(57)【要約】本発明は新規化合物およびＩκＢのＩＫＫ−βリン酸化のアミノイミダゾール阻害剤で種々の疾患を治療するためのそれらの使用法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＩＫＫ−βリン酸化およびそれに続くＩκＢの分解を阻害する方法であって、それを必要とする患者に有効量の式Ｉ：
【化１】
2004532797.tif 000009
［式中：
Ｒ１はＮＲ４Ｒ５であって；
Ｒ２はＣＯＮＨ２またはＳＯ２ＮＨ２であり；
Ｒ３はアリールまたはヘテロアリールであって；
Ｒ４はＨまたはアルキルであり；
Ｒ５はＨ、ＣＯ−Ｃ１−６アルキル、ＳＯ２−Ｃ１−６アルキル、ＣＯＮＨ−Ｒ６、ＣＯＮＨ−Ｒ７、ＣＳＮＨ−Ｒ６、ＣＳＮＨ−Ｒ７、ＳＯ２ＮＨ−Ｒ７およびＳＯ２ＮＨ−Ｒ８からなる群から選択され；
Ｒ６はＨまたはアルキルである；ただし、Ｒ２がＣＯＮＨ２である場合、Ｒ４はＨであり；
Ｒ７はＨまたはアルキルである；ただし、Ｒ２がＣＯＮＨ２およびＲ５がＨである場合、Ｒ７はＨ以外の基であり；
Ｒ８はＨまたはアルキルである］
で示される化合物またはその医薬上許容される塩、水和物もしくは溶媒和物を投与することを含む、方法。
【請求項２】
化合物が、
Ｒ４がＨであって；および
Ｒ５がＣＯ−Ｃ１−６アルキル、ＣＯＮＨ−Ｒ６およびＳＯ２ＮＨ−Ｒ８からなる群から選択されるものである、請求項１記載の方法。
【請求項３】
化合物が、
Ｒ５がＣＯＮＨ−Ｒ６またはＳＯ２ＮＨ−Ｒ８であるものである、請求項２記載の方法。
【請求項４】
化合物が、
５−アミノ−２−フェニル−１Ｈ−イミダゾール−４−カルボン酸アミド；
５−アミノ−２−（４−ニトロ）−フェニル−１Ｈ−イミダゾール−４−カルボン酸アミド；および
５−アミノ−２−（４−クロロ）−フェニル−１Ｈ−イミダゾール−４−カルボン酸アミド
からなる群から選択される、請求項１記載の方法。
【請求項５】
疾患が炎症または組織修復障害である、請求項１記載の方法。
【請求項６】
疾患が、慢性関節リウマチ、炎症性腸疾患、喘息、ＣＯＰＤ（慢性閉塞性肺疾患）および線維症からなる群から選択される、請求項１記載の方法。
【請求項７】
疾患が皮膚病である、請求項１記載の方法。
【請求項８】
疾患が、乾癬、アトピー性皮膚炎、およびＵＶ誘発皮膚損傷からなる群から選択される、請求項１記載の方法。
【請求項９】
疾患が、自己免疫疾患；組織器官拒絶；アルツハイマー病；発作；アテローム動脈硬化；再狭窄；変形性関節症；骨粗鬆症；および毛細血管拡張性運動失調からなる群から選択される、請求項１記載の方法。
【請求項１０】
疾患が自己免疫疾患である、請求項１記載の方法。
【請求項１１】
自己免疫疾患が多発性硬化症である、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
疾患が癌である、請求項１記載の方法。
【請求項１３】
癌がホジキン病である、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
疾患がエイズである、請求項１記載の方法。
【請求項１５】
Ｒ１がＮＲ４Ｒ５であって；
Ｒ２がＳＯ２ＮＨ２であり；
Ｒ３がアリールまたはヘテロアリールであって；
Ｒ４がＨまたはアルキルであり；
Ｒ５がＨ、ＣＯ−Ｃ１−６アルキル、ＣＯＮＨ−Ｒ６、ＣＯＮＨ−Ｒ７、ＣＳＮＨ−Ｒ６、ＣＳＮＨ−Ｒ７、ＳＯ２ＮＨ−Ｒ７およびＳＯ２ＮＨ−Ｒ８からなる群から選択され；
Ｒ６がＨまたはアルキルであって；
Ｒ７がアリール、またはヘテロアリールであって；および
Ｒ８がＨ、またはアルキルである、
式（Ｉ）の化合物。
【請求項１６】
Ｒ１がＮＲ４Ｒ５であって；
Ｒ２がＣＯＮＨ２であり；
Ｒ３がアリールまたはヘテロアリールであって；
Ｒ４がアルキルであり；
Ｒ５がＨ、ＣＯ−Ｃ１−６アルキル、ＣＯＮＨ−Ｒ６、ＣＯＮＨ−Ｒ７、ＣＳＮＨ−Ｒ６、ＣＳＮＨ−Ｒ７、ＳＯ２ＮＨ−Ｒ７およびＳＯ２ＮＨ−Ｒ８からなる群から選択され；
Ｒ６がＨまたはアルキルであって；
Ｒ７がアリールまたはヘテロアリールであって；および
Ｒ８がＨまたはアルキルである、
式（Ｉ）の化合物。
【請求項１７】
Ｒ１がＮＲ４Ｒ５であって；
Ｒ２がＣＯＮＨ２であり；
Ｒ３がアリールまたはヘテロアリールであって；
Ｒ４がＨであり；
Ｒ５がＣＯＮＨ−Ｒ６、ＣＯＮＨ−Ｒ７、ＣＳＮＨ−Ｒ６、ＣＳＮＨ−Ｒ７からなる群から選択され、
Ｒ６がアルキルであって；
Ｒ７がアリールまたはヘテロアリールである、
式（Ｉ）の化合物。
【請求項１８】
Ｒ１がＮＲ４Ｒ５であって；
Ｒ２がＣＯＮＨ２であり；
Ｒ３がアリールまたはヘテロアリールであって；
Ｒ４がＨまたはアルキルであり；
Ｒ５がＳＯ２ＮＨ−Ｒ７またはＳＯ２ＮＨ−Ｒ８であって；
Ｒ７がアリールまたはヘテロアリールであり；および
Ｒ８がＨまたはアルキルである、
式（Ｉ）の化合物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（技術分野）
本発明は、一般に、アミノイミダゾール化合物を使用して転写因子ＮＦ−κＢ（核因子−κＢ）の病理活性化を阻害する方法に関する。かかる方法は特にＮＦ−κＢの活性化が関係する疾患を治療するのに有用である。より詳細には、これらの方法はＩκＢ（阻害タンパクκＢ）のＩＫＫ−β（ＩκＢキナーゼ−β）リン酸化を阻害するのに用いることができ、その阻害はその後のＮＦ−κＢ二量体の分解および活性化を防止する。かかる方法は、炎症および組織修復障害、特に慢性関節リウマチ、炎症性腸疾患、喘息およびＣＯＰＤ（慢性閉塞性肺疾患）、変形性関節症、骨粗鬆症および線維症、皮膚病、例えば、乾癬、アトピー性皮膚炎および紫外線（ＵＶ）誘発皮膚損傷、自己免疫疾患、例えば、全身性エリテマトーデス、多発性硬化症、乾癬性関節炎、強直性脊椎炎、組織器官拒絶、アルツハイマー病、発作、アテローム性動脈硬化、再狭窄、糖尿病、糸球体腎炎、癌、例えば、ホジキン病、悪液質、感染および後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）を含む特定のウイルス感染に伴う炎症、成人呼吸窮迫症候群ならびに毛細血管拡張性運動失調を含む、ＮＦ−κＢ活性化に付随する種々の疾患の治療に有用である。
【０００２】
（背景技術）
急性および慢性炎症性疾患ならびに癌に関連したメディエーターの科学的研究における最近の発展は有効な治療法の探索における新しい戦略をもたらした。伝統的な方法は特異抗体、受容体アンタゴニスト、または酵素阻害剤の使用のような直接的な標的介入を含む。様々なメディエーターの転写および翻訳に関連した調節機構の説明における最近の躍進によって遺伝子転写レベルに向けられた治療法への関心が増加してきた。
核因子κＢ（ＮＦ−κＢ）はポリペプチドのＲｅｌ／ＮＦ−κＢファミリーの様々な組み合わせから構成される密接に関係した二量体転写因子複合体ファミリーに属する。このファミリーは哺乳類において五つの別々の遺伝子産物、ＲｅｌＡ（ｐ６５）、ＮＦ−κＢ１（ｐ５０／ｐ１０５）、ＮＦ−κＢ２（ｐ４９／ｐ１００）、ｃ−Ｒｅｌ、およびＲｅｌＢから成り、これら全てはヘテロまたはホモ二量体を形成することができる。これらのタンパクはＤＮＡ結合および二量体形成領域を含む高度に相同な３００個のアミノ酸「Ｒｅｌ相同領域」を有する。Ｒｅｌ相同領域のＣ末端には細胞質から核へのＮＦ−κＢの輸送に関して重要な核転位配列がある。さらに、ｐ６５およびｃＲｅｌはそのＣ末端に強力な相互活性領域を有する。
【０００３】
