(57)【要約】本発明は、抗原、より特別には、治療及び／又は予防のためのワクチン成分として有用なストレプトコッカス・ピオゲネス（ストレプトコッカスＡ群（ＧＡＳ）とも呼ばれる）細菌性病原体の抗原に関する。
2004524014.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離されたポリヌクレオチドであって、以下の：
（ａ）ポリヌクレオチドであって、以下の：配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６或いはそれらのフラグメント又はアナログ、を含む配列を有する第２のポリペプチドに対する少なくとも７０％の同一性を有するポリペプチドをコードする前記ポリヌクレオチド；
（ｂ）ポリヌクレオチドであって、以下の：配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６或いはそれらのフラグメント又はアナログ、を含む配列を有する第２のポリペプチドに対する少なくとも９５％の同一性を有するポリペプチドをコードする前記ポリヌクレオチド；
（ｃ）ポリヌクレオチドであって、以下の：配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６或いはそれらのフラグメント又はアナログ、から選ばれる配列を含むポリペプチドをコードする、前記ポリヌクレオチド；
（ｄ）ポリヌクレオチドであって、以下の：配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６或いはそれらのフラグメント又はアナログを含む配列を有するポリペプチドに対する結合特異性を有する抗体を産生することのできるポリペプチドをコードする、前記ポリヌクレオチド；
（ｅ）ポリヌクレオチドであって、以下の：配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６或いはそれらのフラグメント又はアナログ、から選ばれる配列を有するポリペプチドの部分を含むエピトープをコードする、前記ポリヌクレオチド；
（ｆ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、又は（ｅ）に記載のポリヌクレオチドに対して相補的なポリヌクレオチド；
から選ばれるポリヌクレオチドを含む前記ポリヌクレオチド。
【請求項２】
単離されたポリヌクレオチドであって、以下の：
（ａ）ポリヌクレオチドであって、以下の：配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、又は１６を含む配列を有する第２のポリペプチドに対する少なくとも７０％の相同性を有するポリペプチドをコードする、前記ポリヌクレオチド；
（ｂ）ポリヌクレオチドであって、以下の：配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４又は１６を含む配列を有する第２のポリペプチドに対する少なくとも９５％の相同性を有するポリペプチドをコードする、前記ポリヌクレオチド；
（ｃ）ポリヌクレオチドであって、以下の：配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４又は１６、から選ばれる配列を含むポリペプチドをコードする、前記ポリヌクレオチド；
（ｄ）ポリヌクレオチドであって、以下の：配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、又は１６を含む配列を有するポリペプチドに対する結合特異性を有する抗体を産生することのできるポリペプチドをコードする、前記ポリヌクレオチド；
（ｅ）ポリヌクレオチドであって、以下の：配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４又は１６から選ばれる配列を有するポリペプチドの部分を含むエピトープをコードする、前記ポリヌクレオチド；
（ｆ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、又は（ｅ）に記載のポリヌクレオチドに対して相補的なポリヌクレオチド；
から選ばれるポリヌクレオチドを含む前記ポリヌクレオチド。
【請求項３】
前記ポリヌクレオチドがＤＮＡである、請求項１に記載の上記ポリヌクレオチド。
【請求項４】
前記ポリヌクレオチドがＤＮＡである、請求項２に記載の上記ポリヌクレオチド。
【請求項５】
前記ポリヌクレオチドがＲＮＡである、請求項１に記載の上記ポリヌクレオチド。
【請求項６】
前記ポリヌクレオチドがＲＮＡである、請求項２に記載の上記ポリヌクレオチド。
【請求項７】
請求項１に記載の上記ポリヌクレオチドであって、ストリンジェントな条件下で以下の：
（ａ）ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列、又は
（ｂ）ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列の相補的配列であって、ここで前記ポリペプチドが配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６或いはそのフラグメント又はアナログを含む、前記配列、
のいずれかに加水分解する、前記ポリヌクレオチド。
【請求項８】
請求項２に記載の上記ポリヌクレオチドであって、ストリンジェントな条件下で以下の：
（ａ）ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列、又は
（ｂ）ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列の相補的配列であって、ここで前記ポリペプチドが配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６を含む、前記配列、
のいずれかに加水分解する、前記ポリヌクレオチド。
【請求項９】
請求項１に記載の上記ポリヌクレオチドであって、ストリンジェントな条件下で以下の：
（ａ）ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列、又は
（ｂ）ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列の相補的配列であって、ここで前記ポリペプチドが、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６或いはそのフラグメント又はアナログを含むポリペプチドからの近接するアミノ酸残基を少なくとも１０含む、前記配列、
のいずれかに加水分解する、前記ポリヌクレオチド。
【請求項１０】
請求項２に記載の上記ポリヌクレオチドであって、ストリンジェントな条件下で以下の：
（ａ）ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列、又は
（ｂ）ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列の相補的配列であって、ここで前記ポリペプチドが、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６を含むポリペプチドからの近接するアミノ酸残基を少なくとも１０含む、前記配列、
のいずれかに加水分解する、前記ポリペプチド。
【請求項１１】
請求項１に記載の上記ポリヌクレオチドを含むベクターであって、ここで前記ＤＮＡが作働可能であるように発現コントロール領域に連結される、前記ベクター。
【請求項１２】
請求項２に記載の上記ポリヌクレオチドを含むベクターであって、ここで前記ＤＮＡが、作働可能であるように発現コントロール領域に連結される、前記ベクター。
【請求項１３】
請求項１１に記載の上記ベクターにより形質移入された宿主細胞。
【請求項１４】
請求項１２に記載の上記ベクターにより形質移入された宿主細胞。
【請求項１５】
ポリペプチドを生産するための方法であって、前記ポリペプチドの発現に好適な条件下で、請求項１３に記載の宿主細胞を培養することを含む、前記方法。
【請求項１６】
ポリペプチドを生産するための方法であって、前記ポリペプチドの発現に好適な条件下で、請求項１４に記載の宿主細胞を培養することを含む、前記方法。
【請求項１７】
単離されたポリペプチドであって、以下の：
（ａ）ポリペプチドであって、以下の：配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６或いはそのフラグメント又はアナログを含むアミノ酸配列を有する第２のポリペプチドに対する少なくとも７０％の同一性を有する、前記ポリペプチド；
（ｂ）ポリペプチドであって、以下の：配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６或いはそのフラグメント又はアナログを含むアミノ酸配列を有する第２のポリペプチドに対する少なくとも９５％の同一性を有する、前記ポリペプチド；
（ｃ）ポリペプチドであって、以下の：配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６或いはそのフラグメント又はアナログ、から選ばれる配列を含む、前記ポリペプチド；
（ｄ）ポリペプチドであって、以下の：配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、或いはそのフラグメント又はアナログ、から選ばれる配列を有するポリペプチドに対する結合特異性を有する抗体を産生することのできる、前記ポリペプチド；
（ｅ）エピトープであって、以下の：配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６或いはそのフラグメント又はアナログ、から選ばれる配列を有するポリペプチドの部分を含む、前記エピトープ；
（ｆ）Ｎ−末端のＭｅｔ残基が欠失されている、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）又は（ｅ）に記載のポリペプチド；
（ｇ）分泌アミノ酸配列が欠失されている、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、又は（ｅ）に記載のポリペプチド；
から選ばれるポリペプチドを含む、前記ポリペプチド。
【請求項１８】
単離されたポリペプチドであって、以下の：
（ａ）ポリペプチドであって、以下の：配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４又は１６を含むアミノ酸配列を有する第２のポリペプチドに対する少なくとも７０％の同一性を有する、前記ポリペプチド；
（ｂ）ポリペプチドであって、以下の：配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４又は１６を含むアミノ酸配列を有する第２のポリペプチドに対する少なくとも９５％の同一性を有する、前記ポリペプチド；
（ｃ）以下の：配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４又は１６、から選ばれる配列を含む、ポリペプチド；
（ｄ）ポリペプチドであって、以下の：配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４又は１６から選ばれる配列を有するポリペプチドに対する結合特異性を有する抗体を産生することのできる、前記ポリペプチド；
（ｅ）エピトープであって、以下の：配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４又は１６、から選ばれる配列を有するポリペプチドの部分を含む、前記エピトープ；
（ｆ）Ｎ−末端のＭｅｔ残基が欠失されている、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）又は（ｅ）に記載のポリペプチド；
（ｇ）分泌アミノ酸配列が欠失されている、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、又は（ｅ）に記載のポリペプチド；
から選ばれるポリペプチドを含む、前記ポリペプチド。
【請求項１９】
キメラのポリペプチドであって、以下の：配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６或いはそのフラグメント又はアナログ、から選ばれる配列を有する２又はそれを越えるポリペプチドを含み、上記ポリペプチドがキメラのポリペプチドを形成するように連結されるという条件下の、前記ポリペプチド。
【請求項２０】
キメラのポリペプチドであって、以下の：配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、から選ばれる配列を有する２又はそれを越えるポリペプチドを含み、上記ポリペプチドがキメラのポリペプチドを形成するように連結されるという条件下の、前記ポリペプチド。
【請求項２１】
請求項１７〜２０のいずれか１項に記載のポリペプチド及び薬剤として許容できる担体、希釈剤又はアジュバントを含む、医薬組成物。
【請求項２２】
咽頭炎、丹毒及び膿痂疹、猩紅熱並びに菌血症及び壊死性の筋膜炎のような侵入型の疾患そしてまた毒素ショックにかかっている疑いのある宿主における、咽頭炎、丹毒及び膿痂疹、猩紅熱並びに菌血症及び壊死性の筋膜炎のような侵入型の疾患の治療的又は予防的処置のための方法であって、前記宿主に請求項２１に記載の組成物の治療的又は予防的な量を投与することを含む、前記方法。
【請求項２３】
ストレプトコッカス・ピオゲネス感染の疑いのある宿主における、ストレプトコッカス・ピオゲネス細菌感染の治療的又は予防的処置のための方法であって、前記宿主に請求項２１に記載の組成物の治療的又は予防的な量を投与することを含む、前記方法。
【請求項２４】
上記宿主が動物である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
