(57)【要約】本発明は、二相系反応培地中での、キシレンモノオキシゲナーゼを発現する組換え微生物を用いる、芳香族化合物の生体触媒的酸化方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
芳香族化合物の生体触媒的酸化方法であって、
ａ）式II：
Ar-R2        （II）
［式中、
Arは非置換または一置換もしくは多置換の単核芳香族環であり、
R2は、-CH=CH2、-(CH2)n+1R3、または-(CH2)nCHOであり、ここで、
Nは、0〜15の整数であり；
R3は、HまたはOHである］
で表わされる芳香族基質を含む水相−有機相二相系培地において、キシレンモノオキシゲナーゼ（XMO）活性を有する酵素を発現する微生物を、好気的条件下で増殖させ、
ｂ）その培養培地から、酸化反応において形成される少なくとも1種の生成物を単離する
ことを含む、上記方法。
【請求項２】
酸化反応により以下の生成物が得られる、請求項1に記載の方法：
ａ）用いられる基質が式IIで表わされる化合物であり、そこにおいてR2が-(CH2)n+1OHである場合、式Ia：
Ar-(CH2)n-R1        (Ia)
［式中、
Arおよびnは、上記で述べた意味を有し、
R1は、CHOまたはCOOHである］
で表わされる生成物；
ｂ）用いられる基質が式IIで表わされる化合物であり、そこにおいてR2が-(CH2)n+1Hである場合、上記の式Ia、または式Ib：
Ar-(CH2)n+1OH        (Ib)
［式中、Arおよびnは、上記で述べた意味を有する］
で表わされる生成物；
ｃ）用いられる基質が式IIで表わされる化合物であり、そこにおいてR2が-(CH2)nCHOである場合、式Ic：
Ar-(CH2)nCOOH        (Ic)
［式中、Arは、上記で述べた意味を有する］
で表わされる生成物；または
ｄ）用いられる基質が式IIで表わされる化合物であって、そこにおいてR2が-CH=CH2である場合には、上記の式Iaで表わされ、そこにおいてR1がCOOH、CHOもしくはCH2OHであり、nは0である生成物；もしくは、Ar-エポキシ化合物。
【請求項３】
用いられる有機相が、n-オクタノール相／水相の二相系において104より高い分配係数を有する無極性有機化合物である、請求項1または2に記載の方法。
【請求項４】
有機相が、1atmにおいて、酸化生成物の沸点よりも50〜200℃程度上回る沸点または沸点範囲を有する、請求項1〜3のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
用いられる有機相が、フタル酸ジ(C5-C12-アルキル)またはそのようなフタル酸エステルの混合物である、請求項1〜4のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
有機相を分離させ、そこに溶解している酸化生成物を蒸留により取り出す、請求項1〜5のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
XMO活性を発現する微生物が、ベンジルアルコールデヒドロゲナーゼ（BADH）活性および／またはベンズアルデヒドデヒドロゲナーゼ（BZDH）活性を本質的に有していない、請求項1〜6のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
シュードモナス・オレオボランス（Pseudomonas oleovorans）GPo1由来の調節alk系の遺伝的制御下に機能し得る形で連結されているXMOコード遺伝子xylMおよびxylAを含んでいる発現ベクターで形質転換した組換え微生物が用いられる、請求項1〜7のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
微生物が、発現プラスミドpSPZ3で形質転換されている、請求項8に記載の方法。
【請求項１０】
微生物が、エシェリキア（Escherichia）属の細菌である、請求項1〜9のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
酵素の発現が、培養培地へ誘導原を添加することによって開始される、請求項1〜10のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）mt-2キシレンモノオキシゲナーゼが発現される、請求項1〜11のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
本質的に抗生物質を含まない反応培地が用いられる、請求項1〜12のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
変換が半連続式回分操作として行われる、請求項1〜13のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
プソイドクメンが出発物質として用いられる、請求項1〜14のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
反応培地のpHが、生体触媒の生産能のパラメーターとして用いられる、請求項1〜15のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、芳香族化合物の生体触媒的酸化方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
アルデヒド類に属する芳香族化合物は、芳香剤や芳香性物質の重要な構成成分である（WittcoffおよびReuben 1996）。同様に、それらは、様々なポリマー、医薬およびファインケミカルの出発物質と考えられている。
【０００３】
典型的な芳香族アルデヒド（すなわちベンズアルデヒド）を製造するための最も重要な化学合成経路は、トルエンから出発する（WittcoffおよびReuben 1996）。トルエンを二塩素化することにより塩化ベンジリデンが得られ、これを加水分解してベンズアルデヒドが得られる（スキーム1）。
【化１】
2004528842.tif 000002
【０００４】
メチル基を1個だけ特異的に酸化すること、または生成物混合物から単離することは、化学合成において最も困難なものである。更に、反応は、極めて毒性の高い物質を用いるか、あるいは極端な反応条件下で行わなければならない場合が多い。更に、化学合成から生じる副生成物が問題を引き起こす。例えば化学合成による3,4-ジメチルベンズアルデヒドの製造は、上記で述べたような理由から非常に困難である。
【０００５】
上記の化学合成の別法は、アルデヒド類に属する芳香族化合物の生体触媒的製造である。
【０００６】
芳香族アルデヒドの製造に主に使用される酵素のクラスは、トランスフェラーゼ（転移酵素）、リアーゼ（脱離酵素）（SimmondsおよびRobinson 1997；SimmondsおよびRobinson 1998）、およびオキシドレダクターゼ（酸化還元酵素）（Legoy, Kimら, 1985；Molinari, Villaら, 1995；Molinari, Aragozziniら, 1997；Molinari, Gandolfiら, 1999）である。オキシドレダクターゼは、キシレンなどのメチル基1個だけの立体選択的および位置選択的な酸化を行うことができるので、特に関心が持たれる。キシレンは安価な基質と見なされており、二段階反応で対応するアルデヒドへと変換できる。
【０００７】
シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）mt-2由来のTOLプラスミドpWWOは、トルエンおよびキシレンの異化を可能にする。上部およびメタ開裂異化経路は、このプラスミドにある2つの異なるオペロンにコードされる。上部異化経路の酵素は、トルエンまたはキシレンの酸化を触媒して対応する安息香酸を生成し、メタ開裂異化経路の酵素は、安息香酸を開裂させてクエン酸回路の基質にする反応を触媒する（Harayama, Rekikら. 1989; Harayama, Kokら. 1992; Ramos, Marquesら. 1997; Williams, Shawら. 1997）。上部異化経路は、芳香族アルデヒドの製造に関し特に興味深い。上部異化経路のオペロンは5つの遺伝子を含む（Harayama, Leppikら 1986）。スキーム2からも判るように、第一の酵素はキシレンモノオキシゲナーゼ（XMO）であり、これはトルエンまたはキシレンを対応するベンジルアルコールへと変換する。
【化２】
2004528842.tif 000003
【０００８】
第二の酵素はベンジルアルコールデヒドロゲナーゼ（BADH）であり、これはベンジルアルコールからベンズアルデヒドへの反応を触媒することができる。上記の反応において、NADHはキシレンモノオキシゲナーゼにより消費され、アルコールデヒドロゲナーゼにより再合成される。これら2つの酵素をベンズアルデヒドの製造に使用すれば、均衡のとれたNADHバランスが得られるであろう。
【０００９】
トルエンを変換して対応するベンズアルデヒドを得るために、組換え大腸菌においてXMOおよびBADHを同時に使用したところ、ベンズアルデヒドは少量しか形成されなかった。それどころか、ベンズアルデヒドの、対応するベンジルアルコールへの再合成が見られた（Buhler, Schmidら. 2000）。BADHにより触媒される反応の平衡は圧倒的にアルコールの方に向かうことが実証された。
【００１０】
しかし、Buhler, Schmidら（2000）によれば、キシレンモノオキシゲナーゼはそれ自体、BADHが存在しなくとも、トルエンまたはキシレンのメチル基の多段階酸化を触媒して、ベンジルアルコール、ベンズアルデヒドおよび安息香酸を生成することができる。これは、分子酸素の酸素原子を導入すること、すなわち一酸素原子添加（monooxygenations）（Buhler, Schmidら(2000)）により行われる。
【００１１】
スキーム3に、XMOにより触媒される反応を示す。脱水素反応とは違い、一酸素原子添加反応は不可逆的であることに注意しなければならない。
【化３】
2004528842.tif 000004
【００１２】
組換え大腸菌におけるXMOの発現を調節するために、n-オクタンにより誘導可能なalk制御系が用いられた（Panke, Meyerら 1999）（図1を参照）。
【００１３】
選択的に酸化された芳香族化合物（例えば3,4-ジメチルベンズアルデヒド）の、安価な基質からのバイオテクノロジー的製造には、非常に関心が持たれる。何故ならば、化学合成によりメチル基を1個だけ位置特異的に酸化することは非常に困難だからである。基質および生成物の水への低い溶解性および細胞に対する毒性は極めて重要である。かくして、トルエンは、1〜4mMという低濃度で大腸菌にとって有毒である（Schmid 1997）。このために、水系の単相系の適用は制限される。
【００１４】
先の独国特許出願DE-A-199 51 768.1号は、XMO発現微生物を用いた、単相系反応培地における、芳香族アルデヒドおよび／またはカルボン酸の生体触媒的製造方法を記載している。
【発明の開示】
【００１５】
発明の簡単な説明
本発明の目的は、XMO産生微生物を利用する、芳香族化合物の改善された生体触媒的酸化方法を提供することである。特に、この新規な方法は、大規模、半工業的規模または工業的規模で実施するのに適化しようとするものである。
【００１６】
本発明者らは、この目的が、水相／有機相二相系反応培地を用いて達成できることを見出し、驚くべきことに、プソイドクメンの微生物酸化により対応する酸化生成物（アルコール、アルデヒド、カルボン酸）を得るモデル系を用いることによって、それを実証した。本発明による二相系は、従来の水性の単相系と比較して、幾つかの重要な利点を有している点で異なる（表1）。
【００１７】
表１：多相系の利点
−水に難溶性の基質／生成物の濃度をより高くできる；
−相分離によって生成物の後処理（working-up）が容易になる；
−基質または生成物の阻害を低下させる；
−生成物の抽出により、反応平衡がより高い転化率の方向にシフトする；
−水活性を低下させることにより加水分解反応が逆戻りする；
−少容量の反応器および流量で済む；
−微生物混入の危険性が低い；
−不安定な基質または生成物の、加水分解による開裂の危険性が低い。
【００１８】
発明の詳細な説明
特に、本発明は、芳香族化合物の生体触媒的酸化方法であって、
ａ）式II：
Ar-R2        （II）
［式中、
Arは非置換または一置換または多置換の単核芳香族環であり、
R2は、-CH=CH2、-(CH2)n+1R3、または-(CH2)nCHOであり、ここで、
Nは、0〜15の整数、例えば0、1、2、3、4または5であり；
R3は、HまたはOHである］
で表わされる芳香族基質を含む水相−有機相二相系培養培地において、キシレンモノオキシゲナーゼ（XMO）活性を有する酵素を発現する微生物を、好気的条件下で増殖させ、
ｂ）その培養培地から、XMO触媒酸化反応において形成される少なくとも1種の生成物を単離する
ことを含む上記方法に関する。
【００１９】
特に、本発明による方法は、酸化反応によって以下の生成物を取得することを含む：
ａ）用いられる基質が式IIで表わされる化合物であり、そこにおいてR2が-(CH2)n+1OHである場合、式Ia：
Ar-(CH2)n-R1        (Ia)
［式中、
Arおよびnは、上記で述べた意味を有し、
R1は、CHOまたはCOOHである］
で表わされる生成物；
ｂ）用いられる基質が式IIで表わされる化合物であり、そこにおいてR2が-(CH2)n+1Hである場合、上記の式Ia、または式Ib：
Ar-(CH2)n+1OH        (Ib)
［式中、Arおよびnは、上記で述べた意味を有する］
で表わされる生成物；
ｃ）用いられる基質が式IIで表わされる化合物であり、そこにおいてR2が-(CH2)nCHOである場合、式Ic：
Ar-(CH2)nCOOH        (Ic)
［式中、Arは、上記で述べた意味を有する］
で表わされる生成物；または
