(57)【要約】本発明は、ＩＲＳ−１タンパク質の発現を阻害し得る少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを含む、内皮細胞による毛管の形成を阻害するための薬剤組成物を対象とする。本発明によるオリゴヌクレオチドは、抗血管形成剤として示される。本発明の薬剤組成物は、血管形成に関連した病理の治療に特に有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）相補的配列又はその断片の、ＩＲＳ−１タンパク質をコードする遺伝子の核酸分子、（ｉｉ）（ｉ）による核酸分子の発現を阻害し得る分子、から選択された少なくとも１つの物質を活性作用物質として含む、血管形成現象に活性である薬剤組成物。
【請求項２】
活性作用物質として、添付の配列リスト中で配列識別番号２から配列識別番号２３及び配列識別番号２８号で識別されるヌクレオチド配列の集合から選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列を含むことを特徴とする請求項１に記載の薬剤組成物。
【請求項３】
ＩＲＳ−１タンパク質をコードする遺伝子の核酸分子の発現を阻害し得る分子は、少なくとも１２の隣接するヌクレオチド又はその誘導体を含む、添付の配列リスト中で配列識別番号２８号で識別される配列のコード領域のアンチセンス配列であることを特徴とする請求項１又は２に記載の薬剤組成物。
【請求項４】
ＩＲＳ−１タンパク質をコードする遺伝子の核酸分子の発現を阻害し得る分子は、少なくとも１２の隣接するヌクレオチド又はその誘導体を含む、添付の配列リスト中で配列識別番号２から配列識別番号２３の配列、またはその断片を含む群から選択されることを特徴とする請求項１から３のいずれかに記載の薬剤組成物。
【請求項５】
活性作用物質は、許容できる媒介物と前記組成物中で好適には結合される請求項１から４のいずれかに記載の薬剤組成物。
【請求項６】
皮下、筋肉内、静脈内又は経皮で投与されるための形状を呈すること、及び０．００１ｍｇから５０ｍｇの有効成分を含むことを特徴とする請求項１から５のいずれかに記載の薬剤組成物。
【請求項７】
血管形成に関連する病理の治療のための請求項１から６のいずれかに記載の薬剤組成物の使用。
【請求項８】
網膜症の治療、リウマチ様関節炎、クローン病、アテローム硬化症、卵巣過刺激、乾癬、新血管新生に関連した子宮内膜、気球の血管形成による再狭窄、癒着による組織生成過多、末梢血管症、高血圧、血管炎症、レイノー病及び現象、動脈瘤、動脈再狭窄、血栓静脈炎、リンパ管炎（ｌｙｍｐｈａｇｙｔｅ）、リンパ性皮膚病（ｌｙｍｐｈｏｄｅｍｅ）、組織癒着及び修復、虚血、口峡炎、心筋梗塞、慢性心臓病、鬱血性心不全のような心不全、又は加齢に関連した黄斑変性及び骨粗しょう症のための請求項７に記載の使用。
【請求項９】
血管形成現象に関連する病理の診断のための請求項１から６のいずれかに記載の薬剤組成物の使用。
【請求項１０】
網膜症、リウマチ様関節炎、クローン病、アテローム硬化症、卵巣過刺激、乾癬、新血管新生に関連した子宮内膜、気球の血管形成による再狭窄、癒着による組織生成過多、末梢血管症、高血圧、血管炎症、レイノー病及び現象、動脈瘤、動脈再狭窄、血栓静脈炎、リンパ管炎（ｌｙｍｐｈａｇｙｔｅ）、リンパ性皮膚病（ｌｙｍｐｈｏｄｅｍｅ）、組織癒着及び修復、虚血、口峡炎、心筋梗塞、慢性心臓病、鬱血性心不全のような心不全、又は加齢に関連した黄斑変性及び骨粗しょう症の診断のための請求項９に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＩＲＳ−１タンパク質の発現を阻害し、かつ内皮細胞による毛管の形成を阻害し得るアンチセンスオリゴヌクレオチドを対象とする。従って、本発明によるオリゴヌクレオチドは、抗血管形成剤として示される。それらは、抗細胞増殖剤、特に抗腫瘍剤としても同様に示される。
【０００２】
本発明は、前記オリゴヌクレオチドを含む薬剤組成物、及び分析試薬としての前記オリゴヌクレオチドの使用にも関する。
【０００３】
血管形成は、新規な血管が形成される基本的なプロセスである。このプロセスは、生殖、発育、又は癒着のような幾つかの正常な生理学的現象において必要不可欠である。これらの正常な生物学的現象において、血管形成は、厳密に制御される。すなわち、血管形成は、短い期間（数日）中に引き起こされ、次に完全に阻害される。しかしながら、幾つかの病理は、侵襲性でありかつ制御されない血管形成に関連する；侵襲性新血管による軟骨損傷による病理である関節炎；新血管による網膜の侵襲が、患者の失明に至らせる糖尿病性網膜症；視覚器官の新血管新生は、失明の主な原因を示し、かつこの新血管新生は、約２０の眼の疾患に介入する；又は新血管新生に直接関連し、かつ血管形成に左右される腫瘍の増殖及び転移。腫瘍は、それ自体の増殖のために、新血管の増殖を増進する。更に、これらの新血管は、腫瘍の排出路であり、腫瘍は、このようにして血液循環に合流し、かつ肝臓、肺又は骨のような最初の腫瘍発生源から離れた部位への転移を引き起こす。
