(57)【要約】本明細書に開示されるのは、親和性クロマトグラフィー及びファージディスプレイ技術を用いて、２つの生物学上のサンプルの間で異なる蛋白質と他の生物分子を同定し、単離し、そして比較するための方法である。
2004515786.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
蛋白質、ポリペプチド又は他の生物分子の同定方法であって、当該方法は、
（ａ）第１のタイプの個体からの複合生物学サンプルを支持体に接着させることによりアレイを創製すること；
（ｂ）第２のタイプの個体からの複合生物学サンプルを支持体に接着させることによりアレイを創製すること；
（ｃ）ペプチド−核酸カップリングされたライブラリーを工程（ａ）において形成されたアレイに少なくとも１回暴露すること；そして
（ｄ）第１の生成物を工程（ｂ）において形成されたアレイに少なくとも１回暴露することにより第２の生成物を創製すること
を含む。
【請求項２】
工程：
（ｅ）ペプチド−核酸カップリングされたライブラリーを工程（ｂ）において形成されたアレイに少なくとも１回暴露することにより第３の生成物を創製すること；及び
（ｆ）第３の生成物を工程（ａ）において形成されたアレイに少なくとも１回暴露することにより第４の生成物を創製すること
を含む、請求項１記載の方法。
【請求項３】
さらに、工程：
（ｇ）第２の生成物と第４の生成物を比較すること
を含む、請求項２記載の方法。
【請求項４】
さらに、工程：
（ｇ）第２の生成物と第４の生成物を比較することによりプールされた生成物を生成し；そして
（ｈ）プールされた生成物を増幅すること
を含む、請求項２記載の方法。
【請求項５】
さらに、工程：
（ｉ）増幅されたプール生成物の一部を支持体に接着させることによりアレイを提供し；そして
（ｊ）第１のタイプ又は第２のタイプの個体からの複合生物学サンプルを工程（ｉ）により形成されたアレイに少なくとも１回暴露することにより第５の生成物を提供すること
を含む、請求項４記載の方法。
【請求項６】
さらに、工程：
（ｋ）第１のタイプ又は第２のタイプの個体からの複合生物学サンプルを工程（ｉ）により形成されたアレイに少なくとも１回暴露することにより第６の生成物を提供するが、但し、複合生物学サンプルは工程（ｊ）において使用されたのとは異なるタイプの個体からである、
請求項５記載の方法。
【請求項７】
さらに、工程：
（ｉ）第５の生成物と第６の生成物を比較すること
を含む，請求項６記載の方法。
【請求項８】
複合生物学サンプルが組織由来である、請求項１記載の方法。
【請求項９】
組織が、上皮、結合、筋肉及び神経からなる群から選択される、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
複合生物学サンプルが体液由来である、請求項１記載の方法。
【請求項１１】
体液が、髄液、血液、唾液、粘液、涙、膵液、精液、汗、乳汁、胆汁、血漿、血清、リンパ液、尿、胸膜流出液、気管支洗浄液、腹水及び滑液からなる群から選択される、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
体液が髄液である、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
複合生物学サンプルが器官の種類からである、請求項１記載の方法。
【請求項１４】
器官の種類が、皮膚、骨、軟骨、腱、靭帯、骨格筋、平滑筋、心臓、血液、血管、脳、脊髄、末梢神経、鼻、気管、肺、口、食道、胃、腸、腎臓、子宮、尿管、尿道、膀胱、視床下部、下垂体、甲状腺、膵臓、副腎、卵巣、卵管、膣、乳腺、精巣、精嚢、陰茎、リンパ、リンパ節、リンパ管、白血球細胞、Ｔ−細胞及びＢ−細胞からなる群から選択される、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
複合生物学サンプルが培養された細胞種である、請求項１記載の方法。
【請求項１６】
細胞種が上皮組織、結合組織、筋肉組織及び神経組織からなる群から選択される、請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
複合生物学サンプルが疾患個体からであり、そして他の複合生物学サンプルが非疾患個体からである、請求項１記載の方法。
【請求項１８】
複合生物学サンプルの一つが治療された個体からであり、そして他の複合生物学サンプルが非治療個体からである、請求項１記載の方法。
【請求項１９】
ライブラリーがファージディスプレイライブラリーである、請求項１記載の方法。
【請求項２０】
ライブラリーが抗体ライブラリーである、請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
ライブラリーが組換えディスプレイライブラリーである、請求項１９記載の方法。
【請求項２２】
ライブラリーが合成ペプチドライブラリーである、請求項１９記載の方法。
【請求項２３】
第１生成物が、暴露工程（ｃ）の間にアレイに結合して次に解放された物質を含む、請求項１記載の方法。
【請求項２４】
第２生成物が、暴露工程（ｄ）の間にアレイに結合しなかった物質を含む、請求項１記載の方法。
【請求項２５】
第３生成物が、暴露工程（ｅ）の間にアレイに結合して次に解放された物質を含む、請求項２記載の方法。
【請求項２６】
第４生成物が、暴露工程（ｆ）の間にアレイに結合しなかった物質を含む、請求項２記載の方法。
【請求項２７】
工程（ａ）又は（ｂ）の複合生物学サンプルを上記接着の前に処理することをさらに含む、請求項１記載の方法。
【請求項２８】
処理が変性を含む、請求項２７記載の方法。
【請求項２９】
工程（ａ）又は（ｂ）の支持体が固相支持体である、請求項１記載の方法。
【請求項３０】
工程（ａ）の支持体及び工程（ｂ）の支持体が共に固相支持体である、請求項１記載の方法。
【請求項３１】
工程（ａ）又は工程（ｂ）のアレイが複合生物学サンプルへの支持体の架橋結合により創製される、請求項１記載の方法。
【請求項３２】
工程（ａ）のアレイ及び工程（ｂ）のアレイが共に複合生物学サンプルへの支持体の架橋結合により創製される、請求項１記載の方法。
【請求項３３】
第５生成物が暴露工程（ｊ）の間にアレイに結合して次に解放される物質を含む、請求項５記載の方法。
【請求項３４】
第６生成物が暴露工程（ｋ）の間にアレイに結合して次に解放される物質を含む、請求項６記載の方法。
【請求項３５】
第２生成物を精製する工程をさらに含む、請求項１記載の方法。
【請求項３６】
第４生成物を精製する工程をさらに含む、請求項２記載の方法。
【請求項３７】
第２生成物を質量測定分析により分析することをさらに含む、請求項１記載の方法。
【請求項３８】
第４生成物を質量測定分析により分析することをさらに含む、請求項２記載の方法。
【請求項３９】
第５生成物を質量測定分析により分析することをさらに含む、請求項５記載の方法。
【請求項４０】
第６生成物を質量測定分析により分析することをさらに含む、請求項６記載の方法。
【請求項４１】
第５及び第６生成物を質量測定分析を用いて比較する、請求項７記載の方法。
【請求項４２】
ライブラリーを工程（ａ）により形成されたアレイに１回より多く暴露することにより第１生成物を創製する、請求項１記載の方法。
【請求項４３】
第１生成物を工程（ｂ）により形成されたアレイに１回より多く暴露することにより第２生成物を創製する、請求項１記載の方法。
【請求項４４】
ライブラリーを工程（ｂ）により形成されたアレイに１回より多く暴露することにより第３生成物を創製する、請求項２記載の方法。
【請求項４５】
第３生成物を工程（ａ）により形成されたアレイに１回より多く暴露することにより第４生成物を創製する、請求項２記載の方法。
【請求項４６】
工程（ｊ）の複合生物学サンプルを工程（ｉ）により形成されたアレイに１回より多く暴露することにより第５生成物を創製する、請求項５記載の方法。
【請求項４７】
工程（ｋ）の複合生物学サンプルを工程（ｉ）により形成されたアレイに１回より多く暴露することにより第６生成物を創製する、請求項６記載の方法。
【請求項４８】
工程（ｃ）及び工程（ｆ）のアレイが同じアレイである、請求項２記載の方法。
【請求項４９】
工程（ｃ）及び工程（ｆ）のアレイが別のアレイである、請求項２記載の方法。
【請求項５０】
工程（ｄ）及び工程（ｅ）のアレイが同じアレイである、請求項２記載の方法。
【請求項５１】
工程（ｄ）及び工程（ｅ）のアレイが別のアレイである、請求項２記載の方法。
【請求項５２】
工程（ｊ）及び工程（ｋ）のアレイが同じアレイである、請求項６記載の方法。
【請求項５３】
工程（ｊ）及び工程（ｋ）のアレイが異なるアレイである、請求項６記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明は、ファージディスプレイ技術を用いて蛋白質と他の生物学上の分子を同定及び単離する方法に関する。
【０００２】
発明の背景
広範囲の生物学上のプロセスに関与する分子を同定して特性決定し、そしてこれらのプロセスを変調することができる新規な分子を発見することに関して、特に医薬及び農学の分野において増加する要求がある。新規な生物活性化合物を検索するための一つの方法は、天然物質又は合成された分子のライブラリーをスクリーニングすることであり、単純な結合反応から生理学的調製物を合成することまで複雑に変動し得るアッセイ技術を用いる。不幸なことに、多数の集団又はレパートリーから興味のある分子を選択することは、時間を浪費して経費がかさみ、そしてしばしば次の調査及び開発を必要とするリードを提供するだけである。
【０００３】
最近、ライブラリーの生成及びこのアプローチの効率及び有効性を改善してきたそれらの選択の方法の両方においていくつかの発展があった。ファージディスプレイ技術は１９９０年代に大きく発展し、蛋白質（又はペプチド）をファージウイルス粒子の表面上にディスプレイさせるインビトロ選択技術であり、当該蛋白質をコードするＤＮＡがウイルス粒子中に含まれる。ディスプレイされた蛋白質とそれをコードするＤＮＡの間のこの直接の物理的なつながりは、選択及び増幅の連続回転を可能にさせる。大きなファージディスプレイライブラリー（「ＰＤＬｓ」）を標的分子に対して生成してスクリーニングすることができる。これらのＰＤＬｓは様々なマクロ分子、例えば、受容体、ポリペプチド、酵素、糖質、及び抗体に対して有力なリガンドを示す、莫大な数の異なるペプチドを包含するかもしれない。個々のファージはディスプレイされた蛋白質と同族のリガンドとの相互作用によりライブラリーから捕捉することができ、そして捕捉されたファージは細菌の感染により増幅させることができる。即ち、ファージディスプレイ技術は標的分子に結合するペプチドの選択のための極めて強力な手段である。これらのペプチドは、例えば、ワクチン中の抗原として、酵素阻害剤として、又は受容体のアゴニスト又はアンタゴニストとして、多数の応用を見いだすかもしれない。
