(57)【要約】本発明は、デング熱ウイルスのｐＲＭおよびＥ糖タンパク質のプロ−アポトーシスフラグメント、アポトーシスを誘発しえる分子のスクリーニング方法および細胞でアポトーシスを誘発する方法に関するものである。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の配列の単離されたポリペプチド。
【請求項２】
ペプチドが細胞内でアポトーシスを誘発する請求項１の単離されたポリペプチド。
【請求項３】
請求項１のポリペプチドをエンコードする単離されたポリヌクレオチド。
【請求項４】
請求項３のポリヌクレオチドからなるベクター。
【請求項５】
請求項３のポリヌクレオチドからなる原核細胞。
【請求項６】
請求項３のポリヌクレオチドからなる真核細胞。
【請求項７】
請求項３のポリヌクレオチドおよび生理学的に受容される担体からなる組成物。
【請求項８】
請求項１のペプチドおよび生理学的に受容される担体からなる組成物。
【請求項９】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の配列の単離されたポリペプチド。
【請求項１０】
請求項９のポリペプチドをエンコードする単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１１】
請求項１０のポリヌクレオチドからなるベクター。
【請求項１２】
請求項１０のポリヌクレオチドからなる原核細胞。
【請求項１３】
請求項１０のポリヌクレオチドからなる真核細胞。
【請求項１４】
請求項１０のポリヌクレオチドおよび生理学的に受容される担体からなる組成物。
【請求項１５】
請求項９のペプチドおよび生理学的に受容される担体からなる組成物。
【請求項１６】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の配列に作動的に連結したＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の配列の単離されたポリペプチド。
【請求項１７】
請求項１６のポリペプチドをエンコードする単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１８】
請求項１７のポリヌクレオチドからなるベクター。
【請求項１９】
受託番号Ｉ−２３８０で、２０００年１月２１日にＣＮＣＭに寄託されたプラスミドｐ［９５−１１４］ＥＧＦＰ［２０６−２４５］である請求項１８のベクター。
【請求項２０】
受託番号Ｉ−２４７５で、２０００年５月１０日にＣＮＣＭに寄託されたプラスミドｐ［９５−１１４］［２１１−２４５］である請求項１８のベクター。
【請求項２１】
請求項１７のポリヌクレオチドからなる原核細胞。
【請求項２２】
請求項１７のポリヌクレオチドからなる真核細胞。
【請求項２３】
請求項１７のポリヌクレオチドおよび生理学的に受容される担体からなる組成物。
【請求項２４】
請求項１６のポリペプチドおよび生理学的に受容される担体からなる組成物。
【請求項２５】
アポトーシスを誘発する細胞に、請求項１６のポリペプチドの有効量を投与することからなる細胞内でアポトーシスを誘発する方法。
【請求項２６】
細胞がヒトの患者の細胞である請求項２５の方法。
【請求項２７】
患者が癌に罹っている請求項２５の方法。
【請求項２８】
患者がフラビウイルスに感染している請求項２５の方法。
【請求項２９】
アポトーシスを誘発するのに十分な量で、請求項１６のポリペプチドを導出することからなる細部内でアポトーシスを誘発する方法。
【請求項３０】
導出が、細胞に対するポリペプチドをエンコードするポリヌクレオチドの導出からなり、該ポリヌクレオチドが、細胞内での該ポリペプチドの発現に適した発現ベクター中にある請求項２９の方法。
【請求項３１】
細胞がヒトの患者の細胞である請求項２９の方法。
【請求項３２】
患者が癌に罹っている請求項３１の方法。
【請求項３３】
患者がフラビウイルスに感染している請求項３１の方法。
【請求項３４】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に作動的に連結してスクリーンされるペプチドからなる組み換えタンパク質を細胞に導入し、かつその細胞中でアポトーシスを検出することからなるアポトーシスを誘発できるペプチドのスクリーニング方法。
【請求項３５】
導入段階が、組み換えタンパク質をエンコードするポリヌクレオチドからなる発現ベクターの導入からなる請求項３４の方法。
【請求項３６】
組み換えタンパク質が、さらに緑色蛍光タンパク質からなる請求項３４の方法。
【請求項３７】
細胞内へＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の配列のポリペプチドを導入し、ポリペプチドを含む細胞とスクリーンされる分子とを接触させ、および細胞でのアポトーシスの有無を検知することからなるポリペプチドで誘発されたアポトーシスを抑制する分子をスクリーニングする方法。
【請求項３８】
ポリペプチドが、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の配列のポリペプチドに作動的に連結した請求項３７の方法。
【請求項３９】
ポリペプチドが、緑色蛍光タンパク質に作動的に連結する請求項３７の方法。
【請求項４０】
ポリペプチドが、緑色蛍光タンパク質に連結されない請求項３７の方法。
【請求項４１】
導入が、ポリペプチドをエンコードするポリヌクレオチドを導入することからなり、該ポリヌクレオチドが、細胞内でポリペプチドを発現しえる発現ベクターである請求項３７の方法。
【請求項４２】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３の配列の単離されたポリペプチド。
【請求項４３】
ペプチドが細胞内でアポトーシスを誘発する請求項４２の単離されたポリペプチド。
【請求項４４】
請求項４２のポリペプチドをエンコードする単離されたポリヌクレオチド。
【請求項４５】
請求項４４のポリヌクレオチドからなるベクター。
【請求項４６】
受託番号Ｉ−２６２０で、２００１年１月２９日にＣＮＣＭに寄託されたプラスミドｐ［９５−１１４］ＥＧＦＰ［２０６−２４５］ＤＥＮ−２である請求項４５のベクター。
【請求項４７】
請求項４４のポリヌクレオチドからなる原核細胞。
【請求項４８】
請求項４４のポリヌクレオチドからなる真核細胞。
【請求項４９】
請求項４４のポリヌクレオチドおよび生理学的に受容される担体からなる組成物。
【請求項５０】
請求項４２のペプチドおよび生理学的に受容される担体からなる組成物。
【請求項５１】
アポトーシスを誘発する細胞に、請求項４２のポリペプチドの有効量を投与することからなる細胞内でのアポトーシスを誘発する方法。
【請求項５２】
細胞がヒトの患者の細胞である請求項５１の方法。
【請求項５３】
患者が癌に罹っている請求項５１の方法。
【請求項５４】
患者がフラビウイルスに感染している請求項５１の方法。
【請求項５５】
細胞内へＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３の配列のポリペプチドを導入し、ポリペプチドを含む細胞とスクリーンされる分子とを接触させ、および細胞でのアポトーシスの有無を検知することからなるポリペプチドで誘発されるアポトーシスを抑制する分子をスクリーニングする方法。
【請求項５６】
ポリペプチドが、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３の配列のポリペプチドに作動的に連結する請求項５５の方法。
【請求項５７】
ポリペプチドが、緑色蛍光タンパク質に作動的に連結する請求項５５の方法。
【請求項５８】
ポリペプチドが、緑色蛍光タンパク質に連結されない請求項５５の方法。
【請求項５９】
導入が、ポリペプチドをエンコードするポリヌクレオチドを導入することからなり、該ポリヌクレオチドが、細胞内でポリペプチドを発現しえる発現ベクターである請求項５５の方法。
【請求項６０】
ＤＥＮ−１ウイルス性Ｍタンパク質に抗して生成されるモノクローナル抗体。
【請求項６１】
ＤＥＮ−２ウイルス性Ｍタンパク質に抗して生成されるモノクローナル抗体。
【請求項６２】
受託番号Ｉ−２６８４で、ＣＮＣＭに寄託されたプラスミドｐ［９５−１１４］ＥＧＦＰ［Ｍ１０−Ｍ４０］ＤＥＮ−２。
【請求項６３】
受託番号Ｉ−２６８６で、ＣＮＣＭに寄託されたプラスミドｐＴｒｉｐ△Ｕ３［９５−１１４］ＥＧＦＰ［２０６−２４５］ＤＥＮ−２。
【請求項６４】
受託番号Ｉ−２６８５で、ＣＮＣＭに寄託されたプラスミドｐＴｒｉｐ△Ｕ３［９５−１１４］ＥＧＦＰ［２０６−２４５］ＤＥＮ−１。
【請求項６５】
受託番号Ｉ−２４７５で、ＣＮＣＭに寄託されたプラスミドｐ ［９５−１１４］ＥＧＦＰ［２１５−２５５］ＷＮＶ。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、アポトーシスを誘発し、かつ、フラビウイルス感染および癌に対する治療剤として使用されえるデング熱ウイルス糖タンパク質ｐｒＭおよびＥのフラグメントに関するものである。
【０００２】
