(57)【要約】Ｗｎｔ、亜鉛トランスポーター、ミツグミン２９、ｓｌｉｔ−３、ＬＲＲ／ＧＰＣＲ、主要組織適合性複合体エンハンサータンパク質ＭＡＤ３、インターロイキン９、５−ヒドロキシトリプタミンレセプタ、およびチオレドキシン関連ポリペプチドをコードする、核酸配列が本明細書中にて開示される。これらの核酸配によってコードされるポリペプチド、およびこのポリペプチドに免疫特異的に結合する抗体、ならびに前述の、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、または抗体の、誘導体、改変体、変異体、またはフラグメントがまた、開示される。本発明はまた、これらの新規のヒトの核酸およびタンパク質のいずれか１つに関連する、障害の診断、治療、および予防のための、治療方法、診断方法、および研究方法を、さらに開示する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離されたポリペプチドであって、以下：
（ａ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０および３２からなる群より選択されるアミノ酸配列の成熟形態；
（ｂ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０および３２からなる群より選択されるアミノ酸配列の成熟形態の改変体であって、ここで、該改変体中の１以上のアミノ酸残基が、該成熟形態のアミノ酸配列と異なり、ただし、該改変体は、該成熟形態のアミノ酸配列と、そのアミノ酸残基のうちの１５％以下において異なる、改変体；
（ｃ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０および３２からなる群より選択されるアミノ酸配列；ならびに
（ｄ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０および３２からなる群より選択されるアミノ酸配列の改変体であって、ここで、該改変体中の１以上のアミノ酸残基が、該成熟形態のアミノ酸配列と異なり、ただし、該改変体は、該アミノ酸配列と、そのアミノ酸残基のうちの１５％以下において異なる、改変体；からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチド。
【請求項２】
請求項１に記載のポリペプチドであって、該ポリペプチドが、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０および３２からなる群より選択されるアミノ酸配列の天然に存在する対立遺伝子改変体のアミノ酸配列を含む、ポリペプチド。
【請求項３】
請求項２に記載のポリペプチドであって、ここで、前記対立遺伝子改変体が、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９および３１からなる群より選択される核酸配列と単一ヌクレオチドで異なる核酸配列の翻訳物であるアミノ酸配列を含む、ポリペプチド。
【請求項４】
前記改変体のアミノ酸配列が、保存的アミノ酸置換含む、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項５】
単離された核酸分子であって、以下：
（ａ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０および３２からなる群より選択されるアミノ酸配列の成熟形態；
（ｂ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０および３２からなる群より選択されるアミノ酸配列の成熟形態の改変体であって、ここで、該改変体中の１以上のアミノ酸残基が、該成熟形態のアミノ酸配列と異なり、ただし、該改変体は、該成熟形態のアミノ酸配列と、そのアミノ酸残基のうちの１５％以下において異なる、改変体；
（ｃ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０および３２からなる群より選択されるアミノ酸配列；
（ｄ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０および３２からなる群より選択されるアミノ酸配列の改変体であって、ここで、該改変体中の１以上のアミノ酸残基が、該成熟形態のアミノ酸配列と異なり、ただし、該改変体は、該アミノ酸配列と、そのアミノ酸残基のうちの１５％以下において異なる、改変体；
（ｅ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０および３２からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドまたは該ポリペプチドの改変体の、少なくとも一部をコードする核酸フラグメントであって、ここで、該改変体中の１以上のアミノ酸残基が、該成熟形態のアミノ酸配列と異なり、ただし、該改変体は、該アミノ酸配列と、そのアミノ酸残基のうちの１５％以下において異なる、核酸フラグメント；ならびに
（ｆ）  （ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）または（ｅ）の相補体を含む、核酸分子、
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸配列を含む、単離された核酸分子。
【請求項６】
前記核酸分子が天然に存在する対立遺伝子核酸改変体のヌクレオチド配列を含む、請求項５に記載の核酸分子。
【請求項７】
前記核酸分子が天然に存在するポリペプチド改変体のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする、請求項５に記載の核酸分子。
【請求項８】
請求項５に記載の核酸分子であって、ここで、該核酸分子が、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９および３１からなる群より選択される核酸配列と単一ヌクレオチドで異なる、核酸分子。
【請求項９】
請求項５に記載の核酸分子であって、ここで、該核酸分子が以下：
（ａ）配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９および３１からなる群より選択されるヌクレオチド配列；
（ｂ）配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９および３１からなる群より選択されるヌクレオチド配列と１つ以上のヌクレオチドで異なる、ヌクレオチド配列であって、ただし、そのヌクレオチドの２０％以下が、該ヌクレオチド配列と異なる、ヌクレオチド配列；
（ｃ）（ａ）の核酸フラグメント；ならびに
（ｄ）（ｂ）の核酸フラグメント；
からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む、核酸分子。
【請求項１０】
請求項５に記載の核酸分子であって、ここで、該核酸分子が、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９および３１からなる群より選択されるヌクレオチド配列または該ヌクレオチド配列の相補鎖にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、核酸分子。
【請求項１１】
請求項５に記載の核酸分子であって、該核酸分子は、以下：
（ａ）第１のヌクレオチド配列であって、前記アミノ酸配列をコードするコード配列と１以上のヌクレオチド配列で異なるコード配列を含み、ただし、該第１のヌクレオチド配列中のコード配列におけるヌクレオチドの２０％以下が、該コード配列と異なる、第１のヌクレオチド配列；
（ｂ）該第１のポリヌクレオチドの相補体である、単離された第２のポリヌクレオチド；ならびに
（ｃ）（ａ）または（ｂ）の核酸フラグメント；
からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む、核酸分子。
【請求項１２】
請求項１１に記載の核酸分子を含む、ベクター。
【請求項１３】
前記核酸分子に作動可能に連結されたプロモーターをさらに含む、請求項１２に記載のベクター。
【請求項１４】
請求項１２に記載のベクターを含む、細胞。
【請求項１５】
請求項１に記載のポリペプチドに免疫特異的に結合する、抗体。
【請求項１６】
前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項１５に記載の抗体。
【請求項１７】
前記抗体がヒト化抗体である、請求項１５に記載の抗体。
【請求項１８】
サンプル中の請求項１に記載のポリペプチドの存在または量を決定するための方法であって、該方法は、以下：
（ａ）該サンプルを提供する工程；
（ｂ）該サンプルを、該ポリペプチドに免疫特異的に結合する抗体と接触させる工程；および
（ｃ）該ポリペプチドに結合した抗体の存在または量を決定して、それによって該サンプル中のポリペプチドの存在または量を決定する工程、
を包含する、方法。
【請求項１９】
サンプル中の請求項５に記載の核酸分子の存在または量を決定するための方法であって、該方法は、以下：
（ａ）該サンプルを提供する工程；
（ｂ）該サンプルを、該核酸分子に結合するプローブと接触させる工程；および
（ｃ）該核酸分子に結合した該プローブの存在または量を決定して、それによって該サンプル中の該核酸分子の存在または量を決定する工程、
を包含する、方法。
【請求項２０】
前記核酸分子の存在または量が、細胞型または組織型についてのマーカーとして使用される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記細胞型または組織型が癌性である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
請求項１に記載のポリペプチドに結合する因子を同定する方法であって、該方法は、以下：
（ａ）該ポリペプチドを該因子と接触させる工程；および
（ｂ）該因子が該ポリペプチドに結合するか否かを決定する工程；
を包含する、方法。
【請求項２３】
前記因子が、細胞レセプターまたは下流エフェクターである、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
請求項１に記載のポリペプチドの発現または活性を調節する因子を同定するための方法であって、該方法は、以下：
（ａ）該ポリペプチドを発現する細胞を提供する工程；
（ｂ）該因子と該細胞とを接触させる工程；および
（ｃ）該因子が、該ポリペプチドの発現または活性を調節するか否かを決定する工程、
を包含し、それによって、該ペプチドの発現または活性における変化が、該因子が該ポリペプチドの発現または活性の調節することを示す、方法。
【請求項２５】
請求項１に記載のポリペプチドの活性を調節するための方法であって、該方法は、請求項１に記載のポリペプチドを発現する細胞サンプルを、該ポリペプチドの活性を調節するのに十分な量で、該ポリペプチドに結合する化合物と接触させる工程を包含する、方法。
【請求項２６】
ＮＯＶＸ関連障害を処置または予防する方法であって、該方法は、そのような処置または予防が所望される被験体に、該被験体における該ＮＯＶＸ関連障害を処置または予防するのに十分な量で、請求項１に記載のポリペプチドを投与する工程を包含する、方法。
【請求項２７】
前記被験体がヒトである、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
ＮＯＶＸ関連障害を処置または予防する方法であって、該方法は、そのような処置または予防が所望される被験体に、該被験体における該ＮＯＶＸ関連障害を処置または予防するのに十分な量で、請求項５に記載の核酸を投与する工程を包含する、方法。
【請求項２９】
前記被験体がヒトである、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
ＮＯＶＸ関連障害を処置または予防する方法であって、該方法は、そのような処置または予防が所望される被験体に、該被験体における該ＮＯＶＸ関連障害を処置または予防するのに十分な量で、請求項１５に記載の抗体を投与する工程を包含する、方法。
【請求項３１】
前記被験体がヒトである、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
請求項１に記載のポリペプチドおよび薬学的に受容可能なキャリアを含有する、薬学的組成物。
【請求項３３】
請求項５に記載の核酸分子および薬学的に受容可能なキャリアを含有する、薬学的組成物。
【請求項３４】
請求項１５に記載の抗体および薬学的に受容可能なキャリアを含有する、薬学的組成物。
【請求項３５】
請求項３２に記載の薬学的組成物を１つ以上の容器に含む、キット。
【請求項３６】
請求項３３に記載の薬学的組成物を１つ以上の容器に含む、キット。
【請求項３７】
請求項３４に記載の薬学的組成物を１つ以上の容器に含む、キット。
【請求項３８】
第１の哺乳動物被験体において、請求項１に記載のポリペプチドの変化したレベルと関連する、疾患の存在または該疾患に対する素因を決定するための方法であって、該方法は、以下：
（ａ）該第１の哺乳動物被験体由来のサンプル中の該ポリペプチドの発現レベルを測定する工程；および
（ｂ）工程（ａ）のサンプル中の該ポリペプチドの量を、該疾患を有さないことが既知であるか、または該疾患にかかりにくいことが既知の、第２の哺乳動物被験体由来のコントロールサンプル中に存在する該ポリペプチドの量と、比較する工程、
を包含し、ここで、該コントロールサンプルと比較した場合の該第１の被験体における該ポリペプチドの発現レベルにおける変化が、該疾患の存在または該疾患に対する素因を示す、方法。
【請求項３９】
前記素因が癌に対するものである、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
第１の哺乳動物被験体において、請求項５に記載の核酸分子の変化したレベルと関連する、疾患の存在または該疾患に対する素因を決定するための方法であって、該方法は、以下：
（ａ）該第１の哺乳動物被験体由来のサンプル中の該核酸の量を測定する工程；および
（ｂ）工程（ａ）のサンプル中の該核酸の量を、該疾患を有さないことが既知であるかまたは該疾患にかかりにくいことが既知の、第２の哺乳動物被験体由来のコントロールサンプル中に存在する該核酸の量と比較する工程、
を包含し、ここで、該コントロールサンプルと比較した場合の、該第１の被験体における該核酸のレベルにおける変化が、該疾患の存在または該疾患に対する素因を示す、方法。
【請求項４１】
前記素因が癌に対するものである、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
哺乳動物において病理学的状態を処置する方法であって、該方法は、該病理学的状態を緩和するのに十分な量でポリペプチドを該哺乳動物に投与する工程を包含し、ここで、該ポリペプチドが、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０および３２のうちの少なくとも１つのアミノ酸配列を含むポリペプチドまたはそれらの生物学的に活性なフラグメントと、少なくとも９５％同一なアミノ酸配列を有するポリペプチドである、方法。
【請求項４３】
哺乳動物において病理学的状態を処置する方法であって、該方法は、該病理学的状態を緩和するのに十分な量で請求項１５に記載の抗体を該哺乳動物に投与する工程を包含する、方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の背景）
本発明は、概して、核酸およびそれによってコードされるポリペプチドに関する。より詳細には、本発明は、細胞質、核、膜結合、および分泌ポリペプチドをコードする核酸、ならびにこれらの核酸およびポリペプチドを産生するためのベクター、宿主細胞、抗体および組換え方法に関する。
【０００２】
（発明の要旨）
本発明は、新規なポリペプチドをコードする核酸配列の発見に一部は基づく。この新規な核酸およびポリペプチドを、本明細書において、ＮＯＶＸ、またはＮＯＶ１ａ、ＮＯＶ１ｂ、ＮＯＶ１ｃ、ＮＯＶ２ａ、ＮＯＶ２ｂ、ＮＯＶ２ｃ、ＮＯＶ３ａ、ＮＯＶ３ｂ、ＮＯＶ４ａ、ＮＯＶ４ｂ、ＮＯＶ５ａ、ＮＯＶ５ｂ、ＮＯＶ６、ＮＯＶ７、ＮＯＶ８、およびＮＯＶ９の核酸およびポリペプチドと称する。これらの核酸およびポリペプチド、ならびにその誘導体、相同体（ホモログ）、類似体（アナログ）、およびフラグメントを、本明細書において以降は、総称して「ＮＯＶＸ」核酸配列または「ＮＯＶＸ」ポリペプチド配列と称する。
【０００３】
１つの局面において、本発明は、ＮＯＶＸポリペプチドをコードする単離されたＮＯＶＸ核酸分子を提供し、これは、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、および３１に開示される核酸に対して同一性を有する核酸配列を含む。いくつかの実施形態において、このＮＯＶＸ核酸分子は、ＮＯＶＸ核酸配列のタンパク質コード配列を含む核酸分子に相補的な核酸配列に、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする。本発明はまた、ＮＯＶＸポリペプチド、あるいはそのフラグメント、ホモログ、アナログまたは誘導体をコードする、単離された核酸を包含する。例えば、この核酸は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、および３２のアミノ酸配列を含むポリペプチドに対して少なくとも８０％同一であるポリペプチドをコードし得る。この核酸は、例えば、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、および３１のいずれかの核酸配列を含む、ゲノムＤＮＡフラグメントまたはｃＤＮＡ分子であり得る。
【０００４】
オリゴヌクレオチド（例えば、ＮＯＶＸ核酸（例えば、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、および３１）の少なくとも６個連続するヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドまたはそのオリゴヌクレオチドの相補体）もまた、本発明に含まれる。
【０００５】
実質的に精製されたＮＯＶＸポリペプチド（配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、および３２）もまた、本発明に含まれる。特定の実施形態において、このＮＯＶＸポリペプチドは、ヒトＮＯＶＸポリペプチドのアミノ酸配列に実質的に同一であるアミノ酸配列を含む。
【０００６】
本発明はまた、ＮＯＶＸポリペプチド、あるいはそれらのフラグメント、ホモログ、アナログまたは誘導体に免疫選択的に結合する抗体を特徴とする。
【０００７】
別の局面において、本発明は、治療有効量または予防有効量の治療剤および薬学的に受容可能なキャリアを含む、薬学的組成物を包含する。この治療剤は、例えば、ＮＯＶＸ核酸、ＮＯＶＸポリペプチド、またはＮＯＶＸポリペプチドに特異的な抗体であり得る。さらなる局面において、本発明は、１以上の容器に、この薬学的組成物の治療有効量または予防有効量を含む。
【０００８】
さらなる局面において、本発明は、ポリペプチドを産生する方法を包含し、この方法は、ＮＯＶＸ核酸を含む細胞を、このＤＮＡによってコードされるＮＯＶＸポリペプチドの発現を可能にする条件下で培養することによる。所望の場合、次いで、このＮＯＶＸポリペプチドを回収し得る。
【０００９】
別の局面において、本発明は、サンプル中のＮＯＶＸポリペプチドの存在を検出する方法を包含する。この方法において、サンプルを、このポリペプチドに選択的に結合する化合物と、このポリペプチドとこの化合物との間での複合体の形成を可能にする条件下で接触させる。この複合体を、存在するならば、検出し、それによって、このサンプル中のＮＯＶＸポリペプチドを同定する。
【００１０】
本発明はまた、ＮＯＶＸの発現に基づいて特定の細胞型または組織型を同定するための方法を包含する。
【００１１】
サンプル中のＮＯＶＸ核酸分子の存在を検出する方法もまた本発明に包含され、この方法は、このサンプルに、ＮＯＶＸ核酸プローブまたはプライマーを接触させ、そしてこの核酸プローブまたはプライマーが、このサンプル中のＮＯＶＸ核酸分子に結合したか否かを検出することによる。
【００１２】
さらなる局面において、本発明は、ＮＯＶＸポリペプチドの活性を調節するための方法を提供し、この方法は、このＮＯＶＸポリペプチドを含む細胞サンプルに、このＮＯＶＸポリペプチドに結合する化合物を、このポリペプチドの活性を調節するに十分な量で接触させることによる。この化合物は、例えば、本明細書中にさらに記載されるような、低分子（例えば、核酸、ペプチド、ポリペプチド、ペプチド模倣物、糖質、脂質または他の有機分子（炭素含有）または無機分子）であり得る。
【００１３】
以下を含む障害または症候群を処置または予防するための医薬の製造における治療剤の使用もまた、本発明の範囲内にある：例えば、発達障害、内分泌障害、脈管障害、感染症、食欲不振、癌、神経変性障害、肺障害、生殖障害、アルツハイマー病、パーキンソン病、免疫障害、および造血障害、または細胞シグナルプロセシングおよび代謝経路の調節に関連する他の障害。治療剤は、例えば、ＮＯＶＸ核酸、ＮＯＶＸポリペプチド、またはＮＯＶＸ特異的抗体、あるいはそれらの生物学的に活性な誘導体またはフラグメントであり得る。
【００１４】
例えば、本発明の組成物は、以下に罹患した患者の処置についての有効性を有する：神経変性疾患（例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンティングトン病、多発性硬化症、筋萎縮性外側硬化症（Ａｍｙｏｔｒｏｐｉｃ  Ｌａｔｅｒａｌ  Ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ））、急性脳損傷（例えば、発作、頭部損傷、脳性麻痺）、ＣＮＳ機能不全（例えば、うつ病、てんかん、および精神分裂病）、炭水化物代謝に影響する障害（例えば、ガラクトース血症および遺伝性果糖不耐症）、組織障害（例えば、ヴィスコット−オールドリッチ症候群、オールドリッチ症候群、湿疹−血小板減少−免疫欠損症候群、血小板減少、夜盲、バッテン病、セロイド脂褐素症、レット症候群およびピック症候群）、異常な新脈管形成に関連する障害（例えば、癌）、ぜん息、無精子症、学習障害、顔の異形症、自己免疫脳脊髄炎、Ｘ連鎖重症複合免疫不全、および他の免疫学的障害、発作、片頭痛、炎症、自己免疫障害、ならびに睡眠、欲求、温度調節、疼痛知覚、ホルモン分泌および性的行動に影響する他の障害。
【００１５】
このポリペプチドは、本発明に特異的な抗体を産生するための免疫原として、およびワクチンとして使用され得る。これらはまた、潜在的なアゴニスト化合物およびアンタゴニスト化合物についてスクリーニングするためにも使用され得る。例えば、ＮＯＶＸをコードするｃＤＮＡは、遺伝子治療において有用であり得、そしてＮＯＶＸは、それを必要とする被験体に投与される場合に有用であり得る。
【００１６】
本発明はさらに、例えば、発達障害、内分泌障害、脈管障害、感染症、食欲不振、癌、神経変性障害、肺障害、生殖障害、免疫障害および自己免疫障害を含む障害または症候群、ならびに／または細胞のシグナルプロセシングおよび代謝経路の調節に関連する障害のモジュレーターについてスクリーニングするための方法を含む。この方法は、試験化合物にＮＯＶＸポリペプチドを接触させる工程、およびこの試験化合物がこのＮＯＶＸポリペプチドに結合するか否かを決定する工程を包含する。ＮＯＶＸポリペプチドへの試験化合物の結合は、この試験化合物が、前述の障害または症候群に対する活性のモジュレーターあるいは前述の障害または症候群に対する潜在性または素因のモジュレーターであることを示す。
【００１７】
また、例えば、発達障害、内分泌障害、脈管障害、感染症、食欲不振、癌、神経変性障害、肺障害、生殖障害、免疫障害および自己免疫障害を含む障害もしくは症候群、ならびに／または細胞のシグナルプロセシングおよび代謝経路の調節に関連する他の障害に対する活性のモジュレーター、あるいはこれらに対する潜在性または素因のモジュレーターについて、上記の障害または症候群の危険性が高い試験動物に試験化合物を投与することによってスクリーニングするための方法も本発明の範囲内である。この試験動物は、ＮＯＶＸ核酸によってコードされる組換えポリペプチドを発現する。次いで、ＮＯＶＸポリペプチドを組換え的に発現し、そしてこの障害または症候群の危険性が高くないコントロール動物におけるタンパク質の発現または活性と同様に、ＮＯＶＸポリペプチドの発現または活性が試験動物において測定される。次に、試験動物およびコントロール動物の両方におけるＮＯＶＸポリペプチドの発現が比較される。コントロール動物と比較して、試験動物におけるＮＯＶＸポリペプチドの活性における変化は、この試験化合物が、この障害または症候群の潜在性のモジュレーターであることを示す。
【００１８】
なお別の局面において、本発明は、被験体（例えば、ヒト被験体）におけるＮＯＶＸポリペプチド、ＮＯＶＸ核酸、またはその両方の変化したレベルに関連する疾患の存在またはこれらの疾患に対する素因を決定するための方法を包含する。この方法は、被験体由来の試験サンプルにおけるＮＯＶＸポリペプチドの量を測定する工程、およびこの試験サンプルにおけるＮＯＶＸポリペプチドの量を、コントロールサンプル中に存在するＮＯＶＸポリペプチドの量と比較する工程を包含する。コントロールサンプルと比較した場合の試験サンプルにおけるＮＯＶＸポリペプチドレベルの変化は、この被験体における疾患の存在または素因を示す。好ましくは、この素因としては、例えば、発達障害、内分泌障害、脈管障害、感染症、食欲不振、癌、神経変性障害、肺障害、生殖障害、免疫障害および自己免疫障害、ならびに／または細胞シグナルプロセシングおよび代謝経路の調節に関連する他の障害が挙げられる。また、本発明の新しいポリペプチド発現レベルは、種々の癌についてスクリーニングするための方法、ならびに癌の段階を決定するための方法において使用され得る。
【００１９】
さらなる局面において、本発明は、病理学的状態を緩和または予防するために十分な量で、被験体（例えば、ヒト被験体）にＮＯＶＸポリペプチド、ＮＯＶＸ核酸、またはＮＯＶＸ特異的抗体を投与することによって、哺乳動物における障害に関連した病理学的状態を処置または予防する方法を包含する。好ましい実施形態において、この障害としては、例えば、発達障害、内分泌障害、脈管障害、感染症、食欲不振、癌、神経変性障害、肺障害、生殖障害、免疫障害および自己免疫障害、ならびに／または細胞シグナルプロセシングおよび代謝経路の調節に関連する他の障害が挙げられる。
【００２０】
なお別の局面において、本発明は、当該分野において一般的に使用される多数の技術のうちのいずれか１つによって、本発明の細胞性レセプターおよび下流のエフェクターを同定する方法において使用され得る。これらの技術としては、ツーハイブリッド系、アフィニティ精製、抗体または他の特異的に相互作用する分子を用いる共沈が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２１】
他に規定されない限り、本明細書中において使用されるすべての専門用語および科学技術用語は、本発明が属する分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書中に記載された方法および物質と類似または等価な方法および物質が、本発明の実施または試験において使用され得るが、適切な方法および物質を以下に記載する。本明細書中で引用されたすべての刊行物、特許出願、特許および他の参考文献が、それらの全体において、参考として援用される。矛盾する場合には、定義を含む本明細書中が規約する。さらに、物質、方法および例は、例示のみであり、限定されることは意図されない。
【００２２】
本発明の他の特徴および利点が、以下の詳細な説明および特許請求の範囲から明らかである。
【００２３】
（発明の詳細な説明）
本発明に含まれるのは、新規の核酸配列およびそのポリペプチドである。この配列は、集合的に、「ＮＯＶＸ核酸」または「ＮＯＶＸポリヌクレオチド」といわれ、そしてその対応する、コードされたポリペプチドは、「ＮＯＶＸポリペプチド」または「ＮＯＶＸタンパク質」といわれる。別な方法で表示されていない場合、「ＮＯＶＸ」は、本明細書中で開示された任意の新規配列をいうことが意味される。
【００２４】
ＮＯＶＸ核酸およびそれらがコードするポリペプチドは、種々の適用および状況において有用である。本発明によるこの種々のＮＯＶＸ核酸およびポリペプチドは、ドメインおよび配列の、既に記載されているタンパク質との関連性の存在に従って、このタンパク質ファミリーの新規のメンバーとして有用である。さらに、ＮＯＶＸ核酸およびポリペプチドは、ＮＯＶＸポリペプチドが属するファミリーのメンバーであるタンパク質を同定するためにもまた使用され得る。
【００２５】
ＮＯＶ１は、Ｗｎｔ遺伝子ファミリーに相同である。従って、本発明のＮＯＶ１ポリペプチドは、Ｗｎｔ遺伝子ファミリーのメンバーと同様に機能するポリペプチドを含む。この遺伝子ファミリーは、脊椎動物の発生および分化において重要な役割を果たすことが公知の、システインリッチなタンパク質のクラスをコードする。Ｗｎｔ遺伝子ファミリーは、脳の発達に関係する胚性神経細胞の運命を決定するシグナル伝達経路に関係している。最近の研究は、Ｗｎｔシグナル伝達が、神経板の初期形成、および、神経堤の形成を含む胚性神経系における多くの引き続くパターン形成の決定、を制御することを示している。Ｗｎｔタンパク質シグナル伝達は、引き続き発生後期段階に重要である。Ｗｎｔタンパク質は、小脳における神経細胞骨格の解剖学的構造およびシナプスの分化を調節することが示されている。Ｗｎｔタンパク質シグナル伝達は、アポトーシスを調節することが立証されており、そして、その加齢した脳における細胞死を導く変性過程に関与し得る。リンパ球増強因子（Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  ｅｎｈａｎｃｅｒ  ｆａｃｔｏｒ）−１（ＬＥＦ−１）が媒介するＷｎｔタンパク質シグナル伝達は、Ｂ細胞発達に関与することが示されている。最近の研究は、このＷｎｔタンパク質シグナル伝達経路がまた、アルツハイマー病において役割を果たし得ることを示唆している。
【００２６】
このＷｎｔ遺伝子ファミリーは、いくつかのメンバーを含む。それらのうち、分泌シグナルをコードするＷｎｔ−１およびＷｎｔ−３ａは、背面のパターン形成と同時に、発達中の神経管の背側正中線で同時発現される。それぞれのシグナルは胚発生に不可欠であり、Ｗｎｔ−１は中脳のパターン形成のために、そしてＷｎｔ−３ａは沿軸中胚葉の形成のために不可欠である。Ｗｎｔ−３ａ変異胚は、尾部からその前肢レベルに欠損を示し、体節は存在せず、脊索は破壊され、そして中枢神経系は著しい異常形態を有する。最近の遺伝学研究は、このシグナル伝達因子Ｗｎｔ−３ａが海馬の形成に必要であることを示している。さらに、研究は、始原軸形成がＷｎｔ−３に依存することを示している。この神経細胞の発達および維持以外に、Ｗｎｔ−１およびＷｎｔ−３は、マウス乳腺腫瘍において活性化されたオンコジーンとして発見されている。従って、本発明による、このＮＯＶ１核酸およびＮＯＶ１ポリペプチド、抗体、ならびに関連化合物は、種々の神経学的障害における治療適用に有用である。この種々の神経学的障害には、神経変性疾患（例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病、多発性硬化症、ハンティングトン病、筋萎縮（ａｍｙｏｔｒｏｐｉｃ）側索硬化症）、急性脳損傷（例えば、発作、頭部損傷、脳性麻痺）および多数の中枢神経系機能障害（例えば、うつ病、てんかん、および精神分裂病）などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００２７】
ＮＯＶ２は、亜鉛輸送体（Ｚｉｎｃ−ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ）様（ＺＮＴ）ファミリーのタンパク質に相同である。従って、本発明のＮＯＶ２ポリペプチドは、このＺＮＴファミリーのメンバーと同様に機能するポリペプチドを含む。亜鉛輸送体は、亜鉛イオンを細胞内に輸送すること、ならびに細胞生存および増殖のような過程を調節することにおいて役割を果たす。亜鉛結合タンパク質は、脳において単離されており、そして、亜鉛の定常状態濃度を調節する。亜鉛は、多数のスルフヒドリル含有酵素の強力なインヒビターなので、亜鉛結合タンパク質は、脳における遊離亜鉛の上昇を防止することにより、中枢神経毒性の予防において役割を果たし得る。神経細胞の維持以外に、亜鉛結合タンパク質は、炭水化物代謝において重要な役割を果たすことが見出されている。従って、本発明による、このＮＯＶ２核酸およびＮＯＶ２ポリペプチド、抗体、および関連化合物は、神経学的維持、ならびにガラクトース血症および遺伝性果糖不耐症のような炭水化物代謝における種々の障害における治療適用に有用である。
【００２８】
ＮＯＶ３は、Ｍｉｔｓｕｇｕｍｉｎ２９様（ＭＧ２９）ファミリーのタンパク質に相同であり、このＭＧ２９ファミリーはシナプトフィジンファミリーのメンバーである。従って、本発明のＮＯＶ３ポリペプチドは、ＭＧ２９およびシナプトフィジンファミリーの他のメンバーと同様に機能するポリペプチドを含む。シナプトフィジンおよびシナプトポリン（ｓｙｎａｐｔｏｐｏｒｉｎ）は、糖タンパク質と関連がある：これらはまた、種々の非内分泌細胞の小胞において発見され得るが、特定のクラスの小さな神経分泌小胞の主要な一体型膜タンパク質である。このポリペプチド鎖は膜を４回貫通し、そしてイオンチャネルまたは溶質チャネルとしておそらく作用する。最近、骨格筋における三つ組結合部（ｔｒｉａｄ  ｊｕｎｃｔｉｏｎ）に特有のＭＧ２９が、シナプトフィジンファミリーの新規メンバーとして単離された；このファミリーのメンバーは、４回膜貫通セグメントを有し、そして、細胞内小胞上に分布する。マウスＭＧ２９  ｃＤＮＡおよびこの遺伝子を含むゲノムＤＮＡが単離され、そして解析されている。マウス３番染色体のＦ３〜Ｈ２にマッピングされるこのＭＧ２９遺伝子は、エキソン−イントロン構成においてシナプトフィジン遺伝子と密接に関連があり、このことは、分子進化におけるそれらの親密な関係を示している。ＲＮＡブロット・ハイブリダイゼーションおよび免疫ブロット解析は、ＭＧ２９が、骨格筋において大量に、そして腎臓において低レベルで発現されていることを示した。免疫蛍光顕微鏡検査は、ＭＧ２９が、腎臓の近位細管細胞および遠位細管細胞の細胞質領域において特異的に存在することを立証した。得られたこの結果は、ＭＧ２９が、骨格筋および腎細管細胞における特殊化した小胞体系の形成に関係していることを示唆する。
【００２９】
シナプトフィジンファミリーメンバーの生理学的な役割、４回膜貫通セグメントを有すること、そしてシナプス小胞を含む細胞内の膜上に基本的に分布することは、まだ立証されていない。最近、ＭＧ２９は、シナプトフィジンファミリーの新規のメンバーとして、骨格筋から単離された。ＭＧ２９は、三つ組結合部（ここで、脱分極シグナルが、ＳＲからのＣａ（２＋）放出に変換される）と呼ばれる、細胞表面横側の（Ｔ）細管と筋小胞体（ＳＲ）との間の接合部膜複合体において発現される。ＭＧ２９の分布およびタンパク質構造は、このタンパク質が、そのＴ細管と接合部ＳＲ膜との間の連絡に関係していることを示唆する。さらに、その変異筋肉の形態学的および機能的な異常は、互いに関連しているようであり、そして、ＭＧ２９が、その膜構造の微細さおよび骨格筋三つ組結合部における有効な興奮−収縮連結の両方に不可欠であることを示す。
【００３０】
従って、本発明による、このＮＯＶ３核酸およびポリペプチド、抗体、ならびに関連化合物は、組織障害における治療適用に有用である。この組織障害としては、ヴィスコット−オールドリッチ症候群、オールドリッチ症候群、湿疹−血小板減少−免疫不全症候群、血小板減少症、夜盲症、筋萎縮性（ａｍｙｏｔｒｏｐｉｃ）側索硬化症、バッテン病、セロイド脂褐素症、レット症候群、およびピック病（葉性萎縮）などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００３１】
ＮＯＶ４は、Ｓｌｉｔ−３様ファミリーのタンパク質に相同である。従って、本発明のＮＯＶ４ポリペプチドは、Ｓｌｉｔ−３およびＳｌｉｔファミリータンパク質のメンバーと同様に機能するポリペプチドを含む。Ｓｌｉｔは、脊椎動物および無脊椎動物の両方における中枢神経系の正中線で発現される。それぞれのＳｌｉｔ遺伝子は、推定分泌型タンパク質をコードし、ロイシンリッチリピート（ＬＲＲ）および上皮増殖因子（ＥＧＦ）様モチーフを含む、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａタンパク質のモチーフのような、保存されたタンパク質−タンパク質相互作用ドメインを含む。ノーザンブロット分析は、ヒトＳｌｉｔ−１  ｍＲＮＡ、Ｓｌｉｔ−２  ｍＲＮＡ、およびＳｌｉｔ−３  ｍＲＮＡが、それぞれ、脳、脊髄および甲状腺において、排他的に発現されていることを示している。Ｓｌｉｔタンパク質は、タンパク質−タンパク質相互作用による神経系および内分泌系の形成および維持に関与し得る。従って、本発明による、ＮＯＶ４核酸およびＮＯＶ４ポリペプチド、抗体、ならびに関連化合物は、種々の神経学的障害における治療適用に有用である。この種々の神経学的障害としては、神経変性疾患（例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病、多発性硬化症、ハンティングトン病、筋萎縮（ａｍｙｏｔｒｏｐｉｃ）側索硬化症）、急性脳損傷（例えば、発作、頭部損傷、脳性麻痺）および多数の中枢神経系機能不全（例えば、うつ病、てんかん、および精神分裂病）などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００３２】
ＮＯＶ５は、ロイシンリッチリピート（ＬＲＲ）／ＧＰＣＲファミリーのタンパク質に相同である。従って、本発明のＮＯＶ５ポリペプチドは、ロイシンリッチリピート（ＬＲＲ）／ＧＰＣＲファミリーの他のメンバーと同様に機能するポリペプチドを含む。このファミリー内のタンパク質は、個体発生中ならびに創傷治癒、組織修復、および腫瘍支質形成のような病理学的プロセス中の、組織構成、膠原原線維の方向付けおよび順序付けに、関与している。従って、ＮＯＶ５は、重要な構造および／または腫瘍新脈管形成に特徴的な生理学的機能を有する。具体的には、ＮＯＶ５は、ＬＲＲ／ＧＰＣＲ様タンパク質中のＬＲＲドメインの存在により示唆されるように、腫瘍新脈管形成中に生じる、その細胞外マトリックスのリモデリングに関与している。ＮＯＶ５ポリペプチドはまた、未知のリガンドに対するレセプターとして作用し、そして下流のシグナル伝達を媒介する。
【００３３】
従って、本発明による、このＮＯＶ５核酸およびＮＯＶ５ポリペプチド、抗体、ならびに関連化合物は、下記の種々の疾患および障害ならびに／または他の病理に関与する、潜在的な診断上の適用および治療適用において有用である。例えば、ＮＯＶ５の組成物は、癌およびより具体的には悪性の転移性癌（特に、肺、腎臓、脳、肝臓、および結腸の腫瘍）のような、異常な新脈管形成に関連する障害を被っている患者の処置に効果がある。
【００３４】
ＮＯＶ６は、主要組織適合遺伝子複合体エンハンサー結合タンパク質であるＭＡＤ３に相同である。従って、本発明のＮＯＶ６ポリペプチドは、ＭＡＤ３およびＭＡＤファミリータンパク質の他のメンバーと同様に機能するポリペプチドを含む。ＭＡＤ３は、微小管の機能の喪失に応じた細胞周期停止に必要とされる、チェックポイントタンパク質である。このタンパク質は、５個のａｎｋリピートを含み、そして、接着性単球において誘導される。ＭＡＤ３は、単球活性化の接着依存性経路を含む、ＮＦ−κＢに対する転写応答を調節し得る。このＭＡＤ３は、おそらくＰ６５サブユニットを介して、ｎｆ−κｂ複合体と直接相互作用する。
【００３５】
従って、本発明による、このＮＯＶ６核酸およびＮＯＶ６ポリペプチド、抗体、ならびに関連化合物は、下記の種々の疾患および障害、ならびに／または他の病理に関与する、潜在的な診断上の適用および治療適用に有用である。例えば、ＮＯＶ６の組成物は、癌およびより具体的には悪性の転移性癌（特に、肺、腎臓、脳、肝臓、および結腸の腫瘍）のような、異常な新脈管形成に関連する障害を被っている患者の処置に効果がある。
【００３６】
ＮＯＶ７は、インターロイキン−９タンパク質に相同である。従って、本発明のＮＯＶ７ポリペプチドは、インターロイキン−９と同様に機能するポリペプチドを含む。インターロイキン−９（ＩＬ−９）は、ヘルパーＴ細胞のＩＬ−２非依存性増殖およびＩＬ−４非依存性増殖を支持するサイトカインである。インターロイキン−９は、リンパ系および骨髄系の両方の調節因子として働くサイトカインである。ＩＬ−９は、オートクライン増殖因子として、ホジキン病および未分化大細胞リンパ腫において役割を果たし得る。
【００３７】
従って、本発明による、このＮＯＶ７核酸およびＮＯＶ７ポリペプチド、抗体、ならびに関連化合物は、下記の種々の疾患および障害、ならびに／または他の病理に関与する、潜在的な診断上の適用および治療適用に有用である。例えば、本発明のこの組成物は、喘息、種々のタイプの癌、無精子症、学習障害、顔面異形症、多発性硬化症、自己免疫脳脊髄炎、Ｘ連鎖重症複合型免疫不全、および他の免疫学的障害を被っている患者の処置に効果がある。
【００３８】
ＮＯＶ８は、ヒドロキシトリプタミンレセプタ様ファミリーのタンパク質に相同である。従って、本発明のＮＯＶ８ポリペプチドは、ヒドロキシトリプタミンレセプターファミリーと同様に機能するポリペプチドを含む。神経伝達物質、セロトニン（５−ヒドロキシトリプタミン、５−ＨＴ）は、多数のレセプターを介して、広範な種々の生理学的機能に影響を発揮し、そして、不安、うつ病、または片頭痛のような、ヒト神経精神医学的障害に関係し得る。これらのレセプターは、細胞内セカンドメッセンジャーおよび神経系内での分布に関連するそれらの薬理学的特性に基づいて、いくつかの異なるサブタイプに分類される、４つの主要な群（５−ＨＴ−１、５−ＨＴ−２、５−ＨＴ−３、および５−ＨＴ４）から成る。このセロトニン作動性レセプターは、グアニンヌクレオチド結合タンパク質と共役しているレセプターであるマルチ５−ヒドロキシトリプタミンレセプターファミリーに属する。従って、これらのレセプターは、神経に報いる経路（ｎｅｕｒａｌ  ｒｅｗａｒｄ  ｐａｔｈｗａｙ）の活性を調節し得、そしてそれ故に種々の薬物乱用の影響を調節し得る。
【００３９】
従って、本発明による、このＮＯＶ８核酸およびＮＯＶ８ポリペプチド、抗体、ならびに関連化合物は、下記の種々の疾患および障害、ならびに／または他の病理に関与する、潜在的な診断上の適用および治療適用に有用である。例えば、本発明のこの組成物は、痙攣、アルツハイマー病、精神の抑鬱、片頭痛、てんかん、脅迫行動（精神分裂病）、ならびに、他の、睡眠、食欲、体温調節、疼痛認知、ホルモン分泌、および性行動に影響を及ぼす障害を被っている患者の処置に効果がある。
【００４０】
ＮＯＶ９は、チオレドキシン様ファミリーのタンパク質に相同である。チオレドキシンは、タンパク質構築および修復、電離放射線への耐性、ＤＮＡ複製、転写、ならびに細胞分裂のような、いくつかの細胞性プロセスに関係している。ＮＡＤＰ／チオレドキシン系において、チオレドキシンの還元は、フラビン酵素であるＮＡＤＰ−チオレドキシン還元酵素（ＮＴＲ）を介するＮＡＤＰＨと関連する。従って、本発明による、このＮＯＶ９核酸、ポリペプチド、抗体、および関連化合物は、例えば、炎症、自己免疫障害、加齢、および癌、ならびに／または、他の病理／障害に関わる、治療上および診断上の適用に有用である。
【００４１】
これらのＮＯＶＸ核酸およびＮＯＶＸポリペプチドはまた、ＮＯＶＸ活性またはＮＯＶＸ機能を阻害または増強する分子をスクリーニングするために使用され得る。具体的には、本発明によるこれらの核酸およびポリペプチドは、例えば、神経発生、細胞分化、細胞増殖、造血、創傷治癒および新脈管形成を調節または阻害する、低分子同定のための標的として使用され得る。
【００４２】
本発明によるこれらのＮＯＶＸ核酸およびＮＯＶＸポリペプチドに関するさらなる有用性は、本明細書中に開示されている。
【００４３】
（ＮＯＶ１）
本発明に従うＮＯＶ１ポリペプチドは、Ｗｎｔ様タンパク質を含む。本明細書中で開示されたＮＯＶ１核酸配列は、染色体１に位置する。三つのＮＯＶ１配列ーＮＯＶ１ａ、ＮＯＶ１ｂ、およびＮＯＶ１ｃの核酸配列（およびコードされたポリペプチド）を提供する。
【００４４】
（ＮＯＶ１ａ）
ＮＯＶ１ａ（あるいは本明細書中でｓｇｇｃ＿ｄｒａｆｔ＿ｄｊ８８１ｐ１９＿２００００７２５、ｓｇｇｃ＿ｄｒａｆｔ＿ｄｊ８８１ｐ１９＿２００００７２５−Ａ、Ｘ５６８４２＿ｄａｌ、またはＣＧ５５７０２−０１として参照されている）は、１０８２核酸配列（配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：）１）を含み、これは表１Ａに示されるアミノ酸配列をもつＷｎｔ様タンパク質をコードする。開示されたＯＲＦは、ヌクレオチド１６〜１８のＫｏｚａｋコンセンサスＡＴＧ開始コドンで始まり、ヌクレオチド１０７２〜１０７４のＴＡＧコドンで終了する。表１Ａにおいて、開始コドンから上流および終止コドンから下流の非翻訳領域に下線を施し、開始コドンおよび終止コドンを太字にする。
【００４５】
【表１Ａ】
2004529607.tif 000002
ＮＯＶ１ｂの改変体配列は、実施例２、表４８および表４９に含まれる。改変体配列は、一塩基多型（ＳＮＰ）を含み得る。いくつかの実施例において、ＳＮＰは、ＳＮＰを含むヌクレオチド配列がｃＤＮＡとして生じることを表すために「ｃＳＮＰ」として参照され得る。
【００４６】
配列番号１によってコードされているＮＯＶ１ａポリペプチド（配列番号２）は、３５２アミノ酸残基長で、分子量３９３６４．３ダルトンを有し、表１Ｂに示される。
【００４７】
【表１Ｂ】
2004529607.tif 000003
（ＮＯＶ１ｂ）
ＮＯＶ１の改変体はまた、ＮＯＶ１ｂ（あるいは本明細書中でＧＭ＿ＡＬ１３６３７９＿Ａとして参照されている）も含む。開示された１１１６ヌクレオチド配列（配列番号３）のＮＯＶ１ｂ配列を、表１Ｃに示す。開示されたＯＲＦは、ヌクレオチド３１〜３３のＫｏｚａｋコンセンサスＡＴＧ開始コドンで始まり、ヌクレオチド１０８７〜１０８９のＴＡＧコドンで終了する。表１Ｃにおいて、開始コドンより上流および終止コドンより下流の非翻訳領域に下線を施し、開始コドンおよび終止コドンを太字にする。
【００４８】
【表１Ｃ】
2004529607.tif 000004
ＮＯＶ１ｂの改変体配列は、実施例２、表５０中に含まれる。改変体配列は、一塩基多型（ＳＮＰ）を含み得る。いくつかの例において、ＳＮＰは、ＳＮＰを含むヌクレオチド配列がｃＤＮＡとして生じることを表すために「ｃＳＮＰ」として参照され得る。
【００４９】
配列番号３によってコードされているＮＯＶ１ｂタンパク質（配列番号４）は、３５２アミノ酸残基長で、分子量３９３６４．３ダルトンを有し、表１Ｄに示される。
【００５０】
【表１Ｄ】
2004529607.tif 000005
（ＮＯＶ１ｃ）
ＮＯＶ１の改変体は、開示されたＮＯＶ１ｃ（あるいは本明細書中でＣＧ５５７０２−０４として参照されている）であり、表１Ｅに示された９４７ヌクレオチド配列（配列番号５）を含む。ＮＯＶ１ｃのＯＲＦは、ヌクレオチド５〜７で始まり、ヌクレオチド９４４〜９４６で終了する。表１Ｅにおいて、開始コドンより上流および終止コドンより下流の非翻訳領域に下線を施し、開始コドンおよび終止コドンを太字にする。
【００５１】
【表１Ｅ】
2004529607.tif 000006
配列番号５によってコードされるＮＯＶ１ｃタンパク質（配列番号６）は、３１３アミノ酸残基長で、分子量３４９８８．３ダルトンを有し、表１Ｆに示される。
【００５２】
【表１Ｆ】
2004529607.tif 000007
Ｎｏｖ１ｃポリペプチドは、開示されたＮ末端および／またはＣ末端のアミノ酸配列から、一アミノ酸残基によって変化し得る。具体的には、ロイシン残基がＮ末端メチオニン残基の前にある、ＮＯＶ１ｃポリペプチドを開示する。あるいは、ロイシンがＮ末端メチオニン残基の前にあり、２０個の天然に存在するアミノ酸のうちの一つから選ばれた一つのアミノ酸残基によって、Ｃ末端が伸びている、ＮＯＶ１ｃポリペプチドを開示する。さらに他の型において、ＮＯＶ１ｃポリペプチドは、Ｎ末端メチオニン残基を有し、２０個の天然に存在するアミノ酸のうちの一つから選ばれた一つのアミノ酸残基によって、そのＣ末端が伸びている。
【００５３】
（ＮＯＶ１クローン）
ＮＯＶ１に対するＰｓｏｒｔプロフィールは、このペプチド配列が０．４０３７の確実性で細胞外に局在化している可能性があることを予測する。シグナルＰは、ＮＯＶ１ポリペプチドに対する可能性のある切断部位が１８位と１９位との間、つまり、配列ＡＬＧ−ＳＹ中のダッシュにあることを予測する。
【００５４】
Ｐａｔｐデータベース、特許において公開された配列を含む専用データベースまたは特許公報に対する検索によって、いくつかの相同なタンパク質が得られる。これらのタンパク質は、表１Ｇ中で同定される。
【００５５】
【表１Ｇ】
2004529607.tif 000008
公の配列データベースのＢＬＡＳＴ検索において、例えば、ＮＯＶ１ａの核酸配列がＭｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ（ＧＥＮＢＡＮＫ−ＩＤ：ＭＭＷＮＴ３Ａ｜ａｃｃ：Ｘ５６８４２）由来のＷｎｔ−３Ａシステインリッチタンパク質ｍＲＮＡに対して、１０７５塩基のうちの９３９塩基（８７％）の同一性を有することを見出した。本発明のタンパク質の全アミノ酸配列は、Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ（ＳＷＩＳＳＰＲＯＴ−ＡＣＣ：Ｐ２７４６７）由来の３５２アミノ酸残基のＷｎｔ−３Ａ  ＰＲＯＴＥＩＮ  ＰＲＥＣＵＲＳＯＲに対して、３５２アミノ酸残基のうちの３３８残基（９６％）の同一性および、３５２アミノ酸残基のうちの３４４残基（９７％）の類似性を有することを見出した。
【００５６】
