(57)【要約】本発明は、一般に、固相化学用途の新規表面、より具体的には化学物質および／または化合物の化学合成および／または固定化に使用するのグラフト重合により修飾されたプラスチック表面に関する。特に、本発明は、固相有機合成用の試薬、または生体分子、例えばタンパク質、オリゴヌクレオチド、核酸、ペプチド、およびレクチンのアフィニティ捕捉、提示もしくは製造用の試薬として使用するのに適した活性化モジュラーグラフト重合表面に関する。本発明のグラフト重合表面は、コンビナトリアル合成プロトコールにおけるスカベンジャー試薬として、またタンパク質精製およびプロテオミクスにおけるアフィニティ試薬として特に有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
活性化モジュラーグラフト重合表面。
【請求項２】
重合体が所望により置換されたポリオレフィン、シリコン重合体、天然または合成ゴム、ポリウレタン、ポリアミド、ポリエステル、ホルムアルデヒド樹脂、ポリカーボネート、ポリオキシメチレン、ポリエーテル、もしくはエポキシ樹脂、またはこれらのあらゆるものを含む共重合体である請求項１記載の活性化モジュラーグラフト重合表面。
【請求項３】
重合体がポリエチレンとポリプロピレン（ＰＭＡ）の共重合体または修飾分枝ポリオレフィンである請求項１または請求項２に記載の活性化モジュラーグラフト重合表面。
【請求項４】
重合体がグラフト重合により修飾された修飾分枝ポリオレフィン、またはその誘導体、混合物もしくは共重合体である請求項３記載の活性化モジュラーグラフト重合表面。
【請求項５】
該分枝ポリオレフィンがポリアルキルアルケンである請求項３記載の活性化モジュラーグラフト重合表面。
【請求項６】
ポリアルキルアルケンがポリ（４−メチルペンテン−１）である請求項４記載の活性化モジュラーグラフト重合表面。
【請求項７】
グラフト重合がガンマ照射グラフト重合、オゾン誘発グラフト重合、プラズマ誘発グラフト重合、ＵＶ誘発グラフト重合、または化学物質誘発グラフト重合である請求項１〜６のいずれかに記載の活性化モジュラーグラフト重合表面。
【請求項８】
グラフト重合体がポリビニル、ポリビニルアルコール、ポリスチレン、ポリ−α−メチルスチレン、ポリアクリレート、ポリメタクリレート、ポリアクリルアミド、ポリエチレングリコール（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｋｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌｓ）、ポリ乳酸、およびその誘導体、混合物、および共重合体からなる群から選ばれる請求項４または請求項７記載の活性化モジュラーグラフト重合表面。
【請求項９】
グラフト重合体がポリスチレンである請求項８記載の活性化モジュラーグラフト重合表面。
【請求項１０】
グラフト重合体がポリ−４−メチルスチレンおよびポリ−α−メチルスチレンの共重合体である請求項８記載の活性化モジュラーグラフト重合表面。
【請求項１１】
ポリ−４−ブロモスチレンおよびポリ−α−メチルスチレンの共重合体である請求項８記載の活性化モジュラーグラフト重合表面。
【請求項１２】
ポリスチレンおよびポリ−ジメチル ｍ−イソプロペニルベンジルイソシアネートスチレンの共重合体である請求項８記載の活性化モジュラーグラフト重合表面。
【請求項１３】
グラフト重合体がポリジメチルアクリルアミドおよびポリ−ジメチル ｍ−イソプロペニルベンジルイソシアネートスチレンの共重合体である請求項８記載の活性化モジュラーグラフト重合表面。
【請求項１４】
グラフト重合体がポリビニルアルコールである請求項８記載の活性化モジュラーグラフト重合表面。
【請求項１５】
グラフト重合体がポリアクリル酸である請求項８記載の活性化モジュラーグラフト重合表面。
【請求項１６】
トリフェニルホスフィン、還元剤もしくは酸化剤、キレート金属、スカベンジャー、または触媒からなる群から選ばれる試薬がグラフト重合表面に結合している請求項１〜１５のいずれかに記載の活性化モジュラーグラフト重合表面。
【請求項１７】
キレート金属がニッケルまたはカルシウムである請求項１６記載の活性化モジュラーグラフト重合表面。
【請求項１８】
スカベンジャーが求核基である請求項１６記載の活性化モジュラーグラフト重合表面。
【請求項１９】
求核基がアミノメチルまたはヒドラジノである請求項１８記載の活性化モジュラーグラフト重合表面。
【請求項２０】
スカベンジャーが求電子基である請求項１６記載の活性化モジュラーグラフト重合表面。
【請求項２１】
求電子基がイソシアネート、塩化トシル、またはベンズアルデヒドである請求項２０記載の活性化モジュラーグラフト重合表面。
【請求項２２】
触媒がジメチルアミノピリジンである請求項１６記載の活性化モジュラーグラフト重合表面。
【請求項２３】
グラフトがポリアクリル酸であり試薬がキレート金属である請求項１６記載の活性化モジュラーグラフト重合表面。
【請求項２４】
活性化部分がアルデヒド、カルボキシレート、アミノ、ヒドロキシド、ビオチン、チオール、トシル酸、塩化トシル、ヒドラジノ、またはイソシアネートである請求項１〜２３のいずれかに記載の活性化モジュラーグラフト重合表面。
【請求項２５】
活性化部分がアルデヒドである請求項２４記載の活性化モジュラーグラフト重合表面。
【請求項２６】
同じかまたは異なる１またはそれ以上のスペーサー配列が活性化部分とグラフト重合体の間に存在する請求項１〜２５のいずれかに記載の活性化モジュラーグラフト重合表面。
【請求項２７】
同じかまたは異なる１またはそれ以上のスペーサー配列がアルデヒドとグラフト重合体の間に存在する請求項２４記載の活性化モジュラーグラフト重合表面。
【請求項２８】
試薬が表１に記載の構造の一つを有する請求項１６記載の活性化モジュラーグラフト重合表面。
【請求項２９】
（ａ） ベンズアルデヒドポリスチレンランタン、
（ｂ） ストレプトアビジンまたはホースラディッシュパーオキシダーゼと結合したベンズアルデヒドポリスチレンランタン、および
（ｃ） ニッケルキレートポリアクリル酸ギアからなる群から選ばれる請求項１６記載の活性化モジュラーグラフト重合表面。
【請求項３０】
試薬がシッフ塩基形成することができるアミン化合物を結合することができる請求項１５〜２８のいずれかに記載の活性化モジュラーグラフト重合表面。
【請求項３１】
アミン化合物がビオチン化分子、タンパク質、ペプチド、レクチン、オリゴヌクレオチド、糖、または酵素である請求項２９記載の活性化モジュラーグラフト重合表面。
【請求項３２】
ビオチン化分子がペプチド、タンパク質、オリゴヌクレオチド、脂質または糖である請求項３０記載の活性化モジュラーグラフト重合表面。
【請求項３３】
タンパク質がストレプトアビジンである請求項３０記載の活性化モジュラーグラフト重合表面。
【請求項３４】
酵素がホースラディッシュパーオキシダーゼである請求項３０記載の活性化モジュラーグラフト重合表面。
【請求項３５】
生体分子またはその前駆体を請求項１〜３４のいずれかに記載の活性化モジュラーグラフト重合表面に暴露する工程を含む生体分子のアフィニティ捕捉、提示もしくは製造方法。
【請求項３６】
生体分子がタンパク質、オリゴヌクレオチド、核酸、ペプチド、およびレクチンからなる群から選ばれる請求項３５記載の方法。
【請求項３７】
重合体がグラフト重合により修飾された修飾分枝ポリオレフィン、またはその誘導体、混合物もしくは共重合体である請求項１記載の活性化モジュラーグラフト重合表面。