デング熱（ＤＥＮ）は、多くの熱帯および亜熱帯地域でヒトに伝染しえる主要なアルボウイルスである。現在、治療薬およびワクチンのいずれも疾患の迎撃には効果がない。感染源は、黄熱ウイルス、西ナイルウイルス、ダニ媒介性脳炎ウイルス、日本脳炎ウイルスならびにＣ型およびＧ型肝炎ウイルスのような、ヒトに対して病原性が高いウイルスを含むフラビリダ（Ｆｌａｖｉｒｉｄａｅ）属の１員であるＤＥＮウイルスである。ＤＥＮウイルスは、直径４０〜６０ｎｍのエンベロープウイルスであり、そのゲノムは約１１０００ヌクレオチドを含む陽極性（ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｐｏｌａｒｉｔｙ）の一本鎖ＲＮＡ分子である。ウイルスゲノムは、Ｃカプシドタンパク質と結合し、ヌクレオカプシド（ＮＣ）を形成する。ＮＣは、エンベロープ糖タンパク質Ｅおよび膜タンパク質Ｍが寄り集まった小胞体（ＥＲ）の膜から発せられる脂質二重層からなるエンベロープで囲まれている。ウイルス性エンベロープの糖タンパク質ｐｒＭ（タンパク質Ｍの前駆体）およびＥは、ＥＲのルーメンに転位させられ、トランスメンブレン領域（ＴＭＤ）によって、ＥＲ膜につなぎ留められたままである （図１Ａ）。ウイルス性形態形成の第一段階は、ＥＲ内でのヘテロダイマー複合体としてのｐｒＭおよびＥの非共有結合である。ウイルス粒子は、おそらく、ＥＲ内で出芽過程によって集められるのであろう。プロビリオンは、小胞に保持され、ゴルジ体を通過することで原形質膜に移される。フリン型のプロテアーゼによるトランスゴルジ体内での、ｐｒＭのＭへの分裂により、ビリオンは十分に感染性となる。
【０００３】
インビボでのＤＥＮウイルスによるハツカネズミニューロンおよびヒト肝細胞の感染は、アポトーシスによる細胞死を誘発する。インビトロで、ＤＥＮ−１およびＤＥＮ−２ウイルスでの感染によるアポトーシス過程の誘発は、ハツカネズミ神経芽細胞腫細胞（Ｎｅｕｒｏ ２ａ）、ヒト肝がん細胞（ＨｅｐＧ２）、ヒトＨｅｌａ細胞、ＣＨＯ、２９３Ｔおよび霊長類細胞系ＶＥＲＯで再現されている。我々は、ＥＲ内でのＤＥＮウイルスのエンベロープの糖タンパク質の蓄積が、アポトーシスを誘発するストレスを引き起こすのであろうとの仮説を打ち立てた。ヒト肝がんの場合、このストレスは、プロ−アポトーシス遺伝子の発現を制御するであろうＮＦ−κＢ転写ファクターの活性化をもたらすであろう。
【０００４】
アポトーシスまたはプログラムされた細胞死（ＰＣＤ）は、変性死（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ ｄｅａｔｈ）または壊死とは基本的に異なる細胞死の型である。それは、幾つかの例では、生物学的に意義のある恒常性機能に資する、遺伝子支配された細胞自己破壊の活性化過程である。このことは、感染された細胞の環境での激しく有害な変化の結果として起こる細胞死である壊死と比べることができる。アポトーシスの一般的な論評には、Ｔｏｍｅｉ、Ｌ．Ｄ．およびＣｏｐｅ、Ｆ．Ｏ．Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ：Ｔｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ（１９９１）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ出版、Ｎ．Ｙ；Ｔｏｍｅｉ、Ｌ．Ｄ．およびＣｏｐｅ、Ｆ．Ｏ．ＡｐｏｐｔｏｓｉｓＩＩ：Ｔｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｉｎ Ｄｉｓｅａｓｅ（１９９４）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ出版、Ｎ．Ｙ；ならびにＤｕｖａｌｌおよびＷｙｌｌｉｅ（１９８６）Ｉｍｍｕｎ．Ｔｏｄａｙ ７（４）：１１５−１１９を参照。
形態学的に、アポトーシスは、膜を維持したままでの細胞の素早い凝集として特徴付けられる。クロマチンの緊密化と同時発生的に、細胞内での幾つかの生化学的な変化が起こる。核のＤＮＡは、ヌクレオソーム間のリンカー領域で切断されて、特徴的なラダーを生じるアガロースゲル電気泳動で容易に証明されるフラグメントを生産する。
【０００５】
アポトーシスは、胚発生、免疫システムの発生、ウイルス感染した細胞の除去および組織恒常性の維持を含む多くの生物学的な過程に関連している。アポトーシスも、ＣＤ４．ｓｕｐ．＋リンパ球（Ｔ細胞）のヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）感染の結果として起こる。実際、ＡＩＤＳの主な特徴の１つは、疾患が進行する間のＣＤ４．ｓｕｐ．＋Ｔリンパ球の段階的な枯渇である。アポトーシスを含む幾つかのメカニズムでは、ＣＤ４枯渇が原因であることが示唆されている。アポトーシスのメカニズムは、直接的またはＨＩＶエンベロープ遺伝子の発現の結果としてのウイルス複製によって、あるいは、別の因子によって誘発される際に、非感染細胞をアポトーシスに導くことによって間接的に媒介されると推測される。
【０００６】
定義および方法を含み、さらに本発明に包含される基本的な技術を実行するための手段を含む分子生物学の標準的な教書が参照される。例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８２）およびＳａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８２）およびそれらで引用される種々の文献を参照のこと。
【０００７】
我々は、ＤＥＮウイルスの細胞毒性において、どのウイルス性形態形成が、ハツカネズミ神経細胞にとって意味を持っているかを研究した。ウイルス粒子の凝集の第一段階、言い換えれば、ＥＲのルーメン中のエンベロープ糖タンパク質ｐｒＭおよびＥのヘテロダイマー結合は、ＤＥＮ−１ウイルスのＦＧＡ／８９菌株（ウイルス配列の番号付けはＤＥＮポリタンパク質のＭｅｔ１で開始する、図１Ｂ）によって 、または誘発可能なプロモーターの制御下（エクジソン発現系）で２つのウイルス性糖タンパク質をコードするｃＤＮＡを含む確立された系列Ｎ２ａｐｒＭ＋Ｅ（Ｎｅｕｒｏ ２ａ細胞の安定したクローン）から始めることで感染されるＮｅｕｒｏ ２ａ細胞で特徴付けられた。
【０００８】
Ｎ２ａｐｒＭ＋Ｅ細胞での組み換え糖タンパク質ｐｒＭおよびＥの発現は、誘導から３５時間後、アポトーシスによる細胞死を引き起こす。我々は、糖タンパク質ｐｒＭおよびＥでのプロ−アポトーシス配列の同定を試みた。フラビウイルスのタンパク質Ｅエクトドメインの三次元構造は、三つの領域の存在を明らかにした。想定される二つのα−へリックス（ＦＧＡ／８９ポリタンパク質残基６８０〜６９２、７１０〜７２７）は、エクトドメイン （３９０アミノ酸）とタンパク質ＥのＴＭＤ（ＦＧＡ／８９ポリタンパク質残基７３７〜７７５）との間に位置していた（図２Ａ）。タンパク質ｐｒＭの空間構造について利用できる情報はほとんどない。トランスゴルジ体ネットワークでの糖タンパク質ｐｒＭの翻訳後開裂によって生産されるタンパク質Ｍ（ＦＧＡ／８９ポリタンパク質残基２０６〜２８０）は、想定されるβ−シート（ＦＧＡ／８９ポリタンパク質残基２０６〜２２４） 、想定されるα−へリックス（ＦＧＡ／８９ポリタンパク質残基２２４〜２４５）および二つのＴＭＤ（ＦＧＡ／８９ポリタンパク質残基２４６〜２８０）からなる７５アミノ酸の非グリコシル化ポリペプチドである（図２Ｂ）。
【０００９】
本発明の対象は、アポトーシスを誘発するデング熱ウイルス糖タンパク質からポリペプチドを提供することである。
【００１０】
本発明の別の対象は、ポリペプチドをエンコードするポリヌクレオチドを提供することである。
【００１１】
本発明の別の対象は、細胞にポリペプチドを投与することからなる細胞内でのアポトーシスの誘発方法である。
【００１２】
本発明の別の対象は、アポトーシスを誘発しえるポリペプチドのスクリーニング方法である。
【００１３】
本発明の別の対象は、アポトーシスを誘発するデング熱ウイルス糖タンパク質からの、ポリペプチドによって誘発されるアポトーシスを抑制しえる分子のスクリーニング方法である。
【００１４】
本発明の別の対象は、ＤＥＮ−１ウイルスのＦＧＡ／８９菌株（Ｇｅｎｂａｎｋ Ｄａｔａ Ｌｉｂｒａｒｙ、受託ＡＦ２２６６８７）の糖タンパク質ｐｒＭ（ＤＥＮポリタンパク質残基１１５〜２８０）およびＥ（ＤＥＮポリタンパク質残基２８１〜７７５）におけるプロ−アポトーシス配列である。
【００１５】
本発明の別の対象は、ＤＥＮ−２ウイルスジャマイカ（Ｊａｍａｉｃａ）菌株のプロ−アポトーシス配列である。
【００１６】
本発明は、ＤＥＮ−１およびＤＥＮ−２ウイルスＭタンパク質に抗して生成されるモノクローナル抗体ならびに疾患の予防および診断目的でのそれらの利用にも関するものである。
【００１７】
図１：Ａ．ＤＥＮポリタンパク質熟成の模式図、Ｂ．組み換えｐｒＭおよびＥタンパク質の模式図。
【００１８】
図２：Ａ．Ｅタンパク質構造の模式図、Ｂ．ｐｒＭタンパク質構造の模式図。
【００１９】
