(57)【要約】本発明は、Ｐ−セレクチンのレクチンおよびＥＧＦ様（ＬＥ）ドメインの結晶および三次元構造、ＳＬｅＸとそれぞれ複合体形成されたＰ−セレクチンＬＥおよびＥ−セレクチンＬＥの結晶および三次元構造、ならびに、チロシン硫酸化およびＳＬｅＸの両方で修飾された機能性ＰＳＧＬ−１ペプチドと複合体形成されたＰ−セレクチンＬＥの結晶および三次元構造に関する。また本発明は、上記構造のそれぞれを活性化または阻害する作用薬を同定するための方法も提供する。さらに、本発明は、このような方法で同定された作用薬を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
結晶Ｐ−セレクチンＬＥ。
【請求項２】
空間群Ｐ２１のプレート型であり、ａ＝８１．０Å、ｂ＝６０．８Å、ｃ＝９１．４Å、およびβ＝１０３．６°の単位格子パラメータを有することを特徴とする請求項１に記載の結晶Ｐ−セレクチンＬＥ。
【請求項３】
Ｐ−セレクチンＬＥおよびＳＬｅＸの結晶複合体。
【請求項４】
空間群Ｐ２１のプレート型であり、ａ＝８１．１Å、ｂ＝６０．５Å、ｃ＝９１．４Å、およびβ＝１０３．３°の単位格子パラメータを有することを特徴とする請求項３に記載の結晶複合体。
【請求項５】
Ｅ−セレクチンＬＥおよびＳＬｅＸの結晶複合体。
【請求項６】
空間群Ｐ２１２１２１のロッド型であり、ａ＝３４．５Å、ｂ＝７２．４Å、およびｃ＝７７．６Åの単位格子パラメータを有することを特徴とする請求項５に記載の結晶複合体。
【請求項７】
Ｐ−セレクチンＬＥおよびＰＳＧＬ−１ペプチドの結晶複合体。
【請求項８】
空間群Ｉ２２２の両錐型であり、ａ＝６３．４Å、ｂ＝９６．８Å、およびｃ＝１８７．３Åの単位格子パラメータを有することを特徴とする請求項７に記載の結晶複合体。
【請求項９】
ＳＬｅＸ結合タンパク質またはペプチドの活性部位であって、該活性部位が、アミノ酸残基ＴＹＲ４８、ＧＬＵ８０、ＡＳＮ８２、ＧＬＵ９２、ＴＹＲ９４、ＰＲＯ９８、ＳＥＲ９９、ＡＳＮ１０５、ＡＳＰ１０６、ＧＬＵ１０７および結合カルシウムの図３による相対構造座標を含み、該アミノ酸の主鎖原子からの±２乗平均平方根偏差が１．５Å以下である当該活性部位。
【請求項１０】
前記活性部位が、さらに、アミノ酸残基ＴＹＲ４４、ＳＥＲ４６、ＳＥＲ４７、ＡＬＡ７７、ＡＳＰ７８、ＡＳＮ７９、ＰＲＯ８１、ＡＳＮ８３、ＡＲＧ８５、ＧＬＵ８８、ＣＹＳ９０、ＩＬＥ９３、ＬＹＳ９６、ＳＥＲ９７、ＡＬＡ１００、ＴＲＰ１０４、ＨＩＳ１０８、ＬＹＳ１１１およびＬＹＳ１１３の図３による相対構造座標を含み、前記アミノ酸の主鎖原子からの±２乗平均平方根偏差が１．５Å以下である請求項９に記載の活性部位。
【請求項１１】
ＳＬｅＸ結合タンパク質またはペプチドの活性部位であって、該活性部位が、図４によるアミノ酸残基ＴＹＲ４８、ＧＬＵ８０、ＡＳＮ８２、ＡＳＮ８３、ＧＬＵ９２、ＴＹＲ９４、ＡＲＧ９７、ＧＬＵ９８、ＡＳＮ１０５、ＡＳＰ１０６、ＧＬＵ１０７および結合カルシウムの相対構造座標を含み、該アミノ酸の主鎖原子からの±２乗平均平方根偏差が１．５Å以下である当該活性部位。
【請求項１２】
前記活性部位が、さらに、図４によるアミノ酸残基ＴＹＲ４４、ＳＥＲ４５、ＰＲＯ４６、ＳＥＲ４７、ＡＬＡ７７、ＰＲＯ７８、ＧＬＹ７９、ＰＲＯ８１、ＧＬＵ８８、ＣＹＳ９０、ＬＹＳ９９、ＡＳＰ１００、ＴＲＰ１０４、ＡＲＧ１０８、ＬＹＳ１１１およびＬＹＳ１１３の相対構造座標を含み、前記アミノ酸の主鎖原子からの±２乗平均平方根偏差が１．５Å以下である請求項１１に記載の活性部位。
【請求項１３】
ＰＳＧＬ−１結合タンパク質またはペプチドの活性部位であって、該活性部位は、図５によるアミノ酸残基ＡＬＡ９、ＴＹＲ４５、ＳＥＲ４６、ＳＥＲ４７、ＴＹＲ４８、ＧＬＵ８０、ＡＳＮ８２、ＬＹＳ８４、ＡＲＧ８５、ＧＬＵ８８、ＧＬＵ９２、ＴＹＲ９４、ＰＲＯ９８、ＳＥＲ９９、ＡＳＮ１０５、ＡＳＰ１０６、ＧＬＵ１０７、ＨＩＳ１０８、ＬＥＵ１１０、ＬＹＳ１１１、ＬＹＳ１１２、ＬＹＳ１１３、ＨＩＳ１１４、および結合ストロンチウムの相対構造座標を含み、該アミノ酸の主鎖原子からの±２乗平均平方根偏差が１．５Å以下である当該活性部位。
【請求項１４】
前記活性部位が、さらに、図５によるアミノ酸残基ＳＥＲ６、ＴＨＲ７、ＬＹＳ８、ＴＹＲ１０、ＳＥＲ１１、ＴＹＲ４４、ＴＹＲ４９、ＴＲＰ５０、ＡＬＡ７７、ＡＳＰ７８、ＡＳＮ７９、ＰＲＯ８１、ＡＳＮ８３、ＡＳＮ８６、ＡＳＮ８７、ＣＹＳ９０、ＩＬＥ９３、ＩＬＥ９５、ＬＹＳ９６、ＳＥＲ９７、ＡＬＡ１００、ＴＲＰ１０４、およびＣＹＳ１０９の相対構造座標を含み、前記アミノ酸の主鎖原子からの±２乗平均平方根偏差が１．５Å以下である請求項１３に記載の活性部位。
【請求項１５】
、Ｐ−セレクチンＬＥと相互作用する作用薬を同定するための方法であって、
（ａ）アミノ酸の主鎖原子からの±２乗平均平方根偏差が１．５Å以下である図２、３または５による相対構造座標を用いて、Ｐ−セレクチンＬＥの三次元モデルを生成するステップと、
（ｂ）Ｐ−セレクチンＬＥと相互作用する作用薬を設計または選択するために、前記三次元モデルを使用するステップと、
を含む方法。
【請求項１６】
（ｃ）同定された前記作用薬を獲得するステップと、（ｄ）前記同定された作用薬がＰ−セレクチンＬＥ活性に関して有する効果を決定するために、前記同定された作用薬をＰ−セレクチンＬＥと接触させるステップと、をさらに含む請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
ＳＬｅＸ結合部位を含む分子または分子複合体の活性化剤または阻害剤を同定するための方法であって、
（ａ）（ｉ）残基ＴＹＲ４８、ＧＬＵ８０、ＡＳＮ８２、ＧＬＵ９２、ＴＹＲ９４、ＰＲＯ９８、ＳＥＲ９９、ＡＳＮ１０５、ＡＳＰ１０６、ＧＬＵ１０７および結合カルシウムの図３による相対構造座標（前記アミノ酸の主鎖原子からの±２乗平均平方根偏差が１．５Å以下）、または（ｉｉ）アミノ酸残基ＴＹＲ４８、ＧＬＵ８０、ＡＳＮ８２、ＧＬＵ９２、ＴＹＲ９４、ＡＲＧ９７、ＧＬＵ９８、ＡＳＮ１０５、ＡＳＰ１０６、ＧＬＵ１０７および結合カルシウムの図４による相対構造座標（前記アミノ酸の主鎖原子からの±２乗平均平方根偏差が１．５Å以下である）を用いて、ＳＬｅＸ結合部位を含む分子または分子複合体の三次元モデルを生成するステップと、
（ｂ）ステップ（ａ）で生成された三次元モデルと、候補活性化剤または阻害剤のコンピュータフィッティング解析を実行することによって、候補活性化剤または阻害剤を選択または設計するステップと、
を含む当該方法。
【請求項１８】
図３による前記相対構造座標は、さらに、アミノ酸残基ＴＹＲ４４、ＳＥＲ４６、ＳＥＲ４７、ＡＬＡ７７、ＡＳＰ７８、ＡＳＮ７９、ＰＲＯ８１、ＡＳＮ８３、ＡＲＧ８５、ＧＬＵ８８、ＣＹＳ９０、ＩＬＥ９３、ＬＹＳ９６、ＳＥＲ９７、ＡＬＡ１００、ＴＲＰ１０４、ＨＩＳ１０８、ＬＹＳ１１１およびＬＹＳ１１３を含み、前記アミノ酸の主鎖原子からの±２乗平均平方根偏差が１．５Å以下である請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
図４による前記相対構造座標は、さらに、アミノ酸残基ＴＹＲ４４、ＳＥＲ４５、ＰＲＯ４６、ＳＥＲ４７、ＡＬＡ７７、ＰＲＯ７８、ＧＬＹ７９、ＰＲＯ８１、ＧＬＵ８８、ＣＹＳ９０、ＬＹＳ９９、ＡＳＰ１００、ＴＲＰ１０４、ＡＲＧ１０８、ＬＹＳ１１１およびＬＹＳ１１３を含み、前記アミノ酸の主鎖原子からの±２乗平均平方根偏差が１．５Å以下である請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
（ｃ）候補活性化剤または阻害剤を獲得するステップと、（ｄ）前記候補活性化剤または阻害剤を分子または分子複合体と接触させ、前記候補活性化剤または阻害剤が分子または分子複合体に関して有する効果を決定するステップと、をさらに含む請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
前記候補活性化剤または阻害剤が分子または分子複合体のＳＬｅＸへの結合に関して有する効果を決定するために、前記候補活性化剤または阻害剤は、ＳＬｅＸの存在下で分子または分子複合体と接触される請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
ＰＳＧＬ−１結合部位を含む分子または分子複合体の活性化剤または阻害剤を同定するための方法であって、
（ａ）アミノ酸残基ＡＬＡ９、ＴＹＲ４５、ＳＥＲ４６、ＳＥＲ４７、ＴＹＲ４８、ＧＬＵ８０、ＡＳＮ８２、ＬＹＳ８４、ＡＲＧ８５、ＧＬＵ８８、ＧＬＵ９２、ＴＹＲ９４、ＰＲＯ９８、ＳＥＲ９９、ＡＳＮ１０５、ＡＳＰ１０６、ＧＬＵ１０７、ＨＩＳ１０８、ＬＥＵ１１０、ＬＹＳ１１１、ＬＹＳ１１２、ＬＹＳ１１３、ＨＩＳ１１４、および結合ストロンチウムの図５による相対構造座標（前記アミノ酸の主鎖原子からの±２乗平均平方根偏差が１．５Å以下である）を用いて、ＰＳＧＬ−１結合部位を含む分子または分子複合体の三次元モデルを生成するステップと、
（ｂ）前記ステップ（ａ）で生成された三次元モデルと、候補活性化剤または阻害剤のコンピュータフィッティング解析を実行することによって、候補活性化剤または阻害剤を選択または設計するステップと、
を含む当該方法。
【請求項２３】
図５による前記相対構造座標は、さらに、アミノ酸残基ＳＥＲ６、ＴＨＲ７、ＬＹＳ８、ＴＹＲ１０、ＳＥＲ１１、ＴＹＲ４４、ＴＹＲ４９、ＴＲＰ５０、ＡＬＡ７７、ＡＳＰ７８、ＡＳＮ７９、ＰＲＯ８１、ＡＳＮ８３、ＡＳＮ８６、ＡＳＮ８７、ＣＹＳ９０、ＩＬＥ９３、ＩＬＥ９５、ＬＹＳ９６、ＳＥＲ９７、ＡＬＡ１００、ＴＲＰ１０４およびＣＹＳ１０９を含み、前記アミノ酸の主鎖原子からの±２乗平均平方根偏差が１．５Å以下である請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
（ｃ）候補活性化剤または阻害剤を獲得するステップと、（ｄ）前記候補活性化剤または阻害剤を分子または分子複合体と接触させ、前記候補活性化剤または阻害剤が分子または分子複合体に関して有する効果を決定するステップと、をさらに含む請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
前記候補活性化剤または阻害剤が分子または分子複合体のＰＳＧＬ−１またはＰＳＧＬ−１ペプチドへの結合に関して有する効果を決定するために、前記候補活性化剤または阻害剤は、ＰＳＧＬ−１またはＰＳＧＬ−１ペプチドの存在下で分子または分子複合体と接触される請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
ＳＬｅＸと相互作用する作用薬を同定するための方法であって、
（ａ）アミノ酸の主鎖原子からの±２乗平均平方根偏差が１．５Å以下である図３または図４による相対構造座標を用いて、ＳＬｅＸの三次元モデルを生成するステップと、
（ｂ）ＳＬｅＸと相互作用する作用薬を設計または選択するために、前記三次元構造を使用するステップと、
を含む当該方法。
【請求項２７】
（ｃ）同定された前記作用薬を獲得するステップと、（ｄ）前記同定された作用薬がＳＬｅＸ活性に関して有する効果を決定するために、前記同定された作用薬をＳＬｅＸと接触させるステップと、をさらに含む請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
ＰＳＧＬ−１と相互作用する作用薬を同定するための方法であって、
（ａ）アミノ酸の主鎖原子からの±２乗平均平方根偏差が１．５Å以下である図５による相対構造座標を用いて、ＰＳＧＬ−１ペプチドの三次元モデルを生成するステップと、
（ｂ）ＰＳＧＬ−１と相互作用する作用薬を設計または選択するために、前記三次元構造を使用するステップと、
を含む当該方法。
【請求項２９】
（ｃ）同定された前記作用薬を獲得するステップと、（ｄ）前記同定された作用薬がＰＳＧＬ−１またはＰＳＧＬ−１ペプチドの活性に関して有する効果を決定するために、前記同定された作用薬をＰＳＧＬ−１またはＰＳＧＬ−１ペプチドと接触させるステップと、をさらに含む請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
請求項１５の方法によって同定される作用薬。
【請求項３１】
請求項１７の方法によって同定される阻害剤または活性化剤。
【請求項３２】
請求項２２の方法によって同定される阻害剤または活性化剤。
【請求項３３】
請求項２６の方法によって同定される作用薬。
【請求項３４】
請求項２８の方法によって同定される作用薬。
【請求項３５】
Ｅ−セレクチン型分子とカルシウムに配位する化合物との結晶複合体を獲得するための方法であって、
（ａ）カルシウムイオンおよびＰＥＧの存在下で結晶Ｅ−セレクチン型分子とカルシウムに配位する前記化合物とを接触させて、Ｅ−セレクチン型分子とカルシウムに配位する化合物との結晶複合体を形成するステップと、
（ｂ）濃度が低下されたカルシウムイオンならびに十分な濃度のＰＥＧおよびイオン塩の存在下で前記結晶複合体を接触させて、冷却した際に、最終の結晶複合体のＸ線回折によってＥ−セレクチン型分子およびカルシウムに配位する前記化合物の三次元構造を解明するのに適する前記最終の結晶複合体を獲得するステップと、
を含む当該方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
［発明の分野］
本発明は、Ｐ−セレクチンのレクチンおよびＥＧＦ様（ＬＥ）ドメインの結晶および三次元構造、ＳＬｅＸとそれぞれ複合体形成されたＰ−セレクチンＬＥおよびＥ−セレクチンＬＥの結晶および三次元構造、ならびに、チロシン硫酸化およびＳＬｅＸの両方で修飾された機能性ＰＳＧＬ−１ペプチドと複合体形成されたＰ−セレクチンＬＥの結晶および三次元構造に関する。これらの構造は、炎症プロセスにおける白血球の細胞ローリングを妨害する作用薬の設計および選択に重要である。
【０００２】
［発明の背景］
セレクチンは、炎症部位への白血球の補充およびリンパ組織への白血球の遊出において、初期接着現象を担う細胞表面糖タンパク質のファミリーである（（Ｋａｎｓａｓ、１９９６）ならびに（ＶｅｓｔｗｅｂｅｒおよびＢｌａｎｋｓ、１９９９）において概説）。多段階プロセス（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ、１９９４）の一部として、セレクチンは血管壁上の白血球の初期付着（係留（ｔｅｔｈｅｒｉｎｇ））およびそれに続くローリングを促進し、血管壁では、局在的に生成したケモカインへさらされた結果、それらは活性化されることになる。インテグリンにより媒介される白血球の強固な接着は、下側組織への血管外遊走に先行する。Ｐ−セレクチン（ＣＤ６２Ｐ）およびＥ−セレクチン（ＣＤ６２Ｅ）は、炎症刺激に応答して血管内皮表面に誘発される。活性化血小板によっても発現されるＰ−セレクチンは、炎症性媒介物による誘発に続いて、数分以内に細胞内貯蔵所から細胞表面へ移動される。Ｅ−セレクチンは転写的に調節されて、血管内皮の活性化の数時間以内に出現する。セレクチンファミリーの第３のメンバーであるＬ−セレクチン（ＣＤ６２Ｌ）は、白血球上に構成的に発現される。炎症におけるその役割に加えて、Ｌ−セレクチンは、血液からリンパ組織への遊走の過程で、特定化された高内皮性細静脈へのリンパ球の付着を媒介する。
【０００３】
セレクチンは、多数の構造的および機能的特性を共有する。これらは、相同性の高いＮ−末端カルシウム依存性（Ｃ−型（Ｄｒｉｃｋａｍｅｒ、１９８８））レクチンドメインと、上皮成長因子（ＥＧＦ）様ドメインと、可変数の補体調節様ユニットと、膜貫通ドメインと、細胞内領域とから成る。セレクチン結合が、主に、レクチンドメインと、並んだ細胞上のグリカンリガンドとの間の弱いタンパク質−炭水化物の相互作用よって媒介されることが、一般的に認められる。多くの異なるグリカン構造は、セレクチンの結合を支援および／または阻害できると説明されている。しかしながら、シアリルルイスＸ（ＳＬｅＸ、ＮｅｕＮＡｃ２，３Ｇａｌ１，４［Ｆｕｃ１，３］ＧｌｃＮＡｃ）四糖により表示されるエピトープおよび関連構造は、３つすべてのセレクチンに共通する生理学的に適切な認識成分であると思われる（Ｆｏｘａｌｌ他、１９９２）。認識のための更なる因子は、多様な構造の明白な高親和性（または結合性）の特異性糖タンパク質カウンタレセプターの単離によって示唆された。これらには、ＧｌｙＣＡＭ−１（Ｌａｓｋｙ他、１９９２）、ＭＡｄＣＡＭ−１（Ｂｅｒｇ他、１９９３）、ＣＤ３４（Ｂａｕｍｈｅｕｔｅｒ他、１９９３）、ＥＳＬ−１（Ｌｅｖｉｎｏｖｉｔｚ他、１９９３）、およびＰＳＧＬ−１（Ｍｏｏｒｅ他、１９９２）、（Ｓａｋｏ他、１９９３）が含まれる。しかしながら、これらの重グリコシル化タンパク質はどれも、事実上、本質的に、細胞または組織に特異的なグリコシル化能力（すなわち、ＳＬｅＸ様グリカンを生成する能力）であり、特異性タンパク質の発現ではなく、セレクチンの反応性を最終的に与える可能性を生じる、という限られた証拠があるだけである。明白な例外はＰＳＧＬ−１であり、白血球の実質的に全てのサブセットによって発現されるムチン様のホモ二量体糖タンパク質である（（Ｙａｎｇ他、１９９９）ならびに（ＭｃＥｖｅｒおよびＣｕｍｍｉｎｇｓ、１９９７）において概説）。Ｐ−セレクチン認識は、ＰＳＧＬ−１のムチン様領域内のグリカンのＳＬｅＸ様の修飾に依存することが予想されたが、本質的な結合エピトープは、ムチンドメインの十分外側のポリペプチド主鎖のアニオン性Ｎ−末端部分へ局在化された（ＰｏｕｙａｎｉおよびＳｅｅｄ、１９９５、Ｓａｋｏ他、１９９５、Ｗｉｌｋｉｎｓ他、１９９５）。多数の研究は、Ｐ−セレクチン媒介結合および生体内の炎症応答がＰＳＧＬ−１内のこのポリペプチド決定要因を標的にすることによって大きく減少され得ることを実証した（ＭｃＥｖｅｒおよびＣｕｍｍｉｎｇｓ、１９９７、Ｙａｎｇ他、１９９９）。さらに、ＰＳＧＬ−１において遺伝的に欠損されたマウスの最近の研究は、Ｐ−セレクチン媒介の白血球ローリングおよび炎症補充において著しい欠陥を示すと説明した（Ｙａｎｇ他、１９９９）。したがって、ＰＳＧＬ−１は、ポリペプチドおよびＳＬｅＸ−修飾されたグリカン成分の両方が生理学的に適切な結合のために必要とされるセレクチンカウンタレセプターの単一の例を表わす。
【０００４】
脈管構造内で遭遇される剪断応力の影響下の細胞付着およびローリングの媒介物としてのその独特の機能の観点から、セレクチン相互作用の根本的な生物物理的および分子的基礎の特徴づけに対してかなりの努力が向けられてきた。セレクチンは高速結合速度論でそのリガンドと会合および解離し（Ａｌｏｎ他、１９９７、Ａｌｏｎ他、１９９５）、過渡的な係留および細胞ローリング現象を媒介する能力を部分的に担うと思われるのは、この特性である。セレクチン相互作用の機械的特性（Ａｌｏｎ他、１９９５、Ｐｕｒｉ他、１９９８）および独特の構造的特性（Ｃｈｅｎ他、１９９７）を含む他の因子も含まれると思われるが、これらは、生理的リガンドと複合体形成されたセレクチンの高分解能分子構造が欠如しているために、まだ完全には特徴づけられていない。この制限を克服するために著しい努力が成されてきたが、現在まで、これらは不完全なままである。レクチンおよびＥＧＦドメイン（ｌｅｃ／ＥＧＦ）を含むＥ−セレクチン構築物のＸ線結晶構造はすでに記載されており（Ｇｒａｖｅｓ他、１９９４）、部位特異的な突然変異生成の研究（Ｋａｎｓａｓ、１９９６）と組み合わされて、レクチンドメインへ局在化された推定上のＳＬｅＸ結合部位を示唆している。Ｅ−セレクチン結晶構造へ結合するＳＬｅＸのためのモデルは、オリゴマンノースへ結合された相同的なラット血清マンノース−結合タンパク質（ＭＢＰ−Ａ）のＸ線結晶構造（Ｗｅｉｓ他、１９９２）をガイドとして用いて、ＳＬｅＸの遊離または結合溶液構造の分子ドッキング（（Ｐｏｐｐｅ他、１９９７）およびその中の参考文献）に基づいて提案されている（Ｇｒａｖｅｓ他、１９９４、Ｋｏｇａｎ他、１９９５、Ｐｏｐｐｅ他、１９９７）。しかしながら、ＳＬｅＸ様炭水化物リガンドと複合体形成されたＥ−セレクチンまたは他のセレクチンの構造は、これらの仮説を確認すると決定されていない。実際、本発明より以前は、このような結晶は、セレクチン結晶を形成するために使用される高濃度のカルシウムのブロッキング効果のために得ることができなかった。
【０００５】
現在まで、ＳＬｅＸおよび関連のグリカンと共複合体形成されたＥ−セレクチン残基を含むように突然変異された（Ｋ３突然変異体）ＭＢＰ−Ａの結晶構造（ＮｇおよびＷｅｉｓ、１９９７）は、セレクチンがどのようにしてそのリガンドと結合するかの唯一の直接的情報を示す。集約的に、これらのモデルおよび実験的に決定された構造は、Ｆｕｃ部分の２つのヒドロキシル基がレクチンドメイン−結合カルシウムを連結し、更なる結合相互作用がおそらく、Ｇａｌのヒドロキシル基およびＮｅｕＮＡｃのカルボキシレート部分によって媒介されるというＳＬｅＸ結合モチーフを支援する。しかしながら、モデルおよびＭＢＰ−Ａ Ｋ３突然変異体／ＳＬｅＸ結晶構造は、結合部位内のＳＬｅＸの配向の点、および分子接触の同一性の点で異なる。
