(57)【要約】本発明は、９９ｍＴｃで標識された金属輸送タンパク質と、哺乳類の生体内における腫瘍などの高エネルギー／鉄取り込み組織の存在を造影および特に検出する際のその製品および使用とに関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
９９ｍＴｃで標識された金属輸送タンパク質複合体。
【請求項２】
前記金属輸送タンパク質が鉄輸送タンパク質である請求項１に記載の複合体。
【請求項３】
前記鉄輸送タンパク質がトランスフェリンである請求項２に記載の複合体。
【請求項４】
前記トランスフェリンがラクトフェリンである請求項３に記載の複合体。
【請求項５】
前記トランスフェリンが、オボトランスフェリンおよび血清トランスフェリンまたはそれらの一方である請求項３に記載の複合体。
【請求項６】
前記金属輸送タンパク質が哺乳類の組織または血液由来である請求項１〜５のいずれかに記載の複合体。
【請求項７】
前記金属輸送タンパク質が組み換えタンパク質である請求項１〜６のいずれかに記載の複合体。
【請求項８】
哺乳類の生体内における腫瘍の存在の検出および造影をする、またはそれらの一方をするための医薬を製造するための９９ｍＴｃで標識された金属輸送タンパク質の使用。
【請求項９】
請求項２〜７に記載の特徴のいずれか１つ以上をさらに含む請求項８に記載の使用。
【請求項１０】
金属輸送タンパク質と、過テクネチウム酸塩（ＴｃＯ４−）をＴｃ３＋に変換するようにＴｃを変換するための還元剤とを含む製品または組成物。
【請求項１１】
請求項２〜７に記載の特徴のいずれか１つ以上をさらに含む請求項１０に記載の製品。
【請求項１２】
ユニット状（ｕｎｉｔ ｆｏｒｍ）で存在し、ユニットあたりの金属輸送タンパク質の量が２〜６０ｍｇの範囲内である請求項１０または請求項１１に記載の製品。
【請求項１３】
９９ｍＴｃ源をさらに含む請求項１０〜１２のいずれか１項に記載の製品。
【請求項１４】
前記９９ｍＴｃ源が過テクネチウム酸塩ＴｃＯ４−である請求項１３に記載の製品。
【請求項１５】
前記過テクネチウム酸塩源が前記製品と共に提供される請求項１３または請求項１４に記載の製品。
【請求項１６】
前記過テクネチウム酸塩源が、前記金属輸送タンパク質および前記還元剤とは別個に提供される請求項１３または請求項１４に記載の製品。
【請求項１７】
９９ｍＴｃ源が水溶液として提供される請求項１３〜１６のいずれか１項に記載の製品。
【請求項１８】
ユニット状で存在し、ユニットあたりの９９ｍＴｃの量が６〜８ＧＢｑの範囲内である請求項１０〜１７のいずれか１項に記載の製品。
【請求項１９】
前記９９ｍＴｃの量が約７．４ＧＢｑ（２００ｍＣｉ）である請求項１８に記載の製品。
【請求項２０】
前記還元剤が、スズ（ＩＩ）化合物およびアスコルビン酸を含む群から選択される請求項１０〜１９のいずれか１項に記載の製品。
【請求項２１】
ユニット状で存在し、ユニットあたりの前記還元剤の量が０．２〜０．３ｍｇの範囲内である請求項１０〜２０のいずれか１項に記載の製品。
【請求項２２】
可溶化剤および等張剤またはそれらの一方をさらに含む請求項１０〜２１のいずれか１項に記載の製品。
【請求項２３】
前記可溶化剤がゲンチジン酸である請求項２２に記載の製品。
【請求項２４】
ユニット状で存在し、ユニットあたりの前記可溶化剤の量が０．７〜０．９ｍｇの範囲内である請求項２２または請求項２３に記載の製品。
【請求項２５】
前記等張剤が塩化ナトリウムである請求項２２に記載の製品。
【請求項２６】
ユニット状で存在し、ユニットあたりの前記等張剤の量が２０〜４０ｍｇの範囲内である請求項２２または２５に記載の製品。
【請求項２７】
凍結乾燥されている請求項１０〜２６のいずれか１項に記載の製品。
【請求項２８】
粉末形態で提供される請求項１０〜２７のいずれか１項に記載の製品。
【請求項２９】
還元剤の存在下において金属輸送タンパク質と９９ｍＴｃＯ４−源を混合するステップを含む９９ｍＴｃで標識された金属輸送タンパク質複合体を製造する方法。
【請求項３０】
請求項２〜２８の特徴のいずれか１つ以上をさらに含む請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
哺乳類の生体内における腫瘍部位の存在の造影および診断をする、またはそれらの一方をするための９９ｍＴｃ標識造影剤を製造するための金属輸送タンパク質の使用。
【請求項３２】
哺乳類の生体内における腫瘍部位の存在の造影および診断をする、またはそれらの一方をするための造影剤を製造するための金属輸送タンパク質および還元剤の使用。
【請求項３３】
哺乳類の生体内における腫瘍部位の存在の造影および診断をする、またはそれらの一方をするための９９ｍＴｃで標識された金属輸送タンパク質複合体造影剤を製造するための過テクネチウム酸塩の使用。
【請求項３４】
哺乳類の生体内における腫瘍の存在を検出する方法であって、
（ｉ）９９ｍＴｃで標識された金属輸送タンパク質複合体を製造するために、還元剤および水溶液の存在下において金属輸送タンパク質と有効量の過テクネチウム酸塩とを混合するステップと、
（ｉｉ）検討中のレシピエントに得られた水性溶剤を導入するステップと、
（ｉｉｉ）所定の期間にわたってレシピエントの生体内の９９ｍＴｃの画像を観察するステップと
を含む方法。
【請求項３５】
請求項２〜２８の特徴のいずれか１つ以上をさらに含む請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
