(57)【要約】脳内皮低密度リポタンパク質レセプター関連タンパク質１（ＬＲＰ−１）は、脳からのアルツハイマー病のアミロイドβペプチド（Ａβ）の血管クリアランスを媒介する。Ａβの輸送は、血液脳関門（ＢＢＢ）を越えて末梢循環まで生じるが、脳内皮は、アルツハイマー病において傷つけられる。本発明は、症候性個体および無症候性個体におけるこの疾患を診断するために、疾患について危険性のある個体もしくはすでにこれによって罹患した個体を同定するために、疾患の段階もしくはその進行を決定するために、この疾患の天然の履歴の早期に介入するかもしくはこの疾患の天然の履歴を変更するために、治療処置もしくは予防処置のための標的を提供するために、薬物をスクリーニングするかもしくは医療レジメンを比較するために、薬物もしくは医療レジメンの有効性を決定するために、またはこれらの任意の組み合わせのために使用される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくともアルツハイマー病を有する個体を診断するかまたはアルツハイマー病を発症する危険性があるとして個体を同定するための方法であって、該方法は、以下の工程：
（ａ）少なくとも個体中の低密度リポタンパク質レセプター関連タンパク質１（ＬＲＰ−１）の量、その転写産物の量、またはＬＲＰ−１レセプター活性を測定する工程；
（ｂ）該個体中の該ＬＲＰ−１タンパク質の量、その転写産物の量またはＬＲＰ−１レセプターの活性を、アルツハイマー病によって罹患されない少なくとも年齢を合わせたコントロールと比較する工程；ならびに
（ｃ）少なくともアルツハイマー病を有する該個体を診断するか、またはアルツハイマー病を発症する危険性があるとして該個体を同定する工程であって、ここで、該個体中のＬＲＰ−１の量、その転写産物の量、またはＬＲＰ−１レセプター活性は、アルツハイマー病によって罹患されない該年齢を合わせたコントロールと比較して増加される、工程、
を包含する、方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、ここで、前記ＬＲＰ−１タンパク質の量、その転写産物の量、またはＬＲＰ−１レセプター活性は、前記個体の少なくとも脳血管内皮細胞または全身性内皮細胞において測定される、方法。
【請求項３】
請求項１に記載の方法であって、ここで、前記ＬＲＰ−１タンパク質の量、その転写産物の量、またはＬＲＰ−１レセプター活性は、前記個体の少なくとも脳毛細管、側頭動脈、軟膜動脈、または血液脳関門において測定される、方法。
【請求項４】
アルツハイマー病を有するかまたはアルツハイマー病を発症する危険性のある個体を少なくとも処置する方法であって、該方法は、該個体において血液脳関門でのアミロイドβペプチド（Ａβ）の低密度リポタンパク質レセプター関連タンパク質１（ＬＲＰ−１）媒介性除去を脳から血液への方向で増加させる工程を包含する、方法。
【請求項５】
請求項４に記載の方法であって、Ａβの除去は、少なくともＬＲＰ−１発現またはレセプター活性を増加することによって増加される、方法。
【請求項６】
請求項４に記載の方法であって、Ａβの除去は、少なくともＬＲＰ−１のリガンドの発現または該リガンドの輸送を増加することによって増加される、方法。
【請求項７】
前記ＬＲＰ−１のリガンドは、アポリポタンパク質Ｅである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記ＬＲＰ−１のリガンドは、α２−マクログロブリンである、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
アルツハイマー病を有するかまたはアルツハイマー病を発症する危険性のある個体を少なくとも処置する方法であって、該方法は、該個体の脳からのアミロイドβペプチド（Ａβ）の血管クリアランスを増加させる工程を包含する、方法。
【請求項１０】
Ａβに対する血管透過性が増加される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記脳において、少なくとも新血管形成または新生血管形成が増加される、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
アルツハイマー病を処置するために少なくとも薬物または医療レジメンの有効性を決定する方法であって、該方法は、以下の工程：
（ａ）該薬物または医療レジメンの存在下での低密度リポタンパク質レセプター関連タンパク質１（ＬＲＰ−１）の量、その転写物の量、またはＬＲＰ−１レセプターの活性を測定する工程；および
（ｂ）ＬＲＰ−１タンパク質の量、その転写物の量、またはＬＲＰ−１レセプターの活性が、該薬物または医療レジメンの存在下で増加される場合に、該薬物または医療レジメンが効果的であることを少なくとも決定する工程、
を包含する、方法。
【請求項１３】
請求項１２に記載の方法によって効果的であると決定された、アルツハイマー病を処置するための新規薬物、または医療レジメンの使用。
【請求項１４】
低密度リポタンパク質レセプター関連タンパク質１（ＬＲＰ−１）またはその転写産物に対する特異的結合分子を１以上含むキットであって、該ＬＲＰ−１タンパク質の量、その転写産物の量、もしくはＬＲＰ−１レセプター活性、および／またはＬＲＰ−１タンパク質もしくはその転写産物を含む非アルツハイマー病コントロールを測定するために使用される、キット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本出願は、２０００年５月２３日出願の米国特許仮出願番号６０／２０６，４２８および２０００年１１月６日出願の米国特許出願番号６０／２４６，２６８の利益を主張する。
【０００２】
（連邦政府支援の研究に関する供述）
米国政府は、国立衛生研究所によって与えられる助成金によって規定される場合、本発明に特定の権利を有する。
【０００３】
（発明の分野）
本発明は、低密度リポタンパク質レセプター関連タンパク質１（ＬＲＰ−１）によって媒介されるような、中枢神経系（ＣＮＳ）からアルツハイマー病アミロイドβ（Ａβ）を除去する際の血管系の役割に関する。Ａβの輸送は、血液脳関門（ＢＢＢ）を越えて末梢循環にまで生じるが、脳内皮は、アルツハイマー病において傷つけられる。本発明は、症候性個体および無症候性個体を診断するために、疾患について危険性のある個体もしくはすでにこれに罹患した個体を同定するために、疾患の段階もしくはその進行を決定するために、この疾患の天然の履歴の早期に介入するかもしくはこの疾患の天然の履歴を変更するために、治療処置もしくは予防処置のための標的を提供するために、薬物をスクリーニングするかもしくは医療レジメンを比較するために、薬物もしくは医療レジメンの有効性を決定するために、またはこれらの任意の組み合わせのために使用される。
【０００４】
（発明の背景）
脳でのアミロイドβペプチド（Ａβ）の沈着は、正常な加齢の間に生じ、そしてアルツハイマー病（ＡＤ）を有する個体において加速される。Ａβは、ＡＤの病理の中枢であり、そして脳実質および血管アミロイドの主要な構成要素である（１〜６）。老人斑から抽出されたＡβは、主にＡβ１−４０およびＡβ１−４２を含む（７）が、血管アミロイドは、主にＡβ１−３９およびＡβ１−４０を含む（８）。Ａβのいくつかの配列は、両方の病変において見出された（９〜１１）。血液中、脳脊髄液（ＣＳＦ）（１２〜１４）および脳（１５〜１６）に存在する、Ａβの主要な可溶性形態は、Ａβ１−４０である。循環、ＣＳＦおよび脳間質液（ＩＳＦ）において、可溶性Ａβは、遊離ペプチドとして存在し得、および／または様々な輸送結合タンパク質（例えば、アポリポタンパク質Ｊ（ａｐｏＪ）（１７〜１８）、アポリポタンパク質Ｅ（ａｐｏＥ）（１９）、トランスサイレチン（ｔｒａｎｓｔｈｙｒｅｔｉｎ）（２０）、リポタンパク質（２１）、アルブミン（２２）およびα２マクログロブリン（α２Ｍ）（２３））と結合し得る。
【０００５】
神経学説は、可溶性脳由来ＡβがＡβ沈着の前駆体であると主張する。神経細胞は、培養物中にＡβを分泌する（２４）。このことは、この観点を支持する。ＡＤおよびダウン症候群の脳における可溶性Ａβの増加は、アミノイド斑形成に先んじ（１５、２５、２６）、そして血管病理の発症と相関する（２７）。細胞内Ａβをインビトロで分解し得るいくつかの細胞質プロテアーゼは、脳ＩＳＦ（２８）またはＣＳＦ（２９）由来の細胞外Ａβをインビボで分解し得ない。例外は、エンケファリナーゼであり、これは脳ＩＳＦ（２８）由来のＡβ１−４２を分解し得る。しかし、インビボでのこの分解の生理学的重要性は、なお不明なままである。なぜなら、このペプチドは、病理学的に極度の高濃度で研究されていたからである（３０）。
【０００６】
脳およびＣＳＦからのＡβのクリアランスの減少が散発性ＡＤ（３１）におけるＡＤ蓄積の主要な原因であることが、示唆されてきた。Ａβは脳で連続的に生成されるので、本研究における作業仮説は、脳におけるこの蓄積および引き続く凝集を予防するために効率的クリアランス機構が血液脳関門（ＢＢＢ）に存在するに違いないというものであった。細胞表面レセプター（例えば、進行したグリケーション末端産物に対するレセプター（ＲＡＧＥ）（３２〜３３）、スカベンジャーＡ型レセプター（ＳＲ−Ａ）（３４）、低密度リポタンパク質レセプター関連タンパク質１（ＬＲＰ−１）（３５−３８）およびＬＲＰ−２（３９））は、遊離ペプチドとして（例えば、ＲＡＧＥ、ＳＲ−Ａ）、および／またはα２Ｍ、ａｐｏＥもしくはａｐｏＪと結合体化して（例えば、ＬＲＰ−１、ＬＲＰ−２）、低いｎＭ濃度でＡβと結合する。ＲＡＧＥおよびＳＲ−Ａは、ＢＢＢの管腔側で開始するＡβの脳内皮エンドサイトーシスおよびトランスサイトーシスを調節する（３３）が、ＬＲＰ−２は、ａｐｏＪと結合体化した血漿ＡβのＢＢＢ輸送を媒介する（３９）。脳由来Ａβの除去における血管レセプターおよびＢＢＢ輸送の役割は、不明である。
【０００７】
本研究において、マウスでの脳組織クリアランスを測定する技術は、ウサギでの以前のモデル（４０）に基づいて開発された。この技術を使用して、Ａβ１−４０のＣＮＳからの流出速度をインビボで時間およびペプチド濃度の関数として決定し、そしてＢＢＢを越える脳由来Ａβの排除に関する血管輸送および／またはレセプター媒介流出機構を特徴付けた。本研究は、ＬＲＰ−１ならびにそのリガンド（α２ＭおよびａｐｏＥ）に焦点を当てた。なぜなら、両者とも、平滑筋細胞（３５）、神経細胞（３６、３８）および繊維芽細胞（３７）においてＡβクリアランスを促進するからである；そしてａｐｏＥ４遺伝子座は規定されており、α２Ｍ遺伝子座は、ＡＤの危険性の増加におそらく関連する（４１〜４２）からである。
【０００８】
本研究を使用して、アルツハイマー病の病理学および疾患の機能の理解を改善する。診断および処置の、新規かつ自明ではない様式は、本知見により示唆される。本発明の他の利点は、以下に議論されるか、または本明細書中の開示より当業者に明らかである。
【０００９】
（発明の要旨）
本発明の１つの実施形態において、以下のような方法を実施するために使用され得る試薬が、キットの形態で提供される：診断、疾患の危険性があるかまたはすでに罹患したものの同定、または疾患の段階もしくはその進行の決定。さらに、これらの試薬は、以下のような疾患の処置に関連する方法において使用され得る：その疾患の天然の履歴における介入、疾患の経過の変更、停止または遅い進行のための早期介入、機能回復または機能維持の促進、有益な治療または予防のための標的の供給、候補薬物または医療レジメンの比較、あるいは薬物または利用レジメンの有効性の決定。これらの方法を実施するための指示書、参照値およびポジティブコントロール／ネガティブコントロール、ならびに患者の情報（例えば、遺伝子型、医療履歴、症状、遺伝子発現からの転写収率または翻訳収率、生理学的知見または病理学的知見）を含むリレーショナルデータベースは、本発明の局面とみなされるべき他の産物である。
