(57)【要約】Streptomyces platensis subsp. rosaceus由来のポリケチドであるドリゴシン、及びStreptomyces amphibiosporus由来のポリケチドであるラクトイミドマイシンの生合成遺伝子座を形成する遺伝子及びタンパク質を含む、微生物によるポリケチドの生合成に関与する遺伝子及びタンパク質。かかる遺伝子及びタンパク質により、ドリゴシン及びラクトイミドマイシンの生合成に関与する酵素の化学工学的処理を介した、ドリゴシン、ラクトイミドマイシン及び関連する化学構造物の直接的な操作が可能になる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１、２２及び２５；配列番号１、２２及び２５に相補的な配列；配列番号１、２２及び２５の少なくとも５０個のヌクレオチドを連続状態で含む断片；並びに配列番号１、２２及び２５に相補的な配列の少なくとも５０個のヌクレオチドを連続状態で含む断片からなる群より選択される配列を含む、単離、精製又は濃縮を行った核酸。
【請求項２】
請求項１に記載の核酸と高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズできる、単離、精製又は濃縮を行った核酸。
【請求項３】
請求項１に記載の核酸と中程度のストリンジェンシー条件下でハイブリダイズできる、単離、精製又は濃縮を行った核酸。
【請求項４】
デフォルトパラメータを用いたＢＬＡＳＴＮバージョン２．０での分析により、請求項１に記載の核酸に対して少なくとも７０％の相同性を有することが確認された、単離、精製又は濃縮を行った核酸。
【請求項５】
デフォルトパラメータを用いたＢＬＡＳＴＮバージョン２．０での分析により、請求項１に記載の核酸に対して少なくとも９９％の相同性を有することが確認された、単離、精製又は濃縮を行った核酸。
【請求項６】
配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２４、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、及びそれらに相補的な配列からなる群より選択される配列を含む、単離、精製又は濃縮を行った核酸。
【請求項７】
デフォルトパラメータを用いたＢＬＡＳＴＮバージョン２．０での分析により、請求項６に記載の核酸に対して少なくとも９０％の相同性を有することが確認された、単離、精製又は濃縮を行った核酸。
【請求項８】
デフォルトパラメータを用いたＢＬＡＳＴＮバージョン２．０での分析により、請求項６に記載の核酸とハイブリダイズできることが確認された、単離、精製又は濃縮を行った核酸。
【請求項９】
配列番号５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、及びそれらに相補的な配列に対して少なくとも７０％の相同性を有する、単離、精製又は濃縮を行った核酸。
【請求項１０】
デフォルトパラメータを用いたＢＬＡＳＴＮバージョン２．０での分析により、請求項６に記載の核酸に対して少なくとも９９％の相同性を有することが確認された、単離、精製又は濃縮を行った核酸。
【請求項１１】
配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２４、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、及びそれらに相補的な配列からなる群より選択される配列の少なくとも５０個の塩基を連続状態で含む、単離、精製又は濃縮を行った核酸。
【請求項１２】
デフォルトパラメータを用いたＢＬＡＳＴＮバージョン２．０での分析により、請求項１１に記載の核酸に対して少なくとも７０％の相同性を有することが確認された、単離、精製又は濃縮を行った核酸。
【請求項１３】
配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２３、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０及び４２からなる群より選択される配列を含む、単離又は精製を行ったポリペプチド。
【請求項１４】
請求項１３に記載のポリペプチドの少なくとも２０個のアミノ酸を連続状態で含む、単離又は精製を行ったポリペプチド。
【請求項１５】
デフォルトパラメータを用いたＢＬＡＳＴＰバージョン２．２．２での分析により、請求項１３に記載のポリペプチドに対して少なくとも７０％の相同性を有することが確認された、単離、又は精製を行ったポリペプチド。
【請求項１６】
デフォルトパラメータを用いたＢＬＡＳＴＰバージョン２．２．２での分析により、請求項１３に記載のポリペプチドに対して少なくとも９９％の相同性を有することが確認された、単離、又は精製を行ったポリペプチド。
【請求項１７】
デフォルトパラメータを用いたＢＬＡＳＴＰバージョン２．２．２での分析により、請求項１４に記載のポリペプチドに対して少なくとも７５％の相同性を有することが確認された、単離、又は精製を行ったポリペプチド。
【請求項１８】
デフォルトパラメータを用いたＢＬＡＳＴＰバージョン２．２．２での分析により、請求項１４に記載のポリペプチドに対して少なくとも９９％の相同性を有することが確認された、単離、又は精製を行ったポリペプチド。
【請求項１９】
配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２３、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０及び４２からなる群より選択される配列を有するポリペプチドと特異的に結合することが可能な、単離又は精製を行った抗体。
【請求項２０】
配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２３、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０及び４２のポリペプチドのいずれかの、少なくとも２５個のアミノ酸を連続状態で含むポリペプチドと特異的に結合することが可能な、単離又は精製を行った抗体。
【請求項２１】
配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２３、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０及び４２からなる群より選択される配列を有するポリペプチドの製造方法であって、該ポリペプチドをコードし、かつ、操作可能な状態でプロモーターに連結されている核酸を宿主細胞に導入することを特徴とする該ポリペプチドの製造方法。
【請求項２２】
配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２３、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０及び４２からなる群より選択される配列の、少なくとも２５個のアミノ酸を連続状態で有するポリペプチドの製造方法であって、該ポリペプチドをコードし、かつ、操作可能な状態でプロモーターに連結されている核酸を宿主細胞に導入することを特徴とする該ポリペプチドの製造方法。
【請求項２３】
配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２２、２４、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１及び４３の核酸コード、及び配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２３、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０及び４２のポリペプチドコードからなる群より選択される配列が保存されていることを特徴とするコンピュータ読み取り可能な媒体。
【請求項２４】
プロセッサ及びデータ保存装置を含むコンピュータシステムであって、該データ保存装置には配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２２、２４、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１及び４３の核酸コード、及び配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２３、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０及び４２のポリペプチドコードからなる群より選択される配列が保存されていることを特徴とするコンピュータシステム。
【請求項２５】
ドリゴシン化合物又はドリゴシン類似体の合成を誘導するのに充分なポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを含むことを特徴とする単離した遺伝子クラスター。
【請求項２６】
配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２３、及びそれらに相補的な配列からなる群より選択されるオープンリーディングフレームを含むことを特徴とする請求項２５に記載の単離した遺伝子クラスター。
【請求項２７】
ドリゴシン化合物又はドリゴシン類似体の合成を誘導するのに充分なポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを含む単離した遺伝子クラスターであって、該遺伝子クラスターが、請求項２６に記載の配列の少なくとも１０個の塩基を連続状態で有するオープンリーディングフレームを含むことを特徴とする単離した遺伝子クラスター。
【請求項２８】
ドリゴシン化合物又はドリゴシン類似体の合成を誘導するのに充分なポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを含む単離した遺伝子クラスターであって、該遺伝子クラスターが、デフォルトパラメータを用いたＢＬＡＳＴＰバージョン２．２．２により、請求項２６に記載の配列に対して少なくとも７０％の相同性を有することが確認されたオープンリーディングフレームを含むことを特徴とする単離した遺伝子クラスター。
【請求項２９】
遺伝子クラスターが、細菌内に存在することを特徴とする請求項２８に記載の単離した遺伝子クラスター。
【請求項３０】
ドリゴシン生合成遺伝子産物の発現が可能な条件下で請求項２９に記載の細菌を培養することを特徴とするドリゴシン生合成遺伝子産物の発現方法。
【請求項３１】
遺伝子クラスターが、アクセッション番号ＩＤＡＣ２７０２０１−１又はＩＤＡＣ２７０２０１−２の大腸菌株ＤＨ１０Ｂ内に存在することを特徴とする請求項２５に記載の単離した遺伝子クラスター。
【請求項３２】
ラクトイミドマイシン又はラクトイミドマイシン類似体の合成を誘導するのに充分なポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを含むことを特徴とする単離した遺伝子クラスター。
【請求項３３】
配列番号２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、及びそれらに相補的な配列からなる群より選択されるオープンリーディングフレームを含むことを特徴とする請求項３２に記載の単離した遺伝子クラスター。
【請求項３４】
ラクトイミドマイシン化合物又はラクトイミドマイシン類似体の合成を誘導するのに充分なポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを含む単離した遺伝子クラスターであって、該遺伝子クラスターが、請求項３２に記載の配列の少なくとも１０個の塩基を連続状態で有するオープンリーディングフレームを含むことを特徴とする単離した遺伝子クラスター。
【請求項３５】
ラクトイミドマイシン化合物又はラクトイミドマイシン類似体の合成を誘導するのに充分なポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを含む単離した遺伝子クラスターであって、該遺伝子クラスターが、デフォルトパラメータを用いたＢＬＡＳＴＰバージョン２．２．２により、請求項３２に記載の配列に対して少なくとも７０％の相同性を有することが確認されたオープンリーディングフレームを含むことを特徴とする単離した遺伝子クラスター。
【請求項３６】
遺伝子クラスターが、細菌内に存在することを特徴とする請求項３４に記載の単離した遺伝子クラスター。
【請求項３７】
ラクトイミドマイシン生合成遺伝子産物の発現が可能な条件下で請求項３６に記載の細菌を培養することを特徴とするラクトイミドマイシン生合成遺伝子産物の発現方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ポリケチド、特に、ドリゴシン（dorrigocin）ポリケチド、ミグラスタチン（migrastatin）ポリケチド及びラクトイミドマイシン（lactimidomycin）ポリケチドの合成を誘導するタンパク質をコードする核酸分子に関する。本発明は、ドリゴシン、ミグラスタチン及びラクトイミドマイシン構造物に基づいて抗菌作用を示す化合物を作製するための、ＤＮＡの使用にも関する。
【背景技術】
【０００２】
ドリゴシン、ミグラスタチン及びラクトイミドマイシンは、ポリケチド類である。ポリケチドは、真菌及び細菌、特に放線菌をはじめとする多種類の生物の体内で生じる。ドリゴシンＡ及びドリゴシンＢと命名された２種類のドリゴシンの構造については、Hochlowski et al.がJ. Antibiotics 47: 870 (1994)及び米国特許第５，４８４，７９９号に記載されている。ドリゴシンには抗真菌性及び抗腫瘍性作用があることが報告されている（Karwowski et al., J. Antibiotics 47: 862 (1994); 米国特許第５，５８９，４８５号）。ドリゴシンの生物学的性質については、Kadam and McAlpineがJ. Antibiotics 47: 875 (1994)でも議論されている。Nakae et al.は、J. of Antibiotics 53: 1228 (2000)でミグラスタチンの構造について記載している。ミグラスタチンが腫瘍細胞の遊走を阻害するとの報告がある（Nakae et al., J. of Antibiotics 53: 1130 (2000)。Woo et al.は、J. Antibiotics, Vol 55, pp. 141-146 (2002)において、イソミグラスチン（isomigrastin）と称する関連化合物について記載している。ポリケチドは、一連の縮合及びそれに続く修飾により２炭素単位で形成された種類の化合物である。ポリケチドは、ポリケチドシンターゼ（ＰＫＳ）という酵素により天然で合成される。従来の化学的手法ではポリケチドの生成が困難であること、及び野生型細胞内では一般にポリケチドの生成量が少ないことから、ポリケチド化合物を生成するための改良された手段又は代替的な手段を見出だすことには、かなりの関心が寄せられてきた。
【０００３】
ポリケチドシンターゼ（ＰＫＳ）という酵素は、多数の大型タンパク質の複合体である。ＰＫＳは、アシルチオエステルの基本構成単位間での反復的で脱炭酸的なクライゼン縮合を通じたポリケチドの生合成において、触媒として作用する。ＰＫＳは一般的に、合成するポリケチドの種類によって、及びかかるポリケチドを合成する形態によって、Ｉ型、すなわち「モジュラー型」ＰＫＳと、II型、すなわち「反復型」ＰＫＳに分類される。Ｉ型ＰＫＳは、大量の１２員環、１４員環、及び１６員環マクロライド抗生物質の生成に関与している。
【０００４】
Ｉ型すなわちモジュラー型ＰＫＳは、ポリケチド合成経路における炭素鎖伸長及び修飾の各サイクルに対する、別々の酵素活性部位一セットにより形成される。各活性部位をドメインと呼び、活性部位一セットをモジュールと呼ぶ。典型的なモジュラー型ＰＫＳ複合酵素系は、数個の大型ポリペプチドで構成されており、該ポリペプチドをアミノからカルボキシ末端にかけて分離して、ローディングモジュール、多数のエクステンダーモジュール、及びチオエステラーゼドメインを内包する場合が多いリリーシングモジュールとすることが可能である。
【０００５】
一般に、ローディングモジュールは、ポリケチドの合成に使用する最初の基本単位を構築すること、及びそれを最初のエクステンダーモジュールへ移動させることに関与している。ローディングモジュールは、ある特定のアシルＣｏＡ（通常はアセチル又はプロピオニルだが、ときにブチリル又はその他のアシルＣｏＡ）を認識し、それをチオールエステルとして、ローディングモジュールのＡＣＰまで移動させる。
【０００６】
各エクステンダーモジュール上のＡＴは、ある特定のエクステンダーＣｏＡを認識し、それをそのエクステンダーモジュールのＡＣＰまで移動させ、チオエステルを形成する。各エクステンダーモジュールは、前のモジュールから化合物を受け取り、基本構成単位を結合し、その基本構成単位を前のモジュールからの化合物に結合し、１つ以上の付加的な機能を任意に発揮し、結果として生じた化合物を次のモジュールへ移動させる。
【０００７】
これまでに報告されたあらゆるモジュラー型ＰＫＳの各エクステンダーモジュールは、ＫＳ、ＡＴ、ＡＣＰ、及び成長中のポリケチド鎖のベータ炭素を修飾する、０、１、２又は３つのドメインを含んでいる。典型的な（非ローディング）最小Ｉ型ＰＫＳエクステンダーには、ＫＳドメイン、ＡＴドメイン及びＡＣＰドメインが含まれていてもよい。かかるドメインは２炭素エクステンダーユニットを活性化させるのに充分であり、前記ユニットを発達中のポリケチドモジュールに結合させる。同様に、次のエクステンダーモジュールは、合成が完了するまで、次の基本構成単位を結合させること、及び発達中の化合物を次のエクステンダーモジュールへ移動させることに関与している。
【０００８】
いったんＰＫＳがアシルＡＣＰでプライムされると、ローディングモジュールのアシル基が移動して最初のエクステンダーモジュールのＫＳでチオールエステルを形成する（トランスエステル化）。この段階において、エクステンダーモジュール１はアシルＫＳ及びマロニル（又は置換マロニル）ＡＣＰを保有している。その後、かかるローディングモジュール由来のアシル基は、マロニル基のアルファ炭素に共有結合して炭素−炭素結合を形成し、同時に脱炭酸され、ローディング基本構成単位よりも長い、骨格となる２つの炭素を有する新規のアシルＡＣＰを生成する（伸長又は拡張）。
【０００９】
各エクステンダーモジュールで炭素２つ分だけ発達したポリケチド鎖は、続いて、共有結合したチオールエステルとして、流れ作業のようなプロセスにおいて、エクステンダーモジュールからエクステンダーモジュールへと通過していく。このプロセスのみによって生成した炭素鎖は、炭素原子１つおきにケトンを保有していると思われ、ポリケトンを生成する。ポリケチドという名前の由来は、ここからきている。しかし、通常は、２つの炭素ユニットそれぞれのベータケト基を、成長中のポリケチド鎖への添加直後で次のモジュールへの移動前に、付加的な酵素活性によって修飾する。炭素−炭素結合の形成に必要な典型的ＫＳ、ＡＴ及びＡＣＰドメインの他に、モジュールは、ベータ−カルボニル部分を修飾する他のドメインを含んでいてもよい。例えば、モジュールは、ケト基をアルコールに還元するケトレダクターゼ（ＫＲ）ドメインも含んでいてもよい。モジュールは、ＫＲドメインに加えて、アルコールを脱水して二重結合にするデヒドラターゼ（ＤＨ）ドメインも含んでいてもよい。モジュールは、ＫＲドメイン、ＤＨドメインに加えて、二重結合産物を飽和一重結合に変換するエノイルレダクターゼ（ＥＲ）ドメインも含んでいてもよい。エクステンダーモジュールは、例えばメチラーゼ活性又はジメチラーゼ活性などの他の酵素活性も含んでいる場合がある。
