(57)【要約】組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ビリオンを、分泌腺の細胞に導入するための方法が記載される。異種遺伝子を含む組換えＡＡＶビリオンは、分泌腺の管に導入され、１つ以上の分泌腺細胞の形質導入を生じる。一旦、分泌腺細胞がｒＡＡＶビリオンによって形質導入されると、異種遺伝子は発現され、次いで、この発現産物は、分泌される。分泌腺の例示的な例は、肝臓、顎下腺、耳下腺および舌下腺である。本発明の方法を使用して、タンパク質の治療的レベルが達成される。血友病を処置するための方法もまた、開示される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
タンパク質を哺乳動物に送達する方法であって、該方法は、以下：
ａ）組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ビリオンを提供する工程であって、ここで、該ｒＡＡＶビリオンは、ヘルパーウイルスを含まず、そして、ここで、該ｒＡＡＶビリオンは、タンパク質をコードする異種遺伝子を含む、工程；
ｂ）該ｒＡＡＶビリオンと、該哺乳動物の分泌腺の管とを接触させる工程であって、ここで、該接触させる工程は、該分泌腺の少なくとも１つの細胞の形質導入を生じる、工程；
ｃ）該異種遺伝子を発現させる、工程；および
ｄ）該タンパク質を分泌させる、工程
を包含する、方法。
【請求項２】
前記タンパク質を分泌させる工程が、治療効果を生じる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記タンパク質が、血液凝固タンパク質である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記血液凝固タンパク質が、第ＩＸ因子である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記第ＩＸ因子が、ヒト第ＩＸ因子である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記血液凝固タンパク質が、第ＶＩＩＩ因子である、請求項３に記載の方法。
【請求項７】
前記第ＶＩＩＩ因子が、ヒト第ＶＩＩＩ因子である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記ｒＡＡＶビリオンが、逆行性管投与によって、前記分泌線の管に送達される、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記分泌腺が、唾液腺である、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記唾液腺が、顎下腺である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記分泌腺が、肝臓である、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記ｒＡＡＶビリオンが、内視鏡的逆行性胆道膵管造影法によって前記肝臓に送達される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
胆管が、肝管である、請求項１１または請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記胆管が、共通の胆管である、請求項１１または請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記哺乳動物が、ヒトである、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
ヒト第ＩＸ因子を哺乳動物に送達する方法であって、該方法は、以下：
ａ）約１×１０９〜約１×１０１１のｒＡＡＶウイルスゲノムの用量で、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ビリオンを提供する工程であって、該ｒＡＡＶビリオンは、ヘルパーウイルスを含まず、そして、ここで、該ｒＡＡＶビリオンは、ヒト第ＩＸ因子をコードする異種遺伝子を含む、工程；
（ｂ）該ｒＡＡＶビリオンと、該哺乳動物の唾液腺の管を接触させる工程であって、ここで、該接触させる工程が、該唾液腺の管の少なくとも１つの細胞の形質導入を生じる、工程；
（ｃ）該異種遺伝子を発現させる、工程；および
（ｄ）該ヒト第ＩＸ因子を該哺乳動物の血管に分泌させる、工程
を包含する、方法。
【請求項１７】
ヒト第ＩＸ因子を哺乳動物に送達する方法であって、該方法は、以下：
ａ）約１×１０９〜約１×１０１１のｒＡＡＶウイルスゲノムの用量で、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ビリオンを提供する工程であって、該ｒＡＡＶビリオンは、ヘルパーウイルスを含まず、そして、ここで、該ｒＡＡＶビリオンは、ヒト第ＩＸ因子をコードする異種遺伝子を含む、工程；
（ｂ）該ｒＡＡＶビリオンと、該哺乳動物の肝臓の管とを接触させる工程であって、ここで、該接触させる工程が、該肝臓の管の少なくとも１つの細胞の形質導入を生じる、工程；
（ｃ）該異種遺伝子を発現させる、工程；および
（ｄ）該ヒト第ＩＸ因子を該哺乳動物の血管に分泌させる工程であって、ここで、該ヒト第ＩＸ因子が、治療レベルで該血管中に存在する、工程
を包含する、方法。
【請求項１８】
哺乳動物中の血友病を処置する方法であって、該方法は、以下：
ａ）組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ビリオンを提供する工程であって、ここで、該ｒＡＡＶビリオンは、ヘルパーウイルスを含まず、そして、ここで、該ｒＡＡＶビリオンは、血液凝固タンパク質をコードする異種遺伝子を含む、工程；
ｂ）該ｒＡＡＶビリオンと、該哺乳動物の分泌腺の管とを接触させる工程であって、ここで、該接触させる工程は、該分泌腺の少なくとも１つの細胞の形質導入を生じる、工程；
ｃ）該異種遺伝子を発現させる、工程；および
ｄ）該血液凝固因子を該哺乳動物の血管に分泌させる工程であって、ここで、該血液凝固因子の治療有効レベルが達成される、工程
を包含する、方法。
【請求項１９】
前記血友病が、血友病Ｂである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記血友病が、血友病Ａである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
前記血液凝固因子が、第ＶＩＩＩ因子である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２２】
前記第ＶＩＩＩ因子が、ヒト第ＶＩＩＩ因子である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記血液凝固因子が、第ＩＸ因子である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２４】
前記第ＩＸ因子が、ヒト第ＩＸ因子である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記ｒＡＡＶビリオンが、逆行性管投与によって、前記分泌線の管に送達される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２６】
前記分泌腺が、唾液腺である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２７】
前記唾液腺が、顎下腺である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記分泌腺が、肝臓である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２９】
前記ｒＡＡＶビリオンが、内視鏡的逆行性胆道膵管造影法によって前記肝臓に送達される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
発現制御エレメントが、組織特異的プロモーターである、請求項１８に記載の方法。
【請求項３１】
前記組織特異的プロモーターが、肝臓特異的プロモーターである、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記肝臓特異的プロモーターが、ヒトα１−アンチトリプシンプロモーターである、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記肝臓特異的プロモーターが、アポリポタンパク質Ｅ肝臓制御領域に作動可能に連結される、請求項３１に記載の方法。
【請求項３４】
前記哺乳動物が、ヒトである、請求項１８に記載の方法。
【請求項３５】
哺乳動物の分泌腺の管に送達するための医薬の製造における、タンパク質をコードする異種遺伝子を含む組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ビリオンの使用であって、ここで、該医薬は、ヘルパーウイルスを含まない、使用。
【請求項３６】
哺乳動物の唾液腺の管に送達するための医薬の製造における、第ＩＸ因子をコードする遺伝子を含む組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ビリオンの使用であって、ここで、該医薬は、ヘルパーウイルスを含まない、使用。
【請求項３７】
哺乳動物の肝臓の管に送達するための医薬の製造における、第ＩＸ因子をコードする遺伝子を含む組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ビリオンの使用であって、ここで、該医薬は、ヘルパーウイルスを含まない、使用。
【請求項３８】
