(57)【要約】本発明は、新規ＡｌｃＲ制御要素およびそれをコードする核酸配列、並びに植物などの生物において、遺伝子発現を調節する際のその使用に関する。こうした核酸を含有するＤＮＡ構築物、特に、「遺伝子スイッチ」として作用可能な、本発明の誘導性プロモーター要素および制御要素を含んでなる発現カセットが、本発明のさらなる側面を形成する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
化学的誘導因子の存在下で、ａｌｃ誘導性プロモーターを活性化可能なポリペプチドであって、但し、配列番号１２１に特定されたアミノ酸配列を持たない、前記ポリペプチド。
【請求項２】
配列番号１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、および１２０からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する第一のモチーフを少なくとも含んでなる、請求項１記載のポリペプチド。
【請求項３】
配列番号１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、および１２０からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する第二のモチーフを少なくとも含んでなる、請求項２記載のポリペプチドであって、第二のモチーフが第一のモチーフと同じでない、前記ポリペプチド。
【請求項４】
配列番号１２３に明記するコンセンサスアミノ酸配列を含んでなる、請求項１〜３のいずれか１項記載のポリペプチド。
【請求項５】
配列番号１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、５９、１８、６２、６６からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する、請求項１〜４のいずれか１項記載のポリペプチド。
【請求項６】
アミノ酸配列が、アミノ酸残基の少なくともダブレット（ｄｏｕｂｌｅｔ）反復を複数含んでなり、当該複数の少なくともダブレット反復がポリペプチドの７．５％より多くを構成する、請求項１〜５のいずれか１項記載のポリペプチド。
【請求項７】
アミノ酸配列が、アミノ酸残基の少なくともトリプレット（ｔｒｉｐｌｅｔ）反復を複数含んでなり、当該複数の少なくともトリプレットである反復がポリペプチドの１％より多くを構成する、請求項１〜６のいずれか１項記載のポリペプチド。
【請求項８】
ロイシンの少なくとも６つのダブレット反復、セリンの少なくとも３つのダブレット反復、およびスレオニンの少なくとも４つのダブレット反復を含んでなる、請求項６記載のポリペプチド。
【請求項９】
アラニンの少なくとも３つのダブレット反復、システインの少なくとも１つのダブレット反復、アスパラギン酸の少なくとも１つのダブレット反復、およびプロリンの少なくとも１つのダブレット反復を含んでなる、請求項６記載のポリペプチド。
【請求項１０】
アミノ酸残基の少なくともトリプレット反復を複数含んでなり、当該複数の少なくともトリプレット反復がポリペプチドの１％より多くを構成する、請求項８または請求項９記載のポリペプチド。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか１項記載のポリペプチドをコードする核酸。
【請求項１２】
配列番号１０２、１０１、１０３、７６，７４、７５、７８、７７、３８、６１、４６、６５、７９、７３、５８、１７からなる群より選択される配列を含んでなる、請求項１１記載の核酸。
【請求項１３】
（ｉ）第一のプロモーター、
（ｉｉ）請求項１１または１２記載の第一の核酸であって、それにコードされるポリペプチドが、外因性化学的誘導因子の存在下で、ａｌｃ誘導性プロモーターを活性化可能であり、該核酸が第一のプロモーターの調節下にある、前記第一の核酸、
（ｉｉｉ）外因性化学的誘導因子の存在下で、第一の核酸にコードされるポリペプチドによって誘導可能である第二のプロモーター、および
（ｉｖ）発現が第二のプロモーターの調節下にある、第二の核酸
を含んでなる発現カセット。
【請求項１４】
植物遺伝子発現カセットである、請求項１３記載の発現カセット。
【請求項１５】
第一のプロモーターが恒常性プロモーターである、請求項１３または請求項１４記載の発現カセット。
【請求項１６】
第二のプロモーターが真菌種のａｌｃＡ、ａｌｄＡ、ａｌｃＢ、ａｌｃＲまたはａｌｃＣプロモーターであるか、あるいはそれに由来する制御配列を含有するキメラプロモーターである、請求項１３〜１５いずれか１項記載の発現カセット。
【請求項１７】
第二のプロモーターが、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）種由来のａｌｃＡプロモーターである、請求項１６記載の発現カセット。
【請求項１８】
第二のプロモーターが、偽巣性コウジ菌（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）のａｌｃＡプロモーターである、請求項１７の発現カセット。
【請求項１９】
第二のプロモーターが、配列番号１４７を含んでなる、請求項１８記載の発現カセット。
【請求項２０】
第二のプロモーターが、アスペルギルス属種由来のａｌｃＲプロモーターである、請求項１６記載の発現カセット。
【請求項２１】
第二のプロモーターが、偽巣性コウジ菌、アスペルギルス・ウスツス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｕｓｔｕｓ）、黄色コウジ菌（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｌａｖｕｓ）、またはアスペルギルス・ベルシコロル（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ）由来のａｌｃＲプロモーターである、請求項２０記載の発現カセット。
【請求項２２】
第二のプロモーターが、配列番号３９、配列番号４７、または配列番号６０を含んでなる、請求項２１記載の発現カセット。
【請求項２３】
請求項１３〜２２いずれか１項記載の発現カセットを含んでなる細胞。
【請求項２４】
植物細胞である、請求項２３記載の細胞。
【請求項２５】
発現カセットがゲノムに安定に取り込まれている、請求項２３または請求項２４記載の細胞。
【請求項２６】
請求項２３または請求項２４記載の細胞を含んでなる、植物、あるいはその子孫または種子。
【請求項２７】
細胞において、遺伝子発現を調節するための方法であって、請求項１３〜１９いずれか１項記載の発現カセットで細胞を形質転換し、そして第二の核酸の転写を誘導するため、細胞に外因性化学的誘導因子を適用することを含んでなる、前記方法。
【請求項２８】
外因性化学的誘導因子が、アルコール、ケトン、またはエステルである、請求項２７記載の方法。
【請求項２９】
請求項２６記載の植物において、遺伝子発現を調節する方法であって、植物に外因性化学的誘導因子を適用して、第二の核酸の転写を誘導することを含んでなる、前記方法。
【請求項３０】
化学的誘導因子が、ブタン−２−オン（エチルメチルケトン）、シクロヘキサノン、アセトン、ブタン−２−オール、３−オキソ酪酸、プロパン−２−オール、エタノールまたは式（Ｉ）
【化１】
2004535774.tif 000051
（式中、Ｒ1は低級アルキル、低級アルケニルまたは低級アルキニル基であり、そしてＲ2はＲ2ＣＯＯＨが農学的に許容しうる酸であるような有機基である）
の化合物である、請求項２９記載の方法。
【請求項３１】
アスペルギルス・ウスツス、黄色コウジ菌、アスペルギルス・ベルシコロルまたはアスペルギルス・フミガツス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）から得ることが可能なａｌｃＲプロモーター配列であって、ＡｌｃＲ制御因子タンパク質および外因性化学的誘導因子の存在下で、誘導性プロモーターとして作用する、前記プロモーター配列。
【請求項３２】
配列番号３９（ウスツス）、配列番号４７（ベルシコロル）、配列番号６０（黄色コウジ菌）または配列番号？？（偽巣性コウジ菌）を含んでなる、請求項３１記載のａｌｃＲプロモーター配列。
【請求項３３】
ＡｌｃＲ制御因子タンパク質および外因性化学的誘導因子の存在下で、誘導性プロモーターとして作用する、キメラａｌｃＲプロモーターであって、請求項３１または請求項３２記載のａｌｃＲプロモーター配列の少なくとも一部および異種プロモーター領域を含んでなる、前記プロモーター。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、制御要素およびそれをコードする核酸配列、並びに植物などの生物において、遺伝子発現を調節する際のその使用に関する。本発明はまた、こうした核酸を含有するＤＮＡ構築物、およびこうした構築物を取り込んだ生物にも関する。特に、本発明は、「遺伝子スイッチ（ｇｅｎｅ  ｓｗｉｔｃｈ）」として作用可能な、誘導性プロモーターおよび制御要素を含んでなる発現カセットに関する（ＧＥＮＥＳＷＩＴＣＨは、Ｓｙｎｇｅｎｔａ  Ｇｒｏｕｐ社が所有する商標である）。
【０００２】
組換えＤＮＡ技術は、広い範囲の目的のための、非常に多様な生物の操作を含む。宿主生物にとって外来性（ｆｏｒｅｉｇｎ）である遺伝子の発現、または内因性遺伝子の発現パターンの改変は、生物の特性を修正および／または改善する手段を提供する。
【０００３】
こうした遺伝子の発現は制御要素によって調節され、そしてこうした遺伝子で生物を形質転換する際、適切な制御要素が含まれ、そして遺伝子が望ましい方式で発現されるように配置されるのを確実にすることが重要である。生物に望ましい修正を達成するために、例えば、遺伝子が限定された期間のみ、あるいは特定の細胞または組織でのみ発現されることが必要である可能性がある。
【０００４】
遺伝子スイッチは、バイオテクノロジー研究者の「武器庫（ａｒｍｏｕｒｙ）」に非常に有用な追加物を提供する。表現「遺伝子スイッチ」は、本明細書において、外因性に適用される化学的誘導因子に反応性である、調節配列（ｃｏｎｔｒｏｌ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）およびこうした配列の制御因子（ｒｅｇｕｌａｔｏｒ）を指す。こうした遺伝子スイッチの調節下にある遺伝子を含んでなる生物に、化学的誘導因子を適用するか、または該生物から化学的誘導因子を取り除いて、このようにその遺伝子の発現を制御する。
【０００５】
生産性または品質などの特性を改善するため（作物の場合）、あるいは稔性を調節するため（特にハイブリッド植物の産生において）、あるいは除草剤または殺虫剤に対する抵抗性を導入するための、植物、特に作物植物の形質転換が周知である。一般的に、これは、１以上の植物組織における、１以上の外来性または内因性遺伝子の発現を必要とする。しばしば、これらの遺伝子の一過性発現が必要であり、かつ／または望ましく、そして遺伝子スイッチは、こうした一過性発現を制御するのに特に有用である。
【０００６】
植物操作に特に有用であることが見出されている遺伝子スイッチの例は、真菌生物、偽巣性コウジ菌（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）由来である。この生物は、多様なアルコールまたはケトンの存在下で増殖させた場合のみ、酵素アルコールデヒドロゲナーゼＩ（ＡＤＨ１；ａｌｃＡ遺伝子によってコードされる）を発現する。誘導は、恒常的に（ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅｌｙ）発現されるａｌｃＲ遺伝子にコードされる制御因子タンパク質を通じて中継される。誘導因子（アルコールまたはケトン）の存在下で、制御因子タンパク質はＡＤＨ１の発現を活性化する。これは、高レベルのＡＤＨ１酵素が誘導条件下で（すなわちアルコールまたはケトンが存在する際に）産生されることを意味する。逆に、ａｌｃＡ遺伝子（そしてしたがってＡＤＨ１）は、誘導因子の非存在下では、発現されない。要約すると、ａｌｃＡプロモーターは、誘導因子の存在下でＡｌｃＲ制御因子タンパク質によって（すなわち該タンパク質／アルコールまたはタンパク質／ケトンの組み合わせによって）活性化される誘導性プロモーターである。ａｌｃＡの発現および酵素の産生はまた、グルコースの存在下で抑制される。
【０００７】
ａｌｃＲおよびａｌｃＡ遺伝子（それぞれのプロモーターを含む）はどちらも、偽巣性コウジ菌からクローニングされ、そして配列決定されてきている（Ｌｏｃｋｉｎｇｔｏｎ  ＲＡら，  １９８５，  Ｇｅｎｅ，  ３３：１３７−１４９；Ｆｅｌｅｎｂｏｋ  Ｂら，  １９８８，  Ｇｅｎｅ，  ７３：３８５−３９６；Ｇｗｙｎｎｅら，  １９８７，  Ｇｅｎｅ，  ５１：２０５−２１６）。このａｌｃＲ遺伝子のヌクレオチド配列は、本明細書に記載するような配列番号１２２に対応し、そしてそれにコードされるポリペプチド配列は、配列番号１２１に対応する。
【０００８】
アルコールデヒドロゲナーゼ（ａｄｈ）遺伝子は、特定の植物種で調べられてきている。トウモロコシ（ｍａｉｚｅ）および他の穀類において、これらは嫌気性条件によってスイッチを入れられる。トウモロコシ由来のａｄｈ遺伝子のプロモーター領域は、嫌気性条件下での発現に必要な３００ｂｐの制御要素を含有する。しかし、ＡｌｃＲ制御因子タンパク質に同等なものは、いかなる植物にも見出されていない。したがって、ａｌｃＡ／ａｌｃＲ型の遺伝子制御系は、植物では知られていない。したがって、植物細胞におけるａｌｃＲの恒常性発現（ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）は、いかなる内因性のａｄｈ活性の活性化も生じない。したがって、ａｌｃＡ／ａｌｃＲ遺伝子制御系は、いかなる他の植物細胞機能にも干渉せず、また該機能を中断せずに、目的の遺伝子（例えば導入遺伝子）の発現を調節するのに使用可能であるため、植物使用に特に有用な遺伝子スイッチである。
【０００９】
ＷＯ９３／２１３３４は、遺伝子スイッチのような系を含む、トランスジェニック植物の産生を記載する。この文書は、制御因子タンパク質である偽巣性コウジ菌のＡｌｃＲタンパク質をコードする制御因子配列に機能可能であるように連結した第一のプロモーター、および目的の遺伝子に機能可能であるように連結した、偽巣性コウジ菌ａｌｃＡプロモーターまたはａｌｃＡプロモーターの要素を含むキメラプロモーターなどの誘導性プロモーターを含んでなる、化学的に誘導可能な植物遺伝子発現カセットを具体的に記載する。外因性誘導因子の存在下で、制御因子タンパク質は、誘導性プロモーターを活性化し、こうして目的の遺伝子の活性化を仲介する。適用可能な外因性化学的誘導因子には、Ｃｒｅａｓｅｒら（１９８４）に記載されるもの、例えばブタン−２−オン（エチルメチルケトン）、シクロヘキサノン、アセトン、ブタン−２−オール、３−オキソ酪酸、プロパン−２−オールおよびエタノールが含まれる。ＷＯ００／４４９１７に記載されるものなどのエステルもまた、外因性誘導因子として使用可能である。
【００１０】
