(57)【要約】本開示は、ポリペプチドの配列決定を行うのに有用である方法及びキットを提供する。前記方法は、ポリペプチド又はそのペプチドのＮ末端の誘導体化を含む。前記方法はまた、リジンを含有するポリペプチド又はそのペプチドの側鎖のイプシロンアミノ基を誘導体化することも含む。１つ以上の誘導体化された検体の質量スペクトル分析によって、当業者に周知の技術を介して容易に解釈されるスペクトルが提供される。本開示はまた、前記方法の便利な性能を強化するキットも記載する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリペプチドのアミノ酸配列を決定する方法であって、前記ポリペプチドの１つ以上のペプチドはリジンを含有し、
（ａ）前記リジン含有ペプチド上のリジンのイプシロンアミノ基をグアニン又はその他の強塩基性基、固定された陽イオン荷電の基、又は同位体で標識された基に変換すること、
（ｂ）前記ポリペプチド又はペプチドとカップリングするとき、約２未満のｐＫａを有する１つ以上の酸性部分で前記ポリペプチドのＮ末端又は前記ポリペプチドの１つ以上のペプチドのＮ末端を誘導体化し、１つ以上の誘導体化された検体を提供すること、
（ｃ）質量分析技術を用いて１つ以上の誘導体化された検体を分析し、フラグメンテーションパターンを提供すること、及び
（ｄ）フラグメンテーションパターンを解明すること、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
前記フラグメンテーションパターンが実質的にａ−イオン及びｂ−イオンを含まないことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記質量分析技術が、インソースフラグメンテーション後のＭＡＬＤＩ　ＰＳＤ質量分析法、エレクトロスプレーイオン化タンデム質量分析法、又はエレクトロスプレーイオン化単一段階質量分析法であることを特徴とする、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記質量分析技術が、インソースフラグメンテーション後の陽イオンモードＰＳＤ　ＭＡＬＤＩ、タンデムエレクトロスプレーイオン化質量分析法、又はエレクトロスプレーイオン化単一段階質量分析法であることを特徴とする、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記ポリペプチド又はペプチドとカップリングするとき前記酸性部分が約０未満のｐＫａを有することを特徴とする、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記ポリペプチド又はペプチドと結合するとき前記酸性部分が約−２未満のｐＫａを有することを特徴とする、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記フラグメンテーションパターンの解明が、市販のソフトウエアプログラム又はデータベースを使用することを含むことを特徴とする、請求項４に記載の方法。
【請求項８】
前記ポリペプチドが合成ポリペプチドであることを特徴とする、請求項４に記載の方法。
【請求項９】
前記ポリペプチドの１つ以上のペプチドのＮ末端が誘導体化される、請求項４に記載の方法。
【請求項１０】
前記ポリペプチドのペプチドが消化によって生じることを特徴とする、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記消化が化学的消化であることを特徴とする、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記化学的消化が臭化シアン消化であることを特徴とする、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記消化が酵素消化であることを特徴とする、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
前記酵素消化が、エンドプロテイナーゼＬｙｓＣ消化、エンドプロテイナーゼＡｒｇＣ消化、トリプシン消化、及びキモトリプシン消化からなる群より選択されることを特徴とする、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記酵素消化が、エンドプロテイナーゼＬｙｓＣ消化及びエンドプロテイナーゼＡｒｇＣ消化からなる群より選択されることを特徴とする、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記消化がトリプシン消化であることを特徴とする、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記酸性部分が１つ以上のスルホン酸であることを特徴とする、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記酸性部分が２−スルホアセチル部分であることを特徴とする、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記酸性部分が３−スルホプロピオノイル部分であることを特徴とする、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
前記酸性部分が２−スルホベンゾイル部分であることを特徴とする、請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
前記酸性部分がジスルホン酸誘導体であることを特徴とする、請求項１６に記載の方法。
【請求項２２】
前記リジン含有ペプチド上のリジンのイプシロンアミノ基が（ａ）においてグアニンに変換され、（ａ）におけるグアニジン化反応が、前記リジン含有ペプチド上のリジンのイプシロンアミノ基とＯ−メチルイソ尿素又はその塩との反応を含むことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
有機塩基の存在下で、前記リジン含有ペプチド上のリジンのイプシロンアミノ基がＯ−メチルイソ尿素又はその塩と反応することを特徴とする、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記有機塩基がジイソプロピルエチルアミンであることを特徴とする、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
各混合物が等量のタンパク質を有する少なくとも２つの異なるタンパク質混合物の前記リジンのイプシロンアミノ基が
（ａ）同位体で標識された異なる形態の同一の試薬によって誘導体化され、
（ｂ）前記タンパク質混合物を合わせ、次いで個々のタンパク質を単離及び消化し、
（ｃ）前記２つの混合物における前記リジン含有ペプチドの相対存在量が、同一のペプチド配列を有するが、異なった同位体形態のリジン修飾試薬を有するイオン対の質量分析法から得られる相対存在量から決定され、
（ｄ）任意選択により、前記２つのタンパク質混合物の間で相対濃度が変化しない他のタンパク質由来の修飾ペプチドについて観測された比に対し観測された比を修正することによって、これらの測定の量的精度を改善することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項２６】
ポリペプチドのアミノ酸配列を決定するのに用いるキットであって、前記ポリペプチドの１つ以上のペプチドはリジンを含有し、
（ａ）前記リジン含有ペプチド上のリジンのイプシロンアミノ基をグアニン又はその他の塩基性基、又は固定された陽イオンに荷電した基、又は同位体で標識された基に変換するための１つ以上の化学試薬、
（ｂ）前記リジン含有ペプチド上のリジンのイプシロンアミノ基を前記化学試薬によってグアニン又はその他の塩基性基、又は固定された陽イオンに荷電した基、又は同位体で標識された基に変換するための手段、
（ｃ）前記ポリペプチド又は前記ポリペプチドの１つ以上のペプチドとカップリングするとき、約２未満のｐＫａを有する１つ以上の酸性部分を提供する１つ以上の酸性部分試薬、及び
（ｄ）１つ以上の酸性部分試薬によって、又はポリペプチドのＮ末端又はポリペプチドの１つ以上のペプチドのＮ末端を誘導体化するための手段、
を含むことを特徴とするキット。
【請求項２７】
前記誘導体化するための手段が１つ以上の格納装置を含むことを特徴とする、請求項２６に記載のキット。
【請求項２８】
前記誘導体化するための手段が少なくとも１つの緩衝系をさらに含む、請求項２７に記載のキット。
【請求項２９】
前記１つ以上の消化助剤をさらに含むことを特徴とする、請求項２８に記載のキット。
【請求項３０】
前記１つ以上の検定用ペプチドをさらに含むことを特徴とする、請求項２８に記載のキット。
【請求項３１】
参照の質量スペクトルデータをさらに含むことを特徴とする、請求項３０に記載のキット。
【請求項３２】
前記酸性部分試薬又は前記リジン修飾試薬が前記格納装置内に存在することを特徴とする、請求項２７に記載のキット。
【請求項３３】
前記酸性部分試薬及び前記リジン修飾試薬の両方が前記格納装置内に存在することを特徴とする、請求項３２に記載のキット。
【請求項３４】
前記酸性部分試薬又は前記リジン修飾試薬が固形の支持体に結合することを特徴とする、請求項３２に記載のキット。
【請求項３５】
前記酸性部分試薬及び前記リジン修飾試薬の両方が固形の支持体に結合することを特徴とする、請求項３３に記載のキット。
【請求項３６】
（ａ）における前記化学試薬がＯ−メチルイソ尿素又はその塩を含むことを特徴とする、請求項２６に記載のキット。
【請求項３７】
（ａ）における前記化学試薬が有機塩基をさらに含むことを特徴とする、請求項３６に記載のキット。
【請求項３８】
前記有機塩基がジイソプロピルエチルアミンを含むことを特徴とする、請求項３７に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（相互参照）
本出願は、２０００年７月２５日出願の米国仮出願第６０／２２０，５６４号の利益を請求するものである。
（発明の分野）
本発明は、質量分析技術を用いてポリペプチドの配列決定を可能にする方法及びキットに関する。前記方法及び前記キットは、例えば、生物学分野、製薬分野、身体洗浄分野、及び布地洗浄分野において使用するための高分子量のポリペプチドを同定するのに特に有用である。
【０００２】
（発明の背景）