図３：ＢＲ／９０Ｃタンパク質（残基９５〜１１４） Ｃ末端の２０アミノ酸は、ｐｒＭのＥＲのルーメンへの転位を指示する配列シグナルとして機能する。Ｃ−１１２およびＣ−１１４位の二つのアラニン残基は、機能的なシグナルペプチダーゼ部位を提供する。プラスミドｐＦＧＦＰ−ＮＩ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、♯６０８５−１）でエンコードされるＥＧＦＰのＮ−末端に融合したＣ残基９５〜１１４に続く６つのベクター特異的アミノ酸は、［９５−１１４］ＥＧＦＰ融合タンパク質を生産する。Ｍタンパク質（または、その欠失変異体）またはＥタンパク質の想定されるへリックスおよびＴＭＤのいずれかに相当するＦＧＡ／８９ポリタンパク質の領域を、［９５−１１４］ＥＧＦＰ融合構築物のＣ末端に融合した。
図４：Ａ． Ｎｅｕｒｏ ２ａ細胞の二つのセットを、２５時間トランスフェクトし、ＰＯＤ−ＴＵＮＥＬ法にて染色する。（９５−１１４］ＥＧＦＰ融合タンパク質をｙ軸に取り、そして５０，０００細胞あたりのＴＵＮＥＬ＋の数をｘ軸に取る。データを、フィッシャーおよびイェーツｔ試験（Ｆｉｓｈｅｒ ａｎｄ Ｙａｔｅｓ ｔ ｔｅｓｔ）を使って［９５−１１４］ＥＧＦＰ［２０６−２８０］データの結果と比較した。有意なデータ（Ｐ＜０．０５）のみを示す。Ｂ． Ｎｅｕｒｏ ２ａ細胞の３つのセットを、２０時間トランスフェクトさせる。遊離のオリゴヌクレオソームを、ＥＬＩＳＡ法にて定量化する。データをフィッシャーおよびイェーツｔ試験を使い、［９５−１１４］ＥＧＦＰ［２０６−２８０］データの結果と比較した。有意なデータ（Ｐ＜０．０５）のみを示す。Ｃ． Ｎｅｕｒｏ ２ａ細胞の２つのセットが、各々のトランスフェクション時間の間に、 ［９５−１１４］ＥＧＦＰ［２０６−２４５］融合構築物を発現した。アポトーシス細胞をＰＯＤ−ＴＵＮＥＬ法にて染色する。Ｄ．２５時間の間に、 ［９５−１１４］ＥＧＦＰ［２０６−２８０］、［９５−１１４］ＥＧＦＰ［２０６−２４５］またはＥＧＦＰ［２０６−２４５］を発現するＮｅｕｒｏ ２ａ細胞を、ＣｙＴＭ３−ＴＵＮＥＬにて染色し、共焦法（ｃｏｎｆｏｃａｌ ｍｅｔｈｏｄ）にて解析する。
【００２０】
図５．：Ａ． ＨｅｐＧ２細胞の３つのセットを２０時間トランスフェクトする。遊離のオリゴヌクレオソームをＥＬＩＳＡ法にて定量する。データを、フィッシャーおよびイェーツｔ試験を使い、［９５１１４］ＥＧＦＰ［６７３−７２７］データの結果と比較した。有意なデータ（Ｐ＜０．０５）のみを示す。Ｂ． ２５時間の間に、 ［９５−１１４］ＥＧＦＰ［２０６−２８０］、［９５−１１４］ＥＧＦＰ［２０６−２４５］またはＥＧＦＰ［２０６−２４５］を発現するＨｅｐＧ２細胞を、ＣｙＴＭ３−ＴＵＮＥＬにて染色し、共焦法にて解析する。
【００２１】
図６．：ｐＥＧＦＰ−Ｎ１において、ＥＧＦＰ遺伝子のＣタンパク質残基９５〜１１４上流をエンコードするＤＥＮ−１ウイルス菌株ＢＲ／９０を含むプラスミドｐ［９５−１１４］ＥＧＦＰ［２０６−２４５］の配列、およびＥＧＦＰ遺伝子のＭタンパク質残基２０６〜２４５下流をエンコードするＤＥＮ−１ウイルス菌株ＦＧＡ／８９の配列。
【００２２】
図７．：ｐＥＧＦＰ−Ｎ１のＭタンパク質残基２１１〜２４５ をエンコードするＤＥＮ−１ウイルス菌株ＦＧＡ／８９のＮ末端配列に融合したＣタンパク質残基９５〜１１４をエンコードするＤＥＮ−１ウイルス菌株ＢＲ／９０を含むプラスミドｐ［９５−１１４］ ［２１１−２４５］の配列。
【００２３】
図８．：２５時間の間に、［９５−１１４］ ［２１１−２８０］を発現するＨｅｐＧ２およびＮｅｕｒｏ ２ａ細胞を、ＣｙＴＭ３−ＴＵＮＥＬにて染色し、共焦法にて解析する。
【００２４】
図９．：Ｍタンパク質残基２１５〜２５５をエンコードする西ナイル（ＷＮ）ウイルスのＩＳ−９８ ＳＴ１菌株の領域を、［９５−１１４］ＥＧＦＰ融合構築物のＣ末端に融合する。ＤＥＮ−１ウイルス菌株ＦＧＡ／８９およびＷＮウイルス菌株ＩＳ−９８ ＳＴ１のＭタンパク質の配列の同一性および類似性を示す。
【００２５】
図１０．：ＤＥＮ−１ウイルス菌株ＦＧＡ／８９、ならびにＣＤ７２タンパク質の５６〜９５残基、Ｂａｘタンパク質のＢＨ２領域、およびその他のフラビウイルスの間でのＭタンパク質の配列の同一性および類似性。
【００２６】
図１１．：プラスミドｐ［９５−１１４］ＥＦＧＰ ［２０６−２４５］ＤＥＮ−２の配列。
【００２７】
図１２．：ｅｃｔｏＭ ＤＥＮ−２の欠失変異体。
【００２８】
図１３．：組み換えレンチウイルスベクター。
【００２９】
図１４．：トリップ（ｔｒｉｐ）ｅｃｔｏＭ ＤＥＮ−１の活性を誘発する細胞死。
【００３０】
図１５．：ｅｃｔｏＭ分子の細胞毒性。
【００３１】
［９５−１１４］ＥＦＧＰ ［２０６−２４５］融合タンパク質を生産するように［９５−１１４］ＥＦＧＰ融合生産物のＣ末端に融合したデング熱ウイルスＭタンパク質の４０アミノ酸長の配列（ＤＥＮ−１ウイルス菌株ＦＧＡ／８９、残基２０６〜２４５）を図６に示す（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）。
【００３２】
本発明者らは、ＤＥＮ−１およびＤＥＮ−２ Ｍタンパク質の配列（４０アミノ酸）が、次のアラインメントに示すように８３％同一であることを明らかにした：
2004503233.tif 000002
【００３３】
ＤＥＮ−２ Ｍポリペプチドのアミノ酸配列は、図１１に示され、そして、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３である。アミノ酸配列をエンコードするポリヌクレオチドは、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、ＦｒｉｔｓｃｈおよびＭａｎｉａｔｉｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ出版、１９８９で開示されている標準遺伝子コードから決定できる。
【００３４】
Ｄｅｎ−１−Ｃアミノ酸９５〜１１４のアミノ酸配列を図１Ｂに示す（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）。
【００３５】
プラスミドｐ［９５−１１４］ＥＦＧＰ ［２０６−２４５］は、２０００年１月２１日に番号Ｉ−２３８０で、ｔｈｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｎａｔｉｏｎａｌｅ ｄｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ ｄｅ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ、２８ Ｒｕｅ ｄｅ Ｄｏｃｔｅｕｒ Ｒｏｕｘ、Ｆ−７５７２４ Ｐａｒｉｓ Ｃｅｄｅｘ １５に寄託した。プラスミドｐ［９５−１１４］［２１１−２４５］は、２０００年５月１０日に受託番号Ｉ−２４７５で、ｔｈｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｎａｔｉｏｎａｌｅ ｄｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ ｄｅ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ、２８ Ｒｕｅ ｄｅ Ｄｏｃｔｅｕｒ Ｒｏｕｘ Ｆ−７５７２４ Ｐａｒｉｓ、Ｃｅｄｅｘ １５に寄託した。
【００３６】
ｐ［９５−１１４］［２１１−２４５］を生産するため、ＥＧＦＰ遺伝子をプラスミドｐ［９５−１１４］ＥＦＧＰ ［２０６−２４５］から削除し、デング熱ウイルスＭタンパク質の３５アミノ酸長の配列（ＤＥＮ−１ウイルス菌株ＦＧＡ／８９、残基２１１〜２４５）を、図７で示すように、Ｃタンパク質の１５アミノ酸長の配列のＣ末端のフレーム（ＤＥＮ−１ウイルス菌株ＢＲ／９０、残基９５〜１１４）に直接融合した。
【００３７】
タンパク質またはペプチドのアミノ酸配列に関して「から本質的に成る」とは、明細書および請求の範囲が、タンパク質またはペプチドの三次元的なコンフォメーションが実質的に変化しないような配列中での１つ以上のアミノ酸の同類置換または修飾に言及するため、以降で使われる用語である。
【００３８】
「同類置換」とは、前述の機能によって定義され、実質上、アミノ酸が置換されても、同一の電荷、大きさ、親水性および／または芳香性を有するアミノ酸の置換を含む。当該技術分野で公知のそのような置換には、グリシン−アラニン−バリン；イソロイシン−ロイシン；トリプトファン−チロシン；アスパラギン酸−グルタミン酸；アルギニン−リジン；アスパラギン−グルタミン；およびセリン−スレオニンが含まれる。
【００３９】
タンパク質またはペプチドのアミノ酸配列に関して「修飾」とは、タンパク質またはペプチドのコンフォメーション、つまり、生物学的な活性の変化には影響しない１つ以上のアミノ酸の欠失として機能的に定義される。
【００４０】
核酸配列に関して「から本質的に成る」とは、明細書および請求の範囲が、第三番目の塩基の縮重に関連するヌクレオチドの置換に言及するため、以降で使われる用語である。当業者に好まれるように、第三塩基の縮重のため、ほとんど全てのアミノ酸は、コードするヌクレオチド配列に１つ以上の３文字コドンで表すことができる。さらに、軽微な塩基対の変化は、エンコードされるアミノ酸配列で、遺伝子産物の生物学的な活性を実質上変化させるとは考えられない変異（同類置換）を生じるであろう。したがって、ここで開示されるようなタンパク質またはペプチドをエンコードする核酸配列は、配列内でわずかに修飾されてもよく（例えば、３文字コドンでのヌクレオチドの置換）、さらに、同一のアミノ酸配列の各々の遺伝子産物を依然としてエンコードしていてもよい。
