(57)【要約】ヒトＡＰＰ遺伝子のＡベータおよびＣ９９部分の発現により該ハエが変質表現型を示すこととなる、トランスジェニックハエ。アルツハイマー病に潜在的に含まれる、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ遺伝子およびこれらＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ遺伝子のヒトホモログを同定するための方法における、これらのハエの使用をも開示する。アルツハイマー病およびＡＰＰ経路の異常と関連した他の状態を処置する治療薬の開発の薬物標的、およびこれらの遺伝子へ方向付ける物質を含む医薬組成物としての当該ヒトホモログの使用をも開示する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
そのゲノムが、ヒトＡＰＰのＡベータ部分を含むポリペプチドをコード化するＤＮＡ配列を含むトランスジェニックハエであって、該ＤＮＡ配列は、シグナル配列に融合された、Ａベータ４０（配列番号１）もしくはＡベータ４２（配列番号２）をコード化し、該ＤＮＡ配列は組織特異的な発現制御配列に機能し得るように結合され；そして、該ＤＮＡ配列の発現により該ハエが変質表現型を示すこととなる、該ＤＮＡ配列を発現する、ハエ。
【請求項２】
該ＤＮＡ配列はＡベータ４２をコード化し、そして該組織特異的な発現制御配列は眼特異的なプロモーターＧＭＲを含む、請求項１に記載のトランスジェニックハエ。
【請求項３】
該ＤＮＡ配列の該発現により該ハエが“ラッフアイ”表現型を示すこととなる、請求項２に記載のトランスジェニックハエ。
【請求項４】
そのゲノムが、シグナル配列に融合された、ヒトＡＰＰの野生型Ｃ９９部分（配列番号３）もしくはロンドン変異を有するヒトＡＰＰのＣ９９部分（配列番号４）を含むポリペプチドをコード化するＤＮＡ配列を含むトランスジェニックハエであって、該ＤＮＡ配列は組織特異的な発現制御配列に機能し得るように結合され；そして、該ＤＮＡ配列の発現により該ハエが変質表現型を示すこととなる、該ＤＮＡ配列を発現する、ハエ。
【請求項５】
該ＤＮＡ配列は野生型Ｃ９９をコード化し、そして該組織特異的な発現制御配列は、７Ｂ−Ｇａｌ４導入遺伝子によって脳内で生成されるＧａｌ４タンパク質により活性化されるＵＡＳ制御エレメントを含む、請求項４に記載のトランスジェニックハエ。
【請求項６】
該ＤＮＡ配列の該発現により該ハエが運動欠損により特色づけられる表現型を示すこととなる、請求項５に記載のトランスジェニックハエ。
【請求項７】
該ＤＮＡ配列は野生型Ｃ９９もしくはロンドン変異を有するヒトＡＰＰのＣ９９部分のいずれかをコード化し、そして該組織特異的な発現制御配列は、ａｐｔｅｒｏｕｓ−Ｇａｌ４導入遺伝子により生成されるＧａｌ４タンパク質により活性化されるＵＡＳ制御エレメントである、請求項４に記載のトランスジェニックハエ。
【請求項８】
該ＤＮＡ配列の該発現により該ハエが“凹型翅”表現型を示すこととなる、請求項７に記載のトランスジェニックハエ。
【請求項９】
ＡＰＰ経路の遺伝的修飾因子を同定する方法であって、該方法は、
（ａ）そのゲノムは、ヒトＡＰＰのＡベータ部分を含むポリペプチドをコード化するＤＮＡ配列を含み、そこでは該ＤＮＡ配列は、シグナル配列に融合された、Ａベータ４０（配列番号１）もしくはＡベータ４２（配列番号２）をコード化し、該ＤＮＡ配列が組織特異的な発現制御配列に機能し得るように結合され；そして該ＤＮＡの発現により該ハエが変質表現型を示すこととなる、該ＤＮＡ配列を発現する、トランスジェニックハエを提供すること；
（ｂ）該トランスジェニックハエを既知のもしくは予想される遺伝子中に変異を含むハエと交雑させること；そして
（ｃ）該交雑の子孫のスクリーニングにより、該ＤＮＡ配列および該変異を所有しかつ対照と比較して形質転換表現型の修飾された発現を示すハエを求めること：
を含む、方法。
【請求項１０】
該遺伝的修飾因子および／もしくはそのヒトホモログはアルツハイマー病の過程に影響する遺伝子である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
該ＤＮＡ配列はＡベータ４２をコード化し、そして該組織特異的な発現制御配列は眼特異的なプロモーターＧＭＲを含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
該ＤＮＡ配列の該発現により該ハエが“ラッフアイ”表現型を示すこととなる、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
ＡＰＰ経路の遺伝的修飾因子を同定する方法であって、該方法は、
（ａ）そのゲノムが、シグナル配列に融合された、ヒトＡＰＰの野生型Ｃ９９部分（配列番号３）もしくはロンドン変異を有するヒトＡＰＰのＣ９９部分（配列番号４）を含むポリペプチドをコード化するＤＮＡ配列を含むトランスジェニックハエであって、該ＤＮＡ配列が組織特異的な発現制御配列に機能し得るように結合され；そして該ＤＮＡの発現により該ハエが変質表現型を示すこととなる、該ＤＮＡ配列を発現する、トランスジェニックハエを提供すること；
（ｂ）該トランスジェニックハエを既知のもしくは予想される遺伝子中に変異を含むハエと交雑させること；そして
（ｃ）該交雑の子孫のスクリーニングにより、該ＤＮＡ配列および該変異を所有しかつ対照と比較して形質転換表現型の修飾された発現を示すハエを求めること：
を含む、方法。
【請求項１４】
該遺伝的修飾因子および／もしくはそのヒトホモログはアルツハイマー病の経路に影響する遺伝子である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
該ＤＮＡ配列は野生型Ｃ９９をコード化し、そして該組織特異的な発現制御配列は、７Ｂ−Ｇａｌ４導入遺伝子によって脳内で生成されるＧａｌ４タンパク質により活性化されるＵＡＳ制御エレメントを含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
該ＤＮＡ配列の該発現により該ハエが運動欠損により特色づけられる表現型を示すこととなる、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
該ＤＮＡ配列は野生型Ｃ９９もしくはロンドン変異を有するヒトＡＰＰのＣ９９部分のいずれかをコード化し、そして該組織特異的な発現制御配列は、ａｐｔｅｒｏｕｓ−Ｇａｌ４導入遺伝子により生成されるＧａｌ４タンパク質により活性化されるＵＡＳ制御エレメントを含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１８】
該ＤＮＡ配列の該発現により該ハエが“凹型翅”表現型を示すこととなる、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
ＡＰＰ経路の異常な調節に関連する状態を処置し、予防しもしくは軽減するための治療法を開発するための標的を同定する方法であって、該方法は、請求項９の方法にしたがって同定された遺伝的修飾因子のヒトホモログを同定することを含む、方法。
【請求項２０】
該状態がアルツハイマー病である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
アルツハイマー病との遺伝的な関連が示されている第１０ヒト染色体上の区域にマップするところの遺伝的修飾因子のヒトホモログを同定することをさらに含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
ＡＰＰ経路の異常な調節に関連する状態を処置し、予防しもしくは軽減するための治療法を開発するための標的を同定する方法であって、該方法は、請求項１３の方法にしたがって同定された遺伝的修飾因子のヒトホモログを同定することを含む、方法。
【請求項２３】
該状態がアルツハイマー病である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
アルツハイマー病との遺伝的な関連が示されている第１０ヒト染色体上の区域にマップするところの遺伝的修飾因子のヒトホモログを同定することをさらに含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
ＡＰＰ経路の異常な調節に関連する状態を処置し、予防しもしくは軽減するための治療法を開発するための標的を同定する方法であって、該方法は、ｈＣＰ５０７６５（配列番号３５）およびｈＣＰ４１３１３（配列番号１５、配列番号１７、配列番号５３）からなる群から選択されるヒトの配列によってコード化される転写因子により調節される経路に関与する遺伝子を同定することを含む、方法。
【請求項２６】
該状態がアルツハイマー病である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
Ａベータの発現により誘導される表現型を修飾することができる化合物についてアッセイすることを含む、ＡＰＰ経路の異常な調節に関連する状態の処置、予防もしくは軽減のために有用である化合物を同定する方法であって、該方法は、
（ａ）そのゲノムが、シグナル配列に融合された、Ａベータ４０（配列番号１）もしくはＡベータ４２（配列番号２）をコード化するヒトＡＰＰのＡベータ部分を含むポリペプチドをコード化するＤＮＡ配列を含み、該ＤＮＡ配列は組織特異的な発現制御配列に機能し得るように結合され；そして該ＤＮＡ配列の発現により該ハエが変質表現型を示すこととなる、該ＤＮＡ配列を発現する、トランスジェニックハエを提供すること；
（ｂ）該ハエに候補化合物を投与し；そして
（ｃ）ステップ（ａ）の該ハエの表現型の変化について、候補化合物を投与していないステップ（ａ）のハエの表現型と比較してアッセイすること：
を含む方法。
【請求項２８】
該状態がアルツハイマー病である、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
該ＤＮＡ配列はＡベータ４２をコード化し、そして該組織特異的な発現制御配列は眼特異的なプロモーターＧＭＲである、請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
該ＤＮＡ配列の該発現により該ハエが“ラッフアイ”表現型と呼ばれる該変質表現型を示すこととなる、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
Ｃ９９の発現により誘導される表現型を修飾することができる化合物についてアッセイすることを含む、ＡＰＰ経路の異常な調節に関連する状態の処置、予防もしくは軽減のために有用である化合物を同定する方法であって、該方法は、
（ａ）そのゲノムが、シグナル配列に融合された、ヒトＡＰＰの野生型Ｃ９９部分（配列番号３）もしくはロンドン変異を有するヒトＡＰＰのＣ９９部分（配列番号４）を含むポリペプチドをコード化するＤＮＡ配列を含み、該ＤＮＡ配列は組織特異的な発現制御配列に機能し得るように結合され；そして該ＤＮＡ配列の発現により該ハエが変質表現型を示すこととなる、該ＤＮＡ配列を発現する、トランスジェニックハエを提供すること；
（ｂ）該ハエに候補化合物を投与し；そして
（ｃ）ステップ（ａ）の該ハエの表現型の変化について、候補化合物を投与していないステップ（ａ）のハエの表現型と比較してアッセイすること：
を含む方法。
【請求項３２】
該状態がアルツハイマー病である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
該ＤＮＡ配列は野生型Ｃ９９をコード化し、そして該組織特異的な発現制御配列は、７Ｂ−Ｇａｌ４導入遺伝子によって脳内で生成されるＧａｌ４タンパク質により活性化されるＵＡＳ制御エレメントを含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３４】
該ＤＮＡ配列の該発現により該ハエが運動欠損により特色づけられる該変質表現型を示すこととなる、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
該ＤＮＡ配列は野生型Ｃ９９もしくはロンドン変異を有するヒトＡＰＰのＣ９９部分のいずれかをコード化し、そして該組織特異的な発現制御配列は、ａｐｔｅｒｏｕｓ−Ｇａｌ４導入遺伝子により生成されるＧａｌ４タンパク質により活性化されるＵＡＳ制御エレメントを含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３６】
該ＤＮＡ配列の該発現により該ハエが“凹型翅”表現型と呼ばれる該変質表現型を示すこととなる、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
ａ）アルツハイマー病のインビトロもしくはインビボモデルに候補化合物を投与すること；そして
ｂ）候補化合物が投与されていなかった対照でのレベルと比較しての該ホモログのいずれか一つの変質発現、タンパク質レベルもしくはタンパク質活性が、治療上の価値を持つ化合物を示す、請求項９に記載の方法にしたがい同定された遺伝的修飾因子のホモログの発現、タンパク質レベルもしくはタンパク質活性における変化についてアッセイを行うこと
を含む、ＡＰＰ経路の異常な調節に関連する状態の処置、予防もしくは軽減のために有用である化合物を同定する方法。
【請求項３８】
ａ）アルツハイマー病のインビトロもしくはインビボモデルに候補化合物を投与すること；そして
ｂ）候補化合物が投与されていなかった対照でのレベルと比較しての該ホモログのいずれか一つの変質発現、タンパク質レベルもしくはタンパク質活性が、治療上の価値を持つ化合物を示す、請求項１３に記載の方法にしたがい同定された遺伝的修飾因子のホモログの発現、タンパク質レベルもしくはタンパク質活性における変化についてアッセイを行うこと
を含む、ＡＰＰ経路の異常な調節に関連する状態の処置、予防もしくは軽減のために有用である化合物を同定する方法。
【請求項３９】
ａ）アルツハイマー病のインビトロもしくはインビボモデルに候補化合物を投与すること；そして
ｂ）候補化合物が投与されていなかった対照でのレベルと比較しての該ホモログのいずれか一つの変質発現、タンパク質レベルもしくはタンパク質活性が、治療上の価値を持つ化合物を示す、表１に開示されるものからなる群から選択される遺伝的修飾因子のホモログの発現、タンパク質レベルもしくはタンパク質活性における変化についてアッセイを行うこと
を含む、ＡＰＰ経路の異常な調節に関連する状態の処置、予防もしくは軽減のために有用である化合物を同定する方法。
【請求項４０】
該ヒトホモログが、ｈＣＰ５０７６５（配列番号３５）、ｈＣＰ４１３１３（配列番号１５、配列番号１７、配列番号５３）、ｈＣＰ３３７８７（配列番号４１）およびｈＣＰ５１５９４（配列番号４３）からなる群から選択される、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
請求項９に記載の方法にしたがい同定された遺伝的修飾因子のヒトホモログの遺伝子またはコード化されたポリペプチドのいずれか一つもしくはそれ以上の発現および／または機能を阻害もしくは促進する物質の治療法的有効量を、それを必要とする被験者に投与することを含む、ＡＰＰ経路の異常な調節に関連した状態の処置、予防もしくは軽減のための方法。
【請求項４２】
該物質が、化合物、三重らせんＤＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、二重鎖ＲＮＡ分子およびリボザイムからなる群から選択され、そして該物質が、該遺伝的修飾因子のヒトホモログのいずれか一つもしくはそれ以上の発現を阻害するようにデザインされる、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
該物質が、該遺伝的修飾因子のヒトホモログのいずれか一つもしくはそれ以上によりコード化されるポリペプチドに向けられた、いずれか一つもしくはそれ以上の抗体および／またはそれらのフラグメントを含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項４４】
該状態がアルツハイマー病である、請求項４１に記載の方法。
【請求項４５】
請求項１３に記載の方法にしたがい同定された遺伝的修飾因子のヒトホモログの遺伝子またはコード化されたポリペプチドのいずれか一つもしくはそれ以上の発現および／または機能を阻害もしくは促進する物質の治療法的有効量を、それを必要とする被験者に投与することを含む、ＡＰＰ経路の異常な調節に関連した状態の処置、予防もしくは軽減のための方法。
【請求項４６】
該物質が、化合物、三重らせんＤＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、二重鎖ＲＮＡ分子およびリボザイムからなる群から選択され、そして該物質が、該遺伝的修飾因子のヒトホモログのいずれか一つもしくはそれ以上の発現を阻害するようにデザインされる、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
該物質が、該遺伝的修飾因子のヒトホモログのいずれか一つもしくはそれ以上によりコード化されるポリペプチドに向けられた、いずれか一つもしくはそれ以上の抗体および／またはそれらのフラグメントを含む、請求項４５に記載の方法。
【請求項４８】
該状態がアルツハイマー病である、請求項４５に記載の方法。
【請求項４９】
該遺伝的修飾因子が表１に開示されるものからなる群から選択される、遺伝的修飾因子のヒトホモログの遺伝子またはコード化されたポリペプチドのいずれか一つもしくはそれ以上の発現および／または機能を阻害もしくは促進する物質の治療法的有効量を、それを必要とする被験者に投与することを含む、ＡＰＰ経路の異常な調節に関連した状態の処置、予防もしくは軽減のための方法。
【請求項５０】
該物質が、化合物、三重らせんＤＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、二重鎖ＲＮＡ分子およびリボザイムからなる群から選択され、そして該物質が、該遺伝的修飾因子のヒトホモログのいずれか一つもしくはそれ以上の発現を阻害するようにデザインされる、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
該物質が、該遺伝的修飾因子のヒトホモログのいずれか一つもしくはそれ以上によりコード化されるポリペプチドに向けられた、いずれか一つもしくはそれ以上の抗体および／またはそれらのフラグメントを含む、請求項４９に記載の方法。
【請求項５２】
該ヒトホモログが、ｈＣＰ５０７６５（配列番号３５）、ｈＣＰ４１３１３（配列番号１５、配列番号１７、配列番号５３）、ｈＣＰ３３７８７（配列番号４１）およびｈＣＰ５１５９４（配列番号４３）からなる群から選択される、請求項４９に記載の方法。
【請求項５３】
該状態がアルツハイマー病である、請求項４９に記載の方法。
【請求項５４】
請求項９に記載の方法にしたがい同定された遺伝的修飾因子のヒトホモログの遺伝子またはコード化されたポリペプチドのいずれか一つもしくはそれ以上の発現および／または機能を阻害もしくは促進する物質の治療法的有効量を含む医薬組成物を、それを必要とする被験者に投与することを含む、ＡＰＰ経路の異常な調節に関連した状態の処置、予防もしくは軽減のための方法。
【請求項５５】
該医薬組成物が、化合物、三重らせんＤＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、二重鎖ＲＮＡ分子およびリボザイムからなる群から選択される物質の治療法的有効量を含み、そして該物質が、該遺伝的修飾因子のヒトホモログのいずれか一つもしくはそれ以上の発現を阻害するようにデザインされる、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
該医薬組成物が、該遺伝的修飾因子のヒトホモログのいずれか一つもしくはそれ以上によりコード化されるポリペプチドに向けられた、一つもしくは複数の抗体および／またはそれらのフラグメントを含む、請求項５４に記載の方法。
【請求項５７】
該状態がアルツハイマー病である、請求項５４に記載の方法。
【請求項５８】
請求項１３に記載の方法にしたがい同定された遺伝的修飾因子のヒトホモログの遺伝子またはコード化されたポリペプチドのいずれか一つもしくはそれ以上の発現および／または機能を阻害もしくは促進する物質の治療法的有効量を含む医薬組成物を、それを必要とする被験者に投与することを含む、ＡＰＰ経路の異常な調節に関連した状態の処置、予防もしくは軽減のための方法。
【請求項５９】
該医薬組成物が、化合物、三重らせんＤＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、二重鎖ＲＮＡ分子およびリボザイムからなる群から選択される物質の治療法的有効量を含み、そして該物質が、該遺伝的修飾因子のヒトホモログのいずれか一つもしくはそれ以上の発現を阻害するようにデザインされる、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
該医薬組成物が、該遺伝的修飾因子のヒトホモログのいずれか一つもしくはそれ以上によりコード化されるポリペプチドに向けられた、一つもしくは複数の抗体および／またはそれらのフラグメントを含む、請求項５８に記載の方法。
【請求項６１】
該状態がアルツハイマー病である、請求項５８に記載の方法。
【請求項６２】
表１に開示されるものからなる群から選択されるヒトホモログの遺伝子またはコード化されたポリペプチドのいずれか一つもしくはそれ以上の発現および／または機能を阻害もしくは促進する物質の治療法的有効量を含む医薬組成物を、それを必要とする被験者に投与することを含む、ＡＰＰ経路の異常な調節に関連した状態の処置、予防もしくは軽減のための方法。
【請求項６３】
該医薬組成物が、化合物、三重らせんＤＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、二重鎖ＲＮＡ分子およびリボザイムからなる群から選択される物質の治療法的有効量を含み、そして該物質が、該遺伝的修飾因子のヒトホモログのいずれか一つもしくはそれ以上の発現を阻害するようにデザインされる、請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
該医薬組成物が、該遺伝的修飾因子のヒトホモログのいずれか一つもしくはそれ以上によりコード化されるポリペプチドに向けられた、一つもしくは複数の抗体および／またはそれらのフラグメントの治療法的有効量を含む、請求項６２に記載の方法。
【請求項６５】
該状態がアルツハイマー病である、請求項６２に記載の方法。
【請求項６６】
該ヒトホモログが、ｈＣＰ５０７６５（配列番号３５）、ｈＣＰ４１３１３（配列番号１５、配列番号１７、配列番号５３）、ｈＣＰ３３７８７（配列番号４１）およびｈＣＰ５１５９４（配列番号４３）からなる群から選択される、請求項６２に記載の方法。
【請求項６７】
該状態がアルツハイマー病である、請求項６６に記載の方法。
【請求項６８】
請求項９に記載の方法にしたがい同定された遺伝的修飾因子のヒトホモログの遺伝子またはコード化されたポリペプチドのいずれか一つもしくはそれ以上の発現および／または機能を阻害もしくは促進する物質を、それを必要とする被験者においてＡＰＰ経路の異常な調節に関連した状態を処置し、予防しもしくは軽減するための有効量で含む、医薬組成物。
