(57)【要約】ポリアクリルアミドゲル中で、他の物質から分離された標的生体分子を直接的に検出するための改良方法。改良点は、標的生体分子とプローブを結合させる前であって、且つ、標的生体分子がゲル中に存在している間に、（１）ゲルを少なくとも約１０％収縮させるために、水混和性の水抽出媒質にゲルを浸すこと、次いで（２）実質的に元の大きさにゲルを戻すために、ゲルを水で洗浄することに依拠している。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１）ゲルでの電気泳動によって、標的生体分子がゲル中に存在するように、他の物質から該生体分子を分離し、（２）検出性シグナルを提供し得る標識を有するプローブに該生体分子を結合させ、（３）ゲルから非結合プローブを除去し、（４）標的生体分子と結合した標識プローブの存在に起因するシグナルを観察することによって標的生体分子の存在を検出することを含む、ポリアクリルアミドゲル中で標的生体分子を直接的に検出する方法において、
標的生体分子をプローブに結合させる前であって、且つ、標的分子がゲル中で分離された状態にある間に、（Ａ）ゲルを少なくとも約１０％収縮させ、次いで、（Ｂ）実質的に元の大きさにゲルを戻すのに十分な時間、ゲルを水で洗浄するという点で改良された、方法。
【請求項２】
（Ａ）におけるゲルの収縮が、ゲルを約１０％以上約５０％未満にて収縮させるのに十分な時間において、水混和性の水抽出媒質にゲルを浸すことによって行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ゲルの収縮が約１５％以上約３５％未満である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
水抽出媒質が、水、及び約１０−７５％ｖ／ｖの量で存在する短鎖アルコールを含有する、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
アルコールが、約３５−６５％ｖ／ｖの量で存在するメタノール、エタノール、イソプロパノール又はそれらの組合せである、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
アルコールが、約５０％ｖ／ｖの量で存在するイソプロパノールである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
ゲルの収縮が約２０％である、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
ゲルの収縮が約２０％である、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
シグナルが蛍光性又は発光性である、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
標識が酵素であり、且つ検出される蛍光性又は発光性シグナルが、基質に対する酵素の作用により生成する、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
酵素がアルカリホスファターゼであり、且つ観察されるシグナルが蛍光性である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
酵素が西洋ワサビペルオキシダーゼであり、且つ観察されるシグナルが発光性である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
基質がルミノールである、請求項１２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、標的物質の検出に関し、より詳細には、電気泳動によって分離された生体分子のゲル中での直接的検出に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
固相上での、生体分子などの標的物質の捕捉は、更なる同定を容易にするために、及び他の物質との相互作用の様式を研究するために長年使用されてきた。典型的相互作用は、抗原と抗体、ホルモンとレセプター、ビオチン化分子とビオチン結合蛋白質などの間のような蛋白質間の相互作用である。補足の１方法は、「ブロッティング」と一般的には命名され、それでは、標的分子が、ニトロセルロース、ポリビニリデン ジフルオライド（ＰＶＤＦ）、又はナイロンなどの膜に、直接的に、又は他の媒質からの転写によって適用される。
【０００３】
