(57)【要約】真空式固定器具の頂面にマウントされたアレイのアレイ型プレート（Ａ２プレート）を用いるマイクロアレイアッセイシステムと、前記プレートおよび固定器具の組立体を取り扱う自動化ハンドリングシステム。Ａ２プレートは、可撓性素材でできたトレイと、前記固定器具にマウントするための剛直なフレームとを含む。前記固定器具は、頂面に開口し、前記可撓性のプレートを前記固定器具の頂面に対して保持するために陰圧を発生させるべく真空源に接続される複数のオリフィスを有する。前記プレートおよび固定器具の組立体とともに用いることのできる自動化ハンドリングシステムは、マイクロアレイプリント装置と、リキッドハンドリングロボットと、ハイブリダイゼーションおよびインキュベーション用のデバイスと、マイクロアレイ画像化デバイスとを含む。
2004510148.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体識別物質を不動化するために活性化されている複数の離散したアレイ形成領域であって、該アレイ形成領域のそれぞれが可撓性素材でできているアレイ形成領域と、該アレイ形成領域の間を越えて液体が流れ込むことを規制するために前記アレイ形成領域の間に形成された障害物とを含む、マイクロアレイアッセイデバイス用マイクロプレート。
【請求項２】
前記障害物は、前記アレイ形成領域の間に形成され、前記可撓性素材でできた、障壁か、疎水性のパッチか、槽か、ガスケットか、ペデスタルかである、請求項１に記載のマイクロプレート。
【請求項３】
前記障害物は約４ｍｍ未満の高さである、請求項１に記載のマイクロプレート。
【請求項４】
前記可撓性素材でできたトレイであって、内部に複数の離散したウェルを有し、それぞれのウェルの底部にはアレイ形成領域を含むトレイを含む、請求項１に記載のマイクロプレート。
【請求項５】
前記可撓性素材でできたトレイであって、１個以上のアレイ形成領域を取り囲む凹部を有するトレイを含む、請求項１に記載のマイクロプレート。
【請求項６】
支持板と、該支持板を覆う前記可撓性素材でできた平坦な基質と、該基質を覆うように密着し複数の孔が設けられているガスケットであって、該ガスケットの孔によって露出した前記基質のそれぞれの領域はアレイ形成領域を含むガスケットとを含む、請求項１に記載のマイクロプレート。
【請求項７】
前記可撓性素材に脱着可能に取り付けられた剛直なフレームを含む、請求項１に記載のマイクロプレート。
【請求項８】
複数の剛直なハンガーと、前記可撓性素材でできた複数のウェルのストリップとを含み、該ウェルのストリップのそれぞれは剛直なハンガーに圧着され、１以上のアレイ形成領域を含む、請求項７に記載のマイクロプレート。
【請求項９】
複数の生体識別物質のマイクロアレイを含み、それぞれのマイクロアレイはアレイ形成領域の内部に形成されている、請求項１に記載のマイクロプレート。
【請求項１０】
前記生体識別物質は、生体分子、細胞または細胞の構成成分を含む、請求項９に記載のマイクロプレート。
【請求項１１】
前記生体識別物質は標識されている、請求項９に記載のマイクロプレート。
【請求項１２】
それぞれのアレイは１から１５３６個のエレメントの生体識別物質を含む、請求項９に記載のマイクロプレート。
【請求項１３】
前記アレイ形成領域は、共有結合の相互作用か、非共有結合の相互作用か、アフィニティ相互作用かによる生体識別物質の不動化のために活性化されている、請求項１に記載のマイクロプレート。
【請求項１４】
前記アレイ形成領域は、直接的な表面処理か、活性化された挿入物の設置か、活性化されたコーティングの前記領域の表面への吸着かによって活性化された、請求項１に記載のマイクロプレート。
【請求項１５】
前記可撓性素材は熱可塑性ポリマー素材で、前マイクロプレートは真空成形または射出成形により形成された、請求項１に記載のマイクロプレート。
【請求項１６】
前記可撓性素材は、厚さが約０．１ないし１００ｍｉｌである、請求項１に記載のマイクロプレート。
【請求項１７】
前記可撓性素材は、厚さが約１ないし１０ｍｉｌである、請求項１６に記載のマイクロプレート。
【請求項１８】
前記可撓性素材は、曲げ弾性率（ＡＳＴＭ　Ｄ７９０）が約１７０−２２０Ｋｓｉで、ショアＤ堅さ（ＡＳＴＭ　Ｄ　２２４０）が約６５−８０で、６６Ｐｓｉでの加重たわみ温度が約１００−２００゜Ｆである、請求項１に記載のマイクロプレート。
【請求項１９】
複数のキャップが設けられたフタを含み、前記キャップのそれぞれがアレイ形成領域に対応する、請求項１に記載のマイクロプレート。
【請求項２０】
それぞれの前記キャップは、吸気ポートと、排気ポートと、該キャップの内部に設けられたガス拡散部材とを含む、請求項１９に記載のマイクロプレート。
【請求項２１】
前記キャップはそれぞれ温度制御素子を含む、請求項２０に記載のマイクロプレート。
【請求項２２】
