(57)【要約】本発明は、脂肪酸、油および油脂を効果的および効率的に分解する、グラム陽性微生物、バシルス  メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）を開示している。脂肪酸および油脂を分解するための前記微生物を含む組成物および方法もまた開示している。生物分解微生物に対するグリセロールの有効性が、生物分解を増強するために見いだされた。【特許請求の範囲】
【請求項１】
株ＳＢ−３１１２、ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−３１４２の特徴をすべて持つ、バシリウス  メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）の生物学的に純粋な培養液。
【請求項２】
株ＳＢ−３１１２、ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−３１４２の特徴をすべて持つ、バシリウス  メガタリウムを含む組成物、および非毒性栄養素処方、界面活性剤、活性剤、保存剤、充填材、安定剤、香料、粘着剤、酵素からなる群より選択される成分、およびこれらの混合物。
【請求項３】
さらに、さらなる種類の細菌を含む、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
前記さらなる種類の細菌が、アシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、アゾスピリラム（Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ）、ブルコルデリア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）、バシルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、セリポリオシス（Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ）、エンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、エシュリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、ラクトバシルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ペネバシルス（Ｐａｅｎｅｂａｃｉｌｌｕｓ）、パラコッカス（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）、スフィンゴモナス（Ｓｙｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ）、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、チオバシルス（Ｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）、キサントモナス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）、およびその混合物からなる群より選択される、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
前記細菌が、バシルス  リチェニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バシリウス  アミオリキオファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｏｌｉｑｕｏｆａｃｉｅｎｓ）、バシリウス  フェボラクチクス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆａｅｖｏｌａｃｔｉｃｕｓ）、バシリウス  パストウニ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐａｓｔｅｕｒｉｉ）、バシリウス  サブティルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｕｓ）、バシリウス  メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）およびこれらの混合物からなる群より選択される、請求項３に記載の組成物。
【請求項１１】
前記成分が、すべてのパーセンテージが、ｖ／ｖである、以下の、
（ｉ）約１×１０５〜約１×１０９ＣＦＵ／ｍｌの範囲の、バシリウス  メガテリウム  ＳＢ３１１２、ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−３１４２、
（ｉｉ）約０．０１％〜約１０％の範囲のグリセロール、
（ｉｉｉ）０．１〜１０％の範囲の界面活性剤、
（ｉｖ）１ｐｐｍ〜１．０％の範囲の保存剤、
（ｖ）０．０２％〜１％の範囲の着色料、
（ｖｉ）０．０２％〜１．０％の範囲の香料、
（ｖｉｉ）０．０５〜５％の範囲の粘着剤、
である、請求項２の組成物。
【請求項１２】
バシリウス  メガテリウム  ＳＢ３１１２、ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−３１４２を含む組成物に、脂肪酸、油脂、または脂肪酸と油脂を暴露することを含む、脂肪酸または油脂を分解するための方法。
【請求項１３】
前記組成物に、生物学的分解活性剤を添加する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記活性剤が、約０．００１％〜約１０％（ｖ／ｖ）の範囲での、グリセロールである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
