(57)【要約】本発明は、ＣｐＧ含有ジヌクレオチドのメチル化状態を、ゲノムの幅広い規模で決定するための方法を提供し、この方法は、切断頻度の低いメチル化感受性の制限エンドヌクレアーゼ、および得られたＤＮＡフラグメントの二次元ゲル電気泳動ディスプレイを使用する。このような方法を使用して、癌を診断し得、腫瘍を分類し得、そして癌患者に対する予後を提供し得る。本発明はまた、正常な非悪性細胞と比較して、悪性細胞において差示的にメチル化される、ＣｐＧジヌクレオチドを含む単離されたポリヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドを提供する。このようなポリヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドは、癌の診断のために有用である。本発明はまた、ライブラリーにおいて、正常な非悪性細胞と比較して、悪性細胞において差示的にメチル化される、特定のＣｐＧジヌクレオチドを含む新たなＤＮＡクローンを同定するための方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
腫瘍または新生物に含まれる悪性細胞において優先的にメチル化される、ＣｐＧアイランドを同定する方法であって、以下：
ａ）該悪性細胞から得られたゲノムＤＮＡを、切断頻度の低いメチル化感受性制限酵素で消化して、悪性細胞制限フラグメントのセットを提供する工程；
ｂ）非悪性のコントロール細胞から得られたゲノムＤＮＡを、切断頻度の低いメチル化感受性制限酵素で消化して、コントロール細胞制限フラグメントのセットを提供する工程；
ｃ）検出可能な標識を、該悪性細胞制限フラグメントおよび該コントロール制限フラグメントの末端に付着させる工程；
ｄ）該標識された悪性細胞制限フラグメントおよびコントロール細胞制限フラグメントを、第二の制限酵素で消化する工程；
ｅ）該標識された悪性細胞制限フラグメントおよび該標識されたコントロール相棒制限フラグメントを分離する工程であって、該悪性細胞制限フラグメントおよび該コントロール細胞制限フラグメントが、２つの異なるゲル上で電気泳動によって分離される、工程；
ｆ）該ゲルの各々における該制限フラグメントを、第三の制限酵素で消化する工程；
ｇ）該ゲルの各々における該制限フラグメントを、第一の方向に対して垂直な方向で電気泳動して、第一のパターンの検出可能な悪性細胞制限フラグメントおよび第二のパターンの検出可能なコントロール細胞制限フラグメントを提供する工程；ならびに
ｈ）該第一のパターンを該第二のパターンと比較して、該第二のパターンにおける、該第一のパターンに存在しないかまたは該第一のパターンにおいて減少した強度を示す、診断コントロール細胞制限フラグメントを同定する工程であって、該診断コントロール細胞制限フラグメントが、該コントロール細胞のＤＮＡにおいてはメチル化されず、そして該悪性細胞のＤＮＡにおいてはメチル化される、ＣｐＧアイランドを含む、工程、
を包含する、方法。
【請求項２】
診断コントロール細胞制限フラグメントの少なくとも一部の配列を決定する工程をさらに包含し、該一部が、該フラグメントの末端またはその近くに位置する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
診断コントロール細胞制限フラグメントを含むＤＮＡライブラリーから、クローンを得る工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
癌を有することが疑われる被験体から得た組織を特徴付けるための、ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドを調製する方法であって、以下：
請求項２に記載の方法に従って同定された診断コントロールフラグメントの１つの鎖における標的配列と同一であるか、または該標的配列と実質的に相補的である配列を含む、ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドを合成する工程であって、該標的配列が、少なくとも２つのＣｐＧジヌクレオチドを含み、該オリゴヌクレオチドが、１５〜３４ヌクレオチド長であり；そして該ポリヌクレオチドが、３５〜２０００ヌクレオチド長である、工程、
を包含する、方法。
【請求項５】
前記標的配列が、前記メチル化感受性制限酵素によって切断された、前記コントロール制限フラグメントの末端またはその近くに位置している、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記標的配列が、前記メチル化感受性制限酵素によって切断された、前記コントロール制限フラグメントの末端の約１００ヌクレオチド〜約５００ヌクレオチド下流に位置している、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記コントロール制限フラグメントが、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２、および配列番号９３からなる群より選択される配列を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項８】
悪性細胞のゲノムＤＮＡにおける１つまたは複数のＣｐＧアイランドのメチル化に関連する癌を有すると疑われる被験体から得られた細胞を特徴付けるための、単離されたポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドであって、該ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドは、請求項２に記載の方法によって同定された診断コントロールフラグメントの鎖の１つにおける標的配列と同一であるか、または該標的配列と相補的である配列を含み、該標的配列は、少なくとも２つのＣｐＧジヌクレオチドを含み、該オリゴヌクレオチドは、１５〜３４ヌクレオチド長であり、そして該ポリヌクレオチドは；３５〜３０００ヌクレオチド長である、単離されたポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド。
【請求項９】
前記標的配列が、前記メチル化感受性制限酵素によって切断された前記コントロール制限フラグメントの末端またはその近くに位置している、請求項８に記載の単離されたポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド。
【請求項１０】
前記標的配列が、前記メチル化感受性制限酵素によって切断された前記コントロール制限フラグメントの末端の、約１００ヌクレオチド〜約５００ヌクレオチド下流に位置している、請求項８に記載の単離されたポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド。
【請求項１１】
悪性細胞のゲノムＤＮＡにおける１つまたは複数のＣｐＧアイランドのメチル化に関連する癌を有すると疑われる被験体から得られた細胞を特徴付けるための、単離されたポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドであって、該ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドは、請求項２に記載の方法に従って同定された診断コントロールフラグメントの鎖の１つにおける改変された標的配列と同一であるか、または該標的配列に相補的である配列を含み、該改変された標的配列は、二亜硫酸ナトリウムで処理することによって改変された標的配列由来であり、該改変された標的配列は、シトシンを欠き、そして少なくとも２つのＵｐＧジヌクレオチドを含み、該オリゴヌクレオチドは、１５〜３４ヌクレオチド長であり；そして該ポリヌクレオチドは、３５〜３０００ヌクレオチド長である、単離されたポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド。
【請求項１２】
前記改変された標的配列が、前記メチル化感受性制限酵素によって切断された前記コントロール制限フラグメントの末端またはその近くに位置する標的配列由来である、請求項１１に記載の単離されたポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド。
【請求項１３】
前記改変された標的配列が、前記メチル化感受性制限酵素によって切断された前記コントロール制限フラグメントの末端の、約１００ヌクレオチド〜約５０００ヌクレオチド下流に位置する標的配列由来である、請求項１１に記載の単離されたポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド。
【請求項１４】
癌を有すると疑われる被験体から得られた細胞を特徴付けるための、単離されたポリヌクレオチドであって、該癌は、神経膠種、急性骨髄性白血病、小児期の未分化神経外胚葉性腫瘍、乳癌、結腸癌、頭部および頸部の癌、精巣癌ならびに肺癌からなる群より選択され；該ポリヌクレオチドが、３５〜３０００ヌクレオチド長であり、そして少なくとも２つのＣｐＧジヌクレオチドを含み、そして該ポリヌクレオチドが、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２、および配列番号９３からなる群より選択される配列に位置する標的配列と同一であるか、または該標的配列に相補的である配列を含む、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１５】
前記被験体が、神経膠腫を有すると疑われており、そして前記ポリヌクレオチドが、配列番号７８、配列番号７１、配列番号７５、配列番号１８、配列番号４、配列番号２２、配列番号８２、配列番号２７、配列番号３８、配列番号４７、配列番号４９、配列番号５９、配列番号３６、配列番号４６、配列番号２、配列番号７、配列番号２０、配列番号３０、配列番号４５、配列番号７２、配列番号７０、配列番号２６、配列番号５４、または配列番号６９に位置する標的配列と同一であるか、または該標的配列に相補的である配列を含む、請求項１４に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１６】
前記被験体が、急性骨髄性白血病を有すると疑われており、そして前記ポリヌクレオチドが、配列番号１０、配列番号４４、配列番号４８、配列番号５８、配列番号７３、配列番号３、配列番号５、配列番号９、配列番号１４、配列番号２４、配列番号３３、配列番号５６、配列番号６８、配列番号７６、配列番号１７、配列番号５２、配列番号５７、配列番号２６、配列番号３８、配列番号４７、配列番号４９、配列番号５９、配列番号３６、配列番号４６、配列番号３８、配列番号４７、配列番号４９、配列番号５９、配列番号３６、配列番号４６、配列番号２、配列番号７、配列番号２０、配列番号３０、配列番号４５、配列番号７２、配列番号１６、配列番号５５、配列番号６１、配列番号６３、または配列番号７０に位置する標的配列と同一であるか、または該標的配列に相補的な配列を含む、請求項１４に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１７】
前記被験体が、小児期の未分化神経外胚葉性腫瘍を有すると疑われており、そして前記ポリヌクレオチドが、配列番号３９、配列番号４２、配列番号５０、配列番号９、配列番号１４、配列番号２４、配列番号３７、配列番号４、配列番号３６、配列番号４６、配列番号７２、配列番号２６、配列番号１５、配列番号１９、または配列番号６１に位置する標的配列と同一であるか、または該標的配列に相補的な配列を含む、請求項１４に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１８】
前記被験体が、乳癌を有すると疑われており、そして前記ポリヌクレオチドが、配列番号２１、配列番号２８、配列番号４１、配列番号８０、配列番号３７、配列番号６３、配列番号７１、配列番号７５、配列番号１８、配列番号４、配列番号２２、配列番号８２、配列番号１２、配列番号２３、配列番号３１、配列番号３４、配列番号４３、配列番号６０、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６７、または配列番号７７に位置する標的配列と同一であるか、または該標的配列に相補的な配列を含む、請求項１４に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１９】
前記被験体が、結腸癌を有すると疑われており、そして前記ポリヌクレオチドが、配列番号１１、配列番号４０、配列番号７４、配列番号８１、配列番号５３、配列番号６２、配列番号７６、配列番号１７、配列番号５２、配列番号５７、配列番号３７、配列番号７５、配列番号１８、配列番号４、配列番号２７、配列番号３８、配列番号４７、配列番号４９、配列番号５９、配列番号３９、または配列番号４６に位置する標的配列と同一であるか、または該標的配列に相補的な配列を含む、請求項１４に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項２０】
前記被験体が、頭部および頸部の癌を有すると疑われており、そして前記ポリヌクレオチドが、配列番号１、配列番号７９、配列番号３、配列番号５、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５３、配列番号６２、配列番号７６、配列番号８、または配列番号１３に位置する標的配列と同一であるか、または該標的配列に相補的な配列を含む、請求項１４に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項２１】
前記被験体が、精巣癌を有すると疑われており、そして前記ポリヌクレオチドが、配列番号２９、配列番号３３、配列番号５６、配列番号６８、配列番号５１、配列番号５７、配列番号７０、配列番号５４、または配列番号６９に位置する標的配列と同一であるか、または該標的配列に相補的な配列を含む、請求項１４に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項２２】
前記被験体が、肺癌を有すると疑われており、そして前記ポリヌクレオチドが、配列番号８３、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２、および配列番号９３に位置する標的配列と同一であるか、または該標的配列に相補的な配列を含む、請求項１４に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項２３】
癌を有すると疑われる被験体から得られた細胞を特徴付けるための、単離されたＣｐＧ診断オリゴヌクレオチドであって、該癌は、神経膠種、急性骨髄性白血病、小児期の未分化神経外胚葉性腫瘍、乳癌、結腸癌、頭部および頸部の癌、精巣癌ならびに肺癌からなる群より選択され；該オリゴヌクレオチドが、１５〜３４ヌクレオチド長であり、そして少なくとも２つのＣｐＧジヌクレオチドを含み、そして該オリゴヌクレオチドが、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２、および配列番号９３からなる群より選択される配列のヌクレオチド１からヌクレオチド９９にわたる領域に位置する標的配列と同一である配列、または該配列番号の約ヌクレオチド１００〜ヌクレオチド５００にわたる領域に位置する標的配列の逆方向相補体である配列を含む、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項２４】
前記被験体が、神経膠腫を有すると疑われており、そして前記オリゴヌクレオチドが、配列番号７８、配列番号７１、配列番号７５、配列番号１８、配列番号４、配列番号２２、配列番号８２、配列番号２７、配列番号３８、配列番号４７、配列番号４９、配列番号５９、配列番号３６、配列番号４６、配列番号２、配列番号７、配列番号２０、配列番号３０、配列番号４５、配列番号７２、配列番号７０、配列番号２６、配列番号５４、または配列番号６９のヌクレオチド１からヌクレオチド９９にわたる領域に位置する標的配列と同一である配列を含むか、または該オリゴヌクレオチドは、該配列番号の約ヌクレオチド１００〜ヌクレオチド５００にわたる領域に位置する標的配列の逆方向相補体である配列を含む、請求項２３に記載の単離されたオリゴヌクレオチド。
【請求項２５】
前記被験体が、急性骨髄性白血病を有すると疑われており、そして前記オリゴヌクレオチドが、配列番号１０、配列番号４４、配列番号４８、配列番号５８、配列番号７３、配列番号３、配列番号５、配列番号９、配列番号１４、配列番号２４、配列番号３３、配列番号５６、配列番号６８、配列番号７６、配列番号１７、配列番号５２、配列番号５７、配列番号２６、配列番号３８、配列番号４７、配列番号４９、配列番号５９、配列番号３６、配列番号４６、配列番号３８、配列番号４７、配列番号４９、配列番号５９、配列番号３６、配列番号４６、配列番号２、配列番号７、配列番号２０、配列番号３０、配列番号４５、配列番号７２、配列番号１６、配列番号５５、配列番号６１、配列番号６３、または配列番号７０のヌクレオチド１からヌクレオチド９９にわたる領域に位置する標的配列と同一である配列を含むか、または該オリゴヌクレオチドは、該配列番号の約ヌクレオチド１００〜ヌクレオチド５００にわたる領域に位置する標的配列の逆方向相補体である配列を含む、請求項２３に記載の単離されたオリゴヌクレオチド。
【請求項２６】
前記被験体が、小児期の未分化神経外胚葉性腫瘍を有すると疑われており、そして前記オリゴヌクレオチドが、配列番号３９、配列番号４２、配列番号５０、配列番号９、配列番号１４、配列番号２４、配列番号３７、配列番号４、配列番号３６、配列番号４６、配列番号７２、配列番号２６、配列番号１５、配列番号１９、または配列番号６１のヌクレオチド１からヌクレオチド９９にわたる領域に位置する標的配列と同一である配列を含むか、または該オリゴヌクレオチドは、該配列番号の約ヌクレオチド１００〜ヌクレオチド５００にわたる領域に位置する標的配列の逆方向相補体である配列を含む、請求項２３に記載の単離されたオリゴヌクレオチド。
【請求項２７】
