(57)【要約】免疫調節性抗原に結合した抗原提示細胞（ＡＰＣ）標的化分子を含む免疫調節性因子であって、ここでこのＡＰＣ標的化分子が、スーパー抗原を模倣するが、完全に機能的なＴ細胞レセプター結合部位を含まない、免疫調節性因子。【特許請求の範囲】
【請求項１】
免疫調節性抗原に結合した抗原提示細胞（ＡＰＣ）標的化分子を含む免疫調節性因子であって、ここで該ＡＰＣ標的化分子が、スーパー抗原を模倣するが、完全に機能的なＴ細胞レセプター結合部位を含まない、免疫調節性因子。
【請求項２】
免疫調節性抗原に結合した抗原提示細胞（ＡＰＣ）標的化分子を含む免疫調節性因子であって、ここで該ＡＰＣ標的化分子が、構造的にスーパー抗原であるが、ただし崩壊したＴ細胞レセプター結合部位についてのスーパー抗原である分子であり、その結果、該分子は、Ｔ細胞を活性化する能力をほとんど有さないか、または全く有さない、免疫調節性因子。
【請求項３】
請求項１または２に記載の免疫調節性因子であって、ここで前記抗原提示細胞（ＡＰＣ）標的化分子の前記Ｔ細胞レセプター結合部位、またはその少なくとも一部が、置換または付加によって改変されている、免疫調節性因子。
【請求項４】
請求項１または２に記載の免疫調節性因子であって、ここで前記抗原提示細胞（ＡＰＣ）標的化分子の前記Ｔ細胞結合部位が欠失されている、免疫調節性因子。
【請求項５】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の免疫調節性因子であって、ここで前記抗原提示細胞（ＡＰＣ）標的化分子が、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ、および／またはＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓに由来する、免疫調節性因子。
【請求項６】
前記抗原提示細胞（ＡＰＣ）標的化分子が、ＳＰＥ−Ｃ、ＳＭＥＺ、および／またはＳＥＡ由来である、請求項５に記載の免疫調節性因子。
【請求項７】
前記抗原提示細胞（ＡＰＣ）標的化分子が、本明細書において規定されたようにＳＰＥＣ−Ｙ１５Ａと命名される、請求項６に記載の免疫調節性因子。
【請求項８】
前記抗原提示細胞（ＡＰＣ）標的化分子が、ＳＰＥＣ−Ｙ１５Ａ  Ｒ１８１Ｑと命名される、請求項６または７に記載の免疫調節性因子。
【請求項９】
前記抗原提示細胞（ＡＰＣ）標的化分子が、ＳＰＥＣ−Ｙ１５Ａ．Ｃ２７Ｓ．Ｎ７９Ｃ．Ｒ１８１Ｑと命名される、請求項６〜８のいずれか１項に記載の免疫調節性因子。
【請求項１０】
前記抗原提示細胞（ＡＰＣ）標的化分子が、免疫調節性抗原に対して可逆的に結合されている、請求項１〜９のいずれか１項に記載の免疫調節性因子。
【請求項１１】
前記免疫調節性抗原が、タンパク質、ポリペプチド、および／またはペプチドである、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の免疫調節性因子。
【請求項１２】
前記免疫調節性抗原が、核酸である、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の免疫調節性因子。
【請求項１３】
前記免疫調節性抗原が、前記抗原提示細胞（ＡＰＣ）標的化分子に結合されていない場合、非免疫原性である、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の免疫調節性因子。
【請求項１４】
前記抗原提示細胞（ＡＰＣ）標的化分子が、ＳＰＥＣ（−２０−９０）である、請求項４、または請求項１０〜１３のいずれか１項に記載の免疫調節性因子。
【請求項１５】
請求項１〜１４のいずれか１項に記載の免疫調節性因子、ならびに薬学的に受容可能なキャリア、アジュバント、賦形剤、および／または溶媒を含む、薬学的組成物。
【請求項１６】
請求項１〜１４のいずれか１項に記載の免疫調節性因子を含む、ワクチン。
【請求項１７】
免疫系の誘導または刺激を必要とする障害の治療的処置または予防的処置の方法であって、このような処置の必要な被験体に対する、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の免疫調節性因子の投与、請求項１５に記載の薬学的組成物の投与、または請求項１６に記載のワクチンの投与を包含する、方法。
【請求項１８】
前記障害が、細菌感染、ウイルス感染、真菌感染、もしくは寄生生物感染、自己免疫、アレルギー、および／または前悪性形質転換、もしくは悪性形質転換からなる群より選択される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
請求項１〜１４のいずれか１項に記載の免疫調節性因子の使用であって、免疫系の誘導または刺激を必要とする障害の治療的処置、または予防的処置のための医薬の調製のための、使用。
【請求項２０】
前記障害が、細菌感染、ウイルス感染、真菌感染、もしくは寄生生物感染、自己免疫、アレルギー、および／または前悪性形質転換、もしくは悪性形質転換からなる群より選択される、請求項１９に記載の使用。
【請求項２１】
免疫調節性因子を調製するための方法であって、以下の工程：
ａ．構造的にスーパー抗原である抗原提示細胞（ＡＰＣ）標的化分子のＴ細胞結合部位中に改変、および／または欠失を導入する工程、および
ｂ．それに対して、免疫調節性抗原を結合する工程、
を包含する、方法。
【請求項２２】
前記抗原提示細胞（ＡＰＣ）標的化分子が、ＳＰＥ−Ｃ、ＳＭＥＺ、および／またはＳＥＡから選択される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記抗原提示細胞（ＡＰＣ）標的化分子が、ＳＰＥＣ−Ｙ１５Ａ  Ｒ１８１Ｑである、請求項２１または２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記抗原提示細胞（ＡＰＣ）標的化分子が、ＳＰＥＣ−Ｙ１５Ａ．Ｃ２７Ｓ．Ｎ７９Ｃ．Ｒ１８１Ｑと命名される、請求項２１〜２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
前記抗原提示細胞（ＡＰＣ）標的化分子が、ＳＰＥＣ（−２０−９０）である、請求項２１、または請求項２２に記載の方法。
【請求項２６】
化合物の抗原性を増大する方法であって、抗原提示細胞（ＡＰＣ）標的化分子に対して該化合物を結合させる工程を包含し、ここで該ＡＰＣ標的化分子は、スーパー抗原を模倣するが、完全に機能的なＴ細胞レセプター結合部位は含まない、方法。
【請求項２７】
請求項２６に記載の方法であって、前記ＡＰＣ標的化分子が構造的にスーパー抗原であるが、ただし崩壊したＴ細胞レセプター結合部位についてのスーパー抗原である分子であり、その結果、この分子がＴ細胞を活性化する能力をほとんど有さないか、または全く有さない、方法。
【請求項２８】
前記抗原提示細胞（ＡＰＣ）標的化分子の前記Ｔ細胞レセプター結合部位、またはその少なくとも一部が、置換または付加によって改変されている、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
前記抗原提示細胞（ＡＰＣ）標的化分子の前記Ｔ細胞結合部位が欠失されている、請求項２６に記載の方法。
【請求項３０】
請求項２６〜２９のいずれか１項に記載の方法であって、ここで前記抗原提示細胞（ＡＰＣ）標的化分子が、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ、および／またはＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓに由来する、方法。
【請求項３１】
前記抗原提示細胞（ＡＰＣ）標的化分子が、ＳＰＥ−Ｃ、ＳＭＥＺ、および／またはＳＥＡ由来である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記抗原提示細胞（ＡＰＣ）標的化分子が、本明細書において規定されたようにＳＰＥＣ−Ｙ１５Ａと命名される、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記抗原提示細胞（ＡＰＣ）標的化分子が、ＳＰＥＣ−Ｙ１５Ａ  Ｒ１８１Ｑと命名される、請求項３１に記載の方法。
【請求項３４】
前記抗原提示細胞（ＡＰＣ）標的化分子が、ＳＰＥＣ−Ｙ１５Ａ．Ｃ２７Ｓ．Ｎ７９Ｃ．Ｒ１８１Ｑと命名される、請求項３１に記載の方法。
