(57)【要約】本発明は包括的に、細菌、酵母、寄生生物、真菌、ウイルスのような病原体、および癌（これらに限定されない）を含めたヒト疾患を予防および治療するための組成物および方法に関する。特に、本明細書中に記載された実施形態は、病原体上に存在する受容体に対して被験体中の既存の抗体を再指向させるリガンド／受容体特異性変換体の製造および使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
受容体に対するリガンドを含む少なくとも１つの特異性ドメイン、および
該特異性ドメインに連結された少なくとも１つの抗原性ドメインであって、病原体または毒素のエピトープを含む抗原性ドメイン
を含むリガンド／受容体特異性変換体。
【請求項２】
前記特異性ドメインは、細胞外マトリックスタンパク質、ウイルス上の受容体に対するリガンド、および癌細胞上の受容体に対するリガンドからなる群から選択されるペプチドの少なくとも３つ連続するアミノ酸を含む、請求項１に記載のリガンド／受容体特異性変換体。
【請求項３】
前記ペプチドは、フィブリノーゲン、コラーゲン、ビトロネクチン、ラミニン、プラスミノーゲン、トロンボスポンジン、およびフィブロネクチンからなる群から選択される細胞外マトリックスタンパク質である、請求項２に記載のリガンド／受容体特異性変換体。
【請求項４】
前記ペプチドは、Ｔ４糖タンパク質およびＢ型肝炎ウイルスエンベロープタンパク質からなる群から選択されるウイルス上の受容体に対するリガンドである、請求項２に記載のリガンド／受容体特異性変換体。
【請求項５】
前記ペプチドは、ＨＥＲ−２／ｎｅｕに対するリガンドおよびインテグリン受容体に対するリガンドからなる群から選択される癌細胞上の受容体に対するリガンドである、請求項２に記載のリガンド／受容体特異性変換体。
【請求項６】
前記特異性ドメインは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、および配列番号１２４からなる群から選択される少なくとも１つの配列を含む、請求項１に記載のリガンド／受容体特異性変換体。
【請求項７】
前記細胞外マトリックスタンパク質は、フィブリノーゲンのα鎖の少なくとも３アミノ酸を含む、請求項３に記載のリガンド／受容体特異性変換体。
【請求項８】
前記リガンドは、アルギニン−グリシン−アスパラギン酸（ＲＧＤ）の配列を含む、請求項１に記載のリガンド／受容体特異性変換体。
【請求項９】
前記受容体は病原体上に見出される、請求項１に記載のリガンド／受容体特異性変換体。
【請求項１０】
前記受容体は細菌接着受容体である、請求項１に記載のリガンド／受容体特異性変換体。
【請求項１１】
前記細菌接着受容体は、細胞外フィブリノーゲン結合タンパク質（Ｅｆｂ）、コラーゲン結合タンパク質、ビトロネクチン結合タンパク質、ラミニン結合タンパク質、プラスミノーゲン結合タンパク質、トロンボスポンジン結合タンパク質、凝集因子Ａ（ＣｌｆＡ）、凝集因子Ｂ（ＣｌｆＢ）、フィブロネクチン結合タンパク質、コアグラーゼ、および細胞外接着タンパク質からなる群から選択される、請求項１０に記載のリガンド／受容体特異性変換体。
【請求項１２】
前記抗原性ドメインは、単純ヘルペスウイルスタンパク質、Ｂ型肝炎ウイルスタンパク質、ＴＴウイルスタンパク質、およびポリオウイルスタンパク質からなる群から選択されるペプチドの少なくとも３つのアミノ酸を含む、請求項１に記載のリガンド／受容体特異性変換体。
【請求項１３】
前記抗原性ドメインは、配列番号５３および配列番号５４からなる群から選択される少なくとも１つの配列を含む単純ヘルペスウイルスタンパク質である、請求項１２に記載のリガンド／受容体特異性変換体。
【請求項１４】
前記抗原性ドメインは、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５２、および配列番号５９からなる群から選択される少なくとも１つの配列を含むＢ型肝炎ウイルスタンパク質である、請求項１２に記載のリガンド／受容体特異性変換体。
【請求項１５】
前記抗原性ドメインは、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７および配列番号５８からなる群から選択される少なくとも１つの配列を含むＴＴウイルスタンパク質である、請求項１２に記載のリガンド／受容体特異性変換体。
【請求項１６】
前記抗原性ドメインは、配列番号４８および配列番号５１からなる群から選択される１つの配列を含むポリオウイルスタンパク質である、請求項１２に記載のリガンド／受容体特異性変換体。
【請求項１７】
前記抗原性ドメインは、高力価抗体と相互作用する、請求項１に記載のリガンド／受容体特異性変換体。
【請求項１８】
前記抗原性ドメインは、約１：１００〜１：１０００またはそれ以上に希釈された動物血清中に存在する抗体と特異的に結合する、請求項１７に記載のリガンド／受容体特異性変換体。
【請求項１９】
前記リガンド／受容体特異性変換体の配列は、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９６、配列番号９７、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１０４、配列番号１０５、配列番号１３７、および配列番号１４２からなる群から選択される、請求項１に記載のリガンド／受容体特異性変換体。
【請求項２０】
細菌上の受容体と相互作用するリガンドを有する特異性ドメイン、および病原体または毒素のエピトープを有する抗原性ドメインを含む治療上有効量のリガンド／受容体特異性変換体を被験体に提供することを含む、細菌感染を治療または予防する方法。
【請求項２１】
ウイルス上の受容体と相互作用するリガンドを有する特異性ドメイン、および病原体または毒素のエピトープを有する抗原性ドメインを含む治療上有効量のリガンド／受容体特異性変換体を被験体に提供することを含む、ウイルス感染を治療または予防する方法。
【請求項２２】
癌細胞上の受容体と相互作用するリガンドを有する特異性ドメイン、および病原体または毒素のエピトープを有する抗原性ドメインを含む治療上有効量のリガンド／受容体特異性変換体を被験体に提供することを含む、癌を治療または予防する方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
［発明の分野］
本発明は一般的に、細菌、酵母、寄生生物、真菌、ウイルスのような病原体、および癌（これらに限定されない）を含めたヒト疾患を予防および治療するための組成物および方法に関する。特に本明細書中に記載された実施形態は、病原体上に存在する受容体に対して被験体中の既存の抗体を再指向させる、リガンド／受容体特異性変換体の製造および使用に関する。
【０００２】
［発明の背景］
病原体、例えば細菌、酵母、寄生生物、真菌およびウイルスによる感染、ならびに癌の発症および転移は、ヒト、家畜およびペットを含めたすべての動物に関する深刻な健康問題をもたらす。これらの健康への脅威は、ワクチンおよび／または治療に耐性である菌株が生じることにより悪化される。過去において、薬理学従事者は、これらの疾患の治療のための安全でかつ効力のある化合物を得るために薬剤発見の伝統的方法に依存してきた。伝統的な薬剤発見方法は、通常、何らかの疾患に対して有効な治療薬であることを立証し得ることを期待して、しばしば無作為に選択し、考え得る薬剤候補分子を盲検することを含む。しかしながら、分子生物学の進歩に伴って、薬剤開発の焦点は、病因的作用物質に関連した標的分子の同定、ならびにこれらの標的分子と相互作用する化合物の設計に移ってきた。
【０００３】
標的分子として有望な種類の一つは、細菌、酵母、寄生生物、真菌、ウイルスおよび癌細胞の表面に見出される受容体、特に宿主細胞または宿主タンパク質（例えば細胞外マトリックスタンパク質）への接着を可能にする受容体である。この領域における研究は主に、受容体およびそのリガンドの同定、ならびにリガンドと受容体の相互作用を妨げ、それにより宿主細胞またはタンパク質への接着を遮断する分子の発見に集中している。
【０００４】
例えば、多くの病原性細菌（例えば黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ））は、宿主の細胞外マトリックスタンパク質（例えばフィブリノーゲン、フィブロネクチンおよびラミニン）と結合することができる接着受容体（例えばＣｌｆＡ、ＥｆｂおよびＦｎＢＰＡ）を産生する（Ｆｌｏｃｋ， Ｍｏｌ． Ｍｅｄ． Ｔｏｄａｙ ５： ５３２−５３３ （１９９９））。宿主細胞外マトリックスタンパク質の領域に対応するペプチドを提供することにより、宿主細胞外マトリックスタンパク質にいくつかの細菌が接着するのを遮断しうることを研究者等は示した（Ｐｅｉ ｅｔ ａｌ．， Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ６７（９）：４５２５−４５３０（１９９９））。同様に多数のウイルスは、宿主細胞の表面に存在するタンパク質と相互作用する受容体を有する（例えば米国特許第５，９４２，６０６号および第５，９２９，２２０号参照）。Ｔ４糖タンパク質（宿主細胞タンパク質）のフラグメントはヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）のｇｐ１２０と相互作用し得ること、およびＴ４ペプチドがＨＩＶ感染を予防または治療するために用いられ得ることを研究者等は示した（例えば米国特許第６，０９３，５３９号参照）。さらに、研究者等は、多数の種類の癌細胞が宿主細胞外マトリックスタンパク質と相互作用する受容体を発現すること、インテグリン受容体を遮断する分子が組織接着、転移、新脈管形成および腫瘍成長を抑制するために用いられ得ることを示した（例えば米国特許第６，０６６，６４８号、第６，０８７，３３０号、第５，８４６，５３６号、第５，７６６，５９１号および第５，６２７，２６３号参照）。これらの抑制性ペプチドは有望な治療能力を有するが、病原菌による感染およびその他の疾患を治療および予防するための新規の組成物および方法に対する必要性が依然として存在する。
【０００５】
［発明の簡単な概要］
本明細書中に記載された発明は、病原体上の受容体と結合し、病原体に対して被験体中の既存の抗体を向け直す新規の作用物質の製造、特徴付けおよび使用に関する。本発明の実施形態は、受容体に対するリガンドを含む少なくとも１つの特異性ドメイン、および上記特異性ドメインに連結された少なくとも１つの抗原性ドメインであって、病原体または毒素のエピトープを含む抗原性ドメインを有するリガンド／受容体特異性変換体を含む。
【０００６】
リガンド／受容体特異性変換体のいくつかの実施形態は、細胞外マトリックスタンパク質、ウイルス上の受容体に対するリガンド、および癌細胞上の受容体に対するリガンドからなる群から選択されるペプチドの少なくとも３つ連続するアミノ酸を含む特異性ドメインを有する。この実施形態のいくつかの態様では、例えばペプチドは、フィブリノーゲン、コラーゲン、ビトロネクチン、ラミニン、プラスミノーゲン、トロンボスポンジンおよびフィブロネクチンからなる群から選択される細胞外マトリックスタンパク質である。好ましくは細胞外マトリックスタンパク質は、フィブリノーゲンのα鎖の少なくとも３つのアミノ酸を含み、もっとも好ましい実施形態では、リガンドは、配列アルギニン−グリシン−アスパラギン酸（ＲＧＤ）を含む。
【０００７】
その他の実施形態では、上記ペプチドは、Ｔ４糖タンパク質およびＢ型肝炎ウイルスエンベロープタンパク質からなる群から選択されるウイルス上の受容体に対するリガンドである。この実施形態のさらに他の態様では、ペプチドは、ＨＥＲ−２／ｎｅｕに対するリガンドおよびインテグリン受容体に対するリガンドからなる群から選択される癌細胞上の受容体に対するリガンドである。好ましい実施形態は、配列番号１〜４２のうちの１つにより提供される配列を含む特異性ドメインを有する。
【０００８】
本明細書中に記載されたリガンド／受容体特異性変換体は、病原体上に見出される受容体と相互作用する。いくつかの実施形態では、受容体は細菌接着受容体、例えば、細胞外フィブリノーゲン結合タンパク質（Ｅｆｂ）、コラーゲン結合タンパク質、ビトロネクチン結合タンパク質、ラミニン結合タンパク質、プラスミノーゲン結合タンパク質、トロンボスポンジン結合タンパク質、凝集因子Ａ（ＣｌｆＡ）、凝集因子Ｂ（ＣｌｆＢ）、フィブロネクチン結合タンパク質、コアグラーゼおよび細胞外接着タンパク質からなる群から選択される細菌接着受容体である。
【０００９】
本明細書中に記載されたリガンド／受容体特異性変換体はまた、被験体中に存在する抗体と相互作用する。いくつかの実施形態では、例えば抗原性ドメインは、単純ヘルペスウイルスタンパク質、Ｂ型肝炎ウイルスタンパク質、ＴＴウイルスタンパク質、およびポリオウイルスタンパク質からなる群から選択されるペプチドの少なくとも３つのアミノ酸を含む。望ましい実施形態では、リガンド／受容体特異性変換体は、配列番号５３および配列番号５４からなる群から選択される１つの配列を含む単純ヘルペスウイルスタンパク質である抗原性ドメインを有する。その他の所望の実施形態では、抗原性ドメインは、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５２、および配列番号５９のうちの１つの配列を含むＢ型肝炎ウイルスタンパク質である。
【００１０】
いくつかのリガンド／受容体特異性変換体は、配列番号４３〜４７および配列番号５５〜５８のうちの１つにより提供される１つの配列を含むＴＴウイルスタンパク質である抗原性ドメインも有する。リガンド／受容体特異性変換体は、配列番号４８および配列番号５１からなる群から選択される１つの配列を含むポリオウイルスタンパク質である抗原性ドメインも有しうる。好ましくはリガンド／受容体特異性変換体は、高力価抗体と相互作用する抗原性ドメインを有する。例えばいくつかの実施形態では、抗原性ドメインは、約１：１００〜１：１０００またはそれ以上に希釈された動物血清中に存在する抗体と特異的に結合する。配列番号６０〜１０５の特異性変換体は、本発明の実施形態である。
【００１１】
