(57)【要約】本発明はターゲットされた放射免疫療法に有用な放射免疫複合体と、放射免疫複合体を使用して患者を治療する諸方法とに関する。本発明の放射免疫複合体は、α線放出放射線同位元素またはβ線放出放射線同位元素と、腫瘍関連抗原に特異的に結合する抗体の抗原結合断片にリンクしているかあるいはその抗原結合断片上にある結合部位とから成る。患者を治療する諸方法には、本発明の放射免疫複合体と一緒にその患者に１つあるいはそれ以上の清澄化剤を投与するステップと、それに続いて患者に骨髄を移植するステップとを含めることができる。
2004510683.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
腫瘍関連抗原に特異的に結合する抗体の抗原結合断片にリンクしているかまたは該抗原結合断片上にある結合部位に結合している細胞毒性α線またはβ線放出放射性同位元素を含む放射免疫複合体。
【請求項２】
前記抗体が、ＩｇＧ免疫グロブリンであることを特徴とする請求項１に記載の放射免疫複合体。
【請求項３】
抗体の前記断片が、Ｆａｂ′断片であることを特徴とする請求項１に記載の前記放射免疫複合体。
【請求項４】
前記Ｆａｂ′断片が、ヒトＦａｂ′断片と、ヒト化Ｆａｂ′断片と、キメラＦａｂ′断片とから成るグループから選択されることを特徴とする請求項３に記載の放射免疫複合体。
【請求項５】
前記結合部位が、ＤＴＰＡと、ＤＯＴＡと、ＥＤＴＡと、ＰＬＥＤと、Ｆａｂ′上のシステイン残基のスルフヒドリル基と、芳香族化合物と、クラウンエーテルとから成るグループから選択されることを特徴とする請求項１に記載の放射免疫複合体。
【請求項６】
前記細胞毒性α線またはβ線放出放射性同位元素が、９０Ｙと、２１３Ｂｉと、２１１Ａｔとから成るグループから選択されることを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載の放射免疫複合体。
【請求項７】
患者に請求項１〜６のいずれかに記載の放射免疫複合体を投与するステップを含む患者を治療する方法。
【請求項８】
さらに少なくとも１つの清澄化剤を前記患者に投与するステップを含む請求項７に記載の患者を治療する方法。
【請求項９】
さらに患者に骨髄を移植するステップを含む請求項７に記載の患者を治療する方法。
【請求項１０】
さらに患者に自家幹細胞を移植するステップを含む請求項７に記載の患者を治療する方法。
【請求項１１】
前記清澄化剤が、金属キレート清澄化剤と、尿細管の中の小さな分子とイオンの再摂取を妨げる清澄化剤と、前記放射免疫複合体の前記抗体断片部分上のエピトープに対して向けられている抗体とから成るグループから選択されることを特徴とする請求項８に記載の患者を治療する前記方法。
【請求項１２】
前記清澄化剤が、前記放射免疫複合体に特異的に結合するガラクトシル化抗体または抗体断片であることを特徴とする請求項８に記載の患者を治療する方法。
【請求項１３】
前記清澄化剤が、抗イディオタイプ清澄化剤であることを特徴とする請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
腫瘍関連抗原に特異的に結合する抗体の抗原結合断片にリンクしているかまたは該抗原結合断片上にある放射線同位元素を有する分子と、
任意選択的に、少なくとも１つの清澄化剤と
を含む放射免疫複合体のためのキット。
【請求項１５】
前記清澄化剤が、金属キレート清澄化剤と、前記分子上にあるエピトープに対して向けられている抗体と、腎臓の尿細管中の小さな分子とイオンの再摂取を防ぐ清澄化剤とから成るグループから選択されることを特徴とする請求項１４に記載のキット。
【請求項１６】
前記清澄化剤が、前記分子に特異的に結合するガラクシル化抗体または抗体断片であることを特徴とする請求項１５に記載のキット。
【請求項１７】
前記清澄化剤が、抗イディオタイプ清澄化剤であることを特徴とする請求項１５に記載のキット。
【請求項１８】
腫瘍を有する患者の治療における請求項１〜６にいずれかに記載の放射免疫複合体のための使用方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
［発明の背景］
技術分野
本発明は、ターゲットされた放射免疫療法（ＲＡＩＴ：ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ）に効果を生じる腫瘍細胞に放射性同位元素を送達する、改良された諸方法に関する。さらに詳細には、本発明は、α線放射する放射性同位元素あるいはβ線放射する放射性同位元素をＦａｂ′などの免疫グロブリンの断片に付着させた結合薬剤に対して複合体を形成する放射免疫複合体に関する。ターゲットされた腫瘍あるいはターゲットされた癌細胞が破壊されるが、臓器および組織への損傷が最少となるように、Ｄ−リシンなどの清澄化剤を放射免疫複合体とともに患者に投与することが可能である。患者に放射免疫複合体を投与した後、骨髄あるいは自家幹細胞（ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ　ｓｔｅｍ−ｃｅｌｌ）をその患者に移植することが可能である。
【０００２】
関連技術
癌治療において使用される１つの治療方法には、その罹患組織に治療薬剤あるいは細胞毒性化合物を運ぶ抗体を向けるステップが含まれる。疾患部位に局在化している場合は、その抗体は癌化細胞にその治療薬剤あるいは細胞毒性化合物を送達する。この方法に対する１つのアプローチには、その罹患細胞に対して放射性同位元素を送達するステップが含まれる。このアプローチは、特異的画像特性を有する放射性同位元素がターゲットされた罹患組織に送達される場合の診断において有用であることが確かめられている。
【０００３】
いくつかの方法が放射免疫療法（ＲＡＩＴ）に使用されている。１つの方法では、望ましい特性を有する放射性同位元素が、対応する抗原が存在する罹患組織に対して、抗体により運ばれる。ＩｇＧやＩｇＭなどのさまざまな免疫グロブリンが、ターゲットされた罹患組織上に位置している抗原に放射性同位元素を運ぶのに使用されている。
【０００４】
さまざまな放射性同元素がＲＡＩＴにおいて使用されている。２１２Ｂｉとその親核種である２１２Ｐｂが、抗体、その他のタンパク質にＤＴＰＡ（ジエチレンアミン五酢酸）とＤＯＴＡ（テトラアザシクロドデカン−Ｎ，Ｎ′，Ｎ″，Ｎ’’’−四酢酸）誘導体を介して成功裡にキレート化され、またＲＡＩＴにおいてα線放出放射性同位元素として使用されてきた。例えば、Ｍａｃｋｌｉｓらは、悪性Ｔ細胞の表面上に存在するマウス抗原に対して向けられている放射免疫複合体を開示している。これについては、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４０，１０２４，１９８８．を参照されたい。Ｍａｃｋｌｉｓらにより開示されている放射免疫複合体には、モノクローナル抗体に付着させたＤＴＰＡの環状無水物に複合体形成された２１２Ｂｉが含まれる。これについては、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４０，１０２４，１９８８．を参照されたい。ＲＡＩＴにおける２１２Ｂｉとその親核種２１２Ｐｂ使用法の１つの欠点は、２１２Ｂｉの壊変産物が、高エネルギーのβ線エミッタ（放射体）および高エネルギーのγ線エミッタ（放射体）である２０９ＴＩであることである。この特性では放射線保護の諸問題が持ち上がってしまう。
【０００５】
