(57)【要約】【課題】ＩＫＫ−β阻害剤の使用法および前記阻害剤の発見【解決方法】アテローム性動脈硬化症の治療および防止をする薬剤の製造用にＩＫＫ−β阻害剤を使用する。内皮細胞におけるＩＫＫ−β阻害剤の発見する際のスクリーニング方法についても開示する。当該方法には潜在的阻害剤を内皮細胞と接触させること、および当該内皮細胞からＭＣＰ−１の分泌を定量することが含まれる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
アテローム性動脈硬化症の治療および防止用の薬剤を調製するためのＩＫＫ−βの阻害剤の使用。
【請求項２】
該阻害剤が蛋白質である、請求項１記載の使用法。
【請求項３】
該阻害剤が抗体である、請求項２記載の使用法。
【請求項４】
該阻害剤が非蛋白質である、請求項１記載の使用法。
【請求項５】
該非蛋白質が、アンチセンスＲＮＡ、リボザイムまたは低分子量化合物である、請求項４記載の使用法。
【請求項６】
該阻害剤がベクターである、請求項１記載の使用法。
【請求項７】
潜在する阻害剤と活性化された内皮細胞とを接触させ、該内皮細胞からのＭＣＰ−１の分泌を測定することを含む、内皮細胞内のＩＫＫ−βの阻害剤を発見するスクリーニング方法。
【請求項８】
該内皮細胞は、活性化した血小板により活性化される、請求項７記載のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アテローム性動脈硬化症の防止および治療用の薬剤を調製するための特異的阻害剤の新規な使用、並びに新規な阻害剤を発見するための、特異的なスクリーニング方法に関する。
【０００２】
アテローム性動脈硬化症は、血管内皮の損傷結果であり、それは高血圧、局所渦形成または酸素欠如で促進される。当該損傷により曝された血管壁の内皮下構造に起因して、循環血液の血小板が当該内皮の損傷部位に接着し（血小板接着）、その後に凝集する（血小板凝集）と想定されている。
【０００３】
当該血小板と内皮細胞との相互作用の結果として、血管壁への脂質の蓄積を引き起こす多数の二次的なプロセスが生じる。当該血管壁での脂質蓄積により、いわゆるアテローム斑の生成が開始する。移入してきたマクロファージから形成される泡沫細胞が、斑に蓄積する。泡沫細胞は、蓄積した脂質を吸収し、それらを分解する。幾つかのリポ蛋白質は簡単に分解されるが、コレステロールおよびコレステロールエステル類は、ほとんど開裂されずに残る。泡沫細胞は、それ故にコレステロールおよびコレステロールエステルを過剰に搭載した状態となる。
【０００４】
アテローム斑の結果、中央に壊死を生じ、その近隣にカルシウム塩が沈着する。進行した段階では、斑が裂けてアテローム硬化性損傷を生じ、その後、それが血栓で覆われる。動脈壁の肥厚および表面の血栓の生成で、血管の内腔を狭めて完全に閉塞するまでになる。大きな動脈から剥がれた血栓は、体の末梢においてより小さな動脈の閉塞を生じる。多くの場合アテローム性動脈硬化プロセスによる動脈循環の不調は、いわゆる先進工業国における最も一般的な死因で、その約５０％の割合を占める。
【０００５】
粥腫形成の分子学的な機構、特に単球の走化性および単球の遊出を決定するプロセスに関しては殆ど知られていない。しかしながら、サイトカインＭＣＰ−１（単球化学誘引蛋白質−１）が、動脈壁の炎症プロセスにおいて生じ、炎症部位に単球を誘引することは既に知られている。また、ＭＣＰ−１は、内皮細胞において発現できることも知られている。ＭＣＰ−１の発現および分泌は、複雑なシグナルカスケードにより制御される。粥腫形成の初期における内皮細胞中でのＭＣＰ−１の発現および分泌の制御の詳細は、先行技術では知られていない。特に、アテローム性動脈硬化症との関連において、疾病の発生や、その初期の過程に影響を及ぼすために、その作用を利用できる標的蛋白質は知られていない。
【０００６】
アテローム性動脈硬化プロセスの過程において、単球の血管壁への誘引および移入を防止または低減すると、アテローム斑における泡沫細胞の蓄積を遅くすることができ、それ故、アテローム性動脈硬化症プロセスを抑制または防止するのには適当である。
【０００７】
本発明の目的は、アテローム性動脈硬化症を防止または治療することができる新規な方法を提供することである。
【０００８】
本発明の更なる目的は、アテローム性動脈硬化症を防止または治療できる新規の活性物質を発見するためのスクリーニング方法を提供することである。
【０００９】
これらの目的は、各請求項に従って達成される。本発明は、血管内皮上における血小板の凝集が内皮細胞におけるＭＣＰ−１の発現にとって欠くことができないものではないという理解の上に基づいている。逆に、血小板凝集が未だ検出されていないアテローム性動脈硬化の段階で、活性化血小板は既に内皮細胞内にＭＣＰ−１の発現を誘導する。活性化された血小板は、生体内で虚血により活性化された内皮単層に凝集せずにほんの一時的のみに堅固に接着し、近隣の内皮細胞において転写因子ＮＦ−κＢを脱顆粒し活性化することが見出されている。検知されるような損傷を必要としない血小板と活性化内皮細胞間の新しい形態の相互作用は、一方では先行技術で知られている堅固な接着を生じないローリング相互作用とも異なり、他方では一時的ではなく永続的な血小板凝集の場合の堅固な接着および凝集とも異なっている。内皮細胞におけるＮＦ−κＢの活性化は、活性化血小板により媒介され、内皮細胞からのＭＣＰ−１の分泌を引き起こす。ＭＣＰ−１の分泌の結果、血管壁に移動できる単球は、粥腫形成の早い段階で誘引される。従って、活性化血小板の単なる一時的な接着は、アテローム性動脈硬化プロセスにおける斑の形成にとって欠くことができないＭＣＰ−１の分泌を導く。
【００１０】
本発明は更に、活性化血小板によって媒介されるＮＦ−κＢの活性化の場合、阻害剤蛋白質ＩκＢが、ＩＫＫ複合体であるＩＫＫ−βキナーゼにより特異的にリン酸化されることにより活性化されるという理解に基づいている。活性化血小板による特異的な短時間の活性化は、ＩＫＫ−βの関与によりＩκＢの強くて連続的なリン酸化活性を生じ、その活性は１時間に至るまでの間続く。阻害剤蛋白質ＩκＢの連関する分解は、ＮＦ−κＢの長くて強い活性化および対応するＭＣＰ−１の分泌を生じる。これは血小板との相互作用が比較的短時間でしかないことから見ても驚くべきことである。
【００１１】
活性化血小板による活性の場合、当該ＩＫＫ複合体の時間に関する活性化プロファイルは、ＩＫＫ複合体の活性化剤として先行技術において既知であるＩＬ−１βまたはＴＮＦによる活性の場合とは基本的に異なる。活性化血小板は、ＩＫＫ複合体を約６０分間活性化し、最大リン酸化レベルは約３０分後に達し、ＩＫＫ−αおよびＩＫＫ−βの活性化の間には何ら差異が認められない。ＴＮＦは、特にＩＫＫ複合体の極度に強い活性化を数分間だけ導くが、それは約２０分後にはもはや検出されない。一方で、ＩＬ−１βは、特にＩＫＫ−βの非常に長い活性化を起こし、それが約２時間連続する。しかしながら、ＩＫＫ−βの活性化は活性化した血小板による活性化の場合より実質的に弱い。
【００１２】
従って、活性化血小板でのＩＫＫ複合体の活性化により、キナーゼＩＫＫ−βは、強く且つ長い期間活性化され、それはＭＣＰ−１の分泌と関連するＮＦ−κＢの活性化およびそれ故アテローム性動脈硬化プロセスにおける斑の形成にとって決定的なものである。その機構は、早期アテローム性動脈硬化プロセスの制御のみならず、斑形成、斑増殖および斑の不安定化における、決定的段階に関与する。
【００１３】
本発明はそれ故、アテローム性動脈硬化の治療または防止用の薬剤を調製するための、ＩＫＫ−βの阻害剤の使用を提案する。
【００１４】
