(57)【要約】本発明は神経性酸化窒素合成酵素タンパク質(nNOS)またはその変異体のうちの一つと神経性酸化窒素合成酵素の阻害タンパク質(PIN)との間の複合体形成を調節する化合物の検出方法であって、その方法においては:-本化合物、PINおよびnNOSまたはその変異体のうちの一つの混合物をインキュベートする、-対照値に対して、PINとnNOSまたはその変異体のうちの一つとの間で形成される複合体の量における有意な変化を検出する、-上記にて定義される有意な変化がある場合、PINとnNOSまたはその変異体のうちの一つとの間の複合体形成の調節に繋がる、本化合物とPINとの間の、または本化合物とnNOSもしくはその変異体のうちの一つとの間の結合が存在すると結論付ける、化合物の検出方法に関する。
2004528845.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号:2の配列の神経性酸化窒素合成酵素タンパク質(nNOS)、またはその変異体のうちの一つと神経性酸化窒素合成酵素の阻害タンパク質(PIN)との間の複合体形成を調節し、この複合体形成の調節によりnNOSまたはその変異体のうちの一つにより調節されるインスリン反応の変化をもたらす化合物の検出方法であって、その方法においては:
-以下を可能とする条件で当該化合物、PINおよびnNOSまたはその変異体のうちの一つの混合物をインキュベートする:
・PINとnNOSまたはその変異体のうちの一つとの間の複合体形成、
・当該化合物とPINとの間の、または当該化合物とnNOSもしくはその変異体のうちの一つとの間の複合体形成;
-以下に相当する対照値に対して、PINとnNOSまたはその変異体のうちの一つとの間で形成される複合体の量において任意の有意な変化を検出する:
＊試験化合物が存在しない場合のPINとnNOSもしくはその変異体のうちの一つとの間で形成される複合体の量、または
＊PINが存在しないまたはnNOSもしくはその変異体のうちの一つが存在しないことに起因して、PINとnNOSまたはその変異体のうちの一つとの間の複合体が存在しないこと、または
＊参照阻害剤が存在する場合のPINとnNOSまたはその変異体のうちの一つとの間で形成される複合体の量;および
-上記にて定義される有意な変化がある場合、PINとnNOSまたはその変異体のうちの一つとの間の複合体形成の調節に繋がる、当該化合物とPINとの間の、または当該化合物とnNOSもしくはその変異体のうちの一つとの間の結合が存在していたと結論付ける、
化合物の検出方法。
【請求項２】
nNOSおよびその変異体のうちの一つの触媒活性を実質的に変化させない化合物を識別する、請求項1記載の検出方法。
【請求項３】
本発明は神経性酸化窒素合成酵素(nNOS)またはその変異体のうちの一つと神経性酸化窒素合成酵素の阻害タンパク質(PIN)との間の複合体形成を減少させ、この複合体形成の減少によりnNOSまたはその変異体のうちの一つにより調節されるインスリン反応の減少をもたらす化合物の検出方法であって、その方法においては:
-以下を可能とする条件で当該化合物、PINおよびnNOSまたはその変異体のうちの一つの混合物をインキュベートする:
・PINとnNOSまたはその変異体のうちの一つとの間の複合体形成、
・当該化合物とPINとの間の、または当該化合物とnNOSもしくはその変異体のうちの一つとの間の複合体形成;
-以下に相当する対照値に対して、PINとnNOSまたはその変異体のうちの一つとの間で形成される複合体の量における、任意の有意な減少を検出する:
＊検出方法に供された化合物が存在しない場合のPINとnNOSもしくはその変異体のうちの一つとの間で形成される複合体の量、または
＊PINが存在しないまたはnNOSもしくはその変異体のうちの一つが存在しないことに起因して、PINとnNOSまたはその変異体のうちの一つとの間で形成される複合体が存在しないこと、または
＊参照阻害剤が存在する場合のPINとnNOSまたはその変異体のうちの一つとの間で形成される複合体の量;および
-上記にて定義される有意な減少がある場合、PINとnNOSまたはその変異体のうちの一つとの間の複合体形成の減少に繋がる、当該化合物とPINとの間のまたは当該化合物とnNOSもしくはその変異体のうちの一つとの間の結合が存在していたと結論付ける、
化合物の検出方法に関する。
【請求項４】
第一、第二および第三対照値(これらの対照値の一つは、検出方法に供された化合物が存在しない場合のPINとnNOSとの間で形成される複合体の量に相当し;一つはPINが存在しないかまたはnNOSが存在しないことに起因して、PINとnNOSとの間の複合体が存在しないことに相当し;およびもう一つは参照阻害剤が存在する場合のPINとnNOSとの間で形成される複合体の量に相当する)に対して、変化が検出される、特にPINとnNOSとの間で形成される複合体の量における任意の有意な減少が検出される、請求項1〜3項のいずれか一項記載の検出方法。
【請求項５】
PIN、nNOSおよび検出方法に供された化合物の混合物を以下:
-PIN、nNOSおよび検出方法に供された化合物を同時に添加すること、または
-PIN、検出方法に供された化合物およびnNOSを逐次添加する、またはnNOS、検出方法に供された化合物およびPINを逐次添加すること、または
-予めPINまたはnNOSとインキュベートした当該化合物をそれぞれnNOSタンパク質またはPINに添加すること
により調製する、請求項1〜4項のいずれか一項記載の検出方法。
【請求項６】
nNOSタンパク質が最初に固相基質に固定される、請求項1〜5項のいずれか一項記載の検出方法。
【請求項７】
PINが最初に固相基質に固定される、請求項1〜5項のいずれか一項記載の検出方法。
【請求項８】
PINおよびnNOSが溶液中に存在する、請求項1〜5項のいずれか一項記載の検出方法。
【請求項９】
配列番号:2の配列、または少なくとも100アミノ酸を含有する当該タンパク質の断片を、該断片が269位のアミノ酸を含有するという条件で含むか、またはそれより成ることを特徴とするタンパク質。
【請求項１０】
以下のペプチド配列:
2004528845.tif 000016
2004528845.tif 000017
2004528845.tif 000018
2004528845.tif 000019
であって、当該ペプチドは請求項1〜8項のいずれか一項記載の方法で検出されるような化合物であり、および請求項9記載のタンパク質のうちのいずれか一つよりもPINに対してより強い親和性を示すペプチド配列。
【請求項１１】
請求項9または10項記載の、タンパク質のうちの一つ、タンパク質断片のうちの一つ、またはペプチドのうちの一つをコードする核酸であって、当該核酸が配列番号:1のヌクレオチド配列を有する核酸。
【請求項１２】
薬学的に許容される運搬体と一体となった、請求項9または10記載のタンパク質、タンパク質断片、または以下の化学式を有する分子:
【化１】
2004528845.tif 000020
を含むことを特徴とする薬学的組成物。
【請求項１３】
顕性II型糖尿病だけでなく前糖尿病およびインスリン過剰状態の治療を目的とした薬剤の調製のための、請求項9記載のタンパク質もしくはタンパク質断片、または以下の化学式を有する分子:
【化２】
2004528845.tif 000021
の使用。
【請求項１４】
以下を含む、PINとnNOSとの間の複合体形成を減少させる調節化合物を検出するためのキット:
-nNOS、特にnNOSの膵臓型、
-PIN、
-希釈に必要な培地または緩衝液
-必要に応じて、洗浄に必要な物質
-PINとnNOSとの間の複合体形成、およびPINまたはnNOSと検出方法に供された化合物との間の複合体形成に必要な培地または緩衝液、
-変化、特にnNOSまたはPINと形成される複合体の量の減少を検出するための手段。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は神経性酸化窒素合成酵素(nNOS)と神経性酸化窒素合成酵素の阻害タンパク質(PIN)との間の結合の阻害剤をスクリーニングする新規の方法に関する。本発明はまた、ラットおよびヒトを含む他の全動物種のnNOSの膵臓型のほかに、このタンパク質をコードする核酸にも関する。本発明はまた、前糖尿病およびインスリン過剰状態の治療を目的とした薬剤の調製のためのタンパク質およびペプチドの利用に関する。
【背景技術】
【０００２】
神経性酸化窒素合成酵素タンパク質(NOS)は、その基質、アルギニンから酸化窒素(NO)を合成する酵素である。これには三つの型が知られている:二つは構成性のNOS型−内皮性NOS (eNOS)および神経性NOS (nNOS)−ならびにインターロイキンにより誘導される誘導性のNOS。
【０００３】
1991年にD.S. Bredtにより、ラット脳において神経性NOSが最初に同定されおよびクローン化された(Bredtら, 1991)。中枢神経系では、それは長期記憶(LTP)の役割を果たしている、そして末梢神経系では、それは血管の非アドレナリン作動性非コリン作動性(NANC)ニューロン、腸などに存在している。しかし、脳卒中のような病的状況では、過剰なNO産生は有害であり得る、そして神経毒性を引き起こすかもしれない。現在の研究はNOの神経生存への毒性作用を遮断できるnNOS阻害剤を発見することに、より重点を置いている。
【０００４】
S.R. JafferyおよびS.H. Snyder (1996)は、神経性NOSに特異的な内在性阻害因子−神経性酸化窒素合成酵素の阻害タンパク質(PIN)を同定した。この阻害因子は神経性NOS(nNOS)と、nNOSの163〜245番目のアミノ酸で相互作用し、それによりnNOSのホモ二量体化を防ぎ、そしてNO産生を遮断する。PINタンパク質は従って、nNOS活性を調節でき、細胞機能に有害なNOのいかなる過剰産生も防ぐことができる。
【０００５】
