(57)【要約】【課題】本発明は、ピロールを含有する生体化合物を測定する方法およびこの方法で用いることができる化学組成物。【解決手段】この方法は、生体化合物をａ）　生体化合物とともに反応生成物を形成し、ついで、反応生成物とともに複合体を形成する検出可能分子に暴露される、結合したまたは結合可能な誘導体化剤、またはｂ）　生体化合物とともに反応生成物を形成し、ついで反応生成物において生体化合物に特異的な、結合した結合剤に暴露される誘導体化剤、またはｃ）　生体化合物に特異的な結合剤であって、ついで生体化合物とともに反応生成物を形成する誘導体化剤に暴露される結合剤の１つに接触させること、および結合した生体化合物の量を決定することを必要とする。抗原を調製する方法も提供される。【選択図】図１
2004510981.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ピロールを含有する生体化合物を測定する方法であって、
ｉ）生体化合物を
ａ）任意に標識された誘導体化剤（固相支持体に結合したまたは結合することができる）であって、この誘導体化剤は生体化合物とともに反応生成物を形成し、ついで反応生成物との複合体を形成する検出可能分子に暴露される誘導体化剤、または
ｂ）固相支持体に結合しない任意に標識された誘導体化剤であって、その際、この誘導体化剤は生体化合物とともに反応生成物を形成し、ついで反応生成物において生体化合物に特異的な結合剤に暴露され、前記結合剤が固相支持体に結合される誘導体化剤、または
ｃ）固相支持体に結合した結合剤であって、その際、前記結合剤は生体化合物に特異的であり、それと複合体を形成し、ついで、前記複合体の生体化合物部分と反応生成物を形成する任意で標識された誘導体化剤に暴露される結合剤の１つと接触させること、および
ｉｉ）検出可能な分子を検出することによって、または遊離の若しくは結合した結合剤の量を測定することによって、または存在する標識の量を測定することによって結合した生体化合物の量を決定し、それによってピロール含有生体化合物を測定すること、を含むピロール含有生体化合物の測定方法。
【請求項２】
（ａ）結合した形態にて以下の構造の誘導体化剤に生体化合物を接触させ、
【化１】
2004510981.tif 000015
式中、Ｒ１はアルキル基、Ｒ２はアルキル基、Ａは連結基、Ｂは固相支持体であり、その際、接触には反応生成物の形成が誘導され、この反応生成物は誘導体化剤への生体化合物の共有結合を含むこと、
（ｂ）検出可能分子に反応生成物を接触させ、その際、接触には反応生成物に検出可能分子を特異的に結合して複合体を提供することが誘導されること、
（ｃ）検出可能分子を検出し、それによってピロール含有生体化合物を測定すること、を含む請求項１に記載のピロール含有生体化合物の測定方法。
【請求項３】
Ｒ１が１〜１０の炭素原子を含有する直鎖アルキル基、Ｒ２が１〜１０の炭素原子を含有する直鎖アルキル基である請求項２に記載のピロール含有生体化合物の測定方法。
【請求項４】
Ａがヘテロアルキル基である請求項２に記載のピロール含有生体化合物の測定方法。
【請求項５】
検出分子が１次モノクローナル抗体である請求項２に記載のピロール含有生体化合物の測定方法。
【請求項６】
Ｒ１が１〜５の炭素原子を含有する直鎖アルキル基、Ｒ２が１〜５の炭素原子を含有する直鎖アルキル基である請求項３に記載のピロール含有生体化合物の測定方法。
【請求項７】
Ａが少なくとも１つの窒素原子を含むヘテロアルキル基である請求項４に記載のピロール含有生体化合物の測定方法。
【請求項８】
方法が、１次モノクローナル抗体に特異的に結合する２次モノクローナル抗体に複合体を接触させることをさらに含む請求項５に記載のピロール含有生体化合物の測定方法。
【請求項９】
誘導体化剤が結合した形態にて以下の構造のものである請求項６に記載のピロール含有生体化合物の測定方法。
【化２】
2004510981.tif 000016
【請求項１０】
Ａが少なくとも１つの窒素原子を含有するヘテロアルキル基であり、検出分子が１次モノクローナル抗体である請求項９に記載のピロール含有生体化合物の測定方法。
【請求項１１】
方法が、１次モノクローナル抗体に特異的に結合する２次モノクローナル抗体に複合体を接触させることをさらに含む請求項１０に記載のピロール含有生体化合物の測定方法。
【請求項１２】
ａ）溶液中にて任意で標識された誘導体化剤に生体化合物を接触させてそれとの反応生成物を形成し、ついで、固相支持体に結合した結合剤に暴露し、その際、結合剤は反応生成物において生体化合物に特異的であること、および
ｂ）固相支持体に結合した標識された誘導体化剤の量を決定することにより結合した生体化合物の量を決定し、それによってピロール含有化合物を測定すること、を含む請求項１に記載のピロール含有生体化合物の測定方法。
【請求項１３】
誘導体化剤がビオチン化されたエーリッヒ試薬である請求項１２に記載のピロール含有生体化合物の測定方法。
【請求項１４】
誘導体化剤が放射性標識、蛍光標識または酵素標識によって標識される請求項１２のピロール含有生体化合物の測定方法。
【請求項１５】
結合剤との接触に先立って反応生成物を含有する溶液を中和する請求項１２に記載のピロール含有生体化合物の測定方法。
【請求項１６】
ａ）溶液中にて誘導体化剤に生体化合物を接触させ、その際、誘導体化剤が強い結合対の第１のパートナーを含むこと、
ｂ）その表面上に強い結合対の第２のパートナーを有する固相支持体に反応生成物を接触させ、反応生成物とともに結合複合体を形成すること、
ｃ）検出可能分子に結合複合体を接触させること、
ｄ）結合した生体化合物の量を決定し、それによってピロール含有生体化合物を測定すること、を含む請求項１に記載のピロール含有生体化合物の測定方法。
