(57)【要約】本発明は、E3L遺伝子のC末端の7アミノ酸をコードする領域の欠失を含み、かつ外因性DNAを含む組換えワクシニアウイルスを提供する。前記組換えワクシニアウイルスを含有する組成物ならびにその使用方法も提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
E3L遺伝子産物のアミノ酸184-190をコードする領域が欠失されているE3L遺伝子を含む、動物宿主内での病原性を低下させたワクシニアウイルスを含んでなり、さらに、外因性DNAの発現を制御する調節エレメントに機能的に連結された外因性DNAを含んでなる発現ベクター。
【請求項２】
前記外因性DNAが抗原をコードする、請求項１に記載の発現ベクター。
【請求項３】
前記ワクシニアウイルスから該ウイルスによりコードされる１以上の非必須遺伝子機能が欠失されている、請求項１に記載の発現ベクター。
【請求項４】
請求項１に記載の発現ベクターおよび担体を含有する組成物。
【請求項５】
組換え遺伝子産物を生産する方法であって、E3L遺伝子産物のアミノ酸184-190をコードする領域が欠失されているE3L遺伝子を含む、動物宿主内での病原性を低下させたワクシニアウイルスを含んでなり、さらに、該組換え遺伝子産物の発現を制御する調節エレメントに機能的に連結された該組換え遺伝子産物をコードする外因性DNAを含んでなる発現ベクターを、該組換え遺伝子産物が発現される条件にさらすことを特徴とする、上記方法。
【請求項６】
前記組換え遺伝子産物を回収することをさらに含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
被験者において防御免疫応答を引き出す方法であって、E3L遺伝子産物のアミノ酸184-190をコードする領域が欠失されているE3L遺伝子を含む、動物宿主内での病原性を低下させたワクシニアウイルスを含んでなり、さらに、外因性DNAの発現を制御する調節エレメントに機能的に連結された外因性DNAを含んでなる発現ベクターを被験者に導入することを特徴とする、上記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、病原性を低下させたワクシニアウイルスベクターに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ワクシニアウイルスはDNAウイルスのポックスウイルス科のメンバーである。ワクシニアウイルスをはじめとするポックスウイルスは発現ベクターとして広く使用されているが、それは、この組換えウイルスが比較的容易に分離でき、広範な宿主域を有し、しかも大量のDNAを保持させることができるからである。
【０００３】
ワクシニアウイルスのゲノムには、外因性DNAを組み込むことのできる非必須領域が存在する。外因性DNAは周知の相同的組換え法によりワクシニアウイルスのゲノムに挿入することができる。得られる組換えワクシニアウイルスはワクチンおよび抗癌剤として有用である。
【０００４】
ワクシニアウイルス組換え体をベクターとして、特にワクチンおよび抗癌剤として使用することには、生きた組換えウイルスを環境に導入することに伴う安全性の問題が生じる。各種宿主系内でのワクシニアウイルス組換え体の病原性は、ウイルスの生育にとって必須ではない特定のワクシニアウイルス遺伝子の欠失または不活性化によって弱毒化されてきた。しかし、当技術分野では、広い宿主域、所望の遺伝子産物の活発なタンパク質合成といった、野生型ウイルスの望ましい性質を保持しながらも病原性が低下しているベクターの開発が依然として必要とされている。
【発明の開示】
【０００５】
本発明は、二本鎖(ds)RNA結合ドメインをコードするE3L遺伝子の領域にまたはその近傍に突然変異を有する組換えワクシニアウイルスの使用方法を提供する。本発明はさらに、該組換えワクシニアウイルスおよび外因性DNAを含んでなる発現ベクターを提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００６】
