(57)【要約】リボフラノース部分のＣ４’およびＣ５’位に置換基を有するピロロ［２，３−ｄ］ピリミジンヌクレオシド類似体に関する組成物および方法を提供する。意図される組成物は、とりわけ、抗癌作用および免疫調節作用を、低い細胞毒性で示す。【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）：
【化１】
2004529979.tif 000012
［式中、Ａは、Ｏ、ＳまたはＣＨ２である；Ｘは、Ｈ、ＮＨ２またはＯＨである；Ｙは、Ｈ、ハロゲンまたはＮＨ２である；
Ｚは、Ｈ、ハロゲン、Ｒ、ＯＨ、ＯＲ、ＳＨ、ＳＲ、ＮＨ２、ＮＨＲ、ＮＲ２、ＣＮ、Ｃ（Ｏ）ＮＨ２、ＣＯＯＨ、ＣＯＯＲ、ＣＨ２ＮＨ２、Ｃ（＝ＮＯＨ）ＮＨ２およびＣ（＝ＮＨ）ＮＨ２よりなる群から選ばれ、ここで、Ｒは、アルキル、アルケニル、アルキニルまたはアラルキルであり；
Ｒ２およびＲ３は、独立して、Ｈ、ＦおよびＯＨよりなる群から選ばれ；
Ｒ４は、水素、アルキル、アルケニル、アルキニルおよびアラルキルよりなる群から選ばれ、ここで、Ｒ４は、所望により、官能基およびヘテロ原子の少なくとも１つを有していてもよく；
Ｒ５は、Ｈ、ＯＨ、ＯＰ（Ｏ）（ＯＨ）２、Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２、ＯＰ（Ｏ）（ＯＲ’）２またはＰ（Ｏ）（ＯＲ’）２であり、ここで、Ｒ’はマスキング基であり；
Ｒ５’は、アルキル、アルケニル、アルキニルおよびアラルキルよりなる群から選ばれ、ここで、Ｒ５’は、少なくとも２つの炭素原子を有し、所望により、官能基およびヘテロ原子の少なくとも１つを有していてもよい。］
で表されるヌクレオシド類似体。
【請求項２】
ＺがＣＮ、Ｃ（Ｏ）ＮＨ２またはＣ（＝ＮＨ）ＮＨ２であり、Ｒ５’が、少なくとも２つの炭素原子を有し、アルキル、アルケニル、アルキニルおよびアラルキルよりなる群から選ばれる、請求項１記載のヌクレオシド類似体。
【請求項３】
構造
【化２】
2004529979.tif 000013
［式中、Ｚは、ＣＮ、Ｃ（Ｏ）ＮＨ２、Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ２またはＣ（＝ＮＯＨ）ＮＨ２であり；
Ｒ４およびＲ５’は、独立して、水素、アルキル、アルケニル、アルキニルおよびアラルキルよりなる群から選ばれ、ここで、Ｒ４およびＲ５’は、独立して、所望により、官能基およびヘテロ原子の少なくとも１つを含有していてもよく；
ただし、Ｒ４およびＲ５’の両方が水素となることはない。］
を有する、請求項１記載のヌクレオシド類似体。
【請求項４】
細胞からのサイトカインの分泌を変化させる方法であって、式（ＩＩ）：
【化３】
2004529979.tif 000014
［式中、
Ａは、Ｏ、ＳまたはＣＨ２である；Ｘは、Ｈ、ＮＨ２またはＯＨである；Ｙは、Ｈ、ハロゲンまたはＮＨ２であり；
Ｚは、Ｈ、ハロゲン、Ｒ、ＯＨ、ＯＲ、ＳＨ、ＳＲ、ＮＨ２、ＮＨＲ、ＮＲ２、ＣＮ、Ｃ（Ｏ）ＮＨ２、ＣＯＯＨ、ＣＯＯＲ、ＣＨ２ＮＨ２、Ｃ（＝ＮＯＨ）ＮＨ２およびＣ（＝ＮＨ）ＮＨ２よりなる群から選ばれ、ここで、Ｒは、アルキル、アルケニル、アルキニルまたはアラルキルであり；
Ｒ２およびＲ３は、独立して、Ｈ、ＦおよびＯＨよりなる群から選ばれる；
Ｒ４およびＲ５’は、水素、アルキル、アルケニル、アルキニルおよびアラルキルよりなる群から選ばれ、ここで、Ｒ４およびＲ５’は、独立して、所望により、官能基およびヘテロ原子の少なくとも１つを有していてもよく；
Ｒ５は、Ｈ、ＯＨ、ＯＰ（Ｏ）（ＯＨ）２、Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２、ＯＰ（Ｏ）（ＯＲ’）２またはＰ（Ｏ）（ＯＲ’）２であり、ここで、Ｒ’はマスキング基である。］
で表される化合物を準備すること、および
該サイトカインの分泌を変化させるのに有効な濃度の該化合物を該細胞に与えることを含んでなる方法。
【請求項５】
該サイトカインが１型サイトカインである、請求項４記載の方法。
【請求項６】
該１型サイトカインがＩＦＮγである、請求項５記載の方法。
【請求項７】
該サイトカインが２型サイトカインである、請求項４記載の方法。
【請求項８】
該２型サイトカインがＩＬ−４である、請求項７記載の方法。
【請求項９】
該細胞がリンパ球である、請求項４記載の方法。
【請求項１０】
該細胞が癌細胞である、請求項４記載の方法。
【請求項１１】
該癌細胞が前立腺癌細胞である、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
細胞からのサイトカインの分泌を変化させる方法であって、式（ＩＩＩ）
【化４】
2004529979.tif 000015
［式中、Ｚは、ＣＮ、Ｃ（Ｏ）ＮＨ２、Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ２、Ｃ（＝ＮＮＨ２）ＮＨ２または−Ｃ（＝ＮＯＨ）ＮＨ２であり；
Ｒ５は、Ｈ、ＯＨ、ＯＰ（Ｏ）（ＯＨ）２、Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２、ＯＰ（Ｏ）（ＯＲ’）２またはＰ（Ｏ）（ＯＲ’）２であり、ここで、Ｒ’はマスキング基である。］
で表される化合物を準備すること、および
該サイトカインの分泌を変化させるのに有効な濃度の該化合物を該細胞に与えることを含んでなる方法。
【請求項１３】
過剰増殖細胞の増殖を減少させる方法であって、式（ＩＶ）：
【化５】
2004529979.tif 000016
［式中、Ａは、Ｏ、ＳまたはＣＨ２である；Ｘは、Ｈ、ＮＨ２またはＯＨであり；Ｙは、Ｈ、ハロゲンまたはＮＨ２であり；
Ｚは、Ｈ、ハロゲン、Ｒ、ＯＨ、ＯＲ、ＳＨ、ＳＲ、ＮＨ２、ＮＨＲ、ＮＲ２、ＣＮ、Ｃ（Ｏ）ＮＨ２、ＣＯＯＨ、ＣＯＯＲ、ＣＨ２ＮＨ２、Ｃ（＝ＮＯＨ）ＮＨ２およびＣ（＝ＮＨ）ＮＨ２よりなる群から選ばれ、ここで、Ｒは、アルキル、アルケニル、アルキニルまたはアラルキルであり；
Ｒ２およびＲ３は、独立して、Ｈ、ＦおよびＯＨよりなる群から選ばれ；
Ｒ４は、水素、アルキル、アルケニル、アルキニルおよびアラルキルよりなる群から選ばれ、ここで、Ｒ４は、所望により、官能基およびヘテロ原子の少なくとも１つを含有していてもよい；
Ｒ５’は、水素、アルキル、アルケニル、アルキニルおよびアラルキルよりなる群から選ばれ、ここで、Ｒ５’は、少なくとも２つの炭素原子を有し、所望により、官能基およびヘテロ原子の少なくとも１つを含有していてもよい；
Ｒ５は、Ｈ、ＯＨ、ＯＰ（Ｏ）（ＯＨ）２、Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２、ＯＰ（Ｏ）（ＯＲ’）２またはＰ（Ｏ）（ＯＲ’）２であり、ここで、Ｒ’はマスキング基である；
ただし、Ｒ４およびＲ５’の両方が水素となることはない。］
で表される化合物を準備すること、および
該過剰増殖細胞の増殖を減少させるのに有効濃度の該化合物を該過剰増殖細胞に与えることを含んでなる方法。
【請求項１４】
該過剰増殖細胞が癌細胞である、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
該癌細胞が前立腺癌細胞である、請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
増殖の減少がＤＮＡ合成の減少を含む、請求項１３記載の方法。
【請求項１７】
細胞からの増殖因子の放出を減少させる方法であって、
請求項１記載の化合物を準備し、
該増殖因子の放出を減少させるのに有効な濃度の該化合物を該細胞に与えることを含んでなる方法。
【請求項１８】
該増殖因子がＶＥＧＦである、請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
該細胞が癌細胞である、請求項１７記載の方法。
【請求項２０】
該癌細胞が前立腺癌細胞である、請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
式１
【化６】
2004529979.tif 000017
（式中、化学的立体配置はＬ−立体配置またはＤ−立体配置でありうる。）
の化合物を投与することを含んでなる、患者における状態の治療方法。
【請求項２２】
該状態が、１型サイトカイン偏向により少なくとも部分的に特徴づけられる、請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
該状態が自己免疫疾患である、請求項２１記載の方法。
【請求項２４】
該自己免疫疾患が、慢性関節リウマチ、多発性硬化症、炎症性腸疾患、エリテマトーデスおよび糖尿病よりなる群から選ばれる、請求項２３記載の方法。
【請求項２５】
該自己免疫疾患が慢性関節リウマチである、請求項２３記載の方法。
【請求項２６】
該自己免疫疾患が多発性硬化症である、請求項２３記載の方法。
【請求項２７】
該自己免疫疾患が糖尿病である、請求項２３記載の方法。
【請求項２８】
該状態が炎症疾患である、請求項２１記載の方法。
【請求項２９】
該炎症疾患が接触皮膚炎である、請求項２８記載の方法。
【請求項３０】
該炎症疾患が、健常人の１型サイトカインのレベルより高いレベルでの１型サイトカインの発現を含む、請求項２８記載の方法。
【請求項３１】
該１型サイトカインがインターロイキン２である、請求項３０記載の方法。
【請求項３２】
該１型サイトカインが腫瘍壊死因子αである、請求項３０記載の方法。
【請求項３３】
投与工程がインビボ投与を含む、請求項２１記載の方法。
【請求項３４】
投与工程が経口投与を含む、請求項２１記載の方法。
【請求項３５】
投与工程が該Ｌ−リボヌクレオシドの注射を含む、請求項２１記載の方法。
【請求項３６】
投与工程が、患者の体重１ｋｇ当たり０．１ｍｇ〜１．０ｍｇの用量の該化合物を投与することを含む、請求項２１記載の方法。
【請求項３７】
該自己免疫疾患が、健常人の２型サイトカインのレベルより高いレベルでの２型サイトカインの発現を含む、請求項２３記載の方法。
【請求項３８】
該２型サイトカインがインターロイキン４である、請求項３７記載の方法。
【請求項３９】
該化合物を塩酸塩として投与する、請求項２１記載の方法。
【請求項４０】
該化合物をプロドラッグとして投与する、請求項２１記載の方法。
【請求項４１】
式ＩＶ：
【化７】
2004529979.tif 000018
［式中、Ｗは、ＮまたはＣであり；
Ｒ１は、ハロゲン、ＯＨ、ＮＨＲ、Ｃ（ＮＨ）（ＮＨＲ）またはＮ３であり；
Ｒ２は、ＮＨＲ、Ｃ（ＮＨ）（ＮＨＲ）、Ｃ  ＣＲ、ＨまたはＲであり；
Ｒ３は、ハロゲン、ＣＮ、ＣＯＮＨ２、Ｃ（ＮＨ）（ＮＨ２）、Ｃ  ＣＲ、Ｈ、Ｎ３、ＣＨＯ、ＣＯＯＨまたはＣＯＯＲであり；
Ｒ４は、ハロゲン、Ｎ３、ＣＮ、ＮＨＲ、Ｃ  ＣＲ、ＨまたはＲであり；
Ｒ５およびＲ６は、独立して、Ｈ、ＯＨ、ＣＨ３、ＮＨ２またはＯＲであり；
ここで、Ｒは、置換された又は非置換のアルキル、アリール、アルケニル、アルカリルであり；Ｒ１がＯＨであり、Ｒ２およびＲ４がＨであり、Ｒ３がＣ（ＮＨ）（ＮＨ２）であり、ＷがＣであり、Ｒ５およびＲ６がＯＨである場合、該化合物は塩である。］で表される化合物。
【請求項４２】
Ｒ１がＯＨであり、Ｒ５およびＲ６がＯＨである、請求項４１記載の化合物。
【請求項４３】
該塩が、塩酸塩、リン酸水素塩および臭化水素酸塩よりなる群から選ばれる、請求項４１記載の化合物。
【請求項４４】
該塩が塩酸塩である、請求項４３記載の化合物。
【請求項４５】
ある系における１型サイトカインの発現を減少させるための方法であって、
請求項４１記載の化合物を準備し、
該１型サイトカインを減少させるのに有効な濃度の該化合物を該系に投与することを含んでなる方法。
【請求項４６】
該系が、１型サイトカイン偏向により少なくとも部分的に特徴づけられる疾患を有する哺乳動物である、請求項４５記載の方法。
【請求項４７】
該疾患が、慢性関節リウマチ、多発性硬化症、炎症性腸疾患、エリテマトーデスおよび糖尿病よりなる群から選ばれる、請求項４６記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明の分野はヌクレオシド類似体である。
【背景技術】
【０００２】
ヌクレオシド類似体は、癌およびウイルス感染症を治療するための代謝拮抗剤として古くから使用されている。ヌクレオシド類似体は、細胞内への進入後、しばしば、ヌクレオシドサルベージ経路によりリン酸化され、該ヌクレオシドは、典型的には、対応する一、二および三リン酸にリン酸化される。ヌクレオシド類似体は、細胞内での他の利用目的のうち、ＤＮＡまたはＲＮＡポリメラーゼの基質として利用されることが多く、その結果、ＤＮＡまたはＲＮＡ内に取り込まれる。三リン酸化ヌクレオシド類似体が強力なポリメラーゼインヒビターである場合には、それは新生核酸分子の未完成状態での終結を誘導しうる。三リン酸化ヌクレオシド類似体が核酸の複製体または転写産物内に取り込まれると、遺伝子の発現または機能の破壊が生じうる。
【０００３】
より細胞レベルでは、該ヌクレオシド類似体は細胞周期を阻害することもあり、ヌクレオシド類似体の特に望ましい効果には、癌細胞のアポトーシスの誘導が含まれる。さらに、ヌクレオシド類似体は、ある免疫応答をモジュレーションすることも公知である。
【０００４】
比較的強力な抗癌活性を有する種々のヌクレオシド類似体が当技術分野で公知である。例えば、公知薬物には、チミジル酸シンターゼインヒビター、例えば５−フルオロウリジン、アデノシンデアミナーゼインヒビター、例えば２−クロロアデノシン、およびネプラノシンＡ（これはＳ−アデノシルホモシステインヒドラーゼのインヒビターである）が含まれる。しかし、公知ヌクレオシド類似体の全て又はほとんど全ては、正常な哺乳類細胞への脅威をも伴う。その主な理由は、これらのヌクレオシド類似体が正常細胞と腫瘍細胞との間の適当な選択性を欠くことにある。残念ながら、適当な選択性の欠如は重篤な副作用を伴うことが多く、したがって、しばしば、そのような類似体療法の可能性を制限する。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
当技術分野では種々のヌクレオシド類似体が公知であるが、それらの全て又はほとんど全ては１以上の欠点を有する。したがって、ヌクレオシド類似体に関する改善された方法および組成物を得ることが依然として必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
（発明の概要）
本発明は、癌細胞に対して有意な細胞毒性を与える一方で哺乳類細胞に対する毒性を有意に減少させうるピロロ［２，３−ｄ］ピリミジンヌクレオシド類似体の糖部分上の修飾を有するヌクレオシド類似体に関する。これらの修飾は、リボフラノース部分のＣ４’およびＣ５’位における置換を含むが、これに限定されるものではない。本発明はまた、あるピロロ［２，３−ｄ］ピリミジンヌクレオシド類似体が、ＩＬ−２のような１型（Ｔｙｐｅ  １）サイトカインの増強およびＩＬ−４のような２型（Ｔｙｐｅ  ２）サイトカインの抑制を含む所望の免疫調節作用を有することを示す。これらの免疫調節特性は、抗癌、抗ウイルスおよび自己免疫疾患、炎症の治療ならびに移植拒絶の予防において有用でありうる。
【０００７】
本発明の１つの態様においては、該ヌクレオシド類似体は、式（Ｉ）：
【０００８】
【化１】
2004529979.tif 000002
［式中、Ａは、Ｏ、ＳまたはＣＨ２である；Ｘは、Ｈ、ＮＨ２またはＯＨである；Ｙは、Ｈ、ハロゲンまたはＮＨ２である；Ｚは、Ｈ、ハロゲン、Ｒ、ＯＨ、ＯＲ、ＳＨ、ＳＲ、ＮＨ２、ＮＨＲ、ＮＲ２、ＣＮ、Ｃ（Ｏ）ＮＨ２、ＣＯＯＨ、ＣＯＯＲ、ＣＨ２ＮＨ２、Ｃ（＝ＮＯＨ）ＮＨ２およびＣ（＝ＮＨ）ＮＨ２よりなる群から選ばれ、ここで、Ｒは、アルキル、アルケニル、アルキニルまたはアラルキルである；Ｒ２およびＲ３は、独立して、Ｈ、ＦおよびＯＨよりなる群から選ばれる；Ｒ４は、水素、アルキル、アルケニル、アルキニルおよびアラルキルよりなる群から選ばれ、ここで、Ｒ４は、所望により、官能基およびヘテロ原子の少なくとも１つを有していてもよい；Ｒ５は、Ｈ、ＯＨ、ＯＰ（Ｏ）（ＯＨ）２、Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２、ＯＰ（Ｏ）（ＯＲ’）２またはＰ（Ｏ）（ＯＲ’）２であり、ここで、Ｒ’はマスキング基である；Ｒ５’は、アルキル、アルケニル、アルキニルおよびアラルキルよりなる群から選ばれ、ここで、Ｒ５’は、少なくとも２つの炭素原子を有し、所望により、官能基およびヘテロ原子の少なくとも１つを有していてもよい］
の構造を有するピロロ［２，３］−ピリミジンヌクレオシドである。
【０００９】
本発明のもう１つの態様は、該ヌクレオシド類似体は、式（ＩＩ）：
【００１０】
【化２】
2004529979.tif 000003
［式中、Ｚは、ＣＮ、Ｃ（Ｏ）ＮＨ２、Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ２またはＣ（＝ＮＯＨ）ＮＨ２である；Ｒ４およびＲ５’は、独立して、水素、アルキル、アルケニル、アルキニルおよびアラルキルよりなる群から選ばれ、ここで、Ｒ４およびＲ５’は、独立して、所望により、官能基およびヘテロ原子の少なくとも１つを含有していてもよい；ただし、Ｒ４およびＲ５’の両方が水素となることはない］
の構造を有するピロロ［２，３ｄ］ピリミジンヌクレオシドである。
【００１１】
本発明の更にもう１つの態様においては、該ヌクレオシド類似体は、式（ＩＩＩ）：
【００１２】
【化３】
2004529979.tif 000004
の構造を有するピロロ［２，３］ピリミジンヌクレオシドであり、これは塩形態（例えば、ＨＣｌ塩）であることが好都合であり得る。
【００１３】
本発明の更にもう１つの態様においては、意図される化合物を、腫瘍増殖を抑制するために又は１型および２型サイトカイン、ケモカイン産生をモジュレーションするために、および自己免疫疾患の治療において使用する。さらに、本発明の化合物は、該化合物の投与に対して正に反応する任意の状態の治療に使用しうると予想され、医薬組成物は、少なくとも１つの薬学上許容される担体と混合された意図される化合物（適当な場合にはプロドラッグの形態）または薬学上許容されるそのエステルまたは塩を含む。
【００１４】
本発明の種々の目的、特徴、態様および利点は、以下の本発明の好ましい実施形態の詳細な説明および添付図面から、より明らかとなるであろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
（詳細な説明）
意図される化合物
式（Ｉ）、（ＩＩ）および（ＩＩＩ）で表されるピロロ［２，３−ｄ］ピリミジンヌクレオシド類似体は、正常および過剰増殖細胞に対する種々の生物学的効果を有することが判明した。
【００１６】
【化４】
2004529979.tif 000005
［式中、Ａは、Ｏ、ＳまたはＣＨ２である；Ｘは、Ｈ、ＮＨ２またはＯＨである；Ｙは、Ｈ、ハロゲンまたはＮＨ２である；Ｚは、Ｈ、ハロゲン、Ｒ、ＯＨ、ＯＲ、ＳＨ、ＳＲ、ＮＨ２、ＮＨＲ、ＮＲ２、ＣＮ、Ｃ（Ｏ）ＮＨ２、ＣＯＯＨ、ＣＯＯＲ、ＣＨ２ＮＨ２、Ｃ（＝ＮＯＨ）ＮＨ２およびＣ（＝ＮＨ）ＮＨ２よりなる群から選ばれ、ここで、Ｒは、アルキル、アルケニル、アルキニルまたはアラルキルである；Ｒ２およびＲ３は、独立して、Ｈ、ＦおよびＯＨよりなる群から選ばれる；Ｒ４は、水素、アルキル、アルケニル、アルキニルおよびアラルキルよりなる群から選ばれ、ここで、Ｒ４は、所望により、官能基およびヘテロ原子の少なくとも１つを有していてもよい；Ｒ５は、Ｈ、ＯＨ、ＯＰ（Ｏ）（ＯＨ）２、Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２、ＯＰ（Ｏ）（ＯＲ’）２またはＰ（Ｏ）（ＯＲ’）２であり、ここで、Ｒ’はマスキング基である；Ｒ５’は、アルキル、アルケニル、アルキニルおよびアラルキルよりなる群から選ばれ、ここで、Ｒ５’は、少なくとも２つの炭素原子を有し、所望により、官能基およびヘテロ原子の少なくとも１つを有していてもよい］。
【００１７】
本発明で用いる「アルキル」、「アルケニル」、「アルキニル」および「アラルキル」なる語は直鎖状および分枝状の両方の種を意味すると特に理解されるべきである。置換基Ｒ２およびＲ３に関しては、Ｒ２およびＲ３は共に、独立して、αまたはβ面を向いていることが可能であると理解されるべきである。さらに、Ｃ５’上の置換基が同一でない場合には、Ｃ５上の置換はＲ−またはＳ−キラル中心を与えうる。本発明で用いる「ヘテロ原子」なる語は、有機分子中の非炭素原子を意味し、特に意図されるヘテロ原子には、ハロゲン、窒素、酸素および硫黄が含まれる。本発明で用いる「官能基」なる語は、反応性結合（例えば、二重または三重結合）または反応性基（例えば、−ＯＨ、−ＳＨ、−ＮＨ２、−Ｎ３、−ＣＮ、ＣＯＯＨ、−ＣＨＯ、−ＣＯＮＨ２など）を意味する。
【００１８】
特に意図されるピロロ［２，３−ｄ］ピリミジンヌクレオシド類似体としては、ＺがＣＮ、Ｃ（Ｏ）ＮＨ２またはＣ（＝ＮＨ）ＮＨ２であり、Ｒ５’が、少なくとも２つの炭素原子を有し、アルキル、アルケニル、アルキニルおよびアラルキルよりなる群から選ばれる式（Ｉ）で表されるものが挙げられる。
【００１９】
式（ＩＩ）で表されるピロロ［２，３−ｄ］ピリミジンヌクレオシド類似体は、以下の構造を有する。
【００２０】
【化５】
2004529979.tif 000006
［式中、Ｚは、ＣＮ、Ｃ（Ｏ）ＮＨ２、Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ２またはＣ（＝ＮＯＨ）ＮＨ２である；Ｒ４およびＲ５’は、独立して、水素、アルキル、アルケニル、アルキニルおよびアラルキルよりなる群から選ばれる；ここで、Ｒ４およびＲ５’は、独立して、所望により、官能基およびヘテロ原子の少なくとも１つを含有していてもよい；ただし、Ｒ４およびＲ５’の両方が水素となることはない；その他の置換基は、式（Ｉ）で定義されているとおりである］。
【００２１】
