(57)【要約】この発明は、ラクトバチルス・サケイ２５１２から誘導されたサカシンＧと呼ばれるバクテリオシンである単離されたポリペプチドに関係する。この発明は又、該バクテリオシンをコードする核酸及び該ポリペプチドの、食品製造における病原性の及び望ましくない叢に対する活性剤としての利用にも関係する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ラクトバチルス・サケイ２５１２から誘導されるサカシンＧという名称のバクテリオシンであることを特徴とする単離されたポリペプチド。
【請求項２】
クラスＩＩａバクテリオシンである、請求項１に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項３】
配列 ＩＤ Ｎｏ．２及び／又は配列 ＩＤ Ｎｏ．４を含むことを特徴とする単離されたポリペプチド。
【請求項４】
配列 ＩＤ Ｎｏ．１２を含むことを特徴とする単離されたポリペプチド。
【請求項５】
請求項１〜４の何れか一つに記載のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸。
【請求項６】
配列 ＩＤ Ｎｏ．１及び／又は配列 ＩＤ Ｎｏ．３を含む、請求項５に記載の核酸。
【請求項７】
核酸配列 ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１５を含む、請求項５又は６に記載の核酸。
【請求項８】
核酸配列 ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．９を含む、請求項５又は６に記載の核酸。
【請求項９】
配列 ＩＤ Ｎｏ．６を含むことを特徴とする単離されたポリペプチド。
【請求項１０】
配列 ＩＤ Ｎｏ．８を含むことを特徴とする単離されたポリペプチド。
【請求項１１】
配列 ＩＤ Ｎｏ．１４を含むことを特徴とする単離されたポリペプチド。
【請求項１２】
配列 ＩＤ Ｎｏ．５を含む核酸。
【請求項１３】
配列 ＩＤ Ｎｏ．７を含む核酸。
【請求項１４】
配列 ＩＤ Ｎｏ．１３を含む核酸。
【請求項１５】
請求項５〜８、１２又は１４の何れか一つに記載の核酸を含むクローニングベクター及び／又は発現ベクター。
【請求項１６】
請求項１５に記載のベクターによりトランスフォームされた宿主細胞。
【請求項１７】
群ラクトコッカス、ラクトバチルス、リューコノストック、ストレプトコッカス、ペディオコッカス、エシェリキアから選択する微生物であるか又は酵母である、請求項１６に記載の宿主細胞。
【請求項１８】
組換えポリペプチドを製造する方法であって、請求項５〜８及び１２又は１４の何れか一つに記載の核酸を含むベクターを宿主細胞にトランスファーし、それを、請求項１〜４及び９〜１１の何れか一つに記載のポリペプチドの又は請求項５〜８及び１２若しくは１４の何れか一つに規定した核酸配列によりコードされるポリペプチドの発現を可能にする条件下で培養する当該方法。
【請求項１９】
請求項１〜４の何れか一つに記載のポリペプチドの、食品の製造における病原性又は望ましくない叢に対する活性剤としての利用。
【請求項２０】
前記のポリペプチドを用いて、食品におけるリステリアの特にリステリア・モノサイトゲネスの成長及び増殖を阻止する、請求項１９に記載の利用。
【請求項２１】
前記のポリペプチドが、食品中でラクトバチルス・サケイ２５１２株から生成される、請求項１９又は２０に記載の利用。
【請求項２２】
ラクトバチルス・サケイ２５１２株の食品における利用であって、請求項１〜４の何れか一つに記載のバクテリオシンポリペプチドを食品中で生成させる当該利用。
【請求項２３】
請求項１〜４の何れか一つに記載の少なくとも一種のポリペプチド又はラクトバチルス・サケイ２５１２株を含むことを特徴とするバクテリオシン組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、ラクトバチルス・サケイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｋｅｉ）（特に、ラクトバチルス・サケイ２５１２）のバクテリオシン、そのバクテリオシンをコードするヌクレオチド配列、及びそのバクテリオシンの、食品の製造における病原性の又は有害な叢に対する活性剤としての工業的利用に関係する。
【０００２】
乳酸細菌は、食品の発酵において、食品の味及びきめを改善するためだけでなく、特に、それらの貯蔵寿命を延長させるために集中的に利用される。事実、多くの乳酸細菌は、ペプチド分子を含む拮抗性分子の排出のおかげで、リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）などの病原性株を含むある種のグラム陽性細菌の成長を阻害することができる。それ故、これらのペプチド化合物（バクテリオシンと呼ばれる）は、発酵食品の保存のために、品質及び健康に関して、潜在的価値を有している。
【０００３】
かかるバクテリオシンの例として、抗リステリアバクテリオシン、クラスＩＩａのバクテリオシン（Ｅｎｎａｈａｒ Ｓ．等、２０００， ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．， ２４：８５−１０６）及びシスチビオチックバクテリオシン（Ｊａｃｋ Ｒ．等、１９９５， Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．， ５９（２）：１７１−２００）と呼ばれるポリペプチドのサブクラスを形成するものを特に挙げることができる。これらのクラスＩＩａバクテリオシンの一つ、ダイバーシンＶ４１の、スモークサーモンにおけるリステリア・モノサイトゲネスの増殖を防止する潜在的な用途が、最近、記載された（Ｄｕｆｆｅｓ Ｆ．等、１９９９， Ｊ．Ｆｏｏｄ Ｐｒｏｔ．， ６２（１２）：１３９４−１４０３）。
