(57)【要約】本発明は、非膵性幹細胞の膵分化経路への分化転換のための培養法を含む。本発明はまた、そのような培養によって産生できる内分泌ホルモン、及び膵疾患の治療における分化転換細胞の使用にも関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物の非膵性幹細胞を膵分化経路に誘導するための分化転換法であって、
前記幹細胞を膵分化マーカーの発現を可能にする培地中で培養することを含む方法。
【請求項２】
前記培地が、高グルコース及びピルビン酸ナトリウム、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、２−メルカプトエタノール、ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）、ペニシリン及びストレプトマイシン（Ｐｅｎ−Ｓｔｒｅｐ）、並びにインスリン、トランスフェリン及びセレン（ＩＴＳ）を少なくとも約１０〜１４日間含有するダルベッコの最少必須培地（ＤＭＥＭ）を含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
発現される膵マーカーが、Ｐｄｘ−１、Ｉｓｌ−１、Ｐａｘ−４、Ｐａｘ−６、Ｇｌｕｔ−２、ＣＫ−１９及びインスリンからなる群から選ばれる、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記培地がさらに、幹細胞因子（ＳＣＦ）、グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）、アクチビンＡ、ベータセルリン、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、角質細胞増殖因子（ＫＧＦ）、プロラクチン（ＰＲＬ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子−α（ＴＧＦ−α）、ガストリン、並びにＣａｐａｎ−１、ＡＲＩＰ及びＡＲ４２Ｊからなる群から選ばれる細胞系の調整培地からなる群から選ばれる有効な組合せ及び有効濃度の増殖因子を含有する、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記増殖因子が、ＳＣＦ、ＧＬＰ−１、アクチビンＡ、ベータセルリン、ＨＧＦ、ＥＧＦ、ＫＧＦ、ＰＲＬ、ＮＧＦ、ＴＧＦ−α、ガストリン、並びにＣａｐａｎ−１、ＡＲＩＰ及びＡＲ４２Ｊからなる群から選ばれる細胞系の調整培地を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記非膵性幹細胞が造血幹細胞（ＨＳＣ）及び間葉性幹細胞（ＭＳＣ）からなる群から選ばれる、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
ＨＳＣがＣＤ３４＋である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
ＭＳＣが、ＣＤ１０５＋、ＣＤ１６６＋、ＣＤ２９＋及びＣＤ４４＋である、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記幹細胞がヒト由来である、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
内分泌ホルモンの産生法であって、請求項１に記載の方法を含み、さらに前記培地中で前記分化転換細胞の培養を続けるステップを含むことによって内分泌ホルモンを産生できる方法。
【請求項１１】
請求項９に記載の方法によって産生される内分泌ホルモン。
【請求項１２】
膵障害を有する哺乳動物の治療法であって、
ａ）請求項１に記載の方法に従って非膵性幹細胞を培養し、それによって前記幹細胞を膵分化経路に誘導し；
ｂ）ステップ（ａ）の培養の産生物を用いて前記哺乳動物を治療する；
ことを含む方法。
【請求項１３】
前記膵障害がインスリン依存性糖尿病である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
ステップ（ｂ）の産生物が内分泌ホルモンであり、それを哺乳動物に投与する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
請求項１２のステップ（ｂ）の産生物が分化転換細胞であり、前記方法がさらに、
ｃ）前記産生物を前記哺乳動物に移植する
ことを含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
前記移植が、膵臓、腎臓又は肝臓の組織内、もしくは皮下ポケット内である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記分化転換細胞が、分化転換ＨＳＣ及び分化転換ＭＳＣからなる群から選ばれる、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記分化転換細胞が、インスリン依存性糖尿病関連自己抗原、ＧＡＤ、６４ｋＤの膵島細胞膜抗原、及びヒト白血球抗原からなる群から選ばれる抗原の発現を実質的に低減するように改変されていることにより、改変された分化転換細胞は実質的に前記抗原を発現しない、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
前記非膵性幹細胞が、ステップ（ｂ）の治療される哺乳動物と同一の個体由来である、請求項１２に記載の方法。
【請求項２０】
前記移植された分化転換細胞が内分泌ホルモン透過性カプセルに被包されている、請求項１５に記載の方法。
【請求項２１】
前記幹細胞がヒト由来である、請求項１２に記載の方法。
【請求項２２】
請求項１７の方法によって産生される分化転換ＭＳＣ。
【請求項２３】
Ｉｓｌ−１、Ｐａｘ−６、Ｇｌｕｔ−２、グルカゴン及び場合によりＰｄｘ−１又はＰａｘ−４のｍＲＮＡを発現する分化転換ＭＳＣ。
【請求項２４】
請求項１７の方法によって産生される分化転換ＨＳＣ。
【請求項２５】
Ｉｓｌ−１、Ｐａｘ−６、ＣＫ−１９及び場合によりインスリンのｍＲＮＡを発現する分化転換ＨＳＣ。
【請求項２６】
請求項１の方法によって産生される分化転換細胞。
【請求項２７】