【０００６】
高親和性Ｐ−セレクチン／ＰＳＧＬ−１相互作用のための構造的基礎の理解もまた、認識が炭水化物およびポリペプチド成分の両方に基づいているという観察によって、不完全および複雑である。突然変異生成の研究はＰＳＧＬ−１のＮ−末端に集中しており、Ｐ−セレクチンが、ＰＳＧＬ−１ポリペプチドのアニオン領域内の１つまたは複数の硫酸化チロシン残基、およびこの領域へ潜在的に局在化されたＳＬｅＸ−含有Ｏ−グリカンを同時に認識することを実証した（ＰｏｕｙａｎｉおよびＳｅｅｄ、１９９５ 、Ｒａｍａｃｈａｎｄｒａｎ他、１９９９、Ｓａｋｏ他、１９９５、Ｗｉｌｋｉｎｓ他、１９９５）。推定上のＳＬｅＸ結合部位はセレクチン間で同様であると予想され、おそらく、Ｐ−セレクチンによるＰＳＧＬ−１のＳＬｅＸ成分の結合に含まれるが、ＰＳＧＬ−１ポリペプチドとの相互作用を媒介するＰ−セレクチンドメインの同一性および構造的基礎は知られていない。またＬ−セレクチンは、炎症部位への白血球補充の増幅にとっておそらく重要な好中球−好中球相互作用との関連で、ＰＳＧＬ−１を認識すると示されている（Ｋａｎｓａｓ、１９９６、ＶｅｓｔｗｅｂｅｒおよびＢｌａｎｋｓ、１９９９）。また、この相互作用は、ＰＳＧＬ−１ポリペプチドのＮ−末端内の突然変異によって影響され（Ｒａｍａｃｈａｎｄｒａｎ他、１９９９）、Ｐ−およびＬ−セレクチンが共通の結合要件を有することを示唆する。これに対して、ＰＳＧＬ−１または他のＳＬｅＸ提示カウンタレセプターへのＥ−セレクチン結合は、ポリペプチド成分を必要とすると実証されていない。
【０００７】
［発明の概要］
本発明は、Ｐ−セレクチンのレクチンおよびＥＧＦ様（ＬＥ）ドメイン（「Ｐ−セレクチンＬＥ」）の結晶と、Ｐ−セレクチンＬＥ結晶のＸ線回折データにより得られるＰ−セレクチンＬＥの三次元構造と、を提供する。具体的には、Ｐ−セレクチンＬＥの三次元構造は、図２に示される構造座標によって定義され、ここでアミノ酸の主鎖原子からの±２乗平均平方根偏差は１．５Å以下である。Ｐ−セレクチンＬＥの三次元構造の構造座標は多数の用途に有用であり、これらの用途には、ＳＬｅＸが結合する部位を含むＰ−セレクチンＬＥの種々の活性部位の視覚化、同定および特徴付けが含まれるが、これらに限定されない。活性部位の構造は次に、Ｐ−セレクチンＬＥ、ならびにＳＬｅＸ、ＰＳＧＬ−１、または関連の分子と複合体形成されたＰ−セレクチンＬＥと相互作用をする作用薬を設計することに利用され得る。
【０００８】
また本発明は、ＳＬｅＸと複合体形成されたＰ−セレクチンＬＥの結晶と、Ｐ−セレクチンＬＥ：ＳＬｅＸ結晶のＸ線回折データにより得られるＰ−セレクチンＬＥおよびＳＬｅＸの三次元構造と、を提供する。具体的には、Ｐ−セレクチンＬＥおよびＳＬｅＸの三次元構造は、図３に示される構造座標によって定義され、ここでアミノ酸の主鎖原子からの±２乗平均平方根偏差は１．５Å以下である。Ｐ−セレクチンＬＥおよびＳＬｅＸの構造座標は多数の用途に有用であり、これらの用途には、ＳＬｅＸ結合部位を含むＰ−セレクチン、ＳＬｅＸおよびＰ−セレクチンＬＥ：ＳＬｅＸ複合体の種々の活性部位の視覚化、同定および特徴付けが含まれるが、これらに限定されない。活性部位の構造は、次にＰ−セレクチンＬＥ、ＳＬｅＸ、ならびにＳＬｅＸ、ＰＳＧＬ−１、または関連の分子と複合体形成されたＰ−セレクチンＬＥと相互作用をする種々の作用薬を設計することに利用され得る。
【０００９】
またさらに本発明は、ＳＬｅＸと複合体形成されたＥ−セレクチンのレクチンおよびＥＧＦ（ＬＥ）ドメイン（「Ｅ−セレクチンＬＥ」）の結晶と、Ｅ−セレクチンＬＥ：ＳＬｅＸ結晶のＸ線回折データにより得られるＥ−セレクチンＬＥおよびＳＬｅＸの三次元構造と、を提供する。具体的には、Ｅ−セレクチンＬＥおよびＳＬｅＸの三次元構造は、図４に示される構造座標によって定義され、ここでアミノ酸の主鎖原子からの±２乗平均平方根偏差は１．５Å以下である。Ｅ−セレクチンＬＥおよびＳＬｅＸの三次元構造の構造座標は多数の用途に有用であり、これらの用途には、ＳＬｅＸ結合部位を含むＥ−セレクチンＬＥ、ＳＬｅＸおよびＥ−セレクチンＬＥ：ＳＬｅＸ複合体の種々の活性部位の視覚化、同定および特徴付けが含まれるが、これらには限定されない。活性部位の構造は次に、Ｅ−セレクチンＬＥ、ＳＬｅＸ、ならびにＳＬｅＸ、ＰＳＧＬ−１、または関連の分子と複合体形成されたＥ−セレクチンＬＥと相互作用をする種々の作用薬を設計することに利用され得る。
【００１０】
またさらに、本発明は、チロシン硫酸化およびＳＬｅＸの両方で修飾された機能性ＰＳＧＬ−１ペプチドと複合体形成されたＰ−セレクチンＬＥの結晶構造と、Ｐ−セレクチンＬＥ：ＰＳＧＬ−１ペプチド結晶のＸ線回折データにより得られるＰ−セレクチンＬＥおよびＰＳＧＬ−１ペプチドの三次元構造と、を提供する。具体的には、Ｐ−セレクチンＬＥおよびＰＳＧＬ−１ペプチドの三次元構造は図５に示される構造座標によって定義され、ここでアミノ酸の主鎖原子からの±２乗平均平方根偏差は１．５Å以下である。Ｐ−セレクチンＬＥおよびＰＳＧＬ−１ペプチドの構造座標は多数の用途に有用であり、これらの用途には、ＳＬｅＸおよびＰＳＧＬ−１結合部位を含むＰ−セレクチンＬＥ、ＰＳＧＬ−１ペプチド、およびＰ−セレクチンＬＥ：ＰＳＧＬ−１複合体の種々の活性部位の視覚化、同定および特徴付けが含まれるが、これらに限定されない。活性部位の構造は次に、Ｐ−セレクチンＬＥ、ＰＳＧＬ−１、ならびにＳＬｅＸ、ＰＳＧＬ−１、または関連の分子と複合体形成されたＰ−セレクチンＬＥと相互作用をする種々の作用薬を設計することに利用され得る。
【００１１】
また本発明は、ＳＬｅＸ結合タンパク質またはペプチドの活性部位、および好ましくはＰ−セレクチンＬＥのＳＬｅＸ結合部位に関するものであり、この活性部位は、アミノ酸残基ＴＹＲ４８、ＧＬＵ８０、ＡＳＮ８２、ＧＬＵ９２、ＴＹＲ９４、ＰＲＯ９８、ＳＥＲ９９、ＡＳＮ１０５、ＡＳＰ１０６、ＧＬＵ１０７および結合カルシウムの図３による相対構造座標を含み、上記アミノ酸の主鎖原子からの±２乗平均平方根偏差は１．５Å以下である。あるいは、活性部位は、上記で定義された構造座標に加えて、アミノ酸残基ＴＹＲ４４、ＳＥＲ４６、ＳＥＲ４７、ＡＬＡ７７、ＡＳＰ７８、ＡＳＮ７９、ＰＲＯ８１、ＡＳＮ８３、ＡＲＧ８５、ＧＬＵ８８、ＣＹＳ９０、ＩＬＥ９３、ＬＹＳ９６、ＳＥＲ９７、ＡＬＡ１００、ＴＲＰ１０４、ＨＩＳ１０８、ＬＹＳ１１１およびＬＹＳ１１３の図３による相対構造座標も含むことができ、アミノ酸の主鎖原子からの±２乗平均平方根偏差は１．５Å以下である。ＳＬｅＸ活性部位は、作用薬、好ましくはＳＬｅＸとの会合状態、またはその非結合状態のＰ−セレクチンＬＥの立体配置と一致し得る。
【００１２】
さらに本発明は、ＳＬｅＸ結合タンパク質またはペプチドの活性部位、および好ましくはＥ−セレクチンＬＥのＳＬｅＸ結合部位に関するものであり、この活性部位は、アミノ酸残基ＴＹＲ４８、ＧＬＵ８０、ＡＳＮ８２、ＡＳＮ８３、ＧＬＵ９２、ＴＹＲ９４、ＡＲＧ９７、ＧＬＵ９８、ＡＳＮ１０５、ＡＳＰ１０６、ＧＬＵ１０７および結合カルシウムの図４による相対構造座標を含み、上記アミノ酸の主鎖原子からの±２乗平均平方根偏差は１．５Å以下である。あるいは、活性部位は、上記で定義された構造座標に加えて、アミノ酸残基ＴＹＲ４４、ＳＥＲ４５、ＰＲＯ４６、ＳＥＲ４７、ＡＬＡ７７、ＰＲＯ７８、ＧＬＹ７９、ＰＲＯ８１、ＧＬＵ８８、ＣＹＳ９０、ＬＹＳ９９、ＡＳＰ１００、ＴＲＰ１０４、ＡＲＧ１０８、ＬＹＳ１１１およびＬＹＳ１１３の図４による相対構造座標も含むことができ、アミノ酸の主鎖原子からの±２乗平均平方根偏差は１．５Å以下である。ＳＬｅＸ活性部位は、作用薬、好ましくはＳＬｅＸとの会合状態、またはその非結合状態のＥ−セレクチンＬＥの立体配置と一致し得る。
【００１３】
またさらに、本発明は、ＰＳＧＬ−１結合タンパク質またはペプチドの活性部位、および好ましくはＰ−セレクチンＬＥのＰＳＧＬ−１結合部位に関するものであり、この活性部位は、アミノ酸残基ＡＬＡ９、ＴＹＲ４５、ＳＥＲ４６、ＳＥＲ４７、ＴＹＲ４８、ＧＬＵ８０、ＡＳＮ８２、ＬＹＳ８４、ＡＲＧ８５、ＧＬＵ８８、ＧＬＵ９２、ＴＹＲ９４、ＰＲＯ９８、ＳＥＲ９９、ＡＳＮ１０５、ＡＳＰ１０６、ＧＬＵ１０７、ＨＩＳ１０８、ＬＥＵ１１０、ＬＹＳ１１１、ＬＹＳ１１２、ＬＹＳ１１３、ＨＩＳ１１４および結合ストロンチウムの図５による相対構造座標を含み、ここで上記アミノ酸の主鎖原子からの±２乗平均平方根偏差は１．５Å以下である。あるいは、活性部位は、上記で定義された構造座標に加えて、アミノ酸残基ＳＥＲ６、ＴＨＲ７、ＬＹＳ８、ＴＹＲ１０、ＳＥＲ１１、ＴＹＲ４４、ＴＹＲ４９、ＴＲＰ５０、ＡＬＡ７７、ＡＳＰ７８、ＡＳＮ７９、ＰＲＯ８１、ＡＳＮ８３、ＡＳＮ８６、ＡＳＮ８７、ＣＹＳ９０、ＩＬＥ９３、ＩＬＥ９５、ＬＹＳ９６、ＳＥＲ９７、ＡＬＡ１００、ＴＲＰ１０４およびＣＹＳ１０９の図５による相対構造座標も含むことができ、アミノ酸の主鎖原子からの±２乗平均平方根偏差は１．５Å以下である。ＰＳＧＬ−１結合部位は、作用薬、好ましくはＰＳＧＬ−１またはＰＳＧＬ−１ペプチドとの会合状態、もしくはその非結合状態のＰ−セレクチンＬＥの立体配置と一致し得る。
【００１４】
さらに、本発明は、Ｐ−セレクチンＬＥと相互作用する作用薬を同定するための方法であって、（ａ）アミノ酸の主鎖原子からの±２乗平均平方根偏差が１．５Å以下である図２、３または５による相対構造座標を用いて、Ｐ−セレクチンＬＥの三次元モデルを生成するステップと、（ｂ）作用薬を設計または選択するために、上記三次元構造を使用するステップと、を含む方法を提供する。
【００１５】
さらに、本発明は、ＳＬｅＸ結合部位を含む分子または分子複合体の活性化剤または阻害剤を同定するための方法であって、（ａ）（ｉ）残基ＴＹＲ４８、ＧＬＵ８０、ＡＳＮ８２、ＧＬＵ９２、ＴＹＲ９４、ＰＲＯ９８、ＳＥＲ９９、ＡＳＮ１０５、ＡＳＰ１０６、ＧＬＵ１０７および結合カルシウムの図３による相対構造座標（上記アミノ酸の主鎖原子からの±２乗平均平方根偏差が１．５Å以下）、または（ｉｉ）アミノ酸残基ＴＹＲ４８、ＧＬＵ８０、ＡＳＮ８２、ＧＬＵ９２、ＴＹＲ９４、ＡＲＧ９７、ＧＬＵ９８、ＡＳＮ１０５、ＡＳＰ１０６、ＧＬＵ１０７および結合カルシウムの図４による相対構造座標（上記アミノ酸の主鎖原子からの±２乗平均平方根偏差が１．５Å以下である）を用いて、ＳＬｅＸ結合部位を含む分子または分子複合体の三次元モデルを生成するステップと、（ｂ）上記ステップ（ａ）で生成された三次元モデルとのコンピュータフィッティング解析を実行することによって、候補活性化剤または阻害剤を選択または設計するステップと、を含む方法を提供する。別の実施形態では、図３による相対構造座標は、さらに、アミノ酸残基ＴＹＲ４４、ＳＥＲ４６、ＳＥＲ４７、ＡＬＡ７７、ＡＳＰ７８、ＡＳＮ７９、ＰＲＯ８１、ＡＳＮ８３、ＡＲＧ８５、ＧＬＵ８８、ＣＹＳ９０、ＩＬＥ９３、ＬＹＳ９６、ＳＥＲ９７、ＡＬＡ１００、ＴＲＰ１０４、ＨＩＳ１０８、ＬＹＳ１１１およびＬＹＳ１１３も含み、上記アミノ酸の主鎖原子からの±２乗平均平方根偏差は１．５Å以下である。さらに別の実施形態では、図４による相対構造座標は、さらに、アミノ酸残基ＴＹＲ４４、ＳＥＲ４５、ＰＲＯ４６、ＳＥＲ４７、ＡＬＡ７７、ＰＲＯ７８、ＧＬＹ７９、ＰＲＯ８１、ＧＬＵ８８、ＣＹＳ９０、ＬＹＳ９９、ＡＳＰ１００、ＴＲＰ１０４、ＡＲＧ１０８、ＬＹＳ１１１およびＬＹＳ１１３も含み、上記アミノ酸の主鎖原子からの±２乗平均平方根偏差は１．５Å以下である。
【００１６】
またさらに本発明は、分子または分子複合体の活性化剤または阻害剤を同定するための方法であって、（ａ）アミノ酸残基ＡＬＡ９、ＴＹＲ４５、ＳＥＲ４６、ＳＥＲ４７、ＴＹＲ４８、ＧＬＵ８０、ＡＳＮ８２、ＬＹＳ８４、ＡＲＧ８５、ＧＬＵ８８、ＧＬＵ９２、ＴＹＲ９４、ＰＲＯ９８、ＳＥＲ９９、ＡＳＮ１０５、ＡＳＰ１０６、ＧＬＵ１０７、ＨＩＳ１０８、ＬＥＵ１１０、ＬＹＳ１１１、ＬＹＳ１１２、ＬＹＳ１１３、ＨＩＳ１１４、および結合ストロンチウムの図５による相対構造座標（上記アミノ酸の主鎖原子からの±２乗平均平方根偏差が１．５Å以下である）を用いて、ＰＳＧＬ−１結合部位を含む分子または分子複合体の三次元モデルを生成するステップと、（ｂ）上記ステップ（ａ）で生成された三次元モデルとのコンピュータフィッティング解析を実行することによって、候補活性化剤または阻害剤を選択または設計するステップと、を含む方法を提供する。別の実施形態では、図５による相対構造座標は、さらに、アミノ酸残基ＳＥＲ６、ＴＨＲ７、ＬＹＳ８、ＴＹＲ１０、ＳＥＲ１１、ＴＹＲ４４、ＴＹＲ４９、ＴＲＰ５０、ＡＬＡ７７、ＡＳＰ７８、ＡＳＮ７９、ＰＲＯ８１、ＡＳＮ８３、ＡＳＮ８６、ＡＳＮ８７、ＣＹＳ９０、ＩＬＥ９３、ＩＬＥ９５、ＬＹＳ９６、ＳＥＲ９７、ＡＬＡ１００、ＴＲＰ１０４およびＣＹＳ１０９も含み、上記アミノ酸の主鎖原子からの±２乗平均平方根偏差は１．５Å以下である。
【００１７】
さらに本発明は、ＳＬｅＸと相互作用する作用薬を同定するための方法であって、（ａ）アミノ酸の主鎖原子からの±２乗平均平方根偏差が１．５Å以下である図３または４による相対構造座標を用いて、ＳＬｅＸの三次元モデルを生成するステップと、（ｂ）ＳＬｅＸと相互作用する作用薬を設計または選択するために、上記三次元構造を使用するステップと、を含む方法を提供する。
【００１８】
またさらに、本発明は、ＰＳＧＬ−１と相互作用する作用薬を同定するための方法であって、（ａ）アミノ酸の主鎖原子からの±２乗平均平方根偏差が１．５Å以下である図５による相対構造座標を用いて、ＰＳＧＬ−１ペプチドの三次元モデルを生成するステップと、（ｂ）ＰＳＧＬ−１と相互作用する作用薬を設計または選択するために、上記三次元構造を使用するステップと、を含む方法を提供する。
【００１９】
また本発明は、上記の方法を用いて同定される作用薬、活性化剤または阻害剤を提供する。血管組織上での白血球のセレクチン媒介細胞ローリングを阻害するか、さもなくば妨害する小さい分子または他の作用薬が、喘息および乾癬のような異常な炎症応答を伴う疾患の処置において有用となり得る。
【００２０】
最後に、本発明は、Ｅ−セレクチン型分子とカルシウムに配位する化合物との結晶複合体を獲得するための方法を提供する。該方法は、（ａ）カルシウムイオンおよびＰＥＧの存在下で結晶Ｅ−セレクチン型分子とカルシウムに配位する化合物とを接触させて、Ｅ−セレクチン型分子とカルシウムに配位する化合物との結晶複合体を形成するステップと、（ｂ）濃度が低下されたカルシウムイオンならびに十分な濃度のＰＥＧおよびイオン塩の存在下で前記結晶複合体を接触させて、冷却した際に、最終の結晶複合体のＸ線回折によってＥ−セレクチン型分子およびカルシウムに配位する化合物の三次元構造を解明するのに適する最終の結晶複合体を獲得するステップとを含む。
【００２１】
本発明の更なる目的は、以下の説明から明らかになるであろう。
【００２２】
［発明の詳細な説明］
本明細書中で使用される場合、次の用語および句は以下に説明される意味を有するものである。
【００２３】
他に記載されない限り、「セレクチン」は、白血球の炎症部位への補充およびリンパ組織への遊出において、初期接着事象に寄与する細胞表面糖タンパク質ファミリーであり、Ｐ−セレクチン、Ｅ−セレクチンおよびＬ−セレクチン、ならびにセレクチン活性を有するそれらの類似体が含まれる。Ｐ−セレクチンは、好ましくは、保存的置換を含む図６Ａに示されるアミノ酸配列を有する。Ｅ−セレクチンは、好ましくは、保存的置換を含む図６Ｂのアミノ酸配列を有する。「Ｅ−セレクチン型分子」は、Ｅ−セレクチン分子全体、ならびにレクチンおよび／または上皮成長因子（ＥＧＦ）様ドメインのようなその一部を含み、好ましくは、以下に定義されるような「Ｅ−セレクチンＬＥ」である。
【００２４】
「ＬＥドメイン」はセレクチンのレクチンおよび上皮成長因子（ＥＧＦ）様ドメインを表し、本明細書で使用される場合、「Ｐ−セレクチンＬＥ」はＰ−セレクチンのレクチンおよびＥＧＦ様ドメインを表し、「Ｅ−セレクチンＬＥ」はＥ−セレクチンのレクチンおよびＥＧＦ様ドメインを表す。Ｐ−セレクチンＬＥおよびＥ−セレクチンＬＥのアミノ酸配列は、図６Ａおよび図６Ｂにそれぞれ示され（下線）、保存的置換を含む。
【００２５】
「ＳＬｅＸ」はシアリルルイスＸ（ＳＬｅＸ、ＮｅｕＮＡｃ２，３Ｇａｌ１，４［Ｆｕｃ１，３］ＧｌｕＮＡｃ）四糖を表し、ＳＬｅＸと同様の構造および活性を有する「ＳＬｅＸ類似体」を含む。「ＳＬｅＸ結合タンパク質またはペプチド」は、ＳＬｅＸに結合すると共にＳＬｅＸ結合部位を有するタンパク質またはペプチドであり、Ｐ−セレクチン、Ｅ−セレクチン、Ｐ−セレクチンＬＥおよびＥ−セレクチンＬＥを含むが、これらに限定されない。「ＳＬｅＸ結合部位を含む分子または分子複合体」には、（ｉ）Ｐ−セレクチン、Ｅ−セレクチン、Ｐ−セレクチンＬＥ、Ｅ−セレクチンＬＥ、（ｉｉ）Ｐ−セレクチン、Ｅ−セレクチン、Ｐ−セレクチンＬＥ、またはＥ−セレクチンＬＥとＳＬｅＸとの複合体、（ｉｉｉ）Ｐ−セレクチン、Ｅ−セレクチン、Ｐ−セレクチンＬＥ、またはＥ−セレクチンＬＥと他の分子との複合体、および（ｉｖ）ＳＬｅＸ結合部位を有する他の分子または分子複合体が含まれる。
【００２６】
「ＰＳＧＬ−１」はＰＳＧＬ−１活性を有する分子であり、以下に定義される「ＰＳＧＬ−１ペプチド」を含む。ＰＳＧＬ−１のアミノ酸配列は、図６Ｃに示されており、その保存的置換を含む。「ＰＳＧＬ−１ペプチド」はチロシン硫酸化およびＳＬｅＸにより修飾されたペプチドであり、図１Ａに示される（ＳＧＰ−３で表示される）ペプチド構造を含み、その保存的置換が含まれる。「ＰＳＧＬ−１結合タンパク質またはペプチド」は、ＰＳＧＬ−１に結合すると共にＰＳＧＬ−１結合部位を有するタンパク質またはペプチドであり、Ｐ−セレクチン、Ｅ−セレクチン、Ｐ−セレクチンＬＥおよびＥ−セレクチンＬＥを含むが、これらに限定されない。「ＰＳＧＬ−１結合部位を含む分子または分子複合体」には、（ｉ）Ｐ−セレクチン、Ｅ−セレクチン、Ｐ−セレクチンＬＥ、Ｅ−セレクチンＬＥ、（ｉｉ）Ｐ−セレクチン、Ｅ−セレクチン、Ｐ−セレクチンＬＥ、またはＥ−セレクチンＬＥとＰＳＧＬ−１との複合体、（ｉｉｉ）Ｐ−セレクチン、Ｅ−セレクチン、Ｐ−セレクチンＬＥ、またはＥ−セレクチンＬＥと他の分子との複合体、および（ｉｖ）ＰＳＧＬ−１結合部位を有する他の分子または分子複合体が含まれる。
【００２７】
他に示されない限りは、「タンパク質」または「分子」は、タンパク質、タンパク質ドメイン、ポリペプチド、またはペプチドを含むものである。
【００２８】
「構造座標」は、分子または分子複合体中のある他の原子に対する原子の空間的関係に対応するデカルト座標である。構造座標は、Ｘ線結晶学技法またはＮＭＲ技法を用いて得ることができる。あるいは、分子置換解析またはホモロジーモデリングを用いて得ることもできる。種々のソフトウェアプログラムは、分子または分子複合体の三次元表示を得るために、構造座標セットのグラフィック表示を可能にする。本発明の構造座標は、数学的な操作によって、たとえば反転（ｉｎｖｅｒｓｉｏｎ）または整数加算または減算などによって、図２、３、４または５に提供される元の座標セットから変更することができる。このように、本発明の構造座標は相対的であり、決して、図２、３、４または５の実際のｘ、ｙ、ｚ座標によって特に制限されないと理解される。
【００２９】
「作用薬」は、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、ＤＮＡまたはＲＮＡを含む核酸、分子、化合物、または薬剤を含むものである。
【００３０】
「２乗平均平方根偏差（ｒｏｏｔ ｍｅａｎ ｓｑｕａｒｅ ｄｅｖｉａｔｉｏｎ）」は、平均からの偏差の２乗の算術平均の平方根であり、本明細書に記載される構造座標からの偏差またはばらつきを表す手段である。本発明には、明記された２乗平均平方根偏差の範囲内で同一の構造座標をもたらす記載のアミノ酸残基の保存的置換を含む全ての実施形態が包含される。
【００３１】
Ｐ−セレクチン、Ｅ−セレクチン、Ｐ−セレクチンＬＥ、Ｅ−セレクチンＬＥ、ＰＳＧＬ−１およびＰＳＧＬ−１ペプチドのアミノ酸残基の番号付けは、本明細書中に示されるものとは異なってもよく、図２、３、４または５によって本明細書に定義されるものと同一の三次元構造を生じるある種の保存的アミノ酸置換を含んでもよいことは、当業者には明らかであろう。他のアイソフォームまたは類似体における対応のアミノ酸および保存的置換は、適切なアミノ酸配列の外観検査によって、あるいは市販のホモロジーソフトウェアプログラム（例えば、ＭＯＤＥＬＬＡＲ、ＭＳＩ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を用いることによって容易に同定される。
【００３２】