【０００４】
これらのポリペプチドの配列は、Ｎ末端部分における強い類似性を示す（特に、ジスルフィド橋の存在時）。その疎水性Ｃ末端部分は、ずっと変化し易いが、それらのバクテリオシンの幾つか（いわゆるペディオシン型バクテリオシンの、ペディオシンＰＡ−１、エンテロシンＡ及びダイバーシンＶ４１）は、４０より多い残基数及びＣ末端側の第二のジスルフィド橋の存在により特徴付けられる。
【０００５】
本発明の著者は、ラクトバチルス・サケイの特定の株により生成される新規なクラスＩＩａバクテリオシンを発見したが、これは、リステリアの成長、特に、リステリア・モノサイトゲネスの成長の阻止に特に有効であることが分かった。
【０００６】
Ｔａｇｇ Ｊ．Ｒ．等、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．Ｒｅｖ．， ４０：７２２−７５６（１９７６）と一致して、この発明の範囲内で、用語「バクテリオシン」は、他の細菌の成長を特異的に阻害することのできる微生物からリボソーム合成により生成されたポリペプチドをいう。
【０００７】
それ故、本発明は、第一に、ラクトバチルス・サケイ２５１２株から誘導されるバクテリオシン活性を有するポリペプチドに関係する。
【０００８】
ラクトバチルス・サケイ２５１２株を、２０００年５月２５日に、Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｎａｔｉｏｎａｌｅ ｄｅｓ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ ｄｅ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ （Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ）に寄託し、寄託番号Ｉ−２４７９で登録された。
【０００９】
本発明が関係するバクテリオシンは、サカシンＧと命名された。それは、質量分析により測定して３７００〜３９００のオーダーの好ましくは約３８３４Ｄａの分子質量を有するポリペプチドである。それは、クラスＩＩａのバクテリオシンと非常に類似した細菌阻止スペクトルを有する。従って、ラクトバチルス・サケイ２５１２以外のラクトバチルス・サケイ株、ペディオコッカス・セレビシエ（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、リステリア株の全体、及びエンテロコッカス・ファエカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）及びエンテロコッカス・デュランス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｄｕｒａｎｓ）に対して特に有効であることが分かっている。対照的に、それは、ラクトバチルスの他の種例えばラクトバチルス・デブルエキイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｂｒｕｅｃｋｉｉ）、ラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）、ラクトバチルス・ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ）、ラクトバチルス・カゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ）及びエンテロコッカス・ファエシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ）のある株に対して不活性であることが分かっている。
【００１０】
ペディオシン型の抗リステリアバクテリオシンと同様に、サカシンＧは、有利に、２つのジスルフィド橋をそのペプチド構造中に有している。
【００１１】
幾つかのクラスＩＩａバクテリオシンの遺伝的決定基の分析は、それらの生成、輸送及び免疫に関与する遺伝子が一つ以上のオペロン型構造に編成されていることを示している。これらのオペロンは、しばしば、プラスミド内に位置され、一般に、ＡＢＣ輸送体及びアクセサリータンパク質に相同なタンパク質（おそらく、バクテリオシンの輸出に関係している）をコードする少なくとも２つの遺伝子を有する。
【００１２】
サカシンＧ遺伝子を含むヌクレオチド断片のクローニングは、３つの完全なオープンリーディングフレームｓｋｇＡ１（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１）、ｓｋｇＡ２（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３）及びｓｋｇＤｃ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１３）（切り詰められたリーディングフレームｓｋｇＤ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．７）を含む）並びに切り詰められたフレームｓｋｇＩ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．５）の存在を示した（これらの図式表示を図１に示す）。このヌクレオチド断片は、二本鎖であり、その５’−３’一本鎖を配列 ＩＤ Ｎｏ．１５に示す。
