(57)【要約】本発明は、Ｃ３ｂ様受容体と結合する第１抗原認識部分および哺乳動物の循環系中に存在する抗原分子と結合する第２抗原認識部分を有する二重特異性分子を作製するために、タンパク質トランススプライシングを使用する方法を提供する。本発明はまた、タンパク質トランススプライシングにより作製された二重特異性分子を提供する。本発明の二重特異性分子は、哺乳動物の循環系からの病原性抗原分子のクリアランスに使用することができる。本発明はさらに、異なる抗原認識特異性を有する二重特異性分子の集団を含む、二重特異性分子のポリクローナルライブラリーを作製するために、タンパク質トランススプライシングを使用する方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｃ３ｂ様受容体と結合する第１抗原認識部分および病原性抗原分子と結合する第２抗原認識部分を有する二重特異性分子を作製する方法であって、Ｎ−インテイン第１抗原認識部分とＣ−インテイン第２抗原認識部分を、タンパク質トランススプライシングが起こる条件下で接触させることを含んでなり、ここで、該Ｎ−インテイン第１抗原認識部分は、分断インテインのＮ−インテインのアミノ末端にコンジュゲートされた第１抗原認識部分を含むものであり、また、該Ｃ−インテイン第２抗原認識部分は、該分断インテインのＣ−インテインのカルボキシ末端にコンジュゲートされた第２抗原認識部分を含むものであり、さらに、該Ｃ−インテインのスプライス部位のすぐＣ−末端側のアミノ酸残基が、システイン、セリン、およびトレオニンからなる群より選択されるアミノ酸残基であることを特徴とする、上記方法。
【請求項２】
Ｃ３ｂ様受容体と結合する第１抗原認識部分および病原性抗原分子と結合する第２抗原認識部分を有する二重特異性分子を作製する方法であって、
（ａ）  第１抗原認識部分を、分断インテインのＮ−インテインを含む分子のアミノ末端にコンジュゲートさせることにより、Ｎ−インテイン第１抗原認識部分を得ること、
（ｂ）  第２抗原認識部分を、該分断インテインのＣ−インテインを含む分子のカルボキシ末端にコンジュゲートさせることにより、Ｃ−インテイン第２抗原認識部分を得ること、ここで、該Ｃ−インテインのスプライス部位のすぐＣ−末端側のアミノ酸残基は、システイン、セリン、およびトレオニンからなる群より選択されるアミノ酸残基であること、
（ｃ）  該Ｎ−インテイン第１抗原認識部分および該Ｃ−インテイン第２抗原認識部分を、タンパク質トランススプライシングが起こる条件下で接触させて、二重特異性分子を作製すること、
を含んでなる、上記方法。
【請求項３】
分断インテインが天然に存在する分断インテインである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
分断インテインのＮ−インテインの配列が配列番号１であり、該分断インテインのＣ−インテインの配列が配列番号２である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
分断インテインが、天然に存在する非分断インテインをアミノ末端断片とカルボキシ末端断片に分離することにより生成される人工の分断インテインであり、その結果、該アミノ末端断片と該カルボキシ末端断片は再構成されてトランススプライシングを受けることができる、請求項１または２に記載の方法。
【請求項６】
人工の分断インテインがヒト結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）ＲｅｃＡインテインである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
Ｎ−インテインがそのアミノ末端に結合された１個以上の天然の近位Ｎ−エクステインアミノ酸残基の配列をさらに含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項８】
Ｎ−インテインがそのアミノ末端に結合された３〜５個の天然の近位Ｎ−エクステインアミノ酸残基の配列を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
Ｃ−インテインがスプライス部位のカルボキシ末端にシステイン、セリン、およびトレオニンからなる群より選択されるアミノ酸残基をさらに含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１０】
Ｃ−インテインがそのカルボキシ末端に結合された１個以上の天然の近位Ｃ−エクステインアミノ酸残基の配列をさらに含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
Ｃ−インテインがそのカルボキシ末端に結合された３〜５個以上の天然の近位Ｃ−エクステインアミノ酸残基の配列を含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
Ｎ−インテインが非天然アミノ酸残基を含み、その結果、該非天然アミノ酸残基が適切な手段によって通常のアミノ酸残基に変換されると、該Ｎ−インテインがトランススプライシングに対して機能的となる、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１３】
非天然アミノ酸残基がＯ−（２−ニトロベンジル）セリンであり、前記適切な手段が３００〜３５０ｎｍの範囲の波長をもつ光線を使って照射することを含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
第１抗原認識部分が、哺乳動物血液細胞上のＣ３ｂ様受容体と結合する抗原結合ドメインおよび前記病原性抗原分子の該哺乳動物血液細胞から食細胞への移動を促進するエフェクタードメインを含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１５】
第１抗原認識部分がモノクローナル抗体である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１６】
Ｎ−インテイン第１抗原認識部分が、前記モノクローナル抗体の重鎖のカルボキシ末端を該Ｎ−インテインのアミノ末端にコンジュゲートさせることにより生成される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
Ｎ−インテイン第１抗原認識部分断片が、前記モノクローナル抗体の軽鎖のカルボキシ末端を該Ｎ−インテインのアミノ末端にコンジュゲートさせることにより生成される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
第１抗原認識部分が免疫グロブリンＦｃドメインのＮ−末端に融合されたＣ３ｂ様受容体と結合するＳｃＦｖである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１９】
第２抗原認識部分がポリペプチドを含んでなる、請求項１または２に記載の方法。
【請求項２０】
第２抗原認識部分が核酸を含んでなる、請求項１または２に記載の方法。
【請求項２１】
Ｎ−インテイン第１抗原認識部分が組換えにより生産される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項２２】
Ｃ−インテイン第２抗原認識部分が組換えにより生産される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項２３】
Ｃ−インテイン第２抗原認識部分がペプチド合成により調製される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項２４】
Ｎ−インテイン第１抗原認識部分とＣ−インテイン第２抗原認識部分が組換えにより１つの細胞において共発現され、そしてＮ−インテイン第１抗原認識部分とＣ−インテイン第２抗原認識部分が該細胞において再構成されてトランススプライシングを受け、前記二重特異性分子をもたらす、請求項１または２に記載の方法。
【請求項２５】
Ｎ−インテイン第１抗原認識部分が組換えにより第１細胞で発現され、Ｃ−インテイン第２抗原認識部分が組換えにより第２細胞で発現され、そして該Ｎ−インテイン第１抗原認識部分と該Ｃ−インテイン第２抗原認識部分がｉｎ ｖｉｔｒｏで混合されて、前記二重特異性分子をもたらす、請求項１または２に記載の方法。
【請求項２６】
Ｎ−インテイン第１抗原認識部分とＣ−インテイン第２抗原認識部分が別々の発現ベクターにより発現される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
Ｎ−インテイン第１抗原認識部分とＣ−インテイン第２抗原認識部分が１つの発現ベクターにより発現される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
前記抗ＣＲ１ ｍＡｂの重鎖および軽鎖が組換えにより同一のベクターを使って発現される、請求項１５に記載の方法。
【請求項２９】
前記抗ＣＲ１ ｍＡｂの重鎖および軽鎖が組換えにより別々のベクターを使って発現される、請求項１５に記載の方法。
【請求項３０】
前記抗ＣＲ１ ｍＡｂの重鎖および軽鎖が組換えにより同一の細胞において発現される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記抗ＣＲ１ ｍＡｂの重鎖および軽鎖が組換えにより別々のベクターを使って別々の細胞において発現され、該重鎖と該軽鎖がｉｎ ｖｉｔｒｏで前記ｍＡｂへとアセンブルされる、請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
Ｃ３ｂ様受容体と結合する第１抗原認識部分および病原性抗原分子と結合する第２抗原認識部分を有する二重特異性分子を作製する方法であって、
（ａ）  Ｎ−インテイン第１抗原認識部分とＣ−インテインストレプトアビジンを、トランススプライシングが起こる条件下で接触させて、第１抗原認識部分−ストレプトアビジン分子を作製すること、ここで、該Ｎ−インテイン第１抗原認識部分は、分断インテインのＮ−インテインのアミノ末端にコンジュゲートされた第１抗原認識部分を含むものであり、また、該Ｃ−インテインストレプトアビジンは、該分断インテインのＣ−インテインのカルボキシ末端にコンジュゲートされたコアストレプトアビジンを含むものであり、さらに、該Ｃ−インテインのスプライス部位のすぐＣ−末端側のアミノ酸残基が、システイン、セリン、およびトレオニンからなる群より選択されるアミノ酸残基であること、
（ｂ）  該第１抗原認識部分−ストレプトアビジン分子およびビオチン化第２抗原認識部分を、ストレプトアビジンとビオチン間の結合を促す条件下で接触させて二重特異性分子を得ること、
を含んでなる、上記方法。
【請求項３３】
Ｃ３ｂ様受容体と結合する第１抗原認識部分および病原性抗原分子と結合する第２抗原認識部分を有する二重特異性分子を作製する方法であって、
（ａ）  該第１抗原認識部分を分断インテインのＮ−インテインのアミノ末端にコンジュゲートさせることによりＮ−インテイン第１抗原認識部分を得ること、
（ｂ）  コアストレプトアビジンを該分断インテインのＣ−インテインのカルボキシ末端にコンジュゲートさせることによりＣ−インテインストレプトアビジンを得ること、ここで、該Ｃ−インテインのスプライス部位のすぐＣ−末端側のアミノ酸残基はシステイン、セリン、およびトレオニンからなる群より選択されるアミノ酸残基であること、
（ｃ）  該Ｎ−インテイン第１抗原認識部分および該Ｃ−インテインストレプトアビジンを、タンパク質トランススプライシングが起こる条件下で接触させて、第１抗原認識部分−ストレプトアビジン分子を作製すること、ここで、該第１抗原認識部分は該ストレプトアビジンにコンジュゲートされること、
（ｄ）  ビオチン化第２抗原認識部分を得ること、
（ｅ）  該第１抗原認識部分−ストレプトアビジン分子および該ビオチン化第２抗原認識部分を、ストレプトアビジンとビオチン間の結合を促す条件下で接触させて二重特異性分子を得ること、
を含んでなる、上記方法。
【請求項３４】
Ｃ−インテインストレプトアビジンが組換えにより生成される、請求項３２または３３に記載の方法。
【請求項３５】
ステップ（ｂ）において、Ｃ−インテインストレプトアビジンの多量体を解離させるステップをさらに含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
ビオチン化第２抗原認識部分がビオチン化モノクローナル抗体である、請求項３２または３３に記載の方法。
【請求項３７】
ビオチン化第２抗原認識部分が抗体のビオチン化により作製される、請求項３２または３３に記載の方法。
【請求項３８】
ビオチン化モノクローナル抗体が単一の部位でビオチン化される、請求項３６に記載の方法。
【請求項３９】
ビオチン化モノクローナル抗体が、抗原認識ドメインの抗原結合能を損なわないような部位でビオチン化される、請求項３６に記載の方法。
【請求項４０】
ビオチン化第２抗原認識部分がビオチン化核酸である、請求項３２または３３に記載の方法。
【請求項４１】
ビオチン化核酸が、核酸サンプルから、
（ａ）  該核酸を、制限エンドヌクレアーゼの制限消化部位を含むＰＣＲプライマーを使って増幅すること、ここで、該制限エンドヌクレアーゼは該制限消化部位で切断したとき突出末端を生成させるものであること、また、該制限エンドヌクレアーゼは該ＰＣＲプライマーの配列内を除いて該核酸を切断しないものであること、
（ｂ）  該ＰＣＲプライマーを含むＰＣＲ産物を該制限エンドヌクレアーゼで切断して突出末端を生成させること、
（ｃ）  ＤＮＡポリメラーゼを用いて該突出末端にビオチン化ヌクレオチドを付加させてビオチン化核酸を生成させること、
により得られる、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
二重特異性分子のポリクローナルライブラリーを作製する方法であって、該ポリクローナルライブラリーの各メンバーは、Ｃ３ｂ様受容体と結合する第１抗原認識部分および病原性抗原分子と結合する第２抗原認識部分を有するものであり、複数のＮ−インテイン第１抗原認識部分と複数の異なるＣ−インテイン第２抗原認識部分を、タンパク質トランススプライシングが起こる条件下で接触させて、二重特異性分子のポリクローナルライブラリーを作製することを含んでなり、ここで、該複数のＮ−インテイン第１抗原認識部分のそれぞれは、分断インテインのＮ−インテインのアミノ末端にコンジュゲートされた第１抗原認識部分を含むものであり、また、該複数のＣ−インテイン第２抗原認識部分のそれぞれは、該分断インテインのＣ−インテインのカルボキシ末端にコンジュゲートされた、異なる結合特異性を有する第２抗原認識部分を含むものであり、さらに、該Ｃ−インテインのスプライス部位のすぐＣ−末端側のアミノ酸残基が、システイン、セリン、およびトレオニンからなる群より選択されるアミノ酸残基であることを特徴とする、上記方法。
【請求項４３】
二重特異性分子のポリクローナルライブラリーを作製する方法であって、該ポリクローナルライブラリーの各メンバーは、Ｃ３ｂ様受容体と結合する第１抗原認識部分および病原性抗原分子と結合する第２抗原認識部分を有するものであり、
（ａ）  複数の第１抗原認識部分のそれぞれを、分断インテインのＮ−インテインのアミノ末端にコンジュゲートさせることを含む方法によって、複数のＮ−インテイン第１抗原認識部分を得ること、
（ｂ）  ファージディスプレイライブラリーから、アフィニティースクリーニングを用いて、それぞれ異なる結合特異性を有する抗原認識ポリペプチドを展示する複数のファージを選択すること、
（ｃ）  該複数の抗原認識ポリペプチドをそれぞれコードする複数の核酸を得ること、
（ｄ）  該複数の核酸の各核酸を該分断インテインのＣ−インテインのアミノ末端に融合させて、複数のＣ−インテイン抗原認識部分をコードする複数の核酸を得ること、ここで、該Ｃ−インテインのスプライス部位のすぐＣ−末端側のアミノ酸残基が、システイン、セリン、およびトレオニンからなる群より選択されるアミノ酸残基であること、
（ｅ）  該複数のＣ−インテイン抗原認識部分断片をコードする該複数の核酸を宿主において発現させること、
（ｆ）  該複数のＣ−インテイン抗原認識部分を該宿主から取得すること、
（ｇ）  該複数のＣ−インテイン抗原認識部分と複数の該Ｎ−インテイン第１抗原認識部分を、タンパク質トランススプライシングが起こる条件下で接触させて、二重特異性分子のポリクローナルライブラリーを作製すること、
を含んでなる、上記方法。
【請求項４４】
二重特異性分子のポリクローナルライブラリーを作製する方法であって、該ポリクローナルライブラリーの各メンバーは、Ｃ３ｂ様受容体と結合する第１抗原認識部分および病原性抗原分子と結合する第２抗原認識部分を有するものであり、
（ａ）  複数の第１抗原認識部分のそれぞれを、分断インテインのＮ−インテインのアミノ末端にコンジュゲートさせることを含む方法によって、複数のＮ−インテイン第１抗原認識部分を得ること、
（ｂ）  ファージディスプレイライブラリーの各メンバーにおけるポリペプチド抗体をコードする核酸のアミノ末端を、該分断インテインのＣ−インテインのカルボキシ末端に融合させて、Ｃ−インテイン抗原認識部分のレパートリーを展示するファージディスプレイライブラリーを得ること、ここで、該Ｃ−インテインのスプライス部位のすぐＣ−末端側のアミノ酸残基が、システイン、セリン、およびトレオニンからなる群より選択されるアミノ酸残基であること、
（ｃ）  Ｃ−インテイン抗原認識部分のレパートリーを展示する該ファージディスプレイライブラリーから、アフィニティースクリーニングを用いて、それぞれ異なる結合特異性を有するＣ−インテイン抗原認識ポリペプチドを展示する複数のファージを選択すること、
（ｄ）  該複数のＣ−インテイン抗原認識部分をそれぞれコードする複数の核酸を得ること、
（ｅ）  該複数のＣ−インテイン抗原認識部分をコードする該複数の核酸を宿主において発現させること、
（ｆ）  該複数のＣ−インテイン抗原認識部分を該宿主から取得すること、
（ｇ）  該複数のＣ−インテイン抗原認識部分と複数の該Ｎ−インテイン第１抗原認識部分を、タンパク質トランススプライシングが起こる条件下で接触させて、二重特異性分子のポリクローナルライブラリーを作製すること、
を含んでなる、上記方法。
【請求項４５】
二重特異性分子のポリクローナルライブラリーを作製する方法であって、該ポリクローナルライブラリーの各メンバーは、Ｃ３ｂ様受容体と結合する第１抗原認識部分および病原性抗原分子と結合する第２抗原認識部分を有するものであり、
（ａ）  Ｎ−インテイン第１抗原認識部分の集団とＣ−インテインストレプトアビジンの集団を、タンパク質トランススプライシングが起こる条件下で接触させて、第１抗原認識部分−ストレプトアビジン分子の集団を生成させること、ここで、該複数のＮ−インテイン第１抗原認識部分のそれぞれは、分断インテインのＮ−インテインのアミノ末端にコンジュゲートされた該第１抗原認識部分を含むものであり、また、該複数のＣ−インテインストレプトアビジンのそれぞれは、該分断インテインのＣ−インテインのカルボキシ末端にコンジュゲートされたコアストレプトアビジンを含むものであり、さらに、該Ｃ−インテインのスプライス部位のすぐＣ−末端側のアミノ酸残基が、システイン、セリン、およびトレオニンからなる群より選択されるアミノ酸残基であること、
（ｂ）  第１抗原認識部分−ストレプトアビジン分子の該集団と、それぞれ異なる抗原認識特異性を有する複数のビオチン化第２抗原認識部分を、ストレプトアビジンとビオチン間の結合を促進する条件下で接触させて、二重特異性分子のポリクローナルライブラリーを作製すること、
を含んでなる、上記方法。
【請求項４６】
二重特異性分子のポリクローナルライブラリーを作製する方法であって、該ポリクローナルライブラリーの各メンバーは、Ｃ３ｂ様受容体と結合する第１抗原認識部分および病原性抗原分子と結合する第２抗原認識部分を有するものであり、
（ａ）  第１抗原認識部分の集団のそれぞれを分断インテインのＮ−インテインのアミノ末端にコンジュゲートさせることを含む方法によって、Ｎ−インテイン第１抗原認識部分の集団を得ること、
（ｂ）  コアストレプトアビジンの集団のそれぞれを該分断インテインのＣ−インテインにコンジュゲートさせることを含む方法によって、Ｃ−インテインストレプトアビジンの集団を得ること、ここで、該Ｃ−インテインのスプライス部位のすぐＣ−末端側のアミノ酸残基は、システイン、セリン、およびトレオニンからなる群より選択されるアミノ酸残基であること、
（ｃ）  Ｎ−インテイン第１抗原認識部分の該集団とＣ−インテインストレプトアビジンの該集団を、タンパク質トランススプライシングが起こる条件下で接触させて、第１抗原認識部分−ストレプトアビジン分子の集団を生成させること、
（ｄ）  ファージディスプレイライブラリーから、アフィニティースクリーニングを用いて、それぞれ異なる結合特異性を有する抗原認識ポリペプチドを展示する複数のファージを選択すること、
（ｆ）  該複数の抗原認識ポリペプチドをそれぞれコードする複数の核酸を得ること、
（ｇ）  該複数の抗原認識ポリペプチドをコードする該複数の核酸を宿主において発現させること、
（ｈ）  該複数の抗原認識ポリペプチドを該宿主から取得すること、
（ｉ）  活性化されたビオチン剤を用いて、該複数の抗原認識ポリペプチドの各メンバーをビオチンとコンジュゲートさせることによって、複数のビオチン化抗原認識ポリペプチドを得ること、
（ｊ）  該複数のビオチン化抗原認識ポリペプチドと第１抗原認識部分−ストレプトアビジン分子の該集団を、ストレプトアビジンとビオチン間の結合を促進する条件下で接触させて、二重特異性分子のポリクローナルライブラリーを作製すること、
を含んでなる、上記方法。
【請求項４７】
前記複数の抗原認識部分が１つの抗原の複数のエピトープに対する結合特異性を有する、請求項４２、４３、４４、４５、または４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記複数の抗原認識部分が１つの抗原の複数の変異体に対する結合特異性を有する、請求項４２、４３、４４、４５、または４６に記載の方法。
【請求項４９】
前記複数の抗原認識ポリペプチドをコードする前記複数の核酸が、クローン単離せずに前記Ｃ−インテインに融合される、請求項４３または４６に記載の方法。
【請求項５０】
ステップ（ａ）が、複数の異なる第１抗原認識部分のそれぞれを前記分断インテインの複数のＮ−インテインのアミノ末端にコンジュゲートさせることによって、複数の異なるＮ−インテイン第１抗原認識部分を得ることをさらに含む、請求項４３または４６に記載の方法。
【請求項５１】
Ｃ−インテイン抗原認識部分ファージディスプレイライブラリーを作製する方法であって、該Ｃ−インテイン抗原認識部分ファージディスプレイライブラリー中の各ファージは、その表面に、異なるＣ−インテイン抗原認識部分を展示するものであり、ファージディスプレイライブラリーの複数のメンバーの各々においてポリペプチド抗体をコードする核酸のアミノ末端を、分断インテインのＣ−インテインのカルボキシ末端に融合させて、Ｃ−インテイン抗原認識部分のレパートリーを展示するファージディスプレイライブラリーを得ることを含んでなり、ここで、該Ｃ−インテインのスプライス部位のすぐＣ−末端側のアミノ酸残基は、システイン、セリン、およびトレオニンからなる群より選択されるアミノ酸残基であることを特徴とする、上記方法。
【請求項５２】
（ａ） Ｃ３ｂ様受容体と結合する第１抗原認識部分と、（ｂ） 病原性抗原分子と結合する第２抗原認識部分とを含んでなり、該第１抗原認識部分がモノクローナル抗体を含み、該第２抗原認識部分が該第１抗原認識部分の重鎖または軽鎖のカルボキシ末端にコンジュゲートされている、二重特異性分子。
【請求項５３】
（ａ） Ｃ３ｂ様受容体と結合する第１抗原認識部分と、（ｂ） リンカーと、（ｃ） 病原性抗原分子と結合する第２抗原認識部分とを含んでなり、該第２抗原認識部分が該リンカーを介して該第１抗原認識部分のカルボキシ末端にコンジュゲートされている、二重特異性分子。
【請求項５４】
前記リンカーがペプチドリンカーである、請求項５３に記載の二重特異性分子。
【請求項５５】
前記リンカーがストレプトアビジン−ビオチンリンカーである、請求項５３に記載の二重特異性分子。
【請求項５６】
前記リンカーがポリ（エチレングリコール）リンカーである、請求項５３に記載の二重特異性分子。
【請求項５７】
第１抗原認識部分が哺乳動物血液細胞上のＣ３ｂ様受容体と結合する抗原結合ドメインおよび該哺乳動物血液細胞から食細胞への前記病原性抗原分子の移動を促進するエフェクタードメインを含む、請求項５３に記載の二重特異性分子。
【請求項５８】
第１抗原認識部分がモノクローナル抗体である、請求項５３に記載の二重特異性分子。
【請求項５９】
第２抗原認識部分が第１抗原認識部分の重鎖のカルボキシ末端にコンジュゲートされている、請求項５２または５８に記載の二重特異性分子。
【請求項６０】
第２抗原認識部分が第１抗原認識部分の軽鎖のカルボキシ末端にコンジュゲートされている、請求項５２または５８に記載の二重特異性分子。
【請求項６１】
第２抗原認識部分が２つの抗原認識成分を含み、それぞれが第１抗原認識部分の異なる重鎖のカルボキシ末端にコンジュゲートされている、請求項５２または５８に記載の二重特異性分子。
【請求項６２】
第１抗原認識部分がアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）からのハイブリドーマ細胞系ＡＴＣＣ ＨＢ ８５９２により産生される抗ＣＲ１モノクローナル抗体であり、第２抗原認識部分がＦｃｅＲＩ受容体のαサブユニットを含む、請求項５２または５８に記載の二重特異性分子。
【請求項６３】
第２抗原認識部分が２つの抗原認識成分を含み、それぞれが第１抗原認識部分の異なる軽鎖のカルボキシ末端にコンジュゲートされている、請求項５２または５８に記載の二重特異性分子。
【請求項６４】
２つの抗原認識成分が同一の抗原認識成分である、請求項６１に記載の二重特異性分子。
【請求項６５】
２つの抗原認識成分が異なる抗原認識成分である、請求項６１に記載の二重特異性分子。
【請求項６６】
２つの異なる抗原認識成分が協働して前記病原性抗原をターゲッティングする、請求項６５に記載の二重特異性分子。
【請求項６７】
２つの異なる抗原認識成分の一方の作用が該異なる抗原認識成分の他方の結合親和性を高めることである、請求項６５に記載の二重特異性分子。
【請求項６８】
第２抗原認識部分がペプチドまたはポリペプチドを含む、請求項５２または５３に記載の二重特異性分子。
【請求項６９】
前記ペプチドまたはポリペプチドが抗体である、請求項６８に記載の二重特異性分子。
【請求項７０】
