(57)【要約】【課題】典型的には薬剤である、基質分子の反応部位を同定し、ＣＹＰ酵素による代謝の相対速度を決定する。【解決手段】相対速度を決定することは個々の部位および基質分子全体の代謝の絶対速度を決定するのに重要な因子である。またこの情報は基質分子がそのＡＤＭＥ／ＰＫ特定を改善するために再デザインしうるかどうか、またどのように再デザインできるかを決定するためにも重要な因子である。この点において、水生成および基質の再生成のような非代謝副反応（分岐経路）の速度に対して、反応速度がどのように比較されるかを知ることは特に重要である。【選択図】図３Ａ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
分子の代謝速度に及ぼす分子修飾の効果を予測する方法であって、該方法は、
ａ）該分子上の第１部位における該分子修飾の反応速度を予測または決定すること、
ｂ）該反応速度を、基質と該分子を代謝する代謝酵素との複合体からの分岐経路と比較すること、および
ｃ）該第１部位を、その反応速度と該分岐経路の該速度との相対値に基づいて特徴づけることによって、該分子修飾の該効果の予測を促進すること、
を備えた方法。
【請求項２】
該（ａ）から（ｃ）を該分子上の第２部位について繰り返すことをさらに備えた請求項１に記載の方法。
【請求項３】
該（ａ）から（ｃ）を該分子上の３以上の異なる部位について繰り返すことをさらに備えた請求項１に記載の方法。
【請求項４】
該分岐経路が脱離反応である請求項１、２または３に記載の方法。
【請求項５】
該分岐経路が水脱離反応である請求項４に記載の方法。
【請求項６】
該分子上の複数の反応部位を、それらの反応速度が該分岐経路の該速度よりも速いかまたは遅いかに基づいて分類することをさらに備えた請求項２、３、４、または５に記載の方法。
【請求項７】
該分類することは、それぞれの部位の反応速度が該分岐経路の該速度よりも速いか、遅いか、または同程度であるかを決定することを含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
該分子を、該分岐経路の速度よりも速い反応速度をもつ部位の個数に基づいて特徴づけることをさらに備えた、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
もし該分岐経路の速度よりも速い反応速度をもつ部位が所定の数よりも多いなら、該分子は、代謝の速度を遅くすることが困難であると特徴づけられる請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
該分子修飾は、該分子上の該第１部位における酸化である請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
該第１部位における該分子修飾の該反応速度は、該代謝酵素に関連するデータまたは値を用いることなく予測される、請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
該第１部位における該分子修飾の該反応速度が、修飾されない状態における該分子と、該分子修飾の後に形成された該分子のラジカルとのエネルギー差を計算することを含む手続きによって予測される、請求項１〜１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
該第１部位が芳香環の部位であるときに該ラジカルが付加反応によって生成される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
メトキシラジカルが該芳香環に該付加反応によって付加される請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
該ラジカルが該第１部位における水素原子除去によって生成される請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
該反応速度は、速度定数、活性化エネルギー、および反応速度の少なくとも一つによって表現される請求項１〜１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
基質および該代謝酵素の複合体から水が生成される速度は、基質およびＦｅ＋３Ｏを含む種から水が生成される速度である請求項５に記載の方法。
【請求項１８】
基質および該代謝酵素の複合体から水が生成される速度は、シトクロムＰ４５０触媒回路に関連する水脱離反応を介して水が生成される速度である請求項５に記載の方法。
【請求項１９】
同位体効果のデータから計算され、水素原子除去についての約１０ｋｃａｌ／ｍｏｌの活性化エネルギーを用いて計算されるとき、水が生成される速度が、ほぼ９と１０．５ｋｃａｌ／ｍｏｌとの間にある活性化エネルギーによって特徴づけられる請求項５に記載の方法。
【請求項２０】
分子の代謝速度に及ぼす分子修飾の効果を予測するコンピュータシステムであって、該システムは、
一つ以上のプロセッサ、
一つ以上のユーザ入力装置、および
メモリ
を備えており、該プロセッサおよび該メモリは、
ａ）該分子上の第１部位における該分子修飾の反応速度を予測または決定すること、
ｂ）該反応速度を、基質と該分子を代謝する代謝酵素との複合体からの分岐経路と比較すること、および
ｃ）該第１部位を、その反応速度と該分岐経路の該速度との相対値に基づいて特徴づけることによって、該分子修飾の該効果の予測を促進すること、
をおこなうように構成されたコンピュータシステム。
【請求項２１】
該コンピュータシステムは、該（ａ）から（ｃ）を該分子上の第２部位について繰り返すことをさらにおこなう請求項２０に記載のコンピュータシステム。
【請求項２２】
該コンピュータシステムは、該（ａ）から（ｃ）を該分子上の３以上の異なる部位について繰り返すことをさらにおこなう請求項２０に記載のコンピュータシステム。
【請求項２３】
該分岐経路が脱離反応である請求項２０、２１または２２に記載のコンピュータシステム。
【請求項２４】
該分岐経路が水脱離反応である請求項２３に記載のコンピュータシステム。
【請求項２５】
該コンピュータシステムは、該分子上の複数の反応部位を、それらの反応速度が該分岐経路の該速度よりも速いかまたは遅いかに基づいて分類することをさらにおこなう請求項２１、２２、２３、または２４に記載のコンピュータシステム。
【請求項２６】
コンピュータで読み取り可能な媒体および該コンピュータで読み取り可能な媒体を介して提供されるプログラム命令を備えたコンピュータプログラム製造物であって、該プログラム命令は、分子の代謝速度に及ぼす分子修飾の効果を予測する命令を備えており、該命令は、
ａ）該分子上の第１部位における該分子修飾の反応速度を予測または決定すること、
ｂ）該反応速度を、基質と該分子を代謝する代謝酵素との複合体からの分岐経路と比較すること、および
ｃ）該第１部位を、その反応速度と該分岐経路の該速度との相対値に基づいて特徴づけることによって、該分子修飾の該効果の予測を促進すること、
を記述するコンピュータプログラム製造物。
【請求項２７】
該命令は、該（ａ）から（ｃ）を該分子上の第２部位について繰り返すことをさらに備えている請求項２６に記載のコンピュータプログラム製造物。
【請求項２８】
該命令は、該（ａ）から（ｃ）を該分子上の３以上の異なる部位について繰り返すことをさらに備えている請求項２６に記載のコンピュータプログラム製造物。
【請求項２９】
該命令は、該分子上の複数の反応部位を、それらの反応速度が該分岐経路の該速度よりも速いかまたは遅いかに基づいて分類することをさらに備えている請求項２６、２７、または２８に記載のコンピュータプログラム製造物。
【請求項３０】
該分岐経路が脱離反応である請求項２６、２７、２８、または２９に記載のコンピュータプログラム製造物。
【請求項３１】
該分岐経路が水脱離反応である請求項３０に記載のコンピュータプログラム製造物。
【請求項３２】
基質分子の反応部位を特徴づける方法であって、該方法は、
該反応部位の活性化エネルギーまたは速度定数を決定する操作、および
該反応部位の該活性化エネルギーまたは該速度定数を、酵素と複合体化した該基質分子に関連する分岐経路の活性化エネルギーまたは速度定数と比較する操作を備えている方法。
