(57)【要約】本発明は、少なくとも1つの水不溶性化合物およびセルロース誘導体から作成されたマトリックス上に吸着された、バチルス属の非病原性細菌の胞子の組成物に関する。本発明の組成物は、エア−流動床技術を用いて得ることができ、薬学、獣医学および栄養学の分野において有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
エア流動床技術により得ることができる、少なくとも1つの水不溶性吸着性化合物およびセルロース誘導体から作成されたマトリックス上に吸着された、バチルス属の非病原性細菌の胞子の組成物。
【請求項２】
胞子と、少なくとも1つの水不溶性吸着性化合物およびセルロース誘導体から作成されたマトリックスとの懸濁液の、エア流動床技術による処理を含む方法により得ることができることを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
組成物のグラムあたり30〜300億の胞子を含むことを特徴とする、請求項1または2に記載の組成物。
【請求項４】
組成物のグラムあたり50〜200億の胞子を含むことを特徴とする、請求項3に記載の組成物。
【請求項５】
組成物のグラムあたり約100億の胞子を含むことを特徴とする、請求項4に記載の組成物。
【請求項６】
吸着性化合物がカオリンであることを特徴とする、請求項1〜5の1つに記載の組成物。
【請求項７】
吸着性化合物が炭酸カルシウムであることを特徴とする、請求項1〜5の1つに記載の組成物。
【請求項８】
セルロース誘導体が微結晶性セルロースであることを特徴とする、請求項1〜7の1つに記載の組成物。
【請求項９】
吸着性化合物のセルロース誘導体に対する重量比が、90:10〜10:90の間であることを特徴とする、請求項1〜8の1つに記載の組成物。
【請求項１０】
両者の比が70:30〜30:70の間であることを特徴とする、請求項9に記載の組成物。
【請求項１１】
両者の比が約50:50であることを特徴とする、請求項11に記載の組成物。
【請求項１２】
ゲルカプセルまたはサッシェ中の投与量単位の形態にある、請求項1〜11の1つに記載の組成物。
【請求項１３】
各投与量単位当たり、10〜100億の胞子、50〜500 mgのカオリン、および50〜600 mgの微結晶性セルロースを含む、請求項12に記載の組成物。
【請求項１４】
各投与量単位当たり、20〜50億の胞子、50〜250 mgのカオリン、および50〜300 mgの微結晶性セルロースを含む、請求項13に記載の組成物。
【請求項１５】
各投与量単位当たり、約20億の胞子をゲルカプセル中に含む、請求項12に記載の組成物。
【請求項１６】
各投与量単位当たり、約60億の胞子をゲルカプセル中に含む、請求項12に記載の組成物。
【請求項１７】
胞子がバチルス・サチリスまたはバチルス・クラウシイの胞子であることを特徴とする、請求項1〜16の1つに記載の組成物。
【請求項１８】
胞子がバチルス・クラウシイI-273、I-274、I-275およびI-276から選択される1つ以上の株に由来することを特徴とする、請求項17に記載の組成物。
【請求項１９】
胞子が異なるバチルスの胞子の混合物であることを特徴とする、請求項１〜16の1つに記載の組成物。
【請求項２０】
請求項1〜19の1つに記載の組成物を含む医薬品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、薬学、獣医学、栄養学の分野における使用のための、非病原性細菌の胞子を含む固体組成物、特に、バチルス属細菌の胞子を含む組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトまたは動物に投与する目的のために胞子を処方することは、それが生物材料を含むことから、もし不適切な方法が用いられた場合に、かなりの部分の有効成分を失う危険性があるので、困難であり、問題がある。
種々の胞子を基礎とする固体組成物が知られている。これらは、例えば凍結乾燥または「噴霧乾燥」などの種々の技術に従って製造される；同様に、胞子の懸濁液または通常の賦形剤と胞子との単純な混合物は、コレステロールを減少させるための乳酸産生桿菌が記載されているWO 99/49877などの薬学上の技術から公知である。
【０００３】
従来技術の主な欠点の一つは、適度に長い期間の貯蔵を許容せず、胞子の特性をできるだけ変化しないように保つために組成物を使用前に低温に貯蔵し保存することを必要とする臨界係数に起因する、組成物の低い安定性である。
従来技術の組成物の他の欠点は、実際の組成物に導入され得る有効成分の、したがって胞子の濃度の低さである。