同様に、公の配列データベースのＢＬＡＳＴ検索において、例えば、ＮＯＶ１ｂの核酸配列はＭｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ（ＧＥＮＢＡＮＫ−ＩＤ：Ｘ５６８４２）由来のＷｎｔ−３Ａ  ｍＲＮＡに対して１０８４塩基のうちの９４６塩基（８７％）の同一性を有することを見出した。ＮＯＶ１ｂのタンパク質の全アミノ酸配列は、Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ（ＡＣＣ：Ｐ２７４６７）由来のＷｎｔ−３Ａ  タンパク質に対して、３５２アミノ酸残基のうちの３３８残基（９６％）の同一性および、３５２アミノ酸残基のうちの３４４残基（９７％）の類似性を有することを見出した。さらに、公の配列データベースのＢＬＡＳＴ検索において、例えば、ＮＯＶ１ｃのタンパク質の全アミノ酸配列は、ヒトＷｎｔ−３Ａ（ＴＲＥＭＢＬＮＥＷ−ＡＣＣ：ＢＡＢ６１０５２）に対して、１９３アミノ酸残基のうちの１９１アミノ酸残基（９８％）の同一性を有することを見出した。
【００５７】
さらなるＢＬＡＳＴ結果を、表１Ｈに示す。本明細書中のすべてのＢＬＡＳＴアライメントにおいて、「Ｅ値」（”Ｅ−ｖａｌｕｅ”）または「期待」（”Ｅｘｐｅｃｔ”）値は、並べられた配列が、検索されたデータベース内で、偶然のみによって、ＢＬＡＳＴ検索配列への類似性を達成し得る可能性の数値的示度である。例えば、ＩＩＴ  ＢＬＡＳＴ解析から引き出された対象（”Ｓｂｊｃｔ”）が、純粋に偶然に質問（Ｑｕｅｒｙ）ＩＩＴ配列に一致する確率が、Ｅ値である。期待値（Ｅ）は、ある特定のサイズのデータベースを検索しているとき、単に偶然に出あうことを「期待」（”ｅｘｐｅｃｔ”）し得るヒットの数を表すパラメーターである。それは、二つの配列の間の一致を指示するスコアー（Ｓ）とともに指数関数的に減少する。本質的に、Ｅ値は配列間の一致に対して存在するランダムなバックグラウンドノイズを表す。ブラスト処理（Ｂｌａｓｔｉｎｇ）は、ＧｅｎＢａｎｋデータベースおよびＧｅｎｅＳｅｑ特許データベースのような公のヌクレオチドデータベースに対して実行される。例えば、ＢＬＡＳＴＸ検索は、ＧｅｎＢａｎｋデータベース、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ、ＰＤＢおよびＰＩＲを含む公のタンパク質データベースに対して実行される。
【００５８】
期待値は、報告される結果に対する有意な閾値を生成する便利な方法として使用される。ブラスト処理に使用されるデフォルト値は、代表的には０．０００１に設定される。ＢＬＡＳＴ２．０において、期待値はまた、一致の有意性を報告するためにＰ値（確率）の代わりに使用される。例えば、１ヒットを指示するＥ値１は、現在の大きさのデータベースにおいて、単純に偶然に類似するスコアとの一つの一致が確認されることが期待され得ることを意味するとして解釈され得る。Ｅ値０は、単純に偶然に類似するスコアとのいかなる一致も確認することが期待されないことを意味する。例えば、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｌ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ／ＢＬＡＳＴｉｎｆｏ／を参照のこと。時折、ＸまたはＮの記号列がＢＬＡＳＴ検索の結果として生じる。これは、擬似ヒットを防ぐために実行される複雑さが低い配列に対する質問の自動フィルタリングの結果である。このフィルターは、発見した複雑さが低い配列を、ヌクレオチド配列の場合は文字「Ｎ」（例えば「ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ」）に、またはタンパク質配列の場合は文字「Ｘ」（例えば「ＸＸＸＸＸＸＸＸＸ」）に置換する。複雑さが低い配列は、重要な位置ごとのアライメントよりむしろ組成のバイアスを反映したハイスコアを生じ得る。ＷｏｏｔｔｏｎおよびＦｅｄｅｒｈｅｎ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ  ２６６：５５４−５７１、１９９６。
【００５９】
【表１Ｈ】
2004529607.tif 000009
マルチプル配列アライメントは、表１Ｉに与えられ、開示されたＮＯＶ１タンパク質配列は列１に示され、ＣｌｕｓｔａｌＷ解析において、ＮＯＶ１と関連したタンパク質の配列との比較は、表１Ｈに開示される。ＮＯＶ１ａポリペプチド、ＮＯＶ１ｂポリペプチド、およびＮＯＶ１ｃポリペプチドによって共有される相同性はまた、表１Ｉに示される。
【００６０】
【表１Ｉ】
2004529607.tif 000010
2004529607.tif 000011
本明細書中に開示されているタンパク質中の同定可能なドメインの存在は、ＰＲＯＳＩＴＥ、Ｂｌｏｃｋｓ、Ｐｆａｍ、ＰｒｏＤｏｍａｉｎ、Ｐｒｉｎｔｓのようなアルゴリズムを使用した検索によって決定され、Ｉｎｔｅｒｐｒｏウェブサイト（ｈｔｔｐ：ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｉｎｔｅｒｐｒｏ／）を使用したドメインマッチ（またはドメインマッチ数）を掛け合わせることによって、Ｉｎｔｅｒｐｒｏ数が決定された。表４Ｊは、ＮＯＶ１に対するＤＯＭＡＩＮ解析結果由来のドメインの記述を列挙する。
【００６１】
【表１Ｊ】
2004529607.tif 000012
Ｗｎｔドメイン（ＩＰＲ０００９７０）と相同であるＮＯＶ１上のタンパク質領域の存在は、Ｗｎｔタンパク質ファミリーのメンバーの構成と一致する。これは、ＮＯＶ１配列がこれらのドメインを含むことが知られている他のＷｎｔ様タンパク質の配列と似た性質を有することを示す。
【００６２】
本発明のＷｎｔ様タンパク質は、胎児の脳および成人の脳で発現されるＮＯＶ１配列を含む。本発明に対する発現パターン、地図上の位置、ドメイン解析、およびタンパク質類似情報は、本発明がＷｎｔ様タンパク質として機能するＮＯＶ１ポリペプチドを含むことを明らかにする。従って、本発明のＮＯＶ１核酸およびＮＯＶ１タンパク質は、例えば、以下に記載されている様々な病理／障害および／または他の病理／障害に関連する強力な治療的応用に有用であるが、これらに限定されない。本発明に対する強力な治療的使用は、例えば、以下のとおりであるが、これらに限定されない：（ｉ）タンパク質治療法、（ｉｉ）小分子薬剤標的、（ｉｉｉ）抗体標的（治療的、診断的、薬剤標的／細胞毒性抗体）、（ｉｖ）診断的マーカーおよび／または予後マーカー、（ｖ）遺伝子療法（遺伝子輸送／遺伝子除去）、（ｖｉ）研究ツール、および（ｖｉｉ）インビトロおよびインビボでの組織再生（これら組織およびこれら組織由来の細胞型を構成する全てのこれら組織および細胞型の再生）。
【００６３】
本発明の核酸およびタンパク質は、以下に記載された様々な疾患および障害ならびに／または他の病理に関連する強力な診断的および治療的応用において、有用である。非限定的な実施例によって、本発明の組成物は神経発達欠陥、神経変性病（アルツハイマー病を含む）、癌（乳房腫瘍を含む）およびＢ細胞増殖障害のような神経障害を患っている患者の治療に効果を有する。また、ＮＯＶ１を発現する他の器官障害を処置するのに有用である。ＮＯＶ１は発達ならびに分化を損なった条件、およびＷｎｔ−３ａシグナル伝達経路によって修正され得る状態、を治療するのに使用され得る。例えば、Ｗｎｔ様タンパク質をコードするｃＤＮＡは、遺伝子療法に有用であり得、Ｗｎｔ様タンパク質は、それを必要としている被験体に投薬する場合、有用であり得る。ＮＯＶ１タンパク質および核酸またはそれらのフラグメントは、核酸またはタンパク質の存在または量を評価する診療的応用において有用である。
【００６４】
これらの材料は、さらに治療法または診断法において使用するための、本発明の新規の物質に免疫特異的に結合する抗体の産生において有用である。開示されたＮＯＶ１タンパク質は、多数の親水的領域を有し、その領域それぞれは、免疫源として使用され得る。一つの実施形態において、意図されるＮＯＶ１エピトープはアミノ酸約５０〜約１００からなる。別の実施形態において、ＮＯＶ１エピトープはアミノ酸約１２０〜約２００からなる。さらなる実施形態において、ＮＯＶ１エピトープはアミノ酸約２０５〜約３００からなり、約３０１〜約３４５からなる。
【００６５】
（ＮＯＶ２）
本明細書中でＮＯＶ２と記される本発明のタンパク質は、亜鉛トランスポーター様タンパク質（ＺＮＴ）様タンパク質である。３つのＮＯＶ２配列（ＮＯＶ２ａ、ＮＯＶ２ｂおよびＮＯＶ２ｃ）の核酸配列（およびコードされるポリペプチド）が提供される。
【００６６】
（ＮＯＶ２ａ）
ＮＯＶ２ａ（本明細書では他に３０３７０３５９＿ｄａ１と記される）は、表２Ａに示される、１４３１ヌクレオチドの配列（配列番号７）を含む。開示されたＯＲＦは、ヌクレオチド２９２〜２９４にあるコザックコンセンサスＡＴＧ開始コドンにて開始し、そしてヌクレオチド１３９９〜１４０１にあるＴＡＧコドンにて終結する。開始コドン上流および終止コドン下流の非翻訳領域は、表２Ａ中に下線で示され、そして開始コドンおよび終止コドンはボールド文字である。
【００６７】
【表２Ａ】
2004529607.tif 000013
2004529607.tif 000014
配列番号７によりコードされるＮＯＶ２ａポリペプチド（配列番号８）は、３６９アミノ酸残基の長さであり、分子量４０７８４．１ダルトンを有し、そして１文字アミノ酸コードを用いて表２Ｂに提示される。
【００６８】
【表２Ｂ】
2004529607.tif 000015
（ＮＯＶ２ｂ）
ＮＯＶ２ｂ（本明細書では他にＣＧ５７７９９−０１と記される）は、表２Ｃに示される、１６２３ヌクレオチドの配列（配列番号９）を含む。開示されたＯＲＦは、ヌクレオチド２９２〜２９４にあるコザックコンセンサスＡＴＧ開始コドンにて開始し、そしてヌクレオチド１５８８〜１５６０にあるＴＡＧコドンにて終結する。開始コドン上流および終止コドン下流の非翻訳領域は、表２Ｃ中に下線で示され、そして開始コドンおよび終止コドンはボールド文字である。
【００６９】
【表２Ｃ】
2004529607.tif 000016
2004529607.tif 000017
配列番号９によりコードされるＮＯＶ２ｂポリペプチド（配列番号１０）は、４２２アミノ酸残基の長さであり、分子量４７１９９．６ダルトンを有し、そして１文字アミノ酸コードを用いて表２Ｄに提示される。
【００７０】
【表２Ｄ】
2004529607.tif 000018
（ＮＯＶ２ｃ）
ＮＯＶ２ｃ（本明細書では他にＣＧ５７７９９−０２と記される）は、表２Ｅに示される、１３１８ヌクレオチドの配列（配列番号１１）を含む。開示されたＯＲＦは、ヌクレオチド５１〜５３にあるコザックコンセンサスＡＴＧ開始コドンにて開始し、そしてヌクレオチド１１５８〜１１６０にあるＴＡＧコドンにて終結する。開始コドン上流および終止コドン下流の非翻訳領域は、表２Ｅ中に下線で示され、そして開始コドンおよび終止コドンはボールド文字である。
【００７１】
【表２Ｅ】
2004529607.tif 000019
配列番号１１によりコードされるＮＯＶ２ｃタンパク質（配列番号１２）は、３６９アミノ酸残基の長さであり、分子量４０７２１ダルトンを有し、そして１文字コードを用いて表２Ｆに提示される。
【００７２】
【表２Ｆ】
2004529607.tif 000020
（ＮＯＶ２クローン）
ＮＯＶ２のＰｓｏｒｔプロフィールにより、このポリペプチド配列は０．６０００の値で形質膜に局在しそうであると予想される。
【００７３】
特許および特許公報にて公開された配列を包含する独自のデータベースであるＰａｔｐデータベースに対する検索は、表２Ｇに記されるいくつかのホモローグのタンパク質を引き出した。
【００７４】
【表２Ｇ】
2004529607.tif 000021
公共の配列データベースであるＢＬＡＳＴ検索においては、例えば、本発明のＮＯＶ２ｂ配列は、ｇｂ：ＧＥＮＢＡＮＫ−ＩＤ：ＲＮＵ５０９２７｜ａｃｃ：Ｕ５０９２７．１  Ｒａｔｔｕｓ  ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ由来のｍＲＮＡ（Ｒａｔｔｕｓ  ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ亜鉛トランスポーター（ＺｎＴ−２）ｍＲＮＡ、完全ｃｄｓ）に対して、９２０塩基中の５８７塩基（６３％）の同一塩基を有していることが見出された。本発明のタンパク質の全長アミノ酸配列は、３５９アミノ酸残基のｐｔｎｒ：ＳＷＩＳＳＮＥＷ−ＡＣＣ：Ｑ６２９４１タンパク質（Ｒａｔｔｕｓ  ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ由来）（Ｒａｔ）（ＺＩＮＣ  ＴＲＡＮＳＰＯＲＴＥＲ  ２（ＺＮＴ−２））に対して、３３３アミノ酸残基中１６５残基（４９％）の同一残基、および３３３アミノ酸残基中２３０残基（６９％）の類似の残基を有することが見出された。
【００７５】
同様に、公共の配列データベースのＢＬＡＳＴ検索において、例えば、本発明のＮＯＶ２ｃ配列は、ｇｂ：ＧＥＮＢＡＮＫ−ＩＤ：ＡＸ０６１２１０｜ａｃｃ：ＡＸ０６１２１０．１ｍＲＮＡ（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ由来）（特許  ＷＯ００７８９５３の配列５７）に対して、１２３９塩基中１２２１塩基（９８％）の同一塩基を有していることが見出された。本発明のタンパク質の全長アミノ酸配列は、３５９アミノ酸残基のｐｔｎｒ：ＳＷＩＳＳＮＥＷ−ＡＣＣ：Ｑ６２９４１タンパク質（Ｒａｔｔｕｓ  ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ由来）（Ｒａｔ）（ＺＩＮＣ  ＴＲＡＮＳＰＯＲＴＥＲ  ２（ＺＮＴ−２））に対して、３３３アミノ酸残基中１７３残基（５１％）の同一残基、および３３３アミノ酸残基中２３５残基（７０％）の類似残基を有していることが見出された。
【００７６】
さらなるＢＬＡＳＴの結果は表２Ｈに記される。
【００７７】
【表２Ｈ】
2004529607.tif 000022
マルチプル配列アラインメントは表２Ｉに挙げられ、本発明のＮＯＶ２タンパク質が１行目に示され、関連タンパク質配列とＮＯＶ２を比較したＣｌｕｓｔａｌＷ解析におけるマルチプル配列アラインメントが表２Ｈに明示される。ＮＯＶ２ａポリペプチド、ＮＯＶ２ｂポリペプチドおよびＮＯＶ２ｃポリペプチドに共有されるホモロジーも表２Ｉに示される。
【００７８】
【表２Ｉ】
2004529607.tif 000023
2004529607.tif 000024
2004529607.tif 000025
本明細書にて開示されるタンパク質の同定可能なドメインの存在を、アルゴリズム（例えば、ＰＲＯＳＩＴＥ、Ｂｌｏｃｋ、Ｐｆａｍ、ＰｒｏＤｏｍａｉｎ、Ｐｒｉｎｔ）を使用した検索により決定し、それからＩｎｔｅｒｐｒｏウェブサイト（ｈｔｔｐ：ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｉｎｔｅｒｐｒｏ／）を使用して、ドメインマッチ（または数）を組み合わせることにより、Ｉｎｔｅｒｐｒｏ数を決定した。表２Ｊは、ＮＯＶ２に対するＤＯＭＡＩＮ解析の結果からのドメインの詳細を記載する。
【００７９】
【表２Ｊ】
2004529607.tif 000026
ＮＯＶ２において、カチオン流出（Ｃａｔｉｏｎ  Ｅｆｆｌｕｘ）ドメイン（ＩＰＲ００２５２４）のホモローグであるタンパク質領域の存在は、ＺＮＴタンパク質ファミリーのメンバーの構成に適合する。このことは、ＮＯＶ２配列が、それらドメインを含むことが公知の他のカチオン流出タンパク質の性質に類似の性質を有することを、示す。
【００８０】
ＮＯＶ２  ＺＮＴ様遺伝子は、少なくとも次の組織において発現される：膵臓、骨髄、軟骨、胎盤、および腎臓。本発明の発現パターン、マップ位置、ドメイン解析、およびタンパク質類似性の情報は、このＮＯＶ２がＺＮＴ様のタンパク質として機能し得ることを示唆する。
【００８１】
従って、本発明のＮＯＶ２核酸およびタンパク質は、非限定的な例として、以下に挙げるような様々な病理／障害、および／または他の病理／障害に関係する、潜在的な治療的な用途に有益である。例えば、本発明の組成物は、癌、外傷、再生（インビトロおよびインビボ）、ウイルス／細菌／寄生生物の感染、受胎、ならびに他の疾患、障害および状態、に苦しむ患者の治療に有効性を有し得る。本発明についての潜在的な治療的な用途は、非限定的な例として、次の例がある：（ｉ）タンパク質治療、（ｉｉ）小分子薬物標的、（ｉｉｉ）抗体標的（治療的な抗体、診断的な抗体、薬物標的／細胞傷害性の抗体）、（ｉｖ）診断および／または予後診断のマーカー、（ｖ）遺伝子治療（遺伝子送達、遺伝子除去）、（ｖｉ）解析ツール、ならびに（ｖｉｉ）インビトロおよびインビボにおける組織再生（これら組織から誘導される組織および細胞型を含む、全ての組織および細胞型の再生）
非限定的な例として、本発明の組成物は、糖尿病、自己免疫疾患、腎動脈狭窄、間質性腎炎、糸球体腎炎、多発性嚢胞腎疾患、全身性エリテマトーデス、腎尿細管アシドーシス、ＩｇＡネフロパシー、高カルシウム血症、レッシュ−ナイハン症候群、フォン・ヒッペル−リンダウ症候群（ＶＨＬ）、膵臓炎、肥満症、血友病、凝固能亢進、特発性血小板減少性紫斑病、アレルギー、免疫不全、移植、対宿主性移植、関節炎、腱炎、Ｔ細胞増殖性障害および疾患、亜鉛中毒、さらには他の疾患、障害および状態、を被る患者の処置に有効性を有する。ＺＮＴ様タンパク質をコードするｃＤＮＡは遺伝子治療に有用であり得、そしてＺＮＴ様タンパク質は、それを必要とする被験体に投与される場合に、有益であり得る。ＺＮＴ様タンパク質をコードする新規の核酸および本発明のＺＮＴ様タンパク質またはこれらのフラグメントは、さらに診断用途に有益であり得、ここで核酸またはタンパク質の、存在または量が測定され得る。
【００８２】
これらの物質は、治療的または診断的な方法における使用のための、本発明の新規の物質に免疫特異的に結合する抗体の産生に、さらに有益である。開示されたＮＯＶ２タンパク質は複数の親水性領域を有し、各々が免疫原として使用され得る。１つの実施形態において、企図されたＮＯＶ２エピトープはおよそアミノ酸１０位〜７５位である。別の実施形態において、ＮＯＶ２エピトープはおよそアミノ酸１００位〜１５０位である。さらなる実施形態において、ＮＯＶ２エピトープはおよそアミノ酸１７５位〜２５０位、およびおよそアミノ酸３１０位〜４１０位である。
【００８３】
（ＮＯＶ３）
ＮＯＶ３ポリペプチドは、Ｍｉｔｓｕｇｕｍｉｎ２９様タンパク質（ＭＧ２９）である。本明細書中に開示されるＮＯＶ１核酸配列は、第３染色体に位置付けされる。２つのＮＯＶ３配列（ＮＯＶ３ａおよびＮＯＶ３ｂ）の核酸配列（およびコードされたポリペプチド）が提供される。
【００８４】
（ＮＯＶ３ａ）
８５４ヌクレオチド配列（配列番号１３）を含み、新規のＭＧ２９様タンパク質をコードするＮＯＶ３ａ（あるいはＳＣ１２６４１３３９８＿Ａとして本明細書中に述べられる）が、表３Ａに示される。開示されるＯＲＦは、ヌクレオチド２〜４にあるコザックコンセンサスＡＴＧ開始コドンで始まり、そしてヌクレオチド８０３〜８０５にあるＴＡＡコドンで終わる。この開始コドンから上流の非翻訳領域およびこの終止コドンから下流の非翻訳領域は、表３Ａにおいて下線が引かれており、そしてこの開始コドンおよびこの終止コドンは太字である。
【００８５】
【表３Ａ】
2004529607.tif 000027
ＮＯＶ３ａの改変体配列は、実施例２、表５１に含まれる。改変体配列は、一塩基多型（ＳＮＰ）を含み得る。ＳＮＰは、いくつかの場合には、そのＳＮＰを含有するヌクレオチド配列がｃＤＮＡとして生じることを示すために、「ｃＳＮＰ」として呼ばれ得る。
【００８６】
配列番号１３によってコードされたＮＯＶ３ａポリペプチド（配列番号１４）は、２６７アミノ酸残基長であり、２９５８３．５ダルトンの分子量を有し、そして表３Ｂにおいて一文字アミノ酸コードを用いて示される。
【００８７】
【表３Ｂ】
2004529607.tif 000028
（ＮＯＶ３ｂ）
ＮＯＶ３ｂ（あるいはＣＧ５５８６１−０２として本明細書中に述べられる）は、表３Ｃに示される６４２ヌクレオチド配列（配列番号１５）を含む。開示されるＯＲＦは、ヌクレオチド２〜４にあるコザックコンセンサスＡＴＧ開始コドンで始まり、そしてヌクレオチド６２６〜６２８にあるＴＡＡコドンで終わる。この開始コドンから上流の非翻訳領域およびこの終止コドンから下流の非翻訳領域は、表３Ｃにおいて下線が引かれており、そしてこの開始コドンおよびこの終止コドンは太字である。
【００８８】
【表３Ｃ】
2004529607.tif 000029
配列番号１５によってコードされるＮＯＶ１ｂタンパク質（配列番号１６）は、２０８アミノ酸残基長であり、２３６１８．６ダルトンの分子量を有し、そして表３Ｄに一文字アミノ酸コードを用いて示される。
【００８９】
【表３Ｄ】
2004529607.tif 000030
（ＮＯＶ３  クローン）
ＮＯＶ３ａのＰｓｏｒｔプロフィールは、このポリペプチド配列が、確実性０．６０００で原形質膜に局在化されるようであることを推測する。ＮＯＶ３ｂのＰｓｏｒｔプロフィールは、このポリペプチド配列が、確実性０．４４００で原形質膜に局在化されるようであることを推測する。Ｓｉｇｎａｌ  Ｐは、ＮＯＶ３ポリペプチドの可能な切断部位が５７位と５８位との間（すなわち、配列ＳＹＳ−ＧＥ中のダッシュ）にあることを推測する。
【００９０】
Ｐａｔｐデータベース（特許および特許公開にて公開される配列を含む独自のデータベース）に対する検索は、表３Ｅに示されるいくつかな相同タンパク質をもたらした。
【００９１】
【表３Ｅ】
2004529607.tif 000031
公の配列データベースのＢＬＡＳＴサーチにおいて、例えば、ＮＯＶ１ａの核酸配列が、Ｏｒｙｃｔｏｌａｇｕｓ  ｃｕｎｉｃｕｌｕｓ（ＧＥＮＢＡＮＫ−ＩＤ：ＡＢ００４８１６）由来のＭＧ２９ｍＲＮＡと同一の７２５塩基を８０１塩基中に有する（９０％）ことが見出された。本発明のタンパク質の全アミノ酸配列は、Ｏｒｙｃｔｏｌａｇｕｓ  ｃｕｎｉｃｕｌｕｓ（ウサギ）由来の２６４アミノ酸残基のＭＧ２９タンパク質（Ｏ６２６４６）と同一の２５４アミノ酸残基を２６７アミノ残基中に有し（９５％）、そしてＯｒｙｃｔｏｌａｇｕｓ  ｃｕｎｉｃｕｌｕｓ（ウサギ）由来の２６４アミノ酸残基のＭＧ２９タンパク質（Ｏ６２６４６）と類似する２５８アミノ酸残基を２６７アミノ酸残基中に有する（９６％）ことが見出された。
【００９２】
同様に、公の配列データベースのＢＬＡＳＴ検索において、例えば、ＮＯＶ３ｂの核酸配列は、Ｏｒｙｃｔｏｌａｇｕｓ  ｃｕｎｉｃｕｌｕｓ（Ｏｒｙｃｔｏｌａｇｕｓ  ｃｕｎｉｃｕｌｕｓのＭＧ２９のｍＲＮＡ、完全ｃｄｓ）由来のｇｂ：ＧＥＮＢＡＮＫ−ＩＤ：ＡＢ００４８１６｜ａｃｃ：ＡＢ００４８１６．１  ｍＲＮＡと同一の５１１塩基を６１７塩基中に有する（８２％）ことが見出された。本発明のタンパク質の全アミノ酸配列は、Ｏｒｙｃｔｏｌａｇｕｓ  ｃｕｎｉｃｕｌｕｓ（ウサギ）由来の２６４アミノ酸残基のｐｔｎｒ：ＳＰＴＲＥＭＢＬ−ＡＣＣ：Ｏ６２６４６タンパク質（ＭＧ２９）と同一の１４８アミノ酸残基を１７１アミノ酸残基中に有し（８６％）、そしてＯｒｙｃｔｏｌａｇｕｓ  ｃｕｎｉｃｕｌｕｓ（ウサギ）由来の２６４アミノ酸残基のｐｔｎｒ：ＳＰＴＲＥＭＢＬ−ＡＣＣ：Ｏ６２６４６タンパク質（ＭＧ２９）と類似する１５３アミノ酸残基を１７１アミノ酸残基中に有する（８９％）ことが見出された。
【００９３】
さらなるＢＬＡＳＴ結果が、表３Ｆに示される。
【００９４】
【表３Ｆ】
2004529607.tif 000032
マルチプル配列アラインメントが、表３Ｇに与えられ、表３Ｆに開示される関連タンパク質配列とＮＯＶ３とを比較するＣｌｕｓｔａｌＷ解析において、本発明のＮＯＶ３タンパク質が、１列目に示されている。ＮＯＶ３ａポリペプチドとＮＯＶ３ｂポリペプチドとによって共有される相同性もまた、表３Ｇに示される。
【００９５】
【表３Ｇ】
2004529607.tif 000033
2004529607.tif 000034
本明細書中に開示されたタンパク質における同定可能なドメインの存在を、ＰＲＯＳＩＴＥ、Ｂｌｏｃｋｓ、Ｐｆａｍ、ＰｒｏＤｏｍａｉｎ、Ｐｒｉｎｔｓのようなアルゴリズムを用いた検索によって、次いで、Ｉｎｔｅｒｐｒｏウェブサイト（ｈｔｔｐ：ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｉｎｔｅｒｐｒｏ／）を用いてドメインマッチ（または数）をクロスすることによるＩｎｔｅｒｐｒｏ数を決定することによって決定した。表３Ｈは、ＮＯＶ３に対するＤＯＭＡＩＮ分析の結果からのドメインの説明を列挙する。
【００９６】
【表３Ｈ】
2004529607.tif 000035
シナプトフィジンドメイン（ＩＲＰ１１１１１）と相同であるＮＯＶ３におけるタンパク質領域の存在は、ＭＧ２９タンパク質ファミリーのメンバーの構成と一致する。このことは、ＮＯＶ３配列が、他のシナプトフィジンドメイン含有タンパク質の特性と類似の性質を有することを示す。
【００９７】
ＮＯＶ３  ＭＧ２９様遺伝子は、少なくとも心臓および脳で発現される。本発明のための発現パターン、マップ位置、ドメイン分析およびタンパク質類似情報は、このＮＯＶ３がＭＧ２９様タンパク質として機能し得ることを示唆する。
【００９８】
従って、本発明のＮＯＶ３核酸およびＮＯＶ３タンパク質は例えば、限定はしないが、以下に記載される種々の病理／障害、ならびに／または他の病理／障害に関連する潜在的な治療適用において有用である。例えば、本発明の組成物は、癌、外傷、再生（インビトロおよびインビボ）、ウイルス感染／細菌感染／寄生生物感染、受精能、ならびに他の疾患、障害および状態に羅患している患者の治療に効力を有する。本発明の潜在的な治療用途としては、例えば、限定はしないが、以下が挙げられる：（ｉ）タンパク質治療剤、（ｉｉ）低分子薬物標的、（ｉｉｉ）抗体標的（治療的抗体、診断的抗体、薬物標的抗体／細胞傷害性抗体）、（ｉｖ）診断マーカーおよび／または予後マーカー、（ｖ）遺伝子治療（遺伝子送達／遺伝子切除）、（ｖｉ）研究ツール、ならびに（ｖｉｉ）インビトロおよびインビボでの組織再生（これらの組織全ての再生、ならびにこれらの組織およびこれらの組織由来の細胞型から構成される細胞型の全ての再生）。
【００９９】
非限定的な例として、本発明の組成物は、ヴィスコット−オールドリッチ症候群、オールドリッチ症候群、湿疹−血小板減少−免疫不全（Ｅｃｚｅｍａ−Ｔｈｒｏｍｂｏｃｙｔｏｐｅｎｉａ−Ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ）症候群、血小板減少、夜盲症、筋萎縮性側索硬化症、バッテン病、セロイド脂褐素症、レット症候群、ピック病（葉性の萎縮）に罹患している患者の処置のための効力を有する。ＮＯＶ３タンパク質をコードするｃＤＮＡは、遺伝子治療において有用であり得、そしてＭＧ２９様タンパク質は、それを必要とする被検体に投与された場合に有用であり得る。本発明のＭＧ２９様タンパク質をコードする新規な核酸、およびＭＧ２９様タンパク質、もしくはそのフラグメントは、診断適用においてさらに有用であり得、その適用において、その核酸またはタンパク質の存在または量が、評価される。
【０１００】
これらの物質は、治療方法もしくは診断方法における使用のための、本発明の新規な物質に免疫特異的に結合する抗体の産生において、さらに有用である。開示されるＮＯＶ３タンパク質は、複数の親水性領域を有し、その各々が、免疫原として用いられ得る。１つの実施形態において、企図されるＮＯＶ３エピトープは、アミノ酸およそ１〜４である。別の実施形態において、ＮＯＶ３エピトープは、アミノ酸およそ５０〜７５である。さらなる実施形態において、ＮＯＶ３エピトープは、アミノ酸およそ１２５〜１７０、アミノ酸およそ１７１〜２００、そしてアミノ酸およそ２２５〜２６７である。
【０１０１】
（ＮＯＶ４）
ＮＯＶ４は、以下に開示される新規な２つのＳｌｉｔ３様タンパク質を含む。二つのＮＯＶ４配列（ＮＯＶ４ａおよびＮＯＶ４ｂ）の核酸配列（およびコードされるポリペプチド）が提出される。
【０１０２】
（ＮＯＶ４ａ）
新規のＳｌｉｔ３様タンパク質をコードする２３８０ヌクレオチドの開示されたＮＯＶ４ａ（２０７６０８１３．０．１０ともいわれる）の核酸（配列番号１７）を、表４Ａに示す。ヌクレオチド２３７〜２３９のＡＴＧ開始コドンで始まり、そしてヌクレオチド２０５５〜２０５７のＴＧＡコドンで終止するオープンリーディングフレームが、同定された。開始コドンから上流および終止コドンから下流の非翻訳領域に、表４Ａにおいて下線を伏す。開始コドンおよび終止コドンを、太字で示す。
【０１０３】
【表４Ａ】
2004529607.tif 000036
2004529607.tif 000037
ＮＯＶ４ａの改変体配列は、実施例２、表５２に挙げられる。改変体配列は一塩基多型（ＳＮＰ）を含み得る。ある場合において、ＳＮＰは、ＳＮＰを含むヌクレオチド配列がｃＤＮＡとして生じることを示すために、「ｃＳＮＰ」といわれ得る。
【０１０４】
配列番号１７によってコードされるＮＯＶ４ａタンパク質（配列番号１８）は、６０６アミノ酸残基長であり、６８０４６ダルトンの分子量を有し、そしてＮＯＶ４ａタンパク質の配列を、１文字アミノ酸コードを用いて表４Ｂに示す。
【０１０５】
【表４Ｂ】
2004529607.tif 000038
（ＮＯＶ４ｂ）
新規のＳｌｉｔ３様タンパク質をコードする２１８７ヌクレオチドの開示されたＮＯＶ４ｂ核酸（ＣＧ５１５１４−０５ともいわれる）（配列番号１９）を、表４Ｄに示す。ヌクレオチド８３〜８５のＡＴＧ開始コドンで始まり、そしてヌクレオチド１９０１〜１９０３のＴＧＡコドンで終止するオープンリーディングフレームが、同定された。開始コドンから上流および終止コドンから下流の非翻訳領域に、表４Ｃにおいて下線を伏す。開始コドンおよび終止コドンを、太字で示す。
【０１０６】
【表４Ｃ】
2004529607.tif 000039
2004529607.tif 000040
ＮＯＶ４ｂの改変体配列は、実施例２、表５３に挙げられている。改変体配列は一塩基多型（ＳＮＰ）を含み得る。ある場合において、ＳＮＰは、ＳＮＰを含むヌクレオチド配列がｃＤＮＡに由来することを意味するため、「ｃＳＮＰ」と呼ばれ得る。
【０１０７】
配列番号１９にコードされるＮＯＶ４ｂタンパク質（配列番号２０）は、６０６アミノ酸残基の長さである。ＮＯＶ４ｂタンパク質の配列を、１文字アミノ酸表記を用いて表４Ｄに示す。
【０１０８】
【表４Ｄ】
2004529607.tif 000041
（ＮＯＶ４  クローン）
ＮＯＶ４についてのＰｓｏｒｔプロフィールは、これらの配列が単一のペプチドを有し、そして０．４６００の確実性を有して原形質膜に局在化されている可能性が高いと予測する。他の実施形態において、ＮＯＶ４は０．１０００の確実性を有して小胞体（膜）に、０．１０００の確実性を有して小胞体管腔に、または０．１０００の確実性を有して細胞外に局在化する。Ｓｉｇｎａｌ  Ｐは、ＮＯＶ４ペプチドについて可能性のある切断部位が２７位と２８位との間、すなわち、配列ＴＩＧ−ＣＰ中のダッシュ（ｄａｓｈ）の位置であること予測する。
【０１０９】
データベースに対する検索法である、特許として公開された配列および特許公開公報のなかで公開された配列を含む独自のデータベースは、表４Ｅに示すいくつかの相同なタンパク質を見出した。
【０１１０】
【表４Ｅ】
2004529607.tif 000042
公共の配列データベースのＢＬＡＳＴ検索において、例えば、本発明のタンパク質のアミノ酸配列全長は、Ｈｏｍｏ  Ｓａｐｉｅｎｓ由来の６０６アミノ酸残基のタンパク質（ｐｔｎｒ：ＳＰＴＲＥＭＢＬ−ＡＣＣ：Ｑ９ＢＺ２０）に対して、６０６アミノ酸残基中６０３残基（９９％）同一であり、そして６０６残基中６０６残基（１００％）陽性であることが見出された。
【０１１１】
ＮＯＶ４は、表４Ｆの中のＢＬＡＳＴＰデータに示されるタンパク質に対して相同性を有する。
【０１１２】
【表４Ｆ】
2004529607.tif 000043
マルチプル配列アライメントを表４Ｇに示し、ＮＯＶ４ａおよびＮＯＶ４ｂをそれぞれ１行目および２行目に示す。このＣｌｕｓｔａｌ  Ｗ解析は、ＮＯＶ４タンパク質を表４Ｆに示される関連タンパク質の配列と比較する。ＮＯＶ４ａポリペプチドとＮＯＶ４ｂポリペプチドによって共有される相同性をまた、表４Ｇに示す。
【０１１３】
【表４Ｇ】
2004529607.tif 000044
2004529607.tif 000045
2004529607.tif 000046
2004529607.tif 000047
2004529607.tif 000048
本明細書中に開示されるタンパク質の中の同定し得るドメインの存在を、Ｐｆａｍのようなアルゴリズムを用いる検索によって決定した。表４Ｈは、ＮＯＶ４に対するＤＯＭＡＩＮ解析からのドメインの記述を、列挙する。
【０１１４】
【表４Ｈ】
2004529607.tif 000049
ロイシンリッチリピートドメインに相同的なＮＯＶ４の中のタンパク質領域の存在は、Ｓｌｉｔ−３様タンパク質としてのＮＯＶ４タンパク質の同定と合致する。このことは、ＮＯＶ４の配列が、これらのドメインを含むことが公知である他のタンパク質の特性と同様の特性を有することを示唆する。
【０１１５】
本発明のためのドメインおよびタンパク質の類似性の情報は、この遺伝子が「Ｓｌｉｔ−３」として機能し得ることを示唆する。このようなものとして、本発明のＮＯＶ４タンパク質は、神経系の形成および維持において機能し得る。従って、ＮＯＶ４は、これらの組織が関連する障害に関与する。
【０１１６】
本発明の核酸およびタンパク質は、記載されている種々の病理学／障害に関与する潜在的な治療用の適用において有用である。本発明についての潜在的な治療的使用標的として、例えば；タンパク質治療用の、低分子薬物標的、抗体標的（治療用、診断用、薬物標的化／細胞傷害性抗体）、診断用および／または予後用マーカー、遺伝子治療（遺伝子送達／遺伝子除去）、研究ツール、インビトロおよびインビボにおける組織再生（これらの組織およびこれらの組織に由来する細胞型を含む、これらの組織および細胞型の全てについての再生）が挙げられる。
【０１１７】
本発明のＮＯＶ４をコードする新規の核酸またはそのフラグメントは、さらに診断用の適用に有用であり得、ここで、核酸またはタンパク質の存在または量が評価され得る。これらの物質はさらに、本発明の新規物質に免疫特異的に結合する治療法または診断法で使用するための、抗体の産生において有用である。これらの抗体は、以下の「抗ＮＯＶＸ抗体」の項で記載されるような、疎水性チャートからの予測を用いる、当該分野において公知の方法に基づいて生成され得る。開示されたＮＯＶ４タンパク質は、各々が免疫原として使用され得る複数の親水性領域を有する。本発明についての疎水性親水性プロットは、タンパク質配列が、原形質膜を標的化とするシグナルペプチドとして機能し得る、アミノ末端疎水性領域を有することを示す。
【０１１８】
（ＮＯＶ５）
本発明に従うＮＯＶ５ポリペプチドは、ＬＲＲ／ＧＰＣＲ様タンパク質を含む。２つのＮＯＶ５配列（ＮＯＶ５ａおよびＮＯＶ５ｂ）の核酸配列（およびコードされたポリペプチド）が、提供される。
【０１１９】
（ＮＯＶ５ａ）
新規のＬＲＲ／ＧＰＣＲ様タンパク質をコードする４２４５ヌクレオチド（配列番号２１）のＮＯＶ５ａ核酸（１３３７８３５０８ｅｘｔともいう）は、表５Ａに示される。オープンリーディングフレームは、ヌクレオチド２１４〜２１６におけるＡＴＧ開始コドンで始まり、そしてヌクレオチド４１６８〜４１７０におけるＴＡＡコドンで終了すると同定された。開始コドンから上流および終止コドンから下流の非翻訳領域は、表５Ａで下線を引く。開始コドンおよび終止コドンは、太い文字である。
【０１２０】
【表５Ａ】
2004529607.tif 000050
2004529607.tif 000051
公の配列データベースの検索において、第４染色体のｐ３１領域に位置するＮＯＶ５ａ核酸配列は、Ｈｏｍｏ  Ｓａｐｉｅｎｓ由来のｍＲＮＡのｐ５８タンパク質キナーゼ（ｃｌｋ−１）遺伝子のエキソン１２（ＧＥＮＢＡＮＫ−ＩＤ：Ｍ８８５６５）と１３４４塩基中１３２６塩基（９８％）の相同性を有する（Ｅ＝０．０）。公のヌクレオチドデータベースとしては、全てのＧｅｎＢａｎｋデータベースおよびＧｅｎｅＳｅｑ特許データベースが挙げられる。
【０１２１】
配列番号２１によってコードされるＮＯＶ５ａタンパク質（配列番号２２）は、長さ１３１８アミノ酸残基であり、表５Ｂで一文字のアミノ酸コードを用いて示される。
【０１２２】
【表５Ｂ】
2004529607.tif 000052
（ＮＯＶ５ｂ）
新規のＬＲＲ／ＧＰＣＲ様タンパク質をコードする１４１０のヌクレオチド（配列番号２３）の公開されたＮＯＶ５ｂ核酸（ＢＥ３０４１１９ｅｘｔともいう）は、表５Ｃに示される。オープンリーディングフレームは、ヌクレオチド２０４〜２０６におけるＡＧＧ開始コドンで始まり、そしてヌクレオチド１１５４〜１１５６におけるＴＧＡコドンで終了すると同定された。開始コドンから上流および終止コドンから下流の非翻訳領域は、表５Ｃで下線を引く。開始コドンおよび終止コドンは、太い文字である。
【０１２３】
【表５Ｃ】
2004529607.tif 000053
配列番号２３によってコードされるＮＯＶ５ｂタンパク質（配列番号２４）は、長さ３１７アミノ酸残基であり、表５Ｄで一文字のアミノ酸コードを用いて示される。
【０１２４】
【表５Ｄ】
2004529607.tif 000054
（ＮＯＶ５  クローン）
ＮＯＶ５ａに対するＰｓｏｒｔプロフィールは、この配列が、シグナル配列を有し、そして０．６４００の信頼度で原形質膜に局在化する可能性があると予測する。他の実施形態において、ＮＯＶ５ａは、０．４６００の信頼度でゴルジ体、０．３７００の信頼度で小胞体（膜）、０．１０００の信頼度で小胞体（管腔）に局在する。ＮＯＶ５ａペプチドの最も適当な切断部位は、アミノ酸３８と３９との間（ＡＡＡ−ＬＰ）である。
【０１２５】
Ｐａｔｐデータベースに代わる検索（特許および特許公開で公表される配列を含む独自のデータベースより）、表５Ｅに示されるＮＯＶ５ａに対する様々な相同性タンパク質が得られる。
【０１２６】
【表５Ｅ】
2004529607.tif 000055
公の配列のデータべースのＢＬＡＳＴ検索において、ＮＯＶ５ａの完全なアミノ酸配列が、Ｈｏｍｏ  Ｓａｐｉｅｎｓ由来のＬＲＲ／ＧＰＣＲ様タンパク質である１０６０アミノ酸残基のＫＩＡＡ１５３１ＰＲＯＴＡＩＮ（ＧＥＮＢＡＮＫ−ＩＤ：ＢＡＡ９６０５５）と、５５４のアミノ酸残基中３１５アミノ酸残基（９８％）の相同性、５５４アミノ酸残基中４０４アミノ酸残基（９９％）の類似性を有すると見出された（Ｅ＝４．１ｅ−１８５）。
【０１２７】
ＮＯＶ５ａはまた、表５ＦでＢＬＡＳＴＰデータに示されるタンパク質と相同性を有する。
【０１２８】
【表５Ｆ】
2004529607.tif 000056
ＮＯＶ５ｂの同様のＢＬＡＳＴ分析は、このポリペプチドが、表５ＧのＢＬＡＳＴＰデータに示されるタンパク質と相同性を有することを示す。
【０１２９】
【表５Ｇ】
2004529607.tif 000057
多種配列アライメントは、表５Ｈで与えられ、ＮＯＶ５ａおよびＮＯＶ５ｂはそれぞれ、レーン１およびレーン２で示される。このＣｌｕｓｔａｌ  Ｗ分析は、ＮＯＶ５タンパク質を表５Ｆおよび５Ｇに示される関係するタンパク質配列と比較する。ＮＯＶ５ａおよびＮＯＶ５ｂポリペプチドよって共有された相同性はまた、表５Ｈにも示される。
【０１３０】
【表５Ｈ】
2004529607.tif 000058
2004529607.tif 000059
2004529607.tif 000060
2004529607.tif 000061
2004529607.tif 000062
2004529607.tif 000063
2004529607.tif 000064
2004529607.tif 000065
本明細書中で開示されるタンパク質中の同一と確認できるドメインの存在は、Ｐｆａｍのようなアルゴリズムを用いる検索によって決定された。表５Ｉは、ＮＯＶ５ａに対するＤＯＭＡＩＮ分析結果からのドメイン記述を列挙する。
【０１３１】
【表５Ｉ】
2004529607.tif 000066
ロイシンリッチリピートドメインと相同性のあるＮＯＶ５ａ中のタンパク質領域の存在は、ＬＲＲ／ＧＰＣＲ様タンパク質としてのＮＯＶ５タンパク質の同定と一致する。これは、ＮＯＶ５配列が、それらのドメインを含む既知である他の配列の特性と類似する特性を有することを示す。
【０１３２】
本発明におけるドメインおよびタンパク質の類似性情報は、この遺伝子が「ＬＲＲ／ＧＰＣＲ」として機能し得ることを示唆する。このように、本発明のＮＯＶ５タンパク質が、神経系の形成および維持において機能し得る。ＮＯＶ５は、従って、それらの組織を含む障害（例えば、癌、より具体的には、侵襲性癌、転移性癌、より具体的には肺癌、腎臓癌、脳腫瘍、肝臓癌および大腸癌のような異常な新脈管形成）に関係する。
【０１３３】
本発明の核酸およびタンパク質は、記述された様々な病理／障害に関する潜在的な治療適用において有用である。潜在的な治療は、本発明のために使用され、これには、例えば、タンパク質治療、低分子薬物標的、抗体標的（治療用抗体、診断用抗体、薬物標的／細胞障害性抗体）、診断および／または予後マーカー、遺伝子治療（遺伝子送達／遺伝子切断）、検索ツール、インビトロおよびインビボでの組織再生（それらの全ての組織およびそれらの組織を構成する細胞型およびそれらの組織由来の細胞型のための再生）が挙げられる。
【０１３４】
ＮＯＶ５核酸およびポリペプチドは、治療方法および診断方法使用するための本発明の新規の物質と免疫特異的に結合する抗体の産出において、さらに有用である。それらの抗体は、以下の節「抗ＮＯＶＸ抗体」で記載されるように、疎水性チャートからの予測を用いて、当該分野で公知の方法に従って産出され得る。開示されたＮＯＶ５ａタンパク質は、複数の親水性領域を有し、この親水性領域の各々は、免疫原として用いられ得る。１つの実施形態において、意図されるＮＯＶ５ａのエピトープは、アミノ酸約２０〜３０である。別の実施形態において、ＮＯＶ５ａのエピトープは、アミノ酸約５０〜７５である。さらなる実施形態において、ＮＯＶ５ａのエピトープは、アミノ酸約１００〜１２０、アミノ酸約１８０〜３００、アミノ酸約３２５〜４２５、アミノ酸約５２５〜６００、アミノ酸約６２５〜７２５、アミノ酸約８５０〜９００、アミノ酸約９５０〜１０００、そしてアミノ酸約１０５０〜１３５０である。これらの新規のタンパク質は、様々なヒトの障害の機能分析のためのアッセイシステムで使用され得、このアッセイシステムは、疾患の病理の理解および様々な障害に対する新しい薬物標的の開発において有用である。
【０１３５】
（ＮＯＶ６）
新規の主要組織適合性複合体エンハンサー結合タンパク質ＭＡＤ３様タンパク質をコードする、９６１ヌクレオチドの開示されたＮＯＶ６核酸（配列番号２５）（これはまた、ｊｇｉｇｃ＿ｄｒａｆｔ＿ｃｉｔｂ−ｅ１＿２５４０ｂ１５＿２００００８０３＿ｄａ１と呼称される）は、表６Ａに示される。ヌクレオチド１〜３のＡＴＧ開始コドンに始まり、そしてヌクレオチド９５５〜９５７のＴＧＡコドンで終止するオープンリーディングが同定された。この開始コドンの上流の非翻訳領域およびこの終止コドンの下流の非翻訳領域は、表６Ａにおいて下線が付されている。この開始コドンおよび終止コドンは、太字である。
【０１３６】
【表６Ａ】
2004529607.tif 000067
2004529607.tif 000068
ＮＯＶ６の改変体の配列は、実施例２、表５４に含まれる。改変体の配列は、一塩基多型（ＳＮＰ）を含み得る。ＳＮＰは、いくつかの例において、「ｃＳＮＰ」と称され得、ＳＮＰを含むヌクレオチド配列がｃＤＮＡに由来することを示す。
【０１３７】
公の配列データベース検索において、このＮＯＶ６核酸配列は、第４染色体に位置し、ｐ５８プロテインキナーゼ（ｃｌｋ−１）遺伝子（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｃｅｓ由来のｍＲＮＡ）のエキソン１２（ＧＥＮＢＡＮＫ−ＩＤ：Ｍ８８５６５）の１３４４塩基のうち１３２６塩基（９８％同一性）を有する（Ｅ＝０．０）。公のヌクレオチドデータベースとしては、全てのＧｅｎｂａｎｋデータベースおよびＧｅｎｅＳｅｑ特許データベース（ＧｅｎｅＳｅｑ  ｐａｔｅｎｔ  ｄａｔａｂａｓｅ）が挙げられる。
【０１３８】
配列番号２５によってコードされるＮＯＶ６タンパク質（配列番号２６）は、３１８アミノ酸残基長であり、このタンパク質は、３５４２７．５ダルトンの分子量を有し、そして１文字アミノ酸コードを使用して表６Ｂで提供される。ＮＯＶ６についてのＰｓｏｒｔプロフィールによって、この配列がシグナル配列を有さず、そして０．６５００という確実度でこの細胞質に局在する。他の実施形態において、ＮＯＶ６タンパク質は、０．２１９５という確実性でリソソーム（内腔）に局在するか、または、０．１０００という確実性でミトコンドリアの膜間隙に局在する。
【０１３９】
【表６Ｂ】
2004529607.tif 000069
公の配列データベースのＢＬＡＳＴ検索において、例えば、このＮＯＶ６の全長アミノ酸が、Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ由来の１０６０アミノ酸残基のＬＲＲ／ＧＰＣＲ様タンパク質である主要組織適合性複合体エンハンサー結合タンパク質（ＭＡＪＯＲ  ＨＩＳＴＯＣＯＭＰＡＴＡＴＩＢＩＬＩＴＹ  ＣＯＭＰＬＥＸ  ＥＮＨＡＮＣＥＲ−ＢＩＮＤＩＮＧ  ＰＲＯＴＥＩＮ）（ＳＷＩＳＳＰＲＯＴ−ＡＣＣ：Ｐ２５９６３）に対して、３１８アミノ酸残基のうち同一な２８８アミノ酸残基（９０％）を有し、かつ３１８アミノ酸残基のうち類似の２９２アミノ酸残基（９１％）を有していることが見出された（Ｅ＝５．５ｅ−１５１）。
【０１４０】
ＮＯＶ６は、表６ＣにおけるＢＬＡＳＴＰにて示されたタンパク質に対する相同性を有する。
【０１４１】
【表６Ｃ】
2004529607.tif 000070
マルチプル配列アライメントを、表６Ｄに示す。このＮＯＶ６タンパク質は、ＣｌｕｓｔａｌＷ解析で表６Ｄの１行目に示され、そして、ＮＯＶ６タンパク質を表６Ｃに示される関連するタンパク質配列と比較する。このＢＬＡＳＴＰデータは、表６ＤにＣｌｕｓｔａｌＷで図示される。
【０１４２】
【表６Ｄ】
2004529607.tif 000071
2004529607.tif 000072
本明細書中に開示されるタンパク質における同定可能なドメインの存在は、Ｐｆａｍのようなアルゴリズムを使用する検索によって決定された。表６Ｅは、ＮＯＶ６に対するＤＯＭＡＩＮ解析の結果によるドメイン記述を列挙する。
【０１４３】
【表６Ｅ】
2004529607.tif 000073
ロイシンリッチリピートドメインに対して相同である、ＮＯＶ６におけるタンパク質領域の存在は、主要組織適合性複合体エンハンサー結合タンパク質ＭＡＤ３様タンパク質としてＮＯＶ６タンパク質を同定することと矛盾しない。このことによって、ＮＯＶ６配列がこれらのドメインを含むことが既知である他のタンパク質の特性と類似する特性を有することが示される。
【０１４４】
本発明についての、ドメインおよびタンパク質の類似性情報は、この遺伝子が「主要組織適合性複合体エンハンサー結合タンパク質ＭＡＤ３」として機能し得ることを示唆する。従って、本発明のＮＯＶ６タンパク質は、免疫系の、形成および維持において機能し得る。ＮＯＶ６は、従って、これらの組織に関連する障害に関与する。
【０１４５】
本発明の、核酸およびタンパク質は、記載したような種々の病理および／または障害に関する、潜在的な治療学的用途において有用である。本発明に関する潜在的な治療学的用途としては、例えば、以下が挙げられるタンパク質治療剤、低分子薬物標的、抗体標的（治療学的抗体、診断学的抗体、薬物標的化抗体および／または細胞傷害性抗体）、診断マーカーおよび／または予後マーカー、遺伝子治療（遺伝子送達および／または遺伝子切除（ｇｅｎｅ  ａｂｌａｔｉｏｎ））、研究ツール、インビトロおよびインビボにおける組織再生（全てのこれらの組織およびこれらの組織を構成する細胞型ならびにこれらの組織由来の細胞型についての再生）。
【０１４６】
ＮＯＶ６核酸およびＮＯＶ６ポリペプチドは、治療方法および診断法における用途のための本発明の新規物質に免疫特異的に結合する抗体の生成においてさらに有用である。これらの抗体は、以下の「抗ＮＯＶＸ抗体」の節に記載の疎水性チャートによる予測を使用する、当該分野で公知の方法に従って生成され得る。この開示されたＮＯＶ６タンパク質は、複数の親水性領域を有し、この親水性領域の各々は、免疫原として使用され得る。１つの実施形態において、企図されるＮＯＶ６エピトープは、約１〜７５のアミノ酸である。別の実施形態において、ＮＯＶ６エピトープは、約１２５〜１６０のアミノ酸である。さらなる実施形態において、ＮＯＶ６エピトープは、約１７５〜１９０のアミノ酸、約２００〜２３０のアミノ酸、および約２４０〜３２０のアミノ酸である。これらの新規のタンパク質は、種々のヒトの障害の機能的解析のためのアッセイ系において使用され得、これらの解析は、疾患の病理の理解および種々の障害の新規薬物標的の開発において有用である。
【０１４７】
（ＮＯＶ７）
新規インターロイキン９様のタンパク質をコードする４５７ヌクレオチド（配列番号２７）の開示されたＮＯＶ７核酸（ＧＭＡＰ００１９４８＿Ａと呼ばれる）を、表７Ａに示す。オープンリーディングフレームは、開始コドンを伴わずに始まり、そしてヌクレオチド４４５〜４４７のＴＡＡコドンで終結することが、同定された。表７Ａにおいて、開始コドンより上流の非翻訳領域および終止コドンより下流の非翻訳領域に、下線を引く。開始コドンおよび終止コドンは、太字である。
【０１４８】
【表７Ａ】
2004529607.tif 000074
公の配列データベースの検索において、第４染色体のｐ３１領域に位置するこのＮＯＶ７核酸配列は、Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ由来のＰ４０サイトカインｍＲＮＡに対するｈｐ４０遺伝子（ＧＥＮＢＡＮＫ−ＩＤ：Ｘ１７５４３）と、２４１塩基のうち１５２塩基（７１％）の同一性を有した（Ｅ＝９．５ｅ−１４）。公のヌクレオチドデータベースとしては、全ＧｅｎＢａｎｋデータベースおよびＧｅｎｅＳｅｑ特許データベースが、挙げられる。
【０１４９】
配列番号２７によってコードされるＮＯＶ７タンパク質（配列番号２８）は、１４８アミノ酸残基長であり、そして、表７Ｂにおいて、１文字アミノ酸コードを使用して、表記される。ＮＯＶ７についてのＰｓｏｒｔプロフィールによって、この配列がシグナル配列を有さず、そして０．４５００の信頼度で細胞質に局在化する可能性があることが、予想される。他の実施形態において、このＮＯＶ７タンパク質は、０．３０００の信頼度でマイクロボディ（ペルオキシソーム）に、０．１０００の信頼度で糸粒体基質間に、または０．１０００の信頼度でリソソーム（ルーメン）に局在化する。ＮＯＶ７ペプチドの最も可能性のある切断部位は、６６番目のアミノ酸と６７番目のアミノ酸との間（ＳＬＣ−ＣＦ）である。