ＮＦ−κＢの活性は阻害的なＩκＢタンパクファミリーの一つとの相互作用によって調節されている。この相互作用はＮＦ−κＢタンパク核局在配列を効果的に遮断し、二量体の核への移行を阻害する。多様な刺激によって複数のシグナル導入経路に類似のものを介してＮＦ−κＢは活性化する。細菌産生物質（ＬＰＳ）、いくつかのウイルス（ＨＩＶ−１、ＨＴＬＶ−１）、炎症性サイトカイン（ＴＮＦα、ＩＬ−１）、環境および酸化ストレスおよびＤＮＡ損傷物質が含まれる。しかしながら、全ての刺激に明確に共通しているのは、ＩκＢのリン酸化およびその後の分解である。ＩκＢは最近同定されたＩκＢキナーゼ（ＩＫＫ−αおよびＩＫＫ−β）によって二つのＮ末端のセリンがリン酸化される。部位特定変異誘発研究によって一度リン酸化されるとタンパクがユビキチン−プロテアソーム経路を介して分解して断片化するという点でこれらのリン酸化がＮＦ−κＢのその後の活性化に重要であることが示された。ＩκＢが無い場合、活性ＮＦ−κＢ複合体は核へ転移し、選択的な方法で好ましい遺伝子特異エンハンサー配列に結合することができる。ＮＦ−κＢによって調節される遺伝子には多数のサイトカインおよびケモカイン、細胞接着分子、急性期タンパク、免疫調節タンパク、エイコサノイド代謝酵素および抗アポトーシス遺伝子が含まれる。
【０００４】
ＮＦ−κＢがＴＮＦ、ＩＬ−１β、ＩＬ−６およびＩＬ−８のようなサイトカイン、ＩＣＡＭおよびＶＣＡＭのような、細胞接着分子、および誘導型一酸化窒素シンターゼ（ｉＮＯＳ）を含む非常に多くの炎症メディエーター前駆物質の発現調節に重要な役割を担っていることは十分に知られている。上記メディエーターは炎症部位への白血球の供給において作用し、ｉＮＯＳの場合、いくつかの炎症性および自己免疫疾患において器官破壊を誘導する。
炎症性障害におけるＮＦ−κＢの重要性は喘息を含む気道炎症の研究によってさらに支持され、それによるとＮＦ−κＢは活性化することが示された。この活性化はこれらの疾患に特徴的なサイトカイン産生増加および白血球浸潤に基づくものだろう。さらに、吸入ステロイドは気道の過敏反応を減少させて喘息の気道において炎症性反応を抑制することが知られている。ＮＦ−κＢのコルチコステロイド阻害に関する最近の発見に照らしてみると、これらの効果はＮＦ−κＢの阻害を介していると考えられるだろう。
【０００５】
炎症性障害におけるＮＦ−κＢの役割に関するさらなる証拠が滑膜リウマチの研究から生じている。ＮＦ−κＢは通常細胞質複合体として存在するが、最近の免疫組織化学の研究によって滑膜リウマチを含む複数の細胞でＮＦ−κＢは核内に存在する、すなわち活性を有するということが示された。さらに、ＮＦ−κＢはＴＮＦ−αまたはＩＬ−１βの刺激に反応してヒト滑膜細胞内で活性化することが示された。このような説明がこの組織におけるサイトカインおよびエイコサノイド産生増加に関する基本的な機構である。Ｒｏｓｈａｋ，Ａ．Ｋ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７１、３１４９６−３１５０１（１９９６）を参照。ＩＫＫ−βの発現は関節リウマチ患者の滑膜細胞において示され、遺伝子導入研究によってこれらの細胞においての炎症メディエーター産生刺激に関するＩＫＫ−βの中心的な役割が実証された。Ａｕｐｐｅｒｅｌｅら、Ｊ．ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １９９９．１６３：４２７−４３３およびＡｕｐｐｅｒｅｌｅら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２００１；１６６：２７０５−１１を参照。さらに最近、野生型のＩＫＫ−βアデノウイルス構成物の関節内投与が足肢の腫脹を引き起こすことが示され、一方ラットにおいて優性陰性のＩＫＫ−βの関節内投与はアジュバント誘発関節炎を阻害した。Ｔａｋら、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ ａｎｄ Ｒｈｅｕｍａｔｉｓｍ ２００１；４４：１８９７−１９０７を参照。
【０００６】
ＮＦ−κＢ／ＲｅｌおよびＩκＢタンパクはまた腫瘍性形質転換および転移において重要な役割を担っているようである。ファミリーの一員はインビトロおよびインビボにおいて過剰発現、遺伝子増幅、遺伝子再編成または転位の結果として細胞の形質転換に関係している。さらに、これらのタンパクをコードする遺伝子の再編成および／または増幅があるヒトリンパ腫の２０ないし２５％に見られる。さらに、ＮＦ−κＢは癌遺伝子ｒａｓ、ヒト腫瘍において最も共通に欠損している、によって活性化し、ＮＦ−κＢ活性化の遮断がｒａｓ介在細胞形質転換を阻害する。さらに、アポトーシスの調節におけるＮＦ−κＢの役割が報告され、腫瘍細胞増殖の調節においてこの転写因子の役割を強化している。ＴＮＦ、イオン化放射線およびＤＮＡ損傷物質はすべてＮＦ−κＢを活性化してその代わりにいくつかの抗アポトーシスタンパクの発現をアップレギュレートすることが示された。逆に、ＮＦ−κＢの阻害はいくつかの腫瘍細胞型でこれらの物質によるアポトーシス死を高めることが示された。これは化学療法耐性の腫瘍細胞の主な機構を表すと考えられるので、ＮＦ−κＢ活性化の阻害剤は単独または補助的な治療法として有用な化学療法剤であるだろう。最近の報告ではサイトカイン誘導筋消耗の調節と同様に骨格の細胞分化の阻害剤としてＮＦ−κＢが示され（Ｇｕｔｔｒｉｄｇｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ；２０００；２８９：２３６３−２３６５）、さらに新規の癌治療法としてＮＦ−κＢ阻害剤の可能性を支持している。
【０００７】
いくつかのＮＦ−κＢ阻害剤が、Ｃ．Ｗａｈｌら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０１（５）、１１６３−１１７４（１９９８）、Ｒ．Ｗ．Ｓｕｌｌｉｖａｎら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４１、４１３−４１９（１９９８）、Ｊ．Ｗ．Ｐｉｅｒｃｅら．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２、２１０９６−２１１０３（１９９７）に記載されている。
海洋天然産物ヒメニアルジシン（ｈｙｍｅｎｉａｌｄｉｓｉｎｅ）はＮＦ−κＢを阻害することが知られている。Ｒｏｓｈａｋ，Ａ．ら、ＪＰＥＴ、２８３、９５５−９６１（１９９７）。Ｂｒｅｔｏｎ，Ｊ．ＪおよびＣｈａｂｏｔ−Ｆｌｅｔｃｈｅｒ，Ｍ．Ｃ．、ＪＰＥＴ、２８２、４５９−４６６（１９９７）を参照のこと。
さらに、該ＩＫＫ複合体のインドールおよびベンズイミダゾール阻害剤についての特許出願が提出されており（ＤＥ１９９２８４２４およびＷＯ２００１３０７７４参照）、天然産物スタウロスポリン（ｓｔａｕｒｏｓｐｏｒｉｎｅ）、ケセルチン、Ｋ２５２ａおよびＫ２５２ｂはＩＫＫ−β阻害剤であることが示された（Ｐｅｅｔ，Ｇ．Ｗ．およびＬｉ，Ｊ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７４、３２６５５−３２６６１（１９９９）およびＷｉｓｎｉｅｗｓｋｉ，Ｄ．ら、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．２７４、２２０−２２８（１９９９）参照）。
ドイツ公開特許出願ＤＥ２１４２８３２にはあるアミノイミダゾール化合物の調製が記載されている。
本発明者らはあるアミノイミダゾール化合物を使用して活性化転写因子ＮＦ−κＢの新規阻害法を見出した。
【０００８】
（発明の開示）
本発明は新規化合物および活性化転写因子ＮＦ−κＢの阻害におけるそれらの使用法に関するものである。
本発明の目的は転写因子ＮＦ−κＢの活性を変化させて治療的に修飾される疾患の治療法を提供することである。
従って、第一の態様において、本発明は新規化合物および式Ｉに記載の化合物を含む医薬組成物を提供する。
別の態様において、本発明は疾患の病理がＩＫＫ−βによるＩκＢのリン酸化およびその後の分解を阻害して治療的に修飾される疾患の治療法を提供する。