脳腫瘍を検出するための請求項３４または請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
標識金属輸送タンパク質複合体として患者内に導入された９９ｍＴｃの画像を観察するステップを含む腫瘍を検出する方法。
【請求項３８】
（ｉ）金属輸送タンパク質を放射性核種で標識するステップと、
（ｉｉ）前記放射性核種標識金属輸送タンパク質の水性製剤を製造するステップと、
（ｉｉｉ）治療中のレシピエントに前記水性製剤を導入するステップと
を含む、請求項２９、請求項３０、請求項３４、請求項３５または請求項３６のいずれか１項に記載の方法および請求項１０〜２８のいずれか１項に記載の製品、またはそれらの一方を使用して検出される腫瘍を治療する方法。
【請求項３９】
前記腫瘍が脳腫瘍である請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記放射性核種が、５７Ｃｏ、６７Ｃｕ、６７Ｇａ、９０Ｙ、９７Ｒｕ、１６９Ｙｂ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、２０３Ｐｂ、１５３Ｓｍおよび２１２Ｂｉまたはこれらのいずれかを含む群から選択される請求項３８または請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
好適に密封されたバイアルまたは容器に入れた請求項１０〜２８のいずれか１項に記載の製品と、必要に応じて、取り扱い説明書セットとを含むキット。
【請求項４２】
好適に密封されたバイアルまたは容器に入れた請求項１０〜２８のいずれか１項に記載の製品と、好適に密封されたバイアルまたは容器に入れた放射性核種標識金属輸送タンパク質複合体を含むさらに別の製品または組成物と、必要に応じて、取り扱い説明書セットとを含むキット。
【請求項４３】
脳腫瘍および鉄の取り込みが高い異常組織またはそれらの一方を検出するための請求項８、請求項９、請求項３１、請求項３２または請求項３３のいずれか１項に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、特に哺乳類の生体内の腫瘍部位を造影する際に使用するためであるが、このためだけではない、放射性標識金属輸送タンパク質とその使用とに関する。
【０００２】
［背景技術］
核医学では、生体内の腫瘍の存在を可視化するために種々の技法が使用されている。定量的には、テクネチウム（Ｔｃ）化合物は、今日使用されている最も重要な放射性医薬品であり、推定市場占有率は８０％を超える。
【０００３】
放射性医学的な目的では、同位体９９Ｔｃは、β−崩壊が遅い基底状態においてではなく、準安定状態の核励起状態において、すなわち、主にγ−放射９９ｍＴｃとして重要であり、診断的に有用な半減期は６時間である。放射性診断学においてこの放射性同位体がよく使用される主な理由の１つは、通常の臨床環境において適用可能な溶液を都合よく製造できる、操作が容易なテクネチウム「反応炉」または「発生炉」を入手しやすいことである。
【０００４】
過テクネチウム酸陰イオンはヨウ素と同様に挙動し、甲状腺によって取り込まれるという原則に基づいて、甲状腺疾患の画像医学のために過テクネチウム酸陰イオン［９９ｍＴｃＯ４］−を使用することが従来技術から知られている。過テクネチウム酸陰イオンは、心臓、脳、腎臓および肝臓を造影するためにも使用されている。しかし、より特異的な造影剤の需要が増すにつれ、小型ペプチドまたは生物的に活性な分子（ＢＡＭ：ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ ａｃｔｉｖｅ ｍｏｌｅｃｕｌｅ）に適当なテクネチウム複合体を共有結合させたものが開発された。従来技術から知られている例には、脳の脳内血流を造影する際に使用するエチレンシステインジエステルなどのビスアミドジチオール（ｂｉｓａｍｉｄｅｄｉｔｈｉｏｌ）プロリガンドにＴｃＶ複合体が結合したもの、心疾患を造影するための９９ｍＴｃ−テボロキシムおよび９９ｍＴｃＮ−ＮＯＥＴ、肝胆系を造影するための９９ｍＴｃ−ＨＩＤＡ、９９ｍＴｃ−Ｌｉｄｏｆｅｎｅｉｎ、９９ｍＴｃ−Ｍｅｂｒｏｆｅｎｅｉｎ、腎疾患を造影するための９９ｍＴｃ−ジエチレントリアミン五酢酸、骨疾患を造影するためのホスホン酸塩リガンドの９９ｍＴｃ複合体が挙げられる。
【０００５】
画像医学における９９ｍＴｃの使用のさらなる開発は、受容体結合に必要な基を含有するように、テクネチウム複合体の外側面を適合させることに基づいている。例えば、乳癌を同定するためにプロゲステロン受容体を９９ｍＴｃで標識し、精神医学的状態、てんかんおよびアルツハイマー病を同定するために中枢神経系の受容体を９９ｍＴｃで標識し、種々の抗体を９９ｍＴｃで標識する。
【０００６】
この群の従来技術の化合物に関連する問題は、それらは組織特異的でありうるが、９９ｍＴｃ標識プロゲステロン受容体および９９ｍＴｃ標識腫瘍抗体だけしか腫瘍特異的造影剤として考えられないということである。さらに、これらの化合物は高価であり、製造が面倒で困難であり、取り扱いが極めて困難であることが多い。
【０００７】
細胞選択的で、高価でなく、製造が簡単である９９ｍＴｃ標識造影剤は、従来技術を上回る即座の利点を提供すると思われる。
【０００８】
本発明において、本発明者らは、細胞挙動の特徴を利用し、本発明者らが９９ｍＴｃで標識した天然型タンパク質を開発した。
【０００９】
他の特徴または要因の中でも、腫瘍細胞は、迅速な増殖速度によって正常細胞から識別されうる。細胞増殖速度が速いと、金属輸送タンパク質による細胞内への金属輸送の需要増加を含む、ほとんどの細胞過程のための高いエネルギー必要性が腫瘍細胞内に生じる。