【０１５０】
【表７Ｂ】
2004529607.tif 000075
公の配列データベースのＢＬＡＳＴ検索において、例えば、ＮＯＶ７の全アミノ酸配列は、Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ（Ｐ１５２４８）由来の１４４アミノ酸残基のＩＮＴＥＲＬＥＵＫＩＮ−９ＰＲＥＣＵＲＳＯＲ（ＩＬ−９）（Ｔ−ＣＥＬＬ  ＧＲＯＷＴＨ  ＦＡＣＴＯＲ  Ｐ４０）（Ｐ４０  ＣＹＴＯＫＩＮＥ）タンパク質と、９８アミノ酸残基のうち５２アミノ酸残基（５３％）の同一性を有し、９８アミノ酸残基のうち６３アミノ酸残基（６４％）の類似性を有する（Ｅ＝６．５ｅ−２１）、ということが見出された。
【０１５１】
ＮＯＶ７は、表７ＣにおけるＢＬＡＳＴＰのデータ中に示されているタンパク質と、相同性を有する。
【０１５２】
【表７Ｃ】
2004529607.tif 000076
マルチプル配列アライメントを、表７Ｄに示し、ＮＯＶ７タンパク質を、ＣｌｕｓｔａｌＷ分析において表７Ｄ中の１行目に示す。そして、表７Ｃ中に示された関連したタンパク質配列と、ＮＯＶ７タンパク質とを比較する。このＢＬＡＳＴＰデータを、表７Ｄ中のＣｌｕｓｔａｌＷにおいて、図表で示す。
【０１５３】
【表７Ｄ】
2004529607.tif 000077
本明細書中で開示されたタンパク質における同定可能なドメインの存在を、Ｐｆａｍのようなアルゴリズムを使用して検索することによって、決定した。表７Ｅに、ＮＯＶ７に対するＤＯＭＡＩＮ分析結果からのドメインの説明を、列挙する。
【０１５４】
【表７Ｅ】
2004529607.tif 000078
ロイシンリッチリピート配列と相同性があるＮＯＶ７中のタンパク質領域の存在は、Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−９様タンパク質としてのＮＯＶ７タンパク質の同定と、一致する。これは、ＮＯＶ７配列が、これらのドメインを含むことが既知の他のタンパク質の特性と類似した特性を有する、ということを示す。
【０１５５】
本発明に対するドメイン類似性情報およびタンパク質類似性情報は、この遺伝子が、「Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−９」として機能し得ることを、示唆する。従って、本発明のＮＯＶ７タンパク質は、喘息、様々な型の癌、無精子症、学習障害、および顔面異形症、多発性硬化症、自己免疫性脳脊髄炎、Ｘ連鎖重症複合免疫不全ならびに他の免疫学的障害において、機能し得る。
【０１５６】
本発明の核酸およびタンパク質は、記載された種々の病状／障害に関係する、見込みのある治療的適用において、役立つ。本発明のための見込みある治療的使用としては、例えば；タンパク質治療の低分子薬剤標的、タンパク質治療の抗体標的（Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ，Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ，Ｄｒｕｇ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ／Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）、診断マーカーおよび／または予後マーカー、遺伝子治療（遺伝子送達／遺伝子切除）、研究手段、インビトロおよびインビボにおける組織再生（これらの組織およびこれらの組織に由来する細胞型を含む、これらの全組織および全細胞型のための再生）、が挙げられる。
【０１５７】
ＮＯＶ７核酸およびＮＯＶ７ポリペプチドは、治療法または診断法における使用のために、本発明の新規な物質に免疫特異的に結合する抗体の生成において、さらに有用である。これらの抗体は、以下の節「抗ＮＯＶＸ抗体」で記載されるように、疎水性チャートからの予測を使用し、当該分野において公知の方法に従って、生成され得る。この開示されたＮＯＶ７タンパク質は、複数の親水性領域を有し、親水性領域の各々は、免疫原として使用され得る。１つの実施形態において、意図されたＮＯＶ７エピトープは、おおよそ５番目のアミノ酸〜おおよそ４５番目のアミノ酸である。別の実施形態において、ＮＯＶ７エピトープは、おおよそ７０番目のアミノ酸〜おおよそ１２５番目のアミノ酸である。これらの新規なタンパク質は、種々のヒト障害の機能解析のためのアッセイ系において使用され得、これらの新規なタンパク質は、疾患の病状の理解において、そして種々の障害に対する新規薬物標的の開発において、有用である。
【０１５８】
（ＮＯＶ８）
新規な５−ヒドロキシトリプタミンレセプター様タンパク質をコードする１１５５ヌクレオチドの開示されたＮＯＶ８核酸（ＳＣ１２９２８５５１５＿Ａとも称される）（配列番号２９）を表８Ａに示す。オープンリーディングフレームは、ヌクレオチド５〜７のＡＴＧ開始コドンで始まり、そしてヌクレオチド１１４５〜１１４７のＴＧＡコドンで終わることが確認された。開始コドンから上流の非翻訳領域および終止コドンから下流の非翻訳領域は、表８Ａにおいて下線を付している。開始コドンおよび終止コドンは、太字にしている。
【０１５９】
【表８Ａ】
2004529607.tif 000079
公的な配列データベースの検索において、ＮＯＶ８核酸配列は、第２染色体のｐ３１領域に位置され、Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ由来の５−ＨＴ５ＢセロトニンレセプターｍＲＮＡ（ＧＥＮＢＡＮＫ−ＩＤ：Ｘ６９８６７）に対して１０８９塩基のうち８１２塩基（７４％）の同一性を有する（Ｅ＝１．８ｅ−１１５）。公的なヌクレオチドデータベースとしては、全てのＧｅｎＢａｎｋデータベースおよびＧｅｎｅＳｅｑ特許データベースが含まれる。
【０１６０】
配列番号２９によってコードされるＮＯＶ８タンパク質（配列番号３０）は、３８０アミノ酸残基長であり、そしてこれを表８Ｂにおいて一文字アミノ酸コードを用いて示す。ＮＯＶ８に対するＰｓｏｒｔプロフィールは、この配列が、シグナル配列を有し、そして０．６８５０の確実性で小胞体（膜）に局在化されている可能性があることを予測する。他の実施形態において、ＮＯＶ８タンパク質は、０．６４００の確実性で形質膜、０．４６００の確実性でゴルジ体、または０．１０００の確実性で小胞体（内腔）に局在化する。ＮＯＶ８ペプチドに対する最も可能性の高い切断部位は、アミノ酸１６と１７との間のＡＬＡ−ＰＥである。
【０１６１】
【表８Ｂ】
2004529607.tif 000080
公的な配列データベースのＢＬＡＳＴ検索において、例えば、ＮＯＶ８の全アミノ酸配列が、Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｌｕｓ由来の３７０アミノ酸残基の５−ヒドロキシトリプタミン５Ｂレセプター（５−ＨＴ−５Ｂ）（セロトニンレセプター）タンパク質（ＡＣＣ：Ｐ３１３８７）に対して、３６２アミノ酸残基のうち２８８アミノ酸残基（７９％）の同一性、および３６２アミノ酸残基のうち３０６アミノ酸残基（８４％）の類似性を有することが見出された（Ｅ＝２．８ｅ−１４４）。
【０１６２】
ＮＯＶ８は、表８ＣのＢＬＡＳＴＰデータにおいて示されるタンパク質と相同性を有する。
【０１６３】
【表８Ｃ】
2004529607.tif 000081
マルチプル配列アライメントを表８Ｄに示す。ここでは、ＮＯＶ８タンパク質が、ＣｌｕｓｔａｌＷ分析において、表８Ｄの１行目に示され、そして表８Ｃに示された関連のタンパク質配列とＮＯＶ８タンパク質を比較している。このＢＬＡＳＴＰデータを、表８ＤのＣｌｕｓｔａｌＷにおいて図示する。
【０１６４】
【表８Ｄ】
2004529607.tif 000082
本明細書に開示されたタンパク質における同定可能なドメインの存在を、Ｐｆａｍのようなアルゴリズムを用いた検索によって決定した。表８Ｅは、ＮＯＶ８に対するＤＯＭＡＩＮ分析結果からのドメインの説明を列挙する。
【０１６５】
【表８Ｅ】
2004529607.tif 000083
ロイシンリッチリピートドメインに相同性であるＮＯＶ８におけるタンパク質領域の存在は、ＮＯＶ８タンパク質が５−ヒドロキシトリプタミンレセプター様タンパク質として同定されたことと一致する。このことは、ＮＯＶ８配列が、これらのドメインを含むことが公知の他のタンパク質と類似の特性を有することを示す。
【０１６６】
本発明についてのこのドメインおよびタンパク質の類似性の情報は、この遺伝子が「５−ヒドロキシトリプタミンレセプター」として機能し得ることを示唆する。このように、本発明のＮＯＶ８タンパク質は、発作、アルツハイマー病、睡眠、食欲、体温調節、痛覚、ホルモン分泌、および性行動、精神の抑鬱、片頭痛、てんかん、強迫性の行動（精神分裂病）、および情動障害、において機能し得る。
【０１６７】
本発明の核酸およびタンパク質は、記載された種々の病状／疾患に関連した潜在的な治療適用において有用である。本発明の潜在的な治療法としては、例えば、；タンパク質治療剤、低分子薬物標的、抗体標的（治療的抗体、診断的抗体、薬物標的化抗体／細胞傷害性抗体）、診断マーカーおよび／または予後マーカー、遺伝子治療（遺伝子送達／遺伝子切除）、検索ツール、インビトロおよびインビボでの組織再生（これらの組織全て、ならびにこれらの組織を構成する細胞型およびこれらの組織由来の細胞型ての再生）が挙げられる。
【０１６８】
ＮＯＶ８核酸およびＮＯＶ８ポリペプチドはさらに、治療方法または診断方法における使用のための本発明の新規な物質に免疫特異的に結合する抗体の生成において有用である。これらの抗体は、以下の「抗ＮＯＶＸ抗体」の節に記載されるような、疎水性チャートからの予測を使用して、当該分野で公知の方法に従って生成され得る。開示されたＮＯＶ８タンパク質は、複数の親水性領域を有し、この各々が、免疫原として用いられ得る。１つの実施形態において、意図されたＮＯＶ８エピトープは、アミノ酸約２０〜５０である。別の実施形態において、ＮＯＶ８エピトープは、アミノ酸約１２０〜１４０である。さらなる実施形態において、ＮＯＶ８エピトープは、アミノ酸約１６０〜１８０、アミノ酸約２００〜２４０、アミノ酸約２４５〜２８０、アミノ酸約２９０〜３２５、およびアミノ酸約３５０〜３７５である。これらの新規なタンパク質は、種々のヒト障害の機能的な分析のためのアッセイ系において用いられ得、これが、疾患の病理の理解において、そして種々の障害のための新しい薬物標的の開発において有用である。
【０１６９】
（ＮＯＶ９）
新規なチオレドキシン様タンパク質をコードする６２０ヌクレオチドの開示されたＮＯＶ９核酸（ＡＣ０１３５５４＿ｄａｌとも呼ばれる）（配列番号３１）を表９Ａに示す。オープンリーディングフレームは、ヌクレオチド２８２〜２８４のＡＴＧ開始コドンで始まり、ヌクレオチド６１８〜６２０のＴＧＡコドンで終わることが確認された。開始コドンの上流の非翻訳領域および終止コドンの下流の非翻訳領域は、表９Ａにおいて下線を付す。開始コドンおよび終止コドンを太字で示す。
【０１７０】
【表９Ａ】
2004529607.tif 000084
ＮＯＶ９の改変体配列は、実施例２、表５５に含まれる。改変体配列は、一塩基多型（ＳＮＰ）を含み得る。ＳＮＰは、ある場合には、「ｃＳＮＰ」と呼ばれ得、このＳＮＰを含むヌクレオチド配列がｃＤＮＡとして生じることを示す。
【０１７１】
公的な配列データベースの検索において、ＮＯＶ９核酸配列は、第２染色体のｐ３１領域に位置され、Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ由来の５−ＨＴ５ＢセロトニンレセプターｍＲＮＡ（ＧＥＮＢＡＮＫ−ＩＤ：Ｘ６９８６７）に対して１０８９塩基のうち８１２塩基（７４％）同一性を有する（Ｅ＝１．８ｅ−１１５）。公的なヌクレオチドデータベースとしては、全てのＧｅｎＢａｎｋデータベースおよびＧｅｎｅＳｅｑ特許データベースが含まれる。
【０１７２】
配列番号３１によってコードされるＮＯＶ９タンパク質（配列番号３２）は、１１２アミノ酸残基長であり、１２７４６．６ダルトンの分子量を有し、そしてこれを表９Ｂに一文字アミノ酸コードを用いて示す。ＮＯＶ９に対するＰｓｏｒｔプロフィールは、この配列が、シグナル配列を有し、そして０．６５００の確実性で細胞質に局在化されている可能性があることを予測する。
【０１７３】
【表９Ｂ】
2004529607.tif 000085
公的な配列データベースのＢＬＡＳＴ検索において、例えば、ＮＯＶ９の全アミノ酸配列が、１０５アミノ酸残基のチオレドキシン−Ｅｑｕｕｓ  ｃａｂａｌｌｕｓ（ＡＣＣ：Ｏ９７５０８）に対して、１０３アミノ酸残基のうち６５アミノ酸残基（６３％）の同一性、および１０３アミノ酸残基のうち８０アミノ酸残基（７７％）の類似性を有し（Ｅ＝３．２ｅ−３２）、そして１０４アミノ酸残基のチオレドキシン（ＡＴＬ由来因子）（ＡＤＦ）（表面結合スルフヒドリルタンパク質）（ＳＡＳＰ）−Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ（ＡＣＣ：Ｐ１０５９９）に対して、１０３アミノ酸残基のうち６３アミノ酸残基（６１％）の同一性、および１０３アミノ酸残基のうち８０アミノ酸残基（７７％）の類似性を有することが見出された（Ｅ＝２．２ｅ−３１）。
【０１７４】
ＮＯＶ９は、表９ＣのＢＬＡＳＴＰデータにおいて示されるタンパク質と相同性を有する。
【０１７５】
【表９Ｃ】
2004529607.tif 000086
マルチプル配列アライメントを表９Ｄに示す。ここでは、ＮＯＶ９タンパク質が、ＣｌｕｓｔａｌＷ分析において、表９Ｄの１行目に示され、そして表９Ｃに示された関連のタンパク質配列とＮＯＶ９タンパク質を比較している。このＢＬＡＳＴＰデータを、表９ＤのＣｌｕｓｔａｌＷにおいて図示する。
【０１７６】
【表９Ｄ】
2004529607.tif 000087
本明細書に開示されたタンパク質における同定可能なドメインの存在を、Ｐｆａｍのようなアルゴリズムを用いた検索によって決定した。表９Ｅは、ＮＯＶ９に対するＤＯＭＡＩＮ分析結果からのドメインの説明を列挙する。
【０１７７】
【表９Ｅ】
2004529607.tif 000088
ロイシンリッチリピートドメインに相同性であるＮＯＶ９におけるタンパク質領域の存在は、ＮＯＶ９タンパク質がチオレドキシン様タンパク質として同定されたことと一致する。このことは、ＮＯＶ９配列が、これらのドメインを含むことが公知の他のタンパク質と類似の特性を有することを示す。
【０１７８】
本発明についてのこのドメインおよびタンパク質の類似性の情報は、この遺伝子が「チオレドキシン」として機能し得ることを示す。このように、本発明のＮＯＶ９タンパク質は、炎症、自己免疫障害、加齢、およびガンまたは他のチオレドキシン関連障害において機能し得る。
【０１７９】
本発明の核酸およびタンパク質は、記載された種々の病状／疾患に関連した潜在的な治療適用において有用である。本発明の潜在的な治療的使用としては、例えば、以下が挙げられる；タンパク質治療剤、低分子薬物標的、抗体標的（治療的抗体、診断的抗体、薬物標的化抗体／細胞傷害性抗体）、診断マーカーおよび／または予後マーカー、遺伝子治療（遺伝子送達／遺伝子切除）、検索ツール、インビトロおよびインビボでの組織再生（これらの組織全て、ならびにこれらの組織を構成する細胞型およびこれらの組織由来の細胞型の再生）。
【０１８０】
ＮＯＶ９核酸およびＮＯＶ９ポリペプチドはさらに、治療方法または診断方法における使用のための本発明の新規な物質に免疫特異的に結合する抗体の生成において有用である。これらの抗体は、以下の「抗ＮＯＶＸ抗体」の節に記載されるような、疎水性チャートからの予測を使用して、当該分野で公知の方法に従って生成され得る。開示されたＮＯＶ９タンパク質は、複数の親水性領域を有し、この各々が、免疫原として用いられ得る。これらの新規なタンパク質は、種々のヒト障害の機能的な分析のためのアッセイ系において用いられ得、これが、疾患の病理の理解において、そして種々の障害のための新しい薬物標的の開発において有用である。
【０１８１】
【表１０】
2004529607.tif 000089
（ＮＯＶＸ核酸およびポリペプチド）
本発明の１つの局面は、ＮＯＶＸポリペプチドまたはその生物学的に活性な部分をコードする、単離された核酸分子に関する。また、ＮＯＶＸをコードする核酸（例えば、ＮＯＶＸ  ｍＲＮＡ）を同定するためのハイブリダイゼーションプローブとしての用途のために十分な核酸フラグメント、およびＮＯＶＸ核酸分子の増幅および／または変異のためのＰＣＲプライマーとしての使用のためのフラグメントもまた、本発明に含まれる。本明細書中で使用される場合、用語「核酸分子」は、ＤＮＡ分子（例えば、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）、ＲＮＡ分子（例えば、ｍＲＮＡ）、ヌクレオチドアナログを使用して作成されるＤＮＡまたはＲＮＡのアナログ、ならびにそれらの誘導体、フラグメントおよびホモログを含むことを意図する。核酸分子は一本鎖または二本鎖であり得るが、好ましくは二本鎖ＤＮＡで構成される。
【０１８２】
ＮＯＶＸ核酸は、成熟ＮＯＶＸポリペプチドをコードし得る。本明細書中で使用される場合、本発明において開示されるポリペプチドまたはタンパク質の「成熟」形態は、天然に存在するポリペプチドの産物または前駆体形態またはプロプロテイン（ｐｒｏｐｒｏｔｅｉｎ）である。天然に存在するポリペプチド前駆体またはプロプロテインとしては、非限定的な例として、対応する遺伝子によりコードされる全長遺伝子産物が挙げられる。あるいは、これらは、本明細書中に記載されるＯＲＦによりコードされるポリペプチド、前駆体またはプロプロテインとして規定され得る。生成物「成熟」形態は、また非限定的な例の目的として、１以上の天然に存在するプロセシング工程（これらがこの遺伝子産物が生じる細胞または宿主細胞内で起こり得る場合）の結果として生じる。ポリペプチドまたはタンパク質の「成熟」形態に至るこのようなプロセシング工程の例としては、ＯＲＦの開始コドンによりコードされるＮ末端メチオニン残基の切断、またはシグナルペプチドまたはリーダー配列のタンパク質分解切断が挙げられる。従って、残基１〜Ｎ（残基１がＮ末端メチオニンである場合）を有する前駆体ポリペプチドまたはタンパク質から生じる成熟形態は、Ｎ末端メチオニンの除去後に残基２〜Ｎが残る。あるいは、残基１〜Ｎ（ここで、Ｎ末端シグナル配列（残基１〜残基Ｍ）が切断される）を有する前駆体ポリペプチドまたはタンパク質から生じる成熟形態は、残りの残基Ｍ＋１〜残基Ｎを有する。さらに、本明細書中で使用される場合、ポリペプチドまたはタンパク質の「成熟」形態は、タンパク質分解事象ではなく、翻訳後修飾の工程から生じ得る。このようなさらなるプロセスとしては、非限定的な例として、グリコシル化、ミリストイル化またはリン酸化が挙げられる。一般に、成熟ポリペプチドまたはタンパク質は、これらのプロセスの１つのみまたはこれらの任意の組み合わせの操作から生じ得る。
【０１８３】
用語「プローブ」とは、本明細書中で使用される場合、種々の長さの核酸配列をいい、好ましくは、特定の用途に依存して、少なくとも約１０ヌクレオチド（ｎｔ）、１００ｎｔ、または例えば、約６，０００ｎｔほどの大きさの間である。プローブは、同一、類似または相補的な核酸配列の検出において使用される。より長いプローブは、通常、天然供給源または組換え供給源から入手され、非常に特異的であり、そしてより長さの短いオリゴマープローブよりもはるかに遅くハイブリダイズする。プローブは、一本鎖または二本鎖であり得、そしてＰＣＲ、膜ベースのハイブリダイゼーション技術、またはＥＬＩＳＡ様の技術において特異性を有するように設計され得る。
【０１８４】
用語「単離された」核酸分子は、本明細書中で使用される場合、この核酸の天然の供給源中に存在する他の核酸分子から分離された核酸分子である。好ましくは、「単離された」核酸は、この核酸が由来する生物のゲノムＤＮＡ中でこの核酸に天然に隣接する配列（すなわち、この核酸の５’末端および３’末端に位置する配列）を含まない。例えば、種々の実施形態において、単離されたＮＯＶＸ核酸分子は、この核酸が由来する細胞／組織（例えば、脳、心臓、肝臓、脾臓など）のゲノムＤＮＡ中でこの核酸分子に天然で隣接する、約５ｋｂ、４ｋｂ、３ｋｂ、２ｋｂ、１ｋｂ、０．５ｋｂ、または０．１ｋｂ未満のヌクレオチド配列を含み得る。さらに、「単離された」核酸分子、例えば、ｃＤＮＡ分子は、組換え技術により産生される場合、その他の細胞物質または培養培地を実質的に含まないか、または化学的に合成される場合、化学物質前駆体もしくはその他の化学物質を実質的に含まないものであり得る。
【０１８５】
本発明の核酸分子、例えば、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１のヌクレオチド配列を有する核酸分子、または上記のヌクレオチド配列の相補体は、標準的な分子生物学的技術および本明細書で提供される配列情報を用いて単離され得る。ハイブリダイゼーションプローブとして、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、または３１の核酸配列の全部または一部を使用して、ＮＯＶＸ分子は、標準的なハイブリダイゼーションおよびクローニング技術（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（編）、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ  第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ、１９８９；およびＡｕｓｕｂｅｌら、（編）、ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ＮＹ、１９９３に記載されるように）を用いて単離され得る。
【０１８６】
本発明の核酸は、標準的なＰＣＲ増幅技術に従って、テンプレートとしてｃＤＮＡ、ｍＲＮＡあるいはゲノムＤＮＡ、および適切なオリゴヌクレオチドプライマーを用いて増幅され得る。このように増幅された核酸は、適切なベクター中にクローン化され、そしてＤＮＡ配列分析により特徴付けられ得る。さらに、ＮＯＶＸヌクレオチド配列に対応するオリゴヌクレオチドは、標準的な合成技術、例えば、自動化ＤＮＡ合成機を用いることにより調製され得る。
【０１８７】
本明細書で用いられる場合、用語「オリゴヌクレオチド」は、一連の連結されたヌクレオチド残基をいい、このオリゴヌクレオチドは、ＰＣＲ反応で用いられるに十分な数のヌクレオチド塩基を有する。短いオリゴヌクレオチド配列は、ゲノム配列もしくはｃＤＮＡ配列に基づき得るか、またはそれから設計され得、そして特定の細胞もしくは組織において、同一、類似もしくは相補的なＤＮＡもしくはＲＮＡを増幅し、確認し、もしくはその存在を示すために用いられる。オリゴヌクレオチドは、約１０ｎｔ、５０ｎｔ、または１００ｎｔ、好ましくは約１５ｎｔ〜３０ｎｔの長さを有する核酸配列の部分を含む。本発明の１つの実施形態では、１００ｎｔ未満の長さの核酸分子を含むオリゴヌクレオチドは、さらに、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、および３１の少なくとも６個連続するヌクレオチド、またはその相補体を含む。オリゴヌクレオチドは、化学的に合成され得、そしてまたプローブとして用いられ得る。
【０１８８】
別の実施形態では、本発明の単離された核酸分子は、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、および３１に示されるヌクレオチド配列またはこのヌクレオチド配列の一部分（例えば、プローブまたはプライマーとして使用され得るフラグメント、あるいはＮＯＶＸポリペプチドの生物学的に活性な部分をコードするフラグメント）の相補体である核酸分子を含む。配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、または３１に示されるヌクレオチド配列に相補的である核酸分子は、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、または３１に示されるヌクレオチド配列に十分相補的である核酸分子であり、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、および３１に示されるヌクレオチド配列に対しミスマッチがほとんどまたは全くなく水素結合し得、それによって安定な二重鎖を形成する核酸分子である。
【０１８９】
本明細書で用いる場合、用語「相補的」は、核酸分子のヌクレオチド単位間のＷａｔｓｏｎ−ＣｒｉｃｋまたはＨｏｏｇｓｔｅｅｎ塩基対形成をいい、そして用語「結合」は、２つのポリペプチドまたは化合物または関連ポリペプチドもしくは化合物またはその組合せ間の物理的または化学的相互作用を意味する。結合は、イオン性、非イオン性、ファンデルワールス性、疎水性相互作用などを含む。物理的相互作用は直接的または間接的のいずれかであり得る。間接的相互作用は、別のポリペプチドまたは化合物を介するか、またはその効果に起因し得る。直接的結合とは、別のポリペプチドもしくは化合物を介して、またはその効果に起因して生じるのではなく、他の実質的な化学的中間体がない相互作用をいう。
【０１９０】
本明細書中に提供されるフラグメントは、少なくとも６個の（連続する）核酸配列または少なくとも４個の（連続する）アミノ酸配列（それぞれ、核酸の場合には、特異的なハイブリダイゼーションを可能にし、またはアミノ酸の場合には、エピトープの特異的な認識を可能にするに十分な長さ）として規定され、そして全長配列未満のせいぜいいくらかの部分である。フラグメントは、選択された核酸配列またはアミノ酸配列の任意の連続する部分に由来し得る。誘導体は、直接的にかまたは改変もしくは部分的置換によってかのいずれかでネイティブな化合物から形成される核酸配列またはアミノ酸配列である。アナログは、ネイティブな化合物に類似する構造（ただし、同一ではない）を有するが、特定の成分または側鎖に関してそれとは異なる核酸配列またはアミノ酸配列である。アナログは、合成物であり得るか、または進化的に異なる起源に由来し得、そして野生型と比較して、類似の代謝活性または反対の代謝活性を有し得る。ホモログは、異なる種由来の特定の遺伝子の核酸配列またはアミノ酸配列である。
【０１９１】
誘導体およびアナログは、以下に記載のように、誘導体またはアナログが、修飾された核酸またはアミノ酸を含む場合、全長、または全長以外のものであり得る。本発明の核酸またはタンパク質の誘導体またはアナログは、種々の実施形態において、本発明の核酸もしくはタンパク質に、同一の大きさの核酸またはアミノ酸配列にわたって、またはアライメントした配列と比較した場合（このアライメントは、当該分野で公知であるコンピューター相同性プログラムによって実施される）、少なくとも約７０％、８０％、または９５％の同一性（好ましい同一性は、８０〜９５％）で実質的に相同であるか、あるいはそのコードする核酸がストリンジェントの、中程度にストリンジェントの、または低いストリンジェントの条件下で上記のタンパク質をコードする配列の相補体にハイブリダイズし得る、領域を含む分子を包含するが、これらに限定されない。例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら、ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ＮＹ、１９９３、および以下を参照のこと。
【０１９２】
「相同な核酸配列」もしくは「相同なアミノ酸配列」、またはその改変体とは、上記で考察したように、ヌクレオチドレベルまたはアミノ酸レベルにおける相同性によって特徴付けられる配列をいう。相同なヌクレオチド配列は、ＮＯＶＸポリペプチドのアイソフォームをコードする配列をコードする。アイソフォームは、例えば、ＲＮＡの選択的スプライシングの結果として、同一の生物の異なる組織において発現され得る。あるいは、アイソフォームは、異なる遺伝子によってコードされ得る。本発明において、相同なヌクレオチド配列は、ヒト以外の種（脊椎動物が挙げられるが、これに限定されず、従って、例えば、カエル、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ウマおよび他の生物が挙げられ得る）のＮＯＶＸポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。相同なヌクレオチド配列としてはまた、天然に生じる対立遺伝子改変体および本明細書に記載されるヌクレオチド配列の変異体が挙げられるが、これらに限定されない。しかし、相同的ヌクレオチド配列は、ヒトＮＯＶＸタンパク質をコードする正確なヌクレオチド配列を含まない。相同な核酸配列は、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、および３１の保存的アミノ酸置換（以下を参照のこと）、ならびにＮＯＶＸ生物学的活性を保有するポリペプチドをコードする核酸配列を含む。ＮＯＶＸタンパク質の種々の生物学的活性は以下に記載されている。
【０１９３】
ＮＯＶＸポリペプチドは、ＮＯＶＸ核酸のオープンリーディングフレーム（「ＯＲＦ」）によりコードされる。ＯＲＦは、ポリペプチドに潜在的に翻訳され得るヌクレオチド配列に対応する。ＯＲＦを含む核酸のストレッチは、終止コドンによって途切れない。全タンパク質についてのコード配列を表すＯＲＦは、ＡＴＧ「開始（ｓｔａｒｔ）」コドンで始まり、そして３つの「停止（ｓｔｏｐ）」コドン（すなわち、ＴＡＡ、ＴＡＧ、またはＴＧＡ）のうちの１つで終止する。本発明の目的で、ＯＲＦは、開始コドン、終止コドンまたはその両方を有するかまたは有さない、コード配列の任意の部分であり得る。ｂｏｎａ  ｆｉｄｅ細胞タンパク質のコードのための良好な候補としてみなされるＯＲＦについて、最小サイズの要求、例えば、５０アミノ酸以上のタンパク質をコードするＤＮＡのストレッチがしばしば設定される。
【０１９４】
ヒトＮＯＶＸ遺伝子のクローニングから決定されたヌクレオチド配列は、他の細胞型（例えば、他の組織由来）におけるＮＯＶＸホモログ、ならびに他の脊椎動物由来のＮＯＶＸホモログを同定および／またはクローニングする際の使用のために設計されるプローブおよびプライマーの作製を可能にする。このプローブ／プライマーは、代表的には、実質的に精製されたオリゴヌクレオチドを含む。このオリゴヌクレオチドは、代表的には、少なくとも約１２個、約２５個、約５０個、約１００個、約１５０個、約２００個、約２５０個、約３００個、約３５０個または約４００個連続する、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、または３１のセンス鎖ヌクレオチド配列；あるいは配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１のアンチセンス鎖ヌクレオチド配列；あるいは配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、および３１の天然に存在する変異体に、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列の領域を含む。
【０１９５】
ヒトＮＯＶＸヌクレオチド配列に基づくプローブは、同じかまたは相同なタンパク質をコードする転写物またはゲノム配列を検出するために使用され得る。種々の実施形態において、このプローブはさらに、プローブに付着した標識基を含み、例えば、この標識基は放射性同位体、蛍光化合物、酵素、または酵素補因子であり得る。このようなプローブは、ＮＯＶＸタンパク質を誤って発現する細胞または組織を同定するための診断試験キットの一部として、例えば、被験体由来の細胞のサンプル中のＮＯＶＸをコードする核酸のレベルを測定すること（例えば、ＮＯＶＸ  ｍＲＮＡレベルを検出すること、またはゲノムＮＯＶＸ遺伝子が変異しているかまたは欠失しているか否かを決定すること）によって使用され得る。
【０１９６】
「ＮＯＶＸポリペプチドの生物学的に活性な部分を有するポリペプチド」とは、本発明のポリペプチドの活性に類似するが必ずしも同一である必要ははない活性を示すポリペプチドをいい、これには、用量依存性の有無に関わらず、特定の生物学的アッセイにおいて測定されるような成熟形態を含む。「ＮＯＶＸの生物学的に活性な部分」をコードする核酸フラグメントは、ＮＯＶＸの生物学的活性（ＮＯＶＸタンパク質の生物学的活性は、以下に記載される）を有するポリペプチドをコードする、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、または３１の一部を単離し、ＮＯＶＸタンパク質のコードされた部分を発現させ（例えば、インビトロでの組換え発現によって）、そしてＮＯＶＸのコードされた部分の活性を評価することによって調製され得る。
【０１９７】
（ＮＯＶＸの核酸およびポリペプチドの改変体）
本発明はさらに、遺伝コードの縮重に起因して、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、および３１に示されるヌクレオチド配列とは異なる核酸分子を包含し、従って、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、および３１に示されるヌクレオチド配列によってコードされるタンパク質と同じＮＯＶＸタンパク質をコードする。別の実施形態において、本発明の単離された核酸分子は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、および３２に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を有する。
【０１９８】
配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、および３１に示されるヒトＮＯＶＸヌクレオチド配列に加えて、このＮＯＶＸポリペプチドのアミノ酸配列における変化を導くＤＮＡ配列多型は、集団（例えば、ヒト集団）内に存在し得ることが、当業者によって理解される。ＮＯＶＸ遺伝子中のこのような遺伝的多型は、天然の対立遺伝子のバリエーションに起因して、集団内の個体間に存在し得る。本明細書中で使用される場合、用語「遺伝子」および「組換え遺伝子」とは、ＮＯＶＸタンパク質、好ましくは脊椎動物のＮＯＶＸタンパク質をコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含む核酸分子をいう。このような天然の対立遺伝子のバリエーションは、代表的には、ＮＯＶＸ遺伝子のヌクレオチド配列において１〜５％の変動を生じ得る。天然の対立遺伝子バリエーションの結果であり、そしてこのＮＯＶＸポリペプチドの機能的活性を変化させない、ＮＯＶＸポリペプチド内の任意および全てのこのようなヌクレオチドのバリエーションならびに得られるアミノ酸多型は、本発明の範囲内であると意図される。
【０１９９】
さらに、他の種由来のＮＯＶＸタンパク質をコードし、従って、ヒト配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、および３１とは異なるヌクレオチド配列を有する核酸分子は、本発明の範囲内にあることが意図される。本発明のＮＯＶＸのｃＤＮＡの天然の対立遺伝子改変体およびホモログに対応する核酸分子は、本明細書中に開示されるヒトＮＯＶＸ核酸に対するその相同性に基づいて、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、標準的なハイブリダイゼーション技術に従うハイブリダイゼーションプローブとしてヒトｃＤＮＡまたはその一部を用いて単離され得る。
【０２００】
従って、別の実施形態では、本発明の単離された核酸分子は、少なくとも６ヌクレオチド長であり、そしてストリンジェント条件下で配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、および３１のヌクレオチド配列を含む核酸分子にハイブリダイズする。別の実施形態では、この核酸は、少なくとも１０、２５、５０、１００、２５０、５００、７５０、１０００、１５００、または２０００以上のヌクレオチド長である。なお別の実施形態では、本発明の単離された核酸分子は、コード領域にハイブリダイズする。本明細書中で用いられる場合、用語「ストリンジェント条件下でハイブリダイズする」は、ハイブリダイゼーションおよび洗浄に関して、互いに少なくとも６０％相同なヌクレオチド配列が代表的には互いにハイブリダイズしたままである条件を記載することを意図する。
【０２０１】
ホモログ（すなわち、ヒト以外の種由来のＮＯＶＸタンパク質をコードする核酸）または他の関連配列（例えば、パラログ）は、特定のヒト配列の全てまたは一部をプローブとし、核酸ハイブリダイゼーションおよびクローニングに関して当該分野で周知の方法を使用して、低い、中程度の、または高いストリンジェンシーのハイブリダイゼーションによって入手され得る。
【０２０２】
本明細書で用いられる場合、語句「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」は、その条件下で、プローブ、プライマーまたはオリゴヌクレオチドが、その標的配列にハイブリダイズするが、その他の配列にはハイブリダイズしない条件をいう。ストリンジェントな条件は配列依存性であり、そして異なる状況で異なる。より長い配列は、より短い配列より高い温度で特異的にハイブリダイズする。一般に、ストリンジェントな条件は、規定されたイオン強度およびｐＨで、特定の配列の熱融解点（Ｔｍ）より約５℃低いように選択される。このＴｍは、標的配列に相補的なプローブの５０％が、平衡状態で標的配列にハイブリダイズする（規定されたイオン強度、ｐＨおよび核酸濃度下）温度である。標的配列は一般に過剰で存在するので、Ｔｍでは、５０％のプローブが平衡状態で占有されている。代表的には、ストリンジェントな条件は、ｐＨ７．０〜８．３で、塩濃度が約１．０Ｍナトリウムイオンより少なく、代表的には約０．０１〜１．０Ｍナトリウムイオン（またはその他の塩）、そして温度が短いプローブ、プライマーまたはオリゴヌクレオチド（例えば、１０ｎｔ〜５０ｎｔ）について少なくとも約３０℃、そしてより長いプローブ、プライマーおよびオリゴヌクレオチドについて少なくとも約６０℃であるような条件である。ストリンジェントな条件はまた、ホルムアミドのような、不安定化剤の添加で達成され得る。
【０２０３】
ストリンジェント条件は、当業者に公知であり、そしてＡｕｓｕｂｅｌら（編），ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎ．Ｙ．（１９８９），６．３．１−６．３．６に見出され得る。好ましくは、この条件は、互いに少なくとも約６５％、約７０％、約７５％、約８５％、約９０％、約９５％、約９８％または約９９％相同な配列が、代表的には互いにハイブリダイズしたままであるような条件である。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の非限定的な例は、６×ＳＳＣ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．０２％  ＰＶＰ、０．０２％  Ｆｉｃｏｌｌ、０．０２％  ＢＳＡ、および５００ｍｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡを含む高塩緩衝液中での６５℃でのハイブリダイゼーションで、続いて０．２×ＳＳＣ、０．０１％  ＢＳＡ中での５０℃での１回以上の洗浄である。ストリンジェント条件下で配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、および３１の配列にハイブリダイズする、本発明の単離された核酸分子は、天然に存在する核酸分子に対応する。本明細書中で使用される場合、「天然に存在する」核酸分子とは、天然に存在する（例えば、天然のタンパク質をコードする）ヌクレオチド配列を有する、ＲＮＡ分子またはＤＮＡ分子をいう。
【０２０４】
第２の実施形態では、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、および３１のヌクレオチド配列、またはそれらのフラグメント、アナログもしくは誘導体を含む核酸分子に、中程度のストリンジェンシー条件下でハイブリダイズする核酸配列が提供される。中程度のストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件の非限定的な例は、５５℃での６×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、０．５％  ＳＤＳおよび１００ｍｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡ中でのハイブリダイゼーション、続いて１×ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳ中での３７℃での１回以上の洗浄である。用いられ得る中程度のストリンジェンシーの他の条件は、当該分野で周知である。例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら（編），１９９３，ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，ＮＹおよびＫｒｉｅｇｌｅｒ，１９９０，ＧＥＮＥ  ＴＲＡＮＳＦＥＲ  ＡＮＤ  ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ，Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹを参照のこと。
【０２０５】
第３の実施形態では、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、および３１のヌクレオチド配列、またはそれらのフラグメント、アナログもしくは誘導体を含む核酸分子に、低ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズする核酸が提供される。低ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件の非限定的な例は、３５％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．０２％  ＰＶＰ、０．０２％  Ｆｉｃｏｌｌ、０．２％  ＢＳＡ、１００ｍｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡ、１０％（重量／容量）硫酸デキストラン中での４０℃でのハイブリダイゼーション、続いて２×ＳＳＣ、２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、５ｍＭ  ＥＤＴＡおよび０．１％  ＳＤＳ中での５０℃での１回以上の洗浄である。用いられ得る低ストリンジェンシーの他の条件は、当該分野で周知である（例えば、種交差ハイブリダイゼーションについて用いられるように）。例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら（編），１９９３，ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，ＮＹならびにＫｒｉｅｇｌｅｒ，１９９０，ＧＥＮＥ  ＴＲＡＮＳＦＥＲ  ＡＮＤ  ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ，Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ；ＳｈｉｌｏおよびＷｅｉｎｂｅｒｇ，１９８１，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ７８：６７８９−６７９２を参照のこと。
【０２０６】
（保存的変異）
集団中に存在し得るＮＯＶＸ配列の天然に存在する対立遺伝子改変体に加えて、当業者は、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、および３１のヌクレオチド配列への変異によって変化が導入され得、それによって、このＮＯＶＸタンパク質の機能的能力を変更することなく、コードされるＮＯＶＸタンパク質のアミノ酸配列に変化がもたらされることをさらに理解する。例えば、「非必須」アミノ酸残基にてアミノ酸置換をもたらすヌクレオチド置換は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、および３２の配列において行われ得る。「非必須」アミノ酸残基は、その生物学的活性を変更することなく、このＮＯＶＸタンパク質の野生型配列から変更され得る残基であり、一方、「必須」アミノ酸残基は、このような生物学的活性に必要とされる。例えば、本発明のＮＯＶＸタンパク質の間で保存されているアミノ酸残基は、特に変更を受け入れ難いと予測される。保存的置換がなされ得るアミノ酸は、当該分野で周知である。
【０２０７】
本発明の別の局面は、活性に必須ではないアミノ酸残基における変化を含む、ＮＯＶＸタンパク質をコードする核酸分子に関する。このようなＮＯＶＸタンパク質は、アミノ酸配列が、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、または３２とは異なるが、生物学的活性をなお保持する。１つの実施形態では、単離された核酸分子は、タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含み、ここで、このタンパク質は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、または３２のアミノ酸配列に少なくとも約４５％相同であるアミノ酸配列を含む。好ましくは、この核酸分子によってコードされるタンパク質は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、または３２に対して少なくとも約６０％相同であり；より好ましくは配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、および３２に対して少なくとも約７０％相同であり；なおより好ましくは、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、および３２に対してして少なくとも約８０％相同であり；なおより好ましくは、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、および３２に対して少なくとも約９０％相同であり；そして最も好ましくは、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、および３２に対して少なくとも約９５％相同である。
【０２０８】
配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、および３２のタンパク質に相同なＮＯＶＸタンパク質をコードする単離された核酸分子は、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、および３１のヌクレオチド配列に１以上のヌクレオチドの置換、付加または欠失を導入することにより作製され得、その結果、１以上のアミノ酸の置換，付加または欠失が、コードされるタンパク質に導入される。
【０２０９】
変異は、標準技術（例えば、部位特異的変異誘発およびＰＣＲ媒介変異誘発）によって配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、および３２に導入され得る。好ましくは、保存的アミノ酸置換が、１以上の推定非必須アミノ酸残基にて作製される。「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置換される、アミノ酸置換である。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当該分野で定義されている。これらのファミリーとしては、以下が挙げられる：塩基性側鎖を有するアミノ酸（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アルパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β分枝側鎖を有するアミノ酸（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）および芳香族側鎖を有するアミノ酸（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）。従って、ＮＯＶＸタンパク質中の推定非必須アミノ酸残基は、同じ側鎖のファミリー由来の別のアミノ酸残基で置換される。あるいは、別の実施形態では、変異は、ＮＯＶＸコード配列の全てまたは一部に沿って（例えば、飽和変異誘発（ｓａｔｕｒａｔｉｏｎ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）によって）ランダムに導入され得、そして得られる変異体は、ＮＯＶＸの生物学的活性についてスクリーニングされて、活性を維持する変異体を同定し得る。配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、および３１の変異誘発に続いて、コードされるタンパク質は、当該分野で公知の任意の組換え技術によって発現され得、そしてこのタンパク質の活性が決定され得る。
【０２１０】
アミノ酸ファミリーの関連性はまた、側鎖の相互作用に基づいて決定され得る。置換されたアミノ酸は、完全に保存された「強い」残基または完全に保存された「弱い」残基であり得る。保存されたアミノ酸残基の「強い」群は、以下の群のいずれかであり得る：ＳＴＡ、ＮＥＱＫ、ＮＨＱＫ、ＮＤＥＱ、ＱＨＲＫ、ＭＩＬＶ、ＭＩＬＦ、ＨＹ、ＦＹＷ（ここで、一文字アミノ酸コードは、互いに置換され得るこれらのアミノ酸残基によりグループ化される）。同様に、保存された残基の「弱い」群は、以下のいずれか１つで有り得る：ＣＳＡ、ＡＴＶ、ＳＡＧ、ＳＴＮＫ、ＳＴＰＡ、ＳＧＮＤ、ＳＮＤＥＱＫ、ＮＤＥＱＨＫ、ＮＥＱＨＲＫ、ＶＬＩＭ、ＨＦＹ（ここで、各群内の文字は、一文字アミノ酸コードを表する）。