研究調査されてきたもう１つのα線放出放射性同位元素は２１１Ａｔである。これについては、Ｂｌｏｏｍｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２１２，３４０，１９８８．を参照されたい。７．２時間という２１１Ａｔの半減期は、たった６０．５５分という半減期を有する２１２Ｂｉの半減期よりも有意に長い。２１１Ａｔは４２％のα崩壊と、５８％の電子捕獲を受けることが知られている。崩壊に際して放出されるα粒子は、５．９４ＭｅＶというエネルギーを有しており、一方、電子捕獲はγ線放射線８０ｋｅＶを産生する。電子捕獲から生じる２１１Ｐｏ娘核種は０．５秒という半減期を有しており、また、７．４３ＭｅＶというエネルギーを有するα粒子を放出することにより壊変する。したがって、どちらの経路によっても、２１１Ａｔ崩壊毎に１つの高エネルギーα粒子が得られる。同位体的に純粋な２１１Ａｔは、ガスクロマトグラフィにより照射トリウムから放射化学的に純粋な形態で分離することができる２１１Ｒｎの電子捕獲により入手可能である。これについては、Ｃｈａｌｋｉｎら、Ｃｈｅｍｉｋｅｒ−Ｚｔｇ．，１０１，４７０，１９７７．を参照されたい。
【０００６】
アスタチンはハロゲン原子であり、またしたがって、ヨウ素と同様に挙動する。２１１Ａｔの血液クリアランスは、アスタチンが甲状腺に急速に蓄積されるため、非常に速いことが長い間にわたって知られてきた。これについては、Ｈａｍｉｌｔｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，２６：４８３，１９４０．を参照されたい。事実、ラットとサルに対して１９５０年代に行われた研究では、甲状腺におけるアスタチンの濃度が、胃を除いて、その他の臓器においてよりも少なくとも１０２程度大きさの度合いが高いことが確認されている。これについては、Ｈａｍｉｌｔｏｎら、Ｕｎｉｖ．Ｃａｌｉｆ．Ｐｕｂｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，２：２８３，１９５４．を参照されたい。
【０００７】
ＲＡＩＴとともに研究調査されたもう１つの放射性同位元素は２１３Ｂｉである。この放射性同位元素は、４５．６分という半減期でβ線放出および４４０ｋｅＶγ線放出により主に（９８％）、超短寿命高エネルギー（８．３７５ＭｅＶ）α線エミッタ２１３Ｐｏ（４μｓのｔ１／２）に壊変することが知られているが、一方、２０９ＴＩへの直接α崩壊経路は取るに足らない役割だけを果たしている（全２１３Ｂｉ崩壊の２％）。
【０００８】
Ｇｅｅｌｉｎｇｓに発行された米国特許第５，６４１，４７１号は、治療の用途に２１３Ｂｉを作成する方法を開示している。その開示された方法では、モノクローナル抗体が、ターゲッティング部分として使用されている。ＣＨＸ−ＤＴＰＡ（シクロへキシルジエチレントリアミン五酢酸）などのキレート剤がその抗体に付着されていて、またその放射性同位元素をキレート化するように機能する。このようなやり方では、放射性同位元素はその罹患組織を破壊するように、それが１つの治療的なやり方で機能することができるターゲット細胞に送達される。
【０００９】
Ｇｅｅｒｌｉｎｇｓらに発行された米国特許第５，２４６，６９１号には、α粒子放出を用いている放射免疫療法が開示されている。詳細に開示されているのは、ヒトモノクローナル抗体およびヒト化抗体などの抗体からこれまた成る、免疫複合体の一部としての２２５Ａｃおよびその娘核種の使用である。引用されている特許では、α粒子、キレート剤およびヒトＩｇＭ抗体などのゆっくりと局在化される抗体を放出する放射性核種から成る放射免疫複合体において、キレート剤がアクチニウムとビスマス放射性同位元素を結合させるのに使用されていることが開示されている。また、開示されているものは、ＤＴＰＡ、ＥＤＴＡ、ＰＬＥＤ、ならびに結合遊走同位体に使用されるクラウンエーテルなどのスカベンジャー薬剤の使用であり、したがって、ターゲットされていない臓器および組織をその同位体が侵襲するのを阻害するものである。
【００１０】
Ｇａｎｓｏｗらに発行された米国特許第５，４２８，１５４号では、ＤＯＴＡ誘導体と、Ｐｂ、Ｂｉ、Ｙおよびランタニドを含む金属から成るキレートが開示されている。また、開示されているのは、キレート化金属の送達システムを形成するために生体分子に金属キレートをリンクさせることである。Ｇａｎｓｏｗらは、α線エミッタおよびβ線エミッタの両方とも（２１２Ｐｂ、２１２Ｂｉと９０Ｙ）をキレート化して、腫瘍細胞上のエピトープに対して向けられるモノクローナル抗体に付着させたＤＯＴＡ誘導体にすることが可能なことを開示している。
【００１１】
数々の参考文献で放射性同位元素とモノクローナル抗体に付着させたキレート剤から成る放射免疫複合体が説明されている。しかし、罹患組織あるいは癌細胞をターゲットにする免疫グロブリンのＦａｂ′断片を利用する放射免疫複合体に対する需要はそのまま残っている。非結合放射性同位元素により起こされる損傷の量を最少にする患者の治療方法に対する需要もまたそのまま残っている。
【００１２】
［本発明の目的］
本発明の目的は、腫瘍関連抗原に特異的に結合する抗体の抗原結合断片にリンクしているかまたはその抗原結合断片上にある結合部位に結合している細胞毒性放射性同位元素を含む放射免疫複合体を提供することである。
【００１３】
本発明のもう１つの目的は、罹患細胞あるいは組織をターゲッティングし、またターゲットされた細胞あるいは組織に放射性同位元素を送達することができる放射免疫複合体を患者に投与するステップから成る、患者を治療する方法を提供することである。
【００１４】
本発明のさらなるもう１つの目的は、ターゲットされていない臓器およびターゲットされていない組織に対する損傷を最少にする、患者を治療する方法を提供することである。
【００１５】
本発明のさらなるもう１つの目的は、放射免疫複合体とともに清澄化剤を患者に投与するステップから成る、患者を治療する方法を提供することである。
【００１６】
本発明のもう１つの目的は、腫瘍関連抗原に特異的に結合する抗体の抗原結合断片にリンクしているかあるいはその抗原結合断片上にある放射性同位元素を有する分子と、少なくとも１つの清澄化剤とを含む放射免疫療法において使用されるキットを提供することである。
【００１７】
［本発明の概要］
本発明は、腫瘍関連抗原に特異的に結合する抗体の抗原結合断片にリンクしているかその抗原結合断片上にある結合部位に結合している細胞毒性放射性同位元素を含む放射免疫複合体に関する。
【００１８】
本発明の好適な具体例ではその抗原はＩｇＧである。本発明のさらに他の好適な具体例では、その断片はＦａｂ′断片である。特に好適な具体例では、Ｆａｂ′断片はヒト、ヒト化あるいはキメラのものである。
【００１９】
本発明の好適な具体例では、放射免疫複合体の放射性同位元素はα線エミッタあるいはβ線エミッタである。さらに好適な具体例には、α線放出放射性同位元素が含まれ、またその他の好適な具体例では、放射免疫複合体の放射性同位元素は２１３Ｂｉ、９０Ｙあるいは２１１Ａｔである。
【００２０】
本発明の他の好適な具体例では、放射免疫複合体の結合部位は、ＤＴＰＡと、ＤＯＴＡと、ＥＤＴＡと、ＰＬＥＤと、クラウンエーテルと、芳香族化合物と、Ｆａｂ′断片上にあるシステイン残基のスルフヒドリル基とから成るグループから選択される。
【００２１】
本発明はまた、本発明の放射免疫複合体を使用して、患者を治療するための諸方法に関する。
【００２２】
１つの具体例では、患者を治療するための方法は患者に本発明の放射免疫複合体のいずれかを投与するステップから成る。他の好適な具体例は、放射免疫複合体を投与するとともに患者に１つあるいはそれ以上の清澄化剤を投与するステップから成る。さらに好適な具体例では、清澄化剤あるいは複数の清澄化剤が、付加的な塩基窒素官能性を有するアミノ酸あるいはペプチドと、金属キレート清澄化剤と、腫瘍関連抗原に特異的に結合する抗体あるいは抗体断片上にある抗原に向けられる抗体あるいは抗体断片とから成るグループから選択される。さらに好適な具体例にあっても、清澄化剤あるいは薬剤は、リシンと、ポリリシンと、ＤＯＴＡと、ＤＴＰＡと、ＰＬＥＤと、ＥＤＴＡと、抗イディオタイプＦａｂ′断片とから成るグループから選択される。特に好適な具体例では、清澄化剤は、リシンと、ポリリシンと、ガラクトシル化抗イディオタイプＦａｂ′断片とから成るグループから選択される。その上さらに好適な具体例では、そのガラクトシル化抗イディオタイプＦａｂ′断片は、ヒト化Ｆａｂ′断片あるいはキメラＦａｂ′断片である。