ブロッティングは、公知のゲル電気泳動法と組合せて頻繁に使用され、そこでは、先ず、標的物質（例えば、抗原）が、典型的には、通常ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動）と呼ばれる電気泳動法によって、他の物質からゲル上で分離される。次いで、標的物質は、膜に電気泳動で転写される。その後、標的は、抗体などのレポータープローブと、アフィニティ相互作用によって、直接的に又は介在する１次リガンドにより間接的に結合する。当該レポータープローブは、それに結合した、検出性シグナルを提供し得る標識を有する。放射性標識、比色標識、蛍光標識、酵素標識が、検出性シグナルを提供するために通常使用される。検出性シグナルは、次いで、標的分子の存在及び／又は位置を示す。放射性標識及び蛍光標識からの応答は、一般的には直接的に測定され、一方、検出性シグナルが適当な基質に対する酵素の作用から生じるという点で、酵素標識によって生じる応答（発光、蛍光、又は比色）は間接的である。
【０００４】
膜への更なるブロッティングを伴う電気泳動分離方法は、歴史的には、ウエスタンブロッティング、ノーザンブロッティング、又はサザンブロッティングと文献では呼ばれてきた。ウエスタンブロッティングは、標的物質としての抗原の同定を指し、後者の２方法は、それぞれ標的ＲＮＡ配列及びＤＮＡ配列の同定を指す。最近、ファーウエスタンブロッティングと呼ばれるウエスタンブロッティングのバリエーションが、抗原・抗体以外の蛋白質・蛋白質相互作用をキャラクタライズするために用いられている。
【０００５】
ウエスタンタイプや他のブロッティング技術に付随する欠点は、時間を浪費し、煩雑な工程を必要とする点である。これらは、ゲルから物質が固定化される膜への標的物質の転写、次いで膜のブロッキングを含む。これらの工程の幾つか、特に転写と固定化の操作は、アッセイする蛋白質に不利に影響しうる。例えば、蛋白質の抗原性の変化は、対応する抗体が結合するのを妨害し、従って、標的分子の検出を妨害しうる。また、粗溶解液が転写されるとき、膜上で得られるパターンは、真の表示でない可能性もある。なぜなら、より低分子量の蛋白質は、より高分子量の蛋白質よりも効率的に転写するからである。更に、蛋白質の一部は簡単には十分に転写せず、従って、膜上に全く現れない。
【０００６】
従って、ゲルから標的を除去することなく検出が行われる「ゲル中 (in gel)」方法は、明確な利点を有する。そして、ポリアクリルアミドゲル中での標的分子の検出のための「ゲル中」技術は、上記ブロッティング技術の前にも報告されていたが(Burridge, K. (1976) Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 73, 4457-4461;  Rosta, J.A.; Kelly, P.T.; 及び Cotman, C.W. (1977) Anal. Biochem., 80, 336-376; 並びに Olden, K. 及び Yamada K.M. (1977) Anal. Biochem, 78, 483-490)、その方法は、非常に時間を浪費し、長い固定工程、インキュベーション工程及び洗浄工程を伴い、一般的に数日のオーダーを必要とした。更に、「ゲル中」技術は、例えば、抗原−抗体相互作用等の、大きなレポータープローブを用いた標的分子の検出には感度が充分ではないと今まで考えられていた。遭遇する問題は、低濃度の標的の検出を可能とするために必要とされる標的とプローブとの結合を達成するために、３次元ゲル中へのプローブ又は１次リガンドの十分な浸透を得ることである。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
従って、追求する目的は、生体分子の検出において感度が良い有用な効率的「ゲル中」検出方法を提供することである。そして、本発明が関する目的は、この点である。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
発明の概要
本発明によれば、標的生体分子をゲル中で直接的に検出する方法の改良が提供される。本改良が適用される方法は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって、標的生体分子をゲル中に存在させつつ、他の物質から標的生体分子を分離し、当該生体分子を、検出性シグナルを提供し得る標識を有するプローブに（直接的又は間接的に）結合させることを含む。該方法は更に、任意の非結合プローブをゲルから除去し、標的と結合している標識プローブの存在に起因するシグナルを観察することによって標的生体分子の存在を検出することを含む。
【０００９】
本発明によって提供される改良点は、標的分子がゲル中で分離された後であって、且つ標的生体分子のプローブへの結合の開始前に、以下の２工程を行うことに依拠する。第１工程は、少なくとも約１０％、好ましくは少なくとも約１５％、ゲルを収縮させることである。次いで、第２工程では、ゲルを実質的に元の大きさに戻すのに十分な時間、ゲルを水で洗浄する。本発明によれば上記方法が行われた後、インキュベーション工程、洗浄工程、及び検出工程によりアッセイを従来通り継続することができる。
