(57)【要約】本発明は、ガンマ−セクレターゼ基質の開裂を触媒する単離した機能的に活性なタンパク質を提供する。単離したタンパク質の機能的活性は、単離した該タンパク質がガンマ−セクレターゼを含むことを示唆している。一つの態様において、単離したガンマ−セクレターゼタンパク質はＰＳ１と会合している。本発明はまた、ガンマ−セクレターゼによるβ−アミロイド前駆体タンパク質（βＡＰＰ）の開裂をモニターする均一法にも関し、該方法では開裂産物を単離および回収する工程が省略される。開裂の検出は、蛍光付加物の対をガンマ−開裂βＡＰＰフラグメントに結合させることにより行うことができる。好ましくは、第一の蛍光付加物はガンマ−開裂βＡＰＰフラグメントのカルボキシ末端に結合して未開裂のβＡＰＰや他の種類のガンマ−開裂βＡＰＰフラグメントとは実質的に交差反応せず、一方、第二の蛍光付加物はガンマ−開裂βＡＰＰフラグメントのアミノ末端領域内の部分に結合する。ガンマ−開裂βＡＰＰフラグメントへの結合は、両付加物間での蛍光エネルギー移動をモニターすることにより決定する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ガンマ−セクレターゼによるβ−アミロイド前駆体タンパク質（βＡＰＰ）の開裂を検出する均一法であって、該方法はガンマ−開裂βＡＰＰフラグメントと１対の蛍光付加物との結合を検出することを含み、その際、第一の蛍光付加物はガンマ−開裂βＡＰＰフラグメントのカルボキシ末端に特異的に結合して未開裂のβＡＰＰや他の種類のガンマ−開裂βＡＰＰフラグメントとは実質的に交差反応することなく、第二の蛍光付加物はβ−アミロイドペプチド（Ａβ）のアミノ酸配列１−３１に対応するアミノ酸配列内でガンマ−開裂βＡＰＰフラグメントに結合し、これら蛍光付加物のうちの一方の励起が他方の蛍光付加物へのエネルギーの検出しうる移動をもたらすことを特徴とする方法。
【請求項２】
液体試料中、未開裂のβＡＰＰおよび他の種類のガンマ−開裂βＡＰＰフラグメントの存在下で行う、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
試料が、内生のガンマ−セクレターゼおよびスウェーデン変異体βＡＰＰを有する膜画分を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
試料が、可溶化したガンマ−セクレターゼ複合体およびβＡＰＰを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
蛍光付加物がそれぞれ別々に抗体で修飾されている、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
ガンマ−開裂βＡＰＰフラグメントがＡβ−４０である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
第一の蛍光付加物が、アミノ酸残基４０を含むエピトープでＡβ−４０に結合する第一の抗体で修飾されている、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
第二の蛍光付加物が、アミノ酸配列１−１２を含むエピトープでＡβに結合する第二の抗体で修飾されている、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
第一の蛍光付加物の励起が第二の蛍光付加物へのエネルギーの検出しうる移動をもたらす、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
第一の該付加物が、ランタニドのクリプテートまたはキレート、フルオレセイン、ＥＤＡＮＳ、Ｎ−［６−アミノ−９−［２−カルボキシ−フェニル］−４，５−ジスルホキシ−３Ｈ−キサンテン−３−イリデン］アミニウムイオン（２−）の塩および１−（イプシロン−カルボキシペンチル−１’−エチル−３，３，３’，３’−テトラメチルインドカルボシアニン−５，５’−ジスルホネートイオンの塩よりなる群から選ばれた分子を含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
第一の蛍光付加物がユウロピウムクリプテートを含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
第二の蛍光付加物がｘ１−ＡＰＣを含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
エネルギーの検出しうる移動が第二の蛍光付加物からの増幅したシグナルを含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
他方の蛍光付加物が蛍光消光剤分子を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
蛍光消光剤分子が、ダブシルおよび９−［２−［［４−カルボキシ−ピペリジン−１−イル］スルホニル］フェニル］−６−（Ｎ−メチル−Ｎ−フェニルアミノ）−３Ｈ−キサンテン−３−イリデン］−Ｎ−メチルベンゼンアミニウムイオンの塩よりなる群から選ばれる、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
蛍光付加物がそれぞれ別々に抗体で修飾されている、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
エネルギーの検出しうる移動が、励起された蛍光付加物からの蛍光シグナルの低減を含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
励起を、レーザー、キセノンフラッシュランプまたはジュウテリウム−タングステンランプにより行う、請求項１３または１７に記載の方法。
【請求項１９】
励起をレーザーにより行う、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
β−アミロイドペプチド（Ａβ）の存在を決定する均一法であって、
（１）試料を１対の蛍光付加物に暴露し、その際、第一の蛍光付加物はＡβのカルボキシ末端領域に結合し、第二の蛍光付加物はＡβのアミノ末端領域に結合し、少なくとも一方の蛍光付加物が未開裂のβＡＰＰまたは他の種類のガンマ−開裂βＡＰＰフラグメントと実質的に交差反応することなく、ついで
（２）該蛍光付加物の一方の励起により該１対の蛍光付加物とＡβとの結合を検出する
ことを含む方法。
【請求項２１】
第一の蛍光付加物がＡβのカルボキシ末端に特異的に結合し、未開裂のβＡＰＰまたは他の種類のガンマ−開裂βＡＰＰフラグメントとは実質的に交差反応しない、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
ＡβがＡβ−４０である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
蛍光付加物がそれぞれ別々にＡβのアミノ末端かまたはカルボキシ末端のいずれかに特異的に結合し、未開裂のβＡＰＰまたは他の種類のガンマ−開裂βＡＰＰフラグメントとは実質的に交差反応しない、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
励起を、レーザー、キセノンフラッシュランプまたはジュウテリウム−タングステンランプにより行う、請求項２１に記載の方法。
【請求項２５】
励起をレーザーにより行う、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
β−アミロイドペプチドＡβ−４０の存在を決定する均一法であって、
（１）試料を１対の蛍光付加物に暴露し、その際、第一の蛍光付加物はＡβ−４０のカルボキシ末端領域に結合し、第二の蛍光付加物はＡβ−４０のアミノ末端領域に結合し、第一の蛍光付加物は未開裂のβＡＰＰまたは他の種類のガンマ−開裂βＡＰＰフラグメントと実質的に交差反応することなく、ついで
（２）第一の蛍光付加物の励起により該１対の蛍光付加物とＡβ−４０との結合を検出する
ことを含む方法。
【請求項２７】
第一の蛍光付加物がアミノ酸残基４０を含むエピトープでＡβ−４０に結合する第一の抗体で修飾されている、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
第一の蛍光付加物がユウロピウムクリプテートで修飾されている、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
第二の蛍光付加物が、アミノ酸配列１−１２を含むエピトープでＡβに結合する第二の抗体で修飾されている、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
第二の蛍光付加物がｘ１−ＡＰＣを含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
第一の蛍光付加物の励起をレーザーにより行う、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
ガンマ−セクレターゼによるβ−アミロイド前駆体タンパク質（βＡＰＰ）の開裂を検出する均一法であって、該方法は６ｋＤａフラグメントと１対の蛍光付加物との結合を検出することを含み、その際、第一の蛍光付加物は該６ｋＤａフラグメントのアミノ末端に結合して未開裂のβＡＰＰや他の種類のガンマ−開裂βＡＰＰフラグメントとは実質的に交差反応することなく、第二の蛍光付加物は該６ｋＤａフラグメントのカルボキシ末端領域内の部分に結合し、これら蛍光付加物のうちの一方の励起が他方の蛍光付加物へのエネルギーの検出しうる移動をもたらすことを特徴とする方法。
【請求項３３】
蛍光付加物がそれぞれ別々に抗体で修飾されている、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
蛍光付加物の一方が、ランタニドのクリプテートまたはキレート、フルオレセイン、ＥＤＡＮＳ、Ｎ−［６−アミノ−９−［２−カルボキシ−フェニル］−４，５−ジスルホキシ−３Ｈ−キサンテン−３−イリデン］アミニウムイオン（２−）の塩および１−（イプシロン−カルボキシペンチル−１’−エチル−３，３，３’，３’−テトラメチルインドカルボシアニン−５，５’−ジスルホネートイオンの塩よりなる群から選ばれた分子を含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
他方の蛍光付加物が、架橋アロフィコシアニン（「ｘｌ−ＡＰＣ」）、クマリン、ローダミン、テトラメチルローダミンおよび１−（イプシロン−カルボキシペンチル−１’−エチル−３，３，３’，３’−テトラメチルインドジカルボシアニン−５，５’−ジスルホネートイオンの塩よりなる群から選ばれた分子を含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
他方の蛍光付加物が、ダブシルおよび９−［２−［［４−カルボキシ−ピペリジン−１−イル］スルホニル］フェニル］−６−（Ｎ−メチル−Ｎ−フェニルアミノ）−３Ｈ−キサンテン−３−イリデン］−Ｎ−メチルベンゼンアミニウムイオンの塩よりなる群から選ばれた蛍光消光剤分子を含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項３７】
ガンマ−セクレターゼによるβ−アミロイド前駆体タンパク質（βＡＰＰ）の開裂を検出する均一法であって、
（１）第一の蛍光付加物を６ｋＤａフラグメントに結合させ、第二の蛍光付加物をβ−アミロイドペプチド（Ａβ）かまたはｐ３フラグメントに結合させ、その際、少なくとも一方の蛍光付加物が未開裂βＡＰＰの他の部分と実質的に交差反応することなく、両蛍光付加物がそれぞれ別々にドナー分子かまたはアクセプター分子のいずれかを含み、
（２）ドナー分子をレーザー、キセノンフラッシュランプまたはジュウテリウム−タングステンランプにより励起し、ついで
（３）アクセプター分子へのエネルギーの実質的に低減した移動を検出する
工程を含む方法。
【請求項３８】
ドナー分子が、ランタニドのクリプテートまたはキレート、フルオレセイン、ＥＤＡＮＳ、Ｎ−［６−アミノ−９−［２−カルボキシ−フェニル］−４，５−ジスルホキシ−３Ｈ−キサンテン−３−イリデン］アミニウムイオン（２−）の塩および１−（イプシロン−カルボキシペンチル−１’−エチル−３，３，３’，３’−テトラメチルインドカルボシアニン−５，５’−ジスルホネートイオンの塩よりなる群から選ばれる、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
アクセプター分子が、架橋アロフィコシアニン（「ｘｌ−ＡＰＣ」）、クマリン、ローダミン、テトラメチルローダミンおよび１−（イプシロン−カルボキシペンチル−１’−エチル−３，３，３’，３’−テトラメチルインドジカルボシアニン−５，５’−ジスルホネートイオンの塩よりなる群から選ばれる、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
エネルギーの実質的に低減した移動を検出する工程が、アクセプター分子からの殆どまたは全く増幅されていないシグナルを検出することを含む、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
アクセプター分子が、ダブシルおよび９−［２−［［４−カルボキシ−ピペリジン−１−イル］スルホニル］フェニル］−６−（Ｎ−メチル−Ｎ−フェニルアミノ）−３Ｈ−キサンテン−３−イリデン］−Ｎ−メチルベンゼンアミニウムイオンの塩よりなる群から選ばれた蛍光消光剤分子である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４２】
エネルギーの実質的に低減した移動を検出する工程が、ドナー分子からの変化しない蛍光シグナルを検出することを含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
β−アミロイド前駆体タンパク質（βＡＰＰ）におけるガンマ−セクレターゼ開裂のインヒビターをスクリーニングする均一法であって、
（１）ガンマ−セクレターゼおよびβＡＰＰを含む試料に被験化合物を加え、
（２）ついで、１対の蛍光付加物を該試料に加え、その際、第一の蛍光付加物はガンマ−開裂したβＡＰＰフラグメントのカルボキシ末端に対する結合特異性を有し、未開裂のβＡＰＰまたは他の種類のガンマ−開裂βＡＰＰフラグメントに対しては実質的に交差反応性を有さず、第二の蛍光付加物はβ−アミロイドペプチド（Ａβ）の１−３１に対応するアミノ酸配列内でガンマ−開裂βＡＰＰに対する結合特異性を有し、両蛍光付加物がそれぞれ別々にドナー分子かまたはアクセプター分子のいずれかを含み、ついで
（３）該ドナー分子の励起後に両蛍光付加物間での蛍光エネルギーの実質的に低減した移動を検出する
工程を含む方法。
【請求項４４】
ドナー分子が、ランタニドのクリプテートまたはキレート、フルオレセイン、ＥＤＡＮＳ、Ｎ−［６−アミノ−９−［２−カルボキシ−フェニル］−４，５−ジスルホキシ−３Ｈ−キサンテン−３−イリデン］アミニウムイオン（２−）の塩および１−（イプシロン−カルボキシペンチル−１’−エチル−３，３，３’，３’−テトラメチルインドカルボシアニン−５，５’−ジスルホネートイオンの塩よりなる群から選ばれる、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
アクセプター分子が、架橋アロフィコシアニン（「ｘｌ−ＡＰＣ」）、クマリン、ローダミン、テトラメチルローダミンおよび１−（イプシロン−カルボキシペンチル−１’−エチル−３，３，３’，３’−テトラメチルインドジカルボシアニン−５，５’−ジスルホネートイオンの塩よりなる群から選ばれる、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
エネルギーの実質的に低減した移動を検出する工程が、アクセプター分子からの殆どまたは全く増幅されていないシグナルを検出することを含む、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
アクセプター分子が、ダブシルおよび９−［２−［［４−カルボキシ−ピペリジン−１−イル］スルホニル］フェニル］−６−（Ｎ−メチル−Ｎ−フェニルアミノ）−３Ｈ−キサンテン−３−イリデン］−Ｎ−メチルベンゼンアミニウムイオンの塩よりなる群から選ばれた蛍光消光剤分子である、請求項４４に記載の方法。
【請求項４８】
エネルギーの実質的に低減した移動を検出する工程が、ドナー分子からの変化しない蛍光シグナルを検出することを含む、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
β−アミロイド前駆体タンパク質（βＡＰＰ）におけるガンマ−セクレターゼ開裂のインヒビターをスクリーニングする均一法であって、
（１）ガンマ−セクレターゼおよびβＡＰＰを含む試料に被験化合物を加え、
（２）ついで、１対の蛍光付加物を未開裂のβＡＰＰに結合させ、その際、第一の蛍光付加物は未開裂のβＡＰＰのアミノ酸配列７２２−７７０内の部分に結合し、第二の蛍光付加物は未開裂βＡＰＰのアミノ酸配列６７１−７０２内の部分に結合し、これら蛍光付加物のうちの少なくとも一方が未開裂βＡＰＰの他の部分に対して実質的に交差反応性を有さず、両蛍光付加物がそれぞれ別々にドナー分子かまたはアクセプター分子のいずれかを含み、ついで
（３）該ドナー分子の励起後に両蛍光付加物間でのエネルギーの移動を検出する工程を含む方法。
【請求項５０】
ドナー分子が、ランタニドのクリプテートまたはキレート、フルオレセイン、ＥＤＡＮＳ、Ｎ−［６−アミノ−９−［２−カルボキシ−フェニル］−４，５−ジスルホキシ−３Ｈ−キサンテン−３−イリデン］アミニウムイオン（２−）の塩および１−（イプシロン−カルボキシペンチル−１’−エチル−３，３，３’，３’−テトラメチルインドカルボシアニン−５，５’−ジスルホネートイオンの塩よりなる群から選ばれる、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
アクセプター分子が、架橋アロフィコシアニン（「ｘｌ−ＡＰＣ」）、クマリン、ローダミン、テトラメチルローダミンおよび１−（イプシロン−カルボキシペンチル−１’−エチル−３，３，３’，３’−テトラメチルインドジカルボシアニン−５，５’−ジスルホネートイオンの塩よりなる群から選ばれる、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
エネルギーの移動を検出する工程が、アクセプター分子からの増幅したシグナルを検出することを含む、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
アクセプター分子が、ダブシルおよび９−［２−［［４−カルボキシ−ピペリジン−１−イル］スルホニル］フェニル］−６−（Ｎ−メチル−Ｎ−フェニルアミノ）−３Ｈ−キサンテン−３−イリデン］−Ｎ−メチルベンゼンアミニウムイオンの塩よりなる群から選ばれた蛍光消光剤分子である、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
エネルギーの移動を検出する工程が、ドナー分子からの蛍光シグナルの低減を検出することを含む、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
ガンマ−セクレターゼ活性を有する単離タンパク質。
【請求項５６】
ガンマ−セクレターゼを含む単離タンパク質。
【請求項５７】
該ガンマ−セクレターゼがガンマ−セクレターゼ開裂部位を有する基質を認識および開裂する、請求項５６に記載の単離タンパク質。
【請求項５８】
該ガンマ−セクレターゼ開裂部位でのガンマ−セクレターゼによる基質の開裂がβ−アミロイドペプチド（Ａβ）および６ｋＤａフラグメントを生成する、請求項５７に記載の単離タンパク質。
【請求項５９】
ガンマ−セクレターゼおよびＰＳ１を含むタンパク質複合体である、請求項５６に記載の単離タンパク質。
【請求項６０】
ガンマ−セクレターゼを含む膜画分。
【請求項６１】
ＰＳ１と複合体を形成したガンマ−セクレターゼを単離することによる、試料からガンマ−セクレターゼを単離する方法。
【請求項６２】
ＰＳ１と複合体を形成したガンマ−セクレターゼを単離することが、ＰＳ１を認識および結合する試薬に試料を接触させ、それによって試薬／ＰＳ１／ガンマ−セクレターゼ複合体を生成させてガンマ−セクレターゼ活性を有する分子を単離することを含む、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
請求項６１に記載の方法によって単離したガンマ−セクレターゼ活性を有する分子。
【請求項６４】
ＰＳ１を認識および結合する試薬が抗ＰＳ１抗体を含む、請求項６２に記載の方法。
【請求項６５】
試料からガンマ−セクレターゼ活性を有するタンパク質複合体を単離する方法であって、
（ａ）試料をＰＳ１を認識および結合する分子と接触させて分子／ＰＳ１複合体を生成させ、ついで
（ｂ）試料から該分子／ＰＳ１複合体を除去してガンマ−セクレターゼ活性を有するタンパク質複合体を単離する
ことを含む方法。
【請求項６６】
請求項６５に記載の方法によって単離したガンマ−セクレターゼ活性を有するタンパク質複合体。
【請求項６７】
ＰＳ１を認識および結合する分子が抗ＰＳ１抗体を含む、請求項６５に記載の方法。
【請求項６８】
該タンパク質複合体がガンマ−セクレターゼおよびＰＳ１を含む、請求項６５に記載の方法。
【請求項６９】
請求項６５に記載の方法によって単離したタンパク質複合体。
【請求項７０】
ガンマ−セクレターゼおよびＰＳ１を含むタンパク質複合体を単離する方法であって、
（ａ）ガンマ−セクレターゼ陽性細胞を可溶化してガンマ−セクレターゼおよびＰＳ１を含むタンパク質複合体と他の細胞成分との混合物を生成させ、
（ｂ）該混合物を、ＰＳ１を認識および結合する分子と接触させて分子／ＰＳ１複合体を生成させ、ついで
（ｃ）該複合体を他の細胞成分から除去することにより、ガンマ−セクレターゼおよびＰＳ１を含むタンパク質複合体を単離する
ことを含む方法。
【請求項７１】
請求項７０に記載の方法によって単離した、ガンマ−セクレターゼおよびＰＳ１を含むタンパク質複合体。
【請求項７２】
ＰＳ１を認識および結合する分子が抗ＰＳ１抗体である、請求項７０に記載の方法。
【請求項７３】
工程（ａ）において、ガンマ−セクレターゼ陽性細胞の可溶化をＮ−３［（ジメチルアミノ）プロピル］３，７，１２−トリヒドロキシ（３ａ，５ｂ，７ａ，１２ａ）コラン−２−アミド］を含む溶液中で行う、請求項７０に記載の方法。
【請求項７４】
ガンマ−セクレターゼによって開裂される単離された機能的に活性な基質。
【請求項７５】
βＡＰＰを含む、請求項７４に記載の機能的に活性な基質。
【請求項７６】
機能的に活性な基質を開裂する方法であって、機能的に活性な基質を、ガンマ−セクレターゼ活性を有する分子と、ガンマ−セクレターゼ活性を有する該分子が機能的に活性な該基質を開裂して開裂産物を生成する条件下でインキュベートすることを含む方法。
【請求項７７】
目的とする分子が請求項７６に記載の方法に従って基質を開裂することができるか否かを決定することによる、目的とする分子においてガンマ−セクレターゼ活性を検出する方法。
【請求項７８】
機能的に活性な基質がβＡＰＰを含む、請求項７６に記載の方法。
【請求項７９】
機能的に活性な基質およびガンマ−セクレターゼ活性を有する分子を、Ｎ−３［（ジメチルアミノ）プロピル］３，７，１２−トリヒドロキシ（３ａ，５ｂ，７ａ，１２ａ）コラン−２−アミド］を含む溶液中でインキュベートする、請求項７６に記載の方法。
【請求項８０】
機能的に活性な基質を単離する方法であって、
（ａ）ガンマ−セクレターゼ開裂配列を含む基質を生成させ、
（ｂ）該基質をミクロソーム膜フラグメント中に挿入して機能的に活性な基質を生成させ、ついで
（ｃ）機能的に活性な該基質を含む該ミクロソーム膜フラグメントを単離する
ことを含む方法。
【請求項８１】
請求項８０に記載の方法によって生成した機能的に活性な基質。
【請求項８２】
該基質がβＡＰＰを含む、請求項８０に記載の方法。
【請求項８３】
該基質が配列番号２または４に記載のアミノ酸配列を含む、請求項８０に記載の方法。
【請求項８４】
機能的に活性な該基質が検出しうる標識を含む、請求項８０に記載の方法。
【請求項８５】
Ｎ−３［（ジメチルアミノ）プロピル］３，７，１２−トリヒドロキシ（３ａ，５ｂ，７ａ，１２ａ）コラン−２−アミド］を含む溶液を用いて機能的に活性な基質をミクロソーム膜フラグメントから可溶化する、請求項８０に記載の方法。
