(57)【要約】ガン、その中でも胃腸腺ガンと食道腺ガンの診断法または予後予測法を開示する。特に、本発明により、胃腸腺ガン、食道腺ガン、バレット食道、正常な扁平粘膜上皮において、どの遺伝子が高メチル化され、どの遺伝子がメチル化されていないかなどを調べるＣｐＧ島の標準的なメチル化アッセイによって検査することのできるメチル化パターンが提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
組織サンプルからガンまたはガン関連疾患を診断する方法であって、
（ａ）診断する検査組織または検査領域から組織サンプルを取得し、
（ｂ）その組織サンプルのメチル化アッセイを行なって、ＡＰＣ、ＡＲＦ、ＣＡＬＣＡ、ＣＤＨ１、ＣＤＫＮ２Ａ、ＣＤＫＮ２Ｂ、ＥＳＲ１、ＧＳＴＰ１、ＨＩＣ１、ＭＧＭＴ、ＭＬＨ１、ＭＹＯＤ１、ＲＢ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＨＢＳ１、ＴＩＭＰ３、ＣＴＮＮＢ１、ＰＴＧＳ２、ＴＹＭＳおよびＭＴＨＦＲ、ならびにこれらの組み合わせからなるグループの中から選択した少なくとも１つの遺伝子配列内に位置するゲノムＣｐＧ配列のメチル化状態を決定し、
（ｃ）少なくとも部分的に、上記ゲノムＣｐＧ配列のメチル化状態に基づいて、ガンの診断または予後予測を行なう操作を含む方法。
【請求項２】
ＡＰＣ、ＡＲＦ、ＣＡＬＣＡ、ＣＤＨ１、ＣＤＫＮ２Ａ、ＣＤＫＮ２Ｂ、ＥＳＲ１、ＧＳＴＰ１、ＨＩＣ１、ＭＧＭＴ、ＭＬＨ１、ＭＹＯＤ１、ＲＢ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＨＢＳ１、ＴＩＭＰ３、ＣＴＮＮＢ１、ＰＴＧＳ２およびＴＹＭＳからなるグループの中から選択した少なくとも１つの遺伝子配列内に位置するゲノムＣｐＧ配列が、ＣｐＧ島のゲノムＣｐＧ配列に対応している、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ＡＰＣ、ＡＲＦ、ＣＡＬＣＡ、ＣＤＨ１、ＣＤＫＮ２Ａ、ＣＤＫＮ２Ｂ、ＥＳＲ１、ＧＳＴＰ１、ＨＩＣ１、ＭＧＭＴ、ＭＬＨ１、ＭＹＯＤ１、ＲＢ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＨＢＳ１、ＴＩＭＰ３、ＣＴＮＮＢ１、ＰＴＧＳ２、ＴＹＭＳおよびＭＴＨＦＲの遺伝子配列が、表ＩＩに掲載した配列番号１〜６０、６４および６５に対応する特異的オリゴヌクレオチド・プライマーまたはプローブ、あるいはその一部によって規定される配列である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
上記ＣｐＧ島が、ＡＰＣ、ＡＲＦ、ＣＡＬＣＡ、ＣＤＨ１、ＣＤＫＮ２Ａ、ＣＤＫＮ２Ｂ、ＥＳＲ１、ＧＳＴＰ１、ＨＩＣ１、ＭＧＭＴ、ＭＬＨ１、ＭＹＯＤ１、ＲＢ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＨＢＳ１、ＴＩＭＰ３、ＣＴＮＮＢ１、ＰＴＧＳ２およびＴＹＭＳの遺伝子のうちの１つまたはそれ以上のプロモーター領域内に存在している、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
ＡＰＣ、ＡＲＦ、ＣＡＬＣＡ、ＣＤＨ１、ＣＤＫＮ２Ａ、ＣＤＫＮ２Ｂ、ＥＳＲ１、ＧＳＴＰ１、ＨＩＣ１、ＭＧＭＴ、ＭＬＨ１、ＭＹＯＤ１、ＲＢ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＨＢＳ１、ＴＩＭＰ３、ＣＴＮＮＢ１、ＰＴＧＳ２およびＴＹＭＳの遺伝子の配列が、表ＩＩに掲載した配列番号１〜５４、５８〜６０、６４および６５に対応する特異的オリゴヌクレオチド・プライマーまたはプローブ、あるいはその一部によって規定される配列と関係した任意のＣｐＧ島配列に対応しており、関係した上記ＣｐＧ島配列が、配列番号１〜５４、５８〜６０、６４および６５に対応する特異的オリゴヌクレオチド・プライマーおよびプローブによって規定される配列の少なくとも１つのヌクレオチドを含み、ＣｐＧジヌクレオチドの頻度が観測値／予測値の比＞０．６に対応することと、ＧＣ含量＞０．５であることの両方の条件を満たす、ゲノムＤＮＡの隣接配列である、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
上記ゲノムＣｐＧ配列が、ＡＰＣ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＭＹＯＤ１、ＣＡＬＣＡ、ＥＳＲ１、ＭＧＭＴおよびＴＩＭＰ３、ならびにこれらの組み合わせからなるグループの中から選択した少なくとも１つの遺伝子配列内に位置する、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
ＡＰＣ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＭＹＯＤ１、ＣＡＬＣＡ、ＥＳＲ１、ＭＧＭＴおよびＴＩＭＰ３からなるグループの中から選択した少なくとも１つの遺伝子配列内に位置する上記ゲノムＣｐＧ配列が、ＣｐＧ島のゲノムＣｐＧ配列に対応する、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
ＡＰＣ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＭＹＯＤ１、ＣＡＬＣＡ、ＥＳＲ１、ＭＧＭＴおよびＴＩＭＰ３の遺伝子配列が、それぞれ、表ＩＩに掲載した配列番号１９〜２１、配列番号１〜３、配列番号７〜９、配列番号１０〜１２、配列番号４〜６、配列番号１６〜１８および配列番号１３〜１５に対応する特異的オリゴヌクレオチド・プライマーおよびプローブによって規定される配列である、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
上記ＣｐＧ島が、ＡＰＣ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＭＹＯＤ１、ＣＡＬＣＡ、ＥＳＲ１、ＭＧＭＴおよびＴＩＭＰ３の遺伝子のうちの１つまたはそれ以上のプロモーター領域内に存在している、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
ＡＰＣ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＭＹＯＤ１、ＣＡＬＣＡ、ＥＳＲ１、ＭＧＭＴおよびＴＩＭＰ３の遺伝子配列が、それぞれ、表ＩＩに掲載した配列番号１９〜２１、配列番号１〜３、配列番号７〜９、配列番号１０〜１２、配列番号４〜６、配列番号１６〜１８および配列番号１３〜１５に対応する特異的オリゴヌクレオチド・プライマーおよびプローブ、またはその一部によって規定される配列と関係した任意のＣｐＧ島配列に対応しており、関係した上記ＣｐＧ島配列が、配列番号１９〜２１、配列番号１〜３、配列番号７〜９、配列番号１０〜１２、配列番号４〜６、配列番号１６〜１８および配列番号１３〜１５に対応する特異的オリゴヌクレオチド・プライマーおよびプローブによって規定される配列の少なくとも１つのヌクレオチドを含み、ＣｐＧジヌクレオチドの頻度が観測値／予測値の比＞０．６に対応することと、ＧＣ含量＞０．５であることの両方の条件を満たす、ゲノムＤＮＡ中の隣接配列である、請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
上記のガンまたはガン関連疾患を、胃腸腺ガンまたは食道腺ガン、胃腸異形成または食道異形成、胃腸化成または食道化成、バレット腸組織、正常な食道扁平粘膜上皮の前ガン疾患、およびこれらの組み合わせからなるグループの中から選択する、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
上記ガンが食道腺ガンであり、そしてゲノムＣｐＧ配列のメチル化状態に基づいてガンの診断または予後予測をすることにより、その腺ガンの悪性度またはステージを分類する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
上記のガンまたはガン関連疾患を、胃腸腺ガンまたは食道腺ガン、胃腸異形成または食道異形成、胃腸化成または食道化成、バレット腸組織、正常な食道扁平粘膜上皮の前ガン疾患、およびこれらの組み合わせからなるグループの中から選択する、請求項６に記載の方法。
【請求項１４】
上記ガンが食道腺ガンであり、その場合、ゲノムＣｐＧ配列のメチル化状態に基づいてガンの診断または予後予測をすることにより、その腺ガンの悪性度またはステージを分類する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
ゲノムＣｐＧ配列のメチル化状態を明らかにするのに用いるメチル化アッセイを、“メチライト（商標）”、Ｍｓ−ＳＮｕＰＥ、ＭＳＰ、ＣＯＢＲＡ、ＭＣＡおよびＤＭＨ、ならびにこれらの組み合わせからなるグループの中から選択する、請求項２に記載の方法。
【請求項１６】
ゲノムＣｐＧ配列のメチル化状態を明らかにするのに用いるメチル化アッセイを、“メチライト（商標）”、Ｍｓ−ＳＮｕＰＥ、ＭＳＰ、ＣＯＢＲＡ、ＭＣＡおよびＤＭＨ、ならびにこれらの組み合わせからなるグループの中から選択する、請求項６に記載の方法。
【請求項１７】
ゲノムＣｐＧ配列のメチル化状態を明らかにするのに用いるメチル化アッセイの少なくとも一部が、ＡＰＣ、ＡＲＦ、ＣＡＬＣＡ、ＣＤＨ１、ＣＤＫＮ２Ａ、ＣＤＫＮ２Ｂ、ＥＳＲ１、ＧＳＴＰ１、ＨＩＣ１、ＭＧＭＴ、ＭＬＨ１、ＭＹＯＤ１、ＲＢ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＨＢＳ１、ＴＩＭＰ３、ＣＴＮＮＢ１、ＰＴＧＳ２、ＴＹＭＳおよびＭＴＨＦＲからなるグループの中から選択した少なくとも１つの遺伝子配列内に位置するＣｐＧ含有配列を含んで成るアレイまたはマイクロアレイに基づいている、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
ＡＰＣ、ＡＲＦ、ＣＡＬＣＡ、ＣＤＨ１、ＣＤＫＮ２Ａ、ＣＤＫＮ２Ｂ、ＥＳＲ１、ＧＳＴＰ１、ＨＩＣ１、ＭＧＭＴ、ＭＬＨ１、ＭＹＯＤ１、ＲＢ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＨＢＳ１、ＴＩＭＰ３、ＣＴＮＮＢ１、ＰＴＧＳ２およびＴＹＭＳの遺伝子配列が、表ＩＩに掲載した配列番号１〜５４、５８〜６０、６４および６５に対応する特異的オリゴヌクレオチド・プライマーまたはプローブ、またはその一部によって規定される配列と関係した任意のＣｐＧ島配列に対応しており、関係した上記ＣｐＧ島配列が、配列番号１〜５４、５８〜６０、６４および６５に対応する特異的オリゴヌクレオチド・プライマーおよびプローブによって規定される配列の少なくとも１つのヌクレオチドを含み、ＣｐＧジヌクレオチドの頻度が観測値／予測値の比＞０．６に対応することと、ＧＣ含量＞０．５であることの両方の条件を満たす、ゲノムＤＮＡの隣接配列である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
ＡＰＣ、ＡＲＦ、ＣＡＬＣＡ、ＣＤＨ１、ＣＤＫＮ２Ａ、ＣＤＫＮ２Ｂ、ＥＳＲ１、ＧＳＴＰ１、ＨＩＣ１、ＭＧＭＴ、ＭＬＨ１、ＭＹＯＤ１、ＲＢ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＨＢＳ１、ＴＩＭＰ３、ＣＴＮＮＢ１、ＰＴＧＳ２、ＴＹＭＳおよびＭＴＨＦＲの遺伝子配列が、表ＩＩに掲載した配列番号１〜６０、６４および６５に対応する特異的オリゴヌクレオチド・プライマーおよびプローブ、またはその一部によって規定される配列、あるいはこれらに対応する配列である、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
決定されるゲノムＣｐＧ配列のメチル化状態が、高メチル化、低メチル化または正常なメチル化である、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
ガンまたはガン関連疾患を診断するのに役立つキットであって、
（ａ）ＡＰＣ、ＡＲＦ、ＣＡＬＣＡ、ＣＤＨ１、ＣＤＫＮ２Ａ、ＣＤＫＮ２Ｂ、ＥＳＲ１、ＧＳＴＰ１、ＨＩＣ１、ＭＧＭＴ、ＭＬＨ１、ＭＹＯＤ１、ＲＢ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＨＢＳ１、ＴＩＭＰ３、ＣＴＮＮＢ１、ＰＴＧＳ２、ＴＹＭＳおよびＭＴＨＦＲからなるグループの中から選択した少なくとも１つの遺伝子配列内に位置する配列の任意の領域とハイブリダイズするプローブまたはプライマーを含む容器と、
（ｂ）メチル化されたＣｐＧを含む核酸の検出の少なくとも一部を、このプローブまたはプライマーに基づいて行なうのに必要な標準的メチル化アッセイ用添加試薬とを含んで成る１または複数の容器を含む担持手段を有するキット。
【請求項２２】
上記標準的メチル化アッセイ用添加試薬が、“メチライト（商標）”、ＭＳ−ＳＮｕＰＥ、ＭＳＰ、ＣＯＢＲＡ、ＭＣＡおよびＤＭＨ、ならびにこれらの組み合わせからなるグループの中から選択した、メチル化アッセイを行なうための標準的な試薬である、請求項２１に記載のキット。
【請求項２３】
上記プローブまたはプライマーが、表ＩＩに掲載した配列番号１〜６０、６４および６５からなるグループの中から選択した配列の少なくとも約１２〜１５個のヌクレオチドを含んで成る、請求項２１に記載のキット。
【請求項２４】
ガンまたはガン関連疾患を診断するのに役立つキットであって、
（ａ）配列番号１〜６０、６４、６５からなるグループの中から選択した配列の少なくとも約１２〜１５個のヌクレオチドからなる配列と、配列番号１〜５４、５８〜６０、６４および６５と関係したＣｐＧ島配列内に位置する任意の配列とを含んで成るアレイまたはマイクロアレイ、を含んで成る１または複数の容器を含む担持手段を有するキット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
〔発明の属する技術分野〕
関連出願の相互参照
本出願は、「ＥＰＩＧＥＮＥＴＩＣ ＳＥＱＵＥＮＣＥＳ ＦＯＲ ＥＳＯＰＨＡＧＥＡＬ ＡＤＥＮＯＣＡＲ−ＣＩＮＯＭＡ」という名称で２０００年３月３１日に出願されたアメリカ合衆国仮特許出願番号第０６／１９３，８３９号に対する優先権を主張する。
【０００２】
連邦政府から資金援助を受けた研究であることに関する宣言
この研究は、Ｐ．Ｗ．Ｌ．に対するＮＩＨ／ＮＣＩ助成金Ｒ０１ ＣＡ ７５０９０の援助を受けた。アメリカ合衆国は、３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．§２０２（ｃ）（６）に従い、本発明において所定の権利を有する。
【０００３】
本発明の技術分野
本発明は、胃腸腺ガン、中でも食道腺ガン（“ＥＡＣ”）の診断的または予後的なアッセイを提供する。さらに詳細には、本発明は、ＣｐＧ島のメチル化状態を調べる標準的なメチル化アッセイによって検査で、且つ胃腸ガン、正常な扁平上皮細胞、およびＥＡＣの中の２つ以上の遺伝子の相対的メチル化状態を含んで成る多遺伝子後成的フィンガープリントまたはメチル化パターンを提供する。
【０００４】
本発明の背景
ＤＮＡのメチル化とガン。ＤＮＡのメチル化パターンは、ヒトのガンにおいてしばしば変化している。これらのメチル化の変化には、ゲノム全体での低メチル化や、部分的高メチル化が含まれる（ＪｏｎｅｓとＬａｉｒｄ、Ｎａｔ． Ｇｅｎｅｔ．、第２１巻、１６３〜１６７ページ、１９９９年）。正常な組織ではＣｐＧ島は一般にメチル化されないが、ガン細胞における異常な高メチル化は、このＣｐＧ島においてしばしば起こる。プロモーターＣｐＧ島（すなわち遺伝子のプロモーター領域に位置するＣｐＧ島）の高メチル化は、ヒトの多くのタイプのガンにおける転写サイレンシングと関係している。
【０００５】
遺伝子のメチル化パターンからは、ガン細胞に関するさまざまな種類の有用な情報を得ることができる。第１に、それぞれのタイプの腫瘍（すなわち乳ガン、結腸ガン、食道ガンなど）には、メチル化されやすい特徴的な遺伝子群がある（Ｃｏｓｔｅｌｌｏ他、Ｎａｔ． Ｇｅｎｅｔ．、第２４巻、１３２〜１３８ページ、２０００年）。例えばＲＢ１は、網膜芽細胞腫で高メチル化されている（Ｓｔｉｒｚａｋｅｒ他、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、第５７巻、２２２９〜２２３７ページ、１９９７年；Ｓａｋａｉ他、Ａｍ． Ｊ． Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅｔ．、第４８巻、８８０〜８８８ページ、１９９１年）が、急性骨髄性白血病ではそうなっていない（ＫｏｒｎｂｌａｕとＱｉｕ、Ｌｅｕｋ． Ｌｙｍｐｈｏｍａ、第３５巻、２８３〜２８８ページ、１９９９年；Ｍｅｌｋｉ他、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、第５９巻、３７３０〜３７４０ページ、１９９９年）ことが知られている。
【０００６】
第２に、一人の患者の個々の腫瘍は、別の患者の同じタイプの腫瘍と比べると、その腫瘍の進行度を反映した独特な後成的フィンガープリントを持っている（Ｃｏｓｔｅｌｌｏ他、Ｎａｔ． Ｇｅｎｅｔ．、第２４巻、１３２〜１３８ページ、２０００年）。
【０００７】
しかし一般には、ガンにおける後成的変化に関するほとんどの研究は、主として、ごく少数の既知の遺伝子群（ＪｏｎｅｓとＬａｉｒｄ、Ｎａｔ． Ｇｅｎｅｔ．、第２１巻、１６３〜１６７ページ、１９９９年；ＢａｙｌｉｎとＨｅｒｍａｎ、Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ．、第１６巻、１６８〜１７４ページ、２０００年）、あるいは未知のＣｐＧ島の全体的分析（Ｃｏｓｔｅｌｌｏ他、Ｎａｔ． Ｇｅｎｅｔ．、第２４巻、１３２〜１３８ページ、２０００年）に焦点を絞ったものであり、そのため、適切な診断法および／または予後予測法の枠組みは提供されていない。
【０００８】
食道腺ガン（“ＥＡＣ”）。食道腺ガン（“ＥＡＣ”）は、正常な扁平粘膜上皮が化生によって特殊な柱状上皮（腸上皮化生（ＩＭ）またはバレット食道）になり、それが最終的には異形成へと進行し、その後に悪性腫瘍になるという多段階ステップを経て発症する（Ｂａｒｒｅｔｔ他、Ｎａｔ． Ｇｅｎｅｔ．、第２２巻、１０６〜１０９ページ、１９９９年；Ｚｈｕａｎｇ他、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、第５６巻、１９６１〜１９６４ページ、１９９６年）。西洋諸国では過去３０年間にＥＡＣの発生が急速に増えてきている（Ｄｅｖｅｓａ他、Ｃａｎｃｅｒ、第８３巻、２０４９〜２０５３ページ、１９９８年；Ｊａｎｋｏｗｓｋｉ他、Ａｍ． Ｊ． Ｐａｔｈｏｌ．、第１５４巻、９６５〜９７３ページ、１９９９年）。
【０００９】
残念なことに、このモデルの後成的研究は、これまでのところ、数個の遺伝子についてのＤＮＡメチル化分析に限られている（Ｗｏｎｇ他、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、第５７巻、２６１９〜２６２２ページ、１９９７年；Ｋｌｕｍｐ他、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ、第１１５巻、１３８１〜１３８６ページ、１９９８年；Ｅａｄｓ他、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、第６０巻、５０２１〜５０２６ページ、２０００年）。
【００１０】
ＣｐＧ島メチル化の表現型（“ＣＩＭＰ”）。結腸直腸腫瘍と胃腫瘍の一部には、ＣｐＧ島メチル化のある表現型（“ＣＩＭＰ”）が見られることが以前に報告されており（Ｔｏｙｏｔａ他、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、第９６巻、８６８１〜８６８６ページ、１９９９年；Ｔｏｙｏｔａ他、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、第５９巻、５４３８〜５４４２ページ、１９９９年）。この表現型は、１つの腫瘍の多数の遺伝子座に影響を与える広範囲の異常な高メチル化という変化を特徴とする。これは、一群の腫瘍においてメチル化されている遺伝子の数の頻度分布が２つのピークを持つことに反映されている（Ｔｏｙｏｔａ他、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、第９６巻、８６８１〜８６８６ページ、１９９９年）。ＣＩＭＰ腫瘍は、はっきりと識別できる一群の腫瘍であり、ガンにおいてだけメチル化される遺伝子、またはタイプＣの遺伝子において対応するＣｐＧ島が高い割合で高メチル化されていることを特徴としている。ＣＩＭＰは現在のところ、新規ではっきりと識別できる、しかし主要な腫瘍発生の経路であると考えられている（Ｔｏｙｏｔａ他、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、第９６巻、８６８１〜８６８６ページ、１９９９年；Ｔｏｙｏｔａ他、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、第５９巻、５４３８〜５４４２ページ、１９９９年）。
