(57)【要約】【課題】本発明は、優れた毛髪回復活性を有し、且つ副作用のない新たな毛髪再生剤を提供することを目的とする。【解決手段】本発明は、サイクロスポリンＡ分子の７番目のアミノ酸のカルボニル基の酸素（Ｏ）が硫黄（Ｓ）に置き換わったサイクロスポリンＡ ７-チオアミド（［７Ψ８ＣＳ−ＮＨ］サイクロスポリンＡ）を有効成分として含んでなる毛髪成長促進剤に関する。また、本発明は、液状、スプレー、ゲル、ペースト、乳剤、クリーム、コンディショナー及びシャンプーから成る群より選ばれた形状に剤形化されてなる、上記毛髪成長促進剤に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
サイクロスポリンＡ ７-チオアミド（［７Ψ８ＣＳ−ＮＨ］サイクロスポリンＡ）を有効成分として含んでなる毛髪成長促進剤。
【請求項２】
液状、スプレー、ゲル、ペースト、乳剤、クリーム、コンディショナー及びシャンプーから成る群より選ばれた形状に剤形化されてなる、請求項１に記載の毛髪成長促進剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はサイクロスポリン誘導体を有効成分とする毛髪成長促進剤に関する。更に詳しくは、本発明は、サイクロスポリンから化学的に誘導されるサイクロスポリンＡ ７-チオアミドを有効成分として含んでなる毛髪成長促進剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
人間の頭皮には、平均して約１０万から１５万本ほどの毛髪が含有されている。それぞれの毛髪は、主として三つの成長段階、即ち、発育期（ａｎａｇｅｎ）、退行期（ｃａｔａｇｅｎ）、休止期（ｔｅｌｏｇｅｎ）を有し、その後、脱落する。このような毛髪成長サイクルは、３〜６年の周期で繰り返され、一つのサイクルの長さは他のサイクルのそれとは異なる。その結果、平均的な成人で、通常、毎日約５０本から１００本の毛髪が脱落する。一般に脱毛症とはこのような発育成長期の期間が短くなり、退行期及び休止期の毛髪の割合が多くなって、抜け毛の数が過剰に且つ異常に増加する現象に因るものである。
【０００３】
脱毛の原因としては血液循環不良説、男性ホルモン過剰作用説、皮脂の産生・分泌過剰説、過酸化物、細菌などによる頭皮機能低下説、遺伝的要因、老化、ストレスなどが論議されてきた。しかしながら、明確なメカニズムは明らかにされていない。最近は食生活の変化、現代の社会環境などによるストレスの増加などにより脱毛で悩んでいる人口が増えつつある傾向にある。また、脱毛症に罹る人の年齢も低くなっており、しかも女性の脱毛症人口も上昇しつつある現状である。
【０００４】
このような脱毛症の治療や予防のために、これまで幅広く使用されている製剤の一つはミノキシジル含有製剤である。アメリカＦＤＡの承認を受けている毛髪再生剤は二つあり、ミノキシジルはそれら承認を受けている毛髪再生剤のうちの一つである。ミノキシジルは、当初は血圧降下を目的とした高血圧薬剤として開発された。しかしながら、この薬剤を使用した際に、副作用として発毛効果が観察されたことから、それ以後、この薬剤は、毛髪再生剤として有名になった。ミノキシジルが毛髪再生剤として作用するメカニズムについては明確に解明されていないが、ミノキシジルが血管を拡張させることにより血流量が増加し、それによって毛根に多くの栄養が供給され、その結果として毛髪の成育が増進されると推測されている。
【０００５】
このような血流量増加モデルはミノキシジルが毛根を構成する主要細胞である真皮乳頭で血管拡張に関わる成長因子である血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）の発現を増幅させるという最近の報告（Ｂｒ．Ｊ．ｏｆ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ．，１９９８，１３８，４０７〜４１１）によって間接的に支持されている。また、ミノキシジルの毛髪回復メカニズムにおける血管拡張効果以外にも、ミノキシジルが体外培養で毛根中の真皮乳頭細胞の活性化を増進すると共に、体外での小胞の細胞培養において毛嚢の成育を増進させることが報告されている（Ｓｋｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，１９９６，９，３〜８及びＪ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．，１９８９，９２，３１５〜３２０）。
これらの事実は、ミノキシジルが成長因子として毛根に直接作用していることを示している。
【０００６】
更に、最近メルク（Ｍｅｒｃｋ）社が発売開始したプロぺシア（Ｐｒｏｐｅｃｉａ）の主成分であるフィナステライド（ｆｉｎａｓｔｅｒｉｄｅ）は、脱毛症の治療剤として使用される。それは、男性ホルモンであるテストステロンが、テストステロンよりも更に強力な男性ホルモンであるジヒドロテストステロンに転換されることを抑制する。