本発明は、ＩＫＫ−βが粥腫形成の早い段階で阻止されると、内皮層は血小板凝集または表面血栓形成により未だ遮蔽されず、その結果内皮細胞にＭＣＰ−１の発現に影響する阻害剤を容易に、効果的に行き渡らせることができるという利点を提供する。その段階は、いわゆる“脂肪線条”といわれる 最低限の内皮損傷で特徴付けられる。
【００１５】
本発明は更に、ＩＫＫ−βがアテローム斑の近辺の内皮細胞において阻止されれば、当該斑の拡大が防止されるか、存在する斑が安定化されるという利点を提供する。
【００１６】
本発明は更に、活性化血小板による活性化の場合に中心的役割を果たす、ＭＣＰ−１の発現のシグナルカスケードにおける蛋白質であり、その直接的影響は重大な副作用を導くＮＦ−κＢではない蛋白質を阻害するという利点を提供する。ＮＦ−κＢは、例えばＴＮＦ、ＩＬ−１Ｂ、ＩＬ−８のようなサイトカイン、ケモカイン、成長因子；ＩＣＡＭ−１、ＶＣＡＭ−１およびＥＬＡＭ−１などの接着分子；ＭＭＰ−９のようなプロテアーゼ；およびプロトロンビン形成分子ＴＦ；等の他の蛋白質の発現にも関与しているので、その直接的影響は重大な副作用を導く。正しくはＩＫＫ−βを阻害することで、アテローム性動脈硬化症プロセスに特異的に関連しているＮＦ−κＢの効果的活性化経路に影響を及ぼす蛋白質を阻害する。
【００１７】
本発明は更に、内皮細胞からＭＣＰ−１の長時間の分泌を避ける場合の方が、ＴＮＦの阻害の場合におけるような短期であるがより強いＭＣＰ−１の分泌を避ける場合より、単球の移入を避ける効果が遥かに大きいという利点を提供する。
【００１８】
加えて本発明は、単球／マクロファージの血管壁への流入を当該内皮層のレベルで、即ち単球／マクロファージが血管壁へ透過する前に制御できるという利点を提供する。
【００１９】
アテローム性動脈硬化症の従来の治療とは異なり、本発明によれば、既知の治療では効果がない、或いは副作用の点で受け入れ難い患者の新しいクラスを治療に選択できる。
【００２０】
患者の一番目の特定サブクラスは、発作または心筋梗塞のような心臓血管の異常を防止するために一次予防として本発明に従ってＩＫＫ−β阻害剤で治療を受ける人々であり、危険因子の評価により、および／またはアテローム性動脈硬化症の早期段階での診断により、それらの患者を選び、この一番目の特定サブクラスに割り当てることができる。
【００２１】
危険因子の評価による患者の選択および分類は、既知の危険因子の評価に基づいて行うことができる。確認された危険因子の評価は、担当の内科医の一般的経験に基づき主観的に、或いは標準化評価法に基づき客観的に行うことができる。標準化評価法を使用するのがより好ましい。特に好ましいのはＧ．Ａｓｓｍａｎｎ等が提案したＰＲＯＣＡＭ研究に基づいた評価法（Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ２００２；１０５：３１０〜３１５）の使用である。その評価システムでは、患者につき確認した以下の危険因子に標準化係数を割り当て、その係数の合計が急性心臓血管異常の次の１０年における出現危険性と相関する値となる：
年齢、ＬＤＬ−コレステロール、ＨＤＬ−コレステロール、トリグリセリド、喫煙者／非喫煙者、真性糖尿病、家族における心筋梗塞（ＭＩ）の存在および最高血圧。
５０以上の値の患者を選択し、このサブクラスに割り当てる。
【００２２】
アテローム性動脈硬化症の早期診断による患者の選択と分類は、アテローム性動脈硬化症の存在に関する既知徴候の評価に基づいて行うことができる。選択は特に内頚動脈の平均最大内壁厚さの測定に基づき実施するが、１．２ｍｍより厚い場合はアテローム性変化を示している。壁厚さの測定は、例えば１２ＭＨｚのサウンドヘッドを備えた従来の超音波装置のような適切な分解能を示す超音波装置で実施する。
【００２３】
心臓血管の異常がこれまではない患者でも、既に脂質に富む斑またはカルシウム塩沈着を伴う一様な斑を有すれば同じようにこのサブクラスに属する。
【００２４】
本発明によれば、血管でのアテローム性動脈硬化症的変化の進行は、ＩＫＫ−βの阻害剤を投与するこのサブクラスにおける初期予防処置で防止でき、心臓血管異常または心臓血管異常の危険性増加を低減させる結果をもたらす。
【００２５】
患者の二番目の特定サブクラスは、心臓血管異常後に発作または心筋梗塞のような更なる心臓血管異常を防ぐための二次的予防法として、本発明に従ってＩＫＫ−βの阻害剤で治療している人々に関わる。この場合、当該患者は、一次的な異常により、並びに／或いは上記のように、危険因子の評価によりおよび／またはアテローム性動脈硬化症の診断により、単独でこの二番目の特定サブクラスに選択および割り当てることができる。
【００２６】
従って、本発明はアテローム性動脈硬化症の防止または治療するための方法にも関連しており、それは患者にＩＫＫ−βの阻害剤を投与するという点で特徴付けられる。当該阻害剤は、全ての既知の方法で投与できる。例えば、当該阻害剤は経腸投与または腸管外投与ができる。他方、当該阻害剤は、遺伝子治療で、例えばベクターのような前駆体として投与することもできる。経腸投与は好ましくは経口で実施される。腸管外投与は、静脈内、動脈内、筋肉内または皮下で実施するのがよく、好ましくは静脈内または動脈内に投与される。同様に当該阻害剤は、経腸投与、腸管外投与および遺伝子治療投与の組合せにより投与することができる。当該阻害剤を比較的長期間に亘り繰り返して投与しなければならないときは、経口的に投与できる阻害剤を選ぶのが好ましい。
【００２７】
好ましい実施態様では、関係する患者は当該一番目の特定サブクラスに属している人々である。心臓血管の初期異常以前のアテローム性動脈硬化症の防止または治療のための本発明の方法においては、当該阻害剤は、経口的投与されるのが好ましい。
【００２８】
他の好ましい実施態様では、関係する患者は当該二番目の特定サブクラスに属する人々である。心臓血管の初期異常以前のアテローム性動脈硬化症の防止または治療のための本発明の方法においては、当該阻害剤は、経口的投与されるのが好ましい。
【００２９】
他の好ましい実施態様では、関係する患者は当該一番目または二番目の特定サブクラスに属する人々で、当該阻害剤は内皮細胞内で当該ベクターの１つ以上のヌクレオチド配列の発現生成物として血管の内皮細胞にて利用できるようにするためにベクターによる前駆体として血管の内皮細胞に投与される。
【００３０】
本発明を、以下でより詳細に説明する。
【００３１】
ＩＫＫ−βの阻害は、当該蛋白質の発現を防止することによりＤＮＡレベルで達成される。阻害は遺伝子発現のいずれの段階で起こすことができ、それ故、例えば遺伝子それ自体またはＲＮＡや蛋白質のような発現生成物で起こすことができる。遺伝子の構造的変化をもたらす種々の方法が先行技術により知られている。特定のベクターの使用につき特に注意が向けられている。実施例にはベクターのある特定の使用が説明してある。ＩＫＫ−βの発現は、ＩＫＫ−β遺伝子またはそれに対応するｍＲＮＡの転写または翻訳を阻害することでも防止できる。当該阻害剤の例には、アンチセンスＲＮＡ類およびリボザイム類がある。
【００３２】
しかしながら、ＩＫＫ−βの阻害は、発現したＩＫＫ−β蛋白質の機能を阻害することによって蛋白質レベルで達成することもできる。当該蛋白質レベルでの阻害は、蛋白質または非蛋白質によって達成することができる。阻害蛋白質の例としては、ＩＫＫ−βのエピトープと反応する抗体、またはＩＫＫ−βの活性部位と相互作用し、リン酸化活性を防止する蛋白質がある。阻害非蛋白質の例としては、ＩＫＫ−βの活性部位と相互作用してリン酸化活性を防止する活性物質がある。ＩＫＫ−βの分子阻害剤の特定例については、米国特許Ａ第５，９３９，３０２号で明確に言及している。
【００３３】