【００１１】
しかし、ＥＡＣの進行におけるＣＩＭＰ経路の役割は、もし役割があるとしてのことだが、まだ明らかになっていない。というのも、これまでの後成的研究で分析されたのは、１つの遺伝子（Ｗｏｎｇ他、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、第５７巻、２６１９〜２６２２ページ、１９９７年；Ｋｌｕｍｐ他、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ、第１１５巻、１３８１〜１３８６ページ、１９９８年）、または数個の遺伝子（Ｅａｄｓ他、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、第６０巻、５０２１〜５０２６ページ、２０００年）だけだからである。
【００１２】
したがって、ガンの検出、化学的予測および予後予測に関する新規な方法が、当業界で要求されている。ガンなどの病気のさまざまな段階を経て進行する間に多数の遺伝子座で見られるＣｐＧ島メチル化の変化の新規なコーディネート・パターンを明らかにすることが、当業界で要求されている。特定の腫瘍に特異的で、しかも個々の患者に特異的な後成的パターンまたはフィンガープリントを明らかにすることが、当業界で要求されている。ガン処置のための診断法および／または予後予測法で利用できるバイオマーカーまたはプローブ、例えばＥＡＣ特異的なバイオマーカーまたはプローブが、当業界で要求されている。食道腺ガンでＣＩＭＰが見られるかどうかを明らかにすることが、当業界で要求されている。腫瘍のステージを決定する新規な方法が、当業界で要求されている。本発明は、これらの要求に対処するものである。
【００１３】
本発明の要約
本発明は、組織サンプルからガンまたはガン関連疾患を診断する方法であって、（ａ）診断する検査組織または検査領域から組織サンプルを取得し、（ｂ）その組織サンプルのメチル化アッセイを行なって、ＡＰＣ、ＡＲＦ、ＣＡＬＣＡ、ＣＤＨ１、ＣＤＫＮ２Ａ、ＣＤＫＮ２Ｂ、ＥＳＲ１、ＧＳＴＰ１、ＨＩＣ１、ＭＧＭＴ、ＭＬＨ１、ＭＹＯＤ１、ＲＢ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＨＢＳ１、ＴＩＭＰ３、ＣＴＮＮＢ１、ＰＴＧＳ２、ＴＹＭＳおよびＭＴＨＦＲ、ならびにこれらの組み合わせからなるグループの中から選択した少なくとも１つの遺伝子配列内に位置するゲノムＣｐＧ配列のメチル化状態を決定し、（ｃ）少なくとも部分的に、上記ゲノムＣｐＧ配列のメチル化状態に基づいたガンの診断的または予後的な予測を行なうことを含んで成る方法を提供する。ＡＰＣ、ＡＲＦ、ＣＡＬＣＡ、ＣＤＨ１、ＣＤＫＮ２Ａ、ＣＤＫＮ２Ｂ、ＥＳＲ１、ＧＳＴＰ１、ＨＩＣ１、ＭＧＭＴ、ＭＬＨ１、ＭＹＯＤ１、ＲＢ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＨＢＳ１、ＴＩＭＰ３、ＣＴＮＮＢ１、ＰＴＧＳ２およびＴＹＭＳからなるグループの中から選択した少なくとも１つの遺伝子配列内に位置するゲノムＣｐＧ配列は、ＣｐＧ島のゲノムＣｐＧ配列に対応していることが好ましい。ＡＰＣ、ＡＲＦ、ＣＡＬＣＡ、ＣＤＨ１、ＣＤＫＮ２Ａ、ＣＤＫＮ２Ｂ、ＥＳＲ１、ＧＳＴＰ１、ＨＩＣ１、ＭＧＭＴ、ＭＬＨ１、ＭＹＯＤ１、ＲＢ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＨＢＳ１、ＴＩＭＰ３、ＣＴＮＮＢ１、ＰＴＧＳ２、ＴＹＭＳおよびＭＴＨＦＲの遺伝子配列は、表ＩＩに掲載した配列番号１〜６０、６４および６５に対応する特異的オリゴヌクレオチド・プライマーまたはプローブ、またはその一部によって規定される配列であることが好ましい。ＣｐＧ島は、前記遺伝子のプロモーター領域に位置することが好ましい。ＡＰＣ、ＡＲＦ、ＣＡＬＣＡ、ＣＤＨ１、ＣＤＫＮ２Ａ、ＣＤＫＮ２Ｂ、ＥＳＲ１、ＧＳＴＰ１、ＨＩＣ１、ＭＧＭＴ、ＭＬＨ１、ＭＹＯＤ１、ＲＢ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＨＢＳ１、ＴＩＭＰ３、ＣＴＮＮＢ１、ＰＴＧＳ２、およびＴＹＭＳの遺伝子配列は、表ＩＩに掲載した配列番号１〜５４、５８〜６０、６４および６５に対応する特異的オリゴヌクレオチド・プライマーまたはプローブ、あるいはその一部によって規定される配列と関係した任意のＣｐＧ島配列に対応することが好ましい。ここに、関係したＣｐＧ島配列とは、配列番号１〜５４、５８〜６０、６４および６５に対応する特異的オリゴヌクレオチド・プライマーおよびプローブによって規定される配列の少なくとも１つのヌクレオチドを含み、ＣｐＧジヌクレオチドの頻度が観測値／予測値の比＞０．６に対応することと、ＧＣ含量＞０．５であることの両方の条件を満たす、ゲノムＤＮＡの隣接配列である。
【００１４】
ゲノムＣｐＧ配列は、ＡＰＣ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＭＹＯＤ１、ＣＡＬＣＡ、ＥＳＲ１、ＭＧＭＴおよびＴＩＭＰ３、ならびにこれらの組み合わせからなるグループの中から選択した少なくとも１つの遺伝子配列内に位置することが好ましい。ＡＰＣ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＭＹＯＤ１、ＣＡＬＣＡ、ＥＳＲ１、ＭＧＭＴ、ＴＩＭＰ３からなるグループの中から選択した少なくとも１つの遺伝子配列内に位置するゲノムＣｐＧ配列は、ＣｐＧ島のゲノムＣｐＧ配列に対応することが好ましい。ＡＰＣ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＭＹＯＤ１、ＣＡＬＣＡ、ＥＳＲ１、ＭＧＭＴおよびＴＩＭＰ３の遺伝子配列は、それぞれ、表ＩＩに掲載した配列番号１９〜２１、配列番号１〜３、配列番号７〜９、配列番号１０〜１２、配列番号４〜６、配列番号１６〜１８および配列番号１３〜１５に対応する特異的オリゴヌクレオチド・プライマーおよびプローブによって規定される配列であることが好ましい。ＣｐＧ島は、遺伝子のプロモーター領域に位置することが好ましい。ＡＰＣ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＭＹＯＤ１、ＣＡＬＣＡ、ＥＳＲ１、ＭＧＭＴおよびＴＩＭＰ３の遺伝子配列は、それぞれ、表ＩＩに掲載した配列番号１９〜２１、配列番号１〜３、配列番号７〜９、配列番号１０〜１２、配列番号４〜６、配列番号１６〜１８および配列番号１３〜１５に対応する特異的オリゴヌクレオチド・プライマーおよびプローブ、またはその一部によって規定される配列と関係した任意のＣｐＧ島配列に対応することが好ましい。ここに、関係したＣｐＧ島配列とは、配列番号１９〜２１、配列番号１〜３、配列番号７〜９、配列番号１０〜１２、配列番号４〜６、配列番号１６〜１８および配列番号１３〜１５に対応する特異的オリゴヌクレオチド・プライマーおよびプローブによって規定される配列の少なくとも１つのヌクレオチドを含み、ＣｐＧジヌクレオチドの頻度が観測値／予測値の比＞０．６に対応することと、ＧＣ含量＞０．５であることの両方の条件を満たす、ゲノムＤＮＡの隣接配列である。
【００１５】
好ましくは、ガンまたはガン関連疾患は、胃腸腺ガンまたは食道腺ガン、胃腸異形成または食道異形成、胃腸化成または食道化成、バレット腸組織、正常な食道扁平粘膜上皮の前ガン疾患、およびこれらの組み合わせからなるグループの中から選択される。ガンは食道腺ガンであることが好ましく、その場合、ゲノムＣｐＧ配列のメチル化状態に基づいてガンの診断または予後予測をすることにより、その腺ガンの悪性度またはステージを分類することが好ましい。
【００１６】
ゲノムＣｐＧ配列のメチル化状態を明らかにするのに用いるメチル化アッセイは、“メチライト（ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔ：商標）”、Ｍｓ−ＳＮｕＰＥ、ＭＳＰ、ＣＯＢＲＡ、ＭＣＡ、およびＤＭＨ、ならびにこれらの組み合わせからなるグループの中から選択することが好ましい。
【００１７】
ゲノムＣｐＧ配列のメチル化状態を明らかにするのに用いるメチル化アッセイの少なくとも一部は、ＡＰＣ、ＡＲＦ、ＣＡＬＣＡ、ＣＤＨ１、ＣＤＫＮ２Ａ、ＣＤＫＮ２Ｂ、ＥＳＲ１、ＧＳＴＰ１、ＨＩＣ１、ＭＧＭＴ、ＭＬＨ１、ＭＹＯＤ１、ＲＢ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＨＢＳ１、ＴＩＭＰ３、ＣＴＮＮＢ１、ＰＴＧＳ２、ＴＹＭＳおよびＭＴＨＦＲからなるグループの中から選択した少なくとも１つの遺伝子配列内に位置するＣｐＧ配列を含んで成るアレイまたはマイクロアレイに基づいていることが好ましい。ＡＰＣ、ＡＲＦ、ＣＡＬＣＡ、ＣＤＨ１、ＣＤＫＮ２Ａ、ＣＤＫＮ２Ｂ、ＥＳＲ１、ＧＳＴＰ１、ＨＩＣ１、ＭＧＭＴ、ＭＬＨ１、ＭＹＯＤ１、ＲＢ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＨＢＳ１、ＴＩＭＰ３、ＣＴＮＮＢ１、ＰＴＧＳ２、およびＴＹＭＳの遺伝子配列は、表ＩＩに掲載した配列番号１〜５４、５８〜６０、６４および６５に対応する特異的オリゴヌクレオチド・プライマーまたはプローブ、あるいはその一部によって規定される配列と関係した任意のＣｐＧ島配列に対応することが好ましい。ここに、関係したＣｐＧ島配列とは、配列番号１〜５４、５８〜６０、６４および６５に対応する特異的オリゴヌクレオチド・プライマーおよびプローブによって規定される配列の少なくとも１つのヌクレオチドを含み、ＣｐＧジヌクレオチドの頻度が観測値／予測値の比＞０．６に対応することと、ＧＣ含量＞０．５であることの両方の条件を満たす、ゲノムＤＮＡの隣接配列である。ＡＰＣ、ＡＲＦ、ＣＡＬＣＡ、ＣＤＨ１、ＣＤＫＮ２Ａ、ＣＤＫＮ２Ｂ、ＥＳＲ１、ＧＳＴＰ１、ＨＩＣ１、ＭＧＭＴ、ＭＬＨ１、ＭＹＯＤ１、ＲＢ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＨＢＳ１、ＴＩＭＰ３、ＣＴＮＮＢ１、ＰＴＧＳ２、ＴＹＭＳおよびＭＴＨＦＲの遺伝子配列は、表ＩＩに掲載した配列番号１〜６０、６４、６５に対応する特異的オリゴヌクレオチド・プライマーおよびプローブ、またはその一部によって規定される配列、あるいはこれらに対応する配列であることが好ましい。
【００１８】
明らかにされるゲノムＣｐＧ配列のメチル化状態は、高メチル化、低メチル化、正常なメチル化のいずれかであることが好ましい。
【００１９】
本発明は、ガンまたはガン関連疾患の診断または予後に有用なキットであって、（ａ）ＡＰＣ、ＡＲＦ、ＣＡＬＣＡ、ＣＤＨ１、ＣＤＫＮ２Ａ、ＣＤＫＮ２Ｂ、ＥＳＲ１、ＧＳＴＰ１、ＨＩＣ１、ＭＧＭＴ、ＭＬＨ１、ＭＹＯＤ１、ＲＢ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＨＢＳ１、ＴＩＭＰ３、ＣＴＮＮＢ１、ＰＴＧＳ２、ＴＹＭＳおよびＭＴＨＦＲからなるグループの中から選択した少なくとも１つの遺伝子配列内に位置する配列の任意の領域とハイブリダイズするプローブまたはプライマーを含む容器、および（ｂ）メチル化されたＣｐＧを含む核酸の検出の少なくとも一部を、このプローブまたはプライマーに基づいて行なうのに必要な追加の標準的メチル化アッセイ試薬、を含んで成る１または複数の容器を備える担持手段を含んで成るキットも提供する。追加の標準的メチル化アッセイ試薬は、“メチライト（商標）”、ＭＳ−ＳＮｕＰＥ、ＭＳＰ、ＣＯＢＲＡ、ＭＣＡおよびＤＭＨ、ならびにこれらの組み合わせからなるグループの中から選択した、メチル化アッセイを行なうための標準的な試薬であることが好ましい。上記プローブまたはプライマーは、表ＩＩに掲載した配列番号１〜６０、６４および６５からなるグループの中から選択した配列の少なくとも約１２〜１５個のヌクレオチドを含んで成ることが好ましい。
【００２０】
本発明はさらに、ガンまたはガン関連疾患の診断または予後に有用なキットであって、（ａ）配列番号１〜６０、６４、６５からなるグループの中から選択した配列の少なくとも約１２〜１５個のヌクレオチドからなる配列と、配列番号１〜５４、５８〜６０、６４および６５と関係したＣｐＧ島配列内に位置する任意の配列とを含んで成る１または複数の容器を備える担持手段を有するキットも提供する。
【００２１】
本発明の詳細な説明
定義：
“ＥＡＣ”という語は食道腺ガンを意味するが、この語には、正常な扁平粘膜上皮が化生によって特殊な柱状上皮（腸上皮化生（ＩＭ）またはバレット食道）になり、それがついには異形成へと進行し、その後悪性腫瘍になるという多段階プロセスを経る食道腺ガンのさまざまな組織学的段階も含まれる（Ｂａｒｒｅｔｔ他、Ｎａｔ． Ｇｅｎｅｔ．、第２２巻、１０６〜１０９ページ、１９９９年；Ｚｈｕａｎｇ他、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、第５６巻、１９６１〜１９６４ページ、１９９６年）。
【００２２】
“ＣＩＭＰ”という語はＣｐＧ島メチル化の表現型を意味し、１つの腫瘍の多数の遺伝子座に影響を与える広範囲の異常な高メチル化という変化を特徴とする。これは、一群の腫瘍（１６）においてメチル化されている遺伝子の数の頻度分布が２つのピークを持つことに反映されている。ＣＩＭＰ腫瘍は、はっきりと識別できる一群の腫瘍であり、ガンにおいてだけメチル化される遺伝子、またはタイプＣの遺伝子で対応するＣｐＧ島が高い割合で高メチル化されていることを特徴としている。ＣＩＭＰは現在のところ、新規ではっきりと識別できるしかし主要な腫瘍発生経路であると考えられている（Ｔｏｙｏｔａ他、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、第９６巻、８６８１〜８６８６ページ、１９９９年；Ｔｏｙｏｔａ他、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、第５９巻、５４３８〜５４４２ページ、１９９９年）（上記の“背景”を参照のこと）。
【００２３】
“ＰＭＲ”という語は、メチル化された基準の割合を意味し、以下の実施例１に記載したようにして計算する。
【００２４】
“ＧＣ含量”は、特定のＤＮＡ配列内の［（Ｃ塩基の数＋Ｇ塩基の数）／各断片のバンドの長さ］を意味する。
【００２５】
“観測値／予測値の比”（“Ｏ／Ｅ比”）は、特定のＤＮＡ配列内のＣｐＧジヌクレオチドの頻度を表わし、［ＣｐＧ部位の数／（Ｃ塩基の数×Ｇ塩基の数）］×各断片のバンドの長さに対応する。
【００２６】
“ＣｐＧ島”は、（１）ＣｐＧジヌクレオチドの頻度が“観測値／予測値の比”＞０．６に対応することと、（２）“ＧＣ含量”＞０．５であることの両方の条件を満たす、ゲノムＤＮＡの隣接配列を意味する。ＣｐＧ島は、一般に、長さが約０．２ｋｂ〜約１ｋｂであるが、常にそうであるとは限らない。本発明の特定の配列番号の配列と関係するＣｐＧ島の配列は、その特定の配列番号の配列の少なくとも１つのヌクレオチドを含むとともに、ＣｐＧジヌクレオチドの頻度が観測値／予測値の比＞０．６に対応することと、ＧＣ含量＞０．５であることの両方の条件を満たす、ゲノムＤＮＡの隣接配列である。
【００２７】
“メチル化状態”は、ＤＮＡ配列内の１つまたは複数のＣｐＧジヌクレオチドに５−メチルシトシン（“５−ｍＣｙｔ”）が存在しているか不在であるかを意味する。
【００２８】
“高メチル化”は、テストするＤＮＡサンプルのＤＮＡ配列内の１つまたは複数のＣｐＧジヌクレオチドにおける５−ｍＣｙｔの量が、正常な対照ＤＮＡサンプル中の対応するＣｐＧジヌクレオチドにおいて見られる５−ｍＣｙｔの量と比べて多いことに対応するメチル化状態を意味する。
【００２９】
“低メチル化”は、テストするＤＮＡサンプルのＤＮＡ配列内の１つまたは複数のＣｐＧジヌクレオチドにおける５−ｍＣｙｔの量が、正常な対照ＤＮＡサンプル中の対応するＣｐＧジヌクレオチドにおいて見られる５−ｍＣｙｔの量と比べて少ないことに対応するメチル化状態を意味する。
【００３０】
“メチル化アッセイ”は、ＤＮＡ配列内のＣｐＧジヌクレオチドのメチル化状態を明らかにするための任意のアッセイを意味する。
【００３１】
“ＭＳ．ＡＰ−ＰＣＲ”（メチル化感受性のある任意のプライマーを用いたポリメーラーゼ連鎖反応）は、ＣｐＧジヌクレオチドを含むことが非常に確からしい領域に焦点を絞ってＣＧリッチなプライマーを用いてゲノム全体をスキャンすることのできる公知の方法である。これについては、Ｇｏｎｚａｌｇｏ他、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、第５７巻、５９４〜５９９ページ、１９９７年に記載されている。
【００３２】
“メチライト”は、蛍光に基づいたリアルタイムＰＣＲ法として公知であり、Ｅａｄｓ他、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、第５９巻、２３０２〜２３０６ページ、１９９９年に記載されている。
【００３３】
“Ｍｓ−ＳＮｕＰＥ”（メチル化感受性単一ヌクレオチドプライマー伸長）は、ＧｏｎｚａｌｇｏとＪｏｎｅｓ、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、第２５巻、２５２９〜２５３１ページ、１９９７年に記載されている公知のアッセイである。
【００３４】
“ＭＳＰ”（メチル化特異的ＰＣＲ）は、Ｈｅｒｍａｎ他、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、第９３巻、９８２１〜９８２６ページ、１９９６年とアメリカ合衆国特許第５，７８６，１４６号に記載されている公知のメチル化アッセイである。
【００３５】
“ＣＯＢＲＡ”（亜硫酸水素塩と制限酵素を組み合わせた分析）は、ＸｉｏｎｇとＬａｉｒｄ、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、第２５巻、２５３２〜２５３４ページ、１９９７年に記載されている公知のメチル化アッセイである。
【００３６】
“ＭＣＡ”（メチル化されたＣｐＧ島の増幅）は、Ｔｏｙｏｔａ他、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、第５９巻、２３０７〜２３１２ページ、１９９９年とＷＯ ００／２６４０１Ａ１に記載されているメチル化アッセイである。
【００３７】
“ＤＭＨ”（ディファレンシャル・メチル化ハイブリダイゼーション）は、Ｈｕａｎｇ他、Ｈｕｍ． Ｍｏｌ． Ｇｅｎｅｔ．、第８巻、４５９〜４７０ページ、１９９９年とＹａｎ他、Ｃｌｉｎ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、第６巻、１４３２〜１４３８ページ、２０００年に記載されている公知のメチル化アッセイである。
【００３８】
遺伝子と関連参考文献：
“ＡＰＣ”は、大腸腺維症遺伝子である（Ｅａｄｓ他、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、第５９巻、２３０２〜２３０６ページ、１９９９年；Ｈｉｌｔｕｎｅｎ他、Ｉｎｔ． Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ、第７０巻、６４４〜６４８ページ、１９９７年）。
【００３９】
“ＡＲＦ”は、Ｐ１４の細胞周期を調節する腫瘍抑制遺伝子である（Ｅｓｔｅｌｌｅｒ他、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、第６０巻、１２９〜１３３ページ、２０００年；ＲｏｂｅｒｔｓｏｎとＪｏｎｅｓ、Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ．、第１８巻、６４５７〜６４７３ページ、１９９８年）。
【００４０】
“ＣＡＬＣＡ”は、カルシトニン遺伝子である（Ｍｅｌｋｉ他、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、第５９巻、３７３０〜３７４０ページ、１９９９年；Ｈａｋｋａｒａｉｎｅｎ他、Ｉｎｔ． Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ、第６９巻、４７１〜４７４ページ、１９９６年）。
【００４１】
