(57)【要約】本発明は、固相オリゴ合成、及びより特定すると、固相オリゴヌクレオチド合成用の普遍固形支持体、その製造法、及びその使用法に関する。本発明の１つの側面は、固相オリゴ合成での使用に適した普遍固形支持体の製造法に関し、この方法は、（ａ）固形支持体（例、ＣＰＧ）の付帯官能基（例、−ＮＨ２）をリンカー試薬（例、塩化オキサリル）と反応させる工程により、付帯リンカー基（例、−Ｃ（＝Ｏ）Ｃｌ）を形成させる工程；（ｂ）過剰な未反応リンカー試薬の少なくとも一部を蒸発により（例、回転蒸発装置を使用して）除去する工程；及び、（ｃ）前記付帯リンカー基を環式試薬（例、保護化イノシン）と反応させる工程により、付帯環式基を形成させる工程を含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
固相オリゴ合成での使用に適した固形支持体の製造法であって：
（ａ）固形支持体の付帯官能基をリンカー試薬と反応させる工程により、付帯リンカー基を形成させる工程；
（ｂ）過剰な未反応リンカー試薬の少なくとも一部を蒸発により除去する工程；及び、
（ｃ）前記付帯リンカー基を環式試薬と反応させる工程により、付帯環式基を形成させる工程を含む、前記方法。
【請求項２】
固相オリゴヌクレオチド合成での使用に適した固形支持体の製造法であって：
（ａ）固形支持体の付帯官能基をリンカー試薬と反応させる工程により、付帯リンカー基を形成させる工程；
（ｂ）過剰な未反応リンカー試薬の少なくとも一部を蒸発により除去する工程；
（ｃ）前記付帯リンカー基を環式試薬と反応させる工程により、付帯環式基を形成させる工程；及び、
（ｄ）過剰な未反応環式試薬及び／又はその副生成物の少なくとも一部を除去する工程を含む、前記方法。
【請求項３】
固形支持体の付帯官能基をリンカー試薬と反応させる前記工程の後で：
（ｉ）前記固形支持体の残存する付帯官能基の少なくとも一部をキャッピング試薬と反応させる工程により、付帯キャップ化官能基を形成させる工程をさらに含んでなる、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
過剰な未反応リンカー試薬の少なくとも一部を蒸発により除去する前記工程の後で：
（ｉ）前記固形支持体の残存する付帯官能基の少なくとも一部をキャッピング試薬と反応させる工程により、付帯キャップ化官能基を形成させる工程をさらに含んでなる、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記付帯リンカー基を環式試薬と反応させる前記工程の後で：
（ｉ）前記固形支持体の残存する付帯リンカー基の少なくとも一部をキャッピング試薬と反応させる工程により、付帯キャップ化リンカー基を形成させる工程をさらに含んでなる、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記キャッピング試薬が無水酢酸である、請求項３、４、及び５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
過剰な未反応リンカー試薬の少なくとも一部を蒸発により除去する前記工程が減圧及び／又は上昇温度の適用で達成される、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
過剰な未反応リンカー試薬の少なくとも一部を蒸発により除去する前記工程が、過剰な未反応リンカー試薬の実質的な部分を除去する工程を伴う、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
過剰な未反応リンカー試薬の少なくとも一部を除去する前記工程が蒸発だけで達成される、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記方法の１つ以上の工程が蒸発装置を使用して実施される、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記方法が回転蒸発装置若しくは蒸留装置を使用して実施される、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記方法が回転蒸発装置を使用して実施される、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記リンカー試薬が式：
【化１】
2004503560.tif 000047
（式中：
Ｘ１とＸ２は、独立して、−Ｃｌ、−Ｂｒ、又は−Ｉであり；そして、
ＲＬは、共有結合か、又は、１〜１０の炭素原子とＮ、Ｏ、及びＳから選択される０〜５のヘテロ原子を含んでなる有機基である二価基を示す）を有し；そして、前記リンカー試薬が揮発液体である、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記リンカー試薬が式：
【化２】
2004503560.tif 000048
（式中：Ｘ１とＸ２は、独立して、−Ｃｌ、−Ｂｒ、又は−Ｉであり；そして、ｎは、０〜２の整数である）を有する、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記リンカー試薬が：
【化３】
2004503560.tif 000049
の１つである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記リンカー試薬が：
【化４】
2004503560.tif 000050
である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記固形支持体の前記付帯官能基が、以下のように示される−Ｊ１−Ｈ（ここでＪ１は、−ＮＨ−、−Ｏ−、又は−Ｓ−である）である、
【化５】
2004503560.tif 000051
請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
前記固形支持体の前記付帯官能基が、以下のように示される−ＮＨ２である、
【化６】
2004503560.tif 000052
請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記環式試薬が式：
【化７】
2004503560.tif 000053
｛式中：
Ｑは、環式基を示し、これは単一の非芳香環を有し、この環は５〜７の環原子を有し、この環原子は：
（ａ）すべて炭素原子であるか、又は
（ｂ）炭素原子と、酸素、窒素、及びイオウから選択される１若しくは２つのヘテロ原子であり；
Ｗは、反応共役基を示し、−ＯＨ、−ＮＨ２、又は−ＳＨであり；
Ｂは、プリン若しくはピリミジン、又はその誘導体若しくは類似体である、塩基性部分を示し；
Ｙは、−ＯＨ、−ＮＨ２、又は−ＳＨであるオリゴ合成基、又はその保護化形態を示し；そして、
Ｚは、存在する場合、−ＯＨ、−ＮＨ２、又は−ＳＨである補助基、又はその保護化形態を示し；
ここで、前記Ｗ、Ｂ、Ｙ、及びＺは、存在する場合、共有結合により直接的にか、又は−ＣＨ２−及び−ＣＨ２ＣＨ２−から選択される中間共有連結により間接的に、前記Ｑの炭素環原子へそれぞれ個別に付く｝を有する、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
Ｑが：
【化８】
2004503560.tif 000054
から選択される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
環式試薬のＹ−Ｑ−Ｚ部分が：
【化９】
2004503560.tif 000055
から選択される構造を有する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
環式試薬のＹ−Ｑ−Ｚ部分が：
【化１０】
2004503560.tif 000056
から選択される構造を有する、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
環式試薬が：
【化１１】
2004503560.tif 000057
から選択される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
環式試薬が：
【化１２】
2004503560.tif 000058
から選択される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
Ｂが、以下のもの、又はその保護化形態：
【化１３】
2004503560.tif 000059
から選択される、請求項１〜２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
Ｂが、以下のもの、又はその保護化形態：
【化１４】
2004503560.tif 000060
である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
Ｗが−ＯＨである、請求項１〜２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
Ｙが、−ＯＨ又はその保護化形態である、請求項１〜２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
Ｚが、存在する場合、−ＯＨ又はその保護化形態である、請求項１〜２８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３０】
Ｚが、存在する場合、−ＯＲ（ここで、Ｒは、アシル基、Ｃ１−７アルキル基、又はシリル基である）の形態で保護化された−ＯＨである、請求項１〜２９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３１】
ＺとＹの両方が、脱保護化形態では、−ＯＨであり、保護化形態では、構造：
【化１５】
2004503560.tif 000061
のＯ−Ｏ−メトキシエチリデン基とともに、環式構造の一部を一緒に形成する、請求項１〜３０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３２】
前記環式試薬が：
【化１６】
2004503560.tif 000062
又はその保護化形態である、請求項１〜２９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３３】
前記環式試薬が：
【化１７】
2004503560.tif 000063
である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記付帯リンカー基を環式試薬と反応させる前記工程が、付加塩基の存在下で実施される、請求項１〜３３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３５】
前記付加塩基が、ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）又はＮ−メチルイミダゾール（ＮＭＩ）である、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
式：
【化１８】
2004503560.tif 000064
｛式中：
Ｊ１は、−ＮＨ−であり；
ＲＬは、−（ＣＨ２）ｎ−であり；そして、
ｎは、０〜１０の整数である｝の固形支持体、又はその保護化誘導体。
【請求項３７】
式：
【化１９】
2004503560.tif 000065
｛式中：
Ｊ１は、−ＮＨ−であり；
ＲＬは、−（ＣＨ２）ｎ−であり；そして、
ｎは、０〜１０の整数である｝の固形支持体。
【請求項３８】
式：
【化２０】
2004503560.tif 000066
の固形支持体、又はその保護化形態。
【請求項３９】
式：
【化２１】
2004503560.tif 000067
の固形支持体。
【請求項４０】
請求項１〜３５のいずれか１項に記載の方法により製造される、固相オリゴヌクレオチド合成での使用に適した固形支持体。
【請求項４１】
オリゴヌクレオチド合成の方法であって、請求項１〜３５のいずれか１項に記載される普遍固形支持体の製造法を利用する、前記方法。
【請求項４２】
オリゴヌクレオチド合成の方法であって、請求項３６〜３９のいずれか１項に記載の普遍固形支持体を利用する、前記方法。
【請求項４３】
オリゴヌクレオチド合成の方法を使用して製造されたオリゴヌクレオチドであって、前記方法は請求項１〜３５のいずれか１項に記載の普遍固形支持体の製造法を利用する、前記オリゴヌクレオチド。
【請求項４４】
請求項３６〜３９のいずれか１項に記載の普遍固形支持体を使用して製造されたオリゴヌクレオチド。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明は、概して固相オリゴ合成の分野に関し、より特定すると、固相オリゴヌクレオチド合成の普遍固形支持体、その製造法、及び、その使用の方法に関する。
【０００２】
背景技術
修飾及び未修飾オリゴヌクレオチドの分子生物学の分野でのプローブ及びプライマーとしての広汎な使用、並びに、アンチセンス及び抗遺伝子オリゴヌクレオチドの治療薬としての潜在的な応用は、これら分子の新規で改善された合成法の不断の開発をますます重要にしている。
【０００３】