米国特許第5,908,756号は神経型NOS(nNOS)の酸化窒素の産生に関与する触媒活性を増加させるまたは減少させる化合物のスクリーニング試験に関する。PINおよび二つのnNOS単量体の混合物に試験化合物を添加し、次いでその二つのnNOS単量体のホモ二量体化におけるその効果を測定することにより、触媒活性を評価する。PINはホモ二量体化を阻害するので、試験化合物はPINと競合する。要するに、この試験は神経性NO合成酵素の触媒活性を加減する化合物を発見するために利用される。
【０００６】
II型糖尿病またはインスリン非依存性糖尿病(NIDDM)は複数因子由来の不均一性疾患であり、その発生は遺伝的並びにダイエット、過剰体重、運動不足および喫煙を含む環境的要因の双方に依存する。先進工業国の社会経済的背景と関連して、この病気は公衆衛生上の大きな問題となっている−2007年までに2億2千万人が影響を受けると推測される。
【０００７】
II型糖尿病は二つの主要な異常を特徴とし、その相対的重要度は個人間で変化する:末梢組織によるグルコースの取り込みを増加させるインスリン機能の低下、即ちインスリン抵抗性、および膵臓がインスリン抵抗性を補うために十分量のインスリンを分泌するのを困難にさせる、膵臓β細胞における分泌機能の異常。前糖尿病と呼ばれる無症状の前駆期がこれらの二つの異常に先立って起こり、それは数年から数十年まで続く可能性がある。この前糖尿病状態はインスリン不足を特徴とするのではなく、むしろ高インスリン血症を引き起こす、分泌過多を特徴とする。
【０００８】
高インスリン血症はしばしば遺伝的素因を有する患者におけるNIDDM発生の重大な危険因子である、肥満と関連付けられ、とりわけある集団では肥満およびNIDDMの発生率が非常に高い(例えば、ピマ・インディアン)。高インスリン血症はしばしばインスリン抵抗性を補うために発生するが、変換過程にあるプロインスリンおよび中間体の血漿レベルが高くなることが分泌過多およびインスリン過剰症に付随して起こる。未熟インスリンのこの不適当な分泌が、耐糖能異常を示す患者、即ち前糖尿病患者に関するほとんどの研究で見いだされている。そのようなインスリン分泌は予後不良の構成要素となる−プロインスリン／インスリン比率の増加は2〜5年以内のNIDDMおよび心血管系の合併症の発生と結び付く。
【０００９】
NIDDMの発生率が高いことから、糖尿病の異なる段階、特に前糖尿病段階およびII型糖尿病の膵臓機能不全を治療することを目的とした、より広範囲に及ぶ治療を患者に提供するために、画期的な薬剤を開発することが極めて重要であることが示唆される。
【００１０】
現在、インスリン機能不全を治療するために使用される唯一の薬剤は、スルファミド系(hypoglycemic sulfamide)およびグリニド系血糖降下剤(hypoglycemic glnide)である。しかし、前糖尿病および／またはインスリン過剰症の患者における膵臓β細胞機能不全を治療するために、これらのインスリン分泌薬剤を使用することはできない。
【００１１】
現在までに、前糖尿病および／またはインスリン過剰状態を治療するのに特に適した薬剤はない。
【発明の開示】
【００１２】
本発明はこの問題に対する解決策を提供する。
【００１３】
本発明は中でも、PINとnNOSとの間の相互作用を減少させる化合物の迅速なスクリーニングのための新規の検出方法を提供する。
【００１４】
本発明はまた、神経性NOSの触媒活性を変化させない、PINとnNOSとの間の相互作用に向けた阻害剤のための新規の検出方法を提供する。
【００１５】
最後に、前糖尿病患者、インスリン過剰患者およびII型糖尿病患者において正常なインスリン反応を回復させる化合物を検出するために、本発明を使用できる。
【００１６】
本発明は配列番号:2の配列によって表される神経性酸化窒素合成酵素タンパク質(nNOS)、またはその変異体のうちの一つと、神経性酸化窒素合成酵素の阻害タンパク質(PIN)との間の複合体形成を調節し、この複合体形成の調節によりnNOSまたはその変異体のうちの一つにより調節されるインスリン反応の変化をもたらす化合物の検出方法であって、その方法においては:
-以下を可能とする条件で本化合物、PINおよびnNOSまたはその変異体のうちの一つの混合物をインキュベートする:
・PINとnNOSまたはその変異体のうちの一つとの間の複合体形成、
・本化合物とPINとの間の、または本化合物とnNOSもしくはその変異体のうちの一つとの間の複合体形成;
-以下に相当する対照値に対して、PINとnNOSまたはその変異体のうちの一つとの間で形成される複合体の量における、任意の有意な変化を検出する:
＊試験化合物が存在しない場合のPINとnNOSもしくはその変異体のうちの一つとの間で形成される複合体の量、または
＊PINが存在しないまたはnNOSもしくはその変異体のうちの一つが存在しないことに起因して、PINとnNOSまたはその変異体のうちの一つとの間の複合体が存在しないこと、または
＊参照阻害剤(reference inhibitor)が存在する場合のPINとnNOSまたはその変異体のうちの一つとの間で形成される複合体の量;および
-上記にて定義される有意な変化がある場合、PINとnNOSまたはその変異体のうちの一つとの間の複合体形成の調節に繋がる、本化合物とPINとの間の、または本化合物とnNOSもしくはその変異体のうちの一つとの間の結合が存在していたと結論付ける、
化合物の検出方法に関する。
【００１７】
「神経性酸化窒素合成酵素タンパク質(nNOS)と神経性酸化窒素合成酵素の阻害タンパク質(PIN)との間の複合体形成の調節」とは:
-nNOSとPINとの間の複合体形成を調節する化合物の作用下における、nNOSとPINとの間で形成される複合体の量の減少であって、試験化合物が存在しない場合に相当する対照値(100 %)に対して、複合体の量が少なくとも約20 %、および好ましくは約50 %に減少している、または
-nNOSとPINとの間の複合体形成を調節する化合物の作用下における、nNOSとPINとの間で形成される複合体の量の増加であって、試験化合物が存在しない場合に相当する対照値(100 %)に対して、本複合体の量が少なくとも約120 %、好ましくは少なくとも約150 %に増加している
ことを意味する。
【００１８】
「nNOSまたはその変異体のうちの一つ」とは、全ての種、特にヒトにおいて、異なる組織で発現(点突然変異、特異的に異なる遺伝子スプライシング、またはその両方を示す可能性がある)している全ての神経性NOSを意味する。
【００１９】
「インスリン反応の調節」とは、nNOSとPINとの間の複合体形成を調節する化合物の作用下におけるインスリン反応の減少、即ち試験化合物の効果によるインスリン反応の増加を意味する。
【００２０】
nNOSとPINとの間の複合体形成を調節する化合物により誘導されるインスリン反応の調節は、以下の二つのうちの一つの条件下における細胞試験により、特にINS-1細胞株(Asfariら, 1992)を用いることにより測定できる:
-試験化合物が脂溶性であり、従って細胞膜を通過できる場合、アルブミネート化した(albuminated)Krebs-Ringer緩衝液(Asfariら, 1992)中に試験化合物を存在させ、グルコース濃度(0.5, 1.5および2 g/L)を増加させて細胞を刺激する;
-試験化合物が脂溶性ではなく、従って細胞膜を通過できない場合、黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)のα−トキシン(Maechlerら, 1997)の存在下で細胞を浸透化させ、そして試験化合物の存在下でインスリン分泌化合物(細胞中で活性)により細胞を刺激する(Maechlerら, 1997)。
【００２１】
「PINとnNOSまたはその変異体のうちの一つとの間で形成される複合体における有意な変化」とは、試験化合物が存在しない場合に相当する対照値に対して、試験化合物の作用下で形成される複合体の量が少なくとも20 %、好ましくは50 %増加または減少していることを意味する。
【００２２】
PINとnNOSとの間の複合体形成率を定量するために、本発明は放射性、蛍光若しくは発光成分、酵素またはビオチンのような物質で結合相手のうちの一つ、即ちPINおよび／またはnNOSを分子標識することを含む検出方法を利用する。この標識により、自発的なまたは酵素基質の添加若しくは光励起後の、放射(放射、発光または蛍光線)またはシグナル吸収(光または蛍光)に基づく、直接的または間接的な物理的定量測定が提供される。PINとnNOSとの間の複合体形成率を定量するために、PINまたはnNOSをバイオセンサーのチャンネルに固定化するという条件で、二つの相手のうちの一つの標識を必要としない、表面プラズモン共鳴解析(例えば、Biacore AB社)もまた、利用することができる。PINとnNOSとの間の複合体形成率を定量するために、米国特許第5,283,173号および米国特許第5,468,614号に記載されているような、酵母または細菌におけるツーハイブリッド・アッセイもまた、利用することができる。インビボで行われる、この方法はPINとnNOSの産生および精製の必要がない。
【００２３】
本発明にて説明される一つの方法として、エネルギー交換のできる物質でPINおよびnNOSを標識する場合、形成される複合体の量(またはその変化)を溶液中で決定できる。複合体が形成されると、二つの結合相手はより接近し、その結果として二つの標識間のエネルギー転移および二つの標識のうちの一つにより放射される蛍光シグナル強度の増加または減少が引き起こされる。
【００２４】
別の方法として、二つの結合相手のうちの一つを固相基板に固定化する場合、複合体の量(またはその変化)を固相で決定できる。もう一方の結合相手による結合を、表面プラズモン共鳴解析により、または上記にて定義される検出系のように、この相手を標識することにより検出する。
【００２５】