【００１０】
本発明の他の実施形態において、診断および処置のためのこれらの方法が、提供される。薬物および医療試験のスクリーニングについて、選択されたそれぞれの薬物および医療レジメンはまた、本発明の実施形態とみなされる。治療または予防の必要な細胞、組織または個体に投与される処置の量および程度は、冒された細胞、組織または個体を処置する際に効果的である。冒された内皮もしくはその細胞の１以上の特性／機能、または冒された個体の症状の数／重篤度は、改善され得るか、減少され得るか、正規化され得るか、改善され得るか、またはさもなくば首尾よく処置され得る。本発明は、単独でかまたは他の既知の方法と組合わせて使用され得る。これらの方法を実施するための指示書、参照値およびポジティブコントロール／ネガティブコントロール、ならびに患者の情報を含むリレーショナルデータベースはさらに、本発明の局面とみなされる。個体は、任意の動物またはヒトであり得る。哺乳動物、特にヒトおよびげっ歯類または霊長類の疾患モデルは、処置され得る。従って、獣医的方法および医療方法の両方が意図される。
【００１１】
本発明のさらなる局面は、以下の詳細な説明および特許請求の範囲、ならびにこれに対する概念より、当業者に明らかである。
【００１２】
（発明の説明）
脳からのアミロイドβペプチド（Ａβ）の除去は、ほとんど理解されていない。若齢マウスでの大脳内マイクロインジェクションの後、１２５Ｉ−Ａβ１−４０は、主に血液脳関門（ＢＢＢ）を越える血管輸送によって迅速に脳から除去された（ｔ１／２≦２５分）（≧７４％）。ＢＢＢでのＡβ１−４０についての流出輸送システムは、１５．３ｎＭで半分飽和（Ｋ０．５）され、そして、７０ｎＭと１００ｎＭとの間で最大輸送能に達した。Ａβ１−４０クリアランスは、レセプター結合タンパク質（４４％）ならびに低密度リポタンパク質レセプター関連タンパク質１（ＬＲＰ−１）に対する抗体（５８％）およびα２−マクロブロブリンに対する抗体（α２Ｍ）（２５％）によって阻害された。クリアランスは、若齢（３０％）および老齢（４６％）のアポリポタンパク質Ｅ（ａｐｏＥ）ノックアウトマウス、ならびに老齢の野生型マウス（５５％）において顕著に減少した。ＢＢＢを越えて循環に輸送される前にＡβが脳間質液にて代謝され、そしてより小さなペプチドフラグメントおよびアミノ酸に分解される証拠はなかった。ＬＲＰ−１は、若齢マウスの脳微小血管中に豊富であるが、より老いた動物においてダウンレギュレートされた（４５％）。血管ＬＲＰ−１のダウンレギュレートは、アルツハイマー病患者の脳における局所Ａβ蓄積に相関した。ＢＢＢは、主として加齢依存的ＬＲＰ−１媒介輸送機構によって脳からＡβを除去する。この機構は、α２Ｍおよび／またはａｐｏＥによって影響を受ける。この機構は、転写物もしくはタンパク質の量またはレセプター機能（例えば、レセプタートランスサイトーシスまたは再利用に必要な時間、ＢＢＢを越えるリガンド輸送の効率）のレベルで、アルツハイマー病において損なわれるようである。
【００１３】
内皮細胞、単離された組織、およびインビトロでの細胞培養物の調製物は、アルツハイマー病の危険性のある個体、この疾患に罹患した個体、または罹患していない個体の脳（例えば、微小血管系）または他の器官（例えば、皮膚）より提供される。特に、脳の内皮、平滑筋、血管および毛細管、側頭動脈および軟膜動脈、またはＬＲＰ−１を発現する他の任意の組織のような組織は、試験され得る。血球および骨髄細胞もまた、使用され得る。これらは、生検材料または剖検材料として入手され得る；目的の細胞は、これらから単離され得、次いで培養され得る。以下もまた提供される：細胞の抽出物；少なくとも部分的に精製されたＤＮＡ、ＲＮＡおよびこれら由来のタンパク質；ならびに、これらの単離のための方法。これらの試薬を使用して、アッセイについての検出限界、疾患か否かを示す遺伝子発現の絶対量、疾患か否かを示す遺伝子発現の割合、およびこのような値における差異の意義を確立し得る。ポジティブコントロールおよび／またはネガティブコントロールについてのこれらの値は、アッセイの時に、アッセイの前に、アッセイの後に、またはこれらの任意の組合せで測定され得る。値は、記憶媒体に記録され得、そしてコンピューターソフトウェアを用いて操作され得る；データベース中の記憶は、遡及研究または予期研究を可能にする。遺伝子発現（例えば、抗体染色によって検出される）およびＬＲＰ−１のタンパク質活性（例えば、脳から全身循環へのＡβの血管クリアランス）は、アルツハイマー病を有する個体において減少した。
【００１４】
その発現がアルツハイマー病において減少している遺伝子を代表するポリヌクレオチドを使用して、結合アッセイによって相補的ポリヌクレオチドを同定、単離または検出し得る。同様に、アルツハイマー病において減少している遺伝子産物を代表するポリペプチドを使用して、結合アッセイによって相互作用するタンパク質を同定、単離または検出し得る。必要に応じて、相互作用するタンパク質を含む結合した複合体は、アルツハイマー病において減少している遺伝子産物についての特異的結合分子（例えば、抗体）を介して間接的に同定、単離または検出され得る。本明細書中で研究されたレセプター−リガンド系について、ＬＲＰ−１、ａｐｏＥおよびα２Ｍは、相互作用タンパク質である。アルツハイマー病を処置する候補化合物は、レセプター活性（すなわち、Ａβの血管クリアランス）を増加させるレセプター−リガンド系の構成要素である、少なくとも１つの遺伝子、転写物、またはタンパク質と相互作用し得、そして治療または予防を提供するこれらの能力についてスクリーニングされ得る。これらの産物は、アッセイ（例えば、診断方法）において使用され得るかまたは処置のために使用され得る；都合の良いことには、これらは、アッセイキットとしてかまたは薬学的形態にて梱包される。
【００１５】
（ポリヌクレオチドまたはポリペプチドのアッセイ）
ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの結合は、溶液中または基板上で生じ得る。アッセイ形態は、結合したものを結合していないものから分離することを必要としてもしなくてもよい。検出可能なシグナルは、結合した複合体の任意の部分に直接的もしくは間接的に付着され得るか、競合的に測定され得るか、増幅され得るか、またはこれらの任意の組み合わせであり得る。ブロッキングする工程または洗浄する工程は、感度および／または特異性を改善するために挿入され得る。結合の前、後または間での基板への、ポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、相互作用するタンパク質、または特異的結合分子の付着は、付着していない種の捕獲を生じる。米国特許第５，１４３，８５４号および同５，４１２，０８７号を参照のこと。量は、レセプター−リガンド系の構成要素のタンパク質および／または転写物のレベルで測定され得る。
【００１６】
ポリヌクレオチド、ポリペプチドまたは特異的結合分子は、基板上に付着され得る。基板は、固体または多孔性であり得、そしてシート、ビーズまたは繊維として形成され得る。基板は、以下から作製され得る：ワタ、キヌまたはウール；セルロース、ニトロセルロース、ナイロンまたは陽性荷電ナイロン；天然ゴム、ブチルゴム、シリコーンゴムまたはスチレンブタジエンゴム；アガロースまたはポリアクリルアミド；シリコンまたはシリコーン；結晶性珪酸、非晶質珪酸または不純な珪酸（例えば、石英）もしくは珪酸塩（例えば、ガラス）：ポリアクリロニトリル、ポリカーボネート、ポリエチレン、ポリメチルメタクリレート、ポリメチルペンテン、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリスルフォン、ポリテトラフルオロエチレン、ポリフッ化ビニリデン、ポリ酢酸ビニル、ポリ塩化ビニルまたはポリビニルピロリドン；あるいは、これらの組合わせ。結合はモニターされ得、そして光によってシグナルが伝達され得るので、光学的に透明な材料は好ましい。
【００１７】
このような試薬は、同族の分子の間での特異的な相互作用によって溶液中の分子の捕獲を可能にし、次いで、基板上にこの分子を固定し得る。遺伝子発現をモニターすることは、アレイの使用によって容易にされる。
【００１８】
ポリヌクレオチド、ポリペプチドまたは特異的結合分子を、固相化学または写真平板によってインサイチュで合成して基板にヌクレオチドまたはアミノ酸を直接付着させ得る。ポリヌクレオチド、ポリヌクレオチドまたは特異的結合分子の基板への付着は、例えば、カルボキシ基、アミノ基または水酸基のような反応基を介し得る；付着はまた、密着印画、ピンでのスポット、ペンでのピペッティング、またはノズルでのスプレーの後に基板上に直接達成され得る。あるいは、ポリヌクレオチド、ポリペプチドまたは特異的結合分子は、特異的結合対（例えば、抗体−ジゴキシゲニン／ハプテン／ペプチド、ビオチン−アビジン／ストレプトアビジン、グルタチオン　Ｓ　トランスフェラーゼ−グルタチオン、マルトース結合タンパク質−マルトース、ポリヒスチジン−ニッケル、プロテインＡまたはプロテインＧ／免疫グロブリン）の相互作用によって基板上に可逆的に付着され得る；不可逆的付着が所望される場合に、架橋が使用され得る。
【００１９】
遺伝子発現における変化は、転写開始、転写物安定性、転写物のタンパク質産物への翻訳、タンパク質安定性またはこれらの組み合わせに作用することによって細胞中で明示され得る。転写物またはポリペプチドの量は、例えば、以下のような技術によって測定され得る：インビトロ転写、インビトロ翻訳、ノーザンハイブリダイゼーション、核酸ハイブリダイゼーション、逆転写−ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）、ラン−オン（ｒｕｎ−ｏｎ）転写、サザンハイブリダイゼーション、細胞表面タンパク質標識、代謝タンパク質標識、抗体結合、免疫沈降（ＩＰ）、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、蛍光性染色もしくは組織化学染色、顕微鏡法およびデジタル画像分析、ならびに蛍光活性化細胞分析または分類（ＦＡＣＳ）。
【００２０】
タンパク質産物が容易にアッセイされるレポーター遺伝子または選択マーカー遺伝子は、簡便な検出に使用され得る。レポーター遺伝子としては、例えば、以下が挙げられる：アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ（ＬａｃＺ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、β−グルクロニダーゼ（ｇｌｕｃｏｒｏｎｉｄａｓｅ）（ＧＵＳ）、細菌／昆虫／海洋生物（ｍａｒｉｎｅ）の無脊椎動物ルシフェラーゼ（ＬＵＣ）、緑色蛍光タンパク質および赤色蛍光タンパク質（それぞれ、ＧＦＰおよびＲＦＰ）、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、β−ラクタマーゼ、ならびにこれらの誘導体（例えば、青色ＥＢＦＰ、シアンＥＣＦＰ、黄緑色ＥＹＦＰ、不安定化ＧＦＰ改変体、安定化ＧＦＰ改変体、またはＣｌｏｎｔｅｃｈによってＬＩＶＩＮＧ　ＣＯＬＯＲＳ蛍光タンパク質として販売される融合改変体）。レポーター遺伝子は、好ましくは色素原シグナル、蛍光シグナルまたは発光シグナルによってアッセイされる同族の基質を使用する。あるいは、アッセイ産物は、同族の抗体または親和性樹脂が利用可能である異種性エピトープ（例えば、ＦＬＡＧ、ＭＹＣ、ＳＶ４０　Ｔ抗原、グルタチオントランスフェラーゼ、６ヒスチジン、マルトース結合タンパク質）でタグ化され得る。
