(57)【要約】混合物からシアル酸への結合部位を持つ表面タンパク質を有するウイルスを単離する方法を提供する。この方法には混合物を固体支持体にすでに連結したムチンと接触させ、そして固体支持体を洗浄して混合物からムチン連結支持体に特異的に結合しない物質を除去することが含まれる。その後、特異的に結合したウイルス（例えばＡＡＶ４またはＡＡＶ５）は低ｐＨの濃縮塩または溶液を用いたさらなる洗浄工程で取り出すことができる。またシアル酸の結合部位を持つ表面タンパク質を有するウイルスの単離、または生物学的サンプル中のウイルスの存在の検出に使用するための、ムチンを連結した固体支持体を含む製薬学的キットも記載する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
シアル酸に特異的に結合するタンパク質を含んでなる精製標的の単離法であって：
精製標的を、固体支持体にすでに連結したシアル酸を含んでなる分子と接触させ、これによりシアル酸への結合部位を有する精製標的を分子に選択的に結合させる工程を含んでなり、
精製標的がＡＡＶ血清型４キャプシドタンパク質、ＡＡＶ血清型５キャプシドタンパク質、およびシアル酸への結合部位を含むＡＡＶ４またはＡＡＶ５キャプシドのフラグメントを含んでなるキャプシドからなる群より選択されるキャプシドタンパク質を含んでなる上記方法。
【請求項２】
シアル酸を含んでなる分子がムチンである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
固体支持体がセファロース、アガロースおよびポリアクリルアミド樹脂からなる群から選択される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
固体支持体が、ＣｎＢｒ、カルボニルジイミダゾール、グルタルアルデヒド、ヒドロキシスクシンイミドおよびトシルクロライドからなる群から選択される化合物で活性化されているセファロースである請求項３に記載の方法。
【請求項５】
精製標的と分子を連結した固体支持体とが、ＡＡＶおよび細胞性物質および支持体を含んでなる溶液をインキューベーションすることにより接触させられる、請求項１ないし４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
固体支持体が液体クロマトグラフィーカラムに充填されている、請求項１ないし５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
分子を連結した支持体に非特異的に結合した物質を混合物から除去するために、固体支持体を洗浄する工程をさらに含んでなる、請求項１ないし６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
固体支持体から精製標的を分離する工程をさらに含んでなる、請求項１ないし７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
分離した精製標的を濃縮する工程をさらに含んでなる、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
シアル酸への結合部位を持つタンパク質を有するウイルスベクターを混合物から単離する方法であって：
（ａ）ウイルスベクターを含む混合物を、固体支持体にすでに連結したムチンに接触させ、これによりムチン−連結支持体にウイルスを選択的に結合させ、そして
（ｂ）ムチン−連結支持体に非特異的に結合した物質を混合物から除去するために固体支持体を洗浄する、
工程を含んでなる上記方法。
【請求項１１】
洗浄工程（ｂ）の後に、固体支持体からウイルスベクターを分離する工程をさらに含んでなる請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
分離が濃縮塩溶液を使用したさらなる洗浄工程により行われる、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
濃縮塩溶液がリン酸緩衝化生理食塩水および０．４Ｍ塩化ナトリウムである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
分離したウイルスベクターを濃縮する工程をさらに含んでなる請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
キャプシドタンパク質がＡＡＶ血清型４キャプシドタンパク質、ＡＡＶ血清型５キャプシドタンパク質、およびシアル酸への結合部位を含むＡＡＶ４またはＡＡＶ５キャプシドのフラグメントを含んでなるキャプシドからなる群から選択される、請求項１０ないし１５のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
混合物中の精製標的を検出するために有用なキットであって、該キットが固体支持体に連結したシアル酸および精製標的の分子への結合の視覚的検出を可能とする試薬を含んでなり、精製標的がＡＡＶ血清型４キャプシドタンパク質、ＡＡＶ血清型５キャプシドタンパク質からなる群から選択されるタンパク質、またはシアル酸への結合部位を有するＡＡＶ４もしくはＡＡＶ５キャプシドタンパク質のフラグメントを含んでなる上記キット。
【請求項１７】
固体支持体がそれに連結したムチンを含む活性化アガロースである、請求項１６に記載のキット。
【請求項１８】
固体支持体がアフィニティーカラムに充填されている、請求項１６に記載のキット。
【請求項１９】
アフィニティーカラムが液体クロマトグラフィーカラムである請求項１８に記載のキット。
【請求項２０】
キットが洗浄、溶出および濃縮試薬をさらに含んでなる、請求項１６ないし１９のいずれかに記載のキット。
【請求項２１】