前記被験体が、乳癌を有すると疑われており、そして前記オリゴヌクレオチドが、配列番号２１、配列番号２８、配列番号４１、配列番号８０、配列番号３７、配列番号６３、配列番号７１、配列番号７５、配列番号１８、配列番号４、配列番号２２、配列番号８２、配列番号１２、配列番号２３、配列番号３１、配列番号３４、配列番号４３、配列番号６０、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６７、または配列番号７７のヌクレオチド１からヌクレオチド９９にわたる領域に位置する標的配列と同一である配列を含むか、または該オリゴヌクレオチドは、該配列番号の約ヌクレオチド１００〜ヌクレオチド５００にわたる領域に位置する標的配列の逆方向相補体である配列を含む、請求項２３に記載の単離されたオリゴヌクレオチド。
【請求項２８】
前記被験体が、結腸癌を有すると疑われており、そして前記オリゴヌクレオチドが、配列番号１１、配列番号４０、配列番号７４、配列番号８１、配列番号５３、配列番号６２、配列番号７６、配列番号１７、配列番号５２、配列番号５７、配列番号３７、配列番号７５、配列番号１８、配列番号４、配列番号２７、配列番号３８、配列番号４７、配列番号４９、配列番号５９、配列番号３９、または配列番号４６のヌクレオチド１からヌクレオチド９９にわたる領域に位置する標的配列と同一である配列を含むか、または該オリゴヌクレオチドは、該配列番号の約ヌクレオチド１００〜ヌクレオチド５００にわたる領域に位置する標的配列の逆方向相補体である配列を含む、請求項２３に記載の単離されたオリゴヌクレオチド。
【請求項２９】
前記被験体が、頭部および頸部の癌を有すると疑われており、そして前記オリゴヌクレオチドが、配列番号１、配列番号７９、配列番号３、配列番号５、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５３、配列番号６２、配列番号７６、配列番号８、または配列番号１３のヌクレオチド１からヌクレオチド９９にわたる領域に位置する標的配列と同一である配列を含むか、または該オリゴヌクレオチドは、該配列番号の約ヌクレオチド１００〜ヌクレオチド５００にわたる領域に位置する標的配列の逆方向相補体であるヌクレオチド配列を含む、請求項２３に記載の単離されたオリゴヌクレオチド。
【請求項３０】
前記被験体が、精巣癌を有すると疑われており、そして前記オリゴヌクレオチドが、配列番号２９、配列番号３３、配列番号５６、配列番号６８、配列番号５１、配列番号５７、配列番号７０、配列番号５４、または配列番号６９のヌクレオチド１からヌクレオチド９９にわたる領域に位置する標的配列と同一である配列を含むか、または該オリゴヌクレオチドは、該配列番号の約ヌクレオチド１００〜ヌクレオチド５００にわたる領域に位置する標的配列の逆方向相補体である配列を含む、請求項２３に記載の単離されたオリゴヌクレオチド。
【請求項３１】
前記被験体が、肺癌を有すると疑われており、そして前記オリゴヌクレオチドが、配列番号８３、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２、および配列番号９３のヌクレオチド１からヌクレオチド９９にわたる領域に位置する標的配列と同一である配列を含むか、または該オリゴヌクレオチドは、該配列番号の約ヌクレオチド１００〜ヌクレオチド５００にわたる領域に位置する標的配列の逆方向相補体である配列を含む、請求項２３に記載の単離されたオリゴヌクレオチド。
【請求項３２】
癌を有すると疑われる被験体から得られた細胞が悪性であるか非悪性であるかを決定するための方法であって、以下：
ａ）該細胞から単離されたＤＮＡを、メチル化感受性制限酵素で消化して、制限フラグメントのセットを提供する工程；
ｂ）該制限フラグメントを、請求項２に記載の方法に従って同定された診断コントロールフラグメントの鎖の１つの標的配列と同一であるか、または該標的配列に相補的である配列を含むＣｐＧ診断ポリヌクレオチドとハイブリダイズさせる工程であって、該方法は、該メチル化感受性制限酵素を使用し、該標的配列は、少なくとも２つのＣｐＧジヌクレオチドを含み、該ポリヌクレオチドは、３５〜３０００ヌクレオチド長であり、そして該反応は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で実施される、工程；ならびに
ｃ）工程ｂ）の反応生成物をアッセイして、該ＣｐＧ診断ポリヌクレオチドがハイブリダイズされた制限フラグメントの大きさまたは配列を決定する工程、
を包含する、方法。
【請求項３３】
前記被験体が、神経膠種、急性骨髄性白血病、小児期の未分化神経外胚葉性腫瘍、乳癌、結腸癌、頭部および頸部の癌、ならびに精巣癌からなる群より選択される癌を有すると疑われており；
前記ＤＮＡサンプルが、ＮｏｔＩで消化され；そして
前記ポリヌクレオチドが、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９、配列番号８０、配列番号８１、および配列番号８２に位置する標的配列と同一であるかまたは該標的配列に相補的である配列を含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記被験体が、肺癌を有すると疑われており、
前記ＤＮＡが、ＡｓｃＩで消化され、そして
前記ポリヌクレオチドが、配列番号８３、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２、および配列番号９３に位置する標的配列と同一であるか、または該標的配列に相補的である配列を含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３５】
癌を有すると疑われる被験体から得られた組織サンプルに含まれる細胞が悪性であるか否かを決定する方法であって、以下：
ａ）メチル化されていないシトシンを異なるヌクレオチド塩基に変換する化合物で、該組織サンプルから単離されたＤＮＡを処理する工程；
ｂ）癌を有することが既知の被験体の悪性細胞において優先的にメチル化されるＣｐＧアイランドを含む標的配列に相補的な、ＣｐＧ診断オリゴヌクレオチドと、該処理されたＤＮＡの一部とを反応させる工程；
ｃ）該標的配列におけるシトシンが該異なるヌクレオチド塩基で置換された改変標的配列に相補的な、改変ＣｐＧ診断オリゴヌクレオチドと、該処理されたＤＮＡの一部とを反応させる工程；ならびに
ｄ）工程ｂおよび工程ｃの反応生成物をアッセイして、該処理されたＤＮＡが、該ＣｐＧ診断オリゴヌクレオチドとハイブリダイズしたか、該改変されたＣｐＧ診断オリゴヌクレオチドとハイブリダイズしたかを決定する工程であって；該処理されたＤＮＡと該ＣｐＧ診断オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションが、該改変ＣｐＧ診断オリゴヌクレオチドとは対照的に、該ＤＮＡが悪性細胞から得られたことを示す、工程、
を包含する、方法。
【請求項３６】
前記化合物が、二亜硫酸ナトリウムであり、そして前記メチル化されていないシトシンが、ウラシルに変換される、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記アッセイが、ポリメラーゼ連鎖反応であり、
前記処理されたＤＮＡの一部が、２つの診断ＣｐＧオリゴヌクレオチドを含む第一のプライマーセットと反応され；そして
該処理されたＤＮＡの一部が、２つの改変された診断ＣｐＧオリゴヌクレオチドを含む第二のプライマーセットと反応される、
請求項３５に記載の方法。
【請求項３８】
前記被験体が、神経膠種、急性骨髄性白血病、小児期の未分化神経外胚葉性腫瘍、乳癌、結腸癌、頭部および頸部の癌、精巣癌ならびに肺癌からなる群より選択される癌を有すると疑われており；
前記ＣｐＧ診断オリゴヌクレオチドが、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２、および配列番号９３に位置する標的配列と同一であるかまたは該標的配列と相補的である配列を含む、該ポリヌクレオチドからなる群より選択される配列の、ヌクレオチド１とヌクレオチド１００との間に位置する標的配列に同一な配列、または該配列番号の約ヌクレオチド１００〜ヌクレオチド５００にわたる領域に位置する標的配列の逆方向の相補体である配列を含む、
請求項３５に記載の方法。
【請求項３９】
癌を有すると疑われる被験体から得られた細胞を特徴付けるための、単離されたポリヌクレオチドであって、該癌は、神経膠種、急性骨髄性白血病、小児期の未分化神経外胚葉性腫瘍、乳癌、結腸癌、頭部および頸部の癌、精巣癌ならびに肺癌からなる群より選択され；該ポリヌクレオチドが、３５〜１０００ヌクレオチド長であり、そして少なくとも２つのＣｐＧジヌクレオチドを含み、そして該ポリヌクレオチドが、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２、および配列番号９３のヌクレオチド１とヌクレオチド１５との間を起源とする標的配列と同一である配列、または該標的配列に相補的な配列を含む、単離されたポリヌクレオチド。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
本発明は、少なくとも一部、国立癌研究所によって与えられた国立衛生研究所の助成金番号Ｐ３０  ＣＡ１６０５８およびＣＡ８０９１２の下で政府の支援によって実施された。
【０００２】
（発明の背景）
癌の診断、腫瘍の分類、および癌患者の予後は全て、正常な非悪性細胞中では存在しない癌（すなわち、悪性細胞）に固有の特性の検出に依存する。癌はたいてい、細胞のＤＮＡにおける変化から生じかつこれに関連する遺伝子疾患であるので、１つの重要な診断方法は、癌細胞のＤＮＡ内での関連する変化の検出を介する。このような変化は、２つの変化であり得る。第１の型の変化は、ＤＮＡ内のヌクレオチド塩基の配列が変化する場合に生じる遺伝子変化である。ＤＮＡ内の塩基の変化、欠失および挿入は、このような遺伝子変化の例である。ＤＮＡ中の第２の変化は、後成的な変化である。後成的な変化は、ヌクレオチド配列変化を生じず、むしろ、ヌクレオチド塩基の修飾を生じる。後成的変化の最も一般的な型は、ＤＮＡメチル化である。
【０００３】
哺乳動物細胞において、ＤＮＡメチル化はもっぱら、シトシンヌクレオチド塩基の５炭素部分に対するメチル基の付加からなる。このプロセスにおいて、シトシンは、５−メチルシトシンに変化する。細胞酵素は、メチル化事象を実行する。ＣｐＧジヌクレオチド中のグアノシンに対して５’に位置するシトシンのみが、哺乳動物細胞中の酵素によってメチル化される。このようなＣｐＧジヌクレオチドは、ゲノム全体を通して無作為に分布するわけではない。それよりも、多くのＣｐＧジヌクレオチドを含む哺乳動物ゲノムの領域が存在し、一方で、そのゲノムの他の領域は、ほとんどＣｐＧジヌクレオチドを含まない。ゲノムのこのようなＣｐＧに富む領域は、「ＣｐＧアイランド（ＣｐＧ  ｉｓｌａｎｄ）」と呼ばれる。より頻繁に、ＣｐＧアイランドは、遺伝子の転写プロモーター領域中に存在する。
【０００４】
全てのＣｐＧアイランドがメチル化されるわけではない。しかし、ＣｐＧアイランドのメチル化状態（すなわち、特定のＣｐＧアイランド内のＣｐＧジヌクレオチドがメチル化されるかまたはメチル化されないか）は、比較的細胞中で一定である。それにもかかわらず、ＣｐＧアイランドメチル化のパターンは変化し得、そして変化する場合、新規な比較的安定なメチル化パターンが確立される。ＣｐＧアイランドのメチル化におけるこのような変化は、メチル化において増大するかまたは減少するかのいずれかであり得る。
【０００５】
いくつかの特定の遺伝子のプロモーター領域におけるＣｐＧアイランドのメチル化は、いくつかの型のヒト癌において観察されている。しかし、現在のところ、癌を有することが疑われる被験体のゲノムＤＮＡにおける複数のＣｐＧアイランドのメチル化状態が、このような被験体から得られた組織が悪性細胞を含むか否かを決定するための診断ツールとして使用され得るかどうかは、未だ不明である。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
（発明の要旨）
本発明は、被験体中の１つ以上の癌に診断的なＣｐＧアイランドを同定するための方法に関連する。この方法は、制限認識部位ゲノム走査（ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  ｌａｎｄｍａｒｋ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ｓｃａｎｎｉｎｇ）（ＲＬＧＳ）技術を使用し、そして以下の工程を包含する：特定の腫瘍組織に由来する悪性細胞から得られたゲノムＤＮＡおよび健常組織に由来するコントロール細胞から得られたゲノムＤＮＡを別々に消化する工程であって、メチル化認識部位を切断し得ない制限酵素でまれに切断して、腫瘍組織由来のＤＮＡ制限フラグメント（本明細書中の以後「悪性細胞制限フラグメント」と称する）の第１セットおよび健常組織由来のＤＡＮ制限フラグメント（本明細書中の以後「コントロール細胞制限フラグメント」と称する）の第１セットを提供する、工程；悪性細胞制限フラグメントおよびコントロール細胞制限フラグメントの末端に検出可能な標識を結合させる工程；第２の制限酵素を用いてこの標識された悪性細胞制限フラグメントおよびコントロール細胞制限フラグメントを消化する工程；制限フラグメントの各セットをゲル上で分離する工程；第３のより切断頻度の高い制限酵素を用いて各ゲル中の制限フラグメントを消化する工程；第１の方向と垂直方向で制限フラグメントの各セットを電気泳動して、検出可能な悪性細胞制限フラグメントの第１パターンおよび検出可能なコントロール細胞制限フラグメントの第２パターンを提供する工程；そして第２のパターンを第１のパターンと比較して、第１パターン中で存在しないか、または減少した標識強度を示すコントロール細胞制限フラグメント（本明細書中の以後「診断フラグメント」と称する）を同定する工程。このようなフラグメントは、悪性細胞中でメチル化されているＣｐＧアイランドを含む。このようなパターンは、悪性細胞を含むことが疑われる組織の特徴付けに有用である。好ましくは、その後この診断フラグメントの各々は、単離され、そして少なくとも一部、配列決定される。１つの好ましい実施形態において、第１の制限酵素はＮｏｔＩである。別の好ましい実施形態において、第１の制限酵素はＡｓｃＩである。有利なことに、本方法は、全ゲノム内の多数のメチル化部位の検出を可能にする。本方法に従って、出願人は、特定のＣｐＧアイランドが、乳癌、神経膠腫、急性骨髄性白血病、小児の未分化神経外胚葉性腫瘍、結腸癌、頭部および頸部の癌、精巣癌、ならびに肺癌を有すると診断された被験体の腫瘍組織から得られたＤＮＡ中で優先的にメチル化されることを決定した。
【０００７】
本発明はまた、神経膠腫、急性骨髄性白血病、小児の未分化神経外胚葉性腫瘍、または乳癌、結腸癌、頭部および頸部の癌、精巣癌、もしくは肺癌を有することが疑われる被験体から得られた組織サンプルの特徴づけに有用である、本明細書中で以後「ＣｐＧ診断ポリヌクレオチド」と称する単離されたポリヌクレオチドおよび本明細書中で以後「ＣｐＧ診断オリゴヌクレオチド」と称する単離されたオリゴヌクレオチドを提供する。このＣｐＧ診断ポリヌクレオチドおよびＣｐＧ診断オリゴヌクレオチドの両方が、乳癌、神経膠腫、急性骨髄性白血病、小児の未分化神経外胚葉性腫瘍、結腸癌、頭部および頸部の癌、精巣癌、もしくは肺癌を有すると診断された被験体の悪性細胞から得られたＤＮＡ中で優先的にメチル化されることが示されているＣｐＧアイランドを含む、配列を含む。このＣｐＧ診断ポリヌクレオチドは、３５〜３０００ヌクレオチド長であり、好ましくは３５〜１００ヌクレオチド長であり、そして添付のＤＮＡ配列表中に示される配列またはこれらに相補的な配列内に含まれる、１５〜３４（好ましくは１８〜２５）の連続ヌクレオチドを含む。このＣｐＧ診断ポリヌクレオチドは、好ましくは２つ以上の、ＣｐＧジヌクレオチドまたはこれらに相補的なジヌクレオチドを含む。このＣｐＧ診断オリゴヌクレオチドは、１５〜３４ヌクレオチド長であり、そして配列表中に示される配列またはこれらに相補的な配列内に含まれる、１５〜３４の連続ヌクレオチドを含む。このＣｐＧオリゴヌクレオチドは、２つ以上の、ＣｐＧジヌクレオチドまたはこれらに相補的なジヌクレオチドを含む。
【０００８】
本発明はまた、癌を有することが疑われる患者由来の組織を特徴付けるために、本発明のＣｐＧ診断ポリヌクレオチドおよびＣｐＧ診断オリゴヌクレオチドを使用する方法に関する。このような方法は、乳癌、神経膠腫、急性骨髄性白血病、小児の未分化神経外胚葉性腫瘍、結腸癌、頭部および頸部の癌、精巣癌、ならびに肺癌を有すると診断された被験体の腫瘍組織から得られたＤＮＡ中で優先的にメチル化されることが示されているＣｐＧアイランドのメチル化状態に基づく。１つの方法において、被験体由来の疑わしい腫瘍組織から単離されたＤＮＡは、より小さなフラグメントに消化され、そしてストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でＣｐＧ診断ポリヌクレオチドと反応させられる。次いで、この反応生成物は、そのＣｐＧ診断ポリヌクレオチドがハイブリダイズするＤＮＡフラグメントのサイズまたは配列を決定するためにアッセイされる。そのＣｐＧ診断ポリヌクレオチドがハイブリダイズするＤＮＡフラグメント（本明細書中の以後「標的ＤＮＡフラグメント」と称する）のサイズまたは配列は、標的ＤＮＡフラグメントがメチル化ＣｐＧアイランドまたは非メチル化ＣｐＧアイランドを含むか否かを示す。標的ＤＮＡフラグメント中のメチル化ＣｐＧアイランドの存在は、そのＤＮＡが、診断ＣｐＧポリヌクレオチドが診断マーカーとして機能する腫瘍または新生物から得られたことを示す。
【０００９】