1番目の結合相手、即ちnNOSもしくはPINを、物理化学的相互作用(疎水性プラスチック表面への吸着)により、または生物特異的な相互作用(これでは生物学的センサー(1番目の結合相手に特異的な抗体、または1番目の結合相手がビオチンで被覆されている場合はアビジン)が最初にプレートに固定化されている)により、共有的(化学反応)または非共有的に固定化することができる。
【００２６】
2番目の結合相手、即ちPINまたはnNOSを、形成される複合体の量を表面プラズモン共鳴解析により直接的に、またはその標識の定量的検出により間接的に、決定するために使用する。標識は化学結合(放射性、蛍光または発光成分、酵素、ビオチン)により2番目の相手に結合した成分、もう一方の結合相手に対する抗体のような、他の生物特異的な物質(これ自体は直接的かまたは間接的かのどちらかで標識される)、またはアビジン(直接的にまたは間接的に標識される)のいずれかとすることができる。
【００２７】
対照値を以下の方法のうちの一つで得ることができる:
-PINとnNOSとの間の複合体形成がもたらされる条件で、PINとnNOSまたはその変異体のうちの一つの混合物をインキュベートする実験を行い、次いでPINとnNOSとの間で形成される複合体の量を決定し、この量を対照値とする方法;
-結果的にnNOSとPINとの間の複合体形成がもたらされない、PINのみをインキュベートする実験を行う方法、
-結果的にnNOSとPINとの間の複合体形成がもたらされない、nNOSタンパク質のみをインキュベートする実験を行う方法、
-PINとnNOSまたはその変異体のうちの一つとの間の複合体形成がもたらされる条件で、PIN、nNOSまたはその変異体のうちの一つおよび参照阻害剤の混合物をインキュベートする実験を行い、そしてPINとnNOSとの間で形成される複合体の量を決定し、この量を対照値とする方法、
-参照阻害剤とプレインキュベートしたPINを、バイオセンサー(例えば、Biacore AB社)に固定化されているnNOSに加える実験を行い、そしてPINとnNOSとの間で形成される複合体の量を例えば、表面プラズモン共鳴解析により決定し、この量を対照値とする方法。
【００２８】
参照阻害剤を例えば、配列番号:3および配列番号:4の配列のペプチドの中から選択できる。
【００２９】
前記に定義される方法を用い、PINとnNOSとの間で形成される複合体を検出できる。
【００３０】
この試験はNOSの膵臓型のインスリンを調節する特性およびその内在性阻害因子であるPINを用いることにより、II型糖尿病の早期段階、インスリン過剰状態および顕性II型糖尿病を標的にするために利用される。
【００３１】
本発明はまた、化合物がnNOSまたはその変異体のうちの一つの触媒活性を実質的に変化させないことを特徴とする、前記の検出方法にも関する。
【００３２】
「nNOSまたはその変異体のうちの一つの触媒活性を実質的に変化させない」とは、試験化合物がnNOSのNO産生活性に僅かに影響を及ぼすことができるだけであることを意味する。
【００３３】
以下の二つの可能なシナリオがある:
-本化合物がPINタンパク質にのみ結合する場合、触媒活性は変化しない、および
-本化合物がnNOSに結合する場合、本化合物の非存在下ではnNOSの基礎触媒活性は変化しないまたは僅か20〜30 %の増加若しくは減少はない。
【００３４】
例えば、BH4、FAD、FMN、NADPH、Ca2+およびカルモジュリンのような補因子の存在下で、その基質である放射標識されたアルギニンから、放射標識されたシトルリンを産生するその能力により、nNOSの触媒活性を推定できる。産生されるシトルリンをイオン交換クロマトグラフィーによりアルギニンから分離でき、そして放射活性のカウントにより定量できる。
【００３５】
本発明は神経性酸化窒素合成酵素(nNOS)またはその変異体のうちの一つと神経性酸化窒素合成酵素の阻害タンパク質(PIN)との間の複合体形成を減少させ、この複合体形成の減少によりnNOSまたはその変異体のうちの一つにより調節されるインスリン反応の減少をもたらす化合物の検出方法であって、その方法においては:
-以下を可能とする条件で本化合物、PINおよびnNOSまたはその変異体のうちの一つの混合物をインキュベートする:
・PINとnNOSまたはその変異体のうちの一つとの間の複合体形成、
・本化合物とPINとの間の、または本化合物とnNOSもしくはその変異体のうちの一つとの間の複合体形成;
-以下に相当する対照値に関して、PINとnNOSまたはその変異体のうちの一つとの間で形成される複合体の量における、任意の有意な減少を検出する:
＊検出方法に供された(submitted to)化合物が存在しない場合のPINとnNOSもしくはその変異体のうちの一つとの間で形成される複合体の量、または
＊PINが存在しないまたはnNOSもしくはその変異体のうちの一つが存在しないことに起因して、PINとnNOSまたはその変異体のうちの一つとの間で形成される複合体が存在しないこと、または
＊参照阻害剤が存在する場合のPINとnNOSまたはその変異体のうちの一つとの間で形成される複合体の量;および
-上記にて定義される有意な減少がある場合、PINとnNOSまたはその変異体のうちの一つとの間の複合体形成の減少に繋がる、本化合物とPINとの間の、または本化合物とnNOSもしくはその変異体のうちの一つとの間の結合が存在していたと結論付ける、
化合物の検出方法に関する。
【００３６】
「インスリン反応の減少」とは、試験化合物が存在しない場合に相当する対照値に対して、nNOSとPINとの間の複合体形成を減少させる化合物の作用下におけるインスリン分泌の、少なくとも約20 %、および好ましくは少なくとも約50 %の減少を意味する。
【００３７】
「PINとnNOSまたはその変異体のうちの一つとの間で形成される複合体の量における、有意な減少」とは、試験化合物が存在しない場合に相当する対照値に対して、試験化合物の存在下で形成される複合体の量が少なくとも約20 %、および好ましくは少なくとも約50 %変化していることを意味する。
【００３８】
本発明はまた、神経性酸化窒素合成酵素(nNOS)またはその変異体のうちの一つと神経性酸化窒素合成酵素の阻害タンパク質(PIN)との間の複合体形成を増加させ、この複合体形成の増加によりnNOSまたはその変異体のうちの一つにより調節されるインスリン反応の増幅をもたらす化合物の検出方法であって、その方法においては:
-以下を可能とする条件で本化合物、PINおよびnNOSまたはその変異体のうちの一つの混合物をインキュベートする:
・PINとnNOSまたはその変異体のうちの一つとの間の複合体形成、
・本化合物とPINとの間の、または本化合物とnNOSもしくはその変異体のうちの一つとの間の複合体形成;
-以下に相当する対照値に関して、PINとnNOSまたはその変異体のうちの一つとの間で形成される複合体の量における、任意の有意な増加を検出する:
＊検出方法に供された試験化合物が存在しない場合のPINとnNOSもしくはその変異体のうちの一つとの間で形成される複合体の量、または
＊PINが存在しないまたはnNOSもしくはその変異体のうちの一つが存在しないことに起因して、PINとnNOSまたはその変異体のうちの一つとの間で形成される複合体が存在しないこと、または
＊参照阻害剤が存在する場合のPINとnNOSまたはその変異体のうちの一つとの間で形成される複合体の量;および
-上記にて定義される有意な増加がある場合、PINとnNOSまたはその変異体のうちの一つとの間の複合体形成の増加に繋がる、本化合物とPINとの間の、または本化合物とnNOSもしくはその変異体のうちの一つとの間の結合が存在していたと結論付ける、
化合物の検出方法に関する。
【００３９】
「インスリン反応の増幅」とは、試験化合物が存在しない場合に相当する対照値に対して、nNOSとPINとの間の複合体形成を増加させる化合物の作用下におけるインスリン分泌の、少なくとも約20 %、および好ましくは少なくとも約50 %の増加を意味する。
【００４０】
本発明は使用されるnNOSタンパク質が、nNOSの膵臓型かまたは脳に存在する型のどちらかである、前記に定義される検出方法に関する。
【００４１】
膵臓細胞に存在するラットnNOSタンパク質は、膵臓性nNOSである。それはラット神経性NOSの変異型である。
【００４２】
ラット膵臓性nNOSは、ラット脳のnNOSに対して三つのアミノ酸変異を有する。これらの変異は酵素の機能ドメイン(上述のような補因子に対する結合領域)に、またはPINとnNOSとの間の相互作用領域に局在化していないが、それらはその三次元立体構造に大きな影響を及ぼし、そして従ってそれに膵臓特異性を与えている。
【００４３】
使用するnNOSタンパク質はまた、ラット脳に存在するラットnNOSとすることもできる。
【００４４】
本発明によれば、使用する望ましい検出方法は、三つの対照値(第一の対照値は、検出方法に供された化合物が存在しない場合のPINとnNOSとの間で形成される複合体の量に相当する;第二の対照値は、PINが存在しないまたはnNOSが存在しないことに起因して、PINとnNOSとの間で形成される複合体が存在しないことに相当する;および第三の対照値は、参照阻害剤が存在する場合のPINとnNOSとの間で形成される複合体の量に相当する)に対して、変化（即ちPINとnNOSとの間で形成される複合体の量における、任意の有意な減少）を検出することを含む、前記に定義される方法である。
【００４５】
PINとnNOSまたはその変異体のうちの一つとの間で形成される複合体の量は、前記に定義される方法のうちの一つを用いて検出できる。
【００４６】
第一の対照値を例えば、以下の実験を行うことにより得ることができる:
-PINとnNOSまたはその変異体のうちの一つとの間の複合体形成がもたらされる条件で、PINとnNOSまたはその変異体のうちの一つの混合物をインキュベートする実験、