【０００４】
診断試験及び疾患を治療するための薬剤を開発するための一つの戦略は、疾患の進行に因果関係を有する鍵となる細胞成分、例えば蛋白質の同定を含む。これはしばしば疾患に罹った個体と健康な個体の間か又は治療された患者と未治療の患者の間の蛋白質組成又は蛋白質作用の違いを観察することにより達成することができる。不幸なことに、生物分子を分析する現在の方法は時間を浪費して高価であり、そして、検出、イメージ化、精製、及び分析において非能率さを被る。即ち、生物学上のサンプル間の特定の差異及び変化を検出する方法に関する要求が存在する。そのような方法は、診断及び薬剤の開発のための生物学上の標的の同定を促進するはずである。
【０００５】
ゲノミクスによるアプローチは生物学上のプロセスの遺伝学上の基礎に関する我々の認識を前進させたが、顕著な限界を有する。例えば、同定された遺伝子、特に部分的なｃＤＮＡ配列によりコードされる生成物の機能はしばしば未知であり、そして蛋白質の翻訳後修飾についての情報は、その遺伝子の配列の知見から、まれに演繹することができる。大部分の蛋白質は翻訳後修飾（例えばグリコシル化及びリン酸化）を経ることが今や明らかであり、それらの生化学特性に深く影響し得る。さらに、蛋白質の発現はしばしば翻訳後修飾制御に供されて、ｍＲＮＡの細胞のレベルはその遺伝子産物の発現レベルと相関する必要はない。
【０００６】
これらの理由から、蛋白質の発現及び糖質の発現のパターン、及び一般には翻訳後修飾のパターンを、生物学上のプロセス又は疾患のプロセスにおいて、蛋白質、オリゴサッカライド、及び他の生物分子の直接の分析を通して研究することにより、ゲノミックのデータを補足する必要がある。プロテオミクスの急速に成長する分野は、ｍＲＮＡレベルよりも蛋白質のレベルにおける発現を検出及び定量することにより、正常状態と疾患状態の間の細胞蛋白質レベルのバリエーションを研究しようと努める。しかしながら、当該プロテオミクスアプローチは多くの障害に直面しており、サンプルの複雑さ、大きく相対的な豊富さの範囲（ｌａｒｇｅ ｒｅｌａｔｉｖｅ ａｂｕｎｄａｎｃｅ ｒａｎｇｅ）、及び蛋白質の定量を含む。技術的上の制約は、これまで、迅速であり、費用上有効であり、再現性があり、そして組織的な、生物学上のサンプル中に存在する蛋白質及び他の生物分子の分析法を妨げてきた。
【０００７】
発明の概要
本発明は、広い範囲の相対的過剰さにわたる、サンプル間で異なる蛋白質と他の生物分子の単離と定量化の方法を特徴とする。発明は、公知の種、又は新規な配列又は新規な翻訳後修飾を有する種としての蛋白質の同定を提供し、そしてそのような蛋白質に対する特定の親和性試薬の特性決定と単離のための手段を供給する。
【０００８】
一の側面において、発明は、蛋白質、ポリペプチド又は他の生物分子の同定方法を提供し、（ａ）第１のタイプの個体からの複合生物学サンプルを支持体に接着させることによりアレイを創製すること；（ｂ）第２のタイプの個体からの複合生物学サンプルを支持体に接着させることによりアレイを創製すること；（ｃ）ペプチド−核酸カップリングされたライブラリーを工程（ａ）において形成されたアレイに少なくとも１回暴露すること；及び（ｄ）第１の生成物を工程（ｂ）において形成されたアレイに少なくとも１回暴露することにより第２の生成物を創製する工程を含む。
【０００９】
発明の一の態様において、上記方法は、さらに、（ｅ）ペプチド−核酸カップリングされたライブラリーを工程（ｂ）において形成されたアレイに少なくとも１回暴露することにより第３の生成物を創製し；（ｆ）第３の生成物を工程（ａ）において形成されたアレイに少なくとも１回暴露することにより第４の生成物を創製する工程を含む。第２及び第４の生成物は、好ましくは質量測定分析により、比較されて、２つの生物学上のサンプルの間の差異を同定してよい。
【００１０】
別の態様において、上記方法は、以下の追加の工程：（ｇ）第２の生成物と第４の生成物を比較することによりプールされた生成物を生成し；（ｈ）プールされた生成物を増幅し；（ｉ）増幅されたプール生成物の一部を支持体に接着させることによりアレイを提供し；（ｊ）第１のタイプ又は第２のタイプの個体からの複合生物学サンプルを工程（ｉ）により形成されたアレイに少なくとも１回暴露することにより第５の生成物を提供し；（ｋ）第１のタイプ又は第２のタイプの個体からの複合生物学サンプルを工程（ｉ）により形成されたアレイに少なくとも１回暴露することにより第６の生成物を提供するが、但し、複合生物学サンプルは工程（ｊ）において使用されたのとは異なるタイプの個体からであり；そして第５の生成物と第６の生成物を比較することを含む。好ましい態様において、これらの生成物は、質量測定分析により比較する。
【００１１】
発明の方法は、親和性クロマトグラフィーとファージディスプレイ技術を使用することにより２つの生物学上のサンプルの間の差異の同定を可能にさせる。この方法により、疾患個体から選られたサンプルを非疾患個体からのサンプルに対して比較することにより、２つのサンプルの間の生物分子の発現における差異を同定することができる。医療を施された個体及び医療を施されなかった個体からのサンプルを同様に比較することができる。そのようなサンプルの間の差異の同定は診断及び／又は薬剤の開発に有用な生物学上の標的及び情報を導くことができる。
【００１２】
比較される生物学上のサンプルは様々な生物源から取得することができ、組織、例えば上皮組織、結合組織又は神経組織、又はそれら由来の培養細胞種を含む。あるいは、生物学上のサンプルは、体液、例えば、髄液（ＣＳＦ）、血液、唾液、粘液、涙、膵液、精液、汗、乳汁、胆汁、血漿、血清、リンパ液、尿、胸膜流出液、気管支洗浄液、腹水、又は滑液から取得してよい。特に好ましい態様において、体液はＣＳＦである。
【００１３】
別の他の態様において、生物学上のサンプルは、器官の種類からであり、皮膚、骨、血管、脳、脊髄、末梢神経、鼻、気管、肺、口、食道、胃、腸、腎臓、子宮、尿管、尿道、膀胱、視床下部、下垂体、甲状腺、膵臓、副腎、卵巣、卵管、膣、乳腺、精巣、精嚢、陰茎、リンパ、リンパ節、リンパ管、白血球細胞、Ｔ−細胞及びＢ−細胞を含む。
【００１４】
発明のアレイは、複合生物学サンプルを固相支持体に架橋結合させることにより製造することができる。サンプルは、好ましくは、支持体に接着させる前に、蛋白質を変性させるために化学試薬で処理する。
【００１５】
発明の好ましい態様において、ペプチド−核酸カップリングされたライブラリーは、ファージディスプレイライブラリーであり、もっとも好ましくは抗体ライブラリー又は組換え体ライブラリー又は合成ペプチドライブラリーである。
【００１６】
ライブラリー又は複合生物学サンプルをアレイに暴露することにより形成された様々な生成物は、アレイに結合しなかった物質（即ち、フロースルー物質）又はアレイに結合して次に解放された物質（即ち、溶出結合生成物）の何れかを含んでよい。ライブラリー又は複合生物学サンプルは、複数回、アレイに暴露されることにより、生成物を生成してよい。
【００１７】
発明の他の特徴及び利点は以下の詳細な説明及び特許請求の範囲から明らかになる。
定義
「接着させること（ａｄｈｅｒｉｎｇ）」は、共有結合又は非共有結合の何れかによる、別の物質の一部への一つの物質の一部の直接又は間接の結合（ｌｉｎｋｉｎｇ）を意味する。
【００１８】
「増幅すること」は、数を増加させることを意味する。
「アレイ」は、多数の、ポリマー配列（例えば、蛋白質、ペプチド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド等）又は基質又は支持体の表面に関連する他の生物分子を意味する。アレイの例は、蛋白質親和性カラム及びファージ親和性カラムを含む。
【００１９】
「複合生物学サンプル（ｃｏｍｐｌｅｘ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｓａｍｐｌｅ）」又は「生物学上のサンプル（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｓａｍｐｌｅ）」は、あらゆる生存生物から得られるか、排泄されるか又は分泌されるあらゆる固形又は液体のサンプルを意味し、単細胞微生物（例えば、細菌及び酵母）及び多細胞生物（例えば、植物及び動物、例えば脊椎動物又は哺乳類、及び特定すれば健康又は見かけ上健康なヒト被験者又は症状又は疾患に罹患したヒト患者）を含む。生物学上のサンプルは、あらゆる部位から得られる生物学上の液体又は生物の物質（例えば、血液、血漿、血清、尿、胆汁、髄液、水性又は硝子液、又はあらゆる体分泌液）、侵出物（ｔｒａｎｓｕｄａｔｅ）、滲出物（ｅｘｕｄａｔｅ）（例えば、膿瘍又は感染あるいは炎症のあらゆる他の部位から得られる液体）、又は関節（正常な関節又は慢性関節リウマチ、骨関節症、通風又は敗血性関節炎のような疾患に罹った関節）から得られる液体であってよい。あるいは、生物学上のサンプルは、あらゆる器官又は組織（生検標本又は解剖標本を含む）であり得るかまたは細胞（一次細胞または培養細胞）またはあらゆる細胞、組織または器官により条件付けされた培地を含んでよい。所望なら、生物学上のサンプルを予備加工に供してよく、限定ではないが、予備分離技術及び／または変性を含む。例えば、細胞または組織を抽出し、そして別の亜細胞画分中の生物分子、例えば細胞の別の部分に見いだされる蛋白質または薬剤の別の分析のための亜細胞の分画化に供され得る。例えば、Ｄｅｕｔｃｈｅｒ（編纂），Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １８２：１４７−２３８（１９９０）を参照。同様に、免疫沈殿を実施して抗原的に関連する生物分子、例えば蛋白質を同定することができる。
