(57)【要約】本発明は、哺乳動物細胞中で効率良く発現され且つイエダニであるヒョウヒダニ（Ｄｅｒｍａｐｈａｇｏｉｄｅｓ）に由来する昆虫タンパク質をコードするコドン最適化ポリヌクレオチドに関する。特に、これらの最適化コドンポリヌクレオチドは、ヤケヒョヒダニ（Ｄｅｒｍａｐｈａｇｏｉｄｅｓ ｐｔｅｒｏｎｙｓｓｉｎｕｓ）に由来するタンパク質（例えばＤｅｒＰ１やｐｒｏＤｅｒＰ１等）をコードする。また本発明は、このようなコドン最適化ポリヌクレオチドの発現を含む医薬組成物の製造方法、並びにこのようなポリヌクレオチドを含むベクター及び形質転換宿主細胞も提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒョウヒダニ（Ｄｅｍａｔｏｐｈａｇｏｉｄｅｓ）のダニタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列であって、そのポリヌクレオチド配列のコドン使用頻度パターンが高レベルで発現される哺乳動物遺伝子のものと類似していることを特徴とするポリヌクレオチド配列。
【請求項２】
タンパク質中に存在する全てのアミノ酸タイプが、そのアミノ酸をコードするために使用されるコドンが既知の哺乳動物においてそのアミノ酸を表すためにそのコドンが使用される頻度と同じ頻度で使用されるように、最適化されていることを特徴とする請求項１記載のポリ核酸分子。
【請求項３】
ポリ核酸分子によりコードされるタンパク質がある発現系において発現されるときの収量が、そのヒョウヒダニタンパク質の最適化されていない天然遺伝子を用いて同じ発現系から生成されるタンパク質の量よりも２０％を超えて高いことを特徴とする請求項１又は２に記載のポリ核酸分子。
【請求項４】
各アミノ酸をコードするために使用される前記ポリヌクレオチド中に存在するコドンが、以下の表に記載された頻度と実質的に同じ頻度で現れるように選択されることを特徴とする、ヒョウヒダニタンパク質をコードするポリ核酸分子。
【表１】
2004503235.tif 000015
2004503235.tif 000016
【請求項５】
ＤｅｒＰ１をコードすることを特徴とする、請求項１〜４のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含む発現系。
【請求項７】
請求項１〜５のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項８】
配列番号１６のポリヌクレオチド。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、哺乳動物細胞中で効率良く発現され且つ塵中のダニであるヒョウヒダニ（Ｄｅｒｍａｐｈａｇｏｉｄｅｓ）のイエダニに由来する昆虫タンパク質をコードするコドン最適化ポリヌクレオチド（ｃｏｄｏｎ ｏｐｔｉｍｉｓｅｄ ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）に関する。特に、これらの最適化コドンポリヌクレオチドは、ヤケヒョヒダニ（Ｄｅｒｍａｐｈａｇｏｉｄｅｓ ｐｔｅｒｏｎｙｓｓｉｎｕｓ）に由来するタンパク質（例えばＤｅｒＰ１やｐｒｏＤｅｒＰ１等）をコードする。また本発明は、このようなコドン最適化ポリヌクレオチドの発現を含む医薬組成物の調製方法、並びにこのようなポリヌクレオチドを含むベクター及び形質転換宿主細胞も提供する。
【０００２】
家屋塵（ハウスダスト）中のダニであるヒョウヒダニ（Ｄｅｒｍａｔｏｐｈａｇｏｉｄｅｓ）に由来するアレルゲンは、喘息等のアレルギー性過敏反応に関係があると随分前から認識されていた［１］。これらの分子の中でもＤｅｒ ｐ１は、最も強力なＩｇＥ媒介性免疫反応を誘発する免疫優性アレルゲンである［２，３］。Ｄｅｒ ｐ１のシステインプロテイナーゼ活性は、その強力なアレルゲン性を増幅することが分かった［４，５］。Ｄｅｒ ｐ１をコードするｃＤＮＡ配列を見ると、多くの哺乳動物及び植物のプロテイナーゼと同様に、Ｄｅｒ ｐ１が３２０個のアミノ酸残基からなる不活性プレプロ酵素として合成された後、プロセシングをうけて２２２アミノ酸の成熟形態となることが分かる［６，７］。ＰｒｏＤｅｒ ｐ１の成熟については現在のところ不明であるが、このアレルゲンは８０塩基のプロ領域の切断によってプロセシングされると考えられる。
【０００３】
イエダニ菌体の培養物から成熟Ｄｅｒ ｐ１を精製することには成功したが、全体的収率は低かった［８］。アレルゲンの組換え産生は、種々の実験手法のため（例えば免疫学的研究、診断、免疫療法によるＩｇＥ媒介性アレルギー疾患の治療、及び構造と機能との関係の理解のため等）に、所定の物質を高い収率で得る効率的な方法である［９］。細菌及び酵母においてＤｅｒ ｐ１を発現させる過去の試みでは、このアレルゲンの発現レベルは低く、主に不溶性形態で発現されることが示された ［１０〜１２］。更に、細菌中で発現された組換えＤｅｒ ｐ１は、ＩｇＥ結合活性が低いことが分かった。酵母中で産生された組換えタンパク質は、特定のＩｇＥによって認識されたが、天然タンパク質に比べて低いレベルであった。
【０００４】
天然の非最適化ヒョウヒダニ（Ｄｅｒｍａｐｈａｇｏｉｄｅｓ）遺伝子によりコードされる、酵素活性が低い組換えＤｅｒＰ１アレルゲンは、国際特許出願公開番号第ＷＯ９９／２５８２３号に記載されている。その他の組換えヒョウヒダニ（Ｄｅｒｍａｐｈａｇｏｉｄｅｓ）アレルゲンとしては、ＤｅｒＰ１（米国特許第６，０７７，５１８号）、ＤｅｒＰＩＩ（米国特許第６，１３２，７３４号）、並びにＤｅｒＦＩ及びＤｅｒＦＩＩ（米国特許第５，９７３，１３２号、同第５，９５８，４１５号及び同第５，８７６，７２２号）が挙げられる。
【０００５】
医薬品やワクチンの製造または診断アッセイにおいて使用するための組換えヒョウヒダニ（Ｄｅｒｍａｐｈａｇｏｉｄｅｓ）アレルゲンの効率的発現を可能にすることが望ましいことは明らかである。さらに、天然ヒョウヒダニ（Ｄｅｒｍａｐｈａｇｏｉｄｅｓ）アレルゲンと同じコンホメーション及び免疫学的特性を有する組換えアレルゲンを高レベルで産生する発現系が望まれている。
【０００６】
本発明は、ヒョウヒダニ（Ｄｅｒｍａｐｈａｇｏｉｄｅｓ）タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列であって、そのポリヌクレオチド配列のコドンの使用パターンを、高レベルで発現される哺乳動物遺伝子のものと類似するよう改変されたポリヌクレオチド配列を提供することによって、上記のような利点を達成する。よって、ｒｅｃＰｒｏＤｅｒ ｐ１のクローニング及び発現を、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）において高効率で行い、天然の精製ＤｅｒＰ１に非常に良く似たＩｇＥ反応性を示す産物を生成する。
【０００７】
ＤＮＡコードは４文字（Ａ、Ｔ、Ｃ及びＧ）あり、これらを用いて３文字の「コドン」を形成する。これらの「コドン」は、生物の遺伝子中にコードされるタンパク質のアミノ酸を表す。ＤＮＡ分子に沿ったコドンの直鎖状配列は、これらの遺伝子によりコードされるタンパク質（１種もしくは複数）の中のアミノ酸の直鎖状配列に翻訳される。このコードは高度に縮重しており、６１種類のコドンは２０種類のアミノ酸をコードし、３種類のコドンは「停止」シグナルを表す。このように、多くのアミノ酸は２種類以上のコドンでコードされる。事実、幾つかのアミノ酸は４つ以上の異なるコドンによってコードされる。
【０００８】
所与のアミノ酸をコードするために２種類以上のコドンが利用される場合、生物のコドン使用頻度パターンは、常にランダムにあるわけではないことが分かった。種が異なると、そのコドン選択は異なった偏りを見せ、更に、単一の種において高レベルで発現される遺伝子と低レベルで発現される遺伝子との間では、コドンの利用が大きく異なる場合がる。この偏りは、ウイルス、植物、細菌、昆虫及び哺乳動物細胞において異なるものであり、幾つかの種は、他の種に比べて、ランダムなコドン選択とはかけ離れた非常に大きな偏りを見せる。例えば、ヒト及び他の哺乳動物は、ある種の細菌又はウイルスに比べて偏りが少ない。これらの理由により、大腸菌中で発現される哺乳動物遺伝子又は哺乳動物細胞中で発現されるウイルス遺伝子が効率の良い発現に適さないコドン分布を有する、という可能性が大いにある。しかし、大腸菌での発現に適したコドン使用頻度パターンを有する遺伝子が、ヒトにおいても効率的に発現される場合もある。異種ＤＮＡ配列の中に、発現が起こる宿主細胞中において滅多に見られないコドンからなるクラスターが存在すると、その宿主中において異種遺伝子の発現レベルが低くなる可能性が高い、と予想される。