高感度のペプチド及びポリペプチドの配列決定に適用するために、最近、マトリクス支援レーザー脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）質量分析法及びエレクトロスプレーイオン化が開発された。例えば、スペングラー（Ｓｐｅｎｇｌｅｒ）らの、「マトリクス支援レーザー脱離質量分析法によるペプチド配列決定」ラピッドコミュニケーションズインマススペクトロメトリー（Ｒａｐｉｄ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）、第６巻の１０５〜１０８ページ（１９９２年）；スペングラー（Ｓｐｅｎｇｌｅｒ）らの「マトリクス支援レーザー脱離質量分析法におけるポストソース崩壊の基本的性状」ジャーナルオブフィジカルケミストリ（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈｙｓｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、第９６巻の９６７８〜９６８４ページ（１９９２年）；コッフマン（Ｋａｕｆｍａｎｎ）らの「マトリクス支援レーザー脱離イオン化を用いた反射飛行時間質量分析計におけるプロダクトイオン分析による線状ペプチドの質量分析配列決定」、ラピッドコミュニケーションズインマススペクトロメトリー、第７巻９０２〜９１０ページ（１９９３年）；コッフマン（Ｋａｕｆｍａｎｎ）らの「飛行時間質量分析計におけるペプチドの配列決定：マトリクス支援レーザー脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）後のポストソース崩壊の評価」、インターナショナルジャーナルオブマスススペクトロメトリー、アンドイオンプロセス（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ ａｎｄ Ｉｏｎ Ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ）、第１３１巻３５５〜３８５ページ（１９９４年）；コッフマン（Ｋａｕｆｍａｎｎ）らの「マトリクス支援レーザー脱離／イオン化反射飛行時間質量分析法におけるポストソース崩壊及び遅延抽出」、ラピッドコミュニケーションズインマススペクトロメトリー第１０巻１１９９〜１２０８ページ（１９９６年）；及びスペングラー（Ｓｐｅｎｇｌｅｒ）の「生体分子のマトリクス支援レーザー脱離／イオン化質量分析法におけるポストソース崩壊の分析」ジャーナルオブマススペクトロメトリー第３２巻１０１９〜１０３６ページ（１９９７年）；カール（Ｃａｒｒ）らの「分析バイオテクノロジーにおける質量分析法の統合」、アナリティカルケミストリ（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）第６３巻２８０２〜２８２４ページ（１９９１年）；イエーツ（Ｙａｔｅｓ）３世らの「ＭＳによるゲノムの採掘」、アナリティカルケミストリ第６８巻５３４Ａ〜５４０Ａページ（１９９６年）；モリス（Ｍｏｒｒｉｓ）らの「新規の四重極／直交加速飛行時間質量分析計における高感度衝突活性化タンデム質量分析法」、ラピッドコミュニケーションズインマススペクトロメトリー第１０巻８８９〜８９６ページ（１９９６年）を参照のこと。
【０００３】
ＭＡＬＤＩは、質量分析法の分野に幾つかの利点を提供している。例えば、ＭＡＬＤＩは、従来のエレクトロスプレー三連四重極型装置よりも高い感度を提供する。飛行時間質量分析計と組み合わせて用いると、ＭＡＬＤＩは、三連四重極型装置で分析することができるペプチドよりも大きな質量のペプチドに適用可能である。ＭＡＬＤＩは、最低限の試料精製を行った複雑な混合物を分析するのにも有用である。一方、エレクトロスプレーイオン化は、液体クロマトグラフィー（ＬＣ）及び種々の型のキャピラリー電気泳動（ＣＥ）を含む強力な分離技法に容易に接続される。ＬＣ及びＣＥを試料の精製及び装置への導入に用いる場合、高度に自動化された分析が可能である。
【０００４】
しかしながら、現在のＭＡＬＤＩ及び、より少ない程度でエレクトロスプレーイオン化質量分析法は、予測可能なタンデム質量分析法のフラグメンテーションパターンを適切に提供することができない。例えば、複数のイオンシリーズ（ａ−イオン、ｂ−イオン、及びｙ−イオンを含む）が通常観測され、その結果、ＭＡＬＤＩのポストソース崩壊スペクトルが生じ、それは、効率的に解釈し、配列決定するには複雑すぎる。エレクトロスプレーイオン化により生じる多様に荷電した前駆体イオンから、複数のイオンシリーズ（ｂ−及びｙ−イオン）に加えて内部フラグメント及び単一に荷電した及び多様に荷電したイオンの両方が形成され、その結果生じるタンデム質量スペクトルは新規で解釈するのは難しいことが多い。従って、フラグメンテーションに関連する問題は、質量分析法を用いてポリペプチドを迅速に配列決定する能力を制限している。その結果、質量分析法、及び特に、ＭＡＬＤＩ質量分析法はこの領域での価値が限定されている。
【０００５】
幾つかの研究グループが、化学的な誘導体化技法を介してポリペプチドの配列決定の分野における質量分析法の有用性を改善しようと試みている。かかる技法は、感度を高め、生じるスペクトルの複雑さを減らすことを目指して、ペプチドのＭＳＭＳスペクトルにおいてフラグメンテーションを促進し、それを方向付けるのに利用されてきた。このような既知の技法のほとんどは、陽イオン系誘導体を提供している。例えば、キッドウエル（Ｋｉｄｗｅｌｌ）らの「二次イオン質量分析法によるペプチドの配列決定」、ジャーナルオブアメリカンケミカルソサエティ（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ）、第１０６巻２２１９〜２２２０ページ（１９８４年）（四級アンモニウム基による誘導体化、静電気ＳＩＭＳイオン化法を用いた分析（ＭＡＬＤＩ及びエレクトロスプレーイオン化の双方が開発される前））を参照のこと。低エネルギー衝突活性化によるＭＡＬＤＩ及びエレクトロスプレーイオン化を用いたかかる技法の適用は、一般に有効であるとは証明されていない。
【０００６】
さらに最近、質量分析法を用いたペプチド／ポリペプチドの配列決定を強化するために、研究者はその他の誘導体化技法を利用している。例えば、トリプシンペプチド（トリプシンによる消化を介して作製したペプチド）に存在するシステイン残基の酸化が、エレクトロスプレータンデム質量分析法を用いたフラグメンテーションを改善する可能性があることが明らかにされている。例えば、ガスケル（Ｇａｓｋｅｌｌ）らの「気相ペプチドイオンの低エネルギー分解におけるプロトン化の部位の役割」、ジャーナルオブザアメリカンソサエティオブマススペクトロメトリー（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）第７巻５２２〜５３１ページ（１９９６年）及びガスケル（Ｇａｓｋｅｌｌ）らの「プロトン化したペプチドの衝突活性化分解におけるシステイン酸酸化に対するシステインの影響：イオン内相互作用の証拠」、ジャーナルオブザアメリカンソサエティオブマススペクトロメトリー第３巻３３７〜３４４ページ（１９９２年）を参照のこと。
【０００７】
具体的には、ｙ−イオンのフラグメンテーションが促進された。しかしながら、この技法は幾つかの制限を有する。例えば、この技法は、ＭＡＬＤＩ法に拡張されなかった。その技法はまた、解析されるべき配列の中に存在するシステイン残基を有するポリペプチドの解析に制限される。実際、天然に生じるポリペプチドにはシステインはむしろ希にしか存在せず、この技法の有用性に重大な制限を与えている。
従って、簡便で、効率的で、そして野生型及び変異型のポリペプチドに広く適用可能である、ポリペプチドの配列決定を行う質量分析法を提供するというニーズがある。本発明者らは本明細書にて質量分析技術を用いた高感度のポリペプチドの配列決定法を提供する。本発明者らは相対的に強い酸基で誘導体化されたポリペプチド及びそのペプチドはほぼ独占的にｙ−イオンのフラグメンテーションを提供し、その結果、新規に解釈し易いスペクトルを生じることを発見した。本発明はまた、本方法を都合よく実行可能にするために用いられるキットにも関する。
【０００８】
（発明の概要）
本発明は、ポリペプチドの配列決定を行うのに特に有用である質量分析方法及びキットに関する。前記方法には、ポリペプチドのアミノ酸配列を決定することが含まれ、その工程は：
（ａ）ポリペプチド又はペプチドとカップリングするとき、約２未満のｐＫａを有する１つ以上の酸性部分でポリペプチドのＮ末端又はポリペプチドの１つ以上のペプチドのＮ末端を誘導体化し、１つ以上の誘導体化された検体を提供すること；
（ｂ）質量分析技術を用いて１つ以上の誘導体化された検体を分析し、フラグメンテーションパターンを提供すること；及び
（ｃ）フラグメンテーションパターンを解釈することを含む。
【０００９】
ポリペプチドの１つ以上のペプチドがリジン残基を有する、本発明のもう１つの実施形態では、リジン側鎖のイプシロンアミノ基が、ホモアルギニンのような極めて強い塩基性の基への変換又は固定された陽イオン基の付加によって修飾される。ポリペプチドの１つ以上の適宜修飾ペプチドが、次いで上記で概略された（ａ）〜（ｃ）の工程に従って配列決定される。
【００１０】
本発明のさらなる実施形態では、同位体で標識されたリジンを修飾する試薬が質量分析法とともに用いられ、複雑な混合物におけるタンパク質のレベルを定量する。例えば、ガイギ（Ｇｙｇｉ）らの「同位体をコード化した親和性タグを用いた複雑なタンパク質の混合物の定量的分析」、ネイチャーバイオテクノロジー（Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）第１７巻９９４〜９９９ページ（１９９９年）を参照のこと。例えば、２つのタンパク質混合物（対照及び実験試料）を別々に修飾する。一方のタンパク質混合物を天然に豊富な同位体の比を有するリジン修飾試薬で標識する。もう一方のタンパク質混合物を同じリジン修飾試薬の重い同位体を濃縮した形態（１つ以上の２Ｈ、１３Ｃ１５Ｎ）で標識する。２つのタンパク質試料を合わせ、分離する（例えば、ゲル電気泳動又はＨＰＬＣを用いて）。続いて、当該タンパク質を適当な手段で消化し、質量分析法により解析する。軽いリジン修飾ペプチドに対する重いリジン修飾ペプチドの実験的に観測される比を用いて、２つの試料のタンパク質の相対的なレベルを正確に定量する。
【００１１】
本発明のキットは、ポリペプチドとカップリングするとき約２未満のｐＫａを有する酸性部分を提供する１つ以上の酸性部分の試薬；及びポリペプチドのＮ末端又はポリペプチドの１つ以上のペプチドのＮ末端を１つ以上の酸性部分試薬で誘導体化するための手段を含む。キットはまた、リジン側鎖のイプシロンアミノ基を誘導体化するための１つ以上の試薬も包含する。本キットは方法の性能と合わせて特に有用である。
【００１２】
（発明の詳細な説明）
本発明の方法及びキットは、例えば、野生型、変異型、及び／又は合成のポリペプチドを含む配列決定を行うのに有用である。前記方法及び前記キットは、例えば、生物学分野、製薬分野、身体洗浄分野、及び布地洗浄分野において使用するための高分子量のポリペプチドを同定するのに特に有用である。
本方法及びキットは幅広い有用性を有する。適用には：例えば、市販の洗濯及び洗浄製品；遺伝子クローニングのためのオリゴヌクレオチドプローブの設計を助けること；方向性を持った進化研究において形成される生成物の迅速な性状分析；コンビナトリアル化学及びペプチドライブラリの同定；及びプロテオミクスにおいて用いられるもののような、ペプチド又はポリペプチドの配列の迅速な決定を必要とする生物学研究の促進；タンパク質における翻訳後修飾の同定及び変異型タンパク質におけるアミノ酸修飾の同定が挙げられるが、これに限定されない。
【００１３】
本方法には質量スペクトル分析の前に、１つ以上の相対的に強い酸基をポリペプチド又はポリペプチドの開裂を介して形成される１つ以上のペプチドのＮ末端に付加することが含まれる。理論によって制限されることを意図せず、結果的に生じる負に荷電した誘導体は、低エネルギーの荷電部位で開始するフラグメンテーションを促進すると考えられている。このことは、ポリペプチド又はそのペプチドのＣ末端が塩基性又は疎水性、好ましくは塩基性残基である場合、特に有効である。Ｃ末端にリジンを含有するペプチドについては、リジン側鎖の適当な修飾によってこの方法の有効性をさらに改善することができる。適当な修飾には、リジンをホモアルギニンに変換すること、又は固定陽イオン基をリジン側鎖のイプシロンアミンに付加することが挙げられるが、これに限定されない。再び、理論による限定なしに、質量スペクトル分析の間に塩基性残基がプロトン化される場合、相対的に強い酸基が脱プロトン化され、塩基性残基における正の電荷の対抗平衡をとると考えられている。四級化されたリジン側鎖の場合、固定された正の電荷もまた、脱プロトン化された強酸によって提供される負の電荷について対抗平衡をとる。それぞれの場合で、誘導体をイオン化するのに追加のプロトンが必要とされ、ほとんどの塩基性残基はすでにプロトン化されるか、又は四級化されているので、それは実質的に「遊離」ポリペプチド／ペプチドの主鎖アミド基を無作為にイオン化する。さらに、理論による限定なしに、２番目に相対的に強い酸基がポリペプチド／ペプチドに組み入れられ、２つの酸基が脱プロトン化される場合、２つの実質的に「遊離」のプロトンが提供されてポリペプチド／ペプチドの主鎖アミド基を無作為にイオン化すると考えられている。
【００１４】