【００１０】
最後のエクステンダーモジュールを通過すると、ポリケチドは、ＰＫＳからポリケチドを切り離し、一般的にはポリケチドを環状化するリリーシングドメインに到達する。適合化（tailoring）酵素によって、かかるポリケチドをさらに修飾することもできる。これらの酵素は、ポリケチドコア分子に対して、炭水化物基若しくはメチル基の添加、又は酸化若しくは還元など他の修飾を行う。
【００１１】
Ｉ型ＰＫＳポリケチドにおいて、触媒作用を有するドメインの順序は、これまで報告されたあらゆるＩ型ＰＫＳで保存されている。したがって、すべてのベータ−ケト処理ドメインが１つのモジュール内に存在する場合、そのモジュール内のＮ末端からＣ末端までのドメインの順序は、常に、ＫＳ、ＡＴ、ＤＨ、ＥＲ、ＫＲ、ＡＣＰとなる。あるモジュールでは、いくつか又は全部のベータ−ケト処理ドメインが失われている場合があるが、モジュール内に存在するドメインの順序は、報告されたすべての事例で依然として同一である。
【００１２】
こうした酵素の工学的処理は、ドメインの修飾、添加、若しくは欠失によって、又はドメインを他のＩ型ＰＫＳから取得してきたドメインと置換することによって、行われる。他の供給源から取得してきたモジュールで、モジュール全体を欠失させたり、置換したり添加したりすることによっても、行われる。遺伝子組換えＰＫＳ複合体は、もちろん、実施した遺伝子改変から予測される産物の合成に対して触媒作用を及ぼす能力がある。触媒作用を有するドメインと、個々のポリペプチドのＮ末端及びＣ末端との間には、リンカー領域がある。これらリンカー領域の配列は、触媒作用を有するドメインと比較して、保存性が低い。ＰＫＳ複合体を構成するドメイン間及び個々のポリペプチド間で会合が正しく行われるためには、リンカー領域が重要であるのかもしれない。したがって、ドメインとモジュールが正しい配向で位置し、活性を示しているような足場を構築するものとして、リンカーとドメインをひとまとめにして見ることもできる。このような構成及び位置取りが保有されていると、異なる又は同一の基質特異性を有するＰＫＳドメインの、各種利用可能な方法によるＰＫＳ酵素間での置換（通常はＤＮＡレベル）が可能になる。例えば、ＡＴ置換の境界を選択する場合、受け取り側のＰＫＳのリンカーを保有するように、又は、それらを供与側のＰＫＳＡＴドメインのリンカーで置換するように、置換を行うことができる。または、好ましくは、両方の構造物を作って、ＫＳドメインとＡＴドメインとの間の正しいリンカー領域が、少なくとも１つの工学処理済酵素に確実に含まれているようにすることができる。このように、新規ＰＫＳの設計にはかなりの柔軟性があり、その結果、既知のポリケチドのより効率的な生成や、新規ポリケチドの作製が可能になる。
【００１３】
治療上有効なポリケチドはこれまで数多く同定されているが、薬物動態学的プロフィール及び代謝に優れ、副作用の少ない新規ポリケチドを得る必要性は依然として残っている。それに加えて、まったく新しい生物活性を有する新規ポリケチドを得る必要性もある。モジュラー型のＩ型ＰＫＳが生成する複雑なポリケチドには、駆虫剤、殺虫剤、免疫抑制剤、抗真菌剤、抗菌剤としての有用性が知られている化合物を含まれているため、特に価値がある。その構造の複雑さのため、全体的な化学合成又は既知のポリケチドの化学修飾によって、かかる新規ポリケチドを容易に入手するのは不可能である。
【発明の開示】
【００１４】
本発明は、ポリケチドの生成に関与する遺伝子及びタンパク質を有利に提供するものである。かかる遺伝子及びタンパク質の実施形態は、添付した配列表に具体的に示されている。配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２２及び２４は、ポリケチドであるドリゴシンの生合成に関与する核酸を提供する。配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０及び２３は、ポリケチドであるドリゴシンの生合成に関与するタンパク質のアミノ酸配列を提供する。配列番号２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１及び３２は、ポリケチドであるラクトイミドマイシンの生合成に関与する遺伝子の核酸配列を提供する。配列番号２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４１及び４２は、ポリケチドであるラクトイミドマイシンの生合成に関与するタンパク質のアミノ酸配列を提供する。本発明の遺伝子及びタンパク質は、ドリゴシン化合物及びラクトイミドマイシン化合物に基づく新規ポリケチド関連化合物の生成機構を提供する。
【００１５】
本発明は、各種ポリケチドの生成に使用可能なポリケチドシンターゼ（ＰＫＳ）遺伝子（配列番号１１、１３、１５、３３、３５及び３７）及びタンパク質（配列番号１０、１２、１４、３２、３４及び３６）を開示している。ポリケチドには、現在のところ、発酵のみによって生成するものもあれば、発酵及び化学修飾によって生成するものもある。そして発酵によっても化学修飾によっても生成することのない新規ポリケチドもある。本発明により、ドリゴシン及びラクトイミドマイシンの生合成に関与する酵素の化学工学的処理や、構造物の複雑さのために現在の化学的手法では不可能な修飾を介しての、ドリゴシン、ラクトイミドマイシン、及び関連する化学構造物の直接操作が可能になる。
【００１６】
通常は不活性だがきっかけがあれば化学修飾が可能になる位置に「化学的なきっかけ」を導入するために、本発明を使用することもできる。本発明の方法及び試薬により、新規ポリケチドを開発するいくつかの一般的な方法の利便性が上昇する。例えば、分子モデルを使用して最適な構造物を予測することができる。本発明の方法によると、ドリゴシン遺伝子クラスター又はラクトイミドマイシン遺伝子クラスターの遺伝子操作により、さまざまなポリケチド構造物を生成することができる。本発明を使用して、類似体の集中ライブラリーをポリケチドのリード候補物質の周囲に構築し、最適な性質となるように化合物を微調整することもできる。本発明の遺伝子組換え方法は、以前は化学修飾に対して不活性だった分子位置の修飾にも対応可能である。既知のＰＫＳ遺伝子クラスターを操作して、そのＰＫＳが生成するポリケチドを自然に生成する場合よりも高レベルで生成させること、又は、操作しなければポリケチドを生成しない宿主内で生成させることが、既知の技法によって可能になる。構造的には関連しているが、既知のＰＫＳ遺伝子クラスターが生成するポリケチドとは区別される分子を生成することが、既知の技法によって可能になる。例えば、ＰＣＴ公開公報ＷＯ９３／３６６３、９５／０８５４８、９６／４０９６８、９７／０２３５８、９８／４９３１５、米国特許第４，８７４，７４８号、第５，０６３，１５５号、第５，０９８，８３７号、第５，１４９，６３９号、第５，６７２，４９１号、第５，７１２，１４６号、第５，８３０，７５０号及び第５，８４３，７１８号を参照のこと。
【００１７】
このように、本発明の第一の態様は、配列番号１、２２及び２５；配列番号１、２２及び２５に相補的な配列；配列番号１、２２及び２５の少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、７５、１００、２００又は５００個のヌクレオチドを連続状態で含む断片；及び配列番号１、２２及び２５に相補的な配列の少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、７５、１００、２００又は５００個のヌクレオチドを連続状態で含む断片からなる群より選択される配列を含む、単離、精製又は濃縮を行った核酸を提供する。この態様の好ましい実施形態には、上記配列と中程度のストリンジェンシー又は高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズできる、単離、精製又は濃縮を行った核酸；上記配列の少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、７５、１００、２００又は５００個の塩基を連続状態で含む、単離、精製又は濃縮を行った核酸；及びデフォルトパラメータを用いたＢＬＡＳＴＮバージョン２．０での分析により、上記配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％又は９９％の相同性を有することが確認された、単離、精製又は濃縮を行った核酸が含まれる。
【００１８】
本発明のこの態様におけるさらに好ましい実施形態には、配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２４、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、及びそれらに相補的な配列からなる群より選択される配列を含む、単離、精製又は濃縮を行った核酸；配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２４、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、及びそれらに相補的な配列からなる群より選択される配列の少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、７５、１００、２００又は５００個の塩基を連続状態で含む、単離、精製又は濃縮を行った核酸；上記核酸と中程度のストリンジェンシー又は高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズできる、単離、精製又は濃縮を行った核酸；及びデフォルトパラメータを用いたＢＬＡＳＴＮバージョン２．０での分析により、請求項６に記載の核酸に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％又は９９％の相同性を有することが確認された、単離、精製又は濃縮を行った核酸が含まれる。本発明のこの態様におけるより好ましい実施形態には、配列番号１０、１２、１４、３２、３４及び３６のＰＫＳのドメインをコードする単離した核酸；配列番号１０、１２、１４、３２、３４及び３６のＰＫＳの１つ以上のモジュールの一部又は全部をコードする単離した核酸が含まれる。これらの核酸を単独で、又は他のＰＫＳドメイン若しくはモジュールをコードする核酸と組み合わせて、組換え型ベクターの構築における中間物質として容易に用いることができる。別の態様においては、本発明は、モジュール中の少なくとも１つのドメインが非ドリゴシンＰＫＳ及び非ラクトイミドマイシンＰＫＳに由来し、少なくとも１つのドメインがドリゴシンＰＫＳ又はラクトイミドマイシンＰＫＳに由来するモジュールを少なくとも１つ含むＰＫＳの全部又は一部をコードする単離した核酸を提供する。
【００１９】
第二の実施形態においては、本発明は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２３、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０及び４２からなる群より選択される配列を含む、単離又は精製を行ったポリペプチド；配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２３、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０及び４２のポリペプチドの少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、７５、１００、２００又は５００個のアミノ酸を連続状態で含む、単離又は精製を行ったポリペプチド；及びデフォルトパラメータを用いたＢＬＡＳＴＰバージョン２．２．２での分析により、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２３、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０及び４２のポリペプチドに対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％又は９９％の相同性を有することが確認された、単離又は精製を行ったポリペプチドを提供する。さらなる態様においては、本発明は、上記ポリペプチド配列を１、２、３、又は５個以上含むポリペプチドを提供する。
【００２０】
本発明は、上記核酸を含む組換え型ＤＮＡ発現ベクターも提供する。本発明のこうした遺伝子及び方法によって、当業者は、ポリケチド生成能力を有する組換え型宿主細胞を作製することができるようになる。したがって、本発明は、上記核酸を少なくとも１つコードする組換え型ＤＮＡベクターで異種性宿主細胞を形質転換し、かかる宿主細胞を、ＰＫＳが生成されるような条件下で培養し、そのＰＫＳが触媒となってポリケチドの合成にいたる、ポリケチドの調製方法を提供する。１つの態様においては、かかる方法はStreptomycesを宿主細胞として用いて実施される。別の態様においては、生成したポリケチドはドリゴシン又はラクトイミドマイシンである。別の態様においては、生成したポリケチドは、構造的にドリゴシン又はラクトイミドマイシンに関連するポリケチドである。本発明のこの態様における１つの実施形態は、ドリゴシン生合成遺伝子産物が発現するような条件下で宿主細胞を培養することを特徴とするドリゴシン生合成遺伝子産物の発現方法である。本発明のこの態様における第二の実施形態は、ラクトイミドマイシン生合成遺伝子産物が発現するような条件下で宿主細胞を培養することを特徴とするラクトイミドマイシン生合成遺伝子産物の発現方法である。
【００２１】
本発明は、推定ポリケチド生成微生物の検出及び／又は単離用の本発明のプローブを含む試薬；ハイブリダイゼーションが検出されるように、本発明のプローブを用いて、推定ポリケチド生成微生物を検出及び／又は単離する方法をも含む。クローニング、分析、及びＰＫＳ酵素をコードする遺伝子のＤＮＡ組換え技術による操作を、既知の技法によって行うことができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
ドリゴシン分子とミグラスタチン分子を区別する論文執筆者もいる。本明細書では一貫して、ドリゴシンという言葉には、ミグラスタチン及びイソミグラスタチンと称される分子が含まれるものとしている。同様に、ドリゴシンの生合成遺伝子座という言葉には、ミグラスタチン及びイソミグラスタチンと称される分子の合成を誘導する生合成遺伝子座が含まれるものとする。
【００２３】
本明細書及び図面を通して、Streptomyces platensis subsp. rosaceusＮＲＲＬ１８９９３由来のドリゴシンの生合成遺伝子座をＤＯＲＲと称する場合があり、Streptomyces amphibiosporusＡＴＣＣ５３９６４由来のラクトイミドマイシンの生合成遺伝子座をＬＡＣＴと称する場合がある。ＤＯＲＲ及びＬＡＣＴのＯＲＦには、既知のタンパク質との相同性に基づいて推定的な機能が割り当てられ、ファミリーにグループ分けされている。構造と機能を相関させるため、タンパク質ファミリーは、本明細書及び図面を通して、表１に示すとおりの４文字表記で命名されている。
【００２４】
【表１】
2004535175.tif 000002
【００２５】
ドリゴシン生合成遺伝子産物という語は、ドリゴシン、ミグラスタチン又はイソミグラスタチンの生合成に関与するあらゆる酵素を指す。これらの遺伝子は、Streptomyces platensis subsp. rosaceus由来のドリゴシン生合成遺伝子座に局在している。この遺伝子座を図１及び図４に示す。詳しくは、ドリゴシン生合成経路はStreptomyces platensis subsp. rosaceusに関連している。しかし、この語には、Streptomyces属のどの微生物から単離されたドリゴシン生合成酵素（及びかかる酵素をコードする遺伝子）も含まれること、また、これらの遺伝子の新しいホモログが、本件の特許請求の範囲に含まれる関連する放線菌類の微生物中に存在する場合があることは、承知されてしかるべきである。具体的な実施形態において、かかる遺伝子は配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０及び２３に列挙されている。
【００２６】
ラクトイミドマイシン生合成遺伝子産物という語は、ラクトイミドマイシンの生合成に関与するあらゆる酵素を指す。これらの遺伝子は、Streptomyces amphibiosporus由来のラクトイミドマイシン生合成遺伝子座に局在している。この遺伝子座を図４に示す。詳しくは、ラクトイミドマイシン生合成経路はStreptomyces amphibiosporusに関連している。しかし、この語には、Streptomyces属のどの微生物から単離されたラクトイミドマイシン生合成酵素（及びかかる酵素をコードする遺伝子）も含まれること、また、これらの遺伝子の新しいホモログが、本件の特許請求の範囲に含まれる関連する放線菌類の微生物中に存在する場合があることは、承知されてしかるべきである。具体的な実施形態において、かかる遺伝子は配列番号２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０及び４２に列挙されている。
【００２７】
「単離された」という語は、物質がその本来の環境、例えばそれが天然物として生じるのであればその自然環境から除去されたことを意味する。例えば、生体内に存在する自然に生じたポリヌクレオチド又はポリペプチドは、単離されてはいないが、その同じポリヌクレオチド又はポリペプチドが、自然界のシステムで共存している物質のすべて又は一部から分離された場合は、単離されたことになる。そうしたポリヌクレオチドをベクターの一部とすることができ、及び／又は、そうしたポリヌクレオチド又はポリペプチドを組成物の一部とすることができる。その場合もやはり単離されたことになる。なぜなら、そうしたポリヌクレオチド又はポリペプチドにとって、該ベクターや組成物は自然環境の一部ではないからである。
【００２８】
「精製された」という語は、１００％の純度を必要とするわけではなく、どちらかといえば、相対的な定義を意図するものである。従来、ライブラリーから得た個々の核酸は、電気泳動上で均質となるまで精製されている。これらのクローンから得た配列を、コスミドライブラリーなどの大型挿入物ライブラリー又は全生物ＤＮＡから直接得ることは不可能であった。本発明の精製された核酸は、生物のゲノムＤＮＡの残存物から少なくとも１０4〜１０6倍に精製されたものである。しかし、「精製された」という語は、ゲノムＤＮＡの残存物又はライブラリー若しくは他の環境に存在する他の配列から、少なくとも１０1倍、好ましくは１０2倍又は１０3倍、さらに好ましくは１０4倍又は１０5倍に精製された核酸も含むものである。
【００２９】
