(57)【要約】本発明は、ＲＡＮＫＬ誘発性の破骨細胞活性化のプロセスにおいて重要な酵素であるｃａｐＧの同定に関する。本発明は、ｃａｐＧのモジュレーター、該モジュレーターの同定のためのアッセイ、並びに骨粗しょう症および関連疾患状態の治療および予防における該モジュレーターの使用を含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｃａｐＧの活性をモジュレートする化合物を同定するためのアッセイであって、
（１）ｃａｐＧを発現する細胞を供し；
（２）該ｃａｐＧを発現する細胞を被験化合物と接触させ；そして、
（３）該被験化合物がｃａｐＧと相互作用するかどうかを測定する、
ことを含む、該アッセイ。
【請求項２】
アッセイは細胞ベースのアッセイである、請求項１に記載のアッセイ。
【請求項３】
アッセイは細胞なしのアッセイである、請求項１に記載のアッセイ。
【請求項４】
細胞なしのアッセイはリガンド結合アッセイである、請求項３に記載のアッセイ。
【請求項５】
被験化合物はｃａｐＧの活性をモジュレートする、請求項１に記載のアッセイ。
【請求項６】
被験化合物はｃａｐＧ拮抗薬である、請求項１に記載のアッセイ。
【請求項７】
被験化合物はｃａｐＧ作動薬である、請求項１に記載のアッセイ。
【請求項８】
被験化合物はｃａｐＧと結合する、請求項１に記載のアッセイ。
【請求項９】
被験化合物はｃａｐＧの活性を抑制する、請求項１に記載のアッセイ。
【請求項１０】
該アッセイは骨粗しょう症の処置に有用であろう化合物を同定するためである、請求項１に記載のアッセイ。
【請求項１１】
骨粗しょう症の治療法であって、該治療の必要な患者に請求項１に記載のアッセイによって同定された化合物の治療学的に有効な量を投与することを含む、該方法。
【請求項１２】
骨粗しょう症の治療法であって、
（１）骨粗しょう症を患っている患者を同定し；そして、
（２）該患者に治療学的に有効な量のｃａｐＧのモジュレーターを投与する、
ことを含む、該方法。
【請求項１３】
患者におけるｃａｐＧの発現レベルを測定することによって、該患者を骨粗しょう症を患っているものと同定する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
モジュレーターはｃａｐＧ拮抗薬である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
骨粗しょう症の予防法であって、
（１）骨粗しょう症の危険がある患者を同定し；そして、
（２）該患者に治療学的に有効な量のｃａｐＧのモジュレーターを投与する、
ことを含む、該方法。
【請求項１６】
患者におけるｃａｐＧの発現レベルを測定することによって、該患者を骨粗しょう症の危険があるものと同定する、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
モジュレーターはｃａｐＧ拮抗薬である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
骨粗しょう症の予防法であって、
（１）骨粗しょう症の危険がある患者を同定し；そして、
（２）患者がｃａｐＧの発現を増大したかどうかを測定する、
ことを含み、ここで
該増大した発現は骨粗しょう症の危険がない患者におけるｃａｐＧの発現と比べて測定する、該方法。
【請求項１９】
破骨前駆細胞の破骨細胞への分化を低下させる方法であって、該破骨前駆細胞をｃａｐＧモジュレーターと接触させることを含む、該方法。
【請求項２０】
モジュレーターはｃａｐＧ拮抗薬である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
ｃａｐＧの活性をモジュレートすることができる化合物。
【請求項２２】
化合物を、
（１）ｃａｐＧを発現する細胞を供し；
（２）ｃａｐＧを発現する該細胞を該化合物と接触させ；そして、
（３）該化合物がｃａｐＧの活性をモジュレートするかどうかを測定する、
ことによって同定する、請求項２１に記載の化合物。
【請求項２３】
化合物はｃａｐＧ拮抗薬である、請求項２１に記載の化合物。
【請求項２４】
化合物はｃａｐＧ作動薬である、請求項２１に記載の化合物。
【請求項２５】
化合物はｃａｐＧと結合する、請求項２１に記載の化合物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（技術分野）
本発明は、診断学的マーカーとしてのｃａｐＧの使用を含む方法、およびｃａｐＧモジュレーターの同定方法に関する。該ｃａｐＧモジュレーターは、骨粗しょう症および関連疾患状態の治療および予防に有用である。
【０００２】
（背景技術）
破骨細胞は、骨格のモデリングおよびリモデリングの正常なプロセスの一部として骨を再吸収する、単球／マクロファージ系統由来の末端で分化された細胞である。前駆細胞と対比して、十分に分化された成熟破骨細胞だけが骨を再吸収することができる。破骨細胞による骨再吸収の増大は、いくつかの骨格障害、最も顕著には閉経期後の骨粗しょう症の病因と関連付けられてきた。活性化された破骨細胞は骨再吸収の新たな部位を開始するために骨表面上を移動するので、細胞骨格再構築は、ポドソーム(posdosome)（これは、中間段階で骨マトリックスと結合する）と呼ばれる特異な細胞接着構造の生成を生じる。ポドソームは、アクチン結合性タンパク質のビンクリン、タリン(talin)、およびα−アクチニンによって囲まれているＦ−アクチンコアを構成する（Marchisio, P. C.らによる「Cell-substratum interactions of cultured avian osteoclasts is mediated by specific adhesion structures」，J. Cell Biol., 99: 1696-1705 (1984)）。骨と結合した破骨細胞は密接した(tight)シーリングゾーンを生成し、それは封入された(enclosed)再吸収ラクナを生じる。局在化した膜ラフリング(ruffling)は該骨に面している細胞表面で生じ、このことにより、再吸収ラクナ内でのプロトンおよび分解性酵素の運搬が可能となる。それらのラフリングされた辺縁の生成に関与することが知られる１化合物はゲルゾリンであるが、これはその正確な機能が未だ知られていない。