【００２３】
他の具体例では、患者を治療するための方法には、患者に本発明の放射免疫複合体を投与し、それに引き続いて、その患者に骨髄あるいは自家幹細胞を移植するステップが含まれる。
【００２４】
さらに他の好適な具体例では、患者を治療するための方法には、上述のように、清澄化剤とともに患者に本発明の放射免疫複合体を投与し、またそれに引き続いてその患者に骨髄あるいは自家幹細胞を移植するステップが含まれる。
【００２５】
本出願の他の好適な具体例は、腫瘍関連抗原と少なくとも１つの清澄剤に特異的に結合する抗体の抗原結合断片にリンクしているかあるいはその抗原結合断片上に放射性同位元素結合部位を有する分子と、少なくとも１つの清澄化剤とから成る放射免疫療法において使用されるキットを提供する。
【００２６】
本発明のさらに好適な具体例は、キレート化清澄化剤と、腫瘍関連抗原に特異的に結合する抗体あるいは抗体断片上の抗原に向けられる抗体あるいは抗体断片と、腎臓の尿細管中の小さな分子とイオンの再摂取を防ぐ清澄化剤とから成るグループから清澄化剤が選択される、上述されているように、放射免疫療法において使用されるキットを提供する。
【００２７】
本発明のほかの好適な具体例は、少なくとも１つの清澄化剤がＤＴＰＡと、ＤＯＴＡと、ＥＤＴＡと、ＰＬＥＤと、Ｄ−リシンと、ポリリシンと、抗イディオタイプ抗体Ｆａｂ′断片とから成るグループから選択される、上述のように放射免疫療法において使用されるキットを提供する。特に好適な具体例では、そのキットは、その清澄化剤が抗イディオタイプガラクトシル化Ｆａｂ′断片である少なくとも１つの清澄化剤を提供し、またその他のさらに好適な具体例にあっても、抗イディオタイプガラクトシル化Ｆａｂ′断片はキメラあるいはヒト化Ｆａｂ′断片である。
【００２８】
本発明の付加的な態様、特徴および長所は、以下に続くその説明において説明されることであろうし、また、部分的にその説明から明らかになることであろうし、あるいは本発明の実施により学習することができる。本発明の具体例および長所は、添付の請求項に特に指摘されている手段およびその組み合わせにより実現し、また得ることができる。
【００２９】
［詳細な説明］
一般的には、本発明は罹患組織のターゲットに向けられた放射免疫複合体を提供する。本発明の放射免疫複合体は、腫瘍関連抗原に特異的に結合する抗体の抗原結合断片にリンクしているかあるいはその抗原結合断片上にある結合部位に結合している細胞毒性放射性同位元素を含む。
【００３０】
一般的には、本発明はまた、患者に本発明の放射免疫複合体を投与するステップから成る患者を治療するための方法を提供する。好適には、その放射免疫複合体は、非結合放射性同位元素が体内の臓器および組織の中に蓄積する、およびその臓器および組織を損傷するのを防ぐために、１つあるいはそれ以上の清澄化剤ととにも患者に対して投与される。患者を治療するもう１つの好適な方法は、患者に放射免疫複合体を投与し、それに引き続いてその患者に骨髄あるいは自家幹細胞を移植するステップから成る。１つのもっとも好適な治療方法は、１つあるいはそれ以上の清澄化剤とともに患者に対して本発明の放射免疫複合体を投与し、またそれに引き続いて、骨髄あるいは自家幹細胞をその患者に移植するステップから成る。
【００３１】
本発明の放射性同位元素には、α線放出放射性同位元素およびβ線放出放射性同位元素の両方が含まれる。本発明の好適な放射性同位元素には、α線放出放射性同位元素が含まれる。本発明の特に好適な放射性同位元素には、２１３Ｂｉ、９０Ｙと２１１Ａｔが含まれる。
【００３２】
本発明の放射免疫複合体は、腫瘍関連抗原に特異的に結合する抗体の抗原結合断片にリンクしているかまたはその抗原結合断片上にある結合部位を含む。好適にはその抗体はＩｇＧ免疫グロブリンである。そうではあるけれども、抗体の断片は罹患細胞あるいは癌細胞の表面上にある抗原に結合する免疫グロブリンのタイプのいずれかのものの断片であり得ることを記しておく。腫瘍関連抗原に特異的に結合する抗体の抗原結合断片は好適にはＦａｂ′断片である。特に好適であるのは、免疫原性応答が最少なものであるような性質のヒト化あるいはキメラであるＦａｂ′断片である。ヒト化およびキメラＦａｂ′断片は、当業者には公知の諸方法により作成することが可能である。
【００３３】
抗体の断片に付着させた結合部位には、キレート化するグループと、本発明の放射性同位元素に共有的に結合されるものが含まれる。本発明の結合部位にはしたがって、ジスルフィド結合の切断後Ｆａｂ′断片上にあるシステイン残基上のスルフヒドリル（ＳＨ）基も含まれる。そのスルフヒドリル基は、鉛およびビスマスのさまざまな同位体を含む数多くの放射性金属カチオンを結合させているのが見出せることであろう。結合部位にはまた、ＤＴＰＡ、ＤＯＴＡ、ＰＬＥＤ、ＥＤＴＡ、クラウンエーテル、クリプタンド、さまざまなホスフィン、すなわち、ジホスフィンおよびトリホスフィンに限らないが、それらやチオール、本発明の放射性同位元素を結合する当業者には公知のいずれかの他のキレート基などの基が含まれる。好適な結合部位にはＤＴＰＡとＤＯＴＡが含まれる。
【００３４】
上述のように、本出願で使用するとき、結合部位という用語は、放射性同位元素に共有的に付着している基を包含するには十分に広義のものである。これには特に、有機化合物のさまざまなクラス、例えば、数ある中で、とりわけ、トルエン、フェノールおよびフェノールエーテル（例えば、チロシン、４−メトキシフェニルアラニンおよびアニソール）、ベンゼン、アニリン、イミダゾール、フェニルアラニンおよびピリミジンに共有結合を形成する２１１Ａｔなどの放射性同元素が該当する。したがって、この文脈においては、抗体の断片に付着させる結合部位という用語は、アスタチン同位体が共有的に付着する基を言う。
【００３５】
１つあるいはそれ以上の清澄化剤を、本発明の本方法を実施するのに使用することができる。本文脈における清澄化剤はいくつかの異なる目的に役立っている。ターゲットされていない抗体断片複合体では、それがターゲット部位に付着して成長するのに十分な時間が経過した後、血液循環からのクリアランスが利得的に行われる。清澄化剤は複合体のいずれかの一部に特異的に結合する抗体であり得る。その結合部位から治療用放射性同位元素が分離しているかぎりは、通常キレート剤は、キレート化する清澄化剤により利得的にクリアランスが行われる。前者などの清澄化剤のグリコシル化により、肝臓におけるグリコシド受容体による急速な摂取を誘導することによってクリアランスの速度を増加させることができる。ターゲットされていない放射性同位元素のクリアランスに対するさらなる手助けが、腎臓の尿細管における小さな分子の再摂取を阻害する清澄化剤を使用することにより達成することができる。これは、腎臓に対する放射線損傷を軽減し、また、膀胱を通じてのクリアランスを加速する。これらの清澄化剤の組み合わせは、そのそれぞれがもたらす恩恵を得るのに利得的に使用されることが理解されることであろう。
【００３６】
本発明の清澄化剤の１つのタイプには、ヒトの身体の環境に放射性同位元素を結合する金属キレート化剤が含まれる。清澄化剤のこのタイプの例には、ＤＴＰＡ、ＤＯＴＡ、ＥＤＴＡ、ＰＬＥＤおよび当業者には公知の他の材料が含まれる。清澄化剤のもう１つのタイプには、腫瘍関連抗原に特異的に結合する抗体あるいは抗体断片上にあるエピトープに向けられる抗体あるいは抗体断片が含まれる。このクラスの好適な清澄化剤には、清澄化剤が腫瘍あるいは癌細胞上にある抗原に向けられる抗体あるいは抗体断片のパラトープに向けられている抗体あるいは抗体断片である、抗イディオタイプ清澄化剤が含まれる。