【請求項１７】
固相支持体との接触に先立って反応生成物を含有する溶液を中和する請求項１６に記載のピロール含有生体化合物の測定方法。
【請求項１８】
検出可能分子が生体化合物に特異的なモノクローナル抗体であり、固相支持体に結合するＭＡｂの量を検出することによって生体化合物の量を決定する請求項１６に記載のピロール含有生体化合物の測定方法。
【請求項１９】
ａ）結合した形態にて以下の構造の誘導体化剤に生体化合物を接触させ、
【化３】
2004510981.tif 000017
その際、Ｒ１はアルキル基、Ｒ２はアルキル基、Ｒ４はへテロアルキル基、Ｘは第１の標識分子であり、かつ強い結合対の第１のパートナーとして作用し、Ｙは第２の標識分子であり、かつ固相支持体表面上の強い結合対の第２のパートナーとして作用し、その際、接触は反応生成物の形成を誘導し、その際、この反応生成物は誘導体化剤への生体化合物の共有結合を含むこと、
ｂ）検出可能分子に反応生成物を接触させ、その際、この接触は、検出可能分子が反応生成物に特異的に結合して複合体を提供することを誘導すること、
ｃ）検出可能分子を検出し、それによってピロール含有生体化合物を測定すること；を含む請求項１６に記載のピロール含有生体化合物の測定方法。
【請求項２０】
Ｒ１が１〜１０の炭素原子を含有する直鎖アルキル基、Ｒ２が１〜１０の炭素原子を含有する直鎖アルキル基である請求項１９に記載のピロール含有生体化合物の測定方法。
【請求項２１】
Ｒ４が２〜１０の炭素原子および少なくとも２のヘテロ原子を含有する直鎖へテロアルキル基である請求項１９のピロール含有生体化合物の測定方法。
【請求項２２】
Ｙがその表面上にアビジンを有する固相支持体である請求項１９に記載のピロール含有生体化合物の測定方法。
【請求項２３】
検出可能分子が１次モノクローナル抗体である請求項１９に記載のピロール含有生体化合物の測定方法。
【請求項２４】
Ｒ１が１〜５の炭素原子を含有する直鎖アルキル基、Ｒ２が１〜５の炭素原子を含有する直鎖アルキル基である請求項１９に記載のピロール含有生体化合物の測定方法。
【請求項２５】
方法が、１次モノクローナル抗体に特異的に結合する２次モノクローナル抗体に複合体を接触させることをさらに含む請求項１８に記載のピロール含有生体化合物の測定方法。
【請求項２６】
誘導体化剤が、結合した形態にて、以下の構造のものであり、
【化４】
2004510981.tif 000018
式中、Ｒ１は１〜５の炭素原子を含有する直鎖アルキル基、Ｒ２は１〜５の炭素原子を含有する直鎖アルキル基、Ｒ４は２〜１０の炭素原子および少なくとも２のヘテロ原子を含有する直鎖へテロアルキル基、Ｙはその表面にアビジンまたはストレプトアビジンを有する固相支持体である請求項２５に記載のピロール含有生体化合物の測定方法。
【請求項２７】
Ｒ１がＣＨ３、Ｒ２が−ＣＨ２ＣＨ２−、Ｒ４が−ＮＨ（ＣＨ２）５ＮＨ−または−ＮＨ（ＣＨ２）２ＳＳ（ＣＨ２）２ＮＨＣ（Ｏ）（ＣＨ２）５ＮＨ−である請求項２６に記載のピロール含有生体化合物の測定方法。
【請求項２８】
Ｒ４が−ＮＨ（ＣＨ２）５ＮＨ−である請求項２７に記載のピロール含有生体化合物の測定方法。
【請求項２９】
以下の構造の化合物
【化５】
2004510981.tif 000019
式中、Ｒ１はアルキル基、Ｒ２はアルキル基、Ａは連結基、Ｂは固相支持体である。
【請求項３０】
Ｒ１が１〜１０の炭素原子を含有する直鎖アルキル基、Ｒ２が１〜１０の炭素原子を含有する直鎖アルキル基である請求項２９に記載の化合物。
【請求項３１】
Ｒ１が１〜５の炭素原子を含有する直鎖アルキル基、Ｒ２が１〜５の炭素原子を含有する直鎖アルキル基、Ａがヘテロアルキル基である請求項３０に記載の化合物。
【請求項３２】
Ｒ１がＣＨ３、Ｒ２が−ＣＨ２ＣＨ２−、Ａが少なくとも１つの窒素原子を含むヘテロアルキル基である請求項３１に記載の化合物。
【請求項３３】
以下の構造の化合物
【化６】
2004510981.tif 000020
式中、Ｒ１は１〜１０の炭素原子を含有する直鎖アルキル基、Ｒ２は１〜１０の炭素原子を含有する直鎖アルキル基、Ｒ４は２〜１０の炭素原子および少なくとも２のヘテロ原子を含有する直鎖へテロアルキル基である。
【請求項３４】
Ｒ１が１〜５の炭素原子を含有する直鎖アルキル基、Ｒ２が１〜５の炭素原子を含有する直鎖アルキル基である請求項３３に記載の化合物。
【請求項３５】
Ｒ１が−ＣＨ３、Ｒ２が−ＣＨ２ＣＨ２−、Ｒ４が−ＮＨ（ＣＨ２）５ＮＨ−または−ＮＨ（ＣＨ２）２ＳＳ（ＣＨ２）２ＮＨＣ（Ｏ）（ＣＨ２）５ＮＨ−である請求項３４に記載の化合物。
【請求項３６】
Ｒ４が−ＮＨ（ＣＨ２）５ＮＨ−である請求項３５に記載の化合物。
【請求項３７】
抗原の調製方法であって
ｉ）ピロール含有生体化合物を
ａ）任意に標識された誘導体化剤（固相支持体に結合したまたは結合することができる）であって、この誘導体化剤は生体化合物とともに反応生成物を形成し、ついで反応生成物との複合体を形成する検出可能分子に暴露される誘導体化剤、または
ｂ）固相支持体に結合しない任意に標識された誘導体化剤であって、その際、この誘導体化剤は生体化合物とともに反応生成物を形成し、ついで反応生成物において生体化合物に特異的な結合剤に暴露され、前記結合剤が固相支持体に結合される誘導体化剤、または
ｃ）固相支持体に結合した結合剤であって、その際、前記結合剤は生体化合物に特異的であり、それと複合体を形成し、ついで、前記複合体の生体化合物部分と反応生成物を形成する任意で標識された誘導体化剤に暴露される結合剤、の１つと接触させること、および
ｉｉ）固相支持体からこの生体化合物を溶出すること；を含む、抗原の調製方法。
【請求項３８】