本発明の態様は、病原体の感染または増殖を治療または予防するための方法にも関する。例えば一態様は、細菌感染の治療および予防方法を含む。この方法は、治療上有効量のリガンド／受容体特異性変換体を被験体に提供することにより実行されるが、この場合、上記リガンド／受容体特異性変換体は細菌上の受容体と相互作用するリガンドを有する特異性ドメイン、および病原体または毒素のエピトープを含む抗原性ドメインを含む。ウイルス感染の治療または予防方法も一実施形態である。したがってウイルス感染の治療方法または予防方法は、治療上有効量のリガンド／受容体特異性変換体を被験体に提供することにより実行されるが、この場合、上記リガンド／受容体特異性変換体は細菌上の受容体と相互作用するリガンドを有する特異性ドメイン、および病原体または毒素のエピトープを含む抗原性ドメインを含む。同様に、癌の治療または予防方法は一実施形態であって、この方法は、治療上有効量のリガンド／受容体特異性変換体を被験体に提供することにより実行され得るが、この場合、上記リガンド／受容体特異性変換体は、癌細胞上の受容体と相互作用するリガンドを有する特異性ドメイン、および病原体または毒素のエピトープを含む抗原性ドメインを含む。
【００１２】
［発明の詳細な説明］
以下は、病原体上の受容体と結合し、被験体中に存在する抗体を病原体に対して向け直す新規の作用物質の製造、特徴付け、および使用に関する。「抗原／抗体特異性変換体」という用語は、ある抗体が結合するアミノ酸配列（例えば病原体のエピトープ）に連結された抗体のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列（例えば相補性決定領域）を含む分子を指すことが当業界で既知である（例えばＳａｌｌｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ＆ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ， ２０５：１３８６−９０（１９９４）ならびに米国特許第５，８６９，２３２号および第６，０４０，１３７号参照）。抗原／抗体特異性変換体は、被験体中に存在する抗体を病原体に対して向け直すことができ、これらの変換剤は治療および診断上の用途を有する（同上）。
【００１３】
本明細書中に記載された実施形態は、「リガンド／受容体特異性変換体」と呼ばれる第二世代の変換剤に関する。抗原／抗体特異性変換体と異なり、リガンド／受容体特異性変換体は抗体中に見出される配列を含まない。その代わりに、リガンド／受容体特異性変換体は、受容体に対するリガンドを有する第１のドメイン、および病原体または毒素のエピトープを有する第２のドメインを含む。したがって、本発明においては、「リガンド／受容体特異性変換体」という用語は、病原体または毒素（例えば百日咳毒素またはコレラ毒素）の少なくとも１つのエピトープを有する「抗原性ドメイン」に連結された受容体に対する少なくとも１つのリガンド（「リガンド」は抗体またはその一部分ではない）を有する「特異性ドメイン」を含む変換剤を指す。
【００１４】
リガンド／受容体特異性変換体は、複数の特異性ドメインおよび複数の抗原性ドメインを含み得る。例えばいくつかのリガンド／受容体特異性変換体は、複数の特異性ドメインおよび／または複数の抗原性ドメインを含む。多重特異性ドメインおよび／または抗原性ドメインを有するリガンド／受容体特異性変換体は、複数の特異性ドメインおよび／または抗原性ドメインがタンデムに融合されるため、「多重化されている」と言われる。他の実施形態は、特異性ドメインおよび抗原性ドメインのほかに、精製を容易にする配列（例えばポリヒスチジンテール）、リンカー（例えばビオチンおよび／またはアビジンまたはストレプトアビジンまたは８ファージの柔軟性腕（８−リンカー））、およびリガンド／受容体特異性変換体の安定を促進する（例えばプロテアーゼ消化に対する耐性を提供する）またはリガンド／受容体特異性変換体の分解を促す（例えばプロテアーゼ切断部位）配列または修飾を含有するリガンド／受容体特異性変換体に関する。特異性ドメインおよび抗原性ドメインは好ましくはペプチドであるが、いくつかのリガンド／受容体特異性変換体は、修飾または誘導体化されたペプチド、ペプチド模倣体または化学物質からなる特異性ドメインおよび抗原性ドメインを有する。
【００１５】
本明細書中に記載された実施形態は、多くの異なる病原体上の多くの異なる受容体と結合し得るため、リガンド／受容体特異性変換体の多様性は莫大である。したがって、本明細書中で用いられる「病原体」という用語は一般的意味で、つまり動物における疾患の病因性作用物質、例えば細菌、寄生生物、真菌、糸状菌、ウイルス、および癌細胞（これらに限定されない）を指す。同様に「受容体」という用語は一般的意味で用いられ、「リガンド」（通常は、抗体中に見出される配列以外のペプチド、あるいは炭水化物、脂質、核酸またはそれらの組合せ）と相互作用する分子（通常は抗体中に見出される配列以外のペプチドであるが、炭水化物、脂質または核酸であり得る）を指す。「受容体」は、本明細書中で用いる場合、シグナル伝達を受けなければならないというわけではなく、多数の分子相互作用、例えば接着（例えばインテグリン）および分子シグナリング（例えば成長因子受容体）（これらに限定されない）に関与し得る。例えば所望の特異性ドメインは、細胞外マトリックスタンパク質（例えばフィブリノーゲン、コラーゲン、ビトロネクチン、ラミニン、プラスミノーゲン、トロンボスポンジン、およびフィブロネクチン）中に存在するペプチド配列を有するリガンドを含み、またいくつかの特異性ドメインは、細菌接着受容体（例えば細胞外フィブリノーゲン結合タンパク質（Ｅｆｂ）、コラーゲン結合タンパク質、ビトロネクチン結合タンパク質、ラミニン結合タンパク質、プラスミノーゲン結合タンパク質、トロンボスポンジン結合タンパク質、凝集因子Ａ（ＣｌｆＡ）、凝集因子Ｂ（ＣｌｆＢ）、フィブロネクチン結合タンパク質、コアグラーゼおよび細胞外接着タンパク質）と相互作用するリガンドを含む。
【００１６】
他の実施形態では、特異性ドメインは、ウイルス受容体と相互作用するペプチド配列（例えばｇｐ１２０を結合するＴ４糖タンパク質の断片またはヘパドナウイルスファミリーのｇｐ１７０を結合するｐｒｅＳドメインの断片）を有するリガンドを含む。さらに他の実施形態では、特異性ドメインは、癌細胞上の受容体（例えばＨＥＲ−２／ｎｅｕ（Ｃ−ｅｒｂＢ２））またはインテグリン受容体、例えばビトロネクチン受容体、ラミニン受容体、フィブロネクチン受容体、コラーゲン受容体、フィブリノーゲン受容体、∀４∃１受容体、∀６∃１受容体、∀３∃１受容体、∀５∃１受容体および∀Ｖ∃３受容体と相互作用するリガンドを含む。しかしながら、好ましい実施形態は、フィブリノーゲンのα鎖の少なくとも８個のアミノ酸および／または配列アルギニン−グリシン−アスパラギン酸（ＲＧＤ）を含む特異性ドメインを有し、もっとも好ましい実施形態は、配列番号６０〜１０５からなる群から選択される一つの配列を含む特異性ドメインを有する。
【００１７】
所望の抗原性ドメインは、被験体中にすでに存在する抗体により認識されるエピトープを有する。例えば多くの人々は、小児期疾患、例えば限定はしないが、天然痘、麻疹、流行性耳下腺炎、風疹およびポリオに対して免疫化されている。したがってこれらの病原体上のエピトープに対する抗体は、免疫化されたヒトにより産生され得る。望ましい抗原性ドメインは、これらの病因性作用物質のうちの１つに見出されるエピトープを有する。
【００１８】
いくつかの実施形態は、被験体に投与された抗体と相互作用する抗原性ドメインを有する。例えばリガンド／受容体特異性変換体の抗原性ドメインと相互作用する抗体は、リガンド／受容体特異性変換体と同時投与され得る。さらに、リガンド／受容体特異性変換体と相互作用する抗体は、被験体中に通常は存在し得ないが、被験体は生物学的物質（例えば血清、血液または組織）の導入により抗体を獲得し得る。例えば輸血を受ける被験体は多数の抗体を獲得し、そのうちの抗体のいくつかはリガンド／受容体特異性変換体の抗原性ドメインと相互作用し得る。
【００１９】
望ましい抗原性ドメインのほとんどは、高力価抗体により認識されるエピトープを含む。「高力価抗体」とは、抗原（例えば抗原性ドメイン上のエピトープ）に対する高親和性を有する抗体を意味する。例えば固相酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）において、高力価抗体は、およそ１：１００〜１：１０００の範囲、好ましくは約１：５００に希釈した血清の適切な希釈溶液中におけるアッセイにおいて、依然として陽性である血清試料中に存在する抗体に相当する。しかしながら、好ましい抗原性ドメインは、単純ヘルペスウイルスｇＧ２タンパク質、Ｂ型肝炎ウイルスｓ抗原（ＨＢｓＡｇ）、Ｂ型肝炎ウイルスｅ抗原（ＨＢｅＡｇ）、Ｂ型肝炎ウイルスｃ抗原（ＨＢｃＡｇ）、ＴＴウイルス、およびポリオウイルスまたはそれらの組合せに見出されるエピトープを有するか、あるいは配列番号４３〜５９からなる群から選択される配列を含む。
【００２０】
本明細書中に記載されたリガンド／受容体特異性変換体は、組換え工学処理および／またはペプチド化学における慣用的技法により作製され得る。いくつかの実施形態では、特異性ドメインおよび抗原性ドメインは別々に作製され、その後一緒に連結される（例えばリンカーを介して、または共通担体分子との会合による）。他の実施形態では、特異性ドメインおよび抗原性ドメインは、同一分子の一部として作製される。一アプローチにより、抗原性ドメインに連結された特異性ドメインを有するリガンド／受容体特異性変換体は、ペプチド合成機により作製される。別のアプローチによれば、抗原性ドメインに融合された特異性ドメインをコードする核酸は発現構築物中にクローニングされ、細胞にトランスフェクトされ、リガンド／受容体特異性変換体は細胞または細胞上清から精製されるか、あるいは単離される。
【００２１】
いったんリガンド／受容体特異性変換体が作製されれば、それはスクリーニングされて、病原体上の受容体および／または抗原性ドメインに特異的な抗体と相互作用する能力を確定する。したがって、本明細書において用いられる「特徴付けアッセイ」という用語は、病原体または癌細胞またはそれらの断片上の受容体および／または抗原性ドメインに特異的な抗体と相互作用するリガンド／受容体特異性変換体の能力の実験または評価を指す。例えば、いくつかの特徴付けアッセイは、病原体またはその断片にある受容体を有する支持体にリガンド／受容体特異性変換体が結合する能力を評価するか、その逆である、該特異性変換体を有する支持体に該受容体が結合する能力を評価する。その他の特徴付けアッセイは、リガンド／受容体特異性変換体の抗原性ドメインに特異的な抗体と結合するリガンド／受容体特異性変換体の能力を評価する。さらに他の特徴付けアッセイは、培養細胞株または疾患動物中の病原体または癌細胞増殖による感染に対するリガンド／受容体特異性変換体能力を評価する。
【００２２】
本明細書中に記載されたリガンド／受容体特異性変換体は、動物、例えばヒトにおける病原性感染ならびに癌の治療および予防のために、製剤中の有効成分として用いられ得る。製剤実施形態は多数の方法で処方することができ、賦形剤、結合剤、乳化剤、担体、およびその他の補助剤を、リガンド／受容体特異性変換体に加えて含有し得る。リガンド／受容体特異性変換体を含む製剤は、いくつかの経路により投与することができ、その例としては局所、経皮、非経口、胃腸、経気管および経肺胞投与が挙げられるが、これらに限定されない。リガンド／受容体特異性変換体は、医療設備および人工器官のためのコーティングとしても用いることができ、疾患の感染または蔓延を防止し得る。製剤用、治療用プロトコール中に提供されるかまたは医療用具に適用されるリガンド／受容体特異性変換体の量は、意図される用途、患者および投与頻度によって変えることができる。
【００２３】
開示された方法のいくつかは、細菌感染、真菌感染、ウイルス感染、および癌の治療および／または予防を必要とする被験体へのリガンド／受容体特異性変換体の投与に関する。一アプローチによれば、細菌感染に罹患している患者は、細菌受容体と相互作用する特異性ドメインを含むリガンド／受容体特異性変換体を提供される。同様に、ウイルス感染に罹患している被験体はウイルス受容体と相互作用する特異性ドメインを含むリガンド／受容体特異性変換体を提供され、癌に罹患している被験体は、癌細胞上の受容体と相互作用する特異性ドメインを含むリガンド／受容体特異性変換体を提供される。いったん受容体／特異性変換体複合体が形成されれば、病原体または癌細胞が、補体結合反応および／またはマクロファージ分解により身体から排除されることが意図される。
【００２４】
疾患に罹患している被験体または疾患に罹る危険のある被験体が同定され、次に病因性作用物質上に存在する受容体と相互作用する治療上有効量のリガンド／受容体特異性変換体を提供するという、疾患（例えば細菌、真菌、およびウイルス感染、ならびに癌）を治療および予防するための方法が提供される。したがって、細菌感染、真菌感染、ウイルス感染、または癌に罹患している被験体は、慣用的臨床および診断評価により同定され、特定の病原体または癌細胞と相互作用する治療上有効量のリガンド／受容体特異性変換体を提供される。本明細書中に記載されたリガンド／受容体特異性変換体は、疾患の危険のあるすべての動物に予防目的で投与され得るが、危険性の高い個体（例えば幼児、高齢者、および病原体と密接に接触するようになる者）だけにリガンド／受容体特異性変換体を投与するのが望ましい。上記のように、危険性の高い個体は、現在利用可能な臨床的および診断的技法により同定される。
【００２５】
以下のセクションでは、細菌、寄生生物、真菌、糸状菌、ウイルス、および癌細胞上の受容体と相互作用する種々の種類のリガンド／受容体特異性変換体についてさらに多くの説明をする。
【００２６】
病原体上の受容体と相互作用するリガンド／受容体特異性変換体