本方法の利用はフラグメンテーション効率の有意な上昇を提供する。さらに、同一配列を有する誘導体化されていないペプチドに比べて、誘導体化されたペプチドでは、フラグメントイオンのノイズに対するシグナルの比の上昇が観測される。得られた単純なＰＳＤ　ＭＡＬＤＩ及びエレクトロスプレータンデム質量スペクトルは、日常的に新規で解釈することができる。
本開示全般にわたり、出版物及び特許を参照する。本明細書中で引用された全ての参考文献は、参考として本明細書に組み入れられる。
本明細書において用いられる全ての比率は、特に明記しない限り重量に基づく。
本明細書で使用されるとき、略語はアミノ酸を記載するのに用いられる。かかる略語を以下の表Ｉに記載する。さらに、表Ｉで記載されているのは、本発明の実践に有用であるアミノ酸残基の平均質量である。修飾リジンのリジン残基の質量は、天然に豊富な又は重い同位体を濃縮したリジン修飾試薬で誘導体化した後、適当に調整しなければならない。
【００１５】
【表１】
2004505248.tif 000002
【００１６】
（定義）
本明細書で使用されるとき、用語「脱離イオン化」は固相から気相へのイオンとしての検体の転移をいう。
本明細書で使用されるとき、用語「脱離」は表面からの検体の離脱及び／又は検体の気相への流入をいう。
本明細書で使用されるとき、「イオン化」は、正又は負の１以上の電子単位に等しい電荷を検体に創製する又は保持する過程をいう。
本明細書で使用されるとき、用語「ＭＡＬＤＩ」はマトリクス支援レーザー脱離イオン化をいう。
【００１７】
「ＭＡＬＤＩ」に関連して本明細書で使用されるとき、用語「マトリクス」は、当該ポリペプチド、又はかかる様式で当該ペプチドと溶液中で混合してもよいので、試料段階で乾燥するとき、結晶性のマトリクスに埋め込まれた検体が、レーザー照射の後、固相から気相又は蒸気相に上手く脱離し、イオン化することができる小型の酸性の光を吸収する化学物質をいう。別の方法としては、ポリペプチド又はそのペプチドの溶液を、試料段階で予備乾燥される適当なマトリクスに装填してもよい。好適なマトリクスの非限定例には、ニコチン酸、シナピン酸、フェルラ酸、コーヒー酸、ａ−シアノ−４−ヒドロキシ桂皮酸、及びニトロセルロースと混合したａ−シアノ−４−ヒドロキシ桂皮酸が挙げられる。
【００１８】
本明細書で使用されるとき、用語「エレクトロスプレーイオン化」は、接地した対抗電極に関して高い電圧にてキャピラリー電極から溶液を静電気的にスプレーすることによって溶液からイオンを製造する工程をいう。その定義は、エレクトロスプレーイオン化及びイオンスプレーともいわれる空気圧支援のエレクトロスプレーイオン化の双方を包含することを意図する。本明細書で使用されるとき、用語「エレクトロスプレーイオン化」は、あらゆる液体の流速に適用され、ミクロスプレー実験及びナノスプレー実験を包含することを意図する。さらに、その定義は、分離せず直接イオン源に注がれるペプチドの分析、及びエレクトロスプレーイオン化に先立って分離されるペプチド又はペプチド混合物の分析に適用することを意図する。好適な直結式分離法にはＨＰＬＣ、キャピラリーＨＰＬＣ及びキャピラリー電気泳動が挙げられるが、これに限定されない。エレクトロスプレーイオン化実験は、三連四重極型、イオントラップ型、直交式加速飛行時間分析計及びフーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴装置を含むが、これに限定されない種々の質量分析計で行うことができる。
【００１９】
本明細書で使用されるとき、用語「ポリペプチド」は２つ又はそれ以上のアミノ酸残基を有する分子をいう。本発明の方法は、大きい質量のポリペプチドの配列同定に好適である。
本明細書で使用されるとき、用語「野生型」は、突然変異していない生物によって産生されるポリペプチドをいう。
本明細書で使用されるとき、用語「変異型」は、野生型のポリペプチドとは異なるアミノ酸配列を有するポリペプチドをいう。
本明細書で使用されるとき、用語「強い塩基性の基」は、グアニジニウム基のような基を含むが、これに限定されない９．５より大きいｐＫａを持つ官能基をいう。
本明細書で使用されるとき、用語「固定された陽イオンに荷電した基」は、四級アミン、スルホニウム又はピリジニウムのような官能基を含むが、これに限定されない永続的に正の電荷を含む基をいう。
【００２０】
本明細書で使用されるとき、用語「同位体で標識された基」は、１５Ｎを含有するグアニジニウム基、１３Ｃを含有する四級アミン類及び１８Ｏを含有するベタイン類のような基を含むが、これに限定されない、原子の最も一般に天然で豊富な同位体よりも分子量において大きい又は小さい同位体について濃縮されている少なくとも１種の原子を含む基をいう。２Ｈ又は３７Ｃｌ又は８１Ｂｒのようなハロゲンを含有する基も用いることができる。
【００２１】
本発明の方法
本方法は、複雑なタンパク質混合物における相対的なタンパク質のレベルを定量するのに、及びポリペプチドのアミノ酸配列を決定するのに有用である。語句「アミノ酸配列を決定すること」によって、本発明者らは、所与のポリペプチドの配列全体を決定することに限定することを意図しない。むしろ、この語句によって、本明細書では、部分（単数）、部分（複数）、及び／又は全体の配列が決定されることを意味する。
本方法には、質量スペクトル分析のために、１つ以上の相対的に強い酸基をポリペプチド又はその１つ以上のペプチドのＮ末端に付加して１つ以上の誘導体化された検体を製造することが関与する。次いで、質量分析技術を用いてポリペプチド／ペプチドを分析し、フラグメンテーションパターンを提供する。得られたフラグメンテーションパターンを解釈し、それによってポリペプチドの配列が与えられる。
【００２２】
本発明者らは、誘導体化する基の酸性度（酸性部分）が結果として生じる質量スペクトルに深遠な影響を有することを発見した。驚くべきことに、ポリペプチド又はそのペプチドとカップリングするとき、約２未満のｐＫａを有するような酸性部分は、所望の配列情報を提供するのに解釈し易いフラグメンテーションパターンを生じる。当業者は、当該技術分野において既知の常法を用いて本明細書に記載されるｐＫａ値を測定するのに適任である。かかる方法の非限定例には、例えば、滴定法及び電気化学的方法が挙げられる。ｐＫａ値を測定する好ましい方法は滴定を介するものである。
【００２３】
本発明者らは、ペプチドの遊離のＮ末端をスルホン化する前に、リジン側鎖のイプシロンアミノ基を修飾してその塩基性度を高めることによって、又は、そのような側鎖に固定された陽イオン基を付加することによって、リジン含有ペプチドについて、質量分析法による配列決定の結果の質を改善することができることを発見した。遊離のＮ末端アミンにおける明らかな競合反応がなく、加水分解のような明らかな望ましくない副反応もなく、ペプチドのリジン側鎖におけるイプシロンアミノ基を効率的に塩基性度の高いグアニジニウム基に変換することができる（例えば、キメル（Ｋｉｍｍｅｌ）の「タンパク質のグアニジン化」、メソッドインエンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）第１１巻５８４〜５８９ページ（１９６７年）及びボネット（Ｂｏｎｅｔｔｏ）らの「Ｌｙｓ及びＣｙｓ残基の誘導体化後、カルボキシペプチダーゼ及び質量分析法を用いたペプチド及びタンパク質のＣ末端配列の解析」、アナリティカルケミストリ（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）第６９巻１３１５〜１３１９ページ（１９９７年）を参照のこと）。次いで、リジン修飾ペプチドの遊離のＮ末端アミンをスルホネート基で誘導体化し、次いで、我々の以前の出願（Ｐ＆Ｇ特許７３７９Ｐ２）に記載されている質量分析法を用いてペプチドの配列を新規に決定する。別の方法としては、Ｎ末端のスルホン化反応とＣ末端のリジンの修飾反応の順を逆にすることができる。
【００２４】
原則として、グアニジン化反応とスルホン化反応は、反応条件の適切な制御によっていずれの順でも行うことができる。しかしながら、非水性条件下で極めて反応性の高いスルホン化化合物（例えば、実施例２及び８）を用いる場合、先ず、リジン側鎖をグアニジン化することが好ましい。リジンのホモアルギニンへの選択的変換は、極めて強い塩基性の基によってリジン側鎖を効率的に保護する。次いで、リジンイプシロンアミノ基が望ましくなくスルホン化されることなく、リジンが保護されたペプチドをＮ末端で選択的にスルホン化することができる。この戦略によって質量分析法によるリジン終結ペプチドの新規のペプチド配列決定が円滑になる。
【００２５】
ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）のような有機塩基の存在下でグアニジン化反応を行うことは、高いｐＨ（＞１３）でＮａＯＨの存在下でグアニジン化を行うときに観測されることが多い望ましくないペプチドの加水分解を最小限に抑える。揮発性の有機塩基（ＮａＯＨの代わりに）の存在下で調製される低レベルの試料も質量分析法による配列決定に先立ってさらにクリーンアップし易い。
別の方法としては、緩衝化した水性媒体中（例えば、ｐＨが６．５である実施例１を参照のこと）でスルホン化反応を行うことにより、先ず、リジン終結ペプチドのＮ末端をスルホン化することができる。次いで、過剰のスルホン化試薬を取り除き、リジン側鎖のイプシロンアミノ基を、Ｏ−メチルイソ尿素又はその塩でグアニジン化するか、又はそれを四級アンモニウム基に変換する。イプシロンアミンを四級化する方法の１つは、無水イソ酢酸との反応、その後トリメチルアミンとの反応による。この工程はアミンをベタインに変換する。例えば、スタルツ（Ｓｔｕｌｔｓ）らの「アミノ末端誘導体化によるペプチドの高エネルギー衝突スペクトルの簡略化」、アナリティカルケミストリ（Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．）第６５号１７０３〜１７０８ページ（１９９３年）を参照のこと。
【００２６】
本発明の方法は以下のように行ってもよい：
ポリペプチド及び／又はポリペプチドのペプチドの誘導体化：
Ｎ末端の誘導体化：
本発明の重要な特徴は、１つ以上の相対的に強い酸、すなわち、ポリペプチド又は前記ポリペプチドのペプチドとカップリングするとき約２未満、好ましくは約０未満、及びさらに好ましくは約−２未満のｐＫａを有する酸性部分による関心のあるポリペプチド又はポリペプチドのペプチドの誘導体化である。「ポリペプチドのペプチド」によって、本明細書では、ポリペプチドが２つ又はそれ以上のペプチドに消化される、さもなければ切断される（本明細書では、まとめて「消化」などと呼ぶ）ことを意味する。本方法に従って得られたペプチドを誘導体化する。「カップリングするとき」によって本明細書では、本明細書のポリペプチド又はペプチドと共有結合した後、測定されるとき酸性部分のｐＫａが定義されることを意味する。
【００２７】
ポリペプチド又はそのペプチドはいかなる手段で製造してもよい。例えば、必要であれば関心のあるポリペプチドは分析のために単離される。例えば、一次元及び二次元のゲル電気泳動を含む幾つかの方法が単離に利用されてもよい。もう１つの実施例として、ポリペプチドは、当該技術分野において周知のコンビナトリアル化学の方法を介して合成されてもよい。
【００２８】
消化は、ゲル中又は膜上、好ましくはゲル中を含む、多数の方法を介して生じてもよい。例えば、シェブチェンコ（Ｓｈｅｖｃｈｅｎｋｏ）らの「銀染色ポリアクリルアミドゲルからのタンパク質の質量分光分析による配列決定」。アナリティカルケミストリ（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）第６８巻８５０〜８５８ページ（１９９６年）を参照のこと。しかしながら、酵素的に又は化学的に、好ましくは酵素的にポリペプチドを消化することが可能である。塩基性の残基又は疎水性の残基、最も好ましくは塩基性の残基を得られるペプチドのＣ末端にて又はその近傍で生じる消化方法を利用することが最も好ましい。「にて」によって本明細書では、塩基性の残基又は疎水性の残基がペプチドのＣ末端残基であることを意味する。「近傍で」によって本明細書では、塩基性の残基又は疎水性の残基が、好ましくはペプチドのＣ末端から約４０アミノ酸残基の範囲内、さらに好ましくは約３０残基の範囲内、一層さらに好ましくは約２０残基の範囲内、及び最も好ましくはペプチドのＣ末端から約１０アミノ酸残基の範囲内にあることを意味する。