“ＣＤＨ１”は、Ｅ−カドヘリン遺伝子である（Ｍｅｌｋｉ他、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、第５９巻、３７３０〜３７４０ページ、１９９９年；Ｕｅｋｉ他、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、第６０巻、１８３５〜１８３９ページ、２０００年）。
【００４２】
“ＣＤＫＮ２Ａ”は、Ｐ１６遺伝子である（ＪｏｎｅｓとＬａｉｒｄ、Ｎａｔ． Ｇｅｎｅｔ．、第２１巻、１６３〜１６７ページ、１９９９年；Ｍｅｌｋｉ他、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、第５９巻、３７３０〜３７４０ページ、１９９９年；ＢａｙｌｉｎとＨｅｒｍａｎ、Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ．、第１６巻、１６８〜１７４ページ、２０００年；Ｃａｍｅｒｏｎ他、Ｎａｔ． Ｇｅｎｅｔ．、第２１巻、１０３〜１０７ページ、１９９９年；Ｕｅｋｉ他、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、第６０巻、１８３５〜１８３９ページ、２０００年）。
【００４３】
“ＣＤＫＮ２Ｂ”は、Ｐ１５遺伝子である（Ｍｅｌｋｉ他、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、第５９巻、３７３０〜３７４０ページ、１９９９年；Ｃａｍｅｒｏｎ他、Ｎａｔ． Ｇｅｎｅｔ．、第２１巻、１０３〜１０７ページ、１９９９年）。
【００４４】
“ＣＴＮＮＢ１”は、β−カテニン遺伝子である。
【００４５】
“ＥＳＲ１”は、エストロゲン受容体α遺伝子である（ＪｏｎｅｓとＬａｉｒｄ、Ｎａｔ． Ｇｅｎｅｔ．、第２１巻、１６３〜１６７ページ、１９９９年；ＢａｙｌｉｎとＨｅｒｍａｎ、Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ．、第１６巻、１６８〜１７４ページ、２０００年）。
【００４６】
“ＧＳＴＰ１”は、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼＰ１遺伝子である（Ｍｅｌｋｉ他、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、第５９巻、３７３０〜３７４０ページ、１９９９年；Ｔｃｈｏｕ他、Ｉｎｔ． Ｊ． Ｏｎｃｏｌ．、第１６巻、６６３〜６７６ページ、２０００年）。
【００４７】
“ＨＩＣ１”は、ガン１において高メチル化されている遺伝子である（Ｍｅｌｋｉ他、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、第５９巻、３７３０〜３７４０ページ、１９９９年；Ｗａｌｅｓ他、Ｎａｔ． Ｍｅｄ．、第１巻、５７０〜５７７ページ、１９９５年）。
【００４８】
“ＭＧＭＴ”は、Ｏ６−メチルグアニン−ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ遺伝子である（Ｅｓｔｅｌｌｅｒ他、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、第５９巻、７９３〜７９７ページ、１９９９年）。
【００４９】
“ＭＬＨ１”は、Ｍｕｔ Ｌホモログ１遺伝子である（ＪｏｎｅｓとＬａｉｒｄ、Ｎａｔ． Ｇｅｎｅｔ．、第２１巻、１６３〜１６７ページ、１９９９年；ＢａｙｌｉｎとＨｅｒｍａｎ、Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ．、第１６巻、１６８〜１７４ページ、２０００年；Ｃａｍｅｒｏｎ他、Ｎａｔ． Ｇｅｎｅｔ．、第２１巻、１０３〜１０７ページ、１９９９年；Ｅｓｔｅｌｌｅｒ他、Ａｍ． Ｊ． Ｐａｔｈｏｌ．、第１５５巻、１７６７〜１７７２ページ、１９９９年；Ｕｅｋｉ他、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、第６０巻、１８３５〜１８３９ページ、２０００年）。
【００５０】
“ＭＴＨＦＲ”は、メチル−テトラヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子である（Ｐｅｒｅｉｒａ他、Ｏｎｃｏｌ． Ｒｅｐ．、第６巻、５９７〜５９９ページ、１９９９年）。
【００５１】
“ＭＹＯＤ１”は、筋原決定基１遺伝子である（Ｅａｄｓ他、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、第５９巻、２３０２〜２３０６ページ、１９９９年；Ｃｈｅｎｇ他、Ｂｒ． Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ、第７５巻、３９６〜４０２ページ、１９９７年）。
【００５２】
“ＰＴＧＳ２”は、シクロオキシゲナーゼ２遺伝子である（Ｚｉｍｍｅｒｍａｎｎ他、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、第５９巻、１９８〜２０４ページ、１９９９年）。
【００５３】
“ＲＢ１”は、網膜芽細胞腫遺伝子である（Ｓｔｉｒｚａｋｅｒ他、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、第５７巻、２２２９〜２２３７ページ、１９９７年；Ｓａｋａｉ他、Ａｍ． Ｊ． Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅｔ．、第４８巻、８８０〜８８８ページ、１９９１年）。
【００５４】
“ＴＧＦＢＲ２”は、トランスフォーミング増殖因子β受容体ＩＩ遺伝子である（Ｋａｎｇ他、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ、第１８巻、７２８０〜７２８６ページ、１９９９年；Ｈｏｕｇａａｒｄ他、Ｂｒ． Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ、第７９巻、１００５〜１０１１ページ、１９９９年）。
【００５５】
“ＴＨＢＳ１”は、トロンボスポンジン１遺伝子である（Ｕｅｋｉ他、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、第６０巻、１８３５〜１８３９ページ、２０００年；Ｌｉ他、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ、第１８巻、２８４〜２８９ページ、１９９９年）。
【００５６】
“ＴＩＭＰ３”は、メタロプロテアーゼ３組織インヒビター遺伝子である（Ｃａｍｅｒｏｎ他、Ｎａｔ． Ｇｅｎｅｔ．、第２１巻、１０３〜１０７ページ、１９９９年；Ｕｅｋｉ他、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、第６０巻、１８３５〜１８３９ページ、２０００年；Ｂａｃｈｍａｎ他、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、第５９巻、７９８〜８０２ページ、１９９９年）。
【００５７】
“ＴＹＭＳ１”は、チミジル酸シンターゼ遺伝子である（Ｌ． Ｈｅｒｒｅｒａ編、『家族性大腸腺種症』の中のＳａｋａｍｏｔｏ他、３１５〜３２４ページ、ニューヨーク：アラン・Ｒ． リス社、１９９０年）。
【００５８】
概要
本発明は、多彩な遺伝子へのアプローチを含んでおり、遺伝子間で共通して見られるメチル化の状態に関して新規で治療に役に立つ見通しを与える。本発明の特別な実施態様では、食道腺ガン（ＥＡＣ）の異なる組織学的ステージにおける新規な後成的フィンガープリントを提供する。
【００５９】
より詳細には、本発明は、ターゲットを絞った方法と総合的な方法の両方の利点を合わせ持っており、定量的ハイスループット・メチル化アッセイである“メチライト（商標）”（Ｅａｄｓ他、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、第５９巻、２３０２〜２３０６ページ、１９９９年；Ｅａｄｓ他、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、第６０巻、５０２１〜５０２６ページ、２０００年；Ｅａｄｓ他、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、第２８巻、Ｅ３２ページ、２０００年）を利用して異なる２０種類の遺伝子を分析することにより、（ｉ）食道腺ガン（ＥＡＣ）におけるメチル化の変化の特徴をより詳細に明らかにすること；（ｉｉ）ＥＡＣの異なる組織学的ステージについて後成的フィンガープリントを作ること；（ｉｉｉ）病気の診断および予防に有効な後成的バイオマーカーを同定すること；（ｉｖ）ＣＩＭＰが食道腺ガンの腫瘍発生に関与しているかどうかを明らかにすることを実現する。
【００６０】
バレット食道および／またはそれに付随する腺ガンのステージが異なる５１人の患者から採取した合計で１０４個の組織サンプルを分析した。中でも、これら組織サンプルのうちの８４個につき２０種類の遺伝子すべてのスクリーニングを行なったところ、異なる組織においてメチル化パターンがはっきりと異なることが明らかになった。
【００６１】
本発明の目的にとって最も多くの情報をもたらした遺伝子は、有意な高メチル化の頻度が中間的な値の遺伝子である（すなわちサンプルの約１５％（ＣＤＫＮ２Ａ）から約６０％（ＭＧＭＴ）の範囲の遺伝子）。このような遺伝子群は、さらに細かい３つのクラスに分類することができた。すなわち、（１）正常な食道粘膜および胃におけるメチル化がない（ＣＤＫＮ２Ａ、ＥＳＲ１、ＭＹＯＤ１）、（２）正常な食道粘膜および胃においてメチル化がある（ＣＡＬＣＡ、ＭＧＭＴ、ＴＩＭＰ３）、（３）正常な食道粘膜でメチル化があまり頻繁には起こっていないが、正常な胃のサンプルではすべてメチル化が起こっている（ＡＰＣ）という分類である。
【００６２】
他の遺伝子は、これよりも情報が少なかった。というのも、組織のタイプに関係なく、高メチル化の頻度が約５％未満だった（ＡＲＦ、ＣＤＨ１、ＣＤＫＮ２Ｂ、ＧＳＴＰ１、ＭＬＨ１、ＰＴＧＳ２、ＴＨＢＳ１）か、高メチル化がまったくない（ＣＴＮＮＢ１、ＲＢ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＹＭＳ１）か、高メチル化が常に見られた（ＨＩＣ１、ＭＴＨＦＲ）からである。
【００６３】
それぞれの遺伝子クラスは、ＥＡＣの異なる進行段階において独特の後成的変化をしている。これは、ＣｐＧ島が高メチル化されることに対する多重保護障壁が段階的に失われることと合致している。異常な高メチル化は、同じ組織の異なる多数の遺伝子座で起こる。これは、ＥＡＣの腫瘍発生においてメチル化の制御が全体的に異常になることと合致している。しかし、ＣｐＧ島メチル化の表現型（“ＣＩＭＰ”）が見られる腫瘍のグループを識別できるというはっきりとした証拠はなかった。
【００６４】
さらに、異形成またはガンを伴っているという証拠のある患者から採取した正常組織および化生組織では、病気がもはや進行していない患者から採取した同様の組織におけるよりも高メチル化の程度が有意に大きかった。これら２つのグループの患者から採取したサンプルを組織学的に識別することはできないが、分子レベルでは識別できるという事実は、本発明により、そのような高メチル化の発生が、前ガン状態のバレット食道患者の中から病気がさらに進行するリスクを有する患者を同定するための臨床上の新規かつ有用なツールとなることを示唆している。
【００６５】
表Ｉは、ＥＡＣに関してメチライト（商標）アッセイにより分析した遺伝子の名称と機能のリストである。遺伝子は、ＨＵＧＯ（ヒトゲノム国際機構）によって与えられた名称に基づき、アルファベット順に掲載してある。遺伝子は、ＣｐＧ島を有するかどうか、他の腫瘍においてメチル化することが知られているかどうかに従い、３つのグループに分類した。各遺伝子の機能に関する簡単な説明も記載してある。
【表１】
2004505612.tif 000002
【表２】
2004505612.tif 000003
【表３】
2004505612.tif 000004
【００６６】
ガンの診断法および予後予測法
本発明は、ここに示した２０種類の遺伝子配列（ＡＰＣ、ＡＲＦ、ＣＡＬＣＡ、ＣＤＨ１、ＣＤＫＮ２Ａ、ＣＤＫＮ２Ｂ、ＥＳＲ１、ＧＳＴＰ１、ＨＩＣ１、ＭＧＭＴ、ＭＬＨ１、ＭＹＯＤ１、ＲＢ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＨＢＳ１、ＴＩＭＰ３、ＣＴＮＮＢ１、ＰＴＧＳ２、ＴＹＭＳ、ＭＴＨＦＲ；表Ｉと表ＩＩを参照のこと；上記の“定義”を参照のこと）のうちの１または複数のメチル化状態、またはメチル化によってこれら遺伝子において変化したＤＮＡ配列を明らかにすることに基づいたガンの診断アッセイおよび予後予測アッセイを提供する。２０種類あるこれら遺伝子配列領域は、配列番号１〜６０、６４、６５（以下の表ＩＩを参照のこと）に対応するオリゴマー・プライマーおよびプローブによって規定される。配列番号６１〜６３は、この分析で用いるＡＣＴＢ“対照”遺伝子領域に対応する（以下の実施例１を参照のこと）。
【００６７】
さらに、２０種類あるこれら遺伝子配列領域のうちの１９種類は、その遺伝子の（ＧＣ含量とＯ／Ｅ比に基づいた）ＣｐＧ島またはＣｐＧ領域に対応する；１９種類の遺伝子とは、ＡＰＣ、ＡＲＦ、ＣＡＬＣＡ、ＣＤＨ１、ＣＤＫＮ２Ａ、ＣＤＫＮ２Ｂ、ＥＳＲ１、ＧＳＴＰ１、ＨＩＣ１、ＭＧＭＴ、ＭＬＨ１、ＭＹＯＤ１、ＲＢ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＨＢＳ１、ＴＩＭＰ３、ＣＴＮＮＢ１、ＰＴＧＳ２、ＴＹＭＳである（上記の表Ｉを参照のこと）。したがって、所定のＣｐＧ島の一部におけるメチル化状態が一般にその島全体を代表しているという事実に基づくと、本発明にはさらに、（ガンの診断および予後予測への応用においては、配列番号１〜６０、６４、６５に対応するプライマーおよびプローブ（以下の表ＩＩを参照のこと）によって規定される）これら１９種類の遺伝子配列領域と関係する１９の完全なＣｐＧ島の中にある任意の配列の新規な使用法も含まれている。ここに、これら１９種類の遺伝子配列と関係するＣｐＧ島配列は、これら１９種類の遺伝子配列のうちの１つの少なくとも１つのヌクレオチドを含み、ＣｐＧジヌクレオチドの頻度が観測値／予測値の比＞０．６に対応することと、ＧＣ含量＞０．５であることの両方の条件を満たす、ゲノムＤＮＡ中の連続配列である。
【００６８】
一般に、このようなアッセイには、検査組織から組織サンプルを採取し、その組織サンプルに由来するＤＮＡについてメチル化アッセイを行なってそのＤＮＡに付随するメチル化状態を明らかにし、その結果に基づいて診断または予後予測をする操作が含まれる。
【００６９】
メチル化アッセイは、ＤＮＡサンプルのＤＮＡ配列内の１つまたは複数のＣｐＧジヌクレオチドのメチル化状態を明らかにするのに用いる。本発明によれば、可能なメチル化状態としては、正常な状態（すなわちガンでない対照の状態）と比べて高メチル化の状態と低メチル化の状態がある。高メチル化と低メチル化は、検査サンプルのＤＮＡ配列内の１つまたは複数のＣｐＧジヌクレオチドにおける５−メチルシトシン（“５−ｍＣｙｔ”）の量が、正常な対照ＤＮＡサンプル中の対応するＣｐＧジヌクレオチドにおいて見られる５−ｍＣｙｔの量と比べてそれぞれ多いこと、少ないことに対応するメチル化状態を意味する。
【００７０】
診断または予後予測の少なくとも一部は、ガンでない正常な組織から得られた対照データと比較することによって明らかになる、サンプルのＤＮＡ配列のメチル化状態に基づく。
【００７１】
メチル化アッセイの方法
メチル化アッセイの方法はさまざまなものが従来技術で知られており、本発明でも利用することができる。これらアッセイにより、ＤＮＡ配列内の１つまたは複数のＣｐＧジヌクレオチド（例えばＣｐＧ島）のメチル化状態を明らかにすることができる。このようなアッセイとしては、特に、亜硫酸水素塩で処理したＤＮＡのシークエンシング、（配列特異的な増幅を行なうための）ＰＣＲ、サザンブロット分析、メチル化感受性制限酵素の利用などの方法が挙げられる。
【００７２】
例えばＤＮＡのメチル化パターンと５−メチルシトシンの分布を分析するためのゲノム・シークエンシングは、亜硫酸水素塩処理を行なうことにより簡単になった（Ｆｒｏｍｍｅｒ他、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、第８９巻、１８２７〜１８３１ページ、１９９２年）。さらに、亜硫酸水素塩を使用して変換したＤＮＡから増幅したＰＣＲ産物を制限酵素で消化させる。この方法は、例えばサルディとホーンズビー（Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、第２４巻、５０５８〜５０５９ページ、１９９６年）によって、あるいはＣＯＢＲＡ（亜硫酸水素塩と制限酵素を組み合わせた分析）（ＸｉｏｎｇとＬａｉｒｄ、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、第２５巻、２５３２〜２５３４ページ、１９９７年）として記載されている。
【００７３】
“メチライト（商標）”（蛍光に基づいたリアルタイムＰＣＲ法）（Ｅａｄｓ他、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、第５９巻、２３０２〜２３０６ページ、１９９９年）、メチル化感受性単一ヌクレオチドプライマー伸長（“Ｍｓ−ＳｎｕＰＥ”；ＧｏｎｚａｌｇｏとＪｏｎｅｓ、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、第２５巻、２５２９〜２５３１ページ、１９９７年）、メチル化特異的ＰＣＲ（“ＭＳＰ”；Ｈｅｒｍａｎ他、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、第９３巻、９８２１〜９８２６ページ、１９９６年とアメリカ合衆国特許第５，７８６，１４６号）、メチル化されたＣｐＧ島の増幅（“ＭＣＡ”；Ｔｏｙｏｔａ他、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、第５９巻、２３０７〜２３１２ページ、１９９９年）などのアッセイは、単独で、あるいは他の方法と組み合わせて利用することが好ましい。本発明のさまざまな実施態様で用いることのできるメチル化アッセイとしては、以下のアッセイが挙げられるが、これだけに限定されるわけではない。
【００７４】
ＣＯＢＲＡ（亜硫酸水素塩と制限酵素を組み合わせた分析）。ＣＯＢＲＡ分析は、少量のゲノムＤＮＡ中の特定の遺伝子座におけるＤＮＡのメチル化レベルを明らかにするのに有用な定量的メチル化アッセイである（ＸｉｏｎｇとＬａｉｒｄ、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、第２５巻、２５３２〜２５３４ページ、１９９７年）。一言で述べるならば、制限酵素による消化を利用して、亜硫酸水素ナトリウムで処理したＤＮＡのＰＣＲ産物中にある、メチル化に依存した配列の違いを明らかにする。メチル化に依存した配列の違いは、フロマー他（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、第８９巻、１８２７〜１８３１ページ、１９９２年）によって記載された方法に従って標準的な亜硫酸水素塩で処理することにより、ゲノムＤＮＡにまず最初に導入される。次に、亜硫酸水素塩で変換したこのＤＮＡを、興味の対象であるＣｐＧ島に特異的なプライマーを用いてＰＣＲ増幅した後、制限エンドヌクレアーゼで消化させ、電気泳動をかけ、標識された特異的ハイブリダイゼーション・プローブを用いて検出する。元のＤＮＡサンプル中のメチル化レベルは、消化されたＰＣＲ産物と消化されなかったＰＣＲ産物の相対量により、幅広いＤＮＡメチル化レベルにわたって定量的に一次式で表現される。さらに、この方法は、顕微解剖したパラフィン包埋組織サンプルから得られるＤＮＡに安心して適用することができる。ＣＯＢＲＡ分析のための（例えばＣＯＢＲＡに基づいた典型的なメチル化キットに見られるような）一般的な試薬としては、特定の遺伝子のためのＰＣＲプライマー（またはメチル化によって変化したＤＮＡ配列またはＣｐＧ島）；制限酵素と適切な緩衝液；遺伝子ハイブリダイゼーション用オリゴ；対照ハイブリダイゼーション用オリゴ；オリゴ・プローブのためのキナーゼ標識キット；放射性ヌクレオチド（蛍光法やリン光法など、公知の他の標識法も用いることができる）などが挙げられるが、これだけに限定されるわけではない。さらに、亜硫酸水素塩による変換のための試薬としては、ＤＮＡ変性用緩衝液；スルホン化用緩衝液；ＤＮＡ再生用の試薬またはキット（例えば、沈殿、限外濾過、アフィニティ・カラム）；脱スルホン化用緩衝液；ＤＮＡ再生成分などが挙げられる。
