(57)【要約】本発明は、抗原−特異的Ｔｒ１調節リンパ球を調製する方法に関する。本発明方法は、ＨＬＡクラスII系およびヒトＬＦＡ−３分子から分子を発現し、ならびにＢ７−１、Ｂ７−２、Ｂ７−Ｈ１、ＣＤ４０、ＣＤ２３またはＩＣＡＭ−１共刺激分子のいずれも発現しない人工抗原−提示細胞の使用を含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗原−特異的調節Ｔｒ１リンパ球を得るために、ＨＬＡ系のクラスII分子およびヒトＬＦＡ−３分子を発現するが、共刺激分子Ｂ７−１、Ｂ７−２、Ｂ７−Ｈ１、ＣＤ４０、ＣＤ２３またはＩＣＡＭ−１のいずれも発現しない人工抗原−提示細胞の使用。
【請求項２】
患者のリンパ球から抗原−特異的調節Ｔｒ１リンパ球の調製方法であって、
−請求項１で定義したような人工抗原−提示細胞にて提示される選択抗原の存在下で、前記リンパ球をインビトロで活性化し、そして
−前記リンパ球から、少なくとも１０％の先の抗原に特異的なＴｒ１リンパ球を含む活性化されたＣＤ４+Ｔリンパ球の集団を回収すること
を含むことを特徴とする方法。
【請求項３】
使用される人工抗原−提示細胞が、クラスIIＨＬＡ分子のα鎖をエンコードする核酸配列、クラスIIＨＬＡ分子のβ鎖をエンコードする核酸配列およびヒトＬＦＡ−３をエンコードする核酸配列で、繊維芽細胞、ケラチン生成細胞、尿細管細胞、シュワン細胞、筋原細胞、内皮細胞の中から選択される哺乳類細胞のコトランスフェクションで得られることを特徴とする請求項２で請求されている方法。
【請求項４】
前記リンパ球のインビトロでの活性化を、選択抗原の存在下で、前記リンパ球と前記抗原提示細胞を共培養することで行うことを特徴とする請求項２または３で請求されている方法。
【請求項５】
ＣＤ４+Ｔリンパ球が、インビトロでの選択抗原の存在下で活性化される工程の繰り返しと、前記抗原に特異的な少なくとも３０％のＴｒ１リンパ球からなる細胞集団の回収とからなることを特徴とする請求項２〜４のいずれか１つで請求されている方法。
【請求項６】
さらに、回収された細胞集団からのＴｒ１リンパ球クローンの単離および増殖を含むことを特徴とする請求項２〜５のいずれか１つで請求されている方法。
【請求項７】
請求項２〜６のいずれか１つによる方法によって抗原−特異的Ｔｒ１リンパ球を調製し、それらを患者に投与するのに適した製剤に、先のＴｒ１リンパ球を包精することを含むことを特徴とする炎症疾患および／または自己免疫疾患の治療を意図する医薬組成物の調製方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、自己免疫疾患および炎症疾患の予防および治療に使用されうる調節ＣＤ４+Ｔリンパ球を得ることに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
自己免疫疾患は、生物のそれ自体の抗原に対する好まざる免疫応答にて現れる免疫系の自由化（deregulation）の結果である。
これらの病状を引き起こす抗原、またはこれら抗原に特異的である悪性のＴ細胞を操作することが試みられているが、得られた結果は、特に、問題の病状に関連する全ての抗原の知見が欠如しているため、非常に限定されたものであることが多い。このことは、実際の自己抗原、または炎症疾患および自己免疫疾患に応答しうる抗原が、常に知られていないか、個体間で異なるためである。これら疾患に対して近年使用されている治療は、一時しのぎの治療（糖尿病の場合インスリン、アレルギー性疾患の場合抗ヒスタミン）、または抗−炎症（ＡＩＮＳ）および／または免疫抑制（グルココルチコイド、シクロスポリン、抗体など）を使った全身治療のいずれかである。それゆえ、強力であるが、影響器官、またはより正確には免疫系の機能亢進領域が限定される免疫抑制治療の必要が明らかにある。
