(57)【要約】本発明は、体液に接触する接触表面のための生物活性被覆組成物、方法および機器を提供する。該被覆は式ＩＩの複合体を含む。式中のＲ１はＣ１−１８アルキルまたはＣ６−３２アリール基であり、Ｒ２はそれぞれ独立に、Ｃ１−１８アルキルおよびＣ６−３２から成る群から選択され、Ｒ３はＮまたはＯであり、ｎは１から１０の数であり、かつｘは１から約３０の数で、ヘパリン活性分子に直接、共有結合によって結合しており、１つ以上の生物活性分子がヘパリン分子に結合している。生物活性分子はフィブロネクチンなどの接着分子、塩基性線維芽細胞増殖因子などの増殖因子、または他の任意の、任意のメカニズムによって、ヘパリン活性分子に結合する生物活性分子であり得る。
2004505124.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
医療用機器の接触表面のための被覆組成物であって、式１の分子を含み：
【化１】
2004505124.tif 000014
ここで、
Ｒ１はＣ１−１８のアルキルまたはＣ６−３２のアリール基であり、
各Ｒ２は独立にＣ１−１８のアルキルとＣ６−３２のアリールから成る群から選択され、
Ｒ３はＮまたはＯであり、
ｎは１から１０の数であり、かつ
ｘは１から約３０の数であり、
前記分子は共有結合によってヘパリン活性分子に結合し、それによってシリル−ヘパリン共有結合複合体を形成し、生物活性分子が該ヘパリン活性分子に直接結合している組成物。
【請求項２】
該シリル−ヘパリン共有結合複合体が疎水性結合相互作用によって接触表面に結合する請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
該シリル−ヘパリン共有結合複合体がｎとｘの値によって決まる該接触表面からの解離速度を持つ請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
該ヘパリン活性分子がヘパリン、ヘパラン硫酸、ヒアルロン酸、デキストラン、デキストラン硫酸、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、または、Ｄ−グルコサミンおよびＬ−イズロン酸またはＤ−グルクロン酸のいずれかとの反復単位で構成された様々に硫酸化された多糖類鎖の混合物、任意の前記のものの塩および任意の前記のものの誘導体を含む分子である請求項２に記載の組成物。
【請求項５】
前記生物活性分子が接着分子、増殖因子分子または治療的分子である請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
前記生物活性分子が親和性複合化によってヘパリン活性分子に直接結合している請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
該シリル−ヘパリン共有結合複合体が［ベンジル−ビス（ジメチルシリルメチル）］−（Ｎ−ヘパリニル）−カルバメートまたは［ベンジル−トリス（ジメチルシリルメチル）］−（Ｎ−ヘパリニル）−カルバメートを含む請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
該接着分子がフィブロネクチン、ラミニン、ビトロネクチン、トロンボスポンジン、ゼラチン、ポリリジン、ポリオルニチン、接着性配列とヘパリン結合配列を含有するペプチドポリマー、硫酸化複合炭水化物、デキストラン硫酸、増殖ホルモン、サイトカイン、レクチン、またはそれらのペプチドポリマーである請求項５に記載の組成物。
【請求項９】
該増殖因子分子が線維芽細胞増殖因子、血小板誘導増殖因子、血管内皮増殖因子、肝細胞増殖因子、胎盤増殖因子、インスリン様増殖因子、神経増殖因子およびニューロトロフィン、ヘパリン結合内皮増殖因子、形質転換増殖因子−β、骨形態形成たんぱく質２、造骨たんぱく質１またはケラチノサイト増殖因子である請求項５に記載の組成物。
【請求項１０】
体液に接触するための少なくとも１つの接触表面を有する医療用機器であって、該表面が式１の分子を含む被覆組成物で被覆されており：
【化２】
2004505124.tif 000015
ここで、
Ｒ１はＣ１−１８のアルキルまたはＣ６−３２のアリール基であり、
各Ｒ２は独立にＣ１−１８のアルキルとＣ６−３２のアリールから成る群から選択され、
Ｒ３はＮまたはＯであり、
ｎは１から１０の数であり、かつ
ｘは１から約３０の数であり、
前記分子は共有結合によってヘパリン活性分子に直接結合し、それによってシリル−ヘパリン共有結合複合体を形成し、生物活性分子が該ヘパリン活性分子に直接結合している医療用機器。
【請求項１１】
該シリル−ヘパリン共有結合複合体が疎水性結合相互作用によって接触表面に結合する請求項１０に記載の機器。
【請求項１２】
該シリル−ヘパリン共有結合複合体がｎとｘの値によって決まる該接触表面からの解離速度を持つ請求項１０に記載の機器。
【請求項１３】
該ヘパリン活性分子がヘパリン、ヘパラン硫酸、ヒアルロン酸、デキストラン、デキストラン硫酸、コンドロチン硫酸、デルマタン硫酸、またはＤ−グルコサミンおよびＬ−イズロン酸またはＤ−グルクロン酸のいずれかとの反復単位で構成された様々に硫酸化された多糖類鎖の混合物、任意の前記のものの塩および任意の前記のものの誘導体を含む分子である請求項１０に記載の機器。
【請求項１４】
前記生物活性分子が接着分子、増殖因子分子または治療的分子である請求項１０に記載の機器。
【請求項１５】
前記生物活性分子が親和性複合化によってヘパリン活性分子に直接結合している請求項１０に記載の機器。
【請求項１６】
該シリル−ヘパリン共有結合複合体が［ベンジル−ビス（ジメチルシリルメチル）］−（Ｎ−ヘパリニル）−カルバメートまたは［ベンジル−トリス（ジメチルシリルメチル）］−（Ｎ−ヘパリニル）−カルバメートを含む請求項１０に記載の機器。
【請求項１７】
該接着分子がフィブロネクチン、ラミニン、ビトロネクチン、トロンボスポンジン、ゼラチン、ポリリジン、ポリオルニチン、接着性配列とヘパリン結合配列を含有するペプチドポリマー、硫酸化複合炭水化物、デキストラン硫酸、増殖ホルモン、サイトカイン、レクチン、またはそれらのペプチドポリマーである請求項１４に記載の機器。
【請求項１８】
該生物活性分子が接着分子であり、そのため接触表面が非トロンボゲン形成性であり、かつ細胞接着を促進する請求項１４に記載の機器。
【請求項１９】
該増殖因子分子が線維芽細胞増殖因子、血小板誘導増殖因子、血管内皮増殖因子、肝細胞増殖因子、胎盤増殖因子、インスリン様増殖因子、神経増殖因子およびニューロトロフィン、ヘパリン結合内皮増殖因子、形質転換増殖因子−β、骨形態形成たんぱく質２、造骨たんぱく質１またはケラチノサイト増殖因子である請求項１４に記載の機器。
【請求項２０】
該機器が血液ガス交換機器、血液フィルタ、人工血管、人工弁、人工装具、血液シャント、カテーテル、骨代替物、軟骨代替物、縫合糸、移植片、カテーテルまたは神経増殖ガイドである請求項１０に記載の機器。
【請求項２１】
医療用機器の接触表面を生物活性被覆組成物によって被覆する方法であって、
式１の疎水性シリル部分を準備するステップ、
【化３】
2004505124.tif 000016
ここで、
Ｒ１はＣ１−１８のアルキルまたはＣ６−３２のアリール基であり、
各Ｒ２は独立にＣ１−１８のアルキルとＣ６−３２のアリールから成る群から選択され、
Ｒ３はＮまたはＯであり、
ｎは１から１０の数であり、
前記シリル部分を共有結合によってヘパリン活性分子に結合させるステップ、
ここで、ｘは各ヘパリン活性分子に対して１から約３０の数であり、それによってシリル−ヘパリン複合体を形成し、
該シリル−ヘパリン複合体を疎水性相互作用によって接触表面に付着させるステップ、および
生物活性分子をヘパリン活性分子に付着させるステップ、
を含む方法。
【請求項２２】
該シリル−ヘパリン複合体がｎとｘの値によって決まる該接触表面からの解離速度をもつ請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
該ヘパリン活性分子がヘパリン、ヘパラン硫酸、ヒアルロン酸、デキストラン、デキストラン硫酸、コンドロチン硫酸、デルマタン硫酸、またはＤ−グルコサミンおよびＬ−イズロン酸またはＤ−グルクロン酸のいずれかとの反復単位で構成された様々に硫酸化された多糖類鎖の混合物、任意の前記のものの塩および任意の前記のものの誘導体を含む分子である請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
該生物活性分子が接着分子、増殖因子分子または治療的分子である請求項２１に記載の方法。
【請求項２５】
該生物活性分子が親和性複合化によってヘパリン活性分子に付着している請求項２１に記載の方法。
【請求項２６】
該シリル−ヘパリン複合体が［ベンジル−ビス（ジメチルシリルメチル）］−（Ｎ−ヘパリニル）−カルバメートまたは［ベンジル−トリス（ジメチルシリルメチル）］−（Ｎ−ヘパリニル）−カルバメートを含む請求項２１に記載の方法。
【請求項２７】
該接着分子がフィブロネクチン、ラミニン、ビトロネクチン、トロンボスポンジン、ゼラチン、ポリリジン、ポリオルニチン、接着性配列とヘパリン結合配列を含有するペプチドポリマー、硫酸化複合炭水化物、デキストラン硫酸、増殖ホルモン、サイトカイン、レクチン、またはそれらのペプチドポリマーである請求項２４に記載の方法。
【請求項２８】
該生物活性分子が接着分子であり、そのため接触表面が非トロンボゲン形成性であり、かつ細胞接着を促進する請求項２１に記載の方法。
【請求項２９】
該増殖因子分子が線維芽細胞増殖因子、血小板誘導増殖因子、血管内皮増殖因子、肝細胞増殖因子、胎盤増殖因子、インスリン様増殖因子、神経増殖因子およびニューロトロフィン、ヘパリン結合内皮増殖因子、形質転換増殖因子−β、骨形態形成たんぱく質２、造骨たんぱく質１またはケラチノサイト増殖因子である請求項２４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
関連出願のクロスリファレンス
本出願は、レイ・ツァンとシゲマサ・オサキの米国特許第５，９５５，５８８「非トロンボゲン形成被覆組成物および該組成物の使用方法」の継続特許出願である、１９９９年９月２０日に提出されたレイ・ツァンとシゲマサ・オサキの米国特許出願０９／３９９，１１９「非トロンボゲン形成被覆組成物および該組成物の使用方法」の部分継続出願である、２０００年６月３１日に提出されたポール・オー．ザモラ、レイ・ツァンおよびシゲマサ・オサキの米国特許出願０９／６２９．０５９「細胞接着組成物を調整するための両親媒性被覆および方法」の部分継続出願である。上記のそれぞれの明細書は、参照によってここに取り込む。
【０００２】
本発明は、被覆物、被覆組成物の使用方法、および医療用機器の被覆された表面に関する。ここで前記被覆物は、ヘパリンに結合した１個または複数の生物活性分子をもつシリル−ヘパリンを含み、前記生物活性分子は、細胞付着を促進するフィブロネクチンなどの接着分子、細胞増殖を促進する塩基性線維芽細胞増殖因子などの増殖因子分子、および他のさまざまな、１つまたは複数の治療目的に効果を与えるための治療的分子を含む。
【０００３】
【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】
以下の検討では著者（等）による幾つかの刊行物および刊行の年に言及していること、またある刊行物についてはその刊行の時期が最近であったため、本発明に対する先行技術であると考えるべきではないことを注記しておく。本特許出願中におけるかかる刊行物の検討は、背景をより完全にするためになされているのであり、かかる刊行物が特許性の判定目的のための先行技術であることを自認するものとみなすべきではない。
【０００４】
ヘパリンは肝臓および肺、および内皮細胞の管腔表面を含むさまざまな組織内に天然に存在する。ヘパリンは１，４−α連鎖内のＤ−グルクロン酸とＤ−グルコサミンの反復単位で構成されており、これら両方とも硫酸塩である。ヘパリンは抗凝血剤で、内皮細胞の表面上で線維素の蓄積を最小限に抑えることが報告されている。ヘパリンを非経口薬剤として投与すると抗トロンビンＩＩＩを活性化し、これはトロンビンを不活性化させ、最終的に全身的に線維素の形成を阻止する。
【０００５】
血液と接触する多数の医療用機器には、ヘパリンの耐血栓性の性質の利用を目指して、ヘパリンによる被覆が施されている。ステント、カテーテル、酸素供給器ファイバーおよび心臓バイパス回路は、ヘパリンの被覆が施されている医療用機器の例である（ニイミ他、Ａｎｅｓｔｈ Ａｎａｌｇ ８９： ５７３−８，１９９９；イヌイ他、Ａｒｔｉｆ． Ｏｒｇａｎｓ， ２３： １１０７−１２， １９９９）。ヘパリンを医療用ポリマー表面に付着させるためにさまざまな戦略が開発されている。このような戦略には、化学的抱合法（Ｓｉｅｆｅｒｔ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｂｉｏｍａｔｅｒ Ｓｃｉ Ｐｏｌｙｍ Ｅｄ， ７：２７７−８７， １９９５）、プラズマグロー放電法（Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ， ２１： １２１−３０， ２０００）、これら２つの方法の組み合わせ、および本特許出願に記述する疎水性相互作用（米国特許第５，９５５，５８８）が含まれる。
【０００６】