【００１０】
このような群の金属輸送タンパク質として、ラクトフェリン（ｌａｃｔｏｆｅｒｒｉｎ）を含むトランスフェリン（ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ）があり、トランスフェリンは、生体内で輸送機能を有する天然型タンパク質であり、本質的に、血液−脳関門（ｂｌｏｏｄ−ｂｒａｉｎ ｂａｒｒｉｅｒ）を含む全ての膜を通過して輸送する。トランスフェリンが細胞内に流入し、細胞内に鉄を放出する機序は以下のようである。循環液中のトランスフェリンは細胞表面の特異的な受容体に結合し、その後、エンドソームによって受容体／トランスフェリン複合体として細胞質ゾル内に取り込まれる。受容体／トランスフェリン複合体が細胞質ゾル内に存在すると、受容体／トランスフェリン複合体はＦｅ３＋を放出またはデメタレート（ｄｅｍｅｔａｌｌａｔｅｓ）し、アポトランスフェリンおよび受容体は細胞質ゾルを介して細胞表面に放出され、そこで分解または再利用されうる。
【００１１】
本発明者らは、本発明の造影剤を開発するために、金属輸送タンパク質が細胞を標的化する本質的な能力を組み合わせて使用した。
【００１２】
従って、本発明は、一態様において、観血的な診査的調査を行う必要なく、臨床医が早期臨床診断を下す助けとなる腫瘍特異的造影剤を提供すると本発明者らは考えている。
【００１３】
［発明の陳述］
広義的な態様において、本発明は、９９ｍＴｃで標識された金属輸送タンパク質と、哺乳類の生体内における腫瘍の存在を造影、特に検出する際のその使用とに関する。
【００１４】
本発明の第一の態様によると、９９ｍＴｃで標識された金属輸送タンパク質複合体が提供される。
【００１５】
好ましくは、金属輸送タンパク質は鉄輸送であり、さらに好ましくはラクトフェリン、オボトランスフェリン（ｏｖｏｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ）および／または血清トランスフェリン（ｓｅｒｕｍ ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ）を含む群から好ましくは選択されるトランスフェリンである。金属輸送タンパク質がトランスフェリンである場合には、高いエネルギー需要および増殖速度のために腫瘍細胞によって優先的に取り込まれる。
本明細書におけるトランスフェリンへの言及は、アポタンパク質（ａｐｏｐｒｏｔｅｉｎ）または金属負荷状態（ｍｅｔａｌ−ｌｏａｄｅｄ ｓｔａｔｅ）の、ラクトフェリン、オボトランスフェリンおよび／または血清トランスフェリンを含むことが意図されている。
【００１６】
本発明の標識金属輸送タンパク質複合体は、通常では金属イオンが占めている部位に９９ｍＴｃを保有すると考えられる。金属輸送タンパク質がトランスフェリンである実施態様では、タンパク質はＦｅ３＋イオンの代わりに９９ｍＴｃ３＋を保有し、通常の状態においてトランスフェリン糖タンパク質がＦｅ３＋イオンを収容するのと同様の方法で、９９ｍＴｃ３＋が占める２つの結合部位を封入し（ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｅ）、またはその周囲に折り重なる（ｆｏｌｄ）。従って、Ｔｃ−トランスフェリンの形状および構造は、天然型Ｆｅ−トランスフェリン複合体の形状および構造から大きく変形しておらず、実質的に変わっていない。９９ｍＴｃ標識トランスフェリン複合体が細胞によって認識され、内因性トランスフェリンとして取り込まれ、処理されるのは、９９ｍＴｃ−標識トランスフェリン複合体が内因性Ｆｅ３＋保有トランスフェリンと構造が類似しているからである。
【００１７】
腫瘍細胞などの迅速に分裂する細胞はエネルギーおよび栄養要求が高く、多数の通常の細胞代謝過程または活動の需要が増加している。これらのうち、要求が増加しているのは鉄の需要である。鉄金属輸送タンパク質を９９ｍＴｃの担体として使用することによって、本発明の一実施態様は、鉄需要が高い生体内の領域に自然に結合する腫瘍造影剤を提供する。同様に、他の金属輸送タンパク質を、生体内の組織または部位を選択的に標的化するために使用することができる。
【００１８】
好ましくは、金属輸送タンパク質は哺乳類の組織または血液由来であり、さらに好ましくは組み換えタンパク質である。
【００１９】
組み換えタンパク質は、肝炎ウィルスまたはＨＩＶなどの全血中に存在する他の要因または因子による交差血液感染のリスクが回避されるという点において特に有用である。さらに、購入可能な組み換えラクトフェリンは現在豊富であるので、本発明のさらに別の利点は、従来技術の他の化合物または複合体と比較して複合体の価格が低いというところにある。組み換えタンパク質は、機能的金属輸送および受容体結合特性を保持する限り、天然のタンパク質と比較して改変されてもよい。
【００２０】
本発明の別の態様によると、特に哺乳類の生体内における腫瘍の存在を検出する際であるが、これに限定されず、造影剤としての９９ｍＴｃで標識された金属輸送タンパク質の使用が提供される。
【００２１】
好ましくは、９９ｍＴｃで標識された金属輸送タンパク質は、本明細書に記載する好ましい特徴のいずれか１つ以上をさらに含む。
【００２２】
従って、本発明は、従来技術とは別の造影剤を提供する。
【００２３】
本発明のさらに別の態様によると、金属輸送タンパク質と還元剤とを含む製品または組成物であって、前記還元剤の機能が、タンパク質に結合することができるように、過テクネチウム酸塩（ＴｃＯ４−）をＴｃ３＋に変換するようにＴｃを変換することである、製品または組成物が提供される。これに関しては、還元剤は、還元ステップを実施することができる任意の薬剤を含んでもよい。