【０００３】
免疫応答の調節に関連する多数の薬剤の中で、Ｔ−ヘルパーリンパ球としても引用されているＣＤ４+Ｔリンパ球がある。従来、Ｔ−ヘルパーリンパ球の２つの主なタイプに区別されている。
すなわち、細胞免疫応答の発生に関連し、インターロイキン−２（ＩＬ−２）およびγインターフェロン（ＩＦＮγ）のようなプロ−炎症サイトカインを生産し、そしてマクロファージ−活性化活性を有するＴｈ１リンパ球。
インターロイキンＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−１０およびＩＬ−１３のようなサイトカインを生産し、抗体の分泌を促進するＴｈ２リンパ球。
【０００４】
発明者の一人が関係した最近の研究は、インターロイキン１０（ＩＬ−１０）の存在下で、ＣＤ４+Ｔ細胞の活性化によって増殖が誘導され、Ｔｒ１リンパ球と称されている調節Ｔ細胞の新規なカテゴリーをなんとか見出した（PCT出願WO 97/42324）。この研究を続けることで、Ｔｒ１リンパ球と称される調節Ｔ細胞の新規な亜集団を単離し、そして特徴付けることができた(Grouxら、Nature、389、737〜742、1997)。このリンパ球の亜集団は、抗原およびインターロイキン１０（ＩＬ−１０）の存在下で、ＣＤ４+Ｔ細胞を繰り返し活性化させることで得られる。Ｔｒ１細胞は、それらの誘導に使用される抗原によって再び刺激されると、それらは弱く増殖するのみで、多量のＩＬ−１０、多量のＴＧＦ−β（腫瘍生育因子β）、少量のＩＬ−２を生産するが、ＩＬ−４を生産しない。活性化Ｔｒ１細胞を、その他のＣＤ４+Ｔ細胞の存在下で生育させると、それらは、抗原に対する応答で後者の増殖を抑制し、この効果は、Ｔｒリンパ球によるサイトカイン、特にＩＬ−１０の分泌によるものであり、ＣＤ４+Ｔ細胞上での後者の直接的な作用によるものではなく、それゆえ、これら細胞の増殖に応答しうる抗原を識別しなくとも得ることができる。このことは、自己免疫疾患の場合、非常に有利であり、それゆえ病原性細胞に対する正確な抗原を知る必要性なく治療を想定することができる。
【０００５】
つまり、食品での卵白アルブミンの投与との組合せで、卵白アルブミンに対するＴｒ１細胞の動物に対する投与が結腸の慢性炎症が予防されることを、プロ−炎症細胞が腸内フローラの共生バクテリアに指向しているマウスでのクローン病の実験モデルで観察している。
【０００６】
第二に、発明者らは、多発性硬化症または移植片対宿主反応のクローン病の様々な動物モデルでの近年の研究で、調節Ｔｒ１細胞が、これら様々な病状を予防できるだけでなく、治療できることも証明した。さらに、彼らは、Ｔｒ１細胞が炎症の様々な部位に特異的かつ集約的に広がることを観察した。Ｔｒ１細胞のこの特性は、これらの細胞の使用で、深刻な炎症の部位で抗−炎症分子用のベクターとして付加的な利点を示している。それゆえ、患者のＴ細胞由来のＴｒ１細胞は、この患者で免疫応答を調節するための細胞治療の現場で潜在的に有用である。その結果、それらを、特に、上記の自己免疫疾患および炎症疾患のみではなく、同様に糖尿病、乾癬、粥状硬化症、リュウマチ性多発関節炎または喘息のような異常(aberrant)炎症応答によって特徴付けられるその他のあらゆる病状（それらは、同様に移植拒絶反応または移植片対宿主反応の治療で使用されうる）を予防または治療するために使用することができる。