誘導体化剤が、結合した形態にて以下の構造のものである請求項３７に記載の方法：
【化７】
2004510981.tif 000021
式中、Ｒ１はアルキル基、Ｒ２はアルキル基、Ａは連結基、Ｂは固相支持体である。
【請求項３９】
誘導体化剤が、結合した形態にて以下の構造のものである請求項３７に記載の方法：
【化８】
2004510981.tif 000022
式中、Ｒ１はアルキル基、Ｒ２はアルキル基、Ｒ４はヘテロアルキル基、Ｘは強い結合対の第１のパートナー、Ｙはその表面上に強い結合対の第２のパートナーを有する固相支持体である。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ピロール含有生体化合物の測定方法およびこの方法で使用することができる化学組成物に関する。さらに具体的には、特定の疾患状態のマーカーであるピロール含有分子の検出方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
エーリッヒ試薬、またはｐ−ジメチルアミノベンズアルデヒド（１）は、ピロール類およびインドール類と反応して発色性化合物を形成することができる分子である。
【０００３】
【化９】
2004510981.tif 000003
【０００４】
Ｇ．ロンバード（Ｌｏｍｂａｒｄ）およびＶ．ドウエル（Ｄｏｗｅｌｌ）のＪ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（１９８３年）第１８巻の６０９〜６１３を参照のこと。
【０００５】
【化１０】
2004510981.tif 000004
【０００６】
作用機序は、通常、ピロールのα−炭素原子上での求電子攻撃として説明される。この攻撃が、可視スペクトルの光を吸収する高度に共役した陽イオンを形成する。前記組織Ａにかかる機序を模式的に表す。
【０００７】
特定の化合物とのエーリッヒ試薬の反応が議論されている。例えば、アイヤル（Ｉｙｅｒ）は、ＬＧＥ２がタンパク質と反応するとき、ピロールが形成されることを報告した。アイヤルらのＪ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．（１９９４年）第５９巻の６０３８〜６０４３を参照のこと。ＢＦ３ＯＥｔ２の存在下でピロールがエーリッヒ試薬と接触すると、青緑の発色団を生じた。その発色団は、ピロールの求電子置換生成物として特定された。ロンバード（Ｌｏｍｂａｒｄ）は、エーリッヒ試薬と細菌に由来するインドール類との間の反応を報告した。Ｇ．ロンバードおよびＶ．ドウエルのＪ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（１９８３年）第１８巻の６０９〜６１３を参照のこと。２つのその他のインドール検出化合物：コバック（Ｋｏｖａｃ）試薬およびＤＭＣＡとその試薬の感受性を比較した。インドールの検出において、エーリッヒ試薬は、ＤＭＣＡより１０倍感受性が低く、コバック試薬よりも１０倍感受性が高いと報告された。
【０００８】
エーリッヒ試薬は、標的物質におけるピロールまたはインドールの存在をおおまかに検出するのに用いられてきたが、かかる複素環化合物を検出するために改善された組成物および方法は、特定の疾患状態のマーカーであるピロール含有分子を検出するのに備えた特に望ましい方法である。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明は、ピロール含有生体化合物の測定方法を提供する。
【００１０】
事例の１つでは、方法は、
１）生体化合物が
ａ）任意に標識された誘導体化剤（固相支持体に結合した、または結合することができる）であって、この誘導体化剤は生体化合物とともに反応生成物を形成し（好ましくは、それに対する共有結合を介して）、ついで反応生成物との複合体を形成する検出可能分子に暴露される誘導体化剤、または
ｂ）固相支持体に結合しない任意に標識された誘導体化剤であって、この誘導体化剤は生体化合物とともに反応生成物を形成し（好ましくは、それに対する共有結合を介して）、ついで反応生成物において生体化合物に特異的な結合剤に暴露され、前記結合剤が固相支持体に結合される誘導体化剤、または
ｃ）固相支持体に結合した結合剤であって、その際、前記結合剤は生体化合物に特異的であり、それと複合体を形成し、ついで、前記複合体の生体化合物部分と反応生成物を形成する（好ましくはそれに対する共有結合を介して）任意で標識された誘導体化剤に暴露される結合剤のいずれかと接触すること、および
２）検出可能な分子を検出することによって、または遊離の若しくは結合した結合剤の量を測定することによって、または存在する標識の量を測定することによって結合した生体化合物の量を決定することを必要とする。
【００１１】
好ましくは、ピロール含有生体化合物の測定方法は、前記ａ）部分に記載された方法１である。方法１は以下の工程を必要とする。
１）生体化合物を結合した形態における以下の構造の誘導体化剤と接触させ、
【００１２】
【化１１】
2004510981.tif 000005
【００１３】
式中、Ｒ１はアルキル基、Ｒ２はアルキル基、Ａは連結基、Ｂは固相支持体である。その際、接触が反応生成物の形成を誘導し、この反応生成物は誘導体化剤に対する生体化合物の共有結合を含み、ついで反応生成物を検出可能分子に接触させ、その際、接触が反応生成物に対する検出可能分子の特異的な結合を誘導し、複合体を提供する工程、および
２）検出可能分子を検出することによって結合した生体物質の量を決定する工程。
【００１４】
好ましくは、検出可能分子は生体化合物に特異的なモノクローナル抗体（ＭＡｂ）である。好ましくは、固相支持体は、微量滴定用のまたは処理したガラス製のスライドである。
【００１５】