別の方法において、疑わしい腫瘍組織由来のＤＮＡは、非メチル化シトシンを異なるヌクレオチド塩基に変換する化学化合物を用いて処理される。このような化合物の例は、非メチル化シトシンをウラシルに変換する二亜硫酸ナトリウムである。次いでこのＤＮＡは、ＣｐＧ診断オリゴヌクレオチドがＤＮＡ中の相補的配列（本明細書中で以後「標的配列」と称する）にハイブリダイズすることを可能にする条件下で、ＣｐＧ診断オリゴヌクレオチドと反応させられる。このＤＮＡはまた、改変ＣｐＧ診断オリゴヌクレオチドと反応させられる。この改変ＣｐＧ診断オリゴヌクレオチドは、改変標的配列（すなわち、標的配列中の非メチル化シトシンが化学化合物を用いて処理された場合に、異なるヌクレオチド塩基（例えば、ウラシル）に変換される、配列）に相補的な配列を含む。次いで、この反応生成物は、そのＤＮＡが、ＣｐＧ診断オリゴヌクレオチドまたは改変ＣｐＧ診断オリゴヌクレオチドとハイブリダイズする配列を含むか否かを決定するためにアッセイされる。改変ＣｐＧ診断オリゴヌクレオチドとは対照的に、サンプルＤＮＡのＣｐＧ診断オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションは、標的配列中のシトシンがメチル化されること、およびそのＤＮＡサンプルが、ＣｐＧオリゴヌクレオチドが診断マーカーとして機能することが示された腫瘍または新生物から得られたことを示す。
【００１０】
本発明はまた、その発現が癌細胞中で上昇または減少する遺伝子を同定する方法に関する。
【００１１】
（発明の詳細な説明）
１つの局面において、本発明は、特定のクローン内に含まれるかまたは特定のクローンに非常に近接したＣｐＧジヌクレオチドのメチル化状態に基づく、癌診断および腫瘍分類のために使用され得るＤＮＡライブラリー内のクローンを同定するための方法に関する。このような方法は、メチル化感受性制限エンドヌクレアーゼ（ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ−ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ）（ＭＳＲＥ）および制限認識部位ゲノム走査（ＲＬＧＳ）ゲルを使用し、癌を有すと診断された患者から得られた悪性細胞内の、新規な差次的にメチル化されるＣｐＧアイランドを同定する。本発明に従って、出願人は、患者由来の腫瘍生検が良性細胞または悪性細胞を含むか否かを決定するために使用され得る、９３クローンを同定した。
【００１２】
このような方法を実行するために、腫瘍または新生物を含む組織（本明細書中の以後「腫瘍組織」と称する）が、癌を有することが既知の患者から得られる。いくつかの場合、腫瘍組織は、患者から外科的に取り出された特定の型の固形腫瘍から得られる。いくつかの場合、腫瘍組織は、患者の造血系（例えば、骨髄または血液など）から得られる。腫瘍組織は、良性腫瘍もしくは悪性腫瘍または良性新生物もしくは良性新生物のいずれかに由来することが決定される。
【００１３】
これとは別に、腫瘍または新生物を含まない組織（本明細書中の以後「健常組織」と称する）が、被験体から得られる。健常組織は、患者から正常な組織を外科的に取り出すことによってか、または癌を有さない健常なコントロール被験体から正常な組織を外科的に取り出すことによって、入手され得る。健常組織もまた、健常なコントロール被験体の造血系（例えば、骨髄または血液など）に由来し得る。健常組織は、非腫瘍性または非新生物性であることが決定される。
【００１４】
次いで、ＤＮＡが、腫瘍組織および健常組織の両方から単離される。腫瘍組織が固形組織サンプルである場合、このような手順は第１に、組織内に含まれる個々の細胞を互いに分離する工程を包含し得る。例えば、組織サンプルが患者から外科的に取り出された後に凍結された場合、細胞は、乳鉢および乳棒を用いてその凍結組織を砕くことによって、互いに分離され得る。次いで、ＤＮＡは、当業者に周知の手順を用いて個々の細胞から単離される。通常、このようなＤＮＡ単離手順は、例えば、界面活性剤を用いた個々の細胞の溶解を含む。細胞溶解後、通常、タンパク質は、種々のプロテアーゼを用いてＤＮＡから除去される。次いで、このＤＮＡは一般的に、フェノールを用いて抽出され、アルコール中で沈殿され、そして水溶液中に溶解される。
【００１５】
以下の手順において、腫瘍組織から得られたＤＮＡは、健常組織から得られたＤＮＡと別々に処理される（すなわち、これら２つのＤＮＡは、混合しない）。これらのＤＮＡは、制限認識部位ゲノム走査（ＲＬＧＳ）を称される方法を用いて別々に分析される。その目的は、両方のＤＮＡを別々に分析することである。次いで、２つの分析を比較して、癌細胞を正常細胞から識別するＣｐＧアイランドを同定する。
【００１６】
両方のＤＮＡサンプルが制限酵素で処理され、そして制限酵素切断から生じる遊離の末端が標識される。しかし、単離されたＤＮＡは直線の断片であるので、ＤＮＡを制限酵素で切断する前に、遊離の末端が存在する。これらの末端が標識されることを回避するために、好ましくはこれらの末端を、制限酵素処理の前にブロックする。このようなブロックは、制限酵素での処理前の、ジデオキシヌクレオチドおよびイオウ置換ヌクレオチドの遊離末端への付加によってなされ得る。その後、ＤＮＡが制限酵素で切断され、そして標識される場合、制限酵素切断から生じる末端のみが、標識される。
【００１７】
遊離末端をブロックするための反応後、ＤＮＡサンプルを、第１の制限酵素で切断する。この第１の制限酵素は、切断頻度が低いメチル化感受性制限酵素として特徴付けられ得る。適切な第１の制限酵素の例は、ＮｏｔＩ、ＡｓｃＩ、ＢｓｓＨＩＩおよびＥａｇＩである。本明細書中で使用される場合、用語「切断頻度が低い（ｉｎｆｒｅｑｕｅｎｔｌｙ  ｃｌｅａｖｉｎｇ）」とは、１０キロベースより長い間隔でゲノムＤＮＡを切断することが予測される制限酵素をいう。例えば、ＮｏｔＩは、切断頻度が低い制限酵素である。ＮｏｔＩは、ゲノム中の８塩基対（ｂｐ）のヌクレオチド配列（すなわち、５’ＧＣＧＧＣＣＧＣ３’）を認識し、そしてこの部位でＤＮＡを切断する。ヒトゲノム中に、このようなＮｏｔＩ認識配列が、推定４０００〜５０００個存在する。このような認識配列は、そのゲノム中に約１メガベース（Ｍｂ）の間隔を空けて存在していることが推定される。対照的に、切断頻度が高い制限酵素は、５〜１０ｋｂ間隔でヒトゲノムを切断することが予測される。このような酵素は、切断頻度が低い酵素よりも、ヒトゲノム内に約１００倍多い切断部位を有する。このような切断頻度の高い酵素は、通常、ゲノム中の８ｂｐ未満のヌクレオチド配列を認識し、そしてその部位でＤＮＡを切断する。しかし、８ｂｐ未満のヌクレオチド認識配列を有する全ての制限酵素が、切断頻度が高い酵素であるというわけではない。ＢｓｓＨＩＩおよびＥａｇＩの両方は、６ｂｐの認識配列を有するが、これらの２つの酵素についての認識配列は、ゲノム中で１０ｋｂよりも長い間隔を空けて存在する。本明細書中で使用される場合、「メチル化感受性」とは、その認識配列内の１以上のヌクレオチドがメチル化されている場合に、その正常な制限部位でＤＮＡを切断し得ない、任意の酵素をいう。例えば、制限酵素ＮｏｔＩは、５’ＧＣＧＧＣＣＧＣ３’認識配列が、５−メチルシトシンを含まない場合、その配列を切断する。しかし、ＮｏｔＩ酵素は、任意のシトシンがメチル化されて５−メチルシトシンになった場合、この配列を切断しない。
【００１８】
第１の制限酵素でのＤＮＡの消化後、ＤＮＡフラグメントの末端を標識する。これは、例えば、ＤＮＡサンプルの末端への検出可能な標識（例えば、放射性標識）を有するヌクレオチドの付着によって行われ得る。代表的には、付着は、第１の制限酵素での切断によって残された陥凹ＤＮＡ末端を、その末端が平滑末端化（すなわち、陥凹のない）するように充填することによって達成される。このような末端充填反応は、αリン酸位に放射性標識されたリン酸基を有するデオキシヌクレオチド三リン酸を使用し得る。このような標識されたリン酸基は、好ましくは、３２Ｐである。
【００１９】
次いで、各サンプル由来の標識されたフラグメントを、第２の制限酵素で切断する。このような第２の制限酵素は、好ましくは、５〜１０ｋｂの間の平均間隔でヒトＤＮＡを切断する。このような酵素は、通常、６ｂｐの認識配列を有する。好ましくは、第２の制限酵素は、メチル化感受性ではない。適切な第２の制限酵素の例は、ＰｓｔＩ、ＰｖｕＩ、ＥｃｏＲＶまたはＢａｍＨＩである。第２の制限酵素でのＤＮＡフラグメントの切断は、第１の酵素での切断によって残された末端が標識されている、第２のセットのフラグメントを提供する。このような第２のフラグメントの多くは、第１の制限酵素での切断から生じるフラグメントより小さい。
【００２０】
次いで、これらのＤＮＡフラグメントを、互いに分離する。好ましくは、この分離は、サイズに基づく。好ましくは、この分離は、約６０ｃｍ長のアガロースチューブ型ゲルを通す、一次元電気泳動によって行われる。
【００２１】
チューブ型ゲルを通す電気泳動後、ＤＮＡを、第３の制限酵素で、ゲル内で消化する。このような第３の制限酵素は、好ましくは、４ｂｐまたは６ｂｐの認識配列を有する。このような第３の制限酵素はまた、アガロースに包埋されているＤＮＡを切断し得る特性を有する。１つのこのような酵素は、ＨｉｎｆＩである。
【００２２】
第３の制限酵素での切断後、ＤＮＡを、再度、サイズに基づいて（好ましくは、ポリアクリルアミドゲルを通す電気泳動によって）分離する。その後、分離したＤＮＡフラグメントを、これらのＤＮＡフラグメントの標識された末端に基づいて検出する。フラグメントが放射性標識されている場合、検出は、その二次元ゲルのオートラジオグラフィーによる。このようなオートラジオグラフィーは、ＤＮＡフラグメントまたは「スポット」のパターンを提供する。このようなパターンは、ＲＬＧＳプロフィールと呼ばれる。
【００２３】
健常組織由来のＤＮＡを使用して得られたＲＬＧＳプロフィール上の各フラグメントは、オートラジオグラフ上でのその位置（Ｙ座標、Ｘ座標、フラグメント番号）によって固有に識別される。健常組織ＤＮＡから得られたＲＬＧＳプロフィール上の各フラグメントの位置について、同じ位置が、腫瘍組織ＤＮＡから得られたＲＬＧＳプロフィール上に観察される。
【００２４】
腫瘍組織ＤＮＡから得られたＲＬＧＳプロフィールと健常組織ＤＮＡから得られたＲＬＧＳプロフィールとのフラグメントごとの比較において、３つの異なるパターンが生じ得る。第１に、健常組織ＲＬＧＳプロフィール上の所定のフラグメントについて、腫瘍組織ＲＬＧＳプロフィール上に、同じ位置でかつ同じ強度の対応するフラグメントが存在し得る。これは、第１の制限酵素が両方のＤＮＡを同じ配列で切断したことを示す（図１Ａ）。これは、腫瘍組織ＤＮＡと健常組織ＤＮＡとの間のフラグメントのＮｏｔＩヌクレオチド認識配列のメチル化において差異がなかったことを示す。
【００２５】
第２に、健常組織ＲＬＧＳプロフィール上の所定のフラグメントについて、腫瘍組織ＲＬＧＳプロフィール上の同じ位置にフラグメントが存在しないかもしれない。このようなパターンは、第１の制限酵素が、腫瘍組織ＤＮＡを、その特定のフラグメントを生じるのに必要とされる認識配列で切断しないが、健常組織ＤＮＡ内のこのような配列で切断したことを示す（図１Ａ）。これは、腫瘍組織ＤＮＡ中のＮｏｔＩ認識配列内にメチル化が存在するが、健常組織ＤＮＡにメチル化が存在しなかったことを示す。
【００２６】
第３に、健常組織ＲＬＧＳプロフィール上の所定のフラグメントについて、腫瘍組織ＲＬＧＳプロフィール上の同じ位置に対応するフラグメントが存在し得るが、そのフラグメントの強度は、減少された強度のフラグメントであり得る。このようなパターンは、第１の制限酵素が、２コピー（すなわち、そのゲノムが二倍体である）のうち１コピーの腫瘍組織ＤＮＡを、その特定のフラグメントを生じるのに必要とされる認識配列で切断したことを示す（図１Ａ）。健常組織ＤＮＡにおいて、第１の制限酵素は、その認識配列の両方のコピーを切断した。これは、腫瘍組織ＤＮＡ中の２つのＮｏｔＩ認識配列のうちの１つにおいてメチル化が存在したことを示す。
【００２７】
多くの異なる腫瘍組織ＤＮＡから得られたＲＬＧＳプロフィールとの健常組織ＤＮＡから得られたＲＬＧＳプロフィールの比較によって、複数の腫瘍におけると特定のフラグメントの欠失は、特定の型の癌に関連し得る。従って、ＲＬＧＳプロフィールからのこのようなフラグメントの欠失は、被験体における癌について診断的であり得る。例えば、乳癌を有することが既知の女性由来の高い割合の腫瘍組織ＤＮＡにおける特定のフラグメントの欠失（すなわち、そのフラグメントの末端での第１の制限酵素部位のメチル化）は、乳癌を有することが疑われる被験体において、その疾患について診断的であり得る。このような診断分析を行うために、乳癌を有することが疑われる患者から単離されたＤＮＡを、上記のように、ＲＬＧＳによって分析し、乳癌を有することが既知の女性において高い頻度で欠失されることが既知であるＲＬＧＳプロフィール中の１以上のフラグメントが、損失するか否かを決定する。同様に、他の特定のフラグメントの欠失は、他の癌（例えば、結腸癌、頭部および頸部の癌、肺癌、精巣癌、神経外胚葉の癌、神経膠腫、急性骨髄性白血病など）について診断的であり得る。
【００２８】
複数の腫瘍由来のＲＬＧＳプロフィール中の特定フラグメントの欠失はまた、単一の型の癌よりもむしろ、いくつかの型の癌について診断的であり得る。例えば、特定のフラグメントの欠失は、乳癌、結腸癌または肺癌のいずれかを有する個体から得られた、高い割合の腫瘍組織ＤＮＡにおいて生じ得る。癌を有することが疑われる患者から得られたＤＮＡを使用するＲＬＧＳプロフィールからのこのようなスポットの欠失は、その患者における乳癌、結腸癌または肺癌について診断的である。
【００２９】
（癌について診断的な単離されたポリヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチド）
ＲＬＧＳプロフィールを構成する各スポットまたはフラグメントに存在するＤＮＡを含む個々のＤＮＡクローンが、得られ得る。これは、ＲＬＧＳゲル分析を行うために使用した同じ第１の酵素および第２の酵素で切断した健常組織ＤＮＡのＤＮＡライブラリーを構築することによってなされ得る。このようなＤＮＡライブラリーは、個々のクローンを含み、各クローンは、ＲＬＧＳプロフィールの単一スポット中に存在するＤＮＡを含む。このライブラリー中のクローンの全体は、ＲＬＧＳプロフィール中の合わせたＤＮＡスポットを表す。
【００３０】
ＲＬＧＳプロフィール上の各スポットのＤＮＡを含む、ライブラリー中の個々のクローンが、同定され得る。これは、ＤＮＡライブラリーの１または数個の個々のクローン由来のＤＮＡを取り、そしてそれを、ＲＬＧＳプロフィールを開始する前の健常組織ＤＮＡと混合することによってなされ得る。このＤＮＡの混合物を使用してＲＬＧＳプロフィールを生成する場合、その混合物に添加された個々のクローンと同じＤＮＡを含むスポットの強度が、増加される。この型の多重分析を行うことによって、ＲＬＧＳプロフィール上の各スポットは、このライブラリー中のＤＮＡクローンに適合され得る。このような分析の結果は、ＲＬＧＳプロフィール上に提示されたサブセットと同じサブセットのゲノムフラグメントを含む制限フラグメントの、秩序付けられたヒトゲノムライブラリーである。このような秩序付けれたゲノムライブラリーにおいて、ＲＬＧＳプロフィール中の任意のスポットまたはフラグメントに対応する個々のライブラリークローンは、迅速に位置付けられ得る。
【００３１】
診断的なＣｐＧポリヌクレオチドおよびＣｐＧオリゴヌクレオチドを設計するために、悪性腫瘍組織由来のＤＮＡのＲＬＧＳプロフィール上で存在しないかまたは減少された強度を示すスポットに対応する各々のクローン（本明細書中以降、「診断クローン」と呼ぶ）中のＤＮＡ配列を、標準的な技術を使用して配列決定する。一旦、配列情報が得られると、複数のＣｐＧジヌクレオチドを含む領域が、位置付けられる。このような領域は、ＣｐＧポリヌクレオチドおよびＣｐＧオリゴヌクレオチドに対する標的配列として作用する。ＣｐＧオリゴヌクレオチドは、３５〜３０００ヌクレオチド長、好ましくは、３５〜１０００ヌクレオチド長であり、そして２個、または好ましくは、それ以上のＣｐＧジヌクレオチドあるいはそれに相補的なジヌクレオチドを含む。ＣｐＧ診断オリゴヌクレオチドは、１５〜３４ヌクレオチド長、好ましくは、１８〜２５ヌクレオチド長であり、そして少なくとも２つのＣｐＧジヌクレオチドまたはそれに相補的なジヌクレオチドを含む。ＣｐＧ診断ポリヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドは、各々、１以上の型の癌細胞由来のＤＮＡ中で優先的にメチル化されることが既知のＣｐＧアイランドを含む標的配列に、実質的に相補的な配列を含む。「実質的に相補的」とは、ＣｐＧ診断ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドと標的配列との間に十分な相補性が存在し、それ故、ストリンジェントな条件下（好ましくは、高度にストリンジェントな条件下）で、ＣｐＧ診断ポリヌクレオチドとオリゴヌクレオチドとの間で、ハイブリダイゼーションが生じることを意味する。このようなアッセイとしては、ハイブリダイゼーションアッセイ（例えば、サザン分析）が挙げられ、ここで、サンプルＤＮＡは、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でＣｐＧ診断ポリヌクレオチドと反応される。
【００３２】
本明細書中で使用される場合、用語「ストリンジェントな条件」は、およそＴｍ−５（プローブの融解温度より５℃低い）〜およそＴｍより２０℃低い範囲内で生じる「ストリンジェンシー」である。「高度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」とは、５０％  ホルムアミド、５×ＳＳＣ（７５０ｍＭ  ＮａＣｌ、７５ｍＭ  クエン酸ナトリウム）、５０ｍＭ  リン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハルト溶液、１０％  デキストラン硫酸、および２０ｇ／ｍｌ  変性剪断サケ精子ＤＮＡを含む溶液中、４２℃での一晩のインキュベーション、それに続く、０．２×ＳＳＣ中、約６５℃でのフィルターの洗浄をいう。当該分野で認識されるように、ストリンジェンシー条件は、プローブの長さおよび性質（すなわち、ＤＮＡまたはＲＮＡ）；標的配列の長さおよび性質、ハイブリダイゼーション溶液の塩および他の成分（例えば、ホルムアミド、デキストラン硫酸およびポリエチレングリコール）の濃度のような、多くの因子を変えることによって達成され得る。これらの因子の全ては、上記の条件に等価なストリンジェンシーの条件を得るために変更され得る。
【００３３】