サンプル中の、アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）血清型４キャプシドタンパク質またはＡＡＶ血清型５キャプシドタンパク質から選択される表面タンパク質、またはそれらのフラグメントを持つウイルスの存在を検出する方法であって、ウイルスの結合を視覚的に検出するためにサンプルに請求項１６ないし２０のいずれかに記載のキットを使用する工程を含んでなる上記方法。
【請求項２２】
固体支持体に連結された少なくとも１つの２−３，Ｏ−シアル酸部分および少なくとも１つの２，２−Ｎ−シアル酸部分を含んでなる、混合物から精製標的を結合するために有用な組成物。
【請求項２３】
カルチャーに由来するＡＡＶ血清型４タンパク質またはＡＡＶ血清型５キャプシドタンパク質を有するアデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを結合する方法であって、請求項２２に記載の組成物をカルチャーに由来するライゼートまたは培地とインキューベーションする工程を含んでなる上記方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
この研究は一部、国立衛生研究所、Ｐ３０ＤＫ４７７５７により資金を提供されている。米国政府は本発明に一定の権利を有することができる。
【０００２】
アデノ関連ウイルス（ＡＶＶ）血清型２に基づく遺伝子治療ベクターは、インビボ投与の後に安定な形質導入を達成するために好適であることが明らかになった。しかし導入遺伝子発現の安定性は印象的であるものの、その効率はそうでないことが多い。
【０００３】
血清型２に基づくベクターの基礎研究および工業的な開発には、精製のためのクロマトグラフィー法の開発に力が入れられた。他のＡＡＶ血清型ベクターの開発では、そのようなベクターの精製法の必要性が次々と生じた。１つのそのようなベクター、ＡＡＶ血清型５（ＡＡＶ５）に基づくベクターは有用なベクターであることが明らかとなった。しかし今日まで、ＡＡＶ５に基づくベクターの精製にはそれがＡＡＶ２の精製に使用されて来たヘパリンに結合しないので、塩化セシウム（ＣｓＣｌ２）沈降が必要であった。ＣｓＣｌ２沈降には時間を要し、スケールアップできず、そしてかなりの細胞タンパク質の混入がある調製物を生じる。
【０００４】
必要であることは迅速であり、しかも生産に使用するために容易にスケールアップできるＡＡＶ５−に基づくベクターの精製法である。
【発明の開示】
【０００５】
発明の要約
本発明は、細胞性および他のウイルス性の物質を含むカルチャーおよび他の溶液からＡＡＶ４およびＡＡＶ５ウイルスベクターを同定および精製するための迅速な方法を提供する。
【０００６】
すなわち１つの観点では、本発明はシアル酸への結合部位を持つキャプシド（またはエンベロープ）タンパク質を有する構築物を単離する方法を提供する。本発明の方法はアデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）血清型４（ＡＡＶ４）またはＡＡＶ血清型５（ＡＡＶ５）キャプシドタンパク質を含む構築物の単離に特によく適している。この方法にはＡＡＶ４またはＡＡＶ５を含む溶液と固体支持体に連結したシアル酸との接触が関与する。すなわち、シアル酸への結合部位を有するキャプシドタンパク質を有する構築物は、シアル酸を連結した分子と選択的に結合する。
【０００７】
好適な態様では、本発明の方法にはＡＡＶを含む混合物を固体支持体にすでに連結したムチン（ｍｕｃｉｎ）と接触させることが関与する。これによりＡＡＶはムチン−連結支持体に選択的に結合する。その後、ムチン−連結支持体に非選択的に結合した物質を混合物から除去するために固体支持体を洗浄する。
【０００８】
別の観点では、本発明は液体クロマトグラフィーカラムまたはムチンをすでに連結した固体支持体を含む溶液を含んでなる、ＡＡＶ４またはＡＡＶ５を分離するために有用なキットを提供する。
【０００９】
さらに別の観点では、本発明は生物学的サンプル中のＡＡＶ４またはＡＡＶ５の存在を検出するために有用なキットを提供する。そのようなキットは固体支持体に連結したシアル酸を含んでなる分子を有する固体支持体、および該ＡＡＶ４またはＡＡＶ５の分子への結合の視覚的検出を可能にする試薬を含む。
【００１０】
本発明のさらに他の観点および利点は、以下の本発明の詳細な説明から容易に明らかとなるだろう。
発明の詳細な記述
本発明は、固体支持体に連結したムチンを使用することによりシアル酸に特異的に結合する表面タンパク質を有するウイルス（ＡＡＶ４またはＡＡＶ５のような）を単離し、そして検出する方法を提供する。高塩溶液を用いた溶出またはインキューベーションによる特異的に結合したウイルスの取り出しで、ＣｓＣｌ２沈降で達成されるよりもかなり高い純度の高度に活性なウイルスを効率的に回収する。単離されたウイルスは高度に感染性であり、そして通例のＣｓＣｌ２勾配を使用して単離したウイルスより純粋である。さらにこの技術は迅速であり、特別な装置を必要とせず、そして容易にスケールアップすることができる。これは実験台から臨床で使用される高品質ウイルスの生産に重要な特徴である。本発明はさらに本明細書に記載する方法を使用したウイルスの単離および検出に有用なキットを提供し、これは精製のための一段階アフィニティーカラムおよびウイルスベクターの検出、および任意に視覚的に検出可能なマーカー系を利用する。
【００１１】
本発明のこれらのおよび他の観点は、本明細書に詳細に記載する。
精製標的（ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｔａｒｇｅｔ）
