(57)【要約】本発明は、つぎの工程を包含する抗体調製方法を対象とする：ａ）ある細胞株の細胞表面に発現されるべき関心対象ポリペプチドをコードする関心対象核酸配列を含む核酸構築物によるその細胞株のトランスフェクション、ｂ）工程（ａ）で調製した細胞またはそれらの膜を用いての、関心対象ポリペプチドに対する抗体の調製。【特許請求の範囲】
【請求項１】
つぎの工程を包含する抗体の調製方法：
ａ）同一リーディングフレーム内に、膜たんぱく質をコードする核酸配列と関心対象ポリペプチドをコードする核酸配列とを含む核酸構築物によるある細胞株のトランスフェクション、
ｂ）工程（ａ）で調製した細胞またはそれらの膜を用いての、前記関心対象ポリペプチドに対する抗体の調製。
【請求項２】
前記工程（ａ）でトランスフェクトされた細胞株が免疫系の株、好ましくはリンパ系の株であることを特徴とする請求項１の方法。
【請求項３】
前記工程（ａ）でトランスフェクトされた細胞株がＢリンパ球との融合のための株として役立ちうることを特徴とする請求項２の方法。
【請求項４】
前記工程（ｂ）での抗体の調製が、
（ｉ）前記工程（ａ）で調製され、トランスフェクトされ、表面に関心の対象であるポリペプチドを発現する細胞またはそれらの膜を用いての動物の免疫化、
（ｉｉ）前記工程（ａ）で調製され、トランスフェクトされ、表面に関心の対象であるポリペプチドを発現する細胞またはそれらの膜と抗体を産生できる細胞を含む細胞集団との接触
によって得られたＢ細胞に基づいて実施されることを特徴とする請求項１〜３のいずれかの方法。
【請求項５】
前記工程（ａ）でトランスフェクトされた細胞株が前記（ｉ）で免疫化される動物または前記（ｉｉ）で使用される細胞と組織適合性であることを特徴とする請求項４の方法。
【請求項６】
前記関心対象の核酸配列が、前記関心対象ポリペプチドの高発現およびそれの前記トランスフェクトされた細胞の表面への運搬を可能にする調節配列の制御下におかれていることを特徴とする請求項１〜４のいずれかの方法。
【請求項７】
膜たんぱく質をコードする前記核酸配列および前記関心対象核酸配列がともに前記関心対象ポリペプチドの高発現およびそれの前記トランスフェクトされた細胞の表面への運搬を可能にする調節配列の制御下におかれていることを特徴とする請求項１〜４のいずれかの方法。
【請求項８】
前記関心対象の核酸配列が、膜たんぱく質をコードする前記核酸配列の前、後または中に配置されていることを特徴とする請求項１〜７のいずれかの方法。
【請求項９】
膜たんぱく質をコードする前記核酸配列および関心対象ポリペプチドをコードする前記核酸配列が１つまたは同一または異なるいくつかの連結核酸配列によって連結されていることを特徴とする請求項１〜８のいずれかの方法。
【請求項１０】
前記連結核酸配列の１つが免疫応答に関与するポリペプチドをコードしていることを特徴とする請求項９の方法。
【請求項１１】
前記工程（ａ）で細胞株をトランスフェクトするのに使用される前記核酸構築物が、選択遺伝子、たとえば抗生物質耐性遺伝子を含んでいることを特徴とする請求項１〜１０のいずれかの方法。
【請求項１２】
前記工程（ａ）で細胞株をトランスフェクトするのに使用される前記核酸構築物が、前記工程（ａ）でトランスフェクトされた株の細胞に適合した核酸ベクターであることを特徴とする先行請求項のいずれかの方法。
【請求項１３】
前記トランスフェクトされた細胞株が、抗体調製のために前記の（ｉ）または（ｉｉ）で使用される細胞と同一（自家）、同系または同種であることを特徴とする請求項１〜１２のいずれかの方法。
【請求項１４】
前記細胞株のトランスフェクションののち、トランスフェクタントを、前記膜たんぱく質または関心対象ポリペプチドの発現について分析することを特徴とする先行請求項のいずれかの方法。
【請求項１５】
前記工程（ｂ）において、前記工程（ａ）で調製された、その表面に前記関心対象ポリペプチドを発現するトランスフェクトされた細胞またはそれらの膜を投与された動物の細胞から、細胞融合手法により、モノクローナル抗体を調製することを特徴とする先行請求項のいずれかの方法。
【請求項１６】
前記工程（ｂ）が、
−前記関心対象ポリペプチドに対する抗体を産生するＢ細胞からの、該抗体の鎖の各々をコードする核酸配列の単離、
−それら核酸配列の宿主での発現
を包含することを特徴とする請求項１〜１４のいずれかの方法。
【請求項１７】
前記工程（ｂ）のあとに、得られた抗体を
−前記工程（ａ）でトランスフェクトされた株の細胞および／または
−前記工程（ａ）で用いたものと同じ、ただし関心対象の核酸配列をもたない核酸構築物でトランスフェクトされた細胞
と接触させることにより前記抗体の関心対象ポリペプチド認識能を検定することを特徴とする先行請求項のいずれかの方法。
【請求項１８】
同一リーディングフレーム内に、膜たんぱく質をコードする核酸配列と関心対象ポリペプチドをコードする関心対象核酸配列とを含む核酸構築物が導入された細胞。
【請求項１９】
