(57)【要約】本発明は、無菌の培養装置にて造血系前駆細胞を培養することを含んでなる成熟した且つ安定した樹状細胞又は未成熟な樹状細胞を産出する方法、前記方法に好適な装置及び樹状細胞の培養に好適である末梢血単核細胞の調製方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＧＭＰ（製品管理及び品質管理規則）の指針に準拠して成熟した且つ安定した樹状細胞又は未成熟の樹状細胞を産出する方法であって、少なくとも一種の樹状細胞分化／成熟因子の存在下にて無菌の培養装置で造血系前駆細胞を培養することを含んでなり、前記培養装置は、増殖領域を形成する拡張された内部表面（２２、４８）を有し、それによって細胞が該表面（２２、４８）に付着する閉鎖容器を含んでなる方法。
【請求項２】
容器が少なくとも２つの流状連通試験槽（１６；４９、５０、５２）を含み、各試験槽（１６；４９、５０、５２）が増殖領域を含む請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記試験槽（１６）は盆状の手段（１０）により形成され、隣接する盆状の手段（１０）の底表面（１２）、好ましくは前記盆状の手段は平面の底表面（１２）を有する請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記試験槽（１６）は、前記盆状の手段（１０）の積み重ねにより形成される請求項３に記載の方法。
【請求項５】
流状接続のための前記手段（１８、６４）が隣接する試験槽（１６；５０、５２）を接続する請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
各試験槽（１６）が、少なくとも１つの入口開口部及び１つの出口開口部（３０）を含み、好ましくは前記の少なくとも１つの入口開口部が注入／排出装置（１３０）に接続され、及び／又は前述の少なくとも１つの出口開口部がフィルター（１２８）に接続される請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記の主入口開口部（３６、３７）を介して第１の試験槽（１６、５２）に流体を送達し、当該第１の試験槽（１６、５２）から次に隣接する試験槽（１６、５０）などに送達することができるように、装置が共通する１つの主入口開口部（３６、３７）を有する請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
容器の拡張された内部表面（２２、４８）が１以上の規則正しい又は不規則な形状の構造体又は粒子により形成され、それによって、細胞が容器の内部表面及び／又は前記粒子の表面に付着する請求項１に記載の方法。
【請求項９】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法であって、
（ｉ）前記試験槽が、プラスチック類、好ましくは、ポリカーボネート、ポリスチレン、又はポリオレフィンから作られ、及び／又は
（ｉｉ）容器の内部表面、好ましくは、盆状の手段（１０）を含む内部表面及び規則正しい又は不規則な形状の構造体又は粒子の表面の増殖領域が付着介在性作用物で被覆され、及び／又は
（ｉｉｉ）容器の内部表面の有効な増殖面積が２５〜１００００ｃｍ2の間、好ましくは５００〜５０００ｃｍ2の間である、前記方法。
【請求項１０】
付着介在性作用物が、ＩｇＧの被覆を含むＩｇの被覆、並びに抗ＣＤ１４抗体又は抗ＣＤ１６抗体による被覆を含む細胞表面タンパク質に対する抗体による被覆から選択される請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法であって、造血系前駆細胞が、多能性細胞、樹状細胞前駆細胞又は未成熟の樹状細胞であり、好ましくは、前記造血系前駆細胞が、
（ｉ）ＣＤ１４+単核細胞（単球）から、ＣＤ３４+細胞から、又は直接血液から得られる、及び／又は
（ｉｉ）白血球分離採取法産物、懸濁分離（エルトリエーション）プロトコール、末梢で採取した血液又は骨髄に由来する
樹状細胞前駆細胞である、前記方法。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法であって、培養が、
（ｉ）末梢血単核細胞を培養試験槽に適用し、試験槽の内側表面にそれらを付着させること、
（ｉｉ）非付着性細胞を除くために試験槽を洗浄すること、
（ｉｉｉ）前記少なくとも１種の樹状細胞分化／成熟因子を含む培養培地にて付着性細胞を培養すること、及び任意で
（ｉｖ）さらなる分化／成熟因子を培養培地に添加すること、及び又は
（ｖ）培養培地を除き、付着性細胞を洗浄し、工程（ｉｉｉ）と同一の又は異なった樹状細胞成熟因子を含む培養培地で付着性細胞を培養すること
を含んでなる、前記方法。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法であって、培養が、
（ｉ）増殖領域のｃｍ2当たり３ｘ１０5〜４ｘ１０6個の前駆細胞を負荷すること、及び／又は
（ｉｉ）増殖領域が、十分に、好ましくは１〜５ｍｍの培養培地で覆われるように培養培地をｃｍ2当たり０．０１〜３ｍｌ、好ましくは０．１〜０．５ｍｌ加えること
を含んでなる、前記方法。
【請求項１４】
請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法であって、前記少なくとも１つの樹状細胞成熟因子が、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＴＮＦ−α、ＰＧＥ2、ＩＮＦ−α、リポ多糖類及びそのほかの菌体産物（例えば、ＭＰＬ（モノホスホリル脂質Ａ）及びリポタイコ酸）、ホスホリルコリン、カルシウムイオノフォア、ホルボールエステル（例えば、ＰＭＡ）、熱ショックタンパク質、ヌクレオチド類（例えば、ＡＴＰ）、リポペプチド、トールライク受容体に対する人工リガンド、二本鎖ＲＮＡ（例えば、ポリＩ：Ｃ）、免疫刺激性ＤＮＡ配列、ＣＤ４０リガンドなどから成る群から選択され、好ましくは、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＴＮＦ−α及びＰＧＥ2の混合物である、前記方法。
【請求項１５】
増殖領域を形成する拡張された内部表面（２２、４８）を有する閉鎖系容器を含んでなり、それによって細胞が表面（２２、４８）に付着する、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の成熟した且つ安定した樹状細胞を産出するのに使用するための装置。
【請求項１６】
容器が少なくとも２つの流状に連通する試験槽（１６；４８、５０、５２）を含み、各試験槽（１６；４８、５０、５２）が増殖領域を含むことを特徴とする請求項１５に記載の装置。
【請求項１７】
前記増殖領域が平坦な表面（２２、４８）を有することを特徴とする請求項１６に記載の装置。
【請求項１８】
容器が連通位置に配置されれば、流体が前記試験槽（１６；４８、５０、５２）の間で均等に分配されるように連通手段（１８、６４、８８）を前記試験槽（１６；４８、５０、５２）の間に配置することを特徴とする請求項１６又は１７に記載の装置。
【請求項１９】
容器が培養位置に配置されれば、流体が試験槽（１６；４８、５０、５２）の内側に保持されるように連通手段（１８、６４、８８）を前記試験槽（１６；４８、５０、５２）の間に配置することを特徴とする請求項１５〜１８のいずれか１項に記載の装置。
【請求項２０】
前記試験槽（１６）が、盆状の手段（１０）及び隣接する盆状の手段（１０）の底表面（１２）により形成されることを特徴とする請求項１５〜１９のいずれか１項に記載の装置。
【請求項２１】
前記試験槽（１６）が、前記盆状の手段（１０）の積み重ねにより形成されることを特徴とする請求項２０に記載の装置。
【請求項２２】
流状接続（１８、６４）のための前記手段が、隣接する試験槽（１６；４８、５０、５２）を接続することを特徴とする請求項１５〜２１のいずれか１項に記載の装置。
【請求項２３】
各試験槽（１６）が少なくとも１つの入口開口部と１つの出口開口部（２０）とを含んでなることを特徴とする請求項１５〜２２のいずれか１項に記載の装置。
【請求項２４】
前記主入口開口部（３６、７６）を介して第１の試験槽（１６、５２）に流体を送達し、前記第１の試験槽（１６、５２）から次に隣接する試験槽（１６、５０）などに送達することができるように、容器が、共通する１つの主入口開口部（３６、７６）を有することを特徴とする請求項１５〜２３のいずれか１項に記載の装置。
【請求項２５】
前記主入口開口部（７６）が疎水性のフィルタ（８２）を有する蓋（８０）によって密封されることを特徴とする請求項２０〜２９のいずれか１項に記載の装置。
【請求項２６】
容器の拡張された内部表面（２２、４８）が１以上の規則正しい又は不規則な形状の構造体又は粒子によって形成されることを特徴とする請求項２０に記載の装置。
【請求項２７】
試験槽（９２）が気体透過性且つ液体透過性の表面を有し、好ましくは、前記試験槽（９２）が気体試験槽（１０２）に隣接することを特徴とする請求項１５〜２７に記載の装置。
【請求項２８】
注入／排出装置（１３０）が連通手段（１８）に接続可能であることを特徴とする請求項１５〜２８に記載の装置。
【請求項２９】
注入／排出装置（１３０）がバッグ（１３４、１３６、１３８）に接続可能である多数の接続用の管（１４２）を含むことを特徴とする請求項２９に記載の装置。
【請求項３０】
樹状細胞の培養に好適である末梢血単核細胞を白血球分離採取法産物から調製する方法であって、水又は塩化アンモニウム水溶液の添加によって白血球分離採取法産物の中で赤血球を細胞溶解することを含んでなる前記方法。
【請求項３１】
請求項３１に記載の方法であって、細胞溶解が水によって行われ、
（ａ）２０〜３０℃にて５〜３０秒間、細胞溶解を行い；及び／又は
（ｂ）白血球分離採取法産物と水との容積比が２０：１〜２：１であり、
又は
細胞溶解が塩化アンモニウム水溶液で行われ
（ａ）添加溶液における塩化アンモニウムの濃度が０．５〜５％(w/w)、好ましくは１〜３％(w/w)であり；及び／又は