-PINとnNOSまたはその変異体のうちの一つとの間で形成される複合体の量を決定し、この量を対照値とする実験。
【００４７】
第二の対照値を例えば、以下の実験のうちの一つを行うことにより得ることができる:
-nNOSまたはその変異体のうちの一つとPINとの間の複合体形成がもたらされない、PINのみをインキュベートする実験、
-nNOSまたはその変異体のうちの一つとPINとの間の複合体形成がもたらされない、nNOSまたはその変異体のうちの一つのみをインキュベートする実験。
【００４８】
第三の対照値を例えば、以下の実験を行うことにより得ることができる:
-PIN、nNOSまたはその変異体のうちの一つおよび参照阻害剤の混合物をインキュベートする実験、
-PINとnNOSまたはその変異体のうちの一つとの間で形成される複合体の量を検出し、この量を対照値とする実験。
【００４９】
第三の対照値はまた、以下の実験を行うことによっても得ることができる:
-参照阻害剤とプレインキュベートしたPINを、バイオセンサー(例えば、Biacore AB社)に固定化されているnNOSに加える実験、
-PINとnNOSまたはその変異体のうちの一つとの間で形成される複合体の量を決定し（即ち表面プラズモン共鳴解析により）、この量を対照値とする実験。
【００５０】
本発明によれば、使用する望ましい検出方法はPIN、nNOSおよび試験化合物の混合物を以下の方法のうちの一つで調製する、前記に定義される方法である:
-PIN、nNOSおよび検出方法に供された化合物を同時に添加する方法、
-PIN、検出方法に供された化合物およびnNOSを逐次添加する、またはnNOS、検出方法に供された化合物およびPINを逐次添加する方法、
-予めPINまたはnNOSとインキュベートした本化合物を添加し、その後それぞれnNOSまたはPINを添加する方法。
【００５１】
PIN、nNOSおよび検出方法に供された化合物の混合物を、PIN、nNOSおよび本化合物を同時に添加することにより調製する場合、PINとnNOSとの間で形成される複合体に結合する、および前記複合体を解離させる化合物のほか、その二つの結合相手、即ちPINまたはnNOSのうちの一つのみに結合し、且つ複合体形成との競合に対して十分に効果のある化合物を検出することがより容易である。
【００５２】
PIN、nNOSおよび検出方法に供された化合物の混合物を、PIN、本化合物およびnNOSを逐次添加することにより調製する場合、PINに結合する化合物を検出するほか、nNOSの望ましいリガンド(nNOSに対してμM、好ましくはnM程度の強い親和性を有するリガンド)を探索することがより容易である(この場合、それは速度論的に制限される)。
【００５３】
PIN、nNOSおよび検出方法に供された化合物の混合物を、nNOS、本化合物およびPINを逐次添加することにより調製する場合、nNOSに結合する化合物を検出するほか、PINの望ましいリガンド(PINに対してμM、好ましくはnM程度の強い親和性を有するリガンド)を探索することがより容易である(この場合、それは速度論的に制限される)。
【００５４】
PIN、nNOSおよび検出方法に供された化合物の混合物を、予めPINとインキュベートした本化合物をnNOSに添加して調製する場合、nNOSが加わる前に、本化合物とPINとの間の結合が促進し、従ってPINと結合する化合物を検出することが容易となる。
【００５５】
PIN、nNOSおよび検出方法に供された化合物の混合物を、予めnNOSとインキュベートした本化合物をPINに添加して調製する場合、PINが加わる前に、本化合物とnNOSとの間の結合が促進し、従ってnNOSと結合する化合物を検出することが容易となる。
【００５６】
PIN、nNOSおよび本化合物を同時に添加する場合、蛍光標識および蛍光偏光(または転移)を用い、形成される複合体の定量化を溶液中で行うことができる。この方法は迅速である(インキュベーションが1段階のみ、洗浄なし)という利点、および直接検出する系であるという利点を有する。
【００５７】
PIN、本化合物およびnNOSを逐次、またはPIN若しくはnNOSを本化合物とプレインキュベーション後、添加する場合、その二つの結合相手のうちの一つを最初に固相基板に固定化しておく必要がある。表面プラズモン共鳴解析によりまたはもう一方の相手を標識することにより、形成される複合体を定量化する。この方法により、化合物が結合する相手、即ちPIN、nNOSまたは二つのタンパク質の間で形成される複合体を決定することが可能となる。
【００５８】
使用する望ましい検出方法は、nNOSを最初に固相基板に固定化する、前記に定義される方法である。
【００５９】
「固相基板に固定化する」とは、nNOSを固相基板に共有的(化学反応)または非共有的(プラスチックへの非特異的吸着、アビジン−ビオチン系、抗体)に固定化する方法を意味する。
【００６０】
nNOSを最初に固相基板に固定化する場合、表面プラズモン共鳴解析によりまたは検出系(放射性、発光または蛍光標識、酵素、ビオチン)で標識することによりPIN結合を検出し、これにより形成される複合体の量を測定することが可能となる。
【００６１】
nNOSを最初に固相基板に固定化する場合、予め混合していない、PINおよび検出方法に供された化合物を同時添加することで、nNOSのリガンド、PINおよびその二つのタンパク質の間で形成される複合体を検出することが可能となる。故に、この方法によりPINとnNOSとの間の会合を阻害する分子を検出すること、および従ってその二つのタンパク質の間で形成される複合体を解離させる化合物を選別することがより容易となる。
【００６２】
nNOSを最初に固相基板に固定化する場合、検出方法に供された化合物およびPINの逐次添加により、nNOSのみを阻害する化合物を検出することが可能となる。要するに、試験化合物がnNOSに結合しない場合、それはPINを添加する前に行われる洗浄の間に除去される。
【００６３】
nNOSを最初に固相基板に固定化する場合、予めPINとインキュベートしておいた、検出方法に供された化合物を添加することにより、PINのリガンド、nNOSおよびPINとnNOSとの間で形成される複合体を検出することが可能となる。この方法はnNOSとのインキュベーション前に、本化合物のPINとの結合を促進させ、従ってPINのリガンドを選別することが可能となる。この方法はまた、nNOSの望ましいリガンド(nNOSに対してμM、好ましくはnM程度の非常に強い親和性を有するリガンド)を選別することも可能とする(この場合、それは速度論的に制限される)。
【００６４】
本発明はまた、PINを最初に固相基板に固定化する、前記に定義される検出方法にも関する。
【００６５】
「固相基板に固定化する」とは、PINを固相基板に共有的(化学反応)または非共有的(プラスチックへの非特異的吸着、アビジン−ビオチン系、抗体)に固定化する方法を意味する。
【００６６】
PINを最初に固相基板に固定化する場合、表面プラズモン共鳴解析によりまたは検出系(放射性、発光または蛍光標識、酵素、ビオチン)で標識することによりnNOS結合を検出し、これにより形成される複合体の量を測定することが可能となる。
【００６７】
PINを最初に固相基板に固定化する場合、予め混合していない、nNOSおよび検出方法に供された化合物を同時添加することで、nNOSのリガンド、PINおよびその二つのタンパク質の間で形成される複合体を検出することが可能となる。故に、この方法によりPINとnNOSとの間の会合を阻害する分子を検出すること、および従ってその二つのタンパク質の間で形成される複合体を解離させる化合物を選別することがより容易となる。
【００６８】
PINを最初に固相基板に固定化する場合、検出方法に供された化合物およびnNOSの逐次添加により、PINのみを阻害する化合物を検出することが可能となる。要するに、試験化合物がPINに結合しない場合、それはnNOSを添加する前に行われる洗浄の間に除去される。
【００６９】
PINを最初に固相基板に固定化する場合、予めnNOSとインキュベートしておいた、検出方法に供された化合物を添加することにより、PINのリガンド、nNOSおよびPINとnNOSとの間で形成される複合体を検出することが可能となる。この方法はPINとのインキュベーション前に、本化合物のnNOSとの結合を促進させ、従ってnNOSのリガンドを選別することが可能となる。この方法はまた、PINの望ましいリガンド(PINに対してμM、好ましくはnM程度の非常に強い親和性を有するリガンド)を選別することも可能とする(この場合、それは速度論的に制限される)。
【００７０】
本発明によれば、使用する望ましい検出方法は、PINおよびnNOSが溶液中に存在する、前記に定義される方法である。
【００７１】
PINおよびnNOSが溶液中に存在する場合、その二つのタンパク質を蛍光性化合物で標識し、蛍光偏光を測定することにより、形成される複合体を定量化する。
【００７２】
本発明はまた、配列番号:2の配列、または少なくとも100アミノ酸を含有するそのタンパク質の断片を、その断片が269位のアミノ酸を含むという条件で、含むまたはそれから成ることを特徴とするタンパク質に関する。
【００７３】
配列番号:2は神経性NOSの膵臓型に相当するラットから単離された新規タンパク質である。
【００７４】
nNOSの膵臓型はnNOSの変異型である。それは269、953、1008および1299位の4つにヌクレオチド変異がある。
【００７５】
これらの変異のうちの最後のものは、サイレント変異である;従って、アミノ酸を変化させない。
【００７６】
本発明は以下のペプチド配列に関し:
2004528845.tif 000003
2004528845.tif 000004
2004528845.tif 000005
2004528845.tif 000006
2004528845.tif 000007
これらのペプチドを前記に定義される方法により検出できる、および前記に定義される他のタンパク質よりもPINに対して一層強い親和性を示す化合物である。
