(57)【要約】【課題】【解決手段】ケージド化合物、すなわち化学活性または生化学活性が一般に光分解により制御されて、化学反応または生化学反応に関与する活性部分を放出する合成化学化合物を、光ではなくて電流にさらして、活性部分を放出させる。この方法は、反応を誘発する入力エネルギーと測定目的での光出力との間の混同を回避するため、測定下で分析物を定量化するために光出力を測定することが必要とされる場合に、化学発光生化学活性において特に有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
活性部分が不活性形態で保持されているケージド化合物から該活性部分を放出する方法であって、前記ケージド化合物を高エネルギーの電流パルスにさらす工程を含む方法。
【請求項２】
前記ケージド化合物が、該ケージド化合物を前記高エネルギーの電流パルスにさらす時点で、前記活性部分に対して化学的に活性である少なくとも１つの試薬も含有する電解質媒質中に溶解または懸濁される請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記活性化学部分および前記少なくとも１つの試薬が、それらの化学反応が測定可能なシグナルを生じるように選択される請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記測定可能なシグナルが発光である請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記電流がＤＣ電流である請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記ＤＣ電流パルスが、総エネルギー約０．０１ｍＪ〜約１５Ｊを供給する請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記ケージド化合物が芳香環含有保護基を有する請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記ケージド化合物が、ヘテロ原子により前記活性部分に連結された２−ニトロベンジル基を含む請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記活性部分が、測定可能な結果を伴う化学反応を誘発するのに必要な化合物である請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記活性部分が、カルシウムイオン、ＡＴＰ、ＧＴＰ、フルオレセイン、ビオチンまたはストレプトアビジンである請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
所定の分析物に対する生化学的結合アッセイを実施する方法であって、前記分析物を含有するか、または前記分析物を含有することが疑わしい媒質、前記分析物に対する少なくとも１つの特異的結合パートナー、および成分の１つがケージングされているシグナル発生系の他の成分の混合物を調製する工程、ケージド化合物を高エネルギー電気パルスにさらすことにより活性形態でケージド化合物から活性部分を放出させる工程、および前記シグナル発生系より発生したシグナルを測定する工程を含む方法。
【請求項１２】
前記シグナルが発光である請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記電流がＤＣ電流である請求項１１または１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記ＤＣ電流パルスが、総エネルギー約０．０１ｍＪ〜約１５Ｊを供給する請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記分析物が、触媒の存在下でルシフェリンと反応可能な発光タンパク質に連結または結合されて化学発光を放出する請求項１１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
前記触媒が、前記ケージド化合物にケージングされている請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記触媒がカルシウムである請求項１５または１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記発光タンパク質が、貝虫類(ostracods)または介形虫類(cypridina)のエクオリン、オベリン、ニミオプシン、ベロビン、フォラシン、ルシフェラーゼである請求項１５〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
前記分析物が、測定可能な結果を発生するためのルシフェラーゼ酵素に連結または結合されている請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記ケージド化合物が触媒ケージドＡＴＰである請求項１９に記載の活性部分をケージド化合物から放出する方法。
【請求項２１】
前記ケージド化合物がケージドルシフェリンである請求項１５〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
結合アッセイのシグナル伝達メカニズムが一旦活性化されると発光をもたらす、所定の分析物に対する結合アッセイを実施する方法であって、電解質媒質中に、前記分析物を含有するかまたは前記分析物を含有することが疑わしい液体、前記分析物に対する１つまたは複数の特異的結合パートナー、および成分の１つまたは複数がケージングされている光発生シグナル伝達メカニズムの他の必須成分の混合物を調製する工程、ケージド化合物からの活性部分のアンケージングおよびそれによる光生成反応の開始をもたらす高エネルギー電気パルスに前記媒質をさらすことにより、活性形態で前記ケージド化合物から活性部分を放出する工程、および前記シグナル伝達メカニズムから放出された光シグナルを測定する工程を含む方法。
