(57)【要約】ノビスピリンペプチドは、グラム陰性菌に対して強力な活性を有する抗菌剤である。ペプチドは、非溶血性であり、他の抗菌ペプチドと比較してインビトロ細胞障害性の減少を示す。また、ペプチドの静脈内注射後のインビボでの認容性は良好であった。ノビスピリンは、リポ多糖類（ＬＰＳ）にも結合し、グラム陰性菌感染症に関連した症状を緩和する特性も有する。活性物質としてノビスピリンを含む薬学的組成物は、微生物感染症、特にグラム陰性菌感染症を有する、または素因がある患者に投与される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号：１
2004526663.tif 000013
に記載される配列を含む抗菌ポリペプチド；
式中、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３およびＸ４が、グリシン、トレオニン、セリンおよびイソロイシンのＤ型またはＬ型からなる群より独立して選択され、但しＸ残基のうち多くとも３個がイソロイシンである。
【請求項２】
Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３およびＸ４が、グリシン、トレオニン、セリンおよびイソロイシンからなる群より独立して選択され、但しＸ残基のうち多くとも３個イソロイシンである、請求項１記載の抗菌ペプチド。
【請求項３】
Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３およびＸ４の一つのみがグリシン、セリン、およびトレオニンから選択される、請求項２記載の抗菌ペプチド。
【請求項４】
配列番号：３〜配列番号：３７のいずれか１つに記載されるアミノ酸配列を含む、請求項３記載の抗菌ペプチド。
【請求項５】
本質的に配列番号：３〜配列番号：３７のいずれか１つに記載のアミノ酸配列からなる、請求項４記載の抗菌ペプチド。
【請求項６】
ペプチドのカルボキシ末端がアミド化されている、請求項１記載の抗菌ペプチド。
【請求項７】
以下を含む抗菌製剤、ならびに薬学的に許容される担体：
2004526663.tif 000014
に記載される配列を含む抗菌ポリペプチド；
式中、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３およびＸ４は、グリシン、トレオニン、セリン、グルタミン酸、アスパラギン酸、イソロイシン、Ｄ−アラニンならびにＤ−イソロイシンからなる群より独立して選択され、但しＸ残基のうち多くとも３個イソロイシンである。
【請求項８】
Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３およびＸ４が、グリシン、トレオニン、セリンおよびイソロイシンからなる群より独立して選択され、但しＸ残基のうち多くとも３個イソロイシンである、請求項７記載の抗菌製剤。
【請求項９】
Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３およびＸ４の一つのみがグリシン、セリン、およびトレオニンから選択される、請求項８記載の抗菌製剤。
【請求項１０】
ペプチドが配列番号：３〜配列番号：３７のいずれか１つに記載されるアミノ酸配列を含む、請求項９記載の抗菌製剤。
【請求項１１】
ペプチドが、本質的に配列番号：３〜配列番号：３７のいずれか１つに記載のアミノ酸配列からなる、請求項１０記載の抗菌製剤。
【請求項１２】
ペプチドのカルボキシ末端がアミド化されている、請求項７記載の抗菌製剤。
【請求項１３】
薬学的に許容される担体がキレート化剤を含む、請求項７記載の抗菌製剤。
【請求項１４】
キレート化剤がクエン酸塩である、請求項１３記載の抗菌製剤。
【請求項１５】
第二の抗菌剤をさらに含む、請求項７記載の抗菌製剤。
【請求項１６】
第二の抗菌剤が抗生物質である、請求項１５記載の抗菌製剤。
【請求項１７】
抗菌ペプチドのエアロゾル輸送に適している、請求項７記載の抗菌製剤。
【請求項１８】
以下を含む、微生物感染症を治療する方法：
配列番号：１
2004526663.tif 000015
に記載される配列を含む抗菌ポリペプチドに微生物集団を接触させる段階；
式中、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３およびＸ４はグリシン、トレオニン、セリン、グルタミン酸、アスパラギン酸、イソロイシン、Ｄ−アラニンならびにＤ−イソロイシンからなる群より独立して選択され、但しＸ残基のうち多くとも３個イソロイシンである。
【請求項１９】
Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３およびＸ４がグリシン、トレオニン、セリン、およびイソロイシンからなる群より独立して選択され、但しＸ残基のうち多くとも３個イソロイシンである、請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３およびＸ４の一つのみがグリシン、セリン、およびトレオニンから選択される、請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
ペプチドが配列番号：３〜配列番号：３７のいずれか１つに記載されるアミノ酸配列を含む、請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
ペプチドが、本質的に配列番号：３〜配列番号：３７のいずれか１つに記載のアミノ酸配列からなる、請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
微生物集団がグラム陰性菌を含む、請求項１８記載の方法。
【請求項２４】
グラム陰性菌が緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、トラコーマクラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、およびステノトロフォモナス・マルトフィリア（Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ ｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａ）の一つまたはそれ以上である、請求項２３記載の方法。
【請求項２５】
ペプチドのカルボキシ末端がアミド化されている、請求項１８記載の方法。
【請求項２６】
ペプチドが、キレート化剤を含む薬学的に許容される担体において製剤化される、請求項１８記載の方法。
【請求項２７】
キレート化剤がクエン酸塩である、請求項２６記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
連邦政府助成研究に関する声明
本発明は、米国国立衛生研究所によって与えられた政府助成金番号第ＡＩ４３９３４号によってなされた。米国政府は本発明に一定の権利を保有する可能性がある。
【０００２】
緒言
背景
有効な抗菌剤が開発されれば、細菌疾患に対する最終的な治癒となると一度は見なされていた。しかし、最初の抗生物質が開発される前においても、細菌は、環境におけるストレスに対する適合能を示し、それによって耐性を発達させた。近年、様々な抗菌剤が実質的に増加しているが、これに平行して耐性病原性微生物も増加している。耐性は今では、臨床で使用できる全ての抗菌剤に対して認められている。医学界における抗菌耐性に対する対処法は、耐性細菌に対してこれまで用いられていない新しいまたはもう一つの抗生物質を用いることであった。このアプローチでは、現行の化合物の改変体として、または細菌の耐性メカニズムを阻害もしくは迂回する可能性がある化合物の組み合わせのいずれかとしての新しい抗生物質の絶え間ない開発が必要であった。
【０００３】