ワクシニアウイルスのE3L遺伝子産物は190アミノ酸からなるポリペプチドである。E3L遺伝子は、dsRNA結合タンパク質、Z-DNA結合タンパク質、および二量体形成を含めて、いくつかの機能をコードしている。Kiblerら (1997) J. Virol. 71: 1992 (参照により本明細書に組み入れる) に記載されるように、アミノ酸118-190はdsRNA結合に関与している。本明細書で用いるアミノ酸の番号付けはGoebelら (1990) Virology 179: 247-66, 577-63 (その開示内容を参照により本明細書に組み入れる) から採用したものである。
【０００７】
本発明によれば、dsRNA結合ドメインをコードする領域内にまたはその近傍に突然変異を有する組換えワクシニアウイルスは、野生型ワクシニアウイルスと比べて、哺乳動物内での病原性が弱いことが見出された。鼻腔内に投与すると、本発明の組換えウイルスは鼻組織において高力価へと複製するが、肺や脳には広がらない。脳に直接投与する場合には、この組換えウイルスは神経毒を示すが、その毒力は野生型ワクシニアウイルスと比べて低いものである。
【０００８】
本発明により意図される突然変異は、天然のE3L遺伝子産物と比べて、変異型E3L遺伝子産物のdsRNAへの結合を低下させる（しかし、消失させない）ものである。dsRNAに結合するE3L遺伝子産物の能力は、当技術分野で公知の結合アッセイにより測定することができ、かかるアッセイは例えばChangら (1993) Virology 194: 537 (その開示内容を参照により本明細書に組み入れる) に開示されている。dsRNA結合の低下は、本明細書では、Changら (同上) に記載されるアッセイで検出可能なものとして定義される。
【０００９】
本明細書で用いる突然変異という用語は、欠失、置換および点突然変異を包含する。本発明の好ましい実施形態においては、突然変異はE3L遺伝子産物のアミノ酸184-190をコードする領域の欠失であり、これを本明細書ではE3LΔ7Cと記載する。
【００１０】
本発明はさらに、先に開示した組換えワクシニアウイルスを含み、さらに外因性（すなわち、非ワクシニアウイルス）DNAを含んでなる組換えワクシニアウイルスベクターを提供する。外因性DNAはどのような所望の産物をコードしてもよく、例えば、抗原、抗癌剤、またはマーカーもしくはレポーター遺伝子産物をコードすることができる。組換えワクシニアウイルスはさらに、ウイルスによりコードされる非必須遺伝子機能の欠失または不活性化を有していてもよい。非必須遺伝子機能とは、ウイルスが宿主細胞内で複製する際に必要とされない機能のことである。好ましくは、外因性DNAを、その発現を制御する調節エレメントに機能的に連結させる。調節エレメントはワクシニアウイルス由来のものが好ましい。
【００１１】
本発明の組換えワクシニアウイルスは、当技術分野で公知の方法により、好ましくは相同的組換えにより構築することができる。標準的な相同的組換え法は、ウイルスDNAに相同な配列を含むDNA断片もしくはプラスミドによるトランスフェクションを利用したり、感染細胞での組換えを達成するために野生型もしくは組換えワクシニアウイルスによる感染を利用する。通常のマーカーレスキュー法を使用して組換えワクシニアウイルスを同定することができる。組換えワクシニアウイルスを相同的組換えにより作製するための代表的な方法は、Picciniら (1987) Methods in Enzymology 153: 545 (その開示内容を参照により本明細書に組み入れる) に開示されている。
【００１２】
例えば、本発明の好ましい実施形態に従う組換えワクシニアウイルスを構築するには、宿主細胞に、E3L遺伝子が欠失されているワクシニアウイルスを感染させ、該宿主細胞を、ワクシニアウイルスE3L遺伝子を挟んでいる左アームと右アームに相同な配列により挟まれたE3L遺伝子産物のアミノ酸1-183をコードする核酸を含有するプラスミドでトランスフェクトする。本発明の組換えワクシニアウイルスを作製するために用いるワクシニアウイルスは、天然のウイルス株であっても、遺伝子操作されたウイルス株であってもよい。ヒトおよび動物用のワクチンとして有用なウイルス株が特に好ましく、それらは公知であって市販もされている。そのような株として、Wyeth、Lister、WR、および米国特許第5,762,938号 (参照により本明細書に組み入れる) に記載されるようなCopenhagenの遺伝子操作された欠失変異体が挙げられる。組換え用プラスミドは当技術分野で公知の標準方法により作製することができる。