【発明の効果】
【００１０】
一旦従来の電気泳動が終了すると、本発明によって提供される改良点を利用することで、アッセイを迅速に終了させることが可能となることは、明らかである。なぜなら、膜への転写の必要性がないからである。本発明によって提供される改良方法は、電気泳動の終了から、１次リガンドとの初めのインキュベーション、又は標的プローブとの直接的な初めのインキュベーションまでの約３０分間が経過する間に行うことができる。これは、通常のブロッティング方法に伴う膜の準備、転写、ブロッキング操作に必要とされる少なくとも約２．５−３時間の典型的時間と比較されるべきである。そして、分離された標的分子を膜に転写又は固定化する必要が無いので、標的分子に対するダメージが回避される。非常に驚くべきことに、本発明の方法は、少量の高分子（例えば、蛋白質）のゲル中での直接的検出に適用できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
発明の説明
本発明によって提供される改良点は、ドデシル硫酸ナトリウムを含む水性ポリアクリルアミドゲル中での電気泳動によって物質を分離するＳＤＳ−ＰＡＧＥとして知られる技術に関し一般的に適用可能である。本改良点は、特に、抗原、抗体、糖蛋白質及び他の蛋白質などの蛋白質生体分子の検出に適用できる。本改良点はまた、ゲル電気泳動によって分離されるビオチン化分子及び他の予め標識された分子での使用を見出す。一旦ゲル上で分離、同定されると、ゲル中の蛋白質バンドは、更なるキャラクタリゼーション及び同定のためにゲルから回収できる。
【００１２】
前述の観点により、本発明は、ポリアクリルアミドゲル中で直接的に標的生体分子を検出する改良された方法を提供する。（１）ゲルでの電気泳動によって他の物質から標的生体分子を分離し、（２）検出性シグナルを提供し得る標識を有するプローブに該標的生体分子を結合させ、（３）ゲルから非結合プローブを除去し、（４）標的生体分子と結合した標識プローブの存在に起因するシグナルを観察することによって標的生体分子の存在を検出することを含む方法において、改良点は、標的生体分子とプローブを結合させる前であって、且つ、標的分子がゲル中で分離された状態にある間に、（Ａ）ゲルを少なくとも約１０％収縮させ、次いで、（Ｂ）実質的に元の大きさにゲルを戻すのに十分な時間、ゲルを水で洗浄することを含む。
【００１３】
本発明は、検出性シグナルを直接的又は間接的に提供し得る、以前に同定されている種々の実体で標識されたプローブに対して有用である。通常、シグナルは、比色性、蛍光性、又は発光性である。しかし、本発明は、基質との接触により検出可能な発光又は蛍光シグナルを生じる酵素標識を含むプローブとの組合せにおいて特に有用であると考えられる。西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）及びアルカリホスファターゼは有用な酵素である。ＨＲＰが使用されるとき、望ましくは基質はルミノールである。
【００１４】
特に好適な酵素検出系は、1997年10月23日公開のＷＯ 97/39142（この開示は、引用により全部が本明細書に含まれるものとする）に記載されている。そこでは、標識としてＨＲＰを含むプローブが開示されている。ルミノール基質、過酸化水素源、及び増強剤の存在下、ＨＲＰは、持続性の強い発光シグナルを生じる酸化反応を触媒する。本発明の改良方法との組合せにおけるこの系の使用によって、大きな標的生体分子と１次リガンドを用いる蛋白質の「ゲル中」検出が高められる。この発光技術に基づく系は、Pierce Chemical Company, Rockford, ILによって、Supersignal（登録商標）商品名で市販されている。
【００１５】
本発明の実施において、重要な局面は、ゲル中での標的生体分子の電気泳動分離後であって、標的のプローブとの結合の達成を生じるインキュベーション工程（標識プローブと直接的に、又は先ず１次リガンドと間接的に）の開始前に、ゲルを収縮させることである。この目的のために、所望の収縮を達成するのに十分な時間、水混和性の水抽出媒質中に湿ゲルを浸すことができる。水、及びメタノール、エタノール、イソプロパノール、又はそれらの組合せなどの短鎖アルコールからなる媒質は、非常に有用であると考えられる。アルコールの代わりに、又はそれと組合せて、ポリエチレングリコールなどの他の水混和性成分も同様に有用でありうる。
【００１６】