【００４１】
「発現ベクター」という用語は、本発明のペプチドをエンコードし、選択された宿主細胞で発現するのに必要な配列を提供するオリゴヌクレオチドを意味する。発現ベクターとは、一般には、転写プロモーターおよびターミネーターを含むか、または、内在性プロモーターに隣接する取り込みを提供する。発現ベクターは、通常、さらには、複製起点および１つ以上の選択マーカーを含むプラスミドである。しかし、発現ベクターは、代わりに、宿主に感染するように設計されるか、または、宿主ゲノム内の好ましい部位に取り込むように設計されたベクターを取り込むウイルス性組み換え体でもよい。ウイルス組み換え体の例は、当該分野で公知のアデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、ポックスウイルス、レトロウイルスおよびその他のＲＮＡまたはＤＮＡウイルス発現ベクターである。その他の発現ベクターの例は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、ＦｒｉｔｓｃｈおよびＭａｎｉａｔｉｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ出版、１９８９で開示されている。
【００４２】
そのアミノ酸配列を本発明により開示しているため、その配列に基づいて、本発明のペプチドを公知の化学的な合成法で生産することができる（例えば、液相合成法、固相合成法など；Ｉｚｕｍｉｙａ，Ｎ、Ｋａｔｏ，Ｔ、Ａｏｙａｇｉ，Ｈ、Ｗａｋｉ，Ｍ、「Ｂａｓｉｓ ａｎｄ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」、１９８５、Ｍａｒｕｚｅｎ Ｃｏ．，Ｌｔｄを参照）。
【００４３】
本発明のペプチドは、保護されたアミノ酸残基を１つ以上含んでいてもよい。保護されたアミノ酸とは、官能基または基類が、公知の方法で保護基または基類により保護されているアミノ酸で、様々な保護されたアミノ酸が市販されている。
【００４４】
各々の保護基を、ペプチド合成の条件によってそれ自体公知の基から適切に選択することが好ましい。
【００４５】
保護されたアミノ酸の結合は、例えば、ＤＣＣ（ジシクロヘキシルカルボジイミド）法、ＤＩＰＣＤＩ（ジイソプロピルカルボジイミド）法（Ｔａｒｔａｒ，Ａら；Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ、４４、５０００（１９７９））、活性エステル法、混合または対称酸無水物法、カルボニルジイミダゾール法、ＤＣＣ−ＨＯＮＳｕ（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド）法（Ｗｅｙｇａｎｄ，ＦらＺ．Ｎａｔｕｒｆｏｒｓｃｈ、Ｂ、２１、４２６（１９６６）、ＤＣＣ−ＨＯＢｔ（１−ヒドロキシベンゾトリアゾール）法（Ｋｏｅｎｉｇ，Ｗら；Ｃｈｅｍ．Ｂｅｒ、１０３、７８８、２０２４、２０３４（１９７０））、ジフェニルホスホリラジド法、ＢＯＰ試薬（ベンゾトリアゾリル−Ｎ−ヒドロキシトリスジメチルアミノホスホニウム　ヘキサフルオロホスフィド）を用いたＢＯＰ−ＨＯＢｔ法（Ｈｕｄｓｏｎ，Ｄ、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ、５３、６１７（１９８８））、ＨＢＴＵ（２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウム　ヘキサフルオロホスフェート）−ＨＯＢｔ法（Ｋｎｏｒｒ，Ｒら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ、３０、１９２７（１９８９））、ＴＢＴＵ（２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウム　テトラフルオロボレート）−ＨＯＢｔ法（Ｋｎｏｒｒ，Ｒら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ、３０、１９２７（１９８９））などの通常の濃縮方法にて行われる。しかし、これらの方法のうちで、好ましいのはＤＣＣ法、ＤＣＣ−ＨＯＢｔ法、ＢＯＰ−ＨＯＢｔ法、ＨＢＴＵ−ＨＯＢｔ法および対称酸無水物法である。
【００４６】
濃縮反応は、通常、ジクロロメタン、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、Ｎ−メチルピロリドン（ＮＭＰ）など、または、それらから成る混合溶媒のような有機溶媒中で行われる。
【００４７】
α−アミノ基の保護基を除く薬剤として、トリフルオロ酢酸／ジクロロメタン、ＨＣｌ／ジオキサン、ピペリジン／ＤＭＦまたはピペリジン／ＮＭＰなどを使用でき、これらは保護基の種類に従って適切に選択される。
【００４８】
合成の各々の段階での濃縮反応の経過の度合いを、Ｅ．Ｋａｉｓｅｒらの方法［Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ、３４、５９５（１９７０）］（ニンヒドリン反応）にて調べることができる。
【００４９】
上記のようにして、所望のアミノ酸配列を有する保護されたペプチド樹脂を得ることができる。
【００５０】
フッ化水素、ＴＦＭＳＡ（トリフルオロメタンスルフォン酸）［Ｅ．Ｇｒｏｓｓ 編集、Ｙａｊｉｍａ，Ｈら；“Ｔｈｅ ｐｅｐｔｉｄｅ”５、６５（１９８３）、Ａｃａｄｅｍｉｃ 出版］、ＴＭＳＯＴｆ（トリメチルシリル　トリフラート［Ｆｕｊｉｉ，Ｎら；Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ、Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ、２７４（１９８７）］、ＴＭＳＢｒ（トリメチルシリル　ブロミド ［Ｆｕｊｉｉ，Ｎら；Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ、３５、３８８０（１９８７）］、トリフルオロ酢酸などでの保護されたペプチド樹脂の処理は、樹脂および保護基を同時に除去できる。上記脱離試薬を、用いられる手法（ＢｏｃまたはＦｍｏｃ）ならびに樹脂および保護基の種類に従って適切に選択する。上記一連の方法にて、本発明のペプチドを製造することができる。
【００５１】
あるいは、本発明のペプチドは、本発明のペプチドのアミノ酸配列に相当するポリヌクレオチド（ＤＮＡまたはＲＮＡ）を生産し、ポリヌクレオチドを使った遺伝子工学的な技術でペプチドを生産して、製造することができる。アミノ酸残基の配列をコードするポリヌクレオチドは、当該技術分野で公知であり、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、ＦｒｉｔｓｃｈおよびＭａｎｉａｔｉｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ出版、１９８９にて開示されている。
【００５２】
この様に生産される本発明のペプチドは、タンパク質化学の分野で公知のタンパク質の単離／精製方法にて精製できる。さらに特に、例えば、抽出、再結晶、硫酸アンモニウム、硫酸ナトリウムなどでの塩析出、遠心分離、透析、限外濾過、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、順相クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、ゲル濾過法、ゲル透過クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、電気泳動、向流分配など、および、これらの組み合わせが挙げられる。
【００５３】
酸、例えば、塩酸、メタンスルホン酸など、およびそのアミノ酸組成物で加水分解されえる本発明の生産されるペプチドは、公知の方法によって試験することができる。これによって、本発明のペプチドが正確に生産されたかどうかを推定することができる。
【００５４】
さらに厳密には、本発明のペプチドが正確に生産されたかどうかを確かめるため、公知のアミノ酸配列決定法（例えば、エドマン分解技術など）にて、生産されたペプチドのアミノ酸配列が決定される。
【００５５】
本発明のペプチドは、それらの塩の形態を含む。以降挙げるように、本発明のペプチドは、特に、医薬品として有用であり、それゆえ、ペプチドの塩は、好ましくは、医薬的に許容される塩である。
【００５６】
本発明のペプチドは、酸の添加によって塩を形成してもよい。酸の例には、無機酸（例えば、塩酸、臭化水素酸、リン酸、硝酸および硫酸）、 あるいは、有機カルボン酸（例えば、酢酸、プロピオン酸、マレイン酸、コハク酸、リンゴ酸、クエン酸、酒石酸およびサリチル酸）、グルクロン酸、ガラクツロン酸、グルコン酸、アスコルビン酸などのような酸性糖、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、アルギニン酸のような酸性多糖類または有機スルホン酸（例えば、メタンスルホン酸およびｐ−トルエンスルホン酸）などが含まれる。これらの塩のうち、好ましいのは、医薬的に許容される塩である。
【００５７】
本発明のペプチドは、塩基性物質と塩を形成してもよい。塩の例は、例えば、アルカリ金属塩（ナトリウム塩、リチウム塩、カリウム塩など）、アルカリ土類塩、アンモニウム塩などのような無機塩基との塩、またはジエタノールアミン塩、シクロヘキシルアミン塩などのような有機塩基との塩から選択される医薬的に許容される塩を含む。