哺乳動物の分泌腺の管に医薬を送達することによって血友病を処置するための該医薬の製造における、血液凝固タンパク質をコードする遺伝子を含む組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ビリオンの使用であって、ここで、該医薬は、ヘルパーウイルスを含まない、使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ビリオンを哺乳動物被験体に送達する方法に関する。より詳細には、本発明は、ｒＡＡＶビリオンが、治療タンパク質を送達するために、哺乳動物被験体（ヒトを含む）の分泌腺の管に投与される方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
科学者らは、ヒト疾患（例えば、糖尿病、血友病および癌）に関連する遺伝子を、頻繁に発見している。研究努力によってまた、遺伝的障害には関連しないが、代わりに、多数の疾患を処置するために使用され得るタンパク質をコードする遺伝子（例えば、エリトロポイエチン）が明らかになっている。しかし、遺伝子を同定し、そして単離するための努力における有意な進歩にも関わらず、生物医薬品産業が直面する主な障壁は、治療有効量の遺伝子産物をどのようにして安全かつ持続的に患者に送達するかということである。
【０００３】
一般に、これらの遺伝子のタンパク質産物は、培養された細菌、酵母、昆虫、哺乳動物または他の細胞において合成され、そして、直接注射により患者に送達される。組換えタンパク質の注射は、成功しているが、様々な欠点がある。例えば、患者はしばしば、血流中の必要なタンパク質レベルを維持するために、毎週、時には毎日の注射を必要とする。その時でさえ、タンパク質濃度は、生理学的レベルに維持されない−タンパク質のレベルは、通常、注射の直後は異常に高く、そして、注射の前には最適レベルよりもかなり低い。さらに、組換えタンパク質の注射送達は、しばしば、タンパク質を体内の標的細胞、標的組織、または標的器官に送達し得ない。そして、このタンパク質が、その標的に到達する場合、非治療的レベルまで、しばしば希釈される。さらに、この方法は不便で、そして、大幅に患者の生活様式を制限する。生活様式に対する悪影響は、患者が子供である場合に、特に顕著である。
【０００４】
これらの欠点は、持続したレベルの特定のタンパク質を患者に送達するための遺伝子治療方法の開発をもたらしている。これらの方法は、臨床家が、異種核酸分子（ＨＮＡ）をコードするデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）を、直接患者にか（インビボ遺伝子治療）、または患者もしくはドナーから単離された細胞に（エキソビボ遺伝子治療）（これらは、続いて患者に戻される）導入することを可能にするように設計される。次いで、導入されたＤＮＡは、所望のタンパク質産生物を生成するように、患者自身の細胞または移植細胞を指し向ける。従って、遺伝子送達は、頻繁な注射に対する必要性を除外する。遺伝子治療はまた、臨床家が、治療のために特定の器官または細胞標的（例えば、筋肉、血球、脳細胞など）を選択するのを可能にし得る。
【０００５】
ＤＮＡは、様々な方法で患者の細胞に導入され得る。化学的方法（例えば、リン酸カルシウム沈降およびリポソーム媒介トランスフェクション）および物理学的方法（例えば、エレクトロポレーション）を含む、トランスフェクション法がある。一般に、トランスフェクション法は、インビボ遺伝子送達に適切でない。組換えウイルスを使用する方法もまたある。現在のウイルス媒介遺伝子送達ベクターとしては、レトロウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、ポックスウイルスおよびアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）に基づくベクターが挙げられる。レトロウイルスのように、そして、アデノウイルスとは異なり、ＡＡＶは、宿主細胞染色体にそのゲノムを組み込ませる能力を有する。
【０００６】
（アデノ随伴ウイルス媒介遺伝子治療）
ＡＡＶ（Ｄｅｐｅｎｄｏｖｉｒｕｓ属に属するパルボウイルス）は、他のウイルスでは見出されない様々な魅力的な特性を有する。例えば、ＡＡＶは、広範な宿主細胞（非分裂細胞を含む）に感染し得る。さらに、ＡＡＶは、様々な種由来の細胞に感染し得る。重要なことには、ＡＡＶは、ヒトまたは動物の何の疾患に関連していないので、組み込みの際に宿主細胞の生理学的特性を変更しそうでない。最後に、ＡＡＶは、広範な物理学的条件および化学的条件で安定であり、このことは、生産、保存および輸送の必要性に役立つ。
【０００７】
６つの公知のＡＡＶ血清型（ＡＡＶ−１〜ＡＡＶ−６）が存在する。これらの６つの血清型のうち、ＡＡＶ−２が、最も特徴付けられている。例えば、ＡＡＶ−２は、広範な多数の形質導入実験において使用されており、そして、多くの種々の組織型を形質導入することが示されている。
【０００８】
ＡＡＶゲノム（約４７００ヌクレオチドを含む直鎖の１本鎖ＤＮＡ分子（ＡＡＶ−２ゲノムは、４６８１ヌクレオチドからなる））は、一般に、各々の末端に逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）が、隣接している内部非反復セグメントを含む。ＩＴＲは、約１４５ヌクレオチド長（ＡＡＶ−１は、１４３ヌクレオチドのＩＴＲを有する）であり、そして、複数の機能（複製起点としての役割、ウイルスゲノムのパッケージングシグナルとしての役割を含む）を有する。
【０００９】
ゲノムの内部非反復部分には、２つの巨大なオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含み、これらは、ＡＡＶ複製領域（ｒｅｐ）およびキャプシド領域（ｃａｐ）として公知である。これらのＯＲＦは、それぞれ、複製遺伝子産物およびカプシド遺伝子産物をコードする：複製遺伝子産物およびカプシド遺伝子産物（すなわち、タンパク質）は、複製、アセンブリ、および完全なＡＡＶビリオンのパッケージングを可能にする。より詳細には、少なくとも４つのウイルスタンパク質のファミリーは、ＡＡＶ  ｒｅｐ領域から発現される：Ｒｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２およびＲｅｐ４０（これらの全ては、その見かけの分子量から名付けられる）。ＡＡＶ  ｃａｐ領域は、少なくとも３つのタンパク質をコードする（ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３）。
【００１０】
ＡＡＶは、ヘルパー依存的ウイルスであり、機能的に完全なＡＡＶビリオンを形成するために、ヘルパーウイルス（例えば、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、またはワクシニアウイルス）との同時感染を必要とする。ヘルパーウイルスとの同時感染の不存在下では、ＡＡＶは、ウイルスゲノムが、宿主細胞染色体に挿入されるか、またはエピソーム形態で存在するが、感染性ビリオンが生成されない潜伏状態を確立する。ヘルパーウイルスによる続く感染が、組込まれたゲノムを「レスキュー」し、このゲノムは、複製およびウイルスキャプシドへのパッケージが可能となり、これによって、感染ビリオンを再構成する。ＡＡＶは、種々の種由来の細胞を感染し得る一方、ヘルパーウイルスは、宿主細胞と同じ種でなければならない。従って、例えば、ヒトＡＡＶは、イヌアデノウイルスで同時感染されているイヌ細胞中で複製する。
【００１１】
ＨＮＡを含む組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ビリオンを生成するために、適切な宿主細胞株は、ＨＮＡを含むが、ｒｅｐおよびｃａｐが欠如するＡＡＶベクターでトランスフェクトされる。次いで、宿主細胞は、ｒＡＡＶビリオンを形成するために、野生型（ｗｔ）ＡＡＶおよび適切なヘルパーウイルスで、感染される。あるいは、ｗｔ  ＡＡＶ遺伝子（ヘルパー機能遺伝子として知られ、ｒｅｐおよびｃａｐを含む）およびヘルパーウイルス機能遺伝子（補助機能遺伝子として知られる）は、１つ以上のプラスミド中で提供され得、これによって、ｒＡＡＶビリオンの生成におけるｗｔ  ＡＡＶおよびヘルパーウイルスの必要性を排除し得る。このヘルパーおよび補助機能遺伝子産物は宿主細胞中で発現され、宿主細胞中では、これらが、異種遺伝子を含むｒＡＡＶベクターに対してトランスで（ｉｎ  ｔｒａｎｓ）作用する。次いで、異種遺伝子は、ｗｔ  ＡＡＶゲノムであるかのように複製され、そしてパッケージされて、組換えＡＡＶビリオンを形成する。患者細胞が、得られたｒＡＡＶビリオンで形質導入される場合、ＨＮＡは、侵入し、そして患者細胞中で発現される。患者の細胞は、ｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子、ならびに補助機能遺伝子を欠如しているので、ｒＡＡＶビリオンは、そのゲノムをさらに複製も、パッケージもし得ない。さらに、ｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子の供給源なしに、ｗｔ  ＡＡＶビリオンは、患者の細胞中で形成され得ない。
【００１２】
（ＡＡＶ送達制限）
ＡＡＶの全身性（例えば、脈管内）投与は、所望しない体内分布を導き得る。例えば、全身性ＡＡＶ投与からの所望の結果は、肝臓の形質導入であり得るが、このようなアプローチは、他の組織の形質導入を導き得、このことは、治療有効性を制限し得、そして／または治療効果を達成するために、より高い用量のベクターを必要とし得る。さらに、生殖系列伝達が、全身投与の結果として生じ得るが、これは、投与経路が断定され得るということは、無視され得ない（Ａｒｒｕｄａら、（２００１）Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ．４：５８６〜５９２）。
【００１３】
大部分でなくとも、多くの現行のＡＡＶ送達法は、患者が侵襲性の手順に供されることを必要とする。一般に、（例えば、体内分布を制限するために）特定の器官または組織にＡＡＶを標的化することを望めば望むほど、標的特性を達成するために必要な手順はより侵襲性となる。例えば、肝臓を特異的に標的化するために、現行の手順は、肝臓に直接ＡＡＶを注射するために腹開術を実施すること、または、肝臓動脈への後のカテーテル投与のために大腿動脈に接近するために脚における外科的切開を最小限でも必要とする脈管内投与に依存している。有効ではあるが、このような手順は、所望されない効果（例えば、顕著な術後の疼痛、回復時間、院内感染の危険など）を有し得る。
