２）２５０ μｌおよび氷冷０．５ Ｍ ＥＤＴＡ ３７．５ μｌに再浮遊させた。氷中で５分間インキュベートした後、溶解緩衝液（２％ドデシル硫酸ナトリウム、１０ ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ ４．２）３７５ μｌを加えて細胞を溶解して、６５℃で３分間加熱した。浮遊液を予め加温した酸性フェノール（６５℃）（シグマ社）７００ μｌによって３回抽出し、水相をまず酸性フェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（２５：２４：１）の混合物７００ μｌによって抽出し、その後等量のクロロホルム：イソアミルアルコール（２４：１）によって抽出した。水相のＲＮＡを−８０℃でエタノール沈殿させ、ＲＮＡペレットを７０％エタノールによってすすぎ、ＲＮａｓｅ不含水（アンビオンインク、オースチン、テキサス州）１００ μｌに再浮遊させた。製造元の説明書に従って、試料をＤＮａｓｅＩ（増幅等級、ライフテクノロジーズインク、ガイサースバーグ、メリーランド州）によって処理して、ＤＮＡ混入物を除去した。ＲＮＡ中にゲノムＤＮＡがないことは、非変性１．２％アガロースゲル中でＲＮＡの試料を調べることにより、およびゲノムＤＮＡをターゲティングすることが知られているプライマーを用いてＤＮａｓｅ処置ＲＮＡ試料にＰＣＲを行うことにより確認した。ＲＮＡ濃度は分光光度法によって決定した（サムブルック、フリッチュ、およびマニアティス（Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｊ．， Ｆｒｉｔｓｃｈ， Ｅ．Ｆ．， ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ， Ｔ．）ら、（１９８９）「分子のクローニング：実験マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」第二版、コールドスプリングハーバー研究所出版編（コールドスプリングハーバー、ニューヨーク州））。
【０２９３】
標識ｃＤＮＡの調製とアレイへのハイブリダイゼーション
標識ｃＤＮＡは、製造元の説明書に従って、大腸菌ｃＤＮＡ標識プライマー（シグマゲノシス社）を用いて調製した。プライマーを、３３３ μＭ ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、およびｄＴＴＰ、ならびに１×逆転写酵素緩衝液の存在下で総ＲＮＡ１μｇに９０℃で２分間アニーリングした。混合物を４２℃に冷却して、５０ Ｕ ＡＭＶ逆転写酵素（ベーリンガーマンハイム社、インジアナポリス、インジアナ州）および２０ μＣｉ ３２Ｐ−α−ｄＴＰ（２，０００ Ｃｉ／ｍｍｏｌ）（ニューイングランドヌクレア、ボストン、マサチューセッツ州）を加えた。インキュベーションは、４２℃で２時間３０分行った。組み入れられていないヌクレオチドはＮｕｃＴｒａｐプローブ精製カラム（ストラタジーン社、ラホヤ、カリフォルニア州）を用いて、ハイブリダイゼーションの前に標識ｃＤＮＡから除去した。
【０２９４】
精製した標識ｃＤＮＡのパノラマ大腸菌遺伝子アレイ（シグマ−ゲノシス社）へのハイブリダイゼーションは、製造元の説明書に従ってローラーボトルにおいて行った。本質的に、アレイを２×ＳＳＰＥにおいて予め湿らせた後、予め加温したハイブリダイゼーション溶液（５×ＳＳＰＥ、２％ＳＤＳ、１×デンハート試薬および１００ μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡ）５ｍｌにおいて２時間まで６５℃でプレハイブリダイズした。ハイブリダイゼーション溶液５ｍｌ中の変性した標識ｃＤＮＡを、プレハイブリダイゼーション溶液に置換して、ハイブリダイゼーションを１８時間まで６５℃で進行させた。アレイを、室温で洗浄緩衝液（０．５×ＳＳＰＥ−０．２％ＳＤＳ）５０ ｍｌによって３分間隔で３回洗浄し、予め加温（６５℃）した洗浄緩衝液１００ ｍｌによって２０分間隔で３回洗浄した。メンブレン上のハイブリダイズシグナルは、コダックバイオマックスＭＲ Ｘ−線フィルムおよびコダックストレージリン造影（ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｍａｇｅｒ）スクリーンＳＯ２３０（モレキュラーダイナミクス、サニベール、カリフォルニア州）に露出することによって可視化した。１〜３日の露出後、ストーム８６０リン造影機器（モレキュラーダイナミクス社）において、５０ミクロンピクセルの解像度でリンスクリーンをスキャンした。０．５％ＳＤＳ（ｗ／ｖ）の沸騰溶液にメンブレンを浸すことによってアレイをストリッピングし、上記のように再利用する前にプローブが除去されていることを確認した。
【０２９５】
アレイの説明と定量
パノラマ大腸菌遺伝子アレイ（シグマ−ゲノシス社）は、１試料あたり２本ずつスポットすると、大腸菌Ｋ−１２（ＭＧ１６５５）ゲノムのＰＣＲ増幅オープンリーディングフレーム４，２９０個を含む（ブラトナー、プランケット、ブロック、ペルナ、バーランド、リレー、コラド・ビデス、グラスナー、ロード、グレコール、デービス、カークパトリック、ゴーデン、ローズ、マウおよびシャオ（Ｂｌａｔｔｎｅｒ， Ｆ．Ｒ．， Ｐｌｕｎｋｅｔｔ， Ｇ．Ｉ．Ｉ．Ｉ．， Ｂｌｏｃｈ， Ｃ．Ａ．， Ｐｅｒｎａ， Ｎ．， Ｂｕｒｌａｎｄ， Ｖ．， Ｒｉｌｅｙ， Ｍ．， Ｃｏｌｌａｄｏ−Ｖｉｄｅｓ， Ｊ．， Ｇｌａｓｎｅｒ， Ｊ．Ｄ．， Ｒｏｄｅ， Ｃ．Ｋ．Ｍ．， Ｇ．Ｆ．， Ｇｒｅｇｏｒ， Ｊ．， Ｄａｖｉｓ， Ｎ．Ｗ．， Ｋｉｒｋｐａｔｒｉｃｋ， Ｈ．Ａ．， Ｇｏｅｄｅｎ， Ｍ．Ａ．， Ｒｏｓｅ， Ｄ．Ｊ．， Ｍａｕ， Ｂ． ａｎｄ　Ｓｈａｏ， Ｙ）（１９９７）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７７：１４５３〜１４６２）。（アレイのより詳しい説明に関してはタオら（タオ、バウシュ、リッチモンド、ブラトナーおよびコンウェイ（Ｔａｏ， Ｈ．， Ｂａｕｓｃｈ， Ｃ．， Ｒｉｃｈｍｏｎｄ， Ｃ．， Ｂｌａｔｔｎｅｒ， Ｆ．Ｒ． ａｎｄ Ｃｏｎｗｅｙ， Ｔ．）（１９９９）Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １８１：６４２５〜６４４０）を参照のこと）。
【０２９６】
リン造影ファイルにおけるハイブリダイズシグナルの定量は、アレイビジョン＆トレードソフトウェア（イメージングリサーチインク）を用いてシグマ−ゲノシスによって行った。各遺伝子の２個ずつのスポットに関する相対的ピクセル値を平均し、かつ各遺伝子をプリントしたそれぞれの領域におけるゲノムＤＮＡスポットの平均ピクセル値からのシグナルに対する百分率として平均スポットシグナルを表記することで標準化した（図１）。図１において、ＭａｒＡを発現する、または欠損する細胞からの試料におけるこれらの値の比は、遺伝子発現における変化の倍数を表す。バックグラウンドの値は、各アレイにおける各領域に関して、ゲノムＤＮＡと同じ二次グリッドに存在する空白空間のピクセル値を平均することによって決定した（図１）。実験および対照試料の双方においてその平均ピクセル値がバックグラウンドに近い（バックグラウンド値から２倍未満の差）遺伝子はここでは考慮しなかった。同一のアレイを、ｍａｒ欠失ＡＧ１００Ｋａｎ［ｐＭＡＫ７０５］（パネルＡ）およびｍａｒ発現ＡＧ１００Ｋａｎ［ｐＡＳ１０］（パネルＢ）株からの総ＲＮＡから調製した標識３２Ｐ−ｃＤＮＡ集団によってプロービングした。オートラジオグラムの領域１における一次グリッドを形成する縦行（１〜２４）および列（Ａ〜Ｐ）を標識する。領域２および３は、領域１のフォーマットと類似であり、示していない。各場における４つの角における４つのスポットは、ゲノムＤＮＡである。下のボックスは（Ａ）および（Ｂ）に示す代表的な領域の拡大図に対応し、ここでは発現レベルの変化がいくつかの遺伝子に関して見られる（異なるように発現された遺伝子の７個を例として標識する）。