病原体上の受容体と相互作用するリガンド／受容体特異性変換体は、種々の化学構造を有するが、一般的に言えば、それらは、受容体と結合する少なくとも１つの領域（特異性ドメイン）、および病原体または毒素のエピトープに特異的である抗体と相互作用する少なくとも１つの領域（抗原性ドメイン）を有するものとして特徴付けることができる。好ましいリガンド／受容体特異性変換体はペプチドであるが、いくつかの実施形態は、誘導体化または修飾ペプチドまたはペプチド模倣構造を含む。例えば典型的ペプチドベースのリガンド／受容体特異性変換体は、ペプチドに通常は見出されない置換基を有するように、または通常においてもペプチドに見出される置換基であるがが通常でない領域に組入れられた置換基を有するように修飾され得る。このようにして、ペプチドベースのリガンド／受容体特異性変換体は、アセチル化、アシル化、またはアミノ化され、特異性変換体を修飾するためにペプチド上に含入され得る置換基としては、水素、アルキル、アリール、アルケニル、アルキニル、芳香族、エーテル、エステル、非置換または置換アミン、アミド、ハロゲンあるいは非置換または置換スルホニルあるいは５または６員脂肪族または芳香族環が挙げられるが、これらに限定されない。したがって、「リガンド／受容体特異性変換体」という用語は、修飾または非修飾ペプチド構造、ならびにペプチド模倣物およびペプチド模倣化学構造を含む広範な用語である。
【００２７】
ペプチドベースのリガンド／受容体特異性変換体に類似したペプチド模倣物を製造するための多数の方法がある。ペプチドの生物学的産生に用いられる天然アミノ酸はすべて、Ｌ立体配置を有する。合成ペプチドは、慣用的合成方法を用いて、Ｌ−アミノ酸、Ｄ−アミノ酸、または２つの異なる立体配置のアミノ酸の種々の組合せを利用して調製され得る。ペプチドの立体配置および望ましい特徴を模倣しつつ、望ましくない特徴、例えば柔軟性（配座の損失）および結合破壊は有さない合成化合物が、「ペプチド模倣物」として既知である（例えばＳｐａｔｏｌａ， Ａ．Ｆ． Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ． Ｐｅｐｔｉｄｅｓ， ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ（Ｗｅｉｓｔｅｉｎ， Ｂ， Ｅｄ．）， Ｖｏｌ． ７， ｐｐ．２６７−３５７， Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８３）（本文献にははエンケファリン類似体中のアミド置換としてメチレンチオ［ＣＨ２Ｓ］生物学的等価体を使用することが記載されている）；およびＳｚｅｌｋｅ ｅｔ ａｌ．， Ｉｎ ｐｅｐｔｉｄｅｓ： Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ， Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｅｉｇｈｔｈ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ， （Ｈｒｕｂｙ ａｎｄ Ｒｉｃｈ， Ｅｄｓ．）； ｐｐ．５７９−５８２， Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．， Ｒｏｃｋｆｏｒｄ， ＩＩＩ． （１９８３）（本文献には、アンギオテンシノーゲン由来の６〜１３オクタペプチド中のＬｅｕ−Ｖａｌアミド結合でのメチレンアミノ［ＣＨ２ＮＨ］およびヒドロキシエチレン［ＣＨＯＨＣＨ２］生物学的等価体の両方を有するレニン阻害剤が記載されている）参照）。
【００２８】
概して、リガンド／受容体特異性変換体に類似ているペプチド模倣物の設計および合成は、リガンド／受容体特異性変換体の配列、および所望のリガンド／受容体特異性変換体（例えば最もシミュレート化されていると思われるペプチド）の立体配置データ（例えば幾何学的データ、例えば結合長および結合角度）を用いて開始され、さらにこのようなデータを用いてペプチド模倣物として設計されるべき幾何学を決定する事を含む。このステップを実施するための多数の方法および技法が当業界で既知であり、それらの任意の方法および技法を用い得る（例えばＦａｒｍｅｒ， Ｐ．Ｓ．， Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ， （Ａｒｉｅｎｓ， Ｅ．Ｊ． ｅｄ．） Ｖｏｌ．１０， ｐｐ．１１９−１４３ （Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｌｏｎｄｏｎ， Ｔｏｒｏｎｔｏ， Ｓｙｄｎｅｙ ａｎｄ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ）（１９８０）； Ｆａｒｍｅｒ， ｅｔ ａｌ．， ｉｎ ＴＩＰＳ， ９／８２， ｐｐ．３６２−３６５； Ｖｅｒｂｅｒ ｅｔ ａｌ．， ｉｎ ＴＩＮＳ， ９／８５， ｐｐ．３９２−３９６； Ｋａｌｔｅｎｂｒｏｎｎ ｅｔ ａｌ．， ｉｎ Ｊ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． ３３：８３８−８４５ （１９９０）；およびＳｐａｔｏｌａ， Ａ．Ｆ．， ｉｎ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ． Ｐｅｐｔｉｄｅｓ， ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ， Ｖｏｌ． ７， ｐｐ． ２６７−３５７， Ｃｈａｐｔｅｒ ５ 、「Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｂａｃｋｂｏｎｅ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ： Ａ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−Ａｃｔｉｖｉｔｙ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ Ａｍｉｄｅ Ｂｏｎｄ Ｓｕｒｒｏｇａｔｅｓ． Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｎｓｔｒａｉｎｔｓ， ａｎｄ Ｒｅｌａｔｉｏｎｓ」（Ｂ． Ｗｅｉｓｔｅｎ， ｅｄ．； Ｍａｒｃｅｌｌ Ｄｅｋｋｅｒ： Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ｐｕｂ．）（１９８３）； Ｋｅｍｐ， Ｄ．Ｓ．， 「Ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃｓ ａｎｄ ｔｈｅ Ｔｅｍｐｌａｔｅ Ａｐｐｒｏａｃｈ ｔｏ Ｎｕｃｌｅａｔｉｏｎ ｏｆ ∃−ｓｈｅｅｔｓ ａｎｄ ∀−ｈｅｌｉｃｅｓ ｉｎ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ」、Ｔｉｂｅｃｈ， Ｖｏｌ． ８， ｐｐ．２４９−２５５（１９９０）参照）。さらなる教示は、米国特許第５，２８８，７０７号、第５，５５２，５３４号、第５，８１１，５１５号、第５，８１７，６２６号、第５，８１７，８７９号、第５，８２１，２３１号および第５，８７４，５２９号に見出され得る。いったんペプチド模倣物が設計されれば、それはペプチド化学および／または有機化学における慣用的技法を用いて製造され得る。
【００２９】
いくつかの実施形態は、複数の特異性ドメインおよび／または複数の抗原性ドメインを含む。複数の特異性ドメインおよび／または抗原性ドメインを有するリガンド／受容体特異性変換体の１つの型は、同一分子上にタンデムで出現する多重特異性ドメインおよび／または抗原性ドメインを有するために、「多重化リガンド／受容体特異性変換体」と呼ばれる。例えば多重化特異性ドメインは、病原体上の一の型の受容体と相互作用する２つまたはそれ以上のリガンド、病原体上の異なる型の受容体と相互作用する２つまたはそれ以上のリガンド、ならびに異なる病原体上の異なる型の受容体と相互作用する２つまたはそれ以上のリガンドを有し得る。
【００３０】
同様に、多重化抗原性ドメインは、病原体の同一エピトープまたは病原体の異なるエピトープ（これらも多重化され得る）の多重体を有するよう構築され得る。すなわち、いくつかの多重化抗原性ドメインは、同一エピトープが反復されるため、多価である。これに対比して、いくつかの多重化抗原性ドメインは、タンデムで同一分子上に存在する複数の、異なるエピトープを有する。この点で、これらの抗原性ドメインは多重化されるが、多価ではない。さらにいくつかの多重化抗原性ドメインは異なるエピトープを有するよう構築されるが、各型のエピトープが反復されるため、異なるエピトープはそれ自体が多価である。
【００３１】
いくつかのリガンド／受容体特異性変換体は、特異性ドメインおよび抗原性ドメインに加えて、その他の要素、例えば精製を容易にする配列、より高い柔軟性を提供し、かつ立体障害を低減するリンカー、ならびにリガンド／受容体特異性変換体により高い安定性を提供する配列（例えばプロテアーゼ分解に対する耐性）または分解を促進する（例えばプロテアーゼ認識部位）配列を含む。例えば、リガンド／受容体特異性変換体は、抗体カラム、グルタチオンカラム、および金属カラム上での精製を促すペプチドおよび／または切断可能配列タグの細胞質輸出を促進する切断可能シグナル配列を含み得る。
【００３２】
リガンド／受容体特異性変換体は、分子の柔軟性を高めて立体障害を低減する、またはリガンド／受容体特異性変換体を支持体またはその他の分子に付着させる要素を含み得る。これらの要素は、総じて「リンカー」と呼ばれる。例えば、リガンド／受容体特異性変換体とともに組み込まれ得るリンカーの一型は、アビジンまたはストレプトアビジン（またはそれらのリガンド−ビオチン）である。ビオチン−アビジン／ストレプトアビジン結合により、多重リガンド／受容体特異性変換体は一緒に連結され得る（例えば支持体（例えば樹脂）を介して、または直接的に）か、あるいは個々の特異性ドメインおよび抗原性ドメインが連結され得る。リガンド／受容体特異性変換体中に含まれ得るリンカーの別の例は、８ファージ上に見出される配列を有するために、「８リンカー」と呼ばれる。好ましい８配列は、ファージの柔軟性腕に対応するものである。これらの配列は、リガンド／受容体特異性変換体中に（例えば特異性ドメインおよび抗原性ドメインの間に、あるいは特異性ドメインの多重体の間および／または抗原性ドメインの多重体の間に）含入され、より高い柔軟性を提供し、かつ立体障害を低減しうる。
【００３３】
さらに、リガンド／受容体特異性変換体は、プロテアーゼ分解に対する耐性を付与する配列、またはプロテアーゼ分解を促進する配列を含み得る。例えばリガンド／受容体特異性変換体中に多重システインを組み入れることにより、プロテアーゼ分解に対するより強い耐性を付与することができる。これらの実施形態のリガンド／受容体特異性変換体は、長期間にわたって身体中に保持されると予測され、これはいくつかの治療上の用途のために有益であり得る。対照的に、リガンド／受容体特異性変換体は、身体から迅速に除去されるために、分解速度を速める配列も含み得る。セリン、システイン、およびアスパラギン酸プロテアーゼに関する認識部位として機能する多数の配列が既知であり、リガンド／受容体特異性変換体中に組み込まれうる。
【００３４】
以下のセクションでは、特異性ドメインをより詳細に説明する。
【００３５】
特異性ドメイン
膨大な数のリガンドが細菌、寄生生物、真菌、糸状菌、ウイルス、および癌細胞上の受容体と相互作用することが既知であるため、リガンド／受容体特異性変換体に用いられ得る特異性ドメインの型は多様である。例えば、多数の型の細菌、寄生生物、真菌、糸状菌、ウイルス、および癌細胞が、細胞外マトリックスタンパク質と相互作用する。したがって所望の特異性ドメインは、細胞外マトリックスタンパク質中に存在するペプチド配列を有する少なくとも１つのリガンドを含む。すなわち、特異性ドメインは、例えばフィブリノーゲン、コラーゲン、ビトロネクチン、ラミニン、プラスミノーゲン、トロンボスポンジン、およびフィブロネクチン中に見出されるペプチド配列を有するリガンドを有し得る。
【００３６】
いくつかの受容体と相互作用する細胞外マトリックスタンパク質の領域を、研究者はマッピングした（例えばＭｃＤｅｖｖｉｔ ｅｔ ａｌ．， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， ２４７： ４１６−４２４（１９９７）； Ｆｌｏｃｋ， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｄ． Ｔｏｄａｙ， ５：５３２（１９９９）；およびＰｅｉ ｅｔ ａｌ．， Ｉｎｆｅｃｔ． Ａｎｄ Ｉｍｍｕｎ． ６７：４５２５（１９９９）参照）。いくつかの受容体は細胞外マトリックスタンパク質の同一領域に結合し、いくつかは重複結合ドメインを有し、あるものはまったく異なる領域と結合する。好ましくは、特異性ドメインを構成するリガンドは、細胞外マトリックスタンパク質との接着に関与すると同定されたアミノ酸配列を有する。しかしながら、病原体上の任意の受容体に対する既知のリガンドの断片を無作為に用いて、リガンド／受容体特異性変換体を作製することができ、かつこれらの候補リガンド／受容体特異性変換体を、下記の特徴付けアッセイにおいてスクリーニングして、病原体上の受容体と相互作用する分子を同定することもできると理解されるべきである。
【００３７】
いくつかの特異性ドメインは、細菌接着受容体と相互作用するリガンドを有し、受容体の例としては、細胞外フィブリノーゲン結合タンパク質（Ｅｆｂ）、コラーゲン結合タンパク質、ビトロネクチン結合タンパク質、ラミニン結合タンパク質、プラスミノーゲン結合タンパク質、トロンボスポンジン結合タンパク質、凝集因子Ａ（ＣｌｆＡ）、凝集因子Ｂ（ＣｌｆＢ）、フィブロネクチン結合タンパク質、コアグラーゼ、および細胞外接着タンパク質が挙げられるが、これらに限定されない。フィブリノーゲンのγ鎖のＣ末端部分に対応するアミノ酸配列を有するリガンドは、フィブリノーゲンとＣｌｆＡ、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）接着受容体との結合を拮抗阻害することが示されている。（ＭｃＤｅｖｖｉｔ ｅｔ ａｌ．， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， ２４７： ４１６−４２４（１９９７））。さらに、ブドウ球菌属生物は、より多くの接着受容体、例えばフィブリノーゲンのα鎖と結合するＥｆｂ、フィブリノーゲンの∀および∃鎖の両方と相互作用するＣｌｆＢ、ならびにフィブリノーゲンの∃鎖と結合するＦｂｅを産生する。（Ｐｅｉ ｅｔ ａｌ．， Ｉｎｆｅｃｔ． ａｎｄ Ｉｍｍｕｎ． ６７：４５２５（１９９９））。したがって好ましい特異性ドメインは、細菌接着受容体と結合し得る分子（例えばフィブリノーゲン）中に存在する配列の少なくとも３つのアミノ酸を含む。
