(57)【要約】この発明は、アミノ酸が２つ結合したアミジノベンジルアミン誘導体、特に４−アミジノベンジルアミン誘導体に関する。これらの誘導体は心疾患及び血栓症の治療のための高活性の及び非常に選択的なＦ Ｘａ阻害剤の新規なグループを表している。【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式Ｉで示される凝固因子Ｘａ阻害剤：
【化１】
2004503563.tif 000004
式中、置換基Ｙは３位又は４位に存在し、アミジノ基
【化２】
2004503563.tif 000005
であり、式中のＲ５はＨ、ＯＨ若しくはカルボニル基−ＣＯ−Ｒ若しくはオキシカルボニル基−ＣＯＯ−Ｒであり、ここにおいてＲは１〜１６のＣ原子を有する分岐又は直鎖アルキル、置換若しくは非置換アリール基若しくはヘテロアリール基又は置換若しくは非置換アラルキル基若しくはヘテロアラルキル基となることができ、
ＸはＣＨ基又はＮであり、
Ｒ１はＨ、１〜８のＣ原子を有する分岐若しくは直鎖アルキル、又はｎ＝１〜５である（ＣＨ２）ｎ−ＯＨであり、
Ｒ２はＨ又は１〜８のＣ原子を有する分岐若しくは直鎖アルキルであり、
Ｒ３は１〜８のＣ原子を有する分岐若しくは直鎖アルキル、（ＣＨ２）ｎ−Ｏ−Ｒ６、（ＣＨ２）ｎ−Ｓ−Ｒ６、若しくは（ＣＨ２）ｎ−ＮＨ−Ｒ６であり、ここにおいてｎ＝１〜５であり、Ｒ６は１〜１６のＣ原子を有する分岐若しくは直鎖アルキル、置換若しくは非置換アリール基若しくはヘテロアリール基又は置換若しくは非置換アラルキル基若しくはヘテロアラルキル基であり、及び
Ｒ４はスルホニル基−ＳＯ２−Ｒ、カルボニル基−ＣＯ−Ｒ、オキシカルボニル基−ＣＯＯ−Ｒ若しくはＨであり、ここにおいてＲは１〜１６のＣ原子を有する分岐又は直鎖アルキル、置換若しくは非置換アリール基若しくはヘテロアリール基、置換若しくは非置換アラルキル基若しくはヘテロアラルキル基、アダマンチル基、カンファー基又はシクロヘキシルメチル基である。
【請求項２】
前記アミジノベンジルアミド（ａｍｉｄｉｎｏｂｅｎｚｙｌａｍｉｄｅ）において、アミジノ基が４位にあり、さらにアミノ酸Ｇｌｙ及びＤ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）と、Ｒ４として、アリール基又はアラルキルスルホニル基が結合している、ことを特徴とする請求項１に記載の阻害剤。
【請求項３】
血栓塞栓症の予防又は治療のために経口的、皮下的、静脈注射的、又は経皮的に投与できる薬剤の調製のための、請求項１に記載の阻害剤の使用方法。
【請求項４】
前記阻害剤が、錠剤、コーティングされた錠剤、カプセル、ペレット、座薬、溶液又は硬膏剤などの形状の薬剤として使用される、ことを特徴とする請求項３に記載の使用方法。
【請求項５】
特に血栓症における診断薬としての、請求項１に記載される、前記阻害剤の使用方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
この発明は心疾患の治療及び血栓塞栓症の予防のための新規な凝固因子Ｘａ阻害剤に関する。
【０００２】
現在臨床的に用いられている、ヘパリン型の抗凝血剤又はビタミンＫアンタゴニストは「理想的な」抗血栓剤として求められるすべての条件を満たすものではない。それゆえ凝固酵素、特にトロンビン及びＸａ因子（Ｆ Ｘａ）に対する低分子量の阻害剤からなる代替物が求められている。トロンビン阻害剤と比較したＦ Ｘａ阻害剤の特別の利点は、種々の動物実験で証明されているように、出血する傾向がより低くなる可能性があることである。従って抗血栓症の有効薬量を投与した際、出血時間はごくわずかしか影響を受けなかった（Ｊ． Ｍ． Ｈｅｒｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． Ｅｘｐ． Ｔｈｅｒ． ２７６， １０３０−１０３８， １９９６； Ｋ． Ｓａｔｏ ｅｔ ａｌ．， Ｂｒｉｔ． Ｊ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． １２３， ９２−９６， １９９８）。
【０００３】