【０００４】
内皮細胞による新血管の形成、血管形成は、内皮細胞の移動、増殖、及び分化を伴う。これらの生物学的現象の調節は、遺伝子発現に直接関連する。
【０００５】
このようにして、本発明の枠内で行われた研究作業により、血管形成の調節に関わる核酸配列を識別し、かつ調製することが可能になった。
【０００６】
血管形成に関する他の作業により、Ｉ型膠原布で培養され、かつｂＦＧＦのような血管形成因子によって刺激される内皮細胞によって、１８０ｋＤａの細胞内タンパク質のチロシン残基のレベルでの、重要な発現及びリン酸化を明らかにすることが可能になった。１８０ｋＤａの細胞内タンパク質のチロシン残基のレベルでの、重要な発現及びリン酸化は、内皮細胞による毛管の形成に付随する。
【０００７】
このタンパク質は、（ＩＲＳ−１と名付けられた）インシュリン受容体基質としてすでに知られている。これは、実際に糖尿病に取り組んでいる数人の著者によって部分的に識別され、かつ調査された（Ｑｕｏｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９９４）、２６９（４５）、２７９２０−２７９２４）。
【０００８】
これらの著者は、（ｉ）インシュリンによって刺激されたＧＬＵＴ４の転座に関して、及び（ｉｉ）グルコース輸送に関してラットの脂肪細胞中でＩＲＳ−１の役割を調査した。これを行うために、著者らは：
−次の配列識別番号１：５’−ＴＣＧＡＴＧＴＧＡＣ  ＧＣＴＡＣＴＧＡＴＧ  ＡＧＴＣＣＧＴＧＡＧ  ＧＡＣＧＡＡＡＣＴＣ  ＴＧＧＣＣＴＡＧ−３’
の配列のセンスオリゴヌクレオチドから得られる二本鎖オリゴヌクレオチド、及び
−ヒトＩＲＳ−１をコードするｃＤＮＡ、を含むプラスミドを作り、かつ前記プラスミドによってラットの脂肪細胞をトランスフェクトした。
【０００９】
本発明の範囲で行われた作業は、ＩＲＳ−１タンパク質の発現は、内皮細胞が、ｂＦＧＦ血管形成因子によって刺激される時に、内皮細胞中にも同様にもたらされることを明らかにした。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
従って本発明は、（ｉ）相補的配列又はその断片の、ＩＲＳ−１タンパク質をコードする遺伝子の核酸分子又は相補的配列の断片（ｉｉ）（ｉ）による核酸分子の発現を阻害し得る分子から選択された少なくとも１つの物質を活性作用物質として含む、血管形成現象に活性である薬剤組成物に関する。
【００１１】
本発明の枠内で、このタンパク質をコードする遺伝子のアンチセンスオリゴヌクレオチドが、調製された。これらのオリゴヌクレオチドは、注目すべき抗血管形成及び抗腫瘍活性を示す。従ってこれらは、侵襲性であり、かつこれらのオリゴヌクレオチドの少なくとも１つを含む組成物を個体に投与することからなる遺伝子治療法によって制御されない血管形成に関連する疾患の治療に特に有用である。
【００１２】
このようにして、本発明によるオリゴヌクレオチドは、次の配列識別番号２の式のヌクレオチド配列：
５’−ＴＡＴＣＣＧＧＡＧＧＧＣＴＣＧＣＣＡＴＧＣＴＧＣＴＧＣＧＧＡＧＣＡＧＡ−３’
からなり、その断片は、少なくとも１２の隣接するヌクレオチド、又はその誘導体を含む。
【００１３】
本発明は、次の配列識別番号３及び４の式のヌクレオチド配列：
５’−ＴＡＴＣＣＧＧＡＧＧＧＣＴＣＧＣＣＡＴＧＣＴＧＣＴ−３’
５’−ＴＣＧＣＣＡＴＧＣＴＧＣＴＧＣＧＧＡＧＣＡＧＡ−３’
の一方からなるオリゴヌクレオチドに特に関し、その断片は、少なくとも１２の隣接するヌクレオチド、又はその誘導体を含む。
【００１４】
誘導体とは、配列識別番号２、３又は４の配列の１つ、又はその、少なくとも１２の隣接するヌクレオチドの断片と、厳密な条件においてハイブリダイズすることが可能な配列を意味する。
【００１５】
本発明によるオリゴヌクレオチドの例として、次の配列：
配列識別番号５：５’−ＴＡＴＣＣＧＧＡＧＧＧＣＣＴＧＣＣＡＴＧＣＴＧＣＴ−３’
配列識別番号６：５’−ＴＡＴＣＣＧＧＡＧＧ  ＧＣＣＴＧＣＣＡＴＧ  ＣＴＧＣ−３’
配列識別番号７：５’−ＴＡＴＣＣＧＧＡＧＧ  ＧＣＣＴＧＣＣＡＴＧ  ＣＴＧ−３’
配列識別番号８：５’−ＴＡＴＣＣＧＧＡＧＧ  ＧＣＣＴＧＣＣＡＴＧ  ＣＴ−３’
配列識別番号９：５’−ＴＡＴＣＣＧＧＡＧＧ  ＧＣＣＴＧＣＣＡＴＧ  Ｃ−３’
配列識別番号１０：５’−ＴＡＴＣＣＧＧＡＧＧ  ＧＣＣＴＧＣＣＡＴＧ  −３’
配列識別番号１１：５’−ＴＡＴＣＣＧＧＡＧＧ  ＧＣＣＴＧＣＣＡＴ−３’
配列識別番号１２：５’−ＴＡＴＣＣＧＧＡＧＧ  ＧＣＣＴＧＣＣＡ−３’
配列識別番号１３：５’−ＴＡＴＣＣＧＧＡＧＧ  ＧＣＣＴＧＣＣ−３’
配列識別番号１４：５’−ＴＡＴＣＣＧＧＡＧＧ  ＧＣＣＴＧＣ−３’
配列識別番号１５：５’−ＴＡＴＣＣＧＧＡＧＧ  ＧＣＣＴＧ−３’
配列識別番号１６：５’−ＴＡＴＣＣＧＧＡＧＧ  ＧＣＣＴ−３’
配列識別番号１７：５’−ＴＡＴＣＣＧＧＡＧＧ  ＧＣＣ−３’
配列識別番号１８：５’−ＴＡＴＣＣＧＧＡＧＧ  ＧＣ−３’
