(57)【要約】本発明は、発光部分前駆体（例えば、アクリジン、ルシフェリン）および脱離基の前駆体（例えば、オキサジン、アニリド）を含有してなり、アミド結合またはエステル結合によって互いに結合され、酸化の際に脱離基前駆体が脱離基に変換されることを特徴とする化合物に関する。本発明はまた、さらにカップリング基を含有する化合物、生体分子の標識のためのかかる化合物の使用、およびより一般的には化学発光検出手順におけるかかる化合物の使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
発光部分前駆体および脱離基の前駆体を含有してなり、該発光部分前駆体のカルボニル基または化学的に等価な基がアミド結合によって脱離基前駆体の窒素原子に結合されており、酸化の際に該脱離基前駆体が脱離基に変換されることを特徴とする化合物。
【請求項２】
前記脱離基前駆体の窒素原子が酸化還元系の一部であることをさらに特徴とする請求項１記載の化合物。
【請求項３】
前記脱離基前駆体が、ロイコ-レゾルフィン、ロイコ-オキサジンおよび4-ヒドロキシ-アニリンからなる群より選ばれることをさらに特徴とする請求項１または２記載の化合物。
【請求項４】
前記発光部分前駆体が化学発光性ヘテロ環を含むことをさらに特徴とする請求項１〜３いずれか記載の化合物。
【請求項５】
前記発光部分前駆体がルシフェリンまたはそのアナログであることをさらに特徴とする請求項１〜４いずれか記載の化合物。
【請求項６】
発光部分前駆体としてのルシフェリンおよび脱離基の前駆体を含有してなり、カルボニル基または該ルシフェリンの化学的に等価な基がエステル結合によって脱離基前駆体の酸素原子に連結されており、酸化の際に該脱離基前駆体が脱離基に変換されることを特徴とする化合物。
【請求項７】
前記脱離基前駆体がロイコ-レゾルフィン、オルトまたはパラ位で電子供与基で置換されたフェノール基、および4-ヒドロキシ-アニリンからなる群より選ばれることをさらに特徴とする請求項６記載の化合物。
【請求項８】
発光部分前駆体、脱離基の前駆体およびカップリング基を含有してなり、該発光部分前駆体のカルボニル基または化学的に等価な基がアミド結合によって脱離基前駆体の窒素原子に連結されており、酸化の際に該脱離基前駆体が脱離基に変換されることを特徴とする化合物。
【請求項９】
発光部分前駆体としてルシフェリンまたはそのアナログ、脱離基の前駆体およびカップリング基を含有してなり、該発光部分前駆体のカルボニル基または化学的に等価な基がエステル結合によって脱離基前駆体の酸素原子に連結されており、酸化の際に該脱離基前駆体が脱離基に変換されることを特徴とする化合物。
【請求項１０】
生体分子および請求項１〜９いずれか記載の化合物を含有してなるコンジュゲート。
【請求項１１】
サンプル中の分析物の検出のための特異的結合アッセイにおける請求項１０記載のコンジュゲートの使用。
【請求項１２】
過酸化物の検出のための請求項１〜９いずれか記載の化合物または請求項１０記載のコンジュゲートの使用。
【請求項１３】
ペルオキシダーゼの検出のための請求項１〜９いずれか記載の化合物または請求項１０記載のコンジュゲートの使用。
【請求項１４】
過酸化物の存在下で、
ａ）脱離基が酸化される、
ｂ）シグナル放出基前駆体が解放される、
ｃ）光が放出される、および
ｄ）ｃ）で放出された光が測定される、
ことを特徴とする、請求項１〜９いずれか記載の化合物または請求項１０記載のコンジュゲートを使用して発光測定を行う方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、アミド結合またはエステル結合により互いに結合した発光部分前駆体および脱離基の前駆体を含み、酸化の際に脱離基の前駆体が脱離基に変換されることを特徴とする化合物に関する。本発明はまた、カップリング基をさらに含む化合物、生体分子の標識のためのかかる化合物の使用、およびより一般的には、化学発光検出手順におけるかかる化合物の使用に関する。
【０００２】
生物学的分子の特異的検出および定量は、例えば、放射標識レポーター分子の使用により優れた感度を伴って達成される。1950年代終わりに開発された最初の放射性免疫アッセイは、広範な検出またはレポーター系を用いて、特に薬物における、インビトロ診断の最も重要なツールになった。レポーター分子の周知の例は、酵素、標識ラテックスビーズ、蛍光色素および特に化学発光色素である。特定の結合アッセイの理論および実行を記載しているレビューが入手可能である。
【０００３】
当業者は、「Practice and theory of enzyme immunoassays」Tijssen（1990）Amsterdam, Elsevierおよび免疫学的検出方法を扱う種々のエディションの「Methods in Enzymology」Colowick, S.P.およびCaplan, N.O.（1980-1986）, Academic Press, 特に70、73、74、84、92および121巻等のテキストにおいて特定の結合アッセイを行うための全ての必要な技術詳細を見出すだろう。
【０００４】
光測定技術および市販の非常に感度の高い装置の開発と平行して、発光団は、多くの適用において同位体標識に取って代わった。新規発光標識のいくつかは、極めて低いレベルの感度で分析物検出を容易にする。それゆえ、かかる標識はまた商業的に非常に興味深い。
【０００５】
発光標識は、蛍光標識のグループおよび発光標識のグループに細分されうる。蛍光標識は、存在する蛍光標識を検出し、かつ測定するために励起光でのサンプルの照射を必要とするが、化学発光系は光の余計な供給源を必要としない。
【０００６】
周知の化学発光ベース系は、とりわけ以下のカテゴリー、ルシフェリンと対応するルシフェラーゼ、サイクリックアリールヒドラジド、アクリジニウム誘導体、安定なジオキセタン（dioxetane）、およびシュウ酸誘導体との組み合わせを含む標識を利用する。
【０００７】
達成された開発および当該分野でいまだ遭遇する課題のいくつかは、ある特定の例、アクリジニウムエステルを考察することにより例証される。
【０００８】
アクリジニウムエステルは、化学発光において使用される化合物の非常に重要なクラスを表す。かかるアクリジニウムエステルの本質的特徴は、エステル官能基が適切な脱離基を保有するように置換されたことである。適切な脱離基は、２つの本質的な要求：安定性および高量子収量を可能な限り適合するように設計される。
【０００９】
一方で、アクリジニウムエステルの脱離基は、可能な限り活性でなければならず、すなわち、測定条件下で全く容易に脱離し、敏感な検出および高量子収量を可能にする。しかし、他方ではこの高活性は、加水分解に対して不安定にする。かかる化学発光標識が生体分子への結合のために使用される場合、かかる不安定性はさらにより重大である。細密なバランスの作用に等しい高化学発光収量およびさらに標識試薬の高安定性を達成する目的は、いつも光収量と安定性との間の妥協に終わる。
【００１０】
遭遇する課題を少なくとも部分的に解決するために、新規および異なる脱離基が設計された。最も一般的なものは、例えば、US 5,669,819に記載されているN-スルホンアミド、DE3 645 292に記載されているチオエステル、WO98/56765に記載されているヒドロキサム酸エステル、Waldrop III, A.A.ら、Luminescence 15 (2000) 169-182に記載されるイミダゾリドおよびピリジニウムアミド（WO 95/19976）である。
【００１１】
エステル結合により結合したアクリジニウムまたはアクリダン色素およびフェノールまたはヒドロキシフェノール基を含有するいくつかの化合物が、異なる分野の研究から公知である。これらのアクリジニウムまたはアクリダンエステルは、酵素基質として使用されるか、フェノール基は、エステル結合の、それぞれ、加水分解安定性または不安定性を調節するために記載されている（WO 97/33884; WO 01/09372; EP 625 510）。
【００１２】
別のアプローチは、アクリダン部分の酸化後、アクリジン色素と比べて類似して作用するアクリダン化合物の使用である（US 5,593,845）。しかし、記載される全ての代替物は、加水分解にさらに曝される活性エステル部分を含み、注意深く特別な保存および取り扱い条件を必要とする。
【００１３】
