(57)【要約】本発明は、膜の正常な構成の乱れおよび変化を起こした細胞とは選択的に結合するが正常な構成の膜を有する細胞とは結合する度合が低い化合物の使用を提供する。このような化合物を乱れた膜に結合する化合物（ＰＭＢＣ）と呼ぶ。このＰＭＢＣ群の化合物には新規な化合物およびまた公知の化合物が含まれる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
膜の正常な構成の乱れを起こした細胞に選択的に結合する作用剤を調製する際の乱れた膜に結合する化合物（ＰＭＢＣ）の使用であって、前記ＰＭＢＣが式Ｃｅ［式中、ｅは、１、２および３の中から選択され、そしてＣは、式（Ｉ）
【化１】
2004528275.tif 000018
（ここで、
Ｚは、シクロアルキル、シクロアルケニル、ヘテロシクリル、アリールまたはヘテロアリール基または前記基の組み合わせで形成されていて、５から１０個の原子で構成されている環系を表し、
Ｘは、ＣＨ、ＣＨ２、Ｎ、ＮＨ、ＯまたはＳを表し、
ｎ、ｍ、ｒおよびｐは、各々独立して、０または１であり、ここで、ｎ＋ｒ＝１、ｍ＋ｐ＝１であり、
Ｒ１基は、各々同一もしくは異なっていてもよく、独立して、ＡおよびＬ−Ａから成る群から選択され、ここで、Ｌ基は、各々同一もしくは異なっていてもよく、独立して、Ｄ、Ｕ、Ｕ−Ｄ、Ｄ−Ｕ、Ｄ−Ｕ−Ｏ、Ｏ−Ｕ−Ｄ、Ｄ−Ｕ−ＮＨ、ＮＨ−Ｕ−Ｄ、Ｄ−Ｕ−ＤおよびＵ−Ｄ−Ｕから成る群から選択され、
Ｕは、水素を表すか、或は場合により置換されていてもよいＣ１−Ｃ６アルキレン、Ｃ２−Ｃ６アルケニレン、Ｃ３−Ｃ６分枝アルキレン、Ｃ３−Ｃ６分枝アルケニレン、Ｃ３−Ｃ６シクロアルキレン、シクロアルケニレン、アリール、ヘテロシクロアルキレン、ヘテロシクロアルケニレン、ヘテロアリールおよび前記基の任意組み合わせから選択され、
Ｄは、Ｏ、Ｓ、ＳＯ、ＳＯ２、ＳＯ２ＮＨ、ＮＨＳＯ２、ＮＨ、ＰＯ、ＰＯ２、ＰＯＯＨ、ＰＯ（ＮＨ）２、ＮＨＰＯＯＨ、ＣＯ、Ｃ（Ｏ）Ｏ、ＮＨＣＯ、ＣＯＮＨ、ＳＯ２ＮＨＣＨＣＯＯＨ、ＳＯ２ＮＨＣＯまたはＤが二価の基の時の前記リストに由来する相当する意味から成る群から選択され、
Ａ基は、各々同一もしくは異なっていてもよく、ｅが１の時にはｐＨが約７の時に荷電している部分であるか、或はｅが２または３の時には、Ａ基は、独立して、荷電していない極性部分およびｐＨが約７の時に荷電している部分から選択され、ここで、前記荷電している部分は、正に荷電しているか、負に荷電しているか或は双性イオン形態のいずれかであり、
Ｒ２はＷＲ３ｂであり、ここで、Ｗは、存在しないか、或は第二級もしくは第三級アミン、酸素、硫黄およびＤから成る群から選択され、ここで、Ｄはこの上で定義した通りであり、
Ｒ３は、水素、またはＣ１−Ｃ６アルキル、Ｃ２−Ｃ６アルケニル、Ｃ３−Ｃ８分枝アルキル、Ｃ３−Ｃ８分枝アルケニルを表し、ここで、Ｒ３部分は同一または異なっていてもよく、
ｂは、１、２または３であり、そして
ｅが２または３の時には、Ｃ基は互いに直接結合しているか或はＬ部分を通して結合している）
で表される基であるが、これには、式（Ｉ）で表される構造物の薬学的に許容される塩および水和物が含まれ、ここで、
前記Ｃ基は、各々同一もしくは異なっていてもよい］
で表されるものである、使用。
【請求項２】
構造Ｃｅで表される前記ＰＭＢＣにおけるｅが２である請求項１記載の使用。
【請求項３】
前記ＰＭＢＣにおけるＺがシクロアルキル、シクロアルケニル、ヘテロシクリル、アリールまたはヘテロアリールで形成されていて５または６個の原子で構成されている環系を表し、
Ｕが、場合により置換されていてもよいＣ１−Ｃ６アルキレン、Ｃ２−Ｃ６アルケニレン、Ｃ３−Ｃ６分枝アルキレン、Ｃ３−Ｃ６分枝アルケニレンおよび前記基の任意組み合わせを表し、そして
Ｒ２がＷＲ３ｂ［ここで、Ｗは、存在しないか、或は第二級もしくは第三級アミン、酸素および硫黄から成る群から選択される］で構成されている、
請求項１または２記載の使用。
【請求項４】
前記ＰＭＢＣにおけるｂが２であり、Ｒ３基が独立して下記の組み合わせ：（ａ）メチル基、（ｂ）ブチル基、（ｃ）ヘキシル基、（ｄ）ブチル基とメチル基、（ｅ）ヘキシル基とメチル基の組み合わせから選択される請求項１−３のいずれか１項記載の使用。
【請求項５】
Ｃが薬学的に許容される塩および水和物を包含する式（ＩＩ）：
【化２】
2004528275.tif 000019
［式中、Ｒ１、Ｒ２、ｎ、ｍ、ｒおよびｐは、請求項１で定義した意味と同じ意味を有する］
で表される請求項１または２で定義した如き構造Ｃｅで表されるＰＭＢＣを用いる請求項１または２記載の使用。
【請求項６】
Ｃが薬学的に許容される塩を包含する式（ＩＩ）で表される請求項３で定義した如き構造Ｃｅで表されるＰＭＢＣを用いる請求項３記載の使用。
【請求項７】
Ｃが薬学的に許容される塩を包含する式（ＩＩ）で表される請求項４で定義した如き構造Ｃｅで表されるＰＭＢＣを用いる請求項４記載の使用。
【請求項８】
Ｃが請求項１で定義した通りでありそしてｅが１であるが但しＬが−（ＣＨ２）５−でないことを条件とする構造Ｃｅで表される化合物。
【請求項９】
Ｃが請求項１で定義した通りでありそしてｅが２であり、Ｃ基が互いに直接結合しているか或はＬ部分を通して結合しており、ここで、Ｌが請求項１で定義した意味と同じ意味を有する構造Ｃｅで表される化合物であるが、但し下記の化合物：
Ｎ２，Ｎ６−ビス［［５−（ジメチルアミノ）−１−ナフタレニル］スルホニル］−Ｌ−リジン；
Ｎ，Ｎ’−ビス［［５−（ジメチルアミノ）−１−ナフタレニル］スルホニル］−Ｌ−シスチン；
Ｎ，Ｏ−ビス［［５−（ジメチルアミノ）−１−ナフタレニル］スルホニル］−Ｌ−チロシン；および
Ｎ，Ｎ”−ビス［［２−（５−（ジメチルアミノ）ナフタレン−１−スルホニル）アミノエチル］カルバモイル−エチル］−ジエチレントリアミン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ”−トリ酢酸；
を除く化合物。
【請求項１０】
Ｚがシクロアルキル、シクロアルケニル、ヘテロシクリル、アリールまたはヘテロアリールで形成されていて５または６個の原子で構成されている環系を表し、
Ｕが、場合により置換されていてもよいＣ１−Ｃ６アルキレン、Ｃ２−Ｃ６アルケニレン、Ｃ３−Ｃ６分枝アルキレン、Ｃ３−Ｃ６分枝アルケニレンまたは前記基の任意組み合わせを表し、そして
Ｒ２がＷＲ３ｂ［ここで、Ｗは、存在しないか、或は第二級もしくは第三級アミン、酸素および硫黄から成る群から選択される］で構成されている、
請求項８または９記載の化合物。
【請求項１１】
ｂが２でありそしてＲ３基が独立して下記の組み合わせ：（ａ）メチル基、（ｂ）ブチル基、（ｃ）ヘキシル基、（ｄ）ブチル基とメチル基、（ｅ）ヘキシル基とメチル基の組み合わせから選択される請求項８−１０のいずれか１項記載の化合物。
【請求項１２】
ｅが１でありそしてＣが薬学的に許容される塩および水和物を包含する式（ＩＩ）：
【化３】
2004528275.tif 000020
［式中、Ｒ１、Ｒ２、ｎ、ｍ、ｒおよびｐは、請求項１で定義した意味と同じ意味を有するが、但しＬが−（ＣＨ２）５−でないことを条件とする］
で表される請求項８記載の構造Ｃｅで表される化合物。
【請求項１３】
ｅが２でありそしてＣが薬学的に許容される塩および水和物を包含する式（ＩＩ）
【化４】
2004528275.tif 000021
［式中、Ｒ１、Ｒ２、ｎ、ｍ、ｒおよびｐは、請求項１で定義した意味と同じ意味を有する］
で表される請求項９記載の構造Ｃｅで表される化合物。
【請求項１４】
Ｃが薬学的に許容される塩を包含する式（ＩＩ）で表される請求項１０記載の化合物。
【請求項１５】
Ｃが薬学的に許容される塩を包含する式（ＩＩ）で表される請求項１１記載の化合物。
【請求項１６】
Ｃが式（ＩＩ）で表され、ここで、ナフチル基の１つの環が
−ＳＯ２−（ＮＨ）−（ＣＨ２）ｖ−Ａおよび−ＳＯ２−Ｏ−（ＣＨ２）ｖ−Ａ［ここで、ｖは、１の整数を表す］
から選択される単位に連結しておりそしてナフチルの２番目の環がモノアルキルまたはジアルキルアミノ基に連結しており、そして
Ａが、アミノ基および酸性基から選択される荷電した基であり、ここで、前記酸性基がカルボン酸、燐酸、ホスファティックアシッド、スルホン酸および硫酸から選択される、
請求項１２−１５のいずれか１項記載の化合物。
【請求項１７】
Ｃが薬学的に許容される塩および水和物を包含する下記の式（ＩＩＩ）：
【化５】
2004528275.tif 000022
［式中、Ａは、アミノおよび酸性基１種または２種以上から選択される荷電した基であり、Ｒ３基の中の少なくとも１つはＣ１−Ｃ６アルキルでありそしてＬは−ＳＯ２−ＮＨ−（ＣＨ２）ｖ単位であり、ここで、ｖは１−５の整数を表す］
で表される請求項８または９記載の構造Ｃｅで表される化合物。
【請求項１８】
薬学的に許容される塩および水和物を包含する式（ＩＶ）：
【化６】
2004528275.tif 000023
で表される請求項８記載の化合物。
【請求項１９】
前記ＰＭＢＣにおいてｅ＞１の時にＣ基が互いに直接結合しているか或はＬ部分を通して結合しており、ここで、Ｌが請求項１で定義した意味と同じ意味を有する請求項１−７のいずれか１項記載の使用。
【請求項２０】
ｅ＞１の時にＣ基が互いに直接結合しているか或はＬ部分を通して結合しており、ここで、Ｌが請求項１で定義した意味と同じ意味を有する請求項９−１７のいずれか１項記載の化合物。
【請求項２１】
薬学的に許容される塩および水和物を包含する下記の一般式（Ｖ）：
【化７】
2004528275.tif 000024
［式中、Ｇ１、Ｇ２、Ｇ３およびＧ４基は、同一もしくは異なっていてもよく、独立して、水素、ＣＯＯＨ、Ｃ（Ｏ）ＮＨ２、ＮＨ２および−Ｎ＋（ＣＨ３）３の中から選択され、Ｍは、存在なし、Ｃ（Ｏ）ＮＨ、ＮＨ、Ｏ、Ｓ、Ｓ−Ｓ、ＣＨ２、（ＣＨ２）２、ＮＨ（ＣＨ２）２ＮＨ、Ｎ（ＣＨ２）ｋＣＯＯＨおよびＮ＋（ＣＨ３）（ＣＨ２）ｋＣＯＯＨの中から選択され、Ｑ１、Ｑ２、Ｑ３およびＱ４基は、同一もしくは異なっていてもよく、存在なしまたは（ＣＨ２）ｋの中から選択され、ここで、ｋは１−６の整数であり、そしてＲ３は、水素またはＣ１−Ｃ６アルキルを表す］
で表されるＰＭＢＣを用いる請求項１９記載の使用。
【請求項２２】
Ｍ、Ｇ１、Ｇ２、Ｇ３、Ｇ４、Ｑ１、Ｑ２、Ｑ３、Ｑ４、ｋおよびＲ３基が請求項２１で定義した通りである式（Ｖ）で表される請求項２０記載の化合物。
【請求項２３】
薬学的に許容される塩および水和物を包含する下記の式（ＶＩ）：
【化８】
2004528275.tif 000025
で表される請求項２２記載の化合物。
【請求項２４】
薬学的に許容される塩および水和物を包含する下記の式（ＶＩＩ）：
【化９】
2004528275.tif 000026
［式中、Ｒ３は、請求項１で定義した意味と同じ意味を有し、ｙは、２−６の整数を表し、ｚは、１−６の整数を表し、そしてＴは、存在なし、水素およびメチルの中から選択される］
で表される請求項２２記載の化合物。
【請求項２５】
Ｒ３がメチル、ブチルおよびヘキシルの中から選択され、ｙが２または３でありそしてｚが１、２または３である請求項２４記載の化合物。
【請求項２６】
薬学的に許容される塩および水和物を包含する下記の式（ＶＩＩＩ）：
【化１０】
2004528275.tif 000027
で表される請求項２２記載の化合物。
【請求項２７】
薬学的に許容される塩および水和物を包含する下記の式（ＩＸ）：
【化１１】
2004528275.tif 000028
［式中、Ｒ３は、水素またはメチルを表す］
で表される請求項２２記載の化合物。
【請求項２８】
薬学的に許容される塩および水和物を包含する式（Ｘ）：
【化１２】
2004528275.tif 000029
で表されるＰＭＢＣを用いる請求項２１記載の使用。
【請求項２９】
薬学的に許容される塩および水和物を包含する式（ＸＩ）：
【化１３】
2004528275.tif 000030
で表されるＰＭＢＣを用いる請求項２１記載の使用。
【請求項３０】
薬学的に許容される塩および水和物を包含する式（ＸＩＩ）：
【化１４】
2004528275.tif 000031
［式中、Ｒ３基は、独立して、メチル、ブチルおよびヘキシルの中から選択される］
で表されるＰＭＢＣを用いる請求項１９記載の使用。
【請求項３１】
固体状支持体、画像形成用マーカーおよび薬剤から選択される一員に直接結合しているか或はリンカーＹを通して結合している請求項１記載のＰＭＢＣまたは請求項８または９記載の化合物の使用。
【請求項３２】
乱れた膜を有する循環している細胞または細胞構造物を体液から除去する作用剤を製造する目的で固体状支持体に前記ＰＭＢＣまたは化合物を結合させることを含んで成る請求項３１記載の使用。
【請求項３３】
生物学的細胞に入っている乱れた膜を検出する作用剤を製造する目的で画像形成用マーカーに前記ＰＭＢＣまたは化合物を結合させることを含んで成る請求項３１記載の使用。
【請求項３４】
前記マーカーが蛍光、Ｘ線、ＣＴスキャン、ＭＲＩ、ラジオアイソトープスキャンまたはＰＥＴスキャン検出用のマーカーである請求項３３記載の使用。
【請求項３５】
前記マーカーがラジオアイソトープスキャン用金属イオンであるＴｃ−９９ｍおよびＩｎ−１１１そしてＭＲＩ用Ｇｄの中から選択される請求項３４記載の使用。
【請求項３６】