【請求項３５】
前記抗原提示細胞（ＡＰＣ）標的化分子が、ＳＰＥＣ（−２０−９０）である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３６】
前記抗原提示細胞（ＡＰＣ）標的化分子が、前記化合物に対して可逆的に結合される、請求項２６〜２９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３７】
前記化合物が、タンパク質、ポリペプチド、および／またはペプチド、炭水化物、または核酸からなる群より選択される、請求項２６〜２９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３８】
前記化合物が、前記抗原提示細胞（ＡＰＣ）標的化分子に結合されていない場合、非免疫原性である、請求項２５〜２９のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、免疫調節性構築物およびその使用に関する。詳細には、本発明は、宿主免疫応答を増強または抑制する目的のために抗原提示細胞を標的する構築物、および化合物の抗原性を増強する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
専門的抗原提示細胞（ＡＰＣ）は、免疫されていないナイーブな動物において一次免疫応答を開始するのに必須である。最も重要なＡＰＣは、身体の全ての領域で、環境（すなわち、皮膚および肺、気道、鼻腔などのような粘膜表面）と接触して、樹枝状細胞（かみあい細胞）（ｉｎｔｅｒｄｉｇｉｔａｔｉｎｇ ｃｅｌｌ）として見出される、樹状細胞（ＤＣ）である。ＤＣによって提示された抗原は、著しく免疫原性である。ＤＣの重要な表現型マーカーの１つは、極めて高レベルの表面ＭＨＣクラスＩＩの発現である。活性化ＤＣは、二次的なリンパ節に遊走して、ＣＤ４  Ｔ細胞およびＣＤ８Ｔ細胞の両方を「プライム」し、これらのＴ細胞が、抗原活性化エフェクター細胞に進行して、増殖し、サイトカインを産生し、Ｂリンパ球の液性応答を調節する。従って、ＤＣによる抗原提示は、任意の適応的免疫応答において必須の最初のステップであると考えられる。他のＡＰＣ（例えば、マクロファージおよびＢ細胞）は、後の二次応答において重要であると考えられ、そしてそれらだけでは、応答の最初のプライミングにおいて効果的でない。従って、ＤＣは一般に、免疫応答の増強を目標とする最も重要な細胞であると考えられる。
【０００３】
しかし、ＤＣに対する抗原の標的化は、問題であり得る。例えば、多くのペプチドはそれらだけでは、インビボにおいてＡＰＣに効率的に送達されないせいで、抗原性、および免疫原性が乏しい。そのようなペプチドは、同じように、ＡＰＣによってそれ程効率的には取り上げられず、そして効率的な抗原提示に必要な第二のシグナルを惹起しない。
【０００４】
スーパー抗原は、半保存的な細菌タンパク質のファミリーであり、Ｔリンパ球上のＶβドメインを介したＴ細胞レセプター（ＴｃＲ）への、およびＡＰＣ（樹状細胞を含む）上で発現されたＭＨＣクラスＩＩ分子への同時結合によって免疫系を標的する。
【０００５】
スーパー抗原（ＳＡｇ）は、公知の最も強力な免疫マイトジェンであり、そしてフェムト−アトモルの濃度（１０−１５〜１０−１８Ｍ）で、多数のＴ細胞を活性化する。それらは、Ｔ細胞による大量の全身性のサイトカイン放出に起因して有意な毒性を生じる。現在、ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌおよびｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｌのスーパー抗原のファミリーの１９のメンバーが存在する。
【０００６】
Ｔｅｒｍａｎ（ＷＯ  ９８／２６７４７）は、スーパー抗原を使用する治療用組成物を開示している。スーパー抗原は、１つ以上のさらなる免疫治療抗原と組み合わせて、標的に対する治療的な免疫応答を誘導するか、または疾患を生じる免疫応答を阻害するかのいずれかのために用いられ得ることが示唆される。Ｔｅｒｍａｎはさらに、免疫治療的な抗原−スーパー抗原ポリマーの形成を記載している。このようなポリマーとしては、スーパー抗原成分が二次的なアミン連結によってペプチド抗原に結合されているポリマーが挙げられる。しかし、スーパー抗原成分は、ＴｃＲ結合機能が完全にまたは部分的に除去されているものであるということは、Ｔｅｒｍａｎによっては教示も示唆もされていない。実際、ＴｃＲ結合がＡＰＣの活性化、およびポリマーの抗原性成分に対する免疫応答の刺激に必須ではないという認識はない。
【０００７】
従って、野生型ＳＡｇ、または改変されたＳＡｇ（ＴｃＲに対する結合能を保持している）は、ほとんど使われていない。なぜなら、それら自体が、ＴｃＲに対する結合によって、大量で無差別のＴ細胞応答を惹起するからである。このＴｃＲ架橋結合が、それらの毒性の主な原因であると考えられる１２。
【０００８】
従って、改善された免疫調節性因子であって、ＳＡｇのＤＣ標的化および活性化の固有の特徴を発揮して、正常には非免疫原性であるかまたは低い免疫原性を有する抗原（例えば、ペプチド）のＴ細胞認識を送達および増強し、なお効率的で、かつ毒性の低い、免疫調節性因子の必要性が存在する。
【０００９】
【発明の解決しようとする課題】
先行技術の不利な点の少なくともいくつかを克服するか、もしくは改善すること、または有用な代替物を提供することが本発明の目的である。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
第一の局面に従って、免疫調節性抗原に結合した抗原提示細胞（ＡＰＣ）標的化分子を含む免疫調節性因子が提供される。ここでこのＡＰＣ標的化分子は、スーパー抗原（ｓｕｐｅｒａｎｔｉｇｅｎ）を模倣する（ｍｉｍｉｃ）が、完全に機能的なＴ細胞レセプター結合部位を含まない。
【００１１】
第二の局面に従って、免疫調節性抗原に結合した抗原提示細胞（ＡＰＣ）標的化分子を含む免疫調節性因子が提供される。ここでこのＡＰＣ標的化分子は、構造的にスーパー抗原であるが、ただし崩壊したＴ細胞レセプター結合部位についてのスーパー抗原である分子であり、その結果この分子は、Ｔ細胞を活性化する能力をほとんど有さないか、または全く有さない。
【００１２】
好ましくは、この抗原提示細胞（ＡＰＣ）標的化分子のＴ細胞レセプター結合部位、またはその少なくとも一部は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ（黄色ブドウ球菌）、および／またはＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ（化膿連鎖球菌）に由来する。特に好ましいのは、ＳＰＥ−Ｃ由来の標的化分子であり、そして好ましい短縮は、野生型ＳＰＥ−Ｃ配列からの残基２２〜９０の欠失を含む。しかし、この分子の類似の、さもなければ既知のＴｃＲ結合領域を有する他のＳＡｇ（例えば、ＳＭＥＺ、ＳＥＡ、など）がまた有利に用いられ得ることが当業者には明白である。
【００１３】
この抗原提示細胞（ＡＰＣ）標的化分子のＴ細胞レセプター結合部位、またはその少なくとも一部はまた、ＴｃＲ結合を取り除くかまたは最小限にするために、置換または付加によって改変されていてもよい。このような標的化分子の例は、本発明のＳＰＥＣ−Ｙ１５Ａ  Ｒ１８１Ｑである。
【００１４】
免疫調節性因子の生成における特に好ましい中間体は、Ｙ１５Ａ．Ｃ２７Ｓ．Ｎ７９Ｃである。
【００１５】
好ましくは、抗原提示細胞（ＡＰＣ）標的化分子と免疫調節性抗原との間の結合は可逆である。しかし、抗原提示細胞（ＡＰＣ）標的化分子が免疫調節性抗原を放出し得、その結果、その抗原がＡＰＣによって正確に提示されることが好ましくは必要とされることであることが、以下の説明から理解される。従って、免疫調節性因子からの免疫調節性抗原の放出は、細胞内またはリソソーム内の酵素切断によって達成され得るということがまた明白である。このプロセスは、免疫調節性因子の結合領域への適切なタンパク質分解性部位の導入によって補助され得る。この放出はまた、化学的な手段（ジスルフィドおよび遊離スルフヒドリル基を含む酸化還元反応を含む）によって達成され得る。このプロセスはまた、結合領域に特定のアミノ酸残基（例えば、システイン）を導入することによって補助され得る。