水抽出媒質中のアルコールは、約１０−７５％ｖ／ｖの量で存在する。より高濃度では、ゲルが過度に収縮しゲルの脆化が生じる傾向があるのに対し、より低濃度では、相応な時間であっても不十分な収縮しか達成されない。アルコール濃度は、好ましくは約４０−６０％ｖ／ｖ、より好ましくは約５０％ｖ／ｖである。好ましくは、アルコールは、約３５−６５％ｖ／ｖの量のメタノール、エタノール、イソプロパノール、又はそれらの組合せである。より好ましくは、アルコールは、約５０％ｖ／ｖの量のイソプロパノールである。本発明を更に行うに当り、ゲルは、ゲルの元の表面積に基づき、少なくとも約１０％、好ましくは少なくとも約１５％、最も好ましくは約２０％の収縮を達成するのに十分な時間、アルコール媒質中で維持される。所望の収縮を達成するためには、通常、約１５分の浸漬が適切である。有害な脆化を最小にするために、収縮は約５０％未満、一般的には約３５％未満であるべきである。
【００１７】
収縮後、及び本発明によって提供される改良をさらに進めるに当り、収縮ゲルを水のみにより又は適切な緩衝液により洗浄し、ゲルから抽出媒質を除去し、次いでゲルを再水和させて、実質的に元のサイズ、即ち、元の大きさと同じ又は僅かに（約５％）小さい若しくは大きいサイズ（一般的には僅かに大きいサイズ）までゲルを戻す。任意の洗浄方法を用いることができるが、ゲル検出方法のために設計されたコランダーを用いることで、洗浄を容易に行なうことができる。
【００１８】
一旦、洗浄による再水和によりサイズが戻されると、標識された標的プローブを含有する溶液中で、ゲルを直接的にインキュベートすることができる。あるいは、間接的サンドイッチアプローチを用いる場合、標的生体分子に特異的なアフィニティを有する１次リガンドを含有する溶液中で、初めにインキュベーションを行うことができ、続いて、１次リガンドに対するアフィニティを有するレポータープローブを含有する溶液中で第２のインキュベーションを行うことができる。いずれの場合であっても、プローブは、標的生体分子と選択的に結合する。アッセイ方法における幾つかの段階で、ゲルを超音波処理することによってアッセイの感度／強度を高めることができる。インキュベーションに続いて、洗浄と応答誘発という通常の実施後にアッセイを終了できる。
【００１９】
ＳＤＳ−ポリアクリルアミドなどの、電気泳動の適用で有用な多くのゲルのいずれもが、市販されているものであっても、又は個別に調製されるものであっても、本発明において有用である。ゲルは、均質なものであっても、勾配 (gradient)を有するものであってよい。Novexから市販されているPre-cast, Tris-Glycine, Bis-Tris, Tris-Acetate及びTricineゲルが、特に有用であることが見出されている。
【００２０】
更に、１次元電気泳動を参照することで本発明を説明したが、２次元（２Ｄ）分離を伴う電気泳動操作に関しても同様に適用することができる。２Ｄ分離では、ゲル電気泳動の工程の前に、等電点電気泳動により物質が分離される。第１次元のみのゲル電気泳動が標的生体分子を分離するのに十分ではないとき、２Ｄ方法が最も有用である。
【実施例】
【００２１】
実施例
以下の実施例により本発明を説明する。実施例で使用する試薬及び材料は以下の通りである。
【００２２】
純粋なグルタチオン-S-トランスフェラーゼ (GST) 及び抗GST、ウサギポリクローナルIgGは、Santa Cruz BioTechnology (Santa Cruz, CA) から得た。組換えマウスId-1:GST、マウスId-2:GST及びマウスId-3:GSTを発現しているE.coli細菌細胞溶解液は、PharMingen (San Diego, CA) からであった (Id蛋白質の一般的考察については、例えば、Kadesch, T. (1993) Cell Growth Differ., 4, 49-55を参照のこと)。マウス抗ペンタ-His抗体及びHisタグラダーは、Qiagen (Chatsworth, CA) からであった；リビングカラー A.v.ペプチド (Living Color A.v. Peptide) (緑色蛍光蛋白質[GFP]に特異的)抗体，ウサギ，抗6×His抗体，HRP及びGFPモノクローナル抗体，マウスは、ClonTech (Palo Alto, CA)からであった。Tris-Glycine SDSサンプル緩衝液 (2×) は、Novex (San Diego, CA)から得た。9H-(1,3-ジクロル-9,9-ジメチルアクリジン-2-オン-7-イル)−ホスフェート (DDAO-ホスフェート)及びヤギ抗ウサギ，アルカリホスファターゼは、Molecular Probesからであった。増強性化学発光 (ECL) は、Amersham Pharmacia Biotechから得た。Developer/Replenisher及び Fixer/Replenisherは、Sigma Chemical Corporation (St. Louis, MO) から得た。