(57)【要約】本発明は、細菌ＤＮＡ、ならびに細菌細胞壁上に保持および複合体形成された細菌ＤＮＡを含む組成物を用いた動物およびヒトの治療の有効性を評価する方法を提供する。治療後に細胞から放出されるサイトカイン、可溶性ＦＡＳリガンド（ｓＦａｓＬ）およびアポトーシスマーカーのような生物学的マーカーを測定して、治療の有効性を評価し、非応答患者を特定する。この方法により、これらの細菌組成物の治療上の投与を施すべき動物およびヒトと、施すべきではない動物およびヒトの識別が容易となり、かかる治療の有効性を評価する手段を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
動物またはヒトにおける生物学的応答を評価する方法であって、
細菌ＤＮＡ（Ｂ−ＤＮＡ）および薬学的に許容可能なキャリアを含む組成物を該動物またはヒトに投与し、
該組成物の投与後の生物学的分子のレベルを測定し、そして
該生物学的分子の該レベルを該生物学的分子の別のレベルと比較することにより、該動物またはヒトが該生物学的応答を示したかどうかを決定すること
を含む方法。
【請求項２】
動物またはヒトにおける生物学的応答を評価する方法であって、
細菌細胞壁（ＢＣＣ）上に保持および複合体形成された細菌ＤＮＡ（Ｂ−ＤＮＡ）および薬学的に許容可能なキャリアを含む組成物を該動物またはヒトに投与し、
該組成物の投与後の生物学的分子のレベルを測定し、そして
該生物学的分子のレベルを該生物学的分子の別のレベルと比較することにより、該動物またはヒトが該生物学的応答を示したかどうかを決定すること
を含む方法。
【請求項３】
前記生物学的分子の前記別のレベルは、前記生物学的分子に関する臨床的な値に、または前記組成物の投与前に実施した前記生物学的分子の測定に由来する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記生物学的応答を好適であるか、存在しないか、または好適でないとして評価することをさらに含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項５】
前記応答が好適でないか、または存在しない場合、前記組成物の続く投与を終結する、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記応答が好適である場合、前記組成物の続く投与を続ける、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記生物学的分子は、サイトカイン、免疫機能の指標、アポトーシス関連分子、またはそれらの組合せである、先行の請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記生物学的分子は、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８、ｓＦａｓＬ、ＮｕＭＡまたはそれらの組合せである、先行の請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記Ｂ−ＤＮＡは、マイコバクテリウム属ＤＮＡ、ボルデテラ属ＤＮＡ、ロドコッカス属ＤＮＡ、コリネバクテリウム属ＤＮＡ、ノカルジア属ＤＮＡ、リステリア属ＤＮＡ、およびエシェリキア属ＤＮＡからなる群から選択される、先行の請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記Ｂ−ＤＮＡはマイコバクテリウム属ＤＮＡである、先行の請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記Ｂ−ＤＮＡはマイコバクテリウム・フレイＤＮＡ（Ｍ−ＤＮＡ）である、先行の請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記細菌細胞壁は、マイコバクテリウム属細胞壁、ボルデテラ属細胞壁、ロドコッカス属細胞壁、コリネバクテリウム属細胞壁、ノカルジア属細胞壁、リステリア属細胞壁、およびエシェリキア属細胞壁からなる群から選択される、請求項２ないし１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記細菌細胞壁はマイコバクテリウム属細胞壁である、請求項２ないし１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記細菌細胞壁はマイコバクテリウム・フレイ細胞壁（ＭＣＣ）である、請求項２ないし１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記動物または前記ヒトは疾患を有する、先行の請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記疾患は、癌、炎症性疾患または自己免疫疾患である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
動物またはヒトの細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける生物学的応答を評価する方法であって、
細菌ＤＮＡ（Ｂ−ＤＮＡ）および薬学的に許容可能なキャリアを含む組成物を該細胞に投与し、
該組成物の投与後の生物学的分子のレベルを測定し、そして
該生物学的分子のレベルを該生物学的分子の別のレベルと比較することにより、該細胞が該生物学的応答を示したかどうかを決定すること
を含む方法。
【請求項１８】
前記生物学的分子の前記別のレベルは、前記組成物の投与前に実施した前記生物学的分子の測定に由来する、請求項１７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［発明の分野］
本発明は、細菌ＤＮＡ、ならびに細菌細胞壁上に保持および複合体形成された細菌ＤＮＡを含む組成物を用いた免疫応答を評価する方法に関する。治療後に細胞から放出されるサイトカイン、可溶性ＦＡＳリガンド（ｓＦａｓＬ）およびアポトーシスマーカーのような生物学的マーカーを測定することにより治療の有効性を評価し、非応答患者を特定する。
【背景技術】
【０００２】
［発明の背景］
アポトーシスは、成体組織を含むがこれに限定されない組織における、遺伝的にプログラムされた非炎症性のエネルギー依存型の細胞死である。細胞増殖、細胞アポトーシス、またはこれら２つの組合せの調節における異常は、癌、神経変性、自己免疫、心疾患、およびウイルス感染を含むがこれらに限定されない各種疾患の病因に関連する。免疫系の機能不全もまた、自己免疫疾患および癌の発生に関連している。
【０００３】
アポトーシスは、Ｆａｓ(French et al., J. Cell Biology, 133:355-64, 1996)、および腫瘍壊死因子１（ＴＮＦＲ１）を含むがこれらに限定されない細胞表面受容体に結合するリガンドにより開始され得る。ＦａｓへのＦａｓＬ結合は、アポトーシス実行の致死的タンパク質分解カスケードを開始するシステインアスパルチルプロテアーゼ（カスパーゼ）の活性化をもたらす細胞内シグナル伝達を開始し得て、これは核ＤＮＡ断片化、核マトリックスタンパク質（ＮｕＭＡ）の放出、および細胞基質接触の損失に関連する(Muzio et al., Cell, 85:817-27, 1996)。
