(57)【要約】本発明は、ヒトにおけるC型肝炎ウイルス感染のためのモデル系に関する。該モデル系は、ヒト肝芽腫細胞に対して免疫学的に寛容化され、次いで、ヒト肝芽腫細胞を移植された非ヒト動物である。本発明の少なくとも部分的に基礎となった発見は、ヒト肝芽腫細胞に対して子宮内で免疫寛容にされたげっ歯類が生後導入されたヒト肝芽腫細胞に対して長期にわたる宿主として役立つことが見出され、その導入された肝芽腫細胞がその細胞の分化した表現型を維持したということである。したがって、得られたキメラ動物はC型肝炎感染に対し感受性があり、また、感染により新たに形成されるビリオンの産生を生じる。さらに、このヒト肝臓のin vivo モデル系を用いて、HCV受容体を同定・特性決定することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト肝芽腫細胞に対して免疫学的に寛容化され、次いで、ヒト肝芽腫細胞を移植し、C型肝炎ウイルスに感染させた非ヒト動物、を含んでなるヒトにおけるC型肝炎ウイルス感染のモデル系。
【請求項２】
上記ヒト肝芽腫細胞がHuh7細胞系の細胞である、請求項１記載のモデル系。
【請求項３】
ヒト肝芽腫細胞に対して免疫学的に寛容化され、次いで、C型肝炎ウイルスに感染させたヒト肝芽腫細胞を移植した非ヒト動物、を含んでなるヒトにおけるC型肝炎ウイルス感染のモデル系。
【請求項４】
ヒト肝芽腫細胞の移植を受けるための宿主となる非ヒト動物の作出方法であって、
(a) 全細胞および細胞溶解物からなる群より選択される形態のヒト肝芽腫細胞を、出産前後の宿主動物に対し、該宿主動物の免疫寛容化と、それに次ぐヒト肝芽腫細胞への曝露に有効な量で投与する工程; および、次いで、
(b) 肝細胞により代謝されDNAアルキル化物質を産生する肝細胞毒性薬剤を有効量で該宿主動物に投与する工程；
を含んでなる、上記方法。
【請求項５】
上記薬剤がレトロルシンである、請求項４記載の方法。
【請求項６】
さらにヒト肝芽腫細胞が移植されている、請求項４記載の非ヒト動物。
【請求項７】
C型肝炎ウイルス受容体の単離方法であって、
(a) 標識表面分子を有するC型肝炎ウイルスと、C型肝炎ウイルス受容体を有する細胞とを接触させ;
(b) 該表面分子と該受容体とを架橋させ、標識表面分子と該受容体との複合体を形成させ;
(c) 該複合体を単離し;
そして
(d) 該複合体から該受容体を単離すること；
を含んでなる、上記方法。
【請求項８】
上記細胞が、ヒト肝細胞に対して免疫学的に寛容化され、次いで、ヒト肝細胞が移植された非ヒト動物のヒト肝細胞である、請求項７記載の方法。
【請求項９】
上記細胞が、ヒト肝芽腫細胞に対して免疫学的に寛容化され、次いで、ヒト肝芽腫細胞が移植された非ヒト動物の分化ヒト肝芽腫細胞である、請求項７記載の方法。
【請求項１０】
in vitroで該細胞とC型肝炎ウイルスとを接触させる、請求項８記載の方法。
【請求項１１】
in vitroで該細胞とC型肝炎ウイルスとを接触させる、請求項９記載の方法。
【請求項１２】
in vivoで該細胞とC型肝炎ウイルスとを接触させる、請求項８記載の方法。
【請求項１３】
in vivoで該細胞とC型肝炎ウイルスとを接触させる、請求項９記載の方法。
【請求項１４】
上記複合体から上記標識表面分子を単離することをさらに含んでなる、請求項７記載の方法。
【請求項１５】
C型肝炎ウイルスとC型肝炎ウイルス受容体との結合を阻害する化合物の同定法であって、
(a) 試験化合物と該受容体とが結合して複合体を形成するのが可能な条件下で、該ウイルスの表面分子と試験化合物とを接触させ;
(b) 該複合体と該受容体とを接触させ;
そして
(c) 該受容体と該表面分子との結合をアッセイする工程を含んでなり、
対照実験における結合レベルと比較した場合の、該受容体と該表面分子との結合の低下が、C型肝炎ウイルスとC型肝炎ウイルス受容体との結合を該試験化合物が阻害していることの指標となる、上記方法。
【請求項１６】
上記受容体が、ヒト肝細胞に対して免疫学的に寛容化され、次いで、ヒト肝細胞が移植された非ヒト動物のヒト肝細胞上に存在する、請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
上記受容体が、ヒト肝芽腫細胞に対して免疫学的に寛容化され、次いで、ヒト肝芽腫細胞が移植された非ヒト動物の分化ヒト肝芽腫細胞上に存在する、請求項１５記載の方法。
【請求項１８】
in vitroで行われる、請求項１６記載の方法。
【請求項１９】
in vitroで行われる、請求項１７記載の方法。
【請求項２０】
in vivoで行われる、請求項１６記載の方法。
【請求項２１】
in vivoで行われる、請求項１７記載の方法。
【請求項２２】
C型肝炎ウイルスとC型肝炎ウイルス受容体との結合を阻害する化合物の同定法であって、
(a) 該ウイルスの表面分子と該受容体とが結合して複合体を形成するのが可能な条件下で、該表面分子と該受容体を接触させ;
(b) 該複合体と試験化合物を接触させ;
そして
(c) 該複合体の分裂をアッセイする工程を含んでなり、
該複合体の分裂が、C型肝炎ウイルスとC型肝炎ウイルス受容体との結合を該試験化合物が阻害していることの指標となる、上記方法。
【請求項２３】
上記受容体が、ヒト肝細胞に対して免疫学的に寛容化され、次いで、ヒト肝細胞が移植された非ヒト動物のヒト肝細胞上に存在する、請求項２２記載の方法。
【請求項２４】
上記受容体が、ヒト肝芽腫細胞に対して免疫学的に寛容化され、次いで、ヒト肝芽腫細胞が移植された非ヒト動物の分化ヒト肝芽腫細胞上に存在する、請求項２２記載の方法。
【請求項２５】
in vitroで行われる、請求項２３記載の方法。
【請求項２６】
in vitroで行われる、請求項２４記載の方法。
【請求項２７】
in vivoで行われる、請求項２３記載の方法。
【請求項２８】
in vivoで行われる、請求項２４記載の方法。
【請求項２９】
C型肝炎ウイルスと宿主細胞との融合の阻害物質の同定方法であって、
(a) C型肝炎ウイルスが宿主細胞と融合し得る条件下で該ウイルスと該宿主細胞を接触させることにより融合誘導活性の対照値を得る工程;
(b) C型肝炎ウイルスが宿主細胞と融合し得る条件下で、試験化合物存在下、該ウイルスと該宿主細胞を接触させることにより融合誘導活性の実験値を得る工程; および
(c) 該実験値を該対照値と比較する工程;
を含んでなり、該対照値と比較して融合誘導活性の該実験値がより低い場合、融合の阻害物質の存在が示される、上記方法。
【請求項３０】
上記受容体が、ヒト肝細胞に対して免疫学的に寛容化され、次いで、ヒト肝細胞が移植された非ヒト動物のヒト肝細胞上に存在する、請求項２９記載の方法。
【請求項３１】
上記受容体が、ヒト肝芽腫細胞に対して免疫学的に寛容化され、次いで、ヒト肝芽腫細胞が移植された非ヒト動物の分化ヒト肝芽腫細胞上に存在する、請求項２９記載の方法。
【請求項３２】
in vitroで行われる、請求項３０記載の方法。
【請求項３３】
in vitroで行われる、請求項３１記載の方法。
【請求項３４】
in vivoで行われる、請求項３０記載の方法。
【請求項３５】
in vivoで行われる、請求項３１記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
1.序
本発明は、ヒトにおけるC型肝炎ウイルス(HCV)感染のモデル系に関する。このモデル系は、ヒト肝芽腫細胞に対して免疫学的に寛容化され、次いで、ヒト肝芽腫細胞を移植された非ヒト動物として特徴付けられる。得られたキメラ動物を、HCVビリオンが新たに産生されるように、HCVに感染させる。かかるヒト肝臓in vivo モデル系はHCV感染のメカニズムの研究に使用することができる。特に、このHCV感染in vivoモデルを用いて、ウイルス認識、結合、細胞との融合、および宿主細胞へのウイルス侵入のメカニズムを研究することができる。さらに、相当量の宿主細胞を入手できることにより、感受性宿主細胞上で発現するHCV受容体の特性決定が可能となる。
【背景技術】
【０００２】
2.発明の背景
ヒトウイルス性肝炎の研究における１つの大きな問題は、この病気の都合の良い実験モデルが無いことである。肝炎ウイルスは宿主特異性が狭いため、現在のところ感染モデルは高等霊長類に限定されている（Caselmann, 1994, Antiviral Res. 24:121-129）。したがって、ヒト肝臓の病理を正確に研究するために、感染性物質に対して感受性である宿主細胞を含む、利用しやすく経済的な肝臓のモデル系が必要とされている。自然の環境から取り出した際、肝細胞が様々な程度に脱分化していることが少なくとも部分的に原因して、かかる系の設計は分かりにくいものとなっている。in vitroまたはex vivoにおいて、肝臓特異的な形態および生理のいくつかが損なわれることにより、肝臓に影響を与える病原体(例えば、肝炎ウイルス)の博物学的研究、ならびに、かかる病原体に対する肝臓の応答についての研究が困難なものとなっている。
【０００３】
C型肝炎ウイルス(HCV)の特性決定は1989年に最初に行われたが（Chooら, 1989, Science 244: 359-362）、その存在は何年も前から、輸血を受けたある種の患者において流感のような症状を引き起こす病原体としてとらえられていた。時としてこれらの症状の後、何年かを経て、肝臓病を発症するので、この臨床学的症状は非A-非B型肝炎と呼ばれていた。
【０００４】
HCVは現在、Flaviviridaeファミリーのウイルス（ウシ下痢、ブタコレラ、黄熱病、およびダニ媒介脳炎を引き起こすウイルス等）のメンバーであることが分かっている（Katoら, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87:9524-9528; Chooら, 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.88:2451-2455; Okamotoら, 1991, J. Gen. Virol. 72:2697-2704; Takamizawaら, 1991, J. Virol. 65:1105-1113）。ウイルスゲノムは、１つのポリ蛋白をコードするユニークなオープンリーディングフレームを特徴とする約9.5kbの一本鎖＋センスRNA分子からなる（概説についてはClarke, 1997, J. Gen. Virol 78: 2397-2410およびMajorおよびFeinstone, 1997, Hepatology 25:1527-1538）。そのコアタンパク、EIおよびNS5領域の系統発生分析に基づき、HCVは、遺伝学的に不均一であり、少なくとも6つの遺伝子型および30を超えるサブタイプが世界中に分散していることが分かっている（MajorおよびFeinstone, 1997, Hepatology 25: 1527-1538; Clarke, 1997, J. Genl. Virol 78:2397-2410）。
【０００５】
HCVに感染している人は世界中で１億7000万人いると推定されており、この数は、ヒト免疫不全ウイルスに感染した人の数の４倍を超える。従って、HCVに関連する死亡件数は、AIDSによる死亡件数をいつかは追い抜くであろう（Cohen, 1999, Science 285:26-30）。疾患管理センター（The Center for Disease Control）は、HCVがアメリカ合衆国人口の1.8％によって保有されていると算出している（上掲）。唯一の利用可能な治療法はインターフェロンによる治療であり、インターフェロンをリバビリンと組合せて用いた場合はより良い結果が得られているが（Cohenら, 1999, Science 285:26-30。Poynardら, 1998, Lancet 352:1426-1432およびDavisら, 1998, N. Engl. J. Med. 339:1493-1499を引用している）、多くのHCV単離株はインターフェロンに対して耐性がある（Thomasら, 1999, Hepatology 29:1333）。残念ながら、インターフェロンとリバビリンの組合せは、アメリカ合衆国において見られる最も一般的なHCV遺伝子型に対してあまり効果がなく、その遺伝子型に感染した人の28％しか、治療に対し持続的な応答を示さない（Davisら, 1998, N. Engl. J. Med. 339:1493-1499）。
【０００６】
HCV感染のための良いモデル系が存在しないことによって、多くの治療標的の同定および新しい治療法の開発につながり得るHCV生物学のさらなる理解が妨げられてきた。HCVに感染し易いのはヒトおよびある種の霊長類のみである（Feinstoneら, 1981, J. Infect. Dis. 144:588）。ウイルス複製の実証のため鎖特異的RT-PCRが使用される、HCVの増殖を支持する種々の哺乳動物細胞系が報告されている（MajorおよびFeinstone, 1997, Hepatology 25: 1527-1538。Mitzutaniら, 1995, Biochem. Biophys. Res. Commun. 212:906-911; ShimizuおよびYoshikura, 1994, 68:8406-8408; Katoら, 1995, Biochem. Biophys. Res. Commun. 206: 863-869; Cribierら, 1995, J. Gen. Virol. 76:2485-2491;およびYooら, 1995, J. Virol. 69: 32-38を引用）。