配列識別番号１９：５’−ＣＣＧＧＡＧＧ  ＧＣＣＴＧＣＣＡＴＧ  ＣＴＧＣＴ−３’
配列識別番号２０：５’−ＧＡＧＧ  ＧＣＣＴＧＣＣＡＴＧ  ＣＴＧＣＴ−３’
配列識別番号２１：５’−Ｇ  ＧＣＣＴＧＣＣＡＴＧ  ＣＴＧＣＴ−３’
配列識別番号２２：５’−ＣＴＧＣＣＡＴＧ  ＣＴＧＣＴ−３’
配列識別番号２３：５’−ＴＧＣＣＡＴＧ  ＣＴＧＣＴ−３’
のそれを挙げることができる。
【００１６】
好適には、本発明のオリゴヌクレオチドのホスホジエステル結合の全部又は一部は、保護される。この保護は、当業者に周知である従来の方法によって、一般的に化学的に行われる。例えば、チオール基又はアミン、又はフェニル基によってホスホジエステル結合を保護することができる。
【００１７】
同様に好適には、本発明のオリゴヌクレオチドの末端５’−及び／又は３’−は、例えばホスホジエステル結合を保護するために以前に示された技術を使用して、保護される。
【００１８】
本発明のオリゴヌクレオチドは、当業者に周知である従来技術により、例えば様々な会社から商品化されているＤＮＡシンセサイザを用いて合成され得る。
【００１９】
その作用機序が完全に解明されていないが、本発明によるオリゴヌクレオチドは、内皮細胞の中でＩＲＳ−１タンパク質の発現を阻害する。これらのオリゴヌクレオチドは、内皮細胞による新血管の形成を遮断することが可能であり（すなわち、血管形成を阻害し）、かつ従って、それは、マウスの腫瘍細胞の増殖を阻害する。
【００２０】
従って、本発明は、ＩＲＳ−１タンパク質をコードする遺伝子の一部又は前記遺伝子の転写物の少なくとも１つの相補的オリゴヌクレオチドを含む前記遺伝子を阻害するための薬剤組成物も対象とする。
【００２１】
好ましくは、ＩＲＳ−１タンパク質をコードする遺伝子の核酸分子の発現を阻害し得る分子は、添付の配列リスト中で配列識別番号２８号で識別される配列のコード領域のアンチセンス配列である。
【００２２】
好適には、前記アンチセンス配列は、少なくとも１２の隣接するヌクレオチド又はその誘導体を含む。
【００２３】
より好ましくは、本発明の組成物のＩＲＳ−１タンパク質をコードする遺伝子の核酸分子の発現を阻害し得る活性作用物質は、少なくとも１２の隣接するヌクレオチド又はその誘導体を含む、添付の配列リスト中で配列識別番号２から配列識別番号２３号で識別されるヌクレオチド配列の集合から選択されるヌクレオチド配列である。
【００２４】
かかる組成物は、好適には、許容できる媒介物と前記組成物中で好適には結合された、以上に定義した少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを活性作用物質として含む。
【００２５】
従って、本発明の枠内で行われた作業の分析により、ＩＲＳ−１タンパク質が、血管形成プロセスにおいて必要不可欠な細胞成分に相当することを証明することが可能になった。実際、前記アンチセンスオリゴヌクレオチドによるＩＲＳ−１タンパク質の発現阻害は、内皮細胞による毛管の形成阻害に至らせる。
【００２６】
従って、本発明によるオリゴヌクレオチド及びそれらを含む組成物は、抗血管形成剤として示される。それらは、抗細胞増殖剤、特に抗腫瘍剤としても同様に示され、かつ従って、腫瘍の治療に特に有用である。従って、本発明は、例えば非限定的に：腫瘍の血管新生、網膜症のような視覚器官の新血管新生に関連した眼の疾病の治療、リウマチ様関節炎、クローン病、アテローム硬化症、卵巣過刺激、乾癬、新血管新生に関連した子宮内膜、気球の血管形成による再狭窄、癒着による組織生成過多、末梢血管症、高血圧、血管炎症、レイノー病及び現象、動脈瘤、動脈再狭窄、血栓静脈炎、リンパ管炎（ｌｙｍｐｈａｇｙｔｅ）、リンパ性皮膚病（ｌｙｍｐｈｏｄｅｍｅ）、組織癒着及び修復、虚血、口峡炎、心筋梗塞、慢性心臓病、鬱血性心不全のような心不全、加齢に関連した黄斑変性及び骨粗しょう症のような、侵襲性であり、かつ制御されない血管形成に関連する病理の治療又は予防のための組成物を調製するための前記オリゴヌクレオチドの使用を対象とする。
【００２７】
上記の薬剤組成物は、皮下、筋肉内、静脈内又は経皮で投与され得るように、特には製造される。かかる投与のために、薬学的に適合する分散剤及び／又は湿潤剤、例えばプロピレングリコール又はブチレングリコールを含む、水性懸濁液、等張食塩水又は無菌液及び注射液が特に使用される。
【００２８】
投与する普通の単位分量は、０．００１ｍｇから５０ｍｇの有効成分を含む。
【００２９】
本発明のオリゴヌクレオチドは、特に、例えば前記オリゴヌクレオチドによってトランスフェクトされた腫瘍又は非腫瘍細胞に対する、１８０ｋＤａのタンパク質を伴う標識方法のインビトロ調査に、研究試薬としても有用である。それらは、本質的にキナーゼ／ホスファターゼ比からの血管形成又は発癌のような、多数の生理学的及び病理学的現象における１８０ｋＤａのタンパク質を伴う標識方法のインビボ調査にも同様に有用である。
【００３０】