さらに別の態様において、本発明は疾患の病理がＮＦ−κＢの病理活性化を阻害して治療的に修飾される疾患の治療法を提供する。
【０００９】
特定の態様において、本発明は、炎症および組織修復障害、特に慢性関節リウマチ、炎症性腸疾患、喘息およびＣＯＰＤ（慢性閉塞性肺疾患）、変形性関節症、骨粗鬆症および線維症、皮膚病、例えば、乾癬、アトピー性皮膚炎および紫外線（ＵＶ）誘発皮膚損傷、自己免疫疾患、例えば、全身性エリテマトーデス、多発性硬化症、乾癬性関節炎、強直性脊椎炎、組織器官拒絶、アルツハイマー病、発作、アテローム性動脈硬化、再狭窄、糖尿病、糸球体腎炎、癌、例えば、ホジキン病、悪液質、感染および後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）を含む特定のウイルス感染に伴う炎症、成人呼吸窮迫症候群ならびに毛細血管拡張性運動失調を含む、ＮＦ−κＢ活性化に付随する種々の疾患の治療法を提供する。
【００１０】
（発明を実施するための最良の形態）
本発明の化合物は以下の式（Ｉ）：
【化２】
2004532797.tif 000002
［式中：
Ｒ１はＮＲ４Ｒ５であって；
Ｒ２はＣＯＮＨ２またはＳＯ２ＮＨ２であり；
Ｒ３はアリールまたはヘテロアリールであって；
Ｒ４はＨまたはアルキルであり；
Ｒ５はＨ、ＣＯ−Ｃ１−６アルキル、ＳＯ２−Ｃ１−６アルキル、ＣＯＮＨ−Ｒ６、ＣＯＮＨ−Ｒ７、ＣＳＮＨ−Ｒ６、ＣＳＮＨ−Ｒ７、ＳＯ２ＮＨ−Ｒ７およびＳＯ２ＮＨ−Ｒ８からなる群から選択され；
Ｒ６はＨまたはアルキルである；ただし、Ｒ２がＣＯＮＨ２である場合、Ｒ４はＨであり；
Ｒ７はＨまたはアルキルである；ただし、Ｒ２がＣＯＮＨ２およびＲ５がＨである場合、Ｒ７はＨ以外の基であり；
Ｒ８はＨまたはアルキルである］
の化合物またはその医薬上許容される塩、水和物もしくは溶媒和物から選択される。
【００１１】
本発明の好ましい化合物は
Ｒ４がＨであって；および
Ｒ５がＣＯ−Ｃ１−６アルキル、ＳＯ２−Ｃ１−６アルキル、ＣＯＮＨ−Ｒ６、およびＳＯ２ＮＨ−Ｒ８からなる群から選択される
化合物を含む。
さらに好ましい化合物はＲ５がＣＯＮＨ−Ｒ６、またはＳＯ２ＮＨ−Ｒ８である化合物である。
【００１２】
本発明はまた式（Ｉ）［式中：
Ｒ１はＮＲ４Ｒ５であって；
Ｒ２はＳＯ２ＮＨ２であり；
Ｒ３はアリール、またはヘテロアリールであって；
Ｒ４はＨ、またはアルキルであり；
Ｒ５はＨ、ＣＯ−Ｃ１−６アルキル、ＣＯＮＨ−Ｒ６、ＣＯＮＨ−Ｒ７、ＣＳＮＨ−Ｒ６、ＣＳＮＨ−Ｒ７、ＳＯ２ＮＨ−Ｒ７、およびＳＯ２ＮＨ−Ｒ８からなる群から選択され；
Ｒ６はＨ、またはアルキルであって；
Ｒ７はアリール、またはヘテロアリールであって；および
Ｒ８はＨ、またはアルキルである］
の具体例に関するものである。
【００１３】
本発明の別の具体例は式（Ｉ）［式中：
Ｒ１はＮＲ４Ｒ５であって；
Ｒ２はＣＯＮＨ２であり；
Ｒ３はアリール、またはヘテロアリールであって；
Ｒ４はアルキルであり；
Ｒ５はＨ、ＣＯ−Ｃ１−６アルキル、ＣＯＮＨ−Ｒ６、ＣＯＮＨ−Ｒ７、ＣＳＮＨ−Ｒ６、ＣＳＮＨ−Ｒ７、ＳＯ２ＮＨ−Ｒ７、およびＳＯ２ＮＨ−Ｒ８からなる群から選択され；
Ｒ６はＨ、またはアルキルであって；
Ｒ７はアリール、またはヘテロアリールであって；および
Ｒ８はＨ、またはアルキルである］
記載の化合物に関するものである。
【００１４】
さらに別の具体例では式（Ｉ）
［式中：
Ｒ１はＮＲ４Ｒ５であって；
Ｒ２はＣＯＮＨ２であり；
Ｒ３はアリール、またはヘテロアリールであって；
Ｒ４はＨであり；
Ｒ５はＣＯＮＨ−Ｒ６、ＣＯＮＨ−Ｒ７、ＣＳＮＨ−Ｒ６、ＣＳＮＨ−Ｒ７からなる群から選択され、
Ｒ６はアルキルであって；
Ｒ７はアリール、またはヘテロアリールである］
記載の化合物である
【００１５】
さらに別の具体例では式（Ｉ）
［式中：
Ｒ１はＮＲ４Ｒ５であって；
Ｒ２はＣＯＮＨ２であり；
Ｒ３はアリール、またはヘテロアリールであって；
Ｒ４はＨ、またはアルキルであり；
Ｒ５はＳＯ２ＮＨ−Ｒ７、およびＳＯ２ＮＨ−Ｒ８であって；
Ｒ７はアリール、またはヘテロアリールであり；および
Ｒ８はＨ、またはアルキルである］
記載の化合物である。
【００１６】
本発明はさらにＮＦ−κＢ活性化に関連する疾患の好ましい治療法であって、：５−アミノ−２−フェニル−１Ｈ−イミダゾール−４−カルボン酸アミド；
５−アミノ−２−（４−ニトロ）−フェニル−１Ｈ−イミダゾール−４−カルボン酸アミド；および
５−アミノ−２−（４−クロロ）−フェニル−１Ｈ−イミダゾール−４−カルボン酸アミド
からなる群から選択される化合物を一つまたはそれ以上それを必要とする動物、好ましくは哺乳類、最も好ましくはヒトに投与することを含む方法を提供する。
【００１７】
本発明は炎症および組織修復障害、特に慢性関節リウマチ、炎症性腸疾患、喘息およびＣＯＰＤ（慢性閉塞性肺疾患）、変形性関節症、骨粗鬆症および線維症、皮膚病、例えば、乾癬、アトピー性皮膚炎および紫外線（ＵＶ）誘発皮膚損傷、自己免疫疾患、例えば、全身性エリテマトーデス、多発性硬化症、乾癬性関節炎、強直性脊椎炎、組織器官拒絶、アルツハイマー病、発作、アテローム性動脈硬化、再狭窄、糖尿病、糸球体腎炎、癌、例えば、ホジキン病、悪液質、感染および後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）を含む特定のウイルス感染に伴う炎症、成人呼吸窮迫症候群ならびに毛細血管拡張性運動失調を含む、ＮＦ−κＢ活性化に付随する種々の疾患の、式Ｉの化合物、特に好ましくおよび最も好ましくは上記した化合物を使用する、治療法を提供する。
【００１８】
定義
本発明は本発明の化合物のあらゆる水和物、溶媒和物、複合体およびプロドラッグを含む。プロドラッグはインビボで式ＩおよびＩＩに記載の活性親薬物を放出する複数の共有結合性の化合物である。キラル中心または異性体中心の別の形態が本発明の化合物中に存在する場合、このような異性体、エナンチオマーおよびジアステレオマーを含む、の形態すべては本明細書に包含されるものとする。キラル中心を含有する本発明の化合物はラセミ混合物、エナンチオマーに富む混合物として使用されるだろう、またはラセミ混合物は既知の技術を使用して分離されて個々のエナンチオマーは単独で使用されるだろう。化合物が不飽和炭素−炭素二重結合を有する場合、シス（Ｚ）およびトランス（Ｅ）異性体の両方が本発明の範囲内である。化合物がケト−エノール互変異性体のような、互変異性体で存在する場合、各互変異性体は平衡で存在するにせよ一方の形態が優勢に存在するにせよ本発明内に含まれるものと考える。
特記しない限り、式Ｉまたはその下位式中にある一の置換基のいずれの意味も他にある場合のその意味、すなわち他のどの置換基の意味からも、独立している。
【００１９】
本明細書で用いる「アルキル」なる語は、一つの炭素−炭素結合で連結した置換されてもよい炭化水素基をいう。アルキル炭化水素基は直鎖状、枝分かれ状または環状であってもよく、飽和または不飽和であってもよい。置換されてもよいアルキルの置換基はアリール、ＯＨ、Ｏ−アルキル、ＣＯ、ハロゲン、ＣＦ３、およびＯＣＦ３からなる群から選択される。
本明細書で用いる「アリール」なる語は、二個までの共役または縮合環系を含有する、共役π電子系を有する少なくとも一つの環がある、置換されてもよい芳香族基をいう。アリールは炭素環式アリール、およびジアリール基をいい、その全て所望により置換されてもよい。置換基はハロゲン、Ｃ１−４アルキル、ＮＨ２、ＯＣＦ３、ＣＦ３、Ｏ−アルキル、Ｓ−アルキル、ＣＮ、ＣＨＯ、ＳＯ２−アルキルおよびＮＯ２からなる群から選択される。
【００２０】