脂肪酸および油脂のバイオアベイラビリティを増強するために、前記組成物に界面活性剤を添加する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
生物学的分解のために使用する微生物の生物学的分解活性を増強するために、効果量にてグリセロールを使用可能にすることを含む、微生物の生物学的分解活性を増強するための方法。
【請求項１７】
前記グリセロールの量が、約５ｐｐｍ〜約１％（ｗ／ｖ）の範囲である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記微生物が、バシリウス種に属する、請求項１７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、脂肪、油および油脂を分解する、グラム陽性生物を同定することに関する。さらにとりわけ、本発明は、細胞外リパーゼを産出し、また脂肪酸および油脂を効果的に酸化または分解する、非病原性、胞子形成グラム陽性、脂肪親和性細菌株を提供することに関する。本発明はさらに、前記グラム陽性生物を含む液体または乾燥処方に関し、またグリセロールを用いる、脂肪酸分解を増強するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ほとんどのフードサービス施設は、キッチンまたは食物調製領域より下水へ、直接油脂が流れることを阻止する器具を所有すること、または一部委廃棄物処理システムをもつことが必要である。一般的に、油脂トラップと呼ばれる、そのような器具は、油および油脂が、物理的に、講習衛生的下水に直接流れることを防止し、最終的な固体廃棄物処理のために、分離油脂固体を保存するように働く。
【０００３】
多くの自治体は、油脂トラップからの排出物の、生物学的酸素要求（ＢＯＤ）および油および油脂（Ｏ＆Ｇ）濃度に基づいて、制限および追加料金を決めている。廃棄水処理および追加料金に加えて、トラップからの油脂固体はまた、定期的に除去および廃棄されなければならない。ここで、フードサービス施設は、排出水処理のために、繰り返し発生する２つの負担、一つは自治体処理コスト、第二に油脂排出コストに直面する。
【０００４】
しかしながら、蓄積した油脂固体をくみ上げる頻度は、非常に不定であり、数週間から数ヶ月の範囲である。もしトラップが、通常の基準できれいにならなかった場合、油脂のつまりが起こりえ、排出水が、食物調製領域に戻り、悪臭の原因となり、問題が解決するまでその施設を閉鎖しなければならなくなる可能性がある。Ｏ＆Ｇをトラップするために物理的方法を提供することに加えて、油脂トラップは、バルク液体中のＢＯＤおよびＯ＆Ｇをトラップの分解を生物学的に仲介し、結果として、よりきれいな流出排出水となるように機能しうる。このＢＯＤとＯ＆Ｇの分解は、液圧保持時間に依存し、これは、油脂トラップおよび排出水流出の大きさに依存する。油脂トラップ内の生物学的活性に影響する他の因子には、ｐＨ、温度および施設が生物添加を実施するかどうか、が含まれる。
【０００５】
生物添加、システムに生物学的活性を増強させる市販の細菌産物を添加することは、油脂トラップからの排出液中のＢＯＤおよびＯ＆Ｇを減少させるために使用されてきた。これは、フード施設が、排出水サービスのために、自治体に払わなければならない追加料金を少なくする手助けをする。さらに、生物添加は、油脂トラップのくみ上げ頻度を減少させるため、下水ラインを解放したままにするため、および悪臭を減少させるために使用されてきた。
【０００６】
油脂トラップに加えて、生物添加はまた、リフト局、下水ライン、腐敗物タンク、廃棄処理施設および、油脂蓄積が、流出問題および悪臭を引き起こしうる他の状態からの、油脂の除去を助けるために、使用されてきた。
【０００７】
生物添加産物は、液体または乾燥物のいずれかであり得る。取り扱いが簡単なので、液体産物が一般的に好まれ、定期的な基準でいっぱいになる容器上で液体調量ポンプ吸引によって添加しうる。しかしながら、乾燥処方も、排出処理施設のような他の適用で好まれる。
【０００８】
油脂適用の生物添加で使用される種は、重要な細胞外酵素、リパーゼを産出する。この酵素は、油脂を作り出している、グリセロール骨格と脂肪酸部位の間のエステル結合を加水分解し、破壊する。グリセロールは、生物分解によって素早く処理される。しかしながら、脂肪酸は、分解するのが難しく、ｐＨ降下、つまりおよび悪臭を引き起こして、残る。
【０００９】
グラム陰性微生物が、液体産物として、生物添加のために使用される場合、植物細胞として、またそのようなものとして存在し、そのような処方でしばしば使用される、表面活性剤および保存剤のような化学物質によって殺される。したがって、グラム陰性生物を含む産物は、殺虫剤および表面活性際を含み得ない。その結果、保存されない液体産物は、産物中で増殖する、微生物汚染物質より、ひどい悪臭を発展させうる。これらの汚染物のいくつかは、フードサービス環境で望まれない可能性がある。さらに、保存されない産物はまた、保存期間および効果が減少しうる。明らかなのは、グラム陰性微生物が、脂肪酸分解において利点を持つ一方で、居住およびフードサービス産物でのそれらの使用が、重度の障害になる。
【００１０】
一方で、乾燥グラム陰性産物は、液体グラム陰性処方に対して、保存期間が改善されるという利点を持つ。しかしながら、この利点は、中程度であり、細菌種間にて有意に変化する。乾燥産物は、水および適用された同様の液体産物によって再水和されるけれども、グラム陰性微生物を含む保存されない液体を使用することの不利がまた、再水和された乾燥物質にも適用される。
【００１１】
多くのグラム陰性微生物は、リパーゼの活性によって作り出される、脂肪酸を生物分解させる能力を持つと知られている。脂肪酸を酸化および分解するこの能力は、一般的に、グラム陽性、胞子形成微生物、とりわけ、バシルスの種のメンバーでは見られない。
【００１２】
したがって、悪臭、またはグラム陰性生物で起こるような他の望ましくない条件なしに、脂肪、油および油脂を効果的、および効率的に分解または酸化することが可能な、生物添加処方を開発する必要が存在する。