式（ＩＩＩ）で表されるピロロ［２，３−ｄ］ピリミジンヌクレオシド類似体は、以下の構造を有する。
【００２２】
【化６】
2004529979.tif 000007
【００２３】
あるいは、以下に示すとおり、ヘテロ原子および／または置換基を含有させるために、式ＩＩＩで表される化合物（式ＩＩＩの類似体）の意図される構造を修飾することが可能である。
【００２４】
【化７】
2004529979.tif 000008
【００２５】
更に別の意図される化合物には、式ＩＶ：
【００２６】
【化８】
2004529979.tif 000009
［式中、Ｒ１は、ハロゲン、ＯＨ、ＮＨＲ、Ｃ（ＮＨ）（ＮＨＲ）またはＮ３である；Ｒ２は、ＮＨＲ、Ｃ（ＮＨ）（ＮＨＲ）、Ｃ  ＣＲまたはＲである；Ｗは、ＮまたはＣである；Ｒ３は、ハロゲン、ＣＮ、ＣＯＮＨ２、Ｃ  ＣＲ、Ｈ、Ｎ３、ＣＨＯ、ＣＯＯＨまたはＣＯＯＲである；Ｒ４は、ハロゲン、Ｎ３、ＣＮ、ＮＨＲ、Ｃ  ＣＲまたはＲである；Ｒ５およびＲ６は、独立して、Ｈ、ＯＨ、ＣＨ３、ＮＨ２またはＯＲである；Ｒは、分枝状であっても分枝状でなくてもよい置換された又は非置換のアルキル、アリール、アルケニル、アルカリルである］で表される化合物が含まれる。式ＩＶで表される化合物中の糖部分は硫黄原子を含むことも可能であり、Ｃ４−糖、シクロブチルまたはシクロプロピルでありうる。
【００２７】
さらに、すべての意図されるヌクレオシド類似体はＤ配置またはＬ配置でありうると理解されるべきである。また、妥当な場合には、意図される化合物はプロドラッグ形態または塩形態（例えば、ＨＣｌ塩、ＨＢｒ塩またはリン酸水素塩）でありうると特に意図される。
【００２８】
しかし、本発明の化合物は、既に記載されている以外の形態および製剤であることも可能であり、特に意図される形態には、薬理学的および／または薬力学的特性を改善（標的器官、細胞または細胞下区画に対する、より高い特異性、および生体内での半減期の増加を含む）するために、意図される分子が化学的および／または酵素的に修飾されたプロドラッグ形態または修飾形態が含まれる。
【００２９】
例えば、肝臓に対する標的特異性を増加させるためにコレステロール付加体を形成させたり、あるいは、血液脳関門を経て脳へ至る該修飾薬物の透過性を増強するためにアポリポタンパク質付加体を形成させることができる。もう１つの例においては、受容体リガンド複合体を合成して、該リガンドに特異的な受容体を発現する特定の細胞に該修飾薬物を標的化させることができる。あるいは、細胞下位置への該修飾薬物の選択的運搬を増加させるために、抗体または抗体フラグメント複合体を形成させることができる。多数のプロドラッグおよび修飾形態が当技術分野において公知であり、特に意図されるプロドラッグ形態には、参照により本明細書に組み入れる米国仮特許出願第６０／２１６４１８号（０４／１７／００付け出願）に記載のプロドラッグが含まれる。
【００３０】
さらに別の例においては、血清または他の標的器官および／または細胞における半減期を増加させるために、意図される分子に荷電または非荷電基、親油性または極性基を付加することができる。別の例においては、意図される化合物は、Ｃ５原子においてリン酸化されている場合には、二または三リン酸化されていたり、あるいはチオホスファートを含むことが可能であると理解されるべきである。
【００３１】
特に意図されるプロドラッグ形態は、標的器官または標的細胞に対する特異性の増加、標的細胞または器官以外の区画における代謝安定性、毒性の軽減、血清半減期の延長、特定の細胞および／または区画内への取り込みの増加ならびに物理化学的特性（安定性の増加、電荷の中和または導入、極性および／または疎水性の増加／減少）などのうちの少なくとも１つを有利に達成する。ヌクレオシド薬の種々のプロドラッグ形態が当技術分野において公知であり、意図されるプロドラッグ形態は糖部分および／または塩基上の修飾を含みうる。個々の化合物および標的に応じて、特に意図される修飾は、意図される化合物のトリ−Ｏ−アセチル誘導体の形成、糖部分上の５’ＯＨ基のエステル化による５’−レチノイル誘導体または別の酸による誘導体の形成（Ｃ．Ｓｅｒｇｈｅｒａｅｒｔ，Ｃ．Ｐｉｅｒｌｏｔ，Ａ．Ｔａｒｔａｒ，Ｙ．Ｈｅｎｉｎ，Ｍ．Ｌｅｍａｉｔｒｅ，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，３６，８２６−８３０，１９９３に記載のとおりの合成）を含みうる。あるいは、意図される化合物からクマリンまたはアミノ酸エステルを製造することができる。肝臓および胆管系への薬物の特異的運搬のためには、内因性胆汁酸輸送系が魅力的な候補である。したがって、意図される化合物からコール酸エステルを製造することができる。
【００３２】
意図される化合物を修飾してヌクレオチドを形成させる（すなわち、例えば一リン酸、二リン酸または三リン酸としての５’−リン酸基を含有させる）場合には、保護された５’−リン酸誘導体（例えば、環状および非環状のモノ、ジおよびトリエステル）を製造することが可能であり、それらには、特に、アミノ酸ホスホルアミダート、サリシラート  ホスホン酸エステル、および親油性化合物（修飾および非修飾アルキル、アルケニル、コレステロールなど）とのホスホン酸エステルが含まれる。他の可能なプロドラッグには、ＰＣＴ特許出願ＷＯ  ９８／３９３４２、ＷＯ  ９８／３９３４３、ＷＯ  ９８／３９３４４およびＷＯ  ９９／４５０１６に示されているグループの可能な組合せが含まれる。意図される化合物のプロドラッグは、アミジン官能性を誘導体化することによっても得ることが可能であり、特に好ましい誘導体には、意図される化合物のカルボキサミド基に結合した置換アミドが含まれる。ヌクレオシドおよびその類似体の更なる意図されるプロドラッグ形態は、２０００年６月１６日付け出願の米国特許出願第０９／５９４，４１０号（それを参照により本明細書に組み入れることとする）に記載されている。
【００３３】
さらなる立体化学的態様は、特に、適切な場合にはＣ５原子におけるＲおよびＳ立体配置を含み、意図される化合物中の置換基はαまたはβ面を向いていることが可能であると理解されるべきである。
【００３４】
「保護基」なる語は、酸素または窒素が位置する分子中の他の部分の誘導体化の経過中に該酸素または窒素原子の更なる反応を妨げるために該酸素または窒素原子に付加された化学基を意味する。多種多様な酸素および窒素保護基が有機合成分野の当業者に公知である。
【００３５】
「免疫調節物質」および「モジュレーター（調節物質）」なる語は、本発明においては互換的に用いられ、刺激または抑制により正常もしくは異常な免疫系または免疫担当細胞（例えば、Ｔ細胞または抗原提示細胞）を修飾しうる天然または合成産物を意味する。
【００３６】
意図される化合物は複数の不斉中心を有しうる。したがって、それらは、光学活性形態またはラセミ混合物として製造されうる。記載され特許請求されている本発明の範囲は、意図される化合物の個々の光学異性体およびその非ラセミ混合物ならびにラセミ形態を含む。「α」および「β」なる語は、図示されている化学構造中の不斉炭素原子における置換基の特定の立体化学的配置を示す。「エナンチオマー」なる語は、重ね合わすことができないお互いの鏡像である１対の立体異性体を意味する。１対のエナンチオマーの１：１の比の混合物は「ラセミ」混合物である。「異性体」なる語は、同じ式を有する異なる化合物を意味する。「立体異性体」は、原子が空間で配置されている様態のみにおいて異なる異性体である。
【００３７】
意図される化合物の投与
本発明の化合物は、任意の適当な医薬製剤として及び任意の適当な方法で投与されると意図される。したがって、投与は、経口的、非経口的（皮下注射、静脈内、筋肉内、胸骨内注射または注入技術を含む）、吸入噴霧、直腸内または局所的などの方法により、通常の無毒性の薬学上許容される担体、佐剤およびビヒクルを含有する投与単位製剤として行うことが可能である。
【００３８】
したがって、意図される化合物は、液剤、シロップ剤またはゲル形態（例えば、注射、経口摂取または局所投与用のもの）および固体形態（例えば、経口摂取、注射または体腔内への投与用）を含む種々の製剤中に製剤化されうると理解されるべきである。例えば、本発明の化合物が胃環境中で不安定であると予想される場合には、好ましくは等張溶液の注射が特に意図される。あるいは、酸分解を回避するためには、液体形態の鼻腔内適用または吸入が適しているかもしれない。一方、意図される化合物が消化分解に抵抗性であることが知られている場合には、意図される形態をシロップ剤または錠剤の形態で投与することができる。個々の用途に応じて、意図される化合物を局所または経皮適用用に製剤化することも可能である。当技術分野においては、多数の更なる製剤が公知であり、それらの全ても、本明細書に記載の本発明に適していると予想され、特に意図される製剤は、“Ｄｒｕｇ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  ｆｏｒ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｔｒｉａｌｓ：Ａｎ  Ｉｎｔｌ．Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ，Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，Ｑｕａｌｉｔｙ  Ｃｏｎｔｒｏｌ”，Ｄｏｎａｌｄ  Ｃ．ＭｏｎｋｈｏｕｓｅおよびＣｈｒｉｓｔｏｐｈｅｒ  Ｔ．Ｒｈｏｄｅｓ（編）；ＩＳＢＮ：０８２４７９８５２Ｘに記載されている。
【００３９】
例えば、本発明の化合物は、薬学上許容される担体と混合して製剤化されうると意図される。例えば、本発明の化合物は、薬理学的に許容される塩として経口的に投与することができる。本発明の化合物は、ほとんどは、水溶性であるため、それらは、生理食塩水（例えば、約７．２〜７．５のｐＨに緩衝化されたもの）中で静脈内に投与することができる。この目的には、リン酸塩、炭酸水素塩またはクエン酸塩のような通常のバッファーを使用することができる。もちろん、当業者は、本発明の組成物を不安定にしたり又はそれらの治療活性を損なうことなく個々の経路に対する多数の製剤を得るために、本明細書の教示の範囲内の製剤を修飾することが可能である。特に、本化合物を、水または他のビヒクルに、より可溶性にするための、本化合物の修飾は、例えば、当技術分野における通常の技量の範囲内に十分に含まれる若干の修飾（塩製剤化、エステル化など）により容易に達成されうる。患者において最大の有益な効果が得られるよう本化合物の薬物動力学を操作するために個々の化合物の投与経路および投与計画を修飾することは、当技術分野の通常の技量の範囲内に十分に含まれる。
【００４０】
ある医薬投与形態においては、該化合物のプロドラッグ形態、例えば特に、本化合物のアシル化（アセチル化など）およびアミノ酸エステル誘導体、ピリジンエステルならびに種々の塩形態（特にＨＣｌ塩）が好ましく、患者の病態の治療方法において投与することができる。
【００４１】
また、本発明の化合物は、単独で、または感染症または病態（後記）の治療のための他の物質（以下、「剤」）と組合せて投与することができる。本発明の組合せ療法は、本発明の少なくとも１つの化合物またはその機能的誘導体と少なくとも１つの他の薬学的に活性な成分との投与を含む。該有効成分および薬学的に活性な剤は、別々に又は一緒に投与することが可能であり、別々に投与する場合には、これは、同時または任意の順序で別々に行うことが可能である。該有効成分および薬学的に活性な剤の量ならびに投与の相対的時機は、所望の組合せ療法の効果が達成されるよう選択される。好ましくは、該組合せ療法は、本発明の化合物の１つ又はその生理的に機能的な誘導体と後記の剤の１つとの投与を含む。
【００４２】
意図される化合物との組合せにおいて有効と予想される他の薬物または有効成分の具体例としては、抗ウイルス剤、例えばインターフェロン（インターフェロンαおよびγを含むが、これらに限定されるものではない）、リバビリン、アシクロビルおよびＡＺＴ（商標）；抗真菌剤、例えばトルナフタート、Ｆｕｎｇｉｚｏｎｅ（商標）、Ｌｏｔｒｉｍｉｎ（商標）、Ｍｙｃｅｌｅｘ（商標）、ナイスタチンおよびアンホテラシン；抗寄生虫剤、例えばＭｉｎｔｅｚｏｌ（商標）、Ｎｉｃｌｏｃｉｄｅ（商標）、Ｖｅｒｍｏｘ（商標）およびＦｌａｇｙｌ（商標）、；腸剤、例えばＩｍｍｏｄｉｕｍ（商標）、Ｌｏｍｏｔｉｌ（商標）およびＰｈａｚｙｍｅ（商標）；抗腫瘍剤、例えばインターフェロンαおよびγ、Ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ（商標）、Ｃｙｔｏｘａｎ（商標）、Ｉｍｕｒａｎ（商標）、メトトレキセート、Ｍｉｔｈｒａｃｉｎ（商標）、Ｔｉａｚｏｆｕｒｉｎ（商標）、Ｔａｘｏｌ（商標）；皮膚科用剤、例えばＡｃｌｏｖａｔｅ（商標）、Ｃｙｃｌｏｃｏｒｔ（商標）、Ｄｅｎｏｒｅｘ（商標）、Ｆｌｏｒｏｎｅ（商標）、Ｏｘｓｏｒａｌｅｎ（商標）、コールタールおよびサリチル酸；片頭痛用製剤、例えばエルゴタミン化合物；ステロイドおよび免疫抑制剤（前記以外のもの）、例えばシクロスポリン、Ｄｉｐｒｏｓｏｎｅ（商標）、ヒドロコルチゾン、ミコフェノール酸、Ａｒａｖａ（商標）（レフルノミド）；Ｆｌｏｒｏｎ（商標）、Ｌｉｄｅｘ（商標）、トピコルトおよびバリソン；および代謝剤、例えばインスリン、および前記の範疇にうまく当てはまらない他の薬物、例えば、サイトカイン、例えばＩＬ２、ＩＬ４、ＩＬ６、ＩＬ８、ＩＬ１０およびＩＬ１２が挙げられる。特に好ましい主な薬物としては、ＡＺＴ、３ＴＣ、８−置換グアノシン類似体、２，３−ジデオキシヌクレオシド、インターロイキンＩＩ、インターフェロン、例えばＩαβ−インターフェロン、ツカレゾール（ｔｕｃａｒｅｓｏｌ）、レバミゾール、イソプリノシンおよびシクロリグナンが挙げられる。
【００４３】
そのような更なる治療剤の具体例には、免疫系または関連状態のモジュレーションに有効な剤、例えば、ＡＺＴ、３ＴＣ、８−置換グアノシン類似体、２’，３’−ジデオキシヌクレオシド、インターロイキンＩＩ、インターフェロン、例えばα−インターフェロン、ツカレゾール（ｔｕｃａｒｅｓｏｌ）、レバミゾール、イソプリノシンおよびシクロリグナンが含まれる。本発明の或る化合物は、他の化合物の代謝または不活性化を軽減することにより本発明の或る剤の生物活性を増強するのに有効である可能性があり、そのような場合、この意図される効果のために共投与される。
【００４４】
投与に関しては、治療的に有効な量は、治療すべき感染症および病態、その重症度、用いる治療計画、使用する剤の薬物動力学、および治療する患者（動物またはヒト）に応じて様々となると当業者は認識するであろう。投与量は、典型的には、約０．５ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇの範囲内であると一般に予想されるが、種々の代替投与量も適切であり、それらには、０．５ｍｇ／ｋｇ〜０．１ｍｇ／ｋｇ未満の投与量、そして５０〜１００ｍｇ／ｋｇ以上（例えば１２５ｍｇ／ｋｇ）の投与量が含まれる。さらに、意図される化合物の相対的に低い血漿濃度で治療の成功が達成されうる病態もあるが、比較的高い投与量を要しうる病態もあると予想される。
【００４５】
意図される化合物の濃度に関しては、該濃度は、作用部位において測定された場合に約１μＭ〜約１００μＭの範囲内であることが好ましい。しかし、意図される化合物の親和性が１μＭ未満である場合には特に、適当な濃度はまた、９９９ｎＭ〜１０ｎＭ未満の範囲内でありうる。一方、意図される化合物が比較的短い半減期を示す又は高い代謝回転を有する場合には、意図される濃度は０．１ｍＭおよび１００ｍＭ、およびそれ以上でありうる。したがって、意図される化合物の投与量は著しく広範であるが、適当な投与量は、インビトロまたは動物実験において容易に決定することができる。したがって、意図される化合物は、血清／血漿中に約１０ｎＭ〜１ｍＭ、より典型的には、０．１μＭ〜１００μＭの範囲内の濃度で存在すると理解されるべきである。意図される化合物が標的細胞または標的組織内に蓄積する場合には、そのような化合物の濃度は、血漿／血清濃度と同様またはそれより著しく高く（例えば、少なくとも２倍、より好ましくは少なくとも５倍、最も好ましくは少なくとも１０倍）なりうる。しかし、適当な投与計画は、まずは少量を投与し、ついで、副作用が過度に悪化するか又は意図される効果が達成されるまで該量を増加させることにより進展されるであろう。
【００４６】
該活性化合物の投与は、連続的（点滴静注）ないしは１日数回（例えば、１日４回（Ｑ．Ｉ．Ｄ．））の経口投与であることが可能であり、とりわけ、経口的、局所的、非経口的、筋肉内、静脈内、皮下、経皮的（透過性増強剤を含みうる）、頬内および坐剤投与を含みうる。
【００４７】
本発明の医薬組成物を製造するためには、１以上の本発明化合物の治療的に有効な量を、好ましくは、通常の薬学配合技術に従い、薬学上許容される担体と良く混合して１回量を得る。担体は、例えば経口投与または非経口投与などの投与に望ましい製剤の形態に応じて、多種多様な形態をとりうる。経口剤形の医薬組成物の製造においては、通常の薬学媒体のいずれかを使用することができる。したがって、懸濁剤、エリキシル剤および水剤のような液体経口製剤の場合には、水、グリコール、油、アルコール、香味剤、保存剤、着色剤などを含む適当な担体および添加剤を使用することができる。散剤、錠剤、カプセル剤のような固体経口製剤および坐剤のような固体製剤の場合には、デンプン、糖担体、例えばデキストロース、マンニトール、ラクトースおよび関連した担体を含む適当な担体および添加剤、希釈剤、顆粒化剤、滑沢剤、結合剤、崩壊剤などを使用することができる。所望により、錠剤またはカプセル剤は、標準的な技術により、腸溶コーティング剤または徐放剤とすることが可能である。
【００４８】
非経口製剤の場合には、該担体は、通常、無菌水または塩化ナトリウム水溶液を含みうるが、分散を助ける成分などの他の成分も含まれうる。もちろん、無菌水を使用し無菌状態を維持したい場合には、該組成物および担体も滅菌しなければならない。注射用懸濁液を製造することも可能であり、この場合、適当な液体担体、懸濁化剤などを使用することができる。
【００４９】
さらに、意図される化合物および製剤は、機能的および非機能的添加剤を含みうると理解されるべきである。例えば、経皮的薬物運搬が望ましい場合には、皮膚透過性増強剤を加えることができる。非機能的添加剤の具体例には、意図される化合物の特定の質を向上させるための充填剤、抗酸化剤、香味剤または着色剤が含まれる。
【００５０】
意図される用途
式Ｉ〜ＩＩＩで表される化合物は、多種多様な状態、実際には、意図される化合物の投与に正に反応する任意の状態を治療するために使用されると意図される。本発明の化合物は、とりわけ、感染症、寄生、癌もしくは腫瘍または自己免疫疾患を治療するために使用しうると特に意図される。さらに、本発明の化合物は、患者の特定の器官（例えば、肝臓または心臓）における状態または疾患を標的とするために使用しうると意図される。
【００５１】
本発明の化合物で治療されると意図される感染症には、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、単純ヘルペスウイルス１型および２型、陰部ヘルペス、ヘルペス性角膜炎、単純ヘルペス脳炎、帯状疱疹、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、インフルエンザＡウイルス、ハンターンウイルス（出血熱）、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、麻疹および真菌が含まれる。
【００５２】
本発明の化合物で治療されると意図される寄生には、原生動物の寄生、ならびに蠕虫および他の寄生体による寄生が含まれる。
【００５３】
治療されると意図される癌または腫瘍には、ウイルスにより引き起こされるものが含まれ、その効果は、新生物状態へのウイルス感染細胞の形質転換の抑制、形質転換細胞から他の正常細胞へのウイルスの広がりの抑制、および／または、ウイルスで形質転換された細胞の増殖の停止を含みうる。
【００５４】
治療されると意図される自己免疫疾患および他の疾患には、関節炎、乾癬、腸疾患、若年型糖尿病、ループス、多発性硬化症、痛風および痛風性関節炎、慢性関節リウマチ、移植拒絶、巨細胞動脈炎、アレルギーおよび喘息が含まれる。
【００５５】
本発明の化合物の更に他の意図される用途には、治療剤として又は他の目的に有用である他のヌクレオシドまたはヌクレオチド類似体の化学合成における中間体としての用途が含まれる。
【００５６】
更にもう１つの態様においては、本発明の化合物を含有する医薬の治療的および／または予防的に有効な量を投与することを含む、哺乳動物を治療する方法を提供する。この態様において、その効果は、哺乳動物の免疫系の或る部分のモジュレーション、特に、１型および２型のお互いに対するリンホカインプロフィールのモジュレーションに関連づけられうる。１型および２型リンホカインのモジュレーションが生じる場合、該モジュレーションは１型および２型の両方の抑制、または１型の抑制および２型の刺激を含みうると特に意図される。
【００５７】
例えば、多数の自己免疫疾患（例えば、慢性関節リウマチ、多発性硬化症、糖尿病、炎症性腸疾患、乾癬、エリテマトーデス）、およびＣＤ４＋細胞の活性化により（少なくとも部分的に）特徴づけられる疾患は、偏向した１型サイトカインの発現と相関していることが示されている。意図される化合物は、２型サイトカインの発現を誘導すること、１型サイトカインの発現を減少させること、および活性化Ｔ細胞の増殖を減少させることに有効であることが示されている（後記）。したがって、とりわけ、意図される化合物は、１型サイトカイン発現の増加と相関している疾患、または２型サイトカイン発現の減少と相関している疾患、または１型サイトカイン発現の増加および２型サイトカイン発現の減少と相関している疾患を治療するために有利に使用されうると理解されるべきである。したがって、意図される化合物を使用する特に意図される治療には、１型サイトカイン媒介性炎症応答および自己免疫疾患が含まれる。したがって、意図される化合物は免疫調節物質、特に１型サイトカイン抑制物質および／または２型サイトカイン刺激物質として使用されうると理解されるべきである。
