(57)【要約】ヒトＤＳＰＰ７様タンパク質を調節する試薬およびヒトＤＳＰＰ７様遺伝子産物に結合する試薬は、がん、ＣＮＳ障害、喘息またはＣＯＰＤ、肥満症、糖尿病または心疾患を含みこれに限定されない機能不全または疾患の予防、改善または是正において役割を果たすことができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下からなる群から選択される単離されたポリヌクレオチド：
ａ）以下からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む二重特異性タンパク質ホスファターゼ７様タンパク質ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド：
配列番号２に示すアミノ酸配列と少なくとも約８９％同一なアミノ酸配列；
配列番号２に示すアミノ酸配列；
ｂ）配列番号１および４の配列を含むポリヌクレオチド；
ｃ）（ａ）および（ｂ）に明記したポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、二重特異性タンパク質ホスファターゼ７様タンパク質ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
ｄ）遺伝コードの縮重のため、その配列が（ａ）から（ｃ）に明記するポリヌクレオチド配列とは異なり、、二重特異性タンパク質ホスファターゼ７様タンパク質ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；および、
ｅ）（ａ）から（ｄ）に明記したポリヌクレオチド配列の断片、誘導体またはアレル変異を表し、二重特異性タンパク質ホスファターゼ７様タンパク質ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項２】
請求項１に記載の任意のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【請求項３】
請求項２に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項４】
請求項１に記載のポリヌクレオチドによりコードされている、実質上精製された二重特異性タンパク質ホスファターゼ７様タンパク質ポリペプチド。
【請求項５】
以下の工程：
ａ）請求項３に記載の宿主細胞を、二重特異性タンパク質ホスファターゼ７様タンパク質ポリペプチドの発現に好適な条件下で培養し；そして、
ｂ）二重特異性タンパク質ホスファターゼ７様タンパク質ポリペプチドを宿主細胞培養から回収する、
を含む、二重特異性タンパク質ホスファターゼ７様タンパク質ポリペプチドを調製する方法。
【請求項６】
以下の工程：
ａ）請求項１に記載の任意のポリヌクレオチドを生体試料の核酸材料とハイブリダイズさせ、それによりハイブリダイゼーション複合体を形成し；そして、
ｂ）該ハイブリダイゼーション複合体を検出する、
を含む、生体試料中の、二重特異性タンパク質ホスファターゼ７様タンパク質ポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを検出するための方法。
【請求項７】
ハイブリダイゼーションの前に、生体試料の核酸材料を増幅させる、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
生体試料を、請求項１に記載のポリヌクレオチドまたは請求項４に記載の二重特異性タンパク質ホスファターゼ７様タンパク質ポリペプチドと特異的に相互作用する試薬と接触させる工程、
を含む、請求項１に記載のポリヌクレオチドまたは請求項４に記載の二重特異性タンパク質ホスファターゼ７様タンパク質ポリペプチドを検出するための方法。
【請求項９】
請求項６から８までのいずれかに記載の方法を実施するための診断キット。
【請求項１０】
被験化合物を、請求項１に記載の任意のポリヌクレオチドによりコードされる任意の二重特異性タンパク質ホスファターゼ７様タンパク質ポリペプチドと接触させ；
二重特異性タンパク質ホスファターゼ７様タンパク質ポリペプチドに対する被験化合物の結合を検出する工程、
を含む、二重特異性タンパク質ホスファターゼ７様タンパク質の活性を低下させる物質をスクリーニングする方法であって、該ポリペプチドに結合する被験化合物を、二重特異性タンパク質ホスファターゼ７様タンパク質の活性を低下させる可能性ある治療物質として同定する方法。
【請求項１１】
被験化合物を、請求項１に記載の任意のポリヌクレオチドによりコードされる二重特異性タンパク質ホスファターゼ７様タンパク質ポリペプチドと接触させ；そして、
該ポリペプチドの二重特異性タンパク質ホスファターゼ７様タンパク質活性を検出する工程、
を含む、二重特異性タンパク質ホスファターゼ７様タンパク質の活性を調節する物質をスクリーニングする方法であって、二重特異性タンパク質ホスファターゼ７様タンパク質活性を増大させる被験化合物を、二重特異性タンパク質ホスファターゼ７様タンパク質の活性を増大させる可能性ある治療物質として同定し、そして該ポリペプチドの二重特異性タンパク質ホスファターゼ７様タンパク質活性を低下させる被験化合物を、二重特異性タンパク質ホスファターゼ７様タンパク質の活性を低下させる可能性ある治療物質として同定する方法。
【請求項１２】
被験化合物を、請求項１に記載の任意のポリヌクレオチドと接触させ；そして、
該ポリヌクレオチドに対する被験化合物の結合を検出する工程、
を含む、二重特異性タンパク質ホスファターゼ７様タンパク質の活性を低下させる物質をスクリーニングする方法であって、該ポリヌクレオチドに結合する被験化合物を、二重特異性タンパク質ホスファターゼ７様タンパク質の活性を低下させる可能性ある治療物質として同定する方法。
【請求項１３】
細胞を、請求項１に記載の任意のポリヌクレオチドまたは請求項４に記載の任意の二重特異性タンパク質ホスファターゼ７様タンパク質ポリペプチドに特異的に結合する試薬と接触させ、それにより二重特異性タンパク質ホスファターゼ７様タンパク質の活性を減少させる工程、
を含む、二重特異性タンパク質ホスファターゼ７様タンパク質の活性を減少させる方法。
【請求項１４】
請求項１０から１２のいずれかに記載の方法によって同定される、二重特異性タンパク質ホスファターゼ７様タンパク質ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの活性を調節する試薬。
【請求項１５】
請求項２に記載の発現ベクターまたは請求項１４に記載の試薬および製薬的に許容し得る担体、を含む医薬組成物。
【請求項１６】
疾患における二重特異性タンパク質ホスファターゼ７様タンパク質の活性を調節するための医薬の製造における、請求項２に記載の発現ベクターまたは請求項１４に記載の試薬の使用。
【請求項１７】
疾患が、がん、ＣＮＳ障害、喘息またはＣＯＰＤ、肥満症、糖尿病または心疾患である、請求項１６に記載の使用。
【請求項１８】
配列番号１または４に示すアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードしているｃＤＮＡ。
【請求項１９】
配列番号１または４を含む請求項１８に記載のｃＤＮＡ。
【請求項２０】
配列番号１または４より成る請求項１８に記載のｃＤＮＡ。
【請求項２１】
配列番号２に示すアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【請求項２２】
該ポリヌクレオチドが配列番号１または４より成る、請求項２１に記載の発現ベクター。
【請求項２３】
配列番号２に示すアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードしている発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項２４】
該ポリヌクレオチドが配列番号１または４より成る、請求項２３に記載の宿主細胞。
【請求項２５】
配列番号２に示すアミノ酸配列を含む精製されたポリペプチド。
【請求項２６】
配列番号２に示すアミノ酸配列より成る請求項２５に記載の精製されたポリペプチド。
【請求項２７】
配列番号２に示すアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む融合タンパク質。
【請求項２８】
配列番号２に示すアミノ酸配列を含むポリペプチドを調製する方法であって、該ポリペプチドをコードしている発現ベクターを含む宿主細胞を、該ポリペプチドが発現される条件下で培養し；そして該ポリペプチドを単離する工程を含む方法。
【請求項２９】
発現ベクターが配列番号１または４を含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
配列番号１または４に記載の１１個の連続ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを生体試料の核酸材料とハイブリダイズさせ、それによりハイブリダイゼーション複合体を形成し；そして、
該ハイブリダイゼーション複合体を検出する、
工程を含む、配列番号２に示すアミノ酸配列を含むポリペプチドのコード配列を検出する方法。
【請求項３１】
ハイブリダイズする工程の前に核酸材料を増幅する工程をさらに含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
配列番号１または４に記載の１１個の連続ヌクレオチドを含むポリヌクレオチド；および、請求項３０に記載の方法のための使用説明書、
を含む、配列番号２に示すアミノ酸配列を含むポリペプチドのコード配列を検出するためのキット。
【請求項３３】
配列番号２に示すアミノ酸配列を含むポリペプチドを検出する方法であって、生体試料を該ポリペプチドに特異的に結合する試薬と接触させて試薬−ポリペプチド複合体を形成し；そして、この試薬−ポリペプチド複合体を検出する工程を含む方法。
【請求項３４】
該試薬が抗体である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
配列番号２に示すアミノ酸配列を含むポリペプチドを検出するためのキットであって、該ポリペプチドに特異的に結合する抗体；および、
請求項３３に記載の方法のための使用説明書、を含むキット。
【請求項３６】
被験化合物を、（１）配列番号２に示すアミノ酸配列と少なくとも約８９％一致するアミノ酸配列、および（２）配列番号２に示すアミノ酸配列、より成る群から選ばれるアミノ酸配列を含むポリペプチドと接触させ；そして、
該ポリペプチドに対する被験化合物の結合を検出する工程、
を含む、二重特異性タンパク質ホスファターゼ７様タンパク質の活性を調節できる物質をスクリーニングする方法であって、該ポリペプチドに結合する被験化合物を二重特異性タンパク質ホスファターゼ７様タンパク質の活性を調節する可能性ある物質と同定する方法。
【請求項３７】
接触させる工程が細胞内においてである、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
細胞がインビトロである、請求項３６に記載の方法。
【請求項３９】
接触させる工程が無細胞系においてである、請求項３６に記載の方法。
【請求項４０】
該ポリペプチドが検出可能な標識を含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項４１】
被験化合物が検出可能な標識を含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項４２】
被験化合物が該ポリペプチドに結合している標識リガンドに取って代わる、請求項３６に記載の方法。
【請求項４３】
該ポリペプチドが固体支持体に結合している、請求項３６に記載の方法。
【請求項４４】
被験化合物が固体支持体に結合している、請求項３６に記載の方法。
【請求項４５】
被験化合物を、（１）配列番号２に示すアミノ酸配列と少なくとも約８９％一致するアミノ酸配列、および（２）配列番号２に示すアミノ酸配列、より成る群から選ばれるアミノ酸配列を含むポリペプチドと接触させ；そして、
該ポリペプチドの活性を検出する工程、
を含む、ヒト二重特異性タンパク質ホスファターゼ７様タンパク質の活性を調節する物質をスクリーニングする方法であって、該ポリペプチドの活性を増大させる被験化合物を、ヒト二重特異性タンパク質ホスファターゼ７様タンパク質の活性を増大させる可能性ある物質として同定し、そして該ポリペプチドの活性を低下させる被験化合物を、ヒト二重特異性タンパク質ホスファターゼ７様タンパク質の活性を低下させる可能性ある物質として同定する方法。
【請求項４６】
接触させる工程が細胞においてである、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
細胞がインビトロである、請求項４５に記載の方法。
【請求項４８】
接触させる工程が無細胞系においてである、請求項４５に記載の方法。
【請求項４９】
被験化合物を、配列番号１または４に示すヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによりコードされている産物と接触させ；そして、
該産物に対する被験化合物の結合を検出する工程、
を含む、ヒト二重特異性タンパク質ホスファターゼ７様タンパク質の活性を調節する物質をスクリーニングする方法であって、該産物に結合する被験化合物をヒト二重特異性タンパク質ホスファターゼ７様タンパク質の活性を調節する可能性ある物質として同定する方法。
【請求項５０】
該産物がポリペプチドである、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
該産物がＲＮＡである、請求項４９に記載の方法。
【請求項５２】
細胞を、配列番号１または４に示すヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによりコードされている産物に特異的に結合する試薬と接触させ、それによりヒト二重特異性タンパク質ホスファターゼ７様タンパク質の活性を減少させる工程、
を含む、ヒト二重特異性タンパク質ホスファターゼ７様タンパク質の活性を減少させる方法。
【請求項５３】
該産物がポリペプチドである、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
該試薬が抗体である、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
該産物がＲＮＡである、請求項５２に記載の方法。
【請求項５６】
該試薬がアンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
該試薬がリボザイムである、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
細胞がインビトロである、請求項５２に記載の方法。
【請求項５９】
細胞がインビボである、請求項５２に記載の方法。
【請求項６０】
配列番号２に示すアミノ酸配列を含むポリペプチドに特異的に結合する試薬；および、製薬的に許容し得る担体、を含む医薬組成物。
【請求項６１】
該試薬が抗体である、請求項６０に記載の医薬組成物。
【請求項６２】
配列番号１または４に示すヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドの産物に特異的に結合する試薬；および、製薬的に許容し得る担体、を含む医薬組成物。
【請求項６３】
該試薬がリボザイムである、請求項６２に記載の医薬組成物。
【請求項６４】
該試薬がアンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項６２に記載の医薬組成物。
【請求項６５】
該試薬が抗体である、請求項６２に記載の医薬組成物。
【請求項６６】
配列番号２に示すアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードしている発現ベクター；および製薬的に許容し得る担体、を含む医薬組成物。
【請求項６７】
発現ベクターが配列番号１または４を含む、請求項６６に記載の医薬組成物。
【請求項６８】
二重特異性タンパク質ホスファターゼ７様タンパク質機能不全に関連する疾患を処置する方法であって、該疾患が、がん、ＣＮＳ障害、喘息またはＣＯＰＤ、肥満症、糖尿病または心疾患からなる群から選択され、ヒト二重特異性タンパク質ホスファターゼ７様タンパク質の機能を調節する試薬の治療的有効量をそれを必要とする患者に投与し、それにより二重特異性タンパク質ホスファターゼ７様タンパク質機能不全に関連する疾患の症状を改善する工程を含む方法。
【請求項６９】
該試薬が請求項３６に記載の方法によって同定される、請求項６８に記載の方法。
【請求項７０】
該試薬が請求項４５に記載の方法によって同定される、請求項６８に記載の方法。
【請求項７１】
該試薬が請求項４９に記載の方法によって同定される、請求項６８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒト二重特異性タンパク質ホスファターゼ７様タンパク質の調節に関する。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質ホスファターゼは、正確な時間と場所で正しい標的タンパク質を急速に優先的に脱リン酸化するように調節される。米国特許第６，１５９，７０４号。このような酵素の適当な調節の欠如は、様々な疾患過程に関わりうる。このように、調節することにより治療効果をもたらし得るヒトタンパク質ホスファターゼを同定する必要がある。
【発明の開示】
【０００３】
発明の要旨
本発明の目的は、ヒト二重特異性タンパク質ホスファターゼ７様（ＤＳＰＰ７）タンパク質を調節する試薬および方法を提供することである。本発明のこのおよびその他の目的は、下に記載する１またはそれ以上の態様によって提供する。
【０００４】
本発明の一つの態様は、
配列番号２に示すアミノ酸配列と少なくとも約８９％同一なアミノ酸配列；および
配列番号２に示すアミノ酸配列
からなる群から選ばれるアミノ酸配列を含む二重特異性タンパク質ホスファターゼ７様タンパク質ポリペプチドである。
【０００５】
本発明のさらなる態様は、細胞外マトリックス分解を減少させる物質をスクリーニングする方法である。試験化合物を、
配列番号２に示すアミノ酸配列と少なくとも約８９％同一なアミノ酸配列；および
配列番号２に示すアミノ酸配列
からなる群から選ばれるアミノ酸配列を含む二重特異性タンパク質ホスファターゼ７様タンパク質ポリペプチドと接触させる。
【０００６】
試験化合物と二重特異性タンパク質ホスファターゼ７様タンパク質ポリペプチドとの結合を検出する。それにより、二重特異性タンパク質ホスファターゼ７様タンパク質ポリペプチドに結合する試験化合物を、細胞外マトリックス分解を減少させる可能性のある物質として同定する。この物質は二重特異性タンパク質ホスファターゼ７様タンパク質の活性を減少させることによって作用し得る。
【０００７】
本発明の別の態様は、細胞外マトリックス分解を調節する物質をスクリーニングする方法である。試験化合物を、
配列番号１に示すヌクレオチド配列と少なくとも約５０％同一なヌクレオチド配列；
配列番号１に示すヌクレオチド配列；
配列番号４に示すヌクレオチド配列と少なくとも約５０％同一なヌクレオチド配列；
配列番号４に示すヌクレオチド配列；
からなる群から選ばれるヌクレオチド配列を含む、二重特異性タンパク質ホスファターゼ７様タンパク質ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと接触させる。
【０００８】
このポリヌクレオチドに対する化合物の結合を検出する。このポリヌクレオチドに結合する試験化合物を、細胞外マトリックス分解を減少させる可能性のある物質として同定する。この物質は、二重特異性タンパク質ホスファターゼ７様タンパク質ｍＲＮＡとの相互作用を介して二重特異性タンパク質ホスファターゼ７様タンパク質の量を減少させることによって作用し得る。
【０００９】
本発明のさらに別の態様は、細胞外マトリックス分解を調節する物質をスクリーニングする方法である。試験化合物を、
配列番号２に示すアミノ酸配列と少なくとも約８９％同一なアミノ酸配列；
配列番号２に示すアミノ酸配列
からなる群から選ばれるアミノ酸配列を含む二重特異性タンパク質ホスファターゼ７様タンパク質ポリペプチドと接触させる。
【００１０】
ポリペプチドの二重特異性タンパク質ホスファターゼ７様タンパク質活性を検出する。ポリペプチドの試験化合物不在下での二重特異性タンパク質ホスファターゼ７様タンパク質活性を二重特異性タンパク質ホスファターゼ７様タンパク質活性と比較して増加させる試験化合物は、それによって細胞外マトリックス分解を増大させる可能性のある物質として同定する。ポリペプチドの二重特異性タンパク質ホスファターゼ７様タンパク質活性を、その試験化合物の不在下での二重特異性タンパク質ホスファターゼ７様タンパク質活性と比較して減少させる試験化合物は、それによって細胞外マトリックス分解を減少させる可能性のある物質として同定する。
【００１１】
本発明のさらに別の態様は、細胞外マトリックス分解を減少させる物質をスクリーニングする方法である。試験化合物を、
配列番号１に示すヌクレオチド配列と少なくとも約５０％同一なヌクレオチド配列；
配列番号１に示すヌクレオチド配列；
配列番号４に示すヌクレオチド配列と少なくとも約５０％同一なヌクレオチド配列；および
配列番号４に示すヌクレオチド配列
からなる群から選ばれるヌクレオチド配列を含む、ポリヌクレオチドの二重特異性タンパク質ホスファターゼ７様タンパク質産物と接触させる。
【００１２】
この二重特異性タンパク質ホスファターゼ７様タンパク質産物に対する試験化合物の結合を検出する。この二重特異性タンパク質ホスファターゼ７様タンパク質産物と結合する試験化合物を、それによって細胞外マトリックス分解を減少させる可能性のある物質として同定する。
【００１３】
本発明のさらに別の態様は、細胞外マトリックス分解を減少させる方法である。細胞を、
配列番号１に示すヌクレオチド配列と少なくとも約５０％同一なヌクレオチド配列；
配列番号１に示すヌクレオチド配列；
配列番号４に示すヌクレオチド配列と少なくとも約５０％同一なヌクレオチド配列；および
配列番号４に示すヌクレオチド配列；
からなる群から選ばれるヌクレオチド配列を含む、二重特異性タンパク質ホスファターゼ７様タンパク質ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに特異的に結合する物質または、そのポリヌクレオチドによってコードされる産物と接触させる。
【００１４】
細胞中の二重特異性タンパク質ホスファターゼ７様タンパク質活性は、それにより減少する。
【００１５】
このように、本発明は、例えば、その酵素の活性部位でアクチベーターまたはインヒビターとして作用し得る試験化合物を同定するために用いることができるヒトＤＳＰＰ−７様タンパク質を提供する。ヒトＤＳＰＰ７様タンパク質およびその断片はまた、その酵素をブロックおよび効果的にその酵素の活性を減少することができる特異的な抗体を惹起するのに有用でもある。
【００１６】
発明の詳細な記載
本発明は、以下からなる群から選択される、単離されたポリヌクレオチドに関する：
ａ）配列番号２に示すアミノ酸配列と少なくとも約８９％同一なアミノ酸配列；
配列番号２に示すアミノ酸配列；
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む二重特異性タンパク質ホスファターゼ７様タンパク質ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
ｂ）配列番号１または４に示す配列を含むポリヌクレオチド；
ｃ）（ａ）および（ｂ）に示すポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド；
ｄ）その配列が、遺伝コードの縮重のために（ａ）〜（ｃ）に示したポリヌクレオチド配列とは異なり、二重特異性タンパク質ホスファターゼ７様タンパク質ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；および
ｅ）（ａ）〜（ｄ）に示すポリヌクレオチド配列の断片、誘導体またはアレル変異を示し、二重特異性タンパク質ホスファターゼ７様タンパク質ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【００１７】
さらに、本発明者によって、新規な二重特異性タンパク質ホスファターゼ７様タンパク質（ＤＳＰＰ７様タンパク質）、特にヒト二重特異性タンパク質ホスファターゼ７様タンパク質は、がん、ＣＮＳ障害、喘息またはＣＯＰＤ、肥満症、糖尿病または心疾患を処置するための治療方法に用いることができることが発見された。
【００１８】
ヒトＤＳＰＰ７様タンパク質は、配列番号２に示すアミノ酸配列を含む。ヒトＤＳＰＰ７様タンパク質のコード配列は配列番号１に示す。この配列は染色体３ｐ２１．１に位置する。関連ＥＳＴ(emnew|BF469203); (emnew|AL556300); (Aemnew|AL556300); (embl|BE915738); (embl|AL119311); (embl|AL040606); (emnew|BG260493); (embl|BE293889); (emb|R13073); (emnew|BF983889); (emnew|AL527151); (embl|T09371); (EMBLNEW|AL527169)は、胎盤、腎臓、乳房組織、膀胱、杏仁、睾丸、胎児脳、横紋筋肉腫、十二指腸腺癌、および神経芽細胞腫細胞において発現する。
【００１９】
ヒトＤＳＰＰ７様は、二重特異性タンパク質ホスファターゼ６（配列番号１７）（図１）に対して４１９アミノ酸のうち３６７アミノ酸にわたって７１％同一である。ヒトＤＳＰＰ７様タンパク質のＮ末端の３２２アミノ酸は、二重特異性タンパク質ホスファターゼ７（配列番号３）（図２）と同一である。ＥＳＴ(emnew|AL556300)により９７アミノ酸がＮ末端に付加されている（配列番号１８）。この付加された９７アミノ酸は、タンパク質−タンパク質相互作用に関与する部分的なRhodaneseドメインをもたらす。
【００２０】
本発明のヒトＤＳＰＰ７様タンパク質は、これまでに同定されたＤＳＰＰ７様タンパク質酵素と同じ目的として有用であると期待される。ヒトＤＳＰＰ７様タンパク質は、がん、ＣＮＳ障害、喘息またはＣＯＰＤ、肥満症、糖尿病および心疾患等の障害を処置するための方法において有用であると考えられる。ヒトＤＳＰＰ７様タンパク質はまた、ヒトＤＳＰＰ７様タンパク質アクチベーターおよびインヒビターをスクリーニングするために使用することもできる。
【００２１】
ポリペプチド
本発明に係るヒトＤＳＰＰ７様ポリペプチドには、配列番号２に示すアミノ酸配列で示されるアミノ酸配列から選択される、少なくとも６、１０、１５、２０、２５、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５，４００または４１９個の連続アミノ酸、または以下に定義される生物学的に活性な変異体が含まれる。したがって、本発明のＤＳＰＰ７様ポリペプチドは、ＤＳＰＰ７様タンパク質の一部、完全長のＤＳＰＰ７様タンパク質、又はＤＳＰＰ７様タンパク質の全部または一部を含む融合タンパク質であり得る。
【００２２】
生物学的に活性な変異体