【０００９】
コドンを、その宿主中において稀であるコドンから宿主が選好する（ｈｏｓｔ−ｐｒｅｆｅｒｒｅｄ）コドンに変更する（「コドン最適化」）ことにより異種発現レベルが上昇した例が幾つかある。例えば、ＢＰＶ（ウシ乳頭腫ウイルス）後期遺伝子Ｌ１及びＬ２は、コドンが哺乳動物のコドン使用頻度パターンに最適化されたものであり、これは、哺乳動物（Ｃｏｓ−１）細胞培養において、野生型ＨＰＶ配列に比べて発現レベルが高くなることが分かった（Ｚｈｏｕら， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． １９９９． ７３， ４９７２−４９８２）。この研究では、哺乳動物中に比べてＢＰＶにおいて２倍を超える頻度（使用比＞２）で発生する全てのＢＰＶコドン、及び使用比が１．５を超える多くのコドンが、哺乳動物において優先的に使用されるコドンによって保存的に置換された。国際特許出願第ＷＯ９７／３１１１５号、第ＷＯ９７／４８３７０号及び第ＷＯ９８／３４６４０号（Ｍｅｒｃｋ ＆ Ｃｏ．， Ｉｎｃ．）において、その最適化の対象である宿主哺乳動物中においてコドン最適化配列がＤＮＡワクチンとして用いられる場合に、ＨＩＶ遺伝子又はそのセグメントのコドン最適化によって、タンパク質発現が上昇し及び免疫原性が改善されることが示された。各々のウイルスコドンは、対象となる宿主にとって最適なコドンにより保存的に置換されるため、この研究では、配列全体を最適化されたコドンで構成する（ただしそれが望ましくない制限部位やイントロンスプライス部位等を導入する場合を除く）。
【００１０】
発明の概要
第１の態様に従って、本発明は、ヒョウヒダニのダニタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列であって、そのポリヌクレオチド配列のコドン使用頻度パターンが高レベルで発現される哺乳動物遺伝子のものと類似しているポリヌクレオチド配列を提供する。
【００１１】
好ましくは、ポリヌクレオチド配列はＤＮＡ配列である。望ましくは、ポリヌクレオチド配列のコドン使用頻度パターンは、高レベルで発現されるヒト遺伝子に典型的なパターンである。好ましくは、以下に記載する本発明の態様の全てにおいて、イエダニのタンパク質は、ヤケヒョウヒダニ（Ｄｅｒｍａｔｏｐｈａｇｏｉｄｅｓ ｐｔｅｒｏｎｙｓｓｉｎｕｓ）又はコナヒョウヒダニ（Ｄｅｒｍａｔｏｐｈａｇｏｉｄｅｓ ｆａｒｉｎａｅ）に由来するものである。最も好ましくは、ヤケヒョウヒダニタンパク質は、ＤｅｒＰ１、ＰｒｏＤｅｒＰ１又はＤｅｒＰ２である。
【００１２】
従って、本発明の第１の態様においては、ヒョウヒダニタンパク質をコードする複数のコドンを含む合成遺伝子であって、組換え昆虫タンパク質のアミノ酸配列をコードするのに使用することができるコドンの選択が、最適化された哺乳動物のコドン使用頻度をそっくり真似るように変更されて、その合成遺伝子中でのコドンの使用頻度が、同じタンパク質をコードする哺乳動物遺伝子と実質的に同じとなった合成遺伝子を提供する。
【００１３】
この第１の態様において好ましくは、そのタンパク質中に存在する全てのアミノ酸タイプが、そのアミノ酸をコードするために使用されるコドンが既知の哺乳動物においてそのアミノ酸を表すためにそのコドンが使用される頻度と同じ頻度で使用されるように、最適化される。更に、好適な最適化コドン合成遺伝子は、そのヒョウヒダニタンパク質の最適化されていない天然遺伝子を用いて同じ発現系から産生されるタンパク質の量に比べて、そのタンパク質収量が２０％を超える、より好ましくは５０％を超える、及び最も好ましくは１００％を超えて高い発現系において使用される。
【００１４】
或いは、本発明の第２の態様においては、ヒョウヒダニ（Ｄｅｒｍａｐｈａｇｏｉｄｅｓ）タンパク質をコードする単離された核酸分子であって、各アミノ酸をコードするために用いられる前記ポリヌクレオチド中に存在するコドンが、以下の表１に記載された頻度と実質的に同じ頻度で現れるよう選択されることを特徴とする、上記単離された核酸を提供する。
【００１５】
【表２】
2004503235.tif 000002
【００１６】
本明細書において、「実質的に」とは、特定のコドンの使用頻度（％）が表に記載された数字±２０％、より好ましくは±１５％、よりさらに好ましくは±１０％、及び理想的には±５％であることを意味する。
【００１７】
或いは、本発明の第３の態様においては、ヒョウヒダニタンパク質をコードする複数のコドンを一緒に含む合成遺伝子であって、各アミノ酸タイプが、理論的に哺乳動物遺伝子で見られる同じアミノ酸タイプの対応するχ２値とは有意に差がない（信頼区間が８０〜９９％である）χ２値を有することを特徴とする、上記合成遺伝子を提供する。ここでχ２値は、以下の式：
【数１】
2004503235.tif 000003
（式中ｘｉｊは、配列ｉの中のタイプｊのコドンの数であり、ｎは、その配列中の特定のアミノ酸ｋを表すコドンの合計数であり、ｘｊはその２つの配列中のタイプｊのコドンの合計数である）
を用いて算出される。変数の自由度は、種々の可能性あるコドンの数から１を引いた数に等しい。
【００１８】
上記と同様に、本発明は、ヒョウヒダニタンパク質をコードする複数のコドンを一緒に含む合成遺伝子であって、その合成遺伝子中に存在する異なるタイプのアミノ酸の６０〜１００％が最適化されることを特徴とする上記合成遺伝子を提供するものとして表すこともできる。但し、以下の表：
【表３】
2004503235.tif 000004
2004503235.tif 000005
の中に記載された特定のアミノ酸についてその合成遺伝子中のχ２値が有意性の極限χ２値（５％）より小さい場合に、そのアミノ酸タイプは最適化されたとみなされることを特徴とするものである。前記χ２値は、以下の式：
【数２】
2004503235.tif 000006
（式中ｘｉｊは、配列ｉ中のタイプｊのコドンの数であり、ｎは、その配列中の特定のアミノ酸ｋを表すコドンの合計数であり、ｘｊは２つの配列中のタイプｊのコドンの合計数である）
を用いて算出される。変数の自由度は、種々の可能性あるコドンの数から１を引いた数に等しい。好ましくは、７０％を超えるアミノ酸が最適化され、より好ましくは８０％を超えるアミノ酸が最適化され、最も好ましくは９０％を超えるコドンが最適化される。
【００１９】
驚くべきことに、このように最適化されたヒョウヒダニ遺伝子は、ＣＨＯ細胞等の哺乳動物細胞中で非常に良好に発現するだけでなく、酵母のコドン使用頻度が異なるにもかかわらず、酵母細胞中においても良好に発現する。
【００２０】
また本発明は、ヒョウヒダニアミノ酸配列をコードする本発明の第１〜第３の態様のポリヌクレオチド配列を含み且つその発現を指令することができる発現ベクターであって、そのポリヌクレオチド配列のコドン使用頻度パターンが、高レベルで発現される哺乳動物遺伝子（好ましくは高レベルで発現されるヒト遺伝子）に典型的なパターンであることを特徴とする発現ベクターも提供する。このベクターは、細菌、昆虫又は哺乳動物細胞（特にヒト細胞）における異種ＤＮＡの発現を駆動するのに適している。
【００２１】
本発明の第１の態様のポリヌクレオチド配列または第２の態様の発現ベクターを含む宿主細胞が提供される。この宿主細胞は細菌（例えば大腸菌）または哺乳動物（例えばヒト）細胞であってもよいし、あるいは昆虫細胞であってもよい。本発明のベクターを含む哺乳動物細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでトランスフェクトされた培養細胞であってもよいし、またはベクターを哺乳動物に投与することによりｉｎ ｖｉｖｏでトランスフェクトされたものであってもよい。