「組換え体」という語は、核酸が、自然環境では隣接しない「骨格」核酸に隣接していることを意味する。「濃縮」核酸とは、核酸骨格分子群中に数にして５％以上の核酸挿入物が存在することを示す。「骨格」分子には、発現ベクター、自己複製核酸、ウィルス、組込み（integrating）核酸などの核酸、及び目的の核酸の維持又は操作に使用する他のベクター又は核酸などがある。該濃縮核酸は、組換え骨格分子群中に存在する核酸挿入物数の１５％以上であることが好ましく、５０％以上であることがさらに好ましく、９０％以上であることがもっとも好ましい。
【００３０】
「組換え」ポリペプチド又はタンパク質とは、組換えＤＮＡ技術により作製された、すなわち、目的のポリペプチド又はタンパク質をコードする外部ＤＮＡコンストラクトにより形質転換された細胞から作製されたポリペプチド又はタンパク質を示す。「合成」ポリペプチド又はタンパク質とは、化学合成により調製されたポリペプチド又はタンパク質のことである。
【００３１】
「遺伝子」という語は、ポリペプチド鎖の作製に関与するＤＮＡの部分であり、コード領域前後の領域（リーダー及びトレーラー）、及び該当する場合には、個々のコード部分（エキソン）の間にある領域（イントロン）も含むものである。
【００３２】
ある特定のポリペプチド若しくはタンパク質を「コードする配列」、又はＤＮＡ若しくはヌクレオチド「コード配列」とは、適切な制御配列の管理下に置かれた際にポリペプチド又はタンパク質に転写及び翻訳されるＤＮＡ配列のことである。
【００３３】
オリゴヌクレオチドとは、遺伝子、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ又はその他目的の核酸をコードするゲノムＤＮＡ分子、ｃＤＮＡ分子、又はｍＲＮＡ分子とハイブリダイズする核酸であって、一般的には１０個以上、好ましくは１５個、さらに好ましくは２０個以上で、好ましくは１００個以下のヌクレオチドを有する核酸のことである。
【００３４】
プロモーター配列は、ＲＮＡポリメラーゼが認識するコード配列に、「操作可能な状態で連結されて」いる。このＲＮＡポリメラーゼは、該プロモーターで転写を開始し、該コード配列をｍＲＮＡに転写する。
【００３５】
「プラスミド」は、小文字のｐを前につけて、すなわち、その後ろに大文字の文字及び／又は数字を続けて、設計される。ここでは、最初のプラスミドは、市販品で公的な使用に制限は課せられていないもの、又は、入手可能なプラスミドから公開された手順にしたがって構築することが可能なものである。さらに、ここに記載したプラスミドと同等のものは、当該分野では周知であり、当業者であれば容易にわかるものである。
【００３６】
ＤＮＡの「分解」とは、ＤＮＡのある特定の配列だけに作用する制限酵素によるＤＮＡの酵素的開裂を指す。ここで使用した各種制限酵素は市販品であり、その反応条件、補因子その他の要件は、当業者には周知のものとして使用された。
【００３７】
分析を目的とする場合、約２０μｌの緩衝液中で、１μｇのプラスミド又はＤＮＡ断片を約２単位の酵素とともに用いるのが一般的である。プラスミド構築のためにＤＮＡ断片を単離するのが目的の場合は、より多量に、５〜５０μｇのＤＮＡを２０〜２５０単位の酵素で分解するのが一般的である。特定の酵素に対する適切な緩衝液及び基質の量は、製造者によって具体的に示されている。インキュベーションの時間については、３７℃で１時間というのが普通だが、供給業者の指示によって変わる場合もある。分解後は、目的の断片を単離するためにゲル電気泳動が行われる場合がある。
【００３８】
本発明者らは、ポリケチドであるドリゴシン及びラクトイミドマイシンの生合成に関与する遺伝子及びタンパク質を見出すに至った。ドリゴシンの生合成に関与するタンパク質をコードする核酸配列を、添付の配列表中に配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１及び２４として提供する。ドリゴシンの生合成に関与するポリペプチドを、添付の配列表中に配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０及び２３として提供する。ラクトイミドマイシンの生合成に関与するタンパク質をコードする核酸配列を、添付の配列表中に配列番号２７、２９、３１、３３、３５、３７、４１及び４３として提供する。ラクトイミドマイシンの生合成に関与するポリペプチドを、添付の配列表中に配列番号２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０及び４２として提供する。
【００３９】
本発明の１つの態様は、配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２４、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９及び４１の配列、それらに相補的な配列のいずれかを、又は、配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２４、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９及び４１の配列若しくはそれらに相補的な配列のいずれかの少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、７５、１００、１５０、２００、３００、４００又は５００個の塩基を連続状態で含む断片を含む、単離、精製又は濃縮を行った核酸である。該単離、精製又は濃縮を行った核酸は、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、及び合成ＤＮＡなどのＤＮＡを含んでいてもよい。該ＤＮＡは二本鎖でも一本鎖でもよく、一本鎖の場合はコード鎖又は非コード（アンチセンス）鎖でもよい。あるいは、該単離、精製又は濃縮を行った核酸は、ＲＮＡを含んでいてもよい。
【００４０】
以下に詳述するとおり、配列番号のいずれかの単離、精製又は濃縮を行った核酸を用いて、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２３、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０及び４２のポリペプチドのいずれかを、又は配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２３、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０及び４２のポリペプチドのいずれかの少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、７５、１００若しくは１５０個のアミノ酸を連続状態で含む断片を調製してもよい。
【００４１】
したがって、本発明の別の態様は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２３、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０及び４２のポリペプチドのいずれかを、又は配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２３、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０及び４２のポリペプチドのいずれかの少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、７５、１００若しくは１５０個のアミノ酸を連続状態で含む断片をコードする、単離、精製又は濃縮を行った核酸である。これらの核酸のコード配列は、配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２４、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９及び４１の核酸、若しくはその断片のいずれかのコード配列と相同であってもよく、又は、遺伝子情報の冗長性若しくは縮重の結果として、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２３、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０及び４２のポリペプチドのいずれかを、又は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２３、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０及び４２のポリペプチドのいずれかの少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、７５、１００若しくは１５０個のアミノ酸を連続状態で含む断片をコードする別のコード配列であってもよい。かかる遺伝子情報は当業者には周知であり、例えばStryer, Biochemistry, 3rd edition, W. H. Freeman & Co., New Yorkなどから得ることができる。
【００４２】
配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２３、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０及び４２のポリペプチドのいずれかをコードする、単離、精製又は濃縮を行った核酸としては、（１）配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２４、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９及び４１のいずれかのコード配列のみ；（２）配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２４、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９及び４１のコード配列、及びリーダー配列などの付加的なコード配列又はプロタンパク質；及び（３）配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２４、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９及び４１のコード配列、及びイントロンなどの非コード配列、又はコード配列の非コード配列５’及び／又は３’が挙げられるが、これらに限定されるものではない。したがって、ここで使用されているように、「ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド」という語は、付加的なコード配列及び／又は非コード配列をも含むポリヌクレオチドに加えて、該ポリペプチド用コード配列だけを含むポリヌクレオチドをも意味するものである。
【００４３】
本発明は、配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２４、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９及び４１に基づくポリヌクレオチドではあるが、「サイレントな」ポリヌクレオチド変化、たとえば、配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２４、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９及び４１のポリヌクレオチドによりコードされるアミノ酸配列が変わらないような変化を示すポリヌクレオチドに関する。本発明はまた、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２３、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０及び４２のポリペプチドのアミノ酸の置換、付加、欠失、融合及び切断が生じるヌクレオチド変化を示すポリヌクレオチドに関する。かかるヌクレオチド変化の導入には、特定部位の突然変異誘発、ランダムな化学的突然変異誘発、エキソヌクレアーゼIIIの欠失などの技術、その他の組換えＤＮＡ技術を用いてもよい。
【００４４】
配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２４、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９及び４１、それらに相補的な配列、又は、配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２４、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９及び４１の配列若しくはそれらに相補的な配列のいずれかの少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、７５、１００、１５０、２００、３００、４００又は５００個の塩基を連続状態で含む断片の、単離、精製又は濃縮を行った核酸をプローブとして用いて、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２３、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０及び４２のポリペプチドをそれぞれコードするＤＮＡの同定及び単離を行ってもよい。そうした手順においては、試料の微生物、又は、ポリケチドを産生する能力をもつ微生物を含有する試料からゲノムＤＮＡライブラリーを構築する。その後、該ゲノムＤＮＡライブラリーと、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２３、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０及び４２のポリペプチド、若しくはその断片をコードするコード配列若しくは該コード配列の断片を含むプローブとを、該プローブがそれらの相補配列と特異的にハイブリダイズできるような条件下で接触させる。好ましい実施形態においては、該プローブは、長さにして約１０〜約３０個のヌクレオチドを有し、配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２４、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９及び４１の核酸に基づいて設計されたオリゴヌクレオチドである。次いで、該プローブとハイブリダイズするゲノムＤＮＡクローンを検出し、単離する。目的のＤＮＡクローンを調製し同定する手順は、Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley 503 Sons, Inc. 1997; Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2d Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989に開示されている。別の実施形態においては、該プローブは、配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２４、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９及び４１由来のＰＣＲ増幅核酸又は制限断片である。
【００４５】
配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２４、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９及び４１、それらに相補的な配列、又は、配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２４、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９及び４１の配列若しくはそれらに相補的な配列のいずれかの少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、７５、１００、１５０、２００、３００、４００又は５００個の塩基を連続状態で含む断片の、単離、精製又は濃縮を行った核酸をプローブとして用いて、関連する核酸の同定及び単離を行ってもよい。いくつかの実施形態においては、かかる関連する核酸は、潜在的ポリケチド産生株に由来するゲノムＤＮＡ（又はｃＤＮＡ）であってもよい。好ましい実施形態においては、配列番号１１、１３、１５、３３、３５及び３７、それらに相補的な配列、又は配列番号１１、１３、１５、３３、３５及び３７、若しくはそれらに相補的な配列のいずれかの少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、７５、１００、１５０、２００、３００、４００又は５００個の塩基を連続状態で含む断片の、単離、精製又は濃縮を行った核酸をプローブとして用いて、関連する核酸の同定及び単離を行ってもよい。そうした手順においては、潜在的ポリケチド産生株由来の核酸を含有する核酸試料とプローブとを、該プローブが関連する配列と特異的にハイブリダイズできるような条件下で接触させる。かかる核酸試料は、潜在的ポリケチド産生株由来のゲノムＤＮＡ（又はｃＤＮＡ）ライブラリーであってもよい。次いで、上記のいずれかの方法を用いて、該プローブと核酸とのハイブリダイゼーションを検出する。
【００４６】
ハイブリダイゼーションは、低ストリンジェンシー条件下、中程度のストリンジェンシー条件下、又は高ストリンジェンシー条件下で行ってもよい。核酸ハイブリダイゼーションの一例を挙げる。０．９ＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのＮａＨ2ＰＯ4、ｐＨ７．０、５．０ｍＭのＮａ2ＥＤＴＡ、０．５％のＳＤＳ、１０×Denhardt's、及び０．５ｍｇ／ｍｌのポリリボアデニル酸からなる溶液中で、不動化変性核酸を含むポリマー膜を、まず４５℃で３０分間プレハイブリダイズする。その後、約２×１０7ｃｐｍ（比放射能４〜９×１０8ｃｐｍ／ｕｇ）の32Ｐ末端標識オリゴヌクレオチドプローブを溶液に添加する。１２〜１６時間のインキュベーションを行った後、０．５％のＳＤＳを含む１×ＳＥＴ（１５０ｍＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのＴｒｉｓ塩酸、ｐＨ７．８、１ｍＭのＮａ2ＥＤＴＡ）中で、かかる膜を室温で３０分間洗浄し、新しい１×ＳＥＴ中で、オリゴヌクレオチドプローブ用にＴｍ−１０Ｃで３０分間洗浄する。ここでＴｍとは融解温度のことである。その後、ハイブリダイゼーションシグナルを検出するため、かかる膜をオートラジオグラフ用フィルムに曝露させる。
【００４７】
検出可能なプローブとハイブリダイズする、ゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡなどの核酸の同定に使用するハイブリダイゼーションストリンジェンシーの条件を変えると、該プローブに対して異なる相同性を有する核酸の同定及び単離が可能になる。該プローブの融解温度よりも低い温度で、いろいろと温度を変えてハイブリダイゼーションを行うことによって、ストリンジェンシーを変えてもよい。該プローブの融解温度は、下記の式を利用して計算してもよい。