【００２０】
「暴露すること」は、２つの物質の間に接触を起こさせることを意味する。
「個体（ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ）」又は「被験者（ｓｕｂｊｅｃｔ）」は、単細胞又は多細胞の生物、例えば、植物、動物、真菌、原生動物、又は細菌を意味する。好ましい態様において、個体は、哺乳類、もっとも好ましくはヒト又は他の霊長類種である。
【００２１】
「ペプチド−核酸カップリングされたライブラリー」は、各ペプチドが（直接又は間接に）上記ペプチドをコードするＤＮＡに結合された、ペプチドのコレクションを意味する。ペプチド−核酸カップリングされたライブラリーの例は、ファージディスプレイライブラリー（「ＰＤＬ」）のはずである。
【００２２】
用語「ペプチド」、「蛋白質」及び「ポリペプチド」は本明細書において交換可能なように使用されて、翻訳後修飾に拘わらず（例えば、グリコシル化又はリン酸化）、ペプチド結合又は修飾されたペプチド結合により互いに連結した２つ又はそれ以上のアミノ酸のあらゆる鎖を意味する。
【００２３】
本発明は、蛋白質を同定して分析するのには有用であるが、あらゆる生物分子の同定及び分析のために、より一般的に適用可能である。本明細書にて使用されるとおり、用語「生物分子（ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌｅ）」は、生物学上のサンプル中に存在するあらゆる有機分子を意味し、そしてペプチド、ポリペプチド、蛋白質、脂肪酸、オリゴサッカライド、脂質、ステロイド、プロスタグランジン、プロスタサイクリン、及び核酸（ＤＮＡ及びＲＮＡを含む）を含む。
【００２４】
「基質」又は「支持体」は、あらゆる孔性又は非孔性の水不溶性物質を意味し、好ましくは剛体（ｒｉｇｉｄ）又は半剛体（ｓｅｍｉ−ｒｉｇｉｄ）である。表面は多くの形態の如何なる一つを有することもでき、例えば、膜、フィルター、チップ、スライド、ウエハース、繊維、磁気又は非磁気ビーズ、ゲル、管、ストリップ、プレート、ロッド、ポリマー、粒子、マイクロ粒子、キャピラリー等である。基質は、様々な表面形態を有することができ、例えば、ウエル、トレンチ、ピン、チャネル及び孔（ｐｏｒｅｓ）であり、ポリペプチド、ポリヌクレオチド又は他の生物分子が結合される。基質は親水性であり得るか又は親水性にさせられることができ、そして無機粉末、例えば、シリカ、硫酸マグネシウム、及びアルミナ；天然ポリマー物質、特にセルロース性物質及びセルロース由来の物質、例えば繊維を含む紙、例えばフィルターペーパー、クロマトグラフィーペーパー等；合成又は修飾された天然ポリマー、例えば、ニトロセルロース、酢酸セルロース、ポリ（塩化ビニル）、ポリアクリルアミド、架橋結合したデキストラン、アガロースポリアクリレート、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリ（４−メチルブテン）、ポリスチレン、ポリメタクリレート、ポリ（エチレンテレフタレート）、ナイロン、ポリ（酪酸ビニル）、等；それらのみか又は他の物質と混合して使用され；バイオ硝子として利用可能な硝子、セラミック、金属等を含む。天然又は合成集合体、例えばリポソーム、ホスホリピッド小胞及びセルも用いることができる。標準に使用される支持体は孔が制御された硝子（ＣＰＧ）であり、規定されたサイズの孔により均一に製造された硝子マトリックスからなる。蛋白質及び他の生物分子の基質又は表面上の固定化は、文献において共通に利用可能な良く知られた文献により達してよい。
【００２５】
詳細な説明
疾患を診断して治療するための新規な方法の開発においては、疾患に付随した、鍵となる細胞成分、例えば蛋白質及び他の生物分子を同定することが重要である。そのような成分を同定する一つの方法は、疾患の個体と健康な個体の間の蛋白質の発現における差異を捜すことである。
【００２６】
本発明は、サンプル中に存在する蛋白質及び他の生物分子の差異を決定するために、２つの複合生物学サンプルを比較する手段を提供する。好ましい態様において、蛋白質親和性マトリックスの対を、比較される２つの生物学サンプルから用意する。ファージディスプレイライブラリーを一連の捕捉工程中のマトリックスに暴露して、２つのサンプルの間で異なるそれらの蛋白質（即ち、「異なる蛋白質」）に結合するファージの単離をもたらす。これらのファージを増幅して、ファージ親和性マトリックスのセットを用意するのに使用する。比較される生物学サンプルを、次に、これらのファージマトリックスに暴露して、特異的に（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ）発現される蛋白質を捕捉する。疾患被験者からのサンプルを健康被験者からのサンプルと比較することにより、治療上及び診断上重要な生物学上の標的及び薬剤開発のためのリード構造を同定することができる。例えば、疾患個体からのサンプルにのみ存在するか又は疾患サンプルにおいて異なる濃度にて存在することがわかった受容体は、疾患の診断又は治療のための有力な標的となるかもしれない。さらに、受容体に対して高い親和性及び特異性を有することがわかったリガンドは、薬剤開発のリード構造を提供する。さらに、治療においてその分配、レベル又は特性を変化させる蛋白質種は、動物、例えばヒト患者において有益か又は有毒な効果の指標を提供するかもしれない。
【００２７】
サンプルは、広範囲の種類の器官から採取することができ、限定ではないが、皮膚、骨、軟骨、腱、靭帯、骨格筋、平滑筋、心臓、血液、血管、脳、脊髄、末梢神経、鼻、気管、肺、口、食道、胃、腸、腎臓、子宮、尿管、尿道、膀胱、視床下部、下垂体、甲状腺、膵臓、副腎、卵巣、卵管、膣、乳腺、精巣、精嚢、陰茎、リンパ、リンパ節、リンパ管、白血球細胞、Ｔ−細胞及びＢ−細胞を含む。他の適切なサンプル源は、限定ではないが、上皮組織、結合組織、筋肉又は神経組織、又は体液、例えば、髄液（ＣＳＦ）、血液、唾液、涙、粘液、膵液、精液、汗、乳汁、胆汁、血漿、血清、リンパ液、尿、胸膜流出液、気管支洗浄液、腹水、又は滑液を含む。
【００２８】
サンプルの源は様々な因子、例えば、研究される疾患の性質又は症状に基づいて選択される。例えば、ＣＳＦは中枢神経系の疾患を研究するのに採取してよく、膵液は膵臓の疾患を研究するのに採取してよい。癌のような疾患状態においては、特定の種類の癌に直接関係する何れの種類又は全ての種類の組織又は細胞（例えば、リンパ腫に関してのリンパ等）を分析してよい。様々な生物学上のサンプルを正確に回収して保存する方法は当業界で知られており、そしてサンプルの性質に依存して変更してよい。
生物学上のサンプルを用いた親和性マトリックスの用意
生物学上のサンプルを回収した後に、サンプル各々を別の支持体に接着させることにより、アレイ又はマトリックスのセットを創製する（図１）。発明の一つの態様において、アレイは、異なる蛋白質又は他の生物分子を非常に多数結合させる固相支持体又はゲルを含む親和性マトリックスである。適切なマトリックスの材料は、限定ではないが、紙、ガラス、セラミックス、金属、メタロイド、ポリアクリロイルモルフォリド、様々なプラスチック及びプラスチックコポリマー、例えば、ＮＹＬＯＮ（登録商標）、ＴＥＦＲＯＮ（登録商標），ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリ（４−メチルブテン）、ポリスチレン、ポリスチレン、ポリスチレン／ラテックス、ポリメタクリレート、ポリ（エチレンテレフタレート）、レーヨン、ナイロン、ポリ（酪酸ビニル）、ポリビニリデンジフルオリド（ＰＶＤＦ）、シリコーン、ポリフォルムアルデヒド、セルロース、酢酸セルロース、ニトロセルロース及び孔制御性ガラス（コントロールドポアグラス社、フェアフィールド、Ｎ．Ｊ．）、エアロゲル（例えば、Ｒｕｂｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７：４３４１−４３４９（１９９２）；Ｒａｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍａｔｅｒｉａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８：３０２１（１９９３）；Ｂａｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｄ．Ａｐｐｌ．Ｐｈｙｓ．２２：７３０９−７３４（１９８９）；Ｋｉｍ  ＆  Ｊａｎｇ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｒｅａｍ．Ｓｏｃ．７４：１９８７−９２（１９９１）等を参照）、及び親和性カラムにおける使用に適することが一般に公知の他の材料を含む。好ましい態様においては、支持体はストレプトアビジンセファロースカラムである。しかしながら、スクリーニングを他の固相又は溶液中で実施することができる。
【００２９】
生物分子、例えば、蛋白質を、固相基体に結合して、そこで基体に接触した溶液中に存在する相補分子に相互作用する固定化リガンドとして機能する。スクリーニングされる源、例えばファージディスプレイライブラリーを、親和性マトリックスを通過させて、標的分子が固定化リガンドにより捕捉されることを可能にする。未結合の成分は結合した複合体から洗い流されることにより、親和性カラムに結合した標的分子を欠く溶液を提供するか、又は単離された標的分子それ自体を提供する。未結合のバックグラウンド物質が洗い流された後、結合物質を溶出するが、しばしば、標的とリガンドの間の対合を溶液中で弛緩させる（ｌｏｏｓｅｎ）。親和性マトリックス中で捕捉された生物分子は、加熱、塩濃度の調節、又は脱安定化剤、例えばホルムアミド、ＴＷＥＥＮ（商標）−２０変性剤又はドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）の使用により分離及び放出することができる。
【００３０】