本発明の方法は、ＡＡＶ血清型５キャプシドタンパク質またはＡＡＶ血清型４キャプシドタンパク質からなるキャプシドを有するウイルスベクターの分離および単離に特によく適している。本発明者はこれらのＡＡＶ血清型が、これらウイルスのキャプシドが２，３−シアル酸に特異的に結合する能力により、これらのウイルスが生産されるカルチャー中に見いだされる物質から容易に分離できることを見いだした。対照的に、ＡＡＶについてヘルパー無しの生産カルチャーに見いだされる他の物質（例えば細胞の、および他のウイルスタンパク質）は、シアル酸に特異的に結合しない。同様に本発明の方法は、ヘルパー依存型生産カルチャー中に見いだされるアデノウイルス、ＡＡＶ１および他の細胞性物質がシアル酸に特異的に結合しないので、そのようなカルチャーに由来するＡＡＶ４またはＡＡＶ５キャプシドタンパク質の分離および単離に有用である。
【００１２】
加えて本発明の方法はシアル酸の結合部位を含むタンパク質にキャプシド化もしくはエンベロープ化されるウイルス、またはシアル酸の結合部位を含む他の型のタンパク質の精製に容易に応用することもできる。例えばキメラキャプシドまたはエンベロープタンパク質を含むウイルスベクター、例えばシアル酸結合部位を有するＡＡＶ５および／またはＡＡＶ４キャプシドタンパク質の部分を含むもの、あるいはＡＡＶ４、ＡＡＶ５またはキメラキャプシドにシュードタイプ化されたウイルスベクターは、本発明に従い検出、分離、そして単離することができると容易に考えられる。さらに他のウイルスベクター、キメラタンパク質またはタンパク質フラグメントを、本発明に従い分離、単離および／または精製することができる。本明細書に提供する情報を考慮すれば、選択したキャプシドタンパク質または他のタンパク質がシアル酸に特異的に結合するかどうかを決定することは十分に当業者の能力の範囲内である。本明細書を通して便宜上、本明細書に記載するこれらのウイルスベクター（例えばＡＡＶ４およびＡＡＶ５）およびシアル酸に特異的な結合部位を有する他のタンパク質は、「精製標的」と命名する。
シアル酸を含む分子
本発明で使用するために、１以上のシアル酸分子を、本明細書に定義する固体支持体に直接的または間接的（例えば適当なリンカーを介して）に結合することができる。あるいはシアル酸は固体支持体に（直接的または間接的に）結合することができる種々のタンパク質様および化学分子中に見いだすことができる。そのような分子は様々な天然、合成、組換えまたは他の適当な方法から得ることができる。
【００１３】
シアル酸を含むタンパク質様分子の例はムチンである。ムチンはシアル酸が高度に濃縮されている唾液、腸液および他の分泌物に存在する哺乳動物のタンパク質である。種々のムチンタンパク質が知られており、そして本発明の方法および組成物に容易に使用することができる。あるいはムチンのフラグメントまたはシアル酸を含む他の分子を容易に利用することができる。例えばＧｅｎｄｌｅｒ  Ｓ  Ｊ．ｅｔ  ａｌ．ヒト腫瘍に関連する多型上皮ムチンの分子クローニングおよび発現（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｔｕｍｏｒ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｍｕｃｉｎ）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：１５２８６（１９９０）；Ｓｉｄｄｉｑｕｉ  Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，ヒトＤＦ３胸部癌腫に関連する抗原をコードするＣＤＮＡの単離およびシークエンシング（Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｏｆ  ａ  ｃＤＮＡ  ｃｏｄｉｎｇ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ＤＦ３  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ａｎｔｉｇｅｎ）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：２３２０（１９８８）；Ｌｉｇｔｅｎｂｅｒｇ  Ｍ  Ｊ  Ｌ，ｅｔ  ａｌ．，エピシアリン、癌腫に関連するムチンは選択的アミノ末端を持つスプライス変異体をコードする多型遺伝子により生成される（Ｅｐｉｓｉａｌｉｎ，ｃａｒｃｉｎｏｍａ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｍｕｃｉｎ，ｉｓ  ｇｅｎｅｒａｔｅｄ  ｂｙ  ａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ  ｇｅｎｅ  ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ｓｐｌｉｃｅ  ｖａｒｉａｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ  ａｍｉｎｏ  ｔｅｒｍｉｎｉ）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：５５７３（１９９０）膵臓；Ｇｕｍ  Ｊ  Ｒ，ｅｔ  ａｌ，新規なヒト腸ムチン遺伝子に由来するｃＤＮＡのモレキュラークローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ｏｆ  ｃＤＮＡＳ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｈｕｍａｎ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｍｕｃｉｎ  ｇｅｎｅ）．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１７１：４０７（１９９０）；小腸、Ｇｕｍ  Ｊ  Ｒ，ｅｔ  ａｌ，ヒト腸ムチンｃＤＮＡのモレキュラークローニング。