【請求項３３】
該分岐経路は、脱離反応である請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
該分岐経路は、水脱離反応である請求項３２に記載の方法。
【請求項３５】
少なくとも該（ａ）および該（ｂ）の一つからの情報を用いて、該基質分子の代謝に対する該反応部位の効果を決定する操作をさらに備えている請求項３２、３３、または３４に記載の方法。
【請求項３６】
該酵素は、シトクロムＰ４５０酵素である請求項３２、３３、３４、または３５に記載の方法。
【請求項３７】
該基質分子は、経口薬としてデザインされている請求項３２〜３６のいずれかに記載の方法。
【請求項３８】
該反応部位は、脂肪族炭素原子である請求項３２〜３６のいずれかに記載の方法。
【請求項３９】
該活性化エネルギーは、該反応部位の初期状態と、水素原子が除去されたラジカル化された状態との自由エネルギーの差によって計算される請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
該反応部位は、芳香族炭素原子である請求項３２〜３７のいずれかに記載の方法。
【請求項４１】
該活性化エネルギーは、該反応部位の初期状態と、メトキシ基が付加されたラジカル化された状態との自由エネルギーの差によって計算される請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
該活性化エネルギーは、ＡＭ１を用いて計算される請求項３２〜４１のいずれかに記載の方法。
【請求項４３】
該特徴づける方法は、該反応部位を、安定、比較的安定、および不安定の３つのカテゴリーに分類することをさらに備えている請求項３２〜４２のいずれかに記載の方法。
【請求項４４】
該安定のカテゴリーは、活性化エネルギーが約０．５ｋｃａｌ／ｍｏｌ以上該分岐経路の活性化エネルギーよりも大きいとして定義され、該比較的安定のカテゴリーは、活性化エネルギーが約１．５ｋｃａｌ／ｍｏｌだけ該分岐経路の活性化エネルギーよりも小さい点から、約０．５ｋｃａｌ／ｍｏｌだけ該分岐経路の活性化エネルギーよりも大きい点までとして定義され、該不安定のカテゴリーは、活性化エネルギーが約１．５ｋｃａｌ／ｍｏｌ以上該分岐経路の活性化エネルギーよりも小さいとして定義される請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
該分岐経路は水脱離反応であり、該反応の該活性化エネルギーは約１０ｋｃａｌ／ｍｏｌである請求項３２に記載の方法。
【請求項４６】
該分岐経路の該活性化エネルギーは、同位体効果測定によって間接的に測定される請求項３２に記載の方法。
【請求項４７】
該同位体効果測定は、水素および重水素を用いた固有同位体効果反応のアンマスキングである請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
該方法は、該（ａ）および（ｂ）を該分子上の第２部位について繰り返すことをさらに備えている請求項３２に記載の方法。
【請求項４９】
該方法は、該（ａ）および（ｂ）を該分子上の３以上の異なる部位について繰り返すことをさらに備えている請求項３２に記載の方法。
【請求項５０】
分子の代謝速度に及ぼす分子修飾の効果を予測するコンピュータシステムであって、該コンピュータシステムは、
一つ以上のプロセッサ、
一つ以上のユーザ入力装置、および
メモリ
を備えており、該プロセッサおよび該メモリは、
該反応部位の活性化エネルギーまたは速度定数を決定すること、および
該反応部位の該活性化エネルギーまたは該速度定数を、酵素と複合体化した該基質分子に関連する分岐経路の活性化エネルギーまたは速度定数と比較すること、
をおこなうよう構成されているコンピュータシステム。
【請求項５１】
該分岐経路は、脱離反応である請求項５０に記載のコンピュータシステム。
【請求項５２】
該分岐経路は、水脱離反応である請求項５０に記載のコンピュータシステム。
【請求項５３】
該プロセッサおよび該メモリは、少なくとも該（ａ）および該（ｂ）の一つからの情報を用いて、該基質分子の代謝に対する該反応部位の効果を決定することをさらにおこなうように構成されている請求項５０、５１、または５２に記載のコンピュータシステム。
【請求項５４】
該酵素はシトクロムＰ４５０酵素である請求項５０〜５３のいずれかに記載のコンピュータシステム。
【請求項５５】
該基質分子は、経口薬としてデザインされている請求項５０〜５４のいずれかにコンピュータシステム。
【請求項５６】
コンピュータで読み取り可能な媒体および該コンピュータで読み取り可能な媒体を介して提供されるプログラム命令を備えたコンピュータプログラム製造物であって、該プログラム命令は、分子の代謝速度に及ぼす分子修飾の効果を予測する命令を備えており、該命令は、
該反応部位の活性化エネルギーまたは速度定数を決定すること、および
該反応部位の該活性化エネルギーまたは該速度定数を、酵素と複合体化した該基質分子に関連する分岐経路の活性化エネルギーまたは速度定数と比較すること、
を記述するコンピュータプログラム製造物。
【請求項５７】
該分岐経路は、脱離反応である請求項５６に記載のコンピュータプログラム製造物。
【請求項５８】
該分岐経路は、水脱離反応である請求項５６に記載のコンピュータプログラム製造物。
【請求項５９】
該命令は、少なくとも該（ａ）および該（ｂ）の一つからの情報を用いて、該基質分子の代謝に対する該反応部位の効果を決定することをさらに備えている請求項５６〜５８のいずれかに記載のコンピュータプログラム製造物。
【請求項６０】
該酵素はシトクロムＰ４５０酵素である請求項５６〜５９のいずれかに記載のコンピュータプログラム製造物。
【請求項６１】
該基質分子は、経口薬としてデザインされている請求項５６〜６０のいずれかにコンピュータプログラム製造物。
【請求項６２】
該命令は、該（ａ）および（ｂ）を該分子上の第２部位について繰り返すことをさらに備えている請求項５６に記載のコンピュータプログラム製造物。
【請求項６３】
該方法は、該（ａ）および（ｂ）を該分子上の３以上の異なる部位について繰り返すことをさらに備えている請求項５６に記載のコンピュータプログラム製造物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は一般的には、ある薬剤における基質の反応部位を分析するシステムおよび方法に関する。より具体的には本発明は、これらの反応部位の比代謝反応速度を決定するシステムおよび方法に関しており、特にシトクロムＰ４５０酵素の代替反応経路に関しており、またその部位の代謝特性をモデル化し予測することにも関しており、さらには、所望の代謝特性を達成するためにそのような基質をデザインおよび再デザインすることにも関する。
【０００２】
【発明の背景】
薬剤開発は非常に費用がかかる長いプロセスである。一つの薬剤を市場に出すコストは約５億ドルから１０億ドルであり、開発期間は約８年から１５年になる。薬剤開発は、典型的には、最終的に市場に受け入れられるような一つまたはいくつかの薬剤に結びつくような、いくつかの化合物クラスにわたって分散した１０００から１００，０００の候補化合物を同定することを伴う。
【０００３】
これら数千の候補化合物が、研究者が求める薬理学的特性を持つかを評価するために、さまざまな生化学的指標に関してスクリーニングされる。このスクリーニングプロセスによって、ある程度の所望の特性を呈するずっと少ない数の「ヒット」（おそらく５００あるいは１０００）が得られ、これらは、より有効なさらに少ない「リード」（おそらく５０あるいは１００）へと絞り込まれる。この時点で典型的には、このリード化合物はそのＡＤＭＥ／ＰＫ（吸収、分布、代謝、排泄／薬物動態学）特性を評価分析される。これらは、その実際のｉｎ　ｖｉｖｏのＡＤＭＥ／ＰＫ特性を評価するために、ヒト血清アルブミン結合のような生化学的評価、ｐＫＡや溶解度試験のような化学的評価、およびヒト肝の小胞体による代謝のようなｉｎ　ｖｉｔｒｏ生物学的評価を用いてテストされる。これら化合物のほとんどは、受け入れられないＡＤＭＥ／ＰＫ特性のために廃棄される。
【０００４】