【００１３】
遺伝子ｓｋｇＡ１及びｓｋｇＡ２の生成物（プレバクテリオシンと呼ばれる）は突然変異を受けうるが、それらの各リーダーペプチドは、該突然変異中に、残基１８と１９の間で開裂され、そうして、活性なサカシンＧ（残基１９〜５５）を遊離する。
【００１４】
ｓｋｇＡ１、ｓｋｇＡ２、ｓｋｇＤ及びｓｋｇＩを含む５’−３’一本鎖ヌクレオチド断片は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．９に現れる。
【００１５】
従って、本発明は又、バクテリオシンに対応する単離されたポリペプチドにも関係しており、それは、配列ＩＤ Ｎｏ．２及び／又は配列ＩＤ Ｎｏ．４を含むことを特徴とする。成熟バクテリオシンの配列は、配列ＩＤ Ｎｏ．１２に対応し且つ配列ＩＤ Ｎｏ．２及びＩＤ Ｎｏ．４に含まれる。
【００１６】
ｓｋｇＩと呼ばれるリーディングフレームは、５２残基のタンパク質をコードする。その配列とデータベースの配列との比較は、ＳｋｇＩといわゆる免疫タンパク質との間の強い類似性を示す。それは、おそらく、サカシンＧ産生細菌を防護する免疫タンパク質をコードするものである。
【００１７】
本発明は又、リーディングフレームｓｋｇＩに対応する配列ＩＤ Ｎｏ．６を含む単離されたポリペプチドにも及ぶ。
【００１８】
最後の遺伝子ｓｋｇＤｃに関して、それは、ＡＢＣ輸送体ファミリーの、特にペディオシンＰＡ−１の輸送体のタンパク質に相同なタンパク質をコードしている。この遺伝子ｓｋｇＤｃは、おそらく、サカシンＧに特異的なＡＢＣ輸送体をコードしている。
【００１９】
本発明は又、いわゆるｓｋｇＤ遺伝子に対応する配列ＩＤ Ｎｏ．８を含む単離されたポリペプチド及びいわゆるｓｋｇＤｃ遺伝子に対応する配列ＩＤ Ｎｏ．１４を含む単離されたポリペプチドにも及ぶ。
【００２０】
下記のように規定される相同配列も又、含まれるということは理解されよう
ｉ）配列ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２、Ｎｏ．４、Ｎｏ．６、Ｎｏ．８、Ｎｏ．１２若しくはＮｏ．１４の少なくとも７０％に類似している配列；又は
ｉｉ）以下で規定する相同核酸配列によりコードされる配列（即ち、配列ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１、Ｎｏ．３、Ｎｏ．５、Ｎｏ．７、Ｎｏ．９、Ｎｏ．１３若しくはＮｏ．１５（又は、これらの相補性配列）と厳しいハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする核酸配列）。
【００２１】
用語「類似の」は、比較している相同な配列のアミノ酸の間での完全な類似性又は同一性をもいうが、不完全な類似性をもいい、それは、類似性として言及される。ポリペプチド配列中の類似性に対するこの検索は、同じクラスのアミノ酸の置換、例えば非帯電側鎖のアミノ酸（例えば、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン及びチロシン）、塩基性側鎖のアミノ酸（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖のアミノ酸（例えば、アスパラギン酸及びグルタミン酸）；非極性側鎖のアミノ酸（例えば、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン及びシステイン）におけるアミノ酸置換である保存的置換を考慮に入れる。
【００２２】
それ故、より一般的に、「相同アミノ酸配列」は、改変が単離されたポリペプチド（特に、サカシンＧ）の生物学的活性に有意の影響を与えない位置での、少数のアミノ酸の置換、欠失及び／又は挿入により、特に、天然アミノ酸の非天然アミノ酸又は擬似アミノ酸による置換によって、配列ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２、Ｎｏ．４、Ｎｏ．６、Ｎｏ．８、Ｎｏ．１２又はＮｏ．１４と異なる任意のアミノ酸配列として理解される。
【００２３】
かかる相同アミノ酸配列は、好ましくは、配列ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２、Ｎｏ．４、Ｎｏ．６、Ｎｏ．８、Ｎｏ．１２又はＮｏ．１４の少なくとも８５％に、好ましくは少なくとも９５％類似している。
【００２４】
相同性は、一般に、配列分析用ソフトウェア（例えば、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ， ウィスコンシン５３７０５、Ｍａｄｉｓｏｎ， Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ａｖｅｎｕｅ １７１０在、ユニバーシティー オブ ウィスコンシン バイオテクノロジー センター）を利用して測定される。最高度の相同性（即ち、上記の同一性又は類似性）を得るために、類似のアミノ酸配列を整列させる。その目的のためには、配列に人為的にギャップを導入することが必要でありうる。一度最適なアラインメントが達成されれば、比較する２つの配列のアミノ酸が同一であるすべての位置を記録することによって、位置の総数に対する相同性の程度が確立される。
【００２５】
単離されたポリペプチド（特に、サカシンＧ）の生物学的活性は、望ましくない及び／又は病原性の細菌株好ましくはリステリア属の細菌（特に、リステリア・モノサイトゲネス）の成長を阻止するその能力をいう。