ヘパリンは、ヘパラン硫酸との類似性に関連した、他のいくつかの生物学的作用をもつ。細胞外マトリクス内で、細胞外マトリクス内で、ヘパリンおよびそれと化学的に関連しているヘパラン硫酸は複合化して足場になり、この足場に細胞が付着する。ヘパリンはまた、フィブロネクチンおよびその他の接着分子に結合する。更に、細胞外マトリクスのヘパラン硫酸とヘパリンはまた増殖因子のためのリザーバの働きをし、増殖因子に結合するだけでなく、また増殖因子をたんぱく質分解酵素による分解から守る。線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、血小板誘導増殖因子（ＰＤＧＦ）、および骨形態形成たんぱく質（ＢＭＰ）は、ヘパリンと複合化する増殖因子の例である。
【０００７】
ヘパリンは、接着分子および増殖因子に結合するこの能力があるので、細胞が付着し移動し得る表面を提供することによって、体内移植可能な医療用機器の表面を改善するためにヘパリン複合体を使用すべく、数多くの努力がなされている。他の研究者等は、細胞付着を増大させることを目標とした、フィブロネクチン、およびフィブロネクチンから誘導されたペプチドおよび擬似ペプチドの直接の被覆を研究してきた（ヴァルシェク他、Ｅｕｒ Ｊ Ｖａｓｃ Ｅｎｄｏｖａｓｃ Ｓｕｒｇ， １２： ３２１−３０， １９９６；Ｂｏｘｕｓ他、Ｊ Ｂｉｏｏｒｇ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ， ６： １５７７−９５， １９９８；Ｔｗｅｄｅｎ他、Ｊ． Ｈｅａｒｔ Ｖａｌｖｅ Ｄｉｓ．４ Ｓｕｐｐｌ １： Ｓ９０−７， １９９５）。例えば血管移植片は、内皮細胞の増殖を支援する表面によって改善されるであろう。現在のポリテトラフルオロエチレンとポリエチレンテレフタレートの血管移植片は内皮細胞の増殖を支援しないため、患者に対して長期的な抗血小板療法を行わなければならない。
【０００８】
フィブロネクチンは細胞表面上の特異的受容体と相互作用する接着性の、リガンド分子として機能する。フィブロネクチンに付着する細胞タイプには、線維芽細胞、内皮細胞、平滑筋細胞、骨芽細胞および軟骨細胞が含まれる。
【０００９】
他の研究者等は、ヘパリンおよびフィブロネクチン複合体を、ポリマー表面に細胞付着力を供給するために使用した。例えば、ヘパリンーアルブミン抱合体が二酸化炭素ガス・プラズマ処理されたポリスチレン上に固定され（Ｂｏｓ他、Ｊ． Ｂｉｏｍｅｄ Ｍａｔｅｒ Ｒｅｓ， ４７： ２７９−９１， １９９９）、フィブロネクチンと複合化された。これらの表面上のフィブロネクチンは、内皮細胞の付着力を増大させた。Ｂｏｓ他（Ｔｉｓｓｕｅ Ｅｎｇ ４： ２６７−７９， １９９８）は、内皮細胞が、アルブミン−ヘパリン抱合体で被覆された、ＣＯ２ガス・プラズマ処理されたポリスチレンと融合したことを報告している。イシハラ他（Ｊ Ｂｉｏｍｅｄ Ｍａｔｅｒ Ｒｅｓ． ５０： １４４−１５２， ２０００）は、ヘパリンと抱合化されたポリスチレンが線維芽細胞、平滑筋細胞および内皮細胞の細胞付着を促進したことを報告した。ヘパリンが抱合化したポリスチレン上で増殖した線維芽細胞は、フィブロネクチンで被覆された、ゼラチン被覆された、または組織培養処理された培地と少なくとも同等の増殖速度を示した。
【００１０】
フィブロネクチン、他の接着分子、増殖因子分子、および治療的分子、更にこれらの誘導体または類自体を効率的にヘパリン複合体に複合化させる簡単な方法は、細胞を、血管移植片、骨および軟骨のインプラント、神経ガイドなどを含む人工器官に付着させるために広く適用されるであろう。特に必要なのは、フィブロネクチン、ラミニンなどを含む多様な接着分子、およびＦＧＦを含む増殖因子分子を体内移植可能な医療用機器のための被覆の一部として使用することを可能にする方法と組成物である。
【００１１】
更に本技術分野では、細胞付着を促進する、更にその場合細胞付着を接着分子の量によって加減できる、また単純かつ簡単に、特殊な装備または技術なしに塗布することのできる、体内移植可能な医療用機器のための被覆組成物が必要とされている。
【００１２】
【課題を解決するための手段】
本発明の主要な目的は、体内移植可能な医療用機器の接触表面のための被覆組成物であって、疎水性相互作用によって接触表面に付着する、シリル−ヘパリン生物活性分子複合体を含んでいる組成物の提供である。
【００１３】
本発明のもう一つの目的は、体内移植可能な医療用機器の接触表面のための、細胞付着を促進する、両親媒性シリル−ヘパリン−フィブロネクチン被覆組成物の提供である。
【００１４】
本発明のもう一つの目的は、接着分子が存在しないときは被覆がフィブリンの堆積を阻止するが、被覆が接着分子を含有するときは被覆が細胞付着と細胞増殖を促進するように、その組成を変化させることのできる被覆の提供である。
【００１５】
本発明のもう一つの目的は、一つの実施形態においては本発明がシリル−ヘパリン増殖因子分子組成物を供給するが、もう一つの実施形態においては本発明がシリル−ヘパリン治療的分子組成物を供給するように、その組成を変化させることのできる被覆の提供である。
【００１６】
本発明のもう一つの目的は、フィブロネクチン、フィブロネクチン派生体、フィブロネクチンの擬似ペプチド、ラミニン、ビトロネクチン、トロンボスポンジン、ゼラチン、コラーゲンおよびその下位タイプ、ゼラチン、ポリリジン、ポリオルニチン、および他の接着分子あるいは他の接着分子の誘導体または擬似物質を用いた被覆組成物の提供である。
【００１７】
本発明のもう一つの目的は、線維芽細胞増殖因子、血小板誘導増殖因子、血管内皮増殖因子、肝細胞増殖因子、胎盤増殖因子、インスリン様増殖因子、神経増殖因子およびニューロトロフィン、ヘパリンに結合する表皮増殖因子、形質転換増殖因子−β、骨形態形成たんぱく質２、造骨たんぱく質１およびケラチノサイト増殖因子、および他の増殖因子分子あるいは他の増殖因子分子の誘導体または擬似物質を用いた被覆組成物の提供である。
【００１８】
本発明のもう一つの目的は、生分解性の医療用機器を含むポリマー医療用機器を、生物活性分子を含む被覆によって被覆するための、費用に対して効果の高い、商業的に適当な方法の提供である。
【００１９】
本発明のもう一つの目的は、生分解性の医療用機器を含むポリマー医療用機器を、シリル−ヘパリン生物活性分子組成物を含む被覆によって被覆するための、費用に対して効果の高い、商業的に適当な方法の提供である。
【００２０】
本発明の主要な利点は、複雑な形状と表面の医療機器の接触表面を被覆するための、選択された生物活性分子に応じて、望ましい生物学的効果または治療的効果を促進する、耐久性のある低コストの被覆を提供することである。
【００２１】
本発明のもう一つの利点は、接触表面からのシリル−ヘパリン生物活性分子複合体の解離速度を、部分的に、各シリル部分当たりのシリル単位の数、または各ヘパリン分子当たりのシリル部分の数、もしくはこれら両方を決定することによって決定する方法を提供することである。
【００２２】
本発明の他の目的、利点および新規な特性、および更なる適用範囲は、一部は以下の、添付の図面と関連して行う詳細な説明の中で述べるが、一部は当業者にとっては以下の記述を検査すれば明らかになり、または本発明の実施によって知ることができるであろう。本発明の目的および利点は、特に添付の特許請求の範囲の中で指摘されている手段および組み合わせによって実現し、獲得することができるであろう。
【００２３】
【発明の実施の形態】
発明実施の最良の態様
本発明は、シリル−ヘパリン生物活性分子複合体を含む生物活性被覆組成物、前記組成物の製法と使用法、および前記組成物を含む機器に関する。シリルは、式１の疎水性シリル部分を含んでいる：
【００２４】
【化４】
2004505124.tif 000003
【００２５】
ここで、Ｒ１はＣ１−１８のアルキルまたはＣ６−３２のアリール基であり、Ｒ２はそれぞれ独立に、Ｃ１−１８のアルキルおよびＣ６−３２のアリールからなる群から選択され、Ｒ３はＮまたはＯであり、ｎは１から１０の数である。Ｘは１から約３０の数で、１から約３０のシリル部分がヘパリン分子に共有結合している。１つまたは複数の、同一でも異なってもよい、生物活性分子がヘパリン分子に結合している。
【００２６】
一つの実施形態では、本発明は接着分子である生物活性分子を提供し、それによってフィブリンの蓄積を抑止し、かつ細胞付着を促進する両親媒性被覆を形成する。もう一つの実施形態では、本発明は増殖因子分子である生物活性分子を提供し、それによって、増殖因子分子を局所的にまたは局限して供給する被覆を形成する。更にもう一つの実施形態では、本発明は治療的分子である生物活性分子を提供し、それによって、治療的分子の局所的または局限的配送を提供する被覆を形成する。
【００２７】
もう一つの実施形態では、本発明はその接触表面が式Ｉの部分で被覆された医療用機器を提供する。前記部分はヘパリン分子と共有結合して、１つまたは複数の生物活性分子がそのヘパリン分子に結合している。本発明は更に、式Ｉの部分で被覆された医療用機器を提供する。前記部分はヘパリン分子と共有結合しているが、生物活性分子はそのヘパリンに結合しておらず、前記被覆はフィブリンの蓄積と細胞接着を阻止する。
【００２８】
もう一つの実施形態では、本発明は体内の表面細胞接着を促進する、フィブリン耐性をもつ医療用機器を提供する。前記機器は、血液、細胞、組織または他の流体と接触する表面をもつ。血液または細胞と接触する表面は、式Ｉの部分を含む被覆組成物によって被覆されており、前記部分はヘパリン分子と共有結合しており、フィブロネクチンを含むがこれに限定されない接着分子が親和性相互作用によってヘパリンと複合化している。
【００２９】
もう一つの態様では、本発明は式２の複合体を提供する：
【００３０】
【化５】
2004505124.tif 000004
【００３１】
ここでＲ１はＣ１−１８のアルキルまたはＣ６−３２のアリール基であり、Ｒ２はそれぞれ独立に、Ｃ１−１８のアルキルおよびＣ６−３２のアリールからなる群から選択され、Ｒ３はＮまたはＯであり、ｎは１から１０の数、ｘは１から約３０の数である。
【００３２】
本発明の、これらのおよびその他の態様は、後の本発明の説明と実施例の中で更に詳しく記述する。
【００３３】
他の定義がなされていない限り、本出願中に使用する全ての技術および科学用語は本技術分野における通常の意味をもつ。本出願中に使用する以下の用語は、下記の意味をもつ。
【００３４】
「アルキル」は、線形に枝を出した、または環状の、飽和または不飽和Ｃ１−１８の炭化水素であり、例えばメチル、エチル、エテニル、プロピル、プロペニル、イソ−プロピル、ブチル、イソ−ブチル、ｔ−ブチル、ペンチル、シクロペンチル、ヘキシル、シクロヘキシル、オクチルなどである。
【００３５】
「アリール」は、アルキル、ハロまたは他のアリール基によって１〜５回置換されていてもよい不飽和Ｃ６−３２の炭化水素環である。アリールはまた、二環アリール基も含む。アリール基の具体的な例は、フェニル、ベンジル、ジメチルフェニル、トリル、メチルベンジル、ジメチルベンジル、トリメチルフェニル、エチルフェニル、エチルベンジルなどを含むが、これらに限定されない。
【００３６】
「接着分子」は、細胞の付着、接着または増殖を促進する分子であり、フィブロネクチン、ラミニン、ビトロネクチン、トロンボスポンジン、ヘパリン結合領域、およびヘパラン硫酸結合領域、および前記の物質のいずれかから誘導された接着配列を含有しているアミノ酸の合成ポリマーを含む。合成ポリマーは、１文字コ−ドＲＧＤ、ＩＫＶＡＶ、ＹＩＧＳＲ等を持つアミノ酸を含んでいるペプチドまたはポリペプチドなどを含むが、これらに限定されない。接着分子はまた、細胞表面でヘパリンおよび炭水化物部分に結合するレクチンも含む。
【００３７】
「生物活性分子」は、生命体内の生化学的変化を有効にする、または生命体に利益を与える、薬物として使用される分子を含む、生物活性を有する、人体内の任意の分子である。生物活性分子は、好ましくは一つまたは複数の形のヘパリンと結合する。生物活性分子は、ここに開示された接着分子、増殖因子分子および治療的分子を含む。生物活性分子は、分野で習慣的な薬物、化合物、分子、ペプチド、ペプチド類似体、抗体ならびにこれらの断片および疑似体等を更に含む。生物活性分子は、生命体の受容体に結合してもよいが、必要ではなく、生命体の内部で見いだされる内生的物質の受容体であってよく、受容体に媒介されるプロセスまたは反応の作用薬、抑制因子または作用薬−抑制因子の混合体であってよい。好ましい形態では、生物活性分子は、親和性結合を含むがこれに限定はされない任意の手段によってヘパリンに結合してよい。
【００３８】
「増殖因子分子」は、任意の増殖因子、増殖因子の疑似体、増殖因子の誘導体、または増殖因子の効果を持つ他の分子である。これは、線維芽細胞増殖因子、血小板誘導増殖因子、血管内皮増殖因子、肝細胞増殖因子、胎盤増殖因子、インスリン様増殖因子、神経増殖因子およびニューロトロフィン、ヘパリンに結合する表皮増殖因子、形質転換増殖因子−β、骨形態形成たんぱく質２（ＢＭＰ−２）、造骨たんぱく質１（ＯＰ−１、ＢＭＰ−７とも呼ばれる）およびケラチノサイト増殖因子を含む。これは、合成手段、組み換え手段または他の手段により作られていようといまいと、限定無しに既述の任意のものを含む、増殖因子の生物活性を持つペプチド、ペプチド類似体および他の分子を更に含む。好ましい形態では、生物活性分子は、親和性結合を含むがこれに限定はされない本技術分野で既知の任意の手段によって、ヘパリンに結合してもよい。
【００３９】
「ヘパリン」は、ここで使用するときには、ヘパラン硫酸、ヒアルロン酸、デキストラン、デキストラン硫酸、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸等を含み、限定はされないが、Ｄ−グルコサミンとＬ−イズロン酸またはＤ−グルクロン酸のいずれかとの反復単位で構成される種々に硫酸化された多糖類鎖、既述の任意のものの塩及び既述の任意のものの誘導体の混合物を含む分子を含む、ヘパリンに類似の特性を持つ炭水化物複合体または炭水化物複合体の類似体を含む。
【００４０】