ｄ）用いられる基質が式IIで表わされる化合物であって、そこにおいてR2が-CH=CH2である場合には、上記の式Iaで表わされ、そこにおいてR1がCOOH、CHOもしくはCH2OHであり、nは0である生成物；もしくは、Ar-エポキシ化合物。
【００２０】
a) 用いた出発物質
本発明による反応は、１以上の工程で、同じ酵素（XMO）を用いて行うことができる。アルキル化された芳香族化合物、対応するアルコールまたは対応するアルデヒドを基質として用いることができる。用いた基質の所望の程度の酸化は、後記で更に詳細に説明されているようにして調節できる。
【００２１】
本発明に従って製造される、または基質として用いられる式IおよびIIの化合物における芳香族環系Arは、一置換または多置換されていてもよい。環置換基の位置は、所望するとおりに選択できる。しかし、酸化しようとする側鎖に対してメタ位および／またはパラ位であることが好ましい。
【００２２】
芳香族化合物の好適な置換基は、メチル、エチル、n-およびi-プロピルならびにn-ブチルなどのC1-C4-アルキル（特にメチルおよびエチル）、C1-C4-アルコキシ（特にメトキシおよびエトキシ）、F、Cl、BrおよびIなどのハロゲン（特にCl）ならびにニトロを含む。
【００２３】
本発明による方法においてXMOで酸化することが可能な式IIで表わされる基質の特定の非限定的な例は、トルエン、キシレン、スチレン、m-および／またはp-メチル-、エチル-、メトキシ-、ニトロ-およびクロロ-置換されたトルエン、ならびにm-ブロモ-置換されたトルエンおよびプソイドクメン（すなわちトリメチルベンゼン）；ならびにこれらの化合物の対応するアルコールまたはアルデヒドである。
【００２４】
b) 有機相
有機相の選択は、本発明に従って使用される二相系にとって重要であり、次の種々のパラメーターに応じて決まる。
【００２５】
−有機相の、細胞に対する有害または抑制的な影響
−基質および生成物の有機相への溶解性
−基質および生成物の分配係数
−有機相の可燃性および毒性
−有機相と水の密度の差
−有機相の沸点。
【００２６】
二相系反応培地の有機相として本発明に従って好ましく使用されるものは、n-オクタノール／水二相系において104より高い分配係数を有する無極性の有機化合物である。
【００２７】
また、1atmにおける沸点または沸点範囲が酸化生成物（特に、最も高い沸点を有する、単離しようとする酸化生成物）の沸点よりも50〜200℃程度上回る有機相を使用することも好ましい。特に好ましく使用される有機相はフタル酸ジ(C5-C12-アルキル)またはそのようなフタル酸エステルの混合物である。特に好ましく使用されるものは、フタル酸ジオクチル（フタル酸ビスエチルヘキシル）、ならびに、発酵の過程で同時に消泡剤として作用し得るものである。
【００２８】
本発明による方法の好ましい変法では、反応生成物は、有機相を分離させ、そこに溶解している酸化生成物を蒸留により取り出すことによって得られる。
【００２９】
c) 使用される発現構築物および生体触媒
本発明による方法は、好ましくは、GENBANKアクセッションNo. M37480のxylMA由来の遺伝子xylAおよびxylBによってコードされ、イソ酵素に該当するXMOを用いて行われる。XMOは、好ましくは、シュードモナス（Pseudomonas）属の細菌、特にシュードモナス・ブチダ（Pseudomonas putida）種、好ましくはmt-2株（ATCC 33015）に由来するものである。
【００３０】
また、本発明は、具体的に開示されているXMOの「機能的同等物」の使用を包含する。
【００３１】
具体的に開示されているモノオキシゲナーゼの「機能的同等物」または類似体は、本発明の目的については、それらとは異なるが目的とする反応を示し続け、上記式Iで表わされるアルコール、アルデヒドおよび／またはカルボン酸の製造に有用な酵素である。
【００３２】
「機能的同等物」とは、本発明によれば、特に、少なくとも1つの配列位置において生来のアミノ酸とは異なるアミノ酸を有するが、それでも上記の酸化反応の1つを触媒する、突然変異型酵素（enzyme mutants）を意味するものとして理解される。つまり、「機能的同等物」とは、1個以上のアミノ酸の付加、置換、欠失および／または転移（inversions）により得られる突然変異体を包含し、上記の改変は、本発明による触媒活性を有する突然変異体を生じる限り、いずれの配列位置で起こっていてもよい。また、機能的同等物は、特に突然変異体と未改変酵素との反応性パターンが質に関して一致する場合（すなわち、例えば同一の基質が異なる速度で変換される場合）にも存在する。
【００３３】
通常、「機能的同等物」は、他の生物（例えば本明細書で具体的に述べられているもの以外の細菌）から入手可能なモノオキシゲナーゼ、ならびに天然に存在する変異体もしくはイソ酵素も包含する。例えば、相同配列の領域は配列アライメントにより同定でき、同等な酵素は本発明の具体的な作業に従って決定できる。
【００３４】
また、本発明によれば、上記のモノオキシゲナーゼおよびそれらの機能的同等物の１つをコードする、具体的に述べられているもの以外の核酸配列（一本鎖および二本鎖のDNAおよびRNAの配列）の使用も包含される。したがって、本発明に従って有用とされる更に別の核酸配列は、具体的に使用される配列とは１個以上のヌクレオチドの付加、置換、挿入または欠失により異なるが、それでも目的とする範囲の特性を有するモノオキシゲナーゼをコードしている。
【００３５】
また、天然に存在する変異体（例えばそれらのスプライス変異体）のように、サイレント突然変異として知られるものを含んでいる核酸配列や、特定の供給生物もしくは宿主生物のコドン利用により、具体的に述べられている配列と比較して改変されている核酸配列の使用も、本発明により包含される。本発明はまた、保存的ヌクレオチド置換（すなわち、問題のアミノ酸が、同じ電荷、大きさ、極性および／または溶解性を持つアミノ酸で置換される）により取得できる配列に関する。
【００３６】
XMOコード配列は、調節核酸配列の遺伝的制御下に、本発明に従って使用可能なモノオキシゲナーゼ酵素をコードする核酸配列を含む、発現構築物の一成分である。本発明によるそうした構築物は、好ましくは、問題のコード配列の5’側上流にあるプロモーターおよび3’下流側にあるターミネーター配列、そして（それが適当である場合には）更なる慣用の調節エレメントを含み、それぞれ、そのコード配列に機能し得る形で連結されている。「機能し得る形での連結」とは、プロモーター、コード配列、ターミネーター、および（適当である場合には）更に別の調節エレメントが、それら調節エレメントの各々がコード配列の発現においてその機能を果たすことができるように並べて配置される、という意味として理解される。機能し得る形で連結可能な配列の例は、ターゲッティング配列、翻訳エンハンサー、他のエンハンサー、ポリアデニル化シグナルなどである。更に別の調節エレメントは、選択マーカー、増幅シグナル、複製起点などを含む。
【００３７】
人工的な調節配列に加えて、天然の調節配列が実際の構造遺伝子の前に存在したままであってもよい。この天然の調節は、それが適当である場合には、遺伝子改変により除去してもよく、遺伝子発現を増大または低下させることができる。しかし、遺伝子構築物は、単純な構造のものとしてもよい。すなわち、構造遺伝子の前に追加の調節シグナルが挿入されておらず、天然のプロモーターはその調節と共に除去されていない。その代わり、天然の調節配列は、制御が起こらず遺伝子発現が増大または低下するように突然変異される。遺伝子構築物には、核酸配列の1個以上のコピーが存在しうる。
【００３８】
有用なプロモーターの例は、cos、tac、trp、tet、trp-tet、lpp、lac、lpp-lac、lacIq、T7、T5、T3、gal、trc、ara、SP6、l-PRもしくはl-PLプロモーター（これらはグラム陰性細菌において有利に使用される）、グラム陽性プロモーターであるamyおよびSPO2、酵母プロモーターであるADC1、MFa、AC、P-60、CYC1、GAPDH、または植物プロモーターであるCaMV/35S、SSU、OCS、lib4、usp、STLS1、B33、not、またはユビキチンもしくは白インゲン豆プロモーターである。例えば光誘導型プロモーターまたは温度誘導型プロモーター（例えばPrPl-プロモーター）のような誘導型プロモーターを使用することが特に好ましい。
【００３９】
基本的に、全ての天然のプロモーターが、それらの調節配列と一緒に使用可能である。更に、合成プロモーターもまた、有利に使用できる。
【００４０】
上記で述べた調節配列は、核酸配列の制御された発現を可能にすることを目的とする。このことは、宿主生物によっては、例えば、その遺伝子が誘導後にだけ発現もしくは過剰発現されること、あるいは直ちに発現および／もしくは過剰発現されることを意味し得る。
【００４１】
調節配列または調節因子は、好ましくは、発現に正の作用、すなわち発現を増大または低下させる作用を有することができる。したがって、調節エレメントは、プロモーターおよび／またはエンハンサーのような強力な転写シグナルの使用により、転写レベルで有利に増大され得る。更に、例えばmRNAの安定性を向上させることにより、翻訳を増大させることも可能である。
【００４２】
本発明による発現カセットは、適切なプロモーターを適切なモノオキシゲナーゼヌクレオチド配列およびターミネーターもしくはポリアデニル化シグナルに融合させることにより作製される。そうすることにより、例えばSambrookらに記載されているような慣用の組換え技法およびクローニング技法が使用される。
【００４３】
適切な宿主生物で発現させるために、組換え核酸構築物または遺伝子構築物を、宿主内でその遺伝子の最適な発現を可能にする宿主特異的ベクターに挿入するのが好都合である。ベクターは当業者には周知であり、例えば「Cloning Vectors」（Pouwels P. H.ら）に見ることができる。
【００４４】
ベクターは、プラスミドだけでなく、例えばファージ、ウイルス（SV40、CMV、CaMV、バキュロウイルスおよびアデノウイルスなど）、トランスポゾン、ISエレメント、ファージミド、コスミド、ならびに線状もしくは環状のDNAなどの、当業者に公知の全ての他のベクターも意味すると理解される。
【００４５】
本発明におけるそうしたベクターは、例えば少なくとも1個の本発明よるベクターで形質転換された組換え微生物、および本発明による方法において使用可能な組換え微生物の作製に役立ち得る。本発明による上記の組換え構築物は、好都合なことに、適当な宿主系に導入され、発現される。上記の核酸を問題の発現系で発現させるためには、当業者がよく知っているクローニング法およびトランスフェクト法（例えば共沈降、プロトプラスト融合、エレクトロポーレーション、レトロウイルストランスフェクションなど）を用いることが好ましい。適切な系は、例えば、「Current Protocols in Molecular Biology」（F. Ausubelら）に記載されている。
【００４６】
d) 微生物
適切な宿主生物とは、基本的に、本発明による核酸、それらの対立遺伝子変異体、それらの機能的同等物もしくはそれらの誘導体の発現を可能にする全ての生物であり、本発明による微生物酸化反応を行うのに使用される。宿主生物は、例えば、細菌、真菌、酵母、植物細胞、または動物細胞を意味すると理解される。好ましい生物は細菌である。
【００４７】
しかし、好ましく使用されるXMO発現微生物は、本質的にベンジルアルコールデヒドロゲナーゼ（BADH）活性および／またはベンズアルデヒドデヒドロゲナーゼ（BZDH）活性を持たないものである。発現プラスミドpSPZ3で形質転換された微生物が、特に好ましく使用される。
【００４８】
本発明に従って好ましく使用される微生物は、エシェリキア（Escherichia）属の微生物、特に大腸菌（E. coli）であり、例えばJM101株が挙げられる。
【００４９】
ベクターによる微生物の形質転換は、本発明に従い、確立されている標準的な技法を用いて行われ、したがって、更に詳細な説明は不要である。
【００５０】
うまく形質転換された微生物の選別は、マーカー遺伝子（これもまたベクターまたは発現カセット内に存在している）により行うことができる。そのようなマーカー遺伝子の例は、抗生物質への耐性に関する遺伝子、および形質転換細胞の染色を引き起こす色素反応を触媒する酵素の遺伝子である。これらの細胞は、次いで、自動化セルソーティングにより選別できる。抗生物質（例えばG418またはハイグロマイシン）への耐性に関する適切な遺伝子を保有するベクターでうまく形質転換された微生物は、抗生物質を含有する適切な液体培地または固形培地により選別できる。細胞表面に存在するマーカータンパク質は、アフィニティークロマトグラフィーによる選別に使用できる。
【００５１】
宿主生物を、プラスミド、ウイルスもしくはファージ（例えばRNAポリメラーゼ／プロモーター系を含むプラスミド、λもしくはμファージ、または他の溶原性ファージもしくはトランスポゾン）などのその生物に適合するベクター、ならびに／または更に別の有利な調節配列と組み合わせることにより、発現系が形成される。
【００５２】
特に好ましい1つの実施形態によれば、例えばシュードモナス・オレオボランス（Pseudomonas oleovorans）GPo1に由来するalk調節系の遺伝制御下にXMOコード遺伝子であるxylMおよびxylAを保有する発現ベクターで形質転換された組換え微生物が使用される。
【００５３】
この微生物は、特に好ましくは、xylMAコード発現プラスミドpSPZ3で形質転換される。
【００５４】
シュードモナス・オレオボランスGPo1に由来するalk調節系は、それ自体が公知である。上記で述べた2つのalk遺伝子クラスターのうち第一のものの発現は、alkBp（alkプロモーター）の制御下にあり、第二のalk遺伝子クラスターによりコードされる機能性調節タンパク質alkSの存在下で、且つ、例えばアルカン（n-オクタンなど）またはこれらと近縁ではない化合物（ジシクロプロピルケトン（DCPK）など）などの誘導原（inducer）の存在下で開始する（8, 22, 23）。大腸菌においてalk調節系を使用することは、異化生成物の抑制が起こらない、という利点がある。