【００７５】
Ｍｓ−ＳｎｕＰＥ（メチル化感受性単一ヌクレオチドプライマー伸長）。Ｍｓ−ＳｎｕＰＥ法は、ＤＮＡを亜硫酸水素塩で処理した後、単一ヌクレオチド・プライマーにより伸長させることに基づいて特定のＣｐＧ部位におけるメチル化の違いを評価する定量的方法である（ＧｏｎｚａｌｇｏとＪｏｎｅｓ、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、第２５巻、２５２９〜２５３１ページ、１９９７年）。一言で述べるならば、ゲノムＤＮＡを亜硫酸水素ナトリウムと反応させてメチル化されていないシトシンをウラシルに変換し、その一方で５−メチルシトシンは変化させずにそのままにしておく。次に、亜硫酸水素塩で変換したＤＮＡに対して特異的なＰＣＲプライマーを用いて望む標的配列を増幅し、得られた産物を単離し、それを興味の対象であるＣｐＧ部位におけるメチル化分析のための鋳型として用いる。少量のＤＮＡ（例えば顕微解剖した病理切片）を分析することができるため、ＣｐＧ部位におけるメチル化状態を明らかにするのに制限酵素を利用せずにすむ。（例えばＭｓ−ＳｎｕＰＥに基づいた典型的なメチル化キットに見られるような）Ｍｓ−ＳｎｕＰＥ分析のための典型的な試薬としては、特定の遺伝子用のＰＣＲプライマー（またはメチル化によって変化したＤＮＡ配列またはＣｐＧ島）；最適化されたＰＣＲ緩衝液とデオキシヌクレオチド；ゲル抽出キット；正の制御用プライマー；特定の遺伝子用のＭｓ−ＳｎｕＰＥプライマー；（Ｍｓ−ＳｎｕＰＥ反応用の）反応緩衝液；放射性ヌクレオチドなどが挙げられるが、これだけに限定されるわけではない。さらに、亜硫酸水素塩による変換のための試薬としては、ＤＮＡ変性用緩衝液；スルホン化用緩衝液；ＤＮＡ再生のための試薬またはキット（例えば、沈殿、超濾過、アフィニティ・カラム）；脱スルホン化用緩衝液；ＤＮＡ再生成分などが挙げられる。
【００７６】
ＭＳＰ（メチル化特異的ＰＣＲ）。ＭＳＰにより、メチル化感受性制限酵素を使用するかどうかには関係なく、ＣｐＧ島内のほとんどすべてのＣｐＧ部位群のメチル化状態を評価することができる（Ｈｅｒｍａｎ他、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、第９３巻、９８２１〜９８２６ページ、１９９６年とアメリカ合衆国特許第５，７８６，１４６号）。一言で述べるならば、メチル化されているシトシンを除き、亜硫酸水素ナトリウムを用いてメチル化されていないすべてのシトシンをウラシルに変換することによりＤＮＡを変化させた後、メチル化されていないＤＮＡではなくメチル化されたＤＮＡに対して特異的なプライマーを用いて増幅する。ＭＳＰは、ほんの少量のＤＮＡしか必要とせず、所定のＣｐＧ島遺伝子座の０．１％メチル化された対立遺伝子に対して感受性があり、パラフィン包埋サンプルから抽出したＤＮＡに対して実行することができる。（例えばＭＳＰに基づいた典型的なキットに見られるような）ＭＳＰ分析のための典型的な試薬としては、特定の遺伝子用のメチル化された、またはメチル化されていないＰＣＲプライマー（またはメチル化によって変化したＤＮＡ配列またはＣｐＧ島）；最適化されたＰＣＲ緩衝液とデオキシヌクレオチド；特異的なプローブなどが挙げられるが、これだけに限定されるわけではない。
【００７７】
ＭＣＡ（メチル化されたＣｐＧ島の増幅）。ＭＣＡ法は、ゲノムＤＮＡ中の変化したメチル化パターンをスクリーニングし、その変化に関係した特別な配列を単離するのに用いることのできる方法である（Ｔｏｙｏｔａ他、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、第５９巻、２３０７〜２３１２ページ、１９９９年）。一言で述べるならば、シトシンのメチル化に対する認識部位での感受性が異なる複数の制限酵素を用い、原発腫瘍、細胞系、正常な組織からのゲノムＤＮＡを消化させた後、ＡＰ−ＰＣＲ増幅を行なう。ＰＣＲ産物を高分解能ポリアクリルアミドゲル上で分離した後、メチル化の程度が異なる断片をクローニングし、配列を決定する。次に、クローニングした断片をプローブとして用いてサザンブロット分析を行ない、これら断片のメチル化の違いを確認する。（例えばＭＣＡに基づいた典型的なキットに見られるような）ＭＣＡ分析のための典型的な試薬としては、ゲノムＤＮＡに自由に結合するＰＣＲプライマー；ＰＣＲ緩衝液とヌクレオチド、制限酵素と適切な緩衝液；遺伝子ハイブリダイゼーション用のオリゴまたはプローブ；対照ハイブリダイゼーション用のオリゴまたはプローブが挙げられるが、これだけに限定されるわけではない。
【００７８】
ＤＭＨ（ディファレンシャル・メチル化ハイブリダイゼーション）。ＤＭＨは、アレイに基づいた公知のメチル化アッセイであり、フアン他、Ｈｕｍ． Ｍｏｌ． Ｇｅｎｅｔ．、第８巻、４５９〜４７０ページ、１９９９年とヤン他、Ｃｌｉｎ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、第６巻、１４３２〜１４３８ページ、２０００年に記載されている。ＤＭＨにより、ガン細胞系のＣｐＧ島の高メチル化をゲノム全体でスクリーニングすることができる。一言で述べるならば、ＣｐＧ島のタグを固体支持体（例えばナイロン膜、シリコンなど）上に配置し、検査サンプル（例えば腫瘍）または基準サンプルからのメチル化されたＣｐＧ ＤＮＡである“アンプリコン”を用いて調べる。スクリーニングされたＣｐＧ島アレイに関して検査サンプルと基準サンプルの間に見られる信号強度の差は、検査用ＤＮＡ中の対応する配列がメチル化により変化したことを反映している。
【００７９】
メチライト（商標）。好ましい実施態様では、メチライト（商標）アッセイを用いて１または複数のＣｐＧ配列のメチル化状態を明らかにする。メチライト（商標）アッセイは、ＰＣＲステップの後にさらに操作を行なう必要のない、蛍光に基づいたリアルタイムＰＣＲ（タックマン（商標））法を利用したハイスループットの定量的メチル化アッセイである（Ｅａｄｓ他、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、第６０巻、５０２１〜５０２６ページ、２０００年；Ｅａｄｓ他、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、第５９巻、２３０２〜２３０６ページ、１９９９年；Ｅａｄｓ他、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、第２８巻、Ｅ３２ページ、２０００年）。一言で述べるならば、メチライト（商標）法は、ゲノムＤＮＡの混合サンプルを用意し、それを標準的な方法に従って亜硫酸水素ナトリウムと反応させて変換し（亜硫酸水素塩プロセスによって、メチル化されていないシトシン残基がウラシルに変換される）、メチル化に依存した違いを有する配列が混合したプールにする。次に、蛍光に基づいたＰＣＲを、“偏りのない”（既知のＣｐＧメチル化部位と重なっていないプライマーを用いた）ＰＣＲ反応として、または“偏りのある”（既知のＣｐＧジヌクレオチドと重なったＰＣＲプライマーを用いた）反応として行なう。配列の識別は、増幅プロセスまたは蛍光検出プロセスにおいて、あるいはその両方においてなされる可能性がある。
【００８０】
メチライト（商標）アッセイは、ゲノムＤＮＡサンプル中のメチル化パターンの定量的検査に用いることができる。この場合には、配列の識別は、プローブがハイブリダイゼーションするときになされる。この定量的方法では、ＰＣＲ反応により、特定の推定メチル化部位と重なる蛍光プローブの存在下で、偏りのない増幅が行なわれる。入れたＤＮＡに対する偏りのない対照は、プライマーとプローブのいずれもＣｐＧジヌクレオチドとまったく重なっていない反応によって与えられる。また、ゲノムのメチル化に関する定性的検査は、偏りのあるＰＣＲプールを、既知のメチル化部位を“カバー”していない対照オリゴヌクレオチド（蛍光に基づいた“ＭＳＰ”法）と結合させることによって、またはメチル化部位の可能性がある部位をカバーしているオリゴヌクレオチドと結合させることによって実現される。
【００８１】
メチライト（商標）プロセスは、増幅プロセスにおいて“タックマン（ＴａｑＭａｎ：商標）”プローブとともに用いることができる。例えば、二本鎖ゲノムＤＮＡを亜硫酸水素ナトリウムで処理し、次いでタックマン（商標）プローブを用いて２通りあるＰＣＲ反応の一方を行なう；例えば、偏りのあるプライマーとタックマン（商標）プローブを用いるか、あるいは偏りのないプライマーとタックマン（商標）プローブを用いる。タックマン（商標）プローブは、蛍光性“レポーター”分子と“クエンチャー”分子で二重に標識されており、比較的ＧＣ含量の多い領域に対して特異的になるよう設計されているため、ＰＣＲサイクルにおいて順プライマーまたは逆プライマーよりも約１０℃高い温度で溶解する。そのため、タックマン（商標）プローブは、ＰＣＲのアニーリング／伸長ステップを通じ、完全にハイブリダイズしたままになる。Ｔａｑポリメラーゼという酵素はＰＣＲの間に新しい鎖を合成するため、場合によってはアニールされたタックマン（商標）プローブに達することがある。次に、Ｔａｑポリメラーゼの５’→３’エンドヌクレアーゼ活性により、タックマン（商標）プローブが消化されて蛍光性レポーター分子が放出される。そのため、リアルタイム蛍光検出システムを用いて、今やクエンチされていない信号を定量的に検出することができる。
【００８２】
（例えばメチライト（商標）に基づいた典型的なメチル化キットに見られるような）メチライト（商標）分析のための典型的な試薬としては、特定の遺伝子（またはメチル化によって変化したＤＮＡ配列またはＣｐＧ島）のためのＰＣＲプライマー；タックマン（商標）プローブ；最適化されたＰＣＲ緩衝液とデオキシヌクレオチド；Ｔａｑポリメラーゼなどが挙げられるが、これだけに限定されるわけではない。メチライト（商標）アッセイの異なる４つの方法（“Ａ”から“Ｄ”）に関しては、後に詳しく説明する。定量的メチライト（商標）プロセス“Ｂ”を利用することが好ましい。
【００８３】
メチル化された核酸をメチライト（商標）に基づいて検出することは比較的迅速にでき、その検出は、特異的オリゴヌクレオチド・プローブが増幅により置換されることに基づいている。好ましい実施態様では、増幅と検出は、実際には、特異的な二重標識タックマン（商標）オリゴヌクレオチド・プローブを用いて蛍光に基づいたリアルタイム定量的ＰＣＲ（“ＲＴ−ＰＣＲ”）により測定を行なうとき、同時に行なわれる。その後に何らかの操作をすることも分析することも必要ない。この置換可能なプローブは、修飾されていない元の核酸サンプル中に存在するメチル化されたＣｐＧ部位とメチル化されていないＣｐＧ部位を識別できるように特別な設計にすることができる。
【００８４】
メチライト（商標）は、メチル化特異的ＰＣＲ法（“ＭＳＰ”；アメリカ合衆国特許第５，７８６，１４６号）と同様、メチル化パターンを明らかにする上で、従来のＰＣＲに基づいた方法やその他の方法（例えばサザンブロット分析）よりも有意に優れている。メチライト（商標）は、サザンブロット分析よりも実質的に高感度であり、メチライト（商標）を用いると、非常に少数の核酸サンプル中やパフィン包埋サンプル中のメチル化された少数（少ない割合）の対立遺伝子を容易に検出できる。さらに、ゲノムＤＮＡの場合には、分析できるのがメチル化感受性制限エンドヌクレアーゼによって認識されるＤＮＡ配列だけではないため、ＣｐＧリッチな領域のより広い範囲にわたってメチル化パターンを細かくマッピングすることができる。メチライト（商標）を使用しなかったならば、従来のＰＣＲに基づいたメチル化法では不可避なメチル化感受性制限酵素による不完全な消化の結果として偽の結果が生じる可能性があるが、メチライト（商標）を使用すると、偽の結果をすべて排除することができる。
【００８５】
メチライト（商標）は、メチル化の量を測定する定量的方法として利用することができ、しかも他の方法よりも実質的に早い。メチライト（商標）は、ＰＣＲ後の操作または処理をまったく必要としない。そのため、亜硫酸水素塩で処理したＤＮＡの分析に関係する仕事を大きく減らせるだけでなく、ＰＣＲ産物を取り扱うことで後に実施する反応を汚染させる可能性を避けることもできる。
【００８６】
一実施態様では、メチライト（商標）を利用することにより、修飾されていない元のＤＮＡ配列内のどのＣｐＧ配列もカバーしないプライマーを用いて、可能なあらゆるメチル化状態を偏りなく増幅する。すべてのメチル化パターンが同等に増幅されるからには、ＤＮＡのメチル化パターンに関する定量的情報は、配列の違いを検出することのできる任意の方法（例えば蛍光に基づいたＰＣＲ）によって、得られたＰＣＲプールから取り出されることになる。
【００８７】
メチライト（商標）では、１つまたは複数のＣｐＧ特異的タックマン（商標）プローブを利用しており、それぞれのタックマン（商標）プローブが、所定の増幅されたＤＮＡ領域中の特定のメチル化部位に対応している。次に、変化した単一のＤＮＡサンプルについての複数のアリコートを用いた並列増幅反応においてこのプローブ群を利用し、修飾されていない元のゲノムＤＮＡサンプル中に存在しているすべてのメチル化パターンを同時に明らかにする。これは、ゲノムＤＮＡサンプルを直接シークエンシングするよりも少ない時間と費用で実現され、しかも実質的に感受性がより大きい。さらに、メチライト（商標）の一実施態様では、このようなメチル化パターンを定量的に評価することができる。
【００８８】
本発明は、この明細書に記載してあるように、さまざまなメチル化アッセイを利用して実施することができる。メチライト（商標）の実施態様に関しては、メチル化に依存した核酸修飾試薬（例えば亜硫酸水素塩）を用いて核酸サンプル（例えばゲノムＤＮＡサンプル）中のＣｐＧのメチル化状態を定性的かつ定量的に明らかにする４つの方法と、その方法に関係した診断キットがある。これら４つの方法をこの明細書ではプロセス“Ａ”、プロセス“Ｂ”、プロセス“Ｃ”、プロセス“Ｄ”として説明する。結局、メチル化されたＣｐＧ配列の識別が、増幅段階またはプローブのハイブリダイゼーション段階で、あるいはその両方でなされるように設計する。例えばプロセスＣとＤでは、修飾されたメチル化されていない核酸と修飾されたメチル化された核酸を識別できる“偏りのある”プライマーを用いることで、ＰＣＲ増幅の段階でメチル化されたＣｐＧ配列を識別する。プロセスＢでは、修飾された核酸を偏りなしに増幅するために（ＣｐＧメチル化部位をカバーしていない）“偏りのない”プライマーを用いるが、プローブとしては、修飾されたメチル化されていない核酸と修飾されたメチル化された核酸を識別できるプローブを用い、検出段階で（例えば蛍光（または発光）プローブのハイブリダイゼーション段階でだけ）メチル化されたＣｐＧ配列を定量的に識別する。プロセスＡそれ自体は、増幅段階でも検出段階でもメチル化されたＣｐＧ配列を識別しないが、入れたＤＮＡに対する対照反応を提供することによって他の３つの方法の裏付けを与えてそれらの方法を意味あるものにする。
【００８９】
メチライト（商標）プロセスＤ。本発明によるメチライト（商標）の第１の実施態様では、メチル化されたＣｐＧを含む核酸を定性的に検出する方法であって、核酸を含むサンプルを、メチル化されていないシトシンを修飾する修飾剤と接触させて、変換された核酸を生成させ；特異的オリゴヌクレオチド・ハイブリダイゼーション・プローブの存在下で、２つのオリゴヌクレオチド・プライマーを用いてこの変換された核酸を増幅し（プライマーとプローブの両方とも、修飾されたメチル化されていない核酸と修飾されたメチル化された核酸を識別できる）；増幅によるプローブの置換に基づいて、“メチル化された”核酸を検出する操作を含む方法が提供される。
【００９０】
この明細書で用いる“修飾する”という用語は、修飾剤を用いてメチル化されていないシトシンを別のヌクレオチドに変換することを意味する。この変換によって、元の核酸サンプル中でメチル化されていないシトシンがメチル化されたシトシンから識別される。修飾剤は、メチル化されていないシトシンをウラシルに変化させることが好ましい。メチル化されていないシトシンを変化させるのに用いる修飾剤は亜硫酸水素ナトリウムであることが好ましいが、メチル化されていないシトシンを選択的に変化させるがメチル化されたシトシンは変化させない他の等価な修飾剤も、本発明の方法で代わりに用いることができる。亜硫酸水素ナトリウムは、メチル化されたシトシンとは反応せずにシトシンの５， ６−二重結合と簡単に反応してスルホン化されたシトシン中間体を生成させる。この中間体は、アルカリ条件のもとで脱アミノ化反応によりウラシルになる。Ｔａｑポリメラーゼはウラシルをチミンとして認識し、５−メチルシチジン（ｍ５Ｃ）をシチジンとして認識するため、亜硫酸水素ナトリウムによる処理とＰＣＲ増幅を順番に組み合わせることにより、最終的に、メチル化されていないシトシン残基はチミンに変換され（Ｃ→Ｕ→Ｔ）、メチル化されたシトシン残基（“ｍＣ”）はシトシンに変換される（ｍＣ→ｍＣ→Ｃ）。したがってゲノムＤＮＡを亜硫酸水素ナトリウムで処理すると、メチル化されていないシトシンがウラシルに変換されることにより、メチル化に依存した配列の違いが生まれ、ＰＣＲを行なうと、得られた産物は、修飾されていない核酸内でメチル化されたシトシンが生成される位置だけにシトシンを含むようになる。
【００９１】
この明細書で用いるオリゴヌクレオチド“プライマー”とは、修飾された核酸または修飾されていない核酸に相補的な鎖と配列特異的なハイブリダイゼーション（アニーリング）をすることのできる、直線状で一本鎖になったオリゴマーのデオキシリボ核酸分子またはリボ核酸分子を意味する。特異的プライマーは、この明細書で用いられているように、ＤＮＡであることが好ましい。本発明のプライマーには、適切な配列で十分な長さがあり、増幅プロセスにおいて重合（プライマーの伸長）を特異的かつ効果的に開始させるオリゴヌクレオチドが含まれる。本発明の方法で用いられているように、オリゴヌクレオチド・プライマーは、一般に、１２〜３０個またはそれ以上のヌクレオチドを含んでいるが、ヌクレオチドの数はそれよりも少なくてもよい。プライマーは１８〜３０個のヌクレオチドを含んでいることが好ましい。正確な長さは、（増幅中の）温度、緩衝液、ヌクレオチドの組成など、多くの因子に依存するであろう。プライマーは一本鎖であることが好ましいが、二本鎖のプライマーも、鎖が最初に分離するのであれば用いることができる。プライマーは、適切な任意の方法を用いて調製することができる。例えば、従来のホスホトリエステル法、ホスホジエステル法や、従来技術でよく知られている自動化された方法がある。
【００９２】
この明細書に記載した本発明の実施態様におけるように、特異的プライマーは、興味の対象であるゲノム遺伝子座の各鎖と実質的に相補的になるように設計することが好ましい。一般に、一方のプライマーは、遺伝子座のマイナス（−）鎖（水平に置いた二本鎖ＤＮＡ分子の“下方の”鎖）と相補的であり、他方のプライマーは、プラス（＋）鎖（“上方の”鎖）と相補的である。プロセスＤの実施態様で用いられているように、プライマーは、ＤＮＡがメチル化される可能性のある部位（ＣｐＧヌクレオチド）と重なるように設計し、修飾されたメチル化されていないＤＮＡをメチル化されたＤＮＡから特異的に識別できるようにすることが好ましい。この配列識別は、完全に一致したオリゴヌクレオチドと一致しないオリゴヌクレオチドでアニーリング温度に差があることに基づいていることが好ましい。プロセスＤの実施態様では、プライマーは、一般に、１〜数個のＣｐＧ配列と重なるように設計する。プライマーは、１〜５個のＣｐＧ配列と重なるように設計することが好ましく、非常に好ましいのは１〜４個のＣｐＧ配列と重なることである。対照的に、本発明の実施例における定量的実施態様では、プライマーはどのＣｐＧ配列とも重なっていない。
【００９３】
十分に“メチル化されていない”（修飾されたメチル化されていない核酸鎖と相補的な）プライマー・セットの場合には、アンチセンス・プライマーは、対応する（−）鎖配列内にグアノシン残基（“Ｇ”）の代わりにアデノシン残基（“Ａ”）を含んでいる。アンチセンス・プライマー中の置換されたこれらＡ残基は、メチル化されていないＣ残基（“Ｃ”）を亜硫酸水素塩で変化させた後に増幅を行なうことによって生成する対応する（＋）鎖領域であり、ウラシル残基およびチミジン残基（“Ｕ”と“Ｔ”）と相補的になるであろう。この場合、センス・プライマーは、アンチセンス・プライマー伸長産物と相補的になるよう設計し、対応する（＋）鎖配列内のメチル化されていないＣ残基の代わりにＴ残基を含むようにすることが好ましい。このセンス・プライマー中の置換されたこれらＴ残基は、元の（＋）鎖の中の修飾されたＣ（Ｕ）残基と相補的な位置においてアンチセンス・プライマー伸長産物中に組み込まれたＡ残基と相補的になるであろう。
【００９４】