【００１４】
従って、患者の血流に対する曝露を回避するＡＡＶビリオンを送達するための非侵襲性の手順または最小の侵襲性の手順を開発し、これによって所望されない体内分布を潜在的に制限すること、および治療効果または所望の応答を誘発するのに必要なｒＡＡＶビリオンの必要用量を削減するということは、当該分野での進歩である。このような方法が本明細書中に開示される。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１５】
（発明の要旨）
本発明に従って、使用するための方法およびベクターは、異種核酸分子（例えば、タンパク質、アンチセンスＲＮＡおよびリボザイムを発現するコード遺伝子）を哺乳動物の分泌腺に、ｒＡＡＶビリオンを使用して効率的に送達するために、使用される。この方法は、ｒＡＡＶビリオンの分泌器官の管への導入、関連する分泌腺細胞の形質導入および遺伝子産物の長期発現のために提供する。
【００１６】
好ましい実施形態において、異種遺伝子は、分泌タンパク質をコードし、これは、ｒＡＡＶビリオンを使用して、分泌腺の細胞に送達される。好ましくは、ｒＡＡＶビリオンは、約１×１０９ウイルスゲノム（ｖｇ）／哺乳動物〜約１×１０１１ｖｇ／哺乳動物の用量で投与される。一旦発現されると、このタンパク質は、細胞から、好ましくは血流に、治療的効果を達成するのに十分なレベルで分泌される。好ましい実施形態において、哺乳動物はヒトである。
【００１７】
本発明の１つの実施形態において、分泌腺は、唾液腺であり、好ましくは顎下腺である。別の実施形態において、分泌腺は、肝臓である。本発明の１つの局面において、ｒＡＡＶビリオンは、肝管に投与される。別の局面において、ｒＡＡＶビリオンは、共通の胆管に送達される。
【００１８】
好ましくは、ｒＡＡＶビリオンは、逆行性管投与により、分泌腺の管に送達される。分泌腺が肝臓である場合、ｒＡＡＶビリオンを送達する好ましい方法は、内視鏡的逆行性胆道膵管造影法によるものである。
【００１９】
血液凝固タンパク質をコードする遺伝子を含むｒＡＡＶビリオンを送達することが本発明の目的であり、そして、この血液凝固タンパク質が、分泌腺細胞で発現された場合、血友病を有する哺乳動物の血液凝固の効率を改善する。好ましくは、哺乳動物はヒトである。本発明の１つの局面において、哺乳動物は、血友病Ａを有する。別の局面において、哺乳動物は、血友病Ｂを有する。好ましくは、ｒＡＡＶビリオンは、逆行性管投与（ｒｅｔｒｏｄｕｃｔａｌ）によって分泌腺に送達される。
【００２０】
血液凝固タンパク質遺伝子は、組織特異的プロモーターによって分泌腺で発現され得る。１つの局面において、組織特異的プロモーターは、肝臓特異的プロモーターであり、好ましくは、ヒトα１−アンチトリプシン（ＨＡＡＴ）プロモーターである。特に好ましい実施形態において、ＨＡＡＴプロモーターは、アポリポタンパク質Ｅ肝臓制御領域に作動可能に連結される。
【００２１】
本発明の１つの実施形態において、血液凝固タンパク質は、第ＩＸ因子（Ｆ．ＩＸ）であり、好ましくは、ヒトＦ．ＩＸ（ｈＦ．ＩＸ）である。別の実施形態において、血液凝固タンパク質は、第ＶＩＩＩ（Ｆ．ＶＩＩＩ）因子、好ましくはヒトＦ．ＶＩＩＩ（ｈＦ．ＶＩＩＩ）である。
【００２２】
（発明の詳細な説明）
本発明は、哺乳動物被験体の分泌腺の細胞に、異種性核酸（ＨＮＡ）を送達するための、組み換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ビリオンの使用に関する。一旦送達されると、このＨＮＡは転写されて、そしてこのＨＮＡが遺伝子を含む場合、次いでその転写産物はタンパク質へと翻訳されて、そしてそのタンパク質は細胞から分泌される。
【００２３】
本発明の関係において、「組み換えＡＡＶビリオン」または「ｒＡＡＶビリオン」は、「組み換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ベクター」を包み込んだＡＡＶタンパク質殻（すなわち、キャプシド）からなる感染性のウイルスであり、このｒＡＡＶベクターは本明細書中で、ＨＮＡおよび１つ以上のＡＡＶ逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）を含む。ＡＡＶベクターは、当該分野で公知の組み換え技術を使用して構築され得、そして機能性ＩＴＲにより隣接される１つ以上のＨＮＡを含み得る。ｒＡＡＶベクターのＩＴＲは、野生型の核酸配列である必要はなく、そして、その配列が適切な機能（すなわち、ＡＡＶゲノムのレスキュー、複製およびパッケージング）を提供する限り、例えばヌクレオチドの挿入、欠失または置換によって変更され得る。
【００２４】
組み換えＡＡＶビリオンは、当該分野で周知の種々の技術を使用して産生され得る。例えば、当業者は、ｗｔ  ＡＡＶおよびヘルパーウイルスを使用して、ｒＡＡＶビリオンを産生するために必要な複製機能を提供し得る（例えば、米国特許第５，１３９，９４１号を参照のこと）。あるいは、周知のヘルパーウイルスのうちの１つによる感染と組み合わせて、ヘルパー機能遺伝子を有するプラスミドを、複製機能の供給源として使用し得る（例えば、米国特許第５，６２２，８５６号；米国特許第５，１３９，９４１号、前出、を参照のこと）。同様に、当業者は、補助機能遺伝子を含むプラスミドを利用して、ｗｔ  ＡＡＶによる感染と組み合わせて、必要な複製機能を提供し得る。当業者に知られるように、これらの３つのアプローチは、ｒＡＡＶベクターと組み合わせて使用される場合、各々、ｒＡＡＶビリオンを産生するのに十分である。当業者で周知である他のアプローチもまた、ｒＡＡＶビリオンを産生するために当業者によって使用され得る。
【００２５】
本発明の好ましい実施形態において、３重トランスフェクション法（米国特許第６，００１，６５０号に詳細に記載される）がｒＡＡＶビリオンを産生するために使用される。なぜなら、この方法は、感染性のヘルパーウイルスの使用を必要とせず、検出可能なヘルパーウイルスが存在しない状態でｒＡＡＶビリオンが産生され得るからである。これは、ｒＡＡＶビリオン産生について、３つのベクターの使用により達成される：ＡＡＶヘルパー機能ベクター、補助機能ベクターおよびｒＡＡＶベクター。しかし、当業者は、これらのベクターによりコードされる核酸配列が、種々の組み合せの２つ以上のベクターから提供され得ることを理解する。本明細書中で使用される場合、用語「ベクター」は、適切な制御エレメントと結合した場合に複製を行い得、そして細胞間で遺伝子配列を輸送し得る、任意の遺伝子エレメント（例えば、プラスミド、ファージ、トランスポゾン、コスミド、染色体、人工染色体、ウイルス、ビリオン、など）を含む。従って、この用語は、クローニングビヒクルおよび発現ビヒクル、ならびにウイルスベクターを含む。
【００２６】
ＡＡＶヘルパー機能ベクターは、「ＡＡＶへルパー機能」配列（すなわち、ｒｅｐおよびｃａｐ）をコードし、これら配列は増殖性のＡＡＶ複製およびキャプシド形成のためにイントランスで機能する。好ましくは、ＡＡＶヘルパー機能ベクターは、検出可能なｗｔ  ＡＡＶビリオン（すなわち、機能性のｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子を含むＡＡＶビリオン）を全く生成せずに、効率的なＡＡＶベクターの産生を支援する。このようなベクターの１例として、ｐＨＬＰ１９が米国特許第６，００１，６５０号、前出、および実施例１、後述、に記載される。ＡＡＶヘルパー機能ベクターのｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子は、任意の既知のＡＡＶ血清型に由来し得る。例えば、ＡＡＶヘルパー機能ベクターは、ＡＡＶ−２由来のｒｅｐ遺伝子およびＡＡＶ−６由来のｃａｐ遺伝子を有し得る；当業者は、他のｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子の組み合わせが可能であり、これの定義する特徴が、ｒＡＡＶビリオンの産生を支援する能力であることを認識する。
【００２７】
補助機能ベクターは、ＡＡＶが複製のために依存する、非ＡＡＶ由来のウイルスおよび／または細胞の機能（すなわち「補助機能」）のためのヌクレオチド配列をコードする。これら補助機能は、ＡＡＶの複製（ＡＡＶ遺伝子の転写の活性化、ステージ特異的なＡＡＶ  ｍＲＮＡのスプライシング、ＡＡＶ  ＤＮＡ複製、ｃａｐ発現生成物の合成、およびＡＡＶキャプシド組立に関するウイルスおよび／または細胞の部分が挙げられるが、それらに限定されない）に必要とされるウイルスおよび／または細胞の機能を含む。ウイルスに基づく補助機能は、アデノウイルス、ヘルペスウイルス（ヘルペス単純ウイルス１型以外）、およびワクシニアウイルスのような、周知のヘルパーウイルスのいずれかに由来し得る。好ましい実施形態において、補助機能プラスミドｐＬａｄｅｎｏ５を使用する（ｐＬａｄｅｎｏ５に関する詳細は、米国特許第６，００４，７９７号に記載される）。このプラスミドは、ＡＡＶベクター産生のためにアデノウイルスの補助機能の完全なセットを提供するが、複製能を有するアデノウイルスを形成するために必要な成分を、欠失している。
【００２８】
「ｒＡＡＶベクター」は、いずれかのＡＡＶ血清型に由来するベクターであり得、その血清型としてはＡＡＶ−１、ＡＡＶ−２、ＡＡＶ−３Ａ、ＡＡＶ−３Ｂ、ＡＡＶ−４、ＡＡＶ−５、ＡＡＶ−６などが挙げられるが、これらに限定されない。ＡＡＶベクターは、全体または部分的に除かれた、１つ以上のｗｔ  ＡＡＶ遺伝子（すなわち、ｒｅｐ遺伝子および／またはｃａｐ遺伝子）を有し得るが、ＡＡＶビリオンのレスキュー、複製およびパッケージングに必要とされる、少なくとも１つの機能性隣接ＩＴＲ配列を保持する。従って、ＡＡＶベクターは、本明細書中で、ウイルスの複製およびパッケージングにシス性（ｃｉｓ）で必要とされる、少なくともそれらの配列（例えば、機能性ＩＴＲ）を含むことが定義される。このＩＴＲは野生型のヌクレオチド配列である必要がなく、そして、その配列が機能性のレスキュー、複製およびパッケージングを提供する限り、例えばヌクレオチドの挿入、欠失または置換によって変更され得る。ＡＡＶベクターは、機能性のＡＡＶ  ＩＴＲに隣接する１つ以上のＨＮＡを含むよう、当該分野で公知の組み換え技術を使用して構築され得、そのＨＮＡの組み込みが「ｒＡＡＶベクター」を定義する。