蛋白質及び他の生物分子を基体又は支持体に結合させるための多くの技術が当業界公知であり、例えば、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ：Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｏｕｐｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍ．Ａｓｌａｍ，Ａ．Ｄｅｎｔ  Ｇｒｏｖｅｓ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．ニューヨーク、ＮＹ（１９８８）に記載された技術である。あらゆる適切な誘導化又は固相結合の方法を使用してよい。好ましい態様においては、蛋白質をビオチン化して、アビジン又はアビジン関連化合物（例えば、ストレプトアビジン）を含む基体又は支持体を用いることにより、複合生物学サンプルの蛋白質を接着させる。ビオチンは特異的にアビジン関連化合物に結合して、それにより蛋白質を基体に結合させる。他のよく知られた特異的結合対もサンプル蛋白質の支持体への結合のための手段として使用してよい。
【００３１】
サンプルを支持体に接着させる前に、サンプルの蛋白質を変性させて、さらに完全な分析を可能にさせてよい。様々な解離方法が当業界公知であり、蛋白質複合体を解体して（ｂｒｅａｋ ｕｐ）、蛋白質を可溶化して、サンプル内の蛋白質の折り畳みをほどくために使用してよい。これらの方法は、例えば、グアニジンＨＣｌ、ギ酸、様々なカオトロプ、洗浄剤（ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ）、加熱、相分割（ｐｈａｓｅ ｐａｒｔｉｔｉｏｎｉｎｇ）、及び誘導化による処理を含む。あるいは、サンプルの中の蛋白質の解離が保存されるべきであるなら、そのような処理を省いて、蛋白質複合体を任意に架橋結合させて安定性を増大させてよい。解離を保存することにより、蛋白質複合体の一つのメンバーに対するファージが、複合体の一つより多い成分の単離及び同定を可能にさせるかもしれない。
ペプチド−核酸カップリングされたライブラリー
本発明によれば、上記の蛋白質親和性マトリックスを用いてペプチド−核酸カップリングライブラリーをスクリーニングし、ペプチドのコレクションを作成するが、但し、各ペプチドはそれをコードするＤＮＡに結合する。好ましい態様において、ライブラリーはファージディスプレイライブラリーである。ディスプレイ技術は所望の特性に関してスクリーニングできる、モジュールコードされた生物分子のライブラリーを創製する方法のコレクションを表す。最重要なディスプレイ技術の特長のうちの２つは、極めて高い検出感度と初期スクリーニング後に迅速に所望の化合物の構造を決定する能力である。様々なファージライブラリーを本発明において使用することができ、免疫又は非免疫、及び単鎖Ｆｖ又はＦａｂ断片抗体ライブラリー；及び組換えディスプレイ又は合成ペプチドライブラリーを含む。適切なファージディスプレイライブラリー及びそれらの調製のための技術の例は、当業界においてよく知られており、例えば、Ｂａｒｂａｓ，Ｆ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｈａｇｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（２００１）に記載されている。使用できる他のライブラリーは、Ｌｉ，Ｍ．，”Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｄｉｓｐｌａｙ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｎａｌｙｓｉｓ”，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １８：１２５１−１２５８（２０００）により記載される。
【００３２】
ペプチドライブラリーは、所定の長さの多大な数のペプチドを含み、それらの配列は各位置においてアミノ酸残基を変更させるようにランダムに生成された。そのようなライブラリーを使用する通常のゴールは、スクリーニングされるほとんど全ての蛋白質に対して見いだされるバインダーの典型的なプールから高親和性バインダーを選択することである。そのもっとも単純な形態において、発明の方法は、中度／低度親和性の単一のバインダーを用い、最適な蛋白質捕捉及び放出のプロセスの間に選択される。
【００３３】
ファージディスプレイライブラリーはそれらの特定の特性に基づいて選択でき、必要とされる分析の種類と単離される親和試薬の特性に依存する。例えば、ペプチドと抗体ファージディスプレイライブラリーの間の選択は、所望の親和試薬がペプチドであるか抗体であるかに関連した。使用されたライブラリーは、好ましくは、可能な限り大きくて多様な、選択されたサンプルに関して特異的なバインダーの集団を含む。ライブラリーの適合可能な混合物を用いることにより、選択されたサンプルから可能な限り多くの種を捕捉することができる。究極には、あらゆる特定の種のサンプル中の全ての公知の種に関するバインダーを含む、「パンプロテオミク」及び「プロテオミクサブセット」ライブラリーを開発できる。
【００３４】
２つの配列の間で異なる蛋白質を結合するファージを捕捉するために、ファージライブラリーを、２つの異なる生物学上のサンプルから生成された蛋白質親和性マトリックスに通過させる。ファージ暴露の配列を図２及び３に示す。最初に、ファージライブラリーを第１の生物学上のサンプルから用意された蛋白質親和性マトリックスに暴露する。未結合のファージを洗い流して、結合したファージを解放させて、次に第２の生物学上のサンプルから用意された蛋白質親和性マトリックスに暴露する。この第２の暴露工程からのフロースルーを残し、第１生物学サンプルには存在するが第２サンプルには存在しない蛋白質に結合するファージを含む。
【００３５】
同一のファージライブラリーを逆の順序で親和性マトリックスに暴露するが、即ち、ライブラリーを第２サンプルから用意された蛋白質親和性マトリックスに最初に暴露する。未結合のファージを洗い流して、結合したファージを溶出して、次に第１サンプルから用意された蛋白質親和性マトリックスに暴露する。第２暴露工程からのフロースルーを残し、第２生物学サンプルには存在するが第１サンプルには存在しない蛋白質に結合するファージを含む。
【００３６】
即ち、ファージライブラリーは２つの捕捉工程を通る。第１工程において、ファージライブラリーは生物学上のサンプルから用意された蛋白質親和性マトリックスを通過して、結合したファージが回収される。第２の捕捉工程において、第１サンプルから用意された蛋白質親和性マトリックスに結合したファージは第２サンプルから用意された蛋白質親和性マトリックスに暴露される。逆に、第２サンプルから用意された蛋白質親和性マトリックスに結合したファージは第１サンプルから用意された蛋白質親和性マトリックスに暴露される。捕捉工程のこの組み合わせが、第１サンプルと第２サンプルの間で異なるそれらの蛋白質に結合できるファージの単離をもたらす。第２捕捉工程からのフロースルーファージをプールし、増幅し、そして次のスクリーニングのための同一のファージ親和性マトリックスのセットを用意するために使用してよい。さらに、上記ファージを使用して、「異なる」蛋白質に対する親和性試薬を単離してよい（図７）。
ファージ親和性マトリックス
上で論じたとおり、蛋白質親和性マトリックスへの暴露によりファージディスプレイライブラリーから選択されたファージを使用することにより、ファージ親和性マトリックスのセットを生成する（図４）。親和性マトリックスとしてファージを調製する方法は当業界にて公知であり、そして例えばＳｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２１５：１５１−１６１（１９９８）により記載される。これらのファージ親和性マトリックスを用いることにより、比較される生物学上のサンプルを直接スクリーニングすることができる。ファージマトリックスにサンプルを通過させる前に、それらは上で論じたとおりに蛋白質複合体を解体するための様々な解離方法の何れかを使用して処理して、蛋白質を可溶化して、折り畳まれていない蛋白質により完全な分析をさせる。架橋結合させた繊維状ファージを親和性精製のために首尾よく直接用いることができ、そして親和性捕捉ペプチドをコードする凝集ファージの直接の使用は、適切なペプチド配列を翻訳して（ｄｅｃｏｄｅ）、それを合成して、次に親和性捕捉マトリックスを調製する要求を回避させるが、これは所望であれば実施できる。
【００３７】
図５に示すとおり、２つの異なる個体からの複合生物学サンプルをファージ親和性マトリックスに暴露する。ファージマトリックスに結合する蛋白質は、２つのサンプル間で異なるそれらの蛋白質を含む。ファージマトリックスに結合しない蛋白質を洗い流して、結合した蛋白質を溶出して、当業界公知の様々な同定方法及び定量方法を用いて分析する（図６）。（Ｇｙｇｉ，Ｓ．Ｐ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １７：９９４−９９９（１９９９）；Ｇｙｇｉ，Ｓ．Ｐ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １１１：３９６−４０１（２０００）；Ｏｄａ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９６：６５９１−６５９６（１９９９）；Ｍｉｒｇｏｒｏｄｓｋａｙａ，Ｏ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｒａｐｉｄ  Ｃｏｍｍｕｎ．Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．１４：１２２６−１２３２（２０００）；Ｍｕｎｃｈｂａｃｈ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．７２：４０４７−４０５７（２０００）；Ｌｉｎｋ，Ａ．Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  １８：１３１４−１３３４（１９９７）；Ｗａｓｈｂｕｒｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １９：２４２−２４７（２００１）を参照）。好ましい態様において、溶出した蛋白質は逆相カラムをＥＳＩ質量測定分析へ通過させる。蛋白質は質量フィンガープリンティグ及び配列決定により同定される。一方のサンプルには存在して他方には存在しない蛋白質を同定することに加えて、当業者は、発明の方法が２つのサンプル間の蛋白質の異なるレベルを測定するためにも使用できることを認識する。