（ｂ）２５〜５０℃にて５〜２０分間、細胞溶解を行い；及び／又は
（ｃ）白血球分離採取法産物と塩化アンモニウムとの容積比が２０：１〜２：１である、前記方法。
【請求項３２】
さらに、反応を停止すること、及び／又は細胞溶解産物を洗浄すること、及び／又はそれを培養培地もしくは塩の水溶液に懸濁することを含んでなる請求項３１又は３２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、無菌培養装置において造血系前駆細胞を培養することを含んでなる成熟し、且つ安定した樹状細胞又は未成熟樹状細胞を産出する方法、前記方法に好適な装置、並びに樹状細胞を培養するのに好適である末梢血単核細胞を調製する方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
関連技術の考察
樹状細胞（ＤＣ）は、抗原提示細胞の系を構成し、リンパ球と相互作用することによって免疫を制御する。ほとんどのＤＣは、骨髄由来であり、免疫刺激性である（Banchereau, J., Steinman, R.M., Nature 392, 245, (1998)）。これら古典的なＤＣは、いくつかの方法で特殊化され、インビボでヘルパーＴ細胞及びキラーＴ細胞を感作する（「天然のアジュバント」）。最も重要なことに、末梢組織に存在する未成熟ＤＣは、抗原を捕捉し、免疫原性のＭＨＣ−ペプチド複合体を産出する能力を備えている（「抗原処理の状態」）。炎症性サイトカイン（「危険」）のような成熟を誘導する刺激に応答して、これら未成熟ＤＣは、接着分子及び共刺激分子をアップレギュレートすることにより、強力なＴ細胞刺激因子になり（「Ｔ細胞刺激の状態」）、同時に二次リンパ器官に移動して稀な抗原特異的Ｔ細胞を選択し、刺激する。組織又は血液から苦労して単離したＤＣは、試験管内で抗原を負荷し、成熟ＤＣとして戻せば、インビボで免疫原性であることが判っている（Inaba, K. et al., J. Exp. Med., 178, 479, (1993); Inaba, K. et al., Int. Rev. Immunol., 6, 197, (1990); Hsu, F. J. et al., Nature Med., 2, 52, (1996)）。これらのデータは、ＤＣが、腫瘍や感染への免疫介在性の抵抗性に対して有効な免疫賦活剤であることを示唆している。
【０００３】
造血系前駆細胞から大量に生体外でＤＣを生成する方法の開発は、そのようなＤＣを基にしたワクチン法をさらに詳細に探求するための前提条件である。ＧＭ−ＣＳＦがマウスの血液からＤＣを生成する鍵となるサイトカインであることが発見された（Inaba, K. et al., J. Exp. Med., 175, 1157, (1992)）のに続いて、マウスの骨髄から（一次成熟）ＤＣを生成するための簡単で、信頼性のある技術（Inaba, K. et al., J. Exp. Med., 176, 1693, (1992)）が開発された。次いで、幾つかのグループが、そのようなＤＣ子孫の注射は、腫瘍抗原を負荷すれば、マウスにおいてＣＤ８＋ＣＴＬ介在性の腫瘍の緩解を誘導することを一様に実証した（Young, J. W., Inaba, K., J. Exp. Med., 183, 7, (1996); Schuler, G., Steinman, R. M., J. Exp. Med., 186, 1183, (1997)において概説）。ヒトのＤＣを生成する方法も練り上げられてはいるが、未だ、マウスのように標準化されてはいない。前駆細胞から生体外で生成されたＤＣはすでにヒトにワクチン接種し、疾患を治療するのに上手く使用されている（Bancherau, J. et al., Cell, 2001, 印刷中）。
【０００４】
ヒトでは、ＧＭ−ＣＳＦとＴＮＦαを鍵となるサイトカインとして用いて、稀な、増殖しているＣＤ３４＋前駆細胞（Caux, C. et al., Nature, 360, 258, (1992); Siena, S. et al., Exp. Hematol., 23, 1463, (1995); WO 93/20185）、又はＧＭ−ＣＳＦとＩＬ−４（ＷＯ９７／２９１８２）の保護のもとで末梢血における頻度は高いが増殖していないＣＤ１４＋前記細胞（単球）のいずれかからＤＣを生成することができる。１９９４年に導入されて以来（Sallusto, F., Lanzavecchia, A., J. Exp. Med., 179, 1109, (1994); Romani, N. et al., J. Exp. Med., 180, 83, (1994)）、後者の方法が実験目的で広く使用されており、また、多数の理由においても、免疫療法について魅力的であると思われる。第一に、ＣＤ１４＋前駆細胞は豊富にあるので、ほとんどの場合、Ｇ−ＣＳＦ（末梢血においてＣＤ３４＋細胞及びさらに進んだ前駆細胞を増やすのに使用される）のようなサイトカインで患者を前処置する必要がない（Romani, N. et al., J. Immunol. Methods, 196, 137, (1996)）。第二に、この方法で生成したＤＣはある程度均質であると思われ、未成熟な状態又は完全に分化した又は成熟した状態で産出することができる。第三に、ＦＣＳ（ウシ胎児血清）のような非ヒトタンパク質を避けることができ、成熟刺激として自己単球で調整した培地を使用することによって完全に且つ不可逆性に成熟した且つ安定なＤＣを得ることができることが示された（Romani, N. et al., J. Immunol. Methods, 196, 137 (1996); Bender, A. et al., J. Immunol. Methods, 196, 121 (1996)）。（感染性及び免疫原性のために）有害である可能性があり、標準化されていない（使用する特定のＦＣＳバッチによって後代のＤＣの質は顕著に変化する）ので、ＦＣＳを回避することが望ましい。
【０００５】
さらに、以下の特許／特許出願が樹状細胞の産出を開示している：
ＥＰ−Ａ−０  ９２２  ７５８号は、マクロファージ又は樹状細胞のいずれかの特徴を発現する能力を有する多能性細胞に由来する未成熟樹状細胞からの成熟樹状細胞の産出を開示しており、前記方法は、ＩＦＮαを含む樹状細胞成熟因子に未成熟樹状細胞を接触させることを含んでなる。
ＥＰ−Ｂ−０  ６３３９３０号は、
（ａ）ヒトＣＤ３４+造血系細胞を（ｉ）ＧＭ−ＣＳＦ、（ｉｉ）ＴＮＦαとＩＬ−３、又は（ｉｉｉ）ＧＭ−ＣＳＦとＴＮＦ−αとともに培養し、それによってＣＤ１ａ+造血系細胞の形成を誘導する工程；と
（ｂ）前記培養から前記ＣＤ１ａ+ヒト樹状細胞を回収する工程
とを含んでなるヒト樹状細胞の産出を開示している。
ＷＯ  ９５／２８４７９号は、末梢血細胞を単離すること、ＣＤ３４抗原を発現する血液前駆細胞をそれから濃縮すること、及び造血系増殖因子とサイトカインとの組み合わせで前記細胞を増やすことを含んでなる樹状細胞の調製方法を開示している。
【０００６】
成熟ＤＣは多数の理由で免疫療法について未成熟なものに対して好ましいと思われる。成熟ＤＣの後代細胞だけがＭ−ＣＳＦ−Ｒを欠いており、Ｍ−ＣＳＦを除いた場合／その非存在下で相変わらず安定なままである（Romani, N. et al., J. Immunol. Methods, 196, 137 (1996)）。成熟ＤＣは、ＩＬ−１０（Steinbrink, K. et al., J. Immunol., 159, 4772 (1997); Steinbrink, K. et al., (1998)）又はＶＥＧＦ（Gabrilovich et al., Nature Med., 2, 1096, (1996)）のような（腫瘍由来の）阻害因子に抵抗性であるが、未成熟なものはそうではない。成熟ＤＣはまた、インビトロで（Sallusto, F., Lanzavecchia, A., J. Exp. Med., 179, 1109 (1994); Romani, N. et al., J. Immunol. Methods, 196, 137 (1996); Bender, A. et al., Immunol, Methods, 196, 121 (1996); Reddy, A. et al., Blood, 90, 3640 (1997); Inaba et al., J. Exp. Med., 175, 1157 (1992); Inaba et al., J. Exp. Med., 176, 1693 (1992); Larsson, M. et al., J. Immunol., 165(3), 1182-90 (２０００年８月１日); Jonuleit, H. et al., J. Exp. Med., 192(9):1213-22（２０００年１１月６日））及びインビボで（Dhodapkar, M.V. et al., J. Exp. Med., 193(2):233-8（２００１年１月１５日）及びJonuleit, H. et al., Int. J. Cancer., 93(2):243-51（２００１年７月１５日））Ｔ細胞反応を誘導するのに優れていることも明らかにされている。実際のところ、未成熟ＤＣは、調節性Ｔ細胞を誘導することにより、インビトロで（Jonuleit, H. et al., J. Exp. Med., 192(9):1213-22（２０００年１１月６日））並びにインビボで（Dhodapkar, M.V. et al., J. Exp. Med., 193(2):233-8（２００１年１月１５日））トレランスを誘導することさえできる。従って、成熟ＤＣは、トレランスを誘導するために免疫性、未成熟ＤＣを誘導するのに好ましい。
【０００７】