【００２１】
ポリヌクレオチドは、リンカーオリゴヌクレオチドに連結され得るか、または特異的結合対（例えば、抗体−ジゴキシゲニン／ハプテン／ペプチドエピトープ、ビオチン−アビジン／ストレプトアビジン、グルタチオントランスフェラーゼまたはＧＳＴ−グルタチオン、マルトース結合タンパク質−マルトース、ポリヒスチジン−ニッケル、プロテインＡ／Ｇ−免疫グロブリン）の１メンバーに結合体化され得る。ポリヌクレオチドは、結合メンバーをコードするヌクレオチド配列の連結によって結合体化され得る。ポリペプチドは、このような連結または複合体化されたポリヌクレオチドをコードする融合物を生成することによって、あるいは、結合メンバー上の反応部分への化学的架橋による直接的化学結合によって、特異的結合対の１メンバーに接合され得る。このようなポリヌクレオチドおよびポリペプチドを、親和性試薬として使用して、発現ベクターの転写物またはタンパク質産物の特異的結合に関する相互作用を同定し、単離しそして検出し得る。転写物またはタンパク質産物の親和性結合の前または後に、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドに付着されたメンバーは、その候補結合メンバーに結合され得る。これは、溶液中にか、または支持体上に固定化された複合体を生成し得る。
【００２２】
（発現ベクターの構築）
発現ベクターは、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）および／またはリボ核酸（ＲＮＡ）のいずれかの化学的形態にある組換え体ポリヌクレオチドである。発現ベクターの物理的形態はまた、鎖の数（ｓｔｒａｎｄｅｄｎｅｓｓ）（例えば、一本鎖もしくは二本鎖）およびトポロジー（例えば、直線状もしくは環状）において変更され得る。発現ベクターは、好ましくは二本鎖デオキシリボ核酸（ｄｓＤＮＡ）であるか、または細胞への導入（例えば、プロウイルスとしての宿主ゲノムへのレトロウイルスの挿入）の後にｄｓＤＮＡに変換される。発現ベクターは、微小血管系、特に上皮細胞（例えば、ＩＣＡＭ−２、ｔｉｅ）において発現される哺乳動物遺伝子由来、またはウイルス由来（例えば、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、サイトメガロウイルス、単純ヘルペスウイルス、モロニー白血病ウイルス、マウス乳腺腫瘍ウイルス、ラウス肉腫ウイルス、ＳＶ４０ウイルス）の１以上の領域、ならびに遺伝子操作に適切な領域（例えば、選択マーカー、制限エンドヌクレアーゼについての多重認識部位を有するリンカー、インビトロ転写のためのプロモーター、インビトロ複製のためのプライマーアニーリング部位）を含み得る。発現ベクターは、（例えば、ウイルス粒子中にパッケージングされた）キャリア中でタンパク質および他の核酸と会合し得る。
【００２３】
発現ベクターはさらに、遺伝子発現に対する調節領域（例えば、プロモーター部位、エンハンサー部位、サイレンサー部位、スプライシングドナー部位およびスプライシングアクセプター部位、ポリアデニル化シグナル、細胞内局在配列）を含む。転写は、テトラサイクリンまたは二量体化マクロライドによって調節され得る。発現ベクターはさらに、以下を含み得る：発現領域の内部に１以上のスプライシングドナー部位およびスプライシングアクセプター部位；翻訳の開始のための、発現領域の上流のコザックコンセンサス配列；発現領域の下流に、翻訳の終止を保障するための、３つの順方向リーディングフレームにおける多重の停止コドン、１以上のｍＲＮＡ分解シグナル、転写終止シグナル、ポリアデニル化シグナル、および３’切断シグナル。イントロンを含まない発現した領域（例えば、ｃＤＮＡ由来のコード領域）について、スプライシングドナー部位およびスプライシングアクセプター部位の対は、好ましくてもよく好ましくなくてもよい。しかし、これは、誘導条件下でのみ１以上の下流領域を発現することが所望される場合に、ｍＲＮＡ分解シグナルを含むために有用である。宿主ゲノムに組み込まれた発現ベクターの複製、または自律的に複製するエピソームとして発現ベクターの複製を可能にする複製起点は、含まれ得る。動原体配列および末端小粒配列はまた、それぞれ染色体分離および短縮化からの染色体末端の保護のために含まれ得る。宿主ゲノムへの無作為な組み込みまたは標的化された組み込みは、発現ベクターの維持を確実にするようであるが、エピソームは、淘汰圧によって維持され得るか、または発現ベクターが一過性にのみ存在する適用について好ましくあり得る。
【００２４】
発現領域は、調節領域（例えば、構成的、調節性、または内皮特異的なプロモーター、および任意のエンハンサー）と作動可能に連結されている、ＬＲＰ−１またはそのリガンドをコードする遺伝子由来であり得る。発現された領域は、翻訳的融合物をコードし得る。ポリペプチドおよび少なくとも１つの異種性ドメインをコードする領域のオープンリーディングフレームは、見当があって連結され得る。レポーターまたは選択マーカーが異種ドメインとして使用されるならば、融合タンパク質の発現は、容易にアッセイされ得るかまたは局在化され得る。異種性ドメインは、親和性タグまたはエピトープタグであり得る。
【００２５】
（候補化合物のスクリーニング）
本発明の別の局面は、化学的または遺伝的な化合物、これらの誘導体、ならびにアルツハイマー病およびその危険性のある個体の処置において効果的なこれらを含む組成物である。治療または予防を必要とする個体に投与される量、処方、ならびに送達の時期および経路は、症状の数もしくは重篤度を減らすために、症状の進行を遅延もしくは制限するために、アルツハイマー病においてより高いレベルで転写される１以上の遺伝子の発現を阻害するために、アルツハイマー病においてより低いレベルで転写される１以上の遺伝子の発現を活性化するために、またはこれらの組み合わせに効果的である。このような量、処方、ならびに薬物送達の時期および経路の決定は、インビトロでのアッセイ、インビボでの動物モデル研究、およびヒト臨床試験を行う者の技術範囲内である。
【００２６】
スクリーニング法は、生物に候補化合物を投与する工程、または候補化合物を細胞とインキュベートする工程、次いで遺伝子発現が増加するか否かを決定する工程を包含し得る。活性の増加は、アルツハイマー病に関連する変化またはアルツハイマー病を生じ得る変化を部分的にかまたは完全に補い得る。遺伝子発現は、転写開始速度、転写伸長速度、転写物の安定性、転写物の翻訳、翻訳開始速度、翻訳伸長速度、タンパク質の安定性、タンパク質折り畳み速度、活性なコンフォーメーションでのタンパク質の割合、タンパク質の機能的効率（例えば、転写の活性化もしくは抑制）、またはこれらの組み合わせのレベルで増加し得る。米国特許第５，０７１，７７３号および同５，２６２，３００号を参照のこと。高処理量スクリーニングアッセイが可能である。
【００２７】
スクリーニング法は、アッセイ可能な産物をコードする下流の遺伝子にシス配置で共有結合された転写調節領域を含むレポーター構築物を含む細胞とともに、候補化合物をインキュベートする工程；および、このアッセイ可能な産物の生成を測定する工程を包含し得る。このアッセイ可能な産物の生成を増加させる候補化合物は、遺伝子発現を活性化する因子として同定される。米国特許第５，８４９，４９３号および同５，８６３，７３３号を参照のこと。
【００２８】
スクリーニング法は、候補化合物の存在下または非存在下で、転写調節領域を含むレポーター構築物からのインビトロ転写を測定する工程；およびこの候補化合物の存在によって転写が変更されるか否かを決定する工程を包含し得る。インビトロ転写は、無細胞抽出物、特に、無細胞抽出物の部分精製画分、精製された転写因子またはＲＮＡポリメラーゼ、あるいはこれらの組み合わせを使用してアッセイされ得る。米国特許第５，４５３，３６２号；同５，５３４，４１０号；同５，５６３，０３６号；同５，６３７，６８６号；同５，７０８，１５８号；および同５，７１０，０２５号を参照のこと。
【００２９】
転写活性または翻訳活性をインビボで測定するための技術は、当該分野において公知である。例えば、核ラン−オン（ｎｕｃｌｅａｒ　ｒｕｎ−ｏｎ）アッセイは、レポーター遺伝子の転写を測定するために使用され得る。レポーター遺伝子の翻訳は、翻訳産物の活性を決定することによって測定され得る。レポーター遺伝子の活性は、ポリヌクレオチド産物（例えば、ＲＴ−ＰＣＲのＧＦＰ転写物）の転写の量、ポリペプチド産物の翻訳（例えば、ＧＦＰタンパク質の免疫アッセイ）、およびレポータータンパク質自体の酵素活性（例えば、ＧＦＰの蛍光またはそのエネルギー移動）の１以上を決定することによって測定され得る。
【００３０】
（処置のための遺伝的化合物）
遺伝子活性化は、ダウンレギュレートされた遺伝子に関連する下流の領域（例えば、この遺伝子の全長コード領域もしくは機能的部分；ハイパーモルフ変異体、そのホモログ、オルソログもしくはパラログ）、または遺伝子活性化の抑制を解くように作用する（例えば、この遺伝子のネガティブ調節因子の発現を少なくとも部分的に阻害する）遺伝子に関連しない下流の領域を含む発現ベクターを誘導することによって達成され得る。転写または翻訳の過剰発現、ならびにタンパク質機能の過剰発現は、遺伝子活性化へのより直接的アプローチであり得る。あるいは、下流の発現された領域は、ゲノム中の遺伝子座への相同組換えを指向し得、それにより遺伝子の内因性転写調節因子領域を発現カセットと置換され得る。特に、血液脳関門を越えてＡβを輸送するレセプター−リガンド系の構成要素の遺伝子発現は、内因性遺伝子の導入または外因性遺伝子の活性化によって増加し得る。
【００３１】
発現ベクターは、例えば、化学物質（例えば、リン酸カルシウム、ＤＥＡＥ−デキストラン、脂質、ポリマー）、遺伝子銃、エレクトロポレーション、裸のＤＮＡ技術、マイクロインジェクション、またはウイルス感染を使用する、トランスフェクション技術または遺伝子導入技術によって、宿主哺乳動物細胞または非ヒト哺乳動物へ導入され得る。導入された発現ベクターは、哺乳動物細胞または非ヒト哺乳動物の宿主ゲノムへ組み込まれ得る。脂質キャリアビヒクルを作製するための多くの中性の脂質および荷電した脂質、ステロールおよび他のリン脂質が、公知である。例えば、中性脂質は、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）およびジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）であり；アニオン性脂質は、ジオレオイルホスファチジルセリン（ＤＯＰＳ）であり；カチオン性脂質は、ジオレオイルトリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＡＰ）、ジオクタデシルジアミドグリシルスペルミン（ＤＯＧＳ）、ジオレオイルトリメチルアンモニウム（ＤＯＴＭＡ）および１，３−ジ−オレオイルオキシ−２−（６−カルボキシ−スペルミル）−プロピルアミド四酢酸（ＤＯＳＰＥＲ）である。ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）は、送達の効率および／または安定性を改善するために組み込まれ得る。ＦＵＧＥＮＥ　６、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ、ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ、ＤＭＲＩＥ−Ｃ、ＴＲＡＮＳＦＥＣＴＡＭ、ＣＥＬＬＦＥＣＴＩＮ、ＰＦＸ−１、ＰＦＸ−２、ＰＦＸ−３、ＰＦＸ−４、ＰＦＸ−５、ＰＦＸ−６、ＰＦＸ−７、ＰＦＸ−８、ＴＲＡＮＳＦＡＳＴ、ＴＦＸ−１０、ＴＦＸ−２０、ＴＦＸ−５０およびＬＩＰＯＴＡＸＩの脂質は、商標名のついた処方物である。ポリマーは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）またはポリエチレンイミン（ＰＥＩ）であり；あるいは、ポリマー性材料は、ナノスフェアまたはミクロスフェアに形成され得る。裸のＤＮＡ技術は、プラスミド形態で発現ベクターを細胞に送達し、ここで、このプラスミドは、化学的なトランスフェクトする因子（例えば、脂質、ポリマー）を細胞への導入前に発現ベクターを濃縮するために使用することなく、宿主ゲノムに組み込まれてもよいし組み込まれなくてもよい。