請求項１に記載のマイクロプレートと、該マイクロプレートの辺縁に取り付けられた剛直なフレームと、真空源に接続可能な内腔と頂面とが設けられた真空式固定器具とを含むマイクロアレイアッセイシステム用の組立体であって、前記剛直なフレームは、アレイ形成領域が前記真空式固定器具の頂面に支持されるように、前記マイクロプレートを前記真空式固定器具の上にマウントするために適合し、前記マイクロプレートが前記真空式固定器具の頂面に前記剛直なフレームを介してマウントされるとき、前記頂面に前記アレイ形成領域と対応する位置で開口し、前記内腔に接続される、複数のオリフィスが前記真空式固定器具に設けられている、マイクロアレイアッセイシステム用の組立体。
【請求項２３】
前記真空式固定器具は、該真空式固定器具の頂面の温度を制御するための温度制御素子を含む、請求項２２に記載の組立体。
【請求項２４】
前記温度制御素子は、前記真空式固定器具の頂面の近傍に形成された複数の導管を含む、請求項２３に記載の組立体。
【請求項２５】
前記内腔内部に陽圧と陰圧とを交互に発生させるために前記内腔に接続されたペリスタポンプを含み、交互に発生した陽圧と陰圧とは、前記真空式固定器具の頂面のアレイ形成領域に対応する位置に前記オリフィスにより導かれて、微小規模の撹拌を行う効果を発生させる、請求項２２に記載の組立体。
【請求項２６】
それぞれが可撓性素材でできていて生体識別物質の不動化のために活性化されている複数の離散したアレイ形成領域と、該アレイ形成領域の間を越えて液体が流れ込むことを規制するために前記アレイ形成領域の間に設けられた障害物とを含むマイクロプレートを提供すること、真空式固定器具であって、真空源に接続され前記マイクロプレートのアレイ形成領域に対応する位置で前記真空式固定器具の頂面に開口する複数のオリフィスを有する真空式固定器具の頂面に前記マイクロプレートをマウントすること、前記アレイ形成領域を前記固定器具の頂面に対して保持するために、前記オリフィスに陰圧を発生させること、前記アレイ形成領域を前記固定器具の頂面に対して保持する間に、アレイ形成領域に生体識別物質のマイクロアレイをプリントすること、アレイ形成領域にサンプルを添加すること、前記アレイ形成領域に添加されたいずれかのサンプルの温度を制御すること、アレイ形成領域の画像化を行うことからなるグループから選択される少なくとも１つの機能を実行することを含む、マイクロアッセイの方法。
【請求項２７】
それぞれが可撓性素材でできており生体識別物質の不動化のために活性化された複数の離散したアレイ形成領域と、該アレイ形成領域の間を越えて液体が流れ込むことを規制するために前記アレイ形成領域の間に設けられた障害物とを含むマイクロプレートを提供すること、真空式固定器具であって、真空源に接続され前記アレイ形成領域に対応する位置で該真空式固定器具の頂面に開口する複数のオリフィスを有する真空式固定器具の頂面に前記マイクロプレートをマウントすること、少なくとも１つのサンプルを少なくとも１個のアレイ形成領域に添加すること、前記アレイ形成領域を上下に動かして前記サンプルを撹拌するために前記オリフィスに陽圧と陰圧とを交互に発生させることを含む、マイクロアレイの方法。
【請求項２８】
少なくとも１個のアレイ形成領域は不動化された生体識別物質のアレイを含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記生体識別物質は標識されている、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記サンプルは標識されている、請求項２８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、生体分子アレイを処理するためのデバイスおよび装置、特に、「アレイのアレイ」型マイクロプレート（以下「Ａ２プレート」という。）および自動処理システムに関する。本発明は、ＤＮＡ診断、突然変異スクリーニング、遺伝子発現モニタリング、タンパク質解析、細胞に基づくアッセイおよびその他のロボットワークステーションを用いる用途に応用できる。
【０００２】
【従来の技術】
ＤＮＡマイクロアレイ、オリゴマイクロアレイおよびタンパク質マイクロアレイのようなマイクロアレイは、遺伝子発現の変化を監視するための標準的なツールになっている。本技術は多くの分子生物学の研究室で急速に用途が拡大した。発現又は転写に加えて、さまざまな構造ゲノム又は機能ゲノムの特性が研究できる。マイクロアレイアッセイにおいては、数百個から数万個のプローブが基質にアレイ状に付着され、サンプル溶液がこれらのアレイにインキュベートされる。既知の配列のプローブ（オリゴまたはｃＤＮＡ）を用いることにより、ハイブリダイゼーションに固有の特異性によりどの遺伝子がサンプル中に存在するかが示される。ある疾患の進行状況を追跡するため、または数百人についての遺伝的な偏差を同定するためには、多数のサンプルがしばしば必要となる。これは異なるアレイのデータを注意深く比較することを要する。
【０００３】