請求項１８に記載された細胞または該細胞の膜を含有する組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗体、とりわけモノクローナル抗体の調製および有利には選択のための抗原提示方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ハイブリドーマによって産生されるモノクローナル抗体は、いくつもの著作物において網羅的に記述されている様々な関心を抱かせるものである（バザン（Ｂａｚｉｎ）著「ラットハイブリドーマとラットモノクローナル抗体」、ＣＲＣプレス、１９９０年、５１５頁；ゴーディング（Ｇｏｄｉｎｇ）著「モノクローナル抗体：原理と実際」、第３版、アカデミックプレス、１９９６年、４９２頁；シェパード（Ｓｈｅｐｈｅｒｄ）とディーン（Ｄｅａｎ）著「モノクローナル抗体」、オックスフォード大学出版部、２０００年、４７９頁；）。これらの抗体は、診断にも予防および／または治療にも、使用するのに有効である。本発明は、より広義には、インビボ（生体内）ならびにインビトロ（試験管内）での免疫に関するものである。
【０００３】
免疫応答は常に、１つまたは複数のエピトープをもつ天然または人工の分子あるいは少なくとも１つのキャリヤー分子に結合された１つまたは複数のハプテンであってもよいなんらかの物質に向けられる。抗原製剤には、アジュバントを添加することができる。以下「抗原」とも呼ぶこの抗原製剤は、免疫学の教科書の正統的定義に一致するものである。本発明の枠内で考慮の対象となる免疫応答は、免疫学の教科書に記載されている細胞、とりわけ抗体の合成に導く細胞に関するものである。
【０００４】
ある抗原決定基に対するモノクローナル抗体は、骨髄腫細胞と免疫された動物のリンパ系細胞との細胞融合技術が導入されてから、多くの研究室によって生産されている。ケーラー（Ｋｏｅｈｌｅｒ）とミルスタイン（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ）（１９７５年、ネイチャー、２５６巻、第４９５頁）によって開発されたモノクローナル抗体分泌性ハイブリドーマの最初のモデルは、マウスのモデルであった。このモデルはラットという種に拡張され（ガルフレ（Ｇａｌｆｒｅ）ら、１９７９年、２７７，１３１）、現在では広く用いられている。
【０００５】
しかしながら、融合技術以外に、モノクローナル抗体の取得は、使用する免疫法および関心のあるハイブリッドの間違いのない選別にとくに依存する。動物の生体を免疫するのに、それらの細胞のいくつかを選択し、抗原とともに培養するに際して、インビボとインビトロの２つの大きいタイプを区別できる。
【０００６】
また、３つの免疫手法を区別できる：ｉ）精製した関心の対象である抗原による免疫、ｉｉ）関心の対象である抗原を提示する細胞による免疫、ｉｉｉ）関心の対象である抗原をコードする遺伝子を発現するＤＮＡ配列（プラスミド）を投与することからなるＤＮＡ免疫。これら３つの場合に、抗原に対する抗体産生に導く免疫反応は、天然抗原を特異的に認識するＢリンパ球および、より多くの場合、分解され、ペプチドの形で、前記抗原提示細胞の主要組織適合複合体分子によって提示される抗原を特異的に認識するＴリンパ球の同時活性化を必要とする。
【０００７】
それらの異なる様式での通常型の免疫は、インビトロでの免疫はより最近のものではあるが、約１世紀前から記載されており、たとえば、マウスでのミシェル（Ｍｉｓｈｅｌｌ）とダットン（Ｄｕｔｔｏｎ）が記載している技術またはヒトでのいくつかのグループのそれを引用することができる。
【０００８】
蛋白質による免疫には、抗原の前もっての精製または天然たんぱく質の立体配座特性および転写後特性を常に示すとは限らない組換え形態でのそれの生産が必要である。
【０００９】
細胞による免疫には、主要な難点として、産生される抗体が多種にわたり、それらが関心の対象である蛋白質だけでなく、細胞により提示された他の抗原の多くをも認識し、このために得られたモノクローナル抗体のキャラクタリゼーションが困難になるということがある。
【００１０】
最後に、前記のむきだしのＤＮＡ法による免疫は、すでに成功裏に採用されているが（コスタリオガ（Ｃｏｓｔａｇｌｉｏｇａ）ら、ジャーナル・オブ・イムノロジー、１９９８年、１６０、１４５８−１４６５）、得られる免疫応答の規模という面に限られている。実際、これらの方法は、抗原たんぱく質をコードする遺伝子が免疫対象動物の宿主細胞中で発現されること、および、このたんぱく質が引続き該宿主細胞の表面に提示されるか、またはそれらによって分泌されることを必要とする。さらに、これらの方法では、得られたクローンを選別することができない。
【００１１】
これらの情報は、ラット、マウスおよび正常なまたは遺伝子導入技法によって修飾された体液性または細胞性の免疫応答を示しうる他のすべての種などの動物の通常の免疫にあてはまる。それらは、インビボの免疫について、またインビトロの免疫についてさえ、言えることである。
【００１２】
