(57)【要約】本発明は、病原性抗原分子に結合する異なる第２の抗原認識部分に架橋した、C3b様受容体に結合する第１の抗原認識部分をそれぞれ含む複数の異なる二重特異性分子を含む二重特異性分子のポリクローナル集団であって、複数の異なる二重特異性分子が、異なる認識特異性(病原体の異なるエピトープおよび/もしくは異なる変異体、ならびに/または異なる病原体に対する認識特異性等)を有する異なる第２の抗原認識部分を有する、二重特異性分子のポリクローナル集団に関する。本発明は、このような二重特異性分子のポリクローナル集団を産生する方法にも関する。本発明は、このような二重特異性分子のポリクローナル集団を、哺乳動物の循環器系から病原体を排除するために使用する方法にもさらに関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数の異なる二重特異性分子を含み、該複数のうちの各二重特異性分子が、C3b様受容体に結合する第１の抗原認識部分とこれにに架橋した病原性抗原分子に結合するもう一つの第２の抗原認識部分とを含む、二重特異性分子のポリクローナル集団。
【請求項２】
前記第１の抗原認識部分が抗CR1モノクローナル抗体を含む、請求項１に記載の二重特異性分子のポリクローナル集団。
【請求項３】
前記複数の二重特異性分子が、異なる第１の抗原認識部分を含む異なる二重特異性分子を含む、請求項１に記載の二重特異性分子のポリクローナル集団。
【請求項４】
前記第２の抗原認識部分がモノクローナル抗体を含む、請求項１に記載の二重特異性分子のポリクローナル集団。
【請求項５】
前記複数の二重特異性分子が、病原体上の異なるエピトープに対して異なる抗原認識特異性を有する異なる第２の抗原認識部分を含む二重特異性分子を含む、請求項１に記載の二重特異性分子のポリクローナル集団。
【請求項６】
前記複数の二重特異性分子が、病原体の異なる変異体に対して異なる抗原認識特異性を有する異なる第２の抗原認識部分を含む二重特異性分子を含む、請求項１に記載の二重特異性分子のポリクローナル集団。
【請求項７】
前記複数の二重特異性分子が、異なる病原体に対して異なる抗原認識特異性を有する異なる第２の抗原認識部分を含む二重特異性分子を含む、請求項１に記載の二重特異性分子のポリクローナル集団。
【請求項８】
前記病原体の中和において相乗作用的な二重特異性分子を含むことを特徴とする、請求項５に記載の二重特異性分子のポリクローナル集団。
【請求項９】
前記複数の二重特異性分子が、前記集団の少なくとも10％を構成する、請求項１〜８のいずれか１項に記載の二重特異性分子のポリクローナル集団。
【請求項１０】
前記複数の二重特異性分子が、前記集団の少なくとも20％を構成する、請求項１〜８のいずれか１項に記載の二重特異性分子のポリクローナル集団。
【請求項１１】
前記複数の二重特異性分子が、前記集団の少なくとも50％を構成する、請求項１〜８のいずれか１項に記載の二重特異性分子のポリクローナル集団。
【請求項１２】
前記複数の二重特異性分子が、前記集団の少なくとも80％を構成する、請求項１〜８のいずれか１項に記載の二重特異性分子のポリクローナル集団。
【請求項１３】
前記複数の二重特異性分子が、前記集団の少なくとも90％を構成する、請求項１〜８のいずれか１項に記載の二重特異性分子のポリクローナル集団。
【請求項１４】
前記複数のうちの単一の二重特異性分子が、95％を超える割合で存在することはない、請求項１〜８のいずれか１項に記載の二重特異性分子のポリクローナル集団。
【請求項１５】
前記複数のうちの単一の二重特異性分子が、80％を超える割合で存在することはない、請求項１〜８のいずれか１項に記載の二重特異性分子のポリクローナル集団。
【請求項１６】
前記複数のうちの単一の二重特異性分子が、60％を超える割合で存在することはない、請求項１〜８のいずれか１項に記載の二重特異性分子のポリクローナル集団。
【請求項１７】
前記複数のうちの単一の二重特異性分子が、50％を超える割合で存在することはない、請求項１〜８のいずれか１項に記載の二重特異性分子のポリクローナル集団。
【請求項１８】
前記複数の異なる二重特異性分子が、異なる第２の抗原認識部分を有する少なくとも２つの異なる二重特異性分子を含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載の二重特異性分子のポリクローナル集団。
【請求項１９】
前記複数の異なる二重特異性分子が、異なる第２の抗原認識部分を有する少なくとも10の異なる二重特異性分子を含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載の二重特異性分子のポリクローナル集団。
【請求項２０】
前記複数の異なる二重特異性分子が、異なる第２の抗原認識部分を有する少なくとも100の異なる二重特異性分子を含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載の二重特異性分子のポリクローナル集団。
【請求項２１】
精製された、請求項１〜８のいずれか１項に記載の二重特異性分子のポリクローナル集団。
【請求項２２】
前記第２の抗原認識部分は高力価免疫血清に由来するものである、請求項１〜８のいずれか１項に記載の二重特異性分子のポリクローナル集団。
【請求項２３】
C3b様受容体に結合する複数の第１の抗原認識部分と病原性抗原分子に結合する複数の異なる第２の抗原認識部分とを架橋させることにより産生される、複数の二重特異性分子を含む二重特異性分子のポリクローナル集団。
【請求項２４】
前記複数の異なる第２の抗原認識部分は、高力価免疫血清に由来するものである、請求項２３に記載の二重特異性分子のポリクローナル集団。
【請求項２５】
C3b様受容体に結合する複数の第１の抗原認識部分と病原性抗原分子に結合する複数の異なる第２の抗原認識部分とを架橋させることを含む、二重特異性分子のポリクローナル集団を産生する方法。
【請求項２６】
(a)C3b様受容体に結合する複数の第１の抗原認識部分を産生すること；
(b)１つ以上の病原性抗原分子に結合する複数の異なる第２の抗原認識部分を産生すること；および
(c)該複数の異なる第１の抗原認識部分と該複数の異なる第２の抗原認識部分とを架橋させて、二重特異性分子のポリクローナル集団を産生すること、
を含む、二重特異性分子のポリクローナル集団を産生する方法。
【請求項２７】
前記複数の異なる第２の抗原認識部が高力価免疫血清に由来するものである、請求項２５または２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記複数の異なる第２の抗原認識部分がファージ提示ライブラリーから得られるものである、請求項２５または２６に記載の方法。
【請求項２９】
前記複数の第２の抗原認識部分は、免疫グロブリン分子のポリクローナルライブラリー中の異なる免疫グロブリンの重鎖および軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列をそれぞれ含む複数の真核生物発現ベクターを宿主において発現させることを含む方法により産生され、該重鎖および軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列は、頭部-頭部で連結された重鎖および軽鎖をそれぞれコードするヌクレオチド配列を含んで双方向ベクターを形成することを特徴とする、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記複数の第２の抗原認識部分は、
(a)ファージ提示ライブラリーから、１つ以上の抗原分子に対するそれぞれ異なる結合特異性を有する抗原認識ポリペプチドを提示する複数のファージをアフィニティースクリーニングを使用して選択すること；
(b)該複数の抗原認識ポリペプチドをそれぞれコードする複数の核酸を得ること；および
(c)該複数の核酸を宿主において発現させて、該第２の抗原認識部分のポリクローナル集団を産生すること；
を含む方法により産生されることを特徴とする、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
前記架橋は、架橋剤であるN-スクシンイミジルS-アセチルチオアセテートおよびスルホスクシンイミジル4-(N-マレイミドメチル)シクロヘキサン-1-カルボキシレートを使用することを含む、請求項２５または２６に記載の方法。
【請求項３２】
前記架橋は、架橋剤であるN-スクシンイミジル-3-(2-ピリジルジチオ)プロピオネート(SPDP)を使用することを含む、請求項２５または２６に記載の方法。
【請求項３３】
複数の異なる二重特異性分子を含む二重特異性分子の相乗作用的ポリクローナル集団を産生する方法であって、該複数のうちの各二重特異性分子は、同じ病原体または病原性抗原分子のエピトープに結合する異なる第２の抗原認識部分に架橋した、C3b様受容体に結合する第１の抗原認識部分を含むものであり、該方法は、二重特異性分子のポリクローナル集団と、該ポリクローナル集団と組み合わせられた場合に該病原体または病原性抗原分子の中和において相乗作用的活性を示す１つ以上のモノクローナル二重特異性分子とを組み合わせて、二重特異性分子の相乗作用的ポリクローナル集団を産生することを特徴とする、上記方法。
【請求項３４】
(a)C3b様受容体に結合する複数の第１の抗原認識部分を産生すること；
(b)同じ病原体または病原性抗体分子に結合する複数の異なる第２の抗原認識部分を産生すること；
(c)該複数の第１の抗原認識部分と該複数の異なる第２の抗原認識部分とを架橋させて、二重特異性分子のポリクローナル集団を産生すること；
(d)該病原体または病原性抗原分子の中和において相乗作用的な１つ以上のモノクローナルな第２の抗原認識部分を得ること；
(e)該第１の抗原認識部分と、該１つ以上のモノクローナルな第２の抗原認識部分とを架橋させて、１つ以上のモノクローナル二重特異性分子を産生すること；および
(f)該二重特異性分子のポリクローナル集団に、該１つ以上のモノクローナルな二重特異性分子を取り入れて、二重特異性分子の相乗作用的ポリクローナル集団を産生すること、
を含む、二重特異性分子の相乗作用的ポリクローナル集団を産生する方法。
【請求項３５】
複数の異なる二重特異性分子を含む二重特異性分子のポリクローナル集団を治療に有効な用量で哺乳動物に投与することを含み、該複数のうちの各二重特異性分子は、該１つ以上の病原体または病原性抗原分子のエピトープに結合する異なる第２の抗原認識部分に架橋した、C3b様受容体に結合する第１の抗原認識部分を含むことを特徴とする、１つ以上の病原体または病原性抗原分子の存在を伴う疾患もしくは障害、または所望でない症状を有する該哺乳動物を治療する方法。
【請求項３６】
疾患もしくは障害、または所望でない症状の発症前に、複数の異なる二重特異性分子を含む二重特異性分子のポリクローナル集団を予防に有効な用量で哺乳動物に投与することを含み、該複数のうちの各二重特異性分子は、該１つ以上の病原体または病原性抗原分子のエピトープに結合する異なる第２の抗原認識部分に架橋した、C3b様受容体に結合する第１の抗原認識部分を含むことを特徴とする、哺乳動物における１つ以上の病原体または病原性抗原分子の存在を伴う疾患もしくは障害、または所望でない症状を予防する方法。
【請求項３７】
二重特異性分子のポリクローナル集団および１つ以上のモノクローナル二重特異性分子を治療に有効な用量で哺乳動物に投与することを含み、該二重特異性分子のポリクローナル集団は複数の異なる二重特異性分子を含み、該複数のうちの各二重特異性分子は、病原性抗原分子に結合する異なる第２の抗原認識部分に架橋した、C3b様受容体に結合する第１の抗原認識部分を含み、上記モノクローナル二重特異性分子は、該ポリクローナル集団と組み合わせられた場合に該１つ以上の病原体または病原性抗原分子の中和において相乗作用的であることを特徴とする、１つ以上の病原体または病原性抗原分子の存在を伴う疾患もしくは障害または所望でない症状を有する哺乳動物を治療する方法。
【請求項３８】
前記投与は静脈内投与である、請求項３５、３６または３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記哺乳動物はヒトであり、前記C3b様受容体はCR1である、請求項３５、３６または３７に記載の方法。
【請求項４０】
前記哺乳動物は非ヒト哺乳動物である、請求項３５、３６または３７に記載の方法。
【請求項４１】
前記病原体は自己免疫抗原を含む、請求項３５、３６または３７に記載の方法。
【請求項４２】
前記病原体は感染剤を含む、請求項３５、３６または３７に記載の方法。
【請求項４３】
前記感染剤はウイルスである、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記ウイルスはHIV-1ウイルスである、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記感染剤が細菌である、請求項４２に記載の方法。
【請求項４６】
前記感染剤が菌類である、請求項４２に記載の方法。
【請求項４７】
前記感染剤が寄生生物である、請求項４２に記載の方法。
【請求項４８】
前記寄生生物が、原生動物である、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記病原体が、毒性化合物を含む、請求項３５、３６または３７に記載の方法。
【請求項５０】
前記毒性化合物は、毒に含まれる毒性化合物である、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記毒が爬虫類毒である、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記毒がヘビ毒である、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記毒が昆虫毒である、請求項５１に記載の方法。
【請求項５４】
前記複数の二重特異性分子が、同じ病原体または病原性抗原分子の異なるエピトープに対して異なる抗原認識特異性を有する異なる第２の抗原認識部分を含む二重特異性分子を含む、請求項３５、３６または３７に記載の方法。
【請求項５５】
前記複数の二重特異性分子が、病原体の異なる変異体に対して異なる抗原認識特異性を有する異なる第２の抗原認識部分を含む二重特異性分子を含む、請求項３５、３６または３７に記載の方法。
【請求項５６】
前記複数の二重特異性分子が、異なる病原体に対して異なる抗原認識特異性を有する異なる第２の抗原認識部分を含む二重特異性分子を含む、請求項３５、３６または３７に記載の方法。
【請求項５７】
前記複数の異なる二重特異性分子が、異なる第２の抗原認識部分を有する少なくとも２つの異なる二重特異性分子を含む、請求項３５、３６または３７に記載の方法。
【請求項５８】
前記複数の異なる二重特異性分子が、異なる第２の抗原認識部分を有する少なくとも10の異なる二重特異性分子を含む、請求項３５、３６または３７に記載の方法。
【請求項５９】
前記複数の異なる二重特異性分子が、異なる第２の抗原認識部分を有する少なくとも100の異なる二重特異性分子を含む、請求項３５、３６または３７に記載の方法。
【請求項６０】
前記第１の抗原認識部分が、抗CR1モノクローナル抗体を含む、請求項３５、３６または３７に記載の方法。
【請求項６１】
前記複数の二重特異性分子が、異なる第１の抗原認識部分を含む異なる二重特異性分子を含む、請求項３５、３６または３７に記載の方法。
【請求項６２】
前記第２の抗原認識部分が、モノクローナル抗体を含む、請求項３５、３６または３７に記載の方法。
【請求項６３】
前記複数の二重特異性分子が、前記集団の少なくとも10％を構成する、請求項３５、３６または３７に記載の方法。
【請求項６４】
前記複数の二重特異性分子は、前記集団の少なくとも20％を構成する、請求項３５、３６または３７に記載の方法。
【請求項６５】
前記複数の二重特異性分子は、前記集団の少なくとも50％を構成する、請求項３５、３６または３７に記載の方法。
【請求項６６】
前記複数の二重特異性分子は、前記集団の少なくとも80％を構成する、請求項３５、３６または３７に記載の方法。
【請求項６７】
前記複数の二重特異性分子は、前記集団の少なくとも90％を構成する、請求項３５、３６または３７に記載の方法。
【請求項６８】
前記複数の二重特異性分子は、前記集団の少なくとも95％を構成する、請求項３５、３６または３７に記載の方法。
【請求項６９】
前記複数のうちの単一の二重特異性分子が80％を超える割合で存在することはない、請求項３５、３６または３７に記載の方法。
【請求項７０】
前記複数のうちの単一の二重特異性分子が60％を超える割合で存在することはない、請求項３５、３６または３７に記載の方法。
【請求項７１】
前記複数のうちの単一の二重特異性分子が50％を超える割合で存在することはない、請求項３５、３６または３７に記載の方法。
【請求項７２】
複数の異なる二重特異性分子を含む二重特異性分子のポリクローナル集団が容器に入っており、該複数のうちの各二重特異性分子は、病原性抗原分子に結合する異なる第２の抗原認識部分に架橋した、C3b様受容体に結合する第１の抗原認識部分を含む、キット。
【請求項７３】
a)複数の異なる二重特異性分子を含み、該複数のうちの各二重特異性分子は、病原性抗原分子に結合する異なる第２の抗原認識部分に架橋した、C3b様受容体に結合する第１の抗原認識部分を含む、二重特異性分子のポリクローナル集団；および、b)C3b様受容体に結合する第１の抗原認識部分と該病原性抗原分子に結合する第２の抗原認識部分をそれぞれ含み、該病原性抗原分子の中和において、該複数のものと相乗作用的であることを特徴とする、１つ以上のモノクローナル二重特異性分子；が２つ以上の容器に入っているキット。