上記宿主がヒトである、請求項２２に記載の方法。
【請求項２６】
ストレプトコッカス感染の疑いのある宿主における、ストレプトコッカス細菌感染の診断のための方法であって、前記宿主に請求項２１に記載の組成物を投与することを含む、前記方法。
【請求項２７】
ストレプトコッカス感染の疑いのある宿主におけるストレプトコッカス感染の診断のための方法であって、以下の：
（ａ）生物学的サンプルを宿主から得ること；
（ｂ）請求項１７〜２０のいずれか１項に記載のストレプトコッカスのポリペプチドと反応しうる抗体又はそのフラグメントと生物学的サンプルとの混合物を形成するために、両者をインキュベートすること；
（ｃ）ストレプトコッカスの存在を示す、上記混合物中の特異的に結合した抗体又は結合したそのフラグメントを検出すること；
を含む、前記方法。
【請求項２８】
ストレプトコッカス感染の疑いのある宿主におけるストレプトコッカス感染の診断のための方法であって、以下の：
（ａ）生物学的サンプルを宿主から得ること；
（ｂ）請求項１７〜２０のいずれか１項に記載のストレプトコッカスのポリペプチドの１又はそれを越えるもの又はそのフラグメントと生物学的サンプルとの混合物を形成するために、両者をインキュベートすること；
（ｃ）ストレプトコッカスに特異的な抗体の存在を示す、上記混合物中の特異的に結合した抗原又は結合したフラグメントを検出すること；
を含む、前記方法。
【請求項２９】
ストレプトコッカス感染の疑いのある宿主におけるストレプトコッカス細菌感染の予防的又は治療的処置のための、請求項２２に記載の治療的又は予防的処置のための方法であって、前記宿主に請求項２１に記載の組成物の治療的又は予防的な量を投与することを含む、前記方法。
【請求項３０】
ストレプトコッカス感染の検出又は診断のための請求項１７〜２０のいずれか１項に記載のポリペプチドを含むキット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明は、抗原、より特別にはストレプトコッカス感染を予防、診断及び／又は治療するために使用されることのできる、ストレプトコッカスＡ群（Ｓ． ピオゲネス（Ｓ． ｐｙｏｇｅｎｅｓ））細菌性病原体に属するＢＶＨ−Ｐ２、ＢＶＨ−Ｐ３、ＢＶＨ−Ｐ４、ＢＶＨ−Ｐ５及びＢＶＨ−Ｐ６抗原に関する。
【０００２】
発明の背景
ストレプトコッカスは、細菌表面に見出される、群特異的な炭水化物抗原ＡからＯによって区別されるグラム（＋）細菌である。Ｓ． ピオゲネス単離物はさらに型−特異的なＭタンパク抗原によって識別される。Ｍタンパクは分子量及び配列の両方において高度に多様な、重要な病原性因子である。実際に、抗原としての相違に基いて８０を越えるＭタンパクの型が同定された。
【０００３】
Ｓ． ピオゲネスは、咽頭炎、丹毒及び膿痂疹、猩紅熱、並びに菌血症及び壊死性の筋膜炎のような侵入型の疾患を含む多くの多様な感染症の型の原因である。近年における侵入型の疾患の復活は、北米及びヨーロッパ諸国を含む多くの国で証明されてきた。生物体が抗生物質に敏感であるにもかかわらず、高い罹患率及び敗血症の迅速な発生は、高い発病率及び死亡率に帰着する。
【０００４】
Ｓ． ピオゲネス感染から宿主を守るワクチンを開発するために、型−特異的なＭタンパクのような病原性因子に焦点を合わせた努力が払われた。しかしながら、Ｍタンパクのアミノ末端部分がヒト心筋、トロポミオシン、ミオシン、及びビメンチンと反応した交差反応抗体、これは自己免疫疾患と関係があるかも知れないとされる、を誘導することが見出された。他の者は異なる血清型からのＭ−タンパクのアミノ末端ペプチドを含む複合ハイブリッドタンパクを生産するために、組み換え技術を用いた。しかしながら、すべての血清型のＳ． ピオゲネスを含む安全なワクチンは、生産し規格化するのに高度に複雑であろう。
【０００５】
血清型−特異的な抗原に加えて、他のＳ． ピオゲネスタンパクは、潜在的なワクチン候補としての利益を生じさせた。少なくともＳ． ピオゲネス４０血清型により発現されるＣ５ａペプチダーゼは、マウスにおいて免疫原性であることが示されたが、その鼻咽頭のコロニー形成レベルの低下能は限られたものであった。他の研究者はまた、感染の原因に重要な役割を演じると見られるストレプトコッカスの発熱性の菌体外毒素に注目した。これらのタンパクによる免疫化は、毒素ショックの致死性の症状を防止したが、コロニー形成は、防がなかった。
【０００６】
オクラホマ大学は、Ｓ． ピオゲネスＭ１ＧＡＳ系統のためのゲノム配列決定プロジェクトを設立した（ｈｔｔｐ：／／ｄｎａｌ．ｃｈｅｍ．ｏｕ．ｅｄｕ／ｓｔｒｅｐ．ｈｔｍｌ）。
【０００７】
したがって、Ｓ． ピオゲネス感染の予防及び／又は治療のためのワクチン成分として使用されることのできるＳ． ピオゲネス抗原へのまだ対処されていない必要性が残っている。
【０００８】
発明の要約
１の側面によれば、本発明は、単離されたポリヌクレオチドであって、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４及び１６或いはそのフラグメント又はアナログから選ばれる配列を含む第２のポリペプチドとの少なくとも７０％の同一性を有するポリペプチドをコードする前記ポリヌクレオチドを提供する。
【０００９】
１の側面によれば、本発明は配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４及び１６或いはそのフラグメント又はアナログ、から選ばれるアミノ酸配列を含むポリペプチドに関する。
【００１０】
他の側面によれば、本発明によるポリヌクレオチドによりコードされたポリペプチド、医薬組成物、作働可能であるように、発現コントロール領域に連結される、本発明によるポリヌクレオチドを含むベクター、そして同様に前記ベクターで形質移入された宿主細胞及び発現に好適な条件下で前記宿主細胞を培養することを含む、ポリペプチドの製造方法が提供される。
【００１１】
図面の簡単な説明
図１、３、５、７、９中では、配列の下線を引いた部分は、リーダーペプチドをコードする領域を表す。図２、４、６、８、１０中では、配列の下線を引いた部分は、リーダーペプチドを表す。
【００１２】
図１は、Ｍ３血清型Ｓ． ピオゲネスＡＴＣＣ１２３８４株からのＢＶＨ−Ｐ２遺伝子のＤＮＡ配列；配列番号１を表す。
図２は、Ｍ３血清型Ｓ． ピオゲネスＡＴＣＣ１２３８４株からのＢＶＨ−Ｐ２ポリペプチドのアミノ酸配列；配列番号２を表す。
図３は、Ｍ１血清型Ｓ． ピオゲネスＡＴＣＣ７００２９４株からのＢＶＨ−Ｐ３遺伝子のＤＮＡ配列；配列番号３を表す。
図４は、Ｍ１血清型Ｓ． ピオゲネスＡＴＣＣ７００２９４株からのＢＶＨ−Ｐ３ポリペプチドのアミノ酸配列；配列番号４を表す。
図５は、Ｍ１血清型Ｓ． ピオゲネスＡＴＣＣ７００２９４株からのＢＶＨ−Ｐ４遺伝子のＤＮＡ配列；配列番号５を表す。
【００１３】
図６は、Ｍ１血清型Ｓ． ピオゲネスＡＴＣＣ７００２９４株からのＢＶＨ−Ｐ４ポリペプチドのアミノ酸配列；配列番号６を表す。
図７は、Ｍ１血清型Ｓ． ピオゲネスＡＴＣＣ７００２９４株からのＢＶＨ−Ｐ５遺伝子のＤＮＡ配列；配列番号７を表す。
図８は、Ｍ１血清型Ｓ． ピオゲネスＡＴＣＣ７００２９４株からのＢＶＨ−Ｐ５ポリペプチドのアミノ酸配列；配列番号８を表す。
図９は、Ｍ１血清型Ｓ． ピオゲネスＡＴＣＣ７００２９４株からのＢＶＨ−Ｐ６遺伝子のＤＮＡ配列；配列番号９を表す。
図１０は、Ｍ１血清型Ｓ． ピオゲネスＡＴＣＣ７００２９４株からのＢＶＨ−Ｐ６ポリペプチドのアミノ酸配列；配列番号１０を表す。
【００１４】
図１１は、Ｍ３血清型Ｓ． ピオゲネスＡＴＣＣ１２３８４株からのＢＶＨ−Ｐ４遺伝子のＤＮＡ配列；配列番号１１を表す。
図１２は、Ｍ３血清型Ｓ． ピオゲネスＡＴＣＣ１２３８４株からのＢＶＨ−Ｐ４ポリペプチドのアミノ酸配列；配列番号１２を表す。
図１３は、Ｍ６血清型Ｓ． ピオゲネスＳＰＹ６７株からのＢＶＨ−Ｐ４遺伝子のＤＮＡ配列；配列番号１３を表す。
図１４は、Ｍ３血清型Ｓ． ピオゲネスＳＰＹ６７株からのＢＶＨ−Ｐ４ポリペプチドのアミノ酸配列；配列番号１４を表す。
図１５は、血清型Ｓ． ピオゲネスＢ５１４株からのＢＶＨ−Ｐ４遺伝子のＤＮＡ配列；配列番号１５を表す。
図１６は、血清型Ｓ． ピオゲネスＢ５１４株からのＢＶＨ−Ｐ４ポリペプチドのアミノ酸配列；配列番号１６を表す。
【００１５】
図１７は、Ｍ１血清型  Ｓ． ピオゲネスＡＴＣＣ７００２９４株、Ｍ３血清型  ＡＴＣＣ１２３８４株、Ｍ６血清型  ＳＰＹ７７株及びマウス単離物Ｂ５１４からのＢＶＨ−Ｐ４遺伝子のヌクレオチド配列のＭａｃＶｅｃｔｏｒ配列分析ソフトウエア（バージョン６．５）からのプログラムＣｌｕｓｔａｌ  Ｗを用いた比較である。同一のヌクレオチドは＊ で表され、相違は空白スペースで示される。
図１８は、Ｍ１血清型  Ｓ． ピオゲネスＡＴＣＣ７００２９４株、Ｍ３血清型  ＡＴＣＣ１２３８４株、Ｍ６血清型  ＳＰＹ７７株及びマウス単離物Ｂ５１４からのＢＶＨ−Ｐ４の部分的オープンリーディングフレームの予想されたアミノ酸配列のＭａｃｖｅｃｔｏｒ配列分析ソフトウエア（バージョン６．５）からのプログラムＣｌｕｓｔａｌ  Ｗを用いた比較である。列の下には、コンセンサスラインがある。同一のアミノ酸は＊ で表され、一方、相違はピリオドで示される。
【００１６】
発明の詳細な説明
本発明は、精製され、単離されたＤＮＡ分子を提供し、これはストレプトコッカス感染を予防、治療、及び／又は診断するために用いられることのできるストレプトコッカスのポリペプチドをコードする。
当業者は、ここで本特許出願において記載するように、本発明が、そのようなポリペプチドの変異体、変種、同族体及び誘導体のようなアナログをコードするＤＮＡ分子を含むことを評価するだろう。本発明はまた、本発明によるＤＮＡ分子に対応するＲＮＡ分子をも含む。上記ＤＮＡ及びＲＮＡ分子に加えて、本発明は、そのようなポリペプチドに特異的に結合する対応するポリペプチド及び単一特異性抗体を含む。
【００１７】
１の側面によれば、本発明は、単離されたポリヌクレオチドであって、以下の：配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６或いはそれらのフラグメント又はアナログ、から選ばれる配列を含む第２のポリペプチドに対する少なくとも７０％の同一性を有するポリペプチドをコードする前記ポリヌクレオチドを提供する。
１の側面によれば、本発明は、単離されたポリヌクレオチドであって、以下の：配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６或いはそれらのフラグメント又はアナログ、から選ばれる配列を含む第２のポリペプチドに対する少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチドをコードする、前記ポリヌクレオチドを提供する。
１の側面によれば、本発明は、単離されたポリヌクレオチドであって、以下の：配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６或いはそれらのフラグメント又はアナログ、から選ばれる配列を含む第２のポリペプチドに対する少なくとも９０％の同一性を有するポリペプチドをコードする、前記ポリヌクレオチドを提供する。
【００１８】
１の側面によれば、本発明は、単離されたポリヌクレオチドであって、以下の：配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６或いはそれらのフラグメント又はアナログ、から選ばれる配列を含む第２のポリペプチドに対する少なくとも９５％の同一性を有するポリペプチドをコードする、前記ポリヌクレオチドを提供する。
１の側面によれば、本発明は、以下の：配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６或いはそれらのフラグメント又はアナログ、から選ばれる配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。
１の側面によれば、本発明は、ポリヌクレオチドであって、以下の：配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、又は１６或いはそれらのフラグメント又はアナログ、から選ばれる配列を有するポリペプチドに対する結合特異性を有する抗体を産生することのできるポリペプチドをコードする、前記ポリヌクレオチドを提供する。
【００１９】
１の側面によれば、本発明は、ポリヌクレオチドであって、以下の：配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４又は１６或いはそれらのフラグメント又はアナログ、から選ばれる配列を有するポリペプチドの部分を含むエピトープをコードする、前記ポリヌクレオチドを提供する。
１の側面によれば、本発明は、以下の：配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４又は１６或いはそれらのフラグメント又はアナログ、から選ばれる配列を有するポリペプチドの部分を含むエピトープに関する。
１の側面によれば、本発明は、単離されたポリヌクレオチドであって、以下の：配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４又は１６、から選ばれる配列を含む第２のポリペプチドに対する少なくとも７０％の同一性を有するポリペプチドをコードする、前記ポリヌクレオチドを提供する。
１の側面によれば、本発明は、単離されたポリヌクレオチドであって、以下の：配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４又は１６、から選ばれる配列を含む第２のポリペプチドに対する少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチドをコードする、前記ポリヌクレオチドを提供する。
【００２０】