【請求項３８】
分枝ポリオレフィンがポリアルキルアルケンである請求項３７記載の活性化モジュラーグラフト重合表面。
【請求項３９】
ポリアルキルアルケンがポリ−（４−メチルペンテン−１）である請求項３８記載の重合表面。
【請求項４０】
グラフト重合がガンマ照射グラフト重合、オゾン誘発グラフト重合、プラズマ誘発グラフト重合、ＵＶ誘発グラフト重合、または化学誘発グラフト重合である請求項３７〜３９のいずれかに記載のグラフト重合表面。
【請求項４１】
グラフト重合体がポリビニル、ポリスチレン、ポリ−α−メチルスチレン、ポリビニルアルコール、ポリアクリレート、ポリメタクリレート、ポリアクリルアミド、ポリエチレングリコール（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｋｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌｓ）、ポリ乳酸、およびその誘導体、混合物、および共重合体からなる群から選ばれる請求項３７〜４０のいずれかに記載のグラフト重合表面。
【請求項４２】
モジュラー三次元型の、請求項１〜３４または請求項３７〜４１のいずれかに記載のグラフト重合表面。
【請求項４３】
モジュラー三次元型がランタン、クラウン、ギア、ピン、パック、ディスク、ビーズ、マイクロタイタープレート、またはシートである請求項４２記載のグラフト重合表面。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、一般的には固相化学に応用する新規表面、より具体的には化学物質および／または化合物の化学合成および／または固定化に用いるグラフト重合により修飾されたプラスチック表面に関する。
【０００２】
特に、本発明は、固相有機合成用試薬、または生体分子、例えばタンパク質、オリゴヌクレオチド、核酸、ペプチド、およびレクチンのアフィニティ捕捉、提示もしくは製造のための試薬として用いるのに適した活性化モジュラーグラフト重合表面に関する。詳細には、本発明のグラフト重合表面は、コンビナトリアル（組み合せ）合成プロトコールにおけるスカベンジャー試薬として、またタンパク質精製およびプロテオミクスにおけるアフィニティ試薬として有用である。
【０００３】
発明の背景
本明細書で引用したあらゆる特許または特許出願を含むすべての参考文献は本明細書の一部を構成する。あらゆる参考文献が先行技術を構成することは承認しない。参考文献の考察ではその著者が主張することを記載し、本出願人は引用文献の正確さと妥当性について異議を唱える権利を保有する。多くの先行技術刊行物が本明細書に引用されているが、この引用は、これらのあらゆる文献がオーストラリアや他のあらゆる国における当該分野における共通の一般的知識の部分を形成することを承認するものではないことは明らかに理解されよう。
【０００４】
過去１０年間にわたり、多数の化合物の、分離したメンバーのセットまたは混合物としての同時合成は製薬産業における薬剤発見方法で重要な手段となってきた。手動でも自動化方法でも、溶液相または固体支持（固相）合成方法論を介する化学のこの新領域は一般的に「コンビナトリアルケミストリー」と呼ばれる。これら方法で製造した化合物のセットは一般的に「コンビナトリアルライブラリー」として知られる。
【０００５】
コンビナトリアルケミストリーの人気の高まりと並行して高処理能力のスクリーニング技術が開発され、現在では数百〜数千のアッセイを同時に行うことができるので、薬剤発見方法のための新規化合物を供給する伝統的機械的化学プログラムの能力に負担がきている。高処理能力スクリーニングは、分子生物学の劇的な発展とあいまってロボット工学およびコンピュータ使用の劇的な進歩により実行可能となった。過去数年間にわたり、多数のレセプターが同定され、特徴づけられてきた。さらに、現在では多くのレセプターを細胞表面に発現させることができ、これらの細胞を好都合なアレー・フォーマットにプレートアウトすることができることにより、レセプターと結合し、そして／またはレセプターが介在する活性を調節する被験化合物の能力の自動化スクリーニングが容易になる。
【０００６】
これらの方法に用いる最初の「固相」は、ジビニルベンゼンと架橋したポリスチレンビーズであった。幾年にもわたり、ポリメチルアクリルアミド（例えばＰＥＰＳＹＮＫ（登録商標））、ポリスチレン−ポリエチレングリコール共重合体（例えば、ＲＡＰＰ ＴＥＮＴＡＧＥＬ（登録商標））、マクロ多孔性ポリスチレン（例えば、Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｓｔｒａｔｏｓｐｈｅｒｅｓ）、および多くの他の「固相」が開発されてきた。多くのこれらの「樹脂」は、ペプチドおよびオリゴヌクレオチド合成市場に役立つように設計された。しかしながら、そのような樹脂を用いるには、多くの化合物を合成するための封じ込め（コンテインメント）戦略が必要であること、核酸パスレングスの増加およびより大きな樹脂ビーズとの架橋の増加による異なるビーズサイズ間の反応プロフィールの相違、異なる溶媒中の示差的膨張（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｓｗｅｌｌｉｎｇ）（いくつかの樹脂では容量に８倍の差がある）、および温度安定性の制限（最高に機能する樹脂では最高１５０℃）を含む制限がある。
【０００７】
より最近利用可能になった別のタイプの固相は、より流動性の重合体が硬いプラスチックにグラフト（ｇｒａｆｔ）される表面多孔性の固体支持体（以降、本明細書では「グラフト支持体」という）である。この分野で普及している樹脂に比べ、プラスチックはシート、フィルム、繊維（細い糸）として利用可能であるか、または必要に応じていかなる形にも成形することができるので、グラフト支持体は設計の自由度が大きい。多くの種々の重合体（ポリマー）または共重合体（コポリマー）をあらゆる特定の形にグラフトすることができるので、実際の固体支持体の物理化学的特性に広い選択の自由をもたらす。樹脂と異なり、ローディング（ｌｏａｄｉｎｇ）能力を決定するのはグラフト支持体の表面面積であり容積ではない。種々のサイズおよび形状のグラフト支持体間で反応速度論の一貫性を達成することができる。拡散経路長（ｐａｔｈ ｌｅｎｇｔｈ）はサイズで変化し、その結果、反応速度が変化するはずであるから、このことは樹脂ではむずかしい。他の利点には、「樹脂パケット」内へのコンテインメント方法を用いる合成に使用する固相の統合デザイン、および大部分の基質重合体が膨張（膨潤）しないので種々の溶媒中での膨張が最小限であることが挙げられる。
【０００８】
現在のグラフト支持体を用いる制限には約１２０℃の温度制限があり、単位容量あたりのローディングは最もよい高ローディング樹脂より低く、感知される反応速度は従来の樹脂より遅い。
【０００９】
伝統的に、製薬会社は新規リード化合物を発見するため、多年にわたり築き上げてきた大きな化合物目録をスクリーニングしてきた。これら目録は天然産物および合成中間体を含む多くの供給源から構築されてきた。しかしながら、数十年にわたる多数の医薬品化学者の努力が主として化合物収集を担ってきた。医薬品化学者は一般に目的とするファミリー内の化合物の小セットを製造し、そのファミリーの化合物をさらに製造する前に、限られた範囲のスクリーニングアッセイを用いて予備的スクリーニングデータを得てきた。
【００１０】