このように、本発明の薬剤組成物は、血管形成現象に関連する病理の診断テストの実施、特に網膜症、リウマチ様関節炎、クローン病、アテローム硬化症、卵巣過刺激、乾癬、新血管新生に関連した子宮内膜、気球の血管形成による再狭窄、癒着による組織生成過多、末梢血管症、高血圧、血管炎症、レイノー病及び現象、動脈瘤、動脈再狭窄、血栓静脈炎、リンパ管炎（ｌｙｍｐｈａｇｙｔｅ）、リンパ性皮膚病（ｌｙｍｐｈｏｄｅｍｅ）、組織癒着及び修復、虚血、口峡炎、心筋梗塞、慢性心臓病、鬱血性心不全のような心不全、又は加齢に関連した黄斑変性及び骨粗しょう症の診断に特に有用である。
【００３１】
本発明のその他の利点及び特徴は、これに続く実施例から現れるであろう。実施例中、配列識別番号３のオリゴヌクレオチドを「オリゴヌクレオチド」によって指し示し、実施例は、添付図面を参照する。
【実施例１】
【００３２】
ｂＦＧＦによる内皮細胞の刺激に続く、これらの細胞中のＩＲＳ−１（１８０ｋＤａのタンパク質）の発現の誘導を明らかにすること
【００３３】
１８０ｋＤａのタンパク質は、次のように明らかにされた：
内皮細胞は、（Ｍｏｎｔｅｓａｎｏら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、１９８３、８３、１６４８−１６５２）に記載されたように、Ｉ型膠原で予め覆われた６つのウェルを有するマイクロタイトレーション板中で培養された。培養媒質は、１０％のウシ胎児血清、４ｍＭのグルタミン、５００Ｕ／ｍｌのペニシリン、及び１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンで濃縮されたＤＭＥＭ（Ｓｉｇｍａ）である。３〜４日の培養後、内皮細胞の半集密性層が得られる。６つのウェルの培養媒質は、吸入され、かつ新しい培養媒質によって取り替えられた。３つのウェルは、３ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦによって濃縮された。４８時間の保温後、様々なウェルは、リン酸緩衝液によって３回洗浄され、かつ細胞は、当業者に公知の手順により伝令ＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を抽出するために使用される。ｍＲＮＡは、オリゴ（ｄＴ）プライマ（Ｔ１２ＭＮ）（Ｍは、Ｇ、Ａ又はＣでも良く；かつＮは、Ｇ、Ａ、Ｔ及びＣである）の変性された４つのグループの各々を使用して重合連鎖反応（ＰＣＲ）によって逆転写される。各プライマグループは、３’（Ｎ）位の塩基によって書き取られ、（Ｍ）位中に変性を有する。例：Ｎ＝Ｇであるプライマセットは：
配列識別番号２４：５’−ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＧＧ−３’
配列識別番号２５：５’−ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＡＧ−３’
配列識別番号２６：５’−ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＣＧ−３’
からなる。
【００３４】
このようにして得られたｃＤＮＡは、同位体的にマーキングされたＡＴＰの存在下で任意の十量体により増幅され、かつマーキングされる。電気泳動によって増幅されるｃＤＮＡの分析により、配列識別番号２７号で添付の配列リスト中で識別される、ｂＦＧＦによって刺激された内皮細胞に由来する試料中で増幅された３２６ｂｐのｃＤＮＡ断片の存在が明らかになったが、しかしながら、この同じ断片は、ｂＦＧＦにより刺激されない内皮細胞に由来する試料中で僅かに存在するか、又は痕跡の状態で存在する。この断片の配列決定及びデータバンクのその後の調査により、この断片は、インシュリン受容体基質をコードする、すでに知られている遺伝子の一部に相当することが明らかになった（１８０ｋＤａの細胞内タンパク質）。
【実施例２】
【００３５】
ＩＲＳ−１（１８０ｋＤａのタンパク質）の発現の誘導を明らかにすること
【００３６】
ｂＦＧＦによって刺激された、又は刺激されない（実施例１参照）Ｉ型膠原布上で培養中の内皮細胞は、オルトバナジン酸ナトリウムを含む細胞溶解緩衝液中で溶解される。これらの溶液は、次に１４０００ｇで１５分間の遠心分離によって清澄化される。等量のタンパク質を含む、刺激されない細胞及びｂＦＧＦによって刺激された細胞に由来する上澄みの試料は、２％のＳＤＳ及び１５ｍＭのジチオトレイトールを含み、１００℃で５分間加熱され、次に（２％のＳＤＳの存在下）変性させる条件でポリアクリルアミドのゲル（アクリルアミド４〜１５％の勾配）に堆積される、電気泳動溶液によって再び取られた。移動後に、タンパク質は、ニトロセルロース膜上に伝達される。膜は、ＰＢＳ緩衝液中の５％の乳液の溶液中で、外界温度での保温によって遮断される。膜は、次にＰＢＳ緩衝液により３回洗浄され、１μｇ／ｍｌの抗ＩＲＳ−１モノクローナル抗体を含むＰＢＳ緩衝液中で２時間、外界温度で保温され、かつＰＢＳ緩衝液により３回洗浄される。次にタンパク質が、ペルオキシダーゼに結合される抗アイソタイプ二次抗体により明らかにされる。ｂＦＧＦによって刺激される内皮細胞に由来する調合物において、抗ＩＲＳ−１モノクローナル抗体によって認識される分子量１８０ｋＤａのタンパク質の存在が確認される；このタンパク質は、ｂＦＧＦによって刺激されない内皮細胞に由来する調合物において、僅かに存在する（図１）。