【００４８】
長さにして１４〜７０個のヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドプローブの場合、摂氏での融解温度（Ｔｍ）は、下記の式を利用して計算してもよい。
Ｔｍ＝８１．５+１６．６（ｌｏｇ［Ｎａ+］）+０．４１（フラクションＧ+Ｃ）−（６００／Ｎ）、式中、Ｎはオリゴヌクレオチドの長さ。
【００４９】
ホルムアミドを含む溶液中でハイブリダイゼーションを行う場合、以下の方程式を用いて融解温度を計算してもよい。Ｔｍ＝８１．５+１６．６（ｌｏｇ［Ｎａ+］）+０．４１（フラクションＧ+Ｃ）−（０．６３％のホルムアミド）−（６００／Ｎ）、式中、Ｎはプローブの長さ。
【００５０】
６×ＳＳＣ、５×Denhardt's試薬、０．５％のＳＤＳ、０．１ｍｇ／ｍｌの変性分画サケ精子ＤＮＡ、又は６×ＳＳＣ、５×Denhardt's試薬、０．５％のＳＤＳ、０．１ｍｇ／ｍｌの変性分画サケ精子ＤＮＡ、５０％のホルムアミド中で、プレハイブリダイゼーションをおこなってもよい。ＳＳＣ及びDenhardt's溶液の組成については、上記Sambrook et al.中に列挙されている。上に列挙したハイブリダイゼーション溶液に検出可能なプローブを添加することにより、ハイブリダイゼーションを行う。該プローブが二本鎖ＤＮＡを含む場合には、温度を上げながらインキュベーションを行い、次いで急激に冷却することによりかかるＤＮＡを変性させ、その後でハイブリダイゼーション溶液に添加する。また、二次構造の形成若しくはオリゴマー化を皆無にするため又は減らすために、一本鎖プローブを同様に変性させることが望ましい場合もある。フィルターを充分な時間ハイブリダイゼーション溶液と接触させて、相補配列又は相同配列を内包するｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡと該プローブがハイブリダイズできるようにする。長さにして２００以上のヌクレオチドからなるプローブについては、Ｔｍよりも１５〜２５℃低い温度でハイブリダイゼーションを行ってもよい。オリゴヌクレオチドプローブなど、それよりも短いプローブについては、Ｔｍよりも５〜１０℃低い温度でハイブリダイゼーションを行ってもよい。短いプローブのハイブリダイゼーションは、６×ＳＳＣ中で行うのが好ましい。長いプローブのハイブリダイゼーションは、５０％のホルムアミドを含む溶液中で行うのが好ましい。これまで述べたハイブリダイゼーションはすべて、高ストリンジェンシー条件下で行われるハイブリダイゼーションの例と考えられている。
【００５１】
ハイブリダイゼーションに続いて、２×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳ中で少なくとも１５分間、目的のストリンジェンシーに応じて室温又はそれよりも高い温度で、フィルターを洗浄する。その後フィルターを０．１×ＳＳＣ、０．５％のＳＤＳで、３０分〜１時間、（再び）室温で洗浄する。プローブとハイブリダイズした核酸を、オートラジオグラフィー又は他の従来の方法で同定する。
【００５２】
プローブ配列との相同性が低下している核酸を同定する際には、上記手順を修正してもよい。例えば、検出可能なプローブとの相同性が低下している核酸を得るためには、低ストリンジェンシー条件を用いてもよい。例えば、Ｎａ+の濃度が約１Ｍのハイブリダイゼーション緩衝液において、ハイブリダイゼーション温度を、６８℃から４２℃まで、５℃ずつ下げていってもよい。ハイブリダイゼーション後、フィルターを２×ＳＳＣ、０．５％のＳＤＳで、ハイブリダイゼーション温度で洗浄してもよい。これらの条件は、５０℃を越える温度では「中程度のストリンジェンシー」条件で、５０℃以下の温度では「低ストリンジェンシー」条件であると考えられている。「中程度のストリンジェンシー」ハイブリダイゼーション条件の具体例として、上記ハイブリダイゼーションを５５℃で行った場合が挙げられる。「低ストリンジェンシー」ハイブリダイゼーション条件の具体例として、上記ハイブリダイゼーションを４５℃で行った場合が挙げられる。
【００５３】
あるいは、ホルムアミドを含む、例えば６×ＳＳＣなどの緩衝液中で、４２℃でハイブリダイゼーションを行ってもよい。この場合、プローブとの相同性が低下しているクローンを同定するために、ハイブリダイゼーション緩衝液中のホルムアミドの濃度を、５０％から０％へ、５％ずつ下げてもよい。ハイブリダイゼーション後、フィルターを６×ＳＳＣ、０．５％のＳＤＳで、５０℃で洗浄してもよい。これらの条件は、ホルムアミドが２５％を越える場合には「中程度のストリンジェンシー」条件で、２５％以下の場合には「低ストリンジェンシー」条件であると考えられている。「中程度のストリンジェンシー」ハイブリダイゼーション条件の具体例として、上記ハイブリダイゼーションを３０％のホルムアミドで行った場合が挙げられる。「低ストリンジェンシー」ハイブリダイゼーション条件の具体例として、上記ハイブリダイゼーションを１０％のホルムアミドで行った場合が挙げられる。
【００５４】
プローブとハイブリダイズした核酸を、オートラジオグラフィー又は他の従来の方法で同定する。
【００５５】
例えば、配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２４、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９及び４１の配列、上記配列の少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、７５、１００、１５０、２００、３００、４００若しくは５００個の塩基を連続状態で含む断片、及びそれらの相補配列からなる群から選択した核酸配列に対して、少なくとも９７％、少なくとも９５％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７０％の相同性を示す配列を有する核酸を単離するのに、上記方法を用いてもよい。デフォルトパラメータを用いたＢＬＡＳＴＮのバージョン２．０で相同性を測定してもよい。例えば、相同的なポリヌクレオチドは、ここに記載したコード配列のいずれかに対して自然に発生したアレル変異体であるコード配列を有していてもよい。そうしたアレル変異体には、配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２４、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９及び４１、又はその相補配列の核酸と比較して、１つ以上のヌクレオチドの置換、欠失、付加が生じていてもよい。
【００５６】
また、デフォルトパラメータを用いたＢＬＡＳＴＰのバージョン２．２．２アルゴリズムで測定した際に、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２３、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０及び４２のいずれかの配列を有するポリペプチド、又は、上記配列の、少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、７５、１００若しくは１５０個のアミノ酸を連続状態で含む断片を有するポリペプチドに対して、少なくとも９９％、少なくとも９５％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、又は少なくとも７０％の相同性を示すポリペプチドをコードする核酸を単離するのに、上記方法を用いてもよい。
【００５７】
本発明の別の態様は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２３、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０及び４２のいずれかの配列を、又は、上記配列の少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、７５、１００若しくは１５０個のアミノ酸を連続状態で含む断片を含む、単離又は精製を行ったポリペプチドである。上述のとおり、ポリペプチドをコードする核酸をベクターに挿入し、その際に、該コードされたポリペプチドを適切な宿主細胞内で発現させることができる配列に、コード配列が操作可能な状態で連結されるようにすることにより、該ポリペプチドを得てもよい。例えば、かかる発現ベクターは、プロモーター、翻訳開始のためのリボソーム結合部位、及び転写ターミネーターを含んでいてもよい。かかるベクターは、発現レベルを調節する適切な配列、複製起点、及び選択マーカーも含んでいてもよい。
【００５８】
細菌内でポリペプチド又はその断片を発現させる適切なプロモーターには、大腸菌ｌａｃ又はｔｒｐプロモーター、ｌａｃＩプロモーター、ｌａｃＺプロモーター、Ｔ３プロモーター、Ｔ７プロモーター、ｇｐｔプロモーター、ラムダＰRプロモーター、ラムダＰLプロモーター、３−ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）などの解糖酵素をコードするオペロン由来のプロモーター、及び酸ホスファターゼプロモーターなどがある。真菌プロモーターとしては、α因子プロモーターが挙げられる。真核生物のプロモーターとしては、ＣＭＶ前初期プロモーター、ＨＳＶチミジンキナーゼプロモーター、熱ショックプロモーター、初期及び後期ＳＶ４０プロモーター、レトロウィルス由来のＬＴＲ、及びマウスメタロチオネイン−Ｉプロモーターが挙げられる。原核細胞又は真核細胞内で遺伝子の発現を制御することが知られている他のプロモーター及びそれらのウィルスを用いてもよい。
【００５９】
哺乳類の発現ベクターは、複製起点、必要とするすべてのリボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライス供与体部位及び受容体部位、転写終結配列、及び５’フランキング非転写配列を含んでいてもよい。いくつかの実施形態においては、ＳＶ４０スプライス部位及びポリアデニル化部位由来のＤＮＡ配列を用いて、必要な非転写遺伝要素を提供している場合がある。
【００６０】
真核細胞内でポリペプチド又はその断片を発現させるベクターは、発現レベルを高めるエンハンサーも含んでいてもよい。エンハンサーはＤＮＡのシス作用性因子で、通常は約１０〜約３００ｂｐの長さをもち、プロモーターに作用してその転写を増大させる。例として、複製起点の後部側、ｂｐ１００〜２７０にあるＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウィルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後部側にあるポリオーマエンハンサー、及びアデノウィルスエンハンサーが挙げられる。
【００６１】
また、かかる発現ベクターは、ベクターを含む宿主細胞を選択できるように、選択マーカー遺伝子を１つ以上含んでいることが好ましい。使用してもよい選択マーカーの例としては、ジヒドロ葉酸レダクターゼをコードする遺伝子、又は真核細胞培養物にネオマイシン耐性を与える遺伝子、大腸菌においてテトラサイクリン又はアンピシリン耐性を与える遺伝子、及びS. cerevisiaeＴＲＰ１遺伝子が挙げられる。いくつかの実施形態においては、翻訳したポリペプチド又はその断片の分泌を誘発できるリーダー配列を用いて、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２３、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０及び４２のいずれかのポリペプチドを、又は、上記配列の少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、７５、１００若しくは１５０個のアミノ酸を連続状態で含む断片をコードする核酸が、適切な相に集められる。状況に応じて、かかる核酸は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２３、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０及び４２のいずれかのポリペプチド、又は、上記配列の少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、７５、１００若しくは１５０個のアミノ酸を連続状態で含む断片のいずれかと、安定性の増大、精製や検出の簡単さといった望ましい性質を授けるＮ末端同定ペプチドなどの非相同ペプチド又はポリペプチドとを融合させた融合ポリペプチドをコードすることができる。
【００６２】
各種の手順により、適切なＤＮＡ配列をベクターに挿入してもよい。一般に、ＤＮＡ配列がベクター中の目的の場所に連結されるのは、挿入物及びベクターが適切な制限エンドヌクレアーゼで分解された後である。あるいは、ＰＣＲによって、適切な制限酵素部位のＤＮＡ配列中への工学的処理を行うこともできる。Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley 503 Sons, Inc. 1997及びSambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2d Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989には、各種クローニング技術が開示されている。かかる手順及びその他の手順は、当業者であればその知識の範囲に入っていると思われる。
【００６３】
ベクターの形態は、例えばプラスミドでも、ウィルス粒子でも、又はファージでもよい。その他のベクターとしては、染色体ＤＮＡ配列、非染色体ＤＮＡ配列及び合成ＤＮＡ配列、ウィルス、細菌プラスミド、ファージＤＮＡ、バキュロウィルス、酵母プラスミド、プラスミドとファージＤＮＡの組み合わせに由来するベクター、ワクシニア、アデノウィルス、鶏痘ウィルス、及び仮性狂犬病ウィルスなどのウィルスＤＮＡが挙げられる。宿主である原核生物及び真核生物に用いる各種クローニングベクター及び発現ベクターは、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual Second Edition. Cold Spring Harbor, N. Y., (1989) に記載されている。
【００６４】
使用してもよい特定の細菌ベクターとしては、周知のクローニングベクターであるpBR322（ＡＴＣＣ３７０１７）、pKK223-3（スウェーデン国、ウプサラ、Pharmacia Fine Chemicals社製）、ＧＥＭ１（米国、ウィスコンシン州、マジソン、Promega Biotec社製）、pQE70、pQE60、pQE-9（Qiagen社製）、pD10、psiX174 pBlurscript II KS、pNH8A、pNH16a、pNH18A、pNH46A（Staratagene社製）、ptrc99a、pKK223-3、pKK233-3、pDR540、pRIT5（Pharmacia社製）、pKK232-8及びpCM7の遺伝因子を含む市販品のプラスミドが挙げられる。特定の真核ベクターとしては、pSV2CAT、pOG44、pXT1、pSG（Stratagene社製）、pSVK3、pBPV、pMSG、及びpSVL（Pharmacia社製）が挙げられる。しかし、宿主細胞内で複製可能であり、かつ安定しているものであれば、その他のどのようなベクターを用いてもよい。
【００６５】
宿主細胞については、原核細胞又は真核細胞など当業者が精通しているものであれば、どのような宿主細胞を用いてもよい。適切な宿主の代表的な例として記載してよいものとしては、大腸菌、Streptomyces、Bacillus subtilis、Salmonella typhimurium、及びPseudomonas属、Streptomyces属、Staphylococcus属に含まれる多様な種などの細菌細胞、酵母などの真菌細胞、ドロソフィラＳ２又はスポドプテラＳｆ９などの昆虫細胞、ＣＨＯ、ＣＯＳ又はＢｏｗｅｓメラノーマなどの動物細胞、及びアデノウィルスが挙げられる。当業者であれば、適切な宿主を選択できる。
【００６６】
かかるベクターの宿主細胞への導入に際しては、エレクトロポレーションによる形質転換、トランスフェクション、トランスダクション、ウィルス感染、遺伝子銃、又はＴｉを介した遺伝子導入をはじめとするさまざまな技法のどれを用いてもよい。それが適切な場合であれば、工学的処理を行った宿主細胞を、プロモーターの活性化、形質転換体の選択、又は本発明の遺伝子の増幅に適するように、従来の栄養培地を改変した培地で培養することができる。次に述べる適切な宿主株の形質転換及び宿主株の適切な細胞密度への増殖には、適切な手段（例えば、温度変化又は化学的誘導）で選択プロモーターを誘導してもよく、目的のポリペプチド又はその断片が生成されるように、細胞の培養期間を延長してもよい。
【００６７】
細胞を遠心分離によって回収し、物理的又は化学的方法によって破壊し、結果として生じた粗抽出物をさらなる精製のために保有しておくのが一般的である。タンパク質の発現に使用する微生物細胞は、凍結融解サイクル、超音波処理、機械的な破壊、又は細胞溶解剤など従来のどの方法で破壊してもよい。これらの方法は、当業者に周知である。発現したポリペプチド又はその断片を、組換え細胞培養物から回収し精製することができる。その際に用いる方法には、硫酸アンモニウム又はエタノール沈殿、酸抽出、アニオン又はカチオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ハイドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、及びレクチンクロマトグラフィーなどがある。必要に応じて、ポリペプチドの形状を完成させる際にタンパク質の再折りたたみ工程を使用することができる。望ましい場合は、最終的な精製工程で高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を使用することができる。組換えタンパク質を発現させるため、さまざまな哺乳類細胞培養システムも使用可能である。哺乳類の発現系としては、サル腎臓線維芽細胞のＣＯＳ−７株（Cell, 23: 175 (1981)にGluzmanによる記載あり）、及びＣ１２７、３Ｔ３、ＣＨＯ、ＨｅＬａ及びＢＨＫ細胞株など、適合性ベクター由来のタンパク質を発現させられるその他の細胞株が例示できる。
【００６８】
宿主細胞内の構造物を従来の手法で用いて、組換え型配列にコードされる遺伝子産物を生成することができる。組換え体の生成手順で使用した宿主に応じて、ベクターを含む宿主細胞が生成したポリペプチドは、グリコシル化されていてもよく、グリコシル化されていなくてもよい。本発明のポリペプチドは最初のメチオニンアミノ酸残基を含んでいても含んでいなくてもよい。
【００６９】