「治療的分子」は、治療効果をもつ任意の分子、たとえばケモカイン、ホルモン、血管形成抑制物質または薬剤であり、また特に体内に局限的または局所的に持続的に供与することが企図されている治療的分子である。ケモカインおよび免疫系の修飾物質の例は、Ｃ−Ｘ−Ｃケモカイン、インターフェロン−ガンマ、マクロファージ炎症性たんぱく質−１、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８などのインターロイキン、インターフェロン−ガンマ誘導性たんぱく質−１０、ＲＡＮＴＥＳ、ＨＩＶ−ｔａｔ−トランス活性化因子、および顆粒球／マクロファージ−コロニー刺激因子を含む。血管形成抑制物質の例は、血小板因子−４（ＰＦ−４）、ＥＬＲモチ−フを欠いたＣ−Ｘ−Ｃケモカイン（ＥＬＲ−Ｃ−Ｘ−Ｃケモカイン）、エンドスタチンおよびアンギオスタチンを含む。薬剤の例は、ストレプトマイシン、ゲンチミシンおよびネオマイシンＢを含むアミノグルコシド抗生物質、およびアクチノマイシンＤ、ダウノルビシン、ドクソルビシン、ブレオマイシン、ラパマイシンおよびパクリタクソルを含む抗がん抗生物質を含む。好ましい実施形態では、治療的分子は、親和性結合を含むがこれに限定されない、本技術分野で既知の任意の手段によってヘパリンに結合し得る。
【００４１】
以下の検討および実施例においては、「μＬ」はマイクロリットル、「ｍＬ」はミリリットル、「Ｌ」はリットル、「μｇ」はマイクログラム、「ｍｇ」はミリグラム、「ｇ」はグラム、「ｍｏｌ」はモル、「Ｍ」はモル濃度、「Ｍｅ」はメチル、「Ｂｎ」はベンジル、「ｎＢｕ４ＮＩ」はテトラブチルヨウ化アンモニウム、「℃」は摂氏温度を意味する。パ−センテ−ジは全て、他の指示が無い限り、重量パ−セントである。
シリル−ヘパリン組成物
本発明のシリル−ヘパリン組成物は、１つまたは複数の疎水性シリル部分のヘパリンとの共有結合複合体を含んでいる。ヘパリンは、Ｄ−グルコサミンと、Ｌ−イズロン酸またはＤ−グルクロン酸のいずれかとの反復単位で構成された、様々に硫酸化された多糖類鎖の混合物である。
【００４２】
任意の適当な形態のヘパリンを反応に使用することができる。ヘパリンおよびヘパリン誘導体の様々な塩が本技術分野で既知である。例えば、通常のヘパリンの塩はヘパリンナトリウム、ヘパリンカルシウム、ヘパリンマグネシウム、およびヘパリンカリウムを含む。ヘパリン誘導体は、ヘパリンアンモニウム、ヘパリンベンズアルコニウムなどを含むが、これらに限定されない。ヘパリンナトリウムは、本発明に係る共有結合複合体を調製するためのヘパリンの好ましい形態である。既述の物質は全て、その塩および誘導体と共に、上記の「ヘパリン」の定義に含まれる。
【００４３】
シリル部分は、式１で表される。ここでＲ１はＣ１−１８アルキルまたはＣ６−３２アリール基、Ｒ２はそれぞれ独立に、Ｃ１−１８アルキルとＣ６−３２アリールから成る群から選択されている。Ｒ３はＮまたはＯ，ｎは１から１０の数である。当業者には明らかであるように、Ｒ３はヘパリン分子中のＮまたはＯ原子であり、Ｒ３からの占拠されていない結合はシリル部分のヘパリン分子への付着を示している。このように、疎水性シリル部分はヘパリン分子のアルコールのＯ原子（すなわちヒドロキシル）またはアミンのＮ原子のいずれかに付着できる。
【００４４】
ヘパリンは、アミンとヒドロキシル官能基を含有する多数の反復単位を含む。これらは疎水性シリル部分がヘパリン分子に付着するための場所となり得る。したがって、本発明の一実施形態は、２以上の疎水性シリル部分の、単一のヘパリン分子への付着を企図している。式１の３０以上の疎水性シリル部分も、ただ１つの疎水性シリル部分も、単独のヘパリン分子に付着し、本発明のヘパリン被覆組成物中に使用される共有結合複合体を形成することができる。本発明の一実施形態では、２と２５の間の疎水性シリル部分が単独のヘパリン分子に付着する。もう一つの実施形態では、５と２０の間の疎水性シリル部分が単独のヘパリン分子に付着する。もう一つの実施形態では、７と１５の間の疎水性シリル部分が単独のヘパリン分子に付着する。一つの好ましい実施形態では、７または８の疎水性シリル部分が単独のヘパリン分子に付着する。もう一つの好ましい実施形態では、１２の疎水性シリル部分が単独のヘパリン分子に付着する。
【００４５】
ここに開示されているように、シリル−ヘパリン複合体は、医療用機器の接触表面に、疎水性シリル部分と、好ましくは同様に疎水性を持つ接触表面との間の疎水性相互作用によって結合する。付着の強さと、接触表面からのシリル−ヘパリン複合体の解離速度は少なくとも３つの要因によって決まる。すなわち、シリル部分当たりのシリル単位の数（すなわち、ここでｎは１と１０の間の数である）、ヘパリン分子当たりのシリル部分の数（すなわち、ここでｘは１と約３０の間の数である）、および接触表面の疎水性の度合である。極めて僅かな解離しか望まれないか、または機能的に全く解離が望まれない用途、例えば、接着分子がシリル−ヘパリン複合体に結合するような用途に対しては、シリル部分当たりのシリル単位の数およびヘパリン分子当たりのシリル部分の数をそれぞれ、結合強度を最大限にするのに最適な数に増やし、同様に接触表面を、シリル部分と最適な疎水性結合をするように選択することができる。時間の経過に対して放出を制御することが望まれる用途、例えば、増殖因子または治療的分子がシリル−ヘパリン複合体に結合するような用途に対しては、シリル部分当たりのシリル単位の数を減らし、またはヘパリン分子当たりのシリル部分の数を減らし、またはこれら両方の数を減らすことを選択し、あるいはシリル部分への疎水性結合が低減されるような接触表面を選択し、あるいはこれらを組み合わせて、時間とともに生体内で所望の放出が実現するようにする。
【００４６】
２以上の疎水性シリル部分が単独のヘパリン分子に付着する実施形態では、疎水性シリル部分はヘパリンのアミン（例えば、Ｒ３がＮ）を介して、またはヘパリンの水酸基（例えば、Ｒ３がＯ）を介して付着し得る。換言すれば、これらの疎水性シリル部分のいくつかは、ヘパリンのアミン基への結合によってヘパリン分子に付着し、一方他の疎水性シリル部分はヘパリンの水酸基への結合によってヘパリンに付着する。またすべての疎水性シリル部分が一貫してアミン（例えば、すべての疎水性シリル部分中のＲ３がＮ）またはアルコール（例えば、すべての疎水性シリル部分中のＲ３がＯ）のいずれかによってヘパリンに付着することも可能である。
【００４７】
シリル部分のヘパリン成分への付着をもたらす疎水性シリル部分とヘパリン分子の間の結合は共有結合である。従って、本発明の被覆組成物はヘパリンと疎水性部分の間のイオン性相互作用には頼らない。そうではなく、疎水性部分は、アミンまたは水酸基のいずれか（または恐らくは、２つまたはそれ以上の疎水性シリル部分が単独のヘパリン分子に付着する場合は、アミンと水酸基の組み合わせ）との共有結合を介してヘパリン分子に結合する。疎水性シリル部分は共有結合を介してヘパリン分子に結合するので、本発明は従来既知のヘパリン被覆物の一つの弱点を克服する。具体的には、ヘパリンと、ヘパリンを表面へ付着させる基との間のイオン結合の破壊の結果生ずる被覆からのヘパリンの浸出の問題は、ヘパリンと結合基の間のイオン結合相互作用への依存を回避することによって克服される。本発明では、被覆組成物中の疎水性シリル部分とヘパリン分子との間の共有結合が、被覆された表面が接触することになる血液中のイオン種によって崩壊することはない。デ−タは、この共有結合修飾のプロセスはまた、目標基質の表面上でのファクターＸａ／抗トロンビンＩＩＩ発色体基質アッセイによって観察された際に、ヘパリン活性の不利益な損失をもたらさないことを示している。
【００４８】
本発明に係る共有結合複合体は、次の図式１に従って調製することができる。
【００４９】
【化６】
2004505124.tif 000005
【００５０】
ここでＲ１はＣ１−１８のアルキルまたはＣ６−３２のアリール基であり、Ｒ２はそれぞれ独立に、Ｃ１−１８のアルキルおよびＣ６−３２のアリールから成る群から選択され、Ｒ３はＮまたはＯであり、ｎは１から１０の数、かつｘは１から約３０の数である。
【００５１】
一般に、第一の中間生成物、Ｒ１（Ｓｉ（Ｒ２）２ＣＨ２）ｎＣｌ−ここでｎは１である−は、塩化アルキルまたはアリールマグネシウムをクロロ（クロロメチル）ジアルキルシランまたはクロロ（クロロメチル）ジアリールシランと、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）の存在下で反応させることによって生成される。出発物質として使用される塩化アルキルまたはアリールマグネシウムは市販されており、例えば塩化ベンジルマグネシウムを含む。クロロ（クロロメチル）ジアルキルシランおよびクロロ（クロロメチル）ジアリールシランは市販されており、例えばクロロ（クロロメチル）ジメチルシランを含む。この反応は発熱を伴い、典型的には約１０℃以下の温度で行われる。この反応は、十分な時間実施すると約８０〜９０％の収率を得る。典型的には、反応は約２〜約２４時間実施される。
【００５２】
ｎが２以上の第一の中間生成物は、ｎが１である第一の中間生成物とＣｌＳｉ（Ｒ２）２ＣＨ２Ｃｌとの反応を包含するグリニャ−ル反応によって生成できる。このグリニャ−ル反応は、何回でも繰り返して行って、ｎが所望の値である第一の中間生成物を得ることができる。この反応は、触媒量のヨウ素およびＴＨＦの存在下で行われる。
【００５３】
第一の中間生成物（ｎ＝１〜１０）は、約１２０℃を超える温度、好ましくは約１３５℃で、１２と２４の間の時間、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中で酢酸カリウム（ＫＯＡｃ）と反応させることによって、第二の中間生成物、Ｒ１（Ｓｉ（Ｒ２）２ＣＨ２）ｎＯＨに転換される。次いで、この反応の生成物を、メタノ−ル（ＭｅＯＨ）中で還流しながら約２時間、ナトリウムメトキシド（ＮａＯＭｅ）と反応させて、第二の中間生成物を得る。
【００５４】
第二の中間生成物は、２段階の反応プロセスによって最終中間生成物、Ｒ１（Ｓｉ（Ｒ２）２ＣＨ２）ｎＯＣＯ２Ｎ（ＣＯＣＨ２）２、に転換される。第１段階では、第二の中間生成物を塩化メチレン中で、１０℃未満の温度、好ましくは約０℃で、Ｎ−ヒドロキシスクシニミドおよびトリエチルアミン（Ｅｔ３Ｎ）と反応させる。
【００５５】
最終中間生成物は、ヘパリンを最終中間生成物と適当な溶媒（例えば、水／ジメチルホルムアミド）中で、ｐＨ約８．０ないし９．０、好ましくは約８．５で反応させることによって、ヘパリンに共有結合的に抱合される。反応のｐＨは、水酸化ナトリウムなどの塩基を必要に応じて添加することによって調整する。代替的に、また好ましくは、４−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）の若干の超過量を、ヘパリンとの抱合反応のための塩基として使用することができる。これらの一般的な方法を使用して、本発明の共有結合シリル−ヘパリン複合体を生成することができる。これらの共有結合複合体は、一般式３を持つ。
【００５６】
【化７】
2004505124.tif 000006
【００５７】
ここでＲ１はＣ１−１８のアルキルまたはＣ６−３２のアリール基であり、Ｒ２はそれぞれ独立に、Ｃ１−１８のアルキルおよびＣ６−３２のアリールから成る群から選択され、Ｒ３はヘパリンのＮまたはＯであり、ｎは１から１０の数、かつｘは１から約３０の数である。
【００５８】
好ましい複合体は、疎水性シリル部分のＲ１がアリールである複合体を含み、好ましい一実施形態ではＲ１はベンジルである。好ましい一実施形態では、各Ｒ２はアルキルであり、特に好ましい一実施形態では、各Ｒ２はメチル、エチル、プロピルおよびイソプロピルから成る群から選択され、特にメチルである。好ましい一実施形態では、ｎは２から３の数である。
【００５９】
本発明に係る共有結合複合体の具体例は、［ベンジル−ビス（ジメチルシリルメチル）］−（Ｎ−ヘパリニル）−カルバメート、［ベンジル−トリス（ジメチルシリルメチル）］−（Ｎ−ヘパリニル）−カルバメート、およびドデシル［ベンジル−ビス（ジメチルシリルメチル）］−（Ｎ−ヘパリニル）−カルバメートを含むが、これらに限定されない。これら３つの具体的な共有結合複合体は上記一般式ＩＩＩをもつ現在好ましい共有結合複合体であるが、このような複合体の他の具体的な例も当業者には明らかと思われ、本発明によって企図されている。
【００６０】
本発明のシリル−ヘパリン被覆物は、上述のシリル−ヘパリン共有結合複合体を含む。シリル−ヘパリン共有結合複合体に加えて、この被覆組成物はまた、前記組成物を表面に塗布するのを容易にする１種以上の溶媒を含むことができる。適当な溶剤は、共有結合複合体を少なくとも部分的に可溶化させ、ヘパリンの抗血栓性活性に干渉しないものである。本発明の被覆組成物に使用し得る溶媒の例は、水性溶媒、アルコール、ニトリル、アミド、エステル、ケトン、エーテルなどを含むが、これらに限定されない。溶液または溶媒と関連した「水性」という語は、主として水から成る、通常は水の含有率が９０重量％を超える溶液または溶媒をいい、本質的なまたは実質的な純水を含む。水溶液または溶媒は、例えば蒸留水、水道水などであり得る。しかし、水溶液または溶媒は、ｐＨ緩衝剤、ｐＨ調整剤、有機および無機塩、アルコール（例えばエタノ−ル）、糖、アミノ酸、またはこれらに含まれる界面活性剤も含み得る。水溶液または溶媒は、水と、少量の１種以上の共溶媒との混合物であり得る。このような共溶媒は作物栽培学的に適した、水との混和性をもつ、または水と共にエマルジョンを形成し得る有機共溶媒を含む。適当なアルコール溶媒の例は、メタノ−ル、エタノ−ル、プロパノ−ル、イソプロパノ−ル、ヘキサノ−ル、およびエチレングリコ−ルなどのグリコ−ルを含むが、これらに限定されない。適当なニトリルの例は、アセトニトリル、プロピオニトリル、ブチロニトリル、ベンゾニトリルなどを含む。適当なアミドの例は、ホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミドなどを含む。適当なエステルの例は、酢酸メチル、酢酸エチルなどを含む。適当なケトンの例は、アセトン、メチルエチルケトン、ジエチルケトンなどを含む。適当なエーテルの例は、ジエチルエーテル、テトラヒドロフラン、ジオキサン、ジメトキシエタンなどを含む。前記溶媒の任意のうちの任意の２種以上も、同様に被覆組成物に使用できる。現在好ましい溶媒は水、特に蒸留水、イソプロパノ−ル、アセトニトリル、およびこれらの溶媒の任意の２種以上の組み合わせを含む。