【００１６】
好ましくは、この免疫調節性抗原は、タンパク質、ポリペプチド、および／またはペプチドであるが、同様の原理を、非タンパク質性である抗原（例えば、核酸または炭水化物）に適用することが可能である。
【００１７】
免疫調節性抗原は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）標的化分子に対して結合されない場合、完全に非免疫原性であり得るが、本発明の免疫調節性因子はまた、その効率を改善するために、免疫原性である抗原を組み込んでもよい。従って、本発明は、例えば、新しいワクチンに対して、それが既に公知でありかつ用いられているが、本発明の免疫調節性因子によって改善され得る場合、等しく適用可能である。
【００１８】
第三の局面に従って、本発明による免疫調節性因子、ならびに薬学的に受容可能なキャリア、アジュバント、賦形剤、および／または溶媒を含む薬学的組成物が提供される。
【００１９】
第四の局面に従って、本発明による免疫調節性因子を含むワクチンが提供される。
【００２０】
第五の局面に従って、免疫系の誘導または刺激を必要とする障害の治療的処置または予防的処置の方法が提供される。この方法は、このような処置の必要な被験体に対する、本発明による免疫調節性因子、または薬学的組成物の投与を包含する。
【００２１】
好ましくは、この障害は、細菌感染、ウイルス感染、真菌感染、もしくは寄生生物感染、自己免疫、アレルギー、および／または前悪性形質転換もしくは悪性形質転換からなる群より選択される。
【００２２】
第五の局面に従って、第一または第二の局面に従う免疫調節性因子の使用であって、免疫系の誘導または刺激を必要とする障害の治療的処置、または予防的処置のための医薬の調製のための、使用が提供される。
【００２３】
この好ましい障害は、細菌、ウイルス、真菌、もしくは寄生生物の感染、自己免疫、アレルギー、および／または前悪性形質転換、もしくは悪性形質転換からなる群より選択される。
【００２４】
第六の局面に従って、免疫調節性因子を調製する方法が提供される。この方法は、以下の工程：
ａ．構造的にスーパー抗原である抗原提示細胞（ＡＰＣ）標的化分子のＴ細胞結合部位中に改変、および／または欠失を導入する工程、および
ｂ．それに対して、免疫調節性抗原を結合する工程、
を包含する。
【００２５】
好ましくは、この抗原提示細胞（ＡＰＣ）標的化分子は、ＳＰＥ−Ｃ、ＳＭＥＺ、およびＳＥＡからなる群より選択され、より好ましくは、この抗原提示細胞（ＡＰＣ）標的化分子は、ＳＰＥ−Ｃ  Ｙ１５Ａ．Ｒ１８１Ｑ、またはＳＰＥＣ（−２０−９０）である。なおより好ましいのは、ＳＰＥＣ−Ｙ１５Ａ．Ｃ２７Ｓ．Ｎ７９Ｃ．Ｒ１８１Ｑである。
【００２６】
しかし、２つ以上の抗原提示細胞（ＡＰＣ）標的化分子が使用され得ること、および免疫調節性因子の組み合わせが、任意の処置において用いられ得ることが理解される。
【００２７】
【発明の実施の形態】
本発明は、スーパー抗原を模倣するが、完全に機能的なＴｃＲ結合部位を欠失する分子が、免疫調節性抗原に結合された場合、ＡＰＣに結合して、以前には公知でもなく、推測もされなかった程度までＡＰＣを活性化するという予期されなかった観察に、少なくとも一部は基づく。従って、このような免疫調節性の構築物は、ＴｃＲに対する結合を必要とすることなく、抗原提示に有効である。これは、低い免疫原性を有するかまたは免疫原性が存在しない部分（例えば、ペプチド、タンパク質、核酸、ウイルス全体など）に得に関連する。
【００２８】
この技術の適用は、ＴｃＲ除去スーパー抗原の送達能力およびＡＰＣ活性化能力と、結合した抗原の特異性とを組み合わせる、広範な種々の免疫調節性試薬を生成する能力に依存する。
【００２９】
この技術の好ましい用途は、本明細書に示しているように、ＰＣＣペプチドを用いて、合成ペプチドに対する応答を増強することである。しかし、この抗原は合成ペプチドである必要はなく、ネイティブポリペプチド、または組み換えポリペプチド、無効なウイルス全体のタンパク質でさえあり得る。さらに、この抗原はタンパク質性である必要はなく、核酸または炭水化物の抗原であってもよい。また、本発明は、免疫原性を改善するか、または免疫応答を誘導するために必要な抗原の量を減少することによって、免疫原性である抗原に対して適用され得る。
【００３０】
ペプチドは、このペプチドの一次配列に依存して、刺激性（すなわち、アゴニスト性応答を生成する）であるか、または寛容を誘導するために免疫抑制的（すなわち、アンタゴニスト性応答を生成する）であるかのいずれかに設計され得る。これは、病原因子（例えば、ウイルス、細菌、および他の微生物）に対するワクチン接種のための免疫を促進するか、または腫瘍特異的ペプチドを用いて特定の抗腫瘍免疫を生成するための免疫を促進するかのいずれかに有用である。
【００３１】
アンタゴニスト応答は、抗原に対するＴ細胞寛容を誘導し、そして多発性硬化症、糖尿病、または慢性関節リウマチのような疾患の場合、自己抗原（例えば、タンパク質、および／または核酸）に対する望ましくない自己免疫反応を抑制するのに有用であり得る。
【００３２】
多くの自己免疫疾患は、自己抗原に対する自己反応性Ｔ細胞応答にその基礎を有する。慢性関節リウマチ、多発性硬化症、および糖尿病のような疾患が、このような例である。
【００３３】
本発明は、ここに以下の非限定的な実施例を参照して、より詳細に例証される。
【００３４】
【実施例】
（実施例１：スーパー抗原のクローニングおよび発現）
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、および公開された配列から推測されるオリゴヌクレオチドを用いて、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ、またはＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓの単離体のＤＮＡから、個々の野生型スーパー抗原をコードする遺伝子を直接単離して、クローニングした。ＤＮＡ配列決定によって全ての野生型配列を決定した。
【００３５】
単離、クローニング、および配列決定のために用いた方法は、標準的な実験室手順であり、そして例えば、Ｇｏｓｈｏｍ ＳＣ，Ｓｃｈｌｉｅｖｅｒｔ ＰＭ．１９８８．Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｌ ｐｙｒｏｇｅｎｉｃ ｅｘｏｔｏｘｉｎ ｔｙｐｅ Ｃ，Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ．５６（９）：２５１８〜２０，Ｐｒｏｆｔ Ｔ，Ｍｏｆｆａｔｔ ＳＬ，Ｂｅｒｋａｈｎ ＣＪ，Ｆｒａｓｅｒ ＪＤ．１９９９．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｏｖｅｌ ｓｕｐｅｒａｎｔｉｇｅｎｓ ｆｒｏｍ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ．Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ．Ｊａｎ ４；１８９（１）８９〜１０２（全てが参考として本明細書に援用されている）に記載されている。
【００３６】
ＳＰＥ−Ｃの単一のドメイン分子およびその誘導体のまとめは、以下に示しており、これにはヒトＴ細胞のかなり増殖性の応答を含む。
【００３７】
（ＳＰＥ−ＣのＣ末端の単一ドメイン）
（Ｃ末端の単一のドメインとは、「短縮したＳＰＥ−Ｃ（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ  ＳＰＥ−Ｃ）」という用語に参照を付け、そしてＳＰＥＣ−（−２０−９０）を明確に述べるための言及である。括弧で囲んだ数字は、以下の手順に概説したように欠失されたネイティブなＳＰＥ−Ｃのその部分を示す）。
【００３８】
ベクター：ｐＧＥＸ−３Ｃ（ｐＧＥＸ−２Ｔのバリエーション）
宿主：ＤＨ５
抗生物質耐性：アンピシリン
制限部位：５’  ＢａｍＨ１、３’  ＥｃｏＲＩ
簡略な発現プロトコール：
＊．振とうしながら３７℃でＬＢ−Ａｍｐ中で一晩増殖させる。
【００３９】
＊．一晩培養したものを、予熱したＬＢ−Ａｍｐを用いて１：１０に希釈する。
【００４０】
＊．さらに１時間、または６００ｎｍでの吸光度が０．９になるまで増殖させた。