十分にメチル化された（メチル化されたＣｐＧを含む核酸鎖と相補的な）プライマーの場合には、アンチセンス・プライマーは、元の（＋）鎖中のメチル化されたＣ残基（すなわちｍＣｐＧ配列）と相補的な対応する（−）鎖配列内にＧ残基の代わりにＡ残基を含むことはなかろう。同様に、この場合には、センス・プライマーは、対応する（＋）鎖のｍＣｐＧ配列中にあるメチル化されたＣ残基の代わりにＴ残基を含むことはなかろう。しかし十分にメチル化されたプライマーによってカバーされる領域内のＣｐＧ配列中に存在しておらず、しかもメチル化されていないＣ残基は、メチル化されていないプライマーについて上で説明したように、十分にメチル化されたプライマー・セットの中に含まれるであろう。
【００９５】
プロセスＤの実施態様におけるように、増幅プロセスにより、特異的オリゴヌクレオチド・ハイブリダイゼーション・プローブの存在下で、亜硫酸水素塩で変換された核酸を２つのオリゴヌクレオチド・プライマーを用いて増幅することが好ましい。プライマーとプローブの両方とも、修飾されたメチル化されていない核酸と修飾されたメチル化された核酸を識別できる。さらに、“メチル化された”核酸の検出は、増幅により得られるプローブの蛍光に基づいている。一実施態様では、蛍光は、ポリメラーゼ酵素の５’→３’エキソヌクレオチド活性によってプローブが分解されることによって発生する。別の実施態様では、蛍光は、２つの互いに隣接したハイブリダイゼーション・プローブ（ライトサイクラー（Ｌｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ：商標））の間で、またはハイブリダイゼーション・プローブとプライマーの間で蛍光エネルギーが移動することによって発生する。別の実施態様では、蛍光は、プライマー自身から発生する（サンライズ（Ｓｕｎｒｉｓｅ：商標）法）。増幅プロセスは、オリゴヌクレオチド・プライマーを用いた酵素による連鎖反応であることが好ましく、この連鎖反応により、標的となる遺伝子座から、関係する反応ステップの数からして指数関数的な量の増幅産物を生成させる。
【００９６】
上で説明したように、プライマー・セットのうちの一方は（−）鎖と相補的であり、他方は（＋）鎖と相補的である。プライマーは、興味の対象となる増幅領域、すなわち“アンプリコン”を挟むように選択する。標的となる変性した核酸にプライマーをハイブリダイズさせた後、ＤＮＡポリメラーゼとヌクレオチドを用いてプライマーを伸長させると、アンプリコンに対応する新しい核酸鎖が合成される。ＤＮＡポリメラーゼは、従来技術で一般に用いられているＴａｑポリメラーゼであることが好ましい。しかし、５’→３’ヌクレアーゼ活性を有する同等なポリメラーゼを代わりに使用することもできる。新しいアンプリコンの配列もプライマーおよびポリメラーゼの鋳型であるため、変性、プライマーのアニーリング、伸長というサイクルを繰り返すことにより、アンプリコンが指数関数的に生成される。連鎖反応の産物は、アンプリコン配列に対応していて、端部が、使用した特異的プライマーの端部によって決まる別々の核酸のコピーである。利用する増幅法は、ＰＣＲ法（Ｍｕｌｌｉｓ他、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ． Ｓｙｍｐ． Ｑｕａｎｔ． Ｂｉｏｌ．、第５１巻、２６３〜２７３ページ；Ｇｉｂｂｓ、Ａｎａｌ． Ｃｈｅｍ．、第６２巻、１２０２〜１２１４ページ、１９９０年）であることが好ましいが、それよりも好ましいのは、従来技術でよく知られている、この方法を自動化した方法である。
【００９７】
メチル化に依存した配列の違いは、蛍光に基づいた定量的ＰＣＲ法（リアルタイム定量的ＰＣＲ、Ｈｅｉｄ他、Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．、第６巻、９８６〜９９４ページ、１９９６年；Ｇｉｂｓｏｎ他、Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．、第６巻、９９５〜１００１ページ、１９９６年）（例えば“タックマン（商標）”法、“ライトサイクラー（商標）”法、“サンライズ（商標）”法）で検出することが好ましい。タックマン（商標）法とライトサイクラー（商標）法の場合には、配列の識別は、（１）増幅ステップと（２）蛍光検出ステップという２つのステップの一方または両方においてなされうる。サンライズ（商標）法の場合には、増幅ステップと蛍光検出ステップが一致している。ＦＲＥＴハイブリダイゼーションの場合には、ライトサイクラー（商標）に関するプローブのフォーマットとして、配列の違いを識別するためにＦＲＥＴオリゴヌクレオチドの一方または両方を用いることができる。非常に好ましい増幅法は、この明細書に記載した本発明のすべての実施態様で用いられているように、二重標識した蛍光オリゴヌクレオチド・プローブを利用した、蛍光に基づいたリアルタイム定量的ＰＣＲ法（Ｈｅｉｄ他、Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．、第６巻、９８６〜９９４ページ、１９９６年）である（ＡＢＩプリズム７７００配列検出システム（パーキン・エルマー・アプライド・バイオシステムズ社、フォスター・シティ、カリフォルニア州）を使用したタックマン（商標）ＰＣＲ）。
【００９８】
“タックマン（商標）”ＰＣＲ反応では、ペアの増幅用プライマーと、タックマン（商標）プローブと呼ばれる、応答を引き出すための伸長不能なオリゴヌクレオチドとを用いる。このプローブは、順プライマーと逆プライマー（すなわちセンス・プライマーとアンチセンス・プライマー）の間に位置するＧＣリッチな配列とハイブリダイズするよう設計されている。タックマン（商標）プローブは、さらに、蛍光性“レポーター部分”と、タックマン（商標）オリゴヌクレオチドのヌクレオチドに結合しているリンカー部分（例えばホスホラミダイト）と共有結合する“クエンチャー部分”とを備えている。適切なレポーター分子とクエンチャー分子の具体例としては、５’蛍光レポーター染料６ＦＡＭ（“ＦＡＭ”；２， ７−ジメトキシ−４， ５−ジクロロ−６−カルボキシ−フルオレセイン）、ＴＥＴ（６−カルボキシ−４， ７， ２’， ７’−テトラクロロフルオレセイン）、３’クエンチャー染料ＴＡＭＲＡ（６−カルボキシテトラメチルローダミン）（Ｌｉｖａｋ他、ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ａｐｐｌ．、第４巻、３５７〜３６２ページ、１９９５年；Ｇｉｂｓｏｎ他、Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．、第６巻、９９５〜１００１ページ、１９９６年；Ｈｅｉｄ他、Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．、第６巻、９８６〜９９４ページ、１９９６年）が挙げられる。
【００９９】
適切なタックマン（商標）プローブを設計する１つの方法では、“プライマー・エクスプレス（Ｐｒｉｍｅｒ Ｅｘｐｒｅｓｓ）”などの支援用ソフトウエア・ツールを用いる。この“プライマー・エクスプレス”は、特異的配列（ＡＴ塩基対と比べてＣＧ塩基対は結合が強い）であるために、またはプライマーの長さのために（プライマーの融点と比べて）融点に少なくとも１０℃の違いを与えるＧＣリッチな配列内のＣｐＧ島の位置に関する変数を決定することができる。
【０１００】
タックマン（商標）プローブは、本発明のどの方法を利用するかに応じ、既知のＣｐＧメチル化部位をカバーしている場合としていない場合が可能である。プロセスＤの実施態様では、タックマン（商標）プローブは、１〜５個のＣｐＧ配列を重ねることにより、修飾されたメチル化されていない核酸と修飾されたメチル化された核酸を識別できるように設計することが好ましい。十分にメチル化されていないプライマー・セットと十分にメチル化されたプライマー・セットについて上に説明したように、タックマン（商標）プローブは、修飾されていない核酸と相補的になるように、あるいは適切な塩基置換により、亜硫酸水素塩処理で変換した配列と相補的になるように設計することができる。なお亜硫酸水素塩処理で変換した配列は、修飾されていない元の核酸サンプル中で十分にメチル化されていない配列か、十分にメチル化されている配列である。
【０１０１】
タックマン（商標）ＰＣＲ反応におけるそれぞれのオリゴヌクレオチド・プライマーまたはプローブは、０個から異なる多数個のＣｐＧジヌクレオチドにまたがることが可能であるため、それぞれ、亜硫酸水素塩処理の後に、２つの異なる配列となることができる（ｍＣｐＧまたはＵｐＧ）。例えば、１つのオリゴヌクレオチドが３つのＣｐＧジヌクレオチドにまたがっている場合、ゲノムＤＮＡに生じる可能な異なる配列の数は、２３＝８種類である。順プライマーと逆プライマーのそれぞれが３つのＣｐＧジヌクレオチドにまたがっており、プローブ・オリゴヌクレオチド（またはＦＲＥＴフォーマットの場合には両方のオリゴヌクレオチド）が別の３つのＣｐＧジヌクレオチドにまたがっている場合、配列の組み合わせの合計数は８×８×８＝５１２通りになる。理論上は、これら５１２通りの配列それぞれの相対量を定量的に分析するのに別々のＰＣＲ反応を設計することができよう。実際には、メチル化に関する定量的情報のほとんどは、はるかに少数の異なる配列を分析することで得られる。したがって、最も単純な形態として、仮想的な実施例における最も極端な配列である、十分にメチル化された配列と十分にメチル化されていない配列に対する反応を設計することによって、本発明の方法を実施することができる。これら２つの反応の比、またはメチル化された配列の反応と対照反応（プロセスＡ）の比から、この遺伝子座におけるＤＮＡメチル化レベルの指標が得られよう。
【０１０２】
プロセスＤのメチライト（商標）の実施態様におけるメチル化の検出は、この明細書に記載した他のメチライト（商標）の実施態様におけるのと同様、増幅によるプローブの置換に基づいている。理論上は、プローブの置換プロセスは、プローブをそのままにするか、あるいはプローブを消化させるように設計することができる。プローブの置換は、この明細書におけるのと同様、増幅中にプローブの消化によって起こることが好ましい。ＰＣＲサイクルの伸長段階において、蛍光ハイブリダイゼーション・プローブを、ＤＮＡポリメラーゼの５’→３’ヌクレアーゼ活性によって開裂させる。プローブが開裂すると、レポーター部分の放出はもはやクエンチャー部分に効果的には伝わらないため、５１８ｎｍにおけるレポーター部分の蛍光放出スペクトルが大きくなる。クエンチャー部分（例えばＴＡＭＲＡ）の蛍光強度は、ＰＣＲ増幅の間を通じてほんのわずかしか変化しない。タックマン（商標）ＰＣＲ反応の効率にはいくつかの因子が影響を与える可能性がある。そのような因子としては、例えば、磁性や塩の濃度；反応条件（時間と温度）；プライマーの配列；ＰＣＲの標的のサイズ（すなわちアンプリコンのサイズ）と組成などがある。所定のゲノム遺伝子座について最適の蛍光強度を得るためにこれらの因子を最適化する方法は、ＰＣＲの当業者には明らかであるが、好ましい条件をこの明細書の“実施例”においてさらに詳しく説明する。アンプリコンのサイズは、５０〜８，０００塩基対またはそれ以上が可能であるが、これよりも短くてもよい。一般に、アンプリコンは１００〜１，０００塩基対であり、好ましいのは１００〜５００塩基対である。反応は、９６ウエルの光学トレイおよびキャップと、配列検出装置（ＡＢＩプリズム）とを用いてＰＣＲ増幅を行なうことによりリアルタイムで監視し、ＰＣＲ増幅中の熱サイクルにおける９６ウエルすべての蛍光スペクトルを連続的に測定できるようにすることが好ましい。入れる核酸の量を制御し、トレイごとのデータを規格化するため、プロセスＤはプロセスＡと合わせて実行することが好ましい。
【０１０３】
メチライト（商標）プロセスＣ。メチライト（商標）プロセスを変更し、ＰＣＲ産物の検出段階で配列を識別することを回避できる。そこで、追加の定性的方法では、プライマーだけがＣｐＧジヌクレオチドをカバーするように設計し、増幅段階においてだけ配列が識別されるようにする。この実施態様で用いるプローブはやはりタックマン（商標）プローブであるが、このプローブは、修飾されていない元の核酸中に存在するどのＣｐＧ配列とも重ならないように設計することが好ましい。プロセスＣのこの実施態様は、ＭＳＰ法をハイスループットで蛍光に基づいたリアルタイムの方法にしたものであり、メチル化されたＣｐＧ配列を検出するのに必要な時間を短くすることによって顕著な改善が達成されている。反応は、９６ウエルの光学トレイおよびキャップと、配列検出装置（ＡＢＩプリズム）とを用いてＰＣＲ増幅を行なうことによりリアルタイムで監視し、ＰＣＲ増幅中の熱サイクルにおける９６ウエルすべての蛍光スペクトルを連続的に測定できるようにすることが好ましい。入れる核酸の量を制御し、トレイごとのデータを規格化するため、プロセスＣは（下に示す）プロセスＡと合わせて実行することが好ましい。
【０１０４】
メチライト（商標）プロセスＢ。本発明の好ましい実施態様では、やはりメチライト（商標）プロセスを変更し、ＰＣＲ産物の検出段階で配列を識別することを回避できる。定量的プロセスＢの一実施態様では、プローブだけがＣｐＧジヌクレオチドをカバーするように設計し、プローブのハイブリダイゼーション段階においてだけ配列が識別されるようにする。タックマン（商標）プローブを使用することが好ましい。その場合、もともと増幅に偏りがあるのでない限り、亜硫酸水素塩による変換ステップで生成されるさまざまな配列が同じ効率で増幅される（Ｗａｒｎｅｃｋｅ他、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、第２５巻、４４２２〜４４２６ページ、１９９７年）。特定の１つのメチル化パターンに関係する異なる配列のそれぞれについて別々のプローブを設計すると（例えば３個のＣｐＧの場合には２３＝８個のプローブ）、いろいろなＰＣＲ産物が混合したプール内のそれぞれの配列の相対的割合を定量的に決定することができよう。反応は、９６ウエルの光学トレイおよびキャップと、配列検出装置（ＡＢＩプリズム）とを用いてＰＣＲ増幅を行なうことによりリアルタイムで監視し、ＰＣＲ増幅中の熱サイクルにおける９６ウエルすべての蛍光スペクトルを連続的に測定できるようにすることが好ましい。入れる核酸の量を制御し、トレイごとのデータを規格化するため、プロセスＢは下に示すプロセスＡと合わせて実行することが好ましい。
【０１０５】
メチライト（商標）プロセスＡ。メチライト（商標）プロセスＡそれ自体は、増幅段階でも検出段階でもメチル化されたＣｐＧ配列を識別しないが、入れたＤＮＡの対照反応を提供することによって他の３つの方法の裏付けを与えてそれらの方法を意味あるものにするとともに、トレイごとのデータを規格化する。したがって、プライマーとプローブのいずれもどのＣｐＧジヌクレオチドとも重なっていない場合には、反応は偏りのない増幅であり、蛍光に基づいた定量的リアルタイムＰＣＲを利用した増幅の測定結果は、入れたＤＮＡの量に対する対照となる。プロセスＡは、増幅プロセスによる亜硫酸水素塩による処理が何らかの差をもたらすことを回避できるよう、プライマーおよびプローブ中にＣｐＧジヌクレオチドがないだけでなく、アンプリコンにもＣｐＧをまったく含んでいないことが好ましい。プロセスＡのためのアンプリコンは、遺伝子増幅や遺伝子欠失などでコピー数がしばしば変化することのないＤＮＡ領域であることが好ましい。
【０１０６】
定性的メチライト（商標）法（プロセス“Ｂ”の実施態様）で得られた結果を以下の実施例で説明する。ヒトの腫瘍に関する多数のサンプルをこの方法で分析し、良好な結果を得た。
【０１０７】
ガンの診断法および予後予測法と、そのためのキット
一般に、本発明の診断法および／または予後予測法には、検査組織から組織サンプルを取得し、その組織サンプルに由来するＤＮＡについてメチル化アッセイを行なって付随するメチル化状態を明らかにし、その結果に基づいて診断または予後予測を行なう操作が含まれる。
【０１０８】
好ましい実施態様では、ガンの診断法および予後予測法は、配列番号１〜６０、６４、６５（以下の表ＩＩを参照のこと）に対応するオリゴマー・プライマーおよびプローブによって規定されるここに示した２０種類の遺伝子配列（ＡＰＣ、ＡＲＦ、ＣＡＬＣＡ、ＣＤＨ１、ＣＤＫＮ２Ａ、ＣＤＫＮ２Ｂ、ＥＳＲ１、ＧＳＴＰ１、ＨＩＣ１、ＭＧＭＴ、ＭＬＨ１、ＭＹＯＤ１、ＲＢ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＨＢＳ１、ＴＩＭＰ３、ＣＴＮＮＢ１、ＰＴＧＳ２、ＴＹＭＳ、ＭＴＨＦＲ、またはメチル化によってこれら遺伝子において修飾されたＤＮＡ配列）のうちの１または複数のメチル化状態を明らかにすることに基づいている。配列番号６１〜６３は、この分析で用いるＡＣＴＢ“対照”遺伝子領域に対応する（以下の実施例１を参照のこと）。
【０１０９】
さらに、所定のＣｐＧ島の一部におけるメチル化状態が一般にその島全体を代表しているという事実に基づくと、この明細書で用いるＡＰＣ、ＡＲＦ、ＣＡＬＣＡ、ＣＤＨ１、ＣＤＫＮ２Ａ、ＣＤＫＮ２Ｂ、ＥＳＲ１、ＧＳＴＰ１、ＨＩＣ１、ＭＧＭＴ、ＭＬＨ１、ＭＹＯＤ１、ＲＢ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＨＢＳ１、ＴＩＭＰ３、ＣＴＮＮＢ１、ＰＴＧＳ２、ＴＹＭＳに関係するＣｐＧ島の他の配列領域に対応する他のプライマーまたはプローブも用いることができる。
【０１１０】
そこで、公知の１または複数のメチル化アッセイ（上に説明したものも含む）を実行するのに必要な試薬をこのようなプライマーおよび／またはプローブ、またはその一部と組み合わせ、ＣｐＧを含む核酸のメチル化状態を明らかにする。
【０１１１】
例えば、メチライト（商標）、Ｍｓ−ＳＮｕＰＥ、ＭＣＡ、ＣＯＢＲＡ、ＭＳＰというメチル化アッセイを単独で、あるいは組み合わせ、配列番号１〜６５の配列またはその一部を含むプライマーまたはプローブを使用することで、ＡＰＣ、ＡＲＦ、ＣＡＬＣＡ、ＣＤＨ１、ＣＤＫＮ２Ａ、ＣＤＫＮ２Ｂ、ＥＳＲ１、ＧＳＴＰ１、ＨＩＣ１、ＭＧＭＴ、ＭＬＨ１、ＭＹＯＤ１、ＲＢ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＨＢＳ１、ＴＩＭＰ３、ＣＴＮＮＢ１、ＰＴＧＳ２、ＴＹＭＳ、ＭＴＨＦＲに対応する２０種類の遺伝子配列領域のうちの１または複数の中にあるＣｐＧジヌクレオチドのメチル化状態、あるいはこれら２０種類の配列領域のうちの１９種類（すなわちＭＴＨＦＲを除くすべて）の場合には、これら配列に付随する他のＣｐＧ島配列のメチル化状態を明らかにする。なお、これら１９種類の遺伝子配列に関係する他のＣｐＧ島配列は、これら１９種類の遺伝子配列領域のうちの１つの少なくとも１つのヌクレオチドを含み、ＣｐＧジヌクレオチドの頻度が観測値／予測値の比＞０．６に対応することと、ＧＣ含量＞０．５であることの両方の条件を満たす、ゲノムＤＮＡ中の連続配列である。
【０１１２】
実施例１
ＥＡＣの進行とともに増加するＣｐＧ島の高メチル化
この実施例では、合計で２０の遺伝子座の発ガンに関与することが知られているか、あるいは他の腫瘍でメチル化されていることが明らかになっているということで選んだ１９の異なる遺伝子（表Ｉと上記の“定義”を参照のこと）と関係したＣｐＧ島のメチル化状態と、１つの非ＣｐＧ島配列（ＭＴＨＦＲ対照配列）のメチル化状態の分析結果を示す。
【０１１３】
バレット食道および／またはそれに付随する腺ガンがさまざまなステージにある患者３１人から採取した８４個の組織サンプル中の２０種類の遺伝子に関するメチル化の定量的データから、病気のステージが進むにつれてＣｐＧ島が高メチル化される頻度と程度が一般に大きくなることがわかった。そこで、組織ごとに、高メチル化の頻度と程度の両方に基づき、遺伝子をメチル化状態に従って異なるクラスに分けた（図１）。
【０１１４】
材料と方法
サンプルの採取と組織病理学的検査。腺ガンになっているか、ＩＭが最も進んだ段階にある、合計で５１人の患者（年齢は３９歳〜８６歳）から、多数の組織サンプル（正常な食道（ＮＥ）、正常な胃（Ｓ）、腸上皮化生（ＩＭ）、異形成（ＤＹＳ）および／または腺ガン（Ｔ））を採取した。
【０１１５】
分析した最初のサンプル群は３１人の患者から採取したバイオプシー用組織である。採取してすぐに分割し、各サンプルの一部を液体窒素にただちに浸して凍らせ、パラフィン中に埋めた。それを病理学者（Ｋ．Ｗ．）が組織病理学的に調べた。すべての患者について、病気になっている領域から正常な食道の組織を１０ｃｍまたはそれ以上採取した。診断がはっきりしない場合には、凍らせた組織の凍結切片の検査を行なった。接合部を胃粘膜の皺の近位縁であると定義すると、ガンの中心が解剖学的な胃食道接合部よりも上である場合には、ガンの原発部位の分類を食道にした。ＴＮＭ病期分類を用いて各腺ガンのステージを分類した。