配列分析および遺伝的多型の証明（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｍｕｃｉｎ  ｃＤＮＡｓ．Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ａｎｄ  ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：６４８０（１９８９）；Ｇｕｍ  Ｊ  Ｒ，ｅｔ  ａｌ，新規なヒト腸ムチン遺伝子に由来するｃＤＮＡのモレキュラークローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ｏｆ  ｃＤＮＡＳ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｈｕｍａｎ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｍｕｃｉｎ  ｇｅｎｅ）．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１７１：４０７（１９９０）；および気管支上皮細胞ムチン、Ｐｏｒｃｈｅｔ  Ｎ，ｅｔ  ａｌ，４８塩基対の縦列反復配列を含む新規なヒト気管−気管支ムチンｃＤＮＡのモレキュラークローニングおよび染色体位置決定（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌ���ｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ  ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｏｖｅｌ  ｈｕｍａｎ  ｔｒａｃｈｅｏ−ｂｒｏｎｃｈｉａｌ  ｍｕｃｉｎ  ＣＤＮＡ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｔａｎｄｅｍｌｙ  ｒｅｐｅａｔｅｄ  ｓｅｑｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ４８  ｂａｓｅ  ｐａｉｒｓ）、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１７５：４１４（１９９１）を参照にされたい。ムチンの配列はＧｅｎｅＢａｎｋおよびＰｕｂＭｅｄを含む様々なコンピューターデータベースから得ることができる。これらのおよび他のムチンは天然資源、組換え的に生産された供給源または合成的に生成された供給源から精製することができる。
【００１４】
ムチン、そのシアル酸を多く含むフラグメント、またはアルファ−アミノ基のＴＢＯＣまたはＦＭＯＣ保護のような他のペプチドの化学合成も当該技術分野では周知である（Ｃｏｌｉｇａｎ，ｅｔ  ａｌ．，免疫学の現在の手法（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）、ウィリー  インターサイエンス（Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ）、１９９１、ユニット９）。あるいはペプチドは周知の固相ペプチド合成法により合成することもできる（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５：２１４９（１９６２）；Ｓｔｅｗａｒｔ  ａｎｄ  Ｙｏｕｎｇ、固相ペプチド合成（Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）、フリーマン、サンフランシスコ、１９６９）、第２７−６２頁）。
【００１５】
あるいは化学分子が固体支持体に結合するように、１以上のシアル酸部分を含む化学分子を利用してもよい。さらに別の選択では、精製に使用する固体支持体は１、そして好ましくは１より多くのシアル酸分子を含むために、化学的またはそうではなく修飾してもよい。そのようなシアル酸部分は、例えばシアル酸の精製標的への結合および非特異的結合物質の除去に耐える共有結合または他の適当な結合により、固体支持体へ直接的に連結することができる。あるいはシアル酸部分は、例えばシアル酸の支持体への結合を促進する部分により、固体支持体に間接的に連結することができる。そのような部分はタンパク質、化学的部分または他の適当なリンカーでよい。
【００１６】
望ましくはシアル酸を含む固体支持体および／または分子は、２，３−Ｏ−シアル酸および２，３−Ｎ−シアル酸、あるいは１以上のいずれか、または両方の部分を含む。１以上の２，３−Ｏ−シアル酸部分を含む固体支持体（および／またはシアル酸を含む分子）は、精製標的がＡＡＶ４に由来する時の使用に特によく適している。さらに別の態様では、１以上の２，３−Ｎ−シアル酸部分を含む固体支持体（および／またはシアル酸を含む分子）は、精製標的がＡＡＶ５に由来する時の使用に特によく適している。
【００１７】
シアル酸部分および／またはシアル酸を含有する分子を、固体支持体に直接的または間接的に付ける方法は当業者には既知である。
固体支持体
ムチンまたはシアル酸を持つ他の分子は、望ましくは精製標的（例えばＡＡＶ５）を結合するために使用できる固体支持体に連結されている。便宜上、ムチンに言及する。しかし当業者は本発明においてシアル酸を持つ任意の他の分子に置き換えることができると理解するだろう。１つの特に望ましい態様では、ムチンを固体支持体に共有結合させる。適当な方法が当該技術分野では知られており、そして固体支持体の製造元から入手することも可能である。
【００１８】