さらに、これらの試験を通り、研究用新薬（ＩＮＤ）としてＦＤＡの臨床試験に供される最適化されたリードでさえもときには、実際に動物およびヒトで試験されると好ましくないＡＤＭＥ／ＰＫ特性を呈する。この段階での最適化されたリードの廃棄または再デザインは著しくコストがかかる。というのもＦＤＡトライアルは、当該化合物の生成、製造、および広範な試験を要求するからである。
【０００５】
受け入れられないＡＤＭＥ／ＰＫ特性をもつ化合物を開発することは、このように薬剤開発の全体的なコストに大きく影響する。もし開発の初期の段階（早ければ早いほど良い）で化合物が廃棄されたり再デザインされるようなプロセスがあれば、費用と時間の大きな節約が達成される。現在の技術はこれができるような包括的な方法を提供しない。
【０００６】
ヒトおよびほとんど全ての生物におけるすべての薬物代謝の多くの部分は、シトクロムＰ４５０酵素によっておこなわれる。シトクロムＰ４５０酵素（ＣＹＰ）は、植物、バクテリア、および動物の種に存在する７００以上のアイソザイムを含む、ヘム含有酵素を総称したものである。Ｎｅｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．、Ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｅｔｉｃｓ１９９６　６、１−４２。それらは一原子酸素添加酵素である。Ｗｉｓｌｏｃｋｉ ｅｔ ａｌ．、Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｄｅｔｏｘｉｆｉｃａｔｉｏｎ （Ｊａｋｏｂｙ， Ｅｄ．）、１３５−８３、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク、１９８０。ヒトは同一のいくつかのＣＹＰアイソザイムを共通に持つが、これらのアイソザイムは個人によって若干異なり（対立遺伝子）、個人のアイソザイムプロファイルも、存在するそれぞれのアイソザイムの量に関してある程度異なる。
【０００７】
ヒトにおいては、全ての薬剤の５０％が部分的にはＰ４５０酵素によって代謝され、薬剤の３０％が主にこれらの酵素によって代謝される。薬剤代謝において最も重要なＣＹＰ酵素はＣＹＰ３Ａ４、ＣＹＰ２Ｄ６およびＣＹＰ２Ｃ９アイソザイムである。ＣＹＰ以外の酵素による基質代謝を予測するモデリングの技術は存在はするが、ＣＹＰ酵素による代謝をモデリングするじゅうぶんに正確な技術は存在しない。その他の酵素についてモデリングする技術が利用可能な範囲においては、それらＣＹＰ酵素のモデリングは、酵素と基質との相互作用か、一連の基質の共通な特性かのいずれかを分析することによって、機能する。例えば以下を参照されたい。Ｓｃｈｒａｍｍ、「Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ ｓｔａｔｅｓ ａｎｄ ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ ｓｔａｔｅ ａｎａｌｏｇ ｄｅｓｉｇｎ」、Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｂｉｏｃｈｅｍ、１９９８；　６７：６９３−７２０。Ｈｕｎｔｅｒ、「Ａ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−ｂａｓｅｄ ａｐｐｒｏａｃｈ ｔｏ ｄｒｕｇ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ； ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ ａｎｄ ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ａｎｔｉｐａｒａｓｉｔｅ ｄｒｕｇｓ」、Ｐａｒａｓｉｔｏｌｏｇｙ、１９９７；　１１４　Ｓｕｐｐｌ：Ｓ１７−２９。Ｇｅｓｃｈｗｅｎｄ ｅｔ ａｌ．、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｄｏｃｋｉｎｇ ｔｏｗａｒｄｓ ｄｒｕｇ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ」、Ｍｏｌ Ｒｅｃｏｇｎｉｔ、１９９６　Ｍａｒ−Ａｐｒ；９（２）：１７５−８６。
【０００８】
これらのモデリング技術はいくつかの酵素については部分的には効果的だが、ＣＹＰ酵素については非効果的でありえる。これはＣＹＰ酵素が他の酵素が有する結合特異性を有しないからである。ＣＹＰ３Ａは立体の点からほとんど完全に非特異であり、いっぽうでＣＹＰ２Ｄ６やＣＹＰ２Ｃ９は、ある程度だけ立体的に特異である。ある基質の立体的および静電的特性の全体をとっても、ＣＹＰ酵素による代謝に副次的な影響を有するにすぎない。よって現行技術のモデリング技術はＣＹＰ酵素代謝をモデリングするためには使えない。
【０００９】
上述の、薬剤代謝に対するＣＹＰ酵素の重要性を鑑みると、ＣＹＰ基質相互作用および代謝のためのモデリング技術は高度に有用である。そのような技術は、開発過程の初期段階において化合物に関する貴重なＡＤＭＥ／ＰＫ情報を研究者に与えるだろう。
【００１０】
【発明の概要】
本発明は、典型的には薬剤である、ある基質分子における反応部位を同定し、これら反応部位のＣＹＰ酵素による比代謝速度を決定する方法およびシステムを提供することによって、この要望に応えるものである。これらの比速度を決定することは、個々の部位および基質分子全体の代謝の絶対速度を決定するのに重要なファクターである。またこの情報は、ＡＤＭＥ／ＰＫ特性を改善するために基質が再デザインされうるかどうか、またどのようにされうるかを決める上での決定的なファクターでもある。この点において、比速度が、基質の水発生および水再発生のような非代謝の副反応（分岐経路）とどのように対比されるかを知ることが特に重要である。記載されたシステムおよび方法は、本発明とともに用いることによって、ＣＹＰ基質代謝に関ついてのより包括的な情報を提供する。
【００１１】
本発明の好ましい実施形態においては、一つ以上の基質分子化合物（薬剤）、そのような分子化合物のまたは一つ以上のクラスが、原子の有機化学列、２次元構造、ＵＩＰＡＣ標準名、３Ｄ座標マップ、または他の通常使用される表現のような、標準的な表現系で呈示される。まだ３Ｄフォーマットになっていなければ、それら分子は、ＣｏｒｉｎａまたはＣｏｎｃｏｒｄのような３Ｄフォーマッティングソフトウェアツールを用いて３Ｄフォーマットに変換され、さらにＡＭ１を用いて最適化される。
【００１２】
それぞれの分子について、反応部位が同定される。これら反応部位は、ＣＹＰ触媒回路の最終過程についてのそれらの活性エネルギーおよび反応速度を予測するためにラジカル種に変換される。それぞれの反応部位の反応速度はそれから、水脱離の代替分岐の反応速度と比較され、水脱離と比較してその反応部位が不安定か、ある程度不安定か、または安定かを決定する。水脱離反応速度は、同位体効果情報によって決定される。分子全体はそれから、これら反応部位の「比反応速度」つまり「比速度」に関して特徴づけられる。この情報は、分子が適切なＡＤＭＥ／ＰＫ特性を有するか、最も望ましいＡＤＭＥ／ＰＫ特性を実現するために再デザインされうるか、およびこれを行うにはどの部位が修飾されるべきかを決定するのに用いられる。この情報はまた、ＣＹＰ触媒回路における他の段階について得られた情報とともに用いられうる。
【００１３】
本発明のある局面は、ある分子修飾が、その分子の代謝速度に及ぼす影響を予測する方法に関しており、この方法は、分子の第一の部位における反応速度を予測または決定し、その反応速度を分岐経路のそれと比較し、かつその部位をこの反応速度に基づいて特徴づける操作を含む。これにより、分子修飾の分子代謝への影響をモデリングし、かつ予測することが可能になる。この分子は、典型的にはＣＹＰ酵素によって代謝され、その分岐経路は典型的には水脱離反応である。この方法は、一つの分子上の複数の部位について繰り返すことが可能であり、典型的には繰り返される。
【００１４】