【請求項８６】
さらに、
（ａ）機能的に活性な基質をミクロソーム膜フラグメントから可溶化し、ついで
（ｂ）機能的に活性な該基質を単離する
ことを含む請求項８０に記載の方法。
【請求項８７】
試料中のガンマ−セクレターゼ活性を阻害する試薬を同定する方法であって、
（ａ）該試料および該試薬を機能的に活性な基質と接触させ、ついで
（ｂ）機能的に活性な該基質の開裂産物が試料中に生成するか否かを決定し、その際、試料中の開裂産物の欠如は該試薬が試料中のガンマ−セクレターゼ活性を阻害することを示す
ことを含む方法。
【請求項８８】
開裂産物の検出を、開裂産物のＮ末端を認識および結合する抗体を用いて行う、請求項８７に記載の方法。
【請求項８９】
開裂産物の検出を、開裂産物のＣ末端を認識および結合する抗体を用いて行う、請求項８７に記載の方法。
【請求項９０】
開裂産物の検出を１対の蛍光付加物を用いて行い、第一の蛍光付加物は開裂産物のＮ末端に結合し、第二の蛍光付加物は開裂産物のＣ末端に結合し、両蛍光付加物のうちの一方の励起が他方の蛍光付加物へのエネルギーの検出しうる移動をもたらす、請求項８７に記載の方法。
【請求項９１】
複数の実質的に同一の試料をそれぞれ異なる試薬と別々に接触させる、請求項８７に記載の方法。
【請求項９２】
複数の試料が約１０４を超える試料を含む、請求項８７に記載の方法。
【請求項９３】
複数の試料が約１０５を超える試料を含む、請求項８７に記載の方法。
【請求項９４】
複数の試料が約１０６を超える試料を含む、請求項８７に記載の方法。
【請求項９５】
複数の実質的に同一の試料をそれぞれ異なる試薬と本質的に同時に接触させる、請求項８７に記載の方法。
【請求項９６】
膜内在タンパク質またはタンパク質複合体を単離する方法であって、
（ａ）Ｎ−３［（ジメチルアミノ）プロピル］３，７，１２−トリヒドロキシ（３ａ，５ｂ，７ａ，１２ａ）コラン−２−アミド］を含む溶液で細胞を可溶化することにより、膜内在タンパク質またはタンパク質複合体および他の細胞成分を有する混合物を得、ついで
（ｂ）膜内在タンパク質またはタンパク質複合体を単離する
ことを含む方法。
【請求項９７】
請求項９６に記載の方法により単離した膜内在タンパク質またはタンパク質複合体。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（技術分野）
本発明は、一般に、アルツハイマー病の顕著な特徴である斑アミロイド沈積物（ｐｌａｑｕｅ ａｍｙｌｏｉｄ ｄｅｐｏｓｉｔｓ）の分野に関する。とりわけ本発明は、ガンマ−セクレターゼ（ｇａｍｍａ−ｓｅｃｒｅｔａｓｅ）活性を有する、単離した、機能的に活性なタンパク質に関する。ガンマ−セクレターゼ活性はアミロイドの産生に必要である。本発明はまた、本発明のガンマ−セクレターゼタンパク質を含む膜内在（ｉｎｔｅｇｒａｌ−ｍｅｍｂｒａｎｅ）タンパク質およびタンパク質複合体の単離方法、およびガンマ−セクレターゼ活性の検出のためのアッセイにも関する。
【０００２】
（背景技術）
アルツハイマー病は脳内の神経病理学的障害を特徴とし、大脳皮質および辺縁系皮質中の細胞外アミロイド斑およびニューロン内の対合した螺旋フィラメント（ｉｎｔｒａｎｅｕｒｏｎａｌ ｐａｉｒｅｄ ｈｅｌｉｃａｌ ｆｉｌａｍｅｎｔｓ）および神経細線維もつれを特色とする。一般に、アルツハイマー病は年配者の疾患であり、罹患率は６０歳を過ぎると急激に上昇する。しかしながら、アルツハイマー病の早期の発病もわずか４０〜５０歳の患者で認められ、しばしば家族性のアルツハイマー病（ＦＡＤ）と関連付けられている。
【０００３】
両タイプのアルツハイマー病の経過は同じであると思われる。血管および斑のアミロイド沈積物の主要なタンパク質性成分は、βＡＰＰのタンパク分解的開裂によって生成されるＡβ−４２ペプチドである。Ａβ−４２ペプチドがアルツハイマー病の病因において本質的役割を果たしているとの仮説を支持する多大な証拠がある。βアミロイド前駆体タンパク質（βＡＰＰ）からのＡβの生成にはアルファ−セクレターゼ、ベータ−セクレターゼおよびガンマ−セクレターゼと称する３つの異なるプロテアーゼ活性が関与しており、βＡＰＰ、およびＰＳ１およびＰＳ２と称する２つの異なるプレセニリン中の変異によって変わる。
【０００４】
今日ではβＡＰＰ（Ｋａｎｇ， Ｊ．ら、１９８７ Ｎａｔｕｒｅ ３２５： ７３３−７３６）、ＰＳ１（Ｓｈｅｒｒｉｎｇｔｏｎ， Ｒ．ら、１９９５ Ｎａｔｕｒｅ ３７５： ７５４−７６０）およびＰＳ２（Ｌｅｖｙ−Ｌａｈａｄ， Ｅ．ら、１９９５ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６９： ９７３−９７７）についてヌクレオチド配列が決定されている。ベータ−セクレターゼ活性を有するタンパク質をコードする候補ヌクレオチド配列（Ｖａｓｓａｒ， Ｒ．ら、１９９９ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８６： ７３５−７４１； 米国特許第５，７４４，３４６号および同第５，９４２，４００号）、および候補アルファ−セクレターゼ分子（Ｌａｍｍｉｃｈ， Ｓ．ら、１９９９ Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９８： ３９２２−３９２７）が同定されている。ガンマ−セクレターゼの単離配列は未だ解明されていない。
【０００５】
成熟βＡＰＰタンパク質は、細胞質膜、ゴルジ装置および小胞体に認められる膜内在性タンパク質である。βＡＰＰは、大きな細胞外Ｎ末端ドメイン、単一の膜貫通ドメインおよび小さな細胞質内Ｃ末端テールを有する細胞表面レセプターと類似している（Ｋａｎｇ， Ｊ．ら、１９８７上掲）。βＡＰＰ ｍＲＮＡのスプライス変異体は、７７０、７５０および６９５アミノ酸のβＡＰＰポリペプチドをコードしている。これら全ての形態のβＡＰＰは開裂領域を含んでおり、アミロイド原性（ａｍｙｌｏｉｄｏｇｅｎｉｃ）のＡβペプチドを生じ得る。正常な細胞では、βＡＰＰは、アルファ−セクレターゼ、ベータ−セクレターゼおよびガンマ−セクレターゼが関与する２つの異なる連続的な開裂経路のうちの一つを受ける（Ｄｏｖｅｙ， Ｈ． Ｆ．ら、１９９３ Ｎｅｕｒｏｒｅｐｏｒｔ ４： １０３９−１０４２； Ｓｅｌｋｏｅ， Ｄ． Ｊ．ら、１９９４ Ａｎｎ． Ｒｅｖ． ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． １０： ３７３−４０３； Ａｓａｍｉ−Ｏｄａｋａ， Ａ．ら、１９９５ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３４： １０２７２−１０２７８）。
【０００６】
一つの開裂経路では、アルファ−セクレターゼがβＡＰＰを細胞外の膜／近位ドメイン（たとえば、７７０アミノ酸形態のβＡＰＰのアミノ酸残基６８７のＣ末端側）で開裂して可溶性のＮ末端フラグメント（たとえば、アルファ−ｓＡＰＰフラグメント）と膜に結合したＣ末端フラグメント（たとえば、９ｋＤ ＣＴＦまたはＣ８３ ＣＴＦ）を生成する。ついで、ガンマ−セクレターゼが膜に結合したＣＴＦを膜結合ドメイン内で開裂して、ｐ３フラグメント（たとえば、３ｋＤフラグメント）および６ｋＤのＣ末端フラグメントを生成する。
【０００７】
他の開裂経路では、ベータ−セクレターゼがβＡＰＰを細胞外の膜／近位ドメイン（たとえば、７７０アミノ酸形態のβＡＰＰのアミノ酸残基６７１のＣ末端側）で開裂して可溶性のＮ末端フラグメント（たとえば、１００ｋＤ ＮＴＦまたはベータ−ｓＡＰＰフラグメント）と膜に結合したＣ末端フラグメント（たとえば、１１ｋＤ ＣＴＦまたはＣ １００ ＣＴＦ）を生成する。ついで、ガンマ−セクレターゼが膜に結合したＣＴＦを膜結合ドメイン内で開裂して、ｐ６フラグメント（たとえば、６ｋＤフラグメント）およびＡβペプチド（たとえば、４ｋＤフラグメント）を生成する。
【０００８】
ガンマ−セクレターゼ開裂領域のアミノ酸配列は知られている（Ｄｕｆｆｙ， Ｃ． Ｌ．ら、１９８８ Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ． ４７４： １００−１１１； Ｃａｓｔａｎｏ， Ｅ． Ｍ．およびＦｒａｎｇｉｏｎｅ， Ｂ． １９８８ Ｌａｂ． Ｉｎｖｅｓｔ． ５８： １２２−１３２）。ガンマ−セクレターゼは開裂領域内の様々な部位で開裂して（Ｈａａｓｓ， Ｃ．およびＳｅｌｋｏｅ， Ｄ． Ｊ． １９９３ Ｃｅｌｌ ７５： １０３９−１０４２）不均一なＣ末端を有するＡβペプチドの集団を生成する。通常の患者ではＡβペプチドは２つの主要な形態、すなわち大多数のＡβ−４０形と少数のＡβ−４２形（それぞれ異なるＣＯＯＨ末端を有する）で認められる。最も一般的な形態のＦＡＤの患者は、４２形の量の増大を示す。Ａβ−４０形はアミロイド斑の早期の沈積と関連していない。対照的に、Ａβ−４２形は早期かつ主として実質斑（ｐａｒｅｎｃｈｙｍａｌ ｐｌａｑｕｅｓ）中に沈積し、Ａβ−４２がＦＡＤ患者でのアミロイド斑沈積において主要な役割を果たしているとの強力な証拠がある（Ｒｏｈｅｒ， Ａ． Ｅ．ら、１９９３ Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９０： １０８３６； Ｉｗａｔａｓｕｂｏ， Ｔ．ら、１９９４ Ｎｅｕｒｏｎ １３： ４５； Ｙａｍａｇｕｃｈｉ， Ｈ．ら、１９９５ Ａｍｙｌｏｉｄ Ｉｎｔ． Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． ２： ７−１６； Ｍａｎｎ， Ｄ． Ｍ．ら、１９９６ Ａｍ． Ｊ． Ｐａｔｈｏｌ． １４８： １２５７）。
【０００９】
一般に、同じガンマ−セクレターゼ酵素が４０形および４２形を生成すると考えられてきた。当該技術分野の研究者は相反する結果を報告しているため、今日でもこの問題は解決されていない。たとえば、２つの研究グループはそれぞれ独立に、ある種のプロテアーゼインヒビターがＡβ−４２レベルを選択的に低下させることを示唆するインビトロの結果を報告しており、Ａβ−４０およびＡβ−４２が２つの異なるガンマ−セクレターゼによって生成されると結論付けている（Ｃｉｔｒｏｎ， Ｍ．ら、１９９６ Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９３： １３１７０−１３１７５； Ｋｌａｆｋｉ， Ｈ．−Ｗ．ら、１９９６ Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７１： ２８６５５−２８６５９）。第三の研究者のグループは、一連のプロテアーゼインヒビターがＡβ−４０ペプチドおよびＡβ−４２ペプチドの分泌を抑制する相対的な能力を比較し、Ａβ−４０ペプチドおよびＡβ−４２ペプチドが単一のプロテアーゼによって産生されるという反対の結論に到達した（Ｄｕｒｋｉｎ， Ｊ． Ｔ．ら、１９９９ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２７４： ２０４９９−２０５０４）。
【００１０】
Ａβ−４０形およびＡβ−４２形は広範囲の様々な細胞／組織で構成的に分泌され、生物学的流体中では可溶形態で見出されるため（Ｓｅｕｂｅｒｔ， Ｐ．ら、１９９２ Ｎａｔｕｒｅ ３５９： ３２５ ３７５； Ｓｈｏｊｉ， Ｍ．ら、１９９２ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５８： １２６−１２９）、ＦＡＤ患者においてＡβペプチドの両形態を充分に分析することが可能である。ＦＡＤ患者の中には血清のＡβ−４２ペプチドレベルが上昇している者がある（Ｓｃｈｅｕｎｅｒ， Ｄ．ら、１９９６ Ｎａｔ． Ｍｅｄ． ２： ８６４−８７０）。ＦＡＤ患者で認められるβＡＰＰ、ＰＳ１またはＰＳ２遺伝子における変異が、βＡＰＰタンパク質の開裂を変化させてＡＤ−４２ペプチドの相対量を増加させることが知られている（Ｔｏｍｉｔａ， Ｔ．ら、１９９７ Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９４： ２０２５−２０３０； Ｄｕｆｆ， Ｋ．ら、１９９６ Ｎａｔｕｒｅ ３８３： ７１０−７１３； Ｂｏｒｃｈｅｌｔ， Ｄ．ら、１９９６ Ｎｅｕｒｏｎ １７： １００５−１０１３； Ｃｉｔｒｏｎ， Ｍ．ら、１９９７ Ｎａｔ． Ｍｅｄ． ３： ６７−７２）。
【００１１】
βＡＰＰ遺伝子の点変異は、βＡＰＰ−ロンドン、βＡＰＰ−フラマン、およびβＡＰＰ−スウェーデンなどの比較的少数のＦＡＤ家系と連鎖している（Ｇｏａｔｅ， Ａ． Ｍ．ら、１９９１ Ｎａｔｕｒｅ ３４９： ７０４−７０６； Ｃｈａｒｔｉｅｒ−Ｈａｒｌｉｎ， Ｍ． −Ｃ．ら、１９９１ Ｎａｔｕｒｅ ３５３： ８４４−８４６； Ｍｕｒｒｅｌｌ， Ｊ．ら、１９９１ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５４： ９７−９９； Ｋａｒｌｉｎｓｋｙ， Ｈ．ら、１９９２ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ４２： １４４５−１４５３； Ｍｕｌｌａｎ， Ｍ．ら、１９９２ Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １： ３４５−３４７）。ＰＳ２遺伝子の点変異はまた、少数のＦＡＤの症例と連鎖している（Ｌｅｖｙ−Ｌａｈａｄ， Ｅ．ら、１９９５ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６９： ９７３−９７７； Ｒｏｇａｅｖ， Ｅ． Ｉ．ら、１９９５ Ｎａｔｕｒｅ ３７６： ７７５−７７８）。ＦＡＤの症例の大部分はＰＳ１遺伝子の点変異によって引き起こされ（Ｓｈｅｒｒｉｎｇｔｏｎ， Ｒ．ら、１９９５ Ｎａｔｕｒｅ ３７５： ７５４−７６０）、それゆえＡβ−４２ペプチドの選択的な増大という結果となる（Ｓｃｈｅｕｎｅｒ， Ｄ．ら、１９９６上掲）。
【００１２】
ＰＳ１およびＰＳ２は膜内在タンパク質であり、６または８の膜貫通ドメインを有し（Ｄｏａｎ， Ａ．ら、１９９６ Ｎｅｕｒｏｎ １７： １０２３−１０３０； Ｄｅ Ｓｔｏｏｐｅｒ， Ｂ．ら、１９９７ 上掲）、小胞体、初期ゴルジ（ｅａｒｌｙ Ｇｏｌｇｉ）、およびおそらく細胞表面に位置している（Ｘｉａ， Ｗ．ら、１９９８ Ｂｉｏｃｈｅｍ． ３７： １６４６５−１６４７１； Ｋｏｖａｃｓ， Ｄ． Ｍ．ら、１９９６ Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ． ２： ２２４−２２９； Ｒａｙら、１９９９ Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７４： ３６８０１−３６８０７）。これらプレセニリンタンパク質は６３％の配列同一性を有する。
【００１３】
ＰＳ１が未解明の（ｅｌｕｓｉｖｅ）ガンマ−セクレターゼであるかもしれないとの仮説がなされている。この仮説を支持する証拠としては、ＰＳ１を欠くマウスからの細胞が産生するＡβペプチドレベルが有意に低減しているという観察が挙げられ、このことはＰＳ１がガンマ−セクレターゼ活性を容易にするうえで何らかの役割を果たしていることを示している（Ｄｅ Ｓｔｏｏｐｅｒ， Ｂ．ら、１９９７ 上掲）。とりわけ、ＰＳ１がガンマ−セクレターゼ活性を有する自己賦活化した（ａｕｔｏａｃｔｉｖａｔｅｄ）アスパルチルプロテアーゼであるとの仮説がなされている（Ｗｏｌｆｅ， Ｍ． Ｓ．ら、１９９３ Ｎａｔｕｒｅ ３９８： ５１３−５１７）。この仮説は、ＰＳ１の膜貫通ドメイン内に存在する２つのアスパラギン酸残基が、ＰＳ１およびガンマ−セクレターゼ活性のエンドタンパク分解プロセシングに必要であるという知見に基づいている（Ｗｏｌｆｅ， Ｍ． Ｓ．ら、１９９９上掲）。
【００１４】
アスパラギン酸残基２５７のアラニンへの点変異およびアスパラギン酸残基３８５のアラニンへの点変異はＰＳ１のエンドタンパク分解を抑制し、Ｃ１００フラグメントおよびＣ８３βＡＰＰフラグメントの蓄積を引き起こしたが、このことはこれらアスパラギン酸残基がガンマ−セクレターゼ活性に特に必要であることを示唆している。同様の結果は、対応するアスパラギン酸残基の点変異を含む変異体ＰＳ２タンパク質で報告されている（Ｋｉｍｂｅｒｌｅｙ， Ｗ． Ｔ．ら、２０００ Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７５： ３１７３−３１７８）。それでもＰＳ１またはＰＳ２が直接βＡＰＰ基質の開裂を触媒するとの証拠はない。さらに、ＰＳ１およびＰＳ２は既知のプロテアーゼおよびアスパルチルプロテアーゼとの配列および構造上の類似性を有しない。
【００１５】
他の仮説は、ＰＳ１がβＡＰＰ開裂経路の制御補助因子として機能することを示唆している（Ｄｅ Ｓｔｏｏｐｅｒ， Ｂ．ら、１９９７ 上掲； Ｗｏｌｆｅ， Ｍ． Ｓ．ら、１９９９ Ｎａｔｕｒｅ ３９８： ５１３−５１７）。この仮説の支持は、ＰＳ１がＳＲＥＢＰ開裂活性化タンパク質（ＳＣＡＰ）と構造上の類似性を有するとの観察によるものであり、このＳＲＥＢＰ開裂活性化タンパク質（ＳＣＡＰ）もまた６〜８の膜貫通ドメインを有する膜内在タンパク質であり、ＳＲＥＢＰの開裂を制御するうえで役割を果たしている（Ｈｕａ， Ｘ．ら、１９９６ Ｃｅｌｌ ８７： ４１５−４２６； Ｂｒｏｗｎ， Ｍ． Ｓ．およびＧｏｌｄｓｔｅｉｎ， Ｊ． Ｌ． １９９７ Ｃｅｌｌ ８９： ３３１−３４０； Ｓａｋａｉ， Ｊ．ら、１９９７ Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７２： ２０２１３ ２０２２１）。
【００１６】
プレセニリンおよびガンマ−セクレターゼの仮説された役割は、βＡＰＰ様タンパク質であるＡＰＬＰ１タンパク質（Ｗａｓｃｏ， Ｗ．ら、１９９２ Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８９： １０７５８−１０７６２）のＣ末端開裂産物がＰＳ１を欠く原発（ｐｒｉｍａｒｙ）ニューロンに蓄積する（Ｎａｒｕｓｅ， Ｓ．ら、１９９８ Ｎｅｕｒｏｎ ２１： １２１３−１２２１）という事実によってさらに錯綜したものとなっている。この結果を説明する一つの仮説は、ＰＳ１がβＡＰＰおよびＡＰＬＰ１タンパク質の開裂の結果生じるＣ末端フラグメントの細胞内輸送を変調させるというものである（Ｎａｒｕｓｅ、上掲）。
【００１７】
プレセニリンおよびガンマ−セクレターゼの役割として考えられるものはまた、βＡＰＰおよびβＡＰＰ様タンパク質以外のタンパク質のタンパク分解プロセシングにも及んでいる。たとえば、ノッチ（Ｎｏｔｃｈ）タンパク質のタンパク分解開裂にＰＳ１の存在が必要であることが以前に決定されている（Ａｒｔａｖａｎｉｓ−Ｔｓａｋｏｎａｓ， Ｓ．ら、１９９６ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６８： ２２５−２３２； Ｋｏｐａｎ， Ｒ．およびＴｕｒｎｅｒ， Ｄ． １９９６ Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ． ６： ５９４−６０１； Ｗｅｉｎｍａｓｔｅｒ， Ｇ． １９９７ Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． ９： ９１−１０２）。ノッチタンパク質は脊椎動物および無脊椎動物において多くの細胞運命の決定を媒体する単一膜貫通ドメイン細胞表面レセプターである。ＰＳ１内の２つの膜貫通アスパラギン酸残基の変異は、ノッチタンパク質の開裂を抑制する（Ｒａｙ， Ｗ． Ｊ．ら、１９９９ Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７４： ３６８０１−３６８０７）。Ｓ２−開裂したノッチ１タンパク質内の仮説されたガンマ−セクレターゼ開裂配列（Ｓｃｈｒｏｅｔｅｒ， Ｅ． Ｈ．ら、１９９８ Ｎａｔｕｒｅ ３９３： ３８２−３８６）は、一般に受け入れられているプロテアーゼ開裂部位のモチーフと類似性を有しない。
【００１８】
（発明の開示）
（発明が解決しようとする技術的課題）
プレセニリンおよびガンマ−セクレターゼの役割は、ガンマ−セクレターゼの機能的活性を有するタンパク質またはタンパク質複合体を単離することによって解決することができる。一般に、膜内在タンパク質およびタンパク質複合体は単離手順の際にその機能的活性を失いやすいので、機能的に活性な膜内在タンパク質およびタンパク質複合体を単離することは困難である。この困難は、以下に記載する種々の方法を開発することにより克服された。
【００１９】
さらに、本発明は、ガンマ−セクレターゼ活性を有する単離したタンパク質複合体を提供する。本発明の単離したガンマ−セクレターゼタンパク質複合体は、ガンマ−セクレターゼ開裂配列を有するポリペプチド基質の開裂を触媒する。本発明のガンマ−セクレターゼタンパク質複合体は、Ａβ−４２ペプチドを生成するプロセシング経路を担う推定ガンマ−セクレターゼであると仮定されている。
【００２０】
予備的な事項として、ガンマ−セクレターゼ活性の検出には、ガンマ−セクレターゼ開裂産物の存在または不在の信頼でき、正確かつ迅速な検出を可能にするアッセイが必要である。さらに、ガンマ−セクレターゼ活性のインヒビターが望まれる場合には、大量の被験化合物を不当なプロセシングなしに正確にスクリーニングすることがとりわけ役立つ。
【００２１】
（その解決方法）
それゆえ、本発明はガンマ−セクレターゼ活性およびそのインヒビターを検出する均一法を提供する。ガンマ−セクレターゼ活性の均一アッセイ法の発見および応用は、ガンマ−セクレターゼ開裂産物の単離および回収の工程を必要とすることなく活性を検出することを可能にする。開裂産物の単離および回収のためのこれら工程の省略は、スピードおよび正確さの点で明らかな利点を提供する。さらに、本発明は、Ａβまたは６ｋＤａフラグメントの検出を含む、ガンマ−セクレターゼ活性の特異産物の検出の均一法を提供する。
【００２２】
本発明は、ガンマ−セクレターゼが様々な哺乳動物細胞型の小胞体、ゴルジ装置および細胞質膜に認められる膜内在タンパク質であるという知見を提供する。
本発明は、βＡＰＰポリペプチドなどの基質のタンパク分解開裂を触媒する単離タンパク質を提供する。機能的に活性なタンパク質複合体は、本明細書ではガンマ−セクレターゼとして、たとえばガンマ−セクレターゼ複合体として記載する。本発明は、機能的に活性なガンマ−セクレターゼを含む単離した細胞不含膜画分を提供する。本発明はまた、可溶性の形態で単離したガンマ−セクレターゼタンパク質複合体をも提供する。
【００２３】
本発明は、ガンマ−セクレターゼタンパク質をＰＳ１とともに単離することによるガンマ−セクレターゼタンパク質の単離方法を提供する。さらに、本発明は、ガンマ−セクレターゼ複合体などの可溶化した膜内在タンパク質またはタンパク質複合体の単離方法を提供する。
さらに、本発明は、Ｎ−３［（ジメチルアミノ）プロピル］３，７，１２−トリヒドロキシ（３ａ，５ｂ，７ａ，１２ａ）コラン−２−アミド］およびＣＨＡＰＳＯＴＭを含む組成物を提供する。この新規な組成物は、ガンマ−セクレターゼタンパク質複合体の単離、再構成、基質の単離、およびガンマ−セクレターゼ活性を阻害する試薬の同定に有用である。
【００２４】
本発明はまた、ガンマ−セクレターゼ活性の検出方法およびガンマ−セクレターゼ産物、とりわけＡβの検出方法をも提供する。さらに、本発明は、ガンマ−セクレターゼ活性を阻害する試薬の同定方法を提供する。
ガンマ−セクレターゼインヒビターを同定するため、未開裂のβＡＰＰ、βＡＰＰフラグメント、およびガンマ−セクレターゼを含有する試料に被験化合物を入れる。ガンマ−セクレターゼを活性化させ、生成するガンマ−開裂βＡＰＰフラグメントの量に及ぼす被験化合物の影響をモニターする。β−セクレターゼがフラグメントを開裂するかまたは存在する場合でも、Ａβの量をモニターすることができる。
【００２５】
とりわけ本発明は、ガンマ−開裂βＡＰＰフラグメントの産生を測定することにより、流体試料中でのガンマ−セクレターゼによるβＡＰＰ基質の開裂を検出する効率的な系を提供する。この検出系は、一方から他方へ蛍光エネルギーを移転することが可能な１対の蛍光付加物を利用する。この１対の付加物を基質およびガンマ−セクレターゼ産物の標識として用いることにより、ガンマ−セクレターゼの活性をモニターすることができる。
【００２６】
この結合アッセイは、各蛍光付加物を標識として同じガンマ−開裂βＡＰＰフラグメントの異なる部位に結合させることにより行う。本発明の好ましい態様において、第一の蛍光付加物はガンマ−開裂βＡＰＰフラグメントのカルボキシ末端に通常のガンマ−セクレターゼ開裂の部位、すなわちアミノ酸残基７１１（Ａβアミノ酸残基４０に対応）にて特異的に結合し、一方、第二の蛍光付加物は同じガンマ−開裂βＡＰＰフラグメントのアミノ末端領域のアミノ酸１〜７０２の部分に結合する。最も好ましくは、とりわけＡβ検出をも目的とする場合には、第二の蛍光付加物はＡβのアミノ酸配列１〜３１に対応するアミノ酸配列内に結合する。