１の側面によれば、本発明は、単離されたポリヌクレオチドであって、以下の：配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４又は１６、から選ばれる配列を含む第２のポリペプチドに対する少なくとも９０％の同一性を有するポリペプチドをコードする、前記ポリヌクレオチドを提供する。
１の側面によれば、本発明は、単離されたポリヌクレオチドであって、以下の：配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４又は１６、から選ばれる配列を含む第２のポリペプチドに対する少なくとも９５％の同一性を有するポリペプチドをコードする、前記ポリヌクレオチドを提供する。
１の側面によれば、本発明は、以下の：配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４又は１６或いはそれらのフラグメント又はアナログ、から選ばれる配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。
１の側面によれば、本発明は、ポリヌクレオチドであって、以下の：配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４又は１６から選ばれる配列を有するポリペプチドに対する結合特異性を有する抗体を産生することのできるポリペプチドをコードする、前記ポリヌクレオチドを提供する。
１の側面によれば、本発明は、以下の：配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４又は１６、から選ばれる配列を有するポリペプチドの部分を含むエピトープをコードするポリヌクレオチドを提供する。
【００２１】
１の側面によれば、本発明は、以下の：配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４又は１６、から選ばれる配列を有するポリペプチドの部分を含むエピトープに関する。
本発明によれば、ポリペプチドをコードするすべてのポリヌクレオチドは本発明の範囲内にある。
１の側面によれば、本発明は、以下の：配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６或いはそれらのフラグメント又はアナログ、から選ばれるアミノ酸配列を有する第２のポリペプチドに対する少なくとも７０％の同一性を有するポリペプチドに関する。
１の側面によれば、本発明は、以下の：配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６或いはそれらのフラグメント又はアナログ、から選ばれるアミノ酸配列を有する第２のポリペプチドに対する少なくとも９５％の同一性を有するポリペプチドに関する。
【００２２】
１の側面によれば、本発明は、以下の：配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６或いはそれらのフラグメント又はアナログ、からの配列を含むアミノ酸配列に特徴を有するポリペプチドに関する。
１の側面によれば、本発明は、ポリペプチドであって、以下の：配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６或いはそれらのフラグメント又はアナログ、から選ばれる配列を有するポリペプチドに対する結合特異性を有する抗体を産生することのできる前記ポリペプチドに関する。
１の側面によれば、本発明は、以下の：配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６或いはそれらのフラグメント又はアナログ、から選ばれるポリペプチドの部分を含むエピトープに関する。
１の側面によれば、本発明は、以下の：配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６から選ばれるアミノ酸配列を有する第２のポリペプチドに対する少なくとも７０％の同一性を有するポリペプチドに関する。
【００２３】
１の側面によれば、本発明は、以下の：配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６から選ばれるアミノ酸配列を有する第２のポリペプチドに対する少なくとも９５％の同一性を有するポリペプチドに関する。
１の側面によれば、本発明は、以下の：配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、からの配列を含むアミノ酸配列に特徴を有するポリペプチドに関する。
１の側面によれば、本発明は、ポリペプチドであって、以下の：配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６から選ばれる配列を有するポリペプチドに対する結合特異性を有する抗体を産生することのできる前記ポリペプチドに関する。
１の側面によれば、本発明は、以下の：配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６から選ばれる配列を有するポリペプチドの部分を含むエピトープに関する。
【００２４】
さらなる実施態様においては、本発明によるポリペプチドは抗原性がある。
さらなる実施態様においては、本発明によるポリペプチドは、免疫原性がある。
さらなる実施態様においては、本発明によるポリペプチドは、宿主において免疫応答を引き出すことができる。
さらなる実施態様においては、本発明はまた、上で定義された本発明によるポリペプチドに対する結合特異性を有する抗体を産生することのできるポリペプチドに関する。
“結合特異性を有する”抗体は、上記選択されたポリペプチドを認識し、結合するが、例えば、自然に上記選択されたペプチドを含む、生物学的サンプルであるサンプル中の他の分子を実質的に認識し、結合しない抗体である。特異的結合は、上記選択されたポリペプチドが抗原として用いられる、ＥＬＩＳＡアッセイを用いて測定することができる。
【００２５】
本発明によれば、生物学的研究において“保護”とは、生存曲線、生存率又は生存期間の有意な増加と定義される。生存曲線を比較する記録順位検定及び生存率及び死までの日数を比較するフィッシャーの正確検定をそれぞれ用いた統計分析は、Ｐ値を計算し、２の群の間の相違が統計学的に有意であるかを決定するのに有用であろう。０．０５というＰ値は有意でないとみなされる。
本発明によれば、図１７に示されたＢＶＨ−Ｐ４のコンセンサスヌクレオチド配列が提供される。上記配列に見られるように、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、よく保存されている。本発明の範囲を非制限的なものとすることにより、以下の表Ａに、可能な変更を示す：
【表１】
2004524014.tif 000003
【００２６】
本発明によれば、図１８に示されたＢＶＨ−Ｐ４のコンセンサスアミノ酸配列が提供される。上記配列に見られるように、本発明のポリペプチドは、よく保存されている。本発明の範囲を非制限的なものとすることにより、以下の表Ｂに可能な変更を示す：
【表２】
2004524014.tif 000004
本発明の追加の側面においては、本発明のポリペプチド、又はそれらのアナログの抗原性の／免疫原性のフラグメントが提供される。
本発明のフラグメントは、１又はそれを越えるエピトープ領域を含むか又はそれらの抗原性の／免疫原性の性質を保持するためのそのような領域に十分に類似していなければならない。したがって、本発明によるフラグメントについては、同一性の程度はおそらく関連性がない、なぜならば、ここで記載されたように、それらはポリペプチド又はそれらのアナログの特別の部分と１００％同一であることができるからである。本発明はさらに、本発明のポリペプチド配列からの、少なくとも１０の近接するアミノ酸残基を有するフラグメントを提供する。１の実施態様においては、少なくとも１５の近接するアミノ酸残基である。１の実施態様においては、少なくとも２０の近接するアミノ酸残基である。
【００２７】
当業者は本発明のポリペプチドのアナログが、本発明の関係においてその用途、すなわち抗原性の／免疫原性の物質として、をも見い出すことを評価するだろう。したがって、例えば１又はそれを越える付加、欠失、置換又はその他同種のものを含むタンパク又はポリペプチドは、本発明の範囲に含まれる。
これらの置換は、上記ポリペプチドの２次構造及び疎水性親水性指標の性質に最小の影響を有するものである。好ましい置換は、本分野において保存された、すなわち上記被置換残基が疎水性、サイズ、電荷又は官能基のような物理的又は化学的性質を共有する、ものであるとして知られている。これらは、Ｄａｙｈｏｆｆ， Ｍ． によりＡｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ５， １９７８ 及びＡｒｇｏｓ， Ｐ． によりＥＭＢＯ Ｊ． ８， ７７９−７８５， １９８９に記載されたような置換を含む。例えば、以下の群：
ａｌａ，ｐｒｏ，ｇｌｙ，ｇｌｎ，ａｓｎ，ｓｅｒ，ｔｈｒ，ｖａｌ；
ｃｙｓ，ｓｅｒ，ｔｙｒ，ｔｈｒ；
ｖａｌ，ｉｌｅ，ｌｅｕ，ｍｅｔ，ａｌａ，ｐｈｅ；
ｌｙｓ，ａｒｇ，ｏｒｎ，ｈｉｓ；及び
ｐｈｅ，ｔｙｒ，ｔｒｐ，ｈｉｓ；
の１に属する天然又は非天然のいずれかのアミノ酸は保存的な変化を示す。好ましい置換はまた、Ｄ−エナンチオマーの対応するＬ−アミノ酸への置換を含む。
【００２８】
相同性のパーセンテージは、同一性のパーセンテージと類似性又はアミノ酸タイプの保存のパーセンテージの和として定義される。
代わりのアプローチにおいて、上記アナログは、例えば目的のポリペプチドを効果的にタグすることにより、精製を容易なものとする成分を含む融合タンパクであることができる。上記“タグ”を除去することが必要であるかも知れず、又は融合ポリペプチド自体が有用であるのに十分な抗原性を保持している場合であるかも知れない。
したがって、アナログ、誘導体そしてフラグメントにとって重要なのは、少なくともそれらが由来するタンパク又はポリペプチドの抗原性／免疫原性の程度をそれらが有することである。
【００２９】
ここで用いられるように、本発明のポリペプチドの“フラグメント”、“アナログ”又は“誘導体”は、１又はそれを越えるアミノ酸残基が保存された又は非保存の（好ましくは保存された）アミノ酸残基と置換された、天然又は非天然のポリペプチドを含む。
１の実施態様において、本発明のポリペプチドのアナログは、図に表された配列又はそれらのアナログと約７０％の同一性を有するだろう。すなわち、残基の７０％が同一である。さらなる実施態様においては、ポリペプチドは７５％より大きい相同性を有するだろう。さらなる実施態様においては、ポリペプチドは８０％より大きい相同性を有するだろう。さらなる実施態様においては、ポリペプチドは８５％より大きい相同性を有するだろう。さらなる実施態様においては、ポリペプチドは９０％より大きい相同性を有するだろう。さらなる実施態様においては、ポリペプチドは９５％より大きい相同性を有するだろう。さらなる実施態様においては、ポリペプチドは９９％より大きい相同性を有するだろう。さらなる実施態様においては、本発明のポリペプチドのアナログは、約２０アミノ酸残基よりも少ない、そしてより好ましくは１０アミノ酸残基よりも少ない置換、修飾又は欠失を有するだろう。
【００３０】
さらなる実施態様においては、ポリペプチドは７０％より大きい相同性を有するだろう。さらなる実施態様においては、ポリペプチドは７５％より大きい相同性を有するだろう。さらなる実施態様においては、ポリペプチドは８０％より大きい相同性を有するだろう。さらなる実施態様においては、ポリペプチドは、８５％より大きい相同性を有するだろう。さらなる実施態様においては、ポリペプチドは、９０％より大きい相同性を有するだろう。さらなる実施態様においては、ポリペプチドは、９５％より大きい相同性を有するだろう。さらなる実施態様においては、ポリペプチドは、９９％より大きい相同性を有するだろう。さらなる実施態様においては、本発明のポリペプチドの誘導体及びアナログは、約２０アミノ酸残基よりも少ない、そしてより好ましくは１０アミノ酸残基よりも少ない置換、修飾又は欠失を有するだろう。好ましい置換は、本分野において保存された、すなわち上記被置換残基が疎水性、サイズ、電荷又は官能基のような物理的又は化学的性質を共有する、ものであるとして知られている。
【００３１】
ＣＬＵＳＴＡＬプログラムのようなプログラムをアミノ酸配列の比較に用いることができる。このプログラムはアミノ酸配列を比較し、いずれかの配列に適切にスペースを挿入することにより、最適の配列を見出す。最適の配列のためにアミノ酸の同一性又は類似性（同一性に加えてアミノ酸タイプの保存性）を計算することができる。ＢＬＡＳＴＸのようなプログラムは、最長の長さの類似する配列を整列化し、適合度を割り充てる。したがって、それぞれが異なるスコアを有する、類似した数領域が見出される比較を得ることができる。同一性分析の両方のタイプはともに本発明において、熟慮される。
本発明の追加の側面においては、本発明のポリペプチド又はそれらのアナログの抗原性の／免疫原性のフラグメントが提供される。
ここで記載されたポリペプチドのフラグメント又はそれらのアナログについては、未変性のタンパクとは状況がやや異なる。エピトープ領域、すなわち上記ポリペプチドの抗原性又は免疫原性の原因となる領域、を同定するための抗原性ポリペプチドをスクリーニングすることができることは周知である。そのようなスクリーニングを実行するための方法は本分野において周知である。したがって、本発明の上記フラグメントは、１又はそれを越えるそのようなエピトープ領域を含むか又はそれらの抗原性の／免疫原性の性質を保持するのに十分なほど、そのような領域に類似していなければならない。したがって、本発明のフラグメントについては、同一性の程度はおそらく関連性がない、なぜならば、ここで記載されたようにそれらはポリペプチド又はアナログの特別の部分と１００％同一であることができるからである。
【００３２】