【００２９】
この手順には多くの方法を利用してもよいが、例えば、トリプシン、エンドプロテイナーゼＬｙｓ　Ｃ、エンドプロテイナーゼＡｒｇ　Ｃ、又はキモトリプシン、好ましくは、トリプシン、エンドプロテイナーゼＬｙｓ　Ｃ、又はエンドプロテイナーゼＡｒｇ　Ｃ、及び最も好ましくはトリプシンを用いてポリペプチドを酵素的に消化することが好ましい。当然、ポリペプチドの元来のＣ末端の例外は伴うが、得られるポリペプチドのペプチドが通常、Ｃ末端にてアルギニン残基又はリジン残基（塩基性残基）で終結するので、トリプシン、エンドプロテイナーゼＬｙｓ　Ｃ、及びエンドプロテイナーゼＡｒｇ　Ｃが好ましい。特に、得られるペプチドのＣ末端にて又はその近傍で塩基性残基が生じるのであれば、その他の酵素も好適である。通常、疎水性のアミノ酸残基を切断するキモトリプシンも消化には好ましい。化学的消化も有用である。例えば、臭化シアンによる消化が有用である。
【００３０】
本発明の方法は、特にその中に記載された消化技法に関して１９９８年１０月１３日に発行され、パーセプティブバイオシステムズ社（ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｉｎｃ．）に譲渡されたパターソン（Ｐａｔｔｅｒｓｏｎ）らの米国特許第５，８２１，０６３号に基づいて適用される。例えば、本発明に基づいて、ポリペプチドに対する作用剤の異なった比を有する複数の試料を利用してもよく、誘導体化してもよい。
しかしながら、特に、小型のポリペプチドを配列決定する場合（確実に限定されるわけではないが）、消化がいつも必要なわけではない。本明細書で使用されるとき、「小型の」ポリペプチドは、好ましくは約５０未満のアミノ酸残基、さらに好ましくは約４０未満の残基、一層さらに好ましくは約３０未満の残基、尚さらに好ましくは約２０未満の残基、及び最も好ましくは約１０未満のアミノ酸残基を有するものを包含する。
【００３１】
例えば、コンビナトリアル化学法を含む周知の手段によって合成されるポリペプチドが特徴付けられてもよい（「合成ポリペプチド」）。この例では、得られるポリペプチドのＣ末端にて又はその近傍で塩基性の残基又は疎水性の残基、好ましくは塩基性の残基（最も好ましくはアルギニン、ホモアルギニン又はリジン）を有するポリペプチドを合成することが最も好ましい。
【００３２】
ポリペプチド（前記ポリペプチドが本明細書の上記で定義されるように十分に「小型」であれば）又は前記ポリペプチドのペプチドが、約２未満、好ましくは約０未満、及び最も好ましくは約−２未満のｐＫａ（ポリペプチド又はペプチドとカップリングするとき）を有する１つ以上の酸性部分によって誘導体化され、誘導体化された検体を提供する。誘導体化された検体の酸性部分は酸性部分試薬とのカップリンングによって調製される。ポリペプチド又はそのペプチド上の酸性部分が結果として本明細書に記載されるｐＫａを有するという条件で、酸性部分試薬は限定されない。カップリングに利用してもよい酸性部分試薬の非限定例には、例えば、ジチオビス（スルホスクシンイミジルプロピオネート）、Ｓ−アセチルメルカプトコハク酸無水物、２−イミノチオレート（トラウトの試薬とも呼ばれる）、ジチオジグリコール酸無水物、テトラフルオロコハク酸無水物、ヘキサフルオログルタール酸無水物、スルホコハク酸無水物、環状２−スルホ安息香酸無水物、シクロスルホニルアセチルクロリド、及び１，３−プロパンスルトンが挙げられる。Ｓ−アセチルメルカプトコハク酸無水物、２−イミノチオラン、及びジチオジグリコール酸無水物のような試薬の使用は、酸性部分を生じるにはペプチドによる誘導体化した後、酸化を必要とする。酸化工程を必要としない酸性部分試薬には、例えば、テトラフルオロコハク酸無水物、ヘキサフルオログルタール酸無水物、スルホコハク酸無水物、環状２−スルホ安息香酸無水物及びクロロスルホニルアセチルクロリドが挙げられる。さらに効率的な合成及び／又はポリペプチド又はそのペプチドにおける不安定な残基の複雑な酸化の欠如のために、このような試薬が好まれることが多い。システインスルフヒドリル側基のシステイン酸への酸化がその後に続く、システイン含有ペプチドのＮ末端への酸性部分試薬のカップリングは、２つの酸性部分（スルホン酸）を含有するペプチドを作製する１つの手段である。
【００３３】
酸性部分は最も好ましくはスルホン酸である。この中で、さらに好ましい酸性部分には、２−スルホアセチル部分、３−スルホプロピオニル部分、及び２−スルホベンゾイル部分が挙げられる。
ジスルホン酸誘導体の使用も好ましい。ジスルホン酸誘導体の使用は好ましくは、ペプチドのＮ末端の近傍で両方のスルホン酸基を生じる。例えば、システインスルフヒドリル側基のシステイン酸への酸化がその後に続く、システイン含有ペプチドのＮ末端への酸性部分試薬のカップリングは、２つの酸性部分（スルホン酸）を含有するペプチドを作製する１つの手段である。
【００３４】
リジン側鎖のイプシロンアミノ基の修飾：
前の項で記載されるように作製されたリジン含有ペプチドについては、リジン側鎖のイプシロンアミノ基をさらに塩基性の基に選択的に変換することによって、又は固定的な陽イオン基をリジン側鎖に付加することによって、この配列決定法の有効性が強化されることが多い。このような後者のペプチド修飾は、前の項で議論したＮ末端スルホン化反応に加えて行われる。
リジン修飾試薬の非限定例は、Ｏ−メチルイソウレア水素サルフェート、Ｏ−メチルイソウレアサルフェート及びＯ−メチルイソウレア塩酸塩、並びにメシレート、アセテート、ブロミド、ピクレート、ｐ−トルエンスルホネート及びベンゾエートの塩を含むＯ−メチルイソウレアのその他の塩である。
当業者は、本発明によって必要とされる相対的に単純なカップリング手順を実行する能力を有する。しかしながら便宜上、関心のあるポリペプチド、又は前記ポリペプチドのペプチドの誘導体化の非限定例を以下に説明する：
【００３５】
（実地例）
実施例１
【００３６】
【化１】
2004505248.tif 000003
【００３７】
環状２−スルホ安息香酸無水物（ウィスコンシン州ミルウォーキーのアルドリッチケミカル社（Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ）から市販されている）を使用前に無水テトラヒドロフランで０．１Ｍの濃度に調製する。ポリペプチドＡＳＨＬＧＬＡＲ（１ｎＭ、ミズーリ州セントルイスのシグマケミカル社（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．）から市販）（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１）を２０μＬの０．０５Ｍトリメチルアミンで希釈する。環状２−スルホ安息香酸無水物溶液（２μＬ）を加え、反応混合物を３０秒間攪拌する。室温にて反応を約２分間進め、その後、生じた誘導体化された検体を希釈し、質量スペクトルを解析する。酸性部分試薬の濃度は、さらに少ない量を誘導体化する場合、１００という因数で減らす。
【００３８】
実施例２
【００３９】
【化２】
2004505248.tif 000004
【００４０】
ＡＳＨＬＧＬＡＲ（１ｎＭ、ミズーリ州セントルイスのシグマケミカル社（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．）から市販）（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１）を、２μＬの原液クロロスルホニルアセチルクロリド（ウィスコンシン州ミルウォーキーのアルドリッチケミカル社（Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ）から市販されている）を５００μＬの水と混合することにより形成される２μＬの０．０２Ｍスルホ酢酸と混合する。混合物を乾燥し、次いで２０μＬのテトラヒドロフラン：ジイソプロピルエチルアミン（４：１ｖ：ｖ）で再構築する。無水テトラヒドロフラン中の０．１Ｍのクロロスルホニルアセチルクロリド（２μＬ、ウィスコンシン州ミルウォーキーのアルドリッチケミカル社（Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ）から市販）を加え、混合物を３０秒間攪拌するする。室温にて、誘導体化反応をおよそ２分間進める。誘導体化された検体を乾燥し、２０μＬの水で再構築し、さらに希釈して、質量スペクトル分析にかける。クロロスルホニルアセチルクロリドは、２Ｄゲル単離の誘導体化の有用な試薬でもあるが、改変した合成手順は、さらに一貫した生成物収量を提供する。改変した手順は実施例１４で議論する。
【００４１】
実施例３
【００４２】
【化３】
2004505248.tif 000005
【００４３】
Ｓ−アセチルメルカプトコハク酸無水物（ウィスコンシン州ミルウォーキーのアルドリッチケミカル社（Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ）から市販）を使用前に無水テトラヒドロフランで０．１Ｍの濃度に調製する。ＡＳＨＬＧＬＡＲ（１ｎＭ、ミズーリ州セントルイスのシグマケミカル社（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．）から市販）（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１）を２０μＬの０．０５Ｍトリメチルアミンで希釈する。Ｓ−アセチルメルカプトコハク酸無水物溶液（５μＬ）を加え、反応混合物を３０秒間攪拌する。室温にて反応を約２分間進め、次いで、１９：１（ｖ：ｖ）の比に調製した１０μＬのギ酸（８８％）：Ｈ２Ｏ２（３０％）により酸化する。室温にて１６時間酸化を進め、試料を乾燥した後、希釈して、質量スペクトル分析を行う。酸性部分試薬の濃度は、さらに少ない量を誘導体化する場合、１００という因数で減らす。
【００４４】
実施例４
【００４５】
【化４】
2004505248.tif 000006
【００４６】
０．１Ｍのトリメチルアミン（２０μＬ）中のＡＳＨＬＧＬＡＲ（１ｎＭ、ミズーリ州セントルイスのシグマケミカル社（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．）から市販）（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１）に２−イミノチオラン（トラウト試薬、ウィスコンシン州ミルウォーキーのアルドリッチケミカル社（Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ）から市販）（脱イオン水中で３μＬ、０．１Ｍ）を加える。室温にて反応を５分間進める。１９：１（ｖ：ｖ）の比に調製した３μＬのギ酸（８８％）：Ｈ２Ｏ２（３０％）により生成物を酸化する。室温にて酸化を５分間進め、質量スペクトル分析に先立って誘導体化された検体を乾燥する。
【００４７】
実施例５
【００４８】
【化５】
2004505248.tif 000007
【００４９】
ポリペプチドＣＤＰＧＹＩＧＳＲ（ミズーリ州セントルイスのシグマケミカル社（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．）から市販）（ＳＥＱ　Ｉｄ　ＮＯ：２）を、１〜５ｎＭのポリペプチド（５〜２０μＬの水中で）を１９：１（ｖ：ｖ）の比に調製した１０μＬのギ酸（８８％）：Ｈ２Ｏ２（３０％）と混合することにより酸化する。室温にて酸化を３０分間進め、質量スペクトル分析に先立って誘導体化された検体を乾燥する。
【００５０】
実施例６