【００５５】
e) 方法の実施
本発明による方法は、慣用のバイオリアクター（バイオリアクター）内で、回分式、半回分式、または連続式で行うことができる。半回分法を用いることが特に好ましい。ここで、培養培地は、例えば約1〜5容量%程度の少量の残分を除いて、変換が完了した後に反応器から取り出す。この残分は、次いで、後記する回分（batch）のための接種物となる。
【００５６】
通気速度および酸素投入、出発物質の濃度、pH、温度、有機相および栄養培地に関する反応培地の組成、供給時間、ならびに供給速度などの最適なプロセスパラメーター濃度は、当業者であれば、過度の労力をいとわずとも、後記する実験の箇所の開示内容を考慮すれば選択できる。したがって、例えば反応培地のpHは、生体触媒の生産能のパラメーターとして使用できる。
【００５７】
本発明による方法における誘導原としては、n-オクタンが好ましく使用され、特に好ましくは0.001〜0.5%（v/v）の量で使用される。
【００５８】
もう1つの好ましい別法では、本発明による変換は、本質的に抗生物質を含まない反応培地中で行われる。驚くべきことに、このことは有利である。何故ならば、一般的な反応条件下では、使用される組換え微生物が導入されたプラスミドを失うことが実際に予期されるからである。反応培地に抗生物質が不要であること（本発明によれば可能である）は、かなりの経費節減を意味する。何故ならば、抗生物質の使用が不要であり、更に、残留する抗生物質を、処理した反応培地から除去する必要がないからである。
【００５９】
本発明により用いられる基質の酸化程度は、種々の方法で調節可能である。例えば、サンプルを一定時間毎に培地から取り出し、対応するアルコール、アルデヒドおよび／またはカルボン酸誘導体の含有量をガスクロマトグラフィー単独、質量分析と組み合わせたガスクロマトグラフィー（GC-MS）または高速液体クロマトグラフィーにより調べる。どの酸化誘導体を目的とするのか、あるいはいつ目的の混合比が確立されたのか、に応じてインキュベーションを終了させる。これは、例えば、微生物を死滅させること、または（例えば遠心分離およびデカンテーションにより）それらを培地から除去すること、および／または酸（例えばトリクロロ酢酸）による処理、または熱処理によって行うことができる。
【００６０】
酸化された芳香族化合物は、次に、例えば（それが適当である場合には減圧下での）簡単な蒸留、分別蒸留、精留などの慣用の分離方法を用いて、あるいは適切なクロマトグラフィー法を適用することによって培養培地（特に有機相）から単離できるが、好ましくは蒸留により単離する。
【００６１】
f) 3,4-ジメチルベンズアルデヒドの製造:
本発明の1つの好ましい実施形態では、芳香族化合物を本発明により酸化するため、特に二相系流加法でプソイドクメンから3,4-ジメチルベンズアルデヒドを製造するために、有機相に関する上記の基準に従って、フタル酸ビス(2-エチルヘキシル)（フタル酸ジオクチル）を有機相として選んだ。基質も生成物も、フタル酸ジオクチルに容易に溶解した。更に、この安価な有機物質は、難燃性が高く、大腸菌にとって非毒性の第二相を構成する。フタル酸ジオクチルは沸点が高いので（大気圧下で380℃）、蒸留による生成物の分離が可能になる。
【００６２】
プソイドクメン、3,4-ジメチルベンジルアルコール、3,4-ジメチルベンズアルデヒドおよび3,4-ジメチル安息香酸の、フタル酸ジオクチルと水相としてのM9培地との間の分配係数は、表2から判る。
【表１】
2004528842.tif 000005
【００６３】
この多段階法の速度論は、組換えXMO発現大腸菌により3,4-ジメチルベンズアルデヒドを製造するための本発明に従って好ましいとされる二相系流加法において重要な役割を担っている。つまり、3,4-ジメチル安息香酸（DBA）は、残存する基質の濃度が極めて低い（有機相中で90mM未満；水相において約3.7μMに該当)場合にだけ形成されることが見られた。更にこの現象に関与すると思われる要因は、キシレンモノオキシゲナーゼがプソイドクメンに対して対応するアルデヒドに対するよりも高い親和性を有することに加えて、プソイドクメンによる第三の酸化の非競合的阻害である。また、有機相中のプソイドクメン濃度が150mM（水相中で約6.2μMに該当）を超えた場合は、3,4-ジメチルベンジルアルコールと3,4-ジメチルベンズアルデヒドの同時形成が見られた。しかし、プソイドクメン濃度が150mM未満では、主な生成物は3,4-ジメチルベンズアルデヒドである。3,4-ジメチル安息香酸の形成は、水相中のアルコールの濃度がアルデヒドの濃度より高い場合にも阻害される。
【００６４】
組換え大腸菌がXMO活性を持たない場合、3,4-ジメチルベンズアルデヒドから3,4-ジメチルベンジルアルコールへの逆方向の反応が見られた。これは、使用した大腸菌株内の非特異的なアルコールデヒドロゲナーゼ活性が原因であると思われる。この反応でも、BADHの場合と同様に、平衡はアルコールの方に向かう（Buhler, Schmidら 2000）。
【００６５】
酵素活性は、培地中のブドウ糖濃度にも依存する。したがって、培地中の高いブドウ糖濃度だけでなく、ブドウ糖制限および酸素制限もまた、酵素活性に阻害的な影響を及ぼす。
【００６６】
後記に示す実施例でより詳細に説明されている本発明の1つの好ましい実施形態では、3,4-ジメチルベンズアルデヒドは、シュードモナス・プチダmt-2のキシレンモノオキシゲナーゼの遺伝子が組換えにより用いられている大腸菌を用いて、プソイドクメンから速度論的に調節された多段階反応で製造した。これは、キシレンから対応するアルコールおよびアルデヒドを経由する対応する酸への酸化を触媒するキシレンモノオキシゲナーゼの能力により可能になる。この多段階反応の速度論を用いて、アルデヒドを特異的に濃縮した。出発物質が有機相から添加される二相系流加法を用い、パイロット規模での30リットルの回分から484ml（96.5%）の3,4-ジメチルベンズアルデヒドが生成し、遠心分離および蒸留により単離した。
【００６７】
更に、変換に使用した培地は、本発明に従って更にうまく最適化されており、プロセス関連パラメーターは、本発明に従って決定され、うまく最適化されていた。また、プラスミドおよびXMO遺伝子が、選択圧をかけずとも、60時間、14世代にわたってずっと安定であることが実証された。
【００６８】
当業者であれば、プソイドクメンの変換についての上記の結果から始まって、過度の労力なしに、（適当であれば、他の微生物を使用して）本発明の概括的な教示内容を、上記の式Iで表わされる更に別の出発物質の生体触媒的変換に適用できる。この点に関して考慮される要因は、特には、反応培地の組成（例えば緩衝剤、栄養源、有機相）およびプロセス条件（例えば基質濃度、操作条件、反応器のタイプ、通気、反応時間）、反応混合物の処理操作の変更などである。
【００６９】
ここで、以下の非限定的な使用例および添付の図面を参照しながら、本発明を更に詳細に説明する。
【００７０】
使用される略語
CDW      細胞乾燥重量
DBAlk    3,4-ジメチルベンジルアルコール
DBAld    3,4-ジメチルベンズアルデヒド
DBA      3,4-ジメチル安息香酸
DOP      フタル酸ジオクチル
NAD+     β-ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、酸化型
NADH     β-ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、還元型
P        プソイドクメン（トリメチルベンゼン）
ppm      百万分率
rpm      回転数／分
v/v      容量対容量
w/v      容量対重量
XMO      キシレンモノオキシゲナーゼ
材料および方法
１．装置
a) 分析装置
2004528842.tif 000006
b) 生体内変換のための装置
2004528842.tif 000007
c) 下流装置
2004528842.tif 000008
２. 化学物質
実験に使用した化学物質は分析グレードとした。
【００７１】
ブドウ糖、グリセロールおよび酢酸の濃度を測定するために、以下の酵素アッセイキットを使用し、製造元（Sigma Diagnostics, Boehringer Mannheim）の指示書に従って用いた。
【００７２】
ブドウ糖キット           Sigma Diagnostics  ブドウ糖（方法315）
グリセロールUVアッセイ  Boehringer Mannheim  グリセロール（技術No. 148270）
酢酸UVアッセイ          Boehringer Mannheim  酢酸（技術No. 148 261）
ブドウ糖UVアッセイ      Boehringer Mannheim  乳糖／D-ブドウ糖（技術No. 986 119)
３．生物学的材料
a) 細菌
次の細菌株を、本発明による実験に使用した。
大腸菌JM101 F、[traD26 proAB+lacllq,Δ(lacZ)M15] pro AB/supE, thi-1, Δ(lac-proAB)（Sambrook, Fritschら. 1989）
b) プラスミド
次のプラスミドを、本発明による実験に使用した（図1）：pSPZ3 alkS、AlkBp、xylMA、ori pMB1; Kmr（Panke 1999）。
【００７３】
４．培地および溶液
a) 微量元素溶液US＊（Panke, 1999）
リットル当たり：
1M塩酸
1.5g       MnCl2*4H20
1.05g       ZnSO4
0.3g       H3BO3
0.25g       Na2MoO4*2H2O
0.15g       CuCl2*2H2O
0.84g       Na2EDTA*2H2O
4.12g       CaCl2*H2O
4.87g       FeSO4*7H2O
（Riesenberg培地を使用する場合：8.87g FeSO4*7H2O）。
【００７４】
b) LB培地（Luria Bertani培地）
リットル当たり：
10gトリプトン
5g酵母抽出物
5g NaCl
【００７５】
c) M9*培地
リットル当たり：
25.5g        Na2HPO4*2H2O
9g KH2PO4
1g NH4Cl
1g NaCl
pHは、NaOHで7.4とした。
補充したもの：
0.5%（w/v） ブドウ糖
2ml MgSO4（1M）
1ml チアミン（1% w/v）
1ml カナマイシン（50mg/ml）
1ml 微量元素溶液US*
【００７６】
d) M9培地
リットル当たり：
8.82g       KH2PO4
10.85g      K2HPO4
8.82g       Na2HPO4
11.06g      Na2HPO4*2H2O
1g          NH4Cl
0.5g        NaCl
pHは、NaOHで7.1とした。
【００７７】
補充したもの：
0.5%（v/v）ブドウ糖
2ml MgSO4（1M）
1mlチアミン（1% w/v）
1mlカナマイシン（50mg/ml）
1ml微量元素溶液
【００７８】
e) Riesenberg培地
リットル当たり：
13.3g       KH2PO4
4.0g       (NH4)2HPO4
1.7gクエン酸
pHは、NH4OHで6.8に、そしてNaOHで7.1とした。
補充したもの：
0.7〜2.5%（v/v）ブドウ糖または0.7%（v/v）グリセロール
5ml MgSO4（1M）
1mlカナマイシン（50mg/ml）
1ml チアミン（1% w/v）
5ml〜10ml微量元素溶液
【００７９】
培地、ならびに硫酸マグネシウムおよびブドウ糖のストック溶液はオートクレーブ処理した。カナマイシンおよびチアミンのストック溶液は濾過滅菌した。
【００８０】
f) M9培地のための供給溶液1
リットル当たり：
45%（w/v）ブドウ糖
9g     MgSO4*7H2O
（50g 酵母抽出物）
pHはHClで3にした。全ての実験において、酵母抽出物は使用しなかった。
【００８１】
g) Riesenberg培地のための供給溶液II
リットル当たり：
73%（w/v）ブドウ糖
19.6g       MgSO4*7H2O
この供給溶液は濾過滅菌した。
【００８２】
h) プソイドクメンの変換のための有機相
フタル酸ジオクチルのリットル当たり：
20〜40mlプソイドクメン
10mlオクタン
i) 溶液１
100ml当たり
333μl        3M NaAc、pH 5.8
2ml          2.5M MnCl2
100μl        5M NaCl
k) 溶液２
50ml当たり
167μl         3M NaAc、pH 5.8
8.3ml         30%（w/v）グリセロール
3.5ml         1M CaCl2
200μl         2.5M MnCl2
【００８３】
5. 分子生物学的方法
5.1 コンピテント細胞
50mlのLB培地を含む振盪フラスコに500μlの前培養物を接種し、一夜インキュベートした。OD450が0.4に達したら、培養液をSS34チューブ（40M）に分配し、8000rpmで4℃にて8分間遠心分離した。上清を捨てた。細胞を、8mlの上記の溶液１に再懸濁し、氷上で20分間インキュベートした。次に、細胞を、溶液１から、8000rpmで8分間遠心分離することにより分離した。続いて、それらを、800μlの上記の溶液２に氷上で再懸濁し、エッペンドルフチューブに100μlのアリコートづつ分けた。それらを−80℃で保存した。
【００８４】
5.2 プラスミドの単離
プラスミドは、E.Z.N.A.（登録商標）Plasmid Miniprep Kit I（peQLab Biotechnologie GmbH）を用いて単離した。1%（w/v）のブドウ糖および20μlのカナマイシン（50mg/ml）を含有する20mlのLB培地に、形質転換した大腸菌JM101のコロニーを接種し、37℃で一夜インキュベートした。インキュベートした後、培養液を4本の15ml容試験管に分け、遠心分離した。次の処理工程を、Miniprep Kit Iのプロトコールに指示されているようにして行った。得られたプラスミドの量は、ゲル電気泳動により見積もった。