ＣＤ１４+単球前駆細胞からＤＣを発生させる上記方法はさらに改変され、ＤＣに基づいた更に大掛かりなワクチン接種試験を行うために臨床的に実用化されている（Thurner, B. et al., J. Immunological Methods 223, 1-15 (1999)）。ＧＭＰ（製品管理及び品質管理規則）指針に合わせて実施することができ、ＤＣを生成するための複数回の採血の必要性を回避する再生可能なＤＣ生成方法（ヒトにおけるＤＣに基づいたワクチン接種のアプローチには必須である）を提供するために、白血球分離採取法産物（出発集団としての繰り返し採血した新鮮血ではなく）からの完全に成熟したＤＣの再生可能な生成ができるような改変が導入された。特に前記方法では、出発集団としての白血球分離採取法産物とともに使用するために二工程法（ＧＭ−ＳＦ＋ＩＬ−４で感作した後、単球で調整した培地で成熟させる）によってＣＤ１４＋単球から成熟ＤＣを生成した。幾つかの順応が必要であった。改変付着工程は、アフェレーシス単核細胞からＣＤ１４＋ＤＣ前駆細胞を確実に濃縮するために必要であることが開示された。培養開始時でのＧＭ−ＣＳＦ＋ＩＬ−４の添加は不利であることが判ったので、２４時間遅らせた。アフェレーシス細胞からのＤＣの発生は、新鮮血やバフィコートからよりも速く、７日後に完了した。６日目に添加した単球で調整した培地によって、２４時間後すでに完全に成熟し且つ安定したＤＣ（≧８５％がＣＤ８３＋、ｐ５５／ファシン＋、ＣＤ１１５／Ｍ−ＣＳＦ−Ｒ−、ＣＤ８６＋＋のような特徴的な表現型を持つ不鮮明な、移動性の高い且つＴ細胞感作性の細胞）を生じた。成熟ＤＣの後代細胞はサイトカインの非存在下でさらに１〜２日培養しても安定で且つ生きたままであり、ＩＬ−１０の阻害作用に抵抗性であることが示された。ＰＢＭＣ（末梢血単核細胞）の凍結試料からＤＣを生成するために、又は後で使用するために成熟ＤＣ自体を凍結するために凍結条件が確立された。そのアプローチによって、互いに比較することができる正常なＤＣに基づいたワクチン接種試験を行うのに好適である多数の標準化されたＤＣ（５〜１０ｘ１０8個の成熟ＣＤ８３＋ＤＣ／白血球分離採取）が得られる。
【０００８】
アフェレーシス細胞を出発集団として使用すると、ＴＮＦ−α自体は成熟への刺激に不十分であることも判明した。最近、炎症誘発性(pro-inflammatory)サイトカイン、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１−β、ＩＬ−６及びプロスタグランジンＥ２から成るカクテルによってＭＣＭを模倣できることが示されている（Jonuleit, H. et al., Eur. J. Immunol., 27, 3135 (1997)）。これらは、ＭＣＭの主要な構成成分である。また、ＴＮＦ−α＋プロスタグランジンＥ２の組み合わせ（Rieser, C. et al., J. Exp. Med., 186, 1603 (1997)）はさらに変異が大きいが、このＭＣＭはほとんどの場合、このカクテルと同じくらい有効であった。１％の自己血漿を補完したＸ−ｖｉｖｏ１５又は２０培地が、最近、完全に成熟したＤＣの生成に推奨されている（Jonuleit, H. et al., Eur. J. Immunol., 27, 3135 (1997)）。しかしながら、ＲＰＭＩ培地がさらに優れていることが判明した。興味深いことに、Ｘ−ｖｉｖｏ培地で生成されるＤＣは、ＣＤ１ａ陰性又は弱陽性であるが、ＲＰＭＩ培地の使用によってＣＤ１ａ分子を発現した完全に成熟したＤＣを生じる。出発集団としての白血球アフェレーシス産物とともに使用するための方法への適応によって、ＤＣを生成するために繰り返し採血する必要性が未然に防がれ、それは、トゥルナー（Thurner, B. et al., J. Immunol. Methods 223, 1-15 (1999)）によって確立された。一連のワクチン接種全体（≧５ｘ１０8個の成熟ＣＤ８３＋ＤＣ／白血球分離採取）のためにＤＣを生成するのに一回きりの白血球分離採取で十分である。ＤＣは、連続するワクチン接種のために凍結したＰＢＭＣ試料から繰り返し生成されるか、又は最適な凍結プロトコールを用いて、後の使用に備えてアリコートに(in aliquots)凍結することができる大量のＤＣを得るために開始時にアフェレーシス産物全体を処理する。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
しかしながら、上記方法における主要な欠点は、必要なＤＣの培養が一般に（大量の）開放系容器（ウエル又はフラスコ）で行われることである。種々の操作工程、すなわち、試薬を繰り返し添加又は除去することによって、全体の手順を制御された且つ無菌の条件下で処理することが困難になり、すなわち、ＧＭＰ指針に準拠した製造方法は未だに利用可能ではない。しかしながら、そのようなＧＭＰ法は、産出されたＤＣが元来の提供者又はほかの受入者に戻すことが意図されている生体外のＤＣの増殖又は生成の手順（例えば、ＤＣを基にしたワクチン接種処方計画の範囲内で）に対する重要な必要要件である。一方、２，３の論文が樹状細胞の産出における閉鎖系容器の使用を強調しているにすぎない（例えば、ＷＯ９８／０６８２６；Kowalski, K. L. et al., Blood, 88（10）， suppl． 1， 111a （1996））。しかしながら、前記文献で利用される容器は、前記容器で産出されるＤＣの量に特定の制限を課す標準的な容器である。
【００１０】
最後に、樹状細胞の実際の培養に先立つ工程、すなわち、患者からの好適な造血系前駆細胞の単離を円滑にするという一般的な必要性がある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
以下に特定する方法及び装置によって上記課題は解決した。特に、本発明は
（１）ＧＭＰ（製品管理及び品質管理規則）指針に従って、成熟し且つ安定した樹状細胞又は未成熟の樹状細胞を産出する方法であって、該方法は少なくとも１つの樹状細胞分化／成熟因子の存在下で無菌の培養装置において造血系前駆細胞を培養することを含んでなり、前記培養装置は増殖領域を形成する拡張された内部表面を有し、それによって細胞が表面に付着する閉鎖系容器を含んでなる方法；
（２）増殖領域を形成する拡張された内部表面を有する閉鎖系容器を含んでなり、成熟し且つ安定した樹状細胞を産出するのに使用するための装置；及び
（３）樹状細胞の培養に好適である末梢血単核細胞を白血球分離採取法産物から調製する方法であって、水又は塩化アンモニウム水溶液の添加によって白血球分離採取法産物において赤血球（及び顆粒球の一部）を溶解することを含んでなる前記方法
を提供する。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、細胞は、容器の拡張された内部表面に付着する。容器の内部表面を拡張するために、容器は、主要な小部屋を含有してもよく、及び／又は、重合体材料などからできた粒子、例えば、ビーズ、球体、螺旋体、スポンジ様構造体、羊毛様構造体又は網様構造体、三次元網などで満たされてもよい。複数のこれら粒子によって、容器の表面積が拡張され、それによって細胞は、これら粒子の表面に付着する。
【００１３】
本発明によれば、該粒子はいかなる三次元構造を有することもできる。例えば、ナイロン、羊毛、レイティング(ratings)、螺旋体、スポンジ様構造体などを使用することができる。
【００１４】
本発明の好ましい実施形態によれば、容器は少なくとも２つの流状連通試験槽を含み、それによって各試験槽が増殖領域を規定する。この種の容器は、多数の試験槽に容器を分離する１以上の分離壁を有する。本発明によれば、試験槽は流状に接続する。従って、唯一の主入口開口部を持ち、それを介して培養されるべき細胞を含有する流体を挿入することができる装置を提供することができる。好ましくは、流状に連通する手段を介して、流体は試験槽の間に規則正しく分割される。
【００１５】
好ましくは、容器が連通状態において保持されなければならない方法において連通手段は、試験槽の間に配置される。この状態においてのみ、容器の流体は試験槽間に均等に分配される。容器が培養状態又は培養位置に保持されれば、試験槽は互いに流状に連通しないので、流体は、この状態では一方の試験槽からもう１つの試験槽に流れることはない。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
図１〜７を参照して、本発明の実施形態（１）の方法にも好適である本発明の実施形態（２）の培養装置について以下説明する。図１及び図２は、成熟した且つ安定した樹状細胞又は未成熟の樹状細胞を産出するのに使用することができる装置の第１の好ましい実施形態を示す。示された装置は、図２に示すように積み重ねが可能である、積み重ね可能な盆状の手段１０を含む。各盆状の手段１０は、底部１２及び底部１２を取り囲む側壁１４を有する。１つの盆状手段１０をもう１つの盆状手段１０の上に積み重ねることによって、底部１２がさらに上部の役目をするので、図２に示すように２つの盆状手段１０を積み重ねることによって試験槽１６が形成される。最上の盆状手段１０は、最上の盆状手段１０の底部１２の下にある試験槽１６の蓋を形成する。
【００１７】
各盆状手段１０は、隣接する試験槽１６に接続するための少なくとも１つの手段１８を有する。示された好ましい実施形態の範囲内では、各盆状手段１０は隣接する試験槽１６の流状接続のために２つの手段１８を含む。流状接続のための手段１８は好ましくは、円筒状の中空の突起として形成される。言い換えれば、流状接続のための手段１８はパイプ又は管として形成される。これら管のそれぞれは、底部１２の底表面２２から離れて配置される開口部２０を有する。開口部２０の反対側にて、各管は、底部１２の面に配置される第２の開口部２４を有する。この第２の開口部２４は隣接する試験槽１６に対して開口する。
【００１８】
図２は、培養状態又は培養位置での装置を示す。この水平位置では、流体は、底表面２２に配置され、それによって細胞は底表面２２に付着する。従って、盆状手段１０全体及び少なくとも底部１２は、ポリカーボネート、ポリスチレン及びポリオレフィン類を含むが、これらに限定されないプラスチック材から作製される。もう１つの方法として、細胞が底表面２２に付着するように、底部１２の前記材料を、好適な付着介在手段、例えば、Ｉｇ（免疫グロブリン）被覆（IgG被覆を含む）、又は単球の表面分子（ＣＤ１４、ＣＤ１６を含む）に対する抗体で被覆するように被覆することができる。