「保存的置換（ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅ ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）」は、同様の極性、立体配列を有することによって、あるいは置換された残基と同じクラス（たとえば、疎水性、酸性または塩基性）に属することによって、置換されたアミノ酸残基と機能的に同等であるアミノ酸置換であり、これには、Ｐ−セレクチンＬＥ、Ｅ−セレクチンＬＥ、ＳＬｅＸ、ＰＳＧＬ−１ペプチド、Ｐ−セレクチンＬＥ：ＳＬｅＸ複合体、Ｅ−セレクチンＬＥ：ＳＬｅＸ複合体、およびＰ−セレクチンＬＥ：ＰＳＧＬ−１ペプチド複合体の三次元構造に対する影響が、Ｐ−セレクチン、Ｅ−セレクチン、Ｐ−セレクチンＬＥ、Ｅ−セレクチンＬＥ、ＳＬｅＸ、ＰＳＧＬ−１、ＰＳＧＬ−１ペプチド、Ｐ−セレクチンＬＥ：ＳＬｅＸ複合体、Ｅ−セレクチンＬＥ：ＳＬｅＸ複合体、Ｐ−セレクチンＬＥ：ＰＳＧＬ−１ペプチド複合体、ならびに、ＳＬｅＸまたはＰＳＧＬ−１結合部位を含む他のタンパク質、ペプチド、分子または分子複合体と相互作用をする作用薬の同定および設計のために上記構造を使用することに関して、分子置換解析および／またはホモロジーモデリングにとって、取るに足りない程度である置換が含まれる。
【００３３】
「活性部位」は、その形状および電荷電位の結果、種々の共有結合および／または非共有結合の力によって、別の作用薬（タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、ＤＮＡまたはＲＮＡを含む核酸、分子、化合物または薬剤を制限なしで含む）と有利に相互作用をするまたは会合する分子または分子複合体の領域を示す。このように、本発明の活性部位には、例えば、Ｐ−セレクチンＬＥまたはＥセレクチンＬＥと結合するＳＬｅＸまたはＰＳＧＬ−１の実際の部位と、ＳＬｅＸまたはＰＳＧＬ−１結合の実際の部位に隣接または近接する補助結合部位とが含まれ、この補助結合部位は、ＳＬｅＸまたはＰＳＧＬ−１結合の実際の部位を直接妨害することによって、あるいはＰ−セレクチンＬＥまたはＥセレクチンＬＥの立体コンホメーションまたは電荷電位へ間接的に影響することで、ＳＬｅＸまたはＰＳＧＬ−１結合の実際の部位におけるＳＬｅＸまたはＰＳＧＬ−１のＰ−セレクチンＬＥまたはＥセレクチンＬＥへの結合を防止または減少させることによって、それでもなお特定の作用薬との相互作用または会合においてＰ−セレクチンＬＥまたはＥセレクチンＬＥ活性に影響を与えることができ得る。本明細書で使用される場合、「活性部位」は、ＳＬｅＸまたはＰＳＧＬ−１のような結合リガンドの存在下で観察可能なＮＭＲ摂動を示すＰ−セレクチンＬＥおよびＥセレクチンＬＥの類似残基も含む。観察可能なＮＭＲ摂動を示すこのような残基は、必ずしも、残基を結合するリガンドと直接接触する、あるいは極めて近接する必要はないが、理論的な薬剤設計プロトコルのためには、これらは重大なＰ−セレクチンＬＥまたはＥセレクチンＬＥ残基である。
【００３４】
本発明は、まず、結晶Ｐ−セレクチンＬＥを提供する。特定の実施形態では、Ｐ−セレクチンＬＥは、保存的置換を含む図６Ａ（下線）に示されるアミノ酸残基を含む。本発明の結晶は、Ｐ−セレクチンＬＥの構造座標決定のためにＸ線を有効に回折し、空間群Ｐ２１のプレート型であり、ａ＝８１．０Å、ｂ＝６０．８Å、ｃ＝９１．４Åおよびβ＝１０３．６°の単位格子パラメータを有すると特徴付けられる。さらに、結晶Ｐ−セレクチンＬＥの結晶学的な非対称単位は、４分子のＰ−セレクチンＬＥを含む。
【００３５】
また本発明は、Ｐ−セレクチンＬＥおよびＳＬｅＸを含む結晶複合体を提供する。特定の実施形態では、Ｐ−セレクチンＬＥのアミノ酸配列は図６Ａ（下線）に示され、保存的置換を含む。本発明の結晶複合体は、Ｐ−セレクチンＬＥおよびＳＬｅＸの複合体の構造座標を決定するためにＸ線を有効に回折し、空間群Ｐ２１のプレート型であり、ａ＝８１．１Å、ｂ＝６０．５Å、ｃ＝９１．４Åおよびβ＝１０３．３°の単位格子パラメータを有すると特徴付けられる。さらに、本発明の結晶複合体は、非対称の結晶単位中に１分子のＰ−セレクチンＬＥ：ＳＬｅＸ複合体から成る。
【００３６】
本発明は、さらに、Ｅ−セレクチンＬＥおよびＳＬｅＸを含む結晶複合体を提供する。特定の実施形態では、Ｅ−セレクチンＬＥのアミノ酸配列は図６Ｂ（下線）に示され、保存的置換を含む。本発明の結晶複合体は、Ｅ−セレクチンＬＥおよびＳＬｅＸの複合体の構造座標を決定するためにＸ線を有効に回折し、空間群Ｐ２１２１２１のロッド型であり、ａ＝３４．５Å、ｂ＝７２．４Å、およびｃ＝７７．６Åの単位格子パラメータを有すると特徴付けられる。さらに、本発明の結晶複合体は、非対称の結晶単位中に１分子のＥ−セレクチンＬＥ：ＳＬｅＸ複合体から成る。
【００３７】
また、本発明はさらに、Ｐ−セレクチンＬＥおよびＰＳＧＬ−１ペプチドを含む結晶複合体を提供する。本発明の結晶複合体は、Ｐ−セレクチンＬＥおよびＰＳＧＬ−１ペプチドの複合体の構造座標を決定するためにＸ線を有効に回折し、空間群Ｉ２２２の両錐型であり、ａ＝６３．４Å、ｂ＝９６．８Å、およびｃ＝１８７．３Åの単位格子パラメータを有すると特徴付けられる。さらに、本発明の結晶複合体は、非対称の結晶単位中に１分子のＰＥ−セレクチンＬＥ：ＰＳＧＬ−１ペプチド複合体から成る。
【００３８】
いったん本発明の結晶または結晶複合体が成長されると、結晶分子または分子複合体の原子座標を得るために、種々の手段によってＸ線回折データを収集することができる。特別に設計されたコンピュータソフトウェアの助けを借りて、このような結晶学的データを用いて、分子または分子複合体の三次元構造を生成することができる。結晶分子または分子構造の三次元構造を生成および精密化するために使用される種々の方法は当業者には既知であり、多波長異常分散（ＭＡＤ）、多重同形置換、逆格子空間溶媒平滑法（ｒｅｃｉｐｒｏｃａｌ ｓｐａｃｅ ｓｏｌｖｅｎｔ ｆｌａｔｔｅｎｉｎｇ）、分子置換、および異常散乱による単一同形置換（ＳＩＲＡＳ）を、制限されることなく含む。
【００３９】
したがって、本発明はまた、Ｐ−セレクチンＬＥ結晶のＸ線回折データにより得られるＰ−セレクチンＬＥの三次元構造を提供する。特に、Ｐ−セレクチンＬＥの三次元構造は図２に示される構造座標によって定義され、ここでアミノ酸の主鎖原子からの±２乗平均平方根偏差は１．５Å以下であり、好ましくは１．０Å以下、最も好ましくは０．５Å以下である。Ｐ−セレクチンＬＥの三次元構造の構造座標は多数の用途に有用であり、これらの用途には、ＳＬｅＸ結合部位を含むＰ−セレクチンＬＥの種々の活性部位の視覚化、同定および特徴付けが含まれるが、これらに限定されない。活性部位の構造は次に、Ｐ−セレクチンＬＥ、ならびにＳＬｅＸ、ＰＳＧＬ−１、または関連の分子と複合体形成されたＰ−セレクチンＬＥと相互作用をする作用薬を設計することに使用され得る。
【００４０】
さらに、本発明は、Ｐ−セレクチンＬＥ：ＳＬｅＸ結晶のＸ線回折データにより得られるＰ−セレクチンＬＥおよびＳＬｅＸの三次元構造を提供する。特に、Ｐ−セレクチンＬＥおよびＳＬｅＸの三次元構造は図３に示される構造座標によって定義され、ここでアミノ酸の主鎖原子からの±２乗平均平方根偏差は１．５Å以下であり、好ましくは１．０Å以下、最も好ましくは０．５Å以下である。Ｐ−セレクチンＬＥおよびＳＬｅＸの構造座標は多数の用途に有用であり、これらの用途には、ＳＬｅＸ結合部位を含むＰ−セレクチンＬＥ、ＳＬｅＸおよびＰ−セレクチンＬＥ：ＳＬｅＸ複合体の種々の活性部位の視覚化、同定および特徴付けが含まれるが、これらに限定されない。活性部位の構造は次に、Ｐ−セレクチンＬＥ、ＳＬｅＸ、ならびにＳＬｅＸ、ＰＳＧＬ−１、または関連の分子と複合体形成されたＰ−セレクチンＬＥと相互作用をする作用薬を設計することに使用され得る。
【００４１】
本発明は、Ｅ−セレクチンＬＥ：ＳＬｅＸ結晶のＸ線回折データにより得られるＥ−セレクチンＬＥおよびＳＬｅＸの三次元構造をさらに提供する。特に、Ｅ−セレクチンＬＥおよびＳＬｅＸの三次元構造は図４に示される構造座標によって定義され、ここでアミノ酸の主鎖原子からの±２乗平均平方根偏差は１．５Å以下であり、好ましくは１．０Å以下、最も好ましくは０．５Å以下である。Ｅ−セレクチンＬＥおよびＳＬｅＸの構造座標は多数の用途に有用であり、これらの用途には、ＳＬｅＸ結合部位を含むＥ−セレクチンＬＥ、ＳＬｅＸおよびＥ−セレクチンＬＥ：ＳＬｅＸ複合体の種々の活性部位の視覚化、同定および特徴付けが含まれるが、これらに限定されない。活性部位の構造は次に、Ｅ−セレクチンＬＥ、ＳＬｅＸ、ならびにＳＬｅＸ、ＰＳＧＬ−１、または関連の分子と複合体形成されたＥ−セレクチンＬＥと相互作用をする作用薬を設計することに使用され得る。
【００４２】
またさらに、本発明は、Ｐ−セレクチンＬＥ：ＰＳＧＬ−１ペプチド結晶のＸ線回折データにより得られるＰ−セレクチンＬＥおよびＰＳＧＬ−１ペプチドの三次元構造を提供する。特に、Ｐ−セレクチンＬＥおよびＰＳＧＬ−１ペプチドの三次元構造は図５に示される構造座標によって定義され、ここでアミノ酸の主鎖原子からの±２乗平均平方根偏差は１．５Å以下であり、好ましくは１．０Å以下、最も好ましくは０．５Å以下である。Ｐ−セレクチンＬＥおよびＰＳＧＬ−１ペプチドの構造座標は多数の用途に有用であり、これらの用途には、ＰＳＧＬ−１（およびＳＬｅＸ）結合部位を含むＰ−セレクチンＬＥ、ＰＳＧＬ−１、およびＰ−セレクチンＬＥ：ＰＳＧＬ−１ペプチド複合体の種々の活性部位の視覚化、同定および特徴付けが含まれるが、これらに限定されない。活性部位の構造は次に、Ｐ−セレクチンＬＥ、ＰＳＧＬ−１、ならびにＳＬｅＸ、ＰＳＧＬ−１、または関連の分子と複合体形成されたＰ−セレクチンＬＥと相互作用をする作用薬を設計することに使用され得る。
【００４３】
また本発明は、ＳＬｅＸ結合タンパク質またはペプチドの活性部位、および好ましくはＰ−セレクチンＬＥのＳＬｅＸ結合部位に関するものであり、これはアミノ酸残基ＴＹＲ４８、ＧＬＵ８０、ＡＳＮ８２、ＧＬＵ９２、ＴＹＲ９４、ＰＲＯ９８、ＳＥＲ９９、ＡＳＮ１０５、ＡＳＰ１０６、ＧＬＵ１０７および結合カルシウムの図３による相対構造座標を含み、ここで上記アミノ酸の主鎖原子からの±２乗平均平方根偏差は１．５Å以下であり、好ましくは１．０Å以下、最も好ましくは０．５Å以下である。あるいは、活性部位は、上記で定義された構造座標に加えて、アミノ酸残基ＴＹＲ４４、ＳＥＲ４６、ＳＥＲ４７、ＡＬＡ７７、ＡＳＰ７８、ＡＳＮ７９、ＰＲＯ８１、ＡＳＮ８３、ＡＲＧ８５、ＧＬＵ８８、ＣＹＳ９０、ＩＬＥ９３、ＬＹＳ９６、ＳＥＲ９７、ＡＬＡ１００、ＴＲＰ１０４、ＨＩＳ１０８、ＬＹＳ１１１およびＬＹＳ１１３の図３による相対構造座標を含むことができ、ここでアミノ酸の主鎖原子からの±２乗平均平方根偏差は１．５Å以下であり、好ましくは１．０Å以下、最も好ましくは０．５Å以下である。ＳＬｅＸ活性部位は、作用薬、好ましくはＳＬｅＸとの会合状態、またはその非結合状態のＰ−セレクチンＬＥの立体配置に一致し得る。
【００４４】
さらに本発明は、ＳＬｅＸ結合タンパク質またはペプチドの活性部位、および好ましくはＥ−セレクチンＬＥのＳＬｅＸ結合部位に関し、これはアミノ酸残基ＴＹＲ４８、ＧＬＵ８０、ＡＳＮ８２、ＡＳＮ８３、ＧＬＵ９２、ＴＹＲ９４、ＡＲＧ９７、ＧＬＵ９８、ＡＳＮ１０５、ＡＳＰ１０６、ＧＬＵ１０７および結合カルシウムの図４による相対構造座標を含み、ここで上記アミノ酸の主鎖原子からの±２乗平均平方根偏差は１．５Å以下であり、好ましくは１．０Å以下、最も好ましくは０．５Å以下である。あるいは、活性部位は、上記で定義された構造座標に加えて、アミノ酸残基ＴＹＲ４４、ＳＥＲ４５、ＰＲＯ４６、ＳＥＲ４７、ＡＬＡ７７、ＰＲＯ７８、ＧＬＹ７９、ＰＲＯ８１、ＧＬＵ８８、ＣＹＳ９０、ＬＹＳ９９、ＡＳＰ１００、ＴＲＰ１０４、ＡＲＧ１０８、ＬＹＳ１１１およびＬＹＳ１１３の図４による相対構造座標を含むことができ、ここでアミノ酸の主鎖原子からの±２乗平均平方根偏差は１．５Å以下であり、好ましくは１．０Å以下、最も好ましくは０．５Å以下である。ＳＬｅＸ活性部位は、作用薬、好ましくはＳＬｅＸとの会合状態、またはその非結合状態のＥ−セレクチンＬＥの立体配置に一致し得る。
【００４５】
またさらに、本発明は、ＰＳＧＬ−１結合タンパク質またはペプチドの活性部位、および好ましくはＰ−セレクチンＬＥのＰＳＧＬ−１結合部位を提供し、これはアミノ酸残基ＡＬＡ９、ＴＹＲ４５、ＳＥＲ４６、ＳＥＲ４７、ＴＹＲ４８、ＧＬＵ８０、ＡＳＮ８２、ＬＹＳ８４、ＡＲＧ８５、ＧＬＵ８８、ＧＬＵ９２、ＴＹＲ９４、ＰＲＯ９８、ＳＥＲ９９、ＡＳＮ１０５、ＡＳＰ１０６、ＧＬＵ１０７、ＨＩＳ１０８、ＬＥＵ１１０、ＬＹＳ１１１、ＬＹＳ１１２、ＬＹＳ１１３、ＨＩＳ１１４および結合ストロンチウムの図５による相対構造座標を含み、ここで上記アミノ酸の主鎖原子からの±２乗平均平方根偏差は１．５Å以下であり、好ましくは１．０Å以下、最も好ましくは０．５Å以下である。あるいは、活性部位は、上記で定義された構造座標に加えて、アミノ酸残基ＳＥＲ６、ＴＨＲ７、ＬＹＳ８、ＴＹＲ１０、ＳＥＲ１１、ＴＹＲ４４、ＴＹＲ４９、ＴＲＰ５０、ＡＬＡ７７、ＡＳＰ７８、ＡＳＮ７９、ＰＲＯ８１、ＡＳＮ８３、ＡＳＮ８６、ＡＳＮ８７、ＣＹＳ９０、ＩＬＥ９３、ＩＬＥ９５、ＬＹＳ９６、ＳＥＲ９７、ＡＬＡ１００、ＴＲＰ１０４およびＣＹＳ１０９の図５による相対構造座標も含むことができ、ここでアミノ酸の主鎖原子からの±２乗平均平方根偏差は１．５Å以下であり、好ましくは１．０Å以下、最も好ましくは０．５Å以下である。ＰＳＧＬ−１結合部位は、作用薬、好ましくはＰＳＧＬ−１またはＰＳＧＬ−１ペプチドとの会合状態、もしくはその非結合状態のＰ−セレクチンＬＥの立体配置に一致し得る。また、薬剤設計のために構造座標を用いる目的で、ストロンチウムをカルシウムで置換できることも本発明の範囲内にある。
【００４６】
本発明の別の態様は、Ｐ−セレクチンＬＥの結合または活性部位と相互作用する作用薬を同定するための方法に関する。特に、この方法は、（ａ）図２、３または５による相対構造座標（上記アミノ酸の主鎖原子からの±２乗平均平方根偏差は１．５Å以下であり、好ましくは１．０Å以下、最も好ましくは０．５Å以下である）を用いて、Ｐ−セレクチンＬＥの三次元モデルを生成するステップと、（ｂ）作用薬を設計または選択するために、上記三次元構造を使用するステップと、を含む。作用薬は、（ａ）活性部位のホモロジーモデリングまたは原子構造座標を用いて分子または分子複合体の推定上の活性部位の三次元モデルを生成し、（ｂ）推定上の活性部位と同定された作用薬との間の会合度合いを決定することによって、推定上の活性部位と同定された作用薬との間の「適合性（ｆｉｔ）」を評価する種々のコンピュータソフトウェアプログラムを利用するコンピュータフィッティング解析を用いて同定することができる。推定上の活性部位の三次元モデルは当該技術で知られる多数の方法のうちのどの１つを用いて生成されてもよく、ホモロジーモデリング、ならびに結晶学的または分光学的データを用いて生成された生データのコンピュータ解析が含まれるが、これらに限定はされない。このような三次元モデルを生成するため、および／または必要なフィッティング解析を実行するために使用されるコンピュータプログラムには、ＧＲＩＤ（Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、Ｏｘｆｏｒｄ、ＵＫ）、ＭＣＳＳ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）、ＡＵＴＯＤＯＣＫ（Ｓｃｒｉｐｐｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）、ＤＯＣＫ（Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ大学、Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ）、Ｆｌｏ９９（Ｔｈｉｓｔｌｅｓｏｆｔ、Ｍｏｒｒｉｓ Ｔｏｗｎｓｈｉｐ、 ＮＪ）、Ｌｕｄｉ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）、ＱＵＡＮＴＡ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）、Ｉｎｓｉｇｈｔ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）、ＳＹＢＹＬ（ＴＲＩＰＯＳ， Ｉｎｃ．、Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）およびＬＥＡＰＦＲＯＧ（ＴＲＩＰＯＳ， Ｉｎｃ．、Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）が含まれるが、これらに限定はされない。
【００４７】
コンピュータフィッティング解析により同定されたこのような作用薬のＰ−セレクチンＬＥ活性に対する効果は、同定された作用薬をＰ−セレクチンＬＥと接触させ、Ｐ−セレクチンＬＥ活性に対する作用薬の効果を測定することによって、さらに評価できる。Ｐ−セレクチンＬＥの活性部位に対する作用薬の働きによって、作用薬は、Ｐ−セレクチンＬＥ活性の阻害剤または活性化剤のいずれかの機能を果たすことができる。例えば、酵素的アッセイを実行し、結果を解析して、作用薬がＰ−セレクチンＬＥおよびＳＬｅＸの阻害剤である（すなわち、作用薬がＰ−セレクチンＬＥとＳＬｅＸの間の結合親和性を低減または防止する）か、あるいはＰ−セレクチンＬＥおよびＳＬｅＸの活性化剤である（すなわち、作用薬がＰ−セレクチンとＳＬｅＸの間の結合親和性を増大する）か、を決定することができる。更なる試験を実行して、炎症のようなセレクチンに関連する条件において、同定された作用薬の潜在的な治療的効能を評価することができる。
【００４８】
本発明は、Ｐ−セレクチンＬＥの活性部位と相互作用する同定薬に限定されるものではなく、Ｐ−セレクチン、Ｅ−セレクチン、Ｅ−セレクチンＬＥ、Ｐ−セレクチンＬＥ：ＳＬｅＸ複合体、およびＥ−セレクチンＬＥ：ＳＬｅＸ複合体を含むがこれらに限定はされない、ＳＬｅＸ結合部位またはＰＳＧＬ−１結合部位を含む如何なる分子または分子複合体の活性化剤または阻害剤を同定するための方法にも関する。
【００４９】
１つの実施形態では、本発明は、ＳＬｅＸ結合部位を含む分子または分子複合体の活性化剤または阻害剤を同定するための方法を提供する。該方法は、（ａ）（ｉ）残基ＴＹＲ４８、ＧＬＵ８０、 ＡＳＮ８２、 ＧＬＵ９２、ＴＹＲ９４、ＰＲＯ９８、ＳＥＲ９９、ＡＳＮ１０５、ＡＳＰ１０６、ＧＬＵ１０７および結合カルシウムの図３による相対構造座標（上記アミノ酸の主鎖原子からの±２乗平均平方根偏差は１．５Å以下であり、好ましくは１．０Å以下、最も好ましくは０．５Å以下である）、または（ｉｉ）アミノ酸残基ＴＹＲ４８、ＧＬＵ８０、ＡＳＮ８２、ＧＬＵ９２、ＴＹＲ９４、ＡＲＧ９７、ＧＬＵ９８、ＡＳＮ１０５、ＡＳＰ１０６、ＧＬＵ１０７および結合カルシウムの図４による相対構造座標（上記アミノ酸の主鎖原子からの±２乗平均平方根偏差は１．５Å以下であり、好ましくは１．０Å以下、最も好ましくは０．５Å以下である）を用いて、ＳＬｅＸ結合部位を含む上記分子または分子複合体の三次元モデルを生成するステップと、（ｂ）ステップ（ａ）で生成された三次元モデルとのコンピュータフィッティング解析を実行することによって、候補活性化剤または阻害剤を選択または設計するステップと、を含む。別の実施形態では、図３による相対構造座標は、さらに、アミノ酸残基ＴＹＲ４４、ＳＥＲ４６、ＳＥＲ４７、ＡＬＡ７７、ＡＳＰ７８、ＡＳＮ７９、ＰＲＯ８１、ＡＳＮ８３、ＡＲＧ８５、ＧＬＵ８８、ＣＹＳ９０、ＩＬＥ９３、ＬＹＳ９６、ＳＥＲ９７、ＡＬＡ１００、ＴＲＰ１０４、ＨＩＳ１０８、ＬＹＳ１１１およびＬＹＳ１１３も含み、ここで上記アミノ酸の主鎖原子からの±２乗平均平方根偏差は１．５Å以下であり、好ましくは１．０Å以下、最も好ましくは０．５Å以下である。さらに別の実施形態では、図４による相対構造座標はさらに、アミノ酸残基ＴＹＲ４４、ＳＥＲ４５、ＰＲＯ４６、ＳＥＲ４７、ＡＬＡ７７、ＰＲＯ７８、ＧＬＹ７９、ＰＲＯ８１、ＧＬＵ８８、ＣＹＳ９０、ＬＹＳ９９、ＡＳＰ１００、ＴＲＰ１０４、ＡＲＧ１０８、ＬＹＳ１１１およびＬＹＳ１１３も含み、ここで上記アミノ酸の主鎖原子からの±２乗平均平方根偏差は１．５Å以下であり、好ましくは１．０Å以下、最も好ましくは０．５Å以下である。いったん候補活性化剤または阻害剤が獲得または合成されると、候補活性化剤または阻害剤は分子または分子複合体と接触され、上記分子または分子複合体に対して候補活性化剤または阻害剤が有する効果が決定される。好ましくは、ＳＬｅＸへの分子または分子複合体の結合に対して候補活性化剤または阻害剤が有する効果を決定するために、候補活性化剤または阻害剤は、ＳＬｅＸ（もしくは、ＳＬｅＸを含む分子または分子複合体）の存在下で分子または分子複合体と接触される。