【請求項２３】
前記シグナル伝達メカニズムが、発光タンパク質化学発光反応による光発生である請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記シグナル伝達メカニズムが、ルシフェラーゼ化学発光反応による光発生である請求項２２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、「ケージド化合物」（ｃａｇｅｄ  ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ）として知られる化学複合体、ならびに化学反応および生化学反応を開始する際におけるそれらの使用に関する。より具体的には、本発明は、ケージド化合物を開裂させて、そこから反応性の化学的成分または生化学的成分を放出させて、化学反応または生化学反応（例えば、生化学的アッセイ）において放出された活性物を利用する手順に関する。
【背景技術】
【０００２】
化学基によっては、それらが光化学的に除去または破壊され得るという利便性の高い特性を有するものもある。かかる光反応性化学基は広く記述されており、各種用途で使用されている。化学反応の経過中での必須活性化学種の光発生は、一般に使用される開裂方法よりも穏やかな開裂方法を提供する。したがって、光不安定性化学基を含有する化合物は、有機反応および生体有機反応で広く使用されている。
【０００３】
重要な試薬、例えばアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）の活性を調節または阻止し、したがってその生化学機能を妨げる光不安定性化合物を調製することができることにより、試薬の局在化された送達が可能となる。これは「化学ケージング」（ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｃａｇｉｎｇ）と称されている。本質的に、光分解は瞬時にその場（ｉｎ  ｓｉｔｕ）で反応物を放出し、反応を進行させる。
【０００４】
ケージド化合物は、その生物学的活性または生化学的活性が光触媒反応により制御される合成物である。ケージド化合物は、所望の分子（「活性部分」）と適切な光除去可能な保護基すなわち「ケージング基」との共有結合により最も一般的に設計され、その結果活性部分の活性はマスキングされるか、またはケージングされる。一種の化学ケージングでは、適切な波長の光照射（光分解）時に、光不安定性結合が破壊されて、化学反応または生化学反応に関与することができる活性部分を放出し、その結果、それはすぐ周囲の媒質中で化学反応または生化学反応を開始させる。別の種類の化学ケージングでは、光不安定結合が適切な波長を用いた光照射（光分解）時に破壊されて、化学反応の必須成分の１つの除去をもたらす活性部分を放出する。換言すると、ケージド化合物を用いた光触媒反応は、化学反応から必須成分を添加または除去することができる。
【０００５】
「ケージド」という用語は、生物学的活性種または生化学的活性種が、より大きな化学的「フレームワーク」内部に捕捉およびマスキングされ、照射時に「放出」させることができ、したがって活性内容物をアンケージングすることができることを示すものとして利用される。「ケージド」という用語は、それは厳密に正確であるというよりは簡潔かつ視覚的であることからポピュラーになっている（Adams et al., Annu. Rev. Physiol. 55:755-784, 1993を参照）。
【０００６】
化学部分をケージングおよびマスキングするために光不安定化学基を利用する重要な用途の１つは、生物学的な系のプロービングである。例えば、ケージド化合物の光不安定化学基の光分解、およびそれによる酵素系に関与する活性化学部分の放出は、かかる系における生化学応答の迅速な動態または空間的不均質性を検査するための最良の技法の１つである。照射は、時期、位置および強度において容易に制御することが可能である。ケージド化合物のような不活性な光不安定性化合物を生物学的系に導入した後、それを光で非常に迅速に活性化することにより、生理学的に活性な化合物を複雑な系に導入することについて時間的および空間的制御を発揮することができる。このことは、制御された強度で、活性種の濃度の急激な変化および局在化された変化を引き起こす手段を提供する。これは、迅速な機械的混合が、例えば、多かれ少なかれ、無傷細胞、組織またはタンパク質結晶の表面上またはそれらの内部で実行不可能である場合に特に貴重である。
【０００７】
ケージド化合物は、時分解ラウエ結晶解析を使用することにより、短命の酵素中間体の構造を確定するのに利用されている。高速な酵素プロセスを研究する際に、数多くの研究者等がケージド化合物を使用して、必須官能基をマスキングしており、その結果化学反応は光パルスにより開始され得る。
【０００８】
化合物をケージングする際に使用される光不安定性保護基の多く（しかしすべてではない）は芳香環を含む。生化学系で有用であるためには、保護基は幾つかの要件を満たさなくてはならない。光不安定性保護基による化合物のケージングは、ケージド化合物を使用される生化学系に対して不活性なものとするべきである。光不安定性保護基は、生化学調製物にとって不利益ではない波長での光分解によって、高収率かつ十分な速度で活性化学部分を放出すべきである。さらに、活性部分以外の光産物は、系と相互作用すべきではなく、あるいは系を干渉すべきでない。今日までに報告されているほぼすべての有用なケージド生物学的分子において、活性部分を含む単純な共有結合形成が、生物学的認識に重要である幾つかの特徴をマスキングする。当該共有結合の光化学的開裂は、活性種（活性部分）または活性部分に対して変化した（通常かなり低減されたか、またはかなり増大された）親和性を有する光産物を放出する。