【００２６】
本発明は又、上記のポリペプチドをコードする単離された核酸にも関係する。
【００２７】
一層正確には、本発明は、配列ＩＤ Ｎｏ．１及び／又は配列ＩＤ Ｎｏ．３を含む単離された核酸に関係する。
【００２８】
サカシンＧ（３０５５ｂｐ）の発現に関与する領域の完全なヌクレオチド配列は決定されている。それは、二本鎖ＤＮＡであり、その５’−３’鎖を、配列 ＩＤ Ｎｏ．１５に示す。３’−５’鎖は、図２に示してある。本発明は又、かかる配列を含む核酸にも関係する。
【００２９】
上記のように、この配列は、３つの完全なオープンリーディングフレームｓｋｇＡ１、ｓｋｇＡ２及びｓｋｇＤｃ並びに切り詰められたフレームｓｋｇＩを有する。仮定される遺伝子ｓｋｇＡ１（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１）、ｓｋｇＡ２（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３）及びｓｋｇＩ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．５）は、その中で、ｓｋｇＤｃ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１３）と反対方向を向いている。
【００３０】
本発明の範囲内において、配列ＩＤ Ｎｏ．５を含む核酸、配列ＩＤ Ｎｏ．１３を含む核酸及び配列ＩＤ Ｎｏ．７を含む核酸も又、請求される。
【００３１】
以下のように定義される相同配列も又含まれるということは理解されよう：
ｉ）配列ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１、Ｎｏ．３、Ｎｏ．５、Ｎｏ．７、Ｎｏ．９、Ｎｏ．１３若しくはＮｏ．１５の少なくとも７０％と類似する配列；又は
ｉｉ）配列ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１、Ｎｏ．３、Ｎｏ．５、Ｎｏ．７、Ｎｏ．９、Ｎｏ．１３若しくはＮｏ．１５又はそれらの相補性配列と厳しいハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする配列；又は
ｉｉｉ）上記のサカシンＧという名称のポリペプチドをコードする配列。
【００３２】
この発明による相同なヌクレオチド配列は、好ましくは、配列ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１、Ｎｏ．３、Ｎｏ．５、Ｎｏ．７、Ｎｏ．９、Ｎｏ．１３若しくはＮｏ．１５の少なくとも７５％に類似し、好ましくは、少なくとも８５％又は少なくとも９０％に類似する。
【００３３】
かかる相同なヌクレオチド配列は、好ましくは、配列ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１、Ｎｏ．３、Ｎｏ．５、Ｎｏ．７、Ｎｏ．９、Ｎｏ．１３若しくはＮｏ．１５の相補性配列と厳しい条件下で特異的にハイブリダイズする。緊縮条件を規定するパラメーターは、対になった鎖の５０％が分離する温度（Ｔｍ）に依存する。
【００３４】
３０塩基より多くを含む配列について、Ｔｍは、下記の方程式（Ｓａｍｂｒｏｏｋ等、１９８９， ＮＹ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）によって規定される：
【数１】
Ｔｍ＝８１．５＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）＋１６．６Ｌｏｇ（カチオン濃度）−０．６３（ホルムアミド％）−（６００／塩基数）
【００３５】
３０塩基より短い長さを有する配列に関して、Ｔｍは、下記の方程式により規定される：
【数２】
Ｔｍ＝４（Ｇ＋Ｃ）＋２（Ａ＋Ｔ）
【００３６】
非特異的な配列がハイブリダイズしない適当な緊縮条件下で、ハイブリダイゼーション温度は、好ましくは、Ｔｍより５〜１０℃低温であってよく且つ用いるハイブリダイゼーション用緩衝液は、好ましくは、高イオン強度の溶液（例えば、６×ＳＳＣ溶液）である。
【００３７】
上で用いた表現「類似の配列」は、比較するヌクレオチド間での完全な類似性又は同一性をいうが、不完全な類似性（これは、類似性と呼ばれる）をもいう。この核酸配列における類似性の検索は、例えば、プリンとピリミジンを区別する。
【００３８】
それ故、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１、Ｎｏ．３、Ｎｏ．５、Ｎｏ．７、Ｎｏ．９、Ｎｏ．１３若しくはＮｏ．１５に示したオープンリーディングフレームを有する相同性ヌクレオチド配列は、配列ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１、Ｎｏ．３、Ｎｏ．５、Ｎｏ．７、Ｎｏ．９、Ｎｏ．１３若しくはＮｏ．１５から少なくとも１塩基の突然変異、挿入、欠失又は置換により又は遺伝コードの縮重によって異なっている任意のヌクレオチド配列を包含する（それが、サカシンＧの生物学的活性を有するポリペプチドをコードする限りにおいて）。
【００３９】
かかる相同な配列は、サカシンＧをコードするラクトバチルス属以外の細菌の遺伝子の配列を含む。
【００４０】
本発明のポリペプチドは、当業者に公知の任意の方法によって合成することができる。この発明のポリペプチドは、例えば、純度、抗原特異性、望ましくない二次生成物のないこと及び製造の容易さの理由で有利な合成化学例えばメリーフィールド型合成の技術によって合成することができる。