オリゴヌクレオチド合成のいくつかの方法では、合成オリゴヌクレオチドの３’末端でヌクレオシドになるように定められている第一のヌクレオシドを固形支持体が含有することが必要とされる。そのような方法には、全部で８つの通例ヌクレオシド支持体（４つがＤＮＡ用で、４つがＲＮＡ用）の資材（ｉｎｖｅｎｔｏｒｙ）が維持されることが求められる。さらに、異常ヌクレオシドは、ホスホロアミダイトとしてのみ入手可能であることが多く、支持体としては入手可能でないので、３’末端に異常ヌクレオシドを有するオリゴヌクレオチドは、容易には製造され得ない。さらに、そのような方法のもう１つの欠点は、３’−ヌクレオシドを含有するカラムの選択におけるエラーの潜在可能性である。このエラーの潜在可能性は通例のカラム形式の合成機ではかなり低いようだが、２４、９６又は１９２ウェルが一定グリッドに４つの支持体を含有し得る新世代の並列合成機では特に顕著になる。
【０００４】
こういった諸問題を軽減するために、様々な「普遍」固形支持体が開発されてきた。これら普遍固形支持体は、３’末端ヌクレオシドの性質にかかわらず任意のオリゴヌクレオチドを合成するために使用することが可能である。
【０００５】
ＤｅＢｅａｒ ｅｔ ａｌ．， １９８７ は、保護化ウリジン基がスクシニル基を介して固形支持体へ連結している普遍固形支持体を記載する。この支持体は、第一に、４−ジメチルアミノピリジンの存在下で保護化ウリジンを無水コハク酸と反応させること、第二に、生じたコハク酸の半エステルをｐ−トルエンスルホニルニトロトリアゾールで活性化させること、及び、第三に、この活性エステルを固形支持体の付帯（ｐｅｎｄａｎｔ）アミノ基と反応させることによって製造される。これらの工程は２日間以上を必要とし、ピリジン、メタノール、及びクロロホルムを用いた洗浄による精製に次いで、真空乾燥が含まれる。どの場合でも、過剰な試薬は、蒸発によるか又は蒸発によるだけでは除去されなかった。
【０００６】
Ｗｅｂｂ ｅｔ ａｌ．， １９８７ は、オキシラン、アジリジン、又はエピスルフィド基を担う固形支持体、求核基、例えばフリーアミノ基を有するリンカー化合物、及び、コハク酸ペンタクロロフェニルを担う活性化ヌクレオシドを利用する普遍固形支持体を製造する方法を記載する。この普遍固形支持体は、クロマトグラフィー分離の必要性なしに製造されるようだ（第４カラム、４１〜４２行）が、この合成は実に多くの精製工程（例えば、濾過、洗浄、乾燥）を必要とし、少なくとも２日間を必要とする（実施例１）。除去のために蒸発法を使用することはどこにも述べられていない。
【０００７】
Ｎｅｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， １９８９ は、２つの異なる保護化された基を有するアダプター化合物を記載する。一方（−Ｏ−ＤＭＴ）はオリゴヌクレオチド合成用で、他方（−ＮＨＦｍｏｃ）は他の使用、例えばラベル付加のためである。このアダプターは、はじめに活性化スクシニル基を担うように誘導され、引き続き、固形支持体へカップルされる。これらの工程は多くの精製工程（例、洗浄、乾燥、濾過）を必要とする。どの場合でも、過剰な試薬は、蒸発によるか又は蒸発によるだけでは除去されなかった。固形支持体へのスクシニル化及びカップリングは２０時間以上、そしてしばしばそれよりずっと長い時間を必要とした。
【０００８】
Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９９２ は、例えば、オキサリルリンカーアーム（その文献の図１Ｃ及び図２を参照のこと）を利用する普遍固形支持体を記載する。オキサリルリンカーアームは、活性化されたオキサリル誘導体を使用して導入される（第４カラム、６２〜６４行）。使用に先立って、より反応性の低いトリアゾリド誘導体へ塩化オキサリルを変換する（第５カラム、３０〜３７行）。このヌクレオシドをロードされたオキサリル支持体は、一見すると１〜８時間で製造され得て（第５カラム、４３〜４５行）、実施例１では２．５時間を必要とした（第６カラム、４３〜５６行）。この普遍固形支持体は、シリンジ装置で製造され、（液体、又は溶液中の）反応体が注入され、過剰な反応体がその後排出され、残渣は、溶媒（例、アセトニトリル、ピリジン、塩化メチレン、ジエチルエーテル）で数回濯ぎ、洗浄された。多くの精製工程（例、濯ぎ、洗浄）が必要とされる。除去のために蒸発法を使用することはどこにも述べられていない。
【０００９】
Ａｒｎｏｌｄ， １９９４ と Ａｒｎｏｌｄ， １９９６ は、オリゴヌクレオチドの最終の切り離しを達成するために選択酸化に依存する普遍固形支持体を記載する。いずれの場合でも、オリゴヌクレオチドを固形支持体へ連結させるプライマー部分（例、リボシド）は、１つ以上の酸化可能な置換基を保有する（第６カラム、５２〜６２行）。この合成は多くの精製工程（例、洗浄、濾過、乾燥、遠心分離、分画、及びカラムクロマトグラフィー）を必要とする（実施例１、３、５、及び７を参照のこと）。どの場合でも、過剰な試薬は、蒸発によるか又は蒸発によるだけでは除去されなかった。固形支持体、リンカー基、及びプライマー基の間の連結を形成するには６時間以上、そしてしばしばそれよりずっと長い時間を必要とした。
【００１０】
Ｖｕ ｅｔ ａｌ．， １９９５ は、２つの異なる保護化された基を有する数多くの異なるプライマーを記載する。一方はオリゴヌクレオチド合成用で、他方は他の使用、例えばラベル付加のためである。いずれの場合でも、初めにプライマーがリンカー基へ付けられ（スクシニル化）、引き続き、最終工程で支持体へカップルされ、これらの工程は多くの精製工程（例、濾過、洗浄、乾燥、及びカラムクロマトグラフィー）を必要とした（化合物４、５、及び６；１２及び１３；１８及び１９；２５及び２６；３１及び３２の合成を参照のこと）。どの場合でも、過剰な試薬は、蒸発によるか又は蒸発によるだけでは除去されなかった。スクシニル化と支持体へのカップリングは６時間以上、そしてしばしばそれよりずっと長い時間を必要とした。
【００１１】
Ｓｃｈｗａｒｔｚ ｅｔ ａｌ．， １９９５ は、ヌクレオシド担持固形支持体を普遍固形支持体へ変換し得る普遍アダプター化合物を記載する。完全に保護化された２’（３’）−Ｏ−ジメトキシトリチル−３’（２’）−Ｏ−ベンゾイルウリジン−５’−Ｏ−（２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホロアミダイト）である、このリンカー化合物は、慣用のホスホロアミダイト法を使用して、ヌクレオシド担持固形支持体へ連結される。
【００１２】
ＭｃＬｅａｎ ｅｔ ａｌ．， １９９７ は、求核基（例、ヒドロキシル、又は保護化ヒドロキシル）を担うホモ環式（例、シクロヘキシル）若しくはヘテロ環式（例、フラン、ピラン）の環がスペーサー基（例、スクシニル）により固形支持体へつながっている普遍固形支持体を記載する。この普遍固形支持体は、初めにリンカー基を環式基へ付けてから、このリンカー−環式基を固形支持体へ付けることによって合成される。この合成は多くの精製工程（例、濾過、洗浄、乾燥、カラムクロマトグラフィー、分画）を必要とする（実施例１及び２、１３及び１４、１６及び１７、１９、２０及び２１、２３及び２４、及び２６を参照のこと）。どの場合でも、過剰な試薬は、蒸発によるか又は蒸発によるだけでは除去されなかった。リンカー基の環式基へのカップリングと、後続の固形支持体へのカップリングは、３６時間以上、そしてしばしばそれよりずっと長い時間を必要とした。
【００１３】
Ｌｙｔｔｌｅ ｅｔ ａｌ．， １９９６ は、オリゴ合成用の（−Ｏ−ＤＭＴとしての）保護化ヒドロキシ基と切り離しの機構を促進する（カルバミン酸アリルとしての）保護化アミノ基を担うプロピル基（ここで、プロピル基は、スクシニル基を介して固形支持体へ結合している）の普遍固形支持体を記載する。この支持体は、普遍リンカーである、１−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２−Ｏ−スクシノイル−３−Ｎ−アリルオキシカルボニルプロパンを使用して製造される。コハク酸誘導体の形成（化合物５から化合物１へ）は、１２時間以上と、カラムクロマトグラフィーを含む、いくつかの精製工程を必要とした。どの場合でも、過剰な試薬は、蒸発によるか又は蒸発によるだけでは除去されなかった。後続の固形支持体へのカップリングはさらに１２時間を必要とした。
【００１４】
Ｓｃｈｅｕｅｒ−Ｌａｒｓｅｎ ｅｔ ａｌ．， １９９７ は、オリゴヌクレオチド合成用の（−Ｏ−ＤＭＴとしての）保護化ヒドロキシ基と（クロロアセチルとしての）保護化ヒドロキシル基を担うＤ−リボース基がスクシニル基により固形支持体へ連結している普遍固形支持体を記載する。コハク酸誘導体の形成と後続の固形支持体のカップリング（化合物５から６へ、スキーム１の工程ｆ及びｇ）はいくつかの精製工程（例、洗浄、分画、及び乾燥）と４４時間以上を必要とした。どの場合でも、過剰な試薬は、蒸発によるか又は蒸発によるだけでは除去されなかった。
【００１５】
Ｒｅｄｄｙ ｅｔ ａｌ．， １９９７ は、ビシナル基（−ＸＲ１及び−ＹＲ２）を担う環部分（−Ｒ３、好ましくはリボシド）が、例えば、エステル連結、リン酸連結（例、実施例８）、ホスホロアミデート連結（例、実施例１１）、又はエステル連結（例、実施例１３）により、典型的にはスクシニル基を介して固形支持体へ連結している普遍固形支持体を記載する。実施例１３では、固形支持体を無水コハク酸で誘導化し、後続して２’，３’−保護化ウリジンと反応させる。この方法は３日以上と多くの精製工程（例、濾過、洗浄、及び乾燥）を必要とする。どの場合でも、過剰な試薬は、蒸発によるか又は蒸発によるだけでは除去されなかった。
【００１６】
上記に記載のものを含めて、普遍固形支持体の製造及び使用についての既知の方法は複雑で時間がかかるので、容易かつ迅速に、より少ない工程で、より少なくてより単純な精製工程で製造され得て、合成されたオリゴヌクレオチドの簡単で速やかな切り離し及び脱保護化を促進する、オリゴヌクレオチド合成用の普遍固形支持体への高いニーズが存在する。
【００１７】
（ａ）（付帯リンカー基を形成させるために）固形支持体を初めにリンカー試薬と反応させてから、（付帯環式基を形成させるために）環式試薬と反応させ、（ｂ）リンカー試薬が（ｉ）揮発性であるか、又は、より好ましくは揮発液体であり、（ｉｉ）穏和な条件下で容易に切り離される連結基を産出するように選択する方法を利用することによって、蒸発によるか又は蒸発によるだけで過剰なリンカー試薬を除去するか又は実質的に除去することによって合成を大いに単純化することが可能になる。今日まで、そのような方法は、教示も示唆もされていない。
【００１８】
従って、本発明の１つの目的は、オリゴヌクレオチド合成用普遍固形支持体の製造法の提供であって、この方法は迅速である（例、約３時間未満）。
本発明のもう１つの目的は、オリゴヌクレオチド合成用普遍固形支持体の製造法の提供であって、この方法は、例えば、過剰な未反応の環式試薬、（適宜）キャッピング試薬、及びその副生成物の除去のために、１回だけの精製工程（例、濾過）を利用する。
【００１９】
本発明のもう１つの目的は、オリゴヌクレオチド合成用普遍固形支持体の製造法の提供であって、この方法は、そのような支持体を高収率かつ高ローディング（例、約６０μモル／ｇ）でもたらす。
【００２０】
本発明のもう１つの目的は、オリゴヌクレオチド合成用普遍固形支持体の製造法の提供であって、この方法は、オリゴヌクレオチド合成に続く、実質的に減少した切り離し時間（例、７５℃で約１時間）の使用を可能にする。
【００２１】
本発明のもう１つの目的は、オリゴヌクレオチド合成用普遍固形支持体の製造法の提供であって、この方法は、１つ以上の上記目的を満足させる。
発明の要約
本発明の１つの側面は、オリゴ合成の普遍固形支持体の製造法に関し、この支持体は、例えば、固相オリゴヌクレオチド合成に有用である。
【００２２】
従って、１つの態様では、本発明は、固相オリゴ合成での使用に適した固形支持体の製造法に関し、この方法は：
（ａ）固形支持体の付帯官能基をリンカー試薬と反応させる工程により、付帯リンカー基を形成させる工程；
（ｂ）過剰な未反応リンカー試薬の少なくとも一部を蒸発により除去する工程；及び、
（ｃ）前記付帯リンカー基を環式試薬と反応させる工程により、付帯環式基を形成させる工程を含む。
【００２３】
１つの態様では、本発明は、固相オリゴヌクレオチド合成での使用に適した固形支持体の製造法に関し、この方法は：
（ａ）固形支持体の付帯官能基をリンカー試薬と反応させる工程により、付帯リンカー基を形成させる工程；
（ｂ）過剰な未反応リンカー試薬の少なくとも一部を蒸発により除去する工程；
（ｃ）前記付帯リンカー基を環式試薬と反応させる工程により、付帯環式基を形成させる工程；及び、
（ｄ）過剰な未反応環式試薬及び／又はその副生成物の少なくとも一部を除去する工程を含む。
【００２４】
１つの態様では、本方法は、固形支持体の付帯官能基をリンカー試薬と反応させる前記工程の後で：
（ｉ）前記固形支持体の残存する付帯官能基の少なくとも一部をキャッピング試薬と反応させる工程により、付帯キャップ化官能基を形成させる工程をさらに含む。
【００２５】
１つの態様では、本方法は、過剰な未反応リンカー試薬の少なくとも一部を蒸発により除去する前記工程の後で：
（ｉ）前記固形支持体の残存する付帯官能基の少なくとも一部をキャッピング試薬と反応させる工程により、付帯キャップ化官能基を形成させる工程をさらに含む。
【００２６】
１つの態様では、本方法は、前記付帯リンカー基を環式試薬と反応させる前記工程の後で：
（ｉ）前記固形支持体の残存する付帯リンカー基の少なくとも一部をキャッピング試薬と反応させる工程により、付帯キャップ化リンカー基を形成させる工程をさらに含む。
【００２７】
１つの態様では、過剰な未反応リンカー試薬の少なくとも一部を蒸発により除去する前記工程が、減圧及び／又は上昇温度の適用で達成される。