前記ペプチドまたはポリペプチドがモノクローナル抗体である、請求項６９に記載の二重特異性分子。
【請求項７１】
前記ペプチドまたはポリペプチドがエピトープを含む、請求項６８に記載の二重特異性分子。
【請求項７２】
第２抗原認識部分が核酸を含む、請求項５２または５３に記載の二重特異性分子。
【請求項７３】
複数の二重特異性分子を含んでなる二重特異性分子のポリクローナルライブラリーであって、各二重特異性分子は、（ａ） Ｃ３ｂ様受容体と結合する第１抗原認識部分と、（ｂ） 異なる結合特異性を有する別個の第２抗原認識部分とを含んでなり、ここで、該第１抗原認識部分はモノクローナル抗体を含み、該第２抗原認識部分は該第１抗原認識部分のカルボキシ末端にコンジュゲートされている、上記二重特異性分子のポリクローナルライブラリー。
【請求項７４】
複数の二重特異性分子を含んでなる二重特異性分子のポリクローナルライブラリーであって、各二重特異性分子は、（ａ） Ｃ３ｂ様受容体と結合する第１抗原認識部分と、（ｂ） リンカーと、（ｃ） 異なる結合特異性を有する別個の第２抗原認識部分とを含んでなり、ここで、該第２抗原認識部分は該リンカーを介して該第１抗原認識部分のカルボキシ末端にコンジュゲートされている、上記二重特異性分子のポリクローナルライブラリー。
【請求項７５】
前記リンカーがペプチドリンカーである、請求項７４に記載の二重特異性分子。
【請求項７６】
前記リンカーがストレプトアビジン−ビオチンリンカーである、請求項７４に記載の二重特異性分子。
【請求項７７】
前記リンカーがポリ（エチレングリコール）リンカーである、請求項７４に記載の二重特異性分子。
【請求項７８】
各二重特異性分子の第１抗原認識部分が、哺乳動物血液細胞上のＣ３ｂ様受容体と結合する抗原結合ドメインおよび該哺乳動物血液細胞から食細胞への前記病原性抗原分子の移動を促進するエフェクタードメインを含む、請求項７４に記載の二重特異性分子のポリクローナルライブラリー。
【請求項７９】
各二重特異性分子の第１抗原認識部分がモノクローナル抗体である、請求項７４に記載の二重特異性分子のポリクローナルライブラリー。
【請求項８０】
各二重特異性分子について、第２抗原認識部分が第１抗原認識部分の重鎖のカルボキシ末端にコンジュゲートされている、請求項７３または７９に記載の二重特異性分子のポリクローナルライブラリー。
【請求項８１】
各二重特異性分子について、第２抗原認識部分が第１抗原認識部分の軽鎖のカルボキシ末端にコンジュゲートされている、請求項７３または７９に記載の二重特異性分子のポリクローナルライブラリー。
【請求項８２】
各二重特異性分子について、第２抗原認識部分が２つの抗原認識成分を含み、それぞれが第１抗原認識部分の異なる重鎖のカルボキシ末端にコンジュゲートされている、請求項７３または７９に記載の二重特異性分子のポリクローナルライブラリー。
【請求項８３】
各二重特異性分子について、第２抗原認識部分が２つの抗原認識成分を含み、それぞれが第１抗原認識部分の異なる軽鎖のカルボキシ末端にコンジュゲートされている、請求項７３または７９に記載の二重特異性分子のポリクローナルライブラリー。
【請求項８４】
２つの抗原認識成分が同一の抗原認識成分である、請求項８２に記載の二重特異性分子のポリクローナルライブラリー。
【請求項８５】
２つの抗原認識成分が異なる抗原認識成分である、請求項８２に記載の二重特異性分子のポリクローナルライブラリー。
【請求項８６】
各二重特異性分子について、２つの異なる抗原認識成分が協働して前記病原性抗原をターゲッティングする、請求項８５に記載の二重特異性分子のポリクローナルライブラリー。
【請求項８７】
２つの異なる抗原認識成分の一方の作用が該異なる抗原認識成分の他方の結合親和性を高めることである、請求項８５に記載の二重特異性分子のポリクローナルライブラリー。
【請求項８８】
各二重特異性分子について、第２抗原認識部分がペプチドまたはポリペプチドを含む、請求項７３または７４に記載の二重特異性分子のポリクローナルライブラリー。
【請求項８９】
各二重特異性分子について、前記ペプチドまたはポリペプチドが抗体である、請求項８８に記載の二重特異性分子のポリクローナルライブラリー。
【請求項９０】
前記ペプチドまたはポリペプチドがモノクローナル抗体である、請求項８８に記載の二重特異性分子のポリクローナルライブラリー。
【請求項９１】
前記ペプチドまたはポリペプチドがエピトープを含む、請求項８８に記載の二重特異性分子のポリクローナルライブラリー。
【請求項９２】
各二重特異性分子について、第２抗原認識部分が核酸を含む、請求項７３または７４に記載の二重特異性分子のポリクローナルライブラリー。
【請求項９３】
複数の精製二重特異性分子を含む組成物であって、該複数の精製二重特異性分子の各二重特異性分子は、Ｃ３ｂ様受容体と結合する第１抗原認識部分および病原性抗原分子と結合する第２抗原認識部分を含んでなり、ここで、第１抗原認識部分がモノクローナル抗体を含み、第２抗原認識部分が第１抗原認識部分の重鎖または軽鎖のカルボキシ末端にコンジュゲートされており、該複数の精製二重特異性分子はそれぞれ、異なる結合特異性をもつ別個の第２抗原認識部分を含むものである、上記組成物。
【請求項９４】
複数の精製二重特異性分子を含む組成物であって、該複数の精製二重特異性分子の各二重特異性分子は、（ａ） Ｃ３ｂ様受容体と結合する第１抗原認識部分と、（ｂ） 病原性抗原分子と結合する第２抗原認識部分とを含んでなり、ここで、第１抗原認識部分がモノクローナル抗体を含み、第２抗原認識部分が第１抗原認識部分の重鎖または軽鎖のカルボキシ末端にコンジュゲートされており、該複数の精製二重特異性分子はそれぞれ、異なる結合特異性をもつ別個の第２抗原認識部分を含むものである、上記組成物。
【請求項９５】
（ａ） Ｃ３ｂ様受容体と結合する抗原認識部分と、（ｂ） 分断インテインのＮ−インテインを含むＮ−インテイン部分と、を含んでなる分子であって、該抗原認識部分が該Ｎ−インテイン部分のアミノ末端にコンジュゲートされている、上記分子。
【請求項９６】
前記抗原認識部分がリンカーを介して前記Ｎ−インテインにコンジュゲートされている、請求項９５に記載の分子。
【請求項９７】
前記Ｎ−インテイン部分がＮ−インテインである、請求項９５に記載の分子。
【請求項９８】
前記抗原認識部分がモノクローナル抗体である、請求項９５または９６に記載の分子。
【請求項９９】
前記抗原認識部分がＦｃドメインに融合されたＳｃＦｖである、請求項９５または９６に記載の分子。
【請求項１００】
前記抗原認識部分が、ある生物種由来の可変ドメインまたは相補性決定領域（ＣＤＲ）と別の生物種由来の定常ドメインとを含むキメラ抗体である、請求項９５または９６に記載の分子。
【請求項１０１】
前記可変ドメインまたは相補性決定領域（ＣＤＲ）がマウス由来であり、前記定常ドメインがヒト由来である、請求項１００に記載の分子。
【請求項１０２】
前記Ｎ−インテインが１個以上の天然の近位Ｎ−エクステインアミノ酸残基の配列をさらに含む、請求項９５または９６に記載の分子。
【請求項１０３】
前記Ｎ−インテインが３〜５個の天然の近位Ｎ−エクステインアミノ酸残基の配列をさらに含む、請求項１０２に記載の分子。
【請求項１０４】
前記Ｎ−インテインがそのＮ−末端にＯ−（２−ニトロベンジル）セリンを含む、請求項９５または９６に記載の分子。
【請求項１０５】
前記Ｎ−インテインがＳｓｐのＤｎａＥ遺伝子中にコードされる分断インテインのＮ−インテインである、請求項９５または９６に記載の分子。
【請求項１０６】
前記Ｎ−インテインがＳｓｐのＤｎａＥ遺伝子中にコードされる分断インテインのＮ−インテインである、請求項１０２に記載の分子。
【請求項１０７】
前記抗原認識部分がアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）からのハイブリドーマ細胞系ＡＴＣＣ ＨＢ ８５９２により産生されるモノクローナル抗体である、請求項１０５に記載の分子。
【請求項１０８】
前記抗原認識部分がアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）からのハイブリドーマ細胞系ＡＴＣＣ ＨＢ ８５９２により産生されるモノクローナル抗体である、請求項１０６に記載の分子。
【請求項１０９】
前記Ｎ−インテインがＭｔｕ ＲｅｃＡインテインから作製される人工分断インテインのＮ−インテインである、請求項９５または９６に記載の分子。
【請求項１１０】
（ａ） 抗原認識部分と、（ｂ） 分断インテインのＣ−インテインを含むＣ−インテイン部分と、を含んでなる分子であって、該抗原認識部分が該Ｃ−インテイン部分のカルボキシ末端にコンジュゲートされており、該Ｃ−インテインのスプライス部位のすぐＣ−末端側のアミノ酸残基が、システイン、セリン、およびトレオニンからなる群より選択されるアミノ酸残基である、上記分子。
【請求項１１１】
前記抗原認識部分がリンカーを介して前記Ｃ−インテインにコンジュゲートされている、請求項１１０に記載の分子。
【請求項１１２】
前記Ｃ−インテイン部分がＣ−インテインである、請求項１１０に記載の分子。
【請求項１１３】
前記抗原認識部分がペプチドまたはポリペプチドを含む、請求項１１０または１１１に記載の分子。
【請求項１１４】
前記抗原認識部分が核酸を含む、請求項１１０または１１１に記載の分子。
【請求項１１５】
前記Ｃ−インテインが、システイン、セリン、およびトレオニンからなる群より選択される前記アミノ酸残基の後に、１個以上の天然の近位Ｃ−エクステインアミノ酸残基の配列をさらに含む、請求項１１０または１１１に記載の分子。
【請求項１１６】
前記Ｃ−インテインが、システイン、セリン、およびトレオニンからなる群より選択される前記アミノ酸残基の後に、３〜５個の天然の近位Ｃ−エクステインアミノ酸残基の配列をさらに含む、請求項１１３に記載の分子。
【請求項１１７】
前記Ｃ−インテインがＳｓｐのＤｎａＥ遺伝子中にコードされる分断インテインのＣ−インテインである、請求項１１０または１１１に記載の分子。
【請求項１１８】
前記Ｃ−インテインがＳｓｐのＤｎａＥ遺伝子中にコードされる分断インテインのＣ−インテインである、請求項１１５に記載の分子。
【請求項１１９】
前記抗原認識部分がＦｃεＲＩ受容体のαサブユニットを含む、請求項１１７に記載のＣ−インテイン抗原認識部分。
【請求項１２０】
前記Ｃ−インテインがＭｔｕ ＲｅｃＡインテインから作製される人工分断インテインのＣ−インテインである、請求項１１０または１１１に記載の分子。
【請求項１２１】
前記Ｃ−インテインがＭｔｕ ＲｅｃＡインテインから作製される人工分断インテインのＣ−インテインである、請求項１１５に記載の分子。
【請求項１２２】
（ａ） ストレプトアビジンと、（ｂ） スプライス部位のすぐＣ−末端側にシステイン、セリン、およびトレオニンからなる群より選択されるアミノ酸残基を含む分断インテインのＣ−インテインと、を含んでなる分子であって、該ストレプトアビジンが該Ｃ−インテインのカルボキシ末端にコンジュゲートされている、上記分子。
【請求項１２３】
前記ストレプトアビジンがリンカーを介して前記Ｃ−インテインにコンジュゲートされている、請求項１２２に記載の方法。
【請求項１２４】
前記Ｃ−インテインが１個以上の天然の近位Ｃ−エクステインアミノ酸残基の配列をさらに含む、請求項１２２または１２３に記載の分子。
【請求項１２５】
前記Ｃ−インテインが３〜５個の天然の近位Ｃ−エクステインアミノ酸残基の配列をさらに含む、請求項１２４に記載の分子。
【請求項１２６】
前記Ｃ−インテインがＳｓｐのＤｎａＥ遺伝子中にコードされる分断インテインのＣ−インテインである、請求項１２２または１２３に記載の分子。
【請求項１２７】
前記Ｃ−インテインがＳｓｐのＤｎａＥ遺伝子中にコードされる分断インテインのＣ−インテインである、請求項１２４に記載の分子。
【請求項１２８】
前記Ｃ−インテインがＭｔｕ ＲｅｃＡインテインから作製される人工分断インテインのＣ−インテインである、請求項１２２または１２３に記載の分子。
【請求項１２９】
複数のファージを含むＣ−インテイン抗原認識部分ファージディスプレイライブラリーであって、該複数のファージのそれぞれが、その表面上に、異なるＣ−インテインポリペプチド融合タンパク質を展示しており、各ポリペプチドが異なる結合特異性を有するものである、上記ライブラリー。
【請求項１３０】
分断インテインのＮ−インテインのアミノ末端に融合されたＣ３ｂ様受容体と結合する第１抗原認識部分をコードするヌクレオチド配列に機能的に連結された転写調節エレメントを含む発現ベクター。
【請求項１３１】
分断インテインのＣ−インテインのカルボキシ末端に融合された第２抗原認識部分をコードするヌクレオチド配列に機能的に連結された転写調節エレメントを含む発現ベクターであって、該Ｃ−インテインのスプライス部位のすぐＣ−末端側のアミノ酸残基が、システイン、セリン、およびトレオニンからなる群より選択されるアミノ酸残基である、上記発現ベクター。
【請求項１３２】
分断インテインのＣ−インテインのカルボキシ末端に融合されたコアストレプトアビジンをコードするヌクレオチド配列に機能的に連結された転写調節エレメントを含む発現ベクターであって、該Ｃ−インテインのスプライス部位のすぐＣ−末端側のアミノ酸残基が、システイン、セリン、およびトレオニンからなる群より選択されるアミノ酸残基である、上記発現ベクター。
【請求項１３３】
抗ＣＲ１モノクローナル抗体の重鎖のカルボキシ末端に融合されたＮ−インテインをコードする核酸。
【請求項１３４】
抗ＣＲ１モノクローナル抗体の重鎖のカルボキシ末端に融合されたＮ−インテインをコードするヌクレオチド配列に機能的に連結された転写調節エレメントを含む発現ベクター。
【請求項１３５】
抗ＣＲ１モノクローナル抗体の軽鎖のカルボキシ末端に融合されたＮ−インテインをコードする核酸。
【請求項１３６】
抗ＣＲ１モノクローナル抗体の軽鎖のカルボキシ末端に融合されたＮ−インテインをコードするヌクレオチド配列に機能的に連結された転写調節エレメントを含む発現ベクター。
【請求項１３７】
前記Ｎ−インテインがＳｓｐのＤｎａＥ遺伝子中にコードされる分断インテインのＮ−インテインである、請求項１３３または１３５に記載の核酸。
【請求項１３８】
前記Ｎ−インテインがＭｔｕ ＲｅｃＡインテインから作製される人工分断インテインのＮ−インテインである、請求項１３３または１３５に記載の核酸。
【請求項１３９】
前記抗ＣＲ１モノクローナル抗体がアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）からのハイブリドーマ細胞系ＡＴＣＣ ＨＢ ８５９２により産生されるものである、請求項１３３または１３５に記載の核酸。
【請求項１４０】
ｓｃＦｖに融合されるＦｃドメインのカルボキシ末端に融合されたＮ−インテインをコードする核酸。
【請求項１４１】
ｓｃＦｖに融合されるＦｃドメインのカルボキシ末端に融合されたＮ−インテインをコードするヌクレオチド配列に機能的に連結された転写調節エレメントを含む発現ベクター。
【請求項１４２】
抗原と結合するポリペプチドのアミノ末端に融合されたＣ−インテインをコードする核酸。
【請求項１４３】
抗原と結合するポリペプチドのアミノ末端に融合されたＣ−インテインをコードするヌクレオチド配列に機能的に連結された転写調節エレメントを含む発現ベクター。
【請求項１４４】
コアストレプトアビジンのアミノ末端に、任意のリンカーを介して、融合されたＣ−インテインをコードする核酸。
【請求項１４５】
コアストレプトアビジンのアミノ末端に、任意のリンカーを介して、融合されたＣ−インテインをコードするヌクレオチド配列に機能的に連結された転写調節エレメントを含む発現ベクター。
【請求項１４６】
複数のＣ−インテイン抗原認識部分をコードする複数の核酸。
【請求項１４７】
各発現ベクターがＣ−インテイン抗原認識部分をコードするヌクレオチド配列に機能的に連結された転写調節エレメントを含む、複数の発現ベクター。
【請求項１４８】
容器内に、Ｃ３ｂ様受容体と結合する第１抗原認識部分および病原性抗原分子と結合する第２抗原認識部分を有する二重特異性分子を含んでなるキットであって、第１抗原認識部分がモノクローナル抗体を含み、第２抗原認識部分が第１抗原認識部分の重鎖または軽鎖のカルボキシ末端にコンジュゲートされている、上記キット。
【請求項１４９】
容器内に、（ａ） Ｃ３ｂ様受容体と結合する第１抗原認識部分と、（ｂ） リンカーと、（ｃ） 病原性抗原分子と結合する第２抗原認識部分と、を有する二重特異性分子を含んでなるキットであって、第２抗原認識部分が該リンカーを介して第１抗原認識部分のカルボキシ末端にコンジュゲートされている、上記キット。
【請求項１５０】
容器内に、（ａ） Ｃ３ｂ様受容体と結合する抗原認識部分と、（ｂ） 分断インテインのＮ−インテインを含むＮ−インテイン部分と、を有する分子を含んでなるキットであって、該抗原認識部分が該Ｎ−インテイン部分のアミノ末端にコンジュゲートされている、上記キット。
【請求項１５１】
容器内に、（ａ） 抗原認識部分と、（ｂ） 分断インテインのＣ−インテインを含むＣ−インテイン部分と、を有する分子を含んでなるキットであって、該抗原認識部分が該Ｃ−インテイン部分のカルボキシ末端にコンジュゲートされており、該Ｃ−インテインのスプライス部位のすぐＣ−末端側のアミノ酸残基が、システイン、セリン、およびトレオニンからなる群より選択されるアミノ酸残基である、上記キット。
【請求項１５２】
２つの容器内に、Ｃ３ｂ様受容体と結合する抗原認識部分と、分断インテインのＮ−インテインを含むＮ−インテイン部分とを有する第１分子、および、抗原認識部分と分断インテインのＣ−インテインを含むＣ−インテイン部分とを有する第２分子を含んでなるキットであって、第１分子の該抗原認識部分が該Ｎ−インテイン部分のアミノ末端にコンジュゲートされており、また、第２分子の該抗原認識部分が該Ｃ−インテインペプチドのカルボキシ末端にコンジュゲートされており、かつ該Ｃ−インテインのスプライス部位のすぐＣ−末端側のアミノ酸残基が、システイン、セリン、およびトレオニンからなる群より選択されるアミノ酸残基である、上記キット。
【請求項１５３】
１つ以上の容器内に第１ベクターと第２ベクターを含んでなるキットであって、第１ベクターは、分断インテインのＮ−インテインを含むＮ−インテインペプチドのアミノ末端に融合されたＣ３ｂ様受容体と結合する第１抗原認識部分をコードする第１ＤＮＡ配列を含み、第２ベクターは、該分断インテインのＣ−インテインを含むＣ−インテインペプチドのカルボキシ末端に融合された第２抗原認識部分をコードする第２ＤＮＡ配列を含み、ここで、該Ｃ−インテインペプチドのスプライス部位のすぐＣ−末端側のアミノ酸残基が、システイン、セリン、およびトレオニンからなる群より選択されるアミノ酸残基である、上記キット。
【請求項１５４】
１つ以上の容器内に第１ベクターと第２ベクターを、別の容器内にビオチン化第２抗原認識部分を含んでなるキットであって、第１ベクターは、分断インテインのＮ−インテインを含むＮ−インテインペプチドのアミノ末端に融合されたＣ３ｂ様受容体と結合する第１抗原認識部分をコードする第１ＤＮＡ配列を含み、第２ベクターは、該分断インテインのＣ−インテインを含むＣ−インテインペプチドのカルボキシ末端に融合されたコアストレプトアビジンをコードする第２ＤＮＡ配列を含み、ここで、該Ｃ−インテインペプチドのスプライス部位のすぐＣ−末端側のアミノ酸残基が、システイン、セリン、およびトレオニンからなる群より選択されるアミノ酸残基である、上記キット。
【請求項１５５】
各ファージがその表面上に異なるＣ−インテインポリペプチド融合タンパク質を展示している、ファージディスプレイライブラリーを含んでなるキット。
【請求項１５６】
前記第１ベクターが前記第１ＤＮＡ配列に機能的に連結された第１プロモーターをさらに含み、前記第２ベクターが前記第２ＤＮＡ配列に機能的に連結された第２プロモーターをさらに含む、請求項１５３または１５４に記載のキット。
【請求項１５７】
分断インテインのＮ−インテインのアミノ末端に融合されたＣ３ｂ様受容体と結合する第１抗原認識部分をコードするＤＮＡ配列を含むベクターにより形質転換された細胞。
【請求項１５８】
分断インテインのＣ−インテインのカルボキシ末端に融合された第２抗原認識部分をコードするＤＮＡ配列を含むベクターにより形質転換された細胞であって、該Ｃ−インテインのスプライス部位のすぐＣ−末端側のアミノ酸残基が、システイン、セリン、およびトレオニンからなる群より選択されるアミノ酸残基である、上記細胞。
【請求項１５９】
分断インテインのＣ−インテインのカルボキシ末端に融合されたコアストレプトアビジンをコードするＤＮＡ配列を含むベクターにより形質転換された細胞であって、該Ｃ−インテインのスプライス部位のすぐＣ−末端側のアミノ酸残基が、システイン、セリン、およびトレオニンからなる群より選択されるアミノ酸残基である、上記細胞。
【請求項１６０】
第１ベクターおよび第２ベクターにより形質転換された細胞であって、第１ベクターが分断インテインのＮ−インテインのアミノ末端に融合されたＣ３ｂ様受容体と結合する第１抗原認識部分をコードする第１ＤＮＡ配列を含み、第２ベクターが該分断インテインのＣ−インテインのカルボキシ末端に融合された第２抗原認識部分をコードする第２ＤＮＡ配列を含み、該Ｃ−インテインのスプライス部位のすぐＣ−末端側のアミノ酸残基が、システイン、セリン、およびトレオニンからなる群より選択されるアミノ酸残基である、上記細胞。
【請求項１６１】
分断インテインのＮ−インテインのアミノ末端に融合されたＣ３ｂ様受容体と結合する第１抗原認識部分を含む細胞。
【請求項１６２】
分断インテインのＣ−インテインのカルボキシ末端に融合された第２抗原認識部分を含む細胞であって、該Ｃ−インテインのスプライス部位のすぐＣ−末端側のアミノ酸残基が、システイン、セリン、およびトレオニンからなる群より選択されるアミノ酸残基である、上記細胞。
【請求項１６３】
分断インテインのＮ−インテインのアミノ末端に融合されたＣ３ｂ様受容体と結合する第１抗原認識部分、および、該分断インテインのＣ−インテインのカルボキシ末端に融合された第２抗原認識部分を含む細胞であって、該Ｃ−インテインのスプライス部位のすぐＣ−末端側のアミノ酸残基が、システイン、セリン、およびトレオニンからなる群より選択されるアミノ酸残基である、上記細胞。
【請求項１６４】
病原体または病原性抗原分子の存在に関連した疾病または障害または望ましくない症状を有する哺乳動物に、治療に有効な量の二重特異性分子を投与することを含んでなる、該哺乳動物の治療方法であって、該二重特異性分子が、
（ａ）  Ｃ３ｂ様受容体と結合する第１抗原認識部分であって、モノクローナル抗体を含むもの、および
（ｂ）  該病原体または病原性抗原分子のエピトープと結合する第２抗原認識部分であって、第１抗原認識部分の重鎖または軽鎖のカルボキシ末端にコンジュゲートされているもの、
を含むことを特徴とする、上記方法。
【請求項１６５】
哺乳動物に治療に有効な量の二重特異性分子を投与することを含んでなる、哺乳動物における病原体または病原性抗原分子の存在に関連した疾病または障害または望ましくない症状の予防方法であって、該二重特異性分子が、
（ａ）  Ｃ３ｂ様受容体と結合する第１抗原認識部分であって、モノクローナル抗体を含むもの、および
（ｂ）  該病原体または病原性抗原分子のエピトープと結合する第２抗原認識部分であって、第１抗原認識部分の重鎖または軽鎖のカルボキシ末端にコンジュゲートされているもの、
を含むことを特徴とする、上記方法。
【請求項１６６】
第２抗原認識部分が第１抗原認識部分の重鎖のカルボキシ末端にコンジュゲートされている、請求項１６４または１６５に記載の方法。
【請求項１６７】
第２抗原認識部分が第１抗原認識部分の軽鎖のカルボキシ末端にコンジュゲートされている、請求項１６４または１６５に記載の方法。
【請求項１６８】
第２抗原認識部分が２つの抗原認識成分を含み、それぞれが第１抗原認識部分の異なる重鎖のカルボキシ末端にコンジュゲートされている、請求項１６４または１６５に記載の方法。
【請求項１６９】
静脈内に投与する、請求項１６４または１６５に記載の方法。
【請求項１７０】
前記哺乳動物がヒトであり、前記Ｃ３ｂ様受容体がＣＲ１である、請求項１６４または１６５に記載の方法。
【請求項１７１】
前記哺乳動物が非ヒト哺乳動物である、請求項１６４または１６５に記載の方法。
【請求項１７２】
前記病原体が自己免疫抗原である、請求項１７０に記載の方法。
【請求項１７３】
前記病原体が感染因子である、請求項１７０に記載の方法。
【請求項１７４】
前記感染因子がウイルスである、請求項１７３に記載の方法。
【請求項１７５】
前記ウイルスがＨＩＶ−１ウイルスである、請求項１７４に記載の方法。
【請求項１７６】
前記感染因子が細菌である、請求項１７３に記載の方法。
【請求項１７７】
前記細菌が炭疽菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓ）である、請求項１７６に記載の方法。
【請求項１７８】
前記感染因子が真菌である、請求項１７３に記載の方法。
【請求項１７９】
前記感染因子が寄生体である、請求項１７３に記載の方法。
【請求項１８０】
前記寄生体が原生動物である、請求項１７９に記載の方法。
【請求項１８１】
前記病原性抗原分子が毒素である、請求項１７０に記載の方法。
【請求項１８２】
病原体または病原性抗原分子の存在に関連した望ましくない症状を有する哺乳動物の治療方法であって、
（ａ）  二重特異性分子を、Ｃ３ｂ様受容体を発現する造血細胞と接触させて、造血細胞／二重特異性分子複合体を形成させること、ここで、該二重特異性分子は、（ｉ） Ｃ３ｂ様受容体と結合する第１抗原認識部分であって、モノクローナル抗体を含むもの、および、（ｉｉ） 該病原体または病原性抗原分子のエピトープと結合する第２抗原認識部分であって、第１抗原認識部分の重鎖または軽鎖のカルボキシ末端にコンジュゲートされているもの、を含むこと、
（ｂ）  該造血細胞／二重特異性分子複合体を該哺乳動物に治療有効量で投与すること、
を含んでなる、上記方法。
【請求項１８３】
病原体または病原性抗原分子の存在に関連した望ましくない症状を有する哺乳動物の治療方法であって、治療に有効な量の造血細胞／二重特異性分子複合体を該哺乳動物に投与することを含んでなり、該複合体は本質的に１以上の二重特異性分子に結合したＣ３ｂ様受容体を発現する造血細胞からなり、該二重特異性分子は、（ａ） Ｃ３ｂ様受容体と結合する第１抗原認識部分であって、モノクローナル抗体を含むもの、および、（ｂ） 該病原体または病原性抗原分子のエピトープと結合する第２抗原認識部分であって、第１抗原認識部分の重鎖または軽鎖のカルボキシ末端にコンジュゲートされているもの、を含んでなる、上記方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本出願は、２０００年１１月１日に提出された米国仮特許出願第６０／２４４，８１１号の優先権を主張する。上記明細書は参照によりその全文を本明細書に組み込むものとする。