天然のポリ陽イオン性抗生物質ペプチドが異なる多くの動物種および昆虫において発見され、これらは広い抗菌活性を有することが示されている。哺乳類において、これらの抗菌ペプチドは主に二つのファミリー、すなわちデフェンシンとカテリシジンによって表される。これらのペプチドのほぼ全てが膜に対する親和性を有し、細菌膜に浸透してこれを透過性にすることができ、それによって微生物は障害、溶解、および／または死に至る。例えば、α−デフェンシンと呼ばれるヒトペプチドは、好中球および腸のパネート細胞によって産生される。三次元において、デフェンシンは、両親媒性の大きいβシート構造を表し、極性表面はほどんどがそのアルギニンによって形成され、Ｎ−末端およびＣ−末端残基は抗菌力およびスペクトルを定義する上で重要な役割を果たす。（グドムンドソン（Ｇｕｄｍｕｎｄｓｓｏｎ）ら、（１９９９）、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ ２３２（１−２）：４５〜５４を参照のこと）。抗菌ペプチドは、ハンコックとレーラー（Ｈａｎｃｏｃｋ ａｎｄ Ｌｅｈｒｅｒ、（１９９８）、Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １６：８２）によって論評されている。
【０００４】
嚢胞性繊維症（ＣＦ）は、アメリカの新生児３，３００人に１人の割合で発生する遺伝障害である。これは今日アメリカ人約３０，０００人が罹患している。ＣＦ患者の生存年齢の中央値は３１．３歳に過ぎず、ＣＦはアメリカにおける最も一般的な短命な遺伝疾患となっている。ほとんどのＣＦ患者は、環境中に広く分布するグラム陰性細菌である緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）による慢性の進行性感染症が原因で起こる肺不全のために死亡する。緑膿菌（Ｐ． ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）は、正常な個体に対する感染能は限られているが、免疫無防備、重度の火傷、または抗生物質治療者においては破壊的な二次侵入者となりうる。緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）株はしばしば、従来の抗生物質に対して耐性である、または耐性となることから、それらによって引き起こされる感染症はしばしば根治することが難しい。
【０００５】
セクロピンＰ１、インドリシジン、マガイニンＩＩ、ニシン、およびラナレキシンを含む抗菌ペプチドのインビトロ活性は、緑膿菌（Ｐ． ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）の臨床単離体に対して調べられている。ペプチドは、広い範囲の阻止値を有することが判明し、従来の抗生物質と組み合わせると何らかの相乗効果を示した（ジアコメッティ（Ｇｉａｃｏｍｅｔｔｉ）ら、（１９９９）、Ｊ． Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ． Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ． ４４（５）：６４１〜５）。
【０００６】
薬剤耐性グラム陰性菌に対して活性であって、哺乳類細胞に対する毒性が低いる新規抗生物質が臨床的に必要である。本発明はこの需要に応える。
【０００７】
関連文献
サイマン（Ｓａｉｍａｎ）ら（（１９９９）、Ｐｅｄｉａｔｒ． Ｐｕｌｍｏｎｏｌ． Ｓｕｐｐｌ． １７：３２０）は、ＣＦ患者からの薬剤耐性菌が、カテリシジンペプチドによって阻害されることを報告し、ブログデン（Ｂｒｏｇｄｅｎ）ら（（１９９９）、Ｐｅｄｉａｔｒ． Ｐｕｌｍｏｎｏｌ． Ｓｕｐｐｌ． １７：３２０）は、ヒツジの肺感染症モデルにおいてＳＭＡＰ２９が有効であること、および嚢胞性繊維症（ＣＦ）患者において緑膿菌（Ｐ． ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）感染症を治療できる可能性について報告している。
【０００８】
発明の概要
ノビスピリンペプチドを用いるための方法および組成物を提供する。ノビスピリンペプチドは、トラコーマクラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、およびステノトロフォモナス・マルトフィリア（Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ ｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａ）を含むグラム陰性菌に対して強力な活性を有する低分子抗菌剤である。ペプチドは非溶血性であり、他の抗菌ペプチドと比較してインビトロ細胞障害性の減少を示し、静脈内注射後のインビボでの認容性は良好である。ノビスピリンは、増殖期および静止期緑膿菌（Ｐ． ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）に対して等しく有効であり、それらは高濃度の塩またはヒト血清の存在下においても活性を保持している。ノビスピリンはまた、リポ多糖類（ＬＰＳ）にも結合し、グラム陰性菌感染症に関連した症状を緩和する特性を有する。
【０００９】
活性物質としてノビスピリンを含む薬学的組成物を、微生物感染症、特に細菌感染症を有する患者に投与する。蛋白質はまた、インビトロで多様な微生物を殺すことにおいても有効である。ノビスピリンは単独で投与してもよく、または他の殺菌剤、例えば抗生物質と組み合わせて、有効なペプチドのカクテル等として投与してもよい。微生物のノビスピリン媒介殺菌は、新規抗生物質のモデリングおよびスクリーニングにとっても有用である。
【００１０】
詳細な態様の説明
ノビスピリンを抗菌剤として用いるための方法を提供する。ペプチドは、直接の殺菌活性によってインビトロおよびインビボで多様な微生物を殺すために有効である。（複数の）ノビスピリンは、単独でまたは他の活性物質と組み合わせて、感染症を有するまたは感染症に対して素因を有する患者に、微生物病原体の患者集団を減少させるために十分な用量および期間で投与する。
【００１１】
新規抗菌物質、特に、従来の抗生物質に対して耐性である病原体、例えば緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）を殺すために有効である抗菌物質が常に必要である。関心対象の特定の治療には：例えば、緑膿菌（Ｐ． ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、Ｓ． マルトフィリア（Ｓ． ｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａ）等によって引き起こされる感染症を治療するために、および他の吸入抗生物質に対する耐性が出現する前に嚢胞性繊維症を有する患者の肺へのエアロゾル投与；感染症を予防するために留置カテーテルを有する患者の尿道への注入；重度の火傷を有する患者の皮膚への適用；感染症を治療または予防するために直接または眼科用溶液での眼内注入；例えば、トラコーマクラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）による感染症を予防することによって、細菌性膣症を治療するためおよび／または性的伝幡疾患を予防するための膣内適用が含まれるがこれらに限定されない。ノビスピリンはまた、食用穀物における病気および腐敗の防止のために設計された農業的応用において、植物病原体シュードモナス種菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｄ）の治療に用いられる。
【００１２】
ノビスピリンのペプチド型は、変化した生物および化学的特性を有する改変型を生じるようにポリペプチド構造を改変することによってさらなる治療的開発の基礎を提供する。天然もしくは改変型は、治療的用途のために生理的に許容される担体において製剤化されるか、またはそうでなければ抗菌剤として用いられる。
【００１３】
ノビスピリン組成物
本発明の方法において用いるために、提供されたノビスピリン、その改変体、または一つもしくはそれ以上の型の組み合わせのいずれかを用いてもよい。ノビスピリンには、以下の式のペプチドが含まれる：
2004526663.tif 000002
式中、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３およびＸ４は、グリシン、トレオニン、セリン、およびイソロイシンのＤ型またはＬ型、好ましくはグリシン、トレオニン、セリン、グルタミン酸、アスパラギン酸、イソロイシン、Ｄ−アラニン、およびＤ−イソロイシンからなる群より独立して選択され、但し、Ｘ残基のうち多くともの３個イソロイシンである。非イソロイシン残基の好ましいアミノ酸は、グリシン、セリン、およびトレオニンである。好ましいのは、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３およびＸ４の一つのみがグリシン、セリン、およびトレオニンから選択されるペプチドである。