【０００９】
現時の文献で最も頻繁に記載されるケージング化合物は、２−ニトロベンジル誘導体の光異性化に基づいたものである。ニトロベンジル基は、ヘテロ原子、通常Ｏ、ＳまたはＮを介した結合により活性分子に組み込まれる。広範囲な他の光不安定性保護基もまた市販されている。
【００１０】
これらの光不安定性保護基すべてにおいて、光活性化プロセスは光源を必要とする。任意の適切な従来の光源を利用して、光エネルギーのパルスを送達して、光不安定性化合物をアンケージングして活性物を放出してもよい。最も一般的には、紫外線（ＵＶ）または赤外線領域のエネルギーを放出するレーザーが使用される。光パルスの短い高流束放出は、光不安定性保護基の光除去をもたらす。また、ＵＶスペクトル領域で放出するか、またはそれらの光出力をフィルタリングしてＵＶ照射を送達するＵＶフラッシュランプは、ケージド化合物の光化学に広く応用されている。
【００１１】
光学源の波長およびエネルギーは、ケージド化合物の特定の光不安定性結合を破壊する適切なパルスを発生するように適応されてきた。光不安定性化学基およびそれらの除去に関する最適波長の非網羅的一覧は、最近公表された（１９９８年）Methods in Enzymology Volume 291 「ケージド化合物(Caged Compounds)」に見出され得る。
【００１２】
また、化学反応または生化学反応において種々の機能を媒介するケージング化合物を生産するために種々の特性を有する各種化学物および生化学物において様々な光不安定性化学基を包含することはまた、上記に引用した最近の参照文献に見出される。
【００１３】
光不安定性保護基による化学ケージングは、アミノ酸、核酸、酵素基質、生化学反応の触媒、および親和性が照射時に変化する結合分子との結合に使用されている。生化学系で使用するためのケージド化合物形態で使用される活性部分の一般例には、カルシウムイオン、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、グアノシン三リン酸（ＧＴＰ）、フルオレセインおよびビオチンが挙げられる。
【００１４】
生化学プロセスでのケージド化合物の使用の具体例は、イムノアッセイ、核酸結合アッセイおよび受容体結合アッセイのような生体親和性結合アッセイにおけるものである。かかる結合アッセイでは、親和性パートナーの特異的結合は、容易に測定され得る特性の変化をもたらす。変化した特性は、酵素活性またはある特定の酵素活性を生じる親和性の変化であり得る。変化した活性はまた、結合反応より前にある特定の特性の変化により測定することができる。かかる変化は、光発生、色吸光度の変化または色の発生であり得る。
【００１５】
アビジンまたはストレプトアビジンへのビオチンの結合の親和性は、化学における最強の非共有結合の１つである。ビオチンおよびストレプトアビジンの両方が首尾よくケージングされ、それらの結合が空間的または時間的条件で制御される必要がある光分解反応で利用される。また、これらの結合パートナーの高親和性を利用するために、両分子は様々な化合物に首尾よく結合された。
【００１６】
米国特許第５，９８１，２０７号では、Burbaum等は、レポーター酵素活性、および推論によって創薬のための細胞ベースのアッセイにおける試験下での化合物の活性化因子または抑制因子がモニタリングされ得る生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）細胞ベースのレポーター遺伝子結合アッセイ中での遺伝的に改変された細胞におけるプローブとしてのケージド酵素基質の利用について開示している。また、国際特許出願ＰＣＴ／ＣＡ００／００７１８号では、Gawadは、ケージド化合物を利用することにより生体外（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）結合アッセイをモニタリングするプロセスについて開示している。両発明において、化学発光反応は、結合アッセイに関与する活性部分のケージド化合物からの光分解放出により誘発される。生じた化学発光シグナルは収集されてモニタリングされる。かかる光不安定性反応では、結合動態は厳密に制御される。
【００１７】
かかるプロセスに伴う難題は、ケージド化合物からの結合反応シグナルを開始するのに必要な活性部分の放出を誘発する光源、および化学発光反応の放出光出力を測定するための光検出システムの両方の必要性である。かかる光シグナルは互いに干渉することができ、（ケージド化合物のアンケージングを引き起こすための）誘発性光シグナルと化学発光反応から生じる放出光との間の混同を引き起こす。さらに、十分な発光が意義ある測定のために収集されるべきである場合、光入力を供給するシステムの存在下で発光を測定するのに必要な電子検出システムは複雑であり、扱いにくく、また高価である。さらに、誘発性光は、２つの異なる光シグナルを分離するための光フィルトレーションプロセスの必要性に起因して、結合アッセイの感度を減少させる。
【発明の開示】
【００１８】
本発明の目的は、化学反応に関与することが可能な活性部分を放出するためのケージド化学化合物の開裂に関与するプロセスを実行する新規方法を提供することである。
【００１９】
本発明のさらなるより具体的な目的は、発光生化学親和性アッセイを実施する新規方法を提供することである。
【００２０】