ハイブリダイゼーションおよびシグナル検出のストリンジェンシーにおける変化は、主に、ホルムアミド濃度（ホルムアミドの割合が低いほど、低いストリンジェンシーを生じる）；塩条件または温度の操作によって達成される。例えば、中程度に高いストリンジェンシー条件は、６×ＳＳＰＥ（２０×ＳＳＰＥ＝３Ｍ  ＮａＣｌ；０．２Ｍ  ＮａＨ２ＰＯ４；０．０２Ｍ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４）、０．５％  ＳＤＳ、３０％  ホルムアミド、１００μｇ／ｍｌ  サケ精子ブロッキングＤＮＡを含む溶液中、３７℃での一晩のインキュベーション、それに続く、５０℃での、１×ＳＳＰＥ、０．１％  ＳＤＳでの洗浄をいう。さらに、より低いストリンジェンシーを達成するために、ストリンジェントなハイブリダイゼーション後に行う洗浄を、より高い塩濃度（例えば、５×ＳＳＣ）で行い得る。
【００３４】
上記条件の変形は、ハイブリダイゼーション実験におけるバックグラウンドを抑制するために使用されるブロッキング試薬を含めることによってか、そして／または、代替のブロッキング試薬での置換によって達成され得る。代表的なブロッキング試薬としては、デンハルト試薬、ＢＬＯＴＴＯ、ヘパリン、変性サケ精子ＤＮＡ，および市販の処方物が挙げられる。特定のブロッキング試薬を含めることは、適合性についての問題に起因して、上記のハイブリダイゼーション条件の修正を必要とし得る。
【００３５】
このようなアッセイとしてまた、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）が挙げられ、ここで、サンプルＤＮＡおよび診断ＣｐＧオリゴヌクレオチドが、好ましくは、単一のＰＣＲ産物の合成を生じる条件下で、反応される。コンピュータープログラム（例えば、「ｈｔｔｐ：／／ｇｅｎｏｍｅ．ｗｉ．ｍｉｔ．ｅｄｕ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｐｒｉｍｅｒ／ｐｒｉｍｅｒ＿３ｗｗｗ．ｃｇｉ」でアクセスされ得る、「Ｐｒｉｍｅｒ３」プログラムのような）を使用して、ＣｐＧ診断オリゴヌクレオチドのサイズおよび配列を決定し得る。最適条件は、経験的に決定される。
【００３６】
ＣｐＧ診断ポリヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドは、標準的な技術を使用して作製される。例えば、これらのポリヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドは、市販の合成機を使用して作製され得る。
【００３７】
（診断方法）
別の局面において、本発明は、ＣｐＧ診断ポリヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドを使用して、癌を有することが疑われる被験体由来の組織サンプル（本明細書中以降、試験サンプルＤＮＡと呼ぶ）を特徴付ける方法に関する。これを行うために、ＤＮＡを、患者の組織サンプルの細胞から単離する。好ましくは、コントロールとして作用するＤＮＡもまた、試験被験体または先に記載のようなコントロール被験体の健常組織から得る。この診断方法は、試験サンプルＤＮＡを、診断ＣｐＧポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドと反応させ、そしてその反応の結果として形成される産物をアッセイすることを含む。いくつかの場合、サンプルＤＮＡを、より小さいフラグメントに消化し、その後、ＣｐＧ診断ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドと反応させる。いくつかの場合、試験サンプルＤＮＡの一部を、メチル化されたシトシンを異なるヌクレオチド塩基に変換する化合物（例えば、二亜硫酸ナトリウム）と最初に反応させる。
【００３８】
（サザンブロット分析）
患者における癌を診断するための１つのこのような方法は、メチル化感受性酵素での試験サンプルＤＮＡの切断、次いで、ＣｐＧ診断ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドをプローブとして使用する、その切断されたＤＮＡのサザンブロット分析を含む。例えば、患者由来のＤＮＡおよびコントロールの健常組織ＤＮＡを、メチル化感受性制限エンドヌクレアーゼで別々に切断する。このようなヌクレアーゼは、ＣｐＧ診断ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドに対応するＲＬＧＳプロフィール中の診断スポットを同定するために使用される、同じ第１の制限酵素である。切断後、試験サンプルＤＮＡおよびコントロールＤＮＡを、同じアガロースゲルの異なるレーンにおいて、電気泳動によってサイズで分離し、そしてハイブリダイゼーションに使用され得るメンブレン（例えば、ニトロセルロースまたはナイロンのような）にブロットする。次いで、このメンブレンを、標識ＣｐＧ診断ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドを用いるハイブリダイゼーション反応に使用する。標識ＣｐＧ診断ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドは、メンブレン上の相補的なＤＮＡ配列にハイブリダイズする。ハイブリダイゼーション後、プローブがコントロールＤＮＡおよび患者ＤＮＡにハイブリダイズしたメンブレン上の位置を、可視化する。このような位置は、ＣｐＧ診断ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドと同じ配列を含む、コントロールＤＮＡおよび患者ＤＮＡ内のＤＮＡフラグメントまたはバンドを同定する。プローブがハイブリダイズしたコントロールＤＮＡ内のフラグメントより高い分子量の患者ＤＮＡ内のフラグメントへのプローブのハイブリダイゼーションは、ＣｐＧ診断ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの標的配列に隣接する制限エンドヌクレアーゼ切断部位が、メチル化に起因して切断されていないことを示す。このような結果は、この組織が、このＣｐＧ診断ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドが診断ツールとして作用する癌由来であることを示す。
【００３９】
患者における癌を診断するための第２の方法は、メチル化感受性制限エンドヌクレアーゼでの患者ＤＮＡの切断を含み、このようなヌクレアーゼは、そのフラグメントに対応するＲＬＧＳプロフィール中の診断スポットを同定するために使用した同じ第１の制限酵素である。このようなヌクレアーゼは、そのＤＮＡがメチル化されていない場合のみ、その診断認識配列で患者ＤＮＡを切断する。ＲＬＧＳゲル上の診断スポットに対応するライブラリークローンの配列決定由来のヌクレオチド情報を使用して、診断認識配列に架かるＰＣＲ用プライマーを選択した。このプライマーを使用して、そのＤＮＡに対してＰＣＲを行った。配列のＰＣＲ増幅は、患者ＤＮＡ中の診断ヌクレオチド配列がメチル化されており、そしてその酵素によって切断されなかった場合にのみ、首尾よく行われる。従って、首尾よいＰＣＲ増幅は、患者中の癌の指標である。
【００４０】
（化学的に改変されたＤＮＡ試験サンプルを使用する方法）
ＣｐＧ診断ポリヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドを使用して、患者における癌を診断するための方法の別のグループは、二亜硫酸ナトリウムでの患者ＤＮＡの処理に基づき、この二亜硫酸ナトリウムは、全てのシトシンをウラシルに変換するが、メチル化されているシトシンを変換しない。次いで、この二亜硫酸塩で変換された患者ＤＮＡを、多くの異なる様式で分析し得る。分析の１つの方法は、ＤＮＡの直接的な配列決定であり、その配列がシトシンまたはウラシルのいずれを含むかを決定する。このようなＤＮＡ配列決定は、配列決定する領域に隣接するプライマーを作製することを必要とする。このようなプライマーは、診断ＲＬＧＳスポットから得られたＤＮＡ配列情報に基づく。
【００４１】
二亜硫酸塩で変換された患者ＤＮＡを分析する別の方法は、「メチル化感受性ＰＣＲ」（ＭＳＲ）と呼ばれる方法である。ＭＳＲにおいて、プライマーは、１以上の型の腫瘍組織で見出された細胞のＤＮＡにおいて優先的にメチル化されることが知られるＣｐＧアイランドに実質的に相補的な配列を含むように、設計される。２セットのＰＣＲプライマーを、この領域を取り囲むように作製する。１セットのプライマーを、二亜硫酸塩によって変化された配列（すなわち、元々メチル化されておらず、ウラシルに変化された、シトシン）に相補的であるように設計する。上記で議論されたように、これらは、改変されたＣｐＧ診断オリゴヌクレオチドである。第２のセットのプライマーを、二亜硫酸塩によって変化されなかった同じ配列（すなわち、メチル化されており、ウラシルに変化されなかった、シトシン）に相補的であるように設計する。上記で議論されたように、これらは、非改変ＣｐＧ診断オリゴヌクレオチド（すなわち、少なくとも２つのＣｐＧジヌクレオチドまたはそれらの相補的なジヌクレオチドを含む、オリゴヌクレオチド）である。次いで、２セットのＰＣＲ反応を行い、１つの反応で、テンプレートとして被験体由来のＤＮＡを使用して、各プライマーセットを使用する。被験体ＤＮＡの標的配列内のシトシンがメチル化されていない場合、標的配列は、その化学反応によって改変され、そしてその改変された配列に相補的なプライマー（すなわち、改変ＣｐＧ診断オリゴヌクレオチド）が、ＰＣＲ反応産物を生成し、一方、メチル化された配列に相補的なプライマー（すなわち、非改変ＣｐＧ診断オリゴヌクレオチド）は、ＰＣＲ産物を生成しない。被験体ＤＮＡの標的配列内のシトシンがメチル化されている場合、標的配列は、二亜硫酸ナトリウムでの反応によって変化されず、そしてその変化されなかった配列に相補的なプライマー（すなわち、非改変ＣｐＧ診断オリゴヌクレオチド）が、ＰＣＲ反応産物を生成し、一方、改変された標的配列（すなわち、メチル化されていない配列）に相補的な改変ＣｐＧ診断オリゴヌクレオチドは、ＰＣＲ産物を生成しない。
【００４２】
ＭＳＲの改変型は、患者ＤＮＡの二亜硫酸塩処理、およびメチル化配列または非メチル化配列のいずれかを増幅するように設計されたプライマーを使用するそのＤＮＡのＰＣＲ増幅である。次いで、このＰＣＲ産物を、その産物がウラシル（チミジン（ウラシルの相補体）ではなく：元の患者ＤＮＡがメチル化されていないシトシンを含む場合のＰＣＲ産物に見出される）またはシトシン（元の患者ＤＮＡがメチル化されているシトシンを含む場合のＰＣＲ産物に見出される）のいずれを含むかに依存して切断するかまたは切断しない制限酵素で消化する。
【００４３】
ＭＳ−ＳｎｕＰＥと呼ばれる別の技術は、二亜硫酸塩／ＰＣＲ、およびその後の、プライマー伸長を使用し、ここで、Ｃ（Ｔに対して）の取り込みが、メチル化を示す。
【００４４】
（遺伝子を同定する方法）
本発明の別の局面において、ＣｐＧ診断ポリヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドをプローブとして使用して、その発現が癌性組織において増加または減少される遺伝子を同定し得る。これを行うために、ＣｐＧ診断ポリヌクレオチドを、ＤＮＡライブラリーの個々のクローンと反応させる。次いで、ＣｐＧ診断ポリヌクレオチドとハイブリダイズするクローンを分析して、これらがタンパク質をコードし得るオープンリーディングフレームを含むか否かを決定し得る。ＣｐＧ診断ポリヌクレオチドが既知遺伝子のプロモーター領域とハイブリダイズするか否かを決定するために、そのオープンリーディングフレーム配列を、既存のＤＮＡデータベースを検索することによって分析する。例えば、ＧｅｎＢａｎｋデータベースは、ＢＬＡＳＴアルゴリズムを使用して検索され得る。ライブラリークローンに対応する既知遺伝子が見出されない場合、その配列は、タンパク質をコードし得るオープンリーディングフレームについて検索され得る。このような検索は、当業者に一般的に公知の市販の配列分析プログラムを使用して行われ得る。ＧＣＧは、そのようなプログラムの１例である。
【００４５】
既知の遺伝子またはオープンリーディングフレームのいずれかを含むＤＮＡライブラリーのクローン由来の配列をプローブとして使用して、その配列にコードされる遺伝子が、コントロールの健常組織と比較して、腫瘍組織で発現されるか否かを決定し得る。これを行うために、ＲＮＡ（好ましくは、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ））を、健常組織から、および発現を試験することが望まれる腫瘍組織から、単離する。このようなＲＮＡを、そのライブラリーから得られた配列によってコードされる発現転写物の存在について試験する。発現転写物の存在についての試験は、多くの方法を使用して行われ得る。１つの方法は、ノーザンブロットであり、ここで、単離されたＲＮＡを、ゲル電気泳動によってサイズで分離し、次いで、ハイブリダイゼーションメンブレンにブロットする。ライブラリークローンから得られた配列由来のフラグメント、ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドを標識し、次いで、これを使用して、そのサイズで分離したＲＮＡを含むハイブリダイゼーションメンブレンをプローブする。メンブレンへのプローブのハイブリダイゼーションの検出は、その配列によってコードされる転写物の存在を示し、そしてその配列によってコードされる遺伝子の発現を示す。
【００４６】
発現転写物の存在について単離されたＲＮＡを試験するための別の方法は、ＲＴ−ＰＣＲ分析を使用することである。このような分析において、その発現が試験される遺伝子の領域に架かるプライマーを、設計および作製する。単離されたＲＮＡを、逆転写酵素を使用して、ＤＮＡに逆転写する。次いで、このようなＤＮＡを、ＰＣＲを使用して、その設計したプライマーを用いて増幅する。ＰＣＲ産物を、電気泳動後に可視化する。ゲル上のＰＣＲ産物の存在は、その設計したプライマーによって取り囲まれる遺伝子がＲＮＡ転写物を発現することを示す。このような分析は、その発現が、正常な非癌性細胞と比較して、癌細胞において変化される遺伝子を、同定および決定し得る。
【００４７】
以下の実施例は、例示目的のみであり、添付の特許請求の範囲に規定される本発明の範囲を制限することを意図されない。
【００４８】
（実施例）
（実施例１．ＮｏｔＩおよびＲＬＧＳを使用する診断マーカーの同定）
（Ａ．ゲノムＤＮＡの単離および酵素処理）
固形腫瘍由来の組織を、外科組織サンプルとして得た。可能な場合、周辺の非腫瘍組織を得て、コントロールとして使用した。一致した患者の正常組織を得ることができなかった場合、複数の患者由来の正常組織を使用した。急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）に罹患している患者由来の組織サンプルは、骨髄吸引物または末梢血のいずれかからなった。正常サンプルを、化学療法後に寛解された同じ患者から得た。
【００４９】
外科的に取り出した組織を、液体窒素中で迅速に凍結し、そしてＤＮＡ単離前に−８０℃で保存した。ＤＮＡを単離する準備を行ったとき、２ｍｌの溶解緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０；１５０ｍＭ  ＥＤＴＡ，１％  サルコシル）を、５０ｍＬ  Ｆａｌｃｏｎチューブ中の１００〜３００ｍｇの組織に添加し、そして液体窒素中で凍結した。次いで、この凍結混合物を、チューブから取り出し、アルミニウムホイルでラップし、そしてハンマーで小片へと迅速に破壊した。この細胞の破壊片を、冷却した乳鉢に移し、そして冷却した乳棒で粉末へと挽いた。末梢血サンプルについては、細胞を、滅菌Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ−１０７７（ＳＩＧＭＡ）勾配上で分離し、そしてＤＮＡ単離前に−８０℃で保存した。
【００５０】
細胞を、５０ｍＬチューブに移し、そして１５〜２５ｍｌの溶解緩衝液（１ｍｌの溶解緩衝液当たり０．１ｍｇのプロテイナーゼＫを含む）を添加し、そしてガラス棒を使用して混合した。この混合物を、５分毎に穏やかに混合しながら、２０分間、５５℃でインキュベートした。次いで、この混合物を、氷上に１０分間置いた。その後、等量のＰＣＩ（５０：４９：１の比のフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール）を添加し、この混合物を含むチューブを、３０〜６０分間穏やかに回転させた。次いで、チューブを、３０分間、２５００ｒｐｍで遠心分離し、そして分離された水相を、広い孔のピペットを用いて、新しい５０ｍｌチューブに移した。このＰＣＩ抽出、もう１回繰り返した。ＤＮＡを含む収集した水相を、透析チューブに移し、４Ｌの１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８）に対して、２時間透析した。次いで、この透析チューブを、新しい１０ｍＭ  Ｔｒｉｓに移し、そして室温で一晩透析した。さらにもう１回の透析を、新しい１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ中でさらに２時間行った。次いで、ＤＮＡを、この透析チューブから５０ｍｌチューブに移し、そしてＲＮａｓｅＡを、最終濃度１μｇ／ｍｌに添加した。この混合物を、３７℃で２時間インキュベートした。その後、２．５容量の１００％エタノールを、このＤＮＡに添加し、そして混合物を、穏やかに回転させた。不溶性のＤＮＡを、遠心管に移し、手短に遠心分離し、そして残っているアルコールを除去した。ペレットを、手短に風乾させた。ペレット中のＤＮＡを、最終濃度１μｇ／μｌに再懸濁した。このような単離されたＤＮＡは、２００〜３００ｋｂの平均サイズを有する。
【００５１】