単位時間および単位化学者あたりより多くの化合物を得る能力、および新規リード化合物の発見がますます困難になることにより、コンビナトリアルケミストリーは、液相または固相技術を用い、ますます広く利用されるようになりつつある。したがって、標準的化学者が１年間に製造する化合物数は大規模に増加するであろう。
【００１１】
コンビナトリアルケミストリーは合成化学の実施における重要なパラダイムシフトを示す。過去数年間にわたり、膨大な数の化合物を無差別に無駄に合成するのではなく、特定のパラメータのセットに適合する分子のデザインと合成を強化する化学者の能力に非常に大きな進歩がみられた。現在のところ、ライブラリー合成に必要な合成規模に関しては２つの論派がある。よくデザインされた、個々の、純粋な、完全に特徴付けられた化合物が化合物ライブラリーの傾向であることは疑いないが、合成規模については大規模（２０ｍｇ／化合物）と小規模（０．５−１ｍｇ／化合物）の間でまだ対立がある。
【００１２】
固相有機化学の成功と利点にも関わらず、この技術にはまだ制限がある。第１に、高性能ポリエチレングリコールベースの樹脂およびグラフト重合支持体の開発によりこの問題はある程度解決されたが、該反応は対応する液相を用いるものに比べて遅くなりうる。
【００１３】
第２に、反応の進行をモニターするのが難しいこともあり得る。近年、この領域では、フーリエ変換赤外分光分析、マトリックス補助レーザー脱離インテフェロメトリー（ｉｎｔｅｆｅｒｏｍｅｔｒｙ）質量分析、ゲル相およびマジックアングルスピニング（ＭＡＳ） 核磁気共鳴分析法などのような技術を用いてかなりの改善がなされている。しかしながら、これら技術はまだ、従来の液層技術、例えば薄層クロマトグラフィー、ガスクロマトグラフィー質量分析、液体クロマトグラフィー質量分析、ＳＦＣ質量分析、核磁気共鳴分析法などと同様の急速で好都合な同品質の分析法を提供しない。この問題は、最近、固相反応のＭＡＳ−核磁気共鳴モニタリングにグラフト重合体表面を用いてある程度対処されてきた（ＳｅｆｌｅｒおよびＧｅｒｒｉｔｚ、Ｊ． Ｃｏｍ． Ｃｈｅｍ． ２０００，２，１２７−１３３）。
【００１４】
第３に、固相有機化学の最も時間のかかる局面のひとつは、通常、特に長い合成経路を必要とする重合体支持基質を用いて液相化学の最適化を試みる方法である。
【００１５】
過去数年間にわたり、コンビナトリアルライブラリー合成のパラレル液相法の開発がますます強調されてきた。液相合成は明らかな利点を有し、１００年にわたる化学反応実績で得られた経験が利用可能であり、反応を標準的技術を用いてモニターすることができ、また固体支持体からの化合物の付着および分離にさらなる工程を必要としない。
【００１６】
従来、多くの反応生成物を同時に精製するのが難しいことから、通常、液相パラレル合成は短い高収率の反応系列にのみ応用された。これらの問題は、反応混合物と反応させ、それから未反応の試薬を除去するようにデザインされた特異的機能化樹脂の開発により最近対処されてきた。これらのいわゆる重合体支持試薬とスカベンジャー樹脂は液相パラレル合成に革命をもたらした。
【００１７】
支持された試薬は支持物質と結合する反応性種である。それらは基質を新規化学生成物に変換し、過剰もしくは使用済み試薬をろ過して除去してよい。
【００１８】
支持された触媒は支持物質と結合する反応性種である。それらを化学量論的量以下で用いて基質を新規化学生成物に変換し、次いで、ろ過して除去し、再生してよい。
【００１９】
支持されたスカベンジャーは支持物質と結合する反応性種である。それらは選択的に減衰するかまたは反応の副産物を隔離し、または過剰もしくは未反応の出発物質を除去し、これをろ過して除去してよい。
【００２０】
このようにして、固相合成の利点、すなわち、反応が完結するのを促がすために過剰の試薬を用いることができ、精製物を単離し易いことにより液相合成に応用可能になる。産業的方法に不可欠な利点は、毒性、有害もしくは危険な試薬およびその副産物を固定化することができるため、溶液中に放出されず、それによりその全体的許容性、有用性、および安全性プロフィールを改善することができることである。さらに、低収率で、精製物の複合体混合物が生じる反応については、スカベンジャーを用い、単調な常套的後処理および精製工程を必要とすることなく、簡単な方法で純粋な精製物を単離することができる。簡単な後処理工程、例えばろ過および溶媒除去は、固体支持試薬およびスカベンジャーを特にコンビナトリアルライブラリーの生成にとって魅力的なものにする。
【００２１】
合成すべき化合物数は増加するにつれ、並行して樹脂を操作する複雑さが過大に増大する。したがって、本方法の根本的制限は、高処理能力パラレル法では固相を除去する必要があるため、樹脂を用いる利点がいくらか打ち消されることである。一般的に、ロボット自動化のような高額な装置が樹脂を除去するのに必要である。さらに、樹脂は溶媒中で膨張するので、反応溶液が実質的に乾燥する可能性を排除するには大過剰の溶媒が必要である。有機溶媒は毒性であるかも知れず、その廃棄は重大な環境問題になる。
【００２２】
大量や少量に関わらず分子のアフィニティ分離には、目的分子が固相マトリックスといかに相互作用するかを根本的に理解することが必要である。この基本的相互作用にはすべて化学的根拠があり、化学的官能基の相互作用に伴って生じる。異なる官能基が固相と液相の間でいかに相互作用するかを理解することにより、特定タンパク質が特定の固相表面といかに反応するかを予測することができる。
【００２３】
本発明者らは、ある特定のプラスチックおよびその修飾型を多パラレル有機化合物合成およびいくつかの他の関連適用のための固体支持体として用いることができることをみいだした。
【００２４】
本発明者らは、モジュラーグラフト重合表面である固相支持体と結合する試薬とスカベンジャーを用いることにより合成効率の著しい改善が達成できることもみいだした。モジュラーグラフト表面を用いることにより上記欠点が克服される。本発明のモジュラーグラフト表面は全般的固相有機合成と生体分子、例えばタンパク質、オリゴヌクレオチド、核酸、ペプチド、およびレクチンのアフィニティ捕捉、提示もしくは調製の両方に応用可能である。
【００２５】
（発明の要約）
簡単には、一般的に、本発明は固相有機合成用の試薬もしくは生体分子、例えばタンパク質、オリゴヌクレオチド、核酸、ペプチド、およびレクチンのアフィニティ捕捉、提示もしくは調製用の試薬として用いるのに適した活性化モジュラーグラフト重合表面を指向するものである。本発明のグラフト重合表面はコンビナトリアル合成プロトコールにおけるスカベンジャー試薬、およびタンパク質精製およびプロテオミクスにおけるアフィニティー試薬として特に有用である。
【００２６】
第１の局面において、本発明は活性化モジュラーグラフト重合表面を提供する。
【００２７】