【請求項７４】
a)複数の異なる二重特異性分子を含み、該複数のうちの各二重特異性分子は、病原性抗原分子に結合する異なる第２の抗原認識部分に架橋した、C3b様受容体に結合する第１の抗原認識部分を含む、二重特異性分子のポリクローナル集団；および、b)該病原性抗原分子に結合する抗原認識部分をそれぞれ含み、該病原性抗原分子の中和において、該複数のものと相乗作用的であることを特徴とする、１つ以上のモノクローナル抗体；が２つ以上の容器に入っているキット。
【請求項７５】
前記複数の異なる二重特異性分子は、異なる第２の抗原認識部分を有する少なくとも２つの異なる二重特異性分子を含む、請求項７２、７３または７４に記載のキット。
【請求項７６】
前記複数の異なる二重特異性分子は、異なる第２の抗原認識部分を有する少なくとも10の異なる二重特異性分子を含む、請求項７２、７３または７４に記載のキット。
【請求項７７】
前記複数の異なる二重特異性分子は、異なる第２の抗原認識部分を有する少なくとも100の異なる二重特異性分子を含む、請求項７２、７３または７４に記載のキット。
【請求項７８】
前記複数のうちの前記第１の抗原認識部分が、抗CR1モノクローナル抗体を含む、請求項７２、７３または７４に記載のキット。
【請求項７９】
前記複数の二重特異性分子が、異なる第１の抗原認識部分を含む異なる二重特異性分子を含む、請求項７２、７３または７４に記載のキット。
【請求項８０】
前記複数のうちの前記第２の抗原認識部分が、モノクローナル抗体を含む、請求項７２、７３または７４に記載のキット。
【請求項８１】
前記複数の二重特異性分子は、同じ病原体の異なるエピトープに対して異なる抗原認識特異性を有する異なる第２の抗原認識部分を含む二重特異性分子を含む、請求項８０に記載のキット。
【請求項８２】
前記複数の二重特異性分子が前記集団の少なくとも10％を構成する、請求項７２、７３または７４に記載のキット。
【請求項８３】
前記複数の二重特異性分子が前記集団の少なくとも20％を構成する、請求項７２、７３または７４に記載のキット。
【請求項８４】
前記複数の二重特異性分子が前記集団の少なくとも50％を構成する、請求項７２、７３または７４に記載のキット。
【請求項８５】
前記複数の二重特異性分子が前記集団の少なくとも80％を構成する、請求項７２、７３または７４に記載のキット。
【請求項８６】
前記複数の二重特異性分子が前記集団の少なくとも90％を構成する、請求項７２、７３または７４に記載のキット。
【請求項８７】
前記複数の二重特異性分子が前記集団の少なくとも95％を構成する、請求項７２、７３または７４に記載のキット。
【請求項８８】
前記複数のうちの単一の二重特異性分子が80％を超える割合で存在することはない、請求項７２、７３または７４に記載のキット。
【請求項８９】
前記複数のうちの単一の二重特異性分子が60％を超える割合で存在することはない、請求項７２、７３または７４に記載のキット。
【請求項９０】
前記複数のうちの単一の二重特異性分子が50％を超える割合で存在することはない、請求項７２、７３または７４に記載のキット。
【請求項９１】
１つ以上の二重特異性分子とそれぞれ結合した造血細胞の集団から本質的になり、該二重特異性分子はそれぞれ、病原性抗原分子に結合する異なる第２の抗原認識部分に架橋した、C3b様受容体に結合する第１の抗原認識部分を含む、改変型造血細胞の集団であって、該改変型造血細胞の集団に結合した該二重特異性分子は、異なる第２の抗原認識部分を含む二重特異性分子の集団を形成することを特徴とする、改変型造血細胞の集団。
【請求項９２】
複数の異なる二重特異性分子を含み、該複数のうちの各二重特異性分子は、病原体または病原性抗原分子に結合する異なる免疫グロブリン分子に架橋した、C3b様受容体に結合する第１の抗原認識部分を含む、二重特異性分子のポリクローナル集団。
【請求項９３】
前記第１の抗原認識部分は、抗CR1モノクローナル抗体を含む、請求項９２に記載の二重特異性分子のポリクローナル集団。
【請求項９４】
前記複数の二重特異性分子は、異なる第１の抗原認識部分を含む異なる二重特異性分子を含む、請求項９２に記載の二重特異性分子のポリクローナル集団。
【請求項９５】
前記異なる免疫グロブリン分子が、同じ病原体または病原性抗原分子の異なるエピトープに対して異なる抗原認識特異性を有することを特徴とする、請求項９２に記載の二重特異性分子のポリクローナル集団。
【請求項９６】
前記異なる免疫グロブリン分子が、病原体または病原性抗原分子の異なる変異体に対して異なる抗原認識特異性を有することを特徴とする、請求項９２に記載の二重特異性分子のポリクローナル集団。
【請求項９７】
前記異なる免疫グロブリン分子が、異なる病原体または病原性抗原分子に対して異なる抗原認識特異性を有することを特徴とする、請求項９２に記載の二重特異性分子のポリクローナル集団。
【請求項９８】
前記病原体または病原性分子の中和において相乗作用的な二重特異性分子を含む、請求項９２に記載の二重特異性分子のポリクローナル集団。
【請求項９９】
前記複数の二重特異性分子が前記集団の少なくとも10％を構成する、請求項９２〜９８のいずれか１項に記載の二重特異性分子のポリクローナル集団。
【請求項１００】
前記複数の二重特異性分子が前記集団の少なくとも20％を構成する、請求項９２〜９８のいずれか１項に記載の二重特異性分子のポリクローナル集団。
【請求項１０１】
前記複数の二重特異性分子が前記集団の少なくとも50％を構成する、請求項９２〜９８のいずれか１項に記載の二重特異性分子のポリクローナル集団。
【請求項１０２】
前記複数の二重特異性分子が前記集団の少なくとも80％を構成する、請求項９２〜９８のいずれか１項に記載の二重特異性分子のポリクローナル集団。
【請求項１０３】
前記複数の二重特異性分子が前記集団の少なくとも90％を構成する、請求項９２〜９８のいずれか１項に記載の二重特異性分子のポリクローナル集団。
【請求項１０４】
前記複数のうちの95％を超える割合を有する単一の二重特異性分子はない、請求項９２〜９８のいずれか１項に記載の二重特異性分子のポリクローナル集団。
【請求項１０５】
前記複数のうちの単一の二重特異性分子が80％を超える割合で存在することはない、請求項９２〜９８のいずれか１項に記載の二重特異性分子のポリクローナル集団。
【請求項１０６】
前記複数のうちの単一の二重特異性分子が60％を超える割合で存在することはない、請求項９２〜９８のいずれか１項に記載の二重特異性分子のポリクローナル集団。
【請求項１０７】
前記複数のうちの単一の二重特異性分子が50％を超える割合で存在することはない、請求項９２〜９８のいずれか１項に記載の二重特異性分子のポリクローナル集団。
【請求項１０８】
前記複数の異なる二重特異性分子が、少なくとも２つの異なる二重特異性分子を含む、請求項９２〜９８のいずれか１項に記載の二重特異性分子のポリクローナル集団。
【請求項１０９】
前記複数の異なる二重特異性分子が、少なくとも10の異なる二重特異性分子を含む、請求項９２〜９８のいずれか１項に記載の二重特異性分子のポリクローナル集団。
【請求項１１０】
前記複数の異なる二重特異性分子が、少なくとも100の異なる二重特異性分子を含む、請求項９２〜９８のいずれか１項に記載の二重特異性分子のポリクローナル集団。
【請求項１１１】
前記集団が精製されている、請求項９２〜９８のいずれか１項に記載の二重特異性分子のポリクローナル集団。
【請求項１１２】
前記複数のうちの二重特異性分子が、同じ高力価免疫血清から得られた免疫グロブリン分子を含む、請求項９２〜９８のいずれか１項に記載の二重特異性分子のポリクローナル集団。
【発明の詳細な説明】
【発明の分野】
【０００１】
１．発明の属する技術分野
本出願は、2001年3月15日に出願された米国仮特許出願第60/276,200号(参照により本明細書に全体的に援用する)の恩典を受けることを主張する。
【０００２】
本発明は、複数の異なる二重特異性分子を含む二重特異性分子のポリクローナル集団であって、該二重特異性分子はそれぞれ、C3b様受容体に結合する第１の抗原認識部分、および病原性抗原分子に結合する異なる第２の抗原認識部分を含んで、該集団は複数の異なる抗原認識特異性を含む、ポリクローナル集団に関する。本発明は、このような二重特異性分子のポリクローナル集団を産生する方法にも関する。本発明はさらに、このような二重特異性分子のポリクローナル集団を、哺乳動物の循環器系から病原体を排除するために使用する方法に関する。
【発明の背景】
【０００３】
２．発明の背景
霊長類赤血球、すなわちRBCは、循環器系からの抗原の排除において重要な役割を果たす。循環器系における免疫複合体の形成により、霊長類における補体因子C3bが活性化され、C3bと免疫複合体との結合を生じる。C3b/免疫複合体は、次に、免疫複合体に付着したC3b分子を介して、赤血球の表面上に発現された１型補体受容体(CR1)、すなわちC3b受容体に結合する。次いで、免疫複合体は、肝臓および脾臓中の細網内皮系(RES)まで、赤血球に付き添われて、中和される。RES細胞、特にクッパー細胞と呼ばれる肝臓中の固定性組織マクロファージは、C3b/免疫複合体を認識し、C3b受容体-RBC接合体として作用することによりRBCからのこの複合体を外し、遊離化された赤血球およびC3b/免疫複合体を産生して、その後これはクッパー細胞により飲み込まれ、クッパー細胞の亜細胞小器官内で完全に破壊される。しかし、この病原体排除プロセスは、補体依存性であり、すなわち、C3b受容体により認識される免疫複合体に限定されており、C3b受容体により認識されない免疫複合体を除去するには無効である。
【０００４】
Taylorらは、補体に依存しない、循環器系からの病原体の除去方法を発見した。Taylorらは、霊長類C3b受容体に特異的な第１のモノクローナル抗体(mAb)と、病原性抗原分子に特異的な第２のモノクローナル抗体との化学的架橋が、補体活性化無しで、病原性抗原分子を霊長類のC3b受容体に結合させるメカニズムを提供する二重特異性ヘテロ重合体抗体を作製することを示した。(米国特許第5,487,890号；同第5,470,570号；および同第5,879,679号)。抗C3b受容体mAbのFc部分が、赤血球-免疫複合体の受容細胞への移動、そしてその後の赤血球-免疫複合体のタンパク質分解に重要な役割を果たすことが分かっている(Nardinら, 1999, Molecular Immunology 36:827-835)。Taylorらは、この複合体に依存しないプロセスにより、自然の哺乳動物における通常の補体依存性プロセスによる約10〜15％と比べて、99％を超える病原体を循環器から除去できることを示している。
【０００５】
しかし、特定の病原体は、非常に変異しやすいか、構造が不均一か、それらの両方である。単一の抗原認識特異性を有する二重特異性分子は、通常、このような１つ以上の病原体の排除のためには不足である。例えば、HIV-1は非常に変異しやすいウイルスであり、HIV-1感染の過程の間に、感染した個体において産生した抗体は、一部には中和回避(escape)変異体の早い出現のせいで、永久的な保護効果をもたらさない(Thaliら, 1992, J. Acquired Immune Deficiency Syndromes 5:591-599)。このような場合、複数の感染ドナーの血漿から得た高力価抗HIV IgG調製物等の、抗体のポリクローナル調製物が、幅広い範囲のHIV単離体の認識および中和において特定の利点をもたらすことが示されている(Cumminsら, 1991, Blood 77:1111-1117；Lambertら, 1997, J. Infectious Diseases 175:283-291)。また、このようなポリクローナル調製物中に存在する抗体が、中和に加えて、NK細胞に結合して抗体依存性細胞障害性を生じて、感染細胞を溶解し、ウイルスの細胞から細胞への転移を妨げ得る等の活性を有し得ることも示唆されている。クレブシエラ菌(bacilli Klebsiella)等の、他の病原体に対するポリクローナル高力価免疫グロブリン調製物も実証されている(例えば、Cryzら, 1986, J Lab Clin Med 108:182-9)。
しかし、幅広いスペクトルの特異性を得たが、ポリクローナル調製物の効力はさらに向上させることができる。病原体に対してポリクローナル抗体集団を使用する戦略のより最近の開発も、病原体に対して患者を保護するのに相乗作用的な抗体の集団を産生することにより、ポリクローナル抗体集団の有効性をさらに改善することに焦点を当てている(Laalら, 1994, J. Virol. 68:4001-4008；Burklyら, J. Virol. 69:4267-4273；Vijh-Warrierら, 1996, J. Virol. 70:4466-4473；Mascolaら, 1997, J. Virol. 71:7198-7206；Schaeferら, 2000, Infection and Immunity 68:2608-2616)。例えば、HIV-1の場合、HIV-1エンベロープ糖タンパク質中に４つの主要な中和エピトープクラスター(すなわち、V3ループ、CD4結合部位、gp120中のV2ドメイン、およびgp41中の2F5 mAb規定部位)があることが知られている(Vijh-Warrierら, 1996, J. Virol. 70:4466-4473)。HIV-1ウイルスの相乗作用的中和は、２つ以上のこれらの主要エピトープクラスターに対する特異性を有するモノクローナル抗体の組み合わせ(V2ドメイン、V3ループおよびCD4結合部位を標的化する３つのmAb調製物を含む)を使用して実証されている。(Laalら, 1994, J. Virol. 68:4001-4008；Burklyら, J. Virol. 69:4267-4273；Vijh-Warrierら, 1996, J. Virol. 70:4466-4473；Thaliら, 1992, J. Acquired Immune Deficiency Syndromes 5:591-599)。相乗作用のメカニズムは、いまだに完全には理解されていない。しかし、抗V3ループ抗体の結合により、抗CD4抗体による中和に対し耐性な変異体に対してさえも、抗CD4抗体による中和に対する感受性を高めることができることが分かっている(Thaliら, 1992, J. Acquired Immune Deficiency Syndromes 5:591-599)。これは、異なるエピトープを標的化する複数の抗体による作用が、単純な付加的な効果以上の潜在的な便益を有し得ることを示唆する。また、ポリクローナル高力価抗HIV免疫グロブリン調製物と、２つのモノクローナル抗体(gp120とb-ケモカイン受容体CCR5との相互作用を阻害するモノクローナル抗体、およびgp41融合ドメインに作用するモノクローナル抗体)との組み合わせは、多様なHIV変異体による感染に対して相乗作用的な保護効果を示すことも分かっている(Mascolaら, 1997, J. Virol. 71:7198-7206)。この場合の相乗作用は、２つのmAbの補完的活性、および機能的に多様なスペクトルの高力価抗HIV免疫グロブリン調製物の結果であると示唆されている。このアプローチはまた、ポリクローナル集団の組成を、特定の条件下での保護を最大化するように調整できる等(例えば、特定の患者または患者集団の特定の必要性に応じて調整される)、より適合可能であるというさらなる利点も有する。
【０００６】
従って、病原体を除去するために二重特異性分子を使用することの潜在力を完全に利用するためには、例えば、標的病原体上の複数のエピトープおよび/または標的病原体の複数の変異体に対する複数の特異性を含む二重特異性分子の集団を産生する必要がある。病原体の複数のエピトープおよび/または複数の変異体を標的化することで、二重特異性分子のポリクローナル集団は、より高い変異率を有する病原体の排除においても有利である。なぜなら、１つを上回るエピトープにおける同時突然変異はそれほど頻繁ではないからである。このような二重特異性分子の集団はまた、病原体の異種混合体を標的化および除去するためにも使用できる。
【０００７】
本明細書における参考文献の議論または引用は、このような参考文献が本発明の先行技術であることを認めるものと見なされるべきではない。
【０００８】
３．発明の要旨
本発明は、複数の異なる二重特異性分子を含む二重特異性分子のポリクローナル集団であって、該二重特異性分子はそれぞれ、病原性抗原分子に結合する異なる第２の抗原認識部分に架橋した、C3b様受容体に結合する第１の抗原認識部分を含む、ポリクローナル集団に関する。従って、上記集団は、複数の異なる抗原認識特異性を含む(例えば、１つ以上の病原体および/または１つ以上の病原性抗原分子の異なるエピトープおよび/または異なる変異体に対する)。二重特異性分子のポリクローナル集団は、C3b様受容体に結合する第１の抗原認識部分を、複数の異なる特異性を含む第２の抗原認識部分のポリクローナル集団の各メンバーと架橋させることにより産生する。
【０００９】
本発明のポリクローナル集団中の複数の二重特異性分子中の二重特異性分子中の第１の抗原認識部位は、C3b様受容体結合ドメイン、そして好ましくはエフェクタードメインを含む任意の分子またはその断片であり得る。好適な実施形態では、第１の抗原認識部分は、抗CR1モノクローナル抗体を含む。第１の抗原認識部分はまた、Fcドメインに融合した一本鎖Fvフラグメント、またはC3b様受容体結合ドメインおよびエフェクタードメインを含むキメラ抗体でもあり得る。
【００１０】