単離されたゲノムＤＮＡを、そのＤＮＡが剪断された末端でブロックした。ブロッキングは、ジデオキシヌクレオチドおよび硫黄置換ヌクレオチドの付加によって行った。１．５ｍｌチューブに、７μｌのゲノムＤＮＡ溶液を、２．５μｌのブロッキング緩衝液（１μｌの１０×緩衝液１、０．１μｌの１Ｍ  ＤＴＴ、各０．４μｌの１０μＭ  ｄＧＴＰαＳ、１０μＭ  ｄｄＡＴＰ、１０μＭ  ｄｄＴＴＰ、および０．２μｌの１０μＭ  ｄＣＴＰαＳ；緩衝液１は、５００ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．４）、１００ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１Ｍ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＤＴＴからなる）および０．５μｌＤＮＡポリメラーゼＩと共に添加した。この混合物を徹底的に混合し、３７℃で２０分間インキュベートした。次いで、この混合物を、６５℃で３０分間インキュベートして、ポリメラーゼを不活化した。次いで、この反応液を、氷上に２分間置いた。そのサンプルに、８μｌの２．５×緩衝液２（２０×緩衝液２は、３Ｍ  ＮａＣｌ、０．２％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、０．２％  ＢＳＡである）および２μｌ（１０Ｕ／μｌ）のＮｏｔＩを添加することによって、ＤＮＡをＮｏｔＩで消化した。このサンプルを、３７℃で２時間インキュベートした。次いで、ＤＮＡを、放射活性標識した。これは、０．３μｌの１Ｍ  ＤＴＴ、１μｌの［α−３２Ｐ］−ＧＴＰ、１μｌの［α−３２Ｐ］−ｄＣＴＰおよび０．１  １μｌの［α−３２Ｐ］−ＧＴＰ  Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ  ｖｅｒ  ２．０（１３Ｕ／μｌ）を、サンプルに添加することによって行った。この混合物を、３７℃で３０分間インキュベートした。次いで、そのサンプルに、７．６μｌの第２の酵素消化緩衝液（１μｌの１ｍＭ  ｄｄＧＴＰ、１μｌの１ｍＭ  ｄｄＣＴＰ、４．４μｌのｄｄＨ２Ｏ、１．２μｌの１００ｍＭ  ＭｇＣｌ２）および２μｌのＥｃｏＲＶ（１０Ｕ／μｌ）を添加することによって、ＤＮＡをＥｃｏＲＶで消化した。この混合物を、３７℃で１時間インキュベートした。次いで、７μｌの６×一次元ローディング色素（０．２５％ブロモフェノールブルー、０．２５％キシレンシアノール、１５％  Ｆｉｃｏｌｌ  ｔｙｐｅ  ４００）を添加した。
【００５２】
（Ｂ．一次元ゲル設定および電気泳動）
６０ｃｍ長のアガロースチューブ型ゲルを作製するために、ゲルホルダーを作製した。これを行うために、鋭い剃刀を使用して、ＰＦＡグレードテフロン（登録商標）チュービング（ＰＦＡ  １１薄壁、天然；Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｌａｓｔｉｃ．Ｃｏｌｕｍｂｕｓ，Ｏｈｉｏ）の一端を、傾斜を付けて切断した。このチュービングの傾斜の付いた末端を、ガラス管（４ｍｍ内径、５ｍｍ外径、６０ｃｍ長）に入れた。鉗子を使用して、その傾斜をつけた末端を、ガラス棒のテーパ状の末端を介して、２〜４ｃｍ突出するまで、引き上げた。チュービングを、同じ末端で水平に切断し、２ｍｍの突出部（これは、ゲルホルダーの上部である）を残した。反対側の末端を、水平方向に切断し、ガラス管から５〜６ｃｍの突出部を残した。ゲルホルダーを反転させ、上部の突出端を、加熱金属表面（Ｂｕｎｓｅｎバーナーで加熱した金属スパチュラ）に対してしっかりとプレスし、テフロン（登録商標）の縁を、ガラス支持体のへりの外側に折り曲げた。中心に穴を開けたゴム栓を、この栓がガラス棒のテーパをちょうど過ぎるまで、ゲルホルダーの上端にかぶせた。２方向の止め栓を、１０ｍｌシリンジに取り付け、次いで、２〜３ｃｍの可撓性チュービングを介して、ゲルホルダーに取り付けた。止め栓の弁を、開いた状態に調整した。
【００５３】
次いで、きれいな２００ｍｌのガラス瓶に、６０ｍｌの２×Ｂｏｙｅｒ緩衝液（２０×は、１Ｍ  Ｔｒｉｓ、３６０ｍＭ  ＮａＣｌ、４００ｍＭ  酢酸ナトリウム、４０ｍＭ  ＥＤＴＡである）および０．４８ｇのＳｅａｋｅｍ  ＧＴＧアガロース（０．８％）を添加した。この混合物を、アガロースが溶解するまで、電子レンジで加熱した。次いで、この混合物を、水浴中で５５℃に平衡化した。止め栓の弁を開いた状態にして、突出しているテフロン（登録商標）チューブを、この溶融したアガロース溶液中に降ろした。ゲル溶液がゲルホルダーの上部から１〜２ｃｍに到達するまで、ゲル溶液を、ゲルホルダー中に吸引させた。次いで、止め栓の弁を閉じた。ゲルを直立に維持し、ゲルを、環状スタンドから吊るした。ゲルを、２０分間硬化させた。
【００５４】
次いで、止め栓の弁を開き、そしてシリンジおよび連結チューブを、各ゲルから取り外した。２×Ｂｏｙｅｒ緩衝液を、一次元ゲル装置（Ｃ．Ｂ．Ｓ．Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）の底に添加した後、ゲルを、一次元ゲル装置内に降ろし、その装置の上部の適切な穴にしっかりとゴム栓をした。チャンバ上部を、２×Ｂｏｙｅｒ緩衝液で満たした。
【００５５】
１．０〜１．５μｇのＤＮＡを、各ゲルにロードした。サンプルを、１１０Ｖで２時間、次いで、２３０Ｖで２４時間、電気泳動した。
【００５６】
（Ｃ．ゲル内消化）
ＤＮＡを、アガロースチューブゲル中で、一次元で電気泳動した後、このＤＮＡを、二次元で電気泳動され得るように、さらなる制限エンドヌクレアーゼでさらに消化した。このさらなるエンドヌクレアーゼ消化を行うために、緩衝液およびゲルホルダーを、一次元装置から取り外した。ゲルを、１×緩衝液Ｋ（１０×緩衝液Ｋは、２００ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．４）、１００ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１Ｍ  ＮａＣｌである）を含むパンに、ゲルホルダーの底からゲルに力を与えることによって、押し出した。これは、ピペットチップを取り付けそして緩衝液Ｋを満たした１ｍｌシリンジを使用して、行った。チップを、ゲルホルダーの上部にしっかりと挿入し、そしてプランジャーを、ゲルがゲルホルダーの底から出始めるまで、押し込んだ。この１ｍｌシリンジを、５ｍｌシリンジと取り替え、そしてプランジャーを、ゲル全体が押し出されるまで、押し込んだ。ゲルは、約４３ｃｍの長さになるように、剃刀を用いて、ゲルの低分子量端で傾斜を付けて切断し、そして高分子量端で水平方向に切断した。ここで、このゲルの長さは、二次元ゲルの幅と同じであった。
【００５７】
ゲルを、４０ｍｌの１×緩衝液Ｋを含む、別の５０ｍｌチューブ中に置いた。このチューブを、１０分間室温でインキュベートした。緩衝液を注ぎ出し、ゲルを、１×緩衝液Ｋ中でさらに１０分間インキュベートした。緩衝液Ｋおよびゲルを、新しい緩衝液Ｋを含むパンに注いだ。制限消化チュービング（ＰＦＡグレードテフロン（登録商標），９、薄壁、天然；２．７ｍｍ内径および約３．３ｍｍ外径；Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｌａｓｔｉｃ，Ｃｏｌｕｍｂｕｓ，Ｏｈｉｏ）に取り付けた１０ｍｌシリンジを使用して、１〜２ｃｍセグメントの可撓性チュービングを介して、ゲルを、消化チュービング内に吸引した（低分子量（傾斜の付いた）端を最初にして）。そのチュービングの末端とゲルの傾斜の付いた末端と整列させて、そしてシリンジのプランジャーを引くことによって、ゲルを消化チュービングに吸引した。このチュービングを、シリンジを底にして、垂直に置き、チュービングからの残存する緩衝液を、シリンジ中に吸引した。
【００５８】
きれいなチューブに、１×ＨｉｎｆＩ制限酵素緩衝液（５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．９）、１ｍＭ  ＤＴＴ）、０．１％  ＢＳＡおよび７５０ＵのＨｉｎｆＩ制限酵素の１．６ｍｌ混合物を作製した。消化チュービングの開口端を、制限消化溶液を含有するチューブ内に置いた。シリンジの端部を上に維持して、シリンジ中に少量の消化溶液が現れるまで、吸引を適用した。消化チュービングを取り外し、両方の末端を、上向きにして、Ｕ字状にした。シリンジを取り外し、チュービングの２つの末端を繋いで、閉じた円を形成した。これを、加湿チャンバに配置し、３７℃で２時間インキュベートした。
【００５９】
（Ｄ．二次元電気泳動）
ここで、消化したＤＮＡを、０．８％アガローススペーサーと共に、５％非変性アクリルアミドゲルを使用して、二次元で泳動した。これを行うために、二次元ゲル装置（Ｃ．Ｂ．Ｓ．Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を、最初に組み立てた。全てのガラスプレートを徹底的に洗浄し、そして各プレートの傾きのない面を、ＧｅｌｓｌｉｃｋまたはＳｉｇｍａｃｏｔｅでコートした（１０回の使用毎に１回のみ）。上部の緩衝液チャンバをテーブルの端に置いたまま、この装置の後半分を、テーブル上に水平に置いた。２つの小さいきれいなプラスチックブロックを、各装置の底のコーナーに挿入した。ガラスプレートを、傾きのある縁を、上方に、上部チャンバに近くに面して、装置に配置し、その後、２つのスペーサーを、各側に沿って置いた。ガラスプレートおよびスペーサーを、５番目のプレートが加えられるまで、この様式で加えた。３番目のプレート後、可撓性Ｔｙｇｏｎチュービング（チュービングの先端は、傾きを付けて切ってある）を、装置の側面チャネルにスライドして取り付けた。他端を、切断し、装置から約１０ｃｍの突出部を残した。Ｐｌｅｘｉｇｌａｓ「フィラー」シートを、５番目のガラスプレート上に置いた。装置の前半分を、前半分および後半分のねじ穴を揃えることによって、配置した。これらを、テフロン（登録商標）ねじで固定した。前面の下部の長楕円「ウィンドウ」を、プラスチックテープ（Ｓｃｏｔｃｈブランド）でシールした。装置を、下の緩衝液チャンバ中に真っ直ぐに立てた。
【００６０】
３方向ストップコックを用い、ゲル装置管材を連続して２Ｌリザーバーに取り付け、そして６０ｍｌのシリンジを残りのストップコック出口に取り付けた。この管材は、底ドレインを通じて２Ｌリザーバーに取り付けた（２Ｌの目盛り付シリンダーを用いた）。このリザーバーをゲル装置の上に取り付け、重力流れを可能にした。ストップコックバルブを調節して液体を２Ｌリザーバーと６０ｍｌシリンジとの間に流した。一旦、ＴＥＭＥＤが添加されると、アクリルアミド溶液（２Ｌの総容量中に、１×ＴＢＥ、ｐＨ８．３、９６．９ｇアクリルアミド、３．３ｇビス−アクリルアミド、１．３ｇ過硫酸アンモニウムおよび７００μｌＴＥＭＥＤ）を２Ｌのリザーバー中に注いだ。シリンジプランジャーを５０ｍｌのマークまで引いた。プランジャーを押し下げ、空気を管材上部の外に押し出した。一旦、すべての空気が除去されると、バルブを調節し３つのポートを開放した。アクリルアミドが装置中に流れ、底から上方に全４つのゲルを同時に満たした。レベルがガラスプレートの上端から３ｍｍに到達したとき、流れを停止した。この溶液を２〜３分間沈降させた。ゲル装置に至るバルブを閉じた後、シリンジおよびリザーバーを取り外した。
【００６１】
ゲル内消化の消化管材の端部を分離し、そして一次元ゲルを１×ＴＢＥ、ｐＨ８．３を含むパン中に押出した。このゲルを、４０ｍｌの１×ＴＢＥ、ｐＨ８．３を含む５０ｍｌチューブに移した。これを、室温で１０分間インキュベートし、新鮮ＴＢＥで置き換え、そしてさらに１０分間インキュベートした。この一次元ゲルを、各ガラスプレートの傾斜エッジを通る水平位置に配置した。一旦、すべてのゲルがその場に配置されると、アガロースゲルと、各ポリアクリルアミドゲルの頂部との間のスペースを溶融０．８％アガロースで満たした（５５℃に平衡化）。この連結アガロースを１０〜１５分固化し、そして次いで２５０μｌの二次元ローディング色素（１×ＴＥ、ｐＨ８．３、０．２５％ブロモフェノールブルー、０．２５％キシレンシアノール）を、各ゲルの長さに沿って添加した。次いで、１×ＴＢＥ、ｐＨ８．３を上部および下部緩衝液チャンバーに添加し、そして電気泳動を、１００Ｖで２時間、そして次いで、１５０Ｖで約２４時間実施した。
【００６２】
次いで、緩衝液を取り除き、そして装置を分解した。各ゲルを、プレートから、オートラジオグラフカセットまたは蛍光イメージャーカセットのサイズに切断したＷｈａｔｍａｎｎｎペーパーで覆うことにより持ち上げた。このペーパーの周を、プラスチック定規のエッジでトレースし、任意の過剰なゲルを取り除いた。このＷｈａｔｍａｎｎペーパーとゲルとを持ち上げ、そしてゲル側を上にして、Ｗｈａｔｍａｎｎペーパーの第２片に配置した。これをサランラップで覆い、そしてＷｈａｔｍａｎｎペーパーの第３片を上面に添加し、そしてサランラップをこのＷｈａｔｍａｎｎペーパーの上面上に折り畳んだ。これを、８０℃で１時間、真空を適用しながら、ゲル乾燥器に同じ配向で置いた。次いで、上部および下部Ｗｈａｔｍａｎｎペーパーを取り除き、サランラップを残りのペーパーの下に折り畳み、そしてＸ線フィルム（ＢｉｏＭａｘ  ＭＳ）に感光させた。
【００６３】
（Ｅ．メチル化感受性制限酵素から得られるＲＬＧＳスポットはＣｐＧアイランドを同定する）
この方法を用い、ヒト細胞からのＤＮＡのＲＬＧＳプロフィールは、約２，０００のスポットを提示するパターンを生成する。例えば、図１Ｂは、このような、正常末梢血リンパ球ＤＮＡからのＲＬＧＳプロフィールを示す。標識されたＮｏｔＩ／ＥｃｏＲＶフラグメントの一次元分離は、水平方向に右から左に延びる。ＨｉｎｆＩを用いたゲル内消化の後、フラグメントはポリアクリルアミドゲル中に垂直方向下方に分離され、そしてオートラジオグラフィーにかけた。ＲＬＧＳプロフィールの均一な比較を可能にするために、スポットを、各スポットを、３つの可変指定（Ｙ座標、Ｘ座標、フラグメント番号）を割り当てることによりゲル中のそれらの位置を基に規定した。これは、各スポットに割り当てた番号を示すＲＬＧＳプロフィール（図１Ｃ）のセクション２Ｄの拡大部分でより容易に観察され得る。
【００６４】
正常ＤＮＡのＲＬＧＳプロフィールの中心部分を含む１，５６７のＮｏｔＩスポットのセットから、すべての分析物から、３９２スポットを、二倍体強度より多い、二倍体強度より少ない、または隣接するフラグメントと位置重複の程度を有することを基礎に排除した。さらに、個々の腫瘍プロフィール中の遺伝子座の小フラクションは、乏しい局所ゲル性質に起因して分析することができなかった。正常ＤＮＡプロフィールでは、二倍体コピー数より少ない強度は、多形、部分的メチル化または性染色体に由来するスポットから生じ得る。従って、分析されたスポットは、大部分のサンプル中の二倍体コピー数のスポットである。腫瘍組織および健常組織ＤＮＡプロフィールは、重ねたオートラジオグラフの目視検査により比較した。一致した正常組織が利用可能でなかった場合は、腫瘍プロフィールを、４〜５の非関連個体の組織型に一致したプロフィールと比較した。各ＣｐＧアイランドは、非メチル化またはメチル化として規定された（ＲＬＧＳプロフィール上の強度における視覚による見かけの減少は、２６ＣｐＧアイランド遺伝子座についてのサザンブロットデータを用いた補強および１００以上の損失事象により、３０％以上のレベルのメチル化に相当する）。
【００６５】
ＲＬＧＳスポットを生成したＮｏｔＩ制限部位が、真正のＣｐＧアイランドの特徴を有していたか否かを決定するために、２１０のＮｏｔＩ／ＥｃｏＲＶ  ＲＬＧＳスポットからのＤＮＡを部分的に配列決定した。これは、ヒトＮｏｔＩ／ＥｃｏＲＶ  ＲＬＧＳプロフィール上の各スポットが、ＮｏｔＩ／ＥｃｏＲＶゲノムプラスミドライブラリーからのクローンに先に割り当てられていた（本明細書のより先の記載を参照のこと）ので可能であった。２１０のスポットのうち，１８４をランダムに選択した。別の２６スポットを選択した。なぜなら、これらは、ヒト腫瘍からのＲＬＧＳプロフィールから頻繁に失われ、そのスポットのＮｏｔＩ配列ないのシトシンヌクレオチドが腫瘍中ではメチル化されていたことを示唆したからである。これらのクローン由来の配列から、ＧＣ含量（％ＧＣ）を、各クローンについてＣｐＧ比に対してプロットした（図１Ｄ；ＣｐＧ比＝［（ＣｐＧの数）／（グアニンの数）（シトシンの数）（分析されたヌクレオチドの数）］。ＣｐＧアイランドは、５０％より大きいＧＣ含量、および少なくとも０．６のＣｐＧ値を有する。図１Ｄは、配列決定された２１０クローンのうち、１９７（９４％）が、ＣｐＧ−アイランドＤＮＡと一致する配列特徴を有していたことを示す。
【００６６】
（Ｆ．分析された腫瘍組織サンプル）
ＲＬＧＳ分析を実施するために用いたＤＮＡは、９８の原発性腫瘍から、および可能な場合、一致した正常サンプルから得た。これらのサンプルは、８つの広範な腫瘍型；胸部、結腸、神経膠腫、頭部および頸部、急性骨髄性白血病、未分化神経外胚葉性腫瘍（ＰＮＥＴ）および精巣由来であった。
【００６７】
１４の胸部癌は、２つの腺癌、２つの小葉癌および１０の腺管癌を含んだ。これらサンプルは、Ｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｅ  Ｈｕｍａｎ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｎｅｔｗｏｒｋ（ＣＨＴＮ）から得た。すべての腫瘍は、３８−８９才の年令（平均５４才）の女性からであった。腫瘍に隣接する胸部組織は、１４事例の６つから利用可能であり、そして８つの腫瘍プロフィールを、一致したセットからの４つの胸部サンプルと比較した。
【００６８】
結腸腫瘍は、Ｒｏｓｗｅｌｌ  Ｐａｒｋ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅから得、そしてＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｉｎｔ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｏｎ  Ｃａｎｃｅｒ  ｓｔａｇｉｎｇ  ｍａｎｕａｌに従って分類した。８つの原発性腫瘍は、１つのステージＩ腫瘍、２つのステージＩＩ腫瘍、２つのステージＩＩＩ腫瘍および３つのステージＩＶ腫瘍を含んでいた。患者の年令は、４９〜７７才（平均６３才）の範囲であった。正常な隣接結腸粘膜サンプルをすべての腫瘍について得た。
【００６９】
１２のＷｏｒｌｄ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ（ＷＨＯ）グレードＩＩの星状膠細胞腫および２つのＷＨＯグレードＩＩＩの未分化星状膠細胞腫を含む、１４の神経膠腫は、埼玉医科大学、東京大学、帝京大学医学部、駒込都立病院およびワシントン大学（シアトル）から得た。患者は、７−５７才（平均３４才）の年令範囲の１０人の女性および４人の男性を含んでいた。腫瘍に隣接する脳組織もまた、１つのＷＨＯグレードＩＩおよび１つのＷＨＯグレードＩＩＩ腫瘍について得た。１２の事例を、３つの不一致正常脳サンプルおよび一致したセットからの２つの脳サンプルと比較した。