【００３７】
他の好適な清澄化剤には、より向上した清澄化能力を示すガラクトシル化抗体あるいは抗体断片が含まれる。適当なこうした薬剤には、ターゲッティングＡｂに第２のＡｂが結合する、ガラクトース−第２−Ａｂ−Ｆａｂ′が含まれるが、それに限定されない。このクラスの他の好適な清澄化剤には、キメラ、あるいはヒト化抗イディオタイプ抗体あるいは抗体断片が含まれ、またこのクラスの特に好適な清澄化剤は、ガラクトース−Ｗ１２−Ｆａｂ′などのガラクトシル化ヒト化抗イディオタイプＦａｂ′断片である。
【００３８】
本発明の清澄化剤のもう１つのタイプは、腎臓の尿細管における小さな分子およびイオンの再摂取を予防する。こうした清澄化剤には、天然に生じるアミノ酸に見出されるαアミノ基に加えて、塩基性窒素官能性を有するアミノ酸およびペプチドの両方が含まれる。したがって、清澄化剤のこのクラスには、ポリリシンなどの重合体に加えて、リシンの鏡像異性体、オルニチン、ヒスチジンおよびアルギニンが含まれる。だが、リシン、オルチニン、ヒスチジンおよびアルギニンといったＤアミノ酸がこのタイプの好適な清澄化剤であり、またＤ−リシンは特に好適である。また好適なものはポリリシンなどのリシンの重合体である。
【００３９】
清澄化剤のこの３つのタイプは異なる方法で作用するため、その体系から望ましくない種の除去を促進するのに一緒に使用される。好適には、腎臓の尿細管における小さな分子とイオンの再摂取を防ぐタイプの清澄化剤を、ターゲッティング抗体あるいは抗体断片の表面上にある抗原に対して向けられた抗体あるいは抗体断片であるタイプの清澄化剤と一緒に使用される。特に好適であるのは、リシンのどちらかの鏡像異性体とともにターゲッティング抗体あるいは抗体断片上のパラトープに向けられるガラクトシル化抗イディオタイプ断片の使用である。また好適なものには、上記の清澄化剤の組み合わせにより遊離放射性同位元素の除去を容易なものにするキレート化清澄化剤の使用がある。
【００４０】
本発明はまた、ＲＡＩＴにおいて使用されるキットも提供する。本発明のキットには、腫瘍関連抗原に特異的に結合する抗原結合抗体断片にリンクしているかあるいはその抗原結合抗体断片上にある放射性同位元素結合部位を有する分子としても説明することができる本発明の非錯体化放射免疫複合体が含まれる。キットにはまた、上述されているように、少なくとも１つの清澄化剤が含まれる。キットにおいて使用される好ましい清澄化剤には、リシンとポリリシンなどの腎尿細管中の小さな分子とイオンの再摂取を防ぐものが含まれる。すなわち、ＤＯＴＡ、ＤＴＰＡ、ＰＬＥＤおよびＥＤＴＡなどの金属をキレート化するもの、および放射性同位元素結合部位を備えた分子に向けられているそうした抗体、あるいは抗体断片、特にＦａｂ′断片である。
【００４１】
本発明のキットは、放射性同位元素結合部位を有する分子が特異的に結合する抗原を有する罹患ターゲット組織を有する患者の治療に使用されることを意図している。したがって、放射性同位元素結合部位を有する分子は、本発明の放射免疫複合体を作成するために、２１３Ｂｉあるいは９０Ｙなどの放射性同位元素と混合させることができる。放射免疫複合体はその後に患者に注射され、骨髄、肝臓、腎臓およびその他の臓器に対する損傷を最少にするため、清澄化剤の注射がその後に行われる。腎臓の尿細管中にある小さな分子の再摂取を防ぐ清澄化剤は、放射免疫複合体の注射の前に、その注射と一緒に、あるいはその後に注射されることがある。このようなやり方で、ターゲットされていない組織あるいはターゲットされていない臓器に対する損傷を最少にしながら、ターゲットされた組織を破壊することが可能である。本発明のキットには、少なくとも１つの清澄化剤が含まれるが、キットには、その他の清澄化剤を含めることが可能である。例えば、本発明の好適なキットには、ターゲットされていない組織あるいはターゲットされていない臓器に対する損傷を最少にし、また腎臓の尿細管中での再摂取をさらに防ぐ目的で一緒に使用すべきキメラあるいはヒト化ガラクトシル化抗イディオタイプ清澄化剤およびリシンが含まれる。
【００４２】
本発明はその精神とその中心となる特性から逸脱することなく他の特定の形態で実施することが可能である。説明されている具体例は、すべての観点から説明的なものであって、制限的なものではないものとして考慮されるべきものである。本発明の範囲は、したがって、前記あるいは以下の説明によってよりも、添付の請求項によって示される。その請求項の意味および等価の範囲内にある全ての変更はその範囲内に包含されるべきものである。
【００４３】
実験は、癌および罹患組織の治療における治療薬剤として、本発明の放射免疫複合体の効果を調べるために行われた。２１３Ｂｉと９０Ｙの両方の放射免疫複合体が、マウスにおいてヒト大腸癌細胞系統であるＧＷ−３９の脾臓内注射により誘発される腫瘍を治療する際に、高度に効果的であったことをこれらの研究は見出した。
【００４４】
マウスモノクローナル抗体ＣＯ１７−１ＡであるＩｇＧ２ａイソ型が、その実験に対する免疫グロブリンとして選択された。それは、ヒト胃腸管悪性疾患上で見つかった４１ｋＤ糖タンパク質に対して向けられている。ＣＯ１７−１Ａは、その抗原に対して５×１０７ｌ／ｍｏｌという親和性定数を有する。その抗原に結合した後、ＣＯ１７−１Ａは抗原発現腫瘍細胞の中に容易にその内部に取り入れられる。抗ヒトＣＤ３抗体であるＯＫＴ３は、不適当なイソ型適合制御として使用されていた。ＯＫＴ３はまた、マウスＩｇＧ２ａイソ型でもあり、ＣＩＬＡＧ（Ｓｕｌｚｂａｃｈ／Ｔａｕｎｕｓ社、ドイツ）から入手した。
【００４５】
４０メッシュスクリーンによるミンチを作成しまた、Ｈａｎｋの平衡塩溶液により洗浄することにより継代的に増殖させたヒト腫瘍細胞系統であるＧＷ−３９の２０％細胞懸濁液２００μＬをそれらに注射することによって雌のヌードマウスに腫瘍が誘発された。およそ１０日間待った後、腫瘍は１００〜２００ｍｇのサイズに達し、またそのマウスはその後に実験に使用された。
【００４６】
ＣＯ１７−１ＡのＦａｂ′断片は、ペプシン加水分解により、またその後に引き続いて行われたシステインによるジスルフィド反応によって、完全な免疫グロブリンから作成された。精製され、またヨードアセトアミドにより遮断した後、Ｆａｂ′断片は、ＣＯ１７−１Ａ　ＤＴＰＡ−Ｂｚ−Ｆａｂ′複合体を作成するためにイソチオシアン酸ベンジル−ＤＴＰＡと反応させた。精製後、ＤＴＰＡ−Ｂｚ−Ｆａｂ′断片が、本発明の放射免疫複合体を産生するために、個別に、２１３Ｂｉ、９０Ｙ、８８Ｙ塩と反応させ、また、８８Ｙ複合体が、体内分布を分析するのに使用された。作成された放射免疫複合体はその最終作成の２０分以内にそのマウスに注射された。
【００４７】
皮下ＧＷ−３９腫瘍ヌードマウスの腫瘍、血液、腎臓および骨にある遊離Ｂｉ３＋あるいはＹ３＋にビスマスの体内分布対イットリウム含有ＣＯ１７−１Ａ　Ｆａｂ′が比較された。２１３Ｂｉの短い物理学的半減期のため、体内分布研究は、イットリウム含有複合体による１週間とは対照的に、注射後５時間までで行われた。何らの有意な差は２１３Ｂｉ−あるいは９０Ｙ−含有免疫複合体の間では観察されなかった。血液クリアランスは、放射性ヨウ素標識Ｆａｂ′断片で観察されたものと同様の半減期（ｔ１／２（α線）はほぼ１５分、ｔ１／２（β線）はほぼ５時間）で１０２程度であった。腫瘍での摂取は急速であって、注射（およそ４％ＩＤ／ｇ）後、１〜４時間という早さで極期に到達した。腎臓癒着は広く起こっており、しかも最大摂取値は、８０％ＩＤ／ｇまでであった。Ｄ−リシンの適用は腎臓癒着を４〜５倍に減らした。
【００４８】
