(57)【要約】少なくともイプシロンアミド結合によって連結された塩基性アミノ酸鎖を含み、改善されたＤＮＡトランスフェクション特性を示すペプチド系ジェミニ化合物が開示される。前記化合物の製造方法およびその使用法も開示される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）：
【化１】
2004515228.tif 000007
［式中、
Ａ１およびＡ５は、同じであっても異なっていてもよく、２個もしくはそれ以上の塩基性アミノ酸から形成された正に荷電した基であり、ここで前記塩基性アミノ酸を連結するアミド結合は少なくとも１個のイプシロン（ε）アミド結合を含んでおり、
Ａ２／Ａ６ＣＨ（ＮＨ）ＣＯは、同じであっても異なっていてもよく、アミノ酸から誘導され、
ｐおよびｑは、同じであっても異なっていてもよく、０もしくは１であり、
Ｘ１／Ｘ２ＣＨ２ＣＨ（ＮＨ）ＣＯは、同じであっても異なっていてもよく、システイン（Ｘ１／Ｘ２＝Ｓ）、セリンもしくはスレオニン（Ｘ１／Ｘ２＝Ｏ）から誘導され、
Ａ４／Ａ８ＣＨ（ＮＨ）ＣＯは、同じであっても異なっていてもよく、セリンもしくはスレオニンから誘導され、
Ｙは、リンカー基、もしくはＸ１およびＸ２がそれぞれＳである場合はジスルフィド結合であり、
Ｒ１およびＲ２は、Ｃ（１０−２０）飽和もしくは不飽和アルキル基であり、
ＷおよびＺは、ＮＨ、Ｏ、ＣＨ２もしくはＳである］
で表される、ジェミニ型のペプチド系化合物またはその塩。
【請求項２】
下記の表：
2004515228.tif 000008
［ここでＲは、同一のＲ１およびＲ２を指す］
から選択される、請求項１に記載のジェミニ型ペプチド系化合物。
【請求項３】
ｐおよびｑは０であり、−Ｘ１−Ｙ−Ｘ２−は−ＳＣＨ２ＣＨ２Ｓ−であり、Ａ４／Ａ８ＣＨ（ＮＨ）ＣＯはセリンから誘導され、そしてＷおよびＺは両方ともＮＨである、請求項２に記載のジェミニ型ペプチド系化合物。
【請求項４】
真核細胞もしくは原核細胞へのＤＮＡもしくはＲＮＡまたはその類似体のｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏトランスフェクションを可能にするための請求項１〜３のいずれか１項に記載のジェミニ型ペプチド系化合物の使用。
【請求項５】
前記化合物が、（ｉ）中性キャリアーまたは（ｉｉ）複合化試薬からなる群より選択される１種以上の補助剤と組み合わせて用いられる、請求項４に記載のジェミニ型ペプチド系化合物の使用。
【請求項６】
前記中性キャリアーがジオレイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）である、請求項５に記載の使用。
【請求項７】
前記複合化試薬がＰＬＵＳ試薬である、請求項５に記載の使用。
【請求項８】
前記複合化試薬が主に塩基性アミノ酸を含むペプチドである、請求項５に記載の使用。
【請求項９】
前記ペプチドが塩基性アミノ酸からなる、請求項８に記載の使用。
【請求項１０】
前記塩基性アミノ酸がリシンおよびアルギニンから選択される、請求項８または９に記載の使用。
【請求項１１】
前記ペプチドが分子量１０００〜４０００の範囲のポリ−Ｄ，Ｌ−リシンである、請求項１０に記載の使用。
【請求項１２】
請求項１〜３のいずれか１項に記載のジェミニ型ペプチド系化合物を遺伝子治療用ベクターとともに、または遺伝子治療用ベクターと別々に、投与することを含む、遺伝子治療のために細胞にポリヌクレオチドをｉｎ ｖｉｖｏトランスフェクションする方法。
【請求項１３】
抗感染症治療に使用するポリヌクレオチドまたは抗感染化合物の原核生物または真核生物への導入を容易にするための請求項１〜３のいずれか１項に記載のジェミニ型ペプチド系化合物の使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、ジェミニ型のペプチド系界面活性化合物、前記化合物の使用、およびその製造法に関する。本発明はまた、薬物送達に際して細胞への化合物の導入を容易にするためにジェミニ型ペプチド系化合物を使用することに関する。