【０００７】
Clarke（前掲）に概説されているように、肝組織（Itoら, 1996, J. Gen. Virol. 77:1043-1054）、末梢血単核細胞（Willemsら, 1996, J. Med. Virol. 42:272-278; Zignegoら, 1992, J. Hepatology 15: 382-386）、ヒトT細胞系およびB細胞系（Bertoliniら, 1993, Res. Virol 144: 281-285; Shimizuら, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89: 5477-5481）、ヒト胎児肝細胞（Iacovacciら, 1993, Res. Virol. 144: 275-279）、チンパンジー肝芽腫細胞（Lanfordら, 1994, Virol. 202: 606-614）、Daudi B細胞（Nakajimaら, 1996, J. Virol. 70:3325-3329）およびヒトT細胞白血病ウイルスI型感染T細胞系MT-Z（Mitzutaniら, 1995, Biochem. Biophys. Res. Comm. 212:906-911; Sugiyamaら, 1997, J. Gen. Virol. 78:329-336）に基づく系におけるウイルス複製についての報告がなされている。しかしこれらの系はいずれも満足の得られるものではないことが分かっている。
【０００８】
近年開発されたネズミモデルの中には「Trimera」がある（Ilanら, 1999, Hepatology 29:553-562）。Trimeraモデルにおいては、正常マウスを、致死量の放射線を身体全体に浴びせることにより予め処置しておき（preconditioned）、SCIDマウス骨髄細胞で放射線防護し、次にex vivoでB型肝炎に感染させたヒト肝臓断片を植えつけた。Galunら（1995, J. Infect. Dis. 172:25-30）により報告されたように、C型肝炎に感染したヒト肝組織をTrimeraマウス中に移植した。
【０００９】
最近になって、これより新しい系がLohmannら（1999, Science 285: 110-113）により報告された。この報告によると、サブゲノムHCV RNAレプリコンをヒト肝癌細胞系中にトランスフェクトしたところ、高レベルで複製することが分かった。ただこの系はウイルスを産生しないので、増殖性感染（productive infection）のモデルとはならない（Cohen、前掲）。
【００１０】
したがって、複製を支持する細胞培養系およびHCV複製の簡便な動物モデルが存在しないことから、肝細胞中へのHCV侵入のメカニズムについてはほとんど知られていない。細胞との結合に関わるHCVタンパク質、ならびにHCV認識および侵入を担う細胞表面受容体についても同定されていない(例えば、Flintら, 2001, "In search of hepatitis C virus receptor(s)", Clin. Liver Dis. 5:873-93を参照されたい)。患者の血清から単離されたHCV粒子がLDLおよびVLDL受容体と結合していることが示されたことから、肝細胞中へのHCVの侵入がLDLにより介在されている可能性のあることが示唆されている(Angelloら, 1999, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 96: 12766-12771; Allanderら, 2000, Virology 277, 358-367）。しかしながら、再構成させたHCV E1およびE2エンベロープタンパク質を用いたその他の研究では、LDLまたはVLDLと特異的な相互作用は示さなかった(Lambotら, 2002, J. Biol. Chem. 277:20625-20630)。HCVエンベロープタンパク質であるE2と、in vitro結合アッセイに使用するCD81との結合から、CD81受容体を介した肝細胞へのHCVの侵入に関して同様の考察が生じる(Berry and Friend, 1969, J. Cell Biol. 43: 506-520)。E2-CD81 相互作用は特異的ではあるけれども、細胞結合実験において可溶性の末端切断型E2を使用することは、in vivoにおける標的細胞の表面とHCVとの相互作用を真に表すものではない。
【００１１】
2000年3月3日に出願され、2001年5月10日に国際公開第WO 01/32009 A1号として公開された国際特許出願第PCT/US00/05713号(本明細書中にその全内容を組み入れるものとする)は、ヒト肝細胞に対して寛容にし、次いでヒト肝細胞を移植して、ヒト細胞が動物肝臓にコロニーを形成するようにしたキメラ動物について教示する。これらの動物は、病原体(例えば、ウイルス)感染または毒物への曝露を原因とする肝臓疾患を研究するのに有用なモデル系を提供し、また、自家肝細胞の大量産生をも可能にする。本発明は、国際公開第WO 01/32009 A1号に開示されているキメラ動物系の改良であり、分化肝芽腫細胞を用いてC型肝炎モデル系が作製される。
【００１２】
3.発明の概要
本発明はヒトにおけるHCV病原性のためのモデル系に関する。このモデル系はヒト肝芽腫細胞の非ヒト動物への移植を伴う。移植は、少なくともある程度、宿主動物においてヒト組織に対する寛容を誘導することによって可能になる。次に、これらの寛容化された動物に、ヒト肝芽腫細胞を移植する。好ましくは、該細胞は宿主肝臓中にとどまり、正常肝細胞の生理機能を担う。移植された細胞は、宿主肝臓中でかなりの割合で肝細胞を構成するのが好ましい。次に、得られたキメラ動物をHCVに感染させる。キメラ動物中で移植された細胞はHCV感染および複製を支持し、新しく形成されたHCVを産生する。かかるヒト肝臓in vivo モデル系はHCV感染のメカニズムを研究するのに有用である。
【００１３】
したがって、本発明は、ヒト肝細胞からHCV受容体を単離する方法を提供する。HCV認識、感染および複製を支持する相当量の宿主細胞が利用できることにより、HCV受容体の同定および特性決定が少なくともある程度可能になる。
【００１４】
本発明は、さらに、HCVとHCV受容体との結合を阻害する化合物を同定するための化合物のスクリーニング方法を提供する。
【００１５】
本発明は、さらに、感受性の宿主細胞へのHCVウイルスの融合を抑止する化合物を同定するための化合物スクリーニング法を提供する。
【００１６】
本発明は、さらに、感受性の宿主細胞へのHCVウイルスの融合を抑止する化合物を使用して、感受性の宿主細胞へのHCVウイルスの侵入を抑止する方法を提供する。
【００１７】
本発明は、さらに、感受性の宿主細胞とHCVとのウイルス融合を阻害する化合物、および製薬上許容される担体を含んでなる医薬組成物を提供する。
【００１８】
4.図面の説明
図1は、様々な型のヒト肝芽腫細胞により誘導される寛容化を測定するための混合リンパ球アッセイの結果を示す棒グラフを表す。ラットは、ヒト肝芽腫細胞（例えば、Huh7細胞またはHepG2細胞）を用いて胎児内で寛容化させた。全てのアッセイは生後１週目に行われた。また、アッセイは、生理食塩水のみを胎児内に注入し、次いで、初代培養肝細胞、肝芽腫細胞系Huh7またはHepG2とともにインキュベートしたラット由来の脾臓細胞による放射能取り込みを示している(各々、レーン1、2および3)。初代培養肝細胞、Huh7またはHepG2細胞を胎児内に注入し、次いで、対応する照射済み細胞とともにインキュベートしたラット由来の脾臓細胞の放射能取り込みをそれぞれ、レーン4、5および6に示す。各グループにおけるラットの数をそれぞれの欄の上段に示す。結果は対照(単独でインキュベートした非処理ラット由来の脾臓細胞)に対するパーセンテージを平均+標準誤差として表す。Duncan's 試験を利用して、異なる治療グループ間での有意差を分析した。* は、グループ1と4、2と5、および3と6との間で有意差があることを表す（P＜0.05）。
【００１９】
図2A-Fは、ラット肝臓におけるヒトアルブミンを検出するための免疫組織化学アッセイの結果を表す顕微鏡写真である。ヒトアルブミンに対する抗体は記載の通りDAB法を使用して可視化した。15匹のSD胎仔ラットを、Huh7細胞を用いて寛容化した。次いで、10匹の新生ラットに、生後１日目にHuh7細胞を移植し、残りのラットには移植しなかった。(A)は、Huh7 細胞を用いて寛容化および移植を行い、移植後１日目に犠牲にした代表的なラットの肝臓の切片を表す（倍率x125）。(B)は、(A)と同じ切片で倍率x250のものである。(C)は、Huh7 細胞を用いて寛容化したが該細胞の移植は受けていない代表的なラットの肝臓の切片を表す（倍率x125）。(D)は同じ切片で倍率x250のものである。(E)は、Huh7 細胞を用いて寛容化および移植を行い、生後７日目に犠牲にした代表的なラットの肝臓の切片を表す（倍率x125）。(F)は同じ切片で倍率x250のものである。
【００２０】
図3A-Dは、移植後16週目のラット肝臓におけるヒトアルブミン検出の共焦点免疫蛍光顕微鏡写真を表す。
【００２１】
(A)は、初代培養肝細胞を胎児内に注入し、次いで、初代培養肝細胞を移植し、モノクローナルヤギ抗ラットアルブミン抗体で染色した代表的ラットの肝臓の切片を示す。
【００２２】
(B)は、モノクローナルマウス抗ヒトアルブミン抗体で染色した、(A)と同サンプル由来の切片を示す。
【００２３】
(C)は、初代培養ヒト肝細胞を胎児内に注入したけれども、肝細胞を移植はしていない代表的ラットの、抗ヒトアルブミン抗体で染色した肝臓の切片を示す。
【００２４】
(D)は、２次抗体単独で染色した、(A)と同サンプル由来の切片を示す。倍率は、x 250である。
【００２５】
図4A-Bは、移植後16週目でのラット肝臓ゲノムDNAにおけるヒトアルブミンDNAの検出について表す。図24A-Dに記載されるように処理した動物の肝臓からDNAを抽出し、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を使用して、ヒトアルブミン配列の存在についてアッセイした。DNA源: レーン1 = 分子マーカー; レーン2 = 非処理ラット由来の肝臓; レーン3 = 104個のHuh7 細胞; レーン4 = 103個のHuh7 細胞; レーン5 = 102個のHuh7 細胞; レーン6 = 初代培養ヒト肝細胞を胎児内に注入し、次いで初代培養ヒト肝細胞を移植した代表的ラット由来の肝臓; レーン7 = 初代培養ヒト肝細胞を胎児内に注入し、その後、移植は受けていないラット由来の肝臓。増幅したヒト配列について予想される位置を、レーン1のDNA 分子マーカーを基準とした307 bpに相当する位置に矢印で示す。
【００２６】
図5A-Cは、ドットブロッティングによるラット肝臓におけるヒトアルブミンDNAの定量について表す。(A)上段は、それぞれ、移植後６週目および１６週目における、胎児内注入および移植が行われた肝臓サンプルから抽出したDNAを示す。(A)下段は、同時点における寛容化は行ったが、移植は行っていないラット由来のものの結果を示す。全てのドットはヒトアルブミンDNAに対して32P-標識したプローブとハイブリダイズさせた。(B)は、プラスミド palb3 DNA（該プラスミドは完全長ヒトアルブミン遺伝子を含む）のドットとのハイブリダイゼーションを示す。なお、ドットは、標準として、100 pg、10 pgおよび1 pgと量が減少するように適用した。(C)は、任意の単位を使用した、(B)におけるシグナルの定量を示す。
【００２７】
図6A-Cは、RT-PCRによるラット肝臓におけるヒトアルブミンmRNAの検出について表す。(A)は、移植後１６週目に回収した肝臓サンプルから抽出したRNAのRT-PCR産物の、電気泳動的に分離したゲルのエチジウムブロマイド染色像を示す。レーン1 = 1 kbプラス分子マーカー; レーン2および6 = ヒト肝細胞の移植を受けていない非寛容化ラットの肝臓由来RNAから産生させたRT-PCR産物; レーン3および7 = Huh7細胞(陽性対照)のRNAから産生させたRT-PCR産物; レーン4および8 = ヒト肝芽腫細胞を胎児内に注入し、次いで移植したラットの肝臓由来のRNAから産生させたRT-PCR産物; ならびに、レーン5および9 = ヒト肝芽腫細胞を胎児内に注入するけれども、続く移植は行わないラットの肝臓由来のRNAから産生させたRT-PCR産物を示す。レーン2〜5においては、RNAサンプルをヒトアルブミンDNAのためのプライマーを用いて増幅し、レーン6〜9においては、サンプルをラットアルブミンDNAのためのプライマーを用いて増幅した。レーン10〜12においては、104、103および102個の培養Huh7細胞由来のDNAを、ヒトアルブミンのためのプライマーを用いて増幅した。ヒトおよびラットアルブミンmRNA産物の予想される位置を、それぞれ、315および388 bpの位置に矢印により示す。(B)は、ヒトアルブミンDNA特異的プライマーを用いたラット肝臓RNAのRT-PCR産物のエチジウムブロマイド染色ゲルを表し、これにより、ラット肝臓におけるヒトアルブミンmRNA発現の経過が示される。レーン1 = 1 kbプラス分子マーカー; レーン2 = 非寛容化・非移植ラットの肝臓由来のRNAから産生させたRT-PCR産物; レーン3 = Huh7細胞(陽性対照)のRNAから産生させたRT-PCR産物; ならびに、レーン4〜6 = ヒト肝芽腫細胞で寛容化し、次いで該細胞を移植したラット（各々、移植後２週目、６週目および１６週目の時点に肝芽腫細胞を採取した）由来の肝臓RNAから産生させたRT-PCR産物を示す。(C)は、レーン4〜6において、任意の単位を使用する、ヒトアルブミンmRNAレベルの定量を示す。