【０２１１】
１つの実施形態では、変異ＮＯＶＸタンパク質は、以下についてアッセイされ得る：（ｉ）他のＮＯＶＸタンパク質、他の細胞表面タンパク質、または生物学的に活性なそれらの部分と、タンパク質：タンパク質相互作用を形成する能力；（ｉｉ）変異ＮＯＶＸタンパク質と、ＮＯＶＸのリガンドとの間の複合体形成；または（ｉｉｉ）変異ＮＯＶＸタンパク質が細胞内標的タンパク質またはその生物学的に活性な部分に結合する能力；（例えば、アビジンタンパク質）。
【０２１２】
なお別の実施形態において、変異体ＮＯＶＸタンパク質は、特定の生物学的機能を調節する能力（例えば、インスリン放出の調節）についてアッセイされ得る。
【０２１３】
（アンチセンス核酸）
本発明の別の局面は、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、および３１のヌクレオチド配列またはそのフラグメント、アナログもしくは誘導体を含む核酸分子にハイブリダイズし得るかまたは相補的である、単離されたアンチセンス核酸分子に関する。「アンチセンス」核酸は、タンパク質をコードする「センス」核酸に相補的である（例えば、二本鎖ｃＤＮＡ分子のコード鎖に相補的であるかまたはｍＲＮＡ配列に相補的である）ヌクレオチド配列を含む。特定の局面では、少なくとも約１０、約２５、約５０、約１００、約２５０もしくは約５００ヌクレオチドまたはＮＯＶＸコード鎖の全体、またはそれらの一部のみに相補的な配列を含む、アンチセンス核酸分子が提供される。配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、および３２のＮＯＶＸタンパク質のフラグメント、ホモログ、誘導体およびアナログをコードする核酸分子、または配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、および３１のＮＯＶＸ核酸配列に相補的なアンチセンス核酸がさらに提供される。
【０２１４】
１つの実施形態では、アンチセンス核酸分子は、ＮＯＶＸタンパク質をコードするヌクレオチド配列のコード鎖の「コード領域」に対してアンチセンスである。用語「コード領域」とは、アミノ酸残基に翻訳されるコドンを含む、ヌクレオチド配列の領域をいう。別の実施形態では、このアンチセンス核酸分子は、ＮＯＶＸタンパク質をコードするヌクレオチド配列のコード鎖の「非コード領域」に対してアンチセンスである。用語「非コード領域」とは、コード領域に隣接する、アミノ酸に翻訳されない、５’配列および３’配列をいう（すなわち、５’非翻訳領域および３’非翻訳領域ともいわれる）。
【０２１５】
本明細書中に開示されるＮＯＶＸタンパク質をコードするコード鎖配列を考慮すれば、本発明のアンチセンス核酸は、ＷａｔｓｏｎおよびＣｒｉｃｋの塩基対形成の規則またはＨｏｏｇｓｔｅｅｎの塩基対形成の規則に従って設計され得る。アンチセンス核酸分子は、ＮＯＶＸ  ｍＲＮＡのコード領域全体に相補的であり得るが、より好ましくは、ＮＯＶＸ  ｍＲＮＡのコード領域または非コード領域の一部にのみアンチセンスであるオリゴヌクレオチドである。例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＮＯＶＸ  ｍＲＮＡの翻訳開始部位を取り囲む領域に相補的であり得る。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、例えば、長さが約５、約１０、約１５、約２０、約２５、約３０、約３５、約４０、約４５または約５０ヌクレオチドであり得る。本発明のアンチセンス核酸は、当該分野で公知の手順を用いて、化学的合成または酵素連結反応を用いて構築され得る。例えば、アンチセンス核酸（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド）は、天然に存在するヌクレオチド、またはこの分子の生物学的安定性を増大させるように、もしくはアンチセンス核酸とセンス核酸との間で形成される二重鎖の物理的安定性を増大させるように設計された種々に改変されたヌクレオチドを用いて化学的に合成され得る（例えば、ホスホロチオエート誘導体およびアクリジン置換ヌクレオチドが用いられ得る）。
【０２１６】
アンチセンス核酸を作製するために用いられ得る改変されたヌクレオチドの例としては以下が挙げられる：５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４−アセチルシトシン、５−（カルボキシヒドロキシメチル）ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、β−Ｄ−ガラクトシルキュエオシン（ｇａｌａｃｔｏｓｙｌｑｕｅｏｓｉｎｅ）、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−アデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、β−Ｄ−マンノシルキュエオシン（ｍａｎｎｏｓｙｌｑｕｅｏｓｉｎｅ）、５’−メトキシカルボキシメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、ワイブトキソシン（ｗｙｂｕｔｏｘｏｓｉｎｅ）、プソイドウラシル、キュエオシン（ｑｕｅｏｓｉｎｅ）、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、５−メチル−２−チオウラシル、３−（３−アミノ−３−Ｎ−２−カルボキシプロピル）ウラシル、（ａｃｐ３）ｗ、および２，６−ジアミノプリン。あるいは、このアンチセンス核酸は、核酸がアンチセンス方向でサブクローニングされた発現ベクターを用いて生物学的に生成され得る（すなわち、挿入された核酸から転写されたＲＮＡは、以下の小節にさらに記載される、目的の標的核酸に対してアンチセンス方向である）。
【０２１７】
本発明のアンチセンス核酸分子は、代表的には被験体に投与されるか、またはインサイチュで生成され、その結果それらは、ＮＯＶＸタンパク質をコードする細胞性ｍＲＮＡおよび／またはゲノムＤＮＡとハイブリダイズするか、またはそれに結合し、それによってこのタンパク質の発現を阻害する（例えば、転写および／または翻訳を阻害することによって）。ハイブリダイゼーションは、安定な二重鎖を形成する従来のヌクレオチド相補性によってか、または例えばＤＮＡ二重鎖に結合するアンチセンス核酸分子の場合には、二重らせんの主溝における特異的相互作用を介してであり得る。本発明のアンチセンス核酸分子の投与経路の例としては、組織部位での直接的注射が挙げられる。あるいは、アンチセンス核酸分子は、選択された細胞を標的化するように改変され得、次いで全身に投与される。例えば、全身投与のために、アンチセンス分子は、選択された細胞表面上に発現されたレセプターまたは抗原にそれらが特異的に結合するように改変され得る（例えば、そのアンチセンス核酸分子を細胞表面レセプターまたは抗原に結合するペプチドまたは抗体に連結することによって）。このアンチセンス核酸分子はまた、本明細書中に記載されるベクターを用いて細胞に送達され得る。十分な核酸分子を達成するために、アンチセンス核酸分子が強力なｐｏｌ  ＩＩプロモーターまたはｐｏｌ  ＩＩＩプロモーターの制御下に置かれているベクター構築物が、好ましい。
【０２１８】
なお別の実施形態において、本発明のアンチセンス核酸分子は、α−アノマー核酸分子である。α−アノマー核酸分子は、相補的ＲＮＡと特異的な二本鎖ハイブリッドを形成し、ここで、通常のβ−ユニットとは対照的に、これらの鎖は、互いに平行に延びる（例えば、Ｇａｕｌｔｉｅｒら，１９８７，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１５：６６２５−６６４１を参照のこと）。このアンチセンス核酸分子はまた、２’−ｏ−メチルリボヌクレオチド（例えば、Ｉｎｏｕｅら，１９８７，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１５：６１３１〜６１４８を参照のこと）またはキメラＲＮＡ−ＤＮＡアナログ（例えば、Ｉｎｏｕｅら，１９８７，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．２１５：３２７〜３３０を参照のこと）を含み得る。
【０２１９】
（リボザイムおよびＰＮＡ部分）
核酸の改変としては、非制限的な例として、改変塩基、および糖リン酸骨格が改変または誘導体化された核酸が挙げられる。これらの改変は、少なくとも一部は、改変された核酸の化学的安定性を増強するために実施され、その結果、それらは、例えば、被験体での治療的適用におけるアンチセンス結合核酸として使用され得る。
【０２２０】
１つの実施形態において、本発明のアンチセンス核酸はリボザイムである。リボザイムは、一本鎖核酸（例えば、ｍＲＮＡ）を切断し得るリボヌクレアーゼ活性を有する触媒性ＲＮＡ分子であり、これらは、その一本鎖核酸に対して相補領域を有する。従って、リボザイム（例えば、ＨａｓｅｌｈｏｆｆおよびＧｅｒｌａｃｈ  １９８８．Ｎａｔｕｒｅ  ３３４：５８５−５９１に記載されるハンマーヘッド型リボザイム）を使用して、ＮＯＶＸ  ｍＲＮＡ転写物を触媒的に切断し、それによってＮＯＶＸ  ｍＲＮＡの翻訳を阻害し得る。ＮＯＶＸをコードする核酸に特異性を有するリボザイムは、本明細書中に開示されるＮＯＶＸ  ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（すなわち、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、および３１）に基づいて設計され得る。例えば、活性部位のヌクレオチド配列が、ＮＯＶＸをコードするｍＲＮＡ内で切断されるヌクレオチド配列に相補的である、テトラヒメナ（Ｔｅｔｒａｈｙｍｅｎａ）Ｌ−１９  ＩＶＳ  ＲＮＡの誘導体が構築され得る。例えば、Ｃｅｃｈらの米国特許第４，９８７，０７１号およびＣｅｃｈらの米国特許第５，１１６，７４２号を参照のこと。ＮＯＶＸ  ｍＲＮＡをまた使用して、ＲＮＡ分子のプールから、特異的リボヌクレアーゼ活性を有する触媒性ＲＮＡを選択し得る。例えば、Ｂａｒｔｅｌら（１９９３）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６１：１４１１〜１４１８を参照のこと。
【０２２１】
あるいは、ＮＯＶＸ遺伝子発現は、ＮＯＶＸ核酸の調節領域（例えば、ＮＯＶＸのプロモーターおよび／またはエンハンサー）に相補的なヌクレオチド配列を標的化し、標的細胞中でＮＯＶＸ遺伝子の転写を妨害する三重らせん構造を形成することによって阻害され得る。例えば、Ｈｅｌｅｎｅ，１９９１．Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓ．６：５６９〜８４；Ｈｅｌｅｎｅら．１９９２．Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．６６０：２７−３６；Ｍａｈｅｒ，１９９２．Ｂｉｏａｓｓａｙｓ  １４：８０７−１５を参照のこと。
【０２２２】
種々の実施形態において、ＮＯＶＸ核酸は、塩基部分、糖部分またはリン酸骨格で改変され、例えば、その分子の安定性、ハイブリダイゼーションまたは可溶性を改善し得る。例えば、核酸のデオキシリボースリン酸骨格を改変して、ペプチド核酸を生成し得る（例えば、Ｈｙｒｕｐら，１９９６．Ｂｉｏｏｒｇ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  ４：５−２３を参照のこと）。本明細書中で使用される場合、用語「ペプチド核酸」または「ＰＮＡ」とは、デオキシリボースリン酸骨格が偽ペプチド骨格によって置換され、そして４つの天然の核酸塩基のみが保持されている核酸模倣物（例えば、ＤＮＡ模倣物）をいう。ＰＮＡの中性の骨格は、低いイオン強度の条件下でＤＮＡおよびＲＮＡに対する特異的ハイブリダイゼーションを可能にすることが示されている。ＰＮＡオリゴマーの合成は、Ｈｙｒｕｐら，１９９６．前出；Ｐｅｒｒｙ−Ｏ’Ｋｅｅｆｅら，１９９６．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３：１４６７０−１４６７５において記載されるような標準的固相ペプチド合成プロトコルを用いて行われ得る。
【０２２３】
ＮＯＶＸのＰＮＡは、治療的適用および診断的適用において使用され得る。例えば、ＰＮＡは、例えば転写または翻訳の停止を誘導することまたは複製を阻害することによる、遺伝子発現の配列特異的調節のためのアンチセンスまたは抗遺伝子剤として使用され得る。ＮＯＶＸのＰＮＡはまた、例えばＰＮＡ指向性ＰＣＲクランピングによる遺伝子における一塩基対変異の分析において；他の酵素（例えば、Ｓ１ヌクレアーゼ）と組み合わせて使用される場合の人工制限酵素として（Ｈｙｒｕｐら，１９９６．前出を参照のこと）；またはＤＮＡ配列およびハイブリダイゼーションのプローブもしくはプライマーとして（Ｈｙｒｕｐら，１９９６，前出；Ｐｅｒｒｙ−Ｏ’Ｋｅｅｆｅら，１９９６，前出を参照のこと）、使用され得る。
【０２２４】
別の実施形態において、ＮＯＶＸのＰＮＡは、例えば、それらの安定性または細胞性取り込みを増強するために、ＰＮＡに脂溶性基または他のヘルパー基を結合することによって、ＰＮＡ−ＤＮＡキメラの形成によって、またはリポソームもしくは当該分野において公知の薬物送達の他の技術の使用によって改変され得る。例えば、ＰＮＡおよびＤＮＡの有利な特性を組合せ得る、ＮＯＶＸのＰＮＡ−ＤＮＡキメラが生成され得る。ＰＮＡ部分が高い結合親和性および特異性を提供する一方で、そのようなキメラは、ＤＮＡ認識酵素（例えば、ＲＮａｓｅ  ＨおよびＤＮＡポリメラーゼ）がＤＮＡ部分と相互作用するのを可能にする。ＰＮＡ−ＤＮＡキメラは、塩基のスタッキング、核酸塩基間の結合数および方向を考慮して選択される適切な長さのリンカーを使用して連結され得る（Ｈｙｒｕｐら，１９９６，前出を参照のこと）。ＰＮＡ−ＤＮＡキメラの合成は、Ｈｙｒｕｐら，１９９６，前出およびＦｉｎｎら，１９９６，Ｎｕｃｌ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ２４：３３５７−３３６３において記載されるように行われ得る。例えば、ＤＮＡ鎖は、標準的なホスホルアミダイトカップリング化学を用いて固体支持体上で合成され得、そして改変されたヌクレオシドアナログ（例えば、５’−（４−メトキシトリチル）アミノ−５’−デオキシ−チミジンホスホルアミダイト）が、ＰＮＡとＤＮＡの５’末端との間に使用され得る（Ｍａｇら，１９８９，Ｎｕｃｌ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ  １７：５９７３〜５９８８を参照のこと）。次いで、ＰＮＡモノマーが段階様式でカップリングされ、５’ＰＮＡセグメントおよび３’ＤＮＡセグメントを有するキメラ分子を生成する（例えば、Ｆｉｎｎら，１９９６，前出を参照のこと）。あるいは、５’ＤＮＡセグメントおよび３’ＰＮＡセグメントを用いて、キメラ分子が合成され得る。例えば、Ｐｅｔｅｒｓｅｎら，１９７５，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．５：１１１９〜１１１２４を参照のこと。
【０２２５】
他の実施形態において、オリゴヌクレオチドは、以下のような他の付属の基を含み得る：ペプチド（例えば、インビボで宿主細胞レセプターを標的化するため）、または細胞膜を横切る輸送を容易にする因子（例えば、Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら、１９８９、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８６：６５５３〜６５５６；Ｌｅｍａｉｔｒｅら、１９８７、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８４：６４８〜６５２；ＰＣＴ公開番号ＷＯ８８／０９８１０を参照のこと）、または血液脳関門（例えば、ＰＣＴ公開番号ＷＯ８９／１０１３４を参照のこと）。さらに、オリゴヌクレオチドは、ハイブリダイゼーション誘発切断剤（例えば、Ｋｒｏｌら、１９８８、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ６：９５８〜９７６を参照のこと）、またはインターカレート剤（例えば、Ｚｏｎ，１９８８、Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．５：５３９〜５４９を参照のこと）で改変され得る。この目的のために、オリゴヌクレオチドは、別の分子（例えば、ペプチド、ハイブリダイゼーション誘発架橋剤、輸送剤、ハイブリダイゼーション誘発切断剤など）に結合され得る。
【０２２６】
（ＮＯＶＸポリペプチド）
本発明に従うポリペプチドは、配列が配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、および３２に提供されるＮＯＶＸポリペプチドのアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。本発明はまた、なおそのＮＯＶＸ活性および生理学的機能を維持するタンパク質、またはその機能的フラグメントをコードするが、その任意の残基が配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、および３２に示される対応する残基から変化し得る、変異体または改変体タンパク質を含む。
【０２２７】
一般に、ＮＯＶＸ様機能を保持するＮＯＶＸ改変体は、配列中の特定位置の残基が他のアミノ酸により置換されている任意の改変体を含み、そしてさらに、親タンパク質の２つの残基間にさらなる残基（単数または複数）を挿入する可能性、および親配列から１つ以上の残基を欠失する可能性を含む。任意のアミノ酸置換、挿入または欠失が、本発明に包含される。好適な状況では、この置換は、上記で規定されるような保存的置換である。
【０２２８】
本発明の１つの局面は、単離されたＮＯＶＸタンパク質、およびその生物学的に活性な部分、またはそれらの誘導体、フラグメント、アナログもしくはホモログに関する。抗ＮＯＶＸ抗体を惹起するための免疫原としての使用のために適切なポリペプチドフラグメントもまた提供される。１つの実施形態において、ネイティブなＮＯＶＸタンパク質は、標準的なタンパク質精製技術を用いる適切な精製スキームによって、細胞または組織供給源から単離され得る。別の実施形態において、ＮＯＶＸタンパク質は、組換えＤＮＡ技術によって産生される。組換え発現に代わるものとして、ＮＯＶＸタンパク質またはポリペプチドは、標準的なペプチド合成技術を用いて化学合成され得る。
【０２２９】
「単離された」または「精製された」ポリペプチドまたはタンパク質あるいはその生物学的に活性な部分は、ＮＯＶＸタンパク質の由来する細胞または組織供給源由来の細胞性物質または他の夾雑タンパク質を実質的に含まないか、あるいは化学合成される場合に化学前駆体または他の化学物質を実質的に含まない。用語「細胞性物質を実質的に含まない」は、ＮＯＶＸタンパク質の調製物を含み、この調製物において、ＮＯＶＸタンパク質が単離または組換え産生される細胞の細胞性成分から、ＮＯＶＸタンパク質は分離されている。１つの実施形態において、用語「細胞性物質を実質的に含まない」は、非ＮＯＶＸタンパク質（本明細書中において「夾雑タンパク質」とも呼ばれる）を約３０％未満（乾燥重量にて）、より好ましくは非ＮＯＶＸタンパク質を約２０％未満、なおより好ましくは非ＮＯＶＸタンパク質を約１０％未満、そして最も好ましくは非ＮＯＶＸタンパク質を約５％未満有する、ＮＯＶＸタンパク質の調製物を含む。ＮＯＶＸタンパク質またはその生物学的に活性な部分が組換え産生される場合、好ましくは、調製物はまた培養培地を実質的に含まない。すなわち、培養培地は、そのＮＯＶＸタンパク質調製物の容量の約２０％未満、より好ましくは約１０％未満、そして最も好ましくは約５％未満を示す。
【０２３０】
用語「化学前駆体または他の化学物質を実質的に含まない」は、タンパク質が、そのタンパク質の合成に関与する化学前駆体または他の化学物質から分離されているＮＯＶＸタンパク質の調製物を含む。１つの実施形態において、用語「化学前駆体または他の化学物質を実質的に含まない」は、化学前駆体または非ＮＯＶＸの化学物質を約３０％未満（乾燥重量にて）、より好ましくは化学前駆体または非ＮＯＶＸ化学物質を約２０％未満、なおより好ましくは化学前駆体または非ＮＯＶＸ化学物質を約１０％未満、そして最も好ましくは化学前駆体または非ＮＯＶＸ化学物質を約５％未満有する、ＮＯＶＸタンパク質の調製物を含む。
【０２３１】
ＮＯＶＸタンパク質の生物学的に活性な部分は、全長ＮＯＶＸタンパク質より少ないアミノ酸を含み、そしてＮＯＶＸタンパク質の少なくとも１つの活性を示す、ＮＯＶＸタンパク質のアミノ酸配列（例えば、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、および３２に示されるアミノ酸配列）に十分に相同なアミノ酸配列、またはＮＯＶＸタンパク質のアミノ酸配列に由来するアミノ酸配列を含むペプチドを含む。代表的には、生物学的に活性な部分は、ＮＯＶＸタンパク質の少なくとも１つの活性を有するドメインまたはモチーフを含む。ＮＯＶＸタンパク質の生物学的に活性な部分は、例えば、長さが１０、２５、５０、１００またはそれより多いアミノ酸残基であるポリペプチドであり得る。
【０２３２】
さらに、タンパク質の他の領域が欠失している他の生物学的に活性な部分は、組換え技術によって調製され得、そしてネイティブなＮＯＶＸタンパク質の機能的活性のうちの１つ以上について評価され得る。
【０２３３】
１つの実施形態において、ＮＯＶＸタンパク質は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、および３２に示されるアミノ酸配列を有する。他の実施形態において、ＮＯＶＸタンパク質は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、および３２に実質的に相同であり、そして以下に詳細に議論されるように、天然の対立遺伝子改変体または変異誘発に起因してアミノ酸配列が異なるが、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、および３２のタンパク質の機能的活性を保持する。従って、別の実施形態において、ＮＯＶＸタンパク質は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、および３２のアミノ酸配列に少なくとも約４５％相同なアミノ酸配列を含み、そして、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、および３２のＮＯＶＸタンパク質の機能的活性を保持するタンパク質である。
【０２３４】
（２つ以上の配列間の相同性の決定）
２つのアミノ酸配列または２つの核酸の相同性の百分率を決定するために、配列を、至適な比較の目的のために整列する（例えば、ギャップを、第２のアミノ酸または核酸配列との最適な整列のために、第１のアミノ酸または核酸配列の配列中に導入し得る）。次いで、対応するアミノ酸位置またはヌクレオチド位置でのアミノ酸残基またはヌクレオチドを比較する。第１の配列中の位置が、第２の配列中の対応する位置と同じアミノ酸残基またはヌクレオチドで占められる場合、分子は、その位置で相同である（すなわち、本明細書中で使用される場合、アミノ酸または核酸の「相同性」は、アミノ酸または核酸の「同一性」と等価である）。
【０２３５】
核酸配列の相同性は、２つの配列間の同一性の程度として決定され得る。相同性は、当該分野において公知のコンピュータープログラム（例えば、ＧＣＧプログラムパッケージにおいて提供されるＧＡＰソフトウェア）を用いて決定され得る。ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ，１９７０  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ４８：４４３〜４５３を参照のこと。核酸配列比較のための以下の設定（ＧＡＰ作製ペナルティー、５．０、およびＧＡＰ伸長ペナルティー、０．３）を用いてＧＣＧ  ＧＡＰソフトウェアを使用すると、上記で言及される類似の核酸配列のコード領域は、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、および３１に示されるＤＮＡ配列のＣＤＳ（コード）部分と、好ましくは少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％の同一性の程度を示す。
【０２３６】
用語「配列同一性」は、２つのポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列が、特定の比較領域にわたって、残基毎を基準として同一である程度をいう。用語「配列同一性のパーセンテージ」は、以下により算出される：この比較領域にわたって最適に整列された２つの配列を比較すること、両方の配列において同一の核酸塩基（例えば、核酸の場合にはＡ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、Ｕ、またはＩ）が存在する位置の数を決定し、一致した位置の数を導くこと、この一致した位置の数を、比較領域の内の位置の総数（すなわち、ウインドウサイズ）で除算すること、およびその結果を１００で乗算して、配列同一性のパーセンテージを導くこと。用語「実質的な同一性」は、本明細書中で使用される場合、ポリヌクレオチド配列の特徴を示し、ここでこのポリヌクレオチドは、比較領域にわたり参照配列と比較して、少なくとも８０％の配列同一性、好ましくは少なくとも８５％の同一性、そして頻繁には９０〜９５％の配列同一性、より通常には少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を含む。
【０２３７】
（キメラタンパク質および融合タンパク質）
本発明はまた、ＮＯＶＸキメラタンパク質または融合タンパク質を提供する。本明細書中で使用される場合、ＮＯＶＸ「キメラタンパク質」またはＮＯＶＸ「融合タンパク質」は、非ＮＯＶＸポリペプチドに作動可能に連結された、ＮＯＶＸポリペプチドを含む。「ＮＯＶＸポリペプチド」は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、および３２のＮＯＶＸタンパク質に対応するアミノ酸配列を有するポリペプチドをいうが、「非ＮＯＶＸポリペプチド」は、ＮＯＶＸタンパク質に対して実質的に相同ではないタンパク質（例えば、ＮＯＶＸタンパク質とは異なり、かつ同一でかまたは異なる生物体に由来するタンパク質）に対応するアミノ酸配列を有するポリペプチドをいう。ＮＯＶＸ融合タンパク質において、このＮＯＶＸポリペプチドは、ＮＯＶＸタンパク質のすべてまたは一部分に対応し得る。１つの実施形態では、ＮＯＶＸ融合タンパク質は、ＮＯＶＸタンパク質の少なくとも１つの生物学的に活性な部分を含む。別の実施形態では、ＮＯＶＸ融合タンパク質は、ＮＯＶＸタンパク質の少なくとも２つの生物学的に活性な部分を含む。なお別の実施形態においてＮＯＶＸ融合タンパク質は、ＮＯＶＸタンパク質の少なくとも３つの生物学的に活性な部分を含む。融合タンパク質において、用語「作動可能に連結された」は、ＮＯＶＸポリペプチドおよび非ＮＯＶＸポリペプチドが、インフレームで互いに融合されていることを示すことが意図される。非ＮＯＶＸポリペプチドは、ＮＯＶＸポリペプチドのＮ末端またはＣ末端に融合され得る。
【０２３８】
１つの実施形態においては、この融合タンパク質は、ＧＳＴ−ＮＯＶＸ融合タンパク質であり、ここではＮＯＶＸ配列が、ＧＳＴ（グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ）配列のＣ末端に融合される。このような融合タンパク質は、組換えＮＯＶＸポリペプチドの精製を容易にし得る。
【０２３９】
別の実施形態において、この融合タンパク質は、そのＮ末端に異種シグナル配列を含むＮＯＶＸタンパク質である。特定の宿主細胞（例えば、哺乳動物宿主細胞）において、ＮＯＶＸの発現および／または分泌は、異種シグナル配列の使用を介して増加され得る。
【０２４０】
なお別の実施形態において、この融合タンパク質は、ＮＯＶＸ−免疫グロブリン融合タンパク質であり、ここで、ＮＯＶＸ配列が、免疫グロブリンタンパク質ファミリーのメンバーに由来する配列に融合される。本発明のこのＮＯＶＸ−免疫グロブリン融合タンパク質は、薬学的組成物中に取り込まれ、そして被験体に投与されて、細胞の表面上でＮＯＶＸリガントとＮＯＶＸタンパク質との間の相互作用を阻害し、それによってインビボのＮＯＶＸ媒介シグナル伝達を抑制し得る。このＮＯＶＸ−免疫グロブリン融合タンパク質を用い、ＮＯＶＸ同族リガンドの生体利用性に影響を与え得る。ＮＯＶＸリガンド／ＮＯＶＸ相互作用の阻害は、増殖障害および分化障害の両方の処置、および細胞生存を調節（例えば、促進または阻害）することに、治療的に有用であり得る。さらに、本発明のこのＮＯＶＸ−免疫グロブリン融合タンパク質は、被験体中で抗ＮＯＶＸ抗体を産生するための免疫原として用いられ得、ＮＯＶＸリガンドを精製し、そしてＮＯＶＸリガンドとのＮＯＶＸの相互作用を阻害する分子を同定するスクリーニングアッセイで用いられ得る。
【０２４１】
本発明のＮＯＶＸキメラまたは融合タンパク質は、標準的な組換えＤＮＡ技術により産生され得る。例えば、異なるポリペプチド配列をコードするＤＮＡフラグメントを、従来の技術に従って、例えば、連結のための平滑末端または付着（ｓｔａｇｇｅｒ）末端、適切な末端を提供するための制限酵素消化、必要に応じて粘着（ｃｏｈｅｓｉｖｅ）末端のフィルイン、所望しない連結を避けるためのアルカリホスファターゼ処理、および酵素的連結を採用することにより、インフレームで一緒に連結する。別の実施形態では、融合遺伝子を、自動化ＤＮＡ合成機を含む従来技術により合成し得る。あるいは、遺伝子フラグメントのＰＣＲ増幅を、２つの連続遺伝子フラグメント間の相補的オーバハングを生じるアンカープライマーを用いて実施し得、これを次にキメラ遺伝子配列を生成するためにアニールおよび再増幅し得る（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら（編）ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、１９９２を参照のこと）。さらに、融合成分（例えば、ＧＳＴポリペプチド）をすでにコードした多くの発現ベクターが市販されている。ＮＯＶＸをコードする核酸は、この融合成分がＮＯＶＸタンパク質にインフレーム連結されるように、このような発現ベクター中にクローニングされ得る。
【０２４２】
（ＮＯＶＸアゴニストおよびＮＯＶＸアンタゴニスト）
本発明はまた、ＮＯＶＸアゴニスト（すなわち、模倣物）として、またはＮＯＶＸアンタゴニストのいずれかとして、あるいはＮＯＶＸアゴニストとして機能するＮＯＶＸタンパク質の改変体に関する。ＮＯＶＸタンパク質の改変体（例えば、ＮＯＶＸタンパク質の離散した点変異または短縮）が、変異誘発により生成され得る。ＮＯＶＸタンパク質のアゴニストは、天然に存在する形態のＮＯＶＸタンパク質と実質的に同じ生物学的活性、またはその生物学的活性のサブセットを保持し得る。ＮＯＶＸタンパク質のアンタゴニストは、天然に存在する形態のＮＯＶＸタンパク質の１つ以上の活性を、例えば、ＮＯＶＸタンパク質を含む細胞シグナル伝達カスケードの下流または上流メンバーに競合的に結合することにより阻害し得る。従って、特定の生物学的効果が、限られた機能の改変体を用いた処理により惹起され得る。１つの実施形態では、このタンパク質の天然に存在する形態の生物学活性のサブセットを有する改変体を用いた被験体の処置は、ＮＯＶＸタンパク質の天然に存在する形態を用いた処置に対して被験体における副作用がさらに少ない。
【０２４３】
ＮＯＶＸアゴニスト（すなわち、模倣物）、またはＮＯＶＸアンタゴニストのいずれかとして機能するＮＯＶＸタンパク質の改変体は、ＮＯＶＸタンパク質アゴニストまたはアンタゴニスト活性についてＮＯＶＸタンパク質の変異体（例えば短縮型変異体）のコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングすることにより同定され得る。１つの実施形態では、ＮＯＶＸ改変体の多彩なライブラリーは、核酸レベルでのコンビナトリアル変異誘発により生成され、そして多彩な遺伝子ライブラリーによりコードされる。ＮＯＶＸ改変体の多彩なライブラリーは、例えば、潜在的なＮＯＶＸ配列の縮重セットが、個々のポリペプチドとして、あるいは、その中にＮＯＶＸ配列のセットを含む（例えば、ファージディスプレイのための）より大きな融合タンパク質のセットとして発現可能であるように、合成オリゴヌクレオチドの混合物を、遺伝子配列に酵素的に連結することによって、産生され得る。縮重オリゴヌクレオチド配列から潜在的なＮＯＶＸ改変体のライブラリーを産生するために用いられ得る種々の方法がある。縮重遺伝子配列の化学的合成は、自動化ＤＮＡ合成機中で実施され得、次いでこの合成遺伝子は、適切な発現ベクター中に連結される。遺伝子の縮重セットの使用は、１つの混合物において、潜在的なＮＯＶＸ配列の所望のセットをコードする配列のすべての供給を可能にする。縮重オリゴヌクレオチドを合成する方法は当該分野で周知である。例えば、Ｎａｒａｎｇ，１９８３．Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  ３９：３；Ｉｔａｋｕｒａら，１９８４．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５３：３２３；Ｉｔａｋｕｒａら，１９８４．Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９８：１０５６；Ｉｋｅら，１９８３．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１１：４７７を参照のこと。
【０２４４】
（ポリペプチドライブラリー）
さらに、ＮＯＶＸタンパク質コード配列のフラグメントのライブラリーを用いて、ＮＯＶＸタンパク質の改変体のスクリーニングおよび引き続く選択のためのＮＯＶＸフラグメントの多彩な集団を生成し得る。１つの実施形態では、コード配列フラグメントのライブラリーは、ＮＯＶＸコード配列の二本鎖ＰＣＲフラグメントを、１分子あたり約１つのみのニックが生じる条件下、ヌクレアーゼで処理すること、二本鎖ＤＮＡを変性させること、異なるニック産物からのセンス／アンチセンス対を含み得る二本鎖ＤＮＡを形成するためにこのＤＮＡを再生すること、Ｓ１ヌクレアーゼを用いた処理により再形成された二本鎖から一本鎖部分を除去すること、および得られるフラグメントライブラリーを発現ベクター中に連結することにより生成し得る。この方法によって、ＮＯＶＸタンパク質の種々のサイズのＮ末端および内部フラグメントをコードする発現ライブラリーが派生し得る。
【０２４５】
点変異または短縮により作成されたコンビナトリアルライブラリーの遺伝子産物をスクリーニングするため、および選択された性質を有する遺伝子産物のｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするための種々の技術が当該分野で公知である。このような技術を、ＮＯＶＸタンパク質のコンビナトリアル変異誘発により生成された遺伝子ライブラリーの迅速なスクリーニングに適用可能である。大きな遺伝子ライブラリーをスクリーニングするための、ハイスループット分析に適した最も広く用いられる技術は、代表的には、遺伝子ライブラリーを複製可能な発現ベクター中にクローニングすること、得られるベクターのライブラリーで適切な細胞を形質転換すること、およびこのコンビナトリアル遺伝子を、遺伝子（その産物が検出された）をコードするベクターの単離が、所望の活性の検出によって容易になる条件下で発現することを含む。ライブラリー中の機能的変異体の頻度を増大する新規技術であるリクルーシブアンセブル変異誘発（ｒｅｃｕｒｓｉｖｅ  ｅｎｓｅｍｂｌｅ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）（ＲＥＭ）を、スクリーニングアッセイと組み合わせて用い、ＮＯＶＸ改変体を同定し得る。例えば、ＡｒｋｉｎおよびＹｏｕｒｖａｎ，１９９２．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：７８１１−７８１５；Ｄｅｌｇｒａｖｅら，１９９３．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ６：３２７−３３１を参照のこと。
【０２４６】
（抗ＮＯＶＸ抗体）
本発明は、本発明のＮＯＶＸポリペプチドのいずれかに免疫特異的に結合する、Ｆａｂまたは（Ｆａｂ）２のような抗体および抗体フラグメントを包含する。
【０２４７】
単離されたＮＯＶＸタンパク質、またはその部分もしくはフラグメントは、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体調製のための標準的な技術を用いて、ＮＯＶＸポリペプチドに結合する抗体を産生するための免疫原として用いられ得る。完全長のＮＯＶＸタンパク質が用いられ得るか、あるいは、本発明は、免疫原としての使用のためのＮＯＶＸタンパク質の抗原性ペプチドフラグメントを提供する。ＮＯＶＸの抗原性ペプチドは、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、および３２で示されるアミノ酸配列の少なくとも４アミノ酸残基を含み、そしてこのペプチドに対して惹起された抗体がＮＯＶＸと特異的な免疫複合体を形成するように、ＮＯＶＸのエピトープを含む。好ましくは、この抗原性ペプチドは、少なくとも６、８、１０、１５、２０、または３０個のアミノ酸残基を含む。より長い抗原性ペプチドが、用途に依存して、そして当業者に周知の方法に従い、より短い抗原性ペプチドよりもしばしば好適である。
【０２４８】
本発明の特定の実施形態では、抗原性ペプチドに含まれる少なくとも１つのエピトープは、タンパク質の表面上に位置するＮＯＶＸの領域、例えば、親水性領域である。抗体産生を標的する手段として、親水性および疎水性の領域を示すヒドロパシープロットを、例えば、フーリエ変換を伴うかまたは伴わないかのいずれかの、Ｋｙｔｅ  ＤｏｏｌｉｔｔｌｅまたはＨｏｐｐ  Ｗｏｏｄｓ法を含む、当該分野で周知の任意の方法により生成し得る（例えば、各々がその全体において本明細書に参考として援用される、ＨｏｐｐおよびＷｏｏｄｓ、１９８１、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７８：３８２４−３８２８；ＫｙｔｅおよびＤｏｏｌｉｔｔｌｅ  １９８２、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５７：１０５−１４２を参照のこと）。
【０２４９】
本明細書で開示されるように、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２のＮＯＶＸタンパク質配列、またはその誘導体、フラグメント、アナログもしくはホモログを、これらのタンパク質成分に免疫特異的に結合する抗体の産生における免疫原として利用し得る。本明細書で用いる用語「抗体」は、免疫グロブリン分子、および免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分、すなわち、ＮＯＶＸのような抗原に特異的に結合（免疫反応）する抗原結合部位を含む分子をいう。このような抗体としては、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、単鎖抗体、ＦａｂフラグメントおよびＦ（ａｂ’）２フラグメント、ならびにＦａｂ発現ライブラリーが挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態では、ヒトＮＯＶＸタンパク質に対する抗体が開示される。当該分野で公知の種々の手順が、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２のＮＯＶＸタンパク質配列、またはその誘導体、フラグメント、アナログもしくはホモログに対するポリクローナルまたはモノクローナル抗体の産生のために用いられ得る。これらのタンパク質のいくつかを以下で論議する。
【０２５０】
ポリクローナル抗体の産生のために、種々の適切な宿主動物（例えば、ウサギ、ヤギ、マウスまたはその他の哺乳動物）が、ネイティプタンパク質、またはその合成改変体、または前述の誘導体での注射により免疫され得る。適切な免疫原性調製物は、例えば、組換えにより発現されたＮＯＶＸタンパク質または化学的に合成されたＮＯＶＸポリペプチドを含有し得る。この調製物は、アジュバントをさらに含み得る。免疫学的応答を増大するために用いられる種々のアジュバントとしては、フロイント（完全および不完全）アジュバント、ミネラルゲル（例えば、水酸化アルミニウム）、界面活性物質（例えば、リゾレシチン、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、オイルエマルジョン、ジニトロフェノールなど）、Ｂａｃｉｌｌｅ  Ｃａｌｍｅｔｔｅ−ＧｕｅｒｉｎおよびＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐａｒｖｕｍのようなヒトアジュバント、または類似の免疫刺激剤が挙げられるが、これらに限定されない。所望であれば、ＮＯＶＸに対する抗体分子は、哺乳動物（例えば、血液）から単離され、そしてさらに、ＩｇＧ画分を得るために、プロテインＡクロマトグラフィーのような、周知の技術により精製され得る。
【０２５１】
本明細書で用いられる用語「モノクローナル抗体」または「モノクローナル抗体組成物」は、ＮＯＶＸの特定のエピトープと免疫反応し得る、１種類のみの抗原結合部位を含む抗体分子の集団をいう。従って、代表的には、モノクローナル抗体組成物は、それと免疫反応する特定のＮＯＶＸタンパク質に対し、単一の結合親和性を示す。特定のＮＯＶＸタンパク質、またはその誘導体、フラグメント、アナログもしくはホモログに対するモノクローナル抗体の調製には、継続的な細胞株培養による抗体分子の産生を提供する任意の技術が利用され得る。このような技術としては、ハイブリドーマ技術（例えば、Ｋｏｈｌｅｒ＆Ｍｉｌｓｔｅｉｎ、１９７５  Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５−４９７を参照のこと）；トリオーマ（ｔｒｉｏｍａ）技術；ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（例えば、Ｋｏｚｂｏｒら、１９８３．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ  ４：７２）およびヒトモノクローナル抗体を産生するためのＥＢＶハイブリドーマ技術（例えば、Ｃｏｌｅら、１９８５．ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ  ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ  ＡＮＤ  ＣＡＮＣＥＲ  ＴＨＥＲＡＰＹ、Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．７７−９６頁を参照のこと）が挙げられるが、これらに限定されない。ヒトモノクローナル抗体は、本発明の実施において利用され得、そしてヒトハイブリドーマを用いることによって（例えば、Ｃｏｔｅら、１９８３．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８０：２０２６−２０３０を参照のこと）か、またはインビトロでヒトＢ細胞をエプスタイン−バーウイルスで形質転換することによって（例えば、Ｃｏｔｅら、１９８５  ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ  ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ  ＡＮＤ  ＣＡＮＣＥＲ  ＴＨＥＲＡＰＹ、Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．７７−９６頁を参照のこと）産生され得る。上記の引用の各々は、その全体において参考として本明細書に援用される。
【０２５２】
本発明によれば、技術は、ＮＯＶＸタンパク質に特異的な単鎖抗体の産生のために適合され得る（例えば、米国特許第４，９４６，７７８号を参照のこと）。さらに、方法は、Ｆａｂ発現ライブラリーの構築のために適合されて（例えば、Ｈｕｓｅら、１９８９  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４６：１２７５−１２８１を参照のこと）、ＮＯＶＸタンパク質、またはその誘導体、フラグメント、アナログもしくはホモログに対する所望の特異性を有するモノクローナルＦａｂフラグメントの迅速かつ有効な同定を可能にし得る。非ヒト抗体は、当該分野で周知の技術により「ヒト化」され得る。例えば、米国特許第５，２２５，５３９号を参照のこと。ＮＯＶＸタンパク質に対するイディオタイプを含む抗体フラグメントは、当該分野で公知の技術により産生され得、これらとしては：（ｉ）抗体分子のペプシン消化により産生されるＦ（ａｂ’）２フラグメント；（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２フラグメントのジスルフィド架橋を還元することにより産生されるＦａｂフラグメント；（ｉｉｉ）抗体分子のパパインおよび還元剤での処理により産生されるＦａｂフラグメント；ならびに（ｉｖ）Ｆｖフラグメントが挙げられるがこれらに限定されない。
【０２５３】
さらに、ヒトおよび非ヒト部分の両方を含むキメラ抗体およびヒト化モノクローナル抗体のような、組換え抗ＮＯＶＸ抗体（これらは、標準的な組換えＤＮＡ技術を用いて作製され得る）は、本発明の範囲内である。このようなキメラ抗体およびヒト化モノクローナル抗体は、当該分野で公知の組換えＤＮＡ技術により産生され得る。この技術は例えば、以下に記載の方法を用いる：国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ８６／０２２６９；欧州特許出願番号１８４，１８７；欧州特許出願番号１７１，４９６；欧州特許出願番号１７３，４９４；ＰＣＴ国際公開番号ＷＯ  ８６／０１５３３；米国特許第４，８１６，５６７号；米国特許第５，２２５，５３９号；欧州特許出願番号１２５，０２３；Ｂｅｔｔｅｒら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４０：１０４１〜１０４３；Ｌｉｕら（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８４：３４３９〜３４４３；Ｌｉｕら（１９８７）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３９：３５２１〜３５２６；Ｓｕｎら（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８４：２１４〜２１８；Ｎｉｓｈｉｍｕｒａら（１９８７）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．４７：９９９〜１００５；Ｗｏｏｄら（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ  ３１４：４４６〜４４９；Ｓｈａｗら（１９８８）Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．８０：１５５３〜１５５９）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９：１２０２〜１２０７；Ｏｉら（１９８６）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ４：２１４；Ｊｏｎｅｓら（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５５２〜５２５；Ｖｅｒｈｏｅｙａｎら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：１５３４；ならびにＢｅｉｄｌｅｒら（１９８８）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４１：４０５３〜４０６０。上記引用の各々は、それらの全体において参考として本明細書中に援用される。
【０２５４】
１つの実施形態において、所望の特異性を保有する抗体のスクリーニングのための方法としては、当該分野内で公知の酵素結合イムノソルベント検定法（ＥＬＩＳＡ）および他の免疫学的に媒介された技術が挙げられるがこれらに限定されない。特定の実施形態において、ＮＯＶＸタンパク質の特定のドメインに対して特異的である抗体の選択は、このようなドメインを所有しているＮＯＶＸタンパク質のフラグメントに結合するハイブリドーマの生成により容易にされる。従って、ＮＯＶＸタンパク質、またはそれらの誘導体、フラグメント、アナログもしくはホモログ内の所望のドメインについて特異的である抗体がまた、本明細書において提供される。
【０２５５】
抗ＮＯＶＸ抗体は、ＮＯＶＸタンパク質の局在化および／または定量化に関する当該分野で公知の方法において用いられ得る（例えば、適切な生理学的サンプル中のＮＯＶＸタンパク質のレベルを測定する使用のために、診断的方法における使用のために、タンパク質の画像化における使用のために、など）。所定の実施形態において、ＮＯＶＸタンパク質、またはそれらの誘導体、フラグメント、アナログもしくはホモログについての抗体（抗体由来の結合ドメインを含む）は、薬理学的に活性な化合物（本明細書中、以降において「治療剤」）として利用される。
【０２５６】