【００１３】
とりわけ、細胞外リパーゼを産出し、脂肪酸および油脂を効率的に酸化または分解する、非病原性、胞子形成グラム陽性、脂肪親和性細菌種を発見する必要性が存在する。これまでに、このようなグラム陽性生物および同様のものを含む処方は、同定または産出されてきていない。
【００１４】
脂肪酸分解微生物が同定されたならば、さらに、それに基づいた産物の効果を最大化するために、そのような微生物の脂肪酸分解活性を増加させるか、または増強させる必要性が存在する。
【００１５】
（発明の要約）
したがって、細胞外リパーゼを産出し、また、脂肪酸および油脂、または脂肪酸と油脂の混合物を効率的に加水分解、または分解する、非病原性、胞子形成グラム陽性、脂肪親和性細菌種を提供することが、本発明の目的である。
【００１６】
細胞外リパーゼを産出し、脂肪、油および油脂を効率的に加水分解または分解する、非病原性、胞子形成グラム陽性、脂肪親和成細菌種を含む、液体または乾燥組成物を提供することが、本発明のさらなる目的である。
【００１７】
バシルス種のグラム陽性種を用いて、脂肪酸および油脂を分解するための方法を提供することが、本発明のさらなる目的である。
【００１８】
バシルス種のグラム陽性種の生物分解活性を増強することが、本発明のまた他の目的である。
【００１９】
活性増強剤として、グリセロールを用いる、微生物の脂肪酸分解活性を増大させるための方法を提供することが、本発明のさらなる目的である。
【００２０】
本発明の種々の他の目的および利点が、図面の簡単な記述および本発明の詳細な記述より、明らかになるであろう。
【００２１】
本発明のさらなる利点および新規特徴を、以下の記述で、一部列記し、以下の実験、および本発明の実施によって理解されることで、当業者により明らかになるであろう。
【００２２】
（発明の詳細な記述）
本発明の上記、および種々の他の目的および利点は、ＡＴＣＣ受け入れ番号第ＰＴＡ−３１４２の同定されている特徴を持つ、グラム陽性細菌、バシルス  メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、株ＳＢ３１１２の生物学的に純粋な培養液、およびそれを含む組成物によって実現される。受け入れは、発行特許の全期間に渡り、ＡＴＣＣにおいて、適した状態で保持され、制限なしに、しかし受け入れを管理する法律の規定にしたがって、非商業的使用のために、任意の個人または団体に対して入手可能であるようになる。
【００２３】
他に定義されない限り、本明細書で使用するところのすべての技術的および科学的語句は、本発明に属する当業者によって一般的に理解されるのと同様の意味を持つ。本明細書で使用されたのと同様または等しい任意の方法および物質が、本発明の実施または試験で使用可能であるけれども、本明細書で記述された方法および物質が好ましい。他に言及しない限り、本明細書で使用されたかまたは意図された技術は、当業者によってよく知られている標準の方法論である。物質、方法および例は、ただ単に例示のためであり、限定はしていない。
【００２４】
本明細書で使用されるところの語句「生物分解（ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ）」、「生物分解された（ｂｉｏｄｅｇｒａｄｅｄ）」、または「生物分解されている（ｂｉｏｄｅｇｒａｄｉｎｇ）」は、基質が、微生物によって化学変化、酸化または分解されることを意味する。また、本明細書で使用されるところの語句「活性増強（ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ）」は、微生物の生物分解活性が、特定の成分の存在、または添加によって増加することを意味し、前記成分は、「活性増強剤（ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｅｎｈａｎｃｅｒ）」または「活性剤（ａｃｔｉｖａｔｏｒ）」として表される。
脂肪酸を酸化できる、グラム陽性、胞子形成生物を使用することによって、改善された保存液体産物、安定である、および乾燥産物を使いやすい利点を得ることができる。グラム陰性含有産物と違い、保存胞子に基づくグラム陽性含有産物は、胞子が、比較的殺虫剤および界面活性剤に抵抗性であることから、脂肪、油、または油脂の生物分解を補助するために、保存剤および界面活性剤を含めることが可能である。さらに、これらの産物はまた、微生物の増殖を促進する微少栄養素も含むことが可能である。したがって、保存液体処方中での、リパーゼ産出、脂肪酸分解、胞子形成微生物を含むグラム陽性産物は、油および油脂の有効な分解のために必要な種々の利点を提供する。乾燥産物もまた、ＳＢ３１１２の活性より利益を得る。
【００２５】
油脂トラップ、または脂肪酸または油脂を分解する必要のある場合の他の同様の使用に関して、本発明にしたがって処方した、液体および乾燥産物はまた、界面活性剤、殺虫剤に加えて、増殖促進、非毒性量の無機栄養素および微少栄養素、特定の活性エンハンサー、安定剤、粘着剤、酵素、充填剤、保存剤などを含めることができる。表１は、本発明にしたがったＳＢ３１１２に加えて、液体処方に含めることが可能な、種々の成分の例を列記している。
【００２６】
液体および乾燥処方両方での他の含有物を、以下で例示する。
【００２７】