【００２２】
本発明のポリヌクレオチド又はコドンが最適化されたポリヌクレオチド配列によって発現される組換えヒョウヒダニタンパク質を含む医薬組成物もまた提供される。
【００２３】
好ましくは、この医薬組成物は、本発明の第２の態様のＤＮＡベクターを含む。好適な実施形態において、この組成物は、ヒョウヒダニアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列をコードするベクターを含むＤＮＡでコーティングされた複数の粒子（好ましくは金粒子）を含み、このポリヌクレオチド配列のコドン使用頻度パターンは、高レベルで発現される哺乳動物遺伝子（特にヒト遺伝子）に典型的なパターンであることを特徴とする。他の実施形態において、この組成物は、製薬上許容可能な賦形剤及び本発明の第２の態様のＤＮＡベクターを含む。またこの組成物はアジュバントも含み得る。
【００２４】
他の態様において、本発明は、医薬組成物の作製方法を提供し、該方法は、野生型ヒョウヒダニのヌクレオチド配列のコドン使用頻度パターンを改変するか、またはポリヌクレオチド配列を合成により生成して、高レベルで発現される哺乳動物遺伝子に典型的なコドン使用頻度パターンを有し且つ野生型ヒョウヒダニのアミノ酸配列又はその野生型配列にそのポリペプチドの１つ以上の天然の機能を不活化するのに十分なアミノ酸の変更を加えた突然変異型ヒョウヒダニアミノ酸配列をコードする配列を生成する工程を含む。この方法は更に、哺乳動物宿主細胞における合成ポリヌクレオチド配列の発現、発現された組換えタンパク質の精製、及び製薬上許容可能な賦形剤を用いた製剤化を含む。製薬上許容可能な賦形剤としてアジュバントを含む場合、ワクチンの調製方法が提供される。アジュバントは、当分野において周知である（Ｖａｃｃｉｎｅ Ｄｅｓｉｇｎ − Ｔｈｅ Ｓｕｂｕｎｉｔ ａｎｄ Ａｄｊｕｖａｎｔ Ａｐｐｒｏａｃｈ， １９９５， Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， 第６巻， Ｐｏｗｅｌｌ， Ｍ．Ｆ．及びＮｅｗｍａｎ， Ｍ．Ｊ．編， Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ａｎｄ Ｌｏｎｄｏｎ， ＩＳＢＮ ０−３０６−４４８６７−Ｘ）。
【００２５】
哺乳動物（ヒトを含む）のコドン使用頻度パターンは文献に記載されている（例えばＮａｋａｍｕｒａら， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １９９６， ２４：２１４−２１５を参照されたい）。
【００２６】
本発明のポリヌクレオチドは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｉｎ ｖｉｖｏ又はｅｘ ｖｉｖｏで発現し得るコードされたタンパク質の発現による産生において有用である。従ってこのヌクレオチドは、例えば収量を高めるために組換えタンパク質合成において利用してもよいし、又は実際それ自体を、ＤＮＡワクチン接種技法で用いられる治療薬として用いることもできる。本発明のポリヌクレオチドを、コードされるタンパク質のｉｎ ｖｉｔｒｏもしくはｅｘ ｖｉｖｏ産生で用いる場合、発現すべきポリヌクレオチドを含むように細胞（例えば細胞培養物）を改変する。このような細胞には、一過性のまたは好ましくは安定な哺乳動物細胞系が含まれる。本発明のポリペプチドをコードするベクターの挿入により改変しうる細胞の具体的な例には、哺乳動物ＨＥＫ２９３Ｔ、ＣＨＯ、ＨｅＬａ、２９３及びＣＯＳ細胞が含まれる。好ましくは、選択される細胞系は、安定であるだけでなく、ポリペプチドの成熟グルコシル化及び細胞表面発現をも可能とする細胞系である。発現は、形質転換された卵母細胞中で行われる。ポリペプチドは、トランスジェニック非ヒト動物（好ましくはマウス）の細胞内で本発明のポリヌクレオチドから発現され得る。本発明のポリヌクレオチドからポリペプチドを発現するトランスジェニック非ヒト動物は、本発明の範囲内に含まれる。
【００２７】
本発明のポリヌクレオチドが治療薬として（例えばＤＮＡワクチン接種において）用いられる場合、核酸はワクチン接種しようとする哺乳動物（例えばヒト等）に投与される。ＲＮＡやＤＮＡ等の核酸（好ましくはＤＮＡ）は、哺乳動物の細胞内で発現され得るベクターの形態（例えば上記に記載されたもの等）で提供される。ポリヌクレオチドは、任意の利用可能な技法によって投与することができる。例えば、核酸は、注射針によって好ましくは皮内、皮下又は筋肉内に導入することができる。或いは、核酸は、核酸送達装置（例えば粒子を媒体としたＤＮＡ送達（ＰＭＤＤ）等）を用いて皮膚内に直接送達してもよい。この方法では、不活性粒子（例えば金ビーズ等）を核酸でコーティングし、例えば発射装置から高圧力下で放出することにより、これらの粒子が受容者の表面（例えば皮膚）を貫通することができるように十分な速度に加速させる。（本発明の核酸分子でコーティングされた粒子及びこのような粒子を装填した送達装置は、本発明の範囲内に含まれる）。
【００２８】
裸の（ｎａｋｅｄ）ポリヌクレオチドまたはベクターを患者の体内に導入するのに適した技法としては、適当なビヒクルを用いた局所塗布が挙げられる。核酸は、皮膚に、又は粘膜表面に（例えば鼻腔内、口腔内、膣内又は直腸内投与によって）局所投与することができる。裸のポリヌクレオチド又はベクターは、製薬上許容可能な賦形剤（例えばリン酸緩衝化生理食塩水ＰＢＳなど）と共に存在させてもよい。ブピバカインなどの促進剤を別途用いることによって又はＤＮＡ製剤に配合することによって、ＤＮＡの取込みを更に促進することができる。受容者に核酸を直接投与するための他の方法としては、超音波、電気刺激、エレクトロポレーション及びミクロシーディング（ｍｉｃｒｏｓｅｅｄｉｎｇ）（米国特許第５，６９７，９０１号に記載）が挙げられる。
【００２９】
核酸構築物の取込みは、幾つかの公知のトランスフェクション技法（例えばトランスフェクション試薬を使用するものを含む）によって向上させることができる。これらのトランスフェクション試薬の例としては、カチオン性試薬（例えばリン酸カルシウム及びＤＥＡＥ−デキストラン等）、並びにリポフェクション試薬（リポフェクタント）（例えばリポフェクタム及びトランスフェクタム）が挙げられる。核酸の投与量は、変更することができる。核酸は、粒子を媒体とした遺伝子送達の場合は典型的には１ｐｇ〜１ｍｇ、好ましくは１ｐｇ〜１０μｇの量で投与され、他の経路で投与する場合は１０μｇ〜１ｍｇの量で投与される。
【００３０】
本発明の核酸配列は、遺伝子治療で有用な専用送達ベクターを用いて投与することもできる。遺伝子治療の手法は、例えばＶｅｒｍｅら， Ｎａｔｕｒｅ １９９７， ３８９： ２３９−２４２に記載されている。ウイルスベクター系及び非ウイルスベクター系のいずれを用いることもできる。ウイルスに基づく系としては、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、カナリア痘ウイルス及びワクシニアウイルスに基づく系が挙げられる。ウイルスに基づかない系としては、核酸の直接投与、微小球カプセル化技術（ポリ乳酸グリコール酸共重合体）及びリポソームに基づく系が挙げられる。一回目のワクチン接種後に追加免疫注射を行うことが望ましい場合、ウイルス送達系及び非ウイルス送達系を組み合せてもよい（例えばプラスミドなどの非ウイルスベクターを用いた一回目の「初回抗原刺激」ＤＮＡワクチン接種の後にウイルスベクターもしくはウイルスに基づかない系を用いた１回以上の「追加免疫」ワクチン接種を行う等）。
【００３１】