【請求項６９】
化合物、三重らせんＤＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、二重鎖ＲＮＡ分子およびリボザイムからなる群から選択される物質を含み、そして該物質が、該遺伝的修飾因子のヒトホモログのいずれか一つもしくはそれ以上の発現を阻害するようにデザインされる、請求項６８に記載の医薬組成物。
【請求項７０】
該遺伝的修飾因子のヒトホモログのいずれか一つもしくはそれ以上によりコード化されるポリペプチドに向けられた、一つもしくは複数の抗体および／またはそれらのフラグメントを含む、請求項６８に記載の医薬組成物。
【請求項７１】
該状態がアルツハイマー病である、請求項６８に記載の方法。
【請求項７２】
請求項１３に記載の方法にしたがい同定された遺伝的修飾因子のヒトホモログの遺伝子またはコード化されたポリペプチドのいずれか一つもしくはそれ以上の発現および／または機能を阻害もしくは促進する物質を、それを必要とする被験者においてＡＰＰ経路の異常な調節に関連した状態を処置し、予防しもしくは軽減するための有効量で含む、医薬組成物。
【請求項７３】
化合物、三重らせんＤＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、二重鎖ＲＮＡ分子およびリボザイムからなる群から選択される物質を含み、そして該物質が、該遺伝的修飾因子のヒトホモログのいずれか一つもしくはそれ以上の発現を阻害するようにデザインされる、請求項７２に記載の医薬組成物。
【請求項７４】
該遺伝的修飾因子のヒトホモログのいずれか一つもしくはそれ以上によりコード化されるポリペプチドに向けられた、一つもしくは複数の抗体および／またはそれらのフラグメントを含む、請求項７２に記載の医薬組成物。
【請求項７５】
該状態がアルツハイマー病である、請求項７２に記載の方法。
【請求項７６】
表１に開示されるものからなる群から選択される遺伝的修飾因子のヒトホモログの遺伝子またはコード化されたポリペプチドのいずれか一つもしくはそれ以上の発現および／または機能を阻害もしくは促進する物質を、それを必要とする被験者においてＡＰＰ経路の異常な調節に関連した状態を処置し、予防しもしくは軽減するための有効量で含む、医薬組成物。
【請求項７７】
化合物、三重らせんＤＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、二重鎖ＲＮＡ分子およびリボザイムからなる群から選択される物質を含み、そして該物質が、該遺伝的修飾因子のヒトホモログのいずれか一つもしくはそれ以上の発現を阻害するようにデザインされる、請求項７６に記載の医薬組成物。
【請求項７８】
該遺伝的修飾因子のヒトホモログのいずれか一つもしくはそれ以上によりコード化されるポリペプチドに向けられた、一つもしくは複数の抗体および／またはそれらのフラグメントを含む、請求項７６に記載の医薬組成物。
【請求項７９】
該状態がアルツハイマー病である、請求項７６に記載の方法。
【請求項８０】
該ヒトホモログが、ｈＣＰ５０７６５（配列番号３５）、ｈＣＰ４１３１３（配列番号１５、配列番号１７、配列番号５３）、ｈＣＰ３３７８７（配列番号４１）およびｈＣＰ５１５９４（配列番号４３）からなる群から選択される、請求項７６に記載の方法。
【請求項８１】
該状態がアルツハイマー病である、請求項８０に記載の方法。
【請求項８２】
ａ）被験者において、請求項９に記載の方法にしたがい同定された遺伝的修飾因子のヒトホモログのｍＲＮＡおよび／もしくはタンパク質レベルについてアッセイを行うこと；そして
ｂ）対照に比較して異常なｍＲＮＡおよび／もしくはタンパク質レベルを有する被験者に、該状態の病的作用を処置しまたは軽減するために十分な量で物質を投与すること：
を含む、ＡＰＰ経路の異常な調節に関連する状態を処置し、予防しもしくは軽減する方法。
【請求項８３】
該状態がアルツハイマー病である、請求項８２に記載の方法。
【請求項８４】
ａ）被験者において、請求項１３に記載の方法にしたがい同定された遺伝的修飾因子のヒトホモログのｍＲＮＡおよび／もしくはタンパク質レベルについてアッセイを行うこと；そして
ｂ）対照に比較して異常なｍＲＮＡおよび／もしくはタンパク質レベルを有する被験者に、該状態の病的作用を処置しまたは軽減するために十分な量で物質を投与すること：
を含む、ＡＰＰ経路の異常な調節に関連する状態を処置し、予防しもしくは軽減する方法。
【請求項８５】
該状態がアルツハイマー病である、請求項８４に記載の方法。
【請求項８６】
ａ）被験者において、表１に開示されるものからなる群から選択される、遺伝的修飾因子のヒトホモログのｍＲＮＡおよび／もしくはタンパク質レベルについてアッセイを行うこと；そして
ｂ）対照に比較して異常なｍＲＮＡおよび／もしくはタンパク質レベルを有する被験者に、該状態の病的作用を処置しまたは軽減するために十分な量で物質を投与すること：
を含む、ＡＰＰ経路の異常な調節に関連する状態を処置し、予防しもしくは軽減する方法。
【請求項８７】
該状態がアルツハイマー病である、請求項８６に記載の方法。
【請求項８８】
該ヒトホモログが、ｈＣＰ５０７６５（配列番号３５）、ｈＣＰ４１３１３（配列番号１５、配列番号１７、配列番号５３）、ｈＣＰ３３７８７（配列番号４１）およびｈＣＰ５１５９４（配列番号４３）からなる群から選択される、請求項８６に記載の方法。
【請求項８９】
該状態がアルツハイマー病である、請求項８８に記載の方法。
【請求項９０】
生物学的試料において、請求項９に記載の方法にしたがい同定された遺伝的修飾因子のヒトホモログのｍＲＮＡレベルおよび／もしくはタンパク質レベルを検出するための診断キットであって、該キットは、
（ａ）遺伝的修飾因子のヒトホモログのポリヌクレオチドもしくはそのフラグメント；
（ｂ）（ａ）のそれに相補的なヌクレオチド配列；
（ｃ）遺伝的修飾因子のヒトホモログのポリペプチド、もしくはそのフラグメント；または
（ｄ）該ポリペプチドに対する抗体：
を含み、そこでは成分（ａ）、（ｂ）、（ｃ）もしくは（ｄ）は実質的な成分を含んでもよい、キット。
【請求項９１】
生物学的試料において、請求項１３に記載の方法にしたがい同定された遺伝的修飾因子のヒトホモログのｍＲＮＡレベルおよび／もしくはタンパク質レベルを検出するための診断キットであって、該キットは、
（ａ）遺伝的修飾因子のヒトホモログのポリヌクレオチドもしくはそのフラグメント；
（ｂ）（ａ）のそれに相補的なヌクレオチド配列；
（ｃ）遺伝的修飾因子のヒトホモログのポリペプチド、もしくはそのフラグメント；または
（ｄ）該ポリペプチドに対する抗体：
を含み、そこでは成分（ａ）、（ｂ）、（ｃ）もしくは（ｄ）は実質的な成分を含んでもよい、キット。
【請求項９２】
生物学的試料において、表１に開示されるものからなる群から選択される遺伝的修飾因子のヒトホモログのｍＲＮＡレベルおよび／もしくはタンパク質レベルを検出するための診断キットであって、該キットは、
（ａ）遺伝的修飾因子のヒトホモログのポリヌクレオチドもしくはそのフラグメント；
（ｂ）（ａ）のそれに相補的なヌクレオチド配列；
（ｃ）遺伝的修飾因子のヒトホモログのポリペプチド、もしくはそのフラグメント；または
（ｄ）該ポリペプチドに対する抗体：
を含み、そこでは成分（ａ）、（ｂ）、（ｃ）もしくは（ｄ）は実質的な成分を含んでもよい、キット。
【請求項９３】
該ヒトホモログが、ｈＣＰ５０７６５（配列番号３５）、ｈＣＰ４１３１３（配列番号１５、配列番号１７、配列番号５３）、ｈＣＰ３３７８７（配列番号４１）およびｈＣＰ５１５９４（配列番号４３）からなる群から選択される、請求項９２に記載の診断キット。
【請求項９４】
ｍＲＮＡレベルおよび／または被検者からの生物学的試料中において、請求項９に記載の方法にしたがい同定された遺伝的修飾因子のヒトホモログのいずれか一つもしくはそれ以上によりコード化される、ポリペプチドのレベルもしくは活性を測定することを含み、そこでは対照被験者におけるそのレベルと比べての異常なレベルが該状態に診断的である、ＡＰＰ経路の異常な調節に関連した状態を患う被験者を診断する方法。
【請求項９５】
該状態がアルツハイマー病である、請求項９４に記載の方法。
【請求項９６】
ｍＲＮＡレベルおよび／または被検者からの生物学的試料中において、請求項１３に記載の方法にしたがい同定された遺伝的修飾因子のヒトホモログのいずれか一つもしくはそれ以上によりコード化される、ポリペプチドのレベルもしくは活性を測定することを含み、そこでは対照被験者におけるそのレベルと比べての異常なレベルが該状態に診断的である、ＡＰＰ経路の異常な調節に関連した状態を患う被験者を診断する方法。
【請求項９７】
該状態がアルツハイマー病である、請求項９６に記載の方法。
【請求項９８】
ｍＲＮＡレベルおよび／または被検者からの生物学的試料中において、表１に開示されるものからなる群から選択される遺伝的修飾因子のヒトホモログのいずれか一つもしくはそれ以上によりコード化されるポリペプチドのレベルもしくは活性を測定することを含み、そこでは対照被験者におけるそのレベルと比べての異常なレベルが該状態に診断的である、ＡＰＰ経路の異常な調節に関連した状態を患う被験者を診断する方法。
【請求項９９】
該状態がアルツハイマー病である、請求項９８に記載の方法。
【請求項１００】
該ヒトホモログが、ｈＣＰ５０７６５（配列番号３５）、ｈＣＰ４１３１３（配列番号１５、配列番号１７、配列番号５３）、ｈＣＰ３３７８７（配列番号４１）およびｈＣＰ５１５９４（配列番号４３）からなる群から選択される、請求項９８に記載の方法。
【請求項１０１】
該状態がアルツハイマー病である、請求項１００に記載の方法。
【請求項１０２】
請求項９に記載の方法にしたがい同定された遺伝的修飾因子のヒトホモログのいずれか一つもしくはそれ以上をコード化する核酸を、それを必要とする被験者の一つもしくはそれ以上の組織に導入し、被験者内の細胞により、核酸によってコード化される一つもしくはそれ以上のタンパク質の発現および／または分泌をもたらすことを含む、ＡＰＰ経路の異常な調節に関連する状態を処置し、予防しもしくは軽減する方法。
【請求項１０３】
該状態がアルツハイマー病である、請求項１０２に記載の方法。
【請求項１０４】
請求項１３に記載の方法にしたがい同定された遺伝的修飾因子のヒトホモログのいずれか一つもしくはそれ以上をコード化する核酸を、それを必要とする被験者の一つもしくはそれ以上の組織に導入し、被験者内の細胞により、核酸によってコード化される一つもしくはそれ以上のタンパク質の発現および／または分泌をもたらすことを含む、ＡＰＰ経路の異常な調節に関連する状態を処置し、予防しもしくは軽減する方法。
【請求項１０５】
該状態がアルツハイマー病である、請求項１０４に記載の方法。
【請求項１０６】
表１に開示されるものからなる群から選択される遺伝的修飾因子のヒトホモログのいずれか一つもしくはそれ以上をコード化する核酸を、それを必要とする被験者の一つもしくはそれ以上の組織に導入し、被験者内の細胞により、核酸によってコード化される一つもしくはそれ以上のタンパク質の発現および／または分泌をもたらすことを含む、ＡＰＰ経路の異常な調節に関連する状態を処置し、予防しもしくは軽減する方法。
【請求項１０７】
該状態がアルツハイマー病である、請求項１０６に記載の方法。
【請求項１０８】
該ヒトホモログが、ｈＣＰ５０７６５（配列番号３５）、ｈＣＰ４１３１３（配列番号１５、配列番号１７、配列番号５３）、ｈＣＰ３３７８７（配列番号４１）およびｈＣＰ５１５９４（配列番号４３）からなる群から選択される、請求項１０６に記載の方法。
【請求項１０９】
該状態がアルツハイマー病である、請求項１０８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（背景技術）
アルツハイマー病（ＡＤ）は記憶、認知および行動を制御する脳中枢の神経の変性およびひいては死をもたらす神経疾患である。本疾患の特徴は不溶性のアミロイド沈着の形成（老人斑）であり、その主要な成分は、アミロイド前駆タンパク質（ＡＰＰ）の蛋白分解生成物である、４０〜４２個のアミノ酸のアミロイドベータ（Ａβ）ペプチドである。これらの斑は神経細胞の変性と死をもたらす主要な原因物質であると広く信じられている。
【０００２】
ヒトにおける家族性アルツハイマー病（ＦＡＤ）の遺伝と関連する三つの主要な既知遺伝子は、膜貫通受容体アミロイド前駆タンパク質（ＡＰＰ）ならびに二つのプレセニリン （ＰＳ１およびＰＳ２） 遺伝子である。これらの遺伝子におけるミスセンス変異はＡβペプチドの増加した生成をもたらし、この疾患状態に寄与するこのペプチドの重要性を強調している。ＡＰＰは二つの箇所、ベータおよびガンマ、で切断されて、４０〜４２個のアミノ酸のペプチド、Ａβ、を放出する（総説：Ｍｉｌｌｅｓ， Ｊ． ａｎｄ Ｒｅｉｎｅｒ， Ｐ．Ｂ． （１９９９） Ｊ． Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ ７２： ４４３−４６０）。そこでペプチドのＣ末端が切断される、ガンマ部位近くのＡＰＰ中におけるミスセンス変異（Ｇｏａｔｅ， Ａ．， ｅｔ ａｌ．， （１９９１）． Ｎａｔｕｒｅ ３４９： ７０４−７０６）は、４０／４２比を変えることにより、さらに多くのＡβ４２の生成をもたらす（Ｓｕｚｕｋｉ， Ｎ．， ｅｔ ａｌ．， （１９９４）． Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６４： １３３６−１３４０）。ベータ部位近傍の変異は、両方の型のさらに多い全般的な生成をもたらす（Ｍｕｌｌａｎ， Ｍ．， ｅｔ ａｌ． （１９９２）． Ｎａｔ． Ｇｅｎｅｔ． １： ３４５−３４７）； Ｃｉｔｒｏｎ， Ｍ． ｅｔ ａｌ． （１９９５）． Ｎｅｕｒｏｎ １４： ６６１−６７０）。
【０００３】
プレセニリンは複数回膜貫通タンパク質であり、その機能は現在論議中である。プレセニリン中のミスセンス変異はＡβ４２型の放出を増加させ（Ｂｏｒｃｈｅｌｔ， Ｄ．Ｒ．， ｅｔ ａｌ． （１９９６）， Ｎｅｕｒｏｎ １７： １００５−１０１３； Ｃｉｔｒｏｎ， Ｍ．， ｅｔ ａｌ． （１９９７）． Ｎａｔ． Ｍｅｄ． ３： ６７−７２； Ｍｕｒａｙａｍａ， Ｏ． ｅｔ ａｌ． （１９９９）． Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． Ｌｅｔｔ． ２６５： ６１−６３）、そして大多数のＦＡＤ症例の原因となっている（Ｓｈｅｒｒｉｎｇｔｏｎ， Ｒ．， ｅｔ ａｌ． （１９９５）． Ｎａｔｕｒｅ ３７５： ７５４−７６０）。
【０００４】
多くの研究がＡβの可溶性および不溶性（凝集性）型両方の役割について検討しており、そして凝集性型のペプチドが観察される毒性作用の原因であると広く信じられている（Ｐｉｋｅ， Ｃ．Ｊ．， ｅｔ ａｌ． （１９９３）． Ｊ． Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． １３： １６７６−１６７８； Ｌｏｒｅｎｚｏ， Ａ． ａｎｄ Ｙａｎｋｎｅｒ， Ｂ．Ａ． （１９９４）． Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９１： １２２４３−１２２４７； Ｇｉｏｖａｎｎｅｌｌｉ， Ｌ．， ｅｔ ａｌ （１９９８）． Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． ８７： ３４９−３５７）。Ａβ誘発性神経死に寄与する多数のメカニズムがあり、これらとしては、細胞内カルシウムレベルの混乱（以下の総説を参照：Ｆｒａｓｅｒ， Ｓ．Ｐ．， ｅｔ ａｌ． （１９９７）． Ｔｒｅｎｄｓ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． ２０： ６７−７２； Ｍａｔｔｓｏｎ， Ｍ．Ｐ． （１９９７）， Ｐｈｙｓｉｏｌ． Ｒｅｖ． ７７： １０８１−１１３２； Ｃｏｕｇｈｌａｎ， Ｃ．Ｍ． ａｎｄ Ｂｒｅｅｎ， Ｋ．Ｃ． （２０００）． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． ａｎｄ Ｔｈｅｒ． ８６： １１１−１４４）、小神経膠細胞の活性化によリ引き起される炎症反応誘導（総説：Ｃｏｕｇｈｌａｎ， Ｃ．Ｍ． ａｎｄ Ｂｒｅｅｎ， Ｋ．Ｃ． （２０００）， Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． ａｎｄ Ｔｈｅｒ． ８６： １１１−１４４）ならびに学習と記憶に関与している、基底−前脳コリン作動性神経系の著しい変性および／もしくは破壊（総説：Ｈｅｌｌｓｔｒｏｅｍ−Ｌｉｎｄａｈｌ ａｎｄ Ｃｏｕｒｔ， ２０００， Ｂｅｈａｖ． Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ． １１３ （１−２）： １５９−６８）、が挙げられる。かくして、Ａβ過剰生成の有害な作用およびそれのＡＤへの寄与は複雑多岐にわたることが明白である。
【０００５】
多量の研究がアルツハイマー病およびその一般病理の研究に傾注されているが、ヒトの神経変性障害の遺伝解析は限られている。その結果、ベータアミロイドの蓄積の引き金となる事象、ならびにＡＰＰのような遺伝子およびアルツハイマー病の一部に役割を演じると推測されている他のものの正確な役割は殆ど理解されていない。
【０００６】
ＡＤの発症と進行におけるＡβの中心的役割の確立に対する多数の貢献が、モデルシステムでの研究からもたらされている。野生型もしくは変異型のいずれかのＡＰＰを発現するトランスジェニックマウスはＡＤの病態を示し、多くの場合に年齢依存様式でアミロイド斑を形成し、そして、幾つかの場合には変質した行動および認知能を示す（以下の総説を参照：Ｐｒｉｃｅ， Ｄ．Ｌ．， ｅｔ ａｌ． （１９９８）， Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｇｅｎｅｔ． ３２： ４６１−４９３； ｖａｎ Ｌｅｕｖｅｎ， Ｆ． （２０００）． Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｉｎ Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ． ６１： ３０５−３１２）。Ａβ４２のみを発現するトランスジェニックマウスは、ＡＤにおいて通常障害を受けている脳の領域に広範な神経変性を示し、そして５０％が生後１２ヶ月で死亡する（ＬａＦｅｒｌａ， Ｆ．Ｍ． ｅｔ ａｌ． （１９９５）． Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ． ９： ２１−３０）。これらのマウス中の神経細胞はやがてはアポトーシスを起こし、次いでアストログリアの増加および海綿状態に至る。このことは、Ａβ４２の発現がインビボで毒性であり、神経変性およびアポトーシスをもたらすことを実証している。
【０００７】
ショウジョウバエのゲノムは、機能が極めてよく保持されたところの多くの関連するヒトオーソログを含むため（Ｒｕｂｉｎ， Ｇ．Ｍ．， ｅｔ ａｌ． （２０００）． Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８７： ２２０４−１５）、ショウジョウバエのモデル生物としての使用は、ヒトの神経変性疾患経路の解明の重要な手段であることが証明されている（総説：Ｆｏｒｔｉｎｉ， Ｍ ａｎｄ Ｂｏｎｉｎｉ， Ｎ． （２０００）． Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ． １６： １６１−１６７）。例えば、キイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）は神経系の機能に関与するところのヒトＡＰＰに相同な遺伝子を所有している。この遺伝子、ＡＰＰ−様（Ａｐｐｌ）、は三つの大ドメインに亘りヒトＡＰＰ遺伝子の神経性イソ型とほぼ４０％同一であり（Ｒｏｓｅｎ ｅｔ ａｌ．， ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８６： ２４７８−２４８２ （１９８８））、そして、ヒトＡＰＰ６９５の様に、神経系でもっぱら発現される。Ａｐｐｌ遺伝子を欠損したハエは、ヒトＡＰＰ遺伝子により救済され得るところの行動欠陥を示し、これら二つの遺伝子は二つの生物において類似の機能を有することを示唆する（Ｌｕｏ ｅｔ ａｌ．ｍ Ｎｅｕｒｏｎ ９： ５９５−６０５ （１９９２））。
【０００８】
加えて、ポリグルタミン反復疾患（Ｊａｃｋｓｏｎ， Ｇ．Ｒ．， ｅｔ ａｌ． （１９９８）． Ｎｅｕｒｏｎ ２１： ６３３−６４２； Ｋａｚｅｍｉ−Ｅｓｆａｒｊａｎｉ， Ｐ． ａｎｄ Ｂｅｎｚｅｒ， Ｓ． （２０００）． Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８７： １８３７−１８４０； Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ−Ｆｕｎｅｚ ｅｔ ａｌ． （２０００）． Ｎａｔｕｒｅ ４０８ （６８０８）： １０１−６）およびパーキンソン病（Ｆｅａｎｙ， Ｍ．Ｂ． ａｎｄ Ｂｅｎｄｅｒ， Ｗ．Ｗ． （２０００）． Ｎａｔｕｒｅ ４０４： ３９４−３９８）のショウジョウバエモデルは、細胞レベルならびに生理学的レベルの両方でヒトにおける病態に極めてよく似ており、そしてこれらの疾患で役割を演じているところの他の遺伝子の同定に成功裏に使用されている。かくして、モデルシステムとしてのショウジョウバエの威力は疾患の状態を表しそして大規模の遺伝的スクリーニングを実施する能力において実証される。
【０００９】
この発明は、ＡＤに関係する遺伝子を異所性に発現する、トランスジェニックキイロショウジョウバエにおけるＡＰＰ経路に作用する化合物および遺伝子を同定する方法に一般的に関する。これらの導入遺伝子の発現は可視的表現型を誘導し、そしてここで開示する遺伝的スクリーニング法を使用して、誘導性可視的表現型を修飾するところの変異の同定により、ＡＰＰ経路に関与する遺伝子を同定し得ることがここで意図されている。これらの変異により影響される遺伝子をここでは“遺伝的修飾因子”と呼称する。
【００１０】
かくして同定された遺伝的修飾因子のヒトホモログは、アルツハイマー病（ＡＤ）治療薬の開発を非限定的に含む、ＡＰＰ経路の異常に関連した状態を処置する治療薬の開発のための有用な標的であろうことが、ここで意図される。これらのヒトホモログの幾つかは、アルツハイマー病の連関すると示されているヒト第１０染色体の区域に存在するかもしれないことが（Ｂｅｒｔｒａｍ ｅｔ ａｌ．， Ｅｒｔｅｋｉｎ−Ｔａｎｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｍｙｅｒｓ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９０， ２３０２−２３０５， ２０００）、ここでまた意図される。そのようなヒトホモログは、ＡＤと遺伝的に連関し、ＡＤのマーカーとしてもしくはＡＰＰ経路の異常と関連した状態を処置する治療薬の開発の標的として役立つ潜在性を持つかもしれないが、その開発はアルツハイマー病（ＡＤ）治療薬の開発を非限定的に含む。そのようなヒトホモログはまた、ＡＤに関連した遺伝子を伴う細胞経路において作用しているかもしれないで、そしてこれらのヒトホモログはこれらの経路での遺伝子を同定するために使用されるかもしれない。