Ｆ Ｘａに対して高い親和性を有する、最初の非ペプチド化合物は左右対称のビスベンズアミジン（ｂｉｓｂｅｎｚａｍｉｄｉｎｅ）であった（最も活性の高い化合物ＢＡＢＣＨではＫｉ ＝ １３ ｎＭ）（Ｊ． Ｓｔｕｒｚｅｂｅｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｔｈｒｏｍｂ． Ｒｅｓ． ５４， ２４５−２５２， １９９８）。ナフトアミジン（ｎａｐｈｔｈａｍｉｄｉｎｅ）誘導体であるＤＸ−９０６５ａは２つの塩基性基を有しＦ Ｘａを選択的にＫｉ ＝ ２４ ｎＭで阻害する（Ｔ． Ｈａｒａ ｅｔ ａｌ．， Ｔｈｒｏｍｂ． Ｈａｅｍｏｓｔ． ７１， ３１４−３１９， １９９４）。阻害剤ＹＭ−６０８２８（Ｋ． Ｓａｔｏ ｅｔ ａｌ．， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． ３３９， １４１−１４６， １９９７）は、構造的にＤＸ−９０６５ａと関連があるが、さらに活性が高い（Ｋｉ ＝ １．３ ｎＭ）。その一方で、一連のさらなるビス塩基性化合物が記載され、その中で例えば、２つのベンズアミジン残基はオキサゾリン環（Ｋｉ ＝ １８ ｎＭ）（Ｍ． Ｌ． Ｑｕａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｏｒｇ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． Ｌｅｔｔ． ７， ２８１３−２８１８， １９９７）又はカルボキシメチル−アルキル鎖（Ｋｉ ＝ ３４ ｎＭ）（Ｔ． Ｐ． Ｍａｄｕｓｋｕｉｅ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． ４１， ５３−６２， １９９８）を介して結合している。ビス塩基性化合物の不利な点は、特に、経口投与後の生体利用効率が低いことである。
【０００４】
一つの塩基性基しか含まないＦ Ｘａに対する阻害剤も述べられている。ＢＡＢＣＨを基にしてＮ−置換されたアミジノフェノキシピリジン（ａｍｉｄｉｎｏｐｈｅｎｏｘｙｐｙｒｉｄｉｎｅ）（ＢＸ−８０７８３４に対するＫｉ ＝ ０．１１ ｎＭ）が開発された（Ｒ． Ｍｏｈａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｏｒｇ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． Ｌｅｔｔ． ８， １８７７−１８８２， １９９８； Ｇ． Ｂ． Ｐｈｉｌｌｉｐｓ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． ４１， ３５５７−３５６２， １９９８）。Ｎα−アダマンチルオキシカルボニル−３−アミジノフェニルアラニン（Ｎα−ａｄａｍａｎｔｙｌｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ−３−ａｍｉｄｉｎｏｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ）（最も活性の高い化合物ではＫｉ ＝ ７４ ｎＭ）のアミドはＦ Ｘａに対する選択的阻害剤である（Ｓ． Ｓｐｅｒｌ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ３８１， ３２１−３２９， ２０００）。一方、３−アミジノフェニルアラニンのＮα−アリールスルホニルアミノアシル化エステル（Ｎα−ａｒｙｌｓｕｌｆｏｎｙｌ−ａｍｉｎｏａｃｙｌａｔｅｄ ｅｓｔｅｒ）は低い阻害作用を有する（ＴＡＰＡＭのＫｉは約８４０ ｎＭ）（Ｊ． Ｓｔｕｒｚｅｂｅｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｔｈｒｏｍｂ． Ｒｅｓ． ５４， ２４５−２５２， １９９８）。ＷＯ ９６／１００２２には既に強い電荷を全く持たない阻害剤（最も活性の高い化合物ではＫｉ ＝ ３．０ ｎＭ）が開示されている。
【０００５】