【０００２】
１．発明の技術分野
本発明は、Ｃ３ｂ様受容体と結合する第１抗原認識部分、および哺乳動物の循環系に存在する病原性抗原分子と結合する第２抗原認識部分を有する二重特異性分子を作製するためのタンパク質トランススプライシングの使用方法に関する。本発明はまた、タンパク質トランススプライシングにより作製された二重特異性分子に関する。本発明はさらに、二重特異性分子のポリクローナルライブラリーを作製するためのタンパク質トランススプライシングの使用方法に関する。
【０００３】
２．発明の背景
霊長類赤血球（ＲＢＣ）は、循環系からの抗原のクリアランスに極めて重要な役割を果たしている。循環系における免疫複合体の形成により、霊長類における補体因子Ｃ３ｂが活性化され、Ｃ３ｂと免疫複合体との結合が起こる。次に、Ｃ３ｂ／免疫複合体は、１型補体受容体（ＣＲ１）、すなわち、免疫複合体と結合したＣ３ｂ分子を介して、赤血球表面に発現されるＣ３ｂ受容体と結合する。そして、免疫複合体は、赤血球により付き添われて、肝臓および脾臓における細網内皮系（ＲＥＳ）に導かれて中和される。ＲＥＳ細胞、最も顕著には、クッパー細胞と呼ばれる肝臓における固定組織マクロファージが、Ｃ３ｂ／免疫複合体を認識し、Ｃ３ｂ受容体−ＲＢＣ結合を切断することにより、この複合体をＲＢＣから切断し、遊離赤血球を生成する。その後、Ｃ３ｂ／免疫複合体はクッパー細胞に飲み込まれ、クッパー細胞の細胞下小器官内で完全に破壊される。しかし、この病原体クリアランス過程は補体依存性である、すなわち、Ｃ３ｂ受容体が認識する免疫複合体に限定されるため、Ｃ３ｂ受容体が認識しない免疫複合体の除去には無効である。
【０００４】
Ｔａｙｌｏｒらは、循環系から病原体を除去するための、補体非依存的方法を発見した。Ｔａｙｌｏｒらは、霊長類Ｃ３ｂ受容体に特異的な第１モノクローナル抗体（ｍＡｂ）と、病原性抗原分子に特異的な第２モノクローナル抗体との化学的架橋により、二重特異性ヘテロポリマー抗体が形成され、この抗体は、補体の活性化なしに病原性抗原分子を霊長類Ｃ３ｂ受容体に結合させる作用機構を提供することを明らかにした（米国特許第５，４８７，８９０号；第５，４７０，５７０号；および第５，８７９，６７９号）。Ｃ３ｂ受容体に特異的なｍＡｂのＦｃ部分が、受容細胞への赤血球−免疫複合体の輸送、ならびに、次に起こる赤血球−免疫複合体のタンパク質分解に重要な役割を果たしていることがわかっている（Ｎａｒｄｉｎら、１９９９， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ３６：８２７−８３５）。Ｔａｙｌｏｒらは、通常の補体依存的方法では約１０〜１５％であるのに対して、補体非依存的方法では循環系から９９％を超える病原体を除去できることを証明した。
【０００５】
しかし、Ｔａｙｌｏｒの方法にはいくつかの欠点がある。第１に、架橋反応の化学はあまり効率的でないことである。典型的には、このような化学的架橋反応の収率は約１０％〜２０％にすぎない。その結果、調製工程の化学的架橋段階で、精製したｍＡｂまたは病原体結合成分のかなりの量が失われる。例えば、標準的な化学的架橋剤（ＰｉｅｒｃｅのＳＡＴＡおよびスルホ−ＳＭＣＣなど）を用いて、１ｍｇの純粋ｍＡｂ２に架橋した１ｍｇの純粋ｍＡｂ１からは、わずか０．２〜０．４ｍｇの純粋生成物ｍＡｂ１×ｍＡｂ２が生成されるにすぎない。第２に、化学的架橋により生成される二重特異性分子は、免疫原性をもつ可能性がある化学的架橋剤断片を含んでいる。Ｔａｙｌｏｒの二重特異性分子を同じ個体に投与する場合、架橋剤の免疫原性は有害となることがある。何故なら、この個体は、架橋剤成分に対して免疫応答を生起し、同じ個体をもう一度所定量の二重特異性分子に曝露すると、個体はそれに対して激しい免疫応答を開始し、さもなければ二重特異性分子がもたらしたであろう潜在的治療効果を低下させるからである。第３に、Ｔａｙｌｏｒ特許に記載されている架橋方法は、部位特異的ではないため、ｍＡｂまたは病原体認識ドメインの機能性をいくらか低下させる恐れがある。従って、二重特異性分子を作製するためのさらに効率的な方法が求められる。
【０００６】
タンパク質スプライシングは翻訳後タンパク質プロセシング反応であり、これは前駆体分子からの、介在配列である内部タンパク質（ｉｎｔｅｒｎａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ）ドメイン、すなわちインテイン（ｉｎｔｅｉｎ）の切り出しと、２つのフランキング配列であるＮ−およびＣ−末端外部タンパク質（ｅｘｔｅｒｎａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ）、すなわちＮ−およびＣ−エクステイン（ｅｘｔｅｉｎ）の同時連結による新たな機能性タンパク質の生成を含んでなる（例えば、Ｐａｕｌｕｓ， １９９８， Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． Ｒｅｖ． ２７：３７５−３８６を参照）。切り出しおよび連結は、インテイン内のアミノ酸残基と、Ｃ−エクステインのＮ−末端の第１残基によって触媒される。スプライシングに関与する残基は、インテインＮ−末端の約１００個のアミノ酸と、インテインＣ−末端の約３５個のアミノ酸である（Ｌｅｗら、１９９８， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７３：１５８８７−１５８９０；Ｎｏｒｅｎら、２０００， Ａｎｇｅｗ． Ｃｈｅｍ． Ｉｎｔ． Ｅｄ． ３９：４５０−４６６）。典型的なタンパク質スプライシング反応は、３個の保存されたスプライス部位残基：インテインＮ−末端におけるシステイン（Ｃｙｓ）、セリン（Ｓｅｒ）、またはトレオニン（Ｔｈｒ）、インテインＣ−末端におけるアスパラギン（Ａｓｎ）、ならびに、下流Ｃ−エクステインＮ−末端におけるＣｙｓ、Ｓｅｒ、またはＴｈｒによる４つの求核置換を伴う（Ｐｅｒｌｅら、１９９７， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２５：１０８７−１０９３；Ｓｏｕｔｈｗｏｒｔｈら、１９９８， ＥＭＢＯ Ｊ． １７：９１８−９２６）。上記以外のインテイン残基も求核置換を補助すると考えられる（Ｐｅｒｌｅら、１９９７， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２５：１０８７−１０９３；Ｓｏｕｔｈｗｏｒｔｈら、１９９８， ＥＭＢＯ Ｊ． １７：９１８−９２６）。タンパク質スプライシングは真核生物、真正細菌、および古細菌など、多様な種において確認されている。
【０００７】
インテインはまた、再構成してから、タンパク質トランススプライシングを受けるＮ−末端およびＣ−末端インテイン断片に分断することができる。ラン藻Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ ｓｐ． ＰＣＣ６８０３（Ｓｓｐ）のＤｎａＥ遺伝子にコードされた天然に存在する分断インテイン系が同定された（Ｗｕら、１９９８， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９５：９２２６−９２３１）。この分断インテイン系を大腸菌において発現させると、大腸菌細胞においてトランススプライシング活性を示すことがわかった（Ｗｕら、１９９８， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９５：９２２６−９２３１）。さらに最近では、Ｓｓｐ ＤｎａＥ分断インテイン系が、外来エクステイン内容物において、効率的なｉｎ ｖｉｖｏおよびｉｎ ｖｉｔｒｏトランススプライシングおよびシススプライシングを媒介することも明らかにされている（Ｅｖａｎｓら、２０００， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７５： ９０９１−９０９４）。天然に存在する非分断インテイン系に基づいて作製された分断インテイン系も明らかにされており、例えば、ヒト結核菌（Ｍｔｕ）ＲｅｃＡインテインおよび超好熱古細菌（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ）種（Ｐｓｐ）Ｐｏｌ−１インテインの精製Ｎ−およびＣ−末端断片を用いた、ｉｎ ｖｉｔｒｏトランススプライシング系がある（Ｍｉｌｌｓら、１９９８， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９５：３５４３−３５４８；Ｌｅｗら、１９９８， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７３：１５８８７−１５８９０；Ｓｏｕｔｈｗｏｒｔｈら、１９９８， ＥＭＢＯ Ｊ． １７：９１８−９２６）。Ｍｔｕ ＲｅｃＡインテイン系のＮ−およびＣ−末端断片は、２つのインテイン断片の不活性ジスルフィド連結複合体として再構成することができ、その後、ジスルフィド結合の還元によりトランススプライシング反応を受けることができる。
【０００８】
さらに効率的および／または制御可能なスプライシングおよびトランススプライシング反応のために、インテインおよび分断インテインを修飾することもできる。例えば、キメラな前駆体におけるスプライシングは、通常、天然の前駆体より効率が悪いが、これは恐らく、それらの温度依存的反応性が証明するように、外来エクステイン内容物におけるインテインフォールディングの損傷によるものと考えられる（Ｎｏｒｅｎら、２０００， Ａｎｇｅｗ． Ｃｈｅｍ． Ｉｎｔ． Ｅｄ． ３９：４５０−４６６）。Ｅｖａｎｓらは、Ｓｓｐ ＤｎａＥ系のＮ−およびＣ−インテインに３〜５個の天然エクステイン残基を含有させると、外来エクステインにおけるトランススプライシングおよびシススプライシングを増強できることを明らかにしている（Ｅｖａｎｓら、２０００， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７５： ９０９１−９０９４）。あるいは、天然エクステインと類似した近位（ｐｒｏｘｉｍａｌ）アミノ酸配列を含んでなるエクステインを選択するのが望ましい場合もある。また、インテイン自体を修飾してもよい。例えば、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍのリボヌクレオシド二リン酸レダクターゼ遺伝子におけるＮ−末端Ｃｙｓに隣接するプロリン残基をアラニン残基で置換すると、大腸菌におけるスプライシング能が増加することがわかっている（Ｅｖａｎｓら、１９９９， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７４：３９２３−３９２６）。また、光化学によりスプライシング反応を制御できるように、部位特異的突然変異誘発でインテインを修飾した例もある（Ｃｏｏｋら、１９９５， Ａｎｇｅｗ． Ｃｈｅｍ． １０７：１７３６−１７３７；Ｃｏｏｋら、１９９５， Ａｎｇｅｗ． Ｃｈｅｍ． Ｉｎｔ． Ｅｄ． Ｅｎｇｌ． ３４：１６２９−１６３０；Ｎｏｒｅｎら、１９８９， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：１８２−１８８）。
【０００９】
タンパク質スプライシングおよびトランススプライシングに基づいてタンパク質および／または合成ポリペプチドを融合する手段が報告されている（例えば、Ｅｖａｎｓら、１９９９， Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒ ５１：３３３−３４１；Ｅｖａｎｓら、１９９９， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７４：３９２３−３９２６；Ｅｖａｎｓら、１９９９， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７４：１８３５９−１８３６３）。ｉｎ ｖｉｔｒｏトランススプライシングは、一般に、タンパク質合成にタンパク質スプライシングを利用する上で、これまでより制御された手段を提供する。また、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの再構成およびトランススプライシングにより、様々な細胞で発現されたエクステインの連結も可能になる。これはさらに、単細胞では不可能なタンパク質の発現も可能にした（Ｎｏｒｅｎら、２０００， Ａｎｇｅｗ． Ｃｈｅｍ． Ｉｎｔ． Ｅｄ． ３９：４５０−４６６）。他方、共発現させたインテインが、より効率的な再構成および／または細胞に存在する強力なタンパク質フォールディング機構の補助により、ミスフォールディングしにくいという点で、ｉｎ ｖｉｖｏトランススプライシングの方が効率的であろう（Ｓｏｕｔｈｗｏｒｔｈら、１９９８， ＥＭＢＯ Ｊ． １７：９１８−９２６）。
【００１０】
本明細書における参照文献の考察または引用は、そのような参照文献が本発明に対する先行技術であることを認めたものとして解釈されるべきではない。
【００１１】
３．発明の概要
本発明は、タンパク質トランススプライシングを用いて、Ｃ３ｂ様受容体と結合する第１抗原認識部分と、病原性抗原分子と結合する第２抗原認識部分とを有する二重特異性分子を作製する方法に関する。本発明では、第１抗原認識部分を、好適な分断インテインのＮ−インテインのＮ−末端にコンジュゲートさせることにより、Ｎ−インテイン第１抗原認識部分断片を生成すると共に、第２抗原認識部分を上記分断インテインのＣ−インテインのＣ−末端にコンジュゲートさせることにより、Ｃ−インテイン第２抗原認識部分断片を生成する。次に、Ｎ−インテイン第１抗原認識部分断片とＣ−インテイン第２抗原認識部分断片を一緒にすることにより、これらが再構成し、トランススプライシングを経て、二重特異性分子を生成するようにする。本発明の二重特異性分子は、哺乳動物の循環系からの病原性抗原分子のクリアランスに有用である。
【００１２】
本発明の第１抗原認識部分は、Ｃ３ｂ様受容体結合ドメインとエフェクタードメインを有する分子またはその断片でありうる。好ましい実施形態では、第１抗原認識部分が抗ＣＲ１モノクローナル抗体を含む。また、第１抗原認識部分は、Ｆｃドメインに融合した一本鎖Ｆｖフラグメント、またはＣ３ｂ様受容体結合ドメインとエフェクタードメインを有するキメラ抗体であってもよい。
【００１３】
本発明の第２抗原認識部分は、病原性抗原分子、例えば、天然に存在する抗原、および／またはその誘導体もしくは断片を認識し、それと結合する分子またはその断片でありうる。病原性抗原分子は、循環系中に存在する物質で、治療しようとする被験者に有害となり得るか、または望ましくないあらゆる物質であり、例えば、限定するものではないが、タンパク質または薬物または毒素、自己抗体または自己抗原、あるいは、感染因子の分子もしくはその産物が挙げられる。病原性抗原分子は疾患もしくは障害、またはその他の望ましくない状態の原因となる物質（例えば、病原体）またはその一部である抗原決定基を含む（あるいは、結合ドメインにより結合され得る）あらゆる分子である。本発明の第２抗原認識部分は、限定するものではないが、ペプチドおよびポリペプチド、核酸、オリゴ糖、および有機小分子など、あらゆるタイプの分子でよい。
【００１４】
本発明の二重特異性分子の第１および第２抗原認識部分は、直接連結することができる。また、本発明の二重特異性分子の第１および第２抗原認識部分は、好適なリンカー、例えば、限定するものではないが、ペプチドリンカー、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）リンカー、ストレプトアビジン−ビオチンもしくはアビジン−ビオチンリンカー、またはこれらの組合せを介して、連結することも可能である。本発明の好ましい実施形態では、部位特異的連結により、第１および第２抗原認識部分がコンジュゲートされる。連結は、限定するものではないが、水素結合のような非共有結合および／または共有結合でありうる。
【００１５】
本発明の二重特異性分子は、第１抗原認識部分にコンジュゲートさせた第２抗原認識部分を含むことができる。これ以外にも、本発明の二重特異性分子は、第１抗原認識部分の様々な領域にコンジュゲートさせた２以上の第２抗原認識部分を含んでいてもよい。例えば、上記二重特異性分子は、第１抗原認識モノクローナル抗体の重鎖の各々にコンジュゲートさせた２つの第２抗原認識部分を含むことができる。２以上の第２抗原認識部分が二重特異性分子に含まれる場合には、このような第２抗原認識部分は同じまたは異なる抗原認識部分であってよい。第１および第２抗原認識部分は、クリアランスしようとする同一抗原をターゲッティングする様々な抗原認識部分でよい。本発明の好ましい実施形態では、第１および第２抗原認識部分は、協働的にクリアランスしようとする抗原分子をターゲッティングする。非限定的例として、第２抗原認識部分の一方が、他方の第２抗原認識部分と病原性抗原分子との結合を増強し、これによって病原性抗原分子の除去を促進することができる。第１および第２抗原認識部分は、クリアランスしようとする様々な病原性抗原分子をターゲッティングする様々な抗原認識部分でよい。
【００１６】
本発明は、多様な分断インテインを使用して、二重特異性分子を作製する。本発明の一形態では、天然に存在する分断インテインを用いて二重特異性分子を作製する。本発明の別の形態では、天然に存在する非分断インテインに基づき作製した分断インテインを用いて、二重特異性分子を作製する。本発明の様々な実施形態では、修飾によって、インテインのトランススプライシング能が改善または増強するように、かつ／またはトランススプライシング過程の制御が可能になるように、Ｎ−インテインおよび／またはＣ−インテインへの１個以上のアミノ酸残基の付加、欠失、および／または突然変異を行って、分断インテインを修飾することができる。好ましい一実施形態では、Ｃ−インテインのカルボキシ末端にＣｙｓ残基を含有させることにより、Ｃ−インテインにコンジュゲートされた分子成分がＣｙｓで始まらなければならないという要件を解決できる。別の好ましい実施形態では、１個以上の天然の近位エクステイン残基をＮ−および／またはＣ−インテインに付加することによって、外来エクステイン内容物におけるトランススプライシングを促進することができる。
【００１７】
本発明の好ましい実施形態では、ラン藻Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ ｓｐ． ＰＣＣ６８０３のＤｎａＥ遺伝子にコードされた分断インテインのトランススプライシング系を用いる。本発明の別の実施形態では、ヒト結核菌Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ ＲｅｃＡインテインに基づいて作製した分断インテイン系を用いる。二重特異性分子の生成はｉｎ ｖｉｔｒｏで実施することができ、その際、インテイン抗原認識部分断片を個別の宿主に発現させる。また、二重特異性分子の生成はｉｎ ｖｉｖｏでも実施することができる。一実施形態では、インテイン抗原認識部分断片をコードする核酸を個別のベクターに挿入した後、これらベクターを宿主へと共トランスフェクトすることにより、二重特異性分子のｉｎ ｖｉｖｏ生成を実施する。別の実施形態では、インテイン断片をコードする核酸を同じベクターに挿入した後、このベクターを宿主にトランスフェクトすることにより、二重特異性分子のｉｎ ｖｉｖｏ生成を実施する。
【００１８】
本発明では、Ｎ−インテイン第１抗原認識部分断片は、Ｃ３ｂ様受容体と結合する適切な抗原認識部分を好適な分断インテインのＮ−インテインのＮ−末端に融合させることにより生成するのが好ましい。好ましい実施形態では、抗ＣＲ１ ｍＡｂの重鎖のＣ−末端を分断インテインのＮ−インテインのＮ−末端に融合させる。
【００１９】
本発明では、Ｃ−インテイン第２抗原認識部分断片は、クリアランスしようとする病原性抗原分子と結合する適切な抗原認識部分を、好適な分断インテインのＣ−インテインのＣ−末端に融合させることにより生成するのが好ましい。Ｃ−インテインのスプライス部位のＣ−末端側に隣接するアミノ酸残基は、システイン、セリン、またはトレオニンである。本発明の別の実施形態では、ストレプトアビジンを、スプライス部位のすぐ下流にＣｙｓ、Ｓｅｒ、またはＴｈｒを含むＣ−インテインのＣ−末端に融合させることにより、Ｃ−インテインストレプトアビジンを生成し、これをトランススプライシングに用いることにより、第１抗原認識部分−ストレプトアビジン融合分子を生成した後、これをビオチン化第２抗原認識部分と反応させて二重特異性分子を生成する。また、限定するものではないが、アビジンのような、ビオチンと特異的に結合するその他の分子も、本発明の範囲に包含されることは理解されよう。
【００２０】
本発明の一実施形態では、Ｎ−インテイン第１抗原認識部分断片とＣ−インテイン第２抗原認識部分断片をｉｎ ｖｉｔｒｏで混合して、これら断片が再構成して、トランススプライシングを経るようにすることにより、二重特異性分子を生成する。本発明の別の実施形態では、Ｎ−インテイン第１抗原認識部分断片とＣ−インテインストレプトアビジン断片をｉｎ ｖｉｔｒｏで混合して、第１抗原認識部分−ストレプトアビジン分子を生成することにより、第１抗原認識部分−ストレプトアビジン分子を得る。次に、第１抗原認識部分−ストレプトアビジン分子とビオチン化第２抗原認識部分との反応により、二重特異性分子を生成する。また、限定するものではないが、アビジンのような、ビオチンと特異的に結合するその他の分子も、本発明の範囲に包含されることは理解されよう。
【００２１】
本発明はまた、二重特異性分子のポリクローナルライブラリーの作製にも関する。本発明の一実施形態では、トランススプライシングを用いて、第２抗原認識部分の集団の各メンバー（十分に大きなファージディスプレイライブラリーから選択されるものなど）を抗ＣＲ１モノクローナル抗体（ｍＡｂ）とコンジュゲートさせて、病原性抗原分子の複数のエピトープをターゲッティングする二重特異性分子のライブラリーを作製する。好ましい実施形態では、選択した第２抗原認識部分の集団から個々のメンバーをクローン分離することなく、ポリクローナルライブラリーを作製する。さらには、病原性抗原分子の複数の変異体をターゲッティングする二重特異性分子のポリクローナルライブラリーも考えられる。本発明の別の実施形態では、本発明のストレプトアビジン−ビオチン構成（ｃｏｎｆｉｇｕｒａｔｉｏｎ）を用いて、二重特異性分子のポリクローナルライブラリーを作製する。本発明のさらに別の実施形態では、赤血球の様々な部位をターゲッティングする複数の異なる抗ＣＲ１ ｍＡｂを含む複数のＮ−インテイン抗ＣＲ１ ｍＡｂ断片を、複数の特異性を有する複数のＣ−インテイン抗原認識部分断片と混合することにより、ポリクローナル第１および第２抗原認識部分を有する二重特異性分子のポリクローナルライブラリーを作製する。
【００２２】
本発明はまた、本発明の二重特異性分子および本発明の中間体分子をコードする核酸を提供する。
【００２３】
本発明はまた、二重特異性分子を含む細胞、および中間体分子をコードするベクターにより形質転換された細胞を提供する。
【００２４】
本発明はまた、１以上の容器に、本発明のインテイン抗原認識部分断片、または本発明のインテイン抗原認識部分断片をコードする１以上の核酸、あるいは、このような核酸で形質転換された細胞を含むキットを提供する。このようなキットを用いて、本発明を実施することができる。
【００２５】
本発明はさらに、様々な障害の治療に二重特異性分子を用いる方法を提供する。
【００２６】
４．図面の説明
図１ａ〜１ｅは、本発明の二重特異性分子の好ましい実施形態をいくつか示す。図１ａ：Ｎ−インテイン抗ＣＲ１断片の模式図；図１ｂ：Ｃ−インテイン病原体結合部分断片の模式図；図１ｃ：Ｃ−インテインストレプトアビジン断片の模式図；図１ｄ：二重特異性分子のいくつかの構成の模式図；図１ｅ：ストレプトアビジン−ビオチンリンカーを含む二重特異性分子のいくつかの構成の模式図。
【００２７】
図２は、タンパク質トランススプライシングを用いて二重特異性分子を生成する工程を示す。
【００２８】
図３ａ〜３ｄは、ＳｓｐのＤｎａＥ遺伝子にコードされた天然に存在する分断インテインのアミノ酸配列を示す（Ｗｕら、１９９８， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ， Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９５：９２２６−９２３１）。図３ａ：Ｎ−インテインのアミノ酸配列（配列番号１）；図３ｂ：すぐ下流のシステインを含むＣ−インテインのアミノ酸配列（配列番号２）；図３ｃ：最初の１０個のＮ−エクステイン残基のアミノ酸配列（配列番号３）；図３ｄ：最初の１０個のＣ−エクステイン残基のアミノ酸配列（配列番号４）。
【００２９】
５．発明の開示
本発明は、タンパク質トランススプライシングを用いて、Ｃ３ｂ様受容体またはその機能的同等物と、循環系からクリアランスしようとする病原性抗原分子の両方と結合する二重特異性分子を作製する方法を提供する。分断インテイン系由来のＮ−およびＣ−インテインをＣ３ｂ様受容体認識部分および抗原認識部分にそれぞれ連結させる。これに続く再構成およびトランススプライシングによって、２つの抗原認識部分が連結されて、二重特異性分子が生成される。タンパク質トランススプライシングを用いて、二重特異性分子を生成する方法は部位特異的であるため、特定の構造および機能を持つ二重特異性分子の設計および構築を可能にする。本発明はまた、タンパク質トランススプライシングを用いて、Ｃ３ｂ様受容体認識部分を、ストレプトアビジン−ビオチンまたはアビジン−ビオチンリンカーを介して、抗原認識部分と連結させる方法に関する。以下ではストレプトアビジンを使用するが、ストレプトアビジンの代わりにアビジンを用いてもよく、これも本発明の範囲に含まれることは理解されよう。本発明のこの構成では、抗原認識部分に直接連結するのではなく、Ｃ−インテインをストレプトアビジンに連結する。ストレプトアビジンは、ヒトに投与しても、免疫応答を誘発しない（Ｌｉら、１９９９， Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ １２：７８７−７９６；Ｒｕｓｃｋｏｗｓｋｉら、１９９６， Ｊ． Ｎｕｃｌ． Ｍｅｄ． ３７：１６５５−１６６２；Ｓａｍｕｅｌら、１９９６， Ｊ． Ｎｕｃｌ． Ｍｅｄ． ３７：５５−６１）。再構成およびトランススプライシングにより、ストレプトアビジンに連結されたＣ３ｂ様受容体認識部分からなる分子が生成される。次に、ビオチン化抗原認識部分との反応により、この分子を抗原認識部分とコンジュゲートさせることができる。本発明の上記構成は、特に、抗原認識部分としてモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を含む二重特異性分子を生成するのに有用である。本発明の構成はまた、抗原認識部分が核酸または有機小分子などの非タンパク質性部分である二重特異性分子を生成する上でも特に有用である。本発明はさらに、タンパク質トランススプライシングを用いて、二重特異性分子のポリクローナルライブラリーを作製する方法に関する。