本明細書で用いる「ヘテロアリール」なる語は、二個までの共役または縮合環系およびＯ、ＳおよびＮから選択される１−３個のヘテロ原子を含有する、共役π電子系を有する少なくとも一つの環がある、置換されてもよい芳香族基をいう。ヘテロアリールは炭素環式ヘテロアリール、アリール−ヘテロアリールおよびジヘテロアリールアリール基を含み、その全て所望により置換されてもよい。好ましいアリールはフェニルおよびナフチルである。より好ましいアリールはフェニルを含む。好ましい置換基はハロゲン、Ｃ１−４アルキル、ＮＨ２、ＯＣＦ３、ＣＦ３、Ｏ−アルキル、Ｓ−アルキル、ＣＮ、ＣＨＯ、ＳＯ２−アルキルおよびＮＯ２からなる群から選択される。ヘテロアリール環の例はピロール、フラン、チオフェン、インドール、イソインドール、ベンゾフラン、イソベンゾフラン、ベンゾチオフェン（ｂｅｎｚｏｔｈｉｐｈｅｎｅ）、ピリジン、キノリン、イソキノリン、キノリジン、ピラゾール、イミダゾール、イソオキサゾール、オキサゾール、イソチアゾール、チアゾール、ピリダジン、ピリミジン、およびピラジンを含む。
本明細書で用いる「ハロゲン」なる語はＦ、Ｃｌ、Ｂｒ、およびＩをいう。
【００２１】
製法
本発明の化合物は以下のスキーム１−６に記載される方法によって容易に調製することができる。アミノイミダゾールカルボキシアミドの一般的な溶液調製はＪ．Ｈｅｙｅｓらの、ＤＥ特許出願番号２１４２８３２（出典明示により本明細書の一部とする）に開示され、それは以下およびスキーム１に記載される。対応するスルホンアミドの一般的な製法をスキーム２に概説する。イミダゾール尿素カルボキシアミド類似物の一般的な製法をスキーム３に記載し、イミダゾール尿素スルホンアミド類似物の一般的な製法をスキーム４に記載する。イミダゾールカルボキシアミドスルホニル尿素類似物の一般的な製法をスキーム５に記載し、イミダゾールスルホンアミドスルホニル尿素類似物の一般的な製法をスキーム６に記載する。
【００２２】
一般的調製：
ＤＥ２１４２８３２の手順を使用して、アリールホルムイミノベンゾチオエーテル塩酸塩およびアミノシアノ酢酸アミドのクロロホルム中混合液を還流温度で加熱し、該アミノイミダゾールカルボキシアミドを得る（スキーム１）。該アミンを、ピリジン中、酸無水物または酸塩化物で処理して対応するアミドを得る（スキーム１）。該アミンを、ピリジン中、塩化スルホニルで処理して対応するスルホンアミドを得る（スキーム１）。アリールホルムイミノベンゾチオエーテル塩酸塩およびアミノシアノスルホンアミドのクロロホルム中混合液を還流温度で加熱して対応するアミノイミダゾールスルホンアミドを得る（スキーム２）。該アミンを、ピリジン中、酸無水物または酸塩化物で処理して対応するアミドを得る（スキーム２）。該アミンを、ピリジン中、スルホニル塩化物で処理して対応するスルホンアミドを得る（スキーム２）。アミノイミダゾールカルボキシアミドをアルキルまたはアリールイソシアン化物またはイソチオシアン化物で処理して対応するアルキルまたはアリール尿素またはチオ尿素を得る（スキーム３）。アミノイミダゾールスルホンアミド類似物をアルキルまたはアリールイソシアン化物またはイソチオシアン化物で処理して対応するアルキルまたはアリール尿素またはチオ尿素を得る（スキーム４）。アミノイミダゾールスルホンアミド類似物をクロロスルホニルイソシアン化物またはクロロスルホニルイソシアン化物で処理し、その後水でクエンチして対応する一級尿素を得る（スキーム４）。アミノイミダゾールカルボキシアミドをアミノスルホニルクロリドで処理して対応するスルホニル尿素を得る（スキーム５）。アミノイミダゾールスルホンアミド類似物をアミノスルホニルクロリドで処理して対応するスルホニル尿素を得る（スキーム６）。
【００２３】
スキーム１
【化３】
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【００２４】
スキーム２
【化４】
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【００２５】
スキーム３
【化５】
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【００２６】
スキーム４
【化６】
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【００２７】
スキーム５
【化７】
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【００２８】
スキーム６
【化８】
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【００２９】
上記のスキーム１−６に記載される式Ｉの化合物の製法を参照すると、当業者であれば本発明が式Ｉの化合物を製造するのに必要とされる新規中間物質全てを含むことがわかるだろう。
本明細書で用いる開始物質は市販されているか、または当該分野の当業者に周知の常法により調製される。その方法は、ＣＯＭＰＥＮＤＩＵＭ  ＯＦ  ＯＲＧＡＮＩＣ  ＳＹＮＴＨＥＴＩＣ  ＭＥＴＨＯＤＳ、Ｖｏｌ．Ｉ−ＶＩ（Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ刊行）などの基本参考書に見出すことができる。
式Ｉの化合物の酸付加塩は適当な溶媒中で親化合物および、塩酸、臭化水素酸、フッ化水素酸、硫酸、リン酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、マレイン酸、コハク酸またはメタンスルホン酸のような、過剰な酸から標準の技術で調製される。該化合物のあるものは許容される内部塩または両性イオンを形成する。カチオン塩は親化合物を、適当なカチオンを含有する、水酸化物、炭酸塩またはアルコキシドのような、過剰なアルカリ試薬で；または適当な有機アミンで処理して調製される。Ｌｉ＋、Ｎａ＋、Ｋ＋、Ｃａ＋＋、Ｍｇ＋＋およびＮＨ４＋のようなカチオンは医薬上許容される塩中にあるカチオンの具体例である。ハロゲン化物、硫酸塩、リン酸塩、アルカン酸塩（例えば酢酸塩およびトリフルオロ酢酸塩）、安息香酸塩、およびスルホン酸塩（例えばメシラート）は医薬上許容される塩のアニオンの例である。
【００３０】
本発明は式Ｉ記載の化合物および医薬上許容される担体、希釈剤または賦形剤を含む医薬組成物を提供する。従って、式Ｉの化合物は医薬の製造において使用されるだろう。下記のように調製される式Ｉの化合物の医薬組成物は非経口投与形態では溶液または凍結乾燥散剤として処方されるだろう。散剤は使用前に適当な希釈剤または他の医薬上許容される担体を加えて復元させてもよい。液体処方は緩衝液、等張液、水溶液であるだろう。適当な希釈剤の例として通常の生理食塩水、標準５％デキストロース水溶液または酢酸ナトリウムまたはアンモニウム緩衝液である。このような処方は非経口投与に特に適しているが、経口投与で使用されても吸入剤として用量計測吸入器または噴霧器内に含有されていてもよい。ポリビニルピロリドン、ゼラチン、ヒドロキシセルロース、アカシアガム、ポリエチレングリコール、マンニトール、塩化ナトリウムまたはクエン酸ナトリウムのような賦形剤を加えるのが望ましいだろう。
【００３１】
別法として、これらの化合物は経口投与用にカプセル化、錠剤化または乳化剤またはシロップに調製してもよい。医薬上許容される固形または液状担体が該組成物を促進するかまたは安定化するため、または該組成物の調製を容易にするために加えられてもよい。固形担体はスターチ、ラクトース、硫酸カルシウム二水和物、白土、ステアリン酸マグネシウムまたはステアリン酸、タルク、ペクチン、アカシアガム、アガーガムまたはゼラチンを含む。液状担体はシロップ、ピーナッツ油、オリーブ油、食塩水および水を含む。該担体はまたグリセリルモノステアリン酸塩またはグリセリルジステアリン酸塩のような、持続放出物質を単独またはワックスとともに含むだろう。固形担体の量は様々であるが、好ましくは、単位投与当たり約２０ｍｇないし約１ｇとすることができる。医薬調製は錠剤の場合必要なのは、粉砕、混合、顆粒化、および圧縮；またはハードゼラチンカプセルでは粉砕、混合および封入を含む製薬学の従来の技術に従って行われる。液状担体が用いられる場合、その調製はシロップ、エリキシル、乳化剤または水性または非水性懸濁液の形態であるだろう。このような液体処方は直接経口投与またはソフトゼラチンカプセルに封入することができる。