本明細書で使用する用語「固体支持体」は、固体支持体に結合したシアル酸分子がシアル酸の精製標的への結合および非特異的結合物質の除去に耐えるように、シアル酸またはシアル酸（１つまたは複数）を含有する分子を結合させることができるゲル、樹脂、ビーズ、粉末および他の固体を含む任意の支持体を称する。適当な固体支持体の例には、セファロース、アガロース、架橋化アガロース、混合アガロース−ポリアクリルアミドまたはポリアクリレインからなる樹脂；ビーズ（ミクロビーズを含む）；シリコン；ガラス；マイクロセル；マイクロカプセル；マイクロタイタープレート；およびバイオチップを含む。有用な支持体には１９９９年６月３日に公開された国際公開第９９／２７３５１号明細書；１９９９年６月３日に公開された国際公開第９９／２７１４０号明細書；米国特許第６，０９６，２７３号明細書；２０００年３月１６日に公開された国際公開第００／１４１９７号明細書に記載されているものを含む。
【００１９】
種々のマイクロビーズが知られており、それらには米国特許第６，０７４，８８４号；同第５，９４５，２９３号；および同第５，６５８，７４１号明細書に記載されているアミノデキストランビーズを含む。磁性鉄［米国特許第５，２４０，６４０号明細書］；金属［米国特許第５，２４８，７７２号明細書］；ポリスチレン［米国特許第５，４６６，６０９号；同第５，７０７，８７７号；同第５，６３９，６２０号；同第５，７７６，７０６号明細書］およびポリスチレン−金属［米国特許第５，５５２，０８６号；同第５，５２７，７１３号明細書］粒子のアミノデキストランをコートした単分散化コロイド状分散物は、本発明に従い固体支持体として使用することもできる。別の種類の支持体は、アミノデキストランコーティングの表面を覆うコロイドサイズの金属固体の層を持つ上記コート支持体を含んでなることができる。金／銀コロイド被覆ポリスチレン−アミノデキストランビーズ、その調製、特性、および全血中の白血球の亜群の分析における使用が記載された。例えば米国特許第５，２４８，７７２号；同第５，５５２，０８６号；同第５，９４５，２９３号明細書；Ｏ．Ｓｉｉｍａｎ  ａｎｄ  Ａ．Ｂｕｒｓｈｔｅｙｎ，Ｊ．Ｐｈｙｓ，Ｃｈｅｍ．，１０４：９７９５−９８１０（２０００）；およびＯ．Ｓｉｉｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ，４１：２９８−３０７（２０００）を参照にされたい。このコート支持体に対する代替には、米国特許第５，６３９，６２０号明細書に記載されているようなＥＤＡＣカップリングによるアミノデキストランで被覆される中心支持体としてカルボキシ−官能化ポリスチレン粒子を使用する。これらのおよび他の固体支持体は当業者には既知であり、そして限定するわけではないが中でもアマーシャム、ファルマシア（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ）（ウプサラ、スウェーデン）：ピアス（Ｐｉｅｒｃｅ）：バイオラッド（Ｂｉｏｒａｄ）（リッチモンド、バージニア州）およびベックマン  コールター（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）を含む様々な販売元から入手可能である。
【００２０】
１つの態様では、固体支持体は活性化セファロースからなる。ＣｎＢｒ−活性化セファロースはアマーシャム  ファルマシアから購入することができる。しかしセファロースおよび活性化セファロースの他の供給源も、活性化法および活性化化合物と同様に知られている。適当な活性化セファロースの例には、ＣｎＢｒ−、カルボニルジイミダゾール−、グルタルアルデヒド−、ヒドロキシスクシンイミド−およびトシルクロライド−活性化セファロースを含む。
【００２１】
シアル酸またはシアル酸を含んでなる分子（例えばムチン）を固体支持体に結合する方法は、既知の方法の中から選択することができる。そのような方法も固体支持体の製造元により提供されている。
【００２２】
１つの態様では、ムチン−連結固体支持体は、シアル酸結合部位を含むタンパク質の分離、単離および／または精製用のアフィニティーカラムに充填される。この態様では、精製標的がムチン−連結固体支持体に特異的に結合するように、精製標的を含むサンプル（例えばＡＡＶ５細胞カルチャーに由来するライゼート）をカラムに流す。その後、カラムは特異的に結合した精製標的を保持しながら非特異的に結合した物質を除去するために洗浄する。望ましくは洗浄試薬は塩水、または生理学的ｐＨに緩衝化された別の適当な試薬（例えばリン酸緩衝化生理食塩水）である。次いでカラムは精製標的を取り出す条件下でさらなる洗浄工程にかける。適当には溶出試薬は高濃度の塩を含有する溶液である。１つの適当な例は、少なくとも約０．１Ｍの濃度のＮａＣｌを含有するリン酸緩衝化生理食塩水溶液である。別の適当な溶液はリン酸緩衝化生理食塩水および少なくとも約０．４ＭのＮａＣｌを含む。この情報を考慮すれば、当業者は同様な効果を達成する別の塩溶液を容易に選択することができる。あるいは溶出試薬は任意の適当な酸性試薬またはその塩でよい（例えば試薬は約１〜約５の範囲の低ｐＨを有する）。そのような試薬の例にはとりわけ酢酸（例えば１ｍＭ）および酢酸ナトリウムのようなその塩、および０．１Ｍ  グリシン（ｐＨ３）を含み、これらは当業者には明白である。精製標的（例えばＡＡＶ５）の溶出後、ＡＡＶ５を通例の技術による濃縮にかける。
【００２３】
別の態様では、ムチン−連結固体支持体（または別の望ましいシアル酸を含有する分子に連結した固体支持体）は、精製標的を含有するサンプルとインキューベーションすることができる。そのような態様では、サンプルは単離されるべきタンパク質が生産された細胞のカルチャーに由来するライゼートを含有する溶液でよい。あるいはサンプルは個体に由来する生物学的サンプル、または適当な希釈剤との混合状態の個体に由来する生物学的サンプルでよい。
【００２４】