【０００３】
ゲルゾリンは、大きく且つ多様なゲルゾリンスーパーファミリータンパク質の要素である。いくつかのゲルゾリンファミリータンパク質はアクチンフィラメントを切断し、およびキャップ(cap)するが、一方で他のものはキャップするだけである。いくつかはまた、フィラメントを束ねることができる。ゲルゾリンそのものは、様々な機構によってインビトロではアクチンフィラメントの長さをおよびインビボでは細胞の形および運動性を制御する、アクチン結合性のタンパク質である（Cunningham, C. C.らによる「Enhanced motility in NIH3T3 fibroblasts that overexpress gelsolin」，Science, 251: 1233-1236 (1991)）。ゲルゾリンは、集合したアクチンフィラメントを切断し、速く増殖するプラス(plus)端をキャップし、そして核形成部位を創生することによってアクチンフィラメントの増殖を促進する（Stossel, T. P.らによる「From signal to pseudopod. How cells control cytoplasmic actin assembly」，J. Biol. Chem., 264: 18261-18264 (1989)）。切断およびキャッピングはカルシウムイオンおよびｐＨによって調節され、これはゲルゾリンのアクチンとの結合を相乗的に活性化する。ゲルゾリンのホスホイノシチドとの結合はフィラメント端（非キャッピング）からのゲルゾリンの放出を引き起こし、これにより速い単量体の付加のための部位を与える（Jamney, P. A.およびT. P. Stosselによる「Modulation of gelsolin function by polyphosphoinositol (4,5)-bisphosphate」，Nature, 325: 362-364 (1987)；Janmey, P. A.らによる「Polyphosphoinositide micelles and polyphosphoinositide-containing vesicles dissociate endogenous gelsolin-actin complex and promote actin assembly from the fast growing end of actin filaments blocked by gelsolin」，J. Biol. Chem., 262：12228-12236 (1987)）。
【０００４】
タンパク質のゲルゾリンスーパーファミリーの他の要素である、ｃａｐＧ（これは、これまでにマクロファージのキャップタンパク質、ｇＣａｐ３９およびＭｂｈ１として知られる）は、ゲルゾリンに対する配列類似度を示し（Onoda, K.およびH. L. Yinによる「gCap39 is phosphorylated. Stimulation by okadaic acid and preferential association with nuclei」，J. Biol. Chem., 268: 4106-4112 (1993)；Prendergast, G. C.およびE. B. Ziffによる「Mbh 1: A novel gelsolin/severin-related protein which binds actin in vitro and exhibits nuclear localization in vivo」，EMBO, 10: 757766 (1991)）、そしてこのものはマクロファージ機能において重要な役割を果たしていることが分かっている。ＣａｐＧは、反矢じり端(barbed ends)をキャップし、そしてアクチン集合を核形成するが、切断せず、このことはゲルゾリンとは異なる。ゲルゾリンと同様に、ｃａｐＧはミクロモルのカルシウムを必要とし、そしてホスホイノシチドによって抑制されるが、ゲルゾリンとは違って、ｃａｐＧは低カルシウム濃度でアクチンフィラメントの端から解離する（Young, C. L.らによる「Calcium regulation of actin filament capping and monomer binding by macrophage capping protein」，J. Biol. Chem., 269: 13997-14002 (1994)）。
【０００５】