【０００４】
サイトカイン、ＦａｓＬ、およびＮｕＭＡのような様々な生物学的分子は、免疫系の細胞、または細胞死およびアポトーシスを受ける細胞に関連する。インターロイキン−１２（ＩＬ−１２）およびＩＬ−１８のようなサイトカインは、免疫応答の重要な媒介物質である。
【０００５】
ＩＬ−１２は、Ｂリンパ球、樹状細胞、およびマクロファージにより優位に合成される誘導性サイトカインである。ＩＬ−１２は、単独で、および他のサイトカインと組み合わせて、Ｂ−リンパ球、ＣＤ４＋細胞、ＣＤ８＋細胞、およびＮＫ細胞を含むがこれらに限定されない白血球の成熟を促進し、インターフェロン−γの分泌を誘導する。ＩＬ−１２は、各種悪性疾患を保有するヒトおよび動物において、全身投与または局所投与後に強力な抗腫瘍活性を有することがわかっている(Brunda et al., J. Exp. Med., 178:1223, 1993; Rook et al., Blood, 94:902, 1999)。ＩＬ−１２は、樹立した腫瘍を根絶することが可能であることが示された最初のサイトカインであった。ＩＬ−１２は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞およびＴリンパ球を刺激してサイトカイン発現を高め、血管形成を阻止することによりその抗腫瘍活性を発揮するようである(Stern et al., Life Sci. 58:639, 1996)。ＩＬ−１２は、マウス膀胱癌に対する抗腫瘍活性を有することがわかっており、ヒト膀胱癌に対するＩＬ−１２の臨床的な用途を示す(Eto et al., J. Urol. 163:1549, 2000)。基線状態としての、あるいは免疫療法に応答した、高レベルのＩＬ−１２の存在は、固形腫瘍を有する患者に関する好適な予後指標である(Lissoni et al., J. Biol. Regul. Homeost. Agents, 12:38, 1998)。
【０００６】
ＩＬ−１８は、単球、マクロファージ、および表皮細胞により優位に産生される。ＩＬ−１８もまた、ＮＫ細胞、Ｔリンパ球を刺激してサイトカイン発現を高め、血管形成を阻止することによりその活性を発揮する(Cao et al., FASEB J., 13:2195, 1999; Dinarello, Methods, 19:121, 1999)。ＩＬ−１８は、ｉｎ  ｖｉｖｏで抗腫瘍活性を示す(Micaleff et al., Cancer Immunol. Immunother., 43:361, 1997)。ＩＬ−１８の機能は、ＩＬ−１２に関して報告されるものと同一であるようだが、活性化のメカニズムが異なる(Dinarello, Methods, 19:121, 1999)。例えば、ＩＬ−１８は、飽和量のＩＬ−１２の存在下でさえもＩＦＮ−γ合成、Ｔヘルパー１クローンの増殖およびＩＬ−２受容体α鎖発現を増強することができることが示されている。ＩＬ−１２およびＩＬ−１８は、マウス膀胱癌モデルにおいて相乗的な抗腫瘍効果を有することが報告されている(Yamanaka et al., Cancer Immunol. Immunother., 48:297, 1999)。
【０００７】
Ｆａｓリガンド（ＦａｓＬ）は、活性化Ｔリンパ球およびＮＫ細胞において優位に発現されるＩＩ型膜受容体である。ＦａｓＬに対する受容体であるＦａｓは、様々な組織において発現されるＩ型膜受容体である。標的組織細胞上でのＦａｓ受容体へのＦａｓＬの結合は、アポトーシスで終了する事象のカスケードを誘発する(Nagata, Ann. Rev. Genetics, 33:29, 1999)。Ｆａｓ／ＦａｓＬは、細胞傷害性Ｔリンパ球およびＮＫ細胞による癌細胞の死滅を媒介する。
【０００８】
細胞傷害性Ｔリンパ球もまたＦａｓを発現するが、それら自身のＦａｓＬから防御される。癌細胞によっては、それら自身のＦａｓＬを発現するものがある。したがって、「Ｆａｓカウンターアタック」メカニズムが発生し、それにより癌細胞のＦａｓＬは抗腫瘍Ｔ細胞のＦａｓに結合し、Ｆａｓ媒介性アポトーシスにより抗腫瘍Ｔ細胞を抹消する。ＦａｓＬは、アポトーシスによる腫瘍浸潤リンパ球の排除を引き起こす様々な癌細胞においてアップレギュレートされ得る(O'Connell et al., J. Immunol., 160:5669, 1998)。
【０００９】
ＦａｓＬはまた、メタロプロテイナーゼにより細胞表面から切断され、可溶性Ｆａｓリガンド（ｓＦａｓＬ）と称される活性な可溶型の分子を放出することができる(Kayagaki et al., J. Exp. Med., 182:1777, 1995)。ｓＦａｓＬは、非常に敏感な癌細胞のアポトーシスを誘導することができるが、ｓＦａｓＬは膜関連ＦａｓＬとは異なる。ＦａｓＬがアポトーシスにより免疫細胞および癌細胞の両方を死滅させることがわかっているのに対して、ｓＦａｓＬは、休止Ｔリンパ球および活性化Ｔリンパ球がＦａｓＬにより死滅するのを防ぐことが見出されている(Suda et al., J. Exp. Med., 186:2045, 1997)。さらに、ｓＦａｓＬは、ヒト好中球に関する走化性分子として作用する(Ottonello et al., J. Immunol., 162:3601, 1999)。
【００１０】
核分裂装置タンパク質であるＮｕＭＡは、アポトーシスを受ける細胞から放出される(Miller et al., Biotechniques, 15:1042, 1993)。ＮｕＭＡは、広範囲の癌を有する患者の血清中で(Miller et al., Cancer Res., 52:422, 1992)、具体的には、膀胱癌を有する患者の尿中で(Stampfer et al., J. Urol., 159:394, 1998)検出されている。
【００１１】
治療用組成物による有効な疾患治療は、現代医学の目標である。たいていの抗癌剤は、直接癌細胞を死滅させるように（アポトーシスの誘導）、あるいは患者の免疫応答を刺激するように設計される。多くの場合、療法が長期間施されるまで、動物またはヒトが治療的介入に応答しているかどうかを決定するのは困難である。化学療法および放射線のような他の形態の療法は、レシピエントに対して有害かつ有毒な影響を有し、数多くの他の問題を引き起こすことが多い。特定の療法が有効であるかどうかを迅速に決定する方法は、医師および獣医のような医療の専門家にとって有用であり、その結果、療法が効果のない場合には中止し、それによりレシピエントに対する有害かつ有毒な影響を最低限に抑える。必要なのは、治療的介入の有効性の測定である。
【００１２】