現在、ＡｌｃＲ中、異なる機能ドメインがどこに位置するかに関する手がかりを提供する情報は非常にわずかしか入手可能でない。ＡｌｃＲは、それ自体のプロモーターを自己制御すると共に、ａｌｃＡ（アルコールデヒドロゲナーゼをコードする）およびａｌｄＡ（アルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする）を含む遺伝子クラスターの活性を制御する転写因子であることが知られる。ＡｌｃＲは、Ｚｎ[2]−Ｃｙｓ[6]真菌型、二核ファミリーの転写因子に属する。酵母において、このファミリーは、５８ポリペプチドを含んでなる（例えばＧａｌ４、ＵＧＡ３など）。ＡｌｃＲタンパク質は、長さ７８０アミノ酸であり、このうち、アミノ酸１２〜５０はＤＮＡ結合領域を含んでなり、このことは、ＤＮＡ結合ドメインのＣ末端を越えて位置する７２０アミノ酸が性質決定されないままであることを示唆する（図１を参照されたい）。Ｚｎ[2]−Ｃｙｓ[6]を含んでなるＡｌｃＲ  ＤＮＡ結合ドメインのＮＭＲ構造がＣｅｒｄａｌら（１９９７，  ＦＥＢＳ  ｌｅｔｔｅｒ  ４０８，  ２３５−２４０）に報告されている。これは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、ＡｌｃＲが単量体としてＤＮＡに結合可能であることを示す。しかし、ｉｎ  ｖｉｖｏの証拠は、ＡｌｃＲタンパク質がホモ二量体としてまたは別の因子の補助で結合するかいずれかであることを示す（Ｋｕｌｍｂｕｒｇ，  Ｐら，  １９９２，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １２，  １９３２−１９３９；Ｐａｎｏｚｚｏ，  Ｃ．ら，  １９９７，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２７２，  ２２８５９−２２８６５）。ＡｌｃＲタンパク質をＮ末端領域での５アミノ酸欠失およびＡｒｇ６での単一アミノ酸改変を含んで産生した突然変異研究によって、こうした突然変異タンパク質が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで単量体ＤＮＡ結合部位に結合不能であり、そしてｉｎ  ｖｉｖｏで（アスペルギルス属において）、エタノールの存在下で、ａｌｃＡ遺伝子発現を誘導することが不能であることが立証された。このように突然変異ＡｌｃＲがａｌｃＡを誘導不能であるのは、突然変異ＡｌｃＲがそれ自体のプロモーターまたはやはりその調節下にある他の遺伝子のプロモーターに結合不能である結果と示された（Ｎｉｋｏｌａｅｖ，  Ｉ．ら（１９９９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ３１，  １１１５−１１２４）。
【００１１】
現在までの研究は、ＡｌｃＲ  ＤＮＡ結合ドメインに重点を置いてきている。トランス活性化、リガンド依存トランス活性化、リガンド結合、および核局在化に関与するものなどの他の機能ドメインは、構造的に定義されないかまたは性質決定されないままである。
【００１２】
本発明者らは、異なるアスペルギルス属種由来の新規ａｌｃＲポリヌクレオチド配列の単離および性質決定を通じて、偽巣性コウジ菌のＡｌｃＲ制御因子タンパク質の新規ポリペプチド相同分子種（ｏｒｔｈｏｌｏｇｕｅ）ファミリーを同定し、そして性質決定した。ファミリーの性質決定によって、ＡｌｃＲ制御因子タンパク質活性に機能的にそして／または構造的に重要と考えられる保存アミノ酸モチーフが複数同定されてきている。これらの新規ａｌｃＲ相同分子種は、上述の遺伝子スイッチ系において使用される偽巣性コウジ菌ａｌｃＲ遺伝子の有用な代替物を提供する。
【００１３】
本発明によれば、化学的誘導因子の存在下で、ａｌｃ誘導性プロモーターを活性化可能なポリペプチドであって、但し、配列番号１２１に明記するアミノ酸配列を持たない、前記ポリペプチドが提供される。
【００１４】
表現「ａｌｃ誘導性プロモーター」は、本明細書において、上述の遺伝子クラスターの一部である、誘導性プロモーターいずれかに関する。これらには、例えば、真菌から得ることが可能な、ａｌｃＡ、ａｌｄＡ、ａｃｌＢ、ａｌｃＲまたはａｌｃＣプロモーターが含まれる。例えば、ａｌｃ誘導性プロモーターは、アスペルギルス属種から得ることが可能なａｌｃＲ遺伝子プロモーター、例えば偽巣性コウジ菌、Ａ．ウスツス（Ａ．  ｕｓｔｕｓ）、Ａ．フミガツス（Ａ．  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）、Ａ．ベルシコロル（Ａ．  ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ）、黄色コウジ菌（Ａ．  ｆｌａｖｕｓ）、Ａ．ファベオラツス（Ａ．  ｆａｖｅｏｌａｔｕｓ）、Ａ．コルガツス（Ａ．  ｃｏｒｒｕｇａｔｕｓ）、Ａ．クレイストミヌツス（Ａ．  ｃｌｅｉｓｔｏｍｉｎｕｔｕｓ）、Ａ．ナバホエンシス（Ａ．  ｎａｖａｈｏｅｎｓｉｓ）、Ａ．ヘテロタリクス（Ａ．  ｈｅｔｅｒｏｔｈａｌｌｉｃｕｓ）、Ａ．スペクタビリス（Ａ．  ｓｐｅｃｔａｂｉｌｉｓ）、またはＡ．ビコロル（Ａ．  ｂｉｃｏｌｏｒ）由来のａｌｃＲプロモーターであることが可能である。特に適切なａｌｃＲプロモーターは、偽巣性コウジ菌、Ａ．ウスツス、黄色コウジ菌またはＡ．ベルシコロルに見られるものであって、具体的な例を配列番号３９、配列番号６０および配列番号４７によって提供する。あるいは、ａｌｃ誘導性プロモーターは、偽巣性コウジ菌由来の既知のａｌｃＡプロモーター（配列番号１４７）であることが可能である。
【００１５】
上述のように、出願者らは、本明細書に同定する新規ＡｌｃＲポリペプチドメンバー全体で保存されるいくつかのアミノ酸モチーフを同定した。この高レベルの保存は、これらのモチーフが、ＡｌｃＲポリペプチドにおいて、重要な構造的および／または機能的役割を果たしていることの示標であり、例えばこれらのモチーフは（別個であるかまたは組み合わせであるかいずれかで）、トランス活性化、リガンド依存トランス活性化、リガンド結合、または核局在化ドメインの一部を形成可能である。したがって、これらのモチーフは、ＡｌｃＲタンパク質ファミリーのメンバーを定義する（そしてしたがってさらに同定する）のに使用可能である。この方法で同定されるいかなるさらなる新規ＡｌｃＲ相同分子種もまた、本明細書に記載する遺伝子スイッチ系の構成要素として使用可能である。したがって、１つの態様において、本発明は、以下のアミノ酸モチーフの少なくとも１つを含んでなるポリペプチドを提供する：モチーフ１  ＣＤＰＣＲＫＧＫＸＣＤ（配列番号１０４）；モチーフ２  ＣＸＮＣＫＸＷＸＫＸＣＸＦ（配列番号１０５）；モチーフ３  ＮＡＬＳＣＷＬＴＥＨＮＣＰＹ（配列番号１０６）；モチーフ４  ＷＳＮＭＲＣＩ（Ｘ）0-1ＲＶＣＸＬＤＲ（配列番号１０７）；モチーフ５  ＲＸＲＡＬＳ（Ｘ）2ＥＤ（配列番号１０８）；モチーフ６  ＦＡＳＱＷＴＱＨＡＱ（配列番号１０９）；モチーフ７  ＲＨＡ（Ｘ）4ＴＸＩＰＳＦＲ（配列番号１１０）；モチーフ８  ＦＡＮＩＩＦＳＬＴＱＳ（配列番号１１１）；モチーフ９  ＦＬＥ（Ｘ）2ＮＲ（Ｘ）4ＦＲＨＫＦ（配列番号１１２）；モチーフ１０  ＭＦＤＴＬＳ（配列番号１１３）；モチーフ１１  ＡＭＹＱＲＰＬＶＶＳＤＥＤＳＱＩ（配列番号１１４）；モチーフ１２  ＤＶＷＧ（Ｘ）2ＦＬ（配列番号１１５）；モチーフ１３  ＡＴＰＶＫＶＬＬＹＲＲ（配列番号１１６）；モチーフ１４  ＬＤＧＨＷＨＬ（配列番号１１７）；モチーフ１５  ＮＡＬＡＶＸＡＬＡＲ（配列番号１１８）；モチーフ１６  ＥＶＡＦＸＶＥＰＷ（Ｘ）2ＶＬ（配列番号１１９）；またはモチーフ１７  ＬＸＲＫＳＤＭ（配列番号１２０）。おそらく、本発明のポリペプチドは、上述のアミノ酸モチーフを少なくとも２つ含んでなるであろうし、第二のモチーフは第一のモチーフと同じでない。さらにより好ましくは、本発明のポリペプチドは、上述のモチーフを少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、または１７含んでなるであろうし、各モチーフは異なる。最も好ましくは、本発明のポリペプチドは、配列番号１２３に示すコンセンサス配列を有するであろう。本発明のポリペプチドの具体的な例は、配列番号１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、５９、１８、６２、６６によって提供される。
【００１６】
疑いを回避するため、本明細書に記載するすべてのアミノ酸配列は、標準的一文字コードを用い、「Ｘ」は任意のアミノ酸を表し、そして下付きの数字は、先行する括弧内に記載する文字の残基の数を示し、例えば、上述のモチーフ１６は、完全に書いた場合、ＥＶＡＦＸＥＰＷＸＸＶＬ（Ｘは任意のアミノ酸）と読める。
【００１７】
上述の高度に保存されたアミノ酸モチーフに加え、本明細書に同定するＡｌｃＲポリペプチドメンバーのメンバー解析によって、これらがさらに特筆すべき構造的特徴を所持することが明らかになった：これらは驚くほど多数のダブレット（ｄｏｕｂｌｅｔ）およびトリプレット（ｔｒｉｐｌｅｔ）アミノ酸反復を含んでなる。
【００１８】
用語、ダブレットアミノ酸反復は、本明細書において、２つの連続する同一のアミノ酸の反復が、ポリペプチド配列全体に見られることを意味する。例えば、モチーフ１３（ＡＴＰＶＫＶＬＬＹＲＲ）は、２つのダブレットアミノ酸反復を含んでなり、１つは「ＬＬ」そして二番目は「ＲＲ」である：モチーフの３６％より多くが、ダブレット反復で構成されることがわかる。
【００１９】
同様に、用語、トリプレットアミノ酸反復は、本明細書において、少なくとも３つの連続する同一のアミノ酸の反復が、ポリペプチド配列全体に見られることを意味する。例えば、Ａ．フミガツスＡｌｃＲ相同分子種（配列番号１８）は、全部で６つのトリプレットアミノ酸反復を含んでなる：アラニンのトリプレット１つ（すなわち、１ｘ少なくともＡＡＡ）、アルギニンのトリプレット１つ（すなわち、１ｘ少なくともＲＲＲ）およびセリンのトリプレット４つ（すなわち４ｘ少なくともＳＳＳ）。
【００２０】
割合で表現すると、本発明のポリペプチドの少なくとも７．５％はダブレット反復で構成され、そして本明細書に記載するポリペプチドの具体的な例において、この割合は１２％以上であることが可能である。同様に、トリプレット反復に関して、本発明のポリペプチドの少なくとも１％はトリプレット反復で構成され、そして本明細書に記載するポリペプチドの具体的な例において、この割合は２．５％以上であることが可能である。一般的に、本発明のポリペプチドは、かなりの数のダブレット反復のプロリン、グルタミン、アルギニン、セリン、ロイシンおよび／またはスレオニンを含んでなる。特に、本発明のポリペプチドは、ロイシンの少なくとも６つのダブレット反復、セリンの少なくとも３つのダブレット反復、およびスレオニンの少なくとも４つのダブレット反復を含んでなる。こうしたポリペプチドはまた、アラニンの少なくとも３つのダブレット反復、システインの少なくとも１つのダブレット反復、アスパラギン酸の少なくとも１つのダブレット反復、およびプロリンの少なくとも１つのダブレット反復を含んでなることも可能である。
【００２１】
したがって、さらなる態様において、アミノ酸配列が、アミノ酸残基の少なくともダブレットである反復を複数、含んでなり、複数の少なくともダブレットである反復が７．５％より多くを構成する、先に記載する態様いずれか１つに記載のポリペプチドを提供する。好ましくは、こうしたポリペプチドは、ロイシンの少なくとも６つのダブレット反復、セリンの少なくとも３つのダブレット反復、およびスレオニンの少なくとも４つのダブレット反復を含んでなる。さらにより好ましくは、こうしたポリペプチドはまた、アラニンの少なくとも３つのダブレット反復、システインの少なくとも１つのダブレット反復、アスパラギン酸の少なくとも１つのダブレット反復、およびプロリンの少なくとも１つのダブレット反復を含んでなるであろう。
【００２２】
さらなる態様において、本発明のポリペプチドは、アミノ酸残基の少なくともトリプレットである反復を複数、含んでなり、複数の少なくともトリプレットである反復がポリペプチドの１％より多くを構成する。
【００２３】
上で用いるような用語「ダブレット反復（ｄｏｕｂｌｅｔ  ｒｅｐｅａｔ）」および「トリプレット反復（ｔｒｉｐｌｅｔ  ｒｅｐｅａｔ）」は、「少なくとも（ａｔ  ｌｅａｓｔ）」によって条件付けされる場合、これは、各反復が、適切なように、少なくとも２つの連続する同一のアミノ酸残基（すなわち少なくとも１つのダブレットである）または少なくとも３つの連続するアミノ酸残基（すなわち少なくとも１つのトリプレットである）を含んでなることを意味する。本発明の第二の側面は、上述の本発明の第一の側面にしたがったポリペプチドをコードする核酸を提供する。こうした核酸の具体的な例は、配列番号１０２、１０１、１０３、７６，７４、７５、７８、７７、３８、６１、４６、６５、７９、７３、５８、および１７によって提供される。しかし、当業者は、遺伝暗号の縮重（ｄｅｇｅｎｅｒａｃｙ）のため、複数の異なる核酸が、本発明の各ポリペプチドをコードすることが可能であると認識するであろう。本発明のこの側面は、すべてのこうした核酸を含むことを意図する。
【００２４】
本発明の第三の側面において：（ｉ）第一のプロモーター、（ｉｉ）本発明のポリペプチドをコードする第一の核酸であって、該ポリペプチドが、外因性化学的誘導因子の存在下で、ａｌｃ誘導性プロモーターを活性化可能であり、そして第一の核酸が第一のプロモーターの調節下にある、前記第一の核酸、（ｉｉｉ）外因性化学的誘導因子の存在下で、第一の核酸にコードされるポリペプチドによって誘導可能である第二のプロモーター、および（ｉｖ）発現が第二のプロモーターの調節下にある、第二の核酸を含んでなる発現カセットを提供する。
【００２５】
本発明の発現カセットの第一のプロモーターは、宿主生物において、機能可能である、いかなるプロモーターであってもよい。プロモーターは、恒常性プロモーター（ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ）、組織または発生特異的プロモーター、あるいは誘導性プロモーターであることが可能である。しかし、必要に応じて、第二の核酸の発現を仲介するため、第一の核酸にコードされるポリペプチドが、時間的および空間的に望ましい方式で、すなわち、宿主生物の正しい細胞で、そして正しい時点で、発現されることが必要である。したがって、１つの態様において、組織特異的プロモーター、例えば花特異的プロモーター（葯特異的プロモーターまたは柱頭特異的プロモーターなど）を使用する。別の態様において、プロモーターが発生特異的プロモーターであることが好ましい。特に好ましい組織特異的および発生特異的プロモーターは、システインプロテイナーゼプロモーター（国際公告第WO  WO  ９７／３５９８３号に明記されるようなもの）およびリンゴ酸シンターゼプロモーターなどの、種子形成および発芽中の遺伝子発現を調節するものである。さらなる態様において、第一のプロモーターは恒常性プロモーターであろう。宿主生物が植物である場合、適切な恒常性プロモーターの例には、限定されるわけではないが、カリフラワーモザイクウイルス３５Sプロモーター、フェロドキシン−ＲｏｌＤプロモーター、トウモロコシ・ユビキチンプロモーターおよびイネ（ｒｉｃｅ）・アクチンプロモーターが含まれる。
【００２６】