【００１４】
これらの置換を作製するための理論に拘束されることなく、抗菌ペプチドオビスピリン（配列番号：２）の細胞毒性は、その高い程度の硬度および両親媒性に関連していると考えられている。オビスピリンの６位、７位、１０位または１１位のイソロイシン残基の一つをグリシン、トレオニン、セリン、グルタミン酸、アスパラギン酸、イソロイシン、Ｄ−アラニン、またはＤ−イソロイシンに置換すると、柔軟性（グリシン）、αヘリックスの切断（Ｄ−アラニン（ＤＡ）またはＤ−イソロイシン（ＤＩ）を付加し、または過度に疎水性領域を破壊するための極性残基を付加する。
【００１５】
表１は、オビスピリンおよび例としてのノビスピリンペプチドの一次配列を示す。太字は、これらのノビスピリンをオビスピリンと区別する残基を示す。
2004526663.tif 000003
【００１６】
ノビスピリンポリペプチドの配列はまた、標的化した配列変化を作製するために当技術分野で既知の様々な方法において改変してもよい。ポリペプチドは通常、本明細書に提供した配列と実質的に類似であると考えられ、すなわちアミノ酸１個が異なる、およびアミノ酸２個が異なってもよい。配列の変化は置換、挿入、または欠失であってもよい。
【００１７】
蛋白質は、多様な目的のために他の多様なオリゴペプチドまたは蛋白質に結合させてもよい。本発明のペプチドの発現を提供することによって、様々な翻訳後修飾が得られる可能性がある。例えば、適当なコード配列を用いることによって、ファルネシル化またはプレニル化を提供してもよい。この状況において、ペプチドは、リポソームのような脂質膜に結合することができるように末端で脂質基に結合すると考えられる。もう一つの例において、ペプチドのカルボキシ末端をアミド化して、それによってペプチドの正電荷を増加させる。
【００１８】
本発明の方法において用いられるノビスピリンは、組換え法によって真核細胞もしくは原核細胞から産生してもよく、または当技術分野で既知のようにインビトロで合成してもよい。
【００１９】
本発明の一つの態様において、抗菌ペプチドは、本質的に、配列番号：１、または配列番号：３〜配列番号：３０のいずれか一つに述べたポリペプチド配列からなる。本明細書に記載したポリペプチドの意味において「本質的になる」とは、ポリペプチドが、その配列がポリペプチドの（複数の）基本的特徴に実質的な影響を及ぼさない一つまたはそれ以上のアミノ酸または他の残基に隣接してもよい、配列表に記載の配列で構成されることを意味する。
【００２０】
使用方法
ノビスピリン製剤を、微生物感染症を有する、または素因がある宿主に投与する。投与は特定の微生物に応じて、外用、局所または全身投与であってもよく、好ましくは外用であると考えられる。一般的に、ノビスピリンの用量は、微生物集団を少なくとも約５０％、通常、少なくとも１対数減少させるために十分であり、２対数またはそれ以上の対数の殺菌であってもよい。本発明の化合物は、如何なる副作用も最小限にしながら微生物集団を減少させる用量で投与される。組成物は、インビボで用いるために医師の指導の下で得て用いられると考慮される。ノビスピリンは、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）およびトラコーマクラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）を含むグラム陰性菌を殺すために特に有用である。
【００２１】
ノビスピリンはまた、特に従来の抗生物質の量を導入したくない場合に、微生物を殺すためのインビトロ製剤にとって有用である。例えば、ノビスピリンは、動物および／またはヒトの食品調製物に添加してもよい。ノビスピリンは、細胞のインビトロ培養の添加剤として、または組織培養における微生物の過剰増殖を予防するために含めてもよい。
【００２２】
ノビスピリンによる殺菌に対する特定の微生物の感受性は、実験の章に詳細を記すように、インビトロ試験によって決定してもよい。典型的に、微生物の培養物を、蛋白質が作用するために十分な期間、通常約１時間〜１日、様々な濃度のノビスピリンと混合する。次に、生存微生物を計数して、殺菌レベルを決定する。
【００２３】
関心対象の微生物には、グラム陰性菌：例えば、シトロバクター種（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ）；エンテロバクター種（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ）；大腸菌種（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｓｐ）、例えば大腸菌；クレブシエラ種（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｓｐ）；モルガネラ種（Ｍｏｒｇａｎｅｌｌａ ｓｐ）；プロテウス種（Ｐｒｏｔｅｕｓ ｓｐ）；プロビデンシア種（Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ ｓｐ）；サルモネラ種（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｓｐ）、例えば、チフス菌（Ｓ． ｔｙｐｈｉ）、ネズミチフス菌（Ｓ． ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）；セラチア種（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｓｐ）；赤痢菌種（Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｓｐ）；シュードモナス種（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ）、例えば、緑膿菌（Ｐ． ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）；エルシニア種（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｓｐ）、例えばペスト菌（Ｙ． ｐｅｓｔｉｓ）、偽結核エルシニア菌（Ｙ． ｐｓｅｕｄｏｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、エルシニア・エンテロコリチカ（Ｙ． ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ）；フランシセラ種（Ｆｒａｎｃｉｓｃｅｌｌａ ｓｐ）；パスツレラ種（Ｐａｓｔｕｒｅｌｌａ ｓｐ）；ビブリオ種（Ｖｉｂｒｉｏ ｓｐ）、例えばビブリオコレラ（Ｖ． ｃｈｏｌｅｒａｅ）、腸炎ビブリオ（Ｖ． ｐａｒａｈｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ）；カンピロバクター種（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ）、例えばカンピロバクター・ジェジュニ（Ｃ． ｊｅｊｕｎｉ）；ヘモフィルス種（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｓｐ）、例えばインフルエンザ菌（Ｈ． ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、ヘモフィルス・デュクレイ（Ｈ． ｄｕｃｒｅｙｉ）；ボルデテラ種（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｓｐ）、例えば、百日咳菌（Ｂ． ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）、気管支敗血症菌（Ｂ． ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ）、パラ百日咳菌（Ｂ． ｐａｒａｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）；ブルセラ種（Ｂｒｕｃｅｌｌａ ｓｐ）；ナイセリア種（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｓｐ）、例えば淋菌（Ｎ． ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）、髄膜炎菌（Ｎ． ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）等が含まれるがこれらに限定されない。関心対象の他の細菌には、レジオネラ種（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｓｐ）、例えば、レジオネラ・ニューモフィラ（Ｌ． ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ）；リステリア種（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｓｐ）、例えば、リステリア菌（Ｌ． ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）；マイコプラズマ種（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｓｐ）、例えば、マイコプラズマ・ホミニス（Ｍ． ｈｏｍｉｎｉｓ）、肺炎マイコプラズマ（Ｍ． ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）；マイコバクテリウム種（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ）、例えば、結核菌（Ｍ． ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、らい菌（Ｍ． ｌｅｐｒａｅ）；トレポネーマ種（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｓｐ）、例えば梅毒トレポネーマ（Ｔ． ｐａｌｌｉｄｕｍ）；ボレリア種（Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｓｐ）、例えば、ボレリア・ブルグドルフェリ（Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）；レプトスピラ種（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａｅ ｓｐ）；リケッチア種（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ ｓｐ）、例えば、斑点熱リケッチア（Ｒ． ｒｉｃｋｅｔｔｓｉｉ）、発疹熱リケッチア（Ｒ． ｔｙｐｈｉ）；クラミジア種（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｓｐ）、例えば、トラコーマクラミジア（Ｃ． ｔｒａｃｈｏｍ���ｔｉｓ）、肺炎クラミジア（Ｃ． ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、オウム病クラミジア（Ｃ． ｐｓｉｔｔａｃｉ）；ヘリコバクター種（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ）、例えばピロリ菌（Ｈ． ｐｙｌｏｒｉ）等が含まれる。
【００２４】
関心対象の非細菌病原体には、真菌および原虫病原体、例えば、プラスモジウム種（Ｐｌａｓｍｏｄｉａ ｓｐ）、例えば、熱帯熱マラリア（Ｐ． ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）、トリパノソーマ種（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｓｐ）、例えば、トリパノソーマ・ブルサー（Ｔ． ｂｒｕｃｅｒ）；シストソーム（Ｓｈｉｓｔｏｓｏｍｅｓ）；体内寄生性アメーバ種（Ｅｎｔａｅｍｏｅｂａ ｓｐ）、クリプトコッカス種（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ）、カンジダ種（Ｃａｎｄｉｄａ ｓｐ）、例えばカンジダ・アルビカンス（Ｃ． ａｌｂｉｃａｎｓ）等が含まれる。
【００２５】
様々な投与方法を用いてもよい。ポリペプチド製剤は、経口投与してもよく、または血管内、皮下、腹腔内、エアロゾル、眼内、膀胱内、局所等に注射してもよい。例えば、吸入による投与方法は当技術分野で周知である。治療的製剤の用量は、投与される特定のノビスピリン、疾患の特性、投与回数、投与様式、宿主からの原因物質の排泄等に応じて広く変化すると考えられる。初回用量をより高くしてその後より低い維持用量を投与してもよい。用量は、週に１回、２週間に１回のようなあまり頻繁でない回数で投与してもよく、または有効な投与レベルを維持するために、より低い用量に分割して１日１回もしくは数回、週に２回等で投与してもよい。多くの場合、経口投与は静脈内投与の場合より高い用量を必要とすると考えられる。経口投与の安定性をより大きくするために、アミド結合と共にアミノ末端およびカルボキシ末端を改変してもよい。例えば、カルボキシ末端はアミド化してもよい。
【００２６】
製剤
本発明の化合物は、治療的投与のために多様な製剤に組み入れることができる。より詳しくは、本発明の化合物は、適当な薬学的に許容される担体または希釈剤と組み合わせて薬学的組成物に組み入れることができ、錠剤、カプセル剤、粉剤、顆粒、軟膏、クリーム、フォーム、溶液、坐剤、注射剤、吸入剤、ゲル、ミクロスフェア、ローション、およびエアロゾルのような固体、半固体、液体、またはガス状剤形の調製物に製剤化してもよい。そのため、化合物の投与は、経口、口腔内、直腸内、非経口、腹腔内、皮内、経皮、気管内等を含む様々なように行うことができる。ノビスピリンは、投与後全身的であってもよく、または埋め込み部位での活性な用量を保持するように作用するインプラントもしくは他の製剤を用いることによって限定してもよい。
【００２７】
一つの態様において、局所使用のための製剤は、二価陽イオン、特にカルシウムおよびマグネシウムの有効な濃度を減少させるキレート化剤を含む。例えば、クエン酸塩、ＥＧＴＡ、またはＥＤＴＡのような物質を含めてもよく、クエン酸塩が好ましい。クエン酸塩の濃度は通常約１〜１０ ｍＭであると考えられる。
【００２８】
本発明の化合物は、単独で、互いに組み合わせて投与することができ、またはそれらは他の既知の化合物（例えば、パーフォリン、抗炎症薬、抗生物質等）と組み合わせて用いることができる。薬学的投与剤形において、化合物は、その薬学的に許容される塩の形で投与してもよい。以下の方法および賦形剤は単なる例に過ぎず、制限するためではない。
【００２９】
経口調製物の場合、化合物は、単独でまたは適当な添加剤、例えば乳糖、マンニトール、コーンスターチ、またはジャガイモデンプンのような従来の添加剤；結晶セルロース、セルロース誘導体、アカシア、コーンスターチ、またはゼラチンのような結合剤；コーンスターチ、ジャガイモデンプン、カルボキシメチルセルロースナトリウムのような崩壊剤；タルクまたはステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤；ならびに必要に応じて希釈剤、緩衝剤、湿潤剤、保存剤、および着香料と組み合わせて、錠剤、粉末、顆粒、またはカプセル剤を作製することができる。
【００３０】
化合物は、植物油または他の類似の油、合成脂肪酸グリセリド、高級脂肪酸のエステルまたはポリエチレングリコールのような水性または非水性溶媒において、必要に応じて、溶解剤、等張剤、懸濁剤、乳化剤、安定化剤および保存剤のような従来の添加剤と共に溶解、懸濁、または乳化することによって注射用調製物に処方してもよい。
【００３１】
化合物は、吸入によって投与するためのエアロゾル製剤において使用することができる。本発明の化合物は、ジクロロジフルオロメタン、プロパン、窒素等のような加圧された許容される噴射剤に製剤化することができる。
【００３２】
化合物は、例えば溶解剤、等張剤、懸濁剤、乳化剤、安定化剤および保存剤のような従来の添加剤と共に製剤化することによって、火傷の感染症を予防するためのローションとして用いることができる。
【００３３】
さらに、化合物は、乳化基剤または水溶性基剤のような多様な基剤と混合することによって坐剤に調製することができる。本発明の化合物は、坐剤によって直腸内投与することができる。坐剤には、体温で融解するが室温では固化するココアバター、カルボワックスおよびポリエチレングリコールのような溶媒が含まれうる。