【０００２】
界面活性剤とは、低い濃度であっても、液体の表面特性に顕著な影響を与える物質のことである。例えば、界面活性剤は、水または水溶液に溶解した場合には表面張力を著しく減少させ、また、２つの液体間、または液体と固体間の界面張力を減少させることができる。界面活性分子のこの性質は産業界、特に洗剤およびオイル産業で広く利用されてきた。１９７０年代には新しいクラスの界面活性分子が報告され、それは極性ヘッド基をもつ２つの疎水性鎖が疎水性架橋で連結されている点に特徴がある（Ｄｅｉｎｅｇａ， Ｙら、Ｋｏｌｌｏｉｄｎ． Ｚｈ． ３６， ６４９， １９７４）。これらの分子は「ジェミニ」（ｇｅｍｉｎｉ）と呼ばれており（Ｍｅｎｇｅｒ， ＦＭおよびＬｉｔｔａｕ， ＣＡ， Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． １１３， １４５１， １９９１）、それらの単量体等価物に比較して非常に望ましい性質を持っている。例えば、それらは油と水性液体との間の界面張力を減少させるうえでかなり有効であり、そして非常に低い臨界ミセル濃度を有している。
【０００３】
カチオン性の界面活性剤はとりわけ、培養中の細胞にポリヌクレオチドをトランスフェクションするために用いられており、遺伝子技術に関わっている科学者には商業的に入手可能なそのような薬剤の例がいくつかある（例えば、Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ． ＷＩ， ＵＳＡから入手可能な真核細胞トランスフェクション用の試薬ＴｆｘＴＭ−５０）。
【０００４】
遺伝子治療またはアンチセンス治療のために、細胞にＤＮＡを効率よくｉｎ ｖｉｖｏ送達することが何年にもわたって主な課題となってきた。送達ビヒクルとしてウイルスを使用すること、例えば嚢胞性繊維症（ＣＦ）の矯正的遺伝子治療のために気管の上皮細胞にアデノウイルスを使用すること、に多大な関心が寄せられている。しかしながら、ＣＦ患者で遺伝子導入がうまくいっている証拠がいくつかあるにもかかわらず、アデノウイルス経路は炎症性の副作用があり、かつ導入された遺伝子の発現が限定的な一過性であることが原因して、依然として問題を抱えている。ｉｎ ｖｉｖｏ遺伝子送達のいくつかの代替法が研究されており、例えばカチオン性界面活性剤を用いる研究がある。Ｇａｏ， Ｘら、（１９９５） Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． ２， ７１０−７２２は、アミン含有カチオン性脂質を利用して、ＣＦマウスの呼吸器上皮へのＣＦ膜貫通調節タンパク質（ＣＦＴＲ）の正常なヒト遺伝子を用いるこのアプローチの実施可能性を証明した。このグループはさらにリポソームＣＦ遺伝子治療試験により追跡し、それは部分的にうまくいったにすぎなかったが、ヒトでのこのアプローチの可能性を証明した（Ｃａｐｌｅｎ， ＮＪ．ら、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ， １， ３９−４６， １９９５）。比較的最近になって、他のグループは、遺伝子送達のための他のカチオン性脂質、例えばコレステロール誘導体の可能性について検討した（Ｏｕｄｒｈｉｒｉ， Ｎら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ９４， １６５１−１６５６， １９９７）。この限られた研究により、ｉｎ ｖｉｔｒｏでもｉｎ ｖｉｖｏでも上皮細胞への遺伝子の導入を容易にするコレステロール系化合物の能力が実証され、それによってこの一般的なアプローチの有効性が支持されるようになった。
【０００５】