１９９７年１２月、フィナステライドの１ｍｇタブレットが男性型脱毛症の治療のための毛髪再生剤としてＦＤＡから使用承認を受けて現在販売中である。臨床試験において、それは有意な毛髪成長促進効果を有することが証明されている。しかしながら、フィナステライドには、副作用として男性機能を抑制する虞があることも報告されている（Ｊ．Ａｍ．Ａｃａｄ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．，１９９８，３９，５７８〜５８９）。
フィナステライドもミノキシジルも臨床試験における効果がさほど優れず、しかも副作用に対する虞があることから、新たな改善された毛髪再生剤の開発のための研究が活発になされている。
【０００７】
サイクロスポリン系の薬剤は免疫抑制活性を有している。これらはまた、ウィルス、真菌類、原虫等の成長を抑制する効果を有していると共に、腎臓毒性、肝毒性、高血圧、歯周組織肥大、発毛効果等々の様々な生理学的な効果を副作用として有している（Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，１９９６，３５，１１４〜２４６及びＤｒｕｇ  Ｓａｆｅｔｙ，１９９４，１０，３１０〜３１７）。
代表的なサイクロスポリンであるサイクロスポリンＡは多数個のＮ−メチルアミノ酸と８番目の位置にＤ−アラニンを有する１１個のアミノ酸で構成された環状のペプチドであって、以下の構造式で表される。
【０００８】
【化１】
2004532807.tif 000002
【０００９】
上記式中、ＭｅＢｍｔは、Ｎ−メチル−（４Ｒ）−４−［（Ｅ）−２−ブテニル］−４−メチル−Ｌ−スレオニンを示し、ＡｂｕはＬ−α−アミノ酪酸を示し、Ｓａｒはザルコシンを示し、ＭｅＬｅｕはＮ−メチル−Ｌ−ロイシンを示し、ＶａｌはＬ−バリンを示し、ＡｌａはＬ−アラニンを示し、ＤＡｌａはＤ−アラニンを示し、ＭｅＶａｌはＮ−メチル−Ｌ−バリンを示す。
【００１０】
前記サイクロスポリンＡのアミノ酸の形態は、特に指定がなければＬ−配置であり、アミノ酸残基の番号は上記構造式で示した通り、ＭｅＢｍｔから出発して、即ち、ＭｅＢｍｔを１番にして、時計方向の順序で最後のＭｅＶａｌ（Ｎ−メチル−Ｌ−バリン）を１１番とした。サイクロスポリンＡからサイクロスポリンＺの多様な誘導体命名法は一般的に使用される方法に基づいた（Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ、１９８７、７０、１３−３６）。  例えば、サイクロスポリンＡの２番めの残基であるＡｂｕ（Ｌ−α−アミノ酪酸）だけがＬ−アラニンに置換されたサイクロスポリンＢとＬ−スレオニンに置換されたサイクロスポリンＣを異なる残基だけ表示する方法で、それぞれ［Ａｌａ］２サイクロスポリンと［Ｔｈｒ］２サイクロスポリンで表した。
【００１１】
サイクロスポリン分子の４番目又は７番目の残基のアミノ酸、或いはそれら両方のアミノ酸のカルボニルの酸素が硫黄で置換された３種のチオアミド誘導体は、周知の方法（Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ  １９９１，７４，１９５３−１９９０；Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．１９９３，５８，６７３−６７７；Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．１９９４，５９，７２４９−７２５８）に従って、それぞれサイクロスポリン ４−チオアミド（［４Ψ５ＣＳ−ＮＨ］サイクロスポリン）、サイクロスポリン ７−チオアミド（［７Ψ８ＣＳ−ＮＨ］サイクロスポリン）及びサイクロスポリン ４、７−ビス（チオアミド）（［４Ψ５ＣＳ−ＮＨ；７Ψ８ＣＳ−ＮＨ］サイクロスポリン）と命名した。
【００１２】
これまで、サイクロスポリンの毛髪再生剤としての開発可能性について多くの研究グループによって検討されてきた。特に、動物の発毛試験（Ａｒｃｈ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．Ｒｅｓ．，１９９６，２８８，４０８〜４１０）、ヒトの円形脱毛症（Ｊ．Ａｍ．Ａｃａｄ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．，１９９０，２２，２４２〜２５０）、ヒト男性型脱毛症（Ｊ．Ａｍ．Ａｃａｄ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．，１９９０，２２，２５１〜２５３及びＳｋｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，１９９４，７，１０１〜１０４）及び動物モデルでの化学療法による脱毛抑制効果（Ｃｌｉｎ．Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．，１９９５，１９０，１９２〜１９６及びＡｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．，１９９７，１５０，１４３３〜１４４１）などについての研究が幅広くなされてきた。マウスの背中での比較試験結果によれば、サイクロスポリンは、ミノキシジルより約１００倍ほど優れた発毛効果を有することが示されている。この結果に基づいて、サイクロスポリンを男性型脱毛症の治療剤として利用する試みがなされており、数多くの特許出願がなされている。
【００１３】
例えば、日本国特開昭６０-２４３００８号公報、特開昭６２-１９５１２号公報、及び特開昭６２-１９５１３号公報は、サイクロスポリン誘導体の毛髪再生剤としての利用を開示している。
また、ヨーロッパ公開特許第０４１４６３２号公報は、８番目の残基が修飾されたサイクロスポリン誘導体を開示しており、ＰＣＴ国際公開特許ＷＯ９３/１７０３９号公報及びＷＯ００/５１５５８号公報は、それぞれイソサイクロスポリン及び免疫抑制サイクロスポリン誘導体を開示している。これらのサイクロスポリン及びその誘導体は、毛髪再生剤として提示されている。
更に、アメリカ特許第５、８０７、８２０号及びイギリス特許第２、２１８、３３４Ａ号には、経皮吸収性に優れたサイクロスポリンを含んだ製剤の新しい用途として毛髪再生剤が示唆されている。
しかしながら、優れた毛髪回復活性を有し、且つ副作用のない新たな毛髪再生剤に対する要望は依然として無くならない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明は前述したような従来の技術の問題点を解決するために案出されたもので、サイクロスポリン分子の４番目のアミノ酸又は７番目のアミノ酸、或いはそれら両方のアミノ酸のカルボニル基の酸素が硫黄で置換されたサイクロスポリンのチオアミド誘導体から選ばれた毛髪再生活性を有する新規毛髪成長促進剤を提供することを目的とする。  硫黄で置換されたサイクロスポリンのチオアミド誘導体はサイクロスポリン分子の種々の誘導体化研究のために使用されてきた（Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ  １９９１，７４，１９５３−１９９０；Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．１９９３，５８，６７３−６７７；Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．１９９４，５９，７２４９−７２５８）。
本発明者らは、３種のサイクロスポリンチオアミド誘導体、即ち、サイクロスポリン分子の４番目のアミノ酸のカルボニル基の酸素が硫黄で置換されたサイクロスポリン４−チオアミド（［４Ψ５ＣＳ−ＮＨ］サイクロスポリン）、サイクロスポリン分子の７番目のアミノ酸のカルボニル基の酸素が硫黄で置換されたサイクロスポリン７−チオアミド（［７Ψ８ＣＳ−ＮＨ］サイクロスポリン）、及び４番目と７番目のアミノ酸のカルボニル基の酸素が硫黄で置換されたサイクロスポリン４，７−ビス（チオアミド）（［４Ψ５ＣＳ−ＮＨ；７Ψ８ＣＳ−ＮＨ］サイクロスポリン）を合成し、これらの毛髪再生効果について調べた。その結果、これら誘導体の全てが毛髪再生効果を有するわけではなく、サイクロスポリン７−チオアミド（［７Ψ８ＣＳ−ＮＨ］サイクロスポリン、Ｃ６２Ｈ１１１Ｎ１１Ｏ１１Ｓ）だけが毛髪再生効果を有することが判った。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
斯くして、本発明は、毛髪成長促進剤としての下式［１］で表されるサイクロスポリン７−チオアミド（［７Ψ８ＣＳ−ＮＨ］サイクロスポリン、Ｃ６２Ｈ１１１Ｎ１１Ｏ１１Ｓ）に関する。
【００１６】
【化２】
2004532807.tif 000003
【００１７】
上記式［１］において、
Ａは、Ｎ−メチル−（４Ｒ）−４−［（Ｅ）−２−ブテニル］−４−メチル−Ｌ−スレオニン（ＭｅＢｍｔ）、（２Ｓ、３Ｒ、４Ｒ、６Ｅ）−３−スルフヒドリル−４−メチル−２−（メチルアミノ）−６−オクテン酸、又は（２Ｓ、４Ｒ、６Ｅ）−３−オキソ−４−メチル−２−（メチルアミノ）−６−オクテン酸を示し、
Ｂは、Ｌ−アラニン（Ａｌａ）、Ｌ−スレオニン（Ｔｈｒ）、Ｌ−バリン（Ｖａｌ）、又はＬ−ノルバリン（Ｎｖａ）を示し、