もっとも豊富な（ａｂｕｎｄａｎｔ）蛋白質の消耗（ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ）
図８に示すとおり、発明の一つの態様において、生物学上のサンプルに含まれるもっとも豊富な蛋白質は、初期捕捉工程後に結合したファージを回収して（図２）、ファージを増幅して、ファージ親和性カラムを調製し、そして上で記載されて下の実施例に記載される方法を用いてサイクルを循環させることにより、消耗させる（ｄｅｐｌｅｔｅｄ）ことができる。分析用装置の検出の限界に達するまで、図８及び９に示す工程を連続して繰り返すことができる。豊富な蛋白質が消耗したら、生物学上のサンプル間の差異を、本明細書に記載された技術に従い、あまり豊富でない蛋白質を含むサンプルを用いて分析することができる。これにより、生物学上のサンプル中に極めて少量しか存在しないかもしれない蛋白質の同定が可能になる。
【００３８】
本発明を、ヒト髄液（ＣＳＦ）のサンプルの対に対する本発明の方法の適用を記載する以下の実施例により例示する。実施例は、如何なる意味においても、発明の限定を意図しない。
【００３９】
実施例
工程Ｉ．サンプル間で異なる蛋白質に対する蛋白質捕捉ファージ
（ａ）２つのサンプルのための蛋白質親和性マトリックスの用意（図１）。
【００４０】
サンプルの回収。ヒトＣＳＦのサンプルを滅菌コンテナー中の腰椎穿刺により２つの別々の個体から回収する。サンプルは、すぐに、分析のために氷浴中に入れて研究室に運ばれるべきである。研究室に到着したら、ＣＳＦサンプルを２，０００ｇにて１０分間５℃において遠心分離することにより、循環細胞を除去するべきである。サンプルは、すぐに処理するか又は分析まで−７℃において保存することができる（Ｓａｎｃｈｅｚ，Ｊ．Ｃ．ａｎｄ  Ｈｏｃｈｓｔｒａｓｓｅｒ，Ｄ．Ｆ．，“Ｏｒｏｔｅｏｍｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ”  ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１１２，ヒューマンプレス、トトワ、ＮＪ（１９９９））。
【００４１】
サンプルの調製。結合した蛋白質と他の種を解離するため、そして蛋白質の相互作用を最小にするため、サンプルのアリコート（１００μｌ）を３ＭグアニジンＨＣｌ及び０．２Ｍギ酸の最終濃度に作成して、氷上で６０分間インキュベートする。それらを次にＨｉＴｒａｐ  Ｄｅｓａｌｔｉｎｇ  Ｃｏｌｕｍｎ（アマシャムファルマシアバイオテック）をＨＰＬＣシステム上で５ｍｌ／分の流速にてリン酸緩衝塩溶液（ＰＢＳ）と共に用いてバッファー交換し、そして最終容量２００μｌに回収される。低分子量のフロースルーはＳｅｐＰａｋカラムを通過させて、ＰＢＳで洗浄することにより、所望であれば追加の分析のためのペプチドを単離する。蛋白質のインビボの解離を保存するなら、次にグアニジンＨＣｌとギ酸の添加を省き、そして次の工程の前にＰＢＳでＣＳＦアリコートを１：２希釈する。
【００４２】
蛋白質のビオチン化。次に工程において、バッファー交換したサンプル中の蛋白質をビオチン化する。使用の直前に、２ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨ６．０中に、Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチンの０．５ｍｇ／ｍｌ溶液を作成する。この溶液５０μｌを脱塩したＣＳＦサンプルに加え、そして氷上で２時間インキュベートする。５００μｌの１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．４を加え、そしてさらに３０分間インキュベートすることにより、残りのビオチンリンカーを不活性化する。未反応のビオチンを除去するため、ＨｉＴｒａｐ  Ｄｅｓａｌｔｉｎｇ  Ｃｏｌｕｍｎ（アマシャムファルマシアバイオテック）をＨＰＬＣシステム上で５ｍｌ／分の流速にてＴＢＳ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ．ｐＨ７．５，１５０ｍＭ  ＮａＣｌ）と共に用いて脱塩し、そして最終容量２００μｌに回収する（Ｂａｒｂａｓ，Ｆ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｈａｇｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ニューヨーク（２００１））。
【００４３】
捕捉カラム製造。サンプル１と命名したヒトＣＳＦサンプルからのビオチン化された脱塩溶液を、ＴＢＳで平衡化したＨＰＬＣシステム上でＨｉＴｒａｐ  Ｄｅｓａｌｔｉｎｇ  Ｃｏｌｕｍｎ（アマシャムファルマシアバイオテック）に、０．１ｍｌ／分にて通過させる。このカラムを２０ｍｌのＴＢＳにより１．０ｍｌ分にて洗浄して（「カラム１」）する。このプロセスを第２サンプルと命名した第２ＣＳＦサンプルに関して繰り返し、第２カラムを生じさせる（「カラム２」）。
【００４４】
（ｂ）捕捉工程１（図２）
蛋白質捕捉ファージ。５ｍｌのＴＢＳ中のファージペプチドライブラリーの１０３から１０４均等物（例えば、２  ｘ  １０８クローンのライブラリーに関しては２  ｘ  １０１１粒子が１０３と均等のはずである）を、ＨＰＬＣシステム上のカラム１及び２の各々にわたり４０μｌ／分の流速にて通過させる。カラムを２０ｍｌのＴＢＳで０．５ｍｌ／分の流速にて洗浄する。
【００４５】
捕捉ファージを溶出する。結合したファージを１ｍｌのＰａｎｎｉｎｇ  Ｅｌｕｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ（グリシンによりｐＨ２．２に調節した０．１Ｍ  ＨＣｌ）を流速０．５ｍｌ／分にて溶出して、画分を回収する。ファージを含む画分をプールし、そしてＨｉＴｒａｐ  Ｄｅｓａｌｔｉｎｇ  Ｃｏｌｕｍｎ（アマシャムファルマシアバイオテック）をＨＰＬＣシステム上で５ｍｌ／分の流速にてＴＢＳと共に用いてバッファー交換し、そして最終容量約１ｍｌに回収される。（Ｂａｒｂａｓ，Ｆ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｈａｇｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ニューヨーク（２００１））。
【００４６】
（ｃ）捕捉工程３（図３）
交換したカラムからの蛋白質捕捉ファージ。溶出してバッファー交換したファージをＨＰＬＣシステム上でカラム１から２に流速４０μｌ／分にて通過させる。カラムを２０ｍｌのＴＢＳで０．５ｍｌ／分の流速にて洗浄する。このプロセスをカラム２から１の溶出してバッファー交換したファージに繰り返す。
【００４７】
交換したカラムからの捕捉されたファージを溶出する。結合したファージを１ｍｌのＰａｎｎｉｎｇ  Ｅｌｕｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ（グリシンによりｐＨ２．２に調節した０．１Ｍ  ＨＣｌ）を流速０．５ｍｌ／分にて溶出して、画分を回収する。ファージを含む画分をプールし、約１４０μｌの１Ｍ  Ｔｒｉｓ塩基、ｐＨ９．１を用いて中和する。ｐＨが上昇してｐＨ７．０−８．２の溶液を生じたことを確かめる。このプロセスをカラム２からの結合ファージに繰り返す。
【００４８】
工程ＩＩ．特定のファージ捕捉相異蛋白質
（ａ）ファージ親和性マトリックスの用意（図４）
ファージをプールする。カラム１及び２からのフロースルーファージをプールする。
【００４９】
ファージを増幅する。以下のプロトコルに従い感染を準備する：
１．Ｋ９１細胞の単一コロニーを２ｍｌのＮＺＹを含む培養チューブに移す。激しく撹拌しながら（２５０ｒｐｍ）一晩３７℃においてインキュベートする。
【００５０】
２．２０ｍｌのＮＺＹを含む１２５−ｍｌのフラスコに４００μｌの一晩培養物を接種する。細胞が中期−対数相（ＯＤ５９５＝〜０．４５；これは１．５−２時間かかる）に達するまで、３７℃において激しく撹拌する（２５０ｒｐｍ）。
【００５１】
３．１００ｒｐｍまでの遅い撹拌を１０分間用いて、細菌が、専断されたＦ．ｐｉｌｉを再生することを可能にする。ＯＤ５９５を測定する；０．６５を越えないことが好ましい（最良なのは０．５５−０．６５）。
【００５２】
４．培養物をオークリッジチューブに移して、６００ｇ（２，２００ｒｐｍ）にてＳＯＲＶＡＬＬ  ＳＳ３４ローター（又は均等物）中で１０分間室温又は４℃において遠心分離する。
【００５３】
５．上清を捨てて、細胞を２０ｍｌの８０ｍＭ  ＮａＣｌに徐々に懸濁する。
６．混合物を１２５−ｍｌ培養フラスコに移して３７℃において４５分間穏やかに振る（１００ｒｐｍ）。
【００５４】
７．混合物をオークリッジチューブに移して、８５０ｇ（２，８００ｒｐｍ）にてＳＳ３４ローター（又は均等物）中で１０分間４℃にて遠心分離する。
８．上清を注ぎだし、細胞を１ｍｌの４℃ＮＡＰバッファーに徐々に懸濁する。
【００５５】
９．使用する際は細胞を氷上に置き、そして冷凍庫中の氷上に保存する。細胞は直後に使用するのが最良であるが、数日間はファージ感染のための成分を持続する。それらを保存するチューブの穏やかな撹拌の後に凝集したままであれば、細胞はもはやコンピテントではない。細胞の最終濃度は約５  ｘ  １０９細胞／ｍｌであるべきである。（Ｂａｒｂａｓ，Ｆ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｈａｇｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ニューヨーク（２００１））。
【００５６】
空腹の細胞に溶出したファージを感染させる。
１．アガロースゲル電気泳動又は分光測光によりファージの濃度を測定する。
２．希釈したウイルス粒子１０μｌ（１０６粒子に等しいか又はそれ未満）を、マイクロ遠心分離管又は柔軟なＥＬＩＳＡプレートの列の全域に分配することにより細胞を感染させる。１０μｌの空腹か又は新鮮な高密度細胞（〜５  ｘ  １０７細胞）を加える。室温において１０−１５分間インキュベートする。
【００５７】