本発明のポリクローナル集団中の複数の二重特異性分子中の二重特異性分子の第２の抗原認識部分は、病原性抗原分子(任意の抗体またはその抗原結合フラグメントが挙げられるがこれらに限定されない)を認識して結合する任意の分子部分であり得る。第２の抗原認識部分はまた、排除する病原性抗原分子により認識して結合される任意の分子部分であり得る。本発明のポリクローナル集団は、例えば１つ以上の病原体上の複数の認識部位に対する特異性を有する異なる第２の抗原認識部分を有する、複数の異なる二重特異性分子を含む。限定しない例として、二重特異性分子の集団は、病原体上の異なるエピトープを認識して結合する複数の異なる第２の抗原認識部分を有し得る。二重特異性分子の集団は、病原体上の同じエピトープを認識して結合する複数の異なる第２の抗原認識部分も有し得る。
【００１１】
本発明の好適な実施形態では、本発明のポリクローナル集団中の複数の二重特異性分子中の各二重特異性分子は、目的の抗原性病原体分子を認識して結合する異なる第２の抗原認識部分に架橋した抗CR1 mAbを含む。本発明のより好適な実施形態では、本発明のポリクローナル集団中の複数の二重特異性分子中の各二重特異性分子は、目的の抗原性病原体分子を認識して結合する異なるmAbに架橋した抗CR1 mAbを含む。さらに好適な実施形態では、本発明のポリクローナル集団中の複数の二重特異性分子中の各二重特異性分子は、目的の抗原性病原体分子を認識して結合する異なる免疫グロブリン分子に架橋した抗CR1 mAbを含む。
【００１２】
ポリクローナル集団中の複数の二重特異性分子中の各二重特異性分子のメンバーの特徴および機能は、既知でも未知でもあり得る。ポリクローナル集団中の複数の二重特異性分子中の各二重特異性分子メンバーの正確な割合も既知でも未知でもあり得る。ポリクローナル集団中の複数の二重特異性分子中の少なくともいくらかの二重特異性分子メンバーの特徴および割合は既知であって、従って、所望の場合には、このようなメンバーの正確な割合を、最適な治療的および/または予防的効力のために調整できることが好ましい。二重特異性分子のポリクローナル集団は、１つ以上の標的病原性抗原分子に結合しない二重特異性分子を含み得る。例えば、二重特異性分子の集団は、標的病原体上のもの以外の抗原分子に結合する抗体を含む高力価免疫血清から調製され得る。ポリクローナル集団中の複数の二重特異性分子は、集団の少なくとも10％、20％、50％または80％を構成することが好ましい。ポリクローナル集団中の複数の二重特異性分子は、集団の少なくとも90％を構成することがより好ましい。二重特異性分子のポリクローナル集団中の複数の二重特異性分子は、複数のうちの90％、80％または50％を超える割合を有する任意の単一の二重特異性分子を含まないことが好ましい。二重特異性分子のポリクローナル集団中の複数の二重特異性分子は、複数のうちの20％を超える割合を有する任意の単一の二重特異性分子を含まないことがより好ましい。ポリクローナル集団中の複数の二重特異性分子は、異なる抗原認識特異性を有する少なくとも２つの異なる二重特異性分子を含む。ポリクローナル集団中の複数の二重特異性分子は、異なる抗原認識特異性を有する少なくとも10の異なる二重特異性分子を含むことが好ましい。ポリクローナル集団中の複数の二重特異性分子は、異なる抗原認識特異性を有する少なくとも100の異なる二重特異性分子を含むことが好ましい。ポリクローナル集団は、ポリクローナル免疫グロブリン調製物等(ただしこれに限定されない)の抗原認識部分の適切なポリクローナル集団から生成され得る。ポリクローナル集団中の各二重特異性分子は、他の二重特異性分子の活性を阻害または損なわないことが好ましい。ポリクローナル集団中の１つ以上の二重特異性分子は、病原体中和において、ポリクローナル集団中の複数の二重特異性分子と相乗作用的であることがより好ましい。ポリクローナル集団中の１つ以上の二重特異性分子は、１つ以上の他の二重特異性分子の有効性を増強することが最も好ましい。
【００１３】
別の実施形態では、本発明は、１つ以上の二重特異性分子にそれぞれ結合する造血細胞の集団から本質的になる改変型造血細胞の集団であって、該二重特異性分子のそれぞれは、病原性抗原分子に結合する異なる第２の抗原認識部分に架橋した、C3b様受容体に結合する第１の抗原認識部分を含み、該改変型造血細胞の集団に結合した該二重特異性分子は、異なる第２の抗原認識部分を含む二重特異性分子の集団を形成する、改変型造血細胞の集団を提供する。
【００１４】
本発明の二重特異性分子のポリクローナル集団は、化学架橋剤により、抗CR1部分の集団を、抗原認識部分のポリクローナル集団と架橋させることを含む方法により調製される。任意の標準的化学架橋方法が、本発明において使用できる。例えば、架橋剤としては、プロテインＡ、グルタルアルデヒド、カルボジイミド、N-スクシンイミジル-S-アセチル-チオアセテート(SATA)、N-スクシンイミジル-3-(2-ピリジルジチオ)プロピオン酸塩(SPDP)、およびスルホスクシンイミジル4-(N-マレイミドメチル)シクロヘキサン-1-カルボン酸塩(スルホ-SMCC)が使用できる。好適な実施形態では、架橋剤N-スクシンイミジルS-アセチルチオアセテート(SATA)、およびスルホスクシンイミジル4-(N-マレイミドメチル)シクロヘキサン-1-カルボン酸塩(スルホ-SMCC)を使用して、抗CR1部分の集団を、抗原認識部分のポリクローナル集団と架橋させる。別の好適な実施形態では、N-スクシンイミジル3-(2-ピリジルジチオ)プロピオン酸塩(SPDP)を使用して、抗CR1部分の集団と、抗原認識部分のポリクローナル集団とを架橋させる。
【００１５】
本発明は、１つ以上の病原体の存在を伴う疾患もしくは障害または所望でない症状を有する哺乳動物の治療方法を提供する。本発明の方法は、哺乳動物に、複数の異なる二重特異性分子を含む二重特異性分子のポリクローナル集団を治療に有効な用量投与することを含む方法であって、該複数のうちの二重特異性分子はそれぞれ、１つ以上の病原性抗原分子に結合する異なる第２の抗原認識部分に架橋した、C3b様受容体に結合する第１の抗原認識部分を含み、従って、該ポリクローナル集団は、例えば、病原体もしくは病原性抗原分子上の複数の認識部位、または病原体もしくは病原性抗原分子の複数の変異体に対する複数の抗原認識特異性を有する複数の異なる二重特異性分子を含むことを特徴とする方法である。本発明はまた、哺乳動物における１つ以上の病原体の存在を伴う疾患もしくは障害または所望でない症状の予防方法も提供する。本方法は、上記疾患もしくは障害または所望でない症状の発症前に、哺乳動物に、複数の異なる二重特異性分子を含む二重特異性分子のポリクローナル集団を予防に有効な用量投与することを含む方法であって、該複数うちの二重特異性分子はそれぞれ、１つ以上の病原性抗原分子に結合する異なる第２の抗原認識部分に架橋した、C3b様受容体に結合する第１の抗原認識部分を含み、従って、該ポリクローナル集団は、例えば、病原体もしくは病原性抗原分子上の複数の認識部位、または病原体もしくは病原性抗原分子の複数の変異体に対する複数の抗原認識特異性を有する複数の異なる二重特異性分子を含む、方法である。
【００１６】
４．図面の簡単な説明
図面の簡単な説明については、後述する。
【００１７】
５．発明の詳細な説明
本発明は、複数の二重特異性分子を含む二重特異性分子のポリクローナル集団に関し、該二重特異性分子はそれぞれ、病原性抗原分子に結合する異なる第２の抗原認識部分に架橋した、C3b様受容体に結合する第１の抗原認識部分を含む。従って、上記集団は、例えば、異なる病原性抗原分子(例えば、１つ以上の病原体の異なるエピトープおよび/または異なる変異体)に対する複数の抗原認識特異性を有する複数の異なる二重特異性分子を含む。二重特異性分子のポリクローナル集団は、C3b様受容体と結合する第１の抗原認識部分を、複数の異なる特異性を有する異なる第２の抗原認識部分のポリクローナル集団の各メンバーと架橋させることにより産生される。本発明は、化学架橋法により、二重特異性分子のポリクローナル集団を産生する方法にも関する。本発明はさらに、本発明の二重特異性分子のポリクローナル集団を、１つ以上の病原体および/または１つ以上の病原性抗原分子(複数のエピトープおよび/または複数の変異体を有する病原体、ならびに病原体もしくは病原性抗原分子の異種混合物等)を排除するために使用する方法にも関する。
【００１８】
二重特異性分子は、一般的に、２つ以上の異なる抗原認識特異性を有する分子を指す。本発明の二重特異性分子は、循環器から排除される、C3b様受容体に結合する第１の抗原認識部分(霊長類中の１型補体受容体等)、および病原性抗原分子に結合する第２の抗原認識部分(病原体のエピトープが挙げられるがこれに限定されない)を有する分子を指す。本発明では、第１および第２の抗原認識部分は、化学架橋剤により連結される。
【００１９】
本明細書で使用する「抗原認識部分」という用語は、病原性抗原分子を認識して結合するか、あるいはまた、病原性抗原分子により認識されて結合される、分子部分を指す。分子部分は、抗原結合ドメインおよびエフェクタードメインを含むことができる。エフェクタードメインは、血液細胞-免疫複合体(霊長類中の赤血球-免疫複合体等)がタンパク質分解のために受容細胞へ移動するのを円滑にする分子部分の一部を指す。例えば、エフェクタードメインは、mAbのFcドメイン(すなわち、重鎖のヒンジ領域、CH2ドメインおよびCH3ドメインを含み得る。あるいはまた、エフェクタードメインは、CH2ドメインおよびCH3ドメインが逆順になったFcドメイン(すなわち、CH2ドメインのアミノ末端側にCH3ドメインが見とめられる)を含み得る。
【００２０】
本明細書で使用する「分子部分」という用語は、任意の分子またはその断片を指し、ペプチドおよびポリペプチド、核酸、オリゴ糖、有機小分子、ならびにこれらの任意の組み合わせが挙げられるがこれらに限定されない。
【００２１】
本明細書で使用する「C3b様受容体」という用語は、免疫複合体に会合した分子に結合してから、例えば食細胞まで血液細胞に付き添われて排除されるという点で霊長類C3b受容体(CR1)に似た機能を有する、哺乳動物血液細胞の表面上に発現される任意の哺乳動物循環分子を指す。哺乳動物血液細胞は、霊長類赤血球(red-blood cell or erythrocyte)であり得るが、これに限定されない。
【００２２】
本明細書で使用する、本発明の二重特異性分子のポリクローナル集団とは、複数の異なる二重特異性分子(それぞれ、病原性抗原分子に結合する異なる第２の抗原認識部分に架橋した、C3b様受容体に結合する第１の抗原認識部分を含む)を含む任意の集団を広い意味で指す。従って、上記集団は、複数の異なる抗原認識特異性を有する複数の異なる二重特異性分子を含む。複数の異なる第２の抗原認識部分は、病原体上の同じエピトープを認識して結合し得る。複数の異なる抗原認識特異性は、病原体上の複数の異なるエピトープに対するものであり得る。複数の異なる抗原認識特異性が、病原体上の複数の異なるエピトープに対する場合、ポリクローナル集団中の少なくとも一部の二重特異性分子メンバーが相乗作用的に作用することが好ましい。複数の異なる抗原認識特異性はまた、病原体の複数の変異体に対するものであり得る。複数の異なる抗原認識特異性は、さらに複数の異なる病原体に対するものであり得る。複数の異なる抗原認識特異性は、さらに複数の異なる病原体上の複数の異なるエピトープに対するものであり得る。ポリクローナル集団中の複数の二重特異性分子中の二重特異性分子メンバーそれぞれの特徴および機能は、既知であっても未知であってもよい。ポリクローナル集団中の複数の二重特異性分子中での二重特異性分子メンバーのそれぞれの正確な割合も、既知であっても未知であってもよい。ポリクローナル集団中の複数の二重特異性分子の少なくとも一部の二重特異性分子メンバーの特徴および割合が既知であり、従って、所望の場合に、このようなメンバーの正確な割合を、最適な治療的および/または予防的効力のために調整できることが好ましい。二重特異性分子のポリクローナル集団は、１つ以上の標的病原性抗原分子に結合しない二重特異性分子を含み得る。例えば、二重特異性分子の集団は、標的病原体上のもの以外の抗原分子に結合する抗体を含む高力価免疫血清から調製され得る。ポリクローナル集団中の複数の二重特異性分子は、集団の少なくとも１％、５％、10％、20％、50％または80％を構成することが好ましい。ポリクローナル集団中の複数の二重特異性分子は、集団の少なくとも90％を構成することがより好ましい。二重特異性分子のポリクローナル集団中の複数の二重特異性分子は、複数のうちの95％、80％または60％を超える割合を有するいかなる単一の二重特異性分子をも含まないことが好ましい。二重特異性分子のポリクローナル集団中の複数の二重特異性分子は、複数のうちの50％を超える割合を有するいかなる単一の二重特異性分子をも含まないことがより好ましい。ポリクローナル集団中の複数の二重特異性分子は、異なる抗原認識特異性を有する少なくとも２つの異なる二重特異性分子を含む。ポリクローナル集団中の複数の二重特異性分子は、異なる抗原認識特異性を有する少なくとも10の異なる二重特異性分子を含むことが好ましい。ポリクローナル集団中の複数の二重特異性分子は、異なる抗原認識特異性を有する少なくとも100の異なる二重特異性分子を含むことがより好ましい。ポリクローナル集団は、抗原認識部分の適切なポリクローナル集団(ポリクローナル免疫グロブリン調製物が挙げられるがこれに限定されない)から産生されるポリクローナル��団であり得る。
【００２３】
本明細書で使用する「エピトープ」は、抗原決定基(すなわち、宿主中で免疫学的応答を誘発するか、または抗体に結合された分子の領域)を指す。この領域は、連続したアミノ酸を含んでもよいが、必ずしも必要ではない。エピトープという用語は、当該分野において「抗原決定基」としても知られている。エピトープは、空間的コンホメーション中に少なくて３つのアミノ酸を含み得、これは、宿主の免疫系に固有のものである。一般的に、エピトープは、少なくとも５つのこのようなアミノ酸、より通常は少なくとも8〜10のこのようなアミノ酸からなる。このようなアミノ酸の空間的コンホメーションを決定する方法は、当該分野で公知である。
【００２４】
本明細書で使用する「相乗作用的な治療または予防効果」とは、二重特異性分子のポリクローナル集団中の１つ以上の二重特異性分子を含むことで、病原体または病原性抗原分子の中和において相乗作用的な効果をもたらす(すなわち、この組み合わせが、単純な付加的効果以上の中和能力を有する)ことを意味する。ポリクローナル集団中の各メンバーは、部位に結合する上で他のメンバーと競合しないこと、および/または病原体もしくは病原性抗原分子の中和において他のメンバーの活性を阻害もしくは損なわないことが好ましい。ポリクローナル集団の１メンバーの作用により、他のメンバーの有効性が増強されることがより好ましい。
【００２５】
５．１．二重特異性分子
本発明では、二重特異性分子のポリクローナル集団は、病原性抗原分子に結合する第２の抗原認識部分に架橋した、C3b様受容体に結合する第１の抗原認識部分をそれぞれが含む複数の二重特異性分子を含む。
【００２６】
本発明のポリクローナル集団中の複数の二重特異性分子の二重特異性分子の第１の抗原認識部分は、C3b様受容体結合ドメイン、そして好ましくはエフェクタードメインを含む任意のポリペプチドであり得る。好適な実施形態では、第１の抗原認識部分は、抗CR1 mAbである。別の実施形態では、第１の抗原認識部分は、抗CR1ポリペプチド抗体である(免疫グロブリンFcドメインのＮ末端に融合した、C3b様受容体に対して特異性を有する一本鎖可変領域フラグメント(scFv)が挙げられるがこれに限定されない)。第１の抗原認識部分は、相補性決定領域が非ヒト種(例えば、マウス)に由来し、フレームワーク領域がヒトであって、抗体で治療されるヒト患者における免疫応答の可能性を低下させるヒト化モノクローナル抗体等(ただしこれに限定されない)のキメラ抗体でもあり得る(米国特許第4,816,567号、同第4,816,397号、同第5,693,762号；同第5,585,089号；同第5,565,332号および同第5,821,337号(これらは、参照により本明細書に全体的に援用する))。キメラ抗体はまた、非ヒト定常ドメインをヒト定常ドメインと置き換えてもよい。キメラ抗体のFcドメインは、意図する患者の食細胞上のFc受容体により認識されて、RBC-免疫複合体の移動およびその後のタンパク質分解が円滑にされ得ることが好ましい。簡易化のために、本開示は、抗CR1抗原認識部分または抗CR1抗体に言及することが多いが、このような抗原認識部分または抗体は、C3b様受容体に結合する抗原認識部分または抗体を指すことが理解されよう。
【００２７】
本発明のポリクローナル集団中の複数の二重特異性分子の二重特異性分子の第２の抗原認識部分は、病原性抗原分子(例えば、天然型抗原)および/またはその任意の誘導体もしくは断片を認識して結合する任意の分子またはその断片であり得る。病原性抗原分子は、治療される被検体において有害または所望でない可能性のある循環器に存在する任意の物質(タンパク質、薬剤もしくは毒素、自己抗体もしくは自己抗原、または任意の感染剤の分子もしくはその生成物が挙げられるがこれらに限定されない)であり得る。病原性抗原分子は、疾患もしくは障害、または任意の他の所望でない症状の原因である物質(例えば病原体)であるかまたはその一部である抗原決定基を含む(あるいは結合ドメインにより結合され得る)任意の分子である。本発明の第２の抗原認識部分は、任意の種類の分子であり得る(ペプチドおよびポリペプチド、核酸、オリゴ糖、ならびに有機小分子が挙げられるがこれらに限定されない)。本発明のポリクローナル集団は、病原体の複数の異なる認識部位および/または複数の異なる病原体に対する特異性を有する複数の異なる第２の抗原認識部分を含む。限定しない例として、二重特異性分子の集団は、病原体上の異なるエピトープを認識して結合する複数の異なる第２の抗原認識部分を有し得る。しかし、所望であれば、二重特異性分子の集団は、病原体または病原性抗原分子上の同じエピトープを認識して結合する複数の異なる第２の抗原認識部分を有してもよい。