【００２４】
好ましくは、金属輸送タンパク質は本明細書に先に記載するとおりである。
【００２５】
好ましくは、本発明の製品は、２〜６０ｍｇの範囲の量の金属輸送タンパク質を含む。
【００２６】
好ましくは、本発明の製品または組成物は９９ｍＴｃ源をさらに含み、さらに好ましくは、９９ｍＴｃ源は過テクネチウム酸塩、すなわち、ＴｃＯ４−である。過テクネチウム酸塩源は本発明の製品もしくは組成物と共に好適なバイアルもしくは容器に入れて提供されても、または過テクネチウム酸塩源は別個に提供されて、使用直前に金属輸送タンパク質および還元剤に添加されてもよい。典型的には、過テクネチウム酸塩源は溶液として提供され、典型的には、過テクネチウム酸塩源は調査または治療を実施する予定の部位において生成される。
【００２７】
好ましくは、本発明の製品中の９９ｍＴｃ量は、９９ｍＴｃで標識した場合、６〜８ＧＢｑの範囲内であり、さらに好ましくは約７．４ＧＢｑ（２００ｍＣｉ）である。
【００２８】
好ましくは、還元剤は、スズ（ＩＩ）塩、例えば、塩化物、亜硝酸塩および／または亜硫酸塩を含む群から選択される。調製された別の還元剤はアスコルビン酸またはアスコルビン酸塩である。
【００２９】
好ましくは、本発明の製品は、０．２〜０．３ｍｇの範囲内の量の還元剤を含む。
【００３０】
好ましくは、本発明の製品または組成物は、可溶化剤および／または等張剤をさらに含む。
【００３１】
本明細書における等張剤への言及は、本発明の製品または組成物を生体内に導入する結果、レシピエントはショック状態に陥らず、また溶液状態の本発明の組成物のｐＨおよびイオン強度に対するいかなる有害作用も受けないように、本発明の組成物を、血液のｐＨおよびイオン強度に対して等張状態の溶液にすることができる任意の薬剤を意味することが意図されている。
【００３２】
好ましくは、可溶化剤はゲンチジン酸（ｇｅｎｔｉｓｉｃ ａｃｉｄ）である。可溶化剤の目的は、金属／タンパク質複合体の形成を容易にするためにＴｃ３＋の可溶化を可能にすることであり、従って、提供されている例は単に１つの好適な化合物を例示しているにすぎず、本発明の適用範囲を限定する意図のものではない。
【００３３】
好ましくは、本発明の製品は、０．７〜０．９ｍｇの範囲の量の可溶化剤を含む。
【００３４】
好ましくは、等張剤は塩を含み、さらに好ましくは塩化ナトリウムである。
【００３５】
好ましくは、本発明の製品は、２０〜４０ｍｇの範囲の量の等張剤を含む。
【００３６】
好ましくは、本発明の製品または組成物は凍結乾燥される（ｌｙｏｐｈｉｌｉｓｅｄ）、すなわち、凍結乾燥される（ｆｒｅｅｚｅ　ｄｒｉｅｄ）。
【００３７】
好ましくは、本発明の製品または組成物は発熱物質を含有しない。
【００３８】
好ましくは、本発明の製品または組成物は粉末形態で提供される。
【００３９】
本発明のさらに別の態様によると、還元剤の存在下において、金属輸送タンパク質と９９ｍＴｃＯ４−源を混合するステップを含む、９９ｍＴｃで標識された金属輸送タンパク質を製造する方法が提供される。
【００４０】
好ましくは、本明細書に先に記載する金属輸送タンパク質および還元剤は、必要に応じて、本明細書に先に記載する添加剤のいずれか１つ以上をさらに含む密封バイアルまたは容器に入れて提供される。
【００４１】
投与前に、好適な容量の適当な水溶液を、金属輸送タンパク質および還元剤を含有するバイアルに添加する。実際には、その後バイアルを撹拌し、短い時間放置し、成分を水性溶剤（ａｑｕｅｏｕｓ ｍｅｄｉｕｍ）に確実に溶解させる。
【００４２】
好ましくは、９９ｍＴｃＯ４−源を適当な分量として得られた水性溶剤に導入する。または、９９ｍＴｃ源を金属輸送タンパク質および／または還元剤および水性溶剤並びに添加することができる任意の必要な追加の成分と共に提供することができる。還元剤は、過テクネチウム酸塩を、金属輸送タンパク質によって取り込まれる９９ｍＴｃの形態に変換し、その結果、得られた複合体が標識されると考えられている。
【００４３】
本発明のさらに別の態様によると、哺乳類の生体内における腫瘍部位の存在を造影、特に診断するための９９ｍＴｃ標識造影剤を製造するための金属輸送タンパク質の使用が提供される。
【００４４】
本発明のさらに別の態様によると、哺乳類の生体内における腫瘍部位の存在を造影、特に診断するための造影剤を製造するための金属輸送タンパク質および還元剤の使用が提供される。
【００４５】
本発明のさらに別の態様によると、哺乳類の生体内における腫瘍部位の存在を造影、特に診断するための９９ｍＴｃで標識された金属輸送タンパク質複合体造影剤を製造するための過テクネチウム酸塩の使用が提供される。
【００４６】
本発明のよりさらに別の態様によると、哺乳類の生体内における腫瘍の存在を検出する方法であって、
（ｉ）９９ｍＴｃで標識された金属輸送タンパク質複合体を製造するために、還元剤および水性溶剤の存在下において、金属輸送タンパク質と有効量の過テクネチウム酸塩とを混合するステップと、
（ｉｉ）検討中のレシピエントに得られた水性溶剤を導入するステップと、
（ｉｉｉ）所定の期間にわたって、レシピエントの生体内の９９ｍＴｃの画像を観察するステップと
を含む方法が提供される。
【００４７】
好ましくは、混合物は、本明細書に先に記載する添加剤および／または特徴のいずれか１つ以上を含有する。
【００４８】