【００４１】
＊．培養物を３０℃まで冷却する。
【００４２】
＊．０．１ｍＭ  ＩＰＴＧを用いてタンパク質発現を誘導する。
【００４３】
＊．４〜５時間、振とうしながら３０℃でインキュベートする。
【００４４】
＊．細胞を回収して、ペレット１グラムあたり、１０ｍｌのＧＳＨ緩衝液１（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ．Ｃｌ  ｐＨ７．４／５０ｍＭ  ＮａＣｌ／１ｍＭ  ＥＤＴＡ）に再懸濁する。
【００４５】
＊．超音波処理して細胞を溶解し、そして可溶性融合タンパク質を放出する。
【００４６】
＊．溶解物をスピンして、不溶性物質を取り除く。
【００４７】
＊．溶解物をＧＳＨ緩衝液中で一晩透析して、内因性ＧＳＨを取り除く（この工程によって収率が増大するが、必須ではない）。
【００４８】
＊．ＧＳＨアガロースアフィニティークロマトグラフィーを用いて、細菌タンパク質からのＧＳＴ−融合タンパク質を精製する。
【００４９】
＊．３Ｃプロテアーゼを用いて、一晩精製した融合タンパク質を４℃で切断する（ＤＴＴを添加することに注意）。
【００５０】
＊．切断した融合タンパク質を、１０ｍＭ  ＰＯ４（ｐＨ６．０）中に一晩透析する。
【００５１】
＊．陽イオン交換クロマトグラフィーを用いてＧＳＴからＣ末端単一ドメインを精製する（すなわち、ＭｏｎｏＳカラム−ｐＨ勾配６．０〜７．０（カラム容積の２０倍を超える）で溶出する）。
【００５２】
（配列の詳細：）
配列は、ＳＰＥＣ−Ｃの残基１〜２１、第Ｘ因子プロテアーゼ切断部位である４アミノ酸リンカー、その後にＳＰＥＣ−Ｃの残基９１〜２０８を含む。
【００５３】
ＤＮＡ配列（第Ｘ因子の配列を影付で示す）：
▲１▼
【００５４】
【配１】
2004515479.tif 000002
【００５５】
タンパク質のパラメーター：
タンパク質の配列：
▲２▼
【００５６】
【配２】
2004515479.tif 000003
【００５７】
分子量：１６５４３
理論的ｐＩ：７．０２
理論的吸光データ（６Ｍ  グアニジン−ＨＣｌ／２０ｍＭ  リン酸塩（ｐＨ６．５））
全てのシステインが還元されると仮定すれば：
モルＡ２８０：                  ８９６０
Ａ２８０／ｃｍ（１ｍｇ／ｍｌ）：０．５４２
（Ｃ末端ドメインＳＰＥ−Ｃの活性）
（ＰＢＬ刺激アッセイ：）
Ｈｙｐａｑｕｅ−Ｆｉｃｏｌｌを用いて、血液から末梢血リンパ球を単離する。ＲＰＭＩ（完全）中の毒素の５倍段階希釈を９６ウェルプレート中で準備する。種々の濃度の毒素を含む各ウェルに、１×１０５個のＰＢＬを添加する。このプレートを３日間インキュベートさせて、その後、各ウェルに［３Ｈ］チミジンを添加して増殖を測定する。翌日、細胞を回収して、［３Ｈ］チミジン取り込みを測定する。
【００５８】
図６は、Ｃ末端ドメインＳＰＥ−ＣがヒトＰＢＬｓのバックグラウンドを超える刺激活性を有さないことを示す。これは、Ｔ細胞上のＴｃＲとも、抗原提示細胞の細胞表面上の交差ＭＨＣとも相互作用し得ないという事実に起因する可能性が最も高い。
【００５９】
（実施例２：スーパー抗原中のＴｃＲ結合残基の除去）
ＳＰＥ−Ｃ由来の遺伝子は、この遺伝子の５’末端および３’末端に対する合成プライマーを用いるＰＣＲによって、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓの患者単離体から導出した。Ｇｏｓｈｏｒｎ ＳＣ，Ｓｃｈｌｉｅｖｅｒｔ ＰＭ．１９８８．Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｌ ｐｙｒｏｇｅｎｉｃ ｅｘｏｔｏｘｉｎ ｔｙｐｅ Ｃ．Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ．５６（９）：２５１８〜２０の公表された配列（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｍ３５５１４）から、これらのプライマー配列を得た。この目的のために、任意の他のＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ単離体を用い得る。
【００６０】
ＳＰＥＣ遺伝子を増幅するために用いられるプライマーを、ＳＰＥＣ−Ｎ末端、およびＳＰＥＣ−Ｃ末端として表１に列挙する。この配列をＤＮＡ配列決定によって確認した。
【００６１】
全長ＳＰＥ−Ｃ遺伝子を、製造業者の指示に従って、発現ベクターｐＧＥＸ−３Ｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）にサブクローニングし、このベクターを、標準的な手順（Ｍａｎｉａｔｉｓら）を用いて細菌Ｅ．ｃｏｌｉを形質転換するのに用いた。グルタチオンアガロースアフィニティークロマトグラフィーを用いて、グルタチオンＳトランスフェラーゼに対して融合した組み換えＳＰＥ−Ｃを、Ｅ．ｃｏｌｉ培養物から精製した。
【００６２】
【表１】
2004515479.tif 000004
【００６３】
現在の変異のＳＰＥ−Ｃへの連続的導入。
【００６４】
１．ＳＰＥＣ−Ｃ２７Ｓ
Ｎ７９Ｃの好ましい部位に対する抗原の結合を妨げる天然に存在するシステインを取り除くため。
【００６５】
２．ＳＰＥＣ−Ｃ２７Ｓ、ＳＰＥＣ−Ｎ７９Ｃ
抗原についての結合ポイントを導入するため。十分に露出され、かつＭＨＣクラスＩＩ結合を妨害しないように、ＳＰＥ−Ｃの結晶構造から、この位置を選択した。
【００６６】
３．ＳＰＥＣ−Ｃ２７Ｓ、ＳＰＥＣ−７９Ｃ、ＳＰＥＣ−Ｙ１５Ａ
ＴｃＲ結合を破壊するため。
【００６７】
４．ＳＰＥＣ−Ｃ２７Ｓ、ＳＰＥＣ−７９Ｃ、ＳＰＥＣ−Ｒ１８１Ｑ
Ｔ細胞レセプターの結合をさらに制限するため。
【００６８】
【式１】
2004515479.tif 000005
【００６９】
以前に公開された方法２２、２３に従って、グルタチオンアガロースを製造した。トリプシンを用いた融合タンパク質の切断後、本明細書に援用される参考文献５に記載の方法に従って陽イオン交換クロマトグラフィーによって、組み換えＳＰＥ−Ｃタンパク質を精製した。精製したＳＰＥ−Ｃを結晶化し、そして本明細書において参考として援用されるＲｏｕｓｓｅｌ，１９９７（参考文献２６）に従って３−Ｄ構造を決定した。
【００７０】
ＳＰＥ−Ｃの３Ｄ結晶構造の分子モデリング、および関連のスーパー抗原ＳＥＢの公知のＴｃＲ結合残基との比較の組み合わせによって、ＴｃＲ結合に重要なＳＰＥ−Ｃにおけるアミノ酸の同一性を決定した。
【００７１】
（ＴｃＲインターフェースの一部であると考えられる残基の合理的な突然変異誘発）
ＰＣＲ重複の方法２４を用い、部位特異的突然変異誘発によって、ＴｃＲ結合残基を標的した。各変異を生成するために用いた合成プライマーを、添付のプライマーの表に記載している（表１）。ＳＰＥ−Ｃにおける連続的変異の連続的導入を記載する添付の図表（ダイヤグラム）、およびこの変異を導入するために用いるＰＣＲ重複の方法に記載されるとおり、２つの変異を導入するプロセスを連続的に実施した。
【００７２】
本発明のＳＰＥ−Ｃの変異型を、自動化ＤＮＡ配列決定（Ｌｉｃｏｒ Ｉｎｃ．ＵＳＡ）によって確認し、次いで、このベクターについてのクローニング部位の製造業者の説明に従って、ＢａｍＨ１制限部位とＥｃｏＲ１制限部位との間のｐＧＥＸ発現ベクター中に挿入した。Ｅ．ｃｏｌｉの株ＤＨ５ａを、この組み換えベクターで形質転換し、そしてｐＧＥＸ融合タンパク質を発現するコロニーを単離して、タンパク質精製の目的のための大規模培養において増殖させた。
【００７３】
ＴｃＲ結合部位における変異の効果を試験するため、標準的な技術（この技術の例については、Ｈａｎｄｂｏｏｋ Ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ編、Ｄ．Ｍ．Ｗｅｉｒ，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｉｌｉｃａｔｉｏｎｓを参照のこと）によって単離したヒト末梢血リンパ球の培養物に、組み換えタンパク質を添加し、ヒトＴ細胞の増殖を刺激するのにはどの程度の濃度の組み換えＳＰＥ−Ｃが必要であるかを決定した。野生型ＳＰＥ−Ｃは、通常、０．２ｐｇ／ｍｌで、ヒトＴ細胞を最大増殖の５０％に刺激する。変異した場合、野生型ＳＰＥ−Ｃに比べて、１，０００，０００分の１までＴ細胞増殖を低減する２つの残基を、これらの研究から同定した。これらの残基は、Ｙ１５およびＲ１８１である。これらの２つの変異体（ＳＰＥＣ−Ｙ１５Ａ、Ｒ１８１Ｑ）を有するＳＰＥ−Ｃ分子はもはや、ヒトＴ細胞を刺激しない。