【００５１】
【化６】
2004505248.tif 000008
【００５２】
ジチオビス（スルホスクシンイミジルプロピオネート）（ＤＴＳＳＰ）（イリノイ州、ロックフォードのピアースケミカル社（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．）から市販）をホスフェート緩衝生理食塩水に５０ｎＭ／２０μＬで溶解し、１ＮのＮａＯＨでｐＨを７．７に調整する。その溶液（２０μＬ）を１μＬのペプチドＨＬＧＬＡＲ（１ｎＭ／μＬ）（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３）に加え、３０分間反応させる。トリス−ヒドロキシメチル−アミノメタン（０．１Ｍ、２０μＬ）で反応を止める。試料を脱塩し、１９：１（ｖ：ｖ）の比に調製した１０μＬのギ酸（８８％）：Ｈ２Ｏ２（３０％）で酸化する。室温にて酸化を３０分間進め、質量スペクトル分析に先立って誘導体化された検体を乾燥する。
【００５３】
実施例７
【００５４】
【化７】
2004505248.tif 000009
【００５５】
ジチオジグリコール酸（０．９３ｇ、５．１ミリモル、ミズーリ州セントルイスのシグマケミカル社（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．）から市販）（別の方法としては、その無水物のそのポリマー（環式又は非環式）を用いてもよい）をジクロロメタン（２０ｍＬ）に溶解し、不活性の雰囲気下に置く。ジシクロヘキシルカルボジイミド（１．０５ｇ、５．１ミリモル）を一気に加える。約９６時間後、沈殿物をろ過によって除き、ろ液を減圧下で濃縮する。得られた物質をジエチルエーテルに溶解し、ろ過する。再び、ろ液を減圧下で濃縮してジチオジグリコール酸無水物を提供する。ジチオジグリコール酸無水物（この実施例では環状形態を示す）を、使用に先立って、無水テトラヒドロフラン中で０．１Ｍの濃度に調製する。ＡＳＨＬＧＬＡＲ（１ｎＭ）（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１）を２０μＬの０．０５Ｍトリメチルアミンで希釈する。ジチオジグリコール酸無水物溶液（５μＬ）を加え、反応混合物を３０秒間攪拌する。室温にて、反応をおよそ２分間進める。得られた生成物を１９：１（ｖ：ｖ）の比に調製した２μＬのギ酸（８８％）：Ｈ２Ｏ２（３０％）で酸化する。室温にて酸化を３０分間進め、質量スペクトル分析に先立って誘導体化された検体を乾燥する。酸性部分試薬の濃度は、さらに少ない量を誘導体化する場合、１００という因数で減らす。
【００５６】
実施例８
【００５７】
【化８】
2004505248.tif 000010
【００５８】
使用に先立って、３−スルホプロピオン酸無水物を無水テトラヒドロフランで０．１Ｍの濃度に調製する。ＡＳＨＬＧＬＡＲ（１ｎＭ）（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１）を２０μＬのテトラヒドロフラン：ジイソプロピルエチルアミン４：１（ｖ：ｖ）で希釈する。３−スルホプロピオン酸無水物溶液（２μＬ）を加え、反応混合物を３０秒間攪拌する。室温にて反応を約２分進めた後、希釈して質量スペクトル分析を行う。酸性部分試薬の濃度は、さらに少ない量を誘導体化する場合、１００という因数で減らす。
【００５９】
実施例９
【００６０】
【化９】
2004505248.tif 000011
【００６１】
使用に先立って、テトラフルオロコハク酸無水物を無水テトラヒドロフランで０．１Ｍの濃度に調製する。ＡＳＨＬＧＬＡＲ（１ｎＭ）（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１）を２０μＬの０．０５Ｍトリメチルアミンで希釈する。テトラフルオロコハク酸無水物溶液（２μＬ）を加え、反応混合物を３０秒間攪拌する。室温にて反応を約２分進めた後、希釈して質量スペクトル分析を行う。カップリング試薬の濃度は、さらに少ない量を誘導体化する場合、およそ１００という因数で減らす。
【００６２】
実施例１０
【００６３】
【化１０】
2004505248.tif 000012
【００６４】
ペプチドＣＤＰＧＹＩＧＳＲ（ミズーリ州セントルイスのシグマケミカルカンパニー（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ）から市販）（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２）を、２μＬの原液クロロスルホニルアセチルクロリド（ウィスコンシン州ミルウォーキーのアルドリッチケミカル社（Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ）から市販されている）を５００μＬの水と混合することにより形成される２μＬの０．０２Ｍスルホ酢酸と混合する。混合物を乾燥し、次いで２０μＬのテトラヒドロフラン：ジイソプロピルエチルアミン（４：１ｖ：ｖ）で再構築する。無水テトラヒドロフラン中の０．１Ｍのクロロスルホニルアセチルクロリド（２μＬ）を加え、混合物を３０秒間攪拌する。室温にて、誘導体化反応をおよそ２分間進める。誘導体化された検体を乾燥し、１０μＬの水にて再構築する。その溶液に１９：１（ｖ：ｖ）の比に調製した１０μＬのギ酸（８８％）：Ｈ２Ｏ２（３０％）を加える。室温にて酸化を５分間進め、Ｎ末端近傍で２つのスルホン酸基を有する誘導体化されたペプチドを製造する。
【００６５】
（質量分析技術を用いた解析）
誘導体化して、ポリペプチド又はポリペプチドの１つ以上のペプチドが質量分析技術を用いて解析される。利用される技術は限定されないが、好ましい技術は、ポストソース崩壊（ＰＳＤ）マトリクス支援レーザー脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）及びエレクトロスプレーイオン化タンデム質量分析法である。例えば、スペングラー（Ｓｐｅｎｇｌｅｒ）らの、「マトリクス支援レーザー脱離質量分析法によるペプチド配列決定」ラピッドコミュニケーションズインマススペクトロメトリー（Ｒａｐｉｄ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）、第６巻の１０５〜１０８ページ（１９９２年）；スペングラー（Ｓｐｅｎｇｌｅｒ）らの「マトリクス支援レーザー脱離質量分析法におけるポストソース崩壊の基本的性状」ジャーナルオブフィジカルケミストリ（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈｙｓｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、第９６巻の９６７８〜９６８４ページ（１９９２年）；コッフマン（Ｋａｕｆｍａｎｎ）らの「マトリクス支援レーザー脱離イオン化を用いた反射飛行時間質量分析計におけるプロダクトイオン分析による線状ペプチドの質量分析配列決定」、ラピッドコミュニケーションズインマススペクトロメトリー、第７巻９０２〜９１０ページ（１９９３年）；コッフマン（Ｋａｕｆｍａｎｎ）らの「飛行時間質量分析計におけるペプチドの配列決定：マトリクス支援レーザー脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）後のポストソース崩壊の評価」、インターナショナルジャーナルオブマスススペクトロメトリー、アンドイオンプロセス（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ ａｎｄ Ｉｏｎ Ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ）、第１３１巻３５５〜３８５ページ（１９９４年）；カウフマン（Ｋａｕｆｍａｎｎ）らの「マトリクス支援レーザー脱離／イオン化反射飛行時間質量分析法におけるポストソース崩壊及び遅延抽出」、ラピッドコミュニケーションズインマススペクトロメトリー第１０巻１１９９〜１２０８ページ（１９９６年）；及びスペングラー（Ｓｐｅｎｇｌｅｒ）の「生体分子のマトリクス支援レーザー脱離／イオン化質量分析法におけるポストソース崩壊の分析」ジャーナルオブマススペクトロメトリー第３２巻１０１９〜１０３６ページ（１９９７年）；カール（Ｃａｒｒ）らの「分析バイオテクノロジーにおける質量分析法の統合」、アナリティカルケミストリ（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）第６３巻２８０２〜２８２４ページ（１９９１年）；イエーツ（Ｙａｔｅｓ）３世らの「ＭＳによるゲノムの採掘」、アナリティカルケミストリ第６８巻５３４Ａ〜５４０Ａページ（１９９６年）；モリス（Ｍｏｒｒｉｓ）らの「新規のＱｕａｄｒｕｐｏｌｅ／Ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ加速飛行時間質量分析計における高感度衝突活性化タンデム質量分析法」、ラピッドコミュニケーションズインマススペクトロメトリー第１０巻８８９〜８９６ページ（１９９６年）を参照のこと。最も好ましくは、利用される技法は、正イオンモードのＰＳＤ　ＭＡＬＤＩ及びエレクトロスプレーイオン化タンデム質量分析法である。便宜上、以下の実施例１１及び１２が、ポリペプチド及びそのペプチドを解析するために利用されてもよい質量分析技術を説明する。
【００６６】
驚くべきことに本発明者が発見したように、適宜誘導体化されたペプチド又はポリペプチドのペプチドは、主としてｙ−イオンを特徴とするＭＳＭＳスペクトルを提供する。当該技術分野において周知であるように、ｙ−イオンは、ポリペプチド又はペプチドの元来のＣ末端を含有するイオン化されたフラグメントを示す。本明細書で使用されるとき、用語「ｙ−イオン」はまた、（ｙ−ＮＨ３）イオンも包含し；例えば、第２の塩基性（例えば）残基を含有する不完全な消化生成物は、豊富な（ｙ−ＮＨ３）イオンを生じることが多い。好ましくは、この方法で生じるスペクトルは実質的にａ−イオン及びｂ−イオンを含まない。ａ−イオン及びｂ−イオンは主鎖のカルボニル基のいずれかの側の開裂によって形成される。重要なことに、電荷は、ａ−イオン及びｂ−イオンによってＮ末端フラグメントで保持される。本明細書で使用されるとき、ａ−イオン及び／又はｂ−イオンに関する用語「実質的に含まない」は、優勢なｙ−イオンシリーズに比べて、ａ−イオン及びｂ−イオンは合わせて、約２０％未満、好ましくは約１０％未満、及び最も好ましくは約５％未満の相対存在量を有することを意味する。
【００６７】
本発明の方法に従って、特にポリペプチドの配列が配列データベースにあれば、そのポリペプチドを同定するためにあらゆる消化生成物を分析し、及び／又は同定する必要はない。
【００６８】
実施例１１−ＰＳＤ　ＭＡＬＤＩ配列決定技法
この実施例では、質量分析技術は、Ｎ２レーザー（３３７ｎｍ、３ナノ秒パルス幅、２０Ｈｚの反復率）を装備したボイジャー（Ｖｏｙａｇｅｒ）ＤＥ−ＲＰ又はボイジャーＤＥ−ＳＴＲ（マサチューセッツ州フレーミングハムのパーセプティブバイオシステムズ社（ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ））（又は好適な同等物）で行う。遅延抽出による反射モードにて質量スペクトルを得る。外部質量較正は、質量の少ないペプチド標準物で行い、質量測定の精度は、通常、±０．３Ｄａである。誘導体化されたポリペプチド又はペプチドを０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）で約１０ｐＭ／μＬまで希釈する。１０ｍｇを０．１％のＴＦＡを含有する１ｍＬの水性５０％アセトニトリルに溶解することによって調製されるａ−シアノ−４−ヒドロキシ桂皮酸（αＣＮ）で試料をさらに５倍〜１０倍に希釈する。例えば、ベアビス（Ｂｅａｖｉｓ）らの「マトリクス支援レーザー脱離質量分析法のためのマトリクスとしてのａ−シアノ−４−ヒドロキシ桂皮酸」オーガニックマススペクトロメトリー（Ｏｒｇａｎｉｃ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）第２７巻１５６〜１５８ページ（１９９２年）を参照のこと。迅速蒸発法により調製されるａ−シアノ−４−ヒドロキシ桂皮酸／ニトロセルロース（αＣＮ／ＮＣ）の薄膜表面からゲル単離物を解析する。例えば、アーノット（Ａｒｎｏｔｔ）らの「プロテオーム解析への統合的アプローチ：心臓肥大症に関連するタンパク質の同定」、アナリティカルバイオケミストリ（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）第２５８巻１〜１８ページ（１９９８年）を参照のこと。