【００３０】
二重特異性分子とは、一般に、２以上の異なる抗原認識特異性を有する分子を意味する。本発明の二重特異性分子は、霊長類における１型補体受容体などのＣ３ｂ様受容体と結合する第１抗原認識部分と、病原性抗原分子と結合する第２抗原認識部分とを有する分子を指す。病原性抗原分子は、循環系からクリアランスすることが望ましい。第１および第２抗原認識部分は、該第１および第２抗原認識部分が安定した会合を形成するのに十分強力な連結によって連結されるが、好ましくは、この連結は、一方または両方の抗原認識部分に対し部位特異的である。好ましい構成では、第１および第２抗原認識部分をペプチド結合により連結する。また、第１および第２抗原認識部分は、スペーサーまたはリンカー、例えば、限定するものではないが、ペプチドリンカー、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）リンカー、またはストレプトアビジン−ビオチンリンカーなどを介して連結してもよい。
【００３１】
本明細書で用いる用語「抗原認識部分」とは、抗原分子を認識し、これと結合する、または抗原分子により認識および結合される分子成分を意味する。この分子成分は、抗原結合ドメインおよびエフェクタードメインを含んでいてもよい。エフェクタードメインとは、霊長類における赤血球−免疫複合体のような血液細胞−免疫複合体をタンパク質分解のために受容細胞に輸送するのを促進する分子成分の一部を意味する。例えば、エフェクタードメインは、ｍＡｂのＦｃドメイン、すなわち、ヒンジ領域、重鎖のＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインを含むことができる。これ以外にも、エフェクタードメインは、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインを逆の順序で含む（すなわち、ＣＨ３ドメインがＣＨ２ドメインのアミノ末端側に現れる）Ｆｃドメインを含んでいてもよい。
【００３２】
本明細書で用いる用語「分子成分」は、あらゆる分子またはその断片を包含し、例えば、限定するものではないが、ペプチドおよびポリペプチド、核酸、オリゴ糖、有機小分子、ならびに、これらいずれかの組合せを包含する。
【００３３】
本明細書で用いる用語「部位特異的連結」は、２つの分子成分を規定部位でつなぐあらゆる連結を包含する。連結は、限定するものではないが、共有ペプチド結合のような共有結合により形成することができる。また、この連結は、その他のタイプの結合、例えば、限定するものではないが、水素結合などによって形成してもよい。
【００３４】
本明細書で用いる用語「Ｃ３ｂ様受容体」は、哺乳動物の血液細胞の表面に発現される哺乳動物循環分子であって、霊長類Ｃ３ｂ受容体であるＣＲ１と類似した機能を有する、あらゆる分子を意味する。ここで、上記受容体が免疫複合体と会合した分子と結合すると、該複合体は、クリアランスのため血液細胞により食細胞へと導かれる。哺乳動物血液細胞は、限定するものではないが、霊長類赤血球でありうる。
【００３５】
本明細書で用いる用語「タンパク質トランススプライシング」とは、分断インテイン系を含むタンパク質スプライシング反応を意味する。分断インテイン系とは、アミノ末端およびカルボキシ末端のアミノ酸配列間にペプチド結合切断が存在するため、Ｎ−末端配列およびＣ−末端配列が個別の分子となり、これら分子が、再会合または再構成して機能的トランススプライシングエレメントとなるような、あらゆるインテイン系を意味する。分断インテイン系は、天然に存在する分断インテイン系でよく、天然の生物に存在するあらゆる分断インテイン系を包含する。分断インテイン系はまた、人工の（ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ）分断インテイン系であってもよく、当技術分野で公知の標準的方法で非分断インテインをＮ−インテインとＣ−インテインに分離することにより作製されるあらゆる分断インテイン系を包含する。非制限的例として、人工分断インテイン系は、天然に存在する非分断インテインを好適なＮ−およびＣ−末端配列に切断することにより作製することができる。好ましくは、このような人工インテイン系は、トランススプライシング反応に必須のアミノ酸配列だけを含んでなる。
【００３６】
本明細書で用いる用語「Ｎ−末端インテイン」または「Ｎ−インテイン」とは、必須Ｎ−末端アミノ酸配列を含み、かつ、トランススプライシング反応に機能的であるあらゆるインテイン配列を意味する。従って、「Ｎ−インテイン」は、トランススプライシングが起こるときに切り出された（ｓｐｌｉｃｅｄ ｏｕｔ）配列も含む。Ｎ−インテインは、天然に存在するＮ−インテイン配列の修飾体である配列を含んでもよい。例えば、追加のアミノ酸残基および／または変異型残基を含有させることによりトランススプライシングに関してＮ−インテインが非機能的にならない限り、Ｎ−インテインは、追加のアミノ酸残基および／または変異型残基を含むことができる。追加のアミノ酸残基および／または変異型残基を含有させることにより、Ｎ−インテインのトランススプライシング能が改善または増強したり、かつ／またはトランススプライシング過程の制御が可能になることが好ましい。本発明の特定の実施形態で用いられる「Ｎ−インテイン部分」は、Ｎ−インテインおよび随意にリンカー配列を含む分子を意味する。このリンカー配列は、限定するものではないが、Ｎ−インテインのＮ−末端における、ペプチドリンカー、ストレプトアビジン−ビオチンリンカー、またはＰＥＧリンカーでありうる。Ｎ−インテイン部分の末端は、別の分子をコンジュゲートさせることができるＮ−インテイン部分の「Ｎ−末端」と称される。リンカーがペプチドリンカーである場合には、Ｎ−インテイン部分はまた、本明細書では「Ｎ−インテインペプチド」と称され、「Ｎ−末端」はＮ−インテインペプチドのＮ−末端である。
【００３７】
本明細書で用いる用語「Ｃ−末端インテイン」または「Ｃ−インテイン」とは、必須Ｃ−末端アミノ酸配列を含み、かつ、トランススプライシング反応に機能的であるあらゆるインテイン配列を意味する。従って、「Ｃ−インテイン」は、トランススプライシングが起こるときに切り出された配列も含む。Ｃ−インテインは、天然に存在するＣ−インテイン配列の修飾体である配列を含んでもよい。例えば、追加のアミノ酸残基および／または変異型残基の含有により、トランススプライシングに関してＣ−インテインが非機能的にならない限り、Ｃ−インテインは、追加のアミノ酸残基および／または変異型残基を含有してよい。追加のアミノ酸残基および／または変異型残基の含有により、Ｃ−インテインのトランススプライシング能が改善または増強したり、かつ／またはトランススプライシング過程の制御が可能になることが好ましい。非制限的例として、Ｃｙｓ残基をＣ−インテインのカルボキシ末端に含有させることにより、Ｃ−インテインとコンジュゲートされる分子成分がＣｙｓで始まらなければならないという要件を解決することができる。本発明の特定の実施形態で用いられる「Ｃ−インテイン部分」は、Ｃ−インテインおよび随意にリンカー配列を含む分子を意味する。このリンカーは、限定するものではないが、Ｃ−インテインのＮ−末端における、ペプチドリンカー、ストレプトアビジン−ビオチンリンカー、またはＰＥＧリンカーでよい。Ｃ−インテイン部分の末端は、別の分子をコンジュゲートさせることができるＣ−インテイン部分の「Ｃ−末端」と称される。リンカーがペプチドリンカーである場合には、Ｃ−インテイン部分はまた、本明細書では「Ｃ−インテインペプチド」と称され、「Ｃ−末端」はＣ−インテインペプチドのＣ−末端である。
【００３８】
本明細書で用いる用語「Ｎ−末端エクステイン」または「Ｎ−エクステイン」とは、Ｎ−インテインのアミノ末端にコンジュゲートされたあらゆる分子成分を意味する。
【００３９】
本明細書で用いる用語「Ｃ−末端エクステイン」または「Ｃ−エクステイン」とは、Ｃ−インテインのカルボキシ末端にコンジュゲートされたあらゆる分子成分を意味する。
【００４０】
本明細書で用いる、本発明の二重特異性分子のポリクローナルライブラリーとは、Ｃ３ｂ様受容体と結合する第１抗原認識部分と、クリアランスしようとする抗原と結合する第２抗原認識部分とを各々が有する、複数の二重特異性分子を意味し、該ライブラリーは、複数の異なる特異性を有する複数の第２抗原認識部分を含んでなる。好ましくは、上記ポリクローナルライブラリーの複数の二重特異性分子は、１つの抗原分子の異なるエピトープに対する特異性および／または１つの抗原分子の異なる変異体に対する特異性を含む。さらに好ましくは、上記ポリクローナル集団の複数の二重特異性分子は、１つの抗原分子の天然に存在する大部分の変異体に対する特異性を含む。上記ポリクローナルライブラリーはまた、異なる抗原分子の混合物に対する特異性を含んでいてもよい。好ましい実施形態では、上記ポリクローナル集団中の二重特異性分子の少なくとも９０％、７５％、５０％、２０％、１０％、５％、または１％が、所望の抗原分子および／または抗原分子類をターゲッティングする。他の好ましい実施形態では、ポリクローナル集団に占めるいずれか１つの二重特異性分子の比率は、集団の９０％、５０％または１０％を超えない。上記ポリクローナルライブラリーは、異なる特異性を持つ少なくとも２つの異なる二重特異性分子を含んでなる。さらに好ましくは、上記ポリクローナルライブラリーは、異なる特異性を持つ少なくとも１０の異なる二重特異性分子を含んでなる。最も好ましくは、上記ポリクローナルライブラリーは、異なる特異性を持つ少なくとも１００の異なる二重特異性分子を含んでなる。
【００４１】
本明細書で用いる、本発明の二重特異性分子のカクテルとは、１抗原または抗原混合物をターゲッティングするために、ブレンドされた精製二重特異性分子の混合物を意味する。特に、二重特異性分子のカクテルとは、異なるまたは同じ抗原分子をターゲッティングしかつ混合されたタイプのものである複数の第２抗原認識部分を有する、精製された二重特異性分子の混合物を意味する。例えば、第２抗原認識部分の混合物は、ペプチド、核酸、および／または有機小分子の混合物でよい。二重特異性分子のカクテルは、一般に、様々な精製二重特異性分子を混合することにより調製することができる。
【００４２】
以下の５．１節で、本発明の二重特異性分子について説明する。５．２節では、本発明で用いることができるタンパク質トランススプライシング系について説明する。この節では、分断インテインおよびその生成方法を説明する。５．３節では、タンパク質トランススプライシングを用いた二重特異性分子の作製および精製について説明する。この節では、インテイン断片の調製手順、このようなインテイン断片を用いたｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏでの二重特異性分子の作製方法、ならびに、二重特異性分子の精製および特性決定方法を詳細に説明する。５．４節では、タンパク質トランススプライシングを用いた二重特異性分子のポリクローナルライブラリーの作製について説明する。５．５節では、様々な疾患の治療における本発明の二重特異性分子の使用方法について説明する。５．６節では、本発明を実施するのに用いることができる材料のキットについて説明する。５．７節では、その他の二重特異性分子の生成への本発明の方法の応用について説明する。
【００４３】
５．１．二重特異性分子
本発明では、二重特異性分子の第１抗原認識部分は、ＣＲ１結合ドメインとエフェクタードメインを含むどのようなポリペプチドでもよい。好ましい実施形態では、第１抗原認識部分は抗ＣＲ１ ｍＡｂである。別の実施形態では、第１抗原認識部分は抗ＣＲ１ポリペプチド抗体であり、これには、限定するものではないが、免疫グロブリンＦｃドメインのＮ−末端に融合されたＣ３ｂ様受容体に対する特異性を有する一本鎖可変領域フラグメント（ｓｃＦｖ）が含まれる。第１抗原認識部分はまた、キメラ抗体であってもよく、例えば、限定するものではないが、ヒト化モノクローナル抗体が挙げられ、ここでは、相補性決定領域がマウスで、フレームワーク領域がヒトであり、これによって、該抗体で治療したヒト患者における免疫応答の可能性が少なくなる（米国特許第４，８１６，５６７号、第４，８１６，３９７号、第５，６９３，７６２号；第５，５８５，０８９号；第５，５６５，３３２号および第５，８２１，３３７号、これらを参照により本明細書にその全文を組み入れる）。好ましくは、キメラ抗体のＦｃドメインは、食細胞上のＦｃ受容体によって認識され、これにより、ＲＢＣ−免疫複合体の輸送およびその後のタンパク質分解を促進することができる。簡明にするため、本明細書では、抗ＣＲ１抗原認識部分または抗ＣＲ１抗体について述べることが多いが、このような抗原認識部分または抗体がＣ３ｂ様受容体と結合する抗原認識部分または抗体を意味することは理解されよう。
【００４４】
本発明では、二重特異性分子の第２抗原認識部分は、病原性抗原分子を認識し、これと結合するどのような分子成分でもよく、例えば、限定するものではないが、抗体またはその抗原結合フラグメントが挙げられる。例えば、第２抗原認識部分は、自己免疫疾患の原因となるものなど、抗体が結合して循環系からクリアランスされるエピトープまたは抗原決定基でありうる。
【００４５】
本明細書で用いる「エピトープ」は、抗原決定基、すなわち、宿主において免疫応答を誘発するまたは抗体が結合する分子の領域を意味する。この領域は、連続したアミノ酸を含むことができるが、必ずしも含む必要はない。エピトープという用語は、当技術分野では「抗原決定基」としても知られている。エピトープは、宿主の免疫系にユニークな空間コンホメーション内に３個という少数のアミノ酸からなるものでもよい。一般に、エピトープは少なくとも５個のアミノ酸からなり、さらに一般的には少なくとも８〜１０個のアミノ酸からなる。このようなアミノ酸の空間コンホメーションを決定する方法は当分野では公知である。
【００４６】
また、二重特異性分子の第２抗原認識部分は非タンパク質性部分であってもよい。一実施形態では、第２抗原認識部分は核酸である。別の実施形態では、第２抗原認識部分は有機小分子である。さらに別の実施形態では、第２抗原認識部分はオリゴ糖である。
【００４７】
本発明の好ましい実施形態では、二重特異性分子は、抗ＣＲ１ ｍＡｂと２つの第２抗原認識部分（すなわち、第一に、抗ＣＲ１ ｍＡｂの第１重鎖のＣ−末端に融合された第２抗原認識部分と、第二に、抗ＣＲ１ ｍＡｂの第２重鎖のＣ−末端に融合された第２抗原認識部分）を含んでなる。特定の実施形態では、上記２つの第２抗原認識部分が同じ抗原認識部分である。他の実施形態では、上記２つの第２抗原認識部分が異なる抗原認識部分である。上記２つの第２抗原認識部分は、クリアランスしようとする同じ抗原分子をターゲッティングする、異なる抗原認識部分であってよい。本発明の好ましい実施形態では、上記２つの第２抗原認識部分は、協働してクリアランスしようとする抗原分子をターゲッティングする。非制限的例として、上記第２抗原認識部分の一方は、抗原分子のコンホメーション改変を誘導して、他方の第２抗原認識部分の結合親和性を増強し、これによって、抗原分子の除去を促進することができる（Ｔｈａｌｉら、Ｊ． Ａｃｑｕｉｒｅｄ Ｉｍｍｕｎｅ Ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ Ｓｙｎｄｒｏｍｅｓ ５：５９１−５９９）。また、２つの第２抗原認識部分は、クリアランスしようとする異なる抗原をターゲッティングする異なる抗原認識部分であってもよい。第２抗原認識部分は、限定するものではないが、抗原結合ドメイン、エピトープ、核酸、または有機小分子でありうる。
【００４８】
本発明の別の好ましい実施形態では、二重特異性分子は、抗ＣＲ１ ｍＡｂと２つの第２抗原認識部分：第一に、抗ＣＲ１ ｍＡｂの第１軽鎖のＣ−末端に融合した第２抗原認識部分と、第二に、抗ＣＲ１ ｍＡｂの第２軽鎖のＣ−末端に融合した第２抗原認識部分とを含んでなる。特定の実施形態では、上記２つの第２抗原認識部分は、同じ抗原認識部分である。他の実施形態では、上記２つの第２抗原認識部分は、異なる抗原認識部分である。上記２つの第２抗原認識部分は、除去しようとする同じ抗原分子をターゲッティングする、異なる抗原認識部分であってよい。本発明の好ましい実施形態では、上記２つの第２抗原認識部分は、協働して除去しようとする抗原分子をターゲッティングする。非制限的例として、上記第２抗原認識部分の１つは、抗原分子のコンホメーション改変を誘導して、他方の第２抗原認識部分の結合親和性を増強し、これによって、抗原分子の除去を促進することができる（Ｔｈａｌｉら、Ｊ． Ａｃｑｕｉｒｅｄ Ｉｍｍｕｎｅ Ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ Ｓｙｎｄｒｏｍｅｓ ５：５９１−５９９）。また、２つの第２抗原認識部分は、除去しようとする異なる抗原をターゲッティングする、異なる抗原認識部分であってもよい。第２抗原認識部分は、限定するものではないが、抗原結合ドメイン、エピトープ、核酸、または有機小分子でよい。
【００４９】
本発明の好ましい実施形態では、第２抗原認識部分は、抗ＣＲ１ ｍＡｂの重鎖または軽鎖のいずれかとコンジュゲートさせるが、その他の構成も本発明に包含されることは理解されよう。非制限的例として、一方の第２抗原認識部分が重鎖に、他方の第２抗原認識部分が軽鎖に、それぞれコンジュゲートした構成を挙げることができる。また、１つの抗ＣＲ１ ｍＡｂとコンジュゲートさせた３以上の第２抗原認識部分を含む構成も考えられる。
【００５０】
本発明の別の実施形態では、二重特異性分子は、抗ＣＲ１ ｍＡｂと、抗ＣＲ１ ｍＡｂの重鎖の一方のＣ−末端に融合した抗原認識部分とを含んでなる。本発明の別の実施形態では、二重特異性分子は、抗ＣＲ１ ｍＡｂと、抗ＣＲ１ ｍＡｂの軽鎖の一方のＣ−末端に融合した抗原認識ドメインとを含んでなる。本発明のさらに別の実施形態では、二重特異性分子は、抗ＣＲ１ポリペプチド抗体（例えば、限定するものではないが、免疫グロブリンＦｃドメインのＮ−末端に融合したＣ３ｂ様受容体に対して特異性を有するｓｃＦｖ）と、抗ＣＲ１ポリペプチドのＣ−末端に融合した抗原認識ドメインを含んでなる。抗原認識ドメインは、限定するものではないが、抗原結合ドメイン、エピトープ、核酸、または有機小分子でよい。
【００５１】
また、上記のすべての実施形態において、第１および第２抗原認識部分は、リンカーを介して連結可能であることは理解されよう。本発明の好ましい実施形態では、ペプチドリンカーを介して、第１および第２抗原認識部分を連結することができる。別の好ましい実施形態では、ストレプトアビジンまたはＰＥＧリンカーを介して、第１および第２抗原認識部分を連結することができる。
【００５２】
５．２．タンパク質トランススプライシング系
本発明は、タンパク質トランススプライシングを用いて、二重特異性分子を生成する方法に関する。この方法を用いて、直接またはリンカーを介して、第１抗原認識部分（限定するものではないが、抗ＣＲ１ ｍＡｂなど）を、第２抗原認識部分（限定するものではないが、ペプチドまたはポリペプチド、核酸および有機小分子など）とコンジュゲートさせることにより、二重特異性分子を生成することができる。これ以外にも、上記方法を用いて、第１抗原認識部分をストレプトアビジンとコンジュゲートさせて、第１抗原認識部分−ストレプトアビジン融合分子を形成し、この融合分子をビオチン化第２抗原認識部分とコンジュゲートさせることができる。
【００５３】
本発明では、分断インテインのＮ−インテインのＮ−末端をＣ３ｂ様受容体認識部分（例えば、限定するものではないが、抗ＣＲ１ ｍＡｂなど）のＣ−末端に融合させるのに対し、対応するＣ−インテインのＣ−末端を抗原認識部分とコンジュゲートさせる。直接またはリンカー（例えば、限定するものではないが、ペプチドリンカー、ストレプトアビジン−ビオチンリンカー、またはＰＥＧリンカーなど）を介して、どのようなタンパク質性および非タンパク質性抗原認識部分をＣ−インテインにコンジュゲートさせてもよい。次に、上記Ｎ−インテイン抗ＣＲ１ ｍＡｂおよびＣ−インテイン抗原認識部分は、再構成およびトランススプライシングを経るが、これによって、Ｃ３ｂ様受容体認識部分と抗原認識部分が連結して二重特異性分子を形成する。本発明では、限定するものではないが、ラン藻Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ ｓｐ． ＰＣＣ６８０３のＤｎａＥ遺伝子に基づく天然に存在する分断インテイン系など、どのような分断インテイン系を用いてもよい。また、限定するものではないが、ヒト結核菌ＲｅｃＡインテインのような天然に存在する非分断インテイン系を用いることもできる。天然の状態では分断インテイン系ではない、そのようなインテイン系を用いようとする場合には、当分野では公知の標準的分子生物学的方法を用いて、非分断インテインをＮ−インテインとＣ−インテインに分離することにより、人工分断インテインを得ることができる。好ましくは、このような人工分断インテインは、Ｎ−およびＣ−インテインがトランススプライシングに必須のアミノ酸配列だけを含むように、構築する。例えば、天然に存在する非分断インテイン内のホーミングエンドヌクレアーゼ配列は、後に得られる分断インテインのトランススプライシング能力に影響を及ぼすことなく、すべて除去することができる。人工分断インテインに含有させようとする配列は当業者には明らかであろう。
【００５４】
５．２．１．天然に存在する分断インテインに基づくトランススプライシング系
本発明の一実施形態では、天然に存在する分断インテインを本発明の二重特異性分子の生成に用いる。好ましい実施形態では、ラン藻Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ ｓｐ． ＰＣＣ６８０３のＤｎａＥ遺伝子にコードされた分断インテインのトランススプライシング系を用いる。Ｓｓｐ ＤｎａＥ インテインは、１２３−アミノ酸Ｎ−末端インテイン配列（Ｓｓｐ １２３ ａａ Ｎ−インテイン）および３６−アミノ酸Ｃ−末端インテイン配列（Ｓｓｐ ３６ ａａ Ｃ−インテイン）を含む。Ｓｓｐ １２３ ａａ Ｎ−インテインおよびＳｓｐ ３６ ａａ Ｃ−インテインをコードする核酸配列を図３に示す。
【００５５】
一実施形態では、Ｓｓｐ １２３ ａａ Ｎ−インテインを用いて、Ｎ−インテイン第１抗原認識部分断片、すなわち、Ｎ−インテイン抗ＣＲ１を調製する。Ｓｓｐ １２３ ａａ Ｎ−インテインのＮ−末端をＣ３ｂ様受容体認識部分（例えば、限定するものではないが、抗ＣＲ１ ｍＡｂ）のＣ−末端と融合させる。
【００５６】
一実施形態では、Ｓｓｐ ３６ ａａ Ｃ−インテインを用いて、Ｃ−インテイン第２抗原認識部分断片を調製する。Ｓｓｐ ３６ ａａ Ｃ−インテインのＣ−末端を、Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、またはＴｈｒをＮ−末端に有する抗原認識部分とコンジュゲートさせる。
【００５７】
本発明の別の実施形態では、Ｓｓｐ ３６ ａａ Ｃ−インテインのＣ−末端にＣｙｓ、Ｓｅｒ、またはＴｈｒ残基を付加する３７ ａａ Ｃ−インテインを用いて、Ｃ−インテイン第２抗原認識部分断片を調製する。この３７ ａａ Ｃ−インテインは、タンパク質性および非タンパク質性いずれの抗原認識部分ともコンジュゲートさせることができる。
【００５８】
本発明のさらに別の実施形態では、１個以上の天然の近位Ｎ−エクステイン残基をＳｓｐ １２３ ａａ Ｎ−インテインのＮ−末端に付加することにより、本発明のＮ−インテインを形成させる。本明細書で用いる、「天然の近位Ｎ−エクステイン残基」とは、スプライス部位のすぐ上流、すなわち、アミノ末端側にあり、かつ天然のＮ−エクステインと同じ配列を有するアミノ酸残基をさす。好ましい実施形態では、２個以上の天然の近位Ｎ−エクステイン残基をＳｓｐ １２３ ａａ Ｎ−インテインに付加する。次に、このようなＮ−インテインを用いて、Ｎ−インテイン第１抗原認識部分断片を調製する。
【００５９】
本発明のさらに別の実施形態では、１個以上の天然の近位Ｃ−エクステイン残基をＳｓｐ ３６ ａａ Ｃ−インテインのＣ−末端に付加することにより、本発明のＣ−インテインを形成する。本明細書で用いる「天然の近位Ｃ−エクステイン残基」とは、スプライス部位のすぐ下流、すなわち、カルボキシ末端側にあり、かつ天然のＣ−エクステインと同じ配列を有するアミノ酸残基をさす。好ましい実施形態では、３個以上の天然の近位Ｃ−エクステイン残基をＳｓｐ ３６ ａａ Ｃ−インテインに付加する。次に、このようなＣ−インテインを用いて、Ｃ−インテイン抗原認識部分断片を調製する。
【００６０】
別の実施形態では、非天然アミノ酸残基、例えば、限定するものではないが、Ｏ−（２−ニトロベンジル）セリンのようなケージド（ｃａｇｅｄ）光反応性基などを部位特異的突然変異誘発によりＮ−インテインのＮ−末端に組み込み、これにより、好適な波長（好ましくは、３００〜３５０ ｎｍの範囲の波長）の光照射で、スプライシング反応を活性化することができる。制御可能なトランススプライシングを可能にするその他のインテイン系を当技術分野で公知の方法により設計することも可能であり、それらは本発明の範囲に含まれるものとする。
【００６１】
Ｓｓｐ １２３ ａａ Ｎ−インテインおよびいずれかの修飾Ｓｓｐ Ｎ−インテインをコードする核酸は、当技術分野で公知の方法により生成することができる。一実施形態では、所望のＮ−インテインのヌクレオチド配列に及ぶヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドのセットをアニールすることにより、Ｓｓｐ Ｎ−インテインをコードする核酸を合成する。別の実施形態では、好適なプライマーを用いて、好適なプラスミド（例えば、限定するものではないが、プラスミドｐＤｎａＥ−Ｃ−２０９）からの増幅により、Ｎ−インテインをコードする核酸を生成することができる（Ｅｖａｎｓら、２０００， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７５：９０９１−９０９４を参照）。次に、Ｎ−インテインをコードする核酸を、発現ベクターの構築に用いることができる。