【０００４】
胞子を基礎とする液体組成物は市場で入手可能であり、例えば商標「Enterogermina（登録商標）」の下で、長期間イタリアで販売されているバチルスの胞子の懸濁物がある。この懸濁物は、効果的で消費者に長期間好まれているが、有効成分を非常に高濃度（20億の胞子/5 mlより多く）で含有することができない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的は、製造が単純で貯蔵が容易であり、多量の有効成分を含み、長時間安定である、非病原性細菌の胞子（以下、単に「胞子」という）をベースとする固体組成物を提供することである。
今回、エア流動床技術を用いて、適切なマトリックス上に胞子を吸着させることにより、工業的な点で扱いやすく、非常に安定な、非常に高濃度での胞子の固体形態が得られることが見出された。
特に、この固体形態（以下、「組成物」という）は、マトリックスに多量の胞子が付着することを可能にし、高濃度の固形組成物を創り、その粒子サイズおよび比表面積が胃腸管で胞子をインビボ(in vivo)放出するのに特に適していることが見出された。
これに加えて、組成物は優れた流動特性を有し、その結果として、後処理に付する必要なく、単回投与量または複数回投与量の組成物に製剤化する目的のために、それを工業的に取り扱うことができる。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
よって、本発明の一つの観点によると、本発明は、エア流動床技術により得ることができる、少なくとも1つの水不溶性化合物およびセルロース誘導体から作成されたマトリックス上に吸着された、バチルス属の非病原性細菌の胞子の組成物に関する。
より詳しくは、本発明は、上記胞子と、水不溶性吸着性化合物およびセルロース誘導体から作成されたマトリックスとの懸濁液の、エア流動床技術による処理を含む方法により得ることができる、バチルス属の非病原性細菌の胞子の組成物に関する。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
本発明によると、「吸着性化合物」の語句は、摂取可能な、吸着特性を有するいずれの化合物または化合物の混合物を表す；好ましくは、水不溶性吸着性化合物は、クレイ、カオリン、炭酸カルシウム、コロイドシリカ、マグネシウムシリケートおよびアルミニウムシリケート、ならびにセルロースおよびベントナイトの誘導体からなる群から選択され、カオリンが特に好適である。
本発明によると、「セルロース誘導体」の語句は、入手可能であり広く市販されている、例えば微結晶性セルロース、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースなどの摂取可能なセルロースのいずれかの誘導体を意味し、微結晶性セルロースが特に好ましい。
【０００８】
明白に示されていない場合であっても、本発明の組成物の成分は全て、ヒトおよび／または動物に摂取され得るものであり、すなわち「非毒性」である。特に、成分の性質および品質は組成物の最終の使用に従って選択されるものであり、したがってそのタイプおよび純度は組成物の本来の使用に適し、影響を及ぼさない；それゆえ、例えば、組成物が医療を意図する場合、成分の種類および純度は医薬上の観点などから許容されるものでなければならない。
【０００９】
本発明によると、「吸着された胞子」、「吸着」または「吸着する」の表現は、該胞子がそこから消化管において放出され得るマトリックスの表面での胞子の保持を意味することを意図する。
胞子は、使用されるマトリックスの種類に依存して、いずれの付着、すなわち、可能ないかなる付着（化学的、生物学的、物理的など）によってもマトリックス上に保持され得る。
【００１０】
マトリックスを構成する2つの成分の相対的な量は、広い範囲内で変動することができる。例えば、吸着性化合物のセルロース誘導体に対する重量比は、90:10〜10:90の間、好ましくは70:30〜30:70の間、より好ましくは60:40〜40:60の間であってよく、2つの成分がマトリックス中に約50:50の重量比で存在することが好適である。
少なくとも、本発明のマトリックスは胞子に関して不活性である水不溶性混合物であり、ここで、「胞子に関して不活性である」の語句は、それが否定的に胞子に干渉しないことを意味することを意図する。
【００１１】
本発明において用い得る胞子は、好ましくは、薬学、獣医学および／または栄養学の分野で特に有用である、非病原性細菌の胞子である。本発明の組成物は、単一のバチルスの胞子または種々の混合されたバチルスの胞子を含むことができる。