【００４１】
本発明は又、組換えポリペプチドの製造方法にも関係し、該方法においては、本発明による核酸を含むベクターを、宿主細胞にトランスファーし、それを、本発明によるポリペプチド又は本発明による核酸配列によりコードされるポリペプチドの発現を許す条件下で培養する。
【００４２】
組換えバクテリオシンは又、この発明によるヌクレオチド配列好ましくは配列ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１及び／若しくはＮｏ．３又は相同配列を含む核酸を含むベクターを宿主細胞にトランスファーし、該細胞を対応するポリペプチドの発現を許す条件下で培養する方法によって製造することもできる。その結果生成したタンパク質を、次いで、回収して精製することができる。用いる精製方法は、当業者には公知である。その結果生成した組換えポリペプチドを、溶解物及び細胞抽出物から出発して、培養培地の上清から出発して、個別に用いられ又は組合せて用いられる方法例えば分画、クロマトグラフィー法、特異的モノクローナル若しくはポリクローナル抗体の助成を伴う免疫アフィニティー技術などによって精製することができる。
【００４３】
サカシンＧをコードする関心ある核酸配列を、発現ベクターに挿入して、その発現の調節を可能にするエレメント例えばプロモーター、アクチベーター及び／又は転写ターミネーターに機能的仕方で結合させることができる。これらのヌクレオチド配列の発現を制御するシグナル（プロモーター、アクチベーター、ターミネーター配列など）は、用いる宿主細胞に依って選択する。その目的のために、この発明によるヌクレオチド配列を、選択した宿主中で自律的に複製するベクター又は選択した宿主に組み込まれるベクターに挿入することができる。かかるベクターは、当業者に慣用されている方法によって調製され、それから生成されたクローンを標準的な方法例えばエレクトロポレーション又はリン酸カルシウム沈殿によって適当な宿主に導入することができる。
【００４４】
この発明により規定されるヌクレオチド配列を含む上記のようなクローニング及び／又は発現ベクターも又、本発明の部分を形成する。
【００４５】
この発明は又、それらの発現ベクターによって、一時的に又は永久にトランスフォームされた宿主細胞にも関係する。これらの細胞は、宿主細胞好ましくは原核生物宿主細胞中へ、上記のベクターに挿入されたヌクレオチド配列を導入してから該細胞を複製及び／又はトランスファーされたヌクレオチド配列の発現を許す条件下で培養することによって得ることができる。
【００４６】
宿主細胞の例には、特に、ラクトコッカス、ラクトバチルス、リューコノストック、ストレプトコッカス、ペディオコッカス、エシェリキアなどの細菌及び酵母が含まれる。
【００４７】
この発明のヌクレオチド配列は、合成又は天然起源であってよい。それらは、配列ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１、Ｎｏ．３、Ｎｏ．５、Ｎｏ．７、Ｎｏ．９、Ｎｏ．１３及び／又はＮｏ．１５に基づいて生成したプローブを用いる配列ライブラリーのスクリーニングによって得られるＤＮＡ又はＲＮＡ配列であってよい。かかるライブラリーは、当業者に公知の慣用の分子生物学の技術によって調製することができる。
【００４８】
この発明によるヌクレオチド配列は又、化学合成により製造することもできるし、或はライブラリーのスクリーニングによって得られた配列の化学的又は酵素的な改変を含む混合した方法によって製造することもできる。
【００４９】
本発明は、環境（食品環境であってもなくてもよく、リステリア・モノサイトゲネスによる汚染を受けやすい環境）におけるリステリア特にリステリア・モノサイトゲネスの成長を阻止する方法にも関係する。
【００５０】
リステリア・モノサイトゲネスは、ヒト及び動物の重い病気の原因であって、特に、汚染食物（特に、肉、肉製品、海産物製品、ミルク及び乳製品）によって容易に伝染しうる病原性微生物である。それ故、本発明は、リステリア・モノサイトゲネスを汚染物として含んでいそうな食品におけるリステリア・モノサイトゲネスの成長を阻止する方法を提供するが、かかる方法は、この発明によるポリペプチドの、リステリア・モノサイトゲネスの成長を阻止するのに十分な量での、食品への添加を含む。
【００５１】
この発明によるバクテリオシンは、好ましくは、任意の食品システムにおいて、食品１グラム当たり１〜１００，０００任意単位（ＡＵ）のバクテリオシンの量で利用する。
【００５２】
バクテリオシンの１ＡＵは、寒天培地上で、グラム陽性細菌の対照株と比較して、規定の成長阻止域へと導く５μｌの培養上清の最大希釈物として定義される。
【００５３】
食品が最もリステリア・モノサイトゲネス汚染に影響されるが、獣医学用品及び医学用品も又、この種の細菌に汚染されうるし、化粧品なども汚染されうる。
【００５４】
それ故、本発明によるバクテリオシン（特に、サカシンＧ）は、かかる製品におけるこの種の病原体の成長を阻止するために利用することができる。
【００５５】
従って、本発明は、本発明によるバクテリオシンの、病原性の又は望ましくない叢（特に、食品製造における）に対する活性剤として、一層正確にはリステリア特にリステリア・モノサイトゲネスの食品における成長及び増殖を阻止するための活性剤としての利用に関係する。
【００５６】
このポリペプチドは、このように、問題の食品に混合することができ、或は、それは、ラクトバチルス・サケイ２５１２から食品中で生成されうる。
【００５７】