【００６２】
Ｓｓｐ ３６ ａａ Ｃ−インテインおよびいずれかの修飾Ｓｓｐ Ｃ−インテインをコードする核酸は、当技術分野で公知の方法により生成することができる。一実施形態では、所望のＣ−インテインのヌクレオチド配列に及ぶヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドのセットをアニールすることにより、Ｓｓｐ Ｃ−インテインをコードする核酸を合成する。別の実施形態では、当技術分野で公知の標準的方法を用いて、好適なプラスミドからの増幅により、Ｃ−インテインをコードする核酸を生成することができる。次に、Ｃ−インテインをコードする核酸を、発現ベクターの構築に用いることができる。
【００６３】
あるいは、Ｓｓｐ Ｎ−インテインおよびＣ−インテインは、ペプチド合成技法により生成することもできる。この目的のために、どのようなペプチド合成技法を用いてもよい。当業者であれば、Ｎ−インテインの合成に多段階ペプチド合成を使用できることが理解されるだろう。次に、合成したＮ−インテインおよびＣ−インテインを抗原認識部分と、当技術分野で公知の方法により化学的にコンジュゲートさせることができる。
【００６４】
５．２．２．人工分断インテインに基づくトランススプライシング系
本発明の別の実施形態では、人工分断インテインのトランススプライシング系を本発明の二重特異性分子の生成に用いる。人工分断インテイン系の例として、限定するものではないが、Ｍｔｕ ＲｅｃＡインテインに基づくものが挙げられる。人工Ｍｔｕ ＲｅｃＡインテインは、１０５個のアミノ酸からなるＮ−末端インテイン配列（Ｍｔｕ １０５ ａａ Ｎ−インテイン）と３５個のアミノ酸からなるＣ−末端インテイン配列（Ｍｔｕ ３５ ａａ Ｃ−インテイン）を含みうる。Ｍｔｕ Ｎ−インテインおよびＭｔｕ Ｃ−インテインをコードする核酸配列は、Ｍｔｕ ＲｅｃＡ遺伝子の配列にみいだすことができる（例えば、受入れ番号Ｘ５８４８５；Ｐｅｒｌｅｒら、１９９７， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２５：１０８７−１０９３；Ｄａｖｉｓら、１９９２， Ｃｅｌｌ ７１：２０１−２１０；Ｄａｖｉｓら、１９９１， Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １７３：５６５３−５６６２）。
【００６５】
一実施形態では、Ｍｔｕ １０５ ａａ Ｎ−インテインを用いて、Ｎ−インテイン第１抗原認識部分断片を調製する。Ｍｔｕ １０５ ａａ Ｎ−インテインのＮ−末端をＣ３ｂ様受容体認識部分（例えば、限定するものではないが、抗ＣＲ１ ｍＡｂなど）のＣ−末端と融合させる。
【００６６】
別の実施形態では、Ｍｔｕ ３５ ａａ Ｃ−インテインを用いて、Ｃ−インテイン第２抗原認識部分断片を調製する。Ｍｔｕ ３５ ａａ Ｃ−インテインのＣ−末端を、ＣｙｓをＮ−末端に有する抗原認識部分と融合させる。
【００６７】
本発明の別の実施形態では、Ｍｔｕ ３５ ａａ Ｃ−インテインのＣ−末端にＣｙｓ、Ｓｅｒ、またはＴｈｒ残基が付加された３６ ａａ Ｃ−インテインを用いて、Ｃ−インテイン第２抗原認識部分断片を調製する。すると、この３６ ａａ Ｃ−インテインは、タンパク質性および非タンパク質性いずれの抗原認識部分ともコンジュゲートさせることができる。
【００６８】
本発明のさらに別の実施形態では、１個以上の天然の近位Ｎ−エクステイン残基をＭｔｕ １０５ ａａ Ｎ−インテインのＮ−末端に付加することにより、本発明のＮ−インテインを形成する。好ましい実施形態では、２個以上の天然の近位Ｎ−エクステイン残基をＭｔｕ １０５ ａａ Ｎ−インテインに付加する。次に、このようなＮ−インテインを用いて、Ｎ−インテイン抗原認識部分断片を調製する。
【００６９】
本発明のさらに別の実施形態では、１個以上の天然の近位Ｃ−エクステイン残基をＭｔｕ ３５ ａａ Ｃ−インテインのＣ−末端に付加することにより、本発明のＣ−インテインを形成する。好ましい実施形態では、３個以上の天然の近位Ｃ−エクステイン残基をＭｔｕ ３５ ａａ Ｃ−インテインに付加する。次に、このようなＣ−インテインを用いて、Ｃ−インテイン抗原認識部分断片を調製する。
【００７０】
さらに別の実施形態では、３６〜５２個のアミノ酸残基を含むＣ−インテインを用いて、Ｃ−インテイン第２抗原認識部分断片を調製する。このようなＣ−インテインのＣ−末端を、ＣｙｓをＮ−末端に有する抗原認識部分と融合させる。あるいは、３６〜５２個のアミノ酸残基、およびＣｙｓ、Ｓｅｒ、またはＴｈｒ残基をＣ−末端に含むＣ−インテインを用いて、Ｃ−インテイン第２抗原認識部分断片を調製することもできる。
【００７１】
別の実施形態では、非天然アミノ酸残基、例えば、限定するものではないが、Ｏ−（２−ニトロベンジル）セリンのようなケージド光反応性基などを部位特異的突然変異誘発によりＮ−インテインのＮ−末端に組み込むことにより、好適な波長（好ましくは、３００〜３５０ ｎｍの範囲の波長）の光照射で、スプライシング反応を活性化することができる。制御可能なトランススプライシングを可能にするその他のインテイン系を当技術分野で公知の様々な方法により設計することも可能であり、それらは本発明の範囲に含まれるものとする。
【００７２】
Ｍｔｕ １０５ ａａ Ｎ−インテインおよびいずれかの修飾Ｍｔｕ Ｎ−インテインをコードする核酸は、当技術分野で公知の標準的方法により生成することができる。一実施形態では、所望のＮ−インテインのヌクレオチド配列にかかるヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドのセットをアニールすることにより、Ｍｔｕ Ｎ−インテインをコードする核酸を合成する。別の実施形態では、好適なプラスミド（例えば、限定するものではないが、プラスミドｐＭＵ１Ｂ）からの増幅により、Ｎ−インテインをコードする核酸を生成することができる（Ｍｉｌｌｓら、１９９８， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９５：３５４３−３５４８を参照）。次に、Ｎ−インテインをコードする核酸を、発現ベクターの構築に用いることができる。
【００７３】
Ｍｔｕ ３５ ａａ Ｃ−インテインおよびいずれかの修飾Ｍｔｕ Ｃ−インテインをコードする核酸は、当技術分野で公知の標準的方法により生成することができる。一実施形態では、所望のＣ−インテインのヌクレオチド配列にかかるヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドのセットをアニールすることにより、Ｍｔｕ Ｃ−インテインをコードする核酸を合成する。別の実施形態では、当技術分野で公知の標準的方法を用いて、好適なプラスミドからの増幅により、Ｃ−インテインをコードする核酸を生成することができる。次に、Ｃ−インテインをコードする核酸を、発現ベクターの構築に用いることができる。
【００７４】
あるいは、Ｍｔｕ Ｎ−インテインおよびＣ−インテインは、ペプチド合成技法により生成することもできる。この用途のために、どのようなペプチド合成技法を用いてもよい。当業者であれば、Ｎ−インテインの合成に多段階ペプチド合成を使用できることは理解されるだろう。次に、当技術分野で公知の方法によって、合成したＮ−インテインおよびＣ−インテインを抗原認識部分と化学的にコンジュゲートさせることができる。
【００７５】
５．３．二重特異性分子の作製および精製
好適なＮ−インテインおよびＣ−インテイン（５．２節）を抗ＣＲ１および抗原認識部分とそれぞれ融合させることにより、Ｎ−インテイン抗ＣＲ１断片およびＣ−インテイン抗原認識部分断片を生成する。次に、Ｎ−インテイン抗ＣＲ１断片およびＣ−インテイン抗原認識部分断片を、タンパク質トランススプライシングが起こるような条件下で接触させることにより、二重特異性分子を生成する。本明細書で用いる「接触（させる）」とは、反応バッファー、例えば、溶液中で、２種以上の反応体分子を添加または混合することにより、これら２種以上の反応分子が出会って反応できるようにすることを意味する。
【００７６】
５．３．１．Ｎ−インテイン断片の作製および精製
Ｎ−インテイン抗ＣＲ１断片は、抗ＣＲ１を５．２節に記載したような好適なＮ−インテインとコンジュゲートさせることにより得ることができる。Ｎ−インテイン抗ＣＲ１断片は、組換えにより産生させるのが好ましい。次に、Ｎ−インテイン抗ＣＲ１断片を好適なＣ−インテイン抗原認識部分断片と一緒に、トランススプライシング反応に用いることにより、二重特異性分子を生成する。
【００７７】
５．３．１．１．抗ＣＲ１部分の作製
好ましい実施形態では、二重特異性分子の抗ＣＲ１部分は、抗ＣＲ１ ｍＡｂを含む。ヒトＣ３ｂ受容体と結合する抗ＣＲ１ ｍＡｂは、公知の方法により得ることができる。一実施形態では、抗ＣＲ１ ｍＡｂ、好ましくは、抗ＣＲ１ ＩｇＧは、当分野では公知の標準的ハイブリドーマ法（例えば、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ， １９７５， Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５−４９７；Ｈｏｇｇら、１９８４， Ｅｕｒ． Ｊ． ｉｍｍｎｏｌ． １４：２３６−２４３；Ｏ’Ｓｈｅａら、１９８５， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １３４：２５８０−２５８７；Ｓｈｒｅｉｂｅｒ， 米国特許第４，６７２，０４４号参照）を用いて産生させることができる。適当なマウスをヒトＣＲ１（ヒト赤血球から精製することができる）で免疫感作する。免疫したマウスから得られた脾細胞を不死化マウス骨髄腫細胞系と融合させると、ハイブリドーマ細胞の集団が形成され、これには、抗ＣＲ１抗体を産生するハイブリドーマが含まれている。次に、酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）のような通常の技法を用いて、上記ハイブリドーマの集団から、抗ＣＲ１抗体を産生するハイブリドーマを選択または「クローン化」する。抗ＣＲ１ ｍＡｂを発現するハイブリドーマ細胞系は様々な供給源から取得することができ、例えば、米国特許第４，６７２，０４４号に記載されたヒトＣＲ１と結合するマウス抗ＣＲ１ ｍＡｂは、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）からハイブリドーマ細胞系ＡＴＣＣ ＨＢ ８５９２として入手可能である。本発明ではその他の抗ＣＲ１ ｍＡｂを用いることもできる（例えば、Ｎｉｃｋｅｌｌｓら、１９９８， Ｃｌｉｎ． Ｅｘｐ． Ｉｍｍｎｏｌ． １１２：２７−３３を参照）。
【００７８】
次に、当分野では公知の標準的方法により、ハイブリドーマ細胞系から、抗ＣＲ１ ｍＡｂ、好ましくは、抗ＣＲ１ ＩｇＧの重鎖および軽鎖をコードする核酸を調製することができる。非制限的例として、好適なプライマーを用いてｍＲＮＡをプライミングした後、好適なフォワードおよびリバースプライマーを用いたＰＣＲ増幅により、抗ＣＲ１ ＩｇＧの重鎖および軽鎖をコードするｃＤＮＡを調製することができる。ｃＤＮＡ合成のために入手可能な市販のどのようなキットを用いてもよい。次に、上記核酸を発現ベクターの構築に用いることができる。
【００７９】
別の実施形態では、当分野では公知の標準的方法に従って、抗ＣＲ１ ｓｃＦｖをコードする核酸を調製する。別の実施形態では、当分野では公知の標準的方法（米国特許第４，８１６，５６７号、第４，８１６，３９７号、第５，６９３，７２６号；第５，５８５，０８９号；第５，５６５，３３２号および第５，８２１，３３７号、尚、これらの文献は、参照によりその全文を本明細書に組み入れる）に従って、抗ＣＲ１キメラ抗体をコードする核酸を調製する。次に、核酸を発現ベクターの構築に用いることができる。
【００８０】
５．３．１．２．Ｎ−インテイン抗ＣＲ１断片の作製および精製
本発明では、Ｎ−インテインおよびＣ−インテイン断片を組換えにより産生することができるが、その際、Ｎ−インテインをコードするヌクレオチド配列のＮ−末端を免疫グロブリン定常ドメイン配列のＣ−末端と融合させる。この融合は、免疫グロブリン重鎖と行うのが好ましい。しかし、免疫グロブリン軽鎖との融合も考えられる。所望であれば、Ｎ−インテインをコードするヌクレオチド配列と、抗ＣＲ１部分をコードするヌクレオチド配列との間に、好適なリンカーペプチドをコードするヌクレオチド配列を導入してもよい。
【００８１】
一実施形態では、Ｎ−インテイン抗ＣＲ１重鎖断片および免疫グロブリン軽鎖をコードするヌクレオチド配列を個別の発現ベクターに挿入した後、好適な宿主に共トランスフェクトする。宿主の非制限的例として、大腸菌、酵母、昆虫細胞、ならびに、チャイニーズハムスター卵巣細胞系のような哺乳動物宿主系が挙げられる。哺乳動物細胞系は抗ＣＲ１ ｍＡｂの発現のために好ましい。個別の発現ベクターを用いることにより、等比ではない両ポリペプチド鎖のポリペプチド断片の各々の比率を調節することが可能となり、これにより、最適収率が達成される。しかし、少なくとも２つの等比ポリペプチド鎖の発現が高収率をもたらす、または比が特に重要ではない場合、１つの発現ベクターに、２つのポリペプチド鎖のコード配列を挿入することも可能である。
【００８２】
別の実施形態では、異なる宿主に個別に発現ベクターをトランスフェクトする。次に、マルチユニット（ｍｕｌｔｉｕｎｉｔ）抗体の形成を可能にする条件下で、ポリペプチドをｉｎ ｖｉｔｒｏで混合する。別の実施形態では、Ｎ−インテイン抗ＣＲ１重鎖またはＮ−インテイン抗ＣＲ１軽鎖を通常の抗ＣＲ１重鎖および軽鎖と混合し、その結果、マルチユニット抗体の少なくとも一部が、抗ＣＲ１重鎖または抗ＣＲ軽鎖の１つと融合した１つのＮ−インテインを含むＮ−インテイン抗ＣＲ１断片となるようにする。この実施形態は、従って、抗ＣＲ１ ｍＡｂと、抗ＣＲ１ ｍＡｂの重鎖の１つまたは軽鎖の１つのＣ−末端に融合した１つの抗原認識部分とを含む二重特異性分子を生成するのに有用である。
【００８３】
さらに別の実施形態では、Ｎ−インテイン ｓｃＦｖ断片をコードするヌクレオチド配列を発現ベクターに挿入した後、好適な宿主にトランスフェクトする。宿主の非制限的例として、大腸菌、酵母、昆虫細胞、ならびに、チャイニーズハムスター卵巣細胞系のような哺乳動物宿主系が挙げられる。
【００８４】
当分野では公知の様々な方法により、抗体分泌細胞からＮ−インテイン抗ＣＲ１ ｍＡｂ断片を精製することができる。例えば、Ｎ−インテイン抗ＣＲ１ ｍＡｂ断片は、イオン交換クロマトグラフィーにより精製することができる。単離に適したカラムの非制限的例として、ＤＥＡＥ、ヒドロキシアパタイト、リン酸カルシウムなどが挙げられる（全般については、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， １９９４， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ＮＹを参照）。Ｎ−インテイン抗ＣＲ１ ｍＡｂ断片はまた、プロテインＡ−セファロースのカラムを用いたアフィニティークロマトグラフィーと、その後の酸性バッファーを用いた免疫吸着剤からの溶離によって精製することができる。また、Ｃ３ｂ様受容体を利用するカラムを用いてもよい。当業者であれば、サイズまたはアフィニティークロマトグラフィーを用いてタンパク質を精製する方法が本発明に適していることを理解するであろう。
【００８５】
５．３．２．Ｃ−インテイン断片の作製および精製
Ｃ−インテイン抗原認識部分断片は、抗原認識部分を５．２節に記載したような好適なＣ−インテインとコンジュゲートすることにより、生成することができる。Ｃ−インテイン抗原認識部分断片は、化学的または組換えにより生成することができる。次に、Ｃ−インテイン抗原認識部分断片を好適なＮ−抗ＣＲ１断片と混合することにより、トランススプライシング反応を実施して、二重特異性分子を生成する。あるいは、Ｃ−インテインストレプトアビジン断片を調製した後、Ｎ−インテイン断片と混合することにより、トランススプライシング反応を実施して、抗ＣＲ１ストレプトアビジン分子を生成し、これを用いて、ビオチン化抗原認識部分と反応させることにより、二重特異性分子を生成する。
【００８６】
５．３．２．１．抗原認識部分の作製
本発明の二重特異性分子の抗原認識部分は、抗原分子を認識し、これと結合するどのような分子成分でもよく、例えば、限定するものではないが、抗体もしくは抗原結合断片、あるいは、クリアランスしようとする分子により認識および結合されるあらゆる分子成分、例えば、限定するものではないが、エピトープまたは抗原決定基、核酸、ならびに、有機小分子などが挙げられる。このような抗原認識部分は、当分野では公知の様々な方法により生成することができる。次に、トランススプライシングのために、この抗原認識部分をＣ−インテインとコンジュゲートさせる。
【００８７】
抗体は、免疫原としての抗原で好適な被験者を免疫感作することにより調製することができる。固定化ポリペプチドを用いた酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）のような標準的技法により、免疫感作した被験者における抗体力価をモニタリングすることができる。所望であれば、抗体分子を哺乳動物（例えば、血液）から単離した後、ＩｇＧ画分を取得するプロテインＡクロマトグラフィーのような公知の技法により、さらに精製することができる。
【００８８】
免疫感作から適切な時間を経て、例えば、特定の抗体力価が最高の時点で、抗体産生細胞を被験者から取得した後、該細胞を用いて、下記のような標準的技法によりモノクローナル抗体を調製することができる。すなわち、最初にＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎにより記載されたハイブリドーマ技法（１９７５， Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５−４９７）、ＫｏｚｂｏｒらによるヒトＢ細胞ハイブリドーマ技法（１９８３， Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｔｏｄａｙ ４：７２）、ＣｏｌｅらによるＥＢＶ−ハイブリドーマ技法（１９８５， Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ， Ａｌａｎ Ｒ． Ｌｉｓｓ， Ｉｎｃ．， ｐｐ． ７７−９６）またはトリオーマ技法である。ハイブリドーマを作製する技法はよく知られている（全般については、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， １９９４， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ． Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ＮＹを参照）。本発明のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞は、例えば、標準的ＥＬＩＳＡアッセイを用いて、目的とするポリペプチドと結合する抗体についてハイブリドーマ培養上清をスクリーニングすることにより検出する。
【００８９】
モノクローナル抗体は、実質的に均質の抗体の集団から得られる。すなわち、この集団を構成する個々の抗体は、少量存在するかもしれない天然に存在する突然変異を除いて、同じである。従って、修飾語「モノクローナル」とは、明確に区別される別個の抗体の混合物ではないとしての抗体の特性を意味する。例えば、モノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒら、１９７５， Ｎａｔｕｒｅ， ２５６：４９５により最初に記載されたハイブリドーマ法を用いて作製してもよいし、組換えＤＮＡ法（米国特許第４，８１６，５６７号）により作製してもよい。また、本明細書で用いる用語「モノクローナル抗体」は抗体が免疫グロブリンであることを示している。
【００９０】
モノクローナル抗体を生成するハイブリドーマ法では、ハムスターのようなマウスまたはその他の好適な宿主動物を前述のように免疫感作することにより、リンパ球（免疫感作に用いたタンパク質と特異的に結合する抗体を産生するか、または該抗体を産生する能力がある）を惹起する（全般については、米国特許第５，９１４，１１２号を参照：この文献は、参照によりその全文を本明細書に組み入れる）。
【００９１】
あるいはまた、ｉｎ ｖｉｔｒｏでリンパ球を免疫感作してもよい。次に、ポリエチレングリコールのような適当な融合剤を用いて骨髄腫細胞とリンパ球を融合させ、ハイブリドーマ細胞を形成する（Ｇｏｄｉｎｇ， Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ， ｐｐ． ５９−１０３（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， １９８６））。このようにして作製したハイブリドーマ細胞は、好ましくは、非融合の親骨髄腫細胞の増殖または生存を阻害する１種以上の物質を含む好適な培地に接種して増殖させる。例えば、親骨髄腫細胞に酵素ヒポキサチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴまたはＨＰＰＴ）が欠如している場合には、ハイブリドーマ用の培地は、典型的には、ヒポキサンチン、アミノプテリン、およびチミジン（ＨＡＴ培地）を含み、これらの物質は、ＨＧＰＲＴ欠損細胞の増殖を阻止する。
【００９２】
好ましい骨髄腫細胞は、効率的に融合し、選択した抗体産生細胞による抗体の安定した高レベル産生を支持し、かつ、ＨＡＴ培地のような培地に感受性の細胞である。中でも、好ましい骨髄腫細胞系は、マウス骨髄腫系であり、例えば、Ｓａｌｋ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｃｅｌｌ Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ Ｃｅｎｔｅｒ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， Ｃａｌｉｆ． ＵＳＡから入手可能なＭＯＰＣ−２１およびＭＰＣ−１１マウス腫瘍に由来するもの、ならびに、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ， Ｍｄ． ＵＳＡ）から入手可能なＳＰ−２細胞がある。
【００９３】
ヒトモノクローナル抗体の産生のためには、ヒト骨髄腫およびマウス−ヒトヘテロ骨髄腫細胞系も記載されている（Ｋｏｚｂｏｒ， １９８４， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， １３３：３００１；Ｂｒｏｄｅｕｒら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ， ｐｐ． ５１−６３（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ， Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９８７））。ハイブリドーマ細胞が増殖する培地を、抗原に対するモノクローナル抗体の産生についてアッセイする。好ましくは、ハイブリドーマ細胞により産生されたモノクローナル抗体の結合特異性を、免疫沈降、またはラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）または酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）のようなｉｎ ｖｉｔｒｏ結合アッセイにより測定する。モノクローナル抗体の結合親和性は、例えば、Ｍｕｎｓｏｎら、１９８０， Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， １０７：２２０のスカッチャード分析によって決定することができる。
【００９４】
所望の特異性、親和性、および／または活性の抗体を産生するハイブリドーマ細胞を同定したら、限界稀釈法によりクローンをサブクローン化した後、標準的方法（Ｇｏｄｉｎｇ， Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ， ｐｐ． ５９−１０３（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， １９８６））により増殖させる。この目的に適した培地として、例えば、Ｄ−ＭＥＭまたはＰＲＭＩ−１６４０培地が挙げられる。この他にも、ハイブリドーマ細胞は、動物における腹水腫瘍としてｉｎ ｖｉｖｏで増殖させることも可能である。サブクローンにより分泌されたモノクローナル抗体は、例えば、プロテインＡ−セファロース、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、またはアフィニティークロマトグラフィーのような通常の免疫グロブリン精製法により培地、腹水、または血清から好適に分離される。
【００９５】
モノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマの作製に代えて、本発明の病原体または病原性抗原分子ポリペプチドに対して誘導されたモノクローナル抗体は、目的とする抗原を含む組換えコンビナトリアル免疫グロブリンライブラリー（例えば、抗体ファージディスプレイライブラリー）をスクリーニングすることにより同定および単離することができる。ファージディスプレイライブラリーを作製およびスクリーニングするためのキットは、市販のものが入手可能である（例えば、Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｐｈａｇｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｓｙｓｔｅｍ， カタログ番号２７−９４００−０１；ならびに、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ ａｎｔｉｇｅｎ ＳｕｒｆＺＡＰ（商標）ファージディスプレイキット、カタログ番号２４０６１２）。さらには、抗体ディスプレイライブラリーの作製およびスクリーニングに用いるのが特に好適な方法および試薬の例は、例えば、下記の文献にみいだすことができる：米国特許第５，２２３，４０９号および第５，５１４，５４８号；ＰＣＴ公開番号ＷＯ９２／１８６１９；ＰＣＴ公開番号ＷＯ９１／１７２７１；ＰＣＴ公開番号ＷＯ９２／２０７９１；ＰＣＴ公開番号ＷＯ９２／１５６７９；ＰＣＴ公開番号ＷＯ９３／０１２８８；ＰＣＴ公開番号ＷＯ９２／０１０４７；ＰＣＴ公開番号ＷＯ９２／０９６９０；ＰＣＴ公開番号ＷＯ９０／０２８０９；Ｆｕｃｈｓら、１９９１， Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９：１３７０−１３７２；Ｈａｙら、１９９２， Ｈｕｍ． Ａｎｔｉｂｏｄ． Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ ３：８１−８５；Ｈｕｓｅら、１９８９， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４６：１２７５−１２８１；Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓら、１９９３、ＥＭＢＯ Ｊ． １２：７２５−７３４。ファージディスプレイライブラリーにより、非常に広範囲の特異性を有する抗体から所望の抗体を選択することができる。ファージディスプレイライブラリーの別の利点は、選択された抗体をコードする核酸が好都合に得られ、これによって、その後の発現ベクターの構築が容易になることである。