これらの研究、および他の研究からわかったことは、細胞ベースの実験でトランスフェクションするためにｉｎ ｖｉｔｒｏで、また遺伝子治療およびアンチセンス治療のためにｉｎ ｖｉｖｏで、細胞にポリヌクレオチドを効果的に導入しやすくするための低毒性の新規界面活性分子を開発する必要性が依然として存在していることである。本発明は既存の化合物が示す問題点を解決しようとするものである。
【０００６】
本発明は、下記式：
【化２】
2004515228.tif 000002
で表される、２つの連結された鎖を含むジェミニ型のペプチド系化合物に関し、各鎖が、
（１） １個以上のアミノ酸および／またはアミンから形成された正に荷電した親水性ヘッドＱ１またはＱ２、
（２） ポリペプチド骨格をもつ中心部分Ｐ１またはＰ２、および
（３） 疎水性テイルＲ１またはＲ２、
を有し、各鎖の中心部分は、Ｐ１およびＰ２中の残基を介して架橋Ｙによって一緒に連結されている。
【０００７】
好ましくは、この中心部分は、２個または３個のアミノ酸、Ｐａ（任意）、ＰｂおよびＰｃから構成されており、ここで
ＰａはＤ−またはＬ−アミノ酸であって、好ましくはスレオニンまたはセリンのような親水性であり、
Ｐｂは好ましくはＤ−もしくはＬ−システイン、セリンまたはスレオニンであり、
Ｐｃは好ましくはＤ−もしくはＬ−セリンまたはスレオニンであって、Ｒ１またはＲ２に結合している。
【０００８】
本発明の好ましい化合物として、式（Ｉ）：
【化３】
2004515228.tif 000003
［式中、
Ａ１およびＡ５は、同じであっても異なっていてもよく、２個もしくはそれ以上の塩基性アミノ酸から形成された正に荷電した基であり、ここで前記塩基性アミノ酸を連結するアミド結合は少なくとも１個のイプシロン（ε）アミド結合を含んでおり、
Ａ２／Ａ６ＣＨ（ＮＨ）ＣＯは、同じであっても異なっていてもよく、アミノ酸（好ましくはセリン）から誘導され、
ｐおよびｑは、同じであっても異なっていてもよく、０もしくは１であり、
Ｘ１／Ｘ２ＣＨ２ＣＨ（ＮＨ）ＣＯは、同じであっても異なっていてもよく、システイン（Ｘ１／Ｘ２＝Ｓ）、セリンもしくはスレオニン（Ｘ１／Ｘ２＝Ｏ）から誘導され、
Ａ４／Ａ８ＣＨ（ＮＨ）ＣＯは、同じであっても異なっていてもよく、セリンもしくはスレオニンから誘導され、
Ｙは、リンカー基、好ましくは（ＣＨ２）ｍであり、ここでｍは１〜６の整数、最も好ましくは２であり、またＹは、Ｘ１およびＸ２がそれぞれＳである場合にジスルフィド結合であってもよく、
Ｒ１およびＲ２は、Ｃ（１０−２０）飽和もしくは不飽和アルキル基であり、
ＷおよびＺは、ＮＨ、Ｏ、ＣＨ２もしくはＳである］
で表される化合物、またはその塩、好ましくはその薬学的に許容される塩が挙げられる。
【０００９】
好ましくは、上記化合物は対称性であって、即ちＡ１およびＡ５が同一、Ａ２およびＡ６が同一、Ａ４およびＡ８が同一、Ｒ１およびＲ２が同一、そしてＷおよびＺが同一である。
【００１０】
Ａ１／Ａ５の代表的な例には、アルギニン、リシン、オルニチンおよびヒスチジンから選択されるＤ−またはＬ−アミノ酸（好ましくはリシン）、またはスペルミンおよびスペルミジンのようなアミンが含まれる。最大７個までのアミノ酸および／またはアミンを直鎖状または分枝鎖状に連結させることができる。好ましい例として、２個または３個のリシンもしくはオルニチンをもつ基、またはリシン、オルニチン、アルギニンおよびヒスチジンの組合せがあり、例えば、
ＣＯＣＨ（ＮＨＲ）（ＣＨ２）４ＮＨＣＯ（ＮＨ２）（ＣＨ２）４ＮＨ２
または
ＣＯＣＨ（ＮＨＲ）（ＣＨ２）３ＮＨＣＯ（ＮＨ２）（ＣＨ２）３ＮＨ２
または
ＣＯＣＨ（ＮＨＲ）（ＣＨ２）４ＮＨＣＯ（ＮＨ２）（ＣＨ２）３ＮＨ２
であり、ここでＲはＨまたはＮＨＣＯ（ＮＨ２）（ＣＨ２）４ＮＨ２またはＮＨＣＯ（ＮＨ２）（ＣＨ２）３ＮＨ２である。
【００１１】
好ましくは、−Ｘ１−Ｙ−Ｘ２−は−ＳＣＨ２ＣＨ２Ｓ−または−ＯＣＨ２ＣＨ２Ｏ−である。
好ましくは、Ｒ１およびＲ２はそれぞれＣ１２−Ｃ２０アルキル基、例えばＣ１２である。
好ましくは、ＷおよびＺはＮＨであり、それによって、さらなるアミド（ＣＯＮＨ）結合が形成される。
【００１２】