勾配及び均質Tris-Glycineポリアクリルアミドゲルは、Novex (San Diego, CA) から得た。以下の材料は、Pierce Chemical Company (Rockford, Il) から得た: HRP標識ストレプトアビジン; Y-Per (登録商標) 酵母蛋白質抽出試薬；リン酸緩衝化生理食塩水 (PBS); Tris緩衝化生理食塩水 (TBS); Tween (登録商標)-20; ヤギ抗ウサギ，HRP; ヤギ抗マウス，HRP; 電気泳動緩衝液；ウシ血清アルブミン (BSA); Supersignal (登録商標) West Dura Extended Duration Substrate (安定なペルオキシド緩衝液及びルミノール増強剤); イソプロパノール； 曝光フィルム及び塩化マグネシウム。酵母細胞及び溶解液 (GFP & GST) 及び細菌溶解液 (GFP/6xHisタグ化) は、通常の技術で調製された。マイコバクテリウムコンプレックス101株 (MAC101) 溶解液及びビオチン化ヒト呼吸上皮細胞抽出物 (B-Hep-2) は、Venkata Reddy博士 (School of Medicine at University of Illinois at Chicago, Rockford, IL) から得た。
【００２３】
ゲルサンプル調製及びSDS-PAGE電気泳動は、以下のように行った。純粋な蛋白質サンプルは、最終蛋白質濃度が0.1-1 ng/μlとなるように、サンプル緩衝液中での希釈によって調製した。実施例Ｖでは、MAC101溶解液は、最終濃度が 0.5-1.5 μg/mlとなるように希釈した。他の溶解液サンプルは、2×サンプル緩衝液中で1:10-1:1,000に希釈した。全てのサンプルは95℃で5分加熱し、ゲル (4-20%又は10-20% トリス−グリシン) へのローディング前に冷却した。サンプルは、Novexシステムを用いて分析用ミニゲルSDS-PAGEにより、色素フロントが半ばに到達するまでは120Vで、色素フロントがゲル底部に到達するまでは180Vにて分離した。
【００２４】
以下の実施例、実施例Ｉ−ＩＩＩは、標的蛋白質と最初に結合する1次抗体 (1次リガンド)、続いて、１次抗体と結合する標識2次抗体 (レポータープローブ) とのインキュベーションを用いる間接的アッセイプロトコルでの本発明を説明する。従って、標的とプローブの結合は間接的である。実施例ＩＶは、レポータープローブが標的と直接的に結合する、直接的アッセイプロトコルでの本発明を説明する。
【００２５】
実施例Ｉ
純粋なGST、マウスId1:GST溶解液、及び酵母GST溶解液を含む4-20% トリス−グリシンゲル (上記のように電気泳動した) を、50% イソプロパノール／H2O 50 ml中で15分間インキュベートし、約20%の収縮を達成させ、次いで、H2O（Milli-Q（登録商標）） 100 mlで15分間洗浄し、実質的に元の大きさにゲルを戻した。このゲルを、1% BSA/PBS/0.05% Tween（登録商標)-20中で希釈 (1:1,000) されたウサギ抗GST 20 mlと、室温 (RT) で１時間インキュベートした。このゲルを、PBS/0.05% Tween (登録商標)-20 100 mlで10分間、3回洗浄した。10 μg/mlのHRP標識2次抗体 [ヤギ抗ウサギ抗体/HRP (GAR/HRP)] ストック溶液を、1% BSA /PBS/0.05% Tween（登録商標)-20で1:500希釈した。希釈された抗体溶液 (20 ml) をゲルに加えた。ゲルを、RTで1時間インキュベートし、次いで、PBS/0.05% Tween（登録商標)-20 100 mlで10分間、3回洗浄した。ゲルを、Supersignal (登録商標) 基質用試薬 10 ml中でRTで5分間インキュベートした。ゲルを、Milli-Q (登録商標) 水で15秒間洗浄した。ゲルをセロファンシートの間に配置し、長さが異なる時間にてフィルムに曝した。フィルムを、Developer/Replenisher及び Fixer/Replenisherを用い現像した。
【００２６】
図１は、実施例１に基づき行ったアッセイからの現像フィルムのコピーである。レーン1、2、3は、それぞれ、純粋なGST 5 ng、10 ng、1 ngに対応する。レーン４及び5は、それぞれ、1:10及び1:100希釈されたGST溶解液:Id-1 (Santa Cruz Biotech) に対応する。レーン6及び7は、それぞれ、1:10及び1:100希釈された酵母GST溶解液 (Pierce) に対応する。バックグラウンドが低い高感度のシグナルが、比較的大きな蛋白質であるGST及び抗GSTを用いるこのアッセイで得られることに注目すべきである。