【０００７】
Grouxらの発表で記載され、上記で引用されているＴｒ１リンパ球を得る方法は、ＩＬ−１０の存在下で、抗原を使ったＴ細胞の繰り返しの刺激を必要とする。この方法は、面倒であり、治療処置で使用されうるＴｒ１リンパ球集団を、患者から素早く得ることができない。
様々なチームは、Ｔｒ１細胞のこれらと類似した特性を有する細胞を得るなかで、特にＩＬ−１０の生産で、さまざまな共刺激(costimulation)分子の関連を報告している。関連するであろうこれら刺激分子は、大変多様であり、報告されているその効果は、時として矛盾しているようである。
【０００８】
Bleijsら(Eur. J. Immunol.、29、2248、1999)は、ＬＦＡ−１とＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−２またはＩＣＡＭ−３との相互作用による共刺激が、抗−ＣＤ３抗体で刺激されるＴリンパ球によるＧＭ−ＣＳＦ（顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子）、ＩＦＮ−γおよびＩＬ−１０の高生産を誘導することを観察した。ＩＬ−１０の生産は、共刺激がＬＦＡ−１／ＩＣＡＭ−１相互作用によって行われる場合、特に高い。Bullensら(Int. Immunol. 13、181〜191、2001)は、ＣＤ５８による共刺激が、抗−ＣＤ３抗体にて刺激されるＴ細胞によってＩＬ−１０およびＩＮＦ−γの生産を誘導することを報告している。Dongら(Nat. Med.、5、1365、1999)は、Ｂ−７族に属し、そしてＩＬ−１０の分泌を優先的に誘導するＢ７−Ｈ１として引用されている共刺激分子を記載している。
【０００９】
Van Goolら(Eur. J. Immunol.、29、2367、1999)は、ＣＤ８０／ＣＤ２８またはＣＤ８６／ＣＤ２８、およびＣＤ４０／ＣＤ４０Ｌ相互作用をブロックする抗体の存在下で、同種抗原によるＴ細胞の活性化が、ＩＦＮ−γの生産の減少とＩＬ−１０の生産の増加によって成し遂げられる抗原−特異的なアネルギーを誘導することを観察した。
Chabotら(J. Immunol.、162、6819、1999)は、小膠細胞とＴリンパ球の相互作用によって誘導されるＩＬ−１０の生産が、ＣＤ４０／ＣＤ４０Ｌ、Ｂ７／ＣＴＬＡ−４またはＢ７／ＣＤ２８、あるいはＣＤ２３のブロックによって低減されることを報告している。
【００１０】
本発明者らは、ＩＬ−１０の存在下で、ＣＤ４+Ｔ細胞の活性化によって得られる量より十分にまさる量で素早く、抗原−特異的Ｔｒ１リンパ球を得ることを可能にする新規な方法をまさに開発した。このことは、それらが、誘導体抗原の存在下での増殖性ＣＤ４+細胞と、クラスIIＨＬＡ分子ならびにヒトＬＦＡ−３（ＣＤ５８）分子を発現する抗原を提示するが、共刺激分子Ｂ７−１（ＣＤ８０）、Ｂ７−２（ＣＤ８６）、Ｂ７−Ｈ１、ＣＤ４０、ＣＤ２３およびＩＣＡＭ−１（ＣＤ５４）のいずれも発現しない細胞が、先の抗原に特異的なＴｒ１細胞の分化を誘導することを見出したためである。
【００１１】
ＬＦＡ−３分子は、Ｔリンパ球のＣＤ２受容体のリガンドである。ＬＦＡ−３の２つの形態、トランスメンブランの形態(Walnerら、J. Exp. Med. 166、923〜932、1987；PCT出願WO 88/09826)、およびホスファチジルイノシトールを含有するグリコリピッドにて細胞膜に固定される「ＰＩ結合ＬＦＡ３」として引用されている形態(PCT出願WO 90/02181)を記載している。