生物学的に活性な、即ちホスファターゼ活性を保持する、ヒトＤＳＰＰ７様ポリペプチド変異体もまた、ＤＳＰＰ７様タンパク質ポリペプチドである。好ましくは、天然または非天然に存在するＤＳＰＰ７様ポリペプチド変異体は、配列番号２に示すアミノ酸配列またはその断片と少なくとも約８９、９０、９６、９８または９９％一致するアミノ酸配列を有する。推定されるＤＳＰＰ７様ポリペプチド変異体と配列番号２のアミノ酸配列との一致パーセントは、慣用の方法によって決定する。例えば、Altschul et al., Bull. Math. Bio. 48:603 (1986)、およびHenikoff ＆ Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915 (1992)を参照。簡潔には、２つのアミノ酸配列を、ギャップオープニングペナルティ１０、ギャップ伸長ペナルティ１、およびHenikoff & Henikoff (1992)の「BLOSUM62」スコアリングマトリクスを用いてアライメントスコアが最適になるよう整列させる。
【００２３】
当業者は、２つのアミノ酸配列を整列させるために用いることができる確立されたアルゴリズムが多く存在することを理解している。Pearson and Lipmanの「FASTA」類似性検索アルゴリズムは、本明細書に開示されたアミノ酸配列と推定の変異体のアミノ酸配列が共有する同一性のレベルを調べるための適当なタンパク質アライメント法である。FASTAアルゴリズムは、Pearson and Lipman, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 85:2444(1988)、およびPearson, Meth. Enzymol. 183:63 (1990)に記載されている。簡潔には、FASTAは、最初に、保存的なアミノ酸置換、挿入または欠失を考慮することなく、照会する配列（即ち、配列番号２）および最も高い同一性の密度（ktup変数が１である場合）または同一の対（ktup＝２の場合）のいずれかを有する試験配列が共有する領域を同定することによって配列の類似性を特徴付ける。次いで、最も高い同一性の密度を有する１０の領域を、アミノ酸置換マトリクスを用いてすべての対のアミノ酸の類似性を比較することによって再スコア化し、その領域の末端を、最も高いスコア貢献する残基のみを含むように切り取る。「切り捨て（cutoff）」値（配列の長さとktup値に基づいて所定の式によって計算された）よりも大きいスコアを有する領域がいくつか存在する場合は、切取った最初の領域を調べ、その領域が連結してgapを有する近似アライメントを形成することができるかどうかを決定する。最後に、２つのアミノ酸配列の最も高いスコアの領域を、アミノ酸挿入および欠失を許容する、Needleman-Wunsch- Sellers algorithm (Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol.48:444 (1970); Sellers, SIAM J. Appl. Math. 26:787 (1974))を用いて整列させる。FASTA分析に好ましいパラメーターは、以下のとおりである：ktup=1, ギャップオープニングペナルティ=10, ギャップ伸長ペナルティ=1、および置換マトリクス=BLOSUM62。これらのパラメータは、Appendix 2 of Pearson, Meth. Enzymol. 183:63 (1990)において説明されているように、スコアリングマトリクスファイル（「SMATRIX」）に修飾を施してFASTAプログラムに導入することができる。
【００２４】
FASTAは、上記の比率を用いて核酸分子の配列同一性を決定するために用いることもできる。ヌクレオチド配列の比較に関して、ktup値は、１〜６の範囲内であり得、好ましくは３〜６の範囲、最も好ましくは３であり、その他のパラメータは既定値である。
【００２５】
同一性の百分率における変化は、例えばアミノ酸置換、挿入または欠失に起因し得る。アミノ酸置換は１対１のアミノ酸の置き換えとして定義される。置換されたアミノ酸が類似の構造的および／または化学的性質を有する場合、置換は保存的である。保存的置換の例は、イソロイシンまたはバリンによるロイシンの置換、グルタミン酸塩によるアスパラギン酸塩の置換、またはセリンによるスレオニンの置換である。
【００２６】
アミノ酸挿入または欠失は、アミノ酸配列への、またはその内部での変化である。これらは典型的には約１ないし５アミノ酸の範囲で起こる。ヒト膜様セリンプロテアーゼポリペプチドの生物学的または免疫学的活性を廃絶することなく、どのアミノ酸残基が置換、挿入または欠失できるかを決定する際の指針は、当分野で周知のコンピュータープログラム、例えばDNASTARソフトウェアを用いて見出すことができる。
【００２７】
本発明はさらに、例えばグリコシレーション、アセチル化、リン酸化、アミド化、周知の保護／ブッロキング基による誘導体化、タンパク質加水分解的開裂、抗体分子またはその他の細胞リガンド等への結合によって、翻訳の間または翻訳後に異なった形で修飾される膜様セリンプロテアーゼポリペプチドを包含する。数多くの化学的修飾のうちのいずれも、臭化シアン、トリプシン、チモトリプシン、パパイン、Ｖ８プロテアーゼ、ＮａＢＨ4、アセチル化、ホルミル化、酸化、還元、ツニカマイシンの存在下での代謝合成等が含まれるがこれに限定されない周知の技術によって行うことができる。
【００２８】
本発明に包含されるさらなる翻訳後修飾には、例えばＮ結合またはＯ結合炭化水素鎖、（Ｎ末端またはＣ末端処理）アミノ酸骨格への化学的部分の結合、Ｎ−結合またはＯ−結合炭化水素鎖の化学的修飾、および原核宿主発現の結果としてのメチオニン残基の付加または欠失が含まれる。膜様セリンプロテアーゼポリペプチドはまた、酵素、蛍光、イオン等の検出可能な標識で、またはアフィニティー標識によって修飾して、タンパク質を検出し単離することができる。
【００２９】
本発明はさらに、ポリペプチドの溶解性、安定性および循環時間の増大、または免疫原性の減少等（米国特許第４１７９３３７号）のさらなる利点をもたらす、膜様セリンプロテアーゼポリペプチドの化学的に修飾された誘導体を提供する。誘導体化のための化学的部分は、ポリエチレングリコール、エチレングリコール／プロピレングリコールコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール等から選択することができる。ポリペプチドは、無作為にまたはその分子内の予め決められた位置で修飾することができ、１、２、３またはそれ以上の結合した化学的部分を含むことができる。
【００３０】
アミノ酸変化またはポリペプチド修飾が生物学的に活性な膜様セリンプロテアーゼポリペプチドを生じるかどうかは、例えば、Dowd et al., J. Cell Sci. 1998 Nov;111 (Pt22):3389-99に記載されているように、酵素活性を分析することにより容易に決定することができる。
【００３１】
融合タンパク質
融合タンパク質は、ＤＳＰＰ７様ポリペプチドアミノ酸配列に対する抗体の作製に、そして様々な検定系での使用に有用である。例えば、融合タンパク質は、ＤＳＰＰ７様ポリペプチドの一部と相互作用するタンパク質の同定に使用できる。タンパク質親和クロマトグラフィーまたはタンパク質−タンパク質相互作用のためのライブラリーに基づく検定、例えば酵母２−ハイブリッドまたはファージディスプレイ系をこの目的のために使用できる。このような方法は当分野で周知であり、薬物スクリーニングとしても使用できる。
【００３２】
ＤＳＰＰ７様ポリペプチド融合タンパク質は、ペプチド結合により融合した２のポリペプチドセグメントを含んでいる。第一のポリペプチドセグメントは、配列番号２に示すアミノ酸配列から選択される少なくとも６、１０、１５、２０、２５、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００または４１９の連続アミノ酸、または上記に記載したようなその生物学的に活性な変異体を含む。第一のポリペプチドセグメントはまた、完全長ＤＳＰＰ７様タンパク質を含むことができる。
【００３３】
第二のポリペプチドセグメントは、完全長タンパク質またはタンパク質断片であってよい。融合タンパク質の組み立てに一般的に使用するタンパク質は、β−ガラクトシダーゼ、β−グルクロニダーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、自己蛍光タンパク質（青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）を包含する）、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、ルシフェラーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、およびクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）を包含する。さらに、融合タンパク質の組み立てには、ヒスチジン（His）標識、ＦＬＡＧ標識、インフルエンザへマグルチニン（ＨＡ）標識、Ｍｙｃ標識、ＶＳＶ−Ｇ標識、およびチオレドキシン（Ｔｒｘ）標識を包含するエピトープ標識を使用する。その他の融合組み立て物は、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、Ｓ−標識、Lex a ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）融合物、ＧＡＬ４ ＤＮＡ結合ドメイン融合物、および単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ＢＰ１６タンパク質融合物を包含する。融合タンパク質はさらに、ＤＳＰＰ７様ポリペプチドコード配列とヘテロローガスタンパク質配列の間に位置する開裂部位を含むよう組み立てることができ、その結果、このＤＳＰＰ７様ポリペプチドが開裂して、ヘテロローガス部分から精製することができる。
【００３４】
融合タンパク質は当分野で周知のように化学合成できる。好ましくは、融合タンパク質は二つのポリペプチドセグメントを共有結合で連結することにより、または分子生物学分野で標準的な方法により調製する。例えば、当分野で知られているように、第二のポリペプチドセグメントをコードしているヌクレオチドを有する適切なリーディングフレームに配列番号１から選ばれるコード配列を含む、ＤＮＡ組み立て物を作製し、このＤＮＡ組み立て物を宿主細胞で発現させる事による組換えＤＮＡ法を用いて、融合タンパク質を調製できる。融合タンパク質を組み立てるための多くのキットは、Promega Corporation(Madison, WI)、Stratagene(La Jolla, CA)、CLONTECH(Mountain View, CA)、Santa Cruz Biotechnology(Santa Cruz, CA)、MBL international Corporation(MIC; Watertown, MA)、およびQuantum Biotechnologies(Montreal, Canada; 1-888-DNA-KITS)等から入手できる。
【００３５】
種相同体の同定
ＤＳＰＰ７様ポリペプチドのポリヌクレオチド（下記）を使用して他の種、例えばマウス、サル、または酵母由来のｃＤＮＡ発現ライブラリーをスクリーニングするために好適なプローブまたはプライマーを作製し、ＤＳＰＰ７様ポリペプチドの相同体をコードしているｃＤＮＡを同定し、そして当分野で周知のようにこのｃＤＮＡを発現させて、ヒトＤＳＰＰ７様ポリペプチドの種相同体を得ることができる。
【００３６】
ポリヌクレオチド
ＤＳＰＰ７様ポリヌクレオチドは一本鎖または二本鎖であってよく、ＤＳＰＰ７様ポリペプチドのコード配列またはこのコード配列の相補体を含んでいる。ＤＳＰＰ７様のコード配列は配列番号１で示す。
【００３７】
ヒトＤＳＰＰ７様ポリペプチドをコードしている縮重ヌクレオチド配列、および、配列番号１に示すヌクレオチド配列と少なくとも約５０、５５、６０、６５、７０％、好ましくは約７５、９０、９６、９８もしくは９９％一致するホモローガスなヌクレオチド配列またはこれらの相補物もまた、ＤＳＰＰ７様ポリヌクレオチドである。二つのポリヌクレオチド配列間の配列一致パーセントは、ALIGNのようなコンピュータープログラムを用いて決定するが、これは、ギャップオープンペナルティー−１２およびギャップエクステンションペナルティー−２によるアフィンギャップ検索を用いるFASTAアルゴリズムを使用するものである。相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）分子、種相同体および生物学的に活性なＤＳＰＰ７様ポリペプチドをコードするＤＳＰＰ７様ポリヌクレオチドの変異体もやはりＤＳＰＰ７様ポリヌクレオチドである。配列番号１の少なくとも８、９、１０、１１、１２、１５、２０または２５の連続したヌクレオチドを含むポリヌクレオチド断片またはその相補物もまたＤＳＰＰ７様ポリヌクレオチドである。これらの断片は、例えば、ハイブリダイゼーションプローブまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドとして用いることができる。
【００３８】
ポリヌクレオチド変異体および相同体の同定
上記のＤＳＰＰ７様ポリヌクレオチドの変異体および相同体もまたＤＳＰＰ７様ポリヌクレオチドである。典型的には、ＤＳＰＰ７様ポリヌクレオチド配列は、当分野で周知のように、ストリンジェントな条件下で候補ポリヌクレオチドを既知のＤＳＰＰ７様ポリヌクレオチドにハイブリダイズすることにより同定できる。例えば、以下の洗浄条件 -- ２Ｘ ＳＳＣ（０.３M ＮａＣｌ、０.０３Mクエン酸ナトリウム、pH７.０）、０.１％ＳＤＳ、室温  ２回、各々３０分間；次いで２Ｘ ＳＳＣ、０.１％ＳＤＳ、５０℃ １回、３０分間；次いで２Ｘ ＳＳＣ、室温 ２回、各々１０分間 -- を使用して、最大約２５−３０％の塩基対ミスマッチを含むホモローガス配列を同定できる。より好ましくは、ホモローガス核酸鎖は１５−２５％の塩基対ミスマッチを、さらに好ましくは５−１５％の塩基対ミスマッチを含む。
【００３９】
本明細書に開示するＤＳＰＰ７様ポリヌクレオチドの種相同体はさらに、適当なプローブまたはプライマーを作製し、他の種、例えばマウス、サル、または酵母由来のｃＤＮＡ発現ライブラリーをスクリーニングすることによって同定できる。ＤＳＰＰ７様ポリヌクレオチドのヒト変異体は、例えばヒトｃＤＮＡ発現ライブラリーをスクリーニングすることにより同定できる。二本鎖ＤＮＡのＴmは相同性が１％低下する毎に１−１.５℃低下することがよく知られている（Bonner et al., J.Mol.Biol. 81,123(1973)）。故にヒトＤＳＰＰ７様ポリヌクレオチドの変異体または他の種のＤＳＰＰ７様ポリヌクレオチドは、推定のホモローガスＤＳＰＰ７様ポリヌクレオチドを、配列番号１のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドまたはその相補物とハイブリダイズさせて被験ハイブリッドを作製することによって同定できる。被験ハイブリッドの融解温度を、完全に相補的なヌクレオチド配列を有するトランスホルミラーゼポリヌクレオチドを含むハイブリッドの融解温度と比較し、被験ハイブリッドの中の塩基対ミスマッチのパーセント数を算出する。
【００４０】
ストリンジェントなハイブリダイゼーションおよび／または洗浄条件に従いＤＳＰＰ７様ポリヌクレオチドまたはその相補物とハイブリダイズするヌクレオチド配列もまたＤＳＰＰ７様ポリヌクレオチドである。ストリンジェントな洗浄条件は当分野で周知且つ理解されており、例えばSambrook et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2d ed., 1989, 9.50-9.51頁に開示されている。
【００４１】
典型的には、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件のためには、温度と塩濃度の組み合わせを、検討中のハイブリッドの理論的Ｔmよりおよそ１２−２０℃低くなるよう選択すべきである。配列番号１に示すヌクレオチド配列を有するＤＳＰＰ７様ポリヌクレオチドまたはその相同体と、それらのヌクレオチド配列のいずれか１つと少なくとも約５０、好ましくは約７５、９０、９６、または９８％一致するポリヌクレオチド配列とのハイブリッドのＴmは、例えばBolton and McCarthy, Proc.Natl.Acad.Sci. U.S.A. 48,1390(1962)の式：
Ｔm＝８１.５℃−１６.６(log10[Ｎａ+])＋０.４１(％Ｇ＋Ｃ)−０.６３(％ホルムアミド)−６００／ｌ）、
[式中、ｌ＝塩基対で表したハイブリッドの長さ]
を用いて算出できる。
【００４２】
ストリンジェントな洗浄条件としては例えば、４Ｘ ＳＳＣ（６５℃）、または５０％ホルムアミド、４Ｘ ＳＳＣ（４２℃）、または０.５Ｘ ＳＳＣ、０.１％ＳＤＳ（６５℃）が挙げられる。高度ストリンジェントな洗浄条件は、例えば０.２Ｘ ＳＳＣ（６５℃）などである。
【００４３】
ポリヌクレオチドの調製
ＤＳＰＰ７様ポリヌクレオチドは、膜構成成分、タンパク質および脂質といった他の細胞成分を含まないよう単離できる。ポリヌクレオチドは細胞から調製でき、標準的核酸精製技術を用いて単離、またはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）のような増幅技術を用いて合成、もしくは自動合成機を用いることによって調製できる。ポリヌクレオチドを単離する方法は常套的であり、当分野で知られている。ポリヌクレオチドを取得するためこのような任意の技術を用いて、単離されたＤＳＰＰ７様ポリヌクレオチドを得ることができる。例えば、制限酵素およびプローブを用いてＤＳＰＰ７様タンパク質を含むポリヌクレオチド断片を単離できる。単離したポリヌクレオチドは、他の分子を少なくとも７０、８０、または９０％含まない調製物である。
【００４４】
ヒトＤＳＰＰ７様 ｃＤＮＡ分子は、ＤＳＰＰ７様 ｍＲＮＡを鋳型に用いて標準的分子生物学技術にて調製できる。その後ＤＳＰＰ７様 ｃＤＮＡ分子は、当分野で周知でありSambrook et al.(1989)のようなマニュアルに開示される分子生物学技術を用いて複製できる。ヒトゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡを鋳型に使用して本発明に係るポリヌクレオチドのさらなるコピーを得るため、ＰＣＲのような増幅技術を用いることができる。
【００４５】
別法として、合成化学技術を用いてＤＳＰＰ７様ポリヌクレオチドを合成することもできる。遺伝コードの縮重は、例えば配列番号２に示すアミノ酸配列を有するＤＳＰＰ７様ポリペプチドまたはその生物学的に活性な変異体をコードする、別のヌクレオチド配列の合成を可能にする。
【００４６】
ポリヌクレオチドの伸長
本明細書に開示された部分配列を用いてその部分配列から誘導された対応する完全長遺伝子を同定することができる。部分配列をニック翻訳するかまたはポリヌクレオチドキナーゼを用い当業者に周知の標識法(BASIC METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, Davis et al., eds., Elsevier Press, N.Y., 1986)を用いて末端を32Ｐで標識することができる。ヒト組織から調製したラムダライブラリーを目的の標識配列を用いて直接スクリーニングするかまたはライブラリーをまとめてpBluescript (Stratagene Cloning Systems, La Jolla, Calif. 92037)に変換して細菌コロニースクリーニングを容易にすることができる（Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989, pg. 1.20)を参照）。
【００４７】
いずれの方法も当分野では周知である。簡潔には、pBluescriptにそのライブラリーを含有する細菌コロニーを有するフィルターまたはラムダプラークを含有する細菌のローン（lawn）を変性させ、ＤＮＡをフィルターに固定する。このフィルターをDavis et al., 1986に記載されているハイブリダーゼーション条件を用いて標識プローブとハイブリダイズさせる。ラムダまたはpBluescriptにクローニングした部分配列を、ポジティブコントロールとして用い、バックグラウンドの結合を調べ、正確なクローンの同定に必要なハイブリダイゼーションおよび洗浄ストリンジェンシーを調整する。得られたオートラジオグラムを、それぞれ暴露されたスポットが陽性コロニーまたはプラークに対応する、コロニーまたはプラークの２枚一組のプレートと比較する。コロニーまたはプラークを選択し、増殖させ、ＤＮＡを更なる解析および配列決定のためにコロニーから単離する。
【００４８】
それらが含んでいる更なる配列の量を決定するために、一方は部分配列に由来するプライマー、他方はベクターに由来するプライマーを用いるＰＣＲを用いて陽性のｃＤＮＡコロニーを解析する。最初の部分配列よりも大きなベクターインサートＰＣＲ生成物を有するクローンを制限消化およびＤＮＡ配列決定により解析し、それらがノーザンブロット分析から決定されたｍＲＮＡと同じ大きさかまたは同様の大きさのインサートを含んでいるかどうかを決定する。
【００４９】
１またはそれ以上の重複ｃＤＮＡクローンを同定したら、例えばエキソヌクレアーゼＩＩＩ消化（McCombie et al., Methods 3, 33 40, 1991）の後にそのクローンの完全な配列を決定する。一連の欠失クローンを作成し、それぞれの配列を決定する。得られた重複配列を、縮重度の高い１つの連続した配列（各ヌクレオチドの位置で通常３〜５の重複配列）に組み立て、正確度の高い最終配列を得る。
【００５０】
ＰＣＲに基づく様々な方法を用いて本明細書に開示の核酸配列を伸長させ、プロモーターおよび調節エレメントといった上流配列を検出することができる。例えば制限部位ＰＣＲは、既知の座に隣接する未知配列を回収するため、普遍的プライマーを使用する（Sarkar, PCR Methods Applic. 2,318-322,1993）。まず、ゲノムＤＮＡを、リンカー配列に対するプライマーおよび既知領域に対し特異的なプライマーの存在下で増幅する。次に、増幅させた配列を、同じリンカープライマーおよび最初のものの内部にある別の特異的プライマーを用いる第二回目のＰＣＲに付す。各回のＰＣＲの産物を適当なＲＮＡポリメラーゼで転写し、逆転写酵素を用いて配列決定する。
【００５１】
既知領域に基づく異なるプライマーを用いて配列を増幅または伸長するために、逆ＰＣＲを使用することもできる（Triglia et al., Nucleic Acids Res. 16,8186,1988）。OLIGO 4.06 Primer Analysisソフトウェア（National Biosciences Inc., Plymouth, Minn.）のような市販ソフトウェアを用いて、長さ２２−３０ヌクレオチド長、５０％またはそれ以上のＧＣ含有量を持ち、約６８−７２℃の温度で標的配列とアニーリングするプライマーを設計できる。この方法は、遺伝子の既知領域に適当な断片を作り出す幾つかの制限酵素を使用する。次いでこの断片を分子内ライゲーションにより環化し、ＰＣＲ鋳型として使用する。
【００５２】
使用できるもう一つの方法は、ヒトおよび酵母人工染色体ＤＮＡ中の既知配列に隣接するＤＮＡ断片のＰＣＲ増幅を含む、捕捉ＰＣＲである（Lagerstrom et al., PCR Methods Applic. 1,111-119,1991）。この方法では、複数の制限酵素消化物とライゲーションを行って、作製したある二本鎖の配列を、ＰＣＲを行う前にそのＤＮＡ分子の未知断片中に入れることができる。
【００５３】
未知配列を回収するために使用できるもう一つの方法はParker et al., Nucleic Acids Res. 19,3055-3060,1991の方法である。加えて、ＰＣＲ、入れ子式(nested)プライマー、およびPROMOTERFINDERライブラリー（CLONTECH, Palo Alto, Calif.）を用いてゲノムＤＮＡを移動させることができる（CLONTECH, Palo Alto, Calif.）。このプロセスはライブラリーをスクリーニングする必要性を排除し、イントロン／エクソン接合点の発見に有用である。
【００５４】
完全長ｃＤＮＡに対してスクリーニングする場合、より大きなｃＤＮＡを含むようサイズ選択したライブラリーを使用するのが望ましい。遺伝子の５'領域を含む配列をより多く含んでいるという点で、無作為プライミングしたライブラリーが好ましい。無作為プライミングしたライブラリーの使用は、オリゴｄ(Ｔ)ライブラリーが完全長ｃＤＮＡを産生しない状況で特に好ましいであろう。ゲノムライブラリーは、配列を５'非転写調節領域へと伸長させるのに有用であり得る。
【００５５】
市販品が入手可能な毛細管電気泳動系を用いて、ＰＣＲまたは配列決定産物のサイズを分析、またはヌクレオチド配列を確認することができる。例えば、毛細管配列決定は、電気泳動分離用の流動性ポリマー、レーザー励起する４種の異なる蛍光色素（各ヌクレオチドにつき１種ずつ）、および電荷結合素子カメラによる放射された波長の検出を利用することができる。出力／光強度は適当なソフトウェア（例えばGENOTYPERおよびSequence NAVIGATOR、Perkin Elmer）を用いて電気信号に変換でき、試料のロードからコンピューター分析および電子的データ表示に至る全プロセスをコンピューター管理することができる。毛細管電気泳動は、特定の試料中に限られた量で存在するかも知れないＤＮＡの小片を配列決定するのに特に好ましい。
【００５６】
ポリペプチドの取得
ヒトＤＳＰＰ７様ポリペプチドは、例えばヒト細胞からの精製によって、ＤＳＰＰ７様ポリヌクレオチドの発現によって、または直接的化学合成によって取得できる。
【００５７】
タンパク質精製
ヒトＤＳＰＰ７様ポリペプチドは、ＤＳＰＰ７様発現構築物でトランスフェクトした宿主細胞を包含する、該ポリペプチドを発現する任意のヒト細胞から精製できる。精製されたＤＳＰＰ７様ポリペプチドは、細胞内のＤＳＰＰ７様ポリペプチドに通常付随するその他の化合物、例えば或る種のタンパク質、炭水化物、または脂質から、当分野で周知の方法を用いて分離する。このような方法は、サイズ排除クロマトグラフィー、硫酸アンモニウム分画、イオン交換クロマトグラフィー、親和クロマトグラフィー、および調製用ゲル電気泳動を包含するが、これらに限定されない。精製ＤＳＰＰ７様ポリペプチドの調製物は少なくとも８０％純粋であり、好ましくは該調製物は９０％、９５％、または９９％純粋である。調製物の純度はＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動のような当分野で既知の任意の手段によって評価できる。
【００５８】
ポリヌクレオチドの発現
ＤＳＰＰ７様ポリヌクレオチドを発現させるため、挿入されたコード配列の転写と発現に必要な要素を含む発現ベクター中にそのポリヌクレオチドを挿入することができる。ＤＳＰＰ７様ポリペプチドをコードしている配列および適当な転写および翻訳調節エレメントを含む発現ベクターを組み立てるため、当業者に周知の方法が利用できる。これらの方法には、インビトロ組換えＤＮＡ技術、合成技術、およびインビボ遺伝子組換えがある。このような技術は、例えばSambrook et al.(1989)およびAusubel et al., CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, New York., 1989に記載されている。