式（Ｉ）のジェミニ型化合物は国際公開ＷＯ９９／２９７１２ （ＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ Ｂｅｅｃｈａｍ）に開示されている。しかしながら、驚くべきことに、基Ａ１、Ａ５、Ａ２およびＡ６の塩基性アミノ酸を連結するアミド結合が少なくとも１個のイプシロン（ε）アミド結合を含む式（Ｉ）の化合物は、塩基性アミノ酸がαアミド結合を介して直鎖状に連結されている同等の化合物と比較して、かなり優れた遺伝子トランスフェクション特性を示すことが判明した。
【００１３】
「イプシロン（ε）アミド結合によって」とは、ペプチド結合が、塩基性アミノ酸残基にある通常のαアミド基により形成されるのではなく、塩基性アミノ酸の側鎖の末端にあるεアミド基によって形成されることを意味するものと定義される。したがって、そのような鎖は自然界で結合したポリペプチドの意味での「直鎖状」ではなく、むしろ「分枝鎖状」である。好ましい実施形態における塩基性アミノ酸はリシンまたはアルギニンから選択され、最も好ましいのはリシンであり、それらは少なくとも１個、好ましくは２個のイプシロン（ε）アミド結合によって互いに連結される。最も好ましくは、３個のリシンがそのように連結されている（即ち、式（Ｉ）のｐおよびｑが両方とも０であり、Ａ１およびＡ５が−Ｌｙｓ−ε−Ｌｙｓ−ε−Ｌｙｓである）。
【００１４】
本発明の化合物は、当業者に周知の合成ペプチド化学を用いて、容易に入手可能な出発物質から調製することができる。このような化合物を合成するには、例えば、ジシステイン部分の構築から始まり、続いて標準的なペプチド化学を用いて各システイン部分のカルボキシル基にセリン部分を結合させることによって親水性ヘッドを形成し、さらに、当業者に周知の標準的アミド形成反応を用いてセリン部分のカルボキシル基に炭化水素鎖を結合させる。続いて、システイン残基の窒素でさらに反応を行うことによって、この中間体を式（Ｉ）の化合物へと導くことができる。
【００１５】
本発明のもう一つの態様は、ジェミニ型のペプチド系化合物を使用する方法に関する。このような使用法には、完全な生物体におけるアンチセンス法、遺伝子治療法および遺伝的免疫感作法（抗体の作製のため）に向けて、細胞へのオリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドの導入を容易にすることが含まれる。他の使用法としては、このような導入が必要とされる場合、例えば、ほかにもあるがとりわけ、遺伝子発現研究およびアンチセンス制御試験において、培養細胞へのポリヌクレオチドのトランスフェクションを容易にするために本発明の化合物を用いることが含まれる。このポリヌクレオチドを本発明の化合物と混合し、細胞に添加して、ポリヌクレオチドの取り込みを可能にするようにインキュベートする。さらにインキュベートした後、トランスフェクトされたＤＮＡによって与えられる表現型の特質について細胞をアッセイすることができ、また、前記ＤＮＡから発現されたｍＲＮＡのレベルをノーザンブロット法もしくはＴａｑｍａｎ（登録商標）法（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ， Ｃｏｎｎｅｃｔｉｃｕｔ， ＵＳＡ）のようなＰＣＲに基づいた定量法を用いて測定することもできる。本発明の化合物は、培養細胞におけるＤＮＡの細胞取り込みの効率の点で、従来技術における化合物と比較して、典型的には３倍から６倍の顕著な改善をもたらす。トランスフェクション法では、このジェミニ型化合物を、トランスフェクション効率を高めるために１種以上の補助剤と組み合わせて用いてもよい。そのような補助剤は、例えば、以下のものから選択することができる：
（ｉ） 中性キャリアー、例えばジオレイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）（Ｆａｒｈｏｏｄ， Ｈら、（１９８５） Ｂｉｏｃｈｉｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ １２３５ ２８９）、