ｃａｐＧのアミノ酸配列は、ゲルゾリンに存在する３〜６個の繰り返しから構成され、そして原虫生物タンパク質のセベリン(severin)およびフラグミン(fragmin)に類似する（Dabiri, G. A.らによる「Molecular cloning of human macrophage capping protein cDNA. A unique member of the gelsolin/villin family expressed primarily in macrophages」，J. Biol. Chem., 267: 16545-16552 (1992)）。ＣａｐＧ発現はマクロファージ中での全細胞質タンパク質の１％である（「Comparisons of CapG and gelsolin-null macrophages: demonstration of a unique role for CapG in receptor-mediated ruffling, phagocytosis, and vesicle rocketing.」，J. Cell Biol., 154: 775-784 (2001)）。ＣａｐＧは、アクチンベースのマクロファージ運動性において重要な機能を果たしており、これはゲルゾリンのものとは区別される。ＣａｐＧは、受容体媒介性の膜ラフリングに必要とされる。
【０００６】
その上、破骨前駆細胞は受容体、ＮＦ−κＢの受容体アクチベーター（ＲＡＮＫ）（これは、分化を引き起こすリガンド（ＲＡＮＫＬ）を認識する）を有することが知られる（（Suda, T.らによる「Modulation of Osteoclast Differentiation and Function by the New Members of the Tumor Necrosis Factor Receptor and Ligand Families」, Endocr. Rev., 20: 345-357 (1999)：Takahashi, N.らによる「A New Member of Tumor Necrosis Factor Ligand Family, ODF/OPGL/TRANCE/RANKL, Regulates Osteoclast Differentiation and Function」, Biochem. and Biophys. Res. Comm., 256: 449455 (1999)）。該ＲＡＮＫＬ受容体は腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）ファミリーの要素であって、そして骨破壊起源の特異的な誘発物質である（Simonet W. S.らによる「Osteoprotegerin: a novel secreted protein involved in the regulation of bone density」，Cell, 89 (2): 309-319 (1997)：Kong, Y. Y.らによる「OPGL is a key regulator of osteoclastogenesis, lymphocyte development and lymph-node organogenesis」，Nature, 397 (6717): 315-323 (1999)）。加えて、ＲＡＮＫＬおよびＲＡＮＫノックアウトマウスは骨粗しょう症を示し、このことは破骨細胞の分化におけるそれらの重要性を示唆する。
【０００７】
ＰＩ３キナーゼ、ｒｈｏＡ、ゲルゾリンおよびｐｐ６０ｃ−ｓｒｃは細胞骨格再構築および破骨細胞媒介性の骨再吸収にとって必須であることは分かっているが、該ＲＡＮＫＬ受容体を通じて開始されるシグナル伝達事象についてはほとんど知られていない（Nakamura, I.らによる「Phosphatidylinositol-3 kinase is involved in ruffled border formation in osteoclasts」，J. Cell Physiol., 172 (2): 230-239 (1997)；Chellaiah, M. A.らによる「Rho-A is critical for osteoclast podosome organization, motility, and bone resorption」，J. Biol. Chem., 275 (16): 11993-20002 (2000)；Schwartzberg, P. L.らによる「Rescue of osteoclast function by transgenic expression of kinase-deficient Src in src-/-mutant mice」，Genes Dev., 11 (21): 2835-44 (1997)）。
【０００８】
従って、ＲＡＮＫＬ経路に関与する化合物、およびモジュレーター（これは、骨粗しょう症および関連疾患状態の同定、予防および治療に有用である）を同定するための絶え間ない要求が存在する。本発明は、これらの要求および他の要求を満たすことに関する。
【０００９】
（発明の概要）
現在、ｃａｐＧは、ＲＡＮＫＬ誘発性の破骨細胞活性化のプロセスにおける重要な酵素であると見出されている。したがって、本発明は、診断学的な目的のためのタンパク質マーカーとしてのおよび薬物発見のための分子標的としてのｃａｐＧの使用に関する。本発明は更に、ＲＡＮＫＬ経路におけるｃａｐＧのモジュレーター、該モジュレーターの同定方法、並びに骨粗しょう症および関連疾患状態の予防および治療における医薬組成物中の該モジュレーターの使用方法に関する。
【００１０】
１態様において、本発明はｃａｐＧの活性をモジュレートする化合物を同定するためのアッセイに関するものであって、このものは（１）ｃａｐＧを発現する細胞を供し；（２）ｃａｐＧを発現する細胞を被験化合物と接触させ：そして、（３）該被験化合物がｃａｐＧと相互作用するかどうかを測定する、工程を含む。該アッセイは、細胞ベースのアッセイまたは細胞なしのアッセイ（例えば、リガンド結合アッセイ）であり得る。該被験化合物はｃａｐＧの活性をモジュレートすることができ、そしてｃａｐＧ拮抗薬またはｃａＧ作動薬であり得る。更に、該被験化合物はｃａｐＧと結合することができ、そしてｃａｐＧの活性を抑制することができる。該アッセイは、骨粗しょう症の処置に有用であろう化合物を同定するためであり得る。