【００７４】
Ｔ細胞レセプターとの相互作用に重要であるスーパー抗原におけるアミノ酸残基を、この変異性研究、およびその他の研究から同定した（以下の表２）。Ｔ細胞活性化の消失を、インビトロＴ細胞増殖アッセイ（以下参照）によって決定し、そして野生型分子の活性と比較する。Ｂ細胞を発現するＭＨＣクラスＩＩに対する直接結合を含む多数のアッセイ、ならびにスーパー抗原変異体およびＭＨＣクラスＩＩの両方の可溶型を用いるＢｉａｃｏｒｅ研究によって、全ての変異体をその変異体がＭＨＣクラスＩＩに結合する能力についても評価する。
【００７５】
マウスＴ細胞レセプター４，１３に結合したスーパー抗原ＳＥＣ３の３次元結晶構造は、スーパー抗原／ＴｃＲ相互作用の性質についての最も完全な情報を提供するが、それはＳＥＣ３様活性を有するものに限定されている。ほとんどの単一の点変異（ポイントミューテーション）は、ＴｃＲに対する結合親和性におけるごくわずかな低下に起因して、スーパー抗原活性のわずかな損失しか生じない。全ての分裂促進的能力を完全に排除する単一の変異を見出すことはまれである。ＳＰＥ−Ｃ  Ｙ１５Ａのみが、スーパー抗原に対するＴ細胞応答において１０００倍より大きい低下を生じることが示されている（Ｙａｍａｏｋａら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９８ ６６：５０２０、およびＭｃＣｏｒｍｉｃｋら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０００ １６５：２３０６〜２３１２）。
【００７６】
本発明のＳＰＥ−Ｃ  Ｙ１５Ａ，Ｒ１８１Ｑを生成する組み合わせ変異は、検出可能なＴ細胞活性化能力を有さない、ある形態のＳＰＥ−Ｃを生成する。
【００７７】
他のＳＡｇの３Ｄ結晶構造の相同性モデリングによって、ＴｃＲに対する結合のための重要な領域が同定され得、そして対応する変異体が調製され、そして本発明の免疫調節性因子を生成するために用いられ得る。
【００７８】
（実施例３：Ｔ細胞増殖アッセイ）用いられるＴ細胞増殖アッセイは、例えば、本明細書において参考として援用される引用文献５において記載される標準的な技術であった。
【００７９】
精製した組み換え変異スーパー抗原を、マイクロタイタープレート中で、種々の希釈の、新鮮に単離したヒト末梢血リンパ球とともに３日間インキュベートする。固定量の３Ｈチミジンを、３日目に添加して、４日目に細胞を収集する。細胞ＤＮＡに取り込まれた３Ｈチミジンの量をシンチレーションオートグラフィーで測定すれば、これが細胞増殖の程度の直接的測定である。変異体スーパー抗原を野生型スーパー抗原と比較する。所定のスーパー抗原または変異体の増殖能力を、その最大刺激の５０％を誘導するのに必要な濃度（Ｐ５０％）として表現する。
【００８０】
完全に除去したＴｃＲ結合陰性のスーパー抗原を、本明細書においては、野生型スーパー抗原の増殖活性の約０．０００１％未満（すなわち、活性の百万分の一の低下）を示す抗原と規定する。
【００８１】
【表２】
2004515479.tif 000006
【００８２】
ＳＰＥ−Ｃの野生型および変異体型の一次ＤＮＡ配列を、以下に詳述する：
ＳＰＥ−Ｃ野生型（ＧｅｎＢａｎｋ由来）
Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓの発熱性外毒素Ｃ遺伝子、５’末端ｃｄｓ
【００８３】
【配３】
2004515479.tif 000007
【００８４】
タンパク質配列−野生型
【００８５】
【配４】
2004515479.tif 000008
【００８６】
ＳＰＥＣ−Ｙ１５Ａ．Ｃ２７Ｓ．Ｎ７９Ｃ．Ｒ１８１Ｑ
【００８７】
【配５】
2004515479.tif 000009
【００８８】
タンパク質配列（混合変異）
【００８９】
【配６】
2004515479.tif 000010
【００９０】
（実施例４．組み換えの野生型タンパク質および変異タンパク質の精製）
組み換えの野生型スーパー抗原または変異体スーパー抗原をＥ．ｃｏｌｉにおいて発現する。２つの市販のベクターｐＧＥＸ−２Ｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）およびｐＥＴ３２Ａ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂ）は、融合タンパク質とスーパー抗原との間に新しいタンパク質分解性切断部位を導入するように改変されている。単一の認識部位でのみ切断する非常に特異的な３Ｃプロテアーゼを用いて、融合タンパク質の二等分の分離を達成する。
【００９１】
融合タンパク質を精製するには、現在２つの方法を用いている。
【００９２】
ａ．ｐＧＥＸ−２Ｔは、３Ｃプロテアーゼ切断部位を含むタンパク質リンカーを通じてスーパー抗原配列に連結されたグルタチオンＳトランスフェラーゼとしてのＮ末端成分を有する融合タンパク質を産生する。この融合タンパク質は、グルタチオンアガロース上の単回工程の精製で、粗細菌溶解物から精製される。５ｍＭグルタチオンを含有する緩衝液を用いてグルタチオンアガロースから、融合タンパク質を溶出し、そして組み換え３Ｃプロテアーゼの添加によって切断する。イオン交換ＨＰＬＣクロマトグラフィーによって、スーパー抗原をさらに精製する．
ｂ．ｐＥＴ３２−Ａ−３Ｃ。６ヒスチジンタグ（金属キレート化クロマトグラフィーによる単回工程の精製を可能にする）を有する安定なチオレドキシン融合タンパク質として、タンパク質を発現する。組み換え３Ｃプロテアーゼでの切断、続いてＨＰＬＣイオン交換クロマトグラフィーによって、スーパー抗原からのチオレドキシンの分離を達成する。
【００９３】
（組み換えタンパク質の発現および精製）
５０ｍｇ／ｍｌアンピシリンを含有するＬｕｒｌａ  Ｂｒｏｔｈ（ＬＢ）の小規模の１００ｍｌの開始培養物（スタータ・カルチャー）中で、Ｅ．ｃｏｌｉ形質転換体を３７℃で１晩増殖させる。１リットルの培養物を朝に播種して、対数期中期まで増殖させ、ここで、融合タンパク質の発現を誘導するためにＩＰＴＧを０．１ｍＭまで添加する。この培養を３時間継続し、この時点で細胞を遠心分離によってペレットにし、そしてリゾチームおよび超音波処理の組み合わせによって破壊する。５ｍｌのＧＳＨアガロースカラムか、またはＮｉ−ＮＴＡカラムのいずれかに、浄化した溶解物を通過させる。洗浄の後、結合したタンパク質を５ｍＭ  ＧＳＨ（ＧＳＨアガロース）、またはイミダゾールを含有する緩衝液（ＭＣクロマトグラフィー）のいずれかによって溶出する。
【００９４】
融合タンパク質を、１：５００の比の組み換え３Ｃプロテアーゼ（すなわち、１ｍｇの融合タンパク質に対して２ｍｇ  ３Ｃプロテアーゼ）によって、室温で一晩、切断する。２回の陽イオン交換クロマトグラフィーによって、スーパー抗原を融合タンパク質から分離する。タンパク質をろ過滅菌して、必要になるまで１ｍｇ／ｍｌで４℃に保管する。
【００９５】
（ＳＰＥ−Ｃへのジスルフィド結合部位の導入）
ＴｃＲ陰性のＳＰＥ−ＣのＮ末端のＮ７９位置に、露出したシステイン残基を導入した。Ｎ７９は、推定のＴｃＲ結合部位内に配置されている。いくつかの位置を試験した後に、以下の基準を満たす残基を同定した：
ａ．表面露出され、かつアクセス可能である
ｂ．合成ペプチドの効果的な結合を示す
ｃ．ＭＨＣクラスＩＩ結合を妨げない
ｄ．得られたＳＡＧ：ペプチド結合体を不溶性にしない。
【００９６】
導入されたシステインに加えて、２７位置で天然に存在するシステイン残基をセリンに変異させて、再折り畳みに伴う問題、および結合の妨害を回避した。
【００９７】
インビトロおよびインビボの免疫調節性活性の例を提供するために本明細書において用いたＳＰＥ−Ｃの変異体は、ＳＰＥＣ−Ｙ１５Ａ．Ｃ２７Ｓ．Ｎ７９Ｃ．Ｒ１８１Ｑであり、これは、ＴｃＲ結合を破棄する、ここまでに記載した全ての変異体（Ｙ１５ＡおよびＲ１８１Ｑ）の組み合わせであり、効率的な結合残基（Ｎ７９Ｃ）を導入し、そして結合を妨害する天然に存在するシステインを取り除く（Ｃ２７Ｓ）。
【００９８】
（実施例５：Ｎ末端ドメインを欠失する短縮バージョンのＳＰＥＣ）