今まで、基礎配列Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇに由来するごく少数のペプチドがＦ Ｘａの阻害剤として記述されてきた。ｋｅｔｔｎｅｒとＳｈａｗ（Ｔｈｒｏｍｂ． Ｒｅｓ． ２２， ６４５−６５２， １９８１）によって記述されたクロロメチルケトンはＦ Ｘａを不可逆的に阻害し、ｉｎ ｖｉｖｏへの応用には適さない。他方、ペプチドのＳＥＬ２４８９（Ｋｉ ＝ ２５ ｎＭ）とＳＥＬ２７１１（Ｋｉ ＝ ３ ｎＭ）は極めて活性が高い（Ｊ． Ａ． Ｏｓｔｒｅｍ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３７， １０５３−１０５９， １９９８）。いくつかのペプチジルアルギニンアルデヒドもまた、Ｐ１位置におけるアルギニナール（ａｒｇｉｎｉｎａｌ）に加えて、Ｐ３においてＤ−アルギニン又は非天然塩基性アミノ酸を有している（Ｚ． Ｈ． Ｊｏｎａｔｈａｎ， Ｂｉｏｏｒｇ． Ｍｅｄ． Ｌｅｔｔ． ９， ３４５９−３４６４， １９９９）記述されている。しかしながら、このタイプの阻害剤はトロンビン阻害剤のさらなる開発に相当な進展をもたらしたが、今までのところＦ Ｘａの阻害剤として知られているペプチジルアグマチン（ｐｅｐｔｉｄｙｌ ａｇｍａｔｉｎｅ）誘導体は知られていない。この場合、Ｃ末端アグマチンを有するＤ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ型の化合物とそれに由来する誘導体による成功は特に注目に値するものであった。トロンビン阻害に対してピコモルのＫｉ値が達成され、そして経口生体利用効率が改善された（Ｔ． Ｊ． Ｔｕｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． ４０， １５６５−１５６９ 及び ３６８７−３６９３， １９９７）。しかしながら、この場合において、Ｆ Ｘａの阻害は観察されなかった。例えば、Ｃ末端に４−アミジノベンジルアミン残基を有するメラガトラン（ｍｅｌａｇａｔｒａｎ）は、非常に非特異的であり、Ｆ ＸａをＫｉ ＝ ２．８ μＭで阻害する。他方、トリプシン（Ｋｉ ＝ ４．０ ｎＭ）とトロンビン（Ｋｉ ＝ ２．０ ｎＭ）は３桁以上も強く阻害される（Ｄ． Ｇｕｓｔａｆｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｂｌｏｏｄ Ｃｏａｇｕｌ． Ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｓｉｓ ７， ６９−７９， １９９６）。
【０００６】
この発明は、治療への適用にも適し、凝固因子Ｘａを高い活性と特異性で阻害し、可能な限り低い合成費用で調製され得る活性化合物を特定する目的に基づくものである。
【０００７】
驚くべきことに、特許請求項１に示される一般式１の、アシル化アミジノベンジルアミン、特にＸ、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３が天然及び／又は非天然アミノ酸となる４−アミジノベンジルアミン化合物は、Ｘａ因子を非常に有効的かつ選択的に不活性化し、ヒト血漿の凝固を効果的に阻害するということが見出された。アミジノ基が４位にあり、グリシン及びＤ−セリンｔｅｒｔ−ブチルエーテルがアミノ酸として結合しており、及び化合物がアリール−又はアラルキルスルホニル残基から構成されるＮ末端保護基Ｒ４を有している場合には、アミジノベンジルアミンは特にＸａ因子の活性の高い阻害剤を形成する。
【０００８】
Ｘａ因子以外の、他の酵素はグリシン誘導体によって極めて少量の阻害がされたので、この発明のアミジノベンジルアミン誘導体は高活性の及び非常に選択的なＦ Ｘａ阻害剤の新規なグループである。このこととは対照的に、Ｒ１としてＨを有しない（例えば、アラニン誘導体）化合物はもはや選択的にＸａ因子を阻害しない、しかしトリプシン、トロンビン及びプラスミンの強力な阻害剤となる。
【０００９】
化合物は通常無機酸塩として、望ましくはハイドロクロライドとして、又は適当な有機酸塩として存在している。
【００１０】
一般式Ｉの化合物は基本的には公知の方法で、以下に記載されるように、調製され得る：