本発明の発現カセットに使用する第二のプロモーターは、真菌、特に、例えば偽巣性コウジ菌、Ａ．ウスツス、Ａ．フミガツス、Ａ．ベルシコロル、黄色コウジ菌、Ａ．ファベオラツス、Ａ．コルガツス、Ａ．クレイストミヌツス、Ａ．ナバホエンシス、Ａ．ヘテロタリクス、Ａ．スペクタビリス、およびＡ．ビコロルを含むアスペルギルス属種から得ることが可能な、ａｌｃＡ、ａｌｄＡ、ａｃｌＢ、ａｌｃＲまたはａｌｃＣプロモーターいずれかであることが可能である。あるいは、プロモーターは、ＷＯ９３／２１３３４に記載されるように、異種上流および下流領域を融合することによって生成する、「キメラ」プロモーター配列であることが可能である。典型的には、こうしたキメラプロモーターにおいて、上流領域はプロモーター制御配列（ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）を含有し、そして下流領域は転写開始配列を含有し、上流および下流領域は異種性（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ）である。本発明の発現カセットにおいて、こうしたキメラプロモーターを第二のプロモーターとして使用する場合、上流領域が、誘導性ａｌｃＡ、ａｌｄＡ、ａｌｃＢ、ａｌｃＲまたはａｌｃＣプロモーター（上述のとおり）由来であることが好ましい。下流配列は、発現カセットを導入しようとする宿主生物において機能可能なプロモーターいずれかのコアプロモーター領域由来であることが可能である。したがって宿主生物が植物である場合、下流プロモーター領域が、ＣａＭＶ  ３５Ｓ、フェロドキシン−ＲｏｌＤ、トウモロコシ・ユビキチンおよびイネ・アクチンプロモーターなどの、植物機能可能プロモーター（ｐｌａｎｔ−ｏｐｅｒａｔｉｖｅ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ）由来であることが好ましい。あるいは、下流プロモーター領域は、コンセンサスプロモーター配列から合成可能である。
【００２７】
しかし、第二のプロモーター配列が、偽巣性コウジ菌、Ａ．ウスツス、Ａ．フミガツス、Ａ．ベルシコロル、黄色コウジ菌、Ａ．ファベオラツス、Ａ．コルガツス、Ａ．クレイストミヌツス、Ａ．ナバホエンシス、Ａ．ヘテロタリクス、Ａ．スペクタビリス、およびＡ．ビコロルなどのアスペルギルス属種から得ることが可能な、ａｌｃＡまたはａｌｃＲプロモーター配列の制御要素であるか、または該制御要素の一部を含んでなることが好ましい。本発明のこの側面で使用するのに特に適したａｌｃＲプロモーターは、偽巣性コウジ菌、Ａ．ウスツス、黄色コウジ菌またはＡ．ベルシコロルに見られるものであって、具体的な例は配列番号３９、配列番号６０および配列番号４７によって提供される。しかし、第二のプロモーター配列が、偽巣性コウジ菌由来の既知のａｌｃＡプロモーター（配列番号１４７）であることが最も好ましい。
【００２８】
本明細書に開示するＡ．ウスツス、黄色コウジ菌およびＡ．ベルシコロルのａｌｃＲプロモーター（配列番号３９、配列番号６０および配列番号４７）は、新規であり、そして本発明のさらなる側面を形成する。
【００２９】
したがって、本発明は、Ａ．ウスツス、黄色コウジ菌またはＡ．ベルシコロルから得ることが可能なａｌｃＲプロモーター配列、あるいはその修飾型または断片であって、ＡｌｃＲ制御因子タンパク質（特に本発明のＡｌｃＲ制御因子タンパク質）および外因性化学的誘導因子の存在下で、誘導性プロモーターとして作用する、前記プロモーター配列をさらに提供する。
【００３０】
表現「修飾型」は、Ａ．ウスツス、黄色コウジ菌またはＡ．ベルシコロルから得ることが可能なａｌｃＲプロモーター配列と同一性を共有するが、プロモーター活性に有意に影響を与えないヌクレオチド配列のいくつかの相違を含むことが可能なプロモーターに関する。好ましくは、これらの相違は、例えば、以下のように設定されたパラメーター：ｋｔｕｐｌｅ＝３、ギャップペナルティ＝３およびウインドウ＝２０でＷＩＬＢＵＲ−Ｌｉｐｍａｎ法を用いて比較した際、２つの配列間の全体の同一性が７０％を超える、より好ましくは８０％を超える、そして最も好ましくは９０％を超えるようなものである。
【００３１】
用語「部分（ｐａｒｔｓ）」は、本発明のプロモーターに関連して用いた際、プロモーター活性を保持し、そして上に論じるように、他のプロモーター要素と組み合わせてキメラプロモーターを形成する際に有用である可能性がある、プロモーターの一部切除（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）型または活性領域を指す。本発明の文脈において、特に好ましい領域は、上に概略するように、キメラプロモーターにおいて異種転写開始配列と組み合わせて使用可能な、プロモーター制御配列である。
【００３２】
本発明の発現カセットの第二の核酸は、宿主生物で発現することが望ましい、いかなる核酸であることも可能である。宿主生物が植物である場合、第二の核酸は、内因性植物タンパク質または外来性タンパク質いずれかのすべてまたは一部をコードすることが可能である。さらに、第二の核酸は植物の特性を修正するため、調節された方式で発現することが必要なセンスまたはアンチセンス核酸として作用することが可能である。第二の核酸は、単一遺伝子または一連の遺伝子を含んでなることが可能である。
【００３３】
本発明の遺伝子発現カセットは、同一の構築物上にあることが可能であるし、または２つの部分に分けることが可能である。発現カセットが２つの部分を含んでなる場合、１つの部分は、植物発現ベクターなどの適切な発現ベクターにサブクローニングした要素（ｉ）および（ｉｉ）を含んでなるであろう。第二の部分は、下流核酸の発現を調節するよう配置された第二のプロモーターの少なくとも一部を含んでなるであろう。
【００３４】
本発明の発現カセットは、いかなる適切な宿主生物の細胞（類）に形質転換またはトランスフェクションすることも可能である。適切な宿主生物には、微生物（細菌および酵母など）と共に、植物および動物が含まれる。しかし、宿主生物が植物であることが好ましい。
【００３５】
実際には、本発明の発現カセットを含んでなる構築物（類）は、形質転換によって、植物細胞などの宿主細胞に挿入する。宿主が植物である場合、発現カセットは、植物遺伝子発現カセットであろうし、そして植物または植物細胞に適したいかなる形質転換法も使用可能である。こうした方法には、組換えＴｉプラスミドを含有するアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）での感染、エレクトロポレーション（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）、細胞およびプロトプラストのマイクロインジェクション（ｍｉｃｒｏｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）、微粒子銃形質転換（ｍｉｃｒｏｐｒｏｊｅｃｔｉｌｅ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）および花粉管形質転換が含まれる。望ましい場合、こうした形質転換細胞から、ゲノムに安定に取り込まれた新規核酸を有する全植物が再生可能である。単子葉および双子葉トランスジェニック植物両方を、この方法で得ることが可能である。
【００３６】
こうして産生することが可能なトランスジェニック植物の例には：カノラ（ｃａｎｏｌａ）、ヒマワリ（ｓｕｎｆｌｏｗｅｒ）、タバコ（ｔｏｂａｃｃｏ）、テンサイ（ｓｕｇａｒ  ｂｅｅｔ）、ワタ（ｃｏｔｔｏｎ）、ダイズ（ｓｏｙａ）、トウモロコシ、コムギ（ｗｈｅａｔ）、オオムギ（ｂａｒｌｅｙ）、イネ、モロコシ（ｓｏｒｇｈｕｍ）、トマト（ｔｏｍａｔｏ）、マンゴー（ｍａｎｇｏ）、モモ（ｐｅａｃｈ）、リンゴ（ａｐｐｌｅ）、セイヨウナシ（ｐｅａｒ）、イチゴ（ｓｔｒａｗｂｅｒｒｙ）、バナナ（ｂａｎａｎａ）、メロン（ｍｅｌｏｎ）、ジャガイモ（ｐｏｔａｔｏ）、ニンジン（ｃａｒｒｏｔ）、レタス（ｌｅｔｔｕｃｅ）、キャベツ（ｃａｂｂａｇｅ）、およびタマネギ（ｏｎｉｏｎ）などの穀物（ｆｉｅｌｄ  ｃｒｏｐｓ）、穀類、果実および野菜が含まれる。
【００３７】
さらなる側面において、本発明は、本発明の発現カセットを含んでなる細胞、特に植物細胞を提供する。発現カセットは、形質転換によって、宿主細胞ゲノムに安定に取り込まれることが可能である。本発明のさらなる側面は、こうした細胞を含んでなる植物組織または植物と共に、それから得られる子孫植物または種子を提供する。
【００３８】
本発明の上述の側面にしたがった植物細胞、組織および／または植物が、カノラ、ヒマワリ、タバコ、テンサイ、ワタ、ダイズ、トウモロコシ、コムギ、オオムギ、イネ、モロコシ、トマト、マンゴー、モモ、リンゴ、セイヨウナシ、イチゴ、バナナ、メロン、ジャガイモ、ニンジン、レタス、キャベツ、またはタマネギの、そして特にワタ、ダイズ、トウモロコシ、コムギ、オオムギ、イネまたはモロコシの植物細胞、組織および／または植物であることが好ましい。
【００３９】
上述のように、本発明の発現カセットを用いて、該カセットを導入する宿主生物において、遺伝子発現を制御可能である。これは、適切な化学的誘導因子の外因性の適用（または使用中止）を通じて達成する。適切な外因性化学的誘導因子の存在下で、カセットに産生される制御因子タンパク質は、やはりカセットに存在する第二の誘導性プロモーターを刺激することによって、第二の核酸の発現を活性化するであろう。したがって、第二の核酸の発現は、宿主への誘導因子の外部適用によって制御可能である。したがって、本発明のさらなる側面において、細胞において、遺伝子発現を調節するための方法であって、本発明の発現カセットで細胞を形質転換し、そして第二の核酸の転写を誘導するため、細胞に外因性化学的誘導因子を適用することを含んでなる、前記方法を提供する。
【００４０】
誘導因子は、いかなる有効な化学薬品（アルコールまたはケトンなど）であることも可能である。ａｌｃＡ／ａｌｃＲ由来カセットと共に使用するのに適した化学薬品には、Ｃｒｅａｓｅｒら（１９８４，  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ，  ２２５，  ４４９−４５４）に列挙されるもの、例えばブタン−２−オン（エチルメチルケトン）、シクロヘキサノン、アセトン、ブタン−２−オール、３−オキソ酪酸、プロパン−２−オール、およびエタノールが含まれる。他の適切な誘導因子には、ＷＯ００／４４９１７に記載されるものなどの農学的に許容しうるエステルが含まれる。こうした農学的に許容しうるエステルは、一般的に、式（Ｉ）
【００４１】
【化１】
2004535774.tif 000002
【００４２】
式中、Ｒ1は低級アルキル、低級アルケニルまたは低級アルキニル基であり、そしてＲ2はＲ2ＣＯＯＨが農学的に許容しうる酸であるような有機基である
の化合物を含んでなる。式（Ｉ）の化合物の加水分解は、式（ＩＩ）
【００４３】
【化２】
2004535774.tif 000003
【００４４】
のアルコールを生じる。
用語「農学的に許容しうる（ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌｌｙ  ａｃｃｅｐｔａｂｌｅ）」は、本明細書において、許容し得ないレベルの土壌損傷または作物における植物毒性を引き起こすことなく、特定の土壌または作物状況に、化合物を適用可能であることを意味する。表現「低級アルキル」には、本明細書において、直鎖または分枝鎖であることが可能な、Ｃ1-6アルキル基、好ましくはＣ1-4アルキル基が含まれる。同様に、用語「低級アルケニル」および「低級アルキニル」は、直鎖または分枝鎖の、２−６そして好ましくは２−４炭素原子を有することが可能な基を指す。
【００４５】
本発明の植物遺伝子発現カセットの有効性は、適切な制御因子およびレポーター構築物と別個にまたは共に、植物プロトプラストを形質転換し、そして一過性遺伝子発現アッセイを行うことによって立証可能である。
【００４６】
例えば、エタノール（誘導因子）と共にインキュベーションする、トウモロコシまたはタバコプロトプラストなどの植物細胞において、ａｌｃＡプロモーターの調節下にある、ｃａｔ（クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ）またはｇｕｓ（β−グルクロニダーゼ）遺伝子などのレポーター遺伝子の発現は、本発明のポリペプチドの存在に依存すると予期されるであろう。
【００４７】
本発明はここで、付随する図に関連して、例として、より詳細に、具体的に記載する。
（実施例１）
アスペルギルス属種からのＡｌｃＲ  ＤＮＡ結合ドメインの単離
１．１  ゲノムＤＮＡからのＡ．ウスツスＡｌｃＲ  ＤＮＡ結合ドメインの単離
縮重ＰＣＲは、アスペルギルス・ウスツス由来のゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）に対して行った。ゲノムＤＮＡは、ＤＮＡｚｏｌプロトコル（Ｈｅｌｅｎａ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ：０．２５グラムの粉砕凍結組織／０．７５ｍｌのＤＮＡｚｏｌ抽出溶液）または以下に記載するプロトコルいずれかを用いて調製した：
１．  １ｇの凍結菌糸体を液体窒素下で増殖させ、そして１５ｍｌの抽出緩衝液（４２％尿素、０．３２Ｍ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ  ｐＨ８、２０ｍＭ  ＥＤＴＡ  ｐＨ８、０．４％  Ｎ−ラウリルサルコシン）に添加する。
【００４８】
２．  ３ｍｌフェノールｐＨ８および３ｍｌクロロホルム／イソアミルアルコール（２４：１）を添加し、そしてよく混合する。
３．  試料を遠心分離し（１００００ｒｐｍ、１０分間）、そして上相を未使用の試験管に移す。
【００４９】
４．  ３ｍｌの７．５Ｍ  ＮＨ4Ａｃおよび３．６ｍｌのイソプロパノールを添加し、そしてよく混合する。
５．  試料を遠心分離する（１００００ｒｐｍ、５分間）。
【００５０】
６．  ＤＮＡペレットを７０％  ＥｔＯＨで洗浄し、風乾し、そして２００μｌの滅菌水に再懸濁する。
Ｒｅａｄｙ−Ｔｏ−Ｇｏ  ＰＣＲビーズ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いて、ＰＣＲをセットアップする：２２μｌ滅菌水、１μｌ  ｇＤＮＡおよび適切な（以下を参照されたい）１μｌの各プライマー（５０μＭ）、１  ＰＣＲビーズ。用いるプライマー（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから得る）：Ａｌｃ１ａ２、Ａｌｃ１ｂ２、Ａｌｃ１ｃ２、Ａｌｃ１ｄ２（順方向プライマー）およびＡｌｃｒｅｖ１ａ、Ａｌｃｒｅｖ１ｂ、Ａｌｃｒｅｖ１ｃ、Ａｌｃｒｅｖ１ｄ（逆方向プライマー）。以下の表１に示す順方向および逆方向プライマーのマトリックスを用いて、ＰＣＲをセットアップする。
【００５１】
表１．  ＰＣＲ反応を最適化する際の順方向および逆方向プライマーのマトリックス
【００５２】
【表１】
2004535774.tif 000004
【００５３】
対照反応は、１μｇ  ｇＤＮＡおよび１μｌ  ＩＴＳプライマー（１０μＭ）または１μｌ偽巣性コウジ菌ｇＤＮＡおよび１μｌ  Ａｌｃ１ｂ２（５０μＭ）および１μｌ  Ａｌｃｒｅｖ１ａ（５０μＭ）を含有する。ＰＣＲは、以下の条件を用いて、Ｇｒａｄｉｅｎｔ  Ｒｏｂｏｃｙｃｌｅｒ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）上で行う：９４℃３分間、（９４℃１分間、４８−５５℃１分間、７２℃１分間）ｘ３５、７２℃５分間。２％  ｗ／ｖアガロース／ＴＢＥゲルを通じた電気泳動によって、各１０μｌ反応を解析する。適切なサイズの断片を切除して、そしてＤＮＡを溶出し（Ｇｅｎｅｃｌｅａｎスピンプレップ、Ｂｉｏ１０１を用いる）、そして製造者のプロトコルにしたがってｐＣＲ２．１ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングする。これによって、配列番号９の配列を有するＤＮＡ結合ドメインを生じる。