上記ポリペプチドの生物学的又は薬理学的性質を変える、他の化合物をそこへ融合させたポリペプチドもまた含まれ、それはすなわち、半減期を延長させるポリエチレングリコール（ＰＥＧ）；精製を容易にするためのリーダー又は分泌性のアミノ酸配列；プレプロ−及びプロ−配列；及び（ポリ）サッカライドである。
さらには、アミノ酸領域が多型であることが見出される状況において、異なるストレプトコッカス株の異なるエピトープをより効果的に擬態するために１又はそれを越える特別なアミノ酸を多様化することが望ましいかも知れない。
さらには、本発明のポリペプチドは、安定性、支持体又は他の分子への連結又は結合のための増加した疎水性を与えるために末端の−ＮＨ２ のアシル化（例えば、アセチル化又はチオグリコール酸によるアミド化、例えばアンモニア又はメチラミンによるカルボキシ末端のアミド化により）により修飾されることができる。
【００３３】
上記ポリペプチドフラグメント及びアナログのヘテロ及びホモポリペプチド重合体もまた熟考される。これらの重合体は、例えば、アビジン／ビオチン、グルタルアルデヒド又はジメチルスペリミデートのようなクロスリンク剤とクロスリンクした１又はそれを越えるポリペプチドを含む。そのような重合体はまた、組み換えＤＮＡ技術により作られた多シストロンｍＲＮＡｓから産生される２又はそれを越える直列の又は逆位の近接した配列を含むポリペプチドをも含む。さらなる実施態様においては、本発明はまた、本出願の図に定義されるような１又はそれを越えるポリペプチド或いはそれらのフラグメント又はアナログを含むキメラのポリペプチドにも関する。
さらなる実施態様においては、本発明はまた、以下のポリペプチドがキメラのポリペプチドを形成するように連結するという条件で以下の：配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６或いはそれらのフラグメント又はアナログから選ばれる配列を有する２又はそれを越えるポリペプチドを含むキメラのポリペプチドにも関する。
さらなる実施態様においては、本発明はまた、以下のポリペプチドがキメラのポリペプチドを形成するように連結するという条件で以下の：配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４又は１６から選ばれる配列を有する２又はそれを越えるポリペプチドを含むキメラのポリペプチドにも関する。
【００３４】
抗原性のある重合体の形成（すなわち、合成多重合体）を達成するために、ポリペプチドをビスハロアセチル基、ニトロアセチルハライド又はそれと同様のものとともに利用することができ、ここで試薬はチオ基に対して特異的である。したがって、異なるポリペプチドの２のメルカプト基の間の連結は、一重結合又は少なくとも２の炭素原子からなる連結基、典型的には少なくとも４の炭素原子、そして１６以下の炭素原子、しかし通常は、１４以下の炭素原子からなる連結基が構成されることができる。
特別な実施態様においては、本発明のポリペプチドフラグメント及びアナログはメチオニン（Ｍｅｔ）又はバリン（Ｖａｌ）のような開始残基を含まない。
【００３５】
好ましくは、ポリペプチドは、リーダー又は分泌性の配列（シグナル配列）を取り込まない。本発明のポリペプチドのシグナル部分は、確立された分子生物学の技術によって決定されることができる。問題の上記ポリペプチドはストレプトコッカスの培養から単離され、引き続き成熟したタンパクの最初の残基、そしてしたがって成熟ポリペプチド配列を決定するために配列決定される。
組み換えポリペプチドの生産及び精製の便宜のために、ポリペプチドが生産され及び／又はそれらの開始コドン（メチオニン又はバリン）なしに及び／又はそれらのリーダーペプチドなしに用いられることが理解されている。リーダーペプチドをコードする配列を含まない遺伝子のクローニングは、上記ポリペプチドを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の細胞質に限定し、それらの回収を促進することが知られている（Ｇｌｉｃｋ， Ｂ．Ｒ． ａｎｄ Ｐａｓｔｅｒｎａｋ， Ｊ．Ｊ． （１９９８） Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｐｒｏｋａｒｙｏｔｅｓ． Ｉｎ“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ： Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ”， ２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ， ＡＳＭ Ｐｒｅｓｓ， Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ ＤＣ， ｐ．１０９〜１４３）。
【００３６】
上記ポリペプチドはリーダー又は分泌性の配列の存在下又は非存在下で発現することができる。前者の場合、リーダーは翻訳後プロセシングを用いて除去することができ（ここに参考文献として援用されている米国特許第４４３１７３９号、同第４４２５４３７号及び同第４３３８３９７号を参照のこと）、又は発現したポリペプチドの精製に続いて化学的に除去することができる。
本発明の他の側面によれば、以下の：（ｉ）本発明のポリペプチドを担体、希釈剤又はアジュバントとともに含む組成物；（ｉｉ）本発明のポリペプチド及び担体、希釈剤又はアジュバントを含む医薬組成物；（ｉｉｉ）本発明のポリペプチド及び担体希釈剤又はアジュバントを含むワクチン；（ｉｖ）例えば、ストレプトコッカスに対する防御的免疫応答を誘発するために免疫原として有効な量の本発明のポリペプチドを宿主に投与することにより、ストレプトコッカスに対する免疫応答を宿主中で誘導するための方法；（ｖ）必要としている宿主に本発明のポリペプチドの予防的又は治療的な量を投与することにより、ストレプトコッカス感染を予防及び／又は治療するための方法、もまた提供される。
【００３７】
免疫化の前に、本発明のポリペプチドは、破傷風毒素、ジフテリア毒素、Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原、灰白髄炎ウイルスＶＰ１抗原、又は他のいずれかのウイルス性若しくは細菌性の毒素若しくは抗原、或いはより強い免疫応答の発生を刺激するいずれかの好適なタンパクのような担体タンパクに結合又は接合されることもできる。この結合又は接合は化学的又は遺伝的に行われることができる。さらに詳細なペプチド−担体接合についての記載は、Ｖａｎ Ｒｅｇｅｎｍｏｒｔｅｌ， Ｍ．Ｈ．Ｖ．， Ｂｒｉａｎｄ Ｊ．Ｐ．， Ｍｕｌｌｅｒ Ｓ．， Ｐｌａｕｅｅ Ｓ．， ＜＜Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｓ ａｎｔｉｇｅｎｓ＞＞ ｉｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， ｖｏｌ． １９ （ｅｄ．） Ｂｕｒｄｏｕ， Ｒ．Ｈ． ＆ Ｖａｎ Ｋｎｉｐｐｅｎｂｅｒｇ Ｐ．Ｈ． （１９８８）， Ｅｌｓｅｖｔｅｒ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋにおいて入手可能である。
【００３８】
他の側面によれば、１又はそれを越える本発明のストレプトコッカスのポリペプチドを、薬剤として許容できるアジュバントとの混合物中に含む医薬組成物が提供される。好適なアジュバントは以下の：（１）ＭＦ５９（商標）、ＳＡＦ（商標）、Ｒｉｂｉ（商標）のような水中油型乳剤製剤；（２）フロイントの完全又は不完全アジュバント；（３）塩、すなわちＡｌＫ（ＳＯ４）２、ＡｌＮａ（ＳＯ４）２、ＡｌＮＨ４（ＳＯ４）２、Ａｌ（ＯＨ）３、ＡｌＰＯ４、シリカ、カオリン；（４）Ｓｔｉｍｕｌｏｎ（商標）又はＩＳＣＯＭｓ（ｉｍｍｕｎｏｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ 、免疫刺激複合体）；（５）インターロイキン、インターフェロン、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）のようなサイトカイン；（６）カーボンポリヌクレオチドのような他の物質、すなわちポリＩＣ及びポリＡＵ、解毒されたコレラ毒素（ＣＴＢ）並びに粘膜の免疫の誘導のためのＥ．ｃｏｌｉの非耐熱性毒素；を含む。さらに詳細なアジュバントについての記載は、ここに参考文献として援用されている、Ｍ．Ｚ．Ｉ Ｋａｈｎ ｅｔ ａｌ． ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， Ｖｏｌ． １１， Ｎｏ． １ （１９９４） ｐｐ２〜１１ による総説、及びまた、Ｇｕｐｔａ ｅｔ ａｌ．， ｉｎ Ｖａｃｃｉｎｅ， Ｖｏｌ． １３， Ｎｏ１４， ｐｐ１２６３〜１２７６ （１９９５）による総説、並びにＰＣＴ出願公開第９９／２４５７８号において入手可能である。好ましいアジュバントは、ＱｕｉｌＡ（商標）、ＱＳ２１（商標）、Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌ（商標）及びＡｄｊｕｐｈｏｓ（商標）を含む。
【００３９】
さらなる実施態様において、本発明のポリペプチドを、薬剤として許容できる希釈剤、賦型剤又はアジュバントと混合することを含む医薬組成物の製造方法が提供される。
さらなる側面においては、本発明は、宿主に、本発明の組成物の治療的又は予防的な量を投与することを含む、ストレプトコッカス感染の疑いのある宿主におけるストレプトコッカス細菌感染の予防的又は治療的処置のための方法を提供する。
本発明の医薬組成物は、非経口的に注射、高速輸注、鼻咽頭からの吸収、皮膚からの吸収により、又は舌下で或いは経口で投与されることができる。薬剤として許容できる担体もまた破傷風類毒素を含む。
【００４０】
本発明の医薬組成物は、ストレプトコッカス感染症及び／又はストレプトコッカス感染症により仲介された疾患及び症状の治療又は予防のために用いられ、それはＰ．Ｒ． Ｍｕｒｒａｙ（主筆）、Ｅ．Ｊ． Ｂａｒｏｎ， Ｍ．Ａ． Ｐｆａｌｌｅｒ， Ｆ．Ｃ． Ｔｅｎｏｖｅｒ及びＲ．Ｈ． Ｙｏｌｋｅｎに記載された通りである。Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ， ＡＳＭ Ｐｒｅｓｓ， Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ， Ｄ．Ｃ． ｓｉｘｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ， １９９５， １４８２ｐは、ここに参考文献として援用されている。１の実施態様において、本発明の医薬組成物は、咽頭炎、丹毒及び膿痂疹、猩紅熱、並びに菌血症及び壊死性の筋膜炎のような侵入性の疾患、そしてまた毒性ショックの治療又は予防のために使用される。１の実施態様においては、本発明の医薬組成物はストレプトコッカス感染症及び／又はストレプトコッカス感染症により仲介された疾患又は症状、特別には、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）と同様にストレプトコッカスＡ群（Ｓ． ピオゲネス）、ストレプトコッカスＢ群（ＧＢＳ又はＳ．アガラクチエ（Ｓ． ａｇａｌａｃｔｉａｅ））、Ｓ．ニューモニエ（Ｓ． ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、Ｓ．ディスガラクチエ（Ｓ． ｄｙｓｇａｌａｃｔｉａｅ）、Ｓ．ウベリス（Ｓ． ｕｂｅｒｉｓ）、Ｓ．ノカルジア（Ｓ． ｎｏｃａｒｄｉａ）、の治療又は予防に用いられる。さらなる実施態様においては、上記ストレプトコッカス感染はストレプトコッカス・ピオゲネスである。
【００４１】
特別な実施態様においては、医薬組成物は乳児、高齢者、及び免疫無防備状態の宿主のようなストレプトコッカス感染の危険のある宿主に投与される。
さらなる側面によれば、本発明のストレプトコッカスのポリペプチドは、ストレプトコッカス感染症の検出又は診断のための本発明のポリペプチドを含むキット中で用いられることができる。
本出願中で用いられるように、“宿主”という用語は哺乳動物を含む。さらなる実施態様においては、上記哺乳動物はヒトである。
医薬組成物は好ましくは約０．００１〜１００μｇ／ｋｇ（抗原／体重）そしてより好ましくは０．０１〜１０μｇ／ｋｇ、そして最も好ましくは０．１〜１μｇ／ｋｇの単位用量の形態で免疫化の間に約１〜６週の間隔をおいて１〜３回投与する。
医薬組成物は好ましくは約０．１μｇ〜１０ｍｇそしてより好ましくは１μｇ〜１ｍｇそして最も好ましくは１０〜１００μｇの単位用量の形態で、免疫化の間に約１〜６週の間隔をおいて１〜３回投与する。
【００４２】
１の実施態様において、ポリヌクレオチドは、本発明のポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含むことのできる配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５中に表される。
図中に表されたポリヌクレオチド配列がそれでもまだ本発明のポリペプチドをコードする縮退コドンに変更されることができることは理解されるであろう。したがって、本発明は配列間で５０％の同一性、１の実施態様においては配列間で少なくとも７０％の同一性、１の実施態様においては配列間で少なくとも７５％の同一性、１の実施態様においては配列間で少なくとも８０％の同一性、１の実施態様においては配列間で少なくとも８５％の同一性、１の実施態様においては配列間で少なくとも９０％の同一性、を有する、ここにおける上記のポリヌクレオチド配列をさらに提供する。さらなる実施態様においては、ストリンジェントな条件下、すなわち少なくとも９５％の同一性を有する、でポリペプチドはハイブリダイズすることができる。さらなる実施態様においては、９７％を越える同一性である。
【００４３】