【０２９７】
コンピューター分析によってｍａｒレギュロンのメンバーとして同定された全ての遺伝子は、３つの独立した実験においてアレイのオートラジオグラムの肉眼的分析によって確認した。両方の基準を満たす遺伝子のみがｍａｒレギュロンのメンバーであると分類された。
【０２９８】
ノザンブロット分析
ＤＮａｓｅＩで処理した総ＲＮＡ（５〜１０ μｇ）の２本ずつの試料を、１〜１．２％変性ホルムアルデヒド−アガロースゲル上で電気泳動によって分画し、１０×ＳＳＣ中で確立された毛細管ブロッティング法を用いて、ＲＮＡをナイロンメンブレン（ハイボンド−Ｎ、アマシャムライフサイエンスインク、アーリントンハイツ、イリノイ州）に転写した（サムブルック、フリッチュ、およびマニアティス（Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｊ．， Ｆｒｉｔｓｃｈ， Ｅ．Ｆ．， ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ， Ｔ．）ら、（１９８９）「分子のクローニング：実験マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」第二版、コールドスプリングハーバー研究所出版編（コールドスプリングハーバー、ニューヨーク州））。特異的大腸菌遺伝子に対するＤＮＡプローブは、適当な大腸菌ＯＲＦｍｅｒ ＰＣＲプライマー対（シグマ−ゲノシス社）を用いて、製造元の説明書に従って、大腸菌ＡＧ１００染色体ＤＮＡからＰＣＲによって増幅した。増幅後、ＰＣＲ産物を、ＱｉａｅｘＩＩゲル抽出キット（キアゲンインク、バレンシア、カリフォルニア州）を用いてアガロースゲルから精製し、既知濃度のＤＮＡサイズ標準物質（ライフテクノロジーズ社）と比較して定量した。ＲＴＳラドプライム（ＲａｄＰｒｉｍｅ）ＤＮＡ標識システム（ライフテクノロジーズ社）を用いる［３２Ｐ］−ｄＣＴＰ（ニューイングランドヌクレア社）によるＤＮＡプローブの標識は、製造元の説明書に従って実施した。ハイブリダイゼーションは、６５℃で標準的な技法を用いて行い（サムブルック、フリッチュ、およびマニアティス（Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｊ．， Ｆｒｉｔｓｃｈ， Ｅ．Ｆ．， ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ， Ｔ．）ら、（１９８９）「分子のクローニング：実験マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」第二版、コールドスプリングハーバー研究所出版編（コールドスプリングハーバー、ニューヨーク州））、ＲＮＡメンブレンは、高ストリンジェンシーで２×ＳＳＣ緩衝液／０．１％ＳＤＳ中、１５分間隔で４回、そして０．１×ＳＳＣ緩衝液／０．１％ＳＤＳ中、２〜４回洗浄した。ハイブリダイズするバンドは、大腸菌遺伝子マクロアレイについて記述したように可視化した。
【０２９９】
ＤＮＡ操作
ゲノムおよびプラスミドＤＮＡはそれぞれ、製造元の説明書に従ってＱＩＡａｍｐ組織キットおよびＱＩＡｐｒｅｐスピンミニプレップキット（キアゲン社）を用いて大腸菌株から精製した。
【０３００】
実施例１．ＭａｒＡによって調節される遺伝子の同定
ほとんどのゲノムＯＲＦｓを含む大腸菌に関して構築したＤＮＡマクロアレイ（ブラトナー、プランケット、ブロック、ペルナ、バーランド、リレー、コラド・ビデス、グラスナー、ロード、グレコール、デービス、カークパトリック、ゴーデン、ローズ、マウおよびシャオ（Ｂｌａｔｔｎｅｒ， Ｆ．Ｒ．， Ｐｌｕｎｋｅｔｔ， Ｇ．Ｉ．Ｉ．Ｉ．， Ｂｌｏｃｈ， Ｃ．Ａ．， Ｐｅｒｎａ， Ｎ．， Ｂｕｒｌａｎｄ， Ｖ．， Ｒｉｌｅｙ， Ｍ．， Ｃｏｌｌａｄｏ−Ｖｉｄｅｓ， Ｊ．， Ｇｌａｓｎｅｒ， Ｊ．Ｄ．， Ｒｏｄｅ， Ｃ．Ｋ．Ｍ．， Ｇ．Ｆ．， Ｇｒｅｇｏｒ， Ｊ．， Ｄａｖｉｓ， Ｎ．Ｗ．， Ｋｉｒｋｐａｔｒｉｃｋ， Ｈ．Ａ．， Ｇｏｅｄｅｎ， Ｍ．Ａ．， Ｒｏｓｅ， Ｄ．Ｊ．， Ｍａｕ， Ｂ． ａｎｄ　Ｓｈａｏ， Ｙ）（１９９７）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７７：１４５３〜１４６２）によって、ＭａｒＡの存在下または非存在下において完全なゲノムの発現研究を行うことができる。プラスミドｐＭＡＫ７０５のみを有する大腸菌ＡＧ１００Ｋ株（マニーワナクルおよびレビー（Ｍａｎｅｅｗａｎｎａｋｕｌ， Ｋ． ａｎｄ Ｌｅｖｙ， Ｓ．Ｂ．）（１９９６）Ａｎｔｍｉｃｒｏｂ． Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ． ４０：１６９５〜１６９８）は、対照、すなわちｍａｒ発現の欠損を示した。ｐＭＡＫ７０５由来プラスミドｐＡＳ１０を含む実験株ＡＧ１００Ｋａｎ［ｐＡＳ１０］は、ＭａｒＡを構成的に発現する（セオアンおよびレビー（Ｓｅｏａｎｅ， Ａ．Ｓ． ａｎｄ Ｌｅｖｙ， Ｓ．Ｂ．）（１９９５）Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １７７：５３０〜５３５）。Ｅ検定法を用いてアッセイした抗生物質感受性は、ノルフロキサシン、ナリジクス酸、テトラサイクリン、およびアンピシリンを含む調べた抗生物質に対し、ｍａｒ発現株では対照と比較して予測された耐性の増加（〜４から２０倍）を示した（データは示していない）。
【０３０１】
ｍａｒ欠失およびｍａｒ発現株から抽出したＲＮＡから調製した３２Ｐ標識ｃＤＮＡは、対を形成したマクロアレイにハイブリダイズして、リン造影ファイルおよびオートラジオグラムを得た（図１）。これまでに遺伝子〜１５個がＭａｒＡによって調節されることが知られている（アレクシュンおよびレビー（Ａｌｅｋｓｈｕｎ， Ｍ．Ｎ． ａｎｄ Ｌｅｖｙ， Ｓ．Ｂ．）、１９９７、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ． Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ． ４１：２０６７〜２０７５）。遺伝子マクロアレイによって、対数増殖期のｍａｒ調節に反応する遺伝子が全体で６２個同定された：４７個は誘導し、１５個は抑制した（表３）。３つ全ての実験において検出された知見のみをリストに含めた。
【０３０２】