【００５９】
様々な発現ベクター／宿主系が、ＤＳＰＰ７様ポリペプチドをコードしている配列を含みそして発現させるために利用できる。これらには、微生物、例えば組換えバクテリオファージ、プラスミド、またはコスミドＤＮＡ発現ベクターにより形質転換された細菌；酵母発現ベクターにより形質転換された酵母、ウイルス発現ベクター（例えばバキュロウイルス）により感染させた昆虫細胞系、ウイルス発現ベクター（例えばカリフラワーモザイクウイルス、ＣａＭＶ；タバコモザイクウイルス、ＴＭＶ）、もしくは細菌発現ベクター（例えばＴｉまたはｐＢＲ３２２プラスミド）により形質転換された植物細胞系、または動物細胞系が包含されるがこれらに限定される訳ではない。
【００６０】
調節エレメントまたは調節配列は、宿主細胞タンパク質と相互作用して転写と翻訳を実行する、ベクターの非翻訳領域  エンハンサー、プロモーター、５'および３'非翻訳領域 である。このようなエレメントはその強さと特異性において異なっている。利用するベクター系および宿主に応じて、構成的および誘導的プロモーターを包含する、多数の好適な転写および翻訳エレメントを使用できる。例えば、細菌系でクローニングを行う場合、BLUESCRIPTファージミド（Stratagene, LaJolla，Calif.）またはpSPORT１プラスミド（Life Technologies）等のハイブリッドlacZプロモーターのような誘導的プロモーターを使用できる。バキュロウイルスのポリヘドリンプロモーターは昆虫細胞に使用できる。植物細胞のゲノムから（例えば熱ショック、RUBISCO、および貯蔵遺伝子）、または植物ウイルスから（例えば、ウイルスプロモーターまたはリーダー配列）誘導したプロモーターまたはエンハンサーを該ベクター中にクローニングすることができる。哺乳動物細胞系では、哺乳動物遺伝子由来の、または哺乳動物ウイルス由来のプロモーターが好ましい。ＤＳＰＰ７様ポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列を複数コピー含むセルラインを作製する必要がある場合は、ＳＶ４０またはＥＢＶに基づくベクターを適当な選択マーカーと共に使用することができる。
【００６１】
細菌および酵母発現系
細菌系では、ＤＳＰＰ７様ポリペプチドに対して意図する用途に応じて数多くの発現ベクターを選択できる。例えば、抗体の誘導のため大量のＤＳＰＰ７様ポリペプチドが必要である場合は、容易に精製できる融合タンパク質の高レベル発現を指令するベクターが使用できる。このようなベクターは、BLUESCRIPT(Stratagene)のような多機能E.coliクローニングおよび発現ベクターを包含するが、これに限定される訳ではない。BLUESCRIPTベクターにおいては、ＤＳＰＰ７様ポリペプチドをコードしている配列を、β−ガラクトシダーゼのアミノ末端Ｍｅｔとこれに続く７残基の配列と共にフレーム内で該ベクター中にライゲーションすることができ、その結果ハイブリッドタンパク質が産生される。ｐＩＮベクター（Van Heeke & Schuster, J.Biol.Chem. 264,5503-5509,1989）またはｐＧＥＸベクター（Promega, Madison, Wis.）もまた、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）を伴う融合タンパク質として外来ポリペプチドを発現させるのに使用できる。一般に、このような融合タンパク質は可溶性であり、グルタチオン−アガロースビーズに吸着させ、その後遊離グルタチオンの存在下で溶離することにより、溶菌させた細胞から容易に精製できる。このような系で調製したタンパク質は、ヘパリン、トロンビン、または第Ｘａ因子プロテアーゼ開裂部位を含むよう設計でき、その結果、目的とするクローンポリペプチドをＧＳＴ部分から随意に解放することができる。
【００６２】
酵母Saccharomyces cerevisiaeにおいては、α因子、アルコールオキシダーゼ、およびＰＧＨのような構成的または誘導的プロモーターを含む幾つかのベクターが使用できる。総説としてAusubel et al.(1989)およびGrant et al., Methods Enzymol. 153,516-544,1987を参照されたい。
【００６３】
植物および昆虫発現系
植物発現ベクターを使用する場合、ＤＳＰＰ７様ポリペプチドをコードしている配列の発現は、幾つかのプロモーターのうち任意のものにより駆動できる。例えば、ＣａＭＶの３５Ｓおよび１９Ｓプロモーターのようなウイルスプロモーターを、単独で、またはＴＭＶ由来のオメガリーダー配列と組み合わせて使用できる（Takamatsu, EMBO J. 6,307-311,1987）。別法として、RUBISCOの小サブユニットのような植物プロモーターまたは熱ショックプロモーターを使用することもできる（Coruzzi et al., EMBO J. 3,1671-1680,1984；Broglie et al., Science 224,838-843,1984；Winter et al., Results Probl.Cell Differ. 17,85-105,1991）。これらの組み立て物は、直接ＤＮＡ形質転換または病原体仲介トランスフェクションにより植物細胞中に導入できる。このような技術は幾つかの一般に入手可能な総説に記載されている（例えば、HobbsまたはMurray、MCGRAW HILL YEARBOOK OF SCIENCE AND TECHNOLOGY, McGraw Hill, New York, N.Y., pp191-196,1992）。
【００６４】
昆虫系もまたＤＳＰＰ７様ポリペプチドの発現に使用できる。例えば、係る系の１つAutographa californica核多角体病ウイルス（ＡｃＮＰＶ）は、Spodoptera frugiperda細胞またはTrichoplusiaの幼虫で外来遺伝子を発現させるベクターとして使用する。ＤＳＰＰ７様ポリペプチドをコードしている配列を、ポリヘドリン遺伝子のような該ウイルスの非必須領域中にクローニングし、ポリヘドリンプロモーターの調節下に置くことができる。ＤＳＰＰ７様ポリペプチドをうまく挿入すると、ポリヘドリン遺伝子は不活性化し、コートタンパク質を欠く組換えウイルスが生成する。次いでこの組換えウイルスをS.frugiperda細胞またはTrichoplusiaの幼虫への感染に使用し、そこでＤＳＰＰ７様ポリペプチドを発現させることができる（Engelhard et al., Proc.Nat.Acad.Sci. 91,3224-3227,1994）。
【００６５】
哺乳動物発現系
ウイルスに基づく多くの発現系を用いて哺乳動物宿主細胞でＤＳＰＰ７様ポリペプチドを発現させることができる。例えば、発現ベクターとしてアデノウイルスを使用する場合、ＤＳＰＰ７様ポリペプチドをコードしている配列は、後期プロモーターおよび３部に分かれたリーダー配列を含むアデノウイルス転写／翻訳複合体中にライゲーションできる。該ウイルスゲノムの非必須Ｅ１またはＥ３領域における挿入を用いて、感染宿主細胞においてＤＳＰＰ７様ポリペプチドを発現できる生存ウイルスを取得できる（Logan & Shenk, Proc.Natl.Acad.Sci. 81,3655-3659,1984）。所望により、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）エンハンサーのような転写エンハンサーを用いて哺乳動物宿主細胞での発現を増大させることができる。
【００６６】
ヒト人工染色体（ＨＡＣ）もまた、プラスミドが内包し発現するＤＮＡ断片よりも大きなＤＮＡ断片の運搬に使用できる。６Ｍないし１０ＭのＨＡＣを組み立て、常套的デリバリー法により細胞に到達させる（例えば、リポソーム、ポリカチオンアミノポリマー、または小胞）。
【００６７】
さらに、ＤＳＰＰ７様ポリペプチドをコードしている配列の、より効率的な翻訳を達成するために、特異的開始シグナルを使用できる。係るシグナルはＡＴＧ開始コドンおよび連続配列を包含する（Kozak配列）。ＤＳＰＰ７様ポリペプチドをコードしている配列、その開始コドン、および上流配列を適当な発現ベクター中に挿入した場合、さらなる転写または翻訳調節シグナルは必要ないであろう。しかしながら、コード配列またはその断片のみを挿入した場合は、外因性の翻訳調節シグナル（ＡＴＧ開始コドンを包含する）を供給すべきである。開始コドンは挿入物全体を確実に翻訳させるために、正しいリーディングフレームになければならない。外因性翻訳エレメントおよび開始コドンは天然および合成両者の様々な起源であってよい。発現の効率は、使用する特定の細胞系に対し適切なエンハンサーを存在させることにより増強できる（Scharf et al., Results Probl.Cell Differ. 20,125-162,1994）。
【００６８】
宿主細胞
宿主細胞菌株は、挿入した配列の発現を調節する能力または発現されたＤＳＰＰ７様ポリペプチドを所望の方法で処理できる能力を目的として選択できる。該ポリペプチドのこのような修飾には、アセチル化、カルボキシ化、グリコシル化、燐酸化、脂質化、およびアシル化が包含されるがこれらに限定されない。該ポリペプチドの「プレプロ」型を開裂する翻訳後プロセシングもまた、正しい挿入、折り畳み、および／または機能を促進するために使用できる。翻訳後活性のための特異的な細胞機構および特徴的メカニズムを持つ異なる宿主細胞（例えばＣＨＯ、ＨｅＬａ、ＭＤＣＫ、ＨＥＫ２９３、１３２１Ｎ１およびＷＩ３８）が、American Type Culture Collection（ＡＴＣＣ；10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209）から入手でき、外来タンパク質の正しい修飾およびプロセシングを確実とするために選択できる。
【００６９】
組換えタンパク質の、長期高収量産生のために、安定な発現が好ましい。例えば、セルラインは、クローニングされたＤＳＰＰ７様 ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ、ウイルス複製起点および／または内因性発現エレメント、および同じまたは別のベクター上にある選択マーカー遺伝子を含む発現ベクターを使用して、常套的トランスフェクション法、例えばリポソーム、ポリカチオンアミノポリマー、小胞、電気穿孔、燐酸カルシウム等によって安定にトランスフェクトされ得る。該ベクターの導入に続いて、細胞を強化培地で１−２日間生育させた後、培地を選択培地に交換することができる。選択マーカーの目的は選択に対する抵抗性を付与することであり、その存在が、導入されたＤＳＰＰ７様配列をうまく発現する細胞の生育と回収を可能にする。安定に形質転換された細胞の耐性クローンは、その細胞型にとって適当な組織培養技術を用いて増殖させることができる。例えば、ANIMAL CELL CULTURE, R.I.Freshney,ed.,1986を参照されたい。
【００７０】
幾つかの選択系を用いて、形質転換されたセルラインを回収できる。
【００７１】
これらには、それぞれtk-またはaprt-細胞で使用できる単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（Wigler et al., Cell 11,223-32,1977）およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Lowy et al., Cell 22,817-23,1980）遺伝子が包含されるがこれらに限定される訳ではない。さらに、代謝拮抗物質、抗生物質、または除草剤耐性を選択の基準に用いることができる。例えば、dhfrはメソトレキサートに対する耐性を付与し（Wigler et al., Proc.Natl.Acad.Sci. 77,3567-70,1980）nptはアミノグリコシド、ネオマイシンおよびＧ−４１８に対する耐性を付与し（Colbere-Garapin et al., J.Mol. Biol. 150,1014,1981）、そしてalsおよびpatはそれぞれクロルスルフロンおよびホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼに対する耐性を付与する（Murray, 1992,上記）。さらなる選択遺伝子が記載されている。例えば、trpBは細胞がトリプトファンの代わりにインドールを利用するようにさせ、hisDは細胞がヒスチジンの代わりにヒスチノールを利用するようにさせる（Hartman & Mulligan, Proc.Natl.Acad.Sci. 85,8047-51,1988）。アントシアニンのような可視マーカー、β−グルクロニダーゼとその基質ＧＵＳ、およびルシフェラーゼとその基質ルシフェリンは、形質転換体を同定し、特異的ベクター系に帰すことのできる一過性または安定なタンパク質発現の量を定量するために使用できる（Rhodes et al., Methods Mol.Biol. 55,121-131,1995）。
【００７２】
発現の検出
マーカー遺伝子発現の存在はＤＳＰＰ７様ポリヌクレオチドもまた存在することを示唆しているが、その存在と発現は確認する必要がある。例えば、もしＤＳＰＰ７様ポリペプチドをコードしている配列がマーカー遺伝子配列内部に挿入されるならば、ＤＳＰＰ７様ポリペプチドをコードしている配列を含む形質転換された細胞は、マーカー遺伝子機能の不在によって同定できる。これに代わり、マーカー遺伝子は、単一のプロモーターの調節下にＤＳＰＰ７様ポリペプチドをコードしている配列とタンデムに並べて位置させることもできる。誘導または選択に応答したマーカー遺伝子の発現は、通常、ＤＳＰＰ７様ポリヌクレオチドの発現を示す。
【００７３】
これとは別に、ＤＳＰＰ７様ポリヌクレオチドを含みＤＳＰＰ７様ポリペプチドを発現する宿主細胞は、当業者に知られる様々な方法によって同定できる。これらの方法には、ＤＮＡ−ＤＮＡまたはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリダイゼーションおよびタンパク質生検またはイムノアッセイ技術（核酸またはタンパク質の検出および／または定量のための膜、溶液、またはチップに基づく技術を包含する）が包含されるがこれらに限定されない。例えば、ＤＳＰＰ７様ポリペプチドをコードしているポリヌクレオチド配列の存在は、プローブまたは断片またはＤＳＰＰ７様ポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドの断片を使用するＤＮＡ−ＤＮＡまたはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリダイゼーションまたは増幅によって検出できる。核酸増幅に基づく検定は、ＤＳＰＰ７様ポリヌクレオチドを含む形質転換体を検出するための、ＤＳＰＰ７様ポリペプチドをコードしている配列から選択されるオリゴヌクレオチドの使用を含む。
【００７４】
ＤＳＰＰ７様ポリペプチドに対し特異的なポリクローナルまたはモノクローナル抗体のいずれかを使用して該ポリペプチドの発現を検出および測定するための様々なプロトコルが当分野で知られている。例として、酵素結合イムノソルベント検定（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、および蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）がある。ＤＳＰＰ７様ポリペプチド上の２個の非干渉性エピトープに反応するモノクローナル抗体を用いる、２部位のモノクローナルに基づくイムノアッセイが使用でき、または、競合的結合検定を使用することができる。これらのそしてその他の検定はHamptom et al., SEROLOGICAL METHODS: A LABORATORY MANUAL, APS Press, St.Paul, Minn., 1990およびMaddox et al., J.Exp.Med. 158,1211-1216,1983）に記載されている。
【００７５】
多岐にわたる標識およびコンジュゲーション技術が当業者に知られており、様々な核酸およびアミノ酸検定に使用できる。ＤＳＰＰ７様ポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドに関連する配列を検出するための標識化ハイブリダイゼーションまたはＰＣＲプローブを調製する手段は、標識したヌクレオチドを使用する、オリゴ標識化、ニック翻訳、末端標識化、またはＰＣＲ増幅を包含する。これとは別に、ＤＳＰＰ７様ポリペプチドをコードしている配列を、ｍＲＮＡプローブの産生のためのベクター中にクローニングすることもできる。このようなベクターは当分野で既知であり、市販品が入手でき、標識化ヌクレオチドおよび適当なＲＮＡポリメラーゼ、例えばＴ７、Ｔ３、またはＳＰ６を添加することによりインビトロでのＲＮＡプローブの合成に使用することができる。これらの方法は、市販の様々なキットを用いて実施できる（Amersham Pharmacia Biotech、 Promega、およびUS Biochemical）。検出を容易にするために使用できる適当なリポーター分子または標識には、放射性核種、酵素、および蛍光、化学ルミネセント、または色素生成物質、ならびに基質、補助因子、インヒビター、磁性粒子などが包含される。
【００７６】
ポリペプチドの発現および精製
ＤＳＰＰ７様ポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列で形質転換させた宿主細胞は、発現と、細胞培養からのタンパク質の回収に適した条件下で培養できる。形質転換細胞により産生されたポリペプチドは、その配列および／または使用したベクターに応じて分泌されまたは細胞内に貯留され得る。当業者には理解できるであろうが、ＤＳＰＰ７様ポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを含む発現ベクターは、原核または真核細胞膜を通った可溶性ＤＳＰＰ７様ポリペプチドの分泌を指令する、または膜結合ＤＳＰＰ７様ポリペプチドの、膜挿入を指令する、シグナル配列を含むよう設計できる。
【００７７】
上に論じたように、他の組み立て物を用いて、ＤＳＰＰ７様ポリペプチドをコードしている配列を、可溶性タンパク質の精製を促進するポリペプチドドメインをコードしているヌクレオチド配列と結合させることができる。このような精製促進ドメインは、金属キレート化ペプチド、例えば固定化金属上での精製を可能にするヒスチジン−トリプトファンモジュール、固定化免疫グロブリン上での精製を可能にするタンパク質Ａドメイン、およびFLAGS伸長／親和精製系で利用するドメインが包含されるが、これらに限定されない（Immunex Corp., Seattle, Wash.）。精製ドメインとＤＳＰＰ７様ポリペプチドとの間に開裂可能リンカー配列、例えば第Ｘａ因子またはエンテロキナーゼに特異的なリンカー配列を入れること（Invitrogen, San Diego, CA）もまた、精製を促進するために利用できる。このような発現ベクターの１つは、ＤＳＰＰ７様ポリペプチドと、チオレドキシンまたはエンテロキナーゼ開裂部位に先立つ６個のヒスチジン残基とを含む融合タンパク質の発現を提供する。このヒスチジン残基はＩＭＡＣ（Porath et al., Prot.Exp.Purif. 3,263-281,1992に記載の固定化金属イオン親和クロマトグラフィー）による精製を促進し、一方エンテロキナーゼ開裂部位は融合タンパク質からのＤＳＰＰ７様ポリペプチドの精製手段を提供する。融合タンパク質を含むベクターはKroll et al., DNA Cell Biol. 12,441-453,1993に開示されている。
【００７８】
化学合成
ＤＳＰＰ７様ポリペプチドをコードしている配列は、その全体または一部を、当分野で周知の化学的方法を用いて合成できる（Caruthers et al., Nucl.Acids Res.Symp.Ser. 215-223,1980；Horn et al., Nucl.Acids Res.Symp.Ser. 225-232,1980）。これとは別に、ＤＳＰＰ７様ポリペプチド自身を、そのアミノ酸配列を合成するための化学的方法、例えば固相技術を用いる直接ペプチド合成を用いて調製できる（Merrifield, J.Am.Chem.Soc. 85,2149-2154,1963；Roberge et al., Science 269,202-204,1995）。タンパク質合成は手動技術またはオートメーションを用いて実施できる。自動化合成は、例えばApplied Biosystems 431Aペプチド合成機（Perkin Elmer）を用いて達成できる。所望により、ＤＳＰＰ７様ポリペプチドの断片を別々に合成し、化学的方法を用いて合して完全長の分子を調製することもできる。
【００７９】
新たに合成したペプチドは、調製用高速液体クロマトグラフイー（例えばCreighton, PROTEINS: STRUCTURES AND MOLECULAR PRINCIPLES, WH Freeman and Co., New York, N.Y., 1983）により実質的に精製できる。合成ＤＳＰＰ７様ポリペプチドの組成はアミノ酸分析または配列決定により確認できる（例えばエドマン分解法；Creighton、上記を参照されたい）。さらに、直接合成中にＤＳＰＰ７様ポリペプチドのアミノ酸配列の任意の部分を改変させ、そして／または化学的方法を用いて他のタンパク質由来の配列と合して、変異体ポリペプチドまたは融合タンパク質を調製することができる。
【００８０】
改変ポリペプチドの調製
当業者には理解できるであろうが、天然に存在しないコドンを有するＤＳＰＰ７様ポリペプチドコード化ヌクレオチドを調製することは有利であり得る。例えば、特定の原核または真核宿主が好むコドンを選択して、タンパク質発現の速度を増大させ、または所望の性質、例えば天然に存在する配列から産み出される転写物の半減期より長い半減期を持つＲＮＡ転写物を調製することができる。
【００８１】
本明細書に開示するヌクレオチド配列は、当分野で一般的に知られる方法を用いて、該ポリペプチドまたはｍＲＮＡ産物のクローニング、プロセシング、および／または発現を修飾する改変を包含する（但しこれらに限定される訳ではない）様々な理由で、ＤＳＰＰ７様ポリペプチドコード配列を改変させるように設計できる。無作為断片化によるＤＮＡシャフリングと遺伝子断片および合成オリゴヌクレオチドのＰＣＲ再集合を用いてヌクレオチド配列を設計できる。例えば、位置指定突然変異誘発を用いて、新たな制限部位を挿入し、グリコシル化パターンを変え、コドンの優先性を変え、スプライス変異体を調製し、突然変異を導入する等を実施できる。
【００８２】
抗体
当分野で知られているいかなる型の抗体も、ＤＳＰＰ７様ポリペプチドのエピトープに特異的に結合するよう作製できる。本明細書で使用する「抗体」とは、無傷の免疫グロブリン分子、およびその断片、例えばＦａｂ、Ｆ(ａｂ')2、およびＦｖを包含し、これらはＤＳＰＰ７様ポリペプチドのエピトープに結合できる。典型的には、エピトープを形成するためには少なくとも６、８、１０、または１２の連続するアミノ酸が必要である。しかしながら、非連続アミノ酸を含むエピトープはより多くの、例えば少なくとも１５、２５、または５０のアミノ酸を必要とするかも知れない。
【００８３】
ＤＳＰＰ７様ポリペプチドのエピトープに特異的に結合する抗体は治療に使用でき、そして免疫化学検定、例えばウェスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、ラジオイムノアッセイ、免疫組織化学検定、免疫沈降、またはその他の当分野で既知の免疫化学的検定に使用できる。所望の特異性を有する抗体の同定のため、様々なイムノアッセイが使用できる。競合的結合または免疫放射検定のための多数のプロトコルが当分野でよく知られている。このようなイムノアッセイは典型的には、免疫原と、その免疫原に特異結合する抗体との間の複合体形成の測定を含んでいる。
【００８４】
典型的には、ＤＳＰＰ７様ポリペプチドに特異的に結合する抗体は、免疫化学検定に使用する時、他のタンパク質が提供する検出シグナルより少なくとも５、１０、または２０倍高い検出シグナルを提供する。好ましくは、ＤＳＰＰ７様ポリペプチドに特異結合する抗体は、免疫化学検定で他のタンパク質を検出せず、ＤＳＰＰ７様ポリペプチドを溶液から免疫沈降させることができる。
【００８５】
ヒトＤＳＰＰ７様ポリペプチドは、哺乳動物、例えばマウス、ラット、ウサギ、モルモット、サル、またはヒトを免疫してポリクローナル抗体を産生させるのに使用できる。所望により、ＤＳＰＰ７様ポリペプチドは、担体タンパク質、例えば牛血清アルブミン、チログロブリン、およびスカシガイヘモシアニンとコンジュゲートさせることができる。宿主の種に応じて、免疫学的反応を増大させるために種々のアジュバントを使用できる。このようなアジュバントは、フロイントアジュバント、鉱物性ゲル（例えば水酸化アルミニウム）、および界面活性物質（例えばリゾレシチン、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油性エマルジョン、スカシガイヘモシアニン、およびジニトロフェノール）を包含するがこれらに限定されない。ヒトに使用するアジュバントの中ではＢＣＧ（bacilli Calmette-Guerin）およびCorynebacterium parvumが特に有用である。
【００８６】
ＤＳＰＰ７様ポリペプチドに特異的に結合するモノクローナル抗体は、培養中の連続的セルラインにより抗体分子の産生を提供する任意の技術を用いて調製できる。これらの技術には、ハイブリドーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術、およびＥＢＶ−ハイブリドーマ技術があるがこれらに限定されない（Kohler et al., Nature 256,495-497,1985; Kozbor et al., J.Immunol.Methods 81,31-42,1985; Cote et al., Proc.Natl.Acad.Sci. 80,2026-2030,1983; Cole et al., Mol.Cell Biol. 62,109-120,1984）。
【００８７】
さらに、マウス抗体遺伝子をヒト抗体遺伝子にスプライシングして適当な抗原特異性と生物活性を持つ分子を得る、「キメラ抗体」の産生のために開発された技術が利用できる（Morrison et al., Proc.Natl.Acad.Sci. 81,6851-6855,1984; Neuberger et al., Nature 312,604-608,1984; Takeda et al., Nature 314,452-454,1985）。モノクローナルおよびその他の抗体はまた、これを治療に使用した場合に患者が該抗体に対する免疫反応を起こすのを防ぐため、「ヒト化」することができる。このような抗体は、治療に直接使用できるほど配列が充分ヒトに類似しているかも知れず、または幾つかの重要残基の変更を必要とするかも知れない。齧歯類の抗体とヒト配列の間の配列相違は、個々の残基の位置指定突然変異誘発により、または相補性決定領域全体のgratingにより、ヒト配列内の残基と相違する残基を置き換えることによって最小化することができる。別法として、ヒト化抗体はGB2188638Bに記載のように組換え法を用いて調製できる。ＤＳＰＰ７様ポリペプチドに特異的に結合する抗体は、米国特許第５，５６５，３３２号に開示のように、部分的または完全にヒト化した抗原結合部位を含むことができる。