アポトーシスの割合は、照射、細胞傷害性化学療法、加熱、およびホルモン除去に応答する腫瘍において増加する。腫瘍の進行および、照射または化学療法的治療のような腫瘍療法は、免疫系の様々な機能を変更させる。Ｍ−ＤＮＡおよびＭＣＣは、癌細胞のアポトーシスを直接誘導することにより（化学療法様活性）、および免疫系を刺激することにより（免疫療法活性）、抗癌活性を発揮することが示されている(Filion and Phillips Exp Opin Investig Drugs 2001; 10:2157-2165)。これらの治療用組成物および他の治療用組成物を用いた疾患の治療の有効性を決定する方法が必要である。したがって、アポトーシスまたは免疫系の機能不全に関連した生物学的マーカーの測定は、癌療法の有効性を測定する手段を提供することができる。同様に、これらの生物学的マーカーを測定して、他の型の療法に対するヒトまたは動物の応答をモニタリングしてもよい。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
［発明の概要］
本発明は、薬学的に許容可能なキャリアとともに投与される細菌ＤＮＡ（Ｂ−ＤＮＡ）または細菌細胞壁（ＢＣＣ）に複合体形成され、かつ薬学的に許容可能なキャリアとともに投与されるＢ−ＤＮＡを含む免疫刺激性および／またはアポトーシス誘導性組成物の投与に対する動物およびヒトの応答を評価する方法を提供する。動物またはヒトの応答は、組成物の投与後に測定される。かかる応答は、免疫系の細胞により、およびアポトーシスを受ける細胞により、および他の細胞により実証される。
【００１４】
動物またはヒトにおける応答の評価は、生物学的液体、細胞抽出物、または組織抽出物中の１つまたは複数の生物学的分子のレベルを測定することを包含する。かかる生物学的分子としては、サイトカインおよび免疫機能の他の指標、ならびにアポトーシス関連マーカーが挙げられるが、これらに限定されない。これらの生物学的マーカーとしては、インターロイキン（ＩＬ）（例えば、ＩＬ−１２およびＩＬ−１８）、タンパク質可溶性Ｆａｓリガンド（ｓＦａｓＬ）、および核分裂装置タンパク質（ＮｕＭＡ）が挙げられるが、これらに限定されない。組成物を与えた動物もしくはヒトから得られる１つまたは複数の生物学的分子の変化は、組成物に対する応答を示す。変化は、組成物の投与前のレベルと比較した場合の、特定の生物学的分子のレベルの増加または減少であり得る。疾患の進行を促進する分子のような生物学的分子のレベルの減少は、治療効果を示し得る。疾患と内争する免疫系を助長する分子のような生物学的分子のレベルの増加は、治療効果を示し得る。組成物に対する応答の欠如は、組成物を与えた動物またはヒトが組成物に応答し得ず、組成物の連続した投与に関する候補物ではないことを示唆する。別の実施形態では、細胞を動物またはヒトから獲得して、細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで本発明のＢ−ＤＮＡ、ＢＣＣまたは他の細菌組成物に暴露させることにより試験してもよい。応答は、組成物の投与前および後の、細胞培地中もしくは細胞内の１つまたは複数の生物学的分子のレベルの差異を測定することにより評価され得る。この様式では、組成物をｉｎ  ｖｉｖｏで投与する決定がなされる前に、動物細胞またはヒト細胞、例えば腫瘍細胞または免疫系の細胞を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで応答性に関して評価してもよい。
【００１５】
動物およびヒトに由来する生物学的液体、細胞抽出物、および組織抽出物としては、尿、血液、血清、血漿、精液、脊髄液、腹水、唾液、痰、胸部滲出液、前立腺液、前立腺、膀胱、卵巣、胸部、精巣、リンパ節、および腫瘍を含む様々な組織の抽出物が挙げられるが、これらに限定されない。任意の生物学的液体、細胞抽出物、または組織抽出物が、本発明の細菌組成物の投与に対する応答性に関して評価され得る。
【００１６】
本発明の方法により、本発明の組成物による治療に応答する動物およびヒトを特定する。さらに、本発明の組成物による治療に応答しない動物およびヒトもまた特定され、それによりこれらの個体における療法の終結および考え得る代替的療法の導入の根拠を提供する。本発明の組成物は、組成物に対する動物またはヒトの応答性を評価するために、疾患を有するか、または疾患を有さない動物またはヒトに投与され得る。好ましい実施形態では、組成物を与える動物またはヒトは疾患を有する。かかる疾患としては、癌、自己免疫疾患、および炎症性疾患が挙げられるが、これらに限定されない。好ましい実施形態では、疾患は、癌または免疫系の疾患（例えば、自己免疫疾患）である。癌の型としては、膀胱癌、白血病、前立腺癌、腎臓癌、子宮癌、卵巣癌、胸部癌、結腸癌、頸部癌および肺癌が挙げられるが、これらに限定されない。自己免疫疾患の型としては、間質性膀胱炎、多発性硬化症、慢性関節リウマチ、Ｉ型糖尿病、自己免疫性血小板減少性紫斑病、重症筋無力症、尋常性乾癬、および全身性エリテマトーデスが挙げられるが、これらに限定されない。
【００１７】
本発明の免疫刺激性および／またはアポトーシス誘導性組成物は、細菌ＤＮＡ（Ｂ−ＤＮＡ）および薬学的に許容可能な組成物、または細菌細胞壁（ＢＣＣ）に複合体形成され、かつ薬学的に許容可能なキャリアと組み合わせたＢ−ＤＮＡを含む。本明細書中で使用する場合、「Ｂ−ＤＮＡ」は細菌ＤＮＡを意味し、「ＢＣＣ」は細菌細胞壁複合体を意味し、それによりＢ−ＤＮＡは細菌細胞壁上で複合体形成される。本発明の組成物、および本発明の組成物を作製する方法は、ＰＣＴ／ＣＡ／９８／００７４４号およびＰＣＴ／ＣＡ００／００３４２号（これらは、それらの全体が参照により本明細書中に援用される）に記載されている。
【００１８】
Ｂ−ＤＮＡおよび細菌細胞壁は、マイコバクテリウム種、ボルデテラ種、ロドコッカス種、コルネバクテリウム種、ノカルジア種、リステリア種、またはエシェリキア種に由来し得る。本発明の好ましい実施形態では、Ｂ−ＤＮＡはマイコバクテリウム種に由来し、細菌細胞壁はマイコバクテリウム種に由来する。マイコバクテリウム種としては、スメグマ菌(M. smegmatis)、Ｍ．フォルツイトウス(M. fortuitous)、Ｍ．カンサイー(M. kansaii)、ヒト型結核菌(M. tuberculosis)、ウシ型結核菌(M. bovis)、トリ型結核菌(M. avium)、およびチモテ菌(M. phlei)が挙げられるが、これらに限定されない。本発明の好ましい実施形態は、チモテ菌ＤＮＡ（Ｍ−ＤＮＡ）および薬学的に許容可能なキャリアを含む組成物の投与、ならびに応答の評価を包含する。本発明の別の好ましい実施形態は、チモテ菌細胞壁（ＭＣＣ）に保持および複合体形成されたＭ−ＤＮＡおよび薬学的に許容可能なキャリアを含む組成物の投与、ならびに応答の評価を包含する。本明細書中で使用する場合、「Ｍ−ＤＮＡ」はチモテ菌ＤＮＡを意味し、ＭＣＣはチモテ菌細胞壁複合体を意味し、それによりＭ−ＤＮＡは、チモテ菌細胞壁上で複合体形成される。これらの組成物は、癌細胞を含むがこれらに限定されない応答性細胞の増殖の阻止、および応答性細胞におけるアポトーシスの誘導、ならびに生理活性分子を産生するための免疫系の応答性細胞の刺激を含むがこれらに限定されない免疫応答を促進する。さらなる応答としては、疾患の進行を促進する病原性分子のレベルの減少が挙げられる。