全部ではないが多くのケージド化合物は、高エネルギー電流のパルスにさらされることにより活性条件で開裂されて、ケージド化学部分を放出することができることを今回見出した。本発明によれば、光分解により所望の活性部分の放出を誘発するのではなく、まったく異なる入力、すなわち高エネルギー電気パルスが使用され、その結果、活性部分がケージド化合物から放出され、続いてこの活性部分が特に光発生を包含するシグナル発生のための反応に関与する系で、活性部分を放出させるための入力は、反応からの出力と混同され得ない。このことが、より簡素な検出システムの採用へと、また光出力のより正確な測定へと導く。
【００２１】
さらに、ケージド化合物からの活性部分の放出を誘発する方法が光パルス以外である光発生反応では、あまり複雑でない機械を用いて、反応結果の定量化の感度の増大を達成することができる。
【００２２】
したがって、本発明の第１の態様によれば、活性部分が不活性形態で保持されているケージド化合物から該活性部分を放出する方法であって、ケージド化合物を高エネルギー電流のパルスにさらすことを含む方法が提供される。
【００２３】
第２のより具体的な態様によれば、所定の分析物に対する生化学的結合アッセイを実施する方法であって、液体媒質中に、前記分析物と前記分析物に対する特定の結合パートナーとの複合物および構成成分の１つがケージングされているシグナル発生系の他の構成成分を含む混合物を調製する工程、ケージド化合物を高エネルギー電気パルスにさらすことにより活性形態でケージド化合物から活性部分を放出させる工程、およびシグナル発生系より発生されたシグナルを測定する工程を含む方法が提供される。
【００２４】
「分析物」（ａｎａｌｙｔｅ）は一般に使用される当該技術分野の用語であり、その存在および／または量が試験媒質中で決定されるべき標的化合物を表す。分析物は通常、反応スキームにおける必須反応物である。かかる分析物に対するアッセイでは、生体親和性または酵素触媒反応に基づいた結合反応が一般に使用される。試験下で分析物に対して特異的結合親和性を有することが知られている特異的結合パートナー、例えば適切に選択された抗体、天然ホルモン結合タンパク質、レクチン、酵素、受容体、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはペプチド核酸（ＰＮＡ）、あるいは人工抗体または核酸プローブは、分析物と複合体を形成するのに使用され、それは複合体を定量化するための標識を包含する。本発明のプロセス、すなわちケージド化合物を高エネルギー電流にさらして、ケージド化合物から活性成分を放出させることは、分析物と結合パートナーの複合体を形成するか、またはシグナル発生系を活性化するのに必要とされる活性成分のいずれかを反応媒質に提供するために適用することができる。
【００２５】
第３のさらに具体的な態様によれば、所定の分析物に対する結合アッセイを実施する方法であって、結合アッセイのシグナル伝達メカニズムが一旦活性化されると、発光をもたらすことを特徴とする方法が提供される。この態様によれば、電解質媒質中に、前記分析物を含有するか、または前記分析物を含有することが疑わしい液体、前記分析物に対する１つまたは複数の特異的結合パートナー、および成分の１つがケージングされている光発生シグナル伝達メカニズムの他の必須成分の混合物を調製する工程、ケージド化合物からの活性部分のアンケージングおよびそれによる光生成反応の開始をもたらす高エネルギー電気パルスに媒質をさらすことにより、活性形態でケージド化合物から活性部分を放出する工程、およびシグナル伝達メカニズムから放出された光シグナルを測定する工程を含む方法が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２６】
本発明により使用するための高エネルギー電気パルスにさらすことに応答して活性部分の放出を受けるケージド化合物は、有機保護基および活性形態で光化学的に放出可能な活性部分を有する、文献でこれまでに報告されている実質的にすべてのものを包含する。本発明により使用するためのケージド化合物の好ましい保護基としては、２−ニトロベンジル、カルボキシ−２−ニトロベンジル、２，２’−ジニトロベンズヒドリル、１−（２−ニトロフェニル）エチル、４，５−ジメトキシ−２−ニトロベンジル、１−（４，５−ジメトキシ−２−ニトロフェニル）エチル、５−カルボキシメトキシ−２−ニトロベンジル、（（５−カルボキシメトキシ−２−ニトロベンジル）オキシ）カルボニル、臭化（１−ジアゾベンジル）ピレン、臭化Ｎ−ヒドロキシ−２−チオピリドン、臭化Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル、ｐ−アジドベンゾエート、臭化ｐ−アジドベンゾイルグリシンのＮ−ヒドロキシスクシンイミジルエステル、臭化Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル、（１−（２−ニトロ−４，５−ジメトキシ）フェニル−ジアゾエタン、１−（２−ニトロ）フェニル−ジアゾエタン、１−（２−ニトロ−３，４，５，６−テトラメチル−ジアゾエタン、デスオキシベンゾイニル、ヒドロキシフェナシル、６−ニトロベラトリルオキシカルボニル、６−ニトロピペロニルオキシ−カルボニル、α−ジメチル−ジメトキシベンジルオキシカルボニル、１−（４，５−ジメトキシ−２−ニトロフェニル）−１，２−ジアミノエタン−Ｎ，Ｎ，Ｎ，Ｎ−四酢酸（ＤＮＭＰ）、および１−ピレニルメチルが挙げられる。以下にさらに論述するように、これらの保護基と本発明で使用するための好ましい基質（ＡＴＰ、ＧＴＰ、Ｃａイオン等）との最良の組合せを決定するために、またそれらの開裂のための最適電流パルス特性を決定するために、幾つかのルーチンな実験が熟練操作者側に必要とされる場合がある。
【００２７】