【００８８】
これに代わり、当分野で既知の方法を用いて、一本鎖抗体の調製のために記載した技術を適合させ、ＤＳＰＰ７様ポリペプチドに特異結合する一本鎖抗体を調製することができる。関連する特異性を持つが別個のイディオタイプ組成を有する抗体を、無作為組み合わせ免疫グロブリンライブラリーから鎖シャフリングによって調製することができる（Burton, Proc.Natl.Acad.Sci. 88,11120-23,1991）。
【００８９】
一本鎖抗体はまた、ハイブリドーマｃＤＮＡを鋳型に用いて、ＰＣＲのようなＤＮＡ増幅法を用いて組み立てることができる（Thirion et al., 1996, Eur.J.Cancer Prev. 5,507-11）。一本鎖抗体は単一または二重特異性であり得、また、二価または四価であり得る。四価二重特異性一本鎖抗体の組み立ては例えばColoma & Morrison, 1997, Nat.Biotechnol. 15,159-63に教示されている。二価二重特異性一本鎖抗体の組み立てはMallender & Voss, 1994, J.Biol.Chem. 269,199-206に教示されている。
【００９０】
下記のように、一本鎖抗体をコードしているヌクレオチド配列を手動または自動ヌクレオチド合成を用いて組み立て、標準的組換えＤＮＡ法を用いて発現組み立て物中にクローニングし、そして細胞中に導入してコード配列を発現させることができる。別法として、一本鎖抗体を、例えば糸状ファージ技術を用いて直接調製することもできる（Verhaar et al., 1995, Int.J.Cancer 61,497-501; Nicholla et al., 1993, J.Immunol.Meth. 165,81-91）。
【００９１】
ＤＳＰＰ７様ポリペプチドに特異結合する抗体はまた、リンパ球集団においてインビボ産生を誘導することによって、または、文献に開示されている極めて特異的な結合試薬のパネルまたは免疫グロブリンライブラリーをスクリーニングすることによって調製することもできる（Orlandi et al., Proc.Natl.Acad.Sci. 86,3833-3837,1989; Winter et al., Nature 349,293-299,1991）。
【００９２】
その他の型の抗体を、本発明方法において組み立て、治療に使用することができる。例えば、WO93/03151に開示のように、キメラ抗体を組み立てることができる。免疫グロブリンから誘導され多価且つ多重特異的である結合タンパク質、例えばWO94/13804に記載の「diabodies」もまた調製できる。
【００９３】
本発明に係る抗体は当分野で周知の方法により精製できる。例えば、抗体は、ＤＳＰＰ７様ポリペプチドが結合しているカラムを通過させることにより親和精製できる。次いで、結合した抗体を、高い塩濃度の緩衝液を用いてカラムから溶出することができる。
【００９４】
アンチセンスオリゴヌクレオチド
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、特定のＤＮＡまたはＲＮＡ配列に対し相補的なヌクレオチド配列である。いったん細胞中に導入されるとこの相補的ヌクレオチドは、該細胞が産生した天然配列と結合して複合体を形成し、転写または翻訳のいずれかを遮断する。好ましくはアンチセンスオリゴヌクレオチドは少なくとも１１ヌクレオチド長であるが、少なくとも１２、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、もしくは５０またはそれ以上のヌクレオチド長であってもよい。より長い配列もまた使用できる。アンチセンスオリゴヌクレオチド分子をＤＮＡ組み立て物に提供し、上記のように細胞中に導入して、その細胞におけるＤＳＰＰ７様遺伝子産物のレベルを低下させることができる。
【００９５】
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、またはこの両者の組み合わせであってよい。オリゴヌクレオチドは、１つのヌクレオチドの５'末端を、アルキルホスホネート、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、アルキルホスホノチオエート、アルキルホスホネート、ホスホロアミデート、燐酸エステル、カルバメート、アセトアミデート、カルボキシメチルエステル、カルボネート、および燐酸トリエステルといった非ホスホジエステルヌクレオチド間結合を有する別のヌクレオチドの３'末端と共有結合させることにより、手動で、または自動合成機によって合成できる。Brown, Meth.Mol. Biol. 20,1-8,1994; Sonveaux, Meth.Mol.Biol. 26,1-72,1994; Uhlmann et al., Chem.Rev. 90,543-583,1990を参照されたい。
【００９６】
ＤＳＰＰ７様遺伝子の制御、５'、または調節領域と二本鎖を形成するアンチセンスオリゴヌクレオチドを設計することにより、ＤＳＰＰ７様遺伝子発現の修飾が得られる。転写開始部位、例えば開始部位から−１０および＋１０位の間から誘導されるオリゴヌクレオチドが好ましい。同様に、「三重らせん」塩基対合法を用いて阻害を達成できる。三重らせん対合は、二重らせんがポリメラーゼ、転写因子またはシャペロンの結合に足るほど開く能力の阻害を惹起するため、有用である。三本鎖ＤＮＡを用いる治療上の進歩が文献に記載されている（例えばGee et al., Huber & Carr, MOLECULAR AND IMMUNOLOGIC APPROACHES, Futura Publishing Co., Mt.Kisco, N.Y., 1994）。転写物がリボソームに結合するのを防ぐことによりｍＲＮＡの翻訳を遮断するアンチセンスオリゴヌクレオチドもまた設計できる。
【００９７】
アンチセンスオリゴヌクレオチドとＤＳＰＰ７様ポリヌクレオチドの相補配列との間に好結果の複合体を形成させるためには、正確な相補性は必要ない。例えばＤＳＰＰ７様ポリヌクレオチドに対し正確に相補的である２、３、４、もしくは５またはそれ以上の長さの連続するヌクレオチドであって、その各々が、隣接するＤＳＰＰ７様タンパク質ヌクレオチドとは相補的ではない連続するある長さのヌクレオチドによって隔てられているものを含有するアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＤＳＰＰ７様タンパク質ｍＲＮＡに対する充分な標的化特異性を提供できる。好ましくは、相補的な連続ヌクレオチドの長さはそれぞれ少なくとも４、５、６、７もしくは８またはそれ以上のヌクレオチド長である。非相補的な介在配列は、好ましくは１、２、３、または４ヌクレオチド長である。当業者は、アンチセンス−センスの対の算出融点を容易に使用して、特定のアンチセンスオリゴヌクレオチドと特定のＤＳＰＰ７様ポリヌクレオチド配列間で寛容されるミスマッチの程度を決定できるであろう。
【００９８】
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＤＳＰＰ７様ポリヌクレオチドとハイブリダイズする能力に影響を及ぼすことなく修飾できる。これらの修飾は該アンチセンス分子の内部、または一端もしくは両端である。例えば、ヌクレオシド間の燐酸結合は、アミノ基と末端リボースの間にいろいろな数の炭素残基を有するコレステリルまたはジアミン部分を加えることによって修飾できる。修飾された塩基および／または糖、例えばリボースの代わりのアラビノース、または３'ヒドロキシ基または５'燐酸基が置換されている３',５'−置換オリゴヌクレオチドもまた修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドに使用できる。これらの修飾オリゴヌクレオチドは当分野で周知の方法により調製できる。例えば、Agrawal et al., Trends Biotechnol. 10,152-158,1992; Uhlmann et al., Chem.Rev. 90,543-584,1990; Uhlmann et al., Tetrahedron.Lett. 215,3539-3542,1987を参照されたい。
【００９９】
リボザイム
リボザイムは触媒活性を有するＲＮＡ分子である。例えば、Cech, Science 236,1532-1539; 1987; Cech, Ann.Rev.Biochem. 59,543-568; 1990, Cech, Curr.Opin.Struct.Biol. 2,605-609; 1992, Couture & Stinchcomb, Trends Genet. 12,510-515, 1996を参照されたい。当分野で知られるように、リボザイムは、ＲＮＡ配列を開裂することにより遺伝子機能を阻害するのに使用できる（例えば、Haseloff et al., 米国特許5641673）。リボザイムの作用機構は、相補的標的ＲＮＡに対するリボザイム分子の配列特異的ハイブリダイゼーションと、その後のendonucleolyticな開裂を含む。例には、特異的ヌクレオチド配列のendonucleolyticな開裂を特異的且つ効果的に触媒できる、設計されたハンマーヘッドモチーフリボザイム分子がある。
【０１００】
ＤＳＰＰ７様ポリヌクレオチドのコード配列、例えば配列番号１に示したものの相補物を用いて、ＤＳＰＰ７様ポリヌクレオチドから転写されたｍＲＮＡに特異結合するリボザイムを作製できる。他のトランスのＲＮＡ分子を極めて配列特異的に開裂できるリボザイムを設計し組み立てる方法が開発され、当分野で記載されている（Haseloff et al. Nature 334,585-591,1988）。例えば、リボザイムの開裂活性は、別個の「ハイブリダイゼーション」領域を該リボザイム中に組み入れることによって、特定のＲＮＡを標的とさせることができる。このハイブリダイゼーション領域は標的ＲＮＡに対し相補的な配列を含んでおり、したがってその標的と特異的にハイブリダイズする（例えばGerlach et al., EP321201を参照されたい）。
【０１０１】
ＤＳＰＰ７様タンパク質ＲＮＡ標的内部の特異的リボザイム開裂部位は、この標的分子を、以下の配列：ＧＵＡ、ＧＵＵ、およびＧＵＣを包含するリボザイム開裂部位についてスキャンすることにより同定できる。同定できたならば、該開裂部位を含む標的ＲＮＡの領域に対応する、１５および２０の間のリボヌクレオチドを有する短いＲＮＡ配列を、標的を非機能的にし得る二次構造の特徴について評価できる。さらに、候補のＤＳＰＰ７様タンパク質ＲＮＡ標的の適合性を、リボヌクレアーゼ防護検定を用いて相補的オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションに対する利用可能性を試験することによって評価できる。配列番号１、３に示すヌクレオチド配列およびこれらの相補物は、適当なハイブリダイゼーション領域配列の供給源を提供する。より長い相補配列を用いて、標的に対するハイブリダイゼーション配列の親和性を増大させることができる。リボザイムのハイブリダイズおよび開裂する領域は、相補領域を介して標的ＲＮＡにハイブリダイズする時、リボザイムの触媒領域が標的を開裂し得るといったように、完全に相関している。
【０１０２】
リボザイムはＤＮＡ組み立て物の一部として細胞内に導入できる。マイクロ注入、リポソーム仲介トランスフェクション、電気穿孔、または燐酸カルシウム沈殿といった機械的方法を用いて、ＤＳＰＰ７様タンパク質発現の低下が望まれる細胞中にリボザイム含有ＤＮＡ組み立て物を導入することができる。これとは別に、細胞がＤＮＡ組み立て物を安定的に保持することが望まれる場合は、該組み立て物をプラスミド上で供給し、当分野で知られるように、別個のエレメントとして維持するか、または細胞のゲノム中に組み込むことができる。リボザイムコード化ＤＮＡ組み立て物は、細胞中のリボザイムの転写を調節するために、プロモーターエレメント、エンハンサーまたはＵＡＳエレメント、および転写ターミネーターシグナルといった転写調節エレメントを含み得る。
【０１０３】
Haseloff et al.,米国特許5641673に教示のように、リボザイムは、標的遺伝子の発現を誘導する因子に応答してリボザイムの発現が起こるように設計することができる。リボザイムはまた、追加レベルの調節を提供するよう設計でき、その結果、ｍＲＮＡの破壊はリボザイムと標的遺伝子の両者が細胞に誘導された時にのみ起こる。
【０１０４】
区別的に発現する遺伝子
遺伝子産物がヒトＤＳＰＰ７様タンパク質と相互作用する遺伝子の同定方法をここに記載する。このような遺伝子は、がん、ＣＮＳ障害、喘息、ＣＯＰＤ、肥満症、糖尿病および心疾患を包含する（但しこれらに限定されない）疾患において区別して（区別的に）発現される遺伝子を表し得る。
【０１０５】
さらに、係る遺伝子は、このような疾患の進行または治療に関連する操作に応答して区別的に調節される遺伝子を表し得る。加えて、このような遺伝子は、組織または生物の発生の異なる段階で増大または低下する、一時的に調節される発現を示すことができる。区別的に発現される遺伝子はまた、その発現を、対照対実験条件の下で調節させることができる。さらに、ヒトＤＳＰＰ７様遺伝子または遺伝子産物は、これ自体区別的発現について試験できる。
【０１０６】
発現が正常対疾病状態で相違する程度は、標準的特性決定技術、例えば区別的ディスプレイ技術によって視覚化されるに充分大きいというだけでよい。発現の相違を視覚化することのできる、その他のこのような標準的特性決定技術は、定量的ＲＴ（逆転写酵素）、ＰＣＲ、およびノーザン分析を包含するが、これらに限定されない。
【０１０７】
区別的に発現する遺伝子の同定
区別的に発現される遺伝子を同定するためには、目的とする組織から全ＲＮＡ、または好ましくはｍＲＮＡを単離する。例えば、ＲＮＡ試料は、実験対象の組織から、そして対照となる対象の対応組織から取得する。ｍＲＮＡの単離に対して不利に選択しない任意のＲＮＡ単離技術を、係るＲＮＡ試料の精製に利用できる。例えば、Ausubel et al., ed., CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, Inc. New York, 1987-1993を参照されたい。当業者に周知の技術、例えばChomczynski、米国特許4843155の一段階ＲＮＡ単離プロセスを用いて多数の組織試料を容易に処理することができる。
【０１０８】
区別的に発現される遺伝子が産生したＲＮＡを表す、集められたＲＮＡ試料内部の転写物は、当業者に周知の方法により同定する。これらには、例えば、ディファレンシャルスクリーニング（Tedder et al., Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 85,208-12,1988）、差引きハイブリダイゼーション（Hedrick et al., Nature 308,149-53; Lee et al., Proc Natl.Acad.Sci.U.S.A. 88,2825,1984）、および好ましくはディファレンシャルディスプレイ（Liang & Pardee, Science 257,967-71,1992; 米国特許5262311）が包含される。
【０１０９】
区別的発現の情報はこれ自体、ヒトＤＳＰＰ７様ポリペプチドの関与する疾病の治療のための関連法を示唆している。例えば、治療は、区別的に発現される遺伝子および／またはヒトＤＳＰＰ７様タンパク質をコードしている遺伝子の発現の調節を包含し得る。区別的発現の情報は、区別的に発現される遺伝子もしくは遺伝子産物またはヒトＤＳＰＰ７様ポリペプチド遺伝子もしくは遺伝子産物の活性または発現が、アップレギュレーションであるかダウンレギュレーションであるかを示すことができる。
【０１１０】
スクリーニング方法
本発明は、ＤＳＰＰ７様ポリペプチドまたはＤＳＰＰ７様ポリヌクレオチドに結合する、またはその活性を調節する、試験化合物をスクリーニングするための検定を提供する。試験化合物は好ましくはＤＳＰＰ７様ポリペプチドまたはポリヌクレオチドに結合する。より好ましくは、試験化合物は、ホスファターゼ活性を、試験化合物の不在時と比較して少なくとも約１０、好ましくは約５０、より好ましくは約７５、９０、または１００％低下または増大させる。
【０１１１】
試験化合物
試験化合物は当分野で既知の薬理学的物質であってよく、または薬理活性を持っていることが前もって分かっていない化合物であってよい。この化合物は天然に存在する、または実験室で設計されたものであってよい。これらは、微生物、動物、または植物から単離されたものであってよく、そして組換え的に調製され、または当分野で既知の化学的方法により合成されたものであってよい。所望により試験化合物は、生物学的ライブラリー、空間的アドレス特定可能な並行固相または液相ライブラリー、デコンボルーションを要する合成ライブラリー法、「一ビーズ一化合物」ライブラリー法、および親和クロマトグラフィー選択を用いる合成ライブラリー法を包含する（但しこれらに限定される訳ではない）当分野で既知の数多くの組み合わせライブラリー法のいずれかを用いて取得できる。生物学的ライブラリーアプローチはポリペプチドライブラリーに限定されているが、他の４種のアプローチはポリペプチド、非ペプチドオリゴマー、または化合物の小分子ライブラリーに適用できる。Lam, Anticancer Drug Des. 12,145,1997を参照されたい。
【０１１２】
分子ライブラリーの合成法は当分野でよく知られている（例えば、DeWitt et al., Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 90,6909,1993; Erb et al., Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 91,11422,1994; Zuckermann et al., J.Med.Chem. 37,2678,1994; Cho et al., Science 261,1303,1993; Carell et al., Angew.Chem.Int.Ed.Engl. 33,2059,1994; Carell et al., Angew.Chem.Int.Ed.Engl. 33,2061; Gallop et al., J.Med.Chem. 37,1233,1994を参照されたい）。化合物のライブラリーは溶液で（例えば、Houghten, Biotechniques 13,412-421,1992）、またはビーズ(Lam, Nature 354,82-84,1991)、チップ（Fodor, Nature 364,555-556,1993）、細菌または胞子（Ladner、米国特許5223409）プラスミド（Cull et al., Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 89,1865-1869,1992）、またはファージ（Scott & Smith, Science 249,386-390, 1990; Devlin, Science 249,404-406,1990）;Cwirla et al., Proc.Natl.Acad.Sci.97,6378-6382,1990; Felici, J.Mol.Biol. 222,301-310,1991; およびLadner、米国特許5223409）上に提供できる。
【０１１３】
ハイスループットスクリーニング
試験化合物は、高（ハイ）スループットスクリーニングを用いて、ＤＳＰＰ７様ポリペプチドまたはポリヌクレオチドに結合する能力、またはＤＳＰＰ７様タンパク質活性もしくはＤＳＰＰ７様遺伝子発現に影響を及ぼす能力についてスクリーニングできる。ハイスループットスクリーニングを使用して、多くの個別的化合物を並行して試験でき、その結果多数の試験化合物を迅速にスクリーニングできる。最も広範に確立されている技術は９６ウェル微量定量プレートを利用するものである。この微量定量プレートのウェルは、典型的には５０ないし５００μlの範囲の検定容量を必要とする。このプレートに加えて、９６ウェルフォーマットに適合させた多くの機器、材料、ピペット、ロボット、プレート洗浄機、およびプレート読み取り機が市販されている。
【０１１４】
別法として、「自由フォーマット検定」、または試料間に物理的障壁を持たない検定が使用できる。例えば、組み合わせペプチドライブラリーのための、単純な均質検定で色素細胞（メラノサイト）を用いる検定が、Jayawickreme et al., Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 19,1614-18(1994)に記載されている。ペトリ皿中のアガロースの下にこの細胞を入れ、次いで組み合わせ化合物を伴っているビーズをアガロースの表面に載せる。組み合わせ化合物はこのビーズから化合物を部分的に放出する。化合物がゲルマトリックス中へと局所的に拡散するにつれて活性化合物が細胞の色の変化を惹起するため、活性化合物を暗色色素領域として視覚化することができる。
【０１１５】
自由フォーマット検定のもう一つの例は、生体分子スクリーニング学会第１回年次総会（Philadelphia,Pa.、1995年11月7-10日）で報告されたChelsky、「組み合わせライブラリーのスクリーニングのための戦略：新規な、そして伝統的なアプローチ」により記載されている。Chelskyは、カルボニックアンヒドラーゼのための単純な均質酵素検定をアガロースゲルの内部に入れ、その結果ゲル中の酵素がゲル全体に色の変化を惹起するようにさせた。その後、光リンカーを介して組み合わせ化合物を持つビーズをゲル内部に入れ、すると該化合物はＵＶ光により部分的に放出された。酵素を阻害する化合物は、色の変化がより少ない局所阻害領域として観察された。
【０１１６】
さらに別の例がSalmon et al., Molecular Diversity 2,57-63(1996)に記載されている。この例では、組み合わせライブラリーを、寒天中で生育する癌細胞への細胞毒性効果を有する化合物についてスクリーニングした。
【０１１７】
もう一つのハイスループットスクリーニング法がBeutel et al.、米国特許5976813に記載されている。この方法では、被験試料を多孔性マトリックスに入れる。次に１またはそれ以上の検定成分を、マトリックス、例えばゲル、プラスチックシート、フィルター、またはその他の形の容易に操作できる固体担体の内部、上、または底に入れる。試料がこの多孔性マトリックスに導入されるとこれらは充分ゆっくりと拡散し、その結果、被験試料が混ざらずに検定が遂行できる。
【０１１８】
結合検定
結合検定については、試験化合物は好ましくは、例えばＤＳＰＰ７様ポリペプチドの活性部位に結合してこれを占有し、それにより基質がリガンド結合部位に接近できなくさせ、その結果正常な生物活性が妨げられるような小分子またはペプチド様分子である。このような小分子の例は小ペプチドまたはペプチド様分子を包含するが、これらに限定される訳ではない。
【０１１９】
結合検定では、試験化合物またはＤＳＰＰ７様ポリペプチドのいずれかが検出可能な標識、例えば蛍光、放射性同位元素、化学ルミネセント、または酵素標識（例えば西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、またはルシフェラーゼ）を含むことができる。そこで、ＤＳＰＰ７様ポリペプチドに結合している試験化合物の検出は、例えば放射能の放出を直接計数することにより、またはシンチレーション計数により、または検出可能産物への適当な基質の変換を測定することにより、達成できる。
【０１２０】
別法として、ＤＳＰＰ７様ポリペプチドへの試験化合物の結合を、反応体のいずれをも標識せずに測定することができる。例えば、マイクロフィジオメーターを用いて、試験化合物とＤＳＰＰ７様ポリペプチドとの結合を検出できる。マイクロフィジオメーター（例えばサイトセンサー）とは、細胞がその環境を酸性化する速度を光アドレッサブル電位差センサー（ＬＡＰＳ）を用いて測定する分析機器である。この酸性化速度の変化は、試験化合物とＤＳＰＰ７様ポリペプチドの相互作用の指標として使用できる（McConnell et al., Science 257,1906-1912,1992）。
【０１２１】
試験化合物がＤＳＰＰ７様ポリペプチドに結合する能力の測定はまた、実時間Bimolecular Interaction Analysis（ＢＩＡ）のような技術を用いて達成できる（Sjolander & Urbaniczky, Anal.Chem. 63,2338-2345,1991、およびSzabo et al., Curr.Opin.Struct.Biol. 5,699-705,1995）。ＢＩＡは、いかなる反応体をも標識せずに、生体特異的相互作用を実時間で研究するための技術である（例えばBIAcore(登録商標)）。光学的現象表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）の変化を、生体分子間の実時間反応の指標に使用できる。
【０１２２】
本発明のさらに別の態様では、ＤＳＰＰ７様ポリペプチドを二ハイブリッド検定または三ハイブリッド検定（例えば、米国特許5283317; Zervos et al., Cell 72,223-232,1993; Madura et al., J.Biol.Chem. 268,12046-12054,1993; Bartel et al., Biotechniques 14,920-924,1993; Iwabuchi et al., Oncogene 8,1693-1696,1993; およびBrent WO94/10300）における「おとりタンパク質」として使用し、ＤＳＰＰ７様ポリペプチドに結合またはこれと相互作用してその活性を調節する他のタンパク質を同定することができる。
【０１２３】
二ハイブリッド系は殆どの転写因子のモジュール的性格に基づくものであり、それは、分離可能なＤＮＡ結合および活性化ドメインから成っている。簡潔に述べると、この検定は二種の異なるＤＮＡ組み立て物を利用する。例えば、一方の組み立て物においては、ＤＳＰＰ７様ポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドが、既知の転写因子のＤＮＡ結合ドメインをコードしているポリヌクレオチドに融合できる（例えばＧＡＬ−４）。別の組み立て物においては、未同定タンパク質（「餌」または「試料」）をコードしているＤＮＡ配列が、既知の転写因子の活性化ドメインをコードしているポリヌクレオチドに融合できる。もし「おとり」および「餌」タンパク質がインビボで相互作用してタンパク質依存複合体を形成できたならば、該転写因子のＤＮＡ結合および活性化ドメインは極めて近位に招来される。この近位性が、転写因子に応答する転写調節部位と機能的に結合しているリポーター遺伝子（例えばＬａｃＺ）の転写を可能にする。リポーター遺伝子の発現が検出でき、機能的転写因子を含む細胞コロニーを単離し、ＤＳＰＰ７様ポリペプチドと相互作用するタンパク質をコードしているＤＮＡ配列取得に使用することができる。
【０１２４】