好ましいことは、当該阻害剤はＩＫＫ−βに対して選択的であることである。
【００３４】
本発明の好ましい実施態様においては、当該阻害剤は、例えばリボザイムまたはアンチセンスＲＮＡのようなＩＫＫ−βをコードする遺伝子の発現を阻害する化合物である。特に好ましい実施態様では、当該阻害剤は、ＩＫＫ−βまたはその一部分、好ましくはコード領域をコードする遺伝子により転写されたｍＲＮＡに対して相補的で、特異的にそのｍＲＮＡに結合することによりＩＫＫ−βの合成を減少させるか、阻害するアンチセンスＲＮＡである。他の特に好ましい実施態様においては、当該阻害剤は、ＩＫＫ−βまたはその一部分をコードする遺伝子により転写されたｍＲＮＡに相補的であり、当該ｍＲＮＡに特異的に結合して、それを解裂することによりＩＫＫ−βの合成を減少または阻害することができるリボザイムである。アンチセンスＲＮＡの製造に関する適した方法は、欧州特許Ｂ１０２２３３９９または欧州特許Ａ１０４５８に記載されている。リボザイムは、単鎖ＲＮＡからなり、例えばＩＫＫ−βをコードする配列により転写されたｍＲＮＡのような他のＲＮＡを分子内で開裂することができる。これらのリボザイムは基本的に２つのドメイン：（１）触媒ドメインおよび（２）標的ＲＮＡに相補的でそれに結合でき、当該標的ＲＮＡの開裂に不可欠であるドメイン、を有さねばならない。望ましいＲＮＡを予め選択した特定な部位で解裂する特異なリボザイムを構築することが可能となって以来、基礎として、文献に記載された手順が用いられる、（参照、例えばＴａｎｎｅｒ等、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ、Ｉｎｃ．（１９９３）、４１５〜４２６）。
【００３５】
他の好ましい実施態様では、当該阻害剤はベクターである。
【００３６】
他の好ましい実施態様では、当該阻害剤は、ＩＫＫ−βまたはその断片に結合する抗体である。これらの抗体はモノクローナル、ポリクローナルまたは合成抗体、或いはそれらの断片であってもよい。本明細書では、用語“断片”は、完全抗体と同じエピトープ特異性を有するモノクローナル抗体の何れかの部分（例えばＦａｂ、Ｆｖまたは単鎖Ｆｖ断片）を意味する。本発明による抗体は、モノクローナル抗体が好ましい。当該モノクローナル抗体は、動物由来の抗体（例えばマウス）、ヒト化抗体またはキメラ抗体或いはその断片であってもよい。ヒト抗体またはヒト化抗体に似せたキメラ抗体は、潜在的抗原性が低下しているが、標的に対するそれらの親和性は低下していない。キメラ抗体およびヒト化抗体、或いはヒト抗体に似せた抗体の生産は、詳細に記載されている（参照、例えばＱｕｅｅｎ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８６（１９８９）、１００２９およびＶｅｒｈｏｅｙａｎ等、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９（１９８８）、１５３４）。ヒト化免疫グロブリンは、本質的にヒト免疫グロビリン由来の可変基本構造領域（受容体免疫グロブリンと称せられる）および非ヒト免疫グロブリン（例えばマウスから）に本質的に由来する決定領域の相補性（供与体免疫グロブリンと称する）を有する。定常領域がもし存在すれば、それはまた、本質的にヒト免疫グロブリンに由来する。ヒト患者に投与する場合、ヒト化（およびヒト）抗体は、マウスまたは他の種の抗体より多くの利点を提示する：
（ａ）ヒト免疫系は、ヒト化抗体の基本構造または定常領域を異物と認識しないので、そのような注入抗体に対する免疫反応は、完全異物マウス抗体または部分的異物キメラ抗体に対するより低い；
（ｂ）ヒト化抗体のエフェクター領域がヒトなので、ヒト免疫系の他の部分と、より良好な相互作用を行う；
（ｃ）注入されたヒト化抗体は、自然に生じるヒト抗体と同等な半減期を有し、他の種の抗体と比較してより少量およびより低頻度での投与を可能とする。
【００３７】
アプタマーと呼ばれる蛋白質に直接結合する核酸を使用することも可能である。これらは、精製した蛋白質に基づいて、化学的に修飾されたＲＮＡの大きなライブラリーから同定され、精製される。
【００３８】
アプタマー、リボザイム、アンチセンスＲＮＡおよび抗体の阻害剤は、それ自体を投与するか、或いはその代わりとして、好ましくは発現ベクターに挿入した適当なコードＤＮＡ配列を用いる遺伝子治療法により投与し、標的組織に持ち込ませるのが好ましい。従って、本発明には、それらの阻害剤をコードするＤＮＡ配列を含む発現ベクターも含まれる。用語“ベクター”はウイルスまたは他の適した媒体を意味する。当該ＤＮＡ配列は、真核宿主細胞中でその発現を可能にする調節要素とベクター中で機能し得る状態で結合している。調節要素を含有しているのに加えて、当該ベクターは、例えば典型的には複製の開始点であるプロモーターおよび形質転換された宿主細胞の表現型の選択を可能とする特定の遺伝子を含有している。適した調節配列は、Ｇｏｅｄｄｅｌ：Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １８５、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ（１９９０）中に付加的に記述されている。適した哺乳類細胞用の発現ベクターには、例えばｐＭＳＸＮＤ、ｐＫＣＲ、ｐＥＦＢＯＳ、ｃＤＭ８およびｐＣＥＶ４由来並びにｐｃＤＮＡＩ／ａｍｐ、ｐｃＤＮＡＺ／ｎｅｏ、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐＳＶ２ｇｐｔ、ｐＳＶ２ｎｅｏ、ｐＳＶ２−ｄｈｆｒ、ｐＴｋ２、ｐＲＳＶｎｅｏ、ｐＭＳＧ、ｐＳＶＴ７、ｐｋｏ−ｎｅｏおよびｐＨｙｇ由来のベクターが含まれる。
【００３９】
上記のＤＮＡ配列は、例えば、組織特異なプロモーターの制御下で遺伝子治療に適したベクターに挿入し、細胞中に侵入させることが好ましい。好ましい実施態様では、上記ＤＮＡ配列を含有するベクターは、例えばアデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ワクシニアウイルスまたはレトロウイルスなどのウイルスである。好適なレトロウイルスの例としては、ＭｏＭｕＬＶ、ＨａＭｕＳＶ、ＭｕＭＴＶ、ＲＳＶまたはＧａＬＶがある。特に好ましいのはアデノウイルスであり、Ｅ４変異（欠失）を更に有することがあるＥ１および／またはＥ３変異（欠失）を有するアデノウイルス、即ちいわゆる“弱毒化（ｇｕｔｌｅｓｓ）”アデノウイルスである。また、遺伝子治療に好適なベクターは、国際特許９３／０４７０１、国際特許９２／２２６３５、国際特許９２／２０３１６、国際特許９２／１９７４９および国際特許９２／０６１８０に公開されている。遺伝子治療のために、本発明によるＤＮＡ配列は、コロイド分散液の形で標的細胞に運ぶことも可能である。これには、例えばリポソーム類およびリポプレックス類が含まれる（Ｍａｎｎｉｎｏ等、Ｂｉｏｔｅｃｎｉｑｕｅｓ  ６（１９８８）、６８２）。
【００４０】
当該専門分野で知られている一般的方法は、これらのＤＮＡ配列および適当な制御配列を含有する発現ベクターの構築に使用することができる。これらの方法には、例えば、最近の教科書に記載されているような、生体外組換え手法、合成製法および生体組換え方法が含まれる。
【００４１】
上述の化合物またはそれらをコードするＤＮＡ配列或いはベクターは、適当な場合には、製薬上許容される担体と共に投与する。
【００４２】
好適な担体および当該薬物の処方は、当技術分野の当事者であれば既知なものである。適している担体には、例えばリン酸塩緩衝生理食塩溶液、水、水中油エマルションのようなエマルション、湿潤剤、滅菌溶液などが含まれる。適している調剤は、担当医により決められるだろうが、例えば患者の年齢、性別および体重、当該心臓病の性質と段階または投与の方式に依存する。