好ましくは、ピロール含有生体化合物の測定方法は、前記ｂ）部分に記載された方法２である。方法２は以下の工程を必要とする。
１）溶液中にて生体化合物を任意で標識した誘導体化剤と接触させて、それとの反応生成物を形成し（好ましくは、それに対する共有結合を介して）、ついで固相支持体に結合する結合剤に暴露し、反応生成物中で前記結合剤が生体化合物に特異的である工程、および
２）固相支持体に結合する標識された誘導体化剤の量を測定することによって結合した生体化合物の量を決定する工程。
【００１６】
好ましくは、誘導体化剤は、ビオチン化したエーリッヒ試薬である。好ましくは、結合した結合剤との接触に先立って、反応生成物を含有する溶液を中和する。好ましくは、結合したＭＡｂは、固相支持体、好適には、微量滴定用プレートまたは処理したガラス製スライドに結合される。
【００１７】
好ましくは、誘導体化剤は、標識分子、好適には放射性標識、蛍光標識、酵素標識などによって標識される。好ましくは、固相支持体に結合した標識した誘導体化剤の量を検出することによって結合した生体化合物の量を決定する。
【００１８】
方法２は、誘導体化試薬のピロールとの反応には、相対的に強い酸性条件が必要であるという事実を考慮に入れる。したがって、抗体−抗原複合体のような非共有結合の相互作用はほとんど、これらの条件下では破壊されてしまう。この問題を克服するために、方法２では、溶液中にて誘導体化剤と反応させて、好ましくはそれとの共有結合を介した反応生成物を形成し、ついで、特異的な抗体をコーティングした表面に反応生成物を捕捉することによって、生体試料におけるピロール単位を標的とする。
【００１９】
好ましくは、ピロール含有生体化合物の測定方法は、前記ｃ）部分に記載された方法３である。方法３は以下の工程を必要とする。
１）溶液中にて生体化合物を誘導体化剤と接触させて反応生成物を形成し、その際、誘導体化剤は強い結合対の第１のパートナーを含む工程
２）その表面上に強い結合対の第２のパートナーを有する固相支持体と反応生成物を接触させ、反応生成物との結合複合体を形成する工程
３）結合複合体を検出可能分子と接触させる工程
４）固相支持体に結合する検出可能分子の量を検出することによって結合した生体化合物の量を決定する工程。
【００２０】
好ましくは、誘導体化剤は、ｐ−ジメチルアミノベンズアルデヒド誘導体であり、結合した形態にて以下の構造を有する。
【００２１】
【化１２】
2004510981.tif 000006
【００２２】
式中、Ｒ１はアルキル基、Ｒ２はアルキル基、Ｒ４はヘテロアルキル基、Ｘは強い結合対の第１のパートナー、Ｙは、その表面上に強い結合対の第２のパートナーを有する固相支持体である。
【００２３】
好ましくは、固相支持体と接触させるのに先立って、反応生成物を含有する溶液を中和する。
【００２４】
第１の実施態様では、強い結合対の第１のパートナーは、アビジンのものであり、強い結合対の第２のパートナーはビオチンのものである。もう１つの方法として、強い結合対の第１のパートナーは、ビオチンのものであり、強い結合対の第２のパートナーはアビジンのものである。第２の実施態様では、強い結合対の第１のパートナーは、ビオチンのものであり、強い結合対の第２のパートナーはストレプトアビジンのものである。もう１つの方法として、強い結合対の第１のパートナーは、ストレプトアビジンのものであり、強い結合対の第２のパートナーはビオチンのものである。
【００２５】
好ましくは、検出可能分子は、複合体の生体化合物部分に特異的なモノクローナル抗体である。好適には、固相支持体は、微量滴定用プレートまたは処理したガラススライドである。
【００２６】
本発明はまた、抗原の精製方法も提供し、前記方法は、
１）ピロール含有生体化合物を
ａ）任意に標識された誘導体化剤（固相支持体に結合したまたは結合することができる）であって、この誘導体化剤は生体化合物とともに反応生成物を形成し（好ましくは、それに対する共有結合を介して）、ついで反応生成物との複合体を形成する検出可能分子に暴露される誘導体化剤、または
ｂ）固相支持体に結合しない任意に標識された誘導体化剤であって、この誘導体化剤は生体化合物とともに反応生成物を形成し（好ましくは、それに対する共有結合を介して）、ついで固相支持体に結合された結合剤に暴露され、その際、結合剤が反応生成物において生体化合物に特異的である誘導体化剤、または
ｃ）固相支持体に結合した結合剤であって、その際、前記結合剤は生体化合物に特異的であり、それと複合体を形成し、ついで、前記複合体の生体化合物部分と反応生成物を形成する（好ましくはそれに対する共有結合を介して）任意で標識された誘導体化剤に暴露される結合剤の１つと接触させること、および
２）固相支持体から生体化合物を溶出することを含む。
【００２７】
この方法によって抗原を容易に調製することができ、ついで、抗原検出剤、例えば、抗体についてスクリーニングするのに抗原を用いることができる。
【００２８】
好ましくは、抗原を精製する方法に用いるための誘導体化剤は結合した形態にて以下の構造のものである。
【００２９】
【化１３】
2004510981.tif 000007
【００３０】
式中、Ｒ１はアルキル基、Ｒ２はアルキル基、Ａは連結基、Ｂは固相支持体である。
【００３１】
好ましくは、標識された誘導体化剤は、結合した形態にて以下の構造を有する。
【００３２】
【化１４】
2004510981.tif 000008
【００３３】
式中、Ｒ１はアルキル基、Ｒ２はアルキル基、Ｒ４はヘテロアルキル基、Ｘは強い結合対の第１のパートナーであり、Ｙは、その表面上に強い結合対の第２のパートナーを有する固相支持体である。
【００３４】
好ましくは、検出可能分子は、生体化合物に特異的なモノクローナル抗体である。