【００１９】
本発明のＢ−ＤＮＡ組成物およびＢＣＣ組成物は、当業者に一般に知られている幾つかの経路により、動物またはヒトに投与され得る。これらの組成物、またはかかる組成物および他の物質（例えば、様々な形態に特に適している本発明のキャリア）を含む配合物のｉｎ  ｖｉｖｏでの投与方法としては、以下のタイプの投与：経口（例えば、口腔内または舌下）、肛門、直腸（坐剤として）局所、非経口、エーロゾル、吸入、静脈内、動脈内、髄腔内、腹腔内、経皮、皮内、皮下、筋内、子宮内、膀胱内、前立腺内、尿道内、膣、体腔への、腫瘍または内部損傷の位置での外科的投与、直接腫瘍への、器官の内腔もしくは実質への、および骨髄への投与が挙げられるが、これらに限定されない。しかしながら、状況によっては、ＢＣＣおよびＭＣＣは、好ましくは静脈内または動脈内に投与されない。
【００２０】
したがって、本発明の目的は、Ｂ−ＤＮＡまたはＢＣＣおよび薬学的に許容可能なキャリアを含む組成物の投与に応答するか、もしくは応答しない動物またはヒトを特定する方法を提供することである。
【００２１】
本発明の別の目的は、Ｂ−ＤＮＡまたはＢＣＣおよび薬学的に許容可能なキャリアを含む組成物の投与に応答するか、もしくは応答しない疾患を有する動物またはヒトを特定する方法を提供することである。
【００２２】
本発明のさらに別の目的は、疾患を有する動物またはヒトへの、Ｂ−ＤＮＡまたはＢＣＣおよび薬学的に許容可能なキャリアを含む組成物の投与の有効性を解析する方法を提供することである。
【００２３】
本発明のさらなる別の目的は、疾患を有する動物またはヒトへの、Ｂ−ＤＮＡまたはＢＣＣおよび薬学的に許容可能なキャリアを含む組成物の投与の有効性を解析する方法を提供することであり、ここで上記疾患は、癌、炎症性疾患、または免疫系の疾患である。
【００２４】
本発明の別の目的は、Ｂ−ＤＮＡまたはＢＣＣおよび薬学的に許容可能なキャリアを含む組成物の投与に応答するか、もしくは応答しない癌を有する動物またはヒトを特定する方法を提供することである。
【００２５】
本発明の別の目的は、Ｂ−ＤＮＡまたはＢＣＣおよび薬学的に許容可能なキャリアを含む組成物の投与に応答するか、もしくは応答しない免疫系の疾患を有する動物またはヒトを特定する方法を提供することである。
【００２６】
本発明のさらに別の目的は、Ｂ−ＤＮＡまたはＢＣＣおよび薬学的に許容可能なキャリアを含む組成物の投与に応答するか、もしくは応答しない炎症性疾患を有する動物またはヒトを特定する方法を提供することである。
【００２７】
したがって、本発明の目的は、生物学的液体、細胞抽出物、または組織抽出物中の生物学的分子のレベルを測定することにより、Ｂ−ＤＮＡまたはＢＣＣおよび薬学的に許容可能なキャリアを含む組成物の投与に対する動物またはヒトの応答を評価することである。
【００２８】
本発明の別の目的は、生物学的液体、細胞抽出物、または組織抽出物中の生物学的分子のレベルを測定することにより、Ｂ−ＤＮＡまたはＢＣＣおよび薬学的に許容可能なキャリアを含む組成物の投与に対する動物またはヒトの応答を評価することであり、ここで生物学的分子は、サイトカイン、免疫機能の他の指標、アポトーシス関連マーカー、またはそれらの組合せである。
【００２９】
本発明の特定の目的は、生物学的液体、細胞抽出物、または組織抽出物中の生物学的分子のレベルを測定することにより、Ｂ−ＤＮＡまたはＢＣＣおよび薬学的に許容可能なキャリアを含む組成物の投与に対する動物またはヒトの応答を評価することであり、ここで生物学的分子は、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８、タンパク質可溶性Ｆａｓリガンド（ｓＦＡｓＬ）、および核分裂装置タンパク質（ＮｕＭＡ）、またはそれらの組合せである。
【００３０】
本発明の別の目的は、Ｂ−ＤＮＡまたはＢＣＣおよび薬学的に許容可能なキャリアを含む組成物の投与に応答するか、もしくは応答しない癌を有する動物またはヒトを特定する方法を提供することであり、ここで癌は、膀胱癌、白血病、前立腺癌、腎臓癌、子宮癌、卵巣癌、胸部癌、結腸癌、頸部癌、または肺癌である。
【００３１】
本発明の別の目的は、Ｂ−ＤＮＡまたはＢＣＣおよび薬学的に許容可能なキャリアを含む組成物の投与に応答するか、もしくは応答しない免疫系の疾患を有する動物またはヒトを特定する方法を提供することであり、ここで免疫系の疾患は、間質性膀胱炎、多発性硬化症、慢性関節リウマチ、Ｉ型真性糖尿病、自己免疫性血小板減少性紫斑病、重症筋無力症、尋常性乾癬、および全身性エリテマトーデスである。
【００３２】
本発明のこれらのおよび他の目的、特徴ならびに利点は、開示する実施形態の以下の詳細な説明、および併記の特許請求の範囲を参照した後に明らかとなるであろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３３】
［発明の詳細な説明］
本発明は、本明細書中に包含される特定の実施形態の以下の詳細な説明を参照することでより容易に理解され得る。
【００３４】
本発明は、Ｂ−ＤＮＡまたはＢＣＣ、あるいは関連組成物の投与に対する動物またはヒトに生物学的応答を評価する方法を提供する。かかる投与はｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで行われてもよく、また健常なレシピエントまたは疾患を有するレシピエントで行われてもよい。本発明の方法は、本発明の組成物の投与前および後に、生物学的分子のレベルを測定することにより、本発明の組成物の投与に応答するか、または応答しない動物およびヒトの特定を可能にする。この方法は、本発明の治療用組成物を与えることに関する個体の適合性に関して、医療機関に有用な情報を提供する。この方法はさらに、本発明の治療用組成物の有効性を決定することを可能にする。この方法はまた、これらの治療用組成物の効果がない場合には、これらの治療用組成物の投与を終結させるための基盤を提供する。
【００３５】
本発明の免疫刺激性および／またはアポトーシス誘導性組成物は、細菌ＤＮＡ（Ｂ−ＤＮＡ）および薬学的に許容可能な組成物、または細菌細胞壁（ＢＣＣ）に複合体形成され、かつ薬学的に許容可能なキャリアと組み合わせたＢ−ＤＮＡを含む。本明細書中で使用する場合、「Ｂ−ＤＮＡ」は細菌ＤＮＡを意味し、「ＢＣＣ」は細菌細胞壁複合体を意味し、それによりＢ−ＤＮＡは細菌細胞壁上で複合体形成される。本発明の組成物および本発明の組成物を作製する方法は、ＰＣＴ／ＣＡ／９８／００７４４号およびＰＣＴ／ＣＡ００／００３４２号（これらは、それらの全体が参照により本明細書中に援用される）に記載されている。
【００３６】