【００７７】
nNOSを擬態しているこれらのペプチドは、単一または複合変異解析により選別され、かつ化学合成により得られる、nNOSの断片である。
【００７８】
配列番号:3および配列番号:4の配列の二つのペプチドは、配列番号:3の配列のペプチドに関しては9位に一つの変異(ArgがTrpに変異)があり、配列番号:4の配列のペプチドに関しては三つの変異(1位:LysがIleに変異;3位:ThrがValに変異;および9位;ArgがTrpに変異)を示す。これらの二つのペプチドは、実施例2および3に示されるように、配列番号:3の配列のペプチドに関してはKi(IC50) 4 μmol/L (阻害率50 %に相当する阻害定数)で、および配列番号:4の配列のペプチドに関しては0.4 μmol/Lで、PINとnNOSとの間の相互作用を阻害する。
【００７９】
配列番号:3から配列番号:106までは、変異型nNOSタンパク質の断片に相当した。
【００８０】
本発明はまた、前記に定義される、タンパク質のうちの一つ、タンパク質断片のうちの一つ、またはペプチドのうちの一つをコードする核酸にも関する。それはまた、配列番号:1のヌクレオチド配列にも関する。
【００８１】
配列番号:1はラットで同定された新規核酸配列である。それは配列番号:2の配列の神経性NOSの膵臓型に相当する新規タンパク質をコードする。
【００８２】
本発明は薬学的に許容される運搬体(vehicle)と一体となった、前記に定義されるタンパク質、タンパク質断片またはペプチドを含むことを特徴とする、薬学的組成物に関する。
【００８３】
使用投与量は平均体重60kgの成人1日あたり約10mg〜1gまで変化し得る。
【００８４】
本発明はまた、薬学的に許容される運搬体と一体となった、前記に定義されるスクリーニング方法により検出される全ての非ペプチド性物質を含むことを特徴とする、薬学的組成物にも関する。
【００８５】
本発明はまた、薬学的に許容される運搬体と一体となった、以下の化学式を有する分子を含むことを特徴とする薬学的組成物にも関する:
【化１】
2004528845.tif 000008
【００８６】
本発明はまた、前糖尿病およびインスリン過剰状態、並びに顕性II型糖尿病の治療を目的とした薬剤の調製のための、前記に定義されるタンパク質、タンパク質断片、およびペプチドの使用にも関する。
【００８７】
使用投与量は平均体重60kgの成人1日あたり約10mg〜1gまで変化し得る。
【００８８】
本発明はまた、前糖尿病およびインスリン過剰状態、並びに顕性II型糖尿病の治療を目的とした薬剤の調製のための、前記に定義されるスクリーニング方法により検出される任意の非ペプチド性物質の使用にも関する。
【００８９】
本発明はまた、前糖尿病およびインスリン過剰状態、並びに顕性II型糖尿病における変化したインスリン反応の治療を目的とした薬剤の調製のための、以下の化学式を有する分子の使用にも関する:
【化２】
2004528845.tif 000009
【００９０】
前糖尿病状態は基礎量が6 mM(108 mg/dl)と7 mM(126 mg/dl)の間の軽度の高血糖値を特徴とする。前糖尿病状態はまた、耐糖能異常、即ち経口糖負荷試験の2時間後、血糖値が7.8 mM(140 mg/dl)から11 mM(200 mg/dl)であることも特徴とする。
【００９１】
高インスリン血症は、健常人(10 μU/ml 20 pmole/L)に対して文献に示される血漿レベルが1.5から10倍のインスリン血症(insulinemia)に相当する。
【００９２】
II型糖尿病は7 mM (126 mg/dl)以上または相当の空腹時血糖値、および経口糖負荷試験の2時間後、11 mM(200 mg/dl)を越える高血糖値を特徴とする。
【００９３】
前記のおよび前記に定義されるタンパク質、タンパク質断片、ペプチドまたは非ペプチド性物質を用いて得られる薬剤は、前糖尿病および／または高インスリン血症患者において正常な二相性インスリン反応を回復できる。
【００９４】
「正常な二相性インスリン反応」とは、5〜10分間の第一相分泌ならびにグルコース摂取に応じて強度が変化する持続性第二相(約1〜2時間)を与えるインスリン分泌を意味する。
【００９５】
前記のおよび前記に定義されるタンパク質、タンパク質断片、ペプチドまたは非ペプチド性物質を用いて得られる薬剤は、II型糖尿病患者において量的に正常なインスリン分泌を回復できる。
【００９６】
本発明はPINとnNOSとの間の複合体形成を減少させる調節化合物を検出するためのキットに関する。このキットには以下のものが含まれる:
-nNOS、特にnNOSの膵臓型、
-PIN、
-希釈に必要な培地または緩衝液、
-必要に応じて、洗浄に必要な物質、
-PINとnNOSとの間の複合体形成、およびPINまたはnNOSと検出方法に供された化合物との間の複合体形成に必要な培地または緩衝液、
-変化、特にnNOSまたはPINと形成される複合体の量の減少を検出するための手段。
【００９７】
希釈に必要な培地または緩衝液は以下である:
-PBS (137 mM NaCl; 2.7 mM KCl; 4.3 mM Na2HPO4; 1.4 mM K2HPO4)、
-0.1% Tween 20のPBS溶液および1% BSA (ウシ血清アルブミン)。
【００９８】
適当な洗浄用培地は0.1% Tween 20のPBS溶液である。
【００９９】
PINとnNOSとの間の、およびPINまたはnNOSと検出方法に供された化合物との間の複合体形成に必要な培地および緩衝液は、0.1% Tween 20のPBS溶液および1% BSA である。
【０１００】
nNOSとPINとの間で形成される複合体の量の変化を検出するための方法は、以下の通りである:
-ペルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼ標識抗タグ抗体(GSTまたは(HIS)6)を使用する方法、
-ペルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼ標識抗nNOS抗体を使用する方法、
-抗タグ抗体(GSTまたは(HIS)6)または放射標識、ビオチン化若しくは蛍光標識抗nNOS抗体を使用する方法、
-二つの放射標識タンパク質または蛍光標識タンパク質を使用する方法、
-非標識nNOSおよびPINを用いた表面プラズモン共鳴解析を使用する方法。
【０１０１】
材料および方法
膵臓β細胞に存在する神経性酸化窒素合成酵素アイソフォーム(イソ型)の相補DNAの配列決定
ラットのランゲルハンス島およびインスリン分泌細胞株INS-1(Asfariら、1992)からRT-PCRにより、相補DNA(450〜650塩基対からなる)の相互関連断片(Interlocking fragments)を得る。Wistarラット雄の膵臓からコラゲナーゼ消化により、ランゲルハンス島をバラバラに分割し、次いでフィコールの密度勾配上にのせて遠心することにより外分泌腺から分離する(Shibataら、1976)。INS-1細胞はラットのインスリノーマ由来であり、10 %ウシ胎児血清、100 U/mlペニシリン、100μg/mlストレプトマイシン、2 mM L-グルタミン、10 mM HEPES、1 mMピルビン酸ナトリウム、および50μM β-メルカプトエタノールを含有するRPMI1640中で培養する。TRIzol(Life Technologies社)を用い、単離したランゲルハンス島およびINS-1細胞から総RNAを抽出する。相補DNAの第一本鎖は、ランダムプライマー(Life Technologies社) 3μg、オリゴ(dT)プライマー(Life Technologies社) 1μg、およびSuperscript II RNase H-Reverse Transcriptase (Life Technologies社)の存在下、総RNA 10μgから合成する。次いで、下記表に記載のプライマー対を用い、Taqポリメラーゼ(Life Technologies社)の存在下でPCRを行う。
【０１０２】
神経性NO合成酵素の膵臓型の配列決定に使用する時計回りおよび反時計回りのプライマー
2004528845.tif 000010
最初に94℃、5分間の変性をおこなった後、94℃、1分間の変性段階、60℃、1分間のハイブリダイゼーション段階、72℃、1分間の伸張段階を40サイクル、次いで最後に10分間の伸張によるPCRを行う。
【０１０３】
1.5%アガロースゲルにて泳動後、QIAEX II Gel Extraction Kit (Qiagen社)を用い、相補DNA断片を精製する。次いで、dCTP[αS35]およびThermo Sequenase Cycle Sequencing Kit(Amersham社)を用いて手動で2回、並びに自動シークエンサー(ABI PRISM 377, PE Applied Biosystems社)およびdRhodamine Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit(PE Applied Biosystems社)を用いて1回、その断片の配列決定を行う。配列番号:2の配列を見てもわかるように、神経性NO合成酵素の膵臓型の配列中には四つの点突然変異が認められ、このことからそれはラット脳型の配列に対して99.8%の相同性があることを示している。これらの変異のうち三つによっては、以下のようにアミノ酸配列が改変される:一つは269番目の位置でバリンがイソロイシンに変化し、一つは953番目の位置でアラニンがプロリンに変化し、および一つは1008番目の位置でセリンがフェニルアラニンに変化する。膵臓性NO合成酵素は従って、ラット脳において過去に同定された神経性NO合成酵素(Bredtら, 1991)とは僅かに異なっている。
【０１０４】
膵臓内分泌腺のβ細胞におけるPINメッセンジャーRNAの存在