本発明の核酸配列は、形質転換細胞によって投与することもできる。このような細胞としては、被験者から採取した細胞が挙げられる。本発明の裸のポリヌクレオチド又はベクターをこのような細胞の中にｉｎ ｖｉｔｒｏで導入した後、その形質転換細胞を被験者の体内に戻すことができる。本発明のポリヌクレオチドは、相同性組換えによって細胞内に既に存在する核酸の中に組み込むことができる。形質転換細胞は、所望により、ｉｎ ｖｉｔｒｏで増殖させて、得られた細胞の１つ以上を本発明で用いることができる。細胞は、既知の外科的技法又は顕微手術技法（例えば移植（埋込）、マイクロインジェクション法等）によって患者の体内の適当な部位に提供することができる。
【００３２】
本発明の医薬組成物は、アジュバント化合物、又はＤＮＡによりコードされるタンパク質により誘導される免疫反応を強化することができる他の物質を含んでもよい。これらは、抗原とは別にまたは抗原との融合体としてＤＮＡによりコードされるものであってもよいし、その製剤の非ＤＮＡ成分として含まれても良い。本発明の製剤中に含まれ得るアジュバント型物質の例としては、ユビキチン、リソソーム結合膜タンパク質（ＬＡＭＰ）、Ｂ型肝炎ウイルスのコア抗原、ＦＬＴ３−リガンド（特殊な抗原提示細胞（特に樹状細胞等）の生成において重要なサイトカイン）並びにＩＦＮ−γ及びＧＭＣＳＦなどの他のサイトカインが挙げられる。
【００３３】
本発明の方法に従ってコドンを最適化することができる他のダニアレルゲンの例としては、ＤｅｒＦ３及びＤＰ１５が挙げられる。ＤｅｒＦ３は、コナヒョウヒダニに由来するセリンプロテアーゼ（受託番号Ｄ６３８５８ＮＩＤ／ｇ１３１１４５６）である。ＤＰ１５は、ヤケヒョウヒダニに由来する主要なアレルゲンｐＤｐ１５＝グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ相同体（受託番号Ｓ７５２８６／ｇ８０７１３７）である。
【００３４】
ＤｅｒＦ３及びＤＰ１５のコドン使用頻度パターンを以下の表に表す。
【００３５】
【表４】
2004503235.tif 000007
2004503235.tif 000008
太字で表した数値は、統計学的に有意な数値である（コドンが最適化されていないアミノ酸である）。
【００３６】
最適化された遺伝子は、Ｒ．Ｓ． Ｈａｌｅ及びＧ Ｔｈｏｍｐｓｏｎ（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ， 第１２巻， ｐｐ．１８５−１８８（１９９８））により記載されたカルクジーン（Ｃａｌｃｇｅｎｅ）と呼ばれるビジュアル・ベーシック・プログラム（Ｖｉｓｕａｌ Ｂａｓｉｃ Ｐｒｏｇｒａｍ）を用いて設計することができる。元の配列の中の各アミノ酸残基毎に、高レベルで発現される哺乳動物又はヒトの遺伝子において現れる確率に基づいてコドンを割り当てた。マイクロソフトのウィンドウズ３．１環境下で動作するこのプログラムの詳細は、上記著者らから得ることができる。この文献では、その遺伝子の効率的な発現を損ないかねない稀なコドンがまとまって形成されたクラスターが生じる可能性を回避するために、一定の稀なコドンを最適化プロセスから除いた。従って本発明に関して、当業者は、最適化された遺伝子の中に稀なコドンからなるクラスターが存在しないことを確かめるためにそのポリヌクレオチド配列を目でチェックしてもよいし、或いは、最適化プロセスから１つ以上の稀なコドンを除外してもよい。
【００３７】
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９． Ｃｈａｐｍａｎら， Ｉｎｔ Ａｒｃｈ Ａｌｌｅｒｇｙ Ｉｍｍｕｎｏｌ １９９７；１１３：１０２−１０４
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１２． Ｓｃｏｂｉｅら， Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｓｏｃ Ｔｒａｎｓ １９９４； ２２：４４８Ｓ
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３１． Ｍｉｔａら， Ｃｌｉｎ Ｅｘｐ Ａｌｌｅｒｇｙ ２０００；３０：１５８２−１５９０
【００３８】
本発明を例示するが、本発明は以下の実施例に限定されない。
【００３９】
実施例１：ＣＯＳ細胞及びＣＨＯ細胞におけるＲｅｃＰｒｏＤｅｒ Ｐ１の発現
ＰｒｏＤｅｒ ｐ１合成遺伝子の構築
１４個の部分的に重複するオリゴヌクレオチドのセットを用いて、「ヒト化」ＰｒｏＤｅｒ ｐ１遺伝子を合成した。これらのプライマーは、高レベルで発現されるヒト遺伝子のコドン使用頻度に基づいて設計し、３９４ ＤＮＡ／ＲＮＡ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ合成装置によって生成した。縮重してコードされるアミノ酸を、最も優勢である（ｐｒｅｖａｌｅｎｔ）コドンによってコードするようにしたのではなく、個々のコドンの頻度を考慮に入れてコードした。例えば、ヒスチジン残基はＣＡＣ又はＣＡＴによりコードされ、高レベルで発現されるヒト遺伝子においてこれらのコドンはそれぞれ７９％及び２１％の頻度で現れる。従って、本発明者らは、合成ＰｒｏＤｅｒ ｐ１において各ヒスチジン残基についてＣＡＣコドンのみを選択するのではなく、同じコドン頻度となるように試みた。天然Ｄｅｒ ｐ１シグナル配列を、効率の高いＶＺＶ糖蛋白Ｅ（ｇＥ）のリーダーペプチドと交換して、分泌し易くした。オリゴヌクレオチドは以下のものを使用した。
【００４０】
2004503235.tif 000009
2004503235.tif 000010
【００４１】
ＰＣＲ反応で合成ＰｒｏＤｅｒ ｐ１遺伝子を増幅させるために、これらのオリゴヌクレオチドを一緒にインキュベートした。典型的には、高忠実度（ＨｉＦｉ）ポリメラーゼ（ベーリンガー社）を用いて以下の条件でＰＣＲを行った：３０サイクル、９４℃にて３０秒間変性、５０℃にて３０秒間アニーリング、及び７２℃にて３０秒間伸長。こうして生成された産物を、３’及び５’末端プライマー（オリゴ１及び１４）を同じ条件で用いて増幅した。得られた１０８０ｂｐの断片をｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯクローニングベクター（インビトロゲン社）中にクローニングした。得られたプラスミドｐＮＩＶ４８４５を用いて大腸菌ＴＯＰ１０株（インビトロゲン社）を形質転換した。
【００４２】
天然遺伝子及びコドン最適化遺伝子の配列を、それらによりコードされるアミノ酸配列と一緒に、以下に記載する（それぞれ配列番号１５、１６及び１７）。これらの配列は全長ＰｒｏＤｅｒ Ｐ１をコードし、下線を付した核酸又はアミノ酸は、Ｐｒｏ領域の切断により得られる成熟ＤｅｒＰ１配列の開始地点を表す。
【００４３】
2004503235.tif 000011
2004503235.tif 000012
2004503235.tif 000013
2004503235.tif 000014
【００４４】
ヒト化ＰｒｏＤｅｒ ｐ１発現ベクターの構築
８個の細菌クローンの配列決定を行ったところ、合成ＰｒｏＤｅｒ ｐ１遺伝子の中に幾つかの突然変異が見られたので、ｐＮＩＶ４８４５を担持する細菌クローンに由来する４つのＰｒｏＤｅｒ ｐ１ ＤＮＡ断片から出発して、安定な発現のためのプラスミドを作製した。クローンｎ°５およびｎ°２０をそれぞれＨｉｎｄＩＩＩ−ＢｓｓＨＩＩ及びＳｐｈＩ−ＢｇｌＩＩにより二重消化して、２２８ｂｐのＨｉｎｄＩＩＩ−ＢｓｓＨＩＩ及び２７２ｂｐのＳｐｈＩ−ＢｇｌＩＩ ＰｒｏＤｅｒ ｐ１ ＤＮＡ断片を単離した。クローンｎ°７をＢｓｓＨＩＩ−ＳｐｈＩ及びＢｇｌＩＩ−ＸｂａＩで制限処理して２３９ｂｐのＢｓｓＨＩＩ−ＳｐｈＩ及び３２９ｂｐのＢｇｌＩＩ−ＸｂａＩ ＰｒｏＤｅｒ ｐ１ ＤＮＡ断片を作製した。これらの断片を、ＨｉｎｄＩＩＩ−ＸｂａＩで切断したｐＥＥ１４発現ベクター（Ｃｅｌｌｔｅｃｈ）［１６］中に挿入して、最終的なプラスミドｐＮＩＶ４８４６を作製した。ＤＮＡ配列決定によって正しい組換え体を確認した。
【００４５】
ｒｅｃＰｒｏＤｅｒ ｐ１を産生する安定ＣＨＯ−Ｋ１系の一過性トランスフェクション及び選択