【００３２】
従って、哺乳動物細胞は、発現ベクターとトランスフェクトされ得；また、トランスジェニック非ヒト哺乳動物が提供される。以前に議論された代替では、遺伝子由来の相同領域を使用して、宿主ゲノム中の特定の遺伝子座への組み込みを指向させ得、これにより、その遺伝子座での遺伝子の発現を調節し得る。ポリペプチドは、トランスフェクトされた細胞を培養することによってインビトロで；遺伝子導入によってインビボで；または発現ベクターを同種細胞、自己細胞、組織適合性細胞もしくは異種細胞に導入し次いでこれらのトランスフェクトされた細胞を宿主生物に移植することによってエキソビボで生成され得る。特定の回収プロトコールおよび培養プロトコールは、トランスフェクション、および次の宿主哺乳動物への宿主幹細胞の移植に必要である。宿主哺乳動物移植後の免疫抑制または宿主細胞の封入は、拒絶を防ぐために必要であり得る。
【００３３】
発現ベクターを使用して、ダウンレギュレートされるかまたは完全に欠損した遺伝子の機能を置換し得るか、あるいは部分的に欠損した遺伝子の機能を補充し得る。従って、宿主の同族遺伝子は、ネオモルフ、ハイポモルフ、ハイパーモルフ、または正常であり得る。機能の置換または補充は、上記の方法によって達成され得、そしてトランスフェクトされた哺乳動物細胞またはトランスジェニック非ヒト哺乳動物は、下流領域の高発現について選択され得る（例えば、転写産物または翻訳産物の量、あるいはいずれかの産物の生理学的機能を評価する）。
【００３４】
（組成物の処方）
本発明の化合物またはこれらの誘導体は、医薬として使用され得るかまたは本明細書中に開示される１以上の有用性を有する薬学的組成物を処方するために使用され得る。これらは、培養物中の細胞にインビトロで、身体中の細胞にインビボで、または同一の個体または別の個体の身体に後に戻され得る、個体の外側の細胞にエキソビボで投与され得る。このような細胞は、凝集されていなくても（ｄｉａｇｇｒｅｇａｔｅ）固体組織として提供されてもよい。
【００３５】
化合物またはこれらの誘導体を使用して、医薬または他の薬学的組成物を生成し得る。薬学的に受容可能なキャリアをさらに含む組成物、および個体にこの組成物を送達するために有用な成分をさらに含む組成物の使用は、当該分野において公知である。このようなキャリアおよび他の成分を本発明の組成物に添加することは、十分当業者のレベル内である。
【００３６】
脂質を低下させるための脂肪減少食事療法または薬物療法（例えば、スタチン（ｓｔａｔｉｎ））を使用して、有益な様式でＬＲＰ−１レセプター機能を変更し得る。あるいは、薬物を使用して、レセプター−リガンド系の構成要素の遺伝子発現を増加し得る（例えば、転写または翻訳を増強する）。抗体枯渇または抗体−Ａβ複合体の濾過を用いてＡβの全身性の濃度を減少することは、血液脳関門を越える輸送に有利であり得る。血管拡張、血管形成、新血管形成および浸透圧ショックを使用して、血流量を増加し得、これにより脳から全身性循環へのＡβの除去を増加し得る。除去を増加するための別の方法は、公知の薬物（例えば、ブラジキニン、ヒスタミン）で血管の透過性を増加することであり得る。タイトジャンクションが緩められてもよいし、またはその幅が透過性を増大するために増加され得る。トランスサイトーシスを増加しＬＲＰ−１を再利用するための他の方法もまた、使用され得る（例えば、テオフィリンのようなｃＡＭＰシグナル伝達のアクチベーター）。後で例示するように、薬物は、１以上の前述の有利な効果を有し得る。本明細書中に記載される処置の様式は、Ａβのエンドサイトーシスおよび分解における低密度リポタンパク質レセプター関連タンパク質の役割を同定した米国特許第６，１５６，３１１号に記載される機構とは全く異なることに注意せねばならない。
【００３７】
薬学的組成物は、血液脳関門を通過するか、または内皮と直接接触するために適用される処方物として投与され得る。あるいは、薬学的組成物は、培養培地に添加され得る。活性化合物に加えて、このような組成物は、薬学的に受容可能なキャリアならびに投与を容易にすることおよび／または取り込みを増強することが公知の他の成分（例えば、生理食塩水、ジメチルスルホキシド、脂質、ポリマー、親和性ベースの細胞特異的標的化系）を含み得る。組成物は、ゲル、スポンジまたは他の透過可能なマトリックス（例えば、小丸薬またはディスクとして形成される）に組み込まれ得、そして徐放性局所性放出のために内皮に近接して配置され得る。組成物は、単一用量または異なる時間で投与される多用量で投与され得る。
【００３８】
薬学的組成物は、公知の経路のいずれかによって投与され得る。例示の目的で、組成物は、粘膜経路、肺経路、局所経路、または他の局所性もしくは全身性の経路（例えば、経腸および非経口）によって投与され得る。用語「非経口」としては、限定することなく、皮下、皮内、筋肉内、静脈内、動脈内、髄腔内、および他の注射技術または注入技術が挙げられる。
【００３９】
投与の量および時期、処方、ならびに投与経路の適切な選択は、アルツハイマー病を有するかまたはその危険性のある個体において好都合な応答（すなわち、効力）を達成し、そして過度の毒性またはそれに対する他の害を避ける（すなわち、安全性）ことの目標をもってなされ得る。従って、「効果的な」とは、慣用の条件操作を包含するこのような選択が、所望の効果を達成することをいう。
【００４０】
一日に一回短時間で投与されるボーラスは、便利な投薬スケジュールである。あるいは、効果的な毎日の投薬は、投与の目的での多用量（例えば、一日あたり２〜１２用量）に分割され得る。薬学的組成物中の活性成分の投薬レベルはまた、個体、特に、脳の血管内皮中およびその周囲における化合物またはその誘導体の一過性または持続的な濃度を維持するため、ならびに所望の治療応答または予防を生じるために変化され得る。しかし、所望の治療効果を達成するために要求されるよりも低いレベルで投薬を開始すること、および所望の効果が達成されるまで投薬量を徐々に増加することはまた、当業者の範囲内である。
【００４１】
投与される化合物の量は、以下のような当業者に公知の因子に依存する：化合物の生物活性およびバイオアベイラビリティー（例えば、身体における半減期、安定性および代謝）；化合物の化学的特性（例えば、分子量、疎水性および可溶性）；投与の経路およびスケジュールなど。全身性投与について、化合物またはその代謝物の血液脳関門通過は、重要である。任意の特定の個体について達成されるべき特定の用量レベルが種々の因子（年齢、性、健康、医療履歴、体重、１以上の他の薬物との組み合わせおよび疾患の重篤度を包含する）に依存し得ることはまた、理解される。
【００４２】
用語アルツハイマー病の「処置」は、とりわけ個体における１以上の症状を減少するかまたは緩和すること、悪化するかもしくは進行することから１以上の症状を予防すること、回復を促進するかもしくは予後を改善すること、および／または疾患のない個体において疾患を予防すること、ならびに存在する疾患の進行を遅延もしくは減弱することをいう。所定の個体について、症状の改善、その悪化、退行、または進行は、客観的測定または主観的測定によって決定され得る。処置の効力は、罹患率または死亡率における改善として測定され得る（例えば、選択された集団についての生存曲線を延長する）。予防法（例えば、再発の発生を予防または減少すること）もまた、処置とみなされる。処置はまた、他に存在する処置の様式（例えば、ＡＲＩＣＥＰＴまたはドネペジル（ｄｏｎｅｐｅｚｉｌ）、ＥＸＥＬＯＮまたはリバスチグミン（ｒｉｖａｓｔｉｇｍｉｎｅ）、抗アミロイドワクチン、精神的な訓練または刺激）との組合せを含み得る。従って、１以上の他の薬物および１以上の他の医療手順との組合わせ処置が、実践され得る。
【００４３】
個体に投与される量は、好ましくは、その投与により生じる利点に勝る毒性効果を誘導しない量である。さらなる目標は、数を減少すること、重篤度を減少すること、および／または、さもなくば認識された医療水準と比較して疾患症状の罹患を緩和することである。本発明はまた、一般に神経変性障害に効果的であり得る：例えば、痴呆、うつ病、錯乱、クロイツフェルト−ヤーコプ病、ハンティングトン病、パーキンソン病、運動協調の喪失、多発硬化症、発作および失神。
【００４４】
本規定に従う化合物の生成は、政府の機関（例えば、米国食品医薬品局）による適正ラボラトリー基準（ｇｏｏｄ　ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｐｒａｃｔｉｃｅｓ）（ＧＬＰ）および適正製造基準（ｇｏｏｄ　ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ　ｐｒａｃｔｉｃｅｓ）（ＧＭＰ）について規制される。これは、正確かつ完全な記録、およびＱＡ／ＱＣのモニタリングを必要とする。機関および施設のパネルによる患者のプロトコールの監視はまた、インフォームドコンセントが得られること；製品の安全性、生物活性、適切な投与量、および効力が、各段階で研究されること；結果が、統計的に有意であること；および倫理的指針に従うこと、を保障するために想定される。毒性化学物質の使用に加えて、動物モデルを使用するプロトコールの同様の監視、ならびに規定の承諾が、必要とされる。
【００４５】
以下の実施例は、本発明の単なる例示であり、そしてその実施を制限または限定することを意図しない。
【００４６】
（実施例）
（合成ペプチドおよび放射ヨウ素標識）
Ａβ前駆体タンパク質７７０のアミノ酸残基６７２〜７１１由来のペプチド
【００４７】
【化１】
2004510957.tif 000002
を、Ｙａｌｅ　ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙにてＮ−ｔ−ブチロキシカルボニル化学を使用して合成し、そしてＨＰＬＣによって精製した。最終生成物のアリコートを、凍結乾燥し、そして使用するまで−２０℃で保存した。Ｎａ［１２５Ｉ］およびヨードビーズ（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いて放射ヨウ素標識を実施し、生じた成分をＨＰＬＣによって分離した（３９）。放射標識Ａβ１−４０のアリコートを、使用前最大４週間に−２０℃で維持した。ＨＰＬＣ分析によって、９９％より高い放射活性が非酸化モノマーペプチドの形態で存在することを確認した。
【００４８】
（マウスにおける脳クリアランスモデル）
雄性Ｃ５７ＢＬ／６野生型マウス（８〜１０週齢および９〜１０ヶ月齢）、ならびにＣ５７ＢＬ／６バックグラウンドの雄性ａｐｏＥノックアウトマウス（ａｐｏＥ　ＫＯ）（Ｔａｃｏｎｉｃ　Ｆａｒｍ，Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ，ＮＹ）（８〜１０週齢および９〜１０ヶ月齢）を研究した。放射標識されたＡβ１−４０および不活性な極性マーカーであるイヌリンのＣＮＳクリアランスを、以下に記載するように決定した（４０、４３）。