内分泌ホルモン透過性カプセルに被包された分化転換ＭＳＣ又は分化転換ＨＳＣを含む治療用組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、非膵性幹細胞、特に造血幹細胞及び間葉系幹細胞の、膵分化経路への分化転換のための培養法に関する。また、膵障害治療のための分化転換細胞の使用にも関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
糖尿病は大きな公衆衛生問題である。米国では１６００万人が糖尿病に罹患している（米国糖尿病学会、専門部会季刊誌、１９９８年夏）。糖尿病の眼合併症は、米国の２０〜７４歳の人々における法上の失明となる新たなケースの主因である。糖尿病患者の下肢切断のリスクは非患者の１５倍である。腎疾患は糖尿病の発生頻度の高い重症の合併症である。末期腎疾患の治療中の米国の全新規患者の約３０％は糖尿病を持っている。糖尿病患者は歯周病のリスクも増加する。歯周感染が急速に進行し、歯を失うだけでなく代謝機能不全も起こす。女性の糖尿病患者は妊娠にも重篤な合併症のリスクを負う。最新統計によれば、糖尿病患者の母から産まれた子の死亡率は約７％である。
【０００３】
糖尿病の経済的負担も莫大なことは明白である。糖尿病又はその合併症の患者の総入院日数は毎年２４００万日である。糖尿病は我が国で最も費用のかかる疾患で、推定年間総費用は９８０億ドルに達する。しかしながら、この疾患の全経済的影響は、追加の医療費が糖尿病自体よりも糖尿病の特定合併症にかかることが多いので、さらに大きい。
【０００４】
糖尿病は、体が炭水化物、脂肪、及びタンパク質を適正に維持及び使用できなくなる慢性複合性代謝疾患である。種々の遺伝的及び環境的要因の相互作用によって発生し、インスリン産生の欠乏又はその利用不全による高血糖値を特徴とする。糖尿病のほとんどの症例は２つの臨床型に分類される。すなわち、Ｉ型又は若年型、及びII型又は成人型である。Ｉ型糖尿病はインスリン依存性糖尿病、又はＩＤＤと呼ばれることも多い。それぞれの型によって予後、治療、及び原因が異なる。
【０００５】
約５〜１０％の糖尿病患者がＩＤＤである。ＩＤＤは通常、膵臓のランゲルハンス島のインスリン産生細胞の破壊によるインスリンの部分的又は完全な産生不能を特徴とする。ＩＤＤ患者はインスリンを毎日注射して疾患を管理しなければ死亡する。さらに、II型糖尿病の一部もインスリン依存性で、インスリン抵抗性を改善するためにインスリン注射が必要である。Ｉ型及びインスリン依存性II型糖尿病のどちらも、本明細書中に記載のようなインスリン投与の改善による利益を受けうる。
【０００６】
糖尿病の病因解明は、Ｉ型ＩＤＤは自己免疫性の疫学病因を持つことを示唆する証拠が蓄積し始める１９７０年代中頃までほとんど進まなかった。今ではＩＤＤは、遺伝的素因のある個体の膵ランゲルハンス島のインスリン産生細胞を選択的に破壊する進行性の自己免疫反応の結果であることが一般に認められている。ＩＤＤにおける細胞に対する自己免疫は、体液性（Ｂａｅｋｋｅｓｋｏｖら（１９８２）Ｎａｔｕｒｅ  ２９８：１６７；Ｂａｅｋｋｅｓｋｏｖら（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ  ３４７：１５１；Ｒｅｄｄｙら（１９８８）Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ  ３１：３２２；Ｐｏｎｔｅｓｉｌｌｉら（１９８７）Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．７０：８４）及び細胞媒介性（Ｒｅｄｄｙら（１９８８）；Ｐｏｎｔｅｓｉｌｌｉら（１９８７）；Ｗａｎｇら（１９８７）Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ３６：５３５）の免疫機構の両方が関与している。体液性免疫は、細胞膜（抗６９ｋＤ及び膵島細胞膜自己抗体）、細胞内容物（抗カルボキシペプチダーゼＡ1、抗６４ｋＤ及び／又は抗ＧＡＤ自己抗体）、及び／又は細胞分泌産物（抗インスリン）に対する自己抗体の出現を特徴とする。血清はＩＤＤを伝達しないのに、抗細胞自己抗体が極めて低年齢で発現することは、抗原類似性が関与していると思われる環境的要因に疑問を提起している。ＩＤＤの自然経過中に見られる細胞媒介性の免疫反応性は、膵島炎と呼ばれる膵島内の炎症性病変で裏付けられている。組織検査で炎症性／免疫性細胞浸潤がはっきりと目に見える膵島炎は、Ｔ及びＢリンパ球、単球、及びナチュラルキラー細胞などの多数の細胞種を含むことが示されている（Ｓｉｇｎｏｒｅら（１９８９）Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ  ３２：２８２；及びＪａｒｐｅら（１９９１）Ｒｅｇｉｏｎａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．３：３０５）。ヒトＩＤＤのモデルとしてのＮＯＤ（非肥満糖尿病）マウスを用いる養子免疫伝達で、ＩＤＤの病因に自己攻撃的Ｔリンパ球の果たす中心的役割が堅固に確立された（Ｂｅｎｄｅｌａｃら（１９８７）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６６：８２３；Ｍｉｌｌｅｒら（１９８８）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４０：５２；Ｈａｎａｆｕｓａら（１９８８）Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ３７：２０４；及びＢｅｎｄｅｌａｃら（１９８８）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４１：２６２５）。残念なことに、膵細胞破壊の根底にある機序は不明のままである。
【０００７】