モノクローナル抗体は、マウスにおいて、これを、トランスフェクトされ、それらの膜上に関心の対象である抗原を発現している自己または同種非免疫マウスの系統で免疫することによって、得ることができている（パーマー（Ｐａｌｍｅｒ）Ｄ．，ケヴァニー（Ｋｅｖａｎｙ）Ｍ．，マックワース−ヤング（Ｍａｃｋｗｏｒｔｈ−Ｙｏｕｎｇ）Ｃ．，バチェラー（Ｂａｔｃｈｅｌｏｒ）Ｒ．，ロンバルディ（Ｌｏｍｂａｒｄｉ）Ｇ．，レチラー（Ｌｅｃｈｌｅｒ）Ｒ．「ヒトおよびマウスクラスＩＩ主要組織適合二量体を発現するＬ細胞トランスフェクタントを用いてのＨＬＡ−ＤＲ特異性モノクローナル抗体の産生およびキャラクタリゼーション」。イムノジェネティックス３３（１）：１２−１７．１９９１。テュロー（Ｔｈｕｒａｕ）ＳＲ．，ワイルドナー（Ｗｉｌｄｎｅｒ）Ｇ．，クオン（Ｋｕｏｎ）Ｗ．，ワイス（Ｗｅｉｓｓ）ＥＨ，リトゥムラー（Ｒｉｔｈｕｍｕｌｌｅｒ）Ｇ．高トランスフェクションレシピエントＰ８１５におけるＨＬＡ−Ｂ２７の発現と免疫原性：ＨＬＡ−Ｂ２７に対するモノクローナル抗体の新規誘導法。ティシュー・アンティジェン３３（５）：５１１−５１９．１９８９）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明は、きわめて特異的な免疫応答を容易に得て、形成された抗体を容易に選別することのできる新規な免疫方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
この目的は、つぎの工程を包含する抗体調製法によって達成される：
ａ）ある細胞株の細胞表面に発現されるべき関心の対象であるポリペプチドをコードする関心の対象となる核酸配列を含む核酸構築物による該細胞株のトランスフェクション、
ｂ）工程（ａ）で調製した細胞またはそれらの膜を用いての、関心の対象であるポリペプチドに対する抗体の調製。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本発明の範囲内で、「膜」なる語は、当業者には既知の手法に従って得られる無損傷細胞膜およびそれらの断片を区別なく指すものとする。
【００１６】
本発明の方法に使用される細胞は、不死の系統であってもよいが、寿命の長い細胞、たとえば線維芽細胞であってもよい。
【００１７】
好ましい一実施態様に従えば、トランスフェクション工程（ａ）で使用する細胞株（系統）は、免疫系の細胞株、たとえばリンパ系細胞株である。
【００１８】
これら免疫系細胞の選択は、本発明方法にとって決定的役割を果たす。それらは、抗体産生に導く免疫反応が生起するリンパ器官に必然的に定着できるものだからである。他方、免疫に使用されるこのトランスフェクトされた細胞株は、トランスフェクトされた細胞株によって発現された抗原に対する抗体を産生して、表面に発現するＢリンパ球との融合のための細胞株としても役立ちうる。かくして、本発明の方法に従えば、２つのタイプの細胞間の接近が有利に得られ、それにより融合歩留まりが向上する。
【００１９】
抗体は、工程（ｂ）で、当業者には既知の免疫化または分子生物学のあらゆる方法によって調製し、ついで選択することができる。有利には、工程（ｂ）はつぎにより実施する：
（ｉ）工程（ａ）で調製され、トランスフェクトされ、表面に関心対象ポリペプチドを発現する細胞またはそれらの膜を用いての動物の免疫化、
（ｉｉ）工程（ａ）で調製され、トランスフェクトされ、表面に関心対象ポリペプチドを発現する細胞またはそれらの膜と抗体を産生できる細胞を含む細胞集団との接触。
【００２０】
抗体を産生できる細胞とは、抗体を実際に産生するすべての細胞ならびにそれらの構築および産生に必要な機構を有しているが、たとえば単に未熟な発育段階にあるというだけで、それらを産生しないすべての細胞を意味する。
【００２１】
本発明は、とりわけ、工程（ａ）でトランスフェクトされた細胞株が（ｉ）で免疫化された細胞株または（ｉｉ）で使用する細胞と組織適合性である場合の抗体調製法に関する。
【００２２】
本発明の方法は、言うまでもなく哺乳動物などの、抗体を産生できるすべての動物を用いて実施できる。免疫系の細胞株、たとえばリンパ系細胞株であるのが好ましい。トランスフェクトされた細胞株は、哺乳動物、とりわけヒトを含むすべての動物の細胞株であってよい。
【００２３】
特別な例として、げっ歯類の骨髄腫細胞系、好ましくはラットの骨髄腫細胞系、とくに好ましくはＬＯＵ株ラットの骨髄腫細胞株、たとえば２０００年１１月２９日に番号Ｉ−２５８４のもとにパスツール研究所（パリ）の国立微生物培養コレクションに寄託されたラットＬＯＵ  ＩＲ  ９８３  Ｆ／ＴＥＣ骨髄腫細胞株を挙げることができる。
【００２４】
本発明の第一の実施態様に従えば、工程（ａ）の細胞株のトランスフェクションは、関心対象の膜ポリペプチドをコードする関心対象の核酸配列を含む核酸構築物を用いて行う。当然のことながら、関心対象の核酸配列は、関心対象のポリペプチドの高発現とそれのトランスフェクトされた細胞の表面への輸送を可能ならしめる調節配列の制御下におく。
【００２５】
本発明の第二の実施態様に従えば、工程（ａ）の細胞株のトランスフェクションは、同じリーディングフレーム内に「補助膜たんぱく質」と呼ばれる膜たんぱく質をコードする核酸配列と関心対象のポリペプチドをコードする関心対象核酸配列とを含む核酸構築物を用いて行う。当然のことながら、補助膜たんぱく質をコードする核酸配列と関心対象核酸配列は、関心対象ポリペプチドの高発現とそれのトランスフェクトされた細胞の表面への輸送を可能ならしめる調節配列の制御下におく。関心対象の核酸配列は、補助膜たんぱく質をコードする核酸配列の前、後または中に配置できる。この実施形態では、補助膜たんぱく質をコードする核酸配列と関心対象のポリペプチドをコードする核酸配列は、互いに直接連結されていてもよく、１つまたは同一または異なるいくつかの連結核酸配列によって連結されていてもよい。それは、補助膜たんぱく質と関心対象のポリペプチドとの間の相互作用を避けることのみを目的とする相対的に不活性なペプチドまたはポリペプチドをコードする配列であってよい。連結核酸配列は、免疫応答に関与するポリペプチドをコードしていてもよい。かかる連結配列の例として、つぎの配列を挙げることができる：ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ。