好ましい観点によると、本発明の組成物は、枯草菌（バチルス・サチリス(Bacillus subtilis)）またはバチルス・クラウシイ(Bacillus clausii)の胞子を含む。
好ましくは、本発明の組成物は、受理番号：I-273、I-274、I-275およびI-276にて、CNCM、Pasteur Instituteにブダペスト条約に従って寄託された、バチルス・クラウシイ（以前のその分類名は、バチルス・サチリス）の1つ以上の株の胞子を含む。
【００１２】
当業者に公知のエア流動床技術が、本組成物を製造するのに用いられる。
この技術によると、胞子を含む水性懸濁液（以下、「濃縮懸濁液」という）を、少なくとも1つの吸着性化合物とセルロース誘導体とを混合して得られたマトリックス上に噴霧し、例えばエア流動床粒状化装置などのこの目的のために提供された装置内で、工程が継続する間、気流により常に攪拌する。
濃縮懸濁液は水性であり、非常に高い胞子濃度を示す。
【００１３】
本発明の特に好適な観点によると、濃縮懸濁液は、培地（例えばペプトンおよび無機塩をベースとする）にバチルスの1つ以上の株を植菌し、混合物を適切な温度にて48〜72時間好気条件下で培養し、枯渇した培地から蒸留水とともに細胞を遠心分離により分離し、次いで得られた懸濁液を低温殺菌することにより得られる。このような製造例を実験の部分に示す。
このようにして製造された濃縮懸濁液は、バチルスの胞子の濃度がグラムあたり100億を超え、通常、グラムあたり約150〜約200億の間か、またはそれより多い。
一般に、濃縮懸濁液は、周囲温度でその不安定性が高いので、凍結した後に保存することが好ましい。特にこの場合、濃縮懸濁液は本発明の方法において使用する直前に解凍される。
代わりに、濃縮懸濁液は、水中で凍結乾燥させた形態で保存された胞子の即席の懸濁液であってもよい。
【００１４】
本発明の方法において用いられる気流の温度は、周囲温度〜胞子が耐えられる最高温度の間である；好ましい観点によると、この方法は、40〜90℃の間、好適には60〜80℃の間の温度で行うことが好ましい。
濃縮マトリックスの噴霧および吸着が一旦終了すると、得られた組成物は続いて所望の残存水分含量、好ましくは水分含量が3％未満、好適には2％以下に到達するまで、加熱された気流により、懸濁液中に保持される。
この工程の継続時間は、噴霧される濃縮懸濁液の量、噴霧の速度および気流の温度により決められる。通常、約30 kgの量のマトリックスの処理には、この工程を終了するのに約2時間が必要である。
【００１５】
上記に示したように、本発明の組成物は非常に濃縮された形態で得ることができ、例えば最終組成物のグラムあたり30〜300億の間の胞子、例えば最終組成物のグラムあたり50〜200億の間の胞子、好適にはグラムあたり約100億の胞子の濃度を有することができ、よって少量で一定の量の胞子を投与することを可能にする。この重要な特性は、この組成物が特に使用が容易であり、例えば小さいゲルカプセルまたはサッシェに入れるか、食物またはその他の組成物に取り込むことができることを意味する。必要に応じて、組成物をもう一度、水中または他の適切な液体中に懸濁した後に投与することもできる。
【００１６】
本発明の組成物は、周囲温度を超える温度（約40℃）であっても、長期間にわたってその力価を変化させずに維持しながら、同時に安定であることが証明されている。
本発明の組成物の胞子の力価の測定は、例えば通常の培養プレート上で計数することなどのいずれの方法によっても行うことができる。
【００１７】
上記に示したように、本発明の組成物は、粒子サイズが非常に微細であるため、大きい比表面積を有しており、組成物の粒子の90％までが130μm以下の粒子サイズであり、好ましくは組成物の粒子の60％が60μm以下の粒子サイズである。
さらに、組成物は臭いまたは味を有さず、したがって食物や飲料、またはその他の組成物にそれら本来の風味を変化させることなく添加することができる。
所望により、この組成物は、最終消費者、吸収の様式またはそれを付すことが望ましい後処理のタイプにおいて機能するものとして適切に選択された添加物を、該添加物が胞子に関して不活性であることを単一の条件として、含むことができる。
例えば、滑沢剤、希釈剤など、あるいは組成物の後処理を促進するために、その流動性を増大させることができるか、またはその他の特定の物理的性質を向上させることができる、その他全ての剤を添加することが可能である。
例えば、組成物をゼラチンハードカプセルに入れることが望まれる場合には、ステアリン酸マグネシウムおよび／または微結晶性セルロースを添加することが有用であろう。