【００５８】
一般に、本発明の最も好ましい用途は、該活性化合物が非標的細胞に対しては比較的低い細胞毒性を有し標的に対しては比較的により活性となるような用途である。この点ではまた、Ｌ−ヌクレオシドがＤ−ヌクレオシドより高い安定性を有していること（これは、より良好な薬物動力学をもたらしうる）が有利となるかもしれない。この結果は、Ｌ−ヌクレオシドが酵素により認識され得ないため、より長い半減期を有しうることにより達成されうる。
【００５９】
意図される化合物の種々の生物学的効果のうち、特に有意な生物学的効果には、１型および２型サイトカイン産生のモジュレーション、腫瘍状態の制御（すなわち、ＤＮＡ合成の減少または細胞増殖の減少）ならびにケモカインおよび増殖因子の放出の減少（後記のとおり）が含まれる。したがって、細胞からのサイトカインの分泌を変化させるための意図される方法は、式（Ｉ−ＩＶ）で表される化合物を得る工程を含むことが可能であり、該サイトカインの分泌を変化させるのに有効な濃度の式（Ｉ−ＩＶ）で表される化合物を該細胞に加える更なる工程を有する。式（Ｉ−ＩＶ）中の置換基の可能な組合せの全てが一般には意図されるが、特に意図される化合物は、Ｒ４およびＲ５’が、独立して、水素、アルキル、アルケニル、アルキニルおよびアラルキルよりなる群から選ばれ、Ｒ４およびＲ５’が、独立して、所望により、官能基およびヘテロ原子の少なくとも１つを含有していてもよく、その他の置換基が前記式（Ｉ）と同意義を有する式（Ｉ）で表される化合物である。もう１つの態様においては、細胞からのサイトカインの分泌を変化させるために使用する化合物はまた、以下の構造：
【００６０】
【化９】
2004529979.tif 000010
［式中、Ｚは、ＣＮ、Ｃ（Ｏ）ＮＨ２、Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ２、Ｃ（＝ＮＮＨ２）ＮＨ２または−Ｃ（＝ＮＯＨ）ＮＨ２である；Ｒ５は、Ｈ、ＯＨ、ＯＰ（Ｏ）（ＯＨ）２、Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２、ＯＰ（Ｏ）（ＯＲ’）２またはＰ（Ｏ）（ＯＲ’）２である（ここで、Ｒ’はマスキング基である）］で表される化合物でありうる。意図されるサイトカインには、特に、１型（例えば、ＩＬ−２、ＴＦＮ−α、ＩＦＮγ）および２型（例えば、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１３）サイトカインが含まれる。該細胞に関しては、サイトカインを産生し及び／又は分泌することが知られている全ての細胞が適していると意図されるが、特に意図される細胞には、リンパ球および癌細胞（例えば、後記の前立腺癌細胞）が含まれる。
【００６１】
本発明のもう１つの態様において、過剰増殖細胞の増殖を軽減する方法は、式（Ｉ）で表される化合物を準備する工程、および該過剰増殖細胞の増殖を軽減するのに有効な濃度の該化合物を該過剰増殖細胞に加えるもう１つの工程を含みうる。特に好ましい化合物には、Ｒ４が、水素、アルキル、アルケニル、アルキニルおよびアラルキルよりなる群から選ばれ、所望により、官能基およびヘテロ原子の少なくとも１つを含有していてもよく、Ｒ５’が、水素、アルキル、アルケニル、アルキニルおよびアラルキルよりなる群から選ばれ、少なくとも２つの炭素原子を有し、所望により、官能基およびヘテロ原子の少なくとも１つを含有していてもよく（ただし、Ｒ４およびＲ５’の両方が水素となることはない）、その他の置換基が式（Ｉ）と同意義を有する式（Ｉ）で表される化合物が含まれる。特に意図される過剰増殖細胞には、癌細胞が含まれ、特に意図される癌細胞には、前立腺癌細胞が含まれる。特定の理論に拘束されるものではないが、増殖の軽減は核酸合成（例えば、ＲＮＡおよび／またはＤＮＡ）の軽減を含むと意図される。
【００６２】
本発明の更にもう１つ態様において、増殖因子の放出を減少させる方法は、式（Ｉ）で表される化合物を準備する工程、および該増殖因子の放出を減少させるのに有効な濃度の該化合物を該細胞に加えるもう１つの工程を有すると意図される。本発明で提供する方法により種々の増殖因子の放出を減少させることが可能であると意図されるが、ＶＥＧＦの放出の減少が特に意図される。同様に、本発明で提供する方法に関しては、増殖因子を分泌することが知られている全ての細胞が意図され、特に意図される細胞には、癌細胞、特に、前立腺癌細胞が含まれる。
【００６３】
意図される化合物の合成
意図される化合物の合成に関しては、本発明のピロロ［２，３−ｄ］ピリミジンヌクレオシド類似体は、種々の合成経路により合成することが可能であり、以下の方法は単なる例示として記載されているに過ぎないと理解されるべきである。
【００６４】
Ｃ５’−修飾ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジンヌクレオシド類似体の合成
該５’−置換ヌクレオシド類似体は、ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン塩基と適当に保護された５’−置換リボフラノースとの縮合から製造する。図１に示すとおり、後悔されている方法（Ｊｏｎｅｓら，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（ＷｈｉｓｔｌｅｒおよびＭｏｆｆａｔ編），ｖｏｌ．ＶＩ，ｐｐ３１５−３２２，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，（１９７２））に従い製造した化合物１をグリニャール試薬のような種々の求核試薬で処理して化合物２を得、これをベンゾイル化し、ついでトリフルオロ酢酸で処理して化合物４を得た。ベンゾイル化および硫酸の存在下の無水酢酸／酢酸での後続の処理は化合物６を与え、これをピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン塩基との縮合に使用した。
【００６５】
公開されている方法に従い製造した化合物７（Ｊｏｎｅｓら，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  （ＷｈｉｓｔｌｅｒおよびＭｏｆｆａｔ編），ｖｏｌ．ＶＩ，ｐｐ３１５−３２２，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，（１９７２））をトシラート誘導体に変換し、これを水素化アルミニウムリチウムで還元して化合物８を得た。図１に示すのと同様の方法により、化合物８を化合物９に変換した。９とピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン１９との縮合およびそれに続く変換（図２に示すとおり）は、図２に例示するとおりの化合物１０−１５を得た。
【００６６】
図３に示すとおり、化合物２をスルホナート６に変換し、これを求核置換に付して立体配置が反転した化合物１７を得た。イソプロピリデンの脱保護およびそれに続くアセチル化はテトラアセタート１８を与えた。該５−Ｃ置換保護リボフラノースとヌクレオシド塩基との縮合を図４に示す。公開されている方法（Ｔｏｌｍａｎら，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．１９６９，９１，２１０２−２１０８）に従い製造された５−シアノピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン１９を該トリメチルシリル誘導体に変換し、ついで、トヨカマイシンに関して記載されている（Ｓｈａｒｍａら，Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  １９９３，１２，６４３−６４８）のと同様の方法により、トリメチルシリルトリフラートの存在下、化合物６と縮合させた。得られた結合生成物を水素化により脱ブロモ化に付して化合物２０を得た。無水メタノール中のアンモニアでの２０の処理は化合物２１および２３を与えた。化合物２１を酸化して化合物２２を得た。化合物２３をカルボキサミド誘導体２４に変換した。化合物２３および２４を酸化して化合物２５を得た。ヒドロキシアミンでの化合物２５の処理は化合物２６を与え、これをラネーニッケル上で水素化して２７を得た。あるいは、化合物２７は、加圧ボンベ中で化合物２５をアンモニアと共に加熱することによっても製造した。
【００６７】
Ｃ４’−修飾ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジンヌクレオシド類似体の合成
図５においては、化合物１を水性水酸化ナトリウム中のホルムアルデヒドで処理して４’−ヒドロキシメチル誘導体を得、これを選択的に脱保護して化合物２９を得た。ついでＤＭＴでの保護およびＴＢＳの除去は化合物３１を与え、これを種々の置換基に変換した。５−Ｃ置換リボフラノース（スキーム１）と同様の変換に付された４−Ｃ置換誘導体は、化合物３５に変換することが可能であり、これをヌクレオシド塩基との縮合に使用する。Ｃ５’−置換ピロロピリミジンヌクレオシド類似体と同様にして、図６に記載のとおり、化合物３５を化合物１９と縮合させることにより４’−置換類似体３６を得ることができる。後続の変換は４’−Ｃ置換ピロロピリミジンヌクレオシド３７−４２を与えうる。
【００６８】
２’−修飾および他のピロロ［２，３−ｄ］ピリミジンヌクレオシド類似体の合成
生物試験のために、以下のピロロピリミジンヌクレオシド類似体を製造した。それらのうちの幾つかは公開されているか（公知化合物として示されている）、図７に示されている。公知化合物４３、４４、５２〜５５および５７は、公開されている方法（Ｈｉｎｓｈａｗら，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．１９７０，９２，２３６−２４１）に従い製造した。化合物５６は、化合物５２の水素化により製造した。公知化合物４９（Ｋｒａｗｃｚｙｋら，Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  １９８９，８，９７−１１５）を亜硝酸ナトリウムで処理して化合物５０を得た。公知化合物４５および４８は、公開されている方法（Ｒａｍａｓａｍｙら，Ｊ．Ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｉｃ  Ｃｈｅｍ．１９８８，２５，１０４３−１０４６）に従い製造した。化合物４５をアンモニア−メタノールで処理して化合物４６を得、水素化して化合物４７を得た。化合物５８〜６３は、化合物５２〜５７に用いたのと同様の方法により、化合物４５から製造した。公知化合物６４（Ｋｒａｗｃｚｙｋら，Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  １９８９，８，９７−１１５）を化合物６５〜６７に変換した。公知化合物６８（Ｒａｍａｓａｍｙら，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  １９８６，４２，５８６９−５８７８）を化合物６９および７０に変換した。
【００６９】
式ＩＩＩで表される化合物の合成
７−β−Ｄ−リボフラノシル−４−オキソピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−５−カルボキサミジンおよび対応するＨＣｌ塩は、既に記載されているとおり（Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ｐｙｒｒｏｌｏ［２，３−ｄ］−４−ｐｙｒｉｍｉｄｏｎｅ  ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ．Ｊ．Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ．２０００  Ｊｕｎ  ２９；４３（１３）：２５６６−７４）に合成した。典型的な合成経路を以下に概説する。
【００７０】
（実施例）
典型的な意図される化合物の合成
以下のプロトコールは、本発明の種々の化合物の典型的な合成を示し、本発明で提供する発明の概念を単に例示するものであり、それを限定するものではない。
【００７１】
【化１０】
2004529979.tif 000011
【００７２】
メチル  ２，３−Ｏ−イソプロピリデン−５（Ｒ，Ｓ）−Ｃ−エチニル−β−リボフラノシド（２ｂ）の製造
アルゴン下の−４２℃の無水ＴＨＦ（２０ｍＬ）中のメチル  ４−Ｃ，５−Ｏ−ジデヒドロ−２，３−Ｏ−イソプロピリデン−β−Ｄ−リボフラノシド（Ｊｏｎｅｓら，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｖｏｌ  １，ｐｐ３１５−３２２（１９７２），４．００ｇ，１９．７８ｍｍｏｌ）の攪拌溶液に、エチニルマグネシウムブロミド（ＴＨＦ中０．５Ｍ，８０ｍＬ，４０ｍｍｏｌ）を滴下した。添加したら、得られた混合物を０℃までゆっくり（〜９０分間）加温した。氷（５０ｇ）／水（５０ｍＬ）を加えることにより該反応をクエンチし、該混合物を３０分間攪拌した。１０％  酢酸水溶液で中和した後、該混合物を酢酸エチルで２回抽出した。合わせた有機層を乾燥（Ｎａ２ＳＯ４）し、濃縮した。シリカ上のクロマトグラフィー（酢酸エチル−ヘキサン  １：４）により、３．４８ｇの表題化合物（Ｒ／Ｓ比  １：１）を白色固体として得た。同様の方法で以下の化合物を製造した。メチル  ２，３−Ｏ−イソプロピリデン−５（Ｒ）−Ｃ−メチル−β−Ｄ−リボフラノシド（２ａ）をメチル  ４−Ｃ，５−Ｏ−ジヘヒドロ−２，３−Ｏ−イソプロピリデン−β−Ｄ−リボフラノシドおよびエチルマグネシウムブロミドから製造した。メチル  ２，３−Ｏ−イソプロピリデン−５（Ｒ）−Ｃ−ビニル−β−Ｄ−リボフラノシド（２ｃ）をメチル  ４−Ｃ，５−Ｏ−ジヘヒドロ−２，３−Ｏ−イソプロピリデン−β−Ｄ−リボフラノシドおよびビニルマグネシウムブロミドから製造した。メチル  ５（Ｒ）−Ｃ−アリル−２，３−Ｏ−イソプロピリデン−β−Ｄ−リボフラノシド（２ｄ）をメチル  ４−Ｃ，５−Ｏ−ジヘヒドロ−２，３−Ｏ−イソプロピリデン−β−Ｄ−リボフラノシドおよびアリルマグネシウムブロミドから製造した。
【００７３】
メチル  ２，３−Ｏ−イソプロピリデン−５−Ｏ−メタンスルホニル−５（Ｒ）−Ｃ−メチル−β−Ｄ−リボフラノシド（１６）の製造
０℃の無水ピリジン（５０ｍＬ）中のメチル  ２，３−Ｏ−イソプロピリデン−５（Ｒ）−Ｃ−メチル−β−Ｄ−リボフラノシド（２ａ，７．２４ｇ，３３．１７ｍｍｏｌ）の攪拌溶液に、メタンスルホニルクロリド（３．１ｍＬ，３９．９２ｍｍｏｌ）を加えた。得られた混合物を室温で１時間攪拌し、０℃に冷却し、水（１．０ｍＬ）の添加によりクエンチし、室温で３０分間攪拌した。該溶媒を蒸発させ、残渣を酢酸エチルに溶解し、食塩水で３回洗浄し、乾燥（Ｎａ２ＳＯ４）し、濃縮した。シリカ上のクロマトグラフィー（ヘキサン中の３０％  ＥｔＯＡｃ）により、８．６２ｇの表題化合物１６を無色シロップとして得た。
【００７４】
メチル  ２，３−Ｏ−イソプロピリデン−５−Ｏ−アセチル−５（Ｓ）−Ｃ−メチル−β−Ｄ−リボフラノシド（１７）の製造
無水ＤＭＦ（３５０ｍＬ）中のメチル  ２，３−Ｏ−イソプロピリデン−５−Ｏ−メタンスルホニル−５（Ｒ）−Ｃ−メチル−β−Ｄ−リボフラノシド（１６，８．６２ｇ，２９．１ｍｍｏｌ）およびＮａＯＡｃ（無水，３．５ｇ，４２．５ｍｍｏｌ）の攪拌溶液を、アルゴン下、１２５℃で４日間加熱した。該溶媒を蒸発させ、残渣をシリカ上のクロマトグラフィー（ヘキサン中の２５％  ＥｔＯＡｃ）に付して４．０ｇ表題化合物１７を白色固体として得た。
【００７５】
メチル  ２，３−Ｏ−イソプロピリデン−４−Ｃ−ヒドロキシメチル−β−Ｄ−リボフラノシド（２８）の製造
０℃のジオキサン（３８０ｍＬ）中のメチル  ４−Ｃ，５−Ｏ−ジデヒドロ−２，３−Ｏ−イソプロピリデン−β−Ｄ−リボフラノシド１（２０．２２ｇ，１００ｍｍｏｌ）に、ホルムアルデヒド（３７％  溶液，７６ｍＬ）、ついで２Ｍ  ＮａＯＨ（１８８ｍＬ）を加えた。得られた反応混合物を室温で２０時間攪拌し、０℃に冷却し、中和し（１０％  酢酸）、濃縮し（〜５０％）、塩化メチレンで２回抽出した。合わせた有機層を乾燥（Ｎａ２ＳＯ４）し、濃縮乾固した。シリカ上のクロマトグラフィー（クロロホルム中の４％  メタノール）のより、２０．２ｇの表題化合物２８を白色固体として得た。
【００７６】
メチル  ２，３−Ｏ−イソプロピリデン−５−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシド（８）の製造
１０℃の無水ピリジン（２５０ｍＬ）中のメチル  ２，３−Ｏ−イソプロピリデン−β−Ｄ−リボフラノシド（１４．２ｇ，７０．０ｍｍｏｌ）の攪拌溶液に、ｐ−トルエンスルホニルクロリド（１９．１ｇ，１００ｍｍｏｌ）を数分割（３０分かけて）で加えた。得られた混合物を室温で１８時間攪拌し、０℃に冷却し、水（５．０ｍＬ）の添加によりクエンチし、室温で３０分間攪拌した。該溶媒を蒸発させた。残渣を酢酸エチルに溶解し、食塩水で３回洗浄し、乾燥（Ｎａ２ＳＯ４）し、濃縮乾固した。シリカ上のクロマトグラフィー（酢酸エチル−ヘキサン  １：３）により、２４．１ｇの表題化合物を白色固体として得た。
【００７７】
無水ジエチルエーテル（１２０ｍＬ）中のＬｉＡｌＨ４（４．５８ｇ，１２０．５ｍｍｏｌ）の攪拌懸濁液に、ジエチルエーテル−トルエン（２．５：１，１４０ｍＬ）中のメチル  ２，３−Ｏ−イソプロピリデン−５−Ｏ−ｐ−トルエンスルホニル−β−Ｄ−リボフラノシド（１３．１ｇ，３６．５５ｍｍｏｌ）を加えた。得られた混合物を２２時間還流し、室温に冷却し、酢酸エチル（２５ｍＬ）で希釈し、水（５．０ｍＬ）の添加によりクエンチした。該溶媒を蒸発させた。残渣を酢酸エチルに溶解し、食塩水で３回洗浄し、乾燥（Ｎａ２ＳＯ４）し、濃縮乾固した。シリカ上のクロマトグラフィー（酢酸エチル  ヘキサン  １：３）により、３．５８ｇの表題化合物を無色液体として得た。
【００７８】
メチル  ５（Ｒ）−Ｃ−アリル−５−Ｏ−ベンゾイル−２，３−Ｏ−イソプロピリデン−β−Ｄ−リボフラノシド（３ｄ）の製造
０℃の無水ピリジン（４０ｍＬ）中のメチル  ５（Ｒ）−Ｃ−アリル−２，３−Ｏ−イソプロピリデン−β−Ｄ−リボフラノシド（４．４９ｇ，１８．３８ｍｍｏｌ）の攪拌溶液に、ベンゾイルクロリド（２．７ｍＬ，２３．０ｍｍｏｌ）を加えた。得られた混合物を室温で１８時間攪拌し、氷で冷却し、水（１ｍＬ）の添加によりクエンチし、室温で３０分間攪拌した。該溶媒を蒸発させ、残渣を酢酸エチルに溶解し、食塩水で３回洗浄し、乾燥（Ｎａ２ＳＯ４）し、濃縮した。シリカ上のクロマトグラフィー（ヘキサン中の１２％  酢酸エチル）により、６．２６ｇの表題化合物３ｄを無色シロップとして得た。同様にして以下の化合物を製造した。メチル  ５−Ｏ−ベンゾイル−５（Ｒ，Ｓ）−Ｃ−エチニル−２，３−Ｏ−イソプロピリデン−β−Ｄ−リボフラノシド（３ｂ，Ｒ／Ｓ比  １：１）をメチル  ５（Ｒ，Ｓ）−Ｃ−エチニル−２，３−Ｏ−イソプロピリデン−β−Ｄ−リボフラノシド（２ｂ）から製造した。メチル  ４−Ｃ−ベンゾイルオキシメチル−５−Ｏ−ベンゾイル−２，３−Ｏ−イソプロピリデン−β−Ｄ−リボフラノシドをメチル  ２，３−Ｏ−イソプロピリデン−４−Ｃ−ヒドロキシメチル−β−Ｄ−リボフラノシドから製造した。
【００７９】
メチル  ５（Ｒ）−Ｃ−アリル−５−Ｏ−ベンゾイル−β−Ｄ−リボフラノシド（４ｄ）の製造
ＴＦＡ−Ｈ２Ｏ混合物（９：１）中のメチル  ５（Ｒ）−Ｃ−アリル−５−Ｏ−ベンゾイル−２，３−Ｏ−イソプロピリデン−β−Ｄ−リボフラノシド（３ｄ，６．２ｇ，１７．８ｍｍｏｌ）の溶液を０℃で９０分間攪拌し、０℃で濃縮乾固した。残渣をメタノール−トルエン混合物（２０ｍＬ，１：１）に溶解し、濃縮乾固した。シリカ上のクロマトグラフィー（酢酸エチル−ヘキサン  １：１）により、３．７０ｇの表題化合物４ｄを白色固体として得た。同様にして以下の化合物を製造した。メチル  ５−Ｏ−ベンゾイル−５（Ｒ，Ｓ）−Ｃ−エチニル−β−Ｄ−リボフラノシド（４ｂ，Ｒ／Ｓ比  １：１）をメチル  ５−Ｏ−ベンゾイル−５（Ｒ，Ｓ）−Ｃ−エチニル−２，３−Ｏ−イソプロピリデン−β−Ｄ−リボフラノシド（３ｂ）から製造した。メチル  ５−Ｏ−ベンゾイル−４−Ｃ−ベンゾイルオキシメチル−β−Ｄ−リボフラノシドをメチル  ５−Ｏ−ベンゾイル−４−Ｃ−ベンゾイルオキシメチル−２，３−Ｏ−イソプロピリデン−β−Ｄ−リボフラノシドから製造した。
【００８０】
メチル  ５（Ｒ）−Ｃ−アリル−２，３，５−トリ−Ｏ−ベンゾイル−β−Ｄ−リボフラノシド（５ｄ）の製造
０℃の無水ピリジン（８０ｍＬ）中のメチル  ５（Ｒ）−Ｃ−アリル−５−Ｏ−ベンゾイル−β−Ｄ−リボフラノシド（４ｄ，３．６０ｍｇ，１１．６８ｍｍｏｌ）の攪拌溶液に、ベンゾイルクロリド（３．０ｍＬ，２５．８４ｍｍｏｌ）を加えた。得られた混合物を室温で１８時間攪拌し、氷で冷却し、水（１ｍＬ）の添加によりクエンチし、ついで室温で３０分間攪拌した。該混合物を濃縮し、酢酸エチルで希釈し、食塩水で３回洗浄し、乾燥（Ｎａ２ＳＯ４）し、濃縮乾固した。シリカ上のクロマトグラフィー（ヘキサン中の１５％  酢酸エチル）により、５．３ｇの表題化合物５ｄを無色シロップとして得た。同様にして以下の化合物を製造した。メチル  ５（Ｒ，Ｓ）−Ｃ−エチニル−２，３，５−トリ−Ｏ−ベンゾイル−β−Ｄ−リボフラノシド（５ｂ，Ｒ／Ｓ比  １：１）をメチル  ５−Ｏ−ベンゾイル−５（Ｒ，Ｓ）−Ｃ−エチニル−β−Ｄ−リボフラノシド（４ｂ）から製造した。メチル  ４−Ｃ−ベンゾイルオキシメチル−２，３，５−トリ−Ｏ−ベンゾイル−β−Ｄ−リボフラノシドをメチル  ４−Ｃ−ベンゾイルオキシメチル−５−Ｏ−ベンゾイル−β−Ｄ−リボフラノシドから製造した。