【実施例３】
【００３７】
ＩＲＳ−１（１８０ｋＤａのタンパク質）のチロシンのレベルでのリン酸化の誘導を明らかにすること
【００３８】
ｂＦＧＦによって刺激された、又は刺激されないＩ型膠原布上で培養中のヒト内皮細胞は、オルトバナジン酸ナトリウムを含む細胞溶解緩衝液中で溶解される。これらの溶液は、次に１４０００ｇで１５分間の遠心分離によって清澄化される（実施例２参照）。ＩＲＳ−１タンパク質は、抗ＩＲＳ−１モノクローナル抗体により抽出された。この抽出は、抗ＩＲＳ−１モノクローナル抗体（Ｓｉｇｍａ）を用いた免疫沈降後に行われる。アガロースに結合された抗ＩＲＳ−１抗体の付加後に、懸濁液が、外界温度で２時間保温され、次に４０００ｇで１５分間の遠心分離される。得られた沈殿物は、２％のＳＤＳ及び１５ｍＭのジチオトレイトールを含み、１００℃で５分間加熱され、次に（２％のＳＤＳの存在下）変性させる条件でポリアクリルアミドのゲル（アクリルアミド４〜１５％の勾配）に堆積される、電気泳動溶液によって再び取られる。移動後に、タンパク質は、ニトロセルロース膜上に伝達される。膜は、ＰＢＳ緩衝液中の５％の乳液の溶液中で、外界温度での保温によって遮断される。膜は、次にＰＢＳ緩衝液により３回洗浄され、１μｇ／ｍｌの抗ホスホチロシンモノクローナル抗体を含むＰＢＳ緩衝液中で２時間、外界温度で保温され、かつＰＢＳ緩衝液により３回洗浄される。次にタンパク質が、ペルオキシダーゼに結合される抗アイソタイプ二次抗体により明らかにされる。分子量１８０ｋＤａのＩＲＳ−１タンパク質は、ｂＦＧＦによって刺激される内皮細胞に由来する調合物において、チロシン残基のレベルでリン酸化されることが、確認される；このタンパク質は、ｂＦＧＦによって刺激されない内皮細胞に由来する調合物において、チロシン残基のレベルで非常に僅かにリン酸化される（図２）。
【実施例４】
【００３９】
オリゴヌクレオチドのインビトロでの抗血管形成活性の評価
【００４０】
ヒト内皮細胞は、Ｉ型膠原布上で培養される。培養の７日目に、培養ウェルは、４つのロットに分割される：
ロット１：治療を受けない内皮細胞の培養に対応するウェル。（図３Ａ）
ロット２：３ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦによって刺激された内皮細胞の培養に対応するウェル。（図３Ｂ）
ロット３：配列識別番号３の配列の１００μｇ／ｍｌのオリゴヌクレオチドによって４時間保温され、次に３ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦによって刺激された内皮細胞の培養に対応するウェル。（図３Ｃ）
ロット４：配列識別番号３の配列の１００μｇ／ｍｌのオリゴヌクレオチドによって４時間保温された内皮細胞の培養に対応するウェル。（図３Ｄ）
【００４１】
培養の３〜４日後に、様々なウェルは、逆相の光学顕微鏡を用いて検査される。結果を読むと、ロット２中のヒト内皮細胞は、ｂＦＧＦによる刺激に続いて、毛管を形成するように見える。オリゴヌクレオチドは、ロット３中でｂＦＧＦによって刺激されたこれらの同じ細胞によって新血管の形成を阻害することも確認される。オリゴヌクレオチドは、内皮細胞の増殖を顕著には変更しないことが最後に観察される。実際、ロット１のウェル中の内皮細胞数及びロット４のそれは、似通っている。
【実施例５】
【００４２】
オリゴヌクレオチドのインビボでの活性の評価
【００４３】
ヌードマウスの３つのロットが使用された。各ロットは、５匹のマウスからなる。
【００４４】
ロット１号：このロットは、比較基準の役割を果たした。各マウスは、１０６細胞／ｍｌの割合でＰＢＳ中に分散した（ビルジュイフのＩｎｓｔｉｔｕｔ  Ｇｕｓｔａｖｅ  Ｒｏｕｓｓｙによって提供される）２００μｌのＢ１６黒色腫細胞の懸濁液を０日に皮下接種される。これらのマウスは、その後に治療をされていない。
【００４５】
ロット２号：各マウスは、１０６細胞／ｍｌの割合でＰＢＳ中に分散した、２００μｌのＢ１６黒色腫細胞の懸濁液を０日に皮下接種される。１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日及び１０日に、各マウスは、５００μｇ／ｍｌの濃度のＰＢＳ中で希釈された２００μｌのオリゴヌクレオチド溶液の皮下注射を受ける。オリゴヌクレオチド注射は、細胞注射の部位の近傍で行われる。
【００４６】
ロット３号：このロットのマウスは、Ｂ１６黒色腫細胞で皮下接種されない。しかしながら、これらのマウスの各々は、５００μｇ／ｍｌの濃度のＰＢＳ中の２００μｌのオリゴヌクレオチド溶液の注射を受ける；注射は、１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日及び１０日に行われる。