【００５４】
１．２  ゲノムＤＮＡからのＡ．フミガツス中のＡｌｃＲ相同分子種の推定上のＤＮＡ結合ドメインの単離
アスペルギルス・フミガツス由来のｇＤＮＡに対して縮重ＰＣＲを行う。ゲノムＤＮＡは、上の１．１に記載するように、ＤＮＡｚｏｌ  ＥＳ（Ｈｅｌｅｎａ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて調製する。ＰＣＲをセットアップし、そして用いるオリゴヌクレオチドは、上の実施例１．１において、Ａ．ウスツス配列の単離に関して記載するとおりである。対照反応（１μｌ  ｇＤＮＡおよび１μｌ  ＩＴＳプライマー（１０μＭ）または１μｌ偽巣性コウジ菌ｇＤＮＡおよび１μｌ  Ａｌｃ１ｂ２（５０μＭ）および１μｌ  Ａｌｃｒｅｖ１ａ（５０μＭ）を用いる）もまた行う。
【００５５】
ＰＣＲは、以下の条件を用いて、Ｇｒａｄｉｅｎｔ  Ｒｏｂｏｃｙｃｌｅｒ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）上で行う：４℃５分間、（９４℃１分間、４８−５５℃１分間、７２℃１分間）ｘ３５、７２℃６分間。２％  ｗ／ｖアガロース／ＴＢＥゲルを通じた電気泳動によって、各１０μｌ反応を解析する。適切なサイズの断片を切除して、そしてＤＮＡを溶出し（Ｇｅｎｅｃｌｅａｎスピンプレップ、Ｂｉｏ１０１を用いる）、そして製造者のプロトコルにしたがってｐＣＲ２．１ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングする。配列決定したクローンは、配列番号１０に示す配列を生じた。
【００５６】
１．３  ｃＤＮＡからのＡ．ベルシコロル中のＡｌｃＲ相同分子種のＤＮＡ結合ドメインの単離
縮重ＰＣＲは、アスペルギルス・ベルシコロル由来のｃＤＮＡに対して行う。ＲＮＡは、以下の重要でない修正と共に、製造者のプロトコルにしたがって、ＴＲＩｚｏｌ試薬（Ｈｅｌｅｎａ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて調製する：
１．  ＴＲＩｚｏｌ添加前に液体窒素中で菌糸体を粉砕し、
２．  すべての遠心分離工程は、室温で行う。
【００５７】
ｃＤＮＡはオリゴｄＴおよびＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて、酵素と共に提供されるプロトコルにしたがって作成する。推奨されるようにＲＮアーゼＨ消化を行う。Ｒｅａｄｙ−Ｔｏ−Ｇｏ  ＰＣＲビーズ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いて、ＰＣＲをセットアップする：２２μｌ滅菌水、１μｌ  ｃＤＮＡおよび適切な（以下を参照されたい）１μｌの各プライマー（５０μＭ）に加えて１  ＰＣＲビーズ。用いるプライマー（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから得る）：Ａｌｃ１ａ２、Ａｌｃ１ｂ２、Ａｌｃ１ｃ２、Ａｌｃ１ｄ２（順方向プライマー）およびＡｌｃｒｅｖ１ａ、Ａｌｃｒｅｖ１ｂ、Ａｌｃｒｅｖ１ｃ、Ａｌｃｒｅｖ１ｄ（逆方向プライマー）。以下の表２に示す順方向および逆方向プライマーのマトリックスを用いて、ＰＣＲをセットアップする。
【００５８】
表２．  ＰＣＲ反応を最適化する際の順方向および逆方向プライマーのマトリックス：
【００５９】
【表２】
2004535774.tif 000005
【００６０】
対照反応もまた、１μｌ  ｃＤＮＡおよび１μｌ  ＩＴＳプライマー（１０μＭ）または１μｌ偽巣性コウジ菌ｇＤＮＡおよび１μｌ  Ａｌｃ１ｂ２（５０μＭ）および１μｌ  Ａｌｃｒｅｖ１ａ（５０μＭ）を用いてセットアップする。
【００６１】
ＰＣＲは、以下の条件を用いて、Ｇｒａｄｉｅｎｔ  Ｒｏｂｏｃｙｃｌｅｒ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）上で行う：９４℃３分間、（９４℃１分間、４８−５５℃１分間、７２℃１分間）ｘ３５、７２℃６分間。２％  ｗ／ｖアガロース／ＴＢＥゲルを通じた電気泳動によって、各１０μｌ反応を解析する。適切なサイズの断片を切除して、そしてＤＮＡを溶出し（Ｇｅｎｅｃｌｅａｎスピンプレップ、Ｂｉｏ１０１を用いる）、そして製造者のプロトコルにしたがってｐＣＲ２．１ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングする。偽巣性コウジ菌のＤＮＡ結合ドメインに相同性を示す配列を得た（配列番号１１）。
【００６２】
１．４  ゲノムＤＮＡからの黄色コウジ菌のＤＮＡ結合ドメインの単離
黄色コウジ菌由来のｇＤＮＡに対して縮重ＰＣＲを行う。ゲノムＤＮＡは、前述のように（実施例１．１）、ＤＮＡｚｏｌ  ＥＳ（Ｈｅｌｅｎａ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて調製する。Ｒｅａｄｙ−Ｔｏ−Ｇｏ  ＰＣＲビーズ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いて、ＰＣＲをセットアップする：２２μｌ滅菌水、１μｌ  ｇＤＮＡおよび適切な（以下を参照されたい）１μｌの各プライマー（５０μＭ）に加えて１  ＰＣＲビーズ。用いるプライマー：Ａｌｃ１ａ２、Ａｌｃ１ｂ２、Ａｌｃ１ｃ２、Ａｌｃ１ｄ２（順方向プライマー）およびＡｌｃ７００ｒＡ、Ａｌｃ７００ｒＢ、Ａｌｃ７００ｒＣ、Ａｌｃ７００ｒＤ（逆方向プライマー）。以下の表３に示す順方向および逆方向プライマーのマトリックスを用いて、ＰＣＲをセットアップする。１μｌ  ｇＤＮＡおよび１μｌ  ＩＴＳプライマー（１０μＭ）または１μｌ黄色コウジ菌ＤＮＡおよび１μｌ  Ａｌｃ１ｂ２（５０μＭ）および１μｌ  Ａｌｃ７００ｒＣ（５０μＭ）を用いて対照反応もまたセットアップする。
【００６３】
表３．  ＰＣＲ反応を最適化する際の順方向および逆方向プライマーのマトリックス：
【００６４】
【表３】
2004535774.tif 000006
【００６５】
ＰＣＲは、以下の条件を用いて、Ｇｒａｄｉｅｎｔ  Ｒｏｂｏｃｙｃｌｅｒ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）上で行う：９４℃２分間、（９４℃３０秒間、４８−５９℃３０秒間、７２℃１分３０秒間）ｘ３５、７２℃１０分間。２％  ｗ／ｖアガロース／ＴＢＥゲルを通じた電気泳動によって、各１０μｌ反応を解析する。適切なサイズの断片を切除して、そしてＤＮＡを溶出し（Ｇｅｎｅｃｌｅａｎスピンプレップ、Ｂｉｏ１０１を用いる）、そして製造者のプロトコルにしたがってｐＣＲ２．１ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングする。挿入物のＤＮＡ配列を決定し、そしてこれを配列番号１６に示す。
【００６６】
（実施例２）
ＡｌｃＲ相同分子種をコードするゲノムＤＮＡの単離
２．１  Ａ．フミガツスＡｌｃＲ配列をコードする全長ゲノムＤＮＡ配列の単離
推定上のＡｌｃＲ相同分子種をコードするゲノムＤＮＡを単離するための選択法は、以下に記載するようなゲノムウォーキングＰＣＲ技術を用いる。ゲノムＤＮＡは、実施例１．１に記載するように、ＤＮＡｚｏｌ  ＥＳ（Ｈｅｌｅｎａ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて調製する。
【００６７】
「ゲノムウォーカーライブラリー（ｇｅｎｏｍｅ  ｗａｌｋｅｒ  ｌｉｂｒａｒｉｅｓ）」の生成（ｃｒｅａｔｉｏｎ）は、製造者のプロトコルにしたがって、Ｃｌｏｎｔｅｃｈユニバーサル・ゲノムウォーカーキットを用いて行う。一次ＰＣＲをセットアップする：１  Ｒｅａｄｙ−Ｔｏ−Ｇｏ  ＰＣＲビーズ、２２μｌ滅菌水、１μｌ  ＡＰ１プライマー（ゲノムウォーカーキット）、１μｌ  ＧＳＰ１（１０μＭ）、１μｌの適切なゲノムウォーカーライブラリー（詳細に関してはキットプロトコルを参照されたい）。対照（製造者のプロトコルに記載される）もまた、ＰＣＲビーズを用いてセットアップした。二次ＰＣＲをセットアップする：１  ＰＣＲビーズ、２２μｌ滅菌水、１μｌ  ＡＰ２プライマー（ゲノムウォーカーキット）、１μｌ  ＧＳＰ２（１０μＭ）、滅菌水で１：５０に希釈した１μｌの適切な一次ＰＣＲ反応。対照（製造者のプロトコルに記載される）もまた、Ｒｅａｄｙ−Ｔｏ−Ｇｏビーズを用いてセットアップする。ＰＣＲは、ゲノムウォーカープロトコルに記載される条件を用いて行い、簡潔には：一次反応に関しては、（９４℃２５秒間、７２℃３分間）ｘ７、（９４℃２５秒間、６７℃３分間）ｘ３２、６７℃７分間であり、二次反応に関しては、（９４℃２５秒間、７２℃３分間）ｘ５、（９４℃２５秒間、６７℃３分間）ｘ２０、６７℃７分間である。
【００６８】
１％  ｗ／ｖアガロース／ＴＢＥゲルを通じた電気泳動によって、各１０μｌ反応を解析する。断片を切除して、そしてＧｅｎｅｃｌｅａｎスピンプレップ（Ｂｉｏ１０１）を用いてＤＮＡを溶出し、そしてｐＣＲ２．１ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングする。５’および３’配列両方を完成するため、このプロセスを反復し、こうして配列番号１７（ゲノムＤＮＡ）および配列番号１８（予測されるアミノ酸配列）に記載するオープンリーディングフレームを得る。３’ゲノムウォーキングは、２回行い；最初の例では、ＧＳＰ１は配列番号１２に示す配列を有し、そしてＧＳＰ２は配列番号１９に示す配列を有する。第二の周期は、配列番号２０に示す配列を持つＧＳＰ１、並びに配列番号２１および配列番号２２に示す配列を持つＧＳＰ２を用いる。ｐｆｕポリメラーゼ、並びに配列番号２３および２４を持つオリゴを用いて増幅することによって、ゲノムＤＮＡから全オープンリーディングフレームを生成する。ａｌｃＲ相同分子種のプロモーター領域をコードする、得られた５’配列を配列番号２５に開示する。この配列は、推定上のＡｌｃＲ結合部位を含んでなり、これによって、遺伝子の同一性を支持するさらなる証拠が提供される（ＡｌｃＲが自己制御性であるため）。配列番号２６に示す配列を持つＧＳＰ１および配列番号２７に示す配列を持つＧＳＰ２を用いては、１周期のゲノムウォーキングのみを行う。
【００６９】
２．２  全オープンリーディングフレームを単離するための、アスペルギルス・ウスツス・ゲノムウォーキング
Ａ．ウスツスａｌｃＲ相同分子種の全オープンリーディングフレームおよびそのプロモーター領域の単離は、上の実施例２．１に記載する、ゲノムウォーキングＰＣＲに基づく方法を用いて行う。ゲノムＤＮＡは、実施例１．１に記載するように、ＤＮＡｚｏｌ  ＥＳ（Ｈｅｌｅｎａ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて調製する。
【００７０】
製造者のプロトコルにしたがって、Ｃｌｏｎｔｅｃｈユニバーサル・ゲノムウォーカーキットを用い、「ゲノムウォーカーライブラリー」の生成を行う。
一次ＰＣＲは、上の２．１に記載するようにセットアップする。対照は、Ａ．フミガツス・ゲノムウォーカーライブラリーＤＬ４およびプライマーＡＦ  ａｌｃｇｅｎ１を用いる。二次ＰＣＲもまた、上に記載するように（実施例２．１）セットアップする。対照は、Ａ．フミガツス・ゲノムウォーカーライブラリーＤＬ４およびプライマーＡＦ  ａｌｃｇｅｎ２を用いる。ＰＣＲはゲノムウォーカープロトコルに記載される条件（実施例２．１を参照されたい）を用いて行い、そして１％  ｗ／ｖアガロース／ＴＢＥゲルを通じた電気泳動によって、各１０μｌ反応を解析する。断片を切除して、そしてＧｅｎｅｃｌｅａｎスピンプレップ（Ｂｉｏ１０１）を用いてＤＮＡを溶出し、そしてｐＣＲ２．１ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングする。
【００７１】
Ａ．ウスツスに関しては、全オープンリーディングフレームは、３周期のゲノムウォーキングを用いて生成する。ＤＮＡ結合ドメイン配列（配列番号９）の３’端を得るため、第一周期において、ＧＳＴ１プライマーとして配列番号２８を用い、そしてＧＳＴ２として配列番号２９を用いる。第二周期は、ＧＳＴ１として配列番号３０を、そしてＧＳＴ２として配列番号３１を用いる。第三のそして最後の周期は、ＧＳＴ１として配列番号３２を、そしてＧＳＴ２として配列番号３３を用いる。５’ゲノムウォーキングは、１周期のゲノムウォーキングのみを必要とし、ＧＳＴ１プライマーが配列番号３４を有し、そしてＧＳＰ２が配列番号３５を有する。増幅には、ゲノムＤＮＡ由来のＯＲＦの始めおよび終わりに特異的なオリゴヌクレオチド（配列番号３６および３７）を用いる。生じたＯＲＦ配列は配列番号３８を有し、一方、プロモーター配列は配列番号３９を有する。
【００７２】
２．３  全オープンリーディングフレームを単離するための、アスペルギルス・ベルシコロル・ゲノムウォーキング
ゲノムＤＮＡは、前述のように（実施例１．１）調製する。製造者のプロトコルにしたがって、Ｃｌｏｎｔｅｃｈユニバーサル・ゲノムウォーカーキットを用い、Ａ．ベルシコロル・ゲノムウォーカーライブラリーを調製する。一次ＰＣＲは、上の２．１に記載するようにセットアップする。対照は、Ａ．ベルシコロル・ゲノムウォーカーライブラリーＤＬ４およびプライマーＡＦ  ａｌｃｇｅｎ１を用いる。二次ＰＣＲもまた、上に記載するように（実施例２．１）セットアップする。対照は、Ａ．ベルシコロル・ゲノムウォーカーライブラリーＤＬ４およびプライマーＡＦ  ａｌｃｇｅｎ２を用いる。ＰＣＲはゲノムウォーカープロトコルに記載する条件（実施例２．１を参照されたい）を用いて行い、そして１％  ｗ／ｖアガロース／ＴＢＥゲルを通じた電気泳動によって、各１０μｌ反応を解析する。断片を切除して、そしてＧｅｎｅｃｌｅａｎスピンプレップ（Ｂｉｏ１０１）を用いてＤＮＡを溶出し、そしてｐＣＲ２．１ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングする。
【００７３】
Ａ．ベルシコロル遺伝子の３’端部分を単離するため、ＧＳＴ１として配列番号４０を、そしてＧＳＴ２として配列番号４１を用いて、１周期のゲノムウォーキングを行う。遺伝子の５’端を完成するのに１周期のゲノムウォーキングが必要であり、そしてこれによって、プロモーター領域の配列が提供される。これは、ＧＳＴ１として配列番号４２を、そしてＧＳＴ２として配列番号４３を用いることによって達成する。オリゴヌクレオチド（配列番号４４および４５）を用いて、ｐｆｕポリメラーゼで、Ａ．ベルシコロルａｌｃＲ  ＯＲＦのすべてを増幅する。生じた断片は、配列番号４６と同定される配列を有し、プロモーター領域の配列を配列番号４７に示す。この配列は、推定上のＡｌｃＲ結合部位を含んでなり、これによって、遺伝子の同一性を支持するさらなる証拠が提供される（ＡｌｃＲが自己制御性であるため）。
【００７４】
２．４  全オープンリーディングフレームを単離するための、黄色コウジ菌ゲノムウォーキング
黄色コウジ菌ａｌｃＲ相同分子種の全オープンリーディングフレームおよびそのプロモーター領域の単離は、上の実施例２．１に記載する、ゲノムウォーキングＰＣＲに基づく方法を用いて行う。ゲノムＤＮＡは、実施例１．１に記載するように、ＤＮＡｚｏｌ  ＥＳ（Ｈｅｌｅｎａ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて調製する。