（ｉｉ） 複合化試薬、例えば商業的に入手可能なＰＬＵＳ試薬（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ． Ｍａｒｙｌａｎｄ， ＵＳＡ）、またはポリリシンもしくはポリオルニチンペプチドのようなペプチド、または、排他的ではないが、主にリシン、オルニチンおよび／またはアルギニンのような塩基性アミノ酸を含むペプチド。上記リストは網羅しようとする意図はなく、トランスフェクション効率を高める他の補助剤も本発明の範囲に入るものとする。
【００１６】
さらに別の態様では、本発明は、本発明の化合物を用いて遺伝子治療において遺伝物質を導入することに関する。
【００１７】
本発明のさらに別の態様は、本発明の化合物を用いて細胞に非ヌクレオチド系薬物化合物をｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏ送達する方法に関する。
【００１８】
以下の定義は、本明細書中でしばしば用いられるいくつかの用語を理解しやすくするために提示するものである。
【００１９】
「アミノ酸」とは、＋Ｈ３ＮＣＨ（Ｒ）ＣＯ２−で表される形態の双極性イオン（両性イオン）のことをいう。それらは基Ｒの性質によって区別され、そしてＲが水素と異なる場合には不斉であって、Ｄ−およびＬ−アミノ酸のファミリーを形成する。２０種の天然アミノ酸が存在し、その場合のＲ基は例えば非極性（例：アラニン、ロイシン、フェニルアラニン）であるか、または極性（例：グルタミン酸、ヒスチジン、アルギニンおよびリシン）である。非天然アミノ酸の場合には、Ｒは天然に存在するアミノ酸には見られない他のどのような基であってもよい。
【００２０】
「ポリヌクレオチド」とは、一般にポリリボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌクレオチドのことを指し、それは修飾されていないＲＮＡもしくはＤＮＡであっても、修飾されたＲＮＡもしくはＤＮＡであってもよい。「ポリヌクレオチド」には、限定するものではないが、一本鎖および二本鎖ＤＮＡ、一本鎖領域と二本鎖領域が混在するＤＮＡ、一本鎖および二本鎖ＲＮＡ、一本鎖領域と二本鎖領域が混在するＲＮＡ、ＤＮＡとＲＮＡを含むハイブリッド分子（一本鎖、より一般的には二本鎖、あるいは一本鎖領域と二本鎖領域が混在するものでありうる）が含まれる。さらに「ポリヌクレオチド」は、ＲＮＡもしくはＤＮＡ、またはＲＮＡとＤＮＡの両方を含む三本鎖領域をも指す。またポリヌクレオチドという用語には、１個以上の修飾塩基を含むＤＮＡまたはＲＮＡ、および安定性のためまたは他の理由のため修飾された骨格をもつＤＮＡまたはＲＮＡが含まれる。「修飾」塩基には、例えばトリチル化塩基やイノシンのような特異な塩基が含まれる。さまざまな修飾がＤＮＡおよびＲＮＡに対してなされており、したがって「ポリヌクレオチド」は、一般的に天然に見られるポリヌクレオチドの化学的、酵素的または代謝的修飾形態、ならびにウイルスおよび細胞に特有なＤＮＡおよびＲＮＡの化学的形態を包含する。「ポリヌクレオチド」はまた、オリゴヌクレオチドとも呼ばれる比較的短いポリヌクレオチドを包含する。
【００２１】
「トランスフェクション」とは、化学的または物理的手段により細胞膜を改変することを伴う方法を用いて、培養下の細胞にポリヌクレオチドを導入することをいう。このような方法は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ： Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ， 第２版， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎ． Ｙ． （１９８９）に記載されている。このポリヌクレオチドは直鎖状または環状であってよく、また一本鎖でも二本鎖でもよく、そしてポリヌクレオチドの複製を制御するエレメントまたはポリヌクレオチドの一部を含みうる同種または異種遺伝子の発現を制御するエレメントを含んでいてもよい。