【００３４】
それぞれの単位用量、例えば茶さじ１杯、大さじ１杯、錠剤、または坐剤が本発明の一つまたはそれ以上の化合物を含む組成物の規定量を含む、シロップ剤、エリキシル剤および懸濁剤のような経口または直腸内投与のための単位投与剤形を提供してもよい。同様に、注射または静脈内投与のための単位投与剤形は、組成物において滅菌水溶液、通常生理食塩液、または他の薬学的に許容される担体における溶液として含んでもよい。
【００３５】
徐放性製剤のためのインプラントは当技術分野で周知である。インプラントは、生体分解性または非生体分解性ポリマーと共にミクロスフェア、スラブ等として製剤化される。例えば、乳酸および／またはグリコール酸のポリマーは、宿主による認容性が良好な侵食性のポリマーを形成する。ノビスピリンを含むインプラントは、活性成分の局所濃度が体内の残りの部位と比較して増加するように注射部位近位に留置する。
【００３６】
本明細書において用いられるように、「単位投与剤形」という用語は、それぞれの単位が薬学的に許容される希釈剤、担体、または溶媒に関連して所望の作用を生じるために十分な量で計算された本発明の化合物の規定量を含む、ヒトおよび動物被験者にとって単位用量として適した物理的に個別の単位を意味する。本発明の単位用量剤形の仕様は、用いる特定の化合物、得られる作用、および宿主において化合物に関連した薬物動態に依存する。
【００３７】
溶媒、補助剤、担体または希釈剤のような薬学的に許容される賦形剤は容易に公衆に使用できる。その上、ｐＨ調節および緩衝剤、等張性調節剤、安定化剤、湿潤剤等のような薬学的に許容される補助物質は、一般に容易に使用できる。
【００３８】
全身投与のための局所用量は、投与あたり被験者の体重１ｋｇあたり０．１ μｇ〜１００ ｍｇの範囲である。典型的な用量は、１日に錠剤１錠を２〜６回、または活性成分の比例的に高い含有量を含む持効性カプセルまたは錠剤を１日１個服用であってもよい。持効性作用は、異なるｐＨ値で溶解するカプセル材料、浸透圧によって徐々に放出するカプセル剤、または徐放性放出の他の既知の手段によって得てもよい。
【００３９】
当業者は、用量レベルが特定の化合物、症状の重症度および副作用に対する被験者の感受性の関数として変化しうることを容易に認識すると考えられる。特定の化合物のいくつかは他より強力である。所定の化合物の好ましい用量は、多様な手段によって当業者によって容易に決定することができる。好ましい手段は、所定の化合物の生理的効力を測定することである。
【００４０】
リポソームを輸送媒体として使用することは、関心対象の一つの方法である。リポソームは標的部位の細胞と融合して、その内容物を細胞内に輸送する。リポソームは、単離、結合剤等のような接触を維持するための様々な手段を用いて融合するために十分な時間細胞と接触する。本発明の一つの局面において、リポソームは肺内投与のためにエアロゾル化するように設計される。リポソームはセンダイウイルスまたはインフルエンザウイルス等のような膜の融合を媒介する精製蛋白質またはペプチドと共に調製してもよい。脂質は、陽イオンまたはホスファチジルコリンのような両性イオン脂質を含む、既知のリポソーム形成脂質の任意の有用な組み合わせであってもよい。残りの脂質は通常、コレステロール、ホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセロール等のような中性または酸性脂質であると考えられる。
【００４１】
リポソームの調製に関しては、カトウ（Ｋａｔｏ）ら（（１９９１）、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６６：３３６１）によって記載された技法を用いてもよい。簡単に説明すると、脂質と、ペプチドを含む内容組成物とを適当な水性培地、都合がよいのは生理食塩液培地において、固体の全量が約１〜１０重量パーセントの範囲となるように混合する。短時間、約５〜６０秒間強く攪拌した後、試験管を約２５〜４０℃の暖かい水浴に入れて、このサイクルを約５〜１０回繰り返した。次に、組成物を都合のよい時間、一般的に約１〜１０秒間超音波処理して、さらにボルテックスによって攪拌してもよい。次に、水性培地を加えて容量を増加させ、通常約１〜２倍の容量を増加させた後振とうして冷却する。この方法によって高分子量分子を管腔内に組み入れることができる。
【００４２】
他の活性成分との処方
本発明の方法において用いるために、ノビスピリンは、他の薬学的に活性な物質、特に他の抗菌剤と共に処方してもよい。関心対象の他の作用物質には、当技術分野で既知であるように多様な抗生物質が含まれる。抗生物質のクラスには、ペニシリン、例えばペニシリンＧ、ペニシリンＶ、メチシリン、オキサシリン、カルベニシリン、ナフシリン、アンピシリン等；β−ラクタマーゼ阻害剤と組み合わせたペニシリン；セファロスポリン、例えばセファクロル、セファゾリン、セフロキシム、モキサラクタム等；カルバペネム；モノバクタム；アミノグリコシド；テトラサイクリン；マクロライド；リンコマイシン；ポリミキシン；スルホンアミド；キノロン：クロラムフェニコール；メトロニダゾール；スペクチノマイシン；トリメトプリム；バンコマイシン等が含まれる。
【００４３】
ポリエン、例えばアンフォテリシンＢ、ナイスタチン；５−フルコシン；およびアゾール、例えば、ミコナゾール、ケトコナゾール、イトラコナゾール、およびフルコナゾールを含む抗真菌剤も同様に有用である。抗結核薬には、イソニアジド、エタンブトール、ストレプトマイシンおよびリファンピンが含まれる。サイトカイン、例えば、インターフェロンγ、腫瘍壊死因子α、インターロイキン１２等も同様にノビスピリン製剤に含めてもよい。
【００４４】
ノビスピリンの合成
本発明のペプチドは、当技術分野で既知の従来の方法を用いてインビトロ合成によって製剤化してもよい。様々な市販の合成装置、例えばカリフォルニア州フォスターシティのアプライドバイオシステムズインク（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．）、ベックマン（Ｂｅｃｋｍａｎ）等の自動合成機が使用可能である。合成機を用いることによって、天然のアミノ酸を非天然アミノ酸に、特にＤ異性体、例えばＤ−アラニンおよびＤ−イソロイシン、ジアステレオマー、異なる長さまたは官能基を有する側鎖等に置換してもよい。特定の配列および調製方法は、利便性、経済性、必要な純度等によって決定されると考えられる。
【００４５】
アミドまたは置換アミン形成、例えば還元的アミノ化のためのアミノ基、チオエーテルまたはジスルフィド形成のためのチオール基、アミド形成のためのカルボキシル基等のような、結合のための都合のよい官能基を含む化学的結合を、様々なペプチドまたは蛋白質に提供してもよい。
【００４６】
必要に応じて、それによって、他の分子または表面との結合が可能となる様々な基を合成または発現の際にペプチドに導入してもよい。このように、システインを用いてチオエーテル、金属イオン複合体を結合するためのヒスチジン、アミドまたはエステルを結合するためのカルボキシル基、アミドを結合するためのアミノ基等を作製することができる。
【００４７】
ポリペプチドはまた、従来の組換え合成法に従って単離および精製してもよい。発現宿主の溶解物を調製して、溶解物をＨＰＬＣ、排除クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、アフィニティクロマトグラフィー、または他の精製技術を用いて精製してもよい。ほとんどの場合、用いられる組成物は、産物の調製およびその精製方法に関連する混入物と比較して、所望の産物を重量で少なくとも２０％、より通常重量で少なくとも約７５％、好ましくは重量で少なくとも約９５％を含み、治療目的の場合、通常、重量で少なくとも約９９．５％を含むと考えられる。通常、百分率は総蛋白質に基づくと考えられる。
【００４８】
実験例
以下の実施例は、本発明を作製および使用する方法に関する完全な開示および説明を当業者に提供するために説明するのであって、本発明と見なされる範囲を制限すると解釈してはならない。用いる数（例えば、量、温度、濃度等）に関しては正確性が得られるように努力するが、何らかの実験誤差および偏差は許容されるべきである。特に明記していなければ、割合は重量での割合であり、分子量は平均分子量、温度はセ氏；および圧力は大気圧またはほぼ大気圧である。