今日では、大多数のＤＮＡアレイはガラス製顕微鏡用スライドの上に形成される。典型的な作業工程では、ロボット型「スポッタ」がプローブを含む少量の液体をガラススライドの上に付着させてアレイを形成する。約１０，０００個のスポットを１枚のガラススライド上にアレイとして配置することができる。次に標的の溶液が、典型的には手作業で、前記スライド上に添加される。前記スライドをインキュベータ／ミキサーの中に数時間入れた後、結合した標的由来の蛍光シグナルはレーザと光電子増倍管とを用いて画像化される。しかしこの方法は、スループットが低くデータの質および再現性が悪いという短所がある。
【０００４】
ガラススライドを用いることの代替策は、既存の成形されたポリマー製タイタープレートであって、ウェルの中にアレイがプリントされたものを用いることである。マイクロタイタープレートは周知の器具であり、マイクロウェルの中に、単一のエレメント（例えばＥＬＩＳＡプレート）か、またはアレイ状（例えばＧｅｎｏｍｅｔｒｉｘ、ＷＯ　９８／２９７３６）かのいずれかで、生体分子を付着させることも周知である。しかし、従来のマイクロウェルでは、高価な機器を使わないとアレイを読みとることは困難である。焦点の視野とウェルの底の均一な照明とに関しても、従来のマイクロタイタープレートを用いることには限界がある。さらに、これらのプレートが非対称に設計されていること（ウェルの底部が固体で頂部が開放されていること）のために、熱膨張の相違により成形された部分に反りが生じる。その結果、従来の成形されたタイタープレートは、しばしばアレイ用途に必要な平坦さの基準を満たすことができない。例えば、ピン式プリンタを用いてナノリットル程度の液量を正確に付着させるためには、基質がピンの垂直移動距離の１０％以内の平坦さであることが重要である。前記垂直移動距離が０．０６インチのときには平坦さは０．００６インチ以内でなければならないが、これは成形されたタイタープレートでは達成することがしばしば困難である。さらに、プレートが加熱されると、反りのために、ウェルと前記プレートを載せた加熱装置との間に空気の隙間が不均一に生じる。これらの空気の隙間のために、ウェルごとに不均一な熱抵抗が発生し、これがさらに、インキュベーションまたはハイブリダイゼーションの温度をアレイごとに制御することを困難にする。
【０００５】
発明の概要
「９６ヘッド」型リキッドハンドリングロボットが広範に受容されており、これらのロボットにハイブリダイゼーション工程を適合させることがある程度可能であることから、マイクロアレイをロボットが処理できるようにし高品質のデータを生み出すハイスループットのデバイスには需要がある。
【０００６】
したがって本発明は、関連技術の限界および欠点による１つ以上の問題点を実質的に除去するマイクロアレイのアッセイ方法および装置に向けられている。
【０００７】
本発明の目的は、アレイのアレイ型マイクロプレートと、該プレートとともに作動するマイクロアレイアッセイの自動処理用固定器具とを提供することである。
【０００８】
具体化され広範に記載されたとおりの本発明の目的に従って上記その他の長所を実現するために、本発明は、可撓性素材でできたトレイを含むマイクロアレイアッセイ用デバイス用マイクロプレートを提供する。前記トレイは、複数の離散したウェルと、該ウェルの間を越えて液体が流れ込むことを規制するためにウェル間に設けられた複数の障害物とを有する。前記ウェルの表面は、生体分子、細胞または細胞の構成成分のような生体識別物質を不動化するために活性化されている。本発明は、前記トレイにアレイ形成領域を取り囲む凹部が設けられている別のマイクロプレートを提供する。
【０００９】
別の局面では本発明は、前記マイクロプレートのフレームが前記真空式固定器具の頂部の上に前記マイクロプレートをマウントするために適合しており、前記可撓性のトレイが前記真空式固定器具の頂面の上に支持される、前記マイクロプレートとともに作動するための真空式固定器具を提供する。前記真空式固定器具には、真空源に接続可能な内腔と、該内腔に連絡し、前記マイクロプレートが前記真空式固定器具の頂面に前記剛直なフレームを介してマウントされるときに前記トレイのアレイ形成領域に対応する位置で前記真空式固定器具の頂面に開口する複数のオリフィスとが設けられている。内腔で発生する陰圧が前記可撓性のトレイを前記真空式固定器具の頂面に対して固着させる。
【００１０】
別の局面では本発明は、可撓性のトレイと該トレイの表面に設けられた複数のマイクロアレイ形成領域とを有するマイクロプレートを提供すること、真空源に接続され、前記トレイのマイクロアレイ形成領域に対応する位置で前記真空式固定器具の頂面に開口する複数のオリフィスが設けられた前記真空式固定器具の頂面に前記マイクロプレートをマウントすること、前記オリフィスに陰圧を発生させて前記トレイを前記固定器具の頂面に対して固着させること、前記トレイを前記固定器具の頂面に対して固着させている間に、前記マイクロアレイ形成領域に生体識別物質のマイクロアレイをプリントすること、サンプルを前記マイクロアレイ形成領域に添加すること、前記トレイ中のいかなるサンプルの温度をも制御すること、マイクロアレイ形成領域を画像化することからなるグループから選択される少なくとも１つの機能を実行することを含む、マイクロアレイのアッセイ方法を提供する。