【００２８】
図7は、ラット血清中で検出されるヒトアルブミンタンパク質についてのウエスタンブロットにおけるオートラジオグラフを表す。血清サンプルは、初代培養ヒト肝細胞を胎児内に注入し、次いで該細胞を移植した代表的ラットから回収した。レーン1 = ヒトアルブミン標品; レーン2 = ラットアルブミン標品; レーン3 = 移植後１週目のラット由来血清; レーン4 = 移植後２週目のラット由来血清; およびレーン5 = 移植後３週目のラット由来血清を示す。
【００２９】
図8A-Fは、細胞分裂が(ブロモデオキシウリジンの取り込みから明らかなように)ヒトアルブミンの合成と同時に起こることを示す顕微鏡写真を表し、この事実は、移植されたヒト肝芽腫細胞がラット肝臓中で増殖しているという結論を支持するものである。パネルA、CおよびEは、ヒトアルブミンに対する肝臓切片の染色を表し、ならびに、パネルB、DおよびEは、ブロモデオキシウリジン("BrdU")の取り込みに対する肝臓切片の染色を表す。(A)および(B)は、ヒト肝芽腫細胞で寛容化し、甲状腺ホルモンで処理したがヒト肝芽腫細胞を移植しなかったラット由来の肝臓切片を表す。(C)および(D)は、ヒト肝芽腫細胞で寛容化し、甲状腺ホルモンで処理し、ヒト肝芽腫細胞を移植したラット由来の肝臓切片を表す。(E)および(F)は、ヒト肝芽腫細胞での寛容化または移植はいずれも行われておらず、さらに、甲状腺ホルモンでの処理も行われていない対照ラット由来の肝臓の切片を表す。
【００３０】
図9は、合成HCV(+)鎖 RNA基質由来のPCR産物のアガロースゲル電気泳動分析を表す。
【００３１】
図10は、図9において測定したラット血清におけるHCV RNAを表す。
【００３２】
図11は、図9において測定したラット肝臓におけるHCV RNAを表す。
【００３３】
5.発明の詳細な説明
本発明はヒトにおけるC型肝炎ウイルス (HCV)病理のためのモデル系に関する。ヒト肝細胞に対して免疫学的に寛容にした非ヒト動物の作出は、HCVに感染させ得る肝芽腫細胞の大量供給を可能にする意義深い成果である。かかるヒト肝臓in vivoモデル系を使用してHCV感染のメカニズムについて調べることができる。特に、このモデル系は、大量のヒト肝芽腫細胞のHCV感染を可能にし、そのためHCV-HCV受容体複合体の単離が可能になり、次いで、HCV受容体の特性決定が可能になる。さらに、このHCV-HCV受容体複合体またはHCV受容体それ自体をスクリーニング物質として使用して、ウイルス阻害剤およびワクチンを同定し、開発することが可能になる。
【００３４】
本発明の主題の動物は、本明細書では、「キメラ肝臓を持つ非ヒト動物」または単に「キメラ動物」とも呼ぶ。これらの用語は共に、ヒト肝芽腫細胞を含む肝臓を持つ、寛容化された非ヒト動物として定義される。
【００３５】
本発明で使用する肝芽腫細胞は、分化肝芽腫細胞系を用いて得るのが好ましい。分化肝芽腫細胞系の例としては、分化肝芽腫細胞の表現型と関連する１以上の分子マーカー、例えば、限定するものではないが、アシアログリコプロテイン受容体および／または低密度リポタンパク質受容体を発現する細胞を挙げることができる。分化細胞系という定義には、この用語を本明細書中で使用する場合、肝芽腫細胞-特異的機能、例えば、限定するものではないが、肝臓-特異的(または選択的)病原体（例えば、B型肝炎ウイルス）による感染の感受性を示す細胞系も含まれる。
【００３６】
本発明の好ましい特定の非限定的な実施例においては、分化肝芽腫細胞系Huh7およびHepG2が特定の実施形態について適当であり得る。これらの細胞系は最終的には肝芽腫細胞に由来するものであることから、遺伝子治療目的または肝再構成目的のためにヒト被験者に導入するには適しないであろう。しかしながら、上記およびその他の肝細胞由来分化肝芽腫細胞系を用いて、非ヒト動物宿主におけるヒト肝臓疾患のためのモデル系を作製することができる。さらに、本発明によれば、かかる細胞系が、動物を初代培養ヒト肝細胞に対して、また初代培養ヒト肝細胞をかかる細胞系に対して、相互寛容化させ得ることを必要としない(実際、Huh7およびHepG2細胞について、相互寛容化は、散発的であるか、不完全であるか、または全く起こらないかいずれかである)。肝臓疾患のモデル系開発のために有効な肝芽腫細胞源としての分化肝芽腫細胞系の有用性については、後述の実施例において立証する。
【００３７】
分化肝芽腫細胞系に関する参考文献としては、Adenら, 1979, Nature 282:615-616; Schwartzら, 1981, J. Biol. Chem. 256:8878-8881; Wuら, 1984, Hepatology 4(6):1190-1194; Sellsら, 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 84:1105-1009; Nakabayashiら, 1984,. Jpn. J. Cancer Res. 75:151-158; Liangら, 1993, J. Clin. Invest. 91:1241-1246; Changら, 1987, EMBO J. 6:675-680; Sandigら, 1996, Gene Therapy 3:1002-1009; Dashら, 1997, Am. J. Pathol. 151(2):363-373; and Yooら, 1995, J Virol.69:32-38が挙げられる。
【００３８】
ヒト肝芽腫細胞に加えて、本発明のキメラ動物の肝臓は、該動物自体に内因性である肝芽腫細胞および非肝芽腫細胞成分(例えば、胆管および血管の内皮細胞、クッパー細胞等)を含むこともできる。肝芽腫細胞以外のヒト細胞型が存在していてもよい。好ましくは、ヒト肝芽腫細胞のパーセンテージ(存在する肝芽腫細胞の総数に対する割合)は、少なくとも10％であり、より好ましくは少なくとも20％、または少なくとも50％、または少なくとも80％である。
【００３９】
特に、キメラ動物は、ヒト肝芽腫細胞（および、場合によっては追加の細胞型）を、導入したヒト細胞に対して免疫学的に寛容にしてある動物に導入することにより作製される。そのようなことから、該動物は該ヒト細胞にとっての「宿主」であるということができる。本明細書にて用いる「免疫寛容（tolerant）」なる用語（単に寛容ともいう）は、全身免疫抑制の状態（例えばシクロスポリンによる処置などにより達成され得るようなもの、または全身性Ｂ細胞および／もしくはＴ細胞欠損症の動物で見られ得るもの）をいうのではなく、導入されたヒト細胞に対して特異的なクローン除去、細胞仲介性抑制もしくはアネルギー（例えば、Davies, 1997, “Introductory Immunobiology”, Chapman & Hall, London, 366頁を参照されたい）により達成されるリンパ球の抗原誘導非応答性の状態を指す。
【００４０】
5.1 キメラ肝臓を持つ動物の作製
本発明は、ヒト肝芽腫細胞を含む肝臓を持つ非ヒト動物の作製方法であって、（i）宿主動物において寛容（tolerance）を誘導すること、但し、該動物は、好ましくは胎仔または新生仔である；そして（ii）寛容化した動物に、好ましくは生後に、好ましくは脾臓内注射により、ヒト肝芽腫細胞を導入すること；を含んでなる上記方法を提供する。特定の実施形態においては、その宿主動物に、（宿主動物の肝芽腫細胞ではなく）ヒトの肝芽腫細胞の生存および／または増殖に有利な選択圧をかける。本発明のこれらの特徴の詳細な非限定的説明を、以下のサブセクションで述べる。
【００４１】
5.1.1 宿主動物
本発明による宿主となり得る非ヒト動物は、好ましくは哺乳動物であり、（限定するものではないが）マウス、ハムスター、ラット、ウサギ、イヌ、ヤギ、ヒツジ、ブタ、ウシ等が挙げられる。本発明の特定の非限定的な実施形態において、宿主動物は、導入遺伝子として、肝芽腫細胞において発現された場合にそれらの細胞に対して直接的または間接的（すなわち、代謝産物を経て）に有毒である遺伝子を保有するトランスジェニック動物である。そのような遺伝子の例は、ウロキナーゼ遺伝子［直接的に有害である（Sandgrenら, 1991, Cell 66:245）］および単純ヘルペスウイルス（「HSV」）チミジンキナーゼ遺伝子（「HSV-TK」）［薬剤ガンシクロビルを有毒な形態に変換し、よって間接的に有毒である（Smytheら, 1995, Ann. Surg. 222:78-86）]である。好ましくは、該遺伝子は、肝芽腫細胞において選択的に活性であるプロモーター、例えばアルブミンプロモーター、PEPCKプロモーターおよびＢ型肝炎表面抗原プロモーター等に機能しうる形で、すなわち有効に、連結されている。ヒト肝芽腫細胞がコロニー形成する前に該動物の肝臓が破壊されないようにするためには、特に出生前には活性でないプロモーターを利用することが望ましい。そうでないと、そうしたトランスジェニック動物は胎内で死亡してしまう可能性がある。肝臓に局所的に投与できる物質により誘導可能な他のプロモーターもまた好適であり、例えばメタロチオネインプロモーター（重金属イオンにより誘導可能；Palmiterら, 1982, Cell 29:701）が挙げられる。そのような遺伝子はヒト肝芽腫細胞に対して特異的に有毒ではないが、一部のヒト肝芽腫細胞を死滅させる「バイスタンダー（傍観）作用（bystander effect）」が多少ある場合がある。
【００４２】
本発明の１つの特定の非限定的な実施形態では、アルブミンプロモーター／ウロキナーゼ導入遺伝子を保有するトランスジェニックマウスが宿主として使用できる。ウロキナーゼは、血餅を溶解させる上で臨床的に有用なプラスミノーゲンアクチベーターである。それは、アデノウイルスベクターにより肝芽腫細胞に導入された場合に、それらの細胞に対して有毒であることが示された（Lieberら, 1995, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92:6210-6214）。さらに、Sandgrenらは、マウス・アルブミンエンハンサー／プロモーターにより駆動されるマウス・ウロキナーゼ遺伝子を含むトランスジェニックマウスを作製した（Sandgrenら, 1991, Cell 66:245-256）。アルブミンは胎仔の肝臓により産生されないので（Krumlaufら, 1985, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 5-0:371-378）、動物は、ウロキナーゼが産生されなかったために胎内では生存していた。しかし、出生後は、アルブミンプロモーターが活性化されて、ウロキナーゼの存在により肝臓は破壊された。そのようなトランスジェニックマウスを宿主用として作製するために、ヘテロ接合体であるトランスジェニックマウスB6SJLバックグラウンドがJackson Laboratoriesから入手可能であり（ストック番号No. 002214）、これは、ヒト成長ホルモンのポリＡ付加部位と共に3.5kbのマウス・アルブミンプロモーター配列により駆動されるマウス・ウロキナーゼ遺伝子を含んでいる。ヘテロ接合体の交配からの妊娠マウスを用いて、ホモ接合型の子孫を作製することが可能である。出生時に各動物内に存在するウロキナーゼ導入遺伝子のコピー数は、尾部小片のDNA抽出物から求めることができる。この場合、そのDNAをKpn I（ウロキナーゼ遺伝子内で１度切断する）で消化し、検出可能なように標識した、ウロキナーゼ遺伝子に特異的なプローブ、例えば5’-TGTGCTTATGTAGCCATCCAGCGAGTCCCC-3’（配列番号１）を用いてサザンブロットを行えばよい。ウロキナーゼ遺伝子の不活性化を引き起こす体細胞突然変異が起こる場合があるので、ヒト肝芽腫細胞の導入により成体へとうまくレスキューされた雄性マウスと雌性マウスとの交配ペアを用いて、ホモ接合型子孫の同腹子を作製することが望ましいと思われる。さらに、ウロキナーゼ導入遺伝子を保有するマウスに関する先の研究では、ウロキナーゼ遺伝子内で不活性化する突然変異により、体細胞突然変異を有する細胞は増殖するが、ホモ接合型の細胞は増殖しないことが判明した。予想どおり、増殖している細胞は、それほど活性に増殖していない細胞よりも倍数性が高かった（Sandgrenら, 1991, Cell 66:245-256）。したがって、ヒト肝芽腫細胞が増殖している間に測定した場合のヒトDNAのコピー数にはバイアスがかかり、倍数性のせいで細胞数を反映していない可能性がある。この理由から、ヒト細胞の数は、ヒト肝芽腫細胞に特異的なマーカー、例えば（限定するものではないが）ヒトアルブミン遺伝子またはそのタンパク質産物を測定することによって、より良く推定できる。
【００４３】