【００５０】
さらに別の実施形態では、本発明は、ＰＳＧＬ−１結合部位を含む分子または分子複合体の活性化剤または阻害剤を同定するための方法を提供する。該方法は、（ａ）アミノ酸残基ＡＬＡ９、ＴＹＲ４５、ＳＥＲ４６、ＳＥＲ４７、ＴＹＲ４８、ＧＬＵ８０、ＡＳＮ８２、ＬＹＳ８４、ＡＲＧ８５、ＧＬＵ８８、ＧＬＵ９２、ＴＹＲ９４、ＰＲＯ９８、ＳＥＲ９９、ＡＳＮ１０５、ＡＳＰ１０６、ＧＬＵ１０７、ＨＩＳ１０８、ＬＥＵ１１０、ＬＹＳ１１１、ＬＹＳ１１２、ＬＹＳ１１３、ＨＩＳ１１４および結合ストロンチウムの図５による相対構造座標（上記アミノ酸の主鎖原子からの±２乗平均平方根偏差は１．５Å以下であり、好ましくは１．０Å以下、最も好ましくは０．５Å以下である）を用いて、ＰＳＧＬ−１結合部位を含む上記分子または分子複合体の三次元モデルを生成するステップと、（ｂ）ステップ（ａ）で生成された三次元モデルとのコンピュータフィッティング解析を実行することによって、候補活性化剤または阻害剤を選択または設計するステップと、を含む。別の実施形態では、図５による相対構造座標はさらに、アミノ酸残基ＳＥＲ６、ＴＨＲ７、ＬＹＳ８、ＴＹＲ１０、ＳＥＲ１１、ＴＹＲ４４、ＴＹＲ４９、ＴＲＰ５０、ＡＬＡ７７、ＡＳＰ７８、ＡＳＮ７９、ＰＲＯ８１、ＡＳＮ８３、ＡＳＮ８６、ＡＳＮ８７、ＣＹＳ９０、ＩＬＥ９３、ＩＬＥ９５、ＬＹＳ９６、ＳＥＲ９７、ＡＬＡ１００、ＴＲＰ１０４およびＣＹＳ１０９も含み、ここで上記アミノ酸の主鎖原子からの±２乗平均平方根偏差は１．５Å以下であり、好ましくは１．０Å以下、最も好ましくは０．５Å以下である。いったん候補活性化剤または阻害剤が獲得または合成されると、候補活性化剤または阻害剤は分子または分子複合体と接触され、上記分子または分子複合体に対して候補活性化剤または阻害剤が有する効果が決定される。好ましくは、ＰＳＧＬ−１またはＰＳＧＬ−１ペプチドへの分子または分子複合体の結合に対して候補活性化剤または阻害剤が有する効果を決定するために、候補活性化剤または阻害剤は、ＰＳＧＬ−１またはＰＳＧＬ−１ペプチドの存在下で分子または分子複合体と接触される。ここで繰り返しになるが、薬剤設計のために構造座標を用いる目的で、ストロンチウムをカルシウムで置換できることも本発明の範囲内にある。
【００５１】
さらに、図３または４に示されるＳＬｅＸの構造座標、および図５に示されるＰＳＧＬ−１ペプチドの構造座標は、それぞれＳＬｅＸおよびＰＳＧＬ−１と相互作用する作用薬を同定または設計するために使用できる。この点について、本発明は、ＳＬｅＸと相互作用する作用薬を同定するための方法であって、（ａ）図３または４による相対構造座標（上記アミノ酸の主鎖原子からの±２乗平均平方根偏差は１．５Å以下であり、好ましくは１．０Å以下、最も好ましくは０．５Å以下である）を用いて、ＳＬｅＸの三次元モデルを生成するステップと、（ｂ）ＳＬｅＸと相互作用する作用薬を設計または選択するために上記三次元構造を使用するステップと、を含む方法を提供する。次に、同定された作用薬が合成または獲得でき、それから、ＳＬｅＸ（もしくは、ＳＬｅＸを含む分子または分子複合体）と接触させて、作用薬がＳＬｅＸ活性に対して有する効果を決定することができる。
【００５２】
またさらに、本発明は、ＰＳＧＬ−１と相互作用する作用薬を同定するための方法であって、（ａ）図５による相対構造座標（上記アミノ酸の主鎖原子からの±２乗平均平方根偏差は１．５Å以下であり、好ましくは１．０Å以下、最も好ましくは０．５Å以下である）を用いて、ＰＳＧＬ−１ペプチドの三次元モデルを生成するステップと、（ｂ）ＰＳＧＬ−１と相互作用する作用薬を設計または選択するために上記三次元構造を使用するステップと、を含む方法を提供する。次に、同定された作用薬が合成または獲得でき、それからＰＳＧＬ−１またはＰＳＧＬ−１ペプチド（もしくは、ＰＳＧＬ−１またはＰＳＧＬ−１ペプチドを含む分子または分子複合体）と接触させて、作用薬がＰＳＧＬ−１またはＰＳＧＬ−１ペプチド活性に対して有する効果を決定することができる。
【００５３】
種々の分子解析および理論的な薬剤設計技法は、米国特許第５，８３４，２２８号、同第５，９３９，５２８号および同第５，８６５，１１６号、ならびにＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ９８／１６８７９号、国際公開第９９／０９１４８号にさらに開示され、これらの内容は参照によって本明細書中に援用される。
【００５４】
また本発明は、上記の方法を用いて同定される作用薬、活性化剤または阻害剤にも関する。このような作用薬、活性化剤または阻害剤は、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、ＤＮＡまたはＲＮＡを含む核酸、分子、化合物または薬剤でよい。血管組織上での白血球のセレクチン媒介細胞ローリングを阻害するか、そうでなければ妨害する小さい分子または他の作用薬は、喘息および乾癬のような異常な炎症応答を伴う疾患の処置において有用であろう。
【００５５】
加えて、本発明は、その構造が未知の分子または分子複合体の三次元構造を決定するための方法であって、その構造が未知の分子または分子複合体の結晶を獲得するステップと、結晶化された分子または分子複合体からＸ線回折データを生成するステップと、を含む方法に関する。分子または分子複合体からのＸ線回折データは、次に、本発明の上述の結晶のいずれかから決定された既知の三次元構造と比較される。それから、本発明の結晶から決定された既知の三次元構造は、分子置換解析を用いて、結晶分子または分子複合体からのＸ線回折データへ「適合される（ｃｏｎｆｏｒｍｅｄ）」。あるいは、分光学的データまたはホモロジーモデリングを使用して、分子または分子複合体の推定の三次元構造を生成することができ、推定構造は、本発明の結晶のいずれかから決定された既知の三次元構造への適合によって精密化される。
【００５６】
最後に、本発明は、Ｅ−セレクチン型分子とＳＬｅＸなどのカルシウムに配位する化合物との結晶複合体を獲得するための方法を提供する。該方法は、（ａ）カルシウムイオンおよびＰＥＧの存在下で結晶Ｅ−セレクチン型分子とカルシウムに配位する化合物とを接触させて、Ｅ−セレクチン型分子とカルシウムに配位する化合物との結晶複合体を形成するステップと、（ｂ）濃度が低下されたカルシウムイオンならびに十分な濃度のＰＥＧおよびイオン塩の存在下で前記結晶複合体を接触させて、冷却した際に、最終の結晶複合体のＸ線回折によってＥ−セレクチン型分子およびカルシウムに配位する化合物の三次元構造を解明するのに適する最終の結晶複合体を獲得するステップと、を含む。
【００５７】
上記方法において、「Ｅ−セレクチン型分子」は、Ｅ−セレクチン分子全体、ならびにレクチンおよび／または上皮成長因子（ＥＧＦ）様ドメインのようなその一部、また好ましくは、Ｅ−セレクチンＬＥである。カルシウムに配位する化合物は、好ましくは、ＳＬｅＸである。ステップ（ａ）において、結晶Ｅ−セレクチン型分子は、当該技術で知られている手順によって調製できる。結晶Ｅ−セレクチン型分子がＥ−セレクチンＬＥである場合、結晶Ｅ−セレクチンＬＥは、以下の実施例１に説明されるように調製されるのが好ましい。この方法におけるカルシウムイオン源はＣａＣｌ２であるのが好ましく、ＰＥＧは、好ましくはＰＥＧ−１０００からＰＥＧ−２０，０００であり、最も好ましいのはＰＥＧ−４０００である。イオン塩は当該技術で知られる多数のイオン塩でよく、ＮａＣｌが好ましい。
【００５８】
この方法の重要な態様は、ステップ（ｂ）におけるカルシウムイオンの減少、あるいはカルシウムに配位する化合物のＥ−セレクチン型分子への結合の阻害におけるカルシウムの影響を防止および減少させる有効なカルシウム濃度の使用であり、これにより、最終結晶複合体のＸ線回折によってＥ−セレクチン型分子およびカルシウムに配位する化合物の三次元構造を解明するのに適切な最終結晶複合体の形成が可能になる。すなわち、カルシウム濃度は、カルシウムに配位する化合物がＥ−セレクチン型分子上のその結合部位へ結合できるようにするのに十分低くなければならない。例えば、カルシウムに配位する化合物がＳＬｅＸである場合、ステップ（ａ）におけるカルシウムイオン濃度は２０ｍＭから３００ｍＭの範囲であり、ステップ（ｂ）におけるカルシウムイオン濃度はそれより低くし得る（すなわち、１００μＭから２０ｍＭの範囲である）。ステップ（ａ）および（ｂ）において、ＰＥＧは、減少された、すなわちより低いカルシウム濃度を考慮して、結晶の完全性を保持するのに十分な濃度でなければならず、約１５％から６０％（ｗ／ｖ）のＰＥＧが好ましい。ステップ（ｂ）におけるイオン塩の濃度は、約１０ｍＭから５００ｍＭである。ステップ（ａ）における接触は、約１０〜２０時間行い得るが、結晶を配位する化合物がＳＬｅＸである場合には約１５時間が好ましい。ステップ（ｂ）における接触は約０．５〜３時間行なわれ、好ましくは約１時間である。
【００５９】
最終結晶複合体のＸ線回折によってＥ−セレクチン型分子およびカルシウムに配位する化合物の三次元構造を解明するのに適切である（Ｅ−セレクチン型分子とカルシウムに配位する化合物との）結晶複合体を形成するのに十分な濃度のカルシウムイオン、ＰＥＧおよびイオン塩の存在下で、結晶Ｅ−セレクチン型分子がカルシウムに配位する化合物と接触される場合には、ステップ（ａ）および（ｂ）を結合できることもまた、本発明の範囲内である。ステップ（ａ）および（ｂ）が結合される場合、カルシウムイオン、ＰＥＧおよびイオン塩の濃度は、それぞれ、約１００μＭから２０ｍＭ、１５％から６０％（ｗ／ｖ）、および１０ｍＭから５００ｍＭであると考えられる。
【００６０】
本発明は以下の非限定的な実施例を参照してより良く理解されるであろう。以下の実施例は本発明の好ましい実施形態をより完全に説明するために提示されたものであり、決して、本発明の範囲を制限すると解釈されてはならない。
【００６１】
実施例１
１．実験手順
構築物の生成およびタンパク質／ペプチドの調製
介在エンテロキナーゼ切断配列（Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ）によってＩｇＧ１のＣＨ２−ＣＨ３領域へ融合されたＰ−セレクチン（Ｐ−ＬＥ）およびＥ−セレクチン（Ｅ−ＬＥ）のレクチン−ＥＧＦ（ＬＥ）ドメイン（１５３アミノ酸）をＣＨＯ細胞中で発現させ、プロテインＡセファロース（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）クロマトグラフィによって、調整培地から回収した。エンテロキナーゼによる二量体Ｆｃ構築物の消化によって、単量体のセレクチンＬＥドメインを生成し（ＬａＶａｌｌｉｅ他、１９９３）、タンデム大豆トリプシン阻害剤−アガロース（Ｓｉｇｍａ）およびプロテインＡ（Ｐｅｒｓｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）カラムによるクロマトグラフィによって、酵素および残余Ｆｃドメインを除去した。セレクチンＬＥドメインは、２５ミリ単位Ｎ−グリカナーゼ／ｍｇタンパク質の比率において３７℃で４８時間、脱グリコシル化され、陰イオン交換および疎水性相互作用クロマトグラフィによって精製された。ＬＥドメインを減圧濃縮によって１０〜３０ｍｇ／ｍｌにした。Ｐ−ＬＥおよびＥ−ＬＥはいずれも、マススペクトロメトリ（ＭＳ）によって正確であり、ゲルろ過ＨＰＬＣによって単量体であり、表面プラズモン共鳴（ＢＩＡｃｏｒｅ）分析（以下を参照）によって機能性であると決定された。
【００６２】
エンテロキナーゼ切断配列を含む９アミノ酸リンカーを介してＩｇＧ１のＦｃ領域へ融合されたＰＳＧＬ−１のＮ−末端１９アミノ酸を含有する水溶性構築物（１９ｅｋ．Ｆｃ）は、以前に説明されている（Ｇｏｅｔｚ他、１９９７）。１９ｅｋ．Ｆｃを精製し、エンテロキナーゼで消化し、上記のＬＥ構築物の場合と同様に単量体ＰＳＧＬ−１ １９ｅＫペプチドを回収した。０〜５００ｍＭ勾配のＮａＣｌを用いるスーパーＱ陰イオン交換クロマトグラフィによって、不均質の１９ｅｋペプチドを個々の種に精製した。これらの構造は、タンパク質分解およびグリコシドの消化の前後のＭＳ、ＮＭＲによって、ならびに組成分析（Ｊ． Ｒｏｕｓｅ， Ｄ． ＴｓａｏおよびＲ．Ｃａｍｐｈａｕｓｅｎ、未公表データ）によって決定した。
【００６３】
Ｐ−ＬＥ／１９ｅｋペプチド結合の研究
表面プラズモン共鳴は、ストレプトアビジンがコーティングされたセンサチップ（ＢＩＡｃｏｒｅ）と、ＣａＣｌ２およびＭｇＣｌ２をそれぞれ１ｍＭに調整したＨＢＳ−Ｐ緩衝液（ＢＩＡｃｏｒｅ、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭのＮａＣｌおよび０．００５％のポリソルベート２０（ｖ／ｖ））とを用いて、２５℃においてＢＩＡｃｏｒｅの２０００および３０００機器で実行した。１９ｅｋペプチドおよびｓＰＳＧＬ、ＰＳＧＬ−１の二量体の細胞外ドメイン全体のフコシルトランスフェラーゼ−ＶＩＩ修飾形（Ｃｒｏｃｅ他、１９９８）を、Ｌｙｓ残基においてスルホ−ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチン（Ｐｉｅｒｃｅ）でビオチン化した。ビオチン化に続いて、機能性材料を単離するために、ｓＰＳＧＬを固定化Ｐ−セレクチンと反応させた（Ｓａｋｏ他、１９９５）。ＳＧＰ−３のポリペプチド部分に対応する合成ペプチド（ＡｎａＳｐｅｃ， Ｉｎｃ．）を、同様にビオチン化した。ＨＢＳ−Ｐ緩衝液を用いて、ビオチン化された試薬をセンサチップ上へコーティングした。実験的に決定された消衰係数（ｅｘｔｉｎｃｔｉｏｎ ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ）（２８０ｎｍ）により定量されたグリコシル化Ｐ−ＬＥおよびＥ−ＬＥを、１９ｅｋペプチド、ｓＰＳＧＬおよびコントロール表面上へ４０μＬ／分で注入した。結合の特異性は、Ｐ−およびＥ−セレクチンに対する中和Ｍａｂ、１０ｍＭのＥＤＴＡならびに水溶性１９ｅｋペプチドの存在下で実行されたコントロール実験によって確認された（Ｒ． Ｃａｍｐｈａｕｓｅｎ、未公表データ）。脱グリコシル化Ｐ−ＬＥおよびＥ−ＬＥは、そのままのグリコシル化形と同等に結合した。
【００６４】
結晶化およびデータ収集
全ての回折データは、記載された場合を除いて、Ｙａｌｅ／Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ社の集束ミラーおよびＲＡＸＩＳ ＩＩまたはＲＡＸＩＳ ＩＶ画像プレートエリア検出器を用いて、５．０ＫＷで作動するＲｉｇａｋｕのＲＵ２００ジェネレータで社内で収集された。
【００６５】
Ｐ−ＬＥのプレート形状の結晶は、１０ｍｇ／ｍｌのタンパク質、１００ｍＭのトリスＨＣｌ（ｐＨ８．５）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１２ｍＭのＣａＣｌ２、１０％（ｖ／ｖ）の２，４メチルペンタンジオール（ＭＰＤ）、および１０％（ｗ／ｖ）のＰＥＧ６０００を含む溶液から、蒸気拡散を用いて１８℃で成長させた。これらの結晶を、１００ｍＭのトリスＨＣｌ（ｐＨ８．５）、７５ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＣａＣｌ２、１０％（ｖ／ｖ）のＭＰＤ、および１１％（ｗ／ｖ）のＰＥＧ６０００の中へ移行させ、次に、ＭＰＤで５％（ｖ／ｖ）だけ希釈した同じ緩衝液へ２時間移行させた。ＭＰＤによる第２の５％希釈の後、液体窒素温度に保持された液体プロパン中での瞬時の冷却（ｆｌａｓｈ ｃｏｏｌｉｎｇ）の前に、結晶を１３時間浸漬させた。ＳＬｅＸ（ＳＬｅＸ−β−Ｏ−メチル、Ｔｏｒｏｎｔｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）と複合体形成されたＰ−ＬＥは、同一の方法を用いるが、最後の浸漬溶液に８ｍＭのＳＬｅＸを添加して得られた。Ｐ−ＬＥ結晶の空間群はＰ２１であり、格子パラメータはａ＝８１．０Å、ｂ＝６０．８Å、ｃ＝９１．４Åおよびβ＝１０３．６°であった。結晶をＳＬｅＸに浸漬すると、最大分解能が３．４Åへ低下され、モザイク角が１．５°へ増加され、格子パラメータａ＝８１．１Å、ｂ＝６０．５Å、ｃ＝９１．４Åおよびβ＝１０３．３°が与えられた。回折データはＤＥＮＺＯ／ＳＣＡＬＥＰＡＣＫ（ＨＲＬ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， Ｉｎｃ．）を用いて処理およびスケーリングされ、表１に報告される統計値が与えられた。
【００６６】
Ｅ−ＬＥの大きいロッド形状の結晶は、３０ｍｇ／ｍｌのタンパク質、１００ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭのトリスＨＣｌ、２００ｍＭのＣａＣｌ２、および１５％（ｗ／ｖ）のＰＥＧ４０００を含む溶液から、蒸気拡散を用いて１８℃で得られた。結晶は成長するのに数週間かかり、マクロシーディングの使用とともにより再生可能であった。ＳＬｅＸとの複合体のために、Ｅ−ＬＥ結晶を、１００ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、２００ｍＭのＣａＣｌ２、３０％（ｗ／ｖ）のＰＥＧ４０００、および１５ｍＭのＳＬｅＸを含む溶液中へ、２５℃で１５時間移行させた。この初期インキュベーションの後、上記に説明された瞬時の冷却の前にさらに１時間、結晶を、１００ｍＭのトリスＨＣｌ（ｐＨ７．４）、３００ｍＭのＮａＣｌ、２ｍＭのＣａＣｌ２、３０％（ｗ／ｖ）のＰＥＧ４０００、および１５ｍＭのＳＬｅＸ中へ移行させた。Ｅ−ＬＥ／ＳＬｅＸ結晶は、空間群Ｐ２１２１２１に属し、格子パラメータはａ＝３４．５Å、ｂ＝７２．４Å、ｃ＝７７．６Åであった。回折データは上記のように処理された。
【００６７】
０．５×０．５×０．３ｍｍに達するＰ−ＬＥ／ＰＳＧＬ−１ １９ｅｋペプチド（ＳＧＰ−３）複合体の大きな結晶は、気相拡散結晶液滴中への繰り返しマクロシーディングによって得られた。結晶は、８ｍｇ／ｍｌのＰ−ＬＥ、２倍モル過剰のＳＧＰ−３、１０ｍＭのトリスＨＣｌ、１００ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、４ｍＭのＣａＣｌ２、５０ｍＭのＳｒＣｌ２、５％（ｗ／ｖ）のＰＥＧ６０００、および３３％（ｖ／ｖ）のＭＰＤから成長した。初期の小さい種結晶は、５０％ＭＰＤを含むがＳｒＣｌ２またはＰＥＧ６０００を含まない同様の緩衝液から得られた。結晶は、瞬時の冷却の前に１５時間、１００ｍＭのＨＥＰＥＳｐＨ７．０、１０％のＰＥＧ６０００、３０％のＭＰＤ、１００ｍＭのＮａＣｌおよび５０ｍＭのＳｒＣｌ２中へ移動された。水銀−誘導体化結晶は、瞬時の冷却の前に２４時間、最終浸漬緩衝液へ０．５ｍＭの酢酸水銀を添加することによって得られた。複合体結晶の空間群はＩ２２２であり、格子パラメータはａ＝６３．４Å、ｂ＝９６．８Å、およびｃ＝１８７．３Åであることがわかった。結晶は両錐型であった。天然の回折データは、回折データを記録するためにＲＡＸＩＳ ＩＶを用いてＢｒｏｏｋｈａｖｅｎ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｌａｂｓ ｓｔａｔｉｏｎ Ｘ４Ａで収集された。水銀誘導体データは社内で収集された。全てのデータは上記のように換算されて表１の統計値を与えた。
【００６８】
構造決定および精密化
ＳＬｅＸと複合体形成されたＥ−ＬＥの結晶は、以前に報告されたもの（Ｇｒａｖｅｓ他、１９９４）と本質的に同形であり、結晶学的な非対称単位中にＥ−ＬＥの単一コピーを有することがわかった。ＣＮＳにおける剛体精密化（Ｂｒｕｎｇｅｒ他、１９９８）を用いて、結合されたＳＬｅＸ対して明白な電子密度を与える初期位相を得た。これらのマップはさらにＢＵＳＴＥＲ（Ｂｒｉｃｏｇｎｅ、１９９３）を使用して改良され、結合ＳＬｅＸのモデルがＱＵＡＮＴＡ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ， Ｉｎｃ．）を用いて適合されるのを可能にした。全ての更なる精密化はＣＮＳにおいて実行され、ラマチャンドラン・プロットの最も有利な領域に８６％の残基を有し、全体で１５１０個の原子、１８６個の水分子、１個のカルシウムイオン、および１個のＳＬｅＸコピーから成る最終モデルが与えられた。統計値は表１に記載される。
【００６９】
Ｐ−ＬＥの構造は、Ｅ−セレクチンｌｅｃ／ＥＧＦ構築物の公表モデル（ＰＤＢ登録コード１ＥＳＬ）を用いて、分子置換で解明された。プログラムＡＭＯＲＥ（ＣＣＰ４、１９９４）を用いて、Ｐ−ＬＥの４つ全てのコピーを配置した。モデルは、上記の方法を用いて構築および精密化した。１個のＰ−ＬＥコピーは他の３つよりも低い電子密度を有していたが、非結晶学的な対称を使用して、十分進歩した精密化により表１の統計値が与えられた。精密化の最後に、４番目のＰ−ＬＥコピーの平均Ｂ因子は、他の３個のコピーでは４４．２Å２であるのに対し、６３．７Å２であった。最終モデルは４個のＰ−ＬＥコピーから成り、ラマチャンドラン・プロットの最も有利な領域に８１％の残基を有し、全体で５４１８個の原子、１３４個の水分子、２つＭＰＤ分子、および４個のカルシウムイオンを有する。