ｍａｒＲＡＢオペロンによってコードされる３つの遺伝子のシグナルは、ｍａｒ発現株からのｃＤＮＡにおいて容易に検出されたが、ｍａｒ欠失株からのｃＤＮＡでは検出されなかった（図１）。この知見は、相同体の同じファミリーに属する遺伝子からのｃＤＮＡ（例えば、ｍａｒＡに関してｓｏｘＳおよびｒｏｂ）が何らかのレベルの非特異的結合を生じうることを考慮すると、再度保証されるものであった（リッチモンド、グラスナー、マウ、ジン、ブラトナー（Ｒｉｃｈｍｏｎｄ， Ｃ．Ｓ．， Ｇｌａｓｎｅｒ， Ｊ．Ｄ．， Ｍａｕ， Ｒ．， Ｊｉｎ， Ｈ． ａｎｄ Ｂｌａｔｔｎｅｒ， Ｆ．Ｒ．）（１９９９）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２７：３８２１〜３８３５）。ｍａｒＲ、ｍａｒＡ、およびｍａｒＢに関して、発現は対照試料より３１倍、３５倍、および１２倍高かった（平均値）（表３）。ｍａｒＢ発現のシグナルはｍａｒＲおよびｍａｒＡ発現に関するシグナルより一貫して弱かったが、その意味は不明である。スポットしたＰＣＲ産物は、長さが異なるため（ハイブリダイズ強度に影響を有する）（リッチモンド、グラスナー、マウ、ジン、ブラトナー（Ｒｉｃｈｍｏｎｄ， Ｃ．Ｓ．， Ｇｌａｓｎｅｒ， Ｊ．Ｄ．， Ｍａｕ， Ｒ．， Ｊｉｎ， Ｈ． ａｎｄ Ｂｌａｔｔｎｅｒ， Ｆ．Ｒ．）（１９９９）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２７：３８２１〜３８３５）、そして逆転写効率はＲＮＡが異なれば変化するため、この結果から、異なる遺伝子の間の比較分析を行うことはできない。分岐したｍａｒＣの発現（ゲンバンクではｙｄｅＢと呼ばれる）は、実験試料においてバックグラウンドに近かった。このように、ｍａｒＣの発現はこれらの条件ではＭａｒＡによって影響を受けないように思われる。
【０３０３】
同定されたｍａｒ調節遺伝子は、染色体全体に分散し、広範囲の細胞機能に関係している（図２、表２）。図２において、内側の円は、１分間隔で分割した大腸菌Ｋ−１２ ＭＧ１６５５の染色体を表し、外側は１００，０００ヌクレオチド残基の間隔で分割する（ブラトナーら（ブラトナー、プランケット、ブロック、ペルナ、バーランド、リレー、コラド・ビデス、グラスナー、ロード、グレコール、デービス、カークパトリック、ゴーデン、ローズ、マウおよびシャオ（Ｂｌａｔｔｎｅｒ， Ｆ．Ｒ．， Ｐｌｕｎｋｅｔｔ， Ｇ．Ｉ．Ｉ．Ｉ．， Ｂｌｏｃｈ， Ｃ．Ａ．， Ｐｅｒｎａ， Ｎ．， Ｂｕｒｌａｎｄ， Ｖ．， Ｒｉｌｅｙ， Ｍ．， Ｃｏｌｌａｄｏ−Ｖｉｄｅｓ， Ｊ．， Ｇｌａｓｎｅｒ， Ｊ．Ｄ．， Ｒｏｄｅ， Ｃ．Ｋ．Ｍ．， Ｇ．Ｆ．， Ｇｒｅｇｏｒ， Ｊ．， Ｄａｖｉｓ， Ｎ．Ｗ．， Ｋｉｒｋｐａｔｒｉｃｋ， Ｈ．Ａ．， Ｇｏｅｄｅｎ， Ｍ．Ａ．， Ｒｏｓｅ， Ｄ．Ｊ．， Ｍａｕ， Ｂ． ａｎｄ　Ｓｈａｏ， Ｙ）（１９９７）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７７：１４５３〜１４６２）から改変）。ｍａｒによって誘導された遺伝子を染色体の外側に記入して、ｍａｒによって発現された遺伝子を染色体の内側に記入する。太字の書体の遺伝子は、時計回り方向に読むが、通常のフォントは、反対鎖の遺伝子を表す（ブラトナー、プランケット、ブロック、ペルナ、バーランド、リレー、コラド・ビデス、グラスナー、ロード、グレコール、デービス、カークパトリック、ゴーデン、ローズ、マウおよびシャオ（Ｂｌａｔｔｎｅｒ， Ｆ．Ｒ．， Ｐｌｕｎｋｅｔｔ， Ｇ．Ｉ．Ｉ．Ｉ．， Ｂｌｏｃｈ， Ｃ．Ａ．， Ｐｅｒｎａ， Ｎ．， Ｂｕｒｌａｎｄ， Ｖ．， Ｒｉｌｅｙ， Ｍ．， Ｃｏｌｌａｄｏ−Ｖｉｄｅｓ， Ｊ．， Ｇｌａｓｎｅｒ， Ｊ．Ｄ．， Ｒｏｄｅ， Ｃ．Ｋ．Ｍ．， Ｇ．Ｆ．， Ｇｒｅｇｏｒ， Ｊ．， Ｄａｖｉｓ， Ｎ．Ｗ．， Ｋｉｒｋｐａｔｒｉｃｋ， Ｈ．Ａ．， Ｇｏｅｄｅｎ， Ｍ．Ａ．， Ｒｏｓｅ， Ｄ．Ｊ．， Ｍａｕ， Ｂ． ａｎｄ　Ｓｈａｏ， Ｙ）（１９９７）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７７：１４５３〜１４６２）。互いにすぐ隣に位置する遺伝子は、同じ呼称線上に共に掲示した。
【０３０４】
既知機能の遺伝子の発現を変化させることに加えて、ＭａｒＡはまた、まだ特徴付けがなされていない遺伝子の発現を変化させた。例えば、遺伝子ｂＯ４７７は、推定のＬＲＰ様転写調節因子をコードし、ｙａｄＧは輸送系のＡＴＰ結合成分をコードするが、ｂｌ４４８およびｙｇｇＪは既知の相同体を有しない。これらの遺伝子全てがＭａｒ表現型の開発において互いにどのように関連するかは不明である。ｇｓｈＢはグルタチオンの合成に関係し、これは細胞の抗酸化剤防御の一部であり（ヒダルゴおよびデンプル（Ｈｉｄａｌｇｏ， Ｅ． ａｎｄ Ｄｅｍｐｌｅ， Ｂ．）（１９９５）「大腸菌における遺伝子発現の調節（Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）」、リンおよびリンチ（Ｌｉｎ， Ｅ．Ｃ．， ａｎｄ Ｌｙｎｃｈ， Ａ．Ｓ．）編（Ｒ．Ｇ．ランデス社、オースチン）、４３３〜４５０頁）、その他の機能では、ＯｘｙＲのその通常のレドックス状態への還元（チャターおよびニカイドウ（Ｃｈａｔｅｒ， Ｋ．Ｆ．， ａｎｄ Ｎｉｋａｉｄｏ， Ｈ．）（１９９９）、Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ２：１２１〜１２５）、および毒性求電子試薬の解毒（ファーグソン（Ｆｅｒｇｕｓｏｎ， Ｇ．Ｐ．）、（１９９９）、Ｔｒｅｎｄｓ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ７：２４２〜２４７）に関係している。ＭａｒＡによるｇｓｈＢの誘導は、酸化的ストレスに対する抵抗性がなぜＭａｒ表現型であるかを説明するのに役立ちうる。
【０３０５】
実施例２．これまで同定されているｍａｒ調節遺伝子の確認
これまでにｍａｒレギュロン、例えばｉｎａＡ、ｓｏｄＡ、ｏｍｐＦ、ｚｗｆおよびｆｕｍＣの一部であると同定された遺伝子のほとんどの異なる発現（アリザ、コーエン、バクバワト、レビーおよびデンプル（Ａｒｉｚａ， Ｒ．Ｒ．， Ｃｏｈｅｎ， Ｓ．Ｐ．， Ｂａｃｈｂａｗａｔ， Ｎ．， Ｌｅｖｙ， Ｓ．Ｂ． ａｎｄ Ｄｅｍｐｌｅ Ｂ．）（１９９４）Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １７６：１４３〜１４８）；グリーンバーグ、チョウ、モナクおよびデンプル（Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ， Ｊ．Ｔ．， Ｃｈｏｕ， Ｊ．Ｈ．， Ｍｏｎａｃｈ， Ｐ．Ａ． ａｎｄ Ｄｅｍｐｌｅ， Ｂ．）（１９９１）、Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １７３：４４３３〜４４３９）；ジェア、マーチン、ロスナー、フジタ、イシハラおよびウルフ（Ｊａｉｒ， Ｋ．Ｗ．， Ｍａｒｔｉｎ， Ｒ．Ｇ．， Ｒｏｓｎｅｒ， Ｊ．Ｌ．， Ｆｕｊｉｔａ， Ｎ．， Ｉｓｈｉｈａｒａ， Ａ． ａｎｄ Ｗｏｌｆ， Ｊ．Ｒ．Ｅ．）（１９９５）Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １７７：７１００〜７１０４）；ロスナーおよびスロンクゼウスキ（Ｒｏｓｎｅｒ， Ｊ．Ｌ．， ａｎｄ Ｓｌｏｎｃｚｅｗｓｋｉ， Ｊ．