【００１１】
出発化合物４−シアノベンジルアミンはＧａｂｒｉｅｌ合成（Ｇ． Ｗａｇｎｅｒ ａｎｄ Ｉ． Ｗｕｎｄｅｒｌｉｃｈ， Ｐｈａｒｍａｚｉｅ ３２， ７６−７７， １９７７； Ｂ．Ｃ． Ｂｏｏｋｓｅｒ ａｎｄ Ｔ．Ｃ． Ｂｒｕｉｃｅ， Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． １１３， ４２０８−４２１８， １９９１）によって４−シアノベンジルブロミドから調製される。Ｂｏｃで保護されたアセチルオキサミジノベンジルアミン（ａｃｅｔｙｌｏｘａｍｉｄｉｎｏｂｅｎｚｙｌａｍｉｎｅ）はこのようにして調製された４−シアノベンジルアミンから得られる。さらなるアミノ酸と保護基Ｒ４のカップリングはＮ末端保護基としてＢｏｃを使用する標準的なカップリング方法によって行われる。二番目のアミノ酸もＮ−アリール−又はＮ−アラルキルスルホニルで保護されたアミノ酸として直接カップリングされ得る。ペプチド類縁物質はアセチルオキサミジノベンジルアミンを出発として順次に合成される。生成物の多くはよく結晶化し、従って簡単に精製され得る。阻害剤の精製は最終段階において分離用の、逆相ＨＰＬＣによって行われる。
【００１２】
この発明は３つの実施例を用いて以下により詳細に説明される。
【００１３】
実施例１
ベンジルスルホニル−Ｄ−Ｓｅｒ（Ｂｚ）−Ｇｌｙ−４−アミジノベンジルアミド ｘ ＨＣｌの合成
１．１　Ｂｏｃ−４−シアノベンジルアミド
２０ ｇ（０．１５１ ｍｏｌ）の４−シアノベンジルアミンを３００ ｍｌの水、１５０ ｍｌのジオキサンと１５０ ｍｌの１ Ｎ ＮａＯＨに溶解した。氷冷下で３７．５ ｍｌのジ−ｔｅｒｔ−ブチルジカーボネートを滴下し、混合物を０℃で１時間かく拌し室温でさらに２４時間かく拌した。ジオキサンを真空除去し水性残渣を酢酸エチルで３回抽出した。一緒にまとめた抽出液を５％ＫＨＳＯ４溶液で３回洗浄した後に飽和ＮａＣｌ溶液で３回洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し真空濃縮した（白色結晶）。ＨＰＬＣ：アセトニトリル／水、４４．１％アセトニトリルにて溶出；収率：３０．４８ ｇ（０．１３１ ｍｏｌ）、８７％。
【００１４】
１．２　Ｂｏｃ−４−アセチルオキサミジノベンジルアミド
Ｊｕｄｋｉｎｓらの方法（Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｃｏｍｍ． ２６， ４３５１−４３６７， １９９６）に従って、３０．４８ ｇ（０．１３１ ｍｏｌ）のＢｏｃ−４−シアノベンジルアミドを、１３．６５ ｇ（０．１９７ ｍｏｌ）のヒドロキシルアミン ｘ ＨＣｌと３４ ｍｌ（０．１９７ ｍｏｌ）のＤＩＥＡとともに、３００ ｍｌの無水エタノールに溶解した。その溶液を２時間還流した後室温で一晩かく拌した。続いてバッチを真空濃縮し、残渣を約２００ ｍｌの酢酸に溶解し、その溶液を１８．６７ ｍｌ（０．１９７ ｍｏｌ）の無水酢酸で処理した。１時間後、それを再濃縮し、酢酸エチルに溶解し０℃にて５％ＫＨＳＯ４溶液及び飽和ＮａＣｌ溶液で各３回洗浄した。Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し真空濃縮した後、白色粉末が沈殿した。ＨＰＬＣ：アセトニトリル／水、３２．０％アセトニトリルにて溶出；収率：３１．３ ｇ（０．１０２ ｍｏｌ）、７８％。
【００１５】
１．３　４−アセチルオキサミジノベンジルアミン ｘ ＨＣｌ
５ ｍｍｏｌのＢｏｃ−４−アセチルオキサミジノベンジルアミドを２０ ｍｌの１ Ｎ ＨＣｌ氷酢酸溶液に溶解し、その溶液を室温で４５分間静置した。次におおむね真空濃縮し、その生成物を乾燥ジエチルエーテルを用いて沈殿させ、フリット（ｆｒｉｔ）上でろ過し、新しいエーテルで再洗浄し、真空乾燥させた。定量反応のため、生成物をさらなる精製をすることなく次の合成段階へ使用した。
【００１６】
１．４　Ｂｏｃ−Ｇｌｙ−４−アセチルオキサミジノベンジルアミド
Ｂｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ（Ｏｒｐｅｇｅｎ社、ハイデルベルグ）の４−アセチルオキサミジノベンジルアミンへのカップリングはＦｒｅｒｏｔら（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ ４７， ２５９ ｆｆ．， １９９１）に従って実施した。このために、２．０６４ ｇ（９．３ ｍｍｏｌ）の４−アセチルオキサミジノベンジルアミン ｘ ＨＣｌと１．６２９ ｇ（９．３ ｍｍｏｌ）のＢｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨを約２５ ｍｌのＤＭＦに溶解した。次に４．８４ ｇ（９．３ ｍｍｏｌ）のＰｙＰＯＰと３．８７８ ｍｌ（２７．９ ｍｍｏｌ）のＴＥＡを０℃にて加え、ＴＥＡを用いてｐＨを９に調整した。室温で１時間かく拌した後、混合物を真空濃縮し、酢酸エチルに溶解し、各３回の酸性、塩基性及び中性洗浄に供し、乾燥及び濃縮をした。収率：３ ｇ（８．２ ｍｍｏｌ）８８％。
【００１７】
１．５　Ｂｏｃ−Ｇｌｙ−４−アミジノベンジルアミド ｘ ＡｃＯＨ
３ ｇ（８．２ ｍｍｏｌ）のＢｏｃ−Ｇｌｙ−４−アセチルオキサミジノベンジルアミドを２００ ｍｌの９０％酢酸に溶解した。続いて３００ ｍｇの１０％活性炭担持型パラジウムをアルゴン下にて加えた。アルゴンを水素雰囲気に置換した後、バッチに２４時間勢いよくかく拌しながら水素添加した。触媒をろ過し、ろ液を真空濃縮した。収率：２．９ ｇ（７．９ ｍｍｏｌ）９６％。
【００１８】
１．６　Ｈ−Ｇｌｙ−４−アミジノベンジルアミド ｘ ２ＨＣｌ
２．９ ｇ（７．９ ｍｍｏｌ）のＢｏｃ−Ｇｌｙ−４−アミジノベンジルアミドを１００ ｍｌの１ Ｎ ＨＣｌ氷酢酸溶液に溶解し、その溶液を室温で４５分間静置した。次におおむね真空濃縮し、その生成物を乾燥ジエチルエーテルを用いて沈殿させ、フリット（ｆｒｉｔ）上でろ過し、生成物を新しいエーテルで再洗浄した。生成物を真空乾燥させた後、さらなる精製をすることなく項１．８での合成に使用した。
【００１９】
１．７　ベンジルスルホニル−Ｄ−Ｓｅｒ（Ｂｚ）−ＯＨ
２２９ ｍｇ（１．１７３ ｍｍｏｌ）のＨ−Ｄ−Ｓｅｒ（Ｂｚ）−ＯＨと４０８μｌ（２．３４５ ｍｍｏｌ）のＤＩＥＡを５０ ｍｌの５０％アセトニトリルに溶解した。続いて３３５ ｍｇ（１．７６ ｍｍｏｌ）のベンジルスルホニルクロライドを加え、混合物を室温で１２時間かく拌した。混合物を真空濃縮し、酢酸エチルに溶解し、各３回の酸性及び中性洗浄に供した。硫酸ナトリウムで乾燥させた後、真空濃縮した。収率： ２８９ ｍｇ（０．８２７ ｍｍｏｌ）７１％。
【００２０】
１．８　ベンジルスルホニル−Ｄ−Ｓｅｒ（Ｂｚ）−Ｇｌｙ−４−アミジノベンジルアミド ｘ ＴＦＡ　１５１ ｍｇ（０．４３３ ｍｍｏｌ）のベンジルスルホニル−Ｄ−Ｓｅｒ（Ｂｚ）−ＯＨと１２１ ｍｇ（０．４３３ ｍｍｏｌ）のＨ−Ｇｌｙ−４−アミジノベンジルアミド ｘ ２ＨＣｌを少量の無水ＤＭＦに溶解した。２２５ ｍｇ（０．４３３ ｍｍｏｌ）のＰｙＢＯＰと２３０μｌ（１．３２ ｍｍｏｌ）のＤＩＥＡを氷冷下にて加えた。室温にて１時間かく拌した後、混合物を真空濃縮して生成物をＨＰＬＣ（アセトニトリル／水、０．１％トリフルオロ酢酸、３７．４％アセトニトリルにて溶出）によって精製した。収率： ２３２ ｍｇ（０．３５６ ｍｍｏｌ）８２％。
【００２１】
実施例２
Ｙ ＝ アミジノを有する選択された化合物によるＦ Ｘａの阻害
【表１】
2004503563.tif 000002
【００２２】
阻害作用の測定
阻害作用の測定のために、２００μｌのトリスバッファー（０．０５ Ｍ、０．１５４ Ｍ ＮａＣｌ、５％エタノール、ｐＨ ８．０；阻害剤を含む）、２５ μｌの基質（Ｍｏｃ−Ｄ−Ｎｌｅ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ｐＮＡ水溶液；ペンタファーム社、バーゼル、スイス）及び５０μｌのＦ Ｘａ（外皮由来、ダイアグノスティックリージェント社、テーム、英国）を２５℃でインキュベートした。３分後、２５μｌの酢酸（５０％）の添加によって反応を停止させ、マイクロプレートリーダー（ＭＲ ５０００、ダイナテック社、デンケンドルフ、ドイツ）を用いて４０５ ｎｍの吸光度を測定した。Ｋｉ値はＤｉｘｏｎの方法（Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｊ． ５５， １７０−１７１， １９５３）に従ってコンピュータープログラムを用いて直線回帰により決定した。Ｋｉ値は少なくとも３回の測定の平均を用いた。