【００２７】
場合により、第一の蛍光付加物は、代わりにβＡＰＰ、ＰＳ１またはＰＳ２の変異に最も一般的に関連する開裂部位であるガンマ−開裂βＡＰＰフラグメントのカルボキシ末端のアミノ酸７１３（Ａβアミノ酸残基４２）に特異的に結合してよい。これら蛍光付加物はガンマ−開裂βＡＰＰフラグメントの重複する部位に結合せず、第一の蛍光付加物はガンマ−開裂βＡＰＰのカルボキシ末端に特異的であって、未開裂βＡＰＰに対しても他の型のガンマ−開裂βＡＰＰフラグメントに対しても実質的に交差反応しないのが好ましい。ガンマ−セクレターゼ開裂は、結合した一方の蛍光付加物の励起が他方の蛍光付加物へのエネルギーの検出しうる移動を与えるときに検出される。
【００２８】
ガンマ−セクレターゼ開裂の検出の別の態様では、これら付加物は別々の開裂産物に結合する。各蛍光付加物は、未開裂βＡＰＰ上のガンマ−セクレターゼ開裂部位の反対部位に対応する別々のアミノ酸配列に結合する。この別の態様では、蛍光付加物の少なくとも一つがそのアミノ酸配列に結合し、未開裂βＡＰＰの他の部位とは実質的に交差反応しないのが好ましい。ガンマ−セクレターゼ開裂が生じる場合は蛍光付加物はそれぞれ別々のガンマ−開裂βＡＰＰフラグメントに結合し、それゆえ励起後にエネルギー移動の実質的な低減という結果となる。
【００２９】
術語の定義
本明細書において「単離した」とは、ガンマ−セクレターゼタンパク質またはタンパク質複合体がリン脂質二重層から、および他の膜内在タンパク質およびタンパク質複合体から分離されることをいう。
本明細書において「ガンマ−セクレターゼタンパク質」および「ガンマ−セクレターゼ」とは、ガンマ−セクレターゼ活性を示すタンパク質をいう。ガンマ−セクレターゼ活性としては、ガンマ−セクレターゼ開裂配列を有するポリペプチド基質の認識、およびガンマ−セクレターゼ開裂部位でガンマ−セクレターゼ開裂配列の開裂を触媒して基質開裂産物を生成することが挙げられる。
【００３０】
本明細書において「ガンマ−セクレターゼタンパク質複合体」および「ガンマ−セクレターゼ複合体」とは、少なくとも２つのタンパク質分子を含むタンパク質複合体であって、該タンパク質分子のうち少なくとも１つがガンマ−セクレターゼ開裂配列を有するポリペプチド基質の開裂を触媒するものをいう。ガンマ−セクレターゼタンパク質複合体を構成するタンパク質分子は、互いに共有結合的相互作用および／または非共有結合的相互作用で結合していてよい。さらに、ガンマ−セクレターゼタンパク質複合体はまた、ビタミン、ＡＴＰまたは二価カチオンなどの非タンパク質分子をも含んでいてよい。
【００３１】
本明細書において「アミノ末端領域」および「カルボキシ末端領域」は、ある特定の部位（とりわけガンマ−セクレターゼの開裂部位）のいずれかの側にあるペプチド鎖の部分が、それぞれアミノ末端またはカルボキシ末端のいずれに近位した側にあるかを示す参照位置として用いる。該部分は、さらに該ペプチド鎖のアミノ末端またはカルボキシ末端を含んでいても含んでいなくともよい。さらに、本明細書において「アミノ末端」および「カルボキシ末端」は同様に参照位置として用いるが、「アミノ末端」および「カルボキシ末端」は該ペプチド鎖のそれぞれアミノ末端またはカルボキシ末端を含む点で「アミノ末端領域」または「カルボキシ末端領域」とは区別される。
【００３２】
本明細書において「可溶化した」とは、膜を断片化することにより膜内在タンパク質およびタンパク質複合体を膜から分離する化合物を用い、脂質二重層（たとえば、膜二重層）および他の膜内在タンパク質またはタンパク質複合体から所定の膜内在タンパク質またはタンパク質複合体を分離することをいう。膜内在タンパク質を可溶化する典型的な方法は、リン脂質二重層を断片化して膜内在タンパク質またはタンパク質複合体を与える界面活性剤などの化合物を用いることを含み、その際、該脂質二重層の化学特性を模倣した環境を用いて可溶化したタンパク質またはタンパク質複合体が天然のコンホメーションに折り畳まれるようにする。それゆえ、界面活性剤の環境中にあるタンパク質またはタンパク質複合体は可溶化形態にあるタンパク質またはタンパク質複合体である。さらに、可溶化したタンパク質またはタンパク質複合体は、その天然のコンホメーションにある該タンパク質またはタンパク質複合体によって示される生物学的活性を有していても有していなくてもよい。
【００３３】
本明細書に記載する本発明が一層完全に理解されるべく、以下の記載を列記する。
本発明のガンマ−セクレターゼタンパク質
単離したガンマ−セクレターゼタンパク質
ガンマ−セクレターゼタンパク質は、機能的に活性である場合にはガンマ−セクレターゼ開裂配列を有するポリペプチド基質を開裂する。開裂は典型的に基質開裂産物という結果となる。本発明は、たとえば界面活性剤で可溶化した形態で単離したガンマ−セクレターゼタンパク質を提供する。一つの態様において、本発明のガンマ−セクレターゼタンパク質はガンマ−セクレターゼタンパク質複合体の成分を含む。さらに、本発明は、ガンマ−セクレターゼタンパク質と反応する抗体（モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、または抗体フラグメント）を提供する。
【００３４】
単離したガンマ−セクレターゼの機能的活性
本発明は、ガンマ−セクレターゼが膜内在プロテアーゼであるという知見を提供する。さらに本発明は、ガンマ−セクレターゼの機能的活性を示す単離した膜画分および可溶化タンパク質複合体を提供する。
ガンマ−セクレターゼの機能的活性としては、ガンマ−セクレターゼ開裂配列を有するポリペプチド基質の認識、およびガンマ−セクレターゼ開裂部位でガンマ開裂配列の開裂を触媒して基質開裂産物を生成することが挙げられる。たとえば、単離したガンマ−セクレターゼ複合体はβＡＰＰなどのポリペプチド基質を開裂する。
【００３５】
細胞ではガンマ−セクレターゼ複合体はβＡＰＰをガンマ−セクレターゼ開裂部位で開裂してβＡＰＰ開裂産物を生成する。βＡＰＰ開裂産物としては、ベータ−セクレターゼおよびガンマ−セクレターゼから得られる基質開裂産物であるＡβ−４０およびＡβ−４２ペプチド；アルファ−セクレターゼおよびガンマ−セクレターゼから得られる基質開裂産物であるｐ３ペプチド；ガンマ−セクレターゼによる開裂のＣ末端産物であるｐ６ペプチド；またはそれらのフラグメントが挙げられる（Ｈａａｓｓ， Ｃ．およびＳｅｌｋｏｅ， Ｄ． Ｊ． １３ Ｃｅｌｌ ７５： １０３９−１０４２において概説）。βＡＰＰのガンマ−セクレターゼ開裂配列は知られている（Ｄｕｆｆｙ， Ｃ． Ｌ．ら、１９８８ Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ． ４７４： １００−１１１； Ｃａｓｔａｎｏ， Ｅ． Ｍ．およびＦｒａｎｇｉｏｎｅ， Ｂ． １９８８ Ｌａｂ． Ｉｎｖｅｓｔ． ５８： １２２−１３２）。
【００３６】
単離したガンマ−セクレターゼタンパク質複合体
本発明は、ガンマ−セクレターゼタンパク質複合体が様々な哺乳動物細胞型の小胞体またはゴルジ体において典型的に認められる膜内在タンパク質複合体であり得るとの知見を提供する。さらに、ガンマ−セクレターゼタンパク質複合体は細胞質膜でも認められる。さらに、ガンマ−セクレターゼ複合体は酸性であり（ｐＩ＜５．６）、グリコシル化されており、約７００ｋＤａの分子サイズを示す。
【００３７】
ガンマ−セクレターゼタンパク質複合体は、ウシ、ヒツジ、ブタ、マウス、ウマ、および好ましくはヒトなどの哺乳動物種を含む多くの種から得た細胞から単離することができる。さらに、ガンマ−セクレターゼ複合体は、植物、昆虫（Ｄ． ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒなど）および無脊椎動物（Ｃ． ｅｌｅｇａｎｓなど）などの種から単離できる。さらに、ガンマ−セクレターゼはガンマ−セクレターゼ複合体を含むあらゆる適当な組織または細胞（たとえば、ガンマ−セクレターゼ陽性細胞）から単離できる。たとえば、ヒトＨ４神経膠腫細胞、およびマウスＮ２Ａ神経芽細胞腫細胞、ヒト胚性腎（ＨＥＫ）２９３細胞、ＣＯＳ−１細胞、ＣＨＯ細胞、およびＨｅＬａ細胞などのガンマ−セクレターゼ陽性細胞（ｈａａｓｓ， Ｃ．ら、１９９２ Ｎａｔｕｒｅ ３５９： ３２２−３２５； Ｂｕｓｃｉｇｌｉｏ， Ｊ．ら、１９９３ Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９０： ２０９２−２０９６）は、βＡＰＰ開裂産物（たとえば、ｐ３ペプチド、ｐ６ペプチド、およびＡβペプチド）を産生する。
【００３８】
ガンマ−セクレターゼ複合体は、Ａβペプチド（４０形および４２形）、ｐ３ペプチドまたはｐ６ペプチドなどのβＡＰＰ開裂産物の通常レベルの蓄積のような野生型の表現型を示す細胞または組織から単離できる。あるいは、ガンマ−セクレターゼ複合体は、一層高レベルのβＡＰＰ開裂産物の蓄積などの変異表現型を示す細胞または組織から単離できる。変異した組織／細胞での蓄積したβＡＰＰ開裂産物のレベルは、正常な組織／細胞採取源で認められる同開裂産物のレベルと比較すると高い。変異表現型を示す組織／細胞としては、変異形のβＡＰＰ、またはＰＳ１もしくはＰＳ２タンパク質を有するあらゆる種、または組織、または細胞株からの対象物が挙げられる（Ｔａｎｚｉ， Ｒ．ら、１９９６ Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ． Ｄｉｓ． ３： １５９−１６９で概説）。
【００３９】
単離したガンマ−セクレターゼ複合体の成分
本発明は、タンパク質成分としてＰＳ１やＰＳ２などの少なくとも１つのプレセニリンタンパク質分子とともにガンマ−セクレターゼを含む単離したガンマ−セクレターゼ複合体を提供する。さらに、ガンマ−セクレターゼ複合体は、ガンマ−セクレターゼ活性を示す少なくとも１つの他のタンパク質分子と結合したＰＳ１またはＰＳ２タンパク質を含む。ガンマ−セクレターゼ複合体は、ビタミン、ＡＴＰ、二価カチオンまたは脂質などの非タンパク質成分と結合していても結合していなくともよい。
【００４０】
単離したガンマ−セクレターゼ複合体は、同じかまたは異なる多型形態である１を超えるＰＳ１またはＰＳ２分子を含んでいてよく、その結果、それぞれホモ重合性またはへテロ重合性のタンパク質複合体となってよい。たとえば、単離したガンマ−セクレターゼ複合体はＰＳ１またはＰＳ２分子の２つの同一の多型形態を含んでいてよく、その結果、ホモ重合性のタンパク質複合体となってよい。あるいは、単離したガンマ−セクレターゼ複合体はＰＳ１またはＰＳ２の２つの異なる形態を含んでいてよく、その結果、へテロ重合性のタンパク質複合体となってよい。単離したガンマ−セクレターゼ複合体は、それぞれ少なくとも１つのＰＳ１およびＰＳ２分子を含んでいてよい。
【００４１】
本発明は、野生型、変異体またはスプライス変異形を含む、ＰＳ１および／またはＰＳ２タンパク質分子の少なくとも１つの異なる形態を含むガンマ−セクレターゼ複合体を提供する。ガンマ−セクレターゼ複合体は、野生型、変異体、またはスプライス変異形のＰＳ１（Ｓｈｅｒｒｉｎｇｔｏｎ， Ｒ．ら、１９９５ Ｎａｔｕｒｅ ３７５： ７５４−７６０）またはＰＳ２（米国特許第５，９８６，０５４号）を有する主体（たとえば、あらゆる種から）、組織または細胞株などの採取源から単離できる。
【００４２】
膜内在タンパク質の単離方法
ガンマ−セクレターゼ複合体を含む膜画分の単離
ガンマ−セクレターゼ複合体は、膜画分の成分として単離することができる。たとえば、膜画分を単離するための常法は以下の工程を含む：細胞を回収する；該細胞を溶解して周辺膜タンパク質および膜内在タンパク質を含む細胞膜を得る；該膜を回収する；該膜を洗浄して周辺膜タンパク質を除去する；ついで洗浄した膜画分を単離する。たとえば、ＨｅＬａ細胞溶解法はＨｅｉｎｔｚおよびＲｏｅｄｅｒ（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８１： ２７１３）によって記載されており、Ｈ４細胞の溶解および膜画分の単離法はＳ． Ｂ． Ｒｏｂｅｒｔｓら（１９９４ Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６９： ３１１１−３１１６）によって記載されており、膜の洗浄はＰ． ＷａｌｔｅｒおよびＧ． Ｂｌｏｂｅｌ（１９８１ Ｊ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． ９１： ５５１−５５６）によって記載されている。
【００４３】
可溶化形態の膜内在タンパク質の単離方法
本発明は、可溶化形態の膜内在タンパク質の単離方法を提供する。本発明の方法は、機能的な活性を保持しているかまたは保持していない可溶化したタンパク質およびタンパク質複合体を単離するのに用いることができる。さらに、本発明の方法は、ガンマ−セクレターゼの機能的な活性を有する可溶化したタンパク質複合体を単離するのに用いることができる。
本発明は、下記の一般的工程を含む方法を提供する：膜を溶液で可溶化して膜内在タンパク質、タンパク質複合体および他の細胞成分を有する混合物を得る；ついで膜内在タンパク質またはタンパク質複合体を単離する。
【００４４】
好ましい方法は洗浄した膜画分を可溶化することを含む。この洗浄した該膜画分に含まれる膜内在タンパク質およびタンパク質複合体を膜から可溶化する（たとえば抽出する）。通常の抽出法（たとえば、可溶化工程）は、一般に水溶液中の両親媒性界面活性剤を用いて行う。イオン性界面活性剤や非イオン性界面活性剤などの多くの異なる界面活性剤が市販されているが、これらはその解離作用、臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）、酵素活性に及ぼす作用、さらなる精製に及ぼす作用、および溶液からの除去の容易さが異なる。多くの異なる界面活性剤および膜タンパク質の可溶化方法は当業者に知られている（Ｎｅｕｇｅｂａｕｅｒ １９９０ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． １８２： ２３９−２５３； Ｈｊｅｌｍｉｌａｎｄ １９９０ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． １８２： ２５２−２６４）。
【００４５】
単離手順の際に失われ得る膜内在タンパク質およびタンパク質複合体の機能的活性を保持するため、本発明の一つの態様は、Ｎ−［３［（ジメチルアミノ）プロピル］３，７，１２−トリヒドロキシ（３ａ，５ｂ，７ａ，１２ａ）コラン−２−アミド］（これはＣＨＡＰＳＯＴＭ（Ｐｉｅｒｃｅ、ロックフォード、イリノイ）の製造の際の中間体である）を含む抽出溶液を用いた抽出法を提供する。この中間体Ｎ−［３［（ジメチルアミノ）プロピル］３，７，１２−トリヒドロキシ（３ａ，５ｂ，７ａ，１２ａ）コラン−２−アミド］は、以下、「ｍＣＨＡＰＳＯ」と称する。
【００４６】
本発明は、ｍＣＨＡＰＳＯおよび市販の界面活性剤ＣＨＡＰＳＯＴＭを含む溶液を提供する。好ましい溶液は、１部（容量／容量）のｍＣＨＡＰＳＯおよび２部のＣＨＡＰＳＯＴＭを含む。この好ましい溶液は、可溶化した膜内在タンパク質およびタンパク質複合体、たとえばガンマ−セクレターゼ複合体の単離に有用である。
【００４７】
ガンマ−セクレターゼ複合体の濃縮方法
本発明は、可溶化した膜内在タンパク質およびタンパク質複合体、たとえばガンマ−セクレターゼ複合体を有する試料（たとえば、調製物）の濃縮方法を提供する。たとえば、単離した膜内在タンパク質およびタンパク質複合体を本発明の可溶化方法により調製し、ついでイムノアフィニティー濃縮、陽イオン交換または陰イオン交換、レクチン−アフィニティー、および／またはゲル濾過などの常法を用いてガンマ−セクレターゼ複合体を濃縮する。濃縮したガンマ−セクレターゼ複合体は、典型的に比活性（一定容量のガンマ−セクレターゼタンパク質複合体が１分当たりに基質開裂される量として定義される）の増大を示すであろう。
【００４８】
ガンマ−セクレターゼ複合体のイムノアフィニティー濃縮
本発明は、プレセニリンに結合したガンマ−セクレターゼを単離することによるガンマ−セクレターゼの試料からの単離方法を提供する。好ましい方法はイムノアフィニティー濃縮法を用いる。たとえば、イムノアフィニティー法は以下の工程を含む：試料（たとえば、可溶化した膜内在タンパク質およびタンパク質複合体）をプレセニリンを認識および結合する試薬と接触させて試薬／プレセニリン複合体を形成させる；ついで該試薬／プレセニリン複合体を試料から単離する。
【００４９】
好ましい濃縮方法は、プレセニリンに特異的に結合する抗プレセニリン抗体（たとえば、抗ＰＳ１抗体および／または抗ＰＳ２抗体）などの試薬を用いることを含む。しかしながら、他の手段による濃縮が可能であり、当業者には明らかである（表１）。好ましい濃縮方法は、ｍＣＨＡＰＳＯを含む溶液中でプレセニリンを認識および結合する試薬に試料を接触させることを含む。好ましい溶液は、１部のｍＣＨＡＰＳＯおよび２部のＣＨＡＰＳＯＴＭを含む。
【００５０】
好ましい態様において本発明の方法は以下の工程を含む：プレセニリンに特異的に結合するアフィニティーマトリックスを調製する；該アフィニティーマトリックスを新規な平衡溶液を用いて平衡化する；平衡化した該アフィニティーマトリックスを、プレセニリンがアフィニティーマトリックスに結合するのを可能にする条件下でガンマ−セクレターゼ複合体（たとえば、プレセニリンに結合したガンマ−セクレターゼ）を含む可溶化した膜内在画分と接触させる；ついで該アフィニティーマトリックスに結合しなかったタンパク質を除去してガンマ−セクレターゼ複合体を濃縮する。さらなる工程としては、所望のタンパク質を該アフィニティーマトリックスから溶出することが挙げられる。所望のタンパク質またはタンパク質複合体のアフィニティー濃縮のための一般的な工程および条件は、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｈａｒｌｏｗ， Ｅ．およびＬａｎｅ， Ｄ．， １９８８ ＣＳＨＬ、コールドスプリング、ニューヨーク）に記載されている。
【００５１】
イムノアフィニティーマトリックスは、固体支持体マトリックスを選択し；ついで選択した該マトリックスにプレセニリンを認識および結合する試薬（たとえば、抗プレセニリン抗体）を付着させてアフィニティーマトリックスを生成することにより調整する。マトリックスは、プロテインＡまたはプロテインＧビーズ、または活性化ビーズを含む様々な市販の固体支持体マトリックスから選択することができる。使用するマトリックスの選択は、付着させる抗体に対するマトリックスの親和性に依存するであろう。たとえば、プロテインＡおよびプロテインＧビーズは種々の抗体に対して異なる結合親和性スペクトルを示す。
【００５２】
マトリックスの抗体への付着は、直接カップリング法および高塩直接カップリング法を含む種々のカップリング法を用いて行うことができる（Ｇｅｒｓｔｅｎ， Ｄ． Ｍ．およびＭａｒｃｈａｌｏｎｉｓ， Ｊ． Ｊ．， １９７８ Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ， ２４： ３０５−３０９； Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ， Ｃ．ら、１９８２ Ｊ． ＢＩｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２５７： １０７６６−１０７６９）。別法は、抗体を活性化ビーズにカップリングすることを含む（Ｐｏｒａｔｈ， Ｊ．およびＡｘｅｎ， Ｒ． １９７６ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． ４４： １９−４５； Ｓｃｏｕｔｅｎ， Ｗ． Ｈ． １９８７ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． １３５： ３０６５； Ｈａｒｌｏｗ， Ｅ．およびＬａｎｅ， Ｄ．， １９８８上掲）。ガンマ−セクレターゼ複合体のアフィニティー濃縮のための好ましいマトリックスとしては、プロテインＡビーズが挙げられる。好ましいカップリング法としては、ジメチルスベリミデート（ｄｉｍｅｔｈｙｌ ｓｕｂｅｒｉｍｉｄａｔｅ）を用いた直接カップリング法が挙げられる。
【００５３】
マトリックスは、プレセニリンと特異的に反応するモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体またはその組み合わせに付着させることができる。抗ＰＳ１抗体および抗ＰＳ２抗体は、全長または断片のプレセニリンタンパク質に対して産生させることができる。これら抗体は、天然源から単離したプレセニリンまたは組換えＤＮＡ法または化学的合成法によって合成したプレセニリンタンパク質に対して産生させることができる。これら抗体はまた、抗プレセニリン抗体の単離および精製を容易にするためにシステインやヒスチジンなどの付加的なアミノ酸タグを有していてよい。別法として、マトリックスは、単離したガンマ−セクレターゼ複合体に特異的に反応する抗体に付着させることができる。
【００５４】
これら抗体は、プレセニリンへの弱い結合から堅固な結合に到る所定範囲の結合特性を示す。たとえば、マトリックスは、ＰＳ１またはＰＳ２に結合したガンマ−セクレターゼのアフィニティー濃縮のために抗ＰＳ１および／または抗ＰＳ２ポリクローナルまたはモノクローナル抗体を付着させることができる。
【００５５】
一つの態様において、プレセニリンに結合したガンマ−セクレターゼのイムノアフィニティー濃縮に用いる抗体としては、ＣＲＤＳＨＬＧＰＨＲＳＴＰＥＳＲ−アミド（配列番号５）（ヒトＰＳ１のアミノ酸３３４−３５８に対応するものに、該ペプチド抗原を担体タンパク質へカップリングするためのＮ末端システインを付加したもの）の配列を有する合成ペプチド抗原に対して産生することのできるポリクローナル抗体（たとえば、１３５７）が挙げられる。他の好ましい抗体は、ＣＧＨＰＥＰＬＳＮＧＲＰＱＧＮＳＲ−アミド（配列番号６）（ヒトＰＳ１のアミノ酸４５−６０に対応するものに、該ペプチド抗原を担体タンパク質へカップリングするためのＮ末端システインを付加したもの）の配列を有する合成ペプチド抗原に対して産生することのできるポリクローナル抗体（たとえば、１３９８）である。ガンマ−セクレターゼ複合体を濃縮するための最も好ましいアフィニティーマトリックスとしては、１３５７抗体と１３９８抗体との混合物が挙げられる。
【００５６】
他の好ましいポリクローナル抗体は、ノルロイシン−ＲＤＳＨＬＧＰＨＲＳＴＰＥＳＲ−アミド（配列番号９）の配列を有するペプチドに対して産生させることのできるポリクローナル抗体（たとえば、ＳＲ９２）である。
他の好ましい態様は、ガンマ−セクレターゼ複合体のアフィニティー濃縮のための抗ヒトＰＳ１抗体の使用を提供し、該抗体としては、細菌発現したＰＳ１フラグメント（ＰＳ１ １−７７）（配列番号７）に対して産生させた精製ポリクローナルウサギ抗体であるＪＨ２；およびＰＳ１「ループ」−ＧＳＴ融合タンパク質（配列番号８）に対して産生させた精製ポリクローナル抗体であるＪＨ５が挙げられる。イムノアフィニティーマトリックスは、低ｐＨまたはグリシンなどのような穏やかな溶出条件下での結合ガンマ−セクレターゼ複合体の溶出を可能にする抗体とカップリングすることができる。たとえば、１３５７抗体、１３９８抗体、ＪＨ２抗体またはＪＨ５抗体とカップリングしたイムノアフィニティーマトリックスは、比較的穏やかな溶出条件下での結合ガンマ−セクレターゼ複合体の溶出を可能にするであろう。
【００５７】
アフィニティーマトリックスは新規な平衡溶液を用いて平衡化することができる。ガンマ−セクレターゼ複合体などの所望のタンパク質のアフィニティー濃縮のための好ましい平衡化溶液は、１部（容量／容量）のｍＣＨＡＰＳＯおよび２部のＣＨＡＰＳＯＴＭを含む。
所望のタンパク質を含む可溶化した膜内在画分を、所望の該タンパク質とアフィニティーマトリックスとの結合を可能にする条件下でアフィニティーマトリックスと接触させる。接触工程は、懸濁液中、溶液中、またはカラム上で行うことができる。典型的には接触工程は４℃で１〜１６時間行う。所望のタンパク質は、この接触工程の間にアフィニティーマトリックスに吸着または結合することができる。
【００５８】