用語「グラフト重合表面」はグラフト重合により修飾された重合体を表す。グラフト重合により修飾されたその誘導体、混合物および共重合体も本発明の範囲内である。非常に広範なベース重合体、例えば、所望により置換されたポリオレフィン、シリコン重合体、天然または合成ゴム、ポリウレタン、ポリアミド、ポリエステル、ホルムアルデヒド樹脂、ポリカーボネート、ポリオキシメチレン、ポリエーテルもしくはエポキシ樹脂、またはこれらのあらゆるものを含む共重合体を用いてよい。所望により置換されたポリオレフィンを、ポリアルケン、例えば、ポリエチレン、ポリプロピレンおよびポリイソブチレン； アクリル重合体、例えばポリアクリレート、ポリメタクリレートおよびポリエチルアクリレート； ハロゲン化ビニル重合体、例えばポリ塩化ビニル； フッ素重合体、例えばポリテトラフルオロエチレン、クロロトリフルオロエチレンおよびフッ化エチレン−プロピレン； ポリビニルエーテル、例えばポリビニルメチルエーテル； ハロゲン化ポリビニリジン、例えばフッ化ポリビニリジンおよび塩化ポリビニリジン； ポリアクリロニトリル； ポリビニルケトン； ポリビニル芳香族化合物； およびポリビニルエステル、例えばポリビニルアセテートから選んでよい。他の適切なベース重合体は当業者に知られている。例えば、Ｈａｎｓ Ｄｏｍｉｎｉｎｇｈａｕｓ、Ｐｌａｓｔｉｃｓ ｆｏｒ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｓ： Ｍａｔｅｒｉａｌｓ、Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ、Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｈａｎｓｅｒ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９９２）参照。当業者は、ある重合体が本発明での使用に適しているかどうかを日常的方法を用いて容易に試験することができる。
【００２８】
本明細書で用いている用語「固相化学」は その最も広い意味であり、化学的構成要素および／または化合物が種々の化学的適用時に結合する不溶性物質である固体支持体の使用を表す。
【００２９】
ある好ましい態様において、該重合体はポリエチレンとポリプロピレンの共重合体である。第２の好ましい態様において、該重合体は分枝ポリオレフィンまたはグラフト重合により修飾されたその誘導体、混合物もしくは共重合体である。本明細書ではこれを「修飾分枝ポリオレフィン」といい、これは該グラフトがポリアクリル酸であるときに特に好ましい。この修飾分枝ポリオレフィンはそれ自体で用いられ、本発明の第２の局面を表す。
【００３０】
好ましくは、該分岐鎖ポリオレフィンは、ポリアルキルアルケン、より好ましくはポリ−（４−メチルペンテン−１）（本明細書では「ＰＭＰ」という）である。三井化学（〒１００　東京都千代田区霞が関３−２−５）が製造したＰＭＰの商標名はＴＰＸである。
【００３１】
グラフト重合の適切な種類には、ガンマ線照射グラフト重合、オゾン誘発グラフト重合、プラズマ誘発グラフト重合、ＵＶ誘発グラフト重合、および化学誘発グラフト重合、例えばパーオキシダーゼ誘発グラフト重合が含まれる。
【００３２】
分枝ポリオレフィンにグラフトしてよい重合体には、ポリビニル、ポリスチレン、ポリ−α−メチルスチレン、ポリビニルアルコール、例えば、酢酸ポリビニル、ポリアクリレート、例えばポリアクリル酸、ポリメタクリレート、例えば２−ヒドロキシエチルメタクリレート（ＨＥＭＡ）、ポリアクリルアミド、例えばジメチルアクリルアミド（ＤＭＡ）、ポリエチレングリコール（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｋｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ）、ポリ乳酸、およびその誘導体、混合物、および共重合体が含まれる。ある好ましい態様において、グラフト重合体は、ポリスチレンまたはα−メチルスチレンの誘導体である。第２の好ましい態様において、グラフト重合体はポリビニルアルコールである。
【００３３】
用語「活性化（された）」は、試薬、例えばトリフェニルホスフィン、還元剤または酸化剤、キレート金属、例えばニッケルもしくはカルシウム、スカベンジャー、例えば求核基、例えばアミノメチルもしくはヒドラジノ、または求電子基、例えばイソシアネート、塩化トシルもしくはベンズアルデヒド、または触媒、例えばジメチルアミノピリジンが結合したグラフト重合表面を表す。該グラフトがポリアクリル酸であるときはキレート金属が好ましい。
【００３４】
用語「モジュラー」は、活性化グラフト重合表面が一連の同時化学反応に用いるのに適した、再生可能な化学特性をもたらす複数の物理装置の形であることを意味する。これらは広範な望ましい形状、例えばランタン、ギア、ピン、パック、ディスク、ビーズ、マイクロタイタープレート、シートなどであってよい。活性化グラフト重合体は所望の用途に応じてあらゆる形状に成形してよい。これは、活性化グラフト重合支持体の物理化学的特性に柔軟性も提供し、樹脂を使用するときと違って特殊なコンテインメント装置を必要としないことを意味する。
【００３５】
活性化部分は、アルデヒド、カルボキシレート、アミノ、ヒドロキシド、ビオチン、チオール、トシル酸、塩化トシル、ヒドラジノ、イソシアネート、または化学的スカベンジャー、固体支持試薬、固体支持触媒、タンパク質のアフィニティ捕捉物質として作用する適切な化学反応と共に用いることができるあらゆる他の化学的部分であってよい。好ましくは活性化部分はアルデヒドである。
【００３６】
好ましくは、該グラフト重合表面は、シッフ塩基形成をすることができるアミン化合物である標的物質と結合することができる。より好ましくは、標的物質は、ビオチン化分子、例えば、ペプチド、タンパク質、オリゴヌクレオチド、脂質または糖である。あるいはまた、標的物質は、タンパク質、例えばストレプトアビジンもしくは酵素、例えばホースラディッシュパーオキシダーゼである。
【００３７】
所望により、アルデヒドと誘導体化重合体支持体の間に、同じかまたは異なる１またはそれ以上のスペーサー配列があってよい。
【００３８】
特に好ましい態様において、本発明は、
（ａ）例えばフェニルヒドラジンを除去するのに用いることができるベンズアルデヒドポリスチレンランタン、
（ｂ）ストレプトアビジンもしくはホースラディッシュパーオキシダーゼと結合したベンズアルデヒド ポリスチレンランタン、および
（ｃ）ヘキサヒスチジン標識タンパク質のアフィニティ分離に用いることができるニッケルキレートポリアクリル酸ギアを提供する。
【００３９】
本発明のタンパク質アフィニティ捕捉物質は特にプロテオミックスの用途に用いるのに適していることは認識されよう。
【００４０】
本明細書の目的に関して、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は「限定されるものではないが、含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」を意味し、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」は対応する意味を有することは明確に理解されよう。
【００４１】
（図面の簡単な説明）
図１は、ＰＭＰギアの寸法を示すダイアグラムである。
図２は、本発明のニッケルキレートポリアクリル酸ギア（ＰＭＰギア）を示す写真であり、左から右に
（１）アクリル酸でグラフトしたギア（２）、
（２）ローダミンＢ色素で染色した（１）のギア、
（３）ニッケルキレート金属で処理した（１）のギア、
（４）１％ルベアン酸で染色した（３）のギアを示す。
【００４２】
（発明の詳細な説明）
これから、以下の非限定的実施例および図面のみを参照して本発明を詳細に説明する。
【００４３】
モジュラー形状の柔軟性をもたらす本発明のグラフト重合表面の能力に加え、本発明の重合表面、分枝ポリオレフィンの他の利点には、
融点が約２２０℃〜約２４０℃の高熱耐性（これは、約２００℃までの反応温度に耐え得ることを意味し、これはほとんどの有機化学用途に用いる温度範囲を網羅する。）、