【００１９】
示された培養状態では、各試験槽１６は、流体が管１８の開口部２０より高くなるレベルまで満たすとよい。記載される方法について示される装置を使用することによって、流体のレベルはさらにはるかに低くなる。流体の厚さは約３ｍｍである。
【００２０】
示された試験槽１６の流状接続については、管１８が底に配置されるように、図２に示す装置を９０°回転する（図１）。従って、流体２６は、管１８を介して試験槽１６間に均等に分配される。
【００２１】
一番下の盆状手段１０の管１８の開口部２４は蓋２８により閉鎖される。培養に使用されない最上の盆状手段１０は、管１８に挿入された管状部３０を有する。管状部３０の一方は、管状部３０の開口部を無菌的に閉鎖する蓋３２により閉鎖される。蓋３２は、管３０から剥ぎ取ることができるストライプ３４に接続される。図２に示すように、他方の管状部はすでに開口しており、すなわち、蓋３２は外されていた。従って、主入口開口部３６を形成する管状部３０の開口部３６を介して流体を試験槽１６に充填することができる。主開口部３６を介してどの試験槽にも流体が充填される。流体が充填される一方で、装置をすでに培養状態に保持することができる。流体の入口開口部及び／又は出口開口部として各管状部３０を使用することができる。培養状態では各試験槽１６における流体の上の領域は気体で満たされる。例えば、試験槽１６を介して、５％ＣＯ2の空気をポンプで送ることによりこの気体を交換することができる。
【００２２】
図３に示すように、接続のために、１つ、又は好ましくは２つのフィルター１２８を手段１８に接続することができる。フィルター１２８は空気供給のために提供され、そのためにフィルターは漏出耐性である。接続のための追加の手段１８又は接続のための２つの手段１８の１つと共に（図１及び図２）、注入／排出装置１３０を接続する。装置１３０は、好ましくはＰＶＣからできた管状アダプタ又は三方コック１３２を提供する。アダプタ１３２を介してチュービング１４０によってバッグ１３４、１３６、１３８の１つを接続することができる。チュービング１４０には、管１４０の１つを閉鎖する／開放するための締め具１４２又はそのほかの種類の開閉装置が提供され、すなわち、図１及び図２に示されるような装置にバッグ１３４，１３６，１３８の１つを接続する、又は接続を断つ。バッグ１３４，１３６，１３８の代わりに、培地を貯蔵する又は回収するためのそのほかの種類の試験槽様の手段を提供することができる。
【００２３】
上記バッグ１３４，１３６，１３８は、例えば、ＰＢＭＣ、培地又は非付着性分画（ＮＡＦ／廃棄物）を含有してもよい。装填の設定では、ＰＢＭＣを含有するバッグ１３４を熱シールによって装置１３０のＰＶＣチュービングに接続する。次いで、それぞれの締め具１４２を開放して細胞（例えば、完全培地２４０ｍｌにおける約１２０ｘ１０6個）を二重トレイのセルファクトリに移す。慎重に均衡化した後、セルファクトリを３７℃及び５％ＣＯ2のインキュベータに入れる。１時間後、装置１３０のＰＶＣチュービングを介してＮＡＦ／廃棄物バッグ１３８に非付着性分画(NAF)を移す。セルファクトリを（例えば、純粋な培地１６４０にて）洗浄する。その後、培地（例えば、２４０ｍｌの完全培地）を添加し、両トレイ上に均等に分配する。システムを開放することなく、熱シールによって各バッグ１３６は、常に接続され、接続を断たれる。
【００２４】
セルファクトリの養分補給設定では、培地を含有するバッグ１３６が熱シールによってＰＶＣチュービング１３０に接続され、内容物がセルファクトリに移される。セルファクトリの成熟設定では、成熟刺激を含有するバッグ１３６が熱シールによってＰＶＣチュービング１３０に接続され、内容物がセルファクトリに移される。セルファクトリの回収設定では、各バッグ１３８が熱シールによってＰＶＣチュービング１３０に接続される。穏やかに再浮遊した後、システムを開放することなく、非付着性細胞をＤＣバッグ１３８の中に移す。次いでセルファクトリを培地で満たし、ゆるやかに付着した細胞を移動させ、第２のＤＣバッグに回収をもする。次いで双方のＤＣバッグをシステムとの接続から外す。
【００２５】
図４及び図５に示す第２の実施形態は、分離壁４０，４２，４４及び４６を有し、そのために、示された実施形態においてこれら分離壁４０，４２，４４、４６が、３つの試験槽４９，５０及び５２（図５）を形成する、ビン状容器である。試験槽の数はさらに多くてもよい。上の試験槽４９は、図５では水平である底部４２と側壁４０及び４４とを有する盆状手段でできている。底部４２は表面４８を有し、本発明の方法に従って細胞がその上に付着する。図５に示されるように培養状態又は培養位置において流体が試験槽４９の内側に保持されるように、底部４２は、容器の全高に伸びる側壁５４及び５６に密封可能に接続される。側壁４０及び４４も密封可能に壁５４及び５６に接続される。上の壁４８に近接して、各側壁４０，４４は、それぞれ開口部６０及び６２を有する。
【００２６】
中間試験槽６０も、側壁５４及び５６に密封可能に接続される底部４２及び側壁４０を有する。側壁４０の反対側に、中間試験槽５０は、開口していない側壁４６を有する。従って、側壁４６は、底部４２、上の試験槽４９の側壁４４及び側壁５４及び５６に密封可能に接続される。さらに、中間試験槽５０は、底部４２に密封可能に接続され、中間試験槽５０に開口する開口部６６を有する管状突起６４を有する。開口部６６の反対側に、管６４は、下の試験槽５２に向かって開口する、底部４２の面における第２の開口部６８を有する。
【００２７】
側壁７０、底壁７２及び側壁７０に対向する側壁７４によって下の試験槽５２の境界が形成される。側壁７０は、底壁７２から上壁５８まで伸びている。
【００２８】
側壁７４の範囲内で開口部７６が形成される。開口部７６は蓋８０（図５）で閉じられる管状突起７８を有する。蓋８０の範囲内で、空気が容器に入ることができるように疎水性フィルタ８２が配置される。
【００２９】
同一量の流体２６で試験槽４９，５０及び５２を満たすために、矢印８０の方向で管状突起７８及び開口部７６を介して流体が試験槽に充填されるように、図４に示すようにビン状装置を保持する。この連通状態で装置が保持されれば、破線の矢印によって図５で示されるように流体は試験槽の中を流れる。先ず最初に、下の試験槽５２において矢印８４の方向に流体は流れる。下の試験槽５２から、側壁４４における開口部６２を介して上の試験槽４８と下の試験槽５２を接続する水路８９において矢印８６の方向に流体は流れる。水路８９は側壁７０と対向する側壁４６及び４４とからできている。さらに、中間試験槽５０において管６４及び開口部６６を介して矢印８８の方向に流体は流れる。試験槽４９、５０、５２が同一量の流体で均等に満たされれば、流体が平坦な底部４２及び７２の上で均等に分配されるように、ビン状装置を図５に示す位置に回転する。本発明の図１〜５に基づいた好適な無菌培養装置はヌンク（Nunc）セルファクトリ及びヌンクトリプルフラスコである。
【００３０】
本発明のさらなる実施形態では、容器の拡張された内部表面（２２、４８）は、１以上の規則正しい又は不規則な形状の構造体又は粒子によって形成され、それによって、細胞は容器の内部表面及び／又は前記粒子の表面に付着する。好適な構造体及び粒子は、上述のようなビーズ、球体、螺旋体、巻き上げたホイル又はフィルム、スポンジ状、羊毛状又は網状の構造体、三次元の網などである。
【００３１】
成熟した且つ安定した樹状細胞を産出するための連続又は非連続の流体灌流法において前述した本発明の２つの好ましい実施形態を使用することもできる。このためには、管状部（３０）（図２）及び管状突起２８（図５）を柔軟性のある管などに接続することができる。それぞれ試験槽１６及び４９、５０、５２において流体をポンプで動かせるように、柔軟性のある管をペリスタポンプ又はもう１つの流体輸送用装置に接続する。
【００３２】
試験槽の中で流体を分配するために、特に、細胞が付着する底表面２２、４８の上で流体を分配するために、装置を移動させるか、又は傾けることができる。
【００３３】
第３の好ましい実施形態（図６）によれば、培地は柔軟性のある管９０を介してポンプで運ばれる。管９０は２つの試験槽９２に分離する。試験槽９２の内側で、細胞は、これら試験槽の表面又は試験槽９２の内側に配置された粒子に付着する。流体は、矢印９４の方向に連続的に又は非連続的に運ばれる。２つの試験槽は、流体が試験槽９２を通過した後、再び管９０に接続される。試験槽９２を介して流体を運ぶために、ポンプ９６、特に、ペリスタポンプが使用される。
【００３４】
各試験槽９２は底表面９８を有する。底表面９８の反対側には、空気透過性の表面１００が施される。これら表面１００は空気透過性ではあるが、流体は透過しない。表面１００を介して気体は試験槽９２を通り抜け、中間の気体試験槽１０２に入ることができ、逆もできる。気体を供給し、気体試験槽１０２から分散されるように、各気体試験槽１０２は、それぞれ共通の入口開口部１０４及び出口開口部１０６に接続される。図５に示す実施形態は、特に非連続的な流体供給に使用することができる。
【００３５】
もう１つの好ましい実施形態（図７）は、２以上の試験槽１２４に流体を連続して供給するのに使用される。各試験槽１２４は、例えば、波状構造の使用によって拡張された表面を有する底表面１０７を有する。２つの試験槽１２４は、共通の柔軟性のある管１２６に接続される。矢印１０８の方向で試験槽１２４に培地を供給するために、ポンプ１１０、特にペリスタポンプが使用される。矢印１１２の方向で試験槽１２４を流れ出て柔軟性のある管１２６に入る培地は、気体交換装置１１４に運ばれる。気体交換装置の範囲内で、管は、気体透過性且つ液体非透過性の表面１１６を有する。表面１１６を介して、柔軟性のある管１２６と気体交換装置１１４との間で気体が交換される。従って、気体交換装置は、入口開口部１１８及び出口開口部１２０を有する。
【００３６】
細胞が管１２６や気体交換装置１１４にポンプで運ばれるのを防ぐために、試験槽１２４を傾けて、細胞がその重量により試験槽１０４の範囲内に留まるようにすることができる。