ＳＰＥＣ−ＳＰＥＣ−Ｙ１５Ａ．Ｃ２７Ｓ．Ｎ７９Ｃに加えて、野生型配列から残基２２〜９０（ＳＰＥＣ（−２０〜９０））を欠失させることによって、ＳＰＥＣの短縮型変異体を開発した。これは、ＴｃＲ結合領域全体および小さいＮ末端ドメインを取り除く。この短縮型変異体は、Ｅ．ｃｏｌｉ中で非常によく発現し、可溶性であり、そしてＭＨＣクラスＩＩ結合活性を保持している。システイン残基は、９２位置に導入され、全長ＳＰＥＣ−Ｙ１５Ａ．Ｃ２７Ｓ．Ｎ７９Ｃ分子について記載されたのと同じ方法を用いて抗原結合を達成する。この変異体の重要性は、それが非常に小さく、抗原性が低く（抗ＳＰＥＣ抗体応答を促進する可能性が低い）、そしてどのようなＴｃＲ結合能力も完全に欠いているということである。この短縮型ＳＰＥＣが、正常には野生型毒素に関連する、インビボにおける何らかの毒性効果を有する可能性はほとんどないと考えられる。
【００９９】
ＳＰＥ−Ｃの短縮型バージョンの一次ヌクレオチド配列を、以下に詳述する：
（ＤＮＡ配列（第Ｘ因子の配列を影付で示す）：）
【０１００】
【配７】
2004515479.tif 000011
【０１０１】
タンパク質配列
【０１０２】
【配８】
2004515479.tif 000012
【０１０３】
（実施例６：ＳＭＥＺおよびＳＥＡのＴｃＲ結合欠損バージョン）
ＳＰＥ−Ｃに加えて、部位特異的突然変異誘発を用いて、ＳＭＥＺおよびＳＥＡの両方のＴｃＲ結合変異体を調製した。Ｔ細胞増殖に対する、変異体対野生型の比較データを表３に示す。
【０１０４】
【表３】
2004515479.tif 000013
【０１０５】
この目的は、例えば、野生型ＳＡＧの活性の約０．０００１％で、Ｔ細胞を刺激する変異体を生成することであった。さらに、ＳＰＥ−ＣにおけるＮ７９に対して同じ位置にシステイン残基が導入される。
【０１０６】
２つの他のスーパー抗原を含むことは、免疫原性の増強が全てのスーパー抗原の特徴であるか、またはＳＰＥ−Ｃに特異的であるかを決定するために重要である。このことは、本明細書に記載される原理および技術を用いて、明確に広範に適用可能である。
【０１０７】
ＳＰＥ−Ｃ変異体について使用された方法論、および既に公開（例えば、本明細書において参考として援用される、参考文献番号４）されたＳＡＧのＴ細胞レセプター結合領域に対する情報を用いて、ＳＥＡおよびＳＭＥＺのような他のスーパー抗原について、類似の短縮変異体が作製され得る。
【０１０８】
（実施例７：ペプチド結合手順）
タンパク質およびペプチドの両方を、窒素下で１０ｍＭ  リン酸塩（ｐＨ６．０）中で保存し、遊離のシステインを通じた酸化および自己二量体化を防止する。
【０１０９】
Ｃ末端システイン残基を含む合成ペプチドと、ＳＰＥＣ−Ｙ１５Ａ．Ｃ２７Ｓ．Ｎ７９Ｃとを一緒に混合して、１μＭ  Ｃｕ２＋を含有するアルカリ緩衝液中で１：２のモル比で、室温で１時間インキュベートする。銅は、レドックス（酸化還元）触媒として機能する。以下の実施例において、ハトチトクロームＣ（ＰＣＣ）の合成ペプチドを提供するが、この方法は、このペプチド中に遊離のイオウ原子が存在する限り、他のペプチドについても機能する。
【０１１０】
【表４】
2004515479.tif 000014
【０１１１】
慣用的に、８０％を超える（＞８０％）ＳＰＥＣ−Ｙ１５Ａ．Ｃ２７Ｓ．Ｎ７９Ｃ．Ｒ１８１が、１：１の比でペプチドに結合することが示される。結合の有効性は、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動によって評価される。ＳＰＥＣ−Ｙ１５Ａ．Ｃ２７Ｓ．Ｎ７９Ｃ：ペプチド結合体は、ＳＤＳ  ＰＡＧＥ上でより緩徐な移動度を有し、これは、単一ペプチドの付加による分子量の増大と一致している。ＳＤＳ  ＰＡＧＥの前の結合体に対する１ｍＭ  ジチオスレイトール（ＤＴＴ）の添加によって、分子量の減少に一致して、電気泳動の移動度が増大する。このことは、ペプチド結合が、可逆性のジスルフィド結合形成を介していること（ＡＰＣの内部で１回のペプチドの解離について重要であると考えられる特徴）を示す。
【０１１２】
（実施例８：ＳＡＧ：ペプチド結合体に対する応答の試験）
（５Ｃ．Ｃ７  Ｔ細胞レセプタートランスジェニックマウス）
Ｔｈｅ Ｍａｌａｇｈａｎ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｗｅｌｌｉｎｇｔｏｎ Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｍｅｉｎ Ｓｔ Ｗｅｌｌｉｎｇｔｏｎ Ｓｏｕｔｈ，Ｎｅｗ Ｚｅａｌａｎｄから、このマウスを得た。
【０１１３】
これらのマウスは最初に、Ｂｅｒｇら（参考文献１７）によって作製された。
【０１１４】
５Ｃ．Ｃ７トランスジェニックマウスは、元々、Ｂｅｒｇら１７によって作製された。このマウスは、マウスＩ−Ａｄによって示されるハトチトクロームＣ（ＰＣＣ）ペプチドに特異的なＴｃＲについてトランスジェニックである。５Ｃ．Ｃ７マウス由来の成熟Ｔ細胞の８０％より多くが、トランスジェニックＴｃＲを発現し、そしてインビトロで合成ＰＣＣペプチドであるＲＡＤＬＩＡＹＬＫＱＡＴＫに応答する。このマウスは、インビトロおよびインビボの両方でＰＣＣ特異的なＴ細胞応答を試験するために、そして受動移入（受動免疫伝達）実験を実施するために優れた手段を提供する。受動移入は、種々のＴ細胞前駆体頻度における応答を研究するために、非トランスジェニックマウスにＰＣＣ反応性Ｔ細胞の導入を可能にする強力な方法である。
【０１１５】
（５Ｃ．Ｃ７  Ｔ細胞に対するＳＡＧ：ＰＣＣペプチドの抗原性）
本実験は、ＳＡＧ：ペプチド結合体がインビトロでどの程度強力かを決定する。これは、この抗原が、培養物中に存在するＡＰＣにどの程度十分に取り込まれて、提示されるか、そしてＭＨＣクラスＩＩに対するＳＡＧの結合がＴ細胞に対する提示を増強するか否かという試験である。
【０１１６】
成体５Ｃ．Ｃ７マウス由来のリンパ節Ｔ細胞を、培養物中に添加する前に、以下とともにインキュベートした：種々の量のいずれかの合成ＰＣＣペプチド単独、ＳＰＥＣ−Ｙ１５Ａ．Ｃ２７Ｓ．Ｎ７９Ｃ、ＰＣＣペプチド、およびＳＰＥＣ−Ｙ１５Ａ．Ｃ２７Ｓ．Ｎ７９Ｃ、Ｒ１８１（結合していないか、または結合している）。３日間の３Ｈチミジン取り込みアッセイによって、ＭＨＣクラスＩＩ拘束されたＴ細胞応答を測定した。使用した方法は、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（１９９８），Ｃｏｌｌｉｇａｎ，Ｊ．，Ｋｕｉｓｂｅｃｋ，Ａ．Ｍ．Ｓｈｅｖａｃｈ，Ｅ．Ｍ．およびＷ．Ｓｔｒｏｂｅｒ編，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ（参考文献２５）に記載のような標準的技術であった。
【０１１７】
（結果）
図１は、５Ｃ．Ｃ７  Ｔ細胞が、ペプチド単独よりもＳＡＧ：ＰＣＣ結合体に対して反応が１０，０００分の１少なかったことを示す。ＳＡＧ：ＰＣＣ結合体に対する最適の応答は、未結合型に添加した同じ成分についての１００ｎＭと比べて、１０ｐＭで生じた。ＳＡＧ：無関係のペプチドに対しては応答は観察されず、このことは、この応答がＰＣＣペプチドに特異的であることを示した。
【０１１８】
（５Ｃ．Ｃ７マウスにおけるＳＡＧ：ＰＣＣ結合体の免疫原性）
これは、ＳＡＧ：ペプチド結合体がインビトロで免疫応答を生成する能力を試験し、そしてＳＡＧ：ペプチド結合体の免疫原性（すなわち、ペプチド特異的なＴ細胞を刺激および拡張すること）の試験である。
【０１１９】
（ｉ）野生型Ｃ５７Ｂｌ／６マウスへの５Ｃ．Ｃ７  Ｔ細胞の受動移入
正常な雌性Ｃ５７Ｂｌ／６レシピエントマウスに、免疫化の１週間前に、５×１０６個の５Ｃ．Ｃ７リンパ節細胞をＩＰ（腹腔内）投与する。
【０１２０】
（免疫化プロトコール）
成熟雌性Ｃ５７Ｂｌ／６マウス（前に５Ｃ．Ｃ７  Ｔ細胞を投与された）において、フロイント不完全アジュバントを含む安定なエマルジョン（乳濁液）として、単回の皮下（ＳＣ）用量で抗原を注射した。以下のうち１つを用いる各用量について２匹のマウスを注射した：
１．ＰＣＣペプチド単独（１ｍｇおよび１００ｍｇ）
２．ＰＣＣペプチド＋ＳＰＥＣ−Ｙ１５Ａ．Ｃ２７Ｓ．Ｎ７９Ｃ．Ｒ１８１
３．ＳＰＥＣ：ＰＣＣ結合体（２０ｎｇ）
１０日後にマウスを屠殺し、そして腸間膜流入リンパ節を取り出した。１×１０５個のリンパ節細胞／ウェルを、種々の量の合成ＰＣＣペプチドとともに二連で培養し、そして３日間の３Ｈチミジン取り込みアッセイによって、Ｔ細胞の増殖応答を測定した。