本発明の「個体に由来する生物学的サンプル」は、とりわけ流体、全血、血漿または血清を含む任意のサンプルを含むことができ、ここで形成体（ｆｏｒｍｅｄ  ｂｏｄｉｅｓ）は細胞、特に血液細胞である。そのようなサンプルは他の種類のサンプルを取り扱うための遠心等による分離のような常法により精製することができる。これらの「個体に由来する生物学的サンプル」はサンプルの濃度を調整するために、あるいは分析用のサンプルを調製するために標識化合物と混合、および／または任意のバッファーまたは希釈剤と混合することができる。さらに別の選択では生物学的サンプルは組織サンプルでよく、そしてムチン−連結固体支持体は組織サンプルとのインキューベーションのために適当なバッファーまたは他の希釈剤と混合することができる。
精製および診断キット
別の態様では本発明は精製標的を分離するために有用なキットを提供する。このキットはウイルスベクター（例えばＡＡＶ４またはＡＡＶ５）を生産に使用するために特によく適合している。
【００２５】
典型的にはそのようなキットはシアル酸を有する固体支持体または支持体に連結するシアル酸を含む分子を含む。そのような固体支持体は上記の支持体の中から選択される。１つの望ましい態様では、固体支持体はサンプルとインキューベーションするためのビーズまたはゲルである。別の望ましい態様では、固体支持体はアフィニティーカラム（例えば液体クロマトグラフィーカラム）に充填され、そしてサンプルをカラムに通す。
【００２６】
さらに本発明のキットは洗浄試薬、溶出試薬および濃縮試薬を含む所望の試薬を含むこともできる。そのような試薬は本明細書に記載する試薬および通例の濃縮試薬の中から容易に選択できる。１つの望ましい態様では、洗浄試薬はリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）のような生理学的ｐＨに緩衝化された等張性の塩溶液であり；溶出試薬は０．４Ｍ  ＮａＣｌを含有するＰＢＳであり、そして濃縮試薬およびデバイスである。例えば当業者はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）またはＮＨ４ＳＯ４のような試薬が有用であり、またはフィルターデバイスのようなデバイスを考えるだろう。例えば１００Ｋ膜を含むフィルターデバイスはｒＡＡＶを濃縮する。
【００２７】
これらのキットはさらにサンプルを維持または保存するために必要な試薬を含む。より重要なことは、キットは競合アッセイを行い、そして対照を調製するための使用説明を含む。またキットに提供されるのは、サンプル用の適当な希釈剤およびバッファー、シグナルを比較するための指標チャート、使い捨て手袋、汚染除去の説明書、アプリケータースティックまたは容器、およびサンプル調製カップであることができる。キットは好ましくは必要に応じて必要なバッファー基質または媒質をも含む。当業者は任意の特異的な受容体および標的細胞について患者に方法を行うために必要な情報および成分を含む任意の数のキットを集成し、そしてその結合部位についての標準（ｎｏｒｍｓ）に対して結果を比較することができる。
【００２８】
さらに別の態様では、本発明はサンプル中の精製標的（例えばＡＡＶ２／５）の存在を検出するために有用なキットを提供する。上記の成分を含むことに加えて、そのようなキットは精製標的の分子への結合を視覚的に検出することを可能にするマーカー試薬も含むことができる。このキットは個体に由来する生物学的サンプル、例えば血液中の精製標的の検出に特によく適合している。この種類のキットは上記のシアル酸を連結した支持体および試薬を含むことに加えて、さらに視覚的に検出可能なマーカーを含むことができる。
【００２９】
用語「マーカー」は一般に分子、好ましくはタンパク質様分子を称するが、低分子量化学分子、好ましくは視覚的に検出可能なものも称する。１例ではこれらのマーカーは、レーザーによる励起で検出可能な特定の波長のシグナルを発光することにより検出を可能とする。フィコビリプロテイン（ｐｈｙｃｏｂｉｌｉｐｒｏｔｅｉｎ）、タンデム色素（ｔａｎｄｅｍ  ｄｙｅ）、ある種の蛍光タンパク質、低分子量化学分子および他の手段により検出可能なある種の分子はすべて、これら分析用のマーカーと考えることができる。例えば、蛍光プローブおよび研究用化学品のハンドブック（Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｂｅｓ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）、第６版、Ｒ．Ｐ．Ｈａｕｇｌａｎｄ、モレキュラープローブ社、ユージーン、オレゴン州（１９９６）に掲載されているマーカーを参照にされたい。
【００３０】
本発明に有用なフィコビリプロテインの例は、フィコシアニン、オーロフィコシアニン（ＡＰＣ）、オーロフィコシアニンＢ、フィコエリトリン（ＰＥ）および好ましくはＲ−フィコエリトリンである。ＰＥは現在利用可能な中で最も明るい蛍光色素である。抗体に結合したＰＥが、蛍光プレートアッセイおよびＭ．Ｃ．Ｃｕｓｔｅｒ  ａｎｄ  Ｍ．Ｔ．Ｌｏｔｚｅ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．１２８、１０９−１１７（１９９０）でインターロイキン−４を検出するために使用され、そして試験した中で十分なシグナルを生成した唯一のフルオロホアであることが分かった。タンデム色素はフィコビリプロテインおよび他の色素から形成され得る自然には存在しない分子である。例えば米国特許第４，５４２，１０４号および同第５，２７２，２５７号明細書を参照にされたい。本発明に有用なタンデム色素の例は、フィコエリトロシアニンまたはＰＣ５（ＰＥ−Ｃｙ５、フィコエリトリン−シアニン５．１；励起、４８６〜５８０ｎｍ、発光６６０〜６８０ｎｍ）［Ａ．