【００３７】
容器（装置）の試験槽及び／又は試験槽の内部での規則正しい又は不規則な形状の粒子及び構造体は好ましくは、２５〜１００００ｃｍ2の、好ましくは５００〜５０００ｃｍ2の有効表面、すなわち、容器の内側表面の増殖面積を提供する。本発明に従って、その面積はプラスチック、好ましくは、ポリカーボネート、ポリスチレン又はポリオレフィンから作られる。本発明の好ましい実施形態では、容器の内側表面、好ましくは、盆状手段１０及び規則正しい又は不規則な形状の構造体又は粒子の表面を含む内側表面の増殖領域は、付着介在性作用物（単球を付着させる作用剤を含む）で被覆される。好適な付着介在性作用物は、Ｉｇ被覆（ＩｇＧ被覆を含むがこれに限定されない）、細胞表面タンパク質に対する抗体による被覆（抗ＣＤ１４又は抗ＣＤ１６抗体による被覆を含むが、これに限定されない）、接着分子（Ｅ−セレクチン及びＰ−セレクチンのようなセレクチン及び／又はＶＣＡＭ−１のような免疫グロブリンスーパーファミリーの一員を含むが、これらに限定されない）による被覆、などである。
【００３８】
実施形態（１）の成熟及び未成熟の樹状細胞の生成、すなわち、前駆細胞の培養は、公知の方法に類似して行われる。好適な前駆細胞は、多能性細胞、樹状細胞前駆細胞又は未成熟の樹状細胞であり、好ましくは、前記造血系前駆細胞は、
（ｉ）ＣＤ１４+単核細胞（単球）、ＣＤ３４+細胞、又は血液から直接得られる、及び／又は
（ｉｉ）白血球分離採取法産物、懸濁分離（エルトリエーション）プロトコール、末梢で採取した血液又は骨髄に由来する樹状細胞前駆細胞である。
例えば、前駆細胞は（及びＤＣも）、その全体を本願に引用するトゥルナー（Thurner, B. et al., J. Immunol. Methods 223, 1-15 (1999)）が開示した方法に従って白血球分離採取法産物から入手可能である。もう１つの方法としては、以下でさらに定義する本発明の実施形態（３）の方法によって白血球分離採取法産物から前記先駆細胞を単離することができる。培養は好ましくは以下の工程によって行われる。
（ｉ）末梢血単核細胞を培養試験槽に適用し、試験槽の内側表面にそれらを付着させる工程、
（ｉｉ）非付着性細胞を除くために試験槽を洗浄する工程、
（ｉｉｉ）少なくとも１種の樹状細胞分化／成熟因子の存在下で培養培地にて付着性細胞を培養する工程、及び任意で
（ｉｖ）さらなる分化／成熟因子を培養培地に添加する工程、及び又は
（ｖ）培養培地を除き、付着性細胞を洗浄し、工程（ｉｉｉ）と同一の又は異なった樹状細胞成熟因子を含む培養培地で付着性細胞を培養する工程。
【００３９】
本発明の実施形態（１）の好ましい方式では、培養は、以下を含む。
（ｉ）（有効な）増殖領域のｃｍ2当たり３ｘ１０5〜４ｘ１０6個の前駆細胞を負荷すること、及び／又は
（ｉｉ）増殖領域が、十分に、好ましくは１〜５ｍｍの培養培地で覆われるように培養領域ｃｍ2当たり０．０１〜３ｍｌ、好ましくは０．１〜０．５ｍｌの培養培地を加えること。特に、ヌンクトリプルフラスコ（５００ｃｍ2の増殖領域を有する）には、２０〜２００ｍｌの培養培地で１５０〜２０００ｘ１０6個の細胞を加え、ヌンクのセルファクトリ（２つ重ね：１２００ｃｍ2の増殖領域を有する）には、１００〜４００ｍｌの培養培地にて３６０〜４８００ｘ１０6個の細胞を加える。
【００４０】
好適な分化因子は、ＧＭ−ＣＳＦとＩＬ−４、ＩＬ−１３、ＩＬ−５又はＩＦＮ−αとの混合物である。本発明の方法に好適な樹状細胞成熟因子には、ＭＣＭ、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＴＮＦ−α、ＰＧＥ2、ＩＮＦ−α、リポ多糖類及びそのほかの菌体産物（例えば、ＭＰＬ（モノホスホリル脂質Ａ）及びリポタイコ酸）、ホスホリルコリン、カルシウムイオノフォア、ホルボールエステル（例えば、ＰＭＡ）、熱ショックタンパク質、ヌクレオチド類（例えば、ＡＴＰ）、リポペプチド、トールライク受容体に対する人工リガンド、二本鎖ＲＮＡ（ポリＩ：Ｃ）、免疫刺激性ＤＮＡ配列、ＣＤ４０リガンドなどが挙げられるが、これらに限定されない。最も好適な成熟因子は、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＴＮＦα及びＰＧＥ2の混合物である。
【００４１】
本発明の実施形態（３）の方法では、水による細胞溶解を行うのであれば、
（ａ）２０〜３０℃にて５〜３０秒間、細胞溶解を行うこと；及び／又は
（ｂ）白血球分離採取法産物と水の容積比が２０：１〜２：１であることが好ましい。
【００４２】
一方、塩化アンモニウム水溶液で細胞溶解を行うならば
（ａ）添加溶液における塩化アンモニウムの濃度が０．５〜５％(w/w)、好ましくは１〜３％(w/w)であること；及び／又は
（ｂ）２５〜５０℃にて５〜２０分間、細胞溶解を行うこと；及び／又は
（ｃ）白血球分離採取法産物と塩化アンモニウムの容積比が２０：１〜２：１であることが好ましい。
【００４３】
上記方法は、さらに、反応を停止する工程及び／又は溶解産物を洗浄する工程及び／又は溶解産物を好適な培養培地（血漿又はタンパク質を含まない）又は塩溶液（例えば、やや低張の塩溶液）に浮遊させる工程を含んでもよい。
【００４４】
特に、水による細胞溶解では、白血球分離採取法産物を５０ｍｌ試験管（試験管当たり１０ｍｌ）に入れ、遠心する（４℃にて１１００ｒｐｍで１２分間）。上清を捨て、２０ｍｌのアクアデスト（５〜３０ｍｌ）を沈殿物に加え、それを再浮遊させ、２０秒間（５〜３０秒間）ボルテックスで撹拌し、３０ｍｌの完全培地で、好ましくは８００Ｕ／ｍｌのＧＭ−ＣＳＦを補完して満たす。次いで、トゥルナー（Thurner, B. et al., J. Immunol. Methods 223, 1-15 (1999)）により記載されたように懸濁液を洗浄する。細胞溶解はさらに大きな容器、例えば、白血球分離採取用バッグに入れた白血球分離採取法産物で行うことができ、それを遠心する（４℃にて１１００ｒｐｍで１２分間）。上清を捨て、５０ｍｌのアクアデストを加え、沈殿物を再浮遊し、２０秒（５〜３０秒）後、１５０ｍｌの完全培地で満たし、上記のような洗浄工程に進む。
【００４５】
塩化アンモニウムによる細胞溶解では、白血球分離採取法産物を５０ｍｌ試験管（試験管当たり１０ｍｌ）に入れ、遠心する（４℃にて１１００ｒｐｍで１２分間）。上清を捨てる。８００Ｕ／ｍｌのＧＭ−ＣＳＦを補完した１０ｍｌの完全培地に沈殿物を再浮遊し、１０ｍｌ（５〜２０ｍｌ）の１．６％ＮＨ4Ｃｌを加える。懸濁液をよく振り、温水槽（３７℃）に１０（５〜１５）分間入れ、上記のように洗浄工程に進む。上述の水による細胞溶解のように、この場合も、細胞溶解手順をさらに大きな容器で行うことができる。
【００４６】
以下の非限定的な実施例によって本発明をさらに説明する。
【００４７】
実施例
材料及び方法
臨床応用のためにＤＣを生成するのに開発されたプロトコールで採用した試薬及び材料はすべて、エンドトキシンを含まず、利用可能な限り、ほとんどは、ＧＭＰ（製品管理及び品質管理規則）の品質であった。
【００４８】
装置：  微生物学的に安全な実験台（ヘレウス（Heraeus）, HERA safe HS 12/2）；遠心分離機（ヘレウス、メガヒュージ２、ＯＲＳ）；インキュベータ（ヘレウス、サイトパーム２）；−８０℃のフリーザ（National Lab, Profimaster EPF）；−２０℃のフリーザ（Liebherr, GS 1382）；冷蔵庫 レイブヘール(Liebherr) ＫＢ１００１（Liebherr, ベルリン）；透過型光学顕微鏡（Leica, DMLS）；反射型光学顕微鏡（Leica, DMIL）；ピペッティング補助 ピペットエイド（Drummond）；ピペット, エッペンドルフリファレンス（Eppendorf）；ノイバウエル（Neubauer）血球計算盤（スーペリアー・マリエンフェルド（Superior Marienfeld））
プラスチック材料
５０ｍｌの試験管、γ線照射による無菌の円錐底ポリプロピレン製試験管（コーニングコースター、製品番号４３０８２９）；１５ｍｌの試験管、γ線照射による無菌の円錐底ポリプロピレン製試験管、１包装当たり２５本（コーニングコースター、製品番号２５３１５−１５）；γ線照射による無菌の、個別包装したピロゲンを含まない使い捨てのピペット（コーニングコースター、製品番号４４８５／１ｍｌ、４４８６／２ｍｌ、４４８７／５ｍｌ、４４８８／１０ｍｌ、４４８９／２５ｍｌ）；無菌個別包装のピペットチップ（Ｂｉｏｚｙｍ、Ｓａｆｅｓｅａｌ−Ｔｉｐｓ、製品番号７９００１１／１０μｌ、７９０１０１／１００μｌ、７９１００１／１０００μｌ）；無菌、エンドトキシンを含まない、個別包装の使い捨て滅菌フィルタ、０．２２ｍｍ（ミリポア、ミレックス−ＧＳ、製品番号ＳＢＧＳ０２５ＳＢ）；細胞培養用の表面を持つ培養ディッシュ、NUNCLON（登録商標）表面製品［ヌンクセルファクトリ、２つずつ重ねた、個別包装、独自包装、γ線照射により無菌、エンドトキシンを含まない（ヌンク、製品番号１６７６９５）；細胞培養用ジャー、ヌンクトリプルフラスコ、γ線照射により無菌、エンドトキシンを含まない（ヌンク、製品番号１３２８８６７又は１３２９１３）；細胞培養用６穴プレート、個別包装、オプティルクス(Optilux)表面、γ線照射により無菌、エンドトキシンを含まない（ファルコン／ベクトンディッキンソン、製品番号３０４６）；空気フィルタ ミディサート(Midisart)２０００（ザルトリウス、製品番号１７８０５−Ｇ）；凍結用試験管、無菌、エンドトキシンを含まない（ヌンク、ヌンククライオチューブバイアル、製品番号３７５４１８／１．８ｍｌ、３３７５１６／４．５ｍｌ）；カニューレ：ステリカム(Stericam)０．９ｘ７０ｍｍ ２０Ｇｘ２ ４／５ルア、薄壁使い捨てカニューレ（ブラウン、製品番号０４６６５７９１）；ミクロランス ３ ０．４ｘ１９ｍｍ ２７Ｇ１３／４ ＲＥＦ３０２２００（ベクトンディッキンソン）；無菌の外科用手袋、ラテックス製ペハ−タフト（ハートマン、製品番号９４２３ ５３／８（サイズ７）又は９４２３ ５４／７（サイズ７  １／２）；無菌の外科用手袋ペハ−タフトシンテックス、ラテックスなし（ハートマン、製品番号９４２６ ３３／８（サイズ７））。