【００２６】
本発明方法の工程（ａ）で細胞株をトランスフェクトするために用いる核酸構築物は、選択遺伝子、たとえばネオマイシンなどの抗生物質に対する耐性遺伝子を含んでいることが有利である。
【００２７】
工程（ａ）で細胞株をトランスフェクトするために用いる核酸構築物は、工程（ａ）でトランスフェクトされた株細胞に適合した核酸ベクターであることが好ましい。
【００２８】
本発明に従ったベクターのきわめて特徴的な例は、５’から３’へかけて：
−ＳＲαプロモーターなどのプロモーター、
−マウスＣＤ８０のそれのようなリーダー配列、
−関心の対象であるポリペプチドの遺伝子を挿入するポリクローニング部位、
−連結核酸配列、
−場合によりマウスＣＤ８０のリーダー配列が先行した、マウスＣＤ８０のような膜ポリペプチドをコードする核酸配列
を包含する。
【００２９】
本発明のきわめて好ましい形態に従えば、工程（ａ）でトランスフェクトされた細胞株は、抗体調製のために（ｉ）または（ｉｉ）で使用する細胞と同一（自家）、同系または同種である。
【００３０】
有利には、工程（ａ）での細胞株のトランスフェクションののち、トランスフェクタントを、工程（ｂ）に先立ち、補助膜たんぱく質または関心対象のポリペプチドの発現について分析調査する。
【００３１】
たとえば、ベクターによる細胞株のトランスフェクションと耐性遺伝子に対応する培地中での選択ののち、トランスフェクタントを、フローサイトメトリーにより、補助膜たんぱく質または関心対象ポリペプチドの発現について、たとえばこれらのポリペプチドの一つに対するモノクローナル抗体を用いて、分析する。選択されたクローンは、その表面に、関心対象ポリペプチドを呈する。
【００３２】
本発明の方法により調製された抗体は、本発明方法の工程（ｂ）で用いた手法に応じて、ポリクローナルでも、モノクローナルでもありうる。
【００３３】
かくして、本発明方法の工程（ｂ）の第一の実施形態は、関心対象のポリペプチドに対するモノクローナル抗体を調製することにある。この実施態様は、工程（ａ）で調製され、トランスフェクトされていて、その表面に関心対象のポリペプチドを発現する細胞を受容した動物細胞またはそれらの膜からの細胞融合手法を包含する。これらの細胞またはそれらの膜は、単独で、またはアジュバントとともに、１回または数回、動物に投与するのが有利である。免疫化に先立ち該細胞を照射し、あるいはそれらの分裂機構をブロックすることが、有効でありうる。当業者には周知の前述の手法による細胞の免疫化および融合ののち、関心対象のモノクローナル抗体を産生するクローンを、たとえばフローサイトメトリーによって、表面たんぱく質を発現するが、関心対象のポリペプチドを含まないベクター（「エンプティー」ベクター）によってトランスフェクトされている細胞へのそれらの固定と、関心対象のポリペプチドをも含むベクターによってトランスフェクトされ、表面たんぱく質を発現する細胞へのそれらの固定をと比較して、検出することができる。
【００３４】
本発明の方法は、ケーラーとミルステインのモノクローナル抗体合成性ハイブリドーマ調製手法を、マウス、ラットまたはその他のすべての種に様々に適応させて、またインビボ（トランスジェニックまたは非トランスジェニック動物）またはインビトロでの免疫化を採用するすべての方法において、組合せるとき、とくに興味あるものとなる。完全に組織適合性の系の使用はきわめて好ましいが、
−免疫系の意義・価値が、免疫化される系と免疫化する系との間の大多数の抗原の同一性のために、部分的に保存されており、
−選別の意義・価値も、同種抗原または異種抗原について以外は、部分的に保存されている
非組織適合性の系での利用が排除されるものではない。
【００３５】
かくして、本発明方法の工程（ｂ）の第二の実施形態は、工程（ａ）で調製されたその表面に関心対象ポリペプチドを発現するトランスフェクトされた細胞、たとえばＨＡＴ培地に感受性のＩＲ９８３ＦまたはＳｐ２／Ｏ細胞またはそれらの膜を、抗体産生細胞と接触させることにある。それゆえ、ケーラーとミルステインの正統的細胞融合法を用い、たとえばヒト抗体を合成するトランスジェニック動物を用いて、また実際に、抗原によって刺激された未成熟または記憶Ｂリンパ球から特定の抗体を産生するすべての系を用いて、インビボ（たとえばヒト細胞の免疫不全動物への導入により）またはインビトロでの培養で、この免疫応答に由来するＢリンパ球の１つまたは複数を不死化し、採用した種々の手法に由来するクローンを迅速かつ容易に選別することができる。求める特定の抗体をすでに産生しているＢリンパ球（活性化Ｂリンパ球、プレ形質細胞、形質細胞など）の場合には、下記の方法が、不死化細胞からくる抗体の選別に関してその意義・価値を持ち続ける。
【００３６】
本発明方法の工程（ｂ）の第三の実施形態は：
−関心対象のポリペプチドに対する抗体を産生するＢ細胞からの、該抗体の鎖の各々をコードする核酸配列の単離、