内分泌腺の膵臓β細胞において神経性酸化窒素合成酵素の阻害タンパク質(PIN)(Jaffreyら, 1996)のメッセンジャーRNAの存在を示すため、膵臓β細胞の供給源としてラットのランゲルハンス島およびインスリン分泌細胞株INS-1を使用する。TRIzol(Life Technologies社)を用い、単離したランゲルハンス島およびINS-1細胞の総RNAを抽出する。相補DNAの第一本鎖は、ランダムプライマー(Life Technologies社) 3μg、オリゴ(dT)プライマー(Life Technologies社) 1μgおよびSuperscript II RNase H-reverse transcriptase (Life Technologies社)の存在下、総DNA 10μgから合成する。次いで、下記のプライマー対とともにTaqポリメラーゼ(Life Technologies社)を用いてPCRを行う:
2004528845.tif 000011
【０１０５】
最初に94℃、5分間の変性後、94℃、1分間の変性段階、60℃、1分間のハイブリダイゼーション段階、72℃、1分間の伸張段階を40サイクル、次いで最後に10分間の伸張によるPCRを行う。次に、PCR産物を1.5%アガロースゲルで分離し、そしてエチジウムブロマイド染色により視覚化する。膵臓ランゲルハンス島およびINS-1細胞の両方でPINプライマーを用いることにより、予想される大きさの断片(443塩基対)が得られる(図1を参照されたい)。従って、RT-PCR解析により膵臓β細胞におけるPINメッセンジャーRNAの存在が明らかとされている。従って、膵臓内分泌線のインスリン分泌細胞における神経性NO合成酵素およびその天然型阻害因子PINの同時発現が実証される。PIN相補DNAを配列決定し、そしてラット脳PIN配列(Faffreyら, 1996)との完全な相同性が立証される。
【０１０６】
INS-1細胞におけるPINの存在
INS-1細胞およびラット脳を50 mM Tris(pH 7.4)、150 mM NaCl、2 mmol/L EDTA、1 mmol/Lフェニルメチルスルホニルフッ化物、10 μg/mlロイペプチンおよび10 μg/mlアプロチニンを含有する細胞溶解緩衝液中でホモジナイズする。不溶性物質は遠心により除去する。上清中のタンパク質濃度をクマシーブルー染色により決定する(Coomassie Protein Assay Reagent, Pierce社)。次いで、タンパク質80 μgを13.5 %トリシンゲルの電気泳動により分離し、そしてニトロセルロース膜に転写する。その膜をまず、5 %スキムミルク粉末含有0.1 % Tween 20のPBS溶液中で飽和し、次いでモノクローナル抗PIN抗体(250倍希釈、Transduction Laboratories社)と一晩、インキュベートする。PBS-Tweenで3回洗浄後、その膜をペルオキシダーゼ標識抗マウス抗体(5,000倍希釈、Sigma Aldrich社)とインキュベートする。免疫反応を化学発光アッセイ(ECL, Amersham Life Science社)により検出する。ウエスタンブロットにより、そのPINはラット脳で発現しているPINと大きさが同一であることが明らかとされている(図2を参照されたい)。
【０１０７】
INS-1細胞におけるPINの神経性NO合成酵素との同時局在
INS-1細胞をLab-Tek（登録商標）Chamber Slide Systemsに蒔き、そして使用前、4日間培養する。次いで、それらを2 %パラホルムアルデヒドのPBS(リン酸緩衝生理食塩水)溶液で20分間固定し、そして0.1 % Triton X-100で5分間浸透化する。非特異部位を2 % BSA(ウシ血清アルブミン)で飽和後、細胞をモノクローナル抗PIN抗体(100倍希釈、Transduction Laboratories社)および抗ラット神経性NO合成酵素抗体(100倍希釈、Euro-Diagnostica社)と一晩、インキュベートする。数回洗浄後、フルオレセイン標識抗マウス抗体(100倍希釈、Biosys社)およびローダミン標識抗ウサギ抗体(100倍希釈、Biosys社)を細胞と1時間反応させる。数回洗浄後、細胞をCitifluor(Citifluor Ltd社)中にセットし、そしてアルゴンおよびクリプトンレーザー(Biorad社)を用いて共焦点顕微鏡下で観察する。PINはINS-1細胞の細胞質に存在する(図3A)。さらに、PIN(図3A)および神経性NO合成酵素(図3Bを参照されたい)の蛍光シグナルが非常に類似していることから、その二つのタンパク質はラット膵臓β細胞においてかなり同時局在していることが示唆される。実際、PINは163〜245番目のアミノ酸でインビトロおよびインビボにおいて(Jaffreyら, 1996)、神経性NO合成酵素と相互作用することが示されている。故に、神経性NO合成酵素およびPINは、膵臓β細胞内で相互作用していると思われる。
【０１０８】
INS-1細胞株でのグルコース誘導性インスリン分泌におけるPINの調節的役割
PINをINS-1細胞中で過剰発現する、そしてグルコースに対するインスリン反応を測定する。RT-PCRにより得られるPIN相補DNA(上記を参照されたい)を真核細胞発現ベクターpCR3.1(TA Cloning Kit, Invitrogen社)にクローン化する。次いで、LipofectAMINE PLUS Reagent(Life Technologies社)を用い、そのプラスミド(空またはPINを含有する)1.5μgをINS-1細胞(約8×105)に遺伝子導入する。次いで、総RNA 5μgおよび前記プライマー(表1を参照されたい)を用い、PINの過剰発現をRT-PCRにより検証する。次いで、遺伝子導入から48時間後、細胞をグルコース無添加のKrebs-Ringer重炭酸緩衝液(pH 7.4) (108 mM NaCl; 1.19 mM KH2PO4; 4.74 mM KCl; 2.54 mM CaCl2; 1.19 mM MgSO4・7H2O; 18 mM NaHCO3)で洗浄し、次いで同一緩衝液中にて、37℃、1時間プレインキュベートする。その緩衝液を捨てた後、細胞を1g/Lグルコースを含有するKrebs中にて、37℃、1時間インキュベートする。次いで、上清を回収し、そしてラジオイムノアッセイによりインスリン分泌を測定する(Herbertら, 1965)。対照細胞に対して、PINベクターを遺伝子導入後の細胞には約5倍のPINメッセンジャーRNAが存在している(図4A)。さらに、対照細胞に対して、PINを過剰発現している細胞ではグルコース誘導性インスリン分泌が25 %増加している(図4B)。故に、PINはグルコース誘導性インスリン分泌を正に調節する役割を担っているように思われる。
【０１０９】
スクリーニング試験方法
PINを産生するため、RT-PCRにより得られるPIN相補DNA(以下の実施例1を参照されたい)をpET21bベクター(C末端位にポリヒスチジン・タグ, (HIS)6(例えばNovagen社)を含む)およびpGEX-2Tベクター(N末端位にグルタチオン s-トランスフェラーゼ・タグ, GST (例えばPharmacia社)を含む)にクローン化する。遺伝子組換えプラスミドによりBL21菌(DE3) (例えばNovagen社)を形質転換後、その菌をLB培地中、37℃で、ODが0.6になるまで培養する。次いで、30℃にて5時間、1 mM IPTG(イソプロピルチオ-β-D-ガラクトシド)で誘導することにより、タンパク質を産生する。その菌を遠心により回収し、次いで標準的条件の下で溶菌させる(Short Protocols in Molecular Biology, 第2版, John WileyおよびSons)。不溶性物質は遠心により除去し、そしてポリヒスチジン・タグに対してはニッケル・カラム(例えばNi NTAアガロース, Qiagen社)にて、またはGSTタグに対してはグルタチオン・セファロース・カラム(例えばPharmacia社)にて、製造元からの推奨事項に従い、タンパク質を精製する。その後、PINを−80℃で貯蔵する。
【０１１０】
膵臓性nNOSを得るため、ポリヒスチジン・タグの付いた膵臓性nNOSの相補DNAをp119Lベクター(Poulら, 1995)のウイルスプロモーターP10(Poulら, 1995)の制御下にクローン化する。遺伝子組換えウイルスはリポフェクション(DOTAP, Roche Diagnostics社)を用いて、昆虫細胞Sf9(ATCC CRL 1711)に、その搭載ベクター(loaded vector)およびバキュロウイルスDNAを同時に遺伝子導入することにより得られる。次いで、溶菌プラーク法を用いてウイルスクローンを単離し、そして抗nNOS抗体(Transduction Laboratories社)を用いたタンパク質転写(ウエスタンブロット)により、それらのnNOS産生能を目的とした選別を行う。製造元からの推奨事項に従い、タンパク質をニッケル・カラム(例えばNi NTAアガロース, Qiagen社)にて精製する。その後、膵臓性nNOSを−80℃で貯蔵する。
【０１１１】
本発明にて記述される第一の方法として、プラスチック製MaxiSorpプレート(Nunc社)の底面に、膵臓性nNOSをPBS 200μl中で濃度1〜5μg/mlとして、4℃で一晩、固定化する。0.1 % Tween 20を含有するPBSで洗浄後、プレートをPBS/1 % BSA 100μlにて、37℃、1時間飽和する。その後、プレートをPBS/0.1 % Tween 20/1 % BSA 100 μl中で、濃度を0.1〜10 μg/mlとしたGSTタグの付いたPIN(GST-PIN)またはポリヒスチジン・タグの付いたPIN(PIN-(HIS)6)と、試験化合物の存在下または非存在下、37℃、2時間、インキュベートする。プレートを洗浄後、抗タグ抗体、抗GST抗体またはペルオキシダーゼ標識抗(HIS)6抗体(PBS/0.1 % Tween 20/1 % BSAにて2000倍希釈, Sigma Aldrich社)100 μlと、37℃、1時間、インキュベートする。ペルオキシダーゼの基質、O-フェニレンジアミンの存在下、暗所にて30分間の呈色反応により、nNOS-PIN-抗体複合体の形成を検出する。呈色の強度を490nmにて測定する。