哺乳動物の膵臓は、その主構成要素である導管細胞、腺房細胞及び内分泌細胞を通して栄養吸収及びグルコース代謝を制御している。内分泌細胞はインスリン産生β細胞を含む。膵臓のこれら３種類の構成要素はそれぞれ機能が異なるという事実にもかかわらず、起源はいずれも同じ原腸内胚葉である。妊娠初期（ヒトでは２８日）に胚の前腸の膨出（外反）により、膵臓の腹側及び背側膵芽が形成される。この２つの膵芽は、腸がまだ原始間葉で囲まれている間に互いに対向する形で生じる。胃と十二指腸の回転後、腹側原基はそのまわりを回って移動し背側膵芽と融合する。腹側膵芽は鉤状突起を含む膵頭の後部を形成し、背側膵芽は残りの器官を形成する。上皮芽の増殖中に樹状の導管系が発生し、これが最終的に内分泌細胞及び腺房細胞を生じる（Ｐｅｔｅｒｓら（２０００）Ｖｉｒｃｈｏｗｓ  Ａｒｃｈ．４３６：５２７−５３８）。導管に存在する“原始分化した”上皮細胞も導管細胞の特徴を共有していると考えられている（Ｐｉｃｔｅｔら（１９７２）  胚性内分泌膵の発生(Development of the embryonic endocrine pancreas)、Ｇｅｉｇｅｒ  ＳＲ（編）Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ、第７節：Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ、Ｗａｖｅｒｌｅｙ  Ｐｒｅｓｓ、ボルチモア、ｐｐ２５−６６）。これら及びさらに最近の観察によれば、膵管細胞は幹細胞を擁しており、これらの幹細胞は適切な刺激下で腺房及び内分泌細胞を生み出せることが示されている（Ｒａｍｉｙａ  Ｖ．ら（２０００）Ｎａｔ．Ｍｅｄ．６：２７８−２８２；Ｂｏｎｎｅｒ−Ｗｅｉｒら（２０００）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９７：７９９９−８００４）。膵管前駆幹細胞は、チロシンヒドロキシラーゼ（Ｔｅｉｔｅｌｍａｎら（１９９３）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １１８：１０３１−１０３９）、グルコース輸送体（ＧＬＵＴ−２）（Ｐａｎｇら（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：９５５９−９５６３）、サイトケラチン（Ｂｏｕｗｅｎｓら（１９９４）Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ４３：１２７９−１２８３）、Ｐｄｘ−１（Ｊｏｎｓｓｏｎら（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ  ３７１：６０６−６０９）、高親和性神経成長因子ＴｒｋＡ（Ｋａｎａｋａ−Ｇａｎｔｅｎｂｅｉｎら（１９９５）Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １３６：３１５４−３１６２）、Ｉｓｌ−１（Ａｈｌｇｒｅｎら（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ  ３８５：２５７−６０）、及びｎｇｎ−３（Ｇｒａｄｗｏｈｌら（２０００）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９７：１６０７−１６１１）を発現することが示されている。ヒト胎児膵臓では増殖は主として導管細胞コンパートメントで見られ、次いでシナプトフィジン陽性だがホルモン陰性の内分泌細胞、最後にインスリン又はグルカゴン陽性細胞の順である。さらに、内分泌細胞を含むすべての上皮細胞はサイトケラチン１９を妊娠１２〜１６週に発現することが認められた。サイトケラチンは後に内分泌細胞から消失する（Ｂｏｕｗｅｎｓら（１９９７）Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ  ４０：３９８−４０４）。
【０００８】
ＩＤＤ患者の場合、定期的にインスリン注射をしても血糖値が常に正常値付近に維持されるわけではないので、結果的に患者は二次的合併症を引き起こす。膵臓及び膵島の移植は正常血糖の状態を安定的に確立し、長期にわたる合併症を著しく削減できるが、移植片の入手可能性が極度に制限される。これに対し、異種移植はゼノーシス（異種移植由来感染症）（動物の感染症のヒトへの伝播）の重大な脅威をもたらす可能性があり、規制上の問題や遅れが付随する。従って、Ｉ型糖尿病患者のために、要求に応じて十分な数の機能的ヒト膵島又はその等価物を供給できるような膵内分泌代償療法の開発が急務である。
【０００９】
このニーズに対する一つの答えが膵分化細胞又は腫瘍細胞のインビトロ培養法の開発であった（例えば、Ｇａｚｄａｒら（１９８０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７７（６）：３５１９−３５２５；Ｂｒｏｔｈｅｒｓ，Ａ．，ＷＯ９３／００４４１；Ｋｏｒｓｇｒｅｎら（１９９３）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｓｃｉ．９８（１）：３９−５２；Ｎｉｅｌｓｏｎ，Ｊ．，ＷＯ８６／０１５３０；ＭｃＥｖｏｙら（１９８２）Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１１１（５）：１５６８−１５７５；Ｚａｙａｓら、ＥＰ０３６３１２５；及びＣｏｏｎら、ＷＯ９４／２３５７２）。このような培養法は内分泌ホルモンの産生に、又は場合によっては移植用の細胞供給に使用できた。
【００１０】
別の答えは、膵島前駆細胞（ＩＰＣ）及びＩＰＣから誘導された膵島（ＩＤＩ）又は膵島様構造物を生み出すことができる膵幹細胞の確認と培養であった（米国特許出願番号０９／４０６，２５３、出願日１９９９年９月２７日、発明者Ｐｅｃｋら、ＷＯ０１／２３５２８参照）。この方法の利点は、幹細胞の長期増殖、並びに該幹細胞及びそれらの後代を患者への移植に使用することによってそれら幹細胞が増殖して膵臓様構造物を形成し、正常血糖値を回復できることなどである。
【００１１】
このような現状にもかかわらず、更なる膵内分泌代償療法の開発が依然として求められている。本発明は、非膵性幹細胞を使用してＩＤＤのための療法を開発することに関する。具体的には、非膵性幹細胞を膵系統に分化転換する。
【００１２】
幹細胞は、自己再生能及び分化した後代産生能の両方を有する細胞である。既に臨床使用されている２種類の幹細胞は、造血幹細胞（ＨＳＣ）及び間葉系幹細胞（ＭＳＣ）である。哺乳動物の造血系は、少なくとも８種類の異なる系統の成熟血液細胞を成年期のあいだ連続的に産生する。これらの系統は、赤血球、単球、顆粒球、好塩基球、骨髄細胞、Ｔ及びＢ細胞、それに血小板である。この意味において、造血は、小腸、表皮、及び皮膚の毛包、並びに男性生殖細胞のような他の発生系と類似しうる。肝臓、中枢神経系、及び骨格筋のような他の組織型は、これより緩慢に又は損傷に応答して補充が行われるようである（Ｌｅｍｉｓｃｈｋａら（１９８６）Ｃｅｌｌ  ４５：９１７−９２７）。ＨＳＣの複雑な定量分析によって、無傷の正常な造血系をレシピエントホストに移入するには１個の移植可能な幹細胞で必要且つ十分であることを示した例もある（Ｊｏｒｄａｎら（１９９０）Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．４：２２０−２３２；及びＳｍｉｔｈ  Ｌ．ら（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８８：２７８８−２７９２）。