【００９６】
さらに、適切な生物活性のヒト抗体分子由来の遺伝子と、適切な抗原特異性のマウス抗体分子由来の遺伝子とをスプライシングすることにより「キメラ抗体」を作製するために開発された技法（Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、１９８４， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ８１， ６８５１−６８５５；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら、１９８４， Ｎａｔｕｒｅ ３１２， ６０４−６０８；Ｔａｋｅｄａら、１９８５、Ｎａｔｕｒｅ， ３１４， ４５２−４５４）を用いてもよい。キメラ抗体は、様々な部分が様々な動物種から由来した分子であり、例えば、マウスｍＡｂ由来の可変領域およびヒト免疫グロブリン定常領域を有する分子などである（例えば、Ｃａｂｉｌｌｙら、米国特許第４，８１６，５６７号；およびＢｏｓｓら、米国特許第４，８１６，３９７号を参照；これらの文献は参照によりその全文を本明細書に組み入れる）。
【００９７】
ヒト化抗体は、非ヒト種由来の１以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）と、ヒト免疫グロブリン由来のフレームワーク領域とを有する非ヒト種由来の抗体分子である（例えば、米国特許第５，５８５，０８９号参照；この文献は参照によりその全文を本明細書に組み入れる）。このようなキメラおよびヒト化モノクローナル抗体は、例えば、下記の文献に記載されている方法を用いて当分野では公知の組換えＤＮＡ技法により作製することができる：ＰＣＴ公開番号ＷＯ８７／０２６７１；欧州特許出願第１８４，１８７号；欧州特許出願第１７１，４９６号；欧州特許出願第１７３，４９４号；ＰＣＴ公開番号ＷＯ８６／０１５３３；米国特許第４，８１６，５６７号および第５，２２５，５３９号；欧州特許出願第１２５，０２３号；Ｂｅｔｔｅｒら、１９８８， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０：１０４１−１０４３；Ｌｉｕら、１９８７， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８４：３４３９−３４４３；Ｌｉｕら、１９８７， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １３９：３５２１−３５２６；Ｓｕｎら、１９８７， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８４： ２１４−２１８；Ｎｉｓｈｉｍｕｒａら、１９８７， Ｃａｎｃ． Ｒｅｓ． ４７：９９９−１００５；Ｗｏｏｄら、１９８５， Ｎａｔｕｒｅ ３１４：４４６−４４９；Ｓｈａｗら、１９８８， Ｊ． Ｎａｔｌ． Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ． ８０：１５５３−１５５９；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ １９８５， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９：１２０２−１２０７；Ｏｉら、１９８６， Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ４：２１４；Ｊｏｎｅｓら、１９８６， Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５５２−５２５；Ｖｅｒｈｏｅｙａｎら、１９８８， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：１５３４；およびＢｅｉｄｌｅｒら、１９８８， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １４１：４０５３−４０６０。
【００９８】
相補性決定領域（ＣＤＲ）をグラフトすることは、抗体をヒト化する別の方法である。これは、ヒトフレームワークに十分な抗原特異性および結合親和性を移すためにマウス抗体を作りなおすものである（Ｗｉｎｔｅｒら、米国特許第５，２２５，５３９号）。ＣＤＲグラフト抗体は、様々な抗体に対して成功裏に構築されてきており、例えば、下記のものが挙げられる：Ｑｕｅｅｎら、１９８９（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８６：１００２９）に記載されるＩＬ−２受容体に対する抗体；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら（１９８８， Ｎａｔｕｒｅ， ３３２：３２３）に記載される細胞表面受容体ＣＡＭＰＡＴＨに対する抗体；Ｃｏｌｅら（１９９１， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８８：２８６９）におけるＢ型肝炎に対する抗体；ならびに、Ｔｅｍｐｅｓｔら（１９９１， Ｂｉｏ−Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９：２６７）におけるウイルス抗原−ＲＳウイルスに対する抗体。マウスモノクローナル抗体のＣＤＲをヒト抗体にグラフトさせたＣＤＲグラフト抗体が作製される。グラフトした後、ほとんどの抗体は、親和性を維持するためにフレームワーク領域のさらなるアミノ酸改変により利益を被るが、これは恐らく、フレームワーク残基がＣＤＲコンホメーションを維持するのに必要であるためである。そして、いくつかのフレームワーク残基は抗原結合部位の一部であることが証明されている。しかし、抗原部位を一切導入しないようにフレームワーク領域を保存するためには、その配列を確立された生殖細胞系配列と比較した後、コンピューターモデリングを実施する。
【００９９】
ヒト患者の治療には、完全にヒトの抗体が特に望ましい。このような抗体は、内在性免疫グロブリン重鎖および軽鎖遺伝子を発現する能力を欠くが、ヒト重鎖および軽鎖遺伝子を発現する能力があるトランスジェニックマウスを用いて、生産することができる。トランスジェニックマウスは、通常の方法で所定の抗原（例えば、免疫原の全部または一部）により免疫感作される。
【０１００】
抗原に対して誘導されたモノクローナル抗体は、通常のハイブリドーマ技法を用いて取得することができる。トランスジェニックマウスが保有するヒト免疫グロブリントランスジーンは、Ｂ細胞分化の間に再編成し、クラススイッチングおよび体細胞突然変異を受ける。従って、このような技法を用いて、治療に有用なＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＥ抗体を生産することが可能である。ヒト抗体を生産するためのこの技法の概要については、ＬｏｎｂｅｒｇおよびＨｕｓｚａｒ（１９９５， Ｉｎｔ． Ｒｅｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １３：６５−９３）を参照されたい。また、ヒト抗体およびヒトモノクローナル抗体を生産するこの技法、ならびに、このような抗体を生産するプロトコルについて、詳しくは、下記を参照されたい：例えば、米国特許第５，６２５，１２６号；米国特許第５，６３３，４２５号；米国特許第５，５６９，８２５号：米国特許第５，６６１，０１６１号；米国特許第５，５４５，８０６号。さらに、Ａｂｇｅｎｉｘ社（Ｆｒｅｅｍｏｎｔ， ＣＡ（例えば、米国特許第５，９８５，６１５号を参照））やＭｅｄａｒｅｘ社（Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ， ＮＪ）のような会社も、前記の方法と類似した技法を用いて所定の抗原に対するヒト抗体を提供するのに携わっている。
【０１０１】
選択されたエピトープを認識し、これと結合する完全にヒトの抗体は、「ガイド選択（ｇｕｉｄｅｄ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）」と呼ばれる技法を用いて、作製することができる。この手法では、選択された非ヒトモノクローナル抗体（例えば、マウス抗体）を用いて、同じエピトープを認識する完全なヒト抗体の選択をガイドさせる（Ｊｅｓｐｅｒｓら（１９９４） ａｎｔｉｇｅｎ Ｂｉｏ／ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １２：８９９−９０３）。
【０１０２】
病原体に対する既存の抗体を用いて、アフィニティークロマトグラフィーまたは免疫沈降のような標準的技法により、該病原体のさらなる抗原を単離し、免疫原として用いることができる。さらに、このような抗体を用いて、（例えば、細胞溶解物または細胞上清中の）タンパク質を検出し、病原体の存在量およびパターンを評価することができる。また、抗体を診断目的で用いて、臨床試験方法の一部として組織中の病原体レベルをモニタリングする（例えば、所与の治療法の効力を測定する）ことも可能である。検出を容易にするためには、上記抗体を検出可能な物質と結合させる。検出可能な物質の例として、各種酵素、補欠分子族、蛍光物質、発光物質、生物発光物質、および放射性物質が挙げられる。好適な酵素の例として、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、βガラクトシダーゼ、またはアセチルコリンエステラーゼが挙げられ；好適な補欠分子族複合体の例としては、ストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチンが挙げられ、好適な蛍光材料としては、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、塩化ダンシルまたはフィコエリトリンを挙げることができ；発光物質の例としては、ルミノールが、生物発光物質の例としては、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、およびエクオリンが挙げられ；好適な放射性物質の例としては、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３５Ｓまたは３Ｈが挙げられる。
【０１０３】
抗原認識部分として使用するのに適した抗原断片は、長さが８アミノ酸、より好ましくは１０アミノ酸、さらに好ましくは１５アミノ酸である抗原の少なくとも一部を含む。抗原認識部分として用いられる抗原および抗原断片は、組換えにより発現させることも、化学的に合成することも可能である。
【０１０４】
本発明はまた、抗原認識部分として用いるためのキメラまたは融合抗原を提供する。本明細書で用いる「キメラ抗原」または「融合抗原」は、異種ポリペプチドと機能的に連結された、本発明で使用する抗原の全部または一部を含む。融合抗原に関して、用語「機能的に連結された」とは、抗原と異種ポリペプチドが互いにインフレームで融合されていることを意味する。異種ポリペプチドは、抗原のＮ−末端またはＣ−末端と融合させることができる。
【０１０５】
キメラまたは融合タンパク質は、標準的組換えＤＮＡ技法により生成することができる。一実施形態では、融合遺伝子を自動ＤＮＡ合成装置などの通常の技法により合成する。あるいは、アンカープライマーを用いて、遺伝子断片のＰＣＲ増幅を実施する。このアンカープライマーは、２つの連続した遺伝子断片の間に相補的突出部を生じさせるもので、これら断片をアニールおよび再増幅することにより、キメラ遺伝子配列を作製することができる（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら、前掲）。さらに、融合ドメインをすでにコードする多くの発現ベクターが市販されており、入手可能である（例えば、ＧＳＴポリペプチド）。免疫原をコードする核酸をこのような発現ベクターにクローン化することによって、融合ドメインをそのポリペプチドにインフレームで連結させることができる。
【０１０６】
当分野では公知の好適な方法を用いて、その他のタイプの抗原認識部分を生成することができる。例えば、公知のＤＮＡ合成法により核酸を生成することができる。有機合成により有機小分子を生成することができる。
【０１０７】
５．３．２．２．Ｃ−インテイン抗原再認識部分断片の作製および精製
本発明では、Ｃ−インテイン抗原認識部分断片を組換えにより生産するが、この場合、Ｃ−インテインをコードするヌクレオチド配列のＣ−末端を、抗原認識部分のＮ−末端に融合させる。また、所望であれば、Ｃ−インテインをコードするヌクレオチド配列と、抗原認識部分をコードするヌクレオチド配列との間に、好適なリンカーペプチドをコードするヌクレオチド配列を導入してもよい。
【０１０８】
一実施形態では、Ｃ−インテイン抗原認識部分断片をコードするヌクレオチド配列を好適な発現ベクターに挿入し、好適な宿主中にトランスフェクトする。宿主の非制限的例として、大腸菌、酵母、昆虫細胞、ならびに、チャイニーズハムスター卵巣細胞系のような哺乳動物系が挙げられる。
【０１０９】
抗体分泌細胞由来のＣ−インテイン抗原認識部分断片は、イオン交換クロマトグラフィーにより単離することができる。本発明の二重特異性抗体の精製に好適なカラムの非制限的例として、ＤＥＡＥ、ヒドロキシルアパタイト、リン酸カルシウムが挙げられる（全般については、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， １９９４， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ＮＹを参照）。また、Ｃ−インテイン抗原認識部分断片は、特定の抗原を使用する好適なカラムを用いて、アフィニティークロマトグラフィーにより精製することもできる。当業者であれば、サイズまたはアフィニティークロマトグラフィーを用いてタンパク質を精製するどのような方法も本発明に適していることが理解されよう。
【０１１０】
また、Ｃ−インテインと所望の抗原認識部分を化学的にコンジュゲートさせることにより、Ｃ−インテイン抗原認識部分断片を生成することもできる。所望であれば、限定するものではないが、ペプチドリンカーまたはＰＥＧリンカーなどの好適なリンカーをＣ−インテインと抗原認識部分との間に導入してもよい。
【０１１１】
Ｃ−インテインはまた、ストレプトアビジン分子とコンジュゲートさせることもできる。一実施形態では、当業者には公知の標準的方法により化学的にＣ−インテインをストレプトアビジン分子とコンジュゲートさせる。例えば、チオエーテルリンカーを介して、ストレプトアビジン分子とＣ−インテインをコンジュゲートさせることができる（例えば、Ｌｉら、１９９９， Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ １２：７８７−７９６）。
【０１１２】
別の実施形態では、組換えによりＣ−インテインをストレプトアビジン分子とコンジュゲートさせる。Ｃ−インテインをコードする核酸を、コアストレプトアビジンのモノマーをコードする核酸と融合させ、好適なベクターに挿入した後、このベクターを好適な宿主において発現させることができる。しかし、ストレプトアビジンは、四量体および二量体を形成しうることが知られている（Ｅｒｎｓｔら、１９９９， Ｈｕｍａｎ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ９：１６５−１７０；Ｋｉｐｒｉｙｚｎｏｖら、１９９６， Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ９：２０３−２１１）。従って、当技術分野では公知の方法を用いて、このような四量体および二量体を解離させることが望ましいと考えられる。一実施形態では、限定するものではないが、尿素のような好適な変性剤中でストレプトアビジン多量体をまず変性させる。次に、変性させたタンパク質を適切な濃度にまで稀釈し、モノマーに再生させる。
【０１１３】
人工Ｍｔｕ ３５ ａａ Ｃ−インテインのような特定のＣ−インテインはミスフォールディングして凝集体を形成することがある。これは、通常、限定するものではないが、尿素のような好適な変性剤中でＣ−インテイン断片を可溶化および精製することにより、改善することができる。次に、再構成およびトランススプライシングのために、変性させたＣ−インテイン断片をＮ−インテイン断片と混合することができる。
【０１１４】
５．３．３．再構成およびトランススプライシング
精製したＣ−インテイン抗原認識部分断片を、適当な反応バッファー中の精製Ｎ−インテイン抗ＣＲ１断片に添加することにより、ｉｎ ｖｉｔｒｏトランススプライシングを実施することができる。反応混合物を好適な温度で適当な時間インキュベートする。反応温度およびインキュベーション時間は、一部には、用いた特定のトランススプライシング系に応じて異なり、標準的方法（限定するものではないが、サイズ排除ＨＰＬＣまたはＳＤＳ−ＰＡＧＥで反応混合物を分析することにより反応の進行をモニタリングすることを含む）により当業者が決定することができる。
【０１１５】
インテイン断片、すなわち、Ｎ−インテイン抗ＣＲ１およびＣ−インテイン抗原認識部分断片の濃度を調節することによって、より高いスプライシング効率および最適反応収率を達成することできる。タンパク質の濃度を決定するのに、当業者には公知のどのような方法を用いてもよく、例えば、限定するものではないが、標準としてＢＳＡを用いるビシンコニン酸（ｂｉｃｈｉｎｃｈｏｎｉｎｉｃ ａｃｉｄ）法（Ｓｍｉｔｈら、１９８５， Ａｎａｌ， Ｂｉｏｃｈｅｍ． １５０：７６−８５）が挙げられる。通常、反応体濃度が高い方が、高い収率を得るのに有利である。しかし、特定の分断インテイン系の場合、反応体濃度が高いほど、一方または両方のインテイン断片の凝集体の形成およびその沈降が起こりやすくなる。このような状況では、二重特異性分子の生成前に、一方または両方のインテイン断片の濃度を小規模実験で最適化することができる。また、インテイン断片の濃度は、一方のインテイン断片の濃度が他方より高くなるように調節してもよい。これは、一方のインテイン断片の生成が、他方より困難および／または高価である場合に、特に有用であろう。一方のインテイン断片の濃度を他方より高くすると、他方のインテイン断片を効率的に使用することができる。本発明のいくつかの実施形態では、２つの異なる抗原認識部分を、抗ＣＲ１ ｍＡｂの２つの重または軽鎖とコンジュゲートさせるのが望ましいかもしれない。このような場合には、Ｎ−インテイン抗ＣＲ１断片と、２つのＣ−インテイン抗原認識部分断片の濃度を、２つのトランススプライシング反応の相対的効率に従って調節することにより、所望の二重特異性分子の収率を最適化することができる。
【０１１６】
人工Ｍｔｕ ３５ ａａ Ｃ−インテインのような特定のＣ−インテインがミスフォールディングを起こして、凝集体を形成する恐れがある場合には、限定するものではないが、尿素のような好適な変性剤中で再構成を実施してもよい。次に、当分野では公知の方法（限定するものではないが、適当なバッファーに対する透析など）により、この変性剤を除去して、再生およびトランススプライシングを実施する。
【０１１７】
二重特異性分子は、分子サイズまたは特異的結合親和性またはそれらの組合せを用いて、当業者には公知の方法により精製することができる。一実施形態では、ＤＥＡＥ、ヒドロキシルアパタイト、リン酸カルシウムなど、本発明の二重特異性分子を単離するのに適したカラムを用いて、イオン交換クロマトグラフィーにより精製することができる（全般については、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， １９９４， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ＮＹ）。
【０１１８】
別の実施形態では、３段階の連続的アフィニティークロマトグラフィーにより二重特異性分子を精製する（ＣｏｒｖａｌａｎおよびＳｍｉｔｈ， １９８７， Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．， ２４：１２７−１３２）。すなわち、第１カラムは、固相マトリックスに結合させたプロテインＡからなるが、その際、抗体のＦｃ部分はプロテインＡと結合し、抗体はカラムと結合する。次の第２カラムは、固相マトリックスに結合させたＣ３ｂ様受容体を用いて、二重特異性分子の抗ＣＲ１ ｍＡｂ部分を介するＣ３ｂ様受容体結合についてアッセイする。これに続く第３カラムは、二重特異性分子の抗原認識部分と結合する目的の抗原分子の特異的結合を利用する。
【０１１９】
二重特異性分子は、サイズ排除ＨＰＬＣおよびアフィニティークロマトグラフィーの組合せにより精製することもできる。一実施形態では、サイズ排除ＨＰＬＣから溶離した適切な断片を、二重特異的分子の抗原認識部分に特異的な抗原分子を含むカラムを用いて、さらに精製する。
【０１２０】
二重特異性分子は、抗体の等電点電気泳動により単離することもできる。
【０１２１】
当分野では公知の様々な方法により、二重特異性分子の特性決定を実施することができる。一実施形態では、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロットにより特性決定を行うことができる。二重特異性分子の分子量はＳＤＳ−ＰＡＧＥで測定する。次に、ＣＲ１および目的とする抗原分子の両方を用いたウエスタンブロットにより、適当なバンド中の該分子の二重特異性を決定する。あるいは、該分子の二重特異性は、酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）のような固相免疫検定により決定することもできる。二重特異性分子の構造は、さらに、加水分解された二重特異性分子のリンカー領域の選択的配列決定により確認することができる。
【０１２２】
５．３．４．ストレプトアビジン−ビオチンリンカーを含む二重特異性分子の作製
ストレプトアビジン−ビオチンリンカーを含む二重特異性分子は、抗ＣＲ１−ストレプトアビジンとビオチン化抗原認識部分を用いて作製する。ビオチン化抗原認識部分を生成するには、当業者に公知のどのような標準的方法を用いてもよい。
【０１２３】
本発明のこの構成は、Ｃ３ｂ様受容体認識部分にコンジュゲートされた第２抗原認識部分としてｍＡｂを含む二重特異性分子の作製において特に有用である。トランススプライシングを用いて抗原認識ｍＡｂを直接コンジュゲートさせることにより、抗原認識ｍＡｂのアミノ末端が抗ＣＲ１部分のカルボキシ末端と融合された二重特異性分子が形成される。この二重特異性分子の抗原結合親和性は損なわれることがある。これに対し、ビオチン化によるタンパク質の改変は無視できるものであり、免疫反応性は保持されたままであることが知られている（Ｆｏｕｌｏｎら、１９９９， Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ． １０：８６７−８７６；Ｋｈａｗｌｉら、１９９３， Ａｎｔｉｂｏｄｙ， Ｉｍｍｕｎｏｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ， Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍ． ６：１３−２７）。従って、本発明のストレプトアビジン−ビオチン構成を用いると、第２抗原認識部分としてｍＡｂを含む二重特異性分子を生成する手段が提供される。限定するものではないが、ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチンなどの様々な活性型ビオチン剤を用いて、ｍＡｂをビオチンとコンジュゲートさせることができる。ビオチンは、ｍＡｂおよび該ｍＡｂから作製される二重特異性分子の抗原結合能力が損なわれないように、ｍＡｂの抗原認識ドメインから離れた残基とコンジュゲートさせるのが好ましい。例えば、リシン残基のεアミノ基とビオチンをコンジュゲートさせることができる。さらに好ましくは、ビオチンは、ｍＡｂのカルボキシ末端付近の残基とコンジュゲートさせるのが好ましい。ｍＡｂまたは二重特異性分子の抗原認識部分と結合する抗原分子の特異的結合をアッセイする任意の方法を用いて、ビオチン化ｍＡｂと、それから生成される二重特異性分子を機能的抗原結合能力についてスクリーニングすることができる。本発明のこの構成はまた、既存の抗体から二重特異性分子を生成する際にも用いることができる。
【０１２４】
本発明の構成はまた、Ｃ３ｂ様受容体認識部分とコンジュゲートされた非タンパク質性抗原認識部分（核酸を含むが、これに限らない）を含む二重特異性分子の作製にも特に有用である。一実施形態では、制限エンドヌクレアーゼにより切断されると、突出末端を残す好適な制限消化部位を含むＰＣＲプライマーを用いて、所望の核酸を増幅する。ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、限定するものではないが、ＤＮＡポリメラーゼのクレノウフラグメントなど）を用いて、ビオチン化ヌクレオチド（例えば、ビオチニル−ｄＵＴＰ）を末端に組み込む（例えば、米国特許第６，０６０，５９６号を参照）。他のビオチン化抗原認識部分を生成する方法は、抗原認識部分が提供されれば、当業者には理解されるであろう。
【０１２５】
次に、ストレプトアビジン−ビオチン連結を介して、ビオチン化抗原認識部分を二重特異性分子の抗ＣＲ１部分とコンジュゲートさせることができる。
【０１２６】
５．３．５．二重特異性分子のｉｎ ｖｉｖｏ産生