【００３２】
直腸投与の場合、本発明の化合物はまたココアバター、グリセリン、ゼラチンまたはポリエチレングリコールのような賦形剤と合してもよく、坐剤に成形されるだろう。
本発明の方法は式Ｉの化合物の局所投与を含む。局所投与は非全身投与を意味し、本発明の化合物を外部から表皮に、口腔に塗布すること、および耳、眼および鼻に上記化合物を点注することを含み、その点で該化合物は有意に血流には入らない。全身投与は経口、静脈内、腹腔内および筋肉内投与を意味する。局所投与に関して治療または防止効果に要する本発明の化合物の量は（活性成分として下記に記載）、もちろん、選択される化合物、治療される疾患の種類および重度および治療を受ける動物によって様々で、最終的には顧問医の裁量による。
活性成分を原化学物質として単独で投与することも可能であるが、医薬処方として提供することが好ましい。活性成分は、局所投与の場合、処方の０．０１ないし５．０重量％を含む。
【００３３】
本発明の局所処方は、家畜用およびヒト医用の両方で、一つまたはそれ以上の許容される担体とともに活性成分を含み、他のいくつかの治療成分を含んでいてもよい。担体は処方の他の成分と和合し得るという意味で「許容」されなければならなくてレシピエントに有害であってはならない。
局所投与に適した処方は：リニメント、ローション、クリーム、軟膏またはペーストのような皮膚を介して治療が必要とされる部位へ浸透するのに適した液体または半液体製剤、および眼、耳または鼻への投与に適した滴剤を含む。
【００３４】
本発明の滴剤は無菌の水性または油性の溶液または懸濁液を含み、活性成分を適当な殺菌剤および／または殺真菌剤および／または他のいくつかの適当な保存料内に溶解させて調製されるだろうし、界面活性剤を含むのが好ましい。得られた溶液を濾過によって清澄にし、適当な容器に移し、ついでそれを密封してオートクレーブまたは９０ないし１００℃で３０分間維持することによって滅菌処理してもよい。別法として、溶液を濾過によって滅菌処理して無菌的技術で容器に移してもよい。滴剤に適した殺菌剤および殺真菌剤の例として硝酸または酢酸フェニル水銀（０．００２％）、塩化ベンザルコニウム（０．０１％）および酢酸クロルヘキシジン（０．０１％）がある。油性溶液の調製に適した溶媒はグリセロール、希釈アルコールおよびプロピレングリコールを含む。
【００３５】
本発明のローションは皮膚または眼への塗布に適したものを含む。眼用ローションは殺菌剤を含んでいてもよい滅菌水溶液を含み、滴剤の調製に類似の方法で調製されるだろう。皮膚への塗布用のローションまたはリニメントはまた、アルコールまたはアセトンのような、乾燥を早め皮膚を冷却させる物質、および／またはグリセロールまたはヒマシ油またはピーナッツ油のような油のような保湿剤を含んでいてもよい。
本発明のクリーム、軟膏またはペーストは活性成分の外部塗布用半固体処方である。それらは細かく分割したまたは粉末形態で活性成分を混合して、単独または水性または非水性流体の溶液または懸濁液中で、適当な機械を使用して、油性または非油性基剤とともに、製造されるだろう。基剤はハード、ソフトまたは液体パラフィン、グリセロール、蜜蝋、金属性石鹸のような炭化水素；粘滑剤；アーモンド、トウモロコシ、ピーナッツ、ヒマシまたはオリーブ油のような天然油；羊毛脂またはその誘導体、またはステアリン酸またはオレイン酸のような脂肪酸をプロピレングリコールまたはマクロゴールのようなアルコールとともに含むだろう。処方はソルビタンエステルまたはポリオキシエチレン誘導体のようなアニオン性、カチオン性または非イオン性界面活性剤のようないくつかの適当な界面活性剤を含むだろう。また、天然ガム、セルロース誘導体またはシリカなどの無機物質の懸濁剤、およびラノリンなどの他の成分が含まれていてもよい。
【００３６】
（本発明の利用）
式Ｉの化合物はＩκＢのＩＫＫ−ベータキナーゼリン酸化の阻害剤として有用であってＮＦ−κＢ活性化の阻害剤である。本発明の方法は上記の化合物の組成物および処方を利用し、上記の化合物の医薬組成物および処方を含む。
本発明は特に不適当なＮＦ−κＢ活性化に関連する疾患の治療法であって、式Ｉの一つまたはそれ以上の化合物を要する動物、特に哺乳類、最も好ましくはヒトに投与することを含む方法を提供する。特に本発明は炎症および組織修復障害、特に慢性関節リウマチ、炎症性腸疾患、喘息およびＣＯＰＤ（慢性閉塞性肺疾患）、変形性関節症、骨粗鬆症および線維症、皮膚病、例えば、乾癬、アトピー性皮膚炎および紫外線（ＵＶ）誘発皮膚損傷、自己免疫疾患、例えば、全身性エリテマトーデス、多発性硬化症、乾癬性関節炎、強直性脊椎炎、組織器官拒絶、アルツハイマー病、発作、アテローム性動脈硬化、再狭窄、糖尿病、糸球体腎炎、癌、例えば、ホジキン病、悪液質、感染および後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）を含む特定のウイルス感染に伴う炎症、成人呼吸窮迫症候群ならびに毛細血管拡張性運動失調を含む、ＮＦ−κＢ活性化に付随する種々の疾患の治療法を提供する。
【００３７】
急性期治療に関して、式Ｉの一つまたはそれ以上の化合物の非経口投与は有用である。５％デキストロース水または通常の食塩水中該化合物の静脈内注入、または適当な賦形剤での類似の処方は、最も有効であるが、筋肉内ボーラス注射もまた有用である。典型的には、非経口投与量は、ＩＫＫ−ベータおよびそれに続くＮＦ−κＢの活性化を阻害するのに有効な濃度において血漿内薬物濃度を維持する方法では、約０．０１ないし約５０ｍｇ／ｋｇ；好ましくは０．１ないし２０ｍｇ／ｋｇであるだろう。該化合物は約０．４ないし８０ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙの１日総用量を達成するレベルでは１日１ないし４回投与される。治療効果のある本発明の方法で使用される化合物の正確な量、および上記化合物が投与される最善の経路は、治療効果を有するのに要する濃度と物質の血液レベルを比較する当該分野では通常の技術で容易に定量される。
【００３８】
式Ｉの化合物はまた薬物濃度がＩＫＫ−ベータおよびそれに続くＮＦ−κＢの活性化を阻害するまたは本明細書で開示されるような他のいずれの指摘をも達成するのに十分である方法で、患者に経口投与されてもよい。典型的には、該化合物を含有する医薬組成物が患者の症状に合わせた方法で約０．１ないし約５０ｍｇ／ｋｇの経口投与量で投与される。経口投与量は約０．５ないし約２０ｍｇ／ｋｇであるのが好ましいだろう。
式Ｉの化合物はまた薬物濃度がＩＫＫ−ベータおよびそれに続くＮＦ−κＢの活性化を阻害するまたは本明細書で開示されるような他のいずれの指摘をも達成するのに十分である方法で、患者に局所投与されてもよい。典型的には、該化合物を含有する医薬組成物が約０．０１％ないし約５％ｗ／ｗの局所処方で投与される。
本発明の化合物が本発明に従って投与される場合許容され得ない毒性効果は予想されない。
【００３９】
本明細書に記載される化合物のＮＦ−κＢの阻害効果はＩＫＫ−ベータによるＩκＢ−αのＮ末端断片のリン酸化阻害効果として明示される（実施例の表１参照）。これらの化合物はまた前炎症刺激（例えば、ＴＮＦ−α、ＬＰＳ、など）による細胞の活性化に関するヒト単球および他の哺乳類の細胞におけるＩκＢ−αの分解および核転位を阻害する。加えてこれらの化合物はＬＰＳ刺激ヒト単球および刺激されたヒト滑膜線維芽細胞からの炎症メディエーター前駆物質産生を阻害する。疾患の治療に関する本発明のＮＦ−κＢ阻害剤の利用は様々な疾患におけるＮＦ−κＢの重要性を前提とする。