【０１１６】
２０の症例について追試研究を行なうため、第２のサンプル群を採取した。２種類のＩＭサンプル群を採取した。一方のサンプル群は、最も進行したステージのＩＭだけを有する患者（８人）からのものであり、他方のサンプル群は、ＩＭとそれに付随した異形成／腺ガンが食道の別の領域にある患者（１２人）からのものである。各サンプルについてＨ＆Ｅスライド（５ミクロンの切片）を用意し、病理学者（Ｋ．Ｗ．）が検査してＩＭ組織を確認し、異常のある位置を特定した。分析に用いたパラフィン・ブロック中に異形成または腺ガンの何らかの徴候が見られたケースをこの追試研究では除外した。５ミクロンのＨ＆Ｅ切片に隣接する３０ミクロンの切片から、ＩＭ組織を注意深く顕微解剖して他のタイプの細胞と分離した。サンプル中に存在する最も進行した組織病理学的病変がどのステージにあるかに従って、すべてのサンプルを分類した。この研究に関しては、南カリフォルニア大学ケック医学部の審査委員会から承認を得た。
【０１１７】
核酸の単離。簡単化したプロテイナーゼＫ消化法により、凍らせたバイオプシー用組織からゲノムＤＮＡを単離した（Ｌａｉｒｄ他、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、第１９巻、４２９３ページ、１９９１年）。パラフィン包埋組織からのＤＮＡを一晩かけて５０℃にて溶解用緩衝液（１００ｍＭのトリスＨＣｌ、ｐＨ８；１０ｍＭのＥＤＴＡ；１ｍｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫ）中に抽出した（Ｓｈｉｂａｔａ他、Ａｍ． Ｊ． Ｐａｔｈｏｌ．、第１４１巻、５３９〜５４３ページ、１９９２年）。
【０１１８】
亜硫酸水素ナトリウムによる変換。亜硫酸水素ナトリウムによるゲノムＤＮＡの変換を、以前に報告されているようにして行なった（Ｏｌｅｋ他、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、第２４巻、５０６４〜５０６６ページ、１９９６年）。ビーズを５０℃にて１４時間にわたって培養し、完全に変換されるようにした。亜硫酸水素ナトリウムによる処理は、メチル化されていないシトシンがウラシルに変換されるのに対し、メチル化されたシトシン残基はそのままになる（Ｆｒｏｍｍｅｒ他、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、第８９巻、１８２７〜１８３１ページ、１９９２年）。
【０１１９】
メチライト（商標）分析。亜硫酸水素ナトリウムによる変換の後、この明細書に記載したようにして、また以前に報告されているようにして（Ｅａｄｓ他、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、第６０巻、５０２１〜５０２６ページ、２０００年；Ｅａｄｓ他、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、第５９巻、２３０２〜２３０６ページ、１９９９年；Ｅａｄｓ他、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、第２８巻、Ｅ３２ページ、２０００年）、蛍光に基づいたリアルタイムＰＣＲアッセイであるメチライト（商標）によりメチル化分析を行なった。亜硫酸水素塩で変換したＤＮＡに対して特異的になるように設計したプライマーとプローブを２セット用いた。用いたのは、興味の対象である遺伝子用のメチル化されたセットと、入れたＤＮＡに対する規格化用のβ−アクチン（ＡＣＴＢ）という基準セットである。ヒト精子のＤＮＡと、ＳｓｓＩ（ニュー・イングランド・バイオラブズ社）で処理した精子のＤＮＡ（高度にメチル化されている）とを用い、以前に報告されているようにして（Ｅａｄｓ他、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、第６０巻、５０２１〜５０２６ページ、２０００年）、メチル化されたＤＮＡに対する反応の特異性を別々に確認した。
【０１２０】
サンプルの遺伝子／ＡＣＴＢの比を、ＳｓｓＩで処理した精子のＤＮＡの遺伝子／ＡＣＴＢの比で割り、１００を掛けることにより、特定の遺伝子座における十分にメチル化された分子の割合を計算した。ＰＭＲ（メチル化された基準の割合）という略号を用い、この測定結果を示した。亜硫酸水素塩による処理の後、付随している異形成の状態がサンプル中でどうなっているかを知らない人が、上に説明したようにして、顕微解剖したパラフィン包埋サンプルに関するメチル化分析を行なった。
【０１２１】
表ＩＩには、本発明のメチル化分析で用いたメチライト（商標）プライマーとプローブの配列（配列番号１〜６５）を、Ｇｅｎｂａｎｋの配列データに基づき（配列番号６４と６５は除く、下の説明を参照のこと）、リストにしてある。以下の３つのオリゴをすべての反応で用いた。すなわち、用いたのは、５’蛍光レポーター染料（６ＦＡＭ）と３’クエンチャー染料（ＴＡＭＴＲＡ）を有する１つのオリゴヌクレオチド・プライマーが隣接した、遺伝子座特異的な２つのＰＣＲプライマー（Ｌｉｖａｋ他、ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ａｐｐｌ．、第４巻、３５７〜３６２ページ、１９９５年）である。各配列についてのＧｅｎｂａｎｋ登録番号を、この配列内の対応するＰＣＲアンプリコンの位置とともにリストにしてある。メチライト・アンプリコンを含む２００塩基対についてのＧＣ含量％、ＣｐＧの観測値／期待値の比、ＣｐＧ：ＧｐＣの比を、それぞれの遺伝子について示してある。反応のタイプは、メチル化反応については“Ｍ”で、対照反応については“Ｃ”で示してある。亜硫酸水素塩で処理したＤＮＡ鎖（上（“Ｔ”）と下（“Ｂ”））とアンプリコンの方向（平行（“Ｐ”）または反平行（“Ａ”））も示してある。すべてのプライマーとプローブの配列を５’から３’の方向に示してある。それぞれのプライマーまたはプローブの配列の後ろにある括弧内の数字は、関係する配列番号に対応している。星印１つ（＊）は、このＧｅｎｂａｎｋの配列とは異なる塩基が２つ、われわれのＣＤＫＮ２Ａプライマーの中に存在していることを示す。そうなったのも、予備的ハイスループットＧｅｎｂａｎｋの入力データが、出願人がプライマーを設計したときに利用できる唯一の配列だったからである。正しいプライマーは、以下のようでなければならない。順プライマーは、ＴＧＧＡＧＴＴＴＴＣＧＧＴＴＧＡＴＴＧＧＴＴ（配列番号６４）、逆プライマーは、ＡＡＣＡＡＣＧＣＣＣＧＣＡＣＣＴＣＣＴ（配列番号６５）。Ｇｅｎｂａｎｋの配列と異なる塩基に下線を施してある。星印２つ（＊＊）は、開始部位がはっきりしていないことを意味する。
【表４】
2004505612.tif 000005
【表５】
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【表６】
2004505612.tif 000007
【表７】
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【表８】
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【表９】
2004505612.tif 000010
【０１２２】
統計。統計処理をするため、以前に報告されているようにして（Ｅａｄｓ他、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、第６０巻、５０２１〜５０２６ページ、２０００年）、メチライト（商標）により得られたＰＭＲ値（上の説明を参照のこと）を４ＰＲＭを境にして“２つに分けた”。２つに分けることにより、グラフ表示が容易になる。また、２つに分けることにより、高メチル化のレベルが異なる遺伝子座が数値に及ぼす影響が和らげられる結果、遺伝子相互間で高メチル化の頻度を比較するときの信頼性が高まる。特に、２つに分けることにより、各クラスでメチル化された遺伝子が数値に及ぼす影響が等しくなり、メチル化の頻度を遺伝子相互間で比較するのが容易になる。
【０１２３】
４ＰＲＭという二分点は、すべてのＣｐＧ島について正常な組織と悪性組織を最もよく区別できることから選択した（Ｅａｄｓ他、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、第６０巻、５０２１〜５０２６ページ、２０００年）。しかしこの明確な二分点は、統計に有意に影響することはなく、結論を変えることもないため、他の二分点も本発明の範囲に含まれる（下の説明を参照のこと）。
【０１２４】
そこで、４ＰＲＭまたはそれ以上のサンプルはメチル化されたとして値１を与え、４ＰＲＭ未満のサンプルはメチル化されていないとして値０を与えた。次に、各クラス（下の“後成的遺伝子クラス”を参照のこと）、または全部で１９の遺伝子についてメチル化された遺伝子の積算値を、サンプル数が均等でない場合に使用できるようにしたフィッシャーの保護された最小有意差（ＰＬＳＤ）検定（ＳＡＳスタットヴュー・ソフトウエア）における連続変数として用い、ｐ値を得た。組織のタイプ、付随する異形成の存在、腫瘍のステージなどのさまざまなパラメータを名義変数として用いた。ＩＭにおける高メチル化と、付随する異形成および／またはガンの存在に関する上記の“追試”研究におけるＩＭサンプルを、メチル化されたクラスＡ遺伝子が１個以下と２個以上の地点でさらに２つに分けた。次に、フィッシャーの検定を厳密に行なって統計的有意性を明らかにした。
【０１２５】
結果
ＣｐＧ島の高メチル化とＥＡＣの進行。合計で２０の遺伝子座についての、１９の異なる遺伝子に付随する一群のＣｐＧ島のメチル化状態と、１つの非ＣｐＧ島配列のメチル化状態とを、定量的ハイスループット・メチライト（商標）アッセイで分析した（Ｅａｄｓ他、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、第５９巻、２３０２〜２３０６ページ、１９９９年；Ｅａｄｓ他、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、第２８巻、Ｅ３２ページ、２０００年）。メチル化反応の効率は、それぞれの分析においてメチル化されていない対照ＤＮＡとメチル化された対照ＤＮＡを含めることによって制御した（Ｅａｄｓ他、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、第６０巻、５０２１〜５０２６ページ、２０００年）。２０種類の遺伝子は、腫瘍発生への関与が知られているという理由で、または他の腫瘍でメチル化されていることがわかっているという理由で選択した（表Ｉと上記の“定義”を参照のこと）。ＭＴＨＦＲ遺伝子内に位置する１つの領域を、ＣｐＧ島としての条件（上記の“定義”を参照のこと）を満たさない単一コピー配列のための“非ＣｐＧ島”対照として含めた。島の外にあるＣｐＧジヌクレオチドは、ＣｐＧ島内のＣｐＧジヌクレオチドとは異なり、おそらく普通にメチル化される。
【０１２６】
図１は、さまざまなステージにあるバレット食道および／またはそれに付随する腺ガンの患者３１人から採取した８４個の組織サンプル中の２０種類の遺伝子について、メチル化を定量分析したデータを示している。メチル化の分析は、メチライト・アッセイを利用して行なった（Ｅａｄｓ他、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、第５９巻、２３０２〜２３０６ページ、１９９９年；Ｅａｄｓ他、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、第２８巻、Ｅ３２ページ、２０００年）。特定の遺伝子座において十分にメチル化された分子の割合（ＰＭＲ＝メチル化された基準の割合）は、サンプルの遺伝子／ＡＣＴＢ比を、ＳｓｓＩで処理した精子ＤＮＡの遺伝子／ＡＣＴＢ比で割り、その数値を１００倍することによって計算した。次に、得られた値を４％ＰＲＭの位置で２つに分け、グラフを描きやすくするとともに、組織特異的パターンが明らかになるようにした。多数の正方形は、４通りのグレーで示した強度レベル（図１の最下部を参照のこと）のいずれかであり、それぞれ、ＰＭＲが４未満、４〜２０、２１〜５０、５１以上のサンプルを表わしている。なお、グレイが濃くなるほど、ＰＭＲ値が大きくなっている。組織のタイプは左側に示してある。ＴＮＭ病期分類を、“１”、“２”、“３”、“４”で表わしてある。異形成および／または腺ガンが離れた位置に発生した患者がいる場合には、図の右側に“はい”、いない場合には“いいえ”と表示してある。“Ｎ”は、その特定のサンプルの分析におけるメチル化反応については、対照とした遺伝子ＡＣＴＢが１ＰＭＲという最小値を検出できるほど十分なレベルに達していなかったことを意味している。
【０１２７】
病気が重くなるにつれて、ＣｐＧ島の高メチル化の頻度と定量的レベルが一般に増加していた。しかし遺伝子が異常にメチル化する傾向は一定ではなかった。遺伝子は、高メチル化の頻度とレベルの両方が組織ごとに異なっていた。
【０１２８】
したがって、本発明によれば、遺伝子は、メチル化の状態に基づいてクラス（図１の上部に示したようにクラスＡ〜Ｇ）に分けることができる。このようにすることで、腫瘍発生のさまざまなステージにおいて遺伝子がメチル化している様子を目で見て評価することができた。それぞれの遺伝子クラスについての説明は、以下のセクションで行なう。
【０１２９】
後成的遺伝子クラス。ＤＮＡのメチル化レベルが異なる複数の遺伝子の状態を合わせて分析すると、適切なデータ処理をしなければ、グループの振る舞いは、ＤＮＡのメチル化状態が高いレベルにある遺伝子に引っ張られて偏ることが予測される。例えば、ほとんどの腫瘍サンプルについて、遺伝子“クラスＢ”に関する平均値は、主としてＴＩＭＰ３の値によって左右されよう。というのも、この遺伝子は、このグループ内の他の２つの遺伝子よりもメチル化の程度が大きい傾向があったからである（図１を参照のこと）。
【０１３０】
そこで、図１を作成するのに用いたメチル化値は、それぞれの後成的クラス内でメチル化された遺伝子が数値に及ぼす影響を等しくするため、４ＰＭＲという二分点を有する二値変数にした。４ＰＭＲ以上のサンプルはメチル化されたとして値１を与え、４ＰＲＭ未満のサンプルはメチル化されていないとして値０を与えた（上記“材料と方法”の中の“統計”を参照のこと）。このように２つに分けることにより、高度にメチル化された遺伝子の効果が和らげられ、図２に示したようにメチル化の頻度を遺伝子相互間で比較するのが容易になり、図３（下方の図）に示したように、メチル化の頻度のクラス平均を計算することが可能になる。
【０１３１】
図２は、各遺伝子についてメチル化されたサンプルの割合を組織のタイプごとに示した図である。データは、４ＰＲＭの位置で２つに分けた。４ＰＲＭ以上だとメチル化されていて、４ＰＲＭ未満だとメチル化されていないことを意味する。遺伝子は、本発明により、図１に示したようにそれぞれの後成的遺伝子クラス（Ａ〜Ｇ）に従ってグループ分けした。“ｎ”は、各組織について分析したサンプルの数である。
【０１３２】
４ＰＭＲという二分点が適切であることは、図１〜図３に示したように、この点が組織のタイプを識別する能力を持っていることに基づいている（Ｋｌｕｍｐ他、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ、第１１５巻、１３８１〜１３８６ページ、１９９８年も参照のこと）。高度にメチル化された遺伝子が統計に及ぼす効果を和らげ、遺伝子相互間のメチル化の頻度の比較が簡単にできるようにし、メチル化の頻度のクラス平均の計算を簡単にできるような他の二分点も本発明の範囲に含まれる。例えばデータを１０ＰＲＭで二分する場合には、（１９遺伝子のうちで）メチル化された遺伝子の割合の平均値を正常な食道粘膜とＩＭ組織（ｐ＝０．０００３）、ＤＹＳ組織（ｐ＜０．０００１）、Ｔ組織（ｐ＜０．０００１）の間で比べると、やはり統計的に有意な差がある。
【０１３３】
さらに、付随した異形成を伴う、あるいは伴っていないＮＥとＩＭ（以下の実施例３を参照のこと）のメチル化の頻度に関する統計的に有意な発見はすべて、二分点を４ＰＲＭではなく１０ＰＲＭにしても有意なままである。４ＰＲＭは、単一のＣｐＧジヌクレオチドの４％というメチル化レベルとは比較できないことに注目することが大切である。これは、このサンプルでは、ＤＮＡ分子の４％が、３つのメチライト（商標）プライマーによってカバーされるすべてのＣｐＧジヌクレオチド（通常は約８個のＣｐＧ）において完全にメチル化されていたことを示唆する。メチライト（商標）アッセイは、存在する可能性のある他のすべてのメチル化パターンを無視するという性質がある（Ｅａｄｓ他、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、第２８巻、Ｅ３２ページ、２０００年）。
【０１３４】
したがって４ＰＲＭは、メチル化の平均レベルが４％よりも大きいことを示している可能性が大きい。メチライト（商標）アッセイで調べる高度にメチル化された分子は、ＣｐＧ島の高メチル化によって完全に不活性状態になった対立遺伝子を示している可能性が大きいが、これについてはこの明細書では触れなかった。
【０１３５】
２０種類の遺伝子群のうち、もっとも多くの情報をもたらした遺伝子は、高メチル化の頻度が中間的な値の遺伝子である（４ＰＲＭというメチル化カットオフ値よりも大きいサンプルの数が１５％（ＣＤＫＮ２Ａ）から６０％（ＭＧＭＴ）まで）。このグループは正常な食道粘膜および胃にメチル化がない（クラス“Ａ”）、正常な食道粘膜および胃にメチル化がある（クラス“Ｂ”）、正常な食道粘膜ではメチル化があまり頻繁には起こっていないが、正常な胃のサンプルではすべてメチル化が起こっている（クラス“Ｃ”）に従い、さらに３つの後成的遺伝子クラスに分類することができた。他の遺伝子はより少ない情報しかもたらさなかった。というのも、高メチル化の発生は、非常に稀である（クラス“Ｄ”）、まったくない（クラス“Ｅ”）、組織のタイプに関係なくすべてにある（クラス“Ｆ”と“Ｇ”）という状態だったからである（図１、図２、図３）。
【０１３６】
後成的遺伝子クラスＡには、ＣＤＫＮ２Ａ、ＥＳＲ１、ＭＹＯＤ１の遺伝子が含まれる（図１、図２、図３）。正常な食道（ＮＥ）では、ＩＭ組織と比較すると、メチル化の頻度に関する統計的に有意な差が、ＥＳＲ１（ｐ＝０．０００１）とＭＹＯＤ１（ｐ＝０．００３８）において存在していたが、ＣＤＫＮ２Ａ（ｐ＝０．０９７）には存在していなかった。ＣＤＫＮ２Ａのメチル化の頻度は、腺ガン（Ｔ）のさらに進んだステージで有意に増加した（ｐ＜０．０００１）。
【０１３７】
後成的遺伝子クラスＢには、ＣＡＬＣＡ、ＭＧＭＴ、ＴＩＭＰ３の遺伝子が含まれる。クラスＡと比べると、このクラスは正常な食道粘膜（ＮＥ）と胃（Ｓ）の組織でメチル化を示す（図１と図２）。ＴＩＭＰ３だけが、メチル化の頻度に関してＮＥ値とＩＭ値の間で有意な差を示した（ｐ＝０．００７４）。
【０１３８】
後成的遺伝子クラスＣには、ＡＰＣの遺伝子が含まれる。この遺伝子は、クラスＡおよびクラスＢの遺伝子とは異なり、正常な胃のサンプルすべてでメチル化されていた（図１と図２）。これは、正常な胃の組織でＡＰＣがメチル化されているという以前の文献の結果を確認したことになっている（Ｅａｄｓ他、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、第６０巻、５０２１〜５０２６ページ、２０００年）。正常な胃の組織（Ｓ）ではなく正常な食道組織（ＮＥ）でＡＰＣがメチル化されるのを防いでいるメカニズムははっきりしていない。
【０１３９】
後成的遺伝子クラスＤには、あまりメチル化されていないＡＲＦ、ＣＤＨ１、ＣＤＫＮ２Ｂ、ＧＳＴＰ１、ＭＬＨ１、ＰＴＧＳ２、ＴＨＢＳ１の遺伝子が含まれる（図１と図２）。このクラスの遺伝子のメチル化の頻度は腺ガン（Ｔ）においてわずかに増加していたが、統計的に有意というほどではなかった（図３）。興味深いことに、他の系ではまだ調べられていないＰＴＧＳ２を除き、クラスＤのそれ以外の遺伝子は、他のタイプの腫瘍で高メチル化されていることがしばしばある。（表ＩＩ）。
【０１４０】
後成的遺伝子クラスＥには、ＥＡＣが進行する各ステージでメチル化されていなかったＣＴＮＮＢ１、ＲＢ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＹＭＳの遺伝子が含まれる。クラスＤのほとんどの遺伝子と同様、ＲＢ１とＴＧＦＢＲ２は、他のタイプの腫瘍で高メチル化されていることが見いだされた（表Ｉと、上記の“定義”に掲載した参考文献を参照のこと）。すべてのサンプルが、対照遺伝子（ＡＣＴＢ）と比較して、入れたＤＮＡに対してプラスの反応を示したことに注目されたい。したがって、ＤＮＡのメチル化が検出されないのは、入れたＤＮＡが不足していたからではありえない。対照反応はそれぞれのサンプルで十分に起こったため、テストする所定の遺伝子について、１ＰＲＭという低いレベルまで検出することができた。すべてのメチル化反応が完全で特異的であることは、インビトロでメチル化されたヒトＤＮＡを用いて確認した。