可視光の透過率が＞９０％、および紫外線が約３００ｎｍ〜約４００ｎｍである優れた透明度（これにより色に頼る用途において有用になる。）、
優れた化学的耐性、
良好な加熱エージングと蒸気または沸騰水に対する耐性、
約３００ｎｍｏｌ／ｃｍ２までの高ローディング（可能な最大ローディングが約１２４ｎｍｏｌ／ｃｍ２である樹脂に比べて優れた収率特性を生じる。）、
バッチおよびフロー型合成装置の両方に好適、および
マイクロタイタープレート中で成形するときは、小分子（ＭＷ＜５００）、ペプチド、およびオリゴヌクレオチドの小規模（＜５００ｎｍｏｌ）合成に用いる可能性を有することが含まれる。
【００４４】
固相化学に対して２つの利点がある。最初に、支持体結合反応生成物の単離は、該支持体結合物質から試薬を洗浄して除くことにより簡単に達成されるので、該反応は過剰の試薬を用いることにより完結させることができる。第２に、分離した化合物を操作し、化合物が固体支持体に結合するときに化合物の同一性を追跡するために革新的方法を利用することができる。
【００４５】
本発明の重合体が特に有用である固相化学用途の実施例には、化学合成、スカベンジング、精製、固定化および／またはキレート化が含まれる。
固相試薬およびスカベンジャーを製造するためにフラグト表面を使用すると、（ａ） グラフト表面は多くの種々の望ましい形状、例えば再生可能な化学特性をもたらすランタン、ギア、ピン、パック、ビーズ、ディスク、マイクロタイタープレート、シートなどに成形することができ、（ｂ）モジュラー支持体は膨張しないので、反応溶液の容量は、化学反応を行う前に確信を持って設定することができ、（ｃ）モジュラー支持体、例えばランタン、ギア、ピン、ディスク、またはパックは８ｘ１２または同様のフォーマットに成形することができ、簡単に反応溶液に入れて反応させ、次いで簡単に並行して溶液が除去されるので顕著な利点がある。
【００４６】
化学合成用途には、有機化合物の合成、特に生物有機化合物、例えば、ペプチド、タンパク質およびオリゴヌクレオチドの合成が含まれる。
【００４７】
本発明の重合体、特に本発明の分枝ポリオレフィンおよび修飾分枝ポリオレフィンのより高いローディング能は、それらがスカベンジャー用途、すなわち、化学反応物から望ましくない副産物を除去するのに適していることを意味する（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ、Ｌ． Ａ．、Ｒｅｃｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎｓ ｉｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ、２０００、４，３２４−３３７）。本発明のグラフトモジュラー重合支持体を用いるスカベンジャー反応を行うための特殊なろ過装置も必要でない。
【００４８】
別の重要な用途は、タンパク質分解酵素の基質およびインヒビター特異性を決定するために用いる固相蛍光減衰アッセイとしてである（Ｓｔ Ｈｉｌａｉｒｅ、Ｐ． Ｍ．、Ｗｉｌｌｅｒｔ、Ｍ．、Ｊｕｌｉａｎｏ、Ｍ． Ａ．、Ｊｕｌｉａｎｏ、Ｌ．、Ｍｅｌｄａｌｖ Ｍ．、Ｊ Ｃｏｍｂ．． Ｃｈｅｍ．、１９９９、１、５０９−５２３）。
【００４９】
本発明のグラフトモジュラー重合支持体から得られる高い反応速度論と一体となった高ローディングは、該重合体をアフィニティクロマトグラフィー用途の優れた支持体にする。プロテオミック混合物由来のタンパク質の精製、およびゲノミック混合物由来のＤＮＡの精製は、用途の２つの主な領域である。例えば、ポリアクリル酸の分枝ポリオレフィンへのグラフトはニッケルイオンをキレートすることができる表面をもたらす。次に、この表面は、多ヒスチジンタグ、例えばヘキサヒスチジンを有する遺伝子操作されたアフィニティ補足タンパク質に用いることができる。ヒスチジンタグはニッケル表面と統合する。
【００５０】
アクリル酸でグラフトした分枝ポリオレフィンは、カルボン酸基を有する表面を生じる。この表面は上記のような金属、例えばニッケルだけでなく、他の金属、例えば銅、亜鉛、カドミウム、銀、パラジウム、プラチナ、金および鉛と結合する。すなわち、修飾分枝ポリオレフィンは、環境からの金属の除去、例えば、汚染部位の清浄化、または汚染の予防、例えば排出流に放出する前の産業排水の処理もしくは汚水処理に適用される。
【００５１】
本発明は、特定のモジュラー形状および重合体と活性基の組み合せの使用を参照して詳細に説明されるが、他の方法により活性化されるランタン、ギア、または他のモジュラー形状、例えばカルボキシレート、アミノ、ヒドロキシド、ビオチン、または固相試薬もしくはスカベンジャーとして、もしくは生体分子、例えばタンパク質、オリゴヌクレオチド、核酸、ペプチド、およびレクチンを捕捉、提示もしくは調製するためのアフィニティ表面として適切な化学反応で使用するあらゆる他の化学的部分が本発明で使用するのに適していることは明確に理解されよう。
【００５２】
長年、本発明者らは固相コンビナトリアルペプチド合成に複数ピンアレー系を用いてきた。この系はＭｉｍｏｔｏｐｅｓ Ｐｔｙ Ｌｔｄ、Ｃｌａｙｔｏｎ、Ａｕｓｔｒａｌｉａにより販売され、ペプチドを合成し、ペプチドライブラリーを合成するのに用いられてきた。特許のピン、Ｃｒｏｗｎ（登録商標）およびＳｙｎＰｈａｓｅ（登録商標）ランタン支持系は、２−ヒドロキシエチルメタクリレート重合体（ＨＥＭＡ）、メタクリル酸／ジメチルアクリルアミド重合体（ＭＡ／ＤＭＡ）もしくはポリスチレン（ＰＳ）（例えば、Ｍａｅｊｉら、Ｒｅａｃｔｉｖｅ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ １９９４、２２、２０３−２１２）でグラフトされたポリエチレンもしくはポリプロピレン共重合体を利用する。
【００５３】
本発明に用いてよい試薬の例、およびその特に適した用途を表１に示す。この一覧は代表例のみであり、網羅的なものではないことは明らかに理解されよう。
【００５４】
表１
グラフト重合体結合試薬およびスカベンジャー
【表１】
2004503673.tif 000002
【００５５】
2004503673.tif 000003
【００５６】
実施例１： １０００ ＰＭＰ「ギア」＊のグラフティング
スチレン（４８ ｍＬ）をメタノール（１１２ ｍＬ）と混合した。次に、混合物を１０００ギアを含むボトルに注ぎ入れた。混合物を窒素で２０分間パージした。ボトルを密栓し、次いで照射器中に置いた。ボトルを時々振盪させながら内容物を線量１．６ｋＧｙ／時で７時間照射した。ボトルを除去し、スチレンを流出させ、内容をジクロロメタンで洗浄した（（５ｘ１０分間）。該ギアを除去し、乾燥した後、誘導体化した。　＊「ギア」は特定の形成された形状のＰＭＰを表す。寸法は図１を参照のこと。
【００５７】
実施例２： ４−クロロ−３−［３−（４−トリフルオロメチル−フェニル）−ウレイド］−ベンズアミドの固相合成
実施例１のグラフトポリスチレンギアをアミノメチル化し、Ａｄａｍｓらに記載の（Ａｄａｍｓ、Ｊ． Ｈ．、Ｃｏｏｋ、Ｒ． Ｍ．、Ｈｕｄｓｅｎ、Ｄ．、Ｊａｍｍａｌａｍａｄａｋａ、Ｖ．、Ｌｙｔｔｌｅ、Ｍ． Ｈ．、およびＳｏｎｇｓｔｅｒ、Ｍ． Ｆ．、Ｊ． Ｏｒｇ． Ｃｈｅｍ．、１９９８，６３，３７０６−３７１６）、および下記反応式１に示す標準的方法を用いてＲｉｎｋ（リンク）リンカーで誘導体化した。
【００５８】
【化１】
2004503673.tif 000004