【００２９】
ＨＮＡ、すなわち「異種性核酸」は、天然ではそうでなければ一緒に見出されない、一緒に繋がれた核酸配列を含み、この概念が用語「異種性の（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ）」を定義する。この点を例示すると、ＨＮＡの一例は、天然ではその遺伝子と結び付いては見出されない核酸配列に隣接した遺伝子である。ＨＮＡの別の例は、それ自体が天然では見出されない遺伝子（例えば、天然の遺伝子とは異なったコドンを有する合成配列）である。対立遺伝子の多様性または天然に存在する変異誘発事象は、本明細書で使用されるようなＨＮＡを引き起こさない。ＨＮＡは、アンチセンスＲＮＡ分子、リボザイム、またはポリペプチドをコードする遺伝子を含み得る。
【００３０】
ＨＮＡは異種性のプロモーター（恒常的、細胞特異的、または誘導性）と作動可能に連結されて、適切なまたは所望の条件下で患者の標的細胞中で転写され得る。「作動可能に連結される」によって、エレメントの配置が意味され、ここで、そのように記載される成分が、通常機能を実施するように構成される。従って、コード配列と作動可能に連結された制御配列は、コード配列の転写に影響し得る。この制御配列は、コード配列の転写を指示する機能を有する限り、コード配列に近接である必要はない。従って、例えば、介在性の翻訳されないが転写される配列が、プロモーター配列とコード配列との間に存在し得、そしてそのプロモーター配列は依然としてコード配列と「作動可能に連結される」とみなされ得る。
【００３１】
恒常的、細胞特異的、および誘導性のプロモーターの多くの例は当該分野で公知であり、そして当業者は、特定の意図される使用のためのプロモーターを容易に選択し得る（例えば、肝細胞特異的な発現のための、肝臓特異的なヒトα１−アンチトリプシンプロモーターの選択、もしくは唾液腺特異的な発現のための、唾液腺特異的な唾液α−アミラーゼプロモーターの選択、強力なレベルの継続的な、もしくはほぼ継続的な発現のための、恒常的なＣＭＶプロモーターの選択、または誘導性の発現のための、誘導性のエクダイソンプロモーターの選択）。誘導性の発現により、当業者は合成されるタンパク質量を制御し得る。この様式で、治療的生産物の濃度を変動させ得る。誘導性プロモーターの周知の他の例は：ステロイドレセプター（例えば、エストロゲンプロモーターおよびアンドロゲンプロモーター）ならびにメタロチオネインプロモーターがある。
【００３２】
異種性核酸の発現は、「エンハンサーエレメント」によって「増強」され得る。「エンハンサーエレメント」によって、転写因子により結合された場合、プロモーター単独からの発現と相対的に遺伝子発現を増加するＤＮＡ配列（すなわち、シス作用エレメント）を意味する。当該分野で公知な多くのエンハンサーが存在して、そして当業者は特性の目的のためのエンハンサーを容易に選択し得る。肝臓において遺伝子発現を増加させるために有用なエンハンサーエレメントの１例は、アポリポタンパク質Ｅの肝臓の制御領域である（Ｓｃｈａｃｈｔｅｒら、（１９９３）Ｊ  Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓ  ３４：１６９９−１７０７、および以下の実施例１に記載される））。
【００３３】
本発明は、１つ以上のアンチセンスＲＮＡ分子をコードするＨＮＡを含むｒＡＡＶビリオンを包含する。癌のアンチセンス治療またはウイルス疾患の処置における、本発明による使用に適したアンチセンスＲＮＡ分子は、当該分野で掲載されている。例えば、Ｈａｎら、（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：４３１３−４３１７；Ｕｈｌｍａｎｎら、（１９９０）Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．９０：５４３−５８４：Ｈｅｌｅｎｅら、（１９９０）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．１０４９：９９−１２５；Ａｇａｒａｗａら、（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：７０７９−７０８３；およびＨｅｉｋｋｉｌａら、（１９８７）Ｎａｔｕｒｅ３２８：４４５−４４９を参照のこと。本発明はまた、本明細書中に開示される方法を使用する、リボザイムの送達を包含する。適切なリボザイムの考察に関しては、Ｃｅｃｈら、（１９９２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：１７４７９−１７４８２および米国特許第５，２２５，３４７号を参照のこと。
【００３４】
好ましい実施形態において、１つ以上のポリペプチドをコードするＨＮＡを含むｒＡＡＶビリオンは、分泌腺の１つ以上の細胞に送達される。従って、本発明は、哺乳動物の被験体における疾患状態の処置に有用な、１つ以上のペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質をコードするＨＮＡの送達に関する。このようなＤＮＡと関連の疾患状態としては：グルコース−６−脱リン酸酵素をコードするＤＮＡと、グリコーゲン貯蔵欠損１Ａ型との関連；ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼをコードするＤＮＡと、Ｐｅｐｃｋ欠損との関連：ガラクトース‐１リン酸ウリジルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡと、ガラクトース血症との関連；フェニルアラニンデヒドロゲナーゼをコードするＤＮＡと、フェニルケトン尿症との関連；分枝鎖α‐ケトン酸デヒドロゲナーゼをコードするＤＮＡと、カエデシロップ尿病との関連；フマリルアセト酢酸ヒドラーゼをコードするＤＮＡと、チロシン血症１型との関連；メチルマロニルＣｏＡムターゼをコードするＤＮＡと、メチルマロン酸血症との関連；中位鎖アシルＣｏＡデヒドロゲナーゼをコードするＤＮＡと、中位鎖アセチルＣｏＡ欠損との関連；オルニチントランスカルバモイラーゼ（ｔｒａｎｓｃａｒｂａｍｙｌａｓｅ）をコードするＤＮＡと、オルニチントランスカルバモイラーゼ（ｔｒａｎｓｃａｒｂａｍｙｌａｓｅ）欠損との関連；アルギニノコハク酸合成酵素をコードするＤＮＡと、シトルリン血症との関連；低密度リポタンパク質レセプタータンパク質をコードするＤＮＡと、家族性高コレステロール血症との関連；ＵＤＰ−グルクロノシルトランスフェラーゼ（ＵＤＰ−ｇｌｕｃｏｕｒｏｎｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）をコードするＤＮＡと、クリグラー−ナジャー症との関連；アデノシンデアミナーゼをコードするＤＮＡと、重篤な複合型免疫欠損症；ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡと、痛風およびレッシュ‐ナイハン症候群との関連；ビオチニダーゼをコードするＤＮＡと、ビオチニダーゼ欠損との関連；βーグルコセレブロシダーゼをコードするＤＮＡと、ゴシェ病との関連；β−グルクロニダーゼをコードするＤＮＡと、スライ症候群との関連；ペルオキシソーム膜タンパク質７０ｋＤａをコードするＤＮＡと、ツェルヴェーガー症候群との関連；ポルホビリノーゲンデアミナーゼをコードするＤＮＡと、急性間欠性ポルフィリン症との関連；アンチトリプシン欠損症（気腫）の処置のための、α１−アンチトリプシンをコードするＤＮＡ；および種々の癌の処置のためのｐ５３のような腫瘍抑制遺伝子をコードするＤＮＡ。
【００３５】
特に好ましい実施形態において、ｒＡＡＶビリオンを使用して、「分泌性タンパク質」をコードするＨＮＡを送達する。「分泌性タンパク質」によって、それらが合成された細胞から外部に分泌されるタンパク質またはポリペプチドを意味する。分泌性タンパク質は任意の細胞に取り込まれ得（すなわち、内部に局在することになり得る）、その細胞としては、それらタンパク質が合成された細胞から最初に外部に分泌される限り、それらが合成された細胞を含む。あるいは、分泌タンパク質は、細胞外の区画（例えば、細胞外マトリクス、間質液、皮膚の表面、組織もしくは血管の管腔、または細胞内でないかもしくは細胞と物理的に連絡される他のあらゆる位置）に局在され得る。「血管」によって、血液を運搬する、体内のあらゆる管を意味し、動脈、静脈、細静脈および毛管が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３６】
分泌性タンパク質は、天然に存在することが知られるものに限定されずに、シグナル配列を含むことにより分泌される能力を獲得する、天然では通常は分泌されないタンパク質も含む。周知の分子生物学的技術を使用して、当業者は、遺伝子を含むプラスミドまたはベクター内の適切な位置に（通常は遺伝子の開始コドンの５’に）シグナル配列を挿入し得、翻訳の際、その遺伝子にコードされるタンパク質は、それが合成された細胞から分泌され得る。いくつかのシグナル配列が種々のタンパク質について知られており、そのシグナル配列の全てが１つまたは２つのポジティブに荷電したアミノ酸と、続いて一般的に６〜１２個の疎水性残基を含む（例えば、Ｌｅａｄｅｒ，Ｄ．Ｐ．（１９７９）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．４：２０５；Ｒａｐｏｐｏｒｔ，Ｔ．Ａ．（１９８５）Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｅｍｂｒ．Ｔｒａｎｓｐｏｒｔ  ２４；１−６３を参照のこと）。
【００３７】