Ｃは、ザルコシン、Ｄ−メチルアラニン（（Ｄ）−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ（ＣＨ３）−ＣＯ−）、Ｄ−２−（メチルアミノ）ペント−４−エノイル（（Ｄ）−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ（ＣＨ２ＣＨＣＨ２）−ＣＯ−）、Ｄ−２−（メチルアミノ）ペント−４−イノイル（（Ｄ）−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ（ＣＨ２ＣＣＨ）−ＣＯ）、又はＤ−メチルチオザルコシン（（Ｄ）−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ（ＳＣＨ３）−ＣＯ−）を示し、
Ｄは、Ｎ−メチル−Ｌ−ロイシン、γ−ヒドロキシ−Ｎ−メチル−Ｌ−ロイシン、又はＬ−バリンを示し、
Ｅは、Ｌ−バリン又はＬ−ノルバリンを示し、
Ｆは、Ｎ−メチル−Ｌ−ロイシン、γ−ヒドロキシ−Ｎ−メチルＬ−ロイシン又はＬ−ロイシンを示し、
Ａｌａｔｈｉｏは、Ｌ−アラニンチオアミド（［７Ψ８ＣＳ−ＮＨ］、ＮＨ−ＣＨＣＨ３−ＣＳ−）を示し、
Ｇは、Ｄ−アラニン又はＤ−セリンを示し、
Ｈは、Ｎ−メチル−Ｌ−ロイシン、γ−ヒドロキシ−Ｎ−メチル−Ｌ−ロイシン、又はＬ−ロイシンを示し、
Ｉは、Ｎ−メチル−Ｌ−ロイシン、γ−ヒドロキシ−Ｎ−メチル−Ｌ−ロイシン、又はＬ−ロイシンを示し、
Ｊは、Ｎ−メチル−Ｌ−バリン又はＬ−バリンを示す。
【００１８】
毛髪再生活性を有する上記式［１］で表されるサイクロスポリンの好ましい誘導体としては、下式［２］で表される化合物が挙げられる。
【００１９】
【化３】
2004532807.tif 000004
【００２０】
上記式［２］において、
ＭｅＢｍｔは、Ｎ−メチル−（４Ｒ）−４−［（Ｅ）−２−ブテニル］−４−メチル−Ｌ−スレオニンを示し、
Ａ’は、Ｌ−アラニン（Ａｌａ）、Ｌ−スレオニン（Ｔｈｒ）、Ｌ−バリン（Ｖａｌ）、又はＬ−ノルバリン（Ｎｖａ）を示し、
Ｂ’は、ザルコシン、Ｄ−メチルアラニン（（Ｄ）−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ（ＣＨ３）−ＣＯ−）、Ｄ−２−（メチルアミノ）ペント−４−エノイル（（Ｄ）−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ（ＣＨ２ＣＨＣＨ２）−ＣＯ−）、Ｄ−２−（メチルアミノ）ペント−４−イノイル（（Ｄ）−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ（ＣＨ２ＣＣＨ）−ＣＯ）、又はＤ−メチルチオザルコシン（（Ｄ）−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ（ＳＣＨ３）−ＣＯ−）を示し、
Ｃ’は、Ｎ−メチル−Ｌ−ロイシン、γ−ヒドロキシ−Ｎ−メチル−Ｌ−ロイシン、又はＬ−バリンを示し、
Ｄ’は、Ｌ−バリン又はＬ−ノルバリンを示し、
Ｅ’は、Ｎ−メチル−Ｌ−ロイシン、γ−ヒドロキシ−Ｎ−メチル−Ｌ−ロイシン又はＬ−ロイシンを示し、
Ａｌａｔｈｉｏは、Ｌ−アラニンチオアミド（［７Ψ８ＣＳ−ＮＨ］、ＮＨ−ＣＨＣＨ３−ＣＳ−）を示し、
Ｆ’は、Ｄ−アラニン又はＤ−セリンを示し、
Ｇ’は、Ｎ−メチル−Ｌ−ロイシン、γ−ヒドロキシ−Ｎ−メチル−Ｌ−ロイシン、又はＬ−ロイシンを示し、
Ｈ’は、Ｎ−メチル−Ｌ−ロイシン、γ−ヒドロキシ−Ｎ−メチル−Ｌ−ロイシン、又はＬ−ロイシンを示し、
ＭｅＶａｌは、Ｎ−メチル−Ｌ−バリンを示す
【００２１】
毛髪再生活性を有する上記式［１］で表される、より好ましいサイクロスポリンのチオアミド誘導体としては、下式［３］で表される化合物が挙げられる。
【００２２】
【化４】
2004532807.tif 000005
【００２３】
上記式［３］において、
ＭｅＢｍは、Ｎ−メチル−（４Ｒ）−４−［（Ｅ）−２−ブテニル］−４−メチル−Ｌ−スレオニンを示し、
Ａ”は、Ｌ−アラニン（Ａｌａ）、Ｌ−スレオニン（Ｔｈｒ）、Ｌ−バリン（Ｖａｌ）、又はＬ−ノルバリン（Ｎｖａ）を示し、
Ｓａｒは、ザルコシンを示し、
ＭｅＬｅｕは、Ｎ−メチル−Ｌ−ロイシンを示し、
Ｖａｌは、Ｌ−バリンを示し、
Ｂ”は、Ｎ−メチル−Ｌ−ロイシン又はＬ−ロイシンを示し、
Ａｌａｔｈｉｏは、Ｌ−アラニンチオアミド（［７Ψ８ＣＳ−ＮＨ］、ＮＨ−ＣＨＣＨ３−ＣＳ−）を示し、
ＤＡｌａは、Ｄ−アラニンを示し、
Ｃ”は、Ｎ−メチル−Ｌ−ロイシン又はＬ−ロイシンを示し、
Ｄ”は、Ｎ−メチル−Ｌ−ロイシン又はＬ−ロイシンを示し、
ＭｅＶａｌは、Ｎ−メチル−Ｌ−バリンを示す。
【００２４】
毛髪再生活性を有する上記式［１］で表される、更に好ましいサイクロスポリンのチオアミド誘導体としては、下記化学式［４］で表される化合物が挙げられる。
【００２５】
【化５】
2004532807.tif 000006
【００２６】
上記式において、
ＭｅＢｍｔは、Ｎ-メチル-(４Ｒ)-４-[(Ｅ)-２-ブテニル]-４-メチル-Ｌ-スレオニンを示し、