【００７０】
ＳＬｅＸに浸漬されたＰ−ＬＥ結晶は、上記のＰ−ＬＥ構造と本質的に同形であった。ＣＮＳにおける剛体精密化の後、３個の結合されたＳＬｅＸ分子に対する明白な密度が存在した。４番目の結合部位は結晶の接触によって部分的に閉塞されており、したがって、ＳＬｅＸ中での浸漬における分解能の損失が説明された。ＱＵＡＮＴＡを用いて、ＣＮＳ中の制限された精密化の前に、結合ＳＬｅＸをモデル化し、タンパク質残基を修復（ｒｅｆｉｔ）した。これにより、最も有利なラマチャンドラン領域に７１％の残基を有し、全体で５４５５個の原子、３個のＳＬｅＸ分子、４個のカルシウムイオン、および２個のＭＰＤ分子を有する最終モデルが与えられた。
【０００７１】
ＰＳＧＬ−１ １９ｅｋペプチドＳＧＰ−３と複合体形成されたＰ−ＬＥの構造を分子置換によって解明するための試みは全て失敗であった。重原子部位は、ＳＨＡＲＰで精密化されたパターソン技法を用いて配置された（ｄｅ ｌａ ＦｏｕｒｔｅｌｌｅおよびＢｒｉｃｏｇｎｅ、１９９７）。これらの位相は乏しいマップを与えたが、その品質は、Ｐ−ＬＥ構造からの２つのレクチンドメインの位置決め、および２つのＥＧＦドメインの独立的位置決めを可能にするのに十分な品質であった。また、これらのマップによって、Ｐ−ＬＥ／ＳＬｅＸ複合体で見られるのと同じ位置に結合ＳＬｅＸ分子が存在することと、解釈できない余分な密度とが示された。重原子の位相は、ＢＵＳＴＥＲにおけるモデル位相と結合されて、ＱＵＡＮＴＡにおけるＳＧＰ−３ポリペプチドおよびＳＬｅＸ部分のフィッティングを可能にする明白な最大エントロピーマップを与えた。この構造は上記のように精密化され、表１の統計値と、ラマチャンドラン・プロットの最も有利な領域の８４％の残基と、が与えられた。最終モデルは、２つのＰ−ＬＥ／ＳＧＰ−３複合体、３２６３個の原子、２個のストロンチウムイオン、２２４個の水分子、２個のナトリウムイオン、および７個の結合ＭＰＤ分子から成る。
【００７２】
２．結果および議論
Ｐ−セレクチンのレクチン／ＥＧＦドメインのＸ線結晶構造
本発明の発明者らは、Ｎ−末端レクチンおよびＥＧＦドメインを含むＰ−セレクチン構築物（Ｐ−ＬＥと称される）を生成した。Ｅ−セレクチンのｌｅｃ／ＥＧＦ結晶構造（Ｇｒａｖｅｓ他、１９９４）は、レクチンおよびＥＧＦドメイン間の相互作用は最小限であり、推定のＳＬｅＸ結合部位はレクチン−ＥＧＦドメイン接合部から十分に離されることを示したが、本発明者らは、ＥＧＦドメインが機能的な役割を有し得ることを示唆する研究（Ｇｉｂｓｏｎ他、１９９５、Ｋａｎｓａｓ他、１９９４）のために、ＥＧＦドメインを保持することを選択した。Ｐ−ＬＥは、介在エンテロキナーゼ切断配列を介してＩｇＧ１のＦｃ領域へ融合された。この構築物はＰ−ＬＥ．Ｆｃと称され、条件培地からの容易な精製、およびエンテロキナーゼの消化に続く単量体Ｐ−ＬＥドメインの生成を可能にした。ＣＨＯ細胞中で発現されたＰ−ＬＥは３つのＮ−連結グリカンを含み、これは、結晶化の前に酵素によって除去された。Ｐ−ＬＥ結晶は、結晶学的な非対称単位中に４分子を有する空間群Ｐ２１で得られ、２．４Å分解能へ回折された。構造は、検索モデルとしてＥ−セレクチンｌｅｃ／ＥＧＦ結晶の構造座標を用いて分子置換によって解明した。
【００７３】
Ｐ−ＬＥ結晶構造は、Ｅ−セレクチンｌｅｃ／ＥＧＦ構造と本質的に同一の全体的コンホメーションを採用する。これは、これらのドメインにおいてセレクチン間の配列同一性が６２％であることと矛盾せず、その結果、これらのＣ主鎖のＲＭＳ差はたった０．７Åである。Ｐ−ＬＥのレクチンおよびＥＧＦドメインは小さい界面によって相互に作用し、この関係も保持されるので、Ｅ−セレクチン構築物との類似性をさらにより顕著にする。ドメイン間角度の小さな移動と共にＥＧＦドメインのいくつかのループの移動は、２つの構造間の多くの小さな相違に寄与している。また、ドメイン間角度は、結晶中の異なるＰ−ＬＥコピーの間でもわずかに変動し、したがって、おそらく結晶のパッキング力の影響である。
【００７４】
突然変異生成および構造の研究（Ｋａｎｓａｓ、１９９６）によって示唆される推定のＳＬｅＸ結合部位は、Ｐ―ＬＥおよびＥ−セレクチンｌｅｃ／ＥＧＦ構造の間で著しく保存される。この部位の共通の特徴、およびおそらくセレクチン機能の金属依存性の基礎は、Ｇｌｕ−８０、Ａｓｎ−８２、Ａｓｎ−１０５およびＡｓｐ−１０６の側鎖、ならびにＡｓｐ−１０６の主鎖カルボニルによって配位されるカルシウムイオンである。また、２個の水分子もＰ−ＬＥ内でカルシウムと連結し、そのうちの１つはＡｓｎ−８３の側鎖によって安定化される。ＳＬｅＸ結合部位の類似性は、Ｐ−ＬＥのこの領域の８つの結合した水がＥ−セレクチンｌｅｃ／ＥＧＦ構造（図示せず）にも存在する（０．８Å以内）ことを考慮して、さらにより顕著である。しかしながら、結合部位は、Ｅ−セレクチンのＡｒｇ−９７からＰ−セレクチンのＳｅｒ−９７への変更によって大部分定義されるある領域において、相違を有する。Ｅ−セレクチンｌｅｃ／ＥＧＦ構造では、Ａｒｇ−９７はＴｙｒ−９４上に重なることにより、この領域にプラスに帯電した表面を供与するが、Ｐ−ＬＥでは、Ｔｙｒ−９４は、より小さいＳｅｒ−９７残基によって妨害されず、その結果、疎水性相互作用を媒介するための電位を有する。Ｅ−セレクチンｌｅｃ／ＥＧＦ構築物のＡｒｇ−９７はＡｓｐ−１００と水素結合を作るが、これは、Ｐ−ＬＥではアラニン残基である。この領域に隣接するのはＬｙｓ−９９であり、これは、Ｅ−セレクチンｌｅｃ／ＥＧＦ内では、結合部位から離れたところを指す。Ｐ−ＬＥ中の同等の残基はセリン残基であり、これは結合部位に面している。
【００７５】
ＳＬｅＸと複合体形成されたＰ−およびＥ−セレクチンｌｅｃ／ＥＧＦドメインの結晶構造
本発明者らは、ＳＬｅＸと複合体形成されたＰ−ＬＥの結晶構造を得ようとし、予め形成されたＰ−ＬＥ結晶中にＳＬｅＸを浸漬することによって得られるであろうと予測した。また、本発明者らは、Ｅ−セレクチン対Ｐ−セレクチンについて記載された（Ｐｏｐｐｅ他、１９９７）約１０倍高いＳＬｅＸ結合親和性のための構造的基礎を理解することを望み、これは、その推定のＳＬｅＸ結合部位の類似性を仮定すれば予期されない。したがって、本発明者らは、Ｐ−ＬＥに関して発現、精製、および脱グリコシル化されたＥ−セレクチンのレクチン／ＥＧＦ構築物（Ｅ−ＬＥ）を生成した。Ｅ−ＬＥは、Ｅ―セレクチンｌｅｃ／ＥＧＦに対して以前に使用された（Ｇｒａｖｅｓ他、１９９４）ものと同様の条件下で結晶化され、結晶学的な非対称単位中に１つのＥ−ＬＥコピーを有した。
【００７６】
Ｐ−ＬＥ結晶は８ｍＭのＳＬｅＸを含む安定化溶液中に浸漬され、結晶学的データは３．４Åまで広げて収集された（表１）。Ｐ−ＬＥ／ＳＬｅＸ結晶構造は、非対称単位中に４つのＰ−ＬＥコピーを有し、１つのＳＬｅＸ結合部位は結晶接触によって部分的に閉塞される。浸漬時に回折品質においてこのような著しい損失を引き起こすのは、おそらくこの結晶接触である。データの低分解能にもかかわらず、明白な電子密度は３つのＰ−ＬＥコピーの結合カルシウムから離れて伸びることがわかった。これらの結果はあとで高分解能のＥ−ＬＥとのＳＬｅＸ複合体を得た後に精密化されたが、これらのマップはＰ−ＬＥへ結合されたＳＬｅＸの複合体構造を構築するために使用された。２０ｍＭまでのＳＬｅＸ濃度でＳＬｅＸをＥ−ＬＥ結晶中へ浸漬する初期の試みは、成功しなかった。本発明者らは続いて、結晶化のために使用される高濃度のカルシウムがＳＬｅＸ結合分析（図示せず）においてＥ−セレクチンを阻害すると決定した。したがって、ＳＬｅＸ結合を容易にしながら高分解能の回折をも維持するレベルまでカルシウム濃度が低減された浸漬プロトコルが得られた。これらの条件は、１．５Å分解能への回折データおよび結合ＳＬｅＸの明白な電子密度を与える結晶をもたらした（表１）。Ｐ−ＬＥ／ＳＬｅＸ複合体の構造は、相互作用が本質的にほぼ完全に静電的であり、覆い隠された全表面積は、ＳＬｅＸのサイズと比較して小さい（５４９Å２）ことを明らかにした。Ｐ−ＬＥとの複合体は分解能が低いので、保存された相互作用のさらに詳細な説明は、Ｅ−ＬＥ／ＳＬｅＸ複合体について以下に説明されるであろう。Ｆｕｃヒドロキシルの相互作用は、大量の結合エネルギーを提供しなければならない。３−および４−ヒドロキシル基は結合カルシウムに配位するだけでなく、それ自身がカルシウムに配位している残基と水素結合も形成する。さらに、Ｇｌｕ−１０７はＦｕｃ２−ヒドロキシル基から３．４Åしか離れておらず、弱い水素結合を形成できる。ＳＬｅＸＧａｌ残基は、４−ヒドロキシル基（Ｔｙｒ−９４のヒドロキシル基と）および６−ヒドロキシル基（Ｇｌｕ−９２のカルボキシレート基と）を用いて、タンパク質残基と水素結合する。ＮｅｕＮＡｃ残基は、２つのセレクチンが非常に異なる領域、すなわちＡｒｇ−９９（Ｅ−セレクチン）に対してＳｅｒ−９９（Ｐ−セレクチン）である部位において相互作用をする。Ｐ−ＬＥにおいて、Ｔｙｒ−４８およびＳｅｒ−９９のヒドロキシル基は、それぞれ、ＮｅｕＮＡｃのカルボキシレート部分および４−ヒドロキシル基に対して水素結合を形成する。最後に、ＮｅｕＮＡｃ環のＣ−４はＰｒｏ−９８に対して集まるように見える。ＮｅｕＮＡｃの位置決めは、Ｅ−ＬＥにおいてＡｒｇ−９９との好ましくない接触を作り得るので、より良い相互作用を可能にするためにさらに背後へ移動する（図２Ａ）。ＳＬｅＸの残りは、Ｅ−ＬＥおよびＰ−ＬＥの間で本質的に重ね合わせ可能である。
【００７７】
ＳＬｅＸと複合体形成されたＥ−ＬＥの構造は、Ｓｅｒ−９７：Ａｒｇ−９７（Ｐ−セレクチン：Ｅセレクチン）の相違の結果としてＮｅｕＮＡｃへの異なる接触を有して、Ｐ−ＬＥの低分解能構造に見られる相互作用を確認する。Ｆｕｃ３−および４−ヒドロキシル基は結合カルシウムに配位し、やはりカルシウムに配位する残基との水素結合の複合体ネットワークを形成する。Ｆｕｃ４−ヒドロキシル基は、配位子を持たない（ｕｎｌｉｇａｎｄｅｄ）構造で観察されるカルシウムに連結した水分子を正確に置換し、Ａｓｎ−８２から水素結合を受け取り、Ｇｌｕ−８０へ水素結合を提供する。Ｆｕｃ３−ヒドロキシル基は、その最終位置はＡｓｎ−１０５へ１Å近いが、別のカルシウム配位した水分子を置換する。ＳＬｅＸ結合において、Ａｓｎ−８３はその２ねじれ角を５９°へ回転させるので、水素結合を結合水へ提供できるようになり、次に結合水をＦｕｃ２−ヒドロキシル基およびＧｌｕ−１０７の側鎖の両方へ水素結合することができる（図示せず）。またこの回転は、ここでＡｓｎ−８３側鎖がカルシウムに配位できる。Ｐ−ＬＥのＳｅｒ−９７のＥ−ＬＥのＡｒｇ−９７による置換は、ＮｅｕＮＡｃとの異なる相互作用セットの形成を可能にし、発生し得る近接した接触を緩和するために側鎖から離れた糖の移動を引き起こす。Ａｒｇ−９７は、ＮｅｕＮＡｃのグリコシド酸素およびカルボキシレート基へ水素結合を提供する。Ｐ−ＬＥへの同様の配置において、カルボキシレート基はまた、Ｔｙｒ−４８から水素結合を受け取る。
【００７８】
Ｐ−ＬＥおよびＥ−ＬＥへ結合するＳＬｅＸについて観察されるタンパク質接触は、Ｐ−およびＥ−セレクチン認識のために重要な残基を定義することに焦点を絞った部位特異的な突然変異生成の研究（Ｅｒｂｅ他、１９９３、Ｅｒｂｅ他、１９９２、Ｇｒａｖｅｓ他、１９９４、Ｈｏｌｌｅｎｂａｕｇｈ他、１９９３、ＮｇおよびＷｅｉｓ、１９９７）と良く一致する。これらの突然変異（例えば、Ｅ−およびＰ−セレクチンのＴｙｒ−４８およびＴｙｒ−９４、ならびにＥ−セレクチンのＡｒｇ−９７の置換）の多くは今や、ＳＬｅＸとの水素結合相互作用に直接影響すると解釈できる。他の突然変異は、おそらく相互作用する残基の配向を変更することによって間接的に機能を妨害する。Ｅ−およびＰ−セレクチンの両方に見られる三連Ｌｙｓの連続物（残基１１１〜１１３）の突然変異に関連した機能の妨害の説明となりそうなのは、この後者の説明である。ＳＬｅＸと複合体形成されたＰ−ＬＥおよびＥ−ＬＥの構造においてＬｙｓ−１１３は、結合に直接参加しない。しかしながら、この残基は、Ｇｌｕ−９２のカルボキシレート部分へ（その側鎖アミノ基によって）水素結合し、Ｇｌｕ−９２はまた、ＳＬｅＸ内のＧａｌ残基の６−ヒドロキシル基へ水素結合する。したがって、セレクチンのこの領域におけるいくつかの突然変異は、間接的なメカニズムによってＳＬｅＸ結合を妨害し得る。
【００７９】
Ｅ−およびＰ−ＬＥ／ＳＬｅＸ構造と関連のレクチン／グリカン複合体の構造とを比較すると、重要な類似点および相違点が明らかになる。オリゴマンノースへ結合されたＭＢＰ−Ａの結晶構造の試験（Ｗｅｉｓ他、１９９２）は、連結マンノース残基の３−および４−ヒドロキシル基も含むカルシウム結合相互作用の同様の配置を示す。しかしながら、Ｅ−およびＰ−ＬＥ／ＳＬｅＸ構造のＦｕｃ環は、ＭＢＰ−Ａ／オリゴマンノース複合体のマンノースに対して「反転される（ｆｌｉｐｐｅｄ）」。この結果、環位置の交換が起こるので、セレクチンＬＥ／ＳＬｅＸ複合体のＦｕｃ３−および４−ヒドロキシル基は、それぞれ、ＭＢＰ−Ａ／オリゴマンノース複合体のマンノースの４−および３−ヒドロキシル基位置を占める。異なるヒドロキシル基が使用され、糖環に対するその関係が異なる（マンノース３−および４−ヒドロキシル基ではそれぞれエクアトリアル−エクアトリアルなのに対してＦｕｃではエクアトリアル−アキシアル）にもかかわらず、ヒドロキシル基に対する糖環の炭素に沿ったベクトルは保持される。ヒドロキシル基のこの正確な位置決めは、カルシウムイオンへの同時連結反応およびタンパク質との水素結合相互作用のために、不可欠であると思われる。３つのセレクチン残基が導入されたＭＢＰ−ＡのＫ３突然変異体の結晶構造（ＮｇおよびＷｅｉｓ、１９９７）は、セレクチンＬＥ／ＳＬｅＸ複合体について本明細書で本発明者らが観察したのとは大きく異なって、ＳＬｅＸと結合する。この構造および本明細書に提供される構造は結合カルシウムへのＦｕｃ連結反応を示すが、異なるヒドロキシル基が含まれる。Ｋ３突然変異体／ＳＬｅＸ複合体では、Ｆｕｃ２−および３−ヒドロキシル基はカルシウムと連結し、それぞれ、セレクチンＬＥ／ＳＬｅＸ複合体で見られるＦｕｃ４−および３−ヒドロキシル基の位置を占める。この結果、セレクチンＬＥ／ＳＬｅＸ複合体に対して結合ポケット内のＳＬｅＸ配向が９０°回転され、Ｇａｌ４−ヒドロキシル基とＬｙｓ−１１１の側鎖との間の水素結合相互作用（発明者らは観察していない）が提供される。これは、Ｅ−およびＰ−ＬＥ／ＳＬｅＸ複合体におけるリガンドの結合に対するＧｌｕ−９２、Ｔｙｒ−９４、およびＴｙｒ−４８（ならびにＥセレクチンのＡｒｇ−９７）の重要性を強調する。最後に、Ｅ−セレクチンｌｅｃ／ＥＧＦ結晶構造内へ分子的にドッキングされたＳＬｅＸのモデル（Ｇｒａｖｅｓ他、１９９４、Ｋｏｇａｎ他、１９９５、Ｐｏｐｐｅ他、１９９７）は、結合表面のＳＬｅＸの一般的な配向については、本発明の結果と比べてひけをとらない。しかしながら、程度の差はあっても、全て、分子接触の同一性に関して、ここに示された構造と一致しない。ＳＬｅＸの結合カルシウムへの連結反応は、ＭＢＰ−Ａ／オリゴマンノース複合体およびＭＢＰ−Ａ Ｋ３突然変異体／ＳＬｅＸ複合体で観察されるものを模倣するという基本的な前提では、全てのモデルは、ＳＬｅＸのＦｕｃ２−および３−ヒドロキシル基が結合カルシウムと連結することを提案する。これは、Ｆｕｃ連結反応が３−および４−ヒドロキシル基で媒介される発明者らの２つの別々のセレクチンＬＥ／ＳＬｅＸ複合体の観察と鋭く対照的である。Ｅ−セレクチン／ＳＬｅＸ相互作用のための提案される他の接触は、様々な程度で本発明の結果と一致または矛盾する。これらの誤った構造の検討に基づいて治療目的を対象としたＳＬｅＸ模倣体の設計は、最終的に、これらの努力の成果を制限するであろう。
【００８０】
Ｘ線結晶学のための機能性ＰＳＧＬ−１ペプチドの生成
本発明者らは次に、認識の構造的基礎を解明するためにＰＳＧＬ−１と複合体形成されたＰ−ＬＥの結晶構造を得ようとしたが、生理的または大きい細胞外型のＰＳＧＬ−１は共結晶の試行にとって不均質すぎると判明するであろうと予想した。突然変異生成および生化学的な研究は、Ｐ−セレクチンが、Ｅ−セレクチンと対照的に、成熟したＰＳＧＬ−１のＮ−末端内で、ポリペプチド残基およびＳＬｅＸ修飾されたＯ−グリカンの両方を認識することを示す。ＰＳＧＬ−１決定基の候補には、（成熟ポリペプチドのＮ−末端から番号付けされる）Ｔｙｒ−５、Ｔｙｒ−７、およびＴｙｒ−１０（そのうちの１つまたは複数は硫酸化される）、ならびに間接的な方法（ＰｏｕｙａｎｉおよびＳｅｅｄ、１９９５、Ｒａｍａｃｈａｎｄｒａｎ他、１９９９、Ｓａｋｏ他、１９９５、Ｗｉｌｋｉｎｓ他、１９９５）でＴｈｒ−１６へ局在化されたシアリル化、フコシル化（おそらくＳＬｅＸ様の）Ｏ−グリカンを包含するアミノ酸のアニオン性の連続物が含まれる。３つのＴｙｒ残基のいずれか１つの硫酸化は、Ｐ−セレクチン結合を支援できるが、個々の硫酸チロシンの相対的な役割は、ローリング研究（Ｒａｍａｃｈａｎｄｒａｎ他、１９９９）によって推察されたもので、厳密な親和性決定によるものではない。これらの構造的な疑問を探求するため、およびＰ−ＬＥとの結晶に適した均質的に修飾された形のＰＳＧＬ−１を生成するために、発明者らは、切断型のＰＳＧＬ−１をＣＨＯ細胞株中で発現させた。ＣＨＯ細胞株にはあらかじめ、フコシルトランスフェラーゼ−ＶＩＩおよびコア２Ｎ−アセチルグルコサミン、ＣＨＯ細胞中の機能性ＰＳＧＬ−１の生成に不可欠である修飾酵素を移入した（Ｋｕｍａｒ他、１９９６、Ｌｉ他、１９９６）。発明者らは、ＩｇＧ１の重鎖ドメイン（１９．Ｆｃ，（Ｓａｔｏ他、１９９５））に融合されたＰＳＧＬ−１の１９Ｎ−末端アミノ酸をコード化しているＰＳＧＬ−１の可溶性構築物（１９ｅＫ．Ｆｃ，（Ｇｏｅｔｚ他、１９９７））を利用した。ここで、発明者らは、発現および精製に続いて単量体ＰＳＧＬ−１ペプチドの単離を可能にするエンテロキナーゼ切断配列を導入した。ラテックスミクロスフェア上へコーティングされた１９ｅＫ．Ｆｃは、Ｐ−およびＥ−セレクチンを発現するＣＨＯ細胞上のローリングを支援することが以前に証明された（Ｇｏｅｔｚ他、１９９７）。
【００８１】
１９ｅＫ．Ｆｃは、単量体ＰＳＧＬ−１ペプチド（１９ｅｋペプチドと称される）を生成するためにエンテロキナーゼで消化された。ＭＳによる予備的な分析は、１９ｅｋペプチドが構造的に不均質であることを示唆した（図示せず）。したがって、混合物の分解は陰イオン交換ＨＰＬＣによって達成され、１９ｅｋペプチド混合物を、塩の勾配で遅れて溶出する主な種が優位を占める均質な各成分へ分離した（図１Ａ）。主要な１９ｅｋペプチドの構造は、図１Ａに示されるように、スルホグリコペプチド（ＳＧＰ−３と称される）であると決定された。ＳＧＰ−３のＰＳＧＬ−１部分は広範囲にわたって翻訳後に（ｐｏｓｔ−ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌｌｙ）修飾され、３つのチロシン残基すべての上の硫酸塩、およびＴｈｒ−１６におけるＳＬｅＸ−含有コア２修飾されたＯ−グリカンを含む（図１Ａ、挿入図）。重要なことには、グリカンは、ＨＬ−６０骨髄細胞株から単離されたＰＳＧＬ−１について特徴付けられた２つのＳＬｅＸ−含有Ｏ−グリカンのうちの１つと同一である（Ｗｉｌｋｉｎｓ他、１９９６）。１９ｅｋペプチドの主要でない種（図１Ａ）は、ＳＧＰ−３の修飾が少ない型である。１９ｅｋペプチドＳＧＰ−１およびＳＧＰ−２（図１Ａ）の構造は、それぞれ、１つおよび２つの硫酸チロシンを含むＳＧＰ−３の形であると決定された。ＭＳによる予備的実験は、チロシン硫酸化の全ての順列は次亜硫酸化種内に存在するが、これらは定量されないことを示した。また、１９ｅｋペプチドプール内に存在し、クロマトグラフィにより分解される（図１Ａ）のは、ＳＧＰ−３の硫酸チロシンを含まない形（グリコペプチドー１、ＧＰ−１）、あるいは炭水化物を含まない形（スルホペプチドー１、ＳＰ−１）である。
【００８２】