本発明のプロセスは、高エネルギー電気パルスを利用して、化学結合を破壊することにより、あるいは電気パルスを印加する前と後でのケージング分子の化学親和性の変化により、活性形態でケージド化合物から活性部分を放出させる。交流ＡＣパルスの使用は、ケージド化合物の最も効率的な開裂を実施するために電流の周波数のきめ細かい調整を必然的に伴うため、好ましくは電気パルスは直流ＤＣパルスである。エネルギーが光不安定性ケージング基を開裂させるのに十分大きく、化学反応の１つまたは複数の成分を破壊するほど大きくない場合、かかる問題はＤＣ電流に直面しない。最小量の直流電流を用いて、光不安定性化学部分を開裂させる。幾つかのパラメータ、すなわち電流、電圧、および反応が実施される系の物理的パラメータ（例えば、電流を送達するための電極の形状、電解質の性質、電極の材料および反応容器の形状）がケージング化合物に送達されるエネルギーレベルを決める。これらの要因のすべてによって、光不安定性化学基に送達される電流密度が定まる。所望の結合開裂を実施するのに供給されるべき必要なエネルギー量は、選択した結合の結合エネルギーに関連するが、電解質の性質および電解質が吸収するために光不安定性結合に到達しない印加電気エネルギー量といった要因があるので、その関係性は直接的ではない。
【００２８】
本発明の好ましい実施形態において供給される総エネルギーは、約０．０１ｍＪ〜約１５Ｊである。供給されるエネルギーは、電流が送達される時間、ならびに電流強度に依存する。例えば、供給されるＤＣ電流が高電圧（３００ボルト以上）である場合、ケージド化合物を開裂させるのに必要とされるパルスの持続時間は１μ秒程度と短くてもよい。より低電圧（例えば、７０ボルト）が使用される場合、１μ秒のパルス持続時間では単にケージド化合物から活性部分の一部を放出するにすぎず、ケージド化合物すべてを放出させるためにはかかる持続時間の反復パルスが必要とされる。化学反応の様々な態様を制御するために、ケージド活性部分の一部のみの放出が望ましい場合がある。より長いパルスは重大な問題を引き起こさないようである。より長いパルス（３．３秒）のための低電圧（例えば、４．８Ｖ）は実際に満足いくように使用されている。かかる低電圧およびより長い時間の使用はエネルギー損失を最低限に抑えるが、液体媒質を加熱させ得る。最適電気入力を決定するために、選択したシステムを用いた幾つかのルーチンな実験が望まれる場合があるが、かかる実験は十分に当業者の範囲内である。
【００２９】
実際に、本発明のプロセスを実行する好ましい方法は、２つの間隔をあけて配置された電流送達電極を包含する反応セルを利用することであり、電流は電解質を通じてその電極間を通ることができる。セルは、適切な程度に、ケージド化合物を含む必要とされる反応成分全てを含有する電解質媒質で充填される。ＤＣ電流送達時に、ケージド化合物の光不安定性化学基は、所望の化学反応を開始させるのに必要な活性部分を放出する。反応成分の１つがケージド化合物である光発生化学反応では、光受容検出システムが提供されて、反応溶液からの光放出を受け入れて定量化する。
【００３０】
所定の電圧および持続期間、すなわち所定のエネルギーレベルのパルスＤＣ電流を供給するための適切な電気回路は、電極に接続され、そして、活性化されてケージド化合物の開裂を引き起こす。ケージド化合物の開裂を引き起こすのに入射光は使用されないので、光発生化学反応で放出された光を収集するのに、耐光性シャッターまたは濾光装置もしくはビーム分割装置のような特殊な方法は必要とされない。
【００３１】
本発明のプロセスは、上述のように結合アッセイにおける化学反応からの発光放出を引き起こす際の有用性を示すだけでなく、ケージド化合物のアンケージングおよび化学反応の進行に必須な活性部分の放出に起因する検出可能な変化が観察される他の領域でも有用性を示す。
【００３２】
さらに、本発明のプロセスは、反応系の一成分の制御された空間的または時間的送達を提供し、かかる成分の複雑な機械的送達メカニズムを設計することを不要にする。本発明のプロセスから利益を得る各種化学反応には、多くの結合アッセイが包含される。例えば、細菌に対する抗体が、固体基質に結合することができ、そして、後にケージド化合物から放出される活性成分と反応する選択された酵素に選択的に結合して、酵素活性の検出可能な変化が測定される食品中の細菌混入の測定である。
【００３３】
本発明は、以下の具体的な実験例で、単に説明の目的でさらに記載される。
［本発明の方法の特定の実施形態］
【００３４】
本発明の方法は、反応媒質への電気パルスの送達時の化学反応の誘因である。本発明の方法を使用するための前提条件は、化学反応の開始のためにケージド化合物が存在することであり、それはケージド状態では不活性であるか、または誘因化合物を反応を活性化するのに接近しにくいものにする誘因化合物を保有する。電流パルスによる反応の活性化の本発明の方法を使用すると、化学反応は、ケージド不活性前駆体から活性化合物を放出することにより開始される。ケージド化合物は、試薬の送達のための化学的捕捉方法を提供し、これは化学試薬の物理的捕捉（例えば、リポソーム中）のような他の送達方法、あるいは機械的手段による送達より優れている。
【００３５】
ある特定の化学反応は、反応の加速、反応動力学の制御により、あるいは試薬の時間精度の高い添加に必要な機械を簡素化することにより、化学反応が進行するのに必要なケージド化合物から活性化合物を放出するために電流を印加する本発明の方法から、利益を得ることができる。単純な化学反応の一般スキームは以下の通りである：
Ａ＋Ｂ  →  Ｃ
【００３６】
Ｃが最終反応生成物であり、測定することができるにせよ、あるいはＣがこの反応を定量化する測定可能なシグナルを発生するための別の化学反応につなげられるにせよ、本発明の方法を使用することができる。反応成分はすべて測定可能な結果に必須であり、成分のいずれかまたはすべてが光不安定性結合でケージングすることができ、適切な電気回路により供給される本発明による高エネルギー直流電気パルスにより放出させることができる。
【００３７】