二重特異性分子はｉｎ ｖｉｖｏでも産生させることができる。本発明の一実施形態では、好適な宿主細胞において二重特異性分子を産生させる。Ｎ−インテイン抗ＣＲ１重鎖断片および免疫グロブリン軽鎖およびＣ−インテイン抗原認識部分断片をコードするヌクレオチド配列を個別の発現ベクターに挿入した後、宿主細胞に共トランスフェクトさせる。宿主の非制限的例として、大腸菌、酵母、昆虫細胞、ならびに、チャイニーズハムスター卵巣細胞系のような哺乳動物宿主系が挙げられる。抗ＣＲ１ ｍＡｂの発現には、哺乳動物細胞系が好ましい。個別の発現ベクターを用いることにより、３つのポリペプチド断片各々の割合を３つのポリペプチド鎖の等しくない比率に調節することができるため、最適収率が達成される。別の実施形態では、Ｎ−インテイン抗ＣＲ１重鎖断片および免疫グロブリン軽鎖およびＣ−インテイン抗原認識部分断片をコードするヌクレオチド配列を１つの発現ベクターに挿入する。トランスフェクトした細胞を、当分野では公知の標準的方法によりタンパク質を発現させるように誘導することができる。二重特異性分子は、当分野では公知の標準的方法により精製することができる。
【０１２７】
５．４  タンパク質トランススプライシングを用いた二重特異性分子のポリクローナルライブラリーの作製
タンパク質トランススプライシングを用いて、様々な抗原認識特異性を有する複数の二重特異性分子からなる二重特異性分子のライブラリーを作製することもできる。特に、これら複数の抗原認識部分が１つの標的抗原分子の多数のエピトープおよび／または該標的抗原分子の多数の変異体に対する特異性を有するポリクローナルライブラリーには興味がもてる。このような二重特異性分子のポリクローナルライブラリーは、エピトープが多数存在する病原体および／または多数の変異体もしくは突然変異体を有する病原体のより効率的なクリアランスのために使用することができる。こうした病原体は、通常、単一特異性を有するモノクローナル抗体では効率的に標的化してクリアランスすることができない。２以上のエピトープでの同時突然変異は、はるかに頻度が低い傾向にあるため、病原体の多数のエピトープおよび／または多数の変異体を標的とすることにより、二重特異性分子のポリクローナルライブラリーは、突然変異率が比較的高い病原体のクリアランスにおいて有利となる。
【０１２８】
好ましい実施形態では、当分野では公知の標準的方法で、分断インテインのＣ−インテインをコードする核酸を、ファージディスプレイライブラリーのメンバーのポリペプチド抗体をコードする核酸と、組換えにより融合させ、その結果として、融合核酸がＣ−インテイン−ポリペプチドをコードするようにする。その際、Ｃ−インテインのＮ−末端がポリペプチド抗体のＣ−末端と融合し、これによって、ある範囲のＣ−インテイン−ポリペプチドを展示するファージディスプレイライブラリーが得られる。好ましくは、このようなファージディスプレイライブラリーの特異性の数は、哺乳動物の免疫系のリンパ球により任意の時点で発現される異なる特異性の数に近似しており、例えば、マウス免疫系では、１０７（または１０６〜１０８）の異なる特異性がある（例えば、Ｍｉｌｓｔｅｉｎ， １９９０， Ｐｒｏｃ． Ｒ． Ｓｏｃ． Ｌｏｎｄｏｎ Ｂ２３９：１−１６）。さらに好ましくは、ファージディスプレイライブラリーの特異性の数は、哺乳動物の免疫系のリンパ球により任意の時点で発現される異なる特異性の数よりも多い。最も好ましくは、ファージディスプレイライブラリーは、リンパ球によって発現され得る特異性の完全なセットを含む。次に、目的とする抗原を含むファージディスプレイライブラリーのアフィニティースクリーニングにより、ポリクローナルＣ−インテイン抗体融合タンパク質を取得することができる。ファージディスプレイライブラリーを作製およびスクリーニングするキットは市販のものが入手可能である（例えば、Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｐｈａｇｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｓｙｓｔｅｍ， カタログ番号２７−９４００−０１；およびＳｔｒａｔａｇｅｎｅ ａｎｔｉｇｅｎ ＳｕｒｆＺＡＰ（商標）Ｐｈａｇｅ Ｄｉｓｐｌａｙ Ｋｉｔ、カタログ番号２４０６１２）。さらに、抗体ディスプレイライブラリーの作製およびスクリーニングに用いるのに特に適した方法および試薬の例は、例えば、下記の文献に見出すことができる：米国特許第５，２２３，４０９号および第５，５１４，５４８号；ＰＣＴ公開番号ＷＯ９２／１８６１９；ＰＣＴ公開番号ＷＯ９１／１７２７１；ＰＣＴ公開番号ＷＯ９２／２０７９１；ＰＣＴ公開番号ＷＯ９２／０１５６７９；ＰＣＴ公開番号ＷＯ９３／０１２８８；ＰＣＴ公開番号ＷＯ９２／０１０４７；ＰＣＴ公開番号ＷＯ９２／０９６９０；ＰＣＴ公開番号ＷＯ９０／０２８０９；Ｆｕｃｈｓら、１９９１， Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９：１３７０−１３７２；Ｈａｙら、１９９２， Ｈｕｍ． Ａｎｔｉｂｏｄ． Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ ３：８１−８５；Ｈｕｓｅら、１９８９， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４６：１２７５−１２８１；Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓら、１９９３、ＥＭＢＯ Ｊ． １２：７２５−７３４。
【０１２９】
別の実施形態では、Ｃ−インテインとの組換え融合の前に、十分に広範かつ多様なレパートリーの特異性を有する抗体ファージディスプレイライブラリーを目的の抗原によりアフィニティースクリーニングすることで、ポリクローナル抗体を取得することができる。選択した抗体の各メンバーをコードする核酸を、好適なトランススプライシング系のＣ−インテインに融合させた後、好適な宿主において発現させる。Ｃ−インテイン抗原認識部分断片は、対応するＮ−インテイン抗ＣＲ１断片と一緒に再構成させてから、トランススプライシング反応に供することができる。
【０１３０】
好ましい実施形態では、個々のメンバーのクローン単離を行わずに、展示され選択された抗体の全コレクションを用いて、二重特異性分子のポリクローナルライブラリーを作製する。クローン単離を行わずに、ファージディスプレイライブラリーから抗体のポリクローナルライブラリーを作製する方法は、米国特許第６，０５７，０９８号に記載されている。この文献は参照によりその全文を本明細書に組み入れるものとする。好ましくは、多数の抗体を展示するライブラリーメンバーを富化した後、多数のエピトープを有する抗原分子を用いて、十分に広範なレパートリーの特異性を有するファージディスプレイライブラリーをアフィニティースクリーニングすることにより、ポリクローナル抗体を取得する。展示され選択された抗体をコードする核酸は切り出して、好適なＰＣＲプライマーを用いて増幅する。ゲル電気泳動で核酸を精製することにより、完全長の核酸を単離することができる。次に、核酸の各々を適当なトランススプライシング系のＣ−インテインと融合させて、異なる挿入断片を有する発現ベクターの集団を取得する。次に、発現ベクターの集団を好適な宿主において発現させる。それから、Ｃ−インテイン抗原認識部分断片の集団をＮ−インテイン抗ＣＲ１断片と混合して、複数の特異性を有する二重特異性分子のライブラリーを作製する。
【０１３１】
別の実施形態では、二重特異性分子のポリクローナルライブラリーは、抗原のセット（限定するものではないが、１病原体の変異体のセットおよび／または様々な病原体の混合物など）を用いたアフィニティースクリーニングにより得られる展示抗体の集団から作製される。このような二重特異性分子のポリクローナルライブラリーを用いて、抗原のセットを標的化してクリアランスすることができる。
【０１３２】
さらに別の好ましい実施形態では、トランススプライシングおよびストレプトアビジン−ビオチンリンカーを用いて二重特異性分子のポリクローナルライブラリーを作製する。複数の抗体を選択し、標準的ファージディスプレイ法により生成した後、ビオチン化する。次いで、複数のビオチン化抗体を、トランススプライシングにより調製した抗ＣＲ１ストレプトアビジン分子とコンジュゲートさせる。
【０１３３】
さらにまた別の好ましい実施形態では、赤血球のＣＲ１分子上の異なる部位を標的とする複数の抗ＣＲ１ ｍＡｂを含む、複数のＮ−インテイン抗ＣＲ１ ｍＡｂ断片を、複数の特異性を有する複数のＣ−インテイン抗原認識断片と混合して、ポリクローナル第１および第２抗原認識部分を有する二重特異性分子のポリクローナルライブラリーを作製する。
【０１３４】
ファージディスプレイライブラリーから作製される二重特異性分子のポリクローナルライブラリーについて記載したが、好適な抗原認識成分の集団から、ライブラリーの作製に用いられる複数の第２抗原認識部分を取得できることが当業者には理解されよう。このような抗原認識成分の集団から作製される二重特異性分子のライブラリーも本発明の範囲に含まれるものとする。
【０１３５】
５．５．二重特異性分子の用途
本発明の二重特異性分子は、病原性抗原分子の存在と関連する疾患または障害を治療または予防する上で有用である。病原性抗原分子は、治療しようとする被験者に有害でありうるまたは望ましくない、循環系中に存在する物質であって、例えば、限定するものではないが、タンパク質もしくは薬物もしくは毒素、自己抗体もしくは自己抗原、またはあらゆる感染因子もしくはその産物の分子が挙げられる。病原性抗原分子は、疾患もしくは障害またはその他の望ましくない状態の原因となる物質（例えば、病原体）であるかまたはその一部である抗原決定基を含む（あるいは、結合ドメインにより結合され得る）分子である。
【０１３６】
治療または予防を目的として、本発明の二重特異性抗体を投与するのに好ましい被験者は、限定するものではないが、ヒト以外の動物（例えば、ウマ、ウシ、ブタ、イヌ、ネコ、ヒツジ、ヤギ、マウス、ラットなど）を含む哺乳動物であり、好ましい実施形態では、ヒトまたは非ヒト霊長類である。
【０１３７】
一定の組織の食細胞によりクリアランスされる循環病原性抗原分子には、被験者に有害な抗原分子が含まれる。有害な病原性抗原分子の例として、寄生体、真菌、原生動物、細菌、またはウイルスに関連するあらゆる病原性抗原分子が挙げられる。さらに、循環する病原性抗原分子として、毒素、免疫複合体、自己抗体、薬物、バルビツール酸のような物質の過剰量、あるいは、循環系中に存在しかつ宿主哺乳動物の健康に望ましくないまたは有害なあらゆるものが挙げられる。免疫系が哺乳動物の循環系から病原性抗原分子を効果的に取り除くことができないと、外傷性および血液量減少性のショックを引き起こし得る（ＡｌｔｕｒａおよびＨｅｒｓｈｅｙ， １９６８， Ａｍ． Ｊ． Ｐｈｙｓｉｏｌ． ２１５：１４１４−９）。
【０１３８】
さらに、非病原性抗原分子、例えば、移植抗原は宿主に有害であると誤って認識され、それらが病原性抗原分子であるかのように、宿主免疫系から攻撃される。本発明はさらに、移植拒絶に関与する免疫細胞または因子（例えば、移植抗原特異的抗体）と結合してそれを除去する有効量の二重特異性分子を被験者に投与することを含んでなる、移植拒絶を治療する実施形態を提供する。
【０１３９】
５．５．１  自己免疫抗原
一実施形態では、循環系からクリアランスしようとする病原性抗原分子には、自己抗原が含まれる。このような抗原として、限定するものではないが、自己免疫疾患と関連する自己抗体または天然の分子が挙げられる。
【０１４０】
一例として、血友病を有する特定のヒトは、第ＶＩＩＩ因子が欠損していることがわかっている。組換え体第ＶＩＩＩ因子による置換療法は血友病を治療する。しかし、患者によっては、結果的に第ＶＩＩＩ因子に対する抗体が生成され、そのために治療が妨害されることがある。抗抗第ＶＩＩＩ因子抗体を用いて調製した本発明の二重特異性分子は、この問題に治療上の解決をもたらす。特に、Ｃ３ｂ様受容体に対する第１抗原認識部分の特異性と、抗第ＶＩＩＩ因子自己抗体に対する第２抗原認識部分の特異性とを有する二重特異性分子は、循環系から自己抗体をクリアランスする、それゆえ、疾患を改善する上で治療に有用である。
【０１４１】
本発明の二重特異性分子によりクリアランスすることができる自己抗体のさらなる例として、限定するものではないが、下記の抗原に対する自己抗体を挙げることができる：筋肉アセチルコリン受容体（重症筋無力症に関連する抗体）；カルジオリピン（狼瘡に関連する）；血小板関連タンパク質（特発性血小板減少性紫斑に関連する）；シェーグレン症候群に関連する多数の抗原；組織移植自己免疫反応の症例に関与する抗原；心筋にみいだされる抗原（自己免疫性心筋炎に関連する）；免疫複合体媒介腎疾患に関連する抗原；ｄｓＤＮＡおよびｓｓＤＮＡ抗原（ループス腎炎に関連する）；デスモグレインおよびデスモプラキン（天疱瘡および類天疱瘡に関連する）；または病因に関連することが確認されたその他の抗原。
【０１４２】
上記二重特異性抗体をヒトまたは非ヒト霊長類の循環系に注入すると、二重特異性抗体は、ヒトまたは霊長類Ｃ３ｂ受容体ドメイン認識部位を介し、高比率で、赤血球上のＣ３ｂ様受容体部位の数に一致して、赤血球と結合する。二重特異性抗体は、同時に、モノクローナル抗体と結合した抗体を介して、間接的に自己抗体と会合する。そして、表面に二重特異性抗体／自己抗体複合体を有する赤血球は、結合した病原性自己抗体の中和、ならびに、循環系からのそのクリアランスを促進する。
【０１４３】
本発明において、二重特異性抗体は、病原性抗原または自己抗体が、Ｃ３ｂ様受容体を表面上に発現する造血細胞と結合するのを促進し、続いて造血細胞をクリアランスすることなく、上記病原性抗原または自己抗体を循環系からクリアランスさせる。
【０１４４】
５．５．２  感染症
特定の実施形態では、感染症因子の抗原およびＣ３ｂ様受容体の両方と結合する二重特異性分子の投与により、感染症を治療または予防する。従って、このような実施形態では、病原性抗原分子が感染症因子の抗原である。
【０１４５】
このような抗原として、限定するものではないが、下記のものが挙げられる：インフルエンザウイルス血球凝集素（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＪＯ２１３２；Ａｉｒ， １９８１， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７８：７６３９−７６４３；Ｎｅｗｔｏｎら、１９８３， Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １２８：４９５−５０１）、ヒトＲＳウイルスＧ糖タンパク質（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号Ｚ３３４２９；Ｇａｒｃｉａら、１９９４， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．；Ｃｏｌｌｉｎｓら、１９８４， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８１：７６８３）、デング熱ウイルスのコアタンパク質、マトリックスタンパク質またはその他のタンパク質（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号Ｍ１９１９７；Ｈａｈｎら、１９８８， Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １６２：１６７−１８０）、麻疹ウイルス血球凝集素（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号Ｍ８１８９９；Ｒｏｔａら、１９９２， Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １８８：１３５−１４２）、２型単純ヘルペスウイルス糖タンパク質ｇＢ（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号Ｍ１４９２３；Ｂｚｉｋら、１９８６， Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １５５：３２２−３３３）、Ｉ型ポリオウイルスＶＰ１（Ｅｍｉｎｉら、１９８３， Ｎａｔｕｒｅ ３０４：６９９）、ＨＩＶＩ型のエンベロープ糖タンパク質（Ｐｕｔｎｅｙら、１９８６， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３４：１３９２−１３９５）、Ｂ型肝炎表面抗原（Ｉｔｏｈら、１９８６， Ｎａｔｕｒｅ ３０８：１９；Ｎｅｕｒａｔｈら、１９８６， Ｖａｃｃｉｎｅ ４：３４）、ジフテリア毒素（Ａｕｄｉｂｅｒｔら、１９８１， Ｎａｔｕｒｅ ２８９：５４３）、連鎖球菌２４Ｍエピトープ（Ｂｅａｃｈｅｙ， １９８５， Ａｄｖ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． Ｂｉｏｌ． １８５：１９３）、淋菌ピリン（ＲｏｔｈｂａｒｄおよびＳｃｈｏｏｌｎｉｋ， １９８５， Ａｄｖ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． Ｂｉｏｌ． １８５：２４７）、偽狂犬病ウイルスｇ５０（ｇｐＤ）、偽狂犬病ウイルスＩＩ（ｇｐＢ）、偽狂犬病ウイルスｇＩＩＩ（ｇｐＣ）、偽狂犬病ウイルス糖タンパク質Ｈ、偽狂犬病ウイルス糖タンパク質Ｅ、ブタ伝染性胃腸炎糖タンパク質１９５、ブタ伝染性胃腸炎マトリックスタンパク質、ブタロタウイルス糖タンパク質３８、ブタパルボウイルスキャプシドタンパク質、ブタ赤痢菌（Ｓｅｒｐｕｌｉｎａ ｈｄｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ）防御抗原、ウシウイルス性下痢糖タンパク質５５、ニューカッスル病ウイルス血球凝集素−ノイラミニダーゼ、ブタインフルエンザ血球凝集素、ブタインフルエンザウイルスノイラミニダーゼ、口蹄疫ウイルス、豚コレラウイルス、ブタインフルエンザウイルス、アフリカブタ熱ウイルス、マイコプラズマハイオニューモニエ、伝染性ウシ鼻気管炎ウイルス（例えば、伝染性ウシ鼻気管炎ウイルス糖タンパク質Ｅまたは糖タンパク質Ｇ）、または伝染性喉頭気管炎ウイルス（例えば、伝染性喉頭気管炎ウイルス糖タンパク質Ｇまたは糖タンパク質Ｉ）、ラクロス（Ｌａ Ｃｒｏｓｓｅ）ウイルスの糖タンパク質（Ｇｏｎｚａｌｅｓ−Ｓｃａｒａｎｏら、１９８２， Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １２０：４２）、新生子ウシ下痢ウイルス（ＭａｔｓｕｎｏおよびＩｎｏｕｙｅ、１９８３， Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ３９：１５５）、ベネズエラウマ脳脊���炎ウイルス（ＭａｔｈｅｗｓおよびＲｏｅｈｒｉｇ， １９８２， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １２９：２７６３）、パンタトロウイルス（Ｄａｌｒｙｍｐｌｅら、１９８１， Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｎｅｇａｔｉｖｅ Ｓｔｒａｎｄ Ｖｉｒｕｓ， ＢｉｓｈｏｐおよびＣｏｍｐａｎｓ（編）、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ， ＮＹ． ｐ． １６７）、マウス白血病ウイルス（Ｓｔｅｅｖｅｓら、１９７４， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． １４：１８７）、マウス乳癌ウイルス（ＭａｓｓｅｙおよびＳｃｈｏｃｈｅｔｍａｎ， １９８１， Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １１５：２０）、Ｂ型肝炎ウイルスコアタンパク質および／またはＢ型肝炎表面抗原またはその断片もしくは誘導体（例えば、１９８０年、６月４日に公開された英国特許公開番号ＧＢ２０３４３２３Ａ；ＧａｎｅｍおよびＶａｒｍｕｓ， １９８７， Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ５６：６５１−６９３；Ｔｉｏｌｌａｉｓら、１９８５， Ｎａｔｕｒｅ ３１７：４８９−４９５を参照）、ウマインフルエンザウイルスまたはウマヘルペスウイルス（例えば、ウマインフルエンザウイルスＡ型／アラスカ９１ノイラミニダーゼ、ウマインフルエンザウイルスＡ型／マイアミ６３ノイラミニダーゼ、ウマインフルエンザウイルスＡ型／ケンタッキー８１ノイラミニダーゼ、ウマヘルペスウイルス１型糖タンパク質Ｂ、およびウマヘルペスウイルス１型糖タンパク質Ｄ、ウシＲＳウイルスまたはウシパラインフルエンザウイルス（例えば、ウシＲＳウイルス融合タンパク質（ＢＲＳＶ Ｇ）、ウシＲＳウイルス融合タンパク質（ＢＲＳＶ Ｆ）、ウシＲＳウイルスヌクレオキャプシドタンパク質（ＢＲＳＶ Ｎ）、ウシパラインフルエンザウイルス３型融合タンパク質、ならびに、ウシパラインフルエンザウイルス３型血球凝集素ノイラミニダーゼ）、ウシウイルス下痢ウイルス糖タンパク質４８または糖タンパク質５３。
【０１４６】
本発明の二重特異性分子の使用により治療または予防することができる前記以外の疾患または障害として、限定するものではないが、下記のウイルスを原因とするものが挙げられる：Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、インフルエンザウイルス、水痘ウイルス、アデノウイルス、単純ヘルペスウイルスＩ型（ＨＳＶ−Ｉ）、単純ヘルペスウイルスＩＩ型（ＨＳＶ−ＩＩ）、牛疫ウイルス、ライノウイルス、エコーウイルス、ロタウイルス、ＲＳウイルス、パピローマウイルス、パポバウイルス、サイトメガロウイルス、エキノウイルス、アルボウイルス、ハンタウイルス、コクサッキーウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、麻疹ウイルス、風疹ウイルス、ポリオウイルス、ヒト免疫不全ウイルスＩ型（ＨＩＶ−Ｉ）およびヒト免疫不全ウイルスＩＩ型（ＨＩＶ−ＩＩ）、ピコルナウイルス科のあらゆるウイルス、エンテロウイルス、カリシウイルス科、ノーウオーク群のあらゆるウイルス、デング熱ウイルスのようなトガウイルス、アルファウイルス、フラビウイルス、コロナウイルス、狂犬病ウイルス、マルブルクウイルス、エボラウイルス、パラインフルエンザウイルス、オルソミクソウイルス、ブンヤウイルス、アレナウイルス、レオウイルス、ロタウイルス、オルビウイルス、ヒトＴ細胞白血病ウイルスＩ型、ヒトＴ細胞白血病ウイルスＩＩ型、サル免疫不全ウイルス、レンチウイルス、ポリオーマウイルス、パルボウイルス、エプスタイン−バールウイルス、ヒトヘルペスウイルス−６、オナガザルヘルペスウイルス１（Ｂウイルス）、およびポックスウイルス。
【０１４７】
本発明の二重特異性分子を用いて治療または予防することができる細菌性疾患または障害として、限定するものではないが、下記のものが挙げられる：マイコバクテリアリケッチア、マイコプラズマ、ナイセリア属（例えば、髄膜炎菌や淋菌）、レジオネラ菌、コレラ菌、肺炎連鎖球菌のような連鎖球菌属、ジフテリア菌、破傷風菌、百日咳菌、ヘモフィルス属（例えば、インフルエンザ菌）、クラミジア属、腸管毒性大腸菌、および炭疽菌（炭疽）など。
【０１４８】
本発明の二重特異性分子を用いて治療または予防することができる原生動物性疾患または障害として、限定するものではないが、マラリア原虫、アイメリア、リーシュマニア、およびトリパノソーマが挙げられる。
【０１４９】
５．５．３  その他の病原性抗原分子
一実施形態では、本発明の方法および組成物により循環系からクリアランスされる病原性抗原分子には、バルビツール酸、三環系抗うつ薬およびジギタリスなど、あらゆる血清薬物が含まれる。
【０１５０】
別の実施形態では、クリアランスされる病原性抗原分子には、過剰量で存在し、被験者に一時的または永久的な損傷または障害をもたらし得るあらゆる血清抗原が含まれる。この実施形態は特に、薬物の過剰量に関係する。
【０１５１】
別の実施形態では、循環系からクリアランスされる病原性抗原分子は、天然に存在する物質を包含する。本発明の方法および組成物により循環系からクリアランスされる天然の病原性抗原分子の例として、限定するものではないが、低密度リポタンパク質、インターロイキンまたはその他の免疫調節物質およびホルモンが挙げられる。
【０１５２】
５．５．４．二重特異性分子のカクテル
様々な精製二重特異性分子を組み合わせて二重特異性分子の「カクテル」にすることができる。このような二重特異性分子のカクテルは、第１抗原認識部分として抗ＣＲ１ ｍＡｂを、また第２抗原認識部分として複数の所望する抗原認識部分の任意の１つを有する二重特異性分子を含むことができる。例えば、二重特異性分子のカクテルは、複数の異なる二重特異性分子を含んでなり、その際、集団における様々な二重特異性分子の各々は、異なる病原体を標的とする異なる第２抗原認識部分を含み；この第２抗原認識部分は、タンパク質性および／または非タンパク質性成分であってよい。このような二重特異性分子のカクテルは、個々の患者の要求に応じて注文調製された個人用医薬として有用である。
【０１５３】
５．５．５．二重特異性抗体の用量
用量はルーチンの実験を行うことにより医師が決定することができる。ヒトに投与する前に、モデル動物で効能を明らかにするのが好ましい。当分野で公知の循環器疾患用のどのようなモデル動物を用いてもよい。
【０１５４】
さらに具体的には、二重特異性抗体の用量は、造血細胞の濃度、ならびに、造血細胞１個当たりの抗Ｃ３ｂ様受容体モノクローナル抗体が結合したＣ３ｂ様受容体エピトープの数に基づいて決定することができる。二重特異性抗体を過剰に添加すると、二重特異性抗体の一部が造血細胞と結合せず、病原性抗原の造血細胞への結合を阻害する。その理由は、遊離の二重特異性抗体が溶解状態で存在すると、それが造血細胞に結合した二重特異性抗体と競って、未結合の病原性抗原を獲得しようとするためである。従って、二重特異性抗体が介在する病原性抗原の造血細胞への結合は、投入した二重特異性抗体の濃度の関数として結合を分析するとき、釣鐘状の曲線を描く。
【０１５５】
ウイルス血症では、血液１ｍｌ当たりウイルス粒子が１０８〜１０９個存在する（ＨＩＶは１０６／ｍｌ；（Ｈｏ， １９９７， Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ， ９９：２５６５−２５６７））；好ましくは、治療用の二重特異性抗体の用量は血中抗原数の少なくとも約１０倍とすべきである。
【０１５６】