【００４３】
他の好ましい実施態様では、当該阻害剤は以下の群から選択された活性物質である：
スリンダクまたはアスピリン（参照、Ｙ．Ｙａｍａｍｏｔｏ等、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９９；２７４（３８）：２７３０７〜１４）；ＮＥＭＯ結合ドメインペプチド（参照、Ｍａｙ  Ｍｊ．等、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２０００；２８９；１５５０〜４）；３−［（４−メチル−フェニル）−スルホニル］−２−プロペンニトリルおよび３−［（４−メチルフェニル）−スルホニル］−２−プロペンニトリル（参照、Ｊ．Ｗ．Ｐｉｅｒｃｅ等、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９７；２７２（３４））。
【００４４】
本発明は更にＩＫＫ−βの選択的な阻害剤を発見するスクリーニング方法であって、活性化された内皮細胞を、特にＭＣＰ−１の分泌の防止に特異的に関連する潜在的活性物質の有効性を試験するのに用いる方法を提供する。
【００４５】
酵素活性または遺伝子発現が低下されるか完全に阻止されることは、試験化合物が阻害剤としての有効性を示す。適当な測定法は、当技術分野の当事者であれば知っているものである。本発明の方法は、内皮細胞が使用される細胞測定法で実施される。試験化合物とは非常に多様な化合物であり、天然由来物および合成物の両者、有機物および非有機物、或いはポリマー（例えば、オリゴペプチド、ポリペプチド、オリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチド）または小分子、抗体、糖類、脂肪酸、ヌクレオチドおよびヌクレオチド類似体、天然に生じる構造物の類似体（例えば、ペプチド模倣体、核酸類似体など）並びに多くの他の化合物であってよい。更に数多くの有用と思われるＩＫＫ−β阻害化合物が、天然生成物の抽出物を原料としてスクリーニングできる。当該抽出物は多くの起源、例えば真菌類、放線菌類、藻類、昆虫類、原生動物類、植物類および細菌類などの種から生じる。活性を示す抽出物は、その後活性分子を単離するために分析される（参照、例えばＴｕｒｎｅｒ、Ｊ．Ｅｔｈｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌ．５１（１〜３）（１９９６）、３９４３およびＳｕｈ、Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１５（１９９５）２３３〜２３９）。基本的に、ＩＫＫ−βの発現または活性に影響を及ぼす試験化合物の同定に適する測定法は、バイオ技術産業や医薬産業において良く知られており、付加的測定法およびそれら測定法の修正については当技術分野の当事者にとっては明らかである。ＩＫＫ−βの発現レベルにおける変化は、当技術分野の当事者に良く知られた方法を用いて検討できる。これらにはｍＲＮＡ濃度のモニタリング（例えば適当なプローブまたはプライマーを用いる）、当該蛋白質濃度についての免疫測定法、ＲＮａｓｅ保護測定法、増幅測定法または検出に適していて当該専門分野にて知られている他の方法が含まれる。
【００４６】
また、阻害剤の探索は、例えば、物質ライブラリーは合成分子および／または天然分子を含むことができるので、当該物質ライブラリーにある多数の候補化合物をスクリーニングすることにより、大規模に実施することができる。いずれにしても、合成分子の大きなバンクの製造および同時スクリーニングは、コンビナトリアルケミストリーでよく知られた方法、例えばｖａｎ  Ｂｒｅｅｍｅｎ、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．６９（１９９７）、２１５９〜２１６４およびＬａｍ、Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓ．１２（１９９７）、１４５〜１６７により実施できる。また、本発明による方法は、高度処理スクリーニングの形で非常に速めることができる。本明細書で説明した測定法は、当該方法を使う際に適当に変更することができる。
【００４７】
本発明を、特定の実施例により、以下でより詳細に説明する。
【実施例】
【００４８】
（材料および方法）
動物および生体内蛍光顕微鏡検査
５〜７週齢のメスＢａｌｂ／ｃマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ、Ｓｕｚｆｅｌｄ）（試験動物１０匹、血小板供与体１０匹）を使用した。手術手順は、先行技術（１，２）の通りである。具体的には、空腸の部分を外に取り出し、６０分間正常体温での虚血状態とした。当該マウスの血小板を、全血から分離し、ローダミン−６Ｇで標識した。虚血後の微小血管系における血小板−内皮細胞の相互作用を、虚血前および虚血後６０分後に生体内顕微鏡により粘膜下細動脈中で検査した。関心があり、重複しない関心領域を５箇所無作為に選び、血小板−内皮細胞の相互作用の定量検査を実施した。これらの相互作用を、血小板のローリング接着または堅固な接着として分類した。
【００４９】
電子顕微鏡検査および免疫組織化学的検討
虚血の前および６０分後に腸の一部から試料を採取した。電子顕微鏡検査のために、当該組織を固定し、先行技術（２）に記載されたように処理した。超薄層領域を切片として酢酸ウラニルおよびクエン酸鉛で染色し、Ｚｅｉｓｓ  ＥＭ  ９００透過型電子顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ、Ｏｂｅｒｋｏｃｈｅｎ）を８０ｋＶにて走査して試験を行った。免疫染色のために、生検をＯＣＴ化合物（Ｔｉｓｓｕｅ−Ｔｅｋ；Ｍｉｌｅｓ  Ｉｎｃ．，Ｅｌｋｈａｒｔ，ＩＮ，ＵＳＡ）に導入し、直ちに液体窒素で凍結した。活性化ＮＦ−κＢを視覚化するために、アセトン固定クライオスタット切片（６μｍ）を、ＩκＢの非存在下のみでｐ６５と選択的に反応するためＮＦ−κＢの活性化型を認識し、対応マウス抗原（３）と交差反応する、ビオチン抱合マウス抗ヒトα−ｐ６５ｍＡｂ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ）とともにインキュベーションした。当該一次抗体とインキュベーションした後、当該切片をペルオキシダーゼ免疫化学キット（Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ，Ｃａｍｏｎ，Ｗｉｅｓｂａｄｅｎ）で染色した。内生ペルオキシダーゼ活性は室温で１０分間、メタノール／Ｈ2Ｏ2で阻止した。
【００５０】
細胞培養
ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）からの一次培養物を、（４）に記載されたようにコラゲナーゼ処理して臍帯静脈から得た。４〜６の調製物からの細胞を混合し、２％のＦＣＳ、１μｇ／ｍｌのヒドロコルチゾン、０．１ｎｇ／ｍｌのｈＥＧＦ、１．０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ、５０μｇ／ｍｌのゲンタマイシンおよび２．５μｇ／ｍｌのアンホテリシンＢを含む完全内皮細胞生育培地（ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ）中の２４穴培養プレートにて培養した。
【００５１】