１つの態様では、過剰な未反応リンカー試薬の少なくとも一部を蒸発により除去する前記工程が、過剰な未反応リンカー試薬の実質的な部分を除去する工程を伴う。
【００２８】
１つの態様では、過剰な未反応リンカー試薬の少なくとも一部を除去する前記工程が、蒸発だけで達成される。
１つの態様では、前記方法の１つ以上の工程が蒸発装置を使用して実施される。１つの態様では、前記方法が回転蒸発（ｒｏｔａｖａｐｏｒ）装置若しくは蒸留装置を使用して実施される。１つの態様では、前記方法が回転蒸発装置を使用して実施される。
【００２９】
１つの態様では、前記リンカー試薬が式：
【００３０】
【化２２】
2004503560.tif 000002
（式中：
Ｘ１とＸ２は、独立して、−Ｃｌ、−Ｂｒ、又は−Ｉであり；そして、
ＲＬは、共有結合か、又は、１〜１０の炭素原子とＮ、Ｏ、及びＳから選択される０〜５のヘテロ原子を含んでなる有機基である二価基を示す）を有し；そして、ここで前記リンカー試薬は揮発液体である。
【００３１】
１つの態様では、前記リンカー試薬が式：
【００３２】
【化２３】
2004503560.tif 000003
（式中：
Ｘ１とＸ２は、独立して、−Ｃｌ、−Ｂｒ、又は−Ｉであり；そして、ｎは０〜２の整数である）を有する。
【００３３】
１つの好ましい態様では、前記リンカー試薬が：
【００３４】
【化２４】
2004503560.tif 000004
である。
【００３５】
１つの態様では、前記固形支持体の前記付帯官能基が−Ｊ１−Ｈであり、ここでＪ１は、−ＮＨ−、−Ｏ−、又は−Ｓ−である。１つの態様では、前記固形支持体の前記付帯官能基が−ＯＨである。
【００３６】
１つの態様では、前記環式試薬が式：
【００３７】
【化２５】
2004503560.tif 000005
｛式中：
Ｑは、環式基を示し；
Ｂは、塩基性基を示し；
Ｗは、反応共役基を示し；
Ｙは、オリゴ合成基を示し；そして、
Ｚは、存在する場合、補助基を示す｝を有する。
【００３８】
１つの態様では、前記環式試薬が式：
【００３９】
【化２６】
2004503560.tif 000006
｛式中：
Ｑは、環式基を示し、これは単一の非芳香環を有し、この環は５〜７の環原子を有し、この環原子は：
（ａ）すべて炭素原子であるか、又は
（ｂ）炭素原子と、酸素、窒素、及びイオウから選択される１若しくは２つのヘテロ原子であり；
Ｗは、反応共役基を示し、−ＯＨ、−ＮＨ２、又は−ＳＨであり；
Ｂは、プリン若しくはピリミジン、又はその誘導体若しくは類似体である、塩基性部分を示し；
Ｙは、−ＯＨ、−ＮＨ２、又は−ＳＨであるオリゴ合成基、又はその保護化形態を示し；そして、
Ｚは、存在する場合、−ＯＨ、−ＮＨ２、又は−ＳＨである補助基、又はその保護化形態を示し；
ここで、前記Ｗ、Ｂ、Ｙ、及びＺは、存在する場合、共有結合により直接的にか、又は−ＣＨ２−及び−ＣＨ２ＣＨ２−から選択される中間共有連結により間接的に、前記Ｑの炭素環原子へそれぞれ個別に付く｝を有する。
【００４０】
１つの好ましい態様では、前記環式試薬が：
【００４１】
【化２７】
2004503560.tif 000007
である。
【００４２】
１つの態様では、前記付帯リンカー基を環式試薬と反応させる前記工程が、付加塩基の存在下で実施される。１つの態様では、前記付加塩基が、ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）又はＮ−メチルイミダゾール（ＮＭＩ）である。
【００４３】
本発明のもう１つの側面は、固相オリゴ合成、好ましくはオリゴヌクレオチド合成での使用に適した固形支持体に関し、この支持体は、以下の式：
【００４４】
【化２８】
2004503560.tif 000008
（式中、Ｊ１、Ｊ２、ＲＬ、Ｑ、Ｂ、Ｙ、及びＺは、本明細書に定義される通りである）を有する。
【００４５】
１つの好ましい態様では、固形支持体が以下の式：
【００４６】
【化２９】
2004503560.tif 000009
を有する。
【００４７】
本発明のもう１つの側面は、本明細書に記載のような方法により製造される、固相オリゴ合成、好ましくはオリゴヌクレオチド合成での使用に適した固形支持体に関する。
【００４８】
本発明のもう１つの側面は、オリゴ合成、好ましくはオリゴヌクレオチド合成の方法に関し、この方法は、本明細書に記載のような普遍固形支持体の製造法を利用する。
【００４９】
本発明のもう１つの側面は、オリゴ合成、好ましくはオリゴヌクレオチド合成の方法に関し、この方法は、本明細書に記載のような普遍固形支持体を利用する。
【００５０】
本発明のもう１つの側面は、オリゴ合成、好ましくはオリゴヌクレオチド合成の方法を使用して製造されたオリゴヌクレオチドに関し、この方法は、本明細書に記載のような普遍固形支持体の製造法を利用する。
【００５１】
本発明のもう１つの側面は、オリゴ合成、好ましくはオリゴヌクレオチド合成の方法を使用して製造されたオリゴヌクレオチドに関し、この方法は、本明細書に記載のような普遍固形支持体を利用する。
【００５２】
当業者には、本発明の個々の側面及び態様の特別な特徴が、本発明の他の側面及び態様にも関わることが明らかであろう。
発明の詳細な説明
本発明の１つの側面は、オリゴ合成の普遍固形支持体の製造法に関し、この支持体は、例えば、固相オリゴヌクレオチド合成に有用である。
【００５３】
本明細書で使用される「オリゴ合成」という用語は、典型的には、但し絶対的ではないが、モノマー単位からのオリゴマー若しくはポリマーの合成に関し、オリゴマー若しくはポリマーの組成は関係ない。好ましいオリゴ合成は、オリゴヌクレオチド合成である。
【００５４】
本明細書で使用される「オリゴヌクレオチド合成」という用語は、典型的には、但し絶対的ではないが、モノマー単位（例、ヌクレオシドホスホロアミダイト）からのオリゴヌクレオチドと、その類似体、模擬体、及び誘導体の合成に関する。
【００５５】
本明細書で使用されるように、「固相オリゴヌクレオチド合成」という用語は、周知の「液相オリゴヌクレオチド合成」法の場合とは対照的に、成長するオリゴマー（例、オリゴヌクレオチド）が固形支持体へ支持されているか又は他のやり方で付いている（即ち、共有連結している）合成法を記載するために慣用的な意味で使用される。
【００５６】
固形支持体
「固形支持体」という用語は、本明細書では慣用的な意味で使用され、有機化学合成、より特定すると、固相オリゴヌクレオチド合成において慣用的に使用される固形支持体を意味する。
【００５７】
固形支持体は、典型的には、１つ以上の不溶性若しくは実質的に不溶性の材料から形成され、この材料は無機物又は有機物であり得て、この材料は、オリゴヌクレオチド合成（例、脱保護化、カップリング、酸化、切り離し、等）の間に使用される試薬及び条件に関して化学的に不活性（又は実質的に化学的に不活性）である。
【００５８】
１つの態様では、固形支持体が、無機のマクロ細孔性材料から形成される。無機材料の例には、限定されないが、シリカ、ケイソウ土、多孔ガラス、アルミノケイ酸塩、ホウケイ酸塩、金属酸化物（例えば、酸化アルミニウム、酸化ニッケル、及び酸化鉄）、及び／又は粘土が含まれる。
【００５９】
１つの態様では、固形支持体が有機ポリマー材料から形成され、このポリマー材料は、場合により架橋結合している。有機ポリマー材料の例には、限定されないが、セルロース、多糖、架橋多糖、ポリスチレン、架橋ポリスチレン、ポリアクリロイルモルホリド、ポリアミド樹脂、ポリアクリロイルピロリドン、ポリエチレングリコール、架橋ポリエチレングリコール、ポリエチレングリコール−ポリスチレン、架橋デキストラン、及び／又は架橋アガロースが含まれる。
【００６０】
１つの態様では、固形支持体が無機材料と有機ポリマー材料の両方から形成される。そのような固形支持体の例には、限定されないが、アクリルアミド−ケイソウ土樹脂、ＰＥＰＳＹＮ　Ｋ樹脂、及びＰＯＬＹＨＩＰＥ樹脂が含まれる。
【００６１】
本発明での使用に適している、通常使用される固形支持体には、限定されないが、制御孔ガラスビーズ（ＣＰＧ）（例えば、Ｃｒｕａｃｈｅｍ（登録商標）由来）、シリカゲルビーズ（例えば、Ｍｅｒｃｋ（登録商標）又はＣＰＧ社（登録商標）由来）、及びポリスチレンビーズ（例えば、Ｐｏｒａｓｉｌ　Ｃ（登録商標）由来）が含まれる。
【００６２】
オリゴヌクレオチド合成に関連して使用されてきた他の既知の固形支持体も、本発明による使用に適している（例えば、Ｇａｉｔ， １９８４ と Ｋｏｅｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９９０ を参照のこと）。
【００６３】
固形支持体は好適な形態であればよく、限定されないが、樹脂、粒子、ビーズ、繊維、フィルム、等が含まれる。
本発明での使用のために、固形支持体は「官能化」されなければならない、即ち、１つ以上の付帯官能基が固形支持体へ共有連結されている形態であるか、又はその形態になるように誘導化されなければならない。これらの付帯官能基により、例えば、固相オリゴヌクレオチド合成において、分子の固形支持体への付加、合成、伸張、及び／又は成長が可能になる。
【００６４】
付帯官能基の例には、限定されないが、−ＮＨ２、−ＯＨ、及び−ＳＨが含まれ、本明細書では−Ｊ１−Ｈ（Ｊ１は、それぞれ、−ＮＨ−、−Ｏ−、又は−Ｓ−である）として明示される。これらの場合、固形支持体と付帯官能基は、以下に示されるように明示され得る。好ましい態様では、付帯官能基が−ＮＨ２である。
【００６５】
【化３０】
2004503560.tif 000010
固形支持体が官能化され得る方法の例は、Ｇａｉｔ ｅｔ ａｌ．， １９８４ に記載されている。例えば、１つの態様では、アミノ付帯官能基が、以下に示されるように（Ｇａｉｔ ｅｔ ａｌ．， １９８４ の４６頁を参照のこと）、シロキシ基を介して固形支持体へ連結され得る。
【００６６】
【化３１】
2004503560.tif 000011
付帯基は、定常法を使用して分子を共有連結により付けるために使用され得る。そのような連結の例には、限定されないが、アミド連結（−ＮＨ−ＣＯ−）、エステル連結（−Ｏ−ＣＯ−）、及びチオエステル連結（−Ｓ−ＣＯ−）（いずれも、本明細書では−Ｊ１−ＣＯ−と明示される）が含まれる。
【００６７】
リンカー試薬とリンカー基
本明細書で使用される「リンカー試薬」という用語は、式：
【００６８】
【化３２】
2004503560.tif 000012
（式中、Ｘ１とＸ２はハロゲン基を示し、独立して、−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒ、又は−Ｉであり、そしてＲＬは、共有結合若しくは二価基を示す）の化合物に関する。１つの好ましい態様では、Ｘ１とＸ２が、独立して、−Ｃｌ、−Ｂｒ、又は−Ｉである。
【００６９】
本明細書で使用される「付帯リンカー基」という用語は、リンカー試薬から誘導され、以下の式：
【００７０】
【化３３】
2004503560.tif 000013
を有する一価部分に関する。
【００７１】
本明細書で使用される「リンカー基」という用語は、リンカー試薬から誘導され、以下の式：
【００７２】
【化３４】
2004503560.tif 000014
を有する二価部分に関する。
【００７３】
１つの態様では、以下に論じられるように、ＲＬが共有結合である。
１つの態様では、ＲＬが、１〜１０の炭素原子と酸素、窒素、及びイオウから選択される０〜５のヘテロ原子を含んでなる有機基である二価基を示す。
【００７４】
１つの態様では、ＲＬが二価Ｃ１−１０アルキレン基を示す。本明細書で使用される「二価Ｃ１−１０アルキレン基」という用語は、Ｃ１−１０アルカンの２つの異なる炭素原子のそれぞれから１つの水素原子を除去することによって得られる二価の部分に関する。
【００７５】
本明細書で使用される「Ｃ１−１０アルカン」という用語は、１〜１０の炭素原子を有する炭化水素化合物（水素と炭素の原子だけを含有する化合物）に関し、この化合物は、脂肪族若しくは脂環式であるか、又はその組合せであって、飽和しているか、部分的に不飽和であるか、又は完全に不飽和であり得る。
【００７６】
本明細書で使用される「脂肪族」という用語は、直鎖若しくは分岐鎖であるが、環式ではない基に関する。本明細書で使用される「脂環式」という用語は、１つの環、又は、２つ又はそれ以上の環（例、スピロ環、縮合環、ブリッジ環）を有するが、芳香族ではない基に関する。本明細書で使用される「飽和している」という用語は、炭素−炭素二重結合も炭鎖−炭素三重結合も有さない基に関する。本明細書で使用される「不飽和」という用語は、少なくとも１つの炭素−炭素二重結合若しくは炭素−炭素三重結合を有する基に関する。
【００７７】
飽和直鎖Ｃ１−１０アルカンの例には、限定されないが、メタン、エタン、ｎ−プロパン、ｎ−ブタン、ｎ−ペンタン、及びｎ−ヘキサンが含まれる。
飽和分岐鎖Ｃ１−１０アルカンの例には、限定されないが、イソブタン、イソペンタン、ｎｅｏ−ペンタン、及びイソヘキサンが含まれる。
【００７８】
飽和脂環式（炭素環式）Ｃ１−１０アルカン（「Ｃ３−１０シクロアルカン」とも呼ばれる）の例には、限定されないが、シクロプロパン、シクロブタン、シクロペンタン、シクロヘキサン、並びに、メチルシクロプロパン、メチルシクロブタン、メチルシクロペンタン、及びメチルシクロへキサンが含まれる。
【００７９】
１つ以上の炭素−炭素二重結合を有する不飽和Ｃ１−１０アルカン（「Ｃ２−７アルケン」とも呼ばれる）の例には、限定されないが、エテン、プロペン、ブテン、及びブタジエンが含まれる。