【００５８】
本発明で使用されえる医薬的に許容される担体は、特には限定されないが、医薬分野で使用されえる賦形剤、結合剤、滑剤、着色剤、崩壊剤、緩衝剤、等張剤、保存剤、麻酔剤などが含まれる。
【００５９】
本発明の薬剤は、治療目的に応じて、適切な投与方法にて適用され、そして、注射（皮下、皮内、静脈および腹膜など）、点眼、点滴、経皮投与、経口投与、吸入などから選択される。
【００６０】
また、注射可能製剤 （液剤、懸濁剤、乳剤、使用の際に溶解される固形剤など）、錠剤、カプセル、顆粒剤、粉末剤、液剤、リポソーム含有物、軟膏、ゲル、外用粉末剤、スプレー、吸入粉末剤、点眼薬、眼用軟膏剤、座薬、腔坐剤などのような服用形態は、投与方法に従って適切に選択することができ、それに応じて本発明のペプチドを処方することができる。処方は、一般的には、Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第５巻、Ｈａｎｓｃｈら編集、Ｐｅｒｒａｍｏｎ出版 １９９０の２５．２章に記載されている。
【００６１】
本発明の薬剤の服用量は、投与目的（予防、維持（悪化の予防）、緩和（症状の改善）または治療） ；疾患の種類；症状、患者の性別および年齢；投与方法などに従って個々に規定されるべきであり、特には限定されない。
【００６２】
それらの薬剤処方または医薬で含まれるポリペプチドおよびポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、フラビウイルス種のメンバーに感染した患者の治療に有用であろう。
【００６３】
さらに、プロ−アポトーシスフラグメントによるアポトーシスの誘発は、癌の患者の治療に有用であろう。特に、がん細胞を特異的に標的とし、そのがん細胞でアポトーシスを誘発することである。ＤＥＮ−１およびＤＥＮ−２ウイルスＭタンパク質に抗して生成されるモノクローナル抗体、ならびに疾患の予防および診断目的でのそれらの利用は、本発明に含まれる。
【００６４】
アポトーシスを誘発しえる分子のスクリーニング方法が、本発明に含まれる。特に、分子はタンパク質である。この方法は、デング熱ウイルスのＣ−タンパク質のアミノ酸９５〜１１４にスクリーニングされるタンパク質を付着させ；融合タンパク質を細胞に導入し；かつアポトーシスの有無を検出して行うことができる。
【００６５】
ポリヌクレオチドは、当該技術分野で周知のいくつかの方法にて導入してもよい。その例は、リン酸カルシウム、ＤＥＡＥ−デキストラン、リポソーム、ウイルスベクターなどである。細胞にポリヌクレオチドを導入するこれら、およびその他の方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ らのＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８９）にて開示されている。
【００６６】
本発明は、さらに、デング熱ウイルスＭタンパク質のプロ−アポトーシスフラグメントの細胞毒性活性を抑制する分子のスクリーニング方法を含む。この方法は、ポリペプチドまたはポリペプチドをエンコードするポリヌクレオチドの細胞内への導入、細胞とスクリーンされる分子との接触、およびアポトーシスが存在するか存在しないかの検出を含む。スクリーンされる分子は、タンパク質またはその他の有機または無機物質であってもよく、これらはデング熱ウイルスＭタンパク質のアミノ末端の４０アミノ酸で媒介されるアポトーシスを抑制することが認められるであろう。
【００６７】
本発明のペプチドと特異的に反応する抗体は、本発明にも含まれる。特異的なペプチドフラグメントに対する抗体の生成方法は、当該技術分野で公知である。そのような方法の例は、引用によりここに組み込まれるＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ出版、１９８９に開示されている。
【００６８】
アポトーシスの検出方法は、ＴＵＮＥＬアッセイおよびＥＬＩＳＡアッセイを含む。これら、およびその他の方法は、Ｔｏｍｅｉ、Ｌ．Ｄ．およびＣｏｐｅ、Ｆ．Ｏ．Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ：Ｔｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ（１９９１）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ出版、Ｎ．Ｙ；Ｔｏｍｅｉ、Ｌ．Ｄ．およびＣｏｐｅ、Ｆ．Ｏ．ＡｐｏｐｔｏｓｉｓＩＩ：Ｔｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｉｎ Ｄｉｓｅａｓｅ（１９９４）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ出版、Ｎ．Ｙ；ＤｕｖａｌｌおよびＷｙｌｌｉｅ（１９８６）Ｉｍｍｕｎ．Ｔｏｄａｙ ７（４）：１１５〜１１９、およびＳａｍｂｒｏｏｋ ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８９）にて開示されている。
【００６９】
この発明を一般的に記載しているが、さらなる理解は、例示目的のためにのみ供され、特記しない限り限定を意図しない具体的な実施例に言及することによって、得ることができる。
【００７０】
実施例
【００７１】
１．細胞
Ｎｅｕｒｏ ２ａハツカネズミ神経芽腫細胞系（ＡＴＣＣ参照ＣＣＬ１３１）を、５６℃で３０分間熱失活した１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ） および非必須アミノ酸で補充した最小必須培地（ＭＥＭ）にて培養した。細胞を、ｃｍ２あたり１０４個の細胞を基礎として、３７℃のＣＯ２下で培養した。
【００７２】
ヒト肝癌細胞系（ＡＴＣＣ参照ＨＢ８０６５）を、５６℃で３０分間熱失活した１０％ＦＢＳ、４ｍＭのグルタミンおよび抗生物質（ペニシリンおよびストレプトマイシンの混合物）で補充したダルベッコによる修飾イーグル培地（Ｄ−ＭＥＭ）にて培養した。細胞を、ｃｍ２あたり５×１０４個の細胞を基礎として、３７℃のＣＯ２下で培養した。
【００７３】
２．プラスミドおよびトランスフェクト剤
ｐｒＭおよびＥでの潜在的なプロ−アポトーシス配列を同定するため、我々は、増強された緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）／ＤＥＮとして公知のキメラタンパク質を構築した。ＤＥＮ−１ウイルス菌株ＢＲ／９０のＣタンパク質のＣ末端のアミノ酸９５〜１１４は、ＥＲにｐｒＭタンパク質を転位させるシグナル配列として機能する。このウイルス性シグナルタンパク質を、ｐＥＧＦＰ−Ｎ１発現ベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ♯６０８５−１）にて発現されるＥＧＦＰタンパク質のＮ末端にインフェーズで融合させ、キメラタンパク質［９５−１１４］ＥＧＦＰ融合タンパク質を生産する（図２）。ｐｒＭおよびＥ糖タンパク質のα−へリックスおよびトランスメンブレン領域に相当するペプチドセグメントを、キメラタンパク質［９５−１１４］ＥＧＦＰのＣ末端にインフェーズで融合させた（図１参照）。
【００７４】
Ｎｅｕｒｏ ２ａおよびＨｅｐＧ２細胞を、市販のキットの推奨実施要網に従って、ＦｕＧＥＮＥＴＭ６（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ♯１ ８１４ ４４３）を用いて組み換えられた異なるプラスミドにてトランスフェクトさせた。
【００７５】
３．ＴＵＮＥＬ検出
アポトーシスによる細胞死の間に、ゲノムＤＮＡを活性化した細胞質エンドヌクレアーゼにて切断し、そして、オリゴヌクレオソームを遊離させる。ＴＵＮＥＬ技術により、酵素反応を用いて修飾されたヌクレオチドで、その遊離の３’−ＯＨ末端でオリゴヌクレオソームをラベルすることができる。
【００７６】
ＴＵＮＥＬ−ＰＯＤラベリングを、“Ｉｎ Ｓｉｔｕ Ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ”キット（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ♯６８４ ８１７）を用いて行った。トランスフェクトされたＮｅｕｒｏ ２ａおよびＨｅｐＧ２細胞を、市販のキットの推奨実施要網に従って処理した。
【００７７】