【００４７】
結果は、次の通りである：
接種後に、ロット１号のマウスで、腫瘍塊は、非常に急速に発育する。実際、腫瘍塊は、前記ロット１号のマウス（治療を受けないマウス）で、１０日後に直径１．６から２．５ｃｍの大きさに達する。ロット２号のマウス（１日、２日及び３日にオリゴヌクレオチド注射により接種後に治療を受けたマウス）での腫瘍塊の進行は、腫瘍塊の体積の明らかに少ない増加を示している。ロット２のマウスでの腫瘍塊は、１０日目に直径０．８ｃｍを超えない。１４日目には、ロット２号のマウスの腫瘍塊及びロット１号のマウスのそれの間の差は、著しい。
【００４８】
ロット３号のマウス（Ｂ１６黒色腫細胞を受けなかったが、３日間オリゴヌクレオチド注射によって治療を受けたマウス）で、皮膚に関する予期せぬ一般的効果に気付く。それは、オリゴヌクレオチドによって治療を受けた全てのマウス（ロット２）で気付いたものと同一である。皮膚は、老化し、皺の寄った外観を取る。治療を受けた全てのマウスで毛の出現にも気付く。皮膚の徴候の退縮及び腫瘍増殖の継続の間には、進行中に平行状態が存在する。
【００４９】
従って、オリゴヌクレオチドがインビトロでの内皮細胞による新血管の発育及び形成を阻害することが確認される；他方、それは、ヌードマウスで注目すべきインビボでの抗腫瘍活性を有する。
【実施例６】
【００５０】
ラットでの角膜の新血管新生モデルに対する抗血管形成オリゴヌクレオチドの評価
【００５１】
Ａｍａｎｏらの作業（１９９８）に基づき、出願人は、上皮除去（ｄｅｓｅｐｉｔｈｅｌｉａｌｉｓａｔｉｏｎ）及び辺縁切除後の、ラットでの角膜の新血管の形成モデルを繰り返し、変更し、かつ分析した（図５Ａ〜５Ｊ）。それは再生可能であり、細隙灯で新血管を直接検査すること、及びそれらを数量化することを可能にする。詳細は、以下に示す。次にこのモデルは、本発明の抗血管形成剤の効率をテストするために使用された。
【００５２】
６．１  角膜の新血管新生の動物及びモデル
【００５３】
特別な病原菌を有さない、生後５週間の雄のウィスターラット（Ｒａｔｔｕｓ  ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ）（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｆｒａｎｃｅ、フランス、サン−トーバン  レ  ゼルブフ）は、自由に食物を与えられ、かつ水を飲まされ、かつ一定の温度及び湿度条件で、１２時間明るくし／１２時間暗くするサイクルで、研究所の動物飼育場で維持される。
【００５４】
ラットは、ケタミン（Ｋｅｔａｍｉｎｅ  １０００、ＵＶＡ、フランス、イブリ−シュル−セーヌ；１２８ｍｇ／ｋｇ）及びクロルプロマジン（Ｌａｒｇａｃｔｉｌ  ２５ｍｇ／ｍｌ；Ｓｐｅｃｉａ  Ｒｈｏｎｅ  Ｐｏｕｌｅｎｃ、フランス、パリ；５ｍｇ／ｋｇ）の混合物によって麻酔をかけられ、筋肉内注射をされる。一滴のオキシブプロカイン（Ｎｏｖｅｓｉｎｅ、Ｃｈｉｂｒｅｔ、フランス、クレルモンフェラン）が、右目に注入される。拡大システム（巨視Ｗｉｌｄ  ＭＰＳ  ５１  Ｓ、ＬＥＩＣＡ、スイス、ヘーアブルック）を用いて、角膜上皮は、７０％のエタノールを滲みこませた「マイクロスポンジ」によって取り除かれる。辺縁の幅１．５ｍｍの結膜の帯は、顕微手術はさみを用いて切除され、かつ瞼は、Ｖｉｃｒｙｌ５．０の糸（Ｄａｃｒｏｎ、Ａｌｃｏｎ、フランス、リュエイユ−マルメゾン）を用いた一時的眼瞼縫合によって閉じられる。眼は次に、ＰＢＳ１Ｘでふんだんにすすがれ、オキシテトラサイクリン軟膏（Ｐｏｓｉｃｙｃｌｉｎｅ、Ａｌｃｏｎ、フランス）が塗布され、かつ眼瞼縫合は、４日目に開かれる（８、９）。
【００５５】
６．２  結膜下注射による治療及び抗血管形成オリゴヌクレオチドの局所適用
【００５６】
ラットの集合は、６つのグループに分割された：
Ａグループ：モデル＋ＰＢＳ１Ｘ中の６０μＭのアンチセンスオリゴヌクレオチド溶液の結膜下注射、
Ｂグループ：モデル＋ＰＢＳ１Ｘ中の２００μＭのアンチセンスオリゴヌクレオチド溶液の局所適用、
Ｃグループ：モデル＋ＰＢＳ１Ｘ中の６０μＭのセンスオリゴヌクレオチド溶液の結膜下注射、
Ｄグループ：モデル＋ＰＢＳ１Ｘ中の２００μＭのセンスオリゴヌクレオチド溶液の局所適用、
Ｅグループ：モデル＋ＰＢＳ１Ｘの結膜下注射、
Ｆグループ：治療を受けないモデル。
【００５７】
全てのラットは、上記のように上皮除去された；治療は、４日目から９日目まで２４時間毎に行われた。新血管新生は、細隙灯での検査によって、実験手順の最初、中間及び最後に検査された；写真を０日及び９日に撮影した。
【００５８】
６．３  新血管新生の視覚化及び数量化
【００５９】