【００８１】
１−Ｏ−メチル−２，３，５−トリ−Ｏ−ベンゾイル−５（Ｒ）−Ｃ−ビニル−β−Ｄ−リボフラノース（５ｃ）の製造
トリフルオロ酢酸と水との混合物（９：１，ｖ／ｖ，１１ｍＬ）中のメチル  ２，３−Ｏ−イソプロピリデン−５（Ｒ）−Ｃ−ビニル−β−Ｄ−リボフラノシド（２ｃ，１．０ｇ，４．３ｍｍｏｌ）の溶液を０℃で３０分間攪拌し、濃縮乾固した。残渣をメタノールに溶解し、濃縮乾固し（３回）、ついでピリジンに溶解し、蒸発させ、最後に無水ピリジン（１１ｍＬ）に溶解した。この溶液へ、ベンゾイルクロリド（１．９ｍＬ，１６ｍｍｏｌ）を加えた。該反応混合物を２５℃で１６時間攪拌し、氷水（２０ｍＬ）中に注いだ。該混合物をジクロロメタン（２０ｍＬ）で抽出し、該有機層を硫酸ナトリウムで乾燥し、濃縮乾固した。残渣をシリカ上のクロマトグラフィー（ジクロロメタン中の０〜５％  酢酸エチル）に付して１．０ｇの表題化合物５ｃをシロップとして得た。
【００８２】
１−Ｏ−アセチル−２，３，５−トリ−Ｏ−ベンゾイル−５（Ｒ）−Ｃ−アリル−Ｄ−リボフラノース（６ｄ）の製造
０℃の酢酸（１４ｍＬ）および無水酢酸（１．７５ｍＬ，１８．３６ｍｍｏｌ）中のメチル  ５（Ｒ）−Ｃ−アリル−２，３，５−トリ−Ｏ−ベンゾイル−β−Ｄ−リボフラノシド（５ｄ，４．０ｇ，７．７４ｍｍｏｌ）の攪拌溶液へ、濃硫酸（２００μＬ，４．０ｍＬの酢酸中の３．７９ｍｍｏｌ）を加えた。得られた混合物を室温で２０時間攪拌し、０℃に冷却し、冷酢酸エチルで希釈し、水、５％  ＮａＨＣＯ３水溶液、ついで食塩水で洗浄し、乾燥（Ｎａ２ＳＯ４）し、濃縮した。シリカ上のクロマトグラフィー（酢酸エチル−ヘキサン  １：４）により、２．８２ｇの表題化合物６ｄ（α／β比  １：２）を無色泡として得た。同様にして以下の化合物を製造した。１−Ｏ−アセチル−５（Ｒ，Ｓ）−Ｃ−エチニル−２，３，５−トリ−Ｏ−ベンゾイル−β−Ｄ−リボフラノース（６ｂ，Ｒ／Ｓ比  １：１およびα／β比  １：２）をメチル  ５（Ｒ，Ｓ）−Ｃ−エチニル−２，３，５−トリ−Ｏ−ベンゾイル−β−Ｄ−リボフラノシド（５ｂ）から製造した。１−Ｏ−アセチル−４Ｃ−ベンゾイルオキシメチル−２，３，５−トリ−Ｏ−ベンゾイル−Ｄ−リボフラノース（α／β比  １：３）をメチル  ４−Ｃ−ベンゾイルオキシメチル−２，３，５−トリ−Ｏ−ベンゾイル−β−Ｄ−リボフラノシドから製造した。５（Ｒ）−Ｃ−メチル−１，２，３，５−テトラ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−リボフラノースをメチル  ２，３−Ｏ−イソプロピリデン−５（Ｒ）−Ｃ−メチル−β−Ｄ−リボフラノシドから製造した。１，２，３，５−テトラ−Ｏ−アセチル−５（Ｓ）−Ｃ−メチル−Ｄ−リボフラノース６ａを５−Ｏ−アセチル−２，３−Ｏ−イソプロピリデン−５（Ｒ）−Ｃ−メチル−β−Ｄ−リボフラノシドから製造した。５−デオキシ−１，２，３−トリ−Ｏ−アセチル−Ｄ−リボフラノース９をメチル  ５−Ｏ−アセチル−２，３−Ｏ−イソプロピリデン−β−Ｄ−リボフラノシドから製造した。１−Ｏ−アセチル−２，３，５−トリ−Ｏ−ベンゾイル−５（Ｒ）−Ｃ−ビニル−β−Ｄ−リボフラノース６ｃをメチル  ２，３，５−トリ−Ｏ−ベンゾイル−５（Ｒ）−Ｃ−ビニル−β−Ｄ−リボフラノシドから製造した。
【００８３】
４−アミノ−６−ブロモ−５−シアノ−７−（２，３，５−トリ−Ｏ−ベンゾイル−５（Ｒ）−Ｃ−アリル−β−Ｄ−リボフラノシル）ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジンの製造
ＨＭＤＳ（７５ｍＬ）および無水ｍ−キシレン（２５ｍＬ）中の４−アミノ−６−ブロモ−５−シアノピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン（Ｔｏｌｍａｎら，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．１９６９，９１，２１０２−２１０８，１．０５ｇ，４．４１ｍｍｏｌ）および硫酸アンモニウム（５０ｍｇ）の懸濁液をアルゴン下で１８時間還流した。溶媒を蒸発させ、残渣を真空下で乾燥した。残渣を無水１，２−ジクロロエタン（８０ｍＬ）に溶解し、１−Ｏ−アセチル−２，３，５−トリ−Ｏ−ベンゾイル−５（Ｒ）−Ｃ−アリル−Ｄ−リボフラノース（２．００ｇ，３．６７ｍｍｏｌ）と混合した。氷で冷却しながら、ＴＭＳＯＴｆ（１．３ｍＬ，５ｍＬの無水１，２−ジクロロエタン中の７．３０ｍｍｏｌ）を加えた。アルゴン下の該混合物を室温で３０分間攪拌し、ついで９０時間還流し、それ（冷却物）を氷／ＮａＨＣＯ３（５０ｍＬ）に注ぐことによりクエンチし、濾過した。該有機層を分離し、乾燥（Ｎａ２ＳＯ４）し、濃縮した。シリカ上のクロマトグラフィー（ＥｔＯＡｃ−ヘキサン  ２：３）により、１．８１ｇの表題化合物を無色固体として得た。同様にして以下の化合物を製造した。４−アミノ−６−ブロモ−５−シアノ−７−（２，３，５−トリ−Ｏ−ベンゾイル−５（Ｒ，Ｓ）−Ｃ−エチニル−β−Ｄ−リボフラノシル）ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン（Ｒ／Ｓ比  １：１）を１−Ｏ−アセチル−２，３，５−トリ−Ｏ−ベンゾイル−５（Ｒ，Ｓ）−Ｃ−エチニル−Ｄ−リボフラノースおよび４−アミノ−６−ブロモ−５−シアノピロロ［２，３−ｄ］ピリミジンから製造した。
４−アミノ−６−ブロモ−５−シアノ−７−（４−ベンゾイルオキソメチル−２，３，５−トリ−Ｏ−ベンゾイル−β−Ｄ−リボフラノシル）ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジンを１−Ｏ−アセチル−４−ベンゾイルオキシメチル−２，３，５−トリ−Ｏ−ベンゾイル−Ｄ−リボフラノースおよび４−アミノ−６−ブロモ−５−シアノピロロ［２，３−ｄ］ピリミジンから製造した。４−アミノ−６−ブロモ−５−シアノ−７−（１，２，３，５−テトラ−Ｏ−アセチル−５（Ｒ）−Ｃ−メチル−β−Ｄ−リボフラノシル）ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジンを１，２，３，５−テトラ−Ｏ−アセチル−５（Ｒ）−Ｃ−メチル−Ｄ−リボフラノースおよび４−アミノ−６−ブロモ−５−シアノピロロ［２，３−ｄ］ピリミジンから製造した。４−アミノ−６−ブロモ−５−シアノ−７−（１，２，３，５−テトラ−Ｏ−アセチル−５（Ｓ）−Ｃ−メチル−β−Ｄ−リボフラノシル）ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジンを１，２，３，５−テトラ−Ｏ−アセチル−５（Ｓ）−Ｃ−メチル−Ｄ−リボフラノースおよび４−アミノ−６−ブロモ−５−シアノピロロ［２，３−ｄ］ピリミジンから製造した。４−アミノ−６−ブロモ−５−シアノ−７−（２，３−ジ−Ｏ−アセチル−５−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジンを１，２，３−トリ−Ｏ−アセチル−５−デオキシ−Ｄ−リボフラノースおよび４−アミノ−６−ブロモ−５−シアノピロロ［２，３−ｄ］ピリミジンから製造した。４−アミノ−６−ブロモ−５−シアノ−７−（２，３，５−トリ−Ｏ−ベンゾイル−５（Ｒ）−Ｃ−ビニル−β−Ｄ−リボフラノシル）ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジンを１−Ｏ−アセチル−２，３，５−トリ−Ｏ−ベンゾイル−５（Ｒ）−Ｃ−ビニル−β−Ｄ−リボフラノースおよび４−アミノ−６−ブロモ−５−シアノピロロ［２，３−ｄ］ピリミジンから製造した。
【００８４】
４−アミノ−５−シアノ−７−（２，３，５−トリ−Ｏ−ベンゾイル−５（Ｒ）−Ｃ−アリル−β−Ｄ−リボフラノシル）ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン（２０ｅ）の製造
４−アミノ−６−ブロモ−５−シアノ−７−（２，３，５−トリ−Ｏ−ベンゾイル−５（Ｒ）−Ｃ−アリル−β−Ｄ−リボフラノシル）ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン（７３８ｍｇ，１．０ｍｍｏｌ）の酢酸（２５ｍＬ）溶液に、亜鉛末（１．０４ｇ，１６．０ｍｍｏｌ）を２分割（１時間間隔）で加えた。該反応混合物を室温で２０時間攪拌し、濾過した。該濾液を蒸発乾固し、残渣をシリカ上のクロマトグラフィー（酢酸エチル−ヘキサン  １：１）に付して４５０ｍｇの表題化合物２０ｅを無色泡として得た。同様にして以下の化合物を製造した。４−アミノ−５−シアノ−７−（２，３，５−トリ−Ｏ−ベンゾイル−５（Ｒ，Ｓ）−Ｃ−エチニル−β−Ｄ−リボフラノシル）ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン（Ｒ／Ｓ比  １：１）２０ｂを４−アミノ−６−ブロモ−５−シアノ−７−（２，３，５−トリ−Ｏ−ベンゾイル−５（Ｒ，Ｓ）−Ｃ−エチニル−β−Ｄ−リボフラノシル）ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジンから製造した。４−アミノ−５−シアノ−７−（２，３，５−トリ−Ｏ−ベンゾイル−５（Ｒ）−Ｃ−ビニル−β−Ｄ−リボフラノシル）ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン２０ｃを４−アミノ−６−ブロモ−５−シアノ−７−（２，３，５−トリ−Ｏ−ベンゾイル−５（Ｒ）−Ｃ−ビニル−β−Ｄ−リボフラノシル）ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジンから製造した。
【００８５】
４−アミノ−５−シアノ−７−（２，３，５−トリ−Ｏ−ベンゾイル−５（Ｒ）−Ｃ−プロピル−β−Ｄ−リボフラノシル）ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン（２０ｆ）の製造
ジオキサン（５０ｍＬ）およびトリエチルアミン（０．５ｍＬ）中の４−アミノ−６−ブロモ−５−シアノ−７−（２，３，５−トリ−Ｏ−ベンゾイル−５（Ｒ）−Ｃ−アリル−β−Ｄ−リボフラノシル）ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン（４００ｍｇ，０．５４ｍｍｏｌ）および１０％  Ｐｄ／Ｃ（１００ｍｇ，〜５０％  水）の懸濁液を水素化装置（Ｈ２、２０ｐｓｉ）中で４時間振とうした。該触媒を濾過し、洗浄（ジオキサン）した。合わせた濾液を濃縮し、残渣をシリカ上のクロマトグラフィー（酢酸エチル  ヘキサン  １：１）に付して、３４０ｍｇの表題化合物２０ｆを無色泡として得た。同様にして以下の化合物を製造した。４−アミノ−５−シアノ−７−（２，３，５−トリ−Ｏ−ベンゾイル−５（Ｒ，Ｓ）−Ｃ−エチル−β−Ｄ−リボフラノシル）ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン（Ｒ／Ｓ比  １：１）２０ｄを４−アミノ−６−ブロモ−５−シアノ−７−（２，３，５−トリ−Ｏ−ベンゾイル−５（Ｒ，Ｓ）−Ｃ−エチニル−β−Ｄ−リボフラノシル）ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジンから製造した。４−アミノ−５−シアノ−７−（４−ベンゾイルオキソメチル−２，３，５−トリ−Ｏ−ベンゾイル−β−Ｄ−リボフラノシル）ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジンを４−アミノ−６−ブロモ−５−シアノ−７−（４−ベンゾイルオキソメチル−２，３，５−トリ−Ｏ−ベンゾイル−β−Ｄ−リボフラノシル）ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジンから製造した。４−アミノ−５−シアノ−７−（１，２，３，５−テトラ−Ｏ−アセチル−５（Ｒ）−Ｃ−メチル−β−Ｄ−リボフラノシル）ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン２０ａを４−アミノ−６−ブロモ−５−シアノ−７−（１，２，３，５−テトラ−Ｏ−アセチル−５（Ｒ）−Ｃ−メチル−β−Ｄ−リボフラノシル）ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジンから製造した。４−アミノ−５−シアノ−７−（１，２，３，５−テトラ−Ｏ−アセチル−５（Ｓ）−Ｃ−メチル−β−Ｄ−リボフラノシル）ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン２０ａを４−アミノ−６−ブロモ−５−シアノ−７−（１，２，３，５−テトラ−Ｏ−アセチル−５（Ｓ）−Ｃ−メチル−β−Ｄ−リボフラノシル）ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジンから製造した。４−アミノ−５−シアノ−７−（１，２，３−トリ−Ｏ−アセチル−５−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジンを４−アミノ−６−ブロモ−５−シアノ−７−（１，２，３−トリ−Ｏ−アセチル−５−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジンから製造した。４−アミノ−５−シアノ−７−（２，３−ジデオキシ−β−Ｄ−グリセロ−ペントフラノシル）ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジンを４−アミノ−５−シアノ−７−（２，３−ジデオキシ−β−Ｄ−ペント−２−エノフラノシル）ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジンから製造した。
【００８６】
４−アミノ−５−シアノ−７−（５（Ｒ）−Ｃ−アリル−β−Ｄ−リボフラノシル）ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン（２３ｅ）の製造
０℃の４−アミノ−５−シアノ−７−（２，３，５−トリ−Ｏ−ベンゾイル−５（Ｒ）−Ｃ−アリル−β−Ｄ−リボフラノシル）ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン（３００ｍｇ，０．４５４ｍｍｏｌ）のメタノール（４０ｍＬ）溶液をアンモニアで飽和させた。該溶液を室温で２日間放置した。溶媒を蒸発させ、残渣をＮａＯＡｃ（無水、２０ｍｇ）と共にＤＭＦ（２０ｍＬ）に懸濁させた。該混合物をアルゴン下、１２０℃で５時間攪拌した。溶媒を蒸発させた。残渣をシリカゲルに吸着させ、シリカゲルカラムから溶出して（メタノール−酢酸エチル  １：２５）１４５ｍｇの表題化合物を無色固体として得た。
【００８７】
ＤＭＦ中で加熱する前に、該生成物は２つの主要化合物２１および２３を含有しており、それらはシリカゲル上のクロマトグラフィーにより分離することが可能であった。化合物２１はこの方法により製造した。同様にして以下の化合物を製造した。４−アミノ−５−シアノ−７−（５（Ｒ）−Ｃ−プロピル−β−Ｄ−リボフラノシル）ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン２３ｆを４−アミノ−５−シアノ−７−（２，３，５−トリ−Ｏ−ベンゾイル−５（Ｒ）−Ｃ−プロピル−β−Ｄ−リボフラノシル）ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジンから製造した。４−アミノ−５−シアノ−７−（５（Ｒ，Ｓ）−Ｃ−エチニル−β−Ｄ−リボフラノシル）ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン（Ｒ−Ｓ比  １：１）２３ｂを４−アミノ−５−シアノ−７−（２，３，５−トリ−Ｏ−ベンゾイル−５（Ｒ，Ｓ）−Ｃ−エチニル−β−Ｄ−リボフラノシル）ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジンから製造した。４−アミノ−５−シアノ−７−（５（Ｒ，Ｓ）−Ｃ−エチニル−β−Ｄ−リボフラノシル）ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン（Ｒ−Ｓ比  １：１）２３ｄを４−アミノ−５−シアノ−７−（２，３，５−トリ−Ｏ−ベンゾイル−５（Ｒ，Ｓ）−Ｃ−エチル−β−Ｄ−リボフラノシル）ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジンから製造した。４−アミノ−５−シアノ−７−（４−ヒドロキシメチル−β−Ｄ−リボフラノシル）ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン３３ｄを４−アミノ−５−シアノ−７−（４−ベンゾイルオキソメチル−２，３，５−トリ−Ｏ−ベンゾイル−β−Ｄ−リボフラノシル）ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジンから製造した。４−アミノ−５−シアノ−７−（５（Ｒ）−Ｃ−メチル−β−Ｄ−リボフラノシル）ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン２３ａ（５’−Ｒ）を４−アミノ−５−シアノ−７−（１，２，３，５−テトラ−Ｏ−アセチル−５（Ｒ）−Ｃ−メチル−β−Ｄ−リボフラノシル）ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジンから製造した。４−アミノ−５−シアノ−７−（５（Ｓ）−Ｃ−メチル−β−Ｄ−リボフラノシル）ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン２３ａ（５’−Ｓ）を４−アミノ−５−シアノ−７−（１，２，３，５−テトラ−Ｏ−アセチル−５（Ｓ）−Ｃ−メチル−β−Ｄ−リボフラノシル）ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジンから製造した。４−アミノ−５−シアノ−７−（５−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン１０を４−アミノ−５−シアノ−７−（１，２，３−トリ−Ｏ−アセチル−５−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジンから製造した。４−アミノ−５−シアノ−７−（５（Ｒ）−Ｃ−ビニル−β−Ｄ−リボフラノシル）ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン２３ｃを４−アミノ−５−シアノ−７−（２，３，５−トリ−Ｏ−ベンゾイル−５（Ｒ）−Ｃ−ビニル−β−Ｄ−リボフラノシル）ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジンから製造した。
【００８８】
４−アミノ−５−シアノ−７−（２，３−ジ−Ｏ−メタンスルホニル−５−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル−β−Ｄ−リボフラノシル）ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジンの製造
０℃の無水ピリジン（１００ｍＬ）中のトヨカマイシン４３（５．８３ｇ，２０．０ｍｍｏｌ）の攪拌溶液に、ｔｅｒｔ−ブチルクロロジフェニルシラン（６．２ｍＬ，２４．０ｍｍｏｌ）を加えた。得られた混合物を室温で１８時間攪拌し、ついで０℃に冷却し、メタンスルホニルクロリド（３．４ｍＬ，４４．０ｍｍｏｌ）を加えた。得られた混合物を室温で２時間攪拌し、氷で冷却し、水（２ｍＬ）の添加によりクエンチし、室温で３０分間攪拌した。該溶媒を蒸発させた。残渣を酢酸エチルに溶解し、食塩水で３回洗浄し、乾燥（Ｎａ２ＳＯ４）し、濃縮した。シリカ上のクロマトグラフィー（酢酸エチル  ヘキサン  ３：２）により、８．４１ｇの表題化合物を無色固体として得た。
【００８９】
４−アミノ−５−シアノ−７−（５−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル−２，３−ジデヒドロ−２，３−ジデオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジンの製造
アルゴン下のテルル粉末（２００メッシュ、６４０ｍｇ，５．０ｍｍｏｌ）を密封し、水素化トリエチルホウ素リチウム（ＴＨＦ中１．０Ｍ，１１．２５ｍＬ，１１．２５ｍｍｏｌ）と混合した。該混合物を室温で６時間攪拌し、ついで５℃に冷却し、ＴＨＦ（１２ｍＬ）中の４−アミノ−５−シアノ−（２，３−ジ−Ｏ−メタンスルホニル−５−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル−β−Ｄ−リボフラノシル）ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン（１．４０ｇ，２．０９ｍｍｏｌ）を加えた。得られた混合物を室温で１８時間攪拌し、氷で冷却し、水（０℃、５ｍＬ）の添加によりクエンチし、室温で３０分間攪拌した。溶媒を蒸発させ、残渣を酢酸エチルで抽出した。該抽出物を濃縮し、残渣をシリカ上のクロマトグラフィー（ヘキサン中の１５％  酢酸エチル）に付して６４０ｍｇの表題化合物を無色泡として得た。
【００９０】
４−アミノ−５−シアノ−７−（２，３−ジデヒドロ−２，３−ジデオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン（４９）の製造
５℃の無水ＴＨＦ（１００ｍＬ）中の４−アミノ−５−シアノ−７−（５−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル−２，３−ジデヒドロ−２，３−ジデオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン（２．５５ｇ，５．３２ｍｍｏｌ）の攪拌溶液に、テトラブチルアンモニウムフルオリド（ＴＨＦ中１．０Ｍ，６．６ｍＬ）を加えた。得られた混合物を室温で３時間攪拌し、濃縮した。シリカ上のクロマトグラフィー（酢酸エチル中の６％  メタノール）により、１．０９ｇの表題化合物４９を無色固体として得た。
