(57)【要約】乳漿タンパク質濃縮物の酵素的消化物が、動物プロテアーゼ、細菌プロテアーゼおよび真菌プロテアーゼを用いて調製され、抗高血圧活性について評価される。ＡＣＥ阻害活性および高血圧活性は、ブタトリプシンを用いて調製された乳漿タンパク質単離物の加水分解産物を用いて得られた。ＡＣＥ抑制組成物を調製するためのプロセスは、以下の工程を包含する：乳漿タンパク質単離物およびタンパク質分解酵素の水溶液を調製する工程；哺乳動物において増加したＡＣＥ抑制活性を有する加水分解産物を提供するためにこの乳漿タンパク質単離物を部分的に加水分解するのに効果的な条件下でこの溶液を維持する工程；およびこの溶液からこの加水分解産物を回収する工程。【特許請求の範囲】
【請求項１】
アンギオテンシン変換酵素抑制組成物を調製するためのプロセスであって、該プロセスは、以下の工程：
乳漿タンパク質画分およびトリプシンを含むタンパク質分解酵素を含む水溶液を調製する工程；ならびに
哺乳動物において増加したアンギオテンシン変換酵素抑制活性を有する加水分解産物を提供するために該乳漿タンパク質単離物を部分的に加水分解するのに効果的な条件下で該溶液を維持する工程、
を包含する、プロセス。
【請求項２】
アンギオテンシン変換酵素抑制組成物を調製するためのプロセスであって、該プロセスは、以下の工程：
乳漿タンパク質画分およびタンパク質分解酵素を含む水溶液を調製する工程であって、該乳漿タンパク質画分が９７．８％±０．４％から５〜１０％以下変化するタンパク質含量を有する、工程；ならびに
哺乳動物において増加したアンギオテンシン変換酵素抑制活性を有する加水分解産物を提供するために該乳漿タンパク質単離物を部分的に加水分解するのに効果的な条件下で該溶液を維持する工程、
を包含する、プロセス。
【請求項３】
前記乳漿タンパク質画分が、イオン交換プロセスによって調製される、請求項１〜２のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項４】
前記乳漿タンパク質画分が、３％未満の灰分含量を有する、請求項１〜３のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項５】
前記乳漿タンパク質画分が、１５〜２０ｍｅｑ／ｋｇのカルシウムの鉱物含量を有する、請求項１〜４のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項６】
前記乳漿タンパク質画分が、１ｍｅｑ／ｋｇ未満のマグネシウムの鉱物含量を有する、請求項１〜５のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項７】
前記乳漿タンパク質画分が、乳漿タンパク質単離物である、請求項１〜６のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項８】
前記乳漿タンパク質画分が、少なくとも３５％のタンパク質含量を有する、請求項１に記載のプロセス。
【請求項９】
前記乳漿タンパク質画分が、９７．８±０．４％から０〜２５％変化するタンパク質含量を有する、請求項１に記載のプロセス。
【請求項１０】
前記乳漿タンパク質画分が、９７．８±０．４％から５〜１０％変化するタンパク質含量を有する、請求項１に記載のプロセス。
【請求項１１】
前記乳漿タンパク質画分が、９７．８±０．４％から５％未満変化するタンパク質含量を有する、請求項１〜１０のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項１２】
前記乳漿タンパク質画分が、９７．８±０．４％のタンパク質含量を有する、請求項１〜１１のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項１３】
前記乳漿タンパク質画分が、以下のように特徴付けられる、請求項１〜１１のいずれか１項に記載のプロセス：
2004519204.tif 000014
【請求項１４】
前記乳漿タンパク質画分が、以下のように特徴付けられる、請求項１〜１２のいずれか１項に記載のプロセス：
2004519204.tif 000015
【請求項１５】
前記タンパク質分解酵素がトリプシンを含む、請求項２〜１４のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項１６】
前記タンパク質分解酵素が、哺乳動物供給源、家禽供給源または魚供給源由来のトリプシンを含む、請求項１〜１５のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項１７】
前記タンパク質分解酵素が、ブタトリプシンを含む、請求項１〜１６のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項１８】
タンパク質分解酵素を不活化する酵素をさらに包含する、請求項１〜１７のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項１９】
前記タンパク質分解酵素が、加水分解後の加熱によって不活化される、請求項１〜１８のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項２０】
前記溶液から前記加水分解産物を回収する工程をさらに包含する、請求項１〜１９のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項２１】
前記加水分解産物を濃縮する工程をさらに包含する、請求項１〜２０のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項２２】
前記加水分解産物を乾燥する工程をさらに包含する、請求項１〜２１のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項２３】
前記加水分解産物が噴霧乾燥されている、請求項１〜２２のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項２４】
前記加水分解産物を凍結乾燥する工程をさらに包含する、請求項１〜２１のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項２５】
前記加水分解産物が、３〜２０％の程度の加水分解によって特徴付けられる、請求項１〜２４のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項２６】
前記加水分解産物が、以下の分子量プロフィールによって特徴付けられる、請求項１〜２５のいずれか１項に記載のプロセス：
2004519204.tif 000016
【請求項２７】
ＡＣＥ抑制組成物を調製するためのプロセスであって、該プロセスは、以下の工程：
乳漿タンパク質単離物およびタンパク質分解酵素の水溶液を調製する工程；
哺乳動物において増加したＡＣＥ抑制活性を有する加水分解産物を提供するために該乳漿タンパク質単離物を部分的に加水分解するのに効果的な条件下で該溶液を維持する工程；および
該溶液から該加水分解産物を回収する工程、
を包含する、プロセス。
【請求項２８】
請求項１〜２７のいずれか１項に従って調製されるような加水分解産物。
【請求項２９】
アンギオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）を抑制するための哺乳動物の処置のための組成物であって、該組成物が、ＡＣＥ活性を抑制するのに有効な量で請求項１〜２８のいずれか１項に記載の加水分解産物を含み、そして該処置が、ＡＣＥ活性を抑制するのに有効な間隔で該哺乳動物に該組成物を経口投与する工程を包含する、組成物。
【請求項３０】