【００６１】
好ましい一実施形態においては、シリル−ヘパリン共有結合複合体は溶媒中に可溶化されて、濃度が約０．０１と約１０重量パ−セントの間、好ましくは約０．１と約１パ−セントの間、更に好ましくは約０．１２５パ−セントになる。
【００６２】
前記の溶媒に加えて、本発明のシリル−ヘパリン被覆組成物は、様々な通常の添加剤を含有することもできる。本発明の組成物に組み込むことのできる添加剤は、ベンズアルコニウム、４−ジメチルアミノピリジニウム、ハロゲン化テトラブチルアンモニウムなどを含むが、これらに限定されない。
医療用機器の接触表面
被覆物は、医療用機器の非常に多様な接触表面のいずれにも塗布できる。接触表面は、特にヒトを含む哺乳類の、血液、細胞または他の体液あるいは組織を接触させることが企図されている表面を含むが、これらに限定されない。適当な接触表面は、血液または他の組織を接触させることが企図されている医療用機器の１つ以上の表面を含む。医療用機器は、縫合糸、移植材料、包帯、傷被覆材料、骨ワックス、骨補綴材、動脈瘤コイル、塞栓形成粒子、マイクロビ−ズ、ステント、カテーテル、シャント、移植片、人工血管、神経増殖ガイド、人工心臓弁、人工装具、ペースメーカーリード線、留置カテーテル、心血管移植片、骨代替物、創傷治癒機器、軟骨置換機器、尿道置換材、整形外科用インプラント、眼科用インプラントおよびその他の本技術分野で既知の医療用機器である。本発明の適用によって利益を得るであろう医療用機器の他の例は、外科的処置および医療処置の当業者には容易に想到できるものであり、従って本発明によって企図されている。接触表面は、血管内位置、管腔内位置、固形組織内の位置などを含む目標位置に埋め込むことのできるメッシュ、コイル、ワイヤ、可膨張性バル−ン、または他の構造を含み得る。体内移植可能な機器は、永続的にも、一時的にも移植することができる。このような機器は、血管内カテーテルおよび他の医療用カテーテルによって供給し、またはこのようなカテーテルに組み込むことができる。
【００６３】
適当な接触表面は、ステンレス鋼、ニチノール、チタン、タングステン、プラチナ、グラファイトなどの金属および金属合金；セラミック；ポリ塩化ビニル、ポリエチレン、ポリラクチド、ポリグリコリド、ポリカプロラクトン、ポリメチルメタクリレート、ポリヒドロキシルエチルメタクリレート、ポリウレタン、ポリスチレン、ポリカ−ボネ−ト、ダクロン、ポリテトラフルオロエチレンおよび延伸ポリテトラフルオロエチレン（テフロン（登録商標））、関連したフッ素ポリマーコンポジット（ゴアテテックス、登録商標）、ポリエステル、ポロプロピレン、ポリアミド、ポリアクリレート、ポリビニルアルコールなどの様々なポリマー材料および前記の任意の２つ以上の物質のコポリマー；２，４，６，８−テトラメチルシクロテトラシロキサンなどのシロキサン；天然および人造ゴム；およびガラスを含む。一般に、本発明のシリル−ヘパリン生物活性分子で被覆され得る接触表面は、疎水性シリル部分に対して親和性または誘引作用を持つ任意の表面を含む。このような表面は典型的には疎水性表面である。
【００６４】
一実施形態においては、接触表面は生分解性または生腐食性の材料であり得る。生分解性または生腐食性の材料は本技術分野で既知であり、ポリ無水物、ポリグリコ−ル酸、ポリ乳酸／ポリグリコ−ル酸コポリマー、ポリヒドロキシブチレート−吉草酸塩およびその他の脂肪族ポリエステルを含む。生分解性の移植可能な材料は、米国特許５，６５６，２９７； ５，５４３，１５８； ５，４８４，５８４； ４，８９７，２６８； ４，８８３，６６６； ４，８３２，６８６； および３，９７６，０７１に記述されている。一実施形態においては、生吸収性ポリマー接触表面が、ポリカプロラクトン、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド）、ポリ（Ｌ−ラクチド）、ポリグリコリド、ポリ（ジオキサノン）、ポリ（グリコリド−ｃｏ−トリメチレンカーボネート）、ポリ（Ｌ−ラクチド−ｃｏ−グリコリド）、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−ｃｏ−グリコリド）、ポリ（Ｌ−ラクチド−ｃｏ−Ｄ，Ｌ−ラクチド）またはポリ（グリコリド−ｃｏ−トリメチレンカーボネート−ｃｏ−ジオキサノン）などの生体適合性材料で製造されている。一実施形態においては、生体内での生吸収性ポリマー構造成分の持続性が、生物活性薬剤が治療効果を与えると予想される期間を超えており、好ましくはこのような期間を少なくとも２倍超えている。
シリル−ヘパリン複合体の応用
シリル−ヘパリン複合体は、任意の上記の接触表面上に被覆できる。シリル−ヘパリン複合体を表面に塗布するための任意の適当な方法を使用できる。シリル−ヘパリン複合体を接触表面に塗布するための一つの適当な方法は、接触表面を、本発明のシリル−ヘパリン複合体を含有する被覆組成物に浸す方法である。本発明のシリル−ヘパリン複合体を含有する液状の被覆組成物を、任意の上記の溶媒を使用して調製できる。表面を被覆組成物の浴に浸し、または浸漬する。典型的には、液浸プロセスは高い温度、例えば約３０℃と約８０℃の間で、一定の時間、例えば約５分と約２０分の間、好ましくは約１０分間行う。その後、表面をシリル−ヘパリン複合体を含有する被覆組成物に約１５分と６０分の間、好ましくは約２０分間、室温で接触させておくことができる。
【００６５】
本発明の被覆組成物を接触表面上に被覆または塗布するのに使用できる他の方法は、ポンピングまたは噴霧プロセスの使用を含む。ポンピングプロセスでは、シリル−ヘパリン複合体濃度が約０．０５と約５パ−セント（ｗ／ｖ）の間の被覆組成物を、ポンピングにより、約３０分間、医療機器の接触表面を含む部分を貫流させる。その後、いかなる余剰の被覆組成物をも水または生理食塩水で洗い落とす。同様に、接触表面を噴霧によって被覆組成物で被覆することもできる。
【００６６】
被覆に続き、得られたシリル−ヘパリン複合体被覆表面を、典型的には、乾燥させる前に水またはその他の水性溶液で洗浄する。有利なことに、既述の被覆組成物を表面に塗布する方法は比較的速やかに行うことができ、商業的に適当で、費用に対する効果の高いものである。これらの方法は特殊な装備または特殊な技術訓練を必要とせず、複雑な表面形状をもつ機器に塗布することができる。従って、シリル−ヘパリン複合体は、三次元マトリックス、ロッド、コイル、チュ−ブ、シ−ト、ピン、ネジ、糸、組み紐、ビ−ズ、粒子、球およびこれらのものの組み合わせを含む、任意の接触表面に塗布することができる。
【００６７】
疎水性接触表面とシリル−ヘパリン複合体の疎水性シリル部分との間の疎水性相互作用は、シリル−ヘパリン複合体の疎水性シリル部分と表面の間の結合を形成する。この疎水性相互作用は十分に強いので、共有結合複合体と表面の間の妥当な、安定した結合を提供する。有利なことに、また接触表面の材質の疎水性に部分的には依存して、規定可能な解離速度を得ることができ、それによってシリル−ヘパリン複合体の所定の割合が、ヘパリンに結合した生物活性分子と共に、接触表面から解離し、それにより生物活性分子をある時間にわたって、局限的または局所的に供給するようにできる。このような解離速度は、部分的には、シリル部分当たりのシリル単位の数または各ヘパリン分子に結合したシリル部分の数、またはこれらの両方によって決定できる。従ってこのような数は、部分的には、所望の解離速度に基づいて選択される。
接着分子の複合化と使用
生物活性分子は、フィブロネクチンなどの接着分子であり得る。フィブロネクチンは既知であり、ヘパリンに対しる親和性を実証している。フィブロネクチンは２つの類似したたんぱく質鎖で構成されており、各鎖が、細胞結合のための１つの領域と、２つの、鎖の両端にある、ヘパリンと結合するための領域を持つ。フィブロネクチンの親和性結合によって、約１０８Ｍ／Ｌの親和性定数が得られる。
【００６８】
細胞、血漿または組織から誘導されたフィブロネクチン、天然のものまたは遺伝子工学によるもの、およびヒトに由来するものまたは他の動物種から誘導されたものを含め、任意の形態のフィブロネクチンを使用することができる。フィブロネクチンについてここに説明した方法を利用して、上に定義した様な、他の接着性分子も使用できる。
【００６９】
シリル−ヘパリン複合体によって接触表面に被覆を施した後、フィブロネクチンはヘパリンと親和複合化し、シリル−ヘパリン−フィブロネクチン複合体を形成し得る。フィブロネクチンを親和複合化させるために、フィブロネクチンを、フィブロネクチン組成物をシリル−ヘパリンで被覆された接触表面に塗布するプロセスを容易にする１種以上の溶媒に可溶化する。適当な溶媒は、少なくとも部分的にフィブロネクチンを可溶化し、ヘパリンの活性またはフィブロネクチンの細胞付着活性に干渉しない溶媒である。本発明において使用できる溶媒の例は、上に定義した水溶液；アルコール、ニトリル、アミド、エステル、ケトン、エーテルなどを含有する水溶液；およびアルコール、ニトリル、アミド、エステル、ケトン、エーテルなどを含む。水溶液は特に非合成フィブロネクチンにとって有利であり、有機物ベ−スの溶媒は特に合成フィブロネクチンおよび、それから誘導されたペプチドにとって有利である。
【００７０】
フィブロネクチン組成物は、シリル−ヘパリン被覆を施した接触表面に塗布して、接触表面を細胞の接着と付着に適したものにすることができる。フィブロネクチンを表面に塗布するための任意の適当な方法を使用できる。フィブロネクチン組成物を、シリル−ヘパリン被覆を施した接触表面に塗布するための一つの適当な方法は、シリル−ヘパリン被覆を施した接触表面を本発明のフィブロネクチン組成物に浸す方法である。シリル−ヘパリン被覆を施した表面をフィブロネクチン溶液の浴に浸し、または浸漬する。典型的には、浸すプロセスは高い温度、例えば約３０℃と約８０℃の間、好ましくは約４０℃と約５０℃の間で、約５分と約６０分の間、好ましくは約２０分と約３０分の間、実施する。
【００７１】
本発明のフィブロネクチン溶液を、シリル−ヘパリン被覆を施した表面に被覆または塗布するための他の方法は、ポンピングまたは噴霧プロセスの使用を含む。一実施形態では、フィブロネクチン溶液は、フィブロネクチン濃度約０．０５と約５パ−セント（ｗ／ｖ）の間で、この溶液をポンピングにより、約３０分間、医療機器の接触表面を含む部分を貫流させる。その後、いかなる余剰の被覆組成物をも水または生理食塩水で洗い落とす。同様に、接触表面を噴霧によって被覆組成物で被覆することもできる。
【００７２】
フィブロネクチンを接触表面の組成物のシリル−ヘパリン複合体のヘパリンに付着させた後、接触表面を、乾燥させる前に水または生理食塩水で洗浄することができる。有利なことに、被覆組成物を表面に塗布する前記の方法は比較的速やかに行うことができ、商業的に適当で、費用に対する効果の高いものである。
【００７３】
代替的な実施形態においては、フィブロネクチンを水溶液中でシリル−ヘパリンと複合化させ、次いでシリル−ヘパリン−フィブロネクチン複合体全体を接触表面に付着させることができる。この実施形態では、シリル−ヘパリンを水溶液に溶解させ、所定量のフィブロネクチンと混合し、フィブロネクチンが基本的に完全にシリル−ヘパリンと複合化するようにする。イソプロパノ−ルなどの有機溶媒を、水溶液に、２０％と８０％の間、好ましくは３５％の濃度になるように添加することができる。これらの条件の下で、シリル−ヘパリン−フィブロネクチン複合体がミセルを形成し、複合体のフィブロネクチン−ヘパリンの部分がミセルの内部に封鎖される。次いでミセルの溶液を接触表面の表面に塗布し、それによってミセルをこのような接触表面と疎水性相互作用によって会合させる。それから水溶液中で濯いで、余剰の、会合していない材料を除去し、ヘパリン−フィブロネクチンを水性相中で会合させることができる。このやり方は、例えば、フィブロネクチン誘導ペプチドポリマーに有利に使用することができる。
【００７４】
更に別の実施形態では、上述の接着分子に加えて更に他の接着分子を使用することができる。このような接着分子は、ポリリジン、ポリオルニチンおよび類似の、電荷−電荷相互作用によってヘパリンと会合し、それによって細胞接着特性を提供する、正味正電荷を持つ分子を含むが、これらに限定されない。ポリリジンとポリオルニチンはある種のタイプの細胞培養容器への細胞の付着力を増すことが知られており、ここに記述するシリル−ヘパリン複合体に塗布し、結合させることができる。
【００７５】
様々な増殖因子およびサイトカインも、細胞外マトリックスのヘパリンまたはヘパラン硫酸と複合化させ、接着分子として使用できる。結合した増殖因子は、それによって、細胞表面受容体が結合できるリガンドのディスプレイを供給することにより、細胞の接着を促進するために使用できる。線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、血小板誘導増殖因子（ＰＤＧＦ）、および骨形態形成たんぱく質（ＢＭＰ）は、ヘパリンと複合化する増殖因子の例である。同様に、サイトカインはヘパリンと相互作用することが知られており、ガンマ−インターフェロンなどのサイトカインは、シリル−ヘパリン複合体を含む、本発明の細胞外マトリクスのヘパリンまたはヘパラン硫酸組成物と結合することができる。