【０１１２】
本発明にて記述される第二の方法として、PINを、GST-PINまたはPIN-(HIS)6の形態で、プラスチック製プレートの底面に固定化し、次いで膵臓性nNOSと接触させる。次に、ペルオキシダーゼ標識抗nNOS抗体を用いて反応性を検出する。
【０１１３】
実施例1
表面プラズモン共鳴解析に基づいて、本実施例によりnNOSの変異型ペプチド(即ち配列番号:3の配列)が、同じnNOSの非変異型ペプチド(Lys Asp Thr Gly Ile Gln Val Asp Arg Asp)よりもPINに対して一層強い親和性を示すことが明らかとされる。
【０１１４】
nNOSの可溶性ペプチドをFmoc固相ペプチド合成法(Gausephol, 1992)を利用するAMS 422ロボット(Abimed社)により調製する。10アミノ酸を含有するこれらのnNOSペプチドは、PINとの相互作用領域(nNOSアミノ酸229〜238)に相当する。適当な感知器を用い、ペプチドを脱保護しそしてトリフルオロ酢酸による処理によってそれらを樹脂より脱離させる。ペプチドを凍結乾燥し、そしてそれらの純度をHPLC分析により検証する。必要に応じて、次にペプチドをHPLC分取により90 %まで精製した後、質量分析法を用いて解析する。
【０１１５】
PINの固定化ペプチドとの結合をBIAcore 2000 (Biacore AB社)を用いて解析する。NHS/EDC手順(N-ヒドロキシスクシンイミド(NHS), Biacore AB社; N-エチル-N’-(ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド(EDC), Biacore AB社)を用いてペプチドを、10 mM酢酸緩衝液(pH 4)中にて10 μg/mlの濃度で、CM5バイオセンサー(Biacore AB社)のチャンネルに結合させる。これにより固定化ペプチドの密度が約100 pg/mm2のものが作製される。GST-PIN(Pharmacia社)のトロンビン消化により得られるPINを、濃度(5, 10, 20,および40μg/ml)を増加させながらバイオセンサーに流速30μl/minで注入し、そしてPIN-ぺプチド結合に対するセンサグラムを得る(会合180秒間; 解離400秒間)。BIAevaluation 3.0ソフトウェア(Biacore AB社)および全体型解析(使用した全ペプチド濃度のセンサグラムに対する会合および解離速度定数の同時解析)を用い、センサグラムより会合および解離定数を決定する。対照として、nNOSの断片(nNOSタンパク質の131および147位のアミノ酸により囲まれている。図1を参照されたい)ではあるがPINとnNOSタンパク質との間の相互作用領域には相当していない、適当なペプチド(Lys Ala Val Asp Leu Ser His Gln Pro Ser Ala Ser Lys Asp Gln Ser Leu)を同様の方法で固定化し、そしてPINを同じ濃度で加える。
【０１１６】
配列番号:3の配列の変異型ペプチド(図5Bを参照されたい, Ka=1.86×108; Kd=5.38×10-9)に対するPINタンパク質の親和性は、正常型ペプチド(図5Aを参照されたい, Ka=8.43×107; Kd=1.19×10-8)に対するよりも2倍大きい。nNOSペプチドに突然変異を導入する(配列番号:3, 9位でアルギニンがトリプトファンに変異)ことにより、PINタンパク質に対するその親和性が増す。
【０１１７】
実施例2
本実施例はPINに対してnNOSよりも一層強い親和性を示す配列番号:3および配列番号:4の配列の変異型ペプチドが、nNOSとPINとの間の引力を減少させることができることを示すために、本発明にて記述される第一の方法(上記を参照されたい)を利用する。
【０１１８】
ELISA MaxiSorpプレート(Nunc社)に、nNOSタンパク質をPBS 100μl中で濃度1μg/mlとして、4℃で一晩、固定化する。0.1 % Tween 20を含有するPBSで洗浄後、プレートをPBS/1 % BSA 100 μlにて、37℃、1時間飽和する。PBS/0.1 % Tween 20/1 % BSA 100 μl中で濃度を0.5 μg/mlとしたGST-PINを、まず、同一緩衝液中で濃度を増加させた(変異型ペプチドに対しては0.010〜100μg/ml; 非変異型ペプチドに対しては10〜1,000 μg/ml)、所定のペプチド(上述のような)、正常型ペプチド
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または変異型ペプチド(配列番号:3または配列番号:4)と37℃、1時間、インキュベートする。ペプチド-PIN混合液をプレート上にて2時間インキュベート後、プレートを洗浄し、次いでペルオキシダーゼ標識抗GST抗体(PBS/0.1% Tween 20/1% BSAにて2000倍希釈, Sigma Aldrich社)100 μlと、37℃、1時間、インキュベートする。混合液にペルオキシダーゼの基質、O-フェニレンジアミンを暗所にて20分間加えておき、次いで呈色の強度を490nmにて測定することにより、PINとnNOSとの間の複合体形成を検出する。上述のように、各ペプチドに対して対照をとる。
【０１１９】
正常型nNOSペプチド(図6Aを参照されたい)の存在下では、そのペプチド濃度50 μg/mlに対してはPINのnNOSとの結合が14 %まで阻害されている。対照的に、配列番号:3および配列番号:4の配列の二つの変異型ペプチドは、濃度50μg/mlでPINのnNOSとの結合をそれぞれ71 %および78 %まで阻害している。
【０１２０】
PIN-nNOS結合の阻害曲線(図6Bを参照されたい)によると、配列番号:3の配列のペプチドは阻害定数(Ki:IC50) 5 μMを示し、配列番号:4の配列のペプチドは(阻害)定数0. 5 μMを示しているのに対し、正常型ペプチドの阻害定数は僅か300 μMである。
【０１２１】
実施例3
本実施例はPINタンパク質に対してnNOSタンパク質よりも一層強い親和性を示す配列番号:3または配列番号:4の配列の変異型nNOSペプチドが、nNOSとPINとの間の相互作用を阻害できることを示すために、表面プラズモン共鳴解析を利用する。
【０１２２】
合成ペプチドの存在下または非存在下において、固定化したnNOSタンパク質(Alexis社)とのPINの結合をBiacore 2000(Biacore AB社)を用いて解析する。NHS/EDC手順を用いてnNOSを、10 mM酢酸緩衝液(acetate tampon)(pH 5.5)中にて10 μg/mlの濃度で、CM5バイオセンサー(例えば、Biacore AB社)のチャンネルに結合させる。これにより固定化タンパク質の密度が約6000 pg/mm2となる。濃度増加させたペプチド(1〜100 μg/ml)の存在下において濃度5 μg/mlのPINタンパク質を30分間、プレインキュベート後、チップに流速30 μl/minで注入する。ペプチドのnNOSとの結合を示すセンサグラムを会合180秒間および解離400秒間、記録する。BIAevaluation 3.0ソフトウェア(Biacore AB社)および全体型解析(使用した全ペプチド濃度のセンサグラムに対する会合および解離速度定数の同時解析)を用い、センサグラムより会合および解離定数を決定する。対照は、PINとプレインキュベートしておいた所定のペプチドをnNOSに注入することにより行う(上述のように)。
【０１２３】
正常型nNOSペプチド(図7Aを参照されたい)の存在下では、ペプチド20μg/mlでPINのnNOSタンパク質との結合は19 %まで阻害され、ペプチド50 μg/mlおよび100 μg/mlで阻害は45 %で頭打ちとなっている。対照的に、配列番号:3の配列の変異型ペプチド(図7Bを参照されたい)は、ペプチド5 μg/mlでPINのnNOSとの結合を59 %まで阻害し、そしてペプチド濃度30 μg/mlおよび40μg/mlでこの相互作用をほぼ完全に阻害(それぞれ90 %および91 %)している。配列番号:4の配列の変異型ペプチド(図7Cを参照されたい)についても同様であり、これはペプチド1 μg/mlでPINのnNOSとの結合を75 %まで阻害し、そして10 μg/mlでそれをほぼ完全に阻害(98 %)する。使用したペプチド濃度の関数としたPIN-nNOS結合の阻害曲線(図7Dを参照されたい)によると、配列番号:3の配列のペプチドは阻害定数(Ki:IC50) 4 μMを示し、および配列番号:4の配列のペプチドは(阻害)定数0.4 μMを示している。故に、二つの変異型ペプチドはPINとnNOSとの間の相互作用を阻害できる。
【０１２４】
実施例4
本実施例は前述の本発明の方法により、3000化合物のバンク(Chembridge社)をインビトロ・スクリーニングして得られた分子C24H18N4O5Sが、インスリン過剰およびインスリン抵抗性の肥満動物(Zucker(fa/fa)ラット−fa遺伝子(「肥満の(fatty)」の省略形)中に突然変異を有するラットの系統において、インスリン分泌を減少させることができることを示す。
【０１２５】
使用される化学分子は以下の化学式を有する:
【化３】
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【０１２６】