好ましくは、溶液状態の本発明の組成物がレシピエントの生体に注射され、さらに好ましくは、それは静脈内経路で注射される。または、本発明の組成物を経口摂取することができる。
【００４９】
本発明のよりさらに別の態様によると、標識金属輸送タンパク質複合体として患者に導入された９９ｍＴｃの画像を観察するステップを含む、腫瘍を検出する方法が提供される。
【００５０】
本発明のよりさらに別の態様によると、脳腫瘍の存在を検出または診断するために本明細書に先に記載する方法の使用が提供される。
【００５１】
本明細書における脳腫瘍への言及は、血液−脳関門内に生じる任意の種類の腫瘍または増殖を含むことが意図されている。
【００５２】
トランスフェリン複合体が自然に取り込まれ、認識されること、および血液−脳関門を通過するトランスフェリンの本質的な能力のために、トランスフェリンを使用する本発明の製品または組成物および方法は、患者個人の脳腫瘍の存在を検出するのに特に好適である。これに関しては、本発明は、脳組織の全ての領域に接近することができる特異的な腫瘍選択的な造影剤を提供することによって、従来技術を上回る大きな利点を提供する。
【００５３】
９９ｍＴｃで標識された金属輸送タンパク質複合体は、哺乳類の生体内の腫瘍の存在を提供する便利で、価格効率の良い手段を提供することが、本発明の上記の陳述から理解される。放射性核種を搬送するために金属輸送タンパク質を使用して腫瘍が位置づけ（ｌｏｃａｔｅ）または同定（ｉｄｅｎｔｉｆｙ）されると、本発明はまた腫瘍を治療する方法を提供する。
【００５４】
本発明のよりさらに別の態様によると、本発明の方法または製品を使用して検出される腫瘍を治療する方法であって、
（ｉ）金属輸送タンパク質を放射性核種で標識するステップと、
（ｉｉ）前記放射性核種標識金属輸送タンパク質の水性製剤を製造するステップと、
（ｉｉｉ）治療中のレシピエントに前記水性製剤を導入するステップと
を含む、方法が提供される。好ましくは、本発明の方法は、ステップ（ｉ）の前に、本発明の９９ｍＴｃで標識された金属輸送タンパク質複合体で腫瘍の存在を検出するステップをさらに含む。
【００５５】
好ましくは、放射性核種標識金属輸送タンパク質複合体は、本明細書に先に記載する特徴のいずれか１つ以上をさらに含む。
【００５６】
好ましくは、放射性核種標識金属輸送タンパク質の水性製剤（ａｑｕｅｏｕｓ ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）は、本明細書に先に記載する添加剤のいずれか１つ以上をさらに含む。
【００５７】
従って、本発明は、最初に腫瘍を位置づけし、次に、放射性核種を標識した金属輸送タンパク質のさらなる投与が確実に同じ位置に向けられる手段を提供する。従って、放射性核種標識金属輸送タンパク質は腫瘍細胞を特異的に攻撃または標的化（ｔａｒｇｅｔ）することができる。この方法では、併用療法は、腫瘍細胞の局在化因子および破壊治療因子として作用することができる。先に記載したように、トランスフェリンが血液−脳関門を通過することができることにより、この併用療法は脳腫瘍の診断および治療に特に重要であると考えられる。
【００５８】
好ましくは、放射性核種は、５７Ｃｏ、６７Ｃｕ、６７Ｇａ、９０Ｙ、９７Ｒｕ、１６９Ｙｂ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、２０３Ｐｂ、１５３Ｓｍおよび／または２１２Ｂｉを含む群から選択される。
【００５９】
本発明のよりさらに別の態様によると、好適に密封されたバイアルまたは容器に入れた本発明の製品または組成物と、必要に応じて、取り扱い説明書セットとを含むキットが提供される。
【００６０】
本発明のよりさらに別の態様によると、好適に密封されたバイアルまたは容器に入れた製品と、好適に密封されたバイアルまたは容器に入れた放射性核種標識金属輸送タンパク質複合体を含むさらに別の製品または組成物と、必要に応じて、取り扱い説明書セットとを含むキットが提供される。
【００６１】
本発明は、以下の図面を参照にして単に例として本明細書に記載される。
【００６２】
［実施例］
鉄含有タンパク質はアミノ酸残基約７００の１本鎖ポリペプチド鎖からなることが知られている。ラクトフェリンおよびトランスフェリンは共に、両者間の内部配列相同性が約４０％であり、非常に類似した３次構造を有する２つのローブ、Ｎ−ローブおよびＣ−ローブからなる。折りたたみは２つのローブにおいて同一であるが、Ｃ末端ローブはジスルフィド架橋を３つ過剰に含有し、過剰の安定性を与えている。各ローブは、鉄原子が位置する裂け目を有し、結合は立体配座の変化を誘導し、ローブに金属を閉じ込めさせる。金属への配位は、２つのチロシン残基、ヒスチジンおよびアスパラギンによる。２座炭酸塩リガンド（ｂｉｄｅｎｔａｔｅ ｃａｒｂｏｎａｔｅ ｌｉｇａｎｄ）の協働結合も存在し、全６配位のねじれた八面体構造を生じる。炭酸塩の存在は強力な金属結合に必要である。リガンドはタンパク質骨格の異なる部分に結合し、鉄を放出するために、ローブはさらに開いた構造を取る。
【００６３】
金属のトランスフェリンへの結合は、２つのチロシン残基への結合のために、ＵＶ／ｖｉｓスペクトルの新たな吸収バンドを生じる。従って、ＵＶ／ｖｉｓ分光学は、白金結合などの他の部位と比較して、鉄結合部位を識別する方法を提供する。ＵＶ／ｖｉｓ分光学はまた、結合の動態を検討し、種々の金属トランスフェリン複合体の結合定数を得るために、滴定実験と併用して使用されている。本明細書において、本発明者らは、トランスフェリンおよびラクトフェリンへのレニウムおよびテクニチウムの結合を測定するために同じ方法を使用している。
【００６４】