前記Ｙリンカーが検出可能標識とキレート化合物を形成する金属キレーターを含んで成り、前記キレーターが下記の構造：
【化１５】
2004528275.tif 000032
の中のいずれかから選択され、ここで、前記キレーターがこれのアミノ基の１つを通して前記化合物と結合している請求項３１、３３−３５のいずれか１項記載の使用。
【請求項３７】
前記Ｙリンカーが請求項１で定義した如きＬ単位を含んで成る請求項３６記載の使用。
【請求項３８】
細胞、組織または細胞構造物の中に乱れた膜が存在することで特徴づけられる病気を治療する作用剤を製造する目的で薬剤に前記ＰＭＢＣまたは化合物を結合させることを含んで成る請求項３１記載の使用。
【請求項３９】
前記薬剤がアポトーシスの抑制剤、細胞毒性剤、抗血小板剤、抗凝固剤、フィブリン溶解剤、抗炎症薬および免疫調節薬から選択される請求項３８記載の使用。
【請求項４０】
前記薬剤がカスパーゼ阻害剤、Ｂｃ１−２系の調節剤、抗酸化剤、抗癌剤、抗凝固剤、抗血小板剤、ヘパリン、低分子量のヘパリン、糖蛋白質ＩＩｂ／ＩＩＩａの拮抗薬、組織プラスミノゲン活性化剤（ｔＰＡ）または凝固因子の阻害剤、例えばトロンビンの阻害剤または因子Ｘａの阻害剤から選択される請求項３９記載の使用。
【請求項４１】
生物学的細胞に入っている乱れた膜（ＰＭ）を検出する方法であって、
（ｉ）前記細胞を請求項１記載の式（Ｉ）で表されるＰＭＢＣに接触させ、そして
（ｉｉ）前記細胞と結合したＰＭＢＣの存在を検出する、
ことを含んで成っていて、結合したＰＭＢＣが有意な量で存在することがＰＭが前記細胞に存在することを示す方法。
【請求項４２】
死亡過程を経験した細胞を検出するための請求項４１記載の方法。
【請求項４３】
アポトーシスを経験した細胞を検出するための請求項４２記載の方法。
【請求項４４】
活性血小板、血小板由来微細粒子およびアポトーシス体の中から選択される凝固前粒子を検出するための請求項４１記載の方法。
【請求項４５】
活性白血球および活性組織マクロファージの中から選択される活性炎症性細胞を検出するための請求項４１記載の方法。
【請求項４６】
過度のアポトーシスが起こることで特徴づけられる病気、変性障害、神経変性障害、パーキンソン病、アルツハイマー病、ハンティングトン舞踏病、ＡＩＤＳ、脊椎形成異常症候群、虚血性もしくは毒性発作、移植拒絶中の移植細胞損失、過度の血液凝固が起こることで現れる病気、動脈もしくは静脈血栓症、血栓塞栓症、心筋梗塞、脳卒中、深静脈血栓症、汎発性血管内凝固症候群（ＤＩＣ）、血栓性血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）、鎌状赤血球病、地中海貧血、抗燐脂質抗体症候群、全身性紅斑性狼瘡、炎症性障害、および／または免疫媒介病因もしくは病原に関連した病気、自己免疫障害、抗燐脂質抗体症候群、全身性紅斑性狼瘡、結合組織障害、例えば慢性関節リウマチ、硬皮症、甲状腺炎、皮膚科学的障害、天疱瘡、結節性紅斑、自己免疫血液学的障害、自己免疫神経学的障害、重症筋無力症、多発性硬化症、炎症性腸障害、潰瘍性大腸炎、結節性脈管炎から選択される病気を検出するための請求項４１記載の方法。
【請求項４７】
アテローム性動脈硬化斑を検出するための請求項４１記載の方法。
【請求項４８】
不安定なアテローム性動脈硬化斑を検出するための請求項４７記載の方法。
【請求項４９】
腫瘍内のアポトーシスを検出するか、腫瘍の攻撃性を監視するか或は腫瘍の転移を検出するための請求項４１記載の方法。
【請求項５０】
化学療法および放射線療法の中から選択される抗癌治療に対する腫瘍の反応を監視するための請求項４１記載の方法。
【請求項５１】
正常な細胞に好ましくないアポトーシスが誘発されることによる抗癌治療の悪影響を監視するための請求項４１記載の方法。
【請求項５２】
移植した器官の移植後の生存を監視するための請求項４１記載の方法。
【請求項５３】
過度のアポトーシスが起こることで特徴づけられる病気における細胞保護治療に対する反応を監視するための請求項４１記載の方法。
【請求項５４】
請求項８または９記載の化合物を活性材料として含有しかつ薬学的に許容される担体を含有する薬剤組成物。
【請求項５５】
生物学的細胞の中の乱れた膜を検出するための薬剤組成物であって、薬学的に許容される担体と一緒に請求項１記載のＰＭＢＣを活性材料として含んで成る組成物。
【請求項５６】
前記活性材料が蛍光、Ｘ線、ＣＴスキャン、ＭＲＩ、ラジオアイソトープスキャンまたはＰＥＴスキャン検出用のマーカーと結合している請求項５５記載の薬剤組成物。
【請求項５７】
前記マーカーがラジオアイソトープスキャン用金属イオンであるＴｃ−９９ｍおよびＩｎ−１１１そしてＭＲＩ用Ｇｄの中から選択される請求項５６記載の薬剤組成物。
【請求項５８】
細胞、組織または細胞構造物の中に乱れた膜が存在することで特徴づけられる病気を治療するための薬剤組成物であって、請求項１記載のＰＭＢＣと医薬的に有効な薬剤から作られた薬剤接合体を含んで成る有効量の活性材料および薬学的に許容される担体を含んで成る薬剤組成物。
【請求項５９】
前記薬剤がカスパーゼ阻害剤、Ｂｃ１−２系の調節剤、抗酸化剤、細胞毒性剤、抗凝固剤、抗血小板剤、ヘパリン、低分子量のヘパリン、糖蛋白質ＩＩｂ／ＩＩＩａの拮抗薬、組織プラスミノゲン活性化剤、抗炎症性薬剤または免疫調節薬剤の中から選択される請求項５８記載の薬剤組成物。
【請求項６０】
前記薬剤が凝固因子の阻害剤である請求項５９記載の薬剤組成物。
【請求項６１】
前記薬剤がトロンビンの阻害剤または因子Ｘａの阻害剤である請求項６０記載の薬剤組成物。
【請求項６２】
過度のアポトーシスが起こることで特徴づけられる病気、変性障害、神経変性障害、パーキンソン病、アルツハイマー病、ハンティングトン舞踏病、ＡＩＤＳ、脊椎形成異常症候群、虚血性もしくは毒性発作、移植拒絶中の移植細胞損失、腫瘍、過度の血液凝固が起こることで現れる病気、動脈もしくは静脈血栓症、血栓塞栓症、心筋梗塞、脳卒中、深静脈血栓症、汎発性血管内凝固症候群（ＤＩＣ）、血栓性血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）、鎌状赤血球病、地中海貧血、抗燐脂質抗体症候群、全身性紅斑性狼瘡、炎症性障害、および／または免疫媒介病因もしくは病原に関連した病気、自己免疫障害、抗燐脂質抗体症候群、全身性紅斑性狼瘡、結合組織障害、慢性関節リウマチ、硬皮症、甲状腺炎、皮膚科学的障害、天疱瘡、結節性紅斑、自己免疫血液学的障害、自己免疫神経学的障害、重症筋無力症、多発性硬化症、炎症性腸障害、潰瘍性大腸炎、結節性脈管炎、アテローム性動脈硬化斑、不安定なアテローム性動脈硬化斑から選択される病気を検出、予防または治療するための請求項５８記載の薬剤組成物。
【請求項６３】
前記ＰＭＢＣまたは化合物を樹脂被覆球に固定する請求項３２記載の使用。
【請求項６４】
乱れた膜を有する循環している細胞または細胞構造物を体液から除去するための濾過装置であって、請求項３２記載の固定されたＰＭＢＣまたは化合物、流体入り口および流体出口を含んで成る濾過装置。
【請求項６５】
乱れた膜を有する循環している細胞または細胞構造物を血液から除去するための体外循環装置であって、請求項６４記載の濾過装置を含んで成る体外循環装置。
【請求項６６】
ＰＭ含有細胞またはＰＭ含有構造物を体液から除去する方法であって、
固体状支持体に固定された請求項１記載のＰＭＢＣまたは請求項８または９記載の化合物を前記体液にＰＭ含有細胞もしくはＰＭ含有構造物が前記固定された化合物と結合するに充分な条件下で充分な時間接触させることで前記ＰＭ含有細胞もしくは粒子の少なくとも一部を前記体液から除去する、
ことを含んで成る方法。
【請求項６７】
過度のアポトーシスが起こることで特徴づけられる病気、変性障害、神経変性障害、パーキンソン病、アルツハイマー病、ハンティングトン舞踏病、ＡＩＤＳ、脊椎形成異常症候群、虚血性もしくは毒性発作、移植拒絶中の移植細胞損失、腫瘍、過度の血液凝固が起こることで現れる病気、動脈もしくは静脈血栓症、血栓塞栓症、心筋梗塞、脳卒中、深静脈血栓症、汎発性血管内凝固症候群（ＤＩＣ）、血栓性血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）、鎌状赤血球病、地中海貧血、抗燐脂質抗体症候群、全身性紅斑性狼瘡、炎症性障害、および／または免疫媒介病因もしくは病原に関連した病気、自己免疫障害、抗燐脂質抗体症候群、全身性紅斑性狼瘡、結合組織障害、慢性関節リウマチ、硬皮症、甲状腺炎、皮膚科学的障害、天疱瘡、結節性紅斑、自己免疫血液学的障害、自己免疫神経学的障害、重症筋無力症、多発性硬化症、炎症性腸障害、潰瘍性大腸炎、結節性脈管炎、アテローム性動脈硬化斑、不安定なアテローム性動脈硬化斑から選択される病気を治療または予防する方法であって、
前記治療を必要としている被験体に、医薬的に有効な薬剤が前記病気にかかっている細胞または組織を標的にするように薬剤を含んで成るか或は薬剤と結合して請求項３８記載の薬剤接合体を形成している請求項１記載のＰＭＢＣを治療有効量で投与することを含んで成る方法。
【請求項６８】
癌を治療する方法であって、前記治療を必要としている被験体に前記ＰＭＢＣと結合しているか或はこれの中に含まれている薬剤が細胞毒性剤である請求項３８記載のＰＭＢＣ−薬剤接合体を治療有効量で投与することを含んで成る方法。
【請求項６９】
癌を治療する方法であって、
（ｉ）前記治療を必要としている被験体に化学療法および／または放射線療法を施すが、前記治療の目的が、腫瘍内の固有のアポトーシス負荷を高めることにあり、そしてその後、
（ｉｉ）前記被験体に前記ＰＭＢＣと結合しているか或はこれの中に含まれている薬剤が細胞毒性剤である請求項３８記載のＰＭＢＣ−薬剤接合体を治療有効量で投与する、
ことを含んで成る方法。
【請求項７０】
薬剤を調製する時に請求項８−１８、２０および２２−２７のいずれか１項記載の化合物を用いる使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、新規な化合物、薬剤組成物そしてこれを用いた新規な治療および診断方法に関する。
【０００２】
（引用文献のリスト）
下記の文献は本発明の背景の理解の目的に適すると考える：
Ｂｅｖｅｒｓ，Ｅ．Ｍ．他、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ、１４３９：３１７−３３０、１９９０；
Ｂｏｍｂｅｌｉ，Ｔ．他、Ｂｌｏｏｄ、８９：２４２９−２４４２、１９９７；
Ｂｒａｔｔｏｎ，Ｄ．Ｌ．他、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７２：２６１５９−２６１６５、１９９７；
Ｂｕｓｃｈ，Ｗ．他、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｃｉ．、１３：２４５−２５１、１９９２；
Ｋｏｃｈｘ  Ｍ．Ｍ．他、Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｒｅｓ．、４５：７３６−７４６、２０００；
Ｍａｌｌａｔ，Ｚ．他、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ、９６：４２４−４２８、１９９７；
Ｍａｒｔｉｎ，Ｓ．他、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１８２：１５４５−１５５６、１９９５；
Ｐｕｇｓｌｅｙ，Ｗ．他、Ｓｔｒｏｋｅ、２５：１３９３−１３９９、１９９４；
Ｓｉｍｓ，Ｐ．Ｊ．他、Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ、８６：２６６−２７５、２００１；
Ｓｔａｒｙ，Ｈ．Ｃ．他、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ、９２：１３５５−１３７４、１９９５；
Ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｅｉｊｎｄｅ、Ｓ．Ｍ．他、Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ  Ｄｉｆｆ．、４：３１１−３１６、１９９７。
【０００３】
この上に挙げたリストに属する１番目の著者の名称および公開の年を以下の本文の中に括弧に入れて示し、それによって、この上に示した文献が認識されるであろう。
【０００４】
（発明の背景）
無傷の真核生物細胞の生物学的膜は高度に組織化された構造を有することを特徴とする。このように高いレベルの組織化は、とりわけ、前記膜を構成する特定の脂質が有する分子構造、前記膜を構成しているいろいろな脂質種の間の比率、前記膜の外側小葉（ｌｅａｆｌｅｔｓ）と内側小葉の間の燐脂質の分布そして前記膜の蛋白質成分によって決定される。
【０００５】