シグナル配列は、新生ポリペプチド（すなわち、タンパク質）を小胞体の膜にそれ自身を挿入させて、そして次いでそのシグナルペプチドが切断されるＥＲの内腔に移送させ得る。一旦シグナルペプチドがＥＲ内腔で切断されると、そのポリペプチドは分泌経路を経て処理されて、細胞からのペプチドの分泌を生じる（徹底的な考察については、Ｂｌｏｂｅｌ，Ｇ．（１９９５）Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂ  Ｓｙｍｐ  Ｑｕａｎｔ  Ｂｉｏｌ．６０：１−１０を参照のこと）。
【００３８】
本発明は、分泌性タンパク質をコードするＤＮＡを含み、これらタンパク質としては、サラセミアまたは腎不全に起因する貧血の処置のためのエリスロポエチン；血管内皮細胞増殖因子をコードするＤＮＡ；アンジオポイエチン−１をコードするＤＮＡ、および虚血性疾患の処置のための上皮細胞増殖因子をコードするＤＮＡ；例えば、アテローム性動脈硬化症、血栓症または塞栓症において見られる血管閉塞の治療のための組織因子経路インヒビターをコードするＤＮＡ；ならびに炎症および免疫障害、ならびに癌の処置のための種々のインターロイキンのうちの１つのような、サイトカインをコードするＤＮＡ、が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３９】
より好ましくは、本発明は、血液凝固タンパク質をコードするＨＮＡを含むｒＡＡＶビリオンに関し、本発明の方法を使用して、これらのタンパク質を、血友病の処置のために血友病を有する哺乳動物の細胞に送達し得る。従って、本発明は以下を包含する：血友病Ｂの処置のための、哺乳動物への第ＩＸ因子遺伝子の送達、血友病Ａの処置のための、哺乳動物への第ＶＩＩＩ因子遺伝子の送達、第ＶＩＩ因子欠損、第ＶＩＩＩ因子欠損、第ＩＸ因子欠損もしくは第ＸＩ因子欠損、またはグランツマン血小板無力症の処置のための第ＶＩＩ因子遺伝子の送達、第Ｘ因子欠損の処置のための第Ｘ因子の送達、第ＸＩ因子欠損の処置のための第ＸＩ因子遺伝子の送達、第ＸＩＩＩ因子欠損の処置のための第ＸＩＩＩ因子遺伝子の送達、ならびに、タンパク質Ｃ欠損の処置のためのタンパク質Ｃ遺伝子の送達。哺乳動物細胞への上に列挙した各遺伝子の送達は、その遺伝子を含むｒＡＡＶビリオンを先ず最初に生成する工程、次いで哺乳動物にそのｒＡＡＶビリオンを投与する工程によって達成される。従って、本発明は、第ＩＸ因子、第ＶＩＩＩ因子、第Ｘ因子、第ＶＩＩ因子、第ＸＩ因子、第ＸＩＩＩ因子またはタンパク質Ｃのいずれか１つをコードする遺伝子を含むｒＡＡＶビリオンを包含する。組み換えＡＡＶベクター中の取り込みに適したヒト第ＶＩＩＩ因子の構築物を生成する方法は、米国特許第６，２００，５６０号および同第６，２２１，３４９号に記載される。
【００４０】
組み換えＡＡＶビリオンを使用して、腺の輸送管系を介して分泌腺にＨＮＡを送達する。本明細書中で使用される場合、「分泌腺」は、成体の細胞外空間中に物質（それら物質の代謝の必要性には通常は関係なしない）を分泌することに特化した器官および／または組織を含む。分泌腺の例としては、肝臓、膵臓、乳腺、汗腺、唾液腺、腎臓、下垂体、甲状腺、胃、および当該分野で周知の他の腺が挙げられるが、それらに限定されない。分泌腺は、内分泌性もしくは外分泌性、またはその両方であり得る。内分泌腺は一般的に、体内に（例えば、血流中への分泌された物質の能動的な分散を可能とする間質液中に（すなわち、内分泌性方向で））物質を分泌し、一方で外分泌腺は一般的に、それらの物質を生体外に分泌する（例えば、組織の内腔中に、または皮膚の表皮上に（すなわち、外分泌方向で））。外分泌されるタンパク質の血流へのある程度の輸送が存在するので、これらの方向性は絶対的ではない。例えば、主に膵管に分泌される膵臓の消化酵素はまた、血流中にも見出される。外分泌腺と内分泌腺との間の根本的な解剖学上の区別は、管の存在または不在である。外分泌腺は管を含むが、一方で内分泌腺は含まない。内分泌腺の例としては、下垂体、甲状腺および副腎が挙げられるが、それらに限定されない。外分泌腺の例としては、汗腺、唾液腺および胃が挙げられる。内分泌機能および外分泌機能の両方を有する腺の例としては、肝臓、膵臓および腎臓が挙げられる。
【００４１】
分泌腺の例示的な例としては、唾液腺および肝臓が挙げられる。ヒトにおいては、６つの唾液腺が存在する：２つの耳下腺、２つの顎下腺および２つの舌下腺（各々の一方は顎の各側に位置する）。各々の唾液腺は、管（１つまたは複数）により口腔と連絡され、耳下腺は耳下管を介して口内にその内容物を分泌し、顎下腺は顎下管を介して口腔内にその内容物を分泌し、そして舌下腺はいくつかの小管を介して舌下腺管内または口腔内にその内容物を分泌する。
【００４２】
肝臓は、非常に多くの胆管を含み、この胆管は、小管（すなわち、細胞間胆汁通路または毛細胆管）と連絡する肝細胞内のごく小さな経路から形成される。これらの通路は、連続する２つの細胞表面の間に、または、３つ以上の肝細胞が接触し、それらが毛細血管から少なくとも肝細胞の半分の幅だけ離れている隅に残された小さなチャネルまたは空間である。このチャネルは、肝小葉の周縁にまで広がり、そして、小葉間胆管に通じ、ここで、これら小葉間胆管は、門脈および肝臓の動脈を伴うグリソン鞘内を走る。これら小葉間胆管は、合流して、横裂で肝臓を離れる２つの主要な幹を形成し、これらが一緒になることによって胆管を形成する。胆管は、右下方に約４ｃｍ小網の層の間を通り、ここで、胆管は、胆嚢管と鋭角で合流し、そして、同じように総胆管を形成する。
【００４３】
一般的に、肝臓の分泌器は、（１）肝管；（２）胆汁の貯蔵所として働く、胆嚢；（３）胆嚢管（すなわち、胆嚢の管路）；および（４）肝管と胆嚢管との合流によって形成される、総胆管、からなる。
【００４４】
本発明は、逆方向の管投与を介してｒＡＡＶビリオンを分泌腺に導入することを含む。「逆方向の管投与」は、本明細書中で、管路内での物質の通常の流れと反対の方向で、ｒＡＡＶビリオンを投与することとして定義される。ｒＡＡＶビリオンの導入は、ｒＡＡＶビリオンが、ｒＡＡＶビリオンが管路内での物質の通常の流れと反対の方向で運ばれるような方法で投与される限り、管路の外側開口部へのまたは管壁を通した投与を介し得る。逆方向の管投与は、単一の、不連続投与（例えば、単回注射）、または連続投与（例えば、灌流）を含み得る。
【００４５】
本発明は、当該技術分野で認識される非侵襲性手順の使用によって、ｒＡＡＶビリオンを、分泌腺の分泌細胞に送達することを可能にする。例えば、当業者は、内視鏡的逆行性胆道膵管造影（ＥＲＣＰ）を使用して、哺乳動物被験体の総肝管へｒＡＡＶビリオンを送達し得る。この技術では、内視鏡を食道に挿入し、胃腸管を通って総胆管に指向し、そして総胆管を通って肝管まで進める。次いで、肝管にカニューレを挿入し、そして、物質を、逆方向の管投与を介して肝臓に導入し得る。所望の場合、膵管および胆嚢管を、例えば、バルーン閉塞によって閉塞し、膵臓または胆嚢への物質の導入を防止し得る。唾液腺に物質を導入する場合、管路に、口の中のその開口部を通してカニューレを挿入し、物質を、逆方向の管投与を介して唾液腺に導入し得る。
【００４６】
特定の治療効果を達成するために、分泌腺の分泌細胞への送達に必要とされるｒＡＡＶビリオンの用量（例えば、ウイルスゲノム（ｖｇ）／哺乳動物１匹あたりまたはｖｇ／体重１ｋｇ（ｖｇ／ｋｇ）での単位用量）は、以下を含むいくつかの因子に基づいて変化する：治療効果を達成するために必要とされるＨＮＡ発現のレベル、治療されるべき特定の疾患または障害、ｒＡＡＶビリオンへの潜在的な宿主の免疫応答、遺伝子産物への宿主の免疫応答、および遺伝子産物の安定性。用量に関して、用語「ウイルスゲノム」は、「ビリオン」と同義語であり、それは、ウイルスゲノムが、ｒＡＡＶベクター（哺乳動物に送達され、そして哺乳動物内で転写されるＨＮＡを含む）を含み、このｒＡＡＶベクターは、ｒＡＡＶビリオンに封入されるからである。用量のことを言う場合、ウイルスゲノムは、好ましい用語である。それは、用量に関する定量的な測定では、そのエンドポイント（ｅｎｄｐｏｉｎｔ）として、ウイルスゲノムが検出されるからである。ドットブロットハイブリダイゼーション法（米国特許第６，３３５，０１１号に記載される）および定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ＱＰＣＲ）法（Ｒｅａｌ  Ｔｉｍｅ  Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ＰＣＲ．Ｈｅｉｄ  Ｃ．Ａ．，Ｓｔｅｖｅｎｓ  Ｊ．，Ｌｉｖａｋ  Ｋ．Ｊ．，ａｎｄ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  Ｐ．Ｍ．１９９６．Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ６：９８６−９９４．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓに記載される）を含むがこれらに限定されない、いくつかのそのような定量的な測定法が当該分野で周知である。当業者は、特定の疾患または障害を有する患者を処置するために、前記の因子および当該分野で周知の他の因子に基づいて、ｒＡＡＶビリオン用量範囲を迅速に決定し得る。
【００４７】
概して言えば、「治療効果」によって、患者の疾患または障害が臨床的好転を示すような、望ましい成果または臨床的エンドポイントに向けて疾患（または障害）の構成要素を変更するのに十分な、１つ以上のＨＮＡの発現レベル（「治療的有効レベル」）が意味され、しばしばこれら疾患または障害に関連する臨床的徴候または症状の改善によって反映される。特定の疾患の例として、血友病を使用する場合、血友病についての治療効果は、本明細書中で、血友病に罹患する哺乳動物の血液凝固効率の増加として規定され、例えば、周知のエンドポイントまたは全血凝固時間もしくはプロトロンボプラスチン活性化時間を測定するために使用するアッセイのような技術によって、効率が決定される。全血凝固時間またはプロトロンボプラスチン活性化時間のいずれかの減少によって、血液凝固効率の増加が示される。血友病の重篤な場合において、第ＶＩＩＩ因子または第ＩＸ因子が通常レベルの１％未満である血友病患者は、非血友病患者についての約１０分と比べて、６０分を超える全血凝固時間を有する。第ＶＩＩＩ因子または第ＩＸ因子の１％以上の発現によって、血友病の動物モデルでの全血凝固時間が減少することが示され、従って、１％を超える循環第ＶＩＩＩ因子血漿濃度または循環第ＩＸ因子血漿濃度を達成することは、治療的とみなされる。