【００１１】
別の態様において、本発明は骨粗しょう症の治療法に関するものであって、該方法は該治療の必要な患者に、本アッセイによって同定される化合物の治療学的に有効な量を投与することを含む。
【００１２】
別の態様において、本発明は骨粗しょう症の治療法に関するものであって、該方法は（１）骨粗しょう症を患っている患者を同定し；そして、（２）該患者にｃａｐＧモジュレーターの治療学的に有効な量を投与する、工程を含む。患者におけるｃａｐＧの発現レベルを測定することによって、該患者は骨粗しょう症を患っているものと同定され得る。
【００１３】
別の態様において、本発明は骨粗しょう症の予防法に関するものであって、該方法は（１）骨粗しょう症の危険がある患者を同定し；そして、（２）該患者にｃａｐＧモジュレーターの治療学的に有効な量を投与する、工程を含む。患者におけるｃａｐＧの発現レベルを測定することによって、該患者は骨粗しょう症の危険があるものと同定され得る。
【００１４】
別の態様において、本発明は骨粗しょう症の予防法に関するものであって、該方法は（１）骨粗しょう症の危険がある患者を同定し；そして、（２）該患者がｃａｐＧの発現を増大したかどうかを測定する、工程を含み、ここで該増大した発現は骨粗しょう症の危険のない患者におけるｃａｐＧの発現と比べて測定する。
【００１５】
別の態様において、本発明は破骨前駆細胞の分化を低下させる方法に関するものであって、該方法は該破骨前駆細胞をｃａｐＧモジュレーターと接触させる工程を含む。
【００１６】
別の態様において、本発明はｃａｐＧの活性をモジュレートすることができる化合物に関する。本化合物は、（１）ｃａｐＧを発現する細胞を供し；（２）ｃａｐＧを発現する該細胞を該化合物と接触させ：そして、（３）該化合物がｃａｐＧの活性をモジュレートするかどうかを測定する、工程によって同定することができる。該化合物は、ｃａｐＧ拮抗薬、作動薬であり得て、そしてｃａｐＧと結合することができる。
【００１７】
（発明の詳細な記載）
現在、ｃａｐＧは、ＲＡＮＫＬ誘発性の破骨細胞活性化のプロセスにおける重要な酵素であることが見出されている。したがって、本発明は、診断学的な目的のためのタンパク質マーカーとしての、および薬物発見のための分子標的としてのｃａｐＧの使用に関する。本発明は更に、ＲＡＮＫＬ経路におけるｃａｐＧのモジュレーター、該モジュレーターの同定方法、並びに骨粗しょう症および関連疾患状態の予防および治療における医薬組成物中での該モジュレーターの使用方法に関する。
【００１８】
ＣａｐＧ（このものは、マクロファージキャッピングタンパク質、ｇＣａｐ３９およびＭｂｈｌとして当該分野においても知られる）、ｃａｐｓは、アクチンフィラメントの反矢じり端を切断せず、アクチン集合を核形成する。ＣａｐＧは、ミクロモルのカルシウムを必要とし、ホスホイノシチドによって抑制され、そして低カルシウム濃度でアクチンフィラメントの端から解離する。更に、図４に示す通り、そのことはゲルゾリンとの配列類似度に反映される。ほんの１例として、ヒトｃａｐＧは、図４に示すアミノ酸配列を有し（Dabiri, G. A.らによる「Molecular cloning of human macrophage capping protein cDNA. A unique member of the gelsolin/villin family expressed primarily in macrophages」，J. Biol. Chem., 267 (23): 16545-16552 (1992)）、Mishra, V. S.らによる「The human actin-regulatory protein capG：gene structure and chromosome location」，Genomics, 23 (3): 560-565に記載の核酸配列によってコードされる、タンパク質である。加えて、マウスｃａｐＧはを本発明において使用することができ、そのアミノ酸配列を図４に示し、そしてこのものはPrendergast, G. C.およびE. B. Ziffによる「Mbh 1: A novel gelsolin/severin-related protein which binds actin in vitro and exhibits nuclear localization in vivo」，EMBO, 10 (4): 757-766 (1991)に記載の核酸配列によってコードされる。しかしながら、本発明はヒトまたはマウスのｃａｐＧの使用に限定されるものではなく、そしていずれかの適当な生物由来のｃａｐＧの使用を含むことができる。
【００１９】
破骨前駆細胞は、受容体、ＮＦ−κＢの受容体アクチベーター（ＲＡＮＫ）（これは、分化を引き起こすリガンド（ＲＡＮＫＬ）を認識する）を有する。ＲＡＮＫは、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）の一員であり、そして破骨細胞起源(osteoclastogenesis)の特定の誘発物質である。加えて、ＲＡＮＫＬおよびＲＡＮＫＬノックアウトマウスは大理石骨病を示し、このことは破骨細胞の分化におけるそれらの重要性を示している。
【００２０】