【００７５】
製造者のプロトコルにしたがって、Ｃｌｏｎｔｅｃｈユニバーサル・ゲノムウォーカーキットを用い、「ゲノムウォーカーライブラリー」の生成を行う。
一次ＰＣＲは、上の２．１に記載するようにセットアップする。対照は、黄色コウジ菌ゲノムウォーカーライブラリーＤＬ４およびプライマーＡＦ  ａｌｃｇｅｎ１を用いる。二次ＰＣＲもまた、上に記載するように（実施例２．１）セットアップする。対照は、黄色コウジ菌ゲノムウォーカーライブラリーＤＬ４およびプライマーＡＦ  ａｌｃｇｅｎ２を用いる。ＰＣＲはゲノムウォーカープロトコルに記載する条件（実施例２．１を参照されたい）を用いて行い、そして１％  ｗ／ｖアガロース／ＴＢＥゲルを通じた電気泳動によって、各１０μｌ反応を解析する。断片を切除して、そしてＧｅｎｅｃｌｅａｎスピンプレップ（Ｂｉｏ１０１）を用いてＤＮＡを溶出し、そしてｐＣＲ２．１ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングする。
【００７６】
黄色コウジ菌ａｌｃＲ相同分子種の３’端配列を生成するため、３周期のゲノムウォーキングを必要とする。周期１は、ＧＳＴ１プライマーとして配列番号４８を、そしてＧＳＴ２として配列番号４９を用い；周期２は、ＧＳＴ１プライマーとして配列番号５０を、そしてＧＳＴ２として配列番号５１を用い；周期３は、ＧＳＴ１プライマーとして配列番号５２を、そしてＧＳＴ２として配列番号５３を用いる。５’端は、遺伝子のプロモーター配列もまた生成する、単一周期のゲノムウォーキングを用いて生成する。この周期は、ＧＳＴ１として配列番号を、ＧＳＴ２として配列番号５５を用いる。全ＯＲＦは、配列番号５６および５７を有するプライマーを用いたＰＣＲによって増幅し、こうして黄色コウジ菌由来の全長ａｌｃＲ相同分子種をコードするＤＮＡ断片（配列番号５８）を生じる。このＡｌｃＲ相同分子種の予測されるアミノ酸配列は配列番号５９に示す。ａｌｃＲ相同分子種のプロモーター配列（配列番号６０）は、偽巣性コウジ菌において観察されるＡｌｃＲ結合部位と同一性を持つ配列を含有する。
【００７７】
（実施例３）
ａｌｃＲ  ｃＤＮＡ相同分子種の単離
３．１  Ａ．ウスツスのＡｌｃＲ相同分子種をコードするｃＤＮＡの単離
ＲＮＡは実施例１．３に記載するように抽出し、そしてＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて、第一鎖ＤＮＡを生成する。逆転写は、キット中、Ｐｒｏｍｅｇａに供給されるオリゴｄＴプライマーを用いて行う。ｃＤＮＡは、生成するＤＮＡ断片がいかなる潜在的なイントロンも欠くＰＣＲ反応のテンプレートとして用いる。ＰＣＲ条件：９５℃１０分間、（９５℃３０秒間、５５℃３０秒間、７２℃１．５分間）ｘ３５、７２℃１０分間。用いるＰＣＲプライマーは、配列番号３６および３７を有する。産物は、Ａ．ウスツスのａｌｃＲ相同分子種のゲノムＤＮＡ型に比較した際、配列を欠く。さらに、イントロン配列は予測される位置にある。イントロン配列を欠く全長ＯＲＦの配列は、配列番号６１を有する。これは、配列番号６２に示すアミノ酸配列を有する推定上のポリペプチド産物をコードする。
【００７８】
３．２  Ａ．ベルシコロルのＡｌｃＲ相同分子種をコードするｃＤＮＡの単離
ＲＮＡは上述のように抽出し、そしてその後、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて、第一鎖ＤＮＡを生成する。ａｌｃＲ配列特異的プライマー（配列番号６３）をｃＤＮＡ生成に用いる。潜在的なイントロン配列を欠くＤＮＡ断片を生成するため、ＰＣＲ反応のテンプレートとしてｃＤＮＡを用いる。用いるＰＣＲプライマーは、配列番号４４および６４を有する。産物は、偽巣性コウジ菌由来のａｌｃＲに比較した際、配列を欠く。さらに、イントロン配列がそこに見られる。イントロン配列を欠く全長ＯＲＦの配列は、配列番号６５を有する。これは、配列番号６６に示すアミノ酸配列を有する推定上のポリペプチド産物をコードする。
【００７９】
（実施例４）
ａｌｃＲ相同分子種における、ありうるイントロンの解析
偽巣性コウジ菌ａｌｃＲ遺伝子は、ＤＮＡ結合ドメインの中央、ＡＴＧ開始コドンから７５塩基の箇所に、単一イントロンを含有する。このイントロンは、長さ６０ｂｐであり、そしてしたがってインフレームである。アスペルギルス属相同分子種遺伝子のｇＤＮＡ配列解析は、以下を明らかにした：
１）ＤＮＡ結合ドメインの２つの半分がインフレームでないため、Ａ．ベルシコロル遺伝子は、イントロンを含有するに違いない
２）ＤＮＡ結合ドメインの２つの半分がインフレームでないため、Ａ．ウスツス遺伝子は、イントロンを含有するに違いない
３）ＤＮＡ結合ドメインの２つの半分がインフレームであるため、Ａ．フミガツス遺伝子は、イントロンを含有する可能性があるし、または含有しない可能性がある
４）ＤＮＡ結合ドメインの２つの半分がインフレームであるため、黄色コウジ菌遺伝子は、イントロンを含有する可能性があるし、または含有しない可能性がある
Ａ．ベルシコロルおよびＡ．ウスツスにおいてイントロンがどこにあるか、そしてＡ．フミガツスおよび黄色コウジ菌においてイントロンがあるかどうかを確かめるため、ＲＴ  ＰＣＲを行う。
【００８０】
４．１  Ａ．ベルシコロルのａｌｃＲにおけるイントロン境界の同定
ＲＮＡを得るため、アスペルギルス・ベルシコロル培養を、ジャガイモ・デキストロース培地（２０ｍｌグリセロール、１０ｇ酵母エキス、０．５ｇ  ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、６．０ｇ  ＮａＮＯ3、０．５ｇ  ＫＣｌ、１．５ｇ  ＫＨ2ＰＯ4、水で１リットルにする）中、２４℃で５日間増殖させる。ミラ・クローズ（ｍｙｒａ  ｃｌｏｔｈ）を通じて培養をろ過して、菌糸体を収集し、そして液体窒素中で瞬間凍結する。凍結菌糸体は、液体窒素下、乳棒および乳鉢で粉砕する。粉砕菌糸体を０．７５ｍｌのＴＲＩｚｏｌ試薬（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に添加する。クロロホルム（０．７５ｍｌ）を添加し、そして混合物を室温で５分間震盪する。遠心分離（１３，０００ｒｐｍ、１５分間）後、上相（ｔｏｐ  ｐｈａｓｅ）を未使用の試験管に移し、そして１ｍｌイソプロパノールを添加し、そして完全に混合した後、室温で１０分間インキュベーションする。遠心分離（１３，０００ｒｐｍ、１０分間）後、上清を除去し、そして２ｍｌの７０％  ＥｔＯＨを添加する。これを再び完全に混合し、そしてさらに１３，０００ｒｐｍで１０分間、遠心分離する。上清を廃棄し、そしてＤＮＡペレットを風乾し、そして５０μｌのＤＥＰＣ処理Ｈ2Ｏに再懸濁する。
【００８１】
逆転写は、以下のとおりにセットアップする：１μｌオリゴ（配列番号１３４）、１μｌ  ＲＮＡ、１２μｌ  Ｈ2Ｏ。この混合物を７０℃で１０分間インキュベーションし、そしてその後、氷上に戻す。５μｌの第一鎖緩衝液（ｆｉｒｓｔ  ｓｔｒａｎｄ  ｂｕｆｆｅｒ）、２μｌ  ＤＴＴおよび１μｌ  ｄＮＴＰを添加した後、混合物を４２℃で２分間インキュベーションする。このインキュベーション後、１μｌのｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔを添加し、そして混合物を４２℃で５０分間、その後、７２℃で１５分間、そして４℃で１時間インキュベーションする。
【００８２】
ＰＣＲは以下のようにセットアップする：６μｌ逆転写反応、２．５μｌオリゴ１（配列番号１４５；１０μＭ）、５μｌオリゴ２（配列番号１３６；５μＭ）、１７．５μｌ  Ｈ2Ｏに加えて１  Ｒｅａｄｙ−Ｔｏ−Ｇｏ  ＰＣＲビーズ。ＰＣＲ条件は：９５℃１０分間、（９５℃１分間、５５℃１分間、７２℃３分間）ｘ３５周期、７２℃１０分間である。試料は、１％  ｗ／ｖアガロースＴＢＥゲルを通じた電気泳動によって解析し、そしてＧｅｎｅｃｌｅａｎスピンキット（Ｂｉｏ１０１）を用いて、断片を精製する。精製産物は、製造者のプロトコルにしたがって、ｐＣＲ２．１ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングする。連結ＴＯＰＯ産物を大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）ＴＯＰ１０細胞に形質転換する（氷上で３μｌのＤＮＡを細胞に添加し、そして３０分間放置し、４２℃に９０秒間置いた後、氷上に２分間戻す。２５０μｌ  ＳＯＣ培地を添加し、そして３７℃で１時間震盪する。１００μｌの細胞をＬＢ＋ａｍｐプレート上に蒔き、そして３７℃で一晩増殖させる）。
【００８３】
コロニーは、ＰＣＲによってスクリーニングする：２３μｌ水、１  ＰＣＲビーズ、１μｌプライマー（配列番号９１；５ｐｍｏｌ／μｌ）＋１μｌプライマー（配列番号９２；５ｐｍｏｌ／μｌ）。コロニーを用いて、ＰＣＲ混合物に接種し、そしてＬＢ＋ａｍｐストリークプレート（ｓｔｒｅａｋ  ｐｌａｔｅ）を用意する。プレートを３７℃で２日間インキュベーションする。ＰＣＲは、以下の条件を用いて、Ｂｉｏｍｅｔｒａ  Ｔｇｒａｄｉｅｎｔ  ＰＣＲ装置上で行う：９５℃１０分間、（９５℃３０秒間、５５℃３０秒間、７２℃２分間）３５周期、７２℃１０分間。反応は、１％  ｗ／ｖアガロースＴＢＥゲルを通じた電気泳動によって解析する。正しいサイズの断片を示すコロニーを用いて、小規模培養を調製し、そこからＤＮＡを調製する（Ｑｉａｇｅｎスピンミニプレップを用いる）。解析用ＥｃｏＲＩ（ＮＥＢ）制限消化を行って、ＰＣＲの結果を確認する。正しいバンドパターンを示すクローンを配列決定する。これらのクローンは、ｇＤＮＡクローンと比較した際、６５ｂｐの欠失を示す。予測されるアミノ酸配列の解析によって、ＤＮＡ結合ドメインの２つの半分がインフレームであることが示される。こうしたクローンの１つを、ｐＣＲ２．１  Ａｓｐ−ｖｅｒｓ−ＡｌｃＲ−ＲＴｆｒａｇと命名する。
【００８４】
ｃＤＮＡ由来の配列を含有する全長クローンを得るため、ＲＴ断片をＡ．ベルシコロルｇＤＮＡの３’端（遺伝子中にさらなるイントロンがまったくないため、ｃＤＮＡと同じ）上にスプライシングする。ｐＣＲ２．１  Ａｓｐ−ｖｅｒｓ−ＡｌｃＲ−ＲＴｆｒａｇをＳｐｅＩで消化し（３７℃、３時間）、そしてｐＣＲ２．１  ｖｅｒｓ  ＡｌｃＲ  ｇＤＮＡをＳｐｅＩおよびＸｂａＩで消化した（３７℃、３時間）。反応を１％アガロースゲル上で解析し、そしてＧｅｎｅｃｌｅａｎスピンキット（Ｂｉｏ１０１）を用いて、必要なバンドを精製した。エビ（ｓｈｒｉｍｐ）アルカリホスファターゼ（ＳＡＰ；３７℃、１時間）を用いて、ｐＣＲ２．１  Ａｓｐ−ｖｅｒｓ−ＡｌｃＲ−ＲＴｆｒａｇ断片をホスファターゼ処理し、そしてＧｅｎｅｃｌｅａｎスピンキット（Ｂｉｏ１０１）を用いて、ＤＮＡを清浄にする。連結は、６μｌホスファターゼ処理ＲＴｆｒａｇベクターおよび２μｌ挿入物を用いてセットアップする（Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ、１６℃、１６時間）。前述のように、ＴＯＰ１０細胞を各連結反応３μｌで形質転換する。
【００８５】
コロニーは、上述のように、しかし配列番号９２および１３６を持つプライマーを用いて、ＰＣＲによってスクリーニングする。正しいサイズの断片を示すコロニーを用いて、小規模培養を調製し、そこからＤＮＡを調製する（Ｑｉａｇｅｎスピンミニプレップを用いる）。解析用ＥｃｏＲＩ（ＮＥＢ）、およびＸｂａＩ／ＳｐｅＩ（ＮＥＢ）制限消化を行って、ＰＣＲの結果を確認する。正しいバンドパターンを示すクローンを配列決定して、全長ｃＤＮＡ配列の挿入を確認する。全長配列を所持するクローンを、ｐＣＲ２．１  Ａｓｐ−ｖｅｒｓ−ＡｌｃＲ−ｆｌｃＤＮＡと命名する。
【００８６】
４．２  Ａ．ウスツス由来のＡｌｃＲのＤＮＡ結合ドメインにおけるイントロン境界の同定
Ａ．ウスツスからＲＮＡを単離するため、培養を増殖させ、そしてＡ．ベルシコロルに関して記載するように（実施例４．１）ＲＮＡを抽出する。逆転写をセットアップし（１μｌオリゴｄＴ(15)、５μｌ  ＲＮＡ、７μｌ  Ｈ2Ｏ）、そして上述のように行う。
【００８７】
ＰＣＲは以下のようにセットアップし：６μｌ逆転写反応、２μｌオリゴ１（配列番号１３７；１０μＭ）、２μｌオリゴ２（配列番号１３８；１０μＭ）、２１μｌ  Ｈ2Ｏ、１  ＰＣＲビーズ、そして以下の条件下で行う：９５℃１０分間、（９５℃１分間、５５℃１分間、７２℃３分間）ｘ３５周期、７２℃１０分間。試料は、１％  ｗ／ｖアガロースＴＢＥゲルを通じた電気泳動によって解析し、そしてＧｅｎｅｃｌｅａｎスピンキット（Ｂｉｏ１０１）を用いて、断片を精製する。精製産物は、製造者のプロトコルにしたがって、ｐＣＲ２．１ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングする。連結ＴＯＰＯ産物は、前述のようにＴＯＰ１０細胞に形質転換する。
【００８８】
コロニーは、上の実施例４．１に記載するように、ＰＣＲによってスクリーニングする（配列番号９１および９２を持つプライマーを用いる）。正しいサイズの断片を示すコロニーを用いて、小規模培養を調製し、そこからＤＮＡを調製する（Ｑｉａｇｅｎスピンミニプレップを用いる）。解析用ＥｃｏＲＩ（ＮＥＢ）制限消化を行って、そして正しいバンドパターンを示すクローンを配列決定する。これらのクローンは、ｇＤＮＡクローンと比較した際、およそ１００ｂｐの欠失を示す。予測されるアミノ酸配列の解析によって、ＤＮＡ結合ドメインの２つの半分がインフレームであることが示される。しかし、これらのクローンはまた、ｇＤＮＡ配列との他の相違も示し、これはＴａｑポリメラーゼを用いたＰＣＲのためであると考えられる。これらのクローンを、ｐＣＲ２．１  Ａｓｐ−ｕｓｔｓ−ＡｌｃＲ−ｃＤＮＡ*と命名する。
【００８９】
正しい配列を含有するクローンを得るため、ｃＤＮＡの５’端をＡ．ウスツスｇＤＮＡの３’端（遺伝子中にさらなるイントロンがまったくないため、ｃＤＮＡと同じ）上にスプライシングする。ｐＣＲ２．１  Ａｓｐ−ｕｓｔ−ＡｌｃＲ−ｃＤＮＡ*およびｐＣＲ２．１  ｕｓｔ  ＡｌｃＲ  ｇＤＮＡをＢａｍＨＩで消化する（３７℃、３時間）。上述のように、反応を解析し、ＤＮＡ断片を精製する。ＳＡＰ（３７℃、１時間）を用いて、ｐＣＲ２．１  Ａｓｐ−ｕｓｔ−ＡｌｃＲ−ｃＤＮＡ*断片をホスファターゼ処理し、そしてＧｅｎｅｃｌｅａｎスピンキット（Ｂｉｏ１０１）を用いて、ＤＮＡを清浄にする。連結は、６μｌホスファターゼ処理ＲＴｆｒａｇベクターおよび２μｌ挿入物を用いてセットアップする（Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ、１６℃、１６時間）。前述のように、ＴＯＰ１０細胞を形質転換する。
【００９０】
コロニーは、上の実施例４．１に記載するように、ＰＣＲによってスクリーニングする（配列番号９２および１３８を持つプライマーを用いる）。正しいサイズの断片を示すコロニーを用いて、小規模培養を調製し、そこからＤＮＡを調製する（Ｑｉａｇｅｎスピンミニプレップを用いる）。ＤＮＡは配列を確認して、訂正配列の存在をチェックする。正しいＡ．ウスツスｃＤＮＡ配列を所持するクローンを、ｐＣＲ２．１  Ａｓｐ−ｕｓｔ−ＡｌｃＲ−ｆｌｃＤＮＡと命名する。
【００９１】
４．３  黄色コウジ菌由来のＡｌｃＲのＤＮＡ結合ドメイン内のイントロン境界の同定