本発明の方法から利益を得るための反応の前提条件は、反応物すべてを一緒に混合することであり、１つまたは複数の試薬がケージングされ、反応の進行を促進しない。本発明の方法による化学反応が進行するのに必要とされる活性部分としてのケージド成分の放出は、測定可能な生成物の生産をもたらす。本発明のプロセスで供給される電気パルスの特性に応じて、反応速度が制御され得る。
【００３８】
測定可能な結果を生じ、ケージド化合物を放出する本発明の方法から利益を得ることができる様々な化学反応の例は、光生成化学反応、例えば酵素および結果が可視的である化学反応を包含するものが挙げられる。本発明の方法から利益を得ることができる各種化学反応の具体的な実施例は以下の通りである：
【００３９】
実施例１：光生成化学発光反応
数多くの化学発光反応が知られており、研究および臨床検査で利用される。化学発光反応を開始させるのに必要な１つまたは複数の化合物のケージング、および本発明の方法による必要な化合物の放出は、光発生の速度および強度に関する制御、同様に活性化学化合物の放出時期に関する制御を提供する。
【００４０】
例えば、発光タンパク質を使用する化学発光反応では、反応の開始は反応混合物へのＣａの添加に依存する。発光タンパク質化学発光反応は、以下の方程式で説明することができる：
発光タンパク質＋ルシフェリン＋Ｃａ＋酸素  →  光
【００４１】
荷電発光タンパク質（すでにルシフェリンに結合された発光タンパク質）へのＣａの添加により、即時の化学反応および光発生が生じる。ＣａをケージドＣａ化合物で置換すること、および本発明の電気パルスによりケージドＣａの放出を誘発することにより、化学発光反応および光発生が開始される。
【００４２】
電気パルス特性に応じて、化学発光反応からの光発生は、光の単一閃光、または幾つかの閃光、あるいは本発明の方法で使用される電気パルスの特性により規定されるＣａ放出量に応じた固定発光であり得る。
【００４３】
電流パルスが光不安定性ケージング化合物を変化させ、Ｃａを放出させて発光タンパク質化学発光を誘発したことを確認するために、反応成分の１つを反応チャンバから省いた。光不安定性Ｃａケージング化合物を反応から省いた場合、化学発光光発生は起こらなかった。発光タンパク質を省くと、化学発光光放出は起こらなかった。しかしながら、電気パルス後に発光タンパク質を添加することで化学発光光が発生する。
【００４４】
さらに、このプロセスがケージング化合物の変化および反応を誘発するためのＣａの放出に特異的であることを確認するために、発光タンパク質よりもＣａに対して高い親和性を有する非光不安定性Ｃａキレート剤（ＥＤＴＡ）を、Ｃａケージング化合物を含むすべての他の反応成分を含有する反応セルに添加した。かかる条件下では、放出されたＣａが非光不安定性Ｃａキレート剤によりキレート化されるため、光発生は起こらない。
【００４５】
さらに、この形態のエネルギーによる光不安定性誘発化合物のアンローディングの特異性を確認するために、Ｃａケージング化合物の存在下の同じ化学発光反応を誘発する試みにおいて、別の形態のエネルギーを利用した。同じ電気回路により電磁石の電磁場を誘発することで光発生は生じなかった。
【００４６】
発光タンパク質の例は、貝虫類および介形虫類のエクオリン、オベリン、ニミオプシン、ベロビン、フォラシン、ルシフェラーゼである。
【００４７】
別の例である本発明の方法が有用な化学発光反応は、ルシフェラーゼを使用する化学発光反応である。光を発生するホタルルシフェラーゼ媒介性化学反応は、以下のように例示することができる：
ルシフェラーゼ＋ルシフェリン＋ＡＴＰ＋Ｍｇ＋酸素  →  光
【００４８】
ルシフェラーゼ媒介性化学発光光発生反応中、反応の１つまたは複数の必須成分がケージド形態で存在し得る。存在する反応構成成分すべてにより、ケージド分子のアンケージングのために本発明の方法を利用することで、ルシフェラーゼ化学発光反応から光発生を誘導する。反応を誘発するための電流パルスの本発明の方法により反応を誘発することで、ケージド成分の制御された放出が起き、放出された活性部分は反応を誘発して、光発生をもたらす。制御された方式で、１つまたは複数のケージド化合物を放出するための電流パルスの調節は、モニタリングすることができる発光を生じるであろう。
【００４９】
一般に、ルシフェラーゼ媒介性化学発光反応は、せいぜい１秒程度しか持続しないために測定およびモニタリングするのが困難である光バーストの放出をもたらす。幾つかの従来技術の特許は、１つまたは複数の補因子を反応に添加することにより光出力を変化させる方法を開示している。本発明の方法を利用することにより、ケージド化合物の放出を制御することによって、放出される光量を制御し、また発光をモニタリングするのに必要な機械を簡素化する。ルシフェラーゼ酵素の化学発光系の幾つかの成分は、ケージド形態（例えば、ルシフェラーゼ酵素自体、ルシフェリンおよびＡＴＰ）ですでに市販されている。また、ケージドキレート剤を利用して、Ｍｇをケージングすることができる。これらのほとんどがMolecular Probes(Eugene)から入手可能である。
【００５０】
実施例２：非化学発光光放出反応
蛍光結合反応では、結合アッセイの感度は、反応が実施される媒質ならびに容器の蛍光により制限される。高い非特異的バックグラウンドシグナルは、蛍光アッセイの検出の下限を制限する。特異的シグナルの蛍光を刺激する前に反応媒質の非特異的蛍光を消去することにより、より低いバックグラウンドをもたらし、その結果検出の下限を低減させることが示唆されている。幾つかのケージド蛍光化合物がこの目的で開発された。ケージド蛍光化合物が存在する媒質を照射することにより、媒質の蛍光が消去され、同時に枯渇することなくケージド蛍光化合物は維持される。そして、本発明の方法を用いた蛍光化合物のアンケージングは、放出シグナルを集めるのに必要とされる機械を簡素化するであろう。というのは、別の方法ではケージド化合物をＵＶ光で照射する必要があり、近年の蛍光化合物の刺激スペクトルのほとんどが可視域に存在するためである。したがって、本発明の方法を利用することが、様々な検出システムの光学構成部品を単純化する。