一方で安定な化学発光色素または標識、他方で敏感な検出および高量子収量を提供する化学発光アッセイのための新規色素化合物を見出し、同定することが本発明の課題であった。特に、生体分子の標識または生体分子へのコンジュゲーションに適切であるカップリング基をさらに含有する化合物が必要である。
【００１４】
驚くべきことに、当該分野で公知の課題を解決するのに役立つ発光部分前駆体および脱離基の前駆体を含有する化合物を合成できることが見出された。これらの新規化合物は、脱離基前駆体の窒素原子と発光部分前駆体のカルボニル基との間に安定なアミド結合を含み、ここでこの窒素原子は酸化還元系の一部であるか、またはそれらは脱離基前駆体の酸素原子と発光基前駆体のカルボニル基との間の安定なエステル結合を含み、ここでこの酸素は酸化還元系の一部である。
【００１５】
脱離基前駆体の酸化後、アミド結合またはエステル結合は活性化され、発光基前駆体は過酸化物との反応後に化学発光を生じる準備ができる。
【００１６】
要約すると、本発明は、発光部分前駆体および脱離基の前駆体を含有し、該発光部分前駆体のカルボニル基がアミド結合またはエステル結合によって脱離基前駆体に連結されており、酸化の際に該脱離基前駆体が脱離基に変換されることを特徴とする化合物に関する。
【００１７】
本発明はまた、発光部分前駆体、脱離基の前駆体およびカップリング基を含有する化合物に関する。
【００１８】
本発明の化合物は、保存安定性、および化学発光手順における敏感な検出の両方を包囲するので、それらはまた、生体物質を標識するために使用することができ、大きな利点を有する得られるコンジュゲートはサンプル中の分析物の検出のための適切な特異的結合アッセイに適用することができる。
【００１９】
大きな利点を伴って、新規化合物は、過酸化物の検出およびペルオキシダーゼの検出に使用されうる。
【００２０】
本発明はまた、脱離基が最初に酸化され、発光基前駆体が反応性になり、光の形態のエネルギーが標準的な手順に従って作製され、発光が通常通りに測定される記載される新規化合物を用いて化学発光測定を実行する方法に関する。
【００２１】
発明の詳細な説明
本発明は、発光部分前駆体および脱離基の前駆体を含み、ここで該発光部分前駆体のカルボニル基または化学的に等価な基は脱離基前駆体の窒素原子にアミド結合によって連結されており、酸化の際に該脱離基前駆体が脱離基に変換されることを特徴とする化合物に関する。
【００２２】
本発明はまた、発光部分前駆体としてルシフェリンおよび脱離基の前駆体を含み、ここで該ルシフェリンのカルボニル基または化学的に等価な基は、脱離基前駆体の酸素原子にエステル結合によって連結されており、酸化の際に該脱離基前駆体が脱離基に変換されることを特徴とする化合物に関する。
【００２３】
本発明の化合物は、発光部分前駆体および脱離基の前駆体を含む。これらの２つの化学実体は、アミドまたはエステル結合により互いに連結される。従って、このアミドまたはこのエステル結合は、それぞれ、安定であり、全体の化学構造の安定性を確実にする。このかなり安定な結合は、例えば、生理的条件または日常的な保存条件下で加水分解されない。本発明の化合物はまた、発光部分の誘導体として記載されうる。これらの発光部分の新規誘導体は、例えば、生体物質への結合の間、または長期保存条件下で、例えば、多くの市販の適用に必要とされるように容易に扱われうる。
【００２４】
本発明の意味での「発光部分前駆体」は、かかる化学部分を含み、これは適切な活性化の際に化学発光の検出に基づく分析系において使用され、測定されうる。化学発光標識に使用される化合物の周知のクラスは、とりわけ、対応するルシフェラーゼと組み合わせたルシフェリン、サイクリックアリールヒドラジド、アクリジニウム誘導体、安定なジオキセタン、およびシュウ酸誘導体を含む。
【００２５】
本発明の発光部分前駆体は、カルボニル基または化学的に等価な基を保有しなければならない。本発明の化合物において、発光部分前駆体は、もちろん、遊離発光基前駆体として存在しないが、脱離基前駆体のアミドまたはエステルを含む。換言すれば、記載される化合物の発光部分前駆体は、遊離発光基前駆体のエステルまたはアミドのカルボン酸部分として理解されなければならない。
【００２６】
カルボニル基の特徴および重要な機能は、H2O2のような求核試薬がsp2炭素原子を攻撃しうることである。チオカルボニルまたはシアンイミノ残基のような基は、類似した化学特性をもたらすことが周知である。これらの基の中でカルボニル基が好ましい。言語上の重複を避けるために、以下のほとんどの場合には、単にカルボニル基という用語が使用される。しかし、適切な機能的等価物が同様に使用されうることが理解されなければならない。
【００２７】
酸化により脱離基前駆体は脱離基に変換され、用語が示すように、過酸化物とのカルボニル基の反応後に脱離する。
【００２８】
安定なアミドまたはエステル結合の一部であるカルボニル基は、（脱離基が形成された後に）過酸化物による攻撃の際に、発光部分前駆体から切断される発光が付随する同一のカルボニル官能基である。
【００２９】
化学発光標識の１つの好ましいクラスは、アクリジニウム化合物である。それらの化学発光の機序は広範に研究されており、「Angewandte Chem.Intern.Ed.Engl.」、Mayer, A.およびNeuenhofer, S. (1994) 1044-1072, Weinheim, VCH Verlagsgesellschaft mbHに公開された総説文献にうまく要約されている。
【００３０】
化学発光原理により発光にいたるいくつかの機序が提案されている。短命な中間体は、脱炭酸化および発光にいたるプロセスの一部であると考えられている。発光、またはエステルの加水分解にいたる所望されない副反応（暗反応）を生じるアクリジニウムエステル標識に対して仮定されたプロセスが図１に模式的に示される。
【００３１】
提案される機序に従って、H2O2の攻撃によりカルボニル基（アミドまたはエステルの一部である）は、ジオキセタノン（dioxetanone）部分の一部になる。ジオキセタノン部分の自発的分解は、発光により達成され、カルボニル基の場合には、ヘテロ環ケトンおよびCO２を生じ、より一般的な化学用語では、カルボニル基の機能的等価物が存在する場合にはヘテロクムレンを生じる。
【００３２】
図１からすぐに明らかであるのは、明反応（LR）および暗プロセス（DP）の両方が脱離基Ｚの特性に依存していることである。当該分野で公知の化合物とは全く異なり、図１で説明されるように、本発明の化合物では脱離基Ｚの代わりに脱離基の前駆体が存在する。
【００３３】
用語「脱離基の前駆体」は、本発明によるさらなる化学修飾、酸化なしに、脱離基前駆体が脱離基として機能しないか、または少なくとも、かなり弱い脱離基であり、発光部分前駆体が解放されないことを示すために使用される。脱離基前駆体の芳香族系の酸化なしに、発光部分前駆体と脱離基前駆体との間のアミド結合は加水分解に対して安定である。
【００３４】
一見しただけで、いわゆるアクリジニウム-9-（N-スルホニル）カルボキサミド標識は、構造的に本発明の化合物に類似するようである。かかる標識の例は図２に示される。しかし、化学的に、アクリジニウム-9-（N-スルホニル）カルボキサミド標識は、本発明の化合物とは全く異なる。窒素原子は、-SO2基に隣接するために、化学的に言えば、電子が乏しい窒素であり、酸化可能（oxidizable）な芳香族または酸化還元系の一部ではなく、そうでなければ脱離基として機能しない。窒素原子のこれらの特性は、それに連結されたN-スルホニルアミド基に特にもたらされる。当該分野で公知の全ての化学発光標識に関して、これらのアクリジニウム-9-（N-スルホニル）カルボキサミド標識は、加水分解に対する化学発光標識の安定性と、敏感な検出のために脱離基の迅速かつ効率的な放出との間の妥協を示す。
【００３５】
本発明の化合物において、脱離基の前駆体は、脱離基の代わりに使用される、前駆体であり、それらは芳香族系の一部でもあるアミド結合内の「酸化可能な（oxidizable）」窒素を含むか、またはエステル結合の「酸化可能な」酸素原子を含むと特徴づけられる。
【００３６】