抗ＮＯＶＸ抗体（例えば、モノクローナル抗体）は、標準的技術（例えばアフィニティークロマトグラフィまたは免疫沈降）によって、ＮＯＶＸポリペプチドを単離するために用いられ得る。抗ＮＯＶＸ抗体は、細胞からの天然のＮＯＶＸポリペプチド、そして宿主細胞において発現される組換え的に産生されたＮＯＶＸポリペプチドの精製を容易にし得る。さらに、抗ＮＯＶＸ抗体が、（例えば、細胞の溶解産物または細胞上清における）ＮＯＶＸタンパク質を検出するために用いられて、ＮＯＶＸタンパク質の発現の量およびパターンを評価し得る。抗ＮＯＶＸ抗体は、例えば、所定の治療レジメンの有効性を決定するために、臨床試験の手順の一部として、組織におけるタンパク質レベルを診断的にモニターするために用いられ得る。検出は、抗体を検出可能物質に結合する（すなわち、物理的に連結する）ことにより容易にされ得る。検出可能物質の例としては、種々の酵素、補欠分子族、蛍光物質、発光物質、生物発光物質および放射性物質が挙げられる。適切な酵素の例としては、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼまたはアセチルコリンエステラーゼが挙げられる；適切な補欠分子族複合体の例としては、ストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチンが挙げられる；適切な蛍光物質の例としては、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミン（ｄｉｃｈｌｏｒｏｔｒｉａｚｉｎｙｌａｍｉｎｅ）フルオレセイン、ダンシルクロリドまたはフィコエリトリンが挙げられる；発光物質の例としては、ルミノールが挙げられる；生物発光物質の例としては、ルシフェラーゼ、ルシフェリンおよびエクオリンが挙げられる；そして、適切な放射性物質の例としては１２５Ｉ、１３１Ｉ、３５Ｓまたは３Ｈが挙げられる。
【０２５７】
（ＮＯＶＸ組換え発現ベクターおよび宿主細胞）
本発明の別の局面は、ＮＯＶＸタンパク質、またはその誘導体、フラグメント、アナログもしくはホモログをコードする核酸を含む、ベクター、好ましくは、発現ベクターに関する。本明細書において使用する場合、用語「ベクター」は、連結された別の核酸を輸送し得る核酸分子をいう。１つの型のベクターは、「プラスミド」である。これはさらなるＤＮＡセグメントが連結され得る環状の二本鎖ＤＮＡループをいう。別の型のベクターは、ウイルス性ベクターであり、ここでは、さらなるＤＮＡセグメントが、ウイルスゲノムに連結され得る。特定のベクターは、ベクターが導入される宿主細胞中で自律複製し得る（例えば、細菌性の複製起点を有する細菌ベクター、およびエピソーム性哺乳動物ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソーム性哺乳動物ベクター）は、宿主細胞への導入の際、宿主細胞のゲノムに組み込まれ、そして、これにより宿主ゲノムとともに複製される。さらに、特定のベクターは、それらが作動可能に連結される遺伝子の発現を指示し得る。このようなベクターは、本明細書において「発現ベクター」と呼ばれる。一般に、組換えＤＮＡ技術において有用な発現ベクターは、しばしばプラスミドの形態である。本明細書において、「プラスミド」および「ベクター」は、プラスミドが最も一般的に用いられる形態のベクターであるので、交換可能に使用され得る。しかし、本発明は、等価の機能を果たす、ウイルス性ベクター（例えば、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルス、およびアデノ随伴ウイルス）のような、このような他の形態の発現ベクターを含むことを意図する。
【０２５８】
本発明の組換え発現ベクターは、宿主細胞における核酸の発現に適切な形態の本発明の核酸を含む。これは、組換え発現ベクターが、発現されるべき核酸配列に作動可能に連結されている、発現に用いられる宿主細胞に基づいて選択された１つ以上の調節配列を含むことを意味する。組換え発現ベクターにおいて、「作動可能に連結する」とは、目的のヌクレオチド配列が、（例えば、インビトロの転写／翻訳系において、またはベクターが宿主細胞に導入される場合は、宿主細胞において）ヌクレオチド配列の発現を可能にする様式で調節配列に連結されることを意味することを意図する。
【０２５９】
用語「調節配列」は、プロモーター、エンハンサーおよび他の発現制御エレメント（例えば、ポリアデニル化シグナル）を含むことを意図する。このような調節配列は、例えば、Ｇｏｅｄｄｅｌ；ＧＥＮＥ  ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ：ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ  １８５、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．（１９９０）に記載されている。調節配列は、多くの型の宿主細胞においてヌクレオチド配列の構成的発現を指示する配列、および特定の宿主細胞のみにおいてヌクレオチド配列の発現を指示する配列（例えば、組織特異的調節配列）を含む。発現ベクターの設計が、形質転換される宿主細胞の選択、所望のタンパク質の発現のレベルなどのような因子に依存し得ることが当業者に理解される。本発明の発現ベクターは、宿主細胞に導入され得、それにより、本明細書に記載される核酸によってコードされるタンパク質またはペプチド（融合タンパク質またはペプチドを含む）（例えば、ＮＯＶＸタンパク質、ＮＯＶＸタンパク質の変異形態、融合タンパク質など）を産生し得る。
【０２６０】
本発明の組換え発現ベクターは、原核生物細胞または真核生物細胞における、ＮＯＶＸタンパク質発現のために設計され得る。例えば、ＮＯＶＸタンパク質は、細菌細胞（例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、昆虫細胞（バキュロウイルス発現ベクターを用いる）、酵母細胞または哺乳動物細胞において発現され得る。適切な宿主細胞は、Ｇｏｅｄｄｅｌ；ＧＥＮＥ  ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ：ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ  １８５、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．（１９９０）にさらに考察されている。あるいは、組換え型発現ベクターは、例えば、Ｔ７プロモーター調節配列およびＴ７ポリメラーゼを用いて、インビトロで転写および翻訳され得る。
【０２６１】
原核生物におけるタンパク質の発現は、最も頻繁には、融合タンパク質または非融合タンパク質のいずれかの発現を指示する、構成的プロモーターまたは誘導性プロモーターを含むベクターを有するＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉにおいて実施される。融合ベクターは、そこにコードされるタンパク質に、通常、組換えタンパク質のアミノ末端に、多数のアミノ酸を付加する。このような融合ベクターは、代表的には、以下の３つの目的のために役立つ：（ｉ）組換えタンパク質の発現を増加させるため；（ｉｉ）組換えタンパク質の可溶性を増加させるため；および（ｉｉｉ）アフィニティー精製においてリガンドとして作用することによって組換えタンパク質の精製の際に補助するため。しばしば、融合発現ベクターにおいて、タンパク質分解の切断部位が、融合部分と組換えタンパク質との結合部に導入されて、融合タンパク質の精製の後に融合部分から組換えタンパク質を分離することを可能とする。このような酵素、およびその同族（ｃｏｇｎａｔｅ）の認識配列は、第Ｘａ因子、トロンビン、およびエンテロキナーゼを含む。代表的な融合発現ベクターとしては、それぞれ、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトースＥ結合タンパク質、またはプロテインＡを標的の組換えタンパク質に融合する、ｐＧＥＸ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｉｎｃ．；ＳｍｉｔｈおよびＪｏｈｎｓｏｎ（１９８８）Ｇｅｎｅ  ６７：３１−４０）、ｐＭＡＬ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，Ｍａｓｓ．）およびｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎ．Ｊ．）が挙げられる。
【０２６２】
適切な誘導性非融合Ｅ．ｃｏｌｉ発現ベクターの例には、ｐＴｒｃ（Ａｍｒａｎｎら（１９８８）Ｇｅｎｅ  ６９：３０１−３１５）およびｐＥＴ  １１ｄ（Ｓｔｕｄｉｅｒら、ＧＥＮＥ  ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ：ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ  １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．（１９９０）６０−８９）が挙げられる。
【０２６３】
Ｅ．ｃｏｌｉにおける組換えタンパク質発現を最大化するための１つのストラテジーは、組換えタンパク質をタンパク質分解的に切断する能力を欠損した宿主細菌中でタンパク質を発現させることである。例えば、Ｇｏｔｔｅｓｍａｎ，ＧＥＮＥ  ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ：ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ  １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．（１９９０）１１９−１２８を参照のこと。別のストラテジーは、各アミノ酸についての個々のコドンが、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて優先的に利用されるコドンであるように、発現ベクターに挿入される核酸の核酸配列を変更することである（例えば、Ｗａｄａら（１９９２）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２０：２１１１−２１１８を参照のこと）。本発明の核酸配列のこのような変更は、標準的なＤＮＡ合成技術によって実行され得る。
【０２６４】
別の実施形態において、ＮＯＶＸ発現ベクターは、酵母発現ベクターである。酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｉｖｉｓａｅにおける発現のためのベクターの例には、ｐＹｅｐＳｅｃ１（Ｂａｌｄａｒｉら、（１９８７）ＥＭＢＯ  Ｊ．６：２２９−２３４）、ｐＭＦａ（ＫｕｒｊａｎおよびＨｅｒｓｋｏｗｉｔｚ、（１９８２）Ｃｅｌｌ  ３０：９３３−９４３）、ｐＪＲＹ８８（Ｓｃｈｕｌｔｚら、（１９８７）Ｇｅｎｅ  ５４：１１３−１２３）、ｐＹＥＳ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）、およびｐｉｃＺ（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）が挙げられる。
【０２６５】
あるいは、ＮＯＶＸは、バキュロウイルス発現ベクターを使用して、昆虫細胞中で発現され得る。培養昆虫細胞（例えば、ＳＦ９細胞）中でのタンパク質の発現のために利用可能なバキュロウイルスベクターには、ｐＡｃシリーズ（Ｓｍｉｔｈら（１９８３）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３：２１５６−２１６５）およびｐＶＬシリーズ（ＬｕｃｋｌｏｗおよびＳｕｍｍｅｒｓ（１９８９）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １７０：３１−３９）が挙げられる。
【０２６６】
なお別の実施形態において、本発明の核酸は、哺乳動物発現ベクターを使用して、哺乳動物細胞中で発現される。哺乳動物発現ベクターの例には、ｐＣＤＭ８（Ｓｅｅｄ（１９８７）Ｎａｔｕｒｅ  ３２９：８４０）およびｐＭＴ２ＰＣ（Ｋａｕｆｍａｎら（１９８７）ＥＭＢＯ  Ｊ．６：１８７−１９５）が挙げられる。哺乳動物細胞中で使用される場合、発現ベクターの制御機能は、しばしば、ウイルスの調節エレメントによって提供される。例えば、一般に使用されるプロモーターは、ポリオーマ、アデノウイルス２、サイトメガロウイルス、およびシミアンウイルス４０に由来する。原核生物細胞および真核生物細胞の両方のために適切な他の発現系については、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ．第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８９の第１６章および第１７章を参照のこと。
【０２６７】
別の実施形態において、組換え哺乳動物発現ベクターは、特定の細胞型（例えば、組織特異的調節エレメントを使用して核酸を発現する）中で優先的に核酸の発現を指示し得る。組織特異的調節エレメントは、当該分野で公知である。適切な組織特異的なプロモーターの非限定的な例には、アルブミンプロモーター（肝臓特異的；Ｐｉｎｋｅｒｔら（１９８７）Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１：２６８−２７７）、リンパ特異的プロモーター（ＣａｌａｍｅおよびＥａｔｏｎ（１９８８）Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４３：２３５−２７５）、Ｔ細胞レセプターの特定のプロモーターにおいて（ＷｉｎｏｔｏおよびＢａｌｔｉｍｏｒｅ（１９８９）ＥＭＢＯ  Ｊ．８：７２９−７３３）および免疫グロブリンの特定のプロモーターにおいて（Ｂａｎｅｒｊｉら（１９８３）Ｃｅｌｌ  ３３：７２９−７４０；ＱｕｅｅｎおよびＢａｌｔｉｍｏｒｅ（１９８３）Ｃｅｌｌ  ３３：７４１−７４８）、ニューロン特異的プロモーター（例えば、神経フィラメントプロモーター；ＢｙｒｎｅおよびＲｕｄｄｌｅ（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：５４７３−５４７７）、膵臓特異的プロモーター（Ｅｄｌｕｎｄら（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３０：９１２−９１６）、ならびに乳腺特異的プロモーター（例えば、乳清プロモーター；米国特許第４，８７３，３１６号および欧州出願公開第２６４，１６６号）が挙げられる。発達的に調節されるプロモーターもまた含まれる（例えば、マウスｈｏｘプロモーター（ＫｅｓｓｅｌおよびＧｒｕｓｓ（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：３７４−３７９）およびα−フェトプロテインプロモーター（ＣａｍｐｅｓおよびＴｉｌｇｈｍａｎ（１９８９）Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．３：５３７−５４６））。
【０２６８】
本発明はさらに、アンチセンス方向で発現ベクターにクローニングされた本発明のＤＮＡ分子を含む組換え発現ベクターを提供する。すなわち、そのＤＮＡ分子は、ＮＯＶＸ  ｍＲＮＡに対してアンチセンスであるＲＮＡ分子の発現（ＤＮＡ分子の転写によって）を可能にする様式で調節配列に作動可能に連結される。種々の細胞型においてアンチセンスＲＮＡ分子の持続的な発現を指示する、アンチセンス方向でクローニングされた核酸に作動可能に連結された調節配列（例えば、ウイルスプロモーターおよび／もしくはエンハンサー）が選択され得るか、または、アンチセンスＲＮＡの構成的発現、組織特異的発現、または細胞型特異的発現を指示する調節配列が、選択され得る。アンチセンス発現ベクターは、組換えプラスミド、ファージミド、または弱毒化されたウイルスの形態であり得、ここではアンチセンス核酸は、高効率調節領域の制御下で産生され、その活性は、ベクターが導入される細胞型によって決定され得る。アンチセンス遺伝子を使用する遺伝子発現の調節の考察については、例えば、Ｗｅｉｎｔｒａｕｂら、「Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ＲＮＡ  ａｓ  ａ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｔｏｏｌ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ａｎａｌｙｓｉｓ」、Ｒｅｖｉｅｗｓ−Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、第１巻（１）１９８６を参照のこと。
【０２６９】
本発明の別の局面は、本発明の組換え発現べクターが導入された宿主細胞に関する。用語「宿主細胞」および「組換え宿主細胞」は、本明細書中で、交換可能に使用される。このような用語は、特定の被験細胞をいうのみでなく、そのような細胞の子孫または潜在的な子孫をもいうことが理解される。変異または環境の影響のいずれかに起因して、特定の改変は次の世代において生じ得るので、このような子孫は、実際には、親の細胞と同一でないかもしれないが、なお、本明細書中で使用される場合のこの用語の範囲内に含まれる。
【０２７０】
宿主細胞は、任意の原核生物細胞または真核生物細胞であり得る。例えば、ＮＯＶＸタンパク質は、細菌細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）、昆虫細胞、酵母または哺乳動物細胞（例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）またはＣＯＳ細胞）において発現され得る。他の適切な宿主細胞は、当業者に公知である。
【０２７１】
ベクターＤＮＡは、従来の形質転換またはトランスフェクション技術を介して原核生物細胞または真核生物細胞に導入され得る。本明細書中で使用される場合、用語「形質転換」および「トランスフェクション」とは、外来性の核酸（例えば、ＤＮＡ）を宿主細胞に導入するために当該分野で容認されている種々の技術をいうことを意図し、これらには、リン酸カルシウムまたは塩化カルシウム共沈、ＤＥＡＥデキストラン媒介トランスフェクション、リポフェクション、またはエレクトロポレーションが含まれる。宿主細胞を形質転換またはトランスフェクションするための適切な方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ．第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８９）および他の実験室マニュアルに見出され得る。
【０２７２】
安定な哺乳動物細胞のトランスフェクションのために、使用される発現ベクターおよびトランスフェクション技術に依存して、細胞のほんの一部のみが外来ＤＮＡをそのゲノムに組み込み得ることが知られている。これらの要素を同定および選択するために、選択マーカー（例えば、抗生物質に対する耐性）をコードする遺伝子が、一般的には目的の遺伝子とともに宿主細胞に導入される。種々の選択マーカーには、薬物（例えば、Ｇ４１８、ハイグロマイシン、およびメトトレキサート）に対する耐性を付与するものが含まれる。選択マーカーをコードする核酸は、ＮＯＶＸをコードするベクターと同じベクター上で宿主細胞に導入され得るか、あるいは別々のベクター上で導入され得る。導入された核酸で安定にトランスフェクトされた細胞は、薬物選択によって同定され得る（例えば、選択マーカー遺伝子を取り込んだ細胞は生存するが、他の細胞は死滅する）。
【０２７３】
本発明の宿主細胞（例えば、培養中の原核生物宿主細胞および真核生物宿主細胞）は、ＮＯＶＸタンパク質を産生（すなわち、発現）するために使用され得る。従って、本発明はさらに、本発明の宿主細胞を使用して、ＮＯＶＸタンパク質を産生するための方法を提供する。１つの実施形態において、本発明の方法は、ＮＯＶＸタンパク質が産生されるような適切な培地中で、本発明の宿主細胞（ここに、ＮＯＶＸタンパク質をコードする組換え発現ベクターが導入されている）を培養する工程を包含する。別の実施形態において、本発明はさらに、培地または宿主細胞からＮＯＶＸタンパク質を単離する工程を包含する。
【０２７４】
（トランスジェニックＮＯＶＸ動物）
本発明の宿主細胞はまた、非ヒトトランスジェニック動物を作製するために使用され得る。例えば、１つの実施形態において、本発明の宿主細胞は、ＮＯＶＸタンパク質コード配列が導入された、受精卵母細胞または胚性幹細胞である。次いで、このような宿主細胞は、外因性のＮＯＶＸ配列がゲノムに導入された非ヒトトランスジェニック動物、または内因性のＮＯＶＸ配列が変更された相同組換え動物を作製するために使用され得る。このような動物は、ＮＯＶＸタンパク質の機能および／または活性を研究するため、ならびにＮＯＶＸタンパク質活性のモジュレーターを同定および／または評価するために有用である。本明細書中で使用される場合、「トランスジェニック動物」とは、非ヒト動物であり、好ましくは哺乳動物であり、より好ましくは、ラットまたはマウスのような齧歯類であり、ここで、その動物の１つ以上の細胞が、導入遺伝子を含む。トランスジェニック動物の他の例としては、非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ウシ、ヤギ、ニワトリ、両生類などが挙げられる。導入遺伝子は、細胞（この細胞からトランスジェニック動物を発生させた）のゲノムに組み込まれかつ成熟動物のゲノムに残存し、それによって、トランスジェニック動物の１つ以上の細胞型または組織においてコードされた遺伝子産物の発現を指示する、外因性のＤＮＡである。本明細書中で使用される場合、「相同（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ）組換え動物」とは、非ヒト動物であり、好ましくは哺乳動物であり、より好ましくはマウスであり、ここで内因性のＮＯＶＸ遺伝子は、内因性の遺伝子と、その動物の発生の前にその動物の細胞（例えば、その動物の胚細胞）に導入された外因性のＤＮＡ分子との間の相同組換えによって変更されている。
【０２７５】
本発明のトランスジェニック動物は、ＮＯＶＸをコードする核酸を、例えば、マイクロインジェクション、レトロウイルス感染によって、受精卵母細胞の雄性前核に導入すること、およびその卵母細胞を偽妊娠雌性養育動物（ｆｏｓｔｅｒ  ａｎｉｍａｌ）中で発達させることを可能にすることによって作製され得る。配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、および３１のヒトのＮＯＶＸ  ｃＤＮＡ配列は、非ヒト動物のゲノムに導入遺伝子として導入され得る。あるいは、ヒトのＮＯＶＸ遺伝子の非ヒトホモログ（例えば、マウスのＮＯＶＸ遺伝子）は、ヒトのＮＯＶＸ  ｃＤＮＡ（上記にさらに記載された）に対するハイブリダイゼーションに基づいて単離され得、そして導入遺伝子として使用され得る。イントロン配列およびポリアデニル化シグナルもまた導入遺伝子中に含まれ得、その導入遺伝子の発現の効率を増大させ得る。組織特異的調節配列（単数または複数）は、特定の細胞に対して、ＮＯＶＸタンパク質の発現を指示するように、ＮＯＶＸ導入遺伝子に作動可能に連結され得る。胚の操作およびマイクロインジェクションを介するトランスジェニック動物（特に、マウスのような動物）を作製するための方法は、当該分野で慣習的になっており、そして例えば、米国特許第４，７３６，８６６号；同第４，８７０，００９号；および同第４，８７３，１９１号；ならびにＨｏｇａｎ  １９８６、ＭＡＮＩＰＵＬＡＴＩＮＧ  ＴＨＥ  ＭＯＵＳＥ  ＥＭＢＲＹＯ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．に記載されている。同様の方法が、他のトランスジェニック動物の作製のために使用される。トランスジェニック創始（ｆｏｕｎｄｅｒ）動物は、そのゲノムにおけるＮＯＶＸ導入遺伝子の存在および／またはその動物の組織もしくは細胞中のＮＯＶＸ  ｍＲＮＡの発現に基づいて同定され得る。次いで、トランスジェニック創始動物は、導入遺伝子を有するさらなる動物を育種するために使用され得る。さらに、ＮＯＶＸタンパク質をコードする導入遺伝子を有するトランスジェニック動物は、さらに、他の導入遺伝子を有する他のトランスジェニック動物に交雑され得る。
【０２７６】
相同組換え動物を作製するために、ＮＯＶＸ遺伝子の少なくとも一部を含むベクターを調製する。ここで、この遺伝子には、欠失、付加、または置換が導入され、それによってそのＮＯＶＸ遺伝子が変更されている（例えば、機能的に破壊されている）。ＮＯＶＸ遺伝子は、ヒト遺伝子（例えば、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、および３１のｃＤＮＡ）であり得るが、より好ましくは、ヒトのＮＯＶＸ遺伝子の非ヒトホモログである。例えば、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、および３１のヒトのＮＯＶＸ遺伝子のマウスホモログは、マウスゲノムにおける内因性のＮＯＶＸ遺伝子を変更するのに適切な相同組換えベクターを構築するために使用され得る。１つの実施形態において、そのベクターは、相同組換えに際して、その内因性のＮＯＶＸ遺伝子が、機能的に破壊されるように設計される（すなわち、機能的タンパク質をもはやコードしない；「ノックアウト」ベクターともいわれる）。
【０２７７】
あるいは、このベクターは、相同組換えに際して、内因性ＮＯＶＸ遺伝子が変異されるか、あるいはさもなければ、変更されるが、なお機能性タンパク質をコードするように、設計され得る（例えば、上流の調節領域が変更され、それによって内因性ＮＯＶＸタンパク質の発現を変更し得る）。相同組換えベクターにおいて、ＮＯＶＸ遺伝子の変更された部分は、ＮＯＶＸ遺伝子のさらなる核酸によって、その５’末端および３’末端で隣接されることにより、相同組換えが、ベクターによって保有される外因性ＮＯＶＸ遺伝子と胚性幹細胞中の内因性ＮＯＶＸ遺伝子との間で起こることを可能にする。さらなる隣接するＮＯＶＸ核酸は、内因性遺伝子との首尾よい相同組換えのために十分な長さである。典型的に、数キロベースの隣接ＤＮＡ（５’末端および３’末端の両方における）が、ベクターに含まれる。例えば、相同組換えベクターの説明について、Ｔｈｏｍａｓら（１９８７）Ｃｅｌｌ  ５１：５０３を参照のこと。次いで、このベクターは、（例えば、エレクトロポレーションによって）胚性幹細胞株に導入され、そして導入されたＮＯＶＸ遺伝子が内因性ＮＯＶＸ遺伝子と相同組換えした細胞が、選択される（例えば、Ｌｉら（１９９２）Ｃｅｌｌ  ６９：９１５を参照のこと）。
【０２７８】
次いで、選択された細胞が、動物（例えば、マウス）の未分化胚芽細胞へ注入され、凝集キメラを形成する。例えば、Ｂｒａｄｌｅｙ（１９８７）のＴｅｒａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａｓ  ａｎｄ  Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ、Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ編、ＩＲＬ、Ｏｘｆｏｒｄ、１１３頁〜１５２頁を参照のこと。次いで、キメラ胚が、適切な偽妊娠雌性養育動物に移植され得、そしてその胚は分娩に到る。その生殖細胞中に相同組換えされたＤＮＡを保有する子孫が、動物を育種するために使用され得、ここでこの動物の全ての細胞は、導入遺伝子の生殖系列伝達によって、相同組換えされたＤＮＡを含む。相同組換えベクターおよび相同組換え動物を構築するための方法が、さらに以下に記載される；Ｂｒａｄｌｅｙ（１９９１）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２：８２３−８２９；ＰＣＴ国際公開番号：ＷＯ９０／１１３５４；ＷＯ９１／０１１４０；ＷＯ９２／０９６８；およびＷＯ９３／０４１６９。
【０２７９】
別の実施形態において、導入遺伝子の調節された発現を可能にする選択された系を含む非ヒトトランスジェニック動物が産生され得る。このような系の１つの例は、バクテリオファージＰ１のｃｒｅ／ｌｏｘＰリコンビナーゼ系である。ｃｒｅ／ｌｏｘＰリコンビナーゼ系の説明については、例えば、Ｌａｋｓｏら（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：６２３２−６２３６を参照のこと。リコンビナーゼ系の別の例は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＦＬＰリコンビナーゼ系である（Ｏ’Ｇｏｒｍａｎら（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５１：１３５１−１３５５を参照のこと）。ｃｒｅ／ｌｏｘＰリコンビナーゼ系が導入遺伝子の発現を調節するために使用される場合、Ｃｒｅリコンビナーゼおよび選択されたタンパク質の両方をコードする導入遺伝子を含む動物が必要となる。このような動物は、例えば、２つのトランスジェニック動物（一方は選択されたタンパク質をコードした導入遺伝子を含み、他方はリコンビナーゼをコードした導入遺伝子を含む）を交配することによる「二重の」トランスジェニック動物の構築によって提供され得る。
【０２８０】
本明細書中に記載される非ヒトトランスジェニック動物のクローンがまた、Ｗｉｌｍｕｔら（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ  ３８５：８１０−８１３に記載される方法に従って、産生され得る。簡単には、トランスジェニック動物からの細胞（例えば、体細胞）が単離され得、そして増殖サイクル（ｇｒｏｗｔｈ  ｃｙｃｌｅ）から出て、Ｇ０期に入るように誘導され得る。次いで、静止性細胞が、例えば、電気パルスの使用により、その静止性細胞が単離されたのと同種の動物から摘出された卵母細胞へ融合され得る。次いで、この再構築された卵母細胞は培養され、これにより、これは桑実胚または未分化胚芽細胞に発達し、次いで、偽妊娠雌性養育動物に移される。この雌性養育動物から産まれた子孫は、その細胞（例えば、その体細胞）が単離された動物のクローンである。
【０２８１】
（薬学的組成物）
本発明のＮＯＶＸ核酸分子、ＮＯＶＸタンパク質、および抗ＮＯＶＸ抗体（これはまた、本明細書中で、「活性化合物」とも呼ばれる）、ならびにそれらの誘導体、フラグメント、アナログ、およびホモログが、投与に適した薬学的組成物に組み込まれ得る。このような組成物は、典型的に、核酸分子、タンパク質または抗体、および薬学的に受容可能なキャリアを含む。本明細書中で使用される場合、「薬学的に受容可能なキャリア」は、薬学的な投与に適合性の任意のおよび全ての溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤（ｄｅｌａｙｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）などを含むことが意図される。適切なキャリアは、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（当該分野の標準的参考文献であって、本明細書中に参考として援用される）の最新版に記載される。このようなキャリアまたは希釈剤の好ましい例としては、水、生理食塩水、リンガー（ｆｉｎｇｅｒ）溶液、デキストロース溶液、および５％ヒト血清アルブミンが挙げられるが、これらに限定されない。リポソームおよび非水性ビヒクル（例えば、不揮発性油）もまた、使用され得る。薬学的に活性な物質に対するこのような媒体および薬剤の使用は、当該分野で周知である。任意の従来の媒体または薬剤が活性化合物と不適合である場合を除いて、組成物におけるその使用が意図される。補助的な活性化合物もまた、組成物へ組み込まれ得る。
【０２８２】
本発明の薬学的組成物は、その意図される投与経路と適合性であるように処方される。投与経路の例には、非経口（例えば、静脈内、皮内、皮下）投与、経口（例えば、吸入）投与、経皮（すなわち、局所的）投与、経粘膜（ｔｒａｎｓｍｕｃｏｓａｌ）投与、および直腸投与が挙げられる。非経口適用、皮内適用または皮下適用のために使用される溶液または懸濁液は、以下の成分を含み得る：注射用水、生理食塩水溶液、不揮発性油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の合成溶媒のような、滅菌希釈剤；ベンジルアルコールまたはメチルパラベンのような、抗菌剤；アスコルビン酸または重亜硫酸ナトリウムのような、抗酸化剤；エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）のような、キレート剤；酢酸塩、クエン酸塩またはリン酸塩のような緩衝液、および塩化ナトリウムまたはデキストロースのような、張度の調整のための薬剤。ｐＨは、塩酸または水酸化ナトリウムのような酸または塩基で調整され得る。非経口調製物は、ガラスまたはプラスチック製のアンプル、使い捨てシリンジ、または多用量のバイアル中に入れられ得る。
【０２８３】
注入用途に適した薬学的組成物は、滅菌水溶液（ここでは、水溶性）または分散物、および滅菌注入可能溶液または分散物の即座の調製のための滅菌粉末を含む。静脈内投与において、適切なキャリアには、生理食塩水、静菌水、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ  ＥＬＴＭ（ＢＡＳＦ、Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ、Ｎ．Ｊ．）またはリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）が挙げられる。全ての場合において、組成物は、無菌でなければならず、そして容易な注入性（ｓｙｒｉｎｇｅａｂｉｌｉｔｙ）が存在する程度に流動性であるべきである。これは、製造および保存の条件下で安定でなければならず、そして、細菌および真菌のような微生物の汚染行為に対して保護されなければならない。このキャリアは、例えば、以下を含む溶媒または分散媒であり得る：水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）ならびにそれらの適切な混合物。適切な流動性が、例えば、レシチンのようなコーティングの使用によって、分散物の場合には、要求される粒子サイズを維持することによって、および界面活性剤を使用することによって維持され得る。微生物の作用の防止は、種々の抗菌剤および抗真菌剤（例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなど）によって達成され得る。多くの場合、組成物中に等張剤（例えば、糖、ポリアルコール（例えば、マンニトール（ｍａｎｉｔｏｌ）、ソルビトール）、塩化ナトリウム）を含むことが好ましい。注入可能組成物の吸収期間の延長は、組成物に吸収を遅延させる薬剤（例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチン）を含ませることによってもたらされ得る。
【０２８４】
滅菌注射可能溶液は、必要量のこの活性化合物（例えば、ＮＯＶＸタンパク質または抗ＮＯＶＸ抗体）を、適切な溶媒中で、上記で列挙される成分の１つまたは組み合わせと共に組み込み、必要な場合、続いて濾過滅菌することによって調製され得る。一般的に、分散物は、活性化合物を、基本（ｂａｓｉｃ）の分散媒と上記で列挙される成分から必要とされる他の成分とを含む滅菌ビヒクル中へ組み込むことによって調製される。滅菌注射可能液剤の調製のための滅菌粉末の場合において、調製方法は、真空乾燥および凍結乾燥であり、これにより、予め滅菌濾過されたその溶液から活性成分および任意のさらなる所望の成分の粉末を得る。
【０２８５】
経口組成物は、一般的に、不活性希釈剤または食用キャリアを含む。これらは、ゼラチンカプセルに封入され得るか、または錠剤へと圧縮され得る。経口治療投与の目的のために、この活性化合物は、賦形剤とともに組み込まれ得、そして錠剤、トローチ剤、またはカプセル剤の形態で使用され得る。経口組成物はまた、うがい薬としての使用のために流体キャリアを使用して調製され得、ここで、この流体キャリア中のこの化合物は、経口的に適用され、そして音を立てられ（ｓｗｉｓｈ）、そして吐き出されるか、または飲み込まれる。薬学的に適合性の結合剤、および／またはアジュバント物質が、この組成物の一部として含まれ得る。錠剤、丸剤、カプセル剤、トローチ剤などが、任意の以下の成分または同様の性質を有する化合物を含み得る：結合剤（例えば、微結晶セルロース、ガムトラガントまたはゼラチン）；賦形剤（例えば、デンプンまたはラクトース）、崩壊剤（例えば、アルギン酸、プリモゲル（Ｐｒｉｍｏｇｅｌ）、またはコーンスターチ）；滑沢剤（例えば、ステアリン酸マグネシウムまたはステロテス（Ｓｔｅｒｏｔｅｓ））；潤滑剤（ｇｌｉｄａｎｔ）（例えば、コロイド状二酸化ケイ素）；甘味剤（例えば、スクロースまたはサッカリン）；あるいは香味剤（例えば、ペパーミント、サリチル酸メチル、またはオレンジフレーバー）。
【０２８６】
吸入による投与について、この化合物は、適切な噴霧剤（例えば、二酸化炭素のような気体）を含む圧縮容器またはディスペンサー、あるいは噴霧器から、エアロゾル噴霧の形態で送達される。
【０２８７】
全身的投与はまた、経粘膜手段または経皮手段により得る。経粘膜投与または経皮投与について、浸透される障壁に適切な浸透剤が、処方物において使用される。このような浸透剤は、一般的に、当該分野で公知であり、そして、例えば、経粘膜投与については、界面活性剤、胆汁酸塩、およびフシジン酸誘導体が挙げられる。経粘膜投与は、鼻噴霧または坐剤の使用によって達成され得る。経皮投与については、この活性化合物は、当該分野で一般的に公知である軟膏剤（ｏｉｎｔｍｅｎｔ）、軟膏（ｓａｌｖｅ）、ゲル、またはクリーム剤へ処方される。
【０２８８】
この化合物はまた、直腸送達のための坐剤（例えば、ココアバターおよび他のグリセリドのような従来の坐剤基剤と共に）または貯留（ｒｅｎｔｅｎｔｉｏｎ）浣腸の形態で調製され得る。
【０２８９】
１つの実施形態において、この活性化合物は、身体からの迅速な排出に対してこの化合物を保護するキャリアを用いて調製され（例えば、制御放出処方物）、これには、移植片およびマイクロカプセル化された送達系が挙げられる。酢酸エチレンビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸のような、生分解性、生体適合性ポリマーが使用され得る。このような処方物の調製のための方法は、当業者には明らかである。これらの物質はまた、Ａｌｚａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｎｏｖａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．から商業的に入手され得る。リポソーム懸濁物（ウイルス抗原に対するモノクローナル抗体を感染させた細胞へ標的化されるリポソームを含む）もまた、薬学的に受容可能なキャリアとして使用され得る。これらは、例えば米国特許第４，５２２，８１１号に記載されるような、当業者に公知の方法に従って調製され得る。
【０２９０】
投与の容易さおよび投薬量の均一性のために、投薬単位形態で、経口組成物または非経口組成物を処方することが、特に有益である。本明細書で使用される投薬単位形態は、処置される被験体に対する単位投薬量として適切な物理的に個々の単位をいい；各単位は、必要とされる薬学的キャリアと関連して所望の治療的効果を生じるように計算された、所定量の活性化合物を含む。本発明の投薬単位形態についての詳細は、この活性化合物の固有の特徴、および達成される特定の治療効果、ならびに個体の処置のためのこのような活性化合物を調合する分野に固有の制限によって決定されるか、あるいはこれらに直接依存する。
【０２９１】
本発明の核酸分子は、ベクターに挿入され得、そして遺伝子治療ベクターとして使用され得る。遺伝子治療ベクターは、被験体へ、例えば静脈内注射、局所投与（米国特許第５，３２８，４７０号を参照のこと）によって、または定位注射（例えば、Ｃｈｅｎら（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：３０５４−３０５７を参照のこと）によって送達され得る。遺伝子治療ベクターの薬学的調製物には、受容可能な希釈剤中の遺伝子治療ベクターが挙げられ得るか、または遺伝子送達ビヒクルが組み込まれる除放性マトリックスが挙げられ得る。あるいは、完全な遺伝子送達ベクターが組換え細胞からインタクトで産生され得（例えば、レトロウイルスベクター）、薬学的調製物は、遺伝子送達系を産生する１以上の細胞を含み得る。
【０２９２】
薬学的組成物は、投与のための使用説明書と共に、容器、包装、またはディスペンサーに含まれ得る。
【０２９３】
（スクリーニングおよび検出の方法）
本発明の単離された核酸分子は、以下にさらに説明されるように、ＮＯＶＸタンパク質（例えば、遺伝子治療適用における宿主細胞中の組換え発現ベクターを介する）を発現するため、ＮＯＶＸ  ｍＲＮＡ（例えば、生物学的サンプルにおいて）またはＮＯＶＸ遺伝子における遺伝子損傷を検出するため、ならびにＮＯＶＸ活性を調節するために使用され得る。さらに、ＮＯＶＸタンパク質は、ＮＯＶＸタンパク質の活性または発現を調節する薬物または化合物をスクリーニングするために、ならびにＮＯＶＸタンパク質の不十分もしくは過剰な産生によって、あるいはＮＯＶＸ野生型タンパク質と比較して減少した活性もしくは異常な活性を有するＮＯＶＸタンパク質形態の産生によって特徴付けられる障害（例えば、発達障害、内分泌障害、脈管障害、感染症、食欲不振、癌、神経変性障害、肺障害、生殖障害、アルツハイマー病、パーキンソン病、免疫障害、および造血障害、または細胞シグナルプロセシングおよび代謝経路の調節に関連する他の障害、および種々の癌、ならびに感染症（抗菌活性を有する））を処置するために使用され得る。さらに、本発明の抗ＮＯＶＸ抗体が、ＮＯＶＸタンパク質を検出および単離するため、ならびにＮＯＶＸ活性を調節するために使用され得る。さらなる局面において、本発明を、正の様式および負の様式の両方で、食欲、栄養吸収、および代謝物の廃棄に影響する方法で用い得る。
【０２９４】
本発明は、さらに、本明細書中に記載のスクリーニングアッセイによって同定される新規の薬剤、および上記で本明細書中で記載されるような処置のためのそれらの使用に関する。
【０２９５】
（スクリーニングアッセイ）
本発明は、調節因子、すなわち、ＮＯＶＸタンパク質に結合するか、あるいは例えば、ＮＯＶＸタンパク質の発現またはＮＯＶＸタンパク質の活性に対して刺激効果または阻害効果を有する、候補または試験化合物または薬剤（例えば、ペプチド、ペプチド模倣物、低分子または他の薬物）を同定するための方法（本明細書中において「スクリーニングアッセイ」とも称される）を提供する。本発明はまた、本明細書中に記載のスクリーニングアッセイにおいて同定された化合物を含む。
【０２９６】
１実施形態において、本発明は、ＮＯＶＸタンパク質またはポリペプチド、あるいはその生物学的に活性な部分の膜結合形態に結合するか、またはその膜結合形態の活性を調節する、候補化合物もしくは試験化合物をスクリーニングするためのアッセイを提供する。本発明の試験化合物は、当該分野において公知のコンビナトリアルライブラリー法における多数のアプローチのいずれかを使用して得られ得、これには、以下が挙げられる：生物学的ライブラリー；空間的に位置付け可能な並行固相もしくは溶液相ライブラリー；デコンボリューションを要する合成ライブラリー法；「１ビーズ１化合物」ライブラリー法；およびアフィニティークロマトグラフィー選択を使用する合成ライブラリー法。生物学的ライブラリーアプローチはペプチドライブラリーに限定されるが、他の４つのアプローチは、ペプチド、非ペプチドオリゴマーもしくは化合物の低分子ライブラリーに適用可能である（例えば、Ｌａｍ（１９９７）Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ  １２：１４５を参照のこと）。
【０２９７】
本明細書中で使用される場合、「低分子」とは、約５ｋＤ未満の分子量、最も好ましくは約４ｋＤ未満の分子量を有する組成物をいうように意味される。低分子は、例えば、核酸、ペプチド、ポリペプチド、ペプチド模倣体、炭水化物、脂質または他の有機分子もしくは無機分子であり得る。化学的および／または生物学的混合物（例えば、真菌、細菌または藻類抽出物）のライブラリーは、当該分野で公知であり、そして本発明のアッセイのいずれかを用いてスクリーニングされ得る。
【０２９８】
分子ライブラリーの合成のための方法の例は、当該分野において、例えば以下に見出され得る：ＤｅＷｉｔｔら（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９０：６９０９；Ｅｒｂら（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９１：１１４２２；Ｚｕｃｋｅｒｍａｎｎら（１９９４）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３７：２６７８；Ｃｈｏら（１９９３）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６１：１３０３；Ｃａｒｒｅｌｌら（１９９４）Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３３：２０５９；Ｃａｒｅｌｌら（１９９４）Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３３：２０６１；およびＧａｌｌｏｐら（１９９４）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３７：１２３３。
【０２９９】
化合物のライブラリーは、溶液中で（例えば、Ｈｏｕｇｈｔｅｎ（１９９２）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １３：４１２〜４２１）、あるいはビーズ上（Ｌａｍ（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ  ３５４：８２〜８４）、チップ上（Ｆｏｄｏｒ（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ  ３６４：５５５〜５５６）、細菌（Ｌａｄｎｅｒ  米国特許第５，２２３，４０９号）、胞子（Ｌａｄｎｅｒ  米国特許第５，２３３，４０９号）、プラスミド（Ｃｕｌｌら（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：１８６５〜１８６９）またはファージ上（ＳｃｏｔｔおよびＳｍｉｔｈ（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：３８６〜３９０；Ｄｅｖｌｉｎ（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：４０４〜４０６；Ｃｗｉｒｌａら（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８７：６３７８〜６３８２；Ｆｅｌｉｃｉ（１９９１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：３０１〜３１０；Ｌａｄｎｅｒ、米国特許第５，２３３，４０９号）において提示され得る。
【０３００】
１つの実施形態において、アッセイは細胞ベースのアッセイであり、ここで、膜結合形態のＮＯＶＸタンパク質、またはその生物学的に活性な部分を細胞表面上に発現する細胞が、試験化合物と接触され、そしてこの試験化合物が、ＮＯＶＸタンパク質に結合する能力が、決定される。例えば、細胞は、哺乳動物起源または酵母細胞であり得る。この試験化合物がＮＯＶＸタンパク質に結合する能力の決定は、例えば、その試験化合物を放射性同位体または酵素標識とカップリングさせて、その結果、この試験化合物のＮＯＶＸタンパク質またはその生物学的に活性な部分に対する結合が、複合体におけるその標識化合物を検出することによって決定され得ることによって達成され得る。例えば、試験化合物は、１２５Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃ、または３Ｈで直接的または間接的のいずれかで標識され得、そしてその放射性同位体が、放射線放射の直接の計数により、またはシンチレーション計数により、検出され得る。あるいは、試験化合物は、例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、またはルシフェラーゼで酵素的に標識され得、そしてこの酵素的標識が、適切な基質の生成物への転換を決定することにより、検出され得る。１つの実施形態において、このアッセイは、膜結合形態のＮＯＶＸタンパク質、またはその生物学的に活性な部分をその細胞表面上に発現する細胞を、ＮＯＶＸと結合する既知の化合物と接触させて、アッセイ混合物を形成する工程、このアッセイ混合物に試験化合物を接触させる工程、ならびにこの試験化合物がＮＯＶＸタンパク質と相互作用する能力を決定する工程を包含し、ここで、この試験化合物がＮＯＶＸタンパク質と相互作用する能力を決定する工程は、この試験化合物が、既知の化合物と比較して、ＮＯＶＸタンパク質またはその生物学的に活性な部分と優先的に結合する能力を決定する工程を包含する。
【０３０１】
別の実施形態において、アッセイは、細胞ベースのアッセイであり、これは、膜結合形態のＮＯＶＸタンパク質またはその生物学的に活性な部分を細胞表面上で発現する細胞を、試験化合物と接触させる工程、ならびにこの試験化合物が、ＮＯＶＸタンパク質またはその生物学的に活性な部分の活性を調節（例えば、刺激または阻害）する能力を決定する工程を包含する。この試験化合物が、ＮＯＶＸまたはその生物学的に活性な部分の活性を調節する能力の決定は、例えば、ＮＯＶＸタンパク質が、ＮＯＶＸ標的分子に結合またはこれら標的分子と相互作用する能力を決定することによって、達成され得る。本明細書中において使用する場合には、「標的分子」とは、ＮＯＶＸタンパク質が天然に結合または相互作用する分子であり、例えば、ＮＯＶＸ相互作用タンパク質を発現する細胞表面上の分子、第二の細胞表面上の分子、細胞外環境中の分子、細胞膜の内面と会合する分子、または細胞質分子である。ＮＯＶＸ標的分子は、非ＮＯＶＸ分子あるいは本発明のＮＯＶＸタンパク質またはポリペプチドであり得る。１つの実施形態において、ＮＯＶＸ標的分子は、シグナル伝達経路の構成要素であり、これは、細胞膜を通る細胞内への細胞外シグナル（例えば、化合物が膜結合ＮＯＶＸ分子に結合することにより発生するシグナル）の伝達を促進する。その標的は、例えば、触媒活性を有する第二の細胞内タンパク質、または下流シグナル伝達分子とＮＯＶＸとの会合を容易にするタンパク質であり得る。