ハイブリダイゼーションのための好適なストリンジェントな条件は、当業者によって容易に決定されることができる（例としてＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， （１９８９） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ２ｎｄ ｅｄ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎ．Ｙ．； Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， （１９９９） Ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ａｕｓｕｂｅｌ Ｆ．Ｍ． ｅｔ ａｌ．， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ Ｉｎｃ．， Ｎ．Ｙ．を参照せよ）。
【００４４】
さらなる実施態様においては、本発明は、ストリンジェントな条件下で以下の：
（ａ）ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列又は
（ｂ）ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列の相補的配列；
のいずれかにハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、ここで前記ポリペプチドが配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６或いはそれらのフラグメント又はアナログを含む前記ポリヌクレオチドを提供する。
【００４５】
さらなる実施態様においては、本発明は、ストリンジェントな条件下で、以下の：
（ａ）ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列又は
（ｂ）ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列の相補的配列；
のいずれかにハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、ここで前記ポリヌクレオチドが配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４又は１６を含む前記ポリヌクレオチドを提供する。
【００４６】
さらなる実施態様においては、本発明は、ストリンジェントな条件下で、以下の：
（ａ）ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列又は
（ｂ）ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列の相補的配列；
のいずれかにハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、ここで前記ポリペプチドが配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４又は１６或いはそれらのフラグメント又はアナログを含むポリペプチドからの少なくとも１０の近接するアミノ酸残基を含む、前記ポリヌクレオチドを提供する。
【００４７】
さらなる実施態様においては、本発明は、ストリンジェントな条件下で、以下の：
（ａ）ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列又は
（ｂ）ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列の相補的配列；
のいずれかにハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、ここで前記ポリペプチドが配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４又は１６を含むポリペプチドからの少なくとも１０の近接するアミノ酸残基を含む、前記ポリヌクレオチドを提供する。
【００４８】
さらなる実施態様においては、ポリヌクレオチドは、本発明のポリペプチドをコードする配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５に表されたポリヌクレオチドである。
当業者に容易に理解されるように、ポリヌクレオチドは、ＤＮＡ及びＲＮＡの両方を含む。
本発明はまた、本出願において記載されたポリヌクレオチドに対して相補的なポリヌクレオチドを含む。
【００４９】
さらなる側面においては、本発明のポリペプチド又はそれらのフラグメント、アナログ或いはそれらの誘導体をコードするポリヌクレオチドはＤＮＡ免疫化法において用いられることができる。すなわち、それらは複製可能で発現可能なベクターに注射によって取り込まれることができ、それによりｉｎ  ｖｉｖｏにおいて抗原性のポリペプチドを産生する。例えばポリヌクレオチドは、真核細胞中で機能的であるＣＭＶプロモーターの制御下でプラスミドベクターに取り込まれることができる。好ましくは上記ベクターは、筋肉内に注射される。
【００５０】
他の側面によれば、本発明のポリペプチドを生産するための、前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを宿主細胞中で発現し、発現したポリペプチド産物を回収することによる組み換え技術による方法が提供される。代わりに、上記ポリペプチドは、確立された合成化学技術、すなわち完全なポリペプチドを生産するように結合されたオリゴペプチドの液相又は固相合成（ブロックライゲーション）、によって生産されることができる。
【００５１】
ポリヌクレオチド及びポリペプチドの入手及び評価の一般的な方法は以下の参考文献：Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ２ｎｄ ｅｄ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎ．Ｙ．， １９８９； Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ａｕｓｕｂｅｌ Ｆ．Ｍ． ｅｔ ａｌ．， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ． Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ； ＰＣＲ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ， ｆｒｏｍ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ｔｏ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， Ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ｗｈｉｔｅ Ｂ．Ａ．， Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ， Ｔｏｔｏｗａ， Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ， １９９７， ４９０ ｐａｇｅｓ； Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ， Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅｓ， Ｓｃｏｐｅｓ Ｒ．Ｋ．， Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ３ｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ， １９９３， ３８０ ｐａｇｅｓ； Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， Ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ｃｏｌｉｇａｎ Ｊ．Ｅ． ｅｔ ａｌ．， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋに記載されている。
【００５２】
組み換え体の生産のためには、上記ポリペプチドをコードするベクターで宿主細胞に形質移入し、その後、宿生細胞をプロモーターの活性化、形質転換体の選択又は遺伝子の増幅のために適切であるように変更された栄養培地中で培養する。好適なベクターは、選ばれた宿主中で生存可能及び複製可能な、染色体性のＤＮＡ配列、非染色体性のＤＮＡ配列及び合成ＤＮＡ配列、例えば細菌プラスミド、ファージＤＮＡ、バキュロウイルス、酵母プラスミド、プラスミドとファージＤＮＡの組み合わせから誘導されたベクター、である。上記ポリペプチド配列はプロモーター、リボソーム結合部位（コンセンサス領域又はシャイン−ダルガノ配列）及び場合によりオペレーター（制御要素）を含む発現制御領域に、作働可能に連結するように、制限酵素を用いてベクターの適切な位置に取り込まれることができる。所定の宿主及びベクターに適切な、上記発現制御領域の各成分を確立された分子生物学の原理に従って選択することができる（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ２ｎｄ ｅｄ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎ．Ｙ．， １９８９； Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ａｕｓｕｂｅｌ Ｆ．Ｍ． ｅｔ ａｌ．， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ． Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）。好適なプロモーターはＬＴＲ又はＳＶ４０プロモーター、Ｅ．ｃｏｌｉ  ｌａｃ、ｔａｃ又はｔｒｐプロモーター及びファージラムダＰＬプロモーターを含むがこれらに限定されるものではない。ベクターは好ましくは、選択マーカー、すなわちアンピシリン耐性遺伝子と同様に複製開始点を取り込む。好適な細菌ベクターはｐＥＴ、ｐＱＥ７０、ｐＱＥ６０、ｐＱＥ−９、ｐＤ１０  ｐｈａｇｅｓｃｒｉｐｔ、ｐｓｉＸ１７４、ｐｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ、ｐｂｓｋｓ、ｐＮＨ８Ａ、ｐＮＨ１６ａ、ｐＮＨ１８Ａ、ｐＮＨ４６Ａ  ｐｔｒｃ９９ａ、ｐＫＫ２２３−３、ｐＤＲ５４０、ｐＲＩＴ５並びに真核細胞ベクターｐＢｌｕｅＢａｃＩＩＩ、ｐＷＬＮＥＯ、ｐＳＶ２ＣＡＴ、ｐＯＧ４４、ｐＸＴ１、ｐＳＧ、ｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧ及びｐＳＶＬを含む。宿主細胞は細菌性、すなわちＥ．コリ（Ｅ． ｃｏｌｉ）、バシラス・サブチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）；カビ、すなわちアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・ニデュリンス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌｉｎｓ）；酵母すなわちサッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｅｓ）又は真核細胞、すなわちＣＨＯ、ＣＯＳであることができる。
【００５３】
培養中での上記ポリペプチドの発現の上で、典型的には細胞を遠心分離により集め、物理的又は化学的手段によって粉砕し（仮に発現したポリペプチドが培地中へ分泌されない場合）、そして得られた粗抽出物を対象のポリペプチドを単離するために保持する。培養液又は溶菌液からのポリペプチドの精製は、上記ポリペプチドの性質に依存して、確立された技術によって達成されることができ、それらはすなわち、硫酸アンモニウムの使用又はエタノールによる沈澱、酸による抽出、陰イオン又は陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー及びレクチンクロマトグラフィーである。最終的な精製はＨＰＬＣを用いて達成されることができる。
【００５４】
さらなる側面によれば、本発明のストレプトコッカスのポリペプチドは、ストレプトコッカス感染、特別にはストレプトコッカス・ピオゲネス感染の診断テストにおいて使用されることができる。いくつかの診断方法が可能であり、例として、生物学的サンプル中のストレプトコッカス生体の検出については、以下の手順：
ａ）宿主からの生物学的サンプルを得ること；
ｂ）本発明のストレプトコッカスのポリペプチドとの反応性のある抗体又はそのフラグメントと上記生物学的サンプルとを混合物を形成するためにインキュベートすること；そして
ｃ）ストレプトコッカスの存在を示す、上記混合物中の特異的に結合した抗体又は結合したフラグメントを検出すること、
に従うことができる。
代わりに、前記抗体を含むか、含む疑いのある生物学的サンプル中のストレプトコッカス抗原に特異的な抗体の検出方法は以下のように：
ａ）宿主から生物学的サンプルを得ること；
ｂ）１又はそれを越える本発明のストレプトコッカスのポリペプチド又はそれらのフラグメントと上記生物学的サンプルとを混合物を形成するためにインキュベートすること；そして
ｃ）ストレプトコッカスに特異的な抗体の存在を示す、上記混合物中の特異的に結合した抗原又は結合したフラグメントを検出すること；
実行されることができる。
【００５５】
この診断テストが、生体中に上記タンパクに特異的な抗体が存在するか否かを決定するのに必須な酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ又はラテックス凝集アッセイのような免疫学的テストを含むいくつかの形態をとることができることを当業者は認識するであろう。