【００７０】
１４の頭部および頸部の扁平上皮癌を、ＣＨＴＮを通じて得た。腫瘍は、１１人の男性および３人の女性由来であった。患者は、年令４２−７７才（平均５７才）であった。腫瘍に隣接する組織は、１４事例のうち１２で入手可能であり、そして２つの腫瘍を、一致するセットからの４サンプルと比較した。
【００７１】
１９の急性骨髄性白血病サンプル（３つの骨髄吸引液および１４の末梢血）は、Ｃａｎｃｅｒ  ａｎｄ  Ｌｅｕｋｅｍｉａ  Ｇｒｏｕｐ  Ｂ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｂａｎｋ得た。サンプルは、Ｆｒｅｎｃｈ−Ａｍｅｒｉｃａｎ−Ｂｒｉｓｔｉｓｈ  ｓｙｓｔｅｍに従って分類した。サンプルは、ＡＭＬでの初期診断のとき、および誘導化学療法の後、完全寛解のときに再び（２４−１５４日、平均４５日）患者から得た。サンプルは、１４人の男性および３人の女性由来であった。患者は、年令２２−６１才（平均４０才）であった。すべての事例を、寛解時に得た一致サンプル（末梢血リンパ球または骨髄のいずれかであるが、癌サンプルの起源と常に一致）と比較した。
【００７２】
２２のＰＮＥＴは、１７の髄芽腫および５つの小脳テント上のＰＮＥＴを含み、ＣＨＴＮ、小児科部門を通じて得た。腫瘍は、１５人の男性および７人の女性由来であった。患者は、２−２６才の年令で、ピークの年令は３〜６才であった。すべての腫瘍は、ＷＨＯグレードＩＶであった。一致した末梢血リンパ球は、２２の事例のうち６について入手可能であり、そして１８サンプルを非一致正常小脳ＤＮＡと比較した。
【００７３】
９の精巣腫瘍は、６つの精上皮腫および３つの非精上皮腫を含んでいた。サンプルは、Ｎｏｒｗｅｇｉａｎ  Ｒａｄｉｕｍ  ＨｏｓｐｉｔａｌおよびＨｅｌｓｉｎｋｉ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｃｅｎｔｒａｌ  Ｈｏｓｐｉｔａｌから得た。患者は、２１−７７才（平均４１才）であった。隣接精巣組織は、９の事例のうち７で入手可能であり、そして２つのサンプルを、一致したセットで用いた精巣ＤＮＡの４つのサンプルと比較した。
【００７４】
（Ｇ．ＲＬＧＳプロフィールからのスポットの損失はメチル化に起因する）
異なる腫瘍からのＤＮＡのＲＬＧＳプロフィールの、コントロールである健常組織ＤＮＡとの比較において、ＲＬＧＳプロフィールからのフラグメントまたはスポットの損失（図１Ａ）が頻繁に検出された。このようなスポットの損失は、そのスポットを生じるＮｏｔＩ部位におけるＤＮＡ配列のメチル化、または腫瘍のゲノムからのそのＮｏｔＩ部位を取り囲むＤＮＡの欠失のいずれかに起因し得る。各機構の相対的寄与は、サザンブロッティング調査におけるプローブとして、失われたスポットに特異的な、ＮｏｔＩ／ＥｃｏＲＶゲノムライブラリーからのクローンを用いることにより評価された。図２Ａでは、正常な健常組織からのＲＬＧＳプロフィールのセクションを、２つの神経膠腫Ｊ７およびＪ１６からの腫瘍組織と比較した。このＲＬＧＳセクションは、スポット３Ｃ１を含む。腫瘍Ｊ１６では、スポット３Ｃ１は、ＲＬＧＳプロフィールからは存在しない。しかし、ＮｏｔＩ部位を取り囲むＤＮＡの欠失が存在する場合は、サザンブロットにおいて予期される結果は、Ｊ１６ゲノムＤＮＡへのプローブのハイブリダイゼーションがないか、またはＮｏｔＩおよびＥｃｏＲＶで消化された正常な健常組織ＤＮＡならびにＥｃｏＲＶのみで消化された腫瘍組織ＤＮＡを含むレーンで検出されるのとは異なるサイズのバンドへのハイブリダイゼーションであり得る。この結果は観察されない。従って、これらの結果は、サザンブロット結果により示されるように、Ｊ１６神経膠腫ＤＮＡ中のなくなった３Ｃ１スポットに対応するＤＮＡがゲノム中に存在することを示す。
【００７５】
同様に、特定の白血病（図２Ｂ）および子供の神経外胚葉腫瘍（図２Ｃ）でなくなる特異的ＲＬＧＳスポットに対応するＤＮＡが、これらＤＮＡをサザンブロッティングにより分析するとき存在することが見出されている。全部で、２６の腫瘍において、ＲＬＧＳプロフィール中の特異的スポットが、このスポットに対応する、なくなるＤＮＡであり、サザンブロッティングによりゲノム中に存在することが見出された。これらの結果は、ＲＬＧＳプロフィール上のスポットの損失が、対応するＮｏｔＩ部位のメチル化に起因し、そしてそのスポットを示すＤＮＡのゲノムからの欠失ではないことを示す。従って、メチル化が、ＲＬＧＳプロフィールからのスポットの損失の原因となる優勢な機構である。
【００７６】
（Ｈ．腫瘍を通じるＣｐＧ−アイランドメチル化における不均一性）
同じ腫瘍型の異なる腫瘍間のメチル化ＣｐＧアイランドの全体のパターンを比較するために、９８の腫瘍（およびそれらの非腫瘍原性コントロール）の各々における１，１８４のスポットをＲＬＧＳにより分析した。この分析は、コントロールと比較したとき、失われたＲＬＧＳスポットの数、または減少した強度のＲＬＧＳスポット数を測定することにより実施した。失われたスポットまたは減少した強度のスポットの各々は、１つのメチル化されたＣｐＧアイランドと等価である。各腫瘍型について、コントロールと比較したとき、各々の個々の腫瘍におけるメチル化されたＣｐＧアイランドの数をプロットした（図３）。これらのデータは、胸部、頭部および頸部、ならびに精巣腫瘍が、相対的に低いレベルのメチル化を有し、このような腫瘍の多くはメチル化がなかったことを示す。結腸腫瘍、神経膠腫、急性骨髄性白血病および未分化神経外胚葉性腫瘍（ＰＮＥＴ）は、かなりより高い頻度のメチル化を有していた。種々の腫瘍型のメチル化の頻度のノンパラメトリックな比較（Ｋｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ手順）は、それらの間で有意な差異を示した（χ６２＝５６．９、Ｐ＜０．０００１）。
【００７７】
腫瘍型内で、個々の腫瘍におけるメチル化ＣｐＧアイランドの範囲は変動した。データ（図３）は、腫瘍間の偶然変動とは一致していない。なぜなら、不均一性の非存在下では、メチル化頻度の分散は、平均より大きいことが予期されないからである１。この過剰分散の形式的な試験は、各腫瘍型について実施され、そしてこれらの結果を、図３中に、ドットプロット上の予期されるポアソン分布の重ね合わせとして示される。これらのデータは、ＣｐＧの異常メチル化が、腫瘍型内の個々の腫瘍において定量的に異なり得、そして特定の腫瘍型において全体でより目立ち得ることを示した。
１  サンプルを通じるメチル化頻度の不均一性は、メチル化頻度における分散が平均を超えるという証拠について、標準試験によって各腫瘍型内で評価した。この試験は、メチル化の頻度がたとえＣｐＧアイランドを通じて変動するとしても適用されるポアソン近似により理由付けされる。さらに、二項分布からの単純な結果は、この試験が保存的であることを示す。なぜなら、均一性の下では、この集団の分散は、平均を超えないからである。
【００７８】
（Ｉ．ＣｐＧアイランドのサブセットは、腫瘍中で優先的にメチル化されている）
異なる腫瘍中で失われたＲＬＧＳスポットの分析により、ＲＬＧＳゲル上の特定のスポットが複数の腫瘍で失われたことを決定した。これは、１つより多い腫瘍で特定のＣｐＧジヌクレオチドがメチル化されたことを意味する。これは、図４中に示され、ここでは、メチル化された特定のＣｐＧアイランドをもった特定の腫瘍型内の腫瘍の数が示される。
【００７９】
これら共通のＣｐＧアイランドのメチル化はランダムではなかったという仮説を試験するために、標準の適合度検定を用いた２。これは、図４のプロット中に観察され得、ここで、各プロットの黒線は、特定のＣｐＧアイランドのメチル化が複数腫瘍でランダムであったとき予期される分布を示す。図４から、胸部腫瘍、結腸腫瘍、神経膠腫、急性骨髄性白血病および小児ＰＮＥＴについて、実際の分布が、ランダム度の指標である理論的分布から有意に異なっていた（Ｐ＜０．０００１）ことが観察される。同様に、頭部および頸部腫瘍の結果は有意であった（Ｐ＜０．０２５）。精巣腫瘍の結果（Ｐ＝０．３６５）は、有意ではなかった。しかし、この型の腫瘍は、低い全体メチル化頻度を有し、そしてより大きなサンプルサイズが必要である。全体で、データは、腫瘍中のＣｐＧアイランドメチル化のパターンは、ランダムではないことを示す。
２  各ＣｐＧアイランドについて等しいメチル化頻度の帰無仮説の下では、適合性検定（χ２）を、各腫瘍型内の複数の腫瘍におけるメチル化を示すアイランドの観察頻度対期待頻度に適用された。
【００８０】
（Ｊ．共有標的および腫瘍型特異的標的の異常ＣｐＧ−アイランドメチル化の頻度）
データは、それらが非ランダム様式でメチル化されていることを示したので、１つ以上の腫瘍型において、高頻度でメチル化されているＣｐＧアイランドは、腫瘍の診断のために用いられ得る。ＮｏｔＩ／ＥｃｏＲＶ  ＲＬＧＳ分析を用いる９８の腫瘍の分析から、コントロールの健常組織ＤＮＡと比較したとき、存在しないかまは減少した強度の多くのスポットを見出した。表Ｉはこれらのスポットを列挙する。各フラグメント（ＣｐＧアイランド）は、表中３つの方法で同定される。第１に、各ＣｐＧアイランドの位置は、ゲル起点から、一次元および二次元の両方で、電気泳動の間に移動した距離（ｃｍ）として指定される。第２に、各ＣｐＧアイランドは、３つの可変指定で与えられる（Ｙ座標、Ｘ座標、フラグメント番号）。Ｘ座標は、二次元ＲＬＧＳプロフィール状の水平方向を示し、そしてＢ−Ｇの文字である。Ｙ座標は、垂直方向を示し、そして１−５の番号である。ともに、ＸおよびＹ指定は、ＲＬＧＳプロフィールを２８のセクションに分割する。各セクション内で、スポット／フラグメントには番号が与えられる。このようなプロフィールは、ｈｔｔｐ：／／ｐａｎｄｏｒａ．ｍｅｄ．ｏｈｉｏ−ｓｔａｔｅ．ｅｄｕ／ｍａｓｔｅｒＲＬＧＳ／で利用可能である。第３に、個々のスポットの部分ＤＮＡ配列は、各スポットに対応するライブラリークローンの配列決定により決定された。これらの配列は、添付した配列表中に示され、そして配列番号１〜８２に割り当てられている。
【００８１】
この診断ＮｏｔＩ／ＥｃｏＲＶスポットには２つの型がある（図１）。スポットの第１の型は、単一腫瘍型における不在または減少した強度の型である。例えば、２．Ｂ．５３と称されるＣｐＧアイランドの部分であるＮｏｔＩ部位は、頭部および頸部腫瘍においてのみメチル化されている。同様に、ＣｐＧアイランド２．Ｆ．２のＮｏｔＩ部位は、胸部腫瘍においてのみメチル化されている。
【００８２】
スポットの第２の型は、１つより多い腫瘍型における不在または減少した強度である。例えば、２．Ｃ．２４と称されるＮｏｔＩ／ＥｃｏＲＶスポットは、神経膠腫およびＡＭＬにおいてなくなっている。同様に、３．Ｂ．５５と称されるＮｏｔＩ／ＥｃｏＲＶスポットは、胸部、結腸およびＰＮＥＴでメチル化されている。
【００８３】
【表１】
2004524837.tif 000002
2004524837.tif 000003
2004524837.tif 000004
（実施例２．ＡｓｃＩおよびＲＬＧＳを使用する肺癌についての診断マーカーの同定）
肺腫瘍由来の組織を、外科組織サンプルとして得た。可能である場合、同じ患者から周囲の非腫瘍組織を得、コントロールとして使用した。ＤＮＡを、実施例１に記載されるように組織から単離した。ＲＬＧＳ分析についての調製において、ＤＮＡの末端を、実施例１に記載されるようにブロックした。次いで、ＤＮＡをＡｓｃＩで消化し、続いて、ＥｃｏＲＶで消化した。ＡｓｃＩ制限酵素は、配列５’ＧＧＣＧＣＧＣＣ３’を認識し、そしてその配列内のシトシンがメチル化されている場合、その配列を切断しない。第１次元ゲル電気泳動（ＨｉｎｆＩを用いるゲル内消化）、第２次元ゲル電気泳動およびオートラジオグラフィーを、実施例１に記載されるように実施した。
【００８４】
肺腫瘍ＤＮＡ由来のＲＬＧＳプロフィールを、健常な非腫瘍組織ＤＮＡから得たＲＬＧＳプロフィールと比較した。健常組織から得られたプロフィールと比較して、腫瘍組織ＲＬＧＳプロフィールにおいて失われたスポットまたは減少した強度で存在するスポットを、注目した。８個のスポットが、複数の肺腫瘍サンプル由来のＲＬＧＳプロフィールにおいて失われるかまたは変更した。このようなスポットの編集が表ＩＩに示される（肺腫瘍）。
【００８５】
ＤＮＡ配列情報を、肺癌特異的スポットから得た。これは、健常組織由来のＤＮＡから作製したＡｓｃＩ／ＥｃｏＲＶライブラリーの個々のクローンを配列決定することによって行った。ＡｓｃＩ／ＥｃｏＲＶ  ＲＬＧＳプロフィール上のスポットに対応するこのライブラリーの個々のクローンを、ＮｏｔＩ／ＥｃｏＲＶライブラリーについて本出願の明細書において先に記載されたように、種々の群のライブラリークローン由来のＤＮＡを用いて、ＲＬＧＳゲルを過剰負荷することによって同定した。個々のクローンをＡｓｃＩ／ＥｃｏＲＶプロフィールのスポットと一致させた後に、肺腫瘍ＤＮＡ由来のプロフィールにおいて失われたスポット由来のＤＮＡを配列決定した。このような配列情報は、添付のＤＮＡ配列表に示される。
【００８６】
【表２】
2004524837.tif 000005
2004524837.tif 000006
１ＮＤ、決定しなかった。消化されたＣｐＧアイランドがその示された腫瘍型においてメチル化されたが、他の腫瘍型におけるそのメチル化は、決定されなかったことを示す。
２ＣｐＧアイランドについてのＸ、Ｙ、消化数に先行する「Ａ」は、これらのアイランドがＡｓｃＩ／ＥｃｏＲＶ  ＲＬＧＳプロフィール由来であることを示す。
【００８７】
（実施例３．癌診断についてのプライマーの設計）
プライマーを、メチル化特異的ＰＣＲ（ＭＳＲ）を使用して、癌の診断のために設計する。プライマーを、その配列が本出願に開示されるライブラリークローン内に含まれるヒトゲノムの領域を増幅するように、設計する。２つのセットのプライマーが、ＤＮＡ配列が癌の診断ために使用される各ライブラリークローンのために必要である。各プライマーセットを消化して、ゲノムの同じ領域（この領域は、メチル化感受性制限酵素認識部位（すなわち、実施例１に記載されるライブラリーについてのＮｏｔＩ部位；実施例２に記載されるライブラリーについてのＡｓｃＩ部位）を含むライブラリークローンの末端から開始し、そして、メチル化感受性制限酵素認識部位から２００ヌクレオチドまでのクローン内に含まれる領域で終わる）を増幅する。
【００８８】
第１のセットのプライマーを、シトシン残基がメチル化されていないテンプレートゲノムＤＮＡを増幅し、そして二亜硫酸塩処理の後に、このゲノムＤＮＡのシトシンを、ウラシルに変換するように設計する。第２のセットのプライマーを、ＣｐＧジヌクレオチドを含み、シトシン上でメチル化されたテンプレートゲノムＤＮＡを増幅するように設計する。このようなメチル化シトシンは、二亜硫酸塩処理によって影響を受けない。従って、２つのセット（非メチル化ＤＮＡのみを増幅する１つのセット、およびメチル化されたＤＮＡのみを増幅する別のセット）のプライマーを使用することによって、テンプレートＤＮＡのメチル化状態が決定され得る。このようなメチル化状態は、癌についての診断であり得る。
【００８９】
ＭＳＲに使用されるプライマーを、１５〜３４ヌクレオチド長であり、そしてそれらの配列内に、ＣｐＧジヌクレオチドまたは二亜硫酸塩を用いて処理されたＣｐＧジヌクレオチドに相補的なジヌクレオチドのいずれかを含むように設計する。非メチル化ＤＮＡを増幅するために使用されるプライマーの３’末端がＣｐＡジヌクレオチドであることが好ましい。メチル化ＤＮＡを増幅するために使用されるプライマーの３’末端がＣｐＧジヌクレオチドであることが好ましい。
【００９０】
診断的に使用される各ライブラリークローンについて、第１のセットのプライマーを、メチル化されていないゲノムＤＮＡを増幅するように設計する。二亜硫酸塩を用いる、このようなゲノムＤＮＡの処理の後に、このような全ての非メチル化シトシンをウラシルに変換する。テンプレートとしてこのようなＤＮＡを使用し、それを増幅するＰＣＲプライマーは、これらのウラシルに相補的であるアデニン残基を有する。
【００９１】
第１のセットのプライマーについて、プライマーの１つの５’末端は、メチル化感受性制限酵素認識部位を含むライブラリークローンの末端で始まる。このプライマーの配列は、グアニン残基がアデニン残基で置換されていることを除いて、メチル化感受性制限酵素部位の一部としてその５’末端を有するテンプレートの鎖と配列が同一である。アデニンは、プライマーが、テンプレート鎖（シトシンが、二亜硫酸塩によってウラシルに変換されている）にハイブリダイズすることを可能にする。このプライマーは、合計１５のヌクレオチドと合計３２のヌクレオチドとの間の長さに及ぶ。好ましくは、このプライマーの３’末端は、ＣｐＡジヌクレオチドで終わり、このジヌクレオチドのアデニンは、ウラシル（二亜硫酸塩処理の前、ＣｐＧジヌクレオチドを構成するシトシンであった）にハイブリダイズする。
【００９２】
以下のダイアグラムは、ＮｏｔＩ／ＥｃｏＲＶライブラリー（表Ｉおよび添付の配列表）のクローン２．Ｂ．５３を増幅するために使用され得るプライマーを選択するためのこれらの規則の実行を示す。ダイアグラムにおいて、Ｉは、メチル化感受性ＮｏｔＩ部位を含む２．Ｂ．５３クローンの末端を示す（ＮｏｔＩ認識配列は、太字で示される）。ＣｐＧジヌクレオチドに影が付けられる。このクローンのＮｏｔＩ部位の右側の領域を増幅するために、第１のプライマーは、Ｉに示される二重鎖の上の鎖と同一である。しかし、ＩのＤＮＡの二亜硫酸塩処理がシトシンをウラシルに変換するので、ＰＣＲプライマー内のグアニンは、アデニンで置換されなければならない。ＩＩは、二亜硫酸塩処理がシトシンをウラシルに変換した後の、Ｉの下の鎖の配列を示す。二亜硫酸塩処理された下の鎖に相補的なプライマーは、ＩＩＩに示される配列を有する。
【００９３】
【数１】
2004524837.tif 000007