Ｓ．Ｗａｇｇｏｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，６７７：１８５〜１９３（１９９３）および米国特許第５，１７１，８４６号明細書］およびＥＣＤ［フィコエリトリン−テキサス  レッド；励起、４８６〜５７５ｎｍ、発光６１０〜６３５ｎｍ］［米国特許第４，５４２，１０４号および同第５，２７２，２５７号明細書］。他の既知のタンデム色素はＰＥ−Ｃｙ７、ＡＰＣ−Ｃｙ５およびＡＰＣ−Ｃｙ７［Ｍ．Ｒｏｅｄｅｒｅｒ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ，２４：１９１−１９７（１９９６）］である。タンデム色素、ＰＣ５およびＥＣＤは、色素のイミノチオラン活性化が関与する幾つかの方法によりモノクローナル抗体に直接、成功裏に結合された。さらなる数のマーカー（標識リガンド）を方法に加えるために、本発明でリガンドに直接結合でき、そしてフィコビリプロテインまたはタンデム色素と使用され得るさらに他のマーカーには、励起で５５０ｎｍ未満の波長を発光する低分子量分子を含む。そのような分子はフィコビリプロテインの発光と重複しない。そのようなマーカーの１例は、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）である。他は上記のハンドブックに掲載されている。さらなる色を提供するために、本発明に使用することができるさらに他のマーカーは、緑色蛍光タンパク質および青色蛍光タンパク質として知られているタンパク質であり；また有用であるのは、紫外線光による励起で発光するマーカーであり得る。ビリプロテインおよびタンデム色素は、コールターインターナショナル社（Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、マイアミ、フロリダ州、モレキュラープローブ社（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ  Ｉｎｃ．）、ユージーン、オレゴン州およびプロザイム社（Ｐｒｏｚｙｍｅ  Ｉｎｃ．）、サンレアンドロ、カリフォルニア州を含む様々な供給源から市販されている。上で検討した他のマーカーまたは標識は既知の供給源から購入することができる。
【００３１】
これらのマーカーの利用法は当業者には明白であり、そしてサンプルをシアル酸−連結固体支持体に接触させる前にマーカーの存在下でインキューベーションすることを含むかもしれない。あるいはマーカーを固体支持体に結合してもよい。さらに別の選択ではマーカーは、固体支持体から特異的に結合した精製標的を取り出す洗浄工程後に、精製標的を含む溶出液中でインキューベーションすることができる。マーカーの選択および検出系は、本発明を限定しない。
【００３２】
本発明により提供されるキットは、本明細書に記載の方法を行うために有用である。
【００３３】
以下の実施例は本発明を具体的に説明するために提供し、本発明を限定するものではない。
【実施例１】
【００３４】
ベクター精製のためのマトリックスの生成
ＡＡＶ５キャプシドを含むベクターをアフィニティー精製するマトリックスを生成するために、ムチンをＣＮＢｒ−活性化セファロースにカップリングさせた。
【００３５】
簡単に説明すると、１２０ｍｇのムチンＩ−Ｓ型（シグマ（Ｓｉｇｍａ）、セントルイス、ミシガン州）を、製造元の使用説明書に従い３．５ｇのＣｎＢｒ−活性化セファロース（アマーシャム  ファルマシア、ウプサラ、スウェーデン）にカップリングさせた。樹脂（３．５ｍｇの凍結乾燥粉末＋１２０ｍｇのムチン）を、直径２．５ｃｍの液体クロマトグラフィーカラム（シグマ）に充填し、そして２４ｍＬのＰＢＳ、ｐＨ７．４（ライフテクノロジーズ、グランドアイランド、ニューヨーク州）で洗浄した。
【００３６】
組換えＡＡＶ２／５はＡＡＶ血清型２ｒｅｐおよび血清型５ｃａｐをコードするプラスミドおよびＡｄヘルパー機能の２９３細胞中でのトランスフェクションにより、記載されているように生産した（Ａ．Ａｕｒｉｃｃｈｉｏ，ｅｔ  ａｌ．Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ，１２：７１−７６（２００１））。５０×１５０ｎｍプレートから細胞を回収し、２．５ｍｌの無血清ＤＭＥＭ／プレートに再懸濁し、そして２回の凍結そして乾燥により溶解した。生じたウイルスベクターは表１に示した遺伝子（β−ガラクトシダーゼまたは強化型緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ））を挟むＡＡＶ２逆方向末端反復配列および他のベクター要素をＡＡＶ血清型５のキャプシドタンパク質中に含んだ。アフィニティーカラムに乗せる前に、ＡＡＶ２／５ベクターを含むライゼートをＡＡＶ２について記載されているように処理した（Ａ．Ａｕｒｉｃｃｈｉｏ，ｅｔ  ａｌ．，同上）。
【００３７】
濾過したライゼートを１滴／秒の速度でカラムに通し、続いてＰＢＳ（２０ｍｌ）で２回洗浄し、そしてＰＢＳ＋０．４Ｍ  ＮａＣｌ（１５ｍｌ）で溶出した。溶出物はミリポア（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）フィルター−デバイスを通して２〜３ｍｌに濃縮し、１５ｍｌのＰＢＳで１回洗浄し、そして２〜３ｍｌの最終容量に再濃縮してバッファーを交換した。
【００３８】
ＡＡＶ２／５ベクター調製物の特性決定は、物理的（ｐｈｓｉｃａｌ）力価（ゲノムコピー）、２９３細胞での限界希釈感染後の形質導入力価、および感染性センターアッセイを含んだ（表１）。ゲノムコピーはリアルタイムＰＣＲにより記載されているように決定した（Ｇ．Ｇａｏ，ｅｔ  ａｌ，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ，１１：２０７９−２０９１（２０００））。感染性単位は、アデノウイルスの存在下でｒｅｐ−ｃａｐ発現細胞の限界希釈感染後に測定した。