【００５６】
本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡ配列はまた、ストレプトコッカスの存在をそのような細菌を含む疑いのある生物学的サンプル中において、検出するのに使用するためのＤＮＡプローブをデザインするのに用いられることができる。本発明の上記検出方法は、以下の：
ａ）宿主から生物学的サンプルを得ること；
ｂ）本発明のポリペプチド又はそれらのフラグメントをコードするＤＮＡ配列を有する１又はそれを越えるＤＮＡプローブと上記生物学的サンプルとを混合物を形成するためにインキュベートすること；そして
ｃ）ストレプトコッカス細菌の存在を示す、上記混合物中の特異的に結合したＤＮＡプローブを検出すること、
を含む。
【００５７】
本発明の上記ＤＮＡプローブはまた、循環するストレプトコッカス、すなわちサンプル中のストレプトコッカス・ピオゲネスの核酸、の検出のために使用されることもでき、例えば、ストレプトコッカス感染症の診断方法として、ポリメラーゼ連鎖反応法を用いることである。上記プローブは慣用技術を用いて合成されることができ、固相に固定化されることができ、又は検出可能なラベルにより標識されることができる。本出願のために好ましいＤＮＡプローブは本発明のストレプトコッカス・ピオゲネスポリペプチドの少なくとも約６の近接したヌクレオチドに相補的な配列を有するオリゴマーである。
【００５８】
宿主中のストレプトコッカスの検出のための他の診断方法は以下の：
ａ）本発明のポリペプチド又はそのフラグメントとの反応性のある抗体を検出可能なラベルで標識すること；
ｂ）宿主に標識された抗体又は標識されたフラグメントを投与すること；及び
ｃ）宿主中の、ストレプトコッカスの存在を示す特異的に結合した標識された抗体又は標識されたフラグメントを検出すること、
を含む。
【００５９】
本発明のさらなる側面は、ストレプトコッカス感染症の診断及び特別には治療のための特異的な抗体の生産のための抗原としての本発明のストレプトコッカスのポリペプチドの使用である。好適な抗体は、適切なスクリーニング方法を用いて、例えば特別な抗体のストレプトコッカス感染に対して受動的に防御する能力をテストモデルにおいて測定することによって、決定されることができる。動物モデルの１の例は、ここにおいて実施例中に記載されたマウスモデルである。上記抗体は抗体全体又はその抗原結合フラグメントであることができ、いずれのイムノグロブリンクラスに属することもできる。上記抗体又はフラグメントは、動物由来であることができ、特別には哺乳動物由来そしてさらに特別にはマウス、ラット、又はヒト由来であることができる。それは自然抗体又はそのフラグメント、又は所望により組み換えの抗体又は抗体のフラグメントであることができる。組み換えの抗体又は抗体のフラグメントという用語は、分子生物学の技術を用いて生産された抗体又は抗体のフラグメントを意味する。上記抗体又は抗体のフラグメントは、ポリクローナル又は好ましくはモノクローナルであることができる。それは、ストレプトコッカス・ピオゲネスのポリペプチドと関連した数多くのエピトープに対して特異的であることができるが、好ましくは１に対して特異的である。
【００６０】
本発明のさらなる側面は、受動的免疫化のための本発明の上記ポリペプチドに対する抗体の使用である。本出願中に記載された抗体を用いることができる。好適な抗体は、適切なスクリーニング方法、例えば特別な抗体のストレプトコッカス感染に対して受動的に防御する能力をテストモデルにおいて測定することによって、決定されることができる。動物モデルの１の例は、ここにおいて実施例中に記載されたマウスモデルである。上記抗体は抗体全体又はその抗原結合フラグメントであることができ、いずれのイムノグロブリンクラスに属することもできる。上記抗体又はフラグメントは、動物由来であることができ、特別には哺乳動物由来、そしてさらに特別にはマウス、ラット又はヒト由来であることができる。それは自然抗体又はそのフラグメント、又は所望により組み換えの抗体又は抗体のフラグメントであることができる。組み換えの抗体又は抗体のフラグメントという用語は、分子生物学の技術を用いて生産された抗体又は抗体のフラグメントを意味する。上記抗体又は抗体のフラグメントは、ポリクローナル又は好ましくはモノクローナルであることができる。それは、ストレプトコッカスのポリペプチドと関連した数多くのエピトープに対して特異的であることができるが、好ましくは１に対して特異的である。
【００６１】
１の側面によれば、本発明はストレプトコッカス感染症の治療及び／又は予防のための抗体の使用を提供する。
別に定義されない限り、ここにおいて用いられるすべての技術的及び科学的用語はこの発明が属する分野の当業者によって共通して理解されるのと同じ意味を持つ。ここで示されるすべての刊行物、特許出願、特許及び他の参考文献は完全な形で援用されている。矛盾する場合には、定義を含めた本明細書が制限される。加えて、材料、方法及び実施例は、例示的なものであり、制限的であることを意図したものではない。
【００６２】
実施例１
本実施例は、ＢＶＨ−Ｐ２遺伝子及び対応するポリペプチドのクローニング及び分子的特徴を説明する。
Ｓ． ピオゲネス ＢＶＨ−Ｐ２遺伝子（配列番号１）のコード領域をＭ３血清型Ｓ． ピオゲネスＡＴＣＣ１２３８４株のゲノムＤＮＡから、制限部位ＮｄｅＩ（ＣＡＴＡＴＧ）及びＸｈｏＩ（ＣＴＣＧＡＧ）の付加のための塩基の延長を含む以下のオリゴヌクレオチドプライマー：ＤＭＡＲ１２４及びＤＭＡＲ１２５、これらは表１に示されている、を用いてＰＣＲ（Ｒｏｂｏｃｙｃｌｅｒ Ｇｒａｄｉｅｎｔ ９６ Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｃｙｃｌｅｒ， Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ， ＬａＪｏｌｌａ， Ｃａ）により増幅した。ＰＣＲ産物をＱＩＡｇｅｎからのＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キットを用いて、製造者の指示に従い（Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ， ＣＡ）アガロースゲルから精製し、ＮｄｅＩ及びＸｈｏＩ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｃａｎａｄａ Ｉｎｃ， Ｂａｉｅ ｄ’Ｕｒｆｅｅ， Ｃａｎａｄａ）で消化した。ｐＥＴ−２１ｂ（＋）ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ， Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩ）がＮｄｅＩ及びＸｈｏＩで消化し、そしてＱＩＡｇｅｎからのＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キット（Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ， ＣＡ）を用いてアガロースゲルから精製した。ＮｄｅＩ−ＸｈｏＩ  ＰＣＲ産物をＮｄｅＩ−ＸｈｏＩ  ｐＥＴ−２１ｂ（＋）発現ベクターに連結した。連結された産物をＥ．コリ（Ｅ． ｃｏｌｉ）ＤＨ５株［φ８０ｄｌａｃＺΔＭ１５  Δ（ｌａｃＺＹＡ−ａｒｇＦ）Ｕ１６９  ｅｎｄＡ１  ｒｅｃＡ１  ｈｓｄＲ１７（ｒκ−ｍκ＋）ｄｅｏＲ  ｔｈｉ−１  ｓｕｐＥ４４  λ−ｇｙｒＡ９６  ｒｅｌＡ１］（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ， Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ， ＭＤ）中へＳｉｍａｎｉｓの方法に従って（Ｈａｎａｈａｎ， Ｄ． ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ， １９８５， Ｄ．Ｍ Ｇｌｏｖｅｒ （ｅｄ）， ｐｐ．１０９〜１３５）形質転換した。ＢＶＨ−Ｐ２遺伝子を含む組み換えｐＥＴ−２１ｂ（＋）プラスミド（ｒｐＥＴ２１ｂ（＋））をＱＩＡｇｅｎプラスミドキット（Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ， ＣＡ）を用いて精製し、ＤＮＡ挿入断片を配列決定した（Ｔａｑ Ｄｙｅ Ｄｅｏｘｙ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ， ＡＢＩ， Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ， ＣＡ）。
【表３】
2004524014.tif 000005
【表４】
2004524014.tif 000006
【表５】
2004524014.tif 000007
【表６】
2004524014.tif 000008
【００６３】
ＢＶＨ−Ｐ２をコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）が６３３塩基対を含み、予測されるｐＩが６．４０であり、分子量２４、６１１．７８Ｄａと予測される２１０アミノ酸残基のポリペプチドをコードすることを決定した。予測されたアミノ酸残基の配列（配列番号２）のＳｐｓｃａｎ ｓｏｆｔｗａｒｅ （Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐａｃｋａｇｅ； Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ）を用いた分析は、２２アミノ酸残基のシグナルペプチド（ＭＫＫＴＬＴＬＬＬＡＬＦＡＩＧＶＴＳＳＶＲＡ）の存在を示唆し、それはアラニン及びグルタミン酸残基の間に位置する切断部位で終わっている。
【００６４】
ＢＶＨ−Ｐ２（配列番号１）遺伝子の存在をＰＣＲ増幅により確認するために、以下の４の血清学的に異なるＳ． ピオゲネス株：Ｍ１血清型Ｓ． ピオゲネスＡＴＣＣ７００２９４株及びＭ３血清型Ｓ． ピオゲネスＡＴＣＣ１２３８４株はＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ （Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ， ＭＤ， ＵＳＡ）から入手した；Ｍ６血清型Ｓ． ピオゲネスＳＰＹ６７臨床的単離物はｔｈｅ Ｃｅｎｔｒｅ ｄｅ ｒｅｃｈｅｒｃｈｅ ｅｎ ｉｎｆｅｃｔｉｏｌｏｇｉｅ ｄｕ ｃｅｎｔｒｅ ｈｏｓｐｉｔａｌｉｅｒ ｄｅ Ｉ’ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｅｅ Ｌａｖａｌ， Ｓａｉｎｔｅ−Ｆｏｙ より提供された；最初にマウスから単離されたＳ． ピオゲネスＢ５１４株はＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ａｌａｂａｍａ， Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ からのＳｕｓａｎ Ｈｏｌｌｉｎｇｓｈｅａｄより提供された。Ｅ． ｃｏｌｉ  ＸＬ１−Ｂｌｕｅ ＭＲＦ’株をこれらの実験においてネガティブコントロールとして用いた。染色体ＤＮＡは各Ｓ． ピオゲネス株から前述のように単離された（Ｊａｙａｒａｏ ＢＭ ｅｔ ａｌ． １９９１， Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ２９ ： ２７７４〜２７７８）。ＢＶＨ−Ｐ２（配列番号１）遺伝子は、ＰＣＲ（Ｒｏｂｏｃｙｃｌｅｒ Ｇｒａｄｉｅｎｔ ９６ Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｃｙｃｌｅｒ， Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ， ＬａＪｏｌｌａ， Ｃａ）により、上記４のＳ． ピオゲネス株から精製したゲノムのＤＮＡ及びコントロールＥ． ｃｏｌｉ株から、上記オリゴヌクレオチドプライマーＤＭＡＲ１２４及びＤＭＡＲ１２５（表１）を用いて増幅した。ＰＣＲは９５℃において４５秒、５０℃において４５秒及び７２℃において１分、を３０サイクルと、７２℃において７分の最終の伸長期間によって実施した。上記ＰＣＲ産物は１％アガロースゲル中でサイズにより分画し、エチジウムブロマイド染色により可視化した。これらのＰＣＲ増幅の結果を表２に示す。増幅産物の分析により、ＢＶＨ−Ｐ２（配列番号１）遺伝子が、テストされた４のＳ． ピオゲネス株すべてのゲノムに存在することが明らかとなった。コントロールＥ． ｃｏｌｉ  ＤＮＡをこれらのオリゴヌクレオチドプライマーを用いた同一のＰＣＲ増幅に供した場合にはそのような産物は検出されなかった。
【表７】
2004524014.tif 000009
【００６５】
実施例２
本実施例は、ＢＶＨ−Ｐ３遺伝子及び対応するポリペプチドのクローニング及び分子的特徴を説明する。
Ｓ． ピオゲネス ＢＶＨ−Ｐ３遺伝子（配列番号３）のコード領域をＭ１血清型Ｓ． ピオゲネスＡＴＣＣ７００２９４株のゲノムＤＮＡから、制限部位ＮｄｅＩ（ＣＡＴＡＴＧ）及びＸｈｏＩ（ＣＴＣＧＡＧ）の付加のための塩基の延長を含む以下のオリゴヌクレオチドプライマー：ＤＭＡＲ１８８及びＤＭＡＲ１８９、これらは表１に示されている、用いてＰＣＲ（Ｒｏｂｏｃｙｃｌｅｒ Ｇｒａｄｉｅｎｔ ９６ Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｃｙｃｌｅｒ， Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ， ＬａＪｏｌｌａ， Ｃａ）により増幅した。発現ベクターへのＢＶＨ−Ｐ３のクローニング及び配列決定に用いた方法は、実施例１において記載された方法と同様である。
【００６６】