【００５９】
ギア（ローディング＝９μｍｏｌ）をＤＭＦ中の２０％ｖ／ｖ ピペリジンで覆い、室温に３０分間放置する。溶液をデカントし、次いで、ギアをＤＭＦ（２ｘ３分間）およびＤＣＭ（２ｘ３分間）で洗浄した。各Ｆｍｏｃ脱保護ギアを室温で２時間、５０％ｖ／ｖ ＤＣＭ／ＤＭＦ中のＤＩＣ（０．２Ｍ、１００μｍｏｌ、２．９モル当量）、ＨＯＢｔ（０．２Ｍ、１００μｍｏｌ、２．９モル当量）、および４−クロロ−３−ニトロ安息香酸（０．２Ｍ、１００μｍｏｌ、２．９モル当量）の溶液０．５ｍＬで処理した。溶液をデカントし、次いで、ギアをＤＭＦ（２ｘ３分間）およびＤＣＭ（２ｘ３分間）で洗浄した。各ギアを室温で４時間、０．５ｍＬの塩化スズ（ＩＩ）二水和物の２Ｍ溶液（１０００μｍｏｌ、２９モル当量）で処理した。溶液をデカントし、次いで、ギアをＤＭＦ（２ｘ３分間）およびＤＣＭ（２ｘ３分間）で洗浄した。ギアを４０℃／約１ｍｍＨｇの減圧オーブン中で１８時間、前乾燥した。各ギアを３５℃で１８時間、無水ＤＣＭ中の４−トリフルオロメチルフェニルイソシアネートの０．５Ｍ溶液０．５ｍＬ（２５０μｍｏｌ、７．４モル当量）で処理した。反応液を室温に冷却し、次いで溶液をデカントした。次に、ギアをＤＣＭ（１ｘ３分間）、ＤＭＦ（２ｘ３分間）、およびＤＣＭ（２ｘ３分間）で洗浄し、空気乾燥した。個々のギアをＬａｂｓｙｓｔｅｍｓ（登録商標） １．１ｍＬ ポリプロピレンチューブ中に置き、ＤＣＭ（０．６−０．８ｍＬ）中の２０％ｖ／ｖ ＴＦＡで１時間処理した。過剰のＴＦＡおよび溶媒を遠心蒸発器で除去した。さらに、４０℃／約１ｍｍＨｇの減圧オーブン中に１８時間置くことにより乾燥を達成した。粗生成物の重量および該ギアの規定の初期ローディングに基づき、「定量的」収量の４−クロロ−３−［３−（４−トリフルオロメチル−フェニル）−ウレイド］−ベンズアミドを得た。試料を、ＨＰＬＣまたはエレクトロスプレー質量分析（ＥＳＭＳ）分析については９０％ｖ／ｖ ＣＨ３ＣＮ／Ｈ２Ｏに、また１Ｈ ＮＭＲ分析法についてはＤＭＳＯ−ｄ６に溶解した。逆相ＨＰＬＣ（Ｃ１８カラム）に基づく純度（２１４ｎｍで＞９５％）。分析的ＨＰＬＣを、Ｒａｎｉｎ ｍｉｃｒｏｓｏｒｂ（ラニンミクロソーブ）−ｍｖ（＃８６−２００−Ｆ３） ＲＰ−１８カラム（１００Ａ、３μｍ）を用いるＷａｔｅｒｓクロマトグラフィーシステムを用いて行った。以下の条件を用いた：緩衝液Ａ＝水（０．１％ Ｈ３ＰＯ４）； 緩衝液Ｂ＝９０％アセトニトリル／１０％水（０．１％ Ｈ３ＰＯ４）； 直線勾配Ａ〜Ｂ、１〜１１分間； 流速＝１．５ｍＬ ｍｉｎ−１。吸光度を２１４および２５４ｎｍで記録した。ＨＰＬＣ純度を２１４ｎｍでピーク面積により測定した。ＥＳＭＳ： 実測値 ３５８．００［Ｍ＋Ｈ］； 理論値 ３５８．００。ＥＳＭＳ分析は、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｓｃｉｅｘ ＡＰＩ ＩＩＩ質量分析器を用いて行った。
【００６０】
実施例３： ポリスチレン−ベンズアルデヒド ランタン３の合成
新鮮ジクロロメタン（８５０ｍＬ）、次いでジメチルメチルエーテル（２７．３ｍＬ、３００ｍＭ）を２Ｌマルチネック丸底フラスコ中のポリスチレンランタン（４０００）に加えた。ジメチルメチルエーテルは毒性が高く、ヒュームフードの中だけで用いるべきである。装置および試薬の処理および洗浄において標準的予防措置をとらねばならない。フラスコの内容を窒素雰囲気下で器械的振盪により混合した。ＳｎＣｌ４（１５．６ｍＬ、１５０ｍＭ）を乾燥ガラスシリンジを用いて徐々に加えた。ＳｎＣｌ４は空気感受性が高く、使用前に窒素を通気すべきである。混合物を室温で５時間反応させ、ランタンから排出させ、メタノール（１Ｌ）を含むビーカーに入れた。ランタンをジクロロメタン（２ｘ１０分間）、次いで熱２０％ Ｈ２Ｏ／ＴＨＦ（１時間）で洗浄し、２０％ Ｈ２Ｏ／ＴＨＦに一夜浸漬し、次いでジクロロメタン（３０分間）に浸漬し、空気乾燥した。生成物はポリスチレンベンズアルデヒドランタン３である。
【００６１】
実施例４： フェニルヒドラジンを除去する（スカベンジ）するためのポリスチレンベンズアルデヒドランタンの使用
実施例３に記載のごとく製造したポリスチレンベンズアルデヒドランタン（１０ランタン、３当量））を１％酢酸／ジクロロメタン中のフェニルヒドラジン（１当量）を含む混合物に加えた。混合物を室温で１時間静かに撹拌し、次いで反応混合物からのフェニルヒドラジンの除去が完結したことを示す簿相クロマトグラフィー（溶媒系： 酢酸エチル、ペトロール、メタノール： １０，３０，５）を行い、２を得た。
【００６２】
実施例５： ベンズアルデヒド ポリスチレンランタンに対するタンパク質の結合
以下はランタンのさらなる用途である。ランタンに対するタンパク質の一般的結合方法を示す。用途の実例として、２つのタンパク質、ストレプトアビジン（ＳＡ）とホースラディッシュパーオキシダーゼ（ＨＲＰ）を用いた。各タンパク質のアミン基とアルデヒドを反応させることにより該タンパク質をランタンと結合させシッフ塩基を形成した。次いで、還元的アミノ化によりランタンからのタンパク質の漏出が最小限である安定な共有結合を形成する。
【００６３】
この実施例において、種々の誘導体化ランタンフォーマットを用いることができ、例えば、アルデヒドと誘導体化重合体支持体の間に異なるスペーサー配列があってよく、この例では、用語ランタンは表面にアルデヒド部分を有するように化学的に誘導体化されたランタンを意味するものと理解されよう。ランタンの典型的ローディングは≧１５μｍｏｌ／ランタンである。
【００６４】
タンパク質がランタンと結合し得ることを証明するため、未処理ランタンおよび利用可能なアルデヒドを化学的にブロックするよう処理したランタンについて、選択したタンパク質の結合を試験した。タンパク質を結合する性質により、タンパク質は非特異的吸着により名目上ブロックされた表面にも結合するかもしれない。この非特異的結合を調べるため、ブロックされたランタンも製造し、試験した。
【００６５】
ブロッキング方法
数個のランタンを、室温で１時間、０．２％ｗ／ｖシアノ水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＢＨ３ＣＮ）を含む１Ｍ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４）中でインキュベーションした。
次に、処理したランタンを水で５回、０．０１Ｍリン酸緩衝生理食塩水、ｐＨ７．４（ＰＢＳ）で１回洗浄した。
【００６６】
タンパク質のカップリング
２つのタンパク質溶液をストレプトアビジン（０．０５ｍｇ／ｍＬ、０．２％ｗ／ｖ ＮａＢＨ３ＣＮ含有）、およびホースラディッシュパーオキシダーゼ（０．０５ｍｇ／ｍＬ、０．２％ｗ／ｖ ＮａＢＨ３ＣＮ含有）について調製した。ランタンおよびブロックされたランタンをこれらタンパク質溶液に加え、室温で２時間、次いで４℃で一夜インキュベーションした。次に、すべての処理ランタンを水で５回、ＰＢＳで１回洗浄した。
【００６７】
実施例６： タンパク質処理ランタンの試験
ストレプトアビジン処理ランタンを酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）で試験した。ビオチン化陽性および陰性結合ペプチドが利用可能なモノクローナル抗体を用いた。処理したランタンを２群に分け、その一つを「陽性ペプチド」を含むＰＢＳ溶液中でインキュベーションし、他方を「陰性ペプチド」を含むＰＢＳ溶液中でインキュベーションした。ＥＬＩＳＡは、Ｔｒｉｂｂｉｃｋ（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍａｎｕａｌ １９９６、Ｃｈ． １０．８，８１６−８２６）に記載のビオチン化ペプチドＥＬＩＳＡプロトコールに従った。