【００３８】
特異性ドメインは、ウイルス受容体と相互作用するリガンドも含み得る。いくつかのウイルス受容体およびそれに対応するリガンドは既知であり、これらのリガンドまたはそれらの断片は、リガンド／受容体特異性変換体中に組入れられ得る。例えばＴｏｎｇ等は、アヒルＢ型肝炎ウイルスエンベロープタンパク質のｐｒｅ−Ｓドメインと相互作用する１７０ｋｄ細胞表面糖タンパク質であるヘパドナウイルス受容体を同定（米国特許第５，９２９，２２０号）し、Ｍａｄｄｏｎ等は、Ｔ細胞表面タンパク質ＣＤ４（またはＴ４と呼ばれる可溶性形態）がＨＩＶのｇｐ１２０と相互作用することを確定した（米国特許第６，０９３，５３９号）。したがって、ウイルス受容体と相互作用する特異性ドメインは、アヒルＢ型肝炎ウイルスエンベロープタンパク質のｐｒｅ−Ｓドメインの領域（例えばアミノ酸残基８０〜１０２または８０〜１０４）、あるいはＨＩＶのｇｐ１２０と相互作用するＴ細胞表面タンパク質ＣＤ４（またはＴ４と呼ばれる可溶性形態）の領域（例えばＣＤ４／Ｔ４またはその断片の細胞外ドメイン）を含み得る。ウイルス受容体に対するさらに多くのリガンドが存在し、これらの分子またはその断片は特異性ドメインとして用いられ得る。
【００３９】
特異性ドメインは、癌細胞上に存在する受容体と相互作用するリガンドも含み得る。癌原遺伝子ＨＥＲ−２／ｎｅｕ（Ｃ−ｅｒｂＢ２）は、チロシンキナーゼファミリーの表面成長因子受容体ｐ１８５ＨＥＲ２をコードする。乳癌患者の２０〜３０％は、遺伝子増幅により、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ（Ｃ−ｅｒｂＢ２）をコードする遺伝子を過剰発現する。したがって、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ（Ｃ−ｅｒｂＢ２）に対するリガンドをコードする特異性ドメインを含むリガンド／受容体特異性変換体は、望ましい実施形態である。多数の型の癌細胞もインテグリン受容体を過剰発現するかまたは分化発現する。多数の好ましい実施形態は、インテグリン受容体と相互作用する特異性ドメインを含む。インテグリンは主に細胞外マトリックスタンパク質と相互作用するが、これらの受容体は他のリガンド、例えばインベーシン、ＲＧＤ含有ペプチド（すなわちアルギニン−グリシン−アスパラギン酸）および化学物質と相互作用することが既知である（例えば米国特許第６，０９０，９４４号および第６，０９０，３８８号、ならびにＢｒｅｔｔ ｅｔ ａｌ．， Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ， ２３：１６０８（１９９３）参照）。インテグリン受容体に対するリガンドとしては、ビトロネクチン受容体、ラミニン受容体、フィブロネクチン受容体、コラーゲン受容体、フィブリノーゲン受容体、∀４∃１受容体、∀６∃１受容体、∀３∃１受容体、∀５∃１受容体および∀Ｖ∃１受容体と相互作用する分子が挙げられるが、これらに限定されない。表１にも、いくつかの好ましい特異性ドメインを列挙した。上記特異性ドメインは、例示的目的のためにのみ提供されるものであって、本明細書中に記載された実施形態とともに用いられ得る特異性ドメインの範囲をいかなる点においても限定するよう解釈されるべきでない。
【００４０】
次のセクションでは、抗原性ドメインをより詳細に説明する。
【００４１】
【表１】
2004509621.tif 000002
【００４２】
抗原性ドメイン
病原体または毒素は多数の異なるエピトープを提示し得るため、リガンド／受容体特異性変換体に用いられ得る抗原性ドメインの多様性も非常に広い。すなわち、リガンド／受容体特異性変換体中に組入れられ得る抗原性ドメインとしては、細菌、真菌、植物、糸状菌、ウイルス、癌細胞、および毒素のエピトープが挙げられる。所望の抗原性ドメインは、天然獲得免疫または予防接種により、被験体中にすでに存在する病原体のエピトープを含む。例えば小児期疾患を引き起こす病原体のエピトープは、抗原性ドメインとして用いられ得る。
【００４３】
いくつかの実施形態は、別個に被験体に投与される抗体と相互作用する抗原性ドメインを有する。例えば特異性変換体の抗原性ドメインと相互作用する抗体は、特異性変換体と同時投与され得る。さらに、リガンド／受容体特異性変換体と相互作用する抗体は、被験体中には通常は存在し得ないが、被験体は生物学的物質（例えば血清、血液、または組織）の導入により抗体を獲得し得る。例えば輸血を受ける被験体は多数の抗体を獲得し、そのうちのいくつかはリガンド／受容体特異性変換体の抗原性ドメインと相互作用し得る。リガンド／受容体特異性変換体に用いるためのいくつかの好ましい抗原性ドメインは、ウイルスエピトープ、例えば単純ヘルペスウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、ＴＴウイルス、およびポリオウイルス（これらに限定されない）を含む。
【００４４】
いくつかの実施形態では、抗原性ドメインが、「高力価抗体」により認識される病原体または毒素のエピトープを含むのも好ましい。病原体または毒素のエピトープが高力価抗体により認識されるか否かを確定するためのアプローチは以下で提示する。リガンド／受容体特異性変換体の抗原性ドメイン中に含入され得る病原体のエピトープとしては、スウェーデン特許第９９０１６０１−６号、米国特許第５，８６９，２３２号、Ｍｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２８：７１９−７２６（１９９１）、およびＪ． Ｍｅｄ． Ｖｉｒｏｌ． ３３：２４８−２５２（１９９１）に開示されたペプチド配列上のエピトープが挙げられる。表２は、いくつかの好ましい抗原性ドメインのアミノ酸配列を提示する。
【００４５】
表２よりも後のセクションでは、リガンド／受容体特異性変換体の調製をより詳細に説明する。
【００４６】
【表２】
2004509621.tif 000003
【００４７】
細菌、寄生生物、真菌、糸状菌、ウイルス、および癌細胞上の受容体と相互作用するリガンド／受容体特異性変換体の製造方法
いくつかの実施形態では、特異性ドメインおよび抗原性ドメインは別個に製造され、その後一緒に連結され（例えばリンカーにより、または共通担体分子との会合により）、また他の実施形態では、特異性ドメインおよび抗原性ドメインは同一分子の一部として製造される。例えば表１に列挙された特異性ドメインのいずれかが、表２の抗原性ドメインのいずれかと連結される。特異性および抗原性ドメインは別個に製造され、リンカーまたは担体分子により連結されて一緒にされ得る（例えばビオチニル化特異性ドメイン、ストレプトアビジン、およびビオチニル化抗原性ドメインを含む複合体）が、リガンド／受容体特異性変換体は融合タンパク質として作製されるのが好ましい。したがって、好ましい実施形態は、表２中のいずれかの抗原性ドメインに連結された表１中のいずれかの特異性ドメインを有する融合タンパク質を含む。
【００４８】
リガンド／受容体特異性変換体は、タンパク質工学処理、タンパク質化学、有機化学、および分子生物学の慣用的方法にしたがって作製され得る。さらに、いくつかの企業は、注文作製ペプチドを製造するが、リガンド／受容体特異性変換体は、このような会社に所望のリガンド／受容体特異性変換体の配列を提供し、特定の仕様書にしたがって作用物質を製造するそれらのサービスを用いることにより得てもよい（例えばＢａｃｈｅｍ ＡＧ， Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）。好ましくはリガンド／受容体特異性変換体は、当業界で既知の技法、例えばＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． ８５：２１４９（１９６４）， Ｈｏｕｇｈｔｅｎ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８２：５１：３２（１９８５）， Ｓｔｅｗａｒｔ ａｎｄ Ｙｏｕｎｇ（Ｓｏｌｉｄ ｐｈａｓｅ ｐｅｐｔｉｄｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ， Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍ Ｃｏ．， Ｒｏｃｋｆｏｒｄ， ＩＬ（１９８４）およびＣｒｅｉｇｈｔｏｎ， １９８３， Ｐｒｏｔｅｉｎｓ： Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ， Ｗ．Ｈ． Ｆｒｅｅｍａｎ ＆ Ｃｏ．， Ｎ．Ｙ．により記述された技法を用いて、化学合成方法（例えば固相ペプチド合成）により調製される。
【００４９】
一アプローチによれば、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ４３０Ａペプチド合成機（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ， Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ， ＣＡ）を用いて、固相ペプチド合成が実施される。各合成は、ｐ−メチルベンジルヒドリルアミン固相支持体樹脂（Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ， Ｌｏｕｉｓｖｉｌｌｅ， ＫＹ）を使用し、酸加水分解によりペプチドが固体支持体から切り離されると、カルボキシル末端アミドを産生する。使用前に、カルボキシル末端アミドは除去することができ、高速液体クロマトグラフィー（例えばＰｅｐＳ−１５　Ｃ１８カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ， Ｕｐｐｓａｌａ， Ｓｗｅｄｅｎ）を用いた逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ））によりリガンド／受容体特異性変換体が精製され、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ４７３Ａペプチド合成機でシーケンシングされる。代替的合成アプローチは、自動ペプチド合成機（Ｓｙｒｏ， Ｍｕｌｔｉｓｙｎｔｅｃｈ， Ｔｕｂｉｎｇｅｎ， Ｇｅｒｍａｎｙ）および９−フルオレニルメトキシカルボニル（ｆｍｏｃ）保護化アミノ酸（Ｍｉｌｌｉｇｅｎ， Ｂｅｄｆｏｒｄ， ＭＡ）を用いる。
【００５０】
リガンド／受容体特異性変換体は化学的に合成され得るが、一方、当業界で既知の技法を用いた組換えＤＮＡ技術によりこれらのポリペプチドを産生する方が効率的であり得る。このような方法を用いて、リガンド／受容体特異性変換体をコードするヌクレオチド配列ならびに適切な転写および翻訳制御シグナルを含む発現ベクターを構築し得る。これらの方法としては、例えばｉｎ　ｖｉｔｒｏ組換えＤＮＡ技法、合成技法、およびｉｎ　ｖｉｖｏ遺伝子組換えが挙げられる。あるいは、リガンド／受容体特異性変換体をコードし得るＲＮＡは、例えば合成機を用いて化学的に合成され得る。例えばＯｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ， １９８４， Ｇａｉｔ， Ｍ． Ｊ． ｅｄ．， ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ， Ｏｘｆｏｒｄに記載された技法を参照されたい。
【００５１】
種々の宿主発現ベクター系が、リガンド／受容体特異性変換体を発現するために利用され得る。リガンド／受容体特異性変換体は、可溶性分子である場合には培養から、すなわちペプチドまたはポリペプチドが分泌されない場合には宿主細胞から、およびペプチドまたはポリペプチドが細胞から分泌される場合には培地から得られる。しかしながら、発現系は、膜に結合したリガンド／受容体特異性変換体を発現するように工学処理された宿主細胞も含む。このような発現系からのリガンド／受容体特異性変換体の精製または濃縮は、適切な洗剤および脂質ミセルならびに当業者に既知の方法を用いて成し遂げられ得る。
【００５２】
用いられ得る発現系としては、微生物、例えばリガンド／受容体特異性変換体をコードするヌクレオチド配列を含む組換えバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡまたはコスミドＤＮＡ発現ベクターにより形質転換された細菌（例えば大腸菌または枯草菌）など；リガンド／受容体特異性変換体をコードするヌクレオチド配列を含む組換え酵母発現ベクターにより形質転換された酵母（例えばサッカロミセス属、ピキア属）；リガンド／受容体特異性変換体をコードする核酸を含む組換えウイルス発現ベクター（バキュロウイルス属）に感染した昆虫細胞系；あるいはリガンド／受容体特異性変換体をコードする核酸を含有する組換え発現構築物を保有する哺乳類細胞系（例えばＣＯＳ、ＣＨＯ、ＢＨＫ、２９３、３Ｔ３）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５３】