【００５１】
実施例３：色酵素反応
高エネルギー電気パルスの利用によりケージド化合物をアンローディングまたはアンケージングして、活性部分を放出させる本発明の方法は、酵素が媒介する色変化を用いた結合アッセイで使用することができる。数多くの結合反応および結合アッセイが、検討中の化学物の量を示す測定可能な色変化をもたらす酵素を利用する。これらの反応のほとんどにおいて、酵素触媒プロセスは、ある色から別の色への基質の変換をもたらす。そして、色変化量は化学物の量を示す。かかる反応中、系に１つまたは複数の成分を添加することにより反応の開始が誘発される。一般に、この工程は機械的に実施される。機械的工程を本発明の方法で置き換えることにより、測定用機械が簡素化される。
【００５２】
本発明の方法はまた、ケージド化合物を電気パルスにより放出させるができ、かつ測定される特性が電気シグナルではない場合の結合アッセイで利用することができる。測定される出力が電気シグナルでないほとんどの生物学的系で、本発明の方法を利用して、様々なケージング化合物の光不安定性結合の開裂を誘発することができる。例えば、本発明の方法は、ケージド化合物を電気パルスにより放出させることができる細胞媒介性結合アッセイで使用することができる。この領域での応用リストは非常に幅広い。
【００５３】
［実験結果］
本発明の方法は、幾つかの化学発光反応実験を実施することにより実証された。
【００５４】
実験１
１回の実験において、総反応容積１０μＬで、発光タンパク質化学発光反応の成分すべてを適切な電気セルに添加した（エクオリン（自然または組換え）および組換えオベリンは、０．５〜６マイクログラムの量で利用した）。反応セルはまた、遊離Ｃａレベルが発光を誘発しないような程度にＣａを添加したＣａケージング化合物を含んでいた。具体的には、Ｃａケージング化合物は、Ｃａを５０％〜７７％の程度に加えたＤＮＭＰであった。２つの間隔を開けて配置された金属電極を適切な回路に接続して、ＤＣ電気パルスを送達した。電気パルス特性は変化して、反応からの発光がモニタリングされた。様々な金属、すなわち銀、アルミニウムおよび鋼鉄を種々の実験で使用し、また様々な異なる形状の電極（円柱状、Ｕ字形等）を使用した。種々の緩衝電解質溶液（放出された化合物に起因したｐＨの変化を抑えるため）を使用した。これらは、８０ｍＭのＫＣｌを有するＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．４および７．２）、血清および血漿を含んでいた。実験はすべて首尾よく実行された。以下の表に結果をまとめる。
【００５５】
【表１】
2004535584.tif 000002
【００５６】
先の実験それぞれにおいて、ある特定の電圧の電気パルスを送達するために、電極の形状および／または材料を変更したところ、発光プロフィールの特性が変化したが、すべての場合において、実験は首尾よく進行した。電解質媒質を純水で置き換えると実験は失敗した。
【００５７】
実験２
電気パルスが光不安定性Ｃａケージング化合物のアンローディングおよびＣａの放出を誘導し、発光タンパク質の発光を誘発することを確認するために、反応成分の１つを反応から省いた。光不安定性Ｃａケージング化合物を反応から省いた場合、化学発光光発生は起こらなかった。発光タンパク質（エクオリンまたはオベリン）を反応から省くと、化学発光光放出は同様に起こらなかった。しかしながら、ケージドＣａの電気パルス後に発光タンパク質を添加することで化学発光光発生が開始された。これらの実験では、使用した総電気エネルギーは５．９４Ｊである。
【００５８】
実験３
さらに、このプロセスが化学発光反応を誘発するための光不安定性Ｃａケージング化合物のアンローディングおよびＣａの放出に特異的であることを確認するために、発光タンパク質よりもＣａに対して高い親和性を有する非光不安定性Ｃａキレート剤（ＥＤＴＡ）を、他の反応成分すべてを含有する反応セルに添加した。かかる条件下では、放出されたＣａが非光不安定性Ｃａキレート剤によりキレート化されるため、光発生は起こらなかった。この実験では、使用した電気エネルギーは５．９４Ｊであった。
【００５９】
実験４
この形態のエネルギーに対する光不安定性化合物の破壊の特異性を確認するために、化学発光を発生するのに使用される同じ電気回路によりパルス電磁石から磁場を発生させた。電磁場パルスの場合では、光発生は起こらなかった。
【００６０】
実験５
本発明の方法を使用する化学発光反応からの光発生は、その持続時間ならびに強度に関して電気パルスの特性に依存する。この依存性を実証するために、異なる電気回路を使用した。電気コンデンサの速い放電に依存する電気回路を使用して、本発明の方法により化学発光反応の光を発生させた。１００〜３３０ボルトの電圧値および１〜２２０μＦの静電容量を有するコンデンサを利用した。コンデンサ放電の電気パルス形状が、閃光または放出の特性および周波数を決める。さらに、別種の電気回路を使用して、本発明の方法を実証した。３〜１５０Ｖの出力電圧およびある特定の電圧が印加されたパルス持続時間を制御するためのスイッチング回路を伴うＡＤ電源を使用して、発光タンパク質エクオリンおよびオベリンの化学発光の光発生を誘発した。先の表に列挙したような特徴を有する種々の電気パルスを印加することにより、発光の誘発が生じた。さらに、必要とされる特性に満たない直流電気パルスの印加は、同じ電気セルにおける同じ反応から光を発生しなかった。幾つかのパルスは発光前に印加されなくてはならなかった。
【００６１】
実験６：