【０１２１】
（結果）
図２は、免疫した５Ｃ．Ｃ７マウスに対して用いたＳＡＧ：ＰＣＣ結合体の最低用量が２０ｎｇであったこと、およびこれが１００ｍｇの遊離のＰＣＣペプチドと等価な最適の免疫を生成したことを示す。１ｍｇのＰＣＣペプチドは、非免疫原性であった。従って、ＳＡＧ：ＰＣＣ結合体は、遊離のペプチドよりも少なくとも１０，０００倍、免疫原性であった。ＳＰＥＣに対して無関係のペプチドを結合した場合、検出可能な免疫応答は生じなかった。より低用量のＳＡＧ：ＰＣＣ結合体でさえ、免疫原性であると考えられ、これは結合したＰＣＣペプチドと未結合のＰＣＣペプチドとの間の力価の有効な差異を１００，０００倍まで増大する。
【０１２２】
これらの研究は、ＳＰＥＣ−Ｙ１５Ａ．Ｃ２７Ｓ．Ｎ７９Ｃ．Ｒ１８１が、合成ペプチドのような免疫原性に乏しい抗原のための有効な送達ビヒクルとして役立つことを示す。このペプチドはインビトロで、有意にさらに抗原性であるだけでなく、このペプチドは、翻訳されてインビボで結果として免疫原性が増強されもする。ＴｃＲ結合欠損スーパー抗原であるＳＰＥＣ−Ｙ１５Ａ．Ｃ２７Ｓ．Ｎ７９Ｃに対する結合によって、ＰＣＣペプチドの免疫原性は、少なくとも１０，０００倍まで増大した。
【０１２３】
ＭＨＣクラスＩＩ結合欠損のＳＰＥ−Ｃ変異体は、ＰＣＣペプチドの抗原性を増強しない。
【０１２４】
ＭＨＣクラスＩＩに対する単一の亜鉛結合部位を破壊する、ＳＰＥＣ−Ｃの組み換え変異体を作製した。この変異体を合成ＰＣＣペプチドに結合させて、正常なＳＰＥＣ：ＰＣＣ結合体に比べて、インビトロで５Ｃ．Ｃ７  Ｔ細胞を刺激する能力について試験した。
【０１２５】
この結果は、この変異体ＳＰＥＣ：ＰＣＣ結合体が、ＳＰＥＣ＋遊離ペプチド単独と同じ程度に抗原性であることを示す。このことは、抗原性の増強が、ＭＨＣクラスＩＩを発現する細胞に結合するＳＰＥ−Ｃの能力（スーパー抗原に特有の機能）の結果であることを示す。
【０１２６】
図３は、抗原性の増強に対するＭＨＣクラスＩＩ結合の重要性、およびＳＰＥＣが単に「非特異的な（ｎｏｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ）」キャリアタンパク質として機能するのではないことを表すデータを示す。
【０１２７】
（実施例１０：複数のペプチドの結合）
結合は、個々のペプチドに限定される必要はない。ペプチドに対する免疫応答は、宿主のＭＨＣ多形性に緊密に制限されるので、いくつかの状況では、複数のセットのペプチドで免疫して、広範なスペクトルの免疫調節性因子を生成することが適切であるかもしれない。上記の手順または改変されたバージョン（従って、これは当業者に明白である）によって、大きい抗原（例えば、ウイルス、細菌、または他のタンパク質抗原）の種々の成分を示す複数のペプチドが結合され、混合したペプチド：ＳＡＧ結合体抗原応答を提供して、結合体の多様性を増加させる。さらに、免疫応答をより望ましい結果に微調整するために、ペプチドの比は、容易に制御され得る。
【０１２８】
本発明のさらなる実施形態、および本明細書において記載される原理を適用することによって、以下がまた達成され得る：
・ＭＨＣクラスＩおよびＭＨＣクラスＩＩ拘束ペプチドを、組み合わせて、改善されたヘルパーＣＤ４および細胞溶解性ＣＤ８エフェクター細胞を提供し得る。
【０１２９】
・２つ以上のウイルス抗原由来の免疫優性（イムノドミナント）のペプチドを組み合わせて、選択的な抗ウイルス免疫を促進し得る。
【０１３０】
・防御的免疫応答において正常には優勢でない（ただしウイルスの複製またはライフサイクルに必須の領域を示し、そして本質的には強力に保存されている）ウイルス抗原の領域由来のペプチドを用い得る。これは、レトロウイルス（例えば、ＨＩＶ）のような非常に変異しているウイルスに対するワクチンを開発するには特に重要である。
【０１３１】
・ペプチドおよび他の抗原を免疫調節性因子と一緒に組み合わせて、この免疫調節性因子によって送達し、免疫応答を増強または調節し得る。
【０１３２】
（実施例１１：より大きい抗原および複合体構造の結合）
ポリペプチドおよびタンパク質を、変異ＳＡＧに対する可逆性ジスルフィド交換によって、上記と同じ手順を用いて結合し得る。さらに、最初にウイルスを化学物質で処理する（反応性スルフヒドリル基を導入する）ことによって、より大きい構造（例えば、ウイルス）を、ＴｃＲ欠損ＳＡＧで「コーティング（ｃｏａｔｅｄ）」し得る。
【０１３３】
ポリペプチドが天然に存在する露出したシステイン残基を有する場合、反応性スルフヒドリル基の導入の必要性なしに、ＳＡＧに対する直接結合が達成され得る。この場合、結合は上記に概説された確立された手順に従う。
【０１３４】
（化学的な結合方法）
ポリペプチドが、天然に存在するシステインを有さない場合、反応性スルフヒドリル基を導入する２つの方法が存在する。
【０１３５】
ａ．システイン残基を、組み換えペプチドに遺伝子的に導入し得、そしてこのポリペプチドを、異種発現系（原核生物発現系、または真核生物発現系）から発現し得る。
【０１３６】
ｂ．化学的結合試薬を使用して、標的タンパク質またはより大きい構造中に反応性スルフヒドリルを導入し得る。多数の化学物質を使用して、タンパク質および他の構造上に反応性スルフヒドリル基を導入し得る。このような化学物質の１つは、Ｎ−スクシンイミジル  Ｓ−アセチルチオールプロプリオネート（ＳＡＴＡ−Ｐｉｅｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）およびその近接したアナログＳＡＴＰである。この化学物質は、タンパク質またはより大きい構造上の遊離のアミノ基を保護されたスルフヒドリル基に変換し、このスルフヒドリル基がヒドロキシルアミンで活性化される。これによって、還元性ジスルフィド結合を介したＳＰＥＣ−Ｙ１５Ａ．Ｃ２７Ｓ．Ｎ７９Ｃ．Ｒ１８１のようなタンパク質を含む他のスルフヒドリルの結合が可能になる。
【０１３７】
関係する技術は、本明細書において参考として援用される、引用文献２１に記載される。
【０１３８】
特定の病原体についての防御免疫を生成することが公知のタンパク質の送達は、まずＴｃＲ切除したＳＡＧに対するタンパク質の結合によって、より免疫原性にされ得る。このポリペプチドは、宿主の免疫系に対して、複数の拘束されたペプチドエピトープを提示するＡＰＣによって、内部で壊される。抗ウイルス免疫は、樹状細胞のようなＡＰＣに対してウイルスを選択的に標的する分子上への付加によって増強され得る。
【０１３９】
（実施例１２：マウスにおける多発性硬化症、およびＥＡＥ）
多発性硬化症については、優勢な自己抗原は、ミエリン鞘の主な成分である、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）であると考えられる。実験的アレルギー性脳炎（ＥＡＥ）は、ヒトの多発性硬化症のための十分に確立されたマウスモデルである。ＥＡＥは、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）を用いて感受性マウスを免疫することによって生じ得る。このミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）は、神経のミエリンコーティングを攻撃する抗ＭＢＰ反応性Ｔ細胞を生成し、これが、運動制御の消失によって特徴付けられる脳炎疾患を導く１８。
【０１４０】
ＥＡＥモデルは、ＳＡＧ：ＭＢＰペプチド、または変異体ＳＡＧ：ＭＢＰタンパク質結合体が、疾患の開始を阻害するか、または既存の疾患を抑制する能力を試験するために用いられ得る１９。マウスにおけるＥＡＥ疾患の発現を抑制する能力について、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）由来のペプチド（アゴニストおよびアンタゴニストの両方）が試験される。
【０１４１】
（実施例１３：抗ウイルス応答およびＭＨＣクラスＩ拘束ペプチド）
変異体ＳＡＧ：ペプチド結合体はまた、ＭＨＣクラスＩ拘束されたＣＴＬ応答を増強するように働く。ＣＤ８陽性ＣＴＬは、内因性プロセシング経路を介するウイルス感染および複製由来のＭＨＣクラスＩによって提示されるペプチドを認識する。しかし、ＭＨＣクラスＩ分子およびＭＨＣクラスＩＩ分子の両方によって「共有される（ｓｈａｒｅｄ）」べきペプチドについての内因性経路と外因性経路との間には有意なクロストーク（ｃｒｏｓｓ−ｔａｌｋ）が存在することが示されている。