【００４０】
ＮＦ−κＢはＴＮＦ、ＩＬ−１β、ＩＬ−６およびＩＬ−８のようなサイトカイン（Ｍｕｋａｉｄａら、１９９０；ＬｉｂｅｒｍａｎおよびＢａｌｔｉｍｏｒｅ、１９９０；Ｍａｔｓｕｓａｋａら、１９９３）、ＩＣＡＭおよびＶＣＡＭのような、細胞接着分子（Ｍａｒｕｉら、１９９３；Ｋａｗａｉら、１９９５；ＬｅｄｅｂｕｒおよびＰａｒｋｓ、１９９５）、および誘導型一酸化窒素シンターゼ（ｉＮＯＳ）（Ｘｉｅら、１９９４；Ａｄｃｏｃｋら、１９９４）を含む多数の炎症メディエーター前駆物質の発現調節において重要な役割を担っている。（全体の参照引用は本セクションの終わりにある）。このようなメディエーターは炎症部位への白血球の供給において作用することが知られており、ｉＮＯＳの場合、いくつかの炎症性および自己免疫疾患において器官破壊を誘導する（ＭｃＣａｒｔｎｅｙ−Ｆｒａｎｃｉｓら、１９９３；Ｋｌｅｅｍａｎｎら、１９９３）。
【００４１】
炎症性障害におけるＮＦ−κＢの重要な役割に関する証拠が喘息患者の研究で得られた。軽度のアトピー性喘息から得られた気管支生検を通常の非アトピー性対照からの生検と比較すると活性化ＮＦ−κＢ、総ＮＦ−κＢ、およびＧＭ−ＣＳＦおよびＴＮＦαのようなＮＦ−κＢ調節サイトカインに関する粘膜下組織染色で細胞の数が顕著に増加していることがわかる（Ｗｉｌｓｏｎら、１９９８）。さらに、ＮＦ−κＢ免疫反応性を発現する血管の割合が生検標本の上皮においてＩＬ−８免疫反応性と同様に増加している（Ｗｉｌｓｏｎら、１９９８）。このように、ＮＦ−κＢの阻害によるＩＬ−８産生阻害は、これらの化合物によって実証されるように気道炎症において有利であると考えられるだろう。
【００４２】
最近の研究ではＮＦ−κＢはまた炎症性腸疾患（ＩＢＤ）の病因において重要な役割を担っていることが示された。活性化ＮＦ−κＢはクローン病および潰瘍性大腸炎患者からの結腸の生検標本で見られる（Ａｒｄｉｔｅら、１９９８；Ｒｏｇｌｅｒら、１９９８；Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒら、１９９８）。炎症粘膜で活性化が確認されているが非炎症粘膜ではなく（Ａｒｄｉｔｅら、１９９８；Ｒｏｇｌｅｒら、１９９８）同部位でＩＬ−８ｍＲＮＡ発現増加に関連している（Ａｒｄｉｔｅら、１９９８）。さらに、コルチコステロイド治療は腸管ＮＦ−κＢ活性化を強固に阻害して結腸の炎症を減少させる（Ａｒｄｉｔｅら、１９９８；Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒら、１９９８）。再び、ＮＦ−κＢの阻害によるＩＬ−８産生阻害は、これらの化合物によって実証されるように気道炎症において有利であると考えられるだろう。
【００４３】
胃腸の炎症の動物モデルは結腸の炎症の重要な調節因子としてのＮＦ−κＢに関してさらなる支持を提供する。ＮＦ−κＢ活性の増加がマウスにおいて２，４，６−トリニトロベンゼンスルホン酸（ＴＮＢＳ）誘発大腸炎の粘膜固有層マクロファージ内に観察されてｐ６５が活性化複合体の主要な要素である（Ｎｅｕｒａｔｈら、１９９６；ＮｅｕｒａｔｈおよびＰｅｔｔｅｒｓｓｏｎ、１９９７）。ｐ６５のアンチセンスの局所投与によって処置した動物において毒性の徴候なしに慢性大腸炎の徴候が消失する（ＮｅｕｒａｔｈおよびＰｅｔｔｅｒｓｓｏｎ、１９９７）。このように、ＮＦ−κＢの低分子阻害剤がＩＢＤの治療において有用であると考えられるだろう。
【００４４】
炎症性障害におけるＮＦ−κＢの役割に関するさらなる証拠が滑膜リウマチの研究から得られた。ＮＦ−κＢは通常不活性の細胞質複合体として存在するが、最近の免疫組織化学研究によってＮＦ−κＢがヒト滑膜リウマチ（Ｈａｎｄｅｌら、１９９５；Ｍａｒｏｋら、１９９６；Ｓｉｏｕｄら、１９９８）および上記疾患の動物モデル（Ｔｓａｏら、１９９７）において核内に存在する、すなわち活性を有することが示された。染色はＡ型滑膜細胞および血管内皮細胞に関連している（Ｍａｒｏｋら、１９９６）。さらに、ＮＦ−κＢの構造活性化が培養された滑膜細胞（Ｒｏｓｈａｋら、１９９６；Ｍｉｙａｚａｗａら、１９９８）およびＩＬ−１βまたはＴＮＦαで刺激した滑膜細胞培地で（Ｒｏｓｈａｋら、１９９６；Ｆｕｊｉｓａｗａら、１９９６；Ｒｏｓｈａｋら、１９９７）確認される。このように、ＮＦ−κＢの活性化は炎症のある滑膜に特徴的なサイトカイン産生増加および白血球浸潤に基づく。これらの化合物のＮＦ−κＢを阻害およびそれに続くこれらの細胞による炎症メディエーター前駆物質（例えばサイトカインおよびプロスタノイド）の産生を阻害する能力は関節リウマチにおいて有利であると考えられる。
【００４５】
生物学的分析：
本発明の化合物は、一定の薬理学的効果を有するのに要する化合物の濃度を定量するためにいくつかの生物学的分析の一つで試験されるだろう。
ＮＦ−κＢ活性はまた核内ＮＦ−κＢタンパクの存在を評価するために電気泳動度シフトアッセイ（ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｉｃ ｍｏｂｉｌｉｔｙ ｓｈｉｆｔ ａｓｓａｙ）（ＥＭＳＡ）で測定されるだろう。目的の細胞を１ｘ１０６／ｍＬの密度まで培養する。細胞を遠心して収集し、Ｃａ２＋およびＭｇ２＋不含のＰＢＳで洗浄してＣａ２＋およびＭｇ２＋含有のＰＢＳに１ｘ１０７細胞／ｍｌにて再懸濁させる。化合物のＮＦ−κＢの活性化に関する効果を試験するために、細胞懸濁液を異なる濃度の薬物またはビヒクル（ＤＭＳＯ、０．１％）で３０分間３７℃で処理し、その後さらに１５分間ＴＮＦ−α（５．０ｎｇ／ｍＬ）で刺激する。細胞および核抽出物を以下のように調製する。簡単には、インキュベーションの終了時に細胞（１ｘ１０７細胞）をＣａ２＋およびＭｇ２＋不含のＰＢＳで２回洗浄する。得られた細胞ペレットを２０μＬの緩衝液Ａ（１０ｍＭヘペス（ｐＨ７．９）、１０ｍＭＫＣｌ、１．５ｍＭＭｇＣｌ２、０．５ｍＭジチオトレイトール（ＤＴＴ）および０．１％ＮＰ４０）で再懸濁して１０分間氷上でインキュベートする。核を３５００ｒｐｍで１０分間４℃でマイクロ遠心してペレット状にする。得られた上清を細胞抽出物として収集して核ペレットを１５μＬの緩衝液Ｃ（２０ｍＭヘペス（ｐＨ７．９）、０．４２ＭＮａＣｌ、１．５ｍＭＭｇＣｌ２、２５％グリセロール、０．２ｍＭＥＤＴＡ、０．５ｍＭＤＴＴ、および０．５ｍＭフェニルメチルスルホニルフロリド（ＰＭＳＦ））で再懸濁した。懸濁液を２０分間４℃で穏やかに混合して１４０００ｒｐｍで１０分間４℃でマイクロ遠心に付す。上清を収集して６０μＬの緩衝液Ｄ（２０ｍＭヘペス（ｐＨ７．９）、５０ｍＭＫＣｌ、２０％グリセロール、０．２ｍＭＥＤＴＡ、０．５ｍＭＤＴＴ、および０．５ｍＭＰＭＳＦ）で希釈する。全サンプルは分析まで−８０℃で保存される。抽出物のタンパク濃度をＢｉｏＲａｄ試薬でＢｒａｄｆｏｒｄの方法に従って定量する。
【００４６】
転写因子活性化に関する化合物の効果を上記のように処理された細胞からの抽出物を使用して電気泳動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）で評価する。二重鎖ＮＦ−κＢコンセンサスオリゴヌクレオチド（５’−ＡＧＴＴＧＡＧＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣＣＡＧＧＣ−３’）をＴ４ポリヌクレオチドキナーゼおよび［ｇ−３２Ｐ］ＡＴＰで標識する。結合混合物（２５ｕＬ）は１０ｍＭヘペス−ＮａＯＨ（ｐＨ７．９）、４ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．９）、６０ｍＭＫＣｌ、１ｍＭＥＤＴＡ、１ｍＭジチオトレイトール、１０％グリセロール、０．３ｍｇ／ｍＬウシ血清アルブミン、および１ｕｇポリ（ｄＩ−ｄＣ）ポリ（ｄＩ−ｄＣ）を含有する。結合混合物（１０ｕｇ核抽出タンパク）を０．５ｎｇの３２Ｐ−標識オリゴヌクレオチド（５００００−１０００００ｃｐｍ）とともに未標識の競合物質のある場合とない場合で２０分間室温でインキュベートしてその後混合物を１ｘトリスホウ酸塩／ＥＤＴＡで調製した４％ポリアシルアミドゲル上に流して２００Ｖで２時間電気泳動させる。電気泳動後ゲルを乾燥させて結合反応の検出のためにフィルムに曝す。