Ｂ−ＤＮＡおよび細菌細胞壁は、マイコバクテリウム種、ボルデテラ種、ロドコッカス種、コルネバクテリウム種、ノカルジア種、リステリア種、またはエシェリキア種に由来し得る。本発明の好ましい実施形態では、Ｂ−ＤＮＡはマイコバクテリウム種に由来し、細菌細胞壁はマイコバクテリウム種に由来する。マイコバクテリウム種としては、スメグマ菌(M. smegmatis)、Ｍ．フォルツイトウス(M. fortuitous)、Ｍ．カンサイー(M. kansaii)、ヒト型結核菌(M. tuberculosis)、ウシ型結核菌(M. bovis)、トリ型結核菌(M. avium)、およびチモテ菌(M. phlei)が挙げられるが、これらに限定されない。本発明の好ましい実施形態は、チモテ菌ＤＮＡ（Ｍ−ＤＮＡ）および薬学的に許容可能なキャリアを含む組成物の投与、ならびに応答の評価を包含する。本発明の別の好ましい実施形態は、チモテ菌細胞壁（ＭＣＣ）に保持および複合体形成されたＭ−ＤＮＡおよび薬学的に許容可能なキャリアを含む組成物の投与、ならびに応答の評価を包含する。本明細書中で使用する場合、「Ｍ−ＤＮＡ」はチモテ菌ＤＮＡを意味し、ＭＣＣはチモテ菌細胞壁複合体を意味し、それによりＭ−ＤＮＡはチモテ菌細胞壁上で複合体形成される。これらの組成物は、癌細胞を含むがこれらに限定されない応答性細胞の増殖の阻止、および応答性細胞におけるアポトーシスの誘導、ならびに生理活性分子を産生するための免疫系の応答性細胞の刺激を含むがこれらに限定されない免疫応答を促進する。さらなる応答としては、疾患の進行を促進する病原性分子のレベルの減少が挙げられる。
【００３７】
薬学的に許容可能なキャリア
「薬学的に許容可能なキャリア」または「薬学的に許容可能な賦形剤」という用語は、有害な生理学的応答を引き起こさずに、生存動物またはヒト組織と接触させて使用するのに適切であり、かつ有害な様式で組成物の他の構成成分と相互作用しない、水または生理食塩水、ゲル、クリーム、軟膏、溶媒、希釈剤、液体軟膏基剤、軟膏、ペースト、インプラント、リポソーム、ミセル、巨大ミセル等を含むがこれらに限定されない任意の液体、固体または半固体（限定されない）を意味するために本明細書中で使用される。当業者に既知の他の薬学的に許容可能なキャリアまたは賦形剤を使用して、本発明の細菌ＤＮＡおよび細胞壁組成物を送達するための組成物を作製してもよい。
【００３８】
本発明の細菌ＤＮＡおよび細胞壁組成物は、薬学的に許容可能なキャリアと組み合わせて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで組成物として投与され得る。投与形態としては、注射剤、溶液、クリーム、ゲル、インプラント、ポンプ、軟膏、エマルジョン、懸濁液、ミクロスフェア、粒子、微粒子、ナノ粒子、リポソーム、ペースト、パッチ、錠剤、経皮送達デバイス、スプレー、エーロゾル、または当業者が精通している他の手段が挙げられるが、これらに限定されない。かかる薬学的に許容可能なキャリアは、当業者に一般的に知られている。本発明の薬学的配合物は、十分に知られており、かつ容易に入手可能な成分を用いて、当該技術分野で既知の手順により調製することができる。例えば、化合物を、一般的な賦形剤、希釈剤またはキャリアと配合させて、錠剤、カプセル、懸濁液、粉末等に成形することができる。かかる配合物に適した賦形剤、希釈剤、およびキャリアの例としては、以下の：充填剤および増量剤（例えばデンプン、糖、マンニトール、およびケイ酸誘導体）、結合剤（例えばカルボキシメチルセルロースおよび他のセルロース誘導体、アルギン酸塩、ゼラチン、ならびにポリビニルピロリドン）、加湿剤（例えばグリセロール）、崩壊剤（例えば炭酸カルシウム、および炭酸水素ナトリウム）、溶解遅延用作用物質（例えばパラフィン）、吸収促進剤（例えば第四級アンモニウム化合物）、界面活性剤（例えばセチルアルコール、グリセロールモノステアレート）、吸着キャリア（例えばカオリン、およびベントナイト）、乳化剤、防腐剤、甘味剤、安定剤、着色剤、香料剤、風味剤、潤滑剤（例えばタルク、ステアリン酸カルシウムおよびステアリン酸マグネシウム）、固体ポリエチルグリコール、およびそれらの混合物が挙げられる。
【００３９】
配合物はまた、それらがおそらく時間をかけて、専らもしくは好ましくは特定の位置で有効成分を放出するように構成することができる。かかる組合せは、放出動態を制御するためのさらなるメカニズムをも提供する。コーティング、エンベロープ、および保護マトリックスを、例えば高分子物質またはワックスから作製してもよい。
【００４０】
Ｂ−ＤＮＡまたはＢＣＣおよび薬学的に許容可能なキャリアを含む組成物は、配列および薬学的に許容可能なキャリアを均一かつ緊密に会合させることにより調製される。薬学的に許容可能なキャリアとしては、液体キャリア、固体キャリア、またはその両方が挙げられる。液体キャリアは、水性キャリア、非水性キャリア、またはその両方であり、水性懸濁液、油エマルジョン、油中水型エマルジョン、水中油中水型エマルジョン、部位特異的エマルジョン、長期残留エマルジョン、粘着性懸濁液、ミクロエマルジョン、およびナノエマルジョンが挙げられるが、これらに限定されない。固体キャリアは、生物学的キャリア、化学的キャリア、またはその両方であり、ウイルスベクター系、粒子、微粒子、ナノ粒子、ミクロスフェア、ナノスフェア、ミニポンプ、細菌細胞壁抽出物、および細菌組成物の持続性放出を可能にする生分解性もしくは非生分解性の天然または合成ポリマーが挙げられるが、これらに限定されない。エマルジョン、ミニポンプ、およびポリマーは、送達が必要とされる場所の近傍に埋没させることができる(Brem et al., J. Neurosurg. 74:441, 1991)。固体キャリアにＢ−ＤＮＡまたはＢＣＣを複合体形成させるのに使用される方法としては、固体キャリアの表面への直接的吸着、固体キャリアの表面への共有結合（直接的に、あるいは結合部分を介して）、および固体キャリアを作製するのに使用されるポリマーへの共有結合が挙げられるが、これらに限定されない。任意に、Ｂ−ＤＮＡまたはＢＣＣは、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート（ＴＷＥＥＮ）もしくはヒアルロン酸のような非イオン性またはイオン性ポリマーの添加により安定化することができる。
【００４１】
好ましい水性キャリアとしては、水、生理食塩水、および薬学的に許容可能な緩衝液が挙げられるが、これらに限定されない。好ましい非水性キャリアとしては、ジグリセリド、トリグリセリド、リン脂質、脂質、油、およびそれらの混合物を含むがこれらに限定されない鉱物油または中性油が挙げられるが、これらに限定されず、ここで油は、ポリ不飽和脂肪酸および飽和脂肪酸の適切な混合物を含有する。例としては、ダイズ油、キャノーラ油、パーム油、オリーブ油、およびミグリオールが挙げられるが、これらに限定されず、ここで脂肪酸は、飽和または不飽和であり得る。任意に、細胞にＢ−ＤＮＡまたはＢＣＣ組成物を提示するのに使用される薬学的に許容可能なキャリアに関わらず、賦形剤を含んでもよい。これらの賦形剤としては、酸化防止剤、緩衝液、および静菌薬が挙げられるが、これらに限定されず、また沈殿防止剤および増粘剤を含んでもよい。
【００４２】