反応体の一方または両方の非結合型からの結合型の分離を促進するため、そして検定の自動化の便宜を図るため、ＤＳＰＰ７様ポリペプチド（またはポリヌクレオチド）または試験化合物のいずれかを固定化することが望ましいかも知れない。したがって、この酵素ポリペプチド（またはポリヌクレオチド）または試験化合物のいずれかを固体支持体に結合させることができる。好適な固体支持体は、ガラスまたはプラスチックスライド、組織培養プレート、微量定量ウェル、管、シリコンチップ、またはビーズ（ラテックス、ポリスチレン、またはガラスビーズを包含するがこれらに限定されない）のような粒子を包含するがこれらに限定されない。共有および非共有結合、受動吸収、またはそれぞれポリペプチド（またはポリヌクレオチド）または試験化合物に付着させた結合部分と固体支持体の対、の使用を包含する、当分野で既知の任意の方法を用いて酵素ポリペプチド（またはポリヌクレオチド）または試験化合物を固体支持体に付着させることができる。試験化合物は好ましくは整列して固体支持体に結合させ、その結果個々の試験化合物の位置を追跡することができる。ＤＳＰＰ７様ポリペプチド（またはポリヌクレオチド）への試験化合物の結合は、反応体を入れるのに適した任意の容器で達成できる。係る容器の例には微量定量プレート、試験管、および微量遠沈管がある。
【０１２５】
一つの態様において、ＤＳＰＰ７様ポリペプチドは、ＤＳＰＰ７様ポリペプチドを固体支持体に結合させるドメインを含む融合タンパク質である。例えば、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ融合タンパク質をグルタチオンセファロースビーズ（Sigma Chemical, St.Louis, Mo.）上またはグルタチオン誘導体化微量定量プレート上に吸着させ、次いでこれを試験化合物または試験化合物および非吸着ＤＳＰＰ７様ポリペプチドに合し；次にこの混合物を複合体形成が行われる条件下でインキュベートする（例えば、塩およびpHに関して生理的条件）。インキュベーションの後、ビーズまたは微量定量プレートのウェルを洗浄して未結合成分を除去する。反応体の結合は上記のように直接的または間接的に測定できる。別法として、複合体を固体支持体から解離させた後に結合を測定することもできる。
【０１２６】
本発明に係るスクリーニング検定には、タンパク質またはポリヌクレオチドを固体支持体上に固定化するためのその他の技術を使用することもできる。例えば、ＤＳＰＰ７様ポリペプチド（またはポリヌクレオチド）または試験化合物のいずれかを、ビオチンとストレプトアビジンのコンジュゲーションを利用して固定化できる。当分野で周知の技術（例えばビオチニル化キット、Pierce Chemicals, Rockford,Ill.）を用いて、ビオチニル化したＤＳＰＰ７様ポリペプチド（またはポリヌクレオチド）または試験化合物をビオチン−ＮＨＳ（Ｎ-ヒドロキシスクシンイミド）から調製し、ストレプトアビジン被覆した９６ウェルプレート（Pierce Chemical）のウェルに固定化できる。別法として、ＤＳＰＰ７様ポリペプチド、ポリヌクレオチド、または試験化合物に特異的に結合するが、所望の結合部位、例えばＤＳＰＰ７様ポリペプチドの活性部位に干渉しない抗体をプレートのウェルに誘導体化することができる。未結合の標的またはタンパク質が抗体コンジュゲーションによりウェル中に捕捉できる。
【０１２７】
ＧＳＴ−固定化複合体について上に記載した方法に加え、このような複合体を検出する方法には、ＤＳＰＰ７様ポリペプチドまたは試験化合物に特異結合する抗体を用いる、複合体の免疫検出、ＤＳＰＰ７様ポリペプチドの活性検出へと引き継がれる酵素結合検定、および非還元条件下でのＳＤＳゲル電気泳動がある。
【０１２８】
ＤＳＰＰ７様ポリペプチドまたはポリヌクレオチドに結合する試験化合物を求めるスクリーニングは、無傷の細胞で実施することもできる。ＤＳＰＰ７様ポリペプチドまたはポリヌクレオチドを含む任意の細胞が、細胞に基づく検定系で使用できる。ＤＳＰＰ７様ポリヌクレオチドは細胞中に天然に存在し、または上記のような技術を用いて導入できる。ＤＳＰＰ７様ポリペプチドまたはポリヌクレオチドに対する試験化合物の結合は、上記のように測定する。
【０１２９】
機能検定
ヒトＤＳＰＰ７様ポリペプチドのホスファターゼ活性を増大または低下させる能力について試験化合物を試験できる。ホスファターゼ活性は、例えばDowd et al., J. Cell Sci. 1998 Nov;111 (Pt22):3389-99に記載されているように測定することができる。
【０１３０】
酵素検定は、精製したＤＳＰＰ７様ポリペプチド、細胞膜調製物、または無傷の細胞を試験化合物と接触させた後に実施できる。ＤＳＰＰ７様のホスファターゼ活性を少なくとも約１０、好ましくは約５０、より好ましくは約７５、９０、または１００％低下させる試験化合物を、ＤＳＰＰ７様タンパク質活性を減少させる可能性ある治療物質として同定する。ヒトＤＳＰＰ７様ポリペプチドのホスファターゼ活性を少なくとも約１０、好ましくは約５０、より好ましくは約７５、９０、または１００％増大させる試験化合物を、ヒトＤＳＰＰ７様タンパク質活性を増大させる可能性ある治療物質として同定する。
【０１３１】
遺伝子発現
別の態様では、ＤＳＰＰ７様遺伝子発現を増大または減少させる試験化合物を同定する。ＤＳＰＰ７様ポリヌクレオチドを試験化合物と接触させ、ＤＳＰＰ７様ポリヌクレオチドのＲＮＡまたはポリペプチド産物の発現を測定する。試験化合物存在下での適当なｍＲＮＡまたはポリペプチドの発現レベルを、該試験化合物不在下でのｍＲＮＡまたはポリペプチドの発現レベルと比較する。すると試験化合物が、この比較に基づく発現のモジュレーターとして同定できる。例えば、ｍＲＮＡまたはポリペプチドの発現が、試験化合物の不在時よりも存在時により大きい場合は、この試験化合物を、該ｍＲＮＡまたはポリペプチド発現の刺激物質または増強物質と同定する。そうではなく、ｍＲＮＡまたはポリペプチドの発現が、試験化合物の不在時よりも存在時により小さい場合は、この試験化合物を、該ｍＲＮＡまたはポリペプチド発現のインヒビターと同定する。
【０１３２】
細胞におけるＤＳＰＰ７様ｍＲＮＡまたはポリペプチド発現のレベルは、ｍＲＮＡまたはポリペプチドを検出するための当分野で周知の方法により決定できる。定性または定量的方法のいずれかが使用できる。ＤＳＰＰ７様ポリヌクレオチドのポリペプチド産物の存在は、例えばラジオイムノアッセイのような免疫化学的方法、ウエスタンブロッティング、および免疫組織化学を包含する、当分野で周知の様々な技術を用いて決定できる。別法として、ポリペプチド合成は、ＤＳＰＰ７様ポリペプチド内への標識アミノ酸の取り込みを検出することにより、インビボで、細胞培養で、またはインビトロ翻訳系で決定できる。
【０１３３】
このようなスクリーニングは、無細胞検定系または無傷の細胞のいずれかで実施できる。ＤＳＰＰ７様ポリヌクレオチドを発現するいかなる細胞も細胞に基づく検定系で使用できる。ＤＳＰＰ７様ポリヌクレオチドは細胞内に天然に存在するか、または上記のような技術を用いて導入することができる。一次培養または確立されたセルライン、例えばＣＨＯまたはヒト胚性腎２９３細胞のいずれかを使用できる。
【０１３４】
医薬組成物
本発明はさらに、治療効果を達成するために患者に投与できる医薬組成物を提供する。本発明に係る医薬組成物は、例えばＤＳＰＰ７様ポリペプチド、ＤＳＰＰ７様ポリヌクレオチド、リボザイム、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ＤＳＰＰ７様ポリペプチドに特異的に結合する抗体、またはＤＳＰＰ７様ポリペプチド活性の類似体、アクチベーターまたはインヒビターを含み得る。この組成物は単独で、または少なくとも１種類の他の物質、例えば安定化化合物と組み合わせて投与でき、これは、食塩水、緩衝化食塩水、デキストロース、および水を包含する（但しこれらに限定されない）任意の無菌で生物学的適合性のある製薬的担体中で投与できる。この組成物は単独で、または他の物質、薬物またはホルモンと組み合わせて患者に投与できる。
【０１３５】
活性成分に加えてこれらの医薬組成物は、賦形剤および補助物質を含む適当な製薬的に許容し得る担体を含有でき、これらは、製薬的に使用できる調製物への活性化合物の処理を促進する。本発明に係る医薬組成物は、経口、静脈内、筋肉内、動脈内、髄内、髄腔内、心室内、経皮、皮下、腹腔内、鼻腔内、非経口、局所、舌下、または直腸手段を包含する（但しこれらに限定されない）多くの経路により投与できる。経口投与用医薬組成物は、当分野で既知の製薬的に許容し得る担体を用いて経口投与に適した用量に調合できる。このような担体により、該医薬組成物を、患者が内服するための錠剤、丸剤、糖衣剤、カプセル剤、液体、ゲル、シロップ剤、スラリー剤、懸濁剤などに調合できる。
【０１３６】
経口使用のための医薬製剤は、活性化合物を、固体賦形剤と合し、得られた混合物を所望により粉砕し、そしてこの顆粒混合物を、所望ならば適当な補助物質を加えた後に処理して錠剤または糖衣剤核を得る。好適な賦形剤は炭水化物またはタンパク質増量剤、例えば乳糖、シュクロース、マンニトール、またはソルビトールを包含する糖；トウモロコシ、小麦、米、馬鈴薯、またはその他の植物由来の澱粉；セルロース、例えばメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、またはカルボキシメチルセルロースナトリウム；アラビアゴムおよびトラガカントゴムを包含するゴム；ならびにゼラチンおよびコラーゲンのようなタンパク質である。所望により崩壊剤または可溶化剤、例えば架橋ポリビニルピロリドン、寒天、アルギン酸、またはその塩、例えばアルギン酸ナトリウムを添加できる。
【０１３７】
糖衣剤核は、濃縮糖溶液のような適当な被覆剤と共に使用でき、これはさらに、アラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、carbopolゲル、ポリエチレングリコール、および／または二酸化チタン、ラッカー溶液、および適当な有機溶媒または溶媒混合物を含むことができる。製品の同定のためまたは活性化合物の量、即ち用量をあらわすために染料または色素を錠剤または糖衣被覆剤に添加できる。
【０１３８】
経口的に使用できる医薬調合物は、ゼラチン製の押してはめ込むカプセル剤、ならびに、ゼラチンおよび被覆剤、例えばグリセロールまたはソルビトールでできた軟封入カプセル剤を包含する。押してはめ込むカプセル剤は、活性成分を、乳糖または澱粉のような増量剤または結合剤、タルクまたはステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、および所望により安定剤と混合して含有できる。軟カプセル剤では、活性化合物を、安定剤を加えたまたは加えない適当な液体、例えば脂肪油、液体、または液体ポリエチレングリコールに溶解または懸濁できる。
【０１３９】
非経口投与に好適な医薬製剤は、水溶液、好ましくは生理学的適合性の緩衝液、例えばハンクス溶液、リンゲル溶液、または生理学的に緩衝化した食塩水中で調合できる。水性注射用懸濁剤は、該懸濁液の粘度を増加させる物質、例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、またはデキストランを含有できる。さらに、活性化合物の懸濁剤は適当な油性注射用懸濁剤として調製できる。好適な親油性溶媒または媒質は、胡麻油のような脂肪油、またはオレイン酸エチルまたはトリグリセリドのような合成脂肪酸エステル、またはリポソームを包含する。非脂質ポリカチオンアミノポリマーもまたデリバリーに使用できる。所望により懸濁剤は、化合物の溶解性を増し高濃縮溶液の調製を可能にするような適当な安定剤または物質を含むことができる。局所または鼻腔投与のためには、透過すべき特定の障壁に対し適当な浸透剤を製剤に使用する。このような浸透剤は当分野で一般に知られている。
【０１４０】
本発明に係る医薬組成物は当分野で既知の方法で、例えば常套的混合、溶解、顆粒化、糖衣剤製造、すりつぶし、乳化、カプセル化、捕捉、または凍結乾燥プロセスによって製造できる。この医薬組成物は塩として提供でき、塩酸、硫酸、酢酸、乳酸、クエン酸、リンゴ酸、琥珀酸などを包含する（但しこれらに限定されない）多くの酸を用いて調製できる。塩は、水性または他のプロトン性溶媒において、対応する遊離塩基型よりもより可溶性の傾向がある。別の場合には、好ましい調製物は、pH範囲４.５ないし５.５において以下のもの：１−５０mMヒスチジン、０.１％−２％シュクロース、および２−７％マンニトール、の全てまたは任意のものを含有できる凍結乾燥粉末であってよく、これを使用前に緩衝液と合する。
【０１４１】
調合と投与のための技術のさらなる詳細は、REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES（Maack Publishing Co., Easton, Pa）の最新版に見出すことができる。医薬組成物を製造した後、これらを適当な容器に入れ、適応状態の治療のためにラベルを貼る。このようなラベル表示は、投与の量、頻度、および投与方法を包含する。
【０１４２】
治療上の適応および方法
ヒトＤＳＰＰ７様タンパク質は、癌、ＣＮＳ障害、喘息、ＣＯＰＤ、肥満症、糖尿病および心疾患を処置するために調節することができる。
【０１４３】
癌
癌は、基本的に発癌性細胞形質転換によって発症する疾患である。形質転換細胞をそれらの正常な対応物から区別し、かつ癌の病態生理に基づく形質転換細胞の特徴は幾つかある。それらには、非制御型細胞性増殖、通常の死誘導シグナルに対する不応答（不死化）、増大した細胞運動性及び侵襲性、新たな血管新生の誘導を通じた血液供給を補充するための増大した能力（血管新生）、遺伝子の不安定性、並びに調節不全遺伝子発現が挙げられる。薬剤耐性の獲得とともに、これらの異常な生理機能の種々の組み合わせににより、最終的に臓器不全および患者の死となる難治性疾患状態に頻繁に陥る。
【０１４４】
最も一般的な癌治療は、細胞増殖を標的とし、形質転換細胞と正常細胞との間の効率に関するその特異な増殖能に基づいている。このアプローチは、幾つかの重要な正常細胞タイプもまた高増殖であり、かつ癌細胞が高頻度にこれらの物質に対して耐性となるという現実により妨げられている。従って、従来の抗癌治療についての治療指数は珍しく２.０を超えている。
【０１４５】
ゲノミクス主導の分子標的同定は、癌患者に安全で、かつより効率的な処置を提供できる治療介入のための新たな癌特異的標的を同定する可能性を開いた。従って、新たに発見される腫瘍関連遺伝子及びその産物を疾患におけるそれらの機能（群）について試験でき、そして革新的な治療を発見し、かつ発展させるためのツールとして用いることができる。以上に概説した生理学的プロセスの多くに重要な働きがある遺伝子は、癌標的として特徴付けることができる。
【０１４６】
ゲノミクスを通じて同定される遺伝子又は遺伝子断片は容易に１つ又はそれ以上の非相同（ヘテローガス）発現系において発現させ、機能性組換えタンパク質を産生さ細胞ことができる。このタンパク質は、その生物学的機能についてインビトロで特徴付けられ、その後その生化学活性の化学修飾因子（モジュレーター）を同定するため、ハイスループット分子スクリーニングプログラムにおけるツールとして用いられる。標的タンパク質活性のアゴニスト及び／又はアンタゴニストをこの様式で同定し、次いで、細胞およびインビボ疾患モデルにて抗癌活性について試験する。生物学的モデルにおける反復試験や、詳細な薬物動態力学的分析及び中毒学的分析を用いたリード化合物の最適化により、薬物開発及び次のヒトでの試験についての基礎を形成する。
【０１４７】
ＣＮＳ障害
中枢および末梢神経系障害、例えば、脳損傷、気分の障害、不安障害、思考および意思の障害、睡眠および覚醒の障害、運動単位の疾患、例えば、神経性および筋障害性の障害、神経変性疾患、例えばアルツハイマー病およびパーキンソン病および末梢および慢性的な疼痛もまた処置することができる。
【０１４８】
ＣＮＳ障害に関連する疼痛もまた、ヒトＤＳＰＰ７様タンパク質の活性を調節することによって処置できる。処置できる疼痛には、中枢神経系障害と関連するもの、例えば多発性硬化症、脊髄損傷、坐骨神経痛、失敗した腰部手術(failed back surgery)症候群、外傷性脳損傷、癲癇、パーキンソン病、脳卒中後、及び脳や脊髄における血管破壊（例えば、梗塞、出血、血管新生異常）が挙げられる。非中枢神経因性疼痛には、乳房切除術後疼痛、反射性交感神経性ジストロフィー（ＲＤＳ）、三叉神経痛ラジオキュロパシー(trigeminal neuralgiaradio−culopathy)、術後の疼痛、ＨＩＶ／ＡＩＤＳ関連疼痛、癌疼痛、代謝神経痛（例えば、糖尿病性神経障害、結合組織疾患に対する第２の血管炎神経障害）、例えば肺癌種、白血病、リンパ腫、前立腺、大腸若しくは胃癌種、三叉神経痛及び疱疹後神経痛と関連する腫瘍随伴性多発神経障害が挙げられる。癌及び癌処置と関連する疼痛もまた処置でき、頭痛（例えば前兆を伴う片頭痛、前兆を伴わない片頭痛、および他の片頭痛障害）、偶発性及び慢性緊張性頭痛、緊張型様頭痛、群発性頭痛や慢性発作性片頭痛も処置できる。
【０１４９】
アレルギーおよび喘息
アレルギーは環境抗原が臨床的に有害な反応を誘発する複雑なプロセスである。アレルゲンと呼ばれる誘発抗原は、通例、特異的IgE応答を引き起こす。ほとんどの場合、アレルゲンそのものには固有の毒性はほとんどまたは全くないが、ＩｇＥ応答が結果としてＩｇＥ依存性またはＴ細胞依存性の過敏反応を引き起こすと、病的異常が誘発される。過敏反応は局所的である場合も全身的である場合もあり、以前アレルゲンに感作したことのある個体がアレルゲンに曝露すると数分以内に起こる。マスト細胞、好塩基球または好酸球などのエフェクター細胞の表面にある特異的受容体に結合したＩｇＥ抗体によってアレルゲンが認識され、それがエフェクター細胞の活性化ならびに過敏反応の急性の徴候および症状をもたらす媒介物質の放出を引き起こすと、アレルギーの過敏反応が発生する。アレルギー疾患には、喘息、アレルギー性鼻炎（枯草熱）、アトピー性皮膚炎、およびアナフィラキシーが包含される。
【０１５０】
喘息は、複数の遺伝的要因と環境要因との相互作用の結果として生じると考えられ、3つの主特徴、すなわち１）気管支収縮、粘液産生量の増加、および気道の狭窄につながる気道壁の肥厚によって起こる間欠的で可逆的な気道閉塞、２）気道径制御の低下によって起こる気道反応性亢進、ならびに３）気道炎症を特徴とする。喘息の炎症反応にはいくつかの細胞が重要であるが、それらには、Ｔ細胞および抗原提示細胞、IgEを産生するB細胞、およびマスト細胞、好塩基球、好酸球、およびＩｇＥを結合する他の細胞が含まれる。これらのエフェクター細胞は、気道のアレルギー反応部位に蓄積して毒性産物を放出し、それが急性病状の一因となり、最終的にはこの障害に関連する組織破壊の一因となる。喘息を持つ個体では他の常在細胞、例えば平滑筋細胞、肺上皮細胞、粘液産生細胞、および神経細胞なども異常である可能性があり、それらも病状の一因となりうる。臨床的には間欠的な喘鳴および息切れとして現れる喘息の気道閉塞は、一般に、迅速な処置を要する最も切迫したこの疾患の症状であり、この疾患に付随する炎症および組織破壊が不可逆的な変化をもたらして、ついには、喘息を長期管理が必要な慢性障害にしてしまう場合もある。
【０１５１】
喘息の病態生理に関する我々の理解には最近大きな進歩があったにもかかわらず、この疾患の有病率と重症度は増加しつつあるようである（GergenおよびWeiss, Am. Rev. Respir. Dis. 146,823-24,1992）。人口の30〜40％はアトピー性アレルギーを患っており、小児人口の15％および成人人口の5％は喘息を患っていると推定されている（Gergen and Weiss,1992）。したがって我々の保健医療財源には非常に大きい負担がかかっている。しかし喘息は診断も処置も困難である。肺組織炎症の重症度は測定するのが容易でなく、この疾患の症状は呼吸器感染症、慢性呼吸器炎症性障害、アレルギー性鼻炎、または他の呼吸器障害の症状と区別できないことも多い。誘発アレルゲンを決定できないために、原因環境物質の除去が困難である場合も多い。現在の薬物処置にはそれぞれに欠点がある。よく使用されるβアゴニストなどの治療薬は、症状緩和剤として作用して肺機能を一過性に改善することはできるが、根底にある炎症には影響を及ぼさない。根底にある炎症を減少させることができる抗炎症性ステロイドなどの物質は、免疫抑制から骨量減少までに及ぶ重大な欠点を持ちうる（Goodman and Gilman's THE PHARMACOLOGIC BASIS OF THERAPEUTICS, Seventh Edition, MacMillan Publishing Company, NY, USA, 1985）。また、吸入コルチコステロイドなどの現行治療法の多くは持効性に乏しく、不便であり、定期的に（時には一生）使用しなければならないことも多いため、患者がその処置を遵守しないことが大きな問題となり、それが処置としての有効性を減じている。
【０１５２】
従来の治療法には種々の問題があるため代替処置法の評価が行なわれている。グリコホリンＡ（Chu and Sharom, Cell.Immunol. 145,223-39,1992）、シクロスポリン（Alexanderら、Lancet 339,324-28,1992）およびＩＬ−２のノナペプチド断片（Zav'yalovら、Immunol.Lett. 31,285-88,1992）はいずれもインターロイキン２依存性Ｔリンパ球増殖を阻害するが、これらは他にも多くの効果を持つことが知られている。例えばシクロスポリンは免疫抑制剤として臓器移植後に使用される。これらの物質は喘息患者の処置においてステロイドの代替物となりうるが、これらはインターロイキン２依存性Ｔリンパ球増殖を阻害し、ホメオスタシスに関係する重要な免疫機能を抑制する可能性がある。最近、気管支収縮の媒介物質の放出または活性を遮断する他の処置、例えばクロモン類または抗ロイコトリエン類などが、軽度喘息の処置に導入されたが、これらは高価であり、全ての患者に有効なわけではなく、これらが喘息性炎症に伴う慢性的変化に効果があるかどうかははっきりしない。当技術分野で必要とされているのは、喘息の発症に不可欠な経路で作用することができ、この障害の挿間的発作を遮断すると共に、患者の免疫機能を損なわずに、異常に亢進したアレルギー免疫応答を優先的に抑制する処置を同定することである。
【０１５３】
ＣＯＰＤ
慢性閉塞性肺（または気道）疾患（ＣＯＰＤ）は、生理学的には、一般に慢性気管支炎による肺気腫と末梢気道閉塞とが混合した状態に起因する気流閉塞であると定義される（Senior & Shapiro, Pulmonary Diseases and Disorders, 3d ed., New York, McGraw-Hill, 1998, pp. 659- 681,1998; Barnes, Chest 117, 10S-14S, 2000）。肺気腫は、肺の気腔の異常な拡大をもたらす肺胞壁の破壊を特徴とする。慢性気管支炎は、臨床的には、２年連続して毎年３ヶ月にわたって慢性的湿性咳があることと定義される。ＣＯＰＤでは、気流閉塞は通常、進行性であり、部分的にしか可逆ではない。ＣＯＰＤの発症に関して明らかに一番重要な危険因子は喫煙であるが、この疾患は非喫煙者でも起こる。
【０１５４】
気道の慢性炎症はＣＯＰＤの重要な病理学的特徴である（Senior & Shapiro,1998）。炎症細胞集団には、数の増加したマクロファージ、好中球およびＣＤ８+リンパ球が含まれる。タバコの煙などの刺激物を吸入すると、呼吸路に常在するマクロファージおよび上皮細胞が活性化されて、ケモカイン（例えばインターロイキン８）および他の走化性因子の放出が起こる。これらの走化性因子は血液から肺組織および気道への好中球/単球輸送量を増加させる働きをする。気道に動員された好中球と単球は、潜在的に有害な種々の媒介物質、例えばタンパク質分解酵素および反応性酸素種などを放出することができる。マトリックス分解および肺気腫は、気道壁の肥厚、サーファクタント機能不全および粘液分泌過多と共に、いずれも、気流およびガス交換の障害につながるこの炎症応答の続発症となる可能性がある。
【０１５５】
肥満症
肥満症および過体重は、除脂肪体重と比較した体脂肪の過剰として規定される。カロリー摂取の増加またはエネルギー支出の減少、あるいはその両方が、脂肪として貯えられる余剰エネルギーを導く不均衡を生じさせ得る。肥満症は、重大な医療上の罹患率および死亡率の増加と関連している。肥満症の病因は十分に理解されておらず、遺伝的要因、環境要因またはその２つの組み合わせのために、正方向のエネルギーバランスが引き起され得る。対照的に、食欲不振症および悪液質は、エネルギー支出に対するエネルギー取り込みの不均衡によって特徴付けられ、負方向のエネルギーバランスを引き起こし、体重が減少する。エネルギー支出を増大させるか、および／またはエネルギー取り込み、吸収若しくは貯蔵を減少させる物質は、肥満症、過体重、および関連する同時羅患率を処置するのに有用であろう。エネルギー取り込みを増大させる、および／またはエネルギー支出を減少させる、あるいは痩せた組織(lean tissue)の量を増大させる物質は、悪液質、食欲不振症および萎縮病を処置するのに有用であろう。
【０１５６】
糖尿病は、血中グルコースの異常な上昇、脂質の変化および心血管系、眼、腎臓および神経系の異常（合併症）を特徴とする一般的な代謝障害である。糖尿病は２つの独立した疾患、すなわち、インスリンを産生し分泌する細胞の喪失に起因する１型糖尿病（若年発症型）と、インスリン分泌の欠陥およびインスリン作用の欠陥によって起こる２型糖尿病（成人発症型）とに分類される。
【０１５７】
１型糖尿病は、膵島のインスリン分泌細胞（β細胞）を攻撃する自己免疫反応によって惹起される。この反応が起こるのを防ぐ物質、またはβ細胞の破壊が完了してしまう前にこの反応を停止させる物質は、この疾患の治療法になる可能性がある。β細胞の増殖および再生を誘導する他の物質も治療法になる可能性がある。
【０１５８】
ＩＩ型糖尿病は２つの糖尿病状態のうち最も一般的である（人口の６％）。インスリン分泌の欠陥は糖尿病状態の重要な原因であり、これはβ細胞が、血中グルコースレベルの上昇を適切に検出し、その上昇に、インシュリンの放出によって応答することができないために起こる。グルコースに対するβ細胞の応答を増大させる治療法は、この疾患の重要な新しい処置方法になるだろう。
【０１５９】
ＩＩ型糖尿病患者におけるインスリン作用の欠陥は、治療的介入のもう一つの標的である。筋肉、肝臓および脂肪におけるインスリン受容体の活性を増加させる物質は、血中グルコースの低下と、血漿脂質の正常化とをもたらすだろう。受容体活性は、受容体を直接刺激する物質によって、または受容体からの細胞内シグナルを増加させる物質によって、増加させることができる。他の治療法では、細胞側のプロセス、すなわちグルコース輸送または種々の酵素系を直接活性化してインスリン様の効果を生じ、よって有益な結果を得ることができる。過体重者はII型糖尿病にかかりやすいので、体重を減少させる物質はいずれも考え得る治療法である。
【０１６０】
Ｉ型およびＩＩ型糖尿病はどちらも、インスリン作用を模倣する物質、または血中グルコースレベルを低下させることによって糖尿病合併症を処置する物質で、処置することができる。また、新しい血管の成長を減少させる物質は、両疾患で発症する眼合併症の処置に使用することができる。
【０１６１】
心疾患
心疾患には心臓及び血管系における疾患：うっ血性心不全、心筋梗塞、心臓の虚血疾患、全種類の心房性不整脈及び心室性不整脈、高血性血管疾患及び末梢血管疾患が含まれる。
【０１６２】