あるいは、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２３、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０及び４２のいずれかのポリペプチド、又は、上記配列の少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、７５、１００若しくは１５０個のアミノ酸を連続状態で含む断片を、従来のペプチド合成機での合成により生成することができる。他の実施形態においては、ポリヌクレオチドの断片又は部分を使用して、対応する完全長ポリペプチドをペプチド合成によって生成してもよい。したがって、完全長ポリペプチドを生成するための中間物質として、かかる断片を使用してもよい。
【００７０】
ポリペプチド又はその断片をコードする核酸に操作可能な状態で連結されたプロモーターを含むＤＮＡコンストラクトから転写されたｍＲＮＡを用いて、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２３、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０及び４２のいずれかのポリペプチド、又は、上記配列の少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、７５、１００若しくは１５０個のアミノ酸を連続状態で含む断片を生成する際には、無細胞翻訳系も使用することができる。いくつかの実施形態においては、インビトロでの転写反応を行う前に、かかるＤＮＡコンストラクトを線状化してもよい。次いで、転写されたｍＲＮＡを、ウサギの網状赤血球抽出物などの適切な無細胞翻訳抽出物でインキュベーションして、目的のポリペプチド又はその断片を生成する。本発明はまた、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２３、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０及び４２のポリペプチド、又は、上記配列の少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、７５、１００若しくは１５０個のアミノ酸を連続状態で含む断片の変異体に関する。「変異体」という語には、これらのポリペプチドの誘導体又は類似体が含まれる。特に、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２３、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０及び４２のポリペプチド由来のアミノ酸配列に生じる１つ以上の置換、付加、欠失、融合及び切断が変異体間の相違点となる場合がある。これらはあらゆる組み合わせで生じている場合がある。
【００７１】
かかる変異体は、自然に生じる場合もあれば、インビトロで作製される場合もある。特に、特定部位の突然変異誘発、ランダムな化学的突然変異誘発、エキソヌクレアーゼIIIの欠失などの遺伝子組換え技術、及び標準的なクローニング技術を用いてかかる変異体を作製してもよい。あるいは、化学合成又は化学修飾により、かかる変異体、断片、類似体、又は誘導体を作製してもよい。他の変異体作製方法も、当業者にはよく知られている。そうした方法のなかには、天然の隔離集団から得た核酸配列を修飾して、自らの産業上又は実験上の応用価値を高めるような性質をもつポリペプチドをコードする核酸を作製する方法が含まれる。そうした手順においては、天然の隔離集団から得た配列との間でヌクレオチドの相違点を１つ以上有している大量の変異体配列を作製し、その性質決定を行う。これらのヌクレオチドの相違点により、天然の隔離集団由来の核酸がコードするポリペプチドでアミノ酸の変化が生じることが好ましい。例えば、変異性ＰＣＲを用いて変異体を作製してもよい。変異性ＰＣＲでは、ＰＣＲ産物の全長に沿って高い割合で点変異が得られるように、ＤＮＡポリメラーゼの信頼度が低い条件でＤＮＡ増幅を行う。変異性ＰＣＲについては、Leung, D. W., et al., Technique, 1: 11-15 (1989)及びCaldwell, R. C. & Joyce G. F., PCR Method Applic., 2: 28-33 (1992)に記載されている。また、特定部位の突然変異誘発を使って、目的とするクローン化ＤＮＡセグメント内に部位特異的な突然変異を発生させ、変異体を作製してもよい。オリゴヌクレオチドの突然変異誘発については、Reidhaar-Orson, J. F. & Sauer, R. T., et al., Science, 241: 53-57 (1988) に記載されている。配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２３、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０及び４２のポリペプチドの変異体は、（ｉ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２３、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０及び４２のポリペプチドの、１つ以上のアミノ酸残基が、保存又は非保存アミノ酸残基（好ましくは保存アミノ酸残基）で置換され、かかる置換されたアミノ酸残基が遺伝子コードにコードされている場合もあれば、コードされていない場合もある変異体であってもよい。
【００７２】
同類置換とは、ポリペプチド中の所定のアミノ酸を、同様の特徴をもつ別のアミノ酸で置換することである。同類置換として一般的に見うけられるのは、次のような置換である：Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ及びＩｌｅなどの脂肪族アミノ酸を別の脂肪族アミノ酸で置換する；ＳｅｒをＴｈｒで置換する、またはその逆；Ａｓｐ又はＧｌｕなどの酸性残基を別の酸性残基で置換する；Ａｓｎ又はＧｌｎなどのアミド基を有する残基を、アミド基を有する別の残基で置換する；Ｌｙｓ又はＡｒｇなどの塩基性残基を、別の塩基性残基で置換する；及びＰｈｅ又はＴｙｒなどの芳香族残基を、別の芳香族残基で置換する。
【００７３】
他の変異体としては、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２３、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０及び４２のポリペプチドの、１つ以上のアミノ酸残基に置換基が含まれるものがある。
【００７４】
その他の変異体としては、かかるポリペプチドが、ポリペプチドの半減期を延長する化合物（例えば、ポリエチレングリコール）などの他の化合物と会合しているものがある。
【００７５】
さらに他の変異体としては、追加されたアミノ酸がポリペプチドと融合しているもの、例えば、リーダー配列、分泌配列、プロタンパク質配列又はポリペプチドの精製、濃縮若しくは安定化を促進する配列がある。いくつかの実施例においては、かかる断片、誘導体及び類似体は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２３、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０及び４２のポリペプチドと同様の生物学的機能又は活性を保有している。他の実施形態においては、かかる断片、誘導体又は類似体には、かかる断片、誘導体又は類似体から酵素によって全体的又は部分的に切り離すことができるポリペプチドの精製、濃縮、検出、安定化又は分泌を促進する融合異種配列が含まれる。
【００７６】
本発明の別の態様は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２３、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０及び４２のいずれかのポリペプチド、又は、上記配列の少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、７５、１００若しくは１５０個のアミノ酸を連続状態で含む断片に対して少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％又は９５％以上の相同性を有するポリペプチド又はその断片である。相同性の測定には、デフォルトパラメータを用いたＢＬＡＳＴＰバージョン２．２．２でなどのプログラムを用いてもよい。このプログラムは、比較対象のポリペプチド又は断片を整列させ、比較対象物間のアミノ酸の相同性又は類似性の程度を測定する。当然のことながら、アミノ酸「相同性」には上述した同類置換も含まれる。
【００７７】
配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２３、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０及び４２のいずれかのポリペプチド、又は、上記配列の少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、７５、１００若しくは１５０個のアミノ酸を連続状態で含む断片に対して相同性を有するポリペプチド又は断片を、それらをコードする核酸を上記の技法で単離することによって得てもよい。
【００７８】
あるいは、生化学的濃縮手順又は精製手順により、相同的なポリペプチド又は断片を得てもよい。相同的と思われるポリペプチド又は断片の配列を、タンパク質分解、ゲル電気泳動、及び／又はマイクロシーケンシングによって測定してもよい。デフォルトパラメータを用いたＢＬＡＳＴＰバージョン２．２．２などのプログラムを用いて、相同的と思われるポリペプチド又は断片の配列を、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２３、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０及び４２のいずれかのポリペプチド、又は、上記配列の少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、７５、１００若しくは１５０個のアミノ酸を連続状態で含む断片と比較することができる。
【００７９】
本発明の、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２３、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０及び４２のポリペプチド又は、上記配列の少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、７５、１００若しくは１５０個のアミノ酸を連続状態で含む断片、誘導体又は類似体を、さまざまな応用に用いてもよい。例えば、ポリペプチド、又はその断片、誘導体若しくは類似体を、生化学反応の生体触媒として用いてもよい。特に、ポリケチド又はその下部構造の合成若しくは修飾を誘発するために、ＡＹＴＴファミリー、すなわち、配列番号４及び２６のポリペプチド、又はその断片、誘導体若しくは類似体；ＡＣＰＩファミリー、すなわち、配列番号６及び２８のポリペプチド、又はその断片、誘導体若しくは類似体；ＡＯＴＦファミリー、すなわち、配列番号８及び３０のポリペプチド、又はその断片、誘導体若しくは類似体；ＰＫＵＮファミリー、すなわち、配列番号１０、１２、１４、３２、３４及び３６のポリペプチド、又はその断片、誘導体若しくは類似体；ＡＹＯＡファミリー、すなわち、配列番号１６及び３８のポリペプチド、又はその断片、誘導体若しくは類似体を、どのようにでも組み合わせて、インビトロ又はインビボで用いてもよい。宿主により内生的に生成され、成長培地に補充された化合物、又は、精製若しくは濃縮を行ったＯＸＲＹポリペプチドの無細胞調製物に添加された化合物を修飾する酸化還元反応に触媒作用を及ぼすため、ＯＸＲＹファミリー、すなわち、配列番号１８のポリペプチド、又はその断片、誘導体若しくは類似体をインビトロ又はインビボで用いてもよい。宿主により内生的に生成され、成長培地に補充された化合物、又は、精製若しくは濃縮を行ったＭＴＦＡポリペプチドの無細胞調製物に添加された化合物を修飾するメチル化反応に触媒作用を及ぼすため、ＭＴＦＡファミリー、すなわち、配列番号２０のポリペプチド、又はその断片、誘導体若しくは類似体をインビトロ又はインビボで用いてもよい。宿主により内生的に生成され、成長培地に補充された化合物、又は、精製若しくは濃縮を行ったＯＸＲＣポリペプチドの無細胞調製物に添加された化合物を修飾する酸化反応に触媒作用を及ぼすため、ＯＸＲＣファミリー、すなわち、配列番号２３及び４０のポリペプチド、又はその断片、誘導体若しくは類似体をインビトロ又はインビボで用いてもよい。アシル運搬体タンパク質若しくはドメイン、チオール化タンパク質若しくはドメイン、又はペプチジル運搬体タンパク質若しくはドメインのホスホパンテテイニル化反応に触媒作用を及ぼすため、ＰＰＴＦファミリー、すなわち、配列番号４２のポリペプチド、又はその断片、誘導体若しくは類似体をインビトロ又はインビボで用いてもよい。
【００８０】
配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２３、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０及び４２のポリペプチド、又は、上記配列の少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、７５、１００若しくは１５０個のアミノ酸を連続状態で含む断片、誘導体又は類似体を用いて、ポリペプチド、断片、誘導体又は類似体に特異的に結合する抗体を作製してもよい。配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０及び２３から作製される抗体を用いて、生体試料中にStreptomyces platensis subsp. rosaceus又は関連微生物が含まれているかどうかを測定してもよい。配列番号２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０及び４２から作製される抗体を用いて、生体試料中にStreptomyces amphibiosporus又は関連微生物が含まれているかどうかを測定してもよい。そうした手順においては、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２３、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０及び４２のポリペプチドのいずれか、又は、上記配列の少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、７５、１００若しくは１５０個のアミノ酸を連続状態で含む断片に特異的に結合できる抗体と、生体試料とを接触させる。その後、かかる生体試料の抗体結合能力を測定する。例えば、蛍光剤、酵素標識又は放射性同位元素などの検出可能な標識を用いて抗体に標識を施すことによって、結合を測定してもよい。あるいは、検出可能な標識を施された二次抗体を用いて、抗体の試料への結合を測定してもよい。試料中のStreptomyces platensis subsp. rosaceus若しくはStreptomyces amphibiosporus又は配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２３、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０及び４２に関連するポリペプチドの有無を検出するために使用してもよいさまざまな測定方法のプロトコルは、当業者によく知られている。特定の測定方法としては、ＥＬＩＳＡ法、サンドイッチ法、ラジオイムノアッセイ、ウェスタンブロットがある。あるいは、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２３、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０及び４２から作製した抗体を用いて、生体試料中に、ポリケチド類、又は自然状態で部分的にポリケチドの特徴を有する他の類の天然物の生合成に関与する場合もある、関連ポリケチドが含まれているかを測定してもよい。配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２３、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０及び４２のポリペプチド、又は、上記配列の少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、７５、１００若しくは１５０個のアミノ酸を連続状態で含む断片に対して作製されたポリクローナル抗体は、かかるポリペプチドを動物に直接注入すること、又はかかるポリペプチドを動物に、好ましくは非ヒト動物に投与することにより、得ることが可能である。そのようにして得た抗体は、その後、ポリペプチド自体に結合する。このように、ポリペプチドの断片のみをコードする配列でさえ、未加工のポリペプチド全体に結合すると思われる抗体の作製に使用できる。その後かかる��体を使用して、該ポリペプチドを発現する細胞から該ポリペプチドを単離することができる。
【００８１】
モノクローナル抗体の調製に使用する技術としては、連続細胞系培養物から作製される抗体を提供できるものであれば、どのようなものでも使用できる。例としては、ハイブリドーマ法（Kholer and Milstein, 1975, Nature, 256: 495-497）、トリオーマ法、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ法（Kozbor et al., 1983, Immunology Today 4: 72）、及びＥＢＶハイブリドーマ法（Cole, et al., 1985, in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96）が挙げられる。
【００８２】
一本鎖抗体の製造法（米国特許第４，９４６，７７８号）に記載の方法を適用して、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２３、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０及び４２のポリペプチド、又は、上記配列の少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、７５、１００若しくは１５０個のアミノ酸を連続状態で含む断片に対する一本鎖抗体を作製することができる。あるいは、トランスジェニックマウスを使用して、これらのポリペプチド又はその断片に対するヒト化抗体を発現させてもよい。
【００８３】
配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２３、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０及び４２のポリペプチド、又は、上記配列の少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、７５、１００若しくは１５０個のアミノ酸を連続状態で含む断片に対して作製された抗体を、生物又はその無細胞抽出物を含む試料から類似したポリペプチドをスクリーニングする際に使用してもよい。そうした方法においては、試料のポリペプチドを抗体と接触させ、かかる抗体に特異的に結合するポリペプチドを検出する。抗体結合の検出には、上記のいずれの方法を用いてもよい。そうしたスクリーニング法の１つが、“Methods for measuring Cellulase Activities”、Methods in Enzymology, Vol 160, pp. 87-116に記載されている。