【００８０】
１つ以上の炭素−炭素三重結合を有する不飽和Ｃ１−１０アルカン（「Ｃ２−７アルキン」とも呼ばれる）の例には、限定されないが、エチン、プロピン、ブチン、及びブタジインが含まれる。
【００８１】
１つ以上の炭素−炭素二重結合を有する不飽和脂環式（炭素環式）Ｃ１−１０アルカン（「Ｃ３−１０シクロアルケン」とも呼ばれる）の例には、限定されないが、シクロプロペン及びシクロヘキセン、並びに、そのような基を含む基が含まれ、限定されないが、メチルシクロプロペン及びメチルシクロヘキセンが含まれる。
【００８２】
１つの好ましい態様では、Ｃ１−１０アルカンが、式ＣＨ３（ＣＨ２）ｎＣＨ３の飽和直鎖アルカンであり、ここでｎは１〜８の整数である。そのような飽和直鎖Ｃ１−１０アルカンの例には、限定されないが、メタン、エタン、プロパン、ｎ−ブタン、及びｎ−ペンタンが含まれる。
【００８３】
１つの好ましい態様では、ＲＬが式−（ＣＨ２）ｎ−を有し、ここでｎは１〜１０の整数である。１つの好ましい態様では、ｎが１〜８の整数である。１つの好ましい態様では、ｎが１〜６の整数である。１つの好ましい態様では、ｎが１〜４の整数である。１つの好ましい態様では、ｎが１〜３の整数である。１つの好ましい態様では、ｎが１〜２の整数である。そのような基の例には、限定されないが、メチレン（ｎ＝１，−ＣＨ２−）、エチレン（ｎ＝２，−ＣＨ２ＣＨ２−）、トリメチレン（ｎ＝３，−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−）、テトラメチレン（ｎ＝４，−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−）、及びペンタメチレン（ｎ＝５，−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−）が含まれる。
【００８４】
１つの好ましい態様では、ＲＬが式−（ＣＨ２）ｎ−であり、ここでｎは０〜１０の整数である（ｎが０である場合、ＲＬは共有結合である）。１つの好ましい態様では、ｎが０〜８の整数である。１つの好ましい態様では、ｎが０〜６の整数である。１つの好ましい態様では、ｎが０〜４の整数である。１つの好ましい態様では、ｎが０〜３の整数である。１つの好ましい態様では、ｎが０〜２の整数である。１つの好ましい態様では、ｎが０又は１である。１つの好ましい態様では、ｎが０であり、ＲＬが共有結合である。
【００８５】
１つの好ましい態様では、リンカー試薬が式：
【００８６】
【化３５】
2004503560.tif 000015
を有し、ここで、Ｘ１とＸ２は、独立して、−Ｃｌ、−Ｂｒ、又は−Ｉであり、ｎは、０〜１０、より好ましくは０〜８、より好ましくは０〜６、より好ましくは０〜４、より好ましくは０〜３、より好ましくは０〜２の整数である。１つの好ましい態様では、ｎが０又は１である。１つの好ましい態様では、ｎが０である。
【００８７】
１つの好ましい態様では、Ｘ１とＸ２が、独立して、−Ｃｌ又は−Ｂｒである。１つの好ましい態様では、Ｘ１とＸ２が同一である。１つの好ましい態様では、Ｘ１とＸ２がいずれも−Ｃｌであるか、又はいずれも−Ｂｒである。１つの好ましい態様では、Ｘ１とＸ２がいずれも−Ｃｌである。
【００８８】
１つの好ましい態様では、ＲＬが共有結合であって、リンカー試薬が構造Ｘ１−ＣＯ−ＣＯ−Ｘ２を有する。そのような化合物は、好便にも、「二ハロゲン化オキサリル」と呼ばれる場合がある。１つの好ましい態様では、ＲＬが共有結合であって、Ｘ１とＸ２が同一である。１つの好ましい態様では、ＲＬが共有結合であって、Ｘ１とＸ２がいずれも−Ｃｌであるか、又はいずれも−Ｂｒである。１つの好ましい態様では、ＲＬが共有結合であって、Ｘ１とＸ２がいずれも−Ｃｌであり、リンカー試薬が下記に示される通りであって、以下に示される、−１６℃の融点と約６４℃の沸点（１気圧）を有する、二塩化オキサリルとしばしば呼ばれる。
【００８９】
【化３６】
2004503560.tif 000016
１つの好ましい態様では、ＲＬが−ＣＨ２−であって、リンカー試薬が構造Ｘ１−ＣＯ−ＣＨ２−ＣＯ−Ｘ２を有する。そのような化合物は、好便にも、「二ハロゲン化マロニル」と呼ばれる場合がある。１つの好ましい態様では、ＲＬが−ＣＨ２−であって、Ｘ１とＸ２が同一である。１つの好ましい態様では、ＲＬが−ＣＨ２−であって、Ｘ１とＸ２がいずれも−Ｃｌであるか、又はいずれも−Ｂｒである。１つの好ましい態様では、ＲＬが−ＣＨ２−であって、Ｘ１とＸ２がいずれも−Ｃｌであり、リンカー試薬が下記に示される通りであって、以下に示される、約５８℃の沸点（２６ｍｍＨｇ，３．５ｋＰａ）を有する、二塩化マロニルとしばしば呼ばれる。
【００９０】
【化３７】
2004503560.tif 000017
１つの好ましい態様では、ＲＬが−ＣＨ２−であって、リンカー試薬が構造Ｘ１−ＣＯ−ＣＨ２ＣＨ２−ＣＯ−Ｘ２を有する。そのような化合物は、好便にも、「二ハロゲン化スクシニル」と呼ばれる場合がある。１つの好ましい態様では、ＲＬが−ＣＨ２ＣＨ２−であって、Ｘ１とＸ２が同一である。１つの好ましい態様では、ＲＬが−ＣＨ２ＣＨ２−であって、Ｘ１とＸ２がいずれも−Ｃｌであるか、又はいずれも−Ｂｒである。１つの好ましい態様では、ＲＬが−ＣＨ２ＣＨ２−であって、Ｘ１とＸ２がいずれも−Ｃｌであり、リンカー試薬が下記に示される通りであって、以下に示される、２０℃の融点と約１９４℃の沸点（１気圧）を有する、二塩化スクシニルとしばしば呼ばれる。
【００９１】
【化３８】
2004503560.tif 000018
１つの態様では、ＲＬが１〜１０の炭素原子と酸素、窒素、及びイオウから選択される０〜５のヘテロ原子を含んでなる有機基である二価基を示し、この二価基のＲＬは、場合により置換されるＣ１−１０アルキレン基と場合により置換されるＣ５−２０アリーレン基から選択される１つ以上の部分を含み、これらの基は（複数存在する場合）共有結合若しくは共有連結を介して連結され、この二価基のＲＬには、場合により、一方若しくは両方の末端に、末端共有ヘテロ原子連結が含まれ、この場合、それは、隣接したカルボニル基とより大きな共有連結を形成し得る。共有ヘテロ原子連結の例には、限定されないが、エーテル連結（−Ｏ−）及びチオエーテル連結（−Ｓ−）が含まれる。末端に位置づけられる場合、これらの連結は、それぞれエステル（−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−）及びチオエステル（−Ｃ（＝Ｏ）Ｓ−）連結を形成する。
【００９２】
本明細書で使用される「Ｃ５−２０アリーレン基」という用語は、場合により置換されるＣ５−２０アレーンの２つの異なる炭素原子のそれぞれから１つの水素原子を除去することによって得られる二価部分に関する。
【００９３】
１つの態様では、ＲＬが、２−（２−ニトロフェニル）エチルと呼ばれる、以下の基を示す。例えば、Ｅｒｉｔｊａ ｅｔ ａｌ．， １９９１ を参照のこと。
【００９４】
【化３９】
2004503560.tif 000019
１つの態様では、ＲＬが、Ｑ−支持体と呼ばれる、以下の基を示す。例えば、Ｐｏｎ ｅｔ ａｌ．， １９９７ を参照のこと。
【００９５】
【化４０】
2004503560.tif 000020
１つの態様では、ＲＬが、３’−アルキルカルボン酸と呼ばれる、以下の基を示す。例えば、Ｔｒａｃｙ ｅｔ ａｌ．， １９９７ を参照のこと。
【００９６】
【化４１】
2004503560.tif 000021
リンカー試薬の合成法は当技術分野で知られている。実際、リンカー試薬の多くは市販されている。
【００９７】
好ましくは、リンカー試薬は、常圧（１気圧）と関連（ｒｅｌｅｖａｎｔ）温度、特に、固形支持体の付帯官能基をリンカー試薬と反応させる工程が実施される温度、及び／又は過剰な未反応リンカー試薬の少なくとも一部を蒸発により除去する工程が実施される温度、好ましくは後者の温度で液体であるように選択される。
【００９８】
好ましくは、リンカー試薬は、関連温度で揮発化合物であるように選択される。本明細書で使用される「揮発」という用語は、関連温度で、好ましくは少なくとも１０Ｐａ（約０．０７５ｍｍＨｇ）、より好ましくは少なくとも１００Ｐａ（約０．７５ｍｍＨｇ）、より好ましくは少なくとも１０００Ｐａ（約７．５ｍｍＨｇ）の実質蒸気圧を有する化合物（例、リンカー試薬）を記載する。
【００９９】
より好ましくは、リンカー試薬は、関連温度で揮発液体であるように選択される。
環式試薬
本明細書で使用される「環式試薬」という用語は、式：
【０１００】
【化４２】
2004503560.tif 000022
｛式中：
Ｑは、環式基を示し；
Ｂは、塩基性基を示し；
Ｗは、反応共役基を示し；
Ｙは、オリゴ合成基を示し；そして、
Ｚは、存在する場合、補助基を示す｝の化合物に関する。
【０１０１】
環式基、Ｑ
本明細書で使用される「環式基」という用語は、単一の非芳香環を有する部分に関し、この環は５〜７の環原子を有し、この環原子は（ａ）すべて炭素原子である（この場合、この環は「炭素環式環」と呼ばれる場合がある）か、又は（ｂ）炭素原子と、酸素、窒素、及びイオウから選択される１若しくは２つのヘテロ原子である（この場合、この環は「ヘテロ環式環」と呼ばれる場合がある）。
【０１０２】
環原子を結ぶ環結合は、単結合、二重結合、又は三重結合であり得るが、環そのものが芳香族であってはならない。１つの好ましい態様では、環結合が単結合又は二重結合である。１つの好ましい態様では、環結合がすべて単結合である。
【０１０３】
１つの好ましい態様では、環式基が単一の非芳香環を有し、この環は５若しくは６つの環原子を有し、この環原子は（ａ）すべて炭素原子であるか、又は（ｂ）炭素原子と、酸素、窒素、及びイオウから選択される１若しくは２つのヘテロ原子であり、すべての環結合が単結合である。
【０１０４】
１つの好ましい態様では、環式基が単一の非芳香環を有し、この環は５若しくは６つの環原子を有し、この環原子は（ａ）すべて炭素原子であるか、又は（ｂ）炭素原子と１つの酸素原子であり、すべての環結合が単結合である。
【０１０５】
１つの好ましい態様では、環式基が単一の非芳香環を有し、この環は５つの環原子を有し、この環原子は（ａ）すべて炭素原子であるか、又は（ｂ）炭素原子と１つの酸素原子であり、すべての環結合が単結合である。
【０１０６】
１つの好ましい態様では、環式基が単一の非芳香環を有し、この環は６つの環原子を有し、この環原子は（ａ）すべて炭素原子であるか、又は（ｂ）炭素原子と１つの酸素原子であり、すべての環結合が単結合である。
【０１０７】
１つの好ましい態様では、環式基が単一の非芳香環を有し、この環は５つの環原子を有し、この環原子はすべて炭素原子であり、すべての環結合が単結合である。この場合、この環はシクロペンタン環である。
【０１０８】
【化４３】
2004503560.tif 000023
１つの好ましい態様では、環式基が単一の非芳香環を有し、この環は６つの環原子を有し、この環原子はすべて炭素原子であり、すべての環結合が単結合である。この場合、この環はシクロヘキサン環である。
【０１０９】
【化４４】
2004503560.tif 000024
１つの好ましい態様では、環式基が単一の非芳香環を有し、この環は５つの環原子を有し、この環原子は炭素原子と１つの酸素原子であり、すべての環結合が単結合である。この場合、この環はテトラヒドロフラン環である。
【０１１０】
【化４５】
2004503560.tif 000025
１つの好ましい態様では、環式基が単一の非芳香環を有し、この環は６つの環原子を有し、この環原子は炭素原子と１つの酸素原子であり、すべての環結合が単結合である。この場合、この環はテトラヒドロピラン環である。
【０１１１】
【化４６】
2004503560.tif 000026
塩基性基のＢ、反応共役基のＷ、オリゴ合成基のＹ、及び補助基のＺは、存在する場合、それぞれ個別に、直接的に（共有結合を介して）か又は間接的に（中間共有連結を介して）環式基Ｑの炭素環原子へ付く。中間共有連結の例には、限定されないが、−（ＣＨ２）ｎ−（ここでｎは１〜４の整数である）、例えば−ＣＨ２−及び−ＣＨ２ＣＨ２−が含まれる。１つの好ましい態様では、これらの基は直接的に付く。
【０１１２】
１つの好ましい態様では、オリゴ合成基のＹと、存在する補助基のＺが、それぞれ直接的に、環式基Ｑの隣接した炭素環原子へ付く。１つの好ましい態様では、上記の基がｃｉｓ配向で付く。
【０１１３】
環式基はまた、他の所望の置換基、即ち、Ｂ、Ｗ、Ｙ、及びＺ以外の置換基を有する場合がある。そのような所望の置換基の例には、限定されないが、Ｃ１−７アルキル基、Ｃ１−７アルコキシ基、及びアシル基が含まれる。
【０１１４】
塩基性基、Ｂ
塩基性基のＢは、核酸塩基から誘導される。「核酸塩基」、「ヌクレオチド塩基」、及び「ヌクレオシド塩基」という用語は、本明細書では慣用的な意味で使用され、核酸中に典型的に見出されるような、プリン及びピリミジンの塩基とその誘導体及び類似体を意味する。
【０１１５】