「酸化可能」は、前記窒素または酸素原子が電子リッチであり、電子が容易に取り除かれうる、すなわち、従ってその窒素またはその酸素が酸化されることを意味する。当業者が理解するように、電子リッチ酸素または窒素が少なくとも１つのいわゆる（電子）供与体置換基の結合を必要とする。電子供与体置換基は、当業者に周知であり、ここで詳述する必要はない。供与体置換基は、窒素または酸素原子に直接またはビニロガス（vinylogous）またはフェニロガス（phenylogous）に結合されうる。両方の場合、窒素または酸素原子は、２工程供与体-π-供与体酸化還元系の還元形態の一部であり、Huenig（Huenig S., Pure Appl Chem, 62 (1990)395-406）により記載されるように可逆的２工程酸化還元系としても知られる。
【００３７】
適切な芳香族系の酸化可能な窒素原子は当該分野で周知である。最も一般的な酸化可能な芳香族系は、ロイコ-色素であり、これは酸化の際に色素に変換される。これらの芳香族ロイコ-色素／色素-系において、ロイコ-色素の電子リッチ窒素は、酸化の際に電子が乏しい窒素に変換される。この酸化は、アミド結合を高度に不安定にし、かかる脱離基前駆体の酸化形態は、今や脱離基として効率的に働く。
【００３８】
好ましい態様において、本発明の化合物は式１の化合物である。
【００３９】
式１：
【化１】
2004535423.tif 000002
式中、
R1=-NR3R4、-OR5、-SR6、-NR7NR3R4
R2=H、R1、(C1-C10)-アルキル、C2-C10アルケニル、C2-C10アルキニル、C6-C22アリール、SO3-、-COOH、-ハロゲン、ニトロ、アネルレーティッド(anellated)ベンゼン、
R3〜R7=H、（C1-C10）-アルキル、 C2-C10アルケニル、C2-C10アルキニル、C6-C22アリール；
式中、任意のアルキル、アルケニル、アルキニルまたはアリールは、-ハロゲン、カップリング基、-OPO32-、-PO32-、-SO3-、-COOR5、-CO-NR3R4、-S-R6、-NR3R4、-N+(C1-C6アルキル)3、-OR5、-COR5、-NH-CO-NR3R4、-NH-CS-NR3NR4、および-(CH2)n-[O-(CH2)r]s-NR3R4、-(CH2)n-[O-(CH2)r]s-OR5からなる群より選ばれる１つ以上の部分により置換され得、）、式中rおよびsは互いに独立して１〜18の整数であり、ｎはｒおよびｓとは独立して０または１であり；式中、LEGPは発光基前駆体を表す。
【００４０】
好ましくは、R1は、-NR3R4または-OR5であり、式中、R3〜R5は独立してＨ、（C1-C10）-アルキル、またはカップリング基により置換された（C1-C10）-アルキルである。最も好ましいR1は、-N(-エチル)2、-O-エチル、N(-メチル)2、O-メチルまたはカップリング基により置換されたこれらの残基の内の１つである。
R2は好ましくはHまたは-メチルである。
【００４１】
さらに好ましい態様では、本発明の化合物は式２により表される。
【００４２】
式２：
【化２】
2004535423.tif 000003
式中、
R1およびR1'は、独立して、R1について上記に規定された残基であり、
R2およびR2'は、独立して、R2について上記に規定された残基であり、
LEGPは発光基前駆体である。
【００４３】
さらに好ましい態様では、脱離基前駆体は、式３に要約された構造要素を含む。
【００４４】
式３：
【化３】
2004535423.tif 000004
式中、
R1およびR1'は、独立して、R1について上記で規定された残基であり、
R2およびR2'は、独立して、R2について上記で規定された残基であり、
LEGPは、発光基前駆体であり；および
Ｚは、S、OまたはN-R8を示し、式中、R8はH、(C1-C10)アルキル、C2-C10アルケニル、C2-C10アルキニル、C6-C22アリールである。
【００４５】
式１〜３に要約された全ての構造において、窒素原子は、酸化還元系の、好ましくは、酸化可能な芳香族系の一部である。この構造特性、すなわち、酸化還元系の一部である脱離基前駆体の窒素原子は、本発明の好ましい態様を表す。酸化の際に、脱離基前駆体の窒素は、この酸化還元系の一部として酸化される。発光基前駆体と酸化窒素との間のアミド結合は、化学的に非常に不安定であり、発光基前駆体は、H2O2との反応の際に容易に放出される。
【００４６】
好ましい態様では、脱離基前駆体はロイコ-色素である。より好ましいかかるロイコ-色素は、式３に含まれる構造により表されうる。レゾルフィン、オキサジンおよびメチレンブルーからなる化学物質のクラスに対応するロイコ-色素から脱離基を選択することが好ましい。
【００４７】
好ましい態様では、発光部分前駆体は、化学発光ヘテロ環を含む。かかる化学発光ヘテロ環の例は、当該分野で周知であり、例えば、Mayer, A.およびNeuenhofer, S.,「Angewandte Chem. Intern. Ed. Engl.」（1994）1044-1072, Weinheim, VCH Verlagsgesellschaft mbHによる総説文献に要約されている。
【００４８】
さらに上記に記載されるように、発光部分前駆体は、カルボニル基または化学的に等価な官能基を含む化合物から選ばれ、脱離基前駆体は、アミド結合により結合される。好ましくは、発光部分（または基）前駆体は、以下のカテゴリーの化学発光化合物から選ばれる：4Hベンゾ[e][1,3]オキサジン、4,5-ジヒドロチアゾール、ルシフェリン、アクリダンおよびアクリジニウム色素。もちろん、本発明のシグナルまたは発光部分前駆体は、色素それ自身に制限されず、その化学発光誘導体をも含む。
【００４９】
発光部分前駆体および脱離基の前駆体を含み、ここで前記発光部分前駆体のカルボニル基または化学的に等価な基は、アミド結合により脱離基前駆体の窒素原子に連結される化合物において、発光基前駆体は、好ましくは、化学発光ヘテロ環であり、これは、ルシフェリン、アクリジニウムおよびアクリダンからなる群より選ばれる。
【００５０】
好ましい態様では、本発明は、発光部分前駆体としてルシフェリンまたはそのアナログおよび脱離基の前駆体を含み、ここで前記ルシフェリンのカルボニル基または化学的に等価な基はアミド結合によって脱離基前駆体の窒素原子に連結され、酸化の際に前記脱離基前駆体は脱離基に変換されることを特徴とする化合物に関する。
【００５１】
さらなる好ましい態様では、発光前駆体および脱離基前駆体はエステル結合によって連結される。
【００５２】
かかる化合物の例は、一般式４および５により表される。
【００５３】
【化４】
2004535423.tif 000005
式中、
R1およびR2は上記に規定された残基を表し、
LEGPは発光基前駆体である。
【００５４】
このエステル結合の酸素原子は、酸化還元系の一部である。酸素原子を酸化可能にする適切な基は、フェノール残基のオルト-またはパラ-位置の-OR5、-SR6、-NR3R4または-NR7-NR3R4（式中、R3またはR7は上記に規定されるとおりである）等の電子供与体基である。酸化の際に、エステル結合は高度に不安定になる。換言すれば、脱離基前駆体は脱離基に変換される。
【００５５】
好ましい態様では、エステル結合により発光部分前駆体に結合した脱離基前駆体は、オルト-またはパラ-位で電子供与体基で置換されたフェノールを含有する基から選ばれる。最も好ましい電子供与体は、-NR3R4または-O-R5であり、式中、Ｒは好ましくは-HまたはC1〜C5アルキルである。
【００５６】
式４および式５の発光基前駆体はルシフェリン（式６）またはそのアナログ（例えば、式７または式８）である。
【００５７】
式６
【化５】
2004535423.tif 000006
【００５８】
式７
【化６】
2004535423.tif 000007
X=O  2-(4ヒドロキシフェニル)4Hベンゾ[e][1,3]オキサジン-4-カルボン酸
X=S  2-(4ヒドロキシフェニル)4Hベンゾ[e][1,3]チアジン-4-カルボン酸
X=N-アルキル  N-アルキル-2-(4ヒドロキシフェニル)1,4ジヒドロキナゾリン4-カルボン酸
【００５９】
式８
【化７】
2004535423.tif 000008
X=O  2-(4ヒドロキシフェニル)4,5ジヒドロオキサゾール5,5ジメチル-4-カルボン酸
X=S  2-(4ヒドロキシフェニル)4,5ジヒドロチアゾール5,5ジメチル-4-カルボン酸
X=N-アルキル  N-アルキル-2-（4ヒドロキシフェニル）4,5ジヒドロイミダゾール5,5ジメチル-4-カルボン酸。
【００６０】
好ましい態様では、本発明は、それゆえ、発光部分前駆体としてルシフェリンおよび脱離基の前駆体を含有し、ここで該ルシフェリンのカルボニル基または化学的に等価な基がエステル結合によって脱離基前駆体の酸素原子に連結されており、前記脱離基前駆体が酸化の際に脱離基に変換されることを特徴とする化合物に関する。