【００２３】
実施例３
ベンジルスルホニル−Ｄ−Ｓｅｒ（Ｂｚ）−Ｇｌｙ−４−アミジノベンジルアミドによるヒト血漿の凝固阻害
【表２】
2004503563.tif 000003
【００２４】
凝固阻害の測定
プロトロンビン時間（ＰＴ）の測定のため、１００ μｌのトロンボプラスチン（デイド社、ウンターシュライスハイム）及び１００ μｌの阻害剤をＣａＣｌ２（０．０５ Ｍ、５％エタノール）に溶解したものを、３７℃で２分間インキュベートした後、１００ μｌのヒトクエン酸血漿を添加することにより凝固を開始させた。活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）の測定のため、１００ μｌのヒトクエン酸血漿を１００ μｌのａＰＴＴ試薬（ロシュ　ダイアグノスティックス社、マンハイム）と３７℃で３分間インキュベーションし、そして１００ μｌのＣａＣｌ２（０．０５ Ｍ、５％エタノール）に溶解した阻害剤を添加することによって凝固を開始させた。凝固時間はトロンボトラック凝固測定器（Ｔｈｒｏｍｂｏｔｒａｃｋ ｃｏａｇｕｌｏｍｅｔｅｒ）（イムノ社、ハイデルベルグ）にて測定した。
【００２５】
使用した略語
Ａｃ　　　　　ａｃｅｔｙｌ
Ｂｏｃ　　　　 ｔｅｒｔ−ｂｕｔｙｌｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ
Ｂｚ　　　　　ｂｅｎｚｙｌ
ＤＩＥＡ　　　　ｄｉｉｓｏｐｒｏｐｙｌｅｔｈｙｌａｍｉｎｅ
ＤＭＦ　　　　 Ｎ，Ｎ−ｄｉｍｅｔｈｙｌｆｏｒｍａｍｉｄｅ
ｉ．ｖ．　　　　ｉｎ ｖａｃｕｏ
ＰｙＢＯＰ　　　 ｂｅｎｚｏｔｒｉａｚｏｌ−１−ｙｌ−Ｎ−ｏｘｙｔｒｉｓ−（ｐｙｒｒｏｌｉｄｉｎｏ）ｐｈｏｓｐｈｏｎｉｕｍ ｈｅｘａｆｌｕｏｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ
ＴＥＡ　　　　 ｔｒｉｅｔｈｙｌａｍｉｎｅ
ＴＦＡ　　　　 ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ
ＴＨＦ　　　　 ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｆｕｒａｎ
ｔＢｕ　　　　 ｔｅｒｔ−ｂｕｔｙｌ
【国際公開パンフレット】
2004503563.tif 000006
2004503563.tif 000007
2004503563.tif 000008
2004503563.tif 000009
2004503563.tif 000010
2004503563.tif 000011
2004503563.tif 000012
2004503563.tif 000013
2004503563.tif 000014
2004503563.tif 000015
2004503563.tif 000016
2004503563.tif 000017
2004503563.tif 000018
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004503563.tif 000019
【国際調査報告】
2004503563.tif 000020
2004503563.tif 000021
2004503563.tif 000022
2004503563.tif 000023
2004503563.tif 000024
2004503563.tif 000025
2004503563.tif 000026
2004503563.tif 000027
2004503563.tif 000028
2004503563.tif 000029