ＢＶＨ−Ｐ３をコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）が９２１塩基対を含み、予測されるｐＩが５．７３であり分子量が３３、３８２．３６Ｄａと予測される３０６アミノ酸残基のポリペプチドをコードすることを決定した。予測されたアミノ酸残基の配列（配列番号４）のＳｐｓｃａｎ ｓｏｆｗａｒｅ （Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐａｃｋａｇｅ； Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ）を用いた分析は、２７アミノ酸残基のシグナルペプチド（ＭＳＬＩＬＧＡＦＬＳＶＦＬＬＶＡＣＳＳＴＧＴＫＴＡＫＳ）の存在を示唆し、それはセリン及びアスパラギン酸残基の間に位置する切断部位で終わっている。オリゴヌクレオチドプライマーＤＭＡＲ１８８及びＤＭＡＲ１８９を用いたＰＣＲ増幅の後、上記ＢＶＨ−Ｐ３遺伝子が、テストされた４の血清学的なＳ． ピオゲネス株のすべてに存在することが示された（表２）。上記ＢＶＨ−Ｐ３遺伝子のＰＣＲ増幅のために用いられた方法は、実施例１において示された方法と同様であった。コントロールＥ． ｃｏｌｉ  ＤＮＡをこれらのオリゴヌクレオチドプライマーを用いた同一のＰＣＲ増幅に供した場合には、そのような産物は検出されなかった。
【００６７】
実施例３
本実施例は、ＢＶＨ−Ｐ４遺伝子及び対応するポリペプチドのクローニング及び分子的特徴を説明する。
Ｓ． ピオゲネス ＢＶＨ−Ｐ４遺伝子（配列番号５）のコード領域をＭ１血清型Ｓ． ピオゲネスＡＴＣＣ７００２９４株のゲノムＤＮＡから、制限部位ＮｄｅＩ（ＣＡＴＡＴＧ）及びＸｈｏＩ（ＣＴＣＧＡＧ）の付加のための塩基の延長を含む以下のオリゴヌクレオチドプライマー：ＤＭＡＲ１９２及びＤＭＡＲ１９３、これらは表１に示されている、を用いてＰＣＲ（Ｒｏｂｏｃｙｃｌｅｒ Ｇｒａｄｉｅｎｔ ９６ Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｃｙｃｌｅｒ， Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ， ＬａＪｏｌｌａ， Ｃａ）により増幅した。発現ベクターへのＢＶＨ−Ｐ４のクローニング及び配列決定に用いた方法は、実施例１において記載された方法と同様である。
【００６８】
ＢＶＨ−Ｐ４をコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）が１０５３塩基対を含み、予測されるｐＩが７．９０であり分子量が３６、３９２．５０Ｄａと予測される３５０アミノ酸残基のポリペプチドをコードすることを決定した。予測されたアミノ酸残基の配列（配列番号６）のＳｐｓｃａｎ ｓｏｆｗａｒｅ （Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐａｃｋａｇｅ； Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ）を用いた分析は、１９アミノ酸残基のシグナルペプチド（ＭＮＫＫＦＩＧＬＧＬＡＳＶＡＶＬＳＬＡ）の存在を示唆し、それは２のアラニン残基の間に位置する切断部位で終わっている。
【００６９】
オリゴヌクレオチドプライマーＤＭＡＲ１９２及びＤＭＡＲ１９３を用いたＰＣＲ増幅の後、上記ＢＶＨ−Ｐ４遺伝子が、テストされた４の血清学的なＳ． ピオゲネス株中に存在することが示された（表２）。上記ＢＶＨ−Ｐ４遺伝子のＰＣＲ増幅のために用いられた方法は、実施例１において示された方法と同様であった。コントロールＥ． ｃｏｌｉ  ＤＮＡをこれらのオリゴヌクレオチドプライマーを用いた同一のＰＣＲ増幅に供した場合には、そのような産物は検出されなかった。
【００７０】
他の株からの追加のＢＶＨ−Ｐ４遺伝子の配列決定により、この遺伝子のＳ． ピオゲネス単離物間における高度の分子的な保存を確認した。ＡＴＣＣ１２３８４株（配列番号１１）、ＳＰＹ６７株（配列番号１３）及びＢ５１４株（配列番号１５）からのＳ． ピオゲネス ＢＶＨ−Ｐ４遺伝子の各コード領域をゲノムＤＮＡから表１に示されているオリゴヌクレオチドプライマーＤＭＡＲ１９２及びＤＭＡＲ１９３を用いてＰＣＲ（Ｒｏｂｏｃｙｃｌｅｒ Ｇｒａｄｉｅｎｔ ９６ Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｃｙｃｌｅｒ， Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ， ＬａＪｏｌｌａ， Ｃａ）により増幅した。ＰＣＲ産物をＱＩＡｇｅｎからのＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キットを用いて製造者の指示に従い（Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ， ＣＡ）アガロースゲルから精製し、ＤＮＡ挿入断片を配列決定した（Ｔａｑ Ｄｙｅ Ｄｅｏｘｙ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｋｉｔ， ＡＢＩ， Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ， ＣＡ）。ＡＴＣＣ１２３８４株（配列番号１２）、ＳＰＹ６７株（配列番号１４）及びＢ５１４株（配列番号１６）からの予測されたアミノ酸配列は、以下の図１２、１４及び１６にそれぞれ示す。図１８はＳ． ピオゲネス ＢＶＨ−Ｐ４について確立されたコンセンサスな予測アミノ酸配列を示す。これらのＢＶＨ−Ｐ４アミノ酸配列の対比較は、同一性のレベルが９９％より高いこと、これがＳ． ピオゲネス単離物間におけるＢＶＨ−Ｐ４の高レベルの保存性を示していることを明らかに示した。
【００７１】
実施例４
本実施例は、ＢＶＨ−Ｐ５遺伝子及び対応するポリペプチドのクローニング及び分子的特徴を説明する。
Ｓ． ピオゲネス ＢＶＨ−Ｐ５遺伝子（配列番号７）のコード領域をＭ１血清型Ｓ． ピオゲネスＡＴＣＣ７００２９４株のゲノムＤＮＡから、制限部位ＮｄｅＩ（ＣＡＴＡＴＧ）及びＸｈｏＩ（ＣＴＣＧＡＧ）の付加のための塩基の延長を含む以下のオリゴヌクレオチドプライマー：ＤＭＡＲ２００及びＤＭＡＲ２０１、これらは表１に示されている、を用いてＰＣＲ（Ｒｏｂｏｃｙｃｌｅｒ Ｇｒａｄｉｅｎｔ ９６ Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｃｙｃｌｅｒ， Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ， ＬａＪｏｌｌａ， Ｃａ）により増幅した。発現ベクターへのＢＶＨ−Ｐ５のクローニング及び配列決定に用いた方法は、実施例１において記載された方法と同様である。
【００７２】
ＢＶＨ−Ｐ５をコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）が１０４４塩基対を含み、予測されるｐＩが５．６５であり、分子量が３６、８０８．９１Ｄａと予測される３４７アミノ酸残基のポリペプチドをコードすることを決定した。予測されたアミノ酸配列のＳｐｓｃａｎ ｓｏｆｗａｒｅ （Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐａｃｋａｇｅ； Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ）を用いた分析は、１７アミノ酸残基のシグナルペプチド（ＭＮＫＫＶＭＳＬＧＬＶＳＴＡＬＦＴ）の存在を示唆し、それはトレオニン及びロイシン残基の間に位置する切断部位で終わっている。
【００７３】
オリゴヌクレオチドプライマーＤＭＡＲ２００及びＤＭＡＲ２０１を用いたＰＣＲ増幅の後、上記ＢＶＨ−Ｐ５遺伝子がテストされた４の血清学的なＳ． ピオゲネス株中に存在することが示された（表２）。上記ＢＶＨ−Ｐ５遺伝子の増幅のために用いられた方法は、実施例１において示された方法と同様であった。コントロールＥ． ｃｏｌｉ  ＤＮＡをこれらのオリゴヌクレオチドプライマーを用いた同一のＰＣＲ増幅に供した場合には、そのような産物は検出されなかった。
【００７４】
実施例５
本実施例は、ＢＶＨ−Ｐ６遺伝子及び対応するポリペプチドのクローニング及び分子的特徴を説明する。
Ｓ． ピオゲネス ＢＶＨ−Ｐ６遺伝子（配列番号９）のコード領域をＭ１血清型Ｓ． ピオゲネスＡＴＣＣ７００２９４株のゲノムＤＮＡから、制限部位ＮｄｅＩ（ＣＡＴＡＴＧ）及びＸｈｏＩ（ＣＴＣＧＡＧ）の付加のための塩基の延長を含む以下のオリゴヌクレオチドプライマー：ＤＭＡＲ２３５及びＤＭＡＲ２３６、これらは表１に示されている、を用いてＰＣＲ（Ｒｏｂｏｃｙｃｌｅｒ Ｇｒａｄｉｅｎｔ ９６ Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｃｙｃｌｅｒ， Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ， ＬａＪｏｌｌａ， Ｃａ）により増幅した。発現ベクターへのＢＶＨ−Ｐ６のクローニング及び配列決定に用いた方法は、実施例１において記載された方法と同様である。
【００７５】
ＢＶＨ−Ｐ６をコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）が１０２０塩基対を含み、予測されるｐＩが６．６６であり分子量が３８、０１７．７８Ｄａと予測される３３９アミノ酸残基のポリペプチドをコードすることを決定した。予測されたアミノ酸残基の配列（配列番号１０）のＳｐｓｃａｎ ｓｏｆｗａｒｅ （Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐａｃｋａｇｅ； Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ）を用いた分析は、３３アミノ酸残基のシグナルペプチド（ＭＲＫＲＣＹＳＴＳＡＡＶＬＡＡＶＴＬＦＶＬＳＶＤＲＧＶＩＡＤＳＦＳ）の存在を示唆し、それはセリン及びアラニン残基の間に位置する切断部位で終わっている。オリゴヌクレオチドプライマーＤＭＡＲ２３５及びＤＭＡＲ２３６を用いたＰＣＲ増幅の後、上記ＢＶＨ−Ｐ６遺伝子がテストされた４の血清学的なＳ． ピオゲネス株中に存在することが示された（表２）。上記ＢＶＨ−Ｐ６遺伝子のＰＣＲ増幅のために用いられた方法は、実施例１において示された方法と同様であった。コントロールＥ． ｃｏｌｉ  ＤＮＡをこれらのオリゴヌクレオチドプライマーを用いた同一のＰＣＲ増幅に供した場合には、そのような産物は検出されなかった。
【００７６】
実施例６
本実施例は、ＣＭＶプラスミドｐＣＭＶ−ＧＨにおけるＳ． ピオゲネス遺伝子のクローニングを説明する。
Ｓ． ピオゲネスタンパクのＤＮＡコード領域を、上記プラスミドベクターｐＣＭＶ−ＧＨ（Ｔａｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ， １９９２， ３５６ ： １５２）中のサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターの転写制御下にあるヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）遺伝子の下流に挿入した。上記ＣＭＶプロモーターは、Ｅ． ｃｏｌｉ細胞中では機能しないプラスミドであるが、真核細胞中への上記プラスミドの投与においては活性であった。上記ベクターはまたアンピシリン耐性遺伝子をも組み入れた。
【００７７】
リーダーペプチド領域を含まないＢＶＨ−Ｐ２（配列番号１）、ＢＶＨ−Ｐ４（配列番号５）、ＢＶＨ−Ｐ５（配列番号７）及びＢＶＨ−Ｐ６（配列番号９）遺伝子をＭ１血清型Ｓ． ピオゲネスＡＴＣＣ７００２９４株からのゲノムＤＮＡから、制限部位ＢａｍＨＩ（ＧＧＡＴＣＣ）及びＳａｌＩ（ＧＴＣＧＡＣ）の付加のための塩基の延長を含むオリゴヌクレオチドプライマー、これらは表１に示されている、を用いてＰＣＲ（Ｒｏｂｏｃｙｃｌｅｒ Ｇｒａｄｉｅｎｔ ９６ Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｃｙｃｌｅｒ， Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ， ＬａＪｏｌｌａ， Ｃａ）により増幅した。ＰＣＲ産物をＱＩＡｇｅｎ（Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ， ＣＡ）からのＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キットを用いてアガロースゲルから精製し、制限酵素（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｃａｎａｄａ Ｉｎｃ， Ｂａｉｅ ｄ’Ｕｒｆｅ， Ｃａｎａｄａ）により消化した。上記ｐＣＭＶ−ＧＨベクター（Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｄｒ． Ｓｔｅｐｈｅｎ Ａ． Ｊｏｈｎｓｔｏｎ， Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， Ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｔｅｘａｓ， Ｄａｌｌａｓ， Ｔｅｘａｓ）をＢａｍＨＩ及びＳａｌＩにより消化し、ＱＩＡｇｅｎからのＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キット（Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ， ＣＡ）を用いてアガロースゲルから精製した。上記ＢａｍＨＩ−ＳＡｌＩ  ＤＮＡフラグメントを、ｈＧＨ−ＢＶＨ−Ｐ２、ｈＧＨ−ＢＶＨ−Ｐ４、ｈＧＨ−ＢＶＨ−Ｐ５、及びｈＧＨ−ＢＶＨ−Ｐ６融合タンパクをＣＭＶプロモーターの制御下において作成するために、ＢａｍＨＩ−ＳａｌＩ  ｐＣＭＶ−ＧＨベクターに連結した。連結産物をＥ． ｃｏｌｉ  ＤＨ５α株［φ８０ｄｌａｃＺΔＭ１５  Δ（ｌａｃＺＹＡ−ａｒｇＦ）Ｕ１６９  ｅｎｄＡ１  ｒｅｃＡ１  ｈｓｄＲ１７（ｒκ−ｍκ＋）ｄｅｏＲ  ｔｈｉ−１  ｓｕｐＥ４４  λ−ｇｙｒＡ９６  ｒｅｌＡ１］（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ， Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ， ＭＤ）中へＳｉｍａｎｉｓ（Ｈａｎａｈａｎ， Ｄ． ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ， １９８５， Ｄ．Ｍ Ｇｌｏｖｅｒ （ｅｄ）， ｐｐ．１０９〜１３５）の方法に従って形質転換した。上記組み換えｐＣＭＶプラスミドをＱＩＡｇｅｎプラスミドキット（Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ， ＣＡ）を用いて精製し、ＤＮＡ挿入断片のヌクレオチド配列をＤＮＡ配列決定により確認した。