上記の添加物の代わりに、またはそれとともに、組成物に特定の香気または風味を与えることができる、香気向上剤を添加することができる。
後に添加することができる成分は、胞子の吸着前におけるマトリックスに、または本発明の方法により得られる最終組成物に、非常に簡単に添加することができる。
【００１８】
必要に応じて、組成物は後続の変形の主体となることができる；よって、それを圧縮することが望まれる場合には、公知の方法に従って組成物を顆粒化してもよいし、腸においてそれが放出されるのにかかる時間を変更するために、公知の技術に従って、放出が制御された組成物が得られるように処理してもよい。
【００１９】
組成物は、それが投与される必要性に応じて、変動し得る量で投与することができる。一般に、ヒトへの投与の場合、1日当たり100億以上、好適には1日当たり10〜80億、例えば1日当たり20、40または60億の胞子を与えることが可能であり、投与は単回投与または繰返し方式において可能である。
その投与の目的のために、本発明の組成物は、適切であれば投与量単位に製剤化することができる；例えば、その品質のため、投薬部門の専門家により選択される0、1または2号のゼラチンカプセルのようなゼラチンカプセルに容易に製剤化することができる。
【００２０】
ゲルカプセルまたはサッシェの形態における本発明の組成物を含む投与量単位は、本発明の後続の主題を表す。
例えば、これらの投与量単位は、10〜100億の上記の胞子、好適には20〜50億、50〜500 mg、例えば50〜250 mgのカオリン、および例えば50〜600 mg、例えば50〜300 mgの微結晶性セルロースを含むことができる。
これらの投与量単位は、必要により、また投与量単位の濃度に応じて、1日に1回以上投与することができる。
例えば、50〜70億の胞子、好適には約60億の胞子を含む投与量単位を製造し、該投与量単位を1日に1回のみ投与することが可能である。
【００２１】
生物材料を含むことから、微生物力価が変動することは明白である；したがって、組成物の製剤には、所期の用量に対して10〜20％の胞子を過剰に添加することが好ましい。製品に毒性がないので、このような超過はいずれにしても問題を引き起こさない。
【００２２】
ガラスまたはポリエチレン中に包装した本発明の組成物のいくつかのバッチを、異なる温度（5〜40℃）および湿度（相対湿度75％まで）におけるその性質を評価するために、安定性試験に供した。24ヵ月後の結果により、試験した全ての条件下において、組成物の力価が大きく損なわれなかったことが示された。さらに、抗生物質に対する耐性および生化学的性質を同じ条件下で評価し、製品の本来の性質と合致していることが示された。
【００２３】
本発明の組成物は、薬学、獣医学および／または栄養学の分野において有用である。
これは、特に市場で入手可能な製品であるEnterogermina（登録商標）と同様の適用性を有する；特に、本発明の組成物は、腸および免疫系統に有益な作用を示し、特に腸性微生物変質(intestinal dysmicrobism)および内因性ビタミン欠乏症の治療および予防、ならびに例えばヘリコバクター・ピロリ(Helicobacter pylori)に対抗する抗生物質と組合わせた使用に適しているので、抗生物質または化学療法による治療後に変化した腸の微生物相の回復における補助剤治療に好適である。
本発明の主題は、上記で定義した細菌の胞子の組成物を含む医薬品でもある。
【００２４】
以下の実施例は本発明を説明するが、それを限定しない。
濃縮懸濁液の製造
5億の胞子/mlの濃度のバチルス・クラウシイの4つの株、I-273、I-274、I-275およびI-276（等しい割合）の懸濁液600 mlの予備発酵を、30リットルの発酵培地で7時間行う。予備発酵した懸濁液をペプトンおよび無機塩をベースとする1000リットルの発酵培地に植菌する；好気条件下に、37℃で48〜72時間培養を行い、最終容量が100リットルになるまで、培地から蒸留水とともに遠心分離により細胞を分離し、懸濁液を70℃で30分間、低温殺菌する。バチルス・クラウシイの胞子濃度がグラムあたり約200億である濃縮懸濁液を得る。
【００２５】
実施例1