細胞の生理が正常であるには膜の組織化を高いレベルで維持することが基本であるが、正常な膜構成の実質的な乱れ（ｐｅｒｔｕｒｂａｔｉｏｎｓ）および変化（ＰＮＯＭ）がいろいろな生理学的および病理学的条件下で起こり、それが多数の病気を特徴付けている（Ｍａｒｔｉｎ，Ｓ．他、１９９５）。そのような変化および乱れは形態レベル［アポトーシスを経験した（ｕｎｄｅｒｇｏｉｎｇ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）細胞に観察される膜ブレビング（ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｂｌｅｂｂｉｎｇ）］および分子レベルの両方の点で明らかであり得る。細胞の活性化、細胞の病気または細胞の死亡のいずれかを伴う乱れの範囲は完全には明らかになっていない。それらには、とりわけ、膜燐脂質のかき混ぜおよび再分布が起こること［これに伴って、通常はほとんど完全に膜二層の内側小葉に限定されているアミノ燐脂質、主にホスファチジルセリン（ＰＳ）およびホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）が細胞の表面に移動する］、そしてスフィンゴミエリンおよびホスファチジルコリンが膜の外側小葉から内側小葉に移動することが含まれる（Ｓｉｍｓ，Ｐ．Ｊ．他、２００１）。このような再分布を本明細書では細胞膜脂質非対称（ｃｅｌｌ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｌｉｐｉｄ  ａｓｙｍｍｅｔｒｙ）（ＣＭＬＡ）の損失と呼ぶ。そのような変化は、細胞の表面がいくつかの凝固因子複合体（ｃｌｏｔｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ  ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ）、例えばテナーゼ（ｔｅｎａｓｅ）およびプロトロンビナーゼ複合体などの組み立てで触媒作用を示すプラットフォーム（ｃａｔａｌｙｔｉｃ  ｐｌａｔｆｏｒｍ）になる時に必須な役割を果たす（Ｂｅｖｅｒｓ，Ｅ．Ｍ．他、１９９９）。このように、血小板は活性化を受けるとＰＮＯＭを起こし、そしてそのような変化は正常な血液凝固が起こる時に重要な要因を構成するばかりでなくいろいろな障害における正常でない過度の血液凝固の開始および／または伝播でも重要な要因を構成する。そのような障害には、とりわけ、動脈もしくは静脈血栓症または血栓塞栓症［例えば脳卒中、心筋梗塞、深静脈血栓症（ＤＶＴ）、汎発性血管内凝固症候群（ＤＩＣ）、血栓性血小板減少性紫斑病など］、不安定なアテローム性動脈硬化斑（ｕｎｓｔａｂｌｅ  ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｔｉｃ  ｐｌａｑｕｅｓ）、鎌状赤血球病、ベータ−地中海貧血、抗燐脂質抗体症候群、とりわけ全身性紅斑性狼瘡（ＳＬＥ）、膜微細粒子のシェディング（ｓｈｅｄｄｉｎｇ）に関連した病気、例えば心肺バイパスに関連した神経学的機能障害などが含まれる。
【０００６】
細胞膜の変化／乱れを起こす別の主要な事態はアポトーシスである（Ｂｒａｔｔｏｎ，Ｄ．Ｌ．他、１９９７）。アポトーシスは、細胞自身が分解または「自殺」する固有のプログラムであり、これはあらゆる真核生物細胞に固有のものである。細胞は引き金になる刺激に反応して細胞収縮、細胞膜のブレビング、クロマチン凝縮そして断片化に至る非常に特徴的な段階的出来事を経験した後、最終的に、細胞は膜に結合した粒子［アポトーシス体（ａｐｏｐｔｏｔｉｃ  ｂｏｄｉｅｓ）］の束に変化し、その後、マクロファージが前記束を吸い込む（Ｂｕｓｃｈ，Ｗ．他、１９９２）。ＰＮＯＭはアポトーシス時の普遍的現象であり、これはアポトーシスのカスケード（ｃａｓｃａｄｅ）の初期、恐らくは細胞が死亡過程を遂行する時点で起こり、これは、また、マクロファージがアポトーシスを起こした細胞（ａｐｏｐｔｏｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ）を認識して除去する時の重要な要因であることも分かっている（Ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｅｉｊｎｄｅ，Ｓ．Ｍ．他、１９９７）。
【０００７】
最近、アポトーシスを起こした細胞の有力な凝固前活性（ｐｒｏｃｏａｇｕｌａｎｔ  ａｃｔｉｖｉｔｙ）とＰＮＯＭの間に強力な相互関係が存在することが示された（Ｂｏｍｂｅｌｉ，Ｔ．他、１９９７）。アポトーシスを起こした内皮細胞、例えばアテローム性動脈硬化斑（Ｍａｌｌａｔ，Ｚ．他、１９９７）では、恐らく、ＰＮＯＭが血栓性血管障害の病原で重要な役割を果たしているであろう。ＰＮＯＭは、また、いろいろな引き金によって活性化される炎症性細胞（即ちリンパ球、マクロファージ）の特徴でもある。
【０００８】
従って、ＰＮＯＭ膜に選択的に結合する化合物は、活性化、損傷または死亡過程、特にアポトーシスを経験した細胞を検出しそして標的にする重要なツール（ｔｏｏｌ）になり得る。臨床に関連して、前記膜への結合は、（１）診断の面（例えば病気の過程を診断すること、病気の過程および進行を監視すること、病気の過程に対するいろいろな治療アプローチの効果を監視することなど）、（２）治療の面（例えばＰＮＯＭ細胞を標的にする薬剤、および／またはＰＮＯＭ関連障害の調節）、および（３）除去（ｃｌｅａｒａｎｃｅ）の面（ＰＮＯＭ要素に選択的に結合しそしてそれらを体液から選択的に除去）で有用であり得る。
【０００９】
（発明の要約）
本発明は、膜の正常な構成の乱れ（ＰＮＯＭ）を起こした細胞とは選択的に結合し得るが膜の正常な構成を維持している細胞とは結合する度合がずっと低い化合物を見いだしたことが基になっている。
【００１０】
本発明の目的で用語「ＰＮＯＭ」は少なくとも下記の１つを特徴とする細胞膜を指す：
（ｉ）膜燐脂質のかき混ぜに伴って細胞膜の内側小葉と外側小葉の間の正常な非対称的燐脂質分布の度合が低下したこと、
（ｉｉ）アミノ燐脂質が外側細胞表面に露出したこと（主にホスファチジルセリンおよびホスファチジルエタノールアミンが露出したこと）、
（ｉｉｉ）膜構成要素の詰め込みが損なわれたこと、
（ｉｖ）各膜小葉の中の正常な脂質分布が損なわれたこと、例えば特定の脂質膜成分、例えばホスファチジルセリンまたはコレステロールのそれぞれが豊富に存在するか或は欠乏しているラテラルドメイン（ｌａｔｅｒａｌ  ｄｏｍａｉｎｓ）が生じたこと。
【００１１】
用語「乱れた膜に結合する化合物（ｐｅｒｔｕｒｂｅｄ  ｍｅｍｂｒａｎｅ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｃｏｍｐｏｕｎｄ）」（ＰＭＢＣ）は、ＰＮＯＭで特徴づけられる膜に選択的に結合するが正常な膜に結合する度合が低い化合物を指す。
【００１２】
本発明では、乱れた膜に選択的に結合する作用剤を調製する時にＰＭＢＣを用いる。ＰＭＢＣ群の化合物を「ＮＳＴ７００」と表示する。このＰＭＢＣ群には新規な化合物およびまた公知の化合物が含まれる。
【００１３】
このように、本発明は、本発明の１つの面に従い、膜の正常な構成の乱れを起こした細胞に選択的に結合する作用剤を調製する時に乱れた膜に結合する化合物（ＰＭＢＣ）を用いることを提供し、前記ＰＭＢＣは、式Ｃｅ｛式中、ｅは、１、２および３の中から選択され、そしてＣは、式（Ｉ）：
【００１４】
【化１６】
2004528275.tif 000002
【００１５】
［ここで、
Ｚは、シクロアルキル、シクロアルケニル、ヘテロシクリル、アリールまたはヘテロアリール基または前記基の組み合わせで形成されている環系（この環系は５−１０個の原子で構成されている）を表し、
Ｘは、ＣＨ、ＣＨ２、Ｎ、ＮＨ、ＯまたはＳを表し、
ｎ、ｍ、ｒおよびｐは、各々独立して、０または１であり、ここで、ｎ＋ｒ＝１、ｍ＋ｐ＝１であり、
Ｒ１基は、各々同一もしくは異なっていてもよく、独立して、ＡおよびＬ−Ａから成る群から選択され、ここで、Ｌ基は、各々同一もしくは異なっていてもよく、独立して、Ｄ、Ｕ、Ｕ−Ｄ、Ｄ−Ｕ、Ｄ−Ｕ−Ｏ、Ｏ−Ｕ−Ｄ、Ｄ−Ｕ−ＮＨ、ＮＨ−Ｕ−Ｄ、Ｄ−Ｕ−ＤおよびＵ−Ｄ−Ｕから成る群から選択され、
Ｕは、水素を表すか、或は場合により置換されていてもよいＣ１−Ｃ６アルキレン、Ｃ２−Ｃ６アルケニレン、Ｃ３−Ｃ６分枝アルキレン、Ｃ３−Ｃ６分枝アルケニレン、Ｃ３−Ｃ６シクロアルキレン、シクロアルケニレン、アリール、ヘテロシクロアルキレン、ヘテロシクロアルケニレン、ヘテロアリールおよび前記基の任意組み合わせから選択され、
Ｄは、Ｏ、Ｓ、ＳＯ、ＳＯ２、ＳＯ２ＮＨ、ＮＨＳＯ２、ＮＨ、ＰＯ、ＰＯ２、ＰＯＯＨ、ＰＯ（ＮＨ）２、ＮＨＰＯＯＨ、ＣＯ、Ｃ（Ｏ）Ｏ、ＮＨＣＯ、ＣＯＮＨ、ＳＯ２ＮＨＣＨＣＯＯＨ、ＳＯ２ＮＨＣＯまたはＤが二価の基の時の前記リストに属する相当する意味から成る群から選択され、
Ａ基は、各々同一もしくは異なっていてもよく、ｅが１の時にはｐＨが約７の時に荷電している部分であるか、或はｅが２または３の時には、Ａ基は、独立して、荷電していない極性部分およびｐＨが約７の時に荷電している部分から選択され、ここで、前記荷電している部分は、正に荷電しているか、負に荷電しているか或は双性イオン形態のいずれかであり、
Ｒ２はＷＲ３ｂであり、ここで、Ｗは、存在しないか、或は第二級もしくは第三級アミン、酸素、硫黄、炭素およびＤから成る群から選択され、ここで、Ｄはこの上で定義した通りであり、
Ｒ３は、水素、またはＣ１−Ｃ６アルキル、Ｃ２−Ｃ６アルケニル、Ｃ３−Ｃ８分枝アルキル、Ｃ３−Ｃ８分枝アルケニルを表し、ここで、Ｒ３部分は同一または異なっていてもよく、
ｂは、１、２または３であり、そして
ｅが２または３の時には、Ｃ基は互いに直接結合しているか或はＬ部分を通して結合しており、ここで、Ｌは、この上で定義した通りである］
で表される基、または式（Ｉ）で表される構造物の薬学的に許容される塩もしくは水和物である（ここで、前記Ｃ基は、各々同一もしくは異なっていてもよい）｝
で表される。
【００１６】
好適な態様におけるｅは２である。
【００１７】
更に別の好適な態様における前記式Ｉで表されるＰＭＢＣのＺ基は、シクロアルキル、シクロアルケニル、ヘテロシクリル、アリールまたはヘテロアリールで形成されている環系（この環系は５または６個の原子で構成されている）を表す。
【００１８】
Ｕは、場合により置換されていてもよいＣ１−Ｃ６アルキレン、Ｃ２−Ｃ６アルケニレン、Ｃ３−Ｃ６分枝アルキレン、Ｃ３−Ｃ６分枝アルケニレンまたは前記基の任意組み合わせを表し、そして
Ｒ２はＷＲ３ｂ［ここで、Ｗは、存在しないか、或は第二級もしくは第三級アミン、酸素および硫黄から成る群から選択され、そしてＲ３およびｂは、この上で定義した通りである］で構成されている。
【００１９】
好適には、ｂは２であり、そしてＲ３基を独立して下記の組み合わせ：（ａ）メチル基、（ｂ）ブチル基、（ｃ）ヘキシル基、（ｄ）ブチル基とメチル基、（ｅ）ヘキシル基とメチル基の組み合わせから選択する。
【００２０】
前記式（Ｉ）で表されるＰＭＢＣにおけるＲ１およびＲ２は各々場合により基Ｙを含んで成っていてもよく、前記Ｙ基は下記のいずれかへのリンカー（ｌｉｎｋｅｒ）であってもよい：
１．  固体状支持体、
２．  画像形成用マーカー、例えば蛍光、ｘ線、ＣＴスキャン、核磁気共鳴画像形成（ＭＲＩ）、ポジトロンエミッショントモグラフィー（ｐｏｓｉｔｒｏｎ  ｅｍｉｓｓｉｏｎ  ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ（ＰＥＴ）またはラジオアイソトープスキャン検出用のマーカー、
３．  病気にかかった細胞または組織を標的にする別の薬剤（これは特定の病気の予防または治療に医薬的に有効な作用剤である）［これをＰＭＢＣと結合させる］｛好適には、この薬剤はアポトーシスの抑制剤［例えばカスパーゼ阻害剤（ｃａｓｐａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）、抗酸化剤、Ｂｃ１−２系の調節剤（ｍｏｄｕｌａｔｏｒ）または細胞毒性剤、例えばアポトーシスの活性化剤（例えば抗癌剤）であってもよく、別法として、この薬剤は、好適には、抗凝固剤、抗血栓（ａｎｔｉｔｈｒｏｍｂｏｔｉｃ）または血栓溶解（ｔｈｒｏｍｂｏｌｙｔｉｃ）剤である。そのような場合には、前記薬剤を好適には抗血小板剤、ヘパリン、低分子量のヘパリン、糖蛋白質ＩＩｂ／ＩＩＩａの拮抗薬、組織プラスミノゲン活性化剤（ｔＰＡ）または凝固因子の阻害剤、例えばトロンビンの阻害剤または因子Ｘａの阻害剤から選択し、さらなる別法として、この薬剤は好適には抗炎症薬または免疫調節薬である｝。
【００２１】
好適には、ｅが２または３の整数の時には、ＰＭＢＣのＣ基は互いに直接結合しているか或はＬ部分（Ｌはこの上で定義した通りである）を通して結合している。
【００２２】
別の好適な態様における本発明で用いるＰＭＢＣは、式（ＩＩ）：
【００２３】
【化１７】
2004528275.tif 000003
【００２４】
［式中、Ｒ１、Ｒ２、ｎ、ｍ、ｒおよびｐは、全部、この上で定義した意味と同じ意味を有する］
で表されるＣ基［式（ＩＩ）で表される構造物の薬学的に許容される塩および水和物を包含］を含んで成る。
【００２５】
別の好適な態様における式（Ｉ）で表されるＰＭＢＣは、Ｃ基｛このＣ基は、ナフチル基で構成（即ちＺがフェニル環である）されていて前記ナフチルの１つの環が構造−ＳＯ２−（ＮＨ）−（ＣＨ２）ｖ−Ａ、−ＳＯ２−Ｏ−（ＣＨ２）ｖ−Ａ［ここで、ｖは、１−５の整数を表す］の中から選択される単位に連結しておりかつナフチルの２番目の環がモノアルキルまたはジアルキルアミノ基に連結しておりそしてＡがアミノ基１種または２種以上および／または酸性基１種または２種以上、例えばカルボン酸、燐酸、ホスファティックアシッド（ｐｈｏｓｐｈａｔｉｃ  ａｃｉｄ）、スルホン酸または硫酸などから生じた荷電した基である｝を含んで成る。