【００３５】
任意で、誘導体化剤は、放射性標識、蛍光標識、酵素標識などで標識される。
【００３６】
本発明はまた、ピロール含有生体化合物を測定する方法において使用するための化合物も提供する。
【００３７】
事例の１つでは、この化合物は以下の構造のものである。
【００３８】
【化１５】
2004510981.tif 000009
【００３９】
式中、Ｒ１はアルキル基、Ｒ２はアルキル基、Ａは連結基、Ｂは固相支持体である。
【００４０】
さらに好ましくは、標識された誘導体化剤は以下の構造を有する。
【００４１】
【化１６】
2004510981.tif 000010
【００４２】
式中、Ｒ１は、１〜１０の炭素原子を含有する直鎖アルキル基、Ｒ２は、１〜１０の炭素原子を含有する直鎖アルキル基、Ｒ４は、２〜１０の炭素原子および少なくとも２のヘテロ原子を含有する直鎖ヘテロアルキル基である。
【００４３】
【発明の実施の形態】
序論
本発明は、ピロール含有生体化合物の測定方法およびそれらの方法にて使用することができる化学組成物を提供する。本発明の方法１では、処理されてもよい生体試料が、誘導体化剤を結合したまたは結合することができる固相支持体に接触させられる。生体試料におけるピロール単位が誘導体化剤と反応し、それによって、ピロールを含有する成分を固相支持体に不動化する。不動化した生体物質の一部と相互作用するＭＡｂのような検出可能分子に、反応した固相支持体を接触させる。固相支持体上の検出可能分子の検出は、生体物質がピロール単位を含有することを示す。
【００４４】
本発明の方法２では、溶液中にて、結合していない、任意で標識された誘導体化剤に、任意で処理された生体試料を接触させる。この誘導体化剤は、放射性標識、蛍光標識、酵素標識などで好適に標識される。誘導体化剤は、生体試料におけるピロール単位と反応して、反応生成物を形成するが、その際、反応生成物は、誘導体化剤と生体化合物中のピロール単位との共有結合を含む。反応生成物を含む溶液を中和する。
【００４５】
生体試料に特異的なＭＡｂを結合した固相支持体に反応生成物を接触させてもよい。ＭＡｂは、反応生成物と反応して、固相支持体上に不動化された複合体を形成する。固相支持体上における標識された分子の検出は、生体物質がピロール単位を含有することを示す。
【００４６】
本発明の方法３では、任意で処理された生体化合物を誘導体化剤に接触させ、その際、誘導体化剤は、好適にはビオチンのものである、強い結合対の第１の結合パートナーを含む。誘導体化剤は溶液中にある。生体化合物中のピロール単位が誘導体化剤と反応して、反応複合体を形成する。反応生成物を含有する溶液を中和し、その後、強い結合対の第２の結合パートナーをコーティングした固相支持体と接触させ、反応生成物との結合複合体を形成する。好適には、第２の結合パートナーは、ストレプトアビジンのものである。ついで、検出可能分子、好ましくは前記複合体の生体化合物部分に特異的なＭＡｂに固相支持体を接触させる。結合した生体化合物の量を決定する。
【００４７】
図１０は、方法１、方法２および方法３を模式的に説明する。
定義
「アルキル基」は、炭素の主鎖および水素を含有する、直鎖、分枝状または環状の基をいう。直鎖アルキル基の例には、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチルおよびヘキシルの基が挙げられる。分枝状アルキル基の例には、ｉ−プロピル、ｓｅｃ−ブチルおよびｔ−ブチルが挙げられる。環状アルキル基の例には、シクロブチル、シクロペンチルおよびシクロヘキシルが挙げられる。「アルキル」基はまた、アルキレン基もいう。
【００４８】
アルキル基は置換されているか、または置換されていない。置換されたアルキル基では、炭素主鎖上の水素が異なった種類の原子（例えば、酸素、窒素、イオウ、ハロゲン）によって置き換えられる。例えば、２−ヒドロキシエチルは、水素の１つがＯＨ基によって置き換えられたエチル基であり、２−クロロプロピル基は、水素の１つがＣｌ基によって置き換えられたプロピル基である。
【００４９】
「ヘテロアルキル基」は、炭素−ヘテロ原子の主鎖および水素を含有する直鎖、分枝状または環状の基をいう。ヘテロ原子には、酸素、窒素およびイオウが挙げられるが、これに限定されない。以下の基はへテロアルキル基の例である。−ＣＨ２ＯＣＨ２ＣＨ３、−ＮＨ（ＣＨ２）５ＮＨ−および−ＮＨ（ＣＨ２）２ＳＳ（ＣＨ２）２ＮＨＣ（Ｏ）（ＣＨ２）５ＮＨ−。アルキル基と同様に、ヘテロアルキル基は置換されているか、または置換されていない。
【００５０】
「脱離基」は、求核置換反応において置き換えられることが可能である化学基をいう。脱離基の例には、−Ｃｌ、−Ｂｒ、−ＯＣ（Ｏ）ＣＨ３および−ＳＰｈが挙げられる。
【００５１】
「連結基」は、１つの化学基をもう１つに接続する化学基をいう。例えば、化合物ＣＨ３Ｃ（Ｏ）−ＮＨ（ＣＨ２）５ＮＨ−ＣＨ３において、−ＮＨ（ＣＨ２）５ＮＨ−基がＣＨ３Ｃ（Ｏ）−と−ＣＨ３との間の連結基である。
調べるべき生体物質の種類
本方法は、コラーゲン抽出物におけるピロール架橋を含む、生体物質におけるピロール単位の存在を判定するのに用いられる。かねてから、研究者らは、ピロール成分がコラーゲンに存在することを提案してきた。スコット（Ｓｃｏｔｔ）らのＢｉｏｓｃｉ．Ｒｅｐ．（１９８１年）第１巻の６１１〜６１８ページを参照のこと。また、カイパーズ（Ｋｕｙｐｅｒｓ）らのＢｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．（１９９２年）第２８３巻の１２９〜１３５も参照のこと。しかしながら、コラーゲンに由来するピロール架橋の単離と性状分析は難しいことが判っているので、提案に対する間接的な支持が役立つのみである。