ワクシニアウイルスのE3L遺伝子、ならびに左隣と右隣のアームの核酸配列は当技術分野で公知であり、例えば、Earlら (1993) Genetic Maps: locus maps of complex gnomes, O'Brien編, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1.157 (その開示内容を参照により本明細書に組み入れる) およびGoebelら (1990), (前掲)に見出せる。ここで用いるアミノ酸の番号付けは、Goebelら (1990), (前掲)から採用したものである。組換えに用いるワクシニアウイルスは他の欠失、不活性化、または上記のような外因性DNAを含んでいてもよい。
【００１３】
感染およびトランスフェクションに続いて、ワクシニアウイルスおよびプラスミド上のマーカーの存在または非存在を選択することにより組換え体を同定することができる。組換えワクシニアウイルスは標準方法で、例えば、凍結と融解を繰り返すことにより、宿主細胞から抽出することができる。
【００１４】
得られた組換えワクシニアウイルスを相同的組換えによりさらに改変して、他の欠失、不活性化を与えたり、あるいは外因性DNAを挿入したりすることも可能である。
【００１５】
本発明によれば、E3L遺伝子産物のC末端部分（好ましくは、E3L遺伝子産物のアミノ酸184-190）をコードするDNAの欠失を有する組換えワクシニアウイルスは、野生型ウイルスに匹敵するウイルス複製、タンパク質合成およびインターフェロン耐性を維持するが、同一株の野生型ワクシニアウイルスと比べて、マウスにおける病原性が著しく低減していることが見出された。
【００１６】
本発明はさらに、本発明の組換えワクシニアウイルスベクターおよび担体を含有する組成物を提供する。本明細書で用いる担体という用語は、あらゆる溶媒、希釈剤、分散媒、抗菌剤および抗真菌剤、マイクロカプセル、リポソーム、カチオン性脂質担体、等張剤、吸収遅延剤などを含むものである。
【００１７】
本発明の組換えワクシニアウイルスおよび組成物は、組換え遺伝子産物の生産用のin vitro発現ベクターとして、遺伝子産物のデリバリーシステムとして、ヒトもしくは動物用のワクチンとして、または抗癌剤として使用することができる。組換えワクシニアウイルスのそのような用途は当技術分野で知られており、例えば、Moss (1996) "Poxviridae: The Viruses and Their Replication" Virology, Fieldsら編, Lippincott-Raven, Philadelphia, pp. 2637-2671 (参照により本明細書に組み入れる) に記載されている。
【００１８】
本発明はさらに、組換え遺伝子産物を生産する方法を提供し、該方法は、少なくともE3L遺伝子産物のアミノ酸184-190をコードする領域が欠失されているワクシニアウイルスを含み、さらに、該組換え遺伝子産物の発現を制御する調節エレメントに機能的に連結された該組換え遺伝子産物をコードする外因性DNAを含む組換えワクシニアウイルスベクターを、該組換え遺伝子産物が発現される条件にさらし、場合により該組換え遺伝子産物を回収することを含んでなる。好ましい実施形態においては、組換え遺伝子産物は、該遺伝子産物またはそれを発現するベクターを哺乳動物に投与したとき、抗原および／または免疫原応答を惹起する抗原である。
【００１９】
本明細書中に引用する全ての文献は、全体をそのまま組み入れるものとする。
【００２０】
以下の実施例は本発明をさらに説明するのに役立つもので、本発明を限定するものではない。
【実施例】
【００２１】
実施例１
組換えワクシニアウイルスの構築
WR株のワクシニアウイルスのE3L遺伝子座に、7個のC末端アミノ酸の欠失を有するトランケート型E3L遺伝子を再結合させるために、プラスミドpMPE3ΔGPTMCS (Kiblerら (1997) J. Virol. 71: 1992に記載；参照により本明細書に組み入れる) を使用した。組換え用プラスミドpMPE3ΔGPTはpBSIISK (Stratagene, La Jolla, CA) の誘導体であり、これはβ-ガラクトシダーゼ配列を欠失させてあり、また、ワクシニアウイルスE3L遺伝子に隣接する左および右アームに相同な配列を含んでいるが、E3L遺伝子そのものは欠失している。この組換え用プラスミドはE3Lに隣接するアームの外側に大腸菌(E. coli)gpt遺伝子を含んでおり、したがって、ミコフェノール酸(MPA)で処理することによりトランスフェクト細胞を選択することが可能である。プラスミドpMPE3ΔGPTを多重クローニング部位(MCS)の導入により改変して、pMPE3ΔGPTMCSを作製した。