本発明の別の特定の非限定的な実施形態では、アルブミンプロモーター／HSV-チミジンキナーゼ遺伝子を保有するトランスジェニックマウスが宿主として使用できる。HSVのチミジンキナーゼは、薬剤ガンシクロビルをリン酸化できるという点で、哺乳動物のチミジンキナーゼとは異なる（Fyfeら, 1978, J. Biol. Chem. 253:8721-8727）。そうすることによって、HSVのチミジンキナーゼは、その非毒性の薬剤を有毒な形態に変換する（De Clerq. 1984, Biochem. Biopharmacol. 33:2159-2169）。特定の非限定的な実施形態において、HSV-TK遺伝子（D. Klatzmann, Universite Pierre et Marie Curie, Paris, Franceにより開発されたような、プラスミドpLTR-DTK内に存在するようなもの）は、Bgl IIおよびSal I制限酵素（Wilsonら, 1992, J. Biol. Chem. 267:963-967）を用いてマウス・アルブミンプロモーター（例えばpalb9-12 LDLR、James Wilson, University of Pennsylvania, Philadelphia, PA由来）の3.2kbの断片を切り出し、そして該プロモーター断片をHSV-TK遺伝子の直上流にあるポリリンカー部位に配置することにより調製されるアルブミンプロモーターに連結できる。このプラスミドを用いて、異系交配した初代CD1マウスを作製し、これを正常なCD1マウスと交配させてヘテロ接合体を作製し、検出可能なように標識したHSV-TK特異的プローブを用いた尾部小片のDNA分析により検出することができる。次に、ヘテロ接合体の交配ペアを用いて、アルブミンプロモーター／HSV-TK導入遺伝子に関してホモ接合型であるマウスが作製できる。天然のHSV-TK遺伝子が、精巣において該遺伝子を活性化するエレメントを含んでおり、このために交配用動物として使用できない不妊動物ができる可能性がある点に注意すべきである。したがって、プラスミドpLTR-ΔTKに含まれる遺伝子のような、該遺伝子のこれらのエレメントを欠く形態が好ましい（そのような変異型の遺伝子の全部、ならびに野生型のものがHSV-TK遺伝子と考えられる）。この特定の構築物を含むトランスジェニックマウスを交配させることによって、その欠失の成功が確認された（Salomonら, 1995, Mol. Cell. Biol. 15:5322-5328）。さらに、該導入遺伝子を欠く近傍の細胞を破壊してしまうという、HSV-TK遺伝子産物のガンシクロビル用量依存性の（Culverら, 1992, Science 256:1550-1552）バイスタンダー作用が見られている（Kolberg, 1994, J. HIN Res. 6:62-64）。したがって、各種の用量のガンシクロビルを評価し、最大のヒト肝芽腫細胞増殖をもたらすのに要する最少用量を確定することが望ましいと思われる。
【００４４】
本発明のさらに別の非限定的な実施形態では、肝細胞により代謝されて毒物となる薬物を用いて宿主肝細胞数を減少させることができる。例えば、かかる薬物は、寛容化の後に次いで、しかし、ヒト肝芽腫細胞移植の前に投与することができる、薬物への曝露と宿主動物肝芽腫細胞の死滅との間に時間差があるのが好ましい。そうすると、生存に必要とされる肝機能レベルを提供するのに十分な数の肝芽腫細胞が存在する程度に、移植を受けた肝芽腫細胞が増殖しながら、宿主動物が肝機能を維持することができるからである。ある実施形態においては、該薬物は、ピロリジジンアルカロイドであるレトロルシンであることができ、これは肝細胞により代謝されて毒性を有するDNAアルキル化中間体となる。かかる薬物の用量は、宿主動物の生存を維持し得る用量を確立するために滴定されるべきである。例えば、２週間間隔をあけた30 mg/kgのレトロルシンの２回投与は、新生ラットに対して致死的であり、一方、30 mg/kgの１回投与は、全てのラット肝細胞を死滅させるには十分でなかった。しかし、１回目の投与が出生時、２回目の投与がその２週間後である、12 mg/kgのレトロルシンの２回の投与は致死的ではなかった。したがって、本発明は、出生時に10〜30 mg、次いで、その２週間後に10〜30 mgの用量のレトロルシン、そして、総量で60 mg未満、好ましくは40 mg未満のレトロルシンを用いて寛容化して、ヒト肝芽腫細胞移植を受けるための新生ラットを作製するための処理方法を提供する。
【００４５】
5.1.2 寛容化
ヒト肝芽腫細胞の宿主として用いようとする非ヒト動物は、好ましくはヒト肝芽腫細胞またはヒト肝芽腫細胞から調製した溶解物の形で、関連する抗原を投与することにより、それらの肝芽腫細胞に対して寛容にすることができる。分化肝芽腫細胞系を使用する場合、寛容化に使用する細胞は、移植に使用する細胞と同じ継代培養物(例えば、寛容化のための細胞源として使用する培養物は同一の実験室ストック由来のものであるのが好ましく、10回未満継代した同じ培養物であるのが好ましい）からのものであるのが好ましい。寛容化のための抗原は、細胞全体として、細胞抽出物として、またはその１種以上の精製成分として投与すればよい。寛容化抗原の供給源は肝芽腫細胞とすることができるが、あるいはまた、別のタイプの細胞であってもよいし、異なるタイプの細胞の混合物であってもよい。例えば、ヒト肝組織の標本から調製された細胞が寛容化抗原の供給源として使用可能であり、そのような細胞としては、肝細胞だけでなく、線維芽細胞、胆管系の細胞、血管内皮細胞、クッパー細胞なども含まれ得る。別の例として、ヒト脾細胞もしくはその溶解物を用いて寛容を誘導することができる。寛容化に用いようとする細胞は、好ましくは、望ましくない構成成分を含まないものである。例えば、該動物を、最終的に、感染物質に対する免疫応答が望ましくは損なわれていない疾患についてのモデル系として使用しようとする場合、該動物は、その感染物質に対して寛容化すべきではない。あるいはまた、該動物を、肝臓が感染物質により損傷を受けているヒトの肝臓の再構成のために用いるヒト肝芽腫細胞の増殖を支持するための宿主として使用しようとする場合には、該宿主動物を該感染物質に対して寛容化しないか、またはいかなる時点においても該感染物質を該宿主動物に導入しないことが望ましい。上記の細胞または溶解物は、生理学的に適合性である溶液に加えて導入される。ここで、投与される容量とは、そのような溶液中に含まれる細胞または溶解物についていう。
【００４６】
宿主動物は、寛容化される時点で、いつの時期（齢）のものであってもよいとされるが、該動物の齢が高くなるほど寛容化は難しくなると思われる。好ましくは、該動物は、乳幼児のうちに寛容化され、より好ましくは、該動物は、新生仔の場合出産前後期に寛容化されるか、または子宮内で寛容化される。"新生仔"および"新生"という用語は本明細書中では互換的に使用する。対象とする宿主動物がラットである場合、寛容化の好ましい上限齢は受胎後18日（胎内）であり、さらに好ましい寛容化の齢は受胎後17日（胎内）または出生後24時間以内である。対象とする宿主動物がマウスである場合、寛容化の好ましい上限齢は受胎後18日（胎内）であり、さらに好ましい寛容化の齢は受胎後17日（胎内）または出生後24時間以内である。対象とする宿主動物がブタである場合、寛容化の好ましい上限齢は受胎後90日であり、さらに好ましい寛容化の齢は、該動物がまだ胎内にある場合には受胎後80日か、または出生後24時間以内である。
【００４７】
寛容化は、いずれの経路で達成してもよく、例えば（限定するものではないが）静脈内、腹腔内、皮下および胸腺内経路が挙げられる。抗原を静脈内、腹腔内、皮下および胸腺内に導入することにより、動物を抗原に対して寛容にさせる方法は、当技術分野において公知である。寛容化の好ましい方法としては、限定するものではないが、静脈内、腹腔内、皮下、および胸腺内経路によりかかる抗原を含むヒト細胞または細胞抽出物を投与することが含まれる。最も好ましい寛容化の方法には、胸腺内または腹腔内へのヒト細胞の接種が含まれる。
【００４８】
特定の非限定的な一例として、対象とする宿主動物がラットである場合、寛容は、１×104〜１×106個、好ましくは105個のヒト肝芽腫細胞から調製した溶解物を、胎内での15〜18日齢、好ましくは17日齢のラット胎仔の腹膜内に徹照下で接種することにより誘導できる。この溶解物は、適当数のヒト肝芽腫細胞の懸濁液を超音波処理することにより調製できる。また、上記の期間内に同数の細胞全体を腹膜内に接種してもよい。対象とする宿主動物がマウスである場合、溶解物中でのヒト肝芽腫細胞の数は１×103〜１×105個、好ましくは104個とすることができ、腹腔内接種は、受胎後15〜18日の間に行うことができる。対象とする宿主動物がブタである場合、溶解物中のヒト肝芽腫細胞の数は約105〜106個であるかまたは同数の細胞全体とすることができ、腹腔内接種は、受胎後約75〜90日の間に行うことができる。あるいはまた、腹腔内接種は、該動物が新生仔である間に行ってもよい。
【００４９】
第2の非限定的な例として、寛容は、Fabregeら, 1995, Transplantation 59:1362-1364に記載されているような方法に従って胸腺内注射することにより誘導できる。細胞全体または細胞溶解物のいずれかを投与すればよい。特に、対象とする宿主動物がラットである場合、約１〜10μl、好ましくは約５μlに調製した約１×102〜１×105個のヒト肝芽腫細胞（またはその溶解物）を、生まれたて（新生仔）ラットの胸腺に、好ましくは出生後１〜２時間以内に注射できる。対象とする宿主動物がマウスである場合、約１〜10μl、好ましくは約５μlに調製した約１×102〜１×104個、好ましくは100個のヒト肝芽腫細胞（またはその溶解物）を、３ヶ月齢以下、好ましくは新生仔のマウスの胸腺に、例えば出生後１〜２時間以内または24時間以内に注射できる。対象とする宿主動物がブタである場合、約50〜200μlに調製した約１×105〜106個のヒト肝芽腫細胞（またはその溶解物）を、好ましくは１週齢以下の乳仔ブタの胸腺に注射できる。特定の例として、新生仔マウスは、氷上で冷やすことにより麻酔し、胸部をアルコールおよびベタジンのスワイプ（swipe；拭取り剤）で清浄にし、該新生仔の半透明の皮膚を通して胸腺が見えるようにし、眼科用ハサミで１〜２mm切開して胸腺を露出させることができる。次に、ヒト細胞またはヒト細胞の溶解物を胸腺にゆっくり注入し、次に切開部を無菌ナイロン縫合糸で閉じればよい。次に、切開領域を再清浄し、マウスを暖めたパッドにのせ、その母マウスにできるだけ早く戻せばよい。
【００５０】
寛容化の成功を評価するには、該動物へヒト肝芽腫細胞を導入し、それらが長期にわたって生存するか否かを（例えば、ヒト血清アルブミンの生成をモニターすることにより；後記を参照）判定することができる。あるいはまた、該動物からのリンパ球のヒト肝芽腫細胞と反応する能力を、標準的な免疫学的技法、例えば肝芽腫細胞に応答してのＴ細胞の増殖、細胞障害性Ｔ細胞の応答の誘導、または混合リンパ球反応を測定する方法などを用いて評価してもよい。
【００５１】
5.1.3 ヒト肝細胞の導入
次に、先の項で述べたようにして寛容にした宿主動物にヒト肝芽腫細胞を導入することができる。肝芽腫細胞は、好ましくは脾臓内注射により導入できるが、他の経路、例えば肝臓実質への直接注射、肝被膜下、または経門脈なども用いることができる。
【００５２】
特定の非限定的な例として、対象とする宿主動物が上記で述べたようにして寛容化したラットである場合、約106〜５×107個のヒト肝芽腫細胞、好ましくは約２×106個の肝芽腫細胞を、出生後約24時間以内の寛容化ラットに導入でき、これは、該動物を麻酔し、左肋骨周囲領域（left paracostal area）に３〜４mmの切開を行って、脾臓が見えるようにし（Marucciら, 1997, Hepatol, 26:1195-1202）、約50〜300μl、好ましくは約200μlの容量の無菌媒体中に調製した肝芽腫細胞を注入することにより行われる。対象とする宿主動物が寛容化したマウスである場合、同様の手順により導入されるヒト肝芽腫細胞の数は、約５×103〜５×106個、好ましくは約105個を約25〜200μl、好ましくは約100μlの容量の無菌媒体中に調製したものとすることができ、このヒト肝芽腫細胞は、寛容化した後約１日〜２ヶ月の間、好ましくは３〜４日後に投与される。対象とする宿主動物が寛容化したブタである場合、ヒト肝芽腫細胞の数は、約108〜1010個、好ましくは約109個を約10〜20μlの容量の無菌媒体中に調製したものとすることができ、ヒト肝芽腫細胞は、出生後約１日〜７日または寛容化した後約35日で投与される。
【００５３】
当技術分野で公知のいずれの肝芽腫細胞系も本発明に従い使用することができる。ヒト肝芽腫細胞は、民間の供給元から入手でき、例えば、Clonetics Corporation, 8830 Biggs Ford Road, Walkersville, MD 21793（この会社では正常ヒト肝芽腫細胞をカタログ番号CC-2591として販売している）、またはInvitro Technologies, Inc., Baltimore, MD.が挙げられる。
【００５４】