【００２８】
本発明の好適な実施形態では、本発明のポリクローナル集団中の複数の二重特異性分子中の各二重特異性分子は、異なる第２の抗原認識部分に架橋した抗CR1 mAbを含む。第２の抗原認識部分は、抗原結合ドメイン、エピトープ、核酸、または有機小分子であり得るがこれらに限定されない。より好適な実施形態では、本発明のポリクローナル集団中の複数の二重特異性分子中の各二重特異性分子は、病原体のエピトープ等(ただしこれに限定されない)の抗原分子を認識して結合するmAbに架橋した抗CR1 mAbを含む。
【００２９】
本発明の別の実施形態では、本発明のポリクローナル集団中の複数の二重特異性分子中の各二重特異性分子は、抗原認識部分に架橋した抗CR1ポリペプチド抗体(免疫グロブリンFcドメインのＮ末端に融合した、C3b様受容体に対して特異性を有するscFvが挙げられるがこれに限定されない)を含む。抗原認識部分は、抗原結合ドメイン(例えば、抗原結合mAb)、エピトープ、核酸、または有機小分子であり得るがこれらに限定されない。
【００３０】
５．２．二重特異性分子のポリクローナル集団
本発明では、二重特異性分子のポリクローナル集団は、5.1節に記載したように、複数の異なる抗原認識特異性を有する複数の二重特異性分子を含む。複数の異なる抗原認識特異性は、同じ病原体の複数の異なるエピトープに対するものであり得る。複数の異なる抗原認識特異性が、同じ病原体または病原性抗原分子上の複数の異なるエピトープに対する場合、ポリクローナル集団中の一部の二重特異性分子が、病原体または病原性抗原分子の中和において、ポリクローナル集団中の複数の二重特異性分子中の二重特異性分子と相乗作用的に作用することが好ましい。複数の異なる抗原認識特異性は、病原体および/または複数の異なる病原体の複数の変異体に対するものであり得る。複数の異なる抗原認識特異性は、さらに病原体および/または複数の異なる病原体の複数の異なる変異体上の複数の異なるエピトープに対するものであり得る。
【００３１】
ポリクローナル集団中の複数の二重特異性分子中の各二重特異性分子の特徴および機能は、既知であっても未知であってもよい。複数のうち少なくとも一部の二重特異性分子の特徴および機能は既知で、従って、所望の場合に、複数のうちのこのような二重特異性分子の割合が、最適な治療的および/または予防的効力のために調整できることが好ましい。複数の二重特異性分子中の各二重特異性分子の特徴および機能が既知であることがより好ましい。複数のうちの各二重特異性分子は、他の二重特異性分子の機能を阻害したり損なったりしないことが好ましい。限定しない例として、集団中の二重特異性分子と、その結合エピトープとの結合は、集団中の１つ以上の他の異なる二重特異性分子の結合親和性を低下させ得るような他の異なるエピトープにおけるコンホメーションの変化を起こさない。集団中の１つ以上の二重特異性分子の活性は、目的の病原体または病原性抗原分子の中和において、集団中の複数の二重特異性分子中の１つ以上の二重特異性分子の活性と相乗作用的であることが最も好ましい。
【００３２】
ポリクローナル集団中での複数の二重特異性分子中の二重特異性分子の正確な割合もまた、既知であっても、未知であってもよい。ポリクローナル集団中の複数の二重特異性分子中の二重特異性分子の正確な割合は既知で、従って、所望の場合に、最適な治療的および/または予防的効力のために集団を調整できることが好ましい。二重特異性分子のポリクローナル集団は、１つ以上の標的病原性抗原分子に結合しない二重特異性分子を含み得る。例えば、二重特異性分子の集団は、標的病原体上にあるもの以外の抗原分子に結合する抗体を含む高力価免疫血清から調製され得る。ポリクローナル集団中の複数の二重特異性分子は、集団の少なくとも1％、5％、10％、20％、50％または80％を構成することが好ましい。ポリクローナル集団中の複数の二重特異性分子中の複数の二重特異性分子は、集団の少なくとも90％を構成することがより好ましい。二重特異性分子のポリクローナル集団中の複数の二重特異性分子は、集団中の複数の二重特異性分子の95％、80％または60％を超える割合の任意の単一の二重特異性分子を含まないことが好ましい。二重特異性分子のポリクローナル集団中の複数の二重特異性分子は、集団中の複数の二重特異性分子の50％を超える割合の任意の単一の二重特異性分子を含まないことがより好ましい。ポリクローナル集団中の複数の二重特異性分子は、異なる抗原認識特異性を有する少なくとも２つの異なる二重特異性分子を含む。ポリクローナル集団中の複数の二重特異性分子は、異なる抗原認識特異性を有する少なくとも10の異なる二重特異性分子を含むことが好ましい。ポリクローナル集団中の複数の二重特異性分子は、異なる抗原認識特異性を有する少なくとも100の異なる二重特異性分子を含むことがより好ましい。
【００３３】
二重特異性分子のポリクローナル集団は、ポリクローナル免疫グロブリン調製物から産生され得る。二重特異性分子のポリクローナル集団は、抗原認識部分の適切なポリクローナルライブラリーから産生される二重特異性分子のポリクローナルライブラリーでもあり得る。二重特異性分子のポリクローナル集団は、さらに、異なるモノクローナル抗原認識部分のカクテル(cocktail)からも産生され得る。二重特異性分子の集団中の二重特異性分子は、当該分野で公知の任意の化学架橋法を使用して産生され得る。
【００３４】
５．３．二重特異性分子のポリクローナル集団の産生方法
本発明の二重特異性分子のポリクローナル集団は、１つ以上の病原性抗原分子に結合する抗原認識部分のポリクローナル集団を、C3b様受容体に結合する抗原認識部分の集団に架橋させることにより産生される。好適な実施形態では、二重特異性分子のポリクローナル集団全体を、１回の反応で産生できる。これは、通常、まず、抗原認識部分のポリクローナル集団を産生し、このような抗原認識部分の集団全体を、個々のメンバーを単離することなく、C3b様受容体結合部分の集団に架橋させることにより行うことができる。他の好適な実施形態では、ポリクローナル集団のメンバーおよび/または割合を別々に産生し、その後組み合わせて、ポリクローナル集団を形成することができる。このような実施形態は、特定の組成を有するポリクローナル集団を産生する場合に有用である。
【００３５】
５．３．１．抗CR1部分の産生
好適な実施形態では、二重特異性分子の抗CR1部分は、抗CR1 mAbを含む。ヒトC3b受容体に結合する抗CR1 mAbは、公知の方法により生成できる。一実施形態では、抗CR1 mAb、好ましくは抗CR1 IgGは、当該分野で公知の標準的なハイブリドーマ手順を使用して調製できる(例えば、KohlerおよびMilstein, 1975, Nature 256:495-497；Hoggら, 1984, Eur. J. Immunol. 14:236-243；O'Sheaら, 1985, J. Immunol. 134:2580-2587；Schreiber, 米国特許第4,672,044号を参照)。適切なマウスを、ヒト赤血球から精製され得るヒトCR1で免疫化する。免疫化マウスから得た脾臓細胞を、不死化マウス骨髄腫細胞系と融合させ、ハイブリドーマ細胞の集団(抗CR1抗体を産生するハイブリドーマを含む)を得る。次に、抗CR1抗体を産生するハイブリドーマを、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)等の従来技術を用いて、ハイブリドーマの集団から選択(すなわち「クローン化」)する。抗CR1 mAbを発現するハイブリドーマ細胞系は様々な入手先からも得ることができ、例えば、米国特許第4,672,044号に記載されているヒトCR1に結合するマウス抗CR1 mAbが、American Type Culture Collection (ATCC)からハイブリドーマ細胞系ATCC HB 8592として入手可能である。得られたハイブリドーマ細胞を、当該分野で公知の標準的な方法を用いて培養および洗浄する。次いで、抗CR1抗体を、上清から回収する。
【００３６】
他の実施形態では、抗CR1 mAb(好ましくは抗CR1-IgG)の重鎖および軽鎖をコードする核酸を、当該分野で公知の標準的な方法によりハイブリドーマ細胞系から調製する。限定しない例として、抗CR1 IgGの重鎖および軽鎖をコードするcDNAを、適切なプライマーを用いてmRNAをプライミングし、その後適切な順方向および逆方向プライマーを用いてPCR増幅を行うことにより調製する。cDNA合成用のあらゆる市販のキットが使用できる。核酸は、発現ベクターの構築に使用する。発現ベクターは、適切な宿主にトランスフェクトする。限定しない例として、大腸菌、酵母、昆虫細胞、および哺乳動物系(チャイニーズハムスター卵巣細胞系等)が挙げられる。抗体産生は、当該分野で公知の標準的な方法により誘導できる。
【００３７】
別の実施形態では、抗CR1 scFvを、当該分野で公知の標準的方法に従って調製する。一実施形態では、抗CR1キメラ抗体、およびこのような抗CR1キメラ抗体をコードする核酸を、当該分野で公知の標準的方法に従って調製する(米国特許第4,816,567号、同第4,816,397号、同第5,693,762号；同第5,585,089号；同第5,565,332号および同第5,821,337号(これらは参照により本明細書に全体的に援用する))。
【００３８】
抗CR1抗原認識部分は、標準的なファージ提示技術によっても生成できる。ファージ提示ライブラリーを産生およびスクリーニングするためのキットは市販されている(例えば、Pharmacia組換えファージ抗体系、カタログ番号27-9400-01；およびStratagene抗原SurfZAPTMファージ提示キット、カタログ番号240612)。さらに、抗体提示ライブラリーを産生およびスクリーニングするために使用するのに特に向いている方法および試薬の例は、例えば、米国特許第5,223,409号および同第5,514,548号；PCT公報第WO 92/18619号；PCT公報第WO 91/17271号；PCT公報第WO 92/20791号；PCT公報第WO 92/15679号；PCT公報第WO 93/01288号；PCT公報第WO 92/01047号；PCT公報第WO 92/09690号；PCT公報第WO 90/02809号；Fuchsら, 1991, Bio/Technology 9:1370-1372；Hayら, 1992, Hum. Antibod. Hybridomas 3:81-85；Huseら, 1989, Science 246:1275-1281；Griffithsら, 1993, EMBO J. 12:725-734に記載されている。
【００３９】
抗CR1部分は、その後、二重特異性分子のポリクローナル集団の産生に使用できる。
【００４０】
５．３．２．抗原認識部分のポリクローナル集団の産生および精製
１つ以上の病原体上の複数の認識部位に対する特異性を有する抗原認識部分のポリクローナル集団は、当該分野で公知の任意の方法により産生できる。例えば、病原体に対する高力価免疫血清調製物の調製方法が、本発明において使用できる。
【００４１】
５．３．２．１．動物の免疫化による産生
抗原認識部分のポリクローナル集団は、適切な動物(マウス、ウサギおよびウマが挙げられるがこれらに限定されない)の免疫化により産生できる。
【００４２】
典型的に抗原分子を含む(例えば、被検体から排除する１つ以上の病原体を伴う)免疫原性調製物を使用して、適切な被検体(例えば、ウサギ、ヤギ、マウスまたは他の哺乳動物)を免疫化することにより、抗体を調製する。適切な免疫原性調製物は、例えば、組換え発現されたまたは化学的に合成された抗原を含み得る。調製物は、アジュバント(フロイント完全もしくは不完全アジュバント)、または同様の免疫刺激剤をさらに含み得る。
【００４３】
免疫原として使用する単離された抗原、および単離された抗原断片は、抗原に対する抗体を生じるための免疫原としての使用に適している。免疫原としての使用に適した単離された抗原断片は、8アミノ酸、より好ましくは10アミノ酸、そしてさらにより好ましくは15アミノ酸の長さの抗原の少なくとも一部を含む。
【００４４】
別の実施形態では、免疫原として使用する抗原は、標準的な精製技術を使用した適切な精製スキームにより細胞または組織由来源から単離できる。別の実施形態では、免疫原性抗原は、組換えDNA技術により生成される。組換え発現の代わりに、標準的なペプチド合成技術を使用して抗原を化学的に合成してもよい。
【００４５】
「単離された」抗原は、細胞性物質、またはタンパク質が由来する細胞もしくは組織由来源由来の他の汚染物質を実質的に含まないか、または化学的に合成される場合には化学的前駆体もしくは他の化学物質を実質的に含まない。「細胞性物質を実質的に含まない」という言い回しは、単離または組換え生成の由来源である細胞の細胞性成分から抗原が離れている抗原調製物を含む。従って、細胞性物質を実質的に含まない抗原は、約30％、20％、10％または5％(乾燥重量)未満の異種タンパク質(本明細書においては「汚染タンパク質」とも称する)を有する抗原調製物を含む。タンパク質またはその生物学的活性部分が組換え生成されている場合、培養培地も実質的に含まない(すなわち、培養培地が、タンパク質調製物の容量の約20％、10％または5％未満である)ことが好ましい。タンパク質が化学合成により調製されている場合、化学前駆体または他の化学物質を実質的に含まない(すなわち、抗原の合成に関与する化学前駆体または他の化学物質から離れている)ことが好ましい。従って、このような抗原調製物は、目的のポリペプチド以外に、約30％、20％、10％、5％(乾燥重量)未満の化学前駆体または化合物を有する。
【００４６】
本発明は、免疫原として使用するキメラまたは融合抗原も提供する。本明細書で使用する「キメラ抗原」または「融合抗原」とは、異種ポリペプチドに作用可能に連結した本発明で使用する抗原の全体または一部を含む。融合抗原内では、「作用可能に連結」という用語は、抗原と異種ポリペプチドが、互いとインフレームで融合していることを示すことを意図する。異種ポリペプチドは、抗原のＮ末端でもＣ末端にでも融合できる。
【００４７】
１つの有用な融合抗原は、抗原が、GST配列のＣ末端に融合した、GST融合抗原である。このような融合抗原は、組換え抗原の精製を円滑にし得る。
【００４８】
別の実施形態では、融合抗原は、そのＮ末端に異種シグナル配列を含み、従って、高い親和性の抗体が産生されるように、抗原が高均質性で分泌および精製され得るようにする。例えば、免疫原の天然型シグナル配列を除去し、別のタンパク質からのシグナル配列と置き換えてもよい。例えば、バキュロウイルスエンベロープタンパク質のgp67分泌配列が、異種シグナル配列として使用できる(Current Protocols in Molecular Biology, Ausubelら編, John Wiley and Sons, 1992)。真核生物異種シグナル配列の別の例としては、メリチンおよびヒト胎盤アルカリホスファターゼの分泌配列(Stratagene; La Jolla, California)が挙げられる。さらに別の例では、有用な原核生物異種シグナル配列として、phoA分泌シグナルおよびプロテインＡ分泌シグナル(Pharmacia Biotech; Piscataway, New Jersey)が挙げられる。
【００４９】
さらに別の実施形態では、融合抗原は、抗原の全体または一部が、免疫グロブリンタンパク質ファミリーのメンバーから誘導される配列に融合された、免疫グロブリン融合タンパク質である。免疫グロブリン融合タンパク質を免疫原として使用して、被検体中の抗原に対する抗体を産生でき、また、さらなる抗原を精製できる可能性がある。
【００５０】
キメラおよび融合タンパク質は、標準的な組換えDNA技術により生成できる。一実施形態では、融合遺伝子は、自動化DNA合成機を含む従来技術により合成され得る。あるいはまた、２つの連続した遺伝子断片の間の相補的な突出部分を生じる(これは、その後アニーリングおよび再増幅して、キメラ遺伝子配列を生成できる)アンカープライマーを使用して、遺伝子断片のPCR増幅を行ってもよい(例えば、Ausubelら、前掲)。さらに、融合ドメイン(例えば、GSTポリペプチド)を既にコードしている発現ベクターが、多くの市販されている。免疫原をコードする核酸を、融合ドメインがポリペプチドにインフレームで連結されるように、このような発現ベクターにクローニングできる。
【００５１】
本発明のさらに別の実施形態では、爬虫類またはヘビ咬傷に含まれるもの等の毒素物質の混合物を得る。
【００５２】
次いで、免疫原を使用して、適切な動物を免疫化する。動物は、ヒト抗体を分泌可能な特化したトランスジェニック動物であることが好ましい。限定しない例として、特定の病原体に対する抗体のポリクローナル集団を産生するのに使用できるトランスジェニックマウス株が挙げられる(Fishwildら, 1996, Nature Biotechnology 14:845-851；Mendezら, 1997, Nature Genetics 15:146-156)。本発明の一実施形態では、未再配列ヒト免疫グロブリン遺伝子を含むトランスジェニックマウスを、標的免疫原で免疫化する。マウス中で免疫原に対する積極的な免疫応答が引き出された後、マウスの血液を採取し、ヒトIgG分子の精製調製物を、血漿または血清から生成し得る。当該分野で公知の任意の方法(適切なカラムマトリックスに結合した抗ヒトIgG抗体を用いたアフィニティーカラムクロマトグラフィーが挙げられるがこれに限定されない)を使用して、ヒトIgG分子の精製調製物を得ることができる。抗ヒトIgG抗体は、当該分野で公知の(例えば、Dako CorporationおよびICN等の製造元等からの)任意の入手先から得ることができる。生成したIgG分子の調製物は、異なる親和度で１つ以上の免疫原に結合するIgG分子のポリクローナル集団を含む。調製物の実質的な画分は、１つ以上の免疫原に特異的なIgG分子であることが好ましい。IgG分子のポリクローナル調製物について記載しているが、任意の１種類または異なる種類の組み合わせの免疫グロブリン分子を含むポリクローナル調製物も想定されており、本発明の範囲内にあることが意図されることが理解されよう。