【００１１】
本発明は、可撓性のトレイと該トレイの表面に設けられた複数のマイクロアレイ形成領域とを有するマイクロプレートを提供すること、該マイクロプレートを、真空源に接続され、前記トレイのマイクロアレイ形成領域に対応する位置で前記真空式固定器具の頂面に開口する複数のオリフィスを有する前記真空式固定器具の頂面にマウントすること、交互に陽圧と陰圧とを前記オリフィスに発生させて前記マイクロアレイ形成領域に対応する前記トレイの部分を上下に運動させて前記アレイ形成領域の中に添加されたサンプルを撹拌することを含む、別のマイクロアレイのアッセイ方法を提供する。
【００１２】
前記マイクロアレイプレートと真空式固定器具とは、リキッドハンドリングロボットとともに使用するための一種のタイタープレートを構成する。前記プレートおよび前記固定器具はハイスループットのアレイ処理を提供し、平坦なプリント面を実現し、加熱インキュベーションの間のウェル毎の温度偏差を減少させる。このシステムにより、マイクロタイタープレートのフットプリント（設置面積）におけるマイクロアレイの並列処理が可能になる。
【００１３】
発明の詳細な説明
本発明のＡ２プレートのアッセイシステムは、Ａ２プレートを、マイクロアレイのプリントと、リキッドハンドリングおよびハイブリダイゼーションその他の工程用のデバイスと、該デバイスに前記Ａ２プレートを適合させるために必要な固定器具とともに用いる。前記Ａ２プレートは複数のウェルを含むデバイスであり、前記ウェルは、障壁か、疎水性のパッチか、槽か、ガスケットか、ペデスタル等かのような障害物で隔てられた離散した領域であり、該離散した領域の間を越えて液体が流れ込むことを前記障害物は規制する。それぞれのウェル内に、不動化されたエレメントのアレイが形成されるが、ここでエレメントとは、生体識別物質の離散した物理的な場所として定義される。１つのアレイの中のエレメントの数は、１から１５３６以上までであってもよいが、好ましくは１６から４００までである。アレイのサイズは、ウェルごとで同じであっても異なっていてもよい。それぞれのアレイの中のエレメントは、同じ生体識別物質であってもよく、異なる生体識別物質であってもよい。
【００１４】
生体識別物質とは、一般に、サンプル中の標的物質と相互作用して該標的を識別する物質をいう。プレートの上に不動化できる生体識別物質は、ＤＮＡおよびタンパク質のような生体分子と、細胞と、膜レセプター、生体分子識別部位、細胞内小器官の構成要素（ｓｕｂ−ｏｒｇａｎｅｌｌｅｓ）その他の構造的な特徴のような細胞の構成成分とを含む。生体識別物質は、共有結合か、非共有結合か、前記部位に結合した生体識別物質とのアフィニティ相互作用のようなその他のいずれかの適当な手段かによって、前記ウェルの表面に結合される。例えば、フッ化アシルの化学を利用する共有結合を用いてもよい。細胞または細胞の構成成分は、タンパク質、糖、その他の生体分子のような細胞表面成分か、リンカーかを介して前記ウェルに結合してもよい。不動化された生体識別物質は、酵素コンジュゲート、蛍光、化学発光、発光、放射能、近赤外分子、エネルギー転移試薬、酵素基質等のようなさまざまな手段で標識してもよい。それぞれのウェルごとまたはそれぞれのプレートごとのエレメントは、同一の標識で標識してもよく、異なる標識で標識してもよい。前記ウェルに添加されるサンプルを１以上の標識で標識してもよい。サンプルは、標識され、または標識されない、異なる生物的なサンプルの混合物であってもよい。
【００１５】
Ａ２プレートは、生体識別物質の不動化のための表面処理ができるプラスチック素材でできていることが好ましい。好ましい素材は、ポリプロピレン、ポリエチレンおよび／またはこれらの共重合体ブレンドのような熱可塑性プラスチックを含むが、ウェルまたは障害物に成形し表面を活性化することができる場合には、発泡ポリマー、ゲル、ガラスまたはセラミックのようなその他の素材およびこれらの組合せも使うことができる。前記プラスチックの直接的な表面処理の他、ディスク、スクリーン、発泡体または適合した素材（ｆｉｔｔｅｄ　ｍａｔｅｒｉａｌ）のような活性化された挿入物を前記ウェルの中に設置してもよい。代替策として、活性化されたコーティングを前記ウェルの上に吸着することを用いてもよい。バルクのプラスチックは、化学的に不活性であり、生体分子その他の生体識別物質の非特異的な吸着が低いことおよび固有蛍光または自家蛍光が低いことを特徴とするのが好ましい。前記プラスチック素材は実質的に透明であること、および、光の透過および前記ウェルの底を通しての検出（透過光計測）が可能なように光学的な品質がよいことが好ましい。反射光による励起で生じたシグナルの検出（落射光計測）も用いることができる。
【００１６】