通常のスクリーニングアッセイをｃａｐＧモジュレーターの同定のために本発明の方法において使用することができることは、当該分野の当業者にとって明らかであろう。それらのスクリーニングアッセイとしては例えば、ファロイジン結合蛍光アッセイ、アクチン結合アッセイ、アクチン束化(bundling)遠心沈降アッセイ、および破骨基質（例えば、ゾウゲ質）を用いる共焦点顕微鏡アッセイを含むが、これらに限定されない。
【００２１】
本明細書で使用する用語「モジュレーター」とは該用語の通常の意味を示すが、そのものは例えば、作動薬、拮抗薬、並びにｃａｐＧおよびｃａｐＧタンパク質内のカルシウム結合部位と直接的におよび間接的に結合する化合物を含むが、これらに限定されない。
【００２２】
本発明のＣａｐＧモジュレーターは、骨粗しょう症および関連疾患状態の予防および治療において使用するのに適当である。該モジュレーターとして作用する化合物は、生(raw)化学品としての治療学的な使用のために投与することができたり、または医薬製剤中の活性成分であり得る。
【００２３】
医薬製剤中で供される場合には、ｃａｐＧモジュレーターとして作用する化合物、またはそれらの生理学的に許容し得る塩もしくは溶媒和物は、１つ以上の医薬的に許容し得る担体または賦形剤と一緒に供することができる。該担体または賦形剤は、該製剤の他の活性成分と適合し得て且つそのレシピエントにとって有害でないという意味で許容され得なければいけない。
【００２４】
本発明の医薬製剤は、いずれかの適当な経路（例えば、経口、直腸、鼻腔、局所（頬側および舌下を含む）、膣または非経口（例えば、筋肉内、皮下、静脈内および患部組織ヘの直接的を含む）を含むが、これらに限定されない）による投与のために、あるいは吸入またはガス注入による投与に適当な形態で、製剤化することができる。該製剤は、適宜、別個の投与単位で通常供することができ、また医薬の分野においてよく知られるいずれかの方法によって製造することができる。全ての方法は、該活性化合物を液体担体もしくは微細に粉砕した固体の担体またはその両方と一緒にし、次いで必要ならば該生成物を所望の製剤に成型する、工程を含む。
【００２５】
所望するならば、該活性成分の徐放性を与えるために適合した上記の製剤を使用することができる。本発明の化合物および医薬組成物はまた、他の治療学的な薬物と組み合わせて使用することができる。
【００２６】
ＲＡＷ２６４細胞（マウスのマクロファージセルライン）由来のＲＡＮＫＬ誘発性のシグナル伝達中間体のプロテオミクス分析は、以下の実施例に記載する通り行なった。この分析から、ＲＡＮＫＬがｃａｐＧの特定のチロシンホスホリル化を誘発することを知ることができ、これにより、ＲＡＮＫＬ誘発性の破骨細胞活性化のプロセスにおけるｃａｐＧの重要性を確立することができる。例えば、ｃａｐＧは骨粗しょう症の治療および予防における重要な標的である。
【００２７】
（実施例）
ＲＡＮＫＬ経路におけるｃａｐＧの同定
ＲＡＷ２６４細胞は、Bristol Myers Squibb Department of Metabolic Diseasesから入手した。該細胞を、５％ウシ胎児血清および１％非必須アミノ酸で補足した最少必須培地中で増殖した。アッセイの目的のために、ＲＡＷ２６４細胞を無血清培地中で５時間欠乏させ、次いで２％ウシ胎児血清およびＲＡＮＫリフガンドを含有する培地中で培養した。以下に記載する通り、インビイターを使用した場合には、該細胞をＲＡＮＫＬ刺激前に１時間、該インヒビターに予め曝露させた。
【００２８】
ＲＡＮＫＬ特異的なチロシンホスホリル化を同定するために、ＲＡＷ２６４細胞を、ＰＰ１［４−アミノ−５−(４−メチルフェニル)−７−(ｔ−ブチル)ピラゾロ[３,４−ｄ]ピリミジン］、ｐｐ６０ｓｒｃの特異的なインヒビター、およびワートマニン、ＰＩ３キナーゼの特異的なインヒビター（Lakkakorpi, P. T.らによる「Phosphatidylinositol 3-kinase association with the osteoclast cytoskeleton, and its involvement in osteoclast attachment and spreading」，Exp. Cell Res. 237 (2): 296-306 (1997)）の存在下および非存在下でＲＡＮＫＬを用いて処理し、そして細胞ライセートをプロテオミクス分析によって評価した。細胞ライセートを、２次元電気泳動によって２回分離し、ＰＶＤＦ膜に移した。
【００２９】
一旦、ＰＶＤＦ膜をValdes, I.らによる「Novel procedure for the identification of proteins by mass fingerprinting combining two-dimensional electrophoresis with fluorescent SYPRO red staining」，J. Mass. Spectrom. 35 (6): 672-682 (2000)に記載されている通り、Sypro Ruby Redを用いて染色し、続いて、対応する膜を用いたプロテオミクス分析として抗ホスホチロシン抗体を用いたウェスタンブロットによって分析した。Sypro Ruby Red染色した２−ＤのＲＡＮＫＬ刺激のＲＡＷ２６４細胞ライセートを、図１に示す。ＣａｐＧ１０２は図１において同定し、α−エノラーゼ１００を目印として同定する。
【００３０】
等電点電気泳動法は、Pharmacia IPGストリップ(strip)中、ｐＨを３〜１０の非線形勾配で、約１５０,０００Ｖｈｒで行なった。１０％グリセロール、５０ｍＭ  ＤＴＴ、２．３％ＳＤＳおよび６２．５ｍＭ  トリス(ｐＨ６．５）中で１５分間平衡後に、該ＩＰＧストリップを１０％アクリルアミドスラブ(slab)ゲルの上部に層状とし（厚さが１．００ｍｍ）、そしてＳＤＳスラブゲル電気泳動を２０ワット／ゲルで５時間行なった。該スラブゲルを、ＰＶＤＦ膜に終夜かけて移し、そのものを次いで、１０％酢酸−４０％メタノールの溶液中に３０分間固定化し、続いて製造プロトコールに記載する通り、蛍光色素Sypro Ruby Red（Molecular Probes, Eugene, OR）を用いて終夜染色した。最大の蛍光取りこみは、４時間以内に生じた。