３．１５０μｌ（マイクロタイタープレートに関して）を１ｍｌ（マイクロ遠心分離管に関して）の０．２μｇ／ｍｌテトラサイクリン含有ＮＺＹに添加して混合することにより、テトラサイクリン耐性遺伝子を誘導する。３９℃において３０分間間欠的に振盪させる（又はＥＬＩＳＡプレートを軽くたたく）。１．５ｍｌのマイクロ遠心分離管を用いるなら、チューブをビーカーの中に逆さまに置き、そしてインキュベーター中で振盪する、簡単に言えば、開ける前にチューブをマイクロ遠心分離し、そしてピペッティングにより細胞を混合する。
【００５８】
４．柔軟なマイクロタイタープレート中の感染細胞を１５μｇ／ｍｌテトラサイクリン含有ＮＺＹにより希釈する。２０μｌの細胞を１８０μｌのＮＺＹ＋ｔｅｔと１：１０希釈のために混合して、１９８μｌのＮＺＹ＋ｔｅｔに２μｌを混合して１：１０００希釈する。
【００５９】
５．テトラサイクリン耐性形質導入ユニット（ＴＵ）の濃度を力価測定（ｔｉｔｅｒｉｎｇ）により測定する。未知サンプルの力価測定は、通常、その粒子／ｍｌ数が公知で以前に力価測定された陽性対照ファージを感染させた細胞と一緒に行なう。良好な陽性対照はＣｓＣｌ−精製ｆｄ−ｔｅｔ又はｆ８８−４ファージのストックである。ファージ希釈バッファーのみを処理した細胞は、希釈ファージサンプルと平行して、陰性対照として機能する。コロニーを数える際、１コロニー＝１ＴＵである。
【００６０】
６．プレート力価測定に関しては１００μｌの希釈感染細胞を、４０μｇ／ｍｌテトラサイクリンを含むＮＺＹ寒天プレート上にまく。希釈あたり１プレートをまく。プレートを倒置して３７℃にて一晩インキュベートする。
【００６１】
７．スポット力価測定に関しては、それらの蓋を斜めにして３７℃インキュベーター中でそれらをインキュベートすることにより乾燥したプレートを用いるか又は数時間フードを滅菌する。スポッティング前に、各スポット（プレートあたり１６まで）が行くプレートをマークする。各スポットの上に希釈されたファージ１５−２０μｌを注意深く打つ（ｄｏｔ）（これのためにはマルチチャンネルピペッターを使用できる）。寒天にドロップを吸収させて（スポットは平らになるべきである）、次にプレートを倒置して一晩３０℃においてインキュベートする。
【００６２】
８．コロニーのカウント（特にスポット力価測定から）には、テトラサイクリン耐性コロニーは小さいが見えるべきである。コロニーの過剰な成長を阻止するため、（１）夜に放置する前に３７℃インキュベーターの外にプレートを取り出し、一晩室温にて試験させ（ｓｉｔ）、そしてコロニーが良好な大きさになるまで翌日に３７℃にそれらを戻すか；又は（２）感染を夜遅く実施するなら、３０℃において一晩インキュベートして、翌日の早くに誰かにコロニーをチェックさせる。コロニーが最適なカウントサイズに達したら、カウントするまでそれらを４℃に保存するべきである。それらは、プレートがパラフィルムにより封印されるならば、数週間保存できる。（Ｂａｒｂａｓ，Ｆ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｈａｇｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ニューヨーク（２００１））。
【００６３】
大規模なファージの調製
１．全部の単一の感染コロニーを拾い、そして２２０μｌのＮＺＹ培地を含む１．５ｍｌのマイクロ遠心分離チューブにて各々を混合する。全てのチューブの内容物をプールして、５００ｍｌのＮＺＹ及び１５μｇ／ｍｌのテトラサイクリンを含む２つの２リットルフラスコに、希釈したプール細胞を接種する。激しく（〜２００ｒｐｍ）約２０時間３７℃において振盪する。
【００６４】
２．１００μｌ培養物を０．５ｍｌマイクロ遠心分離チューブに移し、そしてフルスピード（１４，０００ｒｐｍ）で２分間スピンすることにより細胞を沈殿させる。２０μｌのファージ含有上清を、５μｌの５Ｘ  Ｌｙｓｉｓ  Ｍｉｘ（Ｌｙｓｉｓ  Ｍｉｘを暖めてＳＤＳが溶液中にあることを確認する）を含む新らしい０．５ｍｌマイクロ遠心分離チューブに移し；ピペッティングにより混合する。チューブを７０℃水浴中で１５−２０分間インキュベートして軽くマイクロ遠心分離する。１５μｌのサンプルを４ｘ  ＧＢＢ中の０．８％アガロースゲルに負荷して、泳動させる。量のわかっているｆ８８．４ファージを対照として用いる（２  ｘ  １０１０ファージ粒子＝１００ｎｇ  ＤＮＡ）。このゲルを、上記の手法を続ける前（ファージ収量が良好であることを確認する；〜１０１２粒子／ｍｌ培養上清）か又は手法の終わりに（ＰＥＧ−精製ファージのパーセント収量を測定するため）泳動させる。
【００６５】
３．工程１からの培養物を４つの２５０ｍｌ遠心分離ボトルに分配する（〜２３０ｍｌ／ボトル）。２，４００ｇにおいて１０分間４℃にて遠心分離する。細胞の沈殿物を妨害しないように、ファージを含有する上清を新しいボトルに移し、そして６，２００ｇにて１０分間４℃において再度遠心分離する。上清を注意深く、きれいな、風袋を測った、２５０ｍｌ遠心分離ボトルに注ぎ、そして各ボトルの培養容量を測定する（１ｇ＝１ｍｌ）。
【００６６】
４．０．１５容のＰＥＧ／ＮａＣｌ溶液を測定上清の各ボトルに加える。スクリューキャップをきつく締めて、ゆっくりと約１００回ボトルを倒置することにより、徹底的に混合する。混合物を少なくとも約４時間氷上又は４℃で一晩インキュベートする。
【００６７】
５．６，２００ｇにおける４０分間４℃の遠心分離によりファージを沈殿させる。上清を捨てて、沈殿物を妨害しないように注意する。ボトルを再度軽く遠心分離することにより残りの上清を除去し、各ボトルを傾けることにより、沈殿物を残りの上清の向かい側にして、１ｍｌのピペッターにより吸引する。
【００６８】
６．７．５ｍｌのＴＢＳを各ボトルに加えて、１５０ｒｐｍにて３７℃インキュベーター中で約３０分間撹拌して沈殿物を懸濁する。軽く遠心分離することにより溶液を各ボトルの底に移動させる。各４つのボトルからの溶液を２つの風袋を測ったオークリッジチューブに移す。各ボトルを別の７．５ｍｌのＴＢＳにより洗浄して、オークリッジチューブに加える。各チューブは今３０ｍｌの全容量を有するであろう。チューブをＴＢＳでバランスをとり、倒置によりファージを徹底的に混合する。
【００６９】
７．チューブを１０，１００−２２，７００ｇにて１０分間４℃において遠心分離して、上清を透明にする。上清を新しくて風袋を測定したオークリッジチューブに移し、そして容量を測定する（１ｇ＝１ｍｌ）。
【００７０】
８．０．１５容のＰＥＧ／ＮａＣｌ溶液を各チューブに加えて、ゆっくりと約１００回倒置する。チューブを少なくとも１時間氷の上でインキュベートすることにより、ファージを沈殿させる。重い沈殿物が出現するはずである。
【００７１】
９．１０，１００ｇにて４０分間４℃において遠心分離することにより沈殿ファージを回収する。上記工程５のとおりに上清を除去する。
１０．１０ｍｌのＴＢＳを各チューブに加える。ゆっくりと渦巻き各般することにより、ファージ沈殿物を懸濁し、そして室温において約１時間かけて沈殿物を柔らかくさせる。再び渦巻き撹拌して、軽く遠心分離することにより、溶液をドライブダウンさせる。（ファージをさらにＣｓＣｌ密度勾配により精製するなら、５ｍｌのみのＴＢＳを各チューブに加えて、ファージを懸濁して、２つの上清を一つのオークリッジチューブ中で混合する。
【００７２】
１１．チューブを１０，１００−２２，７００ｇにて１０分間室温において遠心分離することにより上清を透明にさせる。各チューブからの透明になった上清を１５ｍｌのポリプロピレンスナップキャップチューブに注いで暗黒中で４℃において保存する。
【００７３】
１２．ファージ粒子の濃度と収量を測定するために、ファージのアリコートを５ｘ  Ｌｙｓｉｓ  Ｍａｘで処理する（工程２におけるとおり）。１−５−及び１０μｌのサンプルを１．２％アガロースゲル上で４ｘ  ＧＢＢ中で、標準として公知の量の同じ様式で処理したファージを用いて電気泳動する。最初の培養物の上清からのサンプルをげる上に含ませ（工程２）、パーセント収量を計算する。電気泳動分析もたった一つのＤＮＡ種が存在することを証明するために重要である；これは特にｆｄ−ｔｅｔ誘導体に関して重要であり、テトラサイクリン遺伝子を欠損させることができ、約６ｋｂのゲノムによりファージを生成する。ファージ粒子の濃度は分光光度分析によりもっと正確に評価することができる；しかしながら、これはＣＳＣｌ−精製されたファージに関して、より良好に実施される。ファージの感染特性（ＴＵ／ｍｌ）は力価測定により分析することができる；ｆｄ−ｔｅｔ誘導体の感染性は約２０粒子／ＴＵであり、野生型誘導体のそれは約１粒子／ｐｆｕである。
【００７４】
１３．ファージの最終濃度（それらをＣｓＣｌ精製しないならば）は約３  ｘ  １０１３／ｍＬを越えないべきであり、そうしてファージの濃度が分かったら、ＴＢＳによりそれに応じて調節すべきである。細胞の成長を妨害するため、上記溶液を最終濃度０．０２％（ｗ／ｖ）のアジ化ナトリウム又は２０ｍＭのＮａ２ＥＤＴＡに調節することができる。ファージは長期間５０％（ｖ／ｖ）滅菌グリセロール中で−１８℃において保存することができる。（Ｂａｒｂａｓ，Ｆ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｈａｇｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ニューヨーク（２００１））。
【００７５】
ＣｓＣｌ上のファージの精製
１．上記のファージの大規模な精製の後に、各調製物の最終容量は１０ｍｌのはずである。
【００７６】
２．４．８３ｇのＣｓＣｌを風袋測定した５０ｍｌビーカー中に測りとる。ビーカーを再度風袋測定して、懸濁したファージを加える。ＴＢＳを１０．７５ｇの最終重量に加える（容器とＣＳＣｌ：ファージに加えて＋ＴＢＳ＝１０．７５ｇ）。これは、１２ｍｌの１．３ｇ／ｍｌの密度の３１％（ｗ／ｗ）ＣｓＣｌ溶液を提供する。溶液の密度は、風袋測定したビーカー又はプラスチックカップ中で１ｍｌを秤量して、次にそれを元のビーカーに戻すことにより（その設定のピペットが１ｇの１ｍｌの水を秤量することを、最初に必ずチェックする）チェックすることができる。必要であれば、ＣｓＣｌ又はバッファーにより密度を１．３ｇ／ｍｌに調製する。
【００７７】