【００６１】
ルシフェリンまたはそのアナログと脱離基前駆体との間の酸化可能なエステル結合の場合、前記脱離基前駆体が、ロイコ-レゾルフィン、およびオルトまたはパラ位で電子供与基で置換されたフェノール基からなる群より選ばれるのがさらに好ましい。最も好ましい脱離基は、オルトまたはパラ位で電子供与基で置換されたフェノール基である。
【００６２】
さらに好ましい態様では、本発明の化合物は２つの発光基前駆体を含む。LEGPは同一であり得るが、２つの異なるLEGPを使用することも可能である。これらの発光基前駆体の各々は、安定であるが酸化可能なアミドまたはエステル結合により脱離基前駆体に連結される。好ましくは、脱離基と発光基前駆体との間の両方の結合は同じタイプのものである。しかし、種々の酸化還元系が適用される等の特別な設定では、エステル結合またはアミド結合等の２つの異なるタイプの結合を含む構造は有利でありうる。
【００６３】
２つの発光基前駆体を含む化合物では、脱離基前駆体は、好ましくは置換フェノール基である。最も好ましくは、２つの発光基前駆体は、パラ位でこのフェノール基に結合される。
【００６４】
２つの発光基前駆体を含有する構造式の例は、式９、10、および11に示される。
【００６５】
式９：
【化８】
2004535423.tif 000009
式10：
【化９】
2004535423.tif 000010
式11：
【化１０】
2004535423.tif 000011
【００６６】
式９〜式11では、R2およびR3は、上記に規定される残基を表し、LEGPは発光基前駆体である。
【００６７】
発光部分前駆体および脱離基の前駆体を含有する本発明の化合物は、例えば、生体分子の標識のための非常に魅力的な標識を表す。生体分子への標識のカップリングに使用される方法は、過去に有意に成熟しており、優れた概要は、「Bioconjugation」Aslam, M.およびDent, A.（1998）216-363, London, McMillan Referenceに、および「Practice and theory of enzyme immunoassays」 Tijssen (1990), Elsevier, Amsterdamの「Micromolecule conjugation」の章に示されている。
【００６８】
適切な結合化学は、上記の引用文献（Aslam, 上述）から公知である。本発明の化合物は好ましくは、調査下の生体物質について適切であるカップリング化学に適合するカップリング基を含むように設計され、合成される。
【００６９】
好ましい態様では、本発明の化合物は、発光部分前駆体、脱離基の前駆体およびカップリング基を含有し、ここで、前記発光部分前駆体のカルボニル基または化学的に等価な基は、脱離基前駆体の窒素原子にアミド結合により連結され、酸化の際に、前記脱離基前駆体は脱離基に変換されることを特徴とする。
【００７０】
さらに好ましい態様では、化合物は、発光部分前駆体としてルシフェリンまたはそのアナログ、脱離基の前駆体およびカップリング基を含み、ここで前記発光部分前駆体のカルボニル基または化学的に等価な基は、エステル結合によって脱離基前駆体の酸素原子に連結され、酸化の際に前記脱離基前駆体は脱離基に変換されることを特徴とする。
【００７１】
本発明の化合物はまた、従って、好ましくはカップリング基（これはＹと呼ばれうる）を含む。カップリング基Ｙは、生体分子への化合物の化学的カップリングのために使用される反応性基または活性化基である。Ｙ基は、好ましくは、カルボン酸ハロゲン化物、無水カルボン酸、カルボン酸ヒドラジド、カルボン酸アジド等の活性化カルボン酸基または例えば、N-ヒドロキシ-サクシンイミド、p-ニトロフェニル、ペンタフルオロフェニル、イミダゾリル、またはN-ヒドロキシベンゾトリアゾリルエステル等の活性エステル活性エステル、アミン、マレイミド、チオール、パラアミノベンゾイル基または光活性化基、例えばアジドである。最も好ましいＹはN-ヒドロキシ-サクシンイミドエステルである。
【００７２】
カップリング基Ｙは、カップリングが行われる生体分子における化学機能に適合するように選択される。
【００７３】
生体分子のアミノ基（末端-NH2基またはリジン側鎖のNH2基、およびジアミノカルボン酸のω-アミノ基）は、「アミノ化学」に基づいてマーカー基の化学的カップリングのために使用されうる。アミノ化学の周知の例は、とりわけ、NHS-エステル、他の活性化エステル、酸塩化物およびアジドのようないわゆる活性化基とのアミノ基の反応を含む。
【００７４】
生体分子上のカルボキシル基（末端COO-基、グルタミン酸またはアスパラギン酸のカルボキシ官能基）は、「カルボキシ化学」に基づく化学的カップリングのために使用される。カルボキシ化学の周知の例は、とりわけ、上記活性化基を保有するためのこれらのカルボキシ基の活性化を含む。次いで、例えば、マーカー上のアミノ基へのカップリングが容易に行われうる。
【００７５】
あるいは、生体分子上のスルフヒドリル基（例えば、システインの遊離SH基またはジスルフヒドリル架橋を還元することにより得られる-SH基）は、「スルフヒドリル化学」に基づく化学的カップリングのために使用される。スルフヒドリル化学の周知の例は、とりわけ、マレイミド基との-SH基の反応、またはα-ハロゲンカルボキシル基でのまたはチオエーテルによるアルキル化を含む。
【００７６】
チロシン残基の水酸基またはヒスチジンのイミダゾール基はまた、例えば、ジアゾニウム基の助けを借りて生体分子に本発明の化合物を共有結合するために使用されうる。
【００７７】
カップリング基は、発光基前駆体の一部または脱離基前駆体の一部のいずれかでありうる。化学発光基と生体分子の両方がきわめて接近している場合、大きな生体分子は、化学発光基により発光されるルミネセンス光を妨害しうることが、一般に認められている。したがって、好ましくは、カップリング基が脱離基前駆体の一部であり、好ましくはかかる化合物が生体分子へのカップリングに使用される。この場合、脱離基の前駆体の酸化の際に、発光部分前駆体は生体分子から放出され、両方の分子はもはやきわめて接近はしていない。これは、試料中の分析物の検出のためのアッセイにおいて有利である。
【００７８】
一般に、本発明の化合物は、発光前駆体の活性化型（好ましくは酸塩化物）を還元型の脱離基前駆体と反応させることにより合成される。アニリンまたはフェノールなどの脱離基前駆体として適切である化学物質は、市販されているか、または標準手順により合成されうる。ロイコ色素、すなわち脱離基前駆体は、還元により、好ましくは亜ジチオン酸ナトリウムを用いる還元により、市販の色素から得られうる。カップリング基が脱離基前駆体に付着される場合、カップリング基をすでに含有している色素化合物が、本発明の化合物の合成のための適切なパートナーである。例えば、オキサジン色素のNHS-エステルは、市販されているか（例えば、Evoblue）、または文献(EP 0 510 668)に記載されている。
【００７９】
用語「生体分子」は、治療または診断の分野における目的の分子および物質を含有する。本発明の意味において生体分子は、アミノ酸、ヌクレオチド、ヌクレオシド、脂質、および／または糖のような生物学的分子からなる任意に天然に生じるかまたは合成により作製される分子でありうる。合成アミノ酸または合成ヌクレオチドまたは核酸アナログのようなその非天然誘導体はまた、生体分子を置換するために使用されうる。
【００８０】
好ましい態様において、生体分子は、ポリペプチド、核酸、および低分子量薬物からなる群より選ばれる。
【００８１】
本発明の特徴を有する発光部分前駆体と脱離基の前駆体とを含有する化合物と生体分子との間のコンジュゲートは、さらに好ましい態様を表わす。生体分子と本発明に記載される化合物との間のコンジュゲートが、試料中の分析物の検出のための特異的結合アッセイにおいて大きな利点であることは、当業者により容易に認められるであろう。
【００８２】
一般的に特異的結合アッセイは、バイオアフィン(bioaffine) 結合対の２つのメンバーの特異的相互作用に基づいている。かかる結合対における適切な結合パートナーの例は、ハプテンまたは抗原とそれに反応する抗体、ビオチン、またはアミノ、ビオチン、イミノビオチンもしくはデスチオビオチンなどのビオチン−アナログ（ビオチンまたはストレプトアビジンに結合する）、糖とレクチン、核酸または核酸アナログと相補的な核酸、レセプターとリガンド（例えば、ステロイドホルモンレセプターとステロイドホルモン）、および酵素とその基質である。