【００６９】
時間指定イオン選抜を用いて適当な前駆体イオンを単離した後、誘導体化された検体についてＰＳＤ　ＭＡＬＤＩタンデム質量スペクトルが得られる。αＣＮ、αＣＮ／ＮＣ及び２，５−ジヒドロ安息香酸（ＤＨＢ）を含むが、これに限定されない多数のＭＡＬＤＩ物質を用いて誘導体化された検体を分析することができる。反射に適用される電圧をステッピングすることによってフラグメントイオンは最終検出器に前もって焦点が合わせられる。用いてもよい典型的な電圧比は以下のとおりである：１．００００（前駆体イオン断片）、０．９１２６、０．６０４９、０．４１２５、０．２７３８、０．１９７５、及び０．１２１３（フラグメント断片）。マサチューセッツ州フレーミングハムのパーセプティブバイオシステムズ（ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）から入手可能なソフトウエアを用いて、個々の断片を組み合わせる（当該技術分野において一般に用いられているように「一緒に縫い合わせる」）（解析ウインドウから「ＰＳＤ」を選択する）。前駆体イオン断片はすべて、低いレーザー出力で（変数減衰器＝１４５０）＜２５６のレーザーパルスについて獲得し、検出器を飽和するのを回避する。ＰＳＤ　ＭＡＬＤＩ獲得の残りの断片すべてに対してレーザーの出力を上げる（変数減衰器＝１６５０）。通常、各フラグメントイオンの断片について２５６のレーザーパルスが得られる。２０ＭＨｚのデジタル変換速度にてデータを獲得する。
【００７０】
実施例１２−エレクトロスプレーイオン化タンデム質量分析法による配列決定法
この実施例では、自家製マイクロエレクトロスプレー源（ｕＥＳ）を装備したＬＣＱイオントラップ質量分析計（カリフォルニア州サンノゼのサーモクエスト（ＴｈｅｒｍｏＱｕｅｓｔ））にカップリングしたキャピラリーＬＣシステム（カリフォルニア州フォスターシティのパーキンエルマーバイオシステムズ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ））を用いて質量スペクトルを獲得する。０．５×１５０ｍｍのＣ１８ＬＣカラム（カリフォルニア州フォスターシティのパーキンエルマーバイオシステムズ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ））は、５μｌ／分の流速にて用いる。ＬＣ移動相は、それぞれ０．０２％のＴＦＡを含有する水及びアセトニトリルである。典型的な勾配は、１５％のアセトニトリルで５分間、次いで１５〜６０％のアセトニトリルで４０分かける。ｕＥＳ源への０．５μｌ／分及びＵＶ検出器への４．５μｌ／分の流速は、ＬＣカラムの後に割れたティー（１／１６”、０．２５ｍｍ内径、テキサス州ヒューストンのバルコ（Ｖａｌｃｏ））を置くことによって達成する。オートサンプラー（ジョージア州ノルクロスのアルコット（ＡＬＣＯＴＴ）、モデル７１９）によって、誘導体化したペプチド又はポリペプチドの試料をＬＣカラムに注入する。ｕＥＳ源は装置の前端に載せられたＸ、Ｙ、Ｚマイクロメートル（カリフォルニア州サンタクララのニューフォーカス社（Ｎｅｗ Ｆｏｃｕｓ））に格納される。マイクロエレクトロスプレーの針は、ニューオブジェクティブ（Ｎｅｗ Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ）（マサチューセッツ州ケンブリッジ）のピコチップ（ＰｉｃｏＴｉｐ）（ＦＳ３６０−５０−１５−Ｄ）である。
【００７１】
エレクトロスプレータンデム質量スペクトルは、以下の装置条件を用いて獲得する：スプレー針の電圧１．５ｋＶ、加熱したキャピラリーの温度２００℃、及び衝突エネルギー３５ｅＶ。各完全なＭＳ走査では３００〜２０００ｍ／ｚの質量範囲を用いる。エレクトロスプレータンデム質量スペクトルは、３つの連続した走査：１）完全なＭＳ走査、２）電荷状態を測定するための選択されたイオンにおけるズーム、及び３）ズーム走査から選択された適当なイオンにおけるＭＳ／ＭＳ走査から成る「三連操作」モードにおけるデータ依存性の走査を用いて獲得される。このような３つの事象はＬＣ作動の間中、反復される。
【００７２】
フラグメンテーションパターンの解釈
質量分光分析により生じたフラグメンテーションパターンはポリペプチドの配列に解釈される。質量分析の分野における当業者は、市販のソフトウエア又は配列データベースの助けを借りずに新規の小型ポリペプチドのフラグメンテーションパターンを手動で解釈することができる。同様に、熟練者は、新規のポリペプチドのペプチド（消化生成物）を配列決定することもできる。別の方法としては、熟練者は、例えば、配列データベースの市販のソフトウエアを含む解釈のための既知の助けを借りてもよい。
【００７３】
例えば、ポリペプチド又はそのペプチドの配列は、本発明を介して作製されるｙ−イオンのフラグメンテーションパターンによって効率的に及び正確に決定される。個々のアミノ酸残基の同定は、ｙ−イオンシリーズの隣接するメンバー間の質量の差異を測定することによって新規に達成することができる。次いで、測定された質量の差異を既知のアミノ酸残基の質量（本明細書では上記表Ｉを参照のこと）と比較することによって同定は達成される。例えば、７１．１Ｄａの測定された質量差はアラニンに相当する。読み取り方向も質量スペクトルから直接明らかにされる。小さな質量から大きな質量へと測定するのであれば、方向はＣ末端からＮ末端である。大きい質量から小さい質量へと測定するのであれは、読み取り方向は、Ｎ末端からＣ末端である。
【００７４】
配列データベース検索に対する入力として、フラグメンテーションデータ、解釈されていないｙ−イオンシリーズの質量又はｙ−イオンシリーズに由来する配列タグのいずれかを許容するソフトウエアを用いて、ポリペプチド、及びそのペプチドの配列を効率的に及び正確に決定してもよい。当事者により一般に利用されているそのようなソフトウエアには、「プロテインプロスペクター（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｒｏｓｐｅｃｔｏｒ）」（カリフォルニア大学サンフランシスコ校又はウエブ（ｈｔｔｐ：／／ｐｒｏｓｐｅｃｔｏｒ．ｕｃｓｆ．ｅｄｕ）から市販されている）及び「ペプチドサーチ」（ドイツ、ヘイデルベルグの欧州分子生物学研究所又はウエブ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍａｎｎ．ｅｍｂｌ−ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ．ｄｅ）から市販）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００７５】
本発明で作製されるフラグメンテーションパターンは、ＮＣＢＩ非冗長データベース（ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｌａｓｔ／ｄｂ．ｎｒ．ｚ）、ＳＷＩＳＰＲＯＴ（ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｇｏｖ／ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙ／ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ／ｓｐｒｏｔ３３．ｄａｔ．ｚ）、ＥＭＢＬ（ＦＴＰ：／／ｆｔｐ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｐｕｂ／ｄａｔａｂａｓｅｓ／ｐｅｐｔｉｄｅｓｅａｒｃｈ／）、ＯＷＬ（ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙ／ｏｗｌ／ＦＡＳＴＡ．ｚ）、ｄｂＥＳＴ（ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙ／ｄｂＥＳＴ／ｄｂＥＳＴ．ｗｅｅｋｌｙ．ｆａｓｔａ．ｍｍｄｄｙｙ．ｚ）及びジェンバンク（ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｎｅｂａｎｋ／ｇｅｎｐｅｐｔ．ｆｓａ．ｚ）を含むが、これらに限定されない多数の配列データベースで検索することができる。本発明の方法を用いて形成される１つ以上の関連あるペプチド誘導体から作製されるフラグメンテーションデータを検索することによって配列データベースから、関心のあるポリペプチドの配列全体を取り出すことができることが多い。
【００７６】
当然、データベース検索技術を用いる場合、ｙ−イオン及び（ｙ−ＮＨ３）イオンが、本方法が利用されるフラグメンテーションパターンで観測される最も顕著な種なので、ｙ−イオン又は（ｙ−ＮＨ３）イオンだけがフラグメントになるように指定することによって検索を限定することが最も効率的である。本発明の方法を用いて誘導体化されたペプチドのスペクトルにおいて顕著ではないので、ａ−、ｂ−、（ｂ＋Ｈ２Ｏ）、（ｂ−Ｈ２Ｏ）、（ｂ−ＮＨ３）及び内部開裂イオンのようなその他のフラグメントイオンを否認することができる。本発明によって形成される誘導体は、誘導体化していない同一ペプチドのスペクトルから得られるよりも多くのデータベース検索の特異性を生じることが多い単純なフラグメンテーションパターンを提供する。
以下の非限定例において本発明の方法をさらに説明する。このような実施例では、当業者は、新しいタンパク質が頻繁にデータベースに加えられるので、多数の「候補タンパク質」が本明細書で開示されたものとは異なる可能性があることを認識するであろう。
【００７７】
実施例１３
酸化されたインスリンＢ鎖ＦＶＮＱＨＬＣ（ＳＯ３Ｈ）ＧＳＨＬＶＥＡＬＹＬＶＣ（ＳＯ３Ｈ）ＧＥＲＧＦＦＹＴＰＫＡ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４）（ＭＭ計算値＝３４９５．９Ｄａ）（ミズーリ州セントルイスのシグマケミカルカンパニー（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ）から市販）によって高質量のポリペプチドのＰＳＤ　ＭＡＬＤＩタンデム質量分析法を実証する。このポリペプチドの質量は、従来のほとんどの三連四重極型装置の上限をはるかに超えている。元のままのポリペプチドのタンデム質量スペクトルは、実質的にｙ−イオンから成る相対的に強いイオンシリーズを示す。ｙ９からｙ２４の間のｙ−イオンはすべて観測し易い。分子のＮ末端を規定する配列特異的なフラグメント、ｙ２５〜ｙ２９はスペクトルに存在しない。
【００７８】
酸性部分試薬、スルホ安息香酸環状無水物（ミズーリ州セントルイスのアルドリッチケミカル社（Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ）から市販）を用いる誘導体化によってこのポリペプチドのスペクトルを改善する。誘導体化されたポリペプチドは、分子のＮ末端領域に由来するｙ−イオン（ｙ２５、ｙ２６、ｙ２７、ｙ２８、及びｙ２９）の有意な増強を示す。誘導体化の後、ｙ８〜ｙ２９のｙ−イオンの完全なシリーズが観測される。顕著なｂ−イオンは検知されない。
【００７９】
実施例１４