ヒト内皮細胞株ＥＣＶ３０４（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ，ＵＳＡ）を、１０％のＦＣＳ、１％のピルビン酸ナトリウム、１ｍＭのＬ−グルタミン、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ，Ｂｅｒｌｉｎ）を加えたＭ１９９中で培養した。菌体内毒素汚染を除くために、全ての晶質溶液を限外ろ過（Ｕ２００，Ｇａｍｂｒｏ，Ｈｅｃｈｉｎｇｅｎ）し、蛋白質の母液はポリミキシンカラム（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ，ＵＳＡ）で除染を行った。菌体内毒素汚染を除外するために、全ての細胞懸濁液を全ての試験後に色素生産性Ｌｉｍｕｌｕｓ変形細胞溶解測定法（Ｓｃｈｕｌｚ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ）により評価した。
【００５２】
ＭＣＰ−１の測定
ＨＵＶＥＣの上澄み液中に存在するＭＣＰ−１蛋白質の濃度はＥＬＩＳＡ法（Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ  Ｒ＆Ｄ，Ｗｉｅｓｂａｄｅｎ−Ｎｏｒｄｅｎｓｔａｄｔ）で定量した。
【００５３】
内皮単層と血小板との共培養
非喫煙者であり、血小板機能に影響を及ぼすことで知られるいかなる薬剤の影響下にもない健常な個人から収集した酸性クエン酸塩ブドウ糖液抗凝固全血から血小板を単離した。当該血小板を洗浄し、（５）に記載された血小板数４×１０8／ｍｌを供するためにタイロード液／ＨＥＰＥＳ緩衝液（ＨＥＰＥＳ  ２．５ｍＭ、ＮａＣｌ  １５０ｍＭ、ＮａＨＣＯ3  １２ｍＭ、ＫＣｌ  ２．５ｍＭ、ＭｇＣｌ2  １ｍＭ、ＣａＣｌ2  ２ｍＭ、Ｄ−グルコース  ５．５ｍＭ、１ｍｇ／ｍｌ  のＢＳＡ、ｐＨ７．４）の中に再懸濁させた。血小板は２Ｕ／ｍｌのα−トロンビン（Ｓｉｇｍａ，Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）により２０分間前刺激をし、次いで５Ｕ／ｍｌのヒルジン（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）にてトロンビン中和化を行った。血小板活性化は、Ｐ−セレクチン表面発現および活性化フィブリノーゲンの受容体（ＬＩＢＳ−１、Ｄｒ．Ｍａｒｋ  Ｇｉｎｓｂｅｒｇ，Ｓｃｒｉｐｐｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ，ＵＳＡ）を確認することにより実証した。１ｍｌの血小板懸濁液を、１ｍｌの完全培地に加え（最終血小板数２×１０8／ｍｌ）、６穴プレート上の集密的ＨＵＶＥＣ単層を含有する穴に移した。当該細胞は非処理のままに置くか、或いは前述の如く３７℃で血小板とインキュベーションした。
【００５４】
最終的に、当該血小板を数回注意深い洗浄工程で除去し、培地を当該細胞に当該インキュベーション時間が経過するまでに加えた。血小板特異抗ＣＤ４２ｂ  ｍＡｂを用いた予備研究において、洗浄プロセスで全ての血小板が内皮単層から除去されたのを顕微鏡およびフローサイトメトリーで確かめた。
【００５５】
電気泳動移動度シフト測定法（ＥＭＳＡ＝ゲル・リタデェーション・アッセイ）
当該細胞の核抽出物を作成し、先行技術（６）に記載されているように分析した。プロトタイプの免疫グロブリンκ−鎖オリゴヌクレオチドをプローブとして用い、ＤＮＡポリメラーゼＩのＫｌｅｎｏｗ断片（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）で標識した。核蛋白質を、［α−32Ｐ］ｄＣＴＰ（ＮＥＮ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｂｒｕｓｓｅｌｓ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）により放射能標識したプローブと、バインディング緩衝液（６）中にて室温で３０分間インキュベーションした。試料は、非変性性４％ポリアクリルアミドゲル上に、０．２５×ＴＢＥに流し込んだ。転写因子Ｓｐ−１の結合は、［γ−32Ｐ］ＡＴＰ（ＮＥＮ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）で標識してあるコンセンサスオリゴヌクレオチド（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ）およびＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を用いて分析した。ゲルは乾燥して、オートラジオグラフィーで分析した。
【００５６】
ＰＡＧＥおよびウエスターンブロット分析
細胞質抽出物を単離し、先行技術（６，７）で記述されているように電気泳動およびブロッティングを実施した。移動後、当該膜をＩκＢ−α（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ）、ＩκＢ−ε（Ｐｒｏｆ．Ｎ．Ｒｉｃｅ，ＮＩＨ，Ｆｅｄｅｒｉｃｋ，ＭＤ）、ＩＫＫ−α、ＩＫＫ−β（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）またはα―アクチン（Ｓｉｇｍａ）に対する抗体とともにインキュベーションした。当該蛋白質をウエスターンブロット化学蛍光試薬（ＮＥＮ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）を用いてＸ線フィルム上で可視化した。蛋白質のサイズは、分子量標準品（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ，Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｍｕｎｉｃｈ）により確認した。
【００５７】
免疫沈降法およびキナーゼ測定法
細胞質抽出物につき、１ｍＭのジチオスレイトール、０．５μＭのフッ化４−（２−アミノエチル）−ベンゼンスルホニル（ＡＥＢＳＦ）および、各々０．７５μｇ／ｍｌのロイペプチン、アンチパイン、アプロチニン、ペプスタチンＡとキモスタチン（Ｓｉｇｍａ）を含有するＴＮＴ緩衝液中で免疫沈降（ＩＰ）（７）を行った。非特異的結合は、１μｇの通常ウサギＩｇＧ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）および２５μｌの６％蛋白質Ａ−アガロース（Ｒｏｃｈｅ−Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）と４℃にて３０分間インキュベーションして阻止し、次いで適当な１μｇの抗キナーゼ抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）と４℃で２時間免疫沈降を行った。その度毎に、ＴＮＴおよびキナーゼの緩衝液（２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ８．０；１０ｍＭのＭｇＣｌ2、１００μＭのＮａ3ＶＯ4；２０ｍＭのβ−グリセロリン酸；５０ｍＭのＮａＣｌ；２ｍＭのジチオスレイトール；０．５μＭのＡＥＢＳＦ；各々０．７５μｇ／ｍｌのロイペプチン、アンチパイン、アプロチニン、ペプスタチンＡ、キモスタチン）で３回洗浄した後、沈降させた蛋白質をキナーゼ測定法で分析した。当該反応は５μＣｉの［γ−32Ｐ］ＡＴＰ（ＮＥＮ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）およびＧＳＴ−ＩκＢ−α（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）の存在下、３０℃で３０分間実施した。蛋白質はＰＡＧＥで分析し、オートラジオグラフィーにより可視化した。