一般に、抗体については、適量は０．１ ｍｇ／ｋｇ〜１００ ｍｇ／ｋｇ体重（一般には、１０ ｍｇ／ｋｇ〜２０ ｍｇ／ｋｇ）である。抗体を脳において作用させたい場合には、通常５０ ｍｇ／ｋｇ〜１００ ｍｇ／ｋｇが好適である。一般に、部分的にヒトの抗体および完全にヒトの抗体は、その他の抗体と比較して、ヒトの身体内での半減期が長い。従って、より低い用量またはより少ない投与回数がしばしば可能である。リピド化のような修飾を用いて抗体を安定化させ、取込みおよび組織透過（例えば、脳への）を増強することができる。抗体のリピド化方法は、Ｃｒｕｉｋｓｈａｎｋら（（１９９７）Ｊ． Ａｃｑｕｉｒｅｄ Ｉｍｍｕｎｅ Ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ Ｓｙｎｄｒｏｍｅｓ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｒｅｔｒｏｖｉｒｏｌｏｇｙ １４：１９３）により記載されている。
【０１５７】
本明細書に定義したように、二重特異性抗体の治療に有効な量（すなわち、有効量）は、約０．００１〜３０ ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは、約０．０１〜２５ ｍｇ／ｋｇ体重、さらに好ましくは、約０．１〜２０ ｍｇ／ｋｇ体重、さらに一層好ましくは、約１〜１０ ｍｇ／ｋｇ体重、２〜９ｍｇ／ｋｇ体重、３〜８ ｍｇ／ｋｇ体重、４〜７ｍｇ／ｋｇ体重、または５〜６ｍｇ／ｋｇ体重の範囲である。
【０１５８】
当業者であれば、特定の要因が、被験者を効果的に治療するのに必要な用量に影響を及ぼし得ることを理解できよう。このような要因として、限定するものではないが、疾患または障害の重症度、以前の治療、被験者の全般的健康状態および／または年齢、ならびに、存在するその他の疾患などが挙げられる。さらに、治療に有効な量の二重特異性抗体による被験者の治療は、１回の治療からなるものでも、または好ましくは、一連の治療を含むものでもよい。好ましい例では、約０．１〜２０ ｍｇ／ｋｇ体重の範囲の二重特異性抗体を用いて、週１回、約１〜１０週間、好ましくは、２〜８週間、さらに好ましくは、３〜７週間、さらに一層好ましくは、約４、５、または６週間にわたり、被験者を治療する。また、治療に用いる二重特異性抗体の有効量は、特定の治療の経過を通して増減できることも理解されよう。用量の変更は、本明細書に記載する診断アッセイの結果から生じ、そうした結果から明らかになるだろう。
【０１５９】
二重特異性抗体の適量が、医師、獣医師または研究者の知識の範囲内で、多数の要因に応じて変動することは理解されよう。二重特異性抗体の用量は、例えば、治療しようとする被験者またはサンプルの正体（アイデンティティー）、サイズ、および状態に応じて、さらには適宜、組成物の投与経路、ならびに、実施者が所望する、病原性抗原分子または自己抗体に二重特異性抗体が及ぼす効果に応じて、変動する。
【０１６０】
また、二重特異性抗体の適量は、クリアランスしようとする抗原に対する二重特異性抗体の効力に応じて変動することも理解されるだろう。このような適量は、本明細書に記載したアッセイを用いて決定することができる。これら二重特異性抗体の１種以上を動物（例えば、ヒト）に投与する場合には、医師、獣医師、または研究者は、例えば、初めに比較的低い用量を処方し、あとで適切な応答が得られるまで用量を増加してもよい。さらに、特定の動物被験者に対する具体的用量レベルは、様々な要因、例えば、用いた二重特異性抗体の活性、被験者の年齢、体重、全般的健康状態、性別および食事、投与回数、投与経路、排出速度、何らかの薬物併用、ならびに、クリアランスすべき抗原の濃度などに応じて変動することも理解されよう。
【０１６１】
５．５．６．医薬製剤および投与
本発明の二重特異性抗体は、投与に適した医薬組成物に処方することができる。このような組成物は、典型的には、二重特異性抗体と製薬上許容される担体とを含んでなる。本明細書で用いる用語「製薬上許容される担体」とは、医薬投与に適合する、あらゆる溶剤、分散媒、コーティング剤、抗菌剤および抗真菌剤、等張および吸収遅延剤などを包含することを意図する。薬理活性物質のためのこのような媒質および薬剤の使用は当分野で公知である。慣用の媒質または薬剤が二重特異性抗体と適合性でない場合を除いて、これらを組成物中で用いることが考慮される。補助的な二重特異性抗体を組成物に含めることもできる。
【０１６２】
本発明の医薬組成物は、意図する投与経路に適合するように製剤化する。好ましい投与経路は静脈内である。その他の投与経路の例として、非経口、皮内、皮下、経皮（局部）、および経粘膜が挙げられる。非経口、皮内、および皮下適用に用いる溶液または懸濁液は下記の成分を含むことができる：注射用の水、食塩水、不揮発性油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたはその他の合成溶剤；ベンジルアルコールまたはメチルパラベンのような抗菌剤；アスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウムのような抗酸化剤；エチレンジアミン四酢酸のようなキレート剤；酢酸塩、クエン酸塩またはリン酸塩のようなバッファー、ならびに、塩化ナトリウムまたはデキストロースなどの等張性調整用の薬剤。ｐＨは塩酸または水酸化ナトリウムのような酸または塩基で調節することができる。非経口製剤は、ガラスまたはプラスチック製のアンプル、使い捨て注射器または複数回用量バイアルに封入することができる。
【０１６３】
注射用に適した医薬組成物には、無菌の水溶液（水溶性の場合）または分散液および無菌注射液または分散液をその場で調製するための無菌粉末が含まれる。静脈内投与の場合には、好適な担体として、生理食塩水、静菌水、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ ＥＬ（商標）（ＢＡＳＦ；Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ， ＮＪ）またはリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）が挙げられる。いずれの場合にも、組成物は無菌でなければならず、しかも、粘度が低くかつ二重特異性抗体が注射可能である程度に流動性であるべきである。上記組成物は、製造および貯蔵条件下で安定しており、かつ、細菌や真菌のような微生物の汚染作用に対して保護されていなければならない。
【０１６４】
担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、およびこれらの好適な混合物を含めて、溶剤または分散媒でありうる。適切な流動性は、例えば、レシチンのようなコーティング剤を使用するか、分散液の場合には要求される粒子サイズを維持するか、また、界面活性剤を使用するか、によって維持することができる。微生物の作用からの保護は、各種抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどにより達成することができる。多くの場合、組成物中に等張剤、例えば、糖、マンニトール、ソルビトールのようなポリアルコール、塩化ナトリウムを含有させるのが好ましい。組成物中に吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを含有させることにより、注射用組成物の吸収を長引かせることができる。
【０１６５】
無菌注射液は、上に列挙した成分の１つまたは組合せと一緒に、好適な溶剤中に必要量の二重特異性抗体（例えば、１種以上の二重特異性抗体）を加え、必要に応じて、ろ過滅菌することにより、調製することができる。一般に、分散液を調製するには、基本的な分散媒および前記のものから選択した他の必要な成分を含む無菌ビヒクル中に二重特異性抗体を添加する。無菌注射液を調製するために無菌粉末を用いる場合には、好ましい調製方法は真空乾燥および凍結乾燥であり、これによって、事前に滅菌ろ過した溶液から活性成分と追加の任意所望成分との粉末が得られる。
【０１６６】
一実施形態では、二重特異性抗体は、インプラントやマイクロカプセル化送達系を含む制御放出製剤など、身体からの急速な排出から化合物を保護する担体を用いて調製する。エチレン酢酸ビニル、ポリ酸無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸などの生分解性、生物適合性ポリマーを用いることができる。このような製剤の調製方法は当業者には明らかであろう。また。材料は、Ａｌｚａ ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎおよびＮｏｖａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ， Ｉｎｃ．から市販されており入手可能である。また、リポソーム懸濁液（ウイルス抗原に対するモノクローナル抗体を含む、感染細胞を標的としたリポソームを含む）を製薬上許容される担体として用いてもよい。これらは、当業者には公知の方法、例えば、米国特許第４，５２２，８１１号（参照により本明細書にその全文を組み入れる）に記載される方法に従って調製することができる。
【０１６７】
投与を容易にすると共に投与量を均一化するために、非経口組成物を用量単位形態に製剤化することが有利である。本明細書で用いる用量単位形態とは、治療しようとする被験者のための単位用量として適した物理的に個別の単位を意味する。その際、各単位は、必要な製薬上の担体と一緒に、所望の治療効果を生み出すように計算された所定量の二重特異性抗体を含む。本発明の用量単位形態の明細は、二重特異性抗体のユニークな特性、および達成すべき具体的治療効果、ならびに、個体の治療のためにこのような二重特異性抗体を配合する技術に固有の制限事項により決定され、これらの要因に直接左右される。
【０１６８】
医薬組成物は、投与のための説明書と一緒に、キットとして、または容器、パック、もしくはディスペンサーに入れて提供することができる。
【０１６９】
５．５．７．二重特異性分子のｅｘ ｖｉｖｏ調製
別の実施形態では、投与の前に、二重特異性抗体のような二重特異性分子を被験者の造血細胞にｅｘ ｖｉｖｏで予め結合させる。例えば、治療対象の個体から造血細胞（あるいは、適合する血液型の非自己供血者からの造血細胞）を採取した後、適量の治療用二重特異性抗体と共に、十分な時間インキュベートすることにより、該抗体を造血細胞表面上のＣ３ｂ様受容体と結合させる。次に、適量の造血細胞／二重特異性抗体混合物を治療対象の被験者に投与する（例えば、Ｔａｙｌｏｒら、米国特許第５，４８７，８９０号を参照）。
【０１７０】
造血細胞は、好ましくは、血液細胞であり、最も好ましくは、赤血球である。
【０１７１】
従って、特定の実施形態では、本発明は、病原性抗原分子の存在に関連する望ましくない状態の哺乳動物を治療する方法であって、治療に有効な量の造血細胞／二重特異性分子複合体を被験者に投与することを含み、その際、該複合体が、本質的に、１以上の二重特異性分子に結合したＣ３ｂ様受容体を発現する造血細胞から構成される、上記方法を提供する。これ以外にも、上記方法は、病原性抗原分子の存在に関連する望ましくない状態の哺乳動物を治療する方法であって、（ａ）二重特異性分子を、Ｃ３ｂ様受容体を発現する造血細胞に接触させることにより、造血細胞／二重特異性分子複合体を形成すること；および（ｂ）治療に有効な量の造血細胞／二重特異性分子複合体を上記哺乳動物に投与することからなる方法を包含する。
【０１７２】
本発明はまた、造血細胞／二重特異性分子複合体を調製する方法を提供し、この方法は、二重特異性分子とＣ３ｂ様受容体を発現する造血細胞とを、結合へ導く条件下で接触させることにより複合体を形成することを含んでなり、その際、該複合体は、本質的に、１以上の二重特異性分子に結合した造血細胞から構成される。
【０１７３】
Ｔａｙｌｏｒら（米国特許第５，８７９，６７９号、以後、「’６７９特許」と呼ぶ）は、血漿中の自己抗体（または他の病原性抗原）の濃度があまりにも高いため、二重特異性抗体の投入量が最適であっても、自己抗体の全部が標準条件下で造血細胞と結合できるわけではないことから、上記系が飽和することをいくつかの例で明らかにした。例えば、非常に高力価の自己抗体血清では、その高い濃度ゆえに、自己抗体の一部が造血細胞に結合されない。
【０１７４】
しかし、Ｃ３ｂ様受容体上の異なる部位に結合するモノクローナル抗体を含む二重特異性抗体の組合せを用いて、飽和を解消することができる。例えば、モノクローナル抗体７Ｇ９および１Ｂ４は、霊長類Ｃ３ｂ受容体上の別個の非競合部位に結合する。従って、２つの二重特異性分子（各々、Ｃ３ｂ様受容体に対する異なるモノクローナル抗体を用いて作製された）の混合物を含む「カクテル」により、抗体と赤血球との結合をさらに増強できる可能性がある。本発明の二重特異性抗体は、静脈内注入に用いる特定の液体と組み合わせて使用してもよい。
【０１７５】
さらに別の実施形態では、少なくとも２つの異なる二重特異性抗体のブレンドを用いて、二重特異性抗体のような二重特異性分子を前記のようにｉｎ ｖｉｔｒｏで赤血球に予め結合させる。この実施形態では、２つの異なる二重特異性抗体は同一の抗原と結合するが、Ｃ３ｂ様受容体上の別個の非重複認識部位とも結合する。少なくとも２つの非重複二重特異性抗体を用いてＣ３ｂ様受容体と結合させることにより、１個の赤血球と結合することができる二重特異性抗体／抗原複合体の数を増加させる。従って、２つ以上の二重特異性抗体を１つのＣ３ｂ様受容体と結合させることにより、特に、抗原が非常に高濃度である場合には抗原クリアランスが増強される（例えば、’６７９号特許、第６欄、第４１〜６４行を参照のこと）。
【０１７６】
５．６．キット
本発明はまた、１以上の容器に、本発明のインテイン抗原認識部分断片、または本発明のインテイン抗原認識部分断片をコードする１以上の核酸、あるいは、このような核酸で形質転換させた細胞を含むキットを提供する。上記核酸は、染色体に組み込まれてもよいし、またはベクター（例えば、プラスミド、特に、プラスミド発現ベクター）として存在してもよい。本発明の医薬組成物を含むキットも提供される。
【０１７７】
５．７．その他の二重特異性分子を作製するためのタンパク質トランススプライシング
Ｃ３ｂ様受容体および抗原と結合する二重特異性分子を作製する上で、タンパク質トランススプライシングが有用ではあるが、タンパク質トランススプライシングを用いてその他の二重特異性分子も作製できることが当業者には理解されよう。このような二重特異性分子の作製もまた、本発明の範囲に含まれるものとする。非制限的例として、タンパク質トランススプライシングを用いて、トランスフェリン受容体と結合する抗原認識部分（例えば、限定するものではないが、抗トランスフェリン受容体ｍＡｂ）と、脳における適当な受容体と結合する抗原認識部分（例えば、限定するものではないが、脳における上皮増殖因子受容体と結合するペプチド治療分子）とを含んでなる二重特異性分子を作製することができる。抗トランスフェリン受容体ｍＡｂは、血液−脳関門（ＢＢＢ）を形成する脳毛管内皮壁を通過する受容体介在トランスサイトーシスを受けることができる。従って、この二重特異性分子は、これまでＢＢＢを通って輸送することができなかった薬物を脳に送達する上で有用である（例えば、Ｄｅｇｕｃｈｉら、１９９９， Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ． １０：３２−３７；Ｌｉら、１９９９， Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ １２：７８７−７９６）。
【０１７８】
６．実施例：ＩｇＥを除去するための抗ＣＲ１ ｍＡｂ × ＦｃεＲＩのαサブユニットを含む二重特異性分子
以下の実施例では、抗ＣＲ１ ｍＡｂとＦｃεＲＩのαサブユニットとを含む二重特異性分子の作製について説明する。この実施例は本発明の好ましい例である。
【０１７９】
ＩｇＥは多様なアレルギー性疾患に関与している。ＦｃεＲＩは、アレルギー反応の惹起および維持に重要な役割を果たすヒトＩｇＥ受容体である（Ｓａｂａｎら、１９９４， Ｊ． Ａｌｌｅｒｇｙ Ｃｌｉｎ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ９４：８３６−８４３；Ｔｕｒｎｅｒら、１９９９， Ｎａｔｕｒｅ ４０２：Ｂ２４−Ｂ３０；Ｃｈａｎｇ， ２０００， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １８：１５７−１６２）。ＦｃεＲＩを構成する３つのサブユニット、すなわち、α、βおよびγサブユニットのうち、αサブユニットはＩｇＥのＦｃ部分と結合する。ＦｃεＲＩのαサブユニットは高親和性ＩｇＥ結合にとって十分であるのに対し、βおよびγサブユニットはＩｇＥ結合において重要な役割は果たしていないことが見出された（Ｈａｋｉｍｉら、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６５：２２０７９−２２０８１）。従って、抗ＣＲ１ ｍＡｂとＦｃεＲＩのαサブユニットとを含む二重特異性分子は、循環系からＩｇＥを除去することによりＩｇＥ介在疾患を治療する上で有用である。
【０１８０】
アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）からハイブリドーマ細胞系ＡＴＣＣ ＨＢ ８５９２を得る。このハイブリドーマをダルベッコの改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）において対数期まで増殖させる。１０７個のハイブリドーマ細胞から全ＲＮＡを単離する。ハイブリドーマ細胞をまずＰＢＳで洗浄する。次に、１ｍｌのバッファーＧＴＣ（４Ｍグアニジン−イソチアネート、２５ ｍＭクエン酸ナトリウム、０．５％Ｓａｒｃｏｙｌ、０．１Ｍ ｂ−メルカプトエタノール）中に上記細胞を懸濁させる。次に、この細胞懸濁液に０．１ ｍｌの酢酸ナトリウム（３Ｍ、ｐＨ ５．２）、０．５ ｍｌのフェノール、および０．２ｍｌのクロロホルムを添加する。この細胞懸濁液を１０，０００ ｘ ｇで１５分遠心分離する。１倍容量のイソプロパノールを用いて上清を沈降させてから、１０，０００ ｘ ｇで１５分遠心分離する。ペレットを７０％ ＥｔＯＨで洗浄し、空気乾燥させた後、１００ ｍｌのＤＥＰＣ処理水に再懸濁させる。
【０１８１】
ｃＤＮＡを調製するために、５ｍｌの１０ｘ ＲＴバッファー（０．５ Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ８．２）、０．１ Ｍ ＭｇＣｌ２、および１Ｍ ＫＣｌ）、５ｍｌのＤＴＴ（１００ｍＭ）、５ｍｌのｄＮＴＰ（各５ｍＭ）、１ｍｌのオリゴヌクレオチド（各１０ｐｍｏｌ／ｍｌ）、５ｍｌのＲＮＡｓｉｎ（１０ｕ／ｍｌ）、５ｍｌのＲＴアーゼ（１００ｕ／ｍｌ）および１４ ｍｌのＨ２Ｏを含むバッファーに、１０ ｍｌのＲＮＡを添加し、３７℃で１時間インキュベートする。次に反応混合物を３分沸騰させた後、氷上で急冷させる。
【０１８２】
２．５ ｍｌずつのフォワードおよびリバースプライマー（各１０ ｐｍｏｌ／ｍｌ）、５ｍｌの１０ｘ ＰＣＲバッファー（０．１ Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ８．３）、１５ ｍＭ ＭｇＣｌ２、および０．５ Ｍ ＫＣｌ）、２．５ ｍｌのｄＮＴＰ（各５ｍＭ）、０．５ｍｌのＢＳＡ（１０ ｍｇ／ｍｌ）、および約５０ ｍｌのＨ２Ｏを含むバッファー中で５〜１０ ｍｌのｃＤＮＡを用いて、ＰＣＲ増幅を実施する。反応混合物をパラフィン油で覆ってから、ＰＣＲブロック中で、９４℃で５分加熱した後、０．５〜１Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（５ｕ／ｍｌ）を添加する。３０回の温度サイクル：９４℃で１分、６０℃で１分、７２℃で２分、を用いる。
【０１８３】
ＰＣＲ産物をゲル電気泳動により精製する。重鎖および軽鎖。
【０１８４】
Ｓｓｐ ＤｎａＥ遺伝子のＮ−インテインは、プライマー５’−ＴＴＴＧＧＴＡＣＣＧＡＡＡＴＴＴＴＡＡＣＣＧＴＴＧＡＧ−３’（配列番号５）および５’−ＧＧＣＴＣＴＴＣＣＴＴＴＡＡＡＴＴＧＴＣＣＣＡＧＣＧＴＣＡＡＧ−３’（配列番号６）を用いてプラスミドｐＤｎａＥ−Ｃ−２０９から増幅する。５個のインテインＮ−末端残基と５個の天然Ｎ−エクステイン残基とを含むＮ−末端スプライス部位配列を、増幅産物のＣ−末端に連結させる。
【０１８５】
Ｃ−インテインとシステインからなるＳｓｐ ＤｎａＥ遺伝子の延長Ｃ−インテインは、Ｎ−（９−フルオレニル）メトキシカルボニル化学によるペプチド合成によって、４−メチルベンズヒドリルアミン樹脂（Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ）、Ｏ−トリチル保護トレオニン、全てのトレオニンおよびアルギニン残基の二重カップリング、各サイクルでの無水酢酸ブロッキングステップ、ならびに、１０％までジメチルスルホキシドを補充したＮ−メチルピロリドンを用いてＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｍｏｄｅｌ ４３１ペプチド合成装置で調製する。ペプチドを樹脂から切断し、チオアニソール：１，２−エタンジチオール：水：トリフルオロ酢酸（２：１：２：２０）中の６．２５％（ｗ／ｖ）フェノールにより脱保護する。調製用Ｃ８カラム（Ｖｙｄａｃ）を使ってＨＰＬＣ（Ｒａｉｎｉｎ）によりペプチドを精製する。
【０１８６】
ヒトＦｃεＲＩのαサブユニットをコードする核酸の配列は、Ｋｏｃｈａｎら、１９８８， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １６：３５８４に示されている（登録番号Ｘ０６９４８）。
【０１８７】
Ｓｓｐ Ｎ−インテインをコードする核酸を、抗ＣＲ１ ｍＡｂの重鎖をコードする核酸に融合させて、抗ＣＲ１ ｍＡｂの重鎖のＣ末端に融合されたＳｓｐ Ｎ−インテインのＮ−末端からなる融合タンパク質がコードされるようにする。融合ポリペプチド断片をコードする核酸と、抗ＣＲ１ ｍＡｂの軽鎖をコードする核酸とを含むベクターは、Ｍｕｌｌｉｇａｎら、１９８０， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２０９：１４２３−１４２７に従い、該核酸をサルウイルス４０調節エレメントと機能可能に連結させることにより構築する。Ｎ−インテイン抗ＣＲ１ ｍＡｂの生成のために、Ｓｕｂｒａｍａｎｉら（Ｓｕｂｒａｍａｎｉら、１９８１， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． １：８５４−８６４）に従って２つのベクターをＣＨＯ細胞に同時トランスフェクトする。
【０１８８】
ヒトＦｃεＲＩのαサブユニットを含むＤＮＡ構築物は、Ｈａｋｉｍｉら、１９９０， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６５：２２０７９−２２０８１に従って構築する。次に、Ｓｓｐ Ｃ−インテインをコードする核酸を、ヒトＦｃεＲＩのαサブユニットを含むＤＮＡ構築物に融合させる。αサブユニットに融合させたＳｓｐ Ｃ−インテインを含むＤＮＡ構築物は、Ｈａａｋ−Ｆｒｅｎｄｓｃｈｏら、１９９３， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５１：３５１−８に従って産生用のＣＨＯ細胞にトランスフェクトする。
【０１８９】
Ｎ−インテイン抗ＣＲ１断片とＣ−インテインＦｃεＲＩαサブユニット断片を反応バッファー（５００ ｍＭ ＮａＣｌを含む１００ ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ ７．０）中で混合する。Ｎ−インテイン断片およびＣ−インテイン断片の最終濃度は両方とも５００ ｍＭである。この混合物を室温で一晩反応させる。
【０１９０】
３段階連続アフィニティークロマトグラフィーにより二重特異性分子を精製する。第１カラムは、固相マトリックスに結合させたプロテインＡからなり、その際、抗体のＦｃ部分がプロテインＡと結合し、抗体はカラムと結合する；続く第２カラムは固相マトリックスへのＣＲ１結合を利用し、二重特異性分子の抗ＣＲ１ ｍＡｂ部分を介したＣＲ１結合をアッセイする；これに続く第３カラムは、二重特異性分子のＦｃεＲＩ部分により結合されたＩｇＥの特異的結合を利用する。
【０１９１】
二重特異性分子は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロットによって特性決定する。ＳＤＳ−ＰＡＧＥで二重特異性分子の分子量を決定する。次に、ＣＲ１および目的の抗原の両方を用いたウエスタンブロットによって、適当なバンド中の該分子の二重特異性を確認する。
【０１９２】
７．引用文献
本明細書に引用したすべての文献は、個々の刊行物または特許もしくは特許出願があらゆる目的でその全文を参照により組み入れられるように明確かつ個別に示されているのと同じ程度にまで、あらゆる目的のために参照により本明細書にそれらの全文を含めるものとする。
【０１９３】
本発明の多様な修飾および変更は、当業者には明らかなように、本発明の精神および範囲から逸脱することなく行うことができる。本明細書に記載した具体的実施形態は例示を目的として提供したにすぎず、本発明は、添付の特許請求の範囲、ならびに、特許請求の範囲に含まれる均等物の全範囲によってのみ制限されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【図１】
本発明の二重特異性分子の好ましい実施形態をいくつか示す。図１ａは、Ｎ−インテイン抗ＣＲ１断片の概略図である。図１ｂは、Ｃ−インテイン病原体結合部分断片の概略図である。図１ｃは、Ｃ−インテインストレプトアビジン断片の概略図である。図１ｄは、二重特異性分子の構成例の概略図である。図１ｅは、ストレプトアビジン−ビオチンリンカーを含む二重特異性分子の構成例の概略図である。
【図２】
タンパク質トランススプライシングを用いて、二重特異性分子を作製する工程を示す概略図である。
【図３】
ＳｓｐのＤｎａＥ遺伝子にコードされた天然に存在する分断インテインのアミノ酸配列を示す。図３ａは、Ｎ−インテインのアミノ酸配列（配列番号１）を示す。図３ｂは、すぐ下流のシステインを含むＣ−インテインのアミノ酸配列（配列番号２）を示す。図３ｃは、最初の１０個のＮ−エクステイン残基のアミノ酸配列（配列番号３）を示す。図３ｄは、最初の１０個のＣ−エクステイン残基のアミノ酸配列（配列番号４）を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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2004515233.tif 000120