【００６８】
平均吸光度の結果を表２に示す。
表２
ストレプトアビジンに対するＥＬＩＳＡアッセイの結果
ランタン−ＳＡ−ペプチド　　　 吸光度
陽性ペプチド　　　　　　　 １．２
陰性ペプチド　　　　　　　 ０．２
【００６９】
ホースラディッシュパーオキシダーゼ処理ランタンを水で５回洗浄し、次いで個々にＥＬＩＳＡ基質の部分標本中に入れた。用いたプロトコールは上記の通りであった。平均吸光度の結果を表３に示す。
表３
ホースラディッシュパーオキシダーゼに対するＥＬＩＳＡアッセイの結果
ランタン　　　　　　　　　　　 吸光度
ランタン−ＨＲＰ　　　　　　　　　 １．３５
ブロックされたランタン−ＨＲＰ　　 ０．７８
【００７０】
２つのタンパク質について得られた結果は、タンパク質を固定化するための誘導体化ランタンの使用を説明する。ＨＲＰについて得られた結果は、酵素活性が維持され、該タンパク質が結合方法において変性しなかったことを明らかに示す。
【００７１】
機能的ストレプトアビジン活性の保持は、誘導体化ランタンを、あらゆるビオチン化分子、例えばペプチド、タンパク質、オリゴヌクレオチド、脂質および糖の固定化に用いることができることを明らかに示している。該ランタンを用いるストレプトアビジン、アビジンもしくはあらゆる修飾アビジンの固定化、次いでビオチン化分子の固定化は、当業者によって多くの用途に活用することができる。
【００７２】
実施例７： ニッケルキレートポリアクリル酸ギアの合成
ポリアクリル酸グラフトポリ−（４−メチルペンテン−１）からなるギアを水、０．１Ｍ ＮａＯＨ、水で洗浄し、次いで、ニッケル溶液（１５０ｍＭ ＮｉＳＯ４．６Ｈ２Ｏ）で３０分間処理した。次に、該ギアを水で３回洗浄した。これにより淡緑色に着色したギアとなった。ポリアクリル酸グラフトに対するニッケルのキレート化を確認するため、ニッケルキレートギアを０．１Ｍ水性水酸化アンモニウムで洗浄し、次いでエタノール溶液中の１％ルベアン酸と６０分間反応させた。メタノールで洗浄後のギアの色は黒色のままである。これを図２に示す。
【００７３】
実施例８： 種々のベース重合体を含むニッケルキレートポリアクリル酸ギアにおけるヘキサヒスチジン標識組換えタンパク質の固定化
３種の異なる注入成形ベース重合体のアクリル酸をグラフトする能力およびヘキサＨｉｓ標識組換えタンパク質、ＳＰ２２（精子タンパク質２２）（Ｗｅｌｃｈ、Ｊ． Ｅ．、Ｂａｒｂｅｅ、Ｒ． Ｒ．、Ｒｏｂｅｒｔｓ、Ｎ． Ｌ．、Ｓｕａｒｅｚ、Ｊ． Ｄ．、Ｋｌｉｎｅｆｅｌｔｅｒ、Ｇ． Ｒ．、Ｊ． Ａｎｄｒｏｌ．、１９９８，１９，３８５−３９３）を固定化する能力について評価した。
３種の該ベース重合体は、
（Ａ） ポリ−（４−メチルペンテン−１）（あるいは「ＰＭＰ」として知られる）、
（Ｂ） ポリプロピレンとポリエチレンの共重合体（あるいは「ＰＭＡ」として知られる）、および
（Ｃ） 高密度ポリエチレン（あるいは「ＨＤＰＥ」として知られる）。
【００７４】
すべてアクリル酸でグラフトし、実施例５に記載のごとくニッケルで処理し、６％ポリアクリル酸ギアを得た。
【００７５】
９６ウェルプレートの各ウェルに、２００μＬの８Ｍ尿素、次いで８Ｍ尿素に溶解したヘキサヒスチジン標識ＳＰ２２ ２０μＬを加えた。溶液を２つの連続するウェル中で１１倍に希釈した。上記の異なる３種類のアクリル酸グラフトギアをＮｉＳＯ４．６Ｈ２Ｏの０．１Ｍ溶液中で１時間インキュベーションし、次いで水（ｘ２）で洗浄した。ニッケルコートアクリル酸ギアをヘキサヒスチジン標識ＳＰ２２の希釈溶液を含むウェル中に入れた。反応を１時間進行させ、次いで該ギアを除去し、水（２ｘ）で洗浄した。次に、該ギアをヘキサヒスチジンＳＰ２２（ＥＬＩＳＡ基質）に対する抗体の溶液２００μＬを含むウェルに入れた。ＥＬＩＳＡプロトコールは、Ｔｒｉｂｂｉｃｋ（ｏｐ． ｃｉｔ）に記載のプロトコールに従った。平均吸光度を表４に示す。
【００７６】
表４
ヘキサヒスチジンＳＰ２２に対するＥＬＩＳＡアッセイの結果
2004503673.tif 000005
【００７７】
ＥＬＩＳＡの結果は、ニッケルキレートポリアクリル酸 ギアの成績についてＰＭＰベース重合体が優れていることを明確に示す。
【００７８】
実施例９：カルシウムキレートポリアクリル酸ギア５の合成
ポリアクリル酸グラフトポリ−（４メチルペンテン−１）からなるギアを水、０．１ ＮａＯＨ、水で洗浄し、カルシウム溶液（１５０ｍＭ ＣａＣｌ２）で３０分間処理する。次に、該ギアを水で３回洗浄する。ポリアクリル酸グラフトに対するカルシウムのキレート化を確認するため、カルシウムキレートギアを０．１Ｍ水性水酸化アンモニウムで洗浄し、次いで０．１Ｍ水性水酸化アンモニウム溶液中の１％グリオキサル−ビス（２−ヒドロキシアニル）と６０分間反応させる。水で洗浄後の該ギアの色は赤色のままである。
【００７９】
実施例１０： ミトコンドリアカルシウム結合タンパク質のアフィニティ精製のためのカルシウムキレートポリアクリル酸ギアの使用。
約ｌＯＯμＬの凍結ペレット化ミトコンドリアを８００μＬの１ＯｍＭトリス−アセテート、ｐＨ ７．０に懸濁する。２μＬのプロテアーゼインヒビターカクテル（Ｓｉｇｍａ）をミトコンドリア調製物に加え、該調製物を実施例９に記載のごとく調製したカルシウムキレートポリアクリル酸ギアと１時間インキュベーションする。該ギアを除去し、１ＯｍＭトリス−アセテートｐＨ ７．０緩衝液で洗浄する。結合カルシウム結合タンパク質を該ギアから８Ｍ尿素緩衝液で溶出する。
【００８０】
実施例１１： コンカナバリンＡ結合ランタンの合成
１０個のベンズアルデヒド ポリスチレンランタンを０．２％ｗ／ｖシアノ水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＢＨ３ＣＮ）およびコンカナバリンＡ（０．０５ｍｇ／ｍＬ）を含む１Ｍトリス／ＨＣｌ緩衝液 ｐＨ７．４中、室温で１時間インキュベーションする。
次に、処理ランタンを水で５回、次いで０．０１Ｍリン酸塩緩衝生理食塩水、ｐＨ７．４（ＰＢＳ）で洗浄する。
【００８１】
実施例１２： ミトコンドリア糖タンパク質のアフィニティ精製のためのコンカナバリンＡ結合ランタンの使用
約１００μＬの凍結ペレット化ミトコンドリアを、１ｍＭ ＣａＣｌ２、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ ＭｎＳＯ４含有１０ｍＭトリス−アセテート（ｐＨ７．０）８００μＬに懸濁する。２μＬのプロテアーゼインヒビターカクテル（Ｓｉｇｍａ）をミトコンドリア調製物に加え、実施例１１に記載のごとく調製したコンカナバリンＡ結合ランタンを該調製物中で１時間インキュベーションする。該ランタンを除去し、１ＯｍＭトリスアセテートｐＨ７．０緩衝液で洗浄する。結合糖タンパク質を８Ｍ尿素緩衝液を用いて該ランタンから溶出する。
【００８２】
実施例１３： ポリスチレンスルホン酸ランタン９の合成
１０個のポリスチレンランタンをクロロホルム（２０ｍＬ）の溶液に加えた。１０分後、クロロスルホン酸（４ｍＬ）を加え、次いで混合物を室温で１０分間振盪させた。該ランタンをジクロロメタンで５回洗浄し、次いで減圧下で乾燥してポリスチレンスルホン酸ランタンを得た。
【００８３】