【００４９】
実施例１
方法
抗菌活性
以下を含むいくつかの異なる方法を用いてノビスピリンの抗菌活性を調べた：
ａ）二段階放射状拡散アッセイ法；ｂ）コロニー計数アッセイ法；およびｃ）標準的なマイクロブロス希釈アッセイ法。
【００５０】
抗菌活性は、低塩濃度、正常塩濃度、または高塩濃度の培地において調べた。放射状拡散アッセイ法の場合、これは、ｐＨ ７．４の１０ ｍＭ燐酸ナトリウム緩衝液１ｍｌ中にトリプチカーゼ大豆ブロス粉末０．３ ｍｇを含む低塩「基本培地」を用いて行った。「正常」または「高」塩濃度の培地は、正常塩濃度を有する培地を得る場合には１００ ｍＭ ＮａＣｌを、高塩培地を得る場合には１７５〜２００ ｍＭ ＮａＣｌを基本培地に加えることによって調製した。高塩培地において緑膿菌（Ｐ． ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）に対する活性が保持されていることは、嚢胞性繊維症患者の気道液が高塩濃度を示し、皮膚表面および膀胱を含む他の部位が局所的に高い塩濃度を有する可能性があることが報告されているために重要である。
【００５１】
本研究において用いられる微生物には、異なる１３種の緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）株が含まれた。ＡＭＬ−６５４およびＬＺ−１株は、ＵＣＬＡ臨床微生物研究所からの最近の臨床単離株である。９株（粘液状５株、非粘液状４株）は、リサ・サイマン博士（Ｌｉｓａ Ｓａｉｍａｎ）から提供された最近のＣＦ単離株であった。ＰＡＯ−１株を除く全ての緑膿菌（Ｐ． ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）株は、従来の多数の抗生物質に対して耐性であり、ＣＦ単離株９個は全て２５０ μｇ／ｍｌトブラマイシンに対して耐性であった。本発明者らは同様に、ＣＦ患者からのステノトロフォモナス・マルトフィリア（Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ ｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａ）およびブルクホルデリア・セパシア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｃｅｐａｃｉａ）（同様にリサ・サイマン博士（Ｌｉｓａ Ｓａｉｍａｎ）の提供）それぞれ５株、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）２株（ＭＬ−３５ｐおよびＤＨ−５ａ）、および黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）［ＭＲＳＡ（メチシリン耐性黄色ブドウ球菌）］１株、およびカンジダ・アルビカンス（Ｃ． ａｌｂｉｃａｎｓ）１株についても調べた。
【００５２】
細胞障害性
テトラゾリウム還元アッセイ法（ベーリンガー・マンハイム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ）、インジアナポリス、インディアナ州）を用いて細胞障害性を調べた。ＭＥ−１８０ヒト子宮頚部上皮細胞（ＡＴＣＣ ＨＴＢ−３３）およびＡ５４９ヒト肺上皮細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−１８５）は、１０％ウシ胎児血清、２ｍＭ Ｌ−グルタミンおよび５０ μｇ／ｍｌゲンタマイシン（「培地」）を含む、ＲＰＭＩ培地（ＭＥ−１８０）または２ｍＭ Ｌ−グルタミンを含むハムＦ１２Ｋ培地（Ａ−５４９）においてコンフルエンシーになるまで増殖させた。細胞をトリプシン−ＥＤＴＡによって回収して、培地で洗浄し、濃縮した後生存率（トリパンブルー排除）を調べてから細胞を５×１０４ 個／ｍｌに希釈した。少量（１００ μｌ）を９６ウェル組織培養プレート（コスター社（Ｃｏａｓｔｅｒ））に分注して、５％ＣＯ２を含む大気中で３７℃で５時間インキュベートした。次に、連続希釈したペプチドを加えてさらに２０時間インキュベートした後、ＭＴＴ溶液１０ μｌを加えた。４時間後、溶解緩衝液１００ μｌを加えて一晩放置した。翌日、スペクトラマックス２５０分光光度計（Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ ２５０ Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ）（モレキュラーデバイシズ社（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）、サニーベール、カリフォルニア州）を用いてＭＴＴ還元を６００ ｎｍおよび６５０ ｎｍでの吸光度測定によって決定した。
【００５３】
溶血活性
これは、洗浄したヒト、マウス、ヒツジ、またはウシ赤血球のＰＢＳ浮遊液（２．８％ｖ／ｖ）と共に様々な濃度のペプチドをインキュベートすることによって調べた。３７℃で３０分後、試験管を遠心して、上清に放出された総ヘモグロビンの百分率を測定した。
【００５４】
結果
抗菌特性
オビスピリンおよびノビスピリンは、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）１３株中１３株を含むグラム陰性菌に対して強力な抗菌活性を示した。嚢胞性繊維症患者からの９個（粘液様５個、非粘液様４個）を含むこれらの株のうち１１個は、最近の臨床単離株であった。ＣＦ株は全て２５０ μｇ／ｍｌトブラマイシンに対して耐性であり、ほとんどがさらに多数の抗生物質に対して非常に耐性であった。ノビスピリンはまた、しばしば従来の抗生物質に対して耐性である嚢胞性繊維症における新たな病原体であるステノトロフォモナス・マルトフィリア（Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ ｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａ）５株中５株に対しても活性であった。他の多くの抗生物質および抗菌ペプチドと同様に、ノビスピリンはブルクホルデリア・セパシア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｃｅｐａｃｉａ）に対して不活性であった。
【００５５】
ノビスピリン媒介殺菌活性は、５〜１５分のあいだに認められ、ほとんどがおそらく細菌の内膜および外膜の透過性化によるものであると考えられる。抗菌活性は、高塩（１７５〜２００ ｍＭ ＮａＣｌ）条件で維持され、２０％血清の存在によってほとんど影響を受けなかった。ノビスピリンは、増殖期または静止期の緑膿菌（Ｐ． ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）に対しても等しく有効であった。
【００５６】
２つの微生物、大腸菌と緑膿菌（Ｐ． ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）多剤耐性株に対するオビスピリンとノビスピリンの相対的活性を図１に示す。ＭＩＣｓは、低、正常および高塩条件で行った放射状拡散アッセイ法によって得た（Ｘ−軸に沿ってそれぞれ、０ ｍＭ、１００ ｍＭおよび２００ ｍＭ ＮａＣｌと記す）。バーは、ＭＩＣの平均値±ＳＥＭ（ｎ＝３）を示す。ノビスピリンは、低および正常塩濃度の条件で調べると、オビスピリンより活性であり、高塩濃度条件ではほぼ等しく活性であることが認められた。
【００５７】
表１は、これらのグラム陰性菌に対するノビスピリンの活性をリステリア菌（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）およびカンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）に対するその活性と比較する。作表したデータは放射状拡散アッセイ法に由来し、ＭＩＣの平均値±ＳＥＭ（ｎ＝３）を示す（μｇ／ｍｌで）。ノビスピリンは、生理的な（１００ ｍＭ ＮａＣｌ）塩濃度で調べるとこれらのグラム陽性細菌に対して活性を示し、同様に、ノビスピリンＧ１０はカンジダ・アルビカンス（Ｃ． ａｌｂｉｃａｎｓ）に対して特に活性を示すことに注目すること。オビスピリンもノビスピリンも、非常に高い塩条件（２００ ｍＭ ＮａＣｌ）ではカンジダ・アルビカンス（Ｃ． ａｌｂｉｃａｎｓ）またはグラム陽性菌に対して活性を保持しなかったが、それらはこれらの条件でグラム陰性菌に対しては活性のままであった。その結果、気道のＮａＣｌ濃度がＣＦ患者において例外的に高い場合であっても、この要因は、オビスピリンまたはノビスピリンの緑膿菌（Ｐ． ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）殺菌能を障害しないと考えられる。