【００９１】
５−シアノ−７−（５（Ｒ）−Ｃ−メチル−β−Ｄ−リボフラノシル）ピロロ［２，３−ｄ］−４−ピリミジンの製造（２５ａ）
５５℃の水（３０ｍＬ）および酢酸（２．０ｍＬ）中の４−アミノ−５−シアノ−７−（５（Ｒ）−Ｃ−メチル−β−Ｄ−リボフラノシル）ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン（３０６ｍｇ，１．０ｍｍｏｌ）の攪拌溶液に、亜硝酸ナトリウム（５９０ｍｇ，８．５５ｍｍｏｌ）を数分割して加えた。得られた混合物を７０℃で３時間攪拌し、さらに亜硝酸ナトリウム（３００ｍｇ，４．３０ｍｍｏｌ）を加えた。該混合物を同温度で更に１８時間攪拌した。溶媒を蒸発させ、残渣をシリカ上のクロマトグラフィー（塩化メチレン中の１２％  メタノール）に付して２１０ｍｇの表題化合物２５ａ（５’−Ｒ）を無色固体として得た。同様にして以下の化合物を製造した。４−アミノ−５−シアノ−７−（５（Ｒ）−Ｃ−メチル−β−Ｄ−リボフラノシル）ピロロ［２，３−ｄ］−４−ピリミジン２５ａ（５’−Ｓ）を４−アミノ−５−シアノ−７−（５（Ｓ）−Ｃ−メチル−β−Ｄ−リボフラノシル）ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジンから製造した。４−アミノ−５−シアノ−７−（β−Ｄ−アラビノフラノシル）ピロロ［２，３−ｄ］−４−ピリミドン５８を４−アミノ−５−シアノ−７−（５−デオキシ−β−Ｄ−アラビノフラノシル）ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジンから製造した。４−アミノ−５−シアノ−７−（５−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）ピロロ［２，３−ｄ］−４−ピリミジン１１を４−アミノ−５−シアノ−７−（５−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジンから製造した。４−アミノ−５−シアノ−７−（２，３−ジデオキシ−２，３−ジデヒドロ−β−Ｄ−グリセロ−ペント−フラノシル）ピロロ［２，３−ｄ］−４−ピリミドン５０を４−アミノ−５−シアノ−７−（２，３−ジデオキシ−β−Ｄ−ペント−２−エノフラノシル）ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジンから製造した。４−アミノ−５−シアノ−７−（２，３−ジデオキシ−β−Ｄ−グリセロ−ペントフラノシル）ピロロ［２，３−ｄ］−４−ピリミドン６５を４−アミノ−５−シアノ−７−（２，３−ジデオキシ−β−Ｄ−グリセロ−ペントフラノシル）ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジンから製造した。４−アミノ−５−シアノ−７−（２−デオキシ−β−Ｄ−フラノシル）ピロロ［２，３−ｄ］−４−ピリミドン６９を４−アミノ−５−シアノ−７−（２−デオキシ−β−Ｄ−エリトロペントフラノシル）ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジンから製造した。
【００９２】
７−（５（Ｒ）−Ｃ−メチル−β−Ｄ−リボフラノシル）ピロロ［２，３−ｄ］−４−ピリミドン−５−カルボキサミドキシム（２４ａ）の製造
エタノール（５０ｍＬ）中の５−シアノ−７−（５（Ｒ）−Ｃ−メチル−β−Ｄ−リボフラノシル）ピロロ［２，３−ｄ］ピリミドン（２４０ｍｇ，０．７８４ｍｍｏｌ）、塩酸ヒドロキシルアミン（１６３ｍｇ，２．３５２ｍｍｏｌ）および炭酸カリウム（１６２ｍｇ，１．１７６ｍｍｏｌ）の攪拌懸濁液をアルゴン下で１８時間還流した。沈殿物を濾過し、温エタノールで洗浄した。濾液を濃縮し、残渣をシリカ上のクロマトグラフィー（塩化メチレン中の２０％  メタノール）に付して１７０ｍｇの表題化合物２６ａ（５’−Ｒ）を無色固体として得た。同様にして以下の化合物を製造した。４−アミノ−５−シアノ−７−（β−Ｄ−リボフラノシル）ピロロ［２，３−ｄ］−４−ピリミドン−５−カルボキサミドキシム６０を４−アミノ−５−シアノ−７−（５−デオキシ−β−Ｄ−アラビノフラノシル）ピロロ［２，３−ｄ］−４−ピリミドンから製造した。
【００９３】
４−アミノ−５−シアノ−７−（５−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）ピロロ［２，３−ｄ］−４−ピリミドン−５−カルボキサミドキシム１３を４−アミノ−５−シアノ−７−（５−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）ピロロ［２，３−ｄ］−４−ピリミドンから製造した。４−アミノ−５−シアノ−７−（２，３−ジデヒドロ−２，３−ジデオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）ピロロ［２，３−ｄ］−４−ピリミドン−５−カルボキサミドキシム５１を４−アミノ−５−シアノ−７−（２，３−ジデヒドロ−２，３−ジデオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）ピロロ［２，３−ｄ］−４−ピリミドンから製造した。４−アミノ−５−シアノ−７−（２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）ピロロ［２，３−ｄ］−４−ピリミドン−５−カルボキサミドキシムを４−アミノ−５−シアノ−７−（２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）ピロロ［２，３−ｄ］−４−ピリミドンから製造した。
【００９４】
７−（５（Ｒ）−Ｃ−メチル−β−Ｄ−リボフラノシル）ピロロ［２，３−ｄ］−４−ピリミドン−５−カルボキサミジン塩酸塩（２７ａ）の製造
水（７５ｍＬ）中の７−（５（Ｒ）−Ｃ−メチル−β−Ｄ−リボフラノシル）ピロロ［２，３−ｄ］−４−ピリミドン−５−カルボキサミドキシム（１１０ｍｇ，０．３２４ｍｍｏｌ）、塩化アンモニウム（２０ｍｇ，０．３７４ｍｍｏｌ）およびラネーニッケル（水中の５０％  スラリー，２００ｍｇ）の懸濁液を水素化装置（Ｈ２，５０ｐｓｉ）中、室温で１８時間振とうした。該触媒を濾過し、洗浄（温水）した。合わせた濾液を濃縮し、該生成物をメタノールから再結晶して１００ｍｇの表題化合物２７ａ（５’−Ｒ）を無色固体として得た。同様にして以下の化合物を製造した。４−アミノ−５−シアノ−７−（β−Ｄ−アラビノフラノシル）ピロロ［２，３−ｄ］−４−ピリミドン−５−カルボキサミドキシム塩酸塩６３を４−アミノ−５−シアノ−７−（５−デオキシ−β−Ｄ−アラビノフラノシル）ピロロ［２，３−ｄ］−４−ピリミドン−５−カルボキサミドキシムから製造した。４−アミノ−５−シアノ−７−（５−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）ピロロ［２，３−ｄ］−４−ピリミドン−５−カルボキサミジン塩酸塩１５を４−アミノ−５−シアノ−７−（５−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）ピロロ［２，３−ｄ］−４−ピリミドン−５−カルボキサミドキシムから製造した。４−アミノ−５−シアノ−７−（２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）ピロロ［２，３−ｄ］−４−ピリミドン−５−カルボキサミジン塩酸塩７０を４−アミノ−５−シアノ−７−（２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）ピロロ［２，３−ｄ］−４−ピリミドン−５−カルボキサミドキシムから製造した。
【００９５】
生物学的効果
以下の実施例は、意図される化合物の生物学的効果の幾つかを例示するために記載されている。特に、実験データは、意図される化合物が、用量依存的に、活性化誘導ＩＦＮγ、ＩＬ−２およびＴＮＦαの分泌ならびにＴ細胞の増殖を抑制するがヒトＴ細胞におけるＩＬ−４およびＩＬ−５の産生を増強することを示している。
【００９６】
４８時間の時点で最高になった、末梢Ｔ細胞に対する意図される化合物により媒介される生物学的効果は、ＰＭＡ／イオノマイシンまたはＰＨＡでの刺激により認められ、正常個体および慢性関節リウマチ患者においてサイトカインタンパク質およびｍＲＮＡのレベルで観察され、２型サイトカイン産生細胞の数を増加させる一方で１型サイトカイン産生細胞の数を減少させた。
【００９７】
さらに、意図される化合物による２型サイトカイン偏向（ｂｉａｓ）の誘導は、誘導型一酸化窒素シンターゼ、ｃ−ｍｙｃ、ＩＬ−６およびＩＬ−１ｂのｍＲＮＡ発現の減少と共に生じ（抗炎症効果を示唆する）、ヒトＴ細胞のＣＤ４＋集団において、より顕著であった。さらに、意図される化合物は、マウスリンパ節由来Ｔｈ１細胞において、Ｔｈ２サイトカイン偏向をインビトロで誘導し、ＢＡＬＢ／ｃマウスに腹腔内投与（０．３および０．６ｍｇ／ｋｇ）されると、２つの１型サイトカイン媒介急性炎症応答、すなわち、ジニトロフルオロベンゼンに対する接触過敏症およびブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌ）エンテロトキシンＢ誘発性炎症応答を抑制した。
【００９８】
これらのインビボ効果は、リンパ系器官におけるＩＬ−１０  ｍＲＮＡ発現の増強およびＩＦＮγ  ｍＲＮＡ発現の減少と関連していた。総合すると、これらのデータは、意図される化合物がインビトロおよびインビボでＴｈ２サイトカイン偏向を機能的に誘導しうることを示している。
【００９９】
ヒトＴ細胞の調製およびインビトロでの活性化
末梢血単核細胞を密度勾配遠心分離により健康なドナーから単離し、ついでＬｙｍｐｈｏｋｗｉｋ（Ｏｎｅ  Ｌａｍｂｄａ，Ｃａｎｏｇａ  Ｐａｒｋ  ＣＡ）を使用して、Ｔ細胞を富化した。プラスチックへの付着により混入単球を除去した。精製されたＴ細胞は、＞９９％  ＣＤ２＋、＜１％  ＨＬＡ−ＤＲ＋および＜５％  ＣＤ２５＋であり、ＲＰＭＩ−ＡＰ５（５％  自己血漿、１％  Ｌ−グルタミン、１％  ペニシリン／ストレプトマイシンおよび０．０５％  ２−メルカプトエタノールを含有するＲＰＭＩ１６４０培地）内で維持した。サイトカインタンパク質レベルの測定には、Ｔ細胞（体積０．２ｍｌ中に０．２×１０６細胞）を２ｎｇのホルボールミリステートアセテート＋０．１ｍｇのイオノマイシン（ＰＭＡ−ＩＯＮ、共にＣａｌｂｉｏｃｈｅｍ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡから入手）の添加により活性化し、０または１０μＭの種々のグアノシンヌクレオシドの存在下、９６ウェルプレート中、３７℃で４８時間インキュベートした。活性化後、細胞由来サイトカインの産生に関して上清を分析した。
【０１００】
細胞外サイトカイン分析
ヒトサイトカインレベルは、適当な希釈の後の細胞上清中で、ＩＦＮγおよびＩＬ−４に特異的なＥＬＩＳＡキット（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ，Ｃａｍａｒｉｌｌｏ，ＣＡ）を使用して測定した。すべてのＥＬＩＳＡの結果はｐｇ／ｍｌ単位で表されている。
【０１０１】
活性化ヒトＴ細胞における細胞外サイトカインレベルに対するピロロ−［２，３−ｄ］ピリミジンヌクレオシド類似体の効果
１型サイトカインであるＩＦＮγおよび２型サイトカインであるＩＬ−４のＰＭＡ／イオノマイシン刺激Ｔ細胞発現に対する０および１０μＭのピロロ−［２，３−ｄ］ピリミジンヌクレオシド類似体の効果を、５名のヒトドナーについて図８Ａおよび８Ｂに示す。細胞を含有しない上清中でＥＬＩＳＡによりサイトカインレベルを測定した。最も強力な効果は７−ｂ−リボフラノシル−４−オキソピロロ−［２，３−ｄ］ピリミジン−５−カルボキサミジンで観察された。この化合物は、各サイトカインの活性化対照レベルに対して、活性化ＩＬ−４産生を４９８％±８３増強し、ＩＦＮγを４３％±４抑制した。データは、活性化対照に対する割合（％）として示されている。それは、試験ヌクレオシドの存在下の活性化Ｔ細胞サイトカインレベルを未処理の活性化Ｔ細胞のサイトカインレベルで割ったものに１００を掛けた比率（％）として算出される。試験ヌクレオシドによるサイトカインレベルに対する効果が無ければ、活性化対照値に対する１００％の比率が得られるであろう。ＰＭＡ−ＩＯＮにより誘導されたサイトカイン分泌の絶対レベル（ｐｇ／ｍｌ±標準偏差）は、ＩＦＮγに関しては２２９５４±３３９１、ＩＬ−４に関しては１６２±４０であった。休止レベルは、試験した全てのサイトカインに関して＜３０ｐｇ／ｍｌであった。
【０１０２】
ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジンヌクレオシド類似体のインビトロ細胞毒性
本発明のピロロ［２，３−ｄ］ピリミジンヌクレオシド類似体は生物活性である。なぜなら、それらは何らかのレベルの細胞毒性をインビトロで示すからである。これらの研究においては、正常ヒト繊維芽細胞、ヒト前立腺癌細胞８１、ヒトメラノーマ癌細胞１４０、ヒト肺癌細胞１７７ならびにヒト卵巣癌細胞ＲおよびＮＲ（すべてＡＴＣＣから入手可能）の細胞培養に試験化合物を適用した。これらの実験においては、２０００細胞／２００μｌ培地／ウェル（９６ウェルプレート）の密度で細胞をプレーティングした。細胞のプレーティングの直後に、試験化合物を０．７８〜１００μＭの濃度範囲で該ウェルに１回適用した。７２時間の処理の後、比色細胞毒性アッセイＭＴＳを行った。集めた測定値に基づきＥＣ５０を算出し、それらを図９に示す。いくつかの化合物は、１００μＭ未満の濃度において細胞毒性の欠如を示している。そのような場合には、ＥＣ５０は＞１００と表示されている。他の場合には、ＥＣ５０は、細胞集団の５０％を損傷するのに要した試験化合物濃度を示す。
【０１０３】
ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジンヌクレオシド類似体は、インビトロで培養された細胞におけるＤＮＡ合成を用量依存的に抑制する
ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジンヌクレオシドの類似体は、ＤＮＡレベルで測定された場合のインビトロ培養ヒト細胞の増殖を抑制する。実験計画は前記と同じであった。該化合物を１回適用し、７２時間後にＤＮＡレベルを測定した。その時点で、培地の半分を培養ウェルから除去し、純粋で置換した。その後、該細胞を少なくとも１２時間にわたり−７０℃に移した。次の工程では、細胞を−７０℃から室温に戻し、１μＭのＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２を各ウェルに加えた。２時間のインキュベーションの後、蛍光シグナル（３６０〜５３０ｎｍ）を測定した。この方法では、形成したＤＮＡ−Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２複合体の存在のため、蛍光強度はＤＮＡの量に比例する。結果を図１０に示す。数字は、実験開始時（細胞のプレーティングの２時間後）のＤＮＡ量と比較したＤＮＡ量の増加の倍率を表す。未処理前立腺癌細胞および正常細胞においては、それらのＤＮＡレベルは７２時間の培養中にそれぞれ５．７８倍および４．４７倍増加した。
【０１０４】
化合物２３ａ（５’−Ｒ）および２３ａ（５’−Ｓ）はインビトロでヒト前立腺癌からのＶＥＧＦの分泌を抑制する
化合物２３ａ（５’−Ｒ）および２３ａ（５’−Ｓ）は、ヒト前立腺癌細胞ＨＴＢ８１からの血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）の分泌を強力に抑制する。ＶＥＧＦは血管新生マーカーとして認識されている。なぜなら、この分子は、インビボにおける内皮細胞の遊走および増殖ならびに微小血管形成に決定的に重要だからである。これを得るために、０．５×１０５個の該細胞を１０ｃｍ径のペトリ皿中の５ｍｌの培養培地内でプレーティングした。７２時間のプレーティングの直後に該化合物を適用した。その後、該培地を集め、ＶＥＧＦのレベルをＶＥＧＦ  Ｅｌｉｓａ  Ａｓｓａｙ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）により測定し、該培地１ｍｌ当たりのＶＥＧＦのｐｇとして表した。結果を図１１に示す。これらの結果によると、どちらの化合物も、ＶＥＧＦの分泌を用量依存的に抑制する。
【０１０５】
化合物２３ａ（５’−Ｒ）および２３ａ（５’−Ｓ）は、インビトロで培養されたヒト前立腺癌細胞からのＩＬ−８の放出を抑制する
化合物２３ａ（５’−Ｒ）および２３ａ（５’−Ｓ）は、ヒト前立腺癌細胞ＨＴＢ８１からのインターロイキン８（ＩＬ−８）の分泌に対する抑制効果を示す。ＩＬ−８は、好中球の誘引により炎症過程に関与する化学誘引物質ケモカイン（α型）のクラスに属する。ケモカインは、一般には、種々の型の癌により産生されることが知られている。癌細胞によるケモカイン産生の抑制は宿主にとって有益であることが、いくつかの研究において証明されている。前立腺癌細胞からのＩＬ−８分泌を抑制するこれらの２つの化合物の効力を証明するために、該グラフに示されている濃度の５’−Ｒおよび５’−Ｓの両方の立体配置の化合物２３ａで前立腺癌細胞ＨＴＢ８１をインビトロで処理した。該培養から集めた培地をＲ＆Ｄ  ＳｙｓｔｅｍｓからのＩＬ−８  Ｅｌｉｓａ  ＡｓｓａｙによりＩＬ−８レベルに関して分析した。集めた結果によると、図１２に示すとおり、どちらの化合物も、ＩＬ−８の分泌を用量依存的に抑制しうる。
【０１０６】
しかし、意図される化合物の生物学的効果は、前記の特定の効果に限定されるとは限らないと理解されるべきである。特に、本発明の化合物は、限局性および／または転移性癌（例えば、リンパ腫および癌腫）、良性前立腺肥大および角化症を含む種々の過剰増殖障害において細胞分裂抑制効果を著しく示すと予想される。本発明者らは、ＩＬ−４（２型サイトカイン）およびＩＦＮγ（１型サイトカイン）に対する相当な生物学的効果を見出したが、本発明の化合物は、ＩＬ−４およびＩＦＮ−γ以外のサイトカインのモジュレーションにおいても生物学的に活性であると一般に予想される。意図される化合物は、個々のサイトカインまたは一群のサイトカインの発現／分泌を増加または減少させると特に予想される。したがって、本発明の化合物は、より顕著な１型または２型応答が達成されうるよう生物の免疫系をモジュレーションしうると予想される。したがって、本発明の化合物は、ウイルスポリメラーゼのインヒビターとしての直接的作用により、および／または、特定の体液性もしくは細胞性応答に免疫系を活性化することにより間接的に、生きた系内のウイルスの力価を減少させるのに有効でありうると予想される。さらに、本発明の化合物は、同種または異種移植片に対する細胞性応答の激しさ軽減することにより、同種または異種移植片に対する免疫系の応答を軽減するのにも有用でありうると予想される。
【０１０７】
さらに記載されているインビトロおよびインビボの実施例においては、実験データは、意図される化合物が用量依存的に、ヒトＴ細胞において、活性化により誘導されるＩＦＮγ、ＩＬ−２およびＴＮＦαの分泌ならびにＴ細胞の増殖を抑制するが、ＩＬ−４およびＩＬ−５の産生を増強したことを示している。
【０１０８】
４８時間の時点で最高になった、末梢Ｔ細胞に対する意図される化合物により媒介される生物学的効果は、ＰＭＡ／イオノマイシンまたはＰＨＡでの刺激により認められ、正常個体および慢性関節リウマチ患者においてサイトカインタンパク質およびｍＲＮＡのレベルで観察され、２型サイトカイン産生細胞の数を増加させる一方で１型サイトカイン産生細胞の数を減少させた。
【０１０９】
さらに、意図される化合物による２型サイトカイン偏向の誘導は、誘導型一酸化窒素シンターゼ、ｃ−ｍｙｃ、ＩＬ−６およびＩＬ−１ｂのｍＲＮＡ発現の減少と共に生じ（抗炎症効果を示唆する）、ヒトＴ細胞のＣＤ４＋集団において、より顕著であった。さらに、意図される化合物は、マウスリンパ節由来Ｔｈ１細胞において、Ｔｈ２サイトカイン偏向をインビトロで誘導し、ＢＡＬＢ／ｃマウスに腹腔内投与（０．３および０．６ｍｇ／ｋｇ）されると、２つの１型サイトカイン媒介急性炎症応答、すなわち、ジニトロフルオロベンゼンに対する接触過敏症およびブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌ）エンテロトキシンＢ誘発性炎症応答を抑制した。
【０１１０】
これらのインビボ効果は、リンパ系器官におけるＩＬ−１０  ｍＲＮＡ発現の増強およびＩＦＮγ  ｍＲＮＡ発現の減少と関連していた。総合すると、これらのデータは、意図される化合物がインビトロおよびインビボでＴｈ２サイトカイン偏向を機能的に誘導しうることを示している。
【０１１１】
ヒトＴ細胞の調製およびインビトロでの活性化
末梢血単核細胞を密度勾配遠心分離により健康なドナーまたは慢性関節リウマチ患者から単離し、ついでＬｙｍｐｈｏｋｗｉｋ（Ｏｎｅ  Ｌａｍｂｄａ，Ｃａｎｏｇａ  Ｐａｒｋ  ＣＡ）を使用して、Ｔ細胞を富化した。プラスチックへの付着により混入単球を除去した。精製されたＴ細胞は、＞９９％  ＣＤ２＋、＜１％  ＨＬＡ−ＤＲ＋および＜５％  ＣＤ２５＋であり、ＲＰＭＩ−ＡＰ５（２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳバッファー，ｐＨ７．４、５％  自己血漿、１％  Ｌ−グルタミン、１％  ペニシリン／ストレプトマイシンおよび０．０５％  ２−メルカプトエタノールを含有するＲＰＭＩ１６４０培地）内で維持した。
【０１１２】