これらの部位や反応部位は、分岐経路についてのそれらの比反応速度に基づいて、水脱離よりも速く反応する部位は不安定であり、水脱離とほぼ同じ速度で反応する部位はある程度不安定であり、水脱離よりも遅く反応する部位は安定であるというように、いくつかのカテゴリーに分類される。水脱離活性化エネルギーおよび反応速度は、同位体効果アンマスキングを通じて決定される。ある反応部位のこの反応速度は、典型的にはそのラジカル化された中間体によって、例えば、脂肪族炭素反応部位についての水素分離、および芳香族炭素反応部位についてのメトキシラジカル付加によって決定される。
【００１５】
本発明の他の局面は、基質分子の反応部位を特徴づける方法に関しており、この方法は、その反応部位の活性化エネルギーを決定し、その反応部位の速度定数をその活性化エネルギーに基づいて計算し、かつその活性化エネルギーまたは速度定数を、その酵素基質複合体に関する分岐経路と比較する操作を含む。この基質は、典型的にはＣＹＰ酵素によって代謝され、分岐経路は典型的には水脱離反応である。この方法は、一つの基質上の複数の部位について繰り返すことが可能であり、典型的には繰り返される。
【００１６】
これらの部位や反応部位は、分岐経路についてのそれらの比反応速度に基づいて、水脱離よりも速く反応する部位は不安定であり、水脱離とほぼ同じ速度で反応する部位はある程度不安定であり、水脱離よりも遅く反応する部位は安定であるというように、いくつかのカテゴリーに分類される。水脱離活性化エネルギーおよび反応速度は、同位体効果アンマスキングを通じて決定される。ある反応部位のこの反応速度は、典型的にはそのラジカル化された中間体によって、例えば、脂肪族炭素反応部位についての水素分離、および芳香族炭素反応部位についてのメトキシラジカル付加によって決定される。
【００１７】
本発明の他の局面は、ある分子修飾が、その分子の代謝速度に及ぼす影響を予測する方法に関しており、この方法は、分子の第一の部位における反応速度を予測または決定し、その反応速度を分岐経路のそれと比較し、かつその部位をこの反応速度に基づいて特徴づける操作を含む。これにより、分子修飾の分子代謝への影響をモデリングし、かつ予測することが可能になる。この分子は、典型的にはＣＹＰ酵素によって代謝され、その分岐経路は典型的には水脱離反応である。この方法は、一つの分子上の複数の部位について繰り返すことが可能であり、典型的には繰り返される。
【００１８】
本発明の他の局面は、上述の方法を行うコンピュータシステムに関する。本発明の他の局面は、一つ以上の上述のコンピュータシステムおよび方法を行うプログラム命令がその上に設けられた機械で読み取り可能な媒体を含むコンピュータプログラム製造物に関する。本発明のコンピュータシステムユーザインタフェースまたは方法のいずれもそのようなコンピュータで読み取り可能な媒体上に設けられうるプログラム命令として表現されうる。
【００１９】
これらの本発明の特徴は以下に、次の図面とともに本発明の詳細な説明においてより詳細に記載される。
【００２０】
【発明の実施の形態】
以下の本発明の詳細な説明においては、本発明を完全に理解を促すために、多くの特定の実施形態が述べられている。しかし当業者には明らかになるように、本発明は特定の詳細を用いることなく、または、代替の要素やプロセスを用いて実施されうる。他の場合においては、本発明の局面を不必要にぼやかせないように、よく知られたプロセス、手続き、および要素は詳細には記載されていない。
【００２１】
ここでいう「分子修飾」とは、分子の化学的特徴のいかなる変化をもいう。分子修飾は、分子における、その代謝プロセスのいかなる段階におけるいかなる変化をも含む。ＣＹＰ酵素によって触媒が作用されている薬剤は、典型的には、その代謝回路を通していくつかの分子修飾を経ることになる。
【００２２】
ここでいう「代謝酵素」とは、生体異物代謝に関与するいかなる酵素をもいう。多くの代謝酵素は、外来化合物の代謝に関与する。代謝酵素は、ＣＹＰ酵素、ウリジン二リン酸グルクロン酸グルクロノシルトランスフェラーゼおよびグルタチオントランスフェラーゼのように薬剤を代謝する酵素を含む。
【００２３】
ここでいう「生体異物代謝」とは、同化および異化代謝を含む、生体内で起こるいかなる、かつすべての異物分子代謝をいう。
【００２４】
ここでいう「反応部位」とは、酵素による代謝および／または触媒作用を受けやすい基質分子上の部位をいう。これは、触媒作用に関与する酵素の部分である「活性部位」とは区別されることに注意されたい。
【００２５】
ここでいう「反応速度」とは、化学反応または化学反応の単一段階の動力学的速度をいう。この反応速度は、遷移状態をモデル化することによって、または基質および中間体の自由エネルギーの差から活性化エネルギーを評価することによって予測できる。「反応ｖｅｌｏｃｉｔｙ」という語は、「反応ｒａｔｅ」と交換可能に用いられる。
【００２６】
ここでいう「代謝速度」とは、薬剤の非反応体への代謝にどの反応部位が関与しているかに関わらず基質の代謝の全体的な速度をいう。よって全ての反応部位の反応速度は、代謝速度を決定するのに関与する。
【００２７】
ここでいう「複合体」とは、その基質／薬剤の代謝に結びつく、または結びつかない、共有結合およびその他の結合によって構成された酵素基質複合体である。
【００２８】
ここでいう「主経路」とは、いかなる化学反応をもいうが、より典型的には特定の関心のある反応をいう。主経路は、主経路の代替反応である「分岐経路」を有してもよい。分岐経路は典型的には、異なる生成物つまりその反応が言及する生成物とは異なる生成物を作る。分岐経路は、非代謝反応段階である「脱離反応」を含みうる。以下に詳述するＣＹＰ触媒回路は、３つの脱離反応を有し、一つはスーパーオキシドの脱離であり、一つは過酸化水素の脱離であり、そしてもう一つは水の脱離である。
【００２９】
ここでいう「触媒回路」とは、ＣＹＰ触媒回路のような、酵素によって触媒が作用される一連の基質反応段階をいう。
【００３０】
ここでいう「分子内固有同位体効果」とは、ある酵素と非優先的に反応する異なる同位体からなる反応性化学種について観測された効果をいい、その異なる同位体についての効果を除く。分子間同位体効果は典型的には、二つの同位体についての二つの速度定数の１でない比として表現される。いっぽう「分子間同位体効果」は、律速段階が同位体について重要な段階よりも先行するときにはマスクされる。しかし、もし分岐経路が同位体について重要な段階と競合しているなら、同位体効果は、「分子内固有同位体効果」の比に至るまで、さまざまな程度に「アンマスク」される。アンマスクされる程度は、分岐経路の速度定数の主経路に対する比に依存する。
【００３１】
ここでいう「アクセス可能性」とは、分子効果の立体および方向特性がその代謝速度および活性化エネルギーに及ぼす程度をいう。「アクセス可能性補正係数」は、これらの特性を定量化した係数である。
【００３２】
図１は、哺乳類ＣＹＰ酵素の酸化的ヒドロキシル化触媒回路を示す。図の上部は、一般的な出発基質（ＲＨ）および一般的な生成物（ＲＯＨ）を示す。このヒドロキシル化反応は、しばしば外来化合物代謝において最初の段階であり、薬剤非活性化／代謝におけるＣＹＰ酵素の重要性を部分的に説明する。
【００３３】
触媒回路の最初の段階１，１０１は、基質の、酵素のヘム鉄原子への初期結合を示しており、これはヘム鉄の平衡スピン状態を低から高へと変える。これは鉄の還元電位を低下させ、よって第２の段階２、１０２においてＮＡＤＰＨからシトクロムＰ４５０還元酵素を介して鉄原子へ電子が伝達することを促進する。第３の段階３、１０３において、酸素分子が鉄原子に結合する。第４の段階４，１０４において、鉄は１電子によって還元され、鉄は２価状態から３価状態へと酸化される。この時点で、酸素は、非代謝反応においてスーパーオキシドとして酵素から脱離しえて、よって第１０の段階１０、１１０において酵素基質複合体を初期状態へ戻す。そうでなければ、酸素は、第５の段階５、１０５においてもう１つの電子によって還元され、よって酵素基質複合体により過酸化物中間体を形成する。ここでは、過酸化水素脱離反応が起こりえて、第１１の段階１１、１１１は酵素基質複合体を初期状態へと戻す。
【００３４】
そうでなければ、第６の段階１０６において、過酸化物は異方性分解を経て、１酸素が複合体から水分子として離れ、他の１酸素は反応性酸素原子として鉄原子に配位する。水脱離反応の第１２の段階１２、１１２は、酵素基質複合体を初期状態に戻しうる。そうでなければ第７の段階７、１０７において、反応性の酸素が基質へ転移し、酸化生成物を形成する。それからこの生成物は第８の段階８、１０８において、酵素から解離する。