【００１３】
ＨＳＣのインビボでの増殖及び発生は、骨髄ストローマ細胞及び周囲の細胞外マトリックスとの接触によって促進される。ストローマ細胞マトリックスがなくても、可溶性サイトカイン又は増殖因子に、幹細胞及びそれらの後代の生存及び増殖を促進するいくらかの能力があるが、原始ＨＳＣは、長期的には適切なストローマ細胞環境と共培養したときにのみ維持することができる（Ｄｅｘｔｅｒら（１９９０）Ｃｉｂａ  Ｆｏｕｎｄ．Ｓｙｍｐ．１４８：７６−８６）。０．５〜５％のヒト骨髄細胞によってのみ発現されるＨＳＣ上のＣＤ３４抗原の特徴付けにより、商業生産量のＨＳＣの純化が可能になった。ＣＤ３４はそれより成熟した対応物（カウンターパート）上には発現されない（Ｃｉｖｉｎら（１９９０）Ｐｒｏｇ．Ｃｌｉｎ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｓ．３３３：３８７−４０１）。長期骨髄培養系を用いて、ＣＤ３４＋のＨＳＣを骨髄由来のストローマ細胞と接触させて成長させると、インビトロで生存し分化できることが確立されている。これにより、Ｍ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＬ−１、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＴＧＦ−β、ＬＩＦ、ＳＣＦを含む多量の因子が生じる（Ｈｅｙｗｏｒｔｈら（１９９７）、Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  Ｌｔｄ．ｐｐ２４３−４４１）。
【００１４】
ＨＳＣ及びＭＨＣの両方とも、ＣＤ３４抗原を発現する共通の骨髄前駆体を共有することが示唆されている。従って、ＣＤ５０−でＣＤ３４＋の細胞がＭＳＣを生じ、一方ＣＤ５０＋でＣＤ３４＋の細胞がＨＳＣを生じる。また、循環細胞はＨＳＣと共に線維芽細胞様ＭＳＣ（線維細胞とも呼ばれる）を含む。ＭＳＣは、適切な増殖因子が提供されると、インビトロで骨細胞、脂肪細胞及び軟骨細胞に分化できる（Ｐｉｔｔｅｎｇｅｒら（１９９９）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８４：１４３−１４６）。
【００１５】
範囲は狭いながら、他の研究でも他のいくつかの組織から幹細胞の候補が確認されている（Ｒｅｙｎｏｌｄｓら（１９９２）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５５：１７０７−１７１０；Ｊｏｈａｎｓｓｏｎら（１９９９）Ｃｅｌｌ  ９６：２５−３４；Ｐｏｔｔｅｎら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｐａｔｈｏｌ．７８：２１９−２４３；Ｗａｔｔ  Ｆ（１９９８）Ｐｈｉｌｏｓ．Ｔｒａｎｓ．Ｒ．Ｓｏｃ．Ｌｏｎｄｏｎ  Ｂ  ３５３：８３１−８３７；Ａｌｉｓｏｎ  Ｍ（１９９８）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１０：７１０−７１５；及びＲａｍｉｙａ  Ｖら（２０００）Ｎａｔ．Ｍｅｄ．６：２７８−２８２）。
【００１６】
幹細胞生物学における最近の進歩は、細胞の運命は、細胞が胚の１次胚葉である内胚葉、中胚葉、又は外胚葉の一部になると確定されるという従来の見解を逆説的なものにしている。更に具体的には、幹細胞の成熟細胞集団産生能によって規定される未分化幹細胞の状態は、各個々の組織を特徴づける細胞型の範囲に限定されるという仮定（いかなる所定の体性幹細胞もその適正な組織内に物理的に定住するという暗示）に異議が唱えられている（Ｌｅｍｉｓｃｈｋａ  Ｉ．（１９９９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９６：１４１９３−１４１９５）。例えば、遺伝子標識された神経幹細胞は、放射線照射された宿主に移植後、骨髄細胞及びリンパ系細胞並びに初期造血細胞を含む様々な血液細胞型を産生することが見出された（Ｂｊｏｒｎｓｏｎら（１９９９）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８３：５３４−５３７）。筋肉組織は、蛍光染料Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２の高発光並びに幹細胞抗原Ｓｃａ−１とｃ−Ｋｉｔの発現及びＣＤ４５の非発現を含む骨髄由来ＨＳＣのいくつかの特徴を備えた幹細胞集団を含むことが示されている。これらの幹細胞は、筋衛星細胞と同一であることが示唆されているが、その一部は筋原調節因子を欠いているため、造血シグナルに応答することが可能である（Ｊａｃｋｓｏｎら（１９９９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９６：１４４８２−１４４８６）。似たような観察は別のグループでもなされており、骨髄由来幹細胞のサブセットの筋分化可能性が示されている（Ｇｕｓｓｏｎｉら（１９９９）Ｎａｔｕｒｅ  ４０１：３９０−３９４）。程度こそ少ないが、肝不全時にＨＳＣが動員されて肝臓の再生能を増大させる可能性が報告されている（Ａｌｉｓｏｎら（２０００）Ｎａｔｕｒｅ  ４０６：２５７）。これらの観察は、体組織由来の幹細胞の機能的可塑性は思ったより大きいのではないかとする推測を呼んでいる。
【００１７】
ＨＳＣ及びＭＳＣは現在では臨床の場で日常的に使用されており、購入可能である。それらは末梢血又は骨髄から市販技術を用いて純化できる。膵分化経路に進むように方向付けられたＨＳＣ又はＭＳＣから膵内分泌組織又はホルモンを得ることは糖尿病治療の進歩に非常に有用であろう。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１８】
発明の要旨