図１（ａ）−１（ｃ）は、本発明の１の実施態様による浅いマルチウェルマイクロプレートの形状のＡ２プレートを示す。図１（ａ）（平面図）および図１（ｂ）（Ａ−Ａ’の線に沿った断面図）に示すとおり、前記Ａ２プレート１０は、クラムシェル型フレームのような剛直なフレーム１４で縁取られた、成形トレイのようなトレイ１２を形成している。トレイ１２は凹部またはウェル１６のアレイを形成しており、該凹部またはウェルは生体識別物質を結合するために表面処理されている。図１（ｃ）は、前記トレイの辺縁を支持するクラムシェル型フレームの細部を示す。前記トレイは全ての辺縁を締め付けてもよく、辺縁の一部を締め付けてもよい。このフレームはＢｉｏｍｅｋ　Ｇｒｉｐｐｅｒ　Ｔｏｏｌ３のようなロボットツールとともに使用するために適合されるのが好ましい。
【００１７】
前記プレートは、特定の用途に必要であれば、ウェルの数がいくらであっても、ウェルのパターンまたは幾何学的な配置がどのようなものであってもよい。例えば、トレイ全体が１つのウェルであってもよく、または２，０００以上のような多数の小ウェルが成形されてもよい。好ましい実施態様では、前記プレートは９６個のウェルの８ｘ１２アレイを有し、それぞれのウェルは直径６ｍｍ、深さ約１ないし４ｍｍで、ウェルの中心と中心の間の間隔が９ｍｍである。図２（ａ）および図２（ｂ）に示す別の実施態様では、リキッドハンドリング能力が向上したプレートは、凹部２４に取り囲まれた平坦なアレイ形成領域２２を有するように形成されている。マイクロアレイのアレイ２６は、平坦なアレイ形成領域にプリントされてもよく、サンプルは前記領域に添加された後にピペットチップ２５で凹部２４から除去されてもよい。この幾何学的配置は、より広いプリント表面を提供し、中央の平坦な領域から液体の流れをそらせることによりリキッドハンドリング能力を向上させ、アレイの画像化を改善する。
【００１８】
フレームは支持のために剛直な素材でできているが、トレイは可撓性素材でできている。好ましくは、トレイは熱可塑性ポリマーのシートから真空成形または射出成形により形成される。好ましい実施態様では、トレイはポリプロピレン製で、厚さが約０．１ないし１００ｍｉｌ、好ましくは約１ないし１０ｍｉｌで、曲げ弾性率（ＡＳＴＭ　Ｄ７９０）が約１７０−２２０Ｋｓｉで、ショアＤ堅さ（ＡＳＴＭ　Ｄ　２２４０）が約６５−８０で、６６Ｐｓｉでの加重たわみ温度が約１００−２００゜Ｆである。
【００１９】
マイクロアレイのアッセイ工程の際、Ａ２プレートは、固定器具とともに用いられ、プレートが固定器具の上に載せられるときに、それぞれのウェルが固定器具の頂面の上に平らに置かれる。前記固定器具はマイクロアレイにプリントし、データを計測する際のウェルの底面を平坦に保つこと、ウェルの温度を制御することおよび／または加熱中にウェルの内容物を微小規模で撹拌する（ｍｉｃｒｏｍｉｘｉｎｇ）等のような、異なる処理の必要性に応じてさまざまな機能を提供する。図３（ａ）−３（ｃ）および図４は、Ａ２プレート１０と真空式固定器具３２を示す。図３（ａ）に示すとおり、真空式固定器具３２の頂面には、Ａ２プレート１０のトレイ１２の形状に相補的な形状を有する複数の凹部３８が設けられており、プレートが固定器具（図３（ｂ））の上にマウントされるときに、プレートのウェル１６は凹部３８に嵌るように載り、それぞれのウェルの底部は凹部の底部に対し平らになる。図３（ｃ）は、Ａ２プレート１０が固定器具の上にマウントされるときに、固定器具３２の頂面が平らになりウェル１６の底部が前記の平らな表面に対して設置される代替策の実施態様を示す。図３（ｂ）および図３（ｃ）に示すとおり、Ａ２プレートのフレーム１４は、トレイ１２が固定器具の頂面に留まるように、固定器具にマウントされるべく形作られている。固定器具は、下記のプリント装置、インキュベーター等のようなさまざまな処理装置にマウントされる。
【００２０】
固定器具３２は、真空源（図示されない）に導管３４ａを介して接続可能な内腔３４と、頂面に設けられ内腔に接続される複数のオリフィス３６とを有する。オリフィス３６は、図３（ａ）の実施態様の凹部３８の中か、図３（ｃ）の実施態様のウェル１６の底部かに設けられる。真空が内腔３４に引かれるとき、真空はオリフィス３６を介して連絡され、ウェル１６の底部を固定器具３２の頂面に対して強固に保持するために陰圧を発生させる。結果として、トレイ１２は可撓性素材でできているにもかかわらず、ウェル１６の底部は、高分解能でマイクロアレイをプリントし計測する事を容易にするために、高精度の平坦さを維持する。ウェルの底部の平坦さは、凹部３８またはウェルの底部に対応する固定器具の頂面の平坦さによって決定されるのが一般的である。トレイ全面にわたって０．０００１インチ未満の偏差という高度の平坦さを達成することができる。
【００２１】
温度制御能力は、温度制御された液体を通過させるための導管４４を固定器具の中に設けることにより付与される。代替策としては、温度制御は抵抗ヒータを用いるか、固定器具の表面と冷却すべきトレイとの間に設けられた１層のペルチエ型素子のような固体熱電気素材を用いることにより達成できる。温度制御固定器具では、オリフィス３６は固定器具３２とトレイ１２との間の熱抵抗を減少するために、ウェルの底部と固定器具の表面との間から空気を除去するために機能する。これがウェルの均一な温度制御を確保する。