対照的に、遊離ビスマスは、リシンによっては遮断できない非常に高い腎臓癒着を示す（１５０％ＩＤ／ｇまで）ことが分かったが、一方、イットリウムイオンは骨探索で周知のものである。遊離イオンに比べてその複合体のｉｎ　ｖｉｖｏでの安定性がその比較でははっきりと示されている。
【００４９】
２１３Ｂｉ−および９０Ｙ−含有ＣＯ１７−１Ａ　Ｆａｂ′の最大線量耐性発見治験が実施された。この目的のため、活性に関するさまざまな量が、１００μＣｉから開始され、１０〜２０パーセントの階段状に増加していく注射が行われた。各活性レベルで、動物の１群（群当たり１０〜２０匹）が何らの付加的な支持なしにビスマスあるいはイットリウムを受け、また第２群がＤ−リシンで治療された。アルカリホスファターゼとグルタミン酸オキサロ酢酸トランスアミナーゼとともに血算（白血球と血小板）、血中尿素窒素（ＢＵＮ）およびクレアチニンが放射免疫複合体投与の日と、以後は週間隔で測定された。急性治療関連死が、ＲＡＩＴ後４週間以内に起こるものと定義され、一方、その後の死亡は、それらの死亡が腫瘍増殖関連とすることができない場合は、慢性毒性とみなした。
【００５０】
２１３Ｂｉ−ＣＯ１７−１Ａ　Ｆａｂ′の７００μＣｉとその９０Ｙ対応物の２５０μＣｉで、リシンの投与にかかわりなく、急性治療関連致死率なしにすべての動物により耐容性が示された。これらの活性を１０％増加した場合は、少なくとも１０％の致死率が増加するという結果を生じた。２１３Ｂｉ−Ｆａｂ′および９０Ｙ−Ｆａｂ′に関するこうした各々の最大耐容性活性における活性血算とＢＵＮレベルがそれぞれ測定された。白血球と血小板数は放射性抗体投与後１週間で最下点に達し、また、それぞれ最大耐容性活性の両方で、骨髄毒性の重大度（ｓｅｖｅｒｉｔｙ）は、放射線核種にかかわらず、有意な差はなかった。しかし、骨髄毒性からの回復は、９０Ｙによるよりも短い寿命の２１３Ｂｉによるものの方が早いようであった。このように、２１３Ｂｉ−Ｆａｂ′に関しては、回復を完了する時間は、治療後２〜３週間であり、一方、９０Ｙ−Ｆａｂ′に関しては、回復完了の時間は３〜４週間であった。
【００５１】
動物がＤ−リシンを与えられたかどうかでは、急性骨髄毒性の重篤度に関する差は有意なものは、観察されなかった。しかし、９０Ｙ−Ｆａｂ′の３００μＣｉレベルの投与量では、Ｄ−リシンによる治療を受けていた場合は５０％死亡率であるのに比べて、腎臓の保護がない場合はすべての動物で死亡した。対照的に、骨髄毒性関連致死率は、リシンが投与されたかどうかとは関係なく、２１３Ｂｉ−Ｆａｂ′の８００（１５％致死率）と９００μＣｉ（１５％致死率）で同様であった。
【００５２】
対照的に、慢性毒性に関する顕著な差が、リシンを与えられた動物とリシンを与えられなかった動物の間で観察された。そのデータから、非リシン治療動物では、ＢＵＮ上昇の一過性（２〜３週間）のエピソードとそれに続く正常化の後、ＢＵＮレベルは治療後６〜７週間で上昇を始めた。血清クレアチニン値がＢＵＮ値の後を辿る形になったが、しかし、後者（ＢＵＮ）よりも感受性が低かった。慢性腎不全の発症はさらに劇的であった（２１３Ｂｉ−治療群でよりも９０Ｙ治療群でＢＵＮ値がさらに急激に上昇している）。リシンの保護なく２５０μＣｉ　９０Ｙ−Ｆａｂ′により治療された動物はすべて、治療後３ヶ月内に死亡し、一方、２１３Ｂｉ−Ｆａｂ′を与えられた動物の致死率は５ヶ月後もたった１５％であった。何らの腎臓の損傷兆候もなくリシン治療群は生存し、また、治療後６ヶ月経っても腎不全を引き起こすことはなかった。リシンによる腎臓保護と骨髄移植との組み合わせでは、動物は９０Ｙ−の４００μＣｉと２１３Ｂｉ−ＣＯ１７−１Ａ−Ｆａｂ′の１１００μＣｉでも生存し、一方、１０％活性を高くすると、再び少なくとも１０％の致死率となった。
【００５３】
皮下ＧＷ−３９を有する動物で骨髄移植が行われていないあるいは行われている場合で、それぞれ最大耐容性投与量での２１３Ｂｉ含有ＣＯ１７−１Ａ−Ｆａｂ′対９０Ｙ含有ＣＯ１７−１Ａ−Ｆａｂ′の治療効果もまた研究された。両方の放射免疫複合体は、非治療対照あるいは、不適当な抗体ＯＫＴ３のＦａｂ′断片の同じ活性で治療された動物に比較して、有意な増殖遅延になっていた。抗腫瘍効果は投与量強化により改善された。しかし、各最大耐容性投与量で、２１３Ｂｉ−Ｆａｂ′は、その９０Ｙ−Ｆａｂ′類似体に対して治療上優れており、一方、不適当なＯＫＴ３　Ｆａｂ′については、両方の放射性同位元素間で有意差は観察されなかった。
【００５４】
ＧＷ−３９肝転移を有する動物の生存が測定された。それぞれ２０匹の動物の群が治療せずに放置され、腫瘍播種後、２週間で９０Ｙ−ＣＯ１７１Ａあるいは不適当なＯＫＴ３−Ｆａｂ′の２５０μＣｉ、あるいは２１３Ｂｉ−ＣＯ１７−１Ａあるいは不適当なＯＫＴ３−Ｆａｂ′の７００μＣｉが与えられた。そうしたそれぞれの群では、Ｄ−リシンによる腎臓保護下に置かれた。治療していない動物は、急速に進行する肝転移のため、６〜８週間内に死亡した。不適当な抗体で治療された動物の生存は、放射性同位元素にはかかわらず、１〜３週間だけ延長された。対照的に、９０Ｙ−Ｆａｂ′により治療された動物の平均生存は１５週間であり、また、このやり方で治療されたマウスの２０％は３０週間以上にわたって生存した。組織学的には、これらの長期生存において何らかの生存可能な腫瘍細胞を示すことができなかった。したがって、こうした動物は治癒したものとみなした。２１３Ｂｉ−ＣＯ１７−１Ａ−Ｆａｂ′により治療された動物の９５％治癒率は、その９０Ｙ類似体により治療された動物に関する治癒率よりも有意に高かった。
【００５５】
Ｄ−リシン投与をしなかった場合あるいはＤ−リシン投与をした場合の２１３Ｂｉ−ＣＯ１７−１Ａ−Ｆａｂ′の７００μＣｉ注射後１時間で複数ＧＷ−３９を有する２匹のマウスの外部シンチグラフィスキャンにより、２１３Ｂｉ−ＣＯ１７−１Ａ−Ｆａｂ′の腎臓癒着に対して、リシン投与の効果が示され、また、肝臓の複数転移病変における良好な腫瘍摂取が示されている。
【００５６】
体内分布研究に基づいた、皮下ＧＷ−３９異種間移植片を有するヌードマウスにおける２１３Ｂｉ−含有ＣＯ１７−１Ａ−Ｆａｂ′対９０Ｙ−含有ＣＯ１７−１Ａ−Ｆａｂ′の放射線線量算定が表１に要約されている。９０Ｙのような高エネルギーβ線エミッタは交差臓器照射という結果になるため、ＹｏｒｉｙａｚとＳｔａｂｉｎのモデルが使用された。９０Ｙ−ＣＯ１７−１Ａ−Ｆａｂ′の線量算定に関しては、表で交差照射が説明されており、また、２１３Ｂｉ−ＣＯ１７−１Ａ−Ｆａｂ′に関しては、２１３Ｐｏ（第１カラム）のα粒子の自己吸収率のみから結果的に生じた線量あるいは２１３Ｂｉのβ線およびγ線を含む線量（潜在的な臓器間クロスファイア放射、第２カラム）に区分している。
【００５７】
【表１】
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【００５８】
全治療群で観察された主なものである腫瘍増殖遅延の結果として、平均腫瘍線量と誘発増殖遅延の程度との間の相関関係は、放射免疫複合体の活性の重要な目安となった。ＧＷ−３９は１週間未満の腫瘍容量倍増時間に関しては非常に急速な増殖細胞系統であるため、腫瘍線量と、腫瘍容量を４倍にするのに必要な平均時間との間の相関関係が分析された。９０Ｙ−Ｆａｂ′に関しては、およそ５Ｇｙの腫瘍線量以下では、何ら有意な腫瘍増殖遅延は見つからなかった。閾値よりも上では、腫瘍増殖はおよそ２０Ｇｙで７倍までに線量依存的なやり方で遅延された。その結果生じた非線形退行曲線（退行係数：ｒ＝０．９６）は、およそ５Ｇｙではその肩を有する肩曲線に類似している。明らかに対照的に、閾値線量は２１３Ｂｉ−ＣＯ１７−１Ａ−Ｆａｂ′に関しては何らみられず、また腫瘍容量４倍増までの時間は、増加腫瘍線量に伴うほぼ線形に増加するやり方で延長された（退行係数：ｒ＝０．９８）。相当な抗腫瘍効果が、９０Ｙ放射性同位元素に関して必要とされる値のおよそ半分ほどの高さであった線量の２１３Ｂｉ−ＣＯ１７−１Ａ−Ｆａｂ′でみられた。