高血圧の症状を減少させるための哺乳動物の処置のための組成物であって、該組成物が、高血圧の症状を減少させるのに有効な量で請求項１〜２８のいずれか１項に記載の加水分解産物を含み、そして該処置が、高血圧の症状を減少させるのに有効な間隔で該哺乳動物に該組成物を経口投与する工程を包含する、組成物。
【請求項３１】
前記組成物が、７５〜１５０ｍｇ／ｋｇの用量で前記加水分解産物を含み、そして２〜２４時間の間隔で経口投与される、請求項２９〜３０のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項３２】
前記組成物が、６０〜６００ｍｇ／ｋｇの用量で前記加水分解産物を含み、そして２〜２４時間の間隔で経口投与される、請求項２９〜３０のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項３３】
医学的治療における使用のための、請求項１〜２８のいずれか１項に記載されるような加水分解産物。
【請求項３４】
哺乳動物におけるアンギオテンシン変換酵素を抑制するために有用な医薬を調製するための、請求項１〜２８のいずれか１項に記載されるような加水分解産物の使用。
【請求項３５】
哺乳動物における高血圧を処置するために有用な医薬を調製するための、請求項１〜２８のいずれか１項に記載されるような加水分解産物の使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の背景）
本発明は、１つの局面において、アンギオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）を抑制するための方法、この目的のための組成物およびこの組成物を調製するための方法（特に乳漿タンパク質の酵素的変換による）に関する。
【０００２】
別の局面において、本発明は、乳漿タンパク質の酵素的変換によって得られた特定の加水分解産物を用いて、哺乳動物における高血圧を減少するための方法に関する。
【０００３】
高血圧は、先進工業国におけるヒトの死の最も重要な原因であることが報告されている（例えば、Ｌａｒａｇｈ，Ｊ．Ｈ．，１９７９．Ｌ’ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ．Ｒｅｃｈｅｒｃｈｅ，１０５（１０）：１０６８−１０７６を参照のこと）。成人の死亡のほぼ３０％が、高血圧または高血圧の腎臓合併症、冠動脈合併症もしくは神経性合併症に由来する。高血圧の原因となる生理学的機構の解明は、製薬産業が、アンギオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害物質を提案することを導いた。ＡＣＥは、アンギオテンシンＩのアンギオテンシンＩＩ（強力な血管収縮薬）への分解を触媒する。
【０００４】
ブラジルのヘビ毒において見出されたペプチドは、ＡＣＥの阻害のための最も効果的な天然物質であると確認されている（例えば、Ｆｅｒｒｅｉｒａ，Ｓ．Ｈ．，Ｂａｒｔｅｌｔ，Ｄ．Ｃ．，Ｇｒｅｅｎｅ，Ｌ．Ｊ．，１９７０．Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂｒａｄｙｋｉｎｉｎ−ｐｏｔｅｎｔｉａｔｉｎｇ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｆｒｏｍ  Ｂｏｔｈｒｏｐｓ  ｊａｒａｒａｃａ  ｖｅｎｏｍ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，９（１３）：２５８３−２５９３を参照のこと）。天然ペプチドの阻害効果は、ＡＣＥの活性部位におけるそれらの結合に関連している（Ｍａｕｂｏｉｓ，Ｊ．Ｌ．Ｌｅｏｎｉｌ，Ｊ．，Ｔｒｏｕｖｅ，Ｒ．，Ｂｏｕｈａｌｌａｂ，Ｓ．，１９９１．Ｌｅｓ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｄｕ  ｌａｉｔ  ａ  ａｃｔｉｖｉｔｅ  ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｑｕｅ  ＩＩＩ．Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｄｕ  ｌａｉｔ  ａ  ｅｆｆｅｔ  ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｉｒｅ：ａｃｔｉｖｉｔｅｓ  ａｎｔｉｔｈｒｏｍｏｂｏｔｉｑｕｅ  ｅｔ  ａｎｔｉｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｖｅ．Ｌａｉｔ，７１：２４９−２５５）。
【０００５】
これらの種々の生理活性ペプチドの構造−機能研究によって、これらが、しばしば、それらのＣ末端配列においてＰｒｏ−Ｐｒｏ、Ａｌａ−ＰｒｏまたはＡｌａ−Ｈｙｐを有することを示唆されている（例えば、Ｍａｒｕｙａｍａ，Ｓ．，Ｓｕｚｕｋｉ，Ｈ．，１９８２．Ａ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ  Ｉ  ｃｏｎｖｅｒｔｉｎｇ  ｅｎｚｙｍｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｔｒｙｐｔｉｃ  ｈｙｄｒｏｌｙｓａｔｅ  ｏｆ  ｃａｓｅｉｎ．  Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，４６（５）：１３９３−１３９４；およびＯｓｈｉｍａ，Ｇ．，Ｓｈｉｍａｂｕｋｕｒｏ，Ｈ．，Ｎａｇａｓａｗａ，Ｋ．１９７９．  Ｐｅｐｔｉｄｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｏｆ  ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ  Ｉ−ｃｏｎｖｅｒｔｉｎｇ  ｅｎｘｙｍｅ  ｉｎ  ｄｉｇｅｓｔｓ  ｏｆ  ｇｅｌａｔｉｎ  ｂｙ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ．  Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，５６６：１２８−１３７．）。プロリンの発生率はまた、食品タンパク質に由来するペプチドのＡＣＥ阻害活性に寄与し得る（例えば、Ｋｏｈｍｕｒａ，Ｍ．，Ｎｉｏ，Ｎ．，Ｋｕｄｏ，Ｋ．，Ｍｉｎｏｓｈｉｍａ，Ｙ．，Ｍｕｎｅｋａｔａ，Ｅ．，Ａｒｉｙｏｓｈｉ，Ｙ．１９８９．Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ−ｃｏｎｖｅｒｔｉｎｇ  ｅｎｚｙｍｅ  ｂｙ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  β−ｃａｓｅｉｎ．Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，５３（８）：２１０７−２１１４）。
【０００６】
ＭａｒｕｙａｍａおよびＳｕｚｕｋｉ［前出］は、トリプシンカゼイン加水分解産物由来のペプチドにおけるこのようなアミノ酸配列を証明した。著者らは、ｘｓ１カゼイン（ウシ、改変体Ｂ）由来のペプチドｆ２３−３４が、７７μＭのＩＣ５０値（５０％のＡＣＥ活性を阻害するのに必要な濃度）によって推定されるＡＣＥ阻害活性を有することを示した。多数の他の研究が、この研究に続き、そしてカゼイン加水分解産物における他のＡＣＥ阻害ペプチドを明らかにした。最近の総説において、Ｎａｋａｎｏは、１８個の別個の乳タンパク質由来のペプチド配列（酸乳において見出され、そしてＡＣＥ阻害活性を有することが示されている）の存在を報告した（Ｎａｋａｎｏ，Ｔ．１９９８，Ｍｉｌｋ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ  ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ．  Ｉｎｔ．Ｄａｉｒｙ  Ｊ．，８：３７５−３８１）。