分化肝芽腫細胞系を移植に使用する場合、例えば、限定するものではないが、Huh7またはHepG2細胞などの細胞系は標準的な実験室供給源から入手することができる(Liangら, 1993, J. Clin. Invest. 91:1241-1246参照)。例えば、Huh7は個人の研究者から入手することができる。HepG2はAmerican Type Culture Collection (ATCC) 受託番号HB-8065を有している（ATCCの住所は、10801 University Blvd., Manassas, VA 20110-2209である）。
【００５５】
5.1.4. ヒト肝芽腫細胞の有利な増殖
本発明の特定の非限定的な実施形態では、選択圧を用いて、ヒト肝芽腫細胞の増殖を有利にすることができる。そのような選択圧は、本明細書では、肝芽腫細胞を導入する時点で宿主動物に既に存在しているかまたはその後で課せられ、その結果として（宿主の肝細胞ではなく）ヒト肝芽腫細胞が増殖する見込みがより高くなる任意の条件を含むものとして定義される。
【００５６】
例えば、選択圧は、内因性的に（直接的に）または活性化剤の投与により（間接的に）宿主肝細胞の生存能力を低下させる導入遺伝子の存在によりもたらされるものとすることができる。あるいはまた、ヒト肝芽腫細胞を、肝臓毒素への曝露の後で該細胞を生存可能にする防御遺伝子でトランスフェクトしてもよい。１つの特定の非限定的な例において、その導入遺伝子は、アルブミンプロモーター／ウロキナーゼ構築物とすることができ、それにより、宿主動物が成熟し、アルブミンプロモーターが活性になった時に、宿主の肝細胞がウロキナーゼの毒性作用によって除去できる。そのような場合、選択圧は、該動物の成熟と、その結果もたらされる導入遺伝子の活性化である。第２の特定の非限定的な例において、該導入遺伝子はアルブミンプロモーター／HSV-TK構築物とすることができ、それにより、ガンシクロビルが（例えば無菌のリン酸緩衝生理食塩水（PBS）中に調製した250mg/kgのガンシクロビルの腹腔内注射剤として）宿主動物に投与されると、トランスジェニック宿主の肝細胞は選択的に死滅させられ得る。そのような実施形態において、宿主肝細胞の死は、ヒト肝芽腫細胞の補償的増殖を有利にすると予期される。これは、再生を刺激する条件の間に実質肝細胞が増殖する、という既知の特性によって生じ得る。
【００５７】
宿主の肝細胞を、短期間の間に大部分を除去するのではなく、段階的に弱化させることが望ましい場合がある。何故ならば、突然の肝機能の喪失は、該動物の死、および／または宿主の肝臓におけるヒト肝芽腫細胞集団の確立を不利にする条件を生じる可能性があるからである。例えば、アルブミンプロモーター／HSV-TK構築物に関してトランスジェニックである宿主動物へ、ガンシクロビルを肝芽腫細胞の導入前から投与開始し、その導入後まで何回かにわたって投与し続けると、宿主細胞は徐々に排除され、それにより、宿主肝細胞の機能の大部分が失われる前にヒト肝芽腫細胞が「足場（foothold）」を築くことができる。
【００５８】
別の非限定的な実施形態において、肝芽腫細胞は、防御遺伝子でトランスフェクトすることができる。例えば、シトクロム2E1、1A2および／または3A4に対するアンチセンスRNAもしくはリボザイムをコードする遺伝子（それぞれ、CYP2E1、CYP1A2、CYP3A4）は、薬剤アセトアミノフェンの活性化を阻止する。肝細胞における該薬剤の代謝産物は、肝芽腫細胞の死を引き起こす。したがって、その導入遺伝子を含む肝芽腫細胞は、細胞移植の後で大用量のアセトアミノフェンを投与した場合、宿主細胞よりも生存の上で有利である。同様の戦略は、肝臓毒素ファロイジンの作用に耐性である突然変異型RNAポリメラーゼIIをトランスフェクトすることである。突然変異型ポリメラーゼを産生するトランスフェクトされたヒト肝芽腫細胞を保有する宿主にファロイジンを投与すると、保護され、宿主細胞よりも選択上利点である。
【００５９】
5.1.5. ヒト肝芽腫細胞の存在の確認
宿主におけるヒト肝芽腫細胞の存在は、特定のヒトマーカーについてアッセイすることにより評価できる。該動物から（例えば経皮的に）採取した血液サンプルまたは肝臓生検材料におけるそのようなマーカーの存在は、該動物の生存能力に影響を及ぼさずに評価できる。あるいはまた、キメラ化の成功は、剖検時に過去のデータと照らし合わせて（retrospectively）評価してもよい。
【００６０】
特定の例として、免疫学的に異なるヒトアルブミンの存在の有無は、血液サンプルまたは組織サンプルにおいて、ヒトアルブミンには特異的であるが宿主アルブミンには特異的ではない抗体を用いるウエスタンブロット分析または免疫組織化学により判定できる（例えば、Wuら, 1991, J. Biol. Chem. 266:14338-14342；OsbornおよびWeber, 1982, Meth. Cell Biol. 24:97-132を参照されたい）。公的に入手可能なヒトアルブミン特異的抗体の一例は、Sigma #A6684モノクローナル抗ヒト・アルブミンHSA IIである。
【００６１】
5.2. HCV感染のためのモデル系
本発明の別の非限定的な実施形態では、HCV感染のための一般的なモデル系として、より具体的にはヒト組織におけるHCV病理学のためのモデル系としてキメラ肝臓を有する動物を使用することができる。ヒト肝細胞に対して寛容であり、かつ、HCV複製を支持するキメラヒト-ラット肝臓を持つ動物は、HCVウイルス侵入を担う宿主細胞受容体の同定および特性決定のための価値ある資源であり得る。さらに、かかるモデル系は、HCV感染に関わるウイルス分子の組み立て(elaborate)に役立ち得る。HCVに感染することができ、かつ、該ウイルスの複製を支持しうるヒト幹細胞の利用可能性の高さは、本発明のモデル系により提供されるいくつかの利点の一つである。キメラ肝臓由来の肝細胞は、当技術分野で公知の標準的技法を使用して単離することができる。非限定的実施例において、肝細胞は、コラゲナーゼ潅流アッセイを用いてキメラ肝臓から分離することができる(例えば、Pileriら, 1998, Science 282:938-941を参照されたい)。次いで、ヒト肝細胞を単離し、非ヒト細胞から、例えば、FACS選別により、実質的に精製することができる。
【００６２】
HCVおよびHCVを含む複合体は、当技術分野で公知のいずれかの方法により単離することができる。例えば、HCVを含む複合体は、精製HCV感染ヒト肝芽腫細胞から単離することができる。別の非限定的な実施例では、キメラ肝臓を有する感染動物の血清からHCVを単離することができる。
【００６３】
5.2.1.  感染性血清によって作製されたHCVモデル
非限定的な特定の１実施形態において、本発明はHCV感染のためのキメラ動物モデルの１つを提供する。
【００６４】
１組の好ましい実施形態では、宿主動物は、分化ヒト肝芽腫細胞系の細胞により寛容化され、次いで、該細胞の移植を受ける。かかる実施形態の具体的な非限定的実施例の１つにおいて、該細胞系はHuh7である。より具体的な実施形態において、キメラ動物は、Huh7細胞により寛容化され、Huh7細胞を移植されたラットである。
【００６５】
別の非限定的な１組の実施形態では、キメラ動物は、アルブミンプロモーター／ウロキナーゼ遺伝子またはアルブミンプロモーター／HSV-TK遺伝子などの、その産物が肝芽腫細胞に対して選択的に毒性である１遺伝子についてのトランスジェニックマウスである。こうしたマウスにおけるヒト肝芽腫細胞のC型肝炎感染は、ヒト肝芽腫細胞のコロニー形成のための導入と(i)同時に、または好ましくは(ii)その後であって、毒性導入遺伝子の効果で宿主肝細胞を弱体化または排除した後に、実行するとよい。好ましくは、キメラ動物は感染の前に、実質的に（少なくとも約20％、好ましくは少なくとも50％、さらに好ましくは少なくとも80％の）ヒト肝芽腫細胞を含む肝臓を持つ。
【００６６】
感染薬物の起源は、HCVに感染しているが、肝芽腫細胞に感染する１種以上のその他の薬物による明白な感染がない１以上のヒト被験体からの血清でよい。分枝DNA（bDNA）アッセイ（Chiron, San Fransisco, CA）によって、遺伝子型Iaの血清サンプルをウイルスの負荷についてアッセイすることができる。対照キメラ動物の偽感染には、非感染被験体および非ウイルス性肝炎の個体からの血清を使用することができる。標準的バイオハザード予防手段を使用して、ヒト肝芽腫細胞のコロニー形成後約2〜4ヵ月、好ましくは約6週間後のキメラ動物に、感染性ヒト血清由来の約103〜107粒子／mlの範囲の力価でHCV RNAを含む血清を静脈内注入することができる。好ましくは（例えばNational Genetics Institute, Los Angeles, CAによる）あらかじめ判定されているウイルス力価を持つ感染性ヒト血清中のHCV RNAの量を次第に増大させながら、１パネルのこうしたキメラ動物に注入することができる。該キメラ動物が齧歯動物である場合、注入の部位は尾部静脈とし、注入する血清の容量は0.1〜0.5 mlとすることができる。血清は好ましくは投与の前にフィルター滅菌することができる。好ましい実施形態においては、キメララットを麻酔し、その脾臓を露出させ、血清0.1 mlあたり100,000コピーのHCVを脾臓に注入し、注入部位に圧力を課し、次いで、切開部分を閉じる。
【００６７】
キメラ動物（群）から血清を採取し試験して、AST（アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ）、ALT（アラニンアミノトランスフェラーゼ）およびアルカリホスファターゼなどの肝機能マーカーの基準値および感染後のレベルを確定することができる。例えば、Sigma Chemical Co., St.Louis, MOからのキットを使用して、血清中のAST、ALTおよびアルカリホスファターゼの基準値および感染後の週毎のレベルを分光光度測定によって決定することができる。この場合、適切な標準物質を使用して参照曲線を作製する。該キメラ動物が齧歯動物である場合、標準的技術を使用して、血液サンプルを動物の眼窩後部(retroorbital)から取得することができる。
【００６８】
例えばOrtho Diagnosticsから入手可能なELISAキット（カタログ番号930740：Ortho HCV ver.3.1 ELISA TEST SYSTEM；Ortho Diagnostics, Raritan, NJ）を使用して、循環中の抗体（例えば抗C100-3抗体）について試験することによって、HCVに対する血清変換についてキメラ動物（群）を試験することができる。血清変換に関する試験は、例えば感染後最初の１ヵ月は１週間毎に、その後は毎月実施するとよい。
【００６９】
不適正な鎖の偽プライミングを排除するため、ストリンジェント条件下（70℃）で実施する熱安定性rTth RT-PCRを使用する、プラス鎖HCV RNAについての血清の希釈アッセイによって、ウイルスの負荷を（例えば毎週）判定することができる。分枝DNA分析を使用してもよいが、これはそれほど感度がよくない。プラス鎖RNA分析のためのcDNA逆進プライマーは5'-TCGCGACCCAACACTACTC-3'（配列番号２）、前進プライマーは5'-GGGGGCGACACTCCACCA-3'（配列番号３）とすることができる。逆転写活性がない場合のPCR増幅は、記載されているように（Lanfordら、1995, J.Virol. 69:8079-8083）、マンガンおよびマグネシウムイオンをキレート化することによって、達成することができる。プライマーの内部の１領域に対して検出し得るように標識したプローブを使用するサザンブロットによって、HCVの5'-NTRのヌクレオチド15-274の範囲の増幅された産物を定量することができる。
【００７０】
生検によるかまたは絶命させた動物から取得した肝臓組織は、HCV複製および組織病理学的変化について評価することができる。生検は、ケタミン（40 mg/kg）およびキシラジン（5 mg/kg）の筋内注射でキメラ動物を麻酔し、アルコールおよびベタジン清拭によって腹部を清潔にし、腹壁を切開して肝臓を露出させ、肝臓組織の細片（重量少なくとも約10 mg）を採取することによって、実施することができる。次に、生検部位に殺菌トロンビン 100 U（または必要とされる別の治療的有効量）を局所投与し、その後ゲルフォームを塗布して出血を防止し、腹壁を可溶性縫合糸によって閉じ、皮膚をナイロン糸によって閉じることができる。ウイルス複製は、rTth RT-PCR（Lanfordら、1995, J.Virol. 69:8079-8083）を使用して、（例えばChomczynski and Sacchi, 1987, Anal.Biochem. 162:156-159、に記載されたようにして調製した）肝臓RNA中のマイナス鎖鋳型HCV RNAの量を測定することによって、定量することができる。肝臓組織構造を評価するため、肝臓組織を固定し、切片化し、それぞれ炎症または線維形成を評価するためにヘマトキシリン-エオシンまたはトリクロムで染色することができる。Knodel採点法（Knodelら、1981, Hepatology 1:531）などの標準的採点法を使用することができる。新生物病変の存在または不在を評価することができる。
【００７１】