【００３９】
【表１】
2004538005.tif 000002
【実施例２】
【００４０】
ＡＡＶ２／５とＡＡＶ２との間を識別するための本発明の能力
ムチンがＡＡＶ５キャプシドを持つベクターに効率的に結合することができるという仮説を試験するために、ＡＡＶ２／５またはＡＡＶ２粒子を可溶性ムチンに前吸着させ、そして標的細胞に対する感染性を以下のように試験した。
【００４１】
２９３細胞に感染させる前に、ＡＡＶ２／５またはＡＡＶ−ＣＭＶ−ＥＧＦＰのいずれかの１×１０１０ゲノムコピー（ＧＣ）を３７℃で１時間、ダルベッコの改良イーグル培地中で２０ｍｇムチン／ｍｌと一緒にインキューベーションした（またはしなかった）。４８時間後、形質導入した細胞をトリプルフィルター（ＤＡＰＩ−ＦＩＴＣおよびローダミンの視覚化を可能とする）を使用して蛍光顕微鏡下で評価した。
【００４２】
ムチンはＡＡＶ２／５により２９３細胞の形質導入を阻害することが観察されたが、ＡＡＶ２では観察されず、このタンパク質のシアル酸成分がＡＡＶ５キャプシド結合部位を遮断できたことを示した。すなわち本発明はシアル酸に結合する能力を欠くＡＡＶ２および他の細胞性、タンパク質様およびウイルス性物質からＡＡＶ５を容易に分離する方法を提供する。
【実施例３】
【００４３】
本発明のムチンカラム対従来技術の方法により単離されたＡＡＶ２／５ベクターのインビトロ比較
インビトロで評価した収量、形質導入効率および感染性の特性は、ＣｓＣｌ２沈降を使用して精製したＡＡＶ２／５ベクターと本発明のムチンカラムで精製したものとの間で比較することができる。
【００４４】
調製物ＡＡ１１５および１１６は、細胞ライゼートを含む通例のベクターから生成し、そして２つの等画分に分割した。ＡＡＶ２／５−ＣＭＶ−ｌａｃＺベクターは、頂端側から分化したヒト気道上皮に感染する能力を評価するために、ＡＡＶ２／５のＣｓＣｌ２（ＡＡ１１６）またはムチンカラム（ＡＡ１１５）精製のいずれかにより精製した。形質導入から１週間後、ベクターを物理勾配または本発明のムチンカラムにより精製し、そしてＸ−ｇａｌ染色を行った。
【００４５】
本発明に従いムチンカラムにより精製したＡＡＶ２／５の純度を、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル（４〜１２％ＳＤＳ  ＰＡＧＥ）を使用してＣｓＣｌ２により得られた純度と比較し、そしてタンパク質を視覚化するためにクーマシーブルー染色した。多数の混入タンパク質を含んだＣｓＣｌ２により精製された調製物で観察されたものとは反対に、カラム精製した調製物で検出された唯一のバンドはキャプシドタンパク質ＶＰ１、２および３を表す。ブルー形成単位（ｂｌｕｅ−ｆｏｒｍｉｎｇ  ｕｎｉｔｓ）の数（すなわちＸ−ｇａｌを発現する細胞、ｂｆｕ）は、ＣｓＣｌ２−（５４．６ｂｆｕ／ｌ×１０１０ＧＣ）とカラム精製ベクター（５８ｂｆｕ／１×１０１０ＧＣ）との間で同様であった。
【実施例４】
【００４６】
本発明のムチンカラム対従来技術の方法により単離したベクターのインビボ比較
ＣｓＣｌ２（ｐｒｅｐＡＡ１１６）およびムチン（ＡＡ１１５）により精製したＡＡＶ２／５ベクターの感染性は、以下のように骨格筋への注射後にインビボで評価し、そしてｌａｃＺ発現をホモジネートのＥＬＩＳＡまたは組織切片のＸ−ｇａｌ染色により定量した。
【００４７】
６週齢のオスＣ５７Ｂ１／６マウスの両足の前脛骨筋（ｔｉｂｉａｌｉｓ  ａｎｔｅｒｉｏｒｉｓ）に、ムチンカラムまたはＣｓＣｌ２勾配のいずれかで精製した１×１０１１ＧＣのＡＡＶ２−ＣＭＶ−ｌａｃＺを注射した。ベクター投与から２１日後、右筋肉を回収し、切片とし、そしてＸ−ｇａｌで染色した。
【００４８】
ＣｓＣｌ２−および本発明によるムチンカラムにより精製したベクターを投与したβ−ｇａｌ陽性筋肉細胞に類似の強度および数が、β−ガラクトシダーゼのＥＬＩＳＡ定量により確認された（ＣｓＣｌ２：Ｎ＝５、１１３±１３ｎｇ／ｍｌ；ムチンカラム：Ｎ＝５、１８３±１２３ｎｇ／ｍｌ）。
【００４９】
これは本発明の精製法がそれにより精製されたウイルス構築物の感染性に有害な影響を与えないことを示している。
【００５０】
本明細書中、上記のすべての刊行物は引用により本明細書に編入する。本発明を特定の好適な態様について記載してきたが、本発明の精神から逸脱することなく修飾を行うことができるのは明白である。そのような修飾は前述の特許請求の範囲にあるものとする。
【国際公開パンフレット】
2004538005.tif 000003
2004538005.tif 000004
2004538005.tif 000005
2004538005.tif 000006
2004538005.tif 000007
2004538005.tif 000008
2004538005.tif 000009
2004538005.tif 000010
2004538005.tif 000011
2004538005.tif 000012
2004538005.tif 000013
2004538005.tif 000014
2004538005.tif 000015
2004538005.tif 000016
2004538005.tif 000017
2004538005.tif 000018
2004538005.tif 000019
2004538005.tif 000020
2004538005.tif 000021
2004538005.tif 000022
【国際調査報告】
2004538005.tif 000023
2004538005.tif 000024
2004538005.tif 000025