【００５９】
［例］
例１
ＩｇＧ免疫グロブリンのＦａｂ′断片の作成
ＩｇＧ免疫グロブリンのＦａｂ′断片（マウスモノクローナル抗体ＣＯ１７１Ａ、グラクソウェルカム社（ハンブルグ市、ドイツ）から入手）が、ペプシン加水分解（Ｉｍｍｕｎｏｐｕｒｅ（登録商標）Ｆ（ａｂ′）２作成キット、Ｐｉｅｒｃｅ社、ロックフォード市、イリノイ州）により、またその後に行われた低分子量チオールによる還元によって作成された。一般的には、ＩｇＧ免疫グロブリンは、１時間ｐＨ４でペプシン２００μｇ／μＬでインキュベートされた。結果的に得られた混合液は、タンパク質Ａの縦列カラムにより精製され、加水分解されていないＩｇＧを除去し、その後にＧ−５０Ｓｅｐｈａｄｅｘにより、低分子量汚染物を除去した。それに続いて、３７℃にて１２時間１０ｍＭシステインの存在下で１０ｍＭ　ＥＤＴＡを含有する０．１Ｍリン酸緩衝生理食塩水の中でジスルフィド還元を行い、Ｆａｂ′−ＳＨ断片を産生した。その還元反応の進行に続いてＨＰＬＣが行われ、それが完了すると、Ｆａｂ′−ＳＨが以下に述べる通りに精製された。
【００６０】
例２
Ｆａｂ′−ＳＨ断片の作成
例１で説明されているように作成されたＦａｂ′−ＳＨ断片がタンパク質Ａクロマトグラフィと微細限外ろ過法により精製された。その精製されたＦａｂ′−ＳＨ断片は、１０ｍＭ　ＥＤＴＡを含有するｐＨ５未満で脱酸素化緩衝液に蓄えられた。
【００６１】
例３
ヨードアセトアミド遮断Ｆａｂ′断片の作成
例２により精製されたＦａｂ′−ＳＨ断片は、ヒンジ領域チオール基を遮断し、またその断片の再会合を防ぐために、過剰ヨードアセトアミドと反応させた。そのヨードアセトアミド遮断Ｆａｂ′断片は、過剰ヨードアセトアミドから再精製された。
【００６２】
例４
チオール結合２１３Ｂｉ　Ｆａｂ′断片の作成
２１３Ｂｉ　Ｃｌ３によって例２により精製されたＦａｂ′−ＳＨ断片のインキュベーションにより、Ｆａｂ′断片のシステイン残基上でスルフヒドリル（ＳＨ）基との反応を結果的に生じる。
【００６３】
例５
ヨードアセトアミド遮断Ｆａｂ′断片のＳＣＮ−Ｂｚ−ＤＴＰＡ複合体の作成
ヨードアセトアミド遮断Ｆａｂ′断片のイソチオシアン酸ベンジルジエチレントリアミン五酢酸（ＳＣＮ−Ｂｚ−ＤＴＰＡ）複合体が、標準的な手順で作成された。手短に言うと、ＳＣＮ−Ｂｚ−ＤＴＰＡがＦａｂ′断片（５．０ｍｇ／ｍｌ）に加えられ、事前にＭａｂ（モノクローナル抗体）に対してＤＴＰＡが８：１モル過剰で１５０ｍＭ　ＮａＣｌを含有するｐＨ８．６の１００ｍＭ　ＨＥＰＥＳ（Ｎ−２−ヒドキシエチルピペラジン−Ｎ’−２−エタンスルホン酸）緩衝液に対して透析された。室温にて一晩インキュベートした後、抗体複合体が、ＳｅｐｈａｄｅｘＧ−５０（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｅ社、Ｄｅｉｓｅｎｈｏｆｅｎ市、ドイツ）の１×５０ｃｍカラム上のゲルろ過クロマトグラフィにより反応していなかったＳＣＮ−Ｂｚ−ＤＴＰＡから精製された。
【００６４】
例６
Ｆａｂ′断片の２１３Ｂｉ−含有ＳＣＮ−Ｂｚ−ＤＴＰＡ複合体の作成
２１３Ｂｉは、文献に説明されているように「自家（ｉｎ　ｈｏｕｓｅ）」２２５Ａｃ／２１３Ｂｉジェネレータから混合ヨウ化物／塩化物塩として得られた。手短に言うと、２２５Ａｃは、２２９Ｔｈ線源（後者は２３３Ｕの壊変産物）から得た後、精製された。２２５Ａｃは２Ｍ　ＨＣｌ中で分解され、また、ＡＧ　ＭＧ−５０カチオン交換樹脂（Ｂｉｏ−Ｒａｄ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、ミュンヘン市、ドイツ）の鉛で遮蔽された４×４０ｍｍカラム上に戴置された。０．１Ｍ　ＮａＩ／０．１Ｍ　ＨＣｌの１ｍｌにより２時間毎間隔で溶出された２１３Ｂｉに対する２つの寿命の短いα線放出中間体／γ線放出中間体（２２１Ｆｒと２１７Ａｔ）を介して１０．０日半減期を有するα崩壊／γ崩壊により、２２５Ａｃは崩壊する。それぞれ溶出された後、カオチン交換カラムは、０．０１Ｍ　ＨＣｌの５カラム体積により洗浄された。その活性を含むその０．１Ｍ　ＮａＩ／０．１Ｍ　ＨＣｌ溶出液がｐＨ５．５で０．５Ｍ　ＮａＯＡｃの２００μｌにより緩衝され、またそのｐＨは１．０Ｍ　ＮａＯＨの５０〜７０μｌにより、５．５の値に調節された。
【００６５】
上述されている２１３Ｂｉ溶液が、２〜３ｍＣｉ／ｍｇの特定活性が達成されるまで、ｐＨ５．５で０．５Ｍ　ＮａＯＡｃの中で緩衝されたＦａｂ′のＳＣＮ−Ｂｚ−ＤＴＰＡ複合体の溶液に加えられた。その反応混合液は５分間３７℃にてインキュベートされた。その結果生じた２１３Ｂｉ複合体は、ＰＤ−１０カラム（１５×５０ｍｍカラムの中に事前に詰め込まれたＳｅｐｈａｄｅｘＧ−２５；Ｐｈａｒｍａｃｉａ社、ウプサラ市、スウェーデン）上のサイズ排除クロマトグラフィを使用して５分間内で非結合２１３Ｂｉから精製された。過剰ＤＴＰＡがいずれかの非結合ビスマスを複合体化するために、加えられた。その複合体の品質は、その免疫活性を測定することによるとともに、ＨＰＬＣ（Ｂｉｏ−Ｓｉｌ　ＳＥＣ−２５０カラム、３００×７．８ｍｍ；Ｂｉｏ−Ｒａｄ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、リッチモンド市カリフォルニア州）により試験された。非結合同位体の量は２パーセント未満であった。標識化された抗体断片が、その最終的な作成の２０分間内に投与された。
【００６６】
例７
Ｆａｂ′断片のＹ−含有ＳＣＮ−Ｂｚ−ＤＴＰＡ複合体の作成
体内分布研究に関しては、８８Ｙは、Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　（Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ市、ドイツ）から入手した０．１Ｍ　ＨＣｌ中の８８ＹＣｌ３として得られた。治療研究に関しては、９０Ｙは、０．０５Ｍ　ＨＣｌ中の９０ＹＣｌ３として、Ｐａｃｉｆｉｃ　Ｎｏｒｔｈｗｅｓｔ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ社（リッチランド市、ワシントン州）から入手した。そのイットリウム溶液が、２〜３ｍＣｉ／ｍｇの特定活性が達成されるまで、ｐＨ５．５で０．５Ｍ　ＮａＯＡｃ中で緩衝されたＦａｂ′のＳＣＮ−Ｂｚ−ＤＴＰＡ複合体の溶液に加えられた。８８Ｙ複合体を作成するために等価量が加えられた。その反応混合液は５分間３７℃にてインキュベートされた。結果的に生じたイットリウム複合体は、ＰＤ−１０カラム（１５×５０ｍｍカラムの中に事前に詰め込まれたＳｅｐｈａｄｅｘＧ−２５；Ｐｈａｒｍａｃｉａ社、ウプサラ市、スウェーデン）上のサイズ排除クロマトグラフィを使用して５分間内で非結合イットリウムから精製された。過剰ＤＴＰＡがいずれかの非結合イットリウムを複合体化するために加えられた。その複合体の品質は、その免疫活性を測定することによるとともに、ＨＰＬＣ（Ｂｉｏ−Ｓｉｌ　ＳＥＣ−２５０カラム、３００×７．８ｍｍ；Ｂｉｏ−Ｒａｄ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、リッチモンド市カリフォルニア州）により試験された。非結合同位体の量は２パーセント未満であった。標識化された抗体断片が、その最終的な作成の２０分間内に投与された。
【００６７】
例８
ガラクトース−Ｗ１２−Ｆａｂ′清澄化剤の作成