【００８５】
5.3 細胞の形質転換
大腸菌JM101を、プラスミドpSPZ3で熱ショックにより形質転換した。100μlの凍結したコンピテント細胞を、氷上で20分間にわたり解凍した。3μlのプラスミドを添加した後、細胞を氷上で10〜20分間インキュベートした。次に、それらを37℃での熱ショックに3分間にわたり供し、その時間が経過した後、直ちに5〜10分間氷に戻した。1mlのLB培地を添加した後、細胞を37℃で1時間インキュベートした。最後に、細胞を、20μlのカナマイシン（50mg/ml）を含有するLB寒天プレートにプレーティングし、37℃で一夜インキュベートした。
【００８６】
6. 実験室規模の生体内変換
生体内変換に用いた撹拌型反応器は、3リットルの容積である。温度、pHおよび撹拌速度は、自動的に調整可能とした。培地中の溶存酸素（DOT）は、酸素電極により測定し、経時的にプロットした。
【００８７】
6.1 前培養物
前培養物１：1%（w/v）のブドウ糖および4μlのカナマイシン（50mg/ml）を含有する4mlのLB培地に、新しく形質転換した大腸菌JM101（pSPZ3）のコロニーを接種し、振盪しながら30℃で一夜インキュベートした。
【００８８】
前培養物２：前培養物１を、0.5%（w/v）のブドウ糖もしくはグリセロール、200μlの硫酸マグネシウム（1M）、100μlの微量元素溶液US*、100μlのチアミン（1% w/v）および100μlのカナマイシン（50mg/ml）を含有する100mlのM9*培地に添加し、混合物を振盪しながら30℃で10〜12時間インキュベートした。
【００８９】
6.2 回分
バイオリアクターと共に滅菌され、チアミン、微量元素、ブドウ糖もしくはグリセロール、硫酸マグネシウム、そして（指示されている場合は）抗生物質が補充されている900mlの培地（M9またはRiesenberg培地）に、100mlの前培養物を接種した。撹拌速度は1500rpmとした。また、温度は30℃に調整し、pHは25% NH4OHおよび25%リン酸の添加により7.1に調整した。通気速度は1リットル/分とした。
【００９０】
6.3 流加
添加したブドウ糖が消費され、細菌の代謝により生じた酢酸が利用された後（約9〜12時間）、ブドウ糖/-もしくはグリセロール/硫酸マグネシウム溶液（幾つかの場合には酵母抽出物が添加されている）を培地に添加した。ブドウ糖の供給速度は、それぞれの実験において、4.5g/時〜11.25g/時の間で変えた。また、4mlのチアミンストック溶液および4mlの微量元素溶液US*も添加した。
【００９１】
6.4 生体内変換
流加培養開始の1時間後、有機相（誘導原としての10mlのn-オクタンおよび20〜40mlのプソイドクメンを含有）を添加した。それと同時に、撹拌速度を2000rpmまで上げた。細菌の酸素制限が観察されたら（DOT＜10%）、空気の供給を1.7リットル/分まで上げた。必要に応じて、撹拌速度を2500rpmまで上昇させた。生体内変換は約15〜30時間行った。流加培養を開始した後、サンプルを一定時間毎に採取し、分析した。
【００９２】
7. パイロット規模の生体内変換
生体内変換をパイロット規模で行うために、上記の42リットル容の撹拌型反応器を用いた。反応器内の撹拌速度、温度、pHおよび圧力は、自動的に制御した。反応器は、OS/9オペレーションシステムにより、プログラムCaroline II（PCS, Wetzikon, Switzerland）を用いて自動的に制御した。
【００９３】
7.1 前培養物
前培養物１：1%（w/v）のブドウ糖および4μlのカナマイシン（50mg/ml）を含有する4mlのLB培地に、新しく形質転換した大腸菌JM101（pSPZ3）のコロニーを接種し、振盪しながら30℃で一夜インキュベートした。
【００９４】
前培養物２：前培養物１を、100mlで振盪しながら、30℃にて10〜12時間インキュベートした。
【００９５】
前培養物３：前培養物２を、0.5%（w/v）のブドウ糖もしくはグリセロール、200μlの硫酸マグネシウム（1M）、100μlの微量元素溶液US*、100μlのチアミン（1% w/v）および100μlのカナマイシン（50mg/ml）を含有する2リットルのM9*培地に添加した。
【００９６】
7.2 回分
14リットルのRiesenberg培地を反応器内で滅菌した。滅菌後、培地に、微量元素、硫酸マグネシウム、チアミンおよび0.7%（w/v）のブドウ糖を補充した。カナマイシンの添加は行わなかった。撹拌型反応器に、1〜1.5リットルの前培養物を接種した。撹拌速度は400〜600rpmとした。通気速度は20リットル/分とした。
【００９７】
7.3 流加培養
添加したブドウ糖および細菌により生成した酢酸が消費された後、供給溶液IIを供給した。供給速度は、開始時は180g/時としたが、ブドウ糖が制限されたら上げた。更に、60mlのチアミン（1% w/v）、60mlの微量元素溶液US*および15mlのn-オクタン（細胞を誘導するため）を添加した。
【００９８】
7.4 生体内変換
1時間後、4.3%（v/v）のプソイドクメンおよび1%（v/v）のn-オクタンを含有する15リットルのフタル酸ジオクチルを有機相として添加した。撹拌速度を1000rpmまで上げた。同様に、通気速度を40リットル/分まで上げた。サンプルを一定時間毎に採取し、基質、生成物、副生成物およびオクタンの含有量について分析した。同様に、細胞乾燥重量、ブドウ糖濃度および酢酸濃度を測定した。図7に、このプロセスの経過を図の形態で示す。
【００９９】
8. 二相系における分配係数の測定
分配係数は、水相中の物質の濃度に対する有機相中の物質の濃度として定義される。グリセロールおよびフタル酸ジオクチルを含有するRiesenberg培地の分配係数を求めるために、各種濃度のプソイドクメン、3,4-ジメチルベンジルアルコール、3,4-ジメチルベンズアルデヒドおよび3,4-ジメチル安息香酸を、フタル酸ジオクチルとRiesenberg培地との１：１混合物に添加した。分配平衡は、強い撹拌および一夜のインキュベーションにより確立した。
【０１００】
水相および有機相は、遠心分離により分離させた。有機相をエーテルで希釈し、水相を抽出し、GCにより分析した。2つの相における濃度は測定値に基づいて求め、分配係数を算出した。それぞれの場合、測定は三連で行った。
【０１０１】
9. サンプルの分析
9.1 GC分析
水相と有機相は、20℃での遠心分離により分離させた。次に、0.1mMのドデカンを含有する氷冷エーテルを、内部標準としてサンプルに添加した。飽和濃度の塩化ナトリウムを添加した後、1分間激しく振盪させることにより水相を抽出し、続いて遠心分離により相を分離させた。有機相を硫酸ナトリウムの添加により乾燥し、分析した。基質、生成物、副生成物、およびオクタンの含有量をGC（Nagel, Oensingen, Switzerland）により測定した。サンプルは、分解切断（splitting）を行わずに注入した。水素をキャリアーガスとして使用した。次の温度プログラムを測定に用いた：40℃で2分；15℃/分の加熱速度で40〜70℃；5℃/分の加熱速度で70〜105℃、そして20℃/分の加熱速度で105℃〜280℃；280℃で5分。化合物は、水素炎イオン化検出器を用いて測定した。基質、生成物および副生成物のデータは図で表わした。同様に、比活性（specific activity）およびアルデヒド形成速度を図に表わした。この目的のために、次の計算を行った。
【０１０２】
比活性＝ユニット／g細胞乾燥重量
1ユニットは、1分間に1μmolの全生成物（DBAlk、DBAld、DBAcid）により生じる活性である。
【０１０３】
アルデヒド形成速度＝１分当たりに形成されるアルデヒド1μmol／g細胞乾燥重量
9.2 最適密度の測定
細胞を、4℃での遠心分離により分離した。水相の容量を試験管に記録し、続いて上清を吸引し、捨てた。細胞ペレットを、水相と同容量の培地に取り出し、そこに再懸濁した。最適密度は、分光光度計を用いて450nmにて測定した。
【０１０４】
9.3 ブドウ糖、グリセロールおよび酢酸の濃度の測定
a) 水相中のブドウ糖、グリセロールおよび酢酸の濃度は、上記の酵素アッセイキットを用いて測定した。
【０１０５】
b) GCによる酢酸濃度の測定
50μlの水相を、350μlの水、50μlのH3PO4（85%）および50μlの100mM 酪酸ナトリウム（内部標準）で処理した。後者（つまり酪酸ナトリウム）を、HP5890シリーズ2GCを用いて分析した。用いた温度プログラムは次のとおりであった：85℃で0.5分、12℃/分の加熱速度で85〜100℃、79℃/分の加熱速度で110〜200℃、200℃で2.5分。ヘリウムをキャリアガスとして使用した。
【０１０６】
9.4 プラスミドの安定性の測定
サンプルを遠心分離し、水相と有機相の中間の相を、試験管に印を付けた。上清を捨て、細胞ペレットを、水相と同容量の培地に再懸濁した。サンプルを希釈し、希釈物をLB寒天プレート、20μlのカナマイシン（50mg/ml）を含有するLB寒天プレート、および20μlのカナマイシン（50mg/ml）および20μlのインドールを含有するLB寒天プレートにプレーティングした。細胞がXMO遺伝子を発現した場合、LBインドール寒天プレートのコロニーは青色に変化する。これは、XMO遺伝子がインドールからインジゴへの酸化を触媒する、という事実により説明できる。プレートを30℃で一夜インキュベートし、次に数をカウントした。生きている微生物の数を比較した。
【０１０７】
10. 後処理（下流処理）
10.1 遠心分離
反応器の内容物を回収した後、Heraeus遠心機を用いて有機相および水相を5000rpm、4℃にて15分間にわたり分離した。水相は捨て、有機相は硫酸ナトリウム（1kg/有機相15リットル）で乾燥し、5℃で保存した。硫酸ナトリウムは、蒸留工程の前に（濾紙を用いて）除去した。
【０１０８】
10.2 蒸留
フラスコ中の有機相を、0.08mbar〜0.15mbarの中真空下で200℃に加熱した。蒸留物を3つの画分、すなわち、最初の流出物（110℃〜125℃）、主要な画分（120℃〜170℃）、および最後の流出物（170℃〜200℃）に分けた。真空および温度は自動的に制御した。
【０１０９】
I. 実験室規模のプソイドクメンの生体内変換実験
実験室規模の生体内変換（実施例1、2および3）は、第一には、プロセス関連パラメーターを測定して最適化するためであり、第二には、培地を最適化するためである。目的は、生体内変換の間に生産される3,4-ジメチルベンズアルデヒド（DBAld）の量を増大させることである。
【０１１０】
更に、酢酸の形成（細胞により代謝産物として産生され、は培地に放出される）を、生体内変換において調べた。この代謝産物が必要以上に高濃度で存在すると、バイオマスの増殖を阻害する。新規な培地（Riesenberg培地）を使用するのは、より高い細胞密度を達成して、容積当たりのより高い酵素活性を達成するためである。供給溶液のバリエーションもまた、培地を最適化するための手段と見なされる。供給溶液に酵母抽出物を補充せずに生体内変換を行った。これは、後者（酵母抽出物）が、とりわけ不確定な構成成分を含んでいて、それが生体内変換の再現性を困難にするからである。2種の炭素原であるブドウ糖およびグリセロールの、酵素活性および酢酸生成に及ぼす影響についても調べた。
【０１１１】
さらに、選択圧をかけない場合のプラスミドおよびXMO遺伝子の安定性も調べた。したがって、カナマイシンを使用しない生体内変換を行った。
【０１１２】
二相系流加法は、DBAldの生産について試験した。ここで、流加は、回分の後で開始し、続いて基質および誘導原を含有する有機相を添加した。図に、流加培養のスタート時から得られた結果を示す。基質、生成物、副生成物およびオクタンの濃度を示す図では、水相と有機相中の物質の濃度を合算した。比活性は、１分間に、細胞乾燥重量１g当たりに形成される全生成物（DBAlk、DBAldおよびDBAcid）の1μmolとして定義する。アルデヒド形成速度は、１分間に、細胞乾燥重量１g当たりに形成される3,4-ジメチルベンズアルデヒド1μmolに該当する。
【０１１３】
実施例1：M9培地を用いた生体内変換
実験1.1：酵母抽出物を含有する供給溶液Iを用いた発酵
生体内変換は、上記の発酵プロセスを用いて行った。接種の前に、培地に、0.5%（w/v）のブドウ糖を補充した。回分の後、バイオマスの細胞乾燥重量は3.1g/リットルに達した。供給速度は、流加培養の開始時では10g/時とし、これはブドウ糖の供給速度4.5g/時に相当するものであった。必要以上に厳しいブドウ糖制限を防止するために、供給速度を段階的に上げた。3時間後、通気速度を1リットル/分から1.7リットル/分へと上げて、酸素制限を防止した。
【０１１４】
図2に、酢酸およびブドウ糖の濃度、ならびに細胞乾燥重量のデータを示す。定常期に達した後、細胞乾燥重量は19g/リットルであった。8時間後に細菌の増殖を停止させたところ、酢酸濃度は10g/リットルであり、ブドウ糖濃度は9g/リットルであった。
【０１１５】
図3に、プソイドクメン、3,4-ジメチルベンズアルデヒド（DBAlk）、3,4ジメチルベンジルアルコール（DBAlk）、3,4-ジメチル安息香酸（DBAcid）およびオクタンの濃度の変化を示す。有機相を添加した時、プソイドクメンの濃度は1.6%（v/v）であった。1.5時間の誘導期の後、主に3,4-ジメチルベンズアルデヒドが生成した。基質濃度が90mMに達すると、DBAcidの形成が始まった。10時間後、酸の濃度は22mMに達し、生体内変換の残り期間にわたりずっと一定であった。10時間後にはDBAlkだけが生産された。30時間後の生体内変換の終点では、DBAldの濃度は43mMであり、DBAlkの濃度は20mMであった。
【０１１６】
4時間後、比活性およびアルデヒド形成速度は、それぞれ最大値12.6U/g CDWおよび9.8U/g CDWに達した。その後、比活性は低下し続けた。しかし、アルデヒド形成速度は、流加培養開始の5.5時間後（3,4-ジメチル安息香酸の形成が開始した時点に該当）に急速に低下しただけであった。8時間後、アルデヒド形成速度は再び上昇し始めた。