【００５８】
内皮細胞の形質移入
以下のレポータープラスミドを形質移入にて使用した。
−３×κＢ−ｌｕｃｉ
プロトタイプκＢ部位（７）の３コピーを含有するツチボタルのルシフェラーゼレポータープラスミド
−ＶＣＡＭ−１．ｌｕｃｉ
ＶＣＡＭ−１プロモーター領域の１８１１塩基対（Ｄｒ．Ｎｉｇｅｌ  Ｍａｃｋｍａｎ，Ｓｃｒｉｐｐｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を含んでいるレポータープラスミド
−ＭＣＴ−１．ｌｕｃｉ
ヒトＭＣＰ−１遺伝子（８，９）（Ｄｒ．Ｔｅｉｚｏ  Ｙｏｓｈｉｍｕｒａ，ＮＩＨ，Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ，ＭＤ）の近位プロモーターおよび遠位エンハンサー領域を含有するレポータープラスミド
【００５９】
以下の過剰発現プラスミドを使用した。
−ＩＫＫ−α
−ＩＫＫ−β
−ＮＩＫ
（野生型および変異型、キナーゼ不活性形、Ｄｒ．Ｍｉｋｅ  Ｒｏｔｈｅ，Ｔｕｌａｒｉｋ  Ｉｎｃ．，Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）。
【００６０】
ｅｍｐｔｙ  ＲｃＣＭＶ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｇｒｏｎｉｎｇｅｎ，Ｈｏｌｌａｎｄ）を、陰性対照として用いた。これらのプラスミドは、別個或いは組合せて先行技術（１０）に記載されているように内皮細胞中にて構造的に活性なウミシイタケ（Ｒｅｎｉｌｌａ）ルシフェラーゼコントロールプラスミドＰＲＬｔｋ（Ｐｒｏｍｅｇａ）と一過性に同時形質転換を行った。２４時間後、当該細胞をＩＬ−１βまたは血小板で６０分間刺激し、次いで更に１５時間培養した。刺激後、当該細胞を溶解し、ルシフェラーゼ活性を二元ルシフェラーゼレポーター測定系（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて測定した。結果を、ホタルとウミシイタケのルシフェラーゼの相対発光量（ＲＬＵ）比率として表した。
【００６１】
組換えアデノ随伴ウイルスの構築および精製
プラスミドｐＴＲ−ＵＦ５は、Ｄｒ．Ｍｕｚｙｃｚｋａ（Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  Ｃｅｎｔｅｒ，Ｇａｉｎｓｖｉｌｌｅ，Ｆｌｏｒｉｄａ）（１１，１２）から提供を受け、プラスミドｐＤＧは、Ｄｒ．Ｋｌｅｉｎｓｃｈｍｉｄｔ（Ｄｅｕｔｓｃｈｅｓ  Ｋｒｅｂｓｆｏｒｓｃｈｕｎｇｓｚｅｎｔｒｕｍ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）（１１，１３）から提供された。緑色蛍光蛋白質（ｒＡＡＶ−ＧＦＰ）、ヒト野生型ＩＫＫ−１β（ｒＡＡＶ−ＩＫＫ−β）または変異型ＩＫＫ−βKA（ｒＡＡＶ−ＩＫＫ−βKA）を含有する、組換え体である、複製欠陥アデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）を以下のように構築した。
野生型または変異型の型のＩＫＫ−βのコード配列を、ｐＴＲ−ＵＦ５ベクターのポリリンカー配列中に挿入した。次いで、得られたプラスミドを、半集密的ＨＥＫ２９３細胞中で修正リン酸カルシウム共沈降法を用いてｐＤＧプラスミドと同時形質転換し、ｒＡＡＶの産生を、先行技術（１３，１４）に記載されているように実施した。感染ウイルス粒子（ＩＶＰ）の力価は、増殖Ｈｅｌａ細胞の感染で評価した。
【００６２】
内皮細胞の形質導入
ＨＵＶＥＣを、２００μｌの培養培地が入った９６穴プレートに、穴当たり１０4細胞培養した。半集密的状態で、約１６から２４時間後に１×１０3〜３×１０3のｒＡＡＶの感染ウイルス粒子（ＩＶＰ）を各細胞に加えた。培地はｒＡＡＶ添加後１６時間目で交換し、形質導入した細胞を、更に４８時間培養した。当該細胞はその後ＩＬ−１βまたはα−トロンビン活性化血小板で６０分間刺激し、ＭＣＰ−１の分泌を４時間後に評価した。内皮のｒＡＡＶ−ＧＦＰ形質導入の効率はフローサイトメトリー、蛍光顕微鏡およびウエスターンブロット法により評価した。
【００６３】
（結果）
生体内での血小板相互作用
本実施例で使用した虚血のマウスモデルは、生体内顕微鏡で可視化することで様々な形式の血小板接着を区別することを可能とする。
【００６４】
生体内の生理的状態においては、循環している血小板は殆ど微小血管内皮と相互作用を起こさない（図１ＡおよびＢ、休止）。ほんの少しの血小板が細動脈の内皮細胞被覆に沿ってローリングしているのが観察された（＜１／ｓ／ｍｌ）。同時に、内皮細胞表面のｍｍ2当たり３８±１６個の血小板だけが堅固に接着しているのが見出された。
【００６５】
対照的に、虚血状態（６０分間の虚血）にある動脈で同じ測定を行うと、血小板−内皮細胞接着が劇的に増加するのが見られた（図１ＡおよびＢ、活性化）。虚血内皮へのローリング相互作用の場合で約１６０倍の増加が見られ、堅固な接着については、１３倍の増加が見られた（ｐ＜０．０１）。
【００６６】
血小板の内皮への堅固な接着が顆粒分泌を誘導する
血小板が生体内血管内皮に接着するときの血小板に生じる形態的変化を研究するために、電子顕微鏡による検討を行った。内皮細胞層に欠陥を認めることなく、凝集体が存在しない状態でも、個々の血小板が内皮細胞に接着することが見出された（図２）。これらの血小板は緩やかに内皮細胞に接着し（ローリング血小板）、未だに脱顆粒していない完全顆粒の典型的パターンを示した（図２Ａ）。これと対照的に、内皮細胞表面上に広がる血小板（堅固な接着）は、それらの領域で空のオルガネラが見出されることで証明されるように、それら顆粒の強力な分泌によって特徴付けられる（図２Ｂ）。
【００６７】
ＮＦ−κＢは血小板接着の領域内で微小血管にて活性化される
生体外の研究から、活性化血小板の内皮細胞との相互作用（永続的共培養）が、ＮＦ−κＢの活性化によりケモカインおよび接着分子の遺伝子発現を導くことが知られている。微小血管において増加した血小板−内皮接着の領域における、その転写因子の活性化を研究するために、クライオスタット切片に対し、ＩκＢにより遊離されたＮＦ−κＢ  ｐ６５サブユニットに対するｍＡｂを用いて、免疫組織化学処理を実施した。偽性マウスにおいては、ＮＦ−κＢの活性は、ほぼ完全に欠失している（図３Ａ、休止）。血小板−内皮の相互作用が増加した状態では、ｐ６５標識で示される活性化ＮＦ−κＢの免疫反応性が微小血管系で増加しているのが観察され（図３Ｂ、活性化）、血小板凝集体（図３Ｃ）に近接した内皮単層で顕著であった。これは血小板の内皮への接着が増加すると、生体内でのＮＦ−κＢの活性化が導かれることを示す。
【００６８】
ＨＵＶＥＣの活性化血小板との一過性のインキュベーションはＭＣＰ−１の分泌を誘導する
血小板接着を示す領域では活性化ＮＦ−κＢが相当量見られるので、活性化血小板の培養ＨＵＶＥＣに対する効果を検討した。最初に、ＮＦ−κＢ（８，９）により制御されるケモカインＭＣＰ−１の血小板誘導内皮分泌のタイムコースを生体外で検討した。ＨＵＶＥＣの集密的単層は未処置のままに置くか、或いはα−トロンビン活性化血小板、１００ｐｇ／ｍｌのＩＬ−１βまたは１．６７ｎｇ／ｍｌのＴＮＦと共に、５〜３００分間インキュベーションした。その後、血小板またはサイトカインを内皮単層から除去して、上澄み液中のＭＣＰ−１の量を、更に４時間インキュベーション（短時間共培養）した後に定量した。
【００６９】