【００２２】
さらに、真空式固定器具には、交互に陽圧と陰圧とを発生させるペリスタポンプ（ｐｅｒｉｓｔａｌｔｉｃ　ｐｕｍｐ）に内腔３４を接続することにより微小規模で撹拌する能力を与えることができる。図５（ａ）および図５（ｂ）に示すとおり、この交互に変化する圧力はオリフィス３６により固定器具３２の表面とウェル１６の底部との間の空間に連絡され、ウェルの可撓性の底部を交互に押し上げたり吸引したりする。これが、ウェルに入っている溶液を均一に混合する微小規模での撹拌効果を生じる。
【００２３】
Ａ２プレートおよび固定器具の物理的な寸法および諸特性は、既存のまたは将来のマイクロアレイのアッセイデバイスとともに作動するために適合するように選択することができる。例えば、プレートはＢｉｏｍｅｋシリーズのワークステーションプラットフォームまたは同等のロボットリキッドハンドリング装置での運転に適合するように設計されてもよい。Ａ２プレートの外側の直線寸法は、ワークステーションおよび／またはそのネットワーク接続された周辺機器の上でマイクロプレートがある場所から別の場所へ移動される自動化アッセイに従来用いられている、剛直なフレームを有する標準的なマイクロタイタープレートのフットプリントに適合するように作られている。さらに、Ａ２プレートのウェルは十分に浅く（深さ４ｍｍ未満）、ＣＣＤカメラその他の検出システムによる個々のウェルの計測をウェルの中で行うことを可能にする側部のドラフトを有する。厚さ、引っ張り強さ、弾性および剪断弾性係数、平坦さ、熱容量、溶媒および水の吸着特性、ウェルの形状等のようなプラスチックトレイ素材の具体的な特性は、Ａ２プレートが特定の固定器具およびアッセイデバイスとともに使用されるときに最高の性能を発揮するように選択される。例えば、撹拌用固定器具が用いられるときには、Ａ２プレートがペリスタポンプの作用により上下に屈曲することができるように、素材は選択される。
【００２４】
図６は、本発明の別の実施態様によるＡ２プレート６０の構成を示す。生体識別物質のマイクロアレイを含む活性化されたプラスチック基質６４に密着された打ち抜きガスケット６２を用いてマイクロウェルは形成される。オプションとして、プラスチック基質６４は強度を与えるための堅い支持板６６に結合される。ガスケット６２と、プラスチック基質６４と、支持板６６とは、接着剤、超音波溶接（ｓｏｎｉｃ　ｗｅｌｄｉｎｇ）、圧着または真空成形を用いるなどにより一体になり、浅いウェルのマイクロプレートを形成する。図６ではプレートの構成を図示するために１つのウェルしか示さないが、プレートは９６個または３８４個のマイクロウェルのような複数のマイクロウェルを含むのが典型的である。前の実施態様と同様に、Ａ２プレート６０は真空式取り付けデバイスとともに用いてもよい。
【００２５】
Ａ２プレートは、コンタミネーションの減少、蒸発の遅延、濃縮の防止、および／または温度制御のような細胞培養または敏感なアッセイ系の開発用の微小環境の制御のために、真空クランプ式フタのようなフタとともに提供されてもよい。フタは、細胞増殖に必要なガス分圧およびｐＨ制御を維持するために、温度制御用とウェル中の液体のガス交換用とのポートを提供することにより、細胞培養を可能にするように設計されてもよい。フタの１つの実施態様は、図７（ａ）、７（ｂ）および７（ｃ）に示されている。図７（ａ）はフタとトレイを示す。図７（ｂ）はトレイに嵌ったフタを示す。図７（ｃ）はウェルのキャップの構造を示す。
【００２６】
これらの図に示すとおり、マイクロプレートのフタ７１はウェルのキャップ７２の連結したまたは隣接したユニットでできている。それぞれのウェルのキャップ７２は、吸気ポート７２ａと、排気ポート７２ｂと、キャップの内側にあり吸気および／または排気ポートを覆うガス拡散部材７２ｃとを設えている。ガス拡散部材７２は、膜でも、発泡体その他の媒体でもよく、ガスの自由拡散ができるように透過性であるか、液体または特定のガスに半透性であるかのいずれであってもよい。追加のポート７２ｄが設けられてもよい。ウェルのキャップ７２は、ペルチエ素子またはコイル、テープその他の伝導性素材のような加熱または冷却素子７２ｅを備えていてもよい。フタは、それぞれのウェルのキャップ７２がマイクロプレートのウェル７４を覆うように、マイクロプレート７３に嵌るようにかぶさる。マイクロプレート７３はスロット７５がウェルの間に設けられるように形成され、フタ７１はウェルの側壁を取り囲むスロットに嵌る下向きに突出した部分をウェルのキャップが有するように形成されるのが好ましい。この輪郭では、加熱素子７２ｅは均一な温度制御を行うために前記下向きに突出した部分の内部にある（図７（ｃ））。マイクロプレートのフタはマイクロプレートの上に手作業で載せてもよく、あるいはロボットアームまたは同様のデバイスの補助で載せてもよい。キャップをしたマイクロプレートは、ロボットリキッドハンドリングワークステーション上で使用するためにＡ２プレート固定器具３２に載せてもよい。
【００２７】