【０３０２】
ＮＯＶＸタンパク質がＮＯＶＸ標的分子に結合するかまたはその標的分子と相互作用する能力の決定は、直接的結合を決定するための上記方法の１つにより、達成され得る。１つの実施形態において、ＮＯＶＸタンパク質がＮＯＶＸ標的分子に結合するかまたはその標的分子と相互作用する能力の決定は、その標的分子の活性を決定することにより、達成され得る。例えば、この標的分子の活性は、その標的の細胞性セカンドメッセンジャー（すなわち、細胞内Ｃａ２＋、ジアシルグリセロール、ＩＰ３など）の誘導を検出すること、適切な基質への標的の触媒活性／酵素活性を検出すること、レポーター遺伝子（検出可能なマーカー（例えば、ルシフェラーゼ）をコードする核酸に作動可能に連結されたＮＯＶＸ応答性調節エレメントを含む）の誘導を検出すること、または細胞応答（例えば、細胞生存度、細胞分化、または細胞増殖）を検出することにより、決定され得る。
【０３０３】
なお別の実施形態において、本発明のアッセイは、無細胞（ｃｅｌｌ−ｆｒｅｅ）アッセイであり、ＮＯＶＸタンパク質またはその生物学的に活性な部分を試験化合物に接触させる工程、ならびにその試験化合物がＮＯＶＸタンパク質またはその生物学的に活性な部分と結合する能力を決定する工程を包含する。この試験化合物の、ＮＯＶＸタンパク質への結合は、上記のように、直接的または間接的にのいずれかで決定され得る。１つのこのような実施形態において、このアッセイは、ＮＯＶＸタンパク質またはその生物学的に活性な部分を、ＮＯＶＸを結合する既知の化合物に接触させて、アッセイ混合物を形成する工程、このアッセイ混合物を試験化合物に接触させる工程、ならびにその試験化合物がＮＯＶＸタンパク質と相互作用する能力を決定する工程を包含し、ここで、この試験化合物がＮＯＶＸタンパク質と相互作用する能力を決定する工程は、この試験化合物が、既知の化合物と比較して、ＮＯＶＸ、またはその生物学的に活性な部分と優先的に結合する能力を決定する工程を包含する。
【０３０４】
なお別の実施形態において、アッセイは、無細胞アッセイであり、ＮＯＶＸタンパク質またはその生物学的に活性な部分を試験化合物と接触させる工程、ならびにその試験化合物がＮＯＶＸタンパク質またはその生物学的に活性な部分の活性を調節（例えば、刺激または阻害）する能力を決定する工程を包含する。この試験化合物がＮＯＶＸの活性を調節する能力の決定は、例えば、ＮＯＶＸタンパク質が、ＮＯＶＸ標的分子に結合する能力を、直接的結合の決定のための上記方法の１つによって決定することにより、達成され得る。代替の実施形態において、この試験化合物がＮＯＶＸタンパク質の活性を調節する能力の決定は、ＮＯＶＸタンパク質が、ＮＯＶＸ標的分子をさらに調節する能力を決定することにより、達成され得る。例えば、この標的分子の適切な基質に対する触媒活性／酵素活性は、上記のように決定され得る。
【０３０５】
さらに別の実施形態において、無細胞アッセイは、ＮＯＶＸタンパク質またはその生物学的に活性な部分を、ＮＯＶＸタンパク質を結合する既知の化合物に接触させてアッセイ混合物を形成する工程、このアッセイ混合物を試験化合物と接触させる工程、ならびにこの試験化合物がＮＯＶＸタンパク質と相互作用する能力を決定する工程を包含し、ここで、この試験化合物がＮＯＶＸタンパク質と相互作用する能力の決定は、ＮＯＶＸタンパク質が、ＮＯＶＸ標的分子と優先的に結合するか、またはその標的分子の活性を優先的に調節する能力を決定する工程を包含する。
【０３０６】
本発明の無細胞アッセイは、ＮＯＶＸタンパク質の、可溶性の形態または膜結合形態の両方の使用に受け入れられる。膜結合形態のＮＯＶＸタンパク質を含む無細胞アッセイの場合には、ＮＯＶＸタンパク質の膜結合形態が溶液中に維持されるように、可溶化剤を利用することが所望され得る。このような可溶化剤の例としては、非イオン性界面活性剤が挙げられ、例えば、ｎ−オクチルグルコシド、ｎ−ドデシルグルコシド、ｎ−ドデシルマルトシド、オクタノイル−Ｎ−メチルグルカミド、デカノイル−Ｎ−メチルグルカミド、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１１４、Ｔｈｅｓｉｔ（登録商標）、イソトリデシルポリ（エチレングリコールエーテル）ｎ（Ｉｓｏｔｒｉｄｅｃｙｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ  ｅｔｈｅｒ）ｎ）、Ｎ−ドデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホネート、３−（３−コラミドプロピル）ジメチルアンミニオール−１−プロパンスルホネート（３−（３−ｃｈｏｌａｍｉｄｏｐｒｏｐｙｌ）ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｉｎｉｏｌ−１−ｐｒｏｐａｎｅ  ｓｕｌｆｏｎａｔｅ）（ＣＨＡＰＳ）、または３−（３−コラミドプロピル）ジメチルアンミニオール−２−ヒドロキシ−１−プロパンスルホネート（３−（３−ｃｈｏｌａｍｉｄｏｐｒｏｐｙｌ）ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｉｎｉｏｌ−２−ｈｙｄｒｏｘｙ−１−ｐｒｏｐａｎｅ  ｓｕｌｆｏｎａｔｅ）（ＣＨＡＰＳＯ）である。
【０３０７】
本発明の上記アッセイ方法の１つより多い実施形態において、ＮＯＶＸタンパク質またはその標的分子のいずれかを固定して、そのタンパク質の一方または両方の非複合形態からの複合形態の分離を促進し、そしてそのアッセイの自動化に適合させることが、所望され得る。試験化合物の、ＮＯＶＸタンパク質への結合、または候補化合物の存在下および非存在下での、ＮＯＶＸタンパク質と標的分子との相互作用は、これらの反応物を収容するために適切な任意の容器内で、達成され得る。このような容器の例には、マイクロタイタープレート、試験管、および微小遠心管が挙げられる。１実施形態において、そのタンパク質の一方または両方がマトリックスに結合することを可能にするドメインを付加する融合タンパク質が、提供され得る。例えば、ＧＳＴ−ＮＯＶＸ融合タンパク質またはＧＳＴ標的融合タンパク質は、グルタチオンセファロースビーズ（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）またはグルタチオン誘導体化マイクロタイタープレート上に吸着され得、次いでこれらは、試験化合物と合わせられるか、あるいは試験化合物および未吸着標的タンパク質またはＮＯＶＸタンパク質のいずれかと合わせられ、そしてこの混合物が、複合体形成を誘導する条件下（例えば、塩およびｐＨに関して生理学的条件）でインキュベートされる。インキュベーション後、ビーズまたはマイクロタイタープレートウェルを洗浄して、結合していないあらゆる成分を除去し、ビーズの場合にはマトリックスを固定し、例えば上記のように、複合体を直接的または間接的のいずれかで決定する。あるいは、複合体がマトリックスから解離され得、そしてＮＯＶＸタンパク質の結合レベルまたは活性レベルを、標準的な技術を使用して決定し得る。
【０３０８】
タンパク質をマトリックスに固定するための他の技術もまた、本発明のスクリーニングアッセイにおいて使用され得る。例えば、ＮＯＶＸタンパク質、またはその標的分子のいずれかが、ビオチンとストレプトアビジンとの結合を利用して、固定され得る。ビオチン化ＮＯＶＸタンパク質、または標的分子は、当該分野において周知の技術（例えば、ビオチン化キット、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、Ｉｌｌ．）を使用して、ビオチン−ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド）から調製され得、そしてストレプトアビジンでコーティングした９６ウェルのプレート（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ）のウェルに固定され得る。あるいは、ＮＯＶＸタンパク質、または標的分子と反応性であるがＮＯＶＸタンパク質のその標的分子への結合を妨害しない抗体が、そのプレートのウェルに誘導体化され得、そして結合していない標的またはＮＯＶＸタンパク質が、抗体の結合によってウェル内に捕捉され得る。このような複合体を検出するための方法としては、ＧＳＴ固定複合体に関しての上記で述べた方法に加えて、ＮＯＶＸタンパク質または標的分子と反応性の抗体を使用する、複合体の免疫検出、ならびにＮＯＶＸタンパク質、または標的分子に関する酵素活性の検出に依存する酵素結合アッセイが挙げられる。
【０３０９】
別の実施形態において、ＮＯＶＸタンパク質発現のモジュレーターは、細胞を候補化合物と接触させ、そして細胞中のＮＯＶＸ  ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現を決定する方法において同定される。候補化合物の存在下でのＮＯＶＸ  ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現レベルは、候補化合物の非存在下でのＮＯＶＸ  ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現レベルと比較される。次いで、候補化合物は、この比較に基づいて、ＮＯＶＸ  ｍＲＮＡまたはタンパク質発現のモジュレーターとして同定され得る。例えば、ＮＯＶＸ  ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現が、候補化合物の非存在下よりも、その存在下における方が大きい（すなわち、統計的に有意に大きい）場合、この候補化合物は、ＮＯＶＸ  ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現の刺激物質として同定される。あるいは、ＮＯＶＸ  ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現が、候補化合物の非存在下よりもその存在下の方が少ない（統計的に有意に少ない）場合、この候補化合物は、ＮＯＶＸ  ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現のインヒビターとして同定される。細胞中のＮＯＶＸ  ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現レベルは、ＮＯＶＸ  ｍＲＮＡまたはタンパク質を検出するために本明細書中に記載の方法によって決定され得る。
【０３１０】
本発明のなお別の局面において、ＮＯＶＸタンパク質は、ツーハイブリッドアッセイまたはスリーハイブリッドアッセイにおいて「ベイト（ｂａｉｔ）タンパク質」として使用されて（例えば、米国特許第５，２８３，３１７号；Ｚｅｒｖｏｓら（１９９３）Ｃｅｌｌ  ７２：２２３−２３２；Ｍａｄｕｒａら、１９９３  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：１２０４６−１２０５４；Ｂａｒｔｅｌら、１９９３  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １４：９２０−９２４；Ｉｗａｂｕｃｈｉら、１９９３  Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ８：１６９３−１６９６；およびＢｒｅｎｔ  ＷＯ９４／１０３００を参照のこと）、ＮＯＶＸ（「ＮＯＶＸ結合タンパク質」すなわち「ＮＯＶＸ−ｂｐ」）に結合するか、またはこれと相互作用し、そしてＮＯＶＸ活性を調節する他のタンパク質を同定し得る。このようなＮＯＶＸ結合タンパク質はまた、例えば、ＮＯＶＸ経路の上流または下流エレメントとしてＮＯＶＸタンパク質によるシグナル伝達に関与する可能性がある。
【０３１１】
ツーハイブリッドシステムは、分離可能なＤＮＡ結合ドメインおよび活性化ドメインからなる、大部分の転写因子のモジュール的性質に基づく。簡潔には、このアッセイは、２つの異なるＤＮＡ構築物を利用する。一方の構築物においては、ＮＯＶＸをコードする遺伝子が既知の転写因子（例えば、ＧＡＬ−４）のＤＮＡ結合ドメインをコードする遺伝子に融合される。他方の構築物においては、ＤＮＡ配列のライブラリー由来の、未同定タンパク質（「餌食（ｐｒｅｙ）」または「サンプル」）をコードするＤＮＡ配列が、既知の転写因子の活性化ドメインをコードする遺伝子に融合される。「ベイト」タンパク質および「餌食」タンパク質がインビボで相互作用して、ＮＯＶＸ依存性複合体を形成し得る場合、この転写因子のＤＮＡ結合ドメインおよび活性化ドメインは、非常に近くにある。近位にあることにより、転写因子に応答性の転写調節部位に作動可能に連結されたレポーター遺伝子（例えば、ＬａｃＺ）の転写が可能となる。レポーター遺伝子の発現が検出され得、そして機能的転写因子を含む細胞コロニーが、単離され得、そしてＮＯＶＸと相互作用するタンパク質をコードするクローニングされた遺伝子を得るために使用され得る。
【０３１２】
本発明はさらに、上記のスクリーニングアッセイにより同定される新規な薬剤（因子）および本明細書中に記載されるような処置のためのこの薬剤（因子）の使用に関する。
【０３１３】
（検出アッセイ）
本明細書中で同定されるｃＤＮＡ配列の一部またはフラグメント（および対応する完全な遺伝子配列）は、ポリヌクレオチド試薬として多くの方法で使用され得る。例えば、限定はしないが、これらの配列を使用して、（ｉ）染色体上にそれぞれの遺伝子をマッピングし得；従って遺伝病と関連する遺伝子領域を位置決定し得る；（ｉｉ）微量の生物学的サンプルから個体を同定し得る（組織型決定）；そして（ｉｉｉ）生物学的サンプルの法医学的識別を助け得る。これらの適用のいくつかは、以下の節において記載される。
【０３１４】
（染色体マッピング）
一旦、遺伝子の配列（または配列の一部分）が単離されると、この配列を用いて染色体上に遺伝子の位置をマッピングし得る。このプロセスは、染色体マッピングとよばれる。従って、ＮＯＶＸ配列の一部またはフラグメント、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、および３１、またはそのフラグメントもしくは誘導体を用いて、それぞれ、ＮＯＶＸ遺伝子の位置を染色体上にマッピングし得る。ＮＯＶＸ配列を染色体にマッピングすることは、これらの配列と、疾患と関連する遺伝子とを相関付ける際の重要な第一歩である。
【０３１５】
簡潔には、ＮＯＶＸ遺伝子は、ＮＯＶＸ配列からＰＣＲプライマー（好ましくは、１５〜２５ｂｐの長さ）を調製することにより染色体にマッピングし得る。ＮＯＶＸ配列のコンピューター分析を用いて、ゲノムＤＮＡにおける１つを超えるエキソンにまたがらないプライマーを迅速に選択し得、従って、増幅プロセスを複雑にし得る。次いで、これらのプライマーは、個々のヒト染色体を含む体細胞ハイブリッドのＰＣＲスクリーニングのために使用され得る。ＮＯＶＸ配列に対応するヒト遺伝子を含むハイブリッドのみが増幅されたフラグメントを生じる。
【０３１６】
体細胞ハイブリッドは、異なる哺乳動物由来の体細胞（例えば、ヒトおよびマウス細胞）を融合することにより調製される。ヒトおよびマウスの細胞のハイブリッドが増殖および分裂するにつれ、それらは、無作為な順序で徐々にヒト染色体を失うが、マウス染色体を維持する。マウス細胞は増殖できないが、ヒト細胞は増殖できる培地を使用することにより、それらは特定の酵素を失うので、必要な酵素をコードする遺伝子を含む１つのヒト染色体が維持される。種々の培地を使用することによって、ハイブリッド細胞株のパネルが確立され得る。パネルにおける各細胞株は、単一のヒト染色体または少数のヒト染色体いずれかおよびマウス染色体の完全なセットを含み、これにより、個々の遺伝子を特定のヒト染色体にマッピングすることが容易に可能になる（例えば、Ｄ’Ｅｕｓｔａｃｈｉｏら（１９８３）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２０：９１９−９２４を参照のこと）。ヒト染色体のフラグメントのみを含む体細胞ハイブリッドはまた、転座および欠失を伴うヒト染色体を使用することにより生成され得る。
【０３１７】
体細胞ハイブリッドのＰＣＲマッピングは、特定の染色体に特定の配列を割り当てるための迅速な手順である。１つのサーマルサイクラーを用いて一日に３つ以上の配列が割り当てられ得る。ＮＯＶＸ配列を使用して、オリゴヌクレオチドプライマーを設計すると、下位位置決定（ｓｕｂｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ）は、特定の染色体由来のフラグメントのパネルを用いて達成され得る。
【０３１８】
中期染色体スプレッドに対するＤＮＡ配列の蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）をさらに使用して、一工程で正確な染色体位置を提供し得る。染色体スプレッドは、コルセミド（紡錘体を破壊する）のような化学物質により分裂が中期においてブロックされた細胞を使用して行われ得る。この染色体は、トリプシンで短時間処理され得、次いで、ギムザ染色され得る。薄いバンドおよび濃いバンドのパターンが各染色体で発生し、その結果、この染色体は、個々に同定され得る。ＦＩＳＨ技術は、５００または６００塩基ほどの短さのＤＮＡ配列と共に使用され得る。しかし、１，０００塩基より大きなクローンは、簡単な検出に十分なシグナル強度で、独特の染色体位置に結合する可能性がより高い。好ましくは、１，０００塩基、そしてより好ましくは、２，０００塩基が妥当な時間量で良好な結果を得るために十分である。この技術の総説については、Ｖｅｒｍａら、ＨＵＭＡＮ  ＣＨＲＯＭＯＳＯＭＥＳ：Ａ  ＭＡＮＵＡＬ  ＯＦ  ＢＡＳＩＣ  ＴＥＣＨＮＩＱＵＥＳ（Ｐｅｒｇａｍｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  １９８８）を参照のこと。
【０３１９】
染色体マッピングの試薬は、単一の染色体またはその染色体上の単一部位を印付けするために個々に使用され得るか、または試薬のパネルは複数部位および／または複数染色体を印付けするために使用され得る。遺伝子の非コード領域に対応する試薬は、実際に、マッピング目的のために好ましい。コード配列は、遺伝子ファミリー内に保存されており、従って、染色体マッピングの間に交叉ハイブリダイゼーションの機会が増大する可能性が高い。
【０３２０】
一旦、配列が正確な染色体位置にマッピングされると、その配列の染色体上の物理的位置は、遺伝子マップデータと相関し得る。このようなデータは、例えば、ＭｃＫｕｓｉｃｋ，ＭＥＮＤＥＬＩＡＮ  ＩＮＨＥＲＩＴＡＮＣＥ  ＩＮ  ＭＡＮ（Ｊｏｈｎｓ  Ｈｏｐｋｉｎｓ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｗｅｌｃｈ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｌｉｂｒａｒｙを通じてオンラインで入手可能）において見いだされる。次いで、同じ染色体領域にマッピングされる遺伝子と疾患との間の関係は、例えば、Ｅｇｅｌａｎｄら（１９８７）Ｎａｔｕｒｅ，３２５：７８３−７８７に記載される連鎖分析（物理的に隣接する遺伝子の同時遺伝）によって同定され得る。
【０３２１】
さらに、ＮＯＶＸ遺伝子と関連する疾患に罹患した個体と、この疾患に罹患していない個体との間のＤＮＡ配列における差異が決定され得る。罹患した個体のいくらかまたは全てにおいて変異が認められるが、非罹患個体のいずれにおいても認められない場合、この変異は特定の疾患の候補薬剤（因子）である可能性が高い。罹患個体と非罹患個体の比較は、一般に、染色体における構造的変化（例えば、染色体スプレッドから可視であるか、またはそのＤＮＡ配列に基づいたＰＣＲを用いて検出可能な欠失または転座）を最初に探すことを包含する。最終的に、いくらかの個体に由来する遺伝子の完全な配列決定を行って、変異の存在を確認し、かつ多型に由来する変異を区別し得る。
【０３２２】
（組織型決定（ｔｉｓｓｕｅ  ｔｙｐｉｎｇ））
本発明のＮＯＶＸ配列はまた、わずかな生物学的サンプルから個体を識別するために使用され得る。この技術において、個体のゲノムＤＮＡは、１つ以上の制限酵素で消化され、そして同定のために独特のバンドを生成するためにサザンブロット上でプローブされる。本発明の配列は、ＲＦＬＰ（米国特許第５，２７２，０５７号に記載の「制限酵素断片長多型」）のためのさらなるＤＮＡマーカーとして有用である。
【０３２３】
さらに、本発明の配列を用いて、個体のゲノムの選択された部分について実際の塩基ごとにＤＮＡ配列を決定する代替的技術を提供し得る。従って、本明細書中に記載のＮＯＶＸ配列を用いて、配列の５’末端および３’末端から２つのＰＣＲプライマーを調製し得る。次いで、これらのプライマーを使用して、個体のＤＮＡを増幅し得、引き続いて、配列決定し得る。
【０３２４】
この様式で調製された個体由来の対応するＤＮＡ配列のパネルは、各個体が、対立遺伝子差異に起因するこのようなＤＮＡ配列の独特のセットを有するので、唯一の個体識別を提供し得る。本発明の配列は、個体由来および組織由来の配列のこのような識別を得るために使用され得る。本発明のＮＯＶＸ配列は、ヒトゲノムの部分を独特に表す。対立遺伝子変異は、これらの配列のコード領域においてある程度生じ、そして非コード領域においてより大きな程度に生じる。個々のヒト間での対立遺伝子変異は、各５００塩基につき約１回の頻度で生じると見積もられる。対立遺伝子変異の多さは、制限酵素断片長多型（ＲＦＬＰ）を含む単一塩基多型（ＳＮＰ）に起因する。
【０３２５】
本明細書中に記載の配列の各々は、ある程度、標準物質（これに対して個体からのＤＮＡが識別の目的で比較され得る）として使用され得る。より多くの多型が非コード領域で生じるので、個体を区別するために、それほど多くの配列が必要であるわけではない。非コード配列は、おそらく１０〜１，０００プライマーのパネルを用いてポジティブな個体識別を不自由なく提供し得る。これらのプライマーは、各々が１００塩基の増幅された非コード配列を生じる。推定コード配列（例えば、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、および３１における配列）が使用される場合、ポジティブな個体識別に関するプライマーのより適切な数は、５００〜２，０００である。
【０３２６】
（予測医療）
本発明はまた、診断アッセイ、予後アッセイ、ゲノム薬理学（ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｏｍｉｃｓ）およびモニタリング臨床試験が、予後（予測）の目的に使用され、これによって個体を予防的に処置する、予測医療の分野に関する。従って、本発明の１つの局面は、生物学的サンプル（例えば、血液、血清、細胞、組織）の場合においては、ＮＯＶＸタンパク質および／または核酸の発現、ならびにＮＯＶＸの活性を決定し、これによって、異常なＮＯＶＸの発現または活性に関連して、個体が疾患または障害に罹患するかどうか、あるいは障害を発症するリスクがあるかどうかを決定するための診断アッセイに関する。この障害としては、発達障害、内分泌障害、脈管障害、感染症、食欲不振、癌、神経変性障害、肺障害、生殖障害、アルツハイマー病、パーキンソン病、免疫障害、および造血障害、または細胞シグナルプロセシングおよび代謝経路の調節に関連する他の障害、および種々の癌、ならびに感染症（抗菌活性を有する）が挙げられる。本発明はまた、個体が、ＮＯＶＸのタンパク質、核酸の発現または活性と関連した障害を発症するリスクがあるかどうかを決定するための予後的（または予測的）アッセイを提供する。例えば、ＮＯＶＸの遺伝子における変異が、生物学的サンプルにおいてアッセイされ得る。このようなアッセイは、予後的または予測的な目的に使用され、これによってＮＯＶＸのタンパク質、核酸の発現または生物学的活性によって特徴付けられるかまたは関連した障害の発病の前に、個体を予防的に処置し得る。
【０３２７】
本発明の別の局面は、個体におけるＮＯＶＸのタンパク質、核酸の発現または活性を決定するための方法を提供し、これによって、その個体についての適切な治療的または予防的試薬（本明細書において「ゲノム薬理学」とよばれる）を選択する。ゲノム薬理学は、個体の遺伝型（例えば、特定の因子に対して応答する個体の能力を決定するために試験された個体の遺伝型）に基づいて、個体の治療的または予防的処置のための因子（例えば、薬物）の選択を可能にする。
【０３２８】
本発明のなお別の局面は、臨床試験におけるＮＯＶＸの発現または活性に対する因子（例えば、薬物、化合物）の影響をモニタリングすることに関する。
【０３２９】
これらおよび他の因子は、以下の節でさらに詳細に記載される。
【０３３０】
（診断アッセイ）
生物学的サンプルにおけるＮＯＶＸの存在または非存在を検出するための例示的な方法は、試験被験体から生物学的サンプルを得る工程、およびその生物学的サンプルをＮＯＶＸのタンパク質またはＮＯＶＸタンパク質をコードする核酸（例えば、ｍＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ）を検出し得る化合物もしくは薬剤（因子）とを接触させ、その結果、ＮＯＶＸの存在が、その生物学的サンプルにおいて検出される工程を包含する。ＮＯＶＸのｍＲＮＡもしくはゲノムＤＮＡを検出するための因子は、ＮＯＶＸ  ｍＲＮＡもしくはゲノムＤＮＡにハイブリダイズし得る、標識された核酸プローブである。この核酸プローブは、例えば、全長のＮＯＶＸの核酸（例えば、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、および３１の核酸またはそれらの一部）（例えば、少なくとも、１５、３０、５０、１００、２５０もしくは５００ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドであり、ストリンジェントな条件下でＮＯＶＸのｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡと特異的にハイブリダイズするに十分である核酸）であり得る。本発明の診断アッセイにおける使用のための他の適切なプローブは、本明細書において記載されている。
【０３３１】
ＮＯＶＸのタンパク質を検出するための薬剤（因子）は、ＮＯＶＸのタンパク質に結合し得る抗体であり、好ましくは、検出可能な標識を有する抗体である。抗体は、ポリクローナルであり得るか、またはより好ましくはモノクローナル抗体であり得る。インタクトな抗体またはそのフラグメント（例えば、ＦａｂまたはＦ（ａｂ’）２）が使用され得る。用語「標識（された）」とは、プローブまたは抗体に関して、検出可能な物質をそのプローブもしくは抗体にカップリングさせる（すなわち、物理的に連結する）ことによってそのプローブまたは抗体を直接標識すること、ならびに、直接標識された別の試薬との反応性によってそのプローブもしくは抗体の間接的な標識をすることを包含することが意図される。間接的な標識の例としては、蛍光標識された二次抗体を用いた一次抗体の検出、および蛍光標識されたストレプトアビジンを用いて検出され得るようにＤＮＡプローブのビオチンを用いた末端標識が挙げられる。用語「生物学的サンプル」とは、被験体から単離された、組織、細胞および生物学的流体ならびに被験体に存在する組織、細胞および流体を含むことが意図される。すなわち、本発明の検出方法を用いて、ＮＯＶＸのｍＲＮＡ、タンパク質またはゲノムＤＮＡを、生物学的サンプル中で、インビトロおよびインビボで検出し得る。例えば、ＮＯＶＸのｍＲＮＡの検出のためのインビトロ技術としては、ノーザンハイブリダイゼーションおよびインサイチュハイブリダイゼーションが挙げられる。ＮＯＶＸのタンパク質の検出のためのインビトロ技術としては、酵素連結免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ウェスタンブロット、免疫沈降および免疫蛍光が挙げられる。ＮＯＶＸのゲノムＤＮＡを検出するためのインビトロ技術としては、サザンハイブリダイゼーションが挙げられる。さらに、ＮＯＶＸのタンパク質の検出のためのインビボ技術としては、標識された抗ＮＯＶＸ抗体を被験体に導入することが挙げられる。例えば、その抗体は、放射性マーカーを用いて標識され得る。被験体における放射性マーカーの存在および位置は、標準的な画像化技術によって検出され得る。
【０３３２】
１つの実施形態において、この生物学的サンプルは、その試験被験体からのタンパク質分子を含む。あるいは、その生物学的サンプルは、その試験被験体からのｍＲＮＡ分子またはその試験被験体からのゲノムＤＮＡ分子を含み得る。好ましい生物学的サンプルは、被験体から従来の手段によって単離された末梢血白血球サンプルである。
【０３３３】
別の実施形態において、本発明の方法はさらに、コントロール被験体からコントロール生物学的サンプルを得る工程、そのコントロールサンプルを、ＮＯＶＸのタンパク質、ｍＲＮＡもしくはゲノムＤＮＡを検出し得る化合物もしくは薬剤（因子）と接触させ、その結果、ＮＯＶＸのタンパク質、ｍＲＮＡもしくはゲノムＤＮＡの存在がその生物学的サンプルにおいて検出される工程、およびそのコントロールサンプルにおけるＮＯＶＸのタンパク質、ｍＲＮＡもしくはゲノムＤＮＡの存在と、その試験サンプルにおけるＮＯＶＸのタンパク質、ｍＲＮＡもしくはゲノムＤＮＡの存在とを比較する工程を包含する。
【０３３４】
本発明はまた、生物学的サンプルにおけるＮＯＶＸの存在を検出するためのキットを包含する。例えば、このキットは、以下を備え得る：生物学的サンプルにおいてＮＯＶＸのタンパク質またはｍＲＮＡを検出し得る、標識された化合物または薬剤（因子）；そのサンプルにおいてＮＯＶＸの量を決定するための手段；およびそのサンプルにおいて、標準と、ＮＯＶＸの量とを比較するための手段。この化合物または薬剤は、適切な容器内に包装され得る。このキットは、さらに、ＮＯＶＸのタンパク質または核酸を検出するためにキットを用いるための指示書を備え得る。
【０３３５】
（予後アッセイ）
本明細書において記載された診断方法をさらに利用して、ＮＯＶＸの異常発現または異常活性に関連した疾患もしくは障害を有するか、またはその発症の危険性を有する被験体を同定し得る。例えば、本明細書に記載されるアッセイ（例えば、上述の診断アッセイまたは下記のアッセイ）を利用して、ＮＯＶＸのタンパク質、核酸の発現または活性に関連する障害を有するかまたはその発症の危険性を有する被験体を同定し得る。あるいは、この予後アッセイを利用して、疾患または障害を有するかまたはその発症の危険性を有する被験体を同定し得る。従って、本発明は、ＮＯＶＸの異常発現または異常活性に関連する疾患もしくは障害を同定するための方法を提供する。ここで、試験サンプルは、被験体から得られ、そしてＮＯＶＸのタンパク質または核酸（例えば、ｍＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ）が検出され、ここで、ＮＯＶＸのタンパク質または核酸の存在は、ＮＯＶＸの異常発現または異常活性に関連する疾患または障害を有するかまたはその発症の危険性を有する被験体についての診断指標である。本明細書において使用される場合「試験サンプル」とは、目的の被験体から得られた生物学的サンプルをいう。例えば、試験サンプルは、生物学的流体（例えば、血清）、細胞サンプル、または組織であり得る。
【０３３６】
さらに、本明細書に記載される予後アッセイを使用して、被験体に薬剤（因子）（例えば、アゴニスト、アンタゴニスト、ペプチド模倣物、タンパク質、ペプチド、核酸、低分子、または他の薬物候補）を投与してＮＯＶＸの異常発現または異常活性に関連する疾患または障害を処置し得るか否かを、決定し得る。例えば、このような方法を使用して、被験体が障害のための因子で有効に処置され得るか否かを決定し得る。従って、本発明は、ＮＯＶＸの異常発現または異常活性に関連する障害のための因子を用いて、被験体が有効に処置され得るか否かを決定するための方法を提供する。ここで、試験サンプルが得られ、そしてＮＯＶＸのタンパク質または核酸が検出される（例えば、ここで、ＮＯＶＸのタンパク質または核酸の存在は、この因子が投与されてＮＯＶＸの異常発現または異常活性に関連する障害が処置され得る被験体についての、診断指標である）。
【０３３７】
本発明の方法はまた、ＮＯＶＸ遺伝子における遺伝的損傷を検出し、それによって、その損傷遺伝子を有する被験体が異常な細胞増殖および／または分化によって特徴付けられる障害についての危険性を有するか否かを決定するためにも使用され得る。種々の実施形態において、この方法は、その被験体由来の細胞のサンプルにおいて、ＮＯＶＸタンパク質をコードする遺伝子の統合性に影響を与える少なくとも１つの変更によって特徴付けられる遺伝的損傷の存在または非存在、あるいはＮＯＶＸ遺伝子の誤発現を検出する工程を包含する。例えば、そのような遺伝的損傷は、以下の少なくとも１つの存在を確認することによって検出され得る：（ｉ）ＮＯＶＸ遺伝子からの１つ以上のヌクレオチドの欠失；（ｉｉ）ＮＯＶＸ遺伝子への１つ以上のヌクレオチドの付加；（ｉｉｉ）ＮＯＶＸ遺伝子の１つ以上のヌクレオチドの置換、（ｉｖ）ＮＯＶＸ遺伝子の染色体再配置；（ｖ）ＮＯＶＸ遺伝子のメッセンジャーＲＮＡ転写物のレベルにおける変更、（ｖｉ）ＮＯＶＸ遺伝子の異常改変（例えば、ゲノムＤＮＡのメチル化パターンの異常改変）、（ｖｉｉ）ＮＯＶＸ遺伝子のメッセンジャーＲＮＡ転写物の非野生型スプライシングパターンの存在、（ｖｉｉｉ）ＮＯＶＸタンパク質の非野生型レベル、（ｉｘ）ＮＯＶＸ遺伝子の対立遺伝子の欠失、ならびに（ｘ）ＮＯＶＸタンパク質の不適切な翻訳後修飾。本明細書において記載されるように、当該分野において、ＮＯＶＸ遺伝子における損傷を検出するために使用され得る、多数の公知のアッセイ技術が存在する。好ましい生物学的サンプルは、従来手段によって被験体から単離された末梢血白血球サンプルである。しかし、有核細胞を含む任意の生物学的サンプルが使用され得、これには、例えば、頬粘膜細胞が挙げられる。
【０３３８】
特定の実施形態において、損傷の検出は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（例えば、米国特許第４，６８３，１９５号および同第４，６８３，２０２号を参照のこと）（例えば、アンカーＰＣＲまたはＲＡＣＥ  ＰＣＲ）、あるいは、連結連鎖反応（ＬＣＲ）（例えば、Ｌａｎｄｅｇｒａｎら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４１：１０７７−１０８０；およびＮａｋａｚａｗａら（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｉｃ．ＵＳＡ  ９１：３６０−３６４を参照のこと）におけるプローブ／プライマーの使用を包含する。後者は、ＮＯＶＸ遺伝子における点変異を検出するために特に有用であり得る（Ａｂｒａｖａｙａら，１９９５  Ｎｕｃｌ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ２３：６７５−６８２を参照のこと）。この方法は、患者から細胞のサンプルを収集する工程、核酸（例えば、ゲノム、ｍＲＮＡまたはその両方）をそのサンプルの細胞から単離する工程、ＮＯＶＸの遺伝子に特異的にハイブリダイズする１つ以上のプライマーとその核酸サンプルとを、ＮＯＶＸ遺伝子（存在する場合）のハイブリダイゼーションおよび増幅が生じるような条件下で接触させる工程、ならびに増幅産物の存在もしくは非存在を検出する工程、またはその増幅産物のサイズを検出する工程およびその長さをコントロールサンプルと比較する工程を包含し得る。ＰＣＲおよび／またはＬＣＲは、本明細書中に記載される変異を検出するために使用される技術のいずれかとともに予備的増幅工程として使用されることが望ましくあり得ることが予想される。
【０３３９】
代替的な増幅方法としては、以下が挙げられる：当業者に周知な技術を用いた、その増幅された分子の検出の前の、自己維持配列複製（Ｇｕａｔｅｌｌｉら、１９９０、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：１８７４−１８７８を参照のこと）、転写増幅系（Ｋｗｏｈら、１９８９、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：１１７３−１１７７を参照のこと）、Ｑβレプリカーゼ（Ｌｉｚａｒｄｉら、１９８８、ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６：１１９７を参照のこと）、または他の任意の核酸増幅方法。これらの検出スキームは、核酸分子が非常に極少数で存在する場合に、そのような核酸分子の検出のために特に有用である。
【０３４０】
代替の実施形態において、サンプル細胞からのＮＯＶＸ遺伝子における変異は、制限酵素切断パターンにおける変更によって同定され得る。例えば、サンプルおよびコントロールのＤＮＡが単離され、増幅され（必要に応じて）、１つ以上の制限エンドヌクレアーゼを用いて消化され、そしてフラグメント長の大きさがゲル電気泳動によって決定され、そして比較される。サンプルＤＮＡとコントロールＤＮＡとの間のフラグメント長の大きさにおける差異は、そのサンプルＤＮＡにおける変異を示す。さらに、配列特異的なリボザイムの使用（例えば、米国特許第５，４９３，５３１号を参照のこと）を使用して、リボザイム切断部位の発生または喪失による特異的な変異の存在についてスコア付けし得る。
【０３４１】
他の実施形態において、ＮＯＶＸにおける遺伝子変異は、サンプル核酸およびコントロール核酸（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）を、数百または数千のオリゴヌクレオチドプローブを含む高密度アレイに対してハイブリダイズさせることによって同定され得る（例えば、Ｃｒｏｎｉｎら（１９９６）Ｈｕｍａｎ  Ｍｕｔａｔｉｏｎ  ７：２４４−２５５；Ｋｏｚａｌら（１９９６）Ｎａｔ．Ｍｅｄ．２：７５３−７５９を参照のこと）。例えば、ＮＯＶＸにおける遺伝子変異は、Ｃｒｏｎｉｎら（前出）に記載されるように光生成ＤＮＡプローブを含む二次元アレイにおいて同定され得る。手短には、プローブの第一ハイブリダイゼーションアレイを用いて、サンプルおよびコントロールにおける長いストレッチのＤＮＡにわたって走査し、連続的に重複するプローブの線形アレイを作成することによって、その配列間の塩基変化を同定し得る。この工程は、点変異の同定を可能にする。この工程に第二のハイブリダイゼーションアレイが続き、これによって、検出される全ての改変体または変異体に相補的な、より小さな特化されたプローブアレイを用いることによる特定の変異の特徴付けが可能になる。各変異アレイは、一方が野生型遺伝子に対して相補的であり、そして他方が変異遺伝子に対して相補である並行プローブセットから構成される。
【０３４２】
なお別の実施形態において、当該分野で公知の種々の配列決定反応のいずれかを使用して、ＮＯＶＸ遺伝子を直接配列決定し得、そしてサンプルＮＯＶＸ配列と対応する野生型（コントロール）配列とを比較することによって、変異を検出し得る。配列決定反応の例としては、ＭａｘａｍおよびＧｉｌｂｅｒｔ（１９７７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｉｃ．ＵＳＡ  ７４：５６０またはＳａｎｇｅｒ（１９７７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｉｃ．ＵＳＡ  ７４：５４６３によって開発された技術に基づくものが挙げられる。診断アッセイを実施する場合、種々の自動化配列決定手順のいずれかを利用し得ることもまた企図される（例えば、Ｎａｅｖｅら（１９９５）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １９：４４８を参照のこと）。これらには、質量分析法による配列決定法（例えば、ＰＣＴ国際公開番号ＷＯ  ９４／１６１０１；Ｃｏｈｅｎら（１９９６）Ａｄｖ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  ３６：１２７−１６２；およびＧｒｉｆｆｉｎら（１９９３）Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３８：１４７−１５９を参照のこと）が挙げられる。
【０３４３】
ＮＯＶＸ遺伝子における変異を検出するための他の方法としては、切断剤からの保護を使用して、ＲＮＡ／ＲＮＡもしくはＲＮＡ／ＤＮＡのヘテロ二重鎖におけるミスマッチ塩基を検出する方法が挙げられる（例えば、Ｍｙｅｒｓら（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３０：１２４２を参照のこと）。一般に、「ミスマッチ切断」の当該分野の技術は、野生型のＮＯＶＸ配列を含む（標識された）ＲＮＡまたはＤＮＡを、組織サンプルから得られた潜在的な変異体ＲＮＡまたはＤＮＡとハイブリダイズさせることによって形成されるヘテロ二重鎖を提供する工程によって始まる。この二本鎖の二重鎖を、二重鎖の一本鎖領域（例えば、そのコントロールとサンプルの鎖との間の塩基対ミスマッチに起因して存在するもの）を切断する因子を用いて処理する。例えば、ＲＮＡ／ＤＮＡ二重鎖は、ＲＮａｓｅを用いて処理し得、そしてＤＮＡ／ＤＮＡハイブリッドは、そのミスマッチ領域を酵素的に消化するために、Ｓ１ヌクレアーゼを用いて処理し得る。他の実施形態において、ＤＮＡ／ＤＮＡまたはＲＮＡ／ＤＮＡのいずれかの二重鎖を、ミスマッチ領域を消化するために、ヒドロキシルアミンまたは四酸化オスミウム、およびピペリジンを用いて処理し得る。そのミスマッチ領域の消化後、次いで、得られた物質を変性ポリアクリルアミドゲル上で、大きさにより分離して、変異の部位を決定する。例えば、Ｃｏｔｔｏｎら（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：４３９７；Ｓａｌｅｅｂａら（１９９２）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．２１７：２８６−２９５を参照のこと。１つの実施形態において、コントロールのＤＮＡまたはＲＮＡは、検出のために標識され得る。
【０３４４】
なお別の実施形態において、ミスマッチ切断反応は、二本鎖ＤＮＡにおけるミスマッチ塩基対を認識する１つ以上のタンパク質（いわゆる「ＤＮＡミスマッチ修復」酵素）を、細胞のサンプルから得られたＮＯＶＸ  ｃＤＮＡにおける点変異を検出およびマッピングするために規定された系において使用する。例えば、Ｅ．ｃｏｌｉのｍｕｔＹ酵素は、Ｇ／ＡミスマッチでＡを切断し、そしてＨｅＬａ細胞由来のチミジンＤＮＡグリコシラーゼは、Ｇ／ＴミスマッチでＴを切断する（例えば、Ｈｓｕら（１９９４）Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ  １５：１６５７〜１６６２を参照のこと）。例示的な実施形態に従って、ＮＯＶＸ配列（例えば、野生型ＮＯＶＸ配列）に基づくプローブは、試験細胞由来のｃＤＮＡまたは他のＤＮＡ産物にハイブリダイズされる。二重鎖は、ＤＮＡミスマッチ修復酵素を用いて処理され、そしてその切断産物（存在する場合）は、電気泳動プロトコルなどから検出され得る。例えば、米国特許第５，４５９，０３９号を参照のこと。
【０３４５】
他の実施形態において、電気泳動の移動度における変化は、ＮＯＶＸ遺伝子における変異を同定するために使用される。例えば、一本鎖コンホメーション多型（ＳＳＣＰ）は、変異体と野生型核酸との間の電気泳動の移動度における差異を検出するために使用され得る（例えば、Ｏｒｉｔａら（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ：８６：２７６６、またＣｏｔｔｏｎ（１９９３）Ｍｕｔａｔ．Ｒｅｓ．２８５：１２５〜１４４；Ｈａｙａｓｈｉ（１９９２）Ｇｅｎｅｔ．Ａｎａｌ．Ｔｅｃｈ．Ａｐｐｌ．９：７３〜７９を参照のこと）。サンプルおよびコントロールＮＯＶＸ核酸の一本鎖ＤＮＡフラグメントは、変性され、そして再生される。一本鎖核酸の二次構造は、配列に従って変化し、電気泳動の移動度において得られる変化は、１つの塩基変化の検出さえも可能にする。ＤＮＡフラグメントは、標識され得るか、または標識されたプローブを用いて検出され得る。アッセイの感度は、ＤＮＡよりもむしろ、二次構造が配列中の変化に対してより感受的であるＲＮＡを使用することによって増強され得る。１つの実施形態において、本発明の方法は、ヘテロ二重鎖分析を利用して、電気泳動の移動度における変化に基づいて二本鎖のヘテロ二重鎖分子を分離する。例えば、Ｋｅｅｎら（１９９１）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ．７：５を参照のこと。
【０３４６】
なお別の実施形態において、一定勾配の変性剤を含有するポリアクリルアミドゲルにおける変異体または野生型フラグメントの移動は、変性勾配ゲル電気泳動（ＤＧＧＥ）を使用してアッセイされる。例えば、Ｍｙｅｒｓら（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ  ３１３：４９５を参照のこと。ＤＧＧＥが分析の方法として使用される場合、ＤＮＡは、例えば、ＰＣＲにより約４０ｂｐの高融点ＧＣリッチＤＮＡのＧＣクランプを付加することによって、完全には変性されないことを確実するように改変される。さらなる実施形態において、温度勾配は、コントロールおよびサンプルＤＮＡの移動度における差異を同定するために、変性剤勾配の代わりに使用される。例えば、ＲｏｓｅｎｂａｕｍおよびＲｅｉｓｓｎｅｒ（１９８７）Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．２６５：１２７５３を参照のこと。
【０３４７】
点変異を検出するための他の技術の例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：選択的オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション、選択的増幅、または選択的プライマー伸長。例えば、オリゴヌクレオチドプライマーは、既知の変異が中心的に配置されるように調製され得、次いで、完全なマッチが見出される場合にのみハイブリダイゼーションを許容する条件下で標的ＤＮＡにハイブリダイズされる。例えば、Ｓａｉｋｉら（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ  ３２４：１６３；Ｓａｉｋｉら（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：６２３０を参照のこと。このような対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドは、このオリゴヌクレオチドがハイブリダイズ膜に付着され、そして標識された標的ＤＮＡとハイブリダイズされる場合に、ＰＣＲ増幅された標的ＤＮＡまたは多くの異なる変異にハイブリダイズされる。
【０３４８】
あるいは、選択的ＰＣＲ増幅に依存する対立遺伝子特異的増幅技術は、本発明と合わせて使用され得る。特異的増幅についてのプライマーとして使用されるオリゴヌクレオチドは、分子の中心において（その結果、増幅は、ディファレンシャルハイブリダイゼーションに依存する）（例えば、Ｇｉｂｂｓら（１９８９）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１７：２４３７〜２４４８を参照のこと）か、あるいは適切な条件下でミスマッチが妨げられ得るかまたはポリメラーゼ伸長を減少し得る、１つのプライマーの３’の最末端で、目的の変異を保有し得る（例えば、Ｐｒｏｓｓｎｅｒ（１９９３）Ｔｉｂｔｅｃｈ  １１：２３８を参照のこと）。さらに、切断に基づく検出を行うために、変異領域に新規な制限部位を導入することが、望ましくあり得る。例えば、Ｇａｓｐａｒｉｎｉら（１９９２）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ．６：１を参照のこと。特定の実施形態において、増幅はまた、増幅用Ｔａｑリガーゼを使用して実施され得ることが予測される。例えば、Ｂａｒａｎｙ（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：１８９を参照のこと。このような場合において、連結は、５’配列の３’末端に完全なマッチが存在する場合にのみ生じ、増幅の存在または欠如を探索することによって、特定の部位における既知の変異の存在を検出することを可能にする。
【０３４９】
本明細書中に記載される方法は、例えば、本明細書中に記載れる少なくとも１つのプローブ核酸または抗体試薬を含む、予めパッケージングされた診断キットを利用することによって実施され得、これは、例えば、ＮＯＶＸ遺伝子を含む疾患または疾病の症状または家族病歴を示す患者を診断するための臨床的設定において好都合に使用され得る。
【０３５０】
さらに、ＮＯＶＸが発現される任意の細胞型または組織（好ましくは、末梢血白血球）は、本明細書中に記載される予後アッセイにおいて利用され得る。しかし、有核細胞を含む任意の生物学的サンプル（例えば、頬粘膜細胞を含む）が、使用され得る。
【０３５１】
（ゲノム薬理学（Ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｏｍｉｃｓ））
ＮＯＶＸ活性（例えば、ＮＯＶＸ遺伝子発現）に対する刺激性または阻害性の影響を有する因子、すなわちモジュレーターは、本明細書中に記載されるスクリーニングアッセイによって同定されるように、障害［この障害としては、発達障害、内分泌障害、脈管障害、感染症、食欲不振、癌、神経変性障害、肺障害、生殖障害、アルツハイマー病、パーキンソン病、免疫障害、および造血障害、または細胞シグナルプロセシングおよび代謝経路の調節に関連する他の障害、および種々の癌、ならびに感染症（抗菌活性を有する）が挙げられる］を（予防的または治療的に）処置するために個体に投与され得る。このような処置と合わせて、個体のゲノム薬理学（すなわち、個体の遺伝子型と外来化合物または薬物に対するその個体の応答との間の関係についての研究）が、考慮され得る。治療剤の代謝における差異は、薬理学的に活性な薬物の用量と血中濃度との間の関係を変更することによって、重篤な毒性または治療の失敗を導き得る。従って、個体のゲノム薬理学は、個体の遺伝子型の考慮に基づく予防的または治療的処置のために有効な因子（例えば、薬物）の選択を可能にする。このようなゲノム薬理学は、さらに、適切な投薬量および治療剤レジメンを決定するために使用され得る。従って、ＮＯＶＸタンパク質の活性、ＮＯＶＸ核酸の発現、あるいは個体におけるＮＯＶＸ遺伝子の変異含量が決定されて、それによって個体の治療的または予防的処置のために適切な因子を選択し得る。