【００２６】
好適には、Ｒ３基を下記の組み合わせ：（ａ）２個のメチル基、（ｂ）２個のブチル基、（ｃ）２個のヘキシル基、（ｄ）ブチル基とメチル基の組み合わせ、（ｅ）ヘキシル基とメチル基の組み合わせの中から選択する。
【００２７】
別の好適な態様に従う本発明で用いるＰＭＢＣは、下記の式（ＩＩＩ）：
【００２８】
【化１８】
2004528275.tif 000004
【００２９】
［式中、Ａは、アミノ基１種または２種以上および／またはカルボキシル基１種または２種以上から生じた荷電した基であり、Ｒ３基の中の少なくとも１つがＣ２−Ｃ６アルキルであり、そしてＬは、−ＳＯ２−ＮＨ−（ＣＨ２）ｖ（ｖは１−５の整数を表す）である］
で表されるＣ基（これの薬学的に許容される塩および水和物を包含）を有する。
【００３０】
より特別には、ＰＭＢＣは下記の式（ＩＶ）で表され、これをＮＳＴ７０１と表示する：【００３１】
【化１９】
2004528275.tif 000005
【００３２】
ＰＭＢＣの中の数種は新規な化合物であり、本発明の２番目の面に相当する。このような新規な化合物は、Ｃがこの上で定義した通りでありそしてｅが２（即ち新規な化合物は二量体である）または１であり、ｅ＝１の場合のＰＭＢＣは−（ＣＨ２）５−以外のＬ基を含んで成る構造Ｃｅで表される。
【００３３】
下記のＰＭＢＣは新規な化合物ではない：
Ｎ２，Ｎ６−ビス［［５−（ジメチルアミノ）−１−ナフタレニル］スルホニル］−Ｌ−リジン；Ｎ，Ｎ’−ビス［［５−（ジメチルアミノ）−１−ナフタレニル］スルホニル］−Ｌ−シスチン；Ｎ，Ｏ−ビス［［５−（ジメチルアミノ）−１−ナフタレニル］スルホニル］−Ｌ−チロシン；およびＮ，Ｎ”−ビス［［２−（５−（ジメチルアミノ）ナフタレン−１−スルホニル）アミノエチル］カルバモイルメチル］−ジエチレントリアミン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ”’−トリ酢酸。
【００３４】
本発明の新規な化合物は、好適には、下記の式（Ｖ）：
【００３５】
【化２０】
2004528275.tif 000006
【００３６】
［式中、Ｇ１、Ｇ２、Ｇ３およびＧ４基は、同一もしくは異なっていてもよく、独立して、水素、ＣＯＯＨ、Ｃ（Ｏ）ＮＨ２、ＮＨ２および−Ｎ＋（ＣＨ３）３の中から選択され、Ｍは、存在なし、ＮＨＣ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）ＮＨ、ＮＨ、Ｏ、Ｓ、Ｓ−Ｓ、ＣＨ２、（ＣＨ２）２、ＮＨ−（ＣＨ２）２ＮＨ、Ｎ（ＣＨ２）ｋＣＯＯＨおよびＮ＋（ＣＨ３）（ＣＨ２）ｋＣＯＯＨの中から選択され、Ｑ１、Ｑ２、Ｑ３およびＱ４基は、同一もしくは異なっていてもよく、存在なしまたは（ＣＨ２）ｋの中から選択され、ここで、ｋは１−６の整数であり、そしてＲ３は、水素またはＣ１−Ｃ６アルキルを表す］
で表される。好適には、Ｒ３はメチル基、ブチル基またはヘキシル基である。
【００３７】
特別な態様における本発明の新規な化合物は、下記の式（ＶＩ）で表され、これをＮＳＴ７４０と表示する：
【００３８】
【化２１】
2004528275.tif 000007
【００３９】
別の態様における本発明の新規な化合物は下記の式（ＶＩＩ）：
【００４０】
【化２２】
2004528275.tif 000008
【００４１】
［式中、Ｒ３は、この上で定義した意味と同じ意味を有し、ｙは、２−６の整数であり、ｚは、１−６の整数であり、そしてＴは、存在なし、水素およびメチルの中から選択される］
で表され、これには、これの薬学的に許容される塩および水和物が含まれる。好適には、Ｒ３はメチル、ブチルまたはヘキシルの中から選択され、ｙは２または３でありそしてｚは１、２または３である。
【００４２】
更に別の特別な態様における本発明の新規な化合物は下記の式（ＶＩＩＩ）で表され、これをＮＳＴ７５０と表示する：
【００４３】
【化２３】
2004528275.tif 000009
【００４４】
別の特別な態様における本発明の新規な化合物は、下記の式（ＩＸ）：
【００４５】
【化２４】
2004528275.tif 000010
【００４６】
［式中、Ｒ３基は、同一もしくは異なっていてもよく、この上に示した意味と同じ意味を有する］
で表され、これには、これの薬学的に許容される塩および水和物が含まれる。
【００４７】
この新規な化合物は、好適には、Ｒ３がメチル基である前記式（ＩＸ）で表される構造を有し、これをＮＳＴ７５１と表示する。
【００４８】
特別な態様において本発明で用いるＰＭＢＣは、下記の式（Ｘ）で表され、これをＤＤＬと表示する：
【００４９】
【化２５】
2004528275.tif 000011
【００５０】
別の特別な態様において本発明で用いるＰＭＢＣは、下記の式（ＸＩ）で表され、これをＤＤＣと表示する：
【００５１】
【化２６】
2004528275.tif 000012
【００５２】
更に別の好適な態様において本発明で用いるＰＭＢＣは、下記の式（ＸＩＩ）：
【００５３】
【化２７】
2004528275.tif 000013
【００５４】
［式中、Ｒ３は、メチル基、ブチル基およびヘキシル基の中から選択される］
で表され、これには、これの薬学的に許容される塩および水和物が含まれる。
【００５５】
ＰＭＢＣが正常な構成の乱れ（ＰＮＯＭ）を起こした細胞膜には選択的に結合するが正常な構成を維持している膜には本質的に結合しないか或は結合する度合がずっと低いと言った特性を本発明の異なる３種類のアプローチで用いることができる。
【００５６】
１番目のアプローチ（本明細書では以降「検出アプローチ」と呼ぶ）に従い、そのような選択的結合を利用して乱れた膜（ＰＭ）を有する細胞または細胞由来粒子（ｃｅｌｌ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｐａｒｔｉｃｌｅｓ）を検出することができる。これを用いて本明細書の以下に説明するように細胞がＰＮＯＭを起こした病気を診断することができる。
【００５７】
２番目のアプローチ（本明細書では以降「治療アプローチ」と呼ぶ）に従い、そのようなＰＭに選択的に結合する特性を利用することで、治療に有効な薬剤がＰＮＯＭを起こした体内器官および組織、例えば細胞が死滅した領域、血栓が生じた領域または炎症領域を標的にするように、ＰＭＢＣを標的に向かう部分（ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｍｏｉｅｔｙ）として用いて病気を治療することができる。
【００５８】
本発明の３番目のアプローチ（「除去アプローチ」と呼ぶ）に従い、本発明の化合物がＰＭに選択的に結合することを利用して、ＰＭを有する細胞またはそのような膜を含んで成るより大きな構造物、例えば体内を循環している栓子などを体液から除去する。
【００５９】
検出アプローチに従い、本発明は、生物学的細胞のサンプルに入っている乱れた膜をインビトロ、エクスビボまたはインビボのいずれかで検出するに有効な材料としてこの上で定義した如きＰＭＢＣを含んで成る組成物に関する。本発明の検出アプローチに従うＰＭＢＣは、検定を受けさせるサンプルに存在するＰＭに選択的に結合し得る。その後、本技術分野で公知の任意手段を用いて前記結合を識別することができる。このＰＭＢＣに、これ自身の検出可能特性、例えば蛍光発光を持たせてもよく、そしてそのような検出可能特性を例えば蛍光顕微鏡またはフローシトメトリック（ｆｌｏｗ  ｃｙｔｏｍｅｔｒｉｃ）装置などで検出してもよい。
【００６０】
用語「ＰＭで特徴づけられる病気」は、病気の徴候の１つが膜の正常な構成の乱れである病気を指す。これは、そのような乱れが必ずしも病気の原因または単独の影響であると読まれることがないことを意味し、むしろ、それが病気の徴候の１つであると読まれることを意味する。
【００６１】
本発明の好適な態様に従うＰＭＢＣは検出可能標識、例えば蛍光を発する部分、ラジオラベル（ｒａｄｉｏ−ｌａｂｅｌ）、検出可能な色を発生する酵素反応を起こし得る標識、ｘ線、ＭＲＩ、ラジオアイソトープ画像形成またはＰＥＴスキャン用のマーカーなどを含んで成るか或はそれらにＹ部分を通して結合していてもよく、それによって、ＰＭＢＣ−標識の付加体を生じさせてもよい。そのような付加体は、検出可能標識が本発明の化合物を通してＰＭに選択様式で結合し得る。次に、本技術分野で公知の任意様式を用いて前記検出可能標識を検出することができ、そして使用する特定の標識、例えば蛍光、放射線放出または色発生、ＭＲＩ、ｘ線などに従って検出することができる。用語「結合」は、ＰＭＢＣを検出可能標識につなげる共有または非共有（例えば静電）結合を指す。別法として、ＰＭＢＣに、これの構造の化学的性質から、この上に述べた技術のいずれかを用いて検出することができる検出可能な特性をこれ自身に持たせることも可能である。
【００６２】
好適には、前記検出可能標識を、ラジオアイソトープスキャン用の金属イオンであるＴｃ−９９ｍおよびＩｎ−１１１そしてＭＲＩ用Ｇｄの中から選択する。有利には、Ｙに金属キレーター（ｃｈｅｌａｔｏｒ）を含め、この場合には、前記金属が検出可能な標識であり、ここでは、前記キレーターを下記の構造：
【００６３】
【化２８】
2004528275.tif 000014
【００６４】
のいずれかの中から選択し、そしてここでは、前記キレーターをこれのアミノ基の１つを通して前記化合物に結合させる。
【００６５】
更に有利には、ＹリンカーにＬ単位を含め、それによって、前記キレーターをＰＭＢＣのカルボキシル、アミンまたはスルホンアミド部分のいずれかと結合させるが、ここで、前記Ｌ単位はこの上で定義した通りである。この上に示した付加体は、ＰＭの発生で特徴づけられる幅広く多様な生理学的状態（正常な状態を包含）、病理学的状態、病気または障害の検出および診断で使用可能である。
【００６６】
ＰＭで特徴づけられる状態の例は下記の通りである：
過度の組織増殖に加えて、また、過度のアポトーシスが起こることで特徴づけられる病気、例えば変性障害、神経変性障害（例えばパーキンソン病、アルツハイマー病、ハンティングトン舞踏病）、ＡＩＤＳ、脊椎形成異常症候群、虚血性もしくは毒性発作、移植拒絶中の移植細胞損失、腫瘍、特に非常に悪性／攻撃的な腫瘍もしばしばアポトーシスの度合が高いとして特徴づけられる。
【００６７】
過度の血液凝固が起こることで現れる病気［この場合、血小板活性化中および／または他の細胞要素（例えば内皮細胞）の活性化もしくは損傷中にＰＮＯＭが起こる］。このような病気には、とりわけ、動脈もしくは静脈血栓症、血栓塞栓症、例えば心筋梗塞、脳卒中、深静脈血栓症、汎発性血管内凝固症候群（ＤＩＣ）、血栓性血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）、鎌状赤血球病、地中海貧血、抗燐脂質抗体症候群、全身性紅斑性狼瘡などが含まれる。
【００６８】
炎症性障害、および／または免疫媒介病因もしくは病原に関連した病気、例えば自己免疫障害、例えば抗燐脂質抗体症候群、全身性紅斑性狼瘡、結合組織障害、例えば慢性関節リウマチ、硬皮症など、甲状腺炎、皮膚科学的障害、例えば天疱瘡または結節性紅斑など、自己免疫血液学的障害、自己免疫神経学的障害、例えば重症筋無力症など、多発性硬化症、炎症性腸障害、例えば潰瘍性大腸炎など、結節性脈管炎など。
【００６９】
また、アテローム性動脈硬化斑、特に不安定で脆くかつ崩壊する傾向があるアテローム性動脈硬化斑もＰＭ構造で特徴づけられ、それには、アポトーシスを起こしたマクロファージ、アポトーシスを起こした平滑筋細胞、アポトーシスを起こした内皮細胞、活性血小板および活性炎症性細胞が含まれる。
【００７０】
関連したＰＮＯＭを検出することを通して病理学的状態、障害または病気を検出することは、これ自身、単に特定の個人に病気の状態が存在することを診断する目的になり得る。
【００７１】
また、病気のひどさを評価しかついろいろな治療様式に対する反応を監視する目的で、病気にかかっていることが既に分かっている人に関して前記検出を実施することも可能である。そのような監視の一例は、抗癌治療に対する反応の評価である。大部分の抗腫瘍治療、化学療法または放射線療法はアポトーシスの誘発によって効果を及ぼすことから、治療によって誘発された腫瘍細胞のアポトーシスをＰＭＢＣで検出すると抗癌治療を施す時間とそれの効果を適切に評価する時間の間の遅延期間を実質的に短くすることが可能になる。
【００７２】
その上、前記検出を用いて抗癌治療の悪影響を監視することも可能である。そのような悪影響の大部分は正常であるが敏感な細胞、例えば胃腸官の上皮または骨髄の造血系などの好ましくないアポトーシス（治療によって誘発された）によるものである。ＰＭＢＣを用いてそのようなアポトーシスを検出すると、そのような好ましくない組織の損傷を早い時期に検出することが可能になりかつ治療プロトコルの最適化をより良好に行うことが可能になる。
【００７３】
加うるに、前記検出の目的は、腫瘍内の固有のアポトーシス負荷（ａｐｏｐｔｏｔｉｃ  ｌｏａｄ）の特徴付け、腫瘍の攻撃性レベルの特徴付けおよび転移の検出であってもよい。