【００４８】
本発明の方法を使用することによって、ｒＡＡＶビリオンは、ヒト第ＩＸ因子（ｈＦ．ＩＸ）の循環血漿レベルによって測定されるように、マウス分泌性腺細胞の形質導入での高いレベルの効率を示した。図１に示すように、ｈＦ．ＩＸの長期発現は、Ｃ５７ＢＩ／６ナイーブマウスの顎下腺管へのｒＡＡＶ−ｈＦ．ＩＸの単回注射後に、達成された。これは、３つの用量レベル全てに当てはまった。形質導入３週間後、血清ｈＦ．ＩＸレベルは、低い用量では０．５ｍｇ／ｍＬで、中程度の用量では７．３ｍｇ／ｍＬで、そして高い用量では２５ｍｇ／ｍＬであった。５０ｎｇ／ｍＬの血清ｈＦ．ＩＸは、ヒトに対する治療的レベルとして、一般的に認識されており、これは、約１％の血清Ｆ．ＩＸ濃度に対応する。形質導入９週間後、血清ｈＦ．ＩＸレベルは、低い用量では２ｎｇ／ｍＬで、中程度の用量では１１ｎｇ／ｍＬで、そして高い用量では８９ｎｇ／ｍＬであった。表１は、血清ｈＦ．ＩＸのデータを要約する。
【００４９】
図２は、Ｃ５７ＢＩ／６ナイーブマウスの肝管へのｒＡＡＶ−ｈＦ．ＩＸビリオンの逆方向の投与の結果を示す。３つの用量全ては、循環ｈＦ．ＩＸレベルの持続を生じ；驚くべきことに、高い容量での発現レベルは、形質導入５週間後、超生理学的レベル（５，９８５ｎｇ／ｍＬ）に到達した。形質導入１週間後、循環ｈＦ．ＩＸレベルは、低い用量では１３ｎｇ／ｍＬで、中程度の用量では１３６ｎｇ／ｍＬで、そして高い用量では１，５５７ｎｇ／ｍＬに到達した。レベルは、形質導入３週間後、低い用量では３４ｎｇ／ｍＬ、中程度の用量では２７６ｎｇ／ｍＬ、そして高い用量では１，７１０ｎｇ／ｍＬまで増加した。形質導入９週間後、低い用量は４９ｎｇ／ｍＬを、中程度の用量は４２６ｎｇ／ｍＬを、そして高い用量は８，３６５ｎｇ／ｍＬを生じた（表１を参照のこと）。
【００５０】
図３で見られ得るように、低い用量群および中程度の用量群において、ｒＡＡＶ２−ｈＦ．ＩＸの逆方向の管投与によって、門脈投与によって達成される血清ｈＦ．ＩＸレベルとほぼ等しい血清ｈＦ．ＩＸレベルが生じた。低い用量群において、逆方向の管投与は、実際に、門脈投与より効率的であった。低い用量の逆方向の管送達によって、形質導入１週間後に、１３ｎｇ／ｍＬの血清ｈＦ．ＩＸレベルを生じた。形質導入３週間後、血清ｈＦ．ＩＸレベルは、３４ｎｇ／ｍＬにまで増加し、形質導入９週間後、血清ｈＦ．ＩＸレベルは、４９ｎｇ／ｍＬにまで増加した。門脈投与に関して、低い用量群は、６ｎｇ／ｍＬの血清ｈＦ．ＩＸレベルを生じ、これは、３週間後８ｎｇ／ｍＬまで増加し、そして形質導入９週間後１２ｎｇ／ｍＬに達した（表１を参照のこと）。
【００５１】
中程度の用量によって、両方の送達方法について類似する結果を生じた。高い用量でのみ、門脈送達法は、逆方向の管送達法によって生じた血清ｈＦ．ＩＸ濃度より実質的に高い濃度を達成した。マウスに、当該分野で周知の方法を使用して、筋内注射した（例えば、米国特許第５，８５８，３５１号に詳細に記載される）。
【００５２】
顎下腺または肝臓への逆方向の管送達と比較した場合、ｒＡＡＶ−ｈＦ．ＩＸでのマウスの筋内（ｉ．ｍ．）注射によって、ｈＦ．ＩＸの循環力価を生じるのに、より効率が低いことが示された（表１を参照のこと）。高い用量では、ｒＡＡＶ−ｈＦ．ＩＸの筋内注射は、顎下腺管への逆方向の注射によって生じる循環ｈＦ．ＩＸの２０％しか生じなかった。この差異は、肝臓の場合においてより大いに劇的であった。これは、筋内注射が、胆管への逆方向の注射によって生じる循環ｈＦ．ＩＸレベルの０．２％しか生じなかったからである。
【００５３】
【表１】
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ＨＮＡの生理学的機能または生化学的機能を解明するために、宿主細胞にＨＮＡを送達することが、しばしば望ましい。このＨＮＡは、内因性遺伝子または異種遺伝子のいずれかであり得る。本発明の方法を使用して、当業者は、未知の機能の１つ以上のＨＮＡを含むｒＡＡＶビリオンを、実験動物に投与し得、ＨＮＡを発現し得、そして引き続く任意の機能的変化を観察し得る。そのような変化としては：タンパク質−タンパク質相互作用、生化学的経路の改変、細胞、組織、器官、もしくは器官系の生理学的機能の改変、および／または遺伝子発現の刺激化もしくはサイレンシングが挙げられ得る。
【００５４】
あるいは、当業者は、既知の機能の遺伝子を過剰発現し、そして、その効果を試験し得る。そのような遺伝子は、実験動物に対して内因性であるか天然において異種である（すなわち、導入遺伝子）かのいずれかであり得る。
【００５５】
本発明の方法を使用することによって、当業者はまた、遺伝子発現を破壊または有意に減少し得、それにより、遺伝子機能を決定するための別の方法を使用する。これを達成する１つの方法は、アンチセンスＲＮＡ含有ｒＡＡＶビリオンを実験動物に投与する工程、アンチセンスＲＮＡ分子を発現し、その結果、標的化された内因性遺伝子を「ノックアウト」する工程、次いで、引き続く任意の生理学的変化または生化学的変化を観察する工程による。
【００５６】
本発明の方法は、トランスジェニックマウスおよびノックアウトマウスのような他の周知の技術と適合性であり、これらの技術を補うために使用され得る。当業者は、本発明の方法と既知の技術との組合せを迅速に決定し、遺伝子機能の有用な情報を獲得し得る。
【００５７】
一旦送達されると、多くの例では、単にＨＮＡを発現することは、十分ではない；代わりに、ＨＮＡ発現のレベルを変化することが、しばしば望ましい。ＨＮＡ発現レベルを変化することは、ＨＮＡ発現産物の用量を変化し、ＨＮＡの機能的情報を獲得し、そして／または精密にすることにおいて、しばしば有用である。この変化は、例えば、異種の誘導性プロモーターを、ＨＮＡを含むｒＡＡＶビリオンに組込むことによって達成され得、その結果、プロモーターが誘導された場合のみ、ＨＮＡが発現される。いくつかの誘導性プロモーターはまた、ＨＮＡ発現レベルを精密化する能力を提供し得；すなわち、誘導物質濃度の変化によって、ＨＮＡ発現産物の濃度を微調整する。これは、「オン−オフ」系（すなわち、任意量の誘導物質によって、「全または無」応答と同レベルのＨＮＡ発現産物レベルが提供される）を有することよりも時々より有用である。エクジソンプロモーター、ステロイドプロモーター（例えば、エストロゲンプロモーターおよびアンドロゲンプロモーター）およびメタロチオネインプロモーターを含む、誘導性プロモーターの多数の例が、当該分野で公知である。
【００５８】
本発明の方法は、薬物動態学的研究または毒物動態学的研究を容易にするために使用され得る。例えば、ＡＡＶが高効率で肝細胞を形質導入することが公知であるので、ヒト代謝酵素（例えば、種々のオキシダーゼおよびレダクターゼ（例えば、シトクロムｐ４５０アイソザイム）、種々のエポキシドヒドロラーゼ、種々のデヒドロゲナーゼ（例えば、アルコールデヒドロゲナーゼおよびアルデヒドデヒドロゲナーゼ）、種々のペプチダーゼなど−肝細胞で発現され機能する代謝酵素）は、ｒＡＡＶビリオンを介してマウスの肝臓に送達され得、発現され得、次いで、種々の薬物および／または毒物が、任意の目的の代謝物質をスクリーニングするために、この形質導入マウスに投与し得る。
【００５９】
以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態をより十分に例示するために示される。しかし、これらの実施例は、本発明の広い範囲を限定するものとしては決して解釈されるべきではなく、本発明は、添付された特許請求の範囲によってのみ限定される。
【００６０】
（実施例１：組換えＡＡＶ第ＩＸ因子ビリオンの調製）
ヒト第ＩＸ因子（ｈＦ．ＩＸ）遺伝子−ＧｅｎＢａｎｋ登録番号１８２６１２の下で入手可能なｈＦ．ＩＸについての完全ｃＤＮＡ配列を含む組換えＡＡＶビリオンを、米国特許第６，００１，６５０号（前出）に記載される三重トランスフェクション手順を使用して調製した。
【００６１】
（ベクターの構築）
（ＡＡＶ  ｐＨＬＰ１９ヘルパー機能ベクターの構築）
ＡＡＶ  ｐＨＬＰ１９ヘルパー機能ベクターを、標準的な分子生物学的技術を使用して構築した；その構築は、米国特許第６，００１，６５０号（前出）に詳細に記載される。
【００６２】
まとめると、ＡＡＶ  ｐＨＬＰ１９ヘルパー機能ベクターを、ＡＡＶ−２プロウイルスに由来するＡＡＶ−２配列、ｐＳＭ６２０、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｋ０１６２４およびＫ０１６２５を使用して、いくつかの工程において構築した。最初に、ＩＴＲを、ｒｅｐ配列およびｃａｐ配列から除去した。プラスミドｐＳＭ６２０を、ＳｍａＩおよびＰｖｕＩＩで消化し、４５４３ｂｐのｒｅｐおよびｃａｐをコードするＳｍａＩフラグメントを、ｐＵＣ１９のＳｍａＩ部位にクローニングして、７７０５−ｂｐプラスミドであるｐＵＣｒｅｐｃａｐを生成した。次いで、ｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子に隣接する残りのＩＴＲ配列を、以下のオリゴヌクレオチド１４５Ａ：
【００６３】
【化１】
2004532822.tif 000003
および１４５Ｂ：
【００６４】
【化２】
2004532822.tif 000004
を使用して、オリゴヌクレオチド指向性変異誘発により欠失させた。得られたプラスミドであるｐＵＣＲｅｐＣａｐＭｕｔａｔｅｄ（ｐＵＣＲＣＭ）（７５５９ｂｐ）は、ＡＡＶ−２ゲノム全体（ＡＡＶ−２ゲノム、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＣ＿００１４０１）を含むが、いかなるＩＴＲ配列（４３８９ｂｐ）も含まない。ＳｒｆＩ部位（一部、変異誘発性オリゴヌクレオチドにより導入された）は、この構築物において、ｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子に隣接する。ＡＡＶ配列は、ＡＡＶ−２の１４６〜４，５３４位に対応する。