３．各ビーカーの容量をポリアロマーチューブに移す。チューブがトップまで満たされていることを確認し（遠心分離の間につぶれる）、必要であれば、超過容量の３１％（ｗ／ｗ）ＣｓＣｌのＴＢＳ溶液を加える。溶液を一方から他方に移すか又はＣｓＣｌ溶液を一つのチューブに加えることによりチューブのバランスをとる。チューブをＳＷ４０スイングバケットローターに入れて、３７，０００ｒｐｍにて４８時間５℃において遠心分離する。７０．０  Ｔｉローターに関しては、５８，０００ｒｐｍにて２０時間スピンさせる。
【００７８】
４．ローターからチューブを注意深く抜いて、ラックに置き、そしてそれらをクランプスタンドにて１回に一つセットアップさせる。クランプされたチューブを強い可視光源により上部から照射する（例えば、ハロゲンデスクランプ）。チューブの上部に向かって２つのバンドが存在することになる。ファージのバンドは、弱くて、青っぽく、そして均質（くすんだ外観）になり、狭くて、糸を引く、羊毛のような、不透明な白色のバンド（おそらくはＰＥＧ）のちょうど上に見えるはずである。良好なファージ調製物においては、ファージバンドが５ｍｍの幅であって、その強度は約１．３３ｇ／ｍｌである。
【００７９】
５．滅菌ピペットチップを吸引クランプに結合させて、吸引機を中間速度に設定する。ピペットチップをメニスカスに保って、ファージバンドを覆う液体を上部の縁の２ｍｍ内まで吸引し、ファージバンドを妨害しないように注意する。ポリエチレン製運搬ピペット（好ましくは滅菌）又はさらに良好には、蠕動ポンプを備えた滅菌ガラス製運搬ピペットによりファージバンドを捨てる。ファージバンドは粘性がある：下に隠れている羊毛のようなバンドを避けるように試みる。ＣｓＣｌ精製プラスミドに関するように、迅速に密封されるポリアロマーチューブを用いるなら、バンドをシリンジにより除去する。
【００８０】
６．抽出されたファージバンドを、ベックマン６０  Ｔｉローター用の２６ｍｌのスクリューキャップポリカーボネート遠心分離チューブに移す。４−６のファージバンドが単一のボトル中でプールされ得る。チューブの肩までＴＢＳを満たし、キャップをきつく締めて、繰返し倒置して混合する。遠心分離に関しては、水を満たした別のチューブに対してバランスをとる。
【００８１】
７．ベックマン６０  Ｔｉ固定角度ローター中でチューブを５０，０００ｒｐｍにて４時間遠心分離してファージを沈殿させる。上清を流して捨て、沈殿物を軽く低速で卓上遠心分離機上で遠心分離し、そして残った上清を捨て、沈殿物を液体から離して向ける（ｐｏｉｎｔｅｄ ａｗａｙ）。
【００８２】
８．沈殿物を１０ｍｌのＴＢＳに懸濁する；ゆっくりと渦巻き撹拌して、軽く卓上遠心分離機上中で遠心分離することにより、溶液を下に向け、そして沈殿物を一晩４℃において柔らかくする。渦巻き撹拌して沈殿物を溶解する。
【００８３】
９．ＴＢＳをボトルの上部まで満たして、サイド遠心分離してファージを沈殿させ、そして上清を工程７におけるとおりに除去する。（注：この工程は任意であり、いくらか純粋なファージを提供する）。
【００８４】
１０．１２ｍｌのＴＢＳを開始培養物のリッター均等あたり用いて、工程９におけるとおりに沈殿物をＴＢＳに懸濁する；これは期待された濃度の３  ｘ  １０１３ウイルス粒子／ｍｌを提供する。ファージを滅菌オークリッジチューブに移して、６，５００ｇにて１０分間遠心分離する。
【００８５】
１１．ファージ含有上清を１５ｍｌのポリプロピレンスナップキャップチューブに移す。この点にて、アジ化ナトリウムを保存剤として最終濃度０．０２％（ｗ／ｗ）まで加える。あるいは、Ｎａ２ＥＤＴＡを最終濃度２０ｍＭまで加えることができる。
【００８６】
１２．分光光度分析及び／又はアガロースゲル電気泳動によりファージ粒子の濃度を測定する。
１３．ＴＢＳ／ゼラチン中でファージを１０−７、１０−８及び１０−９に希釈して力価測定する。正確な陰性及び陽性の対照を含ませる。良好な感染力価（ＴＵ／ｍｌ）は、有形の粒子の濃度の約５％である（ウイルス粒子／ｍｌ）。
【００８７】
１４．ファージを４℃において光から離して保存するか又は長期間の保存には５０％のグリセロール中において−１８℃において保存する。これらの条件下で、力価は少なくとも数年安定である。（Ｂａｒｂａｓ，Ｆ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｈａｇｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ニューヨーク（２００１））。
【００８８】
（ｂ）同一ファージカラムの調製
架橋結合。１容のファージを（段落中の全ての以後の容量はこの容量に対する）水中の１．２６ｍＭ  ｐＶＩＩＩサブユニットに相当する濃度において０．１５容の０．５Ｍ  ＮａＣｌ及び０．１５容の１Ｍ  ＮａＨ２ＰＯ４（ＮａＯＨによりｐＨを６．９に調整）と混合する。この溶液に、０．００２６溶液の７６．３ｍｇ／ｍｌのＮＨＳ−デキストランを加える。すぐに、反応混合物を渦巻き撹拌により混合し、０．１５溶液の５０％  ＰＥＧを加え、そして再び渦巻き撹拌する。ファージはＰＥＧ溶液中で沈殿する（最終濃度５０％）。反応混合物を１２−１６時間密封されたチューブ中で室温において回転させ、そして未反応のＮ−ヒドロキシ−サクシニミドを８溶の１Ｍ  エタノールアミン（ＨＣｌによりｐＨを９に調整）及び０．８９溶の５Ｍ  ＮａＣｌの添加によりクエンチする。室温において１−２時間さらに回転を続ける。ＴＢＳ中の架橋結合ファージを希釈して（少なくとも約１０倍）、遠心分離、吸引及び上清のデカントにより５−６回洗浄し、そして新鮮なＴＢＳに沈殿物を懸濁する。最終沈殿物を１０溶のＴＢＳに懸濁して４℃に保存する。
【００８９】
カラムの調製。２つの０．５ｍｌカラム（アマシャムファルマシアバイオテック、ＨＲ  ５／２，コード  １８−０３８２−０１）に、それぞれ、約２  ｘ  １０１３粒子に相当する架橋結合したファージを詰める。ＨＰＬＣシステムのカラムをＴＢＳで平衡化する（他のカラム又は非カラムのバッチ法も適する）。
【００９０】
サンプルの調製。結合した蛋白質及び他の種を解離させるため、及び蛋白質の相互作用を最小にするため、初期ヒトＣＳＦサンプル１及び２のアガロース（１．５ｍｌ）を最終濃度３ＭグアニジンＨＣｌ及び０．２Ｍギ酸に作成して、氷上で６０分間インキュベートする。次に、ＨｉＴｒａｐ脱塩カラム（アマシャムファルマシアバイオテック）をＨＰＬＣシステム上で５ｍｌ／分の流速にてリン酸緩衝塩溶液（ＰＢＳ）と共に用いてバッファー交換し、そして最終容量２ｍｌに回収される。低分子量のフロースルーはＳｅｐＰａｋカラムを通過させて、ＰＢＳで洗浄することにより、所望であれば追加の分析のためのペプチドを単離する。初期サンプル中の蛋白質の解離を保存するなら、次にグアニジンＨＣｌとギ酸の添加を省き、そして次の工程の前にＰＢＳでＣＳＦアリコートを１：２希釈する。
【００９１】
（ｃ）捕捉工程２（図５）
ファージカラムにより捕捉されたサンプル特異的（ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ）蛋白質。１．５ｍｌのサンプル１及び２を、ＨＰＬＣカラム上のＴＢＳ中の専用の架橋結合ファージカラムを流速２０μｌ／分にて通過させる。フロースルーを保存するが、消耗した蛋白質サンプルであり、且つ次のサイクルにおいて使用される。カラムを２０ｍｌのＴＢＳで流速０．５ｍｌ／分において洗浄する。
工程ＩＩＩ：異なる蛋白質の定量と同定（図６）
ファージ親和性カラムを用いた特異的蛋白質の単離。カラムからの結合蛋白質を１ｍｌのＰａｎｎｉｎｇ溶出バッファー（グリシンによりｐＨを２．２に調整した０．１Ｍ  ＨＣｌ）により流速０．５ｍｌ／分にて溶出して、１００μｌの画分を回収する。画分をプールして、約１４０μｌのＴｒｉｓ塩基により中和する。ｐＨ７．０−８．２の溶液を生じるように、ｐＨが上がったことを確認する。
【００９２】
（ａ）カチオン交換／逆相カチオン及びエレクトロスプレー質量測定分析による分析
蛋白質のペプチドへの消化。上で調製されたサンプルを凍結乾燥し、そして８Ｍ尿素、２００ｍＭ  ＮＨ４ＨＣＯ３，及び２０ｍＭ  ＣａＣｌ２中に再度溶解して、ブラッドフォードアッセイを用いて定量する。エンドプロテアーゼＬｙｓ−Ｃ（ベーリンガー−マンハイム）を最終基質対酵素比１００：１に希釈し、そして３７℃において１５時間インキュベートする。Ｌｙｓ−Ｃ消化を水で４倍に希釈して、修飾されたトリプシン（ベーリンガー−マンハイム）を最終基質対酵素比５０：１にて加える。トリプシン消化混合物を３７℃において１５時間インキュベートする。逆相カチオン上のペプチド混合物を脱塩し、凍結乾燥し、そして５ｍＭ  Ｋ２ＨＰＯ４、５％アセトニトリル（ｐＨ３）中に懸濁する（他の化学薬品及び酵素の消化法も適している）。
【００９３】
（ｂ）ペプチドの２Ｄクロマトグラフィー分離
二相性マイクロキャピラリーカチオン。融合シリカキャピラリー（１００μｍ  ｉ．ｄ．ｘ  ３６５μｍ  ｏ．ｄ．）をＣＯ２−に基づくレーザープラーで引くことによりフリットのないカチオンを作成することにより、二相カチオンを構築する。カチオンに最初に８ｃｍの５μｍ  Ｃ１８  ＲＰ粒子（２１８ＴＰ  Ｃ１８  Ｖｙｄａｃ）、そして次に４ｃｍの５μｍ強カチオン交換粒子（ＰｏｌｙＳＵＬＦＯＥＴＨＹＬ  アスパルタミド；ポリＬＣ）を詰める。
【００９４】
ペプチドの分離。ペプチド混合物を二相マイクロキャピラリーカチオン上に負荷する。以下の塩段階勾配を用いてＳＣＸからＲＰ粒子にペプチド画分を置き換える：（１）０％（１’）０％（１”），０％（１”’）０％（２）０−１０％（３）１０−２０％（４）２０−３０％（５）３０−４０％（６）４０−１００％のＳＣＸ−Ｂ’、及び（７）１００％のＳＣＸ−Ｃ”。ＲＰ粒子からペプチドを質量測定分析計へ、０−６０％  ＲＰ−Ｂの直線勾配を用いて３０分かけて３００ｎｌ／分にて溶出する。移動相のバッファーは、ＲＰ−Ａバッファーに関して、０．５％酢酸、５％アセトニトリル；ＲＰ−Ｂに関しては、０．５％酢酸、８０％アセトニトリル、２５０ｍＭ  ＫＣｌ；ＲＰ−Ｃ’に関しては、０．５％酢酸、５％アセトニトリル、５００ｍＭ  ＫＣｌ（他の分離方法も適している）である。
【００９５】