【００１１】
（発明の概要）
本発明は、そのゲノムがヒトＡＰＰのＡベータ部分を含むポリペプチドをコード化する、ＤＮＡ配列を含むトランスジェニックハエに関係し、そこでは該ＤＮＡ配列は、シグナル配列に融合された、Ａベータ４０（配列番号１）もしくはＡベータ４２（配列番号２）をコード化し、該ＤＮＡ配列は組織特異的な発現制御配列に機能し得るように結合され；そして、該ＤＮＡ配列の発現により該ハエが変質表現型を示すこととなる、該ＤＮＡ配列を発現する。一つの特別な実施態様では、ＤＮＡ配列はＡベータ４２をコード化し、組織特異的な発現制御配列は眼特異的なプロモーターＧＭＲを含み、そしてＤＮＡ配列の発現により“ラッフアイ（複眼形態異常）”表現型と呼ばれる変質表現型となる。
【００１２】
さらなる態様では、この発明はトランスジェニックハエに関係するが、そのゲノムは、シグナル配列に融合された、ヒトＡＰＰの野生型Ｃ９９部分（配列番号３）もしくはロンドン変異を有するヒトＡＰＰのＣ９９部分（配列番号４）を含む、ポリペプチドをコード化するＤＮＡ配列を含み、該ＤＮＡ配列が組織特異的な発現制御配列に機能し得るように結合され；そして、該ＤＮＡ配列の発現により該ハエが変質表現型を示すこととなる、該ＤＮＡ配列を発現する。一つの実施態様では、ＤＮＡ配列は野生型Ｃ９９をコード化し、組織特異的な発現制御配列は、７Ｂ−Ｇａｌ４導入遺伝子によって脳内で生成されるＧａｌ４タンパク質で活性化されるところのＵＡＳ制御エレメントであり、そしてＤＮＡ配列の発現が運動欠損により特色づけられる変質表現型となる。もう一つの特別な実施態様では、ＤＮＡ配列は野生型Ｃ９９もしくはロンドン変異を有するヒトＡＰＰのＣ９９部分のいずれかをコード化し、組織特異的な発現制御配列は、ａｐｔｅｒｏｕｓ−Ｇａｌ４導入遺伝子により生成されるＧａｌ４タンパク質により活性化されるＵＡＳ制御エレメントであり、そしてＤＮＡ配列の発現により“凹型翅”表現型と呼ばれる変質表現型となる。
【００１３】
さらなる態様では、この発明はＡＰＰ経路の遺伝的修飾因子を同定する方法に関係し、該方法はトランスジェニックハエを提供することを含むが、そのゲノムは、ヒトＡＰＰのＡベータ部分を含むポリペプチドをコード化するＤＮＡ配列を含み、そこでは該ＤＮＡ配列は、シグナル配列に融合された、Ａベータ４０（配列番号１）もしくはＡベータ４２（配列番号２）をコード化し、該ＤＮＡ配列が組織特異的な発現制御配列に機能し得るように結合され；ならびに、該ＤＮＡの発現により該ハエが変質表現型を示すこととなる、該ＤＮＡ配列を発現し；該トランスジェニックハエを既知のもしくは予想される遺伝子中に変異を含むハエと交雑させ、そして該交雑の子孫のスクリーニングにより、該ＤＮＡ配列および該変異を所有しかつ、対照と比較して、形質転換表現型の修飾された発現を示すハエを求める。一つの実施様態では、ＤＮＡ配列はＡベータ４２をコード化し、組織特異的な発現制御配列は眼特異的なプロモーターＧＭＲを含み、そして該ＤＮＡ配列の発現により該ハエが“ラッフアイ”表現型と呼ばれる変質表現型を示すこととなる。
【００１４】
さらなる態様では、この発明はＡＰＰ経路の遺伝的修飾因子を同定する方法に関係し、該方法はトランスジェニックハエを含むが、そのゲノムは、シグナル配列に融合された、ヒトＡＰＰの野生型Ｃ９９部分（配列番号３）もしくはロンドン変異を有するヒトＡＰＰのＣ９９部分（配列番号４）を含むポリペプチドをコード化するＤＮＡ配列を含み、該ＤＮＡ配列が組織特異的な発現制御配列に機能し得るように結合され；ならびに、該ＤＮＡ配列の発現により該ハエが変質表現型を示すこととなる、該ＤＮＡ配列を発現し；該トランスジェニックハエを既知のもしくは予想される遺伝子の変異を含むハエと交雑させ；そして該交雑の子孫のスクリーニングにより該ＤＮＡ配列および該変異を所有し、対照と比較して形質転換表現型の修飾された発現を示すハエを求める。一つの実施様態では、ＤＮＡ配列は野生型Ｃ９９をコード化し、組織特異的な発現制御配列は、７Ｂ−Ｇａｌ４導入遺伝子によって脳内で生成したＧａｌ４タンパク質により活性化されるＵＡＳ制御エレメントであり、そしてＤＮＡ配列の発現により該ハエが運動欠損で特色づけられる変質表現型を示すこととなる。もう一つの実施態様では、ＤＮＡ配列は野生型Ｃ９９もしくはロンドン変異を有するヒトＡＰＰのＣ９９部分のどちらかをコード化し、組織特異的な発現制御配列はａｐｔｅｒｏｕｓ−Ｇａｌ４導入遺伝子により生成されるＧａｌ４タンパク質により活性化される、ＵＡＳ制御エレメントであり、該ＤＮＡ配列の発現により該ハエが“凹型翅”表現型と呼ばれる変質表現型を示すこととなる。
【００１５】
この発明のさらなる態様は、Ａベータの発現により誘導される表現型を修飾することができる化合物についてアッセイすることにより、ＡＰＰ経路に関与する遺伝子産物に作用する化合物を同定する方法に関係し、該方法はトランスジェニックハエを提供することを含むが、そのゲノムは、シグナル配列に融合された、該ＤＮＡ配列はＡベータ４０（配列番号１）もしくはＡベータ４２（配列番号２）をコード化する、ヒトＡＰＰのＡベータ部分を含むポリペプチドをコード化するＤＮＡ配列を含み、該ＤＮＡ配列は組織特異的な発現制御配列に機能し得るように結合され；ならびに、該ＤＮＡ配列の発現により該ハエが変質表現型を示すこととなる、該ＤＮＡ配列を発現し；該ハエに候補化合物を投与し；そして該ハエの表現型の変化について、候補化合物を投与していない同様のトランスジェニックハエの表現型と比較してアッセイする。一つの実施態様では、ＤＮＡ配列はＡベータ４２をコード化し、組織特異的な発現制御配列は眼特異的なプロモーターＧＭＲであり、そして該ＤＮＡ配列の発現により該ハエが“ラッフアイ”表現型と呼ばれる変質表現型を示すこととなる。
【００１６】
この発明のなおもう一つの態様は、Ｃ９９の発現により誘導される表現型を修飾することができる化合物についてアッセイすることにより、ＡＰＰ経路に関与する遺伝子産物に作用する化合物を同定する方法に関係し、該方法はトランスジェニックハエを提供するが、そのゲノムは、シグナル配列に融合された、ヒトＡＰＰの野生型Ｃ９９部分（配列番号３）もしくはロンドン変異を有するヒトＡＰＰのＣ９９部分（配列番号４）を含むポリペプチドをコード化するＤＮＡ配列を含み、該ＤＮＡ配列が組織特異的な発現制御配列に機能し得るように結合され；ならびに、該ＤＮＡ配列の発現により該ハエが変質表現型を示すこととなる、該ＤＮＡ配列を発現し；該ハエに候補化合物を投与し；そして該ハエの表現型の変化について、候補化合物を投与していない同様のトランスジェニックハエの表現型と比較してアッセイする。
【００１７】
一つの実施態様では、ＤＮＡ配列は野生型Ｃ９９をコード化し、組織特異的な発現制御配列は、７Ｂ−Ｇａｌ４導入遺伝子によって脳内で生成したＧａｌ４タンパク質により活性化されるＵＡＳ制御エレメントであり、そして該ＤＮＡ配列の発現により該ハエが運動欠損で特色づけられる変質表現型を示すこととなる。もう一つの実施態様では、ＤＮＡ配列は野生型Ｃ９９もしくはロンドン変異を有するヒトＡＰＰのＣ９９部分のいずれかをコード化し、組織特異的な発現制御配列は、ａｐｔｅｒｏｕｓ−Ｇａｌ４導入遺伝子により生成されるＧａｌ４タンパク質により活性化される、ＵＡＳ制御エレメントであり、そして該ＤＮＡ配列の発現により該ハエが“凹型翅”表現型と呼ばれる変質表現型を示すこととなる。
【００１８】
なおもう一つの態様では、この発明は、アルツハイマー病を非限定的に含む、ＡＰＰ経路の異常な調節に関連する状態の発生もしくは進行に関与する遺伝子を同定する方法に関係し、そしてそのタンパク生成物がアルツハイマー病の潜在的マーカーとして役立つかもしれないが、該方法は、本発明の方法にしたがって遺伝的修飾因子として同定されているところのハエ遺伝子のヒトホモログを同定することを含む。
【００１９】
なおもう一つの態様では、この発明は、アルツハイマー病を非限定的に含む、ＡＰＰ経路の異常な調節に関連する状態の発生もしくは進行に関与する遺伝子を同定する方法に関係し、そのタンパク生成物がアルツハイマー病の潜在的マーカーとして役立つかもしれないが、該方法は、アルツハイマー病との遺伝的な関連が示されている、ヒト第１０染色体の区域の近傍に位置するところのハエの遺伝的修飾因子のヒトホモログを同定することを含む。
【００２０】
なおもう一つの態様では、この発明はアルツハイマー病の発症もしくは進行に関与する遺伝子を同定する方法に関係し、そのタンパク生成物がアルツハイマー病の潜在的マーカーとして役立つかもしれないが、該方法は、ヒトの配列ｈＣＰ５０７６５（ＥＧＲ２遺伝子によりコード化された配列番号３５）およびｈｃＰ４１３１３（ショウジョウバエｎｏｃＡ遺伝子のヒトホモログによりコード化された配列番号１５、配列番号１７もしくは配列番号５３）でコード化された転写因子により調節される経路に関与するところの遺伝子を同定することを含み、そのヒトの配列は、アルツハイマー病との遺伝的な関連が示されている、ヒト第１０染色体の区域の近傍に位置している。
【００２１】
なおもう一つの態様では、この発明は、アルツハイマー病を非限定的に含む、ＡＰＰ経路の欠陥に関連した病的状態の処置、予防もしくは軽減のために有用である化合物を同定する方法に関係し、アルツハイマー病のインビトロもしくはインビボモデルに候補化合物を投与することを含み；そして遺伝的修飾因子の遺伝的ホモログの発現における変化についてアッセイを行うが、そこでは、候補化合物が投与されていなかった対照でのレベルと比較しての該ホモログのいずれか一つの変質発現が、潜在的治療上の価値を持つ化合物を示す。
【００２２】
この発明はまた、アルツハイマー病を非限定的に含む、ＡＰＰ経路の欠陥に関連した病的状態の処置、予防もしくは軽減のための方法に関係し、ここで同定された遺伝的修飾因子のヒトホモログでコード化されたいずれか一つもしくはそれ以上のポリペプチドの機能を阻害もしくは促進し得る化合物の治療法的有効量を、それを必要とする被験者に投与することを含む。
【００２３】
この発明はまた、アルツハイマー病を非限定的に含む、ＡＰＰ経路の欠陥に関連した病的状態の処置、予防もしくは軽減のための方法に関係し、三重らせんＤＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはリゾザイム：からなる群から選択される、いずれか一つもしくはそれ以上の物質を含む医薬組成物の治療法的有効量を、これを必要とする患者に投与することを含むが、この群の全ては、本発明の方法にしたがって同定された遺伝的修飾因子のヒトホモログのいずれか一つもしくはそれ以上から誘導化されるｍＲＮＡの適切な配列に相補的である。
【００２４】
この発明はまた、アルツハイマー病を非限定的に含む、ＡＰＰ経路の欠陥に関連した病的状態の処置、予防もしくは軽減のための方法に関係し、本発明の方法にしたがって同定された遺伝的修飾因子のヒトホモログの一つもしくはそれ以上へ向けられた二重鎖ＲＮＡ分子を含む、医薬組成物の治療法的有効量を、これを必要とする患者に投与することを含む。
【００２５】
さらなる態様では、この発明は、アルツハイマー病を非限定的に含む、ＡＰＰ経路の欠陥に関連した病的状態の処置、予防もしくは軽減のための方法に関係し、本発明の方法にしたがって同定された遺伝的修飾因子のヒトホモログのいずれか一つまたはそれ以上によりコード化される、ポリペプチドへ向けられた一つもしくは複数の抗体および／またはそれらのフラグメントを含む、医薬組成物の治療法的有効量を、これを必要とする患者に投与することを含む。
【００２６】
さらなる態様では、この発明はまた、アルツハイマー病を非限定的に含む、被験者におけるＡＰＰ経路異常に関連した病的状態の診断方法に関係し、それは、ｍＲＮＡレベルまたは、被検者からの生物学的試料中における遺伝的修飾因子のヒトホモログのいずれか一つもしくはそれ以上によりコード化される、ポリペプチドのレベルもしくは活性を測定することを含むが、そこでは、対照被験者におけるそのレベルと比べての異常なレベルが、該状態に診断的である。
【００２７】
さらにさらなる態様では、この発明は、被験者からの生物学的試料中で、遺伝的修飾因子もしくはそのフラグメントのヒトホモログのいずれか一つもしくはそれ以上によりコード化されるポリペプチド、または該ポリペプチドもしくはそのフラグメントのいずれか一つもしくはそれ以上をコード化する、ポリヌクレオチドの発現レベルを検出するのに必要な成分を含むキットに関係し、そのようなキットは、該ポリペプチドもしくはその該フラグメントに結合する抗体、または該ポリヌクレオチドもしくはその該フラグメントとハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブ、および該キットを使用するための指示書を含む。
【００２８】
なおもう一つの態様では、この発明は、遺伝的修飾因子もしくはそのフラグメントのヒトホモログのいずれか一つもしくはそれ以上へ向けられたアンチセンス、リボザイム、二重鎖ＲＮＡまたは三重らせん核酸、遺伝的修飾因子もしくはそのフラグメントのヒトホモログのいずれか一つもしくはそれ以上によりコード化されるポリペプチド、該ポリペプチドもしくはそのフラグメントをコード化するポリヌクレオチド、および該ポリペプチドもしくはそのフラグメントに結合する抗体：からなる群から選択される物質を含む医薬組成物に関係するが、それは、アルツハイマー病を非限定的に含む、ＡＰＰ経路の異常に関連する病的状態の処置のための、適当な医薬担体、添加物もしくは賦形剤を一緒に含む。
【００２９】
この発明はまた、アルツハイマー病を非限定的に含む、ＡＰＰ経路の異常に関連した病的状態の処置法に関係し、遺伝的修飾因子のヒトホモログのいずれか一つもしくはそれ以上をコード化する核酸を、それを必要とする被験者の一つもしくはそれ以上の組織に導入し、そこで、核酸によりコード化されるタンパク質の一つもしくはそれ以上が発現され、そして／または組織内に細胞によって分泌されることをもたらすことを含む。
【００３０】
（発明の詳細な説明）
ここで引用されるすべての特許出願、特許およびウエブサイト参考資料は、全体的な出典明示により本明細書の一部とする。
【００３１】
本発明の実施にあたり、分子生物学および組換えＤＮＡにおいて多くの従来の技法が用いられる。これらの技法は周知であり、例えば、「分子生物学における最近のプロトコール」、Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ， ＩＩ， ａｎｄ ＩＩＩ， １９９７ （Ｆ． Ｍ． Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｄ．）； Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， １９８９、「分子クローニング：実験室マニュアル、第二版」、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎ． Ｙ．；「ＤＮＡクローニング：実用的アプローチ」、Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ ａｎｄ ＩＩ， １９８５ （Ｄ． Ｎ． Ｇｌｏｂｅｒ ｅｄ．）；「分子クローニングへの実用的ガイド；シリーズ、酵素学における方法」、（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ．）；「哺乳動物の細胞のための遺伝子伝達ベクター」、（Ｊ． Ｈ． Ｍｉｌｌｅｒ ａｎｄ Ｍ． Ｐ． Ｃａｌｏｓ ｅｄｓ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）； ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ． １５４ ａｎｄ Ｖｏｌ． １５５ （Ｗｕ ａｎｄ Ｇｒｏｓｓｍａｎ， ａｎｄ Ｗｕ， ｅｄｓ．のそれぞれ）に説明されている。周知のショウジョウバエ分子遺伝学技法を、例えば、Ｒｏｂｅｒｔ， Ｄ．Ｂ．、「ショウジョウバエ、実用的アプローチ」、（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ， Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ， Ｄ． Ｃ．， １９８６）、に見出すことができる。ハエの保存株の記述を、ｈｔｔｐ：／／ｆｌｙｂａｓｅ．ｂｉｏ．ｉｎｄｉａｎａ．ｅｄｕ．のＦｌｙｂａｓｅデータベースに見出すことができる。
【００３２】
“トランンスジェニック”生物とは、ここで用いる限りでは、そのゲノムの中に挿入された余分な遺伝物質を持っている生物をいう、ここで用いる限りでは、“トランスジェンイックハエ”は、そのゲノムの中に無作為に挿入された同一もしくは別の生物からのＤＮＡ配列を含有するところのキイロショウジョウバエの胚、幼虫および成虫を含む。キイロショウジョウバエが好ましいが、ショウジョウバエ属のいかなるハエを本発明に使用してもよいことが意図される。
【００３３】
ここで用いる限りでは、導入遺伝子の“異所性”発現とは、それが通常発現されない、組織もしくは細胞または特定の発生段階における導入遺伝子の発現をいう。
ここで用いる限りでは、“表現型”は遺伝学的構成および環境の影響の両方により決定される生物の観察可能な物理的もしくは生化学的特色をいう。
ここで用いる限りでは、“遺伝的修飾因子のヒトホモログによりコード化されるポリペプチドのいずれかもしくはそれ以上の機能を阻害または促進”し得る化合物は、間接的に（下流効果を介し）もしくは直接的に、タンパク質へ結合することまたはさもなければ、それと相互作用することにより、そのように行い得る化合物を含み、そしてタンパク質のアンタゴニストもしくはアゴニストを非限定的に含む。
【００３４】
ここで用いる限りでは、“厳密なオーソログ”は次の基準を満たすものとして定義される：ハエのタンパク質Ｘがヒトタンパク質Ｙと最良のマッチを有し、ハエのタンパク質Ｘがヒトタンパク質Ｙとよりももう一つのハエタンパク質とより良いマッチを有することがなく、そしてヒトタンパク質Ｙがハエタンパク質Ｘと最良のマッチを有し、ヒトタンパク質Ｙがハエタンパク質Ｘとよりももう一つのヒトタンパク質とより良いマッチを有することがないが、そこでは“Ｘ”および“Ｙ”は比較されるいずれか二つのハエおよびヒトタンパク質を意味する。
【００３５】
“推定上のオーソログ”は、次の二つの基準のみを満たすものとしてここでは定義される：ハエタンパク質Ｘはヒトタンパク質Ｙと最良のマッチを有し、ならびにヒトタンパク質Ｙはハエタンパク質Ｘと最良のマッチを有し、ここでハエタンパク質Ｘが他のハエタンパク質とより良いマッチを有し、そして／もしくはヒトタンパク質Ｙが他のヒトタンパク質とより良いマッチを有するかを問わない。ここで開示されるように、他の全てのヒト／ハエ蛋白のマッチは“ホモログ”と見なされる。
【００３６】
ここで用いる限りでは、用語“発現制御配列”とは、プロモーターおよびエンハンサーをいう。用語“プロモーター”とは、転写開始の間にＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼによって直接的にもしくは間接的に認識されかつ結合される、ＤＮＡ配列をいい、そしてエンハンサーエレメントを含む。本発明で用いられるエンハンサーは、酵母のＧａｌ４転写調節因子により活性化される、ＵＡＳエレメントを含む。
【００３７】
用語“転写因子”とは、真核生物での転写を開始もしくは調節するために必要とされるいかなるタンパク質をいう。例えば、眼特異的なプロモーターＧＭＲは眼特異的な転写因子、ＧＬＡＳＳ、の結合部位である（Ｍｏｓｅｓ， Ｋ ａｎｄ Ｒｕｂｉｎ， ＧＭ Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ． ５（４）： ５８３−９３ （１９９１））。
【００３８】
ここで用いる限りでは、用語“Ａベータ”（Ａβ）とは、ベータおよびガンマセクレターゼによるＡＰＰの切断により生成される短い（４０〜４２個のアミノ酸）ペプチドである、ベータアミロイドペプチドをいう。これはアミロイド沈着の主要な成分であり、ＡＤの顕著な特徴であり、そして神経細胞死および変性の原因である。本発明のＡベータペプチドは４０個および４２個のアミノ酸のペプチドを非限定的に含み、そして、それぞれ、Ａベータ４０（もしくはＡβ４０）（配列番号１）およびＡベータ４２（もしくはＡβ４２）（配列番号２）と呼ばれる。
【００３９】
“Ｃ９９”とは、Ａベータ領域プラスＡＰＰの細胞質側の尾部を含有するペプチド（配列番号３）をいう。ここで用いる限りでは、この用語はまた、ロンドンＦＡＤアルツハイマーに関連する変異を所持する、Ｃ９９ロンドン配列（配列番号４）を含む（Ｇｏａｔｅ， Ａ． ｅｔ ａｌ （１９９１）． Ｎａｔｕｒｅ ３４９： ７０４−７０６）。ＡベータおよびＣ９９ペプチドは当業者に周知である（例えば、Ｇｏｌｄｅ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５５： ７２８−７３０ （１９９２）； Ｃｏｕｇｈｌａｎ， Ｃ． Ｍ． ａｎｄ Ｂｒｅｅｎ， Ｋ． Ｃ． （２０００）． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． ａｎｄ Ｔｈｅｒ． ８６： １１１−１４４を参照）。
“ＵＡＳ”領域とは、ここで用いる限りでは、ＧＡＬ−４転写活性化因子により認識される上流の活性化配列をいう。
【００４０】
ここで用いる限りでは、“シグナル配列”とは、細胞内でタンパク質の最終的な位置を決定するアミノ酸の短い配列、例えば、新生分泌もしくは膜貫通タンパク質を小胞体に導くＮ末端配列もしくは約２０個のアミノ酸をいう。ここで意図されることは、当業者におなじみの、いかなる従来のシグナル配列を使用して、コード化されたＣ９９もしくはＡベータ蛋白質の分泌経路を介する輸送を確実にし得るが、この配列は、内在性ショウジョウバエＡｐｐｌもしくはプレセニリンの、またはＥＲ（小胞体）滞在性タンパク質をコード化するヴィントボイテル遺伝子（Ｋｏｎｓｏｌａｋｉ ａｎｄ Ｓｃｈｕｐｂａｃｈ， Ｇｅｎｅｓ ＆ Ｄｅｖ． １２： １２０−１３１ （１９９８））のシグナル配列、またはヒトプレプロエンケファリン遺伝子シグナル（配列番号５）を非限定的に含むということである。
【００４１】
ここで用いる限りでは、“対照”ハエとは、本発明の方法で用いられる幼虫もしくは成虫と同じ遺伝子型を持つ幼虫もしくは成虫をいうが、ただし対照ハエの幼虫もしくは成虫は、表現型修飾を試験される変異を所持していないか、または候補化合物を投与されない。
ここで用いる限りでは、“対照被験者”とは、ＡＰＰ経路の異常に関連する状態に罹患していない生物をいう。
【００４２】
ここで用いる限りでは、“ショウジョウバエ形質転換ベクター”とは、転移性エレメントの配列を含有し、ＤＮＡの一片を生物のゲノム中に組み込むことを仲介することができるところのＤＮＡプラスミドをいう。この技術は当業者におなじみである。
この用語をここで用いる限りでは、“ラッフアイ”表現型は、個眼の秩序崩壊および個眼内剛毛により特色づけられ、かつ神経細胞の変性により生じさせられ得る。この表現型は解剖顕微鏡を通して見ることができる。
【００４３】
この用語をここで用いる限りでは、“凹型翅”表現型は、ハエの翅がその長縁に沿って上向きに曲げられるような、翅の異常な褶曲により特色づけられる。