本発明は、抗原−特異的調節Ｔｒ１リンパ球を得るために、ＨＬＡ系のクラスII分子およびヒトＬＦＡ−３分子を発現するが、共刺激分子Ｂ７−１、Ｂ７−２、Ｂ７−Ｈ１、ＣＤ４０、ＣＤ２３またはＩＣＡＭ−１（ＣＤ５４）のいずれも発現しない人工抗原−提示細胞の使用に関する。
【００１２】
抗原−特異的調節Ｔｒ１リンパ球として定義される細胞は、前記抗原で再び刺激した後に、次の特性を有する細胞である。
−それらは、多量のＩＬ−１０、すなわち１０6細胞あたり３×１０3ｐｇ以上の量、一般に１０6細胞あたり５×１０3〜２０×１０3ｐｇのＩＬ−１０を生産する。
−それらは、１０6細胞あたり５０ｐｇ以下の量のＩＬ−２を生産し、前記細胞にて生産されるＩＬ−１０／ＩＬ−２割合は、少なくとも５０／１、一般には１００／１〜５００／１である。
−それらは、１０6細胞あたり５０ｐｇ以下の量のＩＬ−４を生産し、前記細胞にて生産されるＩＬ−１０／ＩＬ−４割合は、少なくとも３００／１、一般には５００／１〜１００００／１である。
−Ｔｒ１細胞の存在下で、抗原にて刺激されるＣＤ４+Ｔ細胞の増殖は、少なくとも２倍、一般には少なくとも２〜１００倍に減少する。
【００１３】
特に、本発明は、患者のリンパ球由来の抗原−特異的調節Ｔｒ１リンパ球の調製方法であって、
−前記で定義したような人工抗原−提示細胞にて提示される選択抗原の存在下で、前記リンパ球をインビトロで活性化し、そして
−前記リンパ球から、少なくとも１０％、好ましくは少なくとも５０％、より特に好ましくは少なくとも８０％の前記抗原に特異的なＴｒ１リンパ球を含む活性化されたＣＤ４+Ｔリンパ球の集団を回収すること
を含むことを特徴とする。
【００１４】
本発明を実行するのに使用できる人工抗原−提示細胞は、有利には、クラスIIＨＬＡ分子のα鎖をエンコードする核酸配列、クラスIIＨＬＡ分子のβ鎖をエンコードする核酸配列およびＬＦＡ−３の２つの形態のいずれかをエンコードする核酸配列で、上記共刺激分子のいずれも発現しない動物細胞を、コトランスフェクト（cotransfect）することで得ることができる。所見により、これら細胞は、同様に、Ｔｒ１リンパ球の特異性が誘導される抗原をエンコードする核酸配列でトランスフェクトできる。これら核酸配列は、異なる核酸分子を持つことができ、またはその他にそれらの２つ以上が同一の核酸分子を持つことができる。
【００１５】
前記人工抗原−提示細胞を得るために使用できる動物細胞は、ヒト、自己または異種の起源の細胞、あるいはその他の異種起源の細胞、特に哺乳類の細胞でありうる。近年、単離された一次培養物が使用できる。一般に、より同種であり、かつ幾つもの世代にわたって増殖しうる確立された細胞系列を使用することが好ましいであろう。
例えば、それらは、繊維芽細胞、ケラチン生成細胞、尿細管細胞、シュワン細胞、筋原細胞、内皮細胞などの形態を取りうる。
【００１６】
人工抗原−提示細胞にて発現されるクラスIIＣＭＨ分子は、ＣＤ４+Ｔリンパ球が得られる患者のＨＬＡクラスIIタイプおよびＴｒ１細胞の意図される用途に従って入手しうる異なるヒトＨＬＡ−２分子の中から選択されるであろう。
【００１７】
一般に、患者にても発現されるＨＬＡ−２分子を発現する人工抗原−提示細胞が使用されるであろう。しかし、患者にて発現されるものとは異なるＨＬＡ−２分子を選択することも可能である。例えば、移植拒絶反応を予防するために使用できるＴｒ１細胞を生産したい場合、これは、移植細胞にて発現されるＨＬＡ−２分子の形態を取ってもよい。この場合、ＨＬＡ−２分子は、得られたＴｒ１細胞が指向するであろう抗原を構築する。