【００２２】
ここで、以下の実施例を用いて本発明を説明することにする。
【００２３】
実施例１−ジェミニ型化合物の一般的な合成経路
条件
（ｉ） ＢｒＣＨ２ＣＨ２Ｂｒ、ＮａＨＣＯ３、８８％の収率；
（ｉｉ） ジ−ｔ−ブチルジカーボネート、ＮａＯＨ、６６％の収率；
（ｉｉｉ） Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、ジシクロヘキシルカルボジイミド、定量的；
（ｉｖ） Ｌ−セリン、Ｋ２ＣＯ３、９０％の収率；
（ｖ） Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、ジシクロヘキシルカルボジイミド、定量的；
（ｖｉ） ＲＮＨ２（ドデシルアミン、テトラデシルアミン、ヘキサデシルアミン、天然のオレイルアミン（８５／１５のｃｉｓ／ｔｒａｎｓ）、オレイルアミンおよびエライジルアミン）、トリエチルアミン、５０〜９０％の収率；
（ｖｉｉ） 濃ＨＣｌ、ＣＨＣｌ３、７０〜９０％の収率；
（ｖｉｉｉ） Ｂｏｃ保護ペプチドのＮ−ヒドロキシ−スクシンイミドエステル（注：どのペプチドもペプチド結合を形成する従来法により製造した）、ＮａＯＨ、５０〜７０％の収率；
（ｉｘ） 濃ＨＣｌ、ＣＨ３ＯＨ、５０〜７０％の収率。
【００２４】
実施例２−ジェミニ化合物の合成
式（Ｉ）において、
ｐおよびｑが０であり、
−Ｘ１−Ｙ−Ｘ２−が−ＳＣＨ２ＣＨ２Ｓ−であり、
基Ａ１およびＡ５が表２に示されるとおりであり、
基Ｒ１／Ｒ２（これらは同一である）が表１に示されるとおりであり（Ｒとして）、
Ａ４／Ａ８ＣＨ（ＮＨ）ＣＯがセリンから誘導され（即ち、Ａ４／Ａ８はそれぞれＣＨ２ＯＨであり）、
ＷおよびＺが両方ともＮＨである、式（Ｉ）のジェミニ化合物を実施例１に示すスキームに従って合成した。
【００２５】
【表１】
2004515228.tif 000004
表１．  選択されたジェミニ型のペプチド系界面活性剤の構造
Ｃ１８：１△９は、Ｃ１８鎖にある９番目の結合が二重結合であることを示す。
【００２６】
実施例３−ＣＨＯ細胞へのルシフェラーゼリポーター遺伝子のジェミニ型界面活性剤を用いたトランスフェクション
チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ−ＤＧ４４）細胞の細胞膜を通るルシフェラーゼリポーター遺伝子の導入を仲介する表１のジェミニ型界面活性剤の能力を、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから市販されている強力な非ウイルス性ビヒクルであるＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ ２０００ＴＭ（Ｌ２０００）の能力と比較した。トランスフェクション活性はルシフェラーゼ活性をアッセイして決定した。
【００２７】
ＣＨＯ−ＤＧ４４細胞を、ジェミニ型界面活性剤（ＧＳ）の５つの濃度（４、８、１０、２０および３０μＭ）においてＤＮＡと一緒にインキュベートした。ルシフェラーゼ活性（１秒あたりのカウント数（ｃｐｓ）で表す）を４回の測定の平均として示した。ＧＳ１１に関しては５つの濃度すべてのデータを表２に示す。その他のジェミニ型界面活性剤に関しては４μＭ濃度でのデータを示す。
【００２８】
【表２】
2004515228.tif 000005
表２． ルシフェラーゼトランスフェクション実験の結果
【００２９】
これらの結果から、炭化水素「テイル」の長さが増加するとトランスフェクション活性が実質的に増加することがわかった。即ちＳ−メチルシステインに基づいた一本鎖類似体は活性を示さなかった（データは示していない）。また遺伝子発現は、ヘッド基にある３個のリシン残基間のアミド結合の性質にかなり依存していることも判明した。したがって、部分的または全体的なα結合ではなくε−アミノ基を介して結合した３個のリシンは、これらのジェミニ型化合物（表２）とＤＮＡとの最適な静電相互作用をもたらした。