【００６５】
第２に、Ｅｃｏ４７ＩＩＩ制限酵素部位を、ｐ５の３’境界に導入した。ｐ５プロモーター配列の切り出しを容易にするために、ｐ５プロモーターの３’末端に、このＥｃｏ４７ＩＩＩ部位を導入した。これを行うために、ｐＵＣＲＣＭを、プライマーｐ５４７
【００６６】
【化３】
2004532822.tif 000005
を用いて変異誘発した。得られた７５５９ｂｐのプラスミドを、ｐＵＣＲＣＭ４７ＩＩＩと称した。
【００６７】
第３に、アセンブリプラスミド（ｐＢｌｕｎｔｓｃｒｉｐｔと称する）を構築した。ｐＢＳＩＩ  ＳＫ＋のポリリンカーを、ＢｓｓＨＩＩを使用してｐＢＳＩＩ  ＳＫ＋の切り出しにより変更し、オリゴヌクレオチド平滑１および２と置換した。得られたプラスミドであるｐＢｌｕｎｔｓｃｒｉｐｔは、２８３０ｂｐ長であり、新たなポリリンカーは、制限部位ＥｃｏＲＶ、ＨｐａＩ、ＳｒｆＩ、ＰｍｅＩ、およびＥｃｏ４７ＩＩＩをコードする。平滑１配列は、
【００６８】
【化４】
2004532822.tif 000006
であり、平滑２配列は、
【００６９】
【化５】
2004532822.tif 000007
である。
【００７０】
第４に、ｐＵＣＲＣＭ由来の４３９７ｂｐのｒｅｐおよびｃａｐをコードするＳｍａＩフラグメントを、ｐＢｌｕｎｔｓｃｒｉｐｔのＳｒｆＩ部位に連結することにより、ＨｐａＩ部位がｒｅｐ遺伝子に近位にあるように、プラスミドｐＨ１を構築した。プラスミドｐＨ１は、７２２８ｂｐ長である。
【００７１】
第５に、プラスミドｐＨ２を構築した。プラスミドｐＨ２は、ｐＨ１のｐ５プロモーターがｐＧＮ１９０９（ＡＴＣＣ登録番号６９８７１。プラスミドｐＧＮ１９０９構築物は、米国特許第５，６２２，８５６号に詳細に記載されている）の５’非翻訳領域により置換されていることを除いて、ｐＨ１と同一である。このことを成し遂げるために、ｐＷ１９０９１ａｃＺ（米国特許第５，６２２，８５６号（前出）に詳細に記載されている）由来の５’非翻訳領域をコードする３２９ｂｐのＡｓｃＩ（平滑）−ＳｆｉＩフラグメントを、ｐＨ１の６８３１ｂｐのＳｍａＩ（部分的）−ＳｆｉＩフラグメントに連結して、ｐＨ２を作成した。プラスミドｐＨ２は、７１５５ｂｐ長である。
【００７２】
第６に、ｐＨ８を構築した。１７２ｂｐのｐＵＣＲＣＭ４７ＩＩＩ由来のｐ５プロモーターをコードするＳｍａＩ−Ｅｃｏ４７ＩＩＩフラグメントを、ｐＨ２におけるＥｃｏ４７ＩＩＩ部位へ挿入することにより、ｐ５プロモーターをｐＨ２の３’末端に付加した。このフラグメントを、３つのＡＡＶプロモーターの全ての転写の方向が同じであるように、配向した。この構築物は、７３２７ｂｐ長である。
【００７３】
第７に、ＡＡＶヘルパー機能ベクターｐＨＬＰ１９を構築した。３’側のｐ５のＴＡＴＡボックス（ＡＡＶ−２  ２５５−２６１位、配列ＴＡＴＴＴＡＡ）を、変異誘発性オリゴヌクレオチド５ＤＩＶＥ２
【００７４】
【化６】
2004532822.tif 000008
を使用して、この配列をＧＧＧＧＧＧＧに変更することにより排除した。得られた構築物ｐＨＬＰｌ９は、７３２７ｂｐ長である。
【００７５】
（ｐＬａｄｅｎｏ５アクセサリ機能ベクター）
アクセサリ機能ベクターｐＬａｄｅｎｏ５を、以下のように構築した：精製アデノウイルス血清型２  ＤＮＡ（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬから入手した）から単離したＥ２ａ、Ｅ４、およびＶＡのＲＮＡ領域をコードするＤＮＡフラグメントを、ｐＡｍｐｓｃｒｉｐｔと称されるプラスミドに連結した。ｐＡｍｐｓｃｒｉｐｔプラスミドを、以下のようにアセンブリした：オリゴヌクレオチド指向性変異誘発を使用して、６２３ｂｐ領域（ｐＢＳＩＩ  ｓ／ｋ＋（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅから入手した）に由来するポリリンカーおよびα補完発現カセットを含む）を排除し、ＥｃｏＲＶ部位で置換した。オリゴヌクレオチド指向性変異誘発の際に使用した変異誘発性オリゴの配列は、以下：
【００７６】
【化７】
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であった。ポリリンカー（以下の制限部位：ＢａｍＨＩ；ＫｐｎＩ；ＳｒｆＩ；ＸｂａＩ；ＣｌａＩ；Ｂｓｔｌ１０７Ｉ；ＳａｌＩ；ＰｍｅＩ；およびＮｄｅＩを含む）を合成し、リンカーのＢａｍＨＩ側が、ｐＡｍｐｓｃｒｉｐｔプラスミドを提供するために、改変したプラスミドにおけるｆ１起点に近位にあるように、上記のように作製したＥｃｏＲＶ部位に挿入した。ポリリンカーの配列は、以下：
【００７７】
【化８】
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であった。
【００７８】
アデノウイルス血清型２のＥ２ａおよびＶＡのＲＮＡ配列を含むＤＮＡフラグメントを、ｐＡｍｐｓｃｒｉｐｔに直接クローニングした。特に、Ｅ２ａ領域を含む５９６２−ｂｐのＳｒｆＩ−ＫｐｎＩ（部分的）フラグメントを、ｐＡｍｐｓｃｒｉｐｔのＳｒｆＩ部位とＫｐｎＩ部位との間にクローニングした。５９６２−ｂｐフラグメントは、アデノウイルス血清型２ゲノムの塩基対２１，６０６〜２７，５６８を含む。アデノウイルス血清型２ゲノムの完全配列は、ＧｅｎＢａｎｋ番号９６２６１５８の下で入手可能である。
【００７９】
アデノウイルス血清型２のＥ４配列を含むＤＮＡは、ｐＡｍｐｓｃｒｉｐｔポリリンカーに挿入され得る前に、改変される必要がある。具体的には、ＰＣＲ変異誘発を使用して、Ｅ４の近位のアデノウイルス末端反復をＳｒｆＩ部位で置換した。このＳｒｆ１部位の位置は、アデノウイルス血清型２ゲノムの塩基対３５，８３６〜３５，８４４に等しい。変異誘発において使用したオリゴヌクレオチドの配列は、以下：
【００８０】
【化９】
2004532822.tif 000011
であった。上記の改変されたＥ４遺伝子をＳｒｆＩおよびＳｐｅＩを用いて切断することにより生成された３，１９２ｂｐのＥ４フラグメントを、ｐＡｍｐｓｃｒｉｐｔ（これは、既に、Ｅ２ａおよびＶＡのＲＮＡ配列を含む）のＳｒｆＩ部位とＸｂａＩ部位との間に連結して、ｐＬａｄｅｎｏ５プラスミドを得た。この３，１９２ｂｐフラグメントは、アデノウイルス血清型２ゲノムの塩基対３２，６４４〜３５，８３６に等しい。
【００８１】
（顎下腺送達のための組換えＡＡＶ２−ｈＦ．ＩＸベクター）
顎下腺（ＳＭＧ）送達のために使用されるｒＡＡＶ−２  ｈＦ．ＩＸベクターを、標準的な分子生物学的技術を使用して構築した。これは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）即時初期プロモーター、ｈＦ．ＩＸのエキソン１、ｈＦ．ＩＸイントロン１の１．４ｋｂフラグメント、ｈ．ＦＩＸのエキソン２〜８、ｈ．ＦＩＸ  ３’ＵＴＲの２２７ｂｐ、および２つのＡＡＶ−２逆末端反復の間のＳＶ４０後期ポリアデニル化配列を含む１１，４４２ｂｐのプラスミドである（その詳細は、米国特許第６，０９３，３９２号に含まれる）。ｈＦ．ＩＸイントロン１の１．４ｋｂフラグメントは、ヌクレオチド１０９８までのイントロン１の５’末端およびヌクレオチド５８８２からエキソン２との接合部分に延びる配列からなる。ＣＭＶ即時初期プロモーターおよびＳＶ４０後期ポリアデニル化シグナル配列は、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅカタログ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）および彼らのウェブサイトｗｗｗ．ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ．ｃｏｍ．から入手されるｐＣＭＶ−Ｓｃｒｉｐｔ（登録商標）の公開された配列から得られ得る。
【００８２】
（肝臓送達のための組換えＡＡＶ２−ＡｐｏＥ−ＨＣＲ−ｈＡＡＴ−ｈＦ．ＩＸｍｇ−ｂｐＡベクター）
ＳＭＧ送達に使用されるｈＦ．ＩＸ発現ベクターの代わりに、新たなｈＦ．ＩＸ発現ベクター（Ｍｉａｏら（２０００）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １：５２２−５３２に記載されるｈＦ．ＩＸカセットＡｐｏＥ−ＨＣＲ−ｈＡＡＴ−ｈＦ．ＩＸｍｇ−ｂｐＡから作製した）を、肝細胞における発現を最大にするために作製した。このベクターは、アポリポタンパク質Ｅ遺伝子座制御領域／ｈＦ．ＩＸ遺伝子（第１イントロン（イントロンＡ）の一部、ウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナル（ｂｐＡ）に作動可能に連結された３’非翻訳領域（ＦＩＸｍｇ）を含む）に作動可能に連結されたヒトα１−アンチトリプシンプロモーターカセット（ＡｐｏＥ−ＨＣＲ−ｈＡＡＴ）からなる。ｈＦ．ＩＸ遺伝子は、上記のＳＭＧ送達において使用されたものと同じである。
【００８３】
このカセットを、以下のように構築した：アポリポタンパク質Ｅ遺伝子座制御領域（ＡｐｏＥ  ＨＣＲ（Ｓｃｈａｃｈｔｅｒら，前出に記載され、以下の配列：
【００８４】
【化１０】
2004532822.tif 000012
を有する））、ヒトα１−アンチトリプシン（ｈＡＡＴ）プロモーター（配列全体は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｄ３８２５７に公開されている）、ｒＡＡＶ２−ＡｐｏＥ−ＨＣＲｈＡＡＴ−ｈＦ．ＩＸｍｇ−ｂｐＡベクターにおいて使用した、ｈＡＡＴ遺伝子（完全配列は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｋ０２２１２にて公開されている）の−３４７〜＋５６にまたがる、４０２ｂｐフラグメントのｈＡＡＴプロモーター配列（Ｌｅら（１９９７）Ｂｌｏｏｄ  ８９：１２５４−１２５９に記載される）、ヒトＦ．ＩＸミニジーン（上記）、およびウシ成長ホルモンポリアデニル化（ｂｐＡ）配列（配列は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＦ０３４３８６にて公開されている）を、標準的な分子生物学的技術を使用して、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（登録商標）骨格（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）に連結し、プラスミドｐＢＳ−ＡｐｏＥ−ＨＣＲ−ｈＡＡＴ−ｈＦ．ＩＸｍｇ−ｂｐＡを作製した。