−それら核酸配列の宿主での発現
を包含する。
【００３７】
本発明の方法は、工程（ｂ）のあとに、得られた抗体を
−工程（ａ）でトランスフェクトされた細胞および／または
−工程（ａ）で用いたものと同じ、ただし関心対象の核酸配列をもたない核酸構築物でトランスフェクトされた細胞
と接触させることによる該抗体の関心対象ポリペプチド認識能の検定を包含できる。
【００３８】
本発明の方法は、きわめて古典的なエプスタイン−バーウイルスの手法により不死化されたＢリンパ細胞を若干もちうる同一生物体、たとえば人類の同一個人の細胞ならびに同一の採血で採取され、冷凍保存されたまたは少しのちの、あるいは同一個体の十分量の細胞を取得できる他のあらゆる組織で採取された他の細胞を不死化することを可能ならしめる点で、すぐれている。不死細胞以外にも、本発明の方法は、寿命の長い、たとえば線維芽細胞を用いて実施できる。
【００３９】
細胞株と適合した発現系を選択することにより、本発明の方法は、免疫化すべき細胞とのクラスＩ組織適合性をもつ細胞中で抗原を発現させうるのみならず、さらに、クラスＩＩ組織適合性分子を発現する細胞を選択することを可能にする。後者の場合、トランスフェクトされた細胞は、抗原を持っておれば、それのＴエピトープを免疫系のＣＤ４Ｔリンパ球に提示できるであろう。
【００４０】
本発明の方法は、求める抗体が特異的にそこへ結合されうるポリペプチド配列または分子全体さえも前もって知っていることも調製することも前提としない点においても、すぐれている。実際、適切な構築物によってコードされた抗原が免疫系（適切な動物または細胞プレパラート）に提示されるとき、インビボまたはインビトロの系においてその抗原だけが異物（免疫学の古典的教科書の非自己）と考えられ、抗体の大部分が実際にそれに向けられるであろう。免疫応答の間に形成された抗体の全部または一部がその系へ導入された抗原に向けられるかどうかを知るという点において異なる複数の理論が存在する。通例は、抗体の大部分が採用した抗原に向けられるとき、免疫応答は特異的であると考えられている。今回の場合、核酸構築物によって誘導された抗原にも向けられうる。この問題に関連した不都合は、検討中の抗原以外のトランスフェクトされた細胞の抗原をすべてもつ適切な対照細胞を適切なトランスフェクションによって取得することにより、回避できる。
【００４１】
最後に、本発明の方法は、関心対象抗体の選別工程をかなり簡易化できる点で、すぐれている。原細胞株または抗原をコードするものを除いて同じ核酸構築物によりトランスフェクトされた株についての検定すべき培養上澄みの抗体の固定を、抗原をコードする核酸を組み入れた核酸構築物によりトランスフェクトされた株のそれと比較すれば、十分である。このタイプの比較は、「蛍光抗体細胞分取器」を略してＦＡＣＳと呼ばれるタイプの装置を用いて行うことができる。フルオレセイン標識第二抗体の使用および第一抗体に結合できるための適切な方法の選択により、その存在を調べている第一抗体を容易に検出することができる。このタイプの手法は、専門実験室で現在普通に用いられているものである。対照細胞とトランスフェクトされた細胞との間の差を与える他のいかなる方法も、採用できる。
【００４２】
本発明の方法は、研究において、また診断または治療のために、使用できるモノクローナル抗体、さらにはポリクローナル抗体の開発を必要とするすべての領域において用途がある。直接的治療の観点からは、本発明の方法は、患者に接種されるトランスフェクトされた細胞の生成の厳密な管理が確保されている患者の免疫化に使用できる。たとえば、トランスフェクトされ、その分裂を阻止するように処理された自家株を用いて、あるいは該株の細胞の膜断片を用いて、患者に免疫応答を誘発するために利用できる。
【００４３】
本発明は、上に定義したごとき、本発明の方法に使用できる核酸構築物に関するものでもある。本発明は、さらに、本発明方法の工程（ａ）で得られた細胞、それらを含有する組成物、あるいはそれらの膜を含有する組成物、ならびに本発明方法によって得られた抗体を含有する組成物に関するものでもある。最後に、本発明は、治療上または診断上関心のもたれるたんぱく質をコードするポリヌクレオチド配列を用いて本発明の方法をインビボで実施することからなる、患者に対して適用される治療または診断方法に関するものである。
【００４４】
本発明のその他の利点および特徴は、本発明方法の利用を限定するものではない以下の実施例を読めば、明らかになるであろう。
【実施例１】
【００４５】
１）方法
ラットＬＯＵ／Ｃおよびその第一世代の雑種、たとえばＬＯＵ／Ｃ  Ｘ  ＯＫＡＭＯＴＯまたはＬＯＵ／Ｃ  Ｘ  ＰＶＧ／ｃと組織適合性である非分泌性骨髄腫株ＩＲ９８３Ｆを、プラスミドＰＢＪ  ＬＬ１７７（アズマＭ，カヤビャブ（Ｃａｙａｂｙａｂ）Ｍ，バック（Ｂｕｃｋ）Ｄ，フィリップス（Ｐｈｉｌｌｉｐｓ）ＪＨおよびラニエ（Ｌａｎｉｅｒ）ＬＬ．ＣＤ２８のＢ７との相互作用は一次同種増殖応答および小型休止期Ｔリンパ球介在細胞毒性を刺激する。ジャーナル・オブ・エクスペリメンタル・メディシン（Ｊ．Ｅｘｐ．ＭｅＤ．）、１７５：３５３−３６０．１９９２）を用い、エレクトロポレーションによりトランスフェクトした。
【００４６】