HCV感染したキメラ動物を作製するための最適条件を決定するため、血清アミノトランスフェラーゼASTおよびALT、アルカリホスファターゼレベル、ならびにウイルスRNAの負荷の時間的経過を時間の関数としてプロットし、感染を持続させるのに必要な最少の数のウイルス当量を決定することができる。１動物の血清中の検出し得るHCV RNAのレベルを感染の慢性度の指示価として使用することができる。
【００７２】
上記の実施形態に関連して考えられる問題には、以下のものがある。第１に、HCV複製の尺度としてのマイナス鎖HCV鋳型の検出は、増幅技法の必要性およびプラス鎖の誤った増幅の可能性による問題がある。RT-PCRの開始のためのストリンジェント条件、およびcDNAのPCRの前のキレート化による逆転写酵素の不活性化を使用する、Lanfordら（上記）の方法は、偽増幅を1／104〜1／105まで低下させることが示された。第2に、実験動物は、肝炎を生じさせる内因性のウイルスを保有していることがあり(例えば、実験室のマウスを宿主とすることを考えると、「病原体を含まない」環境下でもマウス肝炎ウイルスが見つかることがあるという事実から、例えば、Microbiological Associates,Inc.,Rockville,MD、から入手可能なマウスウイルススクリーン（Carlsonら、1989, J.Clin.Invest. 83:1183-1190）を使用して、宿主マウスがウイルスを含まないことを確認する方が望ましいことになる）、ここで正の試験結果が出た動物は宿主として使用しない。第3に、接種に使用するヒト血清の量を増大させることによって、感染の効果を上げることができる。
【００７３】
HCV感染のキメララットモデルの実施例を、後述するセクション13の実施例の項に示す。
【００７４】
5.2.2.  感染性プラスミドによって作製したHCVモデル
関連する１実施形態において、AsOR-PLまたはAsORリシン-VSVGなどの肝臓特異的タンパク質担体と複合体化させたHCVプラスミド（Kolykhalovら、1997, Science 277:570-574）によって、感染を導入することができる。ここでAsOR-PLはアシアロオロソムコイドポリリシンであり、AsORリシン-VSVGはL-リシンメチルエステルおよびVSVGタンパク質の合成25アミノ酸ペプチドに共有結合したアシアロオロソムコイドである。0.15 M NaCl中のDNAに、室温で連続してボルテックスしながら、タンパク質コンジュゲートを25μlアリコートづつ徐々に添加することによって、DNA-タンパク質複合体を形成させることができる。室温で30分のインキュベート後、260 nm、340 nmおよび400 nmでの吸収を測定して、複合体の形成を検出することができる。複合体は0.22ミクロンフィルターを通過させることによってフィルター滅菌することができる。次に、ある量のDNA／タンパク質複合体を投与することができる。次に、滅菌生理食塩水 0.5 ml中のDNA／タンパク質複合体約10〜50μgをマウスの尾部静脈に注入することができ、100〜500 μgのDNA/タンパク質複合体（容量1〜5 ml）をラットに注入することができる。
【００７５】
5.2.3.  感染した肝芽腫細胞の移植によって作製したHCVモデル
感染した血清での接種によるHCV感染の産生の代替法として、HCVに感染した肝芽腫細胞をキメラ動物に移植することによって、感染を産生することができる。感染した肝芽腫細胞をヒト細胞のコロニー形成期間中に導入することもできるが、ヒト肝芽腫細胞の実質的集団を持つキメラ肝臓中に導入する方が好ましい。１組の非限定的実施形態において、キメラ動物は、アルブミンプロモーター／ウロキナーゼ遺伝子またはアルブミンプロモーター／HSV-TK遺伝子などの、その産物が肝芽腫細胞に対して選択的に毒性である１遺伝子についてトランスジェニックなマウスである。別の組の非限定的実施形態において、キメラ動物は、Huh7細胞を用いて寛容化され、移植を受けたラットである。
【００７６】
感染ヒト肝芽腫細胞は、Lieberら、1996, J.Virol. 70: 8782-8791、に記載されているようにして、取得することができる。適切な病原体拘束操作法を使用して、HCVに感染した肝臓移植レシピエントから、ヒト肝臓標品を取得することができる。3面をカプセルでカバーした肝臓の先端片をカルシウムを含まないバッファーで潅流した後、カルシウムを含む潅流バッファー中のコラゲナーゼで潅流する。次に、低速遠心分離によって、肝芽腫細胞をペレット化する。メトリザミド(metrizamide)勾配遠心分離によって、実質肝芽腫細胞から非実質細胞を分離する。トリパンブルー排除法によって、単離した肝芽腫細胞の生存性を評価することができる。肝芽腫細胞をWilliams培地中に約107細胞／mlで再懸濁させる。
【００７７】
次に、感染させた肝芽腫細胞を、少なくとも約20％、好ましくは少なくとも50％、さらに好ましくは少なくとも80％のヒト肝芽腫細胞を含む肝臓を持つキメラ動物などのキメラ動物肝臓中に導入することができる。感染させた肝芽腫細胞を脾内注入によって導入することができる。動物がマウスの場合、肝芽腫細胞を導入するには、ケタミン（90 mg/kg）／キシラジン（10 mg/kg）で動物を麻酔し、次に無菌条件下で、左側方肋骨部で2〜3 mm切開し、脾臓を露出させることができる。次に脾臓を体外に出し、感染肝芽腫細胞を脾臓の実体中に徐々に注入することができる。ゲルフォームを使用して止血し、脾臓を体腔内に戻し、そして傷口を縫合して閉じる。当技術分野で公知の方法により、生成した感染動物の血清変換、ウイルス負荷、肝機能のタンパク質マーカーの血清レベル、および組織病理学の監視を実施する。さらに、これらの方法は、より大きい動物における使用のために適応させることができる。
【００７８】
5.3. HCVモデルの使用
HCV感染のキメラ動物モデルを使用して、HCVの生物学を研究するばかりでなく、HCV感染および／または複製を防止または抑止することができる薬物を同定することもできる。例えば、試験薬物がHCVによる感染を抑止するかどうかを判定するために、感染血清の注入の前またはこれと同時に投与した場合の、薬物の感染を抑止する効果を評価することができる。同様に、感染の経過中に投与された試験薬物の効果を判定することができる。試験薬物の有効性を判定するのに有用なパラメーターとして、試験動物のHCVに対する血清変換の有無および時期、ウイルス負荷、その動物からの血清の別の動物への感染能力、肝機能および／または肝芽腫細胞の生存性に関連するタンパク質／酵素の血中レベル、ならびに肝臓の組織化学が含まれる。
【００７９】
本発明は、宿主細胞からHCV受容体を単離する方法を提供する。宿主細胞は、本明細書中で記載されるキメラ動物から、または、国際特許出願第PCT/US00/05713号 (WO 01/32009 A1)に示される方法に従い作製されるキメラ動物から得られる(in vitro研究のため)または該動物内に含まれる(in vivo研究のため)初代培養ヒト肝細胞または分化ヒト肝芽腫細胞系であることができる。in vitro研究のためには、細胞源としてキメラ動物の肝臓を使用する、初代培養肝細胞を回収するための当技術分野で公知の方法を使用することができる。非限定的実施形態においては、HCVを、分化ヒト肝芽腫細胞系を有するキメラ肝臓を持つ非ヒト動物とともにインキュベートする。HCVの特定の膜表面分子が、宿主認識、結合、膜融合および／またはウイルス侵入に関与している。該分化ヒト肝芽腫細胞上の少なくとも１種のタンパク質(すなわち、HCV受容体)が、HCV膜分子(すなわち、HCV受容体により認識されるHCV表面上のリガンド)により認識されるであろう。かかる分子としては、限定するものではないが、ポリペプチド、炭水化物、脂質、糖化タンパク質、または糖脂質が挙げられる。
【００８０】
HCVと宿主細胞(上記に定義した）上のその受容体との特異的結合は、当技術分野で公知の結合アッセイを用いて検出することができる。非限定的実施形態において、結合はHCVの表面を標識することにより検出する。HCVの膜分子は当技術分野で公知のいずれかの標識方法を用いて標識することができる。非限定的実施例において、光親和性架橋剤を用いてHCVを標識することができる(例えば、Greg T. Hermanson, Bioconjugate Techniques, Chapter 5. Heterobifunctional Cross-linkers. pp. 228-291. Academic Press, Inc. 1996を参照されたい)。HCVを分化ヒト肝芽腫細胞へ結合させた後、該複合体を架橋させる。次いで、該複合体の標識HCV成分を使用して、架橋させた複合体を可視化させ、局在化させ、および／または単離することにより分離し、他の細胞成分および他の汚染物質から該複合体を実質的に精製することができる。
【００８１】
該複合体におけるHCV受容体を該複合体から分離し、次いで、単離し、同定することができる。さらに、HCV受容体によって認識される1つ以上のHCVリガンドを該複合体から単離し、同定することができる。
【００８２】
本発明は、宿主細胞上のHCV受容体とのHCVの結合を阻害する化合物を同定するための方法も提供する。非限定的実施例においては、HCV膜タンパク質を潜在的阻害化合物と結合させることにより複合体を形成する。次いで、この複合体を宿主細胞上のHCV受容体とともにインキュベートし、該HCV受容体のウイルスタンパク質との結合についてアッセイする。対照実験を試験阻害化合物の非存在下で実施する。対照実験と比較して、HCV受容体-ウイルスタンパク質間の結合が低下している場合、HCVとHCV受容体との結合を試験化合物が有効に阻害していることを示す。試験化合物としては、限定するものではないが、ポリペプチド、炭水化物、脂質、糖化タンパク質、糖脂質、もしくはステロイドなどの有機化合物、または、金属などの無機化合物が挙げられる。かかる化合物のライブラリーは当技術分野で公知であり、本発明に従いスクリーニングすることができる。
【００８３】
別の非限定的実施形態では、HCVリガンドをHCV受容体と結合させた後に初めて、試験化合物を該アッセイ中に導入する。この場合、HCV受容体-ウイルスタンパク質間の結合の破壊が検出されると、試験化合物が受容体-リガンド相互作用の有効な阻害物質であることを示す。上述の結合アッセイは、結合していない化合物を除去する１以上の工程を含んでもよい。また、該結合アッセイは、HCV受容体、受容体リガンドおよび／または試験化合物を固体マトリックスに固定化する工程を含んでもよい。さらに、該結合アッセイは、例えば、試験化合物の高密度アレイをスクリーニングすることにより、ハイスループット様式で行うこともできる。かかる高密度アレイ（例えば、タンパク質アレイ）は当技術分野で公知である。
【００８４】
さらに、本発明は、HCVとHCV受容体との結合を阻害する化合物が、細胞融合をも阻害することができるかどうかについて調べる方法に関する。細胞融合アッセイおよび抗ウイルスアッセイは当技術分野で周知である。したがって、融合誘導活性の対照値を得ることが可能な条件下で、HCVと宿主細胞とをインキュベートすることにより、HCVと宿主細胞との間の融合を阻害する物質を同定することができる。並行して行われる実験では、融合が可能な条件のもと、試験化合物の存在下で宿主細胞とともにHCVをインキュベートし、それにより、融合誘導活性の実験値が得られる。対照値に対して融合誘導活性の実験値が低い場合に、該試験化合物が融合阻害物質であることを表す。
【００８５】
特定の非限定的実施形態では、細胞融合アッセイはin vitroで行う。かかるアッセイは、細胞を培養する工程を含み、該工程においていかなる処理も行わない場合、観察可能なレベルのシンシチウム形成が生じ得る。例えば、細胞融合を誘導するウイルスとともに非感染細胞を、HCV感染させた細胞の存在下でインキュベートすることができる。アッセイしようとする試験化合物の存在下で細胞をインキュベートする。各化合物について、ある濃度範囲を試験することができる。当技術分野で周知の培養条件を使用して、HCV感染後、適当な量の時間の間、該細胞を増殖させる。標準的組織学的方法を使用して、細胞融合とシンシチウム形成を示す多核細胞の存在について該培養物を調べる。
【００８６】
上記したように標的細胞に対するHCVの融合を阻害する化合物は、他のウイルス性疾患に対する抗ウイルス性物質としても有用であり得ることに注目すべきである。非限定的実施形態において、抗ウイルス性物質として同定された化合物は、化学的に修飾することができ、修飾していない化合物の有効性と比較して、HCVまたは他のウイルスに対する有効性について試験することができる。
【００８７】
さらに、本発明は、通常は感受性である宿主細胞中へのHCVの侵入を抑制する方法を提供する。例えば、HCVと感受性細胞との間の融合を抑制する化合物を用いて宿主細胞を処理することができる。特定の実施形態においては、該融合抑制性化合物を、ヒト肝細胞を有するキメラ肝臓を持つ非ヒト動物に投与する。有効期間後、キメラ動物におけるヒト肝細胞のHCV感染について調べる。HCV感染は、該化合物により減少させられるか、または優先的に、ほとんど完全に阻止され得る。すなわち、本ヒト肝臓モデル系を用いてかかる化合物のスクリーニングを行うことにより、ヒトの臨床試験における初期段階でのリスクを排除することができる。
【００８８】