細菌系では、多数の発現ベクターは、リガンド／受容体特異性変換体に関して意図された用途に応じて適宜に選択され得る。例えば、多くの量が必要とされる（例えばリガンド／受容体特異性変換体の製剤組成物の生成のために）場合、容易に精製され得る高レベルの融合タンパク質産物の発現を指図するベクターが望ましい。このようなベクターとしては、大腸菌発現ベクターｐＵＲ２７８（Ｒｕｔｈｅｒ ｅｔ ａｌ．， ＥＭＢＯ Ｊ．， ２：１７９１（１９８３））（この場合、融合タンパク質が産生されるように、リガンド／受容体特異性変換体コード配列は、ｌａｃＺコード領域を有する枠内でベクターに別々に連結され得る）；ｐＩＮベクター（Ｉｎｏｕｙｅ ＆ Ｉｎｏｕｙｅ， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， １３：３１０１−３１０９（１９８５）； Ｖａｎ Ｈｅｅｋｅ ＆ Ｓｃｈｕｓｔｅｒ， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２６４：５５０３−５５０９（１９８９））等が挙げられるが、これらに限定されない。ｐＧＥＸベクターは、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）とともに、融合タンパク質のような外来ポリペプチドを発現するためにも用いられ得る。概して、このような融合タンパク質は可溶性であり、グルタチオン−アガロースビーズへの吸着とその後の遊離グルタチオンの存在下での溶離により、溶解細胞から精製され得る。クローニングされた標的遺伝子産物がＧＳＴ部分から放出されるように、ＰＧＥＸベクターは、トロンビンまたはＸａ因子プロテアーゼ切断部位を含むよう設計される。
【００５４】
昆虫系では、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ核多角体病ウイルス（ＡｃＮＰＶ）が外来遺伝子を発現するためのベクターとして用いられる。ウイルスはＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞中で成長する。リガンド／受容体特異性変換体遺伝子コード配列は、ウイルスの非必須領域（例えばポリヘドリン遺伝子）中に別々にクローニングされ、ＡｃＮＰＶプロモーター（例えばポリヘドリンプロモーター）の制御下に置かれる。リガンド／受容体特異性変換体遺伝子コード配列を適切に挿入すると、ポリヘドリン遺伝子の不活性化および非閉塞性組換えウイルス（すなわちポリヘドリン遺伝子によりコードされるタンパク質様被膜を欠くウイルス）の産生を生じる。これらの組換えウイルスは次に、挿入遺伝子を発現するためのＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞を感染させるために用いられる。（例えばＳｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ４６：５８４（１９８３）および米国特許第４，２１５，０５１号（Ｓｍｉｔｈ）参照）。
【００５５】
哺乳類宿主細胞では、多数のウイルスベースの発現系が利用され得る。アデノウイルスが発現ベクターとして用いられる場合、リガンド／受容体特異性変換体をコードする核酸配列は、アデノウイルス転写／翻訳制御複合体、例えば後期プロモーターおよびトリパルタイトリーダー配列に連結され得る。このキメラ遺伝子は次に、ｉｎ　ｖｉｔｒｏまたはｉｎ　ｖｉｖｏ組換えによりアデノウイルスゲノム中に挿入され得る。ウイルスゲノムの非必須領域（例えば領域Ｅ１またはＥ３）中に挿入すると、感染宿主中で生育可能であり、かつリガンド／受容体特異性変換体遺伝子産物を発現し得る組換えウイルスを得ることができる。（例えばＬｏｇａｎ ＆ Ｓｈｅｎｋ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８１：３６５５−３６５９（１９８４）参照）。特定開始シグナルも、挿入リガンド／受容体特異性変換体ヌクレオチド配列を効率的に翻訳するために必要とされ得る（例えばＡＴＧ開始コドンおよび隣接配列）。ほとんどの場合、おそらくはＡＴＧ開始コドンを含めた外因性翻訳制御シグナルが提供されるべきである。さらに、開始コドンは、全挿入物を確実に翻訳するために、所望のコード配列のリーディングフレームと同調して存在する必要がある。これらの外因性翻訳制御シグナルおよび開始コドンは、天然および合成の両方の、種々の起点を有し得る。発現効率は、適切な転写エンハンサー要素、転写ターミネーター等を組み込むことによっても高めることができる。（Ｂｉｔｔｎｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．， １５３：５１６−５４４（１９８７）参照）。
【００５６】
さらに、挿入配列の発現を調整する、あるいは所望の特定方式で遺伝子産物を修飾し、プロセシングする宿主細胞株が選択され得る。タンパク質産物の、このような修飾（例えばグリコシル化）およびプロセシング（例えば切断）は、いくつかの実施形態において重要であり得る。異なる宿主細胞は、タンパク質および遺伝子産物の翻訳後のプロセシングおよび修飾に関する特徴的および特異的メカニズムを有する。適切な細胞株または宿主系を選択することにより、発現された外来タンパク質を確実に、的確な修飾およびプロセシングをし得る。この目的のために、遺伝子産物の一次転写体の適正なプロセシング、グリコシル化、およびリン酸化のための細胞機構を保有する真核生物宿主細胞が用いられ得る。このような哺乳類宿主細胞としては、ＣＨＯ、ＶＥＲＯ、ＢＨＫ、ＨｅＬａ、ＣＯＳ、ＭＤＣＫ、２９３、３Ｔ３、およびＷＩ３８が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５７】
組換えタンパク質を長期間、高収率に産生するためには、安定発現させることが好ましい。例えば、工学処理により上記リガンド／受容体特異性変換体を安定的に発現する細胞株が得られる。複製のウイルス起点を含む発現ベクターを用いるというよりむしろ、宿主細胞は適切な発現制御要素（例えばプロモーター、エンハンサー配列、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位等）および選択可能マーカーにより制御されるＤＮＡを用いて形質転換され得る。外来ＤＮＡの導入後、工学処理細胞は濃縮培地中で１〜２日間成長させることができ、その後、選択培地に切り替えられる。組換えプラスミド中の選択可能マーカーは、選択に対する耐性を付与し、かつ細胞がそれらの染色体中にプラスミドを安定的に組み込み、細胞が成長して細胞増殖巣を形成し、これは次に細胞株中でクローニングされ、拡張される。この方法は、リガンド／受容体特異性変換体を発現する細胞株を工学処理するために適宜に用いられる。
【００５８】
多数の選択系が用いられ、例としては単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（Ｗｉｇｌｅｒ， ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ １１：２２３（１９７７））、ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｓｚｙｂａｌｓｋａ ＆ Ｓｚｙｂａｌｓｋｉ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ４８：２０２６（１９６２））、およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｌｏｗｙ， ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ ２２：８１７（１９８０））遺伝子が挙げられるが、これらに限定されない。これらはそれぞれ、ｔｋ．ｓｕｐ．−、ｈｇｐｒｔ．ｓｕｐ．−またはａｐｒｔ．ｓｕｐ．−細胞中で用いられ得る。さらに、抗代謝産物耐性が以下の遺伝子に関する選択の基礎として用いられ得る：メトトレキセートに対する耐性を付与するｄｈｆｒ（Ｗｉｇｌｅｒ， ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７７：３５６７（１９８０）； Ｏ’Ｈａｒｅ， ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７８： １５２７ （１９８１））；ミコフェノール酸に対する耐性を付与するｇｐｔ（Ｍｕｌｌｉｇａｎ ＆ Ｂｅｒｇ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７８：２０７２（１９８１））；アミノグリコシドＧ−４１８に対する耐性を付与するｎｅｏ（Ｃｏｌｂｅｒｒｅ−Ｇａｒａｐｉｎ， ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １５０：１（１９８１））；およびハイグロマイシンに対する耐性を付与するｈｙｇｒｏ（Ｓａｎｔｅｒｒｅ， ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅ ３０：１４７（１９８４））。
【００５９】
以下のセクションでは、リガンド／受容体特異性変換体の特徴付けアッセイをより詳細に説明する。
【００６０】
リガンド／受容体特異性変換体の特徴付けアッセイ
好ましくは、リガンド／受容体特異性変換体は、受容体と相互作用する能力、および／または被験体中に存在し得る抗体と相互作用する能力に関して分析される。「特徴付けアッセイ」という用語は、リガンド／受容体特異性変換体に関してなされるアッセイ、実験または分析を指し、これは受容体（例えば細菌、ウイルス、糸状菌または真菌中に存在する表面受容体）または抗体（例えば病原体上に見出されるエピトープを認識する抗体）と相互作用する能力、あるいは病原体の増殖に対するリガンド／受容体特異性変換体の能力を評価する。「特徴付けアッセイ」という用語に含まれるのは、結合試験（例えば酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）、酵素結合イムノアッセイ（ＥＬＩＳＡ）、競合的結合アッセイ、コンピューター生成結合アッセイ、支持体結合試験、ならびに１および２ハイブリッド系）、および感染性試験（例えばウイルス感染、増殖および宿主細胞への接着の低減）である。
【００６１】
好ましい結合アッセイは、多重作用物質を用いる。多重作用物質の一形態は、支持体上にあるリガンド／受容体特異性変換体またはそれらの断片を含む組成物に関する。別の形態の多重作用物質は、支持体上にある受容体、または支持体にある抗体であってリガンド／受容体特異性変換体の抗原性ドメインに特異的な抗体を含む組成物を包含する。「支持体」は、このような分子を連結または固定するために用いられる担体、タンパク質、樹脂、細胞膜または任意の高分子構造であり得る。固体支持体としては、反応トレーのウエルの壁、試験管、ポリスチレンビーズ、磁気ビーズ、ニトロセルロースストリップ、膜、微小粒子（例えばラテックス粒子）、動物細胞、デュラサイト（登録商標）、人工細胞等が挙げられるが、これらに限定されない。リガンド／受容体特異性変換体は、例えば支持体上のヒドロキシ、カルボキシまたはアミノ基および反応基を介した共有結合により、無機支持体、例えば酸化ケイ素物質（例えばシリカゲル、ゼオライト、珪藻土またはアミノ化ガラス）とも連結され得る。
【００６２】
いくつかの多重作用物質では、高分子支持体は、疎水性非共有的相互作用によりリガンド／受容体特異性変換体の一部、受容体またはリガンドと相互作用する疎水性表面を有する。いくつかの場合には、支持体の疎水性表面は、ポリマー（例えばプラスチック）、または疎水性基が連結されていた任意のその他のポリマー（例えばポリスチレン、ポリエチレンまたはポリビニル）である。さらに、リガンド／受容体特異性変換体、受容体、またはリガンド／受容体特異性変換体の抗原性ドメインに特異的な抗体は、支持体、例えばタンパク質およびオリゴ／多糖（例えばセルロース、デンプン、グリコーゲン、キトサンまたはアミノ化セファロース）と共有的に結合され得る。これらの後者の多重作用物質では、分子上の反応基、例えばヒドロキシ基またはアミノ基は、担体上の反応基と連結し、共有結合をさせるために用いられる。付加的多重作用物質は、リガンド／受容体特異性変換体、受容体、またはリガンド／受容体特異性変換体の抗原性ドメインに特異的な抗体と結合するように化学的に活性化されているその他の反応基を有する支持体を含む。例えば臭化シアン活性化マトリックス、エポキシ活性化マトリックス、チオおよびチオプロピルゲル、ニトロフェニルクロロホルメートおよびＮ−ヒドロキシスクシンイミドクロロホルメート結合、あるいはオキシランアクリル支持体が用いられ得る（Ｓｉｇｍａ）。さらに、いくつかの実施形態では、リポソームまたは脂質二重層（天然または合成）を支持体として用いることが意図され、リガンド／受容体特異性変換体、受容体、またはリガンド／受容体特異性変換体の抗原性ドメインに特異的な抗体は膜表面に結合され得るか、あるいはリポソーム工学処理における技法により、膜中に組入れられ得る。一アプローチによれば、リポソーム多重支持体は、表面上に曝露されるリガンド／受容体特異性変換体、受容体、またはリガンド／受容体特異性変換体の抗原性ドメインに特異的な抗体を含む。
【００６３】
より柔軟性を高め、支持体により発生する任意の立体障害を克服するために、リガンド／受容体特異性変換体、受容体、またはリガンド／受容体特異性変換体の抗原性ドメインに特異的な抗体、および支持体との間に適切な長さのリンカー（例えば、λファージの柔軟性領域に類似するよう工学処理された「λリンカー」）を挿入することも意図される。最適結合を可能にするリンカーの適切な長さの決定は、本明細書中に詳述された特徴付けアッセイにおいて、種々のリンカーとの結合分子をスクリーニングすることにより見出され得る。
【００６４】
リガンド／受容体特異性変換体を特徴づけするためのいくつかのアプローチは、上記多重体を用いる。例えば、支持体に結合したリガンド／受容体特異性変換体は、「遊離した」接着受容体と接触され、会合が直接的（例えば標識接着受容体を用いることにより）または間接的に（例えば接着受容体に対する標識リガンドを用いることにより）確定され得る。したがって、受容体と支持体結合候補リガンド／受容体特異性変換体との会合によって、候補リガンド／受容体特異性変換体が真正リガンド／受容体特異性変換体として同定される。あるいは支持体結合接着受容体は、「遊離」リガンド／受容体特異性変換体と接触されて、会合したリガンド／受容体特異性変換体の量が直接的に（例えば標識リガンド／受容体特異性変換体を用いることにより）または間接的に（例えばリガンド／受容体特異性変換体の抗原性ドメインに対する標識抗体を用いることにより）確定され得る。同様に、支持体上にあるリガンド／受容体特異性変換体の抗原性ドメインに特異的な抗体、および標識リガンド／受容体特異性変換体（または二次検出試薬、例えば標識受容体またはリガンド／受容体特異性変換体に対する抗体）を用いることにより、リガンド／受容体特異性変換体の抗原性ドメインと結合する抗体の能力が確定され得る。