ＴＵＮＥＬ−Ｃｙ３をラベルするため、２５時間トランスフェクトされたＮｅｕｒｏ ２ａおよびＨｅｐＧ２細胞を、３％（ｗ／ｖ）パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）を含むＰＢＳに固定した。細胞をエタノールに浸透させ、そして、Ｈ２Ｏに再水和させた。そして、細胞を１２．５ユニットのターミナルトランスフェラーゼ（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ♯２２０ ５８２）、２．５ｎｍｏｌのビオチン−１６−ｄＵＴＰ（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ♯１ ０９３ ０７０）、２．５ｍＭのＣｏＣｌ２、０．２Ｍのカコジル酸カリウム、２５ｍＭの塩化トリスおよび０．２５ｍｇ／ｍｌのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含む反応混合物にて、３７℃で１５分間培養した。２×クエン酸ナトリウム緩衝液に室温下で１５分間培養して反応を停止させた。細胞を、異なる段階の間、Ｈ２Ｏで洗浄した。非特異的な固定を制限するため、細胞をＨ２Ｏ中２０ｍｇ／ｍｌのＢＳＡで処理した。そして、細胞を、蛍光色素ＣｙＴＭ３（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｉｎｃ、♯０１６−０１６−０８４）で結合されたストレプトアビジンを使い、３７℃で３０分間ラベルした。試験を共焦点顕微鏡にて観察した。
【００７８】
４．ＥＬＩＳＡ
アポトーシスを細胞に誘発する際に、細胞質エンドヌクレアーゼを活性化し、ゲノムＤＮＡをオリゴヌクレオソームに開裂する。ＥＬＩＳＡ技術は、ヒストンおよびＤＮＡに対するモノクローナル抗体を使うことで、オリゴヌクレオソームを定量することができる。
【００７９】
ＥＬＩＳＡを、“Ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ＥＬＩＳＡＰＬＵＳ”キット（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ♯１ ７７４ ４２５）を用いて行った。トランスフェクトされたＮｅｕｒｏ ２ａおよびＨｅｐＧ２細胞を、市販キットの推奨実施要網に従って処理した。
【００８０】
５．ヨウ化プロピディウムでの染色
アポトーシス過程の間、細胞は、幾つかの特徴的な形態学的な変異を受ける。細胞は縮合し、ＤＮＡフラグメントを含むアポトーシス体（ａｐｏｐｔｏｔｉｃ ｂｏｄｙ）に分離する。ヨウ化プロピディウムは、核酸の間に導入される蛍光試薬である；それは、アポトーシス体の目視での検出を可能にする。アポトーシス中の細胞は、少なくとも３つの核物質の存在によって定義される。
【００８１】
トランスフェクションから２０時間後、Ｎｅｕｒｏ ２ａおよびＨｅｐＧ２細胞を、３％（ｗ／ｖ）パラフォルムアルデヒド（ＰＦＡ）を含むＰＢＳに固定した（表１）。細胞を異なる段階の間、ＰＢＳで洗浄した。細胞を、トランス−ゴルジ複合体の酸性小胞を中和するため、ＰＢＳ中５０ｍＭの ＮＨ４Ｃｌにて１０分間処理し、そして、ＰＢＳ中０．１％ のトリトンＸ−１００にて４分間浸透させる。ＲＮＡの分解を、ＰＢＳ中１０μｇ／ｍｌのＤＮａｓｅがない ＲＮａｓｅにて、３７℃で３０分間処理を行った。そして、細胞をｐＨ６．０の０．１％クエン酸緩衝液中１μｇ／ｍｌのヨウ化プロピディウム（ＰＩ）で染色した。そして、試験を蛍光顕微鏡にて観察した。
【００８２】
ｐｒＭおよびＥでの潜在的なプロ−アポトーシス配列を同定するため、本発明者らは、増強された緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ／ＤＥＮ）の形態のキメラタンパク質を構築した。ＢＲ／９０ Ｃタンパク質のＣ末端の２０アミノ酸（残基９５〜１１４）は、ｐｒＭのＥＲのルーメンへの転位を指示する配列シグナルとして機能する。位置Ｃ−１１２およびＣ−１１４の２つのアラニン残基は、機能的なシグナルペプチダーゼ部位を提供する。プラスミドｐＥＧＦＰ−Ｎ１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、♯６０８５−１）でエンコードされるＥＧＦＰのＮ末端に融合される６つのベクター特異性アミノ酸に続くＣ残基９５〜１１４は、［９５−１１４］ＥＧＦＰ融合タンパク質を生産する。Ｍタンパク質（またはその欠失変異体）または想定されるα−へリックスおよびＥタンパク質のＴＭＤのどちらかに相当するポリタンパク質ＦＧＡ／８９の領域を、［９５−１１４］ＥＧＦＰ融合構築物のＣ末端に融合した（図３）。
【００８３】
ｐ［９５−１１４］［２１１−２４５］を生産するため、ＥＧＦＰ遺伝子をプラスミドｐ［９５−１１４］ＥＧＦＰ［２０６−２４５］から欠失させ、デング熱ウイルスＭタンパク質（ＤＥＮ−１ウイルス菌株ＦＧＡ／８９、残基２１１〜２４５）の３５アミノ酸長の配列を、図７に示すようにＣタンパク質（ＤＥＮ−１ウイルス菌株ＢＲ／９０、残基９５〜１１４）の１５アミノ酸長の配列のＣ末端に直接融合した。
【００８４】
ＥＧＦＰ／ＤＥＮキメラタンパク質の細胞毒性を、ＦｕＧＥＮＥＴＭ６を使って組み換えた異なるプラスミドによって、Ｎｅｕｒｏ ２ａおよびＨｅｐＧ２細胞をトランスフェクトさせることで試験した。異なるキメラタンパク質の発現を、ＥＧＦＰの自動蛍光および抗−ＥＧＦＰ抗体を使った放射線免疫沈降によって観察した。［９５−１１４］ＥＧＦＰ融合構築物由来の異なるキメラタンパク質で誘発されるアポトーシスは、ＴＵＮＥＬ技術によって目視で検出し、ＥＬＩＳＡによって定量した。２つの方法により、アポトーシス条件でＤＮＡを検出することができる（図４および５）。
【００８５】
【表１】
2004503233.tif 000003
表１
ａＮｅｕｒｏ ２ａ細胞を［９５−１１４］ＥＧＦＰ［２０６−２８０］ 、［９５−１１４］ＥＧＦＰ［２０６−２４５］または ［９５−１１４］ＥＧＦＰ［２１１−２４５］構築物と２２時間トランスフェクトさせる。細胞をＰＯＤ−ＴＵＮＥＬ法で染色し、アポトーシス形態を呈したこれらをＰＯＤ−ＴＵＮＥＬ＋と表す。
ｂＨｅｐＧ２細胞を［９５−１１４］ＥＧＦＰ［２０６−２８０］ 、［９５−１１４］ＥＧＦＰ［２０６−２４５］または ［９５−１１４］ＥＧＦＰ［２１１−２４５］構築物と２０時間トランスフェクトさせる。細胞をＰＯＤ−ＴＵＮＥＬ法で染色し、アポトーシス形態を呈したこれらをＰＯＤ−ＴＵＮＥＬ＋と表す。
ｃフィッシャーおよびイェーツｔ試験、２つの平均値の比較。
ｄＰＯＤ−ＴＵＮＥＬ＋細胞を５０００細胞数え、２つの別々のアッセイの平均値として表す。
ｅデータを、９５−１１４］ＥＧＦＰ［２０６−２８０］アッセイの値と比較した。Ｐ＜０．０５は、有意であると考慮される。
【００８６】
ＥＧＦＰ／ＷＮキメラタンパク質の細胞毒性を、Ｎｅｕｒｏ ２ａおよびＨｅｐＧ２細胞をプラスミドｐ［９５−１１４］ＥＧＦＰ［２１５−２５５］ＷＮＶ（寄託番号Ｉ−２４８５にて、２０００年５月３１日にＣＮＣＭに寄託された）でトランスフェクトして試験した （図９）。
【００８７】
【表２】
2004503233.tif 000004
表２
ａＮｅｕｒｏ ２ａ細胞を［９５−１１４］ＥＧＦＰ［２０６−２８０］ 、［９５−１１４］ＥＧＦＰ［２０６−２４５］または ［９５−１１４］ＥＧＦＰ［２１１−２５５］ｗｎｖ構築物と２２時間トランスフェクトさせる。細胞をＰＩ法で染色し、アポトーシス形態を呈したこれらをＰＩ＋と表す。
ｂＨｅｐＧ２細胞を［９５−１１４］ＥＧＦＰ［２０６−２８０］ 、［９５−１１４］ＥＧＦＰ［２０６−２４５］または ［９５−１１４］ＥＧＦＰ［２１１−２５５］ｗｎｖ構築物と２０時間トランスフェクトさせる。細胞をＰＯＤ−ＴＵＮＥＬ法で染色し、アポトーシス形態を呈したこれらをＰＯＤ−ＴＵＮＥＬ＋と表す。
ｃフィッシャーおよびイェーツｔ試験、２つの平均の比較。
ｄ ＰＩ＋またはＰＯＤ−ＴＵＮＥＬ＋細胞を５０，０００細胞数え、２つの別々のアッセイの平均値として表す。
ｅデータを、［９５−１１４］ＥＧＦＰ［２０６−２８０］アッセイの値と比較した。Ｐ＜０．０５は、有意であると考慮される。ｎ．ｓ．は、著しくない。
【００８８】
一連のＤＥＮ−ＥＧＦＰ融合構築物を用いた過渡的発現解析では、Ｍタンパク質のアミノ酸末端の４０アミノ酸（ＤＥＮポリタンパク質残基２１１〜２４５）が［９５−１１４］ＥＧＦＰ のＣ末端に融合される構築物のみが、トランスフェクションから２０時間後と同じぐらい早くＮｅｕｒｏ ２ａおよびＨｅｐＧ２細胞にアポトーシスを誘発することが明らかになった。［９５−１１４］ＥＧＦＰ［２０６−２４５］でみられたことと類似して、ＥＧＦＰの欠失を伴う ［９５−１１４］ ［２１１−２４５］融合構築物での過渡的発現は、アポトーシスを効率よく誘発する。プロテオソーム抑制剤（ＰＳＩ、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ♯５３９１６０）は、プラスミドｐ［９５−１１４］ＥＧＦＰ［２０６−２４５］でトランスフェクトされたＮｅｕｒｏ ２ａ細胞でのアポトーシスを遅らせるため、ユビキチンシステムが細胞死過程に寄与していると考えられる。
【００８９】
Ｍ配列に対して［１４４−１６５］Ｂａｘが２３％の同一性と６４％の類似性を有しているため、Ｍタンパク質の２０アミノ酸長の配列のＬＥＴＲＴＥＴＷＭＳＳＥＧＡＷＫＱＩＱＫ （ＦＧＡ／８９ポリタンパク質残基２１７〜２３６）は、Ｂａｘのようなプロ−アポトーシスタンパク質を含めたＢｃＩ−２タンパク質族の領域と有意な相同性を持つことが予想される。［１４４−１６５］Ｂａｘ領域は、ＢＨ２と呼ばれる第二Ｂｃｌ−２相同性領域（Ｓｗｉｓｓｐｒｏｔ ａｃｃｅｓｓ：Ｑ０７８１２）を含んでいる。
【００９０】
Ｍタンパク質のＮ末端の３９アミノ酸のＳＶＡＬＡＰＨＶＨＬＨＬＥＴＲＴＥＴＷＭＳＳＥＧＡＷＫＱＩＱＫＶＥＴＷＡＬＲＨ （ＦＧＡ／８９ポリタンパク質残基２０６〜２４４）は、Ｂ−細胞識別抗原ＬＹＢ−２（ＣＤ７２）、ＩＩ型膜タンパク質（Ｓｗｉｓｓｐｒｏｔアクセス：Ｐ２１８５５）のＮ末端のサイトソル領域（残基１〜９５）中の５０アミノ酸長の配列（残基４６〜９５）と４０％の同一性を共有していることが想定される。