【００８３】
核酸鎖の間のハイブリダイゼーションの検出に基づくアッセイにおける核酸（または核酸アナログ）とそれに相補的な核酸との間の特異的相互作用および広範囲の免疫アッセイに基づく抗体とそれぞれの抗原との特異的相互作用は、最も好ましい結合対である。
【００８４】
核酸ハイブリダイゼーションアッセイの理論および実践は、Kessler, C.の「Non-radioactive labeling and detection of biomolecules」, Springer Verlag, Berlin Heidelberg（1992）などの関連教科書に要約される。当業者は、その中で全ての関連項目を見出すであろう。
【００８５】
現今、免疫学的検定法は広く使用され、当業者にとって一般的知識である。関連方法および手順は、「Bioconjugation」Aslam, M.およびDent, A.（1998）216〜363, London, McMillan Referenceおよび「Practice and theory of enzyme immunoassays」Tijssen（1990）, Amsterdam, Elsevierなどの関連教科書に要約される。包括的な概要もまた、Mayer, A.およびNeuenhofer, S.によって書かれた論文「Angewandte Chem. Intern. Ed. Engl.」（1994）1063〜1068, Weinheim, VCH Verlagsgesellschaft mbHに見出され得る。
【００８６】
本明細書に記載の化合物は、発光部分前駆体と脱離基の前駆体との間のアミドまたはエステル結合が脱離基前駆体の酸化の際に不安定になるという著しい特性を有する。従って、光発生（すなわち化学発光）は、酸化剤および過酸化物の存在に依存する。従って、記載される化合物が一方では過酸化物の検出アッセイおよび他方ではペルオキシダーゼの検出アッセイの両方に使用され得ることは明らかである。
【００８７】
好ましい態様において、本発明の化合物は、過酸化物の検出方法に使用される。
【００８８】
ペルオキシダーゼを使用して、酸化後脱離基として機能する脱離基前駆体を酸化し得る。従って、適切なアッセイ条件下で、ペルオキシダーゼの存在は、発光される化学発光の測定の際に検出され得る。好ましい態様において、本発明の化合物は、ペルオキシダーゼの活性に基づく検出方法に使用される。最も好ましくは、新規化合物は、ペルオキシダーゼの検出に使用される。
【００８９】
さらに好ましい態様において、本発明は、本発明の化合物の使用に基づくルミネセンス測定を実施する方法に関する。この方法は、過酸化物の存在下で、脱離基前駆体が酸化され、発光基前駆体が活性化され、エネルギーが放射され、測定されることに特徴を有する。
【００９０】
本発明の化合物は、活性な脱離基を含まない。脱離基前駆体は酸化されなければならず、その酸化された形態が脱離基として作用する。酸化を、脱離基前駆体を脱離基に変換する酸化工程と呼ぶ。ドナー−π−ドナー脱離基の場合、これはWursterまたはWeitz型の酸化還元プロセスが生じることを意味する（Huenig、前出）。
【００９１】
脱離基前駆体の芳香族系を酸化するために、種々の機構がすぐに使える。一方では脱離基前駆体および他方では適用の様式の酸化性に依存して、適切な酸化剤が選択される。
【００９２】
本発明の方法を実施する好ましい様式において、酸化はペルオキシダーゼを使用して実施される。
【００９３】
適切な化学酸化剤を使用することも好ましい。本発明の測定プロセスについて、発光分子の破壊が起こらないこと（例えば、Ｃ−Ｃ結合の破壊が起こらないこと）を保証する化学酸化の条件が、選択されなければならない。典型的な化学酸化剤としては、過ホウ酸塩、過硫酸塩、DDQ（ジシアノジクロロキノン）、希HNO3、Br04-、H2O2、または硝酸セルアンモニウム（cerammonium）IVが挙げられる。
【００９４】
さらに好ましい様式において、酸化は電気化学手段により実施される。
【００９５】
発光部分前駆体は、脱離基前駆体の酸化後、容易に遊離する。過酸化物または反応性酸素種（酸素ラジカルアニオンなど）の作用の際に、図１に示した機構に従って、発光部分の前駆体は、カルボキシル基が除去されて電子的に励起したエミッターを発生するジオキセタン（dioxetane）中間体をおそらく形成する。このエミッターの基底状態への遷移は光子の放出（＝化学発光）により起こる。それにより放射されるエネルギー（光）は、標準的手順により日常の器具を用いて測定される。
【００９６】
示されるように、H2O2または酸素ラジカルアニオンなどの反応性酸素種は、中間体ジオキセタノン（dioxetanone）を形成するために存在していなければならない。H2O2は、直接的に付加されるか、または例えば酵素反応（グルコースオキシダーゼ／グルコース）により間接的に生成され得る。反応性酸素種は、酸素またはH2O2から化学発光反応の間に生成される。あるいは、反応性酸素種は、例えば、酸素開始Ｃ−Ｃカップリングにより計画的に生成され得る（インドキシル−リン酸塩、米国特許第5,589,328号）。
【００９７】
上記のように、発光基前駆体は、光発生反応の間に酸化され、例えば、アクリダン(acridan)がアクリジニウム(acridinium)に酸化される。もちろん酸化条件は、発光分子の破壊が起こらないように選択されなければならない。
【００９８】
好ましくは、LEGPの酸化に使用される試薬は、脱離基前駆体を脱離基へ変換するために使用されるものと同じである。最も好ましくは、酸化が実施され、光がペルオキシダーゼの存在下でH2O2の使用により発生する。
【００９９】
上記の酸化工程（例えば、PODなどの酵素により触媒される）はまた、媒介物質またはエンハンサーの使用により加速され得る。
【０１００】
媒介物質は、電子伝達プロセスを加速することによって化合物の酸化を促進する酸化還元活性化合物である。媒介物質は酸化剤により酸化され、次いで本発明の化合物を酸化し、それにより、媒介物質は再度還元される。典型的な媒介物質はヘキソシアノ鉄酸塩（II）およびフェロセンなどの金属複合体である。化学発光反応に使用される他のエンハンサーとしては、ヨードフェノールまたはフェニルボロン酸（boronic acid）などの化学物質が挙げられる。
【０１０１】
酸化は好ましくは、発光複素環式ケトンの周囲に疎水性微小環境（microenvironment）を作る適切な界面活性剤の存在下で実施される。これにより、化学発光定量収量の増加を生じる。なぜならば、水分子との相互作用によるクエンチングが減少するからである。さらに、フルオレセインなどの適切な蛍光物質（fluorophor）は界面活性剤に共有結合され得るか、あるいは、蛍光物質は、励起した複素環式ケトンからこの蛍光物質へエネルギー転移させるために反応混合物に添加され得る。
【０１０２】
本発明に記載の化合物のさらなる魅力的な特性は、全く異なる反応動態が生じ得ることであり、必要により選択される化合物である。これは、図３および５に示される放射動態を比較することにより明らかとなる。グロー（glow）型反応動態（緩徐であるが長期持続反応）は、ブロット技術などの適用に非常に好ましい。一方、フラッシュ型反応（速く高い強度ピーク）は、液相アッセイ系、例えば免疫アッセイにかなり好ましい。ブロット技術に関連する染色への本発明のグロー型化合物の使用もまた、好ましい態様である。最も好ましくは、フラッシュ型化合物が、液相免疫アッセイにおいて使用される。
【０１０３】
以下の実施例、参考文献、及び図面は、本発明の理解を助けるために提供され、本発明の真の範囲は添付の特許請求の範囲に示される。示される手順における改変は本発明の趣旨を逸脱せずになされ得ることが理解される。
【実施例】
【０１０４】
実施例１：発光基前駆体としてアクリジニウム-(9-カルボン酸)および脱離基前駆体としてオキサジンを含有する化合物の合成
a)  アクリジニウム-(9-カルボン酸)クロリドの合成
600mgのアクリジニウム-9-カルボン酸水和物(Aldrich発注番号24,634-4)を3mbar/60℃で３時間エバポレートした。乾燥残渣を5.0mlの塩化チオニルと混合し、３時間還流した。塩化チオニルを蒸留により除去した。残っている(約570mg)カルボン酸塩化物をさらなる精製なしに使用した。