【００６５】
いくつかの特徴付けアッセイは、標的受容体および再指向された抗体と相互作用するリガンド／受容体特異性変換体の能力を評価するが、一方、他の特徴付けアッセイは、リガンド／受容体特異性変換体が標的受容体および再指向抗体の両方と結合し得るか否かを確定するように設計される。概して、特徴付けアッセイは、以下のように分類され得る：（１）ｉｎ　ｖｉｔｒｏ特徴付けアッセイ、（２）細胞特徴付けアッセイ、および（３）ｉｎ　ｖｉｖｏ特徴付けアッセイ。
【００６６】
各種類の特徴付けアッセイの考察を、以下のセクションで提示する。
【００６７】
ｉｎ　ｖｉｔｒｏ特徴付けアッセイ
リガンド／受容体特異性変換体が特定の受容体と結合するか否か、および被験体中にある抗体がリガンド／受容体特異性変換体と結合し得るか否かを確定するために用いられ得る、多数の種類のｉｎ　ｖｉｔｒｏアッセイが存在する。もっとも簡単には、受容体が支持体（例えばペトリ皿）に結合され、リガンド／受容体特異性変換体と受容体との会合が、上記のように直接または間接的にモニタリングされる。同様に、リガンド／受容体特異性変換体の抗原性ドメインに対する一次抗体（例えば被験体中に見出される抗体）が支持体に結合され、リガンド／受容体特異性変換体と一次抗体との会合が直接的に（例えば標識リガンド／受容体特異性変換体を用いて）または間接的に（例えば標識受容体、または一次抗体により認識されるエピトープと競合しないリガンド／受容体特異性変換体上のエピトープと相互作用する標識二次抗体を用いて）確定され得る。
【００６８】
別のアプローチでは、受容体が支持体に結合され、リガンド／受容体特異性変換体が受容体に結合され、一次抗体がリガンド／受容体特異性変換体に結合されるサンドイッチ型アッセイを含む。標識一次抗体が用いられる場合、受容体／特異性変換体／一次抗体の複合体の存在は、直接的に確定され得る。受容体／特異性変換体／一次抗体の複合体の存在は、例えば一次抗体とリガンド／受容体特異性変換体との結合を妨げないエピトープで一次抗体と反応する標識二次抗体を用いることにより、間接的に確定することもできる。いくつかの場合には、無標識二次抗体と反応させて標識三次抗体を用い、したがって受容体／特異性変換体／一次抗体／二次抗体／標識三次抗体の複合体を形成するのが望ましい。
【００６９】
以下の実施例は、フィブリノーゲンのＣ末端ドメイン由来の特異性ドメインが凝集因子（Ｃｌｆ）とフィブリノーゲンとの結合を抑制するか否かを確定するために実施された特徴付けアッセイを説明する。
【００７０】
実施例１
この実施例では、フィブリノーゲン（Ｆｉｂ）のＣ末端ドメインに対応するいくつかのペプチドが、凝集因子（Ｃｌｆ）とフィブリノーゲンとの結合を遮断する能力に関して分析した（表３参照）。ｆｍｏｃ　ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ｓｙｒｏ， ＭｕｌｔｉＳｙｎＴｅｃｈ， Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いたペプチド合成における標準技法を用いて、これらのペプチドを製造した。好ましくは、逆相ＨＰＬＣによりペプチドを精製する。次に競合酵素イムノアッセイを実施して、ペプチドがＣｌｆおよびフィブリノーゲン間の相互作用を遮断することができるか否かを確定した。これらの実験の結果を表３に示す。Ｃｌｆおよびフィブリノーゲン間の相互作用を抑制することが見出されたフィブリノーゲン由来の最小ペプチドは、ＨＬＧＧＡＫＱＡＧＤ（配列番号１２４）であった。アラニンおよびリシンを用いてこの最小ペプチドの最初の２個のアミノ酸を置換すると、ペプチドがＣｌｆおよびフィブリノーゲン間の相互作用を遮断する能力に有意な作用を及ぼした（例えばペプチドＡＬＧＧＡＫＱＡＧＤ（配列番号１２３）はＣｌｆ／フィブリノーゲン相互作用を遮断できなかった）。
【００７１】
【表３】
2004509621.tif 000004
【００７２】
以下の実施例は、リガンド／受容体特異性変換体が、ＣｌｆＡ受容体を有する細菌と相互作用するか否かを確定するために実施した特徴付けアッセイを記載する。
【００７３】
実施例２
フィブリノーゲンγ鎖配列の種々の領域に対応する特異性ドメイン（約２０アミノ酸長）を有するリガンド／受容体特異性変換体を、ｆｍｏｃ　ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ｓｙｒｏ， ＭｕｌｔｉＳｙｎＴｅｃｈ， Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いたペプチド合成における標準技法を用いて製造し、これらのリガンド／受容体特異性変換体が、ＣｌｆＡ受容体、およびそれらの抗原性ドメインに特異的な抗体と結合する能力に関して分析した。これらのリガンド／受容体特異性変換体の配列を表４に列挙し、配列表に提示する（配列番号６０〜１０３）。この分析に用いたリガンド／受容体特異性変換体は、単純ヘルペスウイルスｇＧ２タンパク質のエピトープを提示する抗原性ドメインを有し、単純ヘルペスウイルスｇＧ２タンパク質に対するモノクローナル抗体により認識される。２：ｇ／ｍｌヤギ血清（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ）および０．５％Ｔｗｅｅｎ２０（ＰＢＳ−ＧＴ）を含有するリン酸塩緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）中で、これらのリガンド／受容体特異性変換体の連続希釈を行なった。９６ウエル微小滴定プレートにて、ｐＨ９．６の５０ｍＭ炭酸ナトリウム緩衝液中、＋４℃で一夜、１０μｇ／ｍｌで受容体ＣｌｆＡを受動的に吸着させた。
【００７４】
次にプレート上で６０分間、希釈したリガンド／受容体特異性変換体をインキュベートした。プレートに一次抗体を添加し、６０分間インキュベートすることにより（単純ヘルペスウイルスｇＧ２タンパク質に対するｍＡｂの１：１０００希釈）、受容体と相互作用するリガンド／受容体特異性変換体の能力を確定した。次に、ウサギ抗マウスＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ）二次抗体、およびペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ）三次抗体により、結合一次ｍＡｂを指標した。ジニトロフェニレン−ジアミン（Ｓｉｇｍａ）を用いたインキュベーションによりプレートを展開して、４０５ｎｍでの吸光度を分析した。
【００７５】
表４に提示されたすべてのリガンド／受容体特異性変換体（配列番号６０〜１０３）は、固定化ＣｌｆＡと評価できるほどに結合し、ＨＳＶ　ｇＧ２タンパク質に特異的なｍＡｂの結合も可能にした。接着受容体および一次抗体に対するリガンド／受容体特異性変換体の親和性を確定するための上記方法は、任意の特異性ドメインおよび任意の抗原性ドメインを含む任意の候補リガンド／受容体特異性変換体に関して実施され得るが、ただし、適切な配列および接着受容体を用いることが必要である。
【００７６】
表４以後の実施例は、リガンド／受容体特異性変換体がＣｌｆＡ受容体を有する細菌と相互作用するか否かを確定するために実施した別の特徴付けアッセイを記載する。
【００７７】
【表４】
2004509621.tif 000005
【００７８】
実施例３
凝集因子（Ｃｌｆ）と結合する特異性ドメインおよびポリオウイルス由来のエピトープに相当する抗原性ドメインを有するリガンド／受容体特異性変換体を、ｆｍｏｃ　ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ｓｙｒｏ， ＭｕｌｔｉＳｙｎＴｅｃｈ， Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いたペプチド合成における標準技法を用いて製造した（表５参照）。これらのリガンド／受容体特異性変換体が、ＣＬＦおよびフィブリノーゲン間の相互作用を抑制する能力に関して分析した。これらの実験では、表５に記載したリガンド／受容体特異性変換体を製造し、種々の濃度のこれらの分子について、Ｃｌｆおよびフィブリノーゲンを含む酵素競合イムノアッセイを実施した。Ｃｌｆ／Ｆｉｂ相互作用を抑制するために必要な最低ペプチド濃度である最低抑制濃度を確証した。すなわち、Ｆｉｂ／Ｃｌｆ相互作用を抑制するのに必要な濃度が低いほど、より有効な阻害剤である。さらに、イムノアッセイにおいて抗ポリオウイルス抗体により認識されるペプチドの最低試験濃度である最低固相結合ペプチド濃度を確定した。表５中に星印で示した使用ペプチドのいくつか（例えばＣＰＡＬＴＡＶＥＴＧＣＴＮＰＬＡＡＨＨＬＧＧＡＫＱＡＧ（配列番号１３５）、ＨＨＬＧＧＡＫＱＡＧ−ＡＡ−ＣＰＡＬＴＡＶＥＴＧＣＴＮＰＬ（配列番号１３７）、ＣＰＡＬＴＡＶＥＴＧＣ−ＴＮＰＬＨＨＬＧＧＡＫＱＡＧ（配列番号１３９）およびＨＨＬＧＧＡＫＱＡＧ−ＣＰＡＬＴＡＶＥＴＧＣＴＮＰＬ（配列番号１４１））を、２つの人工的に導入したシステイン残基間で環化した。これらの実験は、ＨＨＬＧＧＡＫＱＡＧ−ＡＡ−ＣＰＡＬＴＡＶＥＴＧＣＴＮＰＬ（配列番号１３７）およびＨＨＬＧＧＡＫＱＡＧ−ＣＰＡＬＴＡＶＥＴＧＣＴＮＰＬ（配列番号１４２）がＣｌｆおよびフィブリノーゲン間の相互作用を効率的に抑制し、機能的ポリオウイルスエピトープを保持することを明示した。
【００７９】
【表５】
2004509621.tif 000006
【００８０】
次のセクションでは、リガンド／受容体特異性変換体が、病原体の増殖に対する作用を有するか否かを確定するために実施され得るいくつかの細胞ベース特徴付けアッセイを記載する。
【００８１】
病原体ベースの特徴付けアッセイ
別の種類の特徴付けアッセイにおいて、病原体ベースのアプローチを用いて、病原体およびリガンド／受容体特異性変換体の抗原性ドメインに対して指向されている抗体と相互作用する、リガンド／受容体特異性変換体の能力を評価する。この分析も、被験体の身体中において、リガンド／受容体特異性変換体と、病原体およびリガンド／受容体特異性変換体の抗原性ドメインに指向されている抗体との間の相互作用をした後に、被験体から病原体を取り除く（ｐｕｒｇｅ）体液性応答および細胞性応答（例えば補体固定およびマクロファージ分解）が続くため、病原体の増殖に対するリガンド／受容体特異性変換体の能力を明示する。一般的にいうと、病原体ベースの特徴付けアッセイは、培養病原体にリガンド／受容体特異性変換体を提供し、リガンド／受容体特異性変換体と、細胞またはウイルスとの会合をモニタリングすることを含む。数種類の病原体ベースの特徴付けアッセイが用いられ得る。以下の実施例は、好ましい特徴付けアッセイのいくつかをより詳細に記載する。
【００８２】
実施例４
病原体ベース特徴付けアッセイの一型は、支持体上に配置された細菌とリガンド／受容体特異性変換体を結合することを含む。したがって、Ｃｌｆａを産生する細菌（例えば黄色ブドウ球菌または大腸菌）を、培養中で、または適切な成長培地（例えばＬＢブロス、血液ブロス、ＬＢ寒天または血液寒天）中の寒天プレート上で成長させる。次に、真空下で膜上に培養を載せる（例えばドットブロット多岐管装置を用いる）ことにより、または移動を可能にするのに十分な時間、コロニー上に膜を載せることにより、細胞を膜（例えばニトロセルロースまたはナイロン）に移す。膜に結合された細胞は次に、リガンド／受容体特異性変換体の連続希釈（例えば、２００：１　ＰＢＳの総容積中に５００ｎｇ、１：ｇ、５：ｇ、１０：ｇ、２５：ｇおよび５０：ｇのリガンド／受容体特異性変換体）を提供される。一実験では、表４または表５に列挙されたリガンド／受容体特異性変換体を用いる。次に膜上で６０分間、希釈リガンド／受容体特異性変換体をインキュベートする。その後、非結合リガンド／受容体特異性変換体を除去し、ＰＢＳで膜を洗浄する（例えば１回の洗浄あたり２ｍｌのＰＢＳ／洗浄で３回洗浄）。次に、リガンド／受容体特異性変換体の抗原性ドメインと相互作用する一次抗体（例えば単純ヘルペスウイルスｇＧ２タンパク質に対するｍＡｂ）の１：１００〜１：１０００希釈液を提供し、結合反応を６０分間起こさせる。再び、ＰＢＳ（例えば１回の洗浄あたり２ｍｌのＰＢＳで３回洗浄）で膜を洗浄して、非結合一次抗体を除去する。適切な対照としては、膜自体、リガンド／受容体特異性変換体を伴わない膜上の細菌、ならびにリガンド／受容体特異性変換体を有するが一次抗体を有さない膜上の細菌が挙げられる。
【００８３】
膜上の細菌と結合したリガンド／受容体特異性変換体の量を検出するために、二次抗体（例えばウサギ抗マウスＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ））および三次抗体（例えばペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ））を用いる。もちろん、一次抗体と相互作用する標識二次抗体も、同様に用いられ得る。上記のように、二次抗体を膜と６０分間接触させた後、ＰＢＳを用いて膜から非結合二次抗体を洗浄する（例えば１回につき２ｍｌのＰＢＳを用いて３回洗浄）。さらに、三次抗体を膜と６０分間接触させた後、ＰＢＳを用いて非結合三次抗体を膜から洗浄する（例えば１回につきｍｌのＰＢＳを用いて３回洗浄）。膜をジニトロ−フェニレン−ジアミン（Ｓｉｇｍａ）とともにインキュベートすることにより、結合三次抗体を検出し得る。
【００８４】
別のアプローチは、固定化したリガンド／受容体特異性変換体の使用を含む。したがって一次抗体（例えば単純ヘルペスウイルスｇＧ２タンパク質に対するｍＡｂ）が、ペトリ皿に結合される。いったん一次抗体が結合されれば、リガンド／受容体特異性変換体（例えば表４または表５に提示されたリガンド／受容体特異性変換体）の種々の希釈液を被覆皿に付加する。リガンド／受容体特異性変換体を一次抗体と６０分間会合させて、さらに非結合リガンド／受容体特異性変換体を洗い落とす（例えば１洗浄あたり２ｍｌのＰＢＳで３回洗浄）。適切な対照としては、一次抗体またはリガンド／受容体特異性変換体を含まないペトリ皿が挙げられる。