洗浄工程は、所望のタンパク質が結合したアフィニティーマトリックスを洗浄溶液と接触させることを含む。好ましい洗浄溶液は非イオン性界面活性剤であるＣＨＡＰＳＯＴＭを含み、このものは膜内在画分中に存在する未結合（たとえば、未吸着）のタンパク質およびタンパク質複合体を除去する。典型的には、使用する洗浄溶液の容量は、アフィニティーマトリックスの容量の少なくとも２０倍である。
【００５９】
溶出工程は、所望のタンパク質が結合したアフィニティーマトリックスを、所望の該タンパク質を結合させないようにする溶出液と接触させることを含む。選択する溶出液は、アフィニティーマトリックスにカップリングさせた抗体の結合特性に依存するであろう。さらに、異なる溶出液を組み合わせてまたは段階的に用いることができる。たとえば、溶出液は、高いかまたは低いｐＨ、高い塩、イオン性界面活性剤、解離剤（たとえば尿素やグアニジンＨＣｌ）、カオトロピック剤、有機溶媒、および／または水を含んでいてよい。アフィニティーマトリックスからガンマ−セクレターゼ複合体を溶出するための好ましい溶出液は、グリシンおよびＣＨＡＰＳＯＴＭを含む低ｐＨ溶液（たとえば、ｐＨ２．５）である。
【００６０】
他の濃縮方法
ガンマ−セクレターゼについて試料を濃縮する他の方法としては、ＰＳ１またはＰＳ２に特異的に結合しない様々な方法が挙げられる。たとえば、他の方法としては、陽イオン交換クロマトグラフィー（たとえば、Ｍｏｎｏ Ｓ； Ｐｈａｒｍａｃｉａ）；陰イオン交換クロマトグラフィー（たとえば、ＤＥＡＥセファロースファーストフロー； Ｐｈａｒｍａｃｉａ）；レクチンアフィニティー（たとえば、コムギ麦芽アグルチニンアガロース； Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ、ピスカタウエイ、ニュージャージー）；およびゲル濾過（たとえば、スペロース６（Ｓｕｐｅｒｏｓｅ ６）； Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ、ピスカタウエイ、ニュージャージー）が挙げられる。
【００６１】
一つの態様において、本発明の方法は、グリコシル化タンパク質を認識および結合する分子（たとえば、コムギ麦芽アグルチニン）に試料を接触させて分子／グリコシル化タンパク質複合体を生成させ；ついで該分子／グリコシル化タンパク質複合体を試料から除去してガンマ−セクレターゼ活性を有するタンパク質複合体について試料を濃縮することを含む。
【００６２】
可溶化した膜内在タンパク質およびタンパク質複合体の試料は、これら様々な濃縮方法のいずれかの組み合わせを用いてガンマ−セクレターゼタンパク質またはタンパク質複合体について濃縮することができる。濃縮のための好ましい方法としては、可溶化した試料を陽イオン交換条件、陰イオン交換条件、レクチンアフィニティー条件、および／またはゲル濾過条件に供することが挙げられる。可溶化した画分の濃縮はガンマ−セクレターゼの単位活性によって測定されるように、様々な条件で増大した（Ｓｃｏｐｅｓ， Ｒ． Ｋ．， １９８７ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ； Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ， Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、ニューヨーク、ニューヨーク）。たとえば、陰イオン交換条件は約２倍の濃縮という結果となり、レクチン−アフィニティー条件は約４６倍の濃縮という結果となり、ゲル濾過条件は約５６倍の濃縮という結果となった（表１参照）。
【００６３】
これら結果は、単離したガンマ−セクレターゼ複合体の化学的および物理的性質の特性を明らかにした。たとえば、ガンマ−セクレターゼ複合体は酸性であり（ｐＩ＜５．６；たとえば、陰イオン交換条件を用いた濃縮の場合）、グリコシル化されており（たとえば、コムギ麦芽レクチンに結合する）、極めて大きい（たとえば、＞７００ｋＤａ；たとえば、ゲル濾過により決定した場合）。
【００６４】
【表１】
2004505608.tif 000002
＊＝開裂した基質（フィコモル）／分／μｌ
＊＊＝フィコモル／分／ｍｇ
【００６５】
ガンマ−セクレターゼの基質
本発明は、ガンマ−セクレターゼ活性を有するプロテアーゼによって開裂されることのできるガンマ−セクレターゼ基質（タンパク質およびタンパク質複合体である）を提供する。該基質は、ガンマ−セクレターゼ開裂配列で開裂されて適当な開裂産物を生成することができる。さらに、本発明は、本発明の基質および基質の開裂産物と反応しうる抗体（モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、または抗体フラグメント）を提供する。
【００６６】
ガンマ−セクレターゼ開裂配列
ガンマ−セクレターゼ開裂配列は、ガンマ−セクレターゼによって認識され開裂されるアミノ酸配列である。ガンマ−セクレターゼ開裂配列は、以前にβＡＰＰで同定されている（Ｈａａｓｓ， Ｃ．およびＳｅｌｋｏｅ， Ｄ． Ｊ． １９９３ Ｃｅｌｌ ７５： １０３９−１０４２で概説）（図４および配列番号１０）。ガンマ−セクレターゼ基質は、ガンマ−セクレターゼ活性を有するタンパク質またはタンパク質複合体によって認識および開裂されるガンマ−セクレターゼ開裂配列を含むタンパク質またはポリペプチドである。従って、ガンマ−セクレターゼ基質としては、βＡＰＰプレタンパク質の完全長配列（Ｋａｎｇ， Ｊ．ら、１９８７上掲）、成熟βＡＰＰタンパク質の完全長配列（Ｋａｎｇ， Ｊ．ら、１９８７上掲）、またはその断片が挙げられる。好ましい基質は、βＡＰＰの膜貫通ドメインを含む。たとえば、基質は、Ｃ１００ ＣＴＦやＣ８３ ＣＴＦ βＡＰＰ開裂産物などのように、膜貫通ドメインを含む完全長で成熟βＡＰＰタンパク質の断片であってよい。好ましい基質は、Ｃ８３ ＣＴＦなどのようにアルファ開裂βＡＰＰタンパク質を模倣したものである（図３）。あるいは、基質は、Ｃ１００ ＣＴＦなどのようにベータ開裂βＡＰＰタンパク質を模倣したものである（図２）。
【００６７】
さらに、ガンマ−セクレターゼは、ノッチやＡＰＬＰ１などの他の膜貫通タンパク質を開裂すると仮定されている。開裂は膜にわたっているドメインのうちの細胞質側の半分で起こり（Ｓｅｌｋｏｅ， Ｄ． Ｊ． １９９９ Ｎａｔｕｒｅ ３９９ （６７３８補遺）： Ａ２３−３１； Ｗａｎｇ， Ｒ．ら、１９９６ Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７１： ３１８９４−３１９０２； Ｓｃｈｒｏｅｔｅｒ， Ｅ． Ｈ．ら、１９９８ Ｎａｔｕｒｅ ３９３： ３８２−３８６）、不均一な開裂産物を生成する（Ｗａｎｇ， Ｒ．ら、１９９６上掲）。ガンマ−セクレターゼによる開裂のための基質の認識、およびおそらく利用可能性（ａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ）は、サイトゾル外膜フェース（ｅｘｔｒａ−ｃｙｔｏｓｏｌｉｃ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｆａｃｅ）の３０アミノ酸残基へのサイトゾル外ドメイン（ｅｘｔｒａ−ｃｙｔｏｓｏｌｉｃ ｄｏｍａｉｎｓ）の短縮に依存している（Ｂｒｏｗｎ， Ｍ． Ｓ．ら、Ｃｅｌｌ １００： ３９１−３９８； Ｍｕｍｍ， Ｊ． Ｓ．ら、２０００ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ ５： １９７−２０６）。
【００６８】
推定ガンマ−セクレターゼ開裂配列がノッチ−１タンパク質で同定されている（Ｓｃｈｒｏｅｔｅｒ， Ｅ． Ｈ．ら、１９９８ Ｎａｔｕｒｅ ３９３： ３８２−３８６）（図５および配列番号１１）。ガンマ−セクレターゼはまたＡＰＬＰ１タンパク質を開裂するとも仮定されている（Ｗａｓｃｏ， Ｗ．ら、１９９２上掲）。好ましいガンマ−セクレターゼ基質としては、ノッチ−１タンパク質の完全長配列（Ｓｃｈｒｏｅｔｅｒ， Ｅ． Ｈ．ら、１９９８上掲； Ｍｕｍｍ， Ｊ． Ｓ．ら、２０００ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ ５： １９７−２０６）、ＡＰＬＰ１タンパク質（Ｗａｓｃｏ， Ｗ．ら、１９９２上掲）、またはその断片が挙げられる。
【００６９】
基質の構造
ガンマ−セクレターゼ基質はまた、βＡＰＰ、ノッチ、またはＡＰＬＰ１などの基質に認められる天然のコンホメーションと類似または同一の構造に折り畳まれた膜貫通ドメインをも含む。天然のコンホメーションとは、天然に存在するタンパク質の折り畳まれた構造をいう。たとえば、膜内在タンパク質の天然のコンホメーションは、天然に存在する膜で認められるようなタンパク質の折り畳まれた構造である。同様に、膜内在タンパク質複合体の天然のコンホメーションは、天然に存在する膜で認められるようなタンパク質複合体の折り畳まれた構造である。
【００７０】
基質は、それを膜様の環境が取り囲むときに天然のコンホメーションに折り畳まれることができる。たとえば、膜様の環境は、膜画分、ミクロソーム、膜内在タンパク質を可溶化するのに用いた界面活性剤により提供することができる。従って、基質は、膜画分またはミクロソーム中のタンパク質成分として、または界面活性剤で可溶化した基質として単離することができる。好ましい基質は、ミクロソーム膜により取り囲まれたポリペプチドである。さらに好ましい基質は、界面活性剤で可溶化した形態で単離したポリペプチドである。
【００７１】
ガンマ−セクレターゼ基質の単離方法
ガンマ−セクレターゼ複合体によって開裂され得るポリペプチド基質は、様々な方法によって生成することができる。たとえば、基質は、組織試料や細胞培養液などの天然に存在する採取源からの膜画分の成分として単離することができる（Ｓｅｕｂｅｒｔ， Ｐ．上掲； Ｓｈｏｊｉ， Ｍ．上掲； Ｈａａｓｓ， Ｃ．上掲； Ｂｕｓｃｉｇｌｉｏ， Ｊ．上掲）。別法として、基質は、組換えＤＮＡ法（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、コールド・スプリング・ハーバー・プレス、Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ、ニューヨーク；およびＡｕｓｕｂｅｌ， Ｆ．ら、１９８９ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、ニューヨーク、ニューヨーク）を用い、βＡＰＰ（Ｈａａｓｓ， Ｃ．およびＳｅｌｋｏｅ， Ｄ． Ｊ． １９９３上掲）、ノッチ（Ｓｃｈｒｏｅｔｅｒ， Ｅ． Ｈ．ら、１９９８上掲）、またはＡＰＬＰ１（Ｋａｎｇ， Ｊ．ら、１９８７上掲； Ｗａｓｃｏ， Ｗ．ら、１９９２上掲）タンパク質またはポリペプチドをコードするヌクレオチド配列および宿主−ベクター系を用いて生成することができる。
【００７２】
基質はまた、ポリペプチドの合成の基礎としてβＡＰＰ、ノッチまたはＡＰＬＰ１のアミノ酸配列を用いて化学合成法（Ｄｕｇａｓ， Ｈ．およびＰｅｎｎｅｙ， Ｃ． １９８１、Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ｐｐ．５４−９２， Ｓｐｒｉｎｇ−Ｖｅｒｌａｇ、ニューヨーク）によっても生成することができる。基質はまた、インビトロでの転写−翻訳法（Ｐｅｌｈａｍ， Ｈ． Ｒ． Ｂ．およびＪａｃｋｓｏｎ， Ｒ． Ｊ． １９７６ Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ６７： ２４７； Ｋｒｉｅｇ， Ｐ．およびＭｅｌｔｏｎ， Ｄ １９８４ Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ． Ｒｅｓ． １２， ７０５７）によっても生成することができる。
【００７３】
好ましい基質は、ミクロソーム膜や膜様の環境（たとえば、可溶化した形態）を模倣する界面活性剤などの膜様の環境に取り囲まれた形態で生成される。さらに好ましい基質は、内生のガンマ−セクレターゼ活性を欠くミクロソーム膜の形態で生成される。たとえば、市販のイヌ膵臓ミクロソームは内生のガンマ−セクレターゼ活性を示さない（Ｐｒｏｍｅｇａ、マジソン、ウイスコンシン）。最も好ましい基質は、内生のガンマ−セクレターゼ活性を欠くミクロソーム膜から基質を可溶化する（たとえば、抽出する）ことにより生成される。
【００７４】
これら方法のいずれかにより生成した基質は、検出しうるマーカーで標識することができる。検出しうるマーカーの例としては、放射性同位体、蛍光化合物、生物発光化合物、化学ルミネセンス化合物、金属キレート化剤または酵素が挙げられるがこれらに限られるものではない。標識したポリペプチドおよびタンパク質を生成する方法は当該技術分野でよく知られている（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９上掲）。
【００７５】
基質をコードする組換え分子
基質は、基質またはその断片をコードする組換え分子（たとえば、ｒＤＮＡ）を用いて組換えＤＮＡ法により生成することができる。本明細書においてｒＤＮＡ分子とは、インビトロで分子操作に供したＤＮＡ分子をいう。ｒＤＮＡ分子を生成する方法は当該技術分野（たとえば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ （１９８９））でよく知られており、基質を生成するのに有用である。
【００７６】
本発明は、基質をコードするヌクレオチド配列を有する種々の核酸分子を提供する。基質を生成する好ましい方法は、ＢＡＰＰタンパク質の最後の１００のアミノ酸残基のＮ末端にインフレームで連結したβＡＰＰプレタンパク質からのシグナルペプチド（Ｋａｎｇ， Ｊ．ら、１９８７上掲）を含むβＡＰＰ基質（図１Ａおよび図２；配列番号１および２）をコードする核酸分子を用いる。この核酸分子は、Ｃ１００ Ｃ末端フラグメント（ＣＴＦ）を模倣するβＡＰＰ基質をコードする。
【００７７】
他の好ましい方法は、βＡＰＰタンパク質の最後の８３アミノ酸残基のＮ末端にインフレームで連結したβＡＰＰシグナルペプチドを含むβＡＰＰ基質（図１Ｂおよび図３；配列番号３および４）をコードする核酸分子を用いる。この核酸分子は、Ｃ−８３ ＣＴＦを模倣するβＡＰＰ基質をコードする。
【００７８】
基質配列を含むベクター
発現ベクターを用いて基質を生成することができる。たとえば、基質をコードするヌクレオチド配列を発現ベクターに作動可能に連結させて組換え発現ベクターを生成することができる。
ベクターとは、プラスミド、コスミド、およびファージミドをいうがこれらに限られるものではない。好ましいベクターとしては、適当な宿主細胞内でのベクターの複製を指令するレプリコンを含む自動複製ベクターが挙げられる。好ましいベクターはまた、プロモーター配列などの発現制御配列をも含み、該配列は作動可能に連結した基質配列の転写を可能とし、大腸菌などの適当な宿主細胞中での作動可能に連結した基質配列の発現を制御するのに用いることができる（たとえば、転写および／または翻訳）。
【００７９】
原核発現制御配列は当該技術分野で知られており、誘導性プロモーター、構成的プロモーター、分泌シグナル、エンハンサー、転写ターミネーター、および他の転写制御配列が挙げられるがこれらに限られるものではない。翻訳に関与する他の発現制御配列は当該技術分野で知られており、シャイン−ダルガノ配列、および開始コドンおよび終止コドンが挙げられるがこれらに限られるものではない。さらに、開始コドンは、挿入配列全体の転写を確実にすべく正しい読取り枠になければならない。外来の転写配列および開始コドンは、様々な由来であってよく、天然および合成のいずれであってもよい。発現の効率は、使用する細胞系に適したエンハンサーを含めることによって促進することができる（Ｓｃｈａｒｆ， Ｄ．ら、１９９４ Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｐｒｏｂｌ Ｃｅｌｌ Ｄｉｆｆｅｒ ２０： １２５−６２； Ｂｉｔｔｎｅｒら、１９８７ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ １５３： ５１６−５４４）。
【００８０】
好ましいベクターはまた、薬剤耐性、たとえばアンピシリン、テトラサイクリン、またはカナマイシンに対する耐性を付与する遺伝子産物をコードする少なくとも１つの選択マーカー遺伝子をも含む。典型的には、ベクターはまた、外来ＤＮＡ配列の都合のよい挿入を可能にするマルチプルエンドヌクレアーゼ制限部位をも含む。
【００８１】
好ましいベクターは、真核宿主細胞と適合する発現ベクターである。好ましいベクターは、精製した細菌またはバクテリオファージのＲＮＡポリメラーゼとの反応でのｍＲＮＡ転写物の産生のためのプロモーター配列要素を含む。真核細胞発現ベクターは当該技術分野でよく知られており、幾つかの市販のものから利用できる。そのようなベクターの典型的なものは、大腸菌で外来遺伝子を発現するのに用いるｐｃＤＮＡ３発現ベクターであり、ファージＴ７プロモーターを含み、アンピシリンおよびＧ４１８に対する耐性を付与する（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ、カールスバード、カリフォルニア）。他の例としては、容易に精製できる融合タンパク質の高レベルの発現を指令するベクターが挙げられる。そのようなベクターとしては、ＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）（基質コード配列をベクター中でアミノ末端のＭｅｔおよびそれに続くβ−ガラクトシダーゼの７残基の配列とインフレームでライゲートしてハイブリッドタンパク質が産生されるようにする）；ｐＩＮベクター（Ｖａｎ Ｈｅｅｋｅ ＆ Ｓｃｈｕｓｔｅｒ １９８９ Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２６４： ５５０３−５５０９）などの多機能性大腸菌クローニングおよび発現ベクターが挙げられるがこれらに限られるものではない。
【００８２】
ｐＧＥＸベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ、マジソン、ウイスコンシン）もまた、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）との融合タンパク質として外来ポリペプチドを発現するのに用いることができる。一般に、そのような融合タンパク質は可溶性であり、グルタチオン−アガロースビーズに吸着させた後、遊離のグルタチオンの存在下で溶出することにより溶解細胞から容易に精製することができる。そのような系で製造するタンパク質は、目的とするクローニングポリペプチドを随意にＧＳＴ残基から放出できるように、ヘパリン、トロンビンまたは第ＸＡ因子プロテアーゼ開裂部位を含ませるようにデザインする。
【００８３】
基質を生成するのに用いる宿主−ベクター系
宿主−ベクター系を用いて基質を生成することができる。宿主−ベクター系としては、基質をコードするヌクレオチド配列を含む組換えベクターを導入した適当な宿主細胞が挙げられる。宿主細胞は原核細胞であっても真核細胞であってもよい。たとえば、多くの市販の大腸菌株がとりわけ外来タンパク質の発現に有用である。適当な真核宿主細胞の例としては、酵母細胞、植物細胞、昆虫細胞、または哺乳動物細胞などの動物細胞が挙げられる。
【００８４】
さらに、宿主細胞株は、挿入した配列の発現を変調する能力または所望の仕方で発現タンパク質をプロセシングする能力により選択することができる。そのようなポリペプチドの修飾としては、アセチル化、カルボキシル化、グリコシル化、リン酸化、脂質付加（ｌｉｐｉｄａｔｉｏｎ）およびアシル化が挙げられるがこれらに限られるものではない。タンパク質の「プレプロ」形を開裂する翻訳後プロセシングもまた、正確な挿入、折り畳みおよび／または機能にとって重要である。様々な宿主細胞、たとえばＣＨＯ、ＨｅＬａ、ＭＤＣＫ、２９３、ＷＩ３８などが、そのような翻訳後の活性のための特別の細胞機構および特徴的なメカニズムを有しており、導入した外来タンパク質の正確な修飾およびプロセシングを確実にするために選択することができる。
【００８５】
組換えタンパク質の長期間の高収率産生のためには安定な発現が好ましい。たとえば、基質を安定に発現する細胞株は、ウイルスの複製起点または内生の発現配列および選択マーカー遺伝子を含む発現ベクターを用いて形質転換することができる。ベクターの導入後、選択培地に切り換える前に細胞を増殖培地で１〜２日増殖させる。選択マーカーの目的は選択に対する耐性を付与することであり、その存在は導入配列を首尾よく発現する細胞の増殖および回収を可能にする。安定に形質転換した細胞の耐性の凝集塊は、細胞型に適した組織培養法を用いて増殖させることができる。
【００８６】
組換えベクターの適当な細胞中への導入は、使用したベクターおよび用いた系の種類に典型的に依存したよく知られた方法により行うことができる。たとえば、エレクトロポレーションおよび塩処理法による原核宿主細胞の形質転換を典型的に用いる。たとえば、Ｃｏｈｅｎら、Ｐｒｏｃ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ （１９７２） ６９： ２１１０；およびＭａｎｉａｔｉｓら、（１９８９） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク）を参照。ｒＤＮＡを含むベクターでの脊椎動物細胞の形質転換、エレクトロポレーション、陽イオン性脂質または塩処理法を典型的に用いる（Ｇｒａｈａｍら、１９７３ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ５２： ４５６； Ｗｉｇｌｅｒら、１９７９ Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７６： １３７３−７６）。
【００８７】
組換えベクターを導入した宿主細胞はよく知られた方法により同定することができる。たとえば、本発明のｒＤＮＡの導入により得られる細胞をクローニングして単一のコロニーを産生することができる。これらコロニーからの細胞を回収し、溶解し、そのＤＮＡ含有物をＳｏｕｔｈｅｒｎ， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． （１９７５） ９８： ５０３またはＢｅｒｅｎｔら、Ｂｉｏｔｅｃｈ． （１９８５） ３： ２０８に記載された方法などを用いてｒＤＮＡの存在について調べるか、または該細胞から産生されるタンパク質を免疫学的方法によりアッセイすることができる。
【００８８】
いずれの選択系を用いても形質転換した細胞株を回収することができる。これらの選択系としては、これらに限られるものではないが、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子（Ｗｉｇｌｅｒ， Ｍ．ら、１９７７ Ｃｅｌｌ １１： ２２３−３２）およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子（Ｌｏｗｙ， Ｉ．ら、１９８０ Ｃｅｌｌ ２２： ８１７−２３）が挙げられ、それぞれｔｋ−マイナス細胞またはａｐｒｔ−マイナス細胞に用いることができる。また、代謝拮抗物質、抗生物質または除草剤耐性を選択の基礎に用いることができる；たとえば、メトトレキセートに対する耐性を付与するｄｈｆｒ（Ｗｉｇｌｅｒ， Ｍ．ら、１９８０ Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ７７： ３５６７−７０）；アミノグリコシドネオマイシンおよびＧ−４１８に対する耐性を付与するｎｐｔ（Ｃｏｌｂｅｒｅ−Ｇａｒａｐｉｎ， Ｆ．ら、１９８１ Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ １５０： １−１４）およびそれぞれクロルスルフロンおよびホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼに対する耐性を付与するａｌｓまたはｐａｔ。
【００８９】
さらなる選択遺伝子が記載されており、たとえば、細胞がトリプトファンの代わりにインドールを利用することを可能にするｔｒｐＢ、または細胞がヒスチジンの代わりにヒスチノールを利用することを可能にするｈｉｓＤがある（Ｈａｒｔｍａｎ， Ｓ． Ｃ．およびＲ． Ｃ． Ｍｕｌｌｉｇａｎ １９８８ Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ８５： ８０４７−５１）。最近、目に見えるマーカーが人気を博しており、アントシアニン、β−グルクロニダーゼおよびその基質であるＧＵＳ、およびルシフェラーゼおよびその基質であるルシフェリンなどのマーカーが、形質転換体を同定するのみならず特定のベクター系に基づく一過性のまたは安定なタンパク質発現の量を測定するためにも広く用いられている（Ｒｈｏｄｅｓ， Ｃ． Ａ．ら、１９９５ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ５５： １２１−１３１）。