心不全は、心機能の異常が新陳代謝組織の要求に見合った割合で血液をポンプする心臓の機能不全が原因の病理学的状態として規定される。これには、ポンプ不全の全ての形態、例えば高拍出及び低拍出、急性及び慢性、右心系又は左心系、収縮期又は拡張期、根本原因とは無関係なものが含まれる。
【０１６３】
心筋梗塞（ＭＩ）は、動脈硬化症により狭くなった冠動脈の血栓性閉塞に続いて、一般的に冠血流量の急激な低下により発症する。ＭＩ予防法（１次予防及び二次予防）が含まれ、ＭＩの急性期処置及び合併症の予防が含まれる。
【０１６４】
虚血疾患は、冠流量が制限され、灌流が心筋の酸素要求量を補うには不十分となる状態を表す。この疾患群には、安定狭心症、不安定狭心症及び無症候性虚血が含まれる。
【０１６５】
不整脈には、心房性及び心室性頻脈性不整脈（心房頻脈、心房粗動、心房細動、心房−心室興奮回帰性(リエントラント)頻脈、早期興奮症候群、心室頻脈、心室粗動、心室細動）の全形態、並びに除脈性不整脈形態が含まれる。
【０１６６】
血管疾患は、原発性および全ての種の二次性動脈性高血圧症（腎性、内分泌性、神経性、その他）を包含する。ここに開示する遺伝子およびその産物は、高血圧症の治療および全合併症の防止のための薬物標的として使用できる。末梢血管疾患とは、動脈および／または静脈血流が減少し、その結果、血液供給と組織の酸素要求の間に不均衡が生じている血管疾患として定義する。これには、慢性末梢動脈閉塞疾患（ＰＡＯＤ）、急性動脈血栓症および塞栓症、炎症性血管疾患、レイノー現象、および静脈疾患が包含される。
【０１６７】
この遺伝子、この遺伝子もしくはこの遺伝子の一部分またはその産物を調節する翻訳されたタンパク質および物質は、肥満症、体重過剰、食欲不振、悪液質、消耗性障害、食欲抑制、食欲増強、満腹の増大または減少、体重の調節または、過食症等の他の摂食障害を処置するのに有用である。また、この遺伝子、この遺伝子またはこの遺伝子の一部分またはその産物を調節する翻訳されたタンパク質および物質は、高血圧、ＩＩ型糖尿病、冠動脈疾患、高脂血症、発作、胆嚢疾患、通風、変形性関節症、睡眠時無呼吸、呼吸困難、いくつかのタイプの癌、例えば、子宮、乳房、前立腺、および大腸癌等、塞栓障害、多嚢胞性卵巣症候群、生殖能力の減退、妊娠合併症、生理不順、多毛症、緊張性尿失禁および鬱を含む、肥満症／体重過剰に伴うコモービディティ（Comorbidity）を処置するのに有用である。
【０１６８】
ＤＳＰＰ７様タンパク質活性に影響を及ぼす試薬を、ＤＳＰＰ７様タンパク質活性を低下させるために、インビトロ又はインビボのいずれかにおいてヒト細胞に投与することができる。試薬は、ヒトＤＳＰＰ７様遺伝子の発現産物と結合することが好ましい。その発現産物がタンパク質である場合、試薬は抗体であることが好ましい。生体外でのヒト細胞の処置については、抗体を、人体から取り出しておいた幹細胞の調製物に添加することができる。その後、その細胞を、当分野で周知のように、クローン増殖させるか、又はさせずに同じ又は別の人体に移すことができる。
【０１６９】
１つの態様においては、試薬を、リポソームを用いて送達する。リポソームは、投与した動物中にて、少なくとも約３０分間、より好ましくは少なくとも約１時間、さらにより好ましくは少なくとも約２４時間安定であることが好ましい。リポソームは、試薬、特にポリヌクレオチドを、動物（例えばヒト）の特定の部位に標的化することができる脂質組成物を含む。リポソームの脂質組成物は、動物の特有の器官、例えば肺、肝臓、脾臓、心臓、脳、リンパ節及び皮膚を標的化できることが好ましい。
【０１７０】
本発明に有用なリポソームは、標的化した細胞の原形質膜と融合でき、その内容物を細胞に送達できる脂質組成物を含む。好ましくは、リポソームのトランスフェクション効率は約１０6細胞に送達されるリポソーム１６ｎｍｏｌ当たりＤＮＡ約０.５μｇであり、より好ましくは約１０6細胞に送達されるリポソーム１６ｎｍｏｌ当たりＤＮＡ約１.０μｇであり、さらにより好ましくは約１０6細胞に送達されるリポソーム１６ｎｍｏｌ当たりＤＮＡ約２.０μｇである。好ましくは、リポソームは直径が、約１００〜５００ｎｍであり、より好ましくは約１５０〜４５０ｎｍであり、さらにより好ましくは約２００〜４００ｎｍである。
【０１７１】
本発明に用いるに適したリポソームは、例えば当業者に知られる遺伝子送達法に標準的に用いられるリポソームを含む。より好ましいリポソームは、ポリカチオン脂質組成物を有するリポソームおよび／またはポリエチレングリコールと連結されたコレステロールバックボーン（骨格鎖）を有するリポソームを含む。場合により、リポソームは特定の細胞タイプを標的化できる化合物、例えばリポソームの外側表面に曝される細胞特異的リガンドを包含する。
【０１７２】
リポソームを、試薬、例えばアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはリボザイムと複合体化することは、当分野で標準的な方法 (例えば、米国特許5,705,151を参照のこと) を用いて達成することができる。好ましくは、ポリヌクレオチド約０.１μｇ〜約１０μｇをリポソーム約８ｎｍｏｌと組み合わせる、より好ましくはポリヌクレオチド約０.５μｇ〜約５μｇをリポソーム約８ｎｍｏｌと組み合わせる、さらにより好ましくはポリヌクレオチド約１０μｇをリポソーム約８ｎｍｏｌと組み合わせる。
【０１７３】
別の態様においては、抗体を、受容体媒介性標的化送達を用いて、インビボにて特定の組織に送達することができる。受容体媒介性ＤＮＡ送達技術は、例えばFindeisら、Trends in Biotechnol. 11, 202-05 (1993); Chiouら、GENE THERAPEUTICS: METHODS AND APPLICATIONS OF DIRECT GENE TRANSFER (J. A. Wolffら、) (1994); Wu ＆ Wu, J. Biol. Chem. 263, 621-24 (1988); Wuら、J. Biol. Chem. 269, 542-46 (1994); Zenkeら、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87, 3655-59 (1990); Wuら、J. Biol. Chem. 266, 338-42 (1991) にて教示されている。
【０１７４】
治療的有効量の決定
治療的有効量の決定は、充分当業者の能力の範囲内にある。治療的有効量とは、治療的有効量の不在下で起こるＤＳＰＰ７様タンパク質活性に比較してＤＳＰＰ７様タンパク質活性を増大させ、または低下させる活性成分の量を指す。
【０１７５】
いかなる化合物に関しても、治療的有効量は最初に細胞培養検定で、または動物モデル、通常マウス、ウサギ、イヌ、またはブタで見積もることができる。動物モデルは適当な濃度範囲および投与経路の決定にも使用できる。次にこのような情報を用いて人間での有用な用量と投与経路を決定できる。
【０１７６】
治療的有効性および毒性、例えばＥＤ50（集団の５０％で治療的に有効な用量）およびＬＤ50（集団の５０％で致死的な用量）は、細胞培養または実験動物における標準的薬学的方法により決定できる。治療効果に対する毒性効果の用量比が治療指数であり、比ＬＤ50／ＥＤ50で表すことができる。
【０１７７】
大きな治療指数を示す医薬組成物が好ましい。細胞培養検定および動物研究から得られるデータを、人間への使用のための用量範囲を処方する際に使用する。かかる組成物に含まれる用量は、好ましくは殆どまたは全く毒性を持たないＥＤ50を包含する循環濃度の範囲内である。この用量は、使用する用量型、患者の感受性、および投与経路に応じてこの範囲内で変わる。
【０１７８】
正確な用量は、治療を必要とする対象に関連する因子に照らして医師が決定する。用量および投与は、充分なレベルの活性成分を提供するよう、または所望の効果を保持するよう、調節する。考慮できる因子は、疾病状態の重篤度、対象の全身健康状態、年齢、体重、および対象の性別、食餌、投与の時間および頻度、薬物の組み合わせ、反応の感受性、および療法に対する寛容／応答を包含する。長時間作用性医薬組成物は、その製剤の半減期およびクリアランス率に応じて３から４日毎、毎週、または２週間に１回投与することができる。
【０１７９】
標準的な用量は投与経路に応じて０.１から１００,０００マイクログラムまで変えることができ、約１gまでの総用量とすることができる。特定の用量および送達方法についての指針は文献に提供されており、一般に当分野の医師が入手できる。当業者は、ヌクレオチド用にはタンパク質またはそれらのインヒビター用のものとは異なる製剤を使用するであろう。同様に、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの送達は特定の細胞、状態、場所などに特異的である。
【０１８０】
この試薬が一本鎖抗体である場合、この抗体をコードしているポリヌクレオチドを構築し、トランスフェリン−ポリカチオン−媒介ＤＮＡ転移、裸のまたはカプセル内核酸を用いるトランスフェクション、リポソームの媒介する細胞融合、ＤＮＡ被覆ラテックスビーズの細胞内輸送、プロトプラスト融合、ウイルス感染、電気穿孔、「遺伝子銃」、およびＤＥＡＥ−または燐酸カルシウム−媒介トランスフェクションを包含する（但しこれらに限定される訳ではない）充分確立した技術を用いて、ex vivoまたはインビボで細胞内に導入できる。
【０１８１】
抗体の有効なインビボ用量は、約５μgから約５０μg/kg、約５０μgから約５mg/kg、約１００μgから約５００μg/kg（患者の体重）、および約２００から約２５０μg/kg（患者の体重）の範囲である。一本鎖抗体をコードしているポリヌクレオチドの投与のためには、有効なインビボ用量は、約１００ngから約２００ng、５００ngから約５０mg、約１μgから約２mg、約５μgから約５００μg、および約２０μgから約１００μgのＤＮＡの範囲である。
【０１８２】
発現産物がｍＲＮＡである場合、試薬は好ましくはアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはリボザイムである。アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはリボザイムを発現するポリヌクレオチドは、上記のように多岐にわたる方法によって細胞中に導入できる。
【０１８３】
好ましくは、試薬は、ＤＳＰＰ７様遺伝子の発現またはＤＳＰＰ７様ポリペプチドの活性を、該試薬の不在時と比較して少なくとも約１０、好ましくは約５０、より好ましくは約７５、９０、または１００％低下させる。ＤＳＰＰ７様遺伝子の発現レベルまたはＤＳＰＰ７様ポリペプチドの活性を低下させるよう選択した機構の有効性は、当分野で周知の方法、例えばＤＳＰＰ７様タンパク質特異的ｍＲＮＡへのヌクレオチドプローブのハイブリダイゼーション、定量的ＲＴ−ＰＣＲ、ＤＳＰＰ７様ポリペプチドの免疫学的検出、またはＤＳＰＰ７様タンパク質活性の測定を用いて評価できる。
【０１８４】
上記のいずれの態様においても、本発明に係る任意の医薬組成物は他の適当な治療薬と組み合わせて投与できる。併用療法に使用するための適当な物質の選択は、常套的製薬原理に従い、当業者により実施することができる。治療薬の組み合わせは、相乗的に働いて、上記の様々な疾患の治療または予防を奏効させる。このアプローチを用いて、より低い各物質の用量で治療効果を達成することができ、したがって有害な副作用の可能性を低減することができる。
【０１８５】
上記の治療方法のいずれも、例えばイヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ウサギ、サル、および最も好ましくはヒトといった哺乳動物を包含する、このような治療を必要とする任意の対象に適用することができる。
【０１８６】
診断方法
ヒトＤＳＰＰ７様タンパク質はさらに、この酵素をコードしている核酸配列における突然変異の存在に関連する疾病および異常、または疾病および異常に対する感受性を検出する診断検定に使用できる。例えば、疾病に罹患している個体と正常な個体とにおけるＤＳＰＰ７様タンパク質をコードしているｃＤＮＡまたはゲノム配列の間の相違を決定できる。もし罹患している個体の幾つかまたは全てに突然変異が観察され、正常な個体には観察されないならば、この突然変異がその疾病の原因であると思われる。
【０１８７】
レファレンス遺伝子および突然変異を有する遺伝子の間の配列相違は、直接ＤＮＡ配列決定法によって明らかにできる。加えて、クローニングしたＤＮＡセグメントを、特定のＤＮＡセグメントを検出するためのプローブとして使用できる。この方法の感受性はＰＣＲと組み合わせる時極めて増強される。例えば、二本鎖ＰＣＲ産物または修飾ＰＣＲにより調製された一本鎖鋳型分子と共に、配列決定プライマーを使用することができる。配列決定は、放射標識したヌクレオチドを用いる常套的方法によって、または蛍光標識を使用する自動配列決定法によって実施する。
【０１８８】
ＤＮＡ配列相違に基づく遺伝子試験は、変性させる物質を含むまたは含まないゲル中のＤＮＡ断片の電気泳動移動度の変化を検出することにより実施できる。小配列の欠失および挿入は、例えば高分解能ゲル電気泳動によって視覚化できる。異なる配列のＤＮＡ断片は変性させるホルムアミド勾配ゲル上で識別でき、ここでは、異なるＤＮＡ断片の移動度が、それらの特異的融解温度または部分的融解温度に従って、ゲル中の異なる位置で遅延する（例えば、Myersら、Science 230,1242,1985を参照されたい）。特定の位置での配列改変もまたヌクレアーゼ保護検定、例えばＲＮアーゼおよびＳ１保護または化学的開裂法によって明らかにすることができる（例えば、Cottonら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85,4397-4401,1985）。即ち特異的ＤＮＡ配列の検出は、ハイブリダイゼーション、ＲＮアーゼ保護、化学的開裂、直接ＤＮＡ配列決定といった方法によって、または制限酵素とゲノムＤＮＡのサザンブロッティングを使用することによって実施できる。ゲル電気泳動およびＤＮＡ配列決定のような直接法に加えて、突然変異はin situ分析により検出することもできる。
【０１８９】
ＤＳＰＰ７様タンパク質のレベルの変化もまた種々の組織で検出できる。血液または組織生検のように、宿主から誘導した身体試料中の受容体ポリペプチドのレベルを検出するために用いる検定は、当業者に周知であり、ラジオイムノアッセイ、競合的結合検定、ウェスタンブロット分析、およびELISA検定を包含する。
【０１９０】
本明細書に引用する全ての特許および特許出願は、引用により特に本明細書の一部とする。上記の内容は本発明を一般的に記載するものである。より完全な理解は以下の具体的実施例を参照することによって得られ、それらの実施例は例示のみの目的で提供するものであり、本発明の範囲を限定する意図は無い。
【実施例】
【０１９１】
実施例１
二重特異性タンパク質ホスファターゼ７様タンパク質活性の検出
配列番号１に記載のポリヌクレオチドを発現ベクターｐＣＥＶ４に挿入し、得られた発現ベクターｐＣＥＶ４−二重特異性タンパク質ホスファターゼ７様タンパク質ポリペプチドをヒト胚の腎臓２９３細胞にトランスフェクトする。これらの細胞から溶解物を得、活性化されたＭＡＰ−キナーゼを脱リン酸化する能力を試験する分析において、Tris（pH７．５）、１ｍＭＥＤＴＡジチオスレイトール、１ｍg／ｍL血清アルブミンを含む緩衝液中、細胞抽出物をＭＡＰ−キナーゼと３０℃にて１０分間接触させることにより、二重特異性タンパク質ホスファターゼ７様タンパク質活性を測定する。放射性のリン酸基をゲル電気泳動し、オートラジオグラフィーによって測定する分析法を用いて、ＭＡＰ−キナーゼの脱リン酸化を検出する。配列番号２のポリペプチドは、二重特異性タンパク質ホスファターゼ７様タンパク質活性を有することが示される。
【０１９２】
実施例２
組換えヒトＤＳＰＰ７様タンパク質の発現
ピキア パストリス(Pichia pastoris)発現ベクターｐＰＩＣＺＢ(Invitrogen, San Diego, CA) を用いて、大量の組換えヒトＤＳＰＰ７様ポリペプチドを酵母中に生産させる。ＤＳＰＰ７様ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列は配列番号１に示されるヌクレオチド配列から得られる。ベクターｐＰＩＣＺＢ中に挿入する前に、ＤＮＡ配列を、その５'端に開始コドン、及び３'端にエンテロキナーゼ開列部位、Ｈｉｓ６レポータータグや終止コドンを含ませるといった周知の方法によって修飾する。さらに、その両末端に制限エンドヌクレアーゼの認識配列を加え、対応する制限酵素を用いてｐＰＩＣＺＢのマルチクローニングサイトを消化した後に、修飾ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列をｐＰＩＣＺＢ中にライゲートする。この発現ベクターを、ピキア パストリスにて発現が酵母プロモーターにより誘導される誘導性発現用に設計する。得られたｐＰＩＣＺ／ｍｄ−Ｈｉｓ６ベクターを用いて、酵母を形質転換する。
【０１９３】
この酵母を、５リッター攪拌フラスコ中で通常の条件下にて培養し、組換え産物タンパク質を、８Ｍウレアの存在下で親和性クロマトグラフィー（Ｎｉ−ＮＴＡ−樹脂）により培養物から単離する。結合したポリペプチドを、ｐＨ３.５の緩衝液を用いて溶出し、中性化する。Ｈｉｓ６レポータータグからのポリペプチドの分離は、製造元の指示に従い、エンテロキナーゼ（Invitrogen, San Diego, CA）を用いる部位特異的タンパク質分解により行なう。精製ヒトＤＳＰＰ７様ポリペプチドを得る。
【０１９４】
実施例３
ＤＳＰＰ７様ポリペプチドと結合する試験化合物の同定
グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼタンパク質を含み９６ウェル マイクロタイタープレートのグルタチオン誘導化ウェルに吸着した精製ＤＳＰＰ７様ポリペプチドを、生理緩衝溶液ｐＨ７.０の小分子ライブラリー由来の試験化合物と接触させる。ＤＳＰＰ７様ポリペプチドは、配列番号２に示すアミノ酸配列を含む。試験化合物は蛍光標識を含む。この試料を５分間〜１時間インキュベートする。コントロール試料は、試験化合物の非存在下にてインキュベートする。
【０１９５】
試験化合物を含む緩衝液を、ウェルから洗い出す。ＤＳＰＰ７様ポリペプチドに対する試験化合物の結合を、ウェルの内容物の蛍光測定により検出する。試験化合物をインキュベートしていないウェルの蛍光と比較して少なくとも１５％ウェル中の蛍光を増大させる試験化合物を、ＤＳＰＰ７様ポリペプチドと結合する化合物と同定する。
【０１９６】
実施例４
ＤＳＰＰ７様遺伝子発現を低下させる試験化合物の同定
試験化合物を、ＤＳＰＰ７様タンパク質発現構築物でトランスフェクトしたヒト培養細胞に投与し、３７℃で１０〜４５分間インキュベートする。トランスフェクトしなかった同じタイプの細胞培養を、試験化合物なして同じ時間インキュベートし、ネガティブコントロールとする。
【０１９７】
ＲＮＡを、Chirgwinら、Biochem. 18, 5294-99,1979に記載のように２つの培養物から単離する。ノーザンブロットを全ＲＮＡ２０〜３０μｇを用いて調製し、エクスプレスハイブ(Expresshyb)（CLONTECH）にて６５℃で、32Ｐ−標識化ＤＳＰＰ７様タンパク質特異的プローブを用いてハイブリダイズさせる。このプローブは配列番号１より選ばれる少なくとも１１個の連続ヌクレオチドを包含する。試験化合物の非存在下にて得られるシグナルと比較してＤＳＰＰ７様タンパク質特異的シグナルを低下させる試験化合物を、ＤＳＰＰ７様遺伝子発現の阻害物質として同定する。
【０１９８】
実施例５
ＤＳＰＰ７様タンパク質活性を低下させる試験化合物の同定
試験化合物を、ＤＳＰＰ７様タンパク質発現構築物でトランスフェクトしたヒト培養細胞に投与し、３７℃で１０〜４５分間インキュベートする。トランスフェクトしなかった同じタイプの細胞培養を、試験化合物なして同じ時間インキュベートし、ネガティブコントロールとする。ＤＳＰＰ７様タンパク質活性は、Dowd et al., J. Cell Sci. 1998 Nov;111 (Pt22):3389-99の方法を用いて測定する。
【０１９９】
試験化合物非存在下でのＤＳＰＰ７様タンパク質活性と比べてＤＳＰＰ７様タンパク質のＤＳＰＰ７様タンパク質活性を減少させる試験化合物を、ＤＳＰＰ７様活性のインヒビターとして同定する。
【０２００】
実施例６
ＤＳＰＰ７様タンパク質の組織特異的発現
種々の組織および細胞系列におけるＤＳＰＰ７様タンパク質の定量的な発現パターンを逆転写ポリメラーゼ連鎖反応によって測定した（ＲＴ−ＰＣＲ）
【０２０１】
ＤＳＰＰ７様タンパク質が癌に関与していることを実証するために、以下の組織における発現を測定する：副腎、骨髄、脳、小脳、結腸、胎児脳、胎児肝臓、心臓、腎臓、肝臓、肺、乳腺、膵臓、胎盤、前立腺、唾液腺、骨格筋、小腸、脊髄、脾臓、胃、睾丸、胸腺、甲状腺、気管、子宮、および末梢血液リンパ球。以下の癌細胞における発現も測定する: DU−145 (前立腺)、NCI−H125 (肺)、HT−29 (結腸)、COLＯ−205 (結腸)、A−549 (肺)、NCI−H460 (肺)、HT−116 (結腸)、DLD−1 (結腸)、MDA−MD−231 (乳房)、LS174T (結腸)、ZF−75 (乳房)、MDA−MＮ−435 (乳房)、HT−1080、MCF−7 (乳房)、およびU87。さらに、同一の患者から採取した癌組織と正常組織の対を調べる。
【０２０２】
ＤＳＰＰ７様タンパク質がＣＮＳ障害に関与することを実証するために、以下の組織をスクリーニングする：胎児および成人脳、筋肉、心臓、肺、腎臓、肝臓、胸腺、睾丸、結腸、胎盤、気管、膵臓、腎臓、胃粘膜、結腸、肝臓、小脳、皮膚、皮質 (アルツハイマー病のおよび正常な)、視床下部、皮質、扁桃、小脳、海馬、脈絡膜、神経叢、視床、および脊髄。
【０２０３】
ＤＳＰＰ７様タンパク質がＣＯＰＤの疾患過程に関与することを実証するために、初期発現パネルはＣＯＰＤに関連する呼吸器組織及び炎症細胞由来のＲＮＡ試料からなる：肺（成人及び胎児）、気管、新たに単離された肺胞型II細胞、培養されたヒト気管支上皮細胞、培養された小気道上皮細胞、培養された気管支平滑筋細胞、培養されたＨ４４１細胞（Ｃｌａｒａ様）、新たに単離された好中球及び単球、並びに培養された単球（マクロファージ様）。また、Clontechから購入した全ＲＮＡパネルを用いてボディマッププロファイリングも行う。組織は、副腎腺、骨髄、脳、大腸、心臓、腎臓、肝臓、肺、乳腺、膵臓、唾液腺、骨格筋、小腸、脾臓、胃、精巣、胸腺、気管、甲状腺及び子宮である。
【０２０４】
ＤＳＰＰ７様タンパク質が肥満症の疾患過程に関与することを実証するために、以下の組織において発現を測定する：皮下脂肪組織、腸間膜脂肪組織、副腎、骨髄、脳 (小脳、脊髄、大脳皮質、尾状核、髄質、黒質、および被殻)、結腸、胎児脳、心臓、腎臓、肝臓、肺、乳腺、膵臓、胎盤、前立腺、唾液腺、骨格筋 小腸、脾臓、胃、testes、胸腺、甲状腺 気管、および子宮。神経芽細胞腫細胞系ＳＫ−Ｎｒ−Ｂｅ(２)、Ｈｒ、Ｓｋ−Ｎ−Ａｓ、ＨＴＢ−１０、ＩＭＲ−３２、ＳＮＳＹ−５Ｙ、Ｔ３、ＳＫ−Ｎ−Ｄ２、Ｄ２８３、ＤＡＯＹ、ＣＨＰ−２、Ｕ８７ＭＧ、ＢＥ(２)Ｃ、Ｔ９８６、ＫＡＮＴＳ、ＭＯ５９Ｋ、ＣＨＰ２３４、Ｃ６(ラット)、ＳＫ−Ｎ−Ｆ１、ＳＫ−ＰＵ−ＤＷ、ＰＦＳＫ−１、ＢＥ(２)Ｍ１７、およびＭＣＩＸＣをＤＳＰＰ７様タンパク質発現について試験する。最後のステップとして、正常な人の細胞におけるＤＳＰＰ７様タンパク質の発現を、肥満症の人から得られた細胞の発現と比較する。
【０２０５】
ＤＳＰＰ７様タンパク質が糖尿病に関与していることを実証するために、以下の全身パネルをスクリーニングして顕著なまたは比較的高い発現を示す：皮下および腸間膜脂肪組織、副腎、骨髄、脳、結腸、胎児脳、心臓、視床下部、腎臓、肝臓、肺、乳腺、膵臓、胎盤、前立腺、唾液腺、骨格筋、小腸、脾臓、胃、睾丸、胸腺、甲状腺、気管、および子宮。さらに、ヒト島細胞および島細胞ライブラリーを試験する。最後のステップとして、正常な人の細胞におけるＤＳＰＰ７様タンパク質の発現を、糖尿病の人から得られた細胞の発現と比較する。
【０２０６】
定量的発現プロファイル。定量的発現プロファイルは、Higuchiら、BioTechnology 10, 413-17,1992、及びHiguchiら、BioTechnology 11, 1026-30,1993に初めて記載された、「速度論的解析」と呼ばれる定量的ＰＣＲ解析の方式により実施した。原理は、ＰＣＲの対数相内の任意に与えられたサイクルにおいて、産物の量が最初の鋳型のコピー数に比例するというものである。
【０２０７】
ＰＣＲ増幅を、標的配列に相補的な、クエンチングを内部に有する（internally quenched）蛍光オリゴヌクレオチド（ＴａｑＭａｎプローブ）の存在下で行なう場合、プローブはＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼの５'−３'エンドヌクレアーゼ活性により開裂され、媒体中に蛍光色素が放出される（Hollandら、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88, 7276-80, 1991）。蛍光発光は、特異的な増幅産物の量に直接比例して増大するため、ＰＣＲ産物の対数増幅相を検出し、最初の鋳型濃度を決定するのに用いることができる（Heidら、Genome Res. 6, 986-94, 1996、及びGibsonら、Genome Res. 6, 995-1001, 1996）。
【０２０８】
内部対照の増幅を行って、反応物に添加したサンプルＲＮＡの量を標準化することができる。この種類の実験では、選択した対照は１８ＳリボソームＲＮＡである。異なる染料で標識下プローブを用いれば、異なる放射スペクトルを有する酵素染料が得られるため、標的と内部標準とを同じ試験管内で独立して定量することができる。
【０２０９】
蛍光のリアルタイムＰＣＲ測定はすべて、ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ７７００で行う。
【０２１０】
ＲＮＡ抽出およびｃＤＮＡ調製。上記の組織から得た全ＲＮＡを発現の定量化に使用する。「剖検から得た」標識ＲＮＡを、ＴＲＩzol試薬（Life Technologies, MD）を用い、製造元のプロトコルにしたがって、剖検組織から抽出した。
【０２１１】
各ＲＮＡ５０μｇを、以下の反応混合物中、ＤＮａｓｅＩで３７℃にて１時間処理する：0.2 Ｕ／μL RNase不含DNase I (Roche Diagnostics, Germany); 0.4 Ｕ／μL RNase インヒビター(PE Applied Biosystems, CA); 10 mM Tris-HCl pH 7.9; 10 mM MgCl2; 50 mM NaCl; および1 mM DTT。
【０２１２】
インキュベーション後、ＲＮＡを１体積のフェノール：クロロホルム−イソアミールアルコール（２４：２４：１）で１回、クロロホルムで１回抽出し、１／１０体積の３Ｍ 酢酸ナトリウム（ pＨ５.２）および２体積のエタノールで沈殿させた。
【０２１３】
剖検組織から得た各ＲＮＡ５０μｇを、Ambion（Ambion, TX）から購入したＤＮＡ不含キットを用いてＤＮａｓｅ処理する。再懸濁および分光学的定量の後、各サンプルをTaqMan逆転写試薬（PE Applied Biosystems, CA）を用い、製造元のプロトコルにしたがって逆転写する。反応混合物中のＲＮＡの最終濃度は２００ｍg／μLである。逆転写は２.５μＭのランダムヘキサマープライマーを用いて行う。