腫瘍細胞は、健康な細胞より速い速度でトランスフェリンを取り込むことが知られているので、トランスフェリンおよびラクトフェリンへのＴｃの取り込みは、有利なことに、癌を造影する新規方法を提供する。その化学的性質がテクニチウムに類似しているレニウムを用いた本発明者らの初期の実験が本発明者らを本発明に導いた。
【００６５】
［実施例１：金属／タンパク質結合］
＜実験手法＞
Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ３０限外ろ過膜を使用して、ウシアポトランスフェリンを０．１ＭのＫＣｌで３回洗浄して、低分子量不純物を除去した。それを１０ｍＭのＨｅｐｅｓ緩衝液（ｐＨ７．４）１０ｃｍ３に溶解し、冷蔵庫で保存した。アポラクトフェリンは、標準的な手法を使用して、Ｆｅ−ラクトフェリンから調製した。ガラス容器は全て、全ての重金属を除去するために使用前に数時間酸に浸漬し、全ての実験には超高純度の水を使用した。吸湿性のために、Ｒｅ２Ｏ７はグローブボックス中で保存し、秤量して、測定精度を確実にした。
【００６６】
バックグラウンド補正として１０ｍＭのＨｅｐｅｓ緩衝液を用い、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ　Ｌａｍｂｄａ　１５分光計をＵＶ／ｖｉｓ実験に使用した。
【００６７】
＜Ｒｅ（ＮＴＡ）ｎの調製＞
ＮＴＡはニトロトリアセテートをいい、ｎはレニウムに対して溶液中に存在するＮＴＡの量である。ｎが１に等しいＲｅ（ＮＴＡ）は、Ｒｅ原子吸光標準溶液（１０１０μｇ／ｍｌの１％ＮＨＯ３溶液）２．３０ｃｍ３に４．１７ｃｍ３のＮＴＡ溶液を添加することによって調製した。マイクロリッター量の１ＭのＮａＯＨを徐々に添加して、ｐＨを５〜６とした。次いで、この溶液を１０ｍＭのＨｅｐｅｓ緩衝液（ｐＨ７．４）で２５ｃｍ３にし、総レニウム濃度を０．５ｍＭとした。Ｒｅ（ＮＴＡ）８およびＲｅ（ＮＴＡ）２０は、同じ方法であるが、それぞれ、８．３４ｃｍ３および２０．８５ｃｍ３のＮＴＡ（０．０２４Ｍ）を使用して作製した。
【００６８】
＜Ｆｅ（ＮＴＡ）２の調製＞
硝酸Ｆｅ（ＩＩＩ）の０．０１Ｍ溶液を調製し、２．５０ｃｍ３を１６．６６ｃｍ３（２モル当量）ＮＴＡ溶液（０．００６Ｍ）に添加した。これを、Ｒｅ（ＮＴＡ）と同じ方法で作製し、０．５ｍＭのＦｅ（ＮＴＡ）２溶液とし、１０ｍＭのＨｅｐｅｓ緩衝液でｐＨ７．４にした。
【００６９】
＜ＵＶ分光法＞
最初に、ε２８０２８０　９３，０００Ｍ−１ｃｍ−１のバンドを使用して、ＵＶ分光法により洗浄後のアポトランスフェリンの濃度を測定した。１０ｍＭのＨｅｐｅｓ緩衝液で容量を３０００μｌに増量することによって、トランスフェリンまたはラクトフェリンを約１０−５Ｍに希釈することによって、ＵＶ試料を調製した。金属を添加する直前に、ＮａＨＣＯ３（０．２５Ｍ）６０μｌを添加して、濃度５ｍＭの炭酸水素塩を得た。
【００７０】
＜滴定実験＞
滴定実験は、文献において以前に実施されているものから採用した。少量（通常、５〜２０μｌ）のＦｅ（ＮＴＡ）２溶液をトランスフェリンに添加し、添加ごとにスペクトルを記録した。少量のＲｅ（ＮＴＡ）２溶液を使用するが、添加ごとに１．５時間（または適宜それ以上の時間）放置して、３１０Ｋに平衡させて、これを反復した。
【００７１】
＜時間依存的分光法＞
２モル当量のＲｅ（ＮＴＡ）溶液をトランスフェリンまたはラクトフェリンに添加し、種々の時間間隔でスペクトルを記録した。平衡に達したら、２モル当量のＦｅ（ＮＴＡ）２を添加し、さらにスペクトルを取った。
【００７２】
＜ＲｅＯ４−の還元＞
０．１４９ｇのＲｅ２Ｏ７を水１００ｃｍ３に溶解して、ＲｅＯ４−の０．００６Ｍのストック溶液を作製した。この溶液の０．５ｃｍ３を１ｃｍ３のＳｎＣｌ２（０．００６Ｍ）および１ｃｍ３のＨＣｌ（１Ｍ）に添加した。次いで、種々の量のＮＴＡの存在下において、ＵＶ分光法によって金属の還元をモニターした。ＳｎＣｌ２の代わりに還元剤としてアスコルビン酸を使用して、この手法を反復した。
【００７３】
次いで、マイクロリッター量の１ＭのＮａＯＨでｐＨを上昇させ、１０ｍＭのＨｅｐｅｓ緩衝液を添加して、レニウム原子吸光標準と同じ方法にこの溶液を使用した。ＵＶ分光法を使用して、トランスフェリンへの添加の影響をモニターした。
【００７４】
＜トランスフェリンへの鉄の結合＞
鉄が結合すると、２８０ｎｍのアポトランスフェリンピークはサイズが減少するが、金属結合の有用な診断試験となる２つの新たなピークが２４０ｎｍおよび２９５ｎｍに出現する。図１は、滴定実験中にＦｅ（ＮＴＡ）２添加ごとに得られたＵＶ／ｖｉｓ差スペクトルを示す。ＵＶ差スペクトル全てのベースラインは、金属添加前のアポトランスフェリンに相当する。２４０ｎｍおよび２９５ｎｍの吸光度の増加は、トランスフェリン結合部位の飽和度に直接関連する。２４０ｎｍの吸光度の増加をモニターし、モル吸光係数の変化を求めた。トランスフェリンに対する鉄の比、ｒを算出し（表１）、吸光係数の変化に対してプロットした（図２）。これは、低鉄濃度（ｒが１未満である場合）におけるｒとΔεの関係を示す。グラフの直線部分の傾斜は１５８００±２１０Ｍ−１ｃｍ−１であると算出され、１つの部位がＦｅで飽和されているトランスフェリンのモル吸光度に等しい。２つの部位が等価であると本発明者らが考える場合には、本発明者らは、両方の部位が鉄で飽和されているトランスフェリンのモル吸光度は、約３１６００Ｍ−１ｃｍ−１で大きさが２倍であると予測できた。これらの実験は、鉄はトランスフェリンに強力に結合すること、および鉄がトランスフェリンに置換されている間でもトランスフェリンタンパク質は無傷であり続けることを証明していると本発明者らは考える。