ＩＩＩは、ライブラリークローン２．Ｂ．５３に対応する非メチル化ゲノムＤＮＡを増幅するために使用される２つのプライマーのうちの１つの配列全体を示す。このプライマーは、上記Ｉにおいて影付きで示されるように、５ＣｐＧジヌクレオチドを含む。２個以上のこのようなＣｐＧジヌクレオチドの含有は、このプライマーが、メチル化されたシトシンを含む二亜硫酸塩処理されたテンプレートにハイブリダイズしないので、好ましい。ＩＩＩに示されるプライマーの３’末端は、ＣｐＡジヌクレオチドで終わる。これはまた、ＭＳＲにおけるメチル化テンプレートＤＮＡと非メチル化テンプレートＤＮＡとの間のプライマーの最大識別を提供するために好ましい。ＩＩＩに示されるプライマーは、３１ヌクレオチドの長さを有する。
【００９４】
第２プライマーを、約２００塩基対未満のフラグメントが増幅されるように、ＰＣＲ増幅において、第１プライマーとともに働くように設計する。従って、このプライマーは、Ｉに示される配列の右側の配列に対して作製される。このプライマーの配列は、グアニン残基がアデニン残基で置換されていることを除いて、メチル化感受性制限酵素認識部位の一部としてその５’末端を有するテンプレートの鎖と配列が相補的である。このプライマーは、好ましくは、１５ヌクレオチド長と３２ヌクレオチド長との間である。このプライマーはまた、好ましくは、２つ以上のＣｐＧジヌクレオチドを含むように設計される。好ましくは、このプライマーの３’末端は、ＣｐＡジヌクレオチドで終わる。
【００９５】
以下のダイアグラムは、ＮｏｔＩ／ＥｃｏＲＶライブラリーのクローン２．Ｂ．５３に対応する非メチル化ゲノムＤＮＡを増幅するために使用され得るプライマーを選択するためのこれらの規則の実行を示す。ＩＶは、先のダイアグラムのＩにおける配列の右側の約７０ヌクレオチドの、２．Ｂ．５３クローンの領域を示す。配列内のＣｐＧジヌクレオチドは、影が付けられている。この領域の左側の領域を増幅するために、この第２のプライマーは、ＩＶに示される二重鎖の上の鎖に相補的でなければならない。しかし、ＩＶにおけるＤＮＡの二亜硫酸塩処理は、シトシンをウラシルに変換する。この二亜硫酸塩処理された上の鎖に相補的なプライマーは、ＶＩに示される配列を有する。
【００９６】
【数２】
2004524837.tif 000008
ＶＩは、ライブラリークローン２．Ｂ．５３に対応する非メチル化ゲノムＤＮＡを増幅するために使用される第２のプライマーの配列全体を示す。このプライマーは、ＩＶに影をつけて示される８ＣｐＧのジヌクレオチドを含む。２つ以上のこのようなＣｐＧジヌクレオチドの含有が好ましい。ＶＩに示されるプライマーの３’末端は、ＣｐＡジヌクレオチドで終わる。これもまた、好ましい。ＶＩに示されるプライマーは、３１ヌクレオチド長を有する。一緒になって、第１プライマーおよび第２プライマーは、１２８塩基対長のＰＣＲフラグメントを増幅する。
【００９７】
上記プライマーは、５−メチルシトシンを含まないゲノムＤＮＡを増幅する。上記プライマーは、５−メチルシトシンを含むゲノムＤＮＡを増幅しない。なぜなら、５−メチルシトシンは、二亜硫酸塩処理によってウラシルに変換されないからである。従って、既に記載された２つのプライマー（ＩＩＩおよびＶＩ）は、メチル化されている、二亜硫酸塩処理されたゲノムＤＮＡに相補的ではない。
【００９８】
従って、第２のセットのプライマーを、メチル化されているゲノムＤＮＡを増幅するように設計する。ヒト細胞におけるメチル化は、ＣｐＧ残基の一部であるシトシンに存在する。このようなメチル化シトシンは、二亜硫酸塩処理によってウラシルに変換されない。ＣｐＧ残基の一部ではないシトシンは、メチル化されず、従って、二亜硫酸塩によってウラシルに変換される。第２セットのプライマーは、第１セットのプライマーと同様に、ライブラリークローンの同じ領域を増幅するように設計する。しかし、ゲノムＤＮＡが、メチル化されたシトシンとメチル化されていないシトシンの両方を含むので、このようなＤＮＡを増幅するために使用されるプライマーの配列は、第１プライマーセットの配列とは異なる。しかし、第１セットのプライマーと同様に、第２セットのプライマーは、好ましくは、１５ヌクレオチド長と３２ヌクレオチド長との間である。好ましくは、このようなプライマーの３’末端は、ＣｐＧジヌクレオチドを含む。
【００９９】
以下のダイアグラムは、ＮｏｔＩ／ＥｃｏＲＶライブラリーのクローン２．Ｂ．５３に対応するメチル化ゲノムＤＮＡを増幅するために使用され得る２つのプライマーのうちの第１プライマーを選択するためのこれらの規則の実行を示す。以下のダイアグラムにおいて、ＶＩＩは、ＮｏｔＩ部位（ＮｏｔＩ認識配列が太字である）を含む２．Ｂ．５３クローンの末端を示す。ＣｐＧジヌクレオチドは、影が付けられている。このＣｐＧジヌクレオチド内のシトシンは、メチル化され、そして５−メチルシトシンに対するメチル化を示すためにＶＩＩにおいて下線を付けて示される。二亜硫酸塩を用いるＶＩＩのＤＮＡの処理は、ＶＩＩＩに示される配列を有する下の鎖を生成する。ＶＩＩＩにおいて、非メチル化シトシンのみが、二亜硫酸塩によってウラシルに変換される。
【０１００】
【数３】
2004524837.tif 000009
ＶＩＩＩに示される二亜硫酸塩処理された下の鎖に相補的なプライマーが、ＩＸに示される。このプライマーは、ＶＩＩに示される配列の右側の配列のＰＣＲ増幅をプライムする。ＩＸで示されるプライマーは、５ＣｐＧジヌクレオチドを含む。２以上のこのようなＣｐＧジヌクレオチドの含有が好ましい。ＩＸに示されるプライマーの３’末端は、ＣｐＧで終わる。これもまた好ましい。ＩＸで示されるプライマーは、３１ヌクレオチド長を有する。
【０１０１】
第２のプライマーは、メチル化ゲノムテンプレートＤＮＡを増幅するために、ＩＸで示されるプライマーとともに働くように設計される。このようなプライマーの設計が以下に示される。ダイアグラムにおいて、Ｘは、ＩＶで示されるクローン２．Ｂ．５３の同じ領域（ＶＩＩで示される配列の右側の約７０ヌクレオチド）を示す。二亜硫酸塩を用いるＸのＤＮＡの処理は、ＸＩに示される配列を有する上の鎖を生成する。ＸＩにおいて、非メチル化シトシンのみが、二亜硫酸塩によってウラシルに変換される。
【０１０２】
【数４】
2004524837.tif 000010
二亜硫酸塩処理された上の鎖（ＸＩ）に相補的なプライマーは、ＸＩＩに示される配列を有する。このプライマーは、Ｘで示される配列の左側の配列のＰＣＲ増幅をプライムする。ＸＩＩに示されるプライマーは、８ＣｐＧジヌクレオチドを含む。２つ以上のこのようなＣｐＧジヌクレオチドの含有が好ましい。ＸＩＩに示されるプライマーの３’末端は、ＣｐＧジヌクレオチドで終わる。これもまた、好ましい。ＸＩＩに示されるプライマーは、３１ヌクレオチド長を有する。一緒になって、第２セットの第１プライマー（ＩＸ）および第２プライマー（ＸＩＩ）は、１２８塩基対長のＰＣＲフラグメントを増幅する。
【０１０３】
（実施例４．癌を診断するためのオリゴヌクレオチドの使用）
ライブラリークローン、およびその中のＤＮＡ配列を使用して、クローン内の配列によって同定される特定の配列でのゲノムにおけるＤＮＡメチル化を検出し得る。このような検出は、癌の診断であり得る。このような診断のための種々の方法が使用され得る。
【０１０４】
（Ａ．メチル化感受性制限酵素の使用、続くサザンブロットによる、癌の診断）
特定の制限酵素認識部位におけるメチル化感受性制限酵素による切断または切断の欠如は、サザンブロットを使用して、特定の認識部位に対するプローブによって検出され得る。ゲノムＤＮＡを、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）を有する患者由来の腫瘍細胞から、（実施例１に記載のように）単離した。化学療法およびこの疾患の寛解の後の同じ患者由来の細胞を、コントロールの健常組織ＤＮＡの供給源として供給した。ＡＭＬおよびコントロールＤＮＡを、２６Ｔおよび２６Ｎとして、それぞれ指定した。ＤＮＡを、ＮｏｔＩおよびＥｃｏＲＶを用いて４時間消化し、次いで、０．８％アガロースゲルを通して電気泳動した。ゲル内のＤＮＡを、１０分間、０．２Ｎ  ＨＣｌ中にゲルを浸すことによって、脱プリン化した。このゲルを、１０分間、移動溶液（０．５Ｎ  ＮａＯＨ、１Ｍ  ＮａＣｌ）中で平衡化させ、次いで、Ｚｅｔａ  Ｂｉｎｄ−ＧＴナイロン膜（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）にブロットした。ブロットをＵＶ光を用いて架橋し、減圧オーブン中でベークし、次いで、７％ＳＤＳ、５００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．２）および１ｍＭ  ＥＤＴＡの溶液中で、６５℃で１時間プレハイブリダイズした。このブロットを、１０８〜１０９ｄｐｍ／μｇの比活性のα−３２Ｐ標識プローブの１０ｎｇを有するプレハイブリダイゼーション溶液中で、６５℃で一晩、ハイブリダイズした。使用されるＤＮＡプローブは、ＮｏｔＩ／ＥｃｏＲＶ  ２．Ｃ．４０ライブラリー由来の２．Ｃ．４０クローンであった。精製されたＮｏｔＩ／ＥｃｏＲＶフラグメント（５０ｎｇ）は、Ｐｒｉｍｅ−Ｉｔ  ＩＩランダム−プライム標識キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を使用して、ランダムプライミングによって、［α−３２Ｐ］ｄＣＴＰを用いて標識した。ブロットを、洗浄溶液１（１００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．２、０．１％ＳＤＳ）中で、６５℃で、２回の迅速なリンスで洗浄し、続いて、洗浄溶液１中で、６５℃で、１回３０分間洗浄した。次いで、ブロットを３０分間、６５℃で、洗浄溶液２（４０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．２、０．１％ＳＤＳ）中で洗浄した。バンドを、Ｋｏｄａｋ  Ｘ−ＯＭＡＴ  ＡＲフィルムを使用して、オートラジオグラフィーによって可視化した。
【０１０５】
図２Ｂは、データを示す。オートラジオグラフの最初の２つのレーンは、関連する。第１のレーンの標識された２６Ｎは、ＮｏｔＩおよびＥｃｏＲＶの両方を用いて切断された正常な健常組織ＤＮＡである。２６Ｎレーンは、オートラジオグラフ標識された「ＮｏｔＩ／ＥｃｏＲＶ」の下の近くのバンドを示す。これは、２．Ｃ．４０クローンに存在するＮｏｔＩ部位がメチル化されていない場合に得られるフラグメントである。隣接するレーン（標識「２６Ｔ」）は、ＮｏｔＩおよびＥｃｏＲＶの両方を用いて切断される腫瘍組織ＤＮＡである。このバンド（標識「ＥｃｏＲＶ」）が、２６Ｎバンドほど速く移動しないことが示される。２．Ｃ．４０クローンに存在するＮｏｔＩ部位がメチル化され、そしてＮｏｔＩ酵素がこの部位で切断できなかったことがその理由である。
【０１０６】
（Ｂ．メチル化特異的ＰＣＲ（ＭＳＲ）を使用する、癌の診断）
ＭＳＲは、ＤＮＡのメチル化状態に依存するＰＣＲによってＤＮＡが増幅される技術である。この実施例において、メチル化状態が決定されるゲノムの特定の領域は、メチル化感受性制限酵素認識配列によって分画されるＣｐＧアイランドの末端の領域である。ＮｏｔＩ／ＥｃｏＲＶ  ＲＬＧＳプロフィールの場合、これは、ＮｏｔＩ部位である。ＡｓｃＩ／ＥｃｏＲＶ  ＲＬＧＳプロフィールの場合、これは、各クローンの末端におけるＡｓｃＩ部位である。
【０１０７】
この実施例のために、ＮｏｔＩ／ＥｃｏＲＶライブラリーのクローン２．Ｂ．５３のＮｏｔＩ部位に対応するゲノム配列のメチル化状態が調べられる。ゲノムＤＮＡが、実施例１に記載されるように、最初に正常な組織および腫瘍組織から単離される。次いで、このＤＮＡは、二亜硫酸塩を用いて処理される。これは、５０μｌの容積中に１μｇのゲノムＤＮＡを取り、そして０．２Ｍ  ＮａＯＨの最終濃度でこのＤＮＡを変性することによってなされる。３０μｌの１０ｍＭヒドロキノンおよび５２０μｌの３Ｍ二亜硫酸ナトリウム（ｐＨ５．０）を添加し、混合し、そして５０℃で１６時間、鉱油下でインキュベートされる。次いで、改変されたＤＮＡを、Ｗｉｚａｒｄ  ＤＮＡ精製樹脂（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して精製し、そして５０μｌの水に溶出した。室温で５分間のＮａＯＨ（最終濃度、０．３Ｍ）処理、続くエタノール沈降によって改変を完了させる。ＤＮＡを水中で再懸濁させる。
【０１０８】
次いで、各ゲノムＤＮＡを２回のＰＣＲ反応に使用する。１つのＰＣＲ反応は、メチル化していない、従って、二亜硫酸塩によって改変されているＤＮＡを増幅する。第２のＰＣＲ反応は、メチル化しているＤＮＡを増幅する。各反応について、別のプライマーが使用される。２．Ｂ．５３クローンに対応するゲノムＤＮＡのＮｏｔＩ部位のメチル化状態を決定するために、実施例３に記載される２つのセットのプライマーが、使用される。各ＰＣＲ反応は、１×ＰＣＲ緩衝液（１６．６ｍＭ硫酸アンモニム、６７ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．８、６．７ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ  ２−メルカプトエタノール）、ｄＮＴＰ（それぞれ、１．２５ｍＭ）、プライマー（反応当たり、それぞれ３００ｎｇ）、および５０ｎｇの二亜硫酸塩改変ＤＮＡを、最終容積５０μｌで含む。二亜硫酸塩によって改変されていないＤＮＡを含む別のコントロール反応を行う。反応を９５℃で５分間熱開始し、その後、１．２５単位のＴａｑポリメラーゼを添加する。増幅を、３５サイクル（９５℃で３０秒間、アニーリング温度で３０秒間、および７２℃で３０秒間）行い、続いて、７２℃で最終の４分間の伸長を行う。各ＰＣＲ反応を、非変性６〜８％ポリアクリルアミドゲル上に直接ロードし、そして電気泳動した。ゲルを臭化エチジウムで染色し、そしてＵＶ照射下で可視化する。
【０１０９】
投入ゲノムＤＮＡが、２．Ｂ．５３  ＣｐＧアイランドクローンの末端に対応するＮｏｔＩ部位におけるＣｐＧジヌクレオチド内のシトシンでメチル化されていない場合、非メチル化ＤＮＡに特異的なプライマー（実施例３のプライマーＩＩＩおよびＶＩ）を使用するＰＣＲ反応は、１２８塩基対長の増幅生成物を生じる。同じ投入ゲノムＤＮＡを使用して、メチル化ＤＮＡに特異的なプライマー（実施例３のプライマーＩＸおよびＸＩＩ）を使用するＰＣＲ反応は、増幅生成物を生成しない。
【０１１０】
投入ゲノムＤＮＡが、２．Ｂ．５３  ＣｐＧアイランドクローンの末端に対応するＮｏｔＩ部位におけるＣｐＧジヌクレオチド内のシトシンでメチル化されている場合、非メチル化特異的プライマーを使用するＰＣＲ反応は、増幅生成物を生じない。同じ投入ゲノムＤＮＡを使用して、メチル化特異的プライマーを使用するＰＣＲ反応は、１２８塩基対長の増幅生成物を生じる。
【０１１１】
（実施例５．遺伝子発現の検出）
ライブラリークローン（表ＩおよびＩＩ）ならびにＤＮＡ配列（添付された配列表）は、このクローンによってコードされる遺伝子が、腫瘍組織または培養された細胞に転写されるか否かを決定するために有用である。転写を決定するために、ＲＮＡを、Ｔｒｉｚｏｌ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）を使用して、５個の異なるヒト神経膠腫細胞株（Ｕ８７ＭＧ、Ｕ１７８、Ｔ９８Ｇ、Ｕ２５１およびＬＮ２３５）から単離した。このようなＲＮＡ単離試薬は、当業者に公知である。ＲＮＡを、分光光度計を使用して定量化し、次いで、増幅グレードＤｎａｓｅ  Ｉ（Ｇｉｂｃｏ）を用いて処理した。ＲＮＡ（２μｇ）を、２０μｌ反応中で、ｏｌｉｇｏ−ｄＴおよびランダムプライマーとともにインキュベーションすることによって逆転写し、７０℃で１０分間加熱し、そして氷上に配置した。１×反応緩衝液（Ｇｉｂｃｏ）、ＤＴＴ（１０ｍＭ）、ｄＮＴＰ（それぞれ０．５ｍＭ）、およびＲＮＡｓｉｎ（８０Ｕ、Ｐｒｏｍｅｇａ）を含む混合物を、各サンプルに添加した。サンプルを２つのチューブ（それぞれ、１９μｌを含む）に分け、３７℃で２分間インキュベートした。Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素（ＲＴ、２００Ｕ）を、２つのチューブのうちの１つの添加し、そしてそれぞれを、３７℃で１時間インキュベートした。ＤＥＰＣ処理した水（３０μｌ）を、各サンプルに添加し、そして５分間沸騰水中で加熱した。
【０１１２】
次いで、逆転写されたＲＮＡのＰＣＲ増幅を行った。この研究において、２．Ｃ．２４ライブラリークローン（表Ｉ）内の配列によってコードされる転写物を探した。ＢＬＡＳＴプログラムを使用するコンピューター検索は、このライブラリークローンの配列内のオープンリーディングフレームを同定した。ＰＣＲプライマーを、この領域に作製した。プライマー１は、５’ＴＧＧＴＧＣＴＧＡＡＧＴＣＧＧＴＧＡＡ３’であった。プライマー２は、５’ＧＧＧＣＣＡＴＣＴＴＣＡＣＣＡＴＣＴＧ３’であった。
【０１１３】
これらのプライマー（それぞれの１０ｐｍｏｌ）を、１０μｌのＰＣＲ反応で使用し、これは、１．５μｌの逆転写反応、１×反応緩衝液、Ｔａｑポリメラーゼ（０．５Ｕ、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）、およびｄＮＴＰ（それぞれ、２５０μＭ）を含んだ。各遺伝子について、別の増幅反応を、ＲＴ−ポジティブ反応およびＲＴ−ネガティブ反応をテンプレートとして使用して実施された。増幅は、ＲＴ−ネガティブ反応から検出されなかった。ＰＣＲ反応を、サンプルを９４℃まで５分間加熱し、次いで、３５サイクル（それぞれのサイクルは、９４℃で３０秒間、５６℃でのアニーリング工程を３０秒間、および７２℃で４５秒間からなる）で増幅することによって行った。次いで、反応を、７２℃で７分間、インキュベートし、そして４℃に冷却した。次いで、サンプルを臭化エチジウムを含むアガロースゲルを通して電気泳動し、そしてＰＣＲ産物を、Ｅａｇｌｅ  Ｅｙｅゲルドキュメンテーションシステム（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を使用して可視化した。ＰＣＲ生成物の正確な同一性は、両方の鎖のヌクレオチド配列決定によって確認した。
【０１１４】
データは、２．Ｃ．２４クローンのこの領域によってコードされる転写物が、５つの神経膠腫細胞株のいずれにおいても見出されなかったことを示した。このような発現された転写物は、ヒト胎児脳および成体脳から得られるＲＮＡに存在する。
【０１１５】