【００７４】
本発明の組成物または化合物は、器官移植後の移植片の生存度の監視で用いるにも同様に有用である、と言うのは、ＰＭＢＣ化合物を用いて潜在的に検出可能なアポトーシスは移植拒絶中の細胞損失で重要な役割を果たすからである。
【００７５】
加うるに、前記検出の目的は、細胞保護（ｃｙｔｏ−ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ）治療への反応を監視、従って細胞死亡の評価の測定を可能にすることによっていろいろな病気（例えばこの上に示した病気）における細胞損失を抑制し得る薬剤の選別および開発を補助する目的であってもよい。
【００７６】
また、前記検出は、アテローム性動脈硬化斑の検出で用いるにも有用であり得る、と言うのは、前記斑は不安定になると脆くなり、崩壊して血栓および塞栓を形成する傾向があるからであり、これは、いくつかの要素が参与することを特徴とし、それらは一般に下記の乱れた膜を有する：（ｉ）アポトーシスを起こした細胞（不安定な斑はアポトーシスを起こしたマクロファージ、アポトーシスを起こした平滑筋細胞およびアポトーシスを起こした内皮細胞を伴うことを特徴とする）、（ｉｉ）活性化された血小板、（ｉｉｉ）活性化された炎症性細胞。脂質中心部（ｌｉｐｉｄ  ｃｏｒｅ）が細胞外に蓄積した脂質で構成されていることもまたアテローム性動脈硬化斑が不安定である証明の１つである（Ｋｏｃｋｘ  Ｍ．Ｍ．他、２０００；Ｓｔａｒｙ，Ｈ．Ｃ．他、１９９５）。前記ＰＭＢＣおよび本発明の化合物は、疎水性の芳香成分を有することから、また、そのような脆いアテローム性動脈硬化斑の脂質中心部の識別で用いるにも有用であり得る。
【００７７】
また、組織培養物および動物モデルにおけるアポトーシスを研究する時の基本的研究目的でそのような検出を行うことも可能であり、これは、また、いろいろな組織の正常な発育および恒常性、例えば胚形成中ばかりでなく正常な老化などの如き状況中の中枢神経系の発育でアポトーシスが果たす役割を測定する時にも役立つ。
【００７８】
このようなアプローチに従い、本発明は、更に、生物学的細胞におけるＰＭの検出方法にも関し、この方法は、
（ｉ）前記細胞のサンプルをＰＭＢＣにこのＰＭＢＣが生物学的膜と結合し得る条件下で接触させ、
（ｉｉ）前記細胞と結合した化合物を検出する、
ことを含んで成り、ここで、結合した化合物が有意な量で存在することは、ＰＭが前記細胞に存在することを示している。
【００７９】
本発明の方法は、ＰＮＯＭが起こることで特徴づけられる病気、例えばこの上に示した病気のいずれか１つの診断で使用可能である。
【００８０】
また、本発明の方法は、前記病気または医学的状態に関してか或は別法としてこの上で説明した如き基本的科学研究の目的でいろいろな治療様式の効果を監視する時にも使用可能である。
【００８１】
「治療アプローチ」と呼ぶ本発明の２番目のアプローチに従い、本発明は、（ｉ）薬学的に活性な薬剤と（ｉｉ）ＰＭＢＣから作られたＰＭＢＣ接合体（ＰＭＢＣ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）を含んで成る活性材料を場合により薬学的に許容される担体と一緒に含んで成る薬剤組成物に関する。前記薬剤組成物は、前記薬剤がＰＮＯＭを起こした細胞を標的にするように働き、従って、この上で定義した如きＰＭの存在で特徴づけられる病気の治療で用いるに有用であり得る。
【００８２】
ＰＭＢＣの相補的単位（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ  ｕｎｉｔ）と結合している薬剤を含んで成る接合体を表す目的で用語「ＰＭＢＣ接合体」を用い、前記接合体はＰＭＢＣとして働き得る。そのような結合は、共有結合、非共有結合（例えば静電力）、または表面にＰＭＢＣを有する薬剤（複合体がＰＭを標的にする）を含んで成る担体粒子（例えばリポソーム）をもたらす結合であってもよい。
【００８３】
ＰＭＢＣ接合体の目的は、当該薬剤がＰＮＯＭを特徴とするか或は有意な量のＰＮＯＭを特徴とする細胞、組織または器官のみに選択的に向かうようにすることにある。前記薬剤がその標的に到達した時点で、これがまだＰＭＢＣの一部として複合体の状態にあるか或はＰＭＢＣが膜に付着している薬剤含有リポソームの食作用または他の公知のいずれかの機構によって相補的ＰＭＢＣ単位から離れた（例えば天然の酵素が有する開裂、分解などの活性によって）後、これはこれの生理学的活性を及ぼす能力を有するべきである。
【００８４】
このような薬剤を選択する時、本組成物が意図する特定の病気に応じて選択を行うべきである。
【００８５】
異常で過度の血液凝固の開始または伝播が起こることで現れる病気［例えば動脈もしくは静脈血栓症、血栓塞栓症、鎌状赤血球病、ベータ−地中海貧血、抗燐脂質抗体症候群、汎発性血管内凝固症候群（ＤＩＣ）、血栓性血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）、全身性紅斑性狼瘡］を予防または治療する場合の薬剤は、血塊の生成を抑制するか或は血塊が生じた後にそれを溶かすことが知られている化合物、例えば抗血小板剤、ヘパリン、低分子量のヘパリン、糖蛋白質ＩＩＢ／ＩＩＩＡの拮抗薬、組織プラスミノゲン活性化剤（ｔＰＡ）または凝固因子の阻害剤、例えばトロンビンの阻害剤または因子Ｘａの阻害剤などでなければならない。
【００８６】
不適当で過度のアポトーシスが起こることで現れる病気、例えば変性障害、神経変性障害（例えばパーキンソン病、アルツハイマー病、ハンティングトン舞踏病）、ＡＩＤＳ、脊椎形成異常症候群、虚血性もしくは毒性発作、移植拒絶中の移植細胞損失などの場合の薬剤は、アポトーシスを抑制し得るべきである。そのような薬剤は、とりわけ、カスパーゼ阻害剤、Ｂｃ１−２系の調節剤または抗酸化剤であり得る。
【００８７】
病気が炎症性障害および／または免疫媒介病因もしくは病原に関連した病気、例えば自己免疫障害、例えば抗燐脂質抗体症候群、全身性紅斑性狼瘡など、結合組織障害、例えば慢性関節リウマチなど、硬皮症、甲状腺炎、皮膚科学的障害、例えば天疱瘡または結節性紅斑など、自己免疫血液学的障害、自己免疫神経学的障害、例えば重症筋無力症など、多発性硬化症、炎症性腸障害、例えば潰瘍性大腸炎など、結節性脈管炎などの場合の薬剤は、抗炎症薬または自己免疫調節薬でなければならない。
【００８８】
血栓、炎症またはアポトーシスで特徴づけられる不安定なアテローム性動脈硬化斑を治療または予防する場合の薬剤はこの上に示した群の薬剤から選択可能である。
【００８９】
本発明の接合体は、抗癌プロトコルの効力を向上させる抗癌薬を含んで成っていてもよい。抗癌プロトコルの向上は（１）前記接合体が異常に過度のアポトーシス負荷で特徴づけられる腫瘍組織を標的にする（後者はしばしば腫瘍の攻撃性レベルと相互に関係する）か或は（２）２波（ｔｗｏ  ｗａｖｅｓ）のアポトーシスを用いる［腫瘍内のアポトーシス過程を開始させることを目的とした標準的化学療法または放射線療法剤を１番目の波の達成で用いそして次に２番目の波のアポトーシスで抗癌剤をＰＭＢＣ−薬剤接合体（これは前記１番目の波によってもたらされたアポトーシスを起こした細胞を標的にする）として投与する］ことで達成する。このようにして腫瘍塊内の抗癌剤の局所的濃度の増加を達成すると、結果として、局所的な腫瘍死滅過程が向上する。
【００９０】
本発明の薬剤組成物の投与は公知経路のいずれかで成されてもよく、とりわけ、経口、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、舌下、眼内、鼻孔内または局所的投与で成されてもよい。その担体は所望投与様式に従って選択されるべきであり、それには公知の如何なる成分も含まれ、例えば溶媒、エマルゲーター（ｅｍｕｌｇａｔｏｒｓ）、賦形剤、タルク、風味剤、着色剤などが含まれる。望まれるならば、本薬剤組成物にまた当該病気の治療で用いられるか、副作用をなくすか或は本活性成分の活性を増大させる他の薬学活性（ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｌｙ−ａｃｔｉｖｅ）化合物を含有させることも可能である。
【００９１】
本発明は、また、薬剤を含んで成るＰＭＢＣ、即ちＰＭＢＣ接合体を薬剤の調製で用いることにも関する。
【００９２】
本発明に従う使用は、好適には、ＰＭの存在で特徴づけられる病気および／またはＰＭが病因または病原の役割を果たす病気を治療および検出する薬剤を調製する使用である。そのような病気の例はこの上に挙げた例である。
【００９３】
この面に従い、本発明は、更にその上、ＰＭが生じることで現れる病気の治療を向上させる方法に関し、この方法は、そのような治療を必要としている個人にＰＭＢＣ接合体（この接合体は前記病気の治療として活性を示す薬剤を含んで成る）を有効量で投与することを含んで成る。このような接合体を用いると、当該薬剤がＰＮＯＭを被った組織を選択的に標的にすることが可能になり、従って、それの局所的濃度が増加することで、それが標的部位で示す治療効果が向上し得る。そのような医学的障害はこの上で定義した障害である。
【００９４】
用語「有効量」は、当該病気の少なくとも１種の不利な徴候を測定可能な効果に至るまで減少させ得る量を指し、この量は、使用する薬剤、投与様式、患者の年令および体重、病気のひどさなどに従って選択されるべきである。
【００９５】
「除去アプローチ」と呼ぶ３番目のアプローチを用いて、ＰＭＢＣがＰＭに特異的に結合する特性を利用することでＰＭを有する細胞、粒子、微細粒子または何らかの構造物を体液から取り除く。この体液は好適には血液または血液産物である。
【００９６】
体外循環が要求される数多くの手術または医学的介在は血液の要素が外来の人工環境にさらされることを伴う。それによってしばしば血液細胞の活性化および損傷、全身性炎症および血栓塞栓現象がもたらされ、それによって重大な臨床的結果、例えば神経学的機能障害などがもたらされ得る。従って、前記損傷を受けたか、活性化を受けたか或はアポトーシスを起こした血液細胞を検出して除去するのが望ましい。
【００９７】
従って、本発明は、固体状支持体に固定させたＰＭＢＣに関する。前記固定は共有または非共有結合のいずれかによる直接結合またはスペーサー（ｓｐａｃｅｒ）を通した結合で実施可能である。そのようなＰＭＢＣの固定化はＰＭ細胞またはＰＭ含有構造物を体液から除去することを意図したものである。
【００９８】
用語「ＰＭ細胞」は、膜がＰＮＯＭを起こした細胞に関する。それには、血液または血液産物の場合、典型的に、活性化を受けたか、アポトーシスを起こしたか或は損傷を受けた赤血球、白血球、血小板、血小板由来微細粒子、組織マクロファージおよび内皮細胞が含まれる。
【００９９】
用語「ＰＭ含有構造物」は、ＰＮＯＭを伴う膜を有する細胞成分および／または非細胞成分の凝集物を指す。この用語は典型的に微細栓子（ｍｉｃｒｏｅｍｂｏｌｉ）を指し、この微細栓子は凝固前粒子および凝固前細胞である。前記微細栓子には活性血小板、血小板誘導微細粒子、血小板−フィブリン凝固体、損傷を受けた細胞、老化した細胞、アポトーシスを起こした内皮細胞および血液細胞、アポトーシス体および細胞の屑が含まれる。そのような要素はＰＭで特徴づけられ、そして前記微細栓子は小さい末端血管の中に留まり、それらを塞ぎそして／または局所的血栓を開始させることで局所的虚血を引き起こす。実際、いろいろな器官の毛細管、注目すべきは、中枢神経系の中にそのような微細栓子が広範に留まることが心臓手術中に心肺バイパスを付けた後の器官の損傷および機能障害の病原にとって重要な要因であると現在考えられている（Ｐｕｇｓｌｅｙ，Ｗ．他、１９９４）。
【０１００】
本発明の文脈における用語「固体状支持体」は固体状マトリックス（ｍａｔｒｉｘ）、不溶なマトリックスおよび不溶な支持体を指す。本発明に従う固体状支持体はいろいろな構造、例えば微細粒子の積み重ね、ミクロフィルターまたはミクロキャピララ（ｍｉｃｒｏ  ｃａｐｉｌｌａｒａ）などの状態で成形可能であり、これをいろいろな材料、例えばアルミナ、ケイソウ土、セライト、炭酸カルシウム、硫酸カルシウム、イオン交換樹脂、シリカゲル、炭、アンバーライト、ダウエックス（ｄｏｗｅｘ）、ユーペルギト（Ｅｕｐｅｒｇｉｔ）およびエチルソフォキシセルロース（ｅｔｈｙｌｓｏｆｏｘｙｃｅｌｌｕｌｏｓｅ）などで構成させてもよい。
【０１０１】
本発明の好適な態様に従う固体状支持体は多数の球であることを特徴とし、これらにＰＭＢＣを結合させる。そのような球は好適には樹脂被覆球である。別法として、そのような球は磁性球であってもよい。
【０１０２】
このような固体状支持体が多数の繊維またはミクロキャピララ（これらの間および／または中を体液が流れる）を含有する場合、それらの内側および／または外側面をＰＭＢＣで覆う。
【０１０３】
固体状支持体に固定された化合物がフィルター装置の一部を形成するようにする。従って、除去アプローチに従い、本発明は、更に、前記固定状支持体に固定されたＰＭＢＣを含有するハウジング（ｈｏｕｓｉｎｇ）と流体入り口と流体出口を含んで成るフィルター装置にも関する。体液、例えば血液または血液産物などは前記入り口を通って前記ハウジングの中に入り込んで、このハウジングの中に含まれている固定されたＰＭＢＣに接触して接着する。このようにして、乱れた膜を有する循環している細胞、例えば損傷を受けたか或は死亡した細胞などを体液から取り除くか或は乱れた膜を有する大きな構造物、例えば栓子などを取り除く。その結果として、前記出口から出て来る流体に入っている前記ＰＭ含有細胞またはＰＭ含有構造物の含有量は低いか或はそれの含有量は本質的にゼロである。