【００８４】
ここで使用する「配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２４、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９及び４１の核酸コード」という語には、配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２４、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９及び４１のヌクレオチド配列、配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２４、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９及び４１の断片、配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２４、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９及び４１に相同的なヌクレオチド配列、又は配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２４、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９及び４１の断片に相同的なヌクレオチド配列、及び前記全配列の相補配列が含まれる。かかる断片としては、配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２４、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９及び４１の部分であって、配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２４、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９及び４１の少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、７５、１００、１５０、２００、３００、４００若しくは５００個のヌクレオチドを連続状態で含むものが挙げられる。該断片は新規断片であることが好ましい。配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２４、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９及び４１の相同配列及び断片とは、これらの配列に対して、少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８０％、７５％又は７０％の相同性を有する配列のことである。相同性の測定は、デフォルトパラメータを用いたＢＬＡＳＴＮ及びＴＢＬＡＳＴＸをはじめとする、ここに記載したコンピュータプログラム及びパラメータのいずれを用いて行ってもよい。相同配列には、配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２４、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９及び４１の核酸コード中のチミンがウリジンに置換されているＲＮＡ配列も含まれる。相同配列は、ここに記載したどの手順を用いて得てもよく、また、シーケンシングエラー訂正の結果として生じる場合もある。当然のことながら、配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２４、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９及び４１の核酸コードは、Ｇ、Ａ、Ｔ及びＣがデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）配列のグアニン、アデニン、チミン及びシトシン塩基をそれぞれ表し、Ｇ、Ａ、Ｕ及びＣがリボ核酸（ＲＮＡ）配列のグアニン、アデニン、ウラシル及びシトシン塩基をそれぞれ表す、従来の１文字表記形式（Stryer, Biochemistry, 3rd edition, W. H. Freeman & Co., New Yorkの裏表紙の見返し部分を参照のこと）、又は、配列中のヌクレオチドの同一性を記録する他のどの形式でも表すことができる。
【００８５】
「配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２３、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０及び４２のポリペプチドコード」という語には、配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２４、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９及び４１のｃＤＮＡにコードされる配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２３、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０及び４２のポリペプチド配列、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２３、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０及び４２のポリペプチドに相同的なポリペプチド配列、又は前記配列の断片が含まれる。相同的なポリペプチド配列とは、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２３、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０及び４２のポリペプチド配列のいずれかに対して、少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、８０％、７５％又は７０％の相同性を有するポリペプチド配列のことである。ポリペプチド配列の相同性の測定は、デフォルトパラメータ又はユーザー指定パラメータを用いたＢＬＡＳＴＰバージョン２．２．２をはじめとする、ここに記載したコンピュータプログラム及びパラメータのいずれを用いて行ってもよい。相同配列は、ここに記載したどの手順を用いて得てもよく、また、シーケンシングエラー訂正の結果として生じる場合もある。ポリペプチド断片は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２３、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０及び４２のポリペプチドの、少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、７５、１００若しくは１５０個のアミノ酸を連続状態で含んでいる。該断片は新規断片であることが好ましい。当然のことながら、配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２４、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９及び４１のポリペプチドコードは、従来の１文字表記形式又は３文字表記形式（Stryer, Biochemistry, 3rd edition, W. H. Freeman & Co., New Yorkの裏表紙の見返し部分を参照のこと）、又は、配列中のポリペプチドの同一性に関する他のどの形式でも表すことができる。
【００８６】
当業者であれば容易にわかることだが、配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２４、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９及び４１の核酸コード、及び配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２３、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０及び４２のポリペプチドコードは、コンピュータによる読み取り及びアクセスが可能ないかなる媒体においても、保存、記録、及び操作が可能である。ここで使用する「記録した」及び「保存した」という語は、コンピュータ媒体に情報を保存する処理のことである。熟練者であれば、コンピュータ読み取り可能な媒体に情報を記録する、現時点で周知の方法を容易に適用して、配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２４、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９及び４１の１つ以上の核酸コード、及び配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２３、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０及び４２の１つ以上のポリペプチドコードを含む製品を作製することができる。
【００８７】
本発明の別の実施形態は、配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２４、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９及び４１の核酸コード、及び配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２３、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０及び４２のポリペプチドコードからなる群より選択される配列を保存したコンピュータ読み取り可能な媒体である。本発明の別の態様は、配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２４、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９及び４１の１つ以上の核酸コード、好ましくは、配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２４、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９及び４１の、少なくとも２、５、１０、１５又は２０個の核酸コードを保存したコンピュータ読み取り可能な媒体である。本発明の別の態様は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２３、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０及び４２の１つ以上のポリペプチドコード、好ましくは、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２３、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０及び４２の、少なくとも２、５、１０、１５又は２０個のポリペプチドコードを保存したコンピュータ読み取り可能な媒体である。
【００８８】
本発明の別の実施形態は、処理装置と、配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２４、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９及び４１の核酸コード、及び配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２３、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０及び４２のポリペプチドコードからなる群より選択される参照配列が保存されているデータ保存装置とを含むコンピュータシステムである。
【００８９】
コンピュータ読み取り可能な媒体としては、磁気的に読み取りが可能な媒体、光学的に読み取りが可能な媒体、電子的に読み取りが可能な媒体、及び磁気／光学的媒体が挙げられる。例えば、該コンピュータ読み取り可能な媒体が、ハードディスク、フレキシブルディスク、磁気テープ、ＣＤ−ＲＯＭ、デジタル多用途ディスク（ＤＶＤ）、ランダムアクセスメモリ（ＲＡＭ）、又はリードオンリーメモリ（ＲＯＭ）、及び当業者に周知の他の種類の媒体であってもよい。
【００９０】
これより本発明を下記の実施例によりさらに詳しく説明するが、本発明がそれら実施例に制限されるものではないことは、承知されてしかるべきである。
【実施例１】
【００９１】
ドリゴシン生合成遺伝子クラスターの同定及びシーケンシング
農業研究サービスカルチャーコレクション（６１６０４、イリノイ州、ピオリア、ユニヴァーシティーストリート、１８１５Ｎに所在のNational Center for Agricultural Utilization Research）より、微生物Streptomyces platensis subsp. rosaceus ＡＢ１９８１Ｆ−７５（ＮＲＲＬ１８９９３）株を入手し、微生物学の標準的技法（上記Kieser et al.）を用いて培養した。この生物をオートミール寒天培地上にて数日間２８℃で増殖させた。高分子量のゲノムＤＮＡを単離するため、増殖させたばかりの、ほぼ密集状態になっている３つの１００ｍｍペトリ皿の細胞集団を使用した。かかる細胞集団をプラスチック製のスパチュラでそっとすくい取って回収した。ＳＴＥ緩衝液（７５ｍＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、２５ｍＭのＥＤＴＡ）で繰返し洗浄し、残った寒天培地を除去した。確立したプロトコル（上記Kieser et al.）により、高分子量のＤＮＡを単離し、FIGE MAPPERTM power supply（BIORAD社製）の事前設定プログラムＮｏ．６を用いたフィールドインバージョンゲル電気泳動（ＦＩＧＥ）により、その完全性を実証した。この高分子量ゲノムＤＮＡは、大型断片のクラスター同定ライブラリー（ＣＩＬ）、すなわち、大型挿入物のライブラリーだけではなく、小型断片のゲノムサンプリングライブラリー（ＧＳＬ）、すなわち、小型挿入物のライブラリーの調製にも役に立つ。これらのライブラリーはともに、ランダムに作製されたS. platensisのゲノムＤＮＡ断片を含んでおり、そのため、この生物の全ゲノムを代表するものとなっている。
【００９２】
S. platensisのＧＳＬライブラリー構築のため、ゲノムＤＮＡを超音波でランダムに切断した。サイズ範囲が１．５〜３ｋｂのＤＮＡ断片をアガロースゲル上で分画し、分子生物学の標準的な技法（上記Sambrook et al.）を用いて単離した。Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼ（Roche社製）を供給業者の記載のとおりに用いて、得られたＤＮＡ断片の末端を修復した。この酵素は、その後のクローン化処理により適切なベクターにすることが可能な、平滑末端を有するＤＮＡ断片を作製する。クローン化ＤＮＡ断片の転写を妨げるpBluescriptＳＫ+ベクター（Stratagene社製）の誘導体に、修復したＤＮＡ断片をサブクローンする。このベクターを選択したのは、Ｔ３、Ｔ７、ＳＫ及びＫＳ（Stratagene社製）などのユニバーサルシーケンシングプライマーに対応する配列に囲まれた便利なポリリンカー領域を含んでいるためである。平滑末端ＤＮＡ断片の挿入が可能になることから、ポリリンカー領域で見られる固有のＥｃｏＲＶ制限部位を使用した。挿入物の結合、宿主である大腸菌ＤＨ１０Ｂ（Invitrogen社製）を形質転換させるための結合産物の使用、及び組換え型クローンの選択は、文献（上記Sambrook et al.）記載のとおりに行った。S. platensisのゲノムＤＮＡ断片を含むプラスミドＤＮＡをアルカリ溶解法（上記Sambrook et al.）で抽出して、サイズが１．５〜３ｋｂの挿入物をアガロースゲル電気泳動で確認した。この手順を用いて、研究対象の微生物の全ゲノムをカバーする小型ランダムゲノムＤＮＡ断片のライブラリーを構築している。作製可能な個々のクローン数は無限だが、少数だけをさらに分析してかかる微生物のゲノムの試料を採取している。
【００９３】
SuperCos-1コスミドベクター（StratageneTM社製）を用いて、S. platensisの高分子量ゲノムＤＮＡからＣＩＬライブラリーを構築した。製造者の指示にしたがい、コスミドアームを調製した。製造者から供給された緩衝液中で、ＤＮＡ１００μｇあたり約１単位のＳａｕ３ＡＩ制限酵素（New England Biolabs社製）を使用して、高分子量ＤＮＡを３７℃で部分的に分解した。この酵素は、当初のＤＮＡ未分解時のサイズのものから、ゲノム中の酵素ＤＮＡ制限部位の頻度及びＤＮＡ分解の程度によって長さが異なる短い断片まで、ＤＮＡのランダムな断片を作製する。さまざまな時点で、分解物の部分標本を新しい微量遠心チューブに移し、最終濃度で１０ｍＭのＥＤＴＡ及び０．１％のＳＤＳを添加して、かかる酵素を失活させた。目的とするサイズ範囲（３０〜５０ｋｂ）の重要なＤＮＡ断片を含むことがＦＩＧＥ分析によって判明した部分標本をプールし、フェノール／クロロホルム（１：１  ｖｏｌ：ｖｏｌ）で抽出し、エタノール沈殿によりペレット化した。製造者の説明書にしたがってアルカリホスファターゼ（Roche社製）を用いて、Ｓａｕ３ＡＩ  ＤＮＡ断片の５’末端を３７℃で３０分間脱リン酸化した。かかるホスファターゼを７０℃で１０分間熱失活させ、フェノール／クロロホルム（１：１  ｖｏｌ：ｖｏｌ）でＤＮＡを抽出し、エタノール沈殿によりペレット化し、滅菌水に再懸濁した。脱リン酸化したＳａｕ３ＡＩ  ＤＮＡ断片を、モルにして約４倍を越えるSuperCos-1コスミドアームを含む反応において、室温で一晩SuperCos-1コスミドアームに結合させた。GigapackR III XL パッケージング抽出物（StratageneTM社製）を製造者の説明書にしたがって使用し、結合産物のパッケージングを行った。ＣＩＬライブラリーは、大腸菌ＤＨ１０Ｂ（Invitrogen社製）中の８６４個の単離したコスミドクローンで構成されていた。これらのクローンを選び、ＬＢ培養液（水１リットルあたり：１０．０ｇのＮａＣｌ、１０．０ｇのトリプトン、５．０ｇの酵母エキス）を入れた９枚の９６ウェルマイクロタイタープレートに移し、一晩増殖させた後、最終濃度で２５％のグリセロールを含むように調節した。これらのマイクロタイタープレートを−８０℃で保管し、ＣＩＬライブラリー用グリセロールの備蓄品とした。二つ組のマイクロタイタープレートをナイロン膜上に下記のように並べた。マイクロタイター上で増殖した培養物を、ペレット化及び少量のＬＢ培養液での再懸濁によって濃縮した。１グリッドあたり９６ピンの３×３グリッドをナイロン膜に置いた。完全なＣＩＬライブラリーであるこれらの膜を、その後ＬＢ寒天上で層状とし、３７℃で一晩インキュベーションし、コロニーが育つようにした。ＤＮＡを変性させるため、事前に０．５ＮのＮａＯＨ／１．５ＭのＮａＣｌに１０分間浸しておいた濾紙上で、かかる膜を層状とし、その後、事前に０．５ＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８）／１．５ＭのＮａＣｌに１０分間浸しておいた濾紙上に移して中和した。細胞の残骸をプラスチック製のスパチュラでそっとすくい取り、GS GENE LINKERTM UV Chamber（BIORAD社製）を使用したＵＶ照射により、ＤＮＡを膜上に交差結合させた。放射線菌ゲノムの平均サイズが８Ｍｂであること、及びＣＩＬライブラリー中のゲノム挿入物の平均サイズが３５ｋｂであることを考えると、このライブラリーは、かかる微生物の全ゲノムのおよそ４倍をカバーしていることになる。