ＭＮ−１４に対して抗イディオタイプである抗体は、Ｗ１２と呼ばれており、例１に概要されているように、ペプシンを使用してＦ（ａｂ′）２断片に加水分解される。そのＦ（ａｂ′）２は、例１に説明されているように、低分子量チオールを使用してＦａｂ′断片に還元される。その還元の終わりに、そのＦａｂ′−ＳＨはスピンカラムクロマトグラフィにより精製され、またそのヒンジ領域チオール基を遮断し、またその断片の再会合を防ぐために、過剰ヨードアセトアミドと反応させる。過剰ヨードアセトアミドにより精製後、そのＦａｂ′は４００倍モル過剰のガラクトシル化剤である、シアノメチル−２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−１−チオ−β−Ｄガラクトピラノシドのチオイミダイトと反応させる。そのガラクトシル化タンパク質は、２つのスピンカラムにより精製され、またそのガラクトース：Ｆａｂ′比は、ＭＡＬＤＩ−ＭＳにより測定される。
【００６８】
例９
マウスにおける腫瘍の誘発
雌ヌードマウス、１９〜２３ｇ、４〜５週齢がＣｈａｒｌｅｓ　Ｒｉｖｅｒ（Ｓｏｌｚｆｅｌｄ市、ドイツ）から購入された。ヒト結腸腫瘍細胞系統であるＧＷ−３９は、２０％細胞懸濁液を産生するために、４０メッシュスクリーンによりミンチを作成することにより、またＨａｎｋの無菌平衡塩溶液（ＩＣＮ　Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ社、Ｅｓｃｈｗｅｇｅ市、ドイツ）により洗浄することにより継代増殖させた。この懸濁液（２００μｌ）はそのマウスのそれぞれの中に皮下的に注射された。およそ１０日後に、腫瘍はおよそ１００〜２００ｍｇのサイズに達した。これがこの研究の諸目的のために使用されたサイズである。
【００６９】
例１０
体内分布研究
例９で説明されているように腫瘍を有するマウスに、尾部静脈に、およそ２００〜３００μｇのタンパク質量でビスマスあるいはイットリウム放射性同位元素を含有するＦａｂ′断片が注射された。そのマウスは、８８Ｙに関しては、１０分、１、４、２４、７２および１６８時間で犠牲にされ、また、２１３Ｂｉ　Ｆａｂ′複合体に関しては、１０分、１、３および５時間で犠牲にされた。マウスは眼窩後穿刺により採血された。全身保持容量を測定するため、マウスはウェルカウンターで測定された。頸椎脱臼後、動物は解剖された。腫瘍と組織（肝臓、脾臓、腎臓、肺、心臓、腸、骨および血液）における活性量が物理学的壊変を報告するために標準的な注射を使用してγ線シンチレーションカウントにより測定された。各研究のために使用された動物の数は典型的には各時点で群毎に５匹の動物であって、また腫瘍のサイズは実際の治療実験に使用されたものと同じ範囲にあった。
【００７０】
例１１
放射線線量算定
体内分布データが時間経過活性曲線を生成するのに使用された。時間経過活性曲線は、摂取成分有りと無し曲線の２つの指数の差あるいは和に適合させた。各臓器で蓄積された活性が、時間経過にわたり結果的に生じる発現を分析的に統合することより得られた。腫瘍と臓器線量が計算され、９０Ｙの電子、あるいは２１３Ｂｉとその娘核種２１３Ｐｏのα粒子、電子およびフォトンの寄与が報告されたが、しかし、２０９Ｐｂあるいは２０９ＴＩのβ線の寄与はみられなかった。これら線量の計算は、ＹｏｒｉｙａｚとＳｔａｂｉｎによる３０ｇマウスの幾何モデルにより実施された。このモデルにより、交差臓器照射と全身寄与率がモンテカルロ輸送シミュレーションコードＭＣＮＰ４Ａを使用して報告される。骨髄線量推定を得るために、骨と骨髄との間の吸収ベータ−分画φβ（ｒｔ←ｒｓ）が使用された。
【００７１】
例１２
実験的な放射免疫療法
皮下腫瘍の腫瘍サイズは、治療直前とそれ以降週間隔で３次元キャリパ測定により測定された。動物は治療しない（対照実験）か、あるいは示された活性を備えた９０Ｙ−あるいは２１３Ｂｉ−含有複合体の単一線量が注射された。各治療群では１０〜２０匹の動物が研究された。非特異的治療対照として、抗ＣＤ３　Ｔ細胞リンパ腫モノクローナル抗体ＯＫＴ３のＢｚ−ＤＴＰＡ−複合体Ｆａｂ′断片が使用された。体重は週毎に記録され、また生存がモニターされた。最大耐容性線量（ＭＴＤ）は、動物死亡という結果をまったく生じさせなかった各条件下での実施可能な最高線量であって、その次のさらに高い最高線量レベルでは動物の少なくとも１０％が死亡するという結果を生じるものであると定義された。死亡時あるいは元の体重の３０％以上の喪失時まで、あるいはその皮膚を通して腫瘍が潰瘍形成し始め、その群から動物が外された時まで動物は観察され、犠牲にされた。
【００７２】
例１３
腎臓摂取減少と骨髄移植
Ｄ−リシン塩酸塩（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｅ社、Ｄｅｉｓｅｎｈｏｆｅｎ社、ドイツ）は、１７５ｍｇ／ｍｌでリン酸緩衝生理食塩水に溶解させた。動物には、この溶液２００μｌ（すなわち、Ｄ−リシン３５ｍｇ）を放射免疫複合体の投与前３０分から開始して４時間毎に非経口的に注射された。
骨髄は、同じ系統の非治療供与体ヌードマウスから無菌技術により回収された。マウスの両大腿骨の髄腔は２６ゲージ針を使用して０．９％無菌生理食塩水により洗浄された。１０７の骨髄細胞の種菌が放射免疫複合体注射後２４時間で尾部静脈を介して静脈内に注射された。
【００７３】
例１４
血算測定、腎臓と肝臓機能パラメータ
合計および較差白血球および血小板数は治療日に測定され、またそれ以降は週間隔で測定された。ヘパリン化された７５μｌの標本が眼窩後採血により回収された。そのサンプルはＴｅｃｈｎｉｃｏｎ　Ｈ３自動分析器（Ｂａｙｅｒ−Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｋ社、ミュンヘン市、ドイツ）上でカウントされた。平均＋／−標準偏差が各群について計算された。血中尿素窒素（ＢＵＮ）、クレアチニン、アルカリホスファターゼ、およびグルタミン酸オキサロ酢酸トランスアミナーゼが、放射免疫複合体注射の日に測定され、またそれ以降は週毎間隔で測定された。これらのパラメータのそれぞれは当業者には公知のものである測定手順により測定された。
【００７４】
例１５
組織像
臓器と腫瘍組織像に関しては、動物が頚椎脱臼により犠牲にされ、また指示された時間に剖検された。臓器は１０％ホルマリンで固定され、パラフィンに包埋され、また、５μｍ切片に切断された。染色はヘマトキシリン−エオシンにより行われた。
【００７５】
例１６
統計分析
組織摂取値と体内分布データにおける差は、不対データに関するスチューデントｔ−検定により統計的に分析された。対比較は、ウィルコクソン順位和検定により実施された。皮下腫瘍における治療様式間の治療効果における差異は、指数関数的腫瘍増殖パターンを想定することにより分析された。すなわち、漸近近似に基づく非線形退行分析が用いられた。生存分析はＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ積極限に基づいたものであり、また各群は対数順位検定を使用して比較された。対数順位検定はまた、腫瘍容量倍増時間を比較するために使用された。
【００７６】
例１７
Ｆａｂ′の放射線同位元素含有ＳＣＮ−Ｂｚ−ＤＴＰＡ複合体と清澄化剤によるヒト患者の治療
結腸直腸腫瘍を有する患者に、放射免疫複合体投与前にＤ−リシンを注射した。一般的には、腎臓の尿細管での再摂取を防ぐ清澄化剤あるいはそのタイプの薬剤は、放射免疫複合体の注射前２４時間から３０分までに投与される。ＭＮ−１４抗ＣＥＡから作成されたＦａｂ′の放射性同位元素含有のＳＣＮ−Ｂｚ−ＤＴＰＡ複合体がその後にその患者に注射され、また、その患者は治療の間モニターされる。放射性同位元素は２１３Ｂｉあるいは９９Ｙに限定されないが、それらなどの複合体に複合体化するいずれかのα線放出放射性同位元素あるいはβ線放出放射性同位元素であり得る。付加的なＤ−リシンは一般的には、放射免疫複合体が注射された後にその患者に投与される。１つあるいはそれ以上の清澄化剤は個別に、あるいは組み合わせて使用することができる。例えば、その複合体のいずれかの部分に特異的に結合するＤ−リシンは、放射免疫複合体がターゲット部位に付着して成長するのに十分な時間が経過するまで、投与すべきではない。したがって、ＤＴＰＡ−ガラクトース−Ｗ１２−Ｆａｂ′などのガラクトシル化抗イディオタイプ清澄化剤は、注射された放射免疫複合体の十分な量がその腫瘍に局在化した後にその患者に注射される。腫瘍に局在化した放射免疫複合体は、その患者の腫瘍細胞破壊という結果を生じるα粒子あるいはβ粒子を放出する。