【０１０４】
そのようなフィルター装置が体外循環装置の取り替え可能か、永久的か或はアドオン（ａｄｄ−ｏｎ）部分を形成するようにしてもよい。従って、本発明は、また、前記フィルター装置を含んで成る体外循環装置にも関し、この場合、前記体外循環装置の中を循環する血液はまた前記フィルター装置の中も通る。
【０１０５】
そのような装置の例は心肺バイパス装置、血液透析装置、血漿搬出装置および輸血装置、例えば最新技術の輸血用バッグなどである。
【０１０６】
この除去面では、また、ＰＭ含有細胞またはＰＭ含有構造物を生物学的流体、好適には体液から除去する方法も提供する。この方法は、前記体液を固体状支持体に固定させたＰＭＢＣにＰＭ含有細胞またはＰＭ含有構造物がＰＭＢＣと結合する条件下で充分な時間接触させることで前記ＰＭ含有細胞もしくは粒子の少なくとも一部を体液から除去することを含んで成る。
【０１０７】
粒子を流体から除去する時の前記体液（例えば血液または血液誘導産物）と前記固定ＰＭＢＣの接触は本技術分野で公知の如何なる方法で実施されてもよく、特に体液を本発明のフィルター装置に通して流すことでその中に存在する微細栓子の少なくとも一部を血液から除去することで実施可能である。
【０１０８】
本発明の方法を用いて潜在的に有害なＰＭ含有細胞またはＰＭ含有構造物（注目すべきは微細栓子）を血液から除去することで、体外循環を伴う処置、例えば心肺バイパスが必要な手術などの臨床結果を向上させることができ、それによって、そのような処置中に起こる血栓塞栓の危険性を低くすることができる。実際、体外循環機から患者に至るラインに本フィルター装置を位置させることで、ＰＭ細胞または凝集物を血液から濾過することを実施することができる。別法として、血液を一時的に本フィルター装置を含んで成る系に転送することでＰＭ要素の濾過を実施した後、それによって浄化された血液を全身循環に戻すことも可能である。この方法を用いて、また、血液透析を受けている患者または血漿搬出を受けている患者の循環からＰＭ含有細胞またはＰＭ含有構造物を除去することも可能である。
【０１０９】
本方法を用いてまた輸血前の貯蔵されている血液を処理することも可能であり、それによって、その中に存在するＰＭ含有細胞またはＰＭ含有構造物の量を最小限にすることで輸血に関連したいろいろな合併症を最小限にすることができる。貯蔵されている血液を処理する場合、前記濾過方法を血液バンクで血液を処理する一部として用いてもよいか或は患者に輸血している時に用いてもよく、この場合には、前記フィルターを輸血用バッグから患者に至るラインに位置させてもよい。
図１：活性赤血球（ＲＢＣ）に対するＤＤＬの選択的結合：フローシトメトリック分析
ＲＢＣにＮ−エチルマレイミド（ＮＥＭ）およびカルシウムイオノファＡ２３１８７による処理をＣａ２＋の存在下で受けさせることで活性化を受けさせた（Ｋｕｙｐｅｒｓ  Ａ．他、１９９６、Ｂｌｏｏｄ、８７、１１７９−１１８７）。活性化を受けさせたＲＢＣおよび処理を受けさせていない対照ＲＢＣにＤＤＬ（１μＭの最終濃度）を加えた。次に、細胞にＢｅｃｋｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ細胞分類分け装置およびＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウエアを用いたフローシトメトリック（ＦＡＣＳ）分析を受けさせた。励起を３６０ｎｍ所で起こさせると発光が５３０ｎｍの所で起こった。無傷のＲＢＣはＤＤＬとの有意な結合を示さず［基本的背景蛍光（ブラックライン）と同様なブルーライン］、活性を受けたＲＢＣは有意なＤＤＣ結合を示し、このことは、ピークが高い方の蛍光値（レッドライン）の方に有意に移行することで示された。Ｘ軸に５３０ｎｍの所の蛍光を示しそしてＹ軸にＲＢＣのカウント数を示す。
図２：アポトーシスを起こした細胞にＤＤＣが選択的に結合することを示す蛍光顕微鏡写真
ヒーラー細胞を５００μＭのドーパミンに１８時間接触させることでアポトーシスを誘発させた後、それをＤＤＣ（１００μＭ）と一緒にインキュベートした。処理を受けさせなかった細胞を対照として用いた。ＩＸ７０蛍光顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ）を用いてＤＤＣ化合物の固有の蛍光の強度を測定することで細胞の可視化を実施した（３６０ｎｍの励起波長、５３０ｎｍの発光波長）。対照培養物（ａ）の無傷の細胞は染色されないままであった。それとは対照的に、アポトーシスを起こした培養物（ｂ）では、細胞の大部分が特異的にＤＤＣと結合した。ＤＤＣと結合した細胞が対照培養物の中に少量存在することは細胞の死亡過程が自然に起こったことを示しており、これは培養物の中で増殖する細胞にとって典型的である（倍率は４００倍である）。
図３：活性ＲＢＣに対するＤＤＣの選択的結合：フローシトメトリック分析
対照および活性化を受けさせたＲＢＣにＤＤＣ（５００μＭの最終濃度）を加えた後、細胞にＢｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ細胞分類分け装置およびＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウエアを用いたＦＡＣＳ分析を受けさせた。励起を３６０ｎｍ所で起こさせると発光が５３０ｎｍの所で起こった。無傷のＲＢＣ（ブラックライン）は、ＤＤＣ（ブルーライン）を添加した時に高い方の蛍光値に有意に移行することが示されなかったが、活性化を受けたＲＢＣは、ピークが高い方の蛍光値（レッドライン）に移行することで示されるように、有意により高い度合でＤＤＣと結合することで特徴づけられた。Ｘ軸に５３０ｎｍの所の蛍光を示しそしてＹ軸にＲＢＣの数を示す。
図４：活性血小板に対するＤＤＣの選択的結合：フローシトメトリック分析
血小板をコラーゲンとトロンビンに接触させることでそれに活性化を受けさせた。（ａ）は、その活性化を受けさせた血小板にＤＤＣが選択的に結合することを示すＦＡＣＳドットプロット分析（ｄｏｔ  ｐｌｏｔ  ａｎａｌｙｓｉｓ）を示している。Ｙ軸に、ＤＤＣとの結合の指標である５３０ｎｍの所の蛍光強度を示す一方、
Ｘ軸に、前方角光散乱（ｆｏｒｗａｒｄ−ａｎｇｌｅ  ｌｉｇｈｔ  ｓａｃａｔｔｅｒ）（これは細胞の直径に関係している）を示す。左側のパネルに示した対照の血小板は蛍光のレベルが低く、このことは、ＤＤＣとの結合が有意でないことの指標である。それとは対照的に、コラーゲンとトロンビンによる活性化を受けさせた血小板（右側のパネルに示す）が示した蛍光値は顕著に高く、このことは、その時点でＤＤＣで標識された血小板の分率が高いことの指標である。各パネルの上部の長方形の中に示した数は、高い蛍光値を示した血小板のパーセント（個体群の中の）を示している。（ｂ）は前記結果のＦＡＣＳヒストグラムを示しており、Ｘ軸に５３０ｎｍの所の蛍光強度を示しそしてＹ軸に起こった数を示し、ブラックラインはＤＤＣによる処理を受けさせていない対照の血小板が示した蛍光を示す一方、レッドラインは活性化を受けていてＤＤＣによって染色された血小板を示す。対照の血小板に活性化を受けさせると、ピークが高い方の蛍光値の方向に強力に移行することが示され、このことは、ＤＤＣがそのような細胞に選択的に顕著に結合したことを示している。
図５：肝臓細胞のアポトーシスをＤＤＣでインビボ検出
Ｏｇａｓａｗａｒａ他（Ｎａｔｕｒｅ、３６４：８０６−８０９、１９９３）によるモデルに従って抗Ｆａｓ  Ａｂをマウスに静脈内投与することで、肝臓細胞のアポトーシスを誘発させた。次に、抗Ｆａｓ−Ａｂで処置した動物および未処置の対照動物の両方にＤＤＣ（７０ｍｇ／ｋｇ）を注射した。２時間後、動物を屠殺して、その肝臓を取り出して凍らせた。次に、組織病理学分析［蛍光顕微鏡（６００倍の倍率）を用いて実施］用のクリオセクション（ｃｒｙｏ−ｓｅｃｔｉｏｎｓ）を調製した。（ａ）対照肝臓、（ｂ）抗Ｆａｓ−Ａｂで処置した肝臓。矢印はアポトーシスを起こした肝細胞を指している。
図６：腫瘍内のアポトーシスを起こした細胞をＤＤＣでインビボ検出してＴＵＮＥＬエクスビボ検定と相互に関係付ける：
Ｄ１２２［小さい気胞の肺の癌（ｓｍａｌｌ  ｃｅｌｌ  ｌｕｎｇ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）］の細胞をｃ５７ブラックマウスに皮下注射した。２−３ｍｍの腫瘍になるまで増殖させた後、ＤＤＣ（７０ｍｇ／ｋｇ）を静脈内投与した。２時間後、腫瘍を切り取って凍らせた。次に、組織病理学分析［蛍光顕微鏡（６００倍の倍率）を使用］用のクリオセクションを調製した。アポトーシスを起こした単細胞を青−緑色の蛍光を発する細胞として見ることができる（図６Ａ）。ＤＤＣと細胞の結合とアポトーシス過程の間の相互関係を示す目的で、また、末端デオキシヌクレオチジル−トランスフェラーゼ（ＴｄＴ）媒介ｄＵＴＰ−ビオチンニック末端標識（ＴＵＮＥＬ）染色（これは特徴的なアポトーシスを起こしたＤＮＡの開裂を検出する目的で幅広く受け入れられている方法である）を用いたエクスビボアポトーシス評価用のクリオセクションも調製した。腫瘍内のアポトーシスを起こした細胞にＤＤＣが特異的に結合することを観察して、これをＴＵＮＥＬ染色と相互に関係付けた（図６Ｂ）
図７：化学療法で誘発されてアポトーシスを起こした小腸上皮細胞をＮＳＴ７５０でインビボ検出
Ｂａｌｂ／ｃマウスにＴａｘｏｌ（３００ｍｇ／ｋｇ）とシクロホフファミド（２７ｍｇ／ｋｇ）の組み合わせを１回投与することによる処置を受けさせた。２４時間後、これらの動物にＮＳＴ７５０を１３ｍｇ／ｍｌの量で静脈注射した。２時間後に動物を屠殺して、小腸の組織に蛍光組織病理学分析を受けさせた。化学療法による処置を受けさせたマウス（Ａ）の小腸のクリプト（ｃｒｙｐｔｓ）にはアポトーシスを起こした上皮単細胞がＮＳＴ７５０で検出されることが観察されたが、化学療法を受けさせていないマウス（Ｂ）から得た組織には観察されなかった。
【０１１０】
（実施例）
実施例１：活性赤血球（ＲＢＣ）に対するＤＤＬの選択的結合
新鮮なＲＢＣにＮ−エチルマレイミド（ＮＥＭ）とカルシウムイオノファＡ２３１８７を組み合わせた処理をＣａ２＋の存在下で受けさせることで活性化を受けさせる（Ｋｕｙｐｅｒｓ  Ａ．他、１９９６、Ｂｌｏｏｄ、８７、１１７９−１１８７）ことを通して、活性化／損傷を受けたＲＢＣにＤＤＬが選択的に結合することを立証した。膜結合が起こった時に生じる固有の蛍光の強度を検出（励起の波長を３６０ｎｍにしそして発光の波長を５３０ｎｍにする）することでＤＤＬの結合を測定した。
【０１１１】
詰め込んだ新鮮な赤血球を緩衝液Ａ（１４３ｍＭのＮａＣｌ、２ｍＭのＫＣｌ、０．１％のグルコース、１０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、ｐＨ＝７．４）で初期体積の０．１になるまで希釈した後、前記緩衝液で４回洗浄した。次に、これらの細胞を緩衝液Ｂ（５５ｍＭのＮａＣｌ、９０ｍＭのＫＣｌ、０．１％のグルコース、１０ｍＭのｈｅｐｅｓ、ｐＨ＝７．４）に入れて再び懸濁させた。この上に示したように調製した細胞を無傷の対照赤血球として用いた。活性化では、細胞に２ｍＭのＣａＣｌと５μＭのカルシウムイオノファＡ２３１８７と５ｍＭのＮＥＭの組み合わせを用いた処理を受けさせた。インキュベーションを３７℃で１５−６０分間行った。次に、細胞をＢＳＡを０．１％入れておいた緩衝液Ｂで２回洗浄した後、最後にＣａＣｌ２を２ｍＭ入れておいた緩衝液Ｂに入れて再び懸濁させた。ＤＤＬを最終濃度が１μＭになるように添加した後、結合したＤＤＬの評価をＦＡＣＳ分析で実施した。
【０１１２】
図１に示すように、対照のＲＢＣはＤＤＬに有意には結合しなかった。それとは対照的に、活性を受けさせたＲＢＣはＤＤＬと顕著に結合することが示され、実際に大部分の細胞が示す蛍光が高い方の値に移行した（図１）。
【０１１３】
従って、ＤＤＬがＰＮＯＭ（この実施例では細胞に活性化を受けさせることで誘発）を起こしたＲＢＣと選択的に結合することは明らかである。
実施例２：アポトーシスを起こした細胞にＤＤＣが選択的に結合
ヒーラーＳ３細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−２．２）をＤｕｌｂｅｃｃｏの修飾Ｅａｇｌｅ培地（ＤＭＥＭ）［Ｌ−グルタミンを２ｍＭ、ペニシリンを１００単位／ｍｌ、ストレプトマイシンを１００μｇ／ｍｌ、ニスタチンを１２．５単位／ｍｌおよびウシ胎児血清（ＦＣＳ）を１０％補充］に入れて増殖させた。細胞を１０ｍｌの体積で１０ｃｍ３の培養板に密度が５ｘ１０６個の細胞／板になるように種付けして２４時間培養した後、アポトーシスを誘発させた。
【０１１４】