Ｌ．）（１９９４）、Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １７６：６２６２〜６２６９）を、本研究において確認した（表３）。Ｍａｒ表現型の主な役割は、流出系ａｃｒＡＢによって示され、これは毒性化合物を細胞外にポンプで汲み出すことによって作用する（ホワイト、ゴールドマン、デンプルおよびレビー（Ｗｈｉｔｅ， Ｄ．Ｇ．， Ｇｏｌｄｍａｎ， Ｊ．Ｄ．， Ｄｅｍｐｌｅ， Ｂ． ａｎｄ Ｌｅｖｙ， Ｓ．Ｂ．）（１９９７）Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １７９：６１２２〜６１２６；モケン、マクムリーおよびレビー（Ｍｏｋｅｎ， Ｍ．Ｃ．， ＭｃＭｕｒｒｙ， Ｌ．Ｍ．， ａｎｄ Ｌｅｖｙ， Ｓ．Ｂ．）（１９９７）Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ． Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ． ４１：２７７０〜２７７２；オクス、マおよびニカイドウ（Ｏｋｕｓｕ， Ｈ．， Ｍａ， Ｄ．， ａｎｄ Ｎｉｋａｉｄｏ， Ｈ．）（１９９６）Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １７８：３０６〜３０８）。ａｃｒＡＢオペロンのａｃｒＡ遺伝子の発現の増加も同様に認められた（表３）が、ａｃｒＢの発現値はバックグラウンドより上ではなかった。ｍａｒＢに関して先に記載したように、この種の知見は、十分に理解されていないが、多シストロン転写物の異なるプロセシングおよび／または転写の安定性のわずかな差から生じる可能性がある。
【０３０６】
これまでの研究は、特に有機溶媒耐性の意味において、Ｍａｒ表現型の発達におけるＴｏｌＣおよびＡｃｒＡＢ流出ポンプの協調的な活性化を示唆している（フラリック（Ｆｒａｌｉｃｋ， Ｊ．Ａ．，）（１９９６）Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １７８：５８０３〜５８０５；アオノ、ツカゴシおよびヤマモト（Ａｏｎｏ， Ｒ．， Ｔｓｕｋａｇｏｓｈｉ， Ｎ． ａｎｄ Ｙａｍａｍｏｔｏ， Ｍ．）（１９９８）Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １８０：９３８〜９４４）。外膜タンパク質の発現の変化（例えば、ＯｍｐＸの増加、ＯｍｐＦおよびＬａｍＢの減少）は、大腸菌ｍａｒＲ変異体およびＭａｒを過剰発現する野生型株において報告されている（アオノ、ツカゴシおよびヤマモト（Ａｏｎｏ， Ｒ．， Ｔｓｕｋａｇｏｓｈｉ， Ｎ． ａｎｄ Ｙａｍａｍｏｔｏ， Ｍ．）（１９９８）Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １８０：９３８〜９４４）。Ｍａｒ発現は、本明細書においてｔｏｌＣとｏｍｐＸとの双方の転写を増加させることが示されている（表３）。ｏｍｐＦレベルの減少を認めたが、ｌａｍＢ発現が同様に減少するという証拠はなく、ＬａｍＢは、初期の試験において同定された過小産生のタンパク質ではない可能性があることを示唆している（アオノ、ツカゴシおよびヤマモト（Ａｏｎｏ， Ｒ．， Ｔｓｕｋａｇｏｓｈｉ， Ｎ． ａｎｄ Ｙａｍａｍｏｔｏ， Ｍ．）（１９９８）Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １８０：９３８〜９４４）。
【０３０７】
これまでに同定されたｍｌｒｌ（ｂｌ４５１）およびｍｌｒ２（ｂ０６０３）遺伝子（セオアンおよびレビー（Ｓｅｏａｎｅ， Ａ．Ｓ． ａｎｄ Ｌｅｖｙ， Ｓ．Ｂ．）（１９９５）Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １７７：５３０〜５３５）は、２つの実験においてｍａｒ発現株において増加したが、第３の実験では影響を受けないように思われ、そのため表３に含めなかった。これまでＭａｒＡによって抑制されるとこれまで記載されているｓｌｐ遺伝子の発現（セオアンおよびレビー（Ｓｅｏａｎｅ， Ａ．Ｓ． ａｎｄ Ｌｅｖｙ， Ｓ．Ｂ．）（１９９５）Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １７７：５３０〜５３５）はかなり低いため、如何なるｍａｒ媒介変化も検出することが難しいであろう。この後者の知見は、これらの実験が対数増殖期中期の細胞において行われたことを反映する可能性があるが、ｓｌｐは静止期誘導型遺伝子である。２つのｍａｔ反応性遺伝子ｓｏｉ−１７とｓｏｉ−１９との同一性（グリーンバーグ、チョウ、モナクおよびデンプル（Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ， Ｊ．Ｔ．， Ｃｈｏｕ， Ｊ．Ｈ．， Ｍｏｎａｃｈ， Ｐ．Ａ． ａｎｄ Ｄｅｍｐｌｅ， Ｂ．）（１９９１）、Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １７３：４４３３〜４４３９）はなおも決定しなければならないため、その異なる発現はマクロアレイ分析によって確認できなかった。
【０３０８】
実施例３．ｓｏｘＲＳとｍａｒレギュロンとの関係
ＳｏｘＳは、酸化的ストレスに対して細胞反応を媒介し、ＭａｒＡと同様に、転写活性化因子ＸｙｌＳ／ＡｒａＣ（ガレゴス、シュライフ、バイロック（Ｇａｌｌｅｇｏｓ， Ｍ， Ｔ．， Ｓｃｈｌｅｉｆ， Ｒ．， Ｂａｉｒｏｃｈ））のメンバーであるｓｏｘＲＳレギュロンの活性化因子である（デンプル（Ｄｅｍｐｌｅ， Ｂ．）（１９９６）Ｇｅｎｅ １７９：５３〜５７）。多くの酸化的ストレス遺伝子が、ＳｏｘＳに反応することが知られており、同様にＭａｒＡにも反応する（ジェア、マーチン、ロスナー、フジタ、イシハラおよびウルフ（Ｊａｉｒ， Ｋ．Ｗ．， Ｍａｒｔｉｎ， Ｒ．Ｇ．， Ｒｏｓｎｅｒ， Ｊ．Ｌ．， Ｆｕｊｉｔａ， Ｎ．， Ｉｓｈｉｈａｒａ， Ａ． ａｎｄ Ｗｏｌｆ， Ｊ．Ｒ．Ｅ．）（１９９５）Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １７７：７１００〜７１０４；ミラー、ガンビノ、スラビックおよびグラチェック（Ｍｉｌｌｅｒ， Ｐ．Ｆ．， Ｇａｍｂｉｎｏ， Ｌ．Ｆ．， Ｓｕｌａｖｉｋ， Ｍ．Ｃ．ａｎｄ Ｇｒａｃｈｅｃｋ， Ｓ．Ｊ．）（１９９４）Ａｎｔｉｍｉｒｏｂ． Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ． ３８：１７７３〜１７７９）。逆に、ＳｏｘＳは、Ｍａｒの制御下である遺伝子の活性化によってＭａｒ表現型を付与することができる（アリザ、コーエン、バクバワト、レビーおよびデンプル（Ａｒｉｚａ， Ｒ．Ｒ．， Ｃｏｈｅｎ， Ｓ．Ｐ．， Ｂａｃｈｂａｗａｔ， Ｎ．， Ｌｅｖｙ， Ｓ．Ｂ． ａｎｄ Ｄｅｍｐｌｅ Ｂ．）（１９９４）Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １７６：１４３〜１４８）；グリーンバーグ、チョウ、モナクおよびデンプル（Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ， Ｊ．Ｔ．， Ｃｈｏｕ， Ｊ．