【００５３】
その後、精製されたポリクローナル調製物は、二重特異性分子のポリクローナル集団の産生に使用できる。
【００５４】
５．３．２．２．ヒトドナーからの産生
特定の１つ以上の病原体および/または１つ以上の病原性抗原分子に対する抗体または高力価免疫血清のポリクローナル調製物は、該１つ以上の病原体および/または該１つ以上の病原性抗原分子に感染したヒト患者から、当該分野で公知の任意の方法を使用して産生できる(例えば、Harlowら, Using Antibodies A Laboratory Manualを参照)。限定しない例として、寄生生物、細菌およびウイルスに対する高力価免疫血清は、例えば、Shiら, 1999, American J Tropical Med. Hyg. 60:135-141、Cryzら, 1986, J. Lab. Clin. Med. 108:182-189、およびCumminsら, 1991, Blood 77:1111-1117に記載されている方法に従って調製できる。
【００５５】
好適な実施形態では、ポリクローナルヒトIgG調製物は、Tanakaら, 1998, Brazilian Journal of Medical and Biological Research 31:1375-81(参照により、本明細書に全体的に援用する)に記載されているクロマトグラフィー法を用いて生成される。具体的には、イオン交換、DEAE-セファロースFFおよびアルギニンセファロース4Bアフィニティークロマトグラフィー、ならびにセファクリルS-300 HRゲル濾過の組み合わせを使用して、ヒト血漿のγグロブリン画分から精製IgG分子を産生する。
【００５６】
しかし、本発明は、IgG分子のポリクローナル調製物に限定されない。任意の１種類または任意の異なる種類の組み合わせの免疫グロブリン分子(IgG、IgE、IgA等が挙げられるがこれらに限定されない)を含むポリクローナル調製物も想定されており、本発明の範囲内にあることが想定されることが理解されよう。このようなポリクローナル調製物は、当該分野で公知の任意の標準的方法を使用して生成できる。
【００５７】
５．３．２．３．ファージ提示ライブラリーからの産生
特定の１つ以上の病原性抗原分子に対する抗体の集団は、ファージ提示ライブラリーから産生できる。ポリクローナル抗体は、１つ以上の目的の抗原により十分に多量かつ多様な特異性の集団を有するファージ提示ライブラリーのアフィニティースクリーニングにより得ることができる。抗体提示ライブラリーの生成およびスクリーニングにおいて使用するのに特に向いている方法および試薬の例は、例えば、米国特許第5,223,409号および同第5,514,548号；PCT公報第WO 92/18619号；PCT公報第WO 91/17271号；PCT公報第WO 92/20791号；PCT公報第WO 92/15679号；PCT公報第WO 93/01288号；PCT公報第WO 92/01047号；PCT公報第WO 92/09690号；PCT公報第WO 90/02809号；Fuchsら, 1991, Bio/Technology 9:1370-1372；Hayら, 1992, Hum. Antibod. Hybridomas 3:81-85；Huseら, 1989, Science 246:1275-1281；Griffithsら, 1993, EMBO J. 12:725-734に記載されている。ファージ提示ライブラリーは、非常に大きい特異性集団からの１つ以上の所望の抗体の選択を可能にする。ファージ提示ライブラリーの付加的な利点は、選択された抗体をコードする核酸が都合良く得られることで、その後の発現ベクターの構築を容易にすることである。
【００５８】
好適な実施形態では、１つ以上の病原性抗原分子の抗体のポリクローナル集団は、Denら, 1999, J. Immunol. Meth. 222:45-57；SharonらComb. Chem. High Throughput Screen. 2000 3:185-96；およびBaecher-Allanら, Comb. Chem. High Throughput Screen. 2000 2:319-325によるファージ提示ライブラリーから産生される。ファージ提示ライブラリーをスクリーニングして、目的の１つ以上の抗原分子に対する結合特異性を有するポリクローナルサブライブラリーを、アフィニティークロマトグラフィーにより選択する(McCaffertyら, 1990, Nature 248:552；Breitlingら, 1991, Gene 104:147；およびHawkinsら, 1992, J. Mol. Biol. 226:889)。次いで、重鎖および軽鎖可変領域をコードする核酸を、頭部-頭部で連結して、双方向ファージ提示ベクターのライブラリーを産生する。次いで、双方向ファージ提示ベクターをまとめて(in mass)、双方向哺乳動物発現ベクター(Sarantopoulosら, 1994, J. Immunol. 152:5344)に導入し、これを、適切なハイブリドーマ細胞系をトランスフェクトするために使用する。当該分野で公知の任意の方法を使用し、トランスフェクトしたハイブリドーマ細胞を誘導して、抗体を産生する。
【００５９】
他の好適な実施形態では、米国特許第6,057,098号(参照により本明細書に全体的に援用する)に記載されるように、１つ以上の病原性抗原分子に対する抗体の集団は、個々のメンバーのクローニング単離をせずに、選択された提示抗体の集団全体を用いる方法により産生される。ポリクローナル抗体は、好ましくは複数の抗体を提示する提示ライブラリーメンバーを富化した後、十分に大きい特異性レパートリー(例えば、複数のエピトープを有する抗原分子)を有するファージ提示ライブラリーのアフィニティースクリーニングにより得る。選択された提示抗体をコードする核酸を切除し、適切なPCRプライマーを用いて増幅する。核酸は、完全長核酸が単離されるように、ゲル電気泳動により精製できる。次いで、各核酸を、適切な発現ベクターに挿入し、異なるインサートを有する発現ベクターの集団を得る。次いで、発現ベクターの集団を、適切な宿主において発現させる。
【００６０】
５．３．２．４．モノクローナル抗体を組み合わせることによる産生
特定の１つ以上の病原体および/または１つ以上の病原性抗原分子に対する抗体の集団は、該１つ以上の病原体および/または該１つ以上の病原性抗原分子に対する特異性を有する異なるモノクローナル抗体を組み合わせることにより産生できる。
【００６１】
モノクローナル抗体は、抗原を免疫原として、適切な被検体を免疫化することにより調製できる。免疫化被検体における抗体力価は、固定化ポリペプチドを用いた酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)等の標準的技術により時間経過と共にモニターできる。所望であれば、抗体分子は、哺乳動物(例えば、血液)から単離し、プロテインＡクロマトグラフィー等の周知の技術によりさらに精製して、IgG画分を得ることができる。
【００６２】
免疫化後の適切な時点(例えば、特定の抗原力価が最高な時点)において、抗体産生細胞を被検体から得て、KohlerおよびMilstein(1975, Nature 256:495-497)に元々記載されるハイブリドーマ技術、Kozborら(1983, Immunol. Today 4:72)によるヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術、Coleら(1985, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96)のEBV-ハイブリドーマ技術、またはトリオーマ技術等の標準的な技術によりモノクローナル抗体を調製するために使用できる。ハイブリドーマを生成するための技術は周知である(Current Protocols in Immunology, 1994, John Wiley and Sons, Inc., New York, NYを全般的に参照)。本発明のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞は、目的のポリペプチドに結合する抗体についてハイブリドーマ培養上清をスクリーニング(例えば、標準的なELISAアッセイを使用)することにより検出される。
【００６３】
モノクローナル抗体は、実質的に同種抗体の集団(すなわち、少量に存在し得る自然発生の突然変異以外は、集団を構成する個々の抗体が同じである)から得る。従って、「モノクローナル」という修飾語は、異なる抗体の混合物でないという抗体の特徴を示す。例えば、モノクローナル抗体は、Kohlerら, 1975, Nature, 256:495に最初に記載されたハイブリドーマ方法を用いて産生され得るか、または組換えDNA方法(米国特許第4,816,567号)によって産生され得る。本明細書で使用する「モノクローナル抗体」という用語は、抗体が免疫グロブリンであることも示す。
【００６４】
モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ方法では、マウスまたは他の適切な宿主動物(ハムスター等)を、上述したように免疫化して、免疫化に使用するタンパク質に特異的に結合する抗体を産生するかまたは産生可能なリンパ球を引き出す(参照により本明細書に全体的に援用する、米国特許第5,914,112号を全般的に参照)。
【００６５】
あるいはまた、リンパ球をin vitroで免疫化してもよい。その後、リンパ球を、適切な融合剤(ポリエチレングリコール等)を用いて骨髄腫細胞と融合させ、ハイブリドーマ細胞を形成する(Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp. 59-103 (Academic Press, 1986))。このように調製したハイブリドーマ細胞を、融合されていない親骨髄腫細胞の成長または生存を阻害する物質を好ましくは１つ以上含有する適切な培養培地に播種し、培養させる。例えば、親骨髄腫細胞が酵素ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(HGPRTまたはHPRT)を欠く場合、ハイブリドーマ用の培養培地は、HGPRT欠損細胞の成長を妨げる物質であるヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジン(HAT培地)を典型的に含む。
【００６６】
好ましい骨髄腫細胞は、効率的に融合し、選択された抗体産生細胞による抗体の安定した高レベル産生を助け、HAT培地などの培地に感受性を有するものである。この中で、好ましい骨髄腫細胞系は、Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, Calif. USAから入手可能なMOPC-21およびMPC-11マウス腫瘍から誘導されたもの等のマウス骨髄腫系、ならびにAmerican Type Culture Collection, Rockville, Md. USAから入手可能なSP-2細胞である。
【００６７】
ヒト骨髄腫およびマウス-ヒトへテロ骨髄腫細胞系も、ヒトモノクローナル抗体の産生のために記載されている(Kozbor, 1984, J. Immunol., 133:3001；Brodeurら, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987))。ハイブリドーマ細胞を培養する培養培地を、抗原に対するモノクローナル抗体の産生についてアッセイする。ハイブリドーマ細胞により産生されたモノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈降により、またはin vitro結合アッセイ(ラジオイムノアッセイ(RIA)もしくは酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)等)により決定されることが好ましい。モノクローナル抗体の結合親和性は、例えば、Munsonら, 1980, Anal. Biochem., 107:220のスキャッチャード分析により決定され得る。
【００６８】
所望の特異性、親和性および/または活性の抗体を産生するハイブリドーマ細胞を同定した後、希釈手順を限定することでクローンをサブクローニングし、標準的な方法で培養させてもよい(Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp. 59-103 (Academic Press, 1986))。この目的のために適した培養培地としては、例えば、D-MEMまたはRPMI-1640培地が挙げられる。さらに、ハイブリドーマ細胞は、動物において腹水腫瘍として、in vivoで培養され得る。サブクローンにより分泌されたモノクローナル抗体は、従来の免疫グロブリン精製手順(例えば、プロテインＡ-セファロース、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析またはアフィニティークロマトグラフィー)により、培養培地、腹水、または血清から適切に分離される。
【００６９】
モノクローナル抗体分泌ハイブリドーマを調製する代わりに、組換えコンビナトリアル免疫グロブリンライブラリー(例えば、抗体ファージ提示ライブラリー)を、目的の抗原でスクリーニングすることにより、本発明の病原体または病原性抗原分子ポリペプチドに対するモノクローナル抗体を同定および単離できる。ファージ提示ライブラリーを産生およびスクリーニングするためのキットは、市販されている(例えば、Pharmacia組換えファージ抗体系、カタログ番号27-9400-01；およびStratagene抗原SurfZAPTMファージ提示キット、カタログ番号240612)。さらに、抗体提示ライブラリーの産生およびスクリーニングにおける使用に特に向く方法および試薬の例は、例えば、米国特許第5,223,409号および同第5,514,548号；PCT公報第WO 92/18619号；PCT公報第WO 91/17271号；PCT公報第WO 92/20791号；PCT公報第WO 92/15679号；PCT公報第WO 93/01288号；PCT公報第WO 92/01047号；PCT公報第WO 92/09690号；PCT公報第WO 90/02809号；Fuchsら, 1991, Bio/Technology 9:1370-1372；Hayら, 1992, Hum. Antibod. Hybridomas 3:81-85；Huseら, 1989, Science 246:1275-1281；Griffithsら, 1993, EMBO J. 12:725-734に記載されている。
【００７０】
さらに、適切な抗原特異性のマウス抗体分子由来の遺伝子を、適切な生物学的活性のヒト抗体分子由来の遺伝子と共にスプライシングすることによる、「キメラ抗体」の産生のために開発された技術(Morrisonら, 1984, Proc. Natl. Acad. Sci., 81, 6851-6855；Neubergerら, 1984, Nature 312, 604-608；Takedaら, 1985, Nature 314, 452-454)が使用できる。キメラ抗体は、マウスmAbから誘導された可変領域およびヒト免疫グロブリン定常領域を有するもの等、異なる動物種から異なる部分が誘導される分子である。(例えば、参照により本明細書に全体的に援用するCabillyら, 米国特許第4,816,567号；およびBossら, 米国特許第4,816,397号を参照)。
【００７１】
ヒト化抗体は、非ヒト種由来の１つ以上の相補性決定領域(CDR)、およびヒト免疫グロブリン分子由来のフレームワーク領域を有する非ヒト種由来の抗体分子である。(例えば、参照により本明細書に全体的に援用する、米国特許第5,585,089号を参照)。このようなキメラおよびヒト化モノクローナル抗体は、例えば、PCT公報第WO 87/02671号；欧州特許出願第184,187号；欧州特許出願第171,496号；欧州特許出願第173,494号；PCT公報第WO 86/01533号；米国特許第4,816,567号および同第5,225,539号；欧州特許出願第125,023号；Betterら, 1988, Science 240:1041-1043；Liuら, 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:3439-3443；Liuら, 1987, J. Immunol. 139:3521-3526；Sunら, 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:214-218；Nishimuraら, 1987, Canc. Res. 47:999-1005；Woodら, 1985, Nature 314:446-449；Shawら, 1988, J. Natl. Cancer Inst. 80:1553-1559；Morrison 1985, Science 229:1202-1207；Oiら, 1986, Bio/Techniques 4:214；Jonesら, 1986, Nature 321:552-525；Verhoeyanら, 1988, Science 239:1534；およびBeidlerら, 1988, J. Immunol. 141:4053-4060に記載される方法を使用して、当該分野で公知の組換えDNA技術により産生され得る。