【００７６】
更に別の実施形態では、２以上のタイプの接着分子をシリル−ヘパリン複合体に結合させることができる。従って、増殖因子とフィブロネクチンの両方をシリル−ヘパリン複合体に塗布して、組成物がこれら両タイプの接着分子を含有するようにすることができる。多くの接着分子に対しては、ヘパリンへの親和性結合は明瞭な受容体、例えばフィブロネクチンおよび線維芽細胞増殖因子などを介して行われる。結合した増殖因子はそれによって、被覆表面上での細胞増殖を最大限にするためのメカニズムを提供する。
【００７７】
本発明のヘパリンおよびフィブロネクチンの被覆組成物は、任意の非常に様々な医療用機器の、血液、組織、細胞または他の身体構成要素と接触する接触表面に塗布し、それによって医療用機器に、細胞の接着と付着を促進する１つ以上の接触表面を供給することができる。シリル−ヘパリン接着分子複合体によって有利に処理することのできる具体的な医療用機器は、人工血管、血液シャント、神経増殖ガイド、人工心臓弁、人工装具、ペースメーカーリード線、留置カテーテル、心血管移植片、骨代替物、創傷治癒機器、軟骨置換機器、尿道置換材などを含むが、これらに限定されない。本発明の接着分子被覆組成物の塗布によって利益を得るであろう医療用機器の他の例は、外科的処置および医療処置の当業者には容易に想到できるものであり、従って本発明によって企図されている。
【００７８】
また、これらの被覆を、細胞培養およびその他の、細胞接着のための表面が望まれる生物学的な生体外での用途を含む、他の用途に使用することが可能であり、企図されている。
増殖因子分子の付着と使用
増殖因子を局限的または局所的に適用するためのヘパリンを含有する供給システムが複数の研究者によって記述されている。ヘパリンが足場に共有結合する場合は、増殖因子の放出は、ヘパリナーゼまたはプラスミンなどの酵素因子と関連しており、またヘパリンからの拡散に基づく増殖因子の放出によって、より著しく起こると理解される。しかし増殖因子とヘパリンの複合体は安定しており、ヘパリンの抱合によって固定化されているため、拡散にとっては有利ではない。本発明では、シリル−ヘパリン複合体は接触表面に共有結合しているのではなく、疎水性相互作用によって結合している。そのためシリル−ヘパリン増殖因子分子の複合体は流出しやすく、より有効な生物学的効果を生じる。
【００７９】
増殖因子分子は、医療用機器の接触表面との疎水性相互作用によってヘパリン表面に結合したシリル−ヘパリン複合体のヘパリン表面上に吸着され得る。このような吸着は、液浸、ポンピング、噴霧または、上で接着分子に関して検討した手段を含む、本技術分野で既知の他の手段によって行うことができる。
【００８０】
シリル−ヘパリン増殖因子分子複合体は、ポリスチレンとラクチド−グリコリドコポリマーを含む、適当な接触表面に付着させた。塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）が接触表面上のシリル−ヘパリン複合体に結合しやすくするために、また結合したｂＦＧＦの量が結合のために供給された量に直接関係づけられるように、免疫測定法を用いた。一度吸着されると、シリル−ヘパリン−ｂＦＧＦは内皮細胞の毛細管形成を誘発し、内皮細胞の増殖を増進させることができた。接触表面としての縫合糸材料に被覆し、筋肉に埋め込むと、シリル−ヘパリン−ｂＦＧＦ被覆は埋め込んだ範囲の線維芽細胞の細胞性を増大させた。従って本発明の機器と方法を組織修復に使用される増殖因子供給システムに用い、ｂＦＧＦおよび関連した増殖因子を局限的に放出させて、修復プロセスを強めることができる。
【００８１】
線維芽細胞増殖因子は、発生信号分子と生理的信号分子の大きな族を含んでいる。ＦＧＦは全て、グリコサミノグリカンヘパリンと細胞表面ヘパラン硫酸（ＨＳ）プロテオグリカンに対して高い親和性をもっている。ＦＧＦのヘパラン硫酸に対する親和性により、ＦＧＦの拡散が制限され、細胞外マトリクス内への放出が限定される。ＦＧＦがヘパリンまたはＨＳに結合すると、その結果、プロテオグリカン鎖に沿ってダイマーまたは高次オリゴマーが形成され、あるいは安定化される。ヘパリンとＨＳはまた、活性ＦＧＦ／ＦＧＦ受容体信号複合体の形成においてもある役割を演じ、またヘパリンとＨＳは、結果として得られるＦＧＦと受容体複合体の親和性と半減期を増大させる。ｂＦＧＦは、線維芽細胞、内皮細胞、平滑筋細胞および骨芽細胞を含む多数の細胞タイプにおいて分裂促進作用をもつ。ｂＦＧＦは血管形成性を持ち、一つの生存因子である。
【００８２】
シリル−ヘパリン増殖因子分子複合体を使用できる医療用機器の例は、縫合糸、移植材料、包帯、傷被覆材料、神経増殖ガイド、骨ワックス、動脈瘤コイル、塞栓形成粒子、マイクロビ−ズ、ステント、歯科用インプラント、整形外科用インプラント、眼科用インプラントおよび骨補綴材を含む。単一のシリル−ヘパリン増殖因子分子複合体を利用することができ、２つ以上のシリル−ヘパリン増殖因子分子複合体を利用することもでき、または１つのシリル−ヘパリン複合体が、接着分子または治療的分子のいずれかと、またはこれら両方と組み合わせた増殖因子分子を含むこともできる。同様に、単一の医療用機器内で２種類以上の接触表面を用いて、１つの接触表面は１つ以上のシリル−ヘパリン増殖因子分子複合体を含み、もう１つの接触表面は異なったシリル−ヘパリン増殖因子分子複合体、またはシリル−ヘパリン接着分子複合体、またはシリル−ヘパリン治療的分子複合体、あるいはこれらのものの組み合わせを含むようにすることもできる。例えば、ある医療用機器の、組織に接触する接触表面にはシリル−ヘパリン接着分子複合体被覆を施し、血液に接触するもう一つの接触表面にはシリル−ヘパリン増殖因子分子複合体またはシリル−ヘパリン治療的分子複合体の被覆を施すことができる。
【００８３】
被覆表面上のシリル−ヘパリン増殖因子分子複合体被覆物が特別に有用なものとなり得る疾患は、火傷、心血管虚血、末梢血管虚血、動脈瘤、骨折、骨格欠損、整形外科的外傷の部位、軟骨損傷の部位、ガン治療、細菌増殖の予防、神経損傷、心筋梗塞、末梢血管閉塞，眼の退化、腎虚血などを含む。
【００８４】
一実施形態では、シリル−ヘパリン増殖因子分子複合体被覆が脳動脈瘤の治療に使用される。血管内コイル、例えばプラチナ、チタン、またはニチノ−ルで製造された直径約０．０１５ｃｍ〜０．０３１ｃｍ、長さ４ｃｍ〜１０ｃｍのものが使用される。血管内コイルの表面は、シリル−ヘパリン増殖因子分子複合体、例えばベンジル−ビス（ジメチルシリルメチル）オキシカルバモイル−ヘパリンを疎水性相互作用によって血管内コイルの接触表面に結合させ、ｂＦＧＦを親和結合によってヘパリンへ結合させたものによって、被覆されている。次いで、被覆された血管内コイルを、例えば蛍光間接撮影によって案内されるカテーテルから動脈瘤へ展開させる。動脈瘤の空洞内に展開させた後、コイルを供給デバイスから外す。各ヘパリン粒子に付着するシリル部分の数または各シリル部分中のシリル単位の数、あるいはこれら両方は、コイルから、シリル−ヘパリン増殖因子分子複合体が所定の、所望の速度で解離するように選択する。これによって、動脈瘤血管壁の修復と強化を刺激するメカニズムを持つ、改良された血管内コイルが得られる。このメカニズムは、部分的には、一時的な、局限された細胞増殖を刺激するヘパリンとｂＦＧＦを包含し、それによって血管壁が強化される。このような効果は血管内コイルからの所定の速度でのシリル−ヘパリン−ｂＦＧＦ複合体の放出によって調整され、増進される。
【００８５】
免疫測定法によって、フィブリノーゲンとｂＦＧＦの両方がシリル−ヘパリン複合体上のヘパリンに結合し、これらのいずれも置換されず、シリル−ヘパリンとフィブリノーゲンとｂＦＧＦの混合複合体が形成されることが確認されている。このような混合複合体は、血管内コイルおよび他の医療用機器の接触表面の被覆に使用することができる。血管内コイルの場合は、シリル−ヘパリン−フィブリノーゲンは、フィブリノーゲンの効果による血栓形成と細胞付着の効力を増進させ、シリル−ヘパリン−ｂＦＧＦは細胞増殖に寄与する。
【００８６】
もう一つの実施形態では、シリル−ヘパリン増殖因子分子複合体被覆が、ヘパリンと増殖因子を局限的、一時的に供給する微細粒子に使用され、虚血組織内の側副血行を増進させ、血管形成を促す。微細粒子は、３％のポリラクチド：ポリグリコリド（ＰＬＧＡ）を含有する塩化メチレン溶液を２％のポリビニルアルコール水溶液で均質化してエマルジョンを形成し、得られた混合物を超音波処理し、有機相が蒸発した後、遠心分離によって粒子を回収することによって製造される。塩化メチレンの蒸発後、ＰＬＧＡ微細粒子を、０．５％のシリル−ヘパリン、例えばベンジル−ビス（ジメチルシリルメチル）オキシカルバモイル−ヘパリンを含む水溶液中で４５分間インキュベ−トする。結合していないシリル−ヘパリンを遠心分離し、リン酸緩衝生理食塩水で濯ぐ。次いで、シリル−ヘパリン被覆を施した微細粒子を水性緩衝液、例えばデキストロ−スを含む緩衝液中に再懸濁させ、任意選択で単位投与量に等分し、凍結乾燥させ、任意選択でガンマ線で滅菌する。増殖因子分子は、増殖因子分子を水溶液中、例えば１％のヒト血清アルブミンを含むリン酸緩衝生理食塩水中で調製し、増殖因子分子と溶液を凍結乾燥した、シリル−ヘパリン被覆を施した微細粒子に添加することによって使用の直前に組み込むことができる。代替方法として、微細粒子をシリル−ヘパリン増殖因子複合体によって被覆する。例えばシリル−ヘパリンで被覆し、続いて増殖因子分子を加え、微細粒子を増殖因子分子と共に所望の濃度でインキュベ−トし、結合していない増殖因子を遠心分離と濯ぎによって除去する。シリル−ヘパリン増殖因子分子複合体で被覆された微細粒子は、次いで上述のように任意選択的に凍結乾燥させ、滅菌する。ｂＦＧＦ、形質転換増殖因子−β（ＴＧＦ−β）および血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）を含む、非常に様々な増殖因子のいずれを使用しても良い。シリル−ヘパリン増殖因子は微細粒子からある選択された時間、例えば数日間、にわたって放出され、それによってヘパリンと増殖因子を局限的、一時的に供給する。一実施形態では、式１または２中の「ｎ」を適当に選択して、結果として得られたシリル部分を合成してシリル部分の長さを調整し、それによって微細粒子の接触表面からの放出または解離の速度を調整し、このようにして生体内の生物使用可能性を制御することができる。同様に、ヘパリン分子当たりのシリル部分の数も、式１または２中の「ｘ」を適当に選択して、それによってまた、微細粒子の接触表面からの放出または解離の速度を調整し、このようにして生体内の生物使用可能性を制御することができる。
治療的分子の付着と使用
治療的分子は、治療的分子の局限された、または局所的な供給のための、本技術分野で周知の、非常に様々な薬剤供給システム、方法および機器に使用されている。上述の接着分子および増殖因子分子に関する方法を治療的分子にも使用することができる。好ましい実施形態では、親和結合または他の手段によってヘパリンに結合し、それによってシリル−ヘパリン−治療的分子複合体を形成する治療的分子が選択される。
産業上の利用可能性
以下、実施例により本発明を更に説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例に限定されるものではない。
実施例１　シリル−ヘパリン共有結合複合体を調製する方法
塩化ベンジルマグネシウム１をクロロ（クロロメチル）ジメチルシラン２によって処理し、ベンジル（クロロメチル）ジメチルシラン３（ｎ＝１）を得た。これらはすべて、下の図式２に示してある。３ｎをマグネシウムで処理して、グリニャ−ル試薬を得、これを再度クロロ（クロロメチル）ジメチル−シランで処理して同族のシリル化合物３ｎ＋１を得た。グリニャ−ル反応を何度も繰り返して、所望の鎖長のシリル化合物を得ることができる。クロロ−シリル化合物３を酢酸カリウムで処理し、続いて、相当する酢酸塩を塩基性化されたメタノ−ルでトランスエステル化してアルコール４を得た。アルコール４をトリホスゲンで処理して、相当するクロロホルム酸塩を得、これをＮ−ヒドロキシ−スクシニミドで処理して、Ｎ−ヒドロキシ炭酸スクシニミジル５を得た。ヘパリンの５との抱合化は、ヘパリンを５および４−（ジメチルアミノ）ピリジンを１：１ＤＭＦ／Ｈ２Ｏ中で処理してシリル酸ヘパリン６を得ることにより実現した。反応物のモル比を調整することにより、ヘパリン当たりの置換基の数を制御した。
【００８７】
【化８】
2004505124.tif 000007
【００８８】
ベンジル（クロロメチル）ジメチルシラン、３（ｎ＝１）の合成。窒素雰囲気下で、クロロ（クロロメチル）ジメチルシラン（１００ｍＬ，０．７４４モル）を注射器でＴＨＦ（５００ｍＬ）に添加し、溶液を氷／アセトン浴で０℃に冷却した。塩化ベンジルマグネシウム（２．０Ｍ溶液、４００ｍＬ，０．８モル）を２時間にわたって滴下によって添加した。全ての試薬が添加されるまで、温度を１０℃未満に保つよう注意した。その後、氷浴を室温に温め、反応混合物を一夜攪拌した。ヘキサン（３００ｍＬ）を加え、ＮＨ４Ｃｌ飽和水溶液（３００ｍＬ）を滴下により添加した。反応混合物を２Ｌの分液漏斗に移し、更にヘキサン（３００ｍＬ）を加えた。分液後、有機層をＮＨ４Ｃｌ飽和水溶液（２００ｍＬ）とＮａＣｌ飽和水溶液（２００ｍｌ）で洗った。一体化した水層をヘキサン（２ｘ５００ｍＬ）で逆洗し、一体化した有機層をＭｇＳＯ４上で乾燥させ、回転蒸発機で蒸発させ、更に真空中で濃縮し、無色の油１６２．０ｇ（収率１０９．５％）を得た。定量的な収率は、粗生成物の純度を９１．３％として想定した。
【００８９】