【０３５２】
ゲノム薬理学は、罹患した人おける変更された薬物の性質および異常な作用に起因して、薬物に応答する臨床的に有意な遺伝性変更を扱う。例えば、Ｅｉｃｈｅｌｂａｕｍ、１９９６、Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ，２３：９８３〜９８５；Ｌｉｎｄｅｒ、１９９７、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ，４３：２５４〜２６６を参照のこと。一般に、２つの型のゲノム薬理学状態が、区別され得る。薬物が身体に作用する方法を変更する１つの因子として伝達される遺伝的状態（変更された薬物作用）、または身体が薬物に作用する方法を変更する１つの因子として伝達される遺伝的状態（変更された薬物代謝）。これらのゲノム薬理学状態は、稀な欠損としてか、または多型としてのいずれかで生じ得る。例えば、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ６ＰＤ）欠損は、一般的な遺伝性酵素病であり、この主な臨床的合併症は、酸化剤薬物（抗マラリア剤、スルホンアミド、鎮痛薬、ニトロフラン）の摂取およびソラマメの摂食後の溶血である。
【０３５３】
例示的な実施形態として、薬物代謝酵素の活性は、薬物作用の強度および持続期間の両方の主要な決定因子である。薬物代謝酵素（例えば、Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ２（ＮＡＴ２）およびシトクロムＰ４５０酵素ＣＹＰ２Ｄ６およびＣＹＰ２Ｃ１９）の遺伝的多型の発見は、幾人かの患者が予期される薬物効果を得ないか、または標準的かつ安全な用量の薬物を摂取した後に過大な薬物応答および深刻な毒性を示すことに関しての説明を提供した。これらの多型は、集団において２つの表現型（高い代謝能を持つ人（ｅｘｔｅｎｓｉｖｅ  ｍｅｔａｂｏｌｉｚｅｒ）（ＥＭ）および低い代謝能を持つ人（ｐｏｏｒ  ｍｅｔａｂｏｌｉｚｅｒ）（ＰＭ））で表現される。ＰＭの有病率は、異なる集団の間で異なる。例えば、ＣＹＰ２Ｄ６をコードする遺伝子は高度に多型であり、そしていくらかの変異がＰＭにおいて同定されており、この全ては機能的ＣＹＰ２Ｄ６の非存在に至る。ＣＹＰ２Ｄ６およびＣＹＰ２Ｃ１９の低い代謝能を持つ人は、彼らが標準的な用量を受ける場合に、かなり頻繁に過大な薬物応答および副作用を経験する。代謝産物が活性な治療的部分である場合、そのＣＹＰ２Ｄ６形成代謝産物によって媒介されるコデインの鎮痛効果について実証されるように、ＰＭは治療的応答を示さない。他の極端なものは、標準的な用量に応答しない、いわゆる超迅速な代謝能を持つ人である。最近、超迅速な代謝の基準となる分子は、ＣＹＰ２Ｄ６遺伝子増幅に起因していることが同定されている。
【０３５４】
従って、ＮＯＶＸのタンパク質の活性、ＮＯＶＸの核酸の発現、あるいは個体におけるＮＯＶＸの遺伝子の変異内容を決定して、それによって、その個体の治療的または予防的処置のために適切な因子を選択し得る。さらに、ゲノム薬理学の研究を使用して、個体の薬物応答性の表現型の同定に対して薬物代謝酵素をコードする多型対立遺伝子の遺伝子型を適用し得る。この知見は、用量または薬物選択に適用される場合、有害な反応または治療の失敗を回避し得、従って、被験体をＮＯＶＸの調節因子（例えば、本明細書中に記載される例示的なスクリーニングアッセイの１つによって同定される調節因子）を用いて処置する場合に治療的または予防的効率を増強し得る。
【０３５５】
（臨床試験中の効果のモニタリング）
ＮＯＶＸの発現または活性（例えば、異常な細胞増殖および／または分化を調節する能力）に対する因子（例えば、薬物、化合物）の影響をモニタリングすることは、基本的な薬物スクリーニングだけでなく臨床試験にも適用され得る。例えば、本明細書中に記載されるようなスクリーニングアッセイによって、ＮＯＶＸの遺伝子発現、タンパク質レベルを増加するため、またはＮＯＶＸ活性をアップレギュレートすることが決定される因子の効力は、減少されたＮＯＶＸの遺伝子発現、タンパク質レベル、またはダウンレギュレートしたＮＯＶＸの活性を示す被験体の臨床試験においてモニターされ得る。あるいは、スクリーニングアッセイによって、ＮＯＶＸの遺伝子発現、タンパク質レベルを減少、またはＮＯＶＸの活性をダウンレギュレートすることが決定される因子の効率は、増加したＮＯＶＸの遺伝子発現、タンパク質レベル、またはアップレギュレートしたＮＯＶＸの活性を示す被験体の臨床試験においてモニターされ得る。このような臨床試験において、ＮＯＶＸの発現または活性、および好ましくは、例えば、細胞増殖または免疫障害に関与する他の遺伝子が、「リードアウト（読み出し）（ｒｅａｄ  ｏｕｔ）」、すなわち、特定の細胞の免疫応答性のマーカーとして使用され得る。
【０３５６】
例えば、ＮＯＶＸを含む遺伝子（これは、ＮＯＶＸ活性（例えば、本明細書中に記載されるようなスクリーニングアッセイにおいて同定される）を調節する因子（例えば、化合物、薬物または低分子）を用いる処置によって、細胞内で調節される）が同定され得るが、これらに限定されない。従って、細胞性増殖障害に対する因子の効果を研究するために、例えば、臨床試験において、細胞が単離され得、そしてＲＮＡが調製され得、そしてＮＯＶＸおよびこの障害に関与する他の遺伝子の発現のレベルについて分析され得る。遺伝子発現のレベル（すなわち、遺伝子発現パターン）は、本明細書中に記載されるように、ノーザンブロット分析もしくはＲＴ−ＰＣＲによるか、あるいは産生されるタンパク質の量を測定することによるか、本明細書中に記載されるような方法の１つによるか、あるいはＮＯＶＸまたは他の遺伝子の活性のレベルを測定することによって、定量され得る。この様式で、この遺伝子発現パターンは、この薬剤に対する細胞の生理学的応答の指標であるマーカーとして作用し得る。従って、この応答状態は、この因子を用いる個体の処置の前、および処置の間の種々の時点で、決定され得る。
【０３５７】
１つの実施形態において、本発明は、因子（例えば、アゴニスト、アンタゴニスト、タンパク質、ペプチド、ペプチド模倣物、核酸、低分子、または本明細書中に記載されるスクリーニングアッセイによって同定される他の薬物候補物）を用いる、被験体の処置の効力をモニタリングするための方法を提供し、これは、以下の工程を包含する：（ｉ）因子の投与の前に、被験体から投与前サンプルを得る工程；（ｉｉ）この投与前サンプルにおいて、ＮＯＶＸのタンパク質、ｍＲＮＡ、またはゲノムＤＮＡの発現のレベルを検出する工程；（ｉｉｉ）この被験体から１つ以上の投与後サンプルを得る工程；（ｉｖ）この投与後サンプルにおいて、ＮＯＶＸのタンパク質、ｍＲＮＡ、またはゲノムＤＮＡの発現または活性のレベルを検出する工程；（ｖ）この投与前サンプルにおけるＮＯＶＸのタンパク質、ｍＲＮＡ、またはゲノムＤＮＡの発現または活性のレベルを、この投与後サンプルにおけるＮＯＶＸのタンパク質、ｍＲＮＡ、またはゲノムＤＮＡの発現または活性のレベルと比較する工程；ならびに（ｖｉ）従って、この被験体に対する因子の投与を変更する工程。例えば、この因子の増加した投与は、検出されるよりも高いレベルにＮＯＶＸの発現または活性を増加すること（すなわち、この因子の効力を増加すること）が望ましくあり得る。あるいは、この因子の減少した投与は、検出されるよりも低いレベルにＮＯＶＸの発現または活性を減少すること（すなわち、この因子の効力を減少すること）が望ましくあり得る。
【０３５８】
（処置方法）
本発明は、異常なＮＯＶＸの発現または活性に関連する障害の危険性のある（または感受性である）か、またはこの障害を有する被験体を処置する予防的および治療的の両方の方法を提供する。これらの障害としては、内分泌障害、；発達障害；胃腸疾患；肺疾患；呼吸障害；脈管疾患；血液障害；自己免疫障害および免疫障害；多発性硬化症；炎症性障害およびＣ型肝炎；外傷；再生（インビトロおよびインビボ）；ウイルス／細菌／寄生生物感染；甲状腺機能亢進；甲状腺機能低下；子宮内膜症；受胎能；新脈管形成；高血圧；発作；虚血；動脈硬化；動脈瘤；発作；および出血障害；不全リンパ球症候群；ＩＩ型；遺伝性球状赤血球症；楕円赤血球症；熱変形赤血球症；溶血性貧血；ヴェルナー症候群（強皮症様の皮膚変化）；若年性関節炎；グレーヴズ病；創傷治癒；Ｘ連鎖精神遅滞；および受胎能障害；精神病性および神経学的な障害；神経退化（パーキンソン病およびアルツハイマー病が挙げられるが、これらに限定されない）；形成異常母斑および癌（神経膠腫；白血病；黒色腫；膵腺癌；非ホジキンリンパ腫；腎癌；肝細胞癌；および骨髄性白血病肺癌または乳癌が挙げられるがこれらに限定されない）、ならびに他の疾患、障害および状態などが挙げられる。
【０３５９】
これらの処置方法は、以下により詳細に記載される。
【０３６０】
（疾患および障害）
（その疾患または障害に罹患していない被験体と比較して）増加したレベルまたは生物学的活性によって特徴付けられる疾患および障害は、活性を拮抗する（すなわち、低減または阻害する）治療剤を用いて処置され得る。活性を拮抗する治療剤は、治療的または予防的な様式で、投与され得る。利用され得る治療剤としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：（ｉ）上記ペプチド、またはそのアナログ、誘導体、フラグメントもしくはホモログ；（ｉｉ）上記ペプチドに対する抗体；（ｉｉｉ）上記ペプチドをコードする核酸；（ｉｖ）相同組換えによって上記ペプチドの内因性機能を「ノックアウトする」ために利用される、アンチセンス核酸および「機能不全性」である（すなわち、上記ペプチドに対するコード配列のコード配列内の異種挿入に起因する）核酸の投与、（例えば、Ｃａｐｅｃｃｈｉ、１９８９、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４：１２８８〜１２９２を参照のこと）；または（ｖ）上記ペプチドとその結合パートナーとの間の相互作用を変化させる、調節因子（すなわち、インヒビター、アゴニストおよびアンタゴニスト（本発明のさらなるペプチド模倣物または本発明のペプチドに対して特異的な抗体を含む））。
【０３６１】
（その疾患または障害に罹患していない被験体と比較して）減少したレベルまたは生物学的活性によって特徴付けられる疾患および障害は、活性を増加させる（すなわち、活性に対するアゴニストである）治療剤を用いて処置され得る。活性をアップレギュレートする治療剤は、治療的または予防的な様式で、投与され得る。利用され得る治療剤としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：上記ペプチド、またはそのアナログ、誘導体、フラグメントもしくはホモログ；あるいはバイオアベイラビリティーを増加させるアゴニスト。
【０３６２】
増加したレベルまたは減少したレベルは、ペプチドおよび／またはＲＮＡを定量することによって、容易に検出され得る。この定量は、患者の組織サンプルを（例えば、生検組織から）入手し、そしてそのサンプルを、その発現したペプチド（または上記ペプチドのｍＲＮＡ）のＲＮＡレベルまたはペプチドレベル、構造および／または活性をインビトロでアッセイすることによる。当該分野において周知の方法としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：イムノアッセイ（例えば、ウェスタンブロット分析、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）ポリアクリルアミドゲル電気泳動が後に続く免疫沈降、免疫細胞化学などによる）および／またはｍＲＮＡの発現を検出するためのハイブリダイゼーションアッセイ（例えば、ノーザンアッセイ、ドットブロット、インサイチュハイブリダイゼーションなど）。
【０３６３】
（予防的方法）
１つの局面において、本発明は、被験体において異常なＮＯＶＸの発現または活性と関連する疾患または状態を、ＮＯＶＸの発現または少なくとも１つのＮＯＶＸ活性を調節する因子をこの被験体に投与することによって予防するための方法を提供する。異常なＮＯＶＸの発現または活性によって引き起こされるかまたはこれらに起因する、疾患にかかる危険がある被験体は、例えば、本明細書中に記載の診断アッセイまたは予後アッセイのいずれか、またはそれらの組み合わせによって、同定され得る。予防薬剤の投与は、疾患または障害が予防されるか、あるいはその進行を遅らせられるように、このＮＯＶＸ異常を特徴とする症状の発現の前に行い得る。このＮＯＶＸ異常の型に依存して、例えば、ＮＯＶＸアゴニスト薬剤またはＮＯＶＸアンタゴニスト薬剤が、その被験体を処置するために使用され得る。その適切な薬剤は、本明細書中に記載のスクリーニングアッセイに基づいて決定され得る。本発明の予防方法は、以下の小節において、さらに議論される。
【０３６４】
（治療方法）
本発明の別の局面は、治療目的のためにＮＯＶＸの発現または活性を調節する方法に関する。本発明の調節方法は、細胞と、その細胞に関するＮＯＶＸタンパク質活性の活性のうちの１つ以上を調節する因子とを接触させる工程を包含する。ＮＯＶＸタンパク質活性を調節する因子は、核酸またはタンパク質、ＮＯＶＸタンパク質の天然に存在する同族リガンド、ペプチド、ＮＯＶＸペプチド模倣物、または他の低分子のような、本明細書中に記載されるような因子であり得る。１つの実施形態において、この因子は、ＮＯＶＸタンパク質活性のうちの１つ以上を刺激する。このような刺激因子の例としては、活性なＮＯＶＸタンパク質、およびその細胞に導入されたＮＯＶＸをコードする核酸分子が挙げられる。別の実施形態において、この因子は、ＮＯＶＸタンパク質活性のうちの１つ以上を阻害する。このような阻害因子の例としては、アンチセンスＮＯＶＸ核酸分子、および抗ＮＯＶＸ抗体が挙げられる。これらの調節方法は、インビトロで（例えば、その因子とともにその細胞を培養することによって）、あるいはインビボで（例えば、被験体にその因子を投与することによって）実施され得る。このように、本発明は、ＮＯＶＸのタンパク質または核酸分子の、異常な発現または異常な活性によって特徴付けられる、疾患または障害に罹患した個体を処置する方法を提供する。１つの実施形態において、この方法は、ＮＯＶＸの発現または活性を調節する（例えば、アップレギュレートまたはダウンレギュレートする）因子（例えば、本明細書中に記載のスクリーニングアッセイによって同定される因子）あるいはそのような因子の組み合わせを投与する工程を包含する。別の実施形態において、この方法は、ＮＯＶＸのタンパク質または核酸分子を、低減したかまたは異常な、ＮＯＶＸの発現または活性を補償するための治療として、投与する工程を包含する。
【０３６５】
ＮＯＶＸ活性の刺激は、ＮＯＶＸが異常にダウンレギュレートされている状況、および／またはＮＯＶＸ活性の増加が有益な効果を有するようである状況において、望ましい。このような状況の１つの例は、被験体が、異常な細胞増殖および／または細胞分化によって特徴付けられる障害（例えば、癌または免疫関連障害）を有する場合である。このような状況の別の例は、被験体が妊娠性疾患（例えば、プレクランプシア（ｐｒｅｃｌａｍｐｓｉａ））を有する場合である。
【０３６６】
（治療剤の生物学的効果の決定）
本発明の種々の実施形態において、適切なインビトロまたはインビボアッセイを行って、特定の治療剤の効果およびその投与が罹患組織の処置を示すか否かを決定する。
【０３６７】
種々の特定の実施形態において、インビトロアッセイが患者の障害に関与する代表的な細胞型で行われ、所定の治療剤がこの細胞型に対して所望の効果を発揮するか否かを決定し得る。治療において使用する化合物は、ヒト被験体において試験する前に、適切な動物モデル系において試験され得る。これらの動物モデル系としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ラット、マウス、ニワトリ、ウシ、サル、ウサギなど。同様に、インビボ試験については、当該分野で公知の任意の動物モデル系が、ヒト被験体に対する投与の前に使用され得る。
【０３６８】
（本発明の組成物の予防的用途および治療的用途）
本発明のＮＯＶＸ核酸およびＮＯＶＸタンパク質は、以下を含むが、これらに限定されない種々の障害に関連する潜在的な予防的適用および治療的適用に有用である：発達障害、内分泌障害、脈管障害、感染症、食欲不振、癌、神経変性障害、肺障害、生殖障害、アルツハイマー病、パーキンソン病、免疫障害および自己免疫障害、ならびに造血障害、または細胞シグナルプロセシングおよび代謝経路の調節に関連する他の障害。
【０３６９】
例えば、本発明のＮＯＶＸタンパク質をコードするｃＤＮＡは、遺伝子治療に有用であり得、そしてこのタンパク質は、遺伝子治療を必要とする被験体に投与される場合、有用であり得る。非制限的な例示として、本発明の組成物は、以下に罹患した患者の処置についての効力を有する：発達障害、内分泌障害、脈管障害、感染症、食欲不振、癌、神経変性障害、肺障害、生殖障害、アルツハイマー病、パーキンソン病、免疫障害および自己免疫障害、ならびに造血障害、または細胞シグナルプロセシングおよび代謝経路の調節に関連する他の障害。
【０３７０】
本発明のＮＯＶＸタンパク質をコードする新規の核酸、およびＮＯＶＸタンパク質の両方、またはそれらのフラグメントは、診断適用にもまた有用であり得、ここで、この核酸またはタンパク質の存在または量が評価される。さらなる用途は、抗菌分子としての用途である（すなわち、いくつかのペプチドは、抗菌特性を有することが見出されている）。これらの材料は、治療的または診断的な方法における用途に関する本発明の新規の物質に免疫特異的に結合する抗体の生成においてさらに有用である。
【０３７１】
（実施例）
（実施例１．種々の細胞および組織中でのクローンの定量的発現分析）
種々のクローンの定量的な発現を、種々の正常なおよび病理由来の細胞、細胞株および組織に由来するＲＮＡサンプルを含有しているマイクロタイタープレートを使用し、実時間定量ＰＣＲ（ＲＴＱ  ＰＣＲ）を使用して評価した。ＲＴＱ  ＰＣＲを、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ（登録商標）７７００  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍによって実施した。サンプルの種々のコレクションは、プレート上に組立てられ、そしてパネル１（正常な供給源および癌の供給源に由来する細胞および細胞株を含む）、パネル２（正常な供給源および癌の供給源に由来する（特に、外科手術のサンプルに由来する）組織由来のサンプルを含む）、パネル３（多種多様の癌の供給源に由来するサンプルを含む）、パネル４（正常細胞および炎症状態に関係する細胞由来の細胞および細胞株を含む）およびパネルＣＮＳＤ．０１（正常な脳および疾患の脳由来のサンプルを含む）と言及される。
【０３７２】
最初に、ＲＮＡサンプルを、恒常的に発現される遺伝子（例えば、β−アクチンおよびＧＡＰＤＨ）のような参照核酸について規格化した。規格化したＲＮＡ（５μｌ）を、ｃＤＮＡに転換させ、そしてＯｎｅ  Ｓｔｅｐ  ＲＴ−ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ（ＰＥ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ；カタログ番号４３０９１６９）および遺伝子特異的プライマーを使用し、製造業者の説明書に従って、ＲＴＱ−ＰＣＲにより分析した。プローブおよびプライマーを、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  ＢｉｏｓｙｓｔｅｍのＰｒｉｍｅｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅパッケージ（Ａｐｐｌｅ  ＣｏｍｐｕｔｅｒのＭａｃｈｉｎｔｏｓｈ  Ｐｏｗｅｒ  ＰＣ用バージョンＩ）または入力として標的配列を使用する同様のアルゴリズムに従って、それぞれのアッセイについて設計した。デフォルト設定を、反応条件について使用し、そして以下のパラメーターを、プライマーの選択の前に設定した：プライマー濃度＝２５０ｎＭ、プライマーの融点（Ｔｍ）範囲＝５８℃〜６０℃、プライマーの最適なＴｍ＝５９℃、最大のプライマー較差＝２℃、プローブは５’にＧを有さない、プローブのＴｍはプライマーのＴｍよりも１０℃高くなければならない、アンプリコンの大きさは７５ｂｐ〜１００ｂｐである。選択したプローブおよびプライマー（下記を参照のこと）を、Ｓｙｎｔｈｅｇｅｎ（Ｈｏｕｓｔｏｎ，ＴＸ，ＵＳＡ）により合成した。プローブを、カップリングしていない色素を除去するためにＨＰＬＣによって二重に精製し、そしてプローブのそれぞれ５’末端および３’末端へのレポーター色素およびクエンチャー色素のカップリングを確認するために質量分析により評価した。それらの最終濃度は：順方向プライマーおよび逆方向プライマーは、それぞれ９００ｎＭ、そしてプローブは２００ｎＭであった。
【０３７３】
ＰＣＲ条件：各組織および各細胞株に由来する規格化したＲＮＡを、９６ウェルＰＣＲプレート（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）の各ウェルにスポットした。２つのプローブ（標的クローンに対して特異的なプローブおよび標的プローブと多重結合する（ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｅｄ）別の遺伝子特異的プローブ）を含有するＰＣＲカクテルを、ＰＥ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ７７００のための１ＸＴａｑＭａｎＴＭ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘを使用して、５ｍＭのＭｇＣｌ２、ｄＮＴＰ（１：１：１：２の割合のｄＡ、Ｇ、Ｃ、Ｕ）、０．２５Ｕ／ｍｌのＡｍｐｌｉＴａｑ  ＧｏｌｄＴＭ  （ＰＥ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、および０．４Ｕ／μｌのＲＮａｓｅインヒビター、ならびに０．２５Ｕ／μｌの逆転写酵素とともにセットした。逆転写を、４８℃で３０分間行い、続いて以下のような増幅／ＰＣＲサイクルを実施した：９５℃で１０分間、次いで、９５℃で１５秒間、６０℃で１分間を４０サイクル。結果を、対数目盛を使用するＣＴ値（所定のサンプルが蛍光の閾値と交差する時点のサイクル）として、２のΔＣＴ乗で示される所定のサンプルと最も低いＣＴ値を有するサンプルとの間でのＲＮＡ濃度の較差とともに記録した。次いで、相対的な発現の百分率は、このＲＮＡ較差の逆数をとり、そして１００を乗じることにより得られる。
【０３７４】
パネル１についての結果においては、以下の略号が使用される：
ｃａ．＝癌腫、
＊＝転移により樹立された、
ｍｅｔ＝転移、
ｓ  ｃｅｌｌ  ｖａｒ＝小細胞変異株、
ｎｏｎ−ｓ＝ｎｏｎ−ｓｍ＝小さくない
ｓｑｕａｍ＝扁平上皮の、
ｐｌ．ｅｆｆ＝ｐｌ  ｅｆｆｕｓｉｏｎ＝胸水、
ｇｌｉｏ＝神経膠腫、
ａｓｔｒｏ＝神経膠星状細胞腫、および
ｎｅｕｒｏ＝神経芽細胞腫。
【０３７５】
（パネル２）
パネル２についてのプレートは、一般的に、２個のコントロールのウェルおよび９４個の試験サンプルを含み、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  ＩｎｓｔｉｔｕｔｅのＣｏｏｐｅｒａｔｉｖｅ  Ｈｕｍａｎ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｎｅｔｗｏｒｋ（ＣＨＴＮ）またはＮａｔｉｏｎａｌ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｉｔｉａｔｉｖｅ（ＮＤＲＩ）との密接な共同研究に協力して働く外科医により得られたヒト組織から単離したＲＮＡまたはｃＤＮＡを含む。組織は、ヒトの悪性腫瘍に由来し、そして示した多くの悪性腫瘍組織が「揃った境界（ｍａｔｃｈｅｄ  ｍａｒｇｉｎ）」を有する場合には、腫瘍にすぐ隣接する非癌性の組織から得た。これらを、正常な隣接組織と称し、そして以下の結果には「ＮＡＴ」と記載する。腫瘍組織および「揃った境界」を、２人の独立した病理学者によって評価する（外科の病理学者、そしてＮＤＲＩまたはＣＨＴＮの病理学者により再度）。この分析は、腫瘍の分化の悪性度分類の全体的な組織病理学的評価を提供する。さらに、ほとんどのサンプルは、もともとの外科的病理報告を含み、患者の臨床段階に関する情報を提供する。これらの揃った境界を、周辺組織（すなわち、すぐ隣接する）から外科手術領域まで採取する（表ＲＲにおいて正常な隣接組織に対して「ＮＡＴ」と明示する）。さらに、ＲＮＡおよびｃＤＮＡサンプルを、高齢者または突然死の被害者（事故など）について実施した死体解剖に由来する種々のヒト組織から得た。これらの組織が疾患を有さないことを確認し、そしてＣｌｏｎｔｅｃｈ（Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）、Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、およびＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのような種々の商業的な供給源から購入した。
【０３７６】
全てのサンプルに由来するＲＮＡの完全性を、指針として２８ＳリボソームＲＮＡおよび１８ＳリボソームＲＮＡの染色強度比（２：１〜２．５：１の２８ｓ：１８ｓ）、および分解産物の指標である低分子量のＲＮＡが存在しないことを利用して、アガロースゲル電気泳動図の視覚的な評価により質について管理した。サンプルを、単一のエキソンの範囲全体を増幅するように設計したプローブおよびプライマーのセットを使用して、逆転写酵素の非存在下でのＲＴＱ  ＰＣＲ反応の実行によるゲノムＤＮＡの混入に対して、管理した。
【０３７７】
（パネル３Ｄ）
パネル３Ｄのプレートは、９４個のｃＤＮＡサンプルおよび２個のコントロールサンプルを含む。詳細には、これらのうちの９２個は培養されたヒトの癌細胞株に由来し、２個のサンプルはヒトの初期の小脳組織であり、そして２個はコントロールである。ヒトの細胞株は、一般的に、ＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）、ＮＣＩまたはＧｅｒｍａｎ腫瘍細胞バンクから入手し、そして以下の組織グループに分類される：舌の扁平上皮細胞癌細胞株、乳癌細胞株、前立腺癌細胞株、黒色腫細胞株、類表皮腫細胞株、肉腫細胞株、膀胱癌細胞株、膵臓癌細胞株、腎臓癌細胞株、白血病／リンパ腫の細胞株、卵巣／子宮／子宮頚癌の細胞株、胃癌細胞株、結腸癌細胞株、肺癌細胞株およびＣＮＳ癌細胞株。さらに、２つの独立した小脳の異なるサンプルが存在する。これらの細胞を、全て、標準的な推奨される条件下で培養し、そして標準的な手順を使用してＲＮＡを抽出する。パネル３Ｄおよびパネル１．３Ｄ内の細胞株は、科学文献において使用される最も一般的な細胞株である。
【０３７８】
全てのサンプルに由来するＲＮＡの完全性を、指針として２８ＳリボソームＲＮＡおよび１８ＳリボソームＲＮＡの染色強度比（２：１〜２．５：１の２８ｓ：１８ｓ）、および分解産物の指標である低分子量のＲＮＡが存在しないことを利用して、アガロースゲル電気泳動図の視覚的な評価により質について管理した。サンプルを、単一のエキソンの範囲全体を増幅するように設計したプローブおよびプライマーのセットを使用して、逆転写酵素の非存在下でのＲＴＱ  ＰＣＲ反応の実行によるゲノムＤＮＡの混入に対して、管理した。
【０３７９】
（パネル４）
パネル４は、９６ウェルプレート（２個のコントロールのウェル、９４個の試験サンプル）上にサンプルを含み、炎症状態に関係する種々のヒトの細胞株または組織から単離したＲＮＡ（パネル４ｒ）またはｃＤＮＡ（パネル４ｄ）を含む。結腸および肺（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）ならびに胸腺および腎臓（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）のようなコントロールの正常組織に由来する全ＲＮＡを使用した。肝硬変患者の肝臓組織および狼瘡患者の腎臓に由来する全ＲＮＡを、ＢｉｏＣｈａｉｎ（Ｂｉｏｃｈａｉｎ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｉｎｃ．，Ｈａｙｗａｒｄ，ＣＡ）から入手した。クローン病および潰瘍性大腸炎を有すると診断された患者からのＲＮＡの調製のための腸組織を、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｔｅｒｃｈａｎｇｅ（ＮＤＲＩ）（Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ）から入手した。
【０３８０】
星状細胞、肺繊維芽細胞、皮膚繊維芽細胞、冠状動脈平滑筋細胞、小気道上皮細胞、気管支上皮細胞、微小血管皮膚内皮細胞、微小血管肺内皮細胞、ヒト肺大動脈血管内皮細胞、ヒト臍帯静脈血管内皮細胞を、全て、Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ（Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ）から購入し、そしてＣｌｏｎｅｔｉｃｓによってこれらの細胞型について提供される培地中で増殖させた。これらの初代細胞型を、示すように、種々のサイトカインまたはサイトカインの組合せを用いて６時間および／または１２〜１４時間の間、活性化した。以下のサイトカインを使用した；約１〜５ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１β、約５〜１０ｎｇ／ｍｌのＴＮＦα、約２０〜５０ｎｇ／ｍｌのＩＦＮγ、約５〜１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−４、約５〜１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−９、約５〜１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１３。内皮細胞を、時折、０．１％の血清を含むＣｌｏｎｅｔｉｃｓによる基本培地中での培養によって種々の時間餓死させた。
【０３８１】
単核細胞を、Ｆｉｃｏｌｌを使用して、ＣｕｒａＧｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎの従業員の血液から調製した。ＬＡＫ細胞を、ＤＭＥＭ  ５％のＦＣＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、１００μＭの可欠アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ／Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ）、５．５×１０−５Ｍのメルカプトエタノール（Ｇｉｂｃｏ）、および１０ｍＭのＨｅｐｅｓ（Ｇｉｂｃｏ）およびインターロイキン２中での４〜６日間の培養によってこれらの細胞から調製した。次いで、細胞を、１０〜２０ｎｇ／ｍｌのＰＭＡおよび１〜２μｇ／ｍｌのイオノマイシン、５〜１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１２、２０〜５０ｎｇ／ｍｌのＩＦＮγおよび５〜１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１８のいずれかで、６時間活性化した。いくつかの場合には、単核細胞を、約５μｇ／ｍｌのＰＨＡ（フィトヘマグルチニン）またはＰＷＮ（アメリカヤマゴボウマイトジェン）を含有する、ＤＭＥＭ  ５％のＦＣＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、１００μＭの可欠アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ）、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ）、５．５×１０−５Ｍのメルカプトエタノール（Ｇｉｂｃｏ）、および１０ｍＭのＨｅｐｅｓ（Ｇｉｂｃｏ）中で、４〜５日間培養した。ＲＮＡの調製のための、サンプルを２４、４８、および７２時間で採取した。ＭＬＲ（混合リンパ球反応）サンプルを、２人のドナーからの採血、Ｆｉｃｏｌｌを使用する単核細胞の単離、および単離した単核細胞の、ＤＭＥＭ  ５％のＦＣＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、１００μＭの可欠アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ）、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ）、メルカプトエタノール（５．５×１０−５Ｍ）（Ｇｉｂｃｏ）、および１０ｍＭのＨｅｐｅｓ（Ｇｉｂｃｏ）中の約２×１０６個の細胞／ｍｌの最終濃度での１：１での混合によって得た。このＭＬＲを培養し、そしてＲＮＡの調製のために１〜７日までの範囲の種々の時点でサンプルを採取した。
【０３８２】
単球を、製造業者の説明書に従って、ＣＤ１４  Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｅａｄｓ、＋ｖｅ  ＶＳ選択カラムおよびＶａｒｉｏ  Ｍａｇｎｅｔを使用して単核細胞から単離した。単球を、ＤＭＥＭ  ５％のウシ胎児血清（ＦＣＳ）（Ｈｙｃｌｏｎｅ，Ｌｏｇａｎ，ＵＴ）、１００μＭの可欠アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ）、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ）、５．５×１０−５Ｍのメルカプトエタノール（Ｇｉｂｃｏ）、および１０ｍＭのＨｅｐｅｓ（Ｇｉｂｃｏ）、５０ｎｇ／ｍｌのＧＭＣＳＦおよび５ｎｇ／ｍｌのＩＬ−４中での５〜７日間の培養によって樹状細胞に分化させた。マクロファージを、ＤＭＥＭ  ５％のＦＣＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、１００μＭの可欠アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ）、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ）、５．５×１０−５Ｍのメルカプトエタノール（Ｇｉｂｃｏ）、１０ｍＭのＨｅｐｅｓ（Ｇｉｂｃｏ）および１０％のＡＢヒト血清または約５０ｎｇ／ｍｌのＭＣＳＦ中で５〜７日間の単球の培養によって調製した。単球、マクロファージおよび樹状細胞を、１００ｎｇ／ｍｌのリポ多糖類（ＬＰＳ）を用いて６時間および１２〜１４時間刺激した。樹状細胞をまた、１０μｇ／ｍｌの抗ＣＤ４０モノクローナル抗体（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）で６時間および１２〜１４時間刺激した。
【０３８３】
ＣＤ４リンパ球、ＣＤ８リンパ球、およびＮＫ細胞をまた、ＣＤ４、ＣＤ８、およびＣＤ５６のＭｉｌｔｅｎｙｉビーズ、ポジティブＶＳ選択カラム、およびＶａｒｉｏ  Ｍａｇｎｅｔを、製造業者の指示に従って用いて、単核細胞から単離した。ＣＤ８、ＣＤ５６、ＣＤ１４、およびＣＤ１９のＭｉｌｔｅｎｙｉビーズおよびポジティブ選択を用いて、ＣＤ８、ＣＤ５６、ＣＤ１４、およびＣＤ１９細胞の単核細胞を枯渇することによって、ＣＤ４５ＲＡおよびＣＤ４５ＲＯのＣＤ４のリンパ球を単離した。次いで、ＣＤ４５ＲＯビーズを用いて、ＣＤ４５ＲＡ  ＣＤ４リンパ球である細胞を残したままで、ＣＤ４５ＲＯ  ＣＤ４リンパ球を単離した。ＣＤ４５ＲＡ  ＣＤ４、ＣＤ４５ＲＯ  ＣＤ４、およびＣＤ８のリンパ球をＤＭＥＭ  ５％  ＦＣＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、１００μＭの非必須アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ）、１ｍＭピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ）、メルカプトエタノール５．５×１０−５Ｍ（Ｇｉｂｃｏ）、および１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ（Ｇｉｂｃｏ）に入れ、そしてＦａｌｃｏｎ６ウェル組織培養プレート上に１０６細胞／ｍｌでプレートし、これをＰＢＳ中の０．５μｇ／ｍｌ抗ＣＤ２８（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）および３μｇ／ｍｌ抗ＣＤ３（ＯＫＴ３、ＡＴＣＣ）を用いて一晩コーティングした。ＲＮＡ調製のために、６時間後、および２４時間後に、この細胞を収集した。慢性的に活性化されたＣＤ８リンパ球を調製するために、本発明者らは、抗ＣＤ２８コーティングしたプレートおよび抗ＣＤ３コーティングしたプレート上で４日間、単離したＣＤ８リンパ球を活性化し、次いでこの細胞を回収して、それをＤＭＥＭ  ５％  ＦＣＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、１００μＭ非必須アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ）、１ｍＭピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ）、メルカプトエタノール５．５×１０−５Ｍ（Ｇｉｂｃｏ）、ならびに１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ（Ｇｉｂｃｏ）およびＩＬ−２中で増殖させた。次いで増殖したＣＤ８細胞を、４日間抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８結合したプレートで再度活性化し、前のように増殖させた。第二の活性化から６時間後および２４時間後、ならびに４日間の第二の増殖培養後、ＲＮＡを単離した。単離したＮＫ細胞を、ＲＮＡの調製の前に、ＤＭＥＭ  ５％  ＦＣＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、１００μＭ非必須アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ）、１ｍＭピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ）、メルカプトエタノール５．５×１０−５Ｍ（Ｇｉｂｃｏ）、ならびに１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ（Ｇｉｂｃｏ）、およびＩＬ−２中で４〜６日間培養した。
【０３８４】
Ｂ細胞を得るために、ＮＤＲＩから扁桃を入手した。扁桃を無菌解剖鋏によって切り出し、次に篩いに通過させた。次いで、扁桃細胞をスピンダウンして、ＤＭＥＭ  ５％  ＦＣＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、１００μＭ非必須アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ）、１ｍＭピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ）、メルカプトエタノール５．５×１０−５Ｍ（Ｇｉｂｃｏ）、および１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ（Ｇｉｂｃｏ）中に１０６細胞／ｍｌで再懸濁した。細胞を活性化するために、本発明者らは、ＰＷＭ（５μｇ／ｍｌ）、または抗ＣＤ４０（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）（約１０μｇ／ｍｌ）およびＩＬ−４（５〜１０ｎｇ／ｍｌ）を用いた。ＲＮＡ調製のために、２４時間、４８時間、および７２時間で細胞を収集した。
【０３８５】
一次および二次のＴｈ１／Ｔｈ２およびＴｒ１細胞を調製するため、１０μｇ／ｍｌ抗ＣＤ２８（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）、および２μｇ／ｍｌ  ＯＫＴ３（ＡＴＣＣ）を用いて、６ウェルＦａｌｃｏｎプレートを一晩コーティングし、次いでＰＢＳで２回洗浄した。臍帯血ＣＤ４リンパ球（Ｐｏｉｅｔｉｃ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｇｅｒｍａｎ  Ｔｏｗｎ，ＭＤ）を、ＤＭＥＭ  ５％  ＦＣＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、１００μＭ非必須アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ）、１ｍＭピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ）、メルカプトエタノール５．５×１０−５Ｍ（Ｇｉｂｃｏ）、および１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ（Ｇｉｂｃｏ）、およびＩＬ−２（４ｎｇ／ｍｌ）中で、１０５〜１０６細胞／ｍｌで培養した。Ｔｈ１を指向するために、ＩＬ−１２（５ｎｇ／ｍｌ）および抗ＩＬ４（１μｇ／ｍｌ）を用い、一方、Ｔｈ２を指向するためにＩＬ−４（５ｎｇ／ｍｌ）および抗ＩＦＮγ（１μｇ／ｍｌ）を用い、そしてＴｒ１を指向するためにＩＬ−１０を５ｎｇ／ｍｌで用いた。４〜５日後、活性化したＴｈ１、Ｔｈ２およびＴｒ１のリンパ球を、ＤＭＥＭ中で１回洗浄し、そしてＤＭＥＭ  ５％  ＦＣＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、１００μＭ非必須アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ）、１ｍＭピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ）、メルカプトエタノール５．５×１０−５Ｍ（Ｇｉｂｃｏ）、１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ（Ｇｉｂｃｏ）およびＩＬ−２（１ｎｇ／ｍｌ）中で４〜７日間増殖させた。この後、活性化したＴｈ１、Ｔｈ２、およびＴｒ１リンパ球を、上記のように、ただし、アポトーシスを防ぐために抗ＣＤ９５Ｌ（１μｇ／ｍｌ）を添加して、抗ＣＤ２８／ＯＫＴ３およびサイトカインで５日間、再刺激した。４〜５日後、Ｔｈ１、Ｔｈ２、およびＴｒ１リンパ球を洗浄し、次いでＩＬ−２で、再度４〜７日間増殖させた。活性化したＴｈ１およびＴｈ２のリンパ球を、最大３回のサイクルまでこの方式で維持した。抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８  ｍＡｂを結合したプレートでの第二および第三の活性化から６時間後および２４時間後、ならびにインターロイキン２における第二および第三の増殖の４日後に、一次および二次のＴｈ１、Ｔｈ２、およびＴｒ１からＲＮＡを調製した。
【０３８６】
以下の白血球細胞株を、ＡＴＣＣから得た：Ｒａｍｏｓ、ＥＯＬ−１、ＫＵ−８１２。ＥＯＬ細胞を、０．１ｍＭ  ｄｂｃＡＭＰ中での８日間にわたる５×１０５細胞／ｍｌでの培養、３日ごとの培地の交換、および細胞濃度を５×１０５細胞／ｍｌに調整することによってさらに分化させた。これらの細胞の培養のために、本発明者らは、ＤＭＥＭまたはＲＰＭＩを（ＡＴＣＣによって推奨されるように）、５％ＦＣＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、１００μＭ非必須アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ）、１ｍＭピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ）、メルカプトエタノール５．５×１０−５Ｍ（Ｇｉｂｃｏ）、１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ（Ｇｉｂｃｏ）の添加を伴って、用いた。休止している細胞、または６時間および１４時間、ＰＭＡ（１０ｎｇ／ｍｌ）およびイオノマイシン（１μｇ／ｍｌ）で活性化した細胞のいずれかから、ＲＮＡを調製した。ケラチノサイト株ＣＣＤ１０６、および気道上皮腫瘍株ＮＣＩ−Ｈ２９２をまた、ＡＴＣＣから得た。この両方をＤＭＥＭ  ５％  ＦＣＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、１００μＭ非必須アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ）、１ｍＭピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ）、メルカプトエタノール５．５×１０−５Ｍ（Ｇｉｂｃｏ）、ならびに１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ（Ｇｉｂｃｏ）中で培養した。約５ｎｇ／ｍｌ  ＴＮＦαおよび１ｎｇ／ｍｌ  ＩＬ−１βを用いて６時間および１４時間、ＣＣＤ１１０６細胞を活性化し、一方、ＮＣＩ−Ｈ２９２細胞を、以下のサイトカインを用いて６時間および１４時間活性化した：５ｎｇ／ｍｌ  ＩＬ−４、５ｎｇ／ｍｌ  ＩＬ−９、５ｎｇ／ｍｌ  ＩＬ−１３、および２５ｎｇ／ｍｌ  ＩＦＮγ。
【０３８７】
これらの細胞株および血球について、Ｔｒｉｚｏｌ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）を用いて約１０７細胞／ｍｌを溶解することによってＲＮＡを調製した。簡単に言うと、１／１０容量のブロモクロロプロパン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）をＲＮＡサンプルに添加し、ボルテックスし、そして室温で１０分後に、このチューブをＳｏｒｖａｌｌ  ＳＳ３４ローター中で１４，０００ｒｐｍでスピンした。水相を取り出し、そして１５ｍｌ  Ｆａｌｃｏｎチューブに入れた。等容量のイソプロパノールを添加し、そして−２０℃に一晩放置した。沈殿したＲＮＡを、１５分間Ｓｏｒｖａｌｌ  ＳＳ３４ローター中で９，０００ｒｐｍでスピンダウンし、そして７０％エタノール中で洗浄した。このペレットを３００μｌのＲＮＡｓｅを含有しない水に再溶解し、そして３５μｌの緩衝液（Ｐｒｏｍｅｇａ）、５μｌ  ＤＴＴ、７μｌ  ＲＮＡｓｉｎおよび８μｌ  ＤＮＡｓｅを添加した。このチューブを３７℃で３０分間インキュベートし、混入しているゲノムＤＮＡを除去し、フェノールクロロホルムで１回抽出し、そして１／１０容量の３Ｍ酢酸ナトリウム、および２容量の１００％エタノールで再沈殿させた。このＲＮＡをスピンダウンし、そしてＲＮＡｓｅを含有しない水に入れた。ＲＮＡを−８０℃で保存した。
【０３８８】
（パネル  ＣＮＳＤ．０１）
パネルＣＮＳＤ．０１のプレートは、２つのコントロールウェルおよびＨａｒｖａｒｄ  Ｂｒａｉｎ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｃｅｎｔｅｒから入手した死後のヒト脳組織から単離したｃＤＮＡからなる９４の試験サンプルを含む。脳を、死後４時間〜２４時間の間にドナーの頭蓋冠から取り出し、神経解剖学者によって切片化し、そして液体窒素蒸気中で−８０℃で凍結させた。全ての脳を神経病理学者によって切片化して試験し、明確に関連した神経病理学によって診断を確認した。
【０３８９】
疾患診断を患者記録から得る。このパネルは、以下の各々の診断由来の２つの脳を含む：アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンティングトン舞踏病、進行性核上麻痺（Ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ  Ｓｕｐｅｒｎｕｃｌｅａｒ  Ｐａｌｓｙ）、抑うつ、および「正常なコントロール（Ｎｏｒｍａｌ  ｃｏｎｔｒｏｌ）」。これらの脳の各々において、以下の領域が示される：帯状回、側頭極、淡蒼球、黒質、ブロードマン野（Ｂｒｏｄｍａｎ  Ａｒｅａ）４（一次運動線条（ｐｒｉｍａｒｙ  ｍｏｔｏｒ  ｓｔｒｉｐ））、ブロードマン野（Ｂｒｏｄｍａｎ  Ａｒｅａ）７（頭頂葉皮質）、ブロードマン野（Ｂｒｏｄｍａｎ  Ａｒｅａ）９（前前頭皮質）、およびブロードマン野（Ｂｒｏｄｍａｎ  Ａｒｅａ）１７（後頭皮質）。全ての場合に全ての脳領域を示すわけではない；例えば、ハンティングトン舞踏病は、淡蒼球における神経変性によって部分的に特徴付けられる。従って、この領域は、確認されたハンティングトン舞踏病の症例から入手することが不可能である。同様にパーキンソン病は、黒質の変性によって特徴付けられ、このことがこの領域を入手することをさらに困難にする。正常なコントロールの脳を神経病理学について試験し、そして神経変性と合致するいかなる病理もないことを見出した。
【０３９０】
ガイドとして２８Ｓと１８ＳとのリボソームＲＮＡ染色強度の比（２：１〜２．５：１  ２８ｓ：１８ｓ）、および分解産物の指標となる低分子量ＲＮＡの非存在を用いた、アガロースゲル電気泳動図の視覚的評価によって、全てのサンプルからのＲＮＡの完全性を品質について管理する。単一のエキソンのスパンにわたって増幅するように設計したプローブおよびプライマーのセットを用い、逆転写酵素の非存在下において実行したＲＴＱ  ＰＣＲ反応によって、ゲノムＤＮＡの混入に対してサンプルを管理する。
【０３９１】
ＣＮＳパネルにおいて組織を同定するために使用した表示においては、以下の略号を用いる：