薬剤品質のカオリン15 kgおよび薬剤品質の微結晶性セルロース15 kgをエア流動床法の系に入れ、混合物を60℃の気流により数分間加熱する。ラミナーフローフードの下で、グラムあたり200億の胞子濃度であるバチルス・クラウシイI-273、I-274、I-275およびI-276の胞子の混合物の水性懸濁液（上記のように製造した濃縮懸濁液）15 kgを、直径1.2 mmの噴霧ノズルに接続され、エア流動床装置に接続された蠕動ポンプを備えた容器に入れる。次いで胞子の濃縮懸濁液を、圧力2 barおよび流速135 ml/分で加熱した混合物に噴霧し、混合物を懸濁液中に60℃の気体とともに保持する。約110分後、系を停止し、放冷し、組成物を回収する。このようにして次の特性を示す組成物を得る：
−  力価−プレート上での計数により測定：100億の胞子/g；
−  残存水分含量 ≦2％；
−  粒子サイズ−脱塩水中で、Malvern（登録商標）レーザー粒子サイズ分析計を用いて測定：90％の粒子＜100μm、60％の粒子＜50μm；
−  比表面積：3〜5 m2/g
【００２６】
実施例2
バチルス・クラウシイI-274株のみを用いて実施例1に記載のような手順を行い、次の特性を有する生成物を得る：
−  力価−プレート上での計数により測定：100億の胞子/g；
−  残存水分含量 ≦2％；
−  粒子サイズ−脱塩水中で、Malvern（登録商標）レーザー粒子サイズ分析計を用いて測定：90％の粒子＜130μm、60％の粒子＜60μm；
−  比表面積：3.5〜5 m2/g
【００２７】
実施例3
バチルス・クラウシイI-276株のみを用いて実施例1に記載のような手順を行い、次の特性を有する生成物を得る：
−  120億の胞子/gの力価；
−  残存水分含量 ≦3％；
−  粒子サイズ−脱塩水中で、Malvern（登録商標）レーザー粒子サイズ分析計を用いて測定：90％の粒子＜130μm、60％の粒子＜60μm；
−  比表面積：3〜5 m2/g
【００２８】
実施例4
微結晶性セルロース57 gおよびステアリン酸マグネシウム3 gを、実施例1の組成物240 gに添加する。混合後、このようにして得られた組成物を蓋つき1号ゼラチンハードカプセル中に分配する。それぞれ、次の組成物300 mgを含む：
バチルス・クラウシイ(I-273、I-274、I-275、I-276)の胞子を
約20億含むマトリックス（カオリン＋微結晶性セルロース）   mg      240.00
微結晶性セルロース                                       mg      57.00
ステアリン酸マグネシウム                                 mg      3.00
【００２９】
実施例5
組成物275 mgを含む1号ゼラチンハードカプセル
バチルス・クラウシイ(I-273、I-274、I-275、I-276)の胞子を
約20億含むマトリックス（カオリン＋微結晶性セルロース）     mg      200.00*
微結晶性セルロース                                         mg      72.25
植物起源のステアリン酸マグネシウム                         mg      2.75
（* 製剤中、10％の過剰用量に相当する220.00 mg）
【００３０】
実施例6
組成物255 mgを含む1号ゼラチンハードカプセル
バチルス・クラウシイ(I-273、I-274、I-275、I-276)の胞子を
約20億含むマトリックス
（炭酸カルシウム＋微結晶性セルロース）                     mg      200.00*
微結晶性セルロース                                         mg      52.25
植物起源のステアリン酸マグネシウム                         mg      2.75
（* 製剤中、10％の過剰用量に相当する220.00 mg）
【国際公開パンフレット】
2004538311.tif 000002
2004538311.tif 000003
2004538311.tif 000004
2004538311.tif 000005
2004538311.tif 000006
2004538311.tif 000007
2004538311.tif 000008
2004538311.tif 000009
2004538311.tif 000010
2004538311.tif 000011
2004538311.tif 000012
2004538311.tif 000013
2004538311.tif 000014
【国際調査報告】
2004538311.tif 000015
2004538311.tif 000016
2004538311.tif 000017
2004538311.tif 000018