【００３５】
過酸化物脱離反応１１１および水脱離反応１１２は共に、基質をその元の形である酵素との複合体へ戻す。よってこれらの経路は基質の代謝速度を減少する。もしいずれかの脱離経路がＣＹＰ触媒回路において優勢であれば、そのときはおそらく基質は急速には代謝されないであろう。
【００３６】
これら反応経路の存在のための実験的証拠および中間体は、Ｋｏｒｚｅｋｗａらによる米国特許出願第０９／３６８，５１１号（弁護士事件番号：ＣＡＭＩＰ００１）に記載されている。この特許出願は、ＣＹＰ酵素−基質相互作用のメカニズムについて補足する内容をも含む。
【００３７】
この証拠はまた、ＣＹＰ触媒回路の最後の段階、段階１０７および１０８が、触媒回路の中で最も遅い段階ではないという意味において、典型的には律速段階ではないことを示す。しかしこれらは、しばしば「産物を決定する」段階である。律速段階は、ふつう産物生成の速度を決定する段階であると考えられているが、もしより速い段階と競合するような非代謝の代替経路が存在するなら、その段階は、産物決定段階となりうる。このシナリオがＣＹＰ触媒回路を物語る。触媒回路の最後の段階が水脱離経路１１２と競合するので、かつ水脱離経路が大きな反応速度をもつので（以下参照）、段階１０７および１０８は、しばしば産物決定段階となる。
【００３８】
したがって本発明の相対速度分析は、触媒回路のこれらの最終段階に適用されるが、基質代謝について有用で、かつしばしば最も重要な反応速度情報を提供する。基質代謝の完全で絶対的な速度を決定するためには、ＣＹＰ触媒回路内の他の反応速度の少なくともいくつかが測定される必要がある。ある好ましい実施形態においてこのモデルはまた、脱離反応１１０および１１１のいずれか、または双方を説明する。例えば過酸化物脱離段階１１１は、ある程度、基質依存のようである。したがってこのモデルによってある基質特性を利用して、この脱離反応がどの程度、代謝の絶対的速度に影響を及ぼすかを予測することができる。
【００３９】
図２は、ＣＹＰ酵素代謝のためのいくつかの反応部位２０１〜２０５をもつ基質分子の簡略化された概念図である。薬剤候補について最もよくあるＡＤＭＥ／ＰＫ問題の一つは、速く代謝されすぎることである。多くの場合、理想的な薬剤は、１日に１度投与されうるようにじゅうぶんゆっくりと代謝される。現在の技術では、もし薬剤候補が毎日の投与のためにはあまりにも速く代謝されるなら、薬剤の設計者は、典型的には最も反応性の高い部位をよりかなり安定させるように変更することによって、薬剤を再デザインする。
【００４０】
しかしこの最も反応性が高い部位を変更することは、それを非常に安定か非反応性にすらすることによってでさえも、薬剤の代謝速度を評価可能なだけ減少させることにつながるかもしれないし、つながらないかもしれない。結果は、現在の技術による方法によっては、実質的に予測不可能である。薬剤設計者にとって、反応部位へのより微少な変更が薬剤の代謝にどのような影響を及ぼすかを予測することは、さらに難しくなる。例えば、部位２０３が最も反応性が高い部位であると認められるかもしれない。それから薬剤設計者は、その部位をより安定にするか、または非反応性にすらするかして、基質の全体的な代謝速度を減少させようとするかもしれない。いくつかの例では、これは成功するかもしれないし、しかしもし基質が比較的、高い反応速度を同様にもつ一つ以上の反応部位を有するなら、これらの部位は、しばしば基質の代謝を「引き継ぎ」、全体としての代謝速度は実質的に変化しないだろう。
【００４１】
したがって薬剤設計者は実質的に当て推量で、ある部位を再デザインする時間のかかるプロセスを経て、ＡＤＭＥ／ＰＫ特性を再テストし、それからその部位を再デザインし、かつ／または一つ以上の他の反応部位をさらなる当て推量で試みることになっていた。このプロセスを薬剤の大部分の、または全ての反応部位についておこなったあとで設計者は、所望のＡＤＭＥ／ＰＫ特性を達成するのは実質的に不可能であること、特にその薬剤の所望の薬理学的特性を弱めたり、または失わせたりすることなしには不可能だと気づくかもしれない。薬剤の再デザインをすればするほど、薬剤の薬理学的特性を変更する可能性も高まる。
【００４２】
ある薬剤候補の代謝速度を遅くすることが、薬剤設計者が影響を及ぼそうと試みる唯一のＡＤＭＥ／ＰＫ特性というわけでは決してない。逆に設計者は、薬剤の代謝速度を速めるように試みるかもしれない。さらに一般的には薬剤は、一つ以上の非活性経路および／または反応部位をもつことが好ましく、それにより主代謝経路が閉鎖されることによって薬剤の有害な相互作用の可能性が最小限に抑えられる。またＣＹＰ酵素は誘導が起きやすく、そのためある薬剤が他の薬剤のより速い代謝を誘導することもある。複数の反応部位がしばしば望ましいという事実は、これらの双方の理由により、薬剤のデザインをより複雑にしている。
【００４３】
図３Ａおよび３Ｂは、ある基質分子についての相対速度曲線および関連した情報を発生するための高レベルのある好ましいプロセスを示すフローチャートを構成する。最初に操作３０３において、基質の分子構造が受け取られる。分子構造は、有機化学原子列、２次元構造、ＩＵＰＡＣ標準名、３Ｄ座標マップ、または他の一般に使われる表現でありうる。もしすでに３Ｄの形でないなら、ＣｏｒｉｎａやＣｏｎｃｏｒｄのような幾何学構造プログラムを用いて分子の３Ｄマップが生成される。３０３を参照。３Ｄ構造生成装置であるのＣｏｒｉｎａは、カリフォルニア州、サンディエゴのＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ， Ｉｎｃ．およびドイツ、アーランゲのＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｎｅｔｗｏｒｋｓ ＧｍｂＨから入手可能である。Ｃｏｎｃｏｒｄは、ミズーリ州、セントルイスのＴｒｉｐｏｓ， Ｉｎｃ．から入手可能である。Ｃｏｒｉｎａは、局所エネルギーを最小にするよう最適化される近似幾何学的３Ｄ構造を生成するために、分子結合および機能グループの立体配置についての直接的な規則を用いる。例えばもしアミン類が見つかったらそれは、そのグループが通常存在する平面構造に配置されるだろう。Ｃｏｎｃｏｒｄも同様の方法を適用し、しかし、その３Ｄ構造を求めるために分岐角、張力およびねじれを含む限定されたセットの分子力学的規則を用いる。
【００４４】
この近似３Ｄ幾何学構造はそれから、典型的にはＡＭ１のような、より洗練されたモデリングツールで最適化される。ＡＭ１は、与えられた３Ｄ構造を局所エネルギーを最小にするように最適化する半経験的、量子化学モデリングプログラムである。３０７を参照。それは近似された分子軌道から電子密度分布を計算する。それはまた、分子のエンタルピー値も計算する。ＡＭ１は、インディアナ州、ブルーミントンのインディアナ大学化学部のＱｕａｎｔｕｍ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｐｒｏｇｒａｍ Ｅｘｃｈａｎｇｅから入手可能な、パブリックドメインのソフトウェアパッケージＭＯＰＡＣの一部として入手可能である。ＭＯＰＡＣのＭＯＰＡＣ−２０００バージョンは、オレゴン州、ポートランドのＳｃｈｒｏｄｉｎｇｅｒ， Ｉｎｃ．から入手できる。
【００４５】
プロセスはそれから分子上のそれぞれの代謝反応部位を同定する。３０９を参照。好ましい実施形態において、反応部位は、脂肪族炭素および芳香族炭素を含む。これらの部位は、ＣＹＰ酵素が一般的にこれらの部位で基質分子を酸化するので選ばれる。他の反応部位は、他の実施形態では酵素および／または注目基質のクラスに応じて考慮されえる。それからプロセスは、操作３１１および３１３でそれぞれの反応部位を分析する。つまりシステムは、考慮される反応部位の個数に等しい変数Ｎを設定し（３１１）、そしてそれらの部位について反復する（３１３）。反復ループ操作３１３は、初期状態ではインデックス値「ｉ」を１に設定する。それからそれは現在のｉの値がＮより大きいかを決定する。もしそうでなければ、それは様々な操作をおこなって、その部位における活性化エネルギー（ＥＡ）を決定する。
【００４６】