本発明者らは、共結晶の試みに対して最も機能的な種を選択するために、表面プラズモン共鳴を使用して、個々の１９ｅｋペプチドに対するＰ−ＬＥの結合親和性を決定した。比較のために、発明者らは、二量体細胞外ドメイン全体からなる可溶性の組み換え型ＰＳＧＬ−１（ｓＰＳＧＬ）を評価した。以前の研究と一致して、Ｐ−ＬＥは、固定化ｓＰＳＧＬおよび１９ｅｋペプチドと速い速度論で結合した（図１Ｂ）。結合は、ＥＤＴＡおよび中和Ｍａｂｓ（図示せず）、ならびに可溶性阻害剤として使用されるＳＧＰ−３（図１Ｂ）とともに実行されたコントロール実験に基づいて、特異的であると決定された。個々の１９ｅｋペプチドについて観察された最も高い親和性相互作用は、ＫＤが７７８ｎＭであり完全修飾された種ＳＧＰ−３についてであった。ｓＰＳＧＬについても本質的に同一の親和性が得られ（図１Ｃ）、これにより、１９ｅｋペプチドＳＧＰ−３は完全長の細胞外ＰＳＧＬ−１構築物を機能的に模倣し、より短い構築物に存在するＰＳＧＬ−１のＮ−末端領域はＰ−ＬＥのための認識領域全体を構成することが示唆された。ＳＧＰ−３の次亜硫酸化型に対するＰ−ＬＥの結合親和性はわずかに弱く（図１Ｃ）、二硫酸化種（ＳＧＰ−２）では２．８８μＭのＫＤを示し、モノ硫酸化種（ＳＧＰ−１）では１２．３μＭのＫＤを示した。ＳＧＰ−３の炭水化物を含まない形（ＳＰ−１）、またはスルホチロシンを含まない形（ＧＰ−１）のＰ−ＬＥ結合親和性はさらに弱く、それぞれ、１１３μＭ、および３１．１μＭであると評価された（図１Ｃ）。炭水化物または硫酸化を含まない１９ｅｋペプチドの合成型に対するＰ−ＬＥの親和性は修飾されたどの種よりもかなり低く、ここで使用されるタンパク質濃度では決定されなかった。ここで決定されたｓＰＳＧＬおよびＳＧＰ−３へのＰ−ＬＥ結合の結合親和性は、完全長の好中球ＰＳＧＬ−１に対するＰ−ＬＥの結合と同様に、可溶性ＰセレクチンおよびＰ−セレクチンのレクチン−ＥＧＦ構成物の結合について以前に決定された値と比較して十分適度である（それぞれ、３２２ｎＭおよび４２２ｎＭのＫＤ）（Ｍｅｈｔａ他、１９９８）。さらに、ＳＧＰ−３と同様に修飾されたＰＳＧＬ−１グリコスルホペプチドに対する可溶性Ｐ−セレクチンの結合親和性は、ＫＤが〜３５０ｎＭであると最近報告された（Ｌｅｐｐａｎｅｎ他、１９９９）。
【００８３】
ＰＳＧＬ−１スルホグリコペプチド−３へ結合されたＰ−ＬＥのＸ線結晶構造　Ｐ−ＬＥは２倍モル過剰のＳＧＰ−３とともに共結晶化された。１．９Åに回折される大きいＩ２２２空間群の結晶を与えるために、繰り返しマクロシーディングおよびストロンチウムによるカルシウム置換が必要とされた。位相は社内で収集した水銀データを用いて生成され、結晶学的な非対称単位中の２つのＰ−ＬＥ／ＳＧＰ−３複合体が明らかにされた。構造は、ＣＮＳを用いて２０．４％のＲ因子（Ｒ遊離、２３．５％）へ精密化された（表１）。ＳＧＰ−３ポリペプチド内の２９アミノ酸では、硫酸化Ｔｙｒ−７（Ｔｙｓ−７）および硫酸化Ｔｙｒ−１０（Ｔｙｓ−１０）を含む残基６〜１８が観察された。構造に乱れのあるおよび不在なのは、最もＮ−末端の硫酸化チロシン（Ｔｙｓ−５）を含むポリペプチド残基１〜５と、エンテロキナーゼ−リンカー領域を含む残基１９〜２９である。Ｔｈｒ−１６でのＳＬｅＸ−修飾されたＯ−グリカンの１残基以外の全てが観察される。Ｇａｌ（１，３）ＧａｌＮＡｃ分枝に（２，３）連結したＮｅｕＮＡｃ（図１Ａ、挿入図）の電子密度は検出されなかったが、この残基は結合のために必要とされるようには見えない（Ｌａｐｐａｎｅｎ他、１９９９）。
【００８４】
Ｐ−ＬＥ／ＳＧＰ−３複合体の２つの異なる見解は、結合相互作用の構造的概観を提供し、これから、生理的Ｐ−セレクチン／ＰＳＧＬ−１相互作用の態様が推測できる。ＳＧＰ−３はＰ−ＬＥレクチンドメインへ１：１化学量論で結合し、大きいエピトープは溶媒から１６４１Åを排除し、Ｐ−ＬＥ／ＳＬｅＸ複合体について記載されたＳＬｅＸ結合部位を含む。ＳＧＰ−３は転移ＮＯＥ研究（Ｄ． Ｔｓａｏ、未発表の観察）により決定されるように溶液中で乱れ、おそらく延びているという事実にもかかわらず、結合コンホメーションは、ヘアピン様構造を生成する内部折りたたみによって凝縮される。これらの結果は、それぞれが結合相互作用の異なる成分を供給するＰＳＧＬ−１ホモ二量体の異なるアームが、同時に単一のＰ−セレクチンレクチンドメインに結合するかもしれない可能性を排除しないが、ＰＳＧＬ−１の単一のアームが完全な結合決定基セットを提供できることを示唆する。さらに、このタイプの結合相互作用は、ＰＳＧＬ−１ホモ二量体の個々のモノマーが２つの異なるＰ−セレクチン分子へ同時に結合するであろう可能性を許す。２つの平行する結合相互作用の同時局在化（ｃｏ−ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ）は、ＰＳＧＬ−１の二量体化突然変異体が剪断の影響下で細胞結合を支援できないという観察（Ｓｎａｐｐ他、１９９８）の点から見て、Ｐ−セレクチン機能の生理的要求かもしれない。また、Ｐ−ＬＥ／ＳＬｅＸ複合体の試験からすぐに明らかなのは、ＳＧＰ−３の結合が、レクチンドメイン：ＥＧＦドメイン界面と本質的に反対のＰ−ＬＥの面で生じることである。これは、Ｐ−セレクチンのＥＧＦドメインが、ＰＳＧＬ−１、少なくとも分子のＮ末端部分への直接結合に関与しないという直接的な証拠を提供するが、Ｐ−セレクチン機能において間接的な役割を有することができる（以下を参照）。
【００８５】
カルシウムがストロンチウムで置換されるという事実にもかかわらず、ＳＬｅＸとＰ−ＬＥの複合体で見られる相互作用はＰ−ＬＥ／ＳＬｅＸ構造中に再現され、この金属がカルシウムを有効に置換できる（Ａｓａ他、１９９２）という以前の観察と一致する。複合体中にはＰ−ＬＥの大きい構造的再配置があり、これは金属イオンの配位に変化を引き起こす。Ｐ−ＬＥ／ＳＬｅＸ複合体において、Ｆｕｃの２−ヒドロキシルは、Ｇｌｕ−１０７と弱い水素結合（３．４Åの距離）を作る。これはＰ−ＬＥ／ＳＧＰ−３複合体には存在しないが、Ｇｌｕ−８８との水素結合に入れ替わり、これはそれ自身もまた結合ストロンチウムに配位する。Ｐ−ＬＥの構造では、Ａｓｎ−８３の側鎖は結合カルシウムに近接するが配位せず、ＳＬｅＸのＥ−ＬＥ結合では、ＳＬｅＸの結合は、それを金属イオンおよびＦｕｃヒドロキシルと相互作用させる。Ｐ−ＬＥ／ＳＧＰ−３複合体では、この残基の位置はＧｌｕ−８８の側鎖に入れ替わっていた。この点で、金属の連結反応は、今、オリゴマンノースと複合体形成されたＭＢＰ（Ｗｅｉｓ他、１９９２）およびＳＬｅＸと複合体形成されたＭＢＰのＫ３突然変異体（ＮｇおよびＷｅｉｓ、１９９７）を厳密に模倣し、ここで対応する残基Ｇｌｕ−１９３はカルシウムに連結することが観察される。
【００８６】
ＳＧＰ−３ポリペプチドとＰ−ＬＥの間の相互作用は、疎水性および静電的接触の組み合わせである。タンパク質と接触するＳＧＰ−３ペプチドの最もＮ−末端の残基はＴｙｓ−７であり、この後に、伸びたコンホメーションで３つの残基が続く。残基Ｔｙｓ−１０からＬｅｕ−１３は湾曲部を形成してペプチドの方向を変化させ、残りの残基は伸びたコンホメーションでＰｒｏ−１８まで達する。Ｔｙｓ−７の硫酸塩は、Ｓｅｒ−４６およびＳｅｒ−４７の側鎖ヒドロキシル基、主鎖アミド窒素と、順序付けられた水分子によって一連の水素結合を形成する。さらに、Ｐ−ＬＥのＨｉｓ−１１４は残りの硫酸塩酸素へ水素結合を提供し、水素結合ネットワークを完成する。また、Ｔｙｓ−７は、Ｌｙｓ−１１２のアミド窒素との主鎖−主鎖の水素結合、ならびにＳｅｒ−４７およびＬｙｓ−１１３の側鎖とのいくつかの疎水性相互作用を形成する。ＳＧＰ−３残基Ｌｅｕ−８はＬｅｕ−１３に対して集まり、これらは両方とも、Ｈｉｓ−１０８およびＬｙｓ−１１１の側鎖により形成されるタンパク質の疎水性表面に対して集められる。これらの相互作用は、ペプチドの緻密な三次構造を安定化するのを助けるに違いない。Ｔｙｓ−１０側鎖の芳香環はこれらの２つのロイシン残基に寄りかかり、Ａｒｇ−８５、およびＴｈｒ−１６の主鎖アミドと水素結合できる位置に硫酸塩を配置する。Ａｒｇ−８５とＳＧＰ−３ポリペプチドの間の相互作用は、Ｐ−ＬＥの大きい構造再配置（以下を参照）によって可能にされ、Ｐ−セレクチン内のこの残基を標的とする以前の部位特異的な突然変異生成の研究（Ｂａｊｏｒａｔｈ他、１９９４）の結論を支持する。Ａｌａへ突然変異される場合、Ｐ−セレクチン突然変異体は、低い親和性（おそらく独占的に、ＳＬｅＸ−媒介される）結合がなお保持されたＰＳＧＬ−１発現細胞への高い親和性結合を失う。同様に、すぐ近くの残基７６〜８３へそのエピトープがマッピングされる抗体は、ＳＬｅＸではなくＰＳＧＬ−１への結合を廃止すると示された（Ｈｉｒｏｓｅ他、１９９８）。このＰ−ＬＥ／ＳＧＰ−３複合体では、ＳＧＰ−３のＰｈｅ−１２の側鎖はタンパク質と接触しないが、非結晶学的に対称の関係にある他の複合体コピー中のそれ自身へ集まる。おそらく、溶液中では、側鎖Ｌｅｕ−１１０により形成された疎水性表面に寄りかかるであろうと思われる。ただひとつ残った相互作用は、ＳＧＰ−３のＰｒｏ−１４とともに見られ、これは、Ｈｉｓ−１０８に対して集まり、Ａｒｇ−８５から水素結合を受け取る。
【００８７】
非連結Ｐ−ＬＥおよびＰ−ＬＥ／ＳＬｅＸ複合体の両方と比較して、ＳＧＰ−３結合に関連するＰ−ＬＥのコンホメーションにはいくつかの目覚しい変化がある。最も顕著なコンホメーション変化は、Ａｓｎ−８３からＡｓｐ−８９までの残基のループの移動であり、Ａｒｇ−８５をＳＧＰ−３のＴｙｓ−１０と接触させ、Ｇｌｕ−８８を結合金属と連結する位置へ動かす。この移動は、次に、Ａｓｎ−８３からＡｓｐ−８９ループにより空けられた空間を占めるように移動する残基Ａｒｇ−５４からＧｌｕ−７４の位置に影響すると思われる。複合体形成されていないＰ−ＬＥでは、Ｔｈｒ−６５はＴｒｐ−１の側鎖に対して集まり、それを溶媒から排除する。Ｐ−ＬＥ／ＳＧＰ−３複合体について観察されたループの移動は、溶媒へのＴｒｐ−１へさらされることが期待されるだろうが、この残基は、レクチンドメインのＴｙｒ−１１８と、ＥＧＦドメインのＧｌｕ−１３５との間に集まるように再配置する。Ｔｒｐ−１の移動とともに、レクチンドメインに対するＥＧＦドメインの５２度の移動が存在し、Ｔｒｐ−１側鎖の移動により形成した空所はＭＰＤ分子によって満たされ、これは側鎖の新しい位置へ集まる。これにより、ＥＧＦドメインの移動が結晶化のために使用される高濃度のＭＰＤによって引き起こされるのか、あるいはＳＧＰ−３の結合によるものなのかに関しての疑問が提起される。ＥＧＦドメインは、ＰＳＧＬ−１、少なくとも分子のＮ−末端領域への結合において直接的な役割を果たすようには見えないが、レクチンドメインに対するその関係の変化は、ＥＧＦドメインがリガンド認識を調節できる（Ｇｉｂｓｏｎ他、１９９５、Ｋａｎｓａｓ他、１９９４）という観察を考慮して、興味深い観察である。
【００８８】
あるいは、これらの研究は、ＥＧＦおよびＣＲドメインならびにここで評価される結合部位へのＰＳＧＬ−１Ｃ−末端の他の領域の間の第２の結合相互作用を示すことができる。更なる構造研究は、レクチンおよびＥＧＦドメインの間の潜在的相互作用をさらに探求することを保証される。Ｔｈｒ−１６におけるＯ−グリカンの近くのＴｙｓ−１０の配置をもたらすＳＧＰ−３ポリペプチドの内部折りたたみは、ＰＳＧＬ−１の直線的配列内の硫酸チロシンに対するＳＬｅＸ修飾グリカンの関係が最少数の介在残基より上では絶対的でないだろうことを示唆する。Ｐ−セレクチンは、ＰＳＧＬ−１Ｎ−末端の多数の結合コンホメーションを支持することができ、そのうちの１つだけがこの研究で示される。Ｐ−ＬＥ／ＳＧＰ−３構造は、ＰＳＧＬ−１のＴｙｓ−７およびＴｙｓ−１０（Ｔｙｓ−５ではない）が結合に不可欠であることを示唆し、Ｐ−セレクチン媒介ローリングにおけるこれらの特異性硫酸チロシン残基のための優先的な役割を示す突然変異生成研究と一致する結果である。しかしながら、ＰＳＧＬ−１Ｎ−末端の柔軟性は、硫酸チロシン、例えばＴｙｓ−５およびＴｙｓ−７またはＴｙｓ−５およびＴｙｓ−１０の異なる順列がＰ−セレクチン内の塩基性残基へ異なる登録で結合することを可能にするかもしれない。この仮定は、三硫酸化ＳＧＰ−３に対するＰ−ＬＥの親和性が、どうして二硫酸化ＳＧＰ−２に対する親和性よりも大きいかを説明できる。この観察を説明するＰ−セレクチン内にさらに第３の未定義の硫酸チロシン結合部位が存在することが可能であるが、ＰＳＧＬ−１ポリペプチドの柔軟性は３つの硫酸チロシン残基のどれもが本明細書に定義される２つの部位へ結合できるようにしてもよい。これは、単一の硫酸チロシン残基（Ｔｙｓ−５を含む）を含むＰＳＧＬ−１の突然変異が、どうしてＰ−セレクチン結合を支援できる（Ｒａｍａｃｈａｎｄｒａｎ他、１９９９）のかを説明することができる。また、結合におけるこの潜在的な柔軟性を支援するのは、マウスＰＳＧＬ−１の対応するＮ−末端領域もＰ−セレクチンへの結合にとって重要であり、さらに、２つの潜在的な硫酸チロシンを含み、Ｔｈｒ−１６に対応する潜在的グリコシル化部位から２つだけおよび４つの残基が除去されるという観察である。マウスＰ−セレクチンはまた、位置８５および１１４に塩基性残基を含み、ヒトのＰ−ＬＥ／ＳＧＰ−３相互作用についての本明細書での観察に基づいて、マウスＰＳＧＬ−１内で硫酸チロシンとの同様のイオン性相互作用を起こすことが予想されるであろう。この相互作用の結果は、硫酸チロシンおよびＳＬｅＸ結合部位にわたる介在残基を少なくするであろう。同様に、ＰＳＧＬ−１のＮ−末端領域の柔軟性は、Ｔｈｒ−１６へ付着した他のＯ−グリカン構造の認識も可能にするであろう。骨髄ＰＳＧＬ−１およびＰ−セレクチンについて記載された、より長いポリ−Ｎ−アセチルラクトサミンＯ−グリカン内のＳＬｅＸおよびＬｅＸエピトープは、同様にしてこれを受け入れ得る。
【００８９】
結言
本明細書中に示された、ＳＬｅＸと複合体形成されたＰ−ＬＥおよびＥ−ＬＥ、ならびにＰＳＧＬ−１スルホグリコペプチドと複合体形成されたＰ−ＬＥの結晶構造は、セレクチン認識の分子基礎についての発明者らの理解へ大きく貢献した。ＳＬｅＸと複合体形成されたＰ−ＬＥおよびＥ−ＬＥの構造は、共通および異なる結合相互作用の両方を示し、この共有リガンドに対するその差別的な親和性を説明する。Ｐ−ＬＥ／ＳＧＰ−３複合体の構造は、特に、Ｅ−およびＰ−セレクチンによる差別的なＰＳＧＬ−１認識がどのようにして達成されるかを説明する。Ｅ−およびＰ−セレクチンのレクチンドメインの主要な配列は５０％以上同一であるが、Ｐ−ＬＥ／ＳＧＰ−３相互作用にとって重要な残基はＰ−セレクチンに特有のものであり、おそらく、Ｐ−セレクチン／ＰＳＧＬ−１相互作用の高い親和性を説明する。ＳＧＰ−３内の硫酸チオシン残基とのイオン性相互作用にとって重要な残基Ａｒｇ−８５およびＨｉｓ−１１４は、Ｐ−セレクチンに特有である（ヒトのＥ−セレクチン中の対応する残基は、それぞれ未帯電のＧｌｎおよびＬｅｕである）。興味深いことに、これらの位置における差別的な電荷のこの傾向は、マウス、ラット、ウサギおよび牛のＰ−セレクチンおよびＥ−セレクチンで観察され、ＰＳＧＬ−１とのＰ−セレクチンの相互作用のための保存された結合のモチーフを示唆する。ここで行われた構造観察は、Ｌ−セレクチン／ＰＳＧＬ−１相互作用の本質へも可能な洞察を提供する。Ｌ−セレクチンも、Ｍａｂ中和（Ｋａｎｓａｓ、１９９６）および突然変異生成（Ｒａｍａｃｈａｎｄｒａｎ他、１９９９）の研究に基づいて、ＰＳＧＬ−１のＮ−末端領域を認識すると思われる。この相互作用の親和性はまだ決定されていないが、Ｐ−セレクチンおよびＥ−セレクチンのＰＳＧＬ−１との相互作用に関連して、中間の親和性を有するであろうと予想される。これは、相同性の高いＬ−セレクチンレクチンドメインはＥ−およびＰ−セレクチンについて決定されたのと同様のコンホメーションを採用し、ＰＳＧＬ−１Ｎ−末端の認識はＰ−セレクチンのそれと特性を共有するという仮定の上に断定される。Ｐ−セレクチンと同様に、ヒトのＬ−セレクチンは位置８５に塩基性残基（Ｌｙｓ残基）を含有し、ＰＳＧＬ−１Ｎ−末端内で硫酸化Ｔｙｒと本質的なイオン性相互作用を起こすと予想される。しかしながら、Ｌ−セレクチンは、位置１１４に、ＰＳＧＬ−１内で硫酸チロシンと第２のイオン性相互作用、したがってＰ−セレクチンにおそらく匹敵する結合親和性を支援できる塩基性残基を含有しない。
【００９０】
水素結合ネットワークおよび選択されたイオン性相互作用に大きく基づいて、ここに示されるＳＬｅＸおよびＰＳＧＬ−１スルホグリコペプチドとのＥ−およびＰ−セレクチンの相互作用は、この種の細胞接着分子について説明された結合親和性および速い結合速度論の基礎である。比較的低い親和性のセレクチン／カウンタレセプターの相互作用の急速な可逆性は、白血球のその後の活性化、強固な接着および組織への血管外遊走に必須である白血球の付着およびローリングを生成する。炎症の状況では、ＰＳＧＬ−１は、セレクチン媒介プロセスにおいて、炎症反応の増幅にとっておそらく重要な好中球−好中球、および好中球−血小板の相互作用を促進するとともに、血管内皮への好中球の初期付着を媒介する、中心的役割を果たすと思われる。Ｅ−およびＰ−セレクチン／ＳＬｅＸならびにＰ−セレクチン／ＰＳＧＬ−１相互作用が証明される炎症条件の処置のための小分子拮抗物質の理論的設計は、本明細書中に提供される構造情報によってかなり支援されるであろう。
【００９１】
【表１】
2004509069.tif 000002
【００９２】
【表２】
［Ｅ−セレクチンＳＬＥＸ４Å接触］
ＴＹＲ４８，ＧＬＵ８０，ＡＳＮ８２，ＡＳＮ８３，ＧＬＵ９２，ＴＹＲ９４，ＡＲＧ９７，ＧＬＵ９８，ＡＳＮ１０５，ＡＳＰ１０６，ＧＬＵ１０７，結合カルシウム
［Ｅ−セレクチンＳＬＥＸ８Å接触］
ＴＹＲ４４，ＳＥＲ４５，ＰＲＯ４６，ＳＥＲ４７，ＴＹＲ４８，ＡＬＡ７７，ＰＲＯ７８，ＧＬＹ７９，ＧＬＵ８０，ＰＲＯ８１，ＡＳＮ８２，ＡＳＮ８３，ＧＬＵ８８，ＣＹＳ９０，ＧＬＵ９２，ＴＹＲ９４，ＡＲＧ９７，ＧＬＵ９８，ＬＹＳ９９，ＡＳＰ１００，ＴＲＰ１０４，ＡＳＮ１０５，ＡＳＰ１０６，ＧＬＵ１０７，ＡＲＧ１０８，ＬＹＳ１１１，ＬＹＳ１１３，結合カルシウム
［Ｐ−セレクチンＳＬＥＸ４Å接触］
ＴＹＲ４８，ＧＬＵ８０，ＡＳＮ８２，ＧＬＵ９２，ＴＹＲ９４，ＰＲＯ９８，ＳＥＲ９９，ＡＳＮ１０５，ＡＳＰ１０６，ＧＬＵ１０７，結合カルシウム
［Ｐ−セレクチンＳＬＥＸ８Å接触］
ＴＹＲ４４，ＳＥＲ４６，ＳＥＲ４７，ＴＹＲ４８，ＡＬＡ７７，ＡＳＰ７８，ＡＳＮ７９，ＧＬＵ８０，ＰＲＯ８１，ＡＳＮ８２，ＡＳＮ８３，ＡＲＧ８５，ＧＬＵ８８，ＣＹＳ９０，ＧＬＵ９２，ＩＬＥ９３，ＴＹＲ９４，ＬＹＳ９６，ＳＥＲ９７，ＰＲＯ９８，ＳＥＲ９９，ＡＬＡ１００，ＴＲＰ１０４，ＡＳＮ１０５，ＡＳＰ１０６，ＧＬＵ１０７，ＨＩＳ１０８，ＬＹＳ１１１，ＬＹＳ１１３，結合カルシウム
［Ｐ−セレクチンＰＳＧＬ−１４Å接触］
ＡＬＡ９，ＴＹＲ４５，ＳＥＲ４６，ＳＥＲ４７，ＴＹＲ４８，ＧＬＵ８０，ＡＳＮ８２，ＬＹＳ８４，ＡＲＧ８５，ＧＬＵ８８，ＧＬＵ９２，ＴＹＲ９４，ＰＲＯ９８，ＳＥＲ９９，ＡＳＮ１０５，ＡＳＰ１０６，ＧＬＵ１０７，ＨＩＳ１０８，ＬＥＵ１１０，ＬＹＳ１１１，ＬＹＳ１１２，ＬＹＳ１１３，ＨＩＳ１１４，結合ストロンチウム
［Ｐ−セレクチンＰＳＧＬ−１８Å接触］
ＳＥＲ６，ＴＨＲ７，ＬＹＳ８，ＡＬＡ９，ＴＹＲ１０，ＳＥＲ１１，ＴＹＲ４４，ＴＹＲ４５，ＳＥＲ４６，ＳＥＲ４７，ＴＹＲ４８，ＴＹＲ４９，ＴＲＰ５０，ＡＬＡ７７，ＡＳＰ７８，ＡＳＮ７９，ＧＬＵ８０，ＰＲＯ８１，ＡＳＮ８２，ＡＳＮ８３，ＬＹＳ８４，ＡＲＧ８５，ＡＳＮ８６，ＡＳＮ８７，ＧＬＵ８８，ＣＹＳ９０，ＧＬＵ９２，ＩＬＥ９３，ＴＹＲ９４，ＩＬＥ９５，ＬＹＳ９６，ＳＥＲ９７，ＰＲＯ９８，ＳＥＲ９９，ＡＬＡ１００，ＴＲＰ１０４，ＡＳＮ１０５，ＡＳＰ１０６，ＧＬＵ１０７，ＨＩＳ１０８，ＣＹＳ１０９，ＬＥＵ１１０，ＬＹＳ１１１，ＬＹＳ１１２，ＬＹＳ１１３，ＨＩＳ１１４，結合ストロンチウム
【００９３】
［参考文献］
（１） Ａｌｏｎ， Ｒ．、Ｃｈｅｎ， Ｓ．、Ｐｕｒｉ， Ｋ． Ｄ．、Ｆｉｎｇｅｒ， Ｅ． Ｂ．およびＳｐｒｉｎｇｅｒ， Ｔ． Ａ． （１９９７）。Ｌ−セレクチン係留（ｔｅｔｈｅｒｓ）の速度論およびセレクチン媒介ローリングの力学。Ｊ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． １３８， １１６９−１１８０。
（２）Ａｌｏｎ，Ｒ．、Ｈａｍｍｅｒ， Ｄ． Ａ．およびＳｐｒｉｎｇｅｒ， Ｔ． Ａ． （１９９５）。Ｐ−セレクチン−炭水化物結合の寿命および流体力学的流れの張力に対するその応答。Ｎａｔｕｒｅ ３７４， ５３９−５４２。
（３）Ａｓａ， Ｄ．、Ｇａｎｔ， Ｔ．、Ｏｄａ， Ｙ．およびＢｒａｎｄｌｅｙ， Ｂ． Ｋ． （１９９２）。セレクチン上の２種類の炭水化物結合部位の証拠。Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ ２， ３９５−３９９．
（４）Ｂａｊｏｒａｔｈ， Ｊ．、Ｈｏｌｌｅｎｂａｕｇｈ， Ｄ．、Ｋｉｎｇ， Ｇ．、Ｈａｒｔｅ， Ｗ．、Ｅｕｓｔｉｃｅ， Ｄ． Ｃ．、Ｄａｒｖｅａｕ， Ｒ． Ｐ．およびＡｒｕｆｆｏ， Ａ． （１９９４）。骨髄細胞およびスルファチドのためのＣＤ６２／Ｐ−セレクチン結合部位のオーバーラッピング。Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３３， １３３２−１３３９。
（５）Ｂａｕｍｈｅｕｔｅｒ， Ｓ．、Ｓｉｎｇｅｒ， Ｍ． Ｓ．、Ｈｅｎｚｅｌ，Ｗ．、Ｈｅｍｍｅｒｉｃｈ， Ｓ．、Ｒｅｎｚ， Ｍ．、Ｒｏｓｅｎ， Ｓ． Ｄ．およびＬａｓｋｙ， Ｌ． Ａ． （１９９３）。血管シアロムチンＣＤ３４へのＬ−セレクチンの結合。Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６２， ４３６−４３８。