Ｈ．， Ｍｏｎａｃｈ， Ｐ．Ａ． ａｎｄ Ｄｅｍｐｌｅ， Ｂ．）（１９９１）、Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １７３：４４３３〜４４３９））。ＭａｒＡおよびＳｏｘＳ調節因子の双方によって直接または間接的に調節されることが知られている遺伝子には、ｚｗｆ、ｆｐｒ、ｆｕｍＣ、ｍｉｃＦ、ｎｆｏ、ｉｎａＡ、ｓｏｄＡ、およびａｃｒＡが含まれる（アリザ、コーエン、バクバワト、レビーおよびデンプル（Ａｒｉｚａ， Ｒ．Ｒ．， Ｃｏｈｅｎ， Ｓ．Ｐ．， Ｂａｃｈｂａｗａｔ， Ｎ．， Ｌｅｖｙ， Ｓ．Ｂ． ａｎｄ Ｄｅｍｐｌｅ Ｂ．）（１９９４）Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １７６：１４３〜１４８）；グリーンバーグ、チョウ、モナクおよびデンプル（Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ， Ｊ．Ｔ．， Ｃｈｏｕ， Ｊ．Ｈ．， Ｍｏｎａｃｈ， Ｐ．Ａ． ａｎｄ Ｄｅｍｐｌｅ， Ｂ．）（１９９１）、Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １７３：４４３３〜４４３９）；ジェア、マーチン、ロスナー、フジタ、イシハラおよびウルフ（Ｊａｉｒ， Ｋ．Ｗ．， Ｍａｒｔｉｎ， Ｒ．Ｇ．， Ｒｏｓｎｅｒ， Ｊ．Ｌ．， Ｆｕｊｉｔａ， Ｎ．， Ｉｓｈｉｈａｒａ， Ａ． ａｎｄ Ｗｏｌｆ， Ｊ．Ｒ．Ｅ．）（１９９５）Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １７７：７１００〜７１０４；ロスナーおよびスロンクゼウスキ（Ｒｏｓｎｅｒ， Ｊ．Ｌ．， ａｎｄ Ｓｌｏｎｃｚｅｗｓｋｉ， Ｊ．Ｌ．）（１９９４）、Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １７６：６２６２〜６２６９）；リオチェフおよびフリドビッチ（Ｌｉｏｃｈｅｖ， Ｓ．Ｉ．， ａｎｄ Ｆｒｉｄｏｖｉｃｈ， Ｉ．）（１９９２）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８９：５８９２〜５８９６；マ、アルベルチ、リンチ、ニカイドウおよびハースト（Ｍａ， Ｄ．， Ａｌｂｅｒｔｉ， Ｍ．， Ｌｙｎｃｈ， Ｃ．， Ｎｉｋａｉｄｏ， Ｈ． ａｎｄ Ｈｅａｒｓｔ， Ｊ．Ｅ．）（１９９６）Ｍｏｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． １９：１０１〜１１２）。ｚｗｆ、ｆｕｍＣ、ａｃｒＡ、ｉｎａＡおよびｓｏｄＡのｍａｒによる正の調節、および同様にｏｍｐＦのダウンレギュレーションがこれらの結果から確認される。しかし、ＭａｒＡのｎｆｏおよびｆｐｒに対する結合は、細胞不含系において示され（ジェア、マーチン、ロスナー、フジタ、イシハラおよびウルフ（Ｊａｉｒ， Ｋ．Ｗ．， Ｍａｒｔｉｎ， Ｒ．Ｇ．， Ｒｏｓｎｅｒ， Ｊ．Ｌ．， Ｆｕｊｉｔａ， Ｎ．， Ｉｓｈｉｈａｒａ， Ａ． ａｎｄ Ｗｏｌｆ， Ｊ．Ｒ．Ｅ．）（１９９５）Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １７７：７１００〜７１０４）、本明細書において用いた実験条件を用いると、これらの２つの遺伝子の発現に有意差は検出されなかった。
【０３０９】
他の知見から、ｍａｒとｓｏｘＲＳレギュロンの間にさらなる重なりがあることが判明した。これまでにｓｏｘＲＳの制御下であることが知られている（グルアーおよびゲスト（Ｇｒｕｅｒ， Ｍ．Ｊ．， ａｎｄ Ｇｕｅｓｔ， Ｊ．Ｒ．）（１９９４）Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ １４０：２５３１〜２５４１；コウ、チュン、リーおよびロウ（Ｋｏｈ， Ｙ．Ｓ．， Ｃｈｕｎｇ， Ｗ．Ｈ．， Ｌｅｅ， Ｊ．Ｈ．， ａｎｄ Ｒｏｅ， Ｊ．Ｈ．）（１９９９）Ｍｏｌ． Ｇｅｎ． Ｃｅｎｔ． ３７４〜３８０；リオチェフ、ハウスラーデンおよびフリドビッチ（Ｌｉｏｃｈｅｖ， Ｓ．Ｉ．， Ｈａｕｓｌａｄｅｎ， Ａ．， ａｎｄ Ｆｒｉｄｏｖｉｃｈ， Ｉ．）（１９９９）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９６：３５３７〜３５３９）アコニターゼ（ａｃｎＡ）、ＧＴＰシクロヒドロラーゼＩＩ（ｒｉｂＡ）遺伝子、および主な酸素不応性ニトロレダクターゼ（ｎｆｓＡ／ｍｄａＡ）のレベルは、ｍａｒ発現株において増加することが認められた（表３）。ＮｆｓＡは、パラコートによって影響を受ける主なイソ酵素であることが示されたが、酸素感受性ＮＡＤ（Ｐ）ＨニトロレダクターゼＢ、ｎｆｎＢ（ｎｆｓＢとも呼ばれる）は、わずかに誘導されることが示された（リオチェフ、ハウスラーデンおよびフリドビッチ（Ｌｉｏｃｈｅｖ， Ｓ．Ｉ．， Ｈａｕｓｌａｄｅｎ， Ａ．， ａｎｄ Ｆｒｉｄｏｖｉｃｈ， Ｉ．）（１９９９）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９６：３５３７〜３５３９））。ｎｆｎＢはｎｆｓＡと同様に、ｍａｒの正の制御下である（表３）。
【０３１０】
ｎｆｓＡは、２つの遺伝子の一つが腫瘍障害化合物に対する細菌の耐性に関連しているため、当初ｍｄａＡ（薬物活性調節物質）と命名された（チャタリーおよびスターンバーグ（Ｃｈａｔｔｅｒｊｅｅ， Ｐ．Ｋ．， ａｎｄ Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇ， Ｎ．Ｌ．）（１９９５）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９２：８９５０〜８９５４）。ｍｄａＢと呼ばれる他の遺伝子も同様に、ｍａｒによって影響を受けることが判明した（表３）。ｍｄａＢに関する情報は非常に限られており、その機能はなおも不明である。これらの知見により、環境ストレスに対する保護における推定の生理的役割に関して示唆的な証拠が提供される。
【０３１１】
ＭａｒＡおよびＳｏｘＳによる、重なり合った調節の正確なメカニズムはなおも十分に理解されていない。ｓｏｘＲＳ座によってコードされる多数の抗生物質耐性は、無傷のｍａｒ座に部分的に依存しているように思われた；ＳｏｘＳを過剰発現する株は、ｍａｒ ＲＡＢ転写レベルの増加を示した（ミラー、ガンビノ、スラビックおよびグラチェック（Ｍｉｌｌｅｒ， Ｐ．Ｆ．， Ｇａｍｂｉｎｏ， Ｌ．Ｆ．， Ｓｕｌａｖｉｋ， Ｍ．Ｃ．ａｎｄ Ｇｒａｃｈｅｃｋ， Ｓ．Ｊ．）（１９９４）Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ． Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ． ３８：１７７３〜１７７９）。一方、他の研究から、ｍａｒおよびｓｏｘＲＳによるいくつかの遺伝子の調節が無関係な経路、例えばｉｎａＡを通して起こりうることが示された（ロスナーおよびスロンクゼウスキ（Ｒｏｓｎｅｒ， Ｊ．Ｌ．， ａｎｄ Ｓｌｏｎｃｚｅｗｓｋｉ， Ｊ．Ｌ．）（１９９４）、Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １７６：６２６２〜６２６９）。ｓｏｘＲＳに及ぼすｍａｒの影響は検出されておらず、ｓｏｘＳ発現のｍａｒによるアップレギュレーションを認めなかった。したがって、ＭａｒＡはＳｏｘＳとは無関係に作用するように思われる。