本発明は、哺乳動物の非膵性幹細胞を、前記幹細胞を膵分化マーカーの発現を可能にする条件下にある培地中で培養することによって、膵分化経路に誘導するための方向付け又は分化転換法に関する。本方法に使用する培地は任意の適切な培地でよいが、好適な態様においては、高グルコース及びピルビン酸ナトリウム、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、２−メルカプトエタノール、ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）、ペニシリン及びストレプトマイシン（Ｐｅｎ−Ｓｔｒｅｐ）、並びにインスリン、トランスフェリン及びセレン（ＩＴＳ）を少なくとも約１０〜１４日間含むダルベッコの最少必須培地（ＤＭＥＭ）を含む。培地成分の濃度は、表１Ａに示されているようなものが好ましい。本発明の方法は、以下の膵マーカー、すなわちＰｄｘ−１、Ｉｓｌ−１、Ｐａｘ−４、Ｐａｘ−６、Ｇｌｕｔ−２、ＣＫ−１９及びインスリンのいずれか又はすべての発現をもたらす。
【００１９】
培地はさらに、幹細胞因子（ＳＣＦ）、グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）、アクチビンＡ、ベータセルリン、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、角質細胞増殖因子（ＫＧＦ）、プロラクチン（ＰＲＬ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子−α（ＴＧＦ−α）、ガストリン、並びにＣａｐａｎ−１、ＡＲＩＰ及びＡＲ４２Ｊからなる群から選ばれる細胞系の調整培地からなる群から選ばれるものなどを含む有効な組合せ及び有効濃度の適切な増殖因子を含有してもよい。追加される増殖因子は、これらの各因子を表１Ｂに示した濃度で含むのが好ましい。膵経路への方向付けを増強するために、ＬＩＦ（白血球抑制因子、これはＨＳＣの分化を抑制する）、並びにＩＬ−３及びＩＬ−７（これらはＨＳＣをリンパ系及び赤血球系の系統に誘導する）は表１Ｂの因子から除いた。
【００２０】
非膵性幹細胞は、膵幹細胞又は前駆細胞以外の任意の幹細胞でよいが、典型的にはＨＳＣ又はＭＳＣである。ＨＳＣはＣＤ３４＋であり、ＭＳＣは、ＣＤ１０５＋、ＣＤ１６６＋、ＣＤ２９＋、及びＣＤ４４＋である。ＨＳＣは末梢血又は骨髄から得られる。ＭＳＣも骨髄から得られる。幹細胞はヒト由来でも任意の他の動物由来でもよい。
【００２１】
本発明は、幹細胞を前述のように因子を加えた培地中で培養することによる内分泌ホルモンの産生法も含む。それにより内分泌ホルモンが産生され、必要に応じて回収される。本発明は、該方法によって産生された内分泌ホルモンも包含する。
【００２２】
別の態様において、本発明は、膵障害を有する哺乳動物の治療法に関する。該方法は、本明細書中に記載のように幹細胞を培養することによって該細胞を膵分化経路に誘導し、前記培養法の産物を用いて前記哺乳動物を治療することによる。一実施態様において、膵障害はインスリン依存性糖尿病（ＩＤＤ）である。
【００２３】
一例において、哺乳動物に投与される培養産物は１種類以上の膵内分泌ホルモンである。培養産物は分化転換されたＨＳＣ又はＭＳＣであってもよく、これらを哺乳動物に移植することができる。そのような細胞の典型的な移植位置は、肝臓、膵臓又は腎臓組織、もしくは皮下ポケット内である。移植を考える場合、非膵性幹細胞は免疫拒絶の可能性を最小限にするために、同種由来、更に好ましくは治療を受けるのと同じ個体由来であるのが好適である。幹細胞及び治療を受ける個体はヒト又は他の任意の哺乳動物であり得る。
【００２４】
免疫拒絶の何らかの問題がある場合、個体に移植される細胞又は細胞塊は、ホルモン透過性カプセルに被包することができる。そのようなカプセルは、移植物からのホルモンの流出や酸素及び他の栄養素の流入は可能にするが、免疫細胞及び抗体の流入は阻害する。
【００２５】
さらに、選択されたタンパク質の細胞発現を修飾（modify）することによって分化転換細胞を免疫拒絶から保護することもできる。例えば、培養された分化転換細胞を形質転換して、破壊的免疫プロセスを抑制又は防止するようなタンパク質又はペプチドを発現させることができる。他の有用なタンパク質又はペプチドを発現させてもよい。さらに、分化転換細胞によって発現されうる程度のＩＤＤのプロセスに特異的な、ＧＡＤ、６４ｋＤの膵島細胞膜抗原のような自己抗原の発現（Ｐａｙｔｏｎら（１９９５）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９６：１５０６−１５１１参照）、又は分化転換細胞上に確認される他の任意のマーカーの発現を、標準的遺伝子ノックアウト又は選択法によって排除し、自己免疫攻撃を全く受けない又は受けにくい分化転換細胞を産生することもできる。そのような突然変異又はノックアウト細胞の産生法は当該技術分野で周知であり、例えば米国特許第５，２８６，６３２号；米国特許第５，３２０，９６２号；米国特許第５，３４２，７６１号；及びＷＯ９０／１１３５４；ＷＯ９２／０３９１７；ＷＯ９３／０４１６９；ＷＯ９５／１７９１１に開示されている相同的組換え法を含む。前記特許はいずれも引用によってその全内容を本明細書に援用する。また、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）マーカーを発現しないように改変した分化転換細胞を作れば万能ドナー細胞ができる（特にＷＯ９５／１７９１１参照）。
【００２６】
本発明は前述の方法だけでなく、該方法によって産生された分化転換ＨＳＣ及び／又はＭＳＣも包含する。また、Ｉｓｌ−１、Ｐａｘ−６、ＣＫ−１９及び場合によりインスリンのｍＲＮＡを発現する分化転換ＨＳＣも包含する。さらに、Ｉｓｌ−１、Ｐａｘ−６、Ｇｌｕｔ−２、グルカゴン及び場合によりＰｄｘ−１及び／又はＰａｘ−４のｍＲＮＡを発現する分化転換ＭＳＣも含む。
【００２７】
本明細書中に引用したすべての参考文献はその全内容を引用によって本明細書に援用する。
発明の詳細な説明
本発明は、非膵性幹細胞、特にヒト骨髄由来幹細胞（ＨＳＣ及びＭＳＣ）の、インスリン遺伝子発現細胞への分化の可能性を初めて示す。本発明の培養法で使用される幹細胞は、任意の非膵性幹細胞であり得る、又は肝臓の幹細胞又は前駆細胞（肝芽細胞又は肝楕円細胞）でない非膵性幹細胞に限定されうる、又は具体的にはＭＳＣ及び／又はＨＳＣであり得る。
【００２８】
“幹細胞”は、自己再生能及び分化後代産生能の両方を有する細胞と定義される。本発明の一実施態様において、非膵性幹細胞とは現在知られている又は後に発見される任意の非膵性幹細胞のことである。この最も広い意味において、非膵性幹細胞は、胚性幹細胞、成体非膵性幹細胞／前駆細胞、脱分化幹細胞／前駆細胞、及び多能性成体幹細胞などでありうるが、これらに限定されない。幹細胞は自己再生能及び分化後代産生能の両方を有するが、前駆細胞は分化後代産生能しか持たない。本発明の非膵性幹細胞は哺乳動物由来であり、ヒト由来であってもなくてもよい。