【０００７】
しかし、乳漿タンパク質加水分解産物の間のＡＣＥ阻害活性の存在を報告する研究はほどんどない。Ａｂｕｂａｋａｒらは、７つの異なる酵素：トリプシン、プロテアーゼ−Ｋ、アクチナーゼ−Ｅ（ａｃｔｉｎａｓｅ−Ｅ）、サーモリシン（ｔｈｅｒｍｏｌｙｓｉｎ）、パパインおよびキモトリプシンを使用して、乳漿タンパク質加水分解産物におけるＡＣＥ阻害活性を決定した。酵素の特異性が、加水分解産物の得られたＡＣＥ阻害活性に著しい効果を与え、そして生物学的活性が、主要な乳漿タンパク質（β−ｌｇ、α−ｌａ、ＢＳＡ、Ｉｇ）に由来し、カゼインマクロペプチドに由来しないことを示した（Ａｂｕｂａｋａｒ，Ａ．，Ｓａｉｔｏ，Ｔ．，Ａｉｍａｒ，Ｍ．Ｖ．，Ｉｔｏｈ，Ｔ．１９９６．Ｎｅｗ  ｄｅｒｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ａｇａｉｎｓｔ  ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ  ｃｏｎｖｅｒｔｉｎｇ  ｅｎｚｙｍｅ（ＡＣＥ）ｆｒｏｍ  ｓｗｅｅｔ  ｃｈｅｅｓｅ  ｗｈｅｙ．  Ｔｏｈｏｋｕ  Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｒｅｓ．，４７（１−２）：１−８．）。Ａｂｕｂａｋａｒらのより最近の研究は、９つのペプチド配列（すなわち、β２−マイクログロブリン（ｆ１８−２０）、β−ラクトグロブリン（ｆ７８−８０）、血清アルブミン（ｆ２２１−２２２）、β−カゼイン（ｆ５９−６１、ｆ５９−６４、ｆ６２−６３、ｆ８０−９０、ｆ１５７−１５８、ｆ２０５−２０６））の同定を可能にし、この中で、β−ラクトグロブリン（ｆ７８−８０）は、自然発生高血圧ラットにおいて最も強力な高血圧活性を示した（Ａｂｕｂａｋａｒ，Ａ．，Ｓａｉｔｏ，Ｔ．，Ｋｉｔａｚａｗａ，Ｈ．，Ｋａｗａｉ，Ｙ．，Ｉｔｏｈ，Ｔ．，１９９８，Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｎｅｗ  ａｎｔｉｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｖｅ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ  ｃｈｅｅｓｅ  ｗｈｅｙ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｂｙ  ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  Ｋ  ｄｉｇｅｎｓｔｉｏｎ．  Ｊ．Ｄａｉｒｙ  Ｓｃｉ．，１２：３１３１−３１３８．）。最後に、Ｍｕｌｌａｌｙらは、ウシβ−ラクトグロブリンを用いて調製したトリプシン加水分解産物からＲＰ−ＨＰＬＣを使用して単離したペプチド画分は、０．００６μｍｏｌ／ＬのＩＣ５０を有するカプトプリル（高血圧処置において一般に使用される市販の薬物）と比較して、１５９．８μｍｏｌ／ＬのＩＣ５０値を有したことを実証した（Ｍｕｌｌａｌｌｙ，Ｍ．Ｍ．，Ｍｅｉｓｅｌ，Ｈ．，ＦｉｔｚＧｅｒａｌｄ，Ｒ．Ｊ．，１９９７．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ−Ｉ−ｃｏｎｖｅｒｔｉｎｇ  ｅｎｚｙｍｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ  ｔｏ  ａ  ｔｒｙｐｔｉｃ  ｆｒａｇｍｅｎｔ  ｏｆ  ｂｏｖｉｎｅ  β−ｌａｃｔｏｇｌｏｂｕｌｉｎ．ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｒｓ，４０２：９９−１０１．）。質量分析法は、β−ラクトグロブリンのトリプシン加水分解産物におけるＡＣＥ阻害活性を担うβ−ラクトグロブリンに由来するペプチドｆ１４２−１４８の同定を可能にする。化学的合成によって得られた同じペプチド配列は、４２．６μｍｏｌ／ＬのＩＣ５０を示した。
【０００８】
アンギオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）を抑制する分野において改善を提供すること、および高血圧およびその症状を処置し得るさらなる物質（特に、食品項目において含まれるような簡単なレジメンの一部として容易に使用され得る物質）を同定すること、が望ましい。
【０００９】
（発明の要旨）
本発明の目的は、アンギオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）を抑制する分野において改善を提供することである。
【００１０】
本発明の目的は、アンギオテンシン変換酵素を抑制するための方法を提供することである。
【００１１】
本発明の別の目的は、アンギオテンシン変換酵素を抑制するために有効な組成物を提供することである。
【００１２】
本発明のなお別の目的は、アンギオテンシン変換酵素を抑制するために（特に乳漿タンパク質の酵素的変換によって）効果的な組成物を調製するための方法を提供することである。
【００１３】
本発明の目的は、哺乳動物における高血圧の分野において改善を提供することである。
【００１４】
本発明の目的は、哺乳動物において、高血圧に関連する心拍数および血圧を減少させるための方法を提供することである。
【００１５】
これらおよび他の目的は、本発明のひとつの局面によって、乳漿タンパク質加水分解産物の加水分解によるＡＣＥ抑制組成物の生成を可能にする改善、ＡＣＥ抑制組成物の回収、およびＡＣＥ抑制組成物の使用のためのレジメンによって達成される。
【００１６】
ＡＣＥ抑制組成物を調製するためのプロセスは、以下の工程を包含する：乳漿タンパク質単離物およびタンパク質分解酵素の水溶液を調製する工程；哺乳動物において増加したＡＣＥ抑制活性を有する加水分解産物を提供するためにこの乳漿タンパク質単離物を部分的に加水分解するのに効果的な条件下でこの溶液を維持する工程；およびこの溶液からこの加水分解産物を回収する工程。タンパク質分解酵素は、必要に応じて、好ましくは加熱によって不活化される。好ましくは、加水分解産物は、ＡＣＥ活性を抑制するのに有効な量および間隔で、哺乳動物（例えば、ヒトまたはイヌまたはネコのような家庭のペット）に経口投与する工程を包含するレジメンにおける使用のために乾燥される。
【００１７】
他の目的は、以下の工程によって得られる有効量の高血圧減少組成物をヒトまたは他の哺乳動物に経口投与する工程を伴う哺乳動物処置レジメンによって、本発明の別の局面によって達成される：乳漿タンパク質単離物およびタンパク質分解酵素の水溶液を調製する工程；哺乳動物において高血圧を減少する能力を有する加水分解産物を提供するためにこの乳漿タンパク質単離物を部分的に加水分解するのに効果的な条件下でこの溶液を維持する工程；およびこの溶液からこの加水分解産物を回収する工程。タンパク質分解酵素は、必要に応じて、好ましくは加熱によって不活化される。好ましくは、加水分解産物は、哺乳動物における高血圧を減少させるのに有効な量および間隔で、哺乳動物（例えば、ヒトまたはイヌまたはネコのような家庭のペット）に経口投与する工程を包含するレジメンにおける使用のために乾燥される。本発明の好ましい局面の多くは、以下に記載される。
【００１８】
本発明の好ましい局面の多くは、以下に記載される。
【００１９】
（発明の詳細な説明）