薬品
モルガモスティム（Molgramostim）（ＧＭ−ＣＳＦ）（リューコマックス(Leukomax)（登録商標）４００）、乾燥物質５４．３８ｍｇ及び１ｍｌの無菌水（医薬品認可番号２５７５６．０３．００）（サンド、製品番号ＰＺＮ−４６０８７４４）；ＮａＣｌ、０．９％、１０ｍｌバイアル（ブラウン、製品番号０２２４６２２８）；アクアアドインジェクショネム(aqua ad injectionem)、１０ｍｌバイアル（ブラウン、製品番号０２２４０２４６）；無菌、エンドトキシンを含まない、ＧＭＰ品質のＰＢＳ（バイオウィタカー（Bio Whittaker）/セルバ（Serva）、製品番号１７−５１２Ｆ）；無菌、エンドトキシンを含まない、ＧＭＰ品質の組み換えヒトＩＬ−４（セルジェニックス）；インターロイキン１ｂ（アメダック(Amedak)）；インターロイキン６（ノバルティス）；腫瘍壊死因子α（ベーリンガーインゲルハイム）；プロスタグランジンＥ２、ミンプロスチン(Minprostin)（登録商標）（ファルマシア）；７０％アルコール（ラボセンター、ヌールンブルグ）；バリーシダル(Barrycidal)（登録商標）３６、殺菌剤（Helmut Schroder）
−インシジンプラス(Incidin Plus)（登録商標）（ヘンケル）；無菌スポンジ ガジン、無菌、個別包装（ローマン、製品番号０１９７）；無菌トリパンブルー ０．４％（シグマ、製品番号Ｔ−８１５４）。
【００４９】
培養培地、サイトカイン、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）
以下の培養培地を用いた：最終濃度２０μｇ／ｍｌのゲンタマイシン（ドイツ、ダルムスタットのメルク、レフォバシン１０）、最終濃度２ｍＭのグルタミン（米国、ウォーカーズビルのバイオウィタカー、製品番号１７−６０５）、及び加熱非働化（５６℃で３０分間した１％のヒト血漿を補完した標準培地ＲＰＭＩ１６４０（バイオウィタカー、製品番号１２−１６７）を用いた（＝さらに完全培地と呼ぶ）。ヒト血漿は、ヘパリン化（スイス、バーゼルのホフマンラロシュ製、Ｌｉｑｕｅｍｉｎ  Ｎ  ２５００、２０ｍｌの血液当たり５００Ｉ．Ｕ．）自己血漿（新しく採血して得る）又は１０％ＡＣＤ−Ａ（酸クエン酸デキストロース処方Ａ、ドイツ、Bad Homburg, Fresenius AG）血漿（白血球分離採取法により得る）のいずれかであり、若しくは、選択された実験については、輸血部門から、単一供血者で同種ＡＢ陽性ＡＣＤ血漿を得た。もう１つの方法として、我々は、我々の標準培地と同じ方法で補完したＸ−ＶＩＶＯ１５及びＸ−ＶＩＶＯ２０（バイオウィタカー）を調べた。
【００５０】
ＧＭＰ品質の組換えヒトＧＭ−ＣＳＦ（８００Ｕ／ｍｌ）（スイス、バーゼルのサンド、リューコマックス）及び組換えヒトＩＬ−４（５００Ｕ／ｍｌ）（オーストリア、ウィーンのノバルティス研究所、Ｅ．リール博士より供与）を標準培養法に用いた。ゲンザイム社（米国、マサチューセッツ州、ケンブリッジ）から入手した、ＧＬＰ（製品管理及び品質管理規則）に準拠して製造され、ＧＬＰ指針に準拠して調べられたヒトＩＬ−４も使用した。
【００５１】
成熟誘導のサイトカインとＭＣＭを比較する実験では、１０ｎｇ／ｍｌの組換えヒトＴＮＦα（オーストリア、ウィーンのベンダー社のアドルフ博士から供与）、１０００Ｕ／ｍｌのＩＬ−６（スイス、バーゼルのノバルティスから供与）、１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１β（米国ミズーリ州、セントルイスのシグマ）及び１μｇ／ｍｌのプロスタグランジンＥ２（米国ミシガン州、アナーバーのカイマンケミカル）を用いた。ＩＬ−１０抵抗性実験については、１０ｎｇ／ｍｌの用量にてｒｈＩＬ−１０（米国マサチューセッツ州、ケンブリッジのゲンザイムコーポレーション）を用いた。
【００５２】
フローサイトメトリについては、以下の抗原に対するモノクローナル抗体を用いた：ＣＤ１ａ（ドイツ、オルソダイアグノスティックシステム）、ＣＤ２、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１４、ＣＤ１９、ＣＤ２５、ＣＤ５６、ＨＬＡ−ＤＲ（すべて、ベルギー、ブリュッセルのベクトンディッキンソンから入手）、ＣＤ３、ＣＤ４０、ＣＤ８６（ドイツ、ハンブルグのＣｙｍｂｕｓ、Ｄｉａｎｏｖａ），ＣＤ８３（フランス、Ｍａｒｓｅｉｌｅｓのイムノテック）、ＣＤ９５（米国サンディエゴのファーミンジェン）、ＣＤ１１５（米国マサチューセッツのカルビオケム）。アイソトープ対照も並行して流した。
【００５３】
細胞内ＦＡＣＳ染色については、製造元の指示書に従って、フィックス＆パーム（ドイツ、Eching, Biozol）により細胞を固定し、透過性にしてｐ５５／抗ファシン(fascin)上清（Mosialos, G. et al., Am. J. Pathol., 148, 593 (1996)）（K-2クローン、ボストンのランゴフ博士(Dr. E. Langhoff)より供与）により染色した。二次抗体として、Ｆｃガンマ断片特異的で、蛍光を結合したアフィニピュアＦ（ａｂ’）2ヤギ抗マウスＩｇＧ（ドイツ、ハンブルグ、Dianova, ジャクソン免疫研究所）を用いた。
【００５４】
白血球アフェレーシス及びＰＢＭＣの単離
アフェレーシス産物の最初の処理：インフォームドコンセントを行った後、健常提供者又は黒色腫の患者から単球分離産物として、輸血部門より白血球分離採取法産物を得た（健常志願者は定期的な細胞分離（サイタフェレーシス）の供血者であり、黒色腫患者は、エリアンゲン−ヌールンベルグ(Eriangen-Nuerenberg)大学倫理委員会並びに米国ニューヨークのルードウィック癌研究所の国際審査会により認可されたフェーズＩのＤＣワクチン接種試験の治療を受けていた）。細胞分離機として、コベスペクトラ（米国コロラド州、レイクウッドのＣｏｂｅ  ＢＣＴ社）又はフレセニウスＡＳＴＥＣ２０４（ドイツ、Ｂａｄ  Ｈｏｍｂｕｒｇ、フレセニウスＡＧ）のいずれかを使用した。白血球細胞のセット及びＭＮＣプログラムにコベスペクトラを用い、Ｐ１Ｙ−セット及びＭＮＣプログラムにフレセニウスＡＳＴＥＣ２０４を用いた。白血球分離採取の間、製造元の指示書に従って、抗凝固物質として酸−クエン酸−デキストロース処方Ａ（ＡＣＤ−Ａ、フレセニウス）を用いた。１０％のＡＣＤ−Ａ（フレセニウス社）と共にＰＢＳ（米国、ウォーカーズビルのバイオウィタカー、製品番号１７−５１２）により希釈した後（灌流シリンジを用いて、６００ｍｌの培養フラスコに白血球分離採取法産物を満たし、次いで、１０％のＡＣＤ−Ａを含有するＰＢＳを最終容量４８０ｍｌで加える）、室温にて３０分間４６０ｇでリンフォプレップ（１．０７７ｇ／ｍｌ；ノルウェイ、オスロのニコメッドファーマ）にて遠心することによりＰＢＭＣを単離する（１５ｍｌのリンフォプレップに３０ｍｌの希釈した白血球分離採取法産物を重層する）。１ｍＭのＥＤＴＡを含有するが、カルシウム又はマグネシウムを含まないＰＢＳで３回細胞を洗浄し、最初は、２５０ｇ、２回目は１７５ｇ、３回目は１１０ｇでそれぞれ４℃にて１２分間遠心した。
【００５５】
自己単球で調整した培地（ＭＣＭ）の生成
使用直前に、Ｉｇを被覆した細菌用プレート（８５ｍｍ、ファルコン１００５）を用意する。免疫グロブリンとして、我々はサンドグロビン（スイス、バーゼルのノバルティス）を用いた。１０ｍｌの希釈した（バイオウィタカーのカルシウム又はマグネシウムを含まないＰＢＳにて）免疫グロブリン（１０μｇ／ｍｌ）で室温にて１０分間、被覆を行った。被覆操作後、カルシウム又はマグネシウムを含まないＰＢＳ（バイオウィタカー）で２回プレートをすすいだ。サイトカインを含まない完全培地中でこれらディッシュに５０ｘ１０6個のＰＢＭＣを入れ、５％ＣＯ2、３７℃で２０時間インキュベートした。次いで、単球調整培地を回収し、１３６０ｇにて１０分間遠心し（２２℃）、無菌的に濾過し（０．２２μｍのフィルタ、フランス、Molsheimミリポア）、−２０℃にアリコットで(in aliquots)凍結した。単球調整培地の場合、ウエル（３ｍｌ容量を含有する）当たり、７５０μｌのＭＣＭ、すなわち、２０容積％加えた。もう１つの方法として、我々は、サイトカインのカクテル（ＩＬ−１β＋ＩＬ−６＋ＴＮＦ−α、各１０ｎｇ／ｍｌ）又はＴＮＦ−α単独（１０−２０−４０ｎｇ／ｍｌ）を加えた。各成熟誘導刺激は、プロスタグランジンＥ２（１μｇ／ｍｌ）の有無との組み合わせにおいても調べた。培養培地、サイトカインも参照のこと。
【００５６】
磁気セルソータ（ＭＡＣＳ）によるＣＤ１４＋単球の単離
製造元の指示書に従って、ＣＤ１４微細磁気ビーズ（ドイツ、Bergisch-Gladbach, Miltenyi）（Miltenyi, S. et al., Cytometry, 11, 231 (1990)）を用いた陽性選抜を行い、ＣＤ１４＋細胞を分離した。
【００５７】
単球単離のための代替方法
Ａ）アクアデストによる細胞溶解：白血球分離採取法産物を５０ｍｌ試験管（試験管当たり１０ｍｌ）に入れ、遠心した（４℃にて１１００ｒｐｍで１２分間）。上清を捨て、２０ｍｌのアクアデストを沈殿物に加え、２０秒間ボルテックスで撹拌することによってそれを再浮遊させ、次いで８００Ｕ／ｍｌのＧＭ−ＣＳＦを補完した３０ｍｌの完全培地で満たした。次いで、懸濁液を１１００ｒｐｍ、４℃にて１２分間遠心し、上清を捨て、残りを５０ｍｌのＰＢＳ／ＥＤＴＡ（１ｍＭ）で満たした。得られた懸濁液を９００ｒｐｍ、４℃にて１２分間遠心し、上清を捨て、残りを５０ｍｌのＰＢＳ／ＥＤＴＡ（１ｍＭ）で満たした。１０μｌの細胞懸濁液を細胞計数のために取り出した。懸濁液を８００ｒｐｍ、４℃にて１２分間遠心し、上清を捨て、残りを完全培地（完全培地：５００ｍｌのＲＰＭＩ１６４０、５ｍｌの自己加熱非働化血漿、５ｍｌのグルタミン及び２００μｌのゲンタマイシン）で満たし、通常の方法で培養容器に入れた／充填した。