サイトカインタンパク質レベルの測定には、Ｔ細胞（体積１ｍｌ中に１×１０６細胞）を１０ｎｇのＰＭＡ＋０．５μｇのイオノマイシン（共にＣａｌｂｉｏｃｈｅｍ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡから入手）の添加により活性化し、０〜２０μＭのヌクレオシドの存在下、加湿インキュベーター中で３７℃で５％  ＣＯ２において、２４ウェルプレート中、４８時間までインキュベートした。活性化後、細胞由来サイトカインの産生に関して上清を分析した。増殖性および生存度の研究には、前記のプロトコールを改変して、０．２ｍｌの体積中で０．２×１０６個の細胞を使用する９６ウェルプレート形式ならびに２ｎｇのＰＭＡおよび０．１μｇのイオノマイシンでの活性化とした。別々の実験において、２ｍｌ中の５×１０６個のＴ細胞を２０ｎｇのＰＭＡ＋１μｇのイオノマイシンで活性化した。ここでは、全ＲＮＡを、６〜２４時間のインキュベーションの後にＴ細胞から単離し、ＲＴ−ＰＣＲにより分析して種々のサイトカインおよび炎症性メディエーターのｍＲＮＡレベルを測定した。また、別の実験において、ヒトＴ細胞を更に精製（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，ＢＣからの細胞濃縮試薬を使用）して、ＣＤ４＋（ＲｏｓｅｔｔｅＳｅｐヒトＣＤ４＋Ｔ細胞単離試薬を使用して＜１％  ＣＤ８＋）およびＣＤ８＋（ＲｏｓｅｔｔｅＳｅｐヒトＣＤ４＋Ｔ細胞単離試薬を使用して＜１％  ＣＤ４＋）Ｔ細胞サブセットの純粋な集団を得、その後、該全Ｔ細胞実験の場合と同様にして、１×１０６細胞／ｍｌをＰＭＡおよびイオノマイシンで活性化した。
【０１１３】
細胞外サイトカイン分析
ヒトサイトカインレベルは、適当な希釈の後の細胞上清中で、ＩＬ−２、ＩＦＮｇ、ＴＮＦａ、ＩＬ−４およびＩＬ−５に特異的なＥＬＩＳＡキット（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｃａｍａｒｉｌｌｏ，ＣＡ）を使用して測定した。マウスサイトカインレベルは、マウスＩＦＮｇおよびＩＬ−４に特異的なＥＬＩＳＡキット（Ｒ  ａｎｄ  Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）を使用し測定した。すべてのＥＬＩＳＡの結果はｐｇ／ｍｌ単位で表されている。いくつかのデータは、活性化対照に対する割合（％）として示されている。それは、試験ヌクレオシドの存在下の活性化Ｔ細胞サイトカインレベルを未処理の活性化Ｔ細胞のサイトカインレベルで割ったものに１００を掛けた比率（％）として算出される。試験ヌクレオシドによるサイトカインレベルに対する効果が無ければ、活性化対照値に対する１００％の比率が得られるであろう。あるいは、データは、活性化対照からの変化の割合（％）として示されている（［（試験ｐｇ／ｍｌ−活性化対照ｐｇ／ｍｌ）／活性化対照ｐｇ／ｍｌ］×１００％）。試験ヌクレオシドによるサイトカインレベルに対する効果が無ければ、これは０％となるであろう。
【０１１４】
ＥＬＩＳＡスポットアッセイ
ＥＬＩＳＡスポットプレート（Ｗｈａｔｍａｎ  Ｐｏｌｙｆｉｌｔｒｏｎｉｃｓ，Ｒｏｃｋｌａｎｄ，ＭＡ）を、滅菌ＰＢＳ中で一晩、捕捉抗体でコートした。ＩＦＮｇに対しては、マウスモノクローナル抗体（ｍＡｂ）抗ヒトインターフェロン−ｇ（ＩＦＮｇ、クローンＭＤ１、Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ）を４ｍｇ／ｍｌの濃度で使用した。ＩＬ−２に対しては抗ＩＬ−２捕捉抗体（４μｇ／ｍｌ、クローン５３３４．２１、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を使用し、ＩＬ−４に対しては抗ＩＬ−４捕捉抗体（クローン８Ｄ４−８，Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を５μｇ／ｍｌの濃度で使用し、ＩＬ−５に対しては抗ＩＬ−５捕捉抗体（５μｇ／ｍｌ、クローンＴＲＦＫ−５，Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を使用した。滅菌ＰＢＳで２回洗浄した後、該プレートを、１％  ＢＳＡを含有する滅菌ＰＢＳで１．５時間にわたりブロックし、ついで、滅菌ＰＢＳで３回洗浄した。２００ｍｌのＲＰＭＩ培地（１％  ｐｅｎ−ｓｔｒｅｐ、１％  グルタミン酸および１％  ＦＣＳを含有する）中の０．２ｘ１０６  ＰＢＭＣを、該ヌクレオシド（１０μＭ）の存在下または非存在下で４μｇ／ｍｌ  ＰＨＡと共に各ウェル中に配置し、３７℃、５％  ＣＯ２中、２４時間（ＩＬ−２）または４８時間（ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＦＮγ）にわたり培養した。洗浄後、ビオチン化抗リンホカイン検出抗体、すなわち、抗ヒトＩＦＮγ（４μｇ／ｍｌ、Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ）、抗ＩＬ−２（３μｇ／ｍｌ、Ｒ  ａｎｄ  Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）、抗ＩＬ−４（２μｇ／ｍｌ、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）および抗ＩＬ−５（２μｇ／ｍｌ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を一晩にわたり加えた。ビオチン化抗体の結合を評価するために、ストレプトアビジン−ホースラディッシュぺルオキシダーゼ（０．０２５％  Ｔｗｅｅｎを含むＰＢＳ中で１：２０００、１．５時間、室温、Ｖｅｃｔｏｒ、Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）を使用した。１２ｍｌの０．１Ｍ  酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ５．０）＋６ｍｌのＨ２Ｏ２中に混合された４００μｌのＡＥＣ（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ、１ｍｌのジメチルホルムアミド中に１０ｍｇ溶解）を使用して、該プレートを現像した。得られたスポットを、所定の基準によりＥＬＩＳＡスポットを検出するよう設計されたコンピューター支援ＥＬＩＳＡスポットイメージ分析装置（ＩｍｍｕｎｏＳｐｏｔ（商標）Ｉｍａｇｅ  Ａｎａｌｙｚｅｒ、Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｌｔｄ．，Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，ＯＨ）で計数した。
【０１１５】
増殖と生存度アッセイ
Ｔ細胞増殖応答は、各アッセイの最後の１６時間での［３Ｈ］−チミジン（１μＣｉ、ＩＣＮ、Ｉｒｖｉｎｅ，ＣＡ）の取り込みを測定することにより評価した。細胞をフィルター上に回収し、Ｗａｌｌａｃ  Ｂｅｔａｐｌａｔｅカウンター（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ／Ｗａｌｌａｃ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ）でのシンチレーション計数によりＤＮＡ合成を測定した。生存度は、ＦＩＴＣ−ＣＤ３（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）で染色された未処理およびヌクレオシド処理ヒトＴ細胞におけるヨウ化プロピジウム（５μｇ／ｍｌ）排除により評価した。ＣＤ３＋細胞の生存度は、ヨウ化プロピジウム（Ｒｏｃｈｏｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ社、インディアナポリス）の添加後、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳｃａｎ、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）により確認された。
【０１１６】
接触過敏症（ＣＨＳ）
接触アレルゲンであるＤＮＦＢに対する反応性を、既に記載されているとおりに（Ｉｓｈｉｉ，Ｎ．，Ｈ．Ｎａｋａｊｉｍａ，Ｓ．Ｔａｎａｋａ，Ｐ．Ｗ．Ａｓｋｅｎａｓｅ．１９９４．ＤＮＦＢ  ｃｏｎｔａｃｔ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ（ＣＳ）ｉｎ  ＢＡＬＢ／ｃ  ａｎｄ  Ｃ３Ｈ／Ｈｅ  ｍｉｃｅ．Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ，１０２：３２１）、ＢＡＬＢ／ｃマウスにおいて測定した。簡潔に説明すると、アセトン：オリーブ油（４：１）中の０．３％  ＤＮＦＢ  ２０μｌをナイーブ（ｎａｉｖｅ）マウスの剃毛腹部上に塗ることにより、マウスを感作した。ＣＨＳの最適な誘導のために、感作の５日後、該マウスを、各耳の両側において、２０μｌの０．１２％  ＤＮＦＢで攻撃した。未感作マウスにも攻撃し、各実験の対照として使用した。２４時間後、耳の厚さの測定を行い、攻撃前の値から攻撃後の値を差し引くことによりＤＮＦＢに対する応答を評価した。示されている場合には、５０μｌのＰＢＳ中６．２μｇ（０．３ｍｇ／ｋｇ）または１００μｌのＰＢＳ中１２．４μｇ（０．６ｍｇ／ｋｇ）の用量の７−β−Ｄ−リボフラノシル−４−オキソピロロ−［２，３−ｄ］ピリミジン−５−カルボキサミジンを、ＤＮＦＢでの攻撃時に腹腔内注射により投与した。７−β−Ｄ−リボフラノシル−４−オキソピロロ−［２，３−ｄ］ピリミジン−５−カルボキサミジンのこれらの用量は、予備最適化研究において最大の効果を与えた。最終的な耳の厚さの測定の後、マウスを頚部脱臼により犠牲にし、腋窩／上腕リンパ節を取り出した。単離したリンパ節細胞からの全細胞ＲＮＡを単離した後、マウスＩＦＮｇ、ＩＬ−２およびＩＬ−１０  ｍＲＮＡレベルに関してモニターするためにＲＴ−ＰＣＲおよびサザンブロット分析を行った。
【０１１７】
インビボでのブドウ球菌エンテロトキシンＢ処理
各群４匹の３群のマウスに、ＳＥＢ（用量：５０μｇ／マウス）を第０日に腹腔内注射した。ＳＥＢの注射の１時間前に、１つの群には、６．２μｇの７−β−Ｄ−リボフラノシル−４−オキソピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−５−カルボキサミジン（０．３ｍｇ／ｋｇ）を、また１つの群には、１２．４μｇの７−β−Ｄ−リボフラノシル−４−オキソピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−５−カルボキサミジン（０．６ｍｇ／ｋｇ）を、共に５０μｌのＰＢＳ中にて腹腔内注射した。７−β−Ｄ−リボフラノシル−４−オキソピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−５−カルボキサミジンの０．６ｍｇ／ｋｇ用量が、予備最適化研究において最大の効果を与えた。２４時間後、すべてのマウスを、適当な用量の吸入麻酔薬Ｐｅｎｔｈｒａｎｅ（Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｓ，Ｎ．Ｃｈｉｃａｇｏ，ＩＬ）で麻酔し、心臓穿刺により除血して全血を得、脾臓を取り出した。ＡＣＫ細胞溶解バッファー（０．１５Ｍ  ＮＨ４Ｃｌ、１ｍＭ  ＫＨＣＯ３および０．１ｍＭ  Ｎａ２ＥＤＴＡ、ｐＨ７．２〜７．４に調節し、濾過したもの）で混入赤血球を除去した後の個々の脾臓から、脾細胞懸濁液を調製した。単離した脾細胞からの全細胞ＲＮＡの単離の後、マウスＩＦＮγ、ＩＬ−２およびＩＬ−１０ならびにｉＮＯＳ  ｍＲＮＡレベルに関してモニターするためにＲＴ−ＰＣＲおよびサザンブロット分析を行った。血清を凝固血から得、一酸化窒素生成の測定に使用した。一酸化窒素の生成は、その安定な最終生成物である亜硝酸塩および硝酸塩を測定することにより評価した。全亜硝酸塩／硝酸塩レベルは、硝酸レダクターゼ酵素反応による硝酸塩から亜硝酸塩への還元、およびそれに続く、Ｇｒｉｅｓｓ試薬による全亜硝酸塩から紫色のアゾ化合物への還元に基づく比色法（Ｓｉｇｍａ）により測定した。
【０１１８】
サイトカインｍＲＮＡの分析
Ｔｒｉｚｏｌ試薬（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を使用して、全細胞ＲＮＡを抽出した。オリゴ（ｄＴ）１２−１８プライマーおよびＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）逆転写酵素を使用して、ｃＤＮＡ合成反応を行った。ＰＣＲ反応は（ＧｅｎｅＡｍｐＰＣＲキット、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｉｍｅｒ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）、ｃＤＮＡ、ｄＮＴＰ（それぞれ２００μＭ）、０．５μＭの各プライマーペアおよび１．２５単位のＴａｑポリメラーゼを含有する５０μｌの混合物よりなるものであった。ヒトＩＬ−２、ＩＬ−１０、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−１ｂ、ＩＦＮｇ、ｃ−ｍｙｃ、ＩＬ−２Ｒ、ＣＤ４０Ｌ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）、ｉＮＯＳ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）およびｐＨＥ７リボソーム遺伝子に対するプライマーを使用した。典型的な増幅条件は、９４℃で５分間の変性および６０℃で５分間のアニール、ならびにそれに続く、７２℃で１．５分間、９４℃で４５秒間および６０℃で４５秒間の３５サイクル、ならびに７２℃で１０分間の最終伸長を含むものであった。マウスＩＬ−２、ＩＦＮγおよびβ−アクチンに対するプライマーはＳｔｒａｔａｇｅｎｅから、そしてマウスＩＬ−１０はＣｌｏｎｔｅｃｈから入手した。Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅマウスサイトカインプライマーの増幅条件は、９４℃で５分間の変性および６０℃で５分間のアニール、ならびにそれに続く、７２℃で１．５分間、９４℃で４５秒間および６０℃で４５秒間の３５サイクル、ならびに７２℃で１０分間の最終伸長であった。ＩＬ−１０については、ＰＣＲ条件は、９４℃で５分間の変性、ならびにそれに続く、９４℃で４５秒間、６０℃で４５秒間および７２℃で２分間の３５サイクル、ならびに７２℃で７分間の最終伸長であった。
【０１１９】
各遺伝子産物に関して、最適なｃＤＮＡ希釈度を実験的に決定し、それは、飽和状態より十分に低い検出可能な濃度を与えるｃＤＮＡ希釈度と定められた。ＰＣＲ産物を、臭化エチジウムを含有する２％  アガロース上で分離し、０．４Ｍ  ＮａＯＨおよび０．２Ｍ  ＮａＣｌを使用してＨｙｂｏｎｄＮ＋膜（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）上に一晩にわたり固定化した。元のプライマー（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）から、あるいは個々のＰＣＲ産物（ヒトｉＮＯＳ，マウスＩＬ−１０、ヒトｐＨＥ７）内の中央領域に相補的となるよう設計された特異的プローブから生成した３２Ｐ−γＡＴＰ標識オリゴヌクレオチドプローブで、ブロットをハイブリダイズさせた。ｐＨＥ７センスプライマーから生成したプローブでのハイブリダイゼーションの後、同等のローディングを評価した。ついで、洗浄したブロットをＰｈｏｓｐｈｏｒＩｍａｇｅｒ（Ｂｉｏｒａｄ，Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＣＡ）を使用して分析した。サイトカインまたは他の試験ｍＲＮＡにおける相対的変化をデンシトメトリー測定値として得、ハウスキーピング遺伝子ｐＨＥ７のｍＲＮＡに対する関心のあるｍＲＮＡのデンシトメトリー比率を測定することにより投入ＲＮＡにおける有りうるばらつきに関して標準化した。
【０１２０】
Ｔｈ１およびＴｈ２  Ｔ細胞の生成
８〜１０匹のＢＡＬＢ／ｃマウスまたはＣ５７ＢＬ／６マウスを頚部脱臼により犠牲にし、腋窩／上腕および膝窩リンパ節を取り出し、リンパ節細胞懸濁液を各動物から調製し、プールした。ＳｔｅｍＳｅｐマウスＴ細胞濃縮試薬（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、各マウス系統のプール化リンパ節調製物からマウスＣＤ４＋  Ｔ細胞を単離した。Ｔｈ１およびＴｈ２細胞の作製は、既に記載されている（Ａｕｓｔｒｕｐ，Ｆ．，Ｄ．Ｖｅｓｔｗｅｂｅｒ，Ｅ．Ｂｏｒｇｅｓ，Ｍ．Ｌｏｈｎｉｎｇ，Ｒ．Ｂｒａｕｅｒ，Ｕ．Ｈｅｒｚ，Ｈ．Ｒｅｎｚ，Ｒ．Ｈａｌｌｍａｎｎｎ，Ａ．Ｓｃｈｅｆｆｏｌｄ，Ａ．Ｒａｄｂｒｕｃｈ，Ａ．Ｈａｍａｎｎ．１９７７．Ｐ−ａｎｄ  Ｅ−ｓｅｌｅｃｔｉｎ  ｍｅｄｉａｔｅ  ｒｅｃｒｕｉｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｔ−ｈｅｌｐｅｒ−１  ｂｕｔ  ｎｏｔ  Ｔ−ｈｅｌｐｅｒ−２  ｃｅｌｌｓ  ｉｎｔｏ  ｉｎｆｌａｍｅｄ  ｔｉｓｓｕｅｓ．Ｎａｔｕｒｅ．３８５：８１）のと同様のプロトコールを用いて行った。簡潔に説明すると、細胞を、示されている組換えマウスサイトカインの存在下の最適量（１ウェルあたり１ｍｇ）の抗ＣＤ−３ｍＡｂ（クローン１４５−２Ｃ１１，Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）およびサイトカインＡｂ（すべてＰｈａｒｍｉｎｇｅｎからのもの）（ＩＬ−２単独，５０Ｕ／ｍｌ；Ｔｈ１：ＩＬ−２，５０Ｕ／ｍｌ；ＩＬ−１２，１０００Ｕ／ｍｌ；１０ｍＭ  ＩＣＮ１０７７６の存在下および非存在下のＩＦＮｇ；Ｔｈ２：ＩＬ−２，５０Ｕ／ｍｌ；ＩＬ−４，１０ｎｇ／ｍｌ；抗−ＩＦＮｇ（クローンＸＭＧ１．２）１０ｍｇ／ｍｌ）でコートされた２４ウェル組織培養プレート上で活性化し、４日間培養した。細胞を、培地の交換を行うことなく新鮮なプレートに移し、さらに４８時間インキュベートし、ついで３回洗浄し、新鮮な培地を加え、一晩インキュベートし、ついでＰＭＡ（１０ｎｇ）およびイオノマイシン（０．５ｍｇ）で５時間にわたり再刺激した。ついで、細胞を含有しない上清をマウスＩＬ−４およびＩＦＮｇレベルのＥＬＩＳＡ測定に使用した。再刺激しなかった細胞はＩＬ−４およびＩＦＮγに対して陰性であり、このことは、培養中に添加したサイトカインが保持されなかったことを示している。
【０１２１】
統計的分析
一元配置または二元配置分散分析を用いて、傾向分析を行った。適当な場合には、統計的有意性を、Ｓｔｕｄｅｎｔ−Ｎｅｗｍａｎ−Ｋｅｕｌｓの多重比較法により評価した。
【０１２２】
結果
活性化ヒトＴ細胞によるサイトカインおよび増殖応答に対するＩＣＮ１０７６６の用量効果
本発明者らは、活性化ヒト末梢Ｔ細胞と共に７−β−Ｄ−リボフラノシル−４−オキソピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−５−カルボキサミジン（ＩＣＮ１０７７６）を４８時間インキュベートすることにより誘導された、１型および２型サイトカインのプロフィールとＴ細胞増殖応答に対する影響とを調べた。０．２〜２０μＭの用量範囲では、ＩＣＮ１０７７６は、２型サイトカインであるＩＬ−４およびＩＬ−５の、ＰＭＡ−イオノマイシン（ＰＭＡ−ＩＯＮ）による誘導レベルを用量依存的に増加させ、１０μＭでの最大増加はそれぞれ１６６％および７７％であった（図１３Ｂ、１３Ｄ）。示されているデータは５名のドナーの代表例である。さらに、同じ用量範囲で、同様に用量依存的に、ＩＣＮ１０７７６は、１型サイトカインであるＩＬ−２、ＩＦＮγおよびＴＮＦαのＰＭＡ−ＩＯＮ誘導レベルを劇的に抑制し（２０μＭでの最大抑制はそれぞれ６２％、７２％および７８％であった（図１３Ａ、１３Ｃ、１３Ｅ））、Ｔ細胞増殖を相当に抑制した（最大抑制は２０μＭで９９％であった（図１３Ｆ））。また、テトラゾリウム塩ＭＴＴがミトコンドリアデヒドロゲナーゼによりホルマザン染料へと変換されることに基づく比色法（ＭＴＴ細胞増殖キットＩ，Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）（５４０ｎｍにおいて検出可能）を用いて、もう１つの増殖アッセイを行った。このアッセイを用いた場合にも、ＩＣＮ１０７７６はＴ細胞増殖を劇的に抑制し（データ非表示）、このことは、他のヌクレオシド類似体に関して示されているのと同様に、ＩＣＮ１０７７６による効果がチミジンの取り込みの干渉によるものではないことを示している。ＰＨＡで刺激したＴ細胞およびＰＢＭＣにおいて、サイトカインのモジュレーションに対する同様の効果が見られた（データ非表示）。
【０１２３】
第２の実験系においては、ＰＭＡ−ＩＯＮ単独または２．５もしくは１０μＭのＩＣＮ１０７７６もしくはそのＬ−エナンチオマーＩＣＮ１７４６５の存在下で６時間または２４時間にわたりＴ細胞を活性化した後、ＲＮＡの単離およびＲＴ−ＰＣＲ分析を行うことにより１型および２型サイトカインｍＲＮＡのレベルを測定した。本発明者らは、ＩＣＮ１０７７６を増量するに伴い、ＩＬ−４  ｍＲＮＡが増加し、同時にＩＦＮγおよびＴＮＦα  ｍＲＮＡが減少することを観察した（図１４、３名のドナーのうちの代表例のデータを示した）。興味深いことに、ＩＣＮ１０７７６のＬ−エナンチオマーであるＩＣＮ１７４６５においては、これらのサイトカインの活性化レベルの同様のモジュレーションは観察されず、このことは、生物活性には、Ｄ−リボース糖部分が不可欠であることを示している（図１４）。
【０１２４】
第３の実験系においては、ＰＨＡ単独または１０μＭのＩＣＮ１０７７６もしくはそのＬ−エナンチオマーＩＣＮ１７４６５の存在下、特異的サイトカイン抗体が結合したＥＬＩＳＡスポットプレート上でＰＢＭＣを２４〜４８時間にわたり活性化した。ついで、特異的サイトカインを産生する細胞の数を、既に記載されているとおりに測定した。ＩＣＮ１０７７６の存在下では、ＩＬ−２およびＩＦＮγ産生細胞数の劇的な減少が観察されたが、Ｌ−エナンチーマーＩＣＮ１７４６５の存在下では観察されなかった（図１５Ａ〜Ｂ）。逆に、ＩＣＮ１０７７６は、ＩＬ−４およびＩＬ−５産生細胞の数を共に実質的に増加させたが、Ｌ−エナンチオマーＩＣＮ１７４６５はそれらを増加させなかった（図１５Ｃ〜Ｄ）。
【０１２５】
総合すると、これらデータは、ＩＣＮ１０７６６が用量依存的に、２型サイトカインレベルを上昇させる一方で、１型サイトカイン産生およびＴ細胞増殖の両方を減少させることを示している。サイトカイン応答に対するＩＣＮ１０７７６の効果は、タンパク質およびｍＲＮＡのレベルで観察され、特異的サイトカイン産生細胞数に影響を及ぼした。さらに、２型サイトカインの偏向誘導はＤ−リボシル化を要した。なぜなら、このヌクレオシドのＬ−エナンチオマーは同様の生物活性を示さなかったからである。
【０１２６】
生存度、サイトカイン応答および活性化ヒトＴ細胞増殖に対するＩＣＮ１０７７６の一過性効果
本発明者らは、１型サイトカイン発現の抑制およびＴ細胞増殖応答の阻害が単なるＩＣＮ１０７７６のＴ細胞に対する毒性の結果であるかどうかを評価した。毒性がこれらの観察結果の原因であれば、Ｔ細胞の生存度はインキュベート時間およびＩＣＮ１０７７６の用量の両者に影響されるであろう。本発明者らは、２０μＭ  ＩＣＮ１０７７６と共に４８時間インキュベートした後、生存度が休止ＣＤ３＋  Ｔ細胞において９５％から８５％へと減少することを、ヨウ化プロピジウム排除分析を用いて観察した（図１６Ａ〜Ｂ）。ヌクレオシド未処理のＰＭＡ−ＩＯＮ活性化ＣＤ３＋  Ｔ細胞において、８時間では９１±１％、２４時間では８８±２％、４８時間では８３±１％というように生存度の一過性減少が観察されたが、これらの数値の有意差は、ＩＣＮ１０７７６の０．２〜２０μＭの用量範囲のヌクレオシド存在下では見出されなかった（図１６Ｃ）。これらのデータは、生存度における僅かな減少が、おそらく、Ｔ細胞の活性化誘導アポトーシスによって誘導されたものであり、該ヌクレオシドによる直接的な毒性効果ではないことを示唆している。さらに、ＩＣＮ１０７７６とのインキュベーションの一過性効果はＴ細胞増殖（図１６Ｄ）およびＩＦＮγ分泌（図１６Ｆ）において用量依存的減少を示し、また４８時間において最大抑制が見られた。同様に、ＩＬ−４においても、用量依存的最大促進は４８時間において観察された（図１６Ｅ）。これらのデータは、ＩＣＮ１０７７６での処理の後で観察される生物学的効果がインビトロ毒性の結果ではなく、また、４８時間のインキュベーションの後に最大効果を有することを示した。４８時間以後の効果の減少は、脱リン酸化または脱リボシル化による不活性分解産物への該ヌクレオシドの代謝に関連づけられうる。
【０１２７】
正常ドナーおよび慢性関節リウマチ患者からの活性化末梢Ｔ細胞におけるＴＮＦα、ＩＦＮγおよびＩＬ−４産生に対するＩＣＮ１０７７６の効果の比較
慢性関節リウマチ患者においては、正常ドナーと比較して、末梢Ｔ細胞の２型表現型へのインビトロ分化が損なわれることが既に示されている（Ｂｅｒｇ，Ｄ．Ｊ．，Ｍ．Ｗ．Ｌｅａｃｈ，Ｒ．Ｋｕｈｎ，Ｋ．Ｒａｊｅｗｓｋｉ，Ｗ．Ｍｕｌｌｅｒ，Ｎ．Ｊ．Ｄａｖｉｄｓｏｎ，Ｄ．Ｒｅｎｎｉｃｋ，１９９５．Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ  １０  ｂｕｔ  ｎｏｔ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ  ４  ｉｓ  ａ  ｎａｔｕｒａｌ  ｓｕｐｐｒｅｓｓａｎｔ  ｏｆ  ｃｕｔａｎｅｏｕｓ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８２：９９）。ここで、本発明者らは、１６名の正常ドナーおよび１６名のＲＡ患者のＰＭＡ−ＩＯＮ活性化末梢Ｔ細胞からの活性化サイトカインプロフィールに対するＩＣＮ１０７７６の効果を比較した。本発明者らは、１０μＭ  ＩＣＮ１０７７６により誘導される２型サイトカイン偏向が正常ドナーおよびＲＡ患者の両方からの活性化末梢Ｔ細胞において生じることを、分泌ＩＦＮγレベルの減少（それぞれ４３％および６３％、ｐ＝０．０００８  ＩＣＮ１０７７６＜未処理群およびＩＣＮ１７４６５群）およびＩＬ−４産生の増加（それぞれ２６６％および１９２％、ｐ＜０．０００１  ＩＣＮ１０７７６＞未処理群およびＩＣＮ１７４６５群）による評価で観察した（図１７Ａ、左パネル）。サイトカイン応答は、正常群において、有意に、より大きかったが（ｐ＜０．０００１）、ＩＣＮ１０７７６により誘導される２型サイトカイン偏向の大きさにおける有意差は、どちらの群においても認められなかった（図１７Ａ、左パネル）。末梢Ｔ細胞を１０μＭ  ＩＣＮ１７４６５（ＩＣＮ１０７７６のＬ−エナンチオマー）にさらした後は、どちらの群においても、活性化サイトカインプロフィールに対する同様の効果は観察されなかった（図１７Ａ、右パネル）。別々の実験において、正常ドナーおよびＲＡ患者の両方からのＰＭＡ−ＩＯＮ刺激末梢Ｔ細胞の活性化サイトカインｍＲＮＡプロフィールを、１０μＭ  ＩＣＮ１０７７６およびＩＣＮ１７４６５の存在下および非存在下において評価した。前記の分泌型サイトカインタンパク質のデータで認められたのと同様に、ＩＣＮ１０７７６は、両対象群からの末梢Ｔ細胞において、ＩＬ−４ｍＲＮＡレベルを上昇させＩＦＮγおよびＴＮＦαを抑制したが、ＩＣＮ１７４６５はそれらを引き起こさなかった（図１７Ｂ）。したがって、タンパク質およびｍＲＮＡの両方のレベルにおける、ＩＣＮ１０７７６による２型サイトカイン偏向誘導は、末梢血Ｔ細胞における一般的現象を表し、ＲＡ患者からの末梢Ｔ細胞においても損なわれないらしい。
【０１２８】
炎症性および抗炎症性メディエーターへのＩＣＮ１０７７６媒介サイトカイン応答の影響
１型サイトカイン偏向は一般には炎症性応答を誘導し、一方、２型サイトカイン偏向は通常は抗炎症性応答を引き起こすため、本発明者らは、活性化ヒトＴ細胞における１型および２型サイトカインのｍＲＮＡレベルを評価し、これらの発現を、同じドナーからの細胞における或る決定的に重要な抗炎症性または炎症性メディエーターのｍＲＮＡレベルと比較した。本発明者らは、ＩＣＮ１０７７６が、１型（ＩＦＮγ、ＴＮＦαおよびＩＬ−２の抑制）および２型サイトカイン（ＩＬ−４の促進）に影響を及ぼす以外に、抗炎症性サイトカインであるＩＬ−１０の促進を誘導し、ＩＬ−６およびＩＬ−１βという２つの炎症性サイトカインのレベルを抑制することも観察した。さらに、抗炎症性メディエーターである一酸化窒素を産生する酵素である誘導型一酸化窒素シンターゼ（ｉＮＯＳ）の発現の付随的減少も観察された（図１８）。さらに、増殖中のリンパ球においてアップレギュレーションされる遺伝子である癌原遺伝子ｃ−ｍｙｃが抑制されたことから、ＩＣＮ１０７７６による抗増殖効果が明らかとなった（図１８）。これらのデータは、ＩＣＮ１０７７６処理により惹起された、２型サイトカイン応答の増強および１型サイトカイン応答の減弱が、末梢Ｔ細胞における著しい抗増殖効果と抗炎症性環境の増強とを引き起こすことを示している。
【０１２９】
ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞サブセットにおける活性化サイトカイン応答に対するＩＣＮ１０７７６の影響
ヘルパーＴ（ＣＤ４＋）および細胞傷害性（ＣＤ８＋）Ｔ細胞サブセットは共に、外来抗原か自己抗原かには無関係に抗原に対する免疫応答において重要な役割を果たしている。両サブセットは、１型または２型サイトカインを産生するよう分化しうる。ＣＤ４＋細胞およびＣＤ８＋細胞は、自己免疫の病原性と病原体に対する防御応答との両方において別々の役割を果たすため、これらの２つのＴ細胞サブセットにおけるＩＣＮ１０７７６による２型サイトカイン偏向の誘導の効果の違いを区別することが重要である。したがって、本発明者らは、ＩＣＮ１０７７６により媒介される活性化サイトカインの応答を、同じドナーからの単離されたＣＤ４＋細胞およびＣＤ８＋細胞ならびに全Ｔ細胞において比較した。ＩＣＮ１０７７６の存在下（黒塗り棒グラフ）では、ＰＭＡ−ＩＯＮでの４８時間の刺激に、未処理活性化対照（付点棒グラフ）と比較して、分泌ＩＬ−４レベルは、すべてのＴ細胞群において有意に増加したが、１７４６５の存在下（線影付き棒グラフ）では増加しなかった（ｐ＜０．０００１  ＩＣＮ１０７７６＞未処理およびＩＣＮ１７４６５）（図１９）。また、ＩＦＮγレベルは、３つすべてのＴ細胞群において、活性化対照またはＩＣＮ１７４６５処理群と比較して有意に減少した（ｐ＜０．０００１）。驚くべきことに、ＩＣＮ１０７７６により媒介される、ＩＬ−４の増加は、ＣＤ４＋  Ｔ細胞において最も劇的であった（活性化対照に対して９９４％の増加であり、一方、ＣＤ８＋  Ｔ細胞および全Ｔ細胞においてはそれぞれ２２８％および３２０％の増加であった；ｐ＜０．０３）。さらに、ＩＣＮ１０７７６によるＩＦＮγの抑制は、３つすべてのＴ細胞群において顕著であったものの、この場合もＣＤ４＋  Ｔ細胞において遥かに劇的であった（活性化対照に対して８１％の減少であり、一方、ＣＤ８＋  Ｔ細胞および全Ｔ細胞においてはそれぞれ３７％および５２％の減少であった；ｐ＜０．０５）（図１９）。ＩＣＮ１７４６５での処理の後には、３つすべてのＴ細胞群において、同様の抑制効果は全く観察されなかった。これらのデータは、ＣＤ４＋  Ｔ細胞が、ＩＣＮ１０７７６によるサイトカインモジュレーションに最も感受性であったことを示している。それはまた、ＣＤ８＋  Ｔ細胞が、ＩＣＮ１０７７６により媒介される効果に、より抵抗性である可能性があり、ＩＣＮ１０７７６により誘導される２型サイトカイン偏向を減弱する調節シグナルをＣＤ４＋  Ｔ細胞に実際に与えうることを示唆している。
【０１３０】
マウスＴｈ１細胞の生成に対するＩＣＮ１０７７６の効果
本発明者らは、マウスリンパ系Ｔ細胞Ｔｈ１  Ｔ細胞を通常は生成する条件下においてもＩＣＮ１０７７６が２型サイトカイン偏向を誘導しうるか否かを評価した。ＢＡＬＢ／ｃおよびＣ５７ＢＬ／６リンパ節Ｔ細胞を単離し、既に記載されているとおりに（Ａｕｓｔｒｕｐ，Ｆ．，Ｄ．Ｖｅｓｔｗｅｂｅｒ，Ｅ．Ｂｏｒｇｅｓ，Ｍ．Ｌｏｈｎｉｎｇ，Ｒ．Ｂｒａｕｅｒ，Ｕ．Ｈｅｒｚ，Ｈ．Ｒｅｎｚ，Ｒ．Ｈａｌｌｍａｎｎ，Ａ．Ｓｃｈｅｆｆｏｌｄ，Ａ．Ｒａｄｂｒｕｃｈ，Ａ．Ｈａｍａｎｎ，１９９７．Ｐ−ａｎｄ  Ｅ−ｓｅｌｅｃｔｉｎ  ｍｅｄｉａｔｅ  ｒｅｃｒｕｉｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｔ−ｈｅｌｐｅｒ−１  ｂｕｔ  ｎｏｔ  Ｔ−ｈｅｌｐｅｒ−２  ｃｅｌｌｓ  ｉｎｔｏ  ｉｎｆｌａｍｅｄ  ｔｉｓｓｕｅｓ．Ｎａｔｕｒｅ．３８５：８１）、プレートに結合した抗ＣＤ３  ＡｂならびにＩＬ−２、ＩＦＮγおよびＩＬ−１２の存在下での初期インキュベーションの後に、Ｔｈ１細胞を生成させた。これらのＴｈ１細胞は再刺激の際に、抗ＣＤ３  ＡｂおよびＩＬ−２処理のみの場合と比較して低レベルのＩＬ−４および相当な量のＩＦＮγを分泌した（図２０）。しかし、Ｔｈ２細胞において観察されているのと同様に、最初のインキュベーション期中のＩＣＮ１０７７６とのコインキュベーションは、これらのマウスＴ細胞に高レベルのＩＬ−４および低レベルのＩＦＮγを生成させた（抗ＣＤ３  ＡｂならびにＩＬ−２、ＩＬ−４および抗ＩＦＮγで処理されたＴ細胞において再刺激後に生成した）（図２０）。これらの観察は両方のマウス系統において一致した。総合すると、これらのデータは、ＩＣＮ１０７７６が、Ｔｈ１細胞の生成を促す条件中でさえもＴｈ２細胞の生成を誘導しうることを示している。
【０１３１】
ＩＣＮ１０７７６投与後の接触過敏症応答の抑制はマウスリンパ節細胞におけるＩＬ−１０の発現の増強ならびにＩＬ−２およびＩＦＮγの発現の減弱と関連している
既に記載されているとおりに（Ｉｓｈｉｉ，Ｎ．，Ｋ．Ｔａｋａｈａｓｈｉ，Ｈ．Ｎａｋａｊｉｍａ，Ｓ．Ｔａｎａｋａ，Ｐ．Ｗ．Ａｓｋｅｎａｓｅ．１９９４．ＤＮＦＢ  ｃｏｎｔａｃｔ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ（ＣＳ）ｉｎ  ＢＡＬＢ／ｃ  ａｎｄ  Ｃ３Ｈ／Ｈｅ  ｍｉｃｅ．Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．１０２：３２１）、ＤＮＦＢ感作ＢＡＬＢ／ｃマウスにおいて、０．２％  ＤＮＦＢでの耳攻撃の後に接触過敏症（ＣＨＳ）応答を惹起した。図２１は、ＤＮＦＢ感作およびナイーブマウスにおいて並びに０．３ｍｇ／ｋｇおよび０．６ｍｇ／ｋｇ  ＩＣＮ１０７７６で処理されたＤＮＦＢ感作マウスにおいて測定した、攻撃後の耳腫脹測定結果を示す。この代表的実験においては、攻撃の２４時間後における０．３ｍｇ／ｋｇ用量での４２％および０．６ｍｇ／ｋｇ用量での６８％の耳の厚さの平均減少により示されるとおり、攻撃時のＩＣＮ１０７７６の腹腔内注射はＤＮＦＢに対するＣＨＳ応答を用量依存的に著しく抑制した（ＣＨＳの抑制は、ＤＮＦＢで攻撃された未感作マウス（ナイーブ）における応答を差し引いた後に算出した）。アセトン：オリーブ油で攻撃されたＤＮＦＢ感作マウスまたはアセトン：オリーブ油で感作されＤＮＢで攻撃されたマウスにおいては、攻撃後の耳の厚さにおける実質的変化は全く観察されなかった。また、図２２に示すとおり、ＩＣＮ１０７７６処理ＤＮＦＢ感作マウスにおけるリンパ節細胞では、ＤＮＦＢ感作のみのマウスの場合と比較して、マウスＩＬ−１０のｍＲＮＡ発現は著しく増強されたが、ＩＬ−２およびＩＦＮγ  ｍＲＮＡレベルは実質的に減弱された。総合すると、これらのデータは、ＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるインビボＣＨＳ応答の減弱が、ＤＮＦＢに対するＣＨＳ応答における主要調節サイトカインであるＩＬ−１０の増加、および共にＣＨＳ応答の重要なメディエーターであるＩＬ−２およびＩＦＮγの抑制と関連していることを示している。
【０１３２】
インビボにおけるＩＣＮ１０７７６投与後の一酸化窒素の放出により評価した場合のＳＥＢ誘導性炎症応答の抑制は、マウスＩＬ１０発現の増強およびＩＦＮγ発現の減弱と関連している。
【０１３３】
既に記載されているとおりに（Ｔａｍ，Ｒ．Ｃ．，Ｋ．Ｒａｍａｓａｍｙ，Ｊ．Ｂａｒｄ，Ｂ．Ｐａｉ，Ｃ．Ｌｉｍ，Ｄ．Ｒ．Ａｖｅｒｅｔｔ．２０００．Ｔｈｅ  ｒｉｂａｖｉｒｉｎ  ａｎａｌｏｇ  ＩＣＮ  １７２６１  ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅｓ  ｒｅｄｕｃｅｄ  ｔｏｘｉｃｉｔｙ  ａｎｄ  ａｎｔｉｖｉｒａｌ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｗｉｔｈ  ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂｏｔｈ  ｉｍｍｕｎｏｍｏｄｕｌａｔｏｒｙ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ａｎｄ  ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｓｅｒｕｍ  ａｌａｎｉｎｅ  ａｍｉｎｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  ｌｅｖｅｌｓ．Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ．Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．４４：１２７６）、５０μｇのＳＥＢでの腹腔内注射の後、ＢＡＬＢ／ｃマウスにおいてＳＥＢ誘導性炎症応答を惹起した。図２３Ａは、０、０．３ｍｇ／ｋｇまたは０．６ｍｇ／ｋｇのＩＣＮ１０７７６で処理したマウスにおいて測定した、ＳＥＢ攻撃後の全血清亜硝酸塩測定結果を示す。このそれぞれの実験においては、攻撃の２４時間後の０．３ｍｇ／ｋｇ用量で５４％および０．６ｍｇ／ｋｇ用量で７８％の血清亜硝酸塩レベルの平均減少により示されるとおり、攻撃時のＩＣＮ１０７７６の腹腔内投与はＳＥＢに対する炎症応答を用量依存的に著しく抑制した。また、図２３Ｂに示すとおり、ＩＣＮ１０７７６処理ＳＥＢ攻撃マウスの脾細胞においては、ＳＥＢ攻撃のみのマウスの場合と比較して、マウスＩＬ−１０のｍＲＮＡ発現は著しく増強されたが、ＩＦＮγ  ｍＲＮＡレベルは実質的に減弱された。総合すると、これらのデータは、ＩＣＮ１０７７６によるＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるインビボＳＥＢ誘導性炎症応答の減弱が、ＳＥＢ誘導性炎症における主要調節サイトカインである抗炎症性サイトカインＩＬ１０の上昇、およびＳＥＢ誘導性炎症応答の重要なメディエーターであるＩＦＮγの抑制と関連していたことを示している。
【０１３４】
ＩＣＮ１０７７６をそのＨＣｌ塩（ＩＣＮ１７７３９；７−（β−Ｄ−リボフラノシル）ピロロ［２，３−ｄ］−４−ピリミドン−５−カルボキサミジン塩酸塩）で置換した場合にも、同様のデータが得られる。図２４は、ＰＨＡ刺激Ｔ細胞における１型サイトカインの有意な減少、および２型サイトカインの産生の有意な増加を示す。ヒトＴ細胞の調製および刺激は前記と実質的に同じ方法で行った。興味深いことに、ＩＣＮ１０７７６のＬ−異性体（ＩＣＮ１７４６５）は、ＩＣＮ１７７３９の効果とは無関係な効果を与えるらしい。
【０１３５】
同様に、図２５に示すとおり、ＩＣＮ１７７３９は用量依存的にＴ細胞増殖に対して同様の効果を与える。対照であるＩＣＮ１７４６５は、前記と同様の条件下、示されている濃度範囲においては見掛け上の抑制効果を何ら与えない。図１８に示す実験に対応する実験において、ＩＣＮ１７３３９は、抗炎症および抗増殖応答の誘導を示すことを明らかに示した（図２６）。
【０１３６】
興味深いことに、ＩＣＮ１７７３９は、マウスＣＤ４＋細胞においてＴｈ１応答を抑制することが可能であった。図２７は、２つの独立した実験（ＢＡＬＢ／ｃマウスでの第１実験、Ｃ５７ＢＬ／６での第２実験）からの結果を示し、ここで、Ｔｈ１細胞はＩＬ−２、ＩＦＮ−γおよびＩＬ−１２で誘導された。そのような細胞は、ＩＣＮ１７７３９が与えられた場合には、ＩＣＮ１７７３９の非存在下でのインキュベーションと比較して、ＩＬ−４産生を有意に増加させた。ＩＬ−２、ＩＬ−４および抗ＩＦＮ−γで誘導されたＴｈ２細胞は強力なＩＬ−４分泌を示し、一方、ＩＬ−２での誘導は中等度の増加を示した。同様に、誘導Ｔｈ１細胞は、ＩＣＮ１７７３９が与えられた場合には、ＩＣＮ１７７３９の非存在下のインキュベーションと比較して、ＩＦＮ−γの産生を有意に減少させ、ＩＬ−２、ＩＬ−４および抗ＩＦＮ−γで誘導されたＴｈ２細胞は、ＩＬ−２での誘導と比較して、ＩＦＮ−γの分泌の減少を示した。
【０１３７】
したがって、１型偏向により少なくとも部分的に特徴づけられる疾患を有する患者における２型偏向の誘導は、そのような患者にＩＣＮ１７７３９が投与された場合には、好ましい結果をもたらしうると予想された。そのようなアプローチの正当性を証明するために、正常ドナーおよび慢性関節リウマチ（ＲＡ）患者からのＴ細胞にＩＣＮ１７７３９を与えた。それらの実験のいくつかの結果を図２８に示す。ここで、１型サイトカインはＩＦＮ−γにより代表され、２型サイトカインはＩＬ−４により代表される。対照化合物ＩＣＮ１７４６５は、適用条件下で、中等度の免疫調節を示したに過ぎなかった。ドナーおよび患者からの１型および２型サイトカインの発現パターンは（図２９）、図２８の結果を証明した。
【０１３８】
１型偏向疾患の治療に使用するための意図される化合物による２型偏向の誘導を証明するために、多発性硬化症（１型偏向型疾患）の動物モデル（マウスＥＡＥ）を使用した。病気の誘発の前に、Ｂ１０．ＰＬ（Ｈ−２ｕ）マウスにＩＣＮ１７７３９（０．１ｍｇ／ｋｇ）を毎日１０日間にわたり腹腔内注射した。完全アジュバント中の２００μｇのＭＢＰ抗原で該マウスを皮下免疫し、１日量の百日咳毒素２回分（２００ｎｇ）をそれに静脈内注射して該疾患を誘発した。ＭＢＰ注射の５日後から、ＥＡＥの発症および重症度を１日おきにモニターした。これらの実験の結果を図３０に示す。ＩＣＮ１７７３９はマウスＥＡＥの発症を明らかに遅らせ、図３１に示すとおり、ＭＢＰ特異的Ｔｈ２サイトカイン産生Ｔ細胞を誘導した。したがって、本発明の化合物は、１型サイトカイン偏向（したがて１型サイトカイン偏向に関連した疾患）を治療するために使用することが可能であるばかりでなく、予防的（すなわち、１型サイトカイン偏向に関連した疾患の発症および／または重症化を予防または遅らせるの）にも有用でありうると予想される。
【０１３９】
以上、ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジンヌクレオシドおよびそれらの類似体の特定の実施形態および用途を開示した。しかし、本明細書に記載の本発明の概念から逸脱することなく、前記のもの以外に更に多くの修飾が可能であることが当業者に明らかなはずである。したがって、本発明は、添付の特許請求の範囲の精神において以外には限定されるものではない。さらに、本明細書および特許請求の範囲の両方の解釈の際には、すべての語は、文脈と合致して可能な限り広く解釈されるべきである。特に、「含む」および「含んでなる」なる語は、非限定的に要素、成分または工程に言及していると解釈されるべきであり、言及されている要素、成分または工程が、明示的には言及されていない他の要素、成分または工程と共に存在しうる又は使用されうる又は組合されうることを示すと解釈されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【０１４０】
【図１】図１は、本発明の化合物の製造に含まれる反応の第１の典型的合成スキームである。
【図２】図２は、本発明の化合物の製造に含まれる反応の第２の典型的合成スキームである。
【図３】図３は、本発明の化合物の製造に含まれる反応の第３の典型的合成スキームである。
【図４】図４は、本発明の化合物の製造に含まれる反応の第４の典型的合成スキームである。
【図５】図５は、本発明の化合物の製造に含まれる反応の第５の典型的合成スキームである。
【図６】図６は、本発明の化合物の製造に含まれる反応の第６の典型的合成スキームである。
【図７】図７は、本発明の典型的化合物を示す。
【図８Ａ】図８Ａは、１型サイトカインの発現に対する意図される化合物の効果を表すグラフである。
【図８Ｂ】図８Ｂは、２型サイトカインの発現に対する意図される化合物の効果を表すグラフである。
【図９】図９は、本発明の種々の化合物の細胞毒性を示す表である。
【図１０】図１０は、本発明の種々の化合物で処理された細胞内のＤＮＡ合成の速度を示す表である。
【図１１】図１１は、本発明の化合物での処理の際のヒト前立腺癌細胞からのＶＥＧＦの放出の抑制を示すグラフである。
【図１２】図１２は、本発明の化合物での処理の際のヒト前立腺癌細胞からのＩＬ−８の放出の抑制を示すグラフである。
【図１３Ａ】図１３Ａは、サイトカインおよび増殖応答（活性化ヒトＴ細胞におけるもの）に対する意図される化合物の用量効果を示すグラフである。
【図１３Ｂ】図１３Ｂは、サイトカインおよび増殖応答（活性化ヒトＴ細胞におけるもの）に対する意図される化合物の用量効果を示すグラフである。
【図１３Ｃ】図１３Ｃは、サイトカインおよび増殖応答（活性化ヒトＴ細胞におけるもの）に対する意図される化合物の用量効果を示すグラフである。
【図１３Ｄ】図１３Ｄは、サイトカインおよび増殖応答（活性化ヒトＴ細胞におけるもの）に対する意図される化合物の用量効果を示すグラフである。
【図１３Ｅ】図１３Ｅは、サイトカインおよび増殖応答（活性化ヒトＴ細胞におけるもの）に対する意図される化合物の用量効果を示すグラフである。
【図１３Ｆ】図１３Ｆは、サイトカインおよび増殖応答（活性化ヒトＴ細胞におけるもの）に対する意図される化合物の用量効果を示すグラフである。
【図１４】図１４は、意図される化合物での処理に応答した細胞内での種々のＲＮＡ発現を示すオートラジオグラフである。
【図１５Ａ】図１５Ａは、意図される化合物での処理に応答した特異的サイトカイン産生細胞の数を示すグラフである。
【図１５Ｂ】図１５Ｂは、意図される化合物での処理に応答した特異的サイトカイン産生細胞の数を示すグラフである。
【図１５Ｃ】図１５Ｃは、意図される化合物での処理に応答した特異的サイトカイン産生細胞の数を示すグラフである。
【図１５Ｄ】図１５Ｄは、意図される化合物での処理に応答した特異的サイトカイン産生細胞の数を示すグラフである。
【図１６Ａ】図１６Ａは、生存性、サイトカイン応答および活性化ヒトＴ細胞の増殖に対する意図される化合物の一時的な効果を示すグラフである。
【図１６Ｂ】図１６Ｂは、生存性、サイトカイン応答および活性化ヒトＴ細胞の増殖に対する意図される化合物の一時的な効果を示すグラフである。
【図１６Ｃ】図１６Ｃは、生存性、サイトカイン応答および活性化ヒトＴ細胞の増殖に対する意図される化合物の一時的な効果を示すグラフである。
【図１６Ｄ】図１６Ｄは、生存性、サイトカイン応答および活性化ヒトＴ細胞の増殖に対する意図される化合物の一時的な効果を示すグラフである。
【図１６Ｅ】図１６Ｅは、生存性、サイトカイン応答および活性化ヒトＴ細胞の増殖に対する意図される化合物の一時的な効果を示すグラフである。
【図１６Ｆ】図１６Ｆは、生存性、サイトカイン応答および活性化ヒトＴ細胞の増殖に対する意図される化合物の一時的な効果を示すグラフである。
【図１７Ａ】図１７Ａは、正常ドナーおよび慢性関節リウマチ患者からの活性化末梢Ｔ細胞におけるサイトカイン産生に対する意図される化合物の効果の比較を示すグラフである。
【図１７Ｂ】図１７Ｂは、正常ドナーおよび慢性関節リウマチ患者からの活性化末梢Ｔ細胞におけるサイトカイン産生に対する意図される化合物の効果の比較を示すグラフである。
【図１８】図１８は、意図される化合物での治療に応答した細胞内での種々のＲＮＡ発現を示すオートラジオグラフである。
【図１９】図１９は、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋  Ｔ細胞サブセットにおける活性化サイトカイン応答に対する意図される化合物の影響を示すグラフである。
【図２０】図２０は、マウスＴｈ１細胞に対する意図される化合物の効果を示すグラフである。
【図２１】図２１は、耳腫張測定に対する意図される化合物のインビボ効果を示すグラフである。
【図２２】図１８は、意図される化合物での治療に応答した細胞内での種々のＲＮＡ発現を示すオートラジオグラフである。
【図２３Ａ】図２３Ａは、耳腫張測定に対する意図される化合物のインビボ効果、および関連遺伝子発現を示すグラフである。
【図２３Ｂ】図２３Ｂは、耳腫張測定に対する意図される化合物のインビボ効果、および関連遺伝子発現を示すグラフである。
【図２４】図２４は、意図される化合物で処理されたＴ細胞における１型サイトカインの減少および２型サイトカインの増加を示すグラフである。
【図２５】図２５は、Ｔ細胞増殖の抑制を示すグラフである。
【図２６】図２６は、抗炎症および抗増殖応答の誘導を示すオートラジオグラフである。
【図２７】図２７は、誘導されたＣＤ４＋細胞におけるＴｈ１応答の優先性を示すグラフである。
【図２８】図２８は、ＲＡ患者および正常ドナーからのＴ細胞における２型サイトカイン偏向の誘導を示すグラフである。
【図２９】図２９は、ＲＡ患者および正常ドナーからのＴ細胞における２型サイトカイン偏向の誘導を示すオートラジオグラフである。
【図３０】図３０は、マウスのＥＡＥの発症の遅延における、意図される化合物での処理の予防効果をグラフである。
【図３１】図３１は、マウスにおけるＭＢＰ特異的Ｔｈ２サイトカイン産生Ｔ細胞の誘導を示すグラフである。
【図２】
2004529979.tif 000019
【図３】
2004529979.tif 000020
【図７】
2004529979.tif 000021
【図１】
2004529979.tif 000022
【図４】
2004529979.tif 000023
【図５】
2004529979.tif 000024
【図６】
2004529979.tif 000025
【図８Ａ】
2004529979.tif 000026
【図８Ｂ】
2004529979.tif 000027
【図９】
2004529979.tif 000028
【図１０】
2004529979.tif 000029
【図１１】
2004529979.tif 000030
【図１２】
2004529979.tif 000031
【図１３Ａ】
2004529979.tif 000032
【図１３Ｂ】
2004529979.tif 000033
【図１３Ｃ】
2004529979.tif 000034
【図１３Ｄ】
2004529979.tif 000035
【図１３Ｅ】
2004529979.tif 000036
【図１３Ｆ】
2004529979.tif 000037
【図１４】
2004529979.tif 000038
【図１５Ａ】
2004529979.tif 000039
【図１５Ｂ】
2004529979.tif 000040
【図１５Ｃ】
2004529979.tif 000041
【図１５Ｄ】
2004529979.tif 000042
【図１６Ａ】
2004529979.tif 000043
【図１６Ｂ】
2004529979.tif 000044
【図１６Ｃ】
2004529979.tif 000045
【図１６Ｄ】
2004529979.tif 000046
【図１６Ｅ】
2004529979.tif 000047
【図１６Ｆ】
2004529979.tif 000048
【図１７Ａ】
2004529979.tif 000049
【図１７Ｂ】
2004529979.tif 000050
【図１８】
2004529979.tif 000051
【図１９】
2004529979.tif 000052
【図２０】
2004529979.tif 000053
【図２１】
2004529979.tif 000054
【図２２】
2004529979.tif 000055
【図２３Ａ】
2004529979.tif 000056
【図２３Ｂ】
2004529979.tif 000057
【図２４】
2004529979.tif 000058
【図２５】
2004529979.tif 000059
【図２６】
2004529979.tif 000060
【図２７】
2004529979.tif 000061
【図２８】
2004529979.tif 000062
【図２９】
2004529979.tif 000063
【図３０】
2004529979.tif 000064
【図３１】
2004529979.tif 000065
【国際公開パンフレット】
2004529979.tif 000066
2004529979.tif 000067
2004529979.tif 000068
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2004529979.tif 000070
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2004529979.tif 000082
2004529979.tif 000083
2004529979.tif 000084
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2004529979.tif 000091
2004529979.tif 000092
2004529979.tif 000093
2004529979.tif 000094
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2004529979.tif 000100
2004529979.tif 000101
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004529979.tif 000153
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004529979.tif 000154
【手続補正書】
【提出日】平成15年2月12日(2003.2.12)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）：
【化１】
2004529979.tif 000155
［式中、Ａは、Ｏ、ＳまたはＣＨ２である；Ｘは、Ｈ、ＮＨ２またはＯＨである；Ｙは、Ｈ、ハロゲンまたはＮＨ２であり；
Ｚは、Ｈ、ハロゲン、Ｒ、ＯＨ、ＯＲ、ＳＨ、ＳＲ、ＮＨ２、ＮＨＲ、ＮＲ２、ＣＮ、Ｃ（Ｏ）ＮＨ２、ＣＯＯＨ、ＣＯＯＲ、ＣＨ２ＮＨ２、Ｃ（＝ＮＯＨ）ＮＨ２およびＣ（＝ＮＨ）ＮＨ２よりなる群から選ばれ、ここで、Ｒは、アルキル、アルケニル、アルキニルまたはアラルキルであり；
Ｒ２およびＲ３は、独立して、Ｈ、ＦおよびＯＨよりなる群から選ばれ；
Ｒ４は、水素、アルキル、アルケニル、アルキニルおよびアラルキルよりなる群から選ばれ、ここで、Ｒ４は、所望により、官能基およびヘテロ原子の少なくとも１つを有していてもよく；
Ｒ５は、Ｈ、ＯＨ、ＯＰ（Ｏ）（ＯＨ）２、Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２、ＯＰ（Ｏ）（ＯＲ’）２またはＰ（Ｏ）（ＯＲ’）２であり、ここで、Ｒ’はマスキング基であり；
Ｒ５’は、アルキル、アルケニル、アルキニルおよびアラルキルよりなる群から選ばれ、ここで、Ｒ５’は、少なくとも２つの炭素原子を有し、所望によりさらに、官能基およびヘテロ原子の少なくとも１つを有していてもよい。］
で表されるヌクレオシド類似体。
【請求項２】
ＺがＣＮ、Ｃ（Ｏ）ＮＨ２またはＣ（＝ＮＨ）ＮＨ２であり、Ｒ５’が、少なくとも２つの炭素原子を有し、アルキル、アルケニル、アルキニルおよびアラルキルよりなる群から選ばれる、請求項１記載のヌクレオシド類似体。
【請求項３】
構造
【化２】
2004529979.tif 000156
［式中、Ｚは、ＣＮ、Ｃ（Ｏ）ＮＨ２、Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ２またはＣ（＝ＮＯＨ）ＮＨ２であり；
Ｒ４およびＲ５’は、独立して、水素、アルキル、アルケニル、アルキニルおよびアラルキルよりなる群から選ばれ、ここで、Ｒ４およびＲ５’は、独立して、所望により、官能基およびヘテロ原子の少なくとも１つを含有していてもよく；
ただし、Ｒ４およびＲ５’の両方が水素となることはない。］
を有する、請求項１記載のヌクレオシド類似体。
【請求項４】
細胞からのサイトカインの分泌を変化させる方法であって、
請求項１記載の化合物を準備すること、および
該サイトカインの分泌を変化させるのに有効な濃度の該化合物を該細胞に与えることを含んでなる方法。
【請求項５】
該サイトカインが１型サイトカインである、請求項４記載の方法。
【請求項６】
該１型サイトカインがＩＦＮγである、請求項５記載の方法。
【請求項７】
該サイトカインが２型サイトカインである、請求項４記載の方法。
【請求項８】
該２型サイトカインがＩＬ−４である、請求項７記載の方法。
【請求項９】
該細胞がリンパ球である、請求項４記載の方法。
【請求項１０】
該細胞が癌細胞である、請求項４記載の方法。
【請求項１１】
該癌細胞が前立腺癌細胞である、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
細胞からのサイトカインの分泌を変化させる方法であって、式（ＩＩＩ）
【化３】
2004529979.tif 000157
［式中、Ｚは、ＣＮ、Ｃ（Ｏ）ＮＨ２、Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ２、Ｃ（＝ＮＮＨ２）ＮＨ２または−Ｃ（＝ＮＯＨ）ＮＨ２であり；
Ｒ２およびＲ３は、Ｈ、ＦおよびおＨよりなる群から独立して選ばれ；
Ｒ４およびＲ５’は、水素、アルキル、アルケニル、アルキニルおよびアラルキルよりなる群から独立して選ばれ、ここで、Ｒ４およびＲ５’は、独立して、所望により、ヘテロ原子および官能基の少なくとも１つを有しても良く；
Ｒ５は、Ｈ、［ＯＨ］、ＯＰ（Ｏ）（ＯＨ）２、Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２、ＯＰ（Ｏ）（ＯＲ’）２またはＰ（Ｏ）（ＯＲ’）２であり、ここで、Ｒ’はマスキング基である。］
で表される化合物を準備すること、および
該サイトカインの分泌を変化させるのに有効な濃度の該化合物を該細胞に与えることを含んでなる方法。
【請求項１３】
過剰増殖細胞の増殖を減少させる方法であって、式（ＩＶ）：
【化４】
2004529979.tif 000158
［式中、Ａは、Ｏ、ＳまたはＣＨ２である；Ｘは、Ｈ、ＮＨ２またはＯＨであり；Ｙは、Ｈ、ハロゲンまたはＮＨ２であり；
Ｚは、Ｈ、ハロゲン、Ｒ、ＯＨ、ＯＲ、ＳＨ、ＳＲ、ＮＨ２、ＮＨＲ、ＮＲ２、ＣＮ、Ｃ（Ｏ）ＮＨ２、ＣＯＯＨ、ＣＯＯＲ、ＣＨ２ＮＨ２、Ｃ（＝ＮＯＨ）ＮＨ２およびＣ（＝ＮＨ）ＮＨ２よりなる群から選ばれ、ここで、Ｒは、アルキル、アルケニル、アルキニルまたはアラルキルであり；
Ｒ２およびＲ３は、独立して、Ｈ、ＦおよびＯＨよりなる群から選ばれ；
Ｒ４は、水素、アルキル、アルケニル、アルキニルおよびアラルキルよりなる群から選ばれ、ここで、Ｒ４は、所望により、官能基およびヘテロ原子の少なくとも１つを含有していてもよく；
Ｒ５’は、水素、アルキル、アルケニル、アルキニルおよびアラルキルよりなる群から選ばれ、ここで、Ｒ５’は、少なくとも２つの炭素原子を有し、所望により、官能基およびヘテロ原子の少なくとも１つを含有していてもよく；
Ｒ５は、Ｈ、ＯＨ、ＯＰ（Ｏ）（ＯＨ）２、Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２、ＯＰ（Ｏ）（ＯＲ’）２またはＰ（Ｏ）（ＯＲ’）２であり、ここで、Ｒ’はマスキング基である；
ただし、Ｒ４およびＲ５’の両方が水素となることはない。］
で表される化合物を準備すること、および
該過剰増殖細胞の増殖を減少させるのに有効濃度の該化合物を該過剰増殖細胞に与えることを含んでなる方法。
【請求項１４】
該過剰増殖細胞が癌細胞である、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
該癌細胞が前立腺癌細胞である、請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
増殖の減少がＤＮＡ合成の減少を含む、請求項１３記載の方法。
【請求項１７】
細胞からの増殖因子の放出を減少させる方法であって、
請求項１記載の化合物を準備し、
該増殖因子の放出を減少させるのに有効な濃度の該化合物を該細胞に与えることを含んでなる方法。
【請求項１８】
該増殖因子がＶＥＧＦである、請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
該細胞が癌細胞である、請求項１７記載の方法。
【請求項２０】
該癌細胞が前立腺癌細胞である、請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
式１
【化５】
2004529979.tif 000159
（式中、化学的立体配置はＬ−立体配置またはＤ−立体配置であり得、およびこの化合物は酸と医薬として許容される塩を形成する。）
の化合物を投与することを含んでなる、患者における状態の治療方法。
【請求項２２】
該状態が、１型サイトカイン偏向により少なくとも部分的に特徴づけられる、請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
該状態が自己免疫疾患である、請求項２１記載の方法。
【請求項２４】
該自己免疫疾患が、慢性関節リウマチ、多発性硬化症、炎症性腸疾患、エリテマトーデスおよび糖尿病よりなる群から選ばれる、請求項２３記載の方法。
【請求項２５】
該自己免疫疾患が慢性関節リウマチである、請求項２３記載の方法。
【請求項２６】
該自己免疫疾患が多発性硬化症である、請求項２３記載の方法。
【請求項２７】
該自己免疫疾患が糖尿病である、請求項２３記載の方法。
【請求項２８】
該状態が炎症疾患である、請求項２１記載の方法。
【請求項２９】
該炎症疾患が接触皮膚炎である、請求項２８記載の方法。
【請求項３０】
該炎症疾患が、健常人の１型サイトカインのレベルより高いレベルでの１型サイトカインの発現を含む、請求項２８記載の方法。
【請求項３１】
該１型サイトカインがインターロイキン２である、請求項３０記載の方法。
【請求項３２】
該１型サイトカインが腫瘍壊死因子αである、請求項３０記載の方法。
【請求項３３】
投与工程がインビボ投与を含む、請求項２１記載の方法。
【請求項３４】
投与工程が経口投与を含む、請求項２１記載の方法。
【請求項３５】
投与工程が該Ｌ−リボヌクレオシドの注射を含む、請求項２１記載の方法。
【請求項３６】
投与工程が、患者の体重１ｋｇ当たり０．１ｍｇ〜１．０ｍｇの用量の該化合物を投与することを含む、請求項２１記載の方法。
【請求項３７】
該自己免疫疾患が、健常人の２型サイトカインのレベルより高いレベルでの２型サイトカインの発現を含む、請求項２３記載の方法。
【請求項３８】
該２型サイトカインがインターロイキン４である、請求項３７記載の方法。
【請求項３９】
該化合物を塩酸塩として投与する、請求項２１記載の方法。
【請求項４０】
該化合物をプロドラッグとして投与する、請求項２１記載の方法。
【請求項４１】
式ＩＶ：
【化６】
2004529979.tif 000160
［式中、Ｗは、ＮまたはＣであり；
Ｒ１は、ハロゲン、ＯＨ、ＮＨＲ、Ｃ（ＮＨ）（ＮＨＲ）またはＮ３であり；
Ｒ２は、ＮＨＲ、Ｃ（ＮＨ）（ＮＨＲ）、Ｃ≡ＣＲ、ＨまたはＲであり；
Ｒ３は、ハロゲン、ＣＮ、ＣＯＮＨ２、Ｃ（ＮＨ）（ＮＨ２）、Ｃ≡ＣＲ、Ｈ、Ｎ３、ＣＨＯ、ＣＯＯＨまたはＣＯＯＲであり；
Ｒ４は、ハロゲン、Ｎ３、ＣＮ、ＮＨＲ、Ｃ≡ＣＲ、ＨまたはＲであり；
Ｒ５およびＲ６は、独立して、Ｈ、ＯＨ、ＣＨ３、ＮＨ２またはＯＲであり；
ここで、Ｒは、置換された又は非置換のアルキル、アリール、アルケニル、アルカリルであり；Ｒ１がＯＨであり、Ｒ２およびＲ４がＨであり、Ｒ３がＣ（ＮＨ）（ＮＨ２）であり、ＷがＣであり、Ｒ５およびＲ６がＯＨである場合、該化合物は塩であり、但し、Ｒ１がＯＨであり、Ｒ５およびＲ６が独立してＨまたはＯＨであるとき、およびＲ２およびＲ４がＨであるとき、およびＷがＣであり、ＡがＯであるとき、Ｒ３はＣ（ＮＨ）ＮＨ２、ＣＮ、またはＣ（Ｏ）ＮＨ２ではない。］で表される化合物。
【請求項４２】
Ｒ１がＯＨであり、Ｒ５およびＲ６がＯＨである、請求項４１記載の化合物。
【請求項４３】
該塩が、塩酸塩、リン酸水素塩および臭化水素酸塩よりなる群から選ばれる、請求項４１記載の化合物。
【請求項４４】
該塩が塩酸塩である、請求項４３記載の化合物。
【請求項４５】
ある系における１型サイトカインの発現を減少させるための方法であって、
請求項４１記載の化合物を準備し、
該系の該１型サイトカインを減少させるのに有効な濃度の該化合物を該系に投与することを含んでなる方法。
【請求項４６】
該系が、１型サイトカイン偏向により少なくとも部分的に特徴づけられる疾患を有する哺乳動物である、請求項４５記載の方法。
【請求項４７】
該疾患が、慢性関節リウマチ、多発性硬化症、炎症性腸疾患、エリテマトーデスおよび糖尿病よりなる群から選ばれる、請求項４６記載の方法。
【国際調査報告】
2004529979.tif 000161