【００３１】
ウェスタンブロットのために、該ＰＶＤＦ膜を１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（ｗ／ｖ）の１％ツウィーン−トリス緩衝生理食塩水（ＴＴＢＳ）（ｖ／ｖ）を用いて２時間よりも長く遮断し、ＴＴＢＳ中ですすぎ、１％ＢＳＡ−ＴＴＢＳ中に１：２,５００で希釈した一次抗体と一緒にインキュベートし、そしてＴＴＢＳ中に１：５,０００で希釈した二次抗体と一緒に１時間インキュベートした。該ブロットをＴＴＢＳを用いてすすぎ、そしてＥＣＤ（Pharmacia Amersham Biotech, Piscataway, NJ）を用いて処理した。画像を、BioRad Fluor-S Max画像診断システムを用いて得た。次いで、該画像をPDQuest 6.1ソフトウェア（BioRad Laboratories Hercules, CA）を用いて解釈した。Sypro蛍光染色したゲル画像と比較して、化学発光染色のウェスタンブロットから得られるデジタル画像から得られる情報に基づいて、ゲル内(ingel)消化のために、試料を選択した。
【００３２】
ＰＰ１の存在下または非存在下でのホスホチロシン活性を示すウェスタンブロットデータを、図２ａ〜２ｄに示す。図２ａは、目印として同定されるα−エノラーゼ１００との非刺激（コントロール）のブロットを示す。ＲＡＮＫＬを用いる刺激は、ｃａｐＧ１０２ホスホリル化を生じる（図２ｂ）。図２ｃおよび２ｄに示す通り、ＰＰ１は、コントロールの非刺激細胞上での、およびＲＡＮＫＬ刺激のＲＡＷ２６４細胞上でのそれぞれのホスホリル化パターンにおいて有意な効果を有する。ＲＡＮＫＬ刺激細胞中でのｃａｐＧホスホリル化の増大、およびＰＰ１の存在下、ＲＡＮＫＬ刺激細胞中でのｃａｐＧホスホリル化の減少は、ｃａｐＧがＲＡＮＫＬ経路における重要な酵素であることを示唆する。
【００３３】
図１〜３に示す対応するSypro Red染色の２−Ｄゲルから選ばれるタンパク質スポットの同定は、インシチュでトリプシンを用いて消化し、次いでＥＳＩ−ＭＳによって分析した。選んだタンパク質スポットを切除し、そして１５分間、２回水洗した。次いで、試料をSavant SpeedVac中で真空乾燥した。次いで、該試料を還元し(reduced)、アルキル化し、そして該ゲル片を５０％アセトニトリル：１００ｍＭ炭酸水素アンモニウム（ｖ／ｖ）を用いて洗浄し、そして再び真空乾燥した。次いで、該ゲル片を１２．５ｎｇのトリプシンを含有する炭酸水素アンモニウムを用いて再水和して、３７℃で終夜インキュベートした。消化後に、該ゲル片を５０％アセトニトリル：１００ｍＭ炭酸水素アンモニウム（ｖ／ｖ）を用いて抽出し、そして該上清を真空乾燥した。該乾燥した物質を、質量スペクトル分析のためにギ酸中に再懸濁した。
【００３４】
該ゲル片からペプチドの抽出後に、該試料を乾固するまで蒸発させた（Model AES2010, Savant Instruments, Holbrook, NY）。該ペプチドを５％ギ酸中に溶解し、渦巻き、音波処理し、そして次いで簡単に遠心分離して不溶性の物質を定着させた(settle)。次いで、該試料を上記の通り、アルゴン圧貯蔵を用いてPOROS R2/H（PE-Biosystems, Framingham, MA）の撹拌スラリーでパックしたキャピラリー上にロードした。
【００３５】
該キャピラリーを、試料をロードする操作前に、＞１０カラム容量の移動相Ａ（Ａは０．２％イソプロパノール、０．１％酢酸、０．００１％トリフルオロ酢酸である）を用いて予め平衡とした。該クロマトグラフィー分離は、バイナリーのＨＰＬＣポンプ（Model 1100, Hewlett-Packard, Palo Alto, CA）を用いて開始使用の圧を２２バールで、０％Ｂ〜１００％Ｂ（Ｂは、Ａ＋８０％のアセトニトリルである）の有機濃度を上昇させながら４５分間行ない、続いてスプリット前に毎分２５０μＬで流出させた。該使用するエレクトロスプレー電位は、２．２ｋＶであった。質量分光計の加熱キャピラリーは１５０℃で操作するが、シースガス (sheath gases)または補給フロー(make up flows)は使用しなかった。該試料を、Model TSQ7000（Finnigan, San Jose, CA）中にスプレーした。
【００３６】
第３の四重極型質量スペクトル計を、１．０秒毎に４７５〜１８００の電荷範囲にまで質量をスキャンした。イオンがこの質量の範囲内で８０,０００の計数を超えて存在する場合には、該スペクトル中に存在する３つの最大強度のイオンを衝突誘起で解離させた。該衝突細胞を〜３ｍトルで操作し、その一方で該使用する衝突電位は各イオン質量を２６因子だけ電荷比(charge ratio)ヘ掛けることによって各前駆イオンについて調節した。ＭＳ／ＭＳスキャンについてのスキャン範囲はまた電荷に依存する質量であって、このものは該前駆体イオンの見掛けの質量の電荷に対する比率が２倍にまでスキャニングした。
【００３７】
該質量スペクトルデータは、スーパーコンピュータ上でのSEQUEST（version 27PVM, Finnigan）によって分析した。次いで、該出力ファイルを各々検証して、タンパク質帰属の正確さを確認した。全スポットのＭＳ分析および同定を、表Ｉに示す。