【００５８】
Ｂ）塩化アンモニウムによる細胞溶解：白血球分離採取法産物を５０ｍｌ試験管（試験管当たり１０ｍｌ）に入れ、遠心した。（４℃にて１１００ｒｐｍで１２分間）。上清を捨てた。１０ｍｌの完全培地（８００Ｕ／ｍｌのＧＭ−ＣＳＦを補完した）で沈殿物を再浮遊し、１０ｍｌの１．６％ＮＨ4Ｃｌを加えた。得られた懸濁液をよく振り、温水槽（３７℃）に５〜１５分間入れた。その後、懸濁液を１１００ｒｐｍ、４℃にて１２分間遠心し、上清を捨て、残りに５０ｍｌのＰＢＳ／ＥＤＴＡ（１ｍＭ）を満たした。次いで、懸濁液を９００ｒｐｍ、４℃にて１２分間遠心し、上清を捨て、残りに５０ｍｌのＰＢＳ／ＥＤＴＡを満たした。１０μｌの懸濁液を細胞計数のために取り出した。懸濁液を８００ｒｐｍ、４℃にて１２分間遠心し、上清を捨て、残りに完全培地を満たし、通常の方法で培養容器に入れた／充填した。
【００５９】
フローサイトメトリ：上記で列記したｍＡｂのパネルによって細胞集団の表現型を分け、ロマーニ（Romani et al., J. Immunol. Methods, 196, 137 (1996)）らが記載したようにＦＡＣＳｃａｎ（ファックスキャン）（ベクトン−ディッキンソン）で分析した。死細胞は、光散乱特性に基づいてゲートの外に出した。
【００６０】
Ｔ細胞刺激性／機能性アッセイ：一次同種ＭＬＲ：Ｔ細胞刺激性の機能を調べるために、段階的な用量にて同種Ｔ細胞にＤＣを加え、ゲンタマイシン、グルタミン及び５％の加熱非働化同種ヒト血清（単一供血者）を補完したＲＰＭＩ１６４０中にて４〜５日間共にインキュベートした。２ｘ１０5個のＴ細胞／ウエルで９６穴平底プレートにて試験を行った。製造元の指示書（ドイツ、フランクフルトのＴＥＢＵ）に従って、分離カラムを用いてＴ細胞を単離した。三連ウエルに１２〜１６時間、５０μｌの３Ｈチミジン（最終濃度４μＣｉ／ｍｌ）加えることにより増殖を測定した。
【００６１】
Ｔ細胞刺激性／機能性アッセイ：二次同種ＭＬＲ：製造元の指示書に従ってＣＤ４／ＣＤ４５ＲＡマルチソートキット（ドイツ、Bergisch-Gladbach, Miltenyi）により未処置のＣＤ４Ｔ細胞を単離した。ＣＤ４＋／ＣＤ４５ＲＡ＋細胞の純度は９５％以上だった。ゲンタマイシン、グルタミン及び５％の加熱非働化同種ヒト血清（単一供血者）を補完したＲＰＭＩ１６４０中にて、未処置のＴ細胞（３ｘ１０6個／ウエル）をマクロウエル（２４穴プレート、ファルコン）に蒔き、成熟ＤＣ（３ｘ１０5個／ウエル）で刺激した。約３日後、Ｔ細胞をＩＬ−２（米国、エメリービル、キロン、プロウキン(Proleukin)）（５０Ｕ／ｍｌ）で増殖させた。一次刺激の２週間後、一次刺激と同じ提供者から生成された成熟ＤＣで同一条件下にてＴ細胞を再刺激した。再刺激のために、３ｘ１０6個のＴ細胞＋３ｘ１０5個のＤＣを２４穴プレートに蒔いた。４８時間後、上清を回収し、−２０℃で凍結し、後で、後述するように、ＥＬＩＳＡアッセイによってサイトカインを測定した。
【００６２】
インフルエンザウイルス特異的ＣＴＬの誘導；Ｔ細胞の調製：記載されているように（Bender et al., 1996）ノイラミニダーゼ(neuraminidase)処理したヒツジ赤血球とのロゼット形成によってＴリンパ球を濃縮した。
【００６３】
インフルエンザウイルス特異的ＣＴＬの誘導：ＨＬＡ−Ａ２．１陽性の提供者から調製された成熟ＤＣを洗浄し、０．５〜１ｘ１０7個／ｍｌでＲＰＭＩ１６４０に再浮遊した。最終濃度１０００ＨＡＵ／ｍｌでインフルエンザ生ウイルスを加えるか、又は５０μｇ／ｍｌのインフルエンザマトリクスペプチド（ＩＭＰ）、ＧＩＬＧＦＶＦＴＬを３７℃にて１時間、ＤＣに負荷した。細胞を３回洗浄し、２４穴プレート（ファルコン）における１ｘ１０6個の精製Ｔ細胞に３ｘ１０4個のＤＣを加えた。培養７日後、Ｔ細胞を回収し、ユーロピウム放出アッセイを用いて細胞障害活性を調べた。
【００６４】
細胞障害活性の測定：３ｘ１０6個の標的細胞（ＨＬＡ  Ａ２．１＋、ＭＨＣクラスＩＩ陰性 Ｔ２細胞）を洗浄し、５０μｇ／ｍｌのインフルエンザマトリクスペプチドと共に又はそれなしで３７℃にて１時間インキュベートした。洗浄した後、１０％ＦＣＳを補完した１ｍｌの培養培地にて３μｌの蛍光増強リガンド（フィンランド、トゥルク、ワラック、ＢＡＴＤＡ）と共に３７℃にて１５分間、１ｘ１０6個のＴ２細胞をインキュベートした。ＰＢＳにて細胞を少なくとも５回洗浄し、１０％ＦＣＳ培養培地に慎重に再浮遊した。９６穴の平底プレートにてエフェクタ細胞と共に５ｘ１０3個の標的細胞を３７℃で２時間インキュベートした。エフェクタ：標的の比は４５：１、２０：１及び５：１であった。２時間後、９６穴プレートを遠心し、各上清を新しい９６穴プレートに移し、１４２０−００２ビクターＴＭマルチラベルカウンタ（フィンランド、トゥルク、ワラック）で分析した。
【００６５】
エンドサイトーシス活性及びＴＴの処理と提示の測定：２、３の実験では、サルスト（Sallusto et al., 1995）らにより記載されているようにＦＩＴＣデキストランの取り込みを正確に測定した。破傷風トキソイドペプチド特異的Ｔ細胞クローンＡＳ１１．１５（バーゼルのバーゼル免疫研究所のランザベキア博士より供与）を用いて、ちょうど記載されているように（Romani et al., 1996）破傷風トキソイドの抗原処理／提示の活性を調べた。
【００６６】
サイトカイン及びＰＧ  Ｅ２のＥＬＩＳＡ：ＥＬＩＳＡについては、マイクロタイタープレート（ヌンク マキシソープ(Maxisorb)ＩＩ丸底）をＩＬ−６（ファーミンジェン）、ＩＬ−１β、ＩＬ４、インターフェロン−γ、ＴＨＦ−α（すべて米国、ウォバーンのエンドジェンから入手）に特異的な抗体で４℃にて一晩被覆した。プレートを洗浄し、１％のヒト血清でブロックした。試料及び標準物質は３連一組で分析し、アビジン−ペルオキシダーゼ系でアッセイした。プロスタグランジンＥ２のＥＬＩＳＡについては、調製済みのキット（英国、バッキンハンプシャー(Buckinhamshire)、アマシャムファルマシア）を用いた。４０５ｎｍの波長にてＥＬＩＳＡリーダ（フィンランド、トゥルク、ワラック）によりプレートを測定した。
【００６７】
ＰＢＭＣ又はＤＣの凍結保存：２０％のＧＭＰ品質のヒト血清アルブミン（ドイツ、マールブルグ、センテオン）＋１０％（最終容積濃度）のＤＭＳＯ（米国、セントルイスのシグマ、カタログ番号２６５０）を含有する凍結培地にて、凍結培地１ｍｌ当たり１０〜３５ｘ１０6個のＰＢＭＣにて完全自動型の凍結装置（フランス、ビュッシー・パリ、ニコールプラス、エアリキッド）（出発点＋６℃、終点−１２０℃、Ｔｘ−４０℃）を用いてＰＢＭＣを凍結した。凍結容積はバイアル当たり４．５ｍｌを超えなかった。凍結された細胞は、５６℃の温水槽で融解し、次いで５ｍｌの冷却したハンクス平衡塩（米国、ウォーカーズビルのバイオウィタカー）に投入し、１２５ｇ、４℃にて１０分間一回遠心した。その後、上述のようにＰＢＭＣをプレートに蒔いた。培養５又は７日間でのＤＣの凍結については、我々は、細胞密度を５〜１５ｘ１０6個のＤＣ／ｍｌに減らしたが、凍結培地及び凍結手順は変更しないままだった。
【実施例１】
【００６８】
（比較例）：開放容器におけるＤＣの生成
ＰＢＭＣからのＤＣの生成：
トゥルナー（Thurner, B. et al., J. Immunol. Methods 223, 1-15 (1999)）が開示した方法に従って、８５ｍｍのディッシュ（細菌培養用ディッシュ、プライマリアディッシュ又は組織培養用ディッシュのいずれか、ファルコン、カタログ番号１００５、３０３８又は３００３：米国、ハーシーのベクトンディッキンソン）に、１０ｍｌの完全培養培地にて、ディッシュ当たり５０ｘ１０6個の細胞密度でＰＢＭＣを入れ、３７℃及び５％ＣＯ2にて１時間培養した。顕微鏡で付着性を制御した後、非付着性分画を除き、１０ｍｌの新鮮で温かい完全培地を加えた（０日目）。非付着分画を遠心し、再付着のために新しい８５ｍｍの組織培養ディッシュにもう一回蒔いた。１時間後、「再び蒔いた」ディッシュから非付着分画を除いた。付着分画すべてを１日目まで培養し、次いで、緩やかに付着した細胞が剥がれないように慎重に培養培地を取り去り、ＧＭ−ＣＳＦ（最終濃度、８００Ｕ／ｍｌ）及びＩＬ−４（最終濃度、１０００Ｕ／ｍｌ）を含有する新しい培養培地を加えた。３日目にディッシュ当たり３ｍｌの新鮮な培地（８０００ＵのＧＭ−ＣＳＦと１００００ＵのＩＬ−４を含有する）でサイトカインを再び加えた。５日目に全ての非付着性細胞を回収し、数を数え、３ｍｌの培地中５ｘ１０5個／ウエルの密度で６穴プレートに新鮮な完全培地（上述と同じ用量のサイトカインを含有する）で再び蒔いた。６日目にＤＣの成熟を誘導する別の刺激を加え、７又は８日目（予備実験では、９及び１０日目も）に細胞を回収した。
前記方法により得られた成熟ＤＣは以下の特性を有する（Thurner, B. et al., J. Immunol. Methods 223, 1-15 (1999)を参照のこと）：
（ａ）サイトカインを取り除いて、さらに３６時間培養しても形態的には安定している非付着性、不鮮明な細胞；
（ｂ）フローサイトメトリでの解析により判定すると成熟ＤＣの特徴的表現型を呈する；
（ｃ）一次同種ＭＬＲにおいてＤＣ：Ｔの比１：３００以上にて強い同種刺激能を示し、ＩＬ−１０の阻害効果に抵抗性である（一方、未成熟ＤＣ（成熟を誘導するＭＣＭに暴露せずに、ＧＭ−ＣＳＦ＋ＩＬ−４で生成される）はこれらの特性を欠く）；
（ｄ）強い細胞障害性Ｔ細胞反応を誘導する；及び
（ｅ）ＣＤ１ａの表面発現を示す（一方、Ｘ−ｖｉｖｏ１５又はＸ−ｖｉｖｏ２０培地で生成されたＤＣはほとんどが、別の点では匹敵する表現型を示すが、表面ＣＤ１ａ分子を欠く）。
【実施例２】
【００６９】
：ヌンクセルファクトリにおける樹状細胞の調製
Ａ：ヌンクセルファクトリにおける新鮮ＰＭＢＣからのヒト樹状細胞の調製のためのプロトコール