ここで用いる限りでは、“運動欠損”とは、ハエが、従来の運動活性アッセイにおいて、機械的擾乱に対して野生型に比べて障害性の応答を示す表現型をいう。
【００４４】
ここで用いる限りでは、以下のおよび関連する語句、即ちＡＰＰ経路の異常に関連する病理学的状態、ＡＰＰ経路の異常な調節に関連する状態、アルツハイマー病に関係する状態、ＡＰＰ経路の欠損に関連する病理学的状態、の全てはアルツハイマー病を非限定的に含み、そして、記憶、認知および行動を調節する脳の一団の神経中の変性および究極的な死によって特色づけられる、それらの状態を含む。
“治療法的有効量”とは、試験する異常の症状を軽快させる活性成分、例えば化合物もしくは遺伝子産物の量をいう。
【００４５】
トランスジェニックショウジョウバエを含むトランスジェニック生物を得る方法は当業者に周知である。例えば、Ｐ−エレメントの仲介による形質転換についてよく用いられる参考書は、Ｓｐｒａｄｋｉｎｇ， １９８６．「ショウジョウバエにおけるＰ−エレメントの仲介による形質転換：実用的アプローチ」（ｅｄ． Ｄ． Ｂ． Ｒｏｂｅｒｔｓ）， ｐｐ １７５−１９７． ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ， Ｏｘｆｏｒｄ， ＵＫ））である。ＥＰエレメント技術とは、酵母のＧａｌ４転写活性化因子を利用する２成分システムをいい、内在性ショウジョウバエ遺伝子の転写を異所性に調節するために使用される。この技術は、Ｂｒａｎｄ ａｎｄ Ｐｅｒｒｉｍｏｎ， １９９３．「細胞の運命を変えて、優勢表現型を作成する手段としての標的遺伝子発現」Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １１８， ｐｐ ４０１−４１５、および、Ｒｏｒｔｈ ｅｔ ａｌ， １９９８．「ショウジョウバエにおける系統的機能獲得遺伝学」Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ， １２５（６）， ｐｐ １０４９−１０５７に記述されている。
【００４６】
本発明は、キイロショウジョウバエであるトランスジェニックハエを開示するが、それは、そのゲノムの中にベータアミロイドタンパク質を含むポリペプチド（配列番号３もしくは配列番号２）またはヒトＡＰＰ遺伝子のＣ９９部分（配列番号３もしくは配列番号４）をコード化するＤＮＡ配列を含有し、これは、従来の方法にしたがって、そのＮ末端でシグナルペプチド配列、例えば配列番号５、に融合して、コード化されたポリペプチドの分泌経路を通じる移動を確実にする。融合したＤＮＡ配列は、利用される発現システムに依存して、プロモーター領域もしくは上流の活性化配列（ＵＡＳ）のような組織特異的な発現制御配列に機能し得るように結合されている。これらの発現制御配列はハエの神経組織に特異的なものを含み、そして眼、翅、背板、脳、ＣＮＳおよびＰＮＳのような器官を含む。これらの組織特異的調節配列による制御下に、コード化されたペプチドは転写されて、ｍＲＮＡを形成するが、これは、検出可能なレベルのベータアミロイドもしくはＣ９９ペプチドに翻訳されて、そしてこれはハエにおける変質表現型を生じさせる。これらの表現型の変化についてアッセイすることにより、これらのハエを用いて、ＡＰＰ経路に影響し得る遺伝子もしくは化合物を同定することができ、そしてＡＰＰ経路およびアルツハイマー病の分子的および生化学的メカニズムに対する洞察を与え得る。
【００４７】
従来の発現制御システムを用いて、本発明のベータアミロイドおよびＣ９９ペプチドを含む、興味のある蛋白の異所性発現を達成し得る。そのような発現は、生化学的経路の擾乱と変質表現型の作成をもたらす。一つのそのような発現制御システムは、プロモーターもしくはエンハンサーのような組織特異的に発現される遺伝子の発現調節配列へのＤＮＡ配列の直接的な融合を伴う。使用し得るもう一つの発現制御システムは２成分のＧａｌ４転写活性化システムである（Ｂｒａｎｄ ａｎｄ Ｐｅｒｒｉｍｏｎ， Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １１８： ４０１−４１５ （１９９３））。
【００４８】
Ｇａｌ４系は酵母の転写活性化因子Ｇａｌ４を用いて、組織特異的な様式で興味のある遺伝子を発現を駆動する。Ｇａｌ４遺伝子は、従来の形質転換システムを用いて、ハエの遺伝子に無作為に挿入されており、そのため時期および組織特異的な様式で発現を駆動するところのゲノムのエンハンサーの制御下に入っている。これらの挿入物を所持する、ハエの個々の株が確立されて、“ドライバー”と呼ばれている（Ｂｒａｎｄ ａｎｄ Ｐｅｒｒｉｍｏｎ， Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １１８： ４０１−４１５ （１９９３））。
【００４９】
Ｇａｌ４システムでは、興味のある遺伝子を形質転換ベクターにクローン化して、その転写がＵＡＳ配列（Ｕｐｓｔｒｅａｍ Ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ）であるＧａｌ４応答性エレメントの制御下にあるようにする。興味のあるＵＡＳ−遺伝子配列を所持するハエの株を、組織特異的なエンハンサーの制御下にＧａｌ４遺伝子を発現するハエの株と交雑させるときには、遺伝子は組織特異的なパターンで発現されるであろう。
【００５０】
成虫の組織で容易に目視され、かくして遺伝的スクリーニングに用いることのできる表現型を作成するために、ハエ発生後期に発現を駆動するＧａｌ４“ドライバー”を本発明に用い得る。これらのドライバーを用いることにより、発現は、翅、眼、脚、種々の感覚器および脳に欠損の可能性をもたらすであろう。これらの“ドライバー”としては、例えば、ａｐｔｅｒｏｕｓ−Ｇａｌ４（翅）、ｅｌａｖ−Ｇａｌ４（ＣＮＳ）、ｓｅｖｅｎｌｅｓｓ−Ｇａｌ４、ｅｙｅｌｅｓｓ−Ｇａｌ４およびｐＧＭＲ−Ｇａｌ４（眼）が挙げられる。加えて、Ａｐｐｌ、即ちＡＰＰのハエのホモログ、はもっぱら神経組織で発現されるため、少なくとも発現サブセットが神経系の一部へ向けられるところの“ドライバー”株が好ましい。これとしては、脳特異的７Ｂ−Ｇａｌが挙げられる。Ｇａｌ４系統およびそれらの特異的発現パターンに関する注釈の記述はＦｌｙｂａｓｅ（ｈｔｔｐ：／／ｆｌｙｂａｓｅ．ｂｉｏ．ｉｎｄｉａｎａ．ｅｄｕ）で入手できる。
【００５１】
種々のＤＮＡ構築物を用いて、本発明のトランスジェニックキイロショウジョウバエを作成し得る。例えば、構築物は、プレプロエンケファリン遺伝子のシグナルペプチド配列に融合し、かつ眼特異的なプロモーターであるＧＭＲに機能し得るように結合された、ヒトＡＰＰ遺伝子のベータアミロイドもしくはＣ９９部分を含有し得る。もう一つの例では、構築物は、ＵＡＳ配列を転写領域の上流に置くところのｐＵＡＳＴベクター（Ｂｒａｎｄ ａｎｄ Ｐｅｒｒｉｍｏｎ， Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １１８： ４０１−４１５ （１９９３））の中にクローン化されたヒトプレプロエンケファリン遺伝子のシグナルペプチド配列に融合された、ヒトＡＰＰ遺伝子のベータアミロイド部分もしくはＣ９９を含有してもよい。これらの構築物のハエゲノム中への挿入は、Ｐ−エレメント組換え、Ｈｏｂｏエレメント組換え（Ｂｌａｃｋｍａｎ ｅｔ ａｌ．， ＥＭＢＯ Ｊ． ８：２１１−２１７ （１９８９））、相同組換え（Ｒｏｎｇ ａｎｄ Ｇｏｌｉｃ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８８： ２０１３−２０１８ （２０００））もしくは当業者に公知の他の標準的技法を通して起こり得る。
【００５２】
上に議論したように、異所性に発現した遺伝子は特定の生化学的経路の破壊により変質表現型をもたらし得る。同一の生化学的経路に作用する遺伝子変異は、変質表現型の修飾を生じさせると期待される。かくして、本発明のハエを用いて、Ｃ９９もしくはＡベータトランスジェニックハエを既知もしくは予想される遺伝子の中に変異を含有するハエと交雑させ；そして交雑の子孫をスクリーニングしてＣ９９もしくはＡベータトランスジェニックハエの変質表現型について対照と比べて定量的もしくは定性的な修正を示すハエを求めることにより、ＡＰＰ経路に作用する遺伝子を同定することができる。かくして、このシステムは、加工されたＡＰＰ遺伝子産物の機能の解明、ならびに、それらと直接もしくは間接に相互作用する他の遺伝子を同定するのに極めて有益である。スクリーニングできる変異としては、既知の遺伝子の機能消失対立遺伝子、欠失変異、Ｐ−エレメントにより作成された“エンハンサートラップ”株、および挿入部位近傍で遺伝子の異所性発現を活性化することのできるところのＧａｌ４−誘導性構築物のショウジョウバエゲノムの中に無作為に挿入することにより作成された機能獲得変異が、非限定的に挙げられる。ここで意図されることは、ＡＰＰ経路に関与する遺伝子をこの様式で同定することができて、そしてそれから、これらの遺伝子は、アルツハイマー病を非限定的に含む疾患に導くＡＰＰ経路における異常と関連する状態を処置するための治療薬を開発するための標的として役立つことができることである。
【００５３】
本発明のＣ９９およびＡベータトランスジェニックハエはまた、ＡＰＰ経路を修飾し得て、かくして上で議論した状態の処置に有用であると証明し得る化合物を同定する方法において用いられ得る。該方法は、候補化合物をＣ９９もしくはＡベータトランスジェニックハエに投与し、それから、化合物を投与されていない対照のＣ９９もしくはＡベータトランスジェニックハエの表現型と比較して、Ｃ９９もしくはＡベータトランスジェニックハエの表現型における変化についてアッセイすることを含み得る。例えば、従来の方法を用いて、候補化合物をベータアミロイドもしくはＣ９９を発現する幼虫に摂食させることができる。それから、幼虫を成虫の段階に成育させ、そしてＣ９９もしくはＡベータ誘導性表現の修飾をアッセイすることができる。候補化合物はまた、成虫のハエに摂食させ、そして表現型の修飾をアッセイしてもよい。
【００５４】
かくして同定された化合物の作用メカニズムを、遺伝操作により生成される表現型と興味のある化合物の投与により誘導される表現型とを比較することにより調べ得る。そのような化合物としては、トランスジェニックハエ中で創製される変質表現型を軽減もしくは悪化させ得る化合物が挙げられる。既知の遺伝的修飾に関連するものと類似した、化合物−誘導の表現型の発現は、その遺伝的修飾が影響を及ぼしているのと同じ経路に、化合物が影響を及ぼしていることを示唆するであろう。
【００５５】
本発明のトランスジェニックハエにおける化合物のスクリーニングに加えて、そのような化合物をまた、従来の方法を用いてＡＤのインビトロおよびインビボモデルによってさらにアッセイし得る。例えば、多数の細胞株はＡＤのインビトロのモデルとして用いられ得て、そして、例えば、Ｘｉａ ｅｔ ａｌ， １９９７ ＰＮＡＳ ＵＳＡ ９４ （１５）： ８２０８−１３、に記述されている細胞株を含み、当業者におなじみである。インビボモデルはまた存在し、例えば、ＷＯ　９４／００５６９に開示されているＡＤのマウスモデルが挙げられる。
【００５６】
ここに開示するトランスジェニックハエ中でベータアミロイドもしくはＣ９９の作用に影響を及ぼすところ化合物の作用メカニズムの解明はまた、チップ上でのＲＮＡプロファイリング（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ， Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ）もしくは他の従来の方法を用いて行われ得る。例えば、候補化合物を投与されているハエのＲＮＡプロファイルをアッセイし、そして、遺伝的に修飾されているハエのＲＮＡプロファイルと比較し得る。類似のプロファイルは、化合物がベータアミロイドもしくはＣ９９により影響を受ける経路に何らかの方式で作用することを示唆するであろう。
【００５７】
ここで意図されることは、なおもう一つの態様では、この発明は、アルツハイマー病の発症もしくは進行に関与しそしてその蛋白生成物がＡＤの潜在的マーカーとして役立つかもしれない、遺伝子を同定する方法に関係するものであり、該方法は、ヒトの配列のｈＣＰ５０７６５（配列番号３５、ＥＧＲ２遺伝子によりコード化される）およびｈＣＰ４１３１３（配列番号１５、配列番号１７もしくは配列番号５３、ショウジョウバエのｎｏｃＡ遺伝子のヒトホモログによりコード化される）によってコード化される転写因子により調節される経路に関与するところの遺伝子を同定することを含み、そのヒトの配列はここで記述するように同定されるショウジョウバエの遺伝的修飾因子のホモログであり、かつ、アルツハイマー病との遺伝的な関連が示されているところのヒト第１０染色体の区域の近傍に位置する、ということである。上述の転写因子により制御されるそのような遺伝子の同定は従来の方法を用いて達成し得るが、その方法としては、Ｔｕｅｒｋ ａｎｄ Ｇｏｌｄ， １９９０， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９， ５０５−５１０、および、Ｂｒｏｗｎ ａｎｄ Ｇｏｌｄ， １９９５， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３４， １４７６５−１４７７４、に参照される、ＳＥＬＥＸと呼ばれる技術が、非限定的に挙げられる。例えば、特異的な転写因子で調節される遺伝子を、特異的な転写因子の標的ＤＮＡ配列を決定することにより同定することができる。そのような標的配列の同定を、ＳＥＬＥＸを非限定的に含む、種々の方法で達成することができる。一旦標的配列が同定されれば、既知および予想される遺伝子の上流の調節領域中におけるこの配列の存在を、当業者に周知のバイオインフォーマティックスの手段を用いて決定することができる。それらの上流調節領域中に標的配列を含有する遺伝子は、特定の転写因子により調節されると期待され得る。
【００５８】
本発明に従って同定される遺伝的修飾因子のヒトホモログによりコード化される、タンパク質の機能もしくは発現に影響を及ぼす（例えば、阻害もしくは促進する）ところの化合物は、アルツハイマー病もしくはＡＰＰ経路の調節における欠陥に関連する他の状態を処置するのに有用であり得るということことが意図される。加えて、また意図されることは、従来の方法を用いて、治療的価値のある、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム、三重らせんＤＮＡおよび／もしくは二重鎖ＲＮＡを、遺伝的修飾因子のこれらヒトホモログのヌクレオチド配列に基づいて創製し得るということことである。遺伝的修飾因子のヒトホモログによりコード化されるポリペプチドに向けられ、かつ従来の方法で創製される抗体の治療的使用もまた、ここで意図される。かくして、この発明のさらなる態様は、薬学的に許容される担体、添加物もしくは賦形剤と一緒に、医薬組成物をアルツハイマー病および関連する状態の処置のために投与することに関する。
【００５９】
そのような医薬組成物は、上で議論された、化合物、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボゾーム、三重らせんＤＮＡ、二重鎖ＲＮＡおよび／もしくは抗体を含有してもよい。組成物はまた、本発明に従って同定された遺伝的修飾因子のヒトホモログの発現生成物（例えばポリペプチドもしくはそれらのフラグメント）を含有してもよい。組成物は、単独でもしくは安定用の化合物のような少なくとも１つの他の試剤と組み合わせて投与され得るが、これを、生理食塩水、緩衝化された生理食塩水、ブドウ糖および水を非限定的に含む、いかなる無菌で生体適合性の薬学的担体の中で投与してもよい。組成物を、単独でもしくは他の試剤、薬剤もしくはホルモンと組合わせて、それを必要とする被験者に投与してもよい。
【００６０】
発明により包含される医薬組成物を、経口、静脈内、筋肉内、関節内、動脈内、脊髄内、クモ膜下、脳室内、経皮、皮下、腹腔内、鼻腔内、経腸的、局所的、舌下もしくは直腸投与を非限定的に含む、いかなる数のルートで投与してもよい。
【００６１】
有効成分に加えて、これらの医薬組成物は、医薬的に使用され得る製剤中への有効化合物の加工を容易にする、添加物および補助剤を含む適当な薬学的に許容される担体を含有してもよい。処方および投与のための技法についてさらなる詳細は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ （Ｍａａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．， Ｅａｓｔｏｎ， Ｐａ．）の最新版に見られ得る。
【００６２】
技術上周知な、薬学的に許容される担体を用いて、経口投与用の医薬組成物を経口投与に適する剤型に処方することができる。そのような担体は、医薬組成物を錠剤、丸剤、糖衣丸剤、カプセル剤、液剤、ゲル剤、シロップ剤、スラリー剤、懸濁剤等として、患者による摂取のために処方することを可能にする。
【００６３】
活性化合物を固体の添加物と配合し、任意に、得られた混合物を摩砕し、望ましければ、錠剤もしくは糖衣丸剤の芯を得るために適当な補助剤を添加した後で、顆粒の混合物を加工することにより、経口用の医薬製剤を得ることができる。適当な添加物は、乳糖、白糖、マンにトールもしくはソルビトールを含む糖類；トウモロコシ、コムギ、コメ、ジャガイモもしくは他の植物からのデンプン；メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースもしくはカルボキシメチルセルロースナトリウムのようなセルロース；アラビアまたはトラガントを含むゴム類；ならびにゼラチンおよびコラーゲンのようなタンパク質のような、炭水化物またはタンパク質の賦形剤である。望ましければ、架橋ポリビニルピロリドン、寒天、アルギン酸もしくはアルギン酸ナトリウムのようなその塩、のような崩壊剤または可溶化剤を添加してもよい。
【００６４】
アラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カルボポールゲル、ポリエチレングリコールおよび／もしくは二酸化チタンをまた含有してもよい、濃縮糖液、ラッカー液ならびに適当な有機溶媒または溶媒混合液のような、適当なコーティング剤と一緒に糖衣丸剤の芯を使用してもよい。製品の同定のためにまたは活性化合物の量、即ち投与量、を特性化するために、染料もしくは色素を錠剤もしくは糖衣丸剤のコーティング剤に添加してもよい。
【００６５】
経口で使用できる医薬製剤としては、ゼラチン製の押込嵌めカプセル、ならびにゼラチンおよびグリセリンもしくはソルビトールのようなコーティング剤から作るソフトな、密閉カプセルが挙げられる。押込嵌めカプセルは、賦形剤または乳糖もしくはでんぷんのような結合剤、タルクもしくはステアリン酸マグネシウムのような滑沢剤および、任意に安定化剤と混合した有効成分を含むことができる。ソフトカプセルにおいては、安定剤の有無において、脂肪油、液剤もしくは液体ポリエチレングリコールのような、適当な液体中に活性化合物を溶解または懸濁させてもよい。
【００６６】
非経口性投与に適する医薬調合品は、水溶液中で、好ましくは、ハンクス溶液、リンゲル液もしくは生理緩衝食塩水のような生理的に適合性の緩衝液中で処方され得る。水性注射懸濁剤は、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトールもしくはデキストランのような、懸濁液の粘度を増加させる物質を含有してもよい。これに加えて、活性化合物の懸濁剤を適切な油性注射懸濁剤として調製してもよい。適当な親油性溶媒もしくはビークルとしては、ゴマ油のような脂肪油、またはオレイン酸エチルもしくはトリグリセリドのような合成脂肪酸エステル、またはリポソームが挙げられる。非脂質性ポリカチオンアミノポリマーもまた送達用に使用され得る。任意に、懸濁液はまた、化合物の溶解度を増加させて、高濃度の液の調製を可能にするところの適当な安定剤もしくは試剤を含有してもよい。
【００６７】
局所的もしくは経鼻的投与のために、特定のバリアーに浸透させる適切な浸透剤が調合剤に用いられる。そのような浸透剤は技術上一般に公知である。
本発明の医薬組成物は、技術上公知の様式で、例えば、従来の混合、溶解、顆粒化、糖衣−作製、湿式粉砕、エマルジョン化、カプセル化、充てんもしくは凍結乾燥プロセスにより、製造され得る。
【００６８】
医薬組成物を塩として提供してもよく、塩酸、硫酸、酢酸、乳酸、酒石酸、リンゴ酸、コハク酸等を非限定的に含む多くの酸で形成させることができる。塩は、水性もしくは他のプロトン性溶媒中に、対応する遊離塩基形より溶けやすい傾向を持つ。他の場合において、好ましい製剤は凍結乾燥粉末であるが、これは以下：１〜５０ｍＭヒスチジン、０．１％〜２％白糖および２〜７％マニトール、のいずれかもしくは全てを、４．５〜５．５のｐＨ範囲で含有してもよく、使用前に緩衝液と配合される。
【００６９】
医薬組成物を調製した後に、それらを適切な容器に入れて、適応される異常の処置について表示することができる。本発明にしたがって同定される化合物もしくは遺伝子製品の投与のためには、そのような表示は投与の量、頻度および方法を含む。
【００７０】
この発明で使用するのに適する医薬組成物としては、活性成分が意図する目的を達成する有効用量で含有される、組成物が挙げられる。有効用量の決定は当業者の能力内に十分にある。
【００７１】
いかなる化合物についても、治療的に有効な用量を、例えば、新生細胞の細胞培養アッセイにおいてまたは通常マウス、ウサギ、イヌもしくはブタの動物モデルにおいてのどちらかで始めに評価することができる。また、動物モデルを使用して、適切な濃度範囲および投与ルートを決定し得る。それから、そのような情報を使用して、ヒトにおける投与について有用な用量およびルートを決定することができる。
【００７２】
“治療的に有効な用量”とは、有効成分、例えば、症状もしくは異常を軽減する化合物もしくは遺伝子製品、のその量をいう。治療的な有効性および毒性は細胞培養もしくは実験動物における標準的な薬学的手順、例えば、ＥＤ５０（母集団の５０％で治療的に有効な用量）およびＬＤ５０（母集団の５０％に致命的な用量）により決定され得る。毒性的および治療的効果の用量比が治療指数であり、そしてそれはＬＤ５０／ＥＤ５０の比として表され得る。大きい治療指数を示す医薬組成物が好ましい。細胞培養アッセイおよび動物試験から得られるデータはヒトの使用についての投与量の範囲を処方するのに使用される。そのような組成物に含有される投与量は好ましくは、殆んどもしくは全く毒性の無いＥＤ５０を含む循環濃度の範囲内にある。投与量は、使用される剤型、患者の感受性および投与ルートに依存してこの範囲で変動する。
【００７３】
正確な投与量は、処置を必要とする患者に関する要素に照らして、医師により決定されるであろう。投与量および投与法は活性成分の十分なレベルを与えるようにもしくは望ましい効果を維持するように調整される。考慮され得る要素としては、疾患状態の重篤度、患者の一般健康状態、年齢、体重、ならびに被験者の性別、食事、投与の時間と回数、薬剤の組合せ、反応感受性および治療法への許容度／応答性、が挙げられる。持続性医薬組成物は、特定の調合品の半減期およびクリアランス比に依存して、３〜４日毎に、各週毎にもしくは２週間毎に投与され得る。
【００７４】