【００２９】
胚性幹細胞は、ヒトを含むいくつかの哺乳動物種から単離されている。ヒト胚性幹細胞は、ＳＳＥＡ−１（−）；ＳＳＥＡ−３（＋）；ＳＳＥＡ−４（＋）；ＴＲＡ−１−６０（＋）；ＴＲＡ−１−８１（＋）；及びアルカリホスファターゼ（＋）である。これらの細胞はインビトロで未分化状態のまま無限に増殖し、内胚葉、中胚葉及び外胚葉に分化することができる。米国特許第６，２００，８０６号及び５，８４３，７８０号参照。
【００３０】
成体非膵性幹細胞／前駆細胞は、肝幹細胞／前駆細胞（肝芽細胞又は肝楕円細胞）、間葉系幹細胞／前駆細胞、神経幹細胞／前駆細胞、脂肪細胞の幹細胞／前駆細胞、造血幹細胞／前駆細胞、及び骨格筋衛星幹細胞／前駆細胞などであるが、これらに限定されない。本明細書中で使用している“成体”幹細胞とは、胚性でない、すなわち胎児、新生児、若年及び成人個体由来の、組織特異的幹細胞のことである。
【００３１】
例えば、肝楕円細胞及び肝芽細胞は、Ｙｉｎ，Ｌ．ら（１９９９）Ｊ．Ｈｅｐａｔｏｌ．３１：４９７−５０７、Ｙｉｎ，Ｌ．ら（２００１）ＰＡＡＣＲ  ４２：３５４，及びＹｉｎ，Ｌ．ら（２００１）ＦＡＳＥＢ  Ｊ．Ｌａｔｅ−Ｂｒｅａｋｉｎｇ  Ａｂｓｔｒａｃｔｓ：４９（ＬＢ２６７）に記載されている。楕円細胞は門脈周囲肝傷害の修復に重要である。肝芽細胞及び楕円細胞マーカーは、α−胎児タンパク質、アルブミン、サイトケラチン１４（ＣＫ１４）、ｃ−ｋｉｔ、ＯＣ．２、ＯＣ．３、ＯＣ．１０、ＯＶ１及びＯＶ６などである。肝芽細胞及び楕円細胞は、ＣＤ３４、Ｔｈｙ１．１及びＣＤ４５を含む造血マーカーも発現できる。楕円細胞自体が肝幹細胞であるのか、肝幹細胞又はＨＳＣから誘導された前駆細胞であるのかまだわかっていない。ＲＴ−ＰＣＲによる肝楕円細胞の研究で、これらの細胞はインスリンＩ及びインスリンII転写物を発現するだけでなく、転写因子Ｉｓｌ１、ＮｅｕｒｏＤ／β２、Ｎｋｘ６．１、及びＰａｘ４のＲＮＡ転写物も発現することが示されている。これらの転写因子は、膵細胞の内分泌細胞への分化を調節するのに重要な役割を有している。
【００３２】
ＭＳＣは米国特許第５，４８６，３５９号に記載されている。ヒトＭＳＣは自己再生し、また骨（骨芽細胞）、軟骨（軟骨細胞）及び他の種々の型の結合組織（脂肪、筋肉、腱、靱帯及び真皮）に分化することができる。Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ（メリーランド州ウォーカーズビル）から入手できるＭＳＣは、ＳＨ２＋、ＳＨ３＋、ＣＤ１０５＋、ＣＤ１６６＋、ＣＤ２９＋、ＣＤ４４＋、ＣＤ４５−及びＣＤ３４−であり、骨髄から得られる。
【００３３】
胎児ＭＳＣは、ＷＯ０１／３４７７５に、ＣＤ３４＋、ＣＤ４５−、Ｔｈｙ−１＋、ＡＳ−Ｏ２＋及びＳＨ２＋（ＣＤ１０５＋）と記載されている。これらの細胞は、骨芽細胞、脂肪細胞、線維芽細胞、筋細胞又は軟骨の再生に使用できる。
【００３４】
実質的に同種のヒトＨＳＣは米国特許第５，０６１，６２０号及び５，７５０，３９７号に記載されている。これらの細胞はＣＤ３４＋及びＴｈｙ１＋で、骨髄、胎児肝臓、胎児及び成人の脾臓及び血液から得ることができる。これらの細胞は、種々の造血（骨髄系及びリンパ系）系統のすべてのメンバーを再生することができる。
【００３５】
ヒトＨＳＣは米国特許第５，８４０，５８０号にも、ＣＤ３４＋及びＣＤ３８−、好ましくはＨＬＡ−ＤＲ＋と記載されている。ＣＤ３８＋細胞を除外することによって成熟及び前駆細胞が除去されるので、選択された細胞は多系統への可能性を委ねられた非系統性である。これらの幹細胞は制限された自己再生が可能で、赤血球系、骨髄系及びリンパ系の前駆細胞及び成熟細胞に分化できる。
【００３６】
ヒト多能性リンパ−造血幹細胞は米国特許第４，７１４，６８０号に記載されている。これらの細胞はＭｙ−１０＋又はＣＤ３４＋である。これらの細胞は、ヒト骨髄中又は血液コロニー形成細胞及び未熟リンパ系前駆細胞の中に見られるが、成熟ヒトリンパ系細胞及び骨髄細胞は含まない。Ｍｙ−１０抗原は系統依存性ではないが、各種のリンパ−造血系前駆細胞上に現れる。
【００３７】
骨格筋衛星細胞は骨髄由来ＨＳＣと、抗原Ｓｃａ−１及びｃ−Ｋｉｔの発現、ＣＤ４５の非発現を含むいくつかの特徴を共有している（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｋ．ら（１９９９）ＰＮＡＳ  ９６：１４４８２−８６）。インビボにおける静止性の筋衛星細胞は、ＣＤ３４＋、Ｍｙｆ５＋、Ｍ−カドヘリン＋及びＭｙｏＤ−である。これらの細胞は筋原性経路に方向付けられているが、損傷又は増殖刺激を受け取るまで抑止されている（Ｂｅａｕｃｈａｍｐら（２０００）Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１５１：１２２１）。また、筋衛星細胞は、致死的放射線照射されたレシピエントの造血系を補充できるという証拠もある（Ｇｏｏｄｅｌｌら（２００１）Ａｎｎ．ＮＹ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９３８：１８）。骨髄由来の高純化ＨＳＣは筋再生に参加することが報告されている。また、骨格筋幹細胞は造血コンパートメントを再構築することが報告されている。衛星細胞は胚の血管系から誘導されうるという仮説もある（Ｓｅａｌ，Ｐ．ら（２０００）Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．２１８：１１５）。現時点で、骨格筋衛星細胞が骨格筋の幹細胞か前駆細胞かは不明である。
【００３８】
神経冠幹細胞は米国特許第５，５８９，３７６号に記載されている。これらの細胞は、低親和性神経成長因子受容体（ＬＮＧＦＲ）＋及びネスチン(nestin)＋であり、成熟末梢神経系の神経細胞及びグリア細胞に関連するマーカーの不在を特徴とし、そして自己再生及び末梢神経系の神経細胞及びグリア細胞への分化が可能である。そのようなグリア細胞マーカーは、スルファチド、グリア細胞線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）及びミエリンタンパク質Ｐoなどであり、神経細胞マーカーはペリフェリン(peripherin)及びニューロフィラメントなどである。