乳漿タンパク質単離物（ＷＰＩ）は、種々のプロセス（これには、単離物の意図された機能性について選択された陽イオン樹脂および／または陰イオン樹脂を用いるイオン交換処理が挙げられる）によってチーズ乳漿の商業規模の分画から入手し得る（Ｐｅａｒｃｅ，Ｒ．Ｊ．，１９９２，Ｗｈｅｙ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｒｅｃｏｖｅｒｙ  ａｎｄ  ｗｈｅｙ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ，Ｗｈｅｙ  ａｎｄ  Ｌａｃｔｏｓｅ  Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ，ＪＧ  Ｚａｄｏｗ，編，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｌｏｎｄｏｎ，２７１−３１６）。イオン交換処理から生じる商業的なＷＰＩ製品（例えば、ＢｉＰＲＯＴＭ（Ｄａｖｉｓｃｏ  Ｆｏｏｄｓ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．，ＬｅＳｕｅｕｒ，ＭＮ））は、高タンパク質含量（＞９４％  ｗ／ｗ）、低灰分含量（＜３％）、微量の脂肪およびラクトース（＜１％）によって特徴付けられる。代表的なＷＰＩのタンパク質分布は、５５〜６５％のβ−ラクトグロブリン、１７〜２５％  α−ラクトアルブミン、４〜７％のウシ血清アルブミン、７〜１１％の免疫グロブリンおよび１％未満の他のものを示す。
【００２０】
ＢｉＰＲＯＴＭ乳漿タンパク質単離物は、本発明の使用のための乳漿タンパク質単離物の好ましい供給源であり、１１０００Ｗ．７８ｔｈ  Ｓｔｒｅｅｔ，Ｓｕｉｔｅ  ２１０，Ｅｄｅｎ  Ｐｒａｉｒｉｅ，Ｍｉｎｎｅｓｏｔａ  ５５３４４にオフィスを置くＤａｖｉｓｃｏ  Ｆｏｏｄｓ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．から入手可能である。好ましいＢｉＰＲＯＴＭ乳漿タンパク質単離物は、１．１４のＰＤＣＡＡＳ（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄｉｇｅｓｔｉｂｉｌｉｔｙ  Ｃｏｒｒｅｃｔｅｄ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄ  Ｓｃｏｒｅ）を有する。脂肪およびラクトースレベルは、１％未満である。ＢｉＰＲＯＴＭ乳漿タンパク質単離物は、イオン交換技術によって調製され、そして約５５〜６５％（ｗ／ｗ）のβ−ラクトグロブリンを含む。好ましくは、本発明に従って使用される乳漿タンパク質単離物は、少なくとも５５％、好ましくは少なくとも６０％のβ−ラクトグロブリンを含み、残りは、α−ラクトアルブミン、血清アルブミンおよび免疫グロブリンを上記の範囲で含む。ＢｉＰＲＯＴＭは、本質的に非変性であり、そしてｐＨ２．０〜９．０にわたって完全に可溶性であり、そして以下の分析を有する。
【００２１】
【表１】
2004519204.tif 000002
＊全ての結果は、注意書きがある以外、「ＡＳ  ＩＳ」基本を報告する。
Ｅｘａｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｄａｉｒｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，第１６版の標準方法。
【００２２】
記載されるように、ＢｉＰＲＯＴＭ以外の乳漿タンパク質単離物が使用され得、そして好ましくは、上記の代表的な範囲の値から０〜２５％（例えば、５〜１０％、またはそれより下）で変化する上記と類似の分析を有する場合、使用され得る。濃縮および噴霧乾燥のために一次的な機能タンパク質（β−ラクトグロブリンおよびα−ラクトアルブミン）を選択する選択的イオン交換プロセスを介して、類似の特性を有する適切な乳漿タンパク質単離物が、生成され得る。このようなプロセスは、Ｊｏｗｅｔｔらの米国特許第４，１５４，６７５号およびＰｈｉｌｌｉｐｓらの米国特許第４，２１８，４９０号に記載される。適切に生成された場合、より低いタンパク質含量（例えば、３５％の低さ）を有する乳漿タンパク質画分が、使用され得る。さらに、イオン交換分離によって生成されたβ−ｌｇもまた使用され得るが、ＢｉＰＲＯＴＭ乳漿タンパク質単離物ほど好ましくない。
【００２３】
ＢｉＰＲＯＴＭ乳漿タンパク質単離物のより詳細な分析に関して、各１００グラムの乳漿タンパク質単離物について、以下のものが見出される：
成分
カロリー                      ３７４
総脂肪からのカロリー              ３
総脂肪（ｇ）                  ０．３
飽和脂肪（ｇ）                ０．２
コレステロール（ｍｇ）          １０
ナトリウム（ｍｇ）            ６００
カリウム（ｍｇ）              １２０
総炭水化物（ｇ）                  ０
食物繊維（ｇ）                    ０
糖（ｇ）                          ０
タンパク質（ｇ）                ９３
ビタミンＡ（ＩＵ）              ２０
ビタミンＣ（ｍｇ）            ２．０
カルシウム（ｍｇ）            １２０
鉄（ｍｇ）                        ５
リン（ｍｇ）                    ２５
マグネシウム（ｍｇ）            １５
灰分（ｇ）                        ２
水分（ｇ）                        ５。
【００２４】
そして、好ましいＢｉＰＲＯＴＭ乳漿タンパク質単離物のアミノ酸プロフィールを提供するために、サンプルを、五酸化リンおよび水酸化ナトリウムに対してデシケーター中で２４時間の乾燥に供した。乾燥サンプルを、アルゴン雰囲気下、ＨＣｌ蒸気（１％  フェノールおよび０．５％  亜硫酸ナトリウムを含む、６Ｎ  ＨＣｌ）中で加水分解した。摂氏１１０度での２０時間の加水分解後、サンプルを、２００μｌのＢｅｃｋｍａｎ  Ｎａ−Ｓサンプル緩衝液に溶解した。この酸加水分解方法は、トリプトファンを破壊する。
【００２５】
分析を、Ｂｅｃｋｍａｎ  ６３００  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄ  Ａｎａｌｙｚｅｒ上で実行した。ノルロイシンを、内部標準として使用した。分析によって、以下のものが示された。
【００２６】
【表２】
2004519204.tif 000003
さらに、ＢｉＰＲＯＴＭ以外の乳漿タンパク質単離物が使用される場合、それらは好ましくは、上記の値から０〜２５％（例えば、５〜１０％）またはそれより下で変化する、上記の分析に類似の分析を有する。
【００２７】
ＢｉＰＲＯＴＭおよび市販のβ−ｌｇリッチな製品の酵素消化を、動物、細菌および真菌プロテアーゼを用いて調製して、抗高血圧活性を有するペプチド混合物の調製のためにこれらの市販の物質の潜在性を決定した。この作業の目的は、他の市販の乳漿タンパク質加水分解産物と比較して、イオン交換クロマトグラフィーによって得られた乳漿タンパク質分離物からの酵素加水分解によって生成された種々の加水分解産物のＡＣＥ阻害活性を決定することであった。
【００２８】
（ＡＣＥ阻害のための材料および方法）