【００２７】
実施例ＩＩ
純粋なGFP/6×Hisタグ化蛋白質、細菌細胞溶解液で発現させたGFP/6×His、及び酵母溶解液で発現させたGFPを標的として用い、用いた1次抗体は、ウサギ抗リビングカラー抗体であることを除いて、実施例Ｉを繰り返した。アッセイでは、電気泳動を終了するのに約3.5時間要した。更に、通常のウエスタンブロットアッセイ（電気泳動後約6.5時間を要した）を、同じ標的分子で行い、検出は、Amersham Pharmacia BiochemからのECL化学発光基質で行った。
【００２８】
図２は、本発明の「ゲル中」検出プロトコル (パネルA) を、検出基質としてECLを用いる従来のウエスタンブロットプロトコル (パネルB) と比較している。レーン1、2、3は、それぞれ、純粋なGFP/6×Hisタグ化 10 ng、5 ng、1 ngに対応する。レーン4及び5は、それぞれ1:100及び1:1,000に希釈されたE.coli GFP/6×Hisタグ化溶解液に対応する。レーン6及び7は、それぞれ1:10及び1:100に希釈された酵母GFP溶解液に対応する。理解されるように、本結果は類似しているが、上記のように、本発明によればアッセイの終了に必要とされる時間は、実質的により短く、また、より操作が少ない工程を含んでいた。
【００２９】
実施例ＩＩＩ
1つのゲル (4-20%) を同じ抗リビングカラー1次抗体でプローブし、ヤギ抗ウサギ抗体：HRPで検出し (図３Ａ)、別のゲルを抗ペンタ-His 1次抗体 (1:500希釈) でプローブし、次いで、ヤギ抗マウス抗体:HRP (1:250; 10 μg/ml) で検出した（図３Ｂ）ことを除いて、本発明に従う実施例ＩＩにおける標的蛋白質の実験を繰り返した。レーン1、2、3は、それぞれ、純粋なGFP/6×Hisタグ化 10 ng、5 ng、1 ngに対応する。レーン4及び5は、それぞれ1:100及び1:1,000に希釈されたE.coli GFP/6×Hisタグ化溶解液に対応する。レーン6及び7は、それぞれ1:10及び1:100に希釈された酵母GFP溶解液に対応する。このことは、本発明の方法を用いる検出が、プローブされている抗原に特異的であること；アッセイで使用される1次抗体に応答して特異的シグナルが得られることを説明する。本実施例は、6×Hisタグを発現しない酵母GFPが抗ペンタHis抗体によっては検出されないことを示す。
【００３０】
実施例ＩＶ
実施例ＩＩのように調製された、分離したGFP/6×His純粋蛋白質、GFP/6×Hisを発現する細菌細胞溶解液、及びGFPを発現する酵母溶解液を有するトリス−グリシンゲル (10-20%) を、50% イソプロパノール/H2O 50 mlと15分間インキュベートし、次いで、H2O (Milli-Q (登録商標)) 100 mlで15分間洗浄した。ゲルを、1% BSA /PBS/0.05% Tween (登録商標)-20中で希釈されたHRP結合1次抗体 (抗6×His; 1:5,000) 20 mlと室温 (RT) で1時間インキュベートした。ゲルを、PBS/0.05% Tween (登録商標)-20 100 mlで10分間、3回洗浄した。次いで、ゲルを、Supersignal (登録商標) 基質用試薬 10 ml中でRTで5分間インキュベートした。ゲルを、Milli-Q (登録商標) 水で15秒間洗浄した。ゲルをセロファンシートの間に置き、Alpha Innotech CCDカメラに曝した。図4に示すように、直接的に標識した1次抗体は、本発明によれば、ゲル中で直接的に抗原を検出するために使用できる。レーン1、2、3は、それぞれ、純粋なGFP/6×Hisタグ化 10 ng、5 ng、1 ngに対応する。レーン4及び5は、それぞれ1:100及び1:1,000に希釈されたE.coli GFP/6×Hisタグ化溶解液に対応する。レーン6及び7は、それぞれ1:10及び1:100に希釈された酵母GFP溶解液に対応する。実施例ＩＩＩと同様に、抗体は、Hisタグを発現しない酵母GFPを認識しない。
【００３１】
実施例Ｖ及びＶＩは、標的が細胞溶解液中の蛋白質であり、且つアッセイが間接的（実施例Ｖ）又は直接的（実施例ＶＩ）である発明を説明する。
【００３２】
実施例Ｖ