【００７２】
相補性決定領域(CDR)移植は、抗体をヒト化するための別の方法である。これは、マウス抗体を作り変えて、完全な抗原特異性および結合親和性を、ヒトフレームワークに移すことを伴う(Winterら 米国特許第5,225,539号)。CDR移植抗体は、様々な抗原に対して上手く構築されてきた。例えば、Queenら, 1989(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:10029)に記載のIL-2受容体に対する抗体；Riechmannら(1988, Nature, 332:323)に記載の細胞表面受容体-CAMPATHに対する抗体；Coleら(1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:2869)に記載のＢ型肝炎に対する抗体；およびTempestら(1991, Bio-Technology 9:267)に記載のウイルス抗原-呼吸器合胞体ウイルスに対するものがある。マウスモノクローナル抗体のCDRがヒト抗体に移植されたCDR移植抗体を産生する。移植後、ほとんどの抗体は、フレームワーク領域における追加のアミノ酸変化により、親和性を維持する利点を受ける。これは、おそらく、フレームワーク残基がCDRコンホメーションを維持するために必要であり、一部のフレームワーク残基が抗原結合部位の一部であることが実証されたためと思われる。しかし、フレームワーク領域を保存して、抗原部位を全く導入しないために、配列を、確立された生殖細胞配列と比較した後に、コンピュータモデリングを行う。
【００７３】
完全なヒト抗体は、ヒト患者の治療的処置のために特に望ましい。このような抗体は、内因性免疫グロブリン重鎖および軽鎖遺伝子は発現できないが、ヒト重鎖および軽鎖遺伝子は発現可能なトランスジェニックマウスを用いて産生できる。トランスジェニックマウスは、選択された抗原(例えば、免疫原の全体または一部)で、通常の様式で免疫化される。
【００７４】
抗原に対するモノクローナル抗体は、従来のハイブリドーマ技術を用いて得られる。トランスジェニックマウスにより含まれるヒト免疫グロブリン導入遺伝子は、Ｂ細胞分化の間に再配列し、その後、クラススイッチングおよび体細胞変異を経る。従って、このような技術を使用して、治療的に有用なIgG、IgAおよびIgE抗体を産生することが可能である。ヒト抗体を産生するこの技術の概要については、LonbergおよびHuszar(1995, Int. Rev. Immunol. 13:65-93)を参照のこと。ヒト抗体およびヒトモノクローナル抗体を産生するためのこの技術の詳細な議論、ならびにこのような抗体を産生するためのプロトコールについては、例えば、米国特許第5,625,126号；米国特許第5,633,425号；米国特許第5,569,825号；米国特許第5,661,016号；および米国特許第5,545,806号を参照のこと。さらに、Abgenix Inc. (Freemont, CA(例えば、米国特許第5,985,615号を参照))およびMedarex, Inc. (Princeton, NJ)等の企業を利用して、上記したものと同様の技術を用いて選択された抗原に対するヒト抗体を得ることができる。
【００７５】
選択されたエピトープを認識かつ結合する完全ヒト抗体は、「誘導型(guided)選択」と呼ばれる技術を用いて産生できる。このアプローチでは、選択された非ヒトモノクローナル抗体(例えば、マウス抗体)を使用して、同じエピトープを認識する完全ヒト抗体の選択を導く(Jespersら (1994) antigen Bio/technology 12:899-903)。
【００７６】
病原体に対する既に存在する抗体を使用して、アフィニティークロマトグラフィーまたは免疫沈降などの標準的な技術により、病原体の追加の抗原を免疫原として使用するために単離できる。さらに、このような抗体を使用して、病原体の発現の発生量およびパターンを評価するために、(例えば、細胞溶解物または細胞上清中の)タンパク質を検出できる。抗体はまた、診断的に使用して、臨床テスト手順の一部として組織中の病原体レベルをモニターできる(例えば、所与の治療計画の効力を決定する)。検出は、抗体を検出可能な物質に結合することにより円滑にされる。検出可能な物質の例としては、様々な酵素、補欠分子族、蛍光物質、発光物質、生物発光物質、および放射能物質が挙げられる。適切な酵素の例としては、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、βガラクトシダーゼまたはアセチルコリンエステラーゼが挙げられる；適切な補欠分子族複合体の例としては、ストレプトアビジン/ビオチンおよびアビジン/ビオチンが挙げられる；適切な蛍光物質の例としては、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセイン、イソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、塩化ダンシルまたはフィコエリスリンが挙げられる；発光物質の例としては、ルミノールが挙げられる；生物発光物質の例としては、ルシフェラーゼ、ルシフェリンおよびエクオリンが挙げられる、ならびに適切な放射能物質としては、125I、131I、35Sまたは3Hが挙げられる。
【００７７】
市販されている抗体を、例えばATCCから購入し、二重特異性抗体を産生するために使用できる。本発明の好適な実施形態では、抗体は、市販のハイブリドーマ細胞系から産生される。より好適な実施形態では、ハイブリドーマはヒト抗体を分泌する。
【００７８】
次いで、任意の方法または任意の方法の組み合わせにより得られた抗体を、次に抗体のポリクローナル集団として組み合わせる。これを、二重特異性分子のポリクローナル集団の産生に使用できる。
【００７９】
５．３．３．二重特異性分子のポリクローナル集団の産生および精製
本発明の二重特異性分子のポリクローナル集団は、抗CR1部分の集団と抗原認識部分のポリクローナル集団とを化学的に架橋させることにより調製される。本発明においては、任意の標準的化学共役方法が使用できる。架橋剤(プロテインＡ、グルタルアルデヒド、カルボジイミド、N-スクシンイミジル-S-アセチル-チオアセテート(SATA)、N-スクシンイミジル-3-(2-ピリジルジチオ)プロピオン酸塩(SPDP)、およびスルホスクシンイミジル4-(N-マレイミドメチル)シクロヘキサン-1-カルボン酸塩(スルホ-SMCC)が挙げられるがこれらに限定されない)が使用できる(例えば、Paulus, 1985, Behring Ins. Mitt. No. 78: 118-132；Karpovskyら1984, J. Exp. Med. 160:1686；Liu, MAら, 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:8648；Brennanら, 1985 Science 229:81-83；およびGlennieら, 1987, J. Immunol. 139: 2367-2375；Perezら, 1985, Nature 316:354-356；ならびにTitusら, 1987, Journal of Immunology 139:3153-3158を参照)。
【００８０】
好適な実施形態では、架橋剤N-スクシンイミジル-S-アセチル-チオアセテート(SATA)、およびスルホスクシンイミジル4-(N-マレイミドメチル)シクロヘキサン-1-カルボン酸塩(スルホ-SMCC)(Pierce Chemical Co., Rockford, Ill.)を使用して、抗CR1部分の集団と、抗原認識部分のポリクローナル集団とを架橋させる(例えば、Liu, MAら, 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:8648を参照)。別の好適な実施形態では、N-スクシンイミジル-3-(2-ピリジルジチオ)プロピオン酸塩(SPDP)を使用して、抗CR1部分の集団と、抗原認識部分のポリクローナル集団とを架橋させる(例えば、Karpovskyら 1984, J. Exp. Med. 160:1686；Perezら, 1985, Nature 316:354-356；およびTitusら, 1987, Journal of Immunology 139:3153-3158を参照)。
【００８１】
二重特異性分子の集団は、分子サイズもしくは特異的結合親和性、またはそれらの組み合わせを用いた当業者に公知の方法により精製できる。一実施形態では、二重特異性分子は、本発明の二重特異性分子の単離に適したカラムを用いたイオン交換クロマトグラフィーにより精製できる(DEAE、ヒドロキシルアパタイト、リン酸カルシウムが挙げられる)(Current Protocols in Immunology, 1994, John Wiley and Sons, Inc., New York, NYを全般的に参照)。
【００８２】
別の実施形態では、二重特異性分子の集団を、３段階連続アフィニティークロマトグラフィーにより精製する(CorvalanおよびSmith, 1987, Cancer Immunol. Immunother., 24:127-132)：第１のカラムは固体マトリックスに結合したプロテインＡからなり、ここで抗体のFc部分はプロテインＡに結合し、抗体はカラムに結合する；続いて、二重特異性分子の抗CR1 mAb部分を介して結合するC3b様受容体についてアッセイする固体マトリックスに結合したC3b様受容体を利用した第２のカラム；そして、二重特異性分子の抗原認識部分に結合する目的の抗原分子の特異的結合を利用した第３のカラムと続く。
【００８３】
二重特異性分子の集団は、サイズ排除HPLCおよびアフィニティークロマトグラフィーの組み合わせによっても精製され得る。一実施形態では、サイズ排除HPLCから溶出した適切な画分を、二重特異性分子の抗原認識部分に特異的な抗原分子を含むカラムを用いてさらに精製する。
【００８４】
二重特異性分子の集団はまた、抗体の等電点電気泳動によっても単離され得る。
【００８５】
二重特異性分子の集団は、当該分野で公知の様々な方法により特徴づけられ得る。一実施形態では、二重特異性分子は、SDS-PAGEおよびウェスタンブロットにより特徴付けられ得る。二重特異性分子の分子量は、SDS-PAGEにより決定する。次いで、適切なバンドにある分子の二重特異性は、CR1および目的の抗原分子の両方を用いたウェスタンブロットにより決定する。あるいはまた、分子の二重特異性は、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)等の固相イムノアッセイにより決定し得る。
【００８６】
二重特異性分子の相乗作用的ポリクローナル集団は、病原体または病原性抗原分子の中和において相乗作用的活性を示す二重特異性分子を、ポリクローナル集団に取り入れることにより産生され得る。一実施形態では、モノクローナル二重特異性分子は、当該分野で公知の任意の方法(例えば、Himawan, 米国仮特許出願第60/199,903号、同第60/244,811号および同第60/244,812号；Taylor, 米国特許第5,470,570号；同第5,487,890号；および同第5,879,679号)を用いて生成されるか、または公的および/もしくは私的な入手先から得る。このようなモノクローナル二重特異性分子による病原体または病原性抗原分子の中和における活性を、当該分野で公知の標準的な方法を用いて、ポリクローナル集団の活性と比較する(例えば、Laalら, 1994, J. Virol. 68:4001-4008；Burklyら, J. Virol. 69:4267-4273；Vijh-Warrierら, 1996, J. Virol. 70:4466-4473；Mascolaら, 1997, J. Virol. 71:7198-7206；Schaeferら, 2000, Infection and Immunity 68:2608-2616を参照)。ポリクローナル集団と組み合わせられた場合に相乗作用的活性を示すモノクローナル二重特異性分子を、ポリクローナル二重特異性集団に取り入れて、二重特異性分子の相乗作用的集団を産生する。別の実施形態では、抗体のポリクローナル調製物と組み合わせられた場合に相乗作用的活性を示すモノクローナル抗体を、まず、ポリクローナル調製物と組み合わせて、抗体の相乗作用的ポリクローナル集団を形成する。次いで、この抗体の相乗作用的ポリクローナル集団を、抗CR1部分の集団と架橋させて、二重特異性分子の相乗作用的ポリクローナル集団を形成する。
【００８７】
５．４．二重特異性分子のポリクローナル集団の使用
本発明の二重特異性分子は、患者において、病原性抗原分子の存在に伴う疾患または障害を治療または予防するのに有用である。患者は、ヒトでも哺乳動物非ヒト動物(家畜動物およびペットが挙げられるがこれらに限定されない)でもあり得る。病原性抗原分子は、治療する被検体において潜在的に有害または所望でない、循環器に存在する任意の物質(タンパク質もしくは薬剤もしくは毒素、自己抗体もしくは自己抗原、または任意の感染剤の分子もしくはその生成物が挙げられるがこれらに限定されない)であり得る。病原性抗原分子は、疾患もしくは障害、または任意のその他の所望でない症状の原因である物質(例えば、病原体)もしくはその一部である抗原決定基を含む(あるいは、結合ドメインに結合され得る)任意の分子である。
【００８８】
固定された組織食細胞により排除された循環性病原性抗原分子としては、被検体に対して有害なあらゆる抗原部分が挙げられる。有害な病原性抗原分子の例としては、寄生生物、菌類、原生動物、細菌またはウイルスを伴うあらゆる病原性抗原が挙げられる。さらに、循環性病原性抗原分子としては、毒素、免疫複合体、自己抗体、薬剤、過剰用量物質(バルビツレート等)、または循環器に存在し、かつ宿主哺乳動物の健康に対して所望でないもしくは弊害なあらゆるものも挙げられる。病原性抗原分子を哺乳動物循環器から有効に除去する際の免疫系の欠陥により、外傷性および循環血液量減少性ショックが生じ得る(AlturaおよびHershey, 1968, Am. J. Physiol. 215:1414-9)。
【００８９】
さらに、非病原性抗原(例えば、移植抗原)は、宿主に対して有害であると誤って認識され、病原性抗原分子であるかのように宿主免疫系により攻撃される。本発明は、移植拒絶を処置する実施形態であって、移植拒絶に関与する免疫細胞または因子(例えば、移植抗原特異的抗体)に結合して除去する二重特異性抗体を有効量被検体に投与することを含む実施形態をさらに提供する。
【００９０】
５．４．１．病原体を除去するための二重特異性分子のポリクローナル集団の使用
二重特異性分子のポリクローナル集団を使用して、疾患を生じる病原体を循環器系から除去することにより、疾患を治療または予防できる。二重特異性分子のポリクローナル集団は、病原体上の複数のエピトープを標的化することにより、非常に変異し易い病原体の排除において特に有用である。ポリクローナル集団は、複数の変異体を構成する病原体の排除においても特に有用である。ポリクローナル集団は、病原体の異種混合物の排除においてさらに特に有用である
５．４．２．標的抗原分子
本発明は、病原性抗原分子の存在を伴う疾患または障害を治療または予防する方法を提供する。病原性抗原分子は、治療する被検体において潜在的に有害または所望でない、循環器に存在するあらゆる物質(タンパク質もしくは薬剤もしくは毒素、自己抗体もしくは自己抗原、または任意の感染剤の分子もしくはその生成物が挙げられるがこれらに限定されない)であり得る。病原性抗原分子は、疾患もしくは障害、または任意のその他の所望でない症状の原因である物質(例えば、病原体)またはその一部である抗原決定基を含む(あるいは、結合ドメインに結合され得る)あらゆる分子である。
【００９１】
固定された組織食細胞により排除される循環性病原性抗原分子としては、被検体に対して有害なあらゆる抗原部分が挙げられる。有害な病原性抗原分子の例としては、寄生生物、菌類、原生動物、細菌またはウイルスを伴うあらゆる病原性抗原が挙げられる。さらに、循環性病原性抗原分子としては、毒素、免疫複合体、自己抗体、薬剤、過剰用量物質(バルビツール酸塩等)、または循環器に存在し、かつ宿主哺乳動物の健康に対して所望でないもしくは弊害なあらゆるものも挙げられる。病原性抗原分子を哺乳動物循環器から有効に除去する際の免疫系の欠陥により、外傷性および循環血液量減少性ショックが生じ得る(AlturaおよびHershey, 1968, Am. J. Physiol. 215:1414-9)。
【００９２】
さらに、非病原性抗原(例えば、移植抗原)は、宿主に対して有害であると誤って認識され、病原性抗原分子であるかのように宿主免疫系により攻撃される。本発明は、移植拒絶を処置する実施形態であって、移植拒絶に関与する免疫細胞または因子(例えば、移植抗原特異的抗体)に結合して除去する二重特異性抗体を有効量被検体に投与することを含む実施形態をさらに提供する。
【００９３】
５．４．２．１．天然型抗原および自己免疫抗原
一実施形態では、循環器から排除される病原性抗原分子としては、天然型抗原および自己免疫抗原が挙げられる。これらの抗原としては、自己抗体、または自己免疫疾患を伴う天然型分子が挙げられるがこれらに限定されない。