【０１１７】
得られた結果について、3,4-ジメチル安息香酸の形成がプソイドクメン濃度90mMにおいて始まることが確認できる。
【０１１８】
実験1.2：酵母抽出物を含有しない供給溶液Iを用いた発酵
この発酵の目的は、酵母抽出物を含有しない供給溶液Iの、生体内変換に及ぼす影響を調べることである。
【０１１９】
図4aに、ブドウ糖および酢酸の濃度ならびに細胞乾燥重量の経時変化を示す。接種前は、培地中のブドウ糖の濃度は0.5%（w/v）であった。流加培養の開始時点では、細胞乾燥重量濃度は3g/リットルであった。酵母抽出物を含有しない供給溶液は、10g/時の一定速度で供給した。これは、ブドウ糖の供給速度4.5g/時に相当する。7時間後、撹拌速度を2000rpmから2500rpmへ上げて、酸素制限を防止した（DOT＞10%）。
【０１２０】
ブドウ糖濃度が低くても、酢酸の形成が起こった。したがって、酢酸濃度は、ブドウ糖制限により1g/リットルの値で一定に保たれた。培地中のブドウ糖濃度を増大させると、酢酸濃度は26.6g/リットルまで上昇し続けた。生体内変換の終点において、バイオマス濃度は12g/リットルであった。
【０１２１】
有機相中の基質濃度は、1.6%(v/v)であった（図4b）。有機相添加の2時間後、3,4-ジメチルベンズアルデヒドの形成が始まった。しかし、基質濃度90mMから、DBAcidが主に生産され、3,4-ジメチルベンズアルデヒドの濃度は一定のままであった。DBAldの形成は、10時間経過後に再び始まり、41mMの濃度に達した。生体内変換の第2部において酵素活性が低い場合（15時間以後）、DBAlkが生成した。
【０１２２】
流加培養開始の3時間後、比活性は最大値10U/g CDWに達したが、その後は低下した。わずかに上昇した後、比活性は、流加培養開始の9時間後まで低下し続けた。アルデヒド形成速度もまた、3時間後に最大値7.1U/g CDWに達した。上記で記載した実験の場合と同様に、3,4-ジメチル安息香酸形成が始まった時点で、アルデヒド形成速度の低下が見られた。
【０１２３】
この発酵から、酵母抽出物を含有させないことが、バイオマスの増殖および酵素活性に重要な影響を及ぼすことが示される。したがって、この流加培養の間に、先の予備実験の場合よりも低い濃度の細胞乾燥物質がもたらされた。同様に、より低い比活性およびアルデヒド形成速度が見られた。上記の実験と比較して、比活性がゆっくり低下することが見られた。同様に、培地中の酢酸濃度は、上記の実験の場合よりも低かった。
【０１２４】
実験1.3：基質濃度を増大させた場合の発酵
先に実験では、基質濃度を増大させることが、3,4-ジメチルベンズアルデヒドの形成に正の影響を及ぼすことが判った。したがって、基質濃度を1.6%(v/v)から3.1%(v/v)へと増大させた。更に、培地中のブドウ糖濃度、したがって酢酸濃度も低く保つことを試みた。生体内変換の第2部において、流加培養開始の15時間後に、厳しいブドウ糖および酸素の制限が同時に起こることの影響を調べた。つまり、供給量および通気を同時に低下させた。
【０１２５】
接種前に、0.5%（w/v）のブドウ糖を培地に添加した。細胞乾燥重量3g/リットルからスタートして、流加培養の間にバイオマスを27g/リットルの濃度にまで増大させた。流加培養の開始時には、酵母抽出物を含有する供給溶液を10g/時（ブドウ糖供給速度は4.5g/時）で供給した。その後、供給速度を段階的に上げたが、培地中で酢酸濃度が高くならないようにブドウ糖制限は維持した。培地中の酢酸濃度を長期にわたって低く保つことは可能であった。これによっても、酢酸の利用が起こった（図5）。酸素制限を防止するために、通気速度を1リットル/分から1.5リットル/分へと上げ、撹拌速度を2000rpmから2500rpmへと上げた。16時間後、供給速度および通気速度を同時に下げたところ、厳しいブドウ糖および酸素の制限と酢酸濃度の上昇が起こった。
【０１２６】
生体内変換は、3.1%（v/v）の基質濃度からスタートした。細胞を誘導した1時間後、3,4-ジメチルベンズアルデヒド（BDAld）および3,4-ジメチルベンジルアルコール（DBAlk）の形成が始まった。流加培養開始の16時間後、そして供給速度および通気速度を下げた後、非特異的な大腸菌のアルコールデヒドロゲナーゼによるDBAldからDBAlkへの逆変換（backconversion）が見られた（図6）。30時間後、DBAlk濃度は130mMになったが、DBAld濃度はわずか30mMであった。この生体内変換の間に、少量の3,4-ジメチル安息香酸の生産が見られた。
【０１２７】
流加培養開始の8時間後に比活性が18.6U/g CDWの最大値に達した後、比活性は低下した。これは、第一には、この時点で細胞の増殖が停止したことが原因であり、第二には、基質濃度が低下したことが原因であると思われる。アルデヒド形成速度は、16U/g CDWの最大値に達した。酵母抽出物を含有する供給溶液Iを用いた発酵や、供給溶液Iに酵母抽出物を補充しなかった発酵とは異なり、5時間後に活性の低下は見られなかった。
【０１２８】
実施した発酵から、基質濃度が高いほど、酵素活性が高くなることが実証された。生体内変換の間に酢酸の形成を低く保つことが可能であったので、流加培養の間により高い細胞密度が達成された。得られた結果から、ブドウ糖と酸素の制限が同時に起こることにより、キシレンモノオキシゲナーゼ活性が失われる、と言うことができる。非特異的な大腸菌のアルコールデヒドロゲナーゼは、3,4-ジメチルベンズアルデヒドを3,4-ジメチルベンジルアルコールへと逆に変換した。
【０１２９】
実施例2：Riesenberg培地を用いた生体内変換
より高い細胞密度を得るために、すなわち容積当たりより高い活性を得るために、文献において高細胞密度培地と命名されている新規な培地を用いた（Riesenberg 1991）。従来用いられてきたM9培地とは違って、このRiesenberg培地は少量のリン酸塩を含有する。更に、この培地は、pHを調整するためにアンモニア水が使用されているので、より多くの窒素を含有している。Riesenberg培地と共に使用される供給溶液IIは、供給溶液Iとは異なって、酵母抽出物を含有していない。
【０１３０】
実験2.1：Riesenberg培地を用いた大腸菌JM101（PSZP3）の増殖曲線
Riesenberg培地を用いた場合の大腸菌JM101（pSZP3）の増殖挙動および代謝産物である酢酸の形成を調べるために、まず、増殖曲線を記録した。プラスミドおよびXMO遺伝子の安定性は、インドール寒天プレートおよびカナマイシン寒天プレートを用いてチェックした。こうして、プラスミドが後の世代へと継代されて発現されるか否かを調べることができた。
【０１３１】
回分培地は、2.5%（w/v）のブドウ糖を含有するものとした。生成した酢酸の分解を伴い、回分培養を15時間行った（図7）。接種後、細胞乾燥重量は0.18g/リットルであり、0.4h-1の増殖速度で15g/リットルまで増大した。この回分培養の間に、1g/リットルの酢酸が生成した。
【０１３２】
Riesenberg培地を使用した場合の細胞の増殖挙動は、M9培地を使用した場合とほぼ同様であった。この回分培養の間に、少量の酢酸の生成が見られた。また、酢酸が細菌によって再利用される期間は比較的短かった。
【０１３３】
LB寒天プレート、カナマイシンを含有するLB寒天プレート、およびインドールとカナマイシンとを含有するLB寒天プレートにおけるコロニーの数から、プラスミドおよびXMO遺伝子はずっと安定であったと言うことができる。したがって、各種のLB寒天プレートで増殖したコロニーの間に有意な差は見られなかった。同様に、インドールを含有するLB寒天プレートでの色素反応は陽性であった。
【０１３４】
実験2.2：流加培養開始時の高細胞密度の発酵
増殖曲線を記録した後、生体内変換においてRiesenberg培地を用いた。これは、特にバイオマスの増殖、そしてこの文脈では酢酸の形成にも重点をおいて行った。
【０１３５】
発酵の目的は、流加培養を高い初期細胞密度でスタートすることにより、生体内変換の終点においてより高いバイオマス濃度を達成することであった。これにより、生体内変換の間の容積当たりの活性が増大すると考えられる。
【０１３６】
回分後に比較的高い細胞密度を達成するために、培地には、0.5%（w/v）ではなく2.5%（w/v）のブドウ糖を補充した。流加培養の開始時に、細胞乾燥重量は16g/リットルであった（図8）。流加培養の間、バイオマスは大きく増大し続けることはなく、24.7g/リットルの最大濃度に達した。
【０１３７】
流加培養の間、バイオリアクターには、供給溶液IIを12.5g/時で供給し続けた。これは、ブドウ糖の供給速度9g/時に相当する。わずか2時間後に細胞は酸素制限を受け、撹拌速度および通気速度は既に最大に設定されていたので、反応器に、空気の代わりに酸素を通気させた。そうすることにより、培地中の溶存酸素（DOT）が10%の値を上回るように保つことができた。5時間目以降、細胞はもうブドウ糖制限を受けなかった。流加培養開始の5時間後から15時間までの間、ブドウ糖濃度は2g/リットルで一定であったが、その後、25g/リットルまで増大した。培地中のブドウ糖濃度は比較的高かったので、培地中の酢酸濃度は上昇し続け、流加培養の終点では30g/リットルの値に達した。
【０１３８】
流加培養の開始時に、培地に、基質濃度が3.4%（v/v）である有機相を1リットル補充した。
【０１３９】
図9には、3,4-ジメチルベンジルアルコールの形成が直ちに始まったことが示されている。3,4-ジメチルベンズアルデヒドの形成は2時間後に始まった。流加培養開始の11時間後には、更に1%（v/v）のプソイドクメンを添加した。しかし、ここでは、この基質のほんの一部だけが変換されただけであった。3,4-ジメチルベンズアルデヒドの最終濃度は113mMであった。生体内変換を停止させた時、プソイドクメンおよび3,4-ジメチルベンジルアルコールの濃度は65mMであった。実質的に、3,4-ジメチル安息香酸は生成しなかった。
【０１４０】
流加培養開始の3時間後、細胞を十分に誘導した。比活性（最大値13U/g CDW）およびアルデヒド形成速度（最大値10U/g CDW）は低かった。細胞の増殖期間の終点の4時間後、比活性は急激に低下した。基質を添加した後では、6U/g CDWまでの増大が見られた。アルデヒド形成速度もまた、増殖期間の終点の4時間後に急速に低下し、ずっと低いままであった。
【０１４１】
流加培養をより高い初期細胞密度で開始しても、選択した条件下で、流加培養の間ずっと、より高い細胞密度がもたらされるわけではない。バイオマスは、たった3時間だけ増大したにすぎなかった。また、酵素活性の喪失も見られた。この流加培養の間に、大量の酢酸が生成した。
【０１４２】
実験2.3：流加培養の開始時に通常の細胞密度とした場合の発酵
上記の発酵では、流加培養の開始時に高い細胞密度としたにもかかわらず、より高い細胞密度を達成することは不可能であった。むしろ、高い初期細胞密度は、生体内変換に負の影響を及ぼした。したがって、比活性は低かった。また、観察されたアルデヒド形成時間は短かった。この理由から、流加培養を低い細胞密度でスタートした。
【０１４３】
2.5%（w/v）のブドウ糖の代わりに、わずか0.7%（w/v）のブドウ糖を添加した。4.1g/リットルのバイオマス濃度からスタートして、流加培養の終点での細胞乾燥重量は22g/リットルであった。ブドウ糖は、9g/時の一定速度でバイオリアクターに供給した。9時間後、酢酸濃度は約7g/リットルになった。この時点で、細菌は定常期に入っていた（図10）。
【０１４４】
流加培養のちょうど開始時に、0.1%（v/v）のオクタンを培地に添加した。1時間後、4%（v/v）のプソイドクメンおよび1%（v/v）のn-オクタンを含有する有機相を添加した。流加培養開始の2時間後、細胞を十分に誘導したところ、3,4-ジメチルベンジルアルコールおよび3,4-ジメチルベンズアルデヒドが有機相中に蓄積し始めた。初期はアルコールがアルデヒドよりも速く蓄積したが、3,4-ジメチルベンズアルデヒドは150Mmの基質濃度から生成した。低いプソイドクメン濃度では、3,4-ジメチルベンジルアルコールは3,4-ジメチルベンズアルデヒドへと変換された。生体内変換の終点における3,4-ジメチルベンズアルデヒドの最終濃度は200mMになった。3,4-ジメチル安息香酸の形成は、低いプソイドクメン濃度および3,4-ジメチルベンジルアルコール濃度において始まった（図11）。
【０１４５】
流加培養開始の3時間後、比活性は26U/g CDWになった。その後、それは基質濃度と平行して低下した。5時間後、アルデヒド形成速度は最大値14U/g CDWに達した。その後、それは低下し続けた。
【０１４６】
基質濃度および初期細胞密度は、3,4-ジメチルベンズアルデヒドへの完全な変換が達成されるように最適に選択した。初期細胞密度が低いほど、長期にわたるアルデヒド形成速度が得られた。
【０１４７】
供給溶液に酵母抽出物を含有しないRiesenberg培地により、供給培地に酵母抽出物だけを含有するM9培地を使用した場合と同様の比活性およびアルデヒド形成速度を達成できる。
【０１４８】
実験2.4：炭素源としてグリセロールを使用する発酵
グリセロールを炭素源として使用することは、炭素源としてブドウ糖を使用することと比較して幾つかの利点を有しうる。すなわち、より少量の酢酸の形成およびより高い酵素活性が期待できる。この理由から、生体内変換に対する炭素源としてのグリセロールの影響を調べた。
【０１４９】
接種前に、0.7%（v/v）のグリセロールを培地に添加した。回分培養の終点において、バイオマスの濃度は4.2g/リットルであった。予想通り、ブドウ糖を炭素源として使用した場合よりもゆっくりしたバイオマスの増殖が見られた。定常期に達した後、細胞乾燥重量は19g/リットルであった。流加培養のちょうど開示時に、0.1%（v/v）のオクタンを培地に添加した。初期供給速度7.7g/時（グリセロール供給速度は7.2g/時）の後、供給速度を段階的に上げて、グリセロール制限を防止した。酢酸の形成は、9.5時間後の定常期の間にだけ始まり、流加培養の終点では18g/リットルの値に達した（図12）。