ＨＵＶＥＣの活性化血小板との３０分間の一過性のインキュベーションにより、ＭＣＰ−１分泌が非常に増大され、それは、ＩＬ−１β刺激（図４）に匹敵する程度であった。ＴＮＦによる効果の方が僅かにより弱かった。ＨＵＶＥＣと休止血小板とのインキュベーションは、ＭＣＰ−１分泌には顕著な増加を誘導しなかった。
【００７０】
血小板とインキュベーションした後の内皮ＮＦ−κＢ活性およびＩκＢ−α／ε蛋白質分解パターン
活性化血小板がＭＣＰ−１のようなＮＦ−κＢ標的遺伝子産物の発現を誘導する機構を、より明らかにするために、ＥＭＳＡにより測定してＮＦ−κＢ活性を観察する時間経過実験を実施した。活性化血小板は、ＨＵＶＥＣ中のＮＦ−κＢの活性化を強く且つ時間依存的に誘導し、最大効果は６０分後に観察された（図５Ａ）。同じ核抽出物において、ローディングコントロール（図５Ａ）として作用するＳｐ−１オリゴヌクレオチド類への蛋白質の結合についても検討した。
【００７１】
次いで、ＩκＢ阻害剤蛋白質の血小板誘導蛋白質分解時間および当該分解範囲を検討した。ＨＵＶＥＣを活性化血小板およびＩＬ−１βとインキュベーションすると、ＩκＢ−αおよびＩκＢ−ε（図５ＢおよびＣ）の顕著な蛋白質分解を生じた。両者の刺激後に起こるＩκＢ蛋白質の分解パターンは類似するが、相違点が観察された。
ＩκＢ−αは、ＩＬ−１βを作用させた後、分解がインキュベーション後１５分に開始し、約３０分後に分解が観察される血小板刺激の場合より幾分急速であった。それとは逆に、血小板はＩＬ−１βより早期にＩκＢ−ε分解を誘導した（顕著な効果：６０分に対し３０分）。これとは明らかに異なって、ＴＮＦはＨＵＶＥＣにおいて両ＩκＢ蛋白質のより急激な分解を誘導した（図５Ｄ）。
【００７２】
血小板、ＩＬ−１βまたはＴＮＦによる刺激後の内皮細胞における異なるＩＫＫ複合体活性
これらの分解に先だって、ＩκＢ蛋白質がリン酸化されるが、このプロセスはＩＫＫ複合体により引き起こされる。このキナーゼ系に対する血小板の効果を特徴付けるために、生体外キナーゼ測定法を使用した。ＨＵＶＥＣは細胞質抽出物を作成する前に、活性化血小板、ＩＬ−１βまたはＴＮＦで前示した期間刺激した。免疫沈降はＩＫＫ−α抗体またはＩＫＫ−β抗体により実施し、当該キナーゼ活性は、ＧＳＴ−ＩκＢ−αのリン酸化状態を測定して決定した。
血小板とのインキュベーションは、ＩＫＫ複合体の顕著な活性化を誘導し、３０分で最大リン酸化レベルとなり、６０分以内で急速にベースラインまで低下した（図６ＡおよびＤ）。類似の結果がＩＬ−１βをＨＵＶＥＣに添加したときに得られるが、４５分に活性ピークが認められ、少なくとも９０分間活性を維持するという違いがあった（図６ＢおよびＤ）。ＴＮＦをＨＵＶＥＣ刺激に用いると、ＩＫＫの活性化が２．５分以内に急速に始まり、２０分以内に低い値に戻った（図６ＣおよびＤ）。ＩＫＫ−αおよびβのレベルはこれらの条件下では一定であった（図５ＢおよびＣ）。同様な結果はＥＣＶ３０４細胞を用いても得られた。
【００７３】
ＩＫＫ−αおよびＮＩＫは血小板誘導のＮＦ−κＢ活性化に関与する
ＮＦ−κＢに関連するシグナルカスケードにおけるＩＫＫおよびＮＩＫ蛋白質の役割を研究するために、血小板またはＩＬ−１βによる刺激に先立って，κＢルシフェラーゼレポータープラスミドとともに野生型若しくは変異型のＦｌａｇ標識キナーゼ過剰発現ベクターを用いてＥＣＶ３０４を形質転換した。抗Ｆｌａｇ抗体を用いるウエスターンブロット法により、関連する系においては特定の蛋白質が過剰発現し、挿入なしの対照ベクターは非特異的Ｆｌａｇ標識を示さないことを確認した。追加的実験により、Ｆｌａｇ標識沈降蛋白質がキナーゼ活性で、変異体は活性を示さないことを示した。ＮＩＫを過剰表現すると、ＣＭＶ対照に比べて３×κＢ．ｌｕｃｉのめざましい誘導が観察され、それは当該細胞を活性化血小板またはＩＬ−１βとのインキュベーションで更に増加した（図７ＡおよびＢ、左側の欄）。変異ＮＩＫの形質移入は、野生型誘導シグナルおよび更なる刺激による追加的増加の両方によって本効果の劇的な減少を生じた。また、野生型ＩＫＫ−αおよび−βの同時形質転換は、３κＢ．ｌｕｃｉプラスミドに直接的効果をもたらし、それは血小板またはＩＬ−１βによる刺激で顕著により強くなった（図７ＡおよびＢ、左側欄）。ＩＫＫ−αおよび−βの両変異体における同時の過剰発現は、直接的効果および刺激誘導効果の双方を阻害して血小板誘導信号が完全に消失した。その一方で、ＩＬ−１βについては弱い効果が観察された。当該キナーゼを、組み合わせではなく個々に発現した場合、血小板またはＩＬ−１βとインキュベーションしたところ、ＩＫＫ−βKAによる顕著な阻害が見出された。ＩＫＫ−αKAは血小板についてのみ阻害効果を示すが、ＩＬ−１β刺激細胞については示さなかった。
【００７４】
変異ＩＫＫ−αおよびβの過剰発現の血小板誘導またはＩＬ−１β誘導プロモーター依存転写に対する効果についても検討した。
ＥＣＶ３０４を、野生型または変異型のキナーゼに関する過剰発現ベクターと共にＭＣＰ−１またはＶＣＡＭ−１κＢキャリングプロモーター断片を含有するルシフェラーゼレポータープラスミドで形質転換した。この場合において、ＩＫＫ−αKAではなく、ＩＫＫ−βKAのみが、それらのプロモーターの調節下における血小板誘導またはＩＬ−１β誘導の転写に著しい減少を生じた（図７Ｃ）。
【００７５】
ＩＫＫ−βKA過剰発現はｒＡＡＶを形質導入したＨＵＶＥＣにおけるＭＣＰ−１の血小板誘導分泌を阻害する
蛋白質レベルにおけるＩＫＫ−βKA過剰発現の効果を示すために、組換えアデノ随伴ウイルス系において野生型または変異型のＩＫＫ−β配列をクローン化した（１３、１４）。最初に、ｒＡＡＶが一次ＨＵＶＥＣ培養物を形質導入できるかどうかを試験するために検討を行った。半集密的内皮単層をｒＡＡＶ−ＧＦＰと１６時間インキュベーションし、更に４８時間細胞培養した後、移入させたＨＵＶＥＣ中のＧＦＰの発現をフローサトメトリーおよび蛍光顕微鏡により分析した（図８ＡおよびＢ）。実施条件下では、約５０％の効率にてＨＵＶＥＣの実質的な形質導入が見出された。これは従来の形質導入法を用いたとき、ＨＵＶＥＣでの形質導入が約５から１０％であるのに対比して有利である。ｒＡＡＶ系によるＩＫＫ−βの過剰発現を、ウエスターンブロット分析を用いて確認した（図８Ｃ）。ＩＫＫ−βおよびＩＫＫ−βKAの過剰発現の効果を検討するために、ＨＵＶＥＣを、これら蛋白質をコードするｒＡＡＶまたは対照ｒＡＡＶ−ＧＦＰで形質導入した。最初のインキュベーションの後、更に４８時間の培養を行った。その後、形質導入細胞を、活性化血小板またはＩＬ−１βにて６０分間処理し、ＭＣＰ−１の分泌を４時間後に測定した。ｒＡＡＶ−ＩＫＫ−βKAにより形質導入された細胞は、ｒＡＡＶ−ＧＦＰまたはｒＡＡＶ−ＩＫＫ−β処理細胞に比べて、血小板誘導またはＩＬ−１β誘導のＭＣＰ−１分泌が顕著な減少を示した（図８Ｄ）。これらの結果は、ｒＡＡＶ系およびそれによって得られる高形質移入効率が、蛋白質濃度の測定によって、負優性（dominant-negative）変異ＩＫＫ−βKAが活性化血小板またはＩＫ−１βとの一過性の相互作用で誘導される内皮炎症遺伝子ＭＣＰ−１の発現を強く阻害するという直接的な証明を可能とする。
【００７６】
文献
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【図面の簡単な説明】
【００７７】