【０１０５】
b)  (3,7-ビス-ジエチルアミノ-フェノキサジン-10-イル)-アクリジニウム-9-イル-メタノンの合成
アルゴン雰囲気下で、500mgの過塩素酸オキサジン(Kodak 11885)を80mlの脱気アルゴン飽和水中で溶解した。溶液が脱色するまで、亜ジチオン酸ナトリウム(Merck 6507)を添加した。次に、80ml中570mgのアクリジニウム-9-カルボン酸塩化物の溶液を添加した。混合物を30分間激しく撹拌した。100mlの蒸留水および100mlの塩化メチレンを添加した。混合物を分液漏斗に移した。有機層を分離し、水で２回洗浄した。硫酸ナトリウムでの乾燥および濾過の後、溶媒をエバポレートした。残渣をヘキサン／酢酸エチル 6:4の混合物に(6:4の比で)溶解し、シリカゲル60(Merck 1.09385.9025)のカラムクロマトグラフィーにより精製した：長さ30cm高さ50cm／直径2.5cm：溶出液：ヘキサン／酢酸エチル 6:4。溶離液を20ml部に分画した。画分をTLC（薄層クロマトグラフィー）(シリカゲル60 F254 Merck 1.05735；ヘキサン／酢酸エチル 6:4)により解析した。所望の生成物を含む画分(この実験において、生成物は0.45のRf値を有した)を回収した。溶媒をエバポレーションにより除去した。
収量：314mg
【０１０６】
c)  (3,7-ビス-ジエチルアミノ-フェノキサジン-10-イル)-N-メチルアクリジニウム-9-イル-メタノンの合成
アルゴン下、67μl(0.59mmol)のトリフルオロメタンスルホン酸を、314mg(0.59mmol)の(3,7-ビス-ジエチルアミノフェノキサジン-10-イル)-アクリジニウム-9-イル-メタノンの乾燥塩化メチレン50mlの溶液に添加した。混合物を室温で16時間撹拌した。200mlの石油エーテル(petrolether)を添加し、所望の産物の沈殿を生じさせる。沈殿物を減圧濾過により濾過し、石油エーテルで洗浄した。わずかに緑色の結晶を水に溶解し、シリンジとフィルター(0.45μm、Minisart RC 15 Sartorius 17762)を使用することにより濾過した。濾液を凍結乾燥した。凍結乾燥物を酢酸エチルに溶解し、TLC(薄層クロマトグラフィー)(シリカゲル60 F254 Merck 1.05735；ヘキサン／酢酸エチル 6:4)により解析した。生成物は、0.41のRf値を有した。アクリジニウムオキサジン(3,7-ビス-ジエチルアミノフェノキサジン-10-イル)-N-メチルアクリジニウム-9-イル-メタノン(M+＝545.36)の同一性をMALDI TOF MS(マトリックス補助レーザー分解イオン化飛行時間質量分析)陽性モードにより確認した。
【０１０７】
実施例２：アクリジニウムオキサジンの評価：速度論、感度、量子収量
Berthold Lumat LB953で測定を行なった。化学発光を作製するために、２つのトリガーを使用した。トリガー１は、脱離基前駆体の酸化を生じ、トリガー２は、化学発光を促進する。
トリガー１：  300μl、0.5％H2O2、0.1M HNO3
トリガー２：  300μl、0.25M NaOH
【０１０８】
実施例１のアクリジニウム−オキサジンを、0.1％Thesitを含むPBS緩衝液中1×10-8Mol/lに希釈した。100μlの試料を5mlのSarstedtチューブに分配し、装置にセットした。トリガー１を位置−１に、トリガー２を装置の測定位置に添加した。測定を10秒間行なった。
【０１０９】
上記条件下でのこの化合物に対する発光の速度論を図３に示す。
【０１１０】
感度、量子収量：
【０１１１】
0.1％Thesitを含むPBS緩衝液中のアクリジニウム−オキサジンの連続希釈を行った。各試料を、測定時間がわずか２秒であることを除いては、上記のように測定した。ブランクとはなおも有意に異なる最少シグナルを、最低検出限界とみなした。
最低検出限界：1×10-11Mol/l
【０１１２】
シグナルの最高値および使用した色素の量から、この実験のための光の収量は、1.34×10e16RLU/molと計算した。
【０１１３】
実施例３：D-ルシフェリン-オキサジン(図４の化合物７)(3,7-ビス-ジエチルアミノフェノキサジン-10-イル)-[4,5-ジヒドロ-2-(6-ヒドロキシベンゾチアゾール-2-イル)チアゾール-4-イル]-メタノンの合成
【０１１４】
a)  2-(6-tert-ブチルジメチルシリルオキシベンゾチアゾール-2-イル)-4,5ジヒドロチアゾール-4-イルカルボン酸塩化物(図４の化合物３)の合成
700mg(2.5mmol)のD-ルシフェリン(Sigma, no. L 9504)をアルゴン下で50mlのテトラヒドロフランに溶解する。830mg(5.5mmol)のtert-ブチルジメチルシリルクロリド(Ardrich, no. 19,050-0)、続いて1.37ml(10mmol)のトリエチルアミンを外界温度で添加する。数分後、塩化アンモニウムの白色沈殿物が形成する。溶液を一晩アルゴン下で撹拌し、次に沈殿物を濾過し、溶媒をロタベーパー(rotavapor)で除去した(水浴40℃)。
【０１１５】
残渣を15mlの塩化メチレンに溶解し、澄んだ溶液を-15℃に冷却し、0.325ml(3.75mol)の塩化オキサリルおよび10滴の新しい蒸留ジメチルホルムアミドの混合物をアルゴン下で数分かけてゆっくり添加し、激しく撹拌する。この工程の間に、少しの気体放出が観察されうる。反応混合物をさらに15分間-15℃で撹拌し、次に85mlの新鮮な蒸留塩化メチレンを添加する。
【０１１６】
得られる酸塩化物(図４の３)の澄んだ溶液を、精製なしにさらなる反応に使用する。
【０１１７】
b)  (3,7-ビス-ジエチルアミノフェノキサジン-10-イル)-(4,5-ジヒドロ-2-(6-tert-ブチルジメチルシリルオキシベンゾチアゾール-2-イル)-チアゾール-4-イル)-メタノン(図４の化合物６)の合成
0.53g(1.25mmol)の過塩素酸オキサジン(Aldrich, no. 37,009-6)を100蒸留水中に溶解し、アルゴンで飽和させる。連続アルゴン流下で1.5gの亜ジチオン酸ナトリウムを暗青色溶液に添加し、反応容器を再び密封する。数分後、還元オキサジンの青色沈殿物（図４の化合物５）の形成により、溶液は色が消え、わずかな黄色に変わる。
【０１１８】
酸塩化物（図４の３）の有機溶液を懸濁液に添加し、得られる混合物をアルゴン下で激しく攪拌する。数分後、青色沈殿物は消え、混合物はわずかに黄色く濁るようになる。反応容器を、アルミホイルで密封し、さらに３時間アルゴン下で保つ。次いで乳濁液を分液漏斗に移し、塩化メチレン相を回収する。水相を100mlの塩化メチレンで抽出し、あわせた有機画分を最後にエバポレートする（水浴40℃）。残りの粗生成物(1.58gの青色オイル)を5mlのテトラヒドロフランに取り出し、シリカゲルカラム(Merck製Kieselgel 60、3×20cm)に供する。生成物を石油（petrol）エーテル／酢酸エチル4/1(v/v)で溶出し、適切な画分を回収し、プールする。溶媒を除去し、約760mgの濃縮生成物を得、それを同じ系で再度クロマトグラフィーにかけた。
【０１１９】
最終的に、140mg(16％)のシリル化コンジュゲート６が黄色でわずかに茶色がかったオイルとして残る。
【０１２０】
TLC(Kieselgel 60 F254、石油エーテル／酢酸エチル  4/1)：Rf＝0.35
【０１２１】
c)  (3,7-ビス-ジエチルアミノフェノキサジン-10-イル)-[4,5-ジヒドロ-2-(6-ヒドロキシベンゾチアゾール-2-イル)-チアゾール-4-イル]-メタノン（図４の化合物７）の合成
140mg(0.2mmol)のシリル化コンジュゲート（図４の６）を12mlの新鮮な蒸留テトラヒドロフランに溶解する。溶液をアルゴンで飽和し、104.6mg(0.4mmol)のテトラブチルフッ化アンモニウム一水和物(Aldrich, no. 24,151-2)を添加する。アルゴン下で外界温度にて１時間撹拌後、20mlの塩化メチレンを添加する。混合物を20mlの5％の塩化アンモニウム溶液、続いて20mlの飽和炭酸水素塩溶液で洗浄する。有機相を硫酸ナトリウムで乾燥し、エバポレートする。高い粘性の残渣を少容積の塩化メチレンに溶解し、シリカゲルカラム(Kieselgel H 60、1.5×35cm)に供する。同時に形成するチアゾール（図４の８）からの所望の生成物の分離（わずかに遅れる）を、石油エーテル／酢酸エチル  1/1(v/v)を用いて行う。生成物を含む画分をプールし、エバポレートする。低圧での乾燥後、純粋なコンジュゲート（図４の７）がほとんど無色の粘性オイルとして残る。