【００３０】
実施例４−トランスフェクション効率に対する塩基性ポリペプチドの効果
ＧＳ１１のトランスフェクション効率を、ＧＳ１１を添加する前にＰＬＵＳ試薬（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）またはポリ−Ｄ，Ｌ−リシン（分子量範囲１０００〜４０００）のいずれかと複合化させてルシフェラーゼリポーター遺伝子を用いて、さらに検討した。細胞はＣ２Ｃ１２マウス筋肉細胞を用いた。その結果を表３に示す。
【００３１】
【表３】
2004515228.tif 000006
表３． 塩基性ポリペプチド実験の結果
【００３２】
表１に示したすべてのジェミニ型界面活性剤の遺伝子発現効率は、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから市販されている塩基性ポリペプチドＰＬＵＳ試薬の存在下で少なくとも２倍に増加する。ＰＬＵＳ試薬をポリリシンと置換しても、表３に示すように同じ増強効果を示した。表３は、数種の添加剤の存在下でのＣ２Ｃ１２マウス筋肉細胞におけるＧＳ１１のトランスフェクション効率を比較したものである。ポリリシン（分子量範囲１０００〜４０００）のいずれかの純粋なエナンチオマー体をプラスミドに添加すると、ラセミ混合物と同じ結果が得られた。また、より高分子量範囲のポリリシンを添加すると、ジェミニ型化合物の遺伝子トランスフェクション効率に関してより一層小さな効果が得られた。
【００３３】
表１のジェミニ型化合物は、ＣＨＯ−ＤＧ４４およびＣ２Ｃ１２のほかに、種々の真核細胞において良好な遺伝子トランスフェクション効率をもたらすことがわかる。これらの化合物は、ＨＥＫ２９３および通常はトランスフェクトすることが困難であると考えられているＳＨＳＹ−５ＹおよびＣ６−１５のようなニューロン起源の細胞系の場合にも効果的である。
【００３４】
実施例５−リポプレックス研究
リポプレックス（ｌｉｐｏｐｌｅｘ）系中に表１のジェミニ型化合物を配合することに関する予備的な研究を実施した。適当なリポプレックス配合物の設計は、リポプレックスがプラスミドＤＮＡの構造上の完全性を保存でき、かつ標的送達を達成できる可能性があるので、選択された投与経路に対して大きな効果を及ぼすことがある。この実験では、ＧＳ１１を「ヘルパー脂質」のＤＯＰＥと組み合わせて、水性媒体中の多重膜脂質小胞懸濁液を形成させた（この懸濁液の光学的性質は、多重膜小胞の場合に観察される性質に典型的なものであった）。形成された小胞は直径が１ミクロン未満であることが押出し法によって判明し、これにより、ジェミニ型界面活性剤とＤＯＰＥとの組合せは種々のサイズと脂質組成のリポソームの調製を可能にすることが示唆される。これらのコロイド状の変化は、動物モデルにおいて最適な遺伝子発現を生じさせる際のジェミニ型界面活性剤の分子組成の変化と同じくらい重要でありうる。
【国際公開パンフレット】
2004515228.tif 000009
2004515228.tif 000010
2004515228.tif 000011
2004515228.tif 000012
2004515228.tif 000013
2004515228.tif 000014
2004515228.tif 000015
2004515228.tif 000016
2004515228.tif 000017
2004515228.tif 000018
2004515228.tif 000019
2004515228.tif 000020
2004515228.tif 000021
【国際調査報告】
2004515228.tif 000022
2004515228.tif 000023
2004515228.tif 000024