ｒｅｃＰｒｏＤｅｒ ｐ１の発現レベルを測定するために、リン酸カルシウム共沈殿法により、１０μｇのｐＮＩＶ４８４６又はｐＮＩＶ４８５３（原物に忠実な（ａｕｔｈｅｎｔｉｃ）ＰｒｏＤｅｒ ｐ１遺伝子を担持するプラスミド）でＣＯＳ細胞（ＡＴＣＣ）を一過性のトランスフェクションにかけた。安定なｒｅｃＰｒｏＤｅｒ ｐ１発現のために、リポフェクションによりｐＮＩＶ４８４６プラスミドでＣＨＯ−Ｋ１細胞（ＡＴＣＣ）をトランスフェクトした。２５μＭメチオニルスルホキシミン（ＭＳＸ、シグマ社）選択を３週間行った後、１００μＭ ＭＳＸを用いて遺伝子増幅を１回行った。
【００４６】
ＣＨＯ細胞における組換えアレルゲンの発現
産生効率の高い組換えＣＨＯ−Ｋ１クローンを、２％ウシ胎児血清（ギブコ社）を添加したＧＭＥＭ培地（インビトロゲン社）中で細胞工場（ｃｅｌｌ ｆａｃｔｏｒｙ）のいて培養した。培養に使われた培地を７２時間経過毎に回収し、精製するまで−２０℃で保存した。
【００４７】
天然のダニ菌体抽出物からの天然Ｄｅｒ ｐ１の精製
以前に記載されたように［１３］、ダニ菌体培養物から天然Ｄｅｒ ｐ１を精製した。簡単に説明すると、ヤケヒョウヒダニ抽出物を６０％飽和となるまで（ＮＨ４）２ＳＯ４沈降法にかけた。沈殿物を、超音波遠心分離により回収し、１Ｍの（ＮＨ４）２ＳＯ４を含むＰＢＳ中に再懸濁したものを、１Ｍの（ＮＨ４）２ＳＯ４を含むＰＢＳ で平衡化したリソースフェニルカラム（Ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｐｈｅｎｙｌ ｃｏｌｕｍｎ）（ファルマシア社）にアプライした。カラムから水でＤｅｒ ｐ１を溶出した。Ｄｅｒ ｐ１富化画分のｐＨ及び伝導率を調節した後、このプールを、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ９で平衡化したＱセファロース・ファストフローカラム（ｆａｓｔ ｆｌｏｗ ｃｏｌｕｍｎ）（ファルマシア社）にアプライした。開始バッファー中に２００ｍＭ ＮａＣｌを入れた溶液を加えて、Ｄｅｒ ｐ１を溶出した。Ｄｅｒ ｐ１の精製は、ＰＢＳ ｐＨ７．３で平衡化したスーパーデックス（ｓｕｐｅｒｄｅｘ）−７５カラム（ファルマシア社）でのゲル濾過クロマトグラフィーにより行った。精製したＤｅｒ ｐ１を濃縮し、−２０℃にて保存した。
【００４８】
ＣＨＯの培養に使われた培地からのｒｅｃＰｒｏＤｅｒ ｐ１の精製
ＣＨＯの培養に使われた培地を水で２倍に希釈し、ｐＨを７．２に調節した。修正した上清を、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．２で平衡化したＱセファロース・ファストフローカラム（５×１０ｃｍ、ファルマシア社）（同じバッファーで調整したヒドロキシアパタイトカラム（２．６×１５ｃｍ、バイオ・ラド社）に連結されている）にアプライした。両方のカラムのｒｅｃＰｒｏＤｅｒ ｐ１を含む流出画分をｐＨ９に調節し、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ９で平衡化したＱセファロース・ファストフローカラム（１．６×１０ｃｍ）にアプライした。カラムを開始バッファー及び同バッファーに１００ｍＭ ＮａＣｌを添加したもので洗浄した。ＰｒｏＤｅｒ ｐ１を、ＮａＣｌの一次勾配（１００〜３００ｍＭ， １５カラム体積）で溶出した。ｒｅｃＰｒｏＤｅｒ ｐ１富化画分をプールし、フィルトロン膜（Ｏｍｅｇａシリーズ、カットオフ：１０ｋＤ）で限外濾過により濃縮した。ｒｅｃＰｒｏＤｅｒ ｐ１の精製は、ＰＢＳ ｐＨ７．３で平衡化したスーパーデックス−７５カラム（１×３０ｃｍ、ファルマシア社）でのゲル濾過クロマトグラフィーにより行った。精製したｒｅｃＰｒｏＤｅｒ ｐ１を濃縮し、−２０℃にて保存した。
【００４９】
ＳＤＳ ＰＡＧＥ及びウェスタンブロット分析
１２．５％ポリアクリルアミドゲル上でのＳＤＳ−ＰＡＧＥによりタンパク質を分析した。電気泳動後、半乾式トランスブロットシステム（バイオ・ラド社）を用いてタンパク質をニトロセルロース膜に移した。膜は、ＴＢＳ−Ｔ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ ｐＨ７．５， １５０ｍＭ ＮａＣｌ， ０．１％ Ｔｗｅｅｎ ８０）中に０．５％インスタゲル（Ｉｎｓｔａｇｅｌ）（ＰＢゼラチン）で３０分間飽和させ、ブロッキング溶液で希釈したＤｅｒ ｐ１ペプチド（２４５〜２６７）に対するウサギポリクローナル血清（１：５０００）（フランスのパスツール研究所（Ｉｎｓｔｉｔｕｔ Ｐａｓｔｅｕｒ ｄｅ Ｌｉｌｌｅ）のペステル博士（Ｄｒ． Ｐｅｓｔｅｌ）により提供）と共にインキュベートした［１７］。アルカリホスファターゼを結合させたヤギ抗ウサギ抗体（プロメガ社、１：７５００）及び５−ブロモ，４−クロロ， ３−インドリルホスフェート（ＢＣＩＰ、ベーリンガー社）／ニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ、シグマ社）を基質として用いて、免疫反応性物質を検出した。
【００５０】
グリカン分析
以下に挙げるレクチンを用い、グリカン識別キット（Ｇｌｙｃａｎ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｉａｔｉｏｎ Ｋｉｔ）（ベーリンガー社）を用いて炭水化物分析を行った：スノードロップ（Ｇａｌａｎｔｈｕｓ ｎｉｖａｌｉｓ）凝集素（ＧＮＡ）、セイヨウニワトコ（Ｓａｍｂｕｃｕｓ ｎｉｇｒａ）凝集素（ＳＮＡ）、イヌエンジェ（Ｍａａｃｋｉａ ａｍｕｒｅｎｓｉｓ）凝集素（ＭＡＡ）、落花生凝集素（ＰＮＡ）及びヨウシュチョウセンアサガオ（Ｄａｔｕｒａ ｓｔｒａｍｏｎｉｕｍ）凝集素（ＤＳＡ）。簡単にまとめると、精製したタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥからニトロセルロース膜に移した。膜を、ジゴキシゲニンに結合させた種々のレクチンと一緒にインキュベートした。アルカリホスファターゼに結合させた抗ジゴキシゲニン抗体を用いて複合体を検出した。
【００５１】
酵素アッセイ
１ｍＭ ＥＤＴＡ及び２０ｍＭ Ｌ−システインを含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７中で、２５℃にて全量１ｍｌで酵素アッセイを行った。Ｃｂｚ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−７−アミノ−４−メチルクマリン（Ｃｂｚ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−ＡＭＣ）及びＢｏｃ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ａｒｇ−７−アミノ−４−メチルクマリン（Ｂｏｃ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ａｒｇ−ＡＭＣ）（シグマ社）（いずれの基質も最終濃度は１００μＭ）の加水分解を、ＳＬＭ８０００分光蛍光計を用いてλｅｘ＝３８０ｎｍ及びλｅｍ＝４６０ｎｍでモニターした。システイン活性化アレルゲンを最終濃度が１００ｎＭとなるように加えることにより、アッセイを開始した。アッセイの前に、精製したＤｅｒｐ１又はｒｅｃＰｒｏＤｅｒ ｐ１を、アプロチニン−アガロース樹脂とｐ−アミノベンズアミジン−アガロース樹脂との混合物（シグマ社）と一緒にインキュベートして、セリンプロテアーゼ活性の推定される微量活性をすべて除去した。
【００５２】
タンパク質測定
標準としてウシ血清アルブミンを用いたビシンコニニン酸手法（ＭｉｒｃｏＢＣＡ、Ｐｉｅｒｃｅ）により、総タンパク質濃度を測定した。
【００５３】
Ｄｅｒ ｐ１ ＥＬＩＳＡ
ＥＬＩＳＡキットで、Ｄｅｒ ｐ１特異的モノクローナル抗体５Ｈ８及び４Ｃ１（インドア・バイオテクノロジーズ社（Ｉｎｄｏｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ））を用いて、Ｄｅｒ ｐ１又はｒｅｃＰｒｏＤｅｒ ｐ１を検出した。アッセイにおいて、Ｄｅｒ ｐ１標準物（ＵＶＡ９３／０３）は、濃度２．５μｇ／ｍｌで用いた。