ＡＴＣＣから得たこのプラスミド（ＡＴＣＣ番号９９５９５）は、ＳＲαプロモーターの制御下にヒトＣＤ８０をコードしている（タカベＹ，セイキＭ，フジサワＪＦ，ホイ（Ｈｏｙ）Ｐ，ヨコタＨ，アライＫＩ，ヨシダＭおよびアライＮ．ＳＲαプロモーター：シミアンウイルス４０初期プロモーターとヒトＴ細胞白血病ウイルスタイプＩ長末端反復配列のＲ−Ｕ５セグメントからなる効率的で汎用性のある哺乳動物ｃＤＮＡ発現系。モレキュラー・アンド・セリュラー・バイオロジー（Ｍｏｌ．．ＣＥＬＬ．ＢｉｏＬ．）、８：４６６−４７２．１９８８）。このプラスミドは、ネオマイシン耐性遺伝子をも含んでいる。
【００４７】
エレクトロポレーション条件：プラスミド濃度１０μｇ／ｍｌの培地５００μｌ中５００万個の細胞に３００ボルトのパルスを与えた。
【００４８】
ネオマイシン（１ｍｇ／ｍｌ）含有培地中で選択後、抗ＣＤ８０  ＢＢ１モノクローナル抗体（ファーミンジェンＰｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を用い、フローサイトメトリーによりヒトＣＤ８０の発現について分析した。その表面に最も多くのヒトＣＤ８０を発現するクローンが開発された。
【００４９】
セシウム線源を用いて２．５Ｇｙで照射し、１回目の注射には完全フロイントアジュバント中に、２回目の注射には不完全フロイントアジュバント中に乳化させた陽性ＩＲ９８３Ｆ  ＣＤ８０（２ｘ１０７／注射）を、ＬＯＵ／Ｃラットに、２か月間の間隔をおいて、２回腹腔内注射した。２回目の免疫化から２週間後に、免疫化動物の血清は、ヒトＣＤ８０を発現するＩＲ９８３Ｆを認識するが、正常なＩＲ９８３Ｆは認識しない抗体を示した。
【００５０】
また、セシウム線源により線量２．５Ｇｙで照射し、１回目の注射には完全フロイントアジュバント中に、２回目の注射には不完全フロイントアジュバント中に乳化させた陽性ＩＲ９８３Ｆ  ＣＤ８０（１０７細胞／脚）を、ＬＯＵ／Ｃラットに、２週間の間隔をおいて、２回足底内注射した。２回目の注射から４日後に、膝窩神経節を採取し、細胞をＩＲ９８３Ｆと融合させた。
【００５１】
ヒトＣＤ８０を発現するＩＲ９８３Ｆを認識するがトランスフェクトされていないＩＲ９８３Ｆは認識しないモノクローナル抗体を産生する１７のハイブリドーマが得られた。３つはＩｇＧ１イソタイプであり、９つはＩｇＧ２ａイソタイプであり、４つがＩｇＧ２ｂイソタイプ、１つがＩｇＭイソタイプであった。
【００５２】
これらの抗体は、やはりＣＤ８０を発現するヒトＤＡＵＤＩ  Ｂ株をも認識した。
【００５３】
２）結果
上に記載した方法により、膜たんぱく質のみに対する抗体を得ることができる。この方法をすべてのたんぱく質に一般化するために、ＩＲ９８３Ｆの表面にポリペプチドを発現することを可能にする発現ベクターを調製した。このベクターは、５’から３’へかけて、それぞれ：
−Ｓｒαプロモーター、
−マウスＣＤ８０のリーダー配列、
−関心対象のポリペプチドをコードする遺伝子の挿入を可能にするＳｆｉＩ／ＮｏｔＩクローニング部位、
−モチーフとして：ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳをもつ補助連結ポリペプチド鎖をコードする核酸配列、および
−リーダー配列を除くマウスＣＤ８０のコーディング部分
を包含する。このベクターもネオマイシン耐性遺伝子をもっている。
【００５４】
このベクターでＩＲ９８３Ｆをトランスフェクトし、ネオマイシン含有培地中で選択したのち、トランスフェクタントを、マウス抗ＣＤ８０モノクローナル抗体を用い、フローサイトメトリーにより、マウスＣＤ８０の発現について分析する。
【００５５】
マウスＣＤ８０を発現するクローンは、必然的に、その表面につぎのポリペプチド配列を発現する：
膜−マウスＣＤ８０−ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ−関心対象ポリペプチド−ＮＨ２。
【００５６】
免疫化および細胞融合後、関心対象のポリペプチドに対するモノクローナル抗体を産生するクローンを、フローサイトメトリーにより、関心対象配列がクローン化されておらず、マウスＣＤ８０のみを発現する「エンプティー」ベクターによりトランスフェクトされたＩＲ９８３ＦおよびマウスＣＤ８０との融合によってクローン化された関心対象配列を含むベクターによりトランスフェクトされたＩＲ９８３Ｆへのそれらの固定を比較して、検出する。
【実施例２】
【００５７】
炭疽菌（バシラス・アントラシス）の防御抗原の最初の２５０のアミノ酸をコードする核酸配列（炭疽菌の防御抗原をコードするＤＮＡの配列および分析。ウェルコス（Ｗｅｌｋｏｓ）ＳＬ，ロウ（Ｌｏｗｅ）ＪＲ，エデン−マッカッチャン（Ｅｄｅｎ−ＭｃＣｕｔｃｈａｎ）Ｆ，ヴォドキン（Ｖｏｄｋｉｎ）Ｍ，ルプラ（Ｌｐｐｌａ）ＳＬ，シュミット（Ｓｃｈｍｉｔｔ）ＪＪ．ジーン（Ｇｅｎｅ）．６９：２８７．１９８８）を、上記発現ベクターに、ＳｆｉＩ／ＮｏｔＩ制限後、クローン化した。
【００５８】
ＩＲ９８３Ｆを、「エンプティー」発現ベクターで、または炭疽菌の遺伝子を含む発現ベクターでトランスフェクトした。
【００５９】
ネオマイシン（１ｍｇ／ｍｌ）含有培地中での選択後、マウスＣＤ８０を発現し、ＭＣＡ１５８６Ｆモノクローナル抗体（せロテックＳｅｒｏｔｅｃ）を用いたフローサイトメトリーにより検出されるトランスフェクタントが得られた。