【０２１４】
ＴａｑＭａｎ定量分析。特異的プライマー及びプローブは、ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓの推奨に基づいて設計する；プローブは、５’末端でＦＡＭ（６−カルボキシフルオレセイン）、３’末端でＴＡＭＲＡ（６−カルボキシ−テトラメチル−ローダミン）を用いて標識することができる。定量実験は、それぞれの試料由来の逆転写ＲＮＡ１０ｎｇに対して行う。それぞれの測定は３回行なう。
【０２１５】
全ｃＤＮＡ含有量を、Pre-Developed TaqMan Assay Reagents (PDAR)コントロールキット （PE Applied Biosystems, CA）を用いて、１８ＳリボソームＲＮＡの同時定量（多重ＰＣＲ）により標準化する。
【０２１６】
検定反応混合物は以下のとおりである：１×最終ＴａｑＭａｎユニバーサルＰＣＲマスターミックス（２×ストック溶液から）（PE Applied Biosystems, CA）；１×ＰＤＡＲコントロール−１８Ｓ ＲＮＡ（２×ストック溶液から）；３００ｎＭ フォワードプライマー；９００ｎＭ リバースプライマー；２００ｎＭ プローブ；１０ｎｇ ｃＤＮＡ；及び水を加えて２５μｌにする。
【０２１７】
以下の工程のそれぞれを一回行う：５０℃で２分間、そして９５℃で１０分間のプレ(前)ＰＣＲ。以下の工程は４０回行なう：９５℃で１５秒の変性、６０℃で１分のアニーリング／伸長。
【０２１８】
実験は、ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ７７００シークエンス検出器（PE Applied Biosystems, CA）を用いて実施する。より良いバックグラウンド控除、並びに出発標的量に対する直線性を達成するために、この実施の最後に、ＰＣＲの間に得られた蛍光データを、ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ７７００ユーザーマニュアルに記載のように処理する。
【０２１９】
実施例７
増殖阻害検定：アンチセンスオリゴヌクレオチドは癌細胞系の増殖を抑制する
試験に用いられる細胞系はヒト大腸癌細胞系ＨＣＴ１１６である。細胞は、１０〜１５％胎児ウシ血清を含むＰＲＭＩ−１６４０中、濃度１０,０００細胞／ｍｌ ０.５ｍｌ量にて３７℃、９５％空気／５％ＣＯ2雰囲気下で培養する。
【０２２０】
ホスホロチオネート オリゴリボヌクレオチドは、ホスホロアミデイト(phosphoroamidite)ケミストリーを用いる応用バイオシステム モデル３８０Ｂ ＤＮＡシンセサイザーにおいて合成する。配列番号１の１〜２４位置のヌクレオチドと相補的な２４塩基の配列を、被験オリゴヌクレオチドとして用いる。コントロールとして、他の（ランダム）配列：５'−ＴＣＡ ＡＣＴ ＧＡＣ ＴＡＧ ＡＴＧ ＴＡＣ ＡＴＧ ＧＡＣ−３'を用いる。アセンブリーと脱保護に次いで、オリゴヌクレオチドを、エタノール沈殿２回、乾燥、そしてリン酸緩衝液中に所望の濃度に懸濁する。オリゴヌクレオチドの純度は、キャピラリーゲル電気泳動及びイオン交換ＨＰＬＣによって試験する。精製オリゴヌクレオを、培養培地に７日間、１日ごとに１度１０μＭ濃度を加える。
【０２２１】
７日間の被験オリゴヌクレオチド添加により、ヒトＤＳＰＰ７様タンパク質の発現は、ウェスタンブロッティングにより決定されるように有意に低下する。この効果は、コントロールオリゴヌクレオチドでは観察されない。３〜７日の後、培養中の細胞の数を、自動細胞カウンターを用いて計数する。被験オリゴヌクレオチドで処理した培養中の細胞の数を、コントロールオリゴヌクレオチドで処理した培養中の細胞の数（１００％と表す）と比較する。被験オリゴヌクレオチドで処理した培養中の細胞の数は、コントロールの３０％を超えない、このことはヒトＤＳＰＰ７様タンパク質の阻害が、癌細胞において抗増殖効果を有することを示している。
【０２２２】
実施例８
化合物／標的確証のインビボ試験
１．急性機械的検定
１.１．分裂促進血漿ホルモンレベルの低下
この非腫瘍検定では、内因性の循環ホルモンレベル又は生物学的刺激に応答して生産されるホルモンレベルのいずれかを低下させる化合物の能力を測定する。げっ歯類に試験化合物を投与（経口、腹腔内、静脈内、筋肉内又は皮下投与）する。試験化合物投与後の所定時間に、血漿を採集する。目的のホルモンレベルについて、血漿を検定する。ホルモンの標準循環レベルが低すぎる、及び／又は可変過ぎて一致した結果が得られない場合は、生物学的刺激で前処理してホルモンレベルを亢進することができる（即ち、ＬＨＲＨ ３０ｎｇ／マウス用量をマウスに筋肉内注射して、テストステロン合成を群発させることができる）。血漿採集の時期を調整して、誘導したホルモン応答のピークを一致させることができよう。化合物効果を、媒体処置コントロール群と比較する。Ｆ試験は分散が一致するか、一致しないかを決定するために行ない、次いであるチューデントｔ試験を行なう。媒体コントロール群と比較して有意性はｐ値０.０５以下である。
【０２２３】
１.２．中空繊維の作用メカニズム分析
中空繊維は、所望の細胞系（群）を用いて調製し、げっ歯類に腹腔内及び／又は皮下移植する。化合物は、経口、腹腔内、静脈内、筋肉内又は皮下投与する。繊維を、特定のげっ歯類検定プロトコル（遺伝子発現（ｄＤＮＡ、ＰＣＲ又はＴａｑｍａｎ）、特定の生化学活性（例えば、ｃＡＭＰレベル）についての検定を含み得る）に基づいて回収する。結果は、群間の分散をＦ試験によって比較し（媒体コントロール群と比較して有意性はｐ値０.０５以下である）、スチューデントｔ試験又は順位和試験によって分析する。
【０２２４】
２．亜急性機能インビボ検定
２.１．ホルモン依存的組織量の低下
これは、ホルモン依存性組織（即ち、雄の精嚢及び雌の子宮）の質量を低下させる化合物の能力を測定する別の非腫瘍検定である。げっ歯類に、試験化合物を所定のスケジュールに基づき、所定の期間（即ち、１週間）投与（経口、腹腔内、静脈内、筋肉内又は皮下）する。この実験の最後に、動物の体重を測り、標的器官を切除し、全ての体液を搾り出し、その器官の重量を記録する。また、血漿も回収できる。血漿は、目的のホルモンレベル又は被験物質レベルについて検定することができる。器官重量を直接比較するか、それらを動物の体重について標準化することができる。化合物の効果を、媒体処置コントロール群と比較する。Ｆ試験は分散が一致するか、一致しないかを決定するために行ない、次いであるチューデントｔ試験を行なう。媒体コントロール群と比較して有意性はｐ値０.０５以下である。
【０２２５】
２.２．中空繊維増殖検定
中空繊維は、所望の細胞系（群）を用いて調製し、げっ歯類に腹腔内及び／又は皮下移植する。化合物は、経口、腹腔内、静脈内、筋肉内又は皮下投与する。繊維を、特定のげっ歯類検定プロトコルに基づいて回収する。細胞増殖は、細胞数マーカー（即ち、ＭＴＴ又はＬＤＨ）を測定することによって決定する。細胞数と出発接種材料からの細胞数の変化を、群間の分散をＦ試験（媒体コントロール群と比較して有意性はｐ値０.０５以下である）によって比較した後、スチューデントｔ試験又は順位和試験によって分析する。
【０２２６】
２.３．抗血管新生モデル
２.３.１．角膜血管新生
成長因子を伴う若しくは伴わないヒドロンペレット又は細胞を、げっ歯類の角膜に外科的に作ったマイクロポケット中に移植する。化合物（ヒドロンペレット中に成長因子と混合した化合物）を、全身又は局所投与することができる。移植の７日後にコロイド性カーボンを心臓内注入した後すぐに、角膜を回収し、そして１０％ホルマリン中に固定する。読み取りは、定性的スコアリング及び／又はイメージ分析で行なう。定性的スコアを順位和試験により比較する。イメージ分析データは、血管新生領域（ピクセル内）を測定することによって評価し、群平均をスチューデントｔ試験（２テイル）によって比較する。成長因子又は細胞のみの群と比較して、有意性はｐ値０.０５以下である。
【０２２７】
２.３.２．マトリゲル(Matrigel)血管新生
細胞又は成長因子を含有するマトリゲルを、皮下注射する。化合物を、経口、腹腔内、静脈内、筋肉内又は皮下投与する。マトリゲルプラグを、所定の時点（群）で回収し、読み取りのために調製する。読み取りは、ヘモグロビン濃度及び／又は組織学試験についてのＥＬＩＳＡを基礎とする検定である（即ち、容器カウント、内皮表面マーカーの特殊染色：ＣＤ３１、因子−８）。読み取りは、群間の分散をＦ試験によって比較した後（媒体コントロール群と比較して有意性はｐ値０.０５以下である）、スチューデントｔ試験によって分析する。
【０２２８】
３．原発性抗腫瘍効果
３.１．初期治療モデル
３.１.１．皮下腫瘍
腫瘍細胞又は破砕物（フラグメント）を、０日目に皮下移植する。媒体及び／又は化合物を、ある時、通常１日目に開始する所定のスケジュールに基づいて経口、腹腔内、静脈内、筋肉内又は皮下投与し、次いでその能力について腫瘍重量(burden)を測定する。体重及び腫瘍測定を週に２、３回記録する。正味の体重及び腫瘍重量の平均を、それぞれのデータ収集日ごとに計算する。抗腫瘍効果は、既定の日に処置腫瘍のサイズ（Ｔ）及びコントロール腫瘍のサイズ（Ｃ）を、群間の分散をＦ試験により比較した後（有意性はｐ０.０５以下で決められる）、スチューデントｔ試験により比較することで最初に決定することができる。また、この実験は、腫瘍成長遅延をモニターし記録して腫瘍測定を継続する場合には、投与の終了後にも継続できる。腫瘍成長遅延は、予め定めたサイズに達したコントロール群の中央時間で、該サイズに達した処置群とコントロール群の中央時間を割ったものの差として表される。成長遅延は、評価サイズに達した個々の腫瘍についての時間からカプラン−マイヤー曲線を作成することによって比較する。有意性はｐ０.０５以下である。
【０２２９】
３.１.２．腹腔内／頭蓋内腫瘍モデル
腫瘍細胞を、０日目に腹腔内又は頭蓋内注射する。化合物を、１日目に開始する所定のスケジュールに基づき、経口、腹腔内、静脈内、筋肉内又は皮下投与する。羅患率及び／又は死亡率の観察を、１日に２回記録する。体重は１週間に２回測定し記録する。羅患率／死亡率のデータを、生存中央値の期間で表し、長期生存数は分けて示す。生存時間を用いて、カプラン−マイヤー曲線を作成する。この実験のコントロール群と比較した対数範囲試験による有意性はｐ０.０５以下である。
【０２３０】
３.２．疾患モデルの確立
腫瘍細胞又は破砕物を、皮下的に移植し、処置を開始するのに所望のサイズにまで成長させる。所定のサイズ範囲に達する、マウスを処置群に無作為に分ける。化合物を、所定のスケジュールに従い、経口、腹腔内、静脈内、筋肉内又は皮下投与する。腫瘍重量及び体重を、１週間に２〜３回測定し記録する。インキュベート後の幾日かに渡って全群の腫瘍重量の平均値を、比較のためにグラフにする。Ｆ試験は分散が一致するか、一致しないかを決定するために行ない、次いであるチューデントｔ試験を処置終了時点の処置群及びコントロール群の腫瘍サイズを比較するために行なう。コントロール群と比較して有意性はｐ値０.０５以下である。腫瘍測定は、投与を止め腫瘍成長遅延をモニターした後に、記録することができる。腫瘍成長遅延は、所定のサイズに達したコントロール群の中央時間で、所定のサイズに達した処置群とコントロール群の中央時間を割ったのものの差として表される。成長遅延は、評価サイズに達した個々の腫瘍についての時間からカプラン−マイヤー曲線を作成することによって比較する。媒体コントロール群と比較して有意性はｐ値０.０５以下である。
【０２３１】
３.３．同所性疾患モデル
３.３.１．哺乳類脂肪体検定
哺乳動物の腺癌起源の腫瘍細胞又は破砕物を、外科的に露出させて表出させ、げっ歯類の乳腺脂肪体(fat pad)に直接移植する。その脂肪体を元あった場所に戻し、外科部分を閉じる。また、ホルモンを、腫瘍の成長を補助するためにげっ歯類に投与することもできる。化合物を所定のスケジュールに基づき、経口、腹腔内、静脈内、筋肉内又は皮下投与する。腫瘍重量及び体重を、１週間に２〜３回測定し記録する。接種後の幾日かに渡って全群の腫瘍重量の平均値を、比較のためにグラフにする。Ｆ試験は分散が一致するか、一致しないかを決定するために行ない、次いであるチューデントｔ試験を処置終了時の処置群及びコントロール群の腫瘍サイズを比較するために行なう。コントロール群と比較して有意性はｐ値０.０５以下である。
【０２３２】
腫瘍測定は、投与を止め腫瘍成長遅延をモニターした後に、記録することができる。腫瘍成長遅延は、所定のサイズに達したコントロール群の中央時間で、所定のサイズに達した処置群とコントロール群の中央時間を割ったのものの差として表される。成長遅延は、評価サイズに達した個々の腫瘍の中央時間からカプラン−マイヤー曲線を作成することによって比較する。媒体コントロール群と比較して有意性はｐ値０.０５以下である。さらに、このモデルは、このタイプの腫瘍の自発的転移速度を増大させる機会を提供する。転移反応は、標的器官当たりの目視できる病巣（フォーカス）の数を計数すること、又は標的器官重量を測定することによって、この研究の最後に評価することができる。これらの終点の平均値を、Ｆ試験を行なった後（この実験のコントロール群と比較して有意性はｐ値０.０５以下である）、スチューデントｔ試験によって比較する。
【０２３３】
３.２.２．前立腺内検定
前立腺癌器官の腫瘍細胞又は破砕物を、外科的に露出させたげっ歯類の前立腺の背葉に直接移植する。移植組織が精嚢に侵入しないことを検証しながら、腫瘍を特に背葉に移植することができるので、腹部切除して前立腺を外面化する。上手く接種した前立腺を腹部に移し、腹部に沿った切開部及び皮膚を閉じる。また、ホルモンを、腫瘍の成長を助けるためにげっ歯類に投与することもできる。化合物を、所定のスケジュールに基づき、経口、腹腔内、静脈内、筋肉内又は皮下投与する。体重を１週間に２〜３回測定し記録する。所定の時点で実験を終了し、動物を解剖する。原発性腫瘍サイズを、解剖範囲に装着させるキャリパーミクロメーターや接眼マイクロメーターのいずれかを用いて三次元測定する。Ｆ試験は分散が一致するか、一致しないかを決定するために行ない、次いであるチューデントｔ試験を処置終了時の処置群及びコントロール群の腫瘍サイズを比較するために行なう。コントロール群と比較して有意性はｐ値０.０５以下である。このモデルは、このタイプの腫瘍の自発的転移速度を増大させる機会を与える。転移反応は、標的器官（即ち、肺）当たりの目視できる病巣の数を計数すること、又は標的器官（即ち、局所的リンパ節）重量を測定することによって、この研究の最後に評価することができる。これらの終点の平均値を、Ｆ試験を行なった後（この実験のコントロール群と比較して有意性はｐ値０.０５以下である）、スチューデントｔ試験によって比較する。
【０２３４】
３.３.３．気管支内検定
肺器官の腫瘍細胞を、皮膚を切開し、気管を曝すことによって、気管支内に移植することができる。気管支は、斜端の２５ゲージニードルを用いて穴を開け、腫瘍細胞を、主要な気管支に屈曲９０°の平滑端の２７ゲージニードルを用いて接種する。化合物を、所定のスケジュールに基づき、経口、腹腔内、静脈内、筋肉内又は皮下投与する。体重を１週間に２〜３回測定し記録する。所定の時点で実験を終了し、動物を解剖する。原発性腫瘍サイズを、解剖範囲に装着させるキャリパーミクロメーターや接眼マイクロメーターのいずれかを用いて三次元測定する。Ｆ試験は分散が一致するか、一致しないかを決定するために行ない、次いであるチューデントｔ試験を処置終了時の処置群及びコントロール群の腫瘍サイズを比較するために行なう。コントロール群と比較して有意性はｐ値０.０５以下である。このモデルは、このタイプの腫瘍の自発的転移速度を増大させる機会を与える。転移反応は、標的器官（即ち、反対側の肺）当たりの目視できる病巣の数を計数すること、又は標的器官重量を測定することによって、この研究の最後に評価することができる。これらの終点の平均値を、Ｆ試験を行なった後（この実験のコントロール群と比較して有意性はｐ値０.０５以下である）、スチューデントｔ試験によって比較する。
【０２３５】
３.３.４．盲腸内検定
胃腸器官の腫瘍細胞を、腹部の皮膚を切開し、腸を外面化することで盲腸内移植することができる。腫瘍細胞を、２７又は３０ゲージニードルを用いて、腸の管腔を貫通することなく、盲腸壁に接種することができる。化合物を、所定のスケジュールに基づき、経口、腹腔内、静脈内、筋肉内又は皮下投与する。体重を１週間に２〜３回測定し記録する。所定の時点で実験を終了し、動物を解剖する。原発性腫瘍サイズを、解剖範囲に装着させるキャリパーミクロメーターや接眼マイクロメーターのいずれかを用いて三次元測定する。Ｆ試験は分散が一致するか、一致しないかを決定するために行ない、次いであるチューデントｔ試験を処置終了時の処置群及びコントロール群の腫瘍サイズを比較するために行なう。コントロール群と比較して有意性はｐ値０.０５以下である。このモデルは、このタイプの腫瘍の自発的転移速度を増大させる機会を与える。転移反応は、標的器官（即ち、肝臓）当たりの目視できる病巣の数を計数すること、又は標的器官重量を測定することによって、この研究の最後に評価することができる。これらの終点の平均値を、Ｆ試験を行なった後（エンドポイント両方の実験におけるコントロール群と比較して有意性はｐ値０.０５以下である）、スチューデントｔ試験によって比較する。
【０２３６】
４．続発性（転移性）抗腫瘍効果
４.１．自発転移
腫瘍細胞を皮下接種させ、腫瘍を肺又は肝臓への自発的転移研究のため予め定めた範囲にまで成長させる。次いで、この原発性腫瘍を切除する。腫瘍転移の初期段階を阻害することを目的とした治療を評価するために原発性腫瘍を切除するまでの期間を含むことある所定のスケジュールに従い、化合物を、経口、腹腔内、静脈内、筋肉内又は皮下投与する。罹患率及び／又は死亡率の観察を毎日記録する。１週間に２回、体重を測定し記録する。可能な指標（エンドポイント）には、生存時間、標的器官当たりの目視できる病巣の数、又は標的器官重量が挙げられる。生存時間をエンドポイントとして用いた場合、他の値は定まらない。生存データは、カプラン−マイヤー曲線を作成するのに用いる。この実験のコントロール群と比較して対数範囲試験による有意性はｐ０.０５以下である。解剖マイクロスコープの下で決定されるような目視できる腫瘍の病巣数の平均と、標的器官重量の平均値は、Ｆ試験を行なった後（エンドポイント両方の実験におけるコントロール群と比較して有意性はｐ値０.０５以下である）、スチューデントｔ試験によって比較する。
【０２３７】
４.２．強制的転移
腫瘍細胞を、尾静脈、門脈、又は心臓の左心室、実験用（強制的）肺、肝臓及び骨転移研究それぞれにおいて注射する。化合物を、所定のスケジュールに基づいて、経口、腹腔内、静脈内、筋肉内又は皮下投与する。罹患率及び／又は死亡率の観察を毎日記録する。１週間に２回、体重を測定し記録する。可能な指標には、生存時間、標的器官当たりの目視できる病巣の数、又は標的器官重量が挙げられる。生存時間をエンドポイントとして用いた場合、他の値は決定されない。生存データは、カプラン−マイヤー曲線を作成するのに用いる。この実験のコントロール群と比較して対数範囲試験による有意性はｐ０.０５以下である。解剖マイクロスコープの下で決定される目視できる腫瘍の病巣数の平均と、標的器官重量の平均値は、Ｆ試験を行なった後（両方エンドポイントの実験における媒体コントロール群と比較して有意性はｐ値０.０５以下である）、スチューデントｔ試験によって比較する。
【０２３８】
実施例９
化合物／標的確証のインビボ試験
１．疼痛：
急性痛
急性痛は、主にラットについてはホットプレート（熱板）で測定される。ホットプレート試験の２つの変法を用いる：典型的な変法は、動物を熱表面（５２〜５６℃）に置き、動物が侵害防御機構行動、例えば、ステップ又は足舐めを見せるまでの潜伏時間を測定する。もう１つの変法は、実験動物を自然温度表面に置く温度上昇ホットプレートである。次いで、この表面を、動物が後足を舐め始めるまで連続的ではあるがゆっくり熱する。後足を舐め始めた時に達している温度を、疼痛の閾値の尺度とする。
【０２３９】
化合物を媒体処置コントロール群に対して試験する。物質適用は、疼痛試験前に、異なる適用経路（静脈内、腹腔内、経口、くも膜下腔内、脳室内、皮下、皮内、経皮的）を介して異なる時点で行なう。
【０２４０】
持続痛は、主にラットについてはホルマリン試験又はカプサイシン試験を用いて測定する。１〜５％ホルマリン又は１０〜１００μｇカプサイシン溶液を、実験動物の片方の後ろ足に注射する。ホルマリン又はカプサイシンを適用した後、その動物は、たじろぎ、患部の足を舐めたり、噛んだりして侵害防御応答を見せる。９０分までの期間内の侵害防御応答の数が、疼痛強度の尺度である。
【０２４１】
化合物を媒体処置コントロール群に対して試験する。物質適用は、ホルマリン投与又はカプサイシン投与の前に、異なる適用経路（静脈内、腹腔内、経口、くも膜下腔内、脳室内、皮下、皮内、経皮的）を介して異なる時点で行なう。
【０２４２】
神経因性疼痛
神経因性疼痛は、主にラットにおいては片側坐骨神経損傷の種々の変法により誘導される。手術は感覚消失下で行なわれる。坐骨神経損傷の第一の変法は、共通の坐骨神経周辺を紐でゆるく締め付けることによって行なわれる。第二の変法は、共通の座骨神経の直径が約半分になるまできつく縛ることである。次の変法は、モデル群を用いて、Ｌ５とＬ６脊髄神経又はＬ５脊髄神経のみ、のいずれかをきつく縛ったもの又は切除したものを作製する。第四の変法は、坐骨神経の３つの末端分枝の２つ（脛骨神経及び共通腓骨神経）を軸索切除し、腓腹神経を無傷で残すことを包含するのに対し、最後の変法は、脛骨分枝のみを軸索切除し、腓腹神経及び共通神経を傷付けずに残すことを含む。コントロール動物は偽手術を用いて処置する。
【０２４３】
術後に、神経損傷動物は、慢性機械的異痛症（アロディニア)、冷アロディニア及び温熱性痛覚過敏症を発症する。機械的アロディニアは、圧力変換法（electronic von Frey Anesthesiometer, IITC Inc.-Life Science Instruments, Woodland Hills, SA, USA; Electronic von Frey System, Somedic Sales AB, Hourby, Sweden）により測定する。温熱性痛覚過敏症は、患部の後足の侵害防御応答を疼痛強度の尺度として計数する放射熱源法（Plantar Test, Ugo Basile, Comerio, Italy）又は冷却プレート（５〜１０℃）により測定する。冷却誘導型疼痛の更なる試験は、患部の後肢にアセトンを足裏投与した後の侵害防御応答をカウントすること、又は侵害防御応答の期間である。一般に慢性痛は、活性のサーカディアンリズムを記録すること（Surjo及びArndt, Universit t zu Kouln, Cologne, Germany）、及び進行の差をスコアリングすること（フットプリントパターン; FOOTPRINTSプログラム, Klapdorら、1997. フットプリントパターン分析の低コスト法、J. Neurosci. Methods 75,49-54）により評価する。
【０２４４】
化合物を、偽手術コントロール群及び媒体処置コントロール群に対して試験する。物質適用は、疼痛試験前に、異なる適用経路（静脈内、腹腔内、経口、くも膜下腔内、脳室内、皮下、皮内、経皮的）を介して異なる時点で行なう。
【０２４５】
炎症痛
炎症痛は、主にラットにおいては一方の後足にカラゲナン０.７５ｍｇ又は完全フロインドアジュバンドを注射することによって引き起こす。動物は、機械的アロディニア及び温熱性痛覚過敏症を伴う浮腫を発症する。機械的アロディニアは、圧力変換器法（electronic von Frey Anesthesiometer, IITC Inc.-Life Science Instruments, Woodland Hills, SA, USA）により測定する。温熱性痛覚過敏症は、放射熱源法（Plantar Test, Ugo Basile, Comerio, Italy, Paw thermal stimulator, G. Ozaki, University of California, USA）により測定する。浮腫測定については、２つの方法を用いる。第一の方法は、動物を屠殺して、患部の後足を細分し、重量を測ることである。第二の方法は、プレチスモメーター（Ugo Basile, Comerio, Italy）における水の押しのけ容積を測定することによる足のボリューム（量）の差を含む。
【０２４６】
化合物を、非炎症コントロール群及び媒体処置コントロール群に対して試験する。物質適用は、疼痛試験前に、異なる適用経路（静脈内、腹腔内、経口、くも膜下腔内、脳室内、皮下、皮内、経皮的）を介して異なる時点で行なう。
【０２４７】
糖尿病性神経症性疼痛
ストレプトゾトシン５０〜８０ｍｇ／ｋｇを単回腹腔内注射して処置したラットは、１〜３週間以内に超高血糖及び機械的アロディニアを発症する。機械的アロディニアは圧力変換器法（electronic von Frey Anesthesiometer, IITC Inc.-Life Science Instruments, Woodland Hills, SA, USA）により測定する。
【０２４８】
化合物を、糖尿病及び非糖尿病媒体コントロール群に対して試験する。物質適用は、疼痛試験前に、異なる適用経路（静脈内、腹腔内、経口、くも膜下腔内、脳室内、皮下、皮内、経皮的）を介して異なる時点で行なう。
【０２４９】
２．パーキンソン病
６−ヒドロキシドパミン（６−ＯＨ−ＤＡ）病変
ドーパミン作動性黒質線条体及び線条体淡蒼球経路の変性は、パーキンソン病における中心的な病理現象である。この疾患は、ラットにおいて６−ＯＨ−ＤＡを内側前脳束（ＭＦＢ）中に単回／逐次片側定位（sequential unilateral stereotaxic）注射して実験的に模倣した。
【０２５０】
実験開始時の体重が２００±２５０ｇの雄ウィスターラット（Harlan Winkelmann, Germany）を用いる。実験セッションにない場合、ラットは食料及び水を自由に得ることができ、昼／夜１２時間のサイクルのもと温度や湿度が制御された環境下で飼育する。以下のインビボプロトコールは、政府の権限により認可されている。苦しむ動物を最小限にし、用いる動物の数を減らし、及びインビボ技術の代替案を利用するあらゆる努力をする。
【０２５１】
動物に、モノアミンオキシダーゼによる６−ＯＨＤＡの代謝を阻害するためパージリン（Sigma, St. Louis, MO, USA; 腹腔内へ５０ｍｇ／ｋｇ）と、ノルアドレナリン作動性ターミナルによる６−ＯＨＤＡの取り込みを防止するためであるメチルイミプラミンＨＣｌ（Sigma; 腹腔内へ２５ｍｇ／ｋｇ）とを、外科手術の日に投与する。３０分後、そのラットをペントバービタルナトリウム（５０ｍｇ／ｋｇ）を用いて麻酔し、定位固定フレームに移す。ＤＡ黒質線条体経路を損傷させるため、６−ＯＨＤＡ ＨＢｒ（Sigma）８μｇを含む０.０１％ アスコルビン酸塩４μｌを、左内側前脳側（十字縫合(ブレグマ)及び頭蓋骨表面に対して２.４ｍｍ 前側、１.４９ｍｍ 側方、−２.７ｍｍ 腹側）に１μｌ／分の割合で注射する。ニードル（針）は拡散させるために更に５分間、所定の位置に置く。
【０２５２】
ステッピング試験