細胞株の試験に加えて、患者サンプルから得られた腫瘍組織は、当業者によって転写物の存在について同様に試験され得る。転写物を検出するための他の技術もまた使用され得る。このような技術としては、例えば、ノーザンブロットハイブリダイゼーション、ＲＮａｓｅ保護およびプライマー伸長アッセイが挙げられる。
【図面の簡単な説明】
【０１１６】
【図１Ａ】制限認識部位ゲノム走査（ＲＬＧＳ）プロフィールにおけるメチル化検出。Ａ、ＲＬＧＳプロフィールに対して示されるＮｏｔＩフラグメントのメチル化検出の定量的性質を示す、ＲＬＧＳ手順の図。ＲＬＧＳプロフィールにおけるメチル化検出は、ＮｏｔＩのエンドヌクレアーゼ活性のメチル化感度に依存する。消化における差異は、切断ＮｏｔＩ部位におけるＤＮＡの放射性標識によって評価される。さらなるエンドヌクレアーゼ消化、２次元電気泳動分離およびオートラジオグラフィーの後、得られるＲＬＧＳプロフィールに対するＤＮＡフラグメントの強度は、ＮｏｔＩフラグメントのコピー数およびメチル化状態を定量的に反映する。論理に基づいて、これは、１コピーのＣｐＧアイランドを含むＮｏｔＩフラグメントが、反復したエレメントおよびｒＤＮＡ配列中に存在する豊富なＮｏｔＩフラグメントから識別されることを可能にする。Ｂ、約２，０００個の１コピーＮｏｔＩフラグメントおよび１５〜２０個の高コピー数フラグメントを示す、正常な末梢血リンパ球のＤＮＡのＲＬＧＳプロフィールの一部。標識ＮｏｔＩ／ＥｃｏＲＶフラグメントの１次元分離は、右から左に水平に延びる。ＨｉｎｆＩを用いるゲル中（ｉｎ−ｇｅｌ）消化の後、それらのフラグメントをポリアクリルアミドゲル中に垂直方向に下へ向かって分離し、そしてオートラジオグラフィーに供する。異なるサンプルおよび異なる実験室からのＲＬＧＳプロフィールの均一な比較を可能にするために、各フラグメントに、３変数での消化を与える（Ｙ座標、Ｘ座標、フラグメント数）。本発明において記載した全ての比較について使用したＲＬＧＳプロフィールの中央領域は、２８の区分を有する（１〜５は垂直方向であり、Ｂ〜Ｇは水平方向である；４Ｇおよび５Ｇは、フラグメントが高密度かつ低解像度であったので、排除した）。Ｃ、各ＮｏｔＩフラグメントに割当てた番号を示す、プロフィール区分２Ｄの拡大図。Ｄ、ＢおよびＲＬＧＳプロフィールの他の部分で見られたＮｏｔＩ／ＨｉｎｆＩフラグメントを含む、２１０個の非重複ＮｏｔＩ／ＥｃｏＲＶクローンの、ＧＣ含量およびＣｐＧ比｛（ＣｐＧの数）／（グアニンの数）（シトシンの数）｝（分析したヌクレオチドの数）の分析。２１０クローンのうち、１８４個のクローンを無作為に選択し、そして２６個が、腫瘍プロフィールから頻繁に損失していたフラグメントに対応した。ＣｐＧアイランドは、大多数のＤＮＡ（４０％の平均ＣＧ含量および０．２のＣｐＧ比）と比較して、５０％より高いＧＣ含量および０．６以上のＣｐＧ値を有する。ヌクレオチド配列を、全体的に９９％より高い精度で決定した。３７７ｎｔ／クローンの平均を分析した（実際のＣｐＧアイランドのサイズは示さない）。平均ＮｏｔＩ／ＥｃｏＲＶクローンのサイズは、約２ｋｂであった。
【図１Ｂ】制限認識部位ゲノム走査（ＲＬＧＳ）プロフィールにおけるメチル化検出。Ａ、ＲＬＧＳプロフィールに対して示されるＮｏｔＩフラグメントのメチル化検出の定量的性質を示す、ＲＬＧＳ手順の図。ＲＬＧＳプロフィールにおけるメチル化検出は、ＮｏｔＩのエンドヌクレアーゼ活性のメチル化感度に依存する。消化における差異は、切断ＮｏｔＩ部位におけるＤＮＡの放射性標識によって評価される。さらなるエンドヌクレアーゼ消化、２次元電気泳動分離およびオートラジオグラフィーの後、得られるＲＬＧＳプロフィールに対するＤＮＡフラグメントの強度は、ＮｏｔＩフラグメントのコピー数およびメチル化状態を定量的に反映する。論理に基づいて、これは、１コピーのＣｐＧアイランドを含むＮｏｔＩフラグメントが、反復したエレメントおよびｒＤＮＡ配列中に存在する豊富なＮｏｔＩフラグメントから識別されることを可能にする。Ｂ、約２，０００個の１コピーＮｏｔＩフラグメントおよび１５〜２０個の高コピー数フラグメントを示す、正常な末梢血リンパ球のＤＮＡのＲＬＧＳプロフィールの一部。標識ＮｏｔＩ／ＥｃｏＲＶフラグメントの１次元分離は、右から左に水平に延びる。ＨｉｎｆＩを用いるゲル中（ｉｎ−ｇｅｌ）消化の後、それらのフラグメントをポリアクリルアミドゲル中に垂直方向に下へ向かって分離し、そしてオートラジオグラフィーに供する。異なるサンプルおよび異なる実験室からのＲＬＧＳプロフィールの均一な比較を可能にするために、各フラグメントに、３変数での消化を与える（Ｙ座標、Ｘ座標、フラグメント数）。本発明において記載した全ての比較について使用したＲＬＧＳプロフィールの中央領域は、２８の区分を有する（１〜５は垂直方向であり、Ｂ〜Ｇは水平方向である；４Ｇおよび５Ｇは、フラグメントが高密度かつ低解像度であったので、排除した）。Ｃ、各ＮｏｔＩフラグメントに割当てた番号を示す、プロフィール区分２Ｄの拡大図。Ｄ、ＢおよびＲＬＧＳプロフィールの他の部分で見られたＮｏｔＩ／ＨｉｎｆＩフラグメントを含む、２１０個の非重複ＮｏｔＩ／ＥｃｏＲＶクローンの、ＧＣ含量およびＣｐＧ比｛（ＣｐＧの数）／（グアニンの数）（シトシンの数）｝（分析したヌクレオチドの数）の分析。２１０クローンのうち、１８４個のクローンを無作為に選択し、そして２６個が、腫瘍プロフィールから頻繁に損失していたフラグメントに対応した。ＣｐＧアイランドは、大多数のＤＮＡ（４０％の平均ＣＧ含量および０．２のＣｐＧ比）と比較して、５０％より高いＧＣ含量および０．６以上のＣｐＧ値を有する。ヌクレオチド配列を、全体的に９９％より高い精度で決定した。３７７ｎｔ／クローンの平均を分析した（実際のＣｐＧアイランドのサイズは示さない）。平均ＮｏｔＩ／ＥｃｏＲＶクローンのサイズは、約２ｋｂであった。
【図１Ｃ】制限認識部位ゲノム走査（ＲＬＧＳ）プロフィールにおけるメチル化検出。Ａ、ＲＬＧＳプロフィールに対して示されるＮｏｔＩフラグメントのメチル化検出の定量的性質を示す、ＲＬＧＳ手順の図。ＲＬＧＳプロフィールにおけるメチル化検出は、ＮｏｔＩのエンドヌクレアーゼ活性のメチル化感度に依存する。消化における差異は、切断ＮｏｔＩ部位におけるＤＮＡの放射性標識によって評価される。さらなるエンドヌクレアーゼ消化、２次元電気泳動分離およびオートラジオグラフィーの後、得られるＲＬＧＳプロフィールに対するＤＮＡフラグメントの強度は、ＮｏｔＩフラグメントのコピー数およびメチル化状態を定量的に反映する。論理に基づいて、これは、１コピーのＣｐＧアイランドを含むＮｏｔＩフラグメントが、反復したエレメントおよびｒＤＮＡ配列中に存在する豊富なＮｏｔＩフラグメントから識別されることを可能にする。Ｂ、約２，０００個の１コピーＮｏｔＩフラグメントおよび１５〜２０個の高コピー数フラグメントを示す、正常な末梢血リンパ球のＤＮＡのＲＬＧＳプロフィールの一部。標識ＮｏｔＩ／ＥｃｏＲＶフラグメントの１次元分離は、右から左に水平に延びる。ＨｉｎｆＩを用いるゲル中（ｉｎ−ｇｅｌ）消化の後、それらのフラグメントをポリアクリルアミドゲル中に垂直方向に下へ向かって分離し、そしてオートラジオグラフィーに供する。異なるサンプルおよび異なる実験室からのＲＬＧＳプロフィールの均一な比較を可能にするために、各フラグメントに、３変数での消化を与える（Ｙ座標、Ｘ座標、フラグメント数）。本発明において記載した全ての比較について使用したＲＬＧＳプロフィールの中央領域は、２８の区分を有する（１〜５は垂直方向であり、Ｂ〜Ｇは水平方向である；４Ｇおよび５Ｇは、フラグメントが高密度かつ低解像度であったので、排除した）。Ｃ、各ＮｏｔＩフラグメントに割当てた番号を示す、プロフィール区分２Ｄの拡大図。Ｄ、ＢおよびＲＬＧＳプロフィールの他の部分で見られたＮｏｔＩ／ＨｉｎｆＩフラグメントを含む、２１０個の非重複ＮｏｔＩ／ＥｃｏＲＶクローンの、ＧＣ含量およびＣｐＧ比｛（ＣｐＧの数）／（グアニンの数）（シトシンの数）｝（分析したヌクレオチドの数）の分析。２１０クローンのうち、１８４個のクローンを無作為に選択し、そして２６個が、腫瘍プロフィールから頻繁に損失していたフラグメントに対応した。ＣｐＧアイランドは、大多数のＤＮＡ（４０％の平均ＣＧ含量および０．２のＣｐＧ比）と比較して、５０％より高いＧＣ含量および０．６以上のＣｐＧ値を有する。ヌクレオチド配列を、全体的に９９％より高い精度で決定した。３７７ｎｔ／クローンの平均を分析した（実際のＣｐＧアイランドのサイズは示さない）。平均ＮｏｔＩ／ＥｃｏＲＶクローンのサイズは、約２ｋｂであった。
【図１Ｄ】制限認識部位ゲノム走査（ＲＬＧＳ）プロフィールにおけるメチル化検出。Ａ、ＲＬＧＳプロフィールに対して示されるＮｏｔＩフラグメントのメチル化検出の定量的性質を示す、ＲＬＧＳ手順の図。ＲＬＧＳプロフィールにおけるメチル化検出は、ＮｏｔＩのエンドヌクレアーゼ活性のメチル化感度に依存する。消化における差異は、切断ＮｏｔＩ部位におけるＤＮＡの放射性標識によって評価される。さらなるエンドヌクレアーゼ消化、２次元電気泳動分離およびオートラジオグラフィーの後、得られるＲＬＧＳプロフィールに対するＤＮＡフラグメントの強度は、ＮｏｔＩフラグメントのコピー数およびメチル化状態を定量的に反映する。論理に基づいて、これは、１コピーのＣｐＧアイランドを含むＮｏｔＩフラグメントが、反復したエレメントおよびｒＤＮＡ配列中に存在する豊富なＮｏｔＩフラグメントから識別されることを可能にする。Ｂ、約２，０００個の１コピーＮｏｔＩフラグメントおよび１５〜２０個の高コピー数フラグメントを示す、正常な末梢血リンパ球のＤＮＡのＲＬＧＳプロフィールの一部。標識ＮｏｔＩ／ＥｃｏＲＶフラグメントの１次元分離は、右から左に水平に延びる。ＨｉｎｆＩを用いるゲル中（ｉｎ−ｇｅｌ）消化の後、それらのフラグメントをポリアクリルアミドゲル中に垂直方向に下へ向かって分離し、そしてオートラジオグラフィーに供する。異なるサンプルおよび異なる実験室からのＲＬＧＳプロフィールの均一な比較を可能にするために、各フラグメントに、３変数での消化を与える（Ｙ座標、Ｘ座標、フラグメント数）。本発明において記載した全ての比較について使用したＲＬＧＳプロフィールの中央領域は、２８の区分を有する（１〜５は垂直方向であり、Ｂ〜Ｇは水平方向である；４Ｇおよび５Ｇは、フラグメントが高密度かつ低解像度であったので、排除した）。Ｃ、各ＮｏｔＩフラグメントに割当てた番号を示す、プロフィール区分２Ｄの拡大図。Ｄ、ＢおよびＲＬＧＳプロフィールの他の部分で見られたＮｏｔＩ／ＨｉｎｆＩフラグメントを含む、２１０個の非重複ＮｏｔＩ／ＥｃｏＲＶクローンの、ＧＣ含量およびＣｐＧ比｛（ＣｐＧの数）／（グアニンの数）（シトシンの数）｝（分析したヌクレオチドの数）の分析。２１０クローンのうち、１８４個のクローンを無作為に選択し、そして２６個が、腫瘍プロフィールから頻繁に損失していたフラグメントに対応した。ＣｐＧアイランドは、大多数のＤＮＡ（４０％の平均ＣＧ含量および０．２のＣｐＧ比）と比較して、５０％より高いＧＣ含量および０．６以上のＣｐＧ値を有する。ヌクレオチド配列を、全体的に９９％より高い精度で決定した。３７７ｎｔ／クローンの平均を分析した（実際のＣｐＧアイランドのサイズは示さない）。平均ＮｏｔＩ／ＥｃｏＲＶクローンのサイズは、約２ｋｂであった。
【図２Ａ】ＰＬＧＳプロフィールからのフラグメントの損失は、メチル化に起因する。上、強度が減少しかたまたは強度の変化がないかのいずれかのＮｏｔＩフラグメントを有する、正常組織および２つの腫瘍から得られたＲＬＧＳプロフィールの一部。下、上のサンプルを含む多数のサンプル由来の、ＥｃｏＲＶ（ＮｏｔＩ：−）およびＥｃｏＲＶ／ＮｏｔＩ（ＮｏｔＩ：＋）で制限消化したＤＮＡのサザンブロット分析。ＮｏｔＩ部位においてメチル化を伴なわないサンプルでは、プローブは、ＮｏｔＩおよびＥｃｏＲＶで二重に消化したより小さいフラグメントを検出する。ホスホイメージャー（ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｍａｇｅｒ）を用いた複数サザンブロットからの定量は、二倍体ＮｏｔＩ／ＥｃｏＲＶフラグメントの３０％増大した強度のＲＬＧＳプロフィールにおける信頼性のある検出の下限の決定を可能にする。対応するＮｏｔＩフラグメントの存在（＋）または非存在（−）が示される。Ｎ、正常組織のＤＮＡ；Ｔ、腫瘍組織のＤＮＡ。Ａ、低いグレードの神経膠腫におけるＣｐＧアイランド座３Ｃ１メチル化。Ｂ、白血病におけるＣｐＧアイランド座２Ｃ４０メチル化。Ｃ、小児のＰＮＥＴにおけるＣｐＧアイランド座３Ｅ２４メチル化。＊、プローブに対して相同性を有する約１３ｋｂのＥｃｏＲＶフラグメント。ＮｏｔＩ−ＥｃｏＲＶクローン配列を用いたＢＬＡＳＴ検索によって、内部ＮｏｔＩ部位を欠く相同性ＢＡＣクローン配列を同定し、これは、サザンブロット上の１３ｋｂフラグメントの説明となる。
【図２Ｂ】ＰＬＧＳプロフィールからのフラグメントの損失は、メチル化に起因する。上、強度が減少しかたまたは強度の変化がないかのいずれかのＮｏｔＩフラグメントを有する、正常組織および２つの腫瘍から得られたＲＬＧＳプロフィールの一部。下、上のサンプルを含む多数のサンプル由来の、ＥｃｏＲＶ（ＮｏｔＩ：−）およびＥｃｏＲＶ／ＮｏｔＩ（ＮｏｔＩ：＋）で制限消化したＤＮＡのサザンブロット分析。ＮｏｔＩ部位においてメチル化を伴なわないサンプルでは、プローブは、ＮｏｔＩおよびＥｃｏＲＶで二重に消化したより小さいフラグメントを検出する。ホスホリメージャー（ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｍａｇｅｒ）を用いた複数サザンブロットからの定量は、二倍体ＮｏｔＩ／ＥｃｏＲＶフラグメントの３０％増大した強度のＲＬＧＳプロフィールにおける信頼性のある検出の下限の決定を可能にする。対応するＮｏｔＩフラグメントの存在（＋）または非存在（−）が示される。Ｎ、正常組織のＤＮＡ；Ｔ、腫瘍組織のＤＮＡ。Ａ、低いグレードの神経膠腫におけるＣｐＧアイランド座３Ｃ１メチル化。Ｂ、白血病におけるＣｐＧアイランド座２Ｃ４０メチル化。Ｃ、小児のＰＮＥＴにおけるＣｐＧアイランド座３Ｅ２４メチル化。＊、プローブに対して相同性を有する約１３ｋｂのＥｃｏＲＶフラグメント。ＮｏｔＩ−ＥｃｏＲＶクローン配列を用いたＢＬＡＳＴ検索によって、内部ＮｏｔＩ部位を欠く相同性ＢＡＣクローン配列を同定し、これは、サザンブロット上の１３ｋｂフラグメントの説明となる。
【図２Ｃ】ＰＬＧＳプロフィールからのフラグメントの損失は、メチル化に起因する。上、強度が減少しかたまたは強度の変化がないかのいずれかのＮｏｔＩフラグメントを有する、正常組織および２つの腫瘍から得られたＲＬＧＳプロフィールの一部。下、上のサンプルを含む多数のサンプル由来の、ＥｃｏＲＶ（ＮｏｔＩ：−）およびＥｃｏＲＶ／ＮｏｔＩ（ＮｏｔＩ：＋）で制限消化したＤＮＡのサザンブロット分析。ＮｏｔＩ部位においてメチル化を伴なわないサンプルでは、プローブは、ＮｏｔＩおよびＥｃｏＲＶで二重に消化したより小さいフラグメントを検出する。ホスホリメージャー（ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｍａｇｅｒ）を用いた複数サザンブロットからの定量は、二倍体ＮｏｔＩ／ＥｃｏＲＶフラグメントの３０％増大した強度のＲＬＧＳプロフィールにおける信頼性のある検出の下限の決定を可能にする。対応するＮｏｔＩフラグメントの存在（＋）または非存在（−）が示される。Ｎ、正常組織のＤＮＡ；Ｔ、腫瘍組織のＤＮＡ。Ａ、低いグレードの神経膠腫におけるＣｐＧアイランド座３Ｃ１メチル化。Ｂ、白血病におけるＣｐＧアイランド座２Ｃ４０メチル化。Ｃ、小児のＰＮＥＴにおけるＣｐＧアイランド座３Ｅ２４メチル化。＊、プローブに対して相同性を有する約１３ｋｂのＥｃｏＲＶフラグメント。ＮｏｔＩ−ＥｃｏＲＶクローン配列を用いたＢＬＡＳＴ検索によって、内部ＮｏｔＩ部位を欠く相同性ＢＡＣクローン配列を同定し、これは、サザンブロット上の１３ｋｂフラグメントの説明となる。
【図３】腫瘍全体にわたるＣｐＧメチル化における不均質性。ＲＬＧＳプロフィールを、９８個の原発性ヒト腫瘍から作製し、そして適合する正常なＤＮＡ（９８ケースのうち５８ケース）のプロフィールまたは関連しない個体由来の組織型が一致する正常ＤＮＡの複数プロフィールのいずれかと比較した。いくつかの隣接する未改変ＮｏｔＩフラグメントに対して、腫瘍における１コピー数フラグメントの強度の損失または低下を、重ね合わされたオートラジオグラフの視覚的な検査によって検出し、そして同じＤＮＡサンプルの独立したプロフィールによって多くのケースを確認した。各腫瘍型について、ドットプロットは、各腫瘍において観察された（分析した１，１８４個のＣｐＧアイランドのうちの）メチル化ＣｐＧアイランドの総数を示す。腫瘍が均質性の分布から引き出され、全ての腫瘍が同じ頻度のメチル化を有するという仮定のもと、その失われた分布は、おおよそポアソン分布になるはずである。色をつけた曲線は、期待される分布を表す。ＢＲＥ、乳房腫瘍；ＣＬＮ、結腸腫瘍；ＧＬＩ、神経膠腫；ＨＮ、頭部および頸部の腫瘍；ＬＥＵ、急性骨髄性白血病；ＰＮＥＴ、小児の未分化神経外胚葉性腫瘍；ＴＳＴ、精巣腫瘍。
【図４Ａ】ＣｐＧアイランドのサブセットは、優先的にメチル化される。各腫瘍型について、これらのヒストグラムは、特定のＣｐＧアイランドがメチル化された腫瘍の数を示す。１，１８４個のＣｐＧアイランドのうちのほとんどが、任意の腫瘍においてメチル化されていないが（０のヒストグラムバーは示されていない）、いくつかのＣｐＧアイランドは、複数の腫瘍においてメチル化されていた。黒の線は、ＣｐＧアイランドが等しい頻度でメチル化されるというヌルの仮定の下での期待される分布を示す。ほとんどの腫瘍型が、有意な優先的メチル化を示す。
【図４Ｂ】ＣｐＧアイランドのサブセットは、優先的にメチル化される。各腫瘍型について、これらのヒストグラムは、特定のＣｐＧアイランドがメチル化された腫瘍の数を示す。１，１８４個のＣｐＧアイランドのうちのほとんどが、任意の腫瘍においてメチル化されていないが（０のヒストグラムバーは示されていない）、いくつかのＣｐＧアイランドは、複数の腫瘍においてメチル化されていた。黒の線は、ＣｐＧアイランドが等しい頻度でメチル化されるというヌルの仮定の下での期待される分布を示す。ほとんどの腫瘍型が、有意な優先的メチル化を示す。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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