動物は、ペントバルビタールの致死注射（腹腔内注射）によって上皮除去後の１０日後に安楽死させられた。微小血管を満たし、かつ角膜の新血管新生を数量化するために、動物の体の上部が、フルオレセイン−デキストラン２×１００００００によって灌流された。眼は、核が摘出され、かつパラホルムアルデヒド／ＰＢＳ１Ｘ４％中に３時間、次にＰＢＳ１Ｘ中に一晩浸漬された。次に手術用顕微鏡で１ｍｍの辺縁を有する角膜を分離抽出し、かつ３から５の放射状の切開により、それを載物ガラス及びカバーガラスの間に平らに置いた。平らな角膜は、次に検査され、かつ蛍光顕微鏡で写真撮影された。一旦、角膜全体が復元されると、それらをスキャンし、次に画像解析によって表面を測定した；ソフトウェア（ＮＩＨ  ｉｍａｇｅ）により、新血管新生の数量化が可能になる。各写真に関して、角膜表面全体を３回、及び新血管新生表面を３回測定した；新血管新生表面／角膜表面全体−の平均の比により、我々が、「新血管新生率」を得ること、及び得られた阻害を測定することが可能になる。
【００６０】
６．４  統計分析
【００６１】
結果は、平均±標準偏差（ＳＤ）で表現される。新血管新生表面／表面全体の率は、マン−ホイットニーノンパラメトリック検定法と比較された。Ｐ＜０．０５の値は、有意義であると見なされる。
【００６２】
６．５  オリゴヌクレオチドの希釈
【００６３】
オリゴヌクレオチドは、ｐＨ７．２のＰＢＳ１Ｘ中で希釈される。文献及び他のオリゴヌクレオチドによって他方で行われた実験のデータに応じて、結膜下注射に対して６０μＭの濃度、及び局所適用に対して２００μＭの濃度を使用することが選択された。
【００６４】
結果
【００６５】
角膜の新血管モデルに関して、添付の配列リスト中で配列識別番号３号で識別されるオリゴヌクレオチド５’−ＴＡＴＣＣＧＧＡＧＧＧＣＴＣＧＣＣＡＴＧＣＴＧＣＴ−３’による治療が行われ、次の実験手順により、４日から９日の１日ごとにホスホロチオエートの形状で変更された：
Ａグループ：６０μｍのアンチセンスオリゴヌクレオチドの結膜下注射（ＡＳ６０）
Ｂグループ：２００μＭのアンチセンスオリゴヌクレオチドの局所適用（ＡＳ２００）
Ｃグループ：６０μＭのセンスオリゴヌクレオチドの結膜下注射（Ｓ６０）
Ｄグループ：２００μＭのセンスオリゴヌクレオチドの局所適用（Ｓ２００）
Ｅグループ：ＰＢＳ１Ｘの結膜下注射（ＰＢＳ）
Ｆグループ：治療なし（Ｏ  Ｔｔ）
【００６６】
実験手順の１０日目に、ラットは、ＦＩＴＣ／デキストラン溶液によって灌流され、次に安楽死させられ、角膜は、採取され、かつＰＡＦ４％の溶液中に固定され；次に角膜は、グリセロール溶液中で載物ガラス及びカバーガラスの間に平らに置かれた；蛍光新血管は、観察され、かつ蛍光顕微鏡で写真撮影され、写真は、スキャンされ、かつ各動物に関して新血管新生率を測定した。
【００６７】
観察された結果は、下記の表１に示す：
【００６８】
【表１】
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【００６９】
マン−ホイットニーノンパラメトリック検定法による結果の統計分析により、次の結果が与えられる：
６０μＭのアンチセンスＯＤＮの結膜下注射（Ａ）は、比較基準のＥ及びＦグループに対して、新血管新生を減少させた（Ｐ＜０．０００１及びＰ＝０．００１１の非常に有意義な結果）；２００μＭの濃度のアンチセンスオリゴヌクレオチドの局所適用（Ｂ）は、比較基準のＥ及びＦグループに対して、新血管新生を減少させた（Ｐ＜０．０００１の極めて有意義な結果）。
【００７０】
６０μＭのセンスＯＤＮの結膜下投与（Ｃ）又は２００μＭのセンスＯＤＮの局所適用（Ｄ）と比較すると、６０μＭのアンチセンスＯＤＮの注射（Ａ）及び２００μＭのアンチセンスＯＤＮの局所適用（Ｂ）は、新血管新生を減少させた。これらの結果は、Ｐ＜０．０００１で極めて有意義である（図４Ａ〜４Ｆ）。
【００７１】
新血管新生の阻害は、アンチセンスオリゴヌクレオチドを結膜下に（６０μＭ）又は局所に（２００μＭ）投与することに応じて著しく相違しない；それは、比較基準（Ｅ及びＦ）に対して約３５％である。
【００７２】
６０μＭのセンスＯＤＮの結膜下注射（Ｃ）及び２００μＭの濃度のセンスＯＤＮの局所適用（Ｄ）は、比較基準グループ（Ｅ及びＦ）に対して新血管新生を変更しなかった。逆に、結膜下注射のセンスオリゴヌクレオチド（Ｃ）に対して局所適用のセンスオリゴヌクレオチド（Ｄ）の小さな効果が観察される（Ｐ＝０．０１１７）。
【００７３】
その上、アンチセンスによって治療を受けたグループ（Ａ及びＢ）において、新血管の小さい直径及び低い密度が観察される。その分布は、比較基準グループに対して相違しておらず、かつ炎症のレベルのいかなる差も観察されない（図４）。
【００７４】
６．７  副作用
【００７５】
２つの連続する実験中に、いかなる顕著な副作用も、いかなるグループにおいても観察されなかった；上記の分量での治療の６日後に、ラットの皮膚は、皺が寄っておらず、毛並みは変わらず、動物の一般的な状態は、良好であった；動物は、最後の日まで普通に食べ、かついかなる疑わしい死亡も観察されなかった。死体解剖も血液分析も行われなかったが、実験終了時の動物の一般的な状態は、肝障害の存在を推測させない。観察された唯一の徴候は、Ａグループの６０％のラット、Ｃグループの６０％のラット、及びＥグループの１０％のラットでの、結膜下注射の場所の一時的な白っぽい膿瘍である。この膿瘍は、全ての場合において、実験終了時には散った。