【００５２】
本明細書における実験結果は、コラーゲンにおけるピロール架橋の直接的な裏付けを提供する。実施例４および５を参照のこと。ｐ−アミノベンズアルデヒドを結合した固相支持体を用いてヒトの骨コラーゲンの酵素消化物から一連のペプチドが単離されたということは、コラーゲンにおけるピロール単位の存在を示している。質量分析計を用いた単離されたペプチドの分析は、相対的に多数のペプチドが、大部分コラーゲンのＮ−テロペプチド部位にて誘導体化される複合体の理論的質量に極めて近い質量を持つことを示した。
【００５３】
ピロール架橋は、それらが組織の天然の成熟過程の結果生じる骨コラーゲンにおいて特に優勢である。破骨細胞による骨の再吸収の間、ピロールによって架橋されるコラーゲン断片は、循環中に放出される。種々の生体液におけるその濃度は、骨破壊の速度の指標を提供する。骨再吸収速度の上昇は、例えば、以下、骨粗鬆症、変形性関節症および慢性関節リウマチを含む多数の疾患、および骨軟化症および副甲状腺機能亢進症のようなビタミンＤまたは副甲状腺ホルモンの異常が関与する疾患に関わっている。本発明を用いてピロール架橋を検出することによって、かかる疾患を特徴付けることができ、モニターすることができる。
【００５４】
本発明を用いて測定することができる生体物質のもう１つの例は、イソレブグランジン（例えば、レブグランジンＥ２）である。イソレブグランジンは、低密度リポタンパクにおいてポリ不飽和脂肪酸エステルのフリーラジカルが介在する酸化を介して形成される。このような化合物は生体内で種々のタンパク質と反応してピロールを生じる。ブレーム（Ｂｒａｍｅ）らのＪ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９９９年）第２７４巻の１３１３９〜１３１４６参照のこと、また、サロモン（Ｓａｌｏｍｏｎ）らのＪ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９９９年）第２７４巻の２０２７１〜２０２８０を参照のこと。
【００５５】
フリーラジカルが介在する酸化は、アテローム性硬化症、癌および神経変性疾患を含む多種多様のヒト疾患に関係するとみなされてきた。Ｂ．ハリウエル（Ｈａｌｌｉｗｅｌｌ）およびＪ．グッターリッジ（Ｇｕｔｔｅｒｉｄｇｅ）のＭｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９９０年）第１８６巻の１〜８５を参照のこと。具体的には、低密度リポタンパクの酸化的変性は、アテローム性硬化症の病因における鍵となる段階である。従って、ピロールに由来するイソレブグランジンの検出は、アテローム性硬化症を診断し、モニターする方法を提供する。
【００５６】
非酵素的グリコシル化反応により修飾されたタンパク質が、本発明を用いて測定することができる生体物質の第３の例を構成する。主としてアスコルビン酸塩（ビタミンＣ）の破壊に由来するトレオースは、この反応の一例を表す。それは、特に、タンパク質におけるリジン残基と反応性であり、その結果、ピロール構造を形成する（例えば、ホルミルトレオシルピロール）。Ｒ．ナガラジ（Ｎａｇａｒａｊｉ）およびＶ．モニエール（Ｍｏｎｎｉｅｒ）のＢｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ（１９９５年）第１２５３巻の７５〜８４を参照のこと。
【００５７】
ホルミルトレオシルピロールを検出することは、具体的には糖尿病患者をモニターするのに有用である。それはまた、進行したグリケーションの最終生成物（ＡＧＥ）の一例でもある。ＡＧＥは、例えば、アルツハイマー病における異常な神経原線維構造に関係しており、高いＡＧＥの存在は、酸化反応を加速してアテローム性硬化症を招くと考えられる。従って、ホルミルトレオシルピロールの検出は、同様にそれらの疾患を診断し、モニターする方法を提供する。
生体物質を処理する方法
本方法を用いて測定される対象生体物質は、処理されていなくてもよいし（例えば、尿、血清または血漿）、処理されていてもよい。処理する主な目的は、試料の可溶化である。
【００５８】
生体物質が組織である場合、普通、アセトンまたはクロロホルム：メタノール（２：１、ｖ：ｖ）による２回の手短な抽出（例えば、１５分）によってそれを脱脂する。例えば、無機物化した組織を液体窒素のもとで粉末化し、その後、０．５ＭのＥＤＴＡ（ｐＨ７．５）による４℃における７２〜９６時間の抽出を用いて、脱塩する。結合組織試料は通常、ｐＨ７．４の生理食塩水中にて７０℃で３０分加熱することにより変性させる。
【００５９】
試料の可溶化には通常、ピロールが特定の条件下で化学的不安定性を示すので、化学的加水分解ではなくプロテアーゼの使用を必要とする。プロテアーゼを用いる場合、好適なタンパク分解酵素（例えば、トリプシン）によって好適な温度（例えば、３７℃）にて試料を処理する。生体物質を可溶化するのに用いることができるその他の酵素の例には、キモトリプシン、プロナーゼ、ペプシン、プロテイナーゼＫおよびカテプシンファミリーのメンバー（Ｂ、Ｌ、ＮまたはＫ）が挙げられる。選択されたいかなる酵素についても、当業者は、好適な反応緩衝液のｐＨおよび温度を容易に決定することができる。
誘導体化剤
【００６０】
【化１７】
2004510981.tif 000011
【００６１】
本測定で用いられる誘導体化剤は、構造４および構造５のものである本測定で用いられるｐ−アミノベンズアルデヒド誘導体である。この構造におけるＲ１はアルキル基、Ｒ２はアルキル基、Ｒ３はヒドロキシル基または脱離基、Ｒ４はヘテロアルキル基である。
【００６２】