【００４７】
化合物のＩκＢのリン酸化に関する効果はウェスタンブロットでモニター観察することができる。細胞抽出物を１０％ゲル（ＢｉｏＲａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）上でドデシル硫酸ナトリウムポリアシルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）に付してタンパクをニトロセルロースシート（Ｈｙｂｏｎｄｔｍ−ＥＣＬ、Ａｍｅｒｓｈａｍ社、Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ Ｈｅｉｇｈｔｓ、ＩＬ）に移す。ＩκＢαまたはＩκＢβに対するポリクローナルウサギ抗体をさらにペルオキシダーゼ共役ロバ抗ウサギ二次抗体（Ａｍｅｒｓｈａｍ社、Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ Ｈｅｉｇｈｔｓ、ＩＬ）を使用して免疫ブロットアッセイを行う。増幅化学発光（ＥＣＬ）アッセイシステム（Ａｍｅｒｓｈａｍ社、Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ Ｈｅｉｇｈｔｓ、ＩＬ）を使用して免疫反応バンドを検出する。
【００４８】
ＩκＢキナーゼに関するアッセイを以下のようにして行った：ＩＫＫ−αをヘキサヒスチジン標識タンパクとしてバキュロウイルス感染昆虫細胞内で発現させてＮｉ−ＮＴＡアフィニティーカラムに通して精製した。示される（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）ような異なる濃度の化合物またはＤＭＳＯビヒクルおよびＡＴＰを含有するアッセイ緩衝液（２０ｍＭヘペス、ｐＨ７．７、２ｍＭＭｇＣｌ２、１０ｍＭβ−グリセリンリン酸、１０ｍＭＮａＦ、１０ｍＭＰＮＰＰ、０．３ｍＭＮａ３ＶＯ４、１ｍＭベンズアミジン、２μＭＰＭＳＦ、１０μｇ／ｍｌアプロチニン、１ｕｇ／ｍＬロイペプチン、１ｕｇ／ｍＬペプスタチン、１ｍＭＤＴＴ）内で５０ｎｇの精製タンパクを使用してキナーゼ活性をアッセイした。２００ｎｇのＩκＢ−ＧＳＴ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ、ＣＡ）を加えて、総量５０μＬで反応を開始した。反応を１時間３０℃で続けた後最終濃度２０ｍＭになるようにＥＤＴＡを加えて反応を停止した。ＩκＢ−αリン酸（Ｓｅｒ３２）抗体（Ｗａｌｌａｃ Ｏｙ、Ｔｕｒｋｕ、Ｆｉｎｌａｎｄ）およびＥｕ３＋標識抗ウサギＩｇＧ（Ｗａｌｌａｃ Ｏｙ、Ｔｕｒｋｕ、Ｆｉｎｌａｎｄ）を使用する解離増強ランタニド蛍光免疫アッセイ（ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ−ｅｎｈａｎｃｅｄ ｌａｎｔｈａｎｉｄｅ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）でキナーゼ活性を定量した。標準ユーロピウムプロトコール（励起３４０ｎｍ、発光６１５ｎｍ；４００μ秒間その後４００μ秒遅れて測定された蛍光）を使用して、ＶＩＣＴＯＲ  １４２０マルチ標識計数器（Ｗａｌｌｅｃ）でプレートを読んだ。データは蛍光（ｃｐｓ）単位で表現される。
【００４９】
ＩＫＫ−βをＧＳＴ標識タンパクとして発現させ、その活性を９６ウェルシンチレーション近位アッセイ（ｓｃｉｎｔｉｌｌａｔｉｏｎ ｐｒｏｘｉｍｉｔｙ ａｓｓａｙ）（ＳＰＡ）で評価した。簡単には、異なる濃度の化合物またはＤＭＳＯビヒクル、２４０ｎＭＡＴＰおよび２００ｎＣｉ［γ−３３Ｐ］−ＡＴＰ（１０ｍＣｉ／ｍＬ、２０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ；ＮＥＮ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ）とともに、アッセイ緩衝液ＩＫＫ−βを上記のようにアッセイ緩衝液（ファイナル２０ｎＭ）で希釈した。ＩκＢ−αの１５−４６のアミノ酸（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐｅｐｔｉｄｅ）を含むビオチン化ペプチドを最終濃度２．４μＭになるように加えて、総量５０μＬで反応を開始した。サンプルを１時間３０℃でインキュベートした後、０．２ｍｇストレプトアビジン被覆ＳＰＡ  ＰＶＴビーズ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）を含有する１５０ｕＬの停止緩衝液（ＰＢＳｗ／ｏＣａ２＋、Ｍｇ２＋、０．１％トリトンＸ−１００（ｖ／ｖ）、１０ｍＭＥＤＴＡ）を加えた。サンプルを混合して、１０分間室温でインキュベートし、遠心して（１０００ｘｇ、２分）、Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ ＴｏｐＣｏｕｎｔで測定した。
【００５０】
ＩＫＫ−β阻害剤の一次滑膜線維芽細胞メディエーター産生に関する効果を以下のように評価した：上記（Ｒｏｓｈａｋら、１９９６ｂ）の関節リウマチの成人患者から得た滑膜を酵素消化してヒトＲＳＦの一次培地を得た。１０％仔ウシ血清（ＦＢＳ）、１００ユニット／ｍｌペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン（ＧＩＢＣＯ、Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）を含むアール最小必須培地（Ｅａｒｌ’ｓ Ｍｉｎｉｍａｌ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ）（ＥＭＥＭ）内、３７℃および５％ＣＯ２で細胞を培養した。より画一のＢ型線維芽細胞数を得るために継代４から９の培養基を使用した。いくつかの実験では、線維芽細胞を１６ｍｍ（直径）２４ウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）内に５ｘ１０４細胞／ｍＬで平板培養した。細胞（７０−８０％集密）をＩＬ−１β（１ｎｇ／ｍＬ）（Ｇｅｎｚｙｍｅ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）に所定の時間曝した。ＩＬ−１を加える１５分前にＤＭＳＯビヒクル（１％）内薬物を細胞培地に加えた。異なるドナーからの滑膜細胞を使用して３−４回実験を行った。ＲＳＦ細胞抽出物を上記のように処理した細胞から調製した。簡単には、ヒトＲＳＦをトリプシン／ＥＤＴＡで除去して、洗浄し、遠心して収集した。細胞抽出物を上記（Ｄｉａｇｎａｍら、１９８３；Ｏｓｂｏｒｎら、１９８９）のように調製した。簡単には、インキュベーションの終了時に細胞（１ｘ１０７細胞）をＣａ２＋およびＭｇ２＋不含のＰＢＳで２回洗浄した。得られた細胞ペレットを２０μＬの緩衝液Ａ（１０ｍＭヘペス（ｐＨ７．９）、１０ｍＭＫＣｌ、１．５ｍＭＭｇＣｌ２、０．５ｍＭ）で再懸濁した。
【００５１】