【００８５】
次いで、このカセットを、標準的な分子生物学的技術を使用して、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（登録商標）骨格から切り出し、２つのＡＡＶ−２逆末端反復（ＩＴＲ）を含むベクターにクローニングし、組換えＡＡＶベクターｒＡＡＶ２−ＡｐｏＥ−ＨＣＲ−ｈＡＡＴ−ｈＦ．ＩＸｍｇ−ｂｐＡを作製した。ＡＡＶ−２の左側ＩＴＲについての配列は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｋ０１６２４の下で公開されており、ＡＡＶ−２の右側ＩＴＲ配列は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｋ０１６２５の下で公開されている。
【００８６】
（三重トランスフェクション手順）
組換えＡＡＶ２−ｈＦ．ＩＸビリオンを、ＡＡＶヘルパー機能ｐＨＬＰ１９ベクター、アクセサリ機能ベクターｐＬａｄｅｎｏ５、ＳＭＧ送達のためのｒＡＡＶ２−ｈＦ．ＩＸベクター（または肝臓送達のためのｒＡＡＶ２−ＡｐｏＥ−ＨＣＲ−ｈＡＡＴ−ｈＦ．ＩＸｍｇ−ｂｐＡベクター）を使用して生成し、これを使用した。簡潔には、ヒト胚性腎臓細胞型２９３（２９３細胞−アメリカンタイプカルチャーコレクション、カタログ番号ＣＲＬ−１５７３から入手可能）を、ダルベッコ改変イーグル培地（１０％ウシ胎仔血清を補充した）からなる細胞培養培地１０ｍＬ中に、１ディッシュあたり３×１０６細胞の密度にて１０ｃｍ組織培養滅菌処理ディッシュ中に播種し、５％ＣＯ２中、３７℃で加湿環境にてインキュベートした。一晩インキュベートした後では、２９３細胞は、約８０％コンフルエントであった。次いで、この２９３細胞を、リン酸カルシウム沈澱法によりＤＮＡでトランスフェクトした。簡潔には、１０μｇの各ベクター（ｐＨＬＰ１０、ｐＬａｄｅｎｏ５、およびｒＡＡＶ２−ｈＦ．ＩＸ（またはｒＡＡＶ２−ＡｐｏＥ−ＨＣＲ−ｈＦ．ＩＸ−ｂｐＡ））を、３ｍＬの滅菌したポリスチレンスナップキャップチューブに、滅菌したピペットチップを使用して添加した。３００ｍＭ  ＣａＣｌ２（ＪＲＨ等級）１．０ｍＬを、各チューブに添加し、上下にピペッティングすることにより混合した。等容量の２×ＨＢＳ（２７４ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＫＣｌ，４２ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１．４ｍＭ  Ｎａ２ＰＯ４、１２ｍＭ  デキストロース，ｐＨ７．０５，ＪＲＨ等級）を、２ｍｌピペットを使用して添加し、溶液を、上下に３回ピペッティングした。このＤＮＡ混合物を、ディッシュ中に均一になるように、一度に一滴ずつ、直ぐ２９３細胞に添加した。次いで、細胞を、５％  ＣＯ２中３７℃で６時間、加湿環境にてインキュベートした。顆粒状の沈殿物が、トランスフェクト細胞培養物中で見えた。６時間後、このＤＮＡ混合物を、細胞から取り出し、次いで、これに、新たな細胞培養培地を提供し、さらに７２時間インキュベートした。
【００８７】
７２時間後、細胞を溶解し、次いで、ヌクレアーゼで処理して、残りの細胞ＤＮＡおよびプラスミドＤＮＡを減らした。沈澱後、ｒＡＡＶビリオンを、２サイクルの等密度遠心分離により精製し；ｒＡＡＶビリオンを含む画分をプールし、透析し、濃縮した。この濃縮したビリオンを処方し、滅菌濾過し（０．２２μＭ）、ガラスバイアル中に無菌的に充填した。ウイルスゲノムを、「リアルタイム定量ポリメラーゼ連鎖反応」法（Ｒｅａｌ  Ｔｉｍｅ  Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ＰＣＲ．Ｈｅｉｄ  Ｃ．Ａ．，Ｓｔｅｖｅｎｓ  Ｊ．，Ｌｉｖａｋ  Ｋ．Ｊ．，およびＷｉｌｌｉａｍｓ  Ｐ．Ｍ．１９９６．Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ６：９８６−９９４．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）により定量した。
【００８８】
（実施例２：マウスの顎下腺への逆方向（ｒｅｔｒｏｇｒａｄｅ）管投与）
Ｃ５７ＢＩ／６未処置マウスを、３つの用量群（６匹の動物／群）に分け、３種類の用量：低用量を構成する１×１０９  ｒＡＡＶ−ｈＦ．ＩＸウイルスゲノム、中用量を構成する１×１０１０  ｒＡＡＶ−ｈＦ．ＩＸウイルスゲノム、および高用量を構成する１×１０１１  ｒＡＡＶ−ｈＦ．ＩＸウイルスゲノムにて、５０μＬのｒＡＡＶ−ｈＦ．ＩＸウイルスゲノムを注射した。このマウスに麻酔をかけ、頬の内側を切開して、顎下腺の管を露出させた。組換えＡＡＶ−ｈＦ．ＩＸビリオンを、逆方向にて、顎下腺の管へ注入した。
【００８９】
循環ｈＦ．ＩＸレベルを、米国特許第６，０９３，３９２号およびＷａｌｔｅｒら（１９９６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９３：３０５６−３０６１に記載のように、ＥＬＩＳＡを使用してマウス血漿中で測定した。一次抗体として、ポリクローナルウサギ抗ヒトＦ．ＩＸ抗体を、１：１２００の希釈度にて使用した。マウス血漿サンプルを、緩衝液（ＰＢＳ／０．０５％  Ｔｗｅｅｎ／６％  ＢＳＡ）中で、標準曲線の範囲内の濃度に希釈した。西洋ワサビペルオキシダーゼに結合させたポリクローナルヤギ抗ヒトＦ．ＩＸ抗体を、１：５００の希釈度にて、二次抗体として使用した。表１および図１は、循環ｈＦ．ＩＸのレベルを示す。
【００９０】
（実施例３：マウスの肝臓への逆方向管投与）
Ｃ５７ＢＩ／６未処置マウスに、肝管を介した逆方向管投与により、２５０μＬのｒＡＡＶ−ｈＦ．ＩＸビリオンを注入した。マウスに麻酔をかけ、手術用顕微鏡下で、腹部正中切開を行い、胆嚢管へ接近できるようにした。鎌状間膜の腹側を分離し、中間の肝葉を転置して、胆嚢、胆嚢管、肝管、および総胆管を露出させた。総胆管を、膵管との接合部の上でクランプで固定して、ベクターの十二指腸への前方への流れを阻止し、膵臓へと逆流させた。しかし、総胆管をクランプで固定する前に、総胆管を、生理食塩水で灌流した。絹製縫合糸を、胆嚢の近位部位の周りに緩く配置し、胆嚢管にカニューレを挿入した。組換えＡＡＶビリオンを、ゆっくりとカニューレに注入した。３種類の用量群（１用量群あたり６匹のマウス）を確立し、低用量群には、１×１０９  ｒＡＡＶ−ｈＦ．ＩＸウイルスゲノムを、中用量の群には、１×１０１０  ｒＡＡＶ−ｈ．ＦＩＸウイルスゲノムを、および高用量群には、１×１０１１  ｒＡＡＶ−ｈＦ．ＩＸウイルスゲノムを与えた。注入後、ポリエチレンチューブの遠位端部を凝固させ、全ての開創器および剣状クランプを開放し、腸管をその元の位置に戻した。ｒＡＡＶビリオン注入の１時間後、総胆管からクランプを外すことにより、胆嚢管から十二指腸の前方への流れを回復させた。次いで、二層にて腹を閉じた。循環ｈＦ．ＩＸレベルを、実施例２のように測定した。表１および図２は、循環ｈＦ．ＩＸレベルを示す。
【００９１】
（実施例４：門脈投与）
Ｃ５７ＢＩ／６未処置マウスを３用量群（３匹のマウス／群）に分け、１×１０９  ｒＡＡＶ−ｈＦ．ＩＸウイルスゲノム（低用量）、１×１０１０  ｒＡＡＶ−ｈＦ．ＩＸウイルスゲノム（中用量）、および１×１０１１  ｒＡＡＶ−ｈＦ．ＩＸウイルスゲノム（高用量）により注入した。Ｎａｋａｉら（１９９８）Ｂｌｏｏｄ  ９１：４６００−４６０７に記載の手順に従って、ｒＡＡＶビリオンをマウスの門脈に注入した。成体マウスにおいて、ｒＡＡＶ−ｈＦ．ＩＸビリオンを、脾臓被膜の真下への注射を介して、門脈循環へ投与した。動物に麻酔をかけ、腹側を正中切開し、続いて腸管を転置することにより門脈を露出させた。組換えＡＡＶビリオン溶液を、ハミルトンシリンジを使用して、門脈へゆっくりと注入した。腹膜腔を縫合し、皮膚を閉じた。循環ｈＦ．ＩＸレベルを、実施例２のように測定した。表１および図３は、循環ｈＦ．ＩＸレベルを示す。
【図面の簡単な説明】
【００９２】
【図１】図１は、実施例２に記載されるように、循環中の血漿ｈＦ．ＩＸを１ミリリットル当たりのナノグラム数（ｎｇ／ｍＬ）で示す。逆方向の顎下腺注射を行い、そして注射量は各用量について５０μＬのｒＡＡＶ−２−ｈＦ．ＩＸビリオンであった：低用量＝１×１０９ウイルスゲノム（ｖｇ）／マウス、中間用量＝１×１０１０ｖｇ／マウス、そして高用量＝１×１０１１ｖｇ／マウス（１用量当たり、ｎ＝６マウス）。
【図２】図２は、実施例３に記載されるように、循環中の血漿ｈＦ．ＩＸをｎｇ／ｍＬで示す。逆方向の肝管注射を行い、そして注射量は各用量について２５０μＬのｒＡＡＶ−２−ｈＦ．ＩＸビリオンであった：低用量＝１×１０９ｖｇ／マウス、中間用量＝１×１０１０ｖｇ／マウス、そして高用量＝１×１０１１ｖｇ／マウス（１用量当たり、ｎ＝６マウス）。
【図３】図３は、実施例４に記載されるように、ｒＡＡＶ−２−ｈＦ．ＩＸビリオンの、門脈注入および逆方向の肝管注射からのｈＦ．ＩＸレベルの循環血漿レベル（ｎｇ／ｍＬで）を比較する。注射量は、両方の投薬経路に対して、２５０μＬのｒＡＡＶ−２−ｈＦ．ＩＸビリオンであった（低用量＝１×１０９ｖｇ／マウス、中間用量＝１×１０１０ｖｇ／マウス、そして高用量＝１×１０１１ｖｇ／マウス（肝管注入について１用量当たりｎ＝６マウス、および門脈注入について１用量あたりｎ＝３マウス）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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