ＰＳＰ＝進行性核上麻痺
Ｓｕｂ  Ｎｉｇｒａ＝黒質（Ｓｕｂｓｔａｎｔｉａ  ｎｉｇｒａ）
Ｇｌｏｂ  Ｐａｌｌａｄｕｓ＝淡蒼球（Ｇｌｏｂｕｓ  ｐａｌｌａｄｕｓ）
Ｔｅｍｐ  Ｐｏｌｅ＝側頭極（Ｔｅｍｐｏｒａｌ  ｐｏｌｅ）
Ｃｉｎｇ  Ｇｙｒ＝帯状回（Ｃｉｎｇｕｌａｔｅ  ｇｙｒｕｓ）
ＢＡ  ４＝ブロードマン野（Ｂｒｏｄｍａｎ  Ａｒｅａ）４。
【０３９２】
（ＮＯＶ１（ＮＯＶ１ａ〜ｃ））
ＮＯＶ１ａの遺伝子（およびその改変体）の発現を、表１１に記載されるプライマー−プローブセットＡｇ２４４５を用いて評価した。ＲＴＱ−ＰＣＲ実行の結果を表１２および１３に示す。
【０３９３】
【表１１】
2004529607.tif 000090
【０３９４】
【表１２】
2004529607.tif 000091
2004529607.tif 000092
2004529607.tif 000093
【０３９５】
【表１３】
2004529607.tif 000094
2004529607.tif 000095
2004529607.tif 000096
（パネル１．３Ｄの要約）
（Ａｇ２４４５）  同じプローブ／プライマーセットを用いた２つの複製実験由来の結果は、組織分布ではなく発現レベルで微小な相違はあったものの優れた一致をみた。ＮＯＶ１ａ遺伝子の有意な発現は、肺、気管、および胎盤に制限されている。それゆえ、ＮＯＶ１ａ核酸はこれらの組織についてのマーカーとして利用され得る。
【０３９６】
（パネル２Ｄの要約）
（Ａｇ２４４５）  同じプローブ／プライマーセットを用いた３つの複製実験からの結果は、適度に一致する。ＮＯＶ１ａ遺伝子発現は、正常な肺組織において最も高い（ＣＴ値＝３１．２）。この結果は、パネル１．３Ｄにみられるものと一致している。さらに、肝臓癌および正常の前立腺組織に由来するサンプルにおいて、この遺伝子の有意ではあるが低い発現が存在する。注目すべきは、正常肺と肺癌サンプルとの間の一致したＮＯＶ１の遺伝子発現の調節不全であり、癌性組織と比較した場合、５サンプルのうち５サンプルで、正常に適合した肺組織内において顕著な発現を示す。このように、この遺伝子の発現は、正常な肺組織と疾患（癌）肺組織を識別するために用いられ得る。さらに、ＮＯＶ１ａ遺伝子産物の活性の治療的な調節は、肺癌の処置において有用である。
【０３９７】
（パネル４Ｄの要約）
（Ａｇ２４４５）  ＮＯＶ１ａ遺伝子の発現は、このパネル上のサンプルにおいて低／検出不能（ＣＴ値＞３５）である（データは示していない）。
【０３９８】
（パネルＣＮＳＤ．０１の要約）
（Ａｇ２４４５）  ＮＯＶ１ａ遺伝子の発現は、このパネル上のサンプルにおいて低／検出不能（ＣＴ値＞３５）である（データは示していない）。
【０３９９】
（ＮＯＶ２（ＮＯＶ２ａ〜ｃ））
ＮＯＶ２ａ遺伝子、およびその改変体の発現を、表１４および表１５に記載されるプライマー−プローブセットＡｇ３３３４およびＡｇ４４０３を用いて評価した。Ａｇ４４０３は、ＮＯＶ２ａおよびＮＯＶ２Ｃ配列に関連した逆方向（ｒｅｖ）プライマーの５’末端中に、一塩基挿入を含み、ＲＴＱ−ＰＣＲの結果を変えないことが予想される。ＲＴＱ−ＰＣＲ実行の結果を表１６に示す。
【０４００】
【表１４】
2004529607.tif 000097
【０４０１】
【表１５】
2004529607.tif 000098
【０４０２】
【表１６】
2004529607.tif 000099
2004529607.tif 000100
2004529607.tif 000101
（パネル２．２の要約：）
（Ａｇ３３３４）  ＮＯＶ２ａ遺伝子の発現は、このパネル上のすべてのサンプルにわたって低い／検出不可能（ＣＴ値＞３５）である（データ示さず）。
【０４０３】
（パネル４Ｄの要約：）
（Ａｇ３３３４）  ＮＯＶ２ａ遺伝子の発現は、このパネル上のすべてのサンプルにわたって低い／検出不可能（ＣＴ値＞３５）である（データ示さず）。
【０４０４】
（パネル４．１Ｄの要約：）
（Ａｇ４４０３）  ＮＯＶ２ａ遺伝子の有意な発現は、腎臓（ＣＴ＝３０．８）に制限されている。従って、ＮＯＶ２ａ核酸は、他の組織から腎臓を区別するマーカーとして用いられ得る。ＮＯＶ２ａ遺伝子は、推定亜鉛輸送体をコードしている。このファミリーのメンバーは、カドミウム、亜鉛、およびコバルトのような二価の金属イオンに対する許容度を増加させることが見出された内在性膜タンパク質である。これらのタンパク質は細胞［ＩＰＲ００２５２４］からこれらのイオンを取り除く流出ポンプであると考えられる。したがって、ＮＯＶ２ａ遺伝子によってコードされるタンパク質は、通常の陽イオンの恒常性に含まれ得、狼瘡のような腎臓の疾患を調節できない。
【０４０５】
（パネル  ＣＮＳ＿神経変性＿ｖ１．０（ＣＮＳ＿ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ＿ｖ１．０）の要約：）
（Ａｇ３３３４）  ＮＯＶ２ａ遺伝子の発現は、このパネル上のすべてのサンプルにわたって低い／検出不可能（ＣＴ値＞３５）である（データ示さず）。
【０４０６】
（ＮＯＶ３）
遺伝子ＮＯＶ３ａ（およびその改変体）の発現は、表１７、１８、および１９で記載されたＡｇ１５０８，Ａｇ２２８４、およびＡｇ２４５４のプライマー−プローブセットを使用して評価された。その改変体ＣＧ５５８６１−０２は、プライマーープローブセットＡｇ１５０８によってのみ認識される。ＲＴＱ−ＰＣＲを実行した結果を表２０、２１、２２、２３、および２４に示す。
【０４０７】
【表１７】
2004529607.tif 000102
【０４０８】
【表１８】
2004529607.tif 000103
【０４０９】
【表１９】
2004529607.tif 000104
【０４１０】
【表２０】
2004529607.tif 000105
2004529607.tif 000106
【０４１１】
【表２１】
2004529607.tif 000107
2004529607.tif 000108
2004529607.tif 000109
【０４１２】
【表２２】
2004529607.tif 000110
2004529607.tif 000111
2004529607.tif 000112
【０４１３】
【表２３】
2004529607.tif 000113
2004529607.tif 000114
2004529607.tif 000115
【０４１４】
【表２４】
2004529607.tif 000116
2004529607.tif 000117
2004529607.tif 000118
（パネル１．２の要約：）
（Ａｇ１５０８）  ＮＯＶ３Ａ遺伝子の発現は、骨格筋由来のサンプルで最も高い（ＣＴ＝１９．５）。したがって、この遺伝子は、他の組織から骨格筋を区別するのに使用され得る。ＮＯＶ３ａの発現はまた、腎臓で高い（ＣＴ＝２３）。
ＮＯＶ３ａ遺伝子の産物は、ミツグミン（ｍｉｔｓｕｇｕｍｉｎ）２９に高い相同性がある。骨格筋および腎臓でのＮＯＶ３ａ遺伝子の発現は、ミツグミン２９遺伝子（参考文献１）で観察されたことと一致している。興味深いことに、ミツグミン２９欠損マウスは、わずかに体重が減少し、そして異常な骨格筋をもつようである（参考文献２）。したがって、ＮＯＶ３ａ遺伝子の産物は、肥満および／または筋ジストロフィーを含む骨格筋疾患、レッシュ−ナイハン症候群、および重症筋無力症の処置における小分子の薬剤標的として役に立ち得る。ＮＯＶ３ａ遺伝子はまた、心臓、副腎、膵臓、甲状腺、下垂体、および肝臓（２９〜３２でのＣＴ値）を含む代謝的に関連した他の組織でさらに中程度に発現される。
【０４１５】
ＮＯＶ３ａ遺伝子は、少なくとも視床、海馬、小脳、扁桃体において、脳で中程度に発現され、そして大脳皮質で高度に発現され、このことは、この遺伝子産物がＣＮＳで機能的な有意性をもつことを示す。ＮＯＶ３ａ遺伝子の産物は、シナプトフィジンファミリーの一員であるミツグミンと高い相同性がある。ミツグミンは、シナプス小胞および三つ組結合部を含む細胞内膜上で発現され、脱分極によって誘導される、細胞内のカルシウム放出を媒介する。研究は、大脳皮質での異常なニューロンのシグナル伝達に関与することが知られている精神分裂病が、シナプスの遺伝子（特に、シナプス前の遺伝子）の異常な発現を包含することを示している（参考文献３〜４）。シナプス小胞の可動化および脱分極に対するカルシウム反応は、潜在的にＮＯＶ３ａ遺伝子が関与するシナプス前後のシグナル伝達の事象である。したがって、ＮＯＶ３ａ遺伝子産物およびその機能を調節する薬剤は、精神分裂症のようなＣＮＳの疾患の処置に役に立ち得る。シナプスの機能はまた、癲癇、脳卒中、アルツハイマー病のような他の疾患、および他の神経変性の疾患で損なわれる。したがって、ＮＯＶ３ａ遺伝子の産物およびその機能を調節する薬剤は、同様に、これらのＣＮＳの処置に役に立ち得る。
【０４１６】
（パネル１．３Ｄの要約：）
（Ａｇ２２８４／Ａｇ２４５４）  ふたつの異なったプローブ／プライマーのセットを使用する実験の結果は、合理的に一致する。これらの結果はまた、パネル１．２で観察されたことと一致している。Ａｇ２２８４  ＮＯＶ３ａ遺伝子は、胎児の骨格筋（ＣＴ＝２６．３）および成人の骨格筋（ＣＴ＝２６．４）で最も高く発現される。非常に低いが有意な発現はまた、脂肪、精巣、子宮、卵巣、腎臓、心臓、甲状腺および副腎（ＣＴ＝３１〜３３）で検出される。Ａｇ２４５４この実験でのＮＯＶ３ａ遺伝子の発現は、胎児の骨格筋について最も高く、そしてほとんど独占的である（ＣＴ＝２９．５）。しかし、有意な発現はまた、成人の骨格筋でみられる（ＣＴ＝３３．４）。したがって、ＮＯＶ３ａ遺伝子の発現は、他の組織から骨格筋を区別するのに使用され得る。さらに、代償療法を介するこの遺伝子または遺伝子産物の治療モジュレーションは、筋肉疾患の再生治療として使用でき得る。
【０４１７】
（パネル２Ｄの要約：）
（Ａｇ１５０８／Ａｇ２４５４）  ふたつの異なるプローブ／プライマーのセットを使用する実験の結果は、合理的に一致する。パネル２でのＮＯＶ３ａ遺伝子の発現は、転移性の癌に隣接した筋肉組織のサンプルで最も高い。さらに、悪性の腎臓と比較した場合に、正常な腎臓組織では中程度の発現がある（ＣＴ３０〜３１）。したがって、この遺伝子の発現は、悪性の腎臓組織から正常な腎臓組織を区別するのに使用され得る。さらに、ＮＯＶ３ａ遺伝子産物の治療モジュレーションは、腎臓癌の処置に有用となる。
【０４１８】
（パネル４Ｄの要約：）
（Ａｇ２４５４）  このパネルでのＮＯＶ３ａ遺伝子の有意な発現は、胸腺に限られている（ＣＴ＝３３）。そのＮＯＶ３ａ遺伝子は、シナプトフィジンファミリーの一員であるミツグミンに相同性のあるタンパク質をコードする。シナプトフィジリンはまた、胸腺で発現され、そして分泌活性およびおそらく特定の小胞体系に関与すると考えられる（参考文献５）。したがって、ＮＯＶ３Ａ遺伝子産物に対して設計された治療薬物は、胸腺の機能を調節するのに重要であり得る。胸腺の機能を調節することは、次に、Ｔ細胞の発達および免疫機能を調節し得る。
【０４１９】
（パネル４．１Ｄの要約：）Ａｇ２２８４  このパネルでの有意な発現は、腎臓に限られている。この知見は、他のパネルで観察されたものと一致している。さらに、相同性のあるミツグミン２９遺伝子はまた、腎臓で発現され、そして分泌活性およびおそらく特定の小胞体系に関与すると考えられる（参考文献１）。したがって、ＮＯＶ３ａ遺伝子産物に対して設計された治療薬物は、腎臓の機能を調節するのに重要であり得る。
【０４２０】
（ＮＯＶ４）
ＮＯＶ４遺伝子の発現は、表２５、２６、および２７で記載されたＧｐｃｒ３８、Ａｇ９９８、およびＧｐｃｒ１０のプライマー−プローブのセットを使用して評価された。ＲＴＱ−ＰＣＲを実行した結果を、表２８、２９、３０、３１、３２、３３、および３４に示す。
【０４２１】
【表２５】
2004529607.tif 000119
【０４２２】
【表２６】
2004529607.tif 000120
【０４２３】
【表２７】
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【０４２４】
【表２８】
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【０４２５】
【表２９】
2004529607.tif 000124
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【０４２６】
【表３０】
2004529607.tif 000128
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2004529607.tif 000130
【０４２７】
【表３１】
2004529607.tif 000131
2004529607.tif 000132
2004529607.tif 000133
【０４２８】
【表３２】
2004529607.tif 000134
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【０４２９】
【表３３】
2004529607.tif 000137
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【０４３０】
【表３４】
2004529607.tif 000140
2004529607.tif 000141
2004529607.tif 000142
（パネル１の要約：）
（Ｇｐｃｒ１０）ＮＯＶ４遺伝子は、中枢神経系に由来するサンプルにおいて比較的高度に発現される。これらの組織の中では、視床、海馬、扁桃体および黒質において穏和な発現が検出されるが、脊髄、視床下部および小脳においてより低い発現が見られる（潜在的な有用性に対するパネル１．３Ｄの考察を参照のこと）。正常な組織の中では、結腸、腎臓、甲状腺、精巣および子宮において、ＮＯＶ４遺伝子発現はまた検出される。
【０４３１】
ＮＯＶ４遺伝子は、肺癌細胞株に由来するサンプルにおいてもっとも高度に発現され、そして肺癌細胞株に由来する他のサンプルにおいて有意な発現を示す。さらに、ＣＮＳ癌由来細胞株、卵巣癌細胞株、および膵臓癌細胞株において、この遺伝子の有意な発現があることは明白である。従って、ＮＯＶ４遺伝子産物の活性の治療的な調節は、この遺伝子発現のパターンに基づいて、ＣＮＳ悪性腫瘍（ｍａｌｉｇｎａｎｃｉｅｓ）、肺癌、膵臓癌および／または卵巣癌の処置において有用である。
【０４３２】
（パネル１．１の要約：）
（Ｇｐｃｒ１０／Ｇｐｃｒ３８）異なるプローブ／プライマーセットを用いて行われた３つの複製実験は、よく一致する結果を与えた。ＮＯＶ４遺伝子の強い発現は、扁桃体、小脳、海馬、黒質、視床および大脳皮質を含むＣＮＳにおいて再び観察される。脊髄においては、より低い発現レベルがまた見られる。この遺伝子はＳｌｉｔ−３に対する相同性を示し、そして脳優先的な発現を示す。これらのスリット（Ｓｌｉｔ）は、それらの細胞周辺レセプターとの相互作用を介するニューロン移動および軸索成長に抵抗し得る分泌ガイダンスタンパク質のファミリーであり、このファミリーを、通常、軸索、樹状突起および／または成長錐体（ｇｒｏｗｔｈ  ｃｏｎｅ）のための優れた候補ニューロンガイダンスタンパク質とする（参考文献２〜３）。このタンパク質のレベルの治療的な調節、またはこのタンパク質を介しての可能なシグナル伝達は、ニューロンの死（脳卒中、頭部外傷）、軸索損傷（脊髄損傷）、あるいは神経変性（アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンティングトン病、血管性痴呆症または任意の神経変性疾患）に対する、ＣＮＳにおける代償的なシナプス形成および繊維成長の増強／指向において有用であり得る。
【０４３３】
代謝関連組織の中では、胎児骨格筋、膵臓、および脳下垂体において、ＮＯＶ４遺伝子の発現が見られる。この観察は、治療的な調節が代謝性疾患（例えば、肥満、および、糖尿病ならびに神経内分泌性疾患）の処置を助け得ることを示唆する。糖タンパク質ホルモンは、特定の高親和性レセプターに結合することによって、卵巣、精巣および甲状腺の、発達および機能に影響する。興味深いことに、これらのレセプターの細胞外ドメインは、ロイシンリッチリピート（ＬＲＲ）タンパク質スーパーファミリーのメンバーであり、そして高親和性結合（参考文献１）の原因である。
【０４３４】
パネル１において観察されたことと同様に、ＮＯＶ４遺伝子は、肺癌細胞株由来のサンプルにおいて最も高度な発現を示し、そしてまた正常な肺制御に関する肺癌細胞株に由来する他のサンプルにおいて有意な過剰発現を示す。さらに、ＮＯＶ４遺伝子は、脳腫瘍由来細胞株によっても高度に発現され、脳腫瘍の発症および成長において可能な役割を示す。メラノーマ細胞株、ならびに、子宮組織および精巣組織において、ＮＯＶ４遺伝子の有意な発現があることは明白である。従って、ＮＯＶ４遺伝子産物の活性の治療的な調節は、この遺伝子発現のパターンに基づいて、ＣＮＳ悪性腫瘍、メラノーマおよび／または肺癌の処置において有用である。
【０４３５】
（パネル１．２の要約：）
（Ｇｐｃｒ１０）ＮＯＶ４遺伝子の発現は、このパネルの全てのサンプルにおいて、低い／検出不可能（ＣＴ値＞３５）である（データを示さず）。
【０４３６】
（パネル１．３Ｄの要約：）
（Ｇｐｃｒ１０／Ａｇ９９８）異なるプローブ／プライマーセットを用いて行われた２つの複製実験の結果であり、これらの結果は優れた一致を示す。ＮＯＶ４遺伝子は、大脳皮質において最も高度に発現され（ＣＴ＝３０）、そして、扁桃体、海馬、および視床を含む、他のＣＮＳ領域においても同様に穏和な発現を示す。このＮＯＶ４遺伝子は、ロイシンリッチリピートタンパク質をコードする。ロイシンリッチリピート（ＬＲＲ）は、可逆的なタンパク質−タンパク質相互作用を媒介し、そして細胞付着およびシグナル伝達を含む多様な細胞機能を有する。これらのタンパク質のいくつか（例えば、コネクチン（ｃｏｎｎｅｃｔｉｎ）、スリット、カオプチン（ｃｈａｏｐｔｉｎ）、およびトル（Ｔｏｌｌ））は、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａにおけるニューロン発達において中心的な役割を有し、そして、ニューロン発達において、およびヒトの成体の神経系において、有意ではあるが異なる役割を果し得る（参考文献２）。Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌｉａにおいて、軸索ガイダンスタンパク質のＬＲＲ領域は、それらの（特に軸索反発における）機能にとって重要であることが示されている。ＮＯＶ４遺伝子によってコードされるロイシンリッチリピートタンパク質は、大脳皮質において高度な発現を示すので、一般的に、軸索、樹状突起および／または成長錐体についての優れた候補ニューロンガイダンスタンパク質である。従って、このタンパク質のレベルの治療的な調節、またはこのタンパク質を介する可能なシグナル伝達は、ニューロンの死（脳卒中、頭部外傷）、軸索損傷（脊髄損傷）、または神経変性（アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンティングトン病、血管性痴呆症または任意の神経変性疾患）に対する、ＣＮＳにおける代償的なシナプス形成および繊維成長の増強／指向において有用であり得る。
【０４３７】
正常な組織の中では、甲状腺（ＣＴ＝３４）、胎児骨格筋（ＣＴ＝３３）、子宮（ＣＴ＝３２）および精巣（ＣＴ＝３３）においてもまた、ＮＯＶ４遺伝子の発現が見られる。さらに、ＣＮＳ癌由来細胞株および肺癌細胞株における発現の、強いクラスターが存在する。従って、ＮＯＶ４遺伝子産物の活性の治療的な調節は、この遺伝子発現のパターンに基づいて、ＣＮＳ悪性腫瘍または肺癌の処置において有用である。
【０４３８】
（パネル２Ｄの要約：）
（Ｇｐｃｒ１０／Ａｇ９９８）異なるプローブ／プライマーセットを用いて行われた２つの複製実験の結果であり、これらの結果は優れた一致を示す。ＮＯＶ４遺伝子は、メラノーマ転移（ＣＴ＝３０．９）由来のサンプルにおいて、もっとも高度に発現される。さらに、この遺伝子は、関連する癌組織と比較した場合、正常な腎臓および甲状腺において、より高度に発現されることが明白である。対照的に、ＮＯＶ４遺伝子は、正常な近接の組織と比較した場合、肺癌組織においてより高度に発現される。従って、このタンパク質産物自体の利用を介するか、または、遺伝子置換療法による、この遺伝子の活性の治療的な上方制御は、腎臓癌および甲状腺癌の処置において有用である。あるいは、抑制抗体または低分子薬剤の使用を介する、ＮＯＶ４遺伝子産物の活性の下方制御は、メラノーマまたは肺癌の処置において有用である。
【０４３９】
（パネル３Ｄの要約：）
（Ｇｐｃｒ１０／Ａｇ９９８）異なるプローブ／プライマーセットを用いて行われた２つの複製実験の結果であり、これらの結果は優れた一致を示す。このパネルにおける、ＮＯＶ４遺伝子のもっとも高度な発現は、小細胞肺癌（ＣＴ＝２９．１）に由来する細胞株において検出される。さらに、この遺伝子活性の抑制が肺癌の治療法において有用であることを示す、肺癌細胞株のクラスターにおける発現がある。この結果は、パネル１．３Ｄおよびパネル２Ｄにおいて観察されたものと一致する。
【０４４０】
（パネル４Ｄの要約：）
（Ｇｐｃｒ１０／Ａｇ９９８）異なるプローブ／プライマーセットを用いて行われた２つの複製実験の結果であり、これらの結果は優れた一致を示す。ＮＯＶ４転写は、ＰＭＡおよびイオノマイシン処理された好塩基球細胞株ＫＵ−８１２において誘導される。好塩基球はヒスタミン、および、アレルゲンに依存する（ｒｅｐｏｓｅ）他の生物学的修飾因子を放出し、そして、喘息および超過敏反応の病理において重要な役割を果す。従って、ＮＯＶ４遺伝子によってコードされる推定ロイシンリッチリピートタンパク質に対して治療的に設計された抗体は、これらの疾患における好塩基球機能をブロックすることによって、炎症を低下または阻害し得る。
【０４４１】
（パネルＣＮＳＤ．０１の要約：）
（Ｇｐｃｒ１０）ＮＯＶ４遺伝子は、皮質全体にわたって最も高度な発現を示し、黒質および淡蒼球においてはより低いレベルである。この結果は、パネル１、１．１、および１．３Ｄで観察されたものと一致する。さらに、このパネルに存在する、ＮＯＶ４遺伝子発現パターンと罹患サンプルとの間には、明白な関連はない。
【０４４２】
（ＮＯＶ５）
遺伝子ＮＯＶ５の発現を、プライマー−プローブセットＡｇ１４３９を用いて評価し、表３５に記載した。ＲＴＱ−ＰＣＲ実験の結果を、表３６、表３７、および表３８に示す。
【０４４３】
【表３５】
2004529607.tif 000143
【０４４４】
【表３６】
2004529607.tif 000144
2004529607.tif 000145
【０４４５】
【表３７】
2004529607.tif 000146
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2004529607.tif 000148
【０４４６】
【表３８】
2004529607.tif 000149
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2004529607.tif 000151
（パネル１．２の要約：）
（Ａｇ１４３９）ＮＯＶ５遺伝子の発現は、骨格筋（ＣＴ＝２４．２）においてもっとも高度である。しかし、この遺伝子の発現は非常に広範である。興味深いことに、ＮＯＶ５遺伝子発現は、正常な組織と比較して、癌細胞において優先的に見られ、そして特に卵巣癌細胞株および肺癌細胞株において、極めて高度な遺伝子発現が検出される。正常な培養細胞株は高度に増殖性であるので、この観察は、ＮＯＶ５遺伝子の発現が、休止細胞または静止（ｑｕｉｅｓｃｅｎｔ）細胞から増殖性細胞を区別するために用いられることを示し得る。さらに、この遺伝子産物の活性の治療的な調節は、卵巣癌および肺癌の処置において有用である。
【０４４７】
ＣＮＳ組織の中で、大脳皮質（ＣＴ＝２６．３）および海馬（ＣＴ＝２６．８）において、この遺伝子の高度な発現が検出される。扁桃体、小脳、視床および脊髄において、より穏和な発現がまた検出される。Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌｉａにおいて、軸索ガイダンスタンパク質のＬＲＲ領域は、（特に軸索反発における）機能にとって重要であることが示されている。ＮＯＶ５遺伝子は、予想されるロイシンリッチリピートを有するタンパク質をコードし、そのタンパク質を、通常、軸索、樹状突起および／または成長錐体に対する優れた候補のニューロンガイダンスタンパク質とする。従って、このタンパク質のレベルの治療的な調節、またはこのタンパク質を介する可能なシグナル伝達は、ニューロンの死（脳卒中、頭部外傷）、軸索損傷（脊髄損傷）、または神経変性（アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンティングトン病、血管性痴呆症または任意の神経変性疾患）に対する、ＣＮＳにおける代償的なシナプス形成および繊維成長の増強／指向において有用であり得る。このタンパク質はまた、レセプターのＧＰＣＲファミリーに対する相同性を含む。いくつかの神経伝達物質はＧＰＣＲであり、これらとして、ドーパミンレセプターファミリー、セロトニンレセプターファミリー、ＧＡＢＡＢレセプター、ムスカリン性アセチルコリンレセプターなどが挙げられ；従って、このＧＰＣＲは、新規の神経伝達物質レセプターを表し得る。種々の神経伝達物質レセプター（ドーパミン、セロトニン）の標的化は、精神医学的疾患（例えば、分裂病、双極性障害および鬱病）における有効な治療法であることが判明している。さらに、大脳皮質および海馬は、アルツハイマー病、癲癇において、および、記憶形成の正常なプロセスにおいて、重要な役割を果すことが公知である脳の領域である。この遺伝子またはそのタンパク質産物の治療的な調節は、この遺伝子によってコードされるレセプターの刺激および／または遮断のように、これらの疾患のうちの１つ以上において有益であり得る。しかし、この遺伝子のレベルは、中枢神経系の外部の領域（心臓、筋肉、肝臓および腎臓）において高く、細胞間シグナル伝達における、より広範な役割の可能性を示唆する。
【０４４８】
代謝関連組織の中で、ＮＯＶ５遺伝子は、心臓および胎児心臓（ＣＴ＝２５）、膵臓（ＣＴ＝３０）、副腎（ＣＴ＝２７）、甲状腺（ＣＴ＝２９）、脳下垂体（ＣＴ＝３１）、骨格筋（ＣＴ＝２４）、肝臓（ＣＴ＝２５）および胎児肝臓（ＣＴ＝２９）において発現される。従って、この遺伝子産物は、代謝組織における疾患（例えば、糖尿病および肥満）の処置のための低分子標的であり得る。
【０４４９】
（パネル２Ｄの要約：）
（Ａｇ１４３９）同一のプローブ／プライマーセットを用いる２つの複製実験の結果は、優れた一致を示す。パネル２ＤにおけるＮＯＶ５遺伝子の発現は、肝臓癌に由来するサンプルにおいて最高である（ＣＴ＝２９．３）。しかし、この遺伝子はまた、このパネル上のほかのサンプルの殆どにおいて、より穏和なレベルで発現される。ある場合に、疾患関連性を有する、発現の実質的な調節不全があることは明白である。例えば、ＮＯＶ５遺伝子の過剰発現は、卵巣癌、肝臓癌および胃癌と関連することが明白である。従って、この遺伝子の発現、またはその産物の機能の調節は、これらの癌の処置において有用である。
【０４５０】
（パネル４Ｄの要約：）
（Ａｇ１４３９）ＮＯＶ５遺伝子は、パネル４Ｄにわたる多数の細胞型において発現され、活性化Ｔｈ１細胞、活性化Ｔｈ２細胞、活性化Ｔ調節細胞、サイトカイン活性化および静止真皮繊維芽細ならびに肺繊維芽細胞、そしていくつかの供給源由来のサイトカイン活性化内皮において特に高度な発現が見られる。ＮＯＶ５遺伝子は、予想されるセリン−スレオニンキナーゼ活性を有するＬＲＲ／ＧＰＣＲをコードし、従って、自己免疫疾患および炎症性疾患の処置に対する低分子薬剤発見のための適切な標的であり得る。
【０４５１】
（ＮＯＶ６）
遺伝子ＮＯＶ６の発現を、プライマー−プローブセットＡｇ１４７１を用いて評価し、表３９に記載した。ＲＰＱ−ＰＣＲ実験の結果を表４０に示す。
【０４５２】
【表３９】
2004529607.tif 000152
2004529607.tif 000153
【０４５３】
【表４０】
2004529607.tif 000154
2004529607.tif 000155
（パネル１．２の要約：）
（Ａｇ１４７１）ＮＯＶ６遺伝子の発現は、このパネル上のサンプルの大部分において、高度〜穏和である。もっとも高度な発現は心臓（ＣＴ＝２２）において検出される。従って、この遺伝子は、心筋症、アテローム硬化、高血圧、先天性心臓欠損、大動脈狭窄、心房中隔欠損（ＡＳＤ）、房室（Ａ−Ｖ）管欠損、動脈管、肺動脈弁狭窄、大動脈弁下部狭窄、心室中隔欠損（ＶＳＤ）、弁病、結節硬化、強皮症、肥満、および移植を含む心血管疾患において役割を果し得る。さらに、ＮＯＶ６遺伝子は、胎児腎臓（ＣＴ＝２５．４）と比較した場合、成体腎臓（ＣＴ＝２２．４）において、より高度に発現する。従って、この遺伝子は、成体腎臓細胞の分化において作用し得、そしてＮＯＶ６遺伝子産物の治療的な調節は、腎臓の過剰増殖性疾患（例えば、多嚢胞性腎臓病）において有用である。
【０４５４】
ＮＯＶ６遺伝子は、核因子κＢインヒビターαと高度に相同であるタンパク質（炎症誘発性転写因子核因子κＢを阻害するタンパク質）をコードする。代謝関連組織の中で、この遺伝子は、胎児心臓および成体心臓（ＣＴ＝２２）、副腎（ＣＴ＝２２）、骨格筋（ＣＴ＝２２．５）ならびに胎児肝臓および成体肝臓（ＣＴ＝２３〜２４）において高度な発現を有する。これはまた、膵臓（ＣＴ＝２８）、甲状腺（ＣＴ＝２８）および脳下垂体（ＣＴ＝２８．５）において穏和に発現される。従って、ＮＯＶ６遺伝子産物（または、このタンパク質のアゴニスト）は、上記の組織の各々の炎症条件の予防および／または処置のための薬剤処置であり得る。
【０４５５】
ＮＯＶ６遺伝子はまた、脳（少なくとも、視床、大脳皮質、扁桃体、小脳、海馬および視床）ならびに脊髄において、高度に発現される。この遺伝子の、ＮＦ−κＢ（ＩκＢ）のインヒビターに対する密接な相同性は、この遺伝子がＣＮＳにおいて類似の機能を所有することを示唆する。ＩκＢは、酸化的ストレスまたはニトロソ化的ストレス、低酸素虚血および興奮毒性を含む多数の重要な病理的プロセスにおける、ニューロンのアポトーシスの重要な媒介因子である。これらのプロセスは、とりわけ、発作ならびに神経変性疾患（例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病）およびトリヌクレオチドリピート障害を含む多数の疾患の、心臓におけるニューロン細胞の死の基礎をなすと考えられる。従って、ＮＯＶ６遺伝子産物およびその作用を調節する薬剤は、これらの疾患の処置のための治療剤として作用し得る。さらに、学習および記憶の基礎をなすシナプスのプロセスにおけるＮＦ−κＢの役割は、記憶障害における、この遺伝子産物およびその作用を調節する薬剤の可能な有用性を示唆する。炎症におけるＮＦ−κＢの役割はまた、炎症を伴うＣＮＳ疾患（例えば、神経変性疾患（例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病およびハンティングトン病など））における、ＮＯＶ６遺伝子産物およびその作用を調節する薬剤の有用性を示唆する。
【０４５６】
（ＮＯＶ７）
遺伝子ＮＯＶ７の発現を、プライマー−プローブセットＡｇ２４４０を用いて評価し、表４１に記載した。ＲＴＱ−ＰＣＲ実験の結果を表４２および表４３に示す。
【０４５７】
【表４１】
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【０４５８】
【表４２】
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【０４５９】
【表４３】
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（パネル１．３Ｄの要約：）
（Ａｇ２４４０）ＮＯＶ７遺伝子の発現は、このパネル上の全てのサンプルにわたって、低い／検出不可能（ＣＴ値＞３５）である（データを示さず）。
【０４６０】
（パネル２Ｄの要約：）
（Ａｇ２４４０）ＮＯＶ７遺伝子の発現は、正常な腎臓組織（ＣＴ＝３０．８）でもっとも高度であり、そしてまた、結腸組織および乳房組織において、低いが有意な発現を示す。特に興味深いことに、この遺伝子のより高度な発現が、正常な乳房組織と比較した場合、乳癌に由来するサンプルにおいて観察される。従って、ＮＯＶ７遺伝子の発現は、正常な乳房組織から乳癌細胞を区別するために用いられ得る。さらに、低分子薬剤および抗体の使用を介する、ＮＯＶ７遺伝子によりコードされるタンパク質の治療的な調節は、乳癌の処置において有用であり得る。
【０４６１】
（パネル４Ｄの要約：）
（Ａｇ２４４０）ＮＯＶ７遺伝子の発現は、胸腺においてもっとも高度であるが、非常に穏やかである（ＣＴ  ３３．１）。従って、ＮＯＶ７遺伝子によりコードされる遺伝子産物に対するタンパク質治療法または抗体は、Ｔ細胞媒介疾患および自己免疫において有用であり得る。この遺伝子はまた、結腸（ＣＴ＝３３．９）において、低いレベルで発現される。
【０４６２】
（パネルＣＮＳ＿ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ＿ｖ１．０の要約：）  （Ａｇ２４４０）ＮＯＶ７遺伝子の発現は、このパネルの全てのサンプルにわたって、低い／検出不可能（ＣＴ値＞３５）である（データを示さず）。
【０４６３】
（ＮＯＶ８）
遺伝子ＮＯＶ８の発現を、プライマー−プローブセットＡｇ１５０７、Ａｇ１５５８、およびＡｇ１６０２（同一の配列）を用いて評価し、表４４に記載した。ＲＴＱ−ＰＣＲ実験の結果を表４５、表４６、および表４７に示す。
【０４６４】
【表４４】
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【０４６５】
【表４５】
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【０４６６】
【表４６】
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【０４６７】
【表４７】
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（パネル１．２  要約：）
（Ａｇ１５０７）  ＮＯＶ８遺伝子発現は、脂肪組織において最も高いようである。しかし、このサンプルは、ゲノムＤＮＡを混入しており、それゆえ、無視しなければならない。このことを考慮に入れると、この遺伝子は卵巣癌細胞株に由来するサンプルにおいて最も高く発現している（ＯＶＣＡＲ−５）（ＣＴ＝３２．５）。概して、正常組織と比較した場合、癌細胞株においてはＮＯＶ８遺伝子の過剰発現を示す顕著なパターンが存在する。例えば、卵巣癌細胞株、黒色腫細胞株、肺癌細胞株、腎臓癌細胞株、および結腸癌細胞株において、この遺伝子の相対的な過剰発現が見られる。それゆえ、ＮＯＶ８遺伝子の発現は、培養細胞株と正常細胞を区別するために用いられ得る。加えて、これらのデータは、この遺伝子の発現が癌に関連していることを示しており、それゆえ、ＮＯＶ８遺伝子産物の治療的調節は、様々な癌の処置において有用である。
【０４６８】
（パネル１．３  要約：）
（Ａｇ１５０７／Ａｇ１５５８／Ａｇ１６０２）  ＮＯＶ８遺伝子の発現は、このパネルにおけるサンプルの全てを通して低い／検出不可能である（ＣＴ値＞３５）（データは示さず）。
【０４６９】
（パネル２Ｄ  要約：）
Ａｇｌ６０２  ＮＯＶ８遺伝子の有意な発現は、正常肺のサンプルに限られる（ＣＴ＝３４．２）。従って、ＮＯＶ８核酸は、肺組織を同定する為のマーカーとして用いられ得る。加えて、ＮＯＶ８遺伝子は、ぜん息および気腫を含む肺疾患の発症に役割を果たし得る。Ａｇｌ５０７／Ａｇｌ５５８  ＮＯＶ８遺伝子の発現は、このパネルにおけるサンプルの全てを通して低い／検出不可能である（ＣＴ値＞３４．５）（データは示さず）。
【０４７０】
（パネル４Ｄ  要約：）
（Ａｇｌ５０７／Ａｇｌ５５８）  ＮＯＶ８遺伝子の発現は、活性化された皮膚線維芽細胞およびＰＨＡ刺激されたＰＢＭＣにおいて、低いが、有意である（ＣＴ  ３４．４）。Ａｇｌ５０７を用いる実験からの結果は、発現が活性化小気道上皮においても見られることを除いてＡｇ１５５８と極めて似ている（ＣＴ  ３４．６）。この結果は、パネル２Ｄにおいて観察されたことと一致している。ＮＯＶ８遺伝子がセロトニンレセプターに相同性を有するタンパク質をコードしていることから、小気道上皮における発現が予測される。従って、抗体の使用またはこのレセプターの細胞外ドメインは、ぜん息、湿疹、アトピー性皮膚炎、および遅延型過敏症に関連した任意の疾患などの対立遺伝子ギー疾患の治療に対して有益であり得る。  Ａｇｌ６０２  ＮＯＶ８遺伝子の発現は、このパネルにおけるサンプルの全てを通して低い／検出不可能である（ＣＴ値＞３４．５）（データは示さず）。
【０４７１】
（パネル  ＣＮＳＤ．０１の要約：）
（Ａｇ１６０２）  ＮＯＶ８遺伝子の発現は、このパネルにおけるサンプルの全てを通して低い／検出不可能である（ＣＴ値＞３４．５）（データは示さず）。
【０４７２】
（パネル  ＣＮＳ＿神経変性＿ｖ１．０（ＣＮＳ＿ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ＿ｖ１．０）の要約：）
（Ａｇｌ５０７／Ａｇｌ５５８／Ａｇｌ６０２）  ＮＯＶ８遺伝子の発現は、このパネルにおけるサンプルの全てを通して低い／検出不可能である（ＣＴ値＞３４．５）（データは示さず）。
【０４７３】
（実施例２．  ＮＯＶＸクローンのＳＮＰ分析）
ＳｅｑＣａｌｌｉｎｇＴＭ技術：ｃＤＮＡは、異なったドナーからの、多数の組織型、正常および疾患状態、生理学的状態、ならびに発達段階を表す様々なヒトサンプルに由来した。サンプルを、全組織、細胞株、初代細胞または組織培養した初代細胞および細胞株として得た。細胞および細胞株は、遺伝子発現を制御する生物学的薬剤または化学的薬剤（例えば、増殖因子、ケモカイン、ステロイド）によって処置され得る。次に、このようにして得られたｃＤＮＡを、ＣｕｒａＧｅｎの所有するＳｅｑＣａｌｌｉｎｇ技術を用いて配列決定した。配列決定の結果を、手動で評価し、適切な場合には、補正のために編集された。全てのサンプルからのｃＤＮＡ配列を、ＳｅｑＣａｌｌｉｎｇアセンブリのＣｕｒａＧｅｎ’ｓヒトＳｅｑＣａｌｌｉｎｇデータベースを生み出すために、バイオインフォマティクスプログラムを用い、それ自体および公的ＥＳＴを用いてアセンブル（構築）した。それぞれのアセンブリは、１つ以上のヒトサンプルに由来する１つ以上の重複するｃＤＮＡ配列を含む。フラグメントおよびＥＳＴを、アセンブリの別の成分に対する同一性の程度が、５０塩基に対して少なくとも９５％である場合、アセンブリのための成分として含めた。それぞれのアセンブリは、ある遺伝子および／またはスプライス形態などのその改変体および／または一塩基多型（ＳＮＰ）ならびにそれらの組み合わせを表し得る。
【０４７４】
改変体配列が含まれる。改変体配列は、一塩基多型（ＳＮＰ）を含み得る。ＳＮＰは、ある場合、ＳＮＰを含むヌクレオチド配列がｃＤＮＡを起源とすることを表すために、「ｃＳＮＰ」といわれ得る。ＳＮＰは、いくつかの様式において生じ得る。例えば、ＳＮＰは、多型部位における一ヌクレオチドの別のヌクレオチドへの置換を原因とし得る。このような置換は、トランジションまたはトランスバージョンのいずれかであり得る。ＳＮＰはまた、参照対立遺伝子に対するヌクレオチドの欠失またはヌクレオチドの挿入により生じ得る。この場合、多型部位は、１つの対立遺伝子がもう１つの対立遺伝子における特定のヌクレオチドに対してギャップを有する部位である。遺伝子内に生じるＳＮＰは、ＳＮＰの位置において、遺伝子によってコードされるアミノ酸に変化を生じ得る。しかし、遺伝子内のＳＮＰはまた、ＳＮＰを含むコドンが、遺伝コードの重複性の結果、同じアミノ酸をコードする場合、サイレントであり得る。遺伝子の領域の外側または遺伝子内のイントロンに生じるＳＮＰは、タンパク質のいずれのアミノ酸配列にも変化を生じないが、発現パターンの調節、例えば、一過性発現、生理学的応答調節、細胞型発現調節、発現の強度、転写されるメッセージの安定性に変化を生じ得る。
【０４７５】
新規なＳＮＰ同定の方法：ＳＮＰは、ＣｕｒａＧｅｎの所有するＳＮＰ  Ｔｏｏｌアルゴリズムを用いて配列アセンブリを解析することによって同定される。ＳＮＰ  Ｔｏｏｌは、次の基準に対してアセンブリにおける変動を同定する：ＳＮＰは、アライメントの両端における１０塩基対以内では解析されない；ウィンドウサイズ（一覧における塩基の数）が１０である；ウィンドウにおけるミスマッチの許容数が２である；最小ＳＮＰ塩基性質（ＰＨＲＥＤスコア）が２３である；ＳＮＰをスコア付けするための変化の最小数が、アセンブリ位置あたり２である。ＳＮＰ  Ｔｏｏｌは、アセンブリを解析し、ＳＮＰ位置、アセンブリにおける関連付けられた個々の改変体配列、与えられた位置におけるアセンブリの深度、想定されるアセンブリ対立遺伝子頻度、およびＳＮＰ配列変動を表示する。次に、配列決定の結果を選択し、手動で確認するために表示する。コンセンサスアセンブリ配列を、ＳＮＰ配列変動に由来する潜在的なアミノ酸変化を同定するために、改変体の配列変化とともにＣｕｒａＴｏｏｌｓにインポートする。次に、包括的ＳＮＰデータ解析を、ＳＮＰＣａｌｌｉｎｇデータベースにエクスポートする。
【０４７６】
新規なＳＮＰ確認の方法：ＳＮＰを、Ｐｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ（Ｐｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ，Ｗｅｓｔｂｏｒｏｕｇｈ，ＭＡ）として知られる確証方法を使用し、確認する。Ｐｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇに関する詳細なプロトコールは次の文献に見出され得る：Ａｌｄｅｒｂｏｒｎら、Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｉｎｇｌｅ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ  ｂｙ  Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  Ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ．（２０００）．Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ．１０，８号，８月．１２４９−１２６５。一言でいえば、Ｐｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇは、遺伝子型決定のリアルタイムプライマー伸長プロセスである。このプロトコールは、ゲノムＤＮＡサンプルから二本鎖の、ビオチン化されたＰＣＲ産物を得、それらをストレプトアビジンビーズに結合させる。次に、一本鎖の結合したＤＮＡを生み出すために、これらのビーズを変性させる。ＳＮＰは、ＤＮＡ鎖伸長においてそれぞれのｄＮＴＰから放出されるピロリン酸（ＰＰｉ）の間接的生物発光測定アッセイに基づく技術を用いて特徴づけられる。Ｋｌｅｎｏｗポリメラーゼを介する塩基の取り込みに続き、ＰＰｉが放出され、アデノシン５’−ホスホ硫酸（ＡＰＳ）と共に、ＡＴＰの形成を生じるＡＴＰ硫酸基転移酵素の基質として用いられる。続いて、ＡＴＰは、ルシフェラーゼの作用によって、そのルシフェリンの酸化誘導体（ｏｘｉ−ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ）への変換を達成する。その後の光出力は、約４塩基までは付加した塩基の数に比例する。この方法のプロセッシビティー（ｐｒｏｃｅｓｓｉｖｉｔｙ）を得るために、過剰のｄＮＴＰを、アピラーゼによって分解し（アピラーゼは開始反応混合液中にも存在する）、よってｄＮＴＰだけが配列決定中に鋳型に付加される。本工程は、完全に自動化され、９６ウェル形式に適合されており、それゆえ大ＳＮＰパネルの迅速なスクリーニングが可能である。新規の一ヌクレオチド多型改変体に関するＤＮＡ配列およびタンパク質配列が報告される。改変体は個別に報告されるが、改変体の全てまたは選択部分集合のいずれの組み合わせもまた、含まれる。加えて、改変塩基および改変アミノ酸残基の位置に下線が引かれる。
【０４７７】
（結果）
改変体は個別に報告されるが、改変体の全てまたは選択部分集合のいずれの組み合わせもまた、意図された本発明のＮＯＶＸ実施形態として含まれる。
【０４７８】
（ＮＯＶ１ａ  ＳＮＰデータ：）
ＮＯＶ１ａ（ｃｌｏｎｅ  ｓｇｇｃ＿ｄｒａｆｔ＿ｄｊ８８１ｐｌ９＿２００００７２５）は、７つのＳＮＰ改変体を有し、そのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列に関する改変位置は、それぞれ、配列番号：１および配列番号：２に従って番号付けされる。ＮＯＶ１改変体のヌクレオチド配列は、表４８に示されるように異なる。
【０４７９】
【表４８】
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さらに、ＮＯＶ１ａ（Ｘ５６８４２＿ｄａｌ）は、７つのＳＮＰ改変体を有し、ヌクレオチド配列およびアミノ酸配列に関する改変位置は、それぞれ、配列番号：１および配列番号：２に従って番号付けされる。ＮＯＶ１改変体のヌクレオチド配列は、表４９に示されるように異なる。
【０４８０】
【表４９】
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（ＮＯＶ１ｂ  ＳＮＰデータ：）
ＮＯＶ１ｂは、７つのＳＮＰ改変体を有し、そのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列に関する改変位置は、それぞれ、配列番号：３および配列番号：４に従って番号付けされる。ＮＯＶ１ｂ改変体のヌクレオチド配列は、表５０に示されるように異なる。
【０４８１】
【表５０】
2004529607.tif 000174
（ＮＯＶ３ａ  ＳＮＰ  データ：）
ＮＯＶ３ａは、  ７つのＳＮＰ改変体を有し、そのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列に関する改変位置は、それぞれ、配列番号：１３および配列番号：１４に従って番号付けされる。ＮＯＶ３ａ改変体のヌクレオチド配列は、表５１に示されるように異なる。
【０４８２】
【表５１】
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（ＮＯＶ４ａ  ＳＮＰデータ：）
次の位置において、ヌクレオチド配列の１つ以上のコンセンサス位置（Ｃｏｎｓ．Ｐｏｓ．）が、ＳＮＰとして同定された。「深度」は、ＳＮＰの領域を含むクローンの数を表す。想定される対立遺伝子頻度（Ｐｕｔａｔｉｖｅ  Ａｌｌｅｌｅ  Ｆｒｅｑ．）は、ＳＮＰを含む全てのクローンのフラクションである。ダッシュ（「―」）は、示される場合、塩基が存在しないことを意味する。記号「＞」は、「変化している」を意味する。
【０４８３】
ＮＯＶ４ａは、１つのＳＮＰ改変体を有し、そのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列に関する改変位置は、それぞれ、配列番号：１７および配列番号：１８に従って番号付けされる。ＮＯＶ３改変体のヌクレオチド配列は、表５２に示されるように異なる。
【０４８４】
【表５２】
2004529607.tif 000176
（ＮＯＶ４ｂ  ＳＮＰ  データ：）
ＮＯＶ４ｂは、４つのＳＮＰ改変体を有し、そのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列に関する改変位置は、それぞれ、配列番号：１９および配列番号：２０に従って番号付けされる。ＮＯＶ４ｂ改変体のヌクレオチド配列は、表５３に示されるように異なる。
【０４８５】
【表５３】
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（ＮＯＶ６  ＳＮＰ  データ：）
ＮＯＶ６は、３つのＳＮＰ改変体を有し、そのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列に関する改変位置は、それぞれ、配列番号：２５および配列番号：２６に従って番号付けされる。ＮＯＶ６改変体のヌクレオチド配列は、表５４に示されるように異なる。
【０４８６】
【表５４】
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（ＮＯＶ９  ＳＮＰ  データ：）
次の位置において、ヌクレオチド配列の１つ以上のコンセンサス位置（Ｃｏｎｓ．Ｐｏｓ．）が、ＳＮＰとして同定された。「深度」は、ＳＮＰの領域を覆うクローンの数を表す。想定される対立遺伝子頻度（Ｐｕｔａｔｉｖｅ  Ａｌｌｅｌｅ  Ｆｒｅｑ．）は、ＳＮＰを含む全てのクローンのフラクションである。ダッシュ（「―」）は、示される場合、塩基が存在しないことを意味する。記号「＞」は、「変化している」を意味する。
【０４８７】
ＮＯＶ９は、６つのＳＮＰ改変体を有し、そのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列に関する改変位置は、それぞれ、配列番号：３１および配列番号：３２に従って番号付けされる。ＮＯＶ６改変体のヌクレオチド配列は、表５５に示されるように異なる。
【０４８８】
【表５５】
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（等価物）
特定の実施形態が、本明細書中に詳細に開示されるが、このことは例示のみの目的のために例によってなされ、上記の添付の特許請求の範囲の範囲に関して限定する意図はない。特に、様々な置換、変更、および改変が、特許請求の範囲によって規定されるような本発明の精神および範囲から逸脱せず、本発明に対してなされ得る。核酸出発物質、目的のクローン、またはライブラリー型の選択は、本明細書中に記載される実施形態に関する知識を有する当業者にとって慣用的な事項であると考えられる。他の局面、利点、および改変は、上記の特許請求の範囲の範囲内にあるとみなされる。
【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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