Ａｂｕは、Ｌ-α-アミノ酪酸を示し、
Ｓａｒは、ザルコシンを示し、
ＭｅＬｅｕは、Ｎ-メチル-Ｌ-ロイシンを示し、
Ｖａｌは、Ｌ-バリンを示し、
Ａｌａｔｈｉｏは、Ｌ−アラニンチオアミド（［７Ψ８ＣＳ−ＮＨ］、ＮＨ−ＣＨＣＨ３−ＣＳ−）を示し、
ＤＡｌａは、Ｄ−アラニンを示し、
ＭｅＶａｌは、Ｎ−メチル−Ｌ−バリンを示す。
【００２７】
サイクロスポリンＡ ７−チオアミドは、サイクロスポリンＡ分子の７番目のアミノ酸のカルボニル基の酸素（Ｏ）が硫黄（Ｓ）に置き換わったサイクロスポリンＡの誘導体であり、［７Ψ８ＣＳ−ＮＨ］（ＮＨ−ＣＨＣＨ３−ＣＳ−）サイクロスポリンＡ（Ｃ６２Ｈ１１１Ｎ１１Ｏ１１Ｓ）と記載される。
【００２８】
他方、本発明はまた、液状、スプレー、ゲル、ペースト、乳剤、クリーム、コンディショナー又はシャンプーに剤形化された毛髪成長促進剤に関する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２９】
以下に本発明を詳細に説明する。
本発明は新規な毛髪再生剤を開発するために種々のサイクロスポリンＡ誘導体を合成し、合成した誘導体について毛髪再生評価試験を行なった。その結果、サイクロスポリンＡ ７-チオアミドが、その他の化合物と比べて毛髪再生（回復）効果が著しく優れていることが判った。
【００３０】
以下の参考例及び実施例は、本発明の発明者らが実際に実施したベストモードの例示であり、本発明の範囲や発明思想を逸脱しない限りにおいて、これに種々の修正、付加、置換を行うことが可能であることは、当業者であれば十分理解出来るであろう。
【００３１】
参考例１
（１）アセチルサイクロスポリンＡの合成
サイクロスポリンＡ（２．４ｇ、２．０ｍｍｏｌ）と４−ジメチルアミノピリジン（０．２４ｇ、２．０ｍｍｏｌ）をピリジン２０ｍｌ及び無水酢酸２０ｍｌの混合溶媒に入れ室温で１８時間撹拌した後、減圧蒸留した。残査に塩化メチレン１００ｍｌを加えて水で洗浄し、無水硫酸マグネシウム（ＭｇＳＯ４）で乾燥した後、シリカゲルカラムクロマトグラフィで精製して標題化合物２．３ｇを得た。
【００３２】
（２−１）アセチルサイクロスポリンＡ ４，７−ビス（チオアミド）の合成
アセチルサイクロスポリンＡ（１．８ｇ、１．４５ｍｍｏｌ）をキシレン５０ｍｌに溶解した溶液を１３０℃で加熱した後、Ｌａｗｅｓｓｏｎ試薬（０．３５ｇ、０．８７ｍｍｏｌ）を少しずつ添加した。１３０℃で３０分間撹拌した後、室温まで冷却した。溶媒を減圧蒸留して除いた後、残査に塩化メチレン１００ｍｌを加えて水で洗浄した。無水硫酸マグネシウム（ＭｇＳＯ４）で乾燥後、シリカゲルカラムクロマトグラフィで精製して標題化合物（０．５７ｇ）を得た。
【００３３】
（２−２）アセチルサイクロスポリンＡ ４−チオアミドの合成
アセチルサイクロスポリンＡ（１．８ｇ、１．４５ｍｍｏｌ）をキシレン５０ｍｌに溶解した溶液を１３０℃で加熱した後、Ｌａｗｅｓｓｏｎ試薬（０．３５ｇ、０．８７ｍｍｏｌ）を少しずつ添加した。１３０℃で３０分間撹拌した後、室温まで冷却した。溶媒を減圧蒸留して除いた後、残査に塩化メチレン１００ｍｌを加えて水で洗浄した。無水硫酸マグネシウム（ＭｇＳＯ４）で乾燥後、シリカゲルカラムクロマトグラフィで精製して標題化合物であるアセトキシ化合物（０．０８ｇ）を得た。
【００３４】
（３−１）サイクロスポリンＡ ４，７−ビス（チオアミド）の合成
アセトキシ化合物であるアセチルサイクロスポリンＡ ４，７−ビス（チオアミド）（０．３２ｇ、０．２５ｍｍｏｌ）をメチルアルコール５０ｍｌに溶解した後、０．５Ｍナトリウムメトキシド／メタノール溶液（２０ｍｌ、１０ｍｍｏｌ）を添加し、室温で４時間撹拌した。反応液を酢酸で中和後、溶媒を減圧蒸留して除き、残査に塩化メチレン１００ｍｌを加えて水で洗浄した。無水硫酸マグネシウム（ＭｇＳＯ４）で乾燥後、シリカゲルカラムクロマトグラフィで精製し、次いで、ＨＰＬＣで精製して標題化合物０．２７ｇを得た。
【００３５】
（３−２）サイクロスポリンＡ ４−チオアミドの合成
アセトキシ化合物であるアセチルサイクロスポリンＡ ４−チオアミド（０．２ｇ）をメチルアルコール５０ｍｌに溶解した後、０．５Ｍナトリウムメトキシド／メタノール溶液（２０ｍｌ、１０ｍｍｏｌ）を添加して、室温で４時間撹拌した。反応液を酢酸で中和後、溶媒を減圧蒸留して除き、残査に塩化メチレン１００ｍｌを加えて水で洗浄した。無水硫酸マグネシウム（ＭｇＳＯ４）で乾燥後、シリカゲルカラムクロマトグラフィで精製し、次いで、ＨＰＬＣで精製して標題化合物０．１６ｇを得た。
【実施例１】
【００３６】
サイクロスポリンＡ７-チオアミドの合成
（１）アセチルサイクロスポリンＡの合成
サイクロスポリンＡ（２．４ｇ）と４−ジメチルアミノピリジン（０．２４ｇ、２．０ｍｍｏｌ）をピリジン２０ｍｌ及び無水酢酸２０ｍｌの混合溶媒中に入れ、室温で１８時間撹拌した後、減圧蒸留した。残査に塩化メチレン１００ｍｌを加えて水で洗浄した後、無水硫酸マグネシウム（ＭｇＳＯ４）で乾燥し、シリカゲルカラムクロマトグラフィで精製して標題化合物２．３ｇを得た。