【００７５】
表１：Ｆｅ（ＮＴＡ）２のｒおよびＡの値の算出
【表１】
2004505932.tif 000002
【００７６】
＜トランスフェリンへのレニウムの結合＞
トランスフェリンへのレニウムの添加も、２３５ｎｍおよび２９２ｎｍに、チロシンπ−π＊遷移によるピークを示したが、これらのうち第２のピークは、鉄より大きさが有意に小さい。スペクトルの可視領域にはピークは見られない。これは、トランスフェリンが結合している、ガリウム、ネオジム、アルミニウムおよびインジウムなどのいくつかの他の金属に見られるスペクトルに一致している。
【００７７】
鉄によって示される瞬時の結合とは異なり、トランスフェリンへのレニウムの結合は平衡に達するのにさらに時間がかかる。これを評価するために、２モル当量のＲｅ（ＮＴＡ）をトランスフェリン溶液に添加し、定期的にスペクトルを取った（図３）。図４は、２３５ｎｍにおける吸光度の経時的な増加を示し、結合が完了するのに少なくとも１時間必要であることを示している。
【００７８】
３１０Ｋより低い温度またはニトロトリアセテートがさらに多量に存在する場合などの他の条件下では、平衡は数時間かかることがある。平衡に達したら、２モル当量のＦｅ（ＮＴＡ）を溶液に添加し、得られたスペクトルを図３に青線で示す。鉄は結合速度がかなり速く、スペクトルにかなり大きな影響を与えることがわかる。しかし、この遅い結合は異常であるとは思われず、いくつかの金属は結合の完了にさらに長くかかることが報告されている。例えば、Ｓｃ（ＮＴＡ）２は平衡に達するのに少なくとも２時間かかり、Ｉｎ（ＮＴＡ）２は約６時間かかる。
【００７９】
Ｆｅ（ＮＴＡ）２をレニウムトランスフェリンに添加する場合には（図３）、スペクトルの変化は大きく、即時的である。トランスフェリンは、レニウムに対してより鉄に対してかなり大きな親和性を有するので、レニウムは即座に置換される。これはまた、ガリウムおよびスカンジウムを含む多数の他の金属トランスフェリンに鉄を添加するとき生じる。
【００８０】
＜レニウム滴定実験＞
アポトランスフェリンをＲｅ（ＮＴＡ）、Ｒｅ（ＮＴＡ）８およびＲｅ（ＮＴＡ）２０で滴定し、溶液が平衡に達する時間放置した後、ＵＶ差スペクトルを記録した（図５）。２３５ｎｍにおける吸光度をモル吸光係数に変換し、トランスフェリンに対するレニウムの比、ｒを鉄と同じ方法で算出した（表２）。
【００８１】
表２：Ｒｅ（ＮＴＡ）ｎのｒおよびΔε値の算出
【表２】
2004505932.tif 000003
【００８２】
＜ラクトフェリンへのレニウムの結合＞
ラクトフェリンおよびレニウムを用いて同様の実験を実施した。以下にデータを記載する。次いで、Ｒｅ／ＮＴＡをアポ−タンパク質に添加し、吸光スペクトルを経時的に記録し、Ｒｅにラクトフェリンが結合したかどうかを調べた（図６（Ａ）、（Ｂ）および（Ｃ）並びに図７）。図６（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）および７は、レニウム結合の結果２３１ｎｍバンドが増加することにより、レニウムがラクトフェリンに結合することを示す。
【００８３】
図６（Ａ）、（Ｂ）および（Ｃ）はアポ−ラクトフェリンとＲｅ／ＮＴＡの反応を示す。１×１０−５Ｍアポ−ラクトフェリンを５ｍＭの炭酸水素ナトリウム（黒）に添加し、次いで５倍過剰量のＲｅ／ＮＴＡを０分、１５分、３０分、９０分、１８０分、２４０分、３００分および４２０分後に添加した。図６（Ｂ）は、２３１ｎｍの吸収ピークを示すが、図６（Ｃ）は５００ｎｍの吸収ピークをさらに詳細に示す。図６（Ｃ）のＸは、０分および１５分経過時の吸収ピークを示す。図６（Ｃ）のＹは、時間経過の終了時の最大吸収波長のシフトを示す。
【００８４】
図７は、アポ−ラクトフェリンおよび炭酸水素ナトリウムと過剰量のＲｅ／ＮＴＡの反応を示す。２３１ｎｍの吸光度を経時的に測定することによって、この反応をモニターした。図６（Ａ）、６（Ｂ）、６（Ｃ）および７は、レニウムが結合する結果２３１ｎｍが増加することにより、レニウムがラクトフェリンに結合することを示している。
【００８５】
これらの実験は、レニウムがトランスフェリンの結合部位に挿入されて、添加約１時間以内に安定な複合体を生じることを示していると本発明者らは考える。この化学は、トランスフェリンおよびラクトフェリンとのテクニチウムの化学に直接適用可能であり、類推すると、テクニチウムおよびレニウムの化学はこのように同様であるので、トランスフェリンおよびラクトフェリンへのレニウム結合の同じ化学プロトコールを同タンパク質に対するテクニチウムの結合に使用することができる。テクニチウムの放射性のために、テクニチウムの実験は同じ方法では分析できない。トランスフェリンおよびラクトフェリンへのテクニチウム結合を用いる実験は、これらの分子種の腫瘍細胞への取り込みを直接示す。これらの実験を以下に示す。
【００８６】
［実施例２：テクニチウム９９ｍによるトランスフェリンの標識および癌細胞によるＴｆ−Ｔｃ複合体の取り込み］
＜実験手法＞
ストック溶液
以下の溶液を作製した。
過テクネチウム酸塩溶液（９９ｍＴｃ）［ＴｃＯ４−］：
２７０ＭＢｑを１ｍｌの水溶液に入れた。
（過テクネチウム酸塩濃度：５×１０−１２ｇ／ＭＢｑ（３．０６×１０−１４ｍｏｌ／ＭＢｑ））
５０ＭＢｑの０．２ｍｌ溶液（１．５３×１０−１２Ｍ）
アポトランスフェリン溶液（Ｔｆ）：