【００４９】
ステンレス鋼ガイドカニューレを、麻酔したマウス（６０ｍｇ／ｋｇ　ｉ．ｐ．　ペントバルビタールナトリウム）の右尾状核に定位的に移植した。カニューレの先端についての座標は、ブレグマの０．９ｍｍ前方および１．９ｍｍ後方であり、脳表面の２．９ｍｍ下方であった。ガイドカニューレおよびスクリューを、メチルメタクリレート（Ｐｌａｓｔｉｃｓ　Ｏｎｅ，Ｒｏａｎｏｋｅ，ＶＡ）で頭蓋に固定し、そしてスタイレットをガイドカニューレに挿入した。動物を、放射性トレーサー研究前の１週間に観察した。
【００５０】
放射性同位元素注入について、動物を再度麻酔し、そしてインジェクターカニューレ（Ｐｌａｓｔｉｃ　Ｏｎｅ，Ｒｏａｎｏｋｅ，ＶＡ）を、２４Ｇ−ＴＥＦＬＯＮチューブ（Ｓｍａｌｌ　Ｐａｒｔｓ，Ｍｉａｍｉ　Ｌａｋｅ，ＦＬ）で１０μｌガスタイトマイクロシリンジ（Ｈａｍｉｌｔｏｎ，Ｒｅｎｏ，ＮＶ）に取り付けた。注入したトレーサーの量を、予め目盛り付けられたマイクロシリンジ中のシリンジプランジャーの線形移動（ｌｉｎｅａｒ　ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ）を測定するためにマイクロメーターを使用して正確に決定した。１２５Ｉ−Ａβ１−４０を０．０５〜１２０ｎＭの種々の濃度で含むトレーサー流体０．５μｌを、１４Ｃ−イヌリンとともに５分間注入した。異なる分子試薬の効果を試験する場合、これらを放射標識されたペプチドと同時に注入した。
【００５１】
１２５Ｉ−Ａβ１−４０を１０分〜３００分用いて時間応答を研究し、用量依存的効果を、３０分と決定した。１２５Ｉ−Ａβ１−４０クリアランスを潜在的に阻害し得る、以下に挙げられる異なる分子試薬の効果を、３０分で研究した：記載された（４４）ようなＳｅｐｈａｒｏｓｅ−ＬＲＰ−１重鎖カラムでアフィニティ精製され、記載された（４４）ようにマウスＬＲＰ−１を沈降させ、マウス（ｍｕｒｉｎｅ）繊維芽細胞におけるＡＰＰおよびトロンボスポンジンのＬＲＰ−１媒介取り込みをブロックする（４５〜４６）、Ｒ７７７と名付けられたウサギ抗ヒトＬＲＰ−１抗体；レセプター関連タンパク質（ＲＡＰ）（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ　ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙのＢｕ博士より提供された）；放射免疫拡散および免疫電気泳動によって立証されるような、マウスα２Ｍに特異的なウサギ抗マウスα２Ｍ抗体（ＹＮＲＭＡ２Ｍと称される）（Ａｃｃｕｒａｔｅ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｃｏｒｐ，Ｗｅｓｔｂｕｒｙ，ＮＹ）；報告された（４７）ように、マウスＬＲＰ−２と交差反応するウサギ抗ラットｇｐ３３０アフィニティ精製ＩｇＧ（Ｒｂ６２８６と称される）（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｓ．ＣａｒｏｌｉｎａのＳｃｏｔｔ　Ａｒｇｒａｖｅｓ博士より提供された）；マウスＲＡＧＥと交差反応する（３２）、ウサギ抗ヒト抗ＲＡＧＥ抗体（Ｃｏｌｕｍｂｉａ　ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙのＤ．Ｓｔｅｒｎより提供された）およびフコイダン（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）。
【００５２】
（組織サンプリングおよび放射活性分析）
脳、血液およびＣＳＦをサンプリングし、そして放射活性分析のために調製した。１２５Ｉ−Ａβ１−４０の分解を、トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）沈殿アッセイによって最初に研究した。１２５Ｉ−Ａβ１−４０での以前の研究は、ＴＣＡ法とＨＰＬＣ法との間の良好な相関を示した（３８、４８〜５１）。脳、血漿およびＣＳＦのサンプルを、ＴＣＡと混合し（最終濃度１０％）、４℃にて１４，０００ｒｐｍで８〜１０分間遠心分離し、そして沈殿相、水相およびクロロホルム相における放射活性をγカウンター（Ｗａｌｌａｃ，Ｔｕｒｋｕ，Ｆｉｎｌａｎｄ）で測定した。脳に注入された１２５Ｉ−Ａβ１−４０の完全性（ｉｎｔａｃｔｎｅｓｓ）は、ＴＣＡ分析によって９７％より高かった。
【００５３】
脳における１２５Ｉ−Ａβ１−４０の分解を、ＨＰＬＣ分析およびＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によってさらに研究した。１２５Ｉ−Ａβ１−４０の大脳内注入に続いて、脳組織を、プロテアーゼインヒビター（０．５ｍＭ　フェニルメチルスルホニルフロリド、１μｇ／ｍｌ　ロイペプチンおよび１ｍＭ　ｐ−アミノベンザミジン）を含有するＰＢＳ中にホモジナイズし、そして４℃にて１００，０００ｇで１時間遠心分離した。次いで、上清を凍結乾燥した。生じた物質を、Ｃ４カラム（Ｖｙｄａｃ，Ｔｈｅ　Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ　Ｇｒｏｕｐ，Ｈｅｓｐｅｒｉａ，ＣＡ）に注入する前に、水中０．００５％のＴＦＡ（ｐＨ２）に溶解した。記載される（５７）ように、０．１％　ＴＦＡ中に３０分間で２５〜８３％の直線勾配のアセトニトリルを流速１ｍｌ／分で用いて、分離を達成した。これらの条件下で、Ａβ１−４０標準は、１４．５分で溶出した。カラム溶出物を、２１４ｎｍでモニターした。溶出された画分を回収しかつ計数した。脳内に注入された１２５Ｉ−Ａβ１−４０のＨＰＬＣ分析による完全性は９７％より高く、ＴＣＡ分析の結果を確認した。
【００５４】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析のために、ＴＣＡ沈殿したサンプルを、１％ＳＤＳ中に再懸濁し、ボルテックスし、そして５５℃で５分間インキュベートし、次いで、中和し、３分間煮沸し、ホモジナイズし、そして１０％Ｔｒｉｓ−ｔｒｉｃｉｎｅゲルにて電気泳動した後に蛍光間接撮影して分析した。凍結乾燥したＨＰＬＣ画分を、サンプル緩衝液に再懸濁し、中和し、煮沸しそして以前に報告された（３９）ように電気泳動した。
【００５５】
（クリアランス速度の算出）
脳からの放射活性消失曲線の分析を、報告された（４０、４３）ように行った。マイクロインジェクション後に脳内に残存する放射活性のパーセントを、脳内の回収％＝１００×（Ｎｂ／Ｎｉ）としての式（ｅｑ．）１より決定した。ここで、Ｎｂは、実験終了時に脳内に残存する放射活性であり、そしてＮｉは、脳内に注入された放射活性である。
【００５６】
全ての計算において、１４Ｃ−イヌリンに対するｄ．ｐ．ｍ．値およびＴＣＡ沈殿可能な１２５Ｉ−放射活性に対するｃ．ｐ．ｍ．値を使用した。イヌリンを、ＢＢＢを越えて輸送されないし脳にも残存しない代謝的に不活性な極性参照マーカーとして研究した（４０）；このクリアランス速度、すなわちｋｉｎｕｌｉｎは、ＩＳＦバルクフローの測定を提供し、そしてＮｂ（ｉｎｕｌｉｎ）／Ｎｉ（ｉｎｕｌｉｎ）＝ｅｘｐ（−ｋｉｎｕｌｉｎ＊ｔ）として計算される（２）。
【００５７】
Ａβについて、以下の２つの可能な生理学的な排除経路が存在する−ＢＢＢを越える血流への直接輸送ならびにＩＳＦバルクフローによるＣＳＦおよび頸部リンパ管への排除。Ａβが、遊離ペプチドとして脳の細胞表面レセプターに直接結合することによってか、および／または異なる輸送タンパク質に結合することのいずれかによって脳内に維持されることもまた可能である。従って、このモデルに従って、脳内に残存するＡβの割合は、
【００５８】
【数１】
2004510957.tif 000003
で表され得、ここで、ａ１＝ｋ２／（ｋ１＋ｋ２）およびａ２＝ｋ１／（ｋ１＋ｋ２）であり、そしてｋ１およびｋ２は、それぞれ、脳からの総流出および脳内の維持の部分係数（ｆｒａｃｔｉｏｎａｌ　ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ）を示す。
【００５９】
脳実質からのＢＢＢを越えるＡβ流出の部分速度定数は、Ａβおよびイヌリンの総流出の部分速度計数を求めて、ｋ３＝ｋ１−ｋ（ｉｎｕｌｉｎ）（４）（すなわち、Ａβの総流出についての部分速度定数とイヌリンの部分速度定数との間の差）として計算され得る。ＢＢＢを越える輸送によるＡβの排除についての半飽和濃度（ｋ０．５）は、等式
【００６０】
【数２】
2004510957.tif 000004
から計算され、ここでＣｌｍａｘは、ＩＳＦフローによるペプチドクリアランスについて補正した、ＢＢＢを越えるＡβクリアランスの可飽和成分の最大流出能力を表す。Ｃｌｍａｘは、３０分にわたる可飽和ＢＢＢ輸送によって脳からクリアされる、注入用量のパーセンテージ［１−（Ｎｂ／Ｎｌ）］×１００として表される。
【００６１】
ＭＬＡＢ数学的モデリングシステム（Ｃｉｖｉｌｉｚｅｄ　Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｓｉｌｖｅｒ　Ｓｐｒｉｎｇ，ＭＤ）を使用して、逆平行重みづけ（ｉｎｖｅｒｓｅ　ｓｑｕａｒｅ　ｗｅｉｇｈｔｉｎｇ）によって、この成分モデルを消失曲線または回復パーセントデータに当てはめた。
【００６２】
（マウスにおける免疫組織化学分析）
マウス脳におけるＬＲＰ−１およびα２Ｍの発現を、免疫組織化学分析によって研究した。２ヶ月齢および９ヶ月齢の野生型マウスならびにａｐｏＥ　ＫＯマウスの新鮮な凍結アセトン固定化脳切片を、抗ヒトＬＲＰ　Ｒ７７７抗体（これは、マウスＬＲＰ−１と交差反応する）（４４−４６）（１．５ｍｇ／ｍｌ；１：３００希釈）および抗マウスα２Ｍ抗体（上記のように、１：２５０希釈）を使用して染色した。Ｒ７７７を、記載（４４）のように、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ−ＬＲＰ−１重鎖カラム上でアフィニティー精製した。陽性血管の数を、２人の独立した盲検観察者によって、１０ヶ所のランダムな領域においてカウントし、そして１ｍｍ２切片当たりのパーセンテージとして表した。細胞エレメントにおける染色の程度および強度を、Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ　Ｉｍａｇｉｎｇ　ＳｙｓｔｅｍおよびＮＩＨ画像化システムを使用して定量した。微小血管を、測定の尺度を適切に変えることによって、この定量化から注意深く排除した。若齢マウスの脳切片中の細胞染色の相対強度（微小血管系を除く）を、比較目的のために、任意に１に正規化した。慣用的なコントロール切片は、一次抗体の欠失、二次抗体の欠失、および無関係の一次抗体の使用を含んだ。
【００６３】
（ヒトにおける神経病理学的分析）
Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ　Ｄｉｓｅａｓｅ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｃｅｎｔｅｒ（ＡＤＲＣ）　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｓｏｕｔｈｅｒｎ　Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａからの３人のＡＤ患者および３人の神経学的に正常な年齢を合わせたコントロールを、臨床的に評価し、そしてその後、剖検を行った。６９歳から９９歳までの年齢範囲の３人の男性および３人の女性が含まれた。
【００６４】