本発明による方法を実行するために使用される抗原は、生産すべき抗原−特異的Ｔｒ１細胞を意図する用途に従って選択されるであろう。抗原は、炎症または自己免疫の病状と関連する抗原の形態を取りうる。同様に、特定の病状とは関係なしに、Ｔｒ１細胞が、好まざる免疫応答を制御するために活性化される場合に、投与できる抗原の形態を取ってもよい。
【００１８】
人工抗原−提示細胞は、細胞と抗原を共インキュベート(coincubate)することによる従来の方法で、抗原でチャージされうる。抗原は、天然の形態で提示でき、抗原−提示細胞で調製できる。同様に、抗原は前記細胞にて発現されるＨＬＡ−２分子で直接付着できる１以上の抗原性ペプチドの形態で提示されうる。対して、抗原がそれをエンコードする核酸配列であらかじめトランスフェクトされている場合、抗原は、人工抗原−提示細胞にて発現できる。
【００１９】
本発明による方法を実行するために、リンパ球のインビトロでの活性化を、患者から得たＰＢＭＣ（末梢血単核細胞）で直接行うことができる。これらＰＢＭＣからあらかじめ単離されているＣＤ４+Ｔ細胞でも行うことができる。
リンパ球は、それらを２〜１０日にわたって、好ましくは６〜８日にわたって、選択された抗原をチャージしている上記の人工抗原−提示細胞の存在下で、共培養（coculture）することで活性化される。
【００２０】
この培養期間の最後に、活性化されたＣＤ４+Ｔリンパ球を、ＣＤ４+マーカーおよびＣＤ２５、ＣＤ６９、ＣＤ４５ＲＯなどのような１つ以上の活性マーカーの発現に基づいて選択する。
この培養期間の最後に、Ｔｒ１リンパ球が、活性化された抗原−特異的Ｔリンパ球の少なくとも１０％、一般には５０〜８０％の間に達する細胞集団が得られる。
【００２１】
この集団で、さらにいっそうＴｒ１リンパ球を濃縮するために、上記で規定した条件下で刺激を繰り返してもよい。
その結果、抗原−特異的Ｔ細胞の中で、Ｔｒ１リンパ球の少なくとも３０％、一般には６０〜９０％の間からなる活性化されたＣＤ４+Ｔリンパ球の集団が得られる。
同様に、Ｔｒ１リンパ球クローンを、この集団から単離することができる。これらクローンを、上記で規定したように、Ｔｒ１リンパ球の特徴的なサイトカイン生産プロフィールに基づいて素早く同定することができる。
【００２２】
クローン増殖を、ＩＬ−４およびＩＬ−２のような非特異的な成長因子を含む栄養培地内で行ってもよい。好ましい実施の形態は、刺激剤として、抗−ＣＤ３−および抗−ＣＤ２８−抗体−結合ビーズを使用することからなる。
本発明による方法で得られるＴｒ１細胞は、ＩＬ−１０の存在下で、ＣＤ４+Ｔリンパ球の活性化によって得られるＴｒ１細胞の特性の全てを提示し、それゆえ、免疫応答を調節するにおいて、後者と同一な用途を有する。
【００２３】
本発明は、炎症疾患および／または自己免疫疾患の治療を意図する医薬品の調製方法に関し、本発明による方法によって抗原−特異的Ｔｒ１リンパ球を調製し、それらを患者に投与するのに適した製剤に、前記Ｔｒ１リンパ球を包精することを含むことを特徴とする。
本発明は、続く残りの記載によって、より理解されるであろうし、本発明による方法をどのようにして実行するかを説明する実施例に限定されるものではないことを記載する。
【００２４】
実施例１：Ｔｒリンパ球の調製
ＣＤ４+Ｔ細胞の単離