Ａ．ベルシコロルに関して記載するように、黄色コウジ菌由来の培養を増殖させ、そしてＲＮＡを抽出する。ＲＮＡをＤＮアーゼで処理して（ＲＱ１  ＤＮアーゼに加えてＲＮａｓｉｎ、３７℃、１時間）、そしてＲＮｅａｓｙキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて清浄にする。ＲＮＡは、ＤＥＰＣ処理Ｈ2Ｏで１：５に希釈し、ＤＮアーゼで再処理し、そしてＲＮｅａｓｙキットを用いて清浄にする。ＲＴ  ＰＣＲは、Ａｍｂｉｏｎの５’ＲＡＣＥキットを用いて行う。ＲＮＡは、ホスファターゼ処理し（ＣＩＰ）、ＲＮｅａｓｙキットを用いて清浄にし、そして製造者の指示にしたがってＴＡＰで処理する。その後、製造者のプロトコルにしたがって、ＲＮＡ  ＲＡＣＥアダプターに連結する。
【００９２】
上述のように、しかし配列番号１３９を有するプライマーを用いて、逆転写をセットアップし、そして行う。Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔを除き、すべての構成要素を含有する対照反応もまたセットアップし、そしてＰＣＲ工程に供する。
【００９３】
以下を含有する、一次ＰＣＲ反応をセットアップする：２μｌ逆転写反応、２μｌオリゴ１（配列番号１４０；１０μＭ）、２μｌオリゴ２（配列番号１４１；１０μＭ）；１９μｌ  Ｈ2Ｏ、１  ＰＣＲビーズ。一次ＰＣＲを行い、そして実施例４．２に記載するように、試料を解析する。一次ＰＣＲを２４５μｌのＴｒｉｃｉｎｅ  ＥＤＴＡで希釈する。その後、二次ＰＣＲをセットアップする：５μｌ希釈一次ＰＣＲ、２μｌオリゴ１（配列番号１４０）、２μｌオリゴ２（配列番号１４２）、１６μｌ  Ｈ2Ｏ、１  ＰＣＲビーズ。ＰＣＲは、実施例４．１に記載する条件下で行う。ＰＣＲ反応は、前述のように、アガロースゲル電気泳動によって解析する。試料は、ＲＴレーンにおいて、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔを欠く対照に存在しない、明確に可視であるバンドを示す。前述のように、このバンドを精製し、そしてｐＣＲ２．１ＴＯＰＯにクローニングする。ＴＯＰ１０細胞を連結反応で形質転換する。
【００９４】
コロニーは、上の実施例４．１に記載するように、ＰＣＲによってスクリーニングする（配列番号９１および９２を持つプライマーを用いる）。正しいサイズの断片を示すコロニーを用いて、小規模培養を調製し、そこからＤＮＡを調製する（Ｑｉａｇｅｎスピンミニプレップを用いる）。これらを配列決定する。コロニーはｇＤＮＡクローンと同一の配列を示し、これによって、黄色コウジ菌ａｌｃＲ相同分子種が、イントロンを含有しないことが確認される。
【００９５】
４．４  Ａ．フミガツスのａｌｃＲ相同分子種におけるイントロン境界の同定
黄色コウジ菌に関して記載するように（実施例４．３）、アスペルギルス・フミガツスの培養を増殖させ、そしてＲＮＡを抽出し、そして調製する。
【００９６】
逆転写反応は：１μｌオリゴｄＴ(15)、１μｌ  ＲＮＡ、１１μｌ  Ｈ2Ｏを含有し、そして実施例４．１に記載するように、適切な対照と共に行う。
ＰＣＲ反応は：１μｌ逆転写反応＋１μｌオリゴ１（配列番号１４３；１０μＭ）、２μｌオリゴ２（配列番号１４４；１０μＭ）、２２μｌ  Ｈ2Ｏ、１  ＰＣＲビーズを含有する。ＰＣＲは、実施例４．１に記載する条件下で行う。前述のように、ＰＣＲ反応はアガロースゲル電気泳動によって解析する。試料は、ＲＴレーンにおいて、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔを欠く対照に存在しない、明確に可視であるバンドを示す。前述のように、このバンドを精製し、そしてｐＣＲ２．１ＴＯＰＯにクローニングする。ＴＯＰ１０細胞を連結反応で形質転換する。
【００９７】
先のように、配列番号９１および９２を有するプライマーを用いたＰＣＲによって、コロニーをスクリーニングする。正しいサイズの断片を示すコロニーを用いて、小規模培養を調製し、そこからＤＮＡを調製する（Ｑｉａｇｅｎスピンミニプレップを用いる）。これらのクローンを配列決定し、そしてこれらはｇＤＮＡクローンと同一の配列を示し、これによって、アスペルギルス・フミガツスａｌｃＲが、イントロンを含有しないことが確認される。
【００９８】
（実施例５）
他のアスペルギルス属種からのａｌｃＲ相同分子種の単離
多様な地理上の場所（ｌｏｃａｔｉｏｎ）から、異なるアスペルギルス属種および亜種を選択した。Ａ．ウスツス、Ａ．ベルシコロル、Ａ．フミガツスおよび黄色コウジ菌のオープンリーディングフレームを並列した後、縮重オリゴヌクレオチドを選択する。ありうる最長の断片を１つのＰＣＲ反応から単離することを可能にするコンセンサス領域を生成する（配列番号２  Ａｌｃ１ｂ２、配列番号６７、ｎ−ａｌｃｒ２および配列番号６８、ｃ−ａｌｃｒ）。コード配列のすべてに渡る縮重オリゴヌクレオチドの第二組もまた、生成する（配列番号６９、ＡｌｃＲＡＴＧおよび配列番号７０、ａｌｃＲＴＧＡ）。最後に、ＰＣＲを介して単離するのが困難であると判明した２．４ｋｂ断片の場合、遺伝子の中央に位置するコンセンサス配列から、縮重オリゴヌクレオチドの組を産生する（配列番号７１、ａｌｃＭＩＤおよび配列番号、ａｌｃＭＩＤＲ）。図２は、遺伝子のコード配列に対するオリゴヌクレオチドの相対的な位置を示す。表４は、遺伝子を単離した種、およびＤＮＡ断片を生成するのに用いた縮重オリゴヌクレオチドを示す。
【００９９】
ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼを用いた標準的ＰＣＲには、Ｒｅａｄｙ−Ｔｏ−Ｇｏ  ＰＣＲビーズ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いる。最終体積２５μｌにした際、各反応は：１．５単位のｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（室温でｐＨ９．０）、５０ｍＭ  ＫＣｌ、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ、２００μＭの各ｄＮＴＡおよびＢＳＡを含む安定化剤を含有する。各ＰＣＲビーズに添加するのは、１μｌのゲノムＤＮＡ、および１μｌの各プライマー（１０μＭ）である。その後、試験管をＰＣＲ装置に入れ、そしてＤＮＡを９５℃で５分間変性する。その後、３５周期の増幅を行う。各周期は、９４℃１分間、融点（Ｔｍ）１分間、および７２℃１．５分間からなり、その後、７２℃でさらに１０分間処理する。Ｔｍは、用いるプライマーに応じて変化する。２つのプライマーのＴｍは異なるため、いくつかのプライマーの組み合わせに関して、温度勾配を用いる。
【０１００】
より忠実度が高いＤＮＡポリメラーゼ酵素を用いて、複製の誤比率（ｅｒｒｏｒ  ｒａｔｅ）を減少させる。ｐｆｕ  ｔｕｒｂｏは、大部分のＤＮＡポリメラーゼの中で、最低の誤比率（１．３ｘ１０-6）を有し、そしてこれを用いて、アスペルギルス属種からＩＴＳ領域を増幅する。４μｌ  ｐｆｕ  ｔｕｒｂｏ  １０ｘ緩衝液、４μｌ  ２．５ｍＭ  ｄＮＴＰミックス、１μｌ  ＤＮＡテンプレート、１μｌ  ＩＴＳ１、１μｌ  ＩＴＳ４、および２７μｌ再蒸留水をエッペンドルフ試験管に添加する。試験管を９４℃で２分間、ＰＣＲ装置に入れて、ＤＮＡを変性させる。その後、２μｌのｐｆｕ  ｔｕｒｂｏを試験管に添加し、そして３５周期の増幅を行う。各周期は、９４℃３０秒間、５５℃３０秒間、および７２℃１分間からなる。３５周期に続いて、７２℃でさらに１０分間処理する。１ＸＴＢＥで作成した１％（ｗ／ｖ）アガロースゲルを用いて、増幅ＤＮＡ断片を分画する。ＵＶトランスイルミネーターを用いて、断片を視覚化し、そしてゲルから切り出して、そしてＱＩＡＧＥＮのＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キットを用いて精製する。その後、産物をｐＣＲ２．１ＴＯＰＯベクター（ＩｎｖｉｔｒｏＧｅｎ）にサブクローニングし、そしてＰＣＲによって陽性クローンをスクリーニングする。小規模培養中で陽性クローンを増殖させ、そしてＤＮＡを抽出し、そして配列決定する。異なる単離配列に関する配列番号を表４に提供する。
【０１０１】
表４  アスペルギルス属種からａｌｃＲ遺伝子を増幅するのに用いるプライマーの組み合わせ。すべてのプライマーがすべての種で働くわけではなく、したがってａｌｃＲ遺伝子が増幅されるまで、組み合わせを用いる
【０１０２】
【表４】
2004535774.tif 000007
【０１０３】
（実施例６）
Ａ．ウスツス、Ａ．ベルシコロル、Ａ．フミガツスおよび黄色コウジ菌由来の単離ＤＮＡ配列を含有する、植物形質転換用の発現ベクターの産生
６．１  クローニング用の中間ベクターの生成
６．１．１  ｐＵＣ  ＳａｌｌｙニダランスＩＩ中間ベクターの生成
ｐＦＳＥ４−３５Ｓ−ＡｌｃＲｎｏｓ／ＡｌｃＡｇｌｕＧＵＳｉｎｔｎｏｓ  ｂ  ｒｅｖベクター（図３）は、Ａ．ウスツス、Ａ．フミガツス、Ａ．ベルシコロルおよび黄色コウジ菌由来のａｌｃＲ相同分子種の中間体クローニングに必要な構成要素をすべて含有する。しかし、適切な制限部位がない。したがって、部位特異的突然変異誘発（ＳＤＭ）を用いて、ベクター中に第二のＳａｌＩ部位を生成する。ＳＤＭは、Ｑｕｉｋｃｈａｎｇｅ  ＳＤＭキット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いて行う。サイクリングは、製造者のプロトコルにしたがって、１μｌのテンプレートＤＮＡ、並びに１２５ｎｇのＳａｌｌｙ  １７Ｐ（配列番号９９）およびＳａｌｌｙ１８Ｐ（配列番号１００）プライマーを用いてセットアップする。サイクリング条件は：９５℃３０秒間、（９５℃３０秒間、５５℃１分間、６８℃１８分間）ｘ１４周期である。その後、反応をＤｐｎＩで消化し（３７℃、１時間）、そして大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ細胞に形質転換する（形質転換は、ＴＯＰ１０細胞に関して前述のように行う）。
【０１０４】
コロニーを用いて培養を調製し、そこからＤＮＡを調製する。ＤＮＡに対してＳａｌＩ制限消化を行い（３７℃、４５分間）、そして１％アガロースゲル上で解析する。正しいバンドパターンを示すクローンの配列を確認する。このベクターを、ｐＵＣ  ＳａｌｌｙニダランスＩＩ（図４）と命名する。
【０１０５】
６．１．２  ｐＵＣ  Ｋｅｌｌｙ中間ベクターの生成
ｐＵＣ  ＳａｌｌｙニダランスＩＩベクターをＳａｌＩで消化し（３７℃、３時間）、そして１％ゲル上で解析する。Ｂｉｏ１０１  Ｇｅｎｅｃｌｅａｎスピンを用いて、大きな主鎖プラスミドバンドを精製する。その後、このプラスミドを自己連結する（１μｌ  ＤＮＡ、１μｌ緩衝液、１μｌ  Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ、１６℃で１６時間）。ＤＮＡをＴＯＰ１０コンピテント細胞に再形質転換する（先に記載するとおり）。コロニーを用いて培養を調製し、そこからＤＮＡを調製する。ＤＮＡに対してＸｍａＩ（ＮＥＢ）制限消化を行い（３７℃、２時間）、そしてこれらを１％アガロースゲル上で解析する。正しいバンドパターンを示すクローンの配列を確認する。このベクターを、ｐＵＣ  Ｋｅｌｌｙ（図５）と命名する。
【０１０６】
６．２  相同分子種特異的発現ベクターの構築
６．２．１  Ａ．ウスツスａｌｃＲ配列発現用の発現ベクター
（すべてのＡｌｃＲは、ゲノムまたはｃＤＮＡからの増幅後、ｐＣＲ２．１にクローニングしたことに注意されたい）
ａｌｃＲ遺伝子は、プライマーＳａｌｌｙ３（配列番号８０）およびＳａｌｌｙ４（配列番号８１）を用いて、ｐＣＲ２．１からのＰＣＲによって増幅し、３’および５’端両方にＳａｌＩ部位を付加する（１μｌ  ｐＣＲ２．１ウスツスＡｌｃＲ、２５ｐｍｏｌ／μｌの各プライマー１μｌ、１０μｌ緩衝液、０．２μｌ  １００ｍＭ  ｄＮＴＰミックス、１μｌ  ｐｆｕ  ＴｕｒｂｏをＨ2Ｏで５０μｌにする）。ＰＣＲ条件は：９５℃５分間、（９５℃１分間、５５℃１分間、７２℃３分間）ｘ４０周期、７２℃１０分間である。製造者のプロトコルにしたがって、このＰＣＲ産物をｐＧＥＭ−Ｔｅａｓｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ）にクローニングする。連結産物を大腸菌ＤＨ５α細胞に形質転換する（形質転換は、ＴＯＰ１０細胞に関して、前述のように行う）。コロニーは、ＳａｌＩでの制限消化によって解析する。期待される制限パターンを生じるクローンを、Ｍ０４３（図６）と命名した。Ｍ０４３をＳａｌＩで消化し（３７℃、１時間）、そしてＢｉｏ１０１  Ｇｅｎｅｃｌｅａｎスピンキットを用いて、必要なバンドを精製した。ｐＵＣ  ＳａｌｌｙニダランスＩＩもまた、ＳａｌＩで消化し（３７℃、４５分間）、その後、ＳＡＰを用いてホスファターゼ処理する（３７℃、４５分間）。１％アガロースゲル上で反応を解析し、そしてＧｅｎｅｃｌｅａｎスピンキット（Ｂｉｏ１０１）を用いて必要なベクター主鎖を精製する。その後、７μｌ  ａｌｃＲ断片および１μｌホスファターゼ処理ベクターを用いて連結をセットアップし（Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ、１６時間、１６℃）、そしてＤＮＡをＤＨ５αコンピテント細胞に形質転換する。
【０１０７】
コロニーはＰＣＲによってスクリーニングする：２３μｌ水、１  Ｒｅａｄｙ−Ｔｏ−Ｇｏ  ＰＣＲビーズ、１μｌ  ＳＡＬＬＹ１４プライマー（配列番号８２；２５ｐｍｏｌ／μｌ）、１μｌ  Ａｌｃｕｓｔ  ｓｅｑ  １０ｒプライマー（配列番号８３；２５ｐｍｏｌ／μｌ）。ＰＣＲ条件は：９５℃１０分間、（９５℃３０秒間、５５℃３０秒間、７２℃１分間）３５周期、７２℃５分間である。アガロースゲル電気泳動によって、反応を解析する。正しいサイズの断片を示すコロニーを用いて、小規模培養を調製し、そこからＤＮＡを調製する（Ｑｉａｇｅｎスピンミニプレップを用いる）。ＤＮＡの配列を確認して、ａｌｃＲの方向（ｏｒｉｅｎｔａｔｉｏｎ）をチェックする。クローンを、ｐＵＣ  ＳａｌｌｙウスツスＡｌｃＲ（図７）と命名した。
【０１０８】
ｐＵＣ  ＳａｌｌｙウスツスＡｌｃＲおよびｐＶＢ６をＦｓｅＩで消化する（３７℃３時間）。１％ゲル上で消化を確認した後、ｐＶＢ６ベクターを精製し（Ｇｅｎｅｃｌｅａｎスピン、Ｂｉｏ１０１）、ＳＡＰを用いてホスファターゼ処理し（３７℃、１時間）、そして清浄にする（Ｇｅｎｅｃｌｅａｎスピン、Ｂｉｏ１０１）。ｐＵＣ  ＳａｌｌｙウスツスＡｌｃＲ由来の必要なバンドを、１％アガロースから精製する（Ｇｅｎｅｃｌｅａｎスピン、Ｂｉｏ１０１）。その後、３μｌ挿入物および１μｌホスファターゼ処理ベクターを用いて、連結をセットアップし（Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ、１６℃、１６時間）、そしてＤＮＡをＤＨ５αコンピテント細胞に形質転換する。
【０１０９】
コロニーは、配列番号８４および８５を有するプライマーを用いて、上述のようにＰＣＲスクリーニングによって解析した。正しいサイズの断片を示すコロニーを用いて、小規模培養を調製し、そこからＤＮＡを調製する（Ｑｉａｇｅｎスピンミニプレップを用いる）。解析用ＸｂａＩおよびＸｍａＩ（ＮＥＢ）制限消化を行って（３７℃、３時間）、そして１％アガロースゲル上で解析する。正しいバンドパターンを示すクローンの配列を確認して、そしてｐＶＢ  ｕｓｔ（図８）と命名する。
【０１１０】