表Ｉ．
ＲＡＮＫＬ誘発性のシグナル伝達中間体のプロテオミクス分析
2004529635.tif 000002
【００３８】
ワートマニンの存在下または非存在下でのホスホチロシン活性を示すウェスタンブロットデータを、図３ａ〜３ｄに示す。図３ａは、目印として同定するα−エノラーゼ１００との非刺激（コントロール）のブロットを示す。ＲＡＮＫＬを用いる刺激は、ｃａｐＧ１０２ホスホリル化を生じる（図３ｂ）。図３ｃおよび３ｄに示す通り、ワートマニンは、コントロールの非刺激細胞上での、およびＲＡＮＫＬ刺激のＲＡＷ２６４細胞上でのそれぞれのホスホリル化パターンにおいて有意な効果を有する。ＲＡＮＫＬ刺激細胞中でのｃａｐＧホスホリル化の増大、およびワートマニンの存在下でのＲＡＮＫＬ刺激細胞中でのｃａｐＧホスホリル化の減少は、ｃａｐＧがＲＡＮＫＬ経路における重要な酵素であることを示唆する。
【００３９】
図１、２ａ〜２ｄおよび３ａ〜３ｄ、並びに表Ｉに示す通り、ＲＡＮＫＬ処置によって差次的にホスホリル化されるが、ＰＰ１またはワートマニンを用いる前処理によってホスホリル化されなかったりまたはホスホリル化において減少すると思われるタンパク質は、主に細胞骨格タンパク質（例えば、ｃａｐＧ）構成する。このことは、ｓｒｃ、チロシンキナーゼおよびＰＩ３キナーゼ、リン脂質キナーゼが、クラスＩ、ＩＩおよび／またはＩＩＩのＰＩ３キナーゼによって、ホスホチジルイノシトール３リン酸（ＰｔｄＩｎｓ３−ｐ）、ホスホチジルイノシトール３,４−ビスリン酸（ＰｔｄＩｎｓ−３,４−Ｐ2）またはホスホチジルイノシトール３,４,５−トリスリン酸（ＰｔｄＩｎｓ３,４,５−Ｐ3）の発生に依存する１つ以上のチロシンキナーゼの上流であることを示す。
【００４０】
ワートマニン抑制は、ＰｔｄＩｎｓからＰｔｄＩｎｓ−３−Ｐ（ＰＩＰ2）、ＰｔｄＩｎｓ−４−ＰからＰｔｄＩｎｓ−３,４−Ｐ2（ＰＩＰ2）およびＰｔｄＩｎｓ−４,５−Ｐ2（ＰＩＰ2）からＰｔｄＩｎｓ−３,４,５−Ｐ3（ＰＩＰ3）のイノシトール環のＤ−３位をホスホリル化するＰＩ３キナーゼの能力を有効に遮断する（Reinhold, S. L.らによる「Activation of human neutrophil phospholipase D by three separable mechanisms」，FASEB J. 4 (2): 208-214 (1990); Arcaro, A.らによる「Wortmannin is a potent phosphatidylinositol 3-kinase inhibitor: the role of phosphatidylinositol 3,4,5-trisphosphate in neutrophil responses.」，Biochem J. 296 (Pt 2): 297-301 (1993)）。加えて、ｃａｐＧは差次的にホスホリル化され、またワートマニン前処理からの観察に基づくとＰＩＰ3の存在に依存すると記す。
【００４１】
図４に示す通り、ｃａｐＧのゲルゾリンとのＤＮＡ配列アラインメントを行なった。該ＤＮＡ配列情報はヒトおよびマウスのｃａｐＧについてはＮＣＢＩから入手して、そしてゲルゾリンはその図に示す相同領域を用いてアラインした。図４に示す通り、ｃａｐＧはゲルゾリンに対する配列類似度を示す。
【００４２】
図５に示す通り、ｃａｐＧの３次元アラインメントを、アクチンの上に投影した。次いで、図６に示す通り、ゲルゾリンおよびｃａｐＧについての３次元構造をアクチンの上に投影した。該ゲルゾリン／アクチン接触面積は７１７平方オングストロームと算出され、一方でｃａｐＧ／アクチンの接触面積は２１７７平方オングストローと算出されることを観察した。このモデルは、ｃａｐＧとアクチンとの相互作用が特異的であり、そして広がった接触面積は特定の化合物を標的とするのに使用することができることを例示する。
【００４３】
図７および８に示す通り、ｃａｐＧ対ゲルゾリンの推測される特異性を、共焦点顕微鏡を用いて確認する。図７に示す通り、マウスの活性化破骨細胞をゾウゲ質、骨再吸収基質上に置いた。次いで、該細胞をアクチンおよびゲルゾリンの両方について免疫染色した。該画像は、ゲルゾリン染色が細胞膜のポドソーム(podosome)および辺縁に限定され、一方でアクチン染色がシーリングゾーン(sealing zone)（これは、骨再吸収が開始されるように、破骨細胞が骨マトリックスの上で生成する特定の構造である）に局在化されることを示す。図８に示す通り、該活性化された破骨細胞はｃａｐＧおよびゲルゾリンの両方について免疫染色した。該画像は、ｃａｐＧおよびアクチンの両方の染色が該シーリングゾーンと一致することを示す。従って、該ｃａｐＧタンパク質は、該シーリングゾーンの形成に必要なアクチンリングの特異的な構成成分である。
【００４４】
図９は、ｃａｐＧ(−／−)および野生型マウスから単離した脛骨の骨ミネラル密度分析を示す。この分析は、該ｃａｐＧノックアウト突然変異が異常な破骨細胞の活性および機能性を示唆する骨粗しょう症の状態を引き起こすことを示す。このことにより、破骨細胞の活性化および続く骨再吸収におけるｃａｐＧの重要性を確認する。したがって、ｃａｐＧは骨粗しょう症についての有用なマーカーおよび標的タンパク質であって、そしてこのものは骨粗しょう症および関連疾患状態の治療および予防において重要な役割を果たしている。
【００４５】