【００３７】
（２）アセチルサイクロスポリンＡ ７−チオアミドの合成
アセチルサイクロスポリンＡ（１．８ｇ）をキシレン５０ｍｌに溶解した溶液を１３０℃で加熱した後、Ｌａｗｅｓｓｏｎ試薬（０．３５ｇ、０．８７ｍｍｏｌ）を少しずつ添加した。１３０℃で３０分間撹拌した後、室温まで冷却した。溶媒を減圧蒸留して除いた後、残査に塩化メチレン１００ｍｌを加えて水で洗浄し、無水硫酸マグネシウム（ＭｇＳＯ４）で乾燥した後、シリカゲルカラムクロマトグラフィで精製して標題化合物であるアセトキシ化合物（０．１９ｇ）を得た。
【００３８】
（３）サイクロスポリンＡ ７−チオアミドの合成
アセトキシ化合物であるアセチルサイクロスポリンＡ ７−チオアミド（０．２ｇ）をメチルアルコール５０ｍｌに溶解した後、０．５Ｍナトリウムメトキシド／メタノール溶液（２０ｍｌ、１０ｍｍｏｌ）を添加して、室温で４時間撹拌した。反応液を酢酸で中和後、溶媒を減圧蒸留して除き、残査に塩化メチレン１００ｍｌを加えて水で洗浄した。無水硫酸マグネシウム（ＭｇＳＯ４）で乾燥後、シリカゲルカラムクロマトグラフィで精製し、次いで、ＨＰＬＣで精製して標題化合物０．１７ｇを得た。
【００３９】
（４）サイクロスポリンＡ７-チオアミドの構造確認
上記（３）で得られたサイクロスポリンＡ ７-チオアミドの分子量は、ＦＡＢ ＭＳ（ＺＭＳ ＡＸ ５０５Ｈ）を用いて測定した。
［Ｍ＋Ｈ］＋ピークは、ｍ／ｚ １２１８．８で観察された。また、その構造は、１Ｈ−ＮＭＲ（Ｂｒｕｋｅｒ ＮＭＲ ６００ＭＨｚ）および１３Ｃ−ＮＭＲ（Ｂｒｕｋｅｒ ＮＭＲ １５０ＭＨｚ）を用いて確認した。
チオアミドが形成されると考えられた７番目の残基であるアラニン、及び上流及び下流の残基、即ち、６番目の残基であるＮ−メチル−Ｌ−ロイシン及び８番目の残基であるＤ−アラニンの水素と炭素の化学シフト（δ）を測定した（図１及び図２）。得られたデータを基に３つの残基の配列を決定して、既存の分子の構造と比較した。
【００４０】
ＴＯＣＳＹ（全相関分光法）により、アラニン１及びアラニン２のα位の水素が４．７３ｐｐｍと５．３５ｐｐｍに化学シフトし、Ｒ基のメチルの水素が１．５８ｐｐｍ及び１．３７ｐｐｍに化学シフトして、６番目の残基であるロイシンに対し４個のピークがあることが観察された（図３）。
ＣＯＳＹ（同核相関分光法）により、アラニン１及びアラニン２のアミノ基の水素がそれぞれ７．５６ｐｐｍ及び８．８６ｐｐｍに帰属した。
ＮＯＥＳＹ（核オーバーハウザー効果分光法）により、アラニン１のアミノ基の水素の７．５６ｐｐｍは、ＴＯＣＳＹによりロイシンのα位の水素であることが証明され、α位の水素である４．９５ｐｐｍの近傍に局在していることが判った。  かくして、アラニン１−ロイシンの部分連結配列が決定された。一方、炭素ＮＭＲにおいて、ピークが２０２．１５ｐｐｍで観察された。即ち、カルボニル基の酸素原子が硫黄原子で置換されたときに、炭素のピークが約３０ｐｐｍ低磁場方向に動いた（低磁場シフト）と言うこと、及びこの化学シフトはチオアミドの炭素により起こったと言うことが判る（Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ  １９９１，７４，１９５３−１９９０；Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．１９９３，５８，６７３−６７７；Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．１９９４，５９，７２４９−７２５８）。
更に、ピークが２０２．１５ｐｐｍで観察され、２〜３個の結合以内に存在する近接した水素がアラニン１及びアラニン２のα位の水素（４．７３ｐｐｍ及び５．３５ｐｐｍ）、アミノ基の水素（７．５６ｐｐｍ及び８．８６ｐｐｍ）及びメチル基の水素（１．５８ｐｐｍ）であったというデータに基づいて、ＨＭＢＣ（異核間多結合相関分光法）により、チオアミドはアラニン１に局在し、アラニン２（８番目のＤ−アラニン）、アラニン１（７番目のアラニン）及びロイシン（６番目のメチルロイシン）の配列が確定されたことが判る。
【００４１】
ＨＭＱＣ（ヘテロ核多重量子コヒーレンス）を用いて７番目と８番目のアミノ酸の炭素の化学シフトを測定した。
７番目のアラニン：
１Ｈ−ＮＭＲ（６００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ ７．５６（ＮＨ），４．７３（Ｈ−Ｃα）及び１．５８（３Ｈ−Ｃβ）。
１３Ｃ−ＮＭＲ（１５０ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：δ ２０２．１５（Ｃ＝Ｓ），５５．９７（Ｃα），２０．１４（Ｃβ）。