好ましい核酸塩基には、よく知られた天然に存在するプリン：アデニン及びグアニンとピリミジン：シトシン、チミン、及びウラシルが含まれる。当技術分野で知られている核酸の他の例にはプリン及びピリミジンの誘導体及び類似体が含まれ、それには限定されないが、サルシン（ｓａｒｃｉｎｅ）（ヒポキサンチン若しくはサルキンとしても知られている）、アジリジニルシトシン、４−アセチルシトシン、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−メチルアデニン、１−メチルシュードウラシル、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−メチルアデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、β−Ｄ−マンノシルクエオシン、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、シュードウラシル、クエオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸、５−ペンチニルウラシル、及び２，６−ジアミノプリンが含まれる。
【０１１６】
１つの好ましい態様では、塩基性基のＢが、アデニン、グアニン、シトシン、チミン、ウラシル、及びサルシン（ヌクレオシドのイノシンに関連した塩基）からなる群から選択される核酸塩基、又はその保護化形態から誘導される。１つの好ましい態様では、塩基性部分のＢが、サルシン又はその保護化形態から誘導される。
【０１１７】
環原子が慣用的にダッシュ（‘）のつかない数（ｕｎｐｒｉｍｅｄ ｎｕｍｂｅｒ）で数えられる塩基性部分のＢは、好ましくは、塩基の環原子を介して環式試薬へ共有結合する。塩基は、好ましくは、塩基の環窒素原子を介して付く。ピリミジンでは、（Ｎ）−１位での付加が好ましいのに対し、プリンでは、（Ｎ）−９位での付加が好ましい。
【０１１８】
１つの好ましい態様では、塩基性基のＢが以下のもの又はその保護化形態から選択される：
【０１１９】
【化４７】
2004503560.tif 000027
１つの好ましい態様では、塩基性基のＢが以下のものであるか、又はその保護化形態である：
【０１２０】
【化４８】
2004503560.tif 000028
塩基性基のＢの反応性官能基は、保護化又は非保護化の形態であり得る。そのような官能基の保護化形態は当技術分野でよく知られている。例えば、アデニン、グアニン、及びシトシンで見出されるような一級アミン（−ＮＨ２）は、アミド、例えば、イソブチルアミド又はベンズアミドとして保護化され得る。そのような保護化は、しばしばオリゴヌクレオチド合成の間に利用される。
【０１２１】
本明細書で使用される「保護化」という用語は、特定条件の下で他の利用可能な官能基に対してほとんど反応しない官能基を意味する。「官能基の保護化」という用語は、本明細書では慣用的な化学の意味で使用され、（ｐＨ、温度、放射線、溶媒、等のような）特定条件の下で、他のやり方では反応性になる官能基を可逆的に非反応性にするために利用される通常の化学的方法を意味する。そのような「保護化」、「ブロッキング」、又は「マスキング」の多種多様な方法が広く使用されていて、有機合成においてよく知られている。例えば、２つの同等でない反応性官能基を有し、その両方が特定条件の下では反応性になる化合物は、その官能基の一方を「保護化」、従って、特定条件の下で非反応性になるように誘導化し得て；このように保護化されると、その化合物は、有効にも１つだけの反応官能基を有する反応体として使用され得る。（他方の官能基が関与する）所望の反応が完了した後で、保護化された基を「脱保護化」して、その元の官能性へそれを戻すことが可能である。
【０１２２】
反応共役基、Ｗ
本明細書で使用される「反応共役基（ｒｅａｃｔｉｖｅ ｃｏｎｊｕｇａｔｉｎｇ）」という用語は、リンカー試薬の−Ｃ（＝Ｏ）Ｘ２基と反応して共有連結を形成することによって、それとコンジュゲートを形成する官能基を意味する。
【０１２３】
好ましい態様では、反応共役基のＷが−Ｊ２−Ｈ（ここでＪ２は−Ｏ−、−ＮＨ−、又は−Ｓ−である）であり、即ち、反応共役基のＷは、それぞれ−ＯＨ、−ＮＨ２、又は−ＳＨである。この場合、環式試薬は、以下の式：
【０１２４】
【化４９】
2004503560.tif 000029
を有する。
【０１２５】
１つの好ましい態様では、反応共役基が−ＯＨ又は−ＮＨ２である。１つの好ましい態様では、反応共役基が−ＯＨである。
反応共役基が−Ｊ２−Ｈである場合、−Ｃ（＝Ｏ）Ｘ２との反応時に形成される共有連結は−Ｃ（＝Ｏ）−Ｊ２、即ち、それぞれ、−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−、−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−、及び−Ｃ（＝Ｏ）−Ｓ−である。
【０１２６】
以下に論じるように、反応共役基は、例えば、Ｎ−メチルイミダゾール（ＮＭＩ）及び／又は４−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）のような塩基の存在により活性化され得る。そのような活性化は、反応共役基とリンカー試薬の−Ｃ（＝Ｏ）Ｘ２基との反応を促進する、及び／又は加速化する。
【０１２７】
オリゴ合成基、Ｙ
本明細書で使用される「オリゴ合成基」という用語は、オリゴ合成を促進する官能基、又は保護化官能基、即ち、脱保護化及び／又は誘導化の形態である場合に好適なモノマーと反応し、所望のオリゴマーの成長を始動させる基を意味する。
【０１２８】
１つの態様では、オリゴ合成基のＹが、−ＯＨ、−ＮＨ２、又は−ＳＨであるか、又はその保護化形態である。１つの態様では、オリゴ合成基のＹが−ＯＨであるか、又はその保護化形態である。
【０１２９】
１つの態様では、オリゴ合成基のＹが保護化形態の−ＯＨ、−ＮＨ２、又は−ＳＨであり、これは、オリゴ合成において使用される脱保護化条件の下で脱保護化される。例えば、この基は、慣用的なオリゴヌクレオチド（例、ホスホロアミダイト）合成サイクル中の脱保護化工程で使用される条件の下で脱保護化され、このようにして、第一のヌクレオチドを付けるためのアンカーとして利用可能になる。典型的には、そして好ましくは、脱保護化工程は酸性条件を利用する。
【０１３０】
−ＯＨを−ＯＲとして保護する好適な保護基、Ｒの例には、限定されないが：ｔ−ブチル（ｔＢｕ）；
４−ジメトキシトリチル（ＭＭＴ）；
４，４’−ジメトキシトリチル（ＤＭＴ）；
４，４’，４’’−ｔｒｉｓ−（ベンジルオキシ）トリチル（ＴＢＴｒ）；
４，４’，４’’−ｔｒｉｓ−（４，５−ジクロロフタルイミド）トリチル（ＣＰＴｒ）；
４，４’，４’’−ｔｒｉｓ−（レブリニルオキシ）トリチル（ＴＬＴｒ）；
３−（イミダゾリルメチル）−４，４’−ジメトキシトリチル（ＩＤＴｒ）；
９−フェニルキサンテン−９−イル（ピキシル）；
９−（ｐ−メトキシフェニル）キサンテン−９−イル（Ｍｏｘ）；
４−デシルオキシトリチル（Ｃ１０Ｔｒ）；
４−ヘキサデシルオキシトリチル（Ｃ１６Ｔｒ）；
９−（４−オクタデシルオキシフェニル）キサンテン−９−イル（Ｃ１８Ｐｘ）；及び、
１，１−ｂｉｓ−（４−メトキシフェニル）−１’−ピレニルメチル（ＢＭＰＭ）が含まれる。
【０１３１】
−ＮＨ２を−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−ＯＲとして保護する、好適な保護基、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲの例には、限定されないが、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル（−Ｃ（＝Ｏ）−ＯＣ（ＣＨ３）３，ｔ−Ｂｏｃ）；及び、ベンジルオキシカルボニル（−Ｃ（＝Ｏ）−ＯＣＨ２Ｐｈ，ＣＢＺ）が含まれる。
【０１３２】
これらと他の好適な保護基については、例えば、Ｂｅａｕｃａｇｅ ｅｔ ａｌ．， １９９２ に記載されている。
補助基、Ｚ
本明細書で使用される「補助基」という用語は、場合により選択され、存在する場合、官能基、より好ましくは、保護化官能基である基を意味する。１つの態様では、補助基が保護化され、慣用的な（例、ホスホロアミダイト）オリゴヌクレオチド合成の間は安定していて、合成の後では、切り離しと同時に、即ち、慣用的な切り離し条件の下で脱保護化される。このように、保護化形態の補助基は、典型的には、保護化形態のオリゴ合成基と異なる。なぜなら、前者がオリゴ合成の間安定しているのに対し、後者は、オリゴ合成の１つ以上の工程の間、脱保護化されているか又は脱保護化の形態であるからである。
【０１３３】
補助基のＺは、保護化若しくは脱保護化の形態で、オリゴ合成基のＹと相互作用する、及び／又はそれと一緒に官能基を形成する。
１つの態様では、補助基のＺが−ＯＨ、−ＮＨ２、又は−ＳＨであるか、又はその保護化形態である。１つの好ましい態様では、補助基が−ＯＨ又はその保護化形態である。
【０１３４】
１つの好ましい態様では、補助基のＺとオリゴ合成基のＹの両方が、脱保護化形態では−ＯＨであり、そして保護化形態では、以下に示されるように、一緒にＯ−Ｏ−メトシキエチリデン基と環式構造の一部を形成する：
【０１３５】
【化５０】
2004503560.tif 000030
１つの好ましい態様では、補助基が脱保護化形態で−ＯＨであり、保護化形態で−ＯＲである（ここで、Ｒは、アシル基、Ｃ１−７アルキル基、又はシリル基である）。
【０１３６】
１つの好ましい態様では、補助基が、脱保護化形態では−ＯＨであり、保護化形態では−ＯＲである（ここで、Ｒはアシル基である）。
本明細書で使用される「アシル基」という用語は、式−Ｃ（＝Ｏ）Ｒの部分に関し、ここで、Ｒはアシル置換基、例えばＣ１−７アルキル基（Ｃ１−７アルキルアシルと呼ばれる基になる）、Ｃ３−２０ヘテロシクリル基（Ｃ３−２０ヘテロシクリルアシルと呼ばれる基になる）、又はＣ５−２０アリール基（Ｃ５−２０アリールアシルと呼ばれる基になる）、好ましくはＣ１−７アルキル基である。アシル基の例には、限定されないが、−Ｃ（＝Ｏ）ＣＨ３（アセチル）、−Ｃ（＝Ｏ）ＣＨ２ＣＨ３（プロピオニル）、−Ｃ（＝Ｏ）ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３（ｎ−ブタノイル）、−Ｃ（＝Ｏ）Ｃ（ＣＨ３）３（ｔ−ブタノイル）、及び−Ｃ（＝Ｏ）Ｐｈ（ベンゾイル）が含まれる。
【０１３７】
本明細書で使用される「Ｃ１−７アルキル基」という用語は、脂肪族若しくは脂環式、又はその組合せであり得て、飽和、一部不飽和、又は完全不飽和であり得る、１〜７の炭素原子を有する一価のアルキル基に関する。
【０１３８】
飽和直鎖Ｃ１−７アルキル基の例には、限定されないが、メチル、エチル、ｎ−プロピル、ｎ−ブチル、及びｎ−ペンチル（アミル）が含まれる。
飽和分岐鎖Ｃ１−７アルキル基の例には、限定されないが、イソプロピル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、及びｎｅｏ−ペンチルが含まれる。
【０１３９】
飽和脂環式（炭素環式）Ｃ１−７アルキル基（「Ｃ３−７シクロアルキル」基とも呼ばれる）の例には、限定されないが、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、及びシクロヘキシル、並びに、そのような基を含む基が含まれ、限定されないが、シクロプロピルメチル及びシクロヘキシルメチルが含まれる。
【０１４０】
１つ以上の炭素−炭素二重結合を有する不飽和Ｃ１−７アルキル基（「Ｃ２−７アルケニル」基とも呼ばれる）の例には、限定されないが、エテニル（ビニル）及び２−プロペニル（アリル）が含まれる。
【０１４１】
１つ以上の炭素−炭素三重結合を有する不飽和Ｃ１−７アルキル基（「Ｃ２−７アルキニル」基とも呼ばれる）の例には、限定されないが、エチニル及び２−プロピニル（プロパルギル）が含まれる。
【０１４２】
１つ以上の炭素−炭素二重結合を有する不飽和脂環式（炭素環式）Ｃ１−７アルキル基（「Ｃ３−７シクロアルケニル」基とも呼ばれる）の例には、限定されないが、シクロプロペニル及びシクロヘキセニル、並びに、そのような基を含む基が含まれ、限定されないが、シクロプロペニルメチル及びメチルシクロヘキセニルメチルが含まれる。
【０１４３】
本明細書で使用される「Ｃ３−２０ヘテロシクリル」という用語は、脂環式（即ち、非芳香環式）化合物の環原子から水素原子を除去することによって得られる一価部分に関し、前記化合物は、３〜２０の環原子（このうち１〜１０は環ヘテロ原子であって、限定されないが、窒素、酸素、及びイオウが含まれる）を有する、１つの環、又は２以上の環（例、スピロ、縮合、ブリッジ）を有する。好ましくは、それぞれの環は３〜７の環原子を有し、そのうち１〜４は環ヘテロ原子である。「Ｃ３−２０」は、炭素原子であれ、ヘテロ原子であれ、環原子を示す。
【０１４４】
１つの窒素環原子を有するＣ３−２０ヘテロシクリル基の例には、限定されないが、アジリジン、アゼチジン、ピロリジン、ピロリン、ピロリニン、ピペリジン、ジヒドロピリジン、及びテトラヒドロピリジンから誘導されるものが含まれる。
【０１４５】
１つの酸素環原子を有するＣ３−２０ヘテロシクリル基の例には、限定されないが、オキシラン、オキセタン、オキソラン（テトラヒドロフラン）、オキソール（ジヒドロフラン）、オキサン（テトラヒドロピラン）、ジヒドロピラン、及びピランから誘導されるものが含まれる。
【０１４６】
１つのイオウ環原子を有するＣ３−２０ヘテロシクリル基の例には、限定されないが、チオラン及びテトラヒドロチオピランから誘導されるものが含まれる。
２つの酸素環原子を有するＣ３−２０ヘテロシクリル基の例には、限定されないが、ジオキサンから誘導されるものが含まれる。
【０１４７】
２つの窒素環原子を有するＣ３−２０ヘテロシクリル基の例には、限定されないが、イミダゾリジン、イミダゾリン、及びピペラジンから誘導されるものが含まれる。
【０１４８】