【図１】図１は、生体内での血小板−内皮細胞の相互作用を示す。血小板−内皮細胞の相互作用は、虚血状態（活性化）に陥ったマウス腸の微小血管系の細動脈につき生体内顕微鏡により検討した。偽性動物を対照とした（休止）。図１Ａ：血小板は先行技術で説明したように（１，２）内皮細胞とそれらの相互作用により分類した。：ローリング（ｒｏｌｌｉｎｇ）血小板は１秒および容器直径のｍｍ当たりの細胞数として与えられる（ローリング）；接着血小板は容器表面のｍｍ2当たりの数として与えられる（堅固な接着）。平均値±平均値の標準誤差（ＳＥＭ）、ｎ＝６群当たりの試験動物、*ｐ＜０．０１みせかけとの比較（Ｄｕｎｎ’ｓ法）。図１Ｂ：生体内蛍光検鏡を用いて細動脈におけるローダミン−６Ｇ−標識血小板を視覚化した。みせかけ動物では僅かな血小板だけが内皮に接着するだけだが、虚血状態における血小板の内皮細胞への接着は顕著に増加している。画像拡大率：４５０倍
【図２】図２は、血小板−内皮単層接着を電子顕微鏡で視覚化したものを示す。電子顕微鏡は傷ついていない虚血後の内皮単層に接着する血小板を示すのに用いた。図２Ａ：内皮に緩やかに接触しているローリング血小板を示す。当該血小板顆粒の通常の外見および通常の分布に注目する。図２Ｂは内皮単層に堅固に接着した血小板を示す。広がり、堅固な接着が生じている領域では、当該血小板から生じる化合物の放出を示す当該血小板の顕著な脱顆粒が起こる。拡大率：２０，０００倍。縮尺バーは１０μｍを表す。
【図３】図３は、内皮への血小板の接着がＮＦ−κＢの活性化に関連することを示す。内臓試料のクライオスタット切片をＩκＢにより解放されたｐ６５（＝活性化ＮＦ−κＢ）に対するモノクローナル抗体（ｍＡｂ）と共にインキュベーションし、ペルオキシダーゼ−抗ペルオキシダーゼ手法による染色を引き続き行った。ｐ６５免疫反応性は赤い反応生成物で示す（図では濃色である）。図３Ａ：対照動物（休止）においては、血管内皮におけるｐ６５の免疫反応性は非存在物と同程度に良好である。図３Ｂ：増加した血小板−内皮の接着（活性化）についての実験では、細動脈および周辺組織におけるｐ６５染色の程度が増加して見出される。図３Ｃ：図３Ｂの一部を拡大して示した相当量の血小板集積領域では、ＩκＢにより解放されたｐ６５が内皮単層に支配的に存在していた（矢印）。拡大率：図３Ａおよび３Ｂでは４０倍であり、図３Ｃでは１００倍である。縮尺バーは１０μｍを示す。
【図４】図４は、ＭＣＰ−１の分泌に対する、ＨＵＶＥＣと活性化血小板の一時的相互作用の効果を示す。ＨＵＶＥＣを５〜３００分間、α−トロンビン活性化血小板（ＰＬＴ；２×１０8／ｍｌ）、ＩＬ−１β（１００ｐｇ／ｍｌ）またはＴＮＦ（１．６７ｎｇ／ｍｌ）の在り無しの何れかで処理した。当該血小板類またはサイトカイン類はその後洗浄して除去し、新しい培地を加えた。当該細胞は全体で５時間培養した。当該上澄み液をその後吸引で除去し、ＭＣＰ−１測定する際にＥＬＩＳＡにおいて使用した。当該曲線は４回の別々の実験からの平均値±標準偏差を示し、その各々は３回行った。
【図５】図５は、ＨＵＶＥＣにおける刺激依存性ＮＦ−κＢ活性化およびＩκＢの分解を示す。図５Ａ：血小板で刺激されたＨＵＶＥＣからの核抽出物（ＰＬＴ；２×１０8／ｍｌ）を、ＮＦ−κＢまたはＳｐ−１の結合につきＥＭＳＡにて試験をし、これを括弧内に示す。図５Ｂ：血小板で刺激した細胞からの細胞質抽出物はウエスターンブロット法により分析した。蛋白質ＩκＢ−α、ＩκＢ−ε、ＩＫＫ−αおよびＩＫＫ−βは矢尻印で示す。α−アクチンを負荷対照として使用した。図５Ｃ：ＩＬ−β（１００ｐｇ／ｍｌ）で刺激した細胞からの細胞質抽出物をウエスターンブロット法で試験を行った。図５Ｄ：細胞をＴＮＦ（１．６７ｎｇ／ｍｌ）とインキュベーションし、細胞質抽出物をウエスターンブロット法で試験をした。上の矢印はＩκＢ−α、ＩκＢ−εのリン酸化形を示す。代表的ブロットを全ての場合につき示した（ｎ＝３）。
【図６】図６は、内皮細胞における相違するＩＫＫ複合体活性化を示す。細胞は前述のようにインキュベーションし、細胞質抽出物を作成した。前述したように抗キナーゼ抗体による免疫沈降に次いで32Ｐ−ＡＴＰの存在下で基質にＧＳＴ．ＩκＢ−αを用いたキナーゼ測定法を実施した。当該基質の時間依存のリン酸化を、ＨＵＶＥＣ（図６Ａ）の血小板（ＰＬＴ；２×１０8／ｍｌ）、ＩＬ−１β（１００ｐｇ／ｍｌ）（図６Ｂ）またはＴＮＦ（１．６７ｎｇ／ｍｌ）（図６Ｃ）による刺激後の各々の場合について示す。代表的な実験を各場合につき示す（ｎ＝３）。図６Ｄ：当該キナーゼ測定法を走査し、濃度計で分析した。図表は刺激後におけるＩＫＫ活性誘導の因子を対照と比較して示す。
【図７】図７は、κＢ依存およびＭＣＰ−１／ＶＣＡＭ−１プロモーター依存の転写がドミナントネガティブＩＫＫ複合体成分の過剰発現により阻害されることを示す。図７Ａおよび図７Ｂ：ＥＣＶ３０４細胞は３ｋＢ．ｌｕｃｉ、ｐＲＬｔｋおよびキナーゼ過剰発現プラスミド（ＩＫＫ−α、βまたはＮＩＫ、野生型または変異型の型、または空のベクターであるＣＶＭ）と前述のような一または二重の形質転換において同時形質転換を行った。一夜のインキュベーション後、当該細胞は活性化血小板（ＰＬＴ；１０８／ｍｌ）（図７Ａ）或いはＩＬ−１β（１００ｐｇ／ｍｌ）（図７Ｂ）で６０分間刺激した。更に１５時間後、当該細胞を溶解してツチボタル（ｇｌｏｗ  ｗｏｒｍ）およびウミシイタケ（Ｒｅｎｉｌｌａ）の相対発光量（ＲＬＵ）を測定した。当該結果は非刺激ＣＭＶ形質転換細胞で得られたものと比較した複合の誘導として示す。左側の縦線は刺激誘導κＢ依存形質転写に対する野生型（ｗｔ）または変異型ＮＩＫの効果およびＩＫＫ−αおよび−βの効果を示す。代表的実験を示す（ｎ＝３）。Ｃｏｎ：非刺激の細胞。図７Ｃ：細胞は前述したように発現プラスミドによりｐＲＬｔｋおよびＩＫＫと共にＭＣＰ−１−プロモーター依存ルシフェラーゼレポータープラスミドまたはＶＣＡＭ−１−プロモーター依存ルシフェラーゼレポータープラスミドのいずれかにより形質転換した。血小板またはＩＬ−１βによる刺激後、ツチボタルおよびウミシイタケのＲＬＵを測定した。当該結果は点線１００％で示す野生型（ｗｔ）で形質転換した細胞との比較で得られた阻害のパーセントとして示した。当該縦線は３回の別個の実験で得た平均値±標準偏差を示す。α、ＩＫＫ−α；β、ＩＫＫ−β：ＫＡ、当該キナーゼ部位は変異している。
【図８】図８は、ｒＡＡＶが仲介するドミナントネガティブＩＫＫ−β伝達が血小板誘導およびＩＬ−１βが誘導する内皮ＭＣＰ−１分泌を阻害する。ＨＵＶＥＣの半集密的を未処理のままで置くか、または対照ｒＡＡＶ−ＧＦＰ、野生型ｒＡＡＶ−ＩＫＫ−β或いはドミナントネガティブ変異株ｒＡＶＶ−ＩＫＫ−βKAで形質転換した。形質転換後４８時間目に、当該細胞は未処理のままで置くか、または活性化血小板（ＰＬＴ；２×１０8／ｍｌ）またはＩＬ−１β（１００ｐｇ／ｍｌ）で６０分間刺激し、洗浄して前述の如く更に培養した。図８Ａ：当該細胞は形質転換効率を測定するためにＧＦＰ発現につきフローサイトメトリーを用い試験をした。“非感染”と記された曲線は非感染細胞を示し、“ｒＡＡＶ−ＧＦＰ感染”と記された曲線はｒＡＡＶ−ＧＦＰで処理した細胞を示す。ＨＵＶＥＣの約５０％はｒＡＡＶ−ＧＦＰで感染していた。図８Ｂ：ＧＦＰ発現は蛍光顕微鏡で分析した。上図：ＨＵＶＥＣ単層の位相差の対比；下図：相当する緑色蛍光（輝点）顕微鏡検査。図８Ｃ：ｒＡＡＶ−ＩＫＫ−β、ｒＡＡＶ−ＩＫＫ−βKAまたはｒＡＡＶ−ＧＦＰにより形質転換したＨＵＶＥＣの細胞質抽出物を内生的ＩＫＫ−β蛋白質（ＧＦＰ）および過剰発現ＩＫＫ−β蛋白質につきウエスターンブロット法により試験をした。α−アクチンは負荷対照として使用した。図８Ｄ：洗浄後４時間目に、当該細胞の上澄み液中の溶解ＭＣＰ−１をＥＬＩＳＡ法により定量した。当該データは２回実施した３種の実験の各々につき平均値±標準偏差で示した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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