二次元ゲル電気泳動により分離されたポリペプチドをトリプシンによりゲル内消化して前記ポリペプチドのペプチドを生じる。ペプチドは、１０６０．８、１０９０．８、１２７１．０、１２９９．０、１３１２．０、１３４４．０、１３９９．１、１４５０．１、１４６０．１、及び１７９４．４ｍ／ｚにおけるイオンを含むＭＡＬＤＩによる強いＭＨ＋シグナルを幾つか示す。ＮＣＢＩタンパク質配列ライブラリのすべてに対するプロテインプロスペクターソフトウエアを用いたデータベース検索により、５以上の入力したトリプシン切断した質量と一致する４１の候補タンパク質のリストを作製する（検索パラメータ：ＭＷ範囲１，０００〜１５０，０００、３．０〜１０．０の等電点、副反応として認められる酸化Ｍｅｔ及び＋／−０．６Ｄａの控え目な質量許容範囲）。
【００８０】
前出の実施例で議論した数種の試薬のいかなる１つによってもポリペプチドのペプチドを誘導体化することができる。それらには、２−スルホ安息香酸環状無水物、３−スルホプロピオン酸無水物又はクロロスルホニルアセチルクロリドが挙げられるが、これらに限定されない。本実施例では、クロロスルホニルアセチルクロリドを酸性部分試薬として用いる。２Ｄゲル電気泳動から単離された低い濃度のペプチドを誘導体化する方法を改変して再現性及び誘導体収率を改善する。通常、２Ｄゲルのペプチド抽出物は、スピードバック上でほぼ乾燥するまで濃縮する（５〜１０μＬ）。１５μＬの０．１％ＴＦＡによって濃縮物を酸性化し、市販のＣ１８ミニカラム（マサチューセッツ州ベッドフォードのミリポアコーポレーションのジップチップ（ＺｉｐＴｉｐ）（商標））を用いてクリーンアップする。
【００８１】
クリーンアップした試料をスピードバックで乾燥し、１０μＬの塩基（ＴＨＦ：ＤＩＥＡ１９：１ｖ／ｖ）で再構築する。本実施例では、２μＬのクロロスルホニルアセチルクロリド溶液（１ｍＬのＴＨＦに２μＬの原液）を加え、室温にて、反応を１〜２分進める。誘導体化された試料を再びスピードバックにて乾燥し、解析前に１０μＬの０．１％ＴＦＡで再構築する。この段階で、ＭＡＬＤＩマトリクス及び解析のために試料ステージに負荷されている部分と試料を混合することができ、又は、市販のＣ１８ミニカラム（ジップチック（商標）、ミリポアコーポレーション）を用いて再びクリーンアップしてもよい。１０ｍｇ／ｍＬのＭＡＬＤＩマトリクスを含有する１〜２μＬ容量のアセトニトリル：０．１％ＴＦＡ（１：１ｖ／ｖ）にてＭＡＬＤＩ試料ステージ上に、ジップチップから直接、クリーンアップされた試料を溶出することができる。後者の手順によって回収された誘導体のすべてをＭＡＬＤＩ試料ステージに負荷することができ、それによって方法全体の感度を改善することができる。約１５７２Ｄａの重量がある誘導体化されたペプチドについてＰＳＤ　ＭＡＬＤＩタンデム質量分析を行う。５７４．５、６６１．７、８７５．９、１００３．８、１１０３．９、１２０４．６、１３０４．１ｍ／ｚにてｙ−イオンを、及び１４５１．０ｍ／ｚにて（ＭＨ＋−誘導体）イオンを有する配列タグが得られる。タンパク質配列データベースに対してスペクトルを検索し、６つの候補タンパク質（すべてミトコンドリア性のアスパルテートアミノトランスフェラーゼ類）が戻ってくる（検索パラメータ：ＭＷ範囲１，０００〜１５０，０００、親イオンの質量許容範囲＋／−０．６Ｄａ、フラグメントイオンの質量許容範囲＋／−２．５Ｄａ、Ｐａｒ（ｍｉ）Ｆｒａｇ（ａｖ）、許容される不足イオンの数＝１）。データベース検索がｙ−イオンを唯一の許容されるフラグメントとみなすように制約されているので、このレベルの特異性が得られる。このような誘導体のタンデム質量スペクトルではＮ末端及び内部開裂のイオンは顕著ではないので、この検索の制約が可能である（本発明に基づいた誘導体化による）。完全なライブラリに対してこの同じタンデム質量スペクトルを検索するとはるかに低い特異性が得られ（２３９の候補タンパク質が帰ってくる）、すべてのフラグメントイオン型（ａ、ｂ、（ｂ＋Ｈ２Ｏ）、（ｂ−ＮＨ３）、（ｂ−Ｈ２Ｏ）、内部及びｙ）が許容される。前記ペプチドは、ＦＶＴＶＱＴＩＳＧＴＧＡＬＲ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５）として同定された。
【００８２】
タンパク質の同定の確認は、約１９１６Ｄａの重量がある誘導体のＰＳＤ　ＭＡＬＤＩによって求める。スペクトルは、プロトン化した前駆体イオンに加えて７２４．６、１１５４．２、１２９９．３、１４３９．０、１５５１．９、１６６５．５、及び１７７９．２ｍ／ｚにおける７つのフラグメントのイオンを含有する。フラグメントをｙ−イオンであると想定してデータベースに対してこのスペクトルを検索する。検索によってミトコンドリア性のアスパルテートアミノトランスフェラーゼ又はその他のいかなる候補タンパク質も戻ってこない。ｙイオン及び（ｙ−ＮＨ３）イオンの両方を許容するデータベース検索によって１６の候補タンパク質ガ得られ、そのうち１０がミトコンドリア性のアスパルテートアミノトランスフェラーゼである。この後者の検索によってタンパク質の同定が裏付けられる。可能性のあるフラグメントとして（ｙ−ＮＨ３）イオンを含めることは、ペプチドが第２のアルギニン残基を含有する不完全なトリプシン処理生成物（ＩＬＩＲＰＬＹＳＮＰＰＬＮＧＡＲ）（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：６）なので、この特定の検索には必要である。本明細書の上記で述べたように、ＰＳＤタンデム質量スペクトルでは、不完全な消化生成物は、（ｙ−ＮＨ３）フラグメントイオンを呈することが多い。
【００８３】
実施例１５
２Ｄゲル電気泳動で単離されたタンパク質のゲル内トリプシン消化物を、本明細書の実施例１４に基づいて誘導体化した後、ＬＣＱイオントラップにてＬＣエレクトロスプレータンデム質量分析法により解析する。マイクロスキャンの「三連操作」配列を用いる自動データ依存モードにてあらゆるスペクトルは無人で獲得する。誘導体化されたトリプシン処理ペプチド（ＭＨ＋＝９７１．５）のタンデム質量スペクトルは、４０１．１、５３８．３、６５１．３、７５０．４ｍ／ｚを含めて幾つかのｙ型生成物イオンを示す。誘導体化されていないトリプシン処理ペプチド（９７１．５−１２２＝８４９．５）のＭＨ＋質量とともに測定されたｙ−イオンをデータベース検索に用いる。ＮＣＢＩタンパク質配列ライブラリに対するプロテインプロスペクターソフトウエアを用いたデータベース検索によって３つの候補タンパク質が得られる（検索パラメータ：ＭＷ範囲すべて、親イオンの質量許容範囲＋／−０．６Ｄａ、フラグメントイオンの質量許容範囲＋／−１．０Ｄａ、単同位体親イオン及びフラグメントイオンは認められ、不足イオンは認められない）。データベース検索から得られる３つの候補タンパク質はすべてハプトグロビンである。ペプチドは、ＶＶＬＨＰＥＲ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：７）として同定された。
【００８４】
第２の誘導体化されたペプチド（誘導体のＭＨ＋＝７７１．４Ｄａ）から生じるタンデム質量スペクトルを用いてデータベース検索からタンパク質同定の裏付けを求める。スペクトルは、３２２．１、４３６．２及び５３５．３ｍ／ｚにおけるｙ−型イオンを含めて幾つかのイオンを示した。上記と同じ検索パラメータを用いて、３つのペプチド配列がエレクトロスプレータンデム質量スペクトルからの入力データに一致する。３つのペプチド配列の１つがハプトグロビンに相当する。当前記ペプチドの同定はＮＶＮＦＲ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：８）として確証された。この結果はタンパク質の同一性を裏付けている。
【００８５】
実施例１６
本発明の方法は、変異型ポリペプチドを同定するのに利用し易い。酵素単離物のトリプシン消化物のＭＡＬＤＩスペクトルは、市販のプロテアーゼ、サビナーゼ（登録商標）（デンマーク、コペンハーゲンのノボノルディスク（Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ）から市販）のそれと同一の多数のトリプシン処理質量を示す。予想されるトリプシン処理ペプチドの１つ、ＧＶＬＶＶＡＡＳＧＮＳＧＡＧＳＩＳＹＰＡＲ（ＭＨ＋＝１９３３Ｄａ）（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：９）がスペクトルからなくなり、未知のイオンが１９６３ｍ／ｚで観測される。このことは、単離物がサビナーゼ（登録商標）の変異型であることを示唆している。１１の異なった単一アミノ酸の変更によって観測された＋３０Ｄａの質量のシフト（４Ｇ→Ｓ、４Ａ→Ｔ、及び３Ｖ→Ｅ）を説明することができる。本明細書の実施例２で説明されているような誘導体化に続いてＰＳＤ　ＭＡＬＤＩタンデム質量スペクトルが得られる。２１アミノ酸のペプチドについてｙ−イオンの完全なシリーズが観測される。スペクトルは残基１４におけるグリシンがセリンに変換されていることを立証している。このスペクトルであらゆるｙ−イオンの質量が測定される。スペクトルは、パーセプティブバイオシステムズのＭＡＬＤＩデータシステムに包含されるペプチドラダー配列決定プログラムを用いて自動的に解釈される。
【００８６】
実施例１７
本明細書の実施例５に従い、実施例１０に従って誘導体化されたＣＤＰＧＹＩＧＳＲ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２）から生じるＭＡＬＤＩＰＳＤスペクトルの比較によって、ペプチドのＮ末端近傍で両方のスルホン酸基を伴ったジスルホン酸誘導体の使用を実証する。システイン残基（実施例５）のスルフヒドリル側基の過ギ酸酸化によって形成される誘導体を、アルファ−シアノ−４−ヒドロキシ桂皮酸のマトリクスからＰＳＤ　ＭＡＬＤＩを用いて解析する。得られるＰＳＤスペクトルは、不安定なＡｓｐ−Ｐｒｏアミド結合の開裂によって形成されるｙ７フラグメントイオンが優勢である。低い質量のｙ型イオンは相対的に低い量を示す。例えば、ｙ７イオンに比べたｙ３イオン及びｙ４イオンの量は、それぞれ８％及び５％でしかない（ピークの高さの比）。理論によって制限されることを意図せず、Ｐｒｏ酸アミド窒素は他の主鎖アミド基よりも塩基性が強いので、「移動可能な」イオン化プロトンは塩基性Ａｓｐ−Ｐｒｏアミド窒素原子に優先的に局在すると考えられている。この電荷局在は、Ａｓｐとプロトン化されたＰｒｏとの間のアミド結合の優先的なフラグメンテーションを生じると考えられている。
【００８７】
実施例１０に従ってペプチドのＮ末端近傍に第２のスルホン酸基を付加することによってこの問題は、最小限に抑えられる。第２のスルホン酸基の付加は、ＭＡＬＤＩＰＳＤ解析で使用され正に荷電したイオンを生じるために、第２の「移動可能な」プロトンを必要とする。再び、理論によって制限されることを意図せず、相対的に塩基性の強いＰｒｏはすでにイオン化されているので、この第２のプロトンはその他の主鎖アミド基を自由にイオン化すると考えられている。
その他の主鎖アミド基のプロトン化は、結果としてそのような基のフラグメンテーションを高め、ＭＡＬＤＩＰＳＤスペクトルにおいて相当するｙ−イオンの相対存在量を高める。実施例１０に従って形成された誘導体のＰＳＤスペクトルにおいて、ｙ７イオンに比べたｙ３イオン及びｙ４イオンの量は、それぞれ４１％及び５７％に上昇する（ピークの高さの比）。
【００８８】
実施例１８
Ｃ末端にて又はその近傍でリジンを有するペプチドから作製される質量分析のフラグメンテーションパターンは、本明細書に記載されるように、リジンをホモアルギニンに変換し、酸性基で誘導体化することにより改善できることが多い。Ｎ末端アミンでの感知できるほどの反応なしで及び加水分解のような感知できるような副反応なしで、リジン側鎖のイプシロンアミノ基をさらに塩基性の強いグアニジニウム基に効率よく変換することができる。この変換を達成するアプローチの１つはグアニジン化試薬としてＯ−メチルイソウレア又はその塩を用いる。例えば、ボネット（Ｂｏｎｅｔｔｏ）らの「Ｌｙｓ及びＣｙｓ残基の誘導体化の後、カルボキシペプチダーゼ及び質量分析法を用いたペプチド及びタンパク質のＣ末端配列分析」アナリティカルケミストリ（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）第６９巻１３１５〜１３１９ページ、（１９９７年）を参照のこと。本実施例では、グアニジン化したペプチドを次いでＮ末端にて誘導体化し、質量分析法による配列決定に先立ってスルホニル基を提供する。当業者は、リジンをホモアルギニン誘導体に変換する反応とＮ末端を誘導体化して酸性基を導入する反応の順序は、反応条件の適当な制御によって入れ換えて同じ誘導体を得ることができることを理解することができる。