従って、本発明は、ラクトバチルス・サケイ２５１２株の食品においてこの発明によるバクテリオシンポリペプチドを生成するための利用にも関係する。
【００５８】
この発明は又、バクテリオシン組成物にも関係し、少なくとも一種の本発明による（即ち、ラクトバチルス・サケイ２５１２株から誘導される）ポリペプチドを含むか又はＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２若しくはＮｏ．４若しくはＮｏ．１２若しくはＮｏ．１４若しくはラクトバチルス・サケイ２５１２株を含むことを特徴とする。
【００５９】
この発明は又、リステリア特にリステリア・モノサイトゲネスの食品における成長及び増殖を阻止するために、ラクトバチルス・サケイ２５１２株の上記のポリペプチドを生成することを意図した利用及びその株を含む組成物にも及ぶ。
【００６０】
以下の説明及び図面は、例として与えるものであり、本発明の主題事項を制限するものではない。
【００６１】
材料と方法
・細菌株及び培養培地。ラクトバチルス・サケイ２５１２を、１１０℃で１２分間滅菌したＭＲＳ培地（ＤＩＦＣＯ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）３０℃で培養する。指標株を、ＢＨＩ培地（脳心臓滲出液；ＤＩＦＣＯ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）中で３７℃で培養する。
【００６２】
・活性試験。１０ｇ／ｌ 寒天を補ったＢＨＩ培地に、指標株の予備培養物を、定常期に１％で接種してから、ペトリ皿に注入する。５０マイクロリットルのサカシンＧ溶液をホールパンチを用いて冷却寒天中に形成したウェル中に入れる。バクテリオシンの活性は、一晩３７℃でインキュベートした後のウェル周囲の阻止域の出現において自身を明示する。
【００６３】
・タンパク質分析。サカシンＧを、イオンスプレーイオン化源を備えた Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ｓｃｉｅｘ ＡＰＩ１６５装置を用いる質量分析によって分析する。凍結乾燥後に、活性なＨＰＬＣ画分を、０．１％ 蟻酸を含むアセトニトリル／水溶液（１：１）中に採り、次いで、５μｌ／分の速度の点滴により注入する。
【００６４】
タンパク質濃度は、ビシンコニン酸法により、ＢＣＡキット（ｓｉｇｍａ）を製造業者の指示に従って用いて測定する。
【００６５】
タンパク質配列の比較は、ＢＬＡＳＴ（１）プログラム（Ｓｗｉｓｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ の ＥｘＰＡＳｙサーバーから入手できる）を用いて行なう。
【００６６】
・分子クローニング及びトランスフォーメーション。プラスミドを、大腸菌及びラクトバチルス・サケイ２５１２株から、以前に Ｓａｍｂｒｏｏｋ等、１９８９， ＮＹ： Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ並びにＭｕｒｉａｎａ及びＫｌａｅｎｈａｍｍｅｒ， １９８７， Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，５３：５５３−５６０によりそれぞれ記載された方法に従って抽出して精製する。
【００６７】
ＤＮＡ制限酵素及び改変酵素は、供給者（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）の指示に従って用いる。分析用及び調製用のアガロースゲル電気泳動を、Ｓａｍｂｒｏｏｋ等、１９８９， ＮＹ： Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ に記載された方法に従って、トリス／ホウ酸／ＥＤＴＡ緩衝液（ｐＨ８．３）中で行なう。消化されたＤＮＡ断片を、アガロースゲルから出発して「Ｐｒｅｐ−ａ−Ｇｅｎｅ」キット（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いて精製する。プラスミドｐＧＥＭ−Ｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ）及びｐＺＥＲＯ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中でのクローニングを、供給者の勧めに従って行なう。サザーン型のトランスファーを、Ｓａｍｂｒｏｏｋ等、１９８９， ＮＹ： Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ に従って、ナイロン膜（Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ＋、Ａｍｅｒｓｈａｍ）上で行なう。トランスファー後に、「ランダムプライマーＤＮＡラベリングシステム」キット（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）の助成により３２Ｐ標識により得られた放射性プローブを用いてハイブリダイゼーションを行なう。大腸菌は、Ｈａｎａｈａｎ， １９８３、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１６６：５５７−５８０の方法により、コンピテントにしてトランスフォームする。
【００６８】