乳漿タンパク質加水分解産物であるＷＰＨ  ９１７（８４．５％  タンパク質  ｗ／ｗ）を、Ｎｅｗ  Ｚｅａｌａｎｄ  Ｍｉｌｋ  Ｐｒｏｄｕｃｔ  Ｉｎｃ．（Ｓａｎｔａ  Ｒｏｓａ，ＵＳＡ）から入手した。乳漿タンパク質加水分解産物であるＬＥ８０ＧＦ（８０．０％  ｗ／ｗ）を、ＤＭＶ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（Ｎｅｗ−Ｙｏｒｋ，ＵＳＡ）から入手した。乳漿タンパク質単離物（ＢｉＰＲＯＴＭ）およびβ−ラクトグロブリンリッチな製品は、Ｄａｖｉｓｃｏ  Ｆｏｏｄｓ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（Ｌｅ  Ｓｕｅｕｒ，ＭＮ，ＵＳＡ）から入手した。β−ｌｇ由来のペプチドｆ−１４２−１４８のモデルである生成したペプチド配列Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｍｅｔ−Ｈｉｓ−Ｉｌｅ−Ａｒｇは、Ｓｅｒｖｉｃｅ  ｄｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｄｅ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｄｅ  ｌ’Ｅｓｔ  ｄｕ  Ｑｕｅｂｅｃ（Ｓｔｅ−Ｆｏｙ，Ｑｃ，Ｃａｎａｄａ）によって化学的に合成した。ＨＥＰＥＳナトリウム塩、ヒプリル−Ｌ−ヒスチジル−Ｌ−ロイシン、およびアンギオテンシン変換酵素（ウサギ肺由来）を、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＵＳＡ）から購入した。使用した他の製品の全ては、分析等級であった。
【００２９】
乳漿タンパク質（ＢｉＰＲＯＴＭまたはβ−ｌｇ）を、２０％  Ｗ／Ｖに溶解し、ＮａＯＨおよびＫＯＨ  ４Ｎの混合物を用いすることによって、ｐＨ８．０またはｐＨ８．５に調整し、そして使用した酵素の最適温度に対応する４０℃と５０℃との間の温度に維持した。表１は、本研究のための酵素加水分解の調製に使用した酵素の特徴を報告する。ＢｉＰＲＯＴＭおよびβ−ｌｇリッチな製品を、６０１および６０５の調製のために利用したが、ＢｉｐｒｏＴＭは、６０３Ｋのためのみに使用した。タンパク質溶液を、ＡＳ−６０１について１：８００の酵素：基質比、ＡＳ−６０３Ｋについて１：５０の酵素：基質比、そしてＡＳ−６０５Ｋについて１：１００の酵素：基質比で、プロテアーゼを用いてインキュベートした。酵素加水分解を、ＡＳ−６０１について５．５〜６．５％の加水分解の程度（ＤＨ）までｐＨ−ｓｔａｔ条件下で実行し、ＡＳ−６０３Ｋについて１１．０〜１２．５％のＤＨまでｐＨ−ｓｔａｔおよび浸透圧測定方法の組合わせ下で実行し、そしてＡＳ−６０５Ｋについて１９．５〜２０．５％のＤＨまでｐＨ−ｓｔａｔおよび浸透圧測定方法の組合わせ下で実行した。加水分解反応を、プレート熱交換器において熱処置（７５〜８５℃を１５秒間）によって選択されたＤＨ値で停止して、酵素を不活化し、そして続いて冷却してさらなる処理まで５〜１０℃で保存した。生じた加水分解産物を、さらに、噴霧乾燥し、粉末成分として取り扱った。画分を、分子量に基づいて採取し得、そして相対的な活性について試験し、最も活性な画分を選択した。
【００３０】
ＢｉＰＲＯＴＭ乳漿タンパク質加水分解産物から調製されたＡＳ−６０１Ｋ生成物およびＡＳ−６０３Ｋ生成物についての代表的な分析を、以下に提供する。
【００３１】
【表３】
2004519204.tif 000004
＊全ての結果は、注意書きがある以外、「ＡＳ  ＩＳ」基本を報告する。
＊＊Ｅｘａｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｄａｉｒｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，第１６版の標準方法。
＊＊＊０．４５μ濾液中の総可溶性ペプチドのパーセント。
【００３２】
【表４】
2004519204.tif 000005
【００３３】
【表５】
2004519204.tif 000006
（ＡＣＥ阻害活性の決定）
ＡＣＥ阻害活性を、ＣｕｓｈｍａｎおよびＣｈｅｕｎｇの方法（Ｃｕｓｈｍａｎ，Ｄ．Ｎ．，Ｃｈｅｕｎｇ，Ｈ．Ｓ．１９７１  Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｒｉｃ  ａｓｓａｙ  ａｎｄ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ  ｃｏｎｖｅｒｔｉｎｇ  ｅｎｚｙｍｅ  ｏｆ  ｒａｂｂｉｔ  ｌｕｎｇ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，２０：１６３７−１６４８）に従って分光測定法的アッセイによってインビトロで測定した。この方法に従って、馬尿酸は、ヒプリル−Ｌ−ヒスチジル−Ｌ−ロイシン（ｈｉｐｐｕｒｙｌ−Ｌ−ｈｉｓｔｉｄｙｌ−Ｌ−ｌｅｕｃｉｎｅ：ＨＨＬ）から、ＡＣＥの酵素反応によって遊離される。酢酸エチルによる抽出および加熱エバポレーションによる酢酸エチルの除去の後、馬尿酸は、脱イオン水中に溶解される。
【００３４】
表２は、このアッセイのために用いた実験条件をまとめる。２２８ｎｍでの馬尿酸溶液の吸光度を、分光測定法によって決定した。
【００３５】
【表６】
2004519204.tif 000007
阻害活性を、以下の方程式に従って算出した：
阻害活性（％）＝［（Ａコントロール−Ａサンプル）／（Ａコントロール−Ａブランク）］×１００［１］
ここで、Ａは、吸光度を表す。サンプル濃度（ｍｇ粉末ｍｌ−１）のｌｏｇ１０に対する阻害活性（％）のプロットを、ＢｉＰＲＯＴＭ、ＡＳ−６０１（ＢｉＰＲＯＴＭβ−ｌｇ）、商業的な加水分解産物（ＷＰＨ  ９１７、ＬＥ８０ＧＦ）およびβ−ｌｇからの合成ペプチド（ｆ１４２−１４８）についての６つの異なる濃度のサンプルを用いて作成した。各濃度を三連で試験し、そして平均値をこれらの曲線にプロットした。ＩＣ５０値（ＡＣＥ活性の５０％阻害を与えるインヒビター濃度として定義される、ｍｇ粉末ｍｌ−１の形で表現される）を、これらの曲線の線形回帰方程式を用いて算出した。
【００３６】
研究中の全ての加水分解産物に対応する線形回帰方程式を表３に報告する。これらのデータは、加水分解されていないＢｉＰＲＯＴＭが、研究中の他の全ての産物と比較して非常に低いＡＣＥ阻害活性（ＩＣ５０３８０ｍｇ粉末ｍｌ−１）を有することを示す。最大のＡＣＥ阻害活性は、β−ｌｇの合成ペプチドｆ１４２−１４８を用いて得られ、β−ｌｇの合成ペプチドｆ１４２−１４８についての５０％の阻害は、最低濃度（ＩＣ５００．０４ｍｇ粉末ｍｌ−１）で既に得られた。研究中の加水分解産物のＡＣＥ阻害効果は、以下の順序に従った：ＡＳ−６０３Ｋ（ＢｉＰＲＯＴＭ）＞ＡＳ−６０５Ｋ（ＢｉＰＲＯＴＭ）＞ＡＳ−６０１（ＢｉＰＲＯＴＭ）＞ＡＳ−６０５Ｋ（β−ｌｇ）＞ＡＳ−６０１（β−ｌｇ）＞ＬＥ８０ＧＦ＞ＷＰＨ  ９１７。
【００３７】
以下の通りの表３は、研究中の加水分解産物と比較して、合成ペプチドβ−ｌｇ（ｆ１４２−１４８）を用いて得られたＡＣＥ阻害活性曲線の線形回帰方程式（ｙ＝ｍ  ｌｎＸ＋ｂ）を表す。
【００３８】
【表７】
2004519204.tif 000008
研究中の全てのサンプルについて算出されたＩＣ５０の値を、表４に列挙する。ＢｉＰＲＯＴＭのサンプルはより低いＡＣＥ阻害活性（３７６ｍｇ粉末ｍｌ−１のＩＣ５０を有する）を示し、一方、β−ｌｇの合成ペプチドｆ１４２−１４８は最も低い値を示した（０．０４ｍｇ粉末ｍｌ−１）。ＢｉＰＲＯＴＭから誘導された加水分解産物またはβ−ｌｇリッチな産物は全て、他の商業的加水分解産物（０．９６および１．３０ｍｇ粉末ｍｌ−１）より低いＩＣ５０値（０．２９〜０．９０ｍｇ粉末ｍｌ−１）を与えた。また、ＢｉＰＲＯＴＭから誘導された加水分解産物は、β−ｌｇリッチな産物から誘導された加水分解産物よりも低いＩＣ５０値を導いた（例えば、ＡＳ−６０１ＢｉＰＲＯＴＭ＝０．４５ｍｇ粉末ｍｌ−１  対  ＡＳ−６０１β−ｌｇ＝０．９０ｍｇ粉末ｍｌ−１）。
【００３９】
【表８】
2004519204.tif 000009
（考察）