【００２２】
E3L突然変異遺伝子Δ7C (Changら (1993) Virology 194: 537に記載；その開示内容を参照により本明細書に組み入れる)を、pMPE3ΔGPTMCS組換え用プラスミドにクローニングした。このE3LΔ7C断片は、Goebelら (1990) (前掲)によって番号付けされているように、E3L遺伝子産物のアミノ酸1-183をコードしており、C末端のアミノ酸184-190をコードするDNAを欠失している。E3LΔ7C断片のpMPE3ΔGPTMCSへのクローニングから得られるプラスミドをpMP-Δ7Cと名づけた。
【００２３】
WRΔE3L（E3L遺伝子がlacZ遺伝子で置換されたワクシニアウイルスのWR株）とのin vitro組換えおよび組換え体の選択を、Kiblerら (1997) J. Virol 71: 1992に記載されるように行って、WRE3LΔ7Cを得た。WRΔE3Lは、lacZ遺伝子がE3L隣接アームの間に挿入されたpMPE3ΔGPT (Kiblerら (1997) J. Virol. 71: 1992) との相同的組換えにより、WR株のワクシニアウイルス由来のE3L遺伝子をlacZ遺伝子で置換して得られたものである。
【００２４】
実施例２
WR、WRE3LΔ7CおよびWRΔE3Lによる感染
WR株の野生型ワクシニアウイルス(wt WR)ならびに実施例１に記載した変異体WRΔE3LおよびWRE3LΔ7Cの病原性を次のようにして評価した。
【００２５】
1群5匹のc57bl6マウス（4週齢）に、様々な用量（103プラーク形成単位(pfu)、104pfu、105pfuおよび106pfu）のWR、WRΔE3LおよびWRE3LΔ7Cを鼻腔内投与により感染させ、その生死を毎日観察した。1群6匹のc57bl6マウス（4週齢）に同量のウイルスを頭蓋内注入により感染させ、その生死を毎日観察した。
【００２６】
図１に示すように、WRの鼻腔内接種は103pfuの用量で致死的であったが、WRΔE3LおよびWRE3LΔ7Cについては最大用量(106pfu)でさえも病原性がまったく認められなかった。同様に、図２に示すように、WRの頭蓋内注入は103pfuの用量で致死的であったが、変異体については105pfuの用量でも病原性がまったく検出されなかった。
【００２７】
実施例３
ウイルスの組織分布
1群3匹のc57bl6マウスに106pfuのwt WR、WRΔE3LおよびWRE3LΔ7Cを鼻腔内投与により注入した。感染から5日後に鼻甲介、肺および脳を回収し、処理し、RK-13細胞系において力価測定を行った。図３に示すように、wt WRは鼻甲介、肺および脳で検出された。WRE3LΔ7Cは鼻甲介で検出されたが、wt WRとは違って、鼻腔内注入後に肺や脳には広がっていなかった。
【００２８】
実施例４
WRE3LΔ7Cによるワクチン接種
1群5匹のc57bl6マウスを様々な用量(35〜35,000 pfuの範囲)のWRE3LΔ7Cで免疫した。1カ月後、免疫マウスと非免疫対照マウス（擬似）を100万pfuのwt WRでチャレンジした。wt WRに起因する疾病の指標として体重減少を採用した。図４に示すように、非免疫対照マウスには重度の体重減少が認められたが、免疫マウスはすべてチャレンジ後に正常な体重増加を記録した。350 pfuの組換えウイルスはwt WR感染からマウスを防御するのに十分であった。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】ワクシニアウイルスを鼻腔内注入した後のマウスの生存を示すグラフである。
【図２】ワクシニアウイルスを頭蓋内注入した後のマウスの生存を示すグラフである。
【図３】鼻腔内注入後のワクシニアウイルスの組織分布を示すグラフである。
【図４】野生型ウイルスでチャレンジした後のワクチン接種マウスとワクチン未接種マウスの体重変化を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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