（Ａ）他の微生物は、アシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、アゾスピリラム（Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ）、ブルコルデリア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）、バシルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、セリポリオシス（Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ）、エンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、エシュリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、ラクトバシルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ペネバシルス（Ｐａｅｎｅｂａｃｉｌｌｕｓ）、パラコッカス（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）、スフィンゴモナス（Ｓｙｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ）、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、チオバシルス（Ｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）、およびキサントモナス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）からなる群より選択されうる。
【００２８】
（Ｂ）バシルス属のなかで、微生物は、バシルス  リチェニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バシリウス  サブティルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｕｓ）、バシリウス  アミオリキオファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｏｌｉｑｕｏｆａｃｉｅｎｓ）、バシリウス  レボラクチクス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌａｅｖｏｌａｃｔｉｃｕｓ）、バシリウス  パストウニ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐａｓｔｅｕｒｉｉ）、およびバシリウス  メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）およびこれらの混合物からなる群より選択されうる。保存剤は、１，２−ベンズイソチアゾリン−３−オン、５−クロロ−２−メチル−４−イソチアゾリン−３−オン、２−メチル−４−イソチアゾリン−３−オン、クアテルニウム−１５、フェノール、ｏ−フェニルフェナートナトリウム、ｏ−フェニルフェノール、６−アセトキシ−２，４−ジメチル−ｍ−ジオキサン、クロロヘキシジン、トリス（ヒドロキシメチル）ニトロメタン、ヘキサヒドロ−１，３，５−トリス（２−ヒドロキシエチル）−ｓ−トリアジン、ｐ−ヒドロキシ安息香酸、またはそのメチル、エチル、プロピルまたはブチルエステル、安息香酸、アスコルビン酸、クエン酸またはソルビン酸、イミダゾリジニル尿素、ジアゾリジニル尿素、ジメチロールジメチルヒダントイン、メチレンビスチオシアネート、２−ブロモ−２−ニトロプロパン−１，３−ジオール、１，２−ベンズイソチアゾリン−３−オン、メチルアントラニレートおよびその混合物からなる群より選択される。
【００２９】
（Ｃ）界面活性剤は、トリデセス−３、直鎖一級Ｃ１２〜１４アルコールの３モルエチレンオキシド添加物、直鎖一級Ｃ１２〜１４アルコールの７モルエチレンオキシド添加物、ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸アンモニウム、ドデシルベンゼンスルホン酸、ラウリル硫酸アンモニウム、キシレンスルホン酸ナトリウム、ラウリル硫酸ナトリウム、コカミドジエタノールアミン、酸化ラウラミン、ナトリウムアルファスルホメチルＣ１２〜１８エステルおよびジナトリウムアルファスルホＣ１２〜１８脂肪酸塩、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム、アルキルポリグリコシド、分岐ノニルフェノキシポリ（エチレンオキシ）エタノール、分岐、ノニルフェノキシポリ（エチレンオキシ）エタノール、アルコキシル化直鎖アルコール、直鎖一級１２〜１４炭素数アルコールのエトキシレートの混合物、直鎖硫酸アルキル、アルカノールアミド、炭酸マグネシウム上に吸着したオクチルフェノキシポリエトキシエタノール、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウムおよびイソプロピルアルコール、ポエ（６）トリデシルアルコール、ポリ（オキシ−１，２−エタンジイル）、分岐アルファ（ノニルフェニル）−オメガヒドロキシ、または本技術分野で公知の他の界面活性剤、またはこれらの混合物からなる群より選択される。
【００３０】
（Ｄ）栄養素は、リン酸二ナトリウム、リン酸一ナトリウム、チオ硫酸ナトリウム、硫酸アンモニウム、硫酸マグネシウム、硫酸マンガン、硫酸第一鉄、硫酸カリウム、硫酸二カリウム、硫酸一カルシウム、塩化マグネシウム、塩化カルシウム、キレート鉄、塩化マンガン、モリブデン酸ナトリウム、塩化コバルト、硝酸ナトリウム、パン酵母、酵母抽出物、大豆ペプトン、スキムミルク粉末、牛肉抽出物、サルサポニン、乳清、ゼラチンおよび尿素、本技術分野で公知の他のもの、およびこれらの混合物からなる群より選択される。
【００３１】
（Ｅ）乾燥充填剤は、でんぷん、塩化ナトリウム、グルコース、重炭酸ナトリウム、トウモロコシ穂軸、ぬかおよび種々の粒に挽いた穀物からなる群より選択される。
【００３２】
（Ｆ）酵素は、プロテアーゼ、アミラーゼ、リパーゼおよびセルラーゼ、ならびに本技術分野で公知の他の酵素、およびこれらの混合物からなる群より選択される。
【００３３】
（Ｇ）種々の成分が、本発明にしたがった乾燥産物組成物中に含まれる、範囲（ｗ／ｗ）は、以下のような、
（ｉ）約１×１０５〜約５×１０１１ＣＦＵ／ｇの範囲のＳＢ３１１２、