本発明の組成物、またはかかる組成物および他の物質（例えば、様々な形態に特に適している本発明のキャリア）を含む配合物のｉｎ  ｖｉｖｏでの投与方法としては、以下のタイプの投与：経口（例えば口腔内または舌下）、肛門、直腸（坐剤として）、局所、非経口、エーロゾル、静脈内、動脈内、吸入、髄腔内、腹腔内、経皮、皮内、皮下、筋内、子宮内、膀胱内、前立腺内、尿道内、膣、体腔への、腫瘍または内部損傷の位置での外科的投与、直接腫瘍への、器官の内腔もしくは実質への、および骨髄への投与が挙げられるが、これらに限定されない。しかしながら、状況によっては、ＢＣＣおよびＭＣＣは、好ましくは静脈内または動脈内に投与されない。上述の様々な投与形態で有用な技法としては、局所塗布、摂取、外科的投与、注射、スプレー、経皮送達デバイス、浸透圧ポンプ、所望の部位への直接的な電着、または当業者が精通している他の手段が挙げられるが、これらに限定されない。適用部位は、表皮上のような外部、または内部（例えば胃潰瘍、手術野、または他の箇所）であり得る。
【００４３】
本発明の組成物は、クリーム、ゲル、溶液、懸濁液、リポソーム、粒子、または組成物の配合および送達の技術分野の当業者に既知の他の手段の形態で適用させることができる。超微粒子サイズは、治療薬の吸入送達に使用することができる。皮下投与に適した配合物の幾つかの例としては、インプラント、デポ剤、針、カプセル、および浸透圧ポンプが挙げられるが、これらに限定されない。膣投与に適した配合物の幾つかの例としては、クリーム、およびリングが挙げられるが、これらに限定されない。経口投与に適した配合物の幾つかの例としては、丸剤、液体、シロップ、および懸濁液が挙げられるが、これらに限定されない。経皮投与に適した配合物の幾つかの例としては、ゲル、クリーム、ペースト、パッチ、スプレー、およびゲルが挙げられるが、これらに限定されない。皮下投与に適した送達メカニズムの幾つかの例としては、インプラント、デポ剤、針、カプセル、および浸透圧ポンプが挙げられるが、これらに限定されない。非経口投与に適した配合物としては、酸化防止剤、緩衝液、静菌薬、および配合物を対象レシピエントの血液と等張性にさせる溶質を含有し得る水性および非水性滅菌注射溶液、ならびに沈殿防止剤および増粘剤を含み得る水性および非水性滅菌懸濁液が挙げられるが、これらに限定されない。即時注射溶液および懸濁液は、当業者により一般に使用される滅菌粉末、顆粒および錠剤から調製され得る。
【００４４】
本発明の組成物を例えば１つまたは複数の薬学的に許容可能なキャリアまたは賦形剤と組み合わせる実施形態は、単位投薬形態で利便性よく提供されてもよく、従来の薬学的技法により調製され得る。かかる技法としては、有効成分および薬学的に許容可能なキャリア（複数可）または賦形剤（複数可）を含有する組成物を会合させる工程が挙げられる。概して、配合物は、有効成分を液体キャリアと均一かつ緊密に会合させることにより調製される。好ましい単位投薬配合物は、投与される成分の用量または単位、あるいはそれらの適切な部分を含有するものである。特に上述した成分のほかに、本発明の組成物を含む配合物は、当業者に一般的に使用される他の作用物質を含んでもよいことが理解されるべきである。
【００４５】
投与容量は、投与経路に応じて様々である。かかる容量は、動物またはヒトに組成物を投与する技術分野の当業者に既知である。投与経路に応じて、１用量当たりの容量は、好ましくは１用量当たり約０．００１〜１００ｍｌ、より好ましくは１用量当たり約０．０１〜５０ｍｌ、最も好ましくは１用量当たり約０．１〜３０ｍｌである。例えば、筋内注射は、約０．１ｍｌ〜１．０ｍｌの容量の範囲であり得る。単独で、または他の治療剤（複数可）と一緒に投与される組成物は、単回用量治療で、複数回用量治療で投与することができるか、あるいはスケジュール通りに、かつ治療される疾患、レシピエントの状態、および投与経路に適切な時間をかけて連続的に注入することができる。さらに、組成物の投与前、投与と同時に、あるいは投与後に、他の治療剤を投与することができる。
【００４６】
好ましくは、１用量当たりの投与されるＢ−ＤＮＡまたはＢＣＣ組成物の量は、約０．０００１〜１００ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは約０．００１〜１０ｍｇ／ｋｇ、最も好ましくは約０．０１〜５ｍｇ／ｋｇである。１つの好ましい実施形態では、Ｂ−ＤＮＡまたはＢＣＣ組成物は、化学療法剤と組み合わせて、Ｂ−ＤＮＡまたはＢＣＣ組成物が化学療法剤の抗腫瘍効果を助長するか、該効果を拮抗するか、該効果と相乗作用を示すか、または該効果を増強するかどうかを評価するのに有効な量で、動物またはヒトに投与される。好ましくは、１用量当たりの投与される治療剤の量は、約０．００１〜１０００ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは約０．０１〜５００ｍｇ／ｋｇ、最も好ましくは約０．１〜１００ｍｇ／ｋｇである。投与される特定の配列および特定の治療剤、１用量当たりの量、用量スケジュール、および投与経路は、当業者に既知の方法を用いて専門家により決定されるべきであり、疾患のタイプ、疾患の重篤性、疾患の位置、ならびにレシピエントの大きさ、体重および健康状態のような他の臨床的要因に依存する。さらに、ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイを任意に使用して、Ｂ−ＤＮＡまたはＢＣＣ、およびＢ−ＤＮＡまたはＢＣＣ＋治療剤投与に関する最適範囲を特定する手助けとなり得る。これらのアッセイは、腫瘍細胞または免疫系の細胞のようなｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養される様々な細胞を使用し得る。
【００４７】
本発明による組成物は、癌細胞を含むがこれらに限定されない応答性細胞におけるアポトーシスの増殖の阻止およびその応答性細胞におけるアポトーシスの誘導の阻止、ならびに生理活性分子を産生するための免疫系の応答性細胞の刺激を含むが、これらに限定されない免疫応答を促進する。
【００４８】
本発明によるＢ−ＤＮＡおよびＢＣＣ組成物は、健常なヒトまたは動物、あるいは疾患（例えば癌、自己免疫疾患、炎症性疾患、またはアポトーシスもしくは免疫応答における機能不全の異常に関連した他の疾患）を有する動物またはヒトに投与され得る。癌としては、扁平上皮癌、線維肉腫、サルコイド癌、黒色腫、乳癌、肺癌、結腸直腸癌、腎臓癌、骨肉腫、皮膚黒色腫、基底細胞癌、膵臓癌、膀胱癌、脳腫瘍、卵巣癌、子宮癌、前立腺癌、白血病、リンパ腫、およびそれら由来の転移が挙げられるが、これらに限定されない。自己免疫疾患としては、間質性膀胱炎、多発性硬化症、慢性関節リウマチ、Ｉ型真性糖尿病、自己免疫性血小板減少性紫斑病、重症筋無力症、尋常性乾癬、および全身性エリテマトーデスが挙げられるが、これらに限定されない。炎症性疾患としては、間質性膀胱炎が挙げられるが、これに限定されない。
【００４９】