したがって、本発明を具体的な態様と組み合わせて記載するが、そのものは更に改変することができ；また、本出願は一般的に本発明の原理に従っておよび本発明の開示からの逸脱（これは、本発明が属する当該分野において知られたりまたは通常実施され、本明細書において上記する本質的な特徴に適用することができ、そして本発明の特許請求の範囲内に従う）を含めて本発明のいずれかの改変、使用または適用を包含することを意図する、と理解される。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
【図１】図１は、シプロ・ルビー・レッド(Sypro Ruby Red)を用いて染色したＲＡＮＫＬ刺激のＲＡＷ２６４細胞の２次元ゲルを示す図面である。
【図２ａ】図２ａは、ＲＡＮＫＬの非存在下で増殖させたＲＡＷ２６４細胞の２次元の抗ホスホチロシンウェスタンブロットを示す図面である。
【図２ｂ】図２ｂは、ＲＡＮＫＬを用いて刺激したＲＡＷ２６４細胞の２次元の抗ホスホチロシンウェスタンブロットを示す図面である。
【図２ｃ】図２ｃは、ＲＡＮＫＬの非存在下で増殖させおよびＰＰ１を用いて前処理した、２次元の抗ホスホチロシンウェスタンブロットを示す図面である。
【図２ｄ】図２ｄは、ＲＡＮＫＬを用いて刺激して増殖させ、続いてＰＰ１を用いて前処理した、ＲＡＷ２６４細胞の２次元の抗ホスホチロシンウェスタンブロットを示す図面である。
【図３ａ】図３ａは、ＲＡＮＫＬの非存在下で増殖させたＲＡＷ２６４細胞の２次元の抗ホスホチロシンウェスタンブロットを示す図面である。
【図３ｂ】図３ｂは、ＲＡＮＫＬを用いて刺激したＲＡＷ２６４細胞の２次元の抗ホスホチロシンウェスタンブロットを示す図面である。
【図３ｃ】図３ｃは、ＲＡＮＫＬの非存在下で増殖させおよびワートマニンを用いて前処理した、ＲＡＷ２６４細胞の２次元の抗ホスホチロシンウェスタンブロットを示す図面である。
【図３ｄ】図３ｄは、ＲＡＮＫＬを用いて刺激し、続いてワートマニンを用いて前処理した、ＲＡＷ２６４細胞の２次元の抗ホスホチロシンウェスタンブロットを示す図面である。
【図４】図４は、ｃａｐＧとゲルゾリンとのＤＮＡアラインメントを示す図面である。
【図５】図５は、ｃａｐＧとアクチンとの３次元アラインメントを示す図面である。
【図６】図６は、アクチンとのゲルゾリン対ｃａｐＧの比較上の接触結合面積を示す図面である。
【図７】図７は、ＲＡＮＫ−ＬおよびＭ−ＣＳＦを用いて分化した、ゾウゲ質上のマウス破骨細胞の共焦点顕微鏡画像を示す図面である。該細胞は、アクチンおよびゲルゾリンについて染色した。
【図８】図８は、ＲＡＮＫ−ＬおよびＭ−ＣＳＦを用いて分化した、ゾウゲ質上のマウス破骨細胞の共焦点顕微鏡画像を示す図面である。該細胞は、アクチンおよびｃａｐＧについて染色した。
【図９】図９は、ｃａｐＧ(−／−)マウス対野生型マウスの骨ミネラル密度分析を示す図面である。
【図１】
2004529635.tif 000003
【図２ａ】
2004529635.tif 000004
【図２ｂ】
2004529635.tif 000005
【図２ｃ】
2004529635.tif 000006
【図２ｄ】
2004529635.tif 000007
【図３ａ】
2004529635.tif 000008
【図３ｂ】
2004529635.tif 000009
【図３ｃ】
2004529635.tif 000010
【図３ｄ】
2004529635.tif 000011
【図４】
2004529635.tif 000012
【図５】
2004529635.tif 000013
【図６】
2004529635.tif 000014
【図７】
2004529635.tif 000015
【図８】
2004529635.tif 000016
【図９】
2004529635.tif 000017
【国際公開パンフレット】
2004529635.tif 000018
2004529635.tif 000019
2004529635.tif 000020
2004529635.tif 000021
2004529635.tif 000022
2004529635.tif 000023
2004529635.tif 000024
2004529635.tif 000025
2004529635.tif 000026
2004529635.tif 000027
2004529635.tif 000028
2004529635.tif 000029
2004529635.tif 000030
2004529635.tif 000031
2004529635.tif 000032
2004529635.tif 000033
2004529635.tif 000034
2004529635.tif 000035
2004529635.tif 000036
2004529635.tif 000037
2004529635.tif 000038
2004529635.tif 000039
2004529635.tif 000040
2004529635.tif 000041
2004529635.tif 000042
2004529635.tif 000043
2004529635.tif 000044
2004529635.tif 000045
2004529635.tif 000046
2004529635.tif 000047
2004529635.tif 000048
2004529635.tif 000049
2004529635.tif 000050
2004529635.tif 000051
2004529635.tif 000052
2004529635.tif 000053
2004529635.tif 000054
2004529635.tif 000055
2004529635.tif 000056
2004529635.tif 000057
【国際調査報告】
2004529635.tif 000058