【０１５０】
有機相を添加した時点での基質濃度は4%（v/v）であった。3,4-ジメチルベンジルアルコールは開始直後から生成された。240mMのプソイドクメン濃度からは、3,4-ジメチルベンズアルデヒドだけが生成した。3,4-ジメチルベンジルアルコールはアルデヒドに直接変換された。酸の形成は約150mMの基質濃度で始まった。図13から判るように、3,4-ジメチルベンズアルデヒドの最終濃度は144mMであった。
【０１５１】
3,4-ジメチルベンズアルデヒドの最大形成速度は高いものであった（32.7U/g CDW）。全体的な比活性は33U/g CDWの値に達した。しかし、この高い活性は長くは維持されなかった。わずか11時間後には、比アルデヒド形成速度は2.5U/g CDWにすぎなかった。
【０１５２】
これらの結果から、グリセロールを炭素源として使用した場合には、30U/g CDWからのより高い酵素活性が達成された。しかし、この活性はバイオマス増殖の間だけ維持されていた。
【０１５３】
より高い酵素活性に加えて、ブドウ糖を炭素源として使用した場合と比較した場合に、別の速度論が見られた。つまり、240mMという高いプソイドクメン濃度において培地中に3,4-ジメチルベンズアルデヒドだけが蓄積するのに対して、ブドウ糖を炭素源として使用した場合は150mMである。3,4-ジメチル安息香酸の形成も、150mMという高い濃度でスタートするが、ブドウ糖を炭素源として使用した場合には90mMでしかなかった。
【０１５４】
実験2.5：炭素源としてグリセロールを用い、より高い基質濃度を用いた発酵
実験2.4に記載した発酵では、培養液における3,4-ジメチルベンジルアルコールの蓄積は、240mMという高いプソイドクメン濃度において停止したことが判った。したがって、生体内変換をより高いプソイドクメン濃度でスタートし、3,4-ジメチルベンズアルデヒド(DBAld)のより高い最終濃度を達成できると思われる。
【０１５５】
回分培養の開始時のグリセロール濃度は0.7%（v/v）であった。開始時、細胞乾燥重量は4.4g/リットルであり、流加培養の終点では25g/リットルに達した（図14）。流加培養の開始時は、グリセロールを3.7g/時の速度で供給した。その後、その速度を段階的に上げていった。10時間の時点まで、酢酸は全く生成しなかった。しかし、この物質は、実験の終点までに、培地中に最大26.7g/リットルの濃度で蓄積した。
【０１５６】
プソイドクメン濃度（有機相中）は5.3%（v/v）とした。開始時に、3,4-ジメチルベンジルアルコール（DBAlk）と3,4-ジメチルベンズアルデヒド（DBAld）の同時形成が見られた。300mM〜150mMのプソイドクメン濃度から、主にDBAldが生成して蓄積した。3,4-ジメチル安息香酸（DBAcid）の形成は、プソイドクメン濃度150mMにおいて始まった。DBAlkの最終濃度は80mMであり、DBAldの最終濃度は212mMであった（図15）。
【０１５７】
グリセロールを用いた最初の発酵と同様に、酵素活性は高いものであった。得られた比活性（１分当たりに生成する全生成物（DBAlk、DBAldおよびDBAcid）1μmol／g CDW）は46U/g CDWの値に達した。5時間後、3,4-ジメチルベンズアルデヒドの比形成速度は22U/g CDWであった。この発酵でも、活性はバイオマス増殖の間だけ維持された。
【０１５８】
基質濃度を上げることは、3,4-ジメチルベンズアルデヒドの最終濃度に何の影響も及ぼさない。何故ならば、長期間にわたって活性を維持することが不可能だからである。3,4-ジメチルベンジルアルコールの濃度は、流加培養の終点で高かった。
【０１５９】
実施例3：繰り返し流加培養
カナマイシンの不在下での細胞の活性を長期間にわたってモニターするために、引き続き2回の流加実験を行った。10mlの1回目の流加培養物は2回目の流加培養の接種物となる。目的は、プラスミドおよびXMO遺伝子の安定性を選択圧をかけずに数世代にわたって調べることである。ブドウ糖を炭素源として用いた。供給の開始時に、4mlのチアミンストック溶液（1% w/v）および4mlの微量元素溶液US*を添加した。
【０１６０】
前培養物1：新たに形質転換した細胞を含む4mlのLB培地（1%ブドウ糖（w/v）、4μlカナマイシン（50mg/ml))を接種し、37℃で一夜インキュベートする。
【０１６１】
前培養物2：4mlの前培養物1を含む100mlのM9*培地（0.5%ブドウ糖（w/v）、200μl硫酸マグネシウム、100μl微量元素溶液US*、100μlチアミン（1% w/v）、100μlカナマイシン（50mg/ml）)を接種し、30℃で10〜12時間インキュベートする。
【０１６２】
バイオリアクター内の900mlの培地に、100mlの前培養物を接種する。回分培養後（9〜12時間）、供給溶液を連続的に添加することにより流加培養を開始する。1時間後、基質（P）および誘導原（オクタン）を含有する1リットルの有機相（DOP）をバイオリアクターに添加する。15時間後、培養液を10mlの容量（これは2回目の流加培養の接種物になる）を残して回収する。990mlの培地をバイオリアクターに添加する。再度、生体内変換を、1回目の流加培養について記載されているようにして正確に行う。
【０１６３】
実験3.1：流加培養、1日目
接種前のブドウ糖濃度は0.7%（w/v）であった。流加培養の開始時に、0.1%（v/v）のオクタンを培地に添加して、細胞を誘導した。流加培養の開始前、バイオマスは4.5g/リットルであった。流加培養の間に、それは28g/リットルまで増大した（図16）。流加培養開始時のブドウ糖の供給速度は9g/時とし、その後、段階的に上げていった。流加培養の終点における酢酸濃度は25g/リットルであった。
【０１６４】
生体内変換は、4%（v/v）の基質濃度でスタートした。プソイドクメン、3,4-ジメチルベンジルアルコール (DBAlk)、3,4-ジメチルベンズアルデヒド(DBAld)、3,4-ジメチル安息香酸（DBAcid）およびオクタンの濃度の経時変化を図17に示す。まず、3,4-ジメチルベンズアルデヒドおよび3,4-ジメチルベンジルアルコールの形成が見られた。流加培養開始の6.5時間後、150mMの基質濃度において、主にDBAldが生成した。酸の形成は12.5時間後に始まった。生体内変換の終点における3,4-ジメチルベンズアルデヒドの形成は220mMであり、DBAlk濃度は14mMであった。プソイドクメンは流加培養の間に利用されて、13mMの濃度まで低下した。
【０１６５】
流加培養開始の3時間後、比活性は27U/g CDWであった。5時間後、アルデヒドの形成速度は最大値16U/g CDWに達した。酵素活性は、15時間にわたって維持された。
【０１６６】
実験3.2：流加培養、2日目
接種前、ブドウ糖の濃度は0.7%（v/v）であった。回分培養の後、バイオマスは4.5g/リットルになり、流加培養の終点では28g/リットルの濃度に達した。開始時のブドウ糖の供給速度は9g/時としたが、ブドウ糖制限が過度に高い時にはこれを上げた。生体内変換の終点における酢酸濃度は44g/リットルであった（図18）。
【０１６７】
流加培養開始の1時間後、有機相（基質濃度は4%（v/v））を培地に添加した。プソイドクメン、DBAld、DBAlkおよびDBAcidの濃度の経時変化は、流加培養の1日目（実験3.1）とほぼ同様であった。プソイドクメン濃度が150mMを超えると、DBAldとDBAlkの同時形成が見られた。基質濃度が150mMの値より下がると終点濃度が220mMになるまで、主にDBAldが生成した。DBAcidの形成は12.5時間後に始まった。DBAlkの最終濃度は30mMになり、DBAcidの最終濃度は13mMになった（図19）。
【０１６８】
2回目の流加培養の間、比活性は、流加培養の1日目（実験3.1）の場合と同じ最大値（27U/g CDW）に達した。同様に、アルデヒド形成速度は、同じ最大値16U/g CDWに達した。酵素活性は15時間にわたって維持された。
【０１６９】
2回の生体内変換により、ほぼ同様または全く同一の結果が得られた。つまり、両方の流加培養において、高い比活性とアルデヒド形成速度が見られた。同様に、2回の生体内変換の終点で、同じ3,4-ジメチルベンズアルデヒド濃度が得られた。両者の流加培養において、酵素活性は15時間にわたって維持された。したがって、プラスミドは、選択圧がかかっていなくても、60時間、14世代にわたって維持された。
【０１７０】
カナマイシンを含むLB寒天プレートと含まないLB寒天プレートでは、有意なコロニー数の差は見られなかった。
【０１７１】
II．パイロット規模の生体内変換実験
実験室規模の実験が完了した後、生体内変換をパイロット規模で行った（実施例4、5）。この目的のために、42リットル容の撹拌型反応器を用いた。回分（バッチ）の容量（同じ部のRiesenberg培地と基質濃度が4.3%（v/v）の有機相とからなる）は30リットルとした。接種前に、0.7%（w/v）のブドウ糖を培地に添加した。既に行った繰り返し流加培養の場合と同様に、カナマイシンの添加は行わなかった。
【０１７２】
実施例4：pH6.6でのパイロット規模の発酵
流加培養の開始前、細胞乾燥重量は4g/リットルであった。しかし、最終濃度は14.5g/リットルでしかなかった。誘導の2時間後、pHは、pH調整のミスにより7.1ではなく6.6であった。この時点で、細胞増殖の停止が見られた。ブドウ糖の供給速度は135g/時（w/v）とした。生体内変換の間、細胞はブドウ糖制限を受けなかった。酢酸濃度は上昇し続けて、最終濃度は47g/リットルになった（図20）。
【０１７３】
15リットルの有機相の基質濃度は4.3%（v/v）であった。3,4-ジメチルベンジルアルコール（DBAlk）の形成は、細胞誘導の2時間後に始まった（図21）。3,4-ジメチルベンズアルデヒドの形成は、細胞誘導のわずか4時間後に始まった。26時間後、3,4-ジメチルベンズアルデヒドの濃度は130mMであり、3,4-ジメチルベンジルアルコールの濃度は100mMであった。3,4-ジメチル安息香酸の形成は非常に低かった。したがって、最終濃度はたったの2mMであった。
【０１７４】
低いpHは、細胞の増殖だけでなく、酵素活性にも影響を及ぼした。生体内変換の開始時、pHが低下したために、比アルデヒド形成速度は低かった。しかし、4時間後、pH7.1において回復し、12U/g CDWの値に達した。流加培養開始の7時間後には、全体の比活性は最大値32U/g CDWに達した。
【０１７５】
一過的なpHの低下は、バイマスの増殖および酵素活性に強い影響を及ぼした。上記の発酵と比較して、バイオマスは低い濃度に達した。したがって、容積活性（U/リットル）は、生体内変換の間ずっと低かった。
【０１７６】
しかし、この多段階プロセスの速度論は、実験室規模の生体内変換の場合と同様であった。したがって、3,4-ジメチルベンジルアルコールもまた、150mMのプソイドクメン濃度で生成した。
【０１７７】
実施例5：pH7.4におけるパイロット規模の発酵
先の発酵では期待した量の3,4-ジメチルベンズアルデヒドが得られなかったので、実験を繰り返した。生体内変換の間にpHを7.4まで上げた。すなわち、生体内変換に対する上昇させたpHの影響も調べることができた。
【０１７８】
回分培養の後、細胞乾燥重量は3.5g/リットルであった。流加培養の間、細胞密度は20g/リットルの値まで増大した。ブドウ糖は培地中で制限されていなかったので、培地中の酢酸濃度は増大し続けた（図22）。生体内変換の後、酢酸濃度は45g/リットルであった。有機相を添加したわずか1時間後、供給空気に酸素を混ぜて、酸素制限を防止した。生体内変換の6時間まで、DOTは15%〜25%の値に維持された。その後、培地中の溶存酸素含有量は25%〜40%であった。
【０１７９】
生体内変換の間のプソイドクメン、3,4-ジメチルベンジルアルコール（DBAlk）、3,4-ジメチルベンズアルデヒド（DBAld）および3,4-ジメチル安息香酸（DBAcid）の濃度の経時変化は、実験室規模の発酵の経時変化と同等である。150mMのプソイドクメン濃度では、主に3,4-ジメチルベンズアルデヒドが培養液に蓄積する。4.8%（v/v）の基質濃度からスタートして、発酵の終点でのプソイドクメン濃度は3mMであった。DBAlkの最終濃度は4mMであり、DBAcidの最終濃度は12mMであった。3,4-ジメチル安息香酸の形成は、約9時間後に始まった。生体内変換の間に、DBAldは275mM以下の最終濃度で生成した。添加した基質の78.6%がDBAldへと変換された（図23）。しかし、流加培養の間、通気による、16%のプソイドクメンの損失が記録された。したがって、反応器の内容物を最終的に回収した時、有機相には、表3に示すパーセンテージが存在した。
【表２】
2004528842.tif 000009
【０１８０】
有機相を添加した3時間後、pHを7.1から7.4へと上げることにより、高い比活性値（51U/g CDW）およびアルデヒド形成速度（30U/g CDW）が達成された。図24は、全体の比活性およびアルデヒド形成速度の経時変化をグラフ化して表わしたものである。すなわち、pHを上げた場合、3時間後に、比活性および比アルデヒド形成速度の顕著な増大が見られた。
【０１８１】
添加した基質は、3,4-ジメチルベンズアルデヒドへと高程度で変換されたが、副生成物である3,4-ジメチルベンジルアルコールと3,4-ジメチル安息香酸は少量しか形成されなかった。pHを上げることは、酵素活性に正の影響を及ぼした。すなわち、pHを増大させた後は、著しく高い比活性およびアルデヒド形成速度が達成された。
【０１８２】
実験室規模で開発された二相系流加法は、パイロット規模の条件にもうまく適用された。
【０１８３】
実施例6：pH7.4でのパイロット規模の発酵において得られた3,4-ジメチルベンズアルデヒドの処理