（６）Ｂｅｒｇ， Ｅ． Ｌ．、ＭｃＥｖｏｙ， Ｌ． Ｍ．、 Ｂｅｒｌｉｎ， Ｃ．、Ｂａｒｇａｔｚｅ， Ｒ． Ｆ．およびＢｕｔｃｈｅｒ， Ｅ． Ｃ． （１９９３）。ＭＡｄＣＡＭ−１上のＬ−セレクチン媒介リンパ球ローリング。Ｎａｔｕｒｅ ３６６， ６９５−６９８。
（７）Ｂｒｉｃｏｇｎｅ， Ｇ． （１９９３）。エントロピー極大化および見込み順位による直接位相決定；状態報告および展望。Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ． Ｄ４９， ３７−６０。
（８）Ｂｒｕｎｇｅｒ， Ａ． Ｔ．、Ａｄａｍｓ， Ｐ． Ｄ．、Ｃｌｏｒｅ， Ｇ． Ｍ．、ＤｅＬａｎｏ， Ｗ． Ｌ．、Ｇｒｏｓ， Ｐ．、Ｇｒｏｓｓｅ−Ｋｕｎｓｔｌｅｖｅ， Ｒ． Ｗ．、Ｊｉａｎｇ， Ｊ． Ｓ．、Ｋｕｓｚｅｗｓｋｉ， Ｊ．、Ｎｉｌｇｅｓ， Ｍ．、Ｐａｎｎｕ， Ｎ． Ｓ．、Ｒｅａｄ， Ｒ． Ｊ．、Ｒｉｃｅ， Ｌ． Ｍ．、Ｓｉｍｏｎｓｏｎ， Ｔ．および Ｗａｒｒｅｎ， Ｇ． Ｌ． （１９９８）。結晶学およびＮＭＲシステム：巨大分子構造決定に適した新しいソフトウェア。Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ． Ｄ５４， ９０５−９２１。
（９）ＣＣＰ４ （１９９４）。ＣＣＰ−４組（ｓｕｉｔｅ）：Ｘ線結晶学のためのプログラム。Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ． Ｄ５０， ７６０−７６３。
（１０）Ｃｈｅｎ， Ｓ．、Ａｌｏｎ， Ｒ．、Ｆｕｈｌｂｒｉｇｇｅ， Ｒ． Ｃ．およびＳｐｒｉｎｇｅｒ， Ｔ． Ａ． （１９９７）。抗体上の白血球のローリングおよび過渡的な係留はセレクチンの特定化を示す。Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９４， ３１７２−３１７７。
（１１）Ｃｒｏｃｅ， Ｋ．、Ｆｒｅｅｄｍａｎ， Ｓ． Ｊ．、Ｆｕｒｉｅ， Ｂ． Ｃ．およびＦｕｒｉｅ， Ｂ． （１９９８）。可溶性Ｐ−セレクチンと可溶性Ｐ−セレクチン糖タンパク質リガンド１の間の相互作用：平衡結合分析。Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３７， １６４７２−１６４８０。
（１２）ｄｅ ｌａ Ｆｏｕｒｔｅｌｌｅ， Ｅ．およびＢｒｉｃｏｇｎｅ， Ｇ． （１９９７）。多重同形置換および多波長異常回折法のための最大見込み重原子パラメータ精密化。Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． ２７６， ４７２−４９４。
（１３）Ｄｒｉｃｋａｍｅｒ， Ｋ． （１９８８）。アニマルレクチン中の２つの別個の種類の炭水化物認識ドメイン。Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６３， ９５５７−９５６０。
（１４）Ｅｒｂｅ， Ｄ． Ｖ．、Ｗａｔｓｏｎ， Ｓ． Ｒ．、Ｐｒｅｓｔａ， Ｌ． Ｇ．、Ｗｏｌｉｔｚｋｙ， Ｂ． Ａ．、Ｆｏｘａｌｌ， Ｃ．、Ｂｒａｎｄｌｅｙ， Ｂ． Ｋ．およびＬａｓｋｙ， Ｌ． Ａ． （１９９３）。Ｐ−およびＥ−セレクチンは炭水化物リガンド認識および細胞接着のために共通の部位を使用する。Ｊ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． １２０， １２２７−１２３５。
（１５）Ｅｒｂｅ， Ｄ． Ｖ．、 Ｗｏｌｉｔｚｋｙ， Ｂ． Ａ．、 Ｐｒｅｓｔａ， Ｌ． Ｇ．、 Ｎｏｒｔｏｎ， Ｃ． Ｒ．、 Ｒａｍｏｓ， Ｒ． Ｊ．、 Ｂｕｒｎｓ， Ｄ． Ｋ．、 Ｒｕｍｂｅｒｇｅｒ， Ｊ． Ｍ．、 Ｒａｏ， Ｂ． Ｎ．、 Ｆｏｘａｌｌ， Ｃ．、 Ｂｒａｎｄｌｅｙ， Ｂ． Ｋ．およびＬａｓｋｙ， Ｌ． Ａ． （１９９２）。炭水化物認識および細胞接着に重要なＥ−セレクチン領域の同定。Ｊ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． １１９， ２１５−２２７。
（１６）Ｆｏｘａｌｌ， Ｃ．、Ｗａｔｓｏｎ， Ｓ． Ｒ．、Ｄｏｗｂｅｎｋｏ， Ｄ．、Ｆｅｎｎｉｅ， Ｃ．、Ｌａｓｋｙ， Ｌ． Ａ．、Ｋｉｓｏ， Ｍ．、Ｈａｓｅｇａｗａ， Ａ．、Ａｓａ， Ｄ．およびＢｒａｎｄｌｅｙ， Ｂ． Ｋ． （１９９２）。セレクチンレセプタファミリーの３つのメンバーは共通の炭水化物エピトープ、シアリルルイスＸオリゴ糖を認識する。Ｊ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． １１７， ８９５−９０２。
（１７）Ｇｉｂｓｏｎ， Ｒ． Ｍ．、Ｋａｎｓａｓ， Ｇ． Ｓ．、Ｔｅｄｄｅｒ， Ｔ． Ｆ．、Ｆｕｒｉｅ， Ｂ．およびＦｕｒｉｅ， Ｂ． Ｃ． （１９９５）。生理的な密度のＰ−セレクチンのレクチンおよび上皮成長因子ドメインは、白血球結合のための認識単位である。Ｂｌｏｏｄ ８５， １５１−１５８。
（１８）Ｇｏｅｔｚ， Ｄ． Ｊ．、Ｇｒｅｉｆ， Ｄ． Ｍ．、Ｄｉｎｇ， Ｈ．、Ｃａｍｐｈａｕｓｅｎ， Ｒ． Ｔ．、Ｈｏｗｅｓ， Ｓ．、Ｃｏｍｅｓｓ， Ｋ． Ｍ．、Ｓｎａｐｐ， Ｋ． Ｒ．、Ｋａｎｓａｓ， Ｇ． Ｓ．およびＬｕｓｃｉｎｓｋａｓ， Ｆ． Ｗ， （１９９７）。単離Ｐ−セレクチン糖タンパク質リガンド−１のＰ−およびＥ−セレクチンへの動的接着。Ｊ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． １３７， ５０９−５１９。
（１９）Ｇｒａｖｅｓ， Ｂ． Ｊ．、Ｃｒｏｗｔｈｅｒ， Ｒ． Ｌ．、Ｃｈａｎｄｒａｎ， Ｃ．、Ｒｕｍｂｅｒｇｅｒ， Ｊ． Ｍ．、Ｌｉ， Ｓ．、Ｈｕａｎｇ， Ｋ． Ｓ．、Ｐｒｅｓｋｙ， Ｄ． Ｈ．、Ｆａｍｉｌｌｅｔｔｉ， Ｐ． Ｃ．、Ｗｏｌｉｔｚｋｙ， Ｂ． Ａ．およびＢｕｒｎｓ， Ｄ． Ｋ． （１９９４）。ｌｅｃ／ＥＧＦドメインの結晶構造および突然変異生成からのＥ−セレクチン／リガンド相互作用への洞察。Ｎａｔｕｒｅ ３６７， ５３２−５３８。
（２０）Ｈｉｒｏｓｅ， Ｍ．、Ｋａｗａｓｈｉｍａ， Ｈ．およびＭｉｙａｓａｋａ， Ｍ． （１９９８）。Ｐ−セレクチンのＰ−セレクチン糖タンパク質リガンド−１への結合を支援するが、シアリルルイスＸオリゴ糖への結合は支援しないＰ−セレクチン上の機能的エピトープ。Ｉｎｔ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １０， ６３９−６４９。
（２１）Ｈｏｌｌｅｎｂａｕｇｈ， Ｄ．、 Ｂａｊｏｒａｔｈ， Ｊ．、Ｓｔｅｎｋａｍｐ， Ｒ．およびＡｒｕｆｆｏ， Ａ． （１９９３）。Ｐ−セレクチン（ＣＤ６２）およびその細胞リガンドの相互作用：重要な残基の分析。Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３２， ２９６０−２９６６。
（２２）Ｈｏｎｉｇ， Ｂ．およびＮｉｃｈｏｌｌｓ， Ａ． （１９９５）。生物学および化学における古典的静電学。Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６８， １１４４−１１４９。
（２３）Ｋａｎｓａｓ， Ｇ． Ｓ． （１９９６）。セレクチンおよびそのリガンド：現在の概念および議論。Ｂｌｏｏｄ ８８， ３２５９−３２８７。
（２４）Ｋａｎｓａｓ， Ｇ． Ｓ．、Ｓａｕｎｄｅｒｓ， Ｋ． Ｂ．、Ｌｅｙ， Ｋ．、Ｚａｋｒｚｅｗｉｃｚ， Ａ．、Ｇｉｂｓｏｎ， Ｒ． Ｍ．、Ｆｕｒｉｅ， Ｂ． Ｃ．、Ｆｕｒｉｅ， Ｂ．およびＴｅｄｄｅｒ， Ｔ． Ｆ． （１９９４）。リガンド認識および細胞接着におけるＰ−セレクチンの上皮成長因子様ドメインの役割。Ｊ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． １２４， ６０９−６１８。
（２５）Ｋｏｇａｎ， Ｔ． Ｐ．、Ｒｅｖｅｌｌｅ， Ｂ． Ｍ．、Ｔａｐｐ， Ｓ．、Ｓｃｏｔｔ， Ｄ．およびＢｅｃｋ， Ｐ． Ｊ． （１９９５）。単一のアミノ酸残基はＥ−セレクチンのリガンド特異性を決定できる。Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７０， １４０４７−１４０５５。
（２６）Ｋｒａｕｌｉｓ， Ｐ． Ｊ． （１９９１）。ＭＯＬＳＣＲＩＰＴ：タンパク質構造の詳細および概略の両方のプロットを生成するためのプログラム。Ｊ． Ａｐｐｌ． Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ． ２４， ９４６−９５０。
（２７）Ｋｕｍａｒ， Ｒ．、Ｃａｍｐｈａｕｓｅｎ， Ｒ． Ｔ．、Ｓｕｌｌｉｖａｎ， Ｆ． Ｘ．およびＣｕｍｍｉｎｇ， Ｄ． Ａ． （１９９６）。コア２ ｂ−１，６−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ酵素活性は、Ｐ−セレクチンへ結合するＰ−セレクチン糖タンパク質リガンド−１のために重要である。Ｂｌｏｏｄ ８８， ３８７２−３８７９。
（２８）Ｌａｓｋｙ， Ｌ． Ａ．、Ｓｉｎｇｅｒ， Ｍ． Ｓ．、Ｄｏｗｂｅｎｋｏ， Ｄ．、Ｉｍａｉ， Ｙ．、Ｈｅｎｚｅｌ， Ｗ． Ｊ．、Ｇｒｉｍｌｅｙ， Ｃ．、Ｆｅｎｎｉｅ， Ｃ．、Ｇｉｌｌｅｔｔ， Ｎ．、Ｗａｔｓｏｎ， Ｓ． Ｒ．および Ｒｏｓｅｎ， Ｓ． Ｄ． （１９９２）。Ｌ−セレクチンのための内皮リガンドは、新規なムチン様分子である。Ｃｅｌｌ ６９， ９２７−９３８。
（２９）ＬａＶａｌｌｉｅ， Ｅ． Ｒ．、Ｒｅｈｅｍｔｕｌｌａ， Ａ．、Ｒａｃｉｅ， Ｌ． Ａ．、ＤｉＢｌａｓｉｏ， Ｅ． Ａ．、Ｆｅｒｅｎｚ， Ｃ．、Ｇｒａｎｔ， Ｋ． Ｌ．、Ｌｉｇｈｔ， Ａ．およびＭｃＣｏｙ， Ｊ． Ｍ． （１９９３）。ウシのエンテロキナーゼの触媒サブユニットをコード化するｃＤＮＡのクローニングおよび機能的発現。Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６８， ２３３１１−２３３１７。
（３０）Ｌｅｐｐａｎｅｎ， Ａ．、Ｍｅｈｔａ， Ｐ．、Ｏｕｙａｎｇ， Ｙ． Ｂ．、Ｊｕ， Ｔ．、Ｈｅｌｉｎ， Ｊ．、Ｍｏｏｒｅ， Ｋ． Ｌ．、ｖａｎ Ｄｉｅ， Ｉ．、Ｃａｎｆｉｅｌｄ， Ｗ． Ｍ．、ＭｃＥｖｅｒ， Ｒ． Ｐ．およびＣｕｍｍｉｎｇｓ， Ｒ． Ｄ． （１９９９）。新規なグリコスルホペプチドはＰ−セレクチンへ結合し、白血球のＰ−セレクチンへの接着を阻害する。Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７４， ２４８３８−２４８４８。
（３１）Ｌｅｖｉｎｏｖｉｔｚ， Ａ．、Ｍｕｈｌｈｏｆｆ， Ｊ．、Ｉｓｅｎｍａｎｎ， Ｓ．および Ｖｅｓｔｗｅｂｅｒ， Ｄ． （１９９３）。マウス骨髄細胞上のＥ−セレクチンのための糖タンパク質リガンドの同定。Ｊ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． １２１， ４４９−４５９。
（３２）Ｌｉ， Ｆ．、Ｗｉｌｋｉｎｓ， Ｐ． Ｐ．、Ｃｒａｗｌｅｙ， Ｓ．、Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ， Ｊ．、Ｃｕｍｍｉｎｇｓ， Ｒ． Ｄ．およびＭｃＥｖｅｒ， Ｒ． Ｐ． （１９９６）。Ｐ−およびＥ−セレクチンへの結合に必要とされる組み換えＰ−セレクチン糖タンパク質リガンド−１の翻訳後修飾。Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７１， ３２５５−３２６４。
（３３）ＭｃＥｖｅｒ， Ｒ． Ｐ．およびＣｕｍｍｉｎｇｓ， Ｒ． Ｄ． （１９９７）。白血球の補充におけるセレクチンへのＰＳＧＬ−１結合の役割。Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． １００， Ｓ９７−１０３。
（３４）Ｍｅｈｔａ， Ｐ．、Ｃｕｍｍｉｎｇｓ， Ｒ． Ｄ．およびＭｃＥｖｅｒ， Ｒ． Ｐ． （１９９８）。Ｐ−セレクチン糖タンパク質リガンド−１へのＰ−セレクチン結合の親和性および速度の分析。Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７３， ３２５０６−３２５１３。
（３５）Ｍｅｒｒｉｔ， Ｅ． Ａ．およびＭｕｒｐｈｙ， Ｍ． Ｅ． Ｐ． （１９９４）。ラスタ３Ｄバージョン２．０：写真のような分子グラフィックスのためのプログラム。Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ． Ｄ５０， ８６９−８７３。
（３６）Ｍｏｏｒｅ， Ｋ． Ｌ．、Ｓｔｕｌｔｓ， Ｎ． Ｌ．、Ｄｉａｚ， Ｓ．、Ｓｍｉｔｈ， Ｄ． Ｆ．、Ｃｕｍｍｉｎｇｓ， Ｒ． Ｄ．、Ｖａｒｋｉ． Ａ． およびＭｃＥｖｅｒ． Ｒ． Ｐ． （１９９２）。骨髄細胞上のＰ−セレクチン（ＣＤ６２）のための特異性糖タンパク質リガンドの同定。Ｊ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． １１８， ４４５−４５６。
（３７）Ｎｇ， Ｋ． Ｋ．およびＷｅｉｓ， Ｗ． Ｉ． （１９９７）。シアリル化および硫酸化ルイスＸオリゴ糖と複合体形成されたマンノース結合タンパク質のセレクチン様突然変異体の構造。Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３６， ９７９−９８８。
（３８）Ｎｉｃｈｏｌｌｓ， Ａ．、Ｓｈａｒｐ， Ｋ．およびＨｏｎｉｇ， Ｂ． （１９９１）。タンパク質の折りたたみおよび会合：炭化水素の界面および熱力学的特性からの洞察。Ｐｒｏｔｅｉｎｓ １１， ２８１−２９６。
（３９）Ｐｏｐｐｅ， Ｌ．、Ｂｒｏｗｎ， Ｇ． Ｓ．、Ｐｈｉｌｏ， Ｊ． Ｓ．、Ｎｉｋｒａｄ， Ｐ． Ｖ．およびＳｈａｈ， Ｂ． Ｈ． （１９９７）。溶液中で遊離であり、Ｅ−、Ｐ−、およびＬ−セレクチンへ結合されたＳＬｅＸ四糖のコンホメーション。Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． １１９， １７２７−１７３６。
（４０）Ｐｏｕｙａｎｉ， Ｔ．およびＳｅｅｄ， Ｂ． （１９９５）。Ｐ−セレクチンのＰＳＧＬ−１認識は、ＰＳＧＬ−１アミノ末端におけるチロシン硫酸化のコンセンサスによって制御される。Ｃｅｌｌ ８３， ３３３−３４３。
（４１）Ｐｕｒｉ， Ｋ． Ｄ．、Ｃｈｅｎ． Ｓ．およびＳｐｒｉｎｇｅｒ， Ｔ． Ａ． （１９９８）。平衡特性とは独立的なＬ−セレクチン接着の機械特性および剪断しきい値の変更。Ｎａｔｕｒｅ ３９２， ９３０−９３３。
（４２）Ｒａｍａｃｈａｎｄｒａｎ， Ｖ．、Ｎｏｌｌｅｒｔ， Ｍ． Ｕ．、Ｑｉｕ， Ｈ．、Ｌｉｕ， Ｗ． Ｊ．、Ｃｕｍｍｉｎｇｓ， Ｒ． Ｄ．、Ｚｈｕ， Ｃ．およびＭｃＥｖｅｒ， Ｒ． Ｐ． （１９９９）。Ｐ−セレクチン糖タンパク質リガンド−１におけるチロシン置換は、Ｐ−およびＬ−セレクチンとの結合の明確な動的および機械的特性に影響を与える。Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９６， １３７７１−１３７７６。
（４３）Ｓａｋｏ， Ｄ．、Ｃｈａｎｇ． Ｘ． Ｊ．、Ｂａｒｏｎｅ， Ｋ． Ｍ．、Ｖａｃｈｉｎｏ， Ｇ．、Ｗｈｉｔｅ， Ｈ． Ｍ．、Ｓｈａｗ， Ｇ．、Ｖｅｌｄｍａｎ， Ｇ． Ｍ．、Ｂｅａｎ，Ｋ． Ｍ．、Ａｈｅｒｎ， Ｔ． Ｊ．、 Ｆｕｒｉｅ， Ｂ．、Ｃｕｍｍｍｉｎｇ， Ｄ． Ａ．およびＬａｒｓｅｎ， Ｇ． Ｒ． （１９９３）。Ｐ−セレクチンのための機能性糖タンパク質リガンドの発現クローニング。Ｃｅｌｌ ７５， １１７９−１１８６。
（４４）Ｓａｋｏ， Ｄ．、Ｃｏｍｅｓｓ， Ｋ． Ｍ．、Ｂａｒｏｎｅ， Ｋ． Ｍ．、Ｃａｍｐｈａｕｓｅｎ， Ｒ． Ｔ．、Ｃｕｍｍｉｎｇ， Ｄ． Ａ．およびＳｈａｗ， Ｇ． Ｄ． （１９９５）。ＰＳＧＬ−１のアミノ末端の硫酸化ペプチドセグメントは、Ｐ−セレクチン結合に重要である。Ｃｅｌｌ ８３， ３２３−３３１。
（４５）Ｓｎａｐｐ， Ｋ． Ｒ．、Ｃｒａｉｇ， Ｒ．、Ｈｅｒｒｏｎ， Ｍ．、Ｎｅｌｓｏｎ， Ｒ． Ｄ．、Ｓｔｏｏｌｍａｎ， Ｌ． Ｍ．およびＫａｎｓａｓ， Ｇ． Ｓ． （１９９８）。Ｐ−セレクチンの最適認識のために必要なＰ−セレクチン糖タンパク質リガンド−１（ＰＳＧＬ−１）の二量体化。Ｊ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． １４２， ２６３−２７０。
（４６）Ｓｐｒｉｎｇｅｒ， Ｔ． Ａ． （１９９４）。リンパ球再循環および白血球遊出のための輸送信号：多段階パラダイム。Ｃｅｌｌ ７６， ３０１−３１４。
（４７）Ｖｅｓｔｗｅｂｅｒ， Ｄ．およびＢｌａｎｋｓ， Ｊ． Ｅ． （１９９９）。セレクチンおよびそのリガンドの機能を調節するメカニズム。Ｐｈｙｓｉｏｌ． Ｒｅｖ． ７９， １８１−２１３。
（４８）Ｗｅｉｓ， Ｗ． Ｉ．、Ｄｒｉｃｋａｍｅｒ， Ｋ．およびＨｅｎｄｒｉｃｋｓｏｎ， Ｗ． Ａ． （１９９２）。オリゴ糖と複合体形成されたＣ−型マンノース−結合タンパク質の構造。Ｎａｔｕｒｅ ３６０， １２７−１３４。
（４９）Ｗｉｌｋｉｎｓ， Ｐ． Ｐ．、ＭｃＥｖｅｒ， Ｒ． Ｐ．およびＣｕｍｍｉｎｇｓ， Ｒ． Ｄ． （１９９６）。ＨＬ−６０細胞からのＰ−セレクチン糖タンパク質リガンド−１上のＯ−グリカンの構造。Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７１， １８７３２−１８７４２。
（５０）Ｗｉｌｋｉｎｓ， Ｐ． Ｐ．、Ｍｏｏｒｅ， Ｋ． Ｌ．、ＭｃＥｖｅｒ， Ｒ． Ｐ．およびＣｕｍｍｉｎｇｓ， Ｒ． Ｄ． （１９９５）。Ｐ−セレクチン糖タンパク質リガンド−１のチオロシン硫酸化は、Ｐ−セレクチンへの高親和性結合のために必要とされる。Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７０， ２２６７７−２２６８０。
（５１）Ｙａｎｇ， Ｊ．、Ｆｕｒｉｅ， Ｂ． Ｃ．およびＦｕｒｉｅ， Ｂ． （１９９９）。Ｐ−セレクチン糖タンパク質リガンド−１の生物学：白血球−内皮、および白血球−血小板相互作用におけるセレクチンカウンタレセプターとしてのその役割。Ｔｈｒｏｍｂ． Ｈａｅｍｏｓｔ． ８１， １−７。
（５２）Ｙａｎｇ， Ｊ．、Ｈｉｒａｔａ， Ｔ．、Ｃｒｏｃｅ， Ｋ．、Ｍｅｒｒｉｌｌ−Ｓｋｏｌｏｆｆ， Ｇ．、Ｔｃｈｅｒｎｙｃｈｅｖ， Ｂ．、Ｗｉｌｌｉａｍｓ， Ｅ．、Ｆｌａｕｍｅｎｈａｆｔ， Ｒ．、Ｆｕｒｉｅ， Ｂ． Ｃ．およびＦｕｒｉｅ， Ｂ． （１９９９）。目標とされる遺伝子の破壊は、Ｐ−セレクチン糖タンパク質リガンド１（ＰＳＧＬ−１）が、Ｅ−セレクチン媒介ではなく、Ｐ−セレクチン媒介の好中球ローリングおよび遊走のために必要とされることを証明する。Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １９０， １７６９−１７８２。
【００９４】
本明細書中で上記に言及された全ての出版物は、発行済み特許、係属中の出願、出版論文、タンパク質構造寄託物であろうとなかろうと、参照によってその全体が本明細書中に援用される。上記の本発明は、明瞭性および理解の目的でいくらか詳細に説明されたが、併記の特許請求の範囲中の本発明の真の範囲から逸脱することなく、形式および細部に種々の変化をもたらすことが可能であることは、開示の解釈から当業者には理解されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【図１Ａ】
ＰＳＧＬ−１ １９ｅｋペプチドの分解およびＢＩＡコアの親和性解析を示す。図１Ａは、陰イオン交換クロマトグラフィにより分解されたＰＳＧＬ−１ １９ｅｋペプチドのプロファイルである。ピークラベルの定義、挿入図、主要なＰＳＧＬ−１ １９ｅｋペプチドＳＧＰ−３の構造については本文を参照。＜Ｑは、ピログルタミン酸へのＮ−末端Ｇｌｎ残基の環化を表し、ＳＯ３は、Ｔｙｒ残基の硫酸化を表す。番号付けされたペプチド配列のオーバーラインは、エンテロキナーゼリンカー領域と関連されるＰＳＧＬ−１起源ではない残基を示す。
【図１Ｂ】
ＰＳＧＬ−１ １９ｅｋペプチドの分解およびＢＩＡコアの親和性解析を示す。図１Ｂ−１および図１Ｂ−２は、固定化ＰＳＧＬ−１構築物への溶液位相（ｓｏｌｕｔｉｏｎ−ｐｈａｓｅ）Ｐ−ＬＥ結合の代表的ＢＩＡコアのセンサグラムである。Ｐ−ＬＥ（８００ｎＭ濃度）をｓＰＳＧＬ（図１Ｂ−１）、およびＳＧＰ−３（図１Ｂ−２）上へ注入した。Ｐ−ＬＥ注入されたあまり修飾されていない他の型のＳＧＰ−３（図示せず）の結合信号は、結合速度論に関しては、これらの結果と同一であった。ｓＰＳＧＬおよびＳＧＰ−３へのＰ−ＬＥ結合は、溶液位相ＳＧＰ−３との共注入によって阻害された（点線）が、チロシン硫酸化またはグリコシル化を含まない合成ペプチドによっては阻害されなかった（破線）。いずれも２０μＭの濃度であった。全ての曲線は、結合全体から非特異性結合を差し引くことにより生成された特異性結合を反映している。