標準的な投与量は、０．１〜１００，０００ミリグラムから約１ｇの合計用量まで、投与ルートに依存して変動し得る。特定の投与量および送達法についてのガイダンスは文献に提供され、そして技術上医師にとって一般的に利用可能である。当業者はタンパク質もしくはそれらの阻害剤についてよりはヌクレオチドについて異なる調合品を使用するであろう。同様に、ポリヌクレオチドもしくはポリペプチドの送達は、特定の細胞、状態、位置等に特異的であろう。タンパク質の経口投与に適する医薬調合品は、例えば、米国特許の５，００８，１１４；５，５０５，９６２；５，６４１，５１５；５，６８１，８１１；５，７００，４８６；５，７６６，６３３；５，７９２，４５１；５，８５３，７４８；５，９７２，３８７；５，９７６，５６９および６，０５１，５６１の各番号に記載されている。
【００７５】
アルツハイマー病を非限定的に含む、被験者におけるＡＰＰ経路の異常に関連する病理学的状態の診断法が表１のデータが与えられることにより可能であることが、ここでまた意図される。例えば、その方法は、被検者からの生物学的試料中にある、表１の遺伝子のヒト遺伝子ホモログのいずれか一つもしくはそれ以上によりコード化される、ポリペプチドのレベルを測定することを含み得るが、ここでは、正常被験者におけるそのレベルと比べて、該ポリペプチドのいずれか一つもしくはそれ以上の異常レベルが該状態の診断となる。そのようなアッセイを当業者におなじみの従来の技術を用いて実施することができるであろう。
【００７６】
もう一つの実施態様では、遺伝的修飾因子のヒトホモログもしくはそれらの機能的誘導体をコード化する配列を含む核酸が投与されて、遺伝子治療によりＡＰＰ経路の機能を促進する。遺伝子治療とは、被検者に核酸を投与することにより実施する治療をいう。この発明のこの実施態様では、核酸は、正常なＡＰＰ経路の機能を促進することにより治療効果を仲介するところのそのコード化されたタンパク質を生成する。
技術上で入手可能な遺伝子治療のいずれも本発明に従って使用することができる。例示的な方法を以下に説明する。
【００７７】
好ましい態様では、治療剤は、適当な宿主中で遺伝的修飾因子タンパク質もしくはそのフラグメントまたはキメラタンパク質を発現する、発現ベクターの一部であるところの遺伝的修飾因子に対する核酸を含む。特に、そのような核酸は、特異的な遺伝的修飾因子タンパク質をコード化する領域に機能し得るように結合されたプロモーターを有し、該プロモーターは誘導性もしくは構成的であり、任意に組織特異的である。もう一つの特別な実施態様では、修飾因子タンパク質をコード化する配列およびいかなる他の望ましい配列が、ゲノムの中の望ましい位置において相同組換えを促進する領域により挟まれているところの核酸分子が用いられ、かくして修飾因子核酸の染色体内発現を提供する（Ｋｏｌｌｅｒ ａｎｄ Ｓｍｉｔｈｉｅｓ， １９８９， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８６： ８９６２−８９３５； Ｚｉｊｌｓｔｒａ ｅｔ ａｌ．， １９８９， Ｎａｔｕｒｅ ３４２： ４３５−４３８）。
【００７８】
患者体の中への核酸の送達は直接的であってもよく、この場合には患者は核酸もしくは核酸を所持するベクターに直接曝露され、または間接的のどちらであってもよく、この場合には細胞が先ずインビトロにおいて核酸で形質転換され、それから患者に移植される。これら二つのアプローチはそれぞれ、インビボまたはエクスビボ遺伝子治療として知られている。
【００７９】
特別な実施態様では、核酸はインビボで直接投与され、そこではそれを発現して、コード化された生成物を生成する。これは技術上周知の多数の方法のいずれかによっても達成することができるが、例えば、適切な核酸発現ベクターの一部としてそれを構築しかつ、例えば、欠陥があるか弱毒化したレトロウイルスもしくは他のウイルスベクターを用いる感染により、それが細胞の中に入るように投与することにより（例えば、米国特許第４，９８０，２８６号および以下に述べる他の特許）、または裸のＤＮＡの直接注入により、または微粒子銃（例えば遺伝子銃；Ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ， Ｄｕｐｏｎｔ）、または、脂質または細胞表面受容体もしくはトランスフェクションを起こさせる試剤、リポゾーム中の被包、微粒子もしくはマイクロカプセルでコーティングの使用により、または、それを核に入ることが知られているペプチドに連関させて投与することにより、受容体仲介性エンドサイトーシスを受けるリガンド対象物と連関させてそれを投与すること（例えば、全て全体的な出典明示により本明細書の一部とする、米国特許の５，１６６，３２０；５，７２８，３９９；５，８７４，２９７；および６，０３０，９５４の各番号を参照）（受容体を特異的に発現する細胞型を標的とするのに用いることができるところの）等により達成され得る。
【００８０】
もう一つの実施態様では、そこでリガンドがエンドゾームを破壊すべき融合誘導性ウイルスペプチドを含む、核酸−リガンド複合体を形成させて、核酸がリソゾームの中で分解されるのを防ぐようにすることができる。なおもう一つの実施態様では、特定の受容体を標的とすることにより、核酸を、インビボで細胞特異的取り込みおよび発現に対する目標とすることができる（例えば、ＰＣＴ公開のＷＯ　９２／０６１８０；ＷＯ　９２／２２６３５；ＷＯ　９２／２０３１６；ＷＯ　９３／１４１８８；およびＷＯ　９３／２０２２１の各番号を参照）。これに代えて、核酸を細胞の中に導入し、そして、相同組換えにより宿主ＤＮＡに組み込んで発現させることができる（例えば、米国特許の５，４１３，９２３；５，４１６，２６０；および５，５７４，２０５の各番号；ならびに、Ｚｉｊｌｓｔｒａ ｅｔ ａｌ．， １９８９， Ｎａｔｕｒｅ ３４２： ４３５−４３８、を参照）。
【００８１】
特別な実施態様では、修飾因子核酸を含有するウイルスベクターが用いられる。例えば、レトロウイルスのベクターを用いることができる（例えば、米国特許の５，２１９，７４０；５，６０４，０９０；および５，８３４，１８２の各番号を参照）。これらのレトロウイルスベクターは修飾されていて、ウイルスゲノムのパッケージングおよび宿主細胞のＤＮＡの中への組み込みに必要でないところのレトロウイルスの配列を欠失させてある。遺伝子治療に使用するべき修飾因子核酸はベクターの中にクローン化され、これが患者への遺伝子の送達を容易にする。
【００８２】
アデノウイルスは、遺伝子治療に用いることのできる他のベクターである。アデノウイルスは、呼吸上皮に遺伝子を送達するためには特に魅力的なベクターである。アデノウイルスは、軽度の疾患を引き起こす、呼吸上皮に自然に感染する。アデノウイルスに基づく送達システムのための他の標的は、肝臓、中枢神経系、内皮細胞および筋肉である。アデノウイルスは非分裂細胞に感染できるという長所を持っている。アデノウイルスに基づく遺伝子治療を実施する方法は、例えば、米国特許の５，８６２，５４４；５，８６８，０４０；５，８７１，７２２；５，８８０，１０２；５，８８２，８７７；５，８８５，８０８；５，９３２，２１０；５，９８１，２２５；５，９９４，１０６；５，９９４，１３２；５，９９４，１３４；６，００１，５５７；および６，０３３，８８４３の各番号に記述されており、これらは全て、全体の出典明示により本明細書の一部とする。
【００８３】
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）はまた、遺伝子治療での使用について提唱されている。ＡＡＶを作成し、利用する方法は、例えば、米国特許の５，１７３，４１４；５，２５２，４７９；５，２５２，３１１；５，６５８，７８５；５，７６３，４１６；５，７７３，２８９；５，８４３，７４２；５，８６９，０４０；５，９４２，４９６；および５，９４８，６７５の各番号に記述されており、これらは全て全体の出典明示により本明細書の一部とする。
【００８４】
遺伝子治療へのもう一つのアプローチは、エレクトロポレーション、リポフェクション、燐酸カルシウム仲介によるトランスフェクションもしくはウイルス感染のような方法により組織培養の細胞に遺伝子を伝達することを伴う。通常、伝達法は選択マーカーの細胞への伝達を含む。それから、細胞を選択にかけて、伝達した遺伝子を取り込んでいてかつ発現している細胞を単離する。それから、これらの細胞は患者に送達される。
【００８５】
この実施態様では、核酸は、こうして得られる組換え細胞のインビボ投与に先立ち細胞に導入される。そのような導入は、トランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、核酸配列を含有するウイルスもしくはバクテリオファージベクター、細胞融合、染色体仲介性遺伝子伝達、マイクロセル仲介性遺伝子伝達、スフェロプラスト融合等を非限定的に含む、技術上周知のいずれかの方法で実施されることができる。外来の遺伝子を細胞の中に導入するための多数の技法が技術上周知であり、そして受容細胞の必要な発生上のおよび生理学的な機能が破壊されないかぎり、本発明にしたがって用いられ得る。この技法は、核酸が細胞により発現可能で、好ましくは遺伝性でかつその細胞の子孫により発現可能であるように、核酸の細胞への安定的な伝達を提供するはずである。
【００８６】
ここ得られる組換え細胞を技術上公知の種々の方法により患者に送達することができる。好ましい実施態様では、上皮細胞は例えば皮下注射される。もう一つの実施態様では、組換え皮膚細胞は、皮膚移植として患者に適用されてもよい。組換え血球細胞（例えば、造血幹細胞もしくは前駆細胞）は好ましくは静脈投与される。細胞の予想使用量は、望まれる効果、患者の状態などに依存し、そして当業者によって決定されることができる。
【００８７】
その中に遺伝子治療の目的で核酸が導入され得る細胞は、いかなる望ましい、入手可能な細胞型を包含し、例としては、上皮細胞、内皮細胞、角質細胞、線維芽細胞、筋肉細胞、肝細胞；Ｔリンパ細胞、Ｂリンパ細胞、単核細胞、マクロファージ、好中球、好酸球、巨核球、顆粒球のような血液細胞；例えば骨髄、臍帯血、末梢血、胎児肝、その他から得られるような種々の幹細胞もしくは前駆細胞、特に造血幹細胞または前駆細胞が、非限定的に挙げられる。
好ましい実施態様では、遺伝子治療に用いられる細胞は患者自身に由来するものである。
【００８８】
組換え細胞が遺伝子治療に用いられる一つの実施態様では、修飾因子核酸は、それが細胞もしくはその子孫により発現可能なように細胞の中に導入され、それから組換え細胞は治療効果を得るためにインビボで投与される。特別な実施態様では、幹細胞もしくは前駆細胞が用いられる。インビトロで単離され維持されるいかなる幹−および／もしくは前駆細胞も、本発明のこの実施態様に従ってインビトロで潜在的に使用され得る。そのような幹細胞としては、造血幹細胞（ＨＳＣ）、皮膚および胃の内層のような上皮組織の幹細胞、胚性心筋細胞、肝幹細胞（例えば、ＷＯ　９４／０８５９８を参照）および神経幹細胞（Ｓｔｅｍｐｌｅ ａｎｄ Ａｎｄｅｒｓｏｎ， １９９２， Ｃｅｌｌ ７１：９７３−９８５）が、非限定的に挙げられる。
【００８９】
上皮幹細胞（ＥＳＣ）もしくは角質細胞は、皮膚および胃の内層のような組織から既知の手順により得られることができる（Ｒｈｅｉｎｗａｌｄ， １９８０， Ｍｅｔｈ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏ． ２１Ａ： ２２９）。皮膚のような層化した上皮組織では、基底層に最も近い層である胚層内の幹細胞の分裂により再生が起こる。胃の内層内の幹細胞はこの組織の迅速な再生率を提供する。患者もしくはドナーの皮膚もしくは胃の内層から得られるＥＳＣもしくは角質細胞は組織培養で増殖させることができる（Ｐｉｔｔｅｌｋｏｗ ａｎｄ Ｓｃｏｔｔ， １９８６， Ｍａｙｏ Ｃｌｉｎｉｃ Ｐｒｏｃ． ６１： ７７１）。もしＥＳＣがドナーにより提供されるならば、宿主対移植片反応性の抑制方法（例えば、中程度の免疫抑制を促進するために放射線照射、薬剤もしくは抗体の投与）をまた用いることもできる。
【００９０】
造血幹細胞（ＨＳＣ）に関しては、ＨＳＣの単離、増殖、およびインビトロでの維持を提供するいかなる技法も、この発明のこの実施態様で用いることができる。これが達成され得る技法としては、（ａ）将来の宿主もしくはドナーから単離される骨髄細胞からのＨＳＣの単離および確立、または（ｂ）予め確立されている長期ＨＳＣ培養の使用が挙げられ、これらは同種異系でも異種でもよい。非自己ＨＳＣは好ましくは、将来の宿主／患者の移植免疫を抑制する方法と一緒に使用される。本発明の特別な実施態様では、ヒト骨髄細胞を後部腸骨稜から針穿刺吸引により得ることができる（例えば、Ｋｏｄｏ ｅｔ ａｌ．， １９８４， Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． ７３： １３７７−１３８４を参照）。本発明の好ましい実施態様では、ＨＳＣを高度に富化されたもしくは実質的に純粋な形で作製することができる。この富化は、長期培養の前、途中、もしくは後で達成されることができて、技術上周知のいかなる技法でも行なわれることができる。骨髄細胞の長期培養は、例えば、改良Ｄｅｘｔｅｒ細胞培養技法（Ｄｅｘｔｅｒ ｅｔ ａｌ， １９７７， Ｊ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ． ９１： ３３５）もしくはＷｉｔｌｏｃｋ−Ｗｉｔｔｅ培養技法（Ｗｉｔｌｏｃｋ ａｎｄ Ｗｉｔｔｅ， １９８２， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７９： ３６０８−３６１２）を用いることにより、確立されかつ維持されることができる。
【００９１】
特別な実施態様では、遺伝子治療の目的で導入されるべき核酸は、核酸の発現が適切な転写誘導因子の存在もしくは非存在を制御することにより制御可能であるように、コード化領域に機能的に連結された誘導性プロモーターを含む。
【００９２】
本発明のさらなる実施態様は、ＡＤを非限定的に含むＡＰＰ経路異常に関連する状態の処置のために、精製抗体もしくはそのフラグメントの治療的な使用に関する。意図されることは、精製抗体もしくはそのフラグメントが、表１に同定される遺伝的修飾因子のいずれかのヒトホモログのアミノ酸配列を含むところのポリペプチド、好ましくはここに開示される第１０染色体に位置するヒトホモログのポリペプチド、最も好ましくは配列番号１５、配列番号１７もしくは配列番号５３、即ちキューレートされたｎｏｃＡ配列によりコード化されるポリペプチドに、または該ポリペプチドのフラグメントに、特異的に結合するということである。一つの好ましい実施態様は、フラグメントがＦａｂもしくはＦ（ａｂ’）２フラグメントであるような抗体のフラグメントに関する。特に、その抗体はポリクローナル抗体もしくはモノクローナル抗体であり得る。
【００９３】
ここで説明されるのは、一つもしくはそれ以上の差別的に発現された遺伝子エピトープを特異的に認識する能力がある抗体を生成する方法である。そのような抗体としては、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体（ｍＡｂｓ）、ヒト化もしくはキメラ抗体、単鎖抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ（ａｂ）２フラグメント、Ｆａｂ発現ライブラリーで生成されたフラグメント、抗イディオタイプ（ａｎｔｉ−Ｉｄ）抗体、および上記いずれかのエピトープ結合性フラグメントが、非限定的に挙げられ得る。そのような抗体を、例えば、フィンガープリント、標的、生物学的試料中の遺伝子の検出に、もしくはそれに代えて、異常な標的遺伝子活性の阻害法として用いることができる。かくして、そのような抗体は、アルツハイマー病の処置法の一部として利用され、または／もしくは診断技法の一部として用いられ得るが、それにより患者は、修飾因子ポリペプチドの異常レベルについて、もしくは修飾ポリペプチドの異常型の存在について試験され得る。
【００９４】
特定の修飾因子ポリペプチドに対する抗体の生成のためには、種々の宿主動物をポリペプチドもしくはその一部の注射により免疫してもよい。そのような宿主動物としては、２〜３だけ指定するならば、ウサギ、マウスおよびラットが、非限定的に挙げられる。宿主の種類に依存して、種々のアジュバントを用いて、免疫応答を増加し得るが、これらとしては、Ｆｒｅｕｎｄの（完全および不完全）アジュバント、水酸化アルミニウムのような金属ゲル、リゾレシチンのような界面活性剤、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、オイルエマルジョン、スカシガイヘモシアニン、ジニトロフェノール、ならびにＢＣＧ（Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ桿菌）およびＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐａｒｖｕｍのような潜在的に有用なヒトアジュバントが、非限定的に挙げられる。
【００９５】
ポリクローナル抗体は、標的遺伝子の産物もしくはその抗原機能的誘導体のような、抗原で免疫した動物の血清から誘導化された抗体分子の不均一性の集団である。ポリクローナル抗体の生成には、上に説明したような宿主動物を、また上に説明したようなアジュバントを添加した修飾因子ポリペプチドもしくはその一部の注射により免疫してもよい。
【００９６】
特定の抗原に対する抗体の均一性の集団である、モノクローナル抗体は、連続培養細胞株による抗体分子の生成を提供するところのいずれの技法により得られ得る。これらとしては、Ｋｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５， Ｎａｔｕｒｅ ２５６： ４９５−４９７；および米国特許第４，３７６，１１０号）のハイブリドーマ技法、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技法（Ｋｏｓｂｏｒ ｅｔ ａｌ．， １９８３， Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ ４： ７２； Ｃｏｌｅ ｅｔ ａｌ．， １９８３， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８０： ２０２６−２０３０）、およびＥＢＶ−ハイブリドーマ技法（Ｃｏｌｅ ｅｔ ａｌ．， １９８５、「モノクローナル抗体おおびがん療法」、Ａｌａｎ Ｒ． Ｌｉｓｓ， Ｉｎｃ． ｐｐ． ７７−９６）が、非限定的に挙げられる。そのような抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびそれらのいずれかのサブクラスを含む、いずれかのイムノグロブリンクラスでもよい。この発明のｍＡｂを生成するハイブリドーマはインビトロもしくはインビボで培養され得る。インビボでの高力価のｍＡｂの生成は、これを現在では好ましい生成法とする。
【００９７】
加えて、適切な抗原特異性を持つマウス抗体分子からの遺伝子を適切な生物活性を持つヒト抗体分子からの遺伝子と一緒にスプライシングさせることによる“キメラ抗体”の生成のために開発された技法（Ｍｏｒｒｉｓｉｏｎ ｅｔ ａｌ．， １９８４， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．， ８１： ６８５１−６８５５； Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９８４， Ｎａｔｕｒｅ， ３１２： ６０４−６０８； Ｔａｋｅｄａ ｅｔ ａｌ．， １９８５， Ｎａｔｕｒｅ， ３１４： ４５２−４５４）を用いることができる。キメラ抗体は、その中で異なる部分が、マウスのｍＡｂから誘導化される可変もしくは超可変領域およびヒトイムノグロブリンの定常領域を持つもののような、異なる動物種から誘導化されるところの分子である。
【００９８】
これに代えて、単鎖抗体生成のために記述された技法（米国特許第４，９４６，７７８号；Ｂｉｒｄ， １９８８， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２： ４２３−４２６； Ｈｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．， １９８８， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８５： ５８７９−５８８３；および、Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ， １９８９， Ｎａｔｕｒｅ ３３４： ５４４−５４６）を、分別的に発現された遺伝子−単鎖抗体を生成するように適応させることができる。単鎖抗体は、Ｆｖ領域の重鎖および軽鎖をアミノ酸の架橋を経由して連結させることにより形成され、単鎖ポリペプチドをもたらす。
【００９９】
最も好ましくは、“ヒト化抗体”の生成に有用である技法を、ポリペプチド、フラグメント、誘導体およびここに開示される機能的同等物に対する抗体の生成に適応させることができる。このような技法は、米国特許第５，９３２，４４８号；第５，６９３，７６２号；第５，６９３，７６１号；第５，５８５，０８９号；第５，６３０，１０１号；第５，９１０，７７１号；第５，５６９，８２５号；第５，６２５，１２６号；第５，６３３，４２５号；第５，７８９，６５０号；第５，５４５，５８０号；第５，６６１，０１６号；および第５，７７０，４２９号に開示されており、これら全ての開示は全体的な出典明示により本明細書の一部とする。
【０１００】
特定のエピトープを認識する抗体フラグメントは既知の技法で作成され得る。例えば、そのようなフラグメントとしては、抗体分子のペプシン消化で生成することのできるＦ（ａｂ’）２フラグメントおよびＦ（ａｂ’）２フラグメントのジスルフィド結合を還元することにより作成することのできるＦａｂフラグメントが、非限定的に挙げられる。これに代えて、Ｆａｂ発現ライブラリーを構築して（Ｈｕｓｅ ｅｔ ａｌ．， １９８９， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２４６： １２７５−１２８１）、望ましい特異性を有するモノクローナルＦａｂフラグメントの迅速かつ容易な同定を可能にし得る。
【０１０１】
本発明の抗体は好ましくは、被験者において異常なＡＰＰ経路調節および／もしくはアルツハイマー病に関連した状態の診断法に、または該状態の素因を有する被験者を確認するために用いることができるが、その方法は、被験者よりの適切な組織もしくは細胞の中において、表１に同定された遺伝的修飾因子のいずれかのヒトホモログのアミノ酸配列を含むポリペプチド、好ましくはここに開示される第１０染色体上に位置するヒトホモログのポリペプチド、最も好ましくは配列番号１５、配列番号１７もしくは配列番号５３、即ちキューレートされたｎｏｃＡ配列、またはそのフラグメントの量を測定することを含み、そこでは、対照被験者からのそれぞれの組織中における該ポリペプチドもしくはフラグメントの量と比べて、該ポリペプチドもしくはそのフラグメントの増加した量の存在が、該状態の診断となる。そのような方法は本発明のさらなる実施態様を形成する。好ましくは、該検出ステップは、該適切な組織もしくは細胞を、上で議論したポリペプチドまたはそのフラグメントの一つもしくはそれ以上のアミノ酸配列を含むポリペプチドに特異的に結合するところの抗体と接触させ、そして、該適切な組織もしくは細胞中のポリペプチドと該抗体との特異的結合を検出することを含むが、そこではポリペプチドへの特異的な結合の検出は、該ポリペプチドまたはそのフラグメントの一つもしくはそれ以上の存在を示す。