組織ブロック（１ｃｍ３）を、死後（４〜７時間の範囲；平均５時間）に得て、１０％中性緩衝化ホルマリン、ｐＨ７．３（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）中に固定し、そしてパラフィン中に包理したかまたは液体窒素−冷却イソペンタン中で瞬間凍結した。組織を、上前頭回および中前頭回（ブロードマン野１０）、ならびに小脳半球からサンプリングした。
【００６５】
切片を、ヘマトキシリンおよびエオシンまたはチオフラビンＳのいずれかで染色した（改変ビールショースキー銀含浸法（Ｇａｌｌｙａｓ染色））。チオフラビンＳ染色切片を、４００〜４５０ｎｍでの狭域の青／紫フィルターを用いて、Ｚｅｉｓｓ蛍光顕微鏡を通して観察した。試験を、２人の独立した観察者によって行った。ＡＤの診断は、改変ＣＥＲＡＤ（Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ　ｔｏ　Ｅｓｔａｂｌｉｓｈ　ａ　Ｒｅｇｉｓｔｒｙ　ｆｏｒ　Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ　Ｄｉｓｅａｓｅ）プロトコル（５２）に従った。
【００６６】
免疫組織化学分析のために、前頭皮質（ブロードマン野１０）の風乾した１０μｍクリオスタット切片を使用した。免疫組織化学を、アビジン−ビオチンペルオキシダーゼ複合体（ＡＢＣ法、Ｖｅｃｔｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）を使用して行った。使用した抗体は、以下を含む：Ａβ１−４０（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ，Ｔｅｍｅｃｕｌａ，ＣＡ）、ウサギ抗ヒト、１：１０００（１ｍｇ／ｍｌ）；Ａβ１−４２、ウサギ抗ヒト、１：１０００（１ｍｇ／ｍｌ）；８Ｇ１と称する、ヒトＬＲＰ−１の重鎖に対するマウスモノクローナル抗体（これは、ヒトＬＲＰ−１に特異的であり、５１５ｋＤａサブユニット上のエピトープを認識する）（５３）、１：３００（１．５ｍｇ／ｍｌ）；およびＣＤ１０５（クローンＳＭＧ）（Ｓｅｒｏｔｅｃ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ）、マウス抗ヒト、１：１００（０．１ｍｇ／ｍｌ）。ＣＤ１０５およびＬＲＰでの単独染色のために、一次抗体とのインキュベーション後、切片を、ＰＢＳ、ｐＨ７．４で３回洗浄し、そしてビオチン化抗マウスＩｇＧで３０分間処理した。ＰＢＳ中での３回の洗浄後、スライドを、アビジン−ビオチン−ＨＲＰ複合体と共に３０分間インキュベートし、そしてＰＢＳ中で３回洗浄した。結合を、Ｖｅｃｔｏｒ　ＳＧペルオキシダーゼ検出キット（青−灰色）で検出した。二重標識のために、Ａβとの４℃で一晩のインキュベーション後、切片を、ＰＢＳで３回洗浄し、そしてビオチン化抗ウサギＩｇＧで処理し、再度洗浄し、そして結合を、Ｖｅｃｔｏｒ　ＮｏｖａＲｅｄで検出した。ＰＢＳ中での３回の洗浄後、二次抗体（ＬＲＰまたはＣＤ−１０５）を適用し、そして染色を、単独標識について記載したように行った。画像化を、Ｓｐｏｔデジタルカメラ（Ｓｐｏｔ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｓｔｅｒｌｉｎｇ　Ｈｅｉｇｈｔｓ，ＭＩ）を備えたＺｅｉｓｓ　Ａｘｉｏｐｈｏｔ　ＩＩ顕微鏡を使用して行った。
【００６７】
（結果）
図１Ａは、６０ｎＭの濃度で研究した１４Ｃ−イヌリンおよび１２５Ｉ−Ａβ１−４０（ＴＣＡ沈殿性１２５Ｉ−放射活性）の脳放射活性−消失曲線を示す。イヌリン（ＢＢＢを越えても輸送されず、脳によっても維持されない、参照ＥＣＦマーカー（４０、４３））のクリアランスは、以前の研究から予測されたように、単独の指数関数的崩壊と近似した。１２５Ｉ−Ａβ１−４０の脳からの総流出を反映するクリアランス曲線は、二重指数関数的（ｂｉ−ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ）であり、そしてイヌリンの曲線よりもはるかに低く、これは、脳からのＡβ１−４０の有意な生物学的輸送を示す。Ａβ１−４０流出の２つの成分（すなわち、血液へのＢＢＢを越える血管輸送による迅速な排除およびＩＳＦフローを介する遅い排除）を、図１Ａから計算し、等式３および４を図１Ｂに示す。図１Ｂは、ＩＳＦバルクフローによるクリアランスよりも有意に高い、ＢＢＢ輸送によるＡβのクリアランスを示す。
【００６８】
図１Ａならびに等式２および３から計算したＡβ１−４０およびイヌリンの脳流出についての半減期（ｔ１／２）は、それぞれ、２５．５±２．０分および２３９．０±１２．５分（表１）であり、９．４倍の差が存在した。ＢＢＢを越えるＡβ１−４０の流出の半減期は、３４．６±３．６分であり、これは、ＩＳＦバルクフローによる流出より６．９倍速い。流出に加え、脳実質中のＡβ１−４０のゆっくりとした時間依存性の維持もまた存在し、その半減期は、１６４．５分である。表１に示されるように、脳からのＡβ１−４０のクリアランスの速度ｋ（分−１）は、イヌリンの速度よりも７．９倍高かった。５時間測定に基づく、ＢＢＢを越える輸送およびＩＳＦバルクフローによる６０ｎＭでのＡβ１−４０流出の相対的寄与は、それぞれ、７３．８％および１０．７％であり、その用量の１５．６％が、ＣＮＳ内に隔離されたままであった（図１Ｃ）。
【００６９】
（表１．１２５Ｉ−Ａβ１−４０および１４Ｃ−イヌリンについてのクリアランス速度ｋ）
【００７０】
【表１】
2004510957.tif 000005
データは、３８人の個体の実験からの平均±ＳＤである；部分係数ｋを、等式３および４を使用して計算した；＊−スチューデントｔ検定によってＰ＜０．０５。
【００７１】
ＣＮＳ注射後、両方のトレーサーはＣＳＦに到達し、そしてＣＳＦ時間出現曲線を、図２Ａに示す。ＣＳＦ中で決定された１２５Ｉ−Ａβ１−４０（ＴＣＡ沈殿性１２５Ｉ−放射活性）の量は、各時点で、イヌリンの量よりも低かった。これはおそらく、以前に示唆されたような（２８）、ＣＳＦからのＡβ１−４０の能動的なクリアランスを反映する。各研究した時点で、ＣＳＦ中のこの１２５Ｉ−標識した物質が、９６％よりも多くがＴＣＡ沈殿性であることは注目すべきであり、これは、ペプチドの分解がなかったことを示す。両方のトレーサーはまた、血漿中に現れ（図２Ｂ）、そして１４Ｃ−イヌリンの放射活性よりも高いレベルの１２５Ｉ−Ａβ１−４０のＴＣＡ沈殿性放射活性は、ＢＢＢを越えるＣＮＳからのＡβ１−４０の能動輸送と一致した。しかし、ＣＳＦおよび血漿中の両方のトレーサーの絶対量は、それぞれ、遅いＩＳＦバルクフローと比較したＣＳＦからの比較的迅速なクリアランス（２９）および有意な全身クリアランス（４８）に起因して低かった。
【００７２】
図３Ａおよび３Ｂは、１２５Ｉ−Ａβ１−４０が、脳中の１２５Ｉ放射活性のＴＣＡ分析、ＨＰＬＣ分析およびＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によって決定されたように、ＢＢＢを越える輸送前に脳ＩＳＦ中で有意に分解されないことを示す。ＴＣＡ分析は、脳中のわずか４．２〜９．９％の１２５Ｉ放射活性だけが、１２５Ｉ−Ａβ１−４０の２７０分の脳内マイクロインジェクション中の異なる時点でＴＣＡ沈殿性でなかったことを示唆する（図３Ａ）。脳の放射活性のＨＰＬＣ分析は、９３．７％のペプチドが６０分で脳ＩＳＦにおいてインタクトなままであることを示すことによって、このＴＣＡ結果を確かめた（図３Ｂ、右）。ＨＰＬＣ分析およびＴＣＡ分析の両方によって決定されたように、１２５Ｉ−Ａβ１−４０が、注入時で９７％よりも多くがインタクトであることは、注目すべきである。これらの結果を、１２５Ｉ−Ａβ１−４０注入後の異なる時点での脳ホモジネートのＨＰＬＣピークの凍結乾燥化アリコートの、ＳＤＳ／ＰＡＧＥ分析によって確かめた。これは、約４ｋＤａの単一の放射活性のバンドを示す（図３Ｂ、左）。このゲル上の放射活性成分のＡβ１−４０ペプチドとしての同定を、抗Ａβ抗体および検出系として増強化学ルミネセンスを使用する、ウエスタンブロット分析によって確かめた。ＣＳＦ中の９６％を超える１２５Ｉ−放射活性は、１５分と２７０分との間の研究した時点でＴＣＡ沈殿性であった。対照的に、１２５Ｉ−Ａβ１−４０の分解生成物が、血漿中に見出され（図３Ｃ）；このＴＣＡ非沈殿性１２５Ｉ−放射活性に対応する分解した１２５Ｉ−Ａβ１−４０の量は、インタクトな１２５Ｉ−Ａβ１−４０の脳内マイクロインジェクションの１５分から１２０分で、３７．６％から５８．３％に増加した（図３Ｃ）。１２０分後の血漿中の放射活性の量は、比較的小さく、そしてＴＣＡアッセイの感度の限界に達したことは、注目すべきである。
【００７３】
若齢マウスにおけるＡβのクリアランスは、濃度依存性であった（図４Ａ）。流出輸送系は、１５．３ｎＭのＡβ１−４０で半飽和（Ｋ０．５）した。プラトーまたは最大クリアランス能力は、７０ｎＭと１００ｎＭとの間で到達され、そしてＡβ濃度のさらなる増加が、脳中のペプチドの進行的により高い維持を生じた。対照的に、１４Ｃ−イヌリンのクリアランスは、Ａβの濃度の増加と共に変化せず、これは、生理学的にインタクトなＢＢＢを示唆する（図４Ａ）。
【００７４】
次セットの実験を、Ａβのトランスサイトーシスを担うＢＢＢ輸送系を特徴付けるために設計した。脳を、１２ｎＭ（図４Ｂ）または６０ｎＭ（図４Ｃ）のいずれかでの１２５Ｉ−Ａβ１−４０で負荷し、そしてクリアランスを、潜在的なインヒビターおよび／または輸送の競合因子として作用し得るいくつかの薬物の非存在下（白棒）または存在下（黒棒）で、３０分で測定した。図４Ｂは、ＬＲＰ−１抗体（６０μｇ／ｍｌ）およびＲＡＰ（２００ｎＭ）の両方が、ビヒクル処理したコントロールと比較して、脳からのＡβクリアランスにおける有意な（それぞれ、５８％および３８％）の減少を生じること；４４％へのＡβクリアランスのさらなる減少が、ＲＡＰ濃度を５μＭに増加することによって得られたことを示す。Ａβクリアランスにおける有意な２５％阻害もまた、抗α２Ｍ抗体（２０μｇ／ｍｌ）の存在下で得られた。対照的に、抗ＬＲＰ−２抗体（図４Ｂ）および抗ＲＡＧＥ抗体（図４Ｃ）は、Ａβクリアランスに影響を及ぼさなかった。フコイダン（ＳＲ−Ａについての特異的リガンド）は、クリアランスにおける中程度の増加を生じ、これは、おそらく、実質のＳＲ−Ａレセプターに対するＡβの結合をブロックし、それによって、より多くのペプチドをクリアランスに利用可能にすることによる。より高いＡβ負荷（図４Ｃ）で、抗ＬＲＰ−１抗体は、クリアランスにおける５３％の減少を生じ、これは、より低い負荷（図４Ｂ）で観察された減少と類似するが、Ａβの回復は、１４Ｃ−イヌリンの回復に達し、これは、ほとんど排他的にＩＳＦバルクフローを介するペプチドの排出を示唆する。１４Ｃ−イヌリンのクリアランスは、研究した分子試薬のいずれによっても影響されなかった。ＢＣＨ（アミノ酸のＬ系を特異的にブロックする基質）は、ＢＢＢを越えるＡβのクリアランスに影響せず、これは、１２５Ｉ−Ａβ１−４０が、１２５Ｉ−チロシンへ分解され、これが、１２５Ｉ−Ａβ１−４０の代わりにＣＮＳから輸送されるという可能性を排除する。
【００７５】
次に、ａｐｏＥおよび加齢の効果を、１２ｎＭ（図５Ａ）または６０ｎＭ（図５Ｂ）の１２５Ｉ−Ａβ１−４０を使用して、２ヶ月齢および９ヶ月齢のａｐｏＥ　ＫＯマウスおよび野生型マウスにおけるＡβクリアランスを決定することによって研究した。図５Ａは、Ａβのクリアランスが、若齢ａｐｏＥ　ＫＯマウスにおいて３０％減少され、９ヶ月齢の野生型マウスおよびａｐｏＥ　ＫＯマウスにおいて、それぞれ、約５５％および４０％減少されたことを示す。これらの結果は、より高いＡβの負荷で確かめられ、そしてクリアランスにおける観察された減少は、９ヶ月齢のａｐｏＥ　ＫＯマウスにおいて４６％であった（図５Ｂ）。