【図１Ｃ】
ＰＳＧＬ−１ １９ｅｋペプチドの分解およびＢＩＡコアの親和性解析を示す。図１Ｃ−１〜図１Ｃ−６は、固定化ｓＰＳＧＬおよびＢＩＡコア解析により精製された１９ｅｋペプチドと反応させた溶液位相Ｐ−ＬＥの結合親和性の決定である。第１列の左から右へ、ｓＰＳＧＬ（図１Ｃ−１）、ＳＧＰ−３（図１Ｃ−２）およびＳＧＰ−２（図１Ｃ−３）である。第２列の左から右へ、ＳＧＰ−１（図１Ｃ−４）、ＧＰ−１（図１Ｃ−５）およびＳＰ−１（図１Ｃ−６）である。示された濃度のＰ−ＬＥは、固定化リガンド（全結合信号を決定するため）と、およびリガンドをまったく含まないコントロール細胞（非特異性結合を決定するため）に対して、反応させた。Ｐ−ＬＥの各濃度における平衡応答（ｅｑｕｉｌｉｂｒｉｕｍ ｒｅｓｐｏｎｓｅ）（Ｒｅｑ）が示される。試験された各Ｐ−ＬＥ濃度では、特異性結合信号（四角）は、全結合信号（ひし形）から非特異性応答（三角）を差し引くことにより決定された。ＫＤおよび標準偏差（図示）は、ＢＩＡ評価ソフトウェア（ＢＩＡｃｏｒｅ）を用いて、特異性結合曲線のラインフィッティングによって決定され、３対１０の分離実験の結果である。ラインフィッティングを用いるＫＤの決定は、スキャッチャードプロット（図示せず）の直線回帰分析により決定される値とうまく一致した。
【図２】
Ｐ−セレクチンＬＥ結晶のＸ線回折によって得られるＰ−セレクチンＬＥの原子構造座標を提供する。「Ａｔｏｍ Ｔｙｐｅ」は、その座標が測定されている原子を示す。「Ｒｅｓｉｄｕｅ」は、各測定原子がその一部であるタイプまたは残基を示し、すなわちアミノ酸、補因子、リガンドまたは溶媒である。「ｘ、ｙ、およびｚ」座標は、各測定原子の単位格子中の位置（Å）のデカルト座標を示す。「Ｏｃｃ」は占有係数を示す。「Ｂ」は、原子構造中で原子がどのくらい移動可能であるかの尺度（Å２）である「Ｂ−値」を示す。「ＭＯＬ」は、結晶中の各分子を同定するために使用されるセグメント識別を示す。「ＭＯＬ」の下の、「ＭＯＬＡ」、「ＭＯＬＢ」、「ＭＯＬＣ」および「ＭＯＬＤ」は、Ｐ−セレクチンＬＥの各分子を示し、「ＳＯＬＶ」は水分子を示し、「ＭＰＤＳ」はＭＰＤ分子を示し、「ＣＡＬＳ」はカルシウムイオンを示す。乱れのある構造のために、Ｐ−セレクチンのＬｙｓ１７（ＭＯＬＡ）、Ｌｙｓ１７（ＭＯＬＣ）およびＡｓｎ５７（ＭＯＬＣ）は、アラニンとして表される。
【図３】
Ｐ−セレクチンＬＥ：ＳＬｅＸ結晶のＸ線回折によって得られるＰ−セレクチンＬＥおよびＳＬｅＸの原子構造座標を提供する。図の見出しは、「ＭＯＬ」の下の、「Ａ」、「Ｂ」、「Ｃ」および「Ｄ」がＰ−セレクチンＬＥの各分子を示し、かつＳＬｅＸ、ＭＤＰ分子およびカルシウムイオンが「ＭＯＬ」の下に表示されない以外は、図２について記された通りである。しかしながら、ＳＬｅＸ、ＭＤＰ分子およびカルシウムイオンは、「Ｒｅｓｉｄｕｅ」の下に同定される。乱れのある構造のために、Ｐ−セレクチンのＬｙｓ１７（ＭＯＬＡ）、Ｌｙｓ１７（ＭＯＬＣ）およびＡｓｎ５７（ＭＯＬＣ）は、アラニンとして表される。
【図４】
Ｐ−セレクチンＬＥ：ＳＬｅＸ結晶のＸ線回折によって得られるＥ−セレクチンＬＥおよびＳＬｅＸについての原子構造座標を提供する。図の見出しは、「ＭＯＬ」の下の「ＳＯＬＶ」が水分子を示し、かつＥ−セレクチンＬＥ、ＳＬｅＸ、カルシウムイオンが「ＭＯＬ」の下に表示されない以外は、図２について記された通りである。しかしながら、Ｅ−セレクチンＬＥ、ＳＬｅＸおよびカルシウムイオンは、「Ｒｅｓｉｄｕｅ」の下に同定される。
【図５】
Ｐ−セレクチン：ＰＳＧＬ−１ペプチド結晶のＸ線回折によって得られるＰ−セレクチンＬＥおよびＰＳＧＬ−１ペプチドの原子構造座標を提供する。図の見出しは、図５が「ＭＯＬ」の見出しを含まない以外は、図２について記された通りである。しかしながら、Ｐ−セレクチンＬＥの各分子、ＰＳＧＬ−１ペプチド、水、およびＭＰＤは、「Ｒｅｓｉｄｕｅ」の下に同定される。乱れのある構造のために、Ｐ−セレクチンのＡｓｎ５７（ＭＯＬＡ）、Ｌｙｓ５８（ＭＯＬＡ）、Ａｓｎ７１（ＭＯＬＡ）、Ａｒｇ２２（ＭＯＬＢ）、Ａｓｎ５７（ＭＯＬＢ）、Ｌｙｓ５８（ＭＯＬＢ）、Ｇｌｕ７２（ＭＯＬＢ）、Ｍｅｔ１２５（ＭＯＬＢ）およびＡｒｇ１５７（ＭＯＬＢ）は、アラニンとして表される。
【図６Ａ】
Ｐ−セレクチンのアミノ酸配列を提供する。結晶中の構築物を作るために使用される配列のセグメントは下線が引かれている。
【図６Ｂ】
Ｅ−セレクチンのアミノ酸配列を提供する。結晶中の構築物を作るために使用される配列のセグメントは下線が引かれている。
【図６Ｃ】
ＰＳＧＬ−１のアミノ酸配列を提供する。結晶中の構築物を作るために使用される配列のセグメントは下線が引かれている。
【図１Ａ】
2004509069.tif 000003
【図１Ｂ】
2004509069.tif 000004
【図１Ｃ】
2004509069.tif 000005
【国際公開パンフレット】
2004509069.tif 000006
2004509069.tif 000007
2004509069.tif 000008
2004509069.tif 000009
2004509069.tif 000010
2004509069.tif 000011
2004509069.tif 000012
2004509069.tif 000013
2004509069.tif 000014
2004509069.tif 000015
2004509069.tif 000016
2004509069.tif 000017
2004509069.tif 000018
2004509069.tif 000019
2004509069.tif 000020
2004509069.tif 000021
2004509069.tif 000022
2004509069.tif 000023
2004509069.tif 000024
2004509069.tif 000025
2004509069.tif 000026
2004509069.tif 000027
2004509069.tif 000028
2004509069.tif 000029
2004509069.tif 000030
2004509069.tif 000031
2004509069.tif 000032
2004509069.tif 000033
2004509069.tif 000034
2004509069.tif 000035
2004509069.tif 000036
2004509069.tif 000037
2004509069.tif 000038
2004509069.tif 000039
2004509069.tif 000040
2004509069.tif 000041
2004509069.tif 000042
2004509069.tif 000043
2004509069.tif 000044
2004509069.tif 000045
2004509069.tif 000046
2004509069.tif 000047
2004509069.tif 000048
2004509069.tif 000049
2004509069.tif 000050
2004509069.tif 000051
2004509069.tif 000052
2004509069.tif 000053
2004509069.tif 000054
2004509069.tif 000055
2004509069.tif 000056
2004509069.tif 000057
2004509069.tif 000058
2004509069.tif 000059
2004509069.tif 000060
2004509069.tif 000061
2004509069.tif 000062
2004509069.tif 000063
2004509069.tif 000064
2004509069.tif 000065
2004509069.tif 000066
2004509069.tif 000067
2004509069.tif 000068
2004509069.tif 000069
2004509069.tif 000070
2004509069.tif 000071
2004509069.tif 000072
2004509069.tif 000073
2004509069.tif 000074
2004509069.tif 000075
2004509069.tif 000076
2004509069.tif 000077
2004509069.tif 000078
2004509069.tif 000079
2004509069.tif 000080
2004509069.tif 000081
2004509069.tif 000082
2004509069.tif 000083
2004509069.tif 000084
2004509069.tif 000085
2004509069.tif 000086
2004509069.tif 000087
2004509069.tif 000088
2004509069.tif 000089
2004509069.tif 000090
2004509069.tif 000091
2004509069.tif 000092
2004509069.tif 000093
2004509069.tif 000094
2004509069.tif 000095
2004509069.tif 000096
2004509069.tif 000097
2004509069.tif 000098
2004509069.tif 000099
2004509069.tif 000100
2004509069.tif 000101
2004509069.tif 000102
2004509069.tif 000103
2004509069.tif 000104
2004509069.tif 000105
2004509069.tif 000106
2004509069.tif 000107
2004509069.tif 000108
2004509069.tif 000109
2004509069.tif 000110
2004509069.tif 000111
2004509069.tif 000112
2004509069.tif 000113
2004509069.tif 000114
2004509069.tif 000115
2004509069.tif 000116
2004509069.tif 000117
2004509069.tif 000118
2004509069.tif 000119
2004509069.tif 000120
2004509069.tif 000121
2004509069.tif 000122
2004509069.tif 000123
2004509069.tif 000124
2004509069.tif 000125
2004509069.tif 000126
2004509069.tif 000127
2004509069.tif 000128
2004509069.tif 000129
2004509069.tif 000130
2004509069.tif 000131
2004509069.tif 000132
2004509069.tif 000133
2004509069.tif 000134
2004509069.tif 000135
2004509069.tif 000136
2004509069.tif 000137
2004509069.tif 000138
2004509069.tif 000139
2004509069.tif 000140
2004509069.tif 000141
2004509069.tif 000142
2004509069.tif 000143
2004509069.tif 000144
2004509069.tif 000145
2004509069.tif 000146
2004509069.tif 000147
2004509069.tif 000148
2004509069.tif 000149
2004509069.tif 000150
2004509069.tif 000151
2004509069.tif 000152
2004509069.tif 000153
2004509069.tif 000154
2004509069.tif 000155
2004509069.tif 000156
2004509069.tif 000157
2004509069.tif 000158
2004509069.tif 000159
2004509069.tif 000160
2004509069.tif 000161
2004509069.tif 000162
2004509069.tif 000163
2004509069.tif 000164
2004509069.tif 000165
2004509069.tif 000166
2004509069.tif 000167
2004509069.tif 000168
2004509069.tif 000169
2004509069.tif 000170
2004509069.tif 000171
2004509069.tif 000172
2004509069.tif 000173
2004509069.tif 000174
2004509069.tif 000175
2004509069.tif 000176
2004509069.tif 000177
2004509069.tif 000178
2004509069.tif 000179
2004509069.tif 000180
2004509069.tif 000181
2004509069.tif 000182
2004509069.tif 000183
2004509069.tif 000184
2004509069.tif 000185
2004509069.tif 000186
2004509069.tif 000187
2004509069.tif 000188
2004509069.tif 000189
2004509069.tif 000190
2004509069.tif 000191
2004509069.tif 000192
2004509069.tif 000193
2004509069.tif 000194
2004509069.tif 000195
2004509069.tif 000196
2004509069.tif 000197
2004509069.tif 000198
2004509069.tif 000199
2004509069.tif 000200
2004509069.tif 000201
2004509069.tif 000202
2004509069.tif 000203
2004509069.tif 000204
2004509069.tif 000205
2004509069.tif 000206
2004509069.tif 000207
2004509069.tif 000208
2004509069.tif 000209
2004509069.tif 000210
2004509069.tif 000211
2004509069.tif 000212
2004509069.tif 000213
2004509069.tif 000214
2004509069.tif 000215
2004509069.tif 000216
2004509069.tif 000217
2004509069.tif 000218
2004509069.tif 000219
2004509069.tif 000220
2004509069.tif 000221
2004509069.tif 000222
2004509069.tif 000223
2004509069.tif 000224
2004509069.tif 000225
2004509069.tif 000226
2004509069.tif 000227
2004509069.tif 000228
2004509069.tif 000229
2004509069.tif 000230
2004509069.tif 000231
2004509069.tif 000232
2004509069.tif 000233
2004509069.tif 000234
2004509069.tif 000235
2004509069.tif 000236
2004509069.tif 000237
2004509069.tif 000238
2004509069.tif 000239
2004509069.tif 000240
2004509069.tif 000241
2004509069.tif 000242
2004509069.tif 000243
2004509069.tif 000244
2004509069.tif 000245
2004509069.tif 000246
2004509069.tif 000247
2004509069.tif 000248
2004509069.tif 000249
2004509069.tif 000250
2004509069.tif 000251
2004509069.tif 000252
2004509069.tif 000253
2004509069.tif 000254
2004509069.tif 000255
2004509069.tif 000256
2004509069.tif 000257
2004509069.tif 000258
2004509069.tif 000259
2004509069.tif 000260
2004509069.tif 000261
2004509069.tif 000262
2004509069.tif 000263
2004509069.tif 000264
2004509069.tif 000265
2004509069.tif 000266
2004509069.tif 000267
2004509069.tif 000268
2004509069.tif 000269
2004509069.tif 000270
2004509069.tif 000271
2004509069.tif 000272
2004509069.tif 000273
2004509069.tif 000274
2004509069.tif 000275
2004509069.tif 000276
2004509069.tif 000277
2004509069.tif 000278
2004509069.tif 000279
2004509069.tif 000280
2004509069.tif 000281
2004509069.tif 000282
2004509069.tif 000283
2004509069.tif 000284
2004509069.tif 000285
2004509069.tif 000286
2004509069.tif 000287
2004509069.tif 000288
2004509069.tif 000289
2004509069.tif 000290
2004509069.tif 000291
2004509069.tif 000292
2004509069.tif 000293
2004509069.tif 000294
2004509069.tif 000295
2004509069.tif 000296
2004509069.tif 000297
2004509069.tif 000298
2004509069.tif 000299
2004509069.tif 000300
2004509069.tif 000301
2004509069.tif 000302
2004509069.tif 000303
2004509069.tif 000304
2004509069.tif 000305
2004509069.tif 000306
2004509069.tif 000307
2004509069.tif 000308
2004509069.tif 000309
2004509069.tif 000310
2004509069.tif 000311
2004509069.tif 000312
2004509069.tif 000313
2004509069.tif 000314
2004509069.tif 000315
2004509069.tif 000316
【国際調査報告】
2004509069.tif 000317
2004509069.tif 000318
2004509069.tif 000319