【０１０２】
検出を容易するために特に好ましいのは、これについて多数の変法が存在する、サンドイッチアッセイであるが、それらの変法の全ては本発明に包含されるべく意図されている。
【０１０３】
例えば、典型的なフォワードアッセイでは、非標識抗体を個体の基質上に固定化し、そして被検試料を結合した分子と接触させる。インキュベーションの適当な期間の後、抗体−抗原２成分複合体の形成を可能にするのに十分な期間の間。この時点で、検出可能なシグナルを誘導する能力のあるレポーター分子で標識された、第二抗体をそれから添加して、抗体−抗原−標識抗体の３成分複合体の形成に十分な時間を与えてインキュベートする。いかなる未反応物質を洗滌して除去し、そして、抗原の存在をシグナルの観察により測定するか、もしくは既知量の抗原を含有する対照試料と比較して定量し得る。フォワードアッセイの変法としては、試料と抗体の両方を結合した抗体に同時に添加するところの同時アッセイ、もしくは標識抗体と被検試料とを先ず結合させ、インキュベートして、非標識の表面結合抗体に添加するところの逆アッセイが挙げられる。これらの技法は当業者に周知であり、そして軽微な変法の可能性は容易に明らかであろう。ここで用いる限りでは、“サンドイッチアッセイ”は、基本的な二部位技法について全ての変法を包含することを意図している。本発明のイムノアッセイにとって、唯一の制限因子は、標識抗体が修飾因子ポリペプチドもしくはそのフラグメントに特異的な抗体でなければならないことである。
【０１０４】
この種のアッセイで最も一般に用いられるレポーター分子は、酵素、蛍光を含有するか、放射性核種を含有する分子である。酵素免疫アッセイの場合には、酵素は、通常グルタルアルデヒドもしくは過ヨウ素酸を用いて、第二抗体に結合される。しかしながら、容易に認識されるであろうように、当業者に周知である、広範な種類の異なる連結技法が存在する。一般に用いられる酵素としては、なかんずく、西洋わさびペルオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、ベータガラクトシダーゼおよびアルカリホスファターゼが挙げられる。特異的な酵素と共に用いられる基質は、相当する酵素による加水分解により検出可能な色彩変化を生成するものが一般的に選択される。例えば、リン酸ｐ−ニトロフェニルはアルカリホスファターゼ複合体との使用に適当であり；ペルオキシダーゼ複合体には１，２−フェニルエチレンジアミンもしくはトルイジンが一般に用いられる。蛍光原基質を用いることは可能であり、これは上述の発色性基質よりむしろ蛍光生成物を生じる。それから、適切な基質を含有する溶液が３成分複合体に添加される。基質は第二抗体に連結した酵素と反応し、定性的な目視性のシグナルを与えるが、これは、通常分光光度的にさらに定量化されて、血清試料中に存在する修飾因子タンパク質の量を評価し得る。
【０１０５】
これに代えて、フルオレッセインおよびローダミンのような蛍光化合物は、抗体の結合能力を変えることなく抗体に化学的にカップルさせ得る。特定波長の光で照射すると、蛍光色素で標識した抗体は光のエネルギーを吸収して、分子中に励起可能状態を誘導し、次いで特色的な長波長の光を発光する。この発光は、光学顕微鏡で目視可能な特色的な色として出現する。免疫蛍光およびＥＩＡ技法は、共に技術上非常に良く確立せれていて、本方法にとって特に好ましい。しかしながら、ラジオアイソトープ、化学発光もしくは生物発光分子のような他のレポーター分子がまた使用され得る。要求される使用に適応させるためにどのように手法を変えるべきかは当業者には容易に明らかであろう。
【０１０６】
本発明の方法に従って同定される遺伝子修飾因子のヒトホモログをコード化するポリヌクレオチドは、アルツハイマー病を非限定的に含む、ＡＰＰ経路の調節における欠陥と関連した状態を診断するための、もしくはそのような状態に対して遺伝的素因を有する個人を同定するため方法に用い得る。例えば、該方法は、ヒトからの適切な組織もしくは細胞の中で、ここに開示される遺伝的修飾因子のヒトホモログをコード化する遺伝子から転写されるｍＲＮＡの転写レベルを検出することを含み、そこでは、対照レベルと比較して異常な転写は該状態もしくは該状態に対する素因の診断となる。特に、該遺伝的修飾因子は表１に同定された遺伝的修飾因子のいずれかのヒトホモログ、好ましくはここに開示される第１０染色体上に位置するヒトホモログのポリペプチド、最も好ましくは配列番号１５、配列番号１７もしくは配列番号５３、即ちキューレートされたｎｏｃＡ配列、または配列番号３５によりコード化されるポリペプチド即ちＥＧＲ配列、または配列番号４１もしくは配列番号４３、アンキリン関連配列によりコード化されるヌクレオチド配列を含む。
【０１０７】
機能障害と関連した、本発明の方法に従って同定される遺伝子修飾因子をコード化する遺伝子の変異型の検出は、遺伝子の過少発現、過剰発現、または空間的もしくは時間的に変動した発現によりもたらされる、疾患もしくは疾患の感受性の診断に追加する、またはこれを規定する、診断手段を提供するであろう。該疾患としては、アルツハイマー病もしくはＡＰＰ経路の調節におけるエラーで特色づけられる他の状態が、非限定的に挙げられる。該遺伝子に変異を所持する個人は各種の技法によりＤＮＡレベルで検出され得る。
【０１０８】
診断用の核酸、特にｍＲＮＡは、血液、尿、唾液、組織バイオプシーもしくはオートプシー物からのような被験者の細胞から得られ得る。ゲノムＤＮＡを直接検出に用いるか、または、分析に先立って、ＰＣＲもしくは他の増幅技術を用いて酵素的に増幅し得る。ＲＮＡもしくはｃＤＮＡをまた、同様な方法で用い得る。欠失および挿入を、正常な遺伝子型と比較して増幅生成物のサイズの変化により検出することができる。増幅したＤＮＡを、本発明の遺伝的修飾因子ポリペプチドのヒトホモログをコード化する標識ヌクレオチド配列にハイブリダイズさせることにより、点変異を同定することができる。完全にマッチした配列を、ＲＮａｓｅ消化によりもしくは融解温度の差により、ミスマッチした二重らせんから識別することができる。ＤＮＡ配列の差はまた、変性剤の有無で、ゲル中でのＤＮＡフラグメントの電気泳動度の変動により、もしくは直接のＤＮＡシークエンシングにり検出され得る（例えば、Ｍｙｅｒｓ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ （１９８５） ２３０： １２４２）。特定の位置における配列変化はまた、ＲＮａｓｅおよびＳ１プロテクションのようなヌクレアーゼプロテクションアッセイ、もしくは化学的切断法（Ｃｏｔｔｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ （１９８５） ８５： ４３９７−４４０１を参照）により明らかにされ得る。
【０１０９】
もう一つの実施態様では、本発明の遺伝的修飾因子ポリペプチドをコード化するヌクレオチド配列、もしくはそのようなヌクレオチド配列のフラグメントを含むオリゴヌクレオチドプローブのアレーを構築して、例えば遺伝的変異の効率良いスクリーニングを行うことができる。アレー技術の方法は周知でありかつ一般的応用性を有し、そして、遺伝子発現、遺伝的連鎖および遺伝的変異性を含む分子遺伝学の多様な問題に対処するのに用いられることができる（例えば：Ｍ． Ｃｈｅｅ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ， Ｖｏｌ ２７４， ｐｐ ６１０−６１３ （１９９６）を参照）。
【０１１０】
診断アッセイは、説明された方法による修飾因子遺伝子のヒトホモログにおける変異の検出を通して、疾患に対する感受性を診断もしくは決定するためのプロセスを提供する。加えて、そのような疾患は、被験者から誘導化される試料から、ポリペプチドもしくはｍＲＮＡの異常に減少したもしくは増加したレベルを測定することを含む方法により診断され得る。減少したもしくは増加した発現を、例えば、ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲを例とする核酸増幅、ＲＮａｓｅプロテクション、ノザンブロッティングおよび他のハイブリダイゼーション法のようなポリヌクレオチドの定量のために技術上周知の方法のいずれかを用いて、ＲＮＡレベルで測定することができる。宿主から誘導化される試料中において、本発明のポリペプチドのようなタンパク質のレベルを測定するために用いることのできるアッセイ技法は、当業者に周知である。そのようなアッセイ法としては、ラジオイムノアッセイ、拮抗結合アッセイ、ウエスタンブロット分析およびＥＬＩＳＡアッセイが挙げられる。
【０１１１】
そのようなハイブリダイゼーションの条件は、上で説明したように、高度に厳密であるか低高度に厳密であってもよい。核酸分子がデオキシオリゴヌクレオチド（“オリゴ”）の場合には、高度に厳密な条件とは、例えば、６Ｘ　ＳＳＣ／０．０５％ピロリン酸ナトリウム中で３７℃（１４塩基オリゴについて）、４８℃（１７塩基オリゴについて）、５５℃（２０塩基オリゴについて）および６０℃（２３塩基オリゴについて）における洗滌を指してもよい。異なる組成の核酸に対するそのような厳密度の条件の適当な範囲は、上で引用したＭａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ．に加えてＫｒａｕｓｅ ａｎｄ Ａａｒｏｎｓｏｎ （１９９１）， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ， ２００： ５４６−５５６に記述されている。
【０１１２】
かくして、もう一つの態様では、本発明は：
（ａ）本発明の方法に従って同定される遺伝的修飾因子のヒトホモログ、好ましくはここに開示される第１０染色体上に位置するヒトホモログのポリペプチドもしくはそのフラグメント、のポリヌクレオチド；
（ｂ）（ａ）のそれに相補的なヌクレオチド配列；
（ｃ）本発明の遺伝的修飾因子のポリペプチド、好ましくは表１に同定された遺伝的修飾因子のヒトホモログのポリペプチド、好ましくはここに開示される第１０染色体上に位置するヒトホモログのポリペプチドもしくはそのフラグメント；または
（ｄ）本発明の遺伝的修飾因子ポリペプチド、好ましくは表１に同定された遺伝的修飾因子のヒトホモログのポリペプチド、好ましくは、ここに開示される第１０染色体上に位置するヒトホモログのポリペプチド、に対する抗体、
を含む診断キットに関する。
【０１１３】
いかなるそのようなキットにおいて、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）もしくは（ｄ）は実質的な成分を含んでもよいことが認識されよう。そのようなキットは、該ヒトホモログの一つもしくはそれ以上に向けられた成分を含んでもよいことが、また意図される。そのようなキットは、疾患または疾患に対する、特にアルツハイマー病を非限定的に含む、ＡＰＰ経路の調節におけるエラーに関連する疾患もしくは異常に対する、感受性の診断に有用であるであろう。
【０１１４】
本発明の遺伝的修飾因子のヒトホモログのヌクレオチド配列をまた、遺伝子連鎖分析に用いることができる。完全なヒトゲノム配列が知られているため、興味のあるヌクレオチド配列は、個別なヒト染色体上の特定の位置に特異的にマップされ得る。本発明に従って適切な配列を染色体へマッピングすることは、これらの配列を遺伝子に関連する疾患に相関させる重要な第一のステップである。一旦配列が正確な染色体上の位置にマップされれば、染色体上の配列の物理的な位置は遺伝的マップのデータと相関させることができる。そのようなデータは、例えば、Ｖ． ＭｃＫｕｓｉｃｋ、「ヒトにおけるメンデル遺伝」（Ｊｏｈｎｓ Ｈｏｐｋｉｎｓ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｗｅｌｃｈ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｌｉｂｒａｒｙを通じてオンラインで入手可能）に見出される。それから、同一の染色体領域にマップされているところの遺伝子と疾患との間の関係は、連鎖分析（物理的に隣接する遺伝子の共同遺伝）により同定される。最近のデータは、第１０ヒト染色体上にアルツハイマー病に連関した領域があることを示しており（Ｂｅｒｔｒａｍ ｅｔ ａｌ．， Ｅｒｔｅｋｉｎ−Ｔａｎｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｍｙｅｒｓ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９０， ２３０２−２３０５， ２０００）、かくして、本発明の方法に従って同定される遺伝的修飾因子のヒトホモログは、従来の技法を用いる染色体マッピング分析に付され得る。
【０１１５】
この発明は、単離された核酸分子、好ましくはＤＮＡ分子を含み、そこでは核酸分子は、配列番号１５、配列番号１７もしくは配列番号５３に示されるヒトｎｏｃＡホモログのキューレートされた配列である。同様に好ましいのは、配列番号３５に示される、ＥＧＲ２の配列によりコード化されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコード化する単離核酸分子、好ましくはＤＮＡ分子である。同様に好ましいのは、配列番号４１もしくは配列番号４３に示される、アンキリンの繰り返しタンパク質の配列のいずれかによりコード化されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコード化する単離核酸分子、好ましくはＤＮＡ分子である。
【０１１６】
従来の技法を用いて、遺伝的修飾因子の適切なヌクレオチド配列に向けられた、アンチセンス分子、二重鎖ＲＮＡ、三重らせんＤＮＡおよびリボザイムを創製し得る。表１に表示した遺伝子の制御領域、即ちプロモーター、エンハンサーおよびイントロン、に対するアンチセンス分子、ＤＮＡもしくはＲＮＡ、をデザインすることにより、遺伝子発現の修飾を得ることができる。転写開始部位、例えば転写開始位置から−１０および＋１０の位置の間、から誘導化されるオリゴヌクレオチドが好ましい。同様に、 “三重らせん”塩基対方法論を用いて、阻害を達成することができる。三重らせん対は、ポリメラーゼ、転写因子もしくは調節分子の結合のために二重らせんが十分開く能力の阻害を引き起こすので、有用である。三重らせんＤＮＡを用いる最近の治療上の進歩は文献に記述されている（Ｇｅｅ， Ｊ． Ｅ． ｅｔ ａｌ． （１９９４） Ｉｎ： Ｈｕｂｅｒ， Ｂ． Ｅ． ａｎｄ Ｂ． Ｉ． Ｃａｒ、「分子的および免疫的アプローチ」、Ｆｕｔｕｒａ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．， Ｍｔ． Ｋｉｓｃｏ， Ｎ． Ｙ．）。アンチセンス分子はまた、転写物をリボゾームへの結合から阻害することにより、ｍＲＮＡの翻訳を阻止するようにデザインされ得る。
【０１１７】
酵素的ＲＮＡ分子であるリゾザイムはまた、ＲＮＡの特異的な切断を触媒するのに使用され得る。リボザイム作用のメカニズムは、相補的標的ＲＮＡへのリボザイム分子の配列特異的なハイブリダイゼーションと、これに続くエンドヌクレオチドの切断を伴う。使用され得る例としては、表１の遺伝子産物をコード化する配列のエンドヌクレオチドの切断を特異的かつ効率的に触媒することのできる、工学されたハンマーヘッドモチーフリボザイムが挙げられる。
【０１１８】
いかなる潜在的ＲＮＡ標的内の特異的なリボザイム切断部位は、次の配列：ＧＵＡ、ＧＵＵおよびＧＵＣを含む、リボザイム切断部位を求めて標的分子をスキャンすることにより初めに同定される。一旦同定されれば、切断部位を含有する標的遺伝子の領域に対応する１５〜２０個のリボヌクレオチドの短いＲＮＡ配列は、オリゴヌクレオチドを機能消失させ得る二次構造の特徴について評価され得る。候補標的の適合性はまた、リボヌクレアーゼプロテクションアッセイを用いて相補的オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションへのし易さを試験することにより評価され得る。
【０１１９】
この発明のアンチセンス分子およびリボザイムは、核酸分子合成について技術上で公知のいかなる方法によっても調製され得る。これらとしては、固相ホスホルアミダイト化学合成のように、オリゴヌクレオチドを化学的に合成する技法が挙げられる。これに代えて、表１の遺伝子をコード化するＤＮＡ配列のインビトロおよびインビボ転写により、ＲＮＡ分子を調製し得る。そのようなＤＮＡ配列は、Ｔ７もしくはＳＰ６のような適当なＲＮＡポリメラーゼプロモーターと共に多様なベクターの中に組み込まれ得る。これに代えて、アンチセンスＲＮＡを構成的もしくは誘導的に合成するところのこれらのｃＤＮＡ構築物を、細胞株、細胞もしくは組織の中に導入することができる。
【０１２０】
ベクターを、多くの使用可能な方法によって細胞もしくは組織の中に導入してもよく、かつインビボ、インビトロもしくはエクスビボで使用してもよい。エクスビボ治療のために、ベクターを患者から採られた幹細胞の中に導入し、同一の患者に返す自己移植のためにクローン的に増殖させてもよい。トランスフェクションおよびリポゾーム注射による送達は技術上周知の方法を用いて達成し得る。
【０１２１】
遺伝子発現の遺伝子特異的な阻害はまた、従来の二重鎖ＲＮＡ技術を用いて達成され得る。そのような技術の記述は、全体的な出典明示により本明細書の一部とする、ＷＯ　９９／３２６１９に見出され得る。
なおさらに、そのような分子は、それによりＡＰＰ経路異常に関連する疾患および／もしくはアルツハイマー病を引き起こす対立遺伝子の存在を検出し得る、診断法およびキットの成分として使用され得る。
【０１２２】
本発明の他の目的、特徴、有利性および態様は、以下の説明から当業者に明らかになるであろう。しかしながら、以下の説明おおび特定の実施例は、この発明の好ましい実施態様を示す一方で、単に例示を意図して示されるということを理解すべきである。開示される発明の精神と範囲内での種々の変更および修飾は、以下の説明を読むことからおよび本開示の他の部分を読むことから、当業者に容易に明らかになるであろう。
【０１２３】
（実施例）
以下の手順を実施して、実施例を行う。
トランスジェニックハエ
トランスジェニックキイロショウジョウバエの創製法は当業者に周知である。いかなる従来法も使用することができるが、例えば、本発明のハエの創製に関与する基本的実験技法は上のＳｐｒａｄｌｉｎｇに記述されている。ここで意図されるように、トランスジェニックハエを、以下に説明するように、興味のあるＤＮＡ配列と発現制御配列との直接融合により創製し得る。例えば、形質転換株は従来の方法にしたがって、上で説明した構築物を用いて作成される。数個の独立した挿入物が構築用に得られ得るが、これらはＵＡＳ−Ａベータ４０、ＵＡＳ−Ａベータ４２、ＵＡＳ−Ｃ９９ｗｔ、ＵＡＳ−Ｃ９９Ｖ７１７１（ロンドン変異）およびｐＧＭＲ−Ａベータ４２である。
【０１２４】
ハエの保存株
本発明のトランスジェニックハエの中で導入遺伝子の発現を駆動するために用いられ得るＧａｌ４系統としては、ａｐｔｅｒｏｕｓ−Ｇａｌ４および７Ｂ−Ｇａｌ４が、非限定的に挙げられる。上述のＧａｌ４系統の記述およびそれらの特異的な発現パターンに関する解説を、Ｆｌｙｂａｓｅ（ｈｔｔｐ：／／ｆｌｙｂａｓｅ．ｂｉｏ．ｉｎｄｉａｎａ．ｅｄｕ）に見出すことができる。当機関で作成した新規トランスジェニック株としては、ＵＡＳ　Ａベータ４０およびＡベータ４２、ＵＡＳ　Ｃ９９野生型およびＵＡＳ　Ｃ９９ロンドン（ロンドンＦＡＤアルツハイマー病関連変異を所持する）を所持する株ならびにＧＭＲ　Ａベータ４２導入遺伝子が挙げられる。
【０１２５】
トランスポザーゼを発現するｙｗ；ＢｃＥｌｐ／ＣｙＯＨｏｐ株、ならびにｙｗ；Ｇｌａ／ＳＭ６ａおよびｙｗ；Ｄｒ／ＴＭ３　Ｓｂ　Ｓｅｒ株は、Ｒ． Ｐｄｇｅｔｔ， Ｗａｋｓｍａｎ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ， Ｒｕｔｇｅｒｓ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙから得られた。ｗ１１１８株ハエおよびＧＭＲ−ＧＡＬ４株ハエはＢｌｏｏｍｉｎｇｔｏｎ保存株センターから得られた。ｐＧＭＰ−１株は公開株であり，カリフォルニア大学バークレー校のＧ． Ｒｕｂｉｎ研究室から得られた。
【０１２６】
ＤＮＡ構築物と分子的技法
Ａβ４２ペプチドをコード化しかつヒトプレプロエンケファリンのシグナルペプチドに融合したＤＮＡフラグメントをＰＣＲ増幅し、ショウジョウバエの眼特異的なＰエレメント形質転換ベクターであるｐＧＭＲ（Ｈａｙ ｅｔ ａｌ．， １９９４ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １２０： ２１２１−２１２９）のＢｇｌ　ＩＩ部位の中にクローン化し、そして挿入物を自動蛍光シークエンス器（ＡＣＧＴ Ｉｎｃ．）によりシークエンスする。ヒトプレプロエンケファリンシグナルペプチドは、形質転換された哺乳動物細胞からのＡβ４２の分泌を成功裏に駆動すると示されている。ＧＭＲは、眼特異的な転写因子ＧＬＡＳＳ（Ｅｌｌｉｓ ｅｔ ａｌ．， Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １１９（３）： ８５５−６５ （１９９３））の結合部位である、ロドプシン−１遺伝子プロモーターから誘導化される応答エレメントの直列コピー５個から構成されている。かくして、Ａベータの発現は眼の中のＧＬＡＳＳ転写活性化因子のパターンで駆動される。上のＤＮＡフラグメントは、導入遺伝子のショウジョウバエゲノムの中への挿入を促進するところのＰエレメント含有ベクターの中に引き続きクローン化される。全ての分子的操作は標準的プロトコール（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｆｒｉｔｓｃｈ ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ、「分子クローニング：実験室マニュアル、第二版」、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， １９８９を参照）にしたがって行われる。
【０１２７】
Ｃ９９ペプチドをコード化しかつヒトプレプロエンケファリンシグナルペプチドに融合したＤＮＡフラグメントをＰＣＲ増幅し、Ｂｒａｎｄ ａｎｄ Ｐｅｒｉｍｍｏｎに記載されるように、ｐＵＡＳＴ形質転換ベクターの中にクローン化する。
【０１２８】
構築物のＵＡＳ−Ａベータ４０、ＵＡＳ−Ａベータ４２、ＵＡＳ−Ｃ９９ｗｔおよびＵＡＳ−Ｃ９９Ｖ７１７１はプレプロエンケファリン遺伝子シグナルペプチドを含有し、これにヒトＡベータ（４０もしくは４２）またはＣ９９（野生型もしくはロンドン変異を持つ）のフラグメントが続いている。ヒトフラグメントを、上のＢｒａｎｄ ａｎｄ Ｐｅｒｒｉｍｏｎに記載されたように、ｐＵＡＳＴの中にクローン化する。このベクター中へのクローニングは、ＵＡＳ配列を挿入された遺伝子の転写領域の上流に置き、またＰエレメントの組換えを通してハエゲノムの中への組込みを可能にする。
【０１２９】
遺伝的交雑、分析および表現型の視覚化