（ｉｉ）約０〜約１０％の範囲のグリセロール、
（ｉｉｉ）０〜１０％の範囲の界面活性剤、
（ｉｖ）０〜１％の範囲の酵素
（ｖ）０〜１．０％の範囲の保存剤、
（ｖｉ）約０〜２０％の範囲の栄養素、
（ｖｉｉ）０〜９５％の範囲の充填剤、
である。
【００３４】
（Ｈ）種々の成分が、本発明にしたがった液体産物組成物中に含まれる、範囲（ｗ／ｖ）は、以下のような、
（ｉ）約１×１０５〜約５×１０１１ＣＦＵ／ｍｌの範囲のＳＢ３１１２、
（ｉｉ）約０〜約１０％の範囲のグリセロール、
（ｉｉｉ）０〜１０％の範囲の界面活性剤、
（ｉｖ）１ｐｐｍ〜１．０％の範囲の保存剤、
（ｖ）０〜１％の範囲の着色料、
（ｖｉ）０〜１．０％の範囲の香料、
（ｖｉｉ）０〜５％の範囲の粘着剤、
（ｖｉｉｉ）０〜２０％の範囲の栄養素、
（ｉｘ）０〜１％の範囲の酵素
である。
【００３５】
（ＳＢ３１１２の優位性）
他のバシルス  メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）株に対する、ＳＢ３１１２の予期しない有意な優位性を示すために、以下の同時の比較研究を、株１、株２、株３と指定した、３つの他のバシルス  メガテリウム株を用いて実施した。ステアリン酸（ＳＡ）およびグリセロール（Ｇ）を基質として使用した。ステアリン酸分解を、標準の呼吸計（酸素取り込み）測定によって決定し、すべての研究で、無菌技術を用いた。
【００３６】
ＣＥＳ  ＡＥＲ−２００呼吸計ユニットを用いた。５００ｍｌ呼吸計器ボトルには、ｐＨ７．２に調製した、ＳＳＣ３最小塩培地および２０ｍＭ  ＭＯＰＳを含めた。呼吸計ボトルを、各ボトルにＳＳＣ３最小塩培地を加えることで調製した。この培地には、水１リットルあたり、以下の化学物質、ＮＨ４Ｃｌ、０．８ｇ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．２ｇ、ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、１０ｍｇ、Ｆｅ２Ｎａ２エチレンジアミンテトラ酢酸、１５ｍｇ、ＫＨ２ＰＯ４、３．０６ｇ、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、２８μｇ、ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、１４０μｇ、ＭｎＳＯ４・Ｈ２Ｏ、８４μｇ、ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、２４μｇ、ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、２５μｇ、ＮａＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ、２４μｇが含まれる。緩衝液、３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）を、リットルあたり４．２８ｇ加えた。本培地のｐＨを、オートクレーブの前に７．０に調製した。ＳＳＣ３培地を含むボトルを、２時間オートクレーブした。
【００３７】
標的基質、１０００ｐｐｍステアリン酸（ＳＡ）を、以下に示したように加えた。ＳＡを計量し、オートクレーブの前に適切な反応器に、別々に加えた。グリセロール、５００ｐｐｍｖを、すべてのボトルに加えた。グリセロールをまず、脱イオン化水にて５０％  ｖ／ｖ希釈し、粘着度を減少させ、０．５ｍｌを、オートクレーブの前に、各反応器に加えた。微生物の純粋培養液を接種材料として使用した。プレート計数培養液（ＰＣＢ）中での一晩培養液の光学密度（ＯＤ）を、細菌総数を見積もるために測定した。各反応器内への標的用量は、培養液の光学密度測定に基づいて、１×１０６ＣＦＵ／ｍｌであった。接種に続き、二酸化炭素を除去するために、５ｍｌの３０％ＫＯＨを含む腐食性トラップをボトル中に懸濁し、隔膜キャップをきつく閉めた。ＭａｃＣｏｎｋｅｙストリークを、グラム陰性汚染がないことを確かめるために、その使用の前に、接種材料において実施した。ＭａｃＣｏｎｋｅｙおよび標準法アガー（ＳＭＡ）プレートストリークをまた、実験の最後に、各ボトルの成分において実施した（ＭａｃＣｏｎｋｅｙアガープレートを、グラム陰性汚染を検出するために使用した。ＳＭＡプレートを純培養液に関して試験するために使用した）。
【００３８】
処理（二重）は以下のようであった。
【００３９】
グリセロール＋ＳＢ３１１２
グリセロール＋ステアリン酸＋ＳＢ３１１２
グリセロール＋株１
グリセロール＋ステアリン酸＋株１
グリセロール＋株２
グリセロール＋ステアリン酸＋株２
グリセロール＋株３
グリセロール＋ステアリン酸＋株３
以上で記したように、すべての培養液を、ステアリン酸＋グリセロールで試験した。グリセロールのみの対照をまた、各個々の株に関してモニタした。
【００４０】
各株に関するステアリン酸分解遅延相、酸素取り込み速度、および総累積酸素取り込みに関する値を表２に示した。これらの酸素取り込み速度は、三点平均を用いて計算し、最大値を示している。データは明らかに、ＳＢ３１１２がより優れていることを示し、試験したすべての他の株と比較して、最も短い遅延相、最も速い取り込み速度、および最も大きい累積酸素取り込みを持つことで、ステアリン酸においてもっとも活性を示している、驚くべき結果を示唆している。
【００４１】
（種々の脂肪酸を分解するためのＳＢ３１１２の有効性）
他のバシルス  メガテリウム下部と比較した、ＳＢ３１１２の優位性を決定するために、以下の研究を実施し、脂肪酸を分解することに関するＳＢ３１１２の有効性を決定した。本目的のために、以下に列記したように、複数の脂肪酸（９９％またはそれ以上の純度）を、市販の供給源より得た。
【００４２】
オレイン酸、Ｃ−１８：１
ステアリン酸、Ｃ１８
パルミチン酸、Ｃ−１６
バレリアン酸、Ｃ−５
酪酸、Ｃ−４
酢酸、Ｃ−２