【００３９】
脂肪由来幹細胞はＷＯ００／５３７９５に記載されている。これらの細胞は実質的に、脂肪細胞、赤血球、及び結合組織幹細胞のクローン集団を持たない。この幹細胞はマーカーに関する定義がなく、代わりに、脂肪形成、軟骨形成、心形成、皮膚形成、造血、血管形成、筋形成、腎形成、神経形成、神経痛形成（neuralgiagenic）、泌尿生殖器形成、骨形成、心膜形成、腹膜形成、胸膜形成、内臓形成、及び間質の発生表現型から選ばれる２種類以上の発生表現型を達成できるとして定義される。
【００４０】
脱分化細胞は、体細胞の脱分化によって得られた幹細胞／前駆細胞を含む。そのような技術は、ＷＯ０１／００６５０に記載の通り、低分化ドナー細胞の細胞質をレシピエント細胞に注入することを含む。ドナー細胞は卵母細胞又は胚細胞であり得る。この方法により胚性幹細胞が得られる。
【００４１】
ＷＯ０１／１１０１１に記載されている多能性成体幹細胞（ＭＡＳＣ）は、脳、肝臓又は骨髄から誘導でき、ＣＤ４５−、ＣＤ４４−、ＨＬＡ−ＤＲ−、ＨＬＡクラスＩ−、ｏｃｔ３／４ｍＲＮＡ＋、及びｈＴＲＴ＋である。適切な増殖因子、ケモカイン及びサイトカインを用いると、ＭＡＳＣは、骨、軟骨、脂肪細胞、線維芽細胞、骨髄ストローマ、骨格筋、平滑筋、心筋、内皮、上皮、内分泌、外分泌、造血、グリア、神経及びオリゴデンドロサイト（乏突起膠細胞）の各細胞に分化できる。ＭＡＳＣ細胞は、一般に胚性幹細胞又は胚生殖細胞にしか見られない遺伝子（ｏｃｔ−４及びＲｅｘ−１）を発現する。ヒトＭＡＳＣのマーカー表現型の全記述はＷＯ０１／１１０１１の２６〜２７ページに提供されている。
【００４２】
別の実施態様において、非膵性幹細胞は、該幹細胞が肝幹細胞又は肝前駆細胞（すなわち肝芽細胞及び肝楕円細胞）でなければ、すべての非膵性幹細胞を意味しうる。
別の実施態様において、非膵性幹細胞は単にＨＳＣ及び／又はＭＳＣを意味する。理論で拘束するつもりはないが、ＭＳＣ及びＨＳＣは、本発明の方法を用いる分化転換に特に利用しやすいと考えられる。なぜならば、これらの細胞は哺乳動物の生涯にわたって絶え間なく再生し、分化した間葉系及び造血細胞集団を補充するからである。同様の再生能及び補充能を有する他の幹細胞も同じく本発明の方法に有用であり得る。
【００４３】
非膵性幹細胞を膵系統に分化転換するための本発明の培養法は、好ましくは表１Ａ及び１Ｂに明記した培養条件を利用する。しかしながら、当該技術分野で公知の日常的方法を用いて、表１Ａ及び１Ｂに明記された濃度をさらに最適化しても、一部の成分を自由選択（optional）にすることに決めてもよい。さらに、本発明は、表１Ａ及び１Ｂに示した濃度から１０〜５０％変動する培地及び添加因子濃度を用いても、本発明の結果を著しく損なうことなく、あるいは改善されて、実施することができる。最適化のための日常的方法を用いることにより、当業者は表１Ａ及び１Ｂに記載の成分の有効な組合せ及び有効濃度を決定することができる。表１Ａにウシ胎仔血清及びウシ血清アルブミンが明記されている。これらの成分は、等価のヒト血清又はアルブミン、又はその中の画分又は特定化合物であって幹細胞の膵系統への分化転換を可能にする又は向上させるもので置き換えてもよい。
【００４４】
表１Ｂで、上皮細胞系、Ｃａｐａｎ−１、ＡＲＩＰ及びＡＲ４２Ｊの調整培地は、１０％ウシ胎仔血清を含む１６４０培地中で少なくとも１週間培養した細胞の集密（コンフルエント）フラスコから得るのが好ましい。ＦＣＳは等価のヒト血清又はその中に含まれる活性画分もしくは特定化合物で置き換えてもよい。
【００４５】
本培養法の産物は内分泌ホルモン及び分化転換幹細胞を含む。内分泌ホルモンは、インスリン、ソマトスタチン、グルカゴン及び／又は膵ポリペプチドを含む。
分化転換幹細胞は、Ｐｄｘ−１、Ｉｓｌ−１、Ｐａｘ−４、Ｐａｘ−６、Ｇｌｕｔ−２、ＣＫ−１９、グルカゴン及び／又はインスリンを含む膵マーカーを（ｍＲＮＡ及び／又はポリペプチドとして）発現する。好ましくは、分化転換ＨＳＣは少なくともＩｓｌ−１、Ｐａｘ−６、ＣＫ−１９及びインスリンを発現する。好ましくは、分化転換ＭＳＣは少なくともＰｄｘ−１、Ｉｓｌ−１、Ｐａｘ−４、Ｐａｘ−６、Ｇｌｕｔ−２及びグルカゴンを発現する。分化転換細胞は、出発幹細胞によって形態が異なる。ＭＳＣは紡錘形であり、分化転換ＭＳＣも実質的に紡錘形を保っている。同様に、ＨＳＣは円形細胞であり、それらの分化転換産物も円形である。連続培養及び／又は膵分化をさらに増強する因子の添加に伴い、分化転換細胞の形態は膵前駆細胞又は分化した内分泌細胞（α、β、δ及びＰＰ細胞）の形態に似てくるのかもしれない。
【００４６】
本発明の治療法は、培養した分化転換細胞から内分泌ホルモン（特にインスリン）を当該技術分野で公知の方法を用いて採取し、該ホルモンを患者に投与することを含む。本発明の別の治療法は、内分泌ホルモンを産生する分化転換細胞をその必要のある個体に移植することを含む。本発明は、糖尿病（ＩＤＤ）患者のインスリン療法の必要性を制御又は排除する方法を提供する。なぜならば分化転換細胞はインビボでインスリンを産生できるからである。従って、本発明の移植法はＩＤＤの治療又は逆転に使用できる。移植部位は、肝臓及び天然膵臓内、腎カプセル下、又は皮下ポケット内などである。
【００４７】
ヒトにおける適切な細胞移植量は、ヒトにおけるエクスビボ膵島移植、更にインビトロ及び動物実験に関する現存情報から、そしてヒト臨床試験から決定できる。ヒトにおけるエクスビボ膵島移植に関するデータから、患者体重１ｋｇあたりの分化細胞数は細胞のホルモン産生量に従って計算できる。移植後の移植片の長期生存を仮定すると（例えば被包化された場合）、エクスビボ膵島移植におけるβ細胞数より少ない数を必要とするであろう。インビトロ培養及びインビボ動物実験から、産生されるホルモンの量は定量できるので、この情報も移植物の適切な量の計算に有用である。さらに、患者をモニターして正常血糖の維持を判定することもできる。このような試験で不十分な応答や高インスリン血症が示されたら、追加の移植を実施したり、必要に応じて移植物を削減することができる。
【００４８】
前述のように、分化転換細胞は免疫拒絶を回避するために治療を受ける患者由来であることが好ましい。しかしながら、自己由来細胞が利用できない場合、分化転換細胞を、インスリン、グルカゴン、ソマトスタチン及び他の膵産生因子を含む内分泌ホルモンに対して透過性があり、免疫体液性因子及び細胞に対して不透過性のカプセルに被包するのが有用であり得る。カプセル材料は、低アレルゲン性であり、標的組織中に容易にそして安定的に配置され、そして移植物に更なる保護を提供するのが好ましい。