Ｂｎ（ＳｉＭｅ２ＣＨ２）ｎＣｌ ３ ｎとＣｌＳｉＭｅ２ＣＨ２Ｃｌのグリニャ−ル反応によってＢｎ（ＳｉＭｅ２ＣＨ２）ｎ＋１Ｃｌ ３ ｎ＋１を得る。
【００９０】
マグネシウム粉末（７．５ｇ，０．３１モル）、触媒量のヨウ素およびＴＨＦ（１００ｍＬ）を、コンデンサＮ２インレット、隔壁よび温度計を取り付けた三つ口フラスコに入れた。混合物を、ヨウ素の褐色が消えるまで短時間加熱還流させた。Ｂｎ（ＳｉＭｅ２ＣＨ２）ｎＣｌ（０．２モル）を注射器で加え、残留試薬をＴＨＦ（２ｘ２５ｍＬ）によって反応混合物中へ洗い入れた。ヒートガンで反応を開始させた。発熱反応が観察され、発熱反応が静まるまで、水浴中に反応フラスコを入れた。得られた灰色の混合物を２４時間加熱還流させた。それから試薬を室温まで冷やし、カニューレによって圧力フィルタ漏斗に入れ、そこで直接、ＣｌＳｉＭｅ２ＣＨ２Ｃｌ（２７．０ｍＬ、０．２モル）のＴＨＦ（５０ｍＬ）溶液が入っている室温のもう一つの５００ｍＬの丸底フラスコに移した。残留マグネシウムをＴＨＦ（２ｘ２５ｍＬ）で反応混合物中へ洗い入れた。反応混合物を一夜加熱還流させた。得られた灰色の懸濁液にＮａＨＣＯ３飽和水溶液（５０ｍＬ）を加え、得られた溶液をヘキサン（２００ｍＬ）を入れた５００ｍＬの分液漏斗に移した。分液後、有機層をＮａＨＣＯ３飽和水溶液（５０ｍＬ）とＮａＣｌ飽和水溶液（５０ｍｌ）で洗った。一体化した水層をヘキサン（２ｘ１００ｍＬ）で逆洗し、ＭｇＳＯ４上で乾燥させ、真空中で徹底的に蒸発させて琥珀色の油を得た。この琥珀色の油を蒸留によって精製し、無色の油を得た。収率は８０％を超えた。
【００９１】
Ｂｎ（ＳｉＭｅ２ＣＨ２）ｎＣｌ ３ｎのＢｎ（ＳｉＭｅ２ＣＨ２）ｎＯＨ ４ｎへの転換
Ｂｎ（ＳｉＭｅ２ＣＨ２）ｎＣｌ（０．１６モル）を１Ｌの三つ口フラスコ内でＤＭＦ（３００ｍＬ）に溶解させた。ＫＯＡｃ（５０ｇ，０．５モル）を加え、続いてｎＢｕ４ＮＩ（４．０ｇ，０．０１モル）を加えて、反応混合物を１３５℃の油浴中で２４時間攪拌した。反応混合物を室温まで冷やして、ヘキサン（５００ｍＬ）を入れた１Ｌの分液漏斗に移し、ＮａＣｌ飽和水溶液（３ｘ１００ｍＬ）で洗った。一体化した水層をヘキサン（３ｘ３００ｍＬ）で逆洗し、一体化した有機層をＭｇＳＯ４上で乾燥させ、真空蒸発させて琥珀色の油を得た。この油をＭｅＯＨ（４００ｍＬ）に溶解させた。調製したばかりの多量のＮａＯＭｅを加えてｐＨを＞１０に調整し、反応混合物を２時間加熱還流させた。この反応混合物をＡｃＯＨで中和し、蒸発乾燥させ、６．５ｘ１００ｃｍ（シリカの高さ４０ｃｍ）のフラッシュカラム内のシリカゲルでクロマトグラフィーを行い、０〜３０％のＥｔＯＡｃ／ヘキサンで溶離させて、所望の生成物である淡黄色の油を得た。収率は８０％を超えた。
【００９２】
Ｂｎ（ＳｉＭｅ２ＣＨ２）ｎＯＨ ４ｎのＢｎ（ＳｉＭｅ２ＣＨ２）ｎＯＣＯ２Ｎ（ＣＯＣＨ２）２ ５ｎへの転換
トリホスゲン（６０ｇ，０．２モル）をＣＨ２Ｃｌ２（２００ｍＬ）に溶解させ、温度計、滴下漏斗およびＮ２インレットを装備した１Ｌの三つ口フラスコ内で、Ｎ２の存在下で０℃で攪拌した。Ｎａ２ＣＯ３（６５ｇ，０．６モル）を加え、次にＢｎ（ＳｉＭｅ２ＣＨ２）ｎＯＨ（０．１３モルを２００ｍＬのＣＨ２Ｃｌ２に溶解させたもの）を３０分間かけて滴下により加えた。その後、氷／アセトン浴を室温にした。反応混合物を一夜攪拌し、焼結ガラス漏斗によってろ過し、反応容器をＰｈＣＨ３（２００ｍＬ）で濯いだ。溶液を真空中で濃縮して、無色の油を得た。この油をＣＨ２Ｃｌ２に溶解させ、氷浴中でＮ２の存在下で撹拌した。Ｎ−ヒドロキシスクシニミド（３０ｇ，０．２６モル）を加え、次にＥｔ３Ｎ（４０ｍＬ，０．２８モル）を１５分間かけて滴下により加え、得られた濁った混合物を室温で１時間攪拌した。反応混合物をヘキサン（６００ｍＬ）で希釈し、ＮＨ４Ｃｌ飽和水溶液（３ｘ１００ｍＬ）で洗い、一体化した水相をヘキサン（２ｘ２００ｍＬ）で逆洗した。一体化した有機相をＭｇＳＯ４上で乾燥させ、真空中で濃縮して琥珀色の油を得た。この琥珀色の油を６．５ｘ１００ｃｍ（シリカの高さ４０ｃｍ）のフラッシュカラム内のシリカゲルでクロマトグラフィーを行い、２０〜５０％のＥｔＯＡｃ／ヘキサンで溶離させて琥珀色のシロップを得た。収量はほぼ７５％を超えた。
【００９３】
ヘパリンをＢｎ（ＳｉＭｅ２ＣＨ２）ｎＯＣＯ２Ｎ（ＣＯＣＨ２）２ ５ｎと抱合化させて６ｎ，ｘを得る。
【００９４】
ヘパリン（アンモニウムイオンがなく、平均分子量１０，０００；１００ｇ，１０ｍｍｏｌ）を２Ｌのフラスコ内で攪拌してＨ２Ｏ（５００ｍＬ）に溶解させた。ＤＭＦ（４００ｍＬ）を加え、続いてＤＭＡＰ（１．６ｘｇ、１３ｘｍｍｏｌ）を加えた。ＤＭＦ（１００ｍｌ）に溶解させたＢｎ（ＳｉＭｅ２ＣＨ２）ｎＯ−ＣＯ２（ＣＯＣＨ２）２， ５ｎ（１０ｘｍｍｏｌ）を加え、得られた乳白色の混合物を室温で＞２４時間攪拌した。反応混合物を、水の大部分を蒸発させることにより濃縮し、続いてアセトン（２Ｌ）によって摩砕した。この白い懸濁液を焼結ガラス漏斗によってろ過し、白色の固形の残渣を得た。この粗材料をアセトンを用いたソックスレー抽出によって一夜精製し、白色の粉末を得た。収率はほぼ９５％を超えた。
【００９５】
ヘパリン１分子当たりの置換ユニットの平均数を、ジメチルメチレンブルーを用いて測定された、加水分解された置換ユニットベンジル−トリ（ジメチルシリル−メチル）−ＯＨとヘパリンのモル比の比較に基づいて推定した。ヘパリンは、Ｘａ因子特異的色素産生基質によって測定される、ヘパリンによって誘発される抗トロンビン／Ｘａ因子の抑制を測定する、市販の酵素結合アッセイによって検出した。
実施例２　シリル−ヘパリン被覆組成物を表面に塗布する技術
実施例１のシリル−ヘパリン複合体は、６０％エタノ−ル水溶液中の１％溶液（ｗ／ｖ）の被覆溶液として使用された。材料をシリル−ヘパリンで１５分間、３７℃で被覆した。次いで被覆された材料を徹底的に水で濯ぎ、空気乾燥させ、使用するまで貯蔵した。
【００９６】
もう一つの実施形態では、シリル−ヘパリン複合体を、静かに攪拌しながら蒸留水に溶解させ、イソプロピルアルコールまたはアセトニトリルなどの有機溶媒を、その有機溶媒が体積のおよそ３分の２を構成するように加えた。例えば実施例１のシリル−ヘパリン複合体１００ｍｇを蒸留水２７ｍｌに、静かに攪拌しながら溶解させ、次いでイソプロピルアルコールまたはアセトニトリル５３ｍＬを加え、溶液中のシリル−ヘパリン複合体の濃度が約０．１２５％になるようにした。他の実施形態では、得られる溶液のシリル−ヘパリン複合体濃度が、溶液の重量を基準にして０．０１と１０パ−セントの間であった。被覆すべき材料を高めの温度、通常３０℃〜５０℃の溶液に約１０分間浸し、その後室温で約２０分間放置した。被覆が施された材料を被覆溶液から取り出し、乾燥前に蒸留水または生理食塩水で徹底的に洗浄した。
実施例３　イオン環境に曝露される表面上のヘパリン被覆組成物の安定性
実施例２に従って被覆を施したさまざまな表面を、３％（重量）塩化ナトリウム溶液で洗った後、ヘパリン活性について評価した。表面ヘパリンの活性を、Ｓｉｇｍａ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、ヘパリン、手順Ｎｏ．ＣＲＳ １０６に記述されている技術に従ってｍＩＵ／ｃｍ２で測定した。
【００９７】
塩化ナトリウムで洗った後のさまざまな表面上の平均ヘパリン活性の評価から得られた結果を下の表１に記す。被覆溶液中の共有結合複合体の濃度は０．２５％（Ｗ／Ｖ）であった。
【００９８】
【表１】
2004505124.tif 000008
【００９９】
実施例４　フィブロネクチンを付着させる前のシリル−ヘパリン塗布
塩化ベンジルマグネシウムを連続的にクロロ（クロロメチル）ジメチルシランで処理し、ベンジル−（１，２テトラメチル）ジシリル化合物を得た。ベンジルジシリル化合物を修飾して活性化Ｎ−ヒドロキシ炭酸スクシニミジルを形成し、更にこれをヘパリンと抱合化させて、ベンジル−（１，２ジメチル）ジシリルヘパリンを得た。これを下の図式３に示す。
【０１００】
【化９】
2004505124.tif 000009
【０１０１】
シリル−ヘパリンは酸性化させた７０％エタノ−ル水溶液に溶解した１％溶液の形で使用した。ウェルを被覆するために、シリル−ヘパリン溶液を各ウェルに２０μＬずつ１５分間、５０〜６０℃で塗布した。次いでウェルを数回、生理食塩水中で濯ぎ、空気乾燥させた。接触表面に被覆を施すために、接触表面を１％シリル−ヘパリン溶液に１５分間、５０〜６０℃で浸漬し、水または生理食塩水中で徹底的に濯いだ。
【０１０２】
シリル−ヘパリン複合体は、任意のポリマー基板に塗布して医療用機器または他の体内移植可能なデバイスを形成し、あるいは被覆または他の方法で医療用機器または他の体内移植可能なデバイスの表面を形成することができる。この複合体を、前述のように、ポリスチレンおよびポリウレタンのポリマー表面に塗布した。ポリマー基板は、例えばポリラクチド、ポリラクチド：ポリグリコリド、およびポリカプロラクトンなどの生分解ポリマーを含む。このポリマー基板にシリル−ヘパリン複合体を塗布した。シリル−ヘパリン複合体はまた、任意の金属基板に塗布することができる。
実施例５　フィブロネクチンのシリル−ヘパリン被覆された基板への付着
フィブロネクチンを、実施例４のシリル−ヘパリン被覆された接触表面に、０．９％生理食塩水に２０μｇ／ｍＬのウシ血漿フィブロネクチンを溶解させた溶液中でのインキュベ−ションによって塗布した。３０分後に濯いで、結合していないフィブロネクチンを除去した。次いでシリル−ヘパリン−フィブロネクチンの被覆を施した接触表面を直接使用するか、または空気乾燥させて後の使用のために保存した。
実施例６　ヘパリンとフィブロネクチンの検出
実施例４に記述したような、シリル−ヘパリンで被覆された接触表面に、実施例５で記述したような、シリル−ヘパリン−フィブロネクチンを付着させたものを用いて、分析アッセイによってヘパリンとフィブロネクチンの存在を検出した。ヘパリンは、特異的色素産生基質によって測定される、ヘパリンによって誘発される抗トロンビン／Ｘａ因子の抑制を測定する市販の酵素結合アッセイキット（シグマケミカル社，セントルイス）によって検出した。酵素抑制アッセイは低付着性の９６ウェルプレートを用いて、メーカーの指示に従って行った。
【０１０３】
両親媒性ヘパリンが未知の変数を酵素抑制アッセイに持ち込まなかったことを確認するために、低付着性の９６ウェルプレートに入れたヒドラジン活性化ビオチンを用いて、第二のアッセイを行った。ヒドラジン活性化ビオチンの溶液を、無被覆またはシリル−ヘパリン複合体被覆を施したウェルに加えた。溶液は、Ｅｚ−ｌｉｎｋビオチン−ＬＣヒドラジン（ピアスケミカル社）３５０ｇを含有する０．１Ｍの酢酸ナトリウムのｐＨ５．２の溶液であった。３０分後に、ウェルを水中ですすぎ、５％デキストロ−ス中で急冷した。血清２０％と、１：１０００に希釈したセイヨウワサビペルオキシダーゼ抱合化アビジン（ＨＲＰＯ−アビジン）を含有するＰＢＳの溶液を加えた。３０分後に、結合していない材料を濯ぎ、色原体（２，２’−アジノビス３−エチルベンゾチアゾリン−６−硫酸）（ワンステップＡＢＴＳ、ピアスケミカル社）の色原体溶液を加えた。発色したとき、分取した０．２Ｍの硫酸を加えて反応を停止させ、吸光度を６５０ｎｍで検出した。
【０１０４】
フィブロネクチンは免疫化学的に検出した。アッセイは、低付着性の９６ウェルプレートの無被覆、フィブロネクチン被覆およびシリル−ヘパリン／フィブロネクチン被覆を施したウェルを用いて行った。飽和量のゼラチンとウサギ抗ヒト−フィブロネクチン（ウシ−フィブロネクチンと交差反応を起こし得ることが既知である）を含有するＰＢＳをウェルに加えた。３０分後に一次抗体を除去し、プレートを濯ぎ、飽和量のゼラチンとヤギ抗ウサギＩｇＧを含有するＰＢＳの溶液を加えた。３０分後に結合していない材料を濯ぎ落とし、ＡＢＴＳの色原体溶液（ワンステップＡＢＴＳ、ピアスケミカル社）を加えた。発色したとき、分取した０．２Ｍの硫酸を加えて反応を停止させ、吸光度を６５０ｎｍで検出した。
実施例７　接着の研究に使用した細胞
ＧＳ−９Ｌ細胞（ラット神経膠肉腫）、Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２（マウス線維芽細胞）、Ｊｕｒｋａｔ（ヒトＴ細胞）、ウシ大動脈内皮（ＢＡＥ）細胞およびラット−リンパ球を含む幾つかの細胞タイプを使用した。ＧＳ−９Ｌ細胞とＣ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞は素材段階（ｌｏｇ ｐｈａｓｅ）で増殖させ、ヴェルセンを用いて培養容器から分離し、遠心分離によって回収した。Ｊｕｒｋａｔ細胞は単独細胞懸濁液の形で増殖させ、遠心分離によって回収した。ラット−リンパ球はヘパリン添加血液から密度勾配分離法によって、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ（登録商標）培地を通じて回収した。回収した細胞を低速遠心分離によって一度濯ぎ、ピルビン酸塩を含有する、血清を含まないＤｕｌｂｅｃｃｏの修飾イーグルズ培地（ＤＭＥＭ）中または１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含有する、ピルビン酸塩を補ったＲＰＭＩ １６４０中に懸濁させた。これに続く接着の研究では、１００μＬ中に細胞を１０４含む液から分取して使用した。
【０１０５】