【００７８】
実施例７
本実施例は、Ｓ． ピオゲネスタンパク抗原に対する免疫応答を明らかにするためのＤＮＡの使用を説明する。
１群あたり８の雌性ＢＡＬＢ／Ｃマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ， Ｓｔ−Ｃｏｎｓｔａｎｔ， Ｑｕｅｅｂｅｃ， Ｃａｎａｄａ）から成る群を５０μｇの顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）を発現するプラスミドｐＣＭＶ−ＧＨ−ＧＭ−ＣＳＦ（Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｄｒ． Ｓｔｅｐｈｅｎ Ａ． Ｊｏｈｎｓｔｏｎ， Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， Ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｔｅｘａｓ， Ｄａｌｌａｓ， Ｔｅｘａｓ）の存在下、ＢＶＨ−Ｐ２（配列番号１）、ＢＶＨ−Ｐ４（配列番号５）、ＢＶＨ−Ｐ５（配列番号７）及びＢＶＨ−Ｐ６（配列番号９）遺伝子をコードする５０μｇの組み換えｐＣＭＶ−ＧＨを含む１００μｌを筋肉内に２又は３週間の間隔で３回注射することにより、免疫化した。血液サンプルを眼窩血洞より、各免疫化の前及び３度めの注射の７日後に採取し、血清抗体応答をヒスチジンでタグされた標識Ｓ． ピオゲネス組み換えタンパクをコーティング抗体として用いたＥＬＩＳＡにより決定した。これらのヒスチジンでタグされた標識Ｓ． ピオゲネス組み換えタンパクの生産及び精製は実施例８に表す。
【００７９】
実施例８
本実施例は、Ｓ． ピオゲネス組み換えタンパクの生産及び精製を説明する。
ＢＶＨ−Ｐ２（配列番号１）、ＢＶＨ−Ｐ３（配列番号３）、ＢＶＨ−Ｐ４（配列番号５）、ＢＶＨ−Ｐ５（配列番号７）及びＢＶＨ−Ｐ６（配列番号９）を含む組み換えｐＥＴ−２１ｂ（＋）プラスミドをエレクトロポーレーション（Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ ＩＩ ａｐｐａｒａｔｕｓ， ＢＩＯ−ＲＡＤ Ｌａｂｓ， Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ， Ｃａｎａｄａ）により、Ｅ． ｃｏｌｉＢＬ２１株（ＤＥ３）（Ｆ−ｏｍｐＴ  ｈｓｄＳＢ（ｒ−Ｂｍ−Ｂ）ｇａｌ  ｄｃｍ（ＤＥ３））（Ｎｏｖａｇｅｎ， Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩ）を形質転換するために用いた。Ｅ． ｃｏｌｉのこの株において、上記組み換えタンパクの発現を制御しているＴ７プロモーターは、その遺伝子が、イソプロピル−β−ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）により誘導されうるｌａｃプロモーターの制御下にあるところのＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ（λＤＥ３プロファージ上に存在する）により特異的に認識される。上記形質転換体ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｒｐＥＴを１ｍｌあたり１００μｇのカルベニシリン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃａｎａｄａ Ｌｔｄ．， Ｏａｋｖｉｌｌｅ， Ｃａｎａｄａ）を含むＬＢブロス（ペプトン１０ｇ／Ｌ、イーストエクストラクト５ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ  １０ｇ／Ｌ）中で３７℃で２５０ｒｐｍ で振とうしながらＡ６００ が０．６の値になるまで増殖させた。ヒスチジンでタグされたＳ． ピオゲネス組み換えタンパクの生産を誘導するために、上記細胞を最終濃度で１ｍＭのＩＰＴＧの存在下、さらに３時間インキュベートした。５００ｍｌの培養液からの誘導された細胞を遠心分離により沈澱させ、−７０℃で凍結した。
【００８０】
ＩＰＴＧ誘導されたＢＬ２１（ＤＥ３）／ｒｐＥＴ２１ｂ（＋）の可溶性の細胞質画分からの組み換えタンパクの精製は、Ｈｉｓ・Ｔａｇ配列（６の連続したヒスチジン残基）の、Ｈｉｓ・Ｂｉｎｄ金属キレート樹脂上に固定化された２価カチオン（Ｎｉ２＋）に結合する性質に基いたアフィニティークロマトグラフィーにより行なう。要するに、ＩＰＴＧにより誘導された５００ｍｌの培養液から得られた沈澱した細胞を１ｍＭのＰＭＳＦを含む溶解緩衝液（２０ｍＭトリス、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭイミダゾール、ｐＨ７．９）に再懸濁し、細片を除去するために、超音波処理し、１２，０００×ｇで２０分間遠心分離した。上清をＮｉ−ＮＴＡアガロースカラム（Ｑｉａｇｅｎ， Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ， Ｏｎｔａｒｉｏ， Ｃａｎａｄａ）に加えた。ヒスチジンでタグされた標識Ｓ． ピオゲネス組み換えタンパクを２５０ｍＭイミダゾール−５００ｍＭ  ＮａＣｌ−２０ｍＭトリスｐＨ７．９で溶出した。上記サンプルからの塩及びイミダゾールの除去は、ＰＢＳに対して、４℃で透析することにより行った。Ｅ． ｃｏｌｉの可溶性画分から得られた組み換えタンパクの量はＭｉｃｒｏＢＣＡ（Ｐｉｅｒｃｅ， Ｒｏｃｋｆｏｒｄ， Ｉｌｌｉｎｏｉｓ）により推定した。
【００８１】
実施例９
本実施例は、ヒスチジンでタグされたＳ． ピオゲネス組み換えタンパクの、ヒト血清及びＳ． ピオゲネス抗原調製物により免疫化後のマウスから採取した血清との反応性を説明する。
表３に示すように、すべての精製された組み換えタンパクが、正常血清のプール中に存在する抗体による免疫ブロットにおいて認識された。それは、Ｓ． ピオゲネスと正常に接触するヒトは、これらのタンパクに特異的な抗体を産生することを示す。これらの特別なヒト抗体はＳ． ピオゲネス感染に対する防御と結びつけられることができる。加えて、免疫ブロットはまた、致死的な免疫試験からマウスを防御する膜タンパクに富むＳ． ピオゲネス抗原調製物で免疫化されたマウスから採取した血清が、またＢＶＨ−Ｐ３、ＢＶＨ−Ｐ４及びＢＶＨ−Ｐ５のヒスチジンでタグされた組み換えタンパクを認識する抗体をも産生したことを明らかにした。この結果は、マウスを感染から防御するＳ． ピオゲネス抗原調製物中にこれらのタンパクが存在したこと、及びそれらが、対応するヒスチジンでタグされた組み換えタンパクと反応した抗体を誘導したことを示す。
【表８】
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１ 実施例７に記載されたように生産され、精製されたヒスチジンでタグされた組み換えタンパクを免疫ブロットの実施に使用した。
２ ヒスチジンでタグされた組み換えタンパクの分子量をＳＤＳ−ＰＡＧＥ後に推定した。
３ 健康なヒトボランティアから採取した２の血清をあわせてプールし、免疫ブロットを実施するために１／５００に希釈した。
４ 膜タンパクに富むＳ． ピオゲネス抗原調製物で免疫化後に採取されたマウス血清をプールし、免疫ブロットを実施するために１／５００に希釈した。これらのマウスは、致死的なＳ． ピオゲネスの免疫試験に対して防御された。
【００８２】
実施例１０
本実施例は、無処置のストレプトコッカス細胞表面におけるＳ． ピオゲネスＢＶＨ−Ｐ４ポリペプチド抗体への接触性を説明する。
細菌を、０．５％イーストエクストラクト（Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）及び０．５％ペプトンエクストラクト（Ｍｅｒｃｋ， Ｄａｒｍｓｔａｄｔ， Ｇｅｒｍａｎｙ）を含むＴｏｏｄ  Ｈｅｗｉｔｔ（ＴＨ）ブロス（Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｄｅｔｒｏｉｔ ＭＩ）中、３７℃、８％ＣＯ２ 大気中でＯＤ４９０ｎｍ が０．６００（〜１０８ ＣＦＵ／ｍｌ）となるまで増殖させた。抗−ＢＶＨ−Ｐ４又はコントロール血清の希釈物をその後加え、細胞に結合させ、これを２時間、４℃でインキュベートした。サンプルをブロッキング緩衝液［２％ウシ血清アルブミンを含むリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）］で４回洗浄し、その後１ｍｌのブロッキング緩衝液中のフルオレセイン（ＦＩＴＣ）−抗マウスＩｇＧ＋ＩｇＭヤギ抗体複合体を加えた。室温における６０分の追加のインキュベーションの後、サンプルをブロッキング緩衝液で４回洗浄しＰＢＳ緩衝液中の０．２５％ホルムアルデヒドで１８〜２４時間、４℃で固定した。細胞をＰＢＳ緩衝液中で２回洗浄し、５００μｌのＰＢＳ緩衝液に再懸濁した。細胞を暗所において４℃でフローサイトメトリー（Ｅｐｉｃｓ（登録商標）ＸＬ；Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ， Ｉｎｃ．）により分析するまで保存した。フローサイトメトリー分析は、ＢＶＨ−Ｐ４特異的な抗体がテストされたＳ． ピオゲネスの異種菌株（ＡＴＣＣ１２３８４；Ｍ３血清型）上の表面に露出したそれらの対応するエピトープを効率的に認識したことを明らかにした。分析された１０、０００のＳ． ピオゲネス細胞の９０％を越えるものが上記ＢＶＨ−Ｐ４特異的な抗血清中に存在する抗体により標識されたことが判明した。上記ＢＶＨ−Ｐ４ポリペプチドはそれが抗体により認識されうる表面において接触可能であると考えられる。
【００８３】
実施例１１
本実施例は、ウサギ過免疫血清によるマウス受動免疫によって誘導された致死的なＳ． ピオゲネス感染に対する防御を説明する。
実施例８に記載されたように生産され、精製され、そしてＡｌｈｙｄｒｏｇｅｌアジュバント（Ｓｕｐｅｒｆｏｓ Ｂｉｏｓｅｃｔｏｒ ａ／ｓ）に吸着されたヒスチジンでタグされた異なるＳ． ピオゲネス組み換えタンパクの５０μｇ及び１００μｇを、Ｎｅｗ  Ｚｅａｌａｎｄウサギ（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｓｔ−Ｃｏｎｓｔａｎｔ， Ｃａｎａｄａ）の多数の部位に皮下注射する。ウサギをヒスチジンでタグされた異なるＳ． ピオゲネス組み換えタンパクで、３週間の間隔で３回免疫化する。３回目の注射の３週間後に血液サンプルを採取する。上記血清中に存在する抗体を４０％飽和硫酸アンモニウムを用いて沈澱により精製する。１群あたり１０の雌性ＣＤ−１マウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｅｒ）から成る群にヒスチジンでタグされた異なるＳ． ピオゲネス組み換えタンパクで免疫化されたウサギ又は無関係のコントロール組み換えタンパクで免疫化されたウサギから採取した５００μｌの精製血清を静脈内注射する。１８時間後、上記マウスを約２×１０７ ＣＦＵの３型Ｓ． ピオゲネスＡＴＣＣ１２３８４株を用いた免疫試験に供する。ＣＦＵを決定し、免疫試験の用量を検証するためにＳ． ピオゲネス免疫試験の種菌のサンプルを血液寒天プレート上で培養する。５日間の間、死を記録する。
【００８４】
実施例１２
本実施例は、免疫化により誘導された致死的なＳ． ピオゲネス感染に対するマウスの防御を説明する。
１群あたり８の雌性ＣＤ−１マウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ）から成る群を、２０μｇのアフィニティー精製された、ヒスチジンでタグされたＳ． ピオゲネス組み換えタンパクを１０μｇのＱｕｉｌＡアジュバント（Ｃｅｄａｒｌａｎｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｌｔｄ， Ｈｏｒｎｂｙ， Ｃａｎａｄａ）の存在下、又はコントロールとしてＰＢＳ中のＱｕｉｌＡアジュバント単独で３週間の間隔で３回皮下に免疫化する。血液サンプルを眼窩血洞より第１、２２、４３日の各免疫化の前及び３回目の注射の７日後（第５０日）に採取する。２週間後に上記マウスを約２×１０７ ＣＦＵの３型Ｓ． ピオゲネスＡＴＣＣ１２３８４株を用いた免疫試験に供する。ＣＦＵを決定し、免疫試験の用量を検証するために、Ｓ． ピオゲネス免疫試験の種菌のサンプルを血液寒天プレート上で培養する。１４日間の間、死を記録する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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2004524014.tif 000084
2004524014.tif 000085
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