【０３１２】
ＭａｒＡ／ＳｏｘＳ相同体であるＲｏｂはまた、ｍａｒレギュロンに属する遺伝子のプロモーターに結合することができ、このタンパク質の過剰発現は大腸菌における多抗生物質耐性および有機溶媒耐性に至る（アリザ、リ、リングスタッドおよびデンプル（Ａｒｉｚａ， Ｒ．Ｒ．， Ｌｉ， Ｚ．， Ｒｉｎｇｓｔａｄ， Ｎ．， ａｎｄ Ｄｅｍｐｌｅ Ｂ．）（１９９５）Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １７７：１６５５〜１６６１）；ジェア、ユ、スカースタッド、トニー、フジタ、イシハラおよびウルフ（Ｊａｉｒ， Ｋ．Ｗ．， Ｙｕ， Ｘ．， Ｓｋａｒｓｔａｄ， Ｋ．， Ｔｈｏｎｙ， Ｂ．， Ｆｕｊｉｔａ， Ｎ．， Ｉｓｈｉｈａｒａ， Ａ． ａｎｄ Ｗｏｌｆ， Ｒ．Ｅ．Ｊ．）（１９９６）Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １７８：２５０７〜２５１３）。ＭａｒＡによってｒｏｂの発現に実質的な変化を認めなかった。
【０３１３】
実施例４．オペロンと同時転写単位のｍａｒ調節
いくつかのｍａｒ調節遺伝子は、報告されたまたは予測されたオペロンの一部として異なる領域に集合していた（ブラトナー、プランケット、ブロック、ペルナ、バーランド、リレー、コラド・ビデス、グラスナー、ロード、グレコール、デービス、カークパトリック、ゴーデン、ローズ、マウおよびシャオ（Ｂｌａｔｔｎｅｒ， Ｆ．Ｒ．， Ｐｌｕｎｋｅｔｔ， Ｇ．Ｉ．Ｉ．Ｉ．， Ｂｌｏｃｈ， Ｃ．Ａ．， Ｐｅｒｎａ， Ｎ．， Ｂｕｒｌａｎｄ， Ｖ．， Ｒｉｌｅｙ， Ｍ．， Ｃｏｌｌａｄｏ−Ｖｉｄｅｓ， Ｊ．， Ｇｌａｓｎｅｒ， Ｊ．Ｄ．， Ｒｏｄｅ， Ｃ．Ｋ．Ｍ．， Ｇ．Ｆ．， Ｇｒｅｇｏｒ， Ｊ．， Ｄａｖｉｓ， Ｎ．Ｗ．， Ｋｉｒｋｐａｔｒｉｃｋ， Ｈ．Ａ．， Ｇｏｅｄｅｎ， Ｍ．Ａ．， Ｒｏｓｅ， Ｄ．Ｊ．， Ｍａｕ， Ｂ． ａｎｄ　Ｓｈａｏ， Ｙ）（１９９７）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７７：１４５３〜１４６２）（図２）。興味深いことに、同じオペロンからの異なる遺伝子の発現レベルのかなりの変動を認め、したがってこれらの遺伝子のごく一部は表３に記載するには不適であった。例えば、トリプトファナーゼオペロン（ｔｎａＬＡＢ；８３．８分の位置）における３つの遺伝子の発現の増加倍数は、ｔｎａＬに関して１．７倍、ｔｎａＡに関して８．１倍（平均値）であったのに対し、ｔｎａＢは不明であり、一つの実験ではバックグラウンド値を生じたが、他の二つの実験では明らかに上方制御された。
【０３１４】
ｍａｒ調節オペロン内の遺伝子の異なる発現は、転写開始の調節の他に他の因子、例えばｍＲＮＡ安定性の差、またはオペロンのシストロン内領域における調節二次構造の存在の結果として生じる可能性がある。例えば、β−メチルガラクトシド（ｍｇｌ）輸送オペロンは、三つのＯｒｆｓ、ｍｇｌＢＡＣで構成される。ノザン分析は、二つの転写物の存在を示し、一つは多シストロンｍｇｌＢＡＣ ｍＲＮＡであり、もう一つはオペロン、ｍｇｌＢにおける第一の遺伝子に対応するより小さい転写物である（ホグ、フェルカーおよびフォンカルロビッツ（Ｈｏｇｇ， Ｒ．Ｗ．， Ｖｏｅｌｋｅｒ， Ｃ．， ａｎｄ ｖｏｎ Ｃａｒｌｏｗｉｔｚ， Ｉ．）（１９９１）Ｍｏｌ． Ｃｅｎ． Ｇｅｎｅｔ． ２２９：４５３〜４５９）。この知見は、より大きいｍＲＮＡが３’側から５’側へ分解された結果であり、その３’末端に存在する反復的な遺伝子外パリンドローム配列によってヌクレアーゼに対してより小さい転写物が保護されていると示唆された。一致して、これらの知見から、より大きい転写物よりもはるかに高いレベルのより小さい転写物が示された（図３）。図３においてｍａｒによって上方制御された遺伝子８個、すなわちａｃｎＡ、ｇｓｈＢ、ｈｅｍＢ、ｍｄａＡ、ｔｐｘ、ｍｇｌＢ、ｎｆｎＢおよびｙａｄＧ、ならびにｍａｒによって下方制御された遺伝子２個、すなわちａｃｅＥおよびｎｄｈを表３に記載された遺伝子から選択した。試料を調製して、ｍａｒ発現（ｍａｒ＋）およびｍａｒ欠失（Δｍａｒ）細胞から一試料あたり２本ずつ実験を行った。ＲＮＡ試料をナイロンメンブレンに転写して、本研究の遺伝子の３２Ｐ標識ＰＣＲ増幅プローブとハイブリダイズさせた。
【０３１５】
大腸菌ゲノムにおいて、パラログを有するように思われるｍａｒレギュロンの唯一のメンバーはａｃｒＡ、ｐｆｌＢ、ｏｍｐＦ、ｍａｒＡ、およびｍｔｒである（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｅｔｉｃｓ． ｗｉｓｃ．ｅｄｕ／）。しかし、ｍｔｒ対ｔｎａＢをおそらく例外として、これらの遺伝子のパラログのいずれもｍａｒによって調節されると同定されておらず、したがって、実質的な配列相同性を有する他の遺伝子（リッチモンド、グラスナー、マウ、ジン、ブラトナー（Ｒｉｃｈｍｏｎｄ， Ｃ．Ｓ．， Ｇｌａｓｎｅｒ， Ｊ．Ｄ．， Ｍａｕ， Ｒ．， Ｊｉｎ， Ｈ． ａｎｄ Ｂｌａｔｔｎｅｒ， Ｆ．Ｒ．）（１９９９）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２７：３８２１〜３８３５）とのクロスハイブリダイゼーションの人為的結果が、認められた知見を説明するようには思われない。
【０３１６】
これまで報告されたオペロンの一部ではない隣接する遺伝子のｍａｒ調節も同様に認められた（表３および図２）。ｍａｒによるｇｓｈＢ（６６．６分の位置）発現のアップレギュレーションは一般的に認められる；その上、その機能がなお不明であり、ｇｓｈＢのすぐ上流に位置するｙｇｇＪ、およびｇｓｈＢの下流のＯｒｆであるｙｑｇＥ（ｂ２９４８）も同様に、ＭａｒＡによって上方制御された。ｙｇｇＪの末端とｇｓｈＢの開始部位との間には１３ ｂｐが存在するに過ぎず、ｇｓｈＢとｙｑｇＥとの間は３７ ｂｐに過ぎず、このためそれぞれの遺伝子間領域にプロモーター配列は存在できない。これらの結果は、これらの３つの遺伝子が「予測されたオペロン」として注釈されることの根拠となる（ブラトナー、プランケット、ブロック、ペルナ、バーランド、リレー、コラド・ビデス、グラスナー、ロード、グレコール、デービス、カークパトリック、ゴーデン、ローズ、マウおよびシャオ（Ｂｌａｔｔｎｅｒ， Ｆ．Ｒ．， Ｐｌｕｎｋｅｔｔ， Ｇ．Ｉ．Ｉ．Ｉ．， Ｂｌｏｃｈ， Ｃ．Ａ．， Ｐｅｒｎａ， Ｎ．， Ｂｕｒｌａｎｄ， Ｖ．， Ｒｉｌｅｙ， Ｍ．， Ｃｏｌｌａｄｏ−Ｖｉｄｅｓ， Ｊ．， Ｇｌａｓｎｅｒ， Ｊ．Ｄ．， Ｒｏｄｅ， Ｃ．Ｋ．Ｍ．， Ｇ．Ｆ．， Ｇｒｅｇｏｒ， Ｊ．， Ｄａｖｉｓ， Ｎ．Ｗ．， Ｋｉｒｋｐａｔｒｉｃｋ， Ｈ．Ａ．， Ｇｏｅｄｅｎ， Ｍ．Ａ．， Ｒｏｓｅ， Ｄ．Ｊ．， Ｍａｕ， Ｂ． ａｎｄ　Ｓｈａｏ， Ｙ）（１９９７）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７７：１４５３〜１４６２）。
【０３１７】