８番目のＤ−アラニン：
１Ｈ−ＮＭＲ（６００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ ８．８６（ＮＨ），５．３５  （Ｈ−Ｃα）及び１．３７（３Ｈ−Ｃβ）。
１３Ｃ−ＮＭＲ（１５０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ １７２．６７（Ｃ＝Ｏ），５５．１２（Ｃα），１６．３７（Ｃβ）。
【００４２】
処方例１  サイクロスポリンＡ ７-チオアミド含有発毛トニックの調製
表１に記載されている如く、サイクロスポリンＡ ７-チオアミドの含有量が異なる３種の発毛トニックを調製した。
固体成分が溶解して発毛トニックが均一な溶液になるように、各成分はよく混合し撹拌した。得られたトニックは、後述する試験例１に従って、動物モデルにおいて毛髪再生効果を調べた。動物試験において、サイクロスポリンＡ ７-チオアミドを０．１％含有する組成物１は、サイクロスポリンＡを０．１％含有する発毛トニックと同等の毛髪再生効果を有することが判った。
【００４３】
【表１】
2004532807.tif 000007
【００４４】
処方例２  サイクロスポリンＡ ７-チオアミド含有ヘアークリームの調製
表２に記載されている如く、サイクロスポリンＡ ７-チオアミドの含有量が異なる３種のヘアークリームを調製した。
各成分が均一な混合物になるように、油状成分は混合して、８０℃に加熱した。また、これとは別に、各成分が均一な混合物になるように、水性成分も混合して、８０℃に加熱した。調製した８０℃の油相原料と水相原料を混合し乳化した。乳化後、常温まで冷却した後、香料と着色剤を添加してヘアークリームを製造した。この段階で、ヘアークリームの全量が１００重量％になるように水を添加した。
得られたヘアークリームは、後述する試験例１に従って、動物モデルにおいて毛髪再生効果を調べた。動物試験において、サイクロスポリンＡ ７-チオアミドを０．１％含有する表２に記載の組成物１は、サイクロスポリンＡを０．１％含有するヘアークリームと同等の毛髪再生効果を有することが判った。
【００４５】
【表２】
2004532807.tif 000008
【００４６】
処方例３  サイクロスポリンＡ ７-チオアミド含有シャンプーの調製
表３に記載されている如く、サイクロスポリンＡ ７-チオアミドの含有量が異なる３種のシャンプーを調製した。
香料、着色剤及び水以外の成分を混合し、各成分が均一な混合物になるように、撹拌しながら加熱した。得られた混合物を常温まで冷却した後、これに香料と着色剤を添加し、最後に水を添加してシャンプーの全量が１００重量％になるようにした。
【００４７】
【表３】
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【００４８】
処方例４  サイクロスポリンＡ ７-チオアミド含有ヘアーコンディショナーの調製
表４に記載されている如く、サイクロスポリンＡ ７-チオアミドの含有量が異なる３種のヘアーコンディショナーを調製した。
各成分が均一な混合物になるように、油状成分は混合して、８０℃に加熱した。また、これとは別に、各成分が均一な混合物になるように、水性成分も混合して、８０℃に加熱した。調製した８０℃の油相原料と水相原料を混合し乳化した。乳化後、常温まで冷却した後、香料と着色剤を添加してヘアーコンディショナーを製造した。ここで、水を添加してヘアーコンディショナーの全量が１００重量％になるようにした。
【００４９】
【表４】
2004532807.tif 000010
【００５０】
試験例１  サイクロスポリンＡ  ７−チオアミド誘導体の毛髪再生効果試験
生後４２〜４９日のＣ５７ＢＬ／６マウス（雌）を使用して試験を行った。
先ず初めに、マウスの背中部位の毛を電気剃刀を用いて除去し、体重を測定した。体重が均一に分散されるようマウスを幾つかのグループに分けた。順応期間を１日設けた後、サイクロスポリンＡ、サイクロスポリンＡ  ７−チオアミド及び対照群１００μｌ（０．１％  ｗ／ｖ）をその除毛部位に、個体あたり１日１回、３０日間塗布した。育毛の程度は肉眼で観察し、マウスの背中を写真撮影した。
図４はＣ５７ＢＬ／６マウスを用いてサイクロスポリンＡとサイクロスポリンＡ−チオアミド誘導体の発毛効果を評価した際の、対照群の写真を示す。図５はＣ５７ＢＬ／６マウスを用いてサイクロスポリンＡとサイクロスポリンＡ ７−チオアミド誘導体の発毛効果を評価した際の、サイクロスポリンＡで処理した場合の写真を示す。図６はＣ５７ＢＬ／６マウスを用いてサイクロスポリンＡとサイクロスポリンＡ ７−チオアミド誘導体の発毛効果を評価した際の、サイクロスポリンＡ ７−チオアミドで処理した場合の写真を示したもので、サイクロスポリンＡと同等な効果を示すことが判る。図７及び図８は、Ｃ５７ＢＬ／６マウスを用いてサイクロスポリンＡとサイクロスポリンＡ−チオアミド誘導体の発毛効果を評価した際の、サイクロスポリンＡ ４、７−ビス（チオアミド）で処理した場合の写真及びサイクロスポリンＡ ４−チオアミドで処理した場合の写真をそれぞれ示したもので、顕著な効果が認められないことが判る。