呼吸計（酸素取り込み）活性を、脂肪酸を分解するためのＳＢ３１１２の能力を測定するために使用した。
【００４３】
ＣＥＳ  ＡＥＲ−２００呼吸計ユニットを用いて、２５℃にて維持した５００ｍｌのボトル中の酸素取り込みをモニタした。５００ｍｌボトルは、ＳＳＣ３最小塩培地および２０ｍＭ  ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．２に調整）を含めた。グリセロール、５００ｐｐｍｖを、すべてのボトルに加えた。グリセロールをまず、脱イオン水にて５０％  ｖ／ｖに希釈し、粘着度を減少させ、０．５ｍｌを各反応器に加えた。高分子量脂肪酸（Ｃ−１６およびＣ−１８）を個々に計量し、オレイン酸をのぞいて、１０００ｍｇ／Ｌ濃度まで適切なボトルに加えた。オレイン酸は２００ｍｇ／Ｌで試験した。低分子脂肪酸（Ｃ−２、Ｃ−４およびＣ−５）を、化学物質抵抗性フィルター（０．２μｍ）を用いて濾過滅菌し、１０００ｍｇ／Ｌ濃度になるように、適切なオートクレーブ済みボトルに加えた。
【００４４】
ＳＢ３１１２の純培養液を、接種材料として使用した。光学密度（ＯＤ）を、細菌総数を見積もるために測定した。各反応器内への標的用量は、培養液の光学密度測定に基づいて、１×１０６ＣＦＵ／ｍｌであった。ＭａｃＣｏｎｋｅｙストリークを、グラム陰性汚染がないことを確かめるために、その使用の前に、接種材料において実施した。無菌技術をすべての実験で使用した。
【００４５】
（処理（以下で示したように、数は三重を示している））
１，２，３  グリセロールのみ対照
４，５，６  Ｃ−１８
７，８，９  Ｃ−１６
１０，１１，１２  Ｃ−５
１３，１４，１５  Ｃ−４
１６，１７，１８  Ｃ−２
１９，２０，２１  Ｃ１８−１
（Ｃは炭素鎖長を表している）
ＭａｃＣｏｎｋｅｙおよび標準法アガー（ＳＭＡ）アガーストリークを、実験の最後に、各ボトル成分にて実施した。ＭａｃＣｏｎｋｅｙアガープレートを、グラム陰性汚染を検出するために使用した。ＳＭＡプレートを、純培養液に関して試験するために使用した。汚染は観察されなかった。
【００４６】
脂肪酸のみの酸化に起因する酸素取り込み量を測定するために、グリセロールデータを脂肪酸＋グリセロールデータより差し引くことで、個々の脂肪酸に起因する酸素取り込み応答を計算した。実験の最後の時点での、各反応器のｐＨは、６．８〜７．２の範囲であった。標準方法アガー（ＳＭＡ）プレートを各ボトルよりストリーキングした。すべてのボトルが、実験の最後にＳＭＡプレート上で単一コロニー形態を示し、これは、純培養試験が達成されたことを示唆している。すべての最終ＭａｃＣｏｎｋｅｙストリークが陰性であった（グラム陰性汚染はなかった）。
【００４７】
表３は、種々の脂肪酸を分解するＳＢ３１１２活性を示している。酸素取り込み速度は、三点測定平均を使用して計算し、最大値を表中で示した。結果は、ＳＢ３１１２が、すべての脂肪酸（オレイン酸、ステアリン酸、パルミチン酸、バレリアン酸、酪酸および酢酸）を分解（酸化）することを示している。バレリアン酸および酪酸がとりわけ臭気があり、ＳＢ３１１２がこれらの化合物を分解するので、ＳＢ３１１２が、これらの、およびより小さな揮発性脂肪酸に起因する臭気を分解するのに有用でありうることが、注目されるであろう。
【００４８】
（油脂を分解するＳＢ３１１２の有効性）
以下の研究を、ＳＢ３１１２の、油脂を分解する有効性を示すために実施した。
【００４９】
呼吸計ボトルを、各ボトルに２５０ｍｌのＳＳＣ３最小塩培地を加えることによって調製した。培地のｐＨを、オートクレーブ前に７．０に調整した。ＳＳＣ３培地を含むボトルを、２時間オートクレーブした。廃棄キッチン油脂を別々にオートクレーブして、望まない微生物を滅菌した。油脂のオートクレーブに続いて、２ｍｌの熱無菌油脂を各冷却済み２５０ｍｌ呼吸測定ボトルに加えた。呼吸測定ボトルに対する接種を、各株の一晩培養液（プレート計数培養）または微生物の９００２混合液で実施した。各ボトルを、最初に〜３×１０５ＣＦＵ／ｍｌを含むように接種した。接種に続いて、二酸化炭素を除去するために、５ｍｌの３０％ＫＯＨを含む腐食性トラップをボトル中に懸濁し、隔膜キャップをきつく閉めた。
【００５０】
ＳＢ３１１２の優位性を示すために、２つの他の接種試料を使用して、比較研究を実施した。ここで、３つの接種は、以下のようであった。
【００５１】
１．バシルス  メガテリウム株ＳＢ３１１２
２．細胞外酵素リパーゼ、アミラーゼおよびプロテアーゼを産出する、４つの胞子（バシルス  リチェニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バシルス  アミロリキエファシエンズ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、バシルス  パストウリ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐａｓｔｅｕｒｉｉ）、およびバシルス  レボラクチクス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌａｅｖｏｌａｃｔｉｃｕｓ））の混合物を示している、接種９００２。本混合物は、キッチン廃棄物質の分解に影響を与えることが知られているが、しかし脂肪酸を分解はしない。
【００５２】
３．脂肪酸を分解するその能力に関して知られている、グラム陰性微生物の混合物を示している、接種ＳＢ３０１２およびＳＢ３０１３。
【００５３】
接種に続き、ＳＳＣ３培養液、廃棄キッチン油脂および接種材料を含むボトルを、呼吸計水浴（２３℃）内においた。ついで各ボトルを、呼吸計ポートに連結した。酸素の消費を、呼吸計によって連続的にモニタした。
【００５４】