ｎｆｓＡから直ちに上流に存在する小さいＯｒｆである遺伝子ｙｂｊＣの転写もまた、ＭａｒＡによって上方制御されるように思われる。ｙｂｊＣに対して内部でその開始コドンに対して近傍のプロモーター配列が、ｎｆｓＡに関して提唱されている（４４）。このように、ｎｆｓＡは、このプロモーターから独立して転写することができるが、得られた転写物はアレイにおける双方の遺伝子にハイブリダイズするであろう。一方、大腸菌ゲノム配列は、これらの２つの遺伝子がオペロンに由来する可能性があることを示唆している（ブラトナー、プランケット、ブロック、ペルナ、バーランド、リレー、コラド・ビデス、グラスナー、ロード、グレコール、デービス、カークパトリック、ゴーデン、ローズ、マウおよびシャオ（Ｂｌａｔｔｎｅｒ， Ｆ．Ｒ．， Ｐｌｕｎｋｅｔｔ， Ｇ．Ｉ．Ｉ．Ｉ．， Ｂｌｏｃｈ， Ｃ．Ａ．， Ｐｅｒｎａ， Ｎ．， Ｂｕｒｌａｎｄ， Ｖ．， Ｒｉｌｅｙ， Ｍ．， Ｃｏｌｌａｄｏ−Ｖｉｄｅｓ， Ｊ．， Ｇｌａｓｎｅｒ， Ｊ．Ｄ．， Ｒｏｄｅ， Ｃ．Ｋ．Ｍ．， Ｇ．Ｆ．， Ｇｒｅｇｏｒ， Ｊ．， Ｄａｖｉｓ， Ｎ．Ｗ．， Ｋｉｒｋｐａｔｒｉｃｋ， Ｈ．Ａ．， Ｇｏｅｄｅｎ， Ｍ．Ａ．， Ｒｏｓｅ， Ｄ．Ｊ．， Ｍａｕ， Ｂ． ａｎｄ　Ｓｈａｏ， Ｙ）（１９９７）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７７：１４５３〜１４６２）。ｎｆｓＡ、ｒｉｍＫおよびｂ０８５３から下流の二つの遺伝子も同様に、ＭａｒＡによって上方制御される。推定の転写終結因子は、ｎｆｓＡおよびｒｉｍＫの遺伝子間領域に同定されている（ゼンノ、コイケ、クマー、ジャヤーマン、タノクラおよびサイゴウ（Ｚｅｎｎｏ， Ｓ．， Ｋｏｉｋｅ， Ｈ．， Ｋｕｍａｒ， Ａ．Ｎ．， Ｊａｙａｒｍａｎ， Ｒ．， Ｔａｎｏｋｕｒａ， Ｍ． ａｎｄ Ｓａｉｇｏ， Ｋ．）（１９９６）Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １７８：４５０８〜４５１４）。それにもかかわらず、一定レベルの読み過ごし転写によって、この遺伝子複合体の同時発現が説明されるであろう。
【０３１８】
実施例５．ｍａｒレギュロンと鉄との関係
ＭａｒＡによって調節される遺伝子のいくつかは鉄に関連している、例えばｈｅｍＢ、ｆｕｍＣ、ｆｅｃＡ、ａｃｎＡ、ｓｏｄＡ。遺伝子のいくつかの産物は鉄−硫黄クラスターを含み、これはＯ２および鉄の感知、ならびに調節機能において主な役割を有する（ベイナートおよびキレー（Ｂｅｉｎｅｒｔ， Ｈ． ａｎｄ Ｋｉｌｅｙ， Ｐ．Ｊ．）（１９９９）、Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｃｈｅｍ． Ｂｉｏｌ． ３：１５２〜１５７）（ディングおよびデンプル（Ｄｉｎｇ， Ｈ． ａｎｄ Ｄｅｍｐｌｅ， Ｂ．）（１９９８）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３７：１７２８０〜１７２８６）。鉄は、細菌細胞にとって必須の元素である（イアーハート（Ｅａｒｈａｒｔ， Ｃ．Ｆ．）（１９９６）、「大腸菌とサルモネラ菌：細胞と分子生物学（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ａｎｄ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ：Ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）」ニードハート（Ｎｅｉｄｈａｒｄｔ， Ｆ．Ｃ．）編（ＡＳＭ出版、ワシントンＤＣ）、１０７５〜１０９０頁）、および宿主からの鉄の獲得は細菌の発病において重要である（リトウィンおよびカルダーウッド（Ｌｉｔｗｉｎ， Ｃ．Ｍ．， ａｎｄ Ｃａｌｄｅｒｗｏｏｄ， Ｓ．Ｂ．）（１９９３）、Ｃｌｉｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｒｅｖ． ６：１３７〜１４９）（マハン、スローチおよびメカラノス（Ｍａｈａｎ， Ｍ．Ｊ．， Ｓｌａｕｃｈ， Ｊ．Ｍ．， ａｎｄ Ｍｅｋａｌａｎｏｓ， Ｊ．Ｊ．）（１９９６）、「大腸菌とサルモネラ菌：細胞と分子生物学（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ａｎｄ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ：Ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）」ニードハート（Ｎｅｉｄｈａｒｄｔ， Ｆ．Ｃ．）編（ＡＳＭ出版、ワシントンＤＣ）、２８０３〜２８１５頁）。しかし、鉄はまたそれが全ての細胞成分を傷害して、細胞死に至ることさえあるフェントン反応を通してヒドロキシルイオンの産生を触媒することから、細菌細胞にとって有害となりうる（ゼング、ドアン、シュナイダーおよびストルツ（Ｚｈｅｎｇ， Ｍ．， Ｄｏａｎ， Ｂ．， Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ， Ｔ．Ｄ．， ａｎｄ Ｓｔｏｒｚ， Ｇ．）（１９９９）Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １８１：４６３９〜４６４３）。
【０３１９】
Ｆｕｒ（鉄取り込み調節物質）によって調節されることが知られているいくつかの遺伝子も同様に、ＳｏｘＳ、ＭａｒＡおよびその他の調節物質、例えばａｃｎＡおよびｓｏｄＡに対して反応性である（カニンガム、グルアーおよびゲスト（Ｃｕｎｎｉｍｇｈａｍ， Ｌ．， Ｇｒｕｅｒ， Ｍ．Ｊ．， ａｎｄ Ｇｕｅｓｔ， Ｊ．Ｒ．）（１９９７）Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ １４３：３７９５〜８０５）（ストルツおよびイムレー（Ｓｔｏｒｚ， Ｇ．，　ａｎｄ Ｉｍｌａｙ， Ｊ．Ａ． ）（１９９９）Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ２：１８８〜１９４）。この同時調節によって、細胞は鉄関連酸化的ストレスに対処することができ、細菌の発病におけるｍａｒの役割を示唆している。
【０３２０】
実施例６．選択された遺伝子のノザンブロット分析
その発現がマクロアレイにおいて誘導型（ｔｐｘ、ａｃｎＡ、ｍｇｌＢ、ｍｄａＡ、ｇｓｈＢ、ｈｅｍＢ、ｙａｄＧおよびｎｆｎＢ）であるか、または抑制的である（ａｃｅＥおよびｎｄｈ）新たに同定されたｍａｒ調節遺伝子１０個を、ノザンブロット分析によって確認した。これにより、遺伝子に関連した単または多シストロン性の転写物の発現の変化が示された（図３）。これらの変化の大きさは、マクロアレイについて得られたものとは幾分異なっていたが意外ではなかった（ブラトナー、プランケット、ブロック、ペルナ、バーランド、リレー、コラド・ビデス、グラスナー、ロード、グレコール、デービス、カークパトリック、ゴーデン、ローズ、マウおよびシャオ（Ｂｌａｔｔｎｅｒ， Ｆ．Ｒ．， Ｐｌｕｎｋｅｔｔ， Ｇ．Ｉ．Ｉ．Ｉ．， Ｂｌｏｃｈ， Ｃ．Ａ．， Ｐｅｒｎａ， Ｎ．， Ｂｕｒｌａｎｄ， Ｖ．， Ｒｉｌｅｙ， Ｍ．， Ｃｏｌｌａｄｏ−Ｖｉｄｅｓ， Ｊ．， Ｇｌａｓｎｅｒ， Ｊ．Ｄ．， Ｒｏｄｅ， Ｃ．Ｋ．Ｍ．， Ｇ．Ｆ．， Ｇｒｅｇｏｒ， Ｊ．， Ｄａｖｉｓ， Ｎ．Ｗ．， Ｋｉｒｋｐａｔｒｉｃｋ， Ｈ．Ａ．， Ｇｏｅｄｅｎ， Ｍ．Ａ．， Ｒｏｓｅ， Ｄ．Ｊ．， Ｍａｕ， Ｂ． ａｎｄ　Ｓｈａｏ， Ｙ）（１９９７）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７７：１４５３〜１４６２；スペンサーおよびゲスト（Ｓｐｅｎｃｅｒ， Ｍ．Ｅ．， ａｎｄ Ｇｕｅｓｔ， Ｊ．Ｒ．）（１９８５）Ｍｏｌ． Ｃｅｎ． Ｇｅｎｅｔ．２００：１４５〜１５４）（クエイル、アイレイドンおよびゲスト（Ｑｕａｉｌ， Ｍ．Ａ．， Ｉｌａｙｄｏｎ， Ｄ．Ｊ．， ａｎｄ Ｇｕｅｓｔ， Ｊ．Ｒ．）（１９９４）Ｍｏｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． １２：９５〜１０４）。