【００５４】
ＩｇＥ−結合活性
イムノプレートをＤｅｒ ｐ１又はｒｅｃＰｒｏＤｅｒ ｐ１（５００ｎｇ／ウェル）で４℃にて一晩かけてコーティングした。次にプレートをウェルあたり１００μｌのＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎバッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．５， １５０ｍＭ ＮａＣｌ， ０．１％ Ｔｗｅｅｎ ８０）で５回洗浄し、同バッファーに１％ＢＳＡ（シグマ社）を加えたもの１５０μｌで３７℃にて１時間飽和させた。次に、ヤケヒョウヒダニに対するアレルギー患者から得た血清を８倍希釈したものを、３７℃にて１時間インキュベートした。実験で用いた９５個の血清のうち、１６個の血清の特異的抗ヤケヒョウヒダニＩｇＥ値（ＲＡＳＴアッセイ）は５８．１ｋＵ／Ｌ〜９９ｋＵ／Ｌであり、７９個は１００ｋＵ／Ｌのカットオフ上限値を超えていた。プレートをＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎバッファーで５回洗浄し、マウス抗−ヒトＩｇＥ抗体（サザンバイオテクノロジー・アソシエーツ社（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ））及びアルカリホスファターゼに結合させたヤギ抗−マウスＩｇＧ抗体（ＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎバッファー中で１／７５００に希釈、プロメガ社）と一緒にインキュベートした後に、アレルゲン−ＩｇＥ複合体を検出した。ジエタノールアミンバッファー（ｐＨ９．８）に溶解したｐ−ニトロフェニルホスフェート基質（シグマ社）を用いて酵素活性を測定した。バイオラド・ナバパスＥＬＩＳＡリーダー（Ｂｉｏｒａｄ Ｎｏｖａｐａｔｈ ＥＬＩＳＡ ｒｅａｄｅｒ）で、ＯＤ４１０ｎｍを測定した。
【００５５】
ＩｇＥ阻害アッセイ用に、同じ濃度（０．１２μＭ）のＤｅｒ ｐ１又はｒｅｃＰｒｏＤｅｒ ｐ１でプレートをコーティングした。アレルギー患者（ＲＡＳＴ値＞１００ｋＵ／Ｌ）から得た２０個のヒト血清からなるプールを、様々な濃度（３．６〜０．００２μＭ）のＤｅｒ ｐ１又はｒｅｃＰｒｏＤｅｒ ｐ１（インヒビターとして）と一緒に４℃にて一晩予めインキュベートしておき、ＥＬＩＳＡプレートに加えた。ＩｇＥ結合は上述したように検出した。
【００５６】
ヒスタミン放出
アレルギードナーの末梢ヘパリン添加血から得た白血球を用いて、ヒスタミン−ＥＬＩＳＡキット（イムノテック社（Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈ））により、ヒスタミン放出について分析した。好塩基球をｒｅｃＰｒｏＤｅｒ ｐ１又はＤｅｒ ｐ１の連続希釈液と一緒に３７℃にて３０分間インキュベートした。界面活性剤ＩＧＥＰＡＬ ＣＡ−６３０（シグマ社）で細胞を破壊した後に、好塩基球中のヒスタミンの合計量を定量した。
【００５７】
［結果］
ヒト化ＰｒｏＤｅｒ ｐ１遺伝子の合成
ＰｒｏＤｅｒ ｐ１遺伝子のコドン優勢率（ｃｏｄｏｎ ｐｒｅｖａｌｅｎｃｅ）は、高レベルで発現されるヒト遺伝子で使用されるものに比べて大きな多様性を示した（図１）。従って、哺乳動物細胞中でのアレルゲンの発現を最適化するための合成ＰｒｏＤｅｒ ｐ１遺伝子を構築するために、オリゴヌクレオチドを設計した。図１に示すように、合成ＰｒｏＤｅｒ ｐ１遺伝子における最終コドン頻度は、高レベルで発現される哺乳動物遺伝子で使用されるものと非常に類似していた。
【００５８】
相互にプライミングするオリゴヌクレオチドから合成ＰｒｏＤｅｒ ｐ１をアセンブルした後、これをＰＣＲにより増幅した（図２）。ＰＣＲを一回行った後、増幅産物は、３０００〜３００ｂｐの分子量を示した。次に、ＶＺＶ ｇＥリーダーペプチドの５’末端に相補的なプライマー及び合成ＰｒｏＤｅｒ ｐ１遺伝子の３’末端に相補的なプライマーを用いて増幅を行ったところ、予想サイズ１０７２ｂｐの断片が得られた。増幅断片をｐＣＲＩＩクローニングベクターにクローニングした。組換えクローンの配列分析により、合成ＰｒｏＤｅｒ ｐ１遺伝子の中の点突然変異及び欠失の存在が明らかとなった。最後に、３つの独立した細菌クローンから単離した４つの異なる断片をライゲートした後に、正しいコードカセットを得、これを哺乳動物発現ベクターｐＥＥ１４中に挿入して、最終的なプラスミドｐＮＩＶ４８４６を得た。
【００５９】
ｒｅｃ ＰｒｏＤｅｒ ｐ１の一過性発現及び安定発現
合成ＰｒｏＤｅｒ ｐ１構築物の発現効率を元の配列の発現効率と比較するために、ＣＯＳ細胞を、ｐＮＩＶ４８４６及びｐＮＩＶ４８５３（原物に忠実なＰｒｏＤｅｒ ｐ１ ｃＤＮＡを担持するｐＥＥ１４−由来プラスミド）でトランスフェクトした。上清のｒｅｃＰｒｏＤｅｒ ｐ１発現レベルを、２つの抗Ｄｅｒ ｐ１モノクローナル抗体を用いて、ＥＬＩＳＡアッセイにより評価した。図３に示すように、合成ｃＤＮＡを担持する発現ベクターは、原物に忠実な遺伝子を含む同じベクターよりも効率良く、ｒｅｃＰｒｏＤｅｒ ｐ１合成を指令した。ヒト化ＰｒｏＤｅｒ ｐ１遺伝子の発現レベルは、最大４５０ｎｇ／ｍｌ／７２時間まで強化された（基準構築物（７５ｎｇ／ｍｌ／７２時間）に比べて６倍増加）。予想通り、挿入体を含まない対照ベクターでトランスフェクトしたＣＯＳ細胞を用いた場合、ｒｅｃＰｒｏＤｅｒ ｐ１の発現は検出されなかった。
【００６０】
ＣＨＯ−Ｋ１細胞をｐＮＩＶ−４８４６でトランスフェクトし、２５μＭ ＭＳＸに対して耐性を示すクローンを選択した。ｒｅｃＰｒｏＤｅｒ ｐ１レベルをＥＬＩＳＡにより分析したところ、３つの独立クローンが最大１１μｇ／ｍｌ／７２時間ものｒｅｃＰｒｏＤｅｒ ｐ１を分泌したことが分かった。酪酸ナトリウム（培地中の組換えタンパク質の発現レベルを強化すると以前に報告された分子［１８］）を加えても、ｒｅｃＰｒｏＤｅｒ ｐ１の合成に影響はなかった。２５μＭ ＭＳＸ−耐性クローンはさらに最大１００μＭ ＭＳＸまで発現が増加した（培地中のｒｅｃＰｒｏＤｅｒ ｐ１が２６〜３４μｇ／ｍｌ／７２時間で上昇）。細胞工場においてｒｅｃＰｒｏＤｅｒ ｐ１を大量に生産及び精製するために、クローンｎ°１を用いた。培養に使われた培地を７２時間毎に回収した。回収は最多で９回行った。これらの条件において、最も高いｒｅｃＰｒｏＤｅｒ ｐ１発現レベルは、精製前の培地中で１５μｇ／ｍｌ上昇した。
【００６１】
ｒｅｃＰｒｏＤｅｒ ｐ１の精製
ｒｅｃＰｒｏＤｅｒ ｐ１の精製は、陰イオン交換、ヒドロキシアパタイト及びゲル濾過媒体を用いた３つのクロマトグラフィーステップを組み合せて行った。最終精製収量は培地１リットルあたりｒｅｃＰｒｏＤｅｒ ｐ１（約６ｍｇ）であり、回収率は４０％近くであった。ＳＤＳ ＰＡＧＥで、精製されたｒｅｃＰｒｏＤｅｒ ｐ１は３つの免疫反応種として泳動し、そのうち２つの主要なバンドのそれぞれの分子量は４１ｋＤ及び３６ｋＤであり、１つのマイナーバンドは３８ｋＤであった（図４）。天然Ｄｒ ｐ１はＳＤＳ ＰＡＧＥ上を２９ｋＤバンドとして泳動するので、この結果は、発現及び精製ステップ中にはプロペプチド切断（成熟Ｄｅｒ ｐ１ができる）は起こらなかったことを示す。生成物の純度は９０％を超えていた。
【００６２】
ＰｒｏＤｅｒ ｐ１の生化学的特徴