１つの窒素環原子と１つの酸素環原子を有するＣ３−２０ヘテロシクリル基の例には、限定されないが、テトラヒドロオキサゾール、ジヒドロオキサゾール、テトラヒドロイソオキサゾール、ジヒドロイソオキサゾール、モルホリン、テトラヒドロオキサジン、及びジヒドロオキサジンから誘導されるものが含まれる。
【０１４９】
１つの酸素環原子と１つのイオウ環原子を有するＣ３−２０ヘテロシクリル基の例には、限定されないが、オキサチオラン及びオキサチアンが含まれる。
本明細書で使用される「Ｃ５−２０アリール」という用語は、芳香族化合物（Ｃ５−２０アレーン）の環原子から１つの水素原子を除去することによって得られる一価部分に関し、前記化合物は、１つの環、又は２以上の縮合環を有し、５〜２０の環原子を有する。この環原子は、「カルボアリール基」のようにすべて炭素原子であり得るか、又は、「へテロアリール基」のように、１つ以上のヘテロ原子（限定されないが、酸素、窒素、及びイオウを含む）を含む場合がある。後者の場合、この基は、好便にも「Ｃ５−２０ヘテロアリール」基と呼ばれ、ここで「Ｃ５−２０」は、炭素原子であれ、ヘテロ原子であれ、環原子を示す。好ましくは、それぞれの環は３〜７の環原子を有し、その０〜４つは環ヘテロ原子である。
【０１５０】
ヘテロ原子を有さないＣ５−２０アリール基（即ち、カルボアリール基）の例には、限定されないが、フェニル、ナフチル、アントラセニル、フェナントレニル、及びピレンが含まれる。
【０１５１】
Ｃ５−２０ヘテロアリール基の例には、限定されないが、ピロリル、イミダゾリル、ピラゾリル、トリアゾリル、ピリジル、ピラジニル、ピリミジニル、ピリダジニル、トリアジニル、フラニル、チエニル、チアゾリル、イソチアゾリル、ピラニル、ピロニル、ベンゾピロニル、オキサゾリル、イソオキサゾリル、オキサジアゾリル、オキサトリアゾリル、オキサチアゾリル、及びオキサチアジニルが含まれる。
【０１５２】
本明細書で使用される「シリル基」という用語は、式−ＳｉＲ３の部分に関し、ここでＲはシリル置換基であって、例えば、−Ｈ、Ｃ１−７アルキル基、Ｃ３−２０ヘテロシクリル基、又はＣ５−２０アリール基、好ましくは、−Ｈ、Ｃ１−７アルキル基、又はＣ５−２０アリール基である。シリル基の例には、限定されないが、−ＳｉＨ３、−ＳｉＨ２（ＣＨ３）、−ＳｉＨ（ＣＨ３）２、−Ｓｉ（ＣＨ３）３、−Ｓｉ（ｔ−Ｂｕ）（ＣＨ３）２、−Ｓｉ（ｉ−Ｐｒ）３、及び−Ｓｉ（ｔ−Ｂｕ）３が含まれる。
【０１５３】
環式試薬の例
１つの好ましい態様では、オリゴ合成基のＹと所望の補助基のＺが共有結合により環式基のＱへ直接的に連結し、「隣接」位置にある（即ち、ＹとＺが、環式基Ｑの隣接した炭素環原子へ付いている）。隣接して付いたＹ及びＺの基を有する環式部分、Ｑの例には、限定されないが、以下のものが含まれる：
【０１５４】
【化５１】
2004503560.tif 000031
「Ｙ（Ｚ）」と「Ｚ（Ｙ）」という表記は、４つの可能性のすべてを示す：３’−Ｙ−２’−Ｚ；３’−Ｚ−２’−Ｙ；３’−Ｙ−２’−Ｈ（ここでＺは不在である、即ち、Ｚは−Ｈである）；及び３’−Ｈ−２’−Ｙ （ここでＺは不在である、即ち、Ｚは−Ｈである）。
【０１５５】
１つの好ましい態様では、Ｙ及びＺ基が「ｃｉｓ」にも位置づけられる。ｃｉｓで隣接して付いているＹ及びＺ基（いずれも環の「下に」ある）を有するそのような環式部分のＱの例には、限定されないが、以下のものが含まれる：
【０１５６】
【化５２】
2004503560.tif 000032
１つの好ましい態様では、Ｗ基が−ＣＨ２−基により環式基のＱへ共有連結し、Ｂ基が環式部分のＱへ直接的に連結される。そのような環式試薬の例には、限定されないが、以下のものが含まれる：
【０１５７】
【化５３】
2004503560.tif 000033
１つの態様では、環式試薬が単糖の糖に類似する。環式形態の糖は、環原子の数に従って慣用的に命名される。例えば、フラノースは５員環を有し、ピラノースは６員環を有する。糖はまた、慣用的に全体の炭素原子数に従っても命名される。例えば、ペントースは５つの炭素原子を有し、ヘキソースは６つの炭素原子を有する。環式形態の糖は、慣用的に、炭素原子の数と環置換基の配向の両方に従って、リボ（ｒｉｂｏ）−、リキソ（ｌｙｘｏ）−、キシロ（ｘｙｌｏ）−、ガラクト（ｇａｌａｃｔｏ）−、スクロ（ｓｕｃｒｏ）−、フルクト（ｆｒｕｃｔｏ）−、及びアラビノ（ａｒａｂｉｎｏ）−のような頭字語を使用してさらに命名される。さらに、糖は、その鏡像異性、ジアステレオ異性、又は立体異性の形態（例、Ｄ−、Ｌ−、α−、β−、及びその組合せ）のいずれでもあり得る。
【０１５８】
１つの好ましい態様では、環式試薬がβ−Ｄ−リボフラノース（β−Ｄ−リボースとも呼ばれる）、２’−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノース（２’−デオキシ−β−Ｄ−リボースとも呼ばれる）、又は３’−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノース（３’−デオキシ−β−Ｄ−リボースとも呼ばれる）に類似し、それらは以下の構造を有する：
【０１５９】
【化５４】
2004503560.tif 000034
このように、１つの好ましい態様では、環式試薬が以下の構造を有する。Ｚが存在する場合、この化合物は、β−Ｄ−リボヌクレオシドである。Ｚが不在である（即ち、Ｚが−Ｈである）場合、この化合物は、２’−デオキシ−β−Ｄ−リボヌクレオシドである。
【０１６０】
【化５５】
2004503560.tif 000035
１つの好ましい態様では、以下の構造に示されるように、例えば、Ｗが−ＯＨであり、Ｙが−ＯＨであるか又はその保護化形態であり、Ｚが、存在する場合、−ＯＨであるか又はその保護化形態である：
【０１６１】
【化５６】
2004503560.tif 000036
１つの好ましい態様では、環式試薬が、以下に示されるように、イノシンであるか又はその保護化形態である。
【０１６２】
【化５７】
2004503560.tif 000037
１つの好ましい態様では、環式試薬が、以下に示されるように、イノシン誘導体の９−β−Ｄ−（２’−３’−Ｏ−Ｏ−メトキシエチリデン−リボフラノシル）ヒポキサンチンであり、ここでは、２’−及び３’−ヒドロキシル基がＯ−Ｏ−メトキシエチリデン基としてともに保護されている。
【０１６３】
【化５８】
2004503560.tif 000038
反応装置
上記に述べたように、固相オリゴ合成での使用に適した固形支持体の製造の１工程は、例えば蒸発装置を使用して達成され得るように、過剰な未反応リンカー試薬の少なくとも一部を蒸発により除去する工程を伴う。
【０１６４】
このように、１つの態様では、本方法の１つ以上の工程が、蒸発装置を使用して（即ち、その内部で）実施される。１つの態様では、ともかくも、過剰な未反応リンカー試薬の少なくとも一部を蒸発により除去する工程が蒸発装置を使用して実施される。
【０１６５】
１つの態様では、ともかくも、固形支持体の付帯官能基をリンカー試薬と反応させる工程と過剰な未反応リンカー試薬の少なくとも一部を蒸発により除去する工程が、蒸発装置を使用して実施される。
【０１６６】
１つの態様では、ともかくも、固形支持体の付帯官能基をリンカー試薬と反応させる工程、過剰な未反応リンカー試薬の少なくとも一部を蒸発により除去する工程、そして前記付帯リンカー基を環式試薬と反応させる工程が蒸発装置を使用して実施される。
【０１６７】
もう１つの態様では、本方法のすべての工程が蒸発装置を使用して実施される。
本明細書で使用される「蒸発装置」という用語は、気密の無水条件（例、乾燥空気、乾燥窒素、乾燥アルゴンのような乾燥気体下の密閉環境）と、１つ以上の反応混合物の成分（例、試薬、生成物、副生成物、溶媒、等）、特に過剰なリンカー試薬の蒸発除去の両方を促進する、本方法の諸工程のような化学反応を行なうのに適した任意の装置に関する。
【０１６８】
好適な装置の例には、限定されないが、回転蒸発装置と蒸留装置が含まれる。１つの好ましい態様では、この装置が回転蒸発装置、例えば、Ｂｕｃｈｉ（登録商標）からのＭｏｄｅｌ　Ｒ−１１４である。
【０１６９】
支持体のリンカー試薬との反応
上記のように、固相オリゴ合成での使用に適した固形支持体の製造の１つの工程は、「活性化」工程、つまり、固形支持体の付帯官能基をリンカー試薬と反応させる工程により、付帯リンカー基を形成させる工程を伴う。
【０１７０】
この反応の例は以下に示される。
【０１７１】
【化５９】
2004503560.tif 000039
一般に、リンカー試薬は水に対して反応性であり、このことは二ハロゲン化オキサリルに対して特に当てはまる（ここで、ＲＬは共有結合である）。従って、リンカー試薬の分解を回避するために、例えば蒸発装置を使用することによって達成され得るように、活性化工程は、好ましくは無水条件下、例えば、密閉された気密環境において、乾燥気体（乾燥空気、乾燥窒素、乾燥アルゴン）下で実施される。より無水の条件を使用すると、より高い収率が得られる。
【０１７２】
上記のように、固相オリゴ合成での使用に適した固形支持体の製造の１つの工程は、過剰な未反応リンカー試薬の少なくとも一部を蒸発により除去する工程を伴う。
【０１７３】
本明細書で使用される「蒸発」という用語は、反応混合物の成分（例、試薬、生成物、副生成物、溶媒、等）が所望される生成物から、気体若しくは蒸気として、気体若しくは蒸気の相を介して除去されることに関する。
【０１７４】
好ましくは、リンカー試薬は、関連温度で揮発性の化合物、より好ましくは揮発性の液体であるように選択される。リンカー試薬がそのように選択されると、過剰なリンカー試薬は、蒸発により、例えば、減圧及び／又は上昇温度の適用により反応混合物から容易に除去され得る。このやり方では、追加の精製が必要とされないので、このことにより、他のやり方では望ましくない副反応及び副生成物をもたらしてしまう、過剰な活性化剤（例、リンカー試薬）を除去するための個別の、集中的で、しばしば時間の浪費となる精製工程を必要とする方法に優る実質的な利点が提供される。例えば、先行技術の方法では、固形支持体の活性化と後続の始動化合物（例、環式試薬）との反応との間に、又は、始動化合物の活性化と後続の固形支持体との反応との間に、個別の精製工程が必ず必要になる。
【０１７５】
このように、１つの態様では、蒸発が減圧及び／又は上昇温度の適用により達成される。１つの好ましい態様では、蒸発が減圧の適用により達成される。１つの好ましい態様では、蒸発が上昇温度の適用により達成される。
【０１７６】
１つの態様では、過剰な未反応リンカー試薬の少なくとも一部を除去する工程が、蒸発だけで、即ち、蒸発により、そして、濾過、吸い取り、洗浄（例、１つ以上の溶媒若しくは溶媒混合物を用いる）、乾燥（例、ＭｇＳＯ４で）、溶媒分画（例、２つ以上の溶媒若しくは溶媒混合物の間で）、粉砕、又はクロマトグラフィー（例、カラムクロマトグラフィー）のような他の非蒸発性の精製法を使用せずに、達成される。
【０１７７】
１つの態様では、蒸発により（又は蒸発によるだけで）過剰な未反応リンカー試薬の少なくとも一部を除去する工程が、過剰な未反応リンカー試薬の実質的な部分、好ましくは過剰な未反応リンカーの少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％を除去することを伴う。
【０１７８】
１つの態様では、過剰な未反応リンカー試薬の少なくとも一部を除去する工程が、蒸発により（又は、蒸発によるだけで）、そしてさらに、例えば、共蒸発法で使用されるような溶媒若しくは共溶媒（例、ピリジン、メタノール）の追加をせずに達成される。
【０１７９】
１つの態様では、過剰な未反応リンカー試薬の少なくとも一部を除去する工程が、蒸発により（又は、蒸発によるだけで）、そしてさらに、例えば、乾燥法で使用されるような乾燥剤（例、Ｐ２Ｏ５）の使用を伴わずに達成される。
【０１８０】
好ましくは、固形支持体は、例えばオーブン（例、１００℃で３０分）での乾燥によって達成され得るように、使用前に実質的に乾燥している。
好適な試薬の相対量と反応条件（例、温度、時間、等）は、当業者により容易に決定され得る。
【０１８１】
１つの好ましい態様では、各１００ｇの固形支持体について約１００〜約１５００ｍＬのリンカー化合物が、より好ましくは約２００〜約１０００ｍＬのリンカー化合物が、より好ましくは約３００〜約８００ｍＬのリンカー化合物が使用される。
【０１８２】
１つの好ましい態様では、この反応が約０℃〜約１００℃、より好ましくは約２０℃〜約１００℃の反応温度で行なわれる。
１つの好ましい態様では、この反応が約１〜約２４０分、より好ましくは約５〜約１２０分の反応時間で行なわれる。
【０１８３】
所望のキャッピング
上記のように、固相オリゴヌクレオチド合成での使用に適した固形支持体の製造には、場合により、付帯官能基についての「キャッピング工程」が含まれる。
【０１８４】
このように、１つの態様では、本方法は、固形支持体の付帯官能基をリンカー試薬と反応させる前記工程の後か、又は、過剰な未反応リンカー試薬の少なくとも一部を蒸発により除去する前記工程の後で：
（ｉ）前記固形支持体の残存する付帯官能基の少なくとも一部をキャッピング試薬と反応させる工程により、付帯キャップ化官能基を形成させる工程をさらに含む。
【０１８５】
固形支持体の付帯官能基のリンカー試薬との反応に続き、所望の「キャッピング」工程が実施される場合があるが、ここでは「未使用の」付帯官能基（即ち、リンカー試薬と反応していない付帯官能基）が保護化か又は他の未反応性の形態へ変換される。