前肢無動症（アキネジア）は、損傷設置後の３週間、改変ステッピング試験プロトコルを用いて評価する。簡単には、実験者が片手でこの動物の後肢を固定し、表面から一方の後足をわずかに持ち上げて、その動物を維持する。一方の足をはテーブルについており、初めはフォアハンド方向、その次はバックハンド方向へゆっくり側方移動させる（５秒で１ｍ）。調整ステップの数を、両足について移動のバックハンド方向及びフォアハンド方向においてカウントする。試験の順序は、右足フォアハンド及びバックハンド調整ステップ、その次に左足フォアハンド及びバックハンド方向である。この試験は、第1回目の試験に先立ち３日間の最初のトレーニングの後、連続して３日間で３回繰り返す。フォアハンド調整ステップは、損傷動物と健康なコントロール動物の間に一致した差がないことは明らかである。従って、分析はバックハンド調整ステップに限定される。
【０２５３】
バランス試験
ステッピング試験セッションの間に、姿勢検証後のバランス調整も測定する。ラットはステッピング試験に記載のように同じ位置で維持し、側方移動に変えて、実験者がテーブルについた足を前方向へ傾ける。この演習はバランスの喪失の結果となり、前肢移動でバランスを回復するラットの能力を０〜３の範囲スケールであるコアーする。スコアー０は正常な足設置に与えられる。前肢運動は遅れるが、姿勢バランスの回復が検出される場合は、スコアー１を与える。スコアー２は、バランス回復は成功していないが、筋肉収縮により証明されるように十分とは言えないが明らかな前肢反応を表し、スコアー３は行動の反応のないものに与える。この試験は、第１回目の試験に先立ち３日間の最初のトレーニングの後、３日間連続してそれぞれの側（足）で１日に３回繰り返す。
【０２５４】
階段試験（足到達）
初期又は第二の損傷設置後の３週間の足到達（リーチング）行動を評価するのに、階段試験の改良法を使用する。中心に台と両端に取り外し可能な階段のあるプレキシガラス試験ボックスを用いる。この器具は、それぞれの階段で同じ側の足のみを用い、独立して足の使用を測定できるように設計することができる。それぞれの試験において、動物を１５分間この試験ボックスに置く。各々の側のダブル階段を、７×３飼料の粒（Precision food pellets, formula : P, purified rodent diet, サイズ４５ｍｇ; Sandown Scientific）で満たす。それぞれの試験の後、各々の足について食べた粒（上手く回収した粒）の数と取得した粒（触ったが、落とした）の数、及びその成功率（食べた粒／取得した粒）を別々に計数する。３日間の食料不足（１日当たり１２ｇ／動物）後の動物を１１日間試験する。全ての分析は最後の５日間のみで行なう。
【０２５５】
ＭＰＴＰ処置
神経毒である１−メチル−４−フェニル−１,２,３,６−テトラヒドロ−ピリジン（ＭＰＴＰ）は、げっ歯類、ヒト以外の霊長類及びヒトにおいて中脳ドーパミン作動性（ＤＡergic）ニューロン変性を引き起すことで、多くのパーキンソン病症状を再現する。ＭＰＴＰは、ドーパミンレベル及びその代謝物レベル、並びに線条体におけるドーパミン作動性ターミナル数の顕著な減少を引き起こし、同様に黒質、パルス緻密質におけるチロシン ヒドロキシラーゼ（ＴＨ）−免疫応答細胞体の著しい喪失を引き起こす。
【０２５６】
重篤で、長期に及ぶ損傷を与え、かつ死亡率を減少させるために、ＭＰＴＰを動物に単回注射し、その後重症度について損傷の７〜１０日後に試験する。ＭＰＴＰの連続注射は、１、２及び３日目に投与する。１日に１度食塩水中のＭＰＴＰヒドロクロライド（シグマ）４ｍｇ／ｋｇを、動物に適用する。注射は全て腹腔内（i.p.）で行ない、ＭＰＴＰストック溶液は、注射と注射との間凍結しておく。動物を１１日目に断頭する。
【０２５７】
免疫組織化学
行動実験が終了した時点で、全ての動物をチオペンタール（腹腔内へ１ｇ／４０ｍｌ、Tyrol Parma）３ｍｌで麻酔する。マウスは、０.０１Ｍ ＰＢＳ（ｐＨ ７.４）で２分間、次いでＰＢＳ中の４％ パラホルムアルデヒド（Merck）で１５分間、経肛門的に還流する。その脳を取り出し、４％ パラホルムアルデヒド中に、４℃にて２４時間置く。その後、脱水のために、それを４℃の０.１Ｍ ＰＢＳ中の２０％ スクロース（Merck）溶液に移し、それらを染み込ませる。その脳を−２０℃のメチルブタン中で２分間凍結させ、−７０℃で保存する。スレッジマイクロトーム（mod. 3800-Frigocut, Leica）を用いて、２５μｍの切片を、脳梁（ＡＰ １.７ｍｍ）の膝部から海馬（ＡＰ ２１.８ｍｍ）まで、及びＡＰ２４.１６からＡＰ ２６.７２から得る。４６の切片をカットし、０.２５Ｍ トリスバッファー（ｐＨ ７.４）中に免疫組織化学について分類して保存する。
【０２５８】
一連の切片を、遊離−浮動性チロシンデヒドロキシラーゼ（ＴＨ）免疫組織化学についての処理する。０.１Ｍ ＰＢＳ中で３回すすいだ後、内因性のペルオキシダーゼ活性を、０.３％ Ｈ2Ｏ2±ＰＢＳ中で１０分間クエンチする。ＰＢＳ中であるすいだ後、切片を、ブロッキング物質として１０％ 正常ウシ血清（シグマ）中で５分間予めインキュベートし、一次抗ラットＴＨラビット抗血清（希釈率１：２０００）のいずれかに移す。
【０２５９】
一晩中室温でインキュベートした後、ＴＨ免疫応答に対する切片をＰＢＳ中であるすぎ（２×１０分）、ヤギで産生させたビオチン標識化抗ラビット免疫グロブリンＧ（希釈率１：２００）（Vector）中で９０分間インキュベートし、繰り返しすすぎ、そしてVectastain ＡＢＣ（Vector）溶液中に移し１時間置く。０.００５％ Ｈ2Ｏ2を加えた０.１Ｍ ＰＢＳ中の３,.３'−ジアミノベンジジン テトラヒドロクロリド（ＤＡＢ；Sigma）は、続く可視化反応における色素原として働く。切片を、ゼラチンコーティングスライドに盛り、乾燥させるために一晩中置き、上方（ascending）アルコール濃度中で脱水化し、かつブチルアセテート中で透明になるヘマトキシリンを用いて対比染色(counter-stained)する。カバースリップをエンテラン（entellan）に置く。
【０２６０】
ローターロッド試験
我々は、ＩＢＭ互換パソコン、ＣＩＯ−２４データ取得カード、コントロールユニット、及び４線ロータロッドユニットを含むＣＲ−１ Ｒｏｔａｍｅｘシステム（Columbus Instruments, Columbus, OH）を用いるRozasおよびLabandeira-Garcia(1997)が記載した手順の改良法を使用する。このロータロッドユニットは、回転軸（半径７.３ｃｍ）と、それぞれのマウスに対する個別のコンピューターとから成る。このシステムソフトウェアーは、回転スピードを変えるように（０〜８０ｒｐｍ）セッションプロトコールを予めプラグラムすることができる。赤外線ビームは、マウスがロータロッドの真下の底辺鉄柵（base grid）に落ちた時を検出するために用いる。このシステムでは、落下をマウスについての実験の終了として記録し、ローターロッドにおける全時間、並びに落下時間及び全組み立て(set-up)パラメーターを記録する。また、このシステムでは、トレーニングを目的として、微弱電流を底辺鉄柵を通じて流すことができる。
【０２６１】
３．痴呆
物体認識課題
物体認識課題は、げっ歯類の認識性能における実験操作の効果を評価するために設計した。ラットを、同一の物体が２個ある開けた空間に置く。ラットは、最初の対物認識課題試行の間中、両方の物体を調べる。２度目の試行では、例えば２４時間の保持間隔の後、最初の試行で用いた２個の物体の内の１個「知っている」物体と新しい物体とを、その開けた空間に置く。この物体それぞれを調べる時間を記録する。ＯＲ課題における基礎的な基準は、ラットが２度目の試行で２個の物体を探索するのにかけた時間である。保持の良さは、「知っている」物体よりも新たな物体に対する探索時間が長いことに反映される。
【０２６２】
最初の試行の前に推定される認識エンハンサーを投与することで、習得及び最終的な固定プロセスにおける効果を評価することができる。最初の試行後の試験化合物の投与は、固定プロセスにおける効果を評価できるのに対して、２度目の試行前の投与では、想起プロセスにおける効果を測定できる。
【０２６３】
受動的回避課題
受動的回避課題により、ラット及びマウスにおける記憶性能を評価する。抑制的回避機器は、明区画と暗区画との２つの区画を持つ箱から成る。この２つの区画は、実験者が操作できるギロチンドアによって分けられている。ギロチンドアを上げた場合、２ｃｍの敷居で２つの区画は分けられている。ドアを開けた場合の暗区画の照度は約２luxである。明区画の中央の床の明度は約５００luxである。
【０２６４】
２４時間のセッション間間隔で分けられた２つの習慣セッション、１つのショックセッション及び保持セッションが与えられる。ラットは、習慣セッションと保持セッションにおいて３００秒間器具内を探索することができる。ラットをギロチンドアの反対の壁に頭を向けた状態で、明区画に置く。１５秒の適応時間の後、ギロチンドアを器具内の全領域を自由に動き回れるように開ける。通常、ラットはまぶしい明領域を避け、数秒の内に暗区画に入るであろう。
【０２６５】
ショックセッションにおいては、ラットが４本の足で暗区画に入るやいなや区画間のギロチンドアを下ろし、すぐさま１ｍＡのフットショックを２秒間与える。ラットを器具から取り出し、ホーム籠に戻す。保持セッション中の手順は、習慣セッションの手順と同じである。
【０２６６】
ステップ通過潜伏、すなわち保持セッション中に暗区画に入る最初の潜伏（秒）は、動物の記憶性能の指標である；暗区画に入る潜伏が長ければ長いほど、保持はよりよい。ショックセッションの３０分前に、スコポラミン１ｍｇ*ｋｇ-1と一緒に試験化合物を与える。スコポラミンは、２４時間後の保持セッション中の記憶性能を損なわせる。試験化合物が、スコポラミン処置コントロールと比較して侵入潜伏を増大させる場合、認識増進させる可能性があり得る。
【０２６７】
モーリス水脱出課題
モーリス水脱出課題により、げっ歯類における空間方向学習を測定する。ラット及びマウスの認知機能において推定される治療効果を調査するのに広く用いられている試験系である。動物のこの性能は、水面下約１ｃｍのところに沈んでいる避難用台のある円形水タンクにおいて評価する。避難用台は、水タンク中を泳いでいる動物には見えない。机、コンピューター設備、第二の水課題を備え、実験者が居る室内の備品及び優しく響く柵上のラジオにより、膨大な迷路外合図を与える。
【０２６８】
動物は、日々の獲得セッション５日の間に４回の試行を受ける。試行は、動物をプール中に置き、タンクの壁に頭を向けることによって始める。四分区画、北、西、南及び東の４つの開始位置のそれぞれは一連の４回の試行で１度は用いる（それらの順序は無作為である）。その避難用台はいつも同じ場所にある。試行は、初めにどんな出来事があっても、動物が避難用台に上った時か又は９０秒経過した時に終了する。その動物はその台上に３０秒間留まることができる。その後台から下し、次の試行を始める。動物が９０秒以内に台を見つけられなかった場合でも、実験者がその動物を台の上に置き、３０秒間そこに留まらせる。５日目の日々のセッションの第４回目の試行後に、探知試行として更なる試行を行なう：それは、台を取りだし、動物が４つの４分円内で過ごす時間を３０秒又は６０秒間測定する。この探知試行において、動物は全て、獲得セッションの間に避難用台が置いてあった４分円の反対側の同じ開始位置から始める。
【０２６９】
動物の性能を評価するため、獲得トレーニングの間に４つの異なる基準：避難潜伏、移動距離、台への距離及び水泳速度を得る。探知試行については以下の基準：４分円内における時間（秒）及び４つの４分円内での移動距離（ｃｍ）を評価する。この探知試行は、動物が避難用台の位置をどれくらい良く学習したかについての情報をさらに与える。動物が、獲得セッション中に台のあった４分円内で、その他の４分円における時間および距離よりも、より多くの時間を費やし、より多くの距離を泳いだ場合、これは結論として、台の位置をよく学習したことを示す。
【０２７０】
推定される認知増進化合物の効果を評価するために、認知機能を損なわせる特定の脳損傷を持つラット若しくはマウス、又は正常な学習を妨げるスコポラミン若しくはＭＫ−８０１などの化合物で処置した動物、又は認知欠損を患っている高齢動物を用いる。
【０２７１】
Ｔ迷路自発的択一課題
Ｔ迷路自発的択一課題（ＴｅＭＣＡＴ）により、マウスの空間認知性能を評価する。Ｔ迷路のスタートアームと２つのゴールアームは、実験者が手動で操作できるギロチンドアを備えている。トレーニングの開始時、マウスをスタートアーム置く。ギロチンドアは閉めてある。最初の試行、「強制試行」では、左又は右のいずれかのゴールアームはギロチンドアを下げてブロックする。マウスがスタートアームから離れた後、迷路を乗り越え、最終的に開いているゴールアームに入り、そしてスタート地点にもどり、そこでギロチンドアを下げることによって５秒間閉じ込められる。次に動物は、１４回の「自由選択」試行の間に左と右のゴールアームを自由に選ぶことができる（全てのギロチンドアは開いている）。マウスが一方のゴールアームに入るとすぐに、もう一方のゴールアームを閉じる。マウスは最終的にスタートアームに戻り、マウスはスタートアームに５秒間閉じ込められた後、望むいずれのゴールアームにも自由に向かうことができる。１回のセッション中１４回の自由選択試行が完了した後、動物を迷路から取り出す。トレーニングの間には、マウスに決して手を触れない。
【０２７２】
１４回後の試行の択一パーセントを計算する。このパーセントと最初の強制試行及び連続１４回の選択試行を完了するのに要した時間（秒）とを分析する。認知欠損は、通常、トレーニングセッションの開始３０分前にスコポラミンを注射することによって誘導する。スコポラミンは、択一パーセントレベルを偶然レベルか又はそれより低いレベルにまで下げる。通常トレーニング試行の前に投与される認知エンハンサーは、少なくとも部分的には偶発的択一率のスコポラミン誘導型低下を拮抗し得る。
【０２７３】
実施例１０
ＣＯＰＤ動物モデルにおける試験化合物効果の同定
ギニアピッグを、１回タバコの煙に５０分間曝す。曝した後１０分〜２４時間の間に動物を屠殺し、その肺をＲＮＡｌａｔｅｒTM中に置く。肺組織をホモジナイズし、キアゲンＲＮｅａｓｙTMＭａｘｉキットを用いて、全ＲＮＡを抽出した。Molecular Probes RiboGreenTMRNA定量法を用いて、それぞれの試料におけるＲＮＡ量を定量する。
【０２７４】
全ＲＮＡを定量し、得られたｃＤＮＡを実時間ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に用いる。そのｃＤＮＡを、センス−及びアンチセンス−プライマー、並びにＤＳＰＰ７様タンパク質遺伝子の６−カルボキシ−テトラメチル−ローダミン標識化プローブを含む溶液に加える。サイクロフィリンをハウスキーピング遺伝子として用いる。ＤＳＰＰ７様タンパク質遺伝子の発現を、それぞれの試料についての増幅曲線を作り出すＴａｑＭａｎ実時間ＰＣＲシステムを用いて測定する。この曲線から閾（threshold）サイクル値を計算する：その増幅標的量が固定された閾値に達する機能サイクル数。ＤＳＰＰ７様タンパク質遺伝子の多数コピーを含む試料は、少ないコピーを含む試料よりも早く閾に達する。閾を０.２に設定し、閾サイクルＣTを増幅曲線から計算する。ＤＳＰＰ７様タンパク質遺伝子のＣT値を、ハウスキーピング遺伝子のＣT値を用いて標準化する。
【０２７５】
ＤＳＰＰ７様タンパク質遺伝子の発現は、空気に曝したコントロール動物と比較して、タバコ煙曝露１０分〜３時間後の動物とでは、少なくとも３倍増大する。
【０２７６】
以下のように試験化合物を評価する。動物を、タバコ煙曝露５分〜１時間前に試験化合物で前処理し、次いでタバコ煙曝露を行なった３時間後までに屠殺する。コントロール動物は、試験化合物の際に選んだ投与経路を介して、試験化合物の媒体で前処理する。媒体処置したタバコの煙曝露動物に見られる発現と比較して、ＤＳＰＰ７様タンパク質遺伝子のタバコ煙誘導性上方制御を低下させる試験化合物を、ＤＳＰＰ７様タンパク質遺伝子発現の阻害物質として同定する。
【０２７７】
実施例１１
ヒトＤＳＰＰ７様タンパク質の発現
Ｔａｑｍａｎ定量分析に使用した全ＲＮＡは、購入（Clontech, CA）するか、またはＴＲＩｚｏｌ試薬（Life Technologies, MD）を用い、Rneasyプロコトル（Qiagen, CA）を利用する修飾された製造者のプロトコルにしたがって組織から抽出した。
【０２７８】
ＲＮｅａｓｙまたはＱｉａＡｍｐカラムを用いるために、各ＲＮＡ１００μgを、ＲＮａｓｅフリーＤＮａｓｅ（Qiagen, CA）を用いて、ＤＮａｓｅＩで処理した。
【０２７９】
溶出およびRibogreen (Molecular Probes Inc., OR)で定量した後、製造者(Life Technologies, MD)のプロトコルに従って、RT-PCRのために各試料をGibcoBRL Superscript II First Strand Synthesis Systemを用いて逆転写した。反応混合物中のＲＮＡの最終濃度は、５０ｎg／μLであった。逆転写は、５０ｎgのランダムヘキサマーを用いて行った。
【０２８０】
具体的なフォワードまたはリバースプライマーをPE Applied Biosystemsの推奨にしたがって設計した。使用したプローブはＳＹＢＲグリーンであった。
【０２８１】
定量実験を、各試料由来の２５ｎgの逆転写ＲＮＡについて行った。Pre-Developed TaqMan 分析試薬 (PDAR)(PE Applied Biosystems, CA)を用いて、１８ＳリボソームＲＮＡを対照として測定した。分析反応混合物は以下のとおりであった：
2004529639.tif 000002
【０２８２】
実験は、ABI Prism 7700 配列検出装置(PE Applied Biosystems, CA)を用いて行った。実験の最後で、ＰＣＲの間で得られた蛍光データを、ABI Prism 7700のユーザーマニュアルに記載されているとおりに処理した。１８Ｓ値に標準化して、デルタ−デルタＣＴ法を用いて変化の倍数を計算した。相対的発現を１８Ｓ（Ｄ，Ｃｔ）に標準化した後、最も高い発現組織を１００として、それぞれをそれに対して相対化することによって計算した。Ｃｎ＝１０（Ｃｔ−４０．００７）／３．６２３の式を用いた標準化なしにコピー数変換を行った。
【０２８３】
結果を図１１および１２に示す。
【０２８４】
肝臓で発現したヒトＤＳＰＰ７様タンパク質を調節して糖新生とインスリン感受性を調節することができた。
【０２８５】
実施例１２
喘息の処置のための化合物のイン・ビボ試験
１．マウス抗ＣＤ３誘発サイとカイン産生モデルにおけるＴ細胞の活性に関する試験
BALB/cマウスに、１０μgの１４５−２Ｃ１１(精製ハムスター抗マウスＣＤ３εモノクローナル抗体, PHARMINGEN)を１回静脈注射する。抗ＣＤ３ｍＡｂ注入の６０分前に化合物を投与する。抗体注射の９０分後に血液を採取する。３０００r.p.m、１０分間の遠心により血清を得る。血清中のＩＬ−２およびＩＬ−４レベルをＥＬＩＳＡにより測定する。
【０２８６】
２．マウス抗ＩｇＤ誘発ＩｇＥ産生モデルにおけるＢ細胞の活性についての試験
BALB/cマウスに、０．８ｍgの精製したヤギ抗マウスＩｇＤ抗体またはＰＢＳ(０日目として定義）を静脈内注射する。化合物を０日目〜６日目まで腹腔内投与する。７日目に血液を採取し、３０００r.p.m、１０分間の遠心により血清を得る。ＩｇＥの全血清レベルをYAMASA's ELISAキットにより測定し、Ig ELISA キット(Rougier Bio-tech's, Montreal, Canada)を用いてそれらをサブタイプに分ける。
【０２８７】
３．マウスＬＰＳ誘発ＴＮＦ−α産生モデルにおける単球／マクロファージの活性についての試験
BALB/cマウスにＬＰＳ（２００μg／マウス）を腹腔内注射する。ＬＰＳ注射の１時間前に化合物を腹腔内投与する。ＬＰＳ投与の９０分後に血液を採取し、血漿を得る。試料中のＴＮＦ−α濃度をＥＬＩＳＡキットを用いて測定する。
【０２８８】
４．エオタキシン誘発マウスにおける好酸球増多症モデルにおける好酸球活性化の試験
エアポーチを作製する３〜６日前に、BALB/cマウスに２．５ｍLの空気を皮下注射する。０日目に化合物をエオタキシン注射（３μg／マウス、i.d.）の６０分前に腹腔内投与する。ＩＬ−５（３００ｎg／マウス）を、エオタキシン投与の３０分前に静脈内投与する。エオタキシン注射の４時間後に滲出物中の白血球を採集し、その全細胞数を計測する。May-Grunwald Gimsa溶液を用いて、滲出物中の区別的細胞計数を行う。
【０２８９】
５．マウスＤ１０細胞転移モデルにおけるＴｈ２細胞の活性化の試験
生理食塩水中に２ｍgのコンカナバリンを含有するＤ１０．Ｇ４．１細胞（１×１０7細胞／マウス）をＡＫＲマウスに静脈内投与した。６時間後に血液を採集し、血清を３０００r.p.m、１０分間の遠心により得た。血清中のＩＬ−４およびＩＬ−５レベルをＥＬＩＳＡキットにより測定する。化合物をこれら細胞の注射の４日前〜１日後に腹腔内投与する。
【０２９０】
６．ラットにおける受動皮膚アナフィラキシー（ＰＣＡ）試験
６週齢の雄性Wistarラットに、軽い麻酔下で、０．１μg／ｍLのマウス抗ＤＮＰＩｇＥモノクローナル抗体（SPE-7）５０μLを剃毛した背中に皮下（i.d.）感作する。２４時間後、０．６ｍgのＤＮＰ−ＢＳＡ（３０）（LSL, CO., LTD）および０．００５ｇのEvansブルーを含有する生理食塩水１ｍLを用いて静脈内で抗原投与する。抗原注射の０．５時間前に化合物を腹腔内注射する。感作、抗原投与および化合物の処置をしていないラットをブランク（対照）として用い、感作、抗原投与およびビークルで処置をしたラットを阻害なしの数値を求めるために用いる。抗原投与の２０分後に、ラットを殺し、背中の皮膚を剥がし、皮膚におけるEvansブルー染料を、６３℃にて一晩、ホルムアルデヒド中に抽出する。ついで、６２０ｎｍでの吸光度を測定し、抽出された染料の光学密度を求める。
【０２９１】
化合物によるＰＣＡの阻害百分率は以下のようにして計算する：
阻害（％）＝{（ビークル値平均−サンプル値）／（ビークル値平均−コントロール値平均）}×１００
【０２９２】
７．ラットにおけるアナフィラキシー性の気管支収縮
６週齢のの雄性Wistarラットに、１０μgのマウス抗ＤＮＰＩｇＥ、SPE-7、を静脈内して感作し、１日後に、ウレタン（１０００ｍg／ｋg、i.p.）およびゲラミン（５０ｍg／ｋg、i.v.）による麻酔下で、ラットに１．５ｍgのＤＮＰ−ＢＳＡ（３０）０．３ｍLを静脈内に抗原投与する。人工呼吸（２ｍL／ストローク、７０ストローク／分）のため気管にカニューレを挿入する。圧力変換器につないだカニューレのサイドアームを介して肺の空気圧（ＰＩＰ）を記録する。ＰＩＰの変化は、肺の抵抗とコンプライアンスの両方の変化を反映する。薬物を評価するために、各薬物を抗原投与の５分前にi.v.投与する。
【０２９３】
参考文献
1.  Groom LA, Sneddon AA, Alessi DR, Dowd S, Keyse SM. Differential regulation of the MAP, SAP and RK/p38 kinases by Pyst1, a novel cytosolic dual-specificity phosphatase. EMBO J. 1996 Jul 15;15(14):3621-32.
2.  Furukawa T, Yatsuoka T, Youssef EM, Abe T, Yokoyama T, Fukushige S, Soeda E, Hoshi M, Hayashi Y, Sunamura M, Kobari M, Horii A. Genomic analysis of DUSP6, a dual specificity MAP kinase phosphatase, in pancreatic cancer. Cytogenet Cell Genet. 1998;82(3-4):156-9.
3.  Stewart AE, Dowd S, Keyse SM, McDonald NQ. Crystal structure of the MAPK phosphatase Pyst1 catalytic domain and implications for regulated activation. Nat Struct Biol. 1999 Feb;6(2):174-81.
4.  Lerman MI, Minna JD. The 630-kb lung cancer homozygous deletion region on human chromosome 3p21.3: identification and evaluation of the resident candidate tumorsuppressor genes. The International Lung Cancer Chromosome 3p21.3 Tumor Suppressor Gene Consortium. Cancer Res. 2000 Nov 1;60(21):6116-33.
【図面の簡単な説明】
【０２９４】
【図１】二重特異性タンパク質ホスファターゼ７様タンパク質ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列（配列番号１）を示す。
【図２】図１のＤＮＡ配列から推定されるアミノ酸配列（配列番号２）を示す。
【図３】swiss|Q16828|DUS7_HUMANによって同定されるタンパク質のアミノ酸配列（配列番号３）を示す。
【図４】二重特異性タンパク質ホスファターゼ７様タンパク質ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列（配列番号４）を示す。
【図５】swissnew|Q16828|DUS6_HUMAN（配列番号１７）に対する３４９_タンパク質（配列番号２）に対するBLASTPアライメントを示す。
【図６】swiss|Q16829|DUS7_HUMAN（配列番号３）に対する３４９_タンパク質（配列番号２）に対するBLASTPアライメントを示す。
【図７】pdb|1MKP|1MKPに対する３４９_タンパク質（配列番号２）に対するBLASTPアライメントを示す。
【図８】pfam|hmm|DSPcに対する３４９_タンパク質（配列番号２）に対するBLASTPアライメントを示す。
【図９】pfam|hmm|Rhodaneseに対する３４９_タンパク質（配列番号２）に対するBLASTPアライメントを示す。
【図１０】ブロックサーチを示す。
【図１１】ヒトＤＳＰＰ７様タンパク質の相対的発現量を示す。
【図１２】肺および肺細胞におけるヒトＤＳＰＰ７様タンパク質の相対的発現量を示す。
【図５Ａ】
2004529639.tif 000003
【図５Ｂ】
2004529639.tif 000004
【図６】
2004529639.tif 000005
【図７】
2004529639.tif 000006
【図８】
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【図９】
2004529639.tif 000008
【図１０】
2004529639.tif 000009
【図１１】
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【図１２】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004529639.tif 000144
【国際調査報告】
2004529639.tif 000145
2004529639.tif 000146
2004529639.tif 000147
2004529639.tif 000148
2004529639.tif 000149