【００９０】
酵母宿主細胞では、β−因子、アルコールオキシダーゼおよびＰＧＨなどの構成的または誘導性プロモーターを含む多くのベクターを用いることができる（Ａｕｓｕｂｅｌ， Ｆ．ら、１９８９、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、ニューヨーク、ニューヨーク； Ｇｒａｎｔら、１９８７ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １５３： ５１６−５４４）。
【００９１】
植物発現ベクターを用いる場合は、基質をコードする配列の発現は多くのプロモーターのいずれによっても行うことができる。たとえば、ＣａＭＶの３５Ｓおよび１９Ｓプロモーター（Ｂｒｉｓｓｏｎら、１９８４ Ｎａｔｕｒｅ ３１０： ５１１−５１４）などのウイルスプロモーターを単独で、またはＴＭＶからのオメガリーダー配列（Ｔａｋａｍａｔｓｕら、１９８７ ＥＭＢＯ Ｊ． ６： ３０７−３１１）と組み合わせて用いることができる。あるいは、ＲＵＢＩＳＣＯの小サブユニット（Ｃｏｒｕｚｚｉら、１９８４ ＥＭＢＯ Ｊ ３： １６７１−１６８０； Ｂｒｏｇｌｉｅら、１９８４ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２４： ８３８−８４３）または熱ショックタンパク質（Ｗｉｎｔｅｒ， Ｊ．およびＳｉｎｉｂａｌｄｉ， Ｒ． Ｍ． １９９１ Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｐｒｏｂｌ． Ｃｅｌｌ． Ｄｉｆｆｅｒ． １７： ８５−１０５）などの植物プロモーターを用いることができる。これらベクターの植物細胞中への導入は、直接ＤＮＡ形質転換または病原体を介したトランスフェクションにより行うことができる（Ｈｏｂｂｓ， Ｓ．， １９９２、ＭｃＧｒａｗ Ｙｅａｒｂｏｏｋ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、マックグロウヒル、ニューヨーク、ニューヨーク、ｐｐ１９１−１９６； ＷｅｉｓｓｂａｃｈおよびＷｅｉｓｓｂａｃｈ １９８８、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、アカデミックプレス、ニューヨーク、ニューヨーク、ｐｐ．４２１−４６３）。
【００９２】
基質を発現させるのに用いることができる他の発現系は昆虫系である。そのような系の一つでは、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ 核多角体病ウイルス（ＡｃＮＰＶ）を、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞中またはＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ幼生中で外来遺伝子を発現させるためのベクターとして用いる。基質コード配列はポリヘドリン遺伝子などのウイルスの非必須領域中にクローニングし、ポリヘドリンプロモーターの制御下に置く。基質配列の挿入が首尾よくいくとポリヘドリン遺伝子は不活化され、外殻タンパク質を欠く組換えウイルスを生成するであろう。ついで、この組換えウイルスを用いてＳ． ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞またはＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ幼生に感染させると該細胞または該幼生中で基質は発現される（Ｓｍｉｔｈら、１９８３ Ｊ Ｖｉｒｏｌ ４６： ５８４； Ｅｎｇｅｌｈａｒｄ， Ｅ． Ｋ．ら、１９９４ Ｐｒｏｃ Ｎａｔ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ９１： ３２２４−７）。
【００９３】
哺乳動物宿主細胞では多くのウイルスベースの発現系を用いることができる。アデノウイルスを発現ベクターとして用いる場合には、アデノウイルス後期プロモーター（たとえば、転写のため）および３分節リーダー配列（たとえば、翻訳のため）を含むアデノウイルスベクター中に基質コード配列を作動可能に連結する。ウイルスゲノムの非必須Ｅ１またはＥ３領域中への挿入は、感染した宿主細胞中で基質を発現できるウイルスという結果となるであろう（ＬｏｇａｎおよびＳｈｅｎｋ １９８４ Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ８１： ３６５５−５９）。さらに、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）エンハンサーなどの転写エンハンサーを用いて哺乳動物宿主細胞中での発現を増大させることができる。
【００９４】
基質を生成するための宿主−ベクター法
一般に、宿主／ベクター系を利用した基質の産生は、典型的に以下の工程を含む。まず、たとえば配列番号１または３に開示するポリヌクレオチド配列のうちのいずれかの一つのような基質をコードする核酸分子を得る。ついで、基質をコードする核酸分子を、好ましくは上記のような発現制御配列に作動可能に連結させて発現ベクター中に挿入し、基質コード配列を含む組換え発現ベクターを生成させる。ついで、標準的な形質転換法により発現ベクターを適当な宿主中に導入し、得られた形質転換宿主を基質のインビボでの産生を可能にする条件下で培養する。たとえば、基質配列の発現が誘導性プロモーターの制御下にある場合には、増殖条件は適当なインデューサーを含むであろう。組換えベクターは、基質配列を宿主ゲノム中に組み込むことができる。別法として、組換えベクターは、自己複製ベクターの一部として基質配列を染色体外にて保持することができる。かくして産生させた基質は、増殖培地または細胞から直接、単離する。不純物が許容し得る幾つかの場合にはタンパク質の回収および精製は必要でない。
【００９５】
当業者であれば容易に当該技術分野で知られた適当な宿主／発現系を基質コード配列に使用すべく適合させて基質を産生させることができる（Ｃｏｈｅｎら、１９７２ Ｐｒｏｃ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ６９： ２１１０；およびＭａｎｉａｔｉｓら、１９８９ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク）。種々のタンパク質精製法の例は、Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ （１９９６） ｐｐ ３９６， Ｍａｒｓｈａｋ， Ｄ． Ｒ．らに見出すことができる。
【００９６】
基質を生成するためのインビトロ転写−翻訳法
基質は、当該技術分野でよく知られた転写−翻訳法を用いてインビトロで生成することができる。たとえば、インビトロ翻訳法としては、ウサギ網状赤血球法（Ｐｅｌｈａｍ， Ｈ． Ｒ． Ｂ．およびＪａｃｋｓｏｎ， Ｒ． Ｊ． １９７６ Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ６７： ２４７）およびコムギ麦芽溶解法が挙げられる。一般に、網状赤血球法は、所望のタンパク質をコードするＲＮＡ鋳型を細胞の翻訳成分（たとえば、リボソームタンパク質、ｒＲＮＡ、およびｔＲＮＡ）およびアミノ酸と、該ＲＮＡ鋳型のコードタンパク質への翻訳を可能とする条件下で反応させることを含む。ＲＮＡ鋳型は、細胞または組織から単離したｍＲＮＡであってよい。ＲＮＡ鋳型はまた、ＳＰ６／Ｔ７転写プロモーターを用いたｐＧＥＭ系（Ｐｒｏｍｅｇａ、マジソン、ウイスコンシン）などのように、組換えＤＮＡ法を用いてＤＮＡ鋳型から生成することもできる。さらに、放射性標識した同位体などの検出しうるマーカーを翻訳反応に含ませて、放射性標識したタンパク質を生成させることができる。ウサギ網状赤血球またはコムギ麦芽から単離した種々のインビトロ翻訳系が市販されている（Ｐｒｏｍｅｇａ、マジソン、ウイスコンシン）。
【００９７】
別法として、基質はまた組み合わせた（ｃｏｕｐｌｅｄ）転写−翻訳系を用いても生成することができる。一般に、このような組み合わせた系は、所望のタンパク質をコードするＤＮＡ鋳型を転写成分および翻訳成分と、該ＤＮＡ鋳型のコードタンパク質への転写および翻訳を可能とする条件下で反応させることを含む。たとえば、ＴＮＴＴＭ系（Ｐｒｏｍｅｇａ、マジソン、ウイスコンシン）は、Ｔ３、Ｔ７、またはＳＰ６プロモーターなどの高度に特異的なＲＮＡポリメラーゼによって認識されるプロモーター配列を含むベクターを使用することを含む。所望のタンパク質をコードするＤＮＡ配列をプロモーターに作動可能に連結させて組換えベクターを生成することができ、この組換えベクターはＤＮＡ鋳型として作用する。このＤＮＡ鋳型を、転写および翻訳成分、たとえばＲＮＡポリメラーゼ、リボヌクレオチド、翻訳成分およびアミノ酸と反応させることができる。さらに、放射性標識した同位体などの検出しうるマーカーを翻訳反応中に含ませて放射性標識したタンパク質を生成させることができる。種々の組み合わせ系が市販されている（Ｐｒｏｍｅｇａ、マジソン、ウイスコンシン）。
【００９８】
ミクロソーム基質の生成方法
本発明は、ミクロソーム形態の基質を生成する方法を提供する。この方法は以下の工程を含む：（１）ガンマ−セクレターゼ開裂配列を含むポリペプチド基質をミクロソーム膜中に挿入することにより、ガンマ−セクレターゼによって開裂しうるポリペプチド基質を有するミクロソーム膜を生成する；ついで（２）ガンマ−セクレターゼによって開裂しうるポリペプチド基質を有するミクロソーム膜を単離する。
【００９９】
基質は、ミクロソーム膜の存在下で組み合わせ転写−翻訳法を行うことにより生成させることができる（Ｗａｌｔｅｒ， Ｐ．およびＢｌｏｂｅｌ， Ｇ． １９８３ Ｍｅｔｈ． Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ６５， ８５６）。組み合わせ転写−翻訳法は、ガンマ−セクレターゼ開裂配列を有するポリペプチドをコードする核酸分子（たとえば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）を用いて行うことができる。この手順の際に、翻訳された基質はミクロソーム膜中に挿入され折り畳まれて、ガンマ−セクレターゼによって認識および開裂され得るポリペプチド基質を有するミクロソーム膜を生成する。ミクロソーム膜の脂質二重層は、膜環境内で挿入タンパク質の折り畳みを可能にする膜環境を提供する。ミクロソーム膜を生成するための好ましい方法は、イヌ膵臓ミクロソーム（Ｐｒｏｍｅｇａ、マジソン、ウイスコンシン）などのように内生のガンマ−セクレターゼ活性を示さないミクロソーム膜を用いることを含む。
【０１００】
可溶化基質を生成する方法
本発明は、界面活性剤で可溶化した形態のガンマ−セクレターゼ基質を生成する方法を提供する。好ましい方法は、ガンマ−セクレターゼ開裂配列を有するポリペプチドを挿入したミクロソーム膜から可溶化基質を単離する。この方法の一般的工程は、（１）ミクロソーム膜からポリペプチド基質を可溶化する；ついで（２）ミクロソーム膜からガンマ−セクレターゼ基質を単離することを含む。
【０１０１】
ミクロソームからのポリペプチド基質の抽出は、Ｎ−［３［（ジメチルアミノ）プロピル］３，７，１２−トリヒドロキシ（３ａ，５ｂ，７ａ，１２ａ）コラン−２−アミド］およびＣＨＡＰＳＯＴＭを含む抽出溶液を用いて行うことができる。好ましい抽出溶液は、１部（容量／容量）のＮ−［３［（ジメチルアミノ）プロピル］３，７，１２−トリヒドロキシ（３ａ，５ｂ，７ａ，１２ａ）コラン−２−アミド］および２部のＣＨＡＰＳＯＴＭを含む。
【０１０２】
ガンマ−セクレターゼ活性を検出するための再構成法
単離した膜画分を用いた再構成法
本発明は、単離したガンマ−セクレターゼ基質の開裂方法を提供する。これは本明細書ではまた「再構成」法とも称し、単離したガンマ−セクレターゼ基質を開裂することによりガンマ−セクレターゼ活性を検出することを含む。本明細書において「再構成」法とは、単離した触媒性タンパク質（たとえば、プロテアーゼ）の機能的活性を試験するために該触媒性タンパク質を別途単離した基質と混合するアッセイをいう。一般的な再構成法は当該技術分野でよく知られている（Ｊａｃｋｓｏｎ， Ｒ． Ｃ．およびＢｌｏｂｅｌ， Ｇ． １９７７ Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １２： ５５０８； ＺｗｉｚｉｎｓｋｉおよびＷｉｃｋｎｅｒ １９８０ Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２５５： ７９７３）。
【０１０３】
たとえば、再構成系では、単離したプロテアーゼが単離した基質を開裂する能力を試験するため、該プロテアーゼと該基質とを混合する。単離したプロテアーゼは、ガンマ−セクレターゼタンパク質、ガンマ−セクレターゼタンパク質複合体、またはガンマ−セクレターゼ活性を含む膜画分であってよい。典型的に、再構成系は、触媒性タンパク質の機能的活性に適した条件下でインキュベートする。
【０１０４】
本発明の一つの態様において、本発明の単離したガンマ−セクレターゼ基質を本発明の単離したガンマ−セクレターゼタンパク質またはタンパク質複合体と接触させ、ついでガンマ−セクレターゼが該基質を開裂させる条件下でかくして接触させた基質をインキュベートする方法を提供する。基質の接触は、ｍＣＨＡＰＳＯを含む溶液中で行うことができる。好ましい反応溶液は、１部のｍＣＨＡＰＳＯおよび２部のＣＨＡＰＳＯＴＭを含む。
【０１０５】
他の態様において、本発明は、単離した膜画分中でガンマ−セクレターゼ活性を検出する再構成法を提供する。この方法は、単離した膜画分を（内生の基質（もし存在するなら）ではなく）別途単離したガンマ−セクレターゼ基質とともにインキュベートし、ついで該膜画分中のガンマ−セクレターゼ活性を有するタンパク質が該基質を開裂させる条件下で、接触した該膜画分をインキュベートすることを含む。ガンマ−開裂基質の検出は、検出しうるマーカーで標識した別途単離した基質を用いてアッセイの明確な解釈を可能とすることによって行うことができる。別法として、ガンマ−開裂基質はまた、開裂したガンマ−セクレターゼ基質で新たに生成する末端に対して反応性の抗体などの免疫検出法を用いて検出することができる。
【０１０６】
開裂産物の検出
本発明はまた、開裂産物の存在を検出することによって試料中のガンマ−セクレターゼ活性または目的とする単離タンパク質を検出する方法を提供する。ガンマ−セクレターゼ活性の結果生じる開裂産物は、免疫検出法を含む種々の方法を用いて検出することができる。たとえば、開裂産物は、ＡβペプチドのＮ末端またはＣ末端に特異的に反応する抗体を用いて免疫沈降させ、ついで標準ＳＤＳ／ＰＡＧＥゲル上で分離することができる（Ｃｉｔｒｏｎ， Ｍ．ら、１９９６ Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９３： １３１７０−１３１７５）。この方法の変法は、免疫沈降による種々のＡβペプチドの存在の検出およびＢｉｃｉｎｅ／Ｔｒｉｓ ＳＤＳ／尿素ゲル（Ｋｌａｆｋｉ， Ｈ． −Ｗ．ら、１９９６ Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７１： ２８６５５−２８６５９）または質量分析法（Ｗａｎｇ， Ｒ．ら、１９９６ Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ． ２７１： ３１８９４−９０２）による４０ペプチド形と４２ペプチド形との分離を同時に行うことを含む。他の方法はＥＬＩＳＡアッセイを含む（Ｗｏｌｆｅ， Ｍ． Ｓ．ら、１９９９ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３８： ４７２０−４７２７； Ｖａｓｓａｒ， Ｒ．ら、１９９９ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８６： ７３５−７４１）。
【０１０７】
別法として、基質を放射性標識などの検出しうるマーカーで標識し、開裂産物をゲル中で検出することができる。たとえば、適当なマーカーを３５Ｓ−Ｍｅｔ放射性標識で標識し、開裂産物を分離し、標準ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで検出することができる。
【０１０８】
開裂産物の量は、免疫学的方法、クロマトグラフィー法または電気泳動法を含む種々の方法により測定できる。再構成アッセイの結果得られた開裂産物の量は、特定のアッセイで使用したガンマ−セクレターゼ複合体が機能的に活性であるか、変異体であるか、あるいはガンマ−セクレターゼの活性を阻害する試薬によって阻害されているかを決定するのに用いることができる。たとえば、機能的に活性であることがわかっているガンマ−セクレターゼ複合体を用いた再構成アッセイで得られた開裂産物の量は、活性が未知のガンマ−セクレターゼ複合体用いた、あるいはガンマ−セクレターゼに対する未知の阻害作用を有する試薬と反応させたガンマ−セクレターゼ複合体を用いた実験的な再構成アッセイから得られた開裂産物の量と比較するための比較標準として用いることができる。開裂産物の欠失を示す、または比較標準アッセイにおける量と比べて開裂産物の量が検出しうるほどに低減している実験的な再構成アッセイは、該実験的アッセイが、機能的に低減した（ｒｅｄｕｃｅｄ−ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ）ガンマ−セクレターゼ、非機能的（ｎｏｎ−ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ）ガンマ−セクレターゼ、またはガンマ−セクレターゼ活性を阻害する試薬を含んでいることを示している。
【０１０９】
ガンマ−セクレターゼのインヒビターの同定方法
本発明の単離したガンマ−セクレターゼタンパク質（たとえば、膜中の、可溶化した、または種々の濃縮形態の複合体）は、ガンマ−セクレターゼに結合するおよび／またはガンマ−セクレターゼの活性に変化を引き起こす試薬を同定するスクリーニング戦略に有用である。たとえば、試薬はガンマ−セクレターゼを活性化あるいは阻害する。好ましい試薬はガンマ−セクレターゼ活性を阻害するであろう。これら試薬は、アルツハイマー病などのようなＡβペプチドの上昇レベルと関連した疾患を治療するうえで有用である。
【０１１０】
本発明の単離したガンマ−セクレターゼ複合体に結合する候補試薬を同定する一般的方法は以下の工程を含む。本発明のガンマ−セクレターゼを単離する；該ガンマ−セクレターゼを目的とする試薬と接触させる；ついで、該試薬がガンマ−セクレターゼを阻害するか否かを上記で述べた適当な手段により検出する。好ましい方法は、ｍＣＨＡＰＳＯを含む溶液の存在下でガンマ−セクレターゼを接触させることを含む。
【０１１１】
スクリーニングアッセイは、膜形態、可溶化形態、または種々の濃縮形態のいずれかにある単離したガンマ−セクレターゼ複合体を用い、上記で記載した再構成法と同様にして行うことができる。
候補試薬は、たとえばリガンドであってよく、これは典型的にポリペプチド、核酸分子、有機分子、ビタミン誘導体または金属である。当業者であれば本発明のスクリーニング法に用いる試薬の構造特性において何ら制約のないことが容易に認識できるであろう。該試薬は、合成したものであってもよいし、あるいは細胞構成成分のように天然に存在するものであってもよい。本発明の方法で試験する細胞抽出物は、たとえば、細胞または組織の水性抽出物、細胞または組織の有機抽出物または部分的に精製した細胞画分であってよい。
【０１１２】
ポリペプチド試薬は、当該技術分野で知られているように、標準的な固相または液相ペプチド合成法を用いて生成することができる。さらに、これらペプチドをコードする核酸分子は、標準的な組換えＤＮＡ法を用いて生成できるし、または市販のオリゴヌクレオチド合成装置を用いても合成できる。
抗体試薬は、ガンマ−セクレターゼ複合体の選択したドメインまたは領域に免疫反応することができる。一般に、抗体は、抗原性領域として該抗体の標的とされることを意図するガンマ−セクレターゼ複合体の部分を含むペプチドで適当な哺乳動物主体を免疫することにより得られる。
【０１１３】
本明細書において試薬は、該試薬が開裂産物のレベルを低減するなどによりガンマ−セクレターゼの活性を低減させるときにガンマ−セクレターゼの活性に拮抗するという。好ましいアンタゴニストは、ガンマ−セクレターゼの活性を５０％以上、好ましくは９０％以上低減させ、最も好ましくはすべての活性を排除するであろう。
本明細書において試薬は、該試薬が開裂産物のレベルを増大させるなどのようにガンマ−セクレターゼの活性を増大させるときにガンマ−セクレターゼの活性を増強させるという。
【０１１４】
ガンマ−セクレターゼ活性を有する膜画分の開裂活性を阻害する目的試薬を迅速に同定する方法
内生のガンマ−セクレターゼ複合体および内生の基質を含む単離した膜画分は、ガンマ−セクレターゼの活性を阻害する試薬をスクリーニングするための比較的迅速な方法に有用である。内生の基質の完全性を保持する単離した膜画分は知られている（Ｒｏｂｅｒｔｓ， Ｓ．ら、１９９４上掲）。たとえば、膜画分は、内生のガンマ−セクレターゼを発現するＨｅＬａ細胞およびβＡＰＰのスウェーデン変異体（「βＡＰＰＳＷ」）などの基質から調製できる。
【０１１５】
単離した膜は、ガンマ−セクレターゼの活性を阻害する候補試薬をスクリーニングするのに用いることができる。内生基質の開裂産物は、開裂産物のＮ末端またはＣ末端に特異的に結合する抗体を用いてモニターおよび検出できる。たとえば、ＡβペプチドのＮ末端領域に結合する抗体（たとえば、２６Ｄ６−Ｂ２−Ｂ３Ｒ、ＳＩＢＩＡ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ラジョラ、カリフォルニア）またはＣ末端領域に結合する抗体（たとえば、９Ｓ３．２Ｒ抗体、Ｂｉｏｓｏｌｕｔｉｏｎｓ、ニューアーク、デラウエア）は知られている。さらに、これら抗体は、１対の蛍光付加物であって、ＡβペプチドのＮ末端またはＣ末端または領域に結合した結果として該蛍光付加物が近接した位置に置かれたときに蛍光エネルギーを移動させるもので修飾することができる（図９）。蛍光の欠如は、ガンマ−セクレターゼ活性の阻害の結果として、開裂産物の不在を示す。
【０１１６】
本明細書において、本発明の「ガンマ−開裂βＡＰＰフラグメント」とは、ガンマ−セクレターゼによってそのガンマ−セクレターゼ開裂部位で開裂されたβＡＰＰまたはβＡＰＰフラグメントの幾つかのタイプのいずれか、すなわち、６ｋＤａ Ｃ末端フラグメント、ｐ３フラグメント、Ａβ−４０ペプチドおよびＡβ−４２ペプチドおよび大きなＮ末端産物をいう。たとえば、β−セクレターゼも開裂するかまたは存在する場合は、ガンマ−開裂βＡＰＰフラグメントはＡβ−４０ペプチドもしくはＡβ−４２ペプチドかまたは６ｋＤａ Ｃ末端フラグメントのいずれかである。もしもα−セクレターゼまたはβ−セクレターゼがガンマ−セクレターゼ活性の前提条件でないなら、ガンマ−開裂βＡＰＰフラグメントは６ｋＤａ Ｃ末端かまたはβＡＰＰのＮ末端からガンマ−セクレターゼ開裂部位にわたる大きなＮ末端産物（７７０形のβＡＰＰから開裂された場合には約１０５ｋＤａ）のいずれかである。さらに、本明細書において「未開裂βＡＰＰ」とは、ガンマ−セクレターゼによっては開裂されていないが、α−セクレターゼもしくはβ−セクレターゼによって、または同一の切断または他の手段によって開裂されているβＡＰＰまたはβＡＰＰフラグメントをいう。
【０１１７】
上記に記載したように、本発明の検出系はガンマ−セクレターゼ開裂の産物を検出するために１対の蛍光付加物を用いる。当業者によって認識されるように、これら蛍光付加物はそれぞれ、蛍光エネルギーを移動または受領しうる分子、および該分子をタンパク質またはペプチドに結合させる官能基を含む。本発明の目的のために使用できるよく知られた官能基としては、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、マレイミド−、ヨードアセトアミド−、またはブロモアセトアミド−官能基が挙げられるが、これらに限られるものではない。
【０１１８】