本発明者らの観察は、イオン交換クロマトグラフィーから流出された乳漿タンパク質（例えば、ＢｉＰＲＯＴＭ乳漿タンパク質単離物）の酵素的加水分解が、他の乳漿タンパク質供給源を用いて調製された商業的な加水分解産物と比較して優れたＡＣＥ阻害活性を有する加水分解産物を生成することを示す。さらに、ＢｉＰＲＯＴＭ乳漿タンパク質単離物は、ＢｉｐｒｏＴＭ乳漿タンパク質単離物から調製されたＡＳ−６０１、ＡＳ−６０３Ｋおよび６０５Ｋについて得られた、より低いＩＣ５０値（表４）によって示されるように、抗高血圧活性を有する加水分解産物の調製のために、β−ｌｇリッチな産物よりも良好な基質であるようである。この観察は予想外であった。なぜなら、β−ｌｇリッチな産物（特に、トリプシンによって遊離されるフラグメントβ−ｌｇ  １４２−１４８）は、ＡＣＥ阻害ペプチドを産生する、より高い可能性を提供すると仮定されていたからである（Ｍｕｌｌａｌｌｙ，Ｍ．Ｍ．，Ｍｅｉｓｅｌ，Ｈ．，ＦｉｔｚＧｅｒａｌｄ，Ｒ．Ｊ．，１９９７．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ−Ｉ−ｃｏｎｖｅｒｔｉｎｇ  ｅｎｚｙｍｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ  ｔｏ  ａ  ｔｒｙｐｔｉｃ  ｆｒａｇｍｅｎｔ  ｏｆ  ｂｏｖｉｎｅ  β−ｌａｃｔｏｇｌｏｂｕｌｉｎ．ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，４０２：９９−１０１）。実際、最低のＩＣ５０（０．２９ｍｇ粉末ｍｌ−１）を有する加水分解産物は、細菌性プロテアーゼ（ＡＳ６０３Ｋ）を用いた加水分解によって入手され、そしてトリプシン（ＡＳ−６０１）を用いた加水分解によっては入手されなかった。全体的に見て、本発明者らの結果は、ＢｉＰＲＯＴＭ乳漿タンパク質単離物を基質として用いた場合の相乗効果の発生を示唆するが、この現象についての説明は明らかではない。
【００４０】
ＢｉＰＲＯＴＭ乳漿タンパク質単離物および同様に調製された他の単離物は、酵素的加水分解の間の、非常に強いＡＣＥ阻害活性を有するペプチドの産生の前駆体であり得る、主なタンパク質の組成（β−ｌｇ、α−ｌａなど）および微量タンパク質（ラクトフェリン、ラクトペルオキシダーゼ（ｌａｃｔｏｐｅｒｏｘｙｄａｓｅ）、免疫グロブリン）またはペプチド性フラグメント（カゼインマクロペプチド（ｃａｓｅｉｎｏｍａｃｒｏｐｅｐｔｉｄｅ）、プロテオース、ペプトンなど）の含量に関する比較のために好ましい。これらの微量タンパク質のいくつかは、異なる分画条件の結果として、β−ｌｇリッチな産物中では、より低い濃度であり得る。
【００４１】
また、ＢｉＰＲＯＴＭ乳漿タンパク質単離物（６０１、６０５Ｋおよび６０３Ｋ）からの酵素的加水分解産物の調製のために用いられた酵素（それぞれ、Ｔｒｙｐｓｉｎ  ＶＩ、Ｐ  Ａｍａｎｏ  ６およびＭｕｌｔｉｆｅｃｔ）が、非常に異なる特異性を有することが強調されなければならない。トリプシンは、ＡｒｇおよびＬｙｓの近傍のペプチド結合のみを切断することが公知であり、一方、他の２つの酵素は、ずっと広い特異性を有し、そしてより多数のより短いペプチドを生じる。Ａｂｕｂａｋａｒら（前出）による近年の研究は、トリペプチドのような短い分子およびジペプチドでさえも、抗高血圧効果を有し得ることを示唆する。β−ｌｇのフラグメント１４２−１４８およびフラグメント７８−８０が、全ての乳漿タンパク質加水分解産物の抗高血圧特性を担う唯一のＡＣＥインヒビターではないことが明らかである。
【００４２】
ＢｉＰＲＯＴＭ乳漿タンパク質単離物が用いられた場合の乳漿タンパク質加水分解産物のＡＣＥ阻害能力に対する相乗効果はまた、（特に、二価カチオン（例えば、カルシウム（１５〜２０ｍｅｑ／ｋｇ）またはマグネシウム（＜１ｍｅｑ／ｋｇ））に関する）その低い鉱物含量に起因し得る。これらの物理化学的条件は、ペプチド−ペプチド相互作用の発生を妨害し得、それゆえ、加水分解産物の高いＡＣＥ阻害能力を保ち得る。この仮説は、ＢｉＰＲＯＴＭ乳漿タンパク質単離物の鉱物組成を、より低いＡＣＥ阻害能力を示した、β−ｌｇリッチな産物の鉱物組成と比較することによってさらに調査される。
【００４３】
この研究は、ＢｉＰＲＯＴＭの酵素的加水分解が、得られる加水分解産物のＡＣＥ阻害能力に関する相乗効果を導くことを示した。相乗作用は微量なタンパク質またはフラグメントの存在に関連してイオン交換プロセスによってもたらされる独特の組成上の特徴から生じ得るようである。
【００４４】
（哺乳動物における高血圧の処置のための材料および方法）
ＢｉＰＲＯＴＭ乳漿タンパク質単離物の酵素消化物を、動物性プロテアーゼ、細菌性プロテアーゼおよび真菌性プロテアーゼを用いて、抗高血圧活性を有するペプチド混合物の調製についてのこれらの商業的基質の能力を決定するために、調製した。本研究の主な目的は、いくつかの特定の乳漿タンパク質加水分解産物の抗高血圧効果を調査することであった。以下は、抗高血圧効果を特徴付け、そして各溶解産物についての用量応答曲線を確立するために、意識のある自然高血圧ラット（ＳＨＲ）において実施されてきた実験をまとめる。ＳＨＲは、本態性高血圧の遺伝的モデルと考えられ、そして一般に、高血圧の発達および確立を理解し、かつ新たに合成された抗高血圧薬物の血圧降下効果を決定するために用いられている。さらに、ＳＨＲにおいて実施された以前の研究では、本発明者らは、アンギオテンシンＩ変換酵素（ＡＣＥ）インヒビターであるＣａｐｔｏｐｒｉｌの静脈内注射が、腎臓、上腸間膜および後ろ四半部の血管床における顕著な血管拡張を伴って、血圧の顕著な低下を引き起こすことを見出した（未公開データ）。それゆえ、ＳＨＲは、ＡＣＥ阻害に対して非常に反応性であるようであり、次いで、特定の乳漿タンパク質加水分解産物が顕著な抗高血圧特性を示すか否かを決定する際に、非常に有用な情報を提供するはずである。
【００４５】
３つの乳漿タンパク質加水分解産物（すなわち、６０１、６０３Ｋおよび６０５Ｋ）ならびにコントロールであるリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）および未処理のＢｉＰＲＯ乳漿タンパク質単離物を調べた。平均および相性の動脈血圧および心拍数に対する各乳漿タンパク質の効果を、意識のある非拘束雄性ＳＨＲにおいて調査した。本研究において、これらの動物を、長期に装置に取り付け、一方の脈管内カテーテルを左大腿動脈に移植して、血圧および心拍数の連続記録を可能にした。この技術は、本発明者らの研究室において非常によく開発されており、そして慣用的に行われている（Ｂａｃｈｅｌａｒｄ，Ｈ．およびＧ．Ｄｒｏｌｅｔ，Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｔｏ  ｐａｒａｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ（ＰＶＮ）ｉｎｊｅｃｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｏｐｉｏｉｄ  ａｇｏｎｉｓｔｓ  ｉｎ  ｃｏｎｓｃｉｏｕｓ  ｒａｔｓ，Ａｂｓｔｒａｃｔ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ．１８：１１７５，１９９２；Ｂａｃｈｅｌａｒｄ，Ｈ．およびＭ．Ｐｉｔｒｅ，Ｒｅｇｉｏｎａｌ  ｈａｅｍｏｄｙｎａｍｉｃ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  μ−，δ−，κ−ｏｐｉｏｉｄ  ａｇｏｎｉｓｔｓ  ｍｉｃｒｏｉｎｊｅｃｔｅｄ  ｉｎｔｏ  ｔｈｅ  ｈｙｐｏｔｈａｌａｍｉｃ  ｐａｒａｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ  ｎｕｃｌｅｉ  ｏｆ  ｃｏｎｓｃｉｏｕｓ，ｕｎｒｅｓｔｒａｉｎｅｄ  ｒａｔｓ，Ｂｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ，１１５：６１３−６２１，１９９５；Ｐｉｔｒｅ，Ｍ．，Ｈ．Ｇａｕｄｒｅａｕｌｔ，Ｍ．