【００７７】
例１８
（ＢＯＣ）Ｇｌｙ−Ｄ−Ｔｙｒ（Ｏ−ｔ−Ｂｕｔ）−Ｄ−Ｌｙｓ−ＯＨの作成
（ＢＯＣ）Ｇｌｙ−Ｄ−Ｔｙｒ（Ｏ−ｔ−Ｂｕｔ）−Ｄ−Ｌｙｓ−ＯＨの合成には、アリルオキシカルボニル（Ａｌｏｃ）および９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）などの周知の保護基により保護されたアミノ酸が使用される。まず、Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ｌｙｓ（Ａｌｏｃ）［０．３２５ｇ；０．７２ｍｍｏｌ］が無水ジクロロメタン（ＣＨ２Ｃｌ２）の５ｍｌの中で溶解され、またジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）０．５５ｍｌと混合させる。その溶液はその後、２０ｍｌバイアル中にある２−クロロトリチル塩化物樹脂０．５ｇに加えられ、またその内容物が１８時間激しく振とうされる。赤褐色スラリーが、混合する目的かあるいはそのカラムから溶液を排出するためかのいずれのために、またそのカラム上にその樹脂を残すためにスラリーにより、窒素を気泡化するのに使用することができるフリットおよび三方活栓に適合させたカラム組立体に置かれる。その溶液は排出され、またその樹脂はＣＨ２Ｃｌ２：ＭｅＯＨ：ＤＩＥＡ（１７：２：１）の３×４０ｍｌ、ＣＨ２Ｃｌ２の３×４０ｍｌ、ＤＭＦの２×４０ｍｌ、ＣＨ２Ｃｌ２の２×４０ｍｌおよび：ＭｅＯＨの２×４０ｍｌにより洗浄される。その樹脂は窒素のフロー下で乾燥される。Ｆｍｏｃ群は１０分間１：１（ｖ／ｖ）ＣＨ２Ｃｌ２−ＤＭＦに５％ピペリジン４０ｍｌを加えることにより切断され、その溶液から排出され、また、１５分間ＣＨ２Ｃｌ２−ＤＭＦの中で２０％ピペリジンにより続けて切断される。この後、ＤＭＦ４０ｍｌ、イソプロパノール（ＩＰＡ）４０ｍｌ、ＮＭＰ（Ｎ−メチルピロリドン）４０ｍｌ、ＩＰＡ４０ｍｌおよびＮＭＰ４×４０ｍｌによる洗浄サイクルが続く。その樹脂はその後に、４０分間、活性化されたＦｍｏｃ−Ｄ−Ｔｙｒ（Ｏ−ｔ−Ｂｕｔ）の１．８ｍｍｏｌと反応させる。その活性化はＦｍｏｃ−Ｄ−Ｔｙｒ（Ｏ−ｔ−Ｂｕｔ）の０．８２７ｇ（１．８ｍｍｏｌ）、ＮＭＰ４ｍｌ中のＨＯＢＴ０．２６９ｇを使用して実施され、ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）０．３１ｍｌの透明溶液に加え、また、２０分間外界温度で維持される。この期間の後、ＤＩＥＡの３．６ｍｍｏｌ（０．６２ｍｌ）が加えられ、また、その反応は２５分間継続される。その洗浄順序は、上述されているように、Ｆｍｏｃ切断とそれに続く洗浄順序の後である。第２の結合が、活性化ＢＯＣ−Ｇｌｙ（Ｂｏｃ−Ｇｌｙの０．３７６ｇないしは３ｍｍｏｌから得られる）が類似のやり方で実施される。Ａｌｏｃ群は、ＣＨ２Ｃｌ２（４０ｍｌ）：ＡｃＯＨ（２ｍｌ）およびＤＩＥＡ（５ｍｌ）、トリブチルチン水素化物５ｍｌの添加が続いて行われる混合液中にあるテトラキス（トリフェニルホスファイン）パラジウム（０）の０．１５４７ｇの溶液を使用して除去される。通常の洗浄順序の後、そのペプチドは樹脂から酢酸−トリフルオロエタノール−ＣＨ２Ｃｌ２１０ｍｇ（１：１：８ｖ／ｖ）で切断される。切断されたペプチド溶液は、主化合物（ゴム状産物）０．２５ｇに濃縮される。その産物は、分析逆相ＨＰＬＣ上では７．１０分の保持時間で単一ピークを示す。エレクトロスプレー質量スペクトル分析では、ｍ／ｅ５２３でＭ＋Ｈピーク（陽性イオンモード）およびｍ／ｅ５２１でＭ−Ｈピーク（陰性イオンモード）を示した。
【００７８】
例１９
Ｇｌｙ−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＳＣＮ−Ｂｚ−ＤＴＰＡ）−ＯＨの作成
例１８から得られた産物の０．００５３ｇ（０．１ｍｍｏｌ）が水−ジオキサンの中のＳＣＮ−Ｂｚ−ＤＴＰＡ（８０％ＤＴＰＡ含量８１ｍｇ；２０％余剰）と混合され、またそのｐＨは８．５に調節される。その溶液は２．５時間３７℃でインキュベートされる。さらにＳＣＮ−Ｂｚ−ＤＴＰＡ（４１ｍｇ）が加えられ、またそのｐＨは８．５６に再調節される。その溶液はその後に２時間同じ温度でインキュベートされる。水の傾斜溶出（０．１％ＴＦＡ）／９０％アセトニトリル−水（０．１％ＴＦＡ）を使用した逆相カラム上での分取ＨＰＬＣ精製は、無色固体として、（ＢＯＣ）Ｇｌｙ−Ｄ−Ｔｙｒ（Ｏ−ｔ−Ｂｕｔ）−Ｄ−Ｌｙｓ（ＳＣＮ−Ｂｚ−ＤＴＰＡ）−ＯＨ３０ｍｇを供給する。分析逆相ＨＰＬＣは、７．５４分間の保持時間を有する単一ピークを示す。質量スペクトル分析では、ｍ／ｅ１０６３でＭ＋Ｈピーク（陽性イオンモード）およびｍ／ｅ１０６１でＭ−Ｈピーク（陰性イオンモード）となっていることが明らかにされた。この材料はその後、１時間ＴＦＡ／ＣＨ２Ｃｌ２／アニソールの混合液で処理され、またＢＯＣ−Ｔｙｒ（Ｏ−ｔ−Ｂｕｔ）保護基が切断される。その主化合物はエチルエーテルにその反応混合物を加えることにより析出される。ＨＰＬＣ保持時間は５．３１分であった。質量スペクトル分析では、９０７でＭ＋Ｈピークおよび９０６でＭ−Ｈピークが示された。
【００７９】
例２０
（ＭＣＣ）Ｇｌｙ−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＳＣＮ−Ｂｚ−ＤＴＰＡ）−ＯＨの作成
例１９から得られる産物の０．０２５ｇ（０．０１３８ｍｍｏｌ）が、ｐＨ７．０で０．１Ｍリン酸ナトリウム溶液０．５ｍｌの中に溶解される。この溶液には、市販されていて入手可能なスルホスクシンイミジル４−（Ｎ−マレイン酸イミドメチル）−１−カルボン酸塩（ＳＭＣＣ）が加えられ、またそのｐＨは７．１７に上昇され、またその透明溶液は１時間攪拌される。例１８におけるのと同じ傾斜溶出を使用して分取逆相カラム上の分取ＨＰＬＣは、主化合物［そこではＭＣＣは４−Ｎ−マレイン酸イミドメチル−１−カルボニル部分を表わす。］０．００５４ｇを産生する。精製された材料の保持時間（分析ＲＰカラム）は６．３６分である。エレクトロスプレー質量スペクトル分析では、ｍ／ｅ１１２６でＭ＋Ｈピークおよびｍ／ｅ１１２４でＭ−Ｈピークとなっていることを明らかにした。
【００８０】
例２１
例２０から得られる産物のアスタチン化とＦａｂ′−ＳＨへの付着
例２０の産物は、１〜２分間で酸化剤としてクロラミンＴを使用して（２１１Ａｔ）−ナトリウムアスタタチドによりアスタチン化される。その標識化された物質は、第２バイアルに移送され、また、反応しないアスタタチドを除去するために４−ヒドロキシフェニル酢酸により処理される。その標識化物質は１〜２時間例２のＦａｂ′−ＳＨ断片により反応させ、また、その溶液はその後にテトラチオン酸ナトリウムの中で５ｍＭとなり、５分間インキュベートされ、また、ｐＨ７の０．１Ｍリン酸ナトリウムの中でＳｅｐｈａｄｅｘＴＭ５０／８０の遠心分離サイズ排除カラム上で精製される。その精製された２１１Ａｔ含有放射免疫複合体はその後に患者に投与される。
【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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