本実験の結果を、図１に示している。本データは、グラム陰性微生物混合物（ＳＢ３０１２およびＳＢ３０１３）が、１．５ｍｇ  Ｏ２／Ｌ／時間の速度で、ほとんど即時に、酸素を消費し始めることを示している。９００２胞子混合物もまた、急速に酸素を消費し始めるが、１．２ｍｇ  Ｏ２／Ｌ／時間の速度は、ＳＢ３０１２およびＳＢ３０１３よりもわずかに低かった。株ＳＢ３１１２は、０．５ｍｇ  Ｏ２／Ｌ／時間の速度にて、酸素消費が始まる前に、５０時間の時間差をもつ。約１８０時間の時点で、ＳＢ３１１２では、胞子混合物９００２およびグラム陰性混合物両方をしのぐ、酸素消費の急速な上昇が始まった。１８０時間後、ＳＢ３１１２による酸素消費速度は、４．４ｍｇ  Ｏ２／Ｌ／時間であり、同時間間隔で比較すると、ＳＢ３０１２＋ＳＢ３０１３および９００２に関しては、それぞれ０．７および０．８ｍｇ  Ｏ２／Ｌ／時間である。接種しない対照は酸素取り込みを示さなかった（データは示していない）。
【００５５】
（ＳＢ３１１２の生物分解活性におけるグリセロールの影響）
以下の研究によって示したように、グリセロールの存在が、ＳＢ３１１２の生物分解活性を増強することが発見された。
【００５６】
ＳＢ３１１２培養液を、保持傾斜より得、標準の方法によってアガー上にプレートした。単一コロニーをピックアップし、ついで標準プレート計数培養液中で一晩増殖させた。測定した光学密度に基づいて、１×１０６ＣＦＵ／ｍｌ（標的）のＳＢ３１１２を各反応器に加えた。各基質（ステアリン酸およびグリセロール）を、オートクレーブ前に、反応管に加えた。反応器の大きさは、ＳＳＣ３オートクレーブ培地を含む５００ｍｌであった。
【００５７】
（処理（二重））
１，２  ステアリン酸、０．２％
３，４  ステアリン酸、０．２％＋０．１％グリセロール
５，６  グリセロール、０．１％
最終ＭａｃＣｏｎｋｅｙストリークを実施して、グラム陰性汚染を検出した。汚染は見られなかった。結果を図２に示している。データは、ＳＢ３１１２の脂肪酸分解活性が、グリセロールの存在または追加によって、有意に増強することを、明らかに示している。
【００５８】
（種々の微生物による脂肪酸分解におけるグリセロールレベルの比較研究）
種々のグリセロールレベルの関数として、種々の微生物の生物分解活性の比較を、活性物としてグリセロールの効果を示すために実施した。長鎖脂肪酸（ＬＣＦＡ）を標的基質として使用し、グリセロール（Ｇ）の水性連続希釈を使用して、活性剤としてのグリセロールの効果的濃度範囲を決定した。ＬＣＦＡ分解の測定を、呼吸計酸素取り込みによって測定し、微生物の生物分解活性の速度を、酸素取り込みの速度によって示した。使用した方法および物質は、本明細書以上の種々の実験に関して記述したものと同様であった。しかしながら、種々の研究の特徴は、以下に列記した各研究に関して言及している。バシルス  メガテリウム株は、ＡＴＣＣより得た。
【００５９】
（以下の実験のおのおのに対する、共通の方法）
ＣＥＳ  ＡＥＲ−２００呼吸計システムを使用した。５００ｍｌ呼吸計ボトル（反応器）には、ｐＨを７．２に調整した、ＳＳＣ３最小塩培地および２０ｍＭ  ＭＯＰＳを含めた。標的基質、ＬＣＦＡを、以下の個々の実験方法で記述したように、加えた。
【００６０】
グリセロールを、脱イオン水で５０％（ｗ／ｗ）に希釈し、粘着度を減少させ、ついで適切な反応器にピペットした（ｖ／ｖ）。反応器を、オートクレーブによって滅菌し、無菌技術を各実験で使用した。ＭａｃＣｏｎｋｅｙストリークを、使用の時点で各接種において実施し、グラム陰性汚染を検出した。ＭａｃＣｏｎｋｅｙおよび標準方法アガー（ＳＭＡ）アガープレートストリークを、実験の最後に、各ボトル成分において実施した。ＳＭＡプレートとを、純培養液に関して試験するために使用した。
【００６１】
以下の４つの研究のそれぞれで使用した特定の方法は、以下に詳述している。
【００６２】
（研究１：グリセロール  ラダー）
本研究は、酸素取り込み速度の増加によって測定されるように、ＬＣＦＡの分解の増強に関する、グリセロールの効果濃度を測定するために実施した。
【００６３】
特定の方法：パルミチン酸を、５００ｍｌあたり５００ｍｇ（ｗ／ｖ）にて、各反応器に加えた。希釈グリセロールを、表４にて記述したように、ピペット（ｖ／ｖ）によって加えた。ＳＢ３１１２の純培養液を、接種材料として使用した。プレート計数培養液（ＰＣＢ）中の一晩培養液の光学密度（ＯＤ）を、細菌数を見積もるために決定した。各反応器内への標的用量は、培養液の光学密度測定に基づいた。
【００６４】
図３は、基質としてパルミチン酸を用いた、グリセロールの連続希釈の関数としての、平均化データを示している。すべてのグリセロール濃度（１０ｐｐｍ〜２００ｐｐｍ）が、パルミチン酸の分解の有意な増強を示した。グリセロールの添加なしには、明らかな酸素取り込みは観察されておらず、このことによって、パルミチン酸の分解がないことを示唆している。
【００６５】
図４は、パルミチン酸が存在しないときに、グリセロールの連続添加の関数としての、酸素取り込みを示している。これらの値は、図３で示したグリセロール＋パルミチン酸データより差し引いた（図３および４間のＹ軸値の違いに注意すること）。図５は、引き算の結果を示しており、したがって、ＳＢ３１１２によるパルミチン酸の分解に起因する酸素取り込みのみを示している。
【００６６】
示されたデータより、１０ｐｐｍほどの低い濃度におけるグリセロールが、ＬＣＦＡ、パルミチン酸の分解を刺激することが明らかである。１０ｐｐｍの濃度でのグリセロールが、細菌細胞数の有意な増加を産出しないことに注意することが重要である。
【００６７】
（研究２：他のバシルス  メガテリウム）
本研究は、種々のバシルス  メガテリウム株を用いて、ＬＣＦＡ、パルミチン酸の分解における、グリセロールの効果を比較するために実施した。
【００６８】
特定の方法：
パルミチン酸を、５００ｍｌ用量反応器あたり５００ｍｇ加えた（１０００ｐｐｍｖ）。グリセロールを、５００ｍｌ反応器あたり５０ｍｇ加えた（１００ｐｐｍｖ）。各株の純培養液を、接種材料として使用した。プレート計数培養液（ＰＣＢ）中の一晩培養液の光学密度（ＯＤ）を、細菌数を見積もるために決定した。各反応器内への標的用量は、培養液の光学密度測定に基づいた。各反応器に関する処理を表５にて示している。