Ｔａｑポリメラーゼ（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）は、供給者の勧めに従って用いる。サカシンＧをコードするＤＮＡ断片の増幅を、次の条件下で、「Ｇｅｎｅａｍｐ ９７００（登録商標）」装置（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）の助成で行なった：３５変性サイクル（９４℃、３０秒）、ハイブリダイゼーション（４５℃、３０秒）及び伸長（７２℃、１分間）、及びその後の更なる伸長サイクル（７２℃、５分間）。
【００６９】
サカシンＧ遺伝子座を運ぶＤＮＡ断片を、ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ３１０（登録商標）自動化シーケンサーの助成により、「Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ」配列決定用キット（Ｂｉｇ−ｄｙｅ ターミネーター（登録商標））及び適当なヌクレオチドプライマーを用いて配列決定する。
【００７０】
実施例１：
サカシンＧの単離及び精製
ラクトバチルス・サケイ２５１２（１００ｍｌ）の１６時間培養物を、６０００ｇで１５分間遠心分離する。次いで、培養上清を７０℃で２０分間加熱する。冷却した上清を、次いで、１容の水で希釈し（希釈した溶液のｐＨは、６未満でなければならないが、必要であれば、１Ｍ ＨＣｌの添加により６未満にする）、その後、水で平衡化したカチオン交換樹脂（カルボキシメチルセルロース；セルフィンＣ−２００、Ａｍｉｃｏｎ）を含むカラムを通過させる。引き続き水（１００ｍｌ）で洗ってから０．１Ｍ ＮａＣｌ溶液（１５０ｍｌ）で洗った後に、サカシンＧを０．５Ｍ ＮａＣｌ溶液（２００ｍｌ）で溶出させる。すべての溶液のｐＨは、６未満でなければならない。次いで、活性な画分を、水で平衡化した固相抽出カートリッジ（Ｓｅｐ−ｐａｋ ｐｌｕｓ Ｃ１８、Ｗａｔｅｒｓ）に入れる。０、１０、２０及び３０％アセトニトリルを含む２０ｍＭ 酢酸アンモニウム溶液５ｍｌで引き続き洗った後、サカシンＧを、８０％ アセトニトリルを含む２０ｍＭ 酢酸アンモニウムの１０ｍｌで溶出させる。凍結乾燥後に、抽出物を、４０％アセトニトリル水溶液の１ｍｌに溶解させてから、Ｃ８逆相分析用ＨＰＬＣカラム（Ｋｒｏｍａｓｉｌ、５μｍ、１００Å、４．６×２５０ｍｍ、Ａ．Ｉ．Ｔ．）に注入する。ＨＰＬＣを、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ ７８５Ａ 検出器に接続したＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒシリーズ２００ ＬＣポンプを含む装置にて実施した。吸着クロマトグラムを２２０ｎｍで記録する。分離を、次の勾配に従って、０．８ｍｌ／分の速度で行う：溶媒Ａ＝水／０．１％ トリフルオロ酢酸；溶媒Ｂ＝アセトニトリル／水／０．０７％ トリフルオロ酢酸。５分間２０％の溶媒Ｂで洗った後に、溶出を、１０分間で２０〜４０％の溶媒Ｂの勾配とその後の２０分間で４０〜５５％の溶媒Ｂの勾配によって行う。
【００７１】
２３分のピークに対応する画分が、リステリア・イバノビＢＵＧ４９６に対して活性であることが分かり、それを、「イオンスプレー」イオン化質量分析により分析した。この分子は、少なくとも９５％の純度であるらしく、３８３４．３２±０．３１Ｄａの分子質量を有する。そのように精製したサカシンＧの定量は、培養物１００ｍｌから１２０μｇと評価した。精製収率を、見出された活性の５５％と評価した。サカシンＧの一次配列の部分を、マイクロシーケンシングにより決定し、その配列から出発して２つの縮重オリゴヌクレオチドを確立した。
【００７２】
実施例２：
サカシンＧの生成に関与する遺伝子座のクローニング
逆遺伝学により、２つの縮重オリゴヌクレオチドＳａｋＧ０１（５’ ＡＡＲＴＡＴＴＡＴＧＧＮＡＡＹＧＧＮＧＴ ３’）（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１０）及びＳａｋＧ０２Ｓ（５’ ＡＣＡＴＧＡＴＧＮＣＣＮＣＣＲＴＴＮＧＣ ３’）（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１１）を、成熟サカシンＧ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１５）の構造遺伝子に対応するＤＮＡ断片をポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅するために選択した。そうして得られた増幅生成物（約１００ｂｐのサイズを有する）を、プラスミドｐＧＥＭ−Ｔ中にクローン化してプラスミドｐＪＭＢＹＣ０１を形成した。ｐＪＭＢＹＣ０１から誘導された５６０ｂｐの制限断片ＰｖｕＩＩ（挿入断片を含む）を、サザーン型トランスファーにおいて、ラクトバチルス・サケイ２５１２のゲノムにおける構造遺伝子の位置を確認するために、ハイブリダイゼーションプローブとして利用した。制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ及びＥｃｏＲＩにより消化したＬｂ．サケイ２５１２のプラスミド抽出物から出発して、このプローブは、それぞれ、約２．１及び９ｋｂｐのサイズを有する断片を明示した。２．１ｋｂｐのＨｉｎｄＩＩＩ断片を精製してから、プラスミドｐＪＭＢＹＣ０２を生成するためにベクターｐＺＥＲＯ２に挿入した。ｐＪＭＢＹＣ０２内のサカシンＧの構造遺伝子の存在が、プライマーＳａｋＧ０１及びＳａｋＧ０２を用いるＰＣＲ増幅とその後のｐＪＭＢＹＣ０２に挿入された断片のヌクレオチド配列決定により示された。同様のストラテジーを用いて、遺伝子ｓｋｇＤの完全な配列を決定した。Ｌｂ．サケイ２５１２のプラスミド抽出物をＸｂａＩにより消化した。その消化産物をプラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ＋に挿入した。関心ある配列を有するクローンを、プラスミドｐＪＭＢＹＣ０２にて、オリゴヌクレオチドＳａｋＧ０３（５’ ＣＣＴＴＧＧＴＣＡＧＧＣＴＡＴＣＧ ３’）（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１６）及びＳａｋＧ０４（５’ ＡＴＣＡＣＣＴＴＴＴＴＧＡＡＴＴＡＣＣＣ ３’）（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１７）の助成で実施するＰＣＲにより調製した放射性プローブによって明示した。