１対の蛍光付加物のうちの一方は、蛍光を与え、第二の分子に蛍光エネルギーを移動させることのできるドナー分子を含む。好ましくはドナー分子は永続する蛍光を有し、ランタニドのクリプテートまたはキレート、フルオレセイン、ＥＤＡＮＳ、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８Ｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、ユージーン、オレゴン）などのＮ−［６−アミノ−９−［２−カルボキシ−フェニル］−４，５−ジスルホキシ−３Ｈ−キサンテン−３−イリデン］アミニウムイオン（２−）の塩、Ｃｙ３Ｒ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｉｎｃ．、ピスカタウエイ、ニュージャージー）などの１−（イプシロン−カルボキシペンチル−１’−エチル−３，３，３’，３’−テトラメチルインドカルボシアニン−５，５’−ジスルホネートイオンの塩および当該技術分野で知られた他のドナー分子であってよい。好ましいドナー分子の化学構造を図１２に示してある。最も好ましくはドナー分子はユウロピウムクリプテートまたはキレートである。
【０１１９】
１対の蛍光付加物のうちの他の蛍光付加物は、ドナー分子からの蛍光エネルギーを受領するアクセプター分子を含む。好ましくはアクセプター分子自体は所定の波長（すなわち、ｘ１−ＡＰＣでは約６６５ｎｍ）で短期間の蛍光しか有しないが、ドナー分子から蛍光エネルギーを受領して増幅した蛍光シグナルを生成することができる。本明細書において増幅したシグナルとは、対合しないアクセプターに通常付随するシグナルに比べて一層長期間で一層大きな強度を有する蛍光シグナルをいい、アクセプターおよび／またはドナーの各種類に応じて変わる（Ｋｏｌｂら、１９９６， ”Ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｉｎ Ｈｉｇｈ Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ”， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ １： ２０３−２１０を参照）。
【０１２０】
本発明において使用できるアクセプター分子としては、アロフィコシアニンの誘導体、すなわちＸＬ６６５Ｒ（Ｐａｃｋａｒｄ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、メリデン、コネチカット）などの架橋アロフィコシアニン（「ｘｌ−ＡＰＣ」）、クマリン、ローダミン、テトラメチルローダミンまたはＣｙ５Ｒ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｉｎｃ．、ピスカタウエイ、ニュージャージー）などの１−（イプシロン−カルボキシペンチル−１’−エチル−３，３，３’，３’−テトラメチルインドジカルボシアニン−５，５’−ジスルホネートイオンの塩が挙げられるが、これらに限られるものではない。好ましいアクセプター分子の化学構造は図１３に示してある。当業者に知られた他のドナーおよびアクセプター分子は、Ｈａｕｇｌａｎｄ， Ｒ． Ｐ．， Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｂｅｓ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｃｈｅｍｉｃａｌｓ， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ Ｉｎｃ．、ユージーン、オレゴン（Ｈａｕｇｌａｎｄ編、第６版、１９９６）； Ｖａｎ Ｄｅｒ Ｍｅｅｒら、Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ Ｅｎｅｒｇｙ Ｔｒａｎｓｆｅｒ， Ｔｈｅｏｒｙ ａｎｄ Ｄａｔａ、ジョンウィリーアンドサンズ、ニューヨーク、ニューヨーク（１９９１）；およびＨｅｍｍｉｌａら、Ｂｉｏａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｌａｂｅｌｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ワラックオイ、ツルク、フィンランド（Ｈｅｍｍｉｌａ編、第２版、１９９４）に見出すことができる。
【０１２１】
互いに極めて近接して結合したときに、ドナー分子の励起はアクセプター分子へのエネルギーの検出しうる移動をもたらす。たとえば、励起したユウロピウムクリプテートはｘ１−ＡＰＣにエネルギーの直接移動をもたらし、かくして約６６５ｎｍにて増幅したシグナル（約６６０−６７０ｎｍで現れる）を生成する。ユウロピウムクリプテートは６６５ｎｍでは殆ど蛍光を放射しないので、６６５ｎｍ蛍光シグナルの検出および測定は、２つの蛍光分子が極めて近接しているときに無放射蛍光共鳴エネルギーがアクセプター分子ｘ１−ＡＰＣに移動したことを示している。さらに、ユウロピウムクリプテートは約６２０ｎｍで蛍光放射する（約６１５−６２５ｎｍで現れる）ので、６２０ｎｍ蛍光の測定は内部標準を提供する。測定した６２０ｎｍ蛍光に対する６６５ｎｍ蛍光の比は、２つの蛍光分子の近接度の指標として用いることができる。それゆえ、エネルギーの検出しうる移動は、対合していないときのアクセプターの波長からドナーの波長（ここでは６６５ｎｍから６２０ｎｍ）へのシグナルの比に比べた該比の変化により、または当業者に知られたこのシグナルの他のある種の標準化（ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ）により、アクセプター波長（ここでは約６６５ｎｍ）での増幅したシグナルによって表される。さらに、この標準化法はユウロピウムクリプテートとｘ１−ＡＰＣに限られるものではなく、近接結合を検出するための他の蛍光対、すなわち、フルオレセインとクマリン、Ｃｙ３ＲとＣｙ５Ｒ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ、ピスカタウエイ、ニュージャージー）またはフルオレセインとテトラメチルローダミンおよび当該技術分野でよく知られた他の蛍光対とともに用いることもできる。
【０１２２】
検出は、レーザー、キセノンフラッシュランプ、ジュウテリウム−タングステンランプまたは当該技術分野でよく知られた他のエネルギー源によるドナー分子の励起により行う。好ましい態様において、好ましい励起源はレーザーによるものである。とりわけ両付加物が同じフラグメントに極めて近接して結合している場合には、ドナー蛍光分子の励起はアクセプター分子への蛍光エネルギーの移動を引き起こし、かくしてアクセプターの放出波長（上記に記載したようにｘ１−ＡＰＣでは約６６５ｎｍ）での蛍光シグナルを生じる。逆に付加物が極めて近接していない（すなわち、未結合かまたは別のフラグメントに結合している）ときは、アクセプター分子からの増幅されたシグナルが殆どまたは全くないことによって、対合していないときのアクセプターの波長からドナーの波長へのシグナルの比に比べた該比が変化しないことによって、または当業者によく知られた他のある種の標準化によって示されるように、エネルギーの移動の実質的な低下をもたらす。
【０１２３】
別法として、アクセプター分子は、励起したドナー分子からの蛍光エネルギーを吸収することによりドナー蛍光シグナルを低減することのできる蛍光消光剤分子であってよい。蛍光消光剤分子はそれ自体は蛍光シグナルを生じることはなく、ドナー分子の蛍光エネルギーを熱または分子運動として消耗させるであろう。本発明において消光剤として用いることのできる蛍光アクセプターとしては、これらに限られるものではないが、ダブシル（ｄａｂｃｙｌ）、ＱＳＹ−７Ｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、ユージーン、オレゴン）やＢＨＱ−３Ｒ（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｉｎｃ．、ノバト、カリフォルニア）などの９−［２−［［４−カルボキシ−ピペリジン−１−イル］スルホニル］フェニル］−６−（Ｎ−メチル−Ｎ−フェニルアミノ）−３Ｈ−キサンテン−３−イリデン］−Ｎ−メチルベンゼンアミニウムイオンの塩が挙げられる。
【０１２４】
好ましい消光剤分子の幾つかの化学構造を図１３に示してある。当業者に知られた他の消光剤分子は、Ｈａｕｇｌａｎｄ， Ｒ． Ｐ．， Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｂｅｓ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｃｈｅｍｉｃａｌｓ， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ Ｉｎｃ．、ユージーン、オレゴン（Ｈａｕｇｌａｎｄ編、第６版、１９９６）； Ｖａｎ Ｄｅｒ Ｍｅｅｒら、Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ Ｅｎｅｒｇｙ Ｔｒａｎｓｆｅｒ， Ｔｈｅｏｒｙ ａｎｄ Ｄａｔａ、ジョンウィリーアンドサンズ、ニューヨーク、ニューヨーク（１９９１）；およびＨｅｍｍｉｌａら、Ｂｉｏａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｌａｂｅｌｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ワラックオイ、ツルク、フィンランド（Ｈｅｍｍｉｌａ編、第２版、１９９４）に見出すことができる。
【０１２５】
ｘ１−ＡＰＣなどの上記に記載したアクセプター分子とは対照的に、蛍光消光剤分子は同じフラグメント上に極めて近接して存在するときに励起したドナーからのエネルギーを吸収し、それ自体の蛍光シグナルは生じないであろう。それゆえ、極めて近接して存在するときにアクセプター分子が消光剤分子である場合のエネルギーの検出しうる移動は、対合しないときのドナーの蛍光シグナルに比べてドナーの蛍光シグナルが低減することによって示される。従って、極めて近接することなく、またアクセプター分子が消光剤である場合に、エネルギー移動の実質的な低下の検出は対合していないときのドナーの蛍光シグナルに比べてドナーによる蛍光シグナルの不変化をもたらす。
【０１２６】
両方の場合においてアクセプターはそれ自体のシグナルを生じない。ドナー分子と消光剤分子との好ましい対としては、ＥＤＡＮＳとダブシル、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８ＲとＱＳＹ−７Ｒ（ともにＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、ユージーン、オレゴンより入手可能）、およびＣｙ５Ｒ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ、ピスカタウエイ、ニュージャージー）とＢＨＱ−３Ｒ（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｉｎｃ．、ノバト、カリフォルニア）が挙げられるが、これらに限られるものではない。他のドナーとアクセプター（または消光剤）との対は、蛍光付加物の当業者による通常の実験によって見出すことができる。
【０１２７】
蛍光付加物によるガンマ−セクレターゼ開裂産物の結合または「標識」は、直接的、半直接的または間接的であってよい。たとえば、蛍光付加物の対は、未開裂βＡＰＰ、βＡＰＰフラグメントまたはガンマ−開裂βＡＰＰに直接結合させることができるし、または半直接的な場合は蛍光付加物の一方を抗体などの第二の分子に結合させるか、またはストレプトアビジン−ビオチン結合または当該技術分野でよく知られた他の結合法により結合させることができる。好ましくは結合は間接的なものであり、その際、各蛍光付加物を別々に抗体で修飾し、少なくとも一つの抗体がガンマ−開裂βＡＰＰフラグメント上のエピトープに特異的であって未開裂βＡＰＰまたは他の種類のガンマ−開裂βＡＰＰフラグメントとは実質的に交差反応しないものである。最も好ましくは、抗体はモノクローナル抗体であり、非交差反応エピトープはガンマ−開裂βＡＰＰのアミノ酸残基７１１かまたは７１３のいずれかでの（ガンマ−開裂βＡＰＰフラグメントがＡβであるときはアミノ酸残基４０または４２）ガンマ−セクレターゼの開裂部位である。
【０１２８】
下記にさらに詳細に記載するように、当業者はガンマ−開裂ペプチド上のいずれの所望の部位についても結合特異性を有するモノクローナル抗体を作製することが可能である。モノクローナル抗体を作製することができるということは、今度はどの部位に蛍光付加物が結合するかに関して柔軟性をもたらす。
【０１２９】
本発明の好ましい態様において、第一の蛍光付加物はガンマ−セクレターゼ開裂部位、すなわちガンマ−開裂βＡＰＰのアミノ酸残基７１１（Ａβ−４０の場合はアミノ酸残基４０）を含むカルボキシ末端でガンマ−開裂βＡＰＰフラグメントに特異的であり、最も好ましくは未開裂βＡＰＰまたは他の種類のガンマ−開裂βＡＰＰフラグメントと交差反応をしない。ガンマ−セクレターゼがアミノ酸残基７１３（Ａβ−４２の場合はアミノ酸残基４２）を開裂する場合は、第一の蛍光付加物はアミノ酸残基７１３を含むカルボキシ末端に結合し、未開裂のβＡＰＰまたは他の種類のガンマ−開裂βＡＰＰとは交差反応しない。第二の蛍光付加物は、同じガンマ−開裂βＡＰＰフラグメントのアミノ末端領域のアミノ酸１〜７０２の部分に結合する。最も好ましくは、第二の蛍光付加物は、Ａβのアミノ酸配列１−３１に対応するアミノ酸配列内でガンマ−開裂βＡＰＰに結合する（図４参照）。
【０１３０】
Ａβアミノ酸配列１−３１の対応位置は、ガンマ−開裂βＡＰＰフラグメントの性質に依存して変わるであろう：（１）ｐ３フラグメントではアミノ酸１−１５のみがＡβに対応する、（２）大きなＮ末端フラグメントでは、対応するアミノ酸配列は開裂したβＡＰＰ形態のサイズに依存して３つの位置のうちの１つであってよい（６９５形では対応アミノ酸配列は５９６−６２７；７５０形では対応配列はアミノ酸６５１−６８２；および７７０形ではアミノ酸６７１−７０２）、およびもちろん（３）Ａβペプチドでは対応するアミノ酸は１−３１である。好ましくは、第一の蛍光付加物の結合部位は第二の蛍光付加物の結合部位と交差反応しないかまたは重複しない。最も好ましくは、第一の蛍光付加物はドナー分子を含み、抗体で修飾されており、一方、第二の蛍光付加物はアクセプター分子を含み、第二の抗体で修飾されている。
【０１３１】
好ましい態様において、検出系は、まずβＡＰＰ基質で開裂反応を行うことにより行う。ガンマ−セクレターゼによる開裂は、下記実施例９に記載するように０℃から３７℃に温度をシフトすることにより開始する。基質の開裂後、好ましくはモノクローナル抗体で修飾した２つの蛍光付加物を反応液に加える。同じガンマ−開裂βＡＰＰフラグメントへの第一の蛍光付加物および第二の蛍光付加物の結合は、蛍光エネルギーの移動を可能にする。第一の蛍光付加物は、ガンマ−開裂βＡＰＰフラグメントのカルボキシ末端に結合し、未開裂のβＡＰＰまたは他の種類のガンマ−開裂βＡＰＰフラグメントなどの前駆体と実質的に交差反応しないのが好ましい。第二の蛍光付加物は、Ａβのアミノ酸配列１−３１に対応するアミノ酸配列内でガンマ−開裂βＡＰＰフラグメント、並びに同配列を含むいかなるβＡＰＰ前駆体または他の種類のガンマ−開裂βＡＰＰフラグメントに結合するであろう。
【０１３２】
エネルギーの検出しうる移動を生成し、それによって開裂を確認するには両方の蛍光付加物の結合が必要である。アクセプターがｘ１−ＡＰＣなどである場合は、エネルギーの検出しうる移動は６６５ｎｍでの増幅した蛍光シグナルによって示されるであろう。一方、アクセプターがダブシルなどの蛍光消光剤分子である場合は、エネルギーの検出しうる移動は対合していない状態に比べてドナー分子による蛍光シグナルが低下していることによって示されるであろう。
検出系の目的は、特定のガンマ−開裂βＡＰＰフラグメントの存在を未開裂のβＡＰＰまたは他の種類のガンマ−開裂βＡＰＰフラグメントから識別することである。検出法は均一であり、開裂産物を前駆体から分離および回収する工程が不要である。
【０１３３】
図９は、蛍光産物の対がユウロピウムクリプテートおよびｘ１−ＡＰＣを含む好ましい態様における検出系の原理の模式図である。βＡＰＰ融合タンパク質は細胞によって作られ、典型的には通常のプロセシングの際にβ−セクレターゼによって開裂される。βＡＰＰがガンマ−セクレターゼによって開裂されると、検出系は新たに生成した結合部位を第一の蛍光付加物のために利用する。一方、第二の蛍光付加物は、ガンマ−開裂βＡＰＰフラグメント（ここではＡβ）並びにα−セクレターゼ、β−セクレターゼかまたはガンマ−セクレターゼを問わずその結合部位を有する他のいずれのβＡＰＰフラグメントのアミノ末端領域に結合するかまたはすでに結合している。同じ開裂フラグメントへの両方の蛍光付加物の結合は、エネルギーの検出しうる移動をもたらす。
【０１３４】
本発明の最も好ましい態様において、一方の蛍光付加物はユウロピウムクリプテートを含み、ガンマ−開裂βＡＰＰフラグメントのカルボキシ末端に対し、すなわちアミノ酸残基７１１（Ａβではアミノ酸残基４０に対応）で特異的な抗体で修飾されている。アミノ酸残基７１１（Ａβアミノ酸４０）を含むエピトープに対する結合特異性を有する一つの抗体は、９Ｓ３．２抗体（Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ Ｃｏ．、プリンストン、ニュージャージーのためにＢｉｏｓｏｌｕｔｉｏｎｓ、ニューアーク、デラウエアにより調製された）である。これと対応して、最も好ましい態様の他の蛍光付加物はｘ１−ＡＰＣを含み、Ａβのアミノ酸配列１−３１に対応するアミノ末端領域内に結合する第二の抗体で修飾されている（図４参照）。Ａβアミノ酸配列１−１２に対応するエピトープに結合する抗体は２６Ｄ６−Ｂ２−Ｂ３であり、これはＳＩＢＩＡ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（ラジョラ、カリフォルニア）によって提供される。
【０１３５】
上記検出系は、ガンマ−セクレターゼ開裂を検出することに加えて、β−セクレターゼも開裂するかまたは存在する場合にＡβを検出するのにも応用できる。上記に記載したように、Ａβの検出は、Ａβのアミノ末端領域かまたはカルボキシ末端のいずれかにそれぞれ別々に結合する蛍光付加物の対を用いて行うことができる。たとえば、蛍光付加物の対が抗体９Ｓ３．２および２６Ｄ６−Ｂ２−Ｂ３で修飾された上記態様では、存在するいかなるＡβ−４０も検出されるであろう。最も好ましくは、それぞれの蛍光付加物がＡβのアミノ末端およびカルボキシ末端に別々に結合し、互いにまたは未開裂のβＡＰＰまたは他の種類のガンマ−開裂βＡＰＰフラグメントと実質的に交差反応しない。かくしてＡβの検出は、一方の蛍光付加物の励起が他方の蛍光付加物へのエネルギーの検出しうる移動をもたらすときに確認されるであろう。
【０１３６】
さらに、最も好ましい態様は、ガンマ−セクレターゼ開裂の結果得られるカルボキシ末端ではなくアミノ末端への特異的結合によってガンマ−セクレターゼ開裂を検出すべく改変することができる。たとえば、ガンマ−開裂βＡＰＰフラグメントのカルボキシ末端（典型的にＡβペプチドのカルボキシ末端に対応する）に結合させる代わりに、第一の蛍光付加物を６ｋＤフラグメントのアミノ末端に特異的に結合させ、未開裂のβＡＰＰまたは他の種類のガンマ−開裂βＡＰＰフラグメント（すなわち、この改変態様ではＡβ）と実質的に交差反応しないようにすることができる。この改変した形態の好ましい態様では、第二の蛍光付加物は６ｋＤフラグメントのカルボキシ末端領域に結合するであろう。この改変態様でのエネルギー移動の検出は６ｋＤフラグメントの存在を示しており、この６ｋＤフラグメントはα−セクレターゼまたはβ−セクレターゼもまた存在するか否かとは無関係にガンマ−セクレターゼ開裂の普遍的な産物である。
【０１３７】
検出系はさらに、ガンマ−セクレターゼのインヒビターをスクリーニングすべく改変することができる。被験化合物を開裂反応の開始前にアッセイウエルに入れ、該被験化合物がガンマ−セクレターゼを競合的に阻害し得るか否かを決定する。ついで、蛍光付加物の対を加えてガンマ−開裂βＡＰＰフラグメントの存在を決定する。蛍光付加物がカルボキシル末端およびアミノ酸末端領域に対する結合特異性を有する上記好ましい態様では、エネルギーの移動の実質的な低下はガンマ−セクレターゼの阻害によりβＡＰＰが開裂されなかったことを示すであろう。
【０１３８】
ガンマ−セクレターゼ開裂の検出のさらに別の態様として、蛍光付加物が別々の開裂産物に結合するものがある。この別の態様では、蛍光付加物はそれぞれ未開裂βＡＰＰ上のガンマ−セクレターゼ開裂部位の反対の部位に対応する別々のアミノ酸配列に結合する。たとえば、一方の蛍光付加物は未開裂βＡＰＰのカルボキシ末端領域に対応するアミノ酸配列にアミノ酸配列７２０−７７０にて、すなわち６ｋＤａフラグメントに結合する。他方の蛍光付加物は、未開裂βＡＰＰのアミノ末端領域に対応するガンマ−セクレターゼ開裂部位の他方の部位にアミノ酸配列６７１−７０２にて、すなわちＡβフラグメントまたはｐ３フラグメントに結合する。この別の態様では、少なくとも一方の蛍光付加物は、そのアミノ酸配列に未開裂βＡＰＰの他の部分と実質的に交差反応することなく結合するのが好ましい。ガンマ−セクレターゼ開裂が生じた場合は、蛍光付加物はそれぞれ別々のガンマ−開裂βＡＰＰフラグメント（すなわち６ｋＤａフラグメントおよびＡβフラグメント）に結合し、それゆえドナー分子が励起した際にエネルギー移動の実質的な低下という結果となるであろう。
【０１３９】
さらに、この別々の産物への結合という態様は、被験化合物を加えることによりガンマ−セクレターゼのインヒビターの検出のために適合させることができる。被験化合物をガンマ−セクレターゼと同時に加える場合は、蛍光エネルギーの移動の検出はガンマ−セクレターゼによる開裂の欠如、それゆえガンマ−セクレターゼのインヒビターの存在を示しているであろう。
【０１４０】
検出系は、上記で記載したような可溶化したガンマ−セクレターゼを含む試料、または適当に希釈した天然産物の試料で行うことができる。本発明では、βＡＰＰ基質の試料は、組織試料または細胞培養液から得られる膜画分中に認めることができる。これらの試料において、未開裂βＡＰＰ、βＡＰＰフラグメントおよびガンマ−セクレターゼ複合体は内生的に産生される。しかしながら上記でも記載したように、βＡＰＰ基質は、組換え宿主−ベクター系、インビトロ転写−翻訳、またはβＡＰＰアミノ酸配列の有機合成並びに当該技術分野でよく知られた他のあらゆる再現可能な方法を含む様々な採取源（これらに限られるものではない）から得ることができる。
【０１４１】
プレセニリンおよびガンマ−セクレターゼタンパク質に対して向けられた抗体の産生方法
ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、およびヒト化抗体などの抗体の産生方法はよく知られている（Ｈａｒｌｏｗ， １９８９， Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、コールドスプリングハーバープレス、ニューヨーク）。たとえば、本発明は、ＰＳ１やＰＳ２などのプレセニリンを認識および結合する抗体を提供する。さらに本発明は、ガンマ−セクレターゼタンパク質またはタンパク質複合体を認識および結合する抗体を提供する。
【０１４２】
好ましくは、抗プレセニリン抗体はＰＳ１またはＰＳ２に選択的に結合し、非プレセニリンタンパク質には結合しない（または弱く結合する）であろう。好ましい抗ガンマ−セクレターゼ抗体はガンマ−セクレターゼに選択的に結合し、非ガンマ−セクレターゼタンパク質には結合しないであろう。抗ＰＳ１抗体、抗ＰＳ２抗体または抗ガンマ−セクレターゼ抗体としては、モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体並びにこれら抗体の抗原結合ドメインおよび／または１またはそれ以上の補体決定（ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ）ドメインを含むそのフラグメント（たとえば、組換えタンパク質）が挙げられる。これら抗体は、いかなる採取源、たとえば、ウサギ、ラット、イヌ、ネコ、ブタ、ウマ、マウスおよびヒトからのものであってよい。
【０１４３】