【０１８６】
例えば、付帯官能基が−ＮＨ２である場合、以下の反応に示されるように、無水酢酸（Ａｃ２Ｏ，ＣＨ３Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）ＣＨ３）が使用され得る。
【０１８７】
【化６０】
2004503560.tif 000040
他の好適なキャッピングの試薬及び条件は当技術分野でよく知られていて、適宜使用され得る。
【０１８８】
付帯官能基が−ＯＨである場合、好適なキャッピング試薬の例には、限定されないが、無水物とエステルが含まれる。
付帯官能基が−ＳＨである場合、好適なキャッピング試薬の例には、限定されないが、ハロアセトアミドが含まれる。
【０１８９】
１つの好ましい態様では、キャッピング試薬が室温又はその付近で揮発性の液体であるように選択され、そのため、過剰なキャッピング試薬は、そしておそらくはキャッピング副生成物も、過剰なリンカー試薬について上記に記載されたように、蒸発により除去され得る。
【０１９０】
好適な試薬の相対量と反応条件（例、温度、時間、等）は、当業者により容易に決定され得る。
１つの好ましい態様では、各１００ｇの固形支持体について、キャッピング試薬として約１０〜約２００ｍＬの無水酢酸と、約１〜約２０ｍＬのＮ−メチルイミダゾール（ＮＭＩ）、及び／又は約０．５〜約２ｇの４−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）が使用される。１つの好ましい態様では、各１００ｇの固形支持体について、キャッピング試薬として約２０〜約１００ｍＬの無水酢酸と、約２〜約１０ｍＬのＮ−メチルイミダゾール（ＮＭＩ）、及び／又は約１ｇの４−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）が使用される。
【０１９１】
１つの好ましい態様では、この反応が約０℃〜約６０℃、より好ましくは約２０℃〜約４０℃の反応温度で行なわれる。
１つの好ましい態様では、この反応が約１〜約６０分、より好ましくは約２〜約３０分の反応時間で行なわれる。
【０１９２】
リンカーの環式試薬との反応
上記のように、固相オリゴ合成での使用に適した固形支持体の製造の１つの工程は、「カップリング」工程、即ち、付帯リンカー基を環式試薬と反応させる工程により、付帯環式基を形成させる工程を伴う。
【０１９３】
この反応（ここで、反応共役基のＷは−Ｊ２−Ｈであって、Ｊ２は−ＮＨ−、−Ｏ−又は−Ｓ−であり、即ち、Ｗは−ＮＨ２、−ＯＨ、又は−ＳＨである）の例を以下に示す：
【０１９４】
【化６１】
2004503560.tif 000041
反応共役基は、例えば、Ｎ−メチルイミダゾール（ＮＭＩ）及び／又は４−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）のような塩基の存在により活性化され得る。そのような活性化は、反応共役基とリンカー試薬の−Ｃ（＝Ｏ）Ｘ２基との反応を促進する、及び／又は加速化する。この塩基はまた、リンカー試薬の−Ｃ（＝Ｏ）Ｘ２基との反応により発生するＨＸ２（例、ＨＣｌ、ＨＢｒ、ＨＩ）と結びつく場合がある。そのような塩基の例には、限定されないが、水性ＮａＯＨ、水性ＫＯＨ、ピリジン、ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）、及びＮ−メチルイミダゾール（ＮＭＩ）が含まれる。
【０１９５】
好適な試薬の相対量と反応条件（例、温度、時間、等）は、当業者により容易に決定され得る。
１つの好ましい態様では、各１００ｇの固形支持体について、約２００〜約６００ｍＬのピリジン中の約５〜約８ｇの環式試薬と、約２０〜約６０ｍＬのＮ−メチルイミダゾール（ＮＭＩ）が使用される。１つの好ましい態様では、各１００ｇの固形支持体について、約３００〜約５００ｍＬのピリジン中の約６〜約７ｇの環式試薬と、約３０〜約５０ｍＬのＮ−メチルイミダゾール（ＮＭＩ）が使用される。
【０１９６】
１つの好ましい態様では、この反応が約０℃〜約６０℃、より好ましくは約２０℃〜約４０℃の反応温度で行なわれる。
１つの好ましい態様では、この反応が約５〜約６０分、より好ましくは約１０〜約３０分の反応時間で行なわれる。
【０１９７】
所望のキャッピング
上記のように、固相オリゴヌクレオチド合成での使用に適した固形支持体の製造には、場合により、付帯リンカー基の「キャッピング工程」が含まれる。
【０１９８】
このように、１つの態様では、本方法は、前記付帯リンカー基を環式試薬と反応させる前記工程の後で：
（ｉ）前記固形支持体の残存する付帯リンカー基の少なくとも一部をキャッピング試薬と反応させる工程により、付帯キャップ化リンカー基を形成させる工程をさらに含む。
【０１９９】
付帯リンカー基の環式試薬との反応に続き、所望の「キャッピング」工程が実施される場合があるが、ここでは「未使用の」付帯リンカー基（即ち、環式試薬と反応していない付帯リンカー基）が保護化か又は他の未反応性の形態へ変換される。
【０２００】
好適なキャッピングの試薬及び条件の例は、上記に記載されている。
所望の精製
上記のように、固相オリゴ合成での使用に適した固形支持体の製造には、場合により、過剰な未反応環式試薬、キャッピング試薬（適用可能ならば）、及びそれらの副生成物の少なくとも一部を除去する工程が含まれる。
【０２０１】
この除去を実施するには、任意の好適な方法を使用してよい。１つの好ましい態様では、この除去は、例えば、フリット化ガラス漏斗、例えばＥｌｖｅｔｅｃ（登録商標）からのＲＯＢＵ−ＰＯＲ−２（登録商標）を使用する濾過により達成される。
【０２０２】
本発明の好ましいクラスの普遍固形支持体の製造を図示する化学スキームを図１に示す。これには、所望の最終脱保護化工程が含まれ、これは典型的にはオリゴヌクレオチド合成の第一工程である。
【０２０３】
実施例に記載される普遍固形支持体の製造を図示する化学スキームを図２に示す。これには、所望の最終脱保護化工程が含まれ、これは典型的にはオリゴヌクレオチド合成の第一工程である。
【０２０４】
普遍固形支持体
上記のように、本発明の１つの側面は、例えば、本明細書に記載の方法により製造されるような普遍固形支持体に関する。
【０２０５】
１つの態様では、普遍固形支持体は以下の式：
【０２０６】
【化６２】
2004503560.tif 000042
（式中、Ｊ１、Ｊ２、ＲＬ、Ｑ、Ｂ、Ｙ、及びＺは、本明細書に定義される通りである）を有する。
【０２０７】
１つの好ましい態様では、普遍固形支持体が以下のものであるか、又はその保護化形態であって、ここでＪ１とＲＬは本明細書に定義される通りであるか、又はより好ましくは、Ｊ１は−ＮＨ−であり、ＲＬは−（ＣＨ２）ｎ−であって、ここでｎは、０〜１０の整数である：
【０２０８】
【化６３】
2004503560.tif 000043
１つの好ましい態様では、普遍固形支持体が以下のものであって、ここでＪ１とＲＬは本明細書に定義される通りであるか、又はより好ましくは、Ｊ１は−ＮＨ−であり、ＲＬは−（ＣＨ２）ｎ−であって、ここでｎは、０〜１０の整数である：
【０２０９】
【化６４】
2004503560.tif 000044
１つの好ましい態様では、普遍固形支持体が以下のものであるか、又はその保護化形態である：
【０２１０】
【化６５】
2004503560.tif 000045
１つの好ましい態様では、普遍固形支持体が以下のものである：
【０２１１】
【化６６】
2004503560.tif 000046
オリゴヌクレオチド
本明細書で使用されるように、「オリゴヌクレオチド」及び「ポリヌクレオチド」という用語は、慣用的な意味で相互交換可能的に使用され、２つ（即ち、２−マー）又はそれより多い（即ち、ｎ−マー）ヌクレオシドを含んでなる分子を意味し、それぞれのヌクレオシドは、ヌクレオシド間連結により少なくとも１つの他のヌクレオシドへ連結している。「ヌクレオシド」という用語は、本明細書では慣用的な意味で使用され、「核酸塩基」（例、プリン、ピリミジン）へ連結した「糖」部分（例、リボース、２’−デオキシリボース）を含んでなる化合物を概して意味する。リボースとアデニン、グアニン、ウラシル、及びシトシンから形成される、よく知られたヌクレオシドの例は、それぞれ、「リボヌクレオシド」、即ち、アデノシン、グアノシン、ウリジン、及びシチジンである。デオキシリボースとアデニン、グアニン、チミン、及びシトシンから形成される、よく知られたヌクレオシドの例は、それぞれ、「デオキシリボヌクレオシド」、即ち、デオキシアデノシン、デオキシグアノシン、デオキシチミジン、及びデオキシシチジンである。よく知られたヌクレオシド間連結の例には、リン酸ジエステル基、−ＯＰ（＝Ｏ）（ＯＨ）Ｏ−；リン酸トリエステル基、−ＯＰ（＝Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ−；亜リン酸ジエステル基、−ＯＰ（ＯＨ）Ｏ−；亜リン酸トリエステル基、−ＯＰ（ＯＲ’）Ｏ−；及びホスホン酸基、−ＯＰ（＝Ｏ）（Ｒ）Ｏ−が含まれる。
【０２１２】
オリゴヌクレオチドは、好便にも、「ヌクレオチド」ポリマー、即ち、ヌクレオチドモノマー単位からなるポリマーであるとみなされ得る。オリゴヌクレオチドは、線状、分岐、又は環式であり得るが、典型的には線状である。「ヌクレオチド」という用語は、慣用的にヌクレオシドのリン酸エステル、つまり、リン酸基（即ち、−ＯＰ（＝Ｏ）（ＯＲ）２、ここでそれぞれのＲは、独立して、−Ｈ、カチオン、又は有機基であり得る）、糖部分、及び核酸塩基を含んでなる化学部分を意味する。リボースとアデニン、グアニン、ウラシル、及びシトシンから形成される、よく知られたヌクレオチドの例は、それぞれ、「５’（若しくは３’）−リボヌクレオチド」、即ち、アデノシン５’（若しくは３’）−一リン酸、グアノシン５’（若しくは３’）−一リン酸、ウリジン５’（若しくは３’）−一リン酸、及びシチジン５’（若しくは３’）−一リン酸である。デオキシリボースとアデニン、グアニン、チミン、及びシトシンから形成される、よく知られたヌクレオチドの例は、それぞれ、「５’（若しくは３’）−２’−デオキシリボヌクレオシド」、即ち、デオキシアデノシン５’（若しくは３’）−一リン酸、デオキシグアノシン５’（若しくは３’）−一リン酸、デオキシチミジン５’（若しくは３’）−一リン酸、及びデオキシシチジン５’（若しくは３’）−一リン酸である。
【０２１３】
デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）とリボ核酸（ＲＮＡ）は重要なオリゴヌクレオチドの例である。これらのオリゴヌクレオチドでは、すべてのヌクレオシド間ブリッジがリン酸ジエステル連結（−ＯＰ（＝Ｏ）（ＯＨ）Ｏ−）であり、一様に５’−３’配向である。ＤＮＡが、核酸塩基のアデニン、グアニン、シトシン、及びチミンを主に含むデオキシリボヌクレオチドのポリマーであるのに対し、ＲＮＡは、核酸塩基のアデニン、グアニン、シトシン、及びウラシルを主に含むリボヌクレオチドのポリマーである。慣用上、単純なリボ−及びデオキシリボヌクレオチドとそのポリマーは、オリゴヌクレオチドの５’末端からオリゴヌクレオチドの３’末端へ列挙されるその塩基（即ち、それぞれＡ、Ｇ、Ｃ、及びＵ；又はｄＡ、ｄＧ、ｄＣ、及びＴ（又はｄＴ））により表示され、ここで「ｄ」は、デオキシリボヌクレオチドを示す。（チミジンはしばしば「デオキシチミジン」と呼ばれ、「ｄＴ」と省略されることに注意すること）。例えば、ｄＧＴは、デオキシグアノシンとデオキシチミジンから形成されるジヌクレオチドであって、ここではデオキシグアノシンの５’位が５’−ＯＨであり、デオキシグアノシンの３’位はリン酸ジエステル結合を介してチミジンの５’位へ連結していて、そしてチミジンの３’位が３’−ＯＨである。
【０２１４】
普遍固形支持体を使用するオリゴ合成
普遍固形支持体は、保護化若しくは非保護化のオリゴ合成基のＹ、例えば、−ＯＨ、−ＮＨ２、−ＳＨ、又はその保護化形態を利用することが可能な固相オリゴ合成の任意の方法で使用され得る。例えば、普遍固形支持体は、固相オリゴヌクレオチド合成で使用され得る。
【０２１５】
典型的には、オリゴヌクレオチド合成法の第一工程は、官能化された固形支持体を酸処理して、第一のモノマー試薬との反応のために官能基（例、オリゴ合成基）を脱保護化することである。このように、オリゴ合成基のＹが保護化形態である場合、それは、好ましくは、オリゴヌクレオチド合成サイクルで使用されるのと同じ酸処理により脱保護化される。
【０２１６】
固相オリゴヌクレオチド合成は、当初はリン酸トリエステル（「トリエステル法」）若しくは亜リン酸（亜リン酸法）の使用を利用した。相対的に安定なモノヌクレオチドホスホロアミダイトカップリング単位の発見（例えば、Ｂｅａｕｃａｇｅ ｅｔ ａｌ．， １９８１ を参照のこと）に伴って、固相オリゴヌクレオチド合成が実践的で、一般的になった。典型的な固相オリゴヌクレオチド合成は、４つの工程（脱保護化、カップリング、キャッピング、及び酸化）を反復的に実施することを伴う。
【０２１７】
標準法は、オリゴヌクレオチドの５’方向（即ち、３→５）への段階合成を伴う。第一の工程（「脱保護化」）では、３’−Ｏ基を介して３’−末端で固形支持体へ付いている成長中のオリゴヌクレオチドが５’脱保護化され、反応基（即ち、５’−ＯＨ基）を提供する。例えば、５’−ＯＨ基は、しばしば、ピリジン中の４，４’−ジメトキシトリチルクロリド（ＤＭＴ−Ｃｌ）との反応により保護化されて５’−Ｏ−ＤＭＴ基を産生し、これは塩基性の条件では安定であるが、酸性の条件、例えば、ジクロロ酢酸（ＤＣＡ）又はトリクロロ酢酸（ＴＣＡ）の存在下では容易に脱保護化される。