【００７６】
免疫組織化学研究は、有意な実質細胞（神経細胞を含む）染色（図６Ａ、上パネル）に加えて、２ヶ月齢のマウスにおける脳微小血管（毛細血管、小さい細静脈および細動脈を含む）におけるＬＲＰ−１の豊富な発現を確かめた（図６Ａおよび６Ｂ、上パネル）。図６Ａおよび６Ｂの下パネルに示されるように、２ヶ月齢のマウスと比較して、９ヶ月齢のマウスにおけるＬＲＰ−１陽性血管の有意な減少が存在し；ＬＲＰ−１陽性血管の数は、２ヶ月齢のマウスにおいて９４％から９ヶ月齢のマウスにおいて５２％に低下した（図６Ｄ、上パネル）。ＬＲＰ−１陽性実質細胞（血管を除く）の定量分析は、高齢の動物において染色が減少する傾向を示すが、その差異は、統計学的に有意ではなかった（図６Ｄ、下パネル）。同様に、若齢マウスと高齢マウスとの間に、脳におけるα２Ｍ陽性微小血管または実質細胞の数の有意な差異は存在しなかった（それぞれ、図６Ｃ上パネルおよび下パネル、図６Ｄ下パネル）。α２Ｍの陽性染色は、循環中のα２Ｍと微小血管上に発現されるα２Ｍとの間を区別することができなかったことは、注目すべきである。
【００７７】
ＡＤ患者の前頭皮質は、全てのＡＤ患者における中程度から顕著な神経炎性斑およびＡβ沈着、ならびに３人のうち２人のＡＤ患者における実質および血管のアミロイドを明らかにした。コントロールは、実質において神経炎性斑もＡβも明らかにせず、そして３人のうち１人の患者における髄膜血管のＡβのみを明らかにした。図７Ａに示されるように、コントロール患者の前頭皮質におけるＬＲＰ−１の染色は、毛細血管および細動脈における中程度の血管染色、ならびにニューロン染色を明らかにした。ＡＤ組織（Ａβ１−４０またはＡβ１−４２が陽性の斑および血管を有する領域を含む）において、減少したＬＲＰ−１染色が存在した（図７Ｂ）。しかし、即時の皮質下白質は、ＡＤおよびコントロールの両方における、ＬＲＰ−１についてのより強い血管染色およびＡβについての染色の非存在を示した。抗ＣＤ１０５（これは、血管内皮を同定する）は、コントロールにおける前頭皮質の毛細血管および細動脈の広範な染色、およびＡＤ組織における染色された血管数の中程度の減少を明らかにした。小脳は、ＡＤ切片およびコントロール切片における抗ＬＲＰ−１およびＣＤ１０５での等価な血管染色を明らかにし、そして抗Ａβ１−４０またはＡβ１−４２陽性染色は、ＡＤ組織またはコントロール組織のいずれにおいても見られなかった。
【００７８】
（考察）
本研究は、脳から循環中へのＡβのクリアリングにおける、ＢＢＢを越える血管輸送の重要性を実証する。さらに、この輸送機構は、脳微小血管内皮においてＬＲＰ−１によって主に媒介されることが示され、そしてＣＮＳからの脳由来Ａβの輸送は、ＬＲＰ−１リガンドである、α２ＭおよびａｐｏＥによって影響され得る。Ａβについてのこの血管クリアランス機構は、年齢依存性であり、そして高齢の動物におけるより低いクリアランス速度は、ＬＲＰ−１の血管量の減少と相関する。
【００７９】
ＢＢＢがＡβを除去する能力は、若齢の動物において有意であった。６０ｎＭでのＡβ１−４０についての排除時間ｔ１／２は、２５分であり、これはすなわち、イヌリン（ＩＳＦバルク流速を決定するために使用されるＥＣＦマーカー）の排除時間（４０）よりも９．４倍速かった。ＡβのＣＮＳ流出の主な要素は、ＢＢＢを越える血管系への輸送であった。ＢＢＢを越えるＡβのクリアランスは、時間および濃度依存性であった。非常に低い濃度（すなわち、マウス脳において通常見出されるような、２ｎＭ未満（５４〜５５））で、Ａβ１−４０は、６０ｎＭの負荷（３〜４ヶ月齢のトランスジェニックＡＰＰ動物の脳において見出されるＡβ１−４０の濃度に匹敵し得る（５４〜５５））での速度よりも、平均３．５倍速い速度で脳から排出された。この流出輸送系は、１５．３ｎＭのＡβ１−４０で半飽和され、そして７０ｎＭと１００ｎＭとの間の濃度で完全に飽和するようである。従って、この流出輸送体は、高齢のトランスジェニックＡＰＰ動物の脳において見出されるような、より高いレベルのＡβによって完全に飽和され得（５４〜５５）、これは、次いで、最近記載されたように（５６〜５７）、Ａβの血管蓄積および脳血管アミロイドの顕著な沈着の発生を導き得る。
【００８０】
本研究において、５時間以内のＡβ１−４０の有意な代謝または分解は観察されず、これは、Ａβ１−４２が数分以内に脳中のエンケファリナーゼ（ネプリリシン（ｎｅｐｒｉｌｙｓｉｎ））によって分解されることを示唆する最近の報告（２８）とは対照的である。Ａβ１−４０およびＡβ１−４２は、脳において差示的にプロセシングされる可能性があり得る。しかし、Ａβ１−４２について提唱された分解機構（２８）の生理学的関連性は、依然明らかではない。なぜなら、このペプチドは、重篤なβ−アミロイドーシスに罹患する脳中でさえ見出されない、約２４０μＭの極度に高い濃度で研究されたからである（３０）。薬理学的研究によって示されるように、これらの高い濃度のＡβは、局所的なＢＢＢの完全性を損ない得（５８〜５９）、これは、次いで、本研究において確認されたように、Ａβ分解活性を有する血液および／または血漿で脳ＩＳＦを汚染し得る（４８）。
【００８１】
サイトゾルペプチダーゼが、脳ＩＳＦ（２８）またはＣＳＦ（２９）に分泌または注入されたＡβペプチドにほとんど接近しないという仮説と一致して、インスリン分解酵素（ＩＤＥ）が、放射標識したペプチドの脳内注入後にインビボで脳中のＡβを分解し得ないことが、最近報告された（２８）。これは、脳および肝臓のサイトゾル画分由来のＩＤＥによる、１２５Ｉ−Ａβ１−４０のインビトロ分解（６０）と対照的である。ＩＤＥは、細胞内プロテアーゼであるので、本明細書および以前の研究（２８）において示唆されたように、ＩＤＥが、脳ＩＳＦ由来のＡβをプロセシングし得ないかもしれない（特に、ペプチドのクリアランスが、その細胞取り込みよりも速い場合に）ということは驚くことではない。Ａβをインビトロで分解する特定のメタロプロテイナーゼを分泌する、活性化された小グリア細胞（６１）とは対照的に、インビトロでの脳内皮細胞（３３）および星状細胞（６１）がＡβを異化しないことは、注目すべきことである。神経細胞は、ａｐｏＥまたはα２Ｍを必要とし得るＬＲＰ−１依存性の機構によって、Ａβをインビトロで代謝する（３８）。しかし、この分解速度は、インビボでＢＢＢを越える輸送よりも、約５０〜１００倍遅い。
【００８２】
ＣＳＦからのＡβの輸送は、ＣＳＦ中のペプチドの有意な分解とは関連しなかった（２９）。インスリンと比較したＡβ１−４０の低いＣＳＦレベルは、以前に示されたように（２９）、おそらく脈絡叢または軟髄膜管を越える、ＣＳＦから血液へのＡβの能動輸送を示唆し得る。インスリンと比較した血漿中の放射標識Ａβの高いレベルは、ＣＮＳからのこのペプチドの血管輸送を確証する。現在の結果は、脳由来のＡβが循環中のペプチドのプールに寄与し得ることを示すが、血漿中の分解、全身代謝および身体のクリアランスは、以前に示されたように（４８）、循環中のペプチドのレベルを減少する傾向にある。現在の実験条件下では、循環中の放射標識Ａβのレベルは、脳レベルよりも２オーダーまたは３オーダー低く、従って、Ａβの血液から脳への輸送は、通常、その濃度勾配を下げるように作用するので、脳内への放射標識Ａβの再流入をほとんど生じない（３９、６２〜６５）。さらに、血液が保持するＡβを脳内へ輸送するａｐｏＪ系は、脳からのＡβの流出を促進し得る生理学的条件下（６４）で飽和される。以前の研究は、循環中の遊離Ａβがまた、おそらく周皮細胞（これは、ＢＢＢを越えるいくつかのペプチドおよびタンパク質の輸送の主要な酵素的障壁を提示する）によって、そのＢＢＢを越える輸送中に代謝されることを示した（４８〜４９、６５〜６６）。
【００８３】
ネプリリシンのその生理学的基質（例えば、エンケファリン、タキキニン、心房性ナトリウム利尿ペプチド）および／または異なる合成ペプチドに対する親和性は、低ｍＭ範囲にある（６８）。対照的に、脳中のＡβのレベルは、通常、低ｎＭ範囲にあり、そして脳アミロイドーシスのトランスジェニックモデルにおいて、そのレベルは、３ヶ月から１２ヶ月で４０ｎｍｏｌ／ｋｇから２５０ｎｍｏｌ／ｋｇに変化する（５４）。従って、生理学的条件下および／または病理学的条件下では、Ａβは、おそらく、その高親和性細胞表面レセプター（例えば、ＲＡＧＥおよび／またはＳＲ−Ａ）および／または高親和性輸送結合タンパク質（例えば、α２Ｍ、ａｐｏＥおよびａｐｏＪ）に結合し、これらは全て、それらのＫＤ値に対応する低ｎＭレベルのペプチドと反応する。
【００８４】
現在の研究において、抗ＬＲＰ−１抗体は、低い負荷（１２ｎＭ）および高い負荷（６０ｎＭ）のペプチドの両方で、Ａβ１−４０のクリアランスを約５５％阻害し、これは、脳からのＡβの血管排除におけるＬＲＰ−１の関与を示唆する。ＲＡＰ（ＬＲＰ−１およびＬＲＰ−２の適切なフォールディングおよびその後の輸送を促進するシャペロンタンパク質（６９））もまた、Ａβのクリアランスを阻害する。ＲＡＰは、ＬＲＰ上の複数の部位に結合し、そしてインビトロにてＬＲＰ−１およびＬＲＰ−２の両方に対する（６９）、ならびにＢＢＢの血液側でのインビボにてＬＲＰ−２に対する（３９）、全ての公知のＬＲＰリガンドの結合をアンタゴナイズする。現在の研究において、より高濃度のＲＡＰが、抗ＬＲＰ−１抗体に匹敵するＡβのクリアランスの阻害を生じた。抗ＬＲＰ−１抗体が、より高い濃度のペプチドでのＡβの血管輸送をほぼ完全に阻害することは興味深く、これは、ＬＲＰ−１が脳からのペプチドの排除において主に重要であり得ることを示し得る。しかし、より低い負荷のペプチド（すなわち、１２ｎＭ）では、いずれの分子試薬も、Ａβのクリアランスを無効にし得、これは、ＬＲＰ−１に加えて、非常に低い濃度で脳からペプチドを排除する、非常に高感度のＢＢＢ輸送機構が存在し得ることを示唆する。この推定の「第２の」輸送系の分子特性は、現在知られていないが、現在のデータは、ＲＡＧＥおよびＬＲＰ−２が、脳からのＡβの迅速な排除に関与するようではないことを示唆する。ＳＲ−Ａリガンドであるフコイダン（ｆｕｃｏｉｄａｎ）がＡβのクリアランスを中程度に増加したという事実は、脳中のＳＲ−Ａレセプターの阻害が、このペプチドのＣＮＳ隔離を減少し得、従って、より多くのペプチドがＢＢＢを越える増強されたクリアランスに利用可能にすることを示唆する。
【００８５】
α２ＭおよびａｐｏＥによる平滑筋細胞、ニューロンおよび線維芽細胞におけるインビトロでのＡβクリアランスの促進におけるＬＲＰ−１の役割が示唆されているが（３５〜３８）、これは、現在の研究において実証されているように、ＢＢＢを越えるよりも、有意に遅い速度である。α２Ｍならびにリピド化（ｌｉｐｉｄａｔｅｄ）ａｐｏＥ３およびａｐｏＥ４へのＡβの高親和性インビトロ結合、および脱リピド化ａｐｏＥアイソフォームへのより低い親和性の結合が、十分に実証されている（２３、７０）。野生型およびＬＲＰ−１欠損性のマウス胚性線維芽細胞における結合／取り込み研究は、遊離Ａβが、ＬＲＰ−１に対するリガンドではないことを確認した（３７、４５）。血管輸送によるＡβの排除におけるこの２つのＬＲＰ−１リガンドの潜在的役割は、抗α２Ｍ抗体でのＡβクリアランスの阻害によって示唆され、そしてこれは、野生型の若齢コントロールと比較して、ａｐｏＥ　ＫＯ動物におけるクリアランスを、２ヶ月齢および９ヶ月齢で、それぞれ、３０％および４６％有意に減少した。これらの知見と関連して、興味深いことに、最近の研究は、ＡＤのＡＰＰＶ７１７ＦマウスモデルおよびＡＰＰｓｗマウスモデルの両方における内因性マウスａｐｏＥｎｏ欠失が、脳におけるＡβ沈着をほとんど生じず、そして原線維Ａβ沈着を全く生じないことを示した（５７、７１）。これは、マウスａｐｏＥが、Ａβ原線維発生を強力に促進することを示唆する。おそらく、現在の研究に示されるように、マウスａｐｏＥはまた、ＢＢＢを越える可溶性Ａβのクリアランスにおいて役割を果たすが、ＡＰＰトランスジェニックマウスにおいてＡβ凝集に影響するその能力が優性である。マウスａｐｏＥの効果と対照的に、現在の研究は、ヒトａｐｏＥアイソフォームが、ＡＰＰＶ７１７Ｆマウスにおいて初期Ａβ沈着を抑制することを実証する（７２）。このモデルにおけるさらなる研究は、初期Ａβ沈着に対するヒトａｐｏＥアイソフォームのこの抑制効果が、ＢＢＢを越えるＡβの輸送の促進に対する効果に対して二次的であるか否かを決定するために有用である。現在の研究は、インビトロで示されたニューロン、血管平滑筋細胞および線維芽細胞によるＡβのクリアランス（３５〜３８）がインビボでも生じ得るという可能性を除外しないが、ＢＢＢを越える血管輸送が、インビボでの脳からのＡβの迅速な排除のために主に重要であるようである。