本発明の方法はまた、他のケージド試薬を使用する化学発光反応から発光を誘発するのに使用された。ルシフェラーゼの化学発光反応の発光は、反応を誘発するのに必要とされる様々なケージド化合物を用いて利用された。典型的なホタルルシフェラーゼ化学発光反応は、酸素の存在下で以下の必須成分、すなわちルシフェラーゼ酵素、ルシフェリン、マグネシウムおよびＡＴＰのすべてを必要とし、以下の反応に従って光を発生する：
ルシフェラーゼ＋Ｄ−ルシフェリン＋ＡＴＰ＋Ｍｇ＋＋  →  酸化ルシフェリン＋ピロリン酸塩＋ＣＯ２＋光
【００６２】
本発明の方法の有用性は、反応成分の１つがケージングされている先のルシフェラーゼ化学発光反応を実施することにより実証された。必要な電気パルスを送達すると、ケージド化合物はアンケージングされて、活性化合物の即時の放出および光発生の誘発を引き起こす。
【００６３】
ケージドＡＴＰを利用して、電流パルスにより光発生の誘因を制御する本発明の方法を実証した。ケージドＡＴＰはルシフェラーゼ化学発光の活性基質ではないが、ルシフェラーゼ反応にとっての基質として作用する機能性ＡＴＰは、本発明の方法により送達することができた。
【００６４】
総反応容積１２μＬで、以下のものを適切な電気反応セル中で混合する：ルシフェラーゼ／Ｄ−ルシフェリンの溶液ミックス（６μＬ）、５ｍＭのＰＢＳ中のクエン酸Ｍｇ（３μＬ）、ケージドＡＴＰ溶液（３μＬ）。電極を電源回路に接続して、電気パルスを誘発し、ＡＴＰをアンケージングして、光発生を開始させた。様々な電圧およびパルス持続時間を利用した。これらの実験条件下で、本発明の方法の使用は、ルシフェラーゼ化学発光反応から光発生をもたらした。
【００６５】
また、電気パルス形状が調節される限りは、本発明の方法が様々なケージド化合物とともに使用することができることを実証するために、ルシフェラーゼ化学発光反応で使用される別のケージド化合物を利用した。この実験では、ケージドＤ−ルシフェリンを利用して、反応動力学を制御した。機能性Ｄ−ルシフェリンは、反応成分を電気パルスに暴露して、ケージドＤ−ルシフェリンから反応に送られた。
【００６６】
総反応容積２５μＬで、以下の成分を適切な電気セルに溶液として添加した：ルシフェラーゼ溶液（１０μＬ）、５ｍＭのＰＢＳ中のクエン酸Ｍｇ（５μＬ）、１ｍＭのＡＴＰ溶液（５μＬ）およびケージドＤ−ルシフェリン溶液（５μＬ）。適切な電気回路をセルに接続して、電気パルスを送った。電気パルスを送ると、ケージド化合物は、ルシフェラーゼ化学発光反応の光発生を誘発するのに必要とされる活性成分を放出した。２つのケージド化合物、すなわちケージドＡＴＰおよびケージドルシフェリンを用いたルシフェラーゼ化学発光反応の両方の実験結果を以下にまとめる：
【００６７】
【表２】
2004535584.tif 000003
【００６８】
ルシフェラーゼ化学発光のこれらの実験では、様々な電圧での電気コンデンサの放電に依存する電気回路を使用した。５０〜３５０ボルトの電圧値および１０〜１５０μＦの静電容量のコンデンサを利用して、電気パルス形状を変化させた。発光が反応から開始する前に約０．５秒のタイムラグが必要とされることが観察された。光発生は瞬時に開始するが、実質的な酵素活性化反応の前に、ケージド化合物から放出される活性誘因化合物の量が蓄積する必要があり、それによって光発生が観察できたと仮定された。
【００６９】
試薬：
−ＤＭ−ＥＤＴＡ（１−（４，５−ジメトキシ−２−ニトロフェニル）−１，２−ジアミノエタン−Ｎ，−Ｎ，−Ｎ，−Ｎ四酢酸）、Molecular Probes, Eugene, OR, USA（カタログ番号Ｄ−６８１４）。
−組換えエクオリン、Ａｑｕａｌｉｔｅ、Molecular Probes, Eugene, OR, USA（カタログ番号Ａ−６７８５）。
−自然エクオリン、Friday Harbor Photoproteins, Friday Harbor, WA, USA。
−組換えオベリン、curtsey of Dr.Eugene Vysotski, Dept. of Biochemistry, University of Georgia, Georgia, USA。
−凍結乾燥したルシフェラーゼ／Ｄ−ルシフェリンの混合物を、トリシン再構成緩衝液［ＮａＯＨでｐＨ７．８に調節した５０ｍＭのＮ−トリス（ヒドロキシメチル）メチルグリシン、ロット１４１８］に溶解した。両方とも、アッセイキットとしてKikkomanにより提供された。（ＣｈｅｃｋＬｉｔｅ  ＨＳ  Ｐｌｕｓ，カタログ番号６０３４２）。
−ＮａＯＨで調節したｐＨ７．８のトリシン緩衝液［５０ｍＭのＮ−トリス（ヒドロキシメチル）メチルグリシン］に溶解したルシフェラーゼ酵素、Kikkomanにより提供、カタログでＬＵＣ  Ｔ。
−リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ７．４）中の５ｍＭのクエン酸Ｍｇ溶液。
−メタノール中のケージドＡＴＰ、３００μＬ中５ｍｇ（Molecular Probes, Eugene, OR, USA、カタログ番号Ａ−１０４９）。
−ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）３００μＬ中に溶解したケージドＤ−ルシフェリン５ｍｇ（Molecular Probes, Eugene, OR, USA、カタログ番号Ｌ−７０８５）。
−１００ｍＭのＡＴＰ溶液、ｐＨ７．５（Amersham Pharmacia、カタログ番号２７２０５６）。
【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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2004535584.tif 000030
2004535584.tif 000031