【００６０】
その表面に最も多くのマウスＣＤ８０を発現するクローンが開発された。
【００６１】
つぎに、これらのトランスフェクタントを用いて、動物を免疫化した。
【００６２】
たとえば、１回目の注射には完全フロイントアジュバント中に、２回目の注射には不完全フロイントアジュバント中に乳化させた、炭疽菌遺伝子含有発現ベクターによりトランスフェクトした陽性ＩＲ９８３Ｆ−ＣＤ８０（１０７細胞／脚）を、ＬＯＵ／Ｃラットに、２週間の間隔をおいて、２回足底内注射した。２回目の注射から４日後に、膝窩神経節を採取し、細胞をＩＲ９８３Ｆと融合させた。
【００６３】
炭疽菌遺伝子含有ベクターによりトランスフェクトされた陽性ＩＲ９８３Ｆ−ＣＤ８０を認識するが、「エンプティー」ベクターによってトランスフェクトされただけの陽性ＩＲ９８３Ｆ−ＣＤ８０は認識しないモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマが得られた。
【実施例３】
【００６４】
１）方法
非分泌性骨髄腫細胞株ＩＲ９８３Ｆを、プラスミドｐＢＪ  ＣＤ９４を用いてのエレクトロポレーションによりトランスフェクトした。このプラスミドは、クローン化したＣＤ２８遺伝子をプラスミドｐＢＪ  ＬＬ１７７中に置換して構築した。このプラスミドはネオマイシン耐性遺伝子をもっている。
【００６５】
エレクトロポレーション条件：プラスミド濃度１０μｇ／ｍｌの培地５００μｌ中５００万個の細胞に３００ボルトのパルスを与えた。
【００６６】
ネオマイシン（１ｍｇ／ｍｌ）含有培地中で選択後、抗ＣＤ９４  ＨＰ−３Ｄ９モノクローナル抗体（ファーミンジェン）を用い、フローサイトメトリーによりヒトＣＤ９４の発現について分析した。その表面に最も多くのヒトＣＤ９４を発現するクローンが開発された。
【００６７】
セシウム線源を用いて２．５Ｇｙで照射し、１回目の注射には完全フロイントアジュバント中に、２回目の注射には不完全フロイントアジュバント中に乳化させた陽性ＩＲ９８３Ｆ  ＣＤ９４（２ｘ１０７／注射）を、ＬＯＵ／Ｃラットに、２か月間の間隔をおいて、２回腹腔内注射した。２回目の免疫化から２週間後に、免疫化動物の血清は、ヒトＣＤ９４を発現するＩＲ９８３Ｆを認識するが、正常なＩＲ９８３Ｆは認識しない抗体を示した。
【００６８】
また、セシウム線源により線量２．５Ｇｙで照射し、１回目の注射には完全フロイントアジュバント中に、２回目の注射には不完全フロイントアジュバント中に乳化させた陽性ＩＲ９８３Ｆ  ＣＤ９４（１０７細胞／脚）を、ＬＯＵ／Ｃラットに、２週間の間隔をおいて、２回足底内注射した。２回目の注射から４日後に、膝窩神経節を採取し、細胞をＩＲ９８３ＦまたはヒトＣＤ９４を発現するＩＲ９８３Ｆと融合させた。
【００６９】
２６００万個の神経節細胞とＩＲ９８３Ｆとの融合によって、抗ヒトＣＤ９４モノクローナル抗体を産生するが、トランスフェクトされていないＩＲ９８３Ｆは認識しない８つのハイブリドーマが得られた。２０００万個の神経節細胞とヒトＣＤ９４を発現するＩＲ９８３Ｆとの融合によって、抗ヒトＣＤ９４抗体を産生する１７のハイブリドーマが得られた。
【００７０】
いずれの抗体も、ＩＲ９８３Ｆ  ＣＤ９４とＣＤ９４を発現するヒトＮＫとを同時に認識した。
【００７１】
これらクローンのイソタイプはつぎの通りである：３  ＩｇＭ、ＩｇＧ１、１５  ＩｇＧ２ａ、５  ＩｇＧ２ｂ、１  ＩｇＧ２ｃ。
【００７２】
この実験を、免疫化株としてヒトリガンドＣＤ１３４を発現するＩＲ９８３Ｆを用いて、繰り返した。３０００万個の神経節細胞とＩＲ９８３Ｆとを融合させて、抗ＣＤ１３４Ｌ抗体を産生する４つのハイブリドーマが得られた。ヒトＣＤ１３４Ｌを発現する細胞３０００万個を融合させて、抗ＣＤ１３４Ｌ抗体を産生する１０のハイブリドーマが得られた。いずれの抗体も、ＩＲ９８３Ｆ  ＣＤ１３４ＬならびにＣＤ１３４を発現するヒトＢリンパ球を同時に認識した。
【実施例４】
【００７３】
ＩＲ９８３Ｆの膜を、たとえばダウンズ（Ｄｏｕｎｚｅ）のホモジェナイゼーション法によって取得する（コイズミＫ，シミズＫＴ，ニシダＫ，サトーＣ，オータＫ，ヤマダＮ．ビオキミカ・エト・ビオフィジカ・アクタ（Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ），６４９：３９３−４０３，１９８１）。
【００７４】
ＬＯＵ／Ｃラットに、ヒトＣＤ７０を発現するＩＲ９８３Ｆ細胞４０００万個に相当する膜を、２日間隔で３回皮下注射した。
【００７５】
最初の注射から１０日後、ヒトＣＤ７０を発現するＩＲ９８３Ｆ細胞を特異的に認識するポリクローナル抗体が、免疫化動物の血清中に、フローサイトメトリーによって証明された。
【実施例５】
【００７６】
本発明の方法は、その方法の工程（ａ）でトランスフェクトされうる細胞株として、ＳＰ２／Ｏ細胞を用いて実施できる。
【００７７】
この特定の実施例を以下に記載する。
【００７８】
材料
完全ＲＰＭＩ培地
−ＲＰＭＩ５００ｍｌ入りフラスコ
−Ｌ−グルタミン５ｍｌ
−ゲンタマイシン（５０ｍｇ／ｍｌ）５００μｍ
エレクトロポレーション培地（滅菌蒸留水で３００ｍｌとする）
−０．３Ｍイノシトール（１６．２ｇ）
＋１ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４（４０．８２ｍｇ）