パイロット規模の生体内変換が完了した後、バイオリアクターの内容物を回収した。水相および有機相を遠心分離により分離させた。続いて、有機相を硫酸ナトリウムの添加により乾燥し、次に分離させた。中真空蒸留を用いて、フタル酸ジオクチルから3,4-ジメチルベンズアルデヒドを分離した。減圧は0.08mbar〜0.15mbarの間に調整した。3,4-ジメチルベンズアルデヒドは、110℃〜120℃のフタル酸ジオクチル温度にて蒸留を開始した。
【０１８４】
この蒸留により、14リットルのフタル酸ジオクチルから484mlの蒸留物が得られた。3,4-ジメチルベンズアルデヒドは蒸留物の96.5%、3,4-ジメチルベンジルアルコールは0.3%、フタル酸ジオクチルは2.8%、プソイドクメンは0.3 %、そしてオクタンは0.04%を占めた。
【０１８５】
実験結果のまとめ
1. プロセス関連パラメーターの最適化
1.1 酸素およびブドウ糖の影響
生体触媒的方法での3,4-ジメチルベンズアルデヒドの製造における重要なパラメーターは、酵素の活性である。酵素活性のレベルおよび持続時間は特に重要である。
【０１８６】
示したように、細胞のブドウ糖濃度と酸素供給量は、酵素活性に影響を及ぼす。したがって、培地中で10g/リットルを超えるブドウ糖濃度は、酵素活性に抑制的な影響を及ぼす。しかし、過度に厳しいブドウ糖制限もまた、触媒の生産能に負の影響を及ぼす。
【０１８７】
この研究では、ブドウ糖と酸素の同時制限によって、キシレンモノオキシゲナーゼが触媒を停止し、非特異的な大腸菌のアルコールデヒドロゲナーゼが3,4-ジメチルベンズアルデヒドを3,4-ジメチルベンジルアルコールへと逆に変換することが実証された（図6）。
【０１８８】
酸素またはブドウ糖の制限が独立して起こり、過度に厳しいものではなかった場合、活性に対する抑制的影響は見られなかった（図16および18）。
【０１８９】
1.2 基質濃度の影響
基質濃度もまた、酵素活性に影響を及ぼし、有機相中における150mM以下のプソイドクメン濃度もまた、3,4-ジメチルベンズアルデヒドの形成に影響を及ぼす。すなわち、プソイドクメン濃度が低いと、酵素活性は低くなる。150mMを超えるプソイドクメン濃度では、多段階プロセスの第一の工程、すなわち3,4-ジメチルベンジルアルコール（DBAlk）の形成は、基質濃度に依存する。
【０１９０】
150mM未満のプソイドクメン濃度では、主に3,4-ジメチルベンズアルデヒド（DBAld）の形成が見られた。このために、3,4-ジメチルベンジルアルコールは培養液中に蓄積されなかった（図3）。この理由から、3,4-ジメチル安息香酸（DBAcid）は、90mMのプソイドクメン濃度から、徐々に形成された。その後で始まった3,4-ジメチルベンジルアルコールの形成は、この時点で酵素活性が非常に低かった、という事実のためであると思われる。
【０１９１】
しかし、初期濃度が150mMを超えると、開始時に、有機相における3,4-ジメチルベンジルアルコールと3,4-ジメチルベンズアルデヒドの同時蓄積が見られた。プソイドクメン濃度が150mMまで低下すると、主にDBAldが形成された。DBAcidの形成は、生体内変換の終点で始まり、この時、DBAlkは実質的に定量的にDBAldへと変換された（図11、23）。このことから、3,4-ジメチル安息香酸の形成におけるDBAlkに対する抑制的影響が確認される。
【０１９２】
高いプソイドクメン初期濃度でも、水相における3,4-ジメチルベンジルアルコールの優先的な蓄積が起こる可能性がある。水相中の3,4-ジメチルベジルアルコールの濃度が100mMの値を超えると、細胞に有毒な影響を及ぼす。
【０１９３】
1.3 炭素源の影響
グリセロールを炭素源として使用した場合に、活性は多少高かったが、終点では生成物は形成されなかった（図12および15）。更に、より高濃度の副生成物が有機相に蓄積した。このことは、特に活性の持続期間が短くなる原因となり得る。かくして、酵素活性は、バイオマス増殖の間にだけ見られた。定常期に達すると、活性は直ちに低下することが見られた。これに対して、ブドウ糖を炭素源として使用した場合、酵素活性は、定常期に入っても十分に見られた。更に、グリセロールを炭素源として使用した場合は、形成された3,4-ジメチルベンジルアルコールは、ブドウ糖を炭素源として使用した場合ほどには、3,4-ジメチル安息香酸の形成を抑制しないことが見られた（図15）。
【０１９４】
1.4 pHの影響
pHを上げることは、酵素活性に正の影響を及ぼす。したがって、比活性およびアルデヒド形成速度の顕著な上昇は、発酵を7.1ではなく7.4のpHにて行った場合に達成された（図24）。発酵においてpHを7.1に設定し、そこにおいてブドウ糖を炭素源として使用した場合、最大のアルデヒド形成速度は16U/g CDWであった。pH 7.4では、30U/g CDWという著しく高いアルデヒド形成速度が達成された。6.6というpHは、酵素活性（生産能）に著しく負の影響を及ぼす。
【０１９５】
2. プラスミドの安定性
3,4-ジメチルベンズアルデヒドは、本発明に従い、組換え大腸菌JM101（pSZP3）によって産生される。プラスミドpSZP3は、Panke（1999）によって開発された。このプラスミドが細菌内で確実に保持されるようにするために、それは、抗生物質カナマイシンに対する耐性を付与する耐性遺伝子を保有する。抗生物質を添加することは、工業的規模のプロセスでは、商業的および環境的な理由から望ましくない。このために、カナマイシンの選択圧をかけずにプラスミドの安定を調べる実験を行った。繰り返し回分培養によって実証されたように、プラスミドおよびXMO遺伝子は60時間にわたって安定であった。このことは、14世代にわたって、プラスミドが保持され、XMO遺伝子が発現されることを意味する。
【０１９６】
3. 培地の最適化
生物学的方法を工業的に利用しようとする場合、培地は幾つかの要件を満足しなければならない。つまり、培地は、可能な限り規定されていなければならない。すなわち、それは、濃度を正確に決定できず、生成物の純度に危険を及ぼす可能性がある構成成分を含んではならない。したがって、酵母抽出物やペプトンなどの不確定な構成成分は、可能であれば、使用されない。
【０１９７】
バイオプロセスにおいて高い細胞密度を得ることは、プロセスの生産能に顕著な影響を及ぼす。つまり、高細胞密度プロセスは、次の利点を有すると思われる：反応器の容積がより小さくて済むこと；調製・処理操作プロセスがあまり煩雑でないこと；そして、容積活性がかなり高いこと。しかし、高い細胞密度を含むプロセスには問題もある。大量の栄養源を添加しなければならず、高い細胞密度のために細胞への酸素供給が難しい。更に、高細胞密度培養は、例えば嫌気性条件下で形成されるエタノール、酢酸エステルおよび乳酸エステルなどの代謝副生成物により阻害される可能性がある。好気性条件下であっても、大腸菌は、培地に蓄積する酸や他の代謝副生成物を形成する可能性がある。pH 7において、酢酸は、5g/リットルという僅かな濃度でも、細胞の増殖に抑制的な影響を及ぼす。このため、バイオプロセスにおいて不必要に高い酸の形成は防止すべきである。
【０１９８】
Riesenberg（1991）は、初期段階でブドウ糖および硫酸マグネシウムを含有しない規定培地を開発した。それは、非制限的な好気的培養条件下で、酢酸を少ししか形成しないことを特徴とする。この培地を使用したところ、大腸菌を用いて110g/リットルという高い細胞密度が達成された（Riesenberg 1991）。
【０１９９】
3.1 Reiesenberg培地の効果
M9培地を使用すると、供給溶液に酵母抽出物を含有させた場合に、20〜27g/リットルという細胞密度しか達成されなかったので、Reisenberg培地を使用して生体内変換を行った。図8に示すように、回分における高い細胞密度は、適切なブドウ糖濃度を用いた場合に達成できる。酢酸の形成は、Riesenberg、Schulzら（1991）により得られた濃度と同じであった。つまり、約1g/リットルの酢酸が形成された。生体内変換は、16g/リットルの細胞乾燥重量からスタートした。酸素が豊富だったにもかかわらず、酢酸の顕著な形成が見られ、これは最終的にはバイマスの増殖に影響を及ぼした。したがって、24.7g/リットルの細胞乾燥重量しか得られなかった（図8）。酢酸の形成は、低いブドウ糖濃度においても見られた（図4）。これは、大腸菌の増殖を抑制するキシレンモノオキシゲナーゼの形成が原因であると思われる（Buhler、Schmidら 2000）。
【０２００】
ブドウ糖の代わりにグリセロールを炭素源として使用すると、酢酸は水相にそれほど蓄積しなかった（図10および12）。
【０２０１】
高細胞密度培養における細胞への酸素供給には問題がある。このことに、生体内変換に使用される酵素（つまりキシレンモノオキシゲナーゼ）が物質を触媒するのに酸素を必要とする（Buhler、Schmidら 2000）、という事実は役に立たない。反応器系は、撹拌速度および通気ならびに30g/リットル未満という細胞乾燥重量（これは発酵において得られた）に関するキャパシティを満足するように使用される。この理由から、パイロット規模での通気では、細胞に十分な酸素を供給するために、酸素−空気混合物を使用しなければならなかった。
【０２０２】
3.2 供給物の組成
Riesenberg培地は、より安価な組成である点がM9培地とは異なる。更に、後処理（起泡、相分離）の過程で問題を引き起こす酵母抽出物は、供給溶液から省かれる。
【０２０３】
酵母抽出物を供給溶液に加えず、M9培地を使用した場合、バイオマスの増殖に対する悪影響が見られた。したがって、流加培養の終点における細胞乾燥重量は、12g/リットルしかなかった（図4）。これに対して、Riesenberg培地を用いた場合には、25〜30g/リットルの細胞密度が達成された。M9培地を使用した場合にバイオマス増殖速度が遅いのは、Riesenberg培地と比較して、アンモニア濃度が低いことが原因であると思われる。
【０２０４】
4. 種々のパラメーターの複合的影響
プロセス関連パラメーターは、本発明において測定され、改善された。図25は、種々のパラメーターおよびプロセス全体に及ぼすそれらの影響を示す概略図である。
【０２０５】
既に記載したように、培地中の溶存酸素およびブドウ糖濃度は、活性のレベルおよび持続時間に実質的な影響を及ぼす。基質および生成物の濃度は、物質によっては、バイオマスに有害な影響を及ぼす。したがって、DBAcidは、水相中で16mMという低い濃度において、バイオマスの増殖を抑制する。バイオマスの増殖を抑制するDBAlk濃度は、水相中で100mMの濃度であり、DBAld濃度は1812mMである。水相中でプソイドクメン濃度が15〜25%を超えると、これもまた細胞にとって有害である。同様に、酢酸濃度はバイオマスの増殖に抑制的な影響を及ぼす。
【０２０６】
5. 生成物の単離
5.1 相分離
反応器の内容物を回収した後の最初の工程は、遠心分離による相分離である。既に述べたように、酵母抽出物およびグリセロールを培地に添加すると、分離プロセスに悪影響を及ぼすことが判った。つまり、分離しようとする容量の1/3以下を占める中間相が形成されていた。撹拌速度が2000rpmを超えた場合にも、同様の影響が見られた。この現象は、酵母抽出物中に存在するタンパク質または過度に高い撹拌速度による細胞の破壊が原因であると思われる。
【０２０７】
5.2 蒸留
3,4-ジメチルベンズアルデヒドは、高い沸点を有する物質である。大気圧における沸点は220〜223℃である。本発明に従って使用される有機相のフタル酸ジオクチルの沸点は380℃である。これら2つの物質のこの大きな沸点の差により、3,4-ジメチルベンズアルデヒドを蒸留により精製することが可能になる。
【０２０８】
3,4-ジメチルベンズアルデヒドを蒸留により有機相から取り出すためには、溶液を実質的に223℃以上に加熱しなければならない。この理由から、中真空蒸留が好ましい方法であると思われる。
【０２０９】
6. パイロット規模の生体内変換
本発明により実証されたように、3,4-ジメチルベンズアルデヒドを製造するために開発された二相系流加培養法は、大きな問題もなしにスケールアップすることが可能である。プロセス関連パラメーターおよび培地を実験室規模で最適化した後、そのプロセスをパイロット規模に適用した。生体内変換の過程での問題となる唯一の点は、細胞への酸素供給である。したがって、酸素は、細胞を誘導した2時間後までに供給空気に混ぜなければならない。
【０２１０】
引用文献
F. Ausubelら, (1997) Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience, New York
Buhler, B., A. Schmid,ら (2000). “Xylene monooxygenase catalyzes the multistep oxygenation of toluene and pseudocumene to corresponding alcohols, aldehydes, and acids in Escherichia coli JM101（キシレンモノオキシゲナーゼは大腸菌JM101におけるトルエンおよびプソイドクメンの対応するアルコール、アルデヒドおよび酸への多段階酸素処理を触媒する）.”The Journal of Biological Chemistry275(14): 10085-10092.
Harayama, S., M. Kok,ら (1992). “Functional and evolutionary relationships among diverse oxygenases（種々のオキシゲナーゼ間の機能的および進化的関係）.”Ann. Rev. Microbiol.46: 565-601.
Harayama, S., R. A. Leppik,ら (1986). “Gene order of the TOL catabolic plasmid upper pathway operon and oxidation of both toluene and benzyl alcohol by the xylA product（TOL異化プラスミドの上部経路オペロンの遺伝子配列およびxylA産物によるトルエンおよびベンジルアルコールの酸化）.”Journal of Bacteriology167(2): 455-461.