実施例１４： ブロモポリスチレンランタン ７の合成
酢酸タリウム（４００ｍｇ）を１００ｍＬの乾燥ＤＣＭに溶解し、いくらかの白色沈殿物を有する黄色溶液を得た。５０個のランタン（１４５μＭＸ５０； ７．２５ｍｍｍｏｌ）を該溶液に加え、１時間振盪させた。臭素（０．５ｍＬ、９．７５７ｍｍｏｌ）を１５分間にわたり０．１ｍＬ部分に加えた。反応混合物を室温で１時間放置し、次いで溶媒をデカントした。ランタンを以下の順序の溶媒で洗浄した：メタノール（Ｘ３）、ＤＣＭ（Ｘ３）、ＴＨＦ（Ｘ３）中の２０％水の温溶液、メタノール（Ｘ２）、およびＤＣＭ（Ｘ３）。該ランタンを１時間空気乾燥し、次いで高減圧下（２５℃）で４時間乾燥して、ブロモポリスチレンランタンを得た。
【００８４】
実施例１５： イソシアネートポリスチレンランタン４の合成
トリホスゲン（１９８ｍｇ）を乾燥ＤＣＭ（ｌＯｍＬ）に溶解し、窒素下で静かに撹拌した。１２個のアミノメチル化ポリスチレンランタン（ＴＦＡ塩）を加え、窒素下で１０分間撹拌した。混合物を氷浴中で冷却し、１５分後、ジイソプロピルエチルアミン（０．２ｍＬ）を徐々に加えた。さらに０．２ｍＬのジイソプロピルエチルアミンを徐々に加え、該混合物を窒素下で３０分間撹拌した。混合物を室温に温め、次いで６時間撹拌し続けた。溶液をデカントし、該ランタンをＤＣＭ（ｘ３）、ＴＨＦ（ｘ３）、ＤＣＭ（ｘ３）で洗浄し、イソシアネートポリスチレンランタンを得た。
【００８５】
実施例１６： 高ローディングアミノメチル化ポリスチレンランタン１の合成
Ｎ−ヒドロキシメチルフタリミド（１２０ｇ）を２０％トリフルオロ酢酸／ＤＣＭ（２５００ｍＬ）に溶解し、次いでメタンスルホン酸（１２５ｍＬ）を加えた。５１００ ポリスチレンランタンを加え、混合物を２４時間静かに振盪させた。該ランタンを２０％トリフルオロ酢酸／ＤＣＭ、ＤＣＭ（ｘ２）およびメタノールで洗浄した。５％ヒドラジン／メタノール（３０００ｍＬ）の溶液を加え、混合物を１８時間還流した。該ランタンを熱メタノール（ｘ４）、１％トリフルオロ酢酸／ＤＣＭ、およびＤＣＭで洗浄した。減圧下で乾燥して高ローディングアミノメチル化ポリスチレンランタン（ＴＦＡ塩）を得た。該ローディングは８０μｍｏｌ／ランタンであった。
【００８６】
実施例１７： パルミチン酸誘導体化ランタンの合成
ＤＭＦ中の、パルミチン酸／ジイソプロピルカルボジイミド（ｄｉｉｓｏｐｒｏｐｙｌｃａｒｂｉｄｉｍｉｄｅ）／１−ヒドロキシベンゾトリアゾールの０．１Ｍ溶液を、実施例１６に記載のごとく調製した１０個の高ローディングアミノメチル化ポリスチレンランタンに加え、３時間反応させる。該ランタンをＤＭＦ（ｘ３）およびＤＣＭ（ｘ３）で洗浄し、次いで減圧下で１８時間乾燥する。
【００８７】
実施例１８： ミトコンドリア疎水性タンパク質のアフィニティ精製のためのパルミチン酸誘導化ランタンの使用
約１００μＬの凍結ペレット化ミトコンドリアを８００μＬの５Ｍ ＮＨ４０Ｈ／１０％メタノールに懸濁する。２μＬのプロテアーゼインヒビターカクテル（Ｓｉｇｍａ）をミトコンドリア調製物に加え、実施例１３に記載のごとく調製したパルミチン酸誘導体化ランタンを該調製物中で１時間インキュベーションする。 該ランタンを除去し、水中の１０％メタノールで洗浄する。結合疎水性タンパク質を８Ｍ尿素緩衝液でランタンから溶出する。
【００８８】
実施例１９： ２−クロロトリチルアルコールランタン１４の合成
塩化アルミニウム（０．７９ｇ）をＤＣＭ（１０ｍＬ）と混合し、２０個のポリスチレンランタンを加えた。２−クロロベンゾイルクロリド（１０５０ｍｇ）を加え、混合物を７分間撹拌し、次いで撹拌せずに３時間おいた。ランタンをメタノール、ＴＨＦ中の２０％水（ｘ２）、メタノール（ｘ２）、およびＤＣＭ（ｘ３）で洗浄した。ランタンをＴＨＦ中の０．８Ｍ水素化ホウ素ナトリウムに懸濁し、次いでメタノールを２滴加えた。室温で１８時間反応させた後、ランタンをメタノール、ＴＨＦ中の２０％水（ｘ２）、ＴＨＦ中の２０％ ２Ｍ ＨＣｌ（ｘ２）、ＴＨＦ中の２０％水（ｘ２）、メタノール（ｘ２）、およびＤＣＭ（ｘ３）で洗浄した。ランタンを減圧下で３時間乾燥し、２−クロロトリチルアルコールポリスチレンランタンを得た。
【００８９】
実施例２０： ＲＥＭリンカーランタン １５の合成
１０個のヒドロキシメチルＤシリーズランタン（初期特定ローディング、３６μｍｏｌ）をＤＣＭ中のＤＩＥＡ（５００μＬ、２８７０μｍｏｌ、８モル当量）の溶液５ｍＬで処理した。混合物に塩化アクリルオイル（２６０μＬ、２８７０μｍｏｌ、８モル当量）を加えた。反応液を４時間室温に放置した。試薬溶液をデカントし、次いでランタンをＤＭＦ（３ｘ３ｍｉｎ）およびＤＣＭ（３ｘ３ｍｉｎ）で洗浄した。
【００９０】
実施例２１： モルホリノランタン １６の合成
ジクロロメタン（５ｍＬ）中の、モルホリンの０．１Ｍ溶液を１０個のＳＰＰＳＤＲＥＭランタンに加え、室温で一夜反応させた。試薬溶液をデカントし、次いでランタンをＤＭＦ（３ｘ３分間）およびＤＣＭ（３ｘ３分間）で洗浄した。
【００９１】
実施例２２： トリフェニルホスフィンランタン １１の合成
窒素雰囲気下の、乾燥ＴＨＦ ５ｍＬ中のクロロジフェニルホスフィンの０．１Ｍ溶液を、１０個のリチエイテッドポリスチレンランタン ６に加えた。３時間反応させた後、該ランタンをジクロロメタン（２ｘ１０分間）、次いで熱２０％ Ｈ２Ｏ／ＴＨＦ（１時間）で洗浄し、２０％ Ｈ２Ｏ／ＴＨＦ中に一夜浸漬し、次いでジクロロメタン（３０分間）に浸漬し、空気乾燥した。
【００９２】
実施例２３： ジメチル ｍ−イソプロペニルベンジルイソシアネートランタン １７の合成
スチレンとジメチル ｍ−イソプロペニルベンジルイソシアネートスチレン（比３：１）の混合物（４８ｍＬ）をメタノール（１１２ ｍＬ）と混合した。次に、混合物を１０００個のランタンを含むボトルに注ぎ入れた。混合物を窒素で２０分間パージした。該ボトルを密栓し、次いで照射機中に置いた。ボトルを時々撹拌しながら、内容物に線量１．６ｋＧｙ／時を７時間照射した。ボトルを除去し、スチレン単量体を排出させ、次いで内容物をジクロロメタン（５ｘ１０分間）で洗浄した。該ランタンを除去し、空気乾燥した。
【００９３】
実施例２４： ４−メチルスチレン／α−メチルスチレングラフトランタンの合成
スチレンおよびα−メチルスチレン（比１：１）の混合物（４８ｍＬ）をメタノール（１１２ｍＬ）と混合した。次に、混合物を１０００個のランタンを含むボトルに注ぎ入れた。混合物を窒素で２０分間パージした。該ボトルを密栓し、次いで照射機中に置いた。ボトルを時々撹拌しながら、内容物に線量１．６ｋＧｙ／時を７時間照射した。ボトルを除去し、スチレン単量体を排出させ、次いで内容物をジクロロメタン（５ｘ１０分間）で洗浄した。該ランタンを除去し、空気乾燥した。
【００９４】
本発明を明確にし、理解させるために幾分詳細に説明してきたが、本明細書に開示した発明思想の範囲から逸脱することなく、本明細書に記載の態様および方法に対して種々の修飾と変更を行ってよいことは当業者に明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
【図１】ＰＭＰギアの寸法を示すダイアグラムである。
【図２】本発明のニッケルキレートポリアクリル酸ギア（ＰＭＰギア）を示す写真である。
【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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