本発明による組成物は、投与される組成物のタイプ、投与経路、治療される疾患、および治療されるヒトまたは動物の体重および健康状態を含むが、これらに限定されない要因により決定される適切な投与量範囲で投与され得る。例えば、膀胱癌を治療する場合、ＭＣＣ上に複合体形成されたＭ−ＤＮＡは、１用量当たり約１〜約１６ｍｇ、より好ましくは１用量当たり約２〜約１２ｍｇ、最も好ましくは１用量当たり約４〜約８ｍｇの範囲で膀胱内に投与され得る。前立腺癌を治療する場合、ＭＣＣ上に複合体形成されたＭ−ＤＮＡは、１用量当たり約１〜約５０００μｇ、より好ましくは１用量当たり約１０〜約２０００μｇ、最も好ましくは１用量当たり約１００〜約１０００μｇの範囲で前立腺内に投与され得る。本発明による組成物の投薬を施すスケジュールは、当業者に既知の方法を用いて専門家により決定され得る。
【００５０】
本発明による組成物を投与した後、生物学的液体、細胞試料、または組織試料を収集して、測定用の生物学的マーカーを収集し得る。体液としては、尿、血液、血清、血漿、精液、骨髄液、腹水、唾液、痰、および胸部滲出液を挙げ得るが、これらに限定されない。専門家は、治療される疾患のタイプに基づいて、収集されるべき体液または組織を選択し得る。別の実施形態では、細胞を動物またはヒトから獲得して、細胞を本発明のＢ−ＤＮＡ、ＢＣＣ、または他の細菌組成物に暴露させることによりｉｎ  ｖｉｔｒｏで試験してもよい。細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養し、培地を回集し、生物学的分子の細胞内レベルを決定するために細胞をホモジナイズする方法は当業者に既知である。応答は、組成物の投与前および後の、培地中もしくは細胞内の１つまたは複数の生物学的分子のレベルの差異を測定することにより評価され得る。この様式では、組成物をｉｎ  ｖｉｖｏで投与することの決定がなされる前に、動物細胞またはヒト細胞、例えば腫瘍細胞または免疫系の細胞を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで応答性に関して評価してもよい。細胞培養液を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養した細胞または組織に関して使用してもよい。
【００５１】
Ｂ−ＤＮＡまたはＢＣＣ組成物の投与の経路に応じて、生物学的液体の採取時間は、好ましくは治療後の約３〜２４時間、より好ましくは治療後の約６〜１８時間、最も好ましくは治療後の約６〜８時間である。あるいは、生物学的液体または組織試料は、生物学的マーカーを検出するのに使用されるべき方法により決定される適切な時間で採取されてもよい。例えば、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８、ｓＦａｓＬ、およびＮｕＭＡに関する採取時間は、生物学的マーカーがＲＴ−ＰＣＲを用いて検出されるか、あるいはＥＬＩＳＡを用いて検出されるかに応じて６〜８時間であり得る。生物学的液体、細胞試料、または組織試料は、組成物の投与前および後の生物学的分子のレベルの比較を容易にするために本発明の組成物の投与前に獲得され得ることが理解されよう。しかしながら、状況によっては、応答および非応答動物ならびにヒトは、健常な動物またはヒト、あるいは特定の疾患を有する動物またはヒトに関して観察される臨床値と比較して、本発明の細菌組成物の投与後の生物学的マーカーのレベルに基づいて特定され得る。
【００５２】
体液または組織試料を採取した後、生物学的分子またはマーカーは、ＥＬＩＳＡ、フローサイトメトリー、ＥＬＩＳＰＯＴ、ＲＴ−ＰＣＲ、生物学的アッセイ、およびｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを含むが、これらに限定されない当業者に既知の方法により測定される。生物学的マーカーとしては、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８、ｓＦａｓＬ、およびＮｕＭＡを挙げ得るが、これらに限定されない。生物学的マーカーが直ちに測定されない場合、ＩＬ−１２およびＩＬ−１８のようなサイトカインは室温で不安定であるため、マーカーを含有する体液、細胞または組織試料を冷蔵保存するか、または冷凍してもよい。体液は、４℃で２４時間、滅菌容器中に保持され得る。より好ましくは、体液、細胞または組織試料は、−２０℃で３〜６ヶ月間保管され得る。最も好ましくは、体液、細胞または組織試料は、−８０℃で６ヶ月以上の間保管され得る。
【００５３】
本発明の細菌組成物のｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏ投与の前および後の選択された生物学的分子のレベルの決定に続いて、生物学的分子のレベルの変化、またはレベルの欠如が決定される。変化がないことは、非応答動物またはヒトを示す。非応答動物またはヒトは、本発明の治療用細菌組成物の連続した適用に関する良好な候補物とみなされない。上述のように、応答動物およびヒトは、増加または減少として明示され得る生物学的分子のレベルの変化を示し得る。かかる増加または減少は、測定される特定の分子を考慮しして解釈されるべきである。病原性分子の減少は、好適な応答と解釈され得る。特定の疾患と闘うインターロイキンの増加もまた、好適な応答と解釈され得る。癌細胞のアポトーシスに関連した生物学的分子の増加もまた、好適な応答と解釈され得る。別の療法により刺激される疾患と闘うインターロイキンの本発明の細菌組成物による増強もまた、好適な応答と解釈され得る。好適な応答を示す動物およびヒトは、本発明の治療用細菌組成物の連続した適用に関する良好な候補物とみなされる。あるいは、病原性分子の増加は、レシピエントが応答したとしても、好適でない応答と解釈され得る。動物またはヒトにおける好適でない応答は、本発明の治療用細菌組成物の連続した適用に関する良好な候補物とみなされない。あるいは、本発明の細菌組成物の投与前および後の両方で生物学的分子のレベルが測定されない場合、投与後のレベルの比較は、レシピエントの臨床状態に適切な臨床値を参照して行われ得る。例えば、レシピエントは健常であってもよく、間質性膀胱炎または前立腺癌を有してもよい。
【００５４】
本発明は、以下の実施例によりさらに説明されるが、以下の実施例は、いかなる場合においても本発明の範囲に限定を課すものとして解釈されるべきではない。それどころか、本発明の様々な他の実施形態、変更および等価物に対する手段がなされてもよく、それらは本明細書中の説明に目を通した後に、本発明の精神を逸脱することなく当業者に思い浮かぶであろう。
【実施例】
【００５５】
実施例１
膀胱癌に関する臨床研究
ＢＣＧ処置に応答しなかった膀胱の上皮内癌（ＣＩＳ）を有する１４人の患者を、オーストラリアおよびカナダの９つのセンターに収容した（表１の詳細な記述を参照）。
【００５６】
【表１】
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【００５７】
ミコバクテウム細胞壁−ＤＮＡ複合体処置
各ＣＩＳ患者をまず、膀胱内投与される生理食塩水５０ｍｌ容量中の乳化マイコバクテリウム細胞壁−ＤＮＡ複合体（ＭＣＣ）４ｍｇを用いて、１週間に一度、６週間処置した。乳化マイコバクテリウム細胞壁−ＤＮＡ複合体（ＭＣＣ）は、２％（ｖ／ｖ）の滅菌かつＤＮアーゼ非含有鉱油、および０．２％（ｖ／ｖ）の滅菌かつＤＮアーゼ非含有ツイーン８０を使用することにより、特許ＰＣＴ／ＣＡ／９８／００７４４号に記載されるように調製した。乳化マイコバクテリウム細胞壁−ＤＮＡ複合体（ＭＣＣ）処置に対する臨床的応答は、１２週目の生検および尿細胞学により評価した（表１の結果を参照）。