かかる方法は、HCV曝露に対する予防法として、あるいは、ヒトにおいて現在罹患しているHCV感染の治療のために有用であり得る。したがって、本発明は、HCVのヒト細胞への感染を減少または抑制する上記抗ウイルス性物質を有効量で、HCV感染が減少するのに有効な時間投与することを含む、ヒトにおけるHCV関連疾患の予防方法または治療方法をも提供する。
【００８９】
本発明の方法により同定された抗ウイルス性化合物は、当技術分野で公知の技法を使用して、製剤化および投与することができる(Goodman & Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 第10版, J.G. Hardman(編), McGraw Hill, 2001; Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 第20版, A.L. Gennaro(編), Lippincott, Williams & Wilkins, 2000; Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, 第7版, H.C. Angel(編), Lippincott, Williams & Wilkins, 1999)。医薬組成物は抗ウイルス性化合物および医薬担体を含む。投与方法としては、限定するものではないが、静脈内、腹腔内、筋肉内投与ならびに直接投与または移植が挙げられる。HCV関連疾患を治療または予防するための抗ウイルス性化合物の有効量は、当技術分野で公知の標準的プロトコールを使用して決定することができる。上記参考文献中に記載されているように、用量および投与方法は、抗ウイルス性化合物の半減期、バイオアベイラビリティーおよび毒性を考慮して、決定することができる。すなわち、厳密な処方、投与経路および用量については、当業者であれば、当技術分野で十分に受け入れられている指針にしたがい判断することができる。
【００９０】
6.  実施例: 分化肝芽腫細胞によるラットの寛容化
6.1  材料および方法
6.1.1.  動物
体重250〜300 gmの妊娠Sprague-Dawleyラットを、12時間の明-暗サイクルで維持し、標準ラット餌を自由に与えた。
【００９１】
6.1.2.  細胞
低温保存されたヒト初代肝細胞をClonetics Corp. (Walkersville, MD)から入手し、使用するまで液体窒素中で維持した。凍結細胞を融解し、5 mg/mlのインスリンおよび0.39 μg/mlのデキサメタゾンを含むヒト肝芽腫細胞培地(Clonetics Corp.)で洗浄し、次いで、50 x g 、10分間、4℃にて遠心した。細胞の生存度はトリパンブルー排除染色法により測定した(約65％の細胞が生存しており、90％が実質性の肝芽腫細胞であった)。ヒト肝芽腫細胞系Huh7およびHepG2、ヒト繊維芽細胞IMR-90およびヒト腎臓293細胞を、10％ウシ胎仔血清("FBS")および抗生物質を含有するダルベッコ改変イーグル培地("DMEM")中で増殖させた。
【００９２】
6.1.3.  ヒト肝芽腫細胞の胎児内注入
妊娠15日〜17日の時点で、妊娠ラット群を、ケタミン(40 mg/体重kg)およびキシラジン(5 mg/体重kg)の筋肉内注射により麻酔した。無菌条件下で開腹し、妊娠している子宮を露出させ、強力なランプ(Fiber-lite MI-150, Dolan-Jenner Industries, Lawrence, MA)で透照した。初代培養ヒト肝細胞、Huh7またはHepG2 細胞（1 x 105個の細胞）を含む10 μl のPBSを、28ゲージのベベル先端針(Hamilton Inc., Reno, NV)を備えた滅菌された200 μlのHamiltonシリンジを用いてラット胎児の腹腔中に子宮壁を通して注射した。
【００９３】
6.1.4.  細胞移植
出生後24時間以内に、新生仔ラットを氷上に２〜５分間置いた。次に、無菌条件下で、左肋骨部切開を行い、初代培養ヒト肝細胞、Huh7またはHepG2 細胞、1mlあたり1 x 107個の細胞を含む200 μl のPBSを、滅菌済みHamiltonシリンジにより脾臓中へ30秒間かけて注入した。
【００９４】
6.1.5.  サンプル回収
ヒト肝芽腫細胞に対する宿主動物の寛容化は、外来抗原に曝露した後の宿主脾臓細胞の増殖を測定する混合リンパ球アッセイにより評価した(Schwartzら, 1975, J. Immunol. 115:1330-1338)。簡潔に述べると、細胞移植後１週目の寛容化動物または出生後１週目の非移植対照動物から脾臓を取り出し、5％PBS含有RPMI-1640培養液(GIBCO-BRL)中に分散させた。刺激細胞(初代培養ヒト肝細胞、Huh7、IMR-90および293 細胞)に2,000 Radでガンマ線を照射し増殖を抑制した。放射線照射した刺激細胞（3 x 105個の細胞/mlの細胞懸濁液0.5 ml）を、1 μCiの3H-チミジン(80 Ci/mmol, Amersham Life Science)でパルス標識したラット脾臓細胞の1 x 106個の細胞/mlの細胞懸濁液0.5 mlと混合し、次いで、37℃にて5％ CO2下72時間インキュベートした。トリクロロ酢酸("TCA")沈殿後、細胞をWhatmanガラスファイバーろ紙(Whatman)上で回収し、PBS、TCAおよびエタノールで逐次洗浄した。シンチレーションカウンター(Tri-CARB 4530, Parkard)でろ紙を測定した。非処理ラット由来の脾臓細胞ならびに単独でインキュベートした刺激細胞を対照として使用した。全ての実験は動物を３匹ずつ用いて行った。結果は、平均±標準誤差を単位cpm/106 細胞で表す。
【００９５】
6.1.6.  ラット肝臓におけるヒトアルブミンの検出
ラット肝臓内で移植後生存しているヒト肝芽腫細胞を検出するために、特異的マーカーとして5'プライマー(5'-CTGGTCTCACCAATCGGG-3')および3'プライマー(5'-CTGGTCTCACCAATCGGGGG-3')を使用してヒトアルブミン遺伝子配列を探索した。Huh7細胞から抽出したゲノムDNAを陽性対照として使用した。未処理ラットおよび非移植ラットからのゲノムDNAを陰性対照として使用した。
【００９６】
6.1.7.  ヒトアルブミンDNAの定量
ラット肝臓中に含まれるヒト肝芽腫細胞の数を定量するために、ヒトアルブミン遺伝子に対して特異的なプローブを使用するドットブロットを、完全ヒトアルブミン遺伝子を含有するプラスミド palb3 (Wuら, 1991, J. Biol. Chem. 266: 14338-1442)から切り出し32P-標識した1750 bp BamHi/BsteII ヒトアルブミンDNA断片を用いて、Kafatosの方法(1979, Nucl. Acids Res. 7: 1541-1552)を改変することにより行った。全てのアッセイは３連で行い、結果は平均±標準誤差で表す。既知数のHuh7細胞からのゲノムDNAを同様に測定した。
【００９７】
6.1.8.  ラット肝臓におけるヒトアルブミンmRNAの検出
移植したヒト肝芽腫細胞が肝臓特異的転写を保持しているかどうかを調べるために、Chomczynskiの方法(1987, Anal. Biochem. 162:156-159)に従い抽出した後で、以下のプライマー:
センス 5'-CCTTGGTGTTGATTGCCTTGCTC-3';および
アンチセンス 5'-CATCACATCAACCTCTGGTCTCACC-3';
を用いて、RT-PCRによりヒトアルブミンmRNAの存在について評価した。
【００９８】
ならびに、ラットアルブミンmRNAの存在については、プライマー:
センス 5'-CGGTTTAGGGACTTAGGAGAACAGC; および
アンチセンス 5'-ATAGTGTCCCAGAAAGCTGGTAGGG-3'；
を用いて評価した。ヒトおよびラットアルブミンmRNAに対するPCR産物の予想サイズは、それぞれ、315および388 bpである。
【００９９】
6.1.9.  ラット肝臓におけるヒトアルブミンの検出
移植後16週目に、ラットを犠牲にし、ラットの肝臓を組織凍結培養液(Triangle Biomedical Sciences, Durham NC)中で5ミクロンの厚さの切片に切断した。モノクローナルマウス抗ヒトアルブミン抗体(Sigma, St. Louis, MO)およびTexas Redコンジュゲートヤギ抗マウスIgG２次抗体(Amersham Pharmacia Biotech)を用いて、Osbornの方法(1982, Methods Cell Biol. 24:97-132)により免疫蛍光染色を行った。ヒトアルブミンに対する免疫組織化学染色はKieranの方法(Histological and Histochemical Methods: Theory and Practice, Oxford: Butterworth Heinemann, 1990)にしたがって行った。組織サンプルは共焦点レーザー走査型顕微鏡(LSM-410, Zeiss, Germany)を使用して調べた。
【０１００】
6.1.10.  ラット血清中ヒトアルブミンのためのアッセイ
ラット血清中のヒトアルブミンを測定するために、モノクローナルマウス抗ヒトアルブミン抗体(Sigma, St. Louis, MO)および西洋ワサビペルオキシダーゼ("HRP"; Sigma , St. Louis, MO)をコンジュゲートさせたウサギ抗マウスIgG ２次抗体を使用して、Gershoniの方法(1982, Anal. Biochem. 124: 396-405)と同様にしてウエスタンブロッティングを行った。シグナルは増幅化学発光法(ECL kit, Amersham)により検出し、フィルムに現像した。
【０１０１】
6.2.  結果
混合リンパ球アッセイを用いて、胎児内注入の結果としての免疫応答の変化を検出した。該アッセイにおいては、生後１週目に採取した脾臓(応答)細胞を、放射線照射した刺激細胞(初代培養ヒト肝細胞、または、Huh7 分化ヒト肝芽腫細胞系、IMR-90 ヒト繊維芽細胞、もしくは293 ヒト腎臓細胞からなる対照群)と混合した。
【０１０２】
刺激効果の欠如が肝芽腫細胞に特異的なものであるのかどうかについて調べるために、初代培養肝細胞を胎児内に注入した動物由来の脾臓細胞をヒトIMR-90繊維芽細胞に曝露した。肝芽腫細胞刺激細胞とは対照的に、脾臓細胞は繊維芽細胞によって刺激された。別の対照群では、肝芽腫細胞を胎児内に注入したラットまたは注入していないラット由来の脾臓細胞への取り込みを293ヒト腎臓細胞により刺激した。単独でインキュベートした、放射線照射したIMR-90および293細胞は無視し得る程度の取り込みしか示さず、このことは、観察された取り込み結果の上昇がこれらの細胞の寄与により説明し得ないことを示す。
【０１０３】
形質転換ヒト肝芽腫細胞も、免疫寛容を誘導させるために使用し得るかどうかを調べるために、免疫寛容の誘導に関して、Huh7およびHepG2 ヒト肝芽腫細胞系を初代培養ヒト肝細胞と比較した。図1は、肝芽腫細胞を胎児内に注入せず、次いで、初代培養肝細胞(レーン1)、Huh7細胞(レーン2)またはHepG2細胞(レーン3)に曝露したラット由来の脾臓細胞は全て、対応する細胞(各々レーン4、5および6)を胎児内に注入し、次いで該細胞に曝露したラット由来の細胞よりも、取り込み率が有意かつ実質的に高かったことを示す。
【０１０４】
細胞系は肝臓からよりも入手しやすい肝芽腫細胞源であることから、分化肝芽腫細胞系Huh7をラット寛容化および移植のための肝芽腫細胞源として使用し、ラット肝臓中における移植細胞の保持を、ヒトアルブミンに対する抗体を使用して免疫化学的に確認した。図2AおよびBに示されるように、移植後１日目にラット肝臓内に染色部分を検出することができ、染色された細胞は、時々２個の場合もあるが大体は１個の細胞であり、実質部分にかなり均一に分布している。出生後７日目のラット仔の肝臓中に、２・３個の細胞の塊を観察することができ、図2EおよびFに示されるように、ヒトアルブミンを発現する単一の細胞はあまり観察されなかった。Huh7で寛容化はしたが、次いで、Huh7の移植は行わなかったラットの肝臓ではヒトアルブミンを検出することはできず(図2CおよびD)、このことは、該抗体がヒトアルブミンに対し実際に特異的であり、内因性のラットアルブミンとの交差反応性を欠くことを明らかにするものである。
【０１０５】
移植した肝芽腫細胞を、ヒトアルブミンに対するモノクローナル抗体で染色することにより、レーザー走査型共焦点顕微鏡を用いて可視化した。図3Bは、ヒト肝芽腫細胞を移植された寛容化ラットの肝臓において、移植後16週目にヒトアルブミンが検出されたことを示す。移植を行わなかった寛容化ラットの肝臓においては、染色が検出されなかった(図3C)。２次抗体のみに曝露したラット肝臓切片(図3D)における染色の欠損は、染色が２次抗体との非特異的相互作用による人為的な結果により引き起こされたものではないことを示した。予想通り、モノクローナルヤギ抗ラットアルブミン抗体で染色した肝臓切片は、ラット肝臓中の事実上全ての実質細胞においてラットアルブミンに対して陽性のシグナルを示した。
【０１０６】