【００５８】
【表１】
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【００５９】
【表２】
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【００６０】
嚢胞性繊維症患者の気道内の緑膿菌（Ｐ． ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）は、その種のプランクトン様の非寄生性メンバーとは多くの点で異なりうる。これらの違いは：アルジネートに富む生体薄膜にそれらが捕獲されること；栄養要求性および抗生物質耐性に関する選択、その脂質およびＬＰＳ構造に対する様々な改変、ならびに高密度栄養制限培養を特徴とする代謝である。従来の多くの抗生物質（例えば、細胞壁または蛋白質合成阻害剤）および多くの抗菌ペプチドは、急速に増殖する微生物に対して選択的に作用して、そのため、細菌の大きい塊／低い代謝回転集団に対して比較的不活性であった。したがって、本発明者らは、ペプチドが、急速に増殖しつつある細菌のみならず静止期または栄養枯渇生物を殺すか否かを調べるために、緑膿菌（Ｐ． ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）の３つの株、ＰＡＯ−１、Ｌｉｚ−１、およびＡＭＬ６５４に対するオビスピリンおよびノビスピリンの活性を調べた。３つの株は全て同じ結果を生じた。表３は、ＰＡＯ−１およびＬｉｚ−１株のデータを示す。増殖期または栄養の有無がノビスピリンに対する緑膿菌（Ｐ． ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）の感受性に影響を及ぼさないことに注目すること。
【００６１】
【表３】
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【００６２】
血清の影響
ヒトデフェンシンおよびＬＬ−３７（αヘリックスヒトカテリシジンペプチド）は、血清分子に広く結合する。その結果、その抗菌活性は、血清が存在する場合には大きく減少する。血清は炎症病変または滲出物に存在し得るため、血清の存在下で機能できるることは望ましい特性であるとと考えられる。本発明者らは最近、ヒツジに認められるαヘリックスカテリシジンであるＳＭＡＰ−２９が、血清の存在下においてもその抗菌活性を保持することを発見し、血清の阻害は不可避ではなく、設計が疑問であることを証明した。表４は、緑膿菌（Ｐ． ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）ＭＲ３００７（血清耐性株）および大腸菌ＭＬ−３５Ｐ（＞５％血清に対して感受性）に対するノビスピリン、ＬＬ−３７、ＳＭＡＰ−２９および他のペプチドの活性（ＭＩＣ）に及ぼす血清の影響を示す。オビスピリンとノビスピリンは、血清の存在下では緑膿菌（Ｐ． ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）に対するいくつかの活性を消失するが、ＬＬ−３７ほど大きく影響を受けなかった。
【００６３】
【表４】
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これらの実験において、下層のゲルは、６０％ＲＰＭＩ １６４０±２．５または２０％正常ヒト血清（ＮＨＳ）を含んだ。溶液の残りは燐酸緩衝生理食塩液であった。
【００６４】
殺菌活性の動態
本発明者らは、１％ｖ／ｖトリプチカーゼ大豆ブロスを含むＰＢＳ培地中で５μｇ／ｍｌオビスピリンまたはノビスピリンに曝露した後一定間隔での緑膿菌（Ｐ． ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）ＭＲ３００７の生存を測定した。図２は、急激な２〜３対数値の減少を示し、生存細菌は３０分以降回収されなかったことを示している。
【００６５】
図３は、赤血球細胞の溶解におけるオビスピリンとノビスピリンの影響を示す。オビスピリンは、ヒト赤血球細胞に関してプロテグリンＰＧ−１とほぼ同程度に溶血性であったが、ノビスピリンは非溶血性であった。類似の結果がマウス赤血球細胞についても得られた。対照的に、これらのペプチドのいずれもヒツジまたはウシ赤血球細胞に対して明らかな溶血性を示さなかった。
【００６６】
細胞障害特性
ノビスピリン、特にノビスピリンＧ１０は、オビスピリンまたはこれまでに試験されている他の抗菌ペプチド、例えばプロテグリンＰＧ−１、マガイニンＭＳＩ−７８もしくはＰＧＧより、ヒト上皮細胞または線維芽細胞に対する毒性が著しく低かった。ＭＥ−１８０ヒト子宮頚部上皮細胞およびＡ−５４９肺上皮細胞に対する細胞障害性の代表的なアッセイ法を図４に示す。
【００６７】
図５は、ＭＲＣ−５ヒト肺線維芽細胞に関するこれらのペプチドの細胞障害性を比較する。Ｇ１０およびＴ１０ノビスピリンは、実質的に細胞障害性を示さず、それらが組織の修復または創傷治癒を遅らせる可能性は低いことを示している。
【００６８】
インビボ毒性
急性毒性試験はマウスにおいて行った。１０ ｍｇノビスピリンＧ１０／ｋｇ体重の静脈内投与を行ったマウス３匹中３匹が生存し、２０ ｍｇ／ｋｇの用量を投与した３匹中１匹が生存した。マウスの血液量がその体の５％を構成する場合、用量１０ ｍｇ／ｋｇは約２００ μｇ／ｍｌのピークレベルを生じ、いくつかはそのＭＩＣ濃度より２０〜５０倍高いレベルを生じた。
【００６９】
ＬＰＳ結合
本発明者らは、二つのアッセイ法においてオビスピリンおよびノビスピリンのＬＰＳ結合能を測定した。一つのアッセイ法は分光光度計により、定量的リムラス色素産生アッセイ法を用いる。もう一つのアッセイ法は、物理的であり、表面プラズモン共鳴変化を測定する。
【００７０】
ＬＰＳに対するオビスピリンの見かけの結合定数は約６．７×１０−６ Ｍであった。結合アッセイ法を低塩条件（０ｍＭ ＮａＣｌ）で行うと、ノビスピリンの親和性は４〜５倍低く、すなわち２．５〜３．３×１０−５ Ｍのあいだであった。生理的なＮａＣｌにおいて結合を調べると、ＬＰＳに対するノビスピリンの親和性は増加した。
【００７１】
細菌膜に及ぼすノビスピリンの効果
ノビスピリンは全て、５μｇ／ｍｌで調べると、大腸菌Ｍ−３５ｐの外膜および内膜を急速に透過性にした。膜の透過性化の発現は急速で、２分以内に始まって５分以内に最大程度に達する。この実験は、ＰＢＳ（１００ ｍＭ ＮａＣｌ）に浮遊させた静止期大腸菌について行った。外膜の透過性化は、セファロスポリンであるＰＡＤＡＣの加水分解をモニターすることによって測定し、内膜の透過性化は、ＯＮＰＧの加水分解をモニターすることによって測定した（この大腸菌株はｌａｃ透過酵素を有しない）。
【００７２】
表５は、Ｓ．マルトフィリア（Ｓ． ｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａ）に対するノビスピリンの活性を示す。
【００７３】
【表５】
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プロテグリンＰＧ−１、ポリミキシンＢおよびＰＧＧは対照として用いた。ＰＧＧはαヘリックスペプチドであり、この配列はＧＬＬＲＲＬＲＫＫＩＧＥＩＦＫＫＹＧである。これは、１９９７年にトッシ（Ｔｏｓｓｉ， Ａ．）、タランティーノ（Ｔａｒａｎｔｉｎｏ， Ｃ．）、およびロメオ（Ｒｏｍｅｏ， Ｄ．）によって設計され、報告された。合成抗菌性ペプチドの設計は、配列類似性と両親媒性に基づいた（Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２５０：５４９〜５８）。
【００７４】
実施例２
トラコーマクラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）血清型変種Ｌ２、ＤおよびＥのＧ−１０ノビスピリンに対する感受性
新規１８残基のαヘリックスペプチドであるノビスピリン（Ｇ−１０）に対する３種のトラコーマ・クラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）血清型変種（Ｌ２、ＤおよびＥ）の感受性を本研究においてアッセイした。Ｇ−１０は非溶血性であり、インビトロで上皮細胞に対して調べると細胞障害性をほとんど示さなかった。これはグラム陰性菌に対して比較的選択的である。
【００７５】
トラコーマ・クラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）血清変種Ｌ２は、浸潤性ＬＧＶを引き起こすのに対し、血清変種ＤおよびＥは典型的な泌尿器株を表す。Ｇ−１０がトラコーマ・クラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）血清型（Ｌ２、ＤおよびＥ）に及ぼす影をは、標準的および改変マッコイ細胞シェルウイルスアッセイ法を用いて様々なペプチド濃度を用いて決定した。標準的なアッセイ法において、クラミジア／ペプチド混合物を２時間プレインキュベートした後、宿主細胞単層から除去した後４８時間インキュベートした。改変アッセイ法において、プレインキュベーション混合物は単層に４８時間インキュベーションのあいだ放置した。第三のアッセイ法において、Ｇ−１０とクラミジアとを混合して、プレインキュベーションを行わずに細胞単層に感染させ、４８時間後に調べた。封入体形成単位（ＩＦＵｓ）を採点してペプチドの阻害作用を測定した。
【００７６】
Ｇ−１０は、トラコーマ・クラミジア（Ｃ． ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）血清型Ｅを、プレインキュベーションアッセイ法において１００ μｇ／ｍｌで完全に阻害した。１００ ｍｇ／ｍｌでは、血清型Ｌ２ ＩＦＵｓは、９２．７〜９９．１％減少して、血清型Ｄ ＩＦＵｓは９９．４％〜１００％減少した。一般的に、プレインキュベーション段階を省略すると、ノビスピリンに対するクラミジアの感受性は低下した。クラミジア／ペプチド混合物を除去しなければ、Ｇ−１０に対する感受性は有意に増加または減少しなかった。Ｇ−１０は、トラコーマ・クラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）に対して優れた活性を示すブタ白血球において認められる抗菌ペプチドであるプロテグリンよりさらに有効である。さらに、調べた三つの血清型は全て、Ｇ−１０に対して感受性であった。したがって、ノビスピリンは、クラミジア感染症を予防するための化学予防物質としての有用性を有することが示される。
【００７７】
実施例３
ノビスピリン活性に及ぼす二価陽イオンの影響
特定の細菌に対するＧ−１０ノビスピリンの活性は、カルシウムおよびマグネシウム約１ｍＭ濃度によって阻害される。この阻害は、クエン酸含有緩衝液を加えることによって軽減することができる。この知見に基づいて、局所使用を意図するノビスピリン製剤は、クエン酸塩またはＥＤＴＡ（エチレン−ジアミン−四酢酸）のようなもう一つの二価陽イオン結合物質を含まなければならない。Ｇ １０ノビスピリンの活性に及ぼすクエン酸塩含有製剤の有用な影響を下記の表６に示す。
【００７８】
この知見に至った実験は、放射状拡散アッセイ法を用いることを含む。下層のゲルは全て、１００ ｍＭ ＮａＣｌおよび５ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ ７．４）を含んだ。さらに、いくつかの下層のゲルには５ｍＭクエン酸緩衝液ｐＨ ７．４を加え、他のゲルは１ｍＭ ＣａＣｌ２または１ｍＭ ＭｇＣｌ２を含んだ。数値はμｇ／ｍｌでのＭＩＣ値を表す。クエン酸塩の増強作用は、黄色ブドウ球菌（Ｓ． ａｕｒｅｕｓ）よりグラム陰性菌においてより顕著であったことに注目すること。カルシウムおよびマグネシウムのさらにより有効なキレート化剤であるＥＤＴＡは、クエン酸塩と同じ作用を有すると予想される。
【００７９】
【表６】
2004526663.tif 000009
【００８０】
実施例４
ノビスピリンＧ１０の三つの新しい変種を調製して、ペプチドの新しい正電荷を増加させると、二価陽イオンの存在においてそれがより有効となるか否かを調べた。全体的な正電荷を増加させるために、いくつかのノビスピリンＧ１０変種におけるカルボキシ末端のアミド化（−ＮＨ２）を設計した。これらのペプチドの配列およびその正味の電荷を下記の表７に示す。ヒスチジン１２上の分画（およびｐＨ依存的）電荷はこの計算において無視された。
【００８１】
【表７】
2004526663.tif 000010
【００８２】
【表８】
2004526663.tif 000011
【００８３】
表８において、ＭＩＣは、二段階放射状拡散アッセイ法によって決定した場合の最小阻止濃度を意味する。これらは、カルシウムを用いて実験を行う場合、溶解度の問題を避けるために１０ ｍＭ燐酸緩衝液の代わりに１０ ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液を用いたことを除いては、標準的な条件で行った。太字の欄は、ノビスピリンＧ１０と比較して活性が有意に改善された結果を示す（ｔ−検定によりｐ＜０．０１）。Ｇ１０、Ｒ１０ノビスピリンアミドは、カルシウムおよびマグネシウムの存在下で試験微生物四つ全てに対して改善された活性を示し、Ｇ１０、Ｒ１０ノビスピリンは、三つのグラム陰性菌（緑膿菌、大腸菌、および肺炎桿菌）に対してより活性であったが、黄色ブドウ球菌に対してはあまり有効ではなかったことに注目すること。上記のＧ１０ノビスピリン誘導体は、８０ μｇ／ｍｌで調べてもヒト赤血球細胞の如何なる溶血も引き起こさなかったことに注目すること。他の陽イオンアミノ酸（例えば、リジン、オルニチン等）も同様に１２位で用いると、カルシウムおよびマグネシウムイオンの存在下でより良好な活性を得ることができる。
【００８４】
実施例５
Ｎ−末端の正電荷を増加させるとカルシウムおよびマグネシウムに対する抵抗性を増加させうるか否かを調べるために、Ｇ１０ノビスピリンの四つの変種を合成した。これらのＧ１０変種のアミノ酸配列をそれぞれの正味の電荷と共に下記の表９に示す。
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【００８５】
本明細書において引用された全ての出版物および特許出願は、本明細書において個々の出版物または特許出願が特に個々に参照として本明細書に組み入れられることを示されるように参照として本明細書に組み入れられる。如何なる出版物の引用も提出日以前にそれらが開示されていたためであり、先行発明に基づいて本開示がなされた日付を早める権利が本発明にはないと自認したと解釈してはならない。
【００８６】
前述の発明は、理解を明確にする目的で説明と例とによって幾分詳細に説明してきたが、特定の変更および改変をそれらに行ってもよく、それらも添付の請求の範囲の精神または範囲内に含まれることは、本発明の開示に照らして当業者によって容易に明らかとなると思われる。
【図面の簡単な説明】
【図１】二つのグラム陰性菌に対するオビスピリンと代表的なノビスピリンの相対活性を示す。
【図２】緑膿菌（Ｐ． ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）に対する抗菌ペプチドの動態を示す。
【図３】ヒト赤血球細胞に対する抗菌ペプチドの溶血活性を示す。
【図４】ヒト細胞に対する抗菌ペプチドの相対的細胞障害性を示す。
【図５】ノビスピリンによるＬＰＳの結合を示す。
【図６】ノビスピリンによる細菌膜の透過性化を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ−Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５】
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【図６】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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