操作３１５において、プロセスは、反応部位が脂肪族炭素か芳香族炭素部位かを決定する。もし脂肪族炭素部位であるなら、プロセスは、その部位からコンピュータ上で水素原子を除去する。３１７を参照。この状態の分子は、分子がステップ１０８の酸化反応に入る遷移状態を近似するために用いられる、分子の中間体である。それからプロセスは、新しいＡＭ１計算を中間体の分子におこない、その３Ｄマップおよびエンタルピーを決定する。３２１を参照。基本となる分子３Ｄマップおよびエンタルピーは、３０７において計算されることに注意。それからプロセスは、その分子の中間体と基本形とのエンタルピー差を決定する。ＣＹＰ酸化が起こる条件としてよい仮定である、デルタＳがゼロに近いことを仮定すれば、プロセスは、その反応部位についての活性化エネルギー値（ＥＡ）のよい近似を生成する。イオン化ポテンシャルのようなそのラジカルの他の特性もＥＡを予測するのに用いられうる。もし反応部位が芳香族炭素であるなら、プロセスは、メトキシ基を分子に付加し、中間体ラジカルを形成する。３１９を参照。新しいＡＭ１計算をおこなう３２１の操作、およびＥＡを決定する３２３の操作は、プロトン除去部位についてのそれと同様である。
【００４７】
図３Ｃは、脂肪族および芳香族反応部位の双方を有するアニソール分子３５１を示し、水素除去、およびメトキシ付加の双方を示すのに用いられる。アニソールの脂肪族反応部位は、末端メチル基３５３である。水素イオン（プロトン）がこの基から除去されるとき、結果としてできる中間体は、反応性炭素上に余分な電子を一つもつ。３５５を参照。芳香環は、オルト、メタ、パラの位置で反応しえ、メトキシ基がこれらの位置に付加することで中間体３５７、３５９、および３６１がそれぞれ生じる。この付加は、自由電子を環に残す。
【００４８】
ｉがＮより大きいときは、すべての反応部位が分析されたことを意味し、プロセスは、それぞれの反応部位の相対不安定性および活性化エネルギーを示す位置選択性テーブルまたは他のデータ表示を出力する。３２５を参照。そのような位置選択性テーブルの概略例は、図４に示される。活性化エネルギーは、反応部位を相対速度曲線にマッピングするのに用いられる。３２７を参照。そのような相対速度曲線の概略例は、図５Ａに示される。反応部位はそれから、それらの相対速度に基づいて分類される。３２９を参照。反応部位は、典型的には、３つのカテゴリーに分類される。すなわち不安定、比較的不安定、および安定である。反応部位の相対速度曲線および活性化エネルギーに関する詳細は、「Ｋｗを生成する方法」と題された下記のセクションで議論される。
【００４９】
今のところ、不安定性のこの概念は、典型的には酵素触媒回路内の脱離経路について特定される。ＣＹＰ酵素の場合、脱離経路は、段階１１０、１１１、および１１２として示されており、それらは酸素、過酸化水素、および水の脱離経路である。これはこれらの脱離経路が未反応基質を再生成するからである。これらの脱離反応と競合し、かつより速く進行する代謝経路をもつ基質反応は、かなり速い代謝を提供する。好ましい実施形態の相対速度データは、特にＣＹＰ触媒回路の最終代謝段階である段階１０７および１０８に最も直接的に適用するが、これはそれらが水脱離の速度と比較されるからである。
【００５０】
最後の操作は、追加の立体および方向因子補正操作である。３３１を参照。前述のように、ＣＹＰ酵素、特に３Ａ４は、他の酵素がそうであるように立体的に特異ではない。しかしある場合においては、反応部位が基質分子の奥深くに埋もれていて、または分子が非常に好ましい両性の方向を持っていて、その結果、反応部位の代謝相対速度が遅れたり、加速されたりする。そのような場合、ユーザは、立体または方向補正因子を導入したいかもしれない。そのような因子を導入するシステムおよび方法は、米国特許仮出願第６０／２１７，２２７、出願日２０００年７月１０日（弁護士事件番号：ＣＡＭＩＰ００４Ｐ）において議論されている。しかしこの操作は、追加的なものであり、いずれにしても図３Ａおよび３Ｂのメインプロセスは、操作３３１なしでも有用な情報を与える。
【００５１】
いずれにしても相対速度を決定するコアプロセスは、ＣＹＰ酵素または他の特定の酵素を参照することなく実行されうることは注目に値する。研究されている酵素が同様のメカニズムで代謝をおこなう限り、基質の同じ遷移状態が作られ、相対速度のある分析からのデータは、多くの酵素に有用に適用できる。
【００５２】
ＫＷを生成する方法（代替分岐経路動力学）：
基質代謝の動力学およびモデリングにおいてこの水脱離反応の重要性がこれから述べられる。動力学の研究によって、ＣＹＰ触媒回路の還元段階１０２および１０５が回路内で最も遅いことがわかっている。したがって通常は、産物形成についていえばそれらは「律速」段階であり、その他の段階は、全体的な反応速度に影響しないと結論づけるだろう。図４は、この原理の例を示す。反応Ａ、４０１は、ある酵素（Ｅ）および基質（Ｓ）が酵素基質複合体（ＥＳ）を段階１２において形成し、段階２３において中間体（ＥＳ＊）が生じ、基質酸化段階３４において酵素（Ｅ）および産物（Ｐ）が生じることを示す。この典型的な例において、段階３４の速度を増すことはもちろん産物生成の全体の速度には影響を与えないのはもちろんである。なぜならｋ３４（１）［ＥＳ＊１］＝ｋ３４（２）［ＥＳ＊２］であるから。言い換えれば、系がもつ速度定数ｋ３４（２）が大きければ、活性化された複合体中間体ＥＳ＊の濃度も低くなる。産物生成の正味の速度は、同じままなのである。
【００５３】
しかしながら、もし反応Ｂ、４０３に示されるように、酵素（Ｅ）および代替産物（Ｐａｌｔ）を生成する代替分岐経路ｋ３５があるなら、もしｋ３４がｋ３５と同じくらいかそれより小さければｋ３４が産物Ｐの生成についての律速段階になりうる。もしｋ３４がｋ３５よりも大きいなら、それは産物生成の全体の速度にほとんどまたは全く寄与しないだろう。方程式４０５は、二つの反応の全体の速度の比であるｖ（Ａ）／ｖ（Ｂ）を導くのに反応４０１および４０３の動力学的関係がどう使われるかを示す。もしｋ３５＞＞ｋ３４であるなら、ｖ（Ａ）／ｖ（Ｂ）は、ｋ３４（Ａ）／ｋ３４（Ｂ）の比に近づくことに注意されたい。
【００５４】
ＣＹＰ酵素においては、産物を生成する一つの代替分岐経路は、段階１１２の水脱離反応である。もし産物生成段階１０８の速度が水脱離反応１１２よりも大きければ、ｋｗは、重要ではなく、触媒回路は、概略的反応４０１に似てくるようになり、ここで段階１０８は、律速的ではない。もしｋｗがｋｗと同程度かより大きければ、段階１０８は、「産物決定」的であり、よって実質的に反応の全体の速度を決定する。
【００５５】
したがって水脱離反応１１２のＥＡおよびｋｗは、基質上のそれぞれの反応部位のＥＡを特徴づける上で重要な基準点である。図５Ａは、分子ロバスタチンの位置選択性テーブルを概略的に示し、これは分析される例示的な基質として用いられる。図５Ｂに示される分子は、１８の反応部位を有する。テーブルは、基質分子のそれぞれの反応部位についてのＥＡおよび相対的反応速度を載せている。ある特定の実施形態においては、反応部位は、すべての水素原子除去部位およびすべての芳香族炭素を含む。水脱離のＥＡは、参考のために示される。反応部位１〜５は、水脱離の活性化エネルギーよりも低い活性化エネルギーをもつ。位置６〜１８は、水脱離よりも大きい活性化エネルギーをもつ。このプロセスのこの時点では、反応部位は、カテゴリーに分類できないので、ここでの位置選択性テーブルは、実際には出力テーブルである図５Ａに示される第３列目は持ちえない。
【００５６】
図６は、相対速度曲線の概略例であり、図５のロバスタチンのデータがプロットされている。それぞれの反応部位のＥＡがＸ軸に独立変数としてプロットされている。このＥＡは最終産物生成段階１０８を実行するために必要な活性化エネルギーを表す。それぞれのＥＡはこの段階１０８の反応速度をもたらし、これを用いてＹ軸の従属変数を計算している。それぞれの反応部位の点が三角形６０１としてプロットされている。Ｙ軸は、もしＸ軸上に表されたその部位がブロックされたとしての、相対的な観測された反応速度である。水生成と競合しない部位は１の値を持ち、水生成と競合する部位は１よりも小さい値を持つ。部位の相対速度は、相対反応速度の比の対数でプロットされている。水脱離反応１１２の反応速度および活性化エネルギー１１２は参考のためにプロットされており、ここで水のＥＡは１０ｋｃａｌ／ｍｏｌ、６０３である。ｋＷを決定する方法は、以下に記載される。