【００９４】
クローン処理したゲノムＤＮＡ挿入物の配列決定により、ＧＳＬライブラリーを分析した。フォワード（Ｆ）プライマーと称されるユニバーサルプライマーのＫＳ又はＴ７を使用して標識ＤＮＡの重合を開始した。ＴＦ、ＢＤＴｖ２．０シーケンシングキットを供給業者（Applied Biosystems社）の指示のとおりに用いて、プライミング部位から少なくとも７００ｂｐを規定どおりに伸長させることができる。3700 ABI capillary electrophoresis DNA sequencer（Applied Biosystems社製）を用いて、小型ゲノムＤＮＡ断片（ゲノム配列タグ、ＧＳＴ）の配列分析を行った。読み込むＤＮＡ配列の長さは平均で〜７００ｂｐだった。各種タンパク質配列データベースとの配列相同性を比較して、得られたＧＳＴをさらに分析した。得られたＧＳＴのＤＮＡ配列をアミノ酸配列に翻訳し、文献（上記Altschul et al.）記載のアルゴリズムを用いて、National Center for Biotechnology Information（ＮＣＢＩ）の非冗長タンパク質データベース及び占有的なエコピア天然産物生合成遺伝子データベースであるDecipherTMと比較した。データベースに存在する機能が明らかな既知のタンパク質との配列類似性により、翻訳されたＧＳＴにコードされる部分タンパク質の機能を予測することが可能となる。
【００９５】
合計で１５３６個のS. platensisのＧＳＴを作製し、Ｂｌａｓｔアルゴリズムを用いた配列比較によって分析した（上記Altschul et al.）。配列のアラインメントが少なくともｅ−５というＥ値を示すと、その配列は有意な相同性を有していると見なされ、さらに評価を加えるために保存された。目的の遺伝子との類似性を示すＧＳＴをこの時点で選択して、目的の遺伝子を含むＣＩＬライブラリーからより大型のゲノムＤＮＡセグメントを同定する際に用いることができる。ドリゴシン及びミグラスタチンはポリケチドであるため、Ｉ型ＰＫＳ遺伝子の部分であることが明らかな数個のS. platensisのＧＳＴを追求した。これらのＩ型ＰＫＳのＧＳＴを用いて、本発明者らは実際にS. platensis内のＩ型ＰＫＳ遺伝子座を同定した。しかし、ＰＫＳドメインの順序及びこのＩ型ＰＫＳのモジュール数は、ドリゴシン及びミグラスタチンの構造と矛盾するものであった（データは図示せず）。Ｉ型ＰＫＳ遺伝子の部分であることが明らかなＧＳＴの他にも、本発明者らはＩ型ＰＫＳ遺伝子に何らかの関わりがあるＧＳＴを同定している。後者をＣＩＬライブラリーのスクリーニング用プローブとして用いて、結果として生じたコスミドクローンの配列決定を行ったところ、ドリゴシン生合成遺伝子座であることが判明した例外的なＰＫＳ遺伝子クラスターを同定した。
【００９６】
製造者により供給されたキナーゼ反応緩衝液中に５ピコモルのオリゴヌクレオチドと６．６ピコモルの［γ−Ｐ32］ＡＴＰを含む１５μｌの反応液において、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（New England Biolabs社製）を使用し、ハイブリダイゼーションオリゴヌクレオチドプローブをＰ32で放射能標識した。最終濃度が５ｍＭになるようにＥＤＴＡを添加することにより、１時間後に３７℃でキナーゼ反応を終了させた。積分器の機能を内蔵したモデル３ガイガーカウンター（テキサス州、スイートウォーター、Ludlum Measurements Inc.社製）を用いて、放射能標識したオリゴヌクレオチドプローブの特異的作用を評価した。８５℃で１０分間のインキュベーションに続いて氷中での急速冷却を行うことにより、放射能標識したオリゴヌクレオチドプローブを使用の直前に熱変性させた。
【００９７】
ハイブリダイゼーションオーブンを低速振盪で使用し、プレハイブリダイゼーション溶液（６×ＳＳＣ、２０ｍＭのＮａＨ2ＰＯ4、５×Denhardt's、０．４％のＳＤＳ、超音波処理及び変性処理済の０．１ｍｇ／ｍｌのシャケ精子ＤＮＡ）において、４２℃で少なくとも２時間のインキュベーションを行うことにより、S. platensisＣＩＬライブラリー膜を前処理した。その後、１×１０6ｃｐｍ／ｍｌの放射能標識オリゴヌクレオチドプローブを含むハイブリダイゼーション溶液（６×ＳＳＣ、２０ｍＭのＮａＨ2ＰＯ4、０．４％のＳＤＳ、超音波処理及び変性処理済の０．１ｍｇ／ｍｌのシャケ精子ＤＮＡ）にかかる膜を入れ、ハイブリダイゼーションオーブンを低速振盪で使用し、４２℃で一晩のインキュベーションを行った。翌日、ハイブリダイゼーションオーブンを低速振盪で使用して、洗浄緩衝液（６×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳ）でかかる膜を４６℃、４８℃及び５０℃で、４５分間ずつ洗浄した。その後、S. platensisＣＩＬ膜をＸ線フィルムに曝露し、陽性のコスミドクローンの視覚化及び同定を行った。陽性のクローンを同定し、アルカリ溶解法（上記Sambrook et al.）を使用して３０ｍｌの培養物からコスミドＤＮＡを抽出し、ショットガンシーケンシング法（Fleischmann et al., Science, 269: 496-512）により、かかる挿入物の完全な配列決定を行った。
【００９８】
Phred-PhrapTMアルゴリズム（米国、シアトル、ワシントン大学）を用いて、配列決定時に読み込んだ情報を組み立てて、コスミド挿入物の全ＤＮＡ配列を再作製した。元のコスミドの末端に由来するプローブを用いてＣＩＬライブラリーのハイブリダイゼーションを繰り返すと、元のコスミド配列の両端にある配列情報を無限に拡張することができ、最終的には、目的の遺伝子クラスターを完全な形で得ることができる。ドリゴシンの構造は、それが１０個のモジュールを含むモジュラー型Ｉ型ポリケチドシンターゼ（ＰＫＳ）によって合成されたことを示唆している。Ｉ型ＰＫＳに間接的に関連するＧＳＴに由来しているオリゴヌクレオチドプローブによって検出された３個のオーバーラップコスミドクローンの完全な配列決定を行い、ドリゴシン生合成遺伝子座を含む約５４ＫｂのＤＮＡを得た（図１）。
【実施例２】
【００９９】
ドリゴシンの生合成に関与する遺伝子及びタンパク質
ドリゴシン遺伝子座は１１個のタンパク質をコードし、塩基対５２，１０１の後ろから始まる１つの間隙以外は隣接しているＤＮＡの約５３，８００の塩基対に及んでいる。ドリゴシン遺伝子座の各サイドで、ＤＮＡ配列のうち１５キロ塩基以上を分析した。これらの領域は一次代謝遺伝子を含むものである。ドリゴシン生合成遺伝子座のタンパク質（ＤＯＲＲ  ＯＲＦ）を示す１１個のオープンリーディングフレームの順序及び相対的位置を、図１に示す。図１の上部にある線は、キロ塩基対を単位とするスケールである。黒い線は配列決定において小さな隙間（＜１００ｂｐ）によって分断された２個のＤＮＡcontigを示す。矢印はドリゴシン生合成遺伝子座の１１個のオープンリーディングフレームを表す。
【０１００】
このように、ドリゴシン生合成を制御する遺伝子の完全な遺伝子座を、２個のＤＮＡ隣接配列（配列番号１及び２２）により形成した。ドリゴシン生合成遺伝子座内で見られるように、ＤＮＡcontig１（配列番号１）の５２１０１塩基対が、ＤＮＡcontig２（配列番号２２）の５’末端に隣接するように、隣接ヌクレオチド配列を調節した。配列番号１の隣接ヌクレオチド配列には、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０に列挙されている１０個のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）が含まれている。ＤＯＲＲ  ＯＲＦ１（配列番号２）は、contig１（配列番号１）の残基３７２０〜６７（アンチセンス鎖）から引き出された配列番号３の核酸配列から推定した１２１７個のアミノ酸である。ＤＯＲＲ  ＯＲＦ２（配列番号４）は、contig１（配列番号１）の残基４０９２〜５６８１（センス鎖）から引き出された配列番号５の核酸配列から推定した５２９個のアミノ酸である。ＤＯＲＲ  ＯＲＦ３（配列番号６）は、contig１（配列番号１）の残基５７６７〜６０１８（センス鎖）から引き出された配列番号７の核酸配列から推定した８３個のアミノ酸である。ＤＯＲＲ  ＯＲＦ４（配列番号８）は、contig１（配列番号１）の残基６０２３〜７９９３（センス鎖）から引き出された配列番号９の核酸配列から推定した６５６個のアミノ酸である。ＤＯＲＲ  ＯＲＦ５（配列番号１０）は、contig１（配列番号１）の残基８００９〜１７５８７（センス鎖）から引き出された配列番号１１の核酸配列から推定した３１９２個のアミノ酸である。ＤＯＲＲ  ＯＲＦ６（配列番号１２）は、contig１（配列番号１）の残基１７６３４〜４１７１４（センス鎖）から引き出された配列番号１３の核酸配列から推定した８０２６個のアミノ酸である。ＤＯＲＲ  ＯＲＦ７（配列番号１４）は、contig１（配列番号１）の残基４１７７２〜４７６３３（センス鎖）から引き出された配列番号１５の核酸配列から推定した１９５３個のアミノ酸である。ＤＯＲＲ  ＯＲＦ８（配列番号１６）は、contig１（配列番号１）の残基４７６３５〜４９８９０（センス鎖）から引き出された配列番号１７の核酸配列から推定した７５１個のアミノ酸である。ＤＯＲＲ  ＯＲＦ９（配列番号１８）は、contig１（配列番号１）の残基４９９２２〜５０９３８（センス鎖）から引き出された配列番号１９の核酸配列から推定した３３８個のアミノ酸である。ＤＯＲＲ  ＯＲＦ１０（配列番号２０）は、contig１（配列番号１）の残基５１２３４〜５２０７９（センス鎖）から引き出された配列番号２１の核酸配列から推定した２８１個のアミノ酸である。配列番号２２の隣接ヌクレオチド配列（１７００塩基対）には、ＤＯＲＲ  ＯＲＦ１１（配列番号２３）が含まれている。ＤＯＲＲ  ＯＲＦ１１（配列番号２３）は、予想されるポリペプチドのＣ末端を表す３２８個のアミノ酸であって、contig２（配列番号２２）の残基１６３〜１１４９（センス鎖）から引き出された配列番号２４の核酸配列から推定したものである。
【０１０１】
２つの寄託株、すなわち、ドリゴシンの部分的生合成遺伝子座のコスミドクローンをそれぞれ含む大腸菌ＤＨ１０Ｂ（０８８ＣＦ）株及び大腸菌ＤＨ１０Ｂ（０８８ＣＸ）株は、カナダ国、Ｒ３Ｅ  ３Ｒ２、マニトバ州、ウィニペグ、アーリントンストリート  １０１５のカナダ国保険省微生物局、カナダ国際寄託局に、２００１年２月２７日に寄託され、寄託のアクセッション番号は、それぞれＩＤＡＣ２７０２０１−３及び２７０２０１−４であった。寄託した大腸菌株をここでは「寄託株」と称する。
【０１０２】
かかる寄託株は、ドリゴシンの完全な遺伝子座を含んでいる。本書類中の配列に関する記載との間で齟齬が生じた場合は、寄託株に含まれるポリヌクレオチド配列及びそれらにコードされるあらゆるポリペプチドのアミノ酸配列が優先される（controlling）。
【０１０３】
かかる寄託株の寄託は、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約に基づいて行われた。特許証が発行されると、寄託株は最終的なものとして、無制限又は無条件で公開される。寄託株は当業者の便宜のためだけに提供されるものであり、米国特許法第１１２条で要求されている実施可能要件を満たすために寄託が必要というわけではない。寄託株及びそれに由来する化合物の作製、使用又は販売には許諾が必要となる場合があり、かかる許諾が寄託により与えられることはない。
【０１０４】
ドリゴシン生合成遺伝子座における遺伝子の機能を同定するため、デフォルトパラメータを用いたＢＬＡＳＴＰバージョン２．２．２アルゴリズムにより、ＤＯＲＲ  ＯＲＦ１〜１１（配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０及び２３）を、National Center for Biotechnology Information（ＮＣＢＩ）の非冗長タンパク質データベース、及び微生物遺伝子、経路及び天然産物のデータベースであるDecipherTM（カナダ国、ケベック州、サンローラン、Ecopia BioSciences Inc.社への登録により利用可能）中の配列と比較した。
【０１０５】
このＢｌａｓｔ分析によりGenBankで最もヒット数が多かったアクセッション番号を、対応するＥ値とともに表２に示す。Ｅ値は、観察されたアラインメントスコアと少なくとも同じアラインメントスコアをもつチャンスアラインメントの予測数に関連している。Ｅ値が０．００ということは、完全なホモログであることを示す。Ｅ値の計算は、Altschul et al. J. Mol. Biol., October 5; 215 (3) 403-10に記載のとおりに行い、その教示内容をここに参照として組み込んでおく。かかるＥ値は、相同だと考えるのが当然とされるほど充分な類似性を、２つの配列が示しているかどうかを確認する際に役に立つ。
【０１０６】
【表２】
2004535175.tif 000003
【実施例３】
【０１０７】
ラクトイミドマイシン生合成遺伝子クラスターの同定及び配列決定
ミグラスタチンとラクトイミドマイシンの構造的類似性（図３）を考慮すると、それらの生合成遺伝子座の類似性は同等であると予想される。本発明者らは、所有のドリゴシン生合成遺伝子座を用いて、Streptomyces amphibiosporusＡＴＣＣ５３９６４からのラクトイミドマイシン生合成遺伝子座の同定及び配列決定に着手した。実施例１で記載したゲノム試料採取方法をS. amphibiosporus由来のゲノムＤＮＡに適用した。フォワードプライマーを使用して、全部で４８０個のＧＳＬクローンの配列を決定し、Ｂｌａｓｔアルゴリズム（上記Altschul et al.）を用いた配列比較により分析を行い、ドリゴシン生合成遺伝子に関連する挿入物を含むクローンを同定した。かかるＧＳＴクローンをいくつか同定し、それを使用して、S. amphibiosporusＣＩＬライブラリーからコスミドクローンを単離した。例えば、１つのオリゴヌクレオチドプローブが由来しているＧＳＴクローン（挿入物のサイズは約２．５ｋｂ）は、明らかに、ドリゴシンＯＲＦ７のホモログをコードしていたS. amphibiosporusゲノム由来の遺伝子の一部であった。このＧＳＴを順方向に読みこんだものは、ドリゴシンシンターゼのモジュール１０のＤＨのＣ末端部分の前にあるドリゴシンシンターゼのモジュール１０のＫＲドメインのＮ末端部分に相当する、アミノ酸１１１２〜１３５４に対して少なくとも５８％の相同性及び６８％の類似性を有するポリペプチドをコードしている。このＧＳＴを逆方向に読みこんだものは、ドリゴシンシンターゼのモジュール１０の相互作用ドメインのＮ末端部分の前にあるドリゴシンシンターゼのモジュール１０のＫＳドメインのＣ末端部分に相当する、アミノ酸５４５〜７６８に対して少なくとも５４％の相同性及び６４％の類似性を有するポリペプチドをコードしている。したがって、このＧＳＴクローンの２．５ｋｂの挿入物は、オープンリーディングフレームがクローニングベクターのＴ３プライマーと同じ向きになるような配向となっていた。オーバーラップコスミドクローンの配列決定により、ラクトイミドマイシン生合成遺伝子座を含むＤＮＡを５０Ｋｂ以上得た（図４）。
【実施例４】
【０１０８】
ラクトイミドマイシンの生合成に関与する遺伝子及びタンパク質
ラクトイミドマイシン遺伝子座は９個のタンパク質をコードし、１つの隣接ＤＮＡ配列（配列番号２５）に開示されているＤＮＡの約５０５００の塩基対に及んでいる。ラクトイミドマイシン生合成遺伝子座のタンパク質（ＬＡＣＴ  ＯＲＦ）を示す９個のオープンリーディングフレームの順序及び相対的位置を、図４に示す。図４の上部にある線は、キロ塩基対を単位とするスケールである。矢印はラクトイミドマイシン生合成遺伝子座の９個のオープンリーディングフレームを表す。
【０１０９】
したがって、ＬＡＣＴ  ＯＲＦ１（配列番号２６）は、配列番号２５の残基１〜１６９８（センス鎖）から引き出された配列番号２７の核酸配列から推定した５６５個のアミノ酸である。ＬＡＣＴ  ＯＲＦ２（配列番号２８）は、配列番号２５の残基１９０８〜２１６２（センス鎖）から引き出された配列番号２９の核酸配列から推定した８４個のアミノ酸である。ＬＡＣＴ  ＯＲＦ３（配列番号３０）は、配列番号２５の残基２１６６〜４１３６（センス鎖）から引き出された配列番号３１の核酸配列から推定した６５６個のアミノ酸である。ＬＡＣＴ  ＯＲＦ４（配列番号３２）は、配列番号２５の残基４１５２〜１４４６２（センス鎖）から引き出された配列番号３３の核酸配列から推定した３４３６個のアミノ酸である。ＬＡＣＴ  ＯＲＦ５（配列番号３４）は、配列番号２５の残基１４５４９〜３９６３１（センス鎖）から引き出された配列番号３５の核酸配列から推定した８３６０個のアミノ酸である。ＬＡＣＴ  ＯＲＦ６（配列番号３６）は、配列番号２５の残基３９６２８〜４５９２４（センス鎖）から引き出された配列番号３７の核酸配列から推定した２０９８個のアミノ酸である。ＬＡＣＴ  ＯＲＦ７（配列番号３８）は、配列番号２５の残基４５９２６〜４８２３２（センス鎖）から引き出された配列番号３９の核酸配列から推定した７６８個のアミノ酸である。ＬＡＣＴ  ＯＲＦ８（配列番号４０）は、配列番号２５の残基４８４４１〜４９６９７（センス鎖）から引き出された配列番号４１の核酸配列から推定した４１８個のアミノ酸である。ＬＡＣＴ  ＯＲＦ９（配列番号４２）は、配列番号２５の残基５０５４３〜４９８００（アンチセンス鎖）から引き出された配列番号４３の核酸配列から推定した２４７個のアミノ酸である。ラクトイミドマイシン生合成遺伝子座における遺伝子の機能を同定するため、デフォルトパラメータを用いたＢＬＡＳＴＰバージョン２．２．２アルゴリズムにより、ＬＡＣＴ  ＯＲＦ１〜９（配列番号２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０及び４２）を、National Center for Biotechnology Information（ＮＣＢＩ）の非冗長タンパク質データベース、及び微生物遺伝子、経路及び天然産物のデータベースであるDecipherTM（カナダ国、ケベック州、サンローラン、Ecopia BioSciences Inc.社への登録により利用可能）中の配列と比較した。このＢｌａｓｔ分析によりGenBankで最もヒット数が多かったアクセッション番号を、対応するＥ値とともに表３に示す。