【００９１】
プラスミドｐ［９５−１１４］ＥＧＦＰ［２０６−２４５］ＤＥＮ−２
ＰＣＴ産物を、Ｅｘｐａｎｄ　Ｒｅｖｅｒｓｅ ＴｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅおよびＥｘｐａｎｄ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＰＣＲシステム（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ、Ｉｎｃ）を使い、ＤＥＮ−２ゲノムＲＮＡから調製した。制限酵素ＢｓｒＧＩおよびＮｏｔＩの認識部位を含むオリゴヌクレオチドプライマーを、全Ｍタンパク質をエンコードするＤＥＮ−２ＲＮＡの特異的な配列の増幅に使った。Ｍタンパク質（ＤＥＮ−２ポリタンパク質２０６〜２８０）をエンコードするＤＥＮ−２ウイルス菌株ジャマイカ（Ｄｅｕｂｅｌら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、１９６：２０９〜２１９、１９９３）を、ＢｓｒＧＩ／ＮｏｔＩ消化したｐ［９５−１１４］ＥＧＦＰに導入した。ＤＥＮ−２ Ｍエクトドメイン（ＤＥＮ−２ポリタンパク質２０６〜２４５）をエンコードする特異的な配列を、ＰＣＲにて増幅するため、得られたプラスミドｐ［９５−１１４］ＥＧＦＰ［２０６−２８０］ＤＥＮ−２を鋳型として使った。ＰＣＲ産物をｐ［９５−１１４］ＥＧＦＰにクローンした。得られたプラスミドｐ［９５−１１４］ＥＧＦＰ［２０６−２４５］ＤＥＮ−２は、融合タンパク質［９５−１１４］ＥＧＦＰにインフレームで融合したＤＥＮ−２ Ｍエクトドメイン（ＤＥＮ−２ポリタンパク質２０６〜２４５）を含む。配列を、自動化した塩基配列決定法にて確認した。プラスミドｐ［９５−１１４］ＥＧＦＰ［２０６−２４５］ＤＥＮ−２を、２０００年１月２９日に番号Ｉ−２６２０でｔｈｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｎａｔｉｏｎａｌｅ ｄｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ ｄｅ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ、２８ ｒｕｅ ｄｕ Ｄｒ Ｒｏｕｘ、Ｆ−７５７２４ Ｐａｒｉｓ Ｃｅｄｅｘ １５に寄託した。
【００９２】
ＤＥＮ−２ Ｍエクトドメインのプロ−アポトーシス活性を試験するため、本発明者らは、キメラタンパク質［９５−１１４］ＥＧＦＰ［２０６−２４５］ＤＥＮ−２を使用した。ＤＥＮ−１ウイルス菌株ＢＲ／９０のＣタンパク質のＣ末端のアミノ酸９５〜１１４は、Ｍタンパク質をＥＲへ転位させるシグナル配列として作用する。このウイルス性シグナルポリペプチドを、ｐＥＧＦＰ−Ｎ１発現ベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ♯６０８５−１）によって発現されるＥＧＦＰタンパク質のＮ末端にインフェーズで融合し、キメラタンパク質［９５−１１４］ＥＧＦＰを生産する。Ｍエクトドメインに相当するＤＥＮ−２ウイルス菌株ジャマイカの領域（ＤＥＮ−２ポリタンパク質２０６〜２４５）を、［９５−１１４］ＥＧＦＰ融合構築物のＣ末端に融合した。この構築物を図１１に示す。
【００９３】
［９５−１１４］ＥＧＦＰ［２０６−２４５］ＤＥＮ−２キメラタンパク質の細胞毒性を、ＦｕＧＥＮＥＴＭ６で細胞にトランスフェクトさせることで試験した。キメラタンパク質の発現を、ＥＧＦＰの自動蛍光にて観察し、アポトーシス細胞死を前記のヨウ化プロビディンで染色させて目視で検出した。［９５−１１４］ＥＧＦＰ［２０６−２４５］ＤＥＮ−２キメラタンパク質の細胞内発現は、細胞死を生じた。ＤＥＮ−２ Ｍエクトドメインは、Ｎｅｕｒｏ ２ａ、ＨｅｐＧ２、ＨｅＬａおよびＶＥＲＯ細胞での急速なアポトーシスを誘発する能力を有する。アポトーシスは、ＤＥＮ−１ Ｍエクトドメインの配列を含むプラスミド［９５−１１４］ＥＧＦＰ［２０６−２４５］でのトランスフェクション後より、プラスミド［９５−１１４］ＥＧＦＰ［２０６−２４５］ＤＥＮ−２でのトランスフェクション後の方がより顕著であった。
【００９４】
本発明者らは、過渡的にトランスフェクトされたヒト細胞系ＨｅＬａ（ＡＴＣＣＮ°ＣＣＬ−２）、２９３Ｔ（国際ＰＣＴ出願ＷＯ ９９／５５８９２）および非−ヒト霊長類細胞系ＶＥＲＯ（ＡＴＣＣＮ°ＣＣＬ−８１） でのアポトーシスを誘発するＤＥＮ−１、ＤＥＮ−２およびＷＮ Ｍエクトドメインの能力も試験した。
【００９５】
ＥＧＦＰ／ＤＥＮおよびＥＧＦＰ／ＷＮキメラタンパク質の発現を、ＥＧＦＰの自動蛍光で観察し、アポトーシスを、トランスフェクション２５時間後にヘキストまたはヨウ化プロピジウムで染色することで目視にて検出した。
【００９６】
キメラタンパク質［９５−１１４］ＥＧＦＰ［２０６−２４５］ＤＥＮ−１および［９５−１１４］ＥＧＦＰ［２０６−２４５］ＤＥＮ−２は、ＨｅＬａ、２９３ＴおよびＶＥＲＯで大きな蛍光の塊中にあった。キメラタンパク質［９５−１１４］ＥＧＦＰ［２１５−２５５］ＷＮを発現するトランスフェクトされた細胞では、大きな蛍光体は存在しなかった。
【００９７】
キメラタンパク質［９５−１１４］ＥＧＦＰ［２０６−２４５］ＤＥＮ−１および［９５−１１４］ＥＧＦＰ［２０６−２４５］ＤＥＮ−２は、トランスフェクションから２５時間でＨｅＬａおよびＶＥＲＯでアポトーシスを誘発し、それに対してキメラタンパク質［９５−１１４］ＥＧＦＰ［２１５−２５５］ＷＮは、細胞死を引き起こさなかった （図１５）。
【００９８】
キメラタンパク質［９５−１１４］ＥＧＦＰ［２０６−２４５］ＤＥＮ−１、［９５−１１４］ＥＧＦＰ［２０６−２４５］ＤＥＮ−２および［９５−１１４］ＥＧＦＰ［２１５−２５５］ＷＮの細胞内発現は、２９３Ｔ細胞でアポトーシスを誘発しなかった。キメラタンパク質は、トランスフェクションから７２時間後に過渡的にトランスフェクトした２９３Ｔで蓄積した。したがって、２９３Ｔ細胞系は、ＤＥＮ Ｍエクトドメインの死誘発活性に対して強い耐性がある。細胞クローン２９３Ｔは、アデノウイルス５変換遺伝子を有するヒト上皮細胞系２９３（ＡＴＣＣ Ｎ ＣＲＬ−１５７３）に、配列をコードするＳＶ４０ Ｔ抗原を導入することで生成した。
【００９９】
ＤＥＮ−２ Ｍエクトドメイン欠失変異体
本発明者らは、ＤＥＮ Ｍエクトドメインの効率的な死誘発活性に寄与する配列の要素も研究した。ＰＣＲ欠失変異誘発にてＤＥＮ−２ ＭエクトドメインのＣ末端領域またはＮ末端領域のいずれかを除いた変異体を構築した。
ＤＥＮ−２エクトドメインの配列Ｍ１→Ｍ４０の欠失変異体：
【化１】
2004503233.tif 000005
【０１００】
は、セグメントＭ１→Ｍ３０（［９５−１１４］ＥＧＦＰ［Ｍ１→Ｍ３０］ＤＥＮ−２）、セグメントＭ１→Ｍ２０（［９５−１１４］ＥＧＦＰ［Ｍ１→Ｍ２０］ＤＥＮ−２） 、セグメントＭ１０→Ｍ４０（［９５−１１４］ＥＧＦＰ［Ｍ１０→Ｍ４０］ＤＥＮ−２） 、セグメントＭ２０→Ｍ４０（［９５−１１４］ＥＧＦＰ［Ｍ２０→Ｍ４０］ＤＥＮ−２） 、セグメントＭ１０→Ｍ３０（［９５−１１４］ＥＧＦＰ［Ｍ１０→Ｍ３０］ＤＥＮ−２）またはセグメントＭ３０→Ｍ４０（［９５−１１４］ＥＧＦＰ［Ｍ３０→Ｍ４０］ＤＥＮ−２）のいずれか含んだ。プラスミド［９５−１１４］ＥＧＦＰ［２０６−２４５］ＤＥＮ−２の欠失変異体を図１２に示す。
【０１０１】
ＤＥＮ−２ Ｍエクトドメインのこれらの欠失変異体の発現を、２９３Ｔ細胞の過渡的トランスフェクションで試験した。欠失変異体を、ＨｅＬａ細胞のトランスフェクションによる細胞死を引き起こす能力について試験した。過渡的にトランスフェクトした細胞を、ヘキストにて染色することでアポトーシスについて解析した。
【０１０２】
キメラタンパク質［９５−１１４］ＥＧＦＰ［２０６−２４５］ＤＥＮ−２の欠失変異体の過渡的な発現は、Ｍエクトドメイン（［９５−１１４］ＥＧＦＰ［Ｍ１０→Ｍ４０］ＤＥＮ−２）のアミノ酸Ｍ１０→Ｍ４０が分泌経路での蛍光の塊の効果的な形成に著しく寄与することを例証した（図１２）。ＤＥＮ−２ Ｍエクトドメインの死誘発活性も、アミノ酸Ｍ１０〜Ｍ４０に起因する（図１２）。プラスミド［９５−１１４］ ＥＧＦＰ［Ｍ１０ Ｍ４０］ＤＥＮ−２は、２００１年６月１４日に受託番号Ｉ−２６８４で、ｔｈｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｎａｔｉｏｎａｌｅ Ｄｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｄｅ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ（ＣＮＣＭ）、Ｉｎｓｔｉｔｕｔ Ｐａｓｔｅｕｒ、２８、ｒｕｅ ｄｕ Ｄｒ Ｒｏｕｘ、７５７２４ Ｐａｒｉｓ Ｃｅｄｅｘ １５に寄託した。
【０１０３】
ＤＥＮ Ｍエクトドメインは、インビトロで可逆的な凝集を形成する傾向がある