【００５８】
尿採取
処置前、ならびに処置の６〜２４時間目、それ以降処置の３週目および６週目に尿を採取した。試料をすぐに−２０℃に凍結させて、分析するまでこの温度で保管した。分析のために、試料を最大４℃に解凍して遠心分離し、細胞および壊死組織片を除去した。続いて、上清液で分析を行った。
【００５９】
サイトカイン、ｓＦＡＳＬ、ＮｕＭＡ、およびクレアチニン測定
尿中のＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８、ＮｕＭＡ、およびｓＦａｓＬを、市販のＥＬＩＳＡキットを用いて測定した（ＩＬ−６、ＩＬ−８、およびＩＬ−１２  ＥＬＩＳＡキットはBioSource, Camarillo, CAから、ＩＬ−１８  ＥＬＩＳＡキットはR&D Systems, Minneapolis, MNから、ＮｕＭＡおよびｓＦａｓＬ  ＥＬＩＳＡキットはOncogen-Calbiochem, Cambridge, MA）から得られた）。産生される尿の容量と有意に相関されることがわかっている（ｐ＜０．００１、de Reijke et al., J. Urol., 155:477, 1996）尿クレアチニンに、データを標準化した。尿中に存在するクレアチニンのレベルは、Jaffe反応に基づいた市販のキット(Sigma-Diagnostics, St-Louis, MO)を用いて測定した。
【００６０】
ＩＬ−１２、ＩＬ−１８、およびｓＦａｓＬの合成と、マイコバクテリウム細胞壁−ＤＮＡ複合体処置の有効性との間の相関
処置の３週目および６週目に、尿中のＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８、ＮｕＭＡ、およびｓＦａｓＬを測定した。表２は、３週目（ｗ３）および６週目（ｗ６）でのマイコバクテリウム細胞壁−ＤＮＡ複合体（ＭＣＣ）に対する各患者の応答を示す。産生されるサイトカイン、ＮｕＭＡ、またはｓＦａｓＬの基線（処置前）レベルを５０％上回る増加は、陽性応答であるとみなした。
【００６１】
【表２】
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【００６２】
３週目および６週目にマイコバクテリウムＤＮＡ複合体（ＭＣＣ）に応答して、ｓＦＡＳＬ、ＩＬ−１２、ＮｕＭＡ、ＩＬ−１８、ＩＬ−６、およびＩＬ−８を産生する患者の数をまとめた（表３）。
【００６３】
【表３】
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【００６４】
表３は、マイコバクテリウム細胞壁−ＤＮＡ複合体（ＭＣＣ）に対する陽性臨床応答を示す患者がｓＦａｓＬを産生したことを示す（３週目で４０％、および６週目で５０％）。非応答患者がｓＦａｓＬを産生しなかった。ｓＦａｓＬが予後マーカーとして作用する場合、偽陽性の出現は０％であった。非応答性患者を特定するための予後マーカーとしてのｓＦａｓＬの使用は有意であった（ｐ＞０．００４７、Fisherの正確確率検定）。ＩＬ−１２は、３週目および６週目にそれぞれ、応答患者の５０％および９０％で産生された。ＩＬ−１２が予後マーカーとして作用する場合、偽陽性の出現は、３週目で３３％、および６週目で４０％であった。ＮｕＭＡは、３週目および６週目にそれぞれ、応答患者の３０％および７０％で産生された。ＮｕＭＡが予後マーカーとして作用する場合、偽陽性の出現は、３週目で６０％、および６週目で０％であった。６週目に非応答性患者を特定するための予後マーカーとしてのＮｕＭＡの使用は有意であった（ｐ＞０．００１５、Fisherの正確確率検定）。ＩＬ−１８は、３週目および６週目にそれぞれ、応答患者の４０％および７０％で産生された。ＩＬ−１８が予後マーカーとして作用する場合、偽陽性の出現は、３週目で２０％、および６週目で２５％であった。ＩＬ−６およびＩＬ−８レベルは、マイコバクテリウム細胞壁−ＤＮＡ複合体（ＭＣＣ）処置後に高まり、臨床応答との相関は見られなかった。これらの結果は、ｓＦａｓＬおよびＮｕＭＡが、マイコバクテリウム細胞壁−ＤＮＡ複合体（ＭＣＣ）処置に応答した臨床的有効性の信頼性高い予後指標であることを実証する。ＩＬ−１２およびＩＬ−１８測定は、マイコバクテリウム細胞壁−ＤＮＡ複合体（ＭＣＣ）処置は抗癌活性のこれらの指標の誘導を誘発することが可能であるが、偽陽性応答がｓＦａｓＬおよびＮｕＭＡよりも高いことを示した。
【００６５】
実施例２
前立腺癌に関する臨床研究
前立腺癌を有する患者を、経直腸または経尿道注射により腫瘍へ直接投与されるマイコバクテリウム細胞壁−ＤＮＡ複合体（ＭＣＣ）のナノ粒子懸濁液約１μｇ〜約５０００μｇで処置する。尿および血液試料を、処置後週１回の間隔で採取する。尿試料は実施例１に記載するように処理して、血液試料は凝固させて、血清を回収する。サイトカイン、ｓＦａｓＬ、およびＮｕＭＡの測定は、尿および血清中のｓＦａｓＬ、ＩＬ−１８、ＩＬ−１２、ならびにＮｕＭＡのレベルの上昇が、超音波または他の画像化技法により決定されるように、増大した免疫応答（細胞浸潤）および前立腺腫瘍生検におけるアポトーシス、ならびに腫瘍質量の客観的減少と相関することを実証する。
【００６６】
実施例３
間質性膀胱炎に関する臨床研究
間質性膀胱炎は、恥骨上の疼痛、尿意促迫、および頻尿を特徴とする膀胱の炎症性疾患である。間質性膀胱炎の病因は依然として不明瞭であるが、考え得る理論としては、Ｔヘルパー細胞１型（Ｔｈ−１）／Ｔ−ヘルパー細胞２型（Ｔｈ−２）の平衡の非調節に関連した自己免疫欠損が挙げられる(Ochs, Clin. Lab. Med. 17:571, 1997; Peters et al., Urology, 54:450, 1999)。間質性膀胱炎の患者を、膀胱内投与されるマイコバクテリウム細胞壁−ＤＮＡ複合体のナノ粒子懸濁液で処置する。尿および血液試料を、処置後週１回の間隔で採取する。尿試料は実施例１に記載するように処理して、血液試料は凝固させて、血清を回集する。サイトカイン、ｓＦａｓＬ、およびＮｕＭＡの測定は、尿および血清中のｓＦａｓＬ、ＩＬ−１８、ＩＬ−１２、ならびにＮｕＭＡのレベルの上昇が、疼痛、尿意促迫、および頻尿の減少と相関することを実証する。
【００６７】
上記に引用した特許、刊行物、および抜粋はすべて、それらの全体が参照により本明細書に援用される。上記の事項は本発明の好ましい実施形態にのみ関するものであり、添付の特許請求の範囲で規定されるような本発明の精神および範囲を逸脱することなく無数の変更および改変がなされ得ることが理解されるべきである。
【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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