【０２１８】
第二の工程（「カップリング」）では、５’脱保護化された支持化オリゴヌクレオチドが所望されるヌクレオチドモノマーと反応し、それ自身、５’保護化された３’−ホスホロアミダイトへはじめて変換される。例えば、５’−ＯＨ基は５’−ＯＤＭＴ基の形態で保護化され得て、３’−ＯＨ基は、−ＯＰ（ＯＲ’）ＮＲ２｛ここでＲは、例えば、イソプロピル基、−ＣＨ（ＣＨ３）２、エチル基、−ＣＨ２ＣＨ３、又はメチル基、−ＣＨ３であり、Ｒ’は、例えば、−Ｈ（ホスホロアミダイトジエステルを産生する）、又は−ＣＨ３、−ＣＨ２ＣＨ３、β−シアノエチル基、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＮ、又はＣ６Ｈ４Ｃｌ（ホスホロアミダイトトリエステルを産生する）｝のような３’−ホスホロアミダイトへ変換され得る。モノマーの３’−ホスホロアミダイト基は、成長するオリゴヌクレオチドの脱保護化５’−ＯＨ基と反応し、亜リン酸連結の５’−ＯＰ（ＯＲ’）Ｏ−３’を産生する。例えば、Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ ｅｔ ａｌ．， １９９５ を参照のこと。
【０２１９】
成長するオリゴヌクレオチドのすべてが提供されるモノマーと反応するわけではないので、「成長」しなかったものは不完全なオリゴヌクレオチドを産生し、故に、さらなる合成から除去されなければならない。このことは、第三の工程（「キャッピング」）により達成され、ここでは、すべての残存−ＯＨ基（即ち、未反応５’−ＯＨ基）が、例えば、無水酢酸（ＣＨ３Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）ＣＨ３）との反応により酢酸エステル（５’−ＯＣ（Ｏ）ＣＨ３）の形態でキャップされる。場合によっては、この脱保護化工程が、以下に論じる酸化工程に先行するのではなく、それに後続することに注意すること。
【０２２０】
第四の工程（「酸化」）では、成長中のオリゴヌクレオチドの新たに形成された亜リン酸基（即ち、５’−ＯＰ（ＯＲ’）Ｏ−３’）が、例えば、水性のヨウ素及びピリジンとの反応により、リン酸基（即ち、５’−ＯＰ（＝Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ−３’）へ変換される。
【０２２１】
次いで、この四工程法を反復し得る。酸化の後で得られるオリゴヌクレオチドが依然として５’−保護化（例、５’−ＯＤＭＴ）のままであり、上記の第一の脱保護化工程での使用に準備されているからである。
【０２２２】
本発明の１つの好ましい普遍固形支持体ではじめる、ホスホロアミダイトオリゴヌクレオチド合成法の第一サイクルを図示する例を図１に示す。
ホスホロアミダイト法について上記で詳しく論じてきたが、本明細書に記載の普遍固形支持体はまた、他の固相オリゴヌクレオチド合成法にも使用され得る。そのような方法の例には、限定されないが、Ｈ−ホスホネート法（亜リン酸法としても知られている；例えば、Ｆｒｏｅｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９９０； Ｆｒｏｅｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９８６ を参照のこと）；及びリン酸トリエステル法（例えば、Ｓｔｅｃ ｅｔ ａｌ．， １９８５； Ｇａｌｌｏ ｅｔ ａｌ．， １９８６； Ｇａｉｔ， １９８４ を参照のこと）が含まれる。
【０２２３】
本明細書に記載の普遍固形支持体はまた他の固相オリゴ合成法でも使用され、オリゴヌクレオチドの誘導体及び類似体を産生し得る。そのような生成物の例には、限定されないが、３’−及び／又は５’−末端で様々な修飾を有するＤＮＡ及びＲＮＡ；オリゴヌクレオシドメチルホスホネート（Ａｇａｒｗａｌ ｅｔ ａｌ．， １９８７）；ホスホロチオエート（Ｂｅａｕｃａｇｅ ｅｔ ａｌ．， １９９０）；ホスホロジチオエート（Ｂｊｅｒｇａｒｄｅ ｅｔ ａｌ．， １９９１）；ＤＮＡ／ＲＮＡコポリマー；ホスホジエステル／ホスホロチオエートコポリマー；環式オリゴヌクレオチド（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．， １９９４）；２’−Ｏ−メチルＲＮＡ（Ｓｐｒｏａｔ ｅｔ ａｌ， １９８９）；ペプチド核酸を含有する生成物（Ｎｉｅｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ， １９９４）；及び、モルホリン型骨格修飾核酸（Ｓｔｉｒｃｈａｋ ｅｔ ａｌ．， １９８９； Ｓｕｍｍｅｒｔｏｎ ｅｔ ａｌ．， １９９１）が含まれる。
【０２２４】
固形支持体からの切り離し
例えば、所望のオリゴヌクレオチドが得られたオリゴ合成の後で、それは、切り離し工程において、切り離し試薬での処理により固形支持体から切り離され得る。切り離し工程は、切り離し温度で、切り離しの時間、実施される。
【０２２５】
切り離し工程は、単一の速い工程において、以下の結果の１つ以上、好ましくはすべてを達成する：
（ａ）オリゴマーの固形支持体からの切り離し、より特定すると、リンカー基と環式基との間の結合の切り離し。
【０２２６】
（ｂ）環式基のオリゴマーからの切り離し、より特定すると、リン酸とオリゴマーとの間の結合の切り離し。例えば、β−脱離反応は、環式リン酸基の付いた環式基とフリーＯＨ基の付いたオリゴマーを産生し得る。
【０２２７】
（ｃ）存在する場合、リン酸トリエステル（−ＯＰ（＝Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ−、ここでＲ’はＨではない）のリン酸ジエステル（−ＯＰ（＝Ｏ）２Ｏ−）への変換。
【０２２８】
（ｄ）存在する場合、ヌクレオチド塩基の易塩基性保護化アミノ基の脱保護化。例えば、アデニン、グアニン、及びシトシンの一級アミンがオリゴ合成の間にアミドとして保護化された場合、それらは脱保護化されてフリーのアミノ基を産生し得る。
【０２２９】
切り離し工程の２つの例を図２及び３に示す。図２では、オリゴマーが３’→５’方向へ成長するオリゴヌクレオチドであり、５’−Ｏ基を介して固形支持体へ付く。オリゴヌクレオチド切り離し生成物は５’−ＯＨ基を有する。図３では、オリゴマーが５’→３’方向へ成長するオリゴヌクレオチドであり、３’−Ｏ基を介して固形支持体へ付く。オリゴヌクレオチド切り離し生成物は３’−ＯＨ基を有する。
【０２３０】
切り離しは、オリゴヌクレオチドを担う普遍固形支持体を好適な切り離し試薬と接触させることによって達成される。１つの態様では、切り離し試薬が以下のものの１つ以上を含む：（ａ）三級アミン（ＮＲ３）、（ｂ）二級アミン（ＮＨＲ２）、（ｃ）一級アミン（ＲＮＨ２）、及び（ｄ）水酸化アンモニウム（ＮＨ４ＯＨ）。
【０２３１】
好適な三級アミンの例には、限定されないが、トリエチルアミン、ジイソプロピルエチルアミン、Ｎ−メチルピペリジン、及びＮ−メチルピロリジンが含まれる。好適な二級アミンの例には、限定されないが、ジメチルアミン、ジエチルアミン、ジイソプロピルアミン、及びピぺリジンが含まれる。好適な一級アミンの例には、限定されないが、メチルアミン、エチルアミン、及びｎ−プロピルアミンが含まれる。
【０２３２】
切り離し試薬中の（ａ）〜（ｄ）の相対量は、存在する場合、モルベースで例えば１％〜９９％と、かなり変化する可能性がある。当業者は、許容されるか又は最適な量を容易に決定することができる。
【０２３３】
１つの好ましい態様では、切り離し試薬が（ｉ）三級アミン（ＮＲ３）若しくは二級アミン（ＮＨＲ２）と（ｉｉ）一級アミン（ＲＮＨ２）若しくは水酸化アンモニウム（ＮＨ４ＯＨ）の混合物を含む。
【０２３４】
１つの好ましい態様では、切り離し試薬がメチルアミンを含む。１つの好ましい態様では、切り離し試薬がメチルアミンと１つ以上の他の成分を含む。
好適な試薬の相対量と反応条件（例、温度、時間、等）は、当業者により容易に決定され得る。
【０２３５】
好ましくは、切り離し温度は室温より高い。１つの態様では、切り離し温度が３０℃であるか又はそれより高い（例、３０〜１００℃）。１つの態様では、切り離し温度が５０℃であるか又はそれより高い（例、５０〜１００℃）。１つの態様では、切り離し温度が６０℃であるか又はそれより高い（例、６０〜１００℃）。１つの態様では、切り離し温度が７０℃であるか又はそれより高い（例、７０〜１００℃）。１つの態様では、切り離し温度が８０℃であるか又はそれより高い（例、８０〜１００℃）。
【０２３６】
切り離し時間は、選択される切り離し試薬及び切り離し温度に従って変化する。典型的には、切り離し時間は１５分〜２４時間である。約７５℃の温度では、切り離し時間は約１時間である。
【０２３７】
上記で論じたように、１つの好ましい態様では、リンカー基のＲＬが共有結合であり、リンカー試薬が二ハロゲン化オキサリルである。この態様では、生じるオキサリル連結が、（ａ）カルボニル基に隣接したエステル基により分与される高い反応性を有し、この位置付けに関連した立体電子効果の結果として、水酸化物、アンモニア、及び一級及び二級アミンのような求核体による切り離しをきわめて受けやすい；及び（ｂ）慣用のＤＮＡ及びＲＮＡ合成で使用される三級アミン（例えば、ピリジン、ルチジン）に対して安定である、という点で特に有利である。
【０２３８】
ローディング
本発明の普遍固形支持体は高いローディング（負荷量）で製造され得る。１つの態様では、固形支持体が３０μモル／ｇ以上のローディング（例、３０〜１００μモル／ｇ）を有する。１つの態様では、固形支持体が４０μモル／ｇ以上のローディング（例、４０〜１００μモル／ｇ）を有する。１つの態様では、固形支持体が５０μモル／ｇ以上のローディング（例、５０〜１００μモル／ｇ）を有する。１つの態様では、固形支持体が４０〜７０μモル／ｇのローディングを有する。
【０２３９】
【実施例】
以下の実施例は本発明を例示するためにのみ提供され、本明細書に記載されるような本発明の範囲を制限するものではない。
【０２４０】
普遍固形支持体を、以下に記載のように、そして図２の化学スキームに例示されるように製造した。
オーブン乾燥（１００℃、３０分）したアミノプロピル−ＣＰＧ（１００ｇ，２５０μモル／ｇ，Ｃｒｕａｃｈｅｍ（登録商標））を、高速（２４０回転／分）、室温、減圧（約５００ミリバール）の下で、回転蒸発システム（Ｒ−１１４，Ｂｕｃｈｉ（登録商標））を使用して、２リットルフラスコ中の５００ｍＬ（７２７．７ｇ）の塩化オキサリル（ＣｌＣ（＝Ｏ）−Ｃ（＝Ｏ）Ｃｌ，Ａｌｄｒｉｃｈ（登録商標））に懸濁させた。１０分後、この混合物を１２０分にわたり１００℃へ加熱した。約２．５時間後に過剰な塩化オキサリルを蒸発させ、乾燥した活性化ＣＰＧ（即ち、付帯リンカー基の付いたＣＰＧ）を得た。
【０２４１】
（ｂ）乾燥ピリジン及び（ｃ）Ｎ−メチルイミダゾール中の（ａ）２’−３’−Ｏ−Ｏ−メトキシエチリデンイノシンの新鮮な溶液（４００ｍＬ，６．７ｇの（ａ）；３６０ｍＬの（ｂ）、及び４０ｍＬの（ｃ））を使用直前に調製した。
【０２４２】
上記の溶液を、高速（２４０回転／分）及び室温で、回転蒸発フラスコ中の活性化ＣＰＧへ加えた。このスラリーを減圧（約５００ミリバール）下で２０分混合した。
【０２４３】
４０ｍＬの無水酢酸（イノシン誘導体の量の１０％）をこの混合物へ加え、減圧（５００ミリバール）下、高速（２４０回転／分）で５分間、この混合物をそのままにした。
【０２４４】
生じたビーズをフリット化ガラス漏斗で濾過し、ピリジン（２ｘ３００ｍＬ）とアセトニトリル（２ｘ３００ｍＬ）で数回洗浄した。このビーズを真空で（室温）乾燥させ、真空下、４℃で保存した。
【０２４５】
このようにして１００ｇの普遍ＣＰＧを得た。このＣＰＧのローディングを制御し、それが６０μモル／ｇであることを示した。
参考文献
本発明と本発明に関連する技術水準をより十分に記載して開示するために、数多くの特許及び公表文献が上記に引用される。これら参考文献のすべての引用を以下に提供する。これら参考文献のそれぞれは、本明細書において、参照によりそのまま本発明の開示へ組込まれる。
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【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は、本発明の好ましい普遍固形支持体のクラスの製造を例示する化学スキームである。
【図２】
図２は、実施例に記載される普遍固形支持体の製造を例示する化学スキームである。
【図３】
図３は、本発明の１つの好ましい普遍固形支持体で始めるホスホロアミダイトオリゴヌクレオチド合成法の第一サイクルを例示する化学スキームである。
【図４】
図４は、本発明の好ましい普遍固形支持体を使用して３’→５’方向で成長したオリゴヌクレオチドの切り離し工程を例示する化学スキームである。
【図５】
図５は、本発明の好ましい普遍固形支持体を使用して５’→３’方向で成長したオリゴヌクレオチドの切り離し工程を例示する化学スキームである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004503560.tif 000147
【国際調査報告】
2004503560.tif 000148
2004503560.tif 000149
2004503560.tif 000150
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