ドーパミン（５００μＭ）［これはアポトーシスの充分に実証された引き金である（Ｌｏｕ  Ｊ．他、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  １９９８；２７３：３７５６−３７６４）］による処理を低血清含有量（２％のＦＣＳ）の培地の存在下で１８時間行うことでアポトーシスを誘発させた。対照として用いる未処理細胞をドーパミンが入っていない増殖用培地に入れて保持した。処理後、細胞かき取り装置（ｃｅｌｌ  ｓｃｒａｐｅｒ）を用いて細胞を収穫し、１８Ｇの針が備わっているシリンジに通すことで単細胞に分離させた後、ｐＨ＝７．４のＰＢＳ緩衝液に密度が１０６個の細胞／ｍｌになるように入れて再び懸濁させた。
【０１１５】
培養物をこの上に示したように増殖させ、ＨＢＳ（ＨＥＰＥＳ緩衝食塩水；１０ｍＭのＨＥＰＥＳ；１５０ｍＭのＮａＣｌ；ｐＨ＝７．４）で２回洗浄した。当該化合物が膜と結合した時に発する固有の蛍光の強度を検出することでＤＤＣの結合を測定した（３６０ｎｍの励起波長、５３０ｎｍの発光波長）。前記結合を測定する時、細胞をＴＢＳ（Ｔｒｉｓ緩衝食塩水；１０ｍＭのＴｒｉｓ；ｐＨ＝７．４、１５０ｍＭのＮａＣｌ）で２回洗浄した。ＤＤＣを０．１ＭのＮａＰＰｉに１ｍＭの濃度で入れてｐＨ＝７．４で懸濁させた後、細胞を最終濃度が１００μＭのＤＤＣと一緒に５０μＬの全体積で２−１０分間インキュベートした。次に、細胞の蛍光顕微鏡写真を撮った。Ｏｌｙｍｐｕｓ蛍光顕微鏡（モデルＩＸ７０、３６０ｎｍの励起波長、５３０ｎｍの発光波長）を用いて観察を実施した。
【０１１６】
アポトーシス引き金による処理を受けさせたヒーラー細胞の培養物にはアポトーシスを起こした単細胞の強力な蛍光が検出された（図２Ｂ）。ＤＤＣで染色された前記細胞の分率（アポトーシスを起こした培養物の中の）は高かった。それとは対照的に、処理を受けさせていないヒーラー細胞の培養物でも培養物の中で細胞死亡過程が自然に起こったことを反映して細胞の染色が起こったが、その分率は非常に低かった（図２Ａ）。従って、ＤＤＣがＰＮＯＭ膜と選択的に結合することを通して培養物に入っているアポトーシスを起こした細胞と選択的に結合することは明らかである。
実施例３：活性赤血球（ＲＢＣ）に対するＤＤＣの選択的結合：フローシトメトリック分析：
活性化または損傷を受けた細胞である赤血球（ＲＢＣ）に対するＤＤＣの選択的結合および健康な対照ＲＢＣに対する結合の調査および実証を行った。無傷のＲＢＣにＮ−エチルマレイミド（ＮＥＭ）とカルシウムイオノファを組み合わせた処理をＣａ２＋の存在下で受けさせることで活性化を誘発した（Ｋｕｙｐｅｒｓ  Ａ．他、１９９６、Ｂｌｏｏｄ、８７、１１７９−１１８７）。
【０１１７】
新鮮なＲＢＣを得て、緩衝液Ａ（１４３ｍＭのＮａＣｌ、２ｍＭのＫＣｌ、０．１％のグルコース、１０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、ｐＨ＝７．４）で初期体積の０．１になるまで希釈した後、前記緩衝液で４回洗浄した。次に、細胞を緩衝液Ｂ（５５ｍＭのＮａＣｌ、９０ｍＭのＫＣｌ、０．１％のグルコース、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ＝７．４）に入れて再び懸濁させた。その後、これらの細胞を対照細胞として用いた。活性化では、前記細胞に２ｍＭのＣａＣｌと５μＭのカルシウムイオノファＡ２３１８７と５ｍＭのＮＥＭの組み合わせを用いた処理を３７℃で１５−６０分間受けさせた。次に、細胞をウシ血清アルブミンを０．１％入れておいた緩衝液Ｂで２回洗浄した後、最後にＣａＣｌ２を２ｍＭ入れておいた緩衝液Ｂに入れて再び懸濁させた。ＤＤＣを０．１ＭのＮａＰＰｉ、ｐＨ＝７．４にストック濃度（ｓｔｏｃｋ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ）が１ｍＭになるように溶解させることを通して、ＤＤＣと細胞の結合を測定した。最終濃度が５００μＭになるようにして結合検定を実施して、結合の度合をフローシトメトリーで評価した。
【０１１８】
図３に示すように、無傷の赤血球はＤＤＣによって有意には染色されなかった。しかしながら、ＲＢＣによる活性化を受けさせると、結果として、細胞の個体群全体が高い方の蛍光レベルへの実質的な移行を示し、このことは、ＤＤＣと結合したことを示している。従って、ＤＤＣは活性化／損傷を受けたＲＢＣと選択的に結合することは明らかである。
実施例４：活性血小板に対するＤＤＣの選択的結合
フローシトメトリック（ＦＡＣＳ）分析を用いて、ＤＤＣが活性血小板に選択的に結合することを測定した。
【０１１９】
健康な志願者から血小板が豊富な血漿を得た。１０９個の新鮮な血小板を遠心分離（５分間、３８０Ｘｇ）にかけ、洗浄した後、Ｔｙｒｏｄｅ緩衝液（１３７ｍＭのＮａＣｌ、２．８ｍＭのＫＣｌ、１ｍＭのＭｇＣｌ２、１２ｍＭのＮａＨＣＯ３、０．４ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４、５．５ｍＭのＤ−グルコースおよび１０ｍＭのＨｅｐｅｓ、ｐＨ＝７．４、０．３５％のＢＳＡ）に入れて再び懸濁させた。この精製を受けさせた血小板を氷の上に保持して、対照として用いた。
【０１２０】
活性化では、洗浄した血小板を２００μｌ用いて、これを０．０５単位／ｍｌのトロンビンと５μｇ／ｍｌのコラーゲンの混合物と一緒に１ｍｌの最終体積で２ｍＭのＣａＣｌ２の存在下３７℃で５分間インキュベートした。インキュベーション後の血小板を遠心分離（１０４ｒｐｍで２分間）にかけた後、１ｍｌのＴｙｒｏｄｅ緩衝液に入れて再び懸濁させた。
【０１２１】
活性化を受けさせた血小板および処理を受けさせていない対照血小板を１０μＭのＤＤＣと一緒に室温で５分間インキュベートした。次に、これらの血小板にＢｅｃｋｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ細胞分類分け装置およびＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウエアを用いたフローシトメトリー（ＦＡＣＳ）による分析を受けさせた。励起を３６０ｎｍの所で起こさせそして発光を５３０ｎｍの所で測定した。図４Ａに、活性化を受けさせた時に血小板がＤＤＣと結合した分率を示す。対照の血小板ではこれがＤＤＣと結合する分率は少しのみ（個体群の３．６％）であったが、血小板に活性化を受けさせると血小板個体群の８１％が顕著なＤＤＣ結合を取得し、このことは、蛍光強度が高い方に顕著に移行することで示された。図４Ｂに示したＦＡＣＳヒストグラムで分かるように、活性化に伴って血小板個体群の全体が高い方の蛍光強度の方向に大きく移行した。従って、ＤＤＣはＰＮＯＭを検出することを通して活性化を受けた血小板と活性化を受けていない血小板の間を区別する効力のある作用剤として働き得る。
実施例５：アポトーシスを起こした細胞にＤＤＣがインビボで選択的に結合
アポトーシスを起こした細胞をインビボで選択的に検出することはいろいろな診断および治療的臨床用途を有する。ＤＤＣがそのような仕事を行う可能性を立証する目的で、抗Ｆａｓ抗体を静脈内投与することによって誘発させた充分に特徴づけられたインビボ肝アポトーシスモデルを用いた（Ｏｇａｓａｗａｒａ他、Ｎａｔｕｒｅ、３６４：８０６−８０９、１９９３）。マウスを抗Ｆａｓモノクローナル拮抗性抗体で処理することで肝細胞のアポトーシスを誘発すると、それによって、動物の死亡が数時間以内にもたらされる。この試験にＤＤＣを抗Ｆａｓ−Ａｂを注射しておいたマウスにばかりでなく未処置の対照動物にも静脈内投与することを含めた。次に、蛍光組織病理学試験を実施してＤＤＣの結合レベルを評価した。
【０１２２】
５週令のオスＢＡＬＢ／ｃマウスに精製ハムスター抗Ｆａｓ  ｍＡｂ（Ｊｏ２、ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ、サンディエゴ、ＣＡ）を動物１匹当たり１０μｇの量で静脈内注射した。次に、マウスにＤＤＣを７０ｍｇ／Ｋｇの量で静脈内注射した。注射を抗体処理して３０分後に実施した。対照動物には抗体投与なしにＤＤＣのみを注射した。全ての動物を抗体投与して３時間後に屠殺した後、器官を取り出した。各小葉（ｌｏｂｅ）の中央部分を横方向に横切るように肝臓を切断し、直ちに液体窒素に浸けた後、２４時間かけて−８０℃に移行させた。次に、器官をＯＣＴ溶液に移した後、クリオセクション（５μｍ）を調製した。これらのセクションの蛍光顕微鏡写真を撮った。前記細胞の特徴的なアポトーシス形態を同時に評価する目的で並列に置いたセクションをヘマトキシリン／エオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色することで、ＤＤＣの結合を立証する。
【０１２３】
ＤＤＣを注射した対照動物は肝臓セクションに有意な蛍光を示さなかった、即ちＤＤＣとの有意な結合は観察されなかった（図５Ａ）。それとは対照的に、抗Ｆａｓ  Ａｂによる処置を受けさせた動物から得た肝臓ではアポトーシスを起こした数多くの細胞にＤＤＣが特異的に顕著に結合したことが観察された（図５Ｂ；矢印はアポトーシスを起こした細胞の数個を示している）。Ｈ＆Ｅ染色を用いた比較により、実際、ＤＤＣ結合を示した細胞は特徴的なアポトーシス形態を有することが立証された。
【０１２４】
従って、これらの実験は、ＤＤＣを全身投与することでアポトーシスを起こした細胞をインビボで検出することができかつＤＤＣがアポトーシスを起こした細胞にインビボで選択的に結合することを実証している。
実施例６：腫瘍内のアポトーシスを起こした細胞をＤＤＣでインビボ検出
一次腫瘍（ｐｒｉｍａｒｙ  ｔｕｍｏｒ）の特徴の１つは、腫瘍性細胞の増殖と平行して腫瘍細胞のアポトーシスが起こることにある。一次腫瘍内で起こる増殖とアポトーシスの間の正味の均衡が重要な予後要因でありかつ転移の指標であることは現在明らかである（Ｎａｒｅｓｈ，Ｋ．Ｙ．他、Ｃａｎｃｅｒ、９１：５７８−５９４、２００１）。アポトーシスを起こした細胞の率が高いと、それに伴って腫瘍の悪性度合がより高くかつ予後がより劣る。従って、腫瘍内のアポトーシス負荷をインビボで評価する非侵入性（ｎｏｎ−ｉｎｖａｓｉｖｅ）診断および予測ツールは恐らく臨床腫瘍学の重要な用途を有するであろう。
【０１２５】
従って、腫瘍内のアポトーシスを起こした細胞を検出する目的でＤＤＣを用いた。Ｄ１２２腫瘍細胞を１２週令のｃ５７ブラックマウスに動物１匹当たり０．５ｘ１０６個の細胞の数で皮下注射することでＬｅｗｉｓ肺癌の一次腫瘍（３ＬＬ）を誘発させた。Ｅｉｓｅｎｂａｃｈ  Ｌ．他（Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ、３４：５６７−５７３、１９８４）が記述したようにして腫瘍細胞系を維持した。注射して２週間後に２−３ｍｍの腫瘍を観察し、動物にＤＤＣを７０ｍｇ／ｋｇの量で静脈内注射した。２時間後、腫瘍を切り取った後、液体窒素に入れて急速に凍らせた。次に、クリオセクションを調製して、これに組織病理学分析［蛍光顕微鏡（６００倍の倍率）を使用］を受けさせた。
【０１２６】
ＤＤＣを全身投与することで腫瘍内のアポトーシスを起こした細胞をインビボで検出することができることを図６Ａに示す。そのような検出によって腫瘍のアポトーシス指数（ａｐｏｐｔｏｔｉｃ  ｉｎｄｅｘ）（ＡＩ）を計算することができる。ＤＤＣを用いた時に達成した前記指数が実際に前記腫瘍の中のアポトーシス負荷を示していることを実証する目的で、ＴＵＮＥＬによる並行染色、即ちアポトーシスを起こした特徴的な染色体間（ｉｎｔｅｒｎｕｃｌｅｏｓｏｍａｌ）ＤＮＡ開裂を検出する充分に受け入れられる方法を用いた（図６Ｂ）。両方の検出方法を用いて観察した腫瘍内のアポトーシスを起こした細胞の数は同様であり得る。従って、ＤＤＣを用いて腫瘍内のアポトーシス負荷をインビボで検出することができる。それを静脈経由で全身投与して腫瘍のＡＩをインビボで測定した時の感度は、組織セクションに関してエクスビボで行ったＴＵＮＥＬ手順で達成した直接的特徴付けと同様である。
実施例７：化学療法で誘発されてアポトーシスを起こした小腸上皮細胞をＮＳＴ７５０で検出
癌にかかった患者に化学治療を施している間に胃腸障害がしばしば観察される。特に、化学療法および照射に対する初期の反応として小腸のクリプトに上皮アポトーシスが現れる（Ｋｅｅｆｅ，Ｄ．Ｍ．Ｋ．他、Ｇｕｔ、４７：６３２−６３７、２０００）。従って、化学療法を１回のみ受けさせることによる処置を受けさせた健康なマウスの小腸にアポトーシス過程が起こることをインビボで検出する能力を有するか否かの評価をＮＳＴ７５０化合物に受けさせた。
【０１２７】
１２週令のＢａｌｂ／ｃマウスまたはＳｗｉｓｓマウスにＴａｘｏｌ（３００ｍｇ／ｋｇ）とシクロホフファミド（２７ｍｇ／ｋｇ）の組み合わせを静脈経由で１回投与することによる処置を受けさせた。化学療法を受けさせなかった動物を対照として用いた。２４時間後、全ての動物にＮＳＴ７５０を１３ｍｇ／ｋｇの量で静脈注射した。２時間後に動物を屠殺して、小腸を凍らせてクリオセクションを調製することで、蛍光顕微鏡写真を撮った。
【０１２８】
化学療法による処置を受けさせたマウスの小腸クリプトにはアポトーシスを起こした多数の細胞（これはＮＳＴ７５０と強力に結合する）が検出された（図７Ａ）。それとは対照的に、処置を受けさせていない対照動物ではＮＳＴ７５０による有意な染色は観察されなかった（図７Ｂ）。従って、ＮＳＴ７５０は化学療法によって誘発されてアポトーシスを起こした小腸上皮細胞と選択的に結合してそれを検出することは明らかであった。これは化学療法のそのような副作用を早期かつ敏感に監視するツールを提供するものである（抗癌治療を１回施してからほんの２４時間後でも）。従って、ＮＳＴ７５０が示すそのような活性は抗癌治療を最適にしようとする時に重要な臨床適用を示し得る。