マイクロプレートおよびフタの典型的な使用法は、Ａ２プレート内で細胞培養を自動化することである。培養液はキャップをしないマイクロプレートにロボット制御されたピペット操作ツールを用いて注入される。フタはロボットアームによって持ち上げられ、プレートの上に載せられる。二酸化炭素−空気の混合物が、所望の溶存ガス平衡に達するまで、吸排気ポートから個々のウェルに分配される。同様に、温度は上記の加熱冷却システムを用いて調節される。細胞の接種液（ｃｅｌｌ　ｉｎｏｃｕｌｕｍ）は、ウェルのキャップに設けられた追加のポート７２ｄを通してか、短時間フタを除去して細胞の接種液をピペットで注入するかのいずれかにより導入される。細胞の微小環境は以前の状態に戻して培養が開始される。
【００２８】
図８ａに示す本発明の別の実施態様によると、Ａ２プレート８０は、１以上の列に配列された複数のウェル８２をそれぞれが含む可撓性の複数のストリップ８１を有するように形成されている。ストリップは可撓性のプラスチック素材を成形または真空成形することにより形成され、分離して形成されてもよく、予め形成されたプレートからストリップに切断されてもよい。それぞれの可撓性のウェルのストリップ８１は剛直なプラスチックのハンガー８３に圧着され、このハンガーはさらに剛直なプラスチックフレーム８４にマウントされる。
【００２９】
図８（ｂ）に示すさらに別の実施態様によると、Ａ２プレート８５はリング８７ａおよびクロスバー８７ｂを含む剛直なプラスチックハンガー８７に嵌め込まれて個別に成形され、あるいは真空成形された、プラスチックウェル８６でできていてもよい。一連のハンガー８７は一体になって剛直なプラスチックフレーム８８に連結されている。図８（ａ）および８（ｂ）に示す実施態様によるプレートは、プレート上の単一のウェルまたはウェルのグループを個別に取り扱うことを可能にし、このデバイスの多目的性を高める。
【００３０】
本発明の実施態様のＡ２プレートは、Ｂｉｏｍｅｋ系列のリキッドハンドリングロボットのような特殊なワークステーションの消耗品として使用してもよい。プレートは、プローブのアレイを予めプリントしたものでも、プリントしていないものでもよい。
【００３１】
マイクロアレイのアッセイシステムおよび方法におけるＡ２プレートおよび固定器具の用途は、図９を参照して説明される。マイクロアレイアッセイシステム９０は、以下のモデュールユニット、すなわち、マイクロアレイプリンタ９２と、Ｂｉｏｍｅｋロボットステーションのようなロボットワークステーション９４と、ハイブリダイゼーションホテル９６と、Ｏｒｃａ３アームおよびスライドレールのような輸送システム９８とを含む。さまざまなモデュールユニットが従来のガラススライドマイクロアレイまたは従来のマルチウェルアッセイを用いるマイクロアレイアッセイシステムで用いられてきており、Ａ２プレートおよび固定器具とともに作動するように適合させてもよい。プリンタ９２は、ｃＤＮＡ、オリゴ、タンパク質等のようなプローブのマイクロアレイをＡ２プレート９１の上にプリントするのに用いられる。プリントのときには、Ａ２プレートは真空式固定器具の上に定位され、真空が引かれる。ＣａｒｔｅｓｉａｎのＢｉｏＤｏｔ　Ａｒｒａｙｅｒのようなアレイスポッタが、それぞれのウェルの内部にプローブのアレイを付着させる。数百個のプローブのアレイをプリントすることができる。プリントの後、マイクロプレートは、サンプルを自動化されたハイブリダイゼーションまたはインキュベーション条件下で処理するためのロボットワークステーション９４への輸送か、保存のためのハイブリダイゼーションホテル９６への移送かのいずれかが行われる。ハイブリダイゼーションおよびインキュベーションのためには、サンプルおよび試薬がロボットワークステーション９２の上のマイクロプレートに添加される。温度制御および／または微小規模の撹拌の能力を有する固定器具がこの工程に使用されてもよい。マイクロプレートがハイブリダイゼーションまたはインキュベーションのために調製された後、マイクロプレートは輸送システム９８を用いてハイブリダイゼーションホテル９６に移送され、そこでプローブと標的とのハイブリダイゼーション（ｃＤＮＡアレイの場合）またはインキュベーション（タンパク質のアッセイの場合）が進行させられる。ハイブリダイゼーションホテル９６は、プログラム可能な湿度および温度制御を提供する大容量インキュベータである。ハイブリダイゼーションまたはインキュベーションの完了後、プレートはホテル９６から取り出され、画像化のようなさらなる処理のためにワークステーション９４に戻される。この工程の間に、プレートは洗浄され、シグナルを発生させる試薬がウェルに注入され、その後プレートはさらに洗浄されて、保存のためにホテルの戻されるか、計測用ステーションに移送されるかのいずれかである。
【００３２】
かかるマイクロアレイアッセイシステムは、完全にアッセイ工程を自動化し、スループットを増大させる。標準的なプロトコールを自動化されたハンドリング工程のために作成することは可能であり、手作業の処理につきものの偏差は除去される。
【００３３】