ＤＮＡは、エレクトロポレーションを用いて、アグロバクテリウム株ＭＯＧ３０１に形質転換し（０．２ｃｍキュベット中、５０μｌコンピテント細胞、１μｌ  ＤＮＡ、２５μＦ、２００オーム、２．５ｋＶで、Ｂｉｏｒａｄジーンパルサーを用いてエレクトロポレーション）、その後、１ｍｌ  ＬＢ培地を添加し、細胞を２８℃で１時間インキュベーションする。２５μｌをＬＢ＋Ｋａｎ＋Ｒｉｆプレート上に広げ、そして２８℃で２日間インキュベーションする。コロニーは、ＮＰＴ２−２およびｐ３５Ｓ−３プライマーを用いたＰＣＲによって解析する。正しいバンドを示すクローンを、さらなる研究に用いる（以下の実施例６．３を参照されたい）。
【０１１１】
６．２．２  Ａ．フミガツスａｌｃＲ配列発現用の発現ベクター
Ａ．フミガツスａｌｃＲは、Ｓａｌｌｙ２１（配列番号８６）およびＳａｌｌｙ２２（配列番号８７）を用いて、ｐＣＲ２．１からのＰＣＲによって増幅し、こうして、３’および５’端両方にＳａｌＩ部位を付加する：１μｌ  ｐＣＲ２．１フミガツスＡｌｃＲ、１００ｎｇ／μｌの各プライマー１μｌ、１  ＰＣＲビーズをＨ2Ｏで２５μｌにする。ＰＣＲ条件は：９５℃５分間、（９５℃１分間、５５℃１分間、７２℃２．５分間）ｘ４０周期、７２℃１０分間である。その後、製造者のプロトコルにしたがって、このＰＣＲ産物をｐＧＥＭ−Ｔｅａｓｙにクローニングする。連結産物をＴＯＰ１０細胞に形質転換する。
【０１１２】
コロニーは、ＳａｌＩでの制限消化によって解析する。望ましい制限パターンを示すクローンを、Ｍ１９２（図９）と命名する。ｐＵＣ  ＳａｌｌｙニダランスＩＩをＳａｌＩで消化し（３７℃、３時間）、そしてＢｉｏ１０１  Ｇｅｎｅｃｌｅａｎスピンキットを用いて、１％アガロースから必要なバンドを精製した。ＳＡＰを用いてこの断片をホスファターゼ処理し（３７℃、１時間）、そしてＧｅｎｅｃｌｅａｎスピンキット（Ｂｉｏ１０１）を用いてＤＮＡを清浄にする。Ａ．フミガツスａｌｃＲを含有するＭ１９２ベクターを１／２［酵素］を用いてＳａｌＩで部分的に消化し（３７℃１５分間）、そして１％アガロースからａｌｃＲ断片を精製する（Ｂｉｏ１０１  Ｇｅｎｅｃｌｅａｎスピン）。
【０１１３】
連結をセットアップし（６μｌ  ａｌｃＲ断片および１μｌホスファターゼ処理ベクター、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ、１６時間、１６℃）、そしてＤＮＡをＤＨ５αコンピテント細胞に形質転換する。
【０１１４】
コロニーは、配列番号８２および８８を有するプライマーを用いたＰＣＲによって解析する：正しいサイズの断片を示すものを用いて、小規模培養を調製し、そこからＤＮＡを調製する（Ｑｉａｇｅｎスピンミニプレップを用いる）。ＸｍａＩ制限消化を行って、ａｌｃＲの方向を決定する（３μｌ  ＤＮＡ＋１μｌ緩衝液＋１μｌ  ＸｍａＩ＋５μｌ  Ｈ2Ｏ、３７℃、２時間）。正しいバンドパターンを示すクローン（ｐＵＣ  ＳａｌｌｙフミガツスＡｌｃＲ*と称する）の配列を決定した。配列解析は、１６１５ｂｐの位で、配列に誤りを示す（ＴからＣ）。この誤りは、ｐＵＣ  ＳａｌｌｙフミガツスＡｌｃＲ*およびｐＣＲ２．１フミガツスＡｌｃＲ（ゲノムＤＮＡ由来のａｌｃＲクローニングからの元来のベクター）をＢｇｌＩＩおよびＳａｃＩで消化する（３７℃、３時間）ことによって、訂正する。ｐＵＣ  ＳａｌｌｙフミガツスＡｌｃＲ由来の大ベクター断片、およびｐＣＲ２．１フミガツスＡｌｃＲ由来の正しい配列を含有する小断片を、１％アガロースから精製する（Ｇｅｎｅｃｌｅａｎスピン、Ｂｉｏ１０１）。その後、３μｌ挿入物および１μｌベクターを用いて連結をセットアップし（Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ、１６時間、１６℃）、そしてＤＮＡをＤＨ５αコンピテント細胞に形質転換した。コロニーを用いて、小規模培養を調製し、そこからＤＮＡを調製する（Ｑｉａｇｅｎスピンミニプレップを用いる）。生じたＤＮＡを配列決定して、誤りが訂正されているかどうかをチェックする。訂正ＤＮＡ配列を持つクローンを、ｐＵＣ  ＳａｌｌｙフミガツスＡｌｃＲ（図１０）と命名した。
【０１１５】
ｐＵＣ  ＳａｌｌｙフミガツスＡｌｃＲおよびｐＶＢ６を、ＦｓｅＩで消化する（３７℃、３時間）。１％ゲル上で消化を確認した後、ｐＶＢ６ベクターを精製し（Ｇｅｎｅｃｌｅａｎスピン、Ｂｉｏ１０１）、ホスファターゼ処理し（１７μｌ  ＤＮＡ＋２μｌリン酸緩衝液＋１μｌ  ＳＡＰ、３７℃で１時間）、そして清浄にする（Ｇｅｎｅｃｌｅａｎスピン、Ｂｉｏ１０１）。ｐＵＣ  ＳａｌｌｙウスツスＡｌｃＲ由来の必要なバンドを、１％アガロースから精製する（Ｇｅｎｅｃｌｅａｎスピン、Ｂｉｏ１０１）。その後、前述のように、連結を行い、そしてＤＮＡをＤＨ５αコンピテント細胞に形質転換する。
【０１１６】
前述のように、ＮＰＴ２−２およびｐ３５Ｓ−３プライマー（それぞれ配列番号８４および８５）を用いたＰＣＲによって、コロニーをスクリーニングした。正しいサイズの断片を示すコロニーを用いて、小規模培養を調製し、そこからＤＮＡを調製する（Ｑｉａｇｅｎスピンミニプレップを用いる）。解析用ＸｍａＩ（ＮＥＢ）制限消化を行い、そして正しいバンドパターンを示すクローンの配列を確認し、そしてｐＶＢ  ｆｕｍ（図１１）と命名する。
【０１１７】
ＤＮＡは、上述のように、エレクトロポレーションを用いて、アグロバクテリウム株ＭＯＧ３０１に形質転換する。コロニーはＰＣＲスクリーニングによって解析し、そして正しいサイズのバンドを示すクローンを、さらなる研究すべてに用いる（以下の実施例６．３を参照されたい）。
【０１１８】
６．２．３  Ａ．ベルシコロルａｌｃＲ配列発現用の発現ベクター
Ａ．ベルシコロルａｌｃＲは、Ｓａｌｌｙ１２（配列番号８９）およびＳａｌｌｙ１３（配列番号９０）を用いて、ｐＣＲ２．１からのＰＣＲによって増幅し、３’および５’端両方にＳａｌＩ部位を付加する：１μｌ  ｐＣＲ２．１ベルシコロルＡｌｃＲ、１０ｐｍｏｌ／μｌの各プライマー１μｌ、４μｌ緩衝液、４μｌ  ２．５ｍＭ  ｄＮＴＰミックス、２μｌ  ｐｆｕ、２７μｌ  Ｈ2Ｏ。ＰＣＲ条件は：９５℃２分間、（９５℃３０秒間、５５℃３０秒間、７２℃５分間）ｘ３０周期、７２℃１０分間である。その後、製造者のプロトコルにしたがって、このＰＣＲ産物をｐＣＲ２．１ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングする。連結ＴＯＰＯ産物をＴＯＰ１０細胞に形質転換する。
【０１１９】
コロニーは、前述のように、ＰＣＲによって解析する（Ｍ１３ｆｏｒプライマー、配列番号９１、およびＭ１３ｒｅｖプライマー、配列番号９２を用いる）。正しいサイズの断片を示すコロニーを用いて、小規模培養を調製し、そこからＤＮＡを調製する（Ｑｉａｇｅｎスピンミニプレップを用いる）。解析用ＥｃｏＲＩ（ＮＥＢ）制限消化を行い、そして正しいバンドパターンを示すクローンの配列を確認し、そしてｐＣＲ２．１  ＳａｌｌｙベルシコロルＡｌｃＲと命名する。
【０１２０】
ｐＵＣ  ＫｅｌｌｙベクターをＳａｌＩで消化する（３７℃、３時間）。１％ゲル上で消化を確認した後、該ベクターを精製し（Ｇｅｎｅｃｌｅａｎスピン、Ｂｉｏ１０１）、ＳＡＰでホスファターゼ処理し（３７℃、１時間）、そして清浄にする（Ｇｅｎｅｃｌｅａｎスピン、Ｂｉｏ１０１）。ｐＣＲ２．１  ＳａｌｌｙベルシコロルＡｌｃＲをＳａｌＩで部分的に消化し（１／２［酵素］、３７℃で１５分間）、そして１％アガロースからａｌｃＲ断片を精製する（Ｂｉｏ１０１  Ｇｅｎｅｃｌｅａｎスピン）。
【０１２１】
３μｌ  ＡｌｃＲ断片および１μｌホスファターゼ処理ベクターを用いて、連結をセットアップし（Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ、１６時間、１６℃）、そしてＤＮＡをＴＯＰ１０コンピテント細胞に形質転換する。コロニーは、前述のように、ＰＣＲによってスクリーニングし（Ａｌｃｖｅｒｓ  ｓｅｑ２プライマー、配列番号９３、およびＡｌｃｖｅｒｓ  ｓｅｑ１ｒプライマー、配列番号９４）、そして正しいサイズのバンドを示すものを用いて、小規模培養に植え付け、そこからＤＮＡを調製する（Ｑｉａｇｅｎスピンミニプレップを用いる）。解析用ＳｍａＩ（ＮＥＢ）制限消化を行い、そして正しいバンドパターンを示すクローンの配列を確認し、そしてｐＵＣ  ＫｅｌｌｙベルシコロルＡｌｃＲ（図１２）と命名する。
【０１２２】
ｐＵＣ  ＫｅｌｌｙベルシコロルＡｌｃＲおよびｐＶＢ６をＦｓｅＩで消化する（３７℃、３時間）。１％ゲル上で消化を確認した後、ｐＶＢ６ベクターを精製し（Ｇｅｎｅｃｌｅａｎスピン、Ｂｉｏ１０１）、そしてＳＡＰでホスファターゼ処理し（３７℃、１時間）、そして清浄にする（Ｇｅｎｅｃｌｅａｎスピン、Ｂｉｏ１０１）。１％アガロースからｐＵＣ  ＫｅｌｌｙベルシコロルＡｌｃＲ由来の必要なバンドを精製する（Ｇｅｎｅｃｌｅａｎスピン、Ｂｉｏ１０１）。連結は、３μｌ挿入物および１μｌホスファターゼ処理ベクターを用いてセットアップし（Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ、１６℃１６時間）、そしてＤＮＡをＤＨ５αコンピテント細胞に形質転換する。
【０１２３】
コロニーは、前述のように、ＮＰＴ２−２およびｐ３５Ｓ−３プライマー（それぞれ配列番号８４および８５）を用いたＰＣＲによってスクリーニングする。正しいサイズの断片を示すコロニーを用いて、小規模培養を調製し、そこからＤＮＡを調製する（Ｑｉａｇｅｎスピンミニプレップを用いる）。解析用ＳｍａＩ（ＮＥＢ）制限消化を行い、そして正しいバンドパターンを示すクローンの配列を確認し、そしてｐＶＢ  ｖｅｒ（図１３）と命名する。
【０１２４】
ＤＮＡは、上述のように、エレクトロポレーションを用いて、アグロバクテリウム株ＭＯＧ３０１に形質転換する。コロニーはＰＣＲスクリーニングによって解析し、そして正しいサイズのバンドを示すクローンを、さらなる研究すべてに用いる（以下の実施例６．３を参照されたい）。
【０１２５】
６．２．４  黄色コウジ菌ａｌｃＲ配列、ＡｌｃＲ発現用の発現ベクター
黄色コウジ菌ａｌｃＲは、「ｋｎｐｆｌａｖ  ｆｏｒ」（配列番号９６）および「ｆｌａｖｋｐｎＩｒｅｖ−２」（配列番号９７）を用いて、ｐＣＲ２．１からのＰＣＲによって増幅し、こうして３’および５’端両方にＫｐｎＩ部位を付加する：１μｌ  ｐＣＲ２．１ベルシコロルＡｌｃＲ、１μｌの各プライマー（１０ｐｍｏｌ／μｌ）、４μｌ緩衝液、４μｌ  ２．５ｍＭ  ｄＮＴＰミックス、２μｌ  ｐｆｕ、２７μｌ  Ｈ2Ｏ。ＰＣＲ条件は：９５℃２分間、（９５℃３０秒間、５５℃３０秒間、７２℃５分間）ｘ３０周期、７２℃１０分間である。その後、製造者のプロトコルにしたがって、このＰＣＲ産物をｐＣＲ２．１ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングする。連結ＴＯＰＯ産物をＴＯＰ１０細胞に形質転換する。
【０１２６】
コロニーは、前述のように、ＰＣＲによって解析する（Ｍ１３ｆｏｒプライマー、配列番号９１、およびＭ１３ｒｅｖプライマー、配列番号９２を用いる）。正しいサイズの断片を示すコロニーを用いて、小規模培養を調製し、そこからＤＮＡを調製する（Ｑｉａｇｅｎスピンミニプレップを用いる）。解析用ＥｃｏＲＩ（ＮＥＢ）制限消化を行い、そして正しいバンドパターンを示すクローンの配列を確認し、そしてｐＣＲ２．１  ＫｅｌｌｙフラブスＡｌｃＲと命名する。
【０１２７】
ｐＵＣ  Ｋｅｌｌｙベクター（詳細に関しては以下を参照されたい）をＫｐｎＩで消化する（３７℃、３時間）。１％ゲル上で消化を確認した後、ベクターを精製し（Ｇｅｎｅｃｌｅａｎスピン）、ＳＡＰでホスファターゼ処理し（３７℃、１時間）、そして清浄にする（Ｇｅｎｅｃｌｅａｎスピン、Ｂｉｏ１０１）。ｐＣＲ２．１  ＫｅｌｌｙフラブスＡｌｃＲをＫｐｎＩで消化し（３７℃、３時間）、そして１％アガロースからａｌｃＲ断片を精製する（Ｂｉｏ１０１、Ｇｅｎｅｃｌｅａｎスピン）。
【０１２８】
３μｌ  ＡｌｃＲ断片および１μｌホスファターゼ処理ベクターを用いて、連結をセットアップし（Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ、１６時間、１６℃）、そしてＤＮＡをＴＯＰ１０コンピテント細胞に形質転換する。コロニーを用いて、小規模培養を調製し、そこからＤＮＡを調製する（Ｑｉａｇｅｎスピンミニプレップを用いる）。ＳｍａＩ制限消化を行い、そして正しいバンドを示すクローンの配列を確認し、そしてｐＵＣ  ＫｅｌｌｙフラブスＡｌｃＲ（図１４）と命名する。
【０１２９】
ｐＶＢ６をＦｓｅＩで消化する（３７℃、３時間）。１％ゲル上で消化を確認した後、該ベクターを精製し（Ｇｅｎｅｃｌｅａｎスピン、Ｂｉｏ１０１）、そしてＳＡＰでホスファターゼ処理し（３７℃、１時間）、そして清浄にする（Ｇｅｎｅｃｌｅａｎスピン、Ｂｉｏ１０１）。ｐＵＣ  ＫｅｌｌｙフラブスＡｌｃＲをＦｓｅＩで部分的に消化し（１／２［酵素］、３７℃、１５分間）、そして１％アガロースから必要なバンドを精製する（Ｇｅｎｅｃｌｅａｎスピン、Ｂｉｏ１０１）。連結は、３μｌ挿入物および１μｌホスファターゼ処理ベクターを用いてセットアップし（Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ、１６℃１６時間）、そしてＤＮＡをＤＨ５αコンピテント細胞に形質転換する。
【０１３０】
コロニーは、前述のように、ＰＣＲによって解析する（Ｍ１３ｆｏｒプライマー、配列番号９１、およびＭ１３ｒｅｖプライマー、配列番号９２を用いる）。正しいサイズの断片を示すコロニーを用いて、小規模培養を調製し、そこからＤＮＡを調製する（Ｑｉａｇｅｎスピンミニプレップを用いる）。解析用ＸｂａＩ制限消化を行い、そして正しいバンドパターンを示すクローンの配列を確認し、そしてｐＶＢ  ｆｌａｖ（図１５）と命名する。
【０１３１】
ＤＮＡは、上述のように、エレクトロポレーションを用いて、アグロバクテリウム株ＭＯＧ３０１に形質転換する。コロニーはＰＣＲスクリーニングによって解析し、そして正しいサイズのバンドを示すクローンを、さらなる研究すべてに用いる（以下の実施例６．３を参照されたい）。
【０１３２】
６．３  アグロバクテリウムが仲介する、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）植物の形質転換
シロイヌナズナ、コロンビア（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  Ｃｏｌｕｍｂｉａ）植物を種子から開花まで成長させる。花が開いたら最初の花の束（ｆｌｏｗｅｒ  ｂｏｌｔ）を取り除き、第二の花穂の成長を助長する。植物は、播種後、およそ１２−１４週間用いる。
【０１３３】
アグロバクテリウム（必要な構築物を含有するＭＯＧ３０１）の２つの１０ｍｌ培養物を、ＬＢ＋Ｋａｎ＋Ｒｉｆ培地中に樹立し、そして２８℃、２３０ｒｐｍで、２４時間増殖させる。これらをその後、５００ｍｌ  ＬＢ＋Ｋａｎ＋Ｒｉｆを含有する２つのコニカルフラスコに移し、そして２８℃、２３０ｒｐｍで、２４時間増殖させる。４０００ｒｐｍ、２０分間の遠心分離によって細胞を採取し、そして１リットルの浸潤培地（５０ｇ／ｌスクロース、４．４ｇ／ｌ  ＭＳ塩、１ｍｌ／ｌ  Ｂ５ビタミン、０．５ｇ／ｌ  ＭＥＳ、０．０４４μＭｏｌ  ＢＡＰ、２００μｌ／ｌ  Ｓｉｌｗｅｔ  Ｌ−７７）に再懸濁する。
【０１３４】