置換基Ｒ１は好ましくは１〜１０の炭素原子を含有する直鎖アルキル基である。さらに好ましくは、１〜５の炭素原子を含有する直鎖アルキル基である。最も好ましいＲ１は、１の炭素原子を含有する（すなわち、−ＣＨ３）。
【００６３】
置換基Ｒ２は好ましくは１〜１０の炭素原子を含有する直鎖アルキル基である。さらに好ましくは、１〜５の炭素原子を含有する直鎖アルキル基である。最も好ましいＲ２は、２の炭素原子を含有する（すなわち、−ＣＨ２ＣＨ２−）。
【００６４】
置換基Ｒ３は、好ましくは、−ＯＨ、−ＯＲ５（式中、Ｒ５は、メチルのような直鎖アルキルである）、−ＣｌまたはＳＲ５である。さらに好ましくは、−ＯＨまたは−ＯＲ５である。最も好ましいＲ３は−ＯＨである。
【００６５】
置換基Ｒ４は、好ましくは、２〜１０の炭素原子および少なくとも２のヘテロ原子を含有する直鎖へテロアルキル基である。さらに好ましくは、４〜１０の炭素原子および少なくとも２の窒素原子を含有する直鎖へテロアルキル基である。最も好ましいＲ４は−ＮＨＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ−または、−ＮＨＣＨ２ＣＨ２ＳＳＣＨ２ＣＨ２ＮＨＣ（Ｏ）−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２Ｎ−である。
【００６６】
３つの好ましい誘導体化剤の例は、ｐ−アミノベンズアルデヒド誘導体であり、化合物６、化合物７および化合物８として示される。
【００６７】
【化１８】
2004510981.tif 000012
【００６８】
【化１９】
2004510981.tif 000013
【００６９】
固相支持体への結合様式
共有結合または非共有結合の相互作用を介して、誘導体化剤を固相支持体に結合する。共有結合を介して固相支持体に結合された結合形態における誘導体化剤を化合物９によって表し、非共有結合の相互作用を介して固相支持体に結合された結合形態における誘導体化剤を化合物１０によって表す。
【００７０】
【化２０】
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【００７１】
化合物９における置換基は以下のように定義される。Ｒ１はアルキル基、Ｒ２はアルキル基、Ａは連結基、Ｂは固相支持体である。好ましいＲ１およびＲ２は１〜１０の炭素原子を含有するアルキル基、Ａはヘテロアルキル基である。さらに好ましいＲ１およびＲ２は１〜５の炭素原子を含有するアルキル基であり、Ａは少なくとも１の窒素原子を含むヘテロアルキル基である。最も好ましいＲ１は−ＣＨ３であり、Ｒ２は−ＣＨ２ＣＨ２−である。化合物１０における置換基は以下のように定義される。Ｒ１はアルキル基、Ｒ２はアルキル基、Ｒ４はヘテロアルキル基、Ｘは、強い結合対の第１のパートナーであり、Ｙは、その表面上に強い結合対の第２のパートナーを有する固相支持体である。好ましいＲ１およびＲ２は、１〜１０の炭素原子を含有するアルキル基であり、Ｒ４は、２〜１０の炭素原子および少なくとも２のヘテロ原子を含有する直鎖へテロアルキル基である。さらに好ましいＲ１およびＲ２は、１〜５の炭素原子を含有するアルキル基であり、Ｒ４は、−ＮＨ（ＣＨ２）５ＮＨ−または−ＮＨ（ＣＨ２）２ＳＳ（ＣＨ２）２ＮＨＣ（Ｏ）（ＣＨ２）５ＮＨ−である。最も好ましいＲ１は−ＣＨ３であり、Ｒ２は−ＣＨ２ＣＨ２−である。
【００７２】
結合に共有結合が用いられる場合、通常、表面を誘導体化して、アルコールまたはアミンのような反応性の官能基を得る。例えば、Ｃ８第１級アミンとのアミド結合の形成を介して、ナルゲヌンク（Ｎａｌｇｅ Ｎｕｎｃ）インターナショナルから入手可能なヌンクコバリンク（Ｎｕｎｃ Ｃｏｖａｌｉｎｋ）プレートに化合物６をカップリングさせる。ｗｗｗ．ｎａｌｇｅｎｕｎｃ．ｃｏｍを参照のこと。好適な固相支持体の第２の例は、コーニング（Ｃｏｒｎｉｎｇ）から入手可能なＤＮＡ−ＢＩＮＤ表面である。ｗｗｗ．ｓｃｉｅｎｃｅｐｒｏｄｕｃｔｓ．ｃｏｒｎｉｎｇ．ｃｏｍを参照のこと。１，５−ジアミノペンタンのような二官能性化合物を表面と反応させて、共有結合に利用可能なアミン基を提供する。カルボン酸を含有する６のような化合物は、アミド結合の形成を介して表面基にカップリングする。固相支持体の第３の例はガラス基質である。アミノプロピル−トリエトキシシランでガラススライドを処理してその表面に反応性アミンを含有するガラス基質を提供する。米国特許第５，９１９，５２３号を参照のこと。アミド結合の形成を誘導する好適な試薬の存在下にて６のような化合物と誘導体化したスライドを反応させる。結合に非共有結合の相互作用を用いる場合、強い結合対の一方のパートナーを含有する化合物を固相支持体に接着するか、または結合する。対のもう一方のパートナーを誘導体化剤に共有結合させて、共役体を形成する。共役体を固相支持体に接触させると、強い相互作用（例えば、１またはそれより多くの水素結合）が支持体上にて共役体を不動化する。
【００７３】
強い結合対の例は、ビオチン・アビジン複合体である。（ビオチン・ストレプトアビジン複合体はもう１つの例である。）通常、支持体表面が誘導体化され、ビオチンまたはアビジンを包含する。アビジンをコーティングしたポリスチレン製プレート（すなわち、リアクチ−バインド（Ｒｅａｃｔｉ−Ｂｉｎｄ）（商標）、ニュートラアビジン（ＮｅｕｔｒＡｖｉｄｉｎ）（商標）をコーティングしたプレート）は、例えば、ピアース（Ｐｉｅｒｃｅ）から入手可能である。ｗｗｗ．ｐｉｅｒｃｅｎｅｔ．ｃｏｍ参照のこと。アビジンをコーティングしたプレートを、化合物７のようなビオチンを含有するｐ−アミノベンズアルデヒド誘導体に接触させる。得られるビオチン・アビジン複合体は、非共有結合の相互作用を介して、化合物７が固相支持体に結合するのに役立つ。
異なった測定形式の例