Ｓａｎｔｕｒｅ，Ａ．Ｎａｄｅａｕ，およびＨ．Ｂａｃｈｅｌａｒｄ．Ｉｓｒａｄｉｐｉｎｅ  ａｎｄ  ｉｎｓｕｌｉｎ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ｉｎ  ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｖｅ  ｒａｔｓ，Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，３９：Ｅ１０３８−Ｅ１０４８，１９９９；Ｐｉｔｒｅ，Ｍ．，Ａ．ＮａｔｅａｕおよびＨ．Ｂａｃｈｅｌａｒｄ，Ｉｎｓｕｌｉｎ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ａｎｄ  ｈｅｍｏｄｙｎａｍｉｃ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｔｏ  ｉｎｓｕｌｉｎ  ｉｎ  Ｗｉｓｔａｒ−Ｋｙｏｔｏ  ａｎｄ  ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓｌｙ  ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｖｅ  ｒａｔｓ，Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２７１：Ｅ６５８−Ｅ６６８，１９９６）。この実験アプローチは、意識のあるラットにおける乳漿タンパク質に対する血行力学応答を調査するための強力なツールを構成する。収縮期血圧を測定するために他者によって一般的に用いられている非侵襲性技術である尾部カフ血圧計は、動物にはストレスが多く（ラットは、測定の間、拘束装置（ｒｅｓｔｒａｉｎｅｒ）中に固定されなければならない）、そして大きな変動性を免れない。それゆえ、意識のある動物における血圧測定における固有の変動性、およびＳＨＲラットはストレスの多い刺激に非常に反応性であることが公知であることを考慮して、本発明者らは、（特に、定常ベースライン測定値を確立する際の）尾部カフ技術を用いて行われた測定にはいくらかの不確実さが存在すると考えた。対照的に、血圧を直接的かつ連続的に記録することによって、この変動性を考慮し、そしてより信頼性のある血圧測定を行うことがより容易である。さらに、本発明者らのラットを、実験の数日前にこのシステムに充分に適応させ、��して血圧の直接的な測定を、この動物に何の痛みもストレスも引き起こすことなく行った。それゆえ、意識のある非拘束動物における血圧および心拍数の直接的かつ連続的な記録は、他の非侵襲性技術に対する明確な利点を表す。
【００４６】
乳漿タンパク質単離物（ＢｉＰＲＯＴＭ）を、Ｄａｖｉｓｃｏ  Ｆｏｏｄｓ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（Ｌｅ  Ｓｕｅｕｒ，ＭＮ，ＵＳＡ）から入手した。Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＵＳＡ）からＨＥＰＥＳ  Ｓｏｄｉｕｍ塩、Ｈｉｐｐｕｒｙｌ−Ｌ−Ｈｉｓｔｉｄｙｌ−Ｌ−Ｌｅｕｃｉｎｅ、およびＡｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ  Ｃｏｎｖｅｒｔｉｎｇ  Ｅｎｚｙｍｅ（ウサギ肺由来）を、購入した。用いた全ての他の製品は分析等級であった。
【００４７】
乳漿タンパク質（ＢｉＰＲＯＴＭ）を、２０％Ｗ／Ｖで溶解して、４ＮのＮａＯＨおよびＫＯＨの混合物を用いて、ｐＨ８．０または８．５に調整し、そして用いた酵素の至適温度に相当する４０℃〜５０℃の間の温度で維持した。表１は、この研究のための酵素加水分解産物の調製のために用いた酵素の特徴を報告する。ＢｉＰＲＯＴＭの乳漿タンパク質単離物を６０１、６０３Ｋ、および６０５Ｋの調製に利用した。このタンパク質溶液を、プロテアーゼとともに、酵素：基質の比が、６０１については１：８００、６０３Ｋについては１：５０、そして６０５Ｋについては１：１００で、インキュベートした。この酵素加水分解を、６０１については、４．５〜６．５％の加水分解（ＤＨ）の程度まで、ｐＨスタット条件下で、そして６０３Ｋについては、７．０〜１０．０％のＤＨまでｐＨスタットおよび浸透圧法の組み合わせ下で、そして６０５Ｋについては、１３．０〜１７．０％のＤＨまで、実施した。この加水分解反応を、プレート熱交換機における熱処理（７５〜８５℃、１５秒）の方法で、選択したＤＨ値に停止させ、酵素を不活性化し、そして続いて冷却してさらなる処理まで５〜１０℃で保存した。得られた加水分解産物をさらに噴霧乾燥して、粉末成分として取り扱った。分子量に基づいて画分をとり、そして選択した最も活性な画分を用いて、相対活性を試験し得る。
【００４８】
ＢｉＰＲＯＴＭ乳漿タンパク質加水分解から調製した６０１Ｋおよび６０３Ｋ生成物についての代表的な分析物を以下に示す。
【００４９】
【表９】
2004519204.tif 000010
【００５０】
【表１０】
2004519204.tif 000011
【００５１】
【表１１】
2004519204.tif 000012
（降圧活性の決定−方法）
全ての外科手順および実験手順は、動物取り扱いガイドライン制度（ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  ａｎｉｍａｌ  ｃａｒｅ  ｇｕｉｄｅｌｉｎｅ）に従った。雄性ＳＨＲラット（２０〜２４週齢でかつ３００〜３５０ｇ重量）をＣｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｃａｎａｄａから購入した。このラットを、ケタミン−キシラジン（それぞれ、１００ｍｇ／ｋｇおよび１０ｍｇ／ｋｇ）の混合物で麻酔し（必要に応じてｉ．ｐ．で追加した）、そして左の大腿動脈を介して遠位腹部大動脈にカテーテルを１本埋め込んだ（血圧および心拍数の測定のため）。次いで、このカテーテルは、皮下にトンネルされ、頸の後ろで現れ、そしてラットによってカスタムメイドされた装具に接着された可撓性の防御スプリングを通過させられた。このラットにＡｍｐｉｃｉｌｌｉｎ（１５０ｍｇ／ｋｇ）およびＡｎａｆｅｎ（５ｍｇ／ｋｇ）のｓ．ｃ．注射をして、住処のケージに戻した。この外科工程の少なくとも４日後に実験を始めた。
【００５２】
実験を通じて、Ｂｉｏｐａｃ  Ｄａｔａ  ＡｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎおよびＡｎａｌｙｓｉｓシステム（Ｍｏｄｅｌ  ＭＰ１００、ＡｃｑＫｏｗｌｅｄｇｅ  ｓｏｆｔｗａｒｅ  バージョン３．１）を用いて、３つの変数（心拍、ならびに位相性および平均の動脈血圧）を記録した。選択した時点で、心拍、位相性動脈血圧、および平均動脈血圧を測定し、加水分解産物またはＢｉＰＲＯ乳漿タンパク質単離物の効果の完全なプロフィールを示した。これは前処理した基準値に関連していた。このラットは意識があり、抑制されておらず、そして実験の間、水および食物に自由に近づけた。
【００５３】
（実験プロトコール）
ＢｉＰＲＯ乳漿タンパク質単離物、または特定の乳漿タンパク質加水分解産物（６０１、６０３Ｋ、６０５Ｋ）の経口投与によって誘発された心臓血管系の変化を、意識があり拘束されてないＳＨＲで評価した。このラットを４日続けて用い、この間、それらのラットに、胃内挿管によって、漸増する用量の特定の加水分解産物（６０１、６０３Ｋ、６０５Ｋ）またはＢｉＰＲＯのうち１つだけを投与した。凍結乾燥した乳漿タンパク質加水分解産物の粉末を、０．２ｍＭ  ＰＢＳ（ｐＨ７．２）に溶解し（同じビヒクルである０．２ｍＭ  ＰＢＳをコントロール投与に用いた）、そして０．５ｍｌの容量で与えた。全ての溶液は新たに準備した。従って、血圧および心拍数の基準測定直後の典型的な日には、ラットにはビヒクル（１日目にコントロールＰＢＳ）、または単離された用量の測定の加水分解産物（２日目、３０ｍｇ／ｋｇ、３日目、７５ｍｇ／ｋｇ、そして４日目１５０ｍｇ／ｋｇ）、またはＢｉＰＲＯ乳漿タンパク質単離物（２日目、３０ｍｇ／ｋｇ、３日目、７５ｍｇ／ｋｇ、そして４日目１５０ｍｇ／ｋｇ）を投与した。ＰＢＳ、ＢｉＰｒｏ乳漿タンパク質単離物、または乳漿タンパク質加水分解産物の単回経口投与の、血圧および心拍への影響を７時間をこえて評価した。