【００７６】
この実施例は、予期し得たことに反して、６０μＭの濃度のアンチセンスオリゴヌクレオチドの結膜下注射が、２００μＭの濃度のアンチセンスオリゴヌクレオチドの局所投与よりも新血管新生を阻害しなかったことを示している。
【００７７】
このことは、使用される濃度の差によって部分的に説明され得る；しかし、この結果は、辺縁よりもむしろ局所によるオリゴヌクレオチドの浸透を同様に暗示している。それは、注射部位からの生成物の長く続く放出がないことを同様に暗示している。
【００７８】
６．８  結論
【００７９】
局所による又は結膜下注射の、アンチセンスオリゴヌクレオチドの適用は、ラットでの我々の角膜の新血管モデルに関して、新血管新生を減少させる。
【００８０】
この作業の目的は、予め調整されたラットでの角膜の新血管新生モデルに対するＩＲＳ−１遺伝子配列に由来するアンチセンスオリゴヌクレオチドの効率をテストすることであった。
【００８１】
このモデルは、容易に利用でき、再生可能であり、かつ数量化可能である。更に、この調査により、新血管新生を阻害するためのインビボでの必要なオリゴヌクレオチドの濃度の最初の評価が可能になった。
【００８２】
（参考文献）
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2004538272.tif 000004
【図面の簡単な説明】
【００８３】
【図１】Ａは、抗ＩＲＳ−１抗体によって明らかにされる、刺激されない細胞（ＮＳトラック）及びｂＦＧＦによって刺激された細胞（Ｓトラック）に由来する上澄みの試料から得られるウェスタンブロット図を表す。Ｂは、刺激されない細胞（ＮＳトラック）及びｂＦＧＦによって刺激された細胞（Ｓトラック）に由来する、同一の上澄みの試料から硝酸銀での着色後に得られるウェスタンブロット図を示す。
【図２】膜が、抗ホスホチロシンモノクローナル抗体によって保温され、かつ実施例３に示すように、ペルオキシダーゼでマーキングされた抗アイソタイプ抗体によって明らかにされる時に、刺激されない細胞（ＮＳトラック）及びｂＦＧＦによって刺激された細胞（Ｓトラック）に由来する上澄みの試料から得られるウェスタンブロット図を示す。
【図３Ａ】内皮細胞のロットのＩ型膠原布上での培養図であり、治療を受けない内皮細胞の培養を示す。
【図３Ｂ】内皮細胞のロットのＩ型膠原布上での培養図であり、３ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦによって刺激された内皮細胞の培養を示す。
【図３Ｃ】内皮細胞のロットのＩ型膠原布上での培養図であり、配列識別番号３の配列の１００μｇ／ｍｌのオリゴヌクレオチドによって４時間保温され、次に３ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦによって刺激された内皮細胞の培養を示す。
【図３Ｄ】内皮細胞のロットのＩ型膠原布上での培養図であり、配列識別番号３の配列の１００μｇ／ｍｌのオリゴヌクレオチドによって４時間保温された内皮細胞の培養を示す。
【図４Ａ】ラットで得られた角膜の新血管新生の阻害試験の結果であり、６０μｍの濃度でアンチセンスオリゴヌクレオチドの結膜下注射によって得られた結果を示す。
【図４Ｂ】ラットで得られた角膜の新血管新生の阻害試験の結果であり、６０μＭの濃度でセンスオリゴヌクレオチドの結膜下注射後に得られた結果を示す。
【図４Ｃ】ラットで得られた角膜の新血管新生の阻害試験の結果であり、２００μＭの濃度でアンチセンスオリゴヌクレオチドの局所適用後に得られた結果を示す。
【図４Ｄ】ラットで得られた角膜の新血管新生の阻害試験の結果であり、２００μＭの濃度でセンスオリゴヌクレオチドの局所適用後に得られた結果を示す。
【図４Ｅ】ラットで得られた角膜の新血管新生の阻害試験の結果であり、いかなる治療も受けない角膜の状態を示す。
【図４Ｆ】ラットで得られた角膜の新血管新生の阻害試験の結果であり、角膜が、ＰＢＳ結膜下注射によって治療を受けた時の角膜の状態を示す。
【図５】４日（図５Ａ〜５Ｅ）及び９日（図５Ｆ〜５Ｊ）でラットの角膜の辺縁切除及び上皮除去（ｄｅｓｅｐｉｔｈｅｌｉａｌｉｓａｔｉｏｎ）後の、（６．６結果の節に記載した）様々なラットのグループで得られた角膜の新血管新生の阻害の結果を示す。様々なラットのグループの血管増殖の比較を示す細隙灯写真である。倍率×１０。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
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【図４Ｆ】
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【図５】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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