全てのｒｅｃＰｒｏＤｅｒ ｐ１種を、アミノ末端のアミノ酸配列決定にかけた。４１ｋＤａ種及び３８ｋＤａ種のＮ末端配列は全く同じであり、Ａｒｇ１９残基で始まっていた。配列は、Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅとして同定された。これは、Ｄｅｒ ｐ１プロペプチドのＮ末端配列に対応し、このことは、ＶＺＶ ｇＥシグナルペプチドの切断が効率良く進行したことを示す。驚くべきことに、３６ｋＤａバンドのＮ末端配列は、Ａｌａ３８残基で始まっており（得られた配列はＡｌａ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ａｓｐであった）、このことは、３６ｋＤａ分子の場合、プロ配列の内部切断がＴｙｒ３７とＡｌａ３８との間で起こったことを示す。ｒｅｃＰｒｏＤｅｒ ｐ１の炭水化物分析は、幾つかの特異的レクチンを用いたグリカン認識によって行った。用いた５つのレクチンのうち、ＧＮＡレクチンのみが３６ｋＤａ ｒｅｃＰｒｏＤｅｒ ｐ１と反応した。このことは、この分子上に末端マンノース残基が高マンノースＮ−グリカン鎖として又はハイブリッド鎖中の露出したマンノースとして存在することを示す（図５）。３８ｋＤａバンド及び４１ｋＤａバンドはそれぞれＤＳＡレクチン及びＭＡＡレクチンにより認識された。このことは、３８ｋＤａ分子が、Ｎグリカン鎖中にＮ−アセチル−グルコサミンのβ（１−４）に結合した末端ガラクトースを担持していたが、上側のバンドの炭水化物構造はガラクトースのα（２−３）に結合したシアル酸で終わっていたことを示す。以前に記載されたように［１３］、Ｄｅｒ ｐ１はどのレシチンとも結合しなかった。このことは、Ｄｅｒ ｐ１がグルコシル化されていないことを示す。Ｃｂｚ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−ＡＭＣ及びＢｏｃ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ａｒｇ−ＡＭＣを基質として用いて、ｒｅｃＰｒｏＤｅｒ ｐ１の酵素活性を測定した［１９，２０］。予想通り、Ｐｒｏ領域の存在により、ｒｅｃＰｒｏＤｅｒ ｐ１は、本発明者らのアッセイにおいて完全に不活性であった。同じ実験条件において、蛍光原分子は、同じモル濃度で天然Ｄｅｒ ｐ１を用いることにより４分以内に完全に分解された。
【００６３】
ｒｅｃＰｒｏＤｅｒ ｐ１のＩｇＧ−及びＩｇＥ−反応性
組換えアレルゲンが、特異的抗−Ｄｅｒ ｐ１ ＩｇＧ及び抗−ヤケヒョウヒダニＩｇＥに対するＤｅｒ ｐ１の反応性に似た反応性を示すか否かを判定するために、ｒｅｃＰｒｏＤｅｒ ｐ１をＥＬＩＳＡアッセイにてテストした。図６に示すように、等モル濃度のこれら２つのアレルゲンは、２つのＤｅｒ ｐ１特異的モノクローナル抗体及び配座抗体（ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ）に対して同様に反応した。このことは、ｒｅｃＰｒｏＤｅｒ ｐ１が天然アレルゲンの全体的な構造を表したことを示す。ｒｅｃＰｒｏＤｅｒ ｐ１及びＤｅｒ ｐ１のＩｇＥ反応性を、イムノプレートをＤｅｒ ｐ１又はｒｅｃＰｒｏＤｅｒ ｐ１で直接コーティングする直接型ＥＬＩＳＡにおいて比較した。放射免疫吸着試験でヤケヒョウヒダニ抽出物に対して陽性であった９５のヒト血清からなるセットを８倍希釈して使用した。ＩｇＥ力価測定により、これら２つのアレルゲンに対するＩｇＥ反応性の密接な相関が明らかとなった。このことは、ｒｅｃＰｒｏＤｅｒ ｐ１が、Ｄｅｒ ｐ１と非常に良く似たＩｇＥ結合特性（Ｒ２＝０．８１７１， ｐ＜０．０００１）を有することを示す（図７）。
【００６４】
ｒｅｃＰｒｏＤｅｒ ｐ１のヒスタミン放出活性
天然Ｄｅｒ ｐ１及びｒｅｃＰｒｏＤｅｒ ｐ１のアレルゲン性活性を比較するために、１人のアレルギー患者から採取した好塩基球を、様々な濃度のこれら２つのアレルゲンを用いてｉｎ ｖｉｔｒｏでチャレンジし、放出されたヒスタミンを測定した。天然Ｄｅｒ ｐ１は、１ｎｇ／ｍｌの濃度でも好塩基球からのヒスタミン放出を誘導することができた。これに対し、ｒｅｃＰｒｏＤｅｒ ｐ１は、１０００倍高い濃度になってやっとヒスタミンを放出することができた（図８）。この結果から、ｒｅｃＰｒｏＤｅｒ ｐ１は、天然Ｄｅｒ ｐ１に比べてアレルゲン性が低いことが分かった。
【００６５】
実施例２：ピヒア・パストリス酵母（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）におけるＲｅｃＰｒｏＤｅｒＰ１の発現
ＰｒｏＤｅｒ ｐ１発現ベクターの構築
ｐＮＩＶ４８４６から得たＰｒｏＤｅｒ ｐ１コードカセット（最適化された哺乳動物コドン使用頻度を有する全長１〜３０２アミノ酸のＰｒｏＤｅｒ ｐ１ ｃＤＮＡ）を、以下のプライマーを用いたＰＣＲにより増幅した：５’ＡＣＴＧＡＣＡＧＧＣＣＴＣＧＧＣＣＧＡＧＣＴＣＣＡＴＴＡＡ３’（太字はＳｔｕＩ制限部位、フォワード）及び５’ＣＡＧＴＣＡＣＣＴＡＧＧＴＣＴＡＧＡＣＴＣＧＡＧＧＧＧＡＴ３’（太字はＡｖｒＩＩ制限部位、リバース）。増幅断片をｐＣＲ２．１ ＴＯＰＯクローニングベクター中にクローニングした。正しいＰｒｏＤｅｒ ｐ１カセットであることをＤＮＡ配列決定により確認した。組換えＴＯＰＯベクターを、ＳｔｕＩ−ＡｖｒＩＩで消化して９１８ｂｐ断片を得、この断片を、ＳｎａＢＩ−ＡｖｒＩＩで制限処理したｐＰＩＣ９Ｋ発現ベクター中に導入した。得られたプラスミドｐＮＩＶ４８７８は、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓａｅ）のα因子の下流にＰｒｏＤｅｒ ｐ１カセットを含む。
【００６６】
部位特異的突然変異誘発
非グリコシル化ＰｒｏＤｅｒ ｐ１（Ｎ５２Ｑ、成熟Ｄｅｒ ｐ１における位置番号）を作製するための発現プラスミドは、４つのプライマーのセットを用いた重複伸長ＰＣＲによりｐＮＩＶ４８７８から得た。以下のプライマー５’ＧＧＣＴＴＴＣＧＡＡＣＡＣＣＴＴＡＡＧＡＣＣＣＡＧ３’（プライマー１、太字はＡｆｌＩＩ制限部位、フォワード）及び５’ＧＣＴＣＣＣＴＡＧＣＴＡＣＧＴＡ ＴＣＧＧＴＡＡＴＡＧＣ３’（プライマー２、太字はＳｎａＢＩ制限部位、リバース）を用いて、ＰｒｏＤｅｒ ｐ１アミノ酸配列７１〜１７６をコードする３１７ｂｐの断片を増幅した。以下のプライマー５’ＣＣＴＣＧＣＧＴＡＴＣＧＧＣＡＡＣＡＧＡＧＣＣＴＧＧＡＣＣ３’（プライマー３、太字は突然変異Ｎ５２Ｑ、フォワード）及び５’ＧＧＴＣＣＡＧＧＣＴＣＴ ＧＴＴＧＣＣＧＡＴＡＣＧＣＧＡＧＧ３’（プライマー４、太字は突然変異Ｎ５２Ｑ、リバース）を用いて、ＰｒｏＤｅｒ ｐ１配列中に突然変異Ｎ５２Ｑを導入した。
【００６７】
３ステップの手順により、突然変異型３１７ｂｐ ＡｆｌＩＩ−ＳｎａＢＩ断片を作製した。１回目のＰＣＲでは、プライマー１及び４をｐＮＩＶ４８７８と混合しておよそ２００ｂｐの断片を作製した。２回目のＰＣＲでは、プライマー２及び３をｐＮＩＶ４８７８と混合して、およそ１４０ｂｐの断片を作製した。これら２つのＰＣＲ産物をアガロースゲル上で精製し、３回目のＰＣＲの鋳型として用いて、およそ３４０ｂｐの断片を得た。この精製された断片を、ｐＣＲ２．１ ＴＯＰＯベクター中にクローニングした。ＤＮＡ配列決定により、突然変異を確かめた。組換えＴＯＰＯベクターをＡｆｌＩＩ−ＳｎａＢＩで消化して３１７ｂｐの断片を作製し、これを、同様に消化したｐＮＩＶ４８７８中にライゲートした。得られたプラスミドｐＮＩＶ４８８３は、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓａｅ）のα因子の下流にＰｒｏＤｅｒ ｐ１ Ｎ５２Ｑを含む。
【００６８】
第４位、３１位又は６５位（成熟Ｄｅｒ ｐ１における位置番号）にＤｅｒ ｐ１システイン残基の突然変異を担持するＰｒｏＤｅｒ ｐ１の非グリコシル化突然変異体を得るために、プラスミドｐＮＩＶ４８７３、ｐＮＩＶ４８７５及びｐＮＶ４８７４を用いて、同じプライマーセットを用いた重複伸長ＰＣＲを行った。得られたプラスミドｐＮＩＶ４８８４、４８８５及び４８８６はそれぞれ、ＰｒｏＤｅｒ ｐ１のＮ５２Ｑ Ｃ４Ｒ、Ｎ５２Ｑ Ｃ３１Ｒ及びＮ５２Ｑ Ｃ６５Ｒをコードする。
【００６９】
ピヒア・パストリス（Ｐ． ｐａｓｔｏｒｉｓ）の形質転換
スフェロプラスト形質転換法を用いて、ピヒア・パストリス中にプラスミドｐＮＩＶ４８７８を導入した。ヒスチジノール・デスヒドロゲナーゼ（Ｈｉｓ＋）原栄養性の形質転換体を選択した。寒天中のＧ４１８の濃度を増加させた寒天上にクローンを植菌することにより、Ｈｉｓ＋形質転換体のジェネチシン（Ｇ４１８）耐性についてスクリーニングを行った。
【００７０】
組換え酵母によるＰｒｏＤｅｒ ｐ１の産生