【０１４１】
後成的遺伝子クラスＦには、組織のタイプに関係なく完全にメチル化されたＨＩＣ１遺伝子が含まれる（図１と図２）。ＨＩＣ１は、他のタイプのガンでも一般にメチル化されており（ＪｏｎｅｓとＬａｉｒｄ、Ｎａｔ． Ｇｅｎｅｔ．、第２１巻、１６３〜１６７ページ、１９９９年；ＢａｙｌｉｎとＨｅｒｍａｎ、Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ．、第１６巻、１６８〜１７４ページ、２０００年）、乳ガン患者の正常な胸管組織やＡＭＬ患者の骨髄サンプルでもメチル化されていることがわかっている（Ｍｅｌｋｉ他、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、第５９巻、３７３０〜３７４０ページ、１９９９年；Ｆｕｊｉｉ他、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ、第１６巻、２１５９〜２１６４ページ、１９９８年）。しかし正常な組織のＣｐＧ島で１００％メチル化されているという発見は予想外であった。したがって、ＨＩＣ１に対するメチライト（商標）アッセイの結果の有効性は、別の方法（ＨｐａＩＩ−ＰＣＲ）（Ｓｉｎｇｅｒ−Ｓａｍ他、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、第１８巻、６８７ページ、１９９０年）で確認した。
【０１４２】
後成的遺伝子クラスＧには、この明細書で対照として用いる非ＣｐＧ島遺伝子ＭＴＨＦＲが含まれる。興味深いことに、１００％の割合で見られるＨＩＣ１のメチル化パターンは、対照である非ＣｐＧ島遺伝子ＭＴＨＦＲ（クラスＧ）と似ているが、メチル化された分子の割合はＨＩＣ１のほうが量的に多い（図１）。
【０１４３】
ＥＡＣの進行の後成的パターン。それぞれのタイプの組織は、病気の進行とともに変化する独特の後成的パターンまたはフィンガープリントを示した（図３の上方の図）。
【０１４４】
図３は、本発明による後成的パターンを比較した図である。データは、４ＰＲＭの位置で２つに分けた。４ＰＲＭ以上だとメチル化されていて、４ＰＲＭ未満だとメチル化されていないことを意味する。誤差を示す棒は、平均値の標準偏差を表わしている。上方の図：各遺伝子クラス（Ａ〜Ｆ、または１９あるＣｐＧ島の合計）においてメチル化された遺伝子の割合の平均値を組織のタイプ別（Ｎ、正常な食道；Ｓ、胃；ＩＭ、腸上皮化生；ＤＹＳ、異形成；Ｔ、腺ガン）に示したもの。誤差棒は、平均値の標準偏差（ＳＥＭ）を示す。下方の図：遺伝子の各クラス（Ａ〜Ｆ）と、１９のＣｐＧ島をすべて合わせた場合（合計）につき、さまざまな組織でメチル化された遺伝子の割合の平均値の違いを統計的に分析した結果。ｐ値は、フィッシャーの保護された最小有意差（ＰＬＳＤ）検定をサンプル数が均等でない場合に使用できるようにして求めた（ＳＡＳスタットヴュー（商標）ソフトウエア）。
【０１４５】
クラスＡ、Ｂ、Ｃは、正常な食道粘膜（ＮＥ）よりもＩＭ組織において有意に高い頻度でメチル化されていた（図３の上下の図）。さらに、ＩＭから異形成（ＤＹＳ）または悪性（Ｔ）への移行は、クラスＡにおけるメチル化の増加と関係していた（図３の上下の図）。どの遺伝子クラスについても、また１９種類の遺伝子をすべて合計した場合でも（図３の上下の図）、異形成と腺ガンの間に有意な差がない。これは、こうした異常な後成的変化のほとんどが、ＥＡＣの進行の初期に起こることを示唆している。
【０１４６】
この実施例のまとめ。本発明によれば、バレット食道および／またはそれに付随する腺ガンがさまざまなステージにある患者３１人から採取した８４個の組織サンプル中の２０種類の遺伝子（上記の表Ｉと表ＩＩ）に関するメチル化の定量的データから、病気の段階が進むにつれてＣｐＧ島が高メチル化される頻度と程度が一般に大きくなることがわかった（上記の図１〜図３）。
【０１４７】
さらに、遺伝子を、腫瘍形成の間のメチル化の状態に基づき、新たな後成的クラスに分類した（図１〜図３に示したクラスＡ〜Ｇ）。こうすることにより、腫瘍発生のさまざまなステージにおいて異なる遺伝子が一斉にメチル化されている様子をグラフに表わすことができた。すると単に目で見るだけで簡単に評価することができる。
【０１４８】
それぞれのタイプの組織は、病気が進行するにつれて変化する後成的パターンまたはフィンガープリントを示した（図３の上方の図）。クラスＡ、Ｂ、Ｃは、正常な食道粘膜（ＮＥ）よりもＩＭ組織において有意に高い頻度でメチル化されていた（図３の上下の図）。さらに、ＩＭから異形成（ＤＹＳ）または悪性（Ｔ）への移行は、クラスＡにおけるメチル化の増加と関係していた（図３の上下の図）。
【０１４９】
実施例２
高メチル化は、ＥＡＣの腫瘍の悪性度とステージを反映していた
この実施例では、食道腺ガンの悪性度またはステージが、ＣｐＧ島の高メチル化の頻度が大きいほど進んでいることと相関しているかどうかを調べた。本発明によれば、ＥＡＣの場合には、後成的遺伝子クラスＡの遺伝子は、ステージＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶの腫瘍のほうが、それよりも前のステージＩの腫瘍よりも有意に多くメチル化されていることがわかる（図４）。
【０１５０】
材料と方法
ＴＮＭ病期分類法。ガンに関するアメリカ両院合同委員会（“ＡＪＣＣ”）は、ＴＮＭ（腫瘍：リンパ節転移、遠方転移）分類による病期分類を提示している。ＴＮＭ病期分類法を用い、実施例１の組織からそれぞれの食道腺ガンのステージを分類した。
【０１５１】
メチル化と統計的分析。メチル化と統計的分析については、この明細書の実施例１のところで説明した。
【０１５２】
結果
クラスＡ遺伝子のメチル化の頻度は、腫瘍のステージが進むほど大きくなる。ある程度分化した腫瘍は、あまり分化していない腫瘍と比べてクラスＡ遺伝子のメチル化が有意に少ない（ｐ＝０．０４５）。しかも、図４（上下の図）から、ステージＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶの腫瘍においては、それよりも前のステージＩの腫瘍よりもメチル化されているクラスＡ遺伝子の平均数が有意に多いことがわかる。ステージＩの腫瘍とステージＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶの腫瘍の差は、他のどの後成的遺伝子クラスでも統計的に有意ではなかった。
【０１５３】
図４は、クラスＡ遺伝子のメチル化の頻度と腫瘍のステージの関係を、本発明に従って示した図である。データは、４ＰＲＭの位置で２つに分けた。４ＰＲＭ以上だとメチル化されていて、４ＰＲＭ未満だとメチル化されていないことを意味する。上方の図：メチル化されたクラスＡ遺伝子の平均数を腫瘍のステージ（Ｉ〜ＩＶ）ごとに示したもの（図１を参照のこと）。誤差棒は、平均値の標準偏差（ＳＥＭ）を示す。“ｎ”は、腫瘍の各ステージについて分析したサンプルの数である。下方の図：腫瘍のステージそれぞれにつき、メチル化された遺伝子の数の平均値の違いを統計的に分析したもの。ｐ値は、フィッシャーの保護された最小有意差（ＰＬＳＤ）検定をサンプル数が均等でない場合に使用できるようにして求めた（ＳＡＳスタットヴュー（商標）ソフトウエア）。
【０１５４】
この実施例のまとめ。本発明によれば、発ガン的な進行を評価するのに後成的パターンまたはフィンガープリント（この明細書に記載した遺伝子クラスを含む）を利用できることに加え、メチル化されたクラスＡ遺伝子の平均数もＥＡＣ腫瘍の相対的ステージを評価するのに用いることができる。
【０１５５】
実施例３
付随する異形成を伴った、あるいは伴わない前ガン組織のメチル化
この実施例は、正常な食道（ＮＥ）におけるクラスＢ遺伝子のメチル化の頻度が、付随する異形成／腫瘍を伴った患者で有意に大きかったことを示している（ｐ＝０．００３７）（図１）。さらに、クラスＡ遺伝子のメチル化は、異形成またはガンを伴っている患者からのＩＭサンプルにおいて、病気が以前よりも進行しているという何らの証拠もない患者からのＩＭサンプルにおけるよりも頻度が大きいことがわかった（ｐ＜０．０００１）（図１と図５）。すなわち、ＩＭサンプル中の後成的クラスＡの遺伝子の高メチル化と、付随する異形成またはガンの存在の間には、有意に正の相関関係が存在していた（図５）。
【０１５６】
材料と方法
組織病理学。組織病理学的分類については、上記の実施例１の“材料と方法”で説明した。
【０１５７】
メチル化と統計的分析。メチル化と統計的分析については、実施例１で説明したのと同じである。
【０１５８】
結果
付随する異形成を伴った、あるいは伴わない前ガン組織のメチル化。本発明によれば、クラスＡに関するいくつかのＩＭのケースとクラスＢに関する正常な食道粘膜のいくつかのケースにおいてＣｐＧ島に高メチル化が起こっていることから、こうしたメチル化が、異形成のないこれらの組織における正常なメチル化パターンを表わしているのか、それとも病気をさらに進行させようとするメチル化の変化を反映しているのかという疑問が湧いた。後者の場合、すでに病気が進行した患者のこれら組織において、ＣｐＧ島の高メチル化がより高い頻度で見いだされることが予測されよう。したがって、ＣｐＧ島の高メチル化の頻度を、（この研究の）付随する異形成を伴った組織と付随する異形成を伴わない組織で比較した。
【０１５９】
最初の研究では、バレット食道（ＩＭ）が最も進行した段階であるかどうか、あるいは付随する異形成および／または腺ガンが食道の別の領域に存在しているかどうか（図１、“はい”、“いいえ”）に基づき、患者を分類した。実際には、正常な食道（ＮＥ）におけるクラスＢ遺伝子のメチル化の頻度は、付随する異形成を伴った患者において有意に大きかった（ｐ＝０．００３７）（図１）。さらに、クラスＡ遺伝子のメチル化は、異形成またはガンを伴っている患者からのＩＭサンプルにおいて、病気が以前よりも進行しているという何らの証拠もない患者からのＩＭサンプルにおけるよりも頻度が大きいことがわかった（ｐ＜０．０００１）（図１）。
【０１６０】
この分析に対して寄せられる可能性のある批判は、遺伝子のクラスを説明するのに臨床パラメータとの関係をテストするのに用いたのと同じサンプル群を用いているという点である。そこで、ＩＭに関する別の２０症例についての追試研究を、最初のデータ群とは完全に独立に実施した。
【０１６１】
２０の症例に関するこの追試研究では、２つのグループからＩＭサンプルを採取した。１つは、最も進行した段階のＩＭだけを有する患者（８人）で、もう１つは、付随した異形成／腺ガンが食道の別の領域にあるＩＭを有する患者（１２人）である。各サンプルについてＨ＆Ｅスライド（５ミクロンの切片）を用意し、病理学者（Ｋ．Ｗ．）が検査してＩＭ組織を確認し、異常のある位置を特定した。分析に用いたパラフィン・ブロック中に異形成または腺ガンの何らかの徴候が見られたケースをこの追試研究では除外した。５ミクロンのＨ＆Ｅ切片に隣接する３０ミクロンの切片から、ＩＭ組織を注意深く顕微解剖して他のタイプの細胞と分離した。サンプル中に存在する最高ステージの組織病理学的病巣に従ってすべてのサンプルを分類した。
【０１６２】
最初の研究により、病気がより進行したすべてのＩＭサンプル（“はい”）ではクラスＡの少なくとも２つの遺伝子がメチル化されていたのに対し、付随する異形成または腺ガンがないすべてのＩＭサンプル（“いいえ”）ではクラスＡのどの遺伝子もメチル化されていなかったことが明らかにされていた（図１、バレット食道（ＩＭ）の項）。したがって、クラスＡの２つ以上の遺伝子がメチル化されているという状態は、付随する異形成または腺ガンが存在しているリスクが大きいことの指標であるとされた。
【０１６３】
われわれの最初の研究でのデータから、この関連性に関してフィッシャーの検定を厳密に行なったところ、ｐ値が０．００４８となった（図５、左図）。それとは独立な２０症例での追試研究からは、ｐ値として０．０１８が得られた（図５、右図）。
【０１６４】
図５は、付随する異形成および／または腺ガンを伴っている場合（“Ｙ”）または伴っていない場合（“Ｎ”）について、腸上皮化生（“ＩＭ”）組織においてメチル化されているクラスＡの２つ以上の遺伝子の割合を示している。データは、４ＰＲＭの位置で２つに分けた。４ＰＲＭ以上だとメチル化されていて、４ＰＲＭ未満だとメチル化されていないことを意味する。左側の図：図１に示したＩＭに関するデータの中のクラスＡ遺伝子のメチル化。右側の図：顕微解剖した２０の異なるＩＭサンプルに関して行なった完全に独立な追試研究におけるＩＭ組織中のクラスＡ遺伝子のメチル化。誤差棒は、平均値の標準偏差（ＳＥＭ）を示す。“ｎ”は、それぞれの組織群について分析したサンプルの数である。
【０１６５】
したがって、クラスＡ遺伝子の高メチル化と、付随する異形成またはガンの存在の間には、有意な正の相関関係がある。この追試研究において、付随する異形成のないＩＭサンプル（図５、右図）の中で少なくとも２つの遺伝子がメチル化されているサンプルが、少ない頻度で存在していたことに注意されたい。これは、最初の研究でメチル化されたサンプルが存在していなかったことと対照的である（図１と、図５の左図）。このような結果になったのは、追試研究でのサンプルはパラフィン包埋切片から顕微解剖したからである可能性がある。したがって、サンプル中には、背景となるメチル化されていないストロマ細胞がより少ない。この場合、メチル化信号が他の正常な細胞によってそれほど弱められることはなく、したがって全ＤＮＡに対するメチル化された分子の比が４ＰＲＭという閾値を超える可能性がある。これ以外にも、内視鏡によるサンプル採取の限界のため、病気が以前と比べて進行していないと判定されたいくつかのケースにおいて、内視鏡検査の間に異形成またはガンの組織が見逃されていた可能性がある。これは、食道腺ガンの検出において詳しく報告されている問題である（Ｐｅｔｅｒｓ他、Ｊ． Ｔｈｏｒａｃ． Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ． Ｓｕｒｇ．、第１０８巻、８１３〜８２１ページ、１９９４年）。
【０１６６】
実施例４
ＥＡＣに関しては、ＣｐＧ島メチル化の表現型（“ＣＩＭＰ”）が存在する明らかな証拠はない
この実施例は、ＥＡＣのこの研究に関し、直腸ガンと胃ガンで以前に明らかにされたように（Ｔｏｙｏｔａ他、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、第９６巻、８６８１〜８６８６ページ、１９９９年；Ｔｏｙｏｔａ他、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、第５９巻、５４３８〜５４４２ページ、１９９９年）、独立したＣＩＭＰ腫瘍群が存在する明らかな証拠はないことを示している。しかしＥＡＣにおけるＣｐＧ島の高メチル化が、特定のサンプル中の多数の遺伝子座で実際に起こった。さらに、１つのサンプル中では、高メチル化された遺伝子座の数が、病気がさまざまな組織学的ステージを経て進行するにつれて増加した（図６）。ＩＭ組織において見られるピークが２つある分布（図６）は、上に説明したように、異形成またはガンも同時に発生していることで十分に説明できる。
【０１６７】
材料と方法
組織病理学。組織病理学的分類については、上記の実施例１の“材料と方法”で説明した。
【０１６８】
メチル化と統計的分析。メチル化と統計的分析については、実施例１で説明したのと同じである。
【０１６９】
結果
ＣＩＭＰ分析。直腸ガンと胃ガンの一部ではＣｐＧ島メチル化の表現型（“ＣＩＭＰ”）として、単一の腫瘍中の多数の遺伝子座に影響を与える広範囲にわたる異常な高メチル化変化を特徴とする表現型が見られることが以前から報告されている（Ｔｏｙｏｔａ他、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、第９６巻、８６８１〜８６８６ページ、１９９９年；Ｔｏｙｏｔａ他、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、第５９巻、５４３８〜５４４２ページ、１９９９年）。これは、一群の腫瘍でメチル化された遺伝子数の頻度が２つのピークを有する分布になることに反映されている（Ｔｏｙｏｔａ他、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、第９６巻、８６８１〜８６８６ページ、１９９９年）。ＣＩＭＰ腫瘍は、はっきりと識別できる一群の腫瘍であり、ガンにおいてだけメチル化される遺伝子またはタイプＣの遺伝子で対応するＣｐＧ島が高い割合で高メチル化されていることを特徴としている。ＣＩＭＰは現在のところ、腫瘍形成の道筋として、はっきりと識別できる、新規だがすでに主要なものになっていると考えられている（Ｔｏｙｏｔａ他、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、第９６巻、８６８１〜８６８６ページ、１９９９年；Ｔｏｙｏｔａ他、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、第５９巻、５４３８〜５４４２ページ、１９９９年）。
【０１７０】
そこで、食道腺ガンにおいてＣｐＧ島メチル化の表現型（ＣＩＭＰ）が見られるかどうかという疑問を調べた。
【０１７１】
本発明のクラスＡの遺伝子は、“タイプＣ”遺伝子の最もよい具体例となっている。というのも、正常な組織ではメチル化されていないからである。メチル化されたクラスＡ遺伝子の数の分布をＥＡＣについて調べた（図６）。
【０１７２】
図６は、本発明に従い、食道腺ガンの進行に伴うメチル化の頻度分布を調べたグラフである。データは、４ＰＲＭの位置で２つに分けた。４ＰＲＭ以上だとメチル化されていて、４ＰＲＭ未満だとメチル化されていないことを意味する。それぞれの組織においてメチル化されたＣｐＧ島の数が０〜３（クラスＡ）、０〜９（クラスＡ＋Ｄ）、０〜１４（クラスＡ＋Ｂ＋Ｃ＋Ｄ）であった患者の割合が示してある。クラスＥとクラスＦのＣｐＧ島は含まれていない。というのも、組織間でメチル化の頻度に違いが見られなかったからである。“ｎ”は、それぞれの組織について分析したサンプルの数である。
【０１７３】
しかし腺ガン組織中では、メチル化された遺伝子の頻度は、ＣＩＭＰで予想される２つのピークを有する分布を示さなかった（図６）（Ｔｏｙｏｔａ他、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、第５９巻、５４３８〜５４４２ページ、１９９９年）。同様の結果が、クラスＡに加えて、やはりタイプＣのメチル化を示すクラスＤの遺伝子を含めた場合（図６の真中の図）と、クラスＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄの遺伝子を合計した場合（図６の右図）に観察された。クラスＥとＧの遺伝子は、組織のタイプが違ってもメチル化に変化がなかったので含めなかった。
【０１７４】
クラスＡ〜Ｄの１４個の遺伝子のうちの１０個がメチル化されたサンプルが１つあった（図１のケース３と図６）。しかしこのサンプルは、正常な食道粘膜においてメチル化されているためにＣＩＭＰ表現型を構成する“タイプＣ”遺伝子の定義にあてはまらないクラスＢの遺伝子を含めているから目立っているだけである。
【０１７５】
したがって、食道腺ガンに関するこの研究では、以前に直腸ガンと胃ガンで見られたような、独立したＣＩＭＰ腫瘍群が存在する明らかな証拠は見つからなかった。
【０１７６】
しかしＥＡＣにおけるＣｐＧ島の高メチル化は、特定のサンプル中の多数の遺伝子座で実際に起こった。さらに、１つのサンプル中では、高メチル化された遺伝子座の数が、病気がさまざまな組織学的段階を経て進行するにつれて増加した（図６）。ＩＭ組織において見られるピークが２つある分布（図６）は、上で説明したように、異形成またはガンも同時に発生していることで十分に説明できる。
【０１７７】
実施例５
アレイまたはマイクロアレイに基づいた応用
マイクロアレイに基づいた実施態様も本発明の範囲に含まれる。例えば、アレイに基づいたそのような１つの実施態様では、ディファレンシャル・メチル化ハイブリダイゼーション（“ＤＭＨ”）が用いられている（Ｈｕａｎｇ他、Ｈｕｍ． Ｍｏｌ． Ｇｅｎｅｔ．、第８巻、４５９〜４７０ページ、１９９９年；Ｙａｎ他、Ｃｌｉｎ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、第６巻、１４３２〜１４３８ページ、２０００年）。ＤＭＨにより、テストするサンプルと正常なサンプルをペアにしてスクリーニングしたり、特定の後成的変化のパターン（実施例１の“後成的パターン”を参照のこと）が、分析する組織サンプル中の病理学的パラメータと相関しているかどうかを明らかにしたりすることができる。これらサンプルに由来するメチル化されたＣｐＧ ＤＮＡのプールである“アンプリコン”（同上）は、本発明のＣｐＧ島タグを含むアレイ・パネルにおけるハイブリダイゼーション用のプローブとして用いられる。