ハエを、全ての交雑体を表現型の最大発現のために２９℃に維持することを除き、従来の方法にしたがって交雑する。２成分のＧａｌ４発現システムでは、この温度がＧＡｌ４タンパク質の活性を最大にする。ｐＧＭＲ−Ａベータ４の場合には、その表現型が２９℃でさらに強いことが観察されており、それでこれらのハエも同様にこの温度で維持される。
【０１３０】
ウエスタン分析
異所性遺伝子発現を従来の方法にしたがってウエスタン分析によりアッセイすることができる。用いられ得る抗体は、ＡＰＰ遺伝子のベータアミロイド部分に対して飼育されたヒト６Ｅ１０モノクローナル抗体を含み、これはＡＰＰのＣ９９部位をまた認識する（Ｓｅｎｅｔｅｋ ＰＬＣ， Ｎａｐａ， ＣＡ）。
【０１３１】
ウエスタンプロトコール
Ａβ４２ペプチドの発現を検出するために、Ｋ１８．１／Ｋ１８．１、Ｋ１８．３／Ｋ１８．３、Ｋ１８．１／Ｋ１８．１；Ｋ１８．３／Ｋ１８．３、ＫＪ１０３／ＴＭ３Ｓｂ　Ｓｅｒ、ＫＪ１０３／ＫＪ１０３、ＫＪ５４／ＣｙＯ；ＫＪ５４／ＴＭ２　ＵｂｘおよびｐＧＭＲ−１の遺伝子型を持つハエ（挿入物の無いｐＧＭＲベクターを所持するハエ）を２９℃で飼育する。上の株のそれぞれから８０〜９０個のショウジョウバエの頭部を集め、１００μｌの２％ＳＤＳ、３０％蔗糖、０．７１８Ｍ　ビストリスおよび０．３１８Ｍ　ビシンを含有する、ドライアイス上のエッペンドルフチューブ中に“完全”プロテアーゼ阻害剤（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）と共に入れ、メカニカルホモジェナイザーを用いて磨砕する。試料を９５℃で５分間加熱し、１２，０００ｒｐｍで５分間遠心沈降させ、上清み液を新しいエッペンドルフチューブ中に移し入れる。５％β―メルカプトエタノールおよび０．０１％ブロムフェノールブルーを添加し、そしてロードする前に試料を煮沸する。それぞれの試料につき総蛋白抽出液約２００ｎｇを、８Ｍ尿素を含有する１５％トリシン／トリスＳＤＳ　ＰＡＧＥゲル上にロードする。Ａβ１−４２ペプチドの対照はヒトβアミロイド［１−４２］（ＢＩＯＳＯＵＲＣＥ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ， ＃０３−１１１）である。試料を濃縮用ゲル中において４０Ｖでおよび分離用ゲル中において１２０Ｖで移動させる。試料を１００Ｖで１時間かけてＰＶＤＦ膜（ＢＩＯ−ＲＡＤ， ＃１６２−０１７４）に移し、そして膜を引き続きＰＢＳ中で３分間煮沸する。抗体のハイブリダイゼーション法は以下の通りである：Ａβペプチドの最初の１９個のアミノ酸を認識するところの一次Ａｂ　６Ｅ１０（ＳＥＮＥＴＥＣＫ ＰＬＣ， ＃３００−０２）を用いて５％無脂乳、０．１％ツイーン２０含有１Ｘ　ＰＢＳ中において室温で９０分間のプロービング（１：２０００の濃度で）を行う。試料を１Ｘ　ＰＢＳ−０．１％　ツイーン−２０中でそれぞれ５分間、１５分間および１５分間３回洗滌する。二次のＡｂは抗マウス−ＨＲＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ， ＃ＮＡ ９３１）であり、５％無脂乳、０．１％ツイーン２０含有１Ｘ　ＰＢＳ中において１：２０００希釈で室温で９０分間用いられる。試料を１Ｘ　ＰＢＳ−０．１％　ツイーン−２０中でそれぞれ５分間、１５分間および１５分間３回洗滌する。ＥＣＬ（ＥＣＬ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ， Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ， ＃ＲＰＮ ２２０９）を検出用に用いる。
【０１３２】
組織学的検査
ハエの頭部のプラスチック包埋切片を従来の方法にしたがって、例えば、「ショウジョウバエプロトコール」、ｐａｇｅ ２３６， Ｅｄｓ． Ｗ． Ｓｕｌｌｉｖａｎ， Ｍ． Ａｓｈｂｕｒｎｅｒ， Ｓ． Ｈａｗｌｅｙ， ＣＳＨＬ Ｐｒｅｓｓ ２０００：に記載のプロトコールにしたがって、作成する。
【０１３３】
凍結切片
成虫のハエをＷｏｌｆ、「ショウジョウバエプロトコール」、ＣＳＨＬ Ｐｒｅｓｓ， ２０００、１３．１および１３．２項にしたがって凍結切片にする。一次抗体は、ヒトＡβ４２ペプチドを認識するモノクローナル６Ｅ１０（Ｓｅｎｅｔｅｋ）であり、１：３０００希釈で用いられる。検出システムはＶｅｃｔａｓｔａｉｎ ＡＢＣキット（ビオチニル化抗マウスＩｇＧ二次抗体および西洋ワサビペルオキシダーゼＨを有する）（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）である。以下の変更をＷｏｌｆｆによるプロトコールに対して行う：６Ｅ１０一次抗体とのインキュベーションに先立ち、Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ ＡＢＣキットのプロトコールにしたがって、正常ウマ血清含有ブロッキング液中で凍結切片をブロックする。二次抗体（ｐＧＭＰ−１の眼組織で予め吸着した）とのインキュベーションを、またＶｅｃｔａｓｔａｉｎ ＡＢＣキットのプロトコールにしたがって、１〜２％正常ウマ血清含有ＰＢＳ／１％ＢＳＡ中で行う。ＡＢＣキットについての手順を次に行う：ＡＢＣ試薬とのインキュベーションをＰＢＳ／０．１％サポニン中で行い、次いでＰＢＳ／０．１％サポニン中で１０分間の洗滌を４回行う。それから、切片をスライド当り０．５ｍｌの西洋ワサビペルオキシダーゼＨ基質溶液、ＰＢＳ／０．１％サポニン中で４００μｇ／ｍｌの３，３’−ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）、０．００６％Ｈ２Ｏ２、でインキュベートし、そして反応を３分後にＰＢＳ中の０．０２％アジ化ナトリウムで停止する。切片をＰＢＳ中で数回すすぎ洗い、ＤＰＸ（Ｆｌｕｋａ）に封入する前にエタノール系列を通して脱水する。
【０１３４】
化合物スクリーニングのためのＲＮＡプロファイルの特性化
ＲＮＡプロファイルは、伝統的なノザンブロット分析ならびにマイクロアッセイチップ技術（Ｉｎｃｙｔｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ， Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ； Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ， Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ， ＣＡ）の使用を含む、既知の方法論にしたがってアッセイされ得る。
【０１３５】
実施例１
Ａβ４２の異所性発現により誘導されるラッフアイ表現型
それによりＡβが神経変性を生じさせる、殆ど未知の経路およびメカニズムを解明するために、神経組織であるショウジョウバエの眼をモデルとして用いる。疾病特異的なＡβ４２の過剰発現を模倣しようとして、ゲノムがＧＭＲ−Ａβ４２アミロイド導入遺伝子を含むトランスジェニクハエを、発生中のショウジョウバエの眼の中で導入遺伝子を異所性に発現させるために、上に開示したＧＭＲ融合発現システムを用いて創製する。
【０１３６】
Ｉ．Ａβ４２の過剰発現はラッフアイ表現型を生じさせる
ショウジョウバエの眼の中にＡβ４２ペプチドを発現させるために、Ａβ４２配列をｐＧＭＲベクターの中にクローン化する。ｐＧＭＲ（Ｇｌａｓｓ Ｍｕｌｔｉｍｅｒ Ｒｅｐｏｒｔｅｒ）ベクターは、Ｇｌａｓｓ転写因子に対して先端を切った結合部位の五量体を含有している。Ｇｌａｓｓは、成虫のショウジョウバエの眼の前駆体である眼原基に始まる、眼の発生の間に広く発現されて、そこで分化中の光受容器ニューロンに検出される。それは、蛹および成虫の発生の間に眼に特異的に発現し続ける（Ｍｏｓｅｓ ｅｔ ａｌ， １９８９ Ｎａｔｕｒｅ ３４０ （６２３４）： ５３１−５３６； Ｍｏｓｅｓ ａｎｄ Ｒｕｂｉｎ， １９９１ Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ． ５： ５８３−５９３）。約２週令のハエにおけるＧＭＲエレメントの発現をレポーター遺伝子を用いて調べると、良好な発現が検出され、ＧＭＲ−エレメントが成虫になっても十分活性であることを示唆する。かくして、ＧＭＲ−調節性発現は眼の発生を通して、ならびに成虫の間、眼組織に向けられており、Ａβ４２の発現にとってそれを適切なシステムとしている。
【０１３７】
二つの独立したトランスジェニック系統が、ｐＧＭＲ−Ａβ４２構築物のＫ１８．１およびＫ１８．３を用いて初めに確立された。加えて、挿入物の無い同一ベクターを発現する、もう一つのトランスジェニック系統のｐＧＭＲ−１をネガティブコントロールとして調べる。ｐＧＭＲ−１導入遺伝子を有する対照ハエとＫ１８．３もしくはＫ１８．１導入遺伝子のいずれかのコピー１個を所持するハエはラッフアイを示さない。同様に、上の導入遺伝子（Ｋ１８．３およびＫ１８．１）の両方のいずれかのコピーを１個ずつ、もしくは１８．１導入遺伝子のコピー２個を所持するハエはまた、野生型のハエを持つ。対照的に、Ｋ１８．３のコピー２個を有するハエは軽度のラッフアイ表現型を持っており；光学顕微鏡下でハエの眼を検査すると、Ａβ４２の異所性過剰発現が、個眼（ショウジョウバエの複眼を形成する同一の単一ユニット）の光受容器細胞の規則正しい台形の配列を破壊していることが示される。上の観察は、ハエゲノム中に存在する導入遺伝子のコピー数に対するラッフアイ表現型には用量応答があるかもしれないことを示唆する。この仮説をさらに検討するために、導入遺伝子の数を３個に増やす（Ｋ１８．３のコピー１個と共にＫ１８．１のコピー２個、もしくはＫ１８．３のコピー２個と共にＫ１８．１のコピー１個）。これらの株はまたラッフアイを示した。最後に、導入遺伝子のコピー４個が存在したときには（Ｋ１８．３のコピー２個と共にＫ１８．１のコピー２個）、ハエは、はるかさらに重度のラッフアイ表現型を示し、用量応答仮説を確認した。ラッフアイ表現型の浸透率は、全ての遺伝的組み合わせで１００％である。ハエを２９℃で飼育するときには、より重度の表現型が観察されることはまた注目すべきである。眼表現型の発現のための温度要求性は先に記述されており（Ｋａｒｉｍ ａｎｄ Ｒｕｂｉｎ， １９９８ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １２５（１）： １−９）、たとえＧＭＲ−含有発現システムに限らないとしても、眼に特異的であるであろう。そのような依存性は高い転写のおよび／もしくは代謝の速度、または高温で変化したタンパク質の立体配座に起因するかもしれない。
【０１３８】
ＩＩ．Ａβ４２転写物はラッフアイ表現型を表示し、その重症度は転写遺伝子のコピー数に依存する。
ショウジョウバエ中の導入遺伝子の発現レベルが特異的な挿入物の染色体上の位置に依存すること、即ち“位置効果”として知られる現象は十分に確立されている（Ｋｅｌｌｕｍ， Ｒ． ａｎｄ Ｓｃｈｅｄｌ， Ｐ． （１９９１）． Ｃｅｌｌ． ６４： ９４１−５０）。したがって、同一の導入遺伝子を持つさらに別の独立した挿入物を生成させることにより、異なるレベルのトランスジェニックタンパク質を発現するトランスジェニック系統を回収することが可能である。かくして、さらに生理的な条件を反映するような低温（２５℃）で、表現型を生じさせるに十分なレベルのＡβ４２導入遺伝子を発現するかもしれないところのトランスジェニック系統を単離することが可能であるかもしれない。この仮説を試験するために、ハエゲノム中へのｐＧＭＲ−Ａβ４２導入遺伝子の新たな挿入物を、“Ｐエレメントホッピング”（Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ， Ｈ．Ｍ． ｅｔ ａｌ． （１９８８）． Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １１８： ４６１−４７０）を用いて作成した。
【０１３９】
新しい染色体の位置においてｐＧＭＲ−Ａβ４２構築物の合計１９個の独立した系統を確立した。新しい株は、染色体連鎖もしくは導入遺伝子の同型接合の致死条件に基づいて、ならびに眼の色の違い（形質転換マーカーとして用いられる、ｗｈｉｔｅ遺伝子の分別発現レベルにより引き起こされる）により、新規挿入物を所持すると判断された。上の新規株の若い幼虫を羽化まで２９℃で引き続き飼育し、眼の表現型の存在を調べた。１９個の新しい系統のうち、７個の系統、即ち３８％、がラッフアイ表現型を示す。ラッフアイ表現型を示す株を２５℃で引き続き飼育し、眼の表現型を採点する。
【０１４０】
新しいトランスジェニック系統は異なる程度の表現型の重症度を示し、そのいくつかはＫ１８．１およびＫ１８．３系統で初めに観察されていたものよりもさらに重症な表現型を示す。そのような例の一つがＫＪ．１０３系統であり、そこではコピー１個の導入遺伝子が成虫の眼を軽度にラッフにしており、これは眼の腹側に散在した、さらに暗い“斑点”（さらに暗赤色に着色した個眼に対応する）の存在により特色づけられ、一方では導入遺伝子のコピー２個は光受容体の広範な組織崩壊を引き起こす。さらに重要なことには、この特定の系統は、ハエを２５℃で飼育するときでさえ、ラッフアイ表現型を示す。ＫＪ．１０３ハエを２９℃で飼育するときには、導入遺伝子のコピー１個もしくは２個のいずれかで生じさせられる表現型の重症度を劇的に増大する。
【０１４１】
以上をまとめると、Ａβ４２ペプチドにより生じさせられるラッフアイ表現型はある範囲の重症度を示す。非常に軽症の系統は、眼の腹側に多数の暗い／黒い“斑点”が典型的に現れ、一方では軽症の系統は、眼の腹側を覆っている、さらにラッフな秩序の乱れた外観を有する。中等度の系統は眼全体に亘ってさらに強いラッフさを示し、一方ではさらに重症の系統では、眼全体は個眼および個眼の間の剛毛の多くを失い／融合しているように見えて、そして眼全体が滑らかで艶のある外観を有している。興味あることに、眼のサイズは、最高レベルのＡβ４２発現を有するハエ（ＫＪ５４株）ではただ中程度に影響をうけている。これは、ヒトα−シヌクレインを発現するハエ（Ｆｅａｎｙ， Ｍ．Ｂ． ａｎｄ Ｂｅｎｄｅｒ， Ｗ．Ｗ． （２０００） Ｎａｔｕｒｅ ４０４： ３９４−３９８）での観察と一致する。ポリグルタミン伸長のヒトハンチンチンを発現するハエでは、最も強く発現するトランスジェニック系統において、眼のサイズの極く軽度の減少が観察される（Ｗａｒｒｉｃｋ， Ｊ．Ｍ．， ｅｔ ａｌ （１９９８）． Ｃｅｌｌ ９３： ９３９−９４９）。上の結果は、ヒト疾患遺伝子の過剰発現により誘導される神経変性が、そこで眼のサイズが主に影響を受ける、アポトーシス経路に作用する遺伝子の過剰発現により生じさせられる表現型とは異なることを示唆する（Ｇｒｅｔｈｅｒ， Ｍ． Ｅ． ｅｔ ａｌ． （１９９５）． Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ． ９， １６９４−１７０８）。
【０１４２】
上の結果に基づき、ラッフアイ表現型の重症度はＡベータタンパク質の存在量に依存すると仮定される。この仮定の結果として、ＫＪ．１０３導入遺伝子はＫ１８．３導入遺伝子よりも高レベルのタンパク質発現を表示することが期待されるべきである（下記参照）。
【０１４３】
ＩＩＩ．ラッフアイ表現型の発現度はＡβ４２タンパク質レベルと相関する
ラッフアイ表現型の重症度がＡβ４２ペプチドの発現レベルと相関するかどうかを決定するために、ショウジョウバエの頭部からのタンパク質抽出物のウエスタンブロット分析を行う（用いた株は上の方法に記述されている）。結果は、導入遺伝子のコピー２個を有する動物は１個の導入遺伝子コピーを有する動物よりもＡβ４２の量が約２倍であることを示す。興味あることに、たとえＫ１８．１のコピー２個を有するハエがＡβ４２ペプチドを検出可能量で発現するとしても、それらは可視の成虫の眼の表現型を有していない。全体的にさらに大量のＡβ４２を発現する、高発現性のＫ１８．３導入遺伝子のコピー２個を有するハエは、ラッフアイ表現型を実際に示す。これはまた、Ｋ１８．１導入遺伝子のコピー２個とＫ１８．１導入遺伝子のコピー２個を有するハエについて当てはまる。ＫＪ１０３導入遺伝子のコピーを１個だけ発現するハエは、Ｋ１８．３のコピー２個を発現するハエとおおよそ同量のタンパク質を有し、ＫＪ１０３導入遺伝子がさらに高いレベルの相対的なタンパク質発現を示すとする仮定を確認する。
【０１４４】
上の結果は、可視の表現型を作成するためには一定レベルのＡβ４２タンパク質が要求されることを示している。より少量のＡβ４２が、超微細構造レベルでのみ可視であるであろう微細な破壊をもたらすことはなお可能である。これを試験するために、成虫の頭部からの薄切片（１．５μｍ）を検査した。これらのデータは、そこでトルイジン−ブルーで染色される光受容器が規則的に配列している、空のｐＧＭＲベクターを所持するハエの眼と比べて、中等度発現性のＫ１８．３導入遺伝子のコピー１個を有しているハエは小規模の異常を有しており、即ち幾つかの光受容器は欠失し、青く染まるかたまりが個眼の周囲に形成していて、そして若干のギャップが組織に現れている。これらの眼は肉眼では正常に見える。
【０１４５】
Ｋ１８．３導入遺伝子のコピー２個を発現する眼の切片は、肉眼レベルでの観察に一致して、多様な組織破壊を表示する。表現型が悪くなるにつれて、個眼周囲の密な染色性のかたまりの濃度が増加し、同時に組織間のギャップも増える。個眼はより小さく見え、光受容器を欠失している。高発現性のＫＪ１０３表現型のコピー２個は同様な重症度の表現型を示す。最後に、強発現性のＫＪ１５４導入遺伝子のコピー４個を発現するショウジョウバエからの眼は、光受容器のほぼ完全な消失を示している。これに加えて、これらの眼は大量の密な染色性のかたまりおよび組織間のギャップを示している。たとえ、個眼を囲む密な染色性のかたまりが異常な／死につつある細胞であるのか、もしくはそれらが凝集性Ａベータペプチドを含有しているのかはこの時点で不明であるとしても、それらの蓄積が、観察される全体的な眼の変性と同時に起こっていることは明らかである。
【０１４６】
眼組織上のベータアミロイドの発現を視覚化するために、Ａβを発現している眼の切片を、ヒトＡβペプチドを認識する抗体で染色する。眼組織の横断切片は対照にはない点状の染色を示す。この点状の染色はベータアミロイドの小さな凝集物／沈着物に相当することが仮定される。この染色の細胞での局在ならびに凝集物／沈着物の本質は、既知のＡβ染色性色素を用いて検討中である。
【０１４７】
以上をまとめると、ショウジョウバエの眼の中にＡβ４２導入遺伝子のコピーをより多数導入することは、Ａβタンパク質の増加したレベルにより反映されて、ラッフアイ表現型に追加的影響を与えることがここで開示される。一定濃度のＡβ４２ペプチドがその凝集／立体配座状態に影響を及ぼすために必要とされることは可能である。これに代えて、毒性作用の出現のためには、飽和レベルのペプチドが必要とされるのかもしれない。Ａβが幾つかのシグナル経路（細胞内カルシウムレベル、酸化的ストレス、炎症反応、ムスカリン性およびニコチン性受容体のシグナル伝達；総説：Ｆｒａｓｅｒ， Ｓ．Ｐ．， ｅｔ ａｌ （１９９７）． Ｔｒｅｎｄｓ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． ２０： ６７−７２： Ｍａｔｔｓｏｎ， Ｍ．Ｐ． （１９９７）． Ｐｈｙｓｉｏｌ． Ｒｅｖ． ７７： １０８１−１１３２； ａｎｄ Ｃｏｕｇｈｌａｎ， Ｃ．Ｍ． ａｎｄ Ｂｒｅｅｎ， Ｋ．Ｃ． （２０００）． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． ａｎｄ Ｔｈｅｒ． ８６： １１１−１１４； Ｈｅｌｌｓｔｒｏｅｍ−Ｌｉｎｄａｈｌ ａｎｄ Ｃｏｕｒｔ， ２０００ Ｂｅｈａｖ Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ． １１３ （１−２）： １５９−１６８）、に神経毒性作用を及ぼすという事実は、破壊を引き起こすためには飽和レベルが必要であることを示しているかもしれない。しかしながら、中等度の量のペプチドの発現が肉眼的形態学的レベルでは成虫の眼の構造に影響しないように見える。
【０１４８】
ＩＶ．Ａβ４２ペプチドで誘導されるラッフアイ表現型は加齢とともに悪化する
アルツハイマー病の患者では、Ａβペプチドの慢性蓄積が疾患の当初の発現にかつ症状の進行性の悪化に至ることが十分確立されている。疾患のこの様相をショウジョウバエモデルで模倣できるかどうかを検討するため、老齢ハエの眼の表現型のラッフネスの程度を記録した。
【０１４９】
ｐＧＭＲ１（陰性対照）およびＫ１８．３を発現する２株のハエを検討した。Ｋ１８．３ハエは、この株の表現型の重症度には巾があり、かくして変化を記録するのがより容易なため使用される。２株からのハエを２５℃で飼育し、そして羽化の０〜２日後に２９℃に移して、導入遺伝子の高発現を誘導する。ハエはその後ほぼ週１回、合計１ヶ月間眼の表現型を採点する。Ｋ１８．３ハエは、眼の表現型の重症度にしたがって三つの異なるグループ（中等度、軽度、中間）に分類される。先に述べたように、ｐＧＭＲ１を発現するハエはいかなる眼の表現型も示さなかった。
【０１５０】
データは、ハエが年をとるにつれて、Ａベータを発現するハエの表現型の重症度にシフトすることを示す。ハエが先ず羽化するとき、中間型表現型の眼は観察されないが、７日目に集団の１５％が中間型表現型を有している。また、７日目までに、全ての子孫がある程度のラッフアイ表現型を示すが、４２％は羽化直後にいかなる表現型も示さない。３２日までに、たとえ多数のハエが死んでしまうとしても、軽度対中間の表現型を有するハエの全体的な比率は有意には変化せず、Ａベータ発現の最大効果が達成されていることを示唆する。
【０１５１】
ここに開示するショウジョウバエモデルは、アルツハイマー病の重要な様相である、この病気の症状の進行性でかつ加齢に伴う悪化を模倣しているように見える。ハエの加齢に伴う眼の表現型の重症度における観察される増加は、Ａβペプチドのレベルに対する神経細胞の増加した感度に起因させることができるかもしれない。事実、上述のように、Ａβペプチドはショウジョウバエの成虫段階を通して生成されている。かくして、Ａβの増加したレベルは効率的には代謝回転されず、その結果ショウジョウバエの細胞内でのペプチドの蓄積をもたらすことが可能である。これに代えて、加齢細胞がＡβペプチドの存在により損傷を受けやすいということが可能である。
【０１５２】
Ｖ．ラッフアイ表現型ならびに幼虫の眼原基および成虫の眼の中のアポトーシス細胞の程度
先に述べたように、Ａβペプチドは既知の毒性作用を有し、そしてアポトーシスにおいて役割を演じていることが示唆される。これに基づき、成虫の眼の前駆体である三齢幼虫の眼原基をアポトーシス、即ちプログラム細胞死、の証拠について調べる。２９℃で飼育したＫ１８．１／Ｋ１８．１；Ｋ１８．３／Ｋ１８．３の幼虫からの切断した眼原基を、従来の方法にしたがって、アクリジンオレンジで染色するが、これはアポトーシス細胞の蛍光を生じさせる。対照として、どれもいかなる眼の異常をも示さない以下の株を用いる：２９℃で飼育されるｗ１１１８（野生型対照）およびｐＧＭＲ−１（“空”のｐＧＭＰベクターを所持する）ならびに１８℃で飼育されるＧＭＲ−ＧＡＬ４（ＧＭＲエレメントの制御下にＧａｌ４を発現する）。
【０１５３】