【０１４２】
ウイルス感染または腫瘍に対する防御的細胞溶解性応答は、長期の防御免疫を提供するためには、必須のＣＤ４  ＭＨＣクラスＩＩ依存性応答、およびＭＨＣクラスＩ拘束ＣＤ８応答を要すると考えられる。従って、ＭＨＣクラスＩ拘束ペプチドおよびＳＡＧ変異体、またはＭＨＣクラスＩ拘束ペプチドおよびＭＨＣクラスＩＩ拘束ペプチドの両方の組み合わせの結合体から構築されたワクチンは、ＣＤ４応答およびＣＤ８応答の両方を促進する効率的なワクチンを設計するための柔軟なアプローチを提供する。
【０１４３】
（ＬＣＭＶ３３〜４１ペプチド、および３１８トランスジェニックマウス）
３１８トランスジェニックマウスは、ＭＨＣクラスＩ抗原Ｈ−２Ｄｂ２０の状況下でリンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）ペプチドを認識する、トランスジェニックＴｃＲを有するＣ５７ＢＬ／６マウスである。活性ペプチドの配列は、ヌクレオカプシドタンパク質に起源する、ＣＫＡＶＹＮＦＡＴＭである。３１８マウスは、ＳＰＥＣ−Ｙ１５Ａ．Ｃ２７Ｓ．Ｎ７９Ｃ．Ｒ１８、および他のＴｃＲ欠損ＳＡＧが、ＣＤ８細胞傷害性Ｔ細胞にＭＨＣクラスＩ拘束ペプチドを送達する能力をモデリングするために用いられる。ＬＣＭＶペプチドを用いてプレインキュベートした標的細胞に対して細胞傷害性応答を生成するために必要なＳＡＧ：ＬＣＭＶ結合体の量によって、送達の有効性を測定する（標準的な細胞傷害性アッセイ）。
【０１４４】
（ＭＨＣクラスＩ拘束応答を測定するための５１Ｃｒ放出細胞傷害性アッセイ）
標的細胞（Ｐ１８４）を５１Ｃｒとともにインキュベートし、そしてＬＣＭＶペプチドを用いて３７℃で１時間パルスする。遠心分離によって細胞を洗浄し、そして免疫マウス由来のリンパ節細胞と種々のＥ：Ｔ比で混合する。
【０１４５】
細胞を軽度に遠心分離し、３７℃で１時間インキュベートする。上清を取り出して、５１Ｃｒについてカウントして、細胞溶解の程度を決定する。
【０１４６】
８位で改変した合成ＬＣＭＶペプチド（Ｍ８Ｃ）を、上記と同じ方法を用いてＳＰＥＣ−Ｙ１５Ａ．Ｃ２７Ｓ．Ｎ７９Ｃ．Ｒ１８１と結合させる。ＳＡＧ：ＬＣＭＶを用いて、３１８マウス由来のリンパ節細胞におけるインビトロ応答を決定する。
【０１４７】
（ウイルス感染に対する耐性）
ＬＣＭＶに感染したマウスは、細胞変性効果によって１４日内に死亡する。ＬＣＭＶに対して免疫したマウスは、ＣＴＬ応答を発達させ、これが完全な防御を提供する。ＳＡＧ：ＬＣＭＶで免疫したマウスを、野生型ＬＣＭＶウイルスに対する耐性について試験する。
【０１４８】
（実施例１４：抗腫瘍免疫）
多くの新規な癌免疫療法は、樹状細胞に対して、可能性のある腫瘍特異的抗原（通常は、系統特異的な抗原または分化抗原）を直接標的することによって、宿主腫瘍耐性を破壊しようと試みた。本発明者らは、ＴｃＲ欠損ＳＡＧが、腫瘍特異的抗原をＡＰＣに有効に標的し、そして抗原提示を増強する同時刺激シグナルを促進し得るという仮説を試験する。最初の研究は、３１８ＴｃＲトランスジェニックマウスにおける腫瘍モデルを使用する。
【０１４９】
（ルイス肺癌および３１８トランスジェニックマウス）
本発明者らは、３１８トランスジェニックマウスを用いる腫瘍防御のマウスモデルを最初に使用する。ＬＣＭＶ糖タンパク質を発現する遺伝子でトランスフェクトされたルイス肺癌細胞株によって、３１８マウスが腫瘍を拒絶する能力を検討するためのモデルが提供される。この細胞株は、高い転移能力を有する。マウスをＳＡＧ：ＬＣＭＶペプチドで免疫し、次いで腫瘍細胞を接種する。転移病巣の程度を、接種後種々の時点で確認し、免疫していないマウスと比較する。
【０１５０】
また、マウスを接種し、次いで腫瘍接種後種々の時点で免疫して、免疫化が、確立された腫瘍増殖を防御するか否かを決定する。
【０１５１】
（実施例１５：ＳＡＧに対する結合によってＴ細胞に対するタンパク質全体の抗原性を増大する）
ハトチトクロームＣタンパク質（ＰＣＣ）（Ｓｉｇｍａ）全体の１ｍｇを、１ｍｇの架橋試薬Ｎ−スクシンイミジルＳアセチルチオプロプリオネート（ＳＡＴＰ）（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いてｐＨ７．０で室温で１時間処理した。十分確立されたプロトコールを用いてゲルクロマトグラフィーによって、過剰な架橋を取り除き、そしてＰＣＣ−ＳＡＴＰを０．１Ｍヒドロキシルアミンで活性化し、１００μｇの組み換えＳＡＧとともにｐＨ８．５で１時間インキュベートしてタンパク質を結合させた。十分に確立されたプロトコールに従ったサイズ排除クロマトグラフィーによって、遊離の反応物から、結合体を分離した。
【０１５２】
この方法によって、１：１のモル比でＰＣＣと結合体を形成する約３０％のＳＡＧが得られる。
【０１５３】
５Ｃ−Ｃ７マウスＴ細胞由来のリンパ節細胞の培養物とともに結合体をインキュベートして、十分に確立されたプロトコールに従って、３Ｈチミジン組み込みによって３日後にＴ細胞の増殖を測定した。これらの研究の結果を図５に示す。
【０１５４】
この結果は、ＳＰＥＣまたはＳＭＥＺのいずれかに対して結合された場合の、ＰＣＣタンパク質に対する抗原性の実質的な増大を示す。それらは、抗原性の増大を達成するためのＭＨＣクラスＩＩに対するＳＡＧの結合の重要性をさらに強調する。
【０１５５】
本発明の例示的なＴｃＲ欠損免疫調節性結合体のいくつかの利点および特徴は以下である：
ａ．ＳＡＧが、全てのＴｃＲに対する結合を完全に欠損しており、そのためインビボで毒性でない。
【０１５６】
ｂ．ペプチドの結合は単純、効率的、かつ可逆性であり、そして広範に適用可能である。
【０１５７】
ｃ．ＳＡＧ：ペプチド結合体が可溶性である。
【０１５８】
ｄ．ＭＨＣクラスＩＩに対するＳＡＧ結合が、免疫原性部分および非免疫原性部分のＡＰＣ活性化を増強する。
【０１５９】
本発明を、特定の好ましい実施例を参照して記載してきたが、本発明の広範な原理および趣旨を保持しているバリエーションはまた、本発明の範囲内であると意図されることが理解される。
【０１６０】
（参考文献）
【０１６１】
【参１】
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【０１６２】
【参２】
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【０１６３】
【参３】
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【０１６４】
【参４】
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【０１６５】
【参５】
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【図面の簡単な説明】
【図１】
ＳＡＧ：ＰＣＣ結合体の抗原性。
【図２】
ＳＰＥＣ：ＰＣＣ結合体の免疫原性。
【図３】
インビトロでのＳＰＥＣ−ＣｙｔＣ、対、ＭＨＣ−／−ＳＰＥＣ−ＣｙｔＣ、および遊離ＣｙｔＣペプチドに対する５Ｃ．Ｃ７  ＬＮ細胞の増殖。
【図４】
ＳＭＥＺ  ＴｃＲ変異体の増殖応答。
【図５】
ＰＣＣ−ＳＡｇ複合体を用いた５Ｃ．Ｃ７  ＬＮ細胞の増殖応答（凡例：赤線は、ＰＣＣタンパク質単独に対する増殖応答を示す。青の四角付の線は、ＰＣＣ−ＳＰＥＣに対する応答が、結合していないＰＣＣタンパク質よりも１００倍抗原性であることを示す。緑の四角付の線は、ＰＣＣ−ＳＭＥＺに対する応答であり、そして結合していないＰＣＣタンパク質に対してよりも約８０倍抗原性である。黒の四角付の線は、ＭＨＣクラスＩＩ結合においてＳＰＥＣ欠損に対して結合したＰＣＣに対する応答が、結合していないＰＣＣタンパク質に対する応答と同程度であることを示す。三角は、ＳＡＧおよびＰＣＣ（混合物として一緒になっているが、結合はしていない）に対するＴ細胞の増殖反応を示す）。
【図６】
Ｃ末端ドメインＳＰＥ−ＣがヒトＰＢＬｓのバックグラウンドを超える刺激活性を有さないことを示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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