Harayama, S., M. Rekik,ら (1989). “Characterization of fivegenes in the upper-pathway operon of TOL plasmid pWW0 from Pseudomonas putida and identification of thegene products（シュードモナス・ブチダ由来のTOLプラスミドpWWOの上部経路オペロン内の5つの遺伝子の特性決定ならびにこれらの遺伝子産物の同定）.”Journal of Bacteriology171(9): 5048-5055.
Legoy, M. D., H. S. Kim,ら (1985). “Use of alcohol dehydrogenase for flavor aldehyde production（芳香族アルデヒド製造のためのアルコールデヒドロゲナーゼの使用）.”Process Biochemistry20: 145-148.
Molinari, F., F. Aragozzini,ら (1997). “Continuous production of isovaleraldehyde through extractive bioconversion in a hollow-fiber membrane bioreactor（中空繊維膜バイオリアクター内での抽出生物変換によるイソバレルアルデヒドの連続生産）.”Enzyme and Microbial Technology20: 604-611.
Molinari, F., R. Gandolfi,ら (1999). “Biotransformations in two-liquid-phase systems. Production of phenylacetaldehyde by oxidation of 2-phenylethanol with acetic acid bacteria（二液相系における生体内変換。2-フェニルエタノールの酢酸細菌による酸化によるフェニルアセトアルデヒドの製造）.”Enzyme and Microbial Technology25: 729-735.
Molinari, F., R. Villa,ら (1995). “Aldehyde production by alcohol oxidation with Gluconobacter oxydans（グルコノバクター・オキシダンスを用いたアルコール酸化によるアルデヒドの製造）.”Applied Microbiology and Biotechnology43: 989-994.
Panke, S. (1999). Production of (S)-styrene oxide with recombinant bacteria（組換え細菌を用いた(S)-スチレンオキサイドの製造）.Institute of Biotechnolgy. Zurich, Swiss Federal Institute of Technology: 208.
Pouwels P. H.ら, (1985) "Cloning Vectors", Elsevier編, Amsterdam-New York-Oxford.
Ramos, J. L., S. Marques,ら (1997). “Transcriptional control of the Pseudomonas TOL plasmid catabolic operons is achieved through an interplay of host factors and plasmid-encoded regulators（シュードモナスのTOLプラスミドの異化オペロンの転写制御は、宿主の因子およびプラスミドによりコードされる調節因子の相互作用により達成される）.”Annual Reviews in Microbiology51: 341-373.
Riesenberg, D. (1991). “High-cell-density cultivation of Escherichia coli（大腸菌の高細胞密度培養）.”Current Opinion in Biotechnology2: 380-384.
Sambrook, J., E. F. Fritsch,ら (1989).Molecular cloning: a laboratory manual, 第2版.Cold Spring Harbor, N.Y., Cold Spring Harbor Laboratory.
Schmid, A. (1997). Der Metabolismus von ortho-Hydroxybiphenylen in Pseudomonas azeleica HBP1, Universitat Stuttgart.
Simmonds, J.およびG. K. Robinson (1997). “Novel biotransformations to produce aromatic and heterocyclic aldehydes（芳香族およびヘテロ環式アルデヒドを製造するための新規な生体内変換）.”Enzyme and Microbial Technology21: 367-374.
Simmonds, J.およびG. K. Robinson (1998). “Formation of benzaldehyde by Pseudomonas putida ATCC 12633（シュードモナス・プチダATCC 12633によるベンズアルデヒドの形成）.”Applied Microbiology and Biotechnology50: 353-358.
Williams, P. A., L. M. Shaw,ら (1997). “xylUW, twogenes at the start of the upper pathway operon of TOL plasmid pWW0, appear to play no essential part in determining its catabolic potential（xylUW 、TOLプラスミドpWWOの上部経路オペロンの開始点にある2つの遺伝子は、その異化能力を決定する上で本質的な役割を担っていないと思われる）.”Microbiology143: 101-107.
Wittcoff, H. A.およびB. G. Reuben (1996).Industrial Organic Chemicals. New-York, John Wiley & Sons . Inc.
【図面の簡単な説明】
【０２１１】
【図１】図1は、alk調節系により制御されたプラスミドpSZP3を示す；alkBp、alkオペロンのプロモーター；alkS、正の調節因子AlkSの遺伝子；xylM*およびxylA、キシレンモノオキシゲナーゼをコードする遺伝子（*は、xylMにおいてNdelインターフェースが除去されていることを意味する）；Km、カナマイシン耐性遺伝子；T4t、T4ファージの転写ターミネーター。
【図２】図2は、酵母抽出物を含有する供給溶液Iを用いた発酵における細胞乾燥重量（CDW）、ブドウ糖濃度および酢酸濃度を示す。
【図３】図3は、酵母抽出物を含有する供給溶液Iを用いた発酵における、水相中および有機相中のプソイドクメン、3,4-ジメチルベンジルアルコール、3,4-ジメチルベンズアルデヒド、3,4-ジメチル安息香酸およびオクタン濃度を示す。
【図４】図4は、a) 酵母抽出物を含有しない供給溶液Iを用いた発酵における、細胞乾燥重量、ブドウ糖濃度、および酢酸濃度；b) 酵母抽出物を含有しない供給溶液Iを用いた発酵における、水相中および有機相中のプソイドクメン、3,4-ジメチルベンジルアルコール、3,4-ジメチルベンズアルデヒド、3,4-ジメチル安息香酸およびオクタンの濃度を示す。
【図５】図5は、基質濃度を増大させた発酵における、細胞乾燥重量、ブドウ糖濃度および酢酸濃度を示す。
【図６】図6は、基質濃度を増大させた発酵における、水相中および有機相中のプソイドクメン、3,4-ジメチルベンジルアルコール、3,4-ジメチルベンズアルデヒド、3,4-ジメチル安息香酸およびオクタンの濃度を示す；矢印は、供給速度および通気速度を同時に低下させたことを示す。
【図７】図7は、Riesenberg培地中の大腸菌JM101の増殖曲線を記録した場合の、細胞乾燥重量（CDW）、ブドウ糖濃度および酢酸濃度を示す。
【図８】図8は、流加培養の開始時に高い細胞密度を用いた発酵における、細胞乾燥重量、ブドウ糖濃度および酢酸濃度を示す。
【図９】図9は、流加培養の開始時に高い細胞密度を用いた発酵における、水相中および有機相中のプソイドクメン、3,4-ジメチルベンジルアルコール、3,4-ジメチルベンズアルデヒド、3,4-ジメチル安息香酸およびオクタンの濃度を示す；矢印は、1%(v/v)のプソイドクメンを添加したことを示す。
【図１０】図10は、流加培養の開始時に通常の細胞密度を用いた発酵における、細胞乾燥重量、ブドウ糖濃度および酢酸濃度を示す。
【図１１】図11は、流加培養の開始時に通常の細胞密度を用いた発酵における、水相中および有機相中のプソイドクメン、3,4-ジメチルベンジルアルコール、3,4-ジメチルベンズアルデヒド、3,4-ジメチル安息香酸およびオクタンの濃度を示す。
【図１２】図12は、炭素源としてグリセロールを使用した発酵における、細胞乾燥重量、グリセロール濃度および酢酸濃度を示す。
【図１３】図13は、炭素源としてグリセロールを使用した発酵における、水相中および有機相中のプソイドクメン、3,4-ジメチルベンジルアルコール、3,4-ジメチルベンズアルデヒド、3,4-ジメチル安息香酸およびオクタンの濃度を示す。
【図１４】図14は、炭素源としてのグリセロールおよびより高い基質濃度を用いた発酵における、細胞乾燥重量、グリセロール濃度および酢酸濃度を示す。
【図１５】図15は、炭素源としてのグリセロールおよびより高いプソイドクメン濃度を用いた発酵における、水相中および有機相中のプソイドクメン、3,4-ジメチルベンジルアルコール、3,4-ジメチルベンズアルデヒド、3,4-ジメチル安息香酸およびオクタンの濃度を示す。
【図１６】図16は、繰り返し流加培養の1日目における、細胞乾燥重量、ブドウ糖濃度および酢酸濃度を示す。
【図１７】図17は、繰り返し流加培養の1日目における、水相中および有機相中のプソイドクメン、3,4-ジメチルベンジルアルコール、3,4-ジメチルベンズアルデヒド、3,4-ジメチル安息香酸およびオクタンの濃度を示す。
【図１８】図18は、繰り返し流加培養の2日目における、細胞乾燥重量、ブドウ糖濃度および酢酸濃度を示す。
【図１９】図19は、繰り返し流加培養の2日目における、水相中および有機相中のプソイドクメン、3,4-ジメチルベンジルアルコール、3,4-ジメチルベンズアルデヒド、3,4-ジメチル安息香酸およびオクタンの濃度を示す。
【図２０】図20は、pH6.6でのパイロット規模の発酵における、細胞乾燥重量、ブドウ糖濃度および酢酸濃度を示す；矢印は、pH6.6に調整したことを示す。
【図２１】図21は、パイロット規模の発酵における、水相中および有機相中のプソイドクメン、3,4-ジメチルベンジルアルコール、3,4-ジメチルベンズアルデヒド、3,4-ジメチル安息香酸およびオクタンの濃度を示す。
【図２２】図22は、pH7.4でのパイロット規模の発酵における、細胞乾燥重量、ブドウ糖濃度および酢酸濃度を示す。
【図２３】図23は、pH7.4でのパイロット規模の発酵における、水相中および有機相中のプソイドクメン、3,4-ジメチルベンジルアルコール、3,4-ジメチルベンズアルデヒド、3,4-ジメチル安息香酸およびオクタンの濃度を示す。
【図２４】図24は、pH7.4でのパイロット規模の発酵における、比活性およびアルデヒド形成速度を示す；矢印は、pHを7.4に上昇させたことを示す。
【図２５】図25は、バイオプロセスに対するプロセス関連パラメーターの影響を示す；P：プソイドクメン、DBAlk：3,4-ジメチルベンジルアルコール、DBAld：3,4-ジメチルベンズアルデヒド、DBA：3,4-ジメチル安息香酸、＋増大作用；−阻害作用。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【国際公開パンフレット】
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【手続補正書】
【提出日】平成15年6月18日(2003.6.18)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
芳香族化合物の生体触媒的酸化方法であって、
ａ）式II：
Ar-R2        （II）
［式中、
Arは非置換または一置換もしくは多置換の単核芳香族環であり、
R2は、-(CH2)n+1R3、または-(CH2)nCHOであり、ここで、
Nは、0〜15の整数であり；
R3は、HまたはOHである］
で表わされる芳香族基質を含む水相−有機相二相系培地において、キシレンモノオキシゲナーゼ（XMO）活性を有する酵素を発現する微生物を、好気的条件下で増殖させ、
ｂ）その培養培地から、酸化反応において形成される少なくとも1種の生成物を単離する
ことを含む、上記方法。
【請求項２】
酸化反応により以下の生成物が得られる、請求項1に記載の方法：
ａ）用いられる基質が式IIで表わされる化合物であり、そこにおいてR2が-(CH2)n+1OHである場合、式Ia：
Ar-(CH2)n-R1        (Ia)
［式中、
Arおよびnは、上記で述べた意味を有し、
R1は、CHOまたはCOOHである］
で表わされる生成物；
ｂ）用いられる基質が式IIで表わされる化合物であり、そこにおいてR2が-(CH2)n+1Hである場合、上記の式Ia、または式Ib：
Ar-(CH2)n+1OH        (Ib)
［式中、Arおよびnは、上記で述べた意味を有する］
で表わされる生成物；
ｃ）用いられる基質が式IIで表わされる化合物であり、そこにおいてR2が-(CH2)nCHOである場合、式Ic：
Ar-(CH2)nCOOH        (Ic)
［式中、Arは、上記で述べた意味を有する］
で表わされる生成物。
【請求項３】
用いられる有機相が、n-オクタノール相／水相の二相系において104より高い分配係数を有する無極性有機化合物である、請求項1または2に記載の方法。
【請求項４】
有機相が、1atmにおいて、酸化生成物の沸点よりも50〜200℃程度上回る沸点または沸点範囲を有する、請求項1〜3のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
用いられる有機相が、フタル酸ジ(C5-C12-アルキル)またはそのようなフタル酸エステルの混合物である、請求項1〜4のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
有機相を分離させ、そこに溶解している酸化生成物を蒸留により取り出す、請求項1〜5のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
XMO活性を発現する微生物が、ベンジルアルコールデヒドロゲナーゼ（BADH）活性および／またはベンズアルデヒドデヒドロゲナーゼ（BZDH）活性を本質的に有していない、請求項1〜6のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
シュードモナス・オレオボランス（Pseudomonas oleovorans）GPo1由来の調節alk系の遺伝的制御下に機能し得る形で連結されているXMOコード遺伝子xylMおよびxylAを含んでいる発現ベクターで形質転換した組換え微生物が用いられる、請求項1〜7のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
微生物が、発現プラスミドpSPZ3で形質転換されている、請求項8に記載の方法。
【請求項１０】
微生物が、エシェリキア（Escherichia）属の細菌である、請求項1〜9のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
酵素の発現が、培養培地へ誘導原を添加することによって開始される、請求項1〜10のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）mt-2キシレンモノオキシゲナーゼが発現される、請求項1〜11のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
本質的に抗生物質を含まない反応培地が用いられる、請求項1〜12のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
変換が半連続式回分操作として行われる、請求項1〜13のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
プソイドクメンが出発物質として用いられる、請求項1〜14のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
反応培地のpHが、生体触媒の生産能のパラメーターとして用いられる、請求項1〜15のいずれか１項に記載の方法。
【国際調査報告】
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