【００５４】
（結果）
連続して４日間、いずれかの介入の前に、毎朝測定した心臓血管測定値の安静時の値を図２に示す。理解されるとおり、１日目、２日目、３日目および４日目に測定した基準平均動脈血圧と心拍数との間に有意な差異はない。
【００５５】
【表１２】
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値は、平均±ＳＥＭであり、ｎは、ラットの数である。（グループは、ビヒクル（ＰＢＳ）、６０１、６０３Ｋ、６０５ＫまたはＢｉＰｒｏ乳漿タンパク質単離物の単回経口投与の、意識下、非拘束ＳＨＲにおける、血圧および心拍への影響を評価するために用いたグループを示す）。ＭＡＰ（平均動脈血圧）；ＨＲ（心拍数）；ｂｐｍ（１分あたりの拍動）。
【００５６】
（加水分解産物６０１に対する心臓血管系の反応）
図１は、意識下、非拘束の高血圧自然発症ラット（ＳＨＲ）における、０．２ｍＭ  ＰＢＳ（ｎ＝３６）、または加水分解産物６０１の０．５ｍｌの、３０ｍｇ／ｋｇ（ｎ＝９）、７５ｍｇ／ｋｇ（ｎ＝８）、または１５０ｍｇ／ｋｇ（ｎ＝７）の用量の、経口投与後の、心拍数および平均動脈血圧の変化を示す。各ポイントは、垂直線によって示される標準誤差をともなう平均を示す。＊Ｐ＜０．０５は、ビヒクル対処理群（ＡＮＯＶＡ、その後のフィッシャー試験）。ＨＲは心拍数；ｂｐｍは１分あたりの拍動；ＭＡＰは、平均動脈血圧である。心拍数の有意な（４時間、６時間および７時間で）低下を誘発した（６時間で最大−７７±１４ｂｐｍ）７５ｍｇ／ｋｇ用量を除いて、本発明者らは、３０ｍｇ／ｋｇおよび１５０ｍｇ／ｋｇの用量で、ＰＢＳと加水分解産物６０１との胃内投与によって起きた心拍数反応の間に、有意な差異を見出さなかった。しかし、本発明者らは、加水分解産物６０１の異なる用量の胃内投与後には、ＰＢＳのコントロール投与に比べて、平均動脈血圧の有意な低下を観察した。
【００５７】
従って、本発明者らは、３０ｍｇ／ｋｇの用量での加水分解産物の投与後６時間で有意な降圧効果（−２７±６ｍｍＨｇ）を観察した。本発明者らは、７５ｍｇ／ｋｇの加水分解産物の用量で、ＰＢＳのコントロール投与の効果と比べて、顕著でかつ長期の降圧効果（１〜７時間で有意）を観察した。平均動脈血圧の最大低下（−３９±６ｍｍＨｇ）を、投与後６時間で達成した。１５０ｍｇ／ｋｇの加水分解産物の胃内投与後、同様の降圧効果（１および３〜７時間で有意）をまた観察した。平均動脈血圧の最大低下（−３２±７ｍｍＨｇ）を、投与後６時間で達成した。
【００５８】
（ＢｉＰＲＯおよび加水分解産物６０３Ｋ、６０５Ｋに対する心臓血管反応）  図２〜４は、０．２ｍＭ  ＰＢＳ（ｎ＝３６）、または加水分解産物６０３（図２）もしくは６０５Ｋ（図３）、またはＢｉＰＲＯ乳漿タンパク質分解物（図４）の０．５ｍｌの、３０ｍｇ／ｋｇ、７５ｍｇ／ｋｇ、または１５０ｍｇ／ｋｇの用量での、経口投与後の、心拍数および平均動脈血圧の変化を示す。本発明者らは、ＰＢＳおよび加水分解産物６０３Ｋ、もしくは６０５Ｋ、またはＢｉＰＲＯ乳漿タンパク質単離物の試験した異なる用量での胃内投与によって起きた心拍数または平均動脈圧の反応の間に、有意な差異を見出さなかった。
【００５９】
（結論）
本発明の結果は以下を示す：
意識下、非拘束ＳＨＲにおける加水分解産物６０１の単回経口投与（７５ｍｇ／ｋｇまたは１５０ｍｇ／ｋｇの用量）は、投与後１〜７時間、平均動脈血圧を有意に低下する。
【００６０】
血圧は、投与後２４時間で最初のレベルに戻る。
【００６１】
逆に、加水分解産物６０３Ｋおよび６０５ＫならびにコントロールのＢｉＰＲＯ乳漿タンパク質単離物は、（試験した用量のいずれにおいても）本研究におけるＳＨＲラットの平均動脈血圧を変化しなかった。
【００６２】
記した加水分解産物６０１での処置に適切なレジメンは、２〜２４時間の間隔で、７５〜１５０ｍｇ／ｋｇ以上の用量の経口投与を含む。より広範には、この投薬量および間隔は、経時的な処置によって示されるように、５０〜５００％まで上昇または減少し得る。
【００６３】
上記の説明は、本発明を実施する当業者に利用可能であると解釈される。この説明を読み取れば、当業者には明白となる全ての可能性のある改変およびバリエーションを詳細に説明することは意図していない。しかし、このような改変およびバリエーションの全てが、上記の説明にみられ、そしてさもなければ添付の特許請求の範囲に規定される本発明の範囲内に含まれると解釈される。この特許請求の範囲は、文脈が特に逆を意味しない限り、本発明について意図される目的に合致するのに有効である任意の配列または順序で、示される構成要素および工程を包含することを意味する。
【００６４】
図１〜４は、上に詳細に議論する抗高血圧（ａｎｔｉｈｙｐｅｒｓｉｏｎ）処置についての実験室試験の結果を要約する。
【図面の簡単な説明】
【図１】
意識のある抑制されていない自発的に高血圧のラット（ＳＨＲ）における、ビヒクル（０．２ｍＭ  ＰＢＳ（ｐＨ７．２）；Ｏ、ｎ＝３６のラット）または３０ｍｇ／ｋｇ（ｎ＝９のラット）、７５ｍｇ／ｋｇ（ｎ＝８）または１５０ｍｇ／ｋｇ（ｎ＝７）の用量での６０１の単一経口投与（時間０）によって誘発された、熱速度（Ａ）および平均動脈血圧（Ｂ）における変化。各点は、平均を示し、標準誤差は、垂直の線によって示す。＊Ｐ＜０．０５  対ビヒクル処理群、フィッシャーの検定に従う分散分析。ＨＲ、熱速度；ｂｐｍ、１分間あたりの脈拍；ＭＡＰ、平均動脈血圧。
【図２】
意識のある抑制されていない自発的に高血圧のラット（ＳＨＲ）における、ビヒクル（０．２ｍＭ  ＰＢＳ（ｐＨ７．２）；Ｏ、ｎ＝３６のラット）または３０ｍｇ／ｋｇ（ｎ＝１０のラット）、７５ｍｇ／ｋｇ（ｎ＝１０）または１５０ｍｇ／ｋｇ（ｎ＝１０）の用量での６０３Ｋの単一経口投与（時間０）によって誘発された、熱速度（Ａ）および平均動脈血圧（Ｂ）における変化。各点は、平均を示し、標準誤差は、垂直の線によって示す。＊Ｐ＜０．０５  対ビヒクル処理群、フィッシャーの検定に従う分散分析。ＨＲ、熱速度；ｂｐｍ、１分間あたりの脈拍；ＭＡＰ、平均動脈血圧。
【図３】
意識のある抑制されていない自発的に高血圧のラット（ＳＨＲ）における、ビヒクル（０．２ｍＭ  ＰＢＳ（ｐＨ７．２）；Ｏ、ｎ＝３６のラット）または３０ｍｇ／ｋｇ（ｎ＝８のラット）、７５ｍｇ／ｋｇ（ｎ＝８）または１５０ｍｇ／ｋｇ（ｎ＝８）の用量での６０５Ｋの単一経口投与（時間０）によって誘発された、熱速度（Ａ）および平均動脈血圧（Ｂ）における変化。各点は、平均を示し、標準誤差は、垂直の線によって示す。ＨＲ、熱速度；ｂｐｍ、１分間あたりの脈拍；ＭＡＰ、平均動脈血圧。
【図４】
意識のある抑制されていない自発的に高血圧のラット（ＳＨＲ）における、ビヒクル（０．２ｍＭ  ＰＢＳ（ｐＨ７．２）；Ｏ、ｎ＝３６のラット）または３０ｍｇ／ｋｇ（ｎ＝８のラット）、７５ｍｇ／ｋｇ（ｎ＝８）または１５０ｍｇ／ｋｇ（ｎ＝８）の用量でのＢｉＰＲＯの単一経口投与（時間０）によって誘発された、熱速度（Ａ）および平均動脈血圧（Ｂ）における変化。各点は、平均を示し、標準誤差は、垂直の線によって示す。ＨＲ、熱速度；ｂｐｍ、１分間あたりの脈拍；ＭＡＰ、平均動脈血圧。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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