ピロールを含有する生体化合物を測定する方法は通常、多数のウエルを持つプレート（例えば、９６ウエルプレート）で行うが、その他の測定形式も用いられる。誘導体化剤が細長い一片の表面に不動化されている細長い一片の形式を用いてもこの方法は実行される。第３の例証となる形式には、その上に誘導体化剤が不動化されるポリマービーズ（例えば、ポリスチレン製のビーズ）の使用が挙げられる。さらにもう１つの形式には、マイクロアレイテクノロジーまたはマイクロチップテクノロジーの使用、プラスモン共鳴技術を伴った使用が挙げられる。
検出化合物との抽出物／単離物の接触
本発明の方法を実行するために、誘導体化剤を結合した固相支持体に生体液または処理された生体物質を接触させる。接触に先立って、生体物質を好適な溶媒中で可溶化し、溶液を形成してもよい。複数のウエル形式を用いる場合、例えば、当業者に容易に識別可能な溶液および追加の要素を１またはそれより多くのウエルに加える。細長い一片の形式については、生体物質を含有する溶液に細長い一片を浸し、およびビーズの形式については、バイアルまたは試験管を用いてビーズと溶液を混合する。
【００７４】
測定形式にかかわりなく、ピロールを含有する生体物質と誘導体化剤を結合した支持体との間の接触は、カップリング反応を誘導する。反応の結果は、生体物質と誘導体化剤との間の共有結合である。これは、ピロールを含有する生体物質を固相支持体に不動化するように作用する。
【００７５】
所望の場合、生体物質を結合した固相支持体を少なくとも１つの好適な溶媒で洗浄して、反応媒体から不純物を取り除く。洗浄工程の後、固相支持体は通常乾燥させる。風乾、減圧下の乾燥、および熱乾燥を含む種々の乾燥技法が用いられる。
検出可能分子を用いた検出方法
本発明の方法では、不動化した物質を検出可能分子に接触させる。検出可能分子は、目的の生体物質のある部分に特異的に結合する。固相支持体上の物質が目的の物質でなければ、検出可能分子は高い親和性ではそれに結合しない。
【００７６】
検出可能分子は、共有結合または非共有結合を介して目的の生体物質に結合することができる。通常、検出可能分子は、非共有結合を介して生体物質に結合するポリクローナル、モノクローナルまたはフェーズライブラリ由来の抗体である。好ましくは、それはモノクローナル抗体である。
【００７７】
検出可能分子は、３つの方法、１）観察することができる官能性をそれが含有する、２）観察可能な生成物を生じる化学反応をそれが誘導する、または３）観察することができる官能性または観察可能な生成物を生じる化学反応をそれが誘導する官能性のいずれかを含有する第２の分子とそれが相互作用する、のうちの１つにおいて検出可能である。観察することができる官能性には、刺激の際に測定可能な効果を示す化学基が包含される。例えば、以下の化学基がかかる効果を示す。特定の波長にて光を吸収する化学基（発色団）および光の特定の波長に暴露すると蛍光を発する化学基。観察可能な生成物を生じる化学反応には、例えば、蛍光化合物、発光化合物または発色化合物を生じる反応が挙げられる。
【００７８】
目的の生体物質がコラーゲンに由来するピロール架橋である場合、検出可能分子の例は、α２（Ｉ）Ｎ末端テロペプチドの配列の一部を含む合成オクタペプチドに対して作成されたモノクローナル抗体（ＮＴＰ）である。不動化された生体物質にＮＴＰ抗体を接触させる。二次抗体（ペルオキシダーゼを結合したヤギ抗マウスＩｇＧ）を導入し、それはＮＴＰ抗体の一部と相互作用する。３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジンジヒドロクロリドおよび過酸化水素を加えると、４５０ｎｍでの吸収を示す発色化合物を生じる。実施例６を参照のこと。
検出化合物との抽出物／単離物の接触
本発明の方法２または方法３を実行するために、溶液中の標識された誘導体化剤に生体液または処理された生体物質を接触させる。標識分子で誘導体化剤を標識する。当業者によって知られるいかなる好適な溶媒を用いてもよい。ピロールを含有する生体物質との間のカップリング反応によって、いかなるピロール含有生体物質にも共有結合した誘導体化剤を含む反応生成物を生じる。
ＭＡｂを用いた検出方法
本発明の方法２では、固相支持体上に結合したＭＡｂに溶液を接触させることによって反応生成物を不動化する。
実施例１：化合物６の調製
Ｎ−メチル−Ｎ−シアノエチル−４−アミノベンズアルデヒド（中国、エンターウインケミカルズ（Ｅｎｔｅｒｗｉｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）または米国、シグマ−アルドリッチ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）から入手可能）を７．５ＭのＮａＯＨ、６％のＨ２Ｏ２（５ｍｌ）に溶解し、２時間還流した。濃塩酸を加えることにより加水分解物を酸性化し、減圧下乾燥して、エタノール（１．５ｍｌ）に再溶解した。その溶液（１ｍｌ）を０．２ＭのＮａＯＨ（１ｍｌ）に加え、陰イオン交換カラム（バイオラッド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）ＡＧ　１−８Ｘ；２ｍｌ、２ＭのＨＣｌ、２ＭのＮａＯＨで前処理し、水で平衡化した）にかけた。水（１２ｍｌ）でカラムを洗浄した後、結合した物質を２ＭのＨＣｌで溶出した。溶出物を減圧下で乾燥し、残留物を水（１ｍｌ）に再懸濁した。少量の残留物（エタノールに可溶であるが、化合物６を含有していない）を取り除き、その後、減圧下にて水性分画を乾燥し（７ｍｇの物質を得る）、０．１％のトリフルオロ酢酸（１ｍｌ）に再溶解した。４ｍｌ／分にてポンプで作動するウォーターＲＣＭプレップパックＣ１８カラム（２５ｍｍＸ１００ｍｍ、１０μｍ