【００５７】
反応部位は、３つのカテゴリーに分類される。すなわち、その反応速度／活性化エネルギーによって不安定、比較的不安定、および安定に分類される。不安定のカテゴリーは、典型的には、水のＥＡよりも約１．５ｋｃａｌ／ｍｏｌ少ないか、それ以下の反応部位からなる。比較的不安定のカテゴリーは、典型的には、水のＥＡと同程度のＥＡを持つ反応部位からなる。安定のカテゴリーは、典型的には、水のＥＡよりも約０．５ｋｃａｌ／ｍｏｌ大きいか、それ以上の反応部位からなる。これらのカテゴリーおよびそれらの境界は、ある程度は恣意的であり、研究者が候補を特徴づけたり再設計の戦略を構築するのを助けるためにもし必要であるなら提供される。
【００５８】
図６は、反応部位の１０個が安定のカテゴリーに属し、相対速度の対数が活性化エネルギーに反比例する、曲線の直線部上に位置する。反応部位の４個は、ある程度不安定のカテゴリーにあり、ここは曲線が勾配を変えつつある。反応部位の２個は、不安定のカテゴリーにあり、ここは曲線の平坦部になる。もしいくつかの反応部位が曲線のこの部分に存在するか、または一つだけでも存在するなら、基質の全体の代謝速度はほとんど変わらないことに注意されたい。なぜならこれらの部位の一つを安定にしても他の不安定な部位はそのままだからである。いくつかの不安定な部位を持つ基質は、典型的には再設計するのが困難であると特徴づけられるだろう。相対速度曲線が完成してから、テーブルがユーザに出力されるが、このテーブルはそれぞれの反応部位のデータを含み、図５Ａに示すように反応部位を不安定６０５、比較的不安定６０７、および安定６０９のカテゴリーに分類する。
【００５９】
これらの反応部位についての相対反応速度は、ＣＹＰ触媒回路の最終段階である段階１０８だけに適用されることに改めて注意されたい。産物生成の速度を決定するので、多くの場合、この段階は、基質の代謝傾向を決定する主要な因子である。場合によっては、より早い段階、特に過酸化物分解および脱離（段階１０６および１１１）は、基質の代謝特性に重要な寄与をしうる。これらの他の段階に関する情報は、本発明から得られた情報と結合できる。
【００６０】
ＫＷの間接的決定（同位体効果）：
化学量論的測定により水溶性反応媒体において直接ＫＷを決定することはもちろん困難である。同位体効果によって間接的に決定する方法は、ＫＷのような速度定数を測定するために用いられる。図７は、このプロセスをフローチャートで示す。７０１を参照。第１に、ＫＷの分岐反応である反応について固有つまり分子内の同位体効果が決定される。典型的には、反応性メチル基の一つの水素（Ｈ）が、１つの重水素（Ｄ）原子と置換される。７０３を参照。それから水素および重水素をもつ産物の比が観測され、これによりｋＨ／ｋＤが決定でき、これは固有同位体効果である。７０５および７０７を参照。ＫＨはＫＤよりも大きいが、これは重水素除去のＥＡが水素除去のそれよりも大きいからである。固有同位体効果は、典型的にはＣＹＰ触媒回路の段階１０９について決定されるが、これは厳密には必要でないことに注意されたい。水脱離のような副反応の存在はまた、固有同位体効果の値に影響しない。
【００６１】
次に、間接的に測定したい反応について観測される分子間同位体効果が決定される。分子間同位体効果は、典型的には、反応部位においてＣＨ３およびＣＤ３の混合物を含む基質の混合物を用いて行われる。もし反応（この例ではメチル基酸化）が全体の反応の律速段階であるなら、観測された分子間同位体効果（ＶＤ）は、固有同位体効果と同じになるだろう。これは固有同位体効果が完全に「アンマスク」されるのである。もしメチル基酸化が律速的でなければ、典型的には同位体効果は観測されない。なぜならＨまたはＤをもつ産物の生成速度は同じになるからである。しかしもし水脱離のような分岐経路が存在するなら、ＣＹＰ触媒回路（段階１１２）において上述したように、同位体効果の部分アンマスキングが存在するだろう。ＫＷがＫＨまたはＫＤと比較して大きければ大きいほど、アンマスキングも大きくなる。ＫＷ＞＞ＫＨまたはＫＤなので、ＶＤはＫＨ／ＫＤに近づく。ＶＤおよび３つの関連する速度定数の関係は、
【００６２】
【数１】
2004503222.tif 000003
【００６３】
この方程式のｋａｌｔの項は、全体の反応の一部でありうる他の分岐経路を反映する。よってＫＷを決定するための残りの操作は、ＣＨ３およびＣＤ３の混合物を作り、Ｈ産物とＤ産物との比を観察し、この比からＶＤを決定し、かつ上の式からｋＷまたは他の分岐反応を決定する。７０９〜７１５を参照。ＤＶと固有同位体効果との関係を導き出す方法は、この具体的なＤＶについての方程式を含めてこの技術分野ではよく知られている。Ｋｏｒｚｅｋｗａ ａｎｄ Ｇｉｌｌｅｔｔｅ， 貼ｏｃｈＯｖｅｒｖｉｅｗ： Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ Ａｓｐｅｃｔｓ ｏｆ Ｉｓｏｔｏｐｅ Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｎ ｔｈｅ Ｐａｔｔｅｒｎ ｏｆ Ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓ Ｆｏｒｍｅｄ ｂｙ Ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ Ｐ−４５０，能ｏｃｈ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅａｃｔｉｖｅ Ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅｓ ＩＶ， Ｗｉｔｍｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｅｄｓ． Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ， ＮＹ （１９９０）； Ｋｏｒｚｅｋｗａ ｅｔ ａｌ．， 貼ｏｃｈＴｈｅｏｒｙ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｏｂｓｅｒｖｅｄ Ｉｓｏｔｏｐｅ Ｅｆｆｅｃｔｓ ｆｒｏｍ Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ Ｓｙｓｔｅｍｓ ｔｈａｔ Ｆｏｒｍ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｖｉａ Ｂｒａｎｃｈｅｄ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｐａｔｈｗａｙｓ： Ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ Ｐ−４５０，能ｏｃｈ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２８： ９０１２ （１９８９）。
【００６４】
この方程式を用いてＫＨ／ＫＷについて解くことができる。例えばＡＭ１のような分子モデリングからＫＨを決定することによって、水についてのｋＷおよびＥＡを得られる。上述の方法によって得られた水のＥＡの値は、用いられる基質によって異なるが、典型的には９〜１０．５ｋｃａｌ／ｍｏｌである。基線水素除去ＥＡ値についてのＥＡの値を得る方法は、米国特許出願第０９／３６８，５１１（弁護士事件番号：ＣＡＭＩＰ００１）に記載されている。
【００６５】
いったん基質分子、分子群、または分子のクラスがこのようにして特徴づけられれば、研究者は今度は、その基質分子を追究する戦略を決定する。典型的な場合だが、もしその基質が、アッセイまたはヒト／動物実験においてあまりに速く代謝されることを示す立証されたＡＤＭＥ／ＰＫ特性を持っているなら、研究者は、さらなる研究および試験からその基質を廃棄するか、または再設計のためのよい候補であるかを決定できる。本発明は、どの反応部位またはどの複数の反応部位が基質の代謝特性を変えるために変更されなければならないかを研究者に知らしめる。
【００６６】