１．０日目におけるＰＢＭＣの平板培養：何個のＰＢＭＣが得られたかによって、相当する数の組織培養容器に装填することができる。各セルファクトリの組織培養ディッシュについて、各２００ｍｌの完全培地にて１２００ｘ１０6個のＰＢＭＣを蒔いた（例えば、３８００百万個のＰＢＭＣがある場合：１２００百万ｘ３＝３６００百万；３個のセルファクトリに蒔き、残りはＰＢＭＣとして凍結保存する）。培養すべき細胞を５０ｍｌ試験管に移し、もう１回遠心する（４℃、７００ｒｐｍ／１１０×ｇで１０分間）。
真空ポンプを用いて上清を除き、培養すべきセルファクトリ当たり１０ｍｌの培養培地で沈殿物を取り上げ、再浮遊した（＝細胞懸濁液）。セルファクトリ毎にラベルを付け（「患者名」）、１９０ｍｌの培地を入れ、セルファクトリ当たり１０ｍｌの細胞懸濁液を加えた。慎重にディッシュを揺らした後、レベル間で平衡化し、１時間、インキュベータに入れた。
【００７０】
２．１時間後の非付着性細胞の除去、培地の交換：６０分後、反射光学顕微鏡のもとで、十分な（約７０％のディッシュ表面が長めの細胞をしっかり付着させることによって覆われるべきである）細胞の培養ディッシュへの付着が達成されているかどうかをチェックした。
付着が十分であれば、細胞培養容器を慎重に撹拌することにより、非付着性分画を移動させ、非付着性細胞とともに培地を無菌の細胞培養ジャーに注ぎ込んだ。１４０ｍｌの純粋ＲＰＭＩを細胞培養容器に再び入れ、再び撹拌し、再び注ぎ出した。工程を再び繰り返し、２００ｍｌの完全培地を加え、平衡化し、新しい密封用リングと空気フィルタを適用した。１０ｍｌの注射器を用いて、注ぎだした培養培地から１０ｍｌ取り、血液培養用ジャーに注入した。ジャーにラベルを付け、それを直ちにインキュベータに入れ、その後、細菌をチェックした。
実験台では一度に１つのディッシュだけを処理した。次いで、ディッシュを再び２４時間インキュベータに入れた。
付着が十分ではない場合、非付着性分画の移動の開始前に、さらに１５〜３０分間ディッシュをインキュベータ内に残した。
非付着性分画を５０ｍｌの試験管に回収し、再び遠心した（１８℃、９００ｒｐｍ／１７５×ｇにて１０分間）。各セルファクトリの回収した非付着細胞を上述したように（再付着）１００ｍｌの完全培地中で１つのヌンクトリプルフラスコに再び蒔き、３７℃にて６０分間再びインキュベートした。上述したように、非付着細胞分画を再び除いた（非付着細胞は、ＧＭＰ部門の外で処分することができ、又は免疫モニタリングのために凍結することができる）。
【００７１】
３．１日目のサイトカインの添加：ＧＭ−ＣＳＦの添加：事前に温めた独自に穴を空けたジャーで、リューコマックス（登録商標）４００を同封のＮａＣｌ（１ｍｌ）で溶解し、１１０ｍｌのＰＢＳ／２％ヒト血清アルブミン（９９ｍｌのＰＢＳ＋１１ｍｌの２０％ＨＳＡ、ベーリング製）により希釈した。続いて、等量を１００本の無菌の１．５ｍｌ凍結試験管に入れ、−８０℃で保存した。
ＩＬ−４の調製：元のバイアル中の乾燥粉末（Ｇｅｎｚｙｍｅ  ＩＬ−４、４ｍｇ）を室温にして１００μｌのアクアアドインジェクトで溶解し、５００μｌのＰＢＳ／２％ＨＳＡで希釈した。等量を各５０μｌの無菌１ｍｌの凍結試験管に入れ、−８０℃で保存した。
さらなる使用については、ＩＬ−４アリコットをバイアル当たり４５０μｌずつのＲＰＭＩで希釈した。培養ディッシュを慎重にインキュベータから取り出し、反射光学顕微鏡でチェックした。各セルファクトリについては、２０ｍｌの培養培地に加えて４８００μｌずつのＧＭ−ＣＳＦと１８０μｌずつのＩＬ−４（総量２４０ｍｌに対して）を調製し、各トリプルフラスコについては１０ｍｌの培養培地に加えて、２０００μｌずつのＧＭ−ＣＳＦと７５μｌずつのＩＬ−４（総量１００ｍｌに対して）を調製した（８００Ｕ／ｍｌのＧＭ−ＣＳＦ及び５００Ｕ／ｍｌのＩＬ−４に相当する）。新しい培地を添加し、平衡化した。続いて、細胞をインキュベータに移し、再び４８時間、インキュベータで維持した。
【００７２】
４．３日目におけるサイトカインの添加：必要量のＧＭ−ＣＳＦとＩＬ−４を融解した。培養培地を温かい場所に保管した。各セルファクトリについては、４０ｍｌの培養培地に加えて６０００μｌずつのＧＭ−ＣＳＦと２２５μｌずつのＩＬ−４（総量３００ｍｌに対して）を調製し、各トリプルフラスコについては２０ｍｌの培養培地に加えて、２６００μｌずつのＧＭ−ＣＳＦと９７．５μｌずつのＩＬ−４（総量１３０ｍｌに対して）を調製した（８００Ｕ／ｍｌのＧＭ−ＣＳＦ及び５００Ｕ／ｍｌのＩＬ−４に相当する）。
培養ディッシュを慎重にインキュベータから取り出し、反射光学顕微鏡でチェックした。新しい培地を添加し、平衡化した。続いて、細胞を再び４８時間、インキュベータに移した。
【００７３】
５．５日目におけるサイトカインの添加：必要量のＧＭ−ＣＳＦとＩＬ−４を融解した。培養培地を温かい場所に保管した。各セルファクトリについては、４０ｍｌの培養培地に加えて６０００μｌずつのＧＭ−ＣＳＦと２２５μｌずつのＩＬ−４（総量３００ｍｌに対して）を調製し、各トリプルフラスコについては２０ｍｌの培養培地に加えて、２６００μｌずつのＧＭ−ＣＳＦと９７．５μｌずつのＩＬ−４（総量１３０ｍｌに対して）を調製した（８００Ｕ／ｍｌのＧＭ−ＣＳＦ及び５００Ｕ／ｍｌのＩＬ−４に相当する）。
培養ディッシュを慎重にインキュベータから取り出し、反射光学顕微鏡でチェックした。新しい培地を添加し、平衡化した。細胞を乱すために、ディッシュを慎重に揺らし、再びインキュベータに移した。
【００７４】
６．６日目の成熟用カクテルの添加：実験台を稼動させながら、室温にて必要量のサイトカインを融解した（培養培地ｍｌ当たり１０μｌの成熟用カクテル）。成熟用サイトカインは溶解形態であり、完全培地のｍｌ当たりの１０μｌの成熟用カクテルの添加が以下に述べる濃度に相当するように濃縮した。
個々のサイトカインの最終濃度／ｍｌは以下に相当する：
２ｎｇ            ＩＬ−１β（インターロイキン１β）
１０００Ｕ  ＩＬ−６（インターロイキン６）
１０ｎｇ    ＴＮＦ−α（腫瘍壊死因子α）
１μｇ            ＰＧ  Ｅ２（プロスタグランジンＥ２）
セルファクトリは：３５５ｍｌ、すなわち、セルファクトリ当たり３．５５ｍｌの成熟用カクテルを含有する。
トリプルフラスコ：１５６ｍｌ、すなわち、トリプルフラスコ当たり１．５６ｍｌの成熟用カクテル
容器をインキュベータから取り出し、反射光学顕微鏡下で評価した。上述の量にて成熟用カクテルをピペットでディッシュに加え、平衡化させ、再びインキュベータに移した。
【００７５】
７．７日目における成熟樹状細胞の回収：
０日目及び５日目における培養培地の細菌チェックが満足できれば、すなわち、試料が無菌であることが判明すれば、ＤＣの以下の最適なチェックを行う：
インキュベータから容器を取り出し、反射光学顕微鏡下で樹状細胞の表面を評価した。反射光学顕微鏡を用いて、ポラロイド写真を作成した。
細胞が良好な外観を有していれば（ほとんど死細胞がない、ほとんど付着していない、培養培地は赤く透明である、目に見える微生物はいない、汚染の兆候はない、ＳＯＰ  ＤＣ１２、項目１も参照されたい）、４ｍｌの細胞懸濁液をセルファクトリから取り出し、ＦＡＣＳ解析を行うのに使用する。
ＦＡＣＳ染色で十分なＣＤ８３の発現（＞７５％ＣＤ８３陽性）が得られれば、細胞を回収することができる。ＣＤＥ８３の発現が未だ不十分であれば（＜７５％）、新しいＦＡＣＳ解析を行う前にもう３時間待つ必要がある。
細胞の回収については、セルファクトリ及びトリプルフラスコの内容物を５０ｍｌの試験管に移した。それぞれ１００ｍｌのＲＰＭＩで細胞培養容器をもう２回すすぐ。７００ｒｐｍ／１１０×ｇ、４℃にて１２分間の遠心分離。
細胞の凍結については、２０％のＤＭＳＯを伴った自己血清（もう１つの方法として、２０％のＤＭＳＯを伴った２０％のヒト血清アルブミンと５％グルコース）を調製した（例えば、３６ｍｌの血清に４ｍｌのＤＭＳＯを添加）。凍結用培地は氷上で冷却した。
参照の試験管（３．６ｍｌ）には、ＤＭＳＯの最終濃度が１０％になるように、凍結用培地を半分（１．８ｍｌ）入れ、純粋な血清（又は２０％のＨＳＡ）を半分入れた。凍結装置を動かし始めた。
細菌検査を繰り返すために、１０ｍｌの上清を血液培養ジャーに移した。細胞を４０ｍｌの培養培地で処理した後、細胞数を数えるために４０μｌを取り出した。１０μｌの細胞懸濁液（それに１０μｌのトリパンブルーを加えた）をピペットでノイバウエル計算盤に入れ、製造元の指示書に従って、細胞を数えた。
さらなる品質制御試験に１００万個のＤＣが必要とされ、もう１００万個のＤＣは追加の１ｍｌバイアルでロット対照として凍結した。
純粋な自己血清（又は２０％ＨＳＡ）で細胞を約２０００万個／ｍｌの濃度に濃縮し、氷上で冷却した。あらかじめラベルを付けた凍結用試験管を氷上で冷却し、それぞれの半分に冷却した細胞懸濁液を入れた（例えば、３．６ｍｌの試験管にはそれぞれ１．８ｍｌの細胞懸濁液）。いったん、凍結装置で試験管挿入の準備ができると、凍結用培地を冷却した細胞懸濁液に添加し、試験管をネジ込みの蓋で密封し、揺すって、凍結用装置に入れ、凍結工程を開始した。
凍結工程終了後（−１３０℃に達する）、試験管を液体窒素に移した。
【００７６】
Ｂ：結果
上記のプロトコールにより９．２６％のＤＣの収率を達成することができた（１９人の患者の白血球分離採取法産物の平均値）。ＣＤ８３の発現は８９．５３％であった。得られたＤＣは、実施例１のＤＣと比べて同一の特性を示した。
【図面の簡単な説明】
【００７７】
本発明に係る装置の好ましい実施形態を図に示す。
【図１】積み重ね可能な盆状の試験槽を有する、本発明に係る装置の概略上面図を示す。
【図２】図１で示される装置の線Ｘ−Ｘに沿った断面図を示す。
【図３】図１及び図２に示す装置の充填装置を伴った概略三次元図を示す。
【図４】本発明に係る装置の第２の好ましい実施形態の概略上面図を示す。
【図５】線ＸＩＩ−ＸＩＩに沿った、図３に示す装置の断面図を示す。
【図６】本発明に係る装置の第３の好ましい実施形態の断面図を示す。
【図７】本発明に係る装置の第４の好ましい実施形態の断面図を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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