これら抗体は、ＰＳ１、ＰＳ２、またはガンマ−セクレターゼタンパク質を特異的に認識する抗体フラグメントであってよい。本明細書において抗体フラグメントは、その標的に結合する免疫グロブリン分子の可変領域、すなわち抗原結合領域の少なくとも一部として定義される。免疫グロブリンの若干の定常領域も含まれていてよい。
【０１４４】
抗体を調製するための様々な方法が当該技術分野でよく知られている。たとえば、抗体は、単離した形態またはイムノコンジュゲートした形態の本発明のＰＳ１、ＰＳ２、または単離ガンマ−セクレターゼタンパク質、またはペプチド、またはフラグメントを用いて適当な哺乳動物宿主を免疫することにより調製できる（Ｈａｒｌｏｗ， １９８９， Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、コールドスプリングハーバープレス、ニューヨーク）。さらに、ＰＳ１またはＰＳ２の融合タンパク質、たとえばＰＳ１ ＧＳＴ−融合タンパク質を用いることもできる。ＰＳ１またはＰＳ２を発現または過剰発現する細胞も免疫に用いることができる。同様に、ＰＳ１またはＰＳ２を発現するように操作した細胞も用いることができる。この戦略は、内生のＰＳ１またはＰＳ２を認識する能力の促進されたモノクローナル抗体の産生という結果となる。
【０１４５】
抗体を産生するためのＰＳ１またはＰＳ２タンパク質の特異的な領域を選択するため、ＰＳ１（Ｓｈｅｒｒｉｎｇｔｏｎ， Ｒ．ら、１９９５ Ｎａｔｕｒｅ ３７５： ７５４−７６０）またはＰＳ２（Ｌｅｖｙ−Ｌａｈａｄ， Ｅ．ら、１９９５ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６９： ９７３−９７７）のアミノ酸配列を用いることができる。たとえば、ＰＳ１またはＰＳ２アミノ酸配列のハイドロフォビシティーおよびハイドロフィリシティー分析を用いてＰＳ１またはＰＳ２構造中の親水性領域を同定することができる。免疫原構造を示すＰＳ１またはＰＳ２タンパク質の領域並びに他の領域およびドメインを、テョウ−ファスマン（Ｃｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎ）、ガルニエ−ロブソン（Ｇａｒｎｉｅｒ−Ｒｏｂｓｏｎ）、カイト−ドゥーリットル（Ｋｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ）、アイゼンベルク（Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ）、カープラス−シュルツ（Ｋａｒｐｌｕｓ−Ｓｃｈｕｌｔｚ）またはジェームソン−ウルフ（Ｊａｍｅｓｏｎ−Ｗｏｌｆ）分析などの当該技術分野で知られた様々な他の方法を用いて容易に同定することができる。これら残基を含むフラグメントは、特定のクラスの抗ＰＳ１抗体を生成するのに特に適している。特に有用なフラグメントとしては、これらに限られるものではないが、配列ＣＲＤＳＨＬＧＰＨＲＳＴＰＥＳＲ−アミド（配列番号５）、ＣＧＨＰＥＰＬＳＮＧＲＰＱＧＮＳＲ−アミド（配列番号６）、およびノルロイシン−ＲＤＳＨＬＧＰＨＲＳＴＰＥＳＲ−アミド（配列番号９）が挙げられる。
【０１４６】
免疫原として使用するタンパク質の調製方法、およびＢＳＡ、ＫＬＨ、ＯＶＡまたは他の担体タンパク質などの担体とのタンパク質の免疫原コンジュゲートの調製方法は当該技術分野でよく知られている。幾つかの状況では、たとえばカルボジイミド試薬を用いた直接コンジュゲート法を用いることができる。他の場合には、Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ、ロックフォード、イリノイによって提供されるもののような連結試薬が有効である。ＰＳ１、ＰＳ２、またはガンマ−セクレターゼ免疫原の投与は、当該技術分野で一般に理解されているように、一般に適当な期間の注射により、適当なアジュバントを用いて行う。免疫スケジュールの間に、抗体生成の適切さ（ａｄｅｑｕａｃｙ）を抗体の力価を決定するのに採用することができる。
【０１４７】
このようにして産生したポリクローナル抗血清も幾つかの応用においては満足のいくものであるが、タンパク質の単離のためにはモノクローナル抗体調製物が好ましい。所望のモノクローナル抗体を分泌する不死化細胞株を、一般に知られているように、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎの標準法（Ｎａｔｕｒｅ ２５６： ４９５−４９７）またはリンパ球または脾臓細胞の不死化を行う改変法を用いて調製することができる。所望の抗体を分泌する不死化細胞株を、抗原がＰＳ１またはＰＳ２タンパク質またはフラグメント、または本発明のガンマ−セクレターゼタンパク質であるイムノアッセイによりスクリーニングする。所望の抗体を分泌する適当な不死化細胞培養液が同定されたら、細胞をインビトロで培養するかまたは腹水中で産生させることができる。
【０１４８】
ついで、所望のモノクローナル抗体を培養上澄み液かまたは腹水上澄み液から回収する。免疫学的に有意の部分（すなわち、ＰＳ１、ＰＳ２、またはガンマ−セクレターゼタンパク質を認識および結合する部分）を含む本発明のモノクローナル抗体またはポリクローナル抗血清のフラグメント（たとえば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖフラグメント、融合タンパク質）を、完全な抗体と同様にアンタゴニストとして用いることができる。
【０１４９】
Ｆａｂ、Ｆａｂ’、またはＦ（ａｂ’）２フラグメントなどの免疫学的に反応性のフラグメントの使用がしばしば好ましい。さらに、２またはそれ以上のエピトープに特異的な２特異的抗体を当該技術分野で一般に知られた方法を用いて生成することができる。ホモダイマー抗体もまた、当該技術分野で知られた架橋法（たとえば、Ｗｏｌｆｆら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５３： ２５６０−２５６５）により生成することができる。
抗体またはフラグメントはまた、最近の技術を用い、組換え手段により産生させることができる。ＰＳ１またはＰＳ２タンパク質の所望の領域に特異的に結合する領域もまた、複数種の起源のキメラ抗体またはＣＤＲグラフト抗体の関連で製造することができる。
【０１５０】
別法として、完全にヒトのモノクローナル抗体を産生する方法としては、ファージディスプレイ法およびトランスジェニック法が挙げられ、知られており、ヒトＭａｂの生成に用いることができる（概説としては、Ｖａｕｇｈａｎら、１９９８， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １６： ５３５−５３９を参照）。たとえば、完全にヒトの抗ＰＳ１抗体または抗ＰＳ２抗体は、大きなヒトＩｇ遺伝子コンビナトリアルライブラリー（すなわち、ファージディスプレイ）を用いたクローニング法を用いて生成することができる（ＧｒｉｆｆｉｔｈｓおよびＨｏｏｇｅｎｂｏｏｍ， Ｂｕｉｌｄｉｎｇ ａｎ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｉｍｍｕｎｅ ｓｙｓｔｅｍ： ｈｕｍａｎ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｆｒｏｍ ｐｈａｇｅ ｄｉｓｐｌａｙ ｌｉｂｒａｒｉｅｓ， Ｉｎ： Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ｆｏｒ Ｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｍａｎ、Ｃｌａｒｋ， Ｍ．（編）、ノッティンガムアカデミック、ｐｐ４５−６４ （１９９３）； ＢｕｒｔｏｎおよびＢａｒｂａｓ， Ｈｕｍａｎ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｆｒｏｍ ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ ｌｉｂｒａｒｉｅｓ、上掲、ｐｐ６５−８２）。
【０１５１】
完全にヒトの抗ＰＳ１または抗ＰＳ２モノクローナル抗体はまた、ＰＣＴ特許出願ＷＯ９８／２４８９３、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら、１９９７年１２月３日公開（Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ， １９９８， Ｅｘｐ． Ｏｐｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． Ｄｒｕｇｓ ７（４）： ６０７−６１４をも参照）に記載されているように、ヒト免疫グロブリン遺伝子座を含むように操作したトランスジェニックマウスを用いても産生できる。この方法は、ファージディスプレイ法で必要なインビトロ操作を必要とせず、高度に親和性の真正ヒト抗体を効率的に産生する。
【０１５２】
標的抗原に対する抗ＰＳ１または抗ＰＳ２モノクローナル抗体の反応性は、必要に応じてＰＳ１またはＰＳ２タンパク質、ペプチド、ＰＳ１発現細胞またはその抽出物を用い、ウエスタンブロット、免疫沈降、ＥＬＩＳＡ、およびＦＡＣＳ分析を含むよく知られた多くの手段により確立することができる。抗ＰＳ１または抗ＰＳ２モノクローナル抗体はまた、補体媒体腫瘍細胞溶解、抗体依存性細胞媒介細胞障害（ＡＤＣＣ）、抗体依存マクロファージ媒介細胞障害（ＡＤＭＭＣ）、腫瘍細胞増殖などを含む様々なインビトロアッセイで特徴付けることもできる。
【０１５３】
本発明の抗体またはフラグメントは、放射性同位体、蛍光化合物、生物発光化合物、化学ルミネセンス化合物、金属キレート化剤または酵素などの検出しうるマーカーで標識することができる。
以下の実施例は本発明を説明するため、および当業者が本発明を製造および使用するのを助けるために記載するものである。これら実施例は、いかなる意味においても本発明の範囲を制限することを意図するものではない。
【０１５４】
実施例１
以下に、放射性標識したβＡＰＰ−Ｃ１００またはβＡＰＰ−Ｃ８３ポリペプチド模倣物などのβＡＰＰ配列を有するガンマ−セクレターゼ基質を生成するのに用いる方法を記載する。実施例１、４、５、６および８に記載してあり本明細書で「ｍＣＨＡＰＳＯ界面活性剤溶液」と称する界面活性剤溶液は、１部のＮ−［３［（ジメチルアミノ）プロピル］３，７，１２−トリヒドロキシ（３ａ，５ｂ，７ａ，１２ａ）コラン−２−アミド］および２部のＣＨＡＰＳＯ（Ｐｉｅｒｃｅ、ロックフォード、イリノイ）を含む。
【０１５５】
ＢＡＰＰ基質をコードする組換えベクター
Ｃ１００ Ｃ末端フラグメントを模倣するヒトβＡＰＰ−Ｃ１００ポリペプチドをコードする組換えベクター（図１Ａおよび図２）としてはｐｃＤＮＡ３ベクター（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ、カールスバード、カリフォルニア）が挙げられ、これはファージＴ７プロモーター、ヒトβＡＰＰ（ジーンバンクＹ００２６４）のヌクレオチド１９３６〜２２３５に直接連結した、ＡＰＰシグナル配列と成熟ＡＰＰのアミノ末端ロイシンとをコードするＤＮＡ（ＡＰＰのヌクレオチド１−５４；ジーンバンクＩＤ Ｙ００２６４；Ｋａｎｇ， Ｊ．ら、１９８７ Ｎａｔｕｒｅ ３２５： ７３３−７３６）を有している。この組換えヌクレオチド配列は、１１ｋＤａポリペプチドとして検出しうるＣ−１００ポリペプチド模倣物をコードしている。そのヌクレオチド配列は図２および配列番号１に記載してあり、コードされるアミノ酸配列は配列番号２に記載してある。
【０１５６】
ヒトβＡＰＰ−Ｃ８３ポリペプチド模倣物をコードする組換えベクター（図１Ｂおよび図３）としてはｐｃＤＮＡ３ベクターが挙げられ、これはファージＴ７プロモーター、配列ＣＴＧＧＡＴＧＣＡＧＡＡＴＴＣ（これはヒトβＡＰＰ（ジーンバンクＹ００２６４）のヌクレオチド１９８７−２２６７に直接連結している）に連結したβＡＰＰシグナル配列をコードするＤＮＡを含んでいる。この組換えヌクレオチド配列は、９ｋＤａであるＣ−８３ポリペプチド模倣物をコードしている。そのヌクレオチド配列は図３および配列番号３に記載してあり、コードされるアミノ酸配列は配列番号４に記載してある。
【０１５７】
ミクロソーム中へのポリペプチド模倣物のインビトロ転写および同時翻訳挿入
ミクロソーム（たとえば、ミクロソーム基質）中に挿入した放射性標識したβＡＰＰ−１００およびβＡＰＰ−Ｃ８３ポリペプチドを、ＴｎＴＴＭカップルド・レティキュロサイト・ライセート・システム（カタログ＃Ｌ４６１０；Ｐｒｏｍｅｇａ、マジソン、ウイスコンシン）および３５Ｓ−メチオニン（ＮＥＮ、ボストン、マサチューセッツ）を用いて製造業者の指示に従い、組み合わせ転写−翻訳法により製造した。放射性標識したβＡＰＰ−Ｃ１００およびβＡＰＰ−Ｃ８３ポリペプチドのミクロソーム膜中への同時翻訳挿入を、製造業者の指示に従ってライセートシステムにイヌ膵臓ミクロソーム膜（カタログ＃：Ｙ４０４１；Ｐｒｏｍｅｇａ、マジソン、ウイスコンシン）を５８単位（膜）／４００μｌ（反応液）にて補充することにより行った。
【０１５８】
簡単に説明すると、６００μｌの網状赤血球溶解液、４８μｌの反応混合液、２４μｌのＴ７ＲＮＡポリメラーゼ、および２４μｌのメチオニン以外のアミノ酸混合液（以上、Ｐｒｏｍｅｇａ ＴｎＴＴＭカップルド・レティキュロサイト・トランスレーション・キット）を、２４μｌのＲＮＡｓｉｎＴＭ（Ｐｒｏｍｅｇａ、マジソン、ウイスコンシン）および１００μｌの３５Ｓ−メチオニンと混合した。全部で４８μｇのβＡＰＰ−Ｃ１００かまたはβＡＰＰ−Ｃ８３のベクターＤＮＡを加え、ついで穏やかなピペッティングによって二重蒸留（ｄｏｕｂｌｅ ｄｉｓｔｉｌｌｅｄ）水を混合することにより容量を１１００μｌとした。ミクロソーム（１７２単位、典型的に〜９０μｌ）を加え、反応液をもう一度穏やかに混合し、ついで３０℃に７５分間置いた。管を氷上に置いて反応を停止させた。
【０１５９】
ミクロソーム基質の単離
０．４ｍｌの転写−翻訳液を氷冷高塩ショ糖（０．５Ｍ ＮａＣｌ、０．５Ｍ ショ糖、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、０．５μＭ ｏ−フェナントロリン、１２＆μｇ／ｍｌのロイペプチン）の１．４ｍｌクッション上に重層することによりミクロソーム膜を単離した。ミクロソーム膜を４℃で１０分間、１００，０００ｒｐｍ（Ｂｅｃｋｍａｎ ＴＬＡ １００．３ローター）で遠心分離して回収した。ミクロソーム膜のペレットを再懸濁することなく１５０μｌの冷低塩緩衝液（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、０．５μＭ ｏ−フェナントロリン、１２μｇ／ｍｌのロイペプチン）で濯ぎ、濯いだ緩衝液を捨てた。ペレットは、放射性標識したβＡＰＰ−Ｃ１００またはβＡＰＰ−Ｃ８３ポリペプチドが挿入された単離ミクロソーム（たとえば、ミクロソーム基質）を含んでいた。
【０１６０】
ミクロソーム基質からのポリペプチドの可溶化
放射性標識したβＡＰＰ−Ｃ１００およびβＡＰＰ−Ｃ８３ポリペプチド模倣物を、「ｍＣＨＡＰＳＯ界面活性剤溶液」（１部のＮ−［３［（ジメチルアミノ）プロピル］３，７，１２−トリヒドロキシ（３ａ，５ｂ，７ａ，１２ａ）コラン−２−アミド］および２部のＣＨＡＰＳＯ（Ｐｉｅｒｃｅ、ロックフォード、イリノイ）を含む）を含む界面活性剤溶液を用いて界面活性剤可溶形態のミクロソームから抽出した。
【０１６１】
ペレットとして回収したミクロソーム基質を１０５μｌのミクロソーム抽出緩衝液（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、０．５％ｍＣＨＡＰＳＯ界面活性剤溶液、１０％グリセリン、１ｍＭエチレンジアミン四酢酸、１ｍＭジチオトレイトール、４μｇ／ｍｌロイペプチン）中に再懸濁して、可溶化した３５Ｓ標識したβＡＰＰ−Ｃ１００またはβＡＰＰ−Ｃ８３ポリペプチドを得た。これら可溶化ポリペプチドを基質として用いた。可溶化した放射性標識βＡＰＰポリペプチドのアリコート（２５μｌ）を液体窒素中でフラッシュ凍結し、使用のときまで−８０℃で貯蔵した。
【０１６２】
実施例２
以下に、膜画分（膜二重層内に埋め込まれた膜内在タンパク質を含む）を単離するのに用いた方法を記載する。
細胞の回収
スピナー増殖させたＨｅＬａ細胞を１リットル容器を１８００ｒｐｍ×１５分×４℃にて遠心分離することにより回収した。収量は１リットル当たり約１ｍｌの細胞ペレットであった。この細胞を５０×のペレット容量を用いて氷冷ＰＢＳ（カタログ＃：１４１９０；Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ゲイサーズバーグ、メリーランド）中に浮遊させた。この浮遊細胞を２５０ｍｌ容の円錐容器に移し、４℃にて１０００×Ｇで１０分間遠心分離した（Ｊｏｕａｎ ＧＲ ４−２２低速遠心管）。細胞ペレットをＰＢＳ中に再浮遊させ、遠心分離工程を繰り返した。
【０１６３】
細胞の溶解
ペレットの容量を測定し、２×ペレット容量のＨＢ低張溶解緩衝液（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、１０ｍＭ ＫＣｌ、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２）を加え、細胞を注意深く再浮遊させて洗浄した。使用の直前に０．５ｍＭ ＤＴＴ、０．５ｍＭ ＰＭＳＦまたはペファブロック（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ、インディアナポリス、インディアナ）を加えた。細胞を４℃にて１０００×Ｇで１０分間遠心分離にかけた（Ｊｏｕａｎ ＧＲ ４−２２低速）。上澄み液を注意深く除去し、細胞ペレットを氷上で１０分間インキュベートして細胞を膨潤させた。細胞をダウンスホモジナイザーを用いて破砕した。
【０１６４】
簡単に説明すると、２０ｍｌの細胞浮遊液を大きなダウンスホモジナイザーに加え、「Ｂ」乳棒を１５回上下往復させてホモジナイズした。ついで、２０ｍｌのＨＢ低張溶解緩衝液をさらに加え、乳棒を５回上下往復させて混合した。ホモジネートを４℃にて１０００×Ｇで１０分間遠心分離した。上澄み液を新たな管に移し、直ちに１１％上澄み容量の氷冷１０×トリス緩衝食塩水（２００ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１．３Ｍ ＮａＣｌ）を加えた。ペレットを１容量のＨＢ低張溶解緩衝液（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、１０ｍＭ ＫＣｌ、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２）に再浮遊させ、細胞を膨潤させ、ホモジネートおよび遠心分離工程を繰り返した。上澄み液をコンバインし、４℃にて１０００×Ｇで１０分間、再度遠心分離にかけた。
【０１６５】
膜画分の回収
上記ホモジナイゼーション工程で得られた上澄み液を４℃にて２０００×Ｇで１０分間遠心分離にかけた（Ｊｏｕａｎ）。ペレットを捨てた。上澄み液を残した；これが「２Ｋ上澄み液」である。この２Ｋ上澄み液を１２，０００×Ｇで遠心分離（１０，０００ｒｐｍ（Ｓｏｒｖａｌｌ ＳＳ−３４））して膜画分を回収した（たとえば、ペレットは膜画分を含む）。上澄み液を除去し、捨てた。ペレットを残した；これが「１２Ｋ膜」である。この１２Ｋ膜を２０％グリセリン、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（１ペレット容量）中に再懸濁させた。膜画分を小さなアリコートにてフラッシュ凍結し、−８０℃にて貯蔵した。
【０１６６】
実施例３
以下に、膜画分の大スケール洗浄に用いた方法を記載する。この方法を用いて膜（塩除去およびアルカリ除去する）を調製した。
洗浄膜画分の調製
膜洗浄手順の全工程において氷冷した管および緩衝液を用いた。
ＨｅＬａ細胞膜画分（たとえば、実施例２）のタンパク質濃度を、ＢＣＡＴＭタンパク質アッセイ試薬（Ｐｉｅｒｃｅ、ロックフォード、イリノイ）を用いて製造業者の指示に従って決定した。濃度は７〜１２ｍｇ／ｍｌの範囲であった。膜のアリコート（２８ｍｌを複数使用）を１０容量の高ＥＤＴＡ緩衝液（１５ｍＭ ＥＤＴＡ、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、０．０５Ｍ ＫＣｌ、１０％グリセリン、１ｍＭジチオトレイトール、０．１ｍＭペファブロック）に加えた。ときどき攪拌しながら膜を氷上で１５分間インキュベートした。膜をスーパーライトＧＳＡローター（ＳＬ−１５００）で４℃にて１３，０００ｒｐｍで３０分間遠心分離して回収した。上澄み液を除去した。ガラス棒を用いてペレットを１０容量の高塩緩衝液（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、１Ｍ ＮａＣｌ、１０％グリセリン、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭジチオトレイトール、４μｇ／ｍｌロイペプチン）中に再懸濁した。
【０１６７】
上下にピペッティングするとともにときどき攪拌しながら氷上で１５分間インキュベートすることによって膜を穏やかに混合した。膜を上記遠心分離により回収した。上澄み液を除去した。ガラス棒を用いてペレットを２１ｍｌの無塩緩衝液（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、１０％グリセリン、１ｍＭ ＥＤＴＡ酸、１ｍＭジチオトレイトール、４μｇ／ｍｌロイペプチン）中に再懸濁させた。次の工程は炭酸塩洗浄を記載する：１２容量（たとえば、２５２ｍｌ）の氷冷０．１Ｍ Ｎａ２ＣＯ３、ｐＨ１１．５を加えた；懸濁液を冷室中、ニューテーター（ｎｕｔａｔｏｒ）で３０分間振動させた；懸濁液を上記遠心分離にかけた。上澄み液を除去した。ガラス棒を用いてペレットを１０容量の無塩緩衝液中に再懸濁させ、穏やかに混合し、上記遠心分離にかけた。上澄み液を除去した。得られたペレットには洗浄した膜画分（たとえば、単離し洗浄した膜画分）が含まれており、該膜画分は脂質二重層中に埋め込まれた膜内在タンパク質を含んでいる。
【０１６８】
実施例４
以下に、洗浄した膜画分から膜内在タンパク質およびタンパク質複合体を抽出するのに用いた方法を記載する。抽出した膜内在タンパク質およびタンパク質複合体は、界面活性剤で可溶化された形態で単離される。
可溶化したタンパク質およびタンパク質複合体の調製
洗浄した膜ペレット（たとえば、実施例３）を、実施例３で決定したように、膜画分中のタンパク質の最初の濃度に基づいて７〜８ｍｇ／ｍｌの濃度にて抽出緩衝液（２０ｍＭビス／トリス、ｐＨ７．１、０．５％ｍＣＨＡＰＳＯ界面活性剤溶液、１０％グリセリン、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭジチオトレイトール、４μｇ／ｍｌロイペプチン）中に再懸濁した。
【０１６９】
再懸濁したペレットをときどき混合しながらゆっくりと攪拌することによって氷上で４５分間インキュベートし、ついで４℃にてＢｅｃｋｍａｎ ＴＬＡ−１００．３ローターで５０，０００ｒｐｍにて４５分間遠心分離にかけて未抽出のタンパク質およびタンパク質複合体をペレット化した。上澄み液は界面活性剤で可溶化した形態にて膜から抽出した膜内在タンパク質を含むので、残した。可溶化した膜内在タンパク質のアリコートを前もって冷却した管（〜１０ｍｌ／管）に入れ、液体窒素中で急速凍結し、ついで−８０℃で貯蔵した。この可溶性調製物のタンパク質濃度は０．５〜１ｍｇ／ｍｌであった。
【０１７０】
実施例５
以下に、可溶化したタンパク質およびタンパク質複合体の調製物をガンマ−セクレターゼ複合体についてイムノアフィニティー濃縮するのに用いた方法を記載する。
ガンマ−セクレターゼ複合体のイムノアフィニティー濃縮
可溶化した膜内在タンパク質およびタンパク質複合体の調製物（たとえば、実施例４）を、抽出緩衝液（２０ｍＭビス／トリス、ｐＨ７．１；１部のｍＣＨＡＰＳＯおよび２部のＣＨＡＰＳＯＴＭからなる０．５％ｍＣＨＡＰＳＯ界面活性剤溶液；１０％グリセリン；１ｍＭ ＥＤＴＡ；１ｍＭジチオトレイトール；および４μｇ／ｍｌロイペプチン）で平衡化した抗ＰＳ１アフィニティーカラム（たとえば、実施例８および９）上に吸着させた。吸着（たとえば、結合）は４℃で行った。
【０１７１】
カラムを少なくとも２０容量のＰＢＳと０．５％ＣＨＡＰＳＯＴＭとで洗浄した。カラムを０．１Ｍグリセリン、ｐＨ２．５と０．５％ＣＨＡＰＳＯＴＭおよび１０％グリセリンとで４℃にて溶出した。溶出した画分（１カラム容量）を直ちに０．１５Ｍトリス／Ｃｌ、ｐＨ８（０．１カラム容量）で中和した。投入した抽出物、フロースルー画分、および溶出画分を実施例７に記載のゲルシステムを用いてガンマ−セクレターゼ活性についてアッセイした。投入したガンマ−セクレターゼ活性はいずれも抗体カラムを通り抜けることはなかった。一般に、投入活性の３０％が溶出画分で回収された。