これらの細胞は、プレーティングの後、反転位相差顕微鏡で検査した。初期播種から４日までの選択された時点に、細胞を３回、生理食塩水で濯ぎ、緩衝液を加えた１０％のホルマリンまたは３５％のエタノ−ル中で固定した。ある場合には、細胞を０．０１％のクリスタルバイオレット水溶液でその場染色した。付着量は目視で評価し、または正確に計量した。結合した細胞の相対数を確証するために、クリスタルバイオレットで染色した細胞を、０．１％のドデシル硫酸ナトリウムと０．３８Ｍのトリスを含む７０％エタノ−ルの溶液に溶解させ、ＳｃｒａｇｇとＦｅｒｒｅｉｒａ（Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ １９８：８０−５， １９９１）およびＧｒａｎｄｏ他（Ｓｋｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ ６：１３５−４７， １９９３）の方法を用いて、６１０ｎｍで吸光度を測定した。
実施例８　細胞の付着
実施例７の細胞を無処理のポリスチレン製ウェル、実施例４のようにシリル−ヘパリンで被覆したウェル、実施例５のようにシリル−ヘパリン−フィブロネクチンで被覆したウェル、および実施例５のようにインキュベーションによってフィブロネクチンだけで被覆したウェルに加えた。表２に示すように、低付着性の、名目上非接着性とされるポリスチレン上の血清を含む培地中で培養したＣ３Ｈ１０Ｔ１／２線維芽細胞、ＧＳ−９Ｌ神経膠肉腫、Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞、ウシ大動脈内皮（ＢＡＥ）細胞およびラット−リンパ球は、基板に付着しなかった。同様に、シリル−ヘパリンだけの上で培養した細胞も付着しなかった。ウシ−フィブロネクチンで前処理した後に播種した場合は、単離されたＣ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞と単離されたＧＳ−９Ｌ細胞が付着しているのが確認された。シリル−ヘパリン−フィブロネクチン上で培養した場合は、ＣＨ３１０Ｔ１／２細胞，ＢＡＥ細胞およびＧＳ−９Ｌ細胞は急速に付着し、基板上に広がった。細胞は血清を含む培地中に１０４細胞／ウェルの濃度で播種した。
【０１０６】
【表２】
2004505124.tif 000010
【０１０７】
実施例９　接着と細胞拡散
実施例８に記述した方法を用いて、ＧＳ−９Ｌ細胞， Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞およびＢＡＥ細胞をシリル−ヘパリン−フィブロネクチン上に播種してから１時間後までに接着させた。細胞の多くは、基板の上に拡散する徴候を示した。２時間経過するまでに細胞の殆どすべてが拡散する徴候を示した。シリル−ヘパリン−フィブロネクチン上で２４時間経過したときのＧＳ−９Ｌ細胞、 Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞およびＢＡＥ細胞の形態は、従来の組織細胞容器上で増殖させた細胞と類似していた。細胞は４日経過するまでに増殖して群集した。血清を含まない培地内に播種した細胞は、付着し、拡散したものの、血清を含む培地中ほど良好には付着や拡散をせず、それ以上増殖しなった。細胞を、増殖を支援することが既知の、規定された培地中または血清含有率の低い培地内で増殖させる努力はしなかった。シリル−ヘパリン−フィブロネクチンで被覆したプレート上で平面培養した細胞の培地に１０Ｕのヘパリンを添加したところ、Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２の付着または増殖は阻止されなかった。ＧＳ−９Ｌ細胞およびＣ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞に対する結果を表３に示す。
【０１０８】
【表３】
2004505124.tif 000011
【０１０９】
実施例１０　様々な基板上での使用
シリル−ヘパリン−フィブロネクチン複合体の一般的な適用可能性を、この被覆を実施例４と５の方法を用いて、ポリスチレン、ポリラクチド：ポリグリコリド、ポリカプロラクトン、ポリウレタンおよびステンレス鋼を含むさまざまな表面に塗布することにより評価した。上の実施例９におけると同様、Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞はポリスチレンに付着しなかった。Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞は、ポリウレタンにも付着しなかった。しかしこの細胞はポリラクチド：ポリグリコリドとポリカプロラクトンにはかなり良く付着し、ステンレス鋼には非常に良く付着した。基板のいかんにかかわらず、シリル−ヘパリンの被覆を施すと、細胞付着が本質的に消滅した。細胞付着の阻止は、細胞増殖を支援することが既知の表面、例えばステンレス鋼においてさえ確認された。細胞を最高４日まで培養しても、細胞付着は認められなかった。ヘパリンだけでプレートを処理した場合は、付着は阻止されなかった。フィブロネクチン単独では、ポリスチレンへの細胞の付着はあまり著しくは支援されなかった。しかしフィブロネクチンは、細胞のポリウレタンおよびポリラクチド：ポリグリコリドへの付着を改善し、またそれより度合は小さいが、ポリカプロラクトンへの付着も改善した。シリル−ヘパリン−フィブロネクチンは、全ての基板に対する細胞密度を、無被覆の表面に対して相対的に増大させ、ポリカプロラクトン上の細胞密度を約２倍増大させた。これらの結果を表４にまとめてある。
【０１１０】
【表４】
2004505124.tif 000012
【０１１１】
＊クリスタルバイオレット染色によって測定した
関連した研究において、シリル−ヘパリン複合体が、ポリスチレン、ヒドロゲル被覆ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリウレタン、ポリカプロラクトン、ポリ塩化ビニル、ステンレス鋼およびチタンを含むさまざまな材料に結合することを確証するために、ヘパリン特異的アッセイとジメチレンブルー染料取り込みを使用した。シリル−ヘパリン複合体の装填効率は基板によって異なるが、一般に１ｃｍ２当たりヘパリン１０〜４０ｍＩＵであった。
実施例１１　フィブロネクチンとシリル−ヘパリンの最適濃度の測定
Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞の付着を支援するのに最適なフィブロネクチンとシリル−ヘパリンの量を図１に示すような交差滴定によって測定した。フィブロネクチンに対するＥＣ５０はおよそ０．５μｇ／ウェル、シリル−ヘパリンに対するＥＣ５０は約８．７μｇ／ウェルであった。フィブロネクチン希釈溶液の細胞付着曲線は急速な下降を示し、閾効果を示唆していた。シリル−ヘパリンの曲線の下降はよりゆるやかであった。連続希釈の後で測定した基板上のシリル−ヘパリンの相対量曲線は、一般に細胞付着曲線に従っていた。シリル−ヘパリンに結合したフィブロネクチンの相対量曲線は、細胞付着曲線を映していなかった。
【０１１２】
図１において、Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞の付着を支援するのに必要な量を測定するために、フィブロネクチン（Δ−−−Δ）またはシリル−ヘパリン（・−−・）を滴定した。希釈はすべて、低付着性ポリスチレンの９６ウェルプレートのウェルで４倍に希釈することにより行った。フィブロネクチンの滴定のために、実施例４に記述したように、７０％エタノ−ルに溶解させた、３０μｇ／ウェルのシリル−ヘパリンを塗布した。濯いだ後、フィブロネクチンを、４μｇ／ウェルから始めて、リン酸緩衝生理食塩水で連続２倍希釈して塗布した。シリル−ヘパリンの滴定のために、初期濃度３０μｇ／ウェルのシリル−ヘパリンを７０％エタノ−ルで連続２倍希釈して塗布した。次いで生理食塩水に溶解させた４μｇ／ウェルのフィブロネクチンを塗布した。培地中の細胞の濃度は１０４細胞／ウェルであった。これら両方の実験に対して、細胞を付着のため２４時間放置し、次いで緩衝ホルマリン中で濯ぎ、固定した。細胞を５分間、０．０１％水性クリスタルバイオレットで染色し、吸光度を６１０ｎｍで測定した。
【０１１３】
図２は、連続２倍希釈溶液中の結合したヘパリンとフィブロネクチンの、付着細胞密度に対する相対量を示している。図２Ａでは、結合したヘパリン（■）の相対量が、フィブロネクチン（●）（４μｇ／ウェル）との複合化の後の、引き続く付着細胞密度と比較されている。図２Ｂでは、シリル−ヘパリン（３００μ／ウェル）で被覆されたウェルに結合したフィブロネクチン（ＦＮ）の相対量が、フィブロネクチンとの複合化の後に得られた付着細胞密度と比較されている。細胞密度はクリスタルバイオレットの最大吸光度のパ−セントで表す。ヘパリンは酵素結合アッセイで検出し、フィブロネクチンは免疫化学的に検出した。
実施例１２　他の接着分子の使用。
【０１１４】
実施例４のシリル−ヘパリンで被覆された接触表面に、２０μｇ／ｍＬの無傷のマウス−ラミニンを含む０．９％生理食塩水中でのインキュベ−ションによって、ラミニンを付着させた。３０分後に濯いで、結合していないラミニンを除去した。実施例８の研究と類似の研究においては、Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞をシリル−ヘパリン−ラミニン複合体で被覆した表面に付着させた。
実施例１３　様々なシリル−ヘパリン接着分子の使用
シリル−ヘパリン複合体を、表５に示すいくつかの接着分子に結合する能力に関して評価した。シリル−ヘパリン複合体はフィブリノーゲンならびに、ＩＶ型コラ−ゲンおよびフィブロネクチンを含む他のいくつかの接着分子に結合した。２時間後のＣ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞の、シリル−ヘパリン複合体及び表に挙げた接着分子で被覆された９６ウェルヒドロゲル−ポリスチレンプレートのウェルへの接着を、クリスタルバイオレットによる染色によって検出した。たんぱく質は全て、緩衝生理食塩水中１００μｇ／ｍｌの濃度で使用した。血清は希釈しないで使用した。緩衝生理食塩水から得られた値に関する統計的有意性をスチュ−デントｔ検定により評価した。＊はｐ＜０．０５、＊＊はｐ＜０．０１、＊＊＊はｐ＜０．００１を示す。
【０１１５】
【表５】
2004505124.tif 000013
【０１１６】
実施例１４　増殖因子分子と共に使用するシリル−ヘパリン複合体の調製
実施例１に一般的に開示されている方法で、シリル部分当たり３つのシリル単位をもつシリル−ヘパリンを調製した。ヘパリン１分子当たりのシリル部分の平均数を、加水分解された置換単位ベンジル−トリ（ジメチルシリル−メチル）−ＯＨとジメチルメチレンブルーを使用して測定したヘパリンのモル比の比較に基づいて推定した。ヘパリンは、Ｘａ因子特異的色素産生基質によって測定される、ヘパリンによって誘発される抗トロンビン／Ｘａ因子の抑制を測定する、市販の酵素結合アッセイによって検出した。このシリル−ヘパリン複合体は６０％エタノール水溶液中の１％溶液（ｗ／ｖ）の被覆溶液で使用された。接触表面は、３７℃で１５分間、シリル−ヘパリンで被覆した。ウェルは、水中で徹底的に濯ぎ、空気乾燥し、使用まで保存した。
実施例１５　シリル−ヘパリン複合体およびヘパリンによるＦＧＦの結合
ｂＦＧＦのヘパリンアガロ−スへの結合と、実施例１４のさまざまなシリル−ヘパリン複合体への結合とを比較した。ヘパリンアガロ−スはリン酸緩衝生理食塩水中で濯ぎ、１％のウシ血清アルブミンを含むリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ／ＢＳＡ）中で平衡させた。分取して微量遠心管に加え、０．５ｍＬのＰＢＳ／ＢＳＡによって体積を０．５ｍＬに調整した。更に、ヘパリンまたは様々なシリル−ヘパリン複合体を含む１０％ＦＢＳを含むＤｕｌｂｅｃｃｏの修飾イーグルズ培地０．５ｍＬを加えた。分取した５μＬのｂＦＧＦ（５０ｎｇ／ｍＬ）を加え、溶液を攪拌しながら３０分間インキュベ−トした。多数回遠心分離し、ＰＢＳ中で濯いで、結合していないｂＦＧＦを除去した。ウサギ抗ｂＦＧＦ（１：５００）を０．５ｍＬのＰＢＳ／ＢＳＡに加え、この溶液を攪拌しながら１時間インキュベ−トした。濯いだ後、ＰＢＳ／ＢＳＡに溶解したロバ抗ウサギ（１：５００）を加え、１時間インキュベ−トした。濯ぎ、新しいガラス瓶に移した後、色原体（ＡＢＴＳワンステップ、ピアスケミカル社）を加え、反応を起こさせ、次いで５９５ｎｍで検出した。ｂＦＧＦのヘパリン−アガロースへの結合の阻止を、１ヘパリン分子当たり５と２０の間のシリル部分をもつシリル−ヘパリン複合体と、シリル部分に結合していないヘパリンとを比較するのに使用した。このアッセイで使用したヘパリンは、シリル−ヘパリンの合成に使用したものと同じであった。図３に示すように、同一の重量ベースで使用した場合、各シリル−ヘパリン複合体組成物が無修飾のヘパリンと基本的に同じＥＣ５０を与えた。
実施例１６　シリル−ヘパリン複合体によって結合されるＦＧＦの濃度
ウェル表面積０．３２ｃｍ２の、９６ウェルポリスチレン微量定量プレートのウェルを、３０μｌのシリル−ヘパリンによって１５分間、３７℃で被覆した。濯ぎ、空気乾燥させた後、ＰＢＳ／ＢＳＡに溶解させたｂＦＧＦ（シグマ・ケミカル社）を連続２倍希釈し、１５０μｌを分取して加えた。プレートを３７℃で１時間インキュベ−トし、ＰＢＳ中で５回濯いだ。１：５００のウサギ抗ＦＧＦ抗体を含むＰＢＳ／ＢＳＡを１５０μｌ分取して加え、１時間インキュベ−トし、濯いだ。ある場合には、類似の濃度の関連性のないウサギ抗体を使用した（ウサギ抗ＴＧＦ受容体ＩＩ、サンタクルス・バイオテクノロジ−）。１：５００のＨＲＰＯと抱合したロバ抗ウサギＩｇＧを含むＰＢＳ／ＢＳＡを分取して加え、インキュベ−ションと濯ぎの後、ＡＢＴＳ色原体を加えた。抗体溶液はすべて、使用前に０．２μｍフィルタによってろ過した。吸光度を４０５ｎｍで測定した。図４Ａと４Ｂに示すように、ｂＦＧＦは、下は２０ｎｇから上は７５０ｎｇまでの濃度で検出された。発色は高濃度では線形であった。これは、このアッセイの条件下では、ｂＦＧＦに対するシリル−ヘパリン複合体の飽和の上限に達していなかったことを示していた。抗ＦＧＦの代わりに抗ＴＧＦ−ＩＩ（形質転換増殖因子受容体に対抗する、関連性のない抗体）を使用し、同じ抗体希釈を行ったときは、ｂＦＧＦは検出されなかった。濃度４０ｎｇのＴＧＦ−βを増殖因子分子として使用したときは、抗ｂＦＧＦ抗体による活性は検出されなかった。