結果は、野生型対照のｗ１１１８には殆どか全く細胞死が見られないことを示す。対照的に、Ｋ１８．１／Ｋ１８．１；Ｋ１８．３／Ｋ１８．３系統には、ある量の細胞死が検出される。ｐＧＭＲを所持するが、いかなる眼の表現型をも示さない対照（ｐＧＭＲ−１およびＧＭＲ−ＧＡＬ４）を調べるときには、ある程度の細胞死がまた観察され、それは実験用ハエのＫ１８．１／Ｋ１８．１；Ｋ１８．３／Ｋ１８で観察された程度とほぼ同じである。それ故に、眼の発生の間にある一定量の細胞死は耐えられ、少なくとも肉眼的形態学的レベルではいかなる成虫の眼の欠陥を生じさせないことはありそうに見える。加えて、もしアポトーシスがラッフアイ表現型の発生に何らかの関与を有するならば、それは眼の初期発生の間では発揮されないことがここに示唆される。
【０１５４】
観察されるラッフアイ表現型がショウジョウバエの成虫段階の間にアポトーシスにより生じさせられるのかどうかを試験するために、アポトーシス阻害因子のＤＩＡＰ１をショウジョウバエの眼の中で共発現させる。Ａベータを発現する眼の中でのＤＩＡＰ１の共発現は、ラッフアイ表現型を少なくとも部分的に抑制すると期待されるであろう（データは示さない）。二つの異なるＤＩＡＰ−発現株で抑制が観察されないので、観察されたラッフアイ表現型は異所性に誘導されたアポトーシス細胞死により生じさせられないのかもしれない。バキュロウイルスの抗アポトーシス性Ｐ３５遺伝子を用いたときに、同じ結果が得られた。これらの結果は、ショウジョウバエの眼中のＡβ４２ペプチドにより引き起こされた作用は、アポトーシスをもたらさない細胞経路により仲介されるかもしれないことを示唆する。
【０１５５】
Ａβ４２の作用は極めて複雑で、ＡＤ発生における因子として知られている他のタンパク質に作用するかもしれない。ＰＳ１およびＰＳ２がＡＰＰと共−免疫沈澱すること（Ｘｉａ ｅｔ ａｌ．， １９９７ ＰＮＡＳ ＵＳＡ ９４ （１５）： ８２０８−１３）ならびにＡβ４２がインビトロでＰＳ２に直接結合すること（Ｃｚｅｃｈ ｅｔ ａｌ．， １９９９ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ ２５： ６４１．１）が示されてきている。野生型および変異ＰＳ型の過剰発現はまた、ショウジョウバエの眼（Ｙｅ， Ｙ ａｎｄ Ｆｏｒｔｉｎｉ， Ｍ． （１９９９）． Ｊ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． １４６： １３５１−１３６４）を含む、幾つかの実験システムにおいてアポトーシスに対する感受性を増大することとなることに注目することは興味深い。これらの研究では、ショウジョウバエのプレセニリン（Ｄｐｓ）は、高レベルに発現されるとき、優勢の陰性作用を発揮することが示唆される。どのようにしてＤｐｓが細胞のアポトーシスを引き起こすかは不明であるが、そのメカニズムはＮｏｔｃｈおよび／もしくはＷｎｔの発生シグナル経路（総説：Ａｎｄｅｒｔｏｎ ｅｔ ａｌ．， ２０００ Ｍｏｌ． Ｍｅｄ． Ｔｏｄａｙ ６： ５４−５９）の調節不全を伴うかもしれない。ここに開示したシステムにおけるＡβ４２の過剰発現が、ことによってはこれらのシグナル経路の一つもしくはそれ以上に干渉することによりＤｐｓ機能に影響しているかどうかは不明である。興味あることに、Ａβ４０もしくはＡβ４２の過剰発現は、同じ組織内でのＤｐｓ（ショウジョウバエのプレセニリン）誘導性の表現型を増強し（データは示さない）、同じ経路における二つのタンパク質の関与を示唆する。
【０１５６】
実施例２
Ｃ９９の異所性発現で誘導される凹型翅表現型
ｐＵＡＳ−Ｃ９９（野生型もしくはロンドン変異を有するかどちらか）のコピー１個およびａｐｔｅｒｏｕｓ−Ｇａｌ４のコピー１個を所持するトランスジェニックショウジョウバエを、標準的方法を用いかつ上で説明したように創製する。データは、これらのハエは、その羽根が凹型に屈曲しているという点で翅の形成異常を示すことを示している。これらの作用はＣ９９の複数の独立した挿入により確認される。ウエスタン分析はこの導入遺伝子の発現を確認する。ｄａｕｇｈｔｅｒｌｅｓｓ−Ｇａｌ４（遍在的に発現されているＧａｌ４ドライバー）の制御下でＣ９９（野生型もしくはロンドン変異を有するどちらか）を発現している幼虫全体からのタンパク質抽出物は、６Ｅ１０抗体（Ｃ９９の初めの１６個のアミノ酸に対して飼育された）と免疫反応する、Ｃ９９について予想されるサイズのタンパク質のバンドを示す。Ｃ１００と呼ばれるヒトＡＰＰ遺伝子の部分がショウジョウバエに挿入されかつ翅原基中で発現されたときには、それはいかなる可視的表現型も生成しなかったところのデータが存在する（Ｆｏｓｓｇｆｒｅｅｎ ｅｔ ａｌ．， ＰＮＡＳ ９５： １３７０３−１３７０８ （１９９８））。対照的に、ここに報告されるデータは、異なるシグナルペプチドに融合された、ヒトＡＰＰの同等なＣ１００領域（ここではＣ９９と呼称される）をもって導入遺伝子的なハエは、翅の形成不全となることを示す。
【０１５７】
実施例３
Ｃ９９の異所性発現で誘導される認知能の欠陥
ｐＵＡＳ−Ｃ９９（野生型もしくはロンドン変異を有するどちらか）のコピー１個および７Ｂ−Ｇａｌ４（脳のキノコ体での発現を可能にするところの）のコピー１個を所持するトランスジェニックショウジョウバエを標準的技法を用いて創製する。これらのハエの認知能の欠陥を、従来の方法にしたがって、嗅覚、歩行運動もしくは学習および記憶のアッセイを実施することにより調べることができる。例えば、Ｂｅｎｚｅｒ， Ｓ． ＰＮＡＳ ５８： １１１２−１１１９ （１９６７）により記述された“暗所反応性”装置を用いて試験された、上のハエにおいて、変質歩行運動行動が観察される。特に、ＵＡＳ−Ｃ９９のコピー１個と７Ｂ−Ｇａｌ４のコピー１個を含有するハエは、野生型のようにはうまく機械的擾乱に応答せず、アッセイ装置の底に軽く叩き落とされた後に野生型より早くはなく歩く。歩行運動用の“暗所反応性”試験はまた、「ショウジョウバエ、実用的アプローチ」、Ｅｄ． Ｄ． Ｂ． Ｒｏｂｅｒｔｓ （１９９８） Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ． Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ｐａｇｅ ２７３、の“行動，学習および記憶”に記述されている。
【０１５８】
実験例４
アルツハイマー病治療薬の標的として、ショウジョウバエの表現型を修飾する遺伝子
以下に詳細に開示するように、実施例２に記述した凹型翅表現型の遺伝的修飾因子を同定するために遺伝的スクリーニングを設定した。試験された候補修飾因子は、翅および背板（Ｇ． Ｂｏｕｌｉａｎｎｅ， Ｈｏｓｐｉｔａｌ ｆｏｒ Ｓｉｃｋ Ｃｈｉｌｄｒｅｎ， Ｔｏｒｏｎｔｏ， Ｃａｎｄａｄａ、私信）でのショウジョウバエのプレセニリン（Ｄｐｓ）の異所性発現により誘導される二つのショウジョウバエ表現型の既知修飾因子を含んだ。第１０染色体のＡＤ遺伝子“ホットスポット”の最近の発見に基づき、上述したショウジョウバエの遺伝的修飾因子のヒトホモログの染色体マッピングを行った。以下に開示するデータは、ここに開示された遺伝的修飾因子の幾つかのヒトホモログはまた、第１０染色体上に位置することを示し、そして、これらの遺伝子がアルツハイマー病ならびにＡＰＰ経路の調節における誤りと関連した他の状態の処置に有用な医薬品のための開発に関連する標的であることがここで意図される。
【０１５９】
ショウジョウバエの翅におけるＣ９９の異所性発現により誘導される凹型翅表現型の遺伝的修飾因子を同定するために、合計９３種の変異をスクリーニングした。スクリーニングは、外部変異が存在するときに、翅の表現型の浸透度の変化を測定することに基づく。より具体的には、野生型の翅を有するハエの数と比較した、変異した翅を有するハエの数を実験群（Ｃ９９および試験される変異の両方を発現するハエ）および対照群（Ｃ９９のみを発現するハエ）について計数する。上述の４群において、変異表現型の浸透度の変化の有意性をＴテストによるＰ値を測定することにより評価する。Ｐ＜０．０５のとき、変異はＣ９９の表現型を有意に修飾すると考えられた。
Ｃ９９−過剰発現表現型に影響する遺伝的修飾因子およびこれらの遺伝的修飾因子と関連するショウジョウバエ遺伝子のリストを表１に提供する。
【０１６０】
プレセニリンおよびＣ９９の過剰発現表現型の修飾因子として同定された全ての変異は挿入変異（ショウジョウバエのゲノム内へのＰ−レトロウイルス様転位因子の挿入により仲介される）であった。これらの挿入物のそれぞれの正確な染色体上の位置は既に決定されている（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔ ＢＤＧＰ， ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｆｒｕｉｔｆｌｙ．ｏｒｇ）。これらの挿入物のそれぞれにより影響される一つもしくは複数の転写物を同定するために、我々は既知のもしくは推定されたショウジョウバエの転写物についてそれぞれの挿入物の右側および左側へ１０ｋＢのゲノム区域をスキャンした。以下の基準を、与えられた挿入物により影響される最も確からしい転写物の選択に採用した：
ａ）挿入部位からの転写物の距離、およびｂ）挿入物に相対的な転写物の向き
【０１６１】
もしゲノム区域が挿入物と同じ向きの二つ以上の候補転写物を含有したならば、挿入物に最も近いもの全てをさらなる分析に選択した。上の分析からのショウジョウバエ転写物の翻訳されたタンパク質配列は“セットＡ”を形成する。
【０１６２】
ヒト第１０染色体のＡＤ−連鎖区域中の上のショウジョウバエタンパク質（“セットＡ”中の）のヒトホモログの存在を調べた。ヒト染色体１０上の配列標識化部位（ＳＴＳ）マーカーの周りの二つの候補領域が連鎖分析で同定されている（Ｂｅｒｔｒａｍ ｅｔ ａｌ．， Ｅｒｔｅｋｉｎ−Ｔａｎｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｍｙｅｒｓ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９０， ２３０２−２３０５， ２０００）。我々は、これらの連鎖分析に用いたＳＴＳマーカー配列もしくはこれらのマーカーに隣接するＳＴＳ配列をｂｌａｓｔｎ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．， １９９７）配列比較によりＣｅｌｅｒａのゲノムデータにマップした。このマッピングの情報に基づいて、有意な連関を示す二つの候補領域（Ｂｅｒｔｒａｍ ｅｔ ａｌ．， ２０００； Ｅｒｔｅｋｉｎ−Ｔａｎｅｒ ｅｔ ａｌ．， ２０００； Ｍｙｅｒｓ ｅｔ ａｌ．， ２０００）およびその間の領域を含有するヒト第１０染色体のサブセットを定義した。定義されたサブセットについてＤＮＡ配列（Ｃｅｌｅｒａコンティグ）およびＣｅｌｅｒａタンパク質翻訳物の対応するリストを検索して取り出し、ｂｌａｓｔフォーマットのデータベースにインプットした。上述のゲノム領域についてのＤＮＡ配列およびＣｅｌｅｒａタンパク質翻訳物のリストは、それぞれ“セットＢ”および“セットＣ”を形成する。
【０１６３】
それから、“セットＢ”に対する“セットＡ”でのｔｂｌａｓｔｎ検索および“セットＣ”に対する“セットＡ”でのｂｌａｓｔｐ検索を実施した。先ず、１０−５より低いＥ値のｔｂｌａｓｔｎおよびｂｌａｓｔｐのヒットを選択した。それから、これらの検索からそれぞれのハエタンパクの最良のマッチを選択し、対応するハエ遺伝子／転写物をＤｐｓおよびＣ９９表現型の遺伝的修飾因子とのそれらの関連についてチェックした。そこで得られた１４対のハエおよびヒトの転写物／タンパク質は“セットＤ”を形成する。
【０１６４】
“セット”Ｄ中の１４対のタンパク質を厳密なもしくは推定上のオーソロジーについて試験した。これは、全てのヒトのおよび全てのハエのＣｅｌｅｒａタンパク質の組み合わせたデータベースとのｂｌａｓｔｐ比較により達成された。先ず、“セットＤ”中のハエタンパク質をこのデータベース中のそれぞれのタンパク質と比較した。それから、ハエタンパク質のそれぞれについて得られた最良のヒトのマッチを組み合わせたヒト／ハエタンパク質データベースと再び比較した。もし下記の四つの基準の全てが満たされたならば、ヒトのマッチは厳密なオーソログに分類された：
１．ハエタンパク質Ｘは、ヒトタンパク質Ｙと最良のマッチを有する
２．ハエタンパク質Ｘは、ヒトタンパク質Ｙとよりももう一つのハエタンパク質とより良いマッチを有しない
３．ヒトタンパク質Ｙは、ハエタンパク質Ｘと最良のマッチを有する
４．ヒトタンパク質Ｙは、ハエタンパク質Ｘとよりももう一つのヒトタンパク質とより良いマッチを有しない
【０１６５】
もし基準１）および２）のみが満たされるならば、ハエタンパク質Ｘがもう一つのハエタンパク質とより良いマッチを有したか、ヒトタンパク質Ｙがもう一つのヒトタンパク質とより良いマッチを有したか、あるいはそれらの両方であるかに関係なく、ヒトのマッチは推定上のオーソログに分類される。全ての他のヒトのマッチはホモログと見なされる。オーソロジー試験の後、候補ヒト遺伝子を下記にしたがって優先順位をつけた：
ａ）ヒト遺伝子が、遺伝的スクリーニングで同定されたショウジョウバエの遺伝的修飾因子により影響されるハエ遺伝子のホモログである
ｂ）ヒトタンパク質（ａのヒト遺伝子によりにコード化される）のショウジョウバエタンパク質（ａのショウジョウバエ遺伝子によりにコード化される）との配列類似性の程度
ｃ）ヒトタンパク質がハエタンパク質の厳密なもしくは推定上のオーソログである
ｄ）ＳＴＳマーカー、他の候補遺伝子もしくは既知のＡＤ遺伝子との関係でのヒト遺伝子の染色体上の位置
ｅ）ヒトタンパク質および／もしくは相同のショウジョウバエタンパク質の推定上の機能
ｆ）予想されるヒト遺伝子が発現されているとの証拠
ｇ）ヒト遺伝子のコーディング領域内での検証されるもしくは予想されるコーディングおよび／または非コーディングＳＮＰの存在
【０１６６】
ヒトホモログ遺伝子が発現されるかどうかをチェックするために、Ｉｎｃｙｔｅ ＬｉｆｅＳｅｑ ＥＳＴデータベースをｂｌａｓｔｎを用いてＣｅｌｅｒａデータベースから同定された、対応する予想されるヒト転写物で検索した。
【０１６７】
これらの基準に基づいて、４個の異なるヒト遺伝子がヒト第１０染色体上に位置するＡＤ関連遺伝子であることがここで意図される。以下にこれらの提案されたヒト遺伝子によりコード化される推定上のタンパク質をリストする：
（１）ｈＣＰ５０７６５（ＥＧＲ２）配列番号３５
（２）ｈＣＰ４１３１３（ハエ遺伝子ｎｏｃＡに相同）配列番号１５、配列番号１７もしくは配列番号５３
（３）ｈＣＰ３３７８７（アンキリン関連タンパク質）配列番号：４１
（４）ｈＣＰ５１５９４（アンキリン−３）配列番号：４３
【０１６８】
Ｃｅｌｅｒａの予想される転写物ｈＣＴ１５０９７を手作業でキューレートして、タンパク質ｈＣＰ４１３１３の二つの予想される形を生成した。キューレーションはＩｎｃｙｔｅ ＬｉｆｅＳｅｑおよび公共のＥＳＴデータベースのｂｌｓｔｎ検索によりこの座位に対応するＥＳＴを同定することおよび同定されたＥＳＴをＣｅｌｅｒａの予想される転写物配列とアラインすることによリ実施した。キューレーションにより、予想されるアミノ酸配列についてＣ末端アミノ酸配列における軽度の変更およびＮ末端に推定されるさらに別の残基が生成した。ヒトタンパク質配列のＣ末端部分の変化は、この領域でのハエｎｏｃＡとの改善されたアラインメントに至る。Ｃｅｌｅｒａタンパク質配列（ｈＣＰ４１３１３）中のＮ末端のＭｅｔ６４およびＭｅｔ１００は、完全なキューレートされたｎｏｃＡホモログの転写物配列の翻訳物中のＭｅｔ１１４およびＭｅｔ１５０にそれぞれ相当する。我々は引き続いて、Ｎｏｖａｒｔｉｓ ＦＧＡのｃＤＮＡコレクションおよびＩｎｃｙｔｅのｃＤＮＡコレクションからのｃＤＮＡを分析し比較している。これらの分析に基づき、我々は第１０染色体上のヒトｎｏｃＡ遺伝子に相当するｃＤＮＡクローンをクローン化し、シークエンシングをしている。このｃＤＮＡクローンの５’末端は、専売のＮｏｖａｒｔｉｓクローンｆｇａ９４３４１からなり、そしてこのクローンの３’末端はＩｎｃｙｔｅクローン２４２２７８．１（配列番号５２、配列番号５３）から得られたｃＤＮＡからなる。
【０１６９】
ＥＧＲ２はＣｅｌｅｒａの予想されるハエ転写物ＣＴ２３７２４の推定上のオーソログであり（表１を参照）、これはショウジョウバエのｓｔｒｉｐｅ遺伝子に相当する。ｓｔｒｉｐｅ遺伝子に影響するハエの変異Ｐ１５０５（表１を参照）はプレセニリンの表現型のみを修飾する。
【０１７０】
ヒトｎｏｃＡはＣｅｌｅｒａの予想されるハエ転写物ＣＴ１４６１９の推定上のオーソログであり（表１を参照）、これはショウジョウバエのｎｏｃＡ遺伝子に相当する。ｎｏｃＡ遺伝子に影響するハエの変異Ｐ２１７３（表１を参照）はプレセニリンおよびＣ９９過剰発現の表現型の両方を修飾する。
【０１７１】
ＥＧＲ２は、ＰＮＳの髄鞘形成を調節するＣ２Ｈ２型亜鉛フィンガー転写因子である。マウスでは、これは後脳の発生に重要であると示されている（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ−Ｍａｕｎｏｕｒｙ ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ ７５， １１９９−１２１４， １９９３； Ｓｗｉａｔｅｋ ＆ Ｇｒｉｄｌｅｙ， Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ． ７， ２０７１−２０８４， １９９３）。ＥＧＲ２での４個の変異は、遺伝性末梢ニューロパシーと関連すると記述されている（Ｗａｒｎｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ １８， ３８２−３８４， １９９８； Ｔｉｍｍｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ５２， １８２７−１８３２， １９９９）。
【０１７２】
ｎｏｃＡヒトホモログは、Ｃ２Ｈ２型亜鉛フィンガードメインを有する推定上の転写因子である。正確な機能は未だ決定されていないが、ここに開示するデータによれば、それはアルツハイマー病の病理に重要な役割を演じているであろう。ｎｏｃＡ遺伝子でコード化されるショウジョウバエのタンパク質は、胚の脳および成虫の単眼構造の発生に関与する転写因子である。
【０１７３】
アンキリン−３は、４８０および２７０ｋＤａの二つの脳特異的なイソ型として存在する（Ｋｏｒｄｅｌｉ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７０， ２３５２−２３５９， １９９５）。神経特異的なアンキリン−３ポリペプチドは、イオンチャンネルならびにランヴィエ絞輪および軸索の初節への細胞接着分子の維持および方向付けに関与する候補である。アンキリン−３は、インビトロで電位依存性ナトリウムチャンネルと関連すると、ならびにランヴィエ絞輪、軸索の初節および神経筋接合部においてこの分子と位置を同じにすると、示されている（Ｓｒｉｎｉｖａｓａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３３３， １７７−１８０， １９８８； Ｋｏｒｄｅｌｉ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １１０， １３４１−１３５２， １９９０； Ｋｏｒｄｅｌｉ ＆ Ｂｅｎｎｅｔ， Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １１４， １２４３−１２５９， １９９１； Ｆｌｕｃｈｅｒ ＆ Ｄａｎｉｌｅｓ， Ｎｅｕｒｏｎ ３， １６３−１７５， １９８９）。
【０１７４】
ハエの転写物ＣＴ１８４１５の第二のヒトホモログはアンキリン関連タンパク質 （ｈＣＰ３３７８７）のファミリーに属する。対応する遺伝子はインスリン分解酵素（ＩＤＥ）から４６９ｋｂｐの位置にある。アンキリン−繰返し体に加えて、ｈＣＰ３３７８７は不稔のアルファモチーフ（ＳＡＭ）ドメインを含有する。ＳＡＭドメインは、発生段階の調節に関与していると示唆されており（Ｓｃｈｕｌｔｚ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ ６， ２４９−２５３， １９９７）、特定のタンパク質−タンパク質相互作用を仲介するとして述べられており、そして伸長したポリマー構造を形成すると示唆されている（Ｔｈａｎｏｓ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８３， ８３３−８３６）。ＳＡＭドメインは、ハエの転写物ＣＴ１８４１５およびｈＣＰ３３７８７との間のアラインメントに含まれる。我々は、これがβ−アミロイドの凝集に役割を演じるかもしれないと推測する。
【０１７５】
γ−シヌクレインがＡＤに関与しているかもしれないことが仮定されている（Ｌｕｅｄｅｃｋｉｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｌｅｔｔｅｒｓ ２６１， １８６−１８８， １９９９）。我々は、γ−シヌクレインがアンキリン繰返し体−含有タンパク質ｈＣＰ３３７８７と相互作用するかもしれないと仮定する。これを支持して、アンキリン繰返し体−関連タンパク質であるシンフィリンおよびα−シヌクレインの間にタンパク質−タンパク質相互作用が示されている（Ｅｎｇｅｌｅｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎ ２２， １１０−１１４， １９９９）。シヌクレインファミリーのメンバーが高度の配列類似性（α−シヌクレインとγ−シヌクレイン間で６４％の配列同一性、Ｌａｖｅｄａｎ， Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ ８， ８７１−８８０， １９９８）を共有していることがまた知られている。アンキリン−繰返し体単位の折りたたみは保存されるので、上の推論は、ｈＣＰ３３７８３もしくはｈＣＰ５１５９４およびγ−シヌクレインとの推定上の間のタンパク質−タンパク質相互作用に支持を加える。コーディングＳＮＰ（Ｅ→Ｋ）がアンキリン−繰返し体領域の開始に相当する、第４８配列位置におけるｈＣＰ３３７８７について予想されることに注目することは興味深い。この配列変動は、推定上のγ−シヌクレイン−アンキリン相互作用の状況に関連するかもしれないが、それはこれが逆に荷電したアミノ酸側鎖を伴うからである。アンキリン−関連タンパク質中の予想されるＳＮＰは、γ−シヌクレインが第１１０位置において、中性アミノ酸側鎖の陰性に荷電したアミノ酸側鎖による交換をコード化するところの検証されたコーディングＳＮＰ（Ｖ→Ｅ）（Ｎｉｎｋｉｎａ ｅｔ ａｌ．， Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ ７， １４１７−１４２４， １９９８）を有するので、特に興味深い。我々は、これらの多形性は、γ−シヌクレインとｈＣＰ３３７８３もしくはｈＣＰ５１５９４との推定上の相互作用に関連するかもしれないと仮定する。
【０１７６】
【表１】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004509646.tif 000133
【国際調査報告】
2004509646.tif 000134
2004509646.tif 000135
2004509646.tif 000136
2004509646.tif 000137
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