ＢＭＧ培地中でＧ４１８耐性クローンをＯＤ６００ｎｍが２〜６になるまで３０℃で増殖させた。遠心分離により細胞を回収し、ＢＭＧ培地１００ｍｌ中にＯＤ６００ｎｍが１になるよう再懸濁した。メタノール０．５％を６日間毎日加えることにより、Ｐｒｏｄｅｒ ｐ１発現を誘導した。遠心分離により上清を回収し、精製するまで−２０℃にて保存した。
【００７１】
酵母培養上清からのＰｒｏＤｅｒ ｐ１の精製
上清を水で１０倍希釈し、ｐＨを９に調節した後、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ９で平衡化したＱセファロースカラムに直接ローディングした。開始バッファーでカラムを洗浄した。バッファー中のＮａＣｌ濃度を段階的に増加させながら、タンパク質溶出を行った。ＰｒｏＤｅｒ ｐ１富化画分をプールし、フィルトロン膜（Ｏｍｅｇａシリーズ、カットオフ：１０ｋＤ）で限外濾過により濃縮した。ＰＢＳ ｐＨ７．３で平衡化したスーパーデックス−７５カラム（１×３０ｃｍ、ファルマシア社）上のゲル濾過クロマトグラフィーにより、ＰｒｏＤｅｒ ｐ１精製を行った。精製したＰｒｏＤｅｒ ｐ１を濃縮し、−２０℃で保存した。驚くべきことに、酵母コドン使用頻度はそのヒトのプロファイルとは大きく異なるという事実を考えあわせると、このヒト化ＰｒｏＤｅｒ Ｐ１は、この系において非常に良好に発現され、タンパク質の収率は高かった。
【００７２】
［検討］
大量のＤｅｒ ｐ１（ヤケヒョウヒダニに由来する主要なアレルゲン）を得られないことは、生化学及び免疫学の研究の発展の大きな障害である。実際に、ダニ菌体培養物は費用効率が良い。天然Ｄｅｒ ｐ１の増殖速度は遅く、精製収率は比較的低く、本発明者らの実験条件において１グラムのダニ菌体培養物から精製されるＤｅｒ ｐ１は約１ｍｇである。さらに、細菌及び酵母中でＤｅｒ ｐ１を発現させる以前の試みは、このアレルゲンが発現レベルが低く、主に不溶性形態で発現されることを示した［１０〜１２］。この研究は、哺乳動物細胞中でのｒｅｃＰｒｏＤｅｒ ｐ１の生成量が非常に低いことを明らかに示しており、このことは、プロ配列の存在がｒｅｃＰｒｏＤｅｒ ｐ１の高レベル発現を誘導するのに十分ではないことを示している。
【００７３】
Ｐｒｏｄｅｒ ｐ１遺伝子のコドン優勢率は、高レベルで発現されるヒト遺伝子で最も頻繁に使用されるものとは異なる。ＣＨＯ細胞中でのｒｅｃＰｒｏＤｅｒ ｐ１発現に適したコドン使用頻度の重要性を評価するために、本発明者らは、哺乳動物において優勢であるコドンに基づいて合成ＰｒｏＤｅｒ ｐ１遺伝子を遺伝子操作することに決めた。その研究結果は、哺乳動物細胞中でのｒｅｃＰｒｏＤｅｒ ｐ１の高レベル発現を誘導するために、コドンの最適化が有益であることを明らかに示している。
【００７４】
まとめると、コドン使用頻度の最適化は、ＣＨＯ細胞中で産生することが難しいアレルゲンであるｒｅｃＰｒｏＤｅｒ ｐ１の高レベル発現を誘導することができる。また、この戦略は、他のアレルゲンの発現に適用することもでき、他の発現系に応用することができるであろう。このように、適切なコドンを有する合成遺伝子は、アレルギー診断及び特定の免疫療法の新しいツールを提供する可能性がある。
【００７５】
特異的ＩｇＥを検出するための診断テストでは、天然Ｄｅｒ ｐ１の代わりに固相に固定化させたｒｅｃＰｒｏＤｅｒ ｐ１を用いることができるであろう。ｒｅｃＰｒｏＤｅｒ ｐ１のアナフィラキシーを誘発する可能性が低下したことを考慮すると、この組換えアレルゲンは将来、免疫療法において一般に使用されているアレルゲン抽出物に代わる代替試薬として使用することができるようになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【図１】
ＰｒｏＤｅｒ ｐ１のコドン使用頻度及び高レベルで発現されるヒト（「高」）遺伝子を示す図である。コドン使用頻度の最適化を行った後の合成ＰｒｏＤｅｒ ｐ１遺伝子（合成）のコドン使用頻度も表される。各対応アミノ酸についての各々のコドンの頻度（％）を表す。最も優勢なコドンは太字で示してある。
【図２】
ＰｒｏＤｅｒ ｐ１ ｃＤＮＡのＰＣＲ合成を示す図である。１４個の相互にプライミングするオリゴヌクレオチドのセットを、合成ＰｒｏＤｅｒ ｐ１ ｃＤＮＡのＰＣＲ増幅に用いた。増幅を一回行った後、得られた増幅産物を、外側のプライマー（プラマー１及び１４）を用いて２回目のＰＣＲ増幅に供した。この合成のＰＣＲ鋳型となったオリゴヌクレオチドを実線の棒で表す。真核生物ｐＥＥ１４発現ベクター中へのクローニングに用いた合成Ｐｒｏｄｅｒ ｐ１ ｃＤＮＡ中へのユニークな制限部位を上に示す。これら２回のＰＣＲ増幅のそれぞれの後に、アガロースゲル上で増幅断片の電気泳動を行った結果も示す。
【図３】
一過性トランスフェクションアッセイにおける合成及び天然のＰｒｏＤｅｒ ｐ１の発現を示す図である。Ｄｅｒ ｐ１ ＥＬＩＳＡにおいて、天然又は合成ＰｒｏＤｅｒ ｐ１をコードするプラスミド（それぞれｐＮＩＶ４８５３及びｐＮＩＶ４８４６）でトランスフェクトしたＣＯＳ細胞から得た上清中に、分泌されたｒｅｃＰｒｏＤｅｒ ｐ１が存在するか否かについて分析した。挿入体を持たないプラスミドでトランスフェクトしたＣＯＳから得た上清を対照として用いた。
【図４】
ｒｅｃＰｒｏＤｅｒ ｐ１の精製を示す図である。精製したアレルゲンをＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析し、クーマシーブルー染色（パネルＡ）、及びＤｅｒ ｐ１ペプチド２４５〜２６７に対するウサギポリクローナル血清を用いたイムノブロット（パネルＢ）によりタンパク質を検出した。レーン１：精製ｒｅｃＰｒｏＤｅｒ ｐ１。レーン２：精製Ｄｅｒ ｐ１。
【図５】
ｒｅｃＰｒｏＤｅｒ ｐ１の炭水化物分析を示す図である。精製したアレルゲンのグリコシル化を、スノードロップ（Ｇａｌａｎｔｈｕｓ ｎｉｖａｌｉｓ）凝集素（ＧＮＡ、レーン１、２）、ヨウシュチョウセナサガオ（Ｄａｔｕｒａ ｓｔｒａｍｏｎｉｕｍ）凝集素（ＤＳＡ、レーン３、４）、及びイヌエンジェ（Ｍａａｃｋｉａ ａｍｕｒｅｎｓｉｓ）凝集素（ＭＡＡ、レーン５、６）を用いたレシチン染色によって分析した。レーン１、３、５：精製Ｄｅｒ ｐ１。レーン２、４、６：精製ｒｅｃＰｒｏＤｅｒ ｐ１。
【図６】
Ｄｅｒ ｐ１に対するモノクローナル抗体によるｒｅｃＰｒｏＤｅｒ ｐ１の免疫認識を示す図である。モノクローナル抗体に対するＤｅｒ ｐ１（●）及びｒｅｃＰｒｏＤｅｒ ｐ１（■）の反応性を、ツーサイトＥＬＩＳＡ（ｔｗｏ−ｓｉｔｅ ＥＬＩＳＡ）で分析した。これら２つのアレルゲンはいずれも、総タンパク質アッセイ（ＭｉｃｒｏＢＣＡ， Ｐｉｅｒｃｅ）で決定した濃度と同じ濃度で用いた。
【図７】
ｒｅｃＰｒｏＤｅｒ ｐ１とＤｅｒ ｐ１のＩｇＥ反応性の相関関係を示す図である。イムノプレートを、精製Ｄｅｒ ｐ１又はｒｅｃＰｒｏＤｅｒ ｐ１（５００ｎｇ／ウェル）でコーティングし、ヤケヒョウヒダニに対して放射線アレルゲン吸着陽性である９５個の血清（８倍希釈したもの）と共にインキュベートした。結合したＩｇＥを、マウス抗ヒトＩｇＥ及びアルカリホスファターゼで標識した抗マウスＩｇＧ抗体と一緒にインキュベートした後に酵素アッセイを行うことにより定量した。結果をＯＤ４１０ｎｍ値で表す。
【図８】
ｒｅｃＰｒｏＤｅｒ ｐ１のヒスタミン放出活性を示す図である。１個体のアレルギードナーの末梢血から単離した好塩基球を、天然Ｄｅｒ ｐ１（●）又はｒｅｃＰｒｏＤｅｒ ｐ１（■）の連続希釈液で刺激した。細胞から放出されたヒスタミンをＥＬＩＳＡにより測定した。好塩基球中のヒスタミンの合計量を、界面活性剤ＩＧＥＰＡＬ ＣＡ−６３０で細胞破壊した後に定量した。結果を、ヒスタミンの合計量に対するアレルゲンにより放出されたヒスタミンの比率で表す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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2004503235.tif 000071
2004503235.tif 000072