【００６９】
図６は、グリセロールの存在下、パルミチン酸の分解に関して、種々のバシルス  メガテリウム株に対する平均酸素取り込みデータを示している。株ＳＢ３１１２は、株３と比較して、すぐに酸素取り込みを開始し、より高い速度の取り込みを産出し、より高い総累積酸素取り込みを示した。グリセロールの存在なしでは、酸素取り込みなしによって示されたように、本研究において、パルミチン酸の分解はない。
【００７０】
ＡＴＣＣ株２および１は、パルミチン酸のみ、またはグリセロールの添加を伴うパルミチン酸における酸素取り込みがないことを示した。事実、グリセロールの分解は、ＰＡの存在下で阻害された。５０ｍｇのグリセロールから予想される酸素取り込み量は、およそ７０ｍｇであるはずである。
【００７１】
簡単に言えば、ＳＢ３１１２は、グリセロールの添加を伴う株３よりも、より大きな程度でパルミチン酸を分解した。ＡＴＣＣ株２および１は、グリセロールあり、またはなしで、パルミチン酸を分解しない。
【００７２】
（研究３：他の種の細菌）
本研究は、５〜７株のグラム陽性混合物を含む市販の産物を、ＳＢ３１１２を含む、本発明の完全処方産物と比較するために実施した。ＳＢ３１１２を含む、すべての株は、胞子形態であった。
【００７３】
完全処方産物を、反応器内の初期胞子数、約５．４×１０４  ＣＦＵ／ｍｌを達成するために、適切な反応器内に希釈した。各反応器に対する処理を、表６で示した。
【００７４】
図７は、２つの産物による、ＬＣＦＡ基質へのグリセロール添加に対する応答を示している。データは、ＳＢ３１１２含有産物が、簡単にパルミチン酸を消費する一方で、市販の混合物が、有意にはパルミチン酸を分解しないことを示唆している。すべての産物および反応器は、ＭａｃＣｏｎｋｅｙアガー上にストリーキングした場合に、増殖がないことによって示唆されたように、グラム陰性汚染はなかった。
【００７５】
データは、市販の産物がパルミチン酸を有意に分解はしない一方で、ＳＢ３１１２を含む産物が、パルミチン酸を分解することを示唆している。両方の産物は、ＬＣＦＡの存在下でグリセロールを分解可能であった。
【００７６】
（研究４：生物分解におけるグリセロールの効果）
本研究は、種々の鎖の長さの脂肪酸の酸化における、グリセロールの効果を実証するために実施した。
【００７７】
特定の方法は以下のようである。呼吸計を使用して、２（酢酸）から１８（オレイン酸）までの鎖の長さの範囲の複数の炭化水素を試験した。１０００ｍｇ／Ｌの各酸を、オレイン酸をのぞいて試験した。オレイン酸は２００ｍｇ／Ｌで試験した。グリセロールは、５００ｐｐｍの濃度で使用した。本研究は、１０日間の期間で実施した。
【００７８】
表７は、グリセロールの存在下、ＳＢ３１１２胞子による長鎖脂肪酸の利用を示している（グリセロール取り込みは差し引いている）。グリセロールが存在しない場合のデータと比較したときに、グリセロールの存在下で得たデータは、長鎖（脂肪）酸の分解を有意に増強することを示している。
【００７９】
本発明の種々の実施様態は、以上で言及した目的および利点に関連して記述した。これらの実施例は、単に例示のためであり、本発明の制限ではないことが理解されるであろう。もちろん、本発明の多くの変法および改変が存在し、当業者に対して提案され、そのようなすべての変法および改変が、請求項の範囲および目的の範囲に含まれる。
【表１】
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【表２】
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【表３】
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【表４】
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【表５】
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【表６】
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【表７】
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【図面の簡単な説明】
【００８０】
【図１】油脂を分解するための、ＳＢ３１１２および種々の細菌の効果を示す図である。
【図２】ＳＢ３１１２の生物分解活性におけるグリセロールの効果を示す図である。
【図３】パルチミン酸（ＰＡ）の分解における、連続希釈グリセロールの効果を示す図である。
【図４】パルチミン酸が存在しない場合のＳＢ３１１２による種々の量のグリセロールの分解を示す図である。
【図５】グリセロール酸素取り込みを差し引いた、パルチミン酸の分解に起因する酸素取り込みを示す図である。
【図６】種々のバシルス  メガテリウムの株をグリセロールの存在下でのパルミチン酸の分解に関して試験した図である。
【図７】グリセロール存在下での、パルチミン（ＰＡ）の分解に関する、市販産物対ＳＢ３１１２産物を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際公開パンフレット】
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2004528852.tif 000048
2004528852.tif 000049
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004528852.tif 000050
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004528852.tif 000051
【国際調査報告】
2004528852.tif 000052
2004528852.tif 000053
2004528852.tif 000054