PBS 100 μl中にて4 ℃、一晩静置する場合、上述の方法により得られる組換え型nNOS (100 ng)は濃度1 μg/mlでマイクロプレート底面に吸着する。1 % PBS/BSA 200 μlで37 ℃、1時間飽和後、nNOSを分子5 μl(最終濃度10μM)およびGST-PIN 0.5 μg/mlと37 ℃、2時間結合させる。次いで、PIN-nNOS複合体の形成を抗GST抗体(2000倍希釈)との37 ℃、1時間のインキュベーションにより検出後、O-フェニレンジアミンと30分間、インキュベーションし、そして490 nmでの吸光度を測定することにより検出する。分子が相互作用を30〜50 %程度まで阻害する場合、それらは陽性であると考えられる。
【０１２７】
Lacyら(Diabetes, 1967)のコラゲナーゼ消化法を用い、Zucker(fa/fa)ラットのランゲルハンス島を単離する。単離後、そのランゲルハンス島をグルコース0.75 g/Lを含有するKrebs-Ringer液にて37 ℃で45分間、安定化させる。次いで、ランゲルハンス島3群を濃度増加させた分子C24H18N4O5S(20〜100 μM)を含有し、グルコース2 g/Lを添加したKrebs-Ringer液中、37 ℃で1時間、インキュベートする。次に、液体上清を回収し、そしてラジオイムノアッセイによりインスリン分泌を測定する(図8を参照されたい)。
【０１２８】
分子C24H18N4O5SがPIN-nNOSの相互作用を減少させる場合、インスリン過剰のラットから単離したランゲルハンス島において、グルコース2 g/Lにより惹起されるインスリン分泌を用量依存的(濃度50 μMから始まる)に阻害する。実質的に、濃度50および100 μMではインスリン反応がそれぞれ36 %および79 %程度まで減少する。
【０１２９】
故に、同分子はこれらの前糖尿病動物におけるインスリン過剰分泌を減少させることができる。
【０１３０】
参考文献
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【図面の簡単な説明】
【０１３１】
（図１）ラット膵臓ランゲルハンス島およびINS-1細胞 におけるPIN発現のRT-PCR解析による結果を示している(Asfariら, 1992)。総RNAを単離し、それから逆転写酵素により合成されたその相補DNAを、次いでPIN配列または陽性対照として使用したβ2ミクログロブリン(β2m)配列に基づくプライマーを用い、PCRにより増幅する。相補DNA(C)なしの場合を陰性対照としている。既知の大きさのDNA断片(2000, 1200, 800, 400, 200および100塩基対)を分子量(MW)マーカーとして使用している。
（図２）INS-1細胞 におけるPINのタンパク質転写解析(ウエスタンブロット)による結果を示している。INS-1細胞およびラット脳(脳)から抽出したタンパク質を13.5%トリシンゲルで分離し、ニトロセルロース膜に転写し、次いでモノクローナル抗PIN抗体とインキュベートする。ペルオキシダーゼ標識抗マウス抗体を用いて検出を行い、続いて化学発光分析を行う。16kDaおよび7kDaは分子量マーカーを示している。
（図３）免疫蛍光法による、INS-1細胞 におけるPINおよび神経性NO合成酵素の同時局在を示している。INS-1細胞をモノクローナル抗PIN抗体(A)およびウサギ抗nNOS抗体(B)で二重標識している。フルオレセイン標識抗マウス抗体およびローダミン標識抗ウサギ抗体を用いて蛍光を検出し、次いで2チャンネル共焦点顕微鏡を用いて解析を行っている。スケールバー(尺度図)は10μmを表している。
（図４）グルコース誘導性インスリン分泌に対するINS-1細胞におけるPIN過剰発現の効果を示している。
A：INS-1細胞におけるPIN過剰発現のRT-PCR解析による結果を示している。空の(バーC)またはPIN相補DNAを含む(バーPIN)発現ベクターで、INS-1細胞に遺伝子導入する。総RNAを単離し、そしてPIN配列に基づくプライマーを用い、RT-PCRにより相補DNAを増幅する。既知の大きさのDNA断片(2000, 1200, 800, 400, 200および100塩基対)を分子量マーカー(MW列)として使用している。
B：対照細胞(C列)に対する、PINを過剰発現している(PIN列)INS-1細胞によるインスリン分泌の解析結果を示している。遺伝子導入から48時間後、細胞を1g/Lグルコース中でインキュベートし、そしてラジオイムノアッセイによりインスリン分泌を測定する。
（図５）PINと正常型nNOSペプチドとの間の(A)、およびPINとペプチド配列が配列番号:3である変異型nNOSペプチドとの間(B)の相互作用の表面プラズモン共鳴解析により得られるセンサグラムを示している。CM5バイオセンサー(Biacore AB社)のチャンネルにペプチドを固定化する、そしてGST-PINをトロンビンで消化して得られるPINタンパク質を、以下の濃度で増加させながら注入する:5μg/ml(破線−Aの曲線4およびBの曲線d);10μg/ml(一点短鎖線−Aの曲線3およびBの曲線c);20μg/ml(点線−Aの曲線2およびBの曲線b);並びに40μg/ml(実線−Aの曲線1およびBの曲線a)。正常型ペプチド(A)および変異型ペプチド(B)に対するPINの結合がセンサグラムに記録され、会合および解離定数を決定することが可能となる。これらのセンサグラムは、その応答性(RU)を時間の関数として示しており、1RU(レゾナンスユニット)はバイオセンサー表面1 mm2あたりタンパク質1 pgに相当する。
（図６）nNOSに対するGST-PINの結合阻害を、異なる濃度の正常型ペプチド並びに配列番号:3および配列番号:4の配列の変異型ペプチドに対して示している。ELISAプレートにnNOSを固定化後、予め濃度増加させたペプチドとインキュベートしておいたGST-PINを添加した。二つのタンパク質間の相互作用をペルオキシダーゼ標識抗GST抗体により検出し、そして吸光度490nmにて測定した。
A：吸光度をペプチド濃度(μg/ml)の関数として示している。丸点のついた曲線は正常型ペプチド、四角点のついた曲線は配列番号:3のペプチド、菱形点のついた曲線は配列番号:4のペプチドを表している。
B：nNOSに対するPINの結合阻害の割合をペプチド濃度(μM)の関数として示している。丸点のついた曲線は正常型ペプチド、四角点のついた曲線は配列番号:3のペプチド、菱形点のついた曲線は配列番号:4のペプチドを表している。
（図７）正常型nNOSペプチドによる(A)並びに配列番号:3および配列番号:4の変異型nNOSペプチドによる(BおよびC)、PINとnNOSとの間の結合阻害の表面プラズモン共鳴解析に対するセンサグラムを示している。A、BおよびCはその反応性をRUとして示しており、1RU(レゾナンスユニット)はバイオセンサー表面1 mm2あたりタンパク質1pgに相当する。
A：正常型ペプチド
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によるnNOSに対するPINの結合阻害を示している。曲線1はペプチドなしに相当する;曲線2、3および4はそれぞれ正常型ペプチド濃度20μg/ml、50μg/mlおよび100μg/mlに相当する。
B：配列番号:3の配列を有する変異型ペプチドによるnNOSタンパク質に対するPINの結合阻害を示している。曲線aは同タンパク質なしに相当する;曲線b、c、d、eおよびfはそれぞれペプチド濃度5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、30μg/mlおよび40μg/mlに相当する。
C：配列番号:4の変異型ペプチドによるnNOSタンパク質に対するPINタンパク質の結合阻害を示している。曲線1は同タンパク質なしに相当する;曲線2、3、4、5および6はそれぞれペプチド濃度1μg/ml、2μg/ml、3μg/ml、5μg/mlおよび10μg/mlに相当する。
D：配列番号:3の変異型ペプチド(曲線a、丸点)および配列番号:4の変異型ペプチド(曲線b、四角点)による、nNOSタンパク質に対するPINの結合の阻害曲線を示している。この図はPINとnNOSとの間の結合の阻害率を変異型ペプチド濃度(μM)の関数として示している。
（図８）C24H18N4O5S分子の非存在下において得られるインスリン分泌に対して、濃度増加させた同分子の存在下におけるZucker(fa/fa)ラット由来膵臓ランゲルハンス島のインスリン分泌結果を示している。単離後、ラットのランゲルハンス島を0.75g/Lグルコースで安定化させ、次いで同分子が添加されたまたは添加されていない2g/Lグルコース中の三群でインキュベートする。次に、ラジオイムノアッセイによりインスリン分泌を測定する。
図8では、インスリン分泌(ng/ml)をその分子の濃度の関数として表している。黒棒は対照(同分子なし)におけるインスリン分泌、灰色棒は分子の濃度20μMにおける;白棒は分子の濃度50μMにおける;縦線棒(hatched bar)は分子の濃度100μMにおけるインスリン分泌を示している。有意水準は対照に対してP＜0.05(＊)およびP＜0.001(＊＊＊)で表示されている(反復数:n=5)。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
2004528845.tif 000029
【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図８】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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2004528845.tif 000123
【国際調査報告】
2004528845.tif 000124
2004528845.tif 000125
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