抗ＰＳ１抗体ＪＨ２またはＪＨ５を結合したマトリックスを有するアフィニティーカラムは、ＨｅＬａ膜抽出物からガンマ−セクレターゼ活性を部分的に奪った。これら２つの抗体の組み合わせは、可溶化ガンマ−セクレターゼ複合体を含有する試料からガンマ−セクレターゼ活性を完全に除去した。
【０１７２】
幾つかの実験では、膜内在タンパク質およびタンパク質複合体の調製物をＰＳ１アフィニティーカラムに吸着させる前に、該調製物をモノＳ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）陽イオン交換クロマトグラフィーに負荷し、ついでＤＥＡＥセファロースファーストフロー（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）陰イオン交換クロマトグラフィーを行い、ついでコムギ麦芽アグルチニンアガロース上でアフィニティー精製した。この濃縮物質の吸着は、コムギ麦芽アグルチニン（ＷＧＡ）溶出緩衝液（２０ｍＭトリス／Ｃｌ、ｐＨ７．７；０．５％ｍＣＨＡＰＳＯ界面活性剤溶液；０．１Ｍ ＮａＣｌ；３０％グリセリン；０．５Ｍ Ｎ−アセチルグルコサミン；０．１３ｍＭペファブロック；および４μｇ／ｍｌロイペプチン）で行った。
【０１７３】
実施例６
以下に、放射性標識したβＡＰＰポリペプチド模倣物（たとえば、ガンマ−セクレターゼ基質）を、（１）洗浄した膜画分（たとえば、実施例３）；（２）可溶化したタンパク質およびタンパク質複合体（たとえば、実施例４）；または（３）アフィニティー濃縮したガンマ−セクレターゼ複合体（たとえば、実施例５）と反応させる３つの異なる再構成方法を記載する。
【０１７４】
洗浄した膜画分を用いた再構成法
洗浄した膜画分（たとえば、実施例３）を低塩緩衝液（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、１２μｇ／ｍｌロイペプチン、０．５μＭ ｏ−フェナントロリン）中に再懸濁させた。２μｌの洗浄した膜を１６μｌのガンマ−セクレターゼ反応緩衝液（４０％グリセリン、０．５％ｍＣＨＡＰＳＯ界面活性剤溶液、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５）に氷上で加え、ついで２μｌの可溶化した放射性標識βＡＰＰ−Ｃ１００（実施例１）を加えてガンマ−セクレターゼ反応混合液の最終容量を２０μｌとした。別法として、５μｌの洗浄した膜を１３μｌのガンマ−セクレターゼ開裂反応混合液に氷上にて加え、ついで２μｌの可溶化した放射性標識βＡＰＰ−Ｃ１００ポリペプチド模倣物を加えてガンマ−セクレターゼ反応混合液の最終容量を２０μｌとした。
【０１７５】
ガンマ−セクレターゼ反応混合液を３７℃に２０分間置くことにより開裂反応を開始した。開裂反応の停止は反応管を氷上に置くことにより行った。８μｌの４×ＮｕＰａｇｅ試料緩衝液（Ｎｏｖｅｘ、サンジエゴ、カリフォルニア）を加え、９５℃にて５分間インキュベートすることにより、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析用に開裂反応液の試料を調製した。ガンマ−セクレターゼ開裂産物の存在は、下記実施例７に記載するようにＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを行うことによって検出した。
【０１７６】
可溶化したタンパク質／複合体を用いた再構成法
２μｌの可溶化したタンパク質および複合体（実施例４）を１６μｌのガンマ−セクレターゼ反応緩衝液（４０％グリセリン、０．５％ｍＣＨＡＰＳＯ界面活性剤溶液、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５）に氷上にて加え、ついで２μｌの可溶化した放射性標識βＡＰＰ−Ｃ１００ポリペプチド（実施例１）を加えてガンマ−セクレターゼ反応混合液の最終容量を２０μｌとした。
【０１７７】
別法として、５μｌの可溶化したタンパク質を１３μｌのガンマ−セクレターゼ開裂反応混合液に氷上にて加え、ついで２μｌの可溶化した放射性標識βＡＰＰ−Ｃ１００ポリペプチド模倣物を加えてガンマ−セクレターゼ反応混合液の最終容量を２０μｌとした。ガンマ−セクレターゼ反応混合液を３７℃に２０分間置くことにより開裂反応を開始した。開裂反応の停止は、ガンマ−セクレターゼ反応混合液を氷上に置き、ついで８μｌの４×ＳＤＳ−ＰＡＧＥ試料緩衝液（Ｎｏｖｅｘ、サンジエゴ、カリフォルニア）を加えることにより行った。ゲル電気泳動の前に試料を９５℃に５分間加熱した。ガンマ−セクレターゼ開裂産物の存在は、下記実施例７に記載するようにＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを行うことによって検出した。
【０１７８】
アフィニティー濃縮したガンマ−セクレターゼ複合体を用いた再構成法
２μｌのアフィニティー濃縮したガンマ−セクレターゼ複合体（実施例５）を１６μｌのガンマ−セクレターゼ反応緩衝液（４０％グリセリン、０．５％ｍＣＨＡＰＳＯ界面活性剤溶液、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５）に氷上にて加え、ついで２μｌの可溶化した放射性標識βＡＰＰ−Ｃ１００ポリペプチド（実施例１）を加えてガンマ−セクレターゼ反応混合液の最終容量を２０μｌとした。
別法として、５μｌのアフィニティー濃縮したガンマ−セクレターゼ複合体を１３μｌのガンマ−セクレターゼ開裂反応混合液に氷上にて加え、ついで２μｌの可溶化した放射性標識βＡＰＰ−Ｃ１００ポリペプチド模倣物を加えてガンマ−セクレターゼ反応混合液の最終容量を２０μｌとした。ガンマ−セクレターゼ反応混合液を３７℃に２０分間置くことにより開裂反応開始した。開裂反応の停止は、ガンマ−セクレターゼ反応混合液を氷上に置き、ついで８μｌの４×ＳＤＳ−ＰＡＧＥ試料緩衝液（Ｎｏｖｅｘ、サンジエゴ、カリフォルニア）を加ることにより行った。ゲル電気泳動の前に試料を９５℃に５分間加熱した。ガンマ−セクレターゼ開裂産物の存在は、下記実施例７に記載するようにＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを行うことによって検出した。
【０１７９】
実施例７
以下に、再構成法（たとえば、実施例６）からのガンマ−セクレターゼ開裂産物の分離および検出を行うのに用いたゲルシステムを記載する。機能的に活性なガンマ−セクレターゼ複合体の存在は、放射性標識したβＡＰＰポリペプチド模倣物の開裂をモニターすることにより検出した。たとえば、１１ｋＤａのβＡＰＰ−Ｃ１００ポリペプチドのガンマ−セクレターゼ開裂は４ｋＤａおよび６ｋＤａの開裂産物を生成した。同様に、９ｋＤａのβＡＰＰ−Ｃ８３ポリペプチドの開裂は３ｋＤａおよび６ｋＤａの開裂産物を生成した。
【０１８０】
ガンマ−セクレターゼ開裂産物の検出
ガンマ−セクレターゼ開裂反応液を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル、たとえば１０％ＮｕＰａｇｅＴＭゲル（ＮＯＶＥＸ、サンジエゴ、カリフォルニア）に負荷し、製造業者の指示に従って泳動した。ゲルを乾燥し、３５Ｓ−標識βＡＰＰ基質（たとえば、みかけの１１ｋＤａのβＡＰＰ−Ｃ１００ポリペプチド）および開裂産物（たとえば、４ｋＤａおよび６ｋＤａのポリペプチド）を蛍光造影（ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｍａｇｅｒ）分析（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ、ピスカタウエイ、ニュージャージー）により検出した。放射性標識した基質および開裂産物の放射能シグナルを蛍光造影により定量した。
【０１８１】
放射性標識したβＡＰＰ−Ｃ１００基質は、可溶化したタンパク質およびタンパク質複合体調製物（図６および図７）およびアフィニティー濃縮したタンパク質調製物（図８）中に存在するガンマ−セクレターゼ複合体によって開裂されて、βＡＰＰポリペプチドのＣ末端側フラグメントに対応する６ｋＤａの開裂産物を生成した。
放射性標識したβＡＰＰ−Ｃ８３基質もまた、可溶化したタンパク質およびタンパク質複合体調製物（図７）およびアフィニティー濃縮したタンパク質調製物中に存在するガンマ−セクレターゼ複合体によって開裂されて、βＡＰＰポリペプチドのＣ末端側フラグメントに対応する６ｋＤａの開裂産物を生成した。
【０１８２】
実施例８
以下に、抗ＰＳ１ポリクローナル抗体を生成するのに用いた方法を記載する。化学合成法を用いたＰＳ１ペプチド抗原の調製
ＣＲＤＳＨＬＧＰＨＲＳＴＰＥＳＲ−アミド（配列番号５）の配列を有するＰＳ１の合成ペプチド抗原に対し、抗ＰＳ１ポリクローナル抗体（「１３５７」と称する）を産生させた。このペプチド抗原はＰＳ１のアミノ酸３４４−３５８を包含し、ペプチド抗原を担体タンパク質にカップリングするためのＣ末端システインを含む。
【０１８３】
ＣＧＨＰＥＰＬＳＮＧＲＰＱＧＮＳＲ−アミド（配列番号６）の配列を有するＰＳ１の合成ペプチドに対しては抗ＰＳ１ポリクローナル抗体（「１３９８」と称する）を産生させた。このペプチド抗原はＰＳ１のアミノ酸４５−６０を包含し、ペプチド抗原を担体タンパク質にカップリングするためのＣ末端システインを含む。
ノルロイシン−ＲＤＳＨＬＧＰＨＲＳＴＰＥＳＲ−アミド（配列番号９）の配列を有するＰＳ１の合成ペプチドに対しては抗ＰＳ１ポリクローナル抗体（「ＳＲ９２」と称する）を産生させた。このペプチドはＰＳ１のアミノ酸３４４−３５８を包含する。
【０１８４】
抗ＰＳ１ポリクローナル抗体１３５７、１３９８、およびＳＲ９２を産生するのに用いた合成ペプチドは、Ｊ． Ｓｔｅｗａｒｔ ＆ Ｊ． Ｙｏｕｎｇ， ”Ｓｏｌｉｄ ｐｈａｓｅ ｐｅｐｔｉｄｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ、ロックフォード、１９８４）の方法により合成した。カップリング剤としてｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルを用い、１３５７および１３９８ポリクローナル抗体をＮ−末端システイン残基を介して卵アルブミン担体タンパク質にカップリングした（Ｈａｒｌｏｗ， Ｅ．およびＬａｎｅ， Ｄ． １９８８： Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ｐｐ８２−８３ ＣＳＨＬ、コールドスプリング、ニューヨーク）。
【０１８５】
組換えＤＮＡ法を用いたＰＳ１ペプチド抗原の調製
組換えＤＮＡ法を用い、細菌で発現したＰＳ１ポリペプチドフラグメントに対して抗ＰＳ１ポリクローナル抗体（「ＪＨ２」と称する）を産生させた。このポリペプチドフラグメントはＰＳ１のアミノ酸１−７７（配列番号７）を包含する。このフラグメントは、ｐＧＥＸ４Ｔ１ベクター（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ、ピスカタウエイ、ニュージャージー）を用いて細菌のグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼとの融合タンパク質として調製した。ＰＳ１コード配列（ヌクレオチド５５４−７８６）を末端ＥｃｏＲＩ部位およびＢａｍＨＩ部位をコードするプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応（米国特許第４，６８３，２０２号および同第４，９６５，１８８号（参照のため本明細書中に引用する））を用いてｃＤＮＡライブラリーから増幅させ、得られたＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩポリヌクレオチドフラグメントをｐＧＥＸ４Ｔ１中にライゲートした。細菌の増殖、誘発、溶解、封入体の精製、融合タンパク質の精製、およびＧＳＴ融合体からのＰＳ１ １−７７の開裂は、ＧＳＴ精製モデュール（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ、ピスカタウエイ、ニュージャージー）で提供される標準プロトコールに従って行った。
【０１８６】
「ＪＨ５」と称する抗ＰＳ１ポリクローナル抗体は、ＰＳ１「ループ」−ＧＳＴ融合タンパク質（配列番号８）に対して産生される精製ポリクローナル抗体である。この融合タンパク質は、ｐＧＥＸ４Ｔ１ベクター（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ、ピスカタウエイ、ニュージャージー）を用いて細菌のグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼとの融合タンパク質として調製した。ＰＳ１コード配列（ヌクレオチド１３８２−１７６９）を末端ＥｃｏＲＩ部位およびＢａｍＨＩ部位をコードするプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応を用いてｃＤＮＡライブラリーから増幅させ、得られたＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩポリヌクレオチドフラグメントをｐＧＥＸ４Ｔ１中にライゲートした。細菌の増殖、誘発、溶解、封入体の精製および融合タンパク質の精製は、ＧＳＴ精製モデュール（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ、ピスカタウエイ、ニュージャージー）で提供される標準プロトコールに従って行った。
【０１８７】
ポリクローナル抗体を生成するための動物の免疫
２００μｌの滅菌リン酸緩衝食塩水中に懸濁し、２００μｌのフロイントの完全アジュバント（ＳＩＧＭＡ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ、セントルイス、ミズーリ）とともに乳濁化した約２ｍｇのペプチド結合卵アルブミンを用いてウサギを免疫した。この乳濁化したペプチドをＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅの記載（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， １９８８， ｐ．１０９、ＣＳＨＬ、コールドスプリング、ニューヨーク）に従い、８−１０の部位にて皮内注射した。４００μｌの５０％リン酸緩衝食塩水／５０％フロイントのアジュバント（不完全）中に１００μｇの抗原を含有する皮内ブースター注射を３週間後に投与した。ブースター注射の２週間後、および抗体力価が高く保持されているその後２週間の間に供試採血を行った（ＨａｒｌｏｗおよびＤ． Ｌａｎｅ， １９８８， Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ｐｐ．１１６−１１９、ＣＳＨＬ、コールドスプリング、ニューヨーク）。抗体力価の決定は、コンジュゲートしていないペプチドを用いてＥＬＩＳＡにより行った（ＨａｒｌｏｗおよびＤ． Ｌａｎｅ， １９８８， Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ｐｐ．５５３−６１２、ＣＳＨＬ、コールドスプリング、ニューヨーク）。
【０１８８】
抗体の免疫精製
これらポリクローナル抗体を抗原カラム上で免疫精製した。抗原カラムは、製造業者の指示に従い、適当なペプチドをＰｈａｒｍａｃｉａ ＨｉＴｒａｐ ＮＨＳ−活性化カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ、ピスカタウエイ、ニュージャージー）に結合させて調製した。免疫精製は標準法（Ｉｍｍｕｎｏａｆｆｉｎｉｔｙ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｏｎ ａｎ Ａｎｔｉｇｅｎ Ｃｏｌｕｍｎ， ｐｐ．３１４−５， Ｅ． ＨａｒｌｏｗおよびＤ． Ｌａｎｅ， ”Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ” ｃ． １９８８、ＣＳＨＬ、コールドスプリング、ニューヨーク）により行った。
【０１８９】
実施例９
以下に、天然に存在する機能的に活性なガンマ−セクレターゼ複合体（たとえば、内生のガンマ−セクレターゼ複合体）および基質（たとえば、内生の基質）を含む膜画分を単離するのに用いた方法を記載する。この膜画分は、試薬をスクリーニングしてガンマ−セクレターゼ活性を阻害する試薬を同定するのに用いることができる。
【０１９０】
内生のガンマ−セクレターゼ複合体および基質を含む膜の調製
ガンマ−セクレターゼ開裂に対する天然に存在する基質（たとえば、スウェーデン変異体βＡＰＰ）並びに内生レベルのガンマ−セクレターゼを発現するＨｅＬａ細胞からの細胞膜を上記実施例２の記載と同様にして調製した。タンパク質濃度を実施例３の記載と同様にして決定したところ７〜１２ｍｇ／ｍｌの範囲であったが、ガンマ−セクレターゼ開裂を検出するにはわずか３ｍｇ／ｍｌのタンパク質を含む希釈液で充分であった。膜を上記実施例３の記載と同様にして高塩緩衝液で２回洗浄した。膜は炭酸塩溶液では洗浄しなかった。その代わり、膜をＴｗｅｅｎ−８０（基質を膜内に保持する）を含有する溶液で洗浄した。簡単に、Ｔｗｅｅｎ−８０洗浄を本明細書に記載する。
【０１９１】
ガラス棒を用いてペレットを１０容量のＴｗｅｅｎ−８０緩衝液（０．０５Ｍ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、１０％グリセリン、０．５％Ｔｗｅｅｎ−８０）中に再懸濁させた。懸濁液を冷室中、ニューテーターで３０分間振動させた。懸濁液を４℃にてスーパーライトＧＳＡローター（ＳＬ−１５００）で１３，０００ｒｐｍで３０分間遠心分離にかけた。上澄み液を除去した。ガラス棒を用いてペレットを１０容量の無塩緩衝液（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、１０％グリセリン、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭジチオトレイトール、４μｇ／ｍｌロイペプチン）中に再懸濁させ、穏やかに混合した。懸濁液を上記遠心分離にかけた。上澄み液を除去した。得られたペレットにはＴｗｅｅｎ−８０洗浄した膜画分が含まれており、該膜画分は脂質二重層中に埋め込まれた膜内在タンパク質（たとえば、ガンマ−セクレターゼ複合体）および基質（たとえば、βＡＰＰ）を含んでいる。
【０１９２】
内生基質の開裂
Ｔｗｅｅｎ−８０洗浄した膜のアリコート（５〜５０μｌ）を０．５〜１ｍｇ／ｍｌの濃度で無塩緩衝液に懸濁させた。膜を３７℃に約３時間温めて開裂反応を開始させ、試料を氷上に置いて反応を停止させた。
インヒビター化合物をスクリーニングするプロトコールにおいて、温度を３７℃にシフトする前に被験インヒビター化合物を膜試料に４〜１０℃にて約１０〜３０μＭの最終濃度にて加えた。
【０１９３】
時間分析（Ｔｉｍｅ−Ｒｅｓｏｌｖｅｄ）蛍光による開裂の検出
内生基質（たとえば、βＡＰＰ）の開裂を、新たに生成したＡβペプチドなどの開裂産物の定量測定により検出した。９Ｓ３．２抗体（Ｂｉｏｓｏｌｕｔｉｏｎｓ、ニューアーク、デラウエア）は、Ａβ−４０ペプチドを用いて調製した高親和性マウスモノクローナル抗体である。９Ｓ３．２抗体はＡβの開裂したＣ末端に特異的に結合する。この抗体は前駆体（たとえば、βＡＰＰタンパク質）には結合しない。モノクローナル抗体２６Ｄ６−Ｂ２−Ｂ３は、カルボキシル末端を介して担体にカップリングしたＡβ１−１２ペプチドを用いて調製した別の高親和性マウスモノクローナル抗体である（ＳＩＢＩＡ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ラジョラ、カリフォルニア）。２６Ｄ６−Ｂ２−Ｂ３抗体はＡβのＮ末端領域に結合する。この抗体は前駆体および開裂産物の両者に結合するであろう。
【０１９４】
上記開裂反応の終了後、６０μｌの冷却した各蛍光標識抗体を２０μｌの１ｍｇ／ｍｌ開裂膜に加えた。各抗体／膜の組み合わせを８回アッセイした。９Ｓ３．２蛍光標識抗体は０．３μｇ／ｍｌにて加え、一方、２６Ｄ２蛍光標識抗体は０．８μｇ／ｍｌにて加えた。これら蛍光標識抗体を膜試料中で室温にて１８〜２４時間インキュベートし、その後、シグナルをＤｉｓｃｏｖｅｒｙＲ ＨＴＲＦマイクロプレート分析器（Ｐａｃｋａｒｄ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ Ｃｏｍｐａｎｙ、メリデン、コネチカット）で読み取った。
【０１９５】
抗体９Ｓ３．２および２６Ｄ６−Ｂ２−Ｂ３を蛍光付加物の適当な対で修飾し、該抗体のＡβペプチドへの結合によって該付加物が極めて近接したときに蛍光エネルギー移動が起こるようにすることによって、開裂産物へのこれら抗体の同時結合を検出した（Ｋｏｌｂ］ら、１９９６， ”Ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｉｎ Ｈｉｇｈ Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ”， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ １： ２０３−２１０）。ついで、蛍光団を窒素レーザーパルスにより励起させ、蛍光エネルギー移動の程度を時間分析蛍光測定により定量した（Ｋｏｌｂ， Ｊ． Ｍ．， Ｙａｍａｎａｋａ， Ｇ．およびＭａｎｌｙ， Ｓ． Ｐ． Ｊ．上掲）。
【０１９６】
図１０に示すように、時間分析蛍光アッセイは、ＨＰＬＡＰ−βＡＰＰＳＷの２μｌ未満の膜懸濁液を入れたウエルでガンマ−セクレターゼ活性を検出した。さらに、このアッセイは、シグナル／バックグラウンドの比例した蛍光比をもたらすことにより増大量のガンマ−セクレターゼ活性に対しても感度を有していた。
このアッセイはまた、図１１に示すようにＡβフラグメントの検出においても同様に感度を有していた。合成Ａβ−４０ペプチドを反応緩衝液中に希釈し、蛍光付加物で修飾した抗体２６Ｄ６および９Ｓ３．２とともにインキュベートした。蛍光シグナルはＡβ−４０ペプチドの濃度の増大に応じて増大した。
【０１９７】
本明細書を通じて様々な刊行物を言及してある。これら刊行物の開示は、本発明が関連する技術の状態を一層詳細に記載するために、その全体が本明細書中に参照のため引用される。
【図面の簡単な説明】
【図１Ａ】βＡＰＰ（Ｃ−１００）ポリペプチド基質をコードする組換えベクターの模式図。
【図１Ｂ】βＡＰＰ（Ｃ−８３）ポリペプチド基質をコードする組換えベクターの模式図。
【図２】組換えβＡＰＰ（Ｃ−１００）ポリペプチド基質のヌクレオチドおよびアミノ酸配列。
【図３】組換えβＡＰＰ（Ｃ−８３）ポリペプチド基質のヌクレオチドおよびアミノ酸配列。
【図４】ベータ−セクレターゼ開裂したヒトβＡＰＰ（ガンマ−セクレターゼによって認識され開裂される）のアミノ酸配列。
【図５】Ｓ２−開裂したヒトノッチ−１（ガンマ−セクレターゼによって認識され開裂される）のアミノ酸配列。
【図６】可溶化ガンマ−セクレターゼ複合体を含む開裂反応液から得られた放射性標識した６ｋＤａガンマ−セクレターゼ開裂産物の検出。
【図７】可溶化ガンマ−セクレターゼ複合体を含む開裂反応液から得られたＣ８３基質およびＣ１００基質の開裂産物の検出。
【図８】免疫単離したガンマ−セクレターゼ複合体を含む開裂反応液から得られたＣ１００基質の開裂産物の検出。
【図９】ガンマ−セクレターゼ基質の開裂を検出するための時間分析蛍光法の模式図。
【図１０】ＨＰＬＡＰ−βＡＰＰＳＷを発現する細胞からの増大する容量の膜懸濁液が、増大する蛍光シグナル／バックグラウンド比によって示されるように、比例量のガンマ−セクレターゼ活性を提供することを示すグラフ。細胞を抗体２６Ｄ６および９Ｓ３．２で修飾した蛍光付加物とともにインキュベートした。
【図１１】増大する濃度のＡβ−４０ペプチドが比例量の蛍光シグナルを提供することを示すグラフ。Ａβペプチドを抗体２６Ｄ６および９Ｓ３．２で修飾した蛍光付加物とともにインキュベートした。
【図１２】好ましいドナー分子の化学構造を示す一覧。
【図１３】好ましい消光剤分子を含む幾つかの好ましいアクセプター分子の化学構造を示す一覧。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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