【００８９】
【化１１】
2004505248.tif 000013
【００９０】
使用の前に、Ｏ−メチルイソウレア水素サルフェート（ウィスコンシン州ミルウォーキーのアルドリッチケミカル社（Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ）から市販）をＨ２Ｏで０．５Ｍに調製する。ポリペプチドＶＧＧＹＧＹＧＡＫ（１〜１０ｎＭ、ミズーリ州セントルイスのシグマケミカル社から市販）（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１０）を２０μＬのＨ２Ｏ：ＤＩＥＡ１９：１ｖ：ｖに溶解する。２μＬの０．５ＭのＯ−メチルイソウレア水素サルフェートを加え、ペプチド溶液を攪拌する。溶液のｐＨをチェックし、（必要に応じて調整し）、それが塩基性であることを確認する。室温にて反応を一晩進める。次いで、少量の原液トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を加えることにより反応を止める。次いで、市販のＣ１８カラム（ジップチップ（ＺｉｐＴｉｐ）（商標）、マサチューセッツ州ベッドフォードのミリポアコーポレーション）を用いて酸性溶液をクリーンアップし、０．１％のＴＦＡを含有する１０μＬのアセトニトリル：水１：１ｖ：ｖで溶出する。次いで、溶液をスピードバックで乾燥し、試料を２０μＬのＴＨＦ：ＤＩＥＡ１９：１ｖ／ｖで再構築する。この溶液のｐＨをチェックして塩基性であることを確認する。２μＬのクロロスルホニルアセチルクロリド溶液を、１ｍＬの無水ＴＨＦ（実施例２を参照のこと）における２μＬの試薬原液で希釈することにより調製し、加えて、試料を攪拌する。室温にて１〜２分間、スルホン化反応を進める。次いで、試料をスピードバックにて乾燥し、２０μＬの０．１％ＴＦＡで再構築する。次いで試料をジップチップ（商標）Ｃ１８カラムでクリーンアップし、０．１％のＴＦＡを含有する少量のアセトニトリル：水１：１で溶出する。当量の試料を２，５−ジヒドロ安息香酸で希釈し、ＭＡＬＤＩポストソース崩壊質量分析法により解析する。スペクトルは、Ｃ末端におけるホモアルギニンから無処理のグアニジン化ペプチド分子のイオンに伸びるｙ−イオンの完全なシリーズを示す。
【００９１】
実施例１９
１つ以上の１３Ｃ又は１５Ｎを含有するＯ−メチルイソウレア又はその塩の同位体で標識した形態を用いてタンパク質の複雑な混合物におけるタンパク質の相対レベルを正確に定量することができる。この能力は、以前開発された同位体コード化親和性タグ法に類似している。例えば、ガイギ（Ｇｙｇｉ）らの「同位体をコード化した親和性タグを用いた複雑なタンパク質の混合物の定量的分析」、ネイチャーバイオテクノロジー（Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）第１７巻９９４〜９９９ページを参照のこと。この能力は定量的プロテオーム分析で特に有用である。細胞又は組織（対照試料）において１つの状態を示している１つのタンパク質混合物におけるリジン側鎖を天然に豊富な同位体を有するＯ−メチルイソウレア又はその塩のような試薬を用いてグアニジン化する（同位体として軽い形態の試薬）。
【００９２】
細胞又は組織（実験試料）で第２の状態を示している等量のタンパク質のリジン側鎖を１つ以上の１３Ｃ又は１５Ｎの元素を濃縮したレベルで含有するＯ−メチルイソウレア又はその塩のような試薬を用いてグアニジン化する（同位体として重い形態の試薬）。２つの誘導体化されたタンパク質混合物を次いで合わせる。例えば１Ｄ又は２Ｄゲル電気泳動のような技術を用いて次いで、合わせられた試料を分離する。付加されたグアニジニウム基を含有するペプチドを生じる分離の後、関心のあるペプチドを消化する。消化は、例えば、トリプシンを介して達成してもよい。例えば、セイドル（Ｓｅｉｄｌ）らの「ボウマン−バーク（Ｂｏｗｍａｎ−Ｂｉｒｋ）大豆阻害剤のグアニジン化：ホモアルギニンを含むペプチド結合のトリプシン加水分解の証拠」、バイオケミカル及びバイオフィジカルリサーチコミュニケーションズ（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ）第４２巻１１０１〜１１０７ページ、（１９７１年）を参照のこと。例えば、ＭＡＬＤＩ質量分析法を用いた質量分析によって又はエレクトロスプレーイオン化を用いたオンラインＬＣ（又はＣＥ）ＭＳによって、得られるペプチドの混合物を直接分析する。別の方法としては、合わせたグアニジン化タンパク質試料を消化し、種々のオンラインＨＰＬＣ又はＣＥ質量分析法で解析する。グアニジン化試薬の同位体として軽い形態及び重い形態を含有する同一のペプチドイオン（同一のペプチド配列）の対のシグナル相対強度を測定することにより２つの試料（対照及び実験試料）におけるタンパク質の比を定量する。次いで、試料の対照状態と実験状態の間で相対濃度が変化しない代表的なタンパク質に対して較正することによって、２つの試料における相対的なタンパク質濃度の正確な定量が可能である。
【００９３】
観測されるペプチドの多くは１つ以上の付加されたグアニジニウム基を含有するので、１回の消化から各タンパク質について数種の定量的測定が得られる。１つのタンパク質目的物について複数の定量的測定を行う能力によって方法の定量的精度が高められる。別々にグアニジン化されたタンパク質の混合物の消化から、又はグアニジン化されたタンパク質混合物の消化から得られるペプチド混合物は、例えば、クロロスルホニルアセチルクロリド（実施例２、１８を参照のこと）のような種々のスルホン化試薬を用いてＮ末端にて、本明細書に記載されるように酸性基で誘導体化することができる。次いで、質量分析法（例えば、ＭＡＬＤＩポストソース崩壊又はエレクトロスプレータンデム質量分析法）を用いてスルホン化されたペプチドの新規配列決定を行う。得られる質量分析のフラグメンテーションパターンは主としてｙ−イオンを呈する。所望の形態を明瞭に選択するのに十分な解像度を有する質量分析計を用いて、グアニジン化されたペプチドのいずれかの同位体形態でタンデム質量分析法による配列決定実験を行う。別の方法としては、タンデム質量スペクトルに寄与するグアニジン化ペプチドイオンの両方の同位体形態でペプチド配列決定実験を行う。この後者の方法も主としてｙ−イオンから成るスペクトルを生じる。しかしながら、各ｙ−イオンは、付加されたグアニジニウム基の同位体として重い形態と軽い形態の間の既知の質量差によって分離される「二重」成分として観測される。ペプチドの配列は、上述のように隣接するｙ−イオンの質量差を測定することによって配置される。対照試料及び実験試料におけるタンパク質の相対量は、グアニジン化されたペプチドにおけるｙ−イオン二重成分のそれぞれについて観測される各同位体の量比を測定することにより独立して決定される。この技術によって、同一の実験から定量的タンパク質解析及び新規のペプチド配列決定の双方が提供される。定量的プロテオミクスの適用に特に有用であるはずである。
【００９４】
本発明のキット
本発明のさらなる実施形態は、ポリペプチドのアミノ酸配列を決定するのに利用されてもよいキットである。キットは以下を含む：
（ａ）ポリペプチド又はポリペプチドの１つ以上のペプチドとカップリングするときに約２未満のｐＫａを有する酸性部分を提供する１つ以上の酸性部分試薬；及び
（ｂ）１つ以上の酸性部分試薬でポリペプチドのＮ末端又はポリペプチドの１つ以上のペプチドのＮ末端を誘導体化するための手段
（ｃ）リジン側鎖をさらに強い塩基性の基、固定的に荷電した誘導体又は同位体で標識した基に変換する１つ以上の試薬；及び
（ｄ）ポリペプチドのリジン側鎖又はポリペプチドの１つ以上のペプチドのリジン側鎖におけるイプシロンアミノ基をリジン修飾試薬で誘導体化する手段。
本発明のキットは、例えば１９９８年１０月２７日に発行され、パーセプティブバイオシステムズ社（ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、 Ｉｎｃ．）に譲渡されたパターソン（Ｐａｔｔｅｒｓｏｎ）らの米国特許第５，８２７，６５９号に記載されるサンプルホルダーとして同様の形式にて質量分析計に適合してもよい。
【００９５】
任意で、キットはさらに、例えば、質量分析技術の精度を調べるための１つ以上の検定用ペプチドを含んでもよい。参照の質量スペクトルデータも任意で包含されてもよい。
キットに包含されてもよい酸性部分試薬及びリジン修飾試薬の一部は上述されている。
誘導体化するための特に好ましい手段には、誘導体化されたポリペプチド又はペプチドを入手することに関心のある分析者又はその他の人に都合の良い誘導体化ができるようなものが挙げられる。誘導体化するのに特に好ましい手段は、例えば酸性部分試薬及び／又はリジン修飾試薬及び最終的に関心のあるポリペプチド／ペプチドを含有する１つ以上の格納装置を含む。
【００９６】
好適な格納装置には、例えば、バイアル瓶、チューブ、ピペットチップ、プレート、サンプルホルダー、及び多穴プレートが挙げられる。誘導体化試薬が格納装置の中に入っているので分析者によって添加される必要がない任意の好都合が提供される。例えば、酸性部分試薬は、ピペットチップの内部に存在し、ポリペプチド、ペプチド又はリジン修飾ポリペプチド又はペプチドが好適な緩衝液とともにチップの中に吸い込まれたとき活性化されてもよい。格納装置は最も好ましくは使い捨てであるが、そうである必要はない。
誘導体化試薬は固体支持体に結合されてもよい。例えば、試薬はピペットチップの内部で支持体に結合してもよいし、多穴プレートの穴にコーティングされてもよい。関心のあるポリペプチド又はペプチドを適当な緩衝系に溶解し、結合された試薬の上に繰り返しかけてもよいし、又は試薬がコーティングされた多穴プレートの中で反応させてもよい。反応後、適当量の誘導体化したポリペプチド又はペプチドを直接ＭＡＬＤＩ質量分析法試料ステージに負荷してもよいし、又はエレクトロスプレーイオン化質量分析装置に注入してもよい。
【００９７】
誘導体化を促進する１つ以上の緩衝系も本発明のキットに包含されてもよい。包含されるのに適当な緩衝系は包含される誘導体化試薬に依存する。好ましい緩衝系の例は、上記誘導体化の実施例で開示されている。特に好ましい緩衝系には、第３級アミン溶液（水性及び非水性の両方（例えば、テトラヒドロフランの溶液））及び原液の第３級アミンが挙げられるが、これに限定されない。特に好ましい第３級アミン類には、トリメチルアミン、トリエチルアミン、及びジイソプロピルエチルアミンが挙げられる。
本発明のキットはまた、本明細書で上記したもののようなさらなる消化助剤の１つを含んでもよい。消化助剤は化学的であっても、酵素的であってもよい。例えば、トリプシン、エンドプロテイナーゼＬｙｓ　Ｃ、エンドプロテイナーゼＡｒｇ　Ｃ、及び／又はキモトリプシン、好ましくは、トリプシン、エンドプロテイナーゼＬｙｓ　Ｃ、及び／又はエンドプロテイナーゼＡｒｇ　Ｃ、及び最も好ましくはトリプシンが消化助剤として挙げられ得る。臭化シアンのような化学的消化助剤も本明細書に包含され得る。
【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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2004505248.tif 000054
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