【００８５】
その後、細菌（例えば大腸菌）の混濁溶液をペトリ皿に加え、細菌を固定化リガンド／受容体特異性変換体と６０分間相互作用させる。次にＰＢＳで洗浄することにより（例えば１洗浄あたり２ｍｌのＰＢＳで３回洗浄）、非結合細菌を除去する。次に成長培地（例えばＬＢブロス）をペトリ皿に加え、培養を一夜インキュベートする。あるいはＬＢ寒天をペトリ皿に加え、培養を一夜インキュベートする。リガンド／受容体特異性変換体と細菌との間の相互作用は、視覚的に観察し得る（例えば混濁成長培地であれば、分光測光分析または寒天上のコロニーの出現を用いて定量し得る）。
【００８６】
上記アプローチを一部変更することにより、ウイルスと相互作用するリガンド／受容体特異性変換体の能力を当業者は評価し得る。例えばＴ４糖タンパク質の可溶性断片は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）エンベロープ糖タンパク質と相互作用することが示されている（例えば米国特許第６，０９３，５３９号参照）。抗原性ドメイン（例えば表２に列挙した抗原性ドメイン）と連結される特異性ドメインを有する融合タンパク質を合成することにより、ＨＩＶエンベロープ糖タンパク質と相互作用するＴ４糖タンパク質の断片を含む特異性ドメイン（例えば米国特許第６，０３９，５３９号で提供されたＴ４糖タンパク質配列のアミノ酸１〜４１９またはその一部分）を有するリガンド／受容体特異性変換体を製造し得る。ペプチド化学を用いてリガンド／受容体特異性変換体を製造し得るが、好ましくは抗原性ドメインに連結されたＴ４糖タンパク質の断片を有する発現構築物が製造されて、適切な細胞中にトランスフェクトされる。米国特許第６，０３９，５３９号および上記に記載された発現および精製戦略も用いられ得る。
【００８７】
いったんリガンド／受容体特異性変換体が構築されたら、フィルター結合アッセイを実施する。すなわち、ＨＩＶ接種物の連続１０倍希釈液を、一定真空下でドットブロット装置中の膜（例えばニトロセルロースまたはナイロン）に適用する。次にリガンド／受容体特異性変換体の連続１０倍希釈液を結合ＨＩＶ粒子に適用する。リガンド／受容体特異性変換体を粒子と６０分間接触させた後、真空を適用して、ＰＢＳで洗浄する（例えば１回につき２ｍｌのＰＢＳで３回洗浄）。いったん非結合リガンド／受容体特異性変換体が除去されれば、抗原性ドメインと結合する一次抗体の１０倍連続希釈液を試料に加え、結合反応を６０分間起こさせる。次に真空を適用し、非結合一次抗体をＰＢＳで洗浄する（例えば１洗浄あたり２ｍｌのＰＢＳで３回洗浄）。上記と同様に、結合一次抗体の検出を行うことができる。
【００８８】
サンドイッチ型アッセイにおいても、ウイルスと相互作用するリガンド／受容体特異性変換体の能力を評価し得る。すなわち、リガンド／受容体特異性変換体の抗原性ドメインと相互作用する一次抗体を微小滴定ウエル中で固定し、リガンド／受容体特異性変換体の連続希釈液を一次抗体に付加し、上記のように一次抗体／特異性変換体の複合体を作製する。次にＨＩＶ接種物の１０倍連続希釈液を加え、結合反応を６０分間起こさせる。ＰＢＳ中での連続洗浄により、非結合ＨＩＶ粒子を除去する。放射能標識抗ＨＩＶ抗体（例えばＨＩＶ感染に罹患しているヒトからの血清から得た抗体）を用いて、結合ＨＩＶ粒子の検出を成し遂げ得る。
【００８９】
上記実施例において、細菌およびウイルスを用いた病原体ベースのアッセイを記載したが、これらのアプローチの一部を変更して、リガンド／受容体特異性変換体と哺乳類細胞の相互作用を試験し得る。例えば、癌細胞上に存在するインテグリン受容体と相互作用するリガンド／受容体特異性変換体の能力を、以下のように確定し得る。∀Ｖ∃３受容体を発現する黒色腫細胞（例えばＭ２１ヒト黒色腫細胞）はフィブリノーゲンと結合し、この相互作用は、ＲＧＤを含むペプチドを投与することにより遮断し得る（例えば、Ｋａｔａｄａ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７２：７７２０（１９９７）およびＦｅｌｄｉｎｇ−Ｈａｂｅｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７１：５８９２−５９００（１９９６）参照）。同様に、多くのその他の種類の癌細胞は、ＲＧＤペプチドと相互作用するインテグリンを発現する。一アプローチによれば、ＲＧＤ応答性インテグリンを発現する癌細胞（例えばＭ２１ヒト黒色腫細胞）を培養して集密にする。Ｍ２１細胞は、１０％ウシ胎児血清、２０ｍＭのＨｅｐｅｓおよび１ｍＭのピルビン酸塩を含有するＤＭＥＭ培地中で成長し得る。
【００９０】
好ましくは、２０μｇ／ｍｌの最終濃度（２ｘ１０６細胞／ｍｌ）で３７℃において３０分間、ヒドロエチジン（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅ， Ｉｎｃ．， Ｗａｒｒｉｎｇｔｏｎ， ＰＡ）で細胞を染色し、次に２回洗浄して、余分の染料を除去する。ヒドロエチジンはＤＮＡ中に入り込んで（ｉｎｔｅｒｃａｌａｔｅ）、細胞の赤色蛍光標識を生じるが、細胞の接着機能を損傷することはない。染色は、細胞とのリガンド／受容体特異性変換体の結合を定量化する一方法を提供する。すなわち、ヒドロエチジン染色細胞の総数を、蛍光標識一次抗体／特異性変換体の複合体に結合した細胞の数と比較することにより、結合効率を確定することができる。
【００９１】
したがって染色細胞を、ＲＧＤ配列（例えばＧＲＧＤＳＰＨＲＧＧＰＥＥ（配列番号１０４）またはＷＳＲＧＤＷＨＲＧＧＰＥＥ（配列番号１０５））を含むリガンド／受容体特異性変換体の種々の希釈液とともにインキュベートする。６０分間のインキュベーション後、１０％ウシ胎児血清、２０ｍＭのＨｅｐｅｓおよび１ｍＭのピルビン酸塩を含有するＤＭＥＭ培地中で数回洗浄する（例えば５ｍｌの培地の３回洗浄）ことにより、非結合リガンド／受容体特異性変換体を除去する。次に、リガンド／受容体特異性変換体の抗原性ドメインと相互作用する一次抗体（例えば単純ヘルペスウイルスｇＧ２タンパク質に対するｍＡｂ）の１：１００〜１：１０００希釈液を提供し、結合反応を６０分間起こさせる。その後、培地中で数回の洗浄を実施して、あらゆる非結合一次抗体を除去する。適切な対照としては、リガンド／受容体特異性変換体を含有しない染色細胞、または一次抗体を含有しない染色細胞が挙げられる。
【００９２】
一次抗体の結合後、ヤギ抗マウスＦＩＴＣ標識抗体（１：１００希釈液）（Ｓｉｇｍａ）を付加し、結合を６０分間起こさせる。再び、数回の培地洗浄を実施して、すべての非結合二次抗体を除去する。ヒドロエチジンに関しては５４３／５９０ｎｍに、およびフルオレセインに関しては４９５／５２５ｎｍに設定したフィルターを用いてフローサイトメトリーにより分析を行なう。リガンド／受容体特異性変換体／細胞の複合体との一次抗体の結合が有意に観察されるが、これは、リガンド／受容体特異性変換体が細胞に相当の影響を及ぼすことを実証する。
【００９３】
以下の実施例は、ＲＧＤ含有リガンド／受容体特異性変換体が哺乳類細胞と効果的に結合し、これらの細胞に抗体を向け直すことを証明する特徴付けアッセイを記載する。
【００９４】
実施例５
ｆｍｏｃ　ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ｓｙｒｏ， ＭｕｌｔｉＳｙｎＴｅｃｈ， Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いたペプチド合成における標準技法を用いて、ペプチドＲＧＤＳＡＡＴＰＰＡＹＲ（配列番号１４５）を製造した。このペプチドは、インテグリン受容体、スペーサー（ＡＡ）、ならびにＢ型肝炎ウイルスｅ抗原（ＨＢｅＡｇ）上に存在するエピトープであるモノクローナル抗体５７／８により認識されるエピトープを有する抗原性ドメインと結合する特異性ドメインを有する。
【００９５】
ネズミ黒色腫細胞（ＳＰ２／０細胞）を血清無含有培地中で洗浄し、次に５０μｇ／ｍｌの濃度で、ＲＧＤＳＡＡＴＰＰＡＹＲ（配列番号１４５）ペプチドまたはＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）ＮＳ３ドメイン由来の対照ペプチドとともにインキュベートした。次に細胞を洗浄し、５７／８抗体で細胞を標識することにより、表面結合ペプチドの量を検出した。１／５００に希釈したＦＩＴＣ標識抗マウスＩｇＧ接合体により表面結合抗体を指標し、蛍光顕微鏡により表面染色のレベルを確定した。
【００９６】
この実験は、対照ペプチドとともにインキュベートした細胞は染色を示さなかったことを明示した。対照的に、ＲＧＤＳＡＡＴＰＰＡＹＲ（配列番号１４５）ペプチドとともにインキュベートした細胞は、表面発現インテグリンの位置と一致して、有意の表面染色を示した。したがって、ＲＧＤ含有リガンド／受容体特異性変換体は、インテグリン産生哺乳類細胞と効果的に結合し、これらの分子を用いて抗体を腫瘍細胞に向けさせ、その抗体を標的化し得る。
【００９７】
次のセクションでは、動物において実施される特徴付けアッセイを記載する。
【００９８】
ｉｎ　ｖｉｖｏ特徴付けアッセイ
特徴付けアッセイは、リガンド／受容体特異性変換体をｉｎ　ｖｉｖｏで評価する実験も含む。リガンド／受容体特異性変換体が、病原性感染を抑制する能力を評価するのに適した多数の動物モデルが存在する。マウスは、維持するのが容易であり、細菌感染、ウイルス感染および癌に罹り易いために好ましい。チンパンジーも、それらがヒトと遺伝的に密接に関連しているために好ましい。
【００９９】
マウスにおけるリガンド／受容体特異性変換体の効力を評価するための一アプローチを次の実施例で提供する。
【０１００】
実施例６
細菌感染を治療するリガンド／受容体特異性変換体の能力を試験するために、以下の特徴付けアッセイを実施し得る。約８週齢、体重２５ｇの数匹の雌ＣＦ−１異系交配マウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）に試験すべきリガンド／受容体特異性変換体の抗原性ドメインを予防接種する。好ましくは、抗原性ドメインを担体と結合させ、アジュバントとともに投与する。例えば抗原性ドメインを、担体およびアジュバントの両方として作用するカギアナカサガイヘモシアニンまたはウシ血清アルブミンと融合させるか、あるいは、フロイントのアジュバントのようなアジュバント、水酸化アルミニウム、またはリソレシチンを用いることができる。いったん抗原性ドメインに対する高力価の抗体を、例えば免疫拡散またはＥＩＡにより立証することができれば、黄色ブドウ球菌ＮＴＣＣ１０６４９の一夜培養を免疫感作マウスに腹腔内接種する。黄色ブドウ球菌に関して約１００ｘＬＤ５０またはｌｏｇ６．６を生産するよう、接種物を調整する。
【０１０１】
リガンド／受容体特異性変換体（例えば表４中に提示されたリガンド／受容体特異性変換体）の連続希釈液を注射用として滅菌水中に処方し、感染の１時間および５時間後に皮下（ＳＣ）または経口（ＰＯ）経路で投与する。同時に各試験に関して、非処置マウスに細菌接種物のｌｏｇ希釈液を接種することにより、接種物の（ｃｈａｌｌｅｎｇｅ）ＬＤ５０を確認する。好ましくは５種類のｌｏｇ希釈範囲の細菌接種物を各１０匹の５群に接種する（１種類のｌｏｇ希釈液につきマウス１０匹）。ＬＤ５０の１００倍の濃度の接種物を接種した非処置マウスの全群において１００％の死亡率を生じる。死亡率に関して、７日間毎日、マウスをモニタリングする。Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ． Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ． ３１：１７６８−１７７４およびＰｒｏｃ． Ｓｏｃ． Ｅｘｐ． Ｂｉｏｌ． Ｍｅｄ． １９９４， ５７， ２６１−２６４に記載されたような「生存対投与量」のプロット化曲線の対数プロビット分析により、累積死亡率から５０％のマウスを防護するための平均有効用量（ＥＤ５０）を算定し得る。当業者が理解するように、同様のアプローチを用いてウイルス感染および癌を抑制するリガンド／受容体特異性変換体の能力を試験し得る。
【０１０２】
本明細書中に記載したリガンド／受容体特異性変換体を製剤中に処方して、病原体の増殖を抑制する作用物質を必要とする被験体に投与し得る。以下のセクションでは、病原体上の受容体と相互作用するリガンド／受容体特異性変換体を含むいくつかの製剤を記載する。
【０１０３】
病原体上の受容体と相互作用するリガンド／受容体特異性変換体を含む製剤
本明細書中に記載されたリガンド／受容体特異性変換体は、病原体による感染を治療または予防する化合物を必要とする被験体に投与するための製剤中へ混入するのに適している。これらの薬理学的活性化合物をガレノス薬学の慣用的方法にしたがって加工して、ヒトを含めた動物への投与のための医薬製剤を生産し得る。有効成分を、修飾を加えてもしくは加えずに、製剤製品中に組込み得る。さらにいくつかの経路により本発明の薬理学的活性化合物を送達する製剤または治療薬の製造は、本発明の態様である。例えば病原体上の受容体と相互作用するリガンド／受容体特異性変換体をコードする配列を有するＤＮＡ、ＲＮＡおよびウイルスベクター（これらに限定されない）を、本発明の実施形態とともに用いる。リガンド／受容体特異性変換体をコードする核酸を単独でまたは他の有効成分と組合せて投与し得る。
【０１０４】