【０１１０】
【表３】
2004535175.tif 000004
【実施例５】
【０１１１】
ドリゴシン及びラクトイミドマイシンの生合成に関与する例外的な二成分ＰＫＳ系
ドリゴシン遺伝子座は、ＫＳ、ＫＲ、ＡＣＰ、及び例外的な配置の例外的なＤＨドメインを含有する３個のＰＫＳをコードしている。この遺伝子座におけるかかる３個のＰＫＳは、ドリゴシンの長さをもつポリケチド鎖の生成には充分である、合計１０個のケトシンターゼ（ＫＳ）ドメインをコードしている。かかる３個のＰＫＳにはＩ型ＰＫＳに典型的ないくつかの特徴を共有している。すなわち、シンターゼに多数の融合ドメインが含まれているのである。しかし、ドリゴシンＰＫＳは、ＰＫＳに物理的に結合しているＡＴドメインを含まないという点で、Ｉ型ＰＫＳと異なっている。その代わりに、別の成分によって、ＡＴ機能がトランスで提供されている。したがって、ドリゴシンＰＫＳ系は新規の二成分ＰＫＳ系を示すものである。特定の作用機構又は生合成図式に限定されることなく、本発明のタンパク質は、ドリゴシンの生成について説明することができる。図２は、段階的に作用してポリケチド骨格を合成する１０個のモジュールの性質を示している。図２においては、ＤＯＲＲアシル運搬体タンパク質ＡＣＰＩ（配列番号６）とＤＯＲＲアミドトランスフェラーゼＡＯＴＦ（配列番号８）とが、ＤＯＲＲ遺伝子座の最初のＰＫＳ（配列番号１０）に並進的に結合されている。ＡＣＰＩ（配列番号６）は、アミノ置換アシル基を移動させるタンパク質に対して、もっとも有意な類似性を示している。ＡＣＰＩ（配列番号６）及びＡＯＴＦ（配列番号８）は協調してポリケチド鎖を伸長させるための出発単位を作製する。
【０１１２】
ＫＳドメインの下流にＡＴドメインを含む典型的なＩ型ＰＫＳモジュールとは違って、ドリゴシン遺伝子座中の各ＰＫＳモジュール（配列番号１０、１２及び１４）のＫＳドメインの後ろには、ＡＴドメインがない。しかし、例外的なドリゴシンＰＫＳは、保存された小型のドメインをＫＳドメインの下流に含んでいる。この保存されたドメインは、マロニル−ＣｏＡ：ＡＣＰマロニルトランスフェラーゼ作用のドッキング部位として作用すると仮定されている。マロニル−ＣｏＡ：ＡＣＰマロニルトランスフェラーゼ作用は、ＡＹＴＴ  ＤＯＲＲ  ＯＲＦ２（配列番号４）、ＡＹＯＡ  ＤＯＲＲ  ＯＲＦ８（配列番号１６）、又は一次代謝脂肪酸マロニル−ＣｏＡ：ＡＣＰマロニルトランスフェラーゼによって提供される場合がある。
【０１１３】
モジュール１は、結合したマロニルエクステンダーユニットを有しており、出発単位を伸長させる１回のラウンドで触媒として機能する。その後に、ケトレダクターゼが続き、脱水が行われる。モジュール２は、独立したＡＴ−チオエステラーゼ融合タンパク質ＡＹＴＴ（配列番号４）により、アシル化される。このタンパク質は、チオエステラーゼと融合したマロニル−ＣｏＡ：ＡＣＰマロニルトランスフェラーゼで構成されている。モジュール２は、モジュール１と２とをつなぐアシル鎖間のイミド結合の形成において触媒作用を及ぼす。イミド結合の形成には、伸長サイクルにおける例外的な「後ろ向き」の段階で、ＡＹＴＴタンパク質（配列番号４）に関連するチオエステラーゼ作用により容易となる操作が必要である。モジュール１のＫＳドメインを再び使用し、今回は、環状グルタルイミド基を構築するクライゼン縮合反応の触媒とする。
【０１１４】
次の伸長段階のため、発生期のポリケチド鎖は、モジュール１のＡＣＰからモジュール３のＫＳに移っていく。モジュール３〜６によって、マロニルエクステンダーユニットが使われる。モジュール５及び６で、ベータケト還元が生じる。モジュール５及び６のＭＴドメインにより、メチル側鎖が付加される。
【０１１５】
モジュール７は、ヒドロキシマロニルエクステンダーを使用している。かかるヒドロキシマロニルエクステンダーユニットは、独立したＡＴ−オキシドレダクターゼ融合タンパク質ＡＹＯＡ（配列番号１６）によって構築され、モジュール７に移される。ヒドロキシル側鎖は、ＭＴＦＡ  Ｏ−メチルトランスフェラーゼ（配列番号２０）によってメチル化される。
【０１１６】
モジュール８〜１０は、マロニルエクステンダーユニットを使用している。モジュール８及び１０で、ケト還元及び脱水が生じる。モジュール９は、ＤＨドメインを含むがＫＲドメインをまったく含まないことで知られている。
【０１１７】
従来のＩ型ポリケチドの生合成を設計する際の一般的な規則は、図２に示すように、ドリゴシンＡ、ドリゴシンＢ、及びミグラスタチン分子に至る中間産物のポリケチド骨格構造の生合成に適用することができる。かかる中間産物は、ベータ−カルボニル還元状態でＣ−１４にメチル側鎖が存在しない点でドリゴシンＢとは異なっている。ドリゴシンＰＫＳ（配列番号１０、１２、１４）は、Ｃ−５、Ｃ−９及びＣ−１７を好適な酸化状態とするのに必要な量だけ、一次脂肪酸シンターゼからケトレダクターゼ、デヒドラターゼ及びエノイルレダクターゼを補充する。エノイルレダクターゼとの相互作用を必要とする２つのモジュールは、分離したＰＫＳペプチドにまたがる２つのモジュールに対応している。Ｃ−１４を組み込んだモジュール中ではＭＴドメインは認められなかった。これは、Ｃ−１４におけるメチル化が、一次メチルトランスフェラーゼ又は隣接したモジュールのＭＴドメインによる触媒作用を受けていることを示唆している。
【０１１８】
ＯＸＲＣ及びＯＸＲＹタンパク質（配列番号２３及び１８）にコードされるオキシドレダクターゼは、ドリゴシンＡとドリゴシンＢとの間の相互変換の触媒となるために、必要な作用を発揮している。
【０１１９】
ラクトイミドマイシン生合成遺伝子座は９個のＯＲＦ（配列番号２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０及び４２）で構成され、そのうちの８個は、ドリゴシン生合成遺伝子座の対応するＯＲＦに対する相同性が高い。ＬＡＣＴ  ＯＲＦ１（配列番号２６）はＤＯＲＲ  ＯＲＦ２（配列番号４）と相同であり、これらはともに、ＡＹＴＴと命名された、アシルトランスフェラーゼとチオエステラーゼの融合物である。ＬＡＣＴ  ＯＲＦ２（配列番号２８）はＤＯＲＲ  ＯＲＦ３（配列番号６）と相同であり、これらはともに、ＡＣＰＩと命名された、アシル運搬体タンパク質である。ＬＡＣＴ  ＯＲＦ３（配列番号３０）はＤＯＲＲ  ＯＲＦ４（配列番号８）と相同であり、これらはともに、ＡＯＴＦと命名された、細菌性アスパラギンシンテターゼに類似性を示すアミドトランスフェラーゼである。ＬＡＣＴ  ＯＲＦ４、５及び６（配列番号３２、３４及び３６）はＤＯＲＲ  ＯＲＦ５、６及び７（配列番号１０、１２及び１４）とそれぞれ相同であり、これらはすべて、ＰＫＵＮと命名された、ＡＴドメインをもたない例外的なモジュラー型ＰＫＳである。ＬＡＣＴ  ＯＲＦ７（配列番号３８）はＤＯＲＲ  ＯＲＦ８（配列番号１６）と相同であり、これらはともに、ＡＹＯＡと命名された、アシルトランスフェラーゼとオキシドレダクターゼの融合物である。最後に、ＬＡＣＴ  ＯＲＦ８（配列番号４０）はＤＯＲＲ  ＯＲＦ１１（配列番号２３）と相同であり、これらはともに、ＯＸＲＣと命名された、シトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼである。ＬＡＣＴ  ＯＲＦ９（配列番号４２）は、ＰＰＴＦと命名された、ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼであり、ドリゴシン遺伝子座にはこれに対応するものが存在しない。このホスホパンテテイニルトランスフェラーゼは、ホスホパンテテイニルの補因子の（prosthetic）アームと、ラクトイミドマイシンシンターゼ複合体のアシル運搬体タンパク質との共有結合に関与している。これに対し、ドリゴシンのアシル運搬体タンパク質は、ドリゴシン生合成遺伝子座の外側の遺伝子にコードされるホスホパンテテイニルトランスフェラーゼによって、ホスホパンテテイニル化される場合がある。
【０１２０】
ドリゴシン生合成遺伝子座には、ラクトイミドマイシン遺伝子座中に対応物をもたない３個のＯＲＦが含まれている。ＤＯＲＲ  ＯＲＦ１（配列番号２）は、ＲＥＢＰと命名された制御因子であり、ＤＯＲＲ  ＯＲＦ９（配列番号１８）は、ＯＸＲＹと命名されたオキシドレダクターゼであり、ＤＯＲＲ  ＯＲＦ１０（配列番号２０）は、ＭＴＦＡと命名されたＯ−メチルトランスフェラーゼである。このＤＯＲＲ  ＯＲＦ９（配列番号１８）は、二重結合の異性化に関与するドリゴシンＡとドリゴシンＢとの相互変換に関わっているため、ラクトイミドマイシン遺伝子座にＯＸＲＹが存在しないことは意義深い。ラクトイミドマイシンの生合成の場合に、類似した異性化が起こるとは知られていない。これはおそらく、ＯＸＲＹホモログが存在しないことによると思われる。ドリゴシンやミグラスタチンとは違ってラクトイミドマイシンはＯ−メチル基をまったく含んでいないため、ラクトイミドマイシン遺伝子座にＭＴＦＡが存在しないことは意義深い。
【０１２１】
特定の作用機構又は生合成図式に限定されることなく、ラクトイミドマイシンの生合成（図５）について、ＬＡＣＴタンパク質は、ドリゴシン及びミグラスタチンの生合成経路（図２）と同様に説明することができる。ラクトイミドマイシンＰＫＳ系とドリゴシンＰＫＳ系との相違点は、それぞれのＰＫＳ系のモジュール７及び８に存在する（図４、１０）。ドリゴシンＰＫＳ系のモジュール７は、トランス作用性ＡＴドメインとともに、メトキシマロニルエクステンダーユニット（又は、その後Ｏ−メチル化するヒドロキシマロニルエクステンダーユニット）の組み込みに関与するＫＳドメイン、相互作用ドメイン、ＡＣＰドメインを含んでいる。反対に、ラクトイミドマイシンＰＫＳ系のモジュール７に含まれるのは、ＫＳドメインと相互作用ドメインのみであり、ＡＣＰドメインは存在しない。そのため、このモジュールはポリケチド鎖を伸長させることができないと予測されている。ラクトイミドマイシンは、Ｃ−８上のヒドロキシメチル置換を含んでおらず、このことは、この予測と一致している。ドリゴシンＰＫＳ系のモジュール８は、ＫＳドメイン、相互作用ドメイン、ＤＨドメイン、ＫＲドメイン、及び２つのタンデムＡＣＰドメインを含んでいる。しかし、１つ目のＡＣＰドメインは、通常はホスホパンテテイン結合部位として機能する保存されたセリン残基がプロリン残基に置換されているため（図１０）、不活性である（図４中、「Ｘ」で示す）と予測されている。反対に、ラクトイミドマイシンＰＫＳ系のモジュール８では、ＡＣＰドメインは両方とも活性部位セリン残基を含んでいる。したがって、これら両方のＡＣＰにはマロニル−ＣｏＡが搭載されており、モジュール７由来のＫＳ又はモジュール８由来のＫＳがポリケチド鎖を伸長させる２回のラウンドで触媒として機能すること、又は、その代わりに、モジュール７及び８に由来するＫＳドメインがそれぞれポリケチド鎖を伸長させる１回のラウンドで触媒として機能することを、本発明者らは提示している。
【０１２２】
図６〜１３は、ドリゴシン生合成遺伝子座及びラクトイミドマイシン生合成遺伝子座に共通する各種ＯＲＦを比較する、アミノ酸アラインメントである。適用可能な場合には、Kakavas et al. (1997) J. Bacteriol. Vol 179 pp. 7515-7522に記載の、各種ポリケチドシンターゼドメインの重要な活性部位残基及びモチーフを図６〜１３に示している。
【０１２３】
ドメインの同定及びその境界の割り当ては、Ｉ型ＰＫＳに関する文献に基づいている。本発明に記載した二成分ＰＫＳ系がＩ型ＰＫＳ系とはかなり異なることを考えると、境界がやや不正確である可能性、又は、かかる二成分ＰＫＳ系に固有の新規ドメインが不注意により見過ごされた可能性がある。表３及び４は、ドリゴシン、ミグラスタチン、及びイソミグラスタチンの生合成（表４）及びラクトイミドマイシンの生合成（表５）に関与するポリケチドシンターゼ成分の各種ドメインの、おおよそのアミノ酸の座標を列挙したものである。ＤＯＲＲ遺伝子座が発現した結果、線状ポリケチド（ドリゴシン）と環状ポリケチド（ミグラスタチン及びイソミグラスタチン）の両方が生成された。したがって、ＬＡＣＴ遺伝子座が発現すると、環状ポリケチドのラクトイミドマイシンに加えて線状ポリケチド産物も生成されると予想するのが妥当といえる。線状のラクトイミドマイシンは、生成レベルが非常に低いこと、又は不安定であることから、今日まで記載されたことがない。
【０１２４】
【表４】
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【０１２５】
【表５】
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【０１２６】
本発明は、ここに記載した具体的な実施形態により、その範囲を限定されるものではない。特に、ここに記載したもの、及びそれ以外の本発明の各種修正は、当業者がここまでの記載及び付随する図面を見れば、容易にわかるものである。そうした修正も、後述のクレームの範囲に含まれるものとする。
【０１２７】
さらに、すべてのサイズ、及びすべての分子量又は質量の値は、おおよそのものであり、記載のために提供されたものであることも、承知されてしかるべきである。
【０１２８】
ここに列挙したいくつかのオープンリーディングフレームは、標準開始コドンのＡＴＧ、すなわち、ＤＯＲＲ  ＯＲＦ２、６、７（配列番号４、１２及び１４）並びにＬＡＣＴ  ＯＲＦ１、３、５及び９（配列番号２６、３０、３４及び４２）よりもむしろ、非標準開始コドン（例えば、ＧＴＧ−バリン）で始まっている。ＯＲＦの最初のコドンの特異性を示すため、すべてのＯＲＦを、アミノ末端部位のＭアミノ酸又はＶアミノ酸とともに列挙している。しかし、すべての事例において、生合成されたタンパク質がメチオニン残基、より具体的にはホルムメチオニン残基をアミノ末端部位に含むであろうことが予測される。このことは、細菌中のタンパク質の生合成は、コードする遺伝子が非標準開始コドンを指定している場合でも、メチオニン（ホルムメチオニン）で始まる（例えば、Stryer, Biochemistry, 3rd edition, 1998, W. H. Freeman & Co., New York, pp. 752-754）という広く受け入れられている原則と一致している。
【０１２９】
本出願に引用した特許、特許公報、手順及び刊行物は、あらゆる目的に使用できるように完全な形でここに組み込んでいる。
【図面の簡単な説明】
【０１３０】
【図１】図１は、S. platensisのドリゴシン生合成遺伝子クラスターの図であり、例外的なＰＫＳ成分の推定ドメイン構造を強調したものである。
【図２】図２は、ドリゴシン及びミグラスタチンの生合成経路の一案を示す図である。
【図３】図３は、ドリゴシン、ミグラスタチン及びイソミグラスタチンの構造を示す図である。
【図４】図４は、S. amphibiosporusのラクトイミドマイシン生合成遺伝子クラスターとS. platensisのドリゴシン生合成遺伝子クラスターを比較した図である。例外的なＰＫＳ成分の推定ドメイン構造を強調している。
【図５】図５は、ラクトイミドマイシンの生合成経路の一案を示す図である。
【図６】図６は、ともに、ＡＹＴＴと命名された、チオエステラーゼとアシルトランスフェラーゼの融合物である、ＤＯＲＲ  ＯＲＦ２（配列番号４）とそのラクトイミドマイシンのホモログであるＬＡＣＴ  ＯＲＦ１（配列番号２６）とを比較したアミノ酸アラインメントを示す図である。
【図７】図７は、ともに、ＡＣＰＩと命名されたアシル運搬体タンパク質である、ＤＯＲＲ  ＯＲＦ３（配列番号６）とそのラクトイミドマイシンのホモログであるＬＡＣＴ  ＯＲＦ２（配列番号２８）とを比較したアミノ酸アラインメントを示す図である。
【図８】図８は、ともに、ＡＯＴＦと命名された、細菌性アスパラギンシンテターゼに類似したアミドトランスフェラーゼである、ＤＯＲＲ  ＯＲＦ４（配列番号８）とそのラクトイミドマイシンのホモログであるＬＡＣＴ  ＯＲＦ３（配列番号３０）とを比較したアミノ酸アラインメントを示す図である。
【図９】図９Ａから図９Ｄは、ともに、ＰＫＵＮと命名された、ＡＴドメインをもたない例外的なモジュラー型ＰＫＳである、ＤＯＲＲ  ＯＲＦ５（配列番号１０）とそのラクトイミドマイシンのホモログであるＬＡＣＴ  ＯＲＦ４（配列番号３２）とを比較したアミノ酸アラインメントを示す図である。
【図１０】図１０Ａから図１０Ｊは、ともに、ＰＫＵＮと命名された、ＡＴドメインをもたない例外的なモジュラー型ＰＫＳである、ＤＯＲＲ  ＯＲＦ６（配列番号１２）とそのラクトイミドマイシンのホモログであるＬＡＣＴ  ＯＲＦ５（配列番号３４）とを比較したアミノ酸アラインメントを示す図である。
【図１１】図１１Ａから図１１Ｃは、ともに、ＰＫＵＮと命名された、ＡＴドメインをもたない例外的なモジュラー型ＰＫＳである、ＤＯＲＲ  ＯＲＦ７（配列番号１４）とそのラクトイミドマイシンのホモログであるＬＡＣＴ  ＯＲＦ６（配列番号１２）とを比較したアミノ酸アラインメントを示す図である。
【図１２】図１２は、ともに、ＡＹＯＡと命名された、アシルトランスフェラーゼとオキシドレダクターゼとの融合物である、ＤＯＲＲ  ＯＲＦ８（配列番号１６）とそのラクトイミドマイシンのホモログであるＬＡＣＴ  ＯＲＦ７（配列番号３８）とを比較したアミノ酸アラインメントを示す図である。
【図１３】図１３は、ともに、ＯＸＲＣと命名されたシトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼである、ＤＯＲＲ  ＯＲＦ１１（配列番号２３）とそのラクトイミドマイシンのホモログであるＬＡＣＴ  ＯＲＦ８（配列番号４０）とを比較したアミノ酸アラインメントを示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１０Ｄ】
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【図１０Ｅ】
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【図１０Ｆ】
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【図１０Ｇ】
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【図１０Ｈ】
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【図１０Ｉ】
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【図１０Ｊ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１２】
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【図１３】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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