末梢単核細胞（ＰＢＭＣ）を、フィコール−ハイパック（Ｈｙｐａｑｕｅ）上で、遠心分離にて得る。
ＣＤ４+Ｔ細胞を、次のプロトコルで記載のような抗−ＣＤ８（Ｌ５３３）、抗−ＣＤ１１ｂ（ＯＫＭ１）および抗−ＣＤ２０（２Ｈ７）抗体を使って、非−ＣＤ４+細胞を排除することで得る。細胞を、飽和抗体濃度（saturating antibody concentration）にて、４℃で２０分間インキュベートする。洗浄後、ダイナビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄ）（Ｄｙｎａｌ、オスロ、ノルウェー）を、１／１のビーズ／標的細胞の割合で加え、混合物を４℃で、１時間インキュベートする。それらに付着した非−ＣＤ４+細胞を有するビーズを、電磁場の適用によって、排除する。フローサイトメトリー（ＦＡＣＳスター、Becton Dickinson）による残存する細胞の解析は、それらが９０〜９５％のＣＤ４+Ｔ細胞を含むことを立証している。
【００２５】
人工抗原−提示細胞の収得
マウスＬ繊維芽細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−１）を、ＬＦＡ−３およびクラスIIＨＬＡ分子をエンコードする核酸配列でコトランスフェクトした。
【００２６】
ＬＦＡ−３−エンコードｃＤＮＡの収得
ＬＦＡ−３−エンコードｃＤＮＡを、ＫｐｎＩサイトにて５’がフランクされたヒトＬＦＡ−３（ジーンバンク  受理番号  Ｘ０６２９６）をエンコードする配列のヌクレオチド１３〜３３の配列、５’ＬＦＡ−３と呼ばれるプライマーおよびＮｏｔＩサイトにて５’がフランクされたヒトＬＦＡ−３をエンコードする配列のヌクレオチド７０８〜７２８の配列を含み、３’ＬＦＡ−３と呼ばれるプライマーを使い、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法にて、ヒト末梢単核細胞の完全なｃＤＮＡライブラリーから調製した。
【００２７】
ＤＲ１−エンコードｃＤＮＡの収得
ＤＲ１α鎖をエンコードするｃＤＮＡを、ＤＲ１α鎖をエンコードする配列（ジーンバンク  受理番号  Ｋ０１１７１）、ならびにヌクレオチド１５１〜１７６の配列およびヌクレオチド７６９〜７９２の配列をそれぞれ含むＤＲ１Ａ５’およびＤＲ１Ａ３’と呼ばれるプライマーを使い、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）にて、ＤＲ１+ドナー由来のヒト末梢単核細胞の完全なｃＤＮＡライブラリーから得た。ＤＲ１β鎖をエンコードするｃＤＮＡを、ＤＲ１β鎖をエンコードする配列（ジーンバンク  受理番号  ＮＭ００２１２４）のヌクレオチド５２〜７４および８５０〜９２３の配列をそれぞれ含むＤＲ１Ｂ５’およびＤＲ１Ｂ３’のような上記で参照したプライマーを使い、同様な方法で得た。
【００２８】
細胞のトランスフェクション
得られた各々のｃＤＮＡを、ベクターｐｃＤＮＡ３．１／ハイグロ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のＴＡサイトにクローンした。得たベクターを、エレクトロポレーションにて、Ｌ細胞をコトランスフェクトさせるために使用した。
【００２９】