質量測定分析。Ｆｉｎｎｉｇａｎ  ＬＣＱイオントラップ質量測定分析計（Ｆｉｎｎｉｇａｎ社、サンホセ、ＣＡ）上で質量測定分析を実施する。インテグラルクロマトグラフィーワークステーション（ＰＥバイオシステムズ、フォスターシティ、ＣＡ）を、エレクトロスプレーイオン源を備えたＬＣＱイオントラップ質量測定分析計にカップリングさせる。エレクトロスプレー針を５．５ｋＶの電位差にて操作して、加熱した脱溶媒化（ｄｅｓｏｌｖａｔｉｏｎ）キャピラリーを２５０℃に保つ。
【００９６】
質量測定分析及びエレクトロスプレー質量測定分析による配列決定による同定と定量。自動化されたスペクトル及びデータの分析のために、各未加工の一列のスペクトルを、本明細書に記載されたとおりに処理する。最初に、単一か又は複数の荷電した親イオンに由来するスペクトルを同定する。処理された一列の質量スペクトルを、ＤＥＣアルファワークステーション上で稼働するプログラムＳＥＱＵＥＳＴを用いて標準のＯＲＦｓに相関させる。用いられたプロテアーゼを考慮せずに全ての検索を実施するが、混合物中の多くの蛋白質は完全に消化されないからである。複数の荷電したペプチドに関しては、以下の基準を用いることにより、＋２か＋３の荷電状態を選択することを決定する：（１）交差相関スコアが他の荷電状態のそれより１Ｕ大きいよりも大きいか又は等しいなら、特定の荷電状態を選択する。（２）スコアを各荷電状態に指定する（トリプシン開始に関して＋５，トリプシン終了に関して＋５，交差相関スコアが他の荷電状態より大きいなら＋２，予備スコアランキングが５０より低いなら＋２，そして最も高いスコアの荷電状態が選択される）。最後の蛋白質同定分析においてペプチドの選択された電荷及び捨てられた他の電荷状態からのＳＥＱＵＥＳＴ出力を使用する。各スペクトルに関して、交差相関スコアの値及び適合した配列を用いて、相関結果を濾過する。単一荷電ペプチドに関しては、交差相関スコアを伴うスペクトルを、１．５より大きいか又は等しいトリプシン性ペプチドに保持する。複数荷電ペプチドに関しては、交差相関を伴うスペクトルを、２より大きいか又は等しいトリプシン性ペプチドに保持する。さらなる考慮からこれらの基準に合わない交差相関を伴う全てのスペクトルを除去する。蛋白質の同定のため、濾過した結果を分類して、ゲノム中の同じ注釈を付けられたＯＲＦｓ由来の唯一のペプチド配列を示す。一つ又はそれ以上の唯一のトリプシン性ペプチドに相関する質量スペクトルに基づく蛋白質の同定は、有効な同定とみなす。単独で蛋白質を同定するペプチドは、以下の基準に適合させた後に、手動により有効である。第１に、ＳＥＱＵＥＳＴ交差相関スコアは、＋１トリプシン性ペプチドに関して１．５より大きいか、又は＋２又は＋３トリプシン性ペプチドに関しては２より大きくなければならない。第２に、ＭＳ／ＭＳスペクトルはベースラインノイズを明らかに上回る断片イオンを伴う良質でなければならない。第３に、ｂ又はｙイオンシリーズに対して同じ連続性がなければならない。第４に、プロリン残基に相当するｙイオンは強烈なイオンであるべきである。第５に、未同定の強烈な断片イオンは＋２断片イオンか又は上記ペプチドの末端の一方からの一つ又は二つのアミノ酸の損失のいずれかに相当する。このプロセスを全部行なった後に、蛋白質の同定を公正に確信することができる。サンプル１と２に共通の蛋白質に関しては、おおよその相対的な豊富な比がＦｉｎｎｉｇａｎ  ＬＣＱＵＡＮソフトウエア及び分子イオンのピーク高を用いて測定できる（Ｌｉｎｋ，Ａ．Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｄｉｒｅｃｔ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ  Ｕｓｉｎｇ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉ���ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １７：６７６−６８２（１９９９））。
【００９７】
工程ＩＶ：特異的蛋白質に対する親和性試薬の単離
図７に示すとおりにフロースルーファージをプールする。ファージを増幅し、ファージ親和性マトリックス及びファージカラムを用意し、そして上記工程ＩＩ（ａ）−（ｃ）において記載されたおとりに特異的蛋白質を捕捉する。工程ＩＩＩ（即ち、特異的蛋白質の定量及び同定を含む工程）において同定された蛋白質の数は、試験されることが必要な違うファージクローンの数を導く。
【００９８】
同定された蛋白質に対するファージクローン特異性の特定は、以下のとおりに実施する：
１．捕捉された蛋白質をファージ親和性カラムを用いて単離する。結合した蛋白質は、カラムから、１ｍｌのＰａｎｎｉｎｇ溶出バッファー（グリシンによりｐＨ２．２に調節した０．１Ｍ  ＨＣｌ）を用いて、０．５ｍｌ／分の流速にて溶出して、１００μｌ画分を回収する。画分をプールして、約１４０μｌの１Ｍ  Ｔｒｉｓ塩基、ｐＨ９．１により中和する。ｐＨ７．０−８．２の溶液を生じさせるようにｐＨが上昇したことを確認する。
【００９９】
２．溶出した蛋白質の同定。溶出した蛋白質は、上記工程ＩＩＩに記載されたとおりにＬＣＱ質量測定分析計を用いて同定し、そして図６に例示されるが、主要な成分は単一の蛋白質であるべきなので、サンプルは装置に直接スプレーできる。
【０１００】
３．ファージクローンの同定された蛋白質への特定。特定のファージクローンの、捕捉する蛋白質の同定との関連は、その特異性が定義されるのを可能にさせる。当該ファージは、蛋白質に対する特定の親和性試薬を提供して、必要なら、ペプチド又は抗体の同定が決定されることにより、よく確立された方法により、高純度のペプチド又は抗体の生産を可能にさせる。同じ蛋白質に結合する複数の別のファージクローンを単離してよい。それらの親和性はそれらの有用性を決定するかもしれない。
【０１０１】
工程Ｖ：最も豊富な蛋白質の消耗（図８）
上記の工程Ｉ（ａ）及び（ｂ）に記載されたとおりに、蛋白質親和性マトリックスを用意して、初期捕捉工程を実施する。図２に示されたとおりに、結合したファージを、１ｍｌのＰａｎｎｉｎｇ溶出バッファー（グリシンによりｐＨ２．２に調節した０．１Ｍ  ＨＣｌ）により流速０．５ｍｌ／分において溶出して、画分を回収する。ファージを含む画分をプールし、ＨｉＴｒａｐ脱塩カラム（アマシャムファルマシアバイオテック）を用いてＨＰＬＣシステム上で流速５ｍｌ／分にて、ＴＢＳとバッファー交換し、そして約１ｍｌの最終容量を回収する。
【０１０２】
ファージカラムにより捕捉される最も豊富な蛋白質。カラム１及び２からの溶出ファージをプールする。ファージを増幅し、ファージ親和性マトリックス及びファージカラムを用意して、上記工程ＩＩ（ａ）−（ｃ）において記載された手法を用いて特異的蛋白質を捕捉する。１．５ｍｌのサンプル１及び２をＨＰＬＣ上のＴＢＳ中の専用の架橋結合ファージカラムに、流速２０μｌ／分にて通過させる。フロースルーを残しておくが、消耗した蛋白質サンプルであって、次のサイクルに使用される（図９）。カラムを２０ｍｌのＴＢＳで０．５ｍｌ／分の流速にて洗浄する。
【０１０３】
ファージ親和性カラムを用いた特異的蛋白質の単離。結合した蛋白質は、１ｍｌのＰａｎｎｉｎｇ溶出バッファー（グリシンによりｐＨ２．２に調節した０．１Ｍ  ＨＣｌ）により流速０．５ｍｌ／分において溶出して、１００μｌ画分を回収する。画分をプールし、約１４０μｌの１Ｍ  Ｔｒｉｓ塩基、ｐＨ９．１により中和する。ｐＨ７．０−８．２の溶液を生じさせるようにｐＨが上昇したことを確認する。溶出した蛋白質は必要ならばさらに精製し、さらなる構造研究及び機能研究のための「天然」物質の非常に貴重な源になり得て、ＤＰＣＰから単離された特定の親和性試薬を用いた免疫親和性に基づいたアッセイの開発の基準を提供することを含む。
【０１０４】
工程ＶＩ．豊富ではない蛋白質による新規なサイクル
消耗した蛋白質サンプルである工程Ｖからのフロースルーをも用いて、上記のサイクルを繰り返す（図９）。
【０１０５】
工程ＶＩＩ．豊富な蛋白質の消耗の継続
分析装置の消耗の限界に達するまで、工程Ｖ及びＶＩを連続して繰り返すことができる。
【０１０６】
他の態様
本発明は好ましい態様に関して記載されてきたが、当業者は、その本質的な特徴を容易に確かめることができ、そして発明の精神及び範囲から逸脱することなく、様々な用途及び条件にそれを適合させるために発明の様々な変化及び修飾をなすことができる。当業者は、日常の実験を超えるものを用いることなく、本明細書に記載された発明の特定の態様の多数の均等物を認識又は確認することができる。そのような均等物は本発明の範囲に包含されることを意図する。
【０１０７】
この明細書中において言及された全ての刊行物及び特許は引用により本明細書に編入される。
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は、２つの異なる生物学上のサンプルからの蛋白質親和性マトリックスの用意を示す模式的図面である。
【図２】
図２は、蛋白質親和性マトリックスによるファージの初期捕捉を示す模式的図面である。
【図３】
図３は、第１親和性カラムにより捕捉されたファージを次に第２カラムにおいて稼働させる次の捕捉工程、そのまた逆を示す模式的図面である。
【図４】
図４は、フロースルーファージをプールして増幅することによる、ファージ親和性マトリックスのセットの用意を示す模式的図面である。
【図５】
図５は、２つの異なる個体からの複合生物学サンプルをファージ親和性マトリックス／カラムのセットを通過させる第３捕捉工程を示す模式的図面である。
【図６】
図６は、ファージ親和性カラムに結合した蛋白質を溶出して質量分析により蛋白質を分析することにより２つの異なる複合生物学サンプルの間で異なる蛋白質の同定を示す模式的図面である。
【図７】
図７は、２つの複合生物学サンプルの間で異なる蛋白質に対する親和性試薬の単離を示す模式的図面である。
【図８】
図８は、２つの複合生物学サンプル内でもっとも豊富な蛋白質の消耗のサイクルを示す模式的図面である。
【図９】
図９は、対の複合生物学サンプルからの豊富な蛋白質の消耗に続く、豊富でない蛋白質の捕捉を示す模式的図面である。
【図１０】
図１−９に示された特異的ファージ捕捉プロテオミクスのプロセスを要約した模式的図面である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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