【０１２２】
TLC(Kieselgel 60 F254、石油エーテル／酢酸エチル  1/1)：Rf＝0.60
【０１２３】
ルミネセンス測定を、実施例２に記載のようにして行なう。
【０１２４】
実施例４：(3,7-ビス-ジエチルアミノフェノキサジン-10-イル)-[4,5-ジヒドロ-2-(6-ヒドロキシベンゾチアゾール-2-イル)-5,5-ジメチルチアゾール-4-イル]-メタノン(図６の構造８)の合成
【０１２５】
a)  (4,5-ジヒドロ-2-(6-ヒドロキシベンゾチアゾール-2-イル)-5,5-ジメチルチアゾール-4-イルカルボン酸)(図６の構造３)の調製
704mg(4mmol)の2-シアノ-6-ヒドロキシベンゾチアゾール１(EP 0024525に従って調製)、596mg(4mmol)のD-ペニシラミン２(Aldrich, no. P40-3)および276mg(2mmol)の炭酸カリウムを、アルゴン雰囲気下で6mlのメタノールおよび3.2mlの蒸留水中に溶解する。撹拌しながら混合物を３時間還流し、澄んだ黄色液体を得る。
【０１２６】
ロータリーエバポレーターを用いることにより、溶媒を減圧下に除去した(水浴40℃)。残りの黄色でわずかに茶色がかった懸濁液を100mlの蒸留水に取り出し、pHを濃塩酸で２に調整する。所望の産物が沈殿し、焼結ガラス濾過器を用いて濾過する。残渣を小容量のメタノールでフラスコ中に洗い出す。次に、メタノールを減圧下でロータリーエバポレーターを用いて除去し（水浴40℃）、黄色固体を得る。
【０１２７】
TLC(Kieselgel 60 F254、メタノール／クロロホルム  1/1)：Rf＝0.81
【０１２８】
b)  2-（6-tert-ブチルジメチルメチルシリルオキシベンゾチアゾール-2-イル）-4,5-ジヒドロ-5,5-ジメチルチアゾール-4-イルカルボン酸クロリド（図６の構造５）の調製
385mg(1.25mmol)のジメチル-D-ルシフェリン３をアルゴン雰囲気下で50mlの乾燥テトラヒドロフランに溶解する。415mg(2.75mmol)のtert-ブチルジメチルシリルクロリド(Aldrich, no. 19,050-0)および続いて0.506ml(5.0mmol)のトリエチルアミンを外界温度で添加する。数分後、塩化アンモニウムの白色沈殿が形成される。溶液を一晩アルゴン雰囲気下で撹拌し、次に沈殿を濾過し、溶媒をロタベーパーで除去し（水浴40℃）、2-(6-tert-ブチルジメチルシリルオキシベンゾチアゾール-2-イル)-5,5-ジメチル-4,5-ジヒドロチアゾール-4-イルカルボン酸tert-ブチルジメチルシリルエステル（図６の構造４）を黄色でわずかに茶色がかったオイルとして得る。
【０１２９】
2-(6-tert-ブチルジメチルシリルオキシベンゾチアゾール-2-イル)-4,5-ジヒドロ-5,5-ジメチル-4-チアゾールカルボン酸を、アルゴン雰囲気下で8mlの乾燥塩化メチレンに溶解し、澄んだ溶液を-15℃に冷却し、0.162ml(1.875mmol)の塩化オキサリルと500μlの新鮮な蒸留ジメチルホルムアミドの混合物を、激しく撹拌しながら反応物に滴下する。わずかな気体の放出が、この工程の間に観察されうる。反応混合物をさらに30分間-15℃で撹拌し、次に新鮮な蒸留塩化メチレンを用いて最終容量30mlまで希釈する。
【０１３０】
得られた2-(6-tert-ブチルジメチルシリルオキシベンゾチアゾール-2-イル)-4,5-ジヒドロ-5,5-ジメチル-4-チアゾールカルボン酸クロリド(図６の構造５)の澄んだ溶液を、さらなる精製なしに次の工程で直接使用する。
【０１３１】
C）(3,7-ビス-ジエチルアミノフェノキサジン-10-イル)-[4,5-ジヒドロ-2-(6-ヒドロキシベンゾチアゾール-2-イル)-5,5-ジメチルチアゾール-4-イル]-メタノン（図６の構造式８）の調製
265mg（0.625mmol）過塩素酸オキサジン（図６の構造式６）（Aldrich, 第37,009-6）を50ml蒸留水に溶解させ、アルゴンで飽和させる。アルゴンの連続流動下で、30mlピリジンおよび30ml塩化メチレンを添加する。さらなる0.75gの亜ジチオン酸ナトリウムを濃青色溶液に加え、反応容器を再び封着する。２、３分後、形成された２相反応混合物は無色になる。
【０１３２】
一方で、酸塩化物溶液５を、アルゴン雰囲気下で第２のフラスコに入れる。
【０１３３】
有機層（ロイコ-オキサジン（図６の構造式７）含有）を、高アルゴン圧を用いて第２のフラスコに薄いゴム管（標準的HPLC装備）によって移す。得られた反応混合物を、外界温度で一晩撹拌し、青緑色の溶液を得る。
【０１３４】
溶媒を除去した後、残存する粗生成物を５mlのテトラヒドロフランで取り上げシリカゲルカラムに適用する（Merck製シリカゲル60、4.5x25cm）。生成物を石油エーテル／酢酸エチル 1/1（v/v）で溶出し、適切な画分を回収し、プールする。溶媒を除去し、深青緑色の結晶固体として約52mgの濃縮生成物を得る。
【０１３５】
生成物を８mlアセトニトリル／酢酸エチル 1/1（v/v）に溶解させ、調製用逆相HPLC（Waters Delta Pak C-18カラム、100Å、15μm、50x300mm）により精製する。生成物をアセトニトリル／蒸留水グラジエント（０〜60％アセトニトリル；0.1％トリフルオロ酢酸）で溶出する。適切な画分を回収し、プールする。最終的に、溶媒を凍結乾燥により除去し、1.8mgのわずかに緑色の生成物（図６の８）を得る。
【０１３６】
TLC（Kieselgel 60 F254, 石油エーテル／酢酸エチル 1/1）：Rf＝0.44
【０１３７】
実施例７  ジメチル-D-ルシフェリン-2,5-ジメチル-4-ヒドロキシアニリド4の合成
[4,5-ジヒドロ-2-(6-ヒドロキシベンゾチアゾール-2-イル)-5,5-ジメチルチアゾール-4-イル]-カルボン酸-2,5-ジメチル-4-ヒドロキシフェニルアミド（図７の４）
【０１３８】
a）2-(6-tert.-ブチルジメチルシリルオキシベンゾチアゾール-2-イル)-4,5-ジヒドロ-5,5-ジメチルチアゾール-4-イル-カルボン酸-2,5-ジメチル-4-ヒドロキシフェニルアミド３の合成
実施例4b）のジメチル-D-塩化ルシフェリン酸（図７の１）の赤褐色の溶液を、−15℃で10mlの乾燥ピリジン／ジメチルホルムアミド1:1（v/v）中で412mg（3mmol）の4-アミノ-2,5-ジメチルフェノール（図７の２）（Aldrich, 第12,649-7）で粉砕する。反応混合物を室温にし、２時間撹拌する。溶媒を蒸発させ、残渣の茶色のオイルをオイルポンプ減圧下で室温で乾燥させる。約760mgの粗生成物を得、これを調製用HPLC（Waters Delta-Pak C-18; 100Å; 50x300mm; 15μm; 溶出液A: 60% H2O/40％アセトニトリル＋0.1％ TFA; 溶出液B: 100％アセトニトリル＋0.1％TFA; 150分で0−＞100％B）により精製する。適切な画分をプールし、凍結乾燥させる。
95mgの無色粉体を得る。
【０１３９】
TLC（Kieselgel 60F254, 石油エーテル／酢酸エチル 1/1 v/v）：Rf＝0.93
【０１４０】
b）4,5-ジヒドロ-2-(6-ヒドロキシベンゾチアゾール-2-イル)-5,5-ジメチルチアゾール-4-イル-カルボン酸-2,5-ジメチル-4-ヒドロキシフェニルアミド（図７の４）の合成
30mgのO-保護アニリド（図７の３）を３mlの乾燥THFに溶解させ、１mlのTHF中の26.15mg（0.1mmol）フッ化テトラブチルアンモニウム一水和物（TBAF; Aldrich, 第24,151-2）をアルゴン雰囲気下で撹拌しながら、明澄なオレンジ色の溶液に添加する。色は深紅色に変化し、10分後に20mlのジクロロメタンを添加する。反応混合物を2x10mlの５％塩化アンモニウムおよび2x飽和炭酸水素塩で洗浄する。有機溶液を小量の無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、次いで溶媒をロータベイパー（rotavapor）で除去する。
【０１４１】