ＩＫＫ−β阻害のヒト単球刺激によるエイコサノイドおよびサイトカイン産生に関する効果を以下のように評価した：上記のようにヘパリン処理した全血液から二重勾配遠心法（ｄｏｕｂｌｅ ｇｒａｄｉｅｎｔ ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎ）によって単球を単離した。ＰＢＭＣｓに富む単離単球を２４ウェル培養プレートにＲＰＭＩ１６４０  １０％ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ、Ｌｏｇａｎ、Ｕｔａｈ）内２ｘ１０６細胞／ｍＬで２時間付着させて単球数をさらに増加させた。培地を除去して、細胞をＲＰＭＩ１６４０で一回洗浄し、１ｍＬＲＰＭＩ１６４０  １０％ＦＢＳをウェルに加えた。試験化合物を最終ビヒクル濃度０．０５％のＤＭＳＯとともにウェルに加えた。２００ｎｇ／ｍＬの内毒素（ＬＰＳ；Ｅ．ｃｏｌｉ血清型０２６：Ｂ６）（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ．）を加えて単球を活性化させて２４時間インキュベートした。無細胞上清をＴＮＦ−α（ＳＢで開発したＥＩＡ）、ＰＧＥ２（Ｃａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ、Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ、ＭＩ）ならびにＩＬ−８およびＩＬ−６（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｃａｍａｒｉｌｌｏ、ＣＡ）についてＥＬＩＳＡで分析した。細胞の生存可能性はトリパンブルー排除で定量した。
【００５２】
ＩＫＫ−β阻害剤のホルボールエステル誘発炎症に関する効果を以下のように評価した：Ｂａｌｂ／ｃマウスの外耳にホルボールエステル（ＰＭＡ）を皮膚塗布して誘発させた炎症反応が表皮の多因子炎症細胞浸潤および炎症性変化を試験するのに有用なモデルであることが明らかになった。強度な炎症病変は好中球浸潤で占められ、好中球内に存在するミエロペルオキシダーゼ、アズール好性顆粒酵素の組織濃度を測定することによって容易に計量できる。加えて、炎症反応の全体の強度は耳の厚さを定量して測定できる。Ｂａｌｂ／ｃマウス（ｎ＝６／グループ）に薬物処理またはビヒクルさらにＰＭＡ（４ｕｇ／耳）を投与した。マウスを４時間後に殺し、耳の厚さを定量してＮＦ−κＢ活性化をＩκＢウェスタンまたはＥＭＳＡ分析でモニターした。
【００５３】
ＩＫＫ−βのラットカラゲナン誘発足肢浮腫に関する効果を以下のように評価した：雄ルイス系ラット（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｐｉｖｅｒ−Ｒａｌｅｉｇｈ、ＮＣ）を飼育して食べ物および水を自由に摂取できるようにしておくと、各実験での体重は２００ないし２７５ｇであった。化合物またはビヒクル（０．５％トラガカント（経口）または１０％ＤＭＳＯ、５％ＤＭＡ、３０％クレモフォール（腹腔内））をカラゲナン注入の３０分ないし１時間前に投与した。滅菌ｄＨ２Ｏ（０．０５ｍｌ／足肢）中１％カラゲナンを右後肢の足底表面に注入して浮腫を誘発した。足肢の体積変化を定量するために、足肢の厚さを化合物またはビヒクルの投与前に測定し、再度３時間後に測定した。ラットをＣＯ２吸入によって殺し、右後肢を除去し、液体窒素で急速冷凍させて分析のために−８０℃で保存した。
【００５４】
総論
核磁気共鳴スペクトルを２５０、３００または４００ＭＨｚのいずれかで、各々、Ｂｒｕｋｅｒ ＡＭ２５０、Ｂｒｕｋｅｒ ＡＲＸ３００またはＢｒｕｋｅｒ ＡＣ４００分光計を使用して記録した。ＣＤＣｌ３はジュウテリオクロロホルムであって、ＤＭＳＯ−ｄ６はヘキサジュウテリオジメチルスルホキシドであり、ＣＤ３ＯＤはテトラジュウテリオメタノールである。化学シフトを内部標準テトラメチルシランからの百万（ｄ）ダウンフィールド（ｄｏｗｎｆｉｅｌｄ）当たりの部分で表記する。ＮＭＲデータに関する省略は以下の通りである：ｓ＝シングレット、ｄ＝ダブレット、ｔ＝トリプレット、ｑ＝カルテット、ｍ＝マルチプレット、ｄｄ＝ダブレットのダブレット、ｄｔ＝トリプレットのダブレット、ａｐｐ＝アパレント、ｂｒ＝ブロード。Ｊはヘルツで測定したＮＭＲカップリング定数を示す。連続波赤外線（ＩＲ）スペクトルをＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ６８３赤外線分光計で記録し、フーリエ変換赤外線（ＦＴＩＲ）スペクトルをＮｉｃｏｌｅｔ  Ｉｍｐａｃｔ４００Ｄ赤外線分光計で記録した。ＩＲおよびＦＴＩＲスペクトルをトランスミッションモードで記録して、バンド位置を逆波数（ｃｍ−１）で表記する。質量スペクトルをＶＧ７０ＦＥ、ＰＥ  Ｓｙｘ  ＡＰＩ  ＩＩＩ、またはＶＧ  ＺＡＢ  ＨＦ装置のいずれかで高速原子衝撃（ＦＡＢ）または電子射出（ＥＳ）イオン化法を使用して計測した。Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ２４０Ｃ元素分析器を使用して元素分析を得た。Ｔｈｏｍａｓ−Ｈｏｏｖｅｒ融点装置で融点を計測したが修正していない。全ての温度は摂氏度で表記される。
【００５５】
Ａｎａｌｔｅｃｈ  Ｓｉｌｉｃａ  Ｇｅｌ  ＧＦおよびＥ．Ｍｅｒｃｋ  Ｓｉｌｉｃａ  Ｇｅｌ６０Ｆ−２５４薄層板を薄層クロマトグラフィーで使用した。閃光および重力クロマトグラフィーの両方をＥ．Ｍｅｒｃｋ  Ｋｉｅｓｅｌｇｅｌ６０（２３０−４００メッシュ）シリカゲルで行った。
示される場合、その物質はＡｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ社、Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ、ＴＣＩ Ａｍｅｒｉｃａ、Ｐｏｒｔｌａｎｄ、ＯＲから購入した。
【００５６】
実施例
以下の合成実施例において、温度は摂氏度（℃）である。特に示されていなければ、すべての開始物質は市販で入手される。さらに詳述しないが、当業者は、上記の説明を使用して、本発明をそのすべてにおいて利用することができると考えられる。下記の実施例は本発明を説明するものであり、その範囲を制限するものではない。本発明者が保留するものに関してはクレームに言及される。
【００５７】
実施例１
５−アミノ−２−フェニル−１Ｈ−イミダゾール−４−カルボン酸アミドの調製
Ｊ．Ｐ．Ｈｅｙｅｓ、Ｎ．Ｔ．Ｗａｒｄ（ＤＥ２１４２８３２）の手順を使用して、フェニルホルムイミノベンジルチオエーテル塩酸塩（０．１モル）およびアミノシアン酢酸アミドのクロロホルム中混合物を還流しながら１時間加熱して室温で８時間攪拌した。混合反応物をエーテルで沈殿させて上記の標記物質を得た、融点３００℃。
【００５８】
実施例２
５−アミノ−２−（４−クロロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−４−カルボン酸アミドの調製
実施例１記載の手順を使用するがフェニルホルムイミノベンジルチオエーテル塩酸塩を４−クロロフェニルホルムイミノベンジルチオエーテル塩酸塩に置換して上記の標記化合物を得た。
【００５９】
実施例３
５−アミノ−２−（４−ニトロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−４−カルボン酸アミドの調製
実施例１記載の手順を使用するがフェニルホルムイミノベンジルチオエーテル塩酸塩を４−ニトロフェニルホルムイミノベンジルチオエーテル塩酸塩に置換して上記の標記化合物を得た。
【００６０】
上記の明細書および実施例は本発明の化合物の製法および使用法を十分に開示している。しかしながら、本発明は上記の特定の具体例に限定するものでなく、あらゆる修正も以下の請求の範囲内に含む。本明細書で引用した雑誌、特許および他の刊行物に関する様々な参照は当業者に公知であって、仮に十分に記載されているとしていても、その出典を明示することにより本明細書の一部とする。
【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
2004532797.tif 000043