実施例８：ＮＳＴ７５０の合成
ＮＳＴ７５０の合成を下記のスキームに従って実施した：
【０１２９】
【化２９】
2004528275.tif 000015
【０１３０】
Ｌ−アスパラギンとカルボベンゾキシ（Ｚ）クロライドをジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）の存在下で６３％の収率で反応させた。Ｚで保護されたアスパラギン２（５０ｇ）をジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）が５００ｍＬで水含有量が１００ｍＬの混合物に入れて０℃に冷却した後、これに８５ｇのビス−トリフルオロアセトキシヨードベンゼンを一度に入れることで処理した。撹拌を０℃で１０分間行った後、この反応物に３１ｍＬのピリジンを１５分かけて滴下することで処理した。この溶液をＲＴで一晩撹拌した。この反応物に濃縮を真空下４５℃で受けさせた後、その結果として得た油状物を水が５００ｍＬでエタノールが２００ｍＬの混合物に溶解させた。この溶液のｐＨをピリジンで５．０に調整した後、結果として生じたかさ高い沈澱物を真空濾過で集めた。この固体を２００ｍＬのジクロロメタンで洗浄した後、真空下４０℃で乾燥させることで、３を７０％の収率（３１ｇ）で得た。Ｚで保護された誘導体３（３１ｇ）を中間体４に８０％の収率で変化させた。ヨードメタンをジアザビシクロウンデセン（ＢＤＵ）の存在下で加えることで同様にメチルエステル５をほとんど定量的に得た。前記Ｚ保護基を水添で除去することで２−アミノ−４−Ｂｏｃアミノメチルブチレート（６）を得た。
【０１３１】
メタノールと塩化アセチルから前以て生じさせておいた溶液にイソセリン１１を窒素下で加えた。２時間の還流後に反応が完了したと判断した。この反応混合物に濃縮乾固を受けさせた後、その結果として得た油をメタノール／ジオキサンの混合物に溶解させ、ＤＩＰＥＡで処理した後、ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）−無水物を添加した。通常の処理を行った後、３０％ＥｔＯＡｃ／ヘプタンを溶離剤として用いたフラッシュカラムクロマトグラフィーで粗反応混合物を精製することで１３を９５％の収率で得た。次に、化合物１３にＤｅｓｓ  Ｍａｒｔｉｎ試薬を用いた酸化を受けさせることで２−ケト−４−Ｂｏｃアミノメチルブチレート７ａを６０％の収率で得た。
【０１３２】
ケト−エステル７ａの還元連成を１．３−１．５当量のアミン６、酢酸および硫酸マグネシウムの存在下において４０℃で実施した。次に、水添（炭に担持させたパラジウム、５０ｐｓｉ、１２時間）を行うことで、結果として、８をジアステレオマーの混合物として得た（５３％の収率）。
【０１３３】
ジアステレオマーの混合物である化合物８（０．２５ｇ）にジオキサン中２ＮのＮａＯＨを用いたメチルエステル加水分解をＲＴで２時間受けさせた。この反応混合物に更に濃縮乾固を受けさせることで白色固体を０．４ｇ得た。相当する固体を６ｍＬのジオキサンに入れて懸濁させた後、２ＭのＨＣｌ／エーテル溶液を５ｍＬ用いて処理した。次に、この反応物に濃縮を受けさせ、その残留物を水／ジオキサンに溶解させた後、ＤＩＰＥＡでｐＨを９．２に調整した。その結果として得た溶液をダンシルクロライド（２当量）の溶液で処理すると同時に反応物のｐＨを約９．２に保持した。これが完了した後、反応物を水（１０ｍＬ）で希釈してエーテルで洗浄した。エーテル層を廃棄した後、水層を酢酸エチルで覆い、そして２ＭのＨＣｌを用いて酸性にすることでｐＨを４．０にした。その有機層を食塩水で洗浄した後、無水硫酸マグネシウムで乾燥させた。濃縮乾固を行うことで明黄色の固体を１６０ｍｇ単離した。この固体にメタノール／エーテル混合物を用いた結晶化を受けさせることで黄色の固体であるイミノ−ビス２−（３−ダンシルアミド）−プロピオン酸（ＮＳＴ７５０）を１００ｍｇ得た。１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＣＤ３ＯＤ）、δ  ８．５８（ｂｍ、２Ｈ）、８．４−８．２（ｂ、４Ｈ）、７．６（ｂ、４Ｈ）、７．２５（ｂ、２Ｈ）、３．５−３．０（ｂ、４Ｈ）、２．９（ｓ、１２Ｈ）、１．４（ｍ、２Ｈ）。ＭＳ（ＥＳＩ）６５８．２（Ｍ＋Ｈ）。
実施例９：ＮＳＴ７４０の合成
ＮＳＴ７４０の合成を下記のスキームに従って実施した：
【０１３４】
【化３０】
2004528275.tif 000016
【０１３５】
ビス−トリフルオロアセトキシヨードベンゼンを用いてカルボベンゾキシ（ｃｂｚ）−Ｄ−アスパラギン１を２−ｃｂｚ保護２，３−ジアミノプロピオン酸２に非常に良好な収率で変化させた。２（７．２ｇ）を塩化アセチルとメタノールの溶液に入れて還流させることでメチルエステルの塩酸塩を定量的収率で得た。この塩を更に無水ジクロロメタンに入れて懸濁させた後、２．５当量のトリエチルアミンで処理した。透明な溶液を得た後、この得た溶液をダンシルクロライドの溶液で処理した。撹拌をＲＴで一晩行うと反応が完了した。この反応混合物を１００ｍＬのジクロロメタン（ＤＣＭ）で希釈した後、逐次的に飽和重炭酸ナトリウム水溶液（２ｘ１００ｍＬ）、水（１００ｍＬ）そして食塩水で洗浄した。その結果として得た有機溶液に乾燥（ＭｇＳＯ４）そして濃縮乾固を受けさせた。その結果として得た油をシリカゲル使用クロマトグラフィー（１０％ＥｔＯＡｃ／ＣＨＣｌ３）にかけることで３を７２％の収率で得た。この材料の一部（３．５ｇ）に加水分解をテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）／ＭｅＯＨ混合物中で受けさせ、通常の処理を行うことで、４を明黄色の固体として３．４ｇ得た。同時に、５．６ｇの３にカルバミン酸ベンジルの除去を受けさせることでアミノエステル５を良好な収率で得た。４（０．５ｇ）に１当量のジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）とＮ−ヒドロキシスクシニミド（ＮＨＳ）による処理を５時間受けさせると結果として所望ＮＨＳエステルへの変換が８３％の収率で完了した。このエステルを更に無水ＴＨＦに溶解させた後、等モル量の５で処理した。６時間後、この反応混合物を酢酸エチルで希釈した後、飽和ＮＨ４Ｃｌで洗浄することで、ＮＨＳの副生成物を除去した。その有機層を更に硫酸マグネシウムで乾燥させた後、濃縮乾固することで、ジペプチド６を７７％の収率で０．８ｇ得たが、これの純度はＨＰＬＣ分析で＞９５％であった。その後、このメチルエステルに水酸化ナトリウムを用いた加水分解をジオキサン中で受けさせた後、カルボベンゾキシ保護基を通常様式（Ｈ２／Ｐｄ）で除去することで、２−（３−ダンシルアミド−２−アミノ−プロピオンカルボキサミド−３−ダンシルアミド−プロピオン酸（ＮＳＴ７４０）を得た。１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＣＤ３ＯＤ）、δ  ８．５３（ｄｄ、２Ｈ、Ｊ＝８．５、８．６Ｈｚ）、８．３４（ｄ、Ｊ＝８．６７Ｈｚ、１Ｈ）、８．２４（ｄｄ、Ｊ＝８．６、７．３Ｈｚ、２Ｈ）、８．１２（ｄ、７．３２Ｈｚ、１Ｈ）、７．５（ｍ、４Ｈ）、７．２６（ｄ、Ｊ＝７．５６Ｈｚ、１Ｈ）、７．１９（ｄ、Ｊ＝６．９８Ｈｚ、１Ｈ）、４．１８（ｔ、Ｊ＝４．３４Ｈｚ、１Ｈ）、３．６５（ｔ、Ｊ＝３．４５Ｈｚ、１Ｈ）、３．２（ｍ、４Ｈ）、２．８５（ｓ、１２Ｈ）。ＭＳ（ＥＳＩ）６５７．１６（Ｍ＋Ｈ）。
実施例１０：ＮＳＴ７５１の合成
ＮＳＴ７５１の合成を下記のスキームに従って実施した：
【０１３６】
【化３１】
2004528275.tif 000017
【０１３７】
４−シククヘキセン−１，２−ジカルボキシ無水物１（３０ｇ）を触媒量の硫酸に加えて１０当量のイソプロピルアルコールと一緒にトルエンに入れて還流させた。撹拌を還流下で６時間行った後、ジイソプロピル−４−シクロヘキセン−１，２−スクシネート２を３０ｇ単離した。化合物２（７ｇ）に四酸化オスミウムに続いて酢酸鉛を用いた酸化開裂を受けさせた。通常の処理を行った後、ビス１，２（２−アセトアルデヒド）メソこはく酸ジイソプロピル３を７ｇ得て、次の段階で直接用いた。化合物３（６．８ｇ）をエタノールに溶解させた後、１当量のホウ水素化ナトリウムで処理した。撹拌を０℃で１時間行うと反応が完了し（Ｒｆ３  ０．４、Ｒｆ４  ０．１：４０％ＥｔＯＡｃ／ヘプタン）、これに１ＭのＨＣｌを注意深く添加することでクエンチを受けさせた（ｑｕｅｎｃｈｅｄ）。有機層を真空下で除去した後、水層を酢酸エチルで抽出した。それを硫酸マグネシウムで乾燥させ、濃縮を真空下で行うことで、ビス１，２（２−エタノール）メソこはく酸ジイソプロピル４を９０％の収量で６．８ｇ得た。１Ｈ  ＮＭＲ  １．３ｐｐｍ（１４Ｈ、イソプロピルエステル）、３．６ｐｐｍ（４Ｈ、ヒドロキシメチル）。
【０１３８】
ジオール４（６．８ｇ）を無水ジクロロメタンに溶解させた後、３当量のトリエチルアミンに続いて２当量のメタンスルホニルクロライドを０℃で２時間かけてゆっくり添加することで処理した。この反応混合物に飽和塩化アンモニウム溶液を添加することでクエンチを受けさせた後、有機層を集め、食塩水で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥させた後、濾過した。その濾液を濃縮乾固した後、シリカゲル使用クロマトグラフィーにかけることでビス１，２（２−メタンスルホニルエチル）メソこはく酸ジイソプロピル５を５５％の収率で４ｇ得た。
【０１３９】
ビス−メシレート５を４０℃のジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）に入れてアジ化ナトリウムで３時間処理した。通常の処理を行った後、ビス１，２（２−アジドールエチル）メソこはく酸ジイソプロピル６を９３％の収率で単離した。化合物６（２．１ｇ）をエタノール／水（３：１）の混合物に溶解させた後、これに水酸化ナトリウム（２当量）により処理を３０℃で一晩受けさせた。この反応物を水で希釈し、エタノールの大部分を真空下で除去した後、水層をエーテルで洗浄した。この水層を酢酸エチル（１００ｍＬ）で覆った後、３ＭのＨＣｌで酸性にすることでｐＨを２．５にした。濃縮を真空下で行うことでビス−酸を１．５ｇ得た。その結果として得たアジド−酸をエタノール／２ＭのＮａＯＨ（１０：１）の混合物に溶解させた後、これに炭に担持されているパラジウムを用いた水添を５０ｐｓｉの水素下で２時間受けさせた。ジアミンへの変換が完了した後、この反応混合物をセライトに通して濾過し、そしてその濾液に濃縮乾固を受けさせることで粘着性のある固体を１．５ｇ得た後、これを次にダンシルクロライドと反応させることで、ビス−１，２−（ダンシル−３−アミノエチル）メソこはく酸（ＮＳＴ７５１）を得た。１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＣＤ３ＯＤ）、δ  ８．５０（ｄ、Ｊ＝８．６Ｈｚ、２Ｈ）、８．３５（ｄ、Ｊ＝８．８Ｈｚ、２Ｈ）、８．１５（ｔ、Ｊ＝４．５Ｈｚ、２Ｈ）、７．５１（ｍ、４Ｈ）、７．１９（ｄ、Ｊ＝８．３Ｈｚ、２Ｈ）、２．８７（ｓ、１２Ｈ）、２．７５（ｍ、４Ｈ）、２．３（ｍ、１Ｈ）、２．２（ｍ、１Ｈ）、１．５（ｍ、２Ｈ）、１．２９（ｍ、２Ｈ）。ＭＳ（ＥＳＩ）６７１．０（Ｍ＋Ｈ）。
【０１４０】
本発明を理解しかつ本発明を実際にどのようにして実施することができるかが分かるように好適な態様をここに記述し、ここでは、アポトーシスまたは活性化のいずれかが理由でＰＮＯＭを起こした細胞に本発明の化合物が結合する検出を評価した。本化合物が発する固有の蛍光の強度を蛍光顕微鏡またはフローシトメトリック（ＦＡＣＳ）分析のいずれかで監視することで結合を測定した。前記好適な態様をここに添付図を参照して単なる非限定例として記述する。
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１：活性赤血球（ＲＢＣ）に対するＤＤＬの選択的結合：フローシトメトリック分析。
【図２】
図２：アポトーシスを起こした細胞にＤＤＣが選択的に結合することを示す蛍光顕微鏡写真。
【図３】
図３：活性赤血球（ＲＢＣ）に対するＤＤＣの選択的結合：フローシトメトリック分析。
【図４】
図４：活性血小板に対するＤＤＣの選択的結合：フローシトメトリック分析。
【図５】
図５：肝臓細胞のアポトーシスをＤＤＣでインビボ検出。
【図６】
図６：腫瘍内のアポトーシスを起こした細胞をＤＤＣでインビボ検出してＴＵＮＥＬエクスビボ検定と相互に関係付ける。
【図７】
図７：化学療法で誘発されてアポトーシスを起こした小腸上皮細胞をＮＳＴ７５０でインビボ検出。
【図１】
2004528275.tif 000033
【図３】
2004528275.tif 000034
【図４】
2004528275.tif 000035
【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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