化合物は、本明細書中に記載した薬理学的有効成分と有害な反応をしない慣用的賦形剤、すなわち非経口、経腸（例えば経口）または局所適用に適した製薬上許容可能な有機または無機担体物質との混和物中に用い得る。適切な製薬上許容可能な担体としては、水、食塩溶液、アルコール、アラビアゴム、植物油、ベンジルアルコール、ポリエチレングリコール、ゼラチン、炭水化物（例えばラクトース）、アミロースまたはデンプン、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ケイ酸、粘性パラフィン、香油、脂肪酸モノグリセリドおよびジグリセリド、ペンタエリスリトール脂肪酸エステル、ヒドロキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドン等が挙げられるが、これらに限定されない。用い得るさらに多数のビヒクルは、Ｒｅｍｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， １５ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｅａｓｔｏｎ： Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ， ｐａｇｅｓ １４０５−１４１２ ａｎｄ １４６１−１４８７（１９７５）およびＴｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｆｏｒｍｕｌａｒｙ ＸＩＶ， １４ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ， Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ（１９７５）に記載されている。製剤調製物を滅菌し、所望により、リガンド／受容体特異性変換体と有害な反応をしない限り、助剤、例えば滑剤、防腐剤、安定剤、湿潤剤、乳化剤、浸透圧に作用するための塩、緩衝剤、着色剤、風味剤および／または芳香性物質等と混合し得る。
【０１０５】
リガンド／受容体特異性変換体を有する特定の製剤の有効用量および投与方法は、患者の個々の必要性および要求される治療手段または予防手段に基づいて変わり得る。このような化合物の治療効力および毒性、例えばＥＤ５０（集団の５０％に治療的に有効な用量）は、細胞培養または実験動物における標準製薬手法により確定し得る。例えばリガンド／受容体特異性変換体の有効用量は、上記特徴付けアッセイを用いて求め得る。これらのアッセイから得られたデータは、次に、ヒトを含めた他の生物体に関して用いるための一連の投与量の処方に用いる。このような化合物の投与量は、好ましくは、毒性を伴わないＥＤ５０を含めた一連の循環濃度内である。投与量は、リガンド／受容体特異性変換体の種類、用いられる投薬形態、生物体の感受性、ならびに投与経路によってこの範囲内で変化する。
【０１０６】
リガンド／受容体特異性変換体の通常の投与量は、投与経路によって、約１〜１００，０００μｇ、約１０ｇの総用量まで変わり得る。望ましい投与量としては、約２５０：ｇ〜１ｍｇ、約５０ｍｇ〜２００ｍｇ、および約２５０ｍｇ〜５００ｍｇが挙げられる。
【０１０７】
いくつかの実施形態では、リガンド／受容体特異性変換体の用量は、好ましくは約０．１：Ｍ〜５００ｍＭの組織濃度もしくは血液濃度またはその両方を生じる。望ましい用量は、約１〜８００μＭの組織濃度もしくは血液濃度またはその両方を生じる。好ましい用量は、約１０μＭ〜約５００：Ｍより高い組織濃度もしくは血液濃度を生じる。８００：Ｍより高い組織濃度を生じる用量は好ましくはないが、それらを用いる可能性はある。血中レベルで測定した場合に組織中の安定濃度を維持するために、リガンド／受容体特異性変換体の定常注入も提供され得る。
【０１０８】
治療される患者を考慮して、個々の医者が正確な投与量を選択する。十分なレベルの活性部分を提供しあるいは所望の作用を保持するよう、投与量および投与法を調整する。考慮され得る付加的因子としては、疾患の重症度、治療される生物体の年齢、および生物体の体重またはサイズ；食餌、投与の時間および頻度、薬剤組合せ（単数または複数）、反応感受性、ならびに治療に対する耐性／応答が挙げられる。短期作用製剤組成物は毎日またはより高い頻度で投与し、一方、長期作用製剤組成物は、２日またはそれ以上の日数毎に、週１回、あるいは２週間に１回またはそれ以下の頻度で投与する。
【０１０９】
製剤の投与経路としては、局所、経皮、非経口、胃腸、経気管支および経肺胞投与が挙げられるが、これらに限定されない。経皮投与は、リガンド／受容体特異性変換体を皮膚に浸透させ得るクリーム、リンス、ゲル等の塗布により成し遂げられる。非経口経路の投与としては、電気的または直接注入、例えば中心静脈系への直接注入、静脈内、筋内、腹腔内、皮内または皮下注入が挙げられるが、これらに限定されない。胃腸経路の投与としては、経口摂取および直腸が挙げられるが、これらに限定されない。経気管支および経肺胞経路の投与としては、口または鼻腔内を介した吸入が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１１０】
経皮または局所投与に適した本明細書中に記載されたリガンド／受容体特異性変換体を有する組成物としては、皮膚に直接塗布されるかまたは経皮用具（「経皮パッチ」）のような保護担体中に混入される製薬上許容可能な懸濁液、油、クリームおよび軟膏が挙げられるが、これらに限定されない。適切なクリーム、軟膏などの例は、例えばＰＤＲ（Ｐｈｙｓｉｃｉａｎ’ｓ Ｄｅｓｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ）中に見出し得る。適切な経皮用具の例は、例えば米国特許第４，８１８，５４０号（Ｃｈｉｎｅｎ等、１９８９年４月４日発行）に記載されている。
【０１１１】
非経口投与に適した薬理学的活性化合物を有する組成物としては、製薬上許容可能な滅菌等張溶液が挙げられるが、これらに限定されない。このような溶液としては、中心静脈系への注入、静脈内、筋内、腹腔内、皮内または皮下注射のための食塩水およびリン酸緩衝化食塩水が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１１２】
経気管支および経肺胞投与に適した薬理学的活性化合物を有する組成物としては、種々の種類の吸入用エーロゾルが挙げられるがこれらに限定されない。これらの経気管支および経肺胞投与に適した用具も、実施形態である。このような用具としては、アトマイザーおよび噴霧器が挙げられるが、これらに限定されない。本明細書中に記載したリガンド／受容体特異性変換体を有する組成物を送達するために、多数の形態の現在利用可能なアトマイザーおよび噴霧器を容易に適応し得る。
【０１１３】
胃腸投与に適した薬理学的活性化合物を有する組成物としては、経口摂取のための製薬上許容可能な粉末、ピルまたは液体、ならびに直腸投与のための座薬が挙げられるが、これらに限定されない。易使用性のために、胃腸投与、特に経口投与は好ましい一実施形態である。いったんリガンド／受容体特異性変換体を含む製剤が得られたら、それは病原体感染を治療または予防する必要がある生物体に投与し得る。
【０１１４】
本発明の態様は、医療設備、例えば人工器官、移植片および器具をコーティングすることも含む。医療用具に用いるのに適したコーティングは、リガンド／受容体特異性変換体を含有するゲルまたは粉末により、あるいはリガンド／受容体特異性変換体が懸濁される高分子コーティングにより提供し得る。用具のコーティングのための適切な高分子物質は、生理学的に許容可能であり、治療上有効量のリガンド／受容体特異性変換体が拡散し得る高分子物質である。適切なポリマーとしては、ポリウレタン、ポリメタクリレート、ポリアミド、ポリエステル、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリテトラフルオロエチレン、ポリ塩化ビニル、酢酸セルロース、シリコーンエラストマー、コラーゲン、シルク等が挙げられるが、これらに限定されない。このようなコーティングは、例えば米国特許第４，６１２，３３７号に記載されている。
【０１１５】
以下のセクションでは、本明細書中に記載したリガンド／受容体特異性変換体を用いた疾患の治療方法および予防方法を記載する。
【０１１６】
リガンド／受容体特異性変換体を用いた疾患の治療および予防
受容体を有する病原体による感染を治療および／または予防する必要がある被験体に、リガンド／受容体特異性変換体を含む製剤を投与し得る。そのような必要がある被験体としては、病原体と接触する危険がある個体、あるいは病原体にすでに感染している個体が挙げられる。標準臨床技法または標準診断技法により、これらの個体を同定し得る。
【０１１７】
例えば一アプローチによれば、細菌感染に罹患している被験体は、病原体の増殖を抑制する作用物質を必要とする被験体として同定される。その場合、治療上有効量のリガンド／受容体特異性変換体をこの被験体に提供する。この方法に用いるリガンド／受容体特異性変換体は、細菌上に存在する受容体（例えば細胞外フィブリノーゲン結合タンパク質（Ｅｆｂ）、コラーゲン結合タンパク質、ビトロネクチン結合タンパク質、ラミニン結合タンパク質、プラスミノーゲン結合タンパク質、トロンボスポンジン結合タンパク質、凝集因子Ａ（ＣｌｆＡ）、凝集因子Ｂ（ＣｌｆＢ）、フィブロネクチン結合タンパク質、コアグラーゼおよび細胞外接着タンパク質）と相互作用する特異性ドメインを含む。リガンド／受容体特異性変換体は、病原体または毒素のエピトープ、好ましくは必要がある被験体中に存在する高力価抗体により認識されるエピトープを有する抗原性ドメインも含む。被験体にリガンド／受容体特異性変換体を提供する前に、抗原性ドメインを認識する高力価抗体の存在に関して、必要がある被験体をスクリーニングするのも望ましい。このスクリーニングは、上記のように固定化した抗原性ドメインまたはリガンド／受容体特異性変換体を用いたＥＩＡまたはＥＬＩＳＡにより成し遂げ得る。
【０１１８】
同様に、特定の病因性作用物質上に存在する受容体を認識するリガンド／受容体特異性変換体を、ウイルス感染を抑制する作用物質を必要とする被験体に投与し得る。したがって、標準臨床手法および標準診断手法により、ウイルス感染を抑制する作用物質を必要とする被験体を同定する。次に、個体に感染する種類のウイルス上に存在する受容体と相互作用する治療上有効量のリガンド／受容体特異性変換体を、必要とする被験体に提供する。上記のように、リガンド／受容体特異性変換体の投与前に、リガンド／受容体特異性変換体の抗原性ドメインと相互作用するのに十分な力価の抗体を被験体が有するか否かを確定するのが望ましい。
【０１１９】
同一静脈中において、癌細胞上に存在する受容体と相互作用するリガンド／受容体特異性変換体を、癌の増殖を抑制する作用物質を必要とする被験体に投与し得る。例えば、標準臨床手法または標準診断手法により癌の増殖を抑制する作用物質を必要とする被験体を同定する。次に、被験体に感染した癌細胞上に存在する受容体と相互作用する治療上有効量のリガンド／受容体特異性変換体を、必要とする被験体に提供する。上記のように、リガンド／受容体特異性変換体の投与前に、リガンド／受容体特異性変換体の抗原性ドメインと相互作用するのに十分な力価の抗体を被験体が有するか否かを確定するのが望ましい。
【０１２０】
本明細書中に記載したリガンド／受容体特異性変換体は、疾患の発症を防止するための予防薬としても被験体に投与し得る。予防目的で（例えば細菌感染、ウイルス感染または癌を予防するために）、事実上誰にでも、本明細書中に記載したリガンド／受容体特異性変換体を投与し得る。しかしながら、特定の疾患に罹患する危険性が高い被験体を同定し、リガンド／受容体特異性変換体を提供するのが望ましい。疾患に罹患する危険性の高い被験体としては、疾患の家族暦を有する個体、高齢者または若年者、あるいは病原体と頻繁に接触する個体（例えば健康管理従事者）が挙げられる。したがって受容体を有する病原体により感染する危険性のある被験体を同定し、次に予防上有効量のリガンド／受容体特異性変換体を提供する。
【０１２１】
本明細書中に記載したリガンド／受容体特異性変換体に関する予防的一用途は、医療用具または移植片をリガンド／受容体特異性変換体で被覆または架橋することに関する。埋め込み型医療用具は、多数の細菌種の感染の病巣となることがある。このような用具関連感染は、これらの生物体が用具の表面に接着し、定着する傾向があることにより促進される。その結果、典型的には医療用具の移植に伴う生物学的有害反応を促進する傾向が低い表面を有する医療用具を開発する重大な必要性が存在する。
【０１２２】
一アプローチによれば、リガンド／受容体特異性変換体を含有する溶液中で医療用具を被覆する。移植前に、例えばリガンド／受容体特異性変換体の溶液中に医療用具（例えば人工弁）を保存する。医療用具は、リガンド／受容体特異性変換体を有する粉末またはゲル中でも被覆し得る。細菌またはウイルス受容体と相互作用する特異性変換体を含有する粉末またはゲル中で、例えば手袋、コンドームおよび子宮内用具を被覆し得る。いったん身体中に移植されれば、これらのリガンド／受容体特異性変換体は病原体による感染に対する予防的バリアとなる。
【０１２３】
いくつかの実施形態では、リガンド／受容体特異性変換体を医療用具に固定する。上記のように、医療用具は、リガンド／受容体特異性変換体が接着し得る支持体である。固定化は、リガンド／受容体特異性変換体と医療用具との間の疎水性相互作用により起こり得るが、医療用具にリガンド／受容体特異性変換体を固定するための好ましい方法は、共有結合を含む。例えば、特異性変換体上に存在する反応基と相互作用する反応基を有する医療用具を製造し得る。
【０１２４】
一アプローチによれば、２−アミノアルコール部分を含むリガンド／受容体特異性変換体と過ヨウ素酸塩とを用いて、約４〜約９のｐＨおよび約０〜約５０℃の温度を有する水性溶液中にアルデヒド−機能交換体を生成する。次に、一級アミン部分を含む医療用具の生体物質表面と、アルデヒド−機能交換体とを組合せて、イミン部分を介して支持体表面にリガンド／受容体特異性変換体を固定する。次に、イミン部分を還元剤と反応させて、二級アミン結合を介して生体物質表面に固定化リガンド／受容体特異性変換体を形成する。医療用具に分子を架橋するためのその他のアプローチ（例えば米国特許第６０１７７４１号に記載）を一部変更して、本明細書中に記載したリガンド／受容体特異性変換体を固定することができる。
【０１２５】
実施形態および実施例を参照しながら本発明を説明してきたが、本発明の精神を逸脱しない限り、種々の修正がなされ得る、と理解されるべきである。したがって本発明は、特許請求の範囲によってのみ限定される。
【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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