【００９４】
多くの異なる天然型抗原および自己抗体が、本発明の二重特異性抗体のポリクローナル集団を使用して、霊長類の循環器から排除され得る。限定しない例では、IgE(免疫グロブリンＥ)抗体が、本発明の二重特異性抗体により循環器から排除される。より具体的には、二重特異性抗体のポリクローナル集団は、C3b様受容体に特異的な第１の抗原認識部分、およびIgE分子に特異的な複数の異なる第２の抗原認識部分を含む。この二重特異性抗体の集団を使用して、循環するIgE抗体を減少させて、喘息等のアレルギー性反応を低下または阻害できる。
【００９５】
別の例では、血友病を患う特定のヒトは因子VIIIが不足していることが示されてきた。組換え因子VIII置換により、この血友病が治療される。しかし、最終的には、一部の患者は、因子VIIIに対する抗体を発達し、療法を妨げてしまう。抗-抗-因子VIII抗体で調製した本発明の二重特異性抗体のポリクローナル集団は、この問題に対する治療的解決をもたらす。特に、C3b様受容体に対する第１の抗原認識部分の特異性、および抗因子VIII自己抗体に対する複数の第２の抗原認識部分の特異性を有する二重特異性抗体のポリクローナル集団は、自己抗体を循環器から排除して、疾患を緩和するのに治療上有用であろう。
【００９６】
本発明の二重特異性抗体のポリクローナル集団により排除できる自己抗体のさらなる例としては、以下の抗原に対する自己抗体が挙げられるがこれらに限定されない：すなわち、筋肉アセチルコリン受容体(この抗体は疾患重症筋無力症に関連する)；カルジオリピン(疾患狼瘡に関連)；血小板関連タンパク質(疾患特発性血小板減少性紫斑病に関連)；シェーグレン病に関連する複数の抗原；組織移植自己免疫反応のケースに関与すると思われる抗原；心筋上に見とめられる抗原(疾患自己免疫心筋炎に関連)；免疫複合体仲介型腎臓疾患に関連する抗原；dsDNAおよびssDNA抗原(ループス腎炎に関連)；デスモグレインおよびデスモプラキン(天疱瘡および類天疱瘡に関連)；または特徴決定され、かつ疾患病因に関連する任意の他の抗原。
【００９７】
上記二重特異性抗体の集団をヒトまたは非ヒト霊長類の循環器に注射した場合、二重特異性抗体は、高いパーセンテージで、赤血球上のC3b様受容体部位の数と合い、ヒトまたは霊長類C3b受容体認識部位を介して、赤血球に結合する。二重特異性抗体は、C3b様受容体に結合する部分に結合した抗原を介して自己抗体に同時に会合する。次いで、表面上に二重特異性抗体/自己抗体複合体を有する赤血球細胞は、結合した病原性自己抗体の中和および循環器からの排除を促す。
【００９８】
本発明では、二重特異性抗体のポリクローナル集団は、病原性抗原または自己抗体が、表面上にC3b様受容体を発現している造血細胞に結合すること、そしてその後、該病原性抗原または自己抗体を、造血細胞は排除することなく、循環器から排除することを促す。
【００９９】
５．４．２．２．感染疾患
特定の実施形態では、感染疾患は、１つ以上の感染疾患剤の１つ以上の抗原、およびC3b様受容体の両方に結合する二重特異性分子のポリクローナル集団の投与により、治療または予防される。従って、このような実施形態では、１つ以上の病原体は、１つ以上の感染疾患剤の抗原である。本発明の二重特異性抗体のポリクローナル集団は、非常に変異し易いおよび/または極度に異種である感染疾患剤を排除するのに特に有用である。
【０１００】
このような抗原は、インフルエンザウイルス赤血球凝集素(Genbank受託番号JO2132；Air, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:7639-7643；Newtonら, 1983, Virology 128:495-501)、ヒト呼吸器合胞体ウイルスＧ糖タンパク質(Genbank受託番号Z33429；Garciaら, 1994, J. Virol.；Collinsら, 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:7683)、デングウイルスのコアタンパク質、マトリックスタンパク質もしくは他のタンパク質(Genbank受託番号M19197；Hannら, 1988, Virology 162:167-180)、麻疹ウイルス赤血球凝集素(Genbank受託番号M81899；Rotaら, 1992, Virology 188:135-142)、単純ヘルペスウイルス２型糖タンパク質gB(Genbank受託番号M14923；Bzikら, 1986, Virology 155:322-333)、ポリオウイルスＩ VP1(Eminiら, 1983, Nature 304:699)、HIV Iのエンベロープ糖タンパク質(Putneyら, 1986, Science 234:1392-1395)、Ｂ型肝炎表面抗原(Itohら, 1986, Nature 308:19；Neurathら, 1986, Vaccine 4:34)、ジフテリア毒素(Audibertら, 1981, Nature 289:543)、ストレプトコッカス24Mエピトープ(Beachey, 1985, Adv. Exp. Med. Biol. 185:193)、ゴノコッカル・ピリン(gonococcal pilin)(RothbardおよびSchoolnik, 1985, Adv. Exp. Med. Biol. 185:247)、仮性狂犬病ウイルスg50(gpD)、仮性狂犬病ウイルスII(gpB)、仮性狂犬病ウイルスgIII(gpC)、仮性狂犬病ウイルス糖タンパク質Ｈ、仮性狂犬病ウイルス糖タンパク質Ｅ、伝染性胃腸炎糖タンパク質195、伝染性胃腸炎マトリックスタンパク質、ブタロタウイルス糖タンパク質38、ブタパルボウイルスキャプシドタンパク質、ブタ赤痢菌(Serpulina hydodysenteriae)保護抗原、ウシウイルス下痢糖タンパク質55、ニューカッスル病ウイルス赤血球凝集素-ノイラミニダーゼ、ブタインフルエンザ赤血球凝集素、ブタインフルエンザノイラミニダーゼ、足口病ウイルス、ブタコレラウイルス、ブタインフルエンザウイルス、アフリカブタ熱ウイルス、ブタマイコプラズマ性肺炎細菌種(Mycoplasma hyopneumoniae)、ウシ感染性鼻気管炎ウイルス(例えば、ウシ感染性鼻気管炎ウイルス糖タンパク質Ｅもしくは糖タンパク質Ｃ)、または感染性喉頭気管炎ウイルス(例えば、感染性喉頭気管炎ウイルス糖タンパク質Ｇもしくは糖タンパク質Ｉ)、ラクロスウイルスの糖タンパク質(Gonzales-Scaranoら, 1982, Virology 120:42)、新生子ウシ下痢ウイルス(MatsunoおよびInouye, 1983, Infection and Immunity 39:155)、ベネズエラウマ脳脊髄炎ウイルス(MathewsおよびRoehrig, 1982, J. Immunol. 129:2763)、プンタ・トロ(punta toro)ウイルス(Dalrympleら, 1981, Replication of Negative Strand Viruses, BishopおよびCompans(編), Elsevier, NY, p. 167)、マウス白血病ウイルス(Steevesら, 1974, J. Virol. 14:187)、マウス乳腺癌ウイルス(MasseyおよびSchochetman, 1981, Virology 115:20)、Ｂ型肝炎ウイルスコアタンパク質および/もしくはＢ型肝炎ウイルス表面抗原またはその断片もしくは誘導体(例えば、1980年6月4日に発行された英国特許公報第GB 2034323A号；GanemおよびVarmus, 1987, Ann. Rev. Biochem. 56:651-693；Tiollaisら, 1985, Nature 317:489-495を参照)、ウマインフルエンザウイルスもしくはウマヘルペスウイルス(例えば、ウマインフルエンザウイルスＡ型/アラスカ91ノイラミニダーゼ、ウマインフルエンザウイルスＡ型/マイアミ63ノイラミニダーゼ、ウマインフルエンザウイルスＡ型/ケンタッキー81ノイラミニダーゼ、ウマヘルペスウイルス１型糖タンパク質Ｂ、およびウマヘルペスウイルス１型糖タンパク質Ｄ)、ウシ呼吸器合胞体ウイルスもしくはウシパラインフルエンザウイルスの抗原(例えば、ウシ呼吸器合胞体ウイルス付着タンパク質(BRSV G)、ウシ呼吸器合胞体ウイルス融合タンパク質(BRSV F)、ウシ呼吸器合胞体ウイルスヌクレオキャプシドタンパク質(BRSV N)、ウシパラインフルエンザウイルス３型融合タンパク質、およびウシパラインフルエンザウイルス３型赤血球凝集素ノイラミニダーゼ)、ウシウイルス性下痢ウイルス糖タンパク質48もしくは糖タンパク質53であり得るがこれらに限定されない。
【０１０１】
本発明の二重特異性のポリクローナル集団の使用により治療または予防できるさらなる疾患または障害としては、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、インフルエンザ、水痘、アデノウイルス、単純ヘルペスウイルスＩ型(HSV-I)、単純ヘルペスウイルスII型(HSV-II)、牛疫、ライノウイルス、エコーウイルス、ロタウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、パピローマウイルス、パポバウイルス、サイトメガロウイルス、エキノウイルス、アルボウイルス、ハンタウイルス、コクサッキーウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、麻疹ウイルス、風疹ウイルス、ポリオウイルス、ヒト免疫欠損ウイルスＩ型(HIV-I)、およびヒト免疫欠損ウイルスII型(HIV-II)、任意のピコルナウイルス、エンテロウイルス、カルシウイルス(caliciviridae)、ノーウォーク群のウイルスのいずれか、トガウイルス(デングウイルス等)、αウイルス、フラビウイルス、コロナウイルス、狂犬病ウイルス、マルブルグウイルス、エボラウイルス、パラインフルエンザウイルス、オルトミクソウイルス、ブンヤウイルス、アレナウイルス、レオウイルス、ロタウイルス、オルビウイルス、ヒトＴ細胞白血病ウイルスＩ型、ヒトＴ細胞白血病II型、サル免疫欠損ウイルス、レンチウイルス、ポリオーマウイルス、パルボウイルス、エプスタイン-バーウイルス、ヒトヘルペスウイルス-6、オナガザルヘルペスウイルス１(Ｂウイルス)、ならびにポックスウイルスにより引き起こされるものが挙げられるがこれらに限定されない。
【０１０２】
本発明の二重特異性分子の使用により治療または予防できる細菌性疾患または障害としては、ミコバクテリア・リケッチア、マイコプラズマ、ナイセリア属(例えば、髄膜炎菌および淋菌)、レジオネラ、コレラ菌、連鎖球菌(肺炎連鎖球菌等)、ジフテリア菌、破傷風菌、百日咳菌、ヘモフィルス属(例えば、インフルエンザ)、クラミジア属、腸毒性大腸菌、ならびに炭疽菌(炭疽)等により引き起こされるものが挙げられるがこれらに限定されない。
【０１０３】
本発明の二重特異性分子の使用により治療または予防できる原生動物疾患または障害としては、プラスモディウム、アイメリア、リーシュマニアおよびトリパノソーマが挙げられるがこれらに限定されない。
【０１０４】
５．４．２．３．爬虫類または昆虫中毒
爬虫類または昆虫による毒物注入は、被害者の血流へ毒素物質の混合物を沈積させることが多い。このような混合物中の毒素物質は構造的に異種である。臨床的症状(すなわち、中毒)は、複数の血行性毒素の結果である。本発明の一実施形態では、中毒を引き起こす毒素物質およびC3b様受容体の両方に結合する二重特異性分子のポリクローナル集団を有効量投与することにより、このような毒素物質の混合物を標的化して排除する。
【０１０５】
５．４．２．４．さらなる病原性抗原分子
一実施形態では、本発明の方法および組成物により、循環器から排除する１つ以上の病原性抗原分子は、任意の血清剤(バルビツレート、三環系抗うつ薬、およびジギタリスが挙げられるがこれらに限定されない)を包含する。
【０１０６】
別の実施形態では、排除する１つ以上の病原性抗原分子は、過剰量で存在し、被検体に対して一時的または永久的な欠陥または弊害を生じ得る任意の血清抗原を含む。本実施形態は、特に薬物過剰摂取に関する。
【０１０７】
別の実施形態では、循環器から排除される１つ以上の病原性抗原分子は、天然型物質を含む。本発明の方法および組成物により除去され得る天然型病原性抗原分子の例としては、低密度リポタンパク質、インターロイキン、または他の免疫モジュレート化学物質およびホルモンが挙げられるがこれらに限定されない。
【０１０８】
５．４．３．二重特異性抗体の用量
用量は、常套的な実験を行うことにより医師により決定され得る。ヒトに投与する前に、動物モデルにおいて効力が示されることが好ましい。当該分野で公知の循環器疾患用の任意の動物モデルが使用できる。
【０１０９】
より具体的には、二重特異性抗体のポリクローナル集団の用量は、造血細胞濃度、および造血細胞当たりの、抗C3b様受容体モノクローナル抗体に結合されたC3b様受容体エピトープ部位の数に基づいて決定できる。二重特異性抗体が過剰に添加される場合、二重特異性抗体の一部は造血細胞に結合せず、病原性抗原が造血細胞に結合するのを阻害する。この理由は、遊離二重特異性抗体が溶液中に存在する場合、造血細胞に結合した二重特異性抗体と、存在する病原性抗原について競合するからである。従って、造血細胞への病原性抗原の二重特異性抗体仲介型結合は、インプットする二重特異性抗体濃度の濃度の関数として結合を検査する場合には釣鐘型曲線に沿う。
【０１１０】
ウイルス血症は、血液の108〜109ウイルス粒子/mlまで及び得る(HIVは106/ml；(Ho, 1997, J. Clin. Invest. 99:2565-2567))；治療的二重特異性抗体の用量は、血中の抗原数の少なくとも約10倍であることが好ましい。
【０１１１】
一般的に、抗体については、好ましい用量は0.1 mg/kg(体重)〜100 mg/kg(体重)(一般的に10 mg/kg〜20 mg/kg)である。抗体が脳内で作用する場合、50 mg/kg〜100 mg/kgの投薬量が通常適切である。一般的に、部分的ヒト抗体および完全ヒト抗体は、他の抗体よりも、ヒト身体内において長い半減期を有する。従って、低い投薬量および頻度の少ない投与も可能である場合が多い。脂質付加反応(lipidation)等の修飾を使用して、抗体を安定させ、(例えば、脳への)摂取および組織浸透を向上させてもよい。抗体の脂質付加反応の方法は、Cruikshankら((1997) J. Acquired Immune Deficiency Syndromes and Human Retrovirology 14:193)に記載されている。
【０１１２】
本明細書に定義するように、治療的有効量の二重特異性抗体(すなわち、有効投薬量)は、約0.001〜30 mg/kg(体重)、好ましくは約0.01〜25 mg/kg(体重)、より好ましくは約0.1〜20 mg/kg(体重)、そして、さらにより好ましくは約1〜10 mg/kg、2〜9 mg/kg、3〜8 mg/kg、4〜7 mg/kg、または5〜6 mg/kg(体重)にわたる。
【０１１３】
当業者は、特定の要因(疾患もしくは障害の重度、これまでの治療、被検体の全般的な健康および/または年齢、ならびに現存する他の疾患が挙げられるがこれらに限定されない)が、被検体を有効に治療するための必要な投薬量に影響を及ぼすことを理解するであろう。さらに、治療的有効量の二重特異性抗体のポリクローナル集団での被検体の治療は、単一の治療、または好ましくは一連の治療を含み得る。好ましい例では、被検体は、約0.1〜20 mg/kg(体重)の範囲の二重特異性抗体のポリクローナル集団で、週に１度、約１〜10週間、好ましくは２〜８週間、より好ましくは約３〜７週間、そしてさらに好ましくは約４、５または６週間の間治療される。治療に使用する二重特異性抗体のポリクローナル集団の有効投薬量が、具体的な治療の過程において増加または減少され得ることが明らかであろう。投薬量の変化は、本明細書に記載した診断アッセイの結果から得られ、明らかになり得る。
【０１１４】
二重特異性抗体のポリクローナル集団の適切な用量は、通常の熟練した医師、獣医または研究者の知識の範囲内にある多数の要因に依存することが理解されるであろう。二重特異性抗体の用量は、例えば、治療する被検体またはサンプルのアイデンティティー、大きさ、および状態に依存し、さらに当てはまる場合には組成物を投与する経路に依存し、そして、実施者が望む二重特異性抗体のポリクローナル集団の病原性抗原分子または自己抗体に対する効果に依存する。
【０１１５】
二重特異性抗体のポリクローナル集団の適切な用量が、排除する１つ以上の抗原に対する二重特異性抗体の能力に依存することも理解されよう。このような適切な用量は、本明細書に記載するアッセイを用いて決定され得る。１つ以上のこれらの二重特異性抗体を、抗原を排除するために動物(例えば、ヒト)に投与する場合、医師、獣医または研究者は、例えば、最初は比較的低い用量で処方し、その後適切な応答が得られるまで用量を増量してもよい。さらに、任意の具体的な動物被検体に対する具体的な用量レベルは、採用する二重特異性抗体の活性、被検体の年齢、体重、全般的な健康、性別および食事、投与の時間、投与の経路、排出率、あらゆる薬剤の組み合わせ、ならびに排除する抗原の濃度等を含む様々な要因に依存することが理解されよう。
【０１１６】
５．４．４．医薬的製剤および投与