【００７３】
この領域（３０５１ｂｐ）の完全な分子配列の分析は、３つの完全なオープンリーディングフレームｓｋｇＡ１及びｓｋｇＡ２及びｓｋｇＤｃ並びに切り詰められたフレームｓｋｇＩの存在を明らかにした。仮定的遺伝子ｓｋｇＡ１、ｓｋｇＡ２及びｓｋｇＩは、ｓｋｇＤと反対向きである。
【００７４】
各オープンリーディングフレームには、潜在的なリボソーム結合部位が先行している。これらの遺伝子ｓｋｇＡ１及びｓｋｇＡ２は、共に、５５アミノ酸残基を有するタンパク質をコードしており、その配列１９〜５５は、完全に同一である。配列１９〜５２は、マイクロシーケンシングにより得られたサカシンＧの配列に対応する。９、１４及び２４位並びにＣ末端位置の４つのシステイン残基の存在に注意すべきである。その上、このペプチドの計算された分子質量３８３８．２Ｄａは、測定された分子質量（３８３４．３２Ｄａ）と４Ｄａだけ異なるが、サカシンＧ内の２つのジスルフィド橋の存在を示している（これは、既に、別の抗リステリアバクテリオシンについて示されている）。
【００７５】
タンパク質ＳｋｇＡ１及びＳｋｇＡ２の配列１〜１８は、３残基のみ異なり、クラスＩＩバクテリオシンの「リーダー」ペプチドと強い相同性を有しており、これらは、それらのペプチドの特異的なＡＢＣ輸送体による輸送に関係している。特に、末端ＧＧユニットは、それらのリーダー配列に特徴的であり、それらのバクテリオシンの成熟部位を構成する。遺伝子ｓｋｇＡ１及びｓｋｇＡ２のヌクレオチド配列の比較も又、成熟バクテリオシンをコードする遺伝子の部分について９５％を超える配列の同一性を示す。
【００７６】
ｓｋｇＩと呼ばれる不完全なオープンリーディングフレームは、５２残基のタンパク質をコードしている。その配列とデータベースの配列との比較は、ＳｋｇＩといわゆる免疫タンパク質のＬｃｃＩ及びＭｅｓＩとの間の強い相同性を示す。メセンテリシンＹ１０５に関する防護へのＭｅｓＩの関与は、示されてきた。ｓｋｇＩがサカシンＧ免疫タンパク質をコードすると仮定することができる。
【００７７】
最後の遺伝子ｓｋｇＤｃは、７２７アミノ酸のタンパク質をコードする。データベースによれば、ＳｋｇＤｃは、ＡＢＣ輸送体ファミリーのタンパク質と高度に相同性であり、特に、ペディオシンＰＡ−１の輸送体：ＰｅｄＤ又はＰａｐＤ（Ｍａｒｕｇｇ等、１９９２； Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ５８，２３６０−２３６７；Ｍｏｔｌａｇｈ等、１９９４， Ｌｅｔｔ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． １８，３０５−３１２）、サカシンＰの輸送体：ＳｐｐＴ（Ｈｕｈｎｅ等、１９９６， Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ １４２，１４３７−１４４８）、サカシンＡの輸送体：ＳａｐＴ（Ａｘｅｌｓｓｏｎ及びＨｏｌｃｋ， １９９５， Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １７７，２１２５−２１３７）及びメセンテリシンＹ１０５の輸送体：ＭｅｓＤ（Ｆｒｅｍａｕｘ等、１９９５， Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ １４１，１６３７−１６４５）と一層高度に相同性である。
【００７８】
実施例３：
阻害スペクトル。
１７の細菌株のサカシンＧ感受性を、ウェル試験法（材料と方法参照）によって試験した。結果を下記の表１に示す：
【００７９】
【表１】
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このバクテリオシンの阻害スペクトルは、極めて狭く、乳酸細菌については、ラクトバチルス・サケイとペディオコッカス・セレビシエに限られている。他のクラスＩＩａバクテリオシンと同様に、このペプチドは、試験したすべてのリステリア株並びにエンテロコッカス・ファエカリス及びエンテロコッカス・デュランスに対して活性であるが、エンテロコッカス・ファエシウムに対しては活性でないらしい。
【図面の簡単な説明】
【図１】
サカシンＧの生成に関係する遺伝子座を図式表示した図である。
【図２】
サカシンＧの発現に関係する領域の完全なヌクレオチド配列に対応する相補的３’−５’鎖を示した図である（５’−３’鎖は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１５に示してある）。
【図１】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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