生成物を、調製用HPLC（Waters Delta-Pak C-18; 100Å; 50x300mm; 15μm; 溶出液A: 80％ H2O/20％アセトニトリル＋0.1％TFA; 溶出液B: 100％アセトニトリル＋0.1％TFA; 80分で０−＞80％B）により深褐色がかった混合物から単離する。
【０１４２】
純粋生成物（図７の４）を含有する画分をプールし、凍結乾燥させ、1.95mgのオレンジ色の粉体を得る。
【０１４３】
TLC（Kieselgel 60 F254、石油エーテル／酢酸エチル 1/1 v/v）:Rf＝0.55
【０１４４】
参考文献のリスト
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WO 98/56765
WO 95/19976
WO 97/33884
WO 01/09372
【図面の簡単な説明】
【０１４５】
【図１】図１は、アクリジニウムエステル：仮定された反応機構を示す。２つの可能性のある経路を示す。光生成反応または光反応(=LR)は化学発光を生じ、一方で暗反応経路または暗プロセス(DP)は発光を伴わない直接の加水分解を生じる。
【図２】図２は、アクリジニウム-9-(N-スルホニル)カルボキシアミド標識の合成を示す。当該分野で公知である標識9-[アリール]-[4-(2,5-ジオキソ-ピロリジン-1-イルオキシカルボニルアルキル)-ベンゼンスルホニル]-アミノカルボニル)-10-メチル−アクリジニウム；トリフルオロ-メタンスルホネートは、本発明の化合物と比較して根本的な差異を例示するために示される。アミド結合の窒素原子は電子不十分であり、したがってアミド結合は、穏やかであるかまたは中程度の条件下で酸化されない。当該分野の化合物のこの状態のスルホニルエステル脱離基は、測定条件下での加水分解に対する安定性と迅速な放出との間の妥協を表わす。
【図３】図３は、アクリジニウム−オキサジンの反応速度論を示す。発光(相対ルミネセンス単位＝RLU)は、測定時間に関して示される。測定は、実施例２に記載の適切なトリガー溶液の添加により行われている。
【図４】図４は、ルシフェリン−オキサジンの合成を示す。(3,7-ビス-ジエチルアミノフェノキサジン-10-イル)-[4,5-ジヒドロ-2-(6-ヒドロキシベンゾチアゾール-2-イル)チアゾール-4-イル]-メタノン(図４の化合物７)を作製するために使用される化学的経路が、概略的に示される。この図に示される他の化合物は、１＝D-ルシフェリン；２＝2-(6-tert-ブチルジメチルシリルオキシベンゾチアゾール-2-イル)-4,5-ジヒドロチアゾール-4-イルカルボン酸tert-ブチルジメチルシリルエステル；３＝2-(6-tert-ブチルジメチルシリルオキシベンゾチアゾール-2-イル)-4,5-ジヒドロチアゾール-4-イルカルボン酸クロリド；４＝オキサジン(3,7-ビス-ジエチルアミノ-フェノキサジニリウム)；５＝ロイコ−オキサジン(N,N,N',N'-テトラエチル-10H-フェノキサジン-3,7-ジアミン)；６＝(3,7-ビス-ジエチルアミノフェノキサジン-10-イル)-(4,5-ジヒドロ-2-(6-tert-ブチルジメチルシリルオキシ-ベンゾチアゾール-2-イル)-チアゾール-4-イル)-メタノンである。
【図５】図５は、ルシフェリン−オキサジンの反応速度論を示す。測定は、実施例２に説明されるように行っている。
【図６】図６は、ルシフェリン−ベンゾキサジン化合物の合成を示す。(3,7-ビス-ジエチルアミノフェノキサジン-10-イル)-[4,5-ジヒドロ-2-(6-ヒドロキシベンジルチアゾール-2-イル)-5,5-ジメチルチアゾール-4-イル]-メタノン（図６の構造８）の化学的合成経路が、概略的に示される。この図において示される他の化合物は、１＝2-シアノ-6-ヒドロキシ-ベンゾチアゾール；２＝ペニシラミン；３＝ジメチルルシフェリン；４＝2-(6-tert-ブチルジメチルシリルオキシベンゾチアゾール-2-イル)-5,5-ジメチル-4,5-ジヒドロチアゾール-4-イルカルボン酸tert-ブチル-ジメチルシリルエステル；５＝2-(6-tert-ブチルジメチルシリルオキシベンゾチアゾール-2-イル)-5,5-ジメチル-4,5-ジヒドロチアゾール-4-イルカルボン酸クロリド；６＝オキサジン-(3,7-ビス-ジエチルアミノフェノキサジニリウム)；７＝ロイコ-オキサジン(N,N,N',N'-テトラエチル-10H-フェノキサジン-3,7-ジアミン)である。
【図７】図７は、ルシフェリン−アニリド化合物の合成を示す。[4,5-ジヒドロ-2-(6-ヒドロキシベンゾチアゾール-2-イル)-5,5-ジメチルチアゾール-4-イル]-カルボン酸-2,5-ジメチル-4-ヒドロキシフェニルアミド（図７の４）の化学的合成経路が示される。示される他の化合物は、2-(6-tert-ブチルジメチルシリルオキシベンゾチアゾール-2-イル)-4,5-ジヒドロ-5,5-ジメチルチアゾール-4-イルカルボン酸クロリド  １、4-アミノ-2,5-ジメチルフェノール  ２、および2-(6-tert-ブチルジメチルシリルオキシベンゾチアゾール-2-イル)-4,5-ジヒドロ-5,5-ジメチルチアゾール-4-イル-カルボン酸-2,5-ジメチル-4-ヒドロキシフェニルアミド３である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６（ａ）】
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【図６（ｂ）】
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【図７】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【手続補正書】
【提出日】平成15年5月14日(2003.5.14)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
発光部分前駆体および脱離基の前駆体を含有してなり、該発光部分前駆体のカルボニル基または化学的に等価な基がアミド結合によって脱離基前駆体の窒素原子に結合されており、酸化の際に該脱離基前駆体が脱離基に変換されることを特徴とする化合物。
【請求項２】
前記脱離基前駆体の窒素原子が供与体- π- 供与体酸化還元系の一部であることをさらに特徴とする請求項１記載の化合物。
【請求項３】
前記脱離基前駆体が、ロイコ- レゾルフィン、ロイコ- オキサジンおよび4-ヒドロキシ- アニリンからなる群より選ばれることをさらに特徴とする請求項１または２記載の化合物。
【請求項４】
前記発光部分前駆体が、ルシフェリン、アクリジニウムおよびアクリダンからなる群より選ばれる化学発光性ヘテロ環を含むことをさらに特徴とする請求項１〜３いずれか記載の化合物。
【請求項５】
前記発光部分前駆体がルシフェリンであることをさらに特徴とする請求項１〜４いずれか記載の化合物。
【請求項６】
発光部分前駆体、脱離基の前駆体およびカップリング基を含有してなり、該発光部分前駆体のカルボニル基または化学的に等価な基がアミド結合によって脱離基前駆体の窒素原子に連結されており、酸化の際に該脱離基前駆体が脱離基に変換されることを特徴とし、該カップリング基が脱離基前駆体の一部である化合物。
【請求項７】
生体分子および請求項１〜６いずれか記載の化合物を含有してなるコンジュゲート。
【請求項８】
サンプル中の分析物の検出のための特異的結合アッセイにおける請求項７記載のコンジュゲートの使用。
【請求項９】
過酸化物の検出のための請求項１〜６いずれか記載の化合物または請求項７記載のコンジュゲートの使用。
【請求項１０】
ペルオキシダーゼの検出のための請求項１〜６いずれか記載の化合物または請求項７記載のコンジュゲートの使用。
【請求項１１】
過酸化物の存在下で、
ａ）脱離基前駆体が酸化される、
ｂ）シグナル放出基前駆体が解放される、
ｃ）光が放出される、および
ｄ）ｃ）で放出された光が測定される、
ことを特徴とする、請求項１〜６いずれか記載の化合物または請求項７記載のコンジュゲートを使用して発光測定を行う方法。
【国際調査報告】
2004535423.tif 000060
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2004535423.tif 000062
2004535423.tif 000063
2004535423.tif 000064
2004535423.tif 000065