３０日の試験期間の間中、マウスの背中の状態を観察したが、対照群及び全ての処理群で特異な皮膚刺激所見は観察されなかった。
【００５１】
試験例２  サイクロスポリンＡ ７-チオアミドの免疫抑制力試験
本発明に係るサイクロスポリンＡ  ７−チオアミドの細胞分裂抑止能を、ＭＬＲ法（Ｍｉｘｅｄ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  ｒｅａｃｔｉｏｎ，Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ，１９９４，４７，２０８〜２１５）に従って、末梢血単核球細胞（ＰＢＭＣ）を細胞分列刺激剤である植物性血球凝集素（ＰＨＡ）で処理することにより求めた。
【００５２】
マイトマイシン−Ｃ（３０μｇ／ｍｌ，３０分）で処理した細胞群（４×１０６／ｍｌ）を賦活細胞として使用して、同数の未処理の反応細胞群と混合して４日間培養した。この間、混合物を１０−６〜１０−１１モル段階希釈のサイクロスポリンＡ及びサイクロスポリンＡ ７-チオアミドを含むその誘導体で処理した。
４日培養した後、混合物に３Ｈ−チミジンを添加し、更に１６時間培養した。
その後、細胞に導入されたチミジン量を測定（液体シンチレーション計数器）して、各サイクロスポリン類のＩＣ５０（μｇ／ｍｌ）を算出した。
【００５３】
その結果、サイクロスポリンＡのＩＣ５０（μｇ／ｍｌ）が０．０５６、０．０５２及び０．０２３であるのに対し、サイクロスポリンＡ ７-チオアミドのそれは０．５８１、０．６０１及び０．４５３であった。
このことから、サイクロスポリンＡ ７-チオアミドは、サイクロスポリンＡよりも免疫抑制効果が低いことが判った。これは文献（Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ，１９９１，７４，１９５３〜１９９０）のデータと一致した。
また、サイクロスポリンＡ ７−チオアミドのＰＨＡ刺激に対する細胞分裂抑制能測定実験では、ＰＨＡ（１０μｇ／ｍｌ）で処理した単核細胞（４×１０６／ｍｌ）に、サイクロスポリンＡ及びサイクロスポリンＡ ７-チオアミドを含むその誘導体を段階希釈で１０−６〜１０−１１モル添加した後、３日間培養した。
その後、ＭＬＲ法と同様に、３Ｈ−チミジンを各細胞に添加し、更に１６時間培養を続けた。培養後、各サイクロスポリン類のＩＣ５０（μｇ／ｍｌ）を算出した。  この結果から、サイクロスポリンＡ７−チオアミドは、サイクロスポリンＡと比べて免疫抑制力が減少していることが判った。
【００５４】
本発明の毛髪再生剤において、毛髪再生を促す投与量は、組成物の全重量に対して０．０１〜３０％、好ましくは０．１〜１０％濃度である。
【産業上の利用可能性】
【００５５】
サイクロスポリンＡ ７−チオアミドを有効成分として含んでなる本発明の毛髪成長促進剤は、免疫抑制力は弱いながらも、より優れた毛髪回復効果に通じる、優れた毛髪成長促進効果を有する。
【図面の簡単な説明】
【００５６】
【図１】図１はサイクロスポリンＡ ７−チオアミドの１Ｈ−ＮＭＲスペクトルである。
【図２】図２はサイクロスポリンＡ ７−チオアミドの１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルである。
【図３】図３はサイクロスポリンＡ ７−チオアミドのＴＯＣＳＹ（全相関分光法）の結果を示す図である。
【図４】図４はＣ５７ＢＬ/６マウスを用いてサイクロスポリンＡとそのチオアミド誘導体の発毛効果を評価した際の、対照群の写真を示す。
【図５】図５はＣ５７ＢＬ/６マウスを用いてサイクロスポリンＡとそのチオアミド誘導体の発毛効果を評価した際の、サイクロスポリンＡで処理した場合の写真を示す。
【図６】図６はＣ５７ＢＬ/６マウスを用いてサイクロスポリンＡとそのチオアミド誘導体の発毛効果を評価した際の、サイクロスポリンＡ ７−チオアミドで処理した場合の写真を示す。
【図７】図７はＣ５７ＢＬ/６マウスを用いてサイクロスポリンＡとそのチオアミド誘導体の発毛効果を評価した際の、サイクロスポリンＡ ４、７−ビス（チオアミド）で処理した場合の写真を示す。
【図８】図８はＣ５７ＢＬ/６マウスを用いてサイクロスポリンＡとそのチオアミド誘導体の発毛効果を評価した際の、サイクロスポリンＡ ４−チオアミドで処理した場合の写真を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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