【０１７８】
したがって、この明細書に開示した２０種類の遺伝子配列のうちの１９種類（すなわちＡＰＣ、ＡＲＦ、ＣＡＬＣＡ、ＣＤＨ１、ＣＤＫＮ２Ａ、ＣＤＫＮ２Ｂ、ＥＳＲ１、ＧＳＴＰ１、ＨＩＣ１、ＭＧＭＴ、ＭＬＨ１、ＭＹＯＤ１、ＲＢ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＨＢＳ１、ＴＩＭＰ３、ＣＴＮＮＢ１、ＰＴＧＳ２、ＴＹＭＳ（上記の表Ｉと表ＩＩ；上記の“定義”を参照のこと））またはこれら遺伝子がメチル化によって変化したＤＮＡ配列と関係するＣｐＧ島配列のうちの１または複数を、アレイまたはマイクロアレイに基づいたアッセイの実施態様におけるＣｐＧ島タグとして用いることができる。これら１９種類の遺伝子配列領域は、配列番号１〜５４、５８〜６０、６４、６５（上記の表ＩＩを参照のこと；配列番号６１〜６３は、本発明の分析で用いるＡＴＣＢ“対照”遺伝子領域に対応する（上記の実施例１を参照のこと））に対応するオリゴヌクレオチド・プライマーまたはプローブによって規定される。関係したＣｐＧ島配列とは、（所定のＣｐＧ島の一部のメチル化状態が一般にその島全体を代表しているという事実に基づき）これらの特異的オリゴヌクレオチド・プライマーおよびプローブによって規定される配列の少なくとも１つのヌクレオチドを含み、ＣｐＧジヌクレオチドの頻度が観測値／予測値の比＞０．６に対応することと、ＧＣ含量＞０．５であることの両方の条件を満たす、ゲノムＤＮＡ中の連続配列である。
【０１７９】
次に、これらのＣｐＧ島タグを固体支持体（例えばナイロン膜、シリコンなど）上に配置し、検査用サンプル（例えば腫瘍）または基準サンプルからの、メチル化された一群のＣｐＧ ＤＮＡを表わすアンプリコンで調べる。スクリーニングされたＣｐＧ島に関する検査用サンプルと基準サンプルの信号強度の差は、検査用ＤＮＡ中の対応する配列がメチル化により変化したことを反映している。
【０１８０】
得られたデータをこの明細書に開示した後成的パターンと比較すると、診断または予後予測ができる。
【０１８１】
したがって、この実施態様によれば、アレイまたはマイクロアレイを形成するために固体支持体に固定したＣｐＧ島タグの一部におけるパターン分析（上記の実施例１〜４を参照のこと）を利用して、ガンが進行するさまざまなステージ（例えば、胃腸異形成および食道異形成、胃腸上皮化生および食道上皮化生、バレット食道、正常な食道扁平粘膜上皮における前ガン状態）における進行状態を追試するとともに、食道腺ガンなどの腫瘍の組織学的悪性度またはステージを明らかにすることができる。
【０１８２】
本発明の他のアレイまたはマイクロアレイの実施態様は、当業者には明らかであろう。そのような実施態様としては、配列番号１〜５４、５８〜６０、６４、６５（上記の表ＩＩを参照のこと；配列番号６１〜６３は、本発明の分析で用いるＡＴＣＢ“対照”遺伝子領域に対応する（上記の実施例１を参照のこと））に対応する、ＡＰＣ、ＡＲＦ、ＣＡＬＣＡ、ＣＤＨ１、ＣＤＫＮ２Ａ、ＣＤＫＮ２Ｂ、ＥＳＲ１、ＧＳＴＰ１、ＨＩＣ１、ＭＧＭＴ、ＭＬＨ１、ＭＹＯＤ１、ＲＢ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＨＢＳ１、ＴＩＭＰ３、ＣＴＮＮＢ１、ＰＴＧＳ２、ＴＹＭＳ（上記の表Ｉと表ＩＩ；上記の“定義”を参照のこと）に対する特異的プライマーおよび／またはプローブが固体支持体上に配置されているものが挙げられるが、これだけに限定されるわけではない。
【０１８３】
考察
ガンの検出、化学的予測、予後予測に関する新規でより感度の高い方法が、従来技術において要求されている。ガンなどの病気が進行する間に多数の遺伝子座で見られるＣｐＧ島のメチル化変化の新規なコーディネート・パターン（すなわち新規な後成的パターン）を明らかにすることが、従来技術において要求されている。特定の腫瘍に特異的で、個々の患者に特異的な後成的パターンまたはフィンガープリントを明らかにすることが、従来技術において要求されている。ガンの処置のための診断法および／または予後予測法で用いることができるバイオマーカーまたはプローブ、例えばＥＡＣ特異的なバイオマーカーまたはプローブが、従来技術において要求されている。食道腺ガンがＣＩＭＰを示すかどうかを明らかにすることが、従来技術において要求されている。腫瘍のステージを決定する新規な方法が、従来技術において要求されている。本発明は、これらの要求に対処しようとするものである。
【０１８４】
蛍光に基づいたハイスループットのメチル化アッセイ（メチライト（商標））を利用して、食道腺ガン（“ＥＡＣ”）が進行する間の１９のＣｐＧ島と１つの非ＣｐＧ島の新規な高メチル化パターンを調べ、その特徴を明らかにした。そうすることにより、遺伝子を、さまざまなタイプの組織において見られる６通りの後成的パターンに分けた。これは、病気が進行するにつれて明確に異なる非常に多数の組織学的ステージを有するシステムに関してこれまでになされた最も包括的なメチル化検査である。さらに、ＤＮＡの異常な高メチル化に関するこの分析は、一般的な制限因子である汚染源となる正常細胞が存在している中での感度が、遺伝子発現分析などの他の方法におけるよりも大きいという顕著な利点を有する。
【０１８５】
この明細書に記載してあるように、ＤＮＡの高メチル化は、ＥＡＣが多段階で進行していくときの初期の後成的変化である。前ガン性の腸上皮化生（“ＩＭ”またはバレット食道）は、正常な組織（正常な扁平粘膜上皮）よりもすでに有意に多くメチル化されている。本発明は、いくつかの実施態様において、この腫瘍系においてさらに５つの遺伝子（ＭＹＯＤ１、ＭＧＭＴ、ＣＡＬＣＡ、ＴＩＭＰ３、ＨＩＣ１）で頻繁に高メチル化が起こっているという新たな発見を提供している。
【０１８６】
正常な組織のＭＧＭＴ、ＴＩＭＰ３、ＨＩＣ１でメチル化が観察されたのは、われわれがメチル化を分析したのが特別な遺伝子領域であったからである可能性がある（Ｓｔｏｇｅｒ他、Ｃｅｌｌ、第７３巻、６１〜７１ページ、１９９３年；Ｌａｒｓｅｎ他、Ｈｕｍ． Ｍｏｌ． Ｇｅｎｅｔ．、第２巻、７７５〜７８０ページ、１９９３年；Ｊｏｎｅｓ， Ｐ．Ａ．、Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ．、第１５巻、３４〜３７ページ、１９９９年）。これら３つの遺伝子は、転写開始部位またはそれよりも下流に位置するＣｐＧ島において分析した（表ＩＩ）。しかしこれではわれわれが観察したＣＡＬＣＡのメチル化を説明できない。というのも、われわれはこの遺伝子のプロモータ領域を分析したからである。ＣＡＬＣＡのメチル化が低いレベルであることは、ＡＭＬ患者の骨髄サンプルで以前に報告されている（Ｍｅｌｋｉ他、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、第５９巻、３７３０〜３７４０ページ、１９９９年）。これは、この遺伝子座が、ガン患者の正常な組織の中ではよりメチル化されやすくなっていることを示唆している。
【０１８７】
特に指摘しておくべきなのは、ステージＩの腫瘍よりも異形成組織で多くメチル化されている状態が、クラスＡ（ｐ＜０．０００１）とクラスＢ（ｐ＝０．０１７４）の両方で見られることである（図１）。これは、遺伝子の異常（ＬＯＨ、欠失、突然変異）が、ステージが進んだ異形成を有するバレット食道には存在するが、隣接する浸潤性ＥＡＣには存在していないという発見（Ｂａｒｒｅｔｔ他、Ｎａｔ． Ｇｅｎｅｔ．、第２２巻、１０６〜１０９ページ、１９９９年）と似ている。ステージＩＩ〜ＩＶの腫瘍はクラスＡの遺伝子に関して異形成と同じ頻度でメチル化されているように見えるため、ステージＩの腫瘍は、実際には、異形成組織よりステージが進んだ腫瘍とは異なる原発巣から進展してきたか、あるいは異形成の後にクローンが増大する間にステージＩＩ〜ＩＶの腫瘍とは独立に大きくなってきた可能性があることが示唆される。また、より可能性は小さいものの、ステージＩの腫瘍では、高メチル化の一時的逆転が起こった可能性がある。バレット食道における腫瘍は、化生−異形成−腫瘍という直線的な多段階経路を通じてクローン化により進行していくことが提案されている（Ｚｈｕａｎｇ他、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、第５６巻、１９６１〜１９６４ページ、１９９６年）。しかし、遺伝子の変化が起こり、本発明により明らかにされたように直線的な順番でない後成的変化が起こるということは、クローン化によるＥＡＣの進行が元々予想されていたよりも複雑であることを示唆している（Ｂａｒｒｅｔｔ他、Ｎａｔ． Ｇｅｎｅｔ．、第２２巻、１０６〜１０９ページ、１９９９年）。同様の観察結果が、膀胱ガンのさまざまなステージについて報告されている（Ｓａｌｅｍ他、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、第６０巻、２４７３〜２４７６ページ、２０００年）。
【０１８８】
ここでの分析では、メチル化された１０種類の遺伝子を有する腫瘍が１つあることは別にして、ＣｐＧ島メチル化の表現型（“ＣＩＭＰ”）であることを示唆する、広範囲にわたる一斉メチル化が見られる独立の腫瘍群が存在しているというはっきりとした証拠はなかった。同様の結果が、ＣＩＭＰ（ガンではメチル化され、正常な組織ではメチル化されていない；Ｔｏｙｏｔａ他、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、第９６巻、８６８１〜８６８６ページ、１９９９年；Ｔｏｙｏｔａ他、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、第５９巻、５４３８〜５４４２ページ、１９９９年）を特徴づける“タイプＣ”遺伝子を調べただけで得られた。興味深いことに、ＥＡＣの“タイプＣ”遺伝子は、直腸ガンについて報告されている遺伝子とは異なっている（同上）。例えば、ＥＳＲ１は、老人の正常な結腸上皮でしばしばメチル化されているため、直腸ガンでは“タイプＣ”遺伝子ではなく（老化した正常な組織でメチル化されている）“タイプＡ”遺伝子に分類される（同上）。しかし食道腺ガンでは、ＥＳＲ１は明らかに“タイプＣ”遺伝子のように振る舞う。これは、高メチル化を測定するのに用いる方法の違いか、あるいはそれ以上に組織のタイプの違いが原因となっている可能性がある。
【０１８９】
本発明によれば、個々の遺伝子の高メチル化には組織特異的かつ腫瘍特異的な傾向がある。例えば、ＡＰＣは正常な胃で高メチル化されているが、正常な食道粘膜では高メチル化されていない。高メチル化が腫瘍特異的であることは、胃ガンと肺ガンでしばしば高メチル化されている遺伝子ＴＧＦＢＲ２、網膜芽繊維症でしばしば高メチル化されているＲＢ１というクラスＥの２つの遺伝子でメチル化が検出されないことに現われている（Ｓｔｉｒｚａｋｅｒ他、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、第５７巻、２２２９〜２２３７ページ、１９９７年；Ｈｏｕｇａａｒｄ他、Ｂｒ． Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ、第７９巻、１００５〜１０１１ページ、１９９９年）。
【０１９０】
ＣｐＧ島の高メチル化が腫瘍特異性を有するという事実は、食道腺ガンと他のタイプの腫瘍では異なっていて、腫瘍発生の間にこれらＣｐＧ島のメチル化の変化を制御している腫瘍特異的なトランス作用因子が存在する可能性があることを示唆している。また、食道腺ガンにおいてＤＮＡのメチル化によりこれら遺伝子が不活性になることには、特別な利点がない可能性がある。これがあてはまる可能性のある２つのシナリオがある。１つは、問題の遺伝子が別の遺伝的メカニズムによって不活化されていて、高メチル化にはもはや特別な利点がない場合である。もう１つは、遺伝子がこの特別な腫瘍系で腫瘍抑制において役割を果たしていない場合である。
【０１９１】
ＤＮＡのメチル化状態が変化するのは腫瘍発生において一般的であるが、裏に隠れているメカニズムははっきりしていない。異常なメチル化が、少なくとも直腸ガンではＤＮＡメチルトランスフェラーゼ遺伝子の単なるアップレギュレーションにはよらないというのは、他の主要なプレイヤーが関与していることを示唆している（Ｅａｄｓ他、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、第５９巻、２３０２〜２３０６ページ、１９９９年）。本発明は、こうした異常なメチル化の裏にあるプロセスを初めて覗き見るものである。
【０１９２】
本発明によれば、機能が互いに無関係のさまざまな遺伝子は、メチル化の変化に関しては、ＥＡＣが進行しているさまざまな組織において、明確に異なるクラスの遺伝子として機能することができる。ＣｐＧ島の高メチル化は、（確率的な要素があるにもかかわらず）確率的なプロセスではなく、複数の異なる変化を含む段階的なプロセスであるらしい。これは、ＣｐＧ島が高メチル化されないようにするいくつかの異なるメカニズムが存在していることと両立する。このシナリオでは、異なるＣｐＧ島で一斉に見られる変化は、病気進行のさまざまな段階において異なるタイプの保護要素が失われた結果であろう。この発見は、遺伝子に対するＣｐＧ島の位置に依存しているようには見えない。というのも、プロモーターと内部ＣｐＧ島の両方がすべての遺伝子クラスで観察されたからである。この分析において、ＧＣ含量％、ＣｐＧの観測値／予測値の比、ＣｐＧ：ＧｐＣ比を分析することによりこれらＣｐＧ島の構造上の特徴も調べたが、遺伝子クラスとの関係は見いだせなかった（表ＩＩ）。
【０１９３】
本発明によれば、ＩＭまたはＮＥのサンプル自体は、付随する異形成またはガンがある場合もない場合も、組織学的には識別できなかったが、分子レベルでは識別できた。離れた位置に異形成またはガンも同時に有する人に由来するＮＥサンプルとＩＭサンプルでは、ＣｐＧ島の高メチル化が統計的に高い頻度で起こっている。この発見は、この明細書において、完全に独立な別の研究の中でＩＭ組織において確認した。これは、後成的マーカー、特にクラスＡとＢの遺伝子を病気のスクリーニング・ツールとして、また病気がさらに進行していくことの予測をするマーカーとして用いる際の強い支持材料となる。
【０１９４】
本発明のメチル化パターンは、ガンを初期の段階で検出するための方法と組成物を提供する。ガンがあるかガンになるリスクが高いかを正常な組織および／または前ガン状態の組織を用いて明らかにするこのような分子診断法は、初期治療の機会を提供する。さらに、診断または予後予測のためのマーカーとしてＣｐＧ島の高メチル化を用いることの利点は、汚染源となる正常細胞を含むサンプル中では遺伝子発現のないこと（例えばＬＯＨや欠失の分析）を明らかにするのが難しいのと異なり、高メチル化をプラスの信号として汚染源となる正常細胞中で容易に検出できることにある。
【０１９５】
要約
本発明によれば、研究した１９のＣｐＧ島（表Ｉと表ＩＩ）は、さまざまなタイプの組織で６通りの後成的パターンに分類される。それぞれの分類クラスは、ＥＡＣが進行していくさまざまな段階で独特の後成的変化をする。これらメチル化パターンは、ガンを初期段階で検出するための方法と組成物を提供する。
【図面の簡単な説明】
【図１】
さまざまな段階にあるバレット食道（“ＩＭ”）、異形成（“ＤＹＳ”）および／またはそれに付随する食道腺ガン（“Ｔ”）の患者３１人から採取した８４個の組織サンプル中の２０種類の遺伝子について、メチル化を本発明に従って定量分析した図である。メチル化の分析は、メチライト（商標）アッセイを利用して行なった（Ｅａｄｓ他、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、第５９巻、２３０２〜２３０６ページ、１９９９年；Ｅａｄｓ他、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、第２８巻、Ｅ３２ページ、２０００年）。特定の遺伝子座において十分にメチル化された分子の割合（ＰＭＲ＝メチル化された基準の割合）は、サンプルの遺伝子／ＡＣＴＢ比を、ＳｓｓＩで処理した精子ＤＮＡの遺伝子／ＡＣＴＢ比で割り、その数値を１００倍することによって計算した。次に、（この明細書に説明してあるように）得られた数値を４％ＰＲＭの位置で２つに分け、グラフを描きやすくするとともに、組織特異的パターンが明らかになるようにした。“Ｎ”は、その特定のサンプルの分析におけるメチル化反応については、対照とした遺伝子ＡＣＴＢが、１ＰＭＲという最小値を検出できるほど十分なレベルに達していなかったことを意味している。
【図２】
各遺伝子についてメチル化されたサンプルの割合を組織のタイプごとに示した図である。データは、４ＰＲＭの位置で２つに分けた。４ＰＲＭ以上だとメチル化されていて、４ＰＲＭ未満だとメチル化されていないことを意味する。遺伝子は、本発明により、図１に示したようにそれぞれの後成的遺伝子クラス（Ａ〜Ｇ）に従ってグループ分けした。“ｎ”は、各組織について分析したサンプルの数である。
【図３】
本発明による後成的パターンを比較した図である。データは、４ＰＲＭの位置で２つに分けた。４ＰＲＭ以上だとメチル化されていて、４ＰＲＭ未満だとメチル化されていないことを意味する。誤差を示す棒は、平均値の標準偏差を表わしている。上方の図：各遺伝子クラス（Ａ〜Ｆ、または１９あるＣｐＧ島の合計）においてメチル化された遺伝子の割合の平均値を組織のタイプ別（Ｎ、正常な食道；Ｓ、胃；ＩＭ、腸上皮化生；ＤＹＳ、異形成；Ｔ、腺ガン）に示したもの。誤差棒は、平均値の標準偏差（ＳＥＭ）を示す。下方の図：遺伝子の各クラス（Ａ〜Ｆ）と、１９のＣｐＧ島をすべて合わせた場合（合計）につき、さまざまな組織でメチル化された遺伝子の割合の平均値の違いを統計的に分析した結果。ｐ値は、フィッシャーの保護された最小有意差（ＰＬＳＤ）検定をサンプル数が均等でない場合に使用できるようにして求めた（ＳＡＳスタットヴュー（Ｓｔａｔｖｉｅｗ：商標）ソフトウエア）。
【図４】
クラスＡ遺伝子のメチル化の頻度と腫瘍のステージの関係を、本発明に従って示した図である。データは、４ＰＲＭの位置で２つに分けた。４ＰＲＭ以上だとメチル化されていて、４ＰＲＭ未満だとメチル化されていないことを意味する。上方の図：メチル化されたクラスＡ遺伝子の平均数を腫瘍のステージ（Ｉ〜ＩＶ）ごとに示したもの（図１を参照のこと）。誤差棒は、平均値の標準偏差（ＳＥＭ）を示す。“ｎ”は、腫瘍の各ステージについて分析したサンプルの数である。下方の図：腫瘍のステージそれぞれにつき、メチル化された遺伝子の数の平均値の違いを統計的に分析したもの。ｐ値は、フィッシャーの保護された最小有意差（ＰＬＳＤ）検定をサンプル数が均等でない場合に使用できるようにして求めた（ＳＡＳスタットヴュー（商標）ソフトウエア）。
【図５】
本発明に従い、腸上皮化生（“ＩＭ”）において、それに付随する異形成および／または腺ガンを伴っている場合（“Ｙ”）または伴っていない場合（“Ｎ”）について、クラスＡの２つ以上の遺伝子がメチル化されている割合を示している。データは、４ＰＲＭの位置で２つに分けた。４ＰＲＭ以上だとメチル化されていて、４ＰＲＭ未満だとメチル化されていないことを意味する。左側の図：図１の中のＩＭに関するデータの中でメチル化されているクラスＡ遺伝子の割合。右側の図：顕微解剖した２０の異なるＩＭサンプルに関する完全に独立な追試研究において、ＩＭ中でメチル化されているクラスＡ遺伝子の割合。誤差棒は、平均値の標準偏差（ＳＥＭ）を示す。“ｎ”は、それぞれの組織群について分析したサンプルの数である。
【図６】
本発明に従い、食道腺ガンの進行に伴うメチル化の頻度分布を調べたグラフである。データは、４ＰＲＭの位置で２つに分けた。４ＰＲＭ以上だとメチル化されていて、４ＰＲＭ未満だとメチル化されていないことを意味する。それぞれの組織においてメチル化されたＣｐＧ島の数が０〜３（クラスＡ）、０〜９（クラスＡ＋Ｄ）、０〜１４（クラスＡ＋Ｂ＋Ｃ＋Ｄ）であった患者の割合が示してある。クラスＥとクラスＦのＣｐＧ島は含まれていない。というのも、組織間でメチル化の頻度に違いが見られなかったからである。“ｎ”は、それぞれの組織について分析したサンプルの数である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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