安定したトランスフェクタントを、細胞を抗−ＬＦＡ−３抗体（１Ｃ３）および抗−ＤＲ抗体（Ｌ２４３）でラベルすることで、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳヴァンテージ  ＳＥ、Becton Dickinson）にて分離させる。ＬＦＡ−３およびＤＲを同時に発現する細胞を、そしてペニシリンおよびストレプトマイシンを添加した１０％仔牛血清（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）で補充したＦ１２培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）上に保持し、培養する。
【００３０】
ＬＦＡ−３およびＤＲ１を共発現（coexpress）する抗原−提示細胞を、同様に、Ｐ８１５細胞（ＡＴＣＣ−ＴＩＢ６４）をコトランスフェクトさせることで上記のように調製した。
トランスフェクトされていないＬ細胞またはＰ８１５細胞、あるいはＤＲ１分子のみを発現するＬ細胞またはＰ８１５細胞のトランスフェクトにて得られる細胞を、同様に対照として使用した。
【００３１】
Ｔｒリンパ球の収得
非−ＤＲ１ドナーのＰＢＭＣから、上記のように単離したＣＤ４+Ｔ細胞を、Ｙｓｓｅｌ培地（Ysselら、J.Immunol.Methods、72、219〜227、1984）中、２×１０6細胞／ｍｌの濃度で懸濁する。細胞懸濁を、１ｍｌ／穴で２４−穴培養プレート内に分ける。上記のようにして得られたトランスフェクトされたＬ−ＤＲ１−ＬＦＡ３細胞またはトランスフェクトされたＬ−ＤＲ１細胞、あるいはコントロールとしてＢ−ＥＢＶ  ＤＲ１+リンパ芽球状細胞を、ガンマ線照射し（６０ＧＹ）、そして各々の穴に５×１０5細胞／ｍｌの濃度で加える。
【００３２】
７日間インキュベートした後、細胞を回収し、ＰＢＳで洗浄し、そして抗−ＣＤ４抗体（ＲＰＡ−Ｔ４）および抗−ＣＤ２５抗体（Ｍ−Ａ２５１）を使ってラベルする。ＣＤ４+ＣＤ２５+細胞を、フローサイトメトリーにて分離し、Ｙｓｓｅｌ培地で９６−穴プレート中、１細胞／穴でクローンする。クローン増殖を、ＩＬ−２およびＩＬ−４の存在下で、ＳｐｉｔｓおよびＹｓｓｅｌにて記載されている技術（J.Immunol.Methods、9、416〜421、1996）にて行う。クローンの増殖後、様々なクローンを、Ｂ−ＥＢＶ  ＤＲ１+リンパ芽球状細胞で再び刺激する。刺激４８時間後、細胞懸濁を回収し、そしてこの刺激に応答するサイトカインＩＬ−１０およびＩＦＮ−γの生産のプロフィールを、Ａｂｒａｍｓらにて記載されているプロトコル（Curr.Protocols Immunol.、13、pp6．1-6-15、1995）に従ってＥＬＩＳＡにてこれらサイトカインを定量分析することで分析した。
【００３３】
下記の表１で説明する結果は、２つの異なるドナー由来のＴｒ１細胞によるサイトカインＩＬ−10およびＩＦＮ−γの生産を示している（１０クローンの平均±標準偏差）。
【００３４】
【表１】
2004526459.tif 000002
【００３５】
その他の実験系で、ＤＲ１+ドナー由来のＰＢＭＣから単離したＣＤ４+Ｔ細胞を、上記したように、ＤＲ１分子およびＬＦＡ−３分子を発現する抗原−提示細胞と混合する。
誘導体抗原（ヘモフィルス  インフルエンザ（Haemophilus influenzae）ウイルスのカプシド抗原のフラグメントに相当するペプチドＨＡ  ３０７−３１９）を、５０μｇ／ｍｌの濃度で、細胞混合物に加える。
【００３６】
３日間インキュベートした後、ＣＤ４+ＣＤ２５+細胞を、フローサイトメトリーにて分離し、上記したようにクローンする。