図１０は、本発明の実施態様によるマイクロアレイアッセイシステムを用いて得られたデータを表す画像を示す。ヒトＩｇＧのレプリカスポットが、９６穴Ａ２プレートのウェルの底の５ｘ５スポットのアレイに、プレート当たりの合計スポット２４００個プリントされた。Ａ２プレートは１０ｍｉｌのポリプロピレン製シート素材から真空成形され、表面がフッ化アシル基で活性化され、これに抗原（ヒトＩｇＧ）が共有結合している。ストレプトアビジン−アルカリフォスファターゼ／ＥＬＦ蛍光基質とともにビオチン化されたマウス抗ヒトＩｇＧがシグナル発生に用いられた。プレートの全体としての変動係数は約９．７％であった。
【００３４】
要約すると、本発明のマイクロアレイアッセイシステムは、処理したガラススライドをアレイの基質として用いる従来のシステムと比較して、顕著により高いスループットを提供する。ガラススライドは有用なもので平坦さの基準を満たすが、多くの分子生物学の実験室で毎月作成される数百枚、数千枚のスライドを処理し、保存し、カタログ作成することは退屈で時間がかかる。また、それぞれのガラススライドには、手作業で載せたりはずしたりしなければならないガラスのカバースリップが１枚ずつある。これに対しＡ２プレートは、多数のサンプルを１枚のプレートで処理することを可能にする。プレートは追跡のためにバーコードで標識することができる。マイクロアレイアッセイシステムは、マイクロアレイのプリント、ハイブリダイゼーションおよび画像化での重要なパラメータの偏差を最少にし、これにより、アッセイの再現性を向上させる。本発明のマイクロアレイアッセイシステムから得られた成績の数値は、特異性が１：２００，０００細胞以上、ダイナミックレンジが３ｌｏｇ以上、変動係数がアレイ間で１０％未満であり、既存のマイクロアレイと同等かより以上であった。本発明は、遺伝子発現、ＳＮＰｓ、免疫アッセイ、細胞アッセイ等に用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【図１ａ】
図１（ａ）、１（ｂ）および１（ｃ）は、本発明のアレイのアレイ型プレート（Ａ２プレート）を示す。図１（ａ）は該プレートの平面図。
【図１ｂ】
図１（ａ）のＡ−Ａ’の直線に沿った前記プレートの断面図。
【図１ｃ】
前記プレートの部分拡大断面図。
【図２ａ】
図２（ａ）および２（ｂ）は本発明の別の実施態様のＡ２プレートを示す。図２（ａ）は、前記プレートの平面図。
【図２ｂ】
図２（ａ）の直線Ｂ−Ｂ’に沿った断面図。
【図３ａ】
本発明の実施態様の真空式固定器具と、その上に載ったＡ２プレートとを示す斜視図。
【図４】
真空式固定器具とその上に載ったＡ２プレートとの部分断面図。
【図５】
真空式固定器具の微小規模での撹拌の動作を示す断面図。
【図６】
本発明の別の実施態様のＡ２プレートの構成を示す斜視図。
【図７】
本発明のある実施態様のＡ２プレートのフタを示す断面図。
【図８ａ】
本発明の別の実施態様の分離したウェルのストリップでできたＡ２プレートを示す斜視図。
【図８ｂ】
本発明のさらに別の実施態様の分離したウェルのストリップでできたＡ２プレートを示す図。
【図９】
マイクロアレイアッセイシステムを示す図。
【図１０】
前記マイクロアレイアレイシステムを用いて得られたデータを表す画像。
【符号の説明】
１０、６０、８０、８５、９１　　アレイのアレイ型マイクロプレート
１２　　トレイ
１４、８４、８８　　フレーム
１６、７４、８２、８６　　ウェル
２２　　平坦なアレイ形成領域
２４　　凹部
３２　　真空式固定器具
３４　　内腔
３４ａ　　導管
６２　　打ち抜きガスケット
６４　　プラスチック基質
６６　　支持板
７２　　ウェルのキャップ
７５　　スロット
８１　　ストリップ
８３、８７　　プラスチックハンガー
８７ａ　　リング
８７ｂ　　クロスバー
９０　　マイクロアレイアッセイシステム
９２　　マイクロアレイプリンタ
９４　　ロボットワークステーション
９６　　ハイブリダイゼーションホテル
９８　　輸送システム
【国際公開パンフレット】
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2004510148.tif 000004
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2004510148.tif 000028
2004510148.tif 000029
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004510148.tif 000030
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004510148.tif 000031
【国際調査報告】
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2004510148.tif 000033
2004510148.tif 000034
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