実施例１７　接着分子がＦＧＦの結合に与える効果
血漿から単離されたマウスＩＶ型コラ−ゲン、ヒト−フィブリノーゲンおよびウシ−フィブロネクチンを、ポリスチレン微量定量プレートのウェルに結合したシリル−ヘパリン複合体に、ＰＢＳ／ＢＳＡ中の濃度１００μｇ／ｍｌで結合させた。選択された接着分子１００μＬを各ウェルに加え、１時間、３７℃でインキュベ−トした。徹底的に洗浄した後、ＰＢＳ／ＢＳＡに溶解させたｂＦＧＦの１５０μｌを分取して各ウェルに加えた。プレートを３７℃で１時間インキュベ−トし、実施例１６のように、それぞれ１：２００と１：５００の一次抗体と二次抗体の希釈溶液を用いて、アッセイを行った。図５に示すように、フィブロネクチンはｂＦＧＦのシリル−ヘパリン接着分子複合体への結合を著しく減少させたが、ＩＶ型コラ−ゲンとフィブリノーゲンへの結合はそれほど著しくない程度に減少させた。
実施例１８　シリル−ヘパリン増殖因子複合体による毛細管の形成
低付着性の９６ウェルプレートに生理食塩水、シリル−ヘパリン複合体、シリル−ヘパリン−フィブリノーゲン複合体またはシリル−ヘパリン−ｂＦＧＦ複合体による被覆を施した。１０％のＦＢＳを含むＤＭＥＭ中のウシ大動脈内皮細胞（５ｘ１０３の細胞）を各ウェルに播種した。細胞を４日間増殖させ、培養液を位相差顕微鏡で検査した。ウシ大動脈内皮細胞は、細胞をシリル−ヘパリン−フィブリノーゲン−ｂＦＧＦで被覆したウェル内で培養した場合は、毛細管の形成と一致した形態的変化を生じた。細胞を、シリル−ヘパリン、シリル−ヘパリン−フィブリノーゲン、フィブリノーゲン、フィブリノーゲンとｂＦＧＦ、またはｂＦＧＦで被覆したウェル内で培養した場合は、管を形成しなかった。シリル−ヘパリン−フィブリノーゲンで被覆した管上では、細胞は本質的に群集した単層を形成していた。
実施例１９　シリル−ヘパリン−ＦＧＦ複合体の解離と生物活性
６ウェルクラスタプレートに５ｘ１０４個のウシ大動脈内皮細胞を播種した。底に３μｍの細孔の空いた細胞培養インサートメンブレン（直径２５ｍｍ）を各ウェルに置いた。縫合糸をシリル−ヘパリン−ｂＦＧＦまたはシリル−ヘパリンで被覆した。被覆された、または無被覆の１０ｃｍの縫合糸を各ウェルに入れ、縫合糸を覆うのに十分な培地を加えた（合計３ｍＬ）。無被覆の縫合糸を入れたインサート１セットに、ｂＧＦＧを直接培地に添加することによってｂＦＧＦを５０ｎｇ加え、正の対照試料として使用した。細胞を４日間増殖させ、次いで固定し、クリスタルバイオレットで染色した。その後、染色を０．４％のＳＤＳを含むエタノ−ル水溶液中へ溶出させ、５９５ｎｍで測定した。シリル−ヘパリン−ｂＦＧＦ被覆を施した縫合糸から放出されるｂＦＧＦは、分離している透過性３μｍメンブレンを通過することができ、図６に示すように、４日目の終りに内皮細胞の増殖を刺激する作用を局所的に示した。シリル−ヘパリン−ｂＦＧＦ複合体で被覆された縫合糸が入っており、メンブレンによって分離されているウェル内では、細胞数が、可溶性ｂＦＧＦを加えた対照培養細胞とほぼ同程度に増加した。シリル−ヘパリン複合体だけで被覆された縫合糸では、細胞数は増加しなかった。
実施例２０　シリル−ヘパリン−ｂＦＧＦで被覆された縫合糸の、筋肉内への埋め込み
ビクリル縫合糸材料に、シリル−ヘパリン複合体を含有する溶液で被覆を施し、またはシリル−ヘパリン複合体を含有する溶液で被覆を施した後、上述のようにｂＦＧＦに浸漬した。次いで縫合糸を徹底的に濯ぎ、空気乾燥させ、１６ゲ−ジ針に付け、使用するまで、典型的には一夜、貯蔵した。ラットの成体に麻酔をかけてから縫合糸をその大腿筋に通し、結び目と外科用クリップで固定した。２週間後にこのラットを安楽死させ、縫合糸を通した部分を切り取り、ホルマリン中で固定し、標準的な組織学的方法で処理した。２週間で、シリル−ヘパリン−ｂＦＧＦ複合体で被覆された縫合糸では、無被覆の対照縫合糸およびシリル−ヘパリン複合体で被覆された縫合糸に比べて、埋め込みを囲む領域に細胞質の著しい増加が見られた。図７に示すように、シリル−ヘパリン−ｂＦＧＦ複合体で被覆された縫合糸の周囲の肉芽組織の直径は、対照縫合糸またはシリル−ヘパリン複合体で被覆された縫合糸のいずれよりも実質的に大きかった。また、シリル−ヘパリン複合体で被覆された縫合糸材料の周囲の組織は、対照縫合糸のそれよりも肉芽の範囲が小さくなる傾向が見られた。
実施例２１　免疫測定法による血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）の検出
抗体溶液は全て、使用前に０．２μｍフィルタによってろ過し、１％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有するリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で調製した。９６ウェルポリスチレン微量定量プレートのウェルにシリル−ヘパリン３０μＬで１５分間、３７℃で被覆を施した。ウェルを水中で徹底的に濯ぎ、空気乾燥させた。３０分間、１％のＢＳＡを含むＰＢＳを２５０μＬ加えて、ウェルをブロックした。ブロック溶液を除去した後、ＰＢＳ／ＢＳＡに溶解したＶＥＧＦを１００μＬ、適当な濃度で加えた。プレートを３７℃で１時間インキュベ−トし、水中で５回濯いだ。分取したウサギ抗ＶＥＧＦ抗体を含有するＰＢＳ／ＢＳＡ（１：１２５）を加え、プレートを１時間インキュベ−トした。水中で濯いだ後、セイヨウワサビ−ペルオキシダーゼ抱合化抗ウサギＩｇＧを含有するＰＢＳ／ＢＳＡ（１：１２５）を分取して加え、１時間インキュベ−トした。濯いだ後、市販のキットの色原体（２，２’−アジノビス−３−エチルベンゾチアゾリン−６−硫酸）２００μＬを加え、色を発現させ、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）２％水溶液５０μＬを加えて反応を停止させた。吸光度を４０５ｎｍで測定した。図８に示す結果は、シリル−ヘパリンに結合したＶＥＧＦと結合が線形であったことを示している。
実施例２２　「ｘ」と「ｎ」を変えることが解離に及ぼす影響。
【０１１７】
式３のシリル−ヘパリン複合体を、ａ）シリル部分内のシリルの鎖長（「ｎ」）、およびｂ）ヘパリン分子当たりのシリル部分の数（「ｘ」）を様々に変えることによって、シリル−ヘパリンを合成した。ステンレス鋼に結合したシリル−ヘパリンの在留時間は、シリル−ヘパリン複合体によって変化し、ｎ＝４のとき、在留時間が最も長かった。ヘパリン分子当たりのシリル部分の数を変えたときも、ｘ＝２からｘ＝２０までの範囲で調べたところ、ステンレス鋼上のシリル−ヘパリン複合体の在留時間に影響が及ぼされ、ｘ＝４からｘ＝６までのとき、在留時間が最も長かった。
【０１１８】
上記の諸実施例は、上記の諸実施例において使用したものの代わりに、一般的または具体的に記述された、本発明の反応物質および／または作業条件を使用して繰り返しても、類似の成果を得ることができる。
【０１１９】
本発明は詳細に、特に上述の好ましい実施形態に関して詳しく述べたが、他の実施形態によっても同じ結果を達成することができる。本発明の変形形態および修正形態は当業者に自明であり、添付の特許請求の範囲においては、かかる修正形態およびそれらと均等のものすべてをカバ−することが企図されている。上に引用したすべての参照文献、出願、特許、および刊行物の全開示を、引用によってここに取り込む。
【図面の簡単な説明】
明細書に組み込まれており、明細書の一部を形成する添付の図面は、本発明の幾つかの実施形態を示し、また記述と共に、本発明の原理の説明に役立つ。図面は本発明の好ましい実施形態を説明する目的のみを持ち、本発明を制限するものと解釈すべきではない。
【図１】細胞付着を支援するのに必要なフィブロネクチンとシリル−ヘパリンの量の滴定プロットである。
【図２Ａおよび図２Ｂ】２Ａおよび２Ｂはアッセイによって測定した、２倍連続希釈したヘパリンとフィブロネクチンの溶液によって得られた吸光度を表す。
【図３】免疫化学法で測定された、ヘパリンおよび様々なシリル−ヘパリン複合体による、ヘパリン−アガロースに結合する塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）の阻止の比較を表す。シリル部分はシリル３単位を含み、ヘパリン分子当たり５〜２０のシリル部分が含まれていた。
【図４Ａおよび４Ｂ】４Ａおよび４Ｂは、１：５００（Ａ）と１：２５０（Ｂ）に希釈した一次抗体と二次抗体を用いた、ｂＦＧＦ濃度に対する信号強度のプロットである。このデ−タは平均±標準偏差を示している。
【図５】シリル−ヘパリンと複合化する接着分子がその後のｂＦＧＦの結合に及ぼす影響を示すプロットである。すべての接着分子（フィブロネクチン、フィブリノーゲンおよびＩＶ型コラ−ゲン）が、１００μｇ／ｍＬの濃度でシリル−ヘパリンと複合化し、結合していない材料はｂＦＧＦの結合の前に洗い落とした。このデ−タは平均±標準偏差で、アステリスクはスチュ−デントｔ検定によるｐ＜０．０５を示す。
【図６】４日後にクリスタルバイオレット染色によって測定された、被覆された縫合糸から排出されるＦＧＦ−シリル−ヘパリンが多孔薄膜を通じてウシ大動脈内皮細胞の増殖に及ぼす効果を示すプロットである。デ−タは平均吸光度±標準偏差で、アステリスクはスチュ−デントｔ検定によるｐ＜０．０５を示す。
【図７】無被覆の、およびシリル−ヘパリンまたはＦＧＦ−シリル−ヘパリンで被覆した縫合糸インプラントを包囲している肉芽組織の直径を表す、４つの異なったインプラントの平均のプロットである。
【図８】抗ＶＥＦＧ抗体を用いて検出された、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）のシリル−ヘパリンへの結合のプロットである。
【図１】
2004505124.tif 000017
【図２Ａ】
2004505124.tif 000018
【図２Ｂ】
2004505124.tif 000019
【図３】
2004505124.tif 000020
【図４Ａ】
2004505124.tif 000021
【図４Ｂ】
2004505124.tif 000022
【図５】
2004505124.tif 000023
【図６】
2004505124.tif 000024
【図７】
2004505124.tif 000025
【国際公開パンフレット】
2004505124.tif 000026
2004505124.tif 000027
2004505124.tif 000028
2004505124.tif 000029
2004505124.tif 000030
2004505124.tif 000031
2004505124.tif 000032
2004505124.tif 000033
2004505124.tif 000034
2004505124.tif 000035
2004505124.tif 000036
2004505124.tif 000037
2004505124.tif 000038
2004505124.tif 000039
2004505124.tif 000040
2004505124.tif 000041
2004505124.tif 000042
2004505124.tif 000043
2004505124.tif 000044
2004505124.tif 000045
2004505124.tif 000046
2004505124.tif 000047
2004505124.tif 000048
2004505124.tif 000049
2004505124.tif 000050
2004505124.tif 000051
2004505124.tif 000052
2004505124.tif 000053
2004505124.tif 000054
2004505124.tif 000055
2004505124.tif 000056
2004505124.tif 000057
2004505124.tif 000058
2004505124.tif 000059
2004505124.tif 000060
2004505124.tif 000061
2004505124.tif 000062
2004505124.tif 000063
2004505124.tif 000064
2004505124.tif 000065
2004505124.tif 000066
2004505124.tif 000067
2004505124.tif 000068
2004505124.tif 000069
2004505124.tif 000070
2004505124.tif 000071
2004505124.tif 000072
2004505124.tif 000073
2004505124.tif 000074
2004505124.tif 000075
2004505124.tif 000076
2004505124.tif 000077
2004505124.tif 000078
2004505124.tif 000079
2004505124.tif 000080
2004505124.tif 000081
2004505124.tif 000082
2004505124.tif 000083
【国際調査報告】
2004505124.tif 000084
2004505124.tif 000085