【０３２１】
転写活性化因子ＭａｒＡは、直接または間接的に遺伝子発現を制御する可能性がある。これが中間体の活性化因子または阻害因子調節タンパク質を活性化して、これが次に、レギュロンにおける他の遺伝子の発現を上方制御または下方制御することができる。適例は、先に述べたｏｍｐＦのｍａｒ調節である（コーエン、マクムリーおよびレビー（Ｃｏｈｅｎ， Ｓ．Ｐ．， ＭｃＭｕｒｒｙ， Ｌ．Ｍ．， ａｎｄ Ｌｅｖｙ， Ｓ．Ｂ．）（１９８８）Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １７０：５１４６〜５４２２）。ＭａｒＡはｍｉｃＦを活性化するが、これはｏｍｐＦの翻訳に負の影響を及ぼすアンチセンスＲＮＡであり、外膜ポリンＯｍｐＦを減少させる（コーエン、ハクラーおよびレビー（Ｃｏｈｅｎ， Ｓ．Ｐ．， Ｈａｃｈｌｅｒ， Ｈ． ａｎｄ Ｌｅｖｙ， Ｓ．Ｂ．）（１９９３）、Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １７５：１４８４〜１４９２；コーエン、マクムリー、アイルーパー、ウルフソンおよびレビー（Ｃｏｈｅｎ， Ｓ．Ｐ．， ＭｃＭｕｒｒｙ， Ｌ．Ｍ．， Ｉ−ｌｏｏｐｅｒ， Ｄ．Ｃ．， Ｗｏｌｆｓｏｎ， Ｊ．Ｓ．， ａｎｄ Ｌｅｖｙ， Ｓ．Ｂ．）（１９８９）Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ． Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ． ３３：１３１８〜１３２５）。さらに、転写活性化因子はまた、抑制の専用域での調節物質結合部位の位置に応じて抑制タンパク質としても作用する（グララおよびコラド・ビデス（Ｇｒａｌｌａ， Ｊ．Ｄ．， ａｎｄ Ｃｏｌｌａｄｏ−Ｖｉｄｅｓ， Ｊ．）（１９９６）、「大腸菌とサルモネラ菌：細胞と分子生物学（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ａｎｄ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ：Ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）」ニードハート（Ｎｅｉｄｈａｒｄｔ， Ｆ．Ｃ．）編（ＡＳＭ出版、ワシントンＤＣ）、１２３２〜１２４５頁）。
【０３２２】
その発現傾向が三つの実験において一貫している遺伝子に限って本明細書において報告する。したがって、ｍａｒレギュロンの大きさは過小評価される可能性がある。そのプロモーター領域において推定のｍａｒボックスを含む遺伝子のいくつか（マーチン、ギレット、リーおよびロスナー（Ｍａｒｔｉｎ， Ｒ．Ｇ．， Ｇｉｌｌｅｔｔｅ， Ｗ．Ｋ．， Ｒｈｅｅ， Ｓ． ａｎｄ Ｒｏｓｎｅｒ， Ｊ．Ｌ．）（１９９９）、Ｍｏｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ３４：４３１〜４４１）は、本明細書において用いられる条件下ではｍａｒレギュロンの一部であることが示されなかった。その上、多数の遺伝子がバックグラウンドレベルで発現され、ｍａｒ発現に対して反応したが、これらは本研究において適用された閾値より低い小さい変化であり、したがって含めなかった。増殖期の異なる段階における細胞、または異なる培地で増殖させた細胞を用いるような異なる組の実験条件では、これらの変化の程度が増加するか、または新しい遺伝子が影響を受ける可能性があり、ｍａｒレギュロンに含めることが正当化される。特に、遺伝子発現における小さく一過性の変化は、外的ストレスに対する細胞反応において重要な意味を有するであろう。実験間の全体的な発現分析に差が認められ、このことは他の著者によっても広く扱われている（リッチモンド、グラスナー、マウ、ジンおよびブラトナー（Ｒｉｃｈｍｏｎｄ， Ｃ．Ｓ．， Ｇｌａｓｎｅｒ， Ｊ．Ｄ．， Ｍａｕ， Ｒ．， Ｊｉｎ， Ｈ． ａｎｄ Ｂｌａｔｔｎｅｒ， Ｆ．Ｒ．）（１９９９）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２７：３８２１〜３８３５；タオ、バウシュ、リッチモンド、ブラトナーおよびコンウェイ（Ｔａｏ， Ｈ．， Ｂａｕｓｃｈ， Ｃ．， Ｒｉｃｈｍｏｎｄ， Ｃ．， Ｂｌａｔｔｎｅｒ， Ｆ．Ｒ． ａｎｄ Ｃｏｎｗａｙ， Ｔ．）（１９９９）Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １８１：６４２５〜６４４０）。他の因子の中でも、著者らは、異なるバッチのＲＮＡを用いると、いくつかの遺伝子のシグナル強度が実験によって有意に異なることを認めた。この問題は、一試料あたり三回ずつ試験を実施することによって部分的に対処した。したがって、遺伝子アレイ法によって検出された傾向は、ノザンブロット分析およびプロモーター融合研究のような他の利用可能な分子および生化学技術によって分析しなければならない。
【０３２３】
【表３】大腸菌パノラマ遺伝子アレイを用いてｍａｒの一部であると同定された遺伝子
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＊　個々の遺伝子に関する情報は、大腸菌のＫ−１２ゲノムプロジェクトウェブページ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｅｔｉｃｓ．ｗｉｓｃ．ｅｄｕ／）を通して得た。ｍａｒ調節は、上方制御遺伝子に関して、独立した２つの実験から得た実験試料と対照試料との遺伝子発現の比、そして下方制御遺伝子に関してはその反対の比に対応する。
【０３２４】
同等物
当業者は、本明細書に記載した特定のポリペプチド、核酸、方法、アッセイ法、および試薬に対する多数の同等物を、単なる日常的な実験を用いて認識する、または確認することができるであろう。そのような同等物は、本発明の範囲内であると見なされ、添付の特許請求の範囲に含まれる。
【図面の簡単な説明】
【図１】大腸菌ＭａｒＡ調節遺伝子の遺伝子発現プロフィールを示す。
【図２】ｍａｒレギュロンの異なるメンバーの染色体分布および位置を示す。
【図３】ＮＩＭＲ遺伝子のノザンブロット分析を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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