【００４９】
免疫拒絶からの保護は、当該技術分野で公知の任意の方法に従って、分化転換細胞の遺伝子修飾によって提供することもできる。自己抗体及びＣＴＬ耐性細胞は、米国特許第５，２８６，６３２号；米国特許第５，３２０，９６２号；米国特許第５，３４２，７６１号；並びにＷＯ９０／１１３５４；ＷＯ９２／０３９１７；ＷＯ９３／０４１６９；及びＷＯ９５／１７９１１に開示されているような方法を用いて作成することができる。あるいは、耐性分化転換細胞（例えばＨＳＣ及び／又はＭＳＣ）を、これらの細胞を自己抗体又はＩＤＤ関連ＣＴＬ又はＩＤＤ特異的自己抗原で活性化したＣＴＬの存在下で培養することによって選択することもできる。これらの技術の結果、抗体又はＴ−リンパ球依存性機序による破壊に対して耐性の増加した細胞が作成される。このような細胞は、本明細書に開示のように適当な宿主の適当な組織に移植でき、自己免疫プロセスによる破壊に対して増大した耐性を有する。
【００５０】
同様に、分化転換細胞（例えばＨＳＣ又はＭＳＣ）のヒト白血球抗原（ＨＬＡ）の特性も、場合により分化転換細胞を正常の同種リンパ球に暴露し生存細胞を選択するという反復プロセスによって改変（修飾）できる。あるいは、部位特異的突然変異誘発法を用いて分化転換細胞の表面からＨＬＡマーカーを除去し、それによって作成された修飾分化転換細胞をそのような移植を必要とするレシピエントの哺乳動物に移植する。
【００５１】
具体的な実施例で、ネオマイシン耐性遺伝子、ｎｅｏを運ぶアデノ随伴ウィルス（ＡＡＶ）ベクター系を使用する。ＡＡＶは真核細胞をトランスフェクトするのに使用できる（Ｌａｆａｃｅら（１９８８）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １６２：４８３−４８６）。さらに、フレオマイシン耐性遺伝子を運ぶｐＢＡＢＥ−ｂｌｅｏシャトルベクター系を使用する（Ｍｏｒｇｅｎｓｔｅｉｎら（１９９０）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１８：３５８７−３５９６）。このシャトルベクターは、ヒト細胞を本明細書中に記載の有用な遺伝子で形質転換するのに使用できる。
【実施例】
【００５２】
ＨＳＣを入手後、基本培地（表１Ａ）中で２日間培養した。２日間寝かせた後、細胞をいくつかの群に分割し、各種因子中で培養した。１４日及び４５日後、ＲＮＡを抽出してＲＴ−ＰＣＲ／サザンブロット分析にかけ、膵臓の器官形成に関係し、造血又は間葉系の分化経路に関与していることが知られていない遺伝子の発現を調べた。これらの遺伝子は、Ｉｓｌ−１、Ｐｄｘ−１、Ｐａｘ−４、Ｐａｘ−６、Ｇｌｕｔ−２及びインスリンを含む。各種因子を含有する基本培地（表１Ｂ）で２週間処理したヒト骨髄由来ＣＤ３４＋幹細胞は、ＣＤ３４と共にＩｓｌ−１、Ｐａｘ−６、ＣＫ−１９のｍＲＮＡを発現した（図１）。４５日まで細胞を連続培養した結果、インスリンのｍＲＮＡの発現とＣＫ１９の維持が認められた（図１）。
【００５３】
興味深いことに、ヒト骨髄由来ＣＤ３４＋ＨＳＣ（ＭＳＣも含む）は、基本培地だけ（表１Ａ）での１４日間の培養期間後、ＣＤ３４と共にＰｄｘ−１、Ｉｓｌ−１、Ｐａｘ−４、Ｐａｘ−６、Ｇｌｕｔ−２、ＣＫ−１９のｍＲＮＡを発現した（図２）。分析時、大多数の細胞は典型的なＭＳＣの形態を発現していた（図３）。
【００５４】
到着後直ちに解凍し、基本培地中で２日間寝かせたＭＳＣを、基本培地のみ、基本培地＋因子（調整培地なし）、及び基本培地＋因子＋調整培地（表１Ｂに記載）の３群に分割した。２１日間の培養後、ＭＳＣは、ＣＤ３４と共にＰｄｘ−１、Ｉｓｌ−１、Ｐａｘ−４、Ｐａｘ−６、Ｇｌｕｔ−２、及びグルカゴンのｍＲＮＡを発現したが、インスリンのｍＲＮＡは発現しなかった（データ示さず）。Ｉｓｌ−１の発現は３群すべてに見られたが、Ｐｄｘ−１及びＰａｘ−４は因子／調整培地が含まれた場合にのみ現れた。グルカゴンのｍＲＮＡ発現はインスリンの発現がなくても見られる。Ｇｌｕｔ２のｍＲＮＡの発現レベルは因子と培養すると増大する。ＣＤ３４メッセージの存在は、細胞供給者（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ）によれば未分化ＭＳＣはＣＤ３４陰性とみなされているので、興味深い。分析時、大多数のＭＳＣは紡錘形の線維芽細胞の形態を示していた。ＨＳＣは、培養の中で、付着細胞と円形浮遊細胞の両方を示す。
【００５５】
このように、我々は、骨髄由来造血幹細胞（通常、赤血球、単球、顆粒球、好塩基球、骨髄細胞、Ｔ及びＢ細胞、並びに血小板を生み出す）、及びＭＳＣ（通常、脂肪細胞、軟骨細胞及び骨細胞を生み出す（Ｐｉｔｔｅｎｇｅｒ  ＭＦ，ら（１９９９）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８４：１４３−１４６））を、膵分化経路に誘導することができる。
【００５６】
【表１Ａ】
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【００５７】
【表１Ｂ】
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【００５８】
当然のことながら、本明細書中に記載の実施例及び態様は説明することだけを目的としたものであり、これらの記述から当業者には多様な変形が暗示されるであろうが、それらも本願の精神及び範囲、並びに添付のクレームの範囲に含まれるとみなされる。
【図面の簡単な説明】
【００５９】
【図１】図１は、基本培地＋表１Ｂの因子中でのＨＳＣの２週間の培養後発現したＩｓｌ−１、Ｐａｘ−６、ＣＫ−１９及びＣＤ３４のｍＲＮＡを示す図である。４５日間の連続培養の結果、インスリンのｍＲＮＡの発現とＣＫ１９のｍＲＮＡの持続発現が認められた。
【図２】図２は、基本培地のみでのＨＳＣ及びＭＳＣの１４日間の混合培養によって発現されたＰｄｘ−１、Ｉｓｌ−１、Ｐａｘ−４、Ｐａｘ−６、Ｇｌｕｔ−２、ＣＫ−１９及びＣＤ３４のｍＲＮＡを示す図である。
【図３】図３は、分化転換ＨＳＣの球状の形態及び分化転換ＭＳＣの紡錘形の形態を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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