本発明は、より洗練されたツールを研究者に提供することによって、結果を分析し、さらに研究の道を拓くことを可能にする。例えば上述のように、不安定部位が１個だけある基質は、再設計のよい候補である。なぜならその部位を変更することが、基質代謝の全体の速度に実質的な効果を及ぼすからである。２個または３個も部位がある基質の場合は、再設計するのが実質的により困難になり、数個の基質は、再設計が非現実的になる。そのような研究判断は基質の全てのクラスやカテゴリーについて適用されうる。なぜならしばしばそれは、共通の反応部位を含む共通の特性を有するからである。例えば不安定な部位の個数は、仮想コンビナトリアル・ライブラリのために決定されえて、分子で問題のあるクラスは、合成前に除外されうる。
【００６７】
別の例では、もし薬剤があまりにも一つの経路に依存しすぎであるか、またはもし主経路が個体において大きな変化の悪影響を受けるなら、代謝の多様性が増すのが望まれるかもしれない。再デザインの候補は、不安定性が増した化合物から選ばれうるかもしれない。他の例では、もし経路が潜在的に毒性を呈するものであれば、代謝の位置選択性がこの経路を最小化するために変更されうるかもしれない。
【００６８】
これらは本発明によって提供される情報がどのように用いられうるかのいくつかの例に過ぎない。他の例としては、研究者がいくつかの反応部位をもつある薬剤を、起こりうる薬剤−薬剤相互作用を最小にするためにデザインする場合がある。提供される情報をもってすれば、研究者は、いくつかの反応部位をもつ基質をどのようにデザインし、かつ同時に特定のＡＤＭＥ／ＰＫ特性を維持するのについて洗練された判断を行うことができる。もちろんこれは一般的には、所望の特性を有する単一の反応部位しかもたない薬剤をデザインするよりはより困難な仕事になるだろうが。
【００６９】
本発明のハードウェアおよびソフトウェアによる実現例：
【００７０】
図８Ａおよび８Ｂは、本発明の実施形態を実現するのに適したコンピュータシステム８００を示す。図８Ａは、そのようなコンピュータシステムの一つの可能な物理的形態を示す。もちろんコンピュータシステムは、集積回路、プリント基板、および小型の携帯機器から大きなスーパーコンピュータまで、実施形態の処理の要件に応じて多くの物理的形態をとりえる。コンピュータシステム８００は、モニタ８０２、ディスプレイ８０４、筐体８０６、ディスクドライブ８０８、キーボード８１０およびマウス８１２を含む。ディスク８１４は、コンピュータシステム８００から、かつコンピュータシステム８００へデータを転送するために用いられるコンピュータで読み取り可能な媒体である。
【００７１】
図８Ｂは、コンピュータシステム８００のブロックダイアグラムの例である。システムバス８２０には様々なサブシステムが設けられている。（単一または複数の）プロセッサ８２２（中央処理装置、ＣＰＵとも呼ばれる）は、メモリ８２４を含む記憶装置に結合される。メモリ８２４は、ランダムアクセスメモリ（ＲＡＭ）およびリードオンリーメモリ（ＲＯＭ）を含む。この技術分野ではよく知られているように、ＲＯＭは、典型的にはデータおよび命令を単一方向にＣＰＵへ転送するために用いられ、ＲＡＭは、典型的にはデータおよび命令を双方向に転送するために用いられる。これらのタイプのメモリはいずれも後述する、コンピュータで読み取り可能な媒体のいかなるものを含んでもよい。固定ディスク８２６も双方向でＣＰＵ８２２と結合され、追加のデータ記憶容量を提供し、やはり後述する、コンピュータで読み取り可能な媒体のいかなるものを含んでもよい。固定ディスク８２６は、プログラム、データなどを記憶するのに用いられ、典型的には主記憶より遅い２次記憶媒体（ハードディスクなど）である。固定ディスク８２６に保持された情報は、適切な場合にはメモリ８２４中の仮想記憶に標準的なかたちで展開されうることがわかるだろう。リムーバブルディスク８１４は、後述する、コンピュータで読み取り可能な媒体のいかなるかたちをとってもよい。
【００７２】
ＣＰＵ８２２は、ディスプレイ８０４、キーボード８１０、マウス８１２、およびスピーカ８３０のような様々な入力／出力装置にも結合されている。一般に、入力／出力装置は、以下のいずれであってもよい：ビデオディスプレイ、トラックボール、マウス、キーボード、マイク、タッチパネルディスプレイ、トランスデューサ・カードリーダー、磁気または紙テープリーダー、タブレット、スタイラス、音声または文字認識装置、生体情報リーダー、または他のコンピュータ。ＣＰＵ８２２は、必須ではないが、ネットワークインタフェース８４０を用いて他のコンピュータや電気通信ネットワークに結合されていてもよい。そのようなネットワークインタフェースがあれば、上述の方法による操作を実行するときにＣＰＵは、ネットワークからの情報を受け取ったり、またはネットワークに情報を出力することができる。さらに本発明の方法の実施形態は、ＣＰＵ８２２だけで実行されてもよいし、またはインターネットのようなネットワーク上において、処理の一部をシェアするリモートＣＰＵと共に実行されてもよい。
【００７３】
さらに本発明の実施形態は、コンピュータでインプリメントされうる様々な操作を実行するコンピュータコードをその上に記憶したコンピュータで読み取り可能な媒体を持ったコンピュータ記憶製造物にも関連する。媒体およびコンピュータコードは、本発明の目的のために特別に設計され構築されたものであってもよく、またはそれらはコンピュータソフトウェアの当業者に利用可能なよく知られたものであってもよい。コンピュータで読み取り可能な媒体の例としては、これらに限られるものではないが以下のものがある：ハードディスク、フロッピーディスク、および磁気テープのような磁気媒体、ＣＤ−ＲＯＭおよびホログラフィックデバイスのような光媒体、フロプティカルディスクのような光磁気媒体、および特定アプリケーション向け集積回路（ＡＳＩＣ）、プログラム可能なロジックデバイス（ＰＬＤ）、ＲＯＭおよびＲＡＭ装置のようなプログラムコードを記憶し実行できるように特別に構成されたハードウェアデバイス、ローカルエリアネットワーク、ワイドエリアネットワークおよびインターネットのようなコンピュータで読み取り可能な命令を送るための信号伝送媒体。コンピュータコードの例としては、コンパイラによって生成される機械語、およびインタープリータを用いて実行されるより高レベルなコードを含むファイルがある。本発明は、本発明のデータおよび命令が伝送される搬送波および伝送媒体にも関連する。
【００７４】
様々な詳細は簡潔さのために省略されているが、明らかな設計上の代替物も用いられうる。したがって、これらの例は、例示的であって限定的ではなく、本発明は、述べられた詳細なものに限定されることなく、添付の特許請求の範囲で決まる範囲内で改変されうる。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、非代謝の分岐反応を含む哺乳類シトクロムＰ４５０の触媒回路の概念図である。
【図２】いくつかの反応部位をもつ基質分子（薬剤）の概念図である。
【図３Ａ】基質分子の構造からスタートして基質分子の比反応速度を決定するフローチャートである。
【図３Ｂ】基質分子の構造からスタートして基質分子の比反応速度を決定するフローチャートである。
【図３Ｃ】脂肪族および芳香族の両方の反応部位をもつアニソール分子を示す図である。
【図４】例示的な反応、および分岐経路の反応速度論に及ぼす影響を示す図である。
【図５Ａ】例示的な基質分子、ロバスタチンのための位置選択性表／例示的な出力の概念図であり、実際の出力の典型であるように、反応部位を安定、ある程度安定、および不安定に分類することを含む図である。
【図５Ｂ】基質分子ロバスタチンの図である。
【図６】図５Ａの位置選択性表からの結果とともに比速度カーブをプロットした概略図である。
【図７】Ｋｗを生成するフローチャートであり、直接に測定することが困難か不可能な他の速度定数を生成することにも適用可能なフローチャートである。
【図８Ａ】本発明の実施形態を実現するのに適したコンピュータシステムを示す図である。
【図８Ｂ】本発明の実施形態を実現するのに適したコンピュータシステムを示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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