サンプル緩衝液中に15 μg/レーン、10 μg/レーン、5 μg/レーンで希釈されたMycobacterium aviumコンプレックス溶解液 (MAC101) を含む8-16% ゲルを、上記のように電気泳動した。ゲルの2つの異なるレーンで、各溶解液の2連サンプルを泳動した。ゲルを、50% イソプロパノール／水 50 mlと15分間インキュベートし、次いで、(Milli-Q(登録商標)) 水 100 mlで15分間洗浄した。ゲルの各半分が全ての溶解液サンプルを含むように、ゲルを中央で半分に切断した。出発濃度 約0.5 mg/mlで、次いで、1X 1% BSA/PBS/05% Tween (登録商標)-20で1:200に希釈されたビオチン化ヒト呼吸上皮 (B-Hep-2) 細胞抽出液 20 ml中で、ゲルの半分の一方をRTで1時間インキュベートした。残りの半分は、1% BSA/PBS/05% Tween (登録商標)-20のみの中で、RTで１時間インキュベートした。ゲルの各半分を、PBS/05% Tween (登録商標)-20 100 mlで10分間、3回洗浄した。次いで、ゲルの各半分を、1% BSA/PBS/05% Tween (登録商標)-20で1:25,000に希釈された、1 mg/ml HRP-標識ストレプトアビジン溶液 20 mlと、RTで1時間インキュベートした。ゲルの半分ずつを、PBS/05% Tween (登録商標)-20 100 mlで10分間、3回洗浄した。ゲルの半分ずつを、Supersignal (登録商標) 基質用試薬 10 ml中で5分間インキュベートし、次いで、Milli-Q (登録商標) 水で15秒間洗浄した。ゲルの半分ずつをセロファンシートの間に配置し、異なる時間でX線フィルムに曝した。Developer/Replenisher及び Fixer/Replenisher溶液を用いて、フィルムを現像した。
【００３３】
31 kD蛋白質に対応するバンドが、B-Hep-2抽出液とインキュベートしたゲルで観察された。これは、B-Hep-2抽出液中の蛋白質と、MAC101溶解液中の蛋白質との反応によるためであった。更なる内因性ビオチンバンドが、MAC101溶解液でインキュベートしなかった対照ゲル、及びMAC101溶解液でインキュベートしたゲルで観察された。
【００３４】
実施例ＶＩ
酵母細胞 (1×106) を、PBS 1 mlで3回洗浄した。最後の洗浄前に、細胞を3個の微量遠心分離チューブに分割した。最後の洗浄後、PBS (100 μl) を各チューブに加えた。2個のチューブ中の細胞を、それぞれ、NHS-LC-ビオチン (DMF中10 mg/ml) 5 μl及び スルホ-NHS-LC-ビオチン (Milli-Q水中10 mg/ml)で、１時間37℃でビオチン化した。第3のチューブにはビオチン化試薬を加えなかった。細胞をPBS 1 mlで2回洗浄し、微量遠心分離機を10,000 rpmで5分間用いて細胞を洗浄緩衝液から分離した。次いで、細胞を、Y-PER (登録商標) (酵母蛋白質抽出試薬) 100 μlで、RTで20分間溶解した。溶解した細胞を、微量遠心分離機を用いて10,000 rpmで5分間遠心分離し、屑を取り除いて、次いで、2X Novex Tris-Glycine SDSサンプル緩衝液と1:3で混合し、95℃で5分加熱した。各サンプル (10 μl) を、4-20% ゲルにアプライした。上記のように、ゲルを電気泳動した。ゲルを、50% イソプロパノール 50 mlで15分間インキュベートし、次いで、(Milli-Q (登録商標)) 水 100 mlで15分間洗浄した。次いで、ゲルを、1% BSA/PBS/05% Tween (登録商標)-20中に1:250,000に希釈された1 mg/ml HRP標識ストレプトアビジン溶液 20 ml中でゲルをインキュベートした。ゲルを、PBS/05% Tween (登録商標)-20 100 mlで10分間、3回洗浄した。ゲルを、SuperSignal (登録商標) 基質用試薬 10 mlで5分間インキュベートし、次いで、Milli-Q (登録商標) 水で15秒間洗浄した。ゲルをセロファンの間に配置し、異なる時間にてＸ線フィルムに曝した。Developer/Replenisher及び Fixer/Replenisher溶液を用い、フィルムを現像した。
【００３５】
本結果は、水溶性スルホ-NHS-LC-ビオチンでビオチン化された細胞と較べて、NHS-LC-ビオチンでビオチン化された細胞では、異なる蛋白質バンドが観察されることを示した。これらの試薬による異なる蛋白質のビオチン化は、膜可溶性NHS-LC-ビオチンでビオチン化された膜内在性蛋白質と、水溶性である膜不溶性スルホ-NHS-LC-ビオチンでビオチン化された細胞表面蛋白質とを区別する。これらの結果は、本技術を用いることで細胞表面蛋白質と膜内在性蛋白質とを区別することが可能であることを示す。対照実験は、ストレプトアビジン-HRP検出に応ずる如何なる蛋白質バンドも示さなかった。
【００３６】
上記実施例では、化学発光基質であるルミノール及びHRPを用いているが、以下の実施例、実施例ＶＩＩでは、アクリジンベースの蛍光発生基質であるDDAO-ホスフェート、及びアルカリホスファターゼについて、本発明を用いることを説明する。
【００３７】
実施例ＶＩＩ