本発明の二重特異性抗体のポリクローナル集団は、投与に適した医薬組成物に取り入れることができる。このような組成物は、典型的に、二重特異性抗体のポリクローナル集団、および製薬上許容可能なキャリアを含む。本明細書で使用する「製薬上許容可能なキャリア」という言い回しは、製薬投与に適合するあらゆる全ての溶剤、分散溶剤、被覆剤、抗細菌および抗真菌剤、等張および吸収遅延剤等を含むことを意図する。製薬上活性な物質用のこのような溶剤および薬剤の使用は、当該分野で周知である。あらゆる従来媒体または薬剤が、二重特異性抗体と適合しない限り以外は、組成物中での使用が想定される。
【０１１７】
本発明の医薬組成物は、意図する投与経路に適合するように処方される。好ましい投与経路は、静脈内である。投与経路の他の例としては、腸管外、皮内、皮下、経皮(局部)、および経粘膜が挙げられる。腸管外、皮内または皮下用途のために使用する溶液または懸濁液は、以下の成分を含み得る：すなわち、注射用水等の滅菌希釈剤、食塩水、不揮発性油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の合成溶剤；ベンジルアルコールまたはメチルパラベン等の抗菌剤；アスコルビン酸または亜硫酸ナトリウム等の抗酸化剤；エチレンジアミンテトラ酢酸等のキレート剤；酢酸塩、クエン酸塩、またはリン酸塩などの緩衝液、ならびに塩化ナトリウムまたはデキストロース等の張力調整剤。pHは、塩酸または水酸化ナトリウム等の酸または塩基により調整できる。腸管外調製物は、ガラスまたはプラスチックからなる、アンプル、使い捨て注射器、または複数用量バイアルに封入され得る。
【０１１８】
注射可能な使用に適した医薬組成物は、滅菌水溶液(水溶性)、または滅菌注射可能溶液もしくは分散液の即席調製用の分散および滅菌粉末を含み得る。静脈投与については、適切なキャリアとしては、生理的食塩水、静菌性水、CremophorELTM(BASF；Parsippany, NJ)、またはリン酸緩衝化食塩水(PBS)が挙げられる。全ての場合、組成物は滅菌され、かつ粘性が低く二重特異性抗体が注射可能な程度に流動性でなければならない。製造および保存の条件下で安定していなければならず、細菌および菌類などの微生物の汚染作用に対抗して保存されなければならない。
【０１１９】
キャリアは、例えば、水、エタノール、ポリオール(例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコール等)、ならびにそれらの適切な混合物を含む溶剤または分散媒体であり得る。適切な流動性は、例えば、レシチン等の被膜物を使用することにより、分散液の場合には必要な粒径を維持することにより、ならびに界面活性剤の使用により、維持できる。微生物の作用を妨げるには、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサール等の様々な抗細菌剤および抗真菌剤により達成できる。多くの場合、糖等の等張剤、マンニトールなどの多価アルコール、ソルビトール、塩化ナトリウムを、組成物中に含むことが好ましい。注射可能組成物の持続した吸収は、組成物に、吸収を遅延させる薬剤(例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチン)を含むことにより実現できる。
【０１２０】
滅菌注射可能溶液は、必要量の二重特異性抗体のポリクローナル集団を、上記列挙した成分の１つまたは組み合わせと共に、適切な溶剤に取り入れ、その後濾過滅菌を行うことにより調製され得る。一般的に、分散液は、二重特異性抗体のポリクローナル集団を、塩基性分散媒体、および上記列挙された中からの必要な他の成分を含む滅菌ビヒクルに取り入れることにより調製される。滅菌注射可能溶液を調製するための滅菌粉末の場合、好ましい調製方法は、活性成分および任意の追加の所望の成分を、先に滅菌濾過されたそれらの溶液から粉末を産出する、真空乾燥および凍結乾燥である。
【０１２１】
一実施形態では、二重特異性抗体のポリクローナル集団は、移植片および微小カプセル化送達系を含む、制御下放出剤形等、身体からの速い排除に対して化合物を保護するキャリアと共に調製される。エチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル(polyorthoester)、およびポリ乳酸等の、生分解性、生適合性高分子が使用できる。このような剤形の調製方法は、当業者には明らかである。材料はまた、Alza CorporationおよびNova Pharmaceuticals, Inc.から市販されている。リポソーム懸濁液(感染細胞を標的化するリポソームを、ウイルス抗原に対するモノクローナル抗体と共に含む)も、製薬上許容可能なキャリアとして使用できる。これらは、例えば、米国特許第4,522,811号(参照により本明細書に全体的に援用する)に記載されるような、当業者に公知の方法により調製され得る。
【０１２２】
腸管外組成物を、投薬量単位で剤形化して、投与を容易にし、投薬量を均一にすることが有利である。本明細書で使用する投薬量単位形態とは、治療する被検体用の単位投薬量に適するように物理的に区別された単位を指す；各単位は、必要とされる製薬キャリアと関連して所望の治療的効果を得るように計算された所定量の二重特異性抗体のポリクローナル集団を含む。本発明の投薬量単位形態の仕様は、二重特異性抗体のポリクローナル集団の独特の特徴、および達成する具体的な治療効果、ならびに個体の治療用にこのような二重特異性抗体のポリクローナル集団を混合する技術特有の限定により決定かつ直接依存する。
【０１２３】
医薬組成物は、投与用の指示書と共に、キット、容器、パック、またはディスペンサーに含まれ得る。
【０１２４】
本発明の一部の実施形態では、二重特異性分子のポリクローナル集団は、１つ以上のモノクローナル二重特異性分子と共に投与され得る。好適な実施形態では、二重特異性分子のポリクローナル集団は、ポリクローナル集団に対して補完的な効果を示し、組み合わせ療法により有効性が向上されるように、１つ以上のモノクローナル二重特異性分子と共に投与される。
【０１２５】
二重特異性分子のポリクローナル集団は、それぞれ抗原認識部分を含む１つ以上のモノクローナル抗体と共に投与されてもよい。このようなモノクローナル抗体は、例えば、ポリクローナル集団中の１つ以上の二重特異性分子の結合親和性を向上させることにより、ポリクローナル集団の治療有効性を高める。好適な実施形態では、二重特異性分子のポリクローナル集団は、ポリクローナル集団に対して補完的な効果を有して、組み合わせ療法により有効性が向上されるように、１つ以上のモノクローナル抗体と共に投与される。
【０１２６】
５．４．５．二重特異性分子のex vivo調製
代替的な実施形態では、二重特異性抗体等の二重特異性分子を、投与前に、被検体の造血細胞とex vivoで予め結合させる。例えば、造血細胞を、治療する個体から採取し(あるいはまた、適合する血液型の非自己ドナー由来の造血細胞を採取し)、適切な用量の二重特異性抗体の治療的ポリクローナル集団と、抗体が造血細胞の表面上のC3b様受容体に結合するのに十分な時間インキュベートする。次いで、造血細胞/二重特異性抗体混合物を、適切な用量で、治療する被検体に投与する(例えば、Taylorら, 米国特許第5,487,890号を参照)。
【０１２７】
造血細胞は、好ましくは血液細胞、最も好ましくは赤血球である。
【０１２８】
従って、具体的な実施形態では、本発明は、１つ以上の病原体または病原性抗原分子の存在を伴う所望でない症状を有する哺乳動物を治療する方法であって、造血細胞/二重特異性分子複合体のポリクローナル集団を治療的有効量で被検体に投与するステップを含む方法であって、該ポリクローナル集団の各メンバーは１つ以上の二重特異性分子に結合したC3b様受容体を発現する造血細胞から本質的になり、該二重特異性分子はそれぞれ、第２の抗原認識部分(例えば、病原体に結合するモノクローナル抗体)に化学的に架橋した第１の抗原認識部位(例えば、CR1に対するモノクローナル抗体)からなり、そして該ポリクローナル集団は、１つ以上の病原体または病原性抗原分子の異なる認識部位に結合するメンバーを含む、方法を提供する。あるいはまた、本方法は、病原性抗原分子の存在を伴う所望でない症状を有する哺乳動物を治療する方法であって、(a)１つ以上の病原体または病原性抗体分子の異なる認識部位を認識する複数の二重特異性分子を有する二重特異性分子のポリクローナル集団を、C3b様受容体を発現する造血細胞と接触させて、造血細胞/二重特異性分子複合体のポリクローナル集団を形成するステップであって、該二重特異性分子はそれぞれ、第２の抗原認識部分(例えば、病原性抗原分子に結合するモノクローナル抗体)に化学的に架橋した第１の抗原認識部位(例えば、CR1に対するモノクローナル抗体)からなるステップ；ならびに(b)該造血細胞/二重特異性分子複合体のポリクローナル集団を治療的有効量で哺乳動物に投与するステップを含む、方法を含む。
【０１２９】
本発明はまた、造血細胞/二重特異性分子複合体のポリクローナル集団を作製する方法であって、二重特異性分子のポリクローナル集団を、C3b様受容体を発現する造血細胞と、結合を促す条件下で接触させて複合体を形成させることを含む方法であって、該複合体は１つ以上の二重特異性分子に結合した造血細胞から本質的になり、該二重特異性分子はそれぞれ、病原体に結合する異なる第２の結合ドメインに架橋した、造血細胞上のC3b様受容体に結合する第１の結合ドメインを含む、方法も提供する。
【０１３０】
Taylorら(米国特許第5,879,679号(以下、「'679特許」))は、場合によっては、二重特異性抗体のインプットが最適でも血漿中の自己抗体(または他の病原性抗原)の濃度が高すぎて、全ての自己抗体が標準的な条件下で造血細胞に結合しないために、この系が飽和することを実証した。例えば、非常に高い力価の自己抗体血清については、自己抗体の一部は、濃度が高いために造血細胞に結合しない。
【０１３１】
しかし、C3b様受容体上の異なる部位に結合するモノクローナル抗体を含む二重特異性抗体の組み合わせを使用することにより、飽和は解決できる。例えば、モノクローナル抗体7G9および1B4は、霊長類C3b受容体上の別々かつ非競合的な部位に結合する。従って、C3b様受容体に対して異なるモノクローナル抗体からそれぞれなる２つの二重特異性抗体の混合物を含む「カクテル」は、赤血球に対する抗体の結合をより高め得る。本発明の二重特異性抗体は、静脈内輸液に使用される特定の流体と組み合わせても使用できる。
【０１３２】
さらに別の実施形態では、二重特異性抗体のポリクローナル集団等の二重特異性分子のポリクローナル集団は、C3b様受容体上の異なりかつ重複しない認識部位に結合する少なくとも２つの異なる第１ののmAbの混合物を用いて、上述したように赤血球とin vitroで予め結合させる。少なくとも２つの重複しない第１のmAbを、C3b様受容体への結合のために使用することで、単一の赤血球に結合できる二重特異性抗体-抗原複合体の数が増える。従って、１つを上回る二重特異性抗体を、単一のC3b様受容体に結合させることで、抗原排除が向上される(特に抗原が非常に高い濃度の場合)(例えば、'679特許、第６欄、41〜64行を参照)。
【０１３３】
５．５．キット
本発明は、本発明の二重特異性分子のポリクローナル集団、または本発明の二重特異性分子のポリクローナル集団および病原体もしくは病原性抗原分子の中和において該ポリクローナル集団と相乗作用的である１つ以上のモノクローナル二重特異性分子が、１つ以上の容器に入ったキットを提供する。本発明はまた、本発明の二重特異性分子のポリクローナル集団、および抗原認識部分をそれぞれ含みかつ該ポリクローナル集団と相乗作用的である１つ以上のモノクローナル抗体が、１つ以上の容器に入ったキットも提供する。本発明の医薬組成物を含むキットも提供する。
【実施例】
【０１３４】
６．実施例：二重特異性分子の抗HIV-1ポリクローナル集団の調製および使用
以下の実施例は、HIV-1ウイルスに結合する第２の抗原認識部分に架橋した、CR1受容体に結合する第１の抗原認識部分をそれぞれ有する複数の二重特異性分子を含む、二重特異性分子のポリクローナル集団の産生および使用を説明する。本実施例は、本発明の好適な実施形態である。
【０１３５】
HIV-1は、一部には、中和回避変異体が迅速に発生することにより、HIV-1感染の間に感染した個体において産生される抗体が永久的な保護効果を提供しないような、非常に変異しやすいウイルスである(Thaliら, 1992, J. Acquired Immune Deficiency Syndromes 5:591-599)。複数の感染ドナーの血漿から得られる高力価抗HIV IgG調製物等の抗体のポリクローナル調製物は、幅広いHIV単離体の認識および中和において特定の利点を有することが示されてきた(Cumminsら, 1991, Blood 77:1111-1117；Lambertら, 1997, J. Infectious Diseases 175:283-291)。従って、HIV-1ウイルスに結合する異なる第２の抗原認識部分に架橋した、CR1受容体に結合する第１の抗原認識部分をそれぞれ含む複数の異なる二重特異性分子を含む二重特異性分子のポリクローナル集団は、HIV-1感染に対する高い治療的および/または予防的効力を患者に提供するのに有利である。
【０１３６】
ハイブリドーマ細胞系ATCC HB 8592を、American Type Culture Collection (ATCC)から得る。ハイブリドーマを、ダルベッコ改変型イーグル培地(DMEM)中で対数期まで培養する。ハイブリドーマ細胞をまずPBS中で洗浄する。次いで、細胞を、1 ml緩衝液GTC(4Mグアニジン-イソチオシアネート、25 mMクエン酸ナトリウム、0.5％サルコイル(Sarcoyl)、0.1Mβ-メルカプトエタノール)中に再懸濁させる。次いで、0.1 ml酢酸ナトリウム(3M、pH5.2)、0.5 mlフェノール、および0.2 mlクロロホルムを、細胞懸濁液に添加する。次に、細胞懸濁液を、10,000×gにて15分間遠心分離にかける。１容量のイソプロパノールを使用して上清を沈降させ、10,000×ｇにて15分間遠心分離にかける。ペレットを、70％EtOH中で洗浄し、通気乾燥させてから、100μl DEPC処理水に再懸濁させる。次いで、抗CR1 mAbを上清から回収する。
【０１３７】
精製ポリクローナル抗HIV-1免疫グロブリン(HIVIG)の調製物は、様々な入手先(例えば、NABI(Boca Raton, FL)、Chromaprobe(Mountain View, CA)、BioHeme(Salt Lake City, UT)、またはNational Institute of Health(www.aidsreagent.com))から得られる。HIVIGを、米国の地理的に多様な領域から選択した複数のHIV-1-陽性ドナーから精製する。生成物は、98％モノマー免疫グロブリンＧを含む50-mg/ml溶液である。
【０１３８】
精製ポリクローナル抗HIV-1免疫グロブリンの調製物を、N-スクシンイミジル-3-(2-ピリジルジチオ)プロピオン酸塩(SPDP)(Pharmacia Fine Chemicals, Piscataway, NJ)を製造元のプロトコールに従い使用して、抗CR1 mAb調製物と架橋させる。架橋させた二重特異性分子を、2.6×90 cm Ultrogel ACA34カラム上でゲル濾過により分画して、非架橋分子を除去する。
【０１３９】
架橋した二重特異性分子の集団の二重特異性を、Taylor, 米国特許第5,470,570号；同第5,487,890号；および同第5,879,679号に記載の方法に従って実証する。
【０１４０】
二重特異性分子のポリクローナル集団を、感染患者の血流からHIV-1ウイルス粒子を除去するための治療薬として使用する。5 mg用量のポリクローナル集団(好ましくは液体形態)を、通常の大きさの感染した成人患者に腸管外的に投与する。患者の血流中のHIV-1ウイルス粒子のレベルを、当該分野で公知の任意の標準的なウイルス量アッセイ(例えば、Roche Diagnostics (Indianapolis, IN)のAMPLICOR HIV-1 MONITOR)を用いてモニターする。ポリクローナル集団の投与により、投与の初期に血中HIV-1レベルが数桁低下する。
【０１４１】
二重特異性分子のポリクローナル集団は、予防的にも使用される。予防的用途においては、ポリクローナル集団は、HIV感染の危険性が高いヒト(医療職員および感染患者の性的パートナーが挙げられるがこれらに限定されない)に月に一度投与される。予防としては、二重特異性分子のポリクローナル集団は、HIV-1ウイルス粒子を、持続的かつ感知可能レベルに到達するのを妨げる。
【０１４２】
７．引用参考文献について
本明細書中で引用した全ての参考文献は、個々の参考文献、特許または特許出願がそれぞれ具体的にかつ個々に、あらゆる目的のために参照により全体的に援用されると記載するのと同等に、あらゆる目的のために参照により本明細書に全体的に援用する。
【０１４３】
本発明の思想および範囲から逸脱することなく、本発明の多くの改変および変更を行うことができることが当業者には明確であろう。本明細書に記載した具体的な実施形態は、例示のためにのみ提供されるものであり、本発明は、請求の範囲が権利を与える等価物の全範囲と共に、添付の請求の範囲の項によってのみ限定される。
【図面の簡単な説明】
【０１４４】
【図１Ａ】ポリクローナル集団中の二重特異性分子の模式図である。
【図１Ｂ】二重特異性分子のポリクローナル集団の模式図である。
【図１Ｃ】モノクローナル二重特異性分子と比べた、二重特異性分子のポリクローナル集団の活性の模式図である。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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