クローンの増殖後、様々なクローンを、ＨＡペプチド（１０μＭ）でチャージされたＢ−ＥＢＶリンパ芽球状細胞で再び刺激する。刺激４８時間後、細胞懸濁を回収し、この刺激の応答で、サイトカインＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−１０およびＩＦＮ−γの生産のプロフィールを、Ａｂｒａｍｓと共同研究者にて記載されたプロトコルに従ってＥＬＩＳＡにてこれらサイトカインの定量分析にて分析した。
単離されたＣＤ４+ＣＤ２５+クローンのほとんど（約７０％）は、ＴＲ１細胞のサイトカイン生産プロフィールを示す。
９つのこれらＴｒ１クローンのサイトカイン生産プロフィールを、下記の表２で説明する。
【００３７】
【表２】
2004526459.tif 000003
【００３８】
同様なサイトカイン生産プロフィールを有するＴｒ１細胞クローンは、抗原−提示細胞としてＰ８１５−ＤＲ１−ＬＦＡ−３細胞を使っても得られ、そのことは、Ｔｒ１細胞を得ることが、抗原−提示細胞が得られる細胞系列の特性とは関連していないことを証明している。
【００３９】
実施例２：本発明による方法で得られるＴＲ１リンパ球の免疫調節特性
抗原−特異的Ｔｒ１細胞の免疫特性を、次のように試験した。
ＤＲ１+ドナー由来のヒトＣＤ４+Ｔ細胞（１×１０6／ｍｌ）を、ペプチドＨＡ３０７−３１９（５０μＭ）および破傷風アナトキシン（ＴＴ：５０μｇ／ｍｌ）の存在下で、ガンマ線照射（６０ＧＹ）された同系の単核細胞（１×１０6／ｍｌ）で刺激する。
上記したように得たＨＡ−特異的Ｔｒ１クローンを、細胞（２×１０5／ｍｌ）のみ、あるいはＩＬ−１０受容体（抗−ＩＬ−１０Ｒ、１０μｇ／ｍｌ）に対する抗体、抗−ＴＧＦ−β抗体（２０μｇ／ｍｌ）またはこれら２つの抗体の混合物の存在下で加える同様な実験を平行して行う。
【００４０】
ＣＤ４+Ｔ細胞の増殖を、５日後に、トリチウム化されたチミジンの取り込みを測定することで分析する。
３つのＨＡ−特異的Ｔｒ１クローンについて得られた結果を、図１で説明する。
図１に対するキー：
Ｘ軸：増殖（取り込まれたトリチウム化されたチミジン、ｃｐｍ）
Ｙ軸：
媒体：刺激されていないＣＤ４+Ｔ細胞
ＴＴ+ＨＡペプチド：ＨＡ３０７−３１９ペプチドおよび破傷風アナトキシンにて刺激されるＣＤ４+Ｔ細胞
+Ｔｒ１  ＨＡ−特異性：ＨＡ抗原に特異的なＴｒ１細胞の存在下で、ペプチドＨＡ３０７−３１９および破傷風アナトキシンにて刺激されるＣＤ４+Ｔ細胞
+抗ＩＬ−１０Ｒ：ＨＡ抗原に特異的なＴｒ１細胞および抗−ＩＬ−１０Ｒ抗体の存在下で、ペプチドＨＡ３０７−３１９および破傷風アナトキシンにて刺激されるＣＤ４+Ｔ細胞
+抗−ＴＧＦ−β：ＨＡ抗原に特異的なＴｒ１細胞および抗−ＴＧＦ−β抗体の存在下で、ペプチドＨＡ３０７−３１９および破傷風アナトキシンにて刺激されるＣＤ４+Ｔ細胞
+抗−ＩＬ−１０Ｒ+抗−ＴＧＦ−β：ＨＡ抗原に特異的なＴｒ１細胞および抗−ＩＬ−１０Ｒ抗体と抗−ＴＧＦ−抗体との混合物の存在下で、ペプチドＨＡ３０７−３１９および破傷風アナトキシンにて刺激されるＣＤ４+Ｔ細胞
【００４１】
これらの結果は、本発明による方法で得られるＴｒ１リンパ球が、ＣＤ４+Ｔ細胞の抗原−特異的な増殖をかなり低下させることを立証している。この抑制効果は、抗−ＩＲ−１０Ｒ抗体または抗−ＴＧＦ−β抗体のみでわずかに弱められるだけであり、かつ２つの抗体の混合物によって部分的に無効にされる。
【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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