０．１ＭのＫＣｌで３回洗浄した。最終容量＝１．２ｍｌ、吸光度＝０．６５（２８０ｎｍにおける吸光係数＝９３，０００Ｍ−１ｃｍ−１）。総Ｔｆ＝８．４×１０−９ｍｏｌ。５ｍｌに希釈した。０．０２５ｍｌを２５ｍｌに希釈した（１．６８×１０−１２ｍｏｌ／ｍｌ）。
スズ（還元）溶液：
ＳｎＣｌ２．２Ｈ２Ｏ　３４×１０−３ｇ＋ＮａＨＣＯ３　４．４×１０−３ｇ＋Ｆｅ（ＮＯ３）３　１２．５×１０−３ｇの２５ｍｌ溶液：
作用イオン混合物：０．２５ｍｌを２５ｍｌに希釈し、この０．０２５ｍｌを２５ｍｌに希釈した。
【００８７】
＜溶液の組み合わせ＞
先に記載したＲｅの化学的性質に準じ、以下の溶液の組み合わせを室温において１時間混合し、その後１０ｍｌのＰＢＳを添加し、溶液を混合した。次いで、９ｍｌを捨て、残り１ｍｌをＰＢＳで２０ｍｌに希釈した。
溶液：
１）０．２ｍｌの９９ｍＴｃ［ＴｃＯ４−］溶液＋０．０２５ｍｌのスズ溶液。
２）０．２ｍｌの９９ｍＴｃ［ＴｃＯ４−］溶液＋０．０２５ｍｌのスズ溶液＋０．２ｍｌのＴｆ。
【００８８】
［実施例３：癌細胞による溶液の取り込み］
以下のように、実施例２の各溶液を細胞と共にインキュベーションした。細胞培養：２５ｃｍ２のフラスコ４つにＲＴ１１２細胞を接種し、ダルベッコの最小必須培地＋５％ウシ胎仔血清中で集密化するまで増殖した。取り込み検討の２時間前に、細胞をハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）で１回洗浄し、４ｍｌのＨＢＳＳと共に室温において２時間インキュベーションした。次いで、細胞をＰＢＳで洗浄し、対応する（１〜４）標識インキュベーション溶液４ｍｌと共に室温において１．５時間インキュベーションした。次いで、インキュベーション溶液を捨て、細胞をＰＢＳで５回洗浄し、２ｍｌのトリプシンで処理し、Ｐａｃｋａｒｄ社製のガンマカウンターで１ｍｌを計測した。細胞数を概算するためにさらに別のフラスコをトリプシン処理した。各溶液を個別に計測し、結果を平均して、取り込み値を得た。
【００８９】
＜結果＞
各場合において、Ｔｃは腫瘍細胞に取り込まれる。細胞は貪食挙動を示すので、一部非特異的な取り込みが予想される。しかし、図８が示すように、Ｔｆと錯体形成すると、Ｔｃ取り込みは明らかに増加する（ほぼ５０％）。
【００９０】
［実施例４：製品の作製］
以下の成分を含む製品を凍結乾燥し、発熱物質を含有しない粉末として作製した：
【表３】
2004505932.tif 000004
【００９１】
次いで、混合物をバイアルに入れ、密封する。次いで、混合物を使用時まで室温において保存することができる。
【００９２】
［実施例５：ラクトフェリンの標識］
過テクネチウム酸塩源は過テクネチウム酸ナトリウム（９９ｍＴｃ）注射液（Ｆｉｓｓｉｏｎ社製）または過テクネチウム酸ナトリウム（９９ｍＴｃ）（非−Ｆｉｓｓｉｏｎ社製）、最大７．４ＧＢｑ２００ｍＣｉである。一定量の過テクネチウム酸塩をバイアル中の３〜６容量の水溶液に無菌的に添加し、数分間放置する（２〜５分）。
【００９３】
１人の患者の用量を調製するために、ラクトフェリンおよび他の添加剤を含有するバイアルを３〜６ｍｌの生理食塩液に溶解し、凍結乾燥した材料を溶液にするために２〜５分間振とうする。約１ｍｌ以外の全ての溶液を取り、必要な量の過テクネチウム酸ナトリウム（９９ｍＴｃ）注射液（Ｆｉｓｓｉｏｎ社製）または過テクネチウム酸ナトリウム（９９ｍＴｃ）（非−Ｆｉｓｓｉｏｎ社製）に添加する。次いで、混合物を振とうし、ラクトフェリンの高標識収率を確実にする。
【００９４】
［実施例６：腫瘍部位の検出］
９９ｍＴｃ標識ラクトフェリン複合体の単回投与を静脈内経路によって実施し、所定の時間にわたって従来の手段によってγ放射線を観察する。９９ｍＴｃは生体内の特異的な領域に濃縮することが見出され、その領域は腫瘍部位に対応することが見出されている。
【図面の簡単な説明】
【図１】
Ｆｅ（ＮＴＡ）２によるアポトランスフェリンの滴定のＵＶ差スペクトルを例示する。
【図２】
アポトランスフェリンにＦｅ（ＮＴＡ）２を添加するための滴定曲線を示すグラフを例示する。
【図３】
アポトランスフェリンおよび２モル当量のＲｅ（ＮＴＡ）を含有する溶液の吸光度の時間依存を例示する。
【図４】
２モル当量のＲｅ（ＮＴＡ）を含有するアポトランスフェリンのＡ２３５の時間依存を示すグラフを例示する。
【図５】
Ｒｅ（ＮＴＡ）によるアポトランスフェリンの滴定のＵＶ差スペクトルを例示する。
【図６】
Ｒｅ／ＮＴＡによるアポ−ラクトフェリンの反応を例示するグラフを例示し、図６Ａは１×１０−５Ｍのアポ−ラクトフェリンおよび５ｍＭの炭酸水素ナトリウム（黒）、次いで０分、１５分、３０分、９０分、１８０分、２４０分、３００分、４２０分後に添加した５倍過剰量のＲｅ／ＮＴＡを例示し、図６Ｂは、２３１ｎｍの吸収ピークを例示し、図６Ｃは５００ｎｍ領域をさらに詳細に例示し、Ｘは０分および１５分経過時の吸収ピークを例示し、Ｙは時間経過曲線の終盤の最大吸収波長を例示する。
【図７】
２３１ｎｍの吸光度を経時的に測定することによってモニターした、アポラクトフェリンおよび炭酸水素ナトリウムの反応を例示するグラフを例示する。
【図８】
対照溶液１（ＴｃＯ４−および還元溶液）および溶液２（ＴｃＯ４−および還元溶液およびＴｆ）の取り込みを示すグラフを例示する。
【図１】
2004505932.tif 000005
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004505932.tif 000048
【国際調査報告】
2004505932.tif 000049
2004505932.tif 000050
2004505932.tif 000051