形質転換直前、すべての開いた花および部分的に開いたつぼみを、ピンセットで植物から除去する。再懸濁した細菌を含有する浸潤培地を、単一のマゼンタ容器に分配し、そして真空チャンバーに入れる。その後、用意した植物をさかさまにして、そしてマゼンタ容器に入れる。その後、８５０ｍｂａｒの真空を１０分間適用し、その後、ゆっくりと真空を解除する。ティッシュペーパー上で植物を簡単に拭き、そして横にして密封プラスチック袋に２４時間入れる。プラスチック袋から植物を除去し、そして直立してメッシュ繁殖容器（ｍｅｓｈ  ｐｒｏｐａｇａｔｏｒ）に入れて、成熟させ、そして種子をつけさせる。
【０１３５】
形質転換３週間後、植物を紙上に置く。植物にはもはや給水せず、そして２週間、完全に乾燥させる。その後、植物を植木鉢から切り取り、そして茶色の紙袋に入れる。
種子を単離するため、植物を含有する紙袋をこすり、乾燥した莢を開く。メッシュ布の二重層を通じて、乾燥した植物材料を軽く叩き、くずと種子を分離する。
【０１３６】
３０００の種子に細かい砂を添加し、そして湿った５０：５０ＪＩｎｏ．３／ピート配合土を満たしたトレー（９ｘ１４インチ）上に蒔く。トレーを冷蔵庫に３−４日間入れ、そしてその後、成長室（１６時間明期、日中２０℃、夜間１６℃）に入れる。１０日後、発芽した実生（ｓｅｅｄｌｉｎｇ）は選択する用意が出来ている。
【０１３７】
１．５リットルのスプレー瓶を用いて、濃度１００〜５００ｍｇ／ｌの範囲のカナマイシンを含む、０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００溶液を、実生にスプレーする。カナマイシンスプレーは、ただ葉を湿らせるのに十分な量のみ供給する。植物には、１００ｍｇ／ｌカナマイシンを２日間、その後、２００ｍｇ／ｌカナマイシンを２日間、その後、５００ｍｇ／ｌカナマイシンを１日間、スプレーする。各スプレー後、過剰な脱水を防ぐため、トレーをプラスチックドームで覆う。トランスジェニック植物は、色の相違に基づいて、１週間後、回避植物（ｅｓｃａｐｅｓ）から区別可能であり；濃い緑がトランスジェニックで、明るい緑／漂白が非形質転換体である。
【０１３８】
同定したトランスジェニック植物を、トレーから、Ｓｉｎｃｌａｉｒ培養土を含有する１インチ実生トレーに移す。確立するため、成長キャビネット（明期の長さ１０時間、日中温度２０℃および夜間温度１８℃、相対湿度６５−７５％、およびおよそ１６０μＭｏｌの光レベル）中で、植物を１週間放置した。
【０１３９】
（実施例７）
植物におけるＡｌｃＲ相同分子種活性の評価
７．１  タバコ葉のアグロバクテリウム浸潤−一過性発現系
目的の構築物で形質転換したアグロバクテリウムを、選択培地の存在下、２８℃で一晩増殖させる。一晩培養の１／１０希釈を作成し、そして新たに日中、増殖させる。培養のＯＤは、Ａ600０．６に到達することが必要である。培養を４０００ｘｇで５分間回転させ、そしてその後、１０ｍＭ  ＭｇＳＯ4に再懸濁し、そして氷上で６０分間インキュベーションする。１ｍｌシリンジを用いて、葉の下側に注入する（針を使わず、そして葉の反対側に指で穏やかに圧を加える）。葉がより半透明になってくるため、液体の浸透は容易に観察される。植物を３日間温室に放置し、３日経ったら、５％エタノール溶液で給水する。２日後、組織を収集し、そしてＧＵＳ組織化学染色に供する。
【０１４０】
７．１．１  β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）組織化学染色
０．０１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００およびＤＭＳＯを補った１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）２５ｍｌに、１２．５ｍｇのＸ−Ｇｌｕｃ（Ｓｉｇｍａ）を溶解した。葉材料を緩衝液中に浸し、そして緩衝液を葉中に真空浸潤させる。その後、材料を３７℃で５〜２４時間インキュベーションする。緩衝液を廃棄し、そして４８時間の期間に渡って、１００％エタノールで数回洗浄して、材料を脱染色する。材料の写真を撮影した。
【０１４１】
７．２  トランスジェニック植物解析
抗生物質選択に耐性を示した一次形質転換体は、ＰＣＲを介して形質転換構築物の存在に関してアッセイする。これは、ｇｕｓ遺伝子およびａｌｃＲ遺伝子に関してアッセイした。陽性であることが見出された植物からは、組織を採取し、そして２％（ｖ／ｖ）エタノールで根を浸して（２’植木鉢中２０ｍｌ）誘導する。正常の給水および光措置下で、植物を温室に放置する。処理３日後、各植物から３枚の葉を収集し、そして各葉を独立にアッセイする。ＧＵＳおよびタンパク質アッセイを行う。
【０１４２】
７．２．１  ＧＵＳアッセイ
植物材料を採取し、そして３００μｌのＧＵＳ抽出緩衝液に再懸濁して（Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎら，  １９８７“ＧＵＳ融合体：高次植物における高感度でそして多用途の遺伝子融合マーカーとしてのβ−グルクロニダーゼ”ＥＭＢＯ  Ｊ．  ６，  ３９０１−３９０７）、β−グルクロニダーゼ抽出物を調製する。植物材料を１分間ホモジナイズし、そしてその後、遠心分離する（１３０００ｒｐｍ、２分間）。上清を未使用のエッペンドルフ試験管に移す。ＧＵＳアッセイには２０μｌの抽出物を用いる。基質として４−メチルウンベリフェリル−Ｄ−グルクロニド（Ｓｉｇｍａ）を用いて、ＧＵＳ活性に関する蛍光光度アッセイを行い、そしてＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  ＬＳ−３５蛍光光度計で蛍光を測定する（Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎら、上記）。組織ホモジネートのタンパク質濃度は、Ｂｉｏ−Ｒａｄタンパク質アッセイによって測定する（Ｂｒａｄｆｏｒｄ，  １９７６“タンパク質−色素結合の原理を利用した、マイクログラム量のタンパク質定量化のための迅速でそして高感度な方法”Ａｎａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ７２，  ２４８−２５４）。
【０１４３】
７．３  結果
ＡｌｃＲ相同分子種のアミノ酸配列の並列によって、アミノ酸モチーフ１〜１７（配列番号１０４〜１２０；図１６）の同定が可能になった。植物における誘導性活性に関して試験するため、タバコ植物を上述のように浸潤した。２つの植物を浸潤し、１つを５％  ｖ／ｖエタノールで処理し、一方、第四の植物には給水のみを行った。植物は、全体で５日間温室に放置し（処理は、第３日に行った）、そして誘導および非誘導組織を採取し、そして組織化学的に染色した。それぞれ、ｐＶＢ６  ｖｅｒ（図１３）、ｐＶｂ  ｕｓｔ（図８）またはｐＶＢ  ｆｕｍ（図１１）を含有するアグロバクテリウム株で浸潤した植物材料は、エタノールで誘導した際、青い染色を示し、レポーター遺伝子の存在を示すが、非誘導植物材料は着色を示さず、これは、レポーター遺伝子活性の欠如を示す。
【０１４４】
配列
すべてのヌクレオチド配列は、標準的一文字暗号を用いて、５’から３’方向に記載してある。すべてのアミノ酸配列は、上述のように、標準的一文字暗号を用いて、Ｎ末端からＣ末端方向に記載してある。
【０１４５】
【化３】
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【０１４６】
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【０１４７】
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【０１４８】
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【０１４９】
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【０１５０】
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【０１５１】
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【０１５２】
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【０１５３】
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【０１５４】
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【０１５５】
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【０１５６】
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【０１５７】
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【０１５８】
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【０１６０】
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【０１６７】
【０１６８】
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【０１６９】
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【０１７０】
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【０１７１】
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【０１７４】
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【０１７７】
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【０１７８】
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【０１７９】
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【０１８０】
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【０１８１】
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【０１８２】
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【０１８３】
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【０１８４】
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【０１８５】
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【０１８６】
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【０１８７】
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【０１８８】
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【図面の簡単な説明】
【０１８９】
【図１】偽巣性コウジ菌由来のａｌｃＲ遺伝子の図式的表示である。アミノ酸１２〜５０はＤＮＡ結合領域に相当し、その配列を、配列番号１〜８に記載する縮重オリゴヌクレオチドの位を示す矢印と共に示す。
【図２】アスペルギルス属種からａｌｃＲ配列を単離するのに用いる縮重プライマーの場所を示す。
【図３】前駆体プラスミドｐＦＳＥ４−３５Ｓ−ＡｌｃＲｎｏｓ／ＡｌｃＡｇｌｕＧＵＳｉｎｔｍｏｓ−ｒｅｖのプラスミドマップを示す。
【図４】ｐＵＣ  ＳａｌｌｙニダランスＩＩベクターのプラスミドマップを示す。
【図５】ｐＵＣ  Ｋｅｌｌｙのプラスミドマップを示す。
【図６】Ｍ０４３と称する、Ａ．ウスツスａｌｃＲ遺伝子を含有するベクターのプラスミドマップを示す。
【図７】ａｌｃＲアスペルギルス・ウスツス遺伝子を含有し、そしてｐＵＣ  ＳａｌｌｙウスツスＡｌｃＲと称するｐＵＣ  Ｓａｌｌｙのプラスミドマップを示す。
【図８】スイッチの両構成要素を含有するバイナリーベクターのプラスミドマップを示す。１つのカセットは、３５Ｓ  ＣａＭＶ調節下のＡ．ウスツスａｌｃＲ遺伝子を含有し、一方、第二のカセットは、ａｌｃＡ誘導性プロモーター調節下のＧＵＳ遺伝子を含有する。ベクターをｐＶＢ  Ｕｓｔと命名した。
【図９】Ｍ１９２と称する、Ａ．フミガツスａｌｃＲ遺伝子のコード配列を含有するプラスミドマップを示す。
【図１０】アスペルギルス・フミガツスａｌｃＲ遺伝子を含有し、そしてｐＵＣ  ＳａｌｌｙフミガツスＡｌｃＲと称するｐＵＣ  Ｓａｌｌｙのプラスミドマップを示す。
【図１１】スイッチの両構成要素を含有するバイナリーベクターのプラスミドマップを示す。１つのカセットは、３５Ｓ  ＣａＭＶ調節下のＡ．フミガツスａｌｃＲ遺伝子を含有し、一方、第二のカセットは、ａｌｃＡ誘導性プロモーター調節下のＧＵＳ遺伝子を含有する。ベクターをｐＶＢ  ｆｕｍと命名した。
【図１２】ａｌｃＲアスペルギルス・ベルシコロル遺伝子を含有し、そしてｐＵＣ  ＳａｌｌｙベルシコロルＡｌｃＲと称するｐＵＣ  Ｋｅｌｌｙのプラスミドマップを示す。
【図１３】スイッチの両構成要素を含有するバイナリーベクターのプラスミドマップを示す。１つのカセットは、３５Ｓ  ＣａＭＶ調節下のＡ．ベルシコロルａｌｃＲ遺伝子を含有し、一方、第二のカセットは、ａｌｃＡ誘導性プロモーター調節下のＧＵＳ遺伝子を含有する。ベクターをｐＶＢ  ｖｅｒと命名した。
【図１４】ａｌｃＲ黄色コウジ菌遺伝子を含有し、そしてｐＵＣ  ＫｅｌｌｙフラブスＡｌｃＲと称するｐＵＣ  Ｋｅｌｌｙのプラスミドマップを示す。
【図１５】スイッチの両構成要素を含有するバイナリーベクターのプラスミドマップを示す。１つのカセットは、３５Ｓ  ＣａＭＶ調節下の黄色コウジ菌ａｌｃＲ遺伝子を含有し、一方、第二のカセットは、ａｌｃＡ誘導性プロモーター調節下のＧＵＳ遺伝子を含有する。ベクターをｐＶＢ  Ｆｌａｖと命名した。
【図１６】図１６−１乃至図１６−４は、保存されるアミノ酸モチーフの存在を示す、本発明のＡｌｃＲ相同分子種のアミノ酸配列の並列を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６−１】
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【図１６−２】
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【図１６−３】
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【図１６−４】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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