初代培養ヒト肝細胞を移植されたラット肝臓に含まれるヒト肝芽腫細胞の数を推定するために、PCRによるラット肝臓ゲノムDNAの増幅によりヒトアルブミンDNA配列を検出した。図4のレーン3〜5は、それぞれ、104個、103個および102個のHuh7 細胞から抽出したヒトアルブミンDNAを示す。PCRにより、シグナル強度が低くなる、予想された307 bpの産物が産生された。初代培養ヒト肝細胞を胎児内に注入し、該細胞を移植したラット由来のDNA(レーン6)は予想された位置にバンドを形成した。対照的に、初代培養ヒト肝細胞を胎児内に注入したが、移植は行わなかった同腹子は、検出し得るヒトアルブミンDNAシグナルを生成しなかった(図4, レーン7)。ゲルの下部のバンドは過剰プライマーによるものである。新生ラットは、死亡率約5％で、ヒト肝芽腫細胞の脾臓内移植を良好に維持した。
【０１０７】
存在するヒトアルブミン遺伝子の量を定量するために、ヒトアルブミンDNAに対するドットブロッティングを行った。図5A上段は、初代培養ヒト肝細胞を用いて胎児内で寛容化し、次いで該細胞を移植したラットの代表的肝臓由来の肝臓サンプルが、移植後６週目および16週目にヒトアルブミンDNAに対して陽性シグナルを生成し、両時点でのシグナルの明らかな変化は少なかったことを示す。対照的に、ヒト肝芽腫細胞で寛容化は行ったが、該細胞の移植は行わなかった同腹子(図5A下段)からは同時点でシグナルの生成は見られず、これは、上段パネルで検出されたヒトアルブミンシグナルが、寛容化手順による残留していたDNAに起因するものでも、ラット配列との交差反応性に起因するものでもないことを示すものである。図5Bは、ヒトアルブミンDNA標準を提供するために、連続希釈された血漿palb3がロードされていることを示す。
【０１０８】
10 μg ラット肝臓 DNA中のヒトアルブミンDNAの量に基づいて、生存しているヒト肝芽腫細胞の数を計算したところ、移植後16週の時点で成体ラットの肝臓全体あたり2.5 x 105細胞であった。移植後16週の時点で、存在するヒト肝芽腫細胞とラット肝芽腫細胞との比率を計算したところ、6 x 103個のラット肝芽腫細胞あたり約1個のヒト細胞であったことを示す。
【０１０９】
ラット肝臓中におけるアルブミン遺伝子転写を評価するために、アルブミンmRNAのRT-PCRを行った。図6Aは、Huh7細胞から抽出したヒトアルブミンmRNAが、予想されたサイズ315 bpの生成物の存在により、RT-PCRによって検出されたことを示す。予想通り、ラットアルブミンプライマーを使用したとき該サンプルはシグナルを生成せず、このことは、ヒトプライマーがヒトアルブミンmRNAの検出には特異的であることを示す(図6A, レーン7)。寛容化を行った、ヒト肝芽腫細胞移植後16週のラットにおいては、ヒトアルブミンmRNAも315 bpのバンドとして検出された(レーン4)。しかしながら、ヒトアルブミンmRNAは、(i) 初代培養肝細胞を胎児内に注入したが、移植は行わなかった同腹子 (レーン5)、または、(ii) 寛容化も移植も行わなかった同腹子 (レーン2)のいずれにおいても検出されなかった。対照として、ラットアルブミン産物に対応する388 bpのバンドは、(i) 寛容化も移植も行わなかったラット(レーン6); (ii) 初代培養ヒト肝細胞を用いて寛容化および移植を行ったラット（移植後16週目）(レーン8); および、(iii) ヒト肝芽腫細胞を用いて寛容化し、移植は行わなかったラット(レーン9)のmRNAにおいて示された。標準として、Huh7細胞からのRNA抽出物をヒトアルブミンに対するプライマーとともに増幅し、315 bp の産物が得られた(レーン10〜12)。
【０１１０】
移植されたヒト肝芽腫細胞の転写活性を、時間の関数として、１６週間の実験期間に渡り測定した。図6B, レーン3は、培養Huh7細胞から抽出され、RT-PCRにより検出されたヒトアルブミンmRNAによって、予想サイズ315 bpの産物が得られたことを示す。ラット由来のヒトアルブミンmRNAレベルは、移植後２週、６週および１６週の時点 (各々、図6B、レーン4、5および6)では明らかに異なることはなく、このことは、アッセイの範囲においては、移植されたヒト肝芽腫細胞の機能が、少なくともアルブミン産生に関して１６週間以上変化せずにいたことを示す。
【０１１１】
図7は、初代培養ヒト肝細胞を用いて寛容化および移植を行った代表的ラット由来の血清のウエスタンブロットを示す。ヒト血清アルブミンの予想サイズである56 kdに対応する移動度を有するバンド(レーン1の標準により示される)は、移植後１週間後に見られ(レーン3)、移植後２・３週間後にも検出され続けた(各々レーン4および5)。これらのデータは、胎児内で寛容化されたラットの肝臓中でヒト肝芽腫細胞が移植・生存することができ、該細胞は、検出可能な量のヒト血清アルブミンを循環中に分泌するのに十分活性でありつづけることができることを示すものである。
【０１１２】
7.  実施例: レトロルシンを用いた寛容化ラット肝臓中における移植ヒト肝芽腫細胞の再生着
ピロリジジンアルカロイドであるレトロルシンは肝細胞により代謝されてDNAアルキル化中間体となる。この物質は他の研究者により、成体肝細胞を選択的に排除するために用いられてきた。本発明者等のプロジェクトにおいてレトロルシンを使用する理論的根拠は、ヒト肝芽腫細胞で寛容化したラットにレトロルシンを与えたときに、宿主ラット肝細胞の死滅が生じると、移植したヒト肝芽腫細胞間で再生応答を刺激し得ることである。ヒト肝芽腫細胞はこれらの条件のもとで増殖することが予想され得る。移植は新生動物中で行うことから、第１の実験の目的は、この年齢でのレトロルシンによる宿主肝細胞死を評価することであった。新生ラットに、様々な時間の間隔で、２種類の異なる用量のレトロルシンを与えた。
【０１１３】
実験結果は次のとおりである。２週間間隔をあけた、30mg/kgのレトロルシンの２回投与(公開プロトコール)は新生ラットに対して致死的であった。２回目の投与後に生存しているラットはいなかった。30mg/kgのレトロルシンの１回投与では、全ての新生ラット肝細胞を死滅させるには十分でなかった。この群の処理ラットにおいてはBrdU陽性肝細胞が存在し、このことは、いくつかの生存肝細胞で再生が起こっていることを示す。第１週と第３週とで２週間の間隔をあけた、12mg/kgのレトロルシンの２回投与は致死的ではなかった。100%の新生ラットがこの処理後生存した。BrdU標識は、処理を行った動物の肝臓中における細胞の分裂を示した。
【０１１４】
8.  実施例: 寛容化されたラットの肝臓中における移植されたヒト肝芽腫細胞の増殖の実証
アルブミンレベルをほとんど検出することができない突然変異体Nagaseラットを、分化ヒト肝臓細胞系Huh7を用いて子宮内で寛容化させた。出生後１日目、ラットに107個のHuh7細胞を移植し、100 mg/kg のT3 (甲状腺ホルモン)を腹腔内に毎日注入することにより肝細胞の増殖を刺激した。移植後４日目、ラットに２時間のBrdUのパルスを与え、肝臓を取り出し、同じ凍結切片に対し、免疫組織化学染色法をヒトアルブミンおよびBrdUの両方について行った。ヒトアルブミンの存在は、ヒト肝細胞の存在と、細胞増殖の指標となるBrdUの存在を示すものである。
【０１１５】
これらの研究の結果を図8A〜Fに示す。対照の寛容化非実施・T3処理非実施ラット由来の肝臓切片は、ヒトアルブミンおよびBrdU染色(図8EおよびF)の両方に対して陰性であった。寛容化実施・移植非実施・T3処理実施ラット由来の肝臓切片はヒトアルブミンに対して陰性であったが、T3処理により宿主ラット肝細胞の増殖が刺激されたことを示すBrdU染色はあらわれた(図8AおよびB)。ヒト肝芽腫細胞を用いて寛容化および移植を行い、T3で処理した肝臓切片は、ヒトアルブミン(図8C)およびBrdU(図8D)の両方に対して陽性である細胞を有しており、移植されたヒト肝芽腫細胞が生存しており、該細胞はT3による増殖刺激がなされると機能性を示し、増殖したことを示している。
【０１１６】
9.  実施例: 寛容化ラットにおけるキメラヒト-ラット肝臓でのHCV感染の確立
ラットは、妊娠16日目に、105個のHuh7 細胞、HepG2細胞または初代培養ヒト肝細胞のいずれかで寛容化した。HepG2は培養液中でHBVの複製を支持することができる。容易に入手することができ、簡単に培養することができるので該細胞系を使用した。生後１日目、寛容化したラットに2 x 106個の細胞を移植した。移植１週間後、ラットに105コピーのHCV RNAを接種した。
【０１１７】
移植群は次の通りである。"Huh7ラット"は、Huh7細胞を用いて寛容化および移植を行い、HCV血清を接種した。"HepG2ラット"は、HepG2細胞を用いて寛容化および移植を行い、HCV血清を接種した。"PHHラット"は、初代培養ヒト肝細胞を用いて寛容化および移植を行い、HCV血清を接種した。対照"PBSラット"は見せかけ(mock)としてPBSを用いて寛容化および移植を行い、HCV血清を接種した。
【０１１８】
１週間ごとに血清を回収した。１月ごとにラット群を犠牲にし、肝臓を取り出した。HCV RNAの存在について、RT-PCRを用いて血清および肝臓中の両方において測定した。
【０１１９】
これらの実験の結果を図9〜11に示す。図9は、＋鎖HCV RNAに対するRT-PCRアッセイの感度の限界がRNA基質0.1 fgであることを示す。HCV＋鎖RNAは、同じアッセイを使用してHCV感染動物の血清および肝臓中で測定した。
【０１２０】
図10に示すように、Huh7肝臓細胞系を用いて寛容化および移植を行ったHCV感染動物においては、16週まで血清HCV RNAが陽性であった。結論的な結果は、別の分化肝臓細胞系であるHepG2でも、初代培養ヒト肝細胞(PHH)でも得られなかった。これらの具体的な実験において使用した初代培養ヒト肝細胞の特定の調製物は、典型的な寛容化／移植挙動を示さなかった。
【０１２１】
図11は、Huh7肝臓細胞系を用いて寛容化および移植を行ったHCV感染動物において、16週まで肝臓HCV RNAが陽性であったことを示す。上記した通り、HepG2およびPHHラットから結論的データは得られなかった。
【０１２２】
10.  実施例: HCV受容体の単離
HCVは、標準的な光親和性架橋剤を使用して表面を標識する。標識したHCVを、キメラ肝臓を有する非ヒト動物から単離した分化ヒト肝細胞癌細胞とともにインキュベートする。細胞は、ウイルスの結合および／または内在化を同定するために共焦点により調べた。細胞性HCV結合タンパク質および／または特異的HCV受容体を単離・同定するために、肝芽腫細胞を、水溶性の光親和性架橋剤、例えば、スルホスクシンイミジル-2-(p-アジドサリチルアミド)エチル-1,3’-ジチオプロピオネート("SASD")で標識することができる。SASDの一方の末端には、光反応性の基と、アミン反応性のNHSエステルとを有する。SASDは、肝芽腫細胞をHCVとともにインキュベートする前に125Iで放射標識することができる。次いで、125Iで標識したHCVは、肝芽腫細胞とともにインキュベートすることができ、特異的受容体を介した肝芽腫細胞との結合の後で、光分解してウイルス表面タンパク質と該タンパク質と結合する肝芽腫細胞上の受容体との架橋形成が生じる。得られた複合体は、肝細胞中で位置決定することができ、かつ／または放射標識タグを使用して単離することができる。
【０１２３】
一旦、HCV受容体が実質的に精製され、特性決定されたら、該受容体をコードする遺伝子をクローニングすることができる。次いで、HCV受容体または受容体複合体を特異的に無効にする分子を設計し、開発することができる。例えば、HCV受容体-HCVリガンド複合体の阻害剤を同定し、単離することができる。次いで、これらの分子を、HCV感染個体の治療のための治療薬として開発することができる。さらに、該受容体のためのワクチンを開発し、それにより、HCV感染を予防的に防止することができる。
【０１２４】
様々な刊行物を本明細書中で引用したが、その内容は参照により本明細書中にその全体を組み入れるものとする。
【図面の簡単な説明】
【０１２５】
【図１】図1は、様々な型のヒト肝芽腫細胞により誘導される寛容化を測定するための混合リンパ球アッセイの結果を示す棒グラフである。
【図２】図2A-Fは、ラット肝臓におけるヒトアルブミンを検出するための免疫組織化学アッセイの結果を示す顕微鏡写真である。
【図３】図3A-Dは、移植後16週目のラット肝臓におけるヒトアルブミン検出の結果を示す共焦点免疫蛍光顕微鏡写真である。
【図４】図4は、移植後16週目のラット肝臓ゲノムDNAにおけるヒトアルブミンDNAの検出の結果を示す電気泳動図である。
【図５】図5A-Cは、ドットブロッティングによるラット肝臓におけるヒトアルブミンDNAの定量について表す。
【図６】図6A-Cは、RT-PCRによるラット肝臓におけるヒトアルブミンmRNAの検出について表す。
【図７】図7は、ラット血清中で検出されるヒトアルブミンタンパク質についてのウエスタンブロットのオートラジオグラフである。
【図８】図8A-Fは、細胞分裂がヒトアルブミンの合成と同時に起こることを示す顕微鏡写真である。
【図９】図9は、合成HCV(+)鎖 RNA基質由来のPCR産物のアガロースゲル電気泳動分析を表す。
【図１０】図10は、図9において測定したラット血清におけるHCV RNAを表す。
【図１１】図11は、図9において測定したラット肝臓におけるHCV RNAを表す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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