実施例Ｉに記載の通り電気泳動した、純粋なGST並びにマウスId1:GST、Id2:GST及びId3:GST溶解液を含む10-20% トリス−グリシンゲルを、50% イソプロパノール/H20 50 mlで15分間インキュベートし、次いでH20 (Milli-Q（登録商標）) 100mlで15分間洗浄した。ゲルを、1% BSA/TBS/0.05% Tween(登録商標)-20で1:1,000に希釈されたウサギ抗GST 20 ml中で、RTにて1時間インキュベートした。ゲルを、TBS/0.05% Tween (登録商標)-20 100 ml中で10分間、3回洗浄した。アルカリホスファターゼ標識2次抗体 (2 mg/mlのヤギ抗ウサギ抗体／アルカリホスファターゼストック溶液) を、1% BSA/TBS/0.05% Tween (登録商標)-20で1:1,000に希釈した。希釈抗体溶液 (20 ml) をゲルに加えた。ゲルを、RTで1時間インキュベートし、次いで、TBS/0.05% Tween (登録商標)-20 100 mlで10分間、2回、及び1 mM MgCl2を含有するTBS (pH 9.5) 10 mlで10分間、1回洗浄した。ゲルを、DDAO-ホスフェート基質用溶液 [DDAO-ホスフェートは1.25 mg/mlに再構成され、1 mM MgCl2を含有する TBS (pH 9.5) で1:1,000に希釈された] 10 ml中で、RTにて15分間インキュベートした。基質を除去し、Amersham Pharmacia BiotechからのTyphoon装置を用い、ゲルをスキャンした。646 nm吸収極大及び659放射極大に装置を設定した。
【００３８】
全てのサンプル、純粋なGST及びGST溶解液を本方法で検出した。即ち、本実施例は、蛍光基質関しての本発明の実現可能性を示す。
【００３９】
上記実施例では、蛋白質間相互作用に関し本発明の使用を説明したが、本発明はまた、核酸などの他の生体分子の相互作用の研究に拡張することができる。特に、遅延する現象によって相互作用が検出されるアッセイに関して、本発明は格別な用途が見出される。例えば、本方法は、ＤＮＡ及びＲＮＡ自身の又は蛋白質との相互作用の検出に使用することができる。このようなアッセイは、目的の生体分子を溶液中で一緒にインキュベートし、次いでゲル電気泳動で分離する方法によって実施される。遅延アッセイ (retardation assay) は、遊離の生体分子（例えば、ＤＮＡ）が複合体（例えば、ＤＮＡと蛋白質との複合体）よりも速く移動するであろうという原理に基いている。ゲル中でのバンド移動の差異を検出することによって、相互作用の存在を立証することができる。
【００４０】
本明細書で引用された刊行物、特許出願及び特許を含む全ての参考文献は、各参考文献が、引用により本明細書に含まれることが個々に且つ具体的に記載され、本明細書に全部が記載されているのと同じ程度まで、引用により本明細書に含まれるものである。
【００４１】
本発明を実施するために、本発明者らが知る最良の形態を含む、本発明の好適実施態様が本明細書に記載されている。上記説明を読むと、それらの好適な実施態様のバリエーションが当業者に明らかになりうる。本発明者らは、当業者がこのようなバリエーションを適宜用いることを予測し、また、本発明者らは、本発明が、本明細書に具体的に記載された以外の方法で実施されることを意図する。従って、本発明は、適用され得る法律によって許容されるように、本明細書に添付した特許請求の範囲に記載した主題の全ての改変及び均等物を含むものである。更に、本明細書に相反する記載がない限り、又は文脈によって明確に否定されない限り、その全ての可能なバリエーションにおける上記要素の如何なる組合せも、本発明に包含されるものである。
【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１】図１は、実施例Ｉのアッセイの終了後、ゲルに曝された現像フィルムを示す。
【図２】図２Ａは、実施例ＩＩのアッセイの終了後、ゲルに曝された現像フィルムを示す。図２Ｂは、通常のウエスタンブロット方法から生じたフィルムを示す。
【図３】図３Ａは、実施例ＩＩＩで行われ、抗リビングカラー１次抗体でプローブされ、ヤギ抗ウサギ抗体：ＨＲＰで検出された、アッセイ終了後のゲルに曝された現像フィルムを示す。図３Ｂは、実施例ＩＩＩで行われ、抗ペンタ−Ｈｉｓ１次抗体でプローブされ、ヤギ抗マウス抗体：ＨＲＰで検出された、アッセイ終了後のゲルに曝された現像フィルムを示す。
【図４】図４は、実施例ＩＶで行われたアッセイ終了後のゲルにおけるＣＣＤカメラからの画像記録を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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