＋０．１ｍＭ酢酸カルシウム（４．７４ｍｇ）
＋０．５ｍＭ酢酸マグネシウム（３２．１７ｍｇ）
エレクトロポレーション後培地（滅菌蒸留水で３００ｍｌとする）
１３２ｍＭ  ＮａＣｌ（２．３１ｇ）
＋８ｍＭ  ＫＣｌ（１７８．９ｍｇ）
＋１０ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４（４０８ｍｇ）
＋０．１ｍＭ酢酸カルシウム（４．７４ｍｇ）
＋０．５ｍＭ酢酸マグネシウム（３２．１７ｍｇ）
方法
−培養フラスコからＳＰ２／Ｏ細胞の計数を行う。
−１・１０７個の細胞を採取する。
−採取した細胞を１３００ｒｐｍで５分間遠心分離する。
−沈渣を３７℃のエレクトロポレーション緩衝液１ミリリットル中に懸濁させる。
−場合に応じて、プラスミドＣＤ４０Ｌ（プラスミドＰＢＪ−ＣＤ４０Ｌは、プラスミドＰＢＪ  ＬＬ１７７中にクローン化されている遺伝子を、最初にＢＧＭＧＳｎｅｏ−ＴＲＡＰ（ＴＲＡＰのクローニング、ヒトＴ細胞上のＣＤ４０のリガンド。ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・イムノロジー（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．）。２２：３１９１−３１９４．１９９２）中にクローン化したＣＤ４０Ｌのそれによって置換することにより構築した）１０μｇまたはプラスミドＣＤ９４を加える。
−得られた懸濁液を吸引吐出しによってホモジェナイズする。
−懸濁液４００μｌを採取する。
−この細胞懸濁液を、プラスミドの存在下に、４００μｌの円錐形キュベット中、つぎの条件下で、エレクトロポレーションに付する：３５０Ｖ、５ｍｓ、１パルス。
−前記キュベット中、３７℃でポストエレクトロポレーション培地１ミリリットルを加える。
−この懸濁液を外界温度で１０分間インキュベートする。
−キュベット内容物を採取し、細胞を、フェノールレッドを含まない完全ＲＰＭＩ培地（インビトロジェンＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）１８．５ｍｌ中に懸濁させる。
【００７９】
つぎに、それらの細胞を、各ウエル当り２００μｌの割合で、９６ウエルの培養プレートに分配する。
【００８０】
それらを、５％ＣＯ２雰囲気下、３７℃で２４時間インキュベートする。
０．５ｍｇ／ｍｌのジェネティシン（インビトロジェン）を含有する完全RＰＭＩ培地（インビトロジェン）を各ウエル当り１５０μｌ加えることにより、培地交換を行う。
【００８１】
前記細胞を改めて、５％ＣＯ２雰囲気下、３７℃でインキュベートする。
【００８２】
当該プラスミド（ゲンタマイシン耐性）によりトランスフェクトされた細胞を生育させる。
【００８３】
当該プラスミドによりトランスフェクトされた細胞をＦＡＣＳにて分析し、場合に応じてＣＤ４０ＬまたはＣＤ９４の膜発現を検出する。
【００８４】
結果
上記の方法に従って実施した実験の結果、下記のものが得られた：
−ＣＤ４０Ｌを発現するトランスフェクトされたＳＰ２／Ｏの１クローン（ＳＰ２Ｏ−ＣＤ４０Ｌ）
−ＣＤ９４を発現するＳＰ２／Ｏの３クローン（ＳＰ２／Ｏ−ＣＤ９４−Ｆ４、ＳＰ２／Ｏ−ＣＤ９４−Ｆ１およびＳＰ２／Ｏ−ＣＤ９４−Ｄ２）。
【国際公開パンフレット】
2004535168.tif 000002
2004535168.tif 000003
2004535168.tif 000004
2004535168.tif 000005
2004535168.tif 000006
2004535168.tif 000007
2004535168.tif 000008
2004535168.tif 000009
2004535168.tif 000010
2004535168.tif 000011
2004535168.tif 000012
2004535168.tif 000013
2004535168.tif 000014
2004535168.tif 000015
2004535168.tif 000016
2004535168.tif 000017
2004535168.tif 000018
2004535168.tif 000019
2004535168.tif 000020
2004535168.tif 000021
2004535168.tif 000022
2004535168.tif 000023
2004535168.tif 000024
2004535168.tif 000025
2004535168.tif 000026
2004535168.tif 000027
2004535168.tif 000028
2004535168.tif 000029
2004535168.tif 000030
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004535168.tif 000031
【国際調査報告】
2004535168.tif 000032
2004535168.tif 000033
2004535168.tif 000034
2004535168.tif 000035
2004535168.tif 000036
2004535168.tif 000037