【００８６】
正常な加齢は、脳中のＡβ蓄積に関連し（１）、そしてトランスジェニックＡＰＰ動物において年齢と共に有意な時間依存性かつ進行性のＡβ蓄積が存在するので（５４〜５５）、Ａβのクリアランス機構は、高齢の動物において損なわれ、そしてまた、おそらく高齢のヒトにおいて損なわれると仮定した。若齢（２ヶ月齢）の動物と比較した９ヶ月齢の野生型動物におけるＡβクリアランスの約５５〜６５％阻害の現在の知見は、この仮説を確証した。免疫組織化学研究は、２ヶ月齢のマウスにおいて９４％から９ヶ月齢のマウスにおいて５２％への、ＬＲＰ−１陽性脳血管の数の有意な減少を示した。これは、この観察された２つの月齢の群間のクリアランス能力における減少と十分相関した。興味深いことに、血管ＬＲＰ−１の下方調節は、年齢を合わせたコントロールと比較した、アルツハイマー病患者の脳におけるＡβの局所的な実質および血管での蓄積と十分に相関した。ＬＲＰ−１血管発現が依然として顕著である脳領域（白質のような）においては、Ａβの蓄積は、アルツハイマー病の脳において見出されなかった。
【００８７】
これらの結果は、血管系が、脳中のＡβのレベルの調節において重要な役割を果たすという発見を示す。これらの知見はさらに、脳の細胞外空間におけるＡβのレベルがＢＢＢを越えるクリアランス機構の輸送能力を超える場合にか、またはこのペプチドの血管輸送が損なわれた（例えば、ＬＲＰ−１の下方調節によって）場合に、これが、脳中のＡβの蓄積およびおそらくアミロイド斑の形成を生じることを示唆する。以前の研究は、循環中のＡβの輸送を調節することによるＣＮＳ中のＡβの濃度の決定における、ＢＢＢの主要な役割を実証した（３３、３９、４９〜５１、６２〜６６）。現在の研究は、脳からのＢＢＢを越える血管輸送が、脳中のＡβの蓄積およびアミロイド沈着を妨げる主要な生理学的機構を提示し得ることを示すことによって、この仮説を伸展させた。
【００８８】
（参考文献）
【００８９】
【表２】
2004510957.tif 000006
【００９０】
【表３】
2004510957.tif 000007
【００９１】
【表４】
2004510957.tif 000008
上記で引用された全ての参考文献（例えば、論文、書籍、特許、および特許出願）は、当業者の水準を示し、そして参考として援用される。
【００９２】
特許請求の範囲の意味およびその法的な等価物の範囲内で生じる全ての改変および置換は、それらの範囲内に包含される。さらに、「含む（包含する）」とは、その請求項における他のエレメントの包含を許容し、「実質的に含む（包含する）」とは、本発明の操作に実質的に影響しないその請求項における他のエレメントの包含を許容し、そして請求項のエレメント間の特定の関係は、このような限定が明らかに引用されない限り、重要でない（例えば、生産物クレームの構成要素の配列、方法クレームの工程の順序）。
【００９３】
前述から、本発明が、その精神または本質的な特徴から逸脱することなく他の特定の形態で具体化され得ることは、当業者に明らかである。記載された実施形態は、単に例示としてみなされるべきであり、限定的とはみなされない。なぜなら、本発明に提供される法的保護の範囲は、本明細書ではなく添付の特許請求の範囲によって示されるからである。
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１Ａは、マウスにおける尾状核へのトレーサーの同時マイクロインジェクションの後の、ＣＮＳからの１４Ｃ−イヌリン（白丸）および１２５Ｉ−Ａβ１−４０（６０ｎＭ；ＴＣＡ沈殿可能な１２５Ｉ−放射活性、黒丸）の時間−消失曲線を示す。各時点は、３〜７動物からの平均±ＳＤである。図１Ｂは、２つの成分の１２５Ｉ−Ａβ１−４０流出を示す。ＢＢＢを越える血管輸送（黒三角）およびＩＳＦバルクフローによる輸送（白三角）を、図１Ａからのデータを使用して式（ｅｑ．）３および４を用いて見積もった。図１Ｃは、ＢＢＢを越える輸送（白バー）、ＩＳＦバルクフローによる拡散（黒バー）および脳内での貯留（陰バー）によるＡβ１−４０流出に対する相対的寄与が、６０ｎＭ濃度で研究され、そして表１に与えられた機能的係数から計算されたことを示す。
【図２】
図２は、マウスにおける尾状核へのトレーサーの同時マイクロインジェクションの後の、ＣＳＦ（図２Ａ）および血漿（図２Ｂ）中の１４Ｃ−イヌリン（白丸）および１２５Ｉ−Ａβ１−４０（６０ｎＭ；ＴＣＡ沈殿可能な１２５Ｉ−放射活性、黒丸）の時間−消失曲線を示す。値を、注入した用量の％（％ＩＤ）として表す；各時点は、３〜７の動物からの平均±ＳＤである。
【図３】
図３Ａは、脳中の総１２５Ｉ−放射活性のパーセントとして表された、マウスにおける尾状核への１２５Ｉ−Ａβ１−４０（６０ｎＭ）の大脳内マイクロインジェクションの後の、脳のＴＣＡ沈殿可能な１２５Ｉ−放射活性（白バー）およびＴＣＡ沈殿不可能な１２５Ｉ−放射活性（黒バー）を示す；平均±ＳＤは、３〜５の動物からである。図３Ｂは、１２５Ｉ−Ａβ１−４０（６０ｎＭ）の大脳内マイクロインジェクションの６０分後の、脳組織（右パネル）のＨＰＬＣ溶出プロファイルを示す。分離を、０．１％　ＴＦＡ（ｐＨ２）中２５〜８３％アセトニトリルの、３０分間の直線勾配を使用する逆相ＨＰＬＣカラムで３０ｍｇの脳組織について実施した。１２５Ｉ−Ａβ１−４０は、Ａβ１−４０標準の溶出時間に対応する５２％で溶出した。左パネルは、１２５Ｉ−Ａβ１−４０（６０ｎＭ）の大脳内マイクロインジェクションの３０分後（レーンａ）および６０分後（レーンｂ）の、脳組織上清のＳＤＳ／ＰＡＧＥ分析を示す。脳中の放射活性を、Ａβ１−４０標準と同一保持時間を有して、ＨＰＬＣで単一のピークとして溶出した。凍結乾燥したサンプルのアリコートを、１０％　Ｔｒｉｓ−トリシン　ＳＤＳ／ＰＡＧＥに供し、ニトロセルロース膜に転写し、そしてＸ線フィルムに露光した。図３Ｃは、マウス尾状核への１２５Ｉ−Ａβ１−４０（６０ｎＭ）の脳内マイクロインジェクション後の、血漿中の総１２５Ｉ−放射活性のパーセントとして示した、血漿のＴＣＡ沈殿可能な１２５Ｉ−放射活性（白バー）およびＴＣＡ沈殿不可能な１２５Ｉ−放射活性（黒バー）を示す；平均±ＳＤは、３〜５の動物からである。
【図４Ａ】
図４Ａは、マウス脳からのＡβ１−４０の濃度依存的クリアランスを示す。漸増濃度（０．０５〜１２０ｎＭ）での１２５Ｉ−Ａβ１−４０を１４Ｃ−イヌリンと組合わせて尾状核内へ同時マイクロインジェクションした３０分後に、クリアランスを決定した。ＢＢＢ輸送によるクリアランス（黒丸）を、ＩＳＦバルクフロー（白丸）によるクリアランスと別々に示した。
【図４Ｂ】
図４Ｂは、抗ＬＲＰ−１抗体Ｒ７７７（６０μｇ／ｍｌ）、ＲＡＰ（０．２μＭおよび５μＭ）、抗α２Ｍ抗体（２０μｇ／ｍｌ）ならびに抗ＬＲＰ−２抗体Ｒｂ６２８６（６０μｇ／ｍｌ）を用いる（黒バー）かまたは用いない（白バー）、１２５Ｉ−Ａβ１−４０／１４Ｃ−イヌリンの同時マイクロインジェクションの３０分後に決定した１２ｎＭでの１２５Ｉ−Ａβ１−４０の脳クリアランスに対する効果を示す。
【図４Ｃ】
図４Ｃは、抗ＬＲＰ−１抗体Ｒ７７７（６０μｇ／ｍｌ）、抗ＲＡＧＥ抗体（６０μｇ／ｍｌ）、フコイダン（１００μｇ／ｍｌ）および２−アミノビシクロ（２，２，１）ヘプタン−２−カルボン酸（ＢＣＨ、１０ｍＭ）の、１２５Ｉ−Ａβ１−４０／１４Ｃ−イヌリンの同時マイクロインジェクションの３０分後に決定したより高い負荷の６０ｎＭでの１２５Ｉ−Ａβ１−４０の脳クリアランスに対する効果を示す。平均±ＳＤは、３〜４の動物である；＊−ｐ＜０．０５、ｎｓ−有意ではない。
【図５】
図５は、１２５Ｉ−Ａβ１−４０の脳クリアランスでのａｐｏＥ遺伝子型および年齢の効果を示す。２ケ月齢および９ケ月齢の野生型マウスおよびａｐｏＥ　ＫＯマウスの脳クリアランスは、１２ｎＭのより低い１２５Ｉ−Ａβ１−４０の負荷（図５Ａ）および６０ｎＭのより高い負荷（図５Ｂ）で研究した。全ての研究において、１２５Ｉ−Ａβ１−４０（黒バー）および１４Ｃ−イヌリン（白バー）を、同時に注入し、そしてクリアランスを３０分後に決定した。平均±ＳＤは、３〜４の動物である；＊−ｐ＜０．０５、ｎｓ−２ケ月齢の野生型マウスと比較して有意ではない。
【図６Ａ】
図６Ａは、若齢（２ケ月齢；上パネル）および老齢（９ケ月齢；下パネル）の野生型マウスの脳微細血管中のＬＲＰ−１免疫反応性を示す。若齢マウスにおける多くの血管は、抗ＬＲＰ−１　Ｒ７７７抗体（５μｇ／ｍｌ　矢印）を使用して検出されるＬＲＰ−１についてポジティブに染色したが、老齢マウスでは比較的わずかにポジティブな血管（矢印）および多くの弱くポジティブまたはネガティブに染色される血管（矢じり）が存在した。実質細胞要素（白矢印）の染色において、弱例と老齢との間に有意な差異はなかった。
【図６Ｂ】
図６Ｂは、老齢マウスにおいてみられるかすかな染色（下パネル）と比較して強くポジティブに染色した若齢マウスにおける血管（上パネル）を示す。
【図６Ｃ】
図６Ｃは、若齢マウス（上パネル）および老齢マウス（下パネル）における脳細胞（矢じり）または微小血管（矢印）中のα２Ｍに対する染色において差異がないことを示す。
【図６Ｄ】
図６Ｄは、若齢野生型マウス（２ケ月齢、白バー）および老齢野生型マウス（９ケ月齢、黒バー）における脳微小血管（上パネル）および実質細胞要素（下パネル）中のＬＲＰ−１およびα２Ｍの免疫反応性を比較する。＊−ｐ＜０．０５、ｎｓ−有意ではない。
【図７】
図７は、ヒト前脳皮質におけるＬＲＰ−１の発現を示す。コントロールの脳切片（領域１０）（図７Ａおよび７Ｃ）は、抗ＬＲＰ−１モノクローナル抗体８Ｇ１（５μｇ／ｍｌ）（図７Ａ）およびＣＤ１０５（図７Ｃ）を使用して検出されたＬＲＰ−１による、毛管（矢じり）および小動脈（矢印）の十分規定された染色を示す。二重標識された切片または連続標識された切片には、Ａβ染色は存在しない。対照的に、ＡＤ患者由来の二重標識された切片（図７Ｂおよび７Ｄ）は、抗Ａβ１−４０（灰色の染色）でポジティブな血管および斑のコア、ならびに減少した数および強度である血管のＬＲＰ−１染色（図７Ｂ）ならびに減少した数のＣＤ１０５標識された血管（図７Ｄ）を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５】
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【図６Ｄ】
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【図７】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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