Ｔ７プロモーターを有する原核生物発現ベクターｐＩＶＥＸ−２，４ａ（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｉｎｃ）を、融合構築物ＥＧＦＰ［２０６−２４５］ＤＥＮ−２のインビトロでの合成について試験した。ＰＣＲ産物を、Ｅｘｐａｎｄ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＰＣＲシステム（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ、Ｉｎｃ）を使い、プラスミドｐ［９５−１１４］ ＥＧＦＰ［２０６−２４５］ＤＥＮ−２から調製した。制限酵素ＫｓｐＩおよびＳｍａＩの認識部位を含むオリゴヌクレオチドプライマーを、融合構築物ＥＧＦＰ［２０６−２４５］ＤＥＮ−２をエンコードする特異的な配列をＰＣＲで増幅するのに使用した。
【０１０４】
ｐＩＶＥＸ−ＥＧＦＰ［２０６−２４５］ＤＥＮ−２を生成するため、ＰＣＲ産物を、ＫｓｐＩ／ＳｍａＩ消化したｐＩＶＥＸ−２，４ａ（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｉｎｃ）に導入した。
【０１０５】
ＲＳＴ５００システム（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｉｎｃ）を用い、転写鋳型としてプラスミドｐＩＶＥＸ−ＥＧＦＰ［２０６−２４５］ＤＥＮ−２を使って、 ［Ｈｉｓ］６でタグした多量のキメラタンパク質ＥＧＦＰ［２０６−２４５］ＤＥＮ−２を生産した。
【０１０６】
インビトロで、新たに合成された分子ＥＧＦＰ［２０６−２４５］ＤＥＮ−２は、自動蛍光沈殿物として凝集する傾向がある。凝集物は、８Ｍウレアでインキュベートして可溶化され、これらの高次構造の形成が疎水性相互作用を要することを示唆した。
【０１０７】
本発明者らは、上記発現システムがエクトＭ分子の生産に有用なことを示した。抗体を生産する公知の実施要網（ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｒｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ出版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ、１９８８）によると、これらの分子は、エクトＭ分子に特異的な抗体の生産に有用である。
【０１０８】
形質導入によるＤＥＮ Ｍエクトドメインの細胞内発現
プラスミドｐＴＲＩＰ△Ｕ３ＣＭＶＥＧＦＰ（国際特許出願ＷＯ９９／５５８９２、その内容は、参照によって組み込まれる）は、形質導入後のＤＥＮ Ｍエクトドメインの細胞内発現に必要とされた。ＰＣＲ産物を、Ｅｘｐａｎｄ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＰＣＲシステム（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ、Ｉｎｃ）を使い、ＤＥＮ−１ Ｍエクトドメインを含むプラスミドｐ［９５−１１４］ ＥＧＦＰ［２０６−２４５］またはｐ［９５−１１４］ ＥＧＦＰ［２０６−２４５］ＤＥＮ−２のいずれかから調製した。制限酵素ＢｇｌＩＩおよびＫｐｎＩの認識部位を含むオリゴヌクレオチドプライマーを、融合構築物ＥＧＦＰ／ＤＥＮをエンコードする特異的な配列の増幅に使った。ＰＣＲ産物を、ＢａｍＨＩ／ＫｐｎＩ消化したｐＴＲＩＰ△Ｕ３ＣＭＶＥＧＦＰに導入した。
【０１０９】
得られたプラスミドｐＴＲＩＰ△Ｕ３ＣＭＶ ［９５−１１４］ ＥＧＦＰ［２０６−２４５］ＤＥＮ−１およびｐＴＲＩＰ△Ｕ３ＣＭＶ ［９５−１１４］ ＥＧＦＰ［２０６−２４５］ＤＥＮ−２を、国際特許出願ＷＯ９９／５５８９２（Ｐｉｅｒｒｅ Ｃｈａｒｍｅａｕ’ｓら）に記載のキメラタンパク質ＥＧＦＰ／ＤＥＮ Ｍエクトドメインをコードする配列を有する非複製レトロウイルスを生産するのに使った。
【０１１０】
大きなフラスコの２９３Ｔ細胞の単層物を、ｐＴＲＩＰ△Ｕ３ＣＭＶ ［９５−１１４］ ＥＧＦＰ［２０６−２４５］ＤＥＮ−１またはｐＴＲＩＰ△Ｕ３ＣＭＶ ［９５−１１４］ ＥＧＦＰ［２０６−２４５］ＤＥＮ−２と、ＶＳＶエンベロープＧタンパク質またはＨＩＶタンパク質のいずれかをコードする配列を有するプラスミドで２日間、同時にトランスフェクト （ｃｏ−ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅ）した。
【０１１１】
プラスミドｐＴｒｉｐ△Ｕ３ ［９５−１１４］ ＥＧＦＰ［２０６−２４５］ＤＥＮ−２は、２００１年６月１４日に受託番号Ｉ−２６８６で、ｔｈｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｎａｔｉｏｎａｌｅ Ｄｅ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ Ｄｅ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ（ＣＮＣＭ）、Ｉｎｓｔｉｔｕｔ Ｐａｓｔｅｕｒ 、２８、ｒｕｅ ｄｕ Ｄｒ Ｒｏｕｘ、７５７２４ Ｐａｒｉｓ Ｃｅｄｅｘ １５、Ｆｒａｎｃｅに寄託した。
【０１１２】
プラスミドｐＴｒｉｐ△ＵＳ［９５−１１４］ ＥＧＦＰ［２０６−２４５］ＤＥＮ−１は、２００１年６月１４日に受託番号Ｉ−２６８５で、ｔｈｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｎａｔｉｏｎａｌｅ Ｄｅ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ Ｄｅ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ（ＣＮＣＭ）、Ｉｎｓｔｉｔｕｔ Ｐａｓｔｅｕｒ、２８、ｒｕｅ ｄｕ Ｄｒ Ｒｏｕｘ、７５７２４ Ｐａｒｉｓ Ｃｅｄｅｘ １５、Ｆｒａｎｃｅに寄託した（図１３）。
【０１１３】
組み換えレトロウイルスの生産および精製は、本質的に、国際特許出願ＷＯ９９／５５８９２（その内容は、参照によって取り込まれる）に記載されているように行った。
【０１１４】
組み換えウイルス粒子ｐＴＲＩＰ△Ｕ３ＣＭＶ ［９５−１１４］ ＥＧＦＰ［２０６−２４５］ＤＥＮ−１およびｐＴＲＩＰ△Ｕ３ＣＭＶ ［９５−１１４］ ＥＧＦＰ［２０６−２４５］ＤＥＮ−２の生産を、ＥＬＩＳＡによる可溶性ｐ２４量の測定で決定した。１０５ＨｅＬａ細胞あたり７５ｎｇの組み換えレトロウイルスｐＴＲＩＰ△Ｕ３ＣＭＶ ［９５−１１４］ ＥＧＦＰ［２０６−２４５］ＤＥＮ−１の投与量では、死亡率は、形質導入から４８時間後に約６０％であった（図１３）。
【０１１５】
上記技術から鑑み、明らかに、本発明について無数の修飾および変更が可能である。それゆえ、別紙の請求の範囲内で、本発明が、具体的に記載されない限り実施されうることが理解される。
【図面の簡単な説明】
【図１】Ａ．ＤＥＮポリタンパク質熟成の模式図
Ｂ．組み換えｐｒＭおよびＥタンパク質の模式図
【図２】Ａ．Ｅタンパク質構造の模式図
Ｂ．ｐｒＭタンパク質構造の模式図
【図４】Ａ． アポトーシス状態での２５時間トランスフェクトさせたＮｅｕｒｏ ２ａ細胞（ＰＯＤ−ＴＵＮＥＬ）
Ｂ． ２０時間トランスフェクトさせたＮｅｕｒｏ ２ａ細胞：ＥＬＩＳＡによる遊離オリゴヌクレオソームの定量
Ｃ． アポトーシス状態で［９５−１１４］ ＥＧＦＰ［２０６−２４５］を発現するＮｅｕｒｏ ２ａ細胞（ＰＯＤ−ＴＵＮＥＬ）
【図５】Ａ． ２０時間感染させたＨｅｐＧ２細胞：ＥＬＩＳＡによる遊離オリゴヌクレオソームの定量
【図６】プラスミドｐ［９５−１１４］ＥＦＧＰ ［２０６−２４５］の配列
【図７】プラスミドｐ［９５−１１４］ ［２１１−２４５］の配列
【図８】［９５−１１４］ＥＧＦＰ［２０６−２４５］融合タンパク質を発現する細胞
【図９】ＤＥＮウイルスとＷＮウイルスとの類似性および同一性
【図１０】ＤＥＮ−１ウイルス菌株ＦＧＡ／８９、ならびにＣＤ７２タンパク質の５６〜９５残基、Ｂａｘタンパク質のＢＨ２領域、およびその他のフラビウイルスの間でのＭタンパク質の配列の同一性および類似性
【図１１】プラスミドｐ［９５−１１４］ＥＦＧＰ ［２０６−２４５］ＤＥＮ−２の配列
【図１２】ｅｃｔｏＭ ＤＥＮ−２の欠失変異体
【図１３】組み換えレンチウイルスベクター
【図１４】トリップｅｃｔｏＭ ＤＥＮ−１の活性を誘発する細胞死
【図１５】ｅｃｔｏＭ分子の細胞毒性
【図１】
2004503233.tif 000006
【図２】
2004503233.tif 000007
【図３】
2004503233.tif 000008
【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
2004503233.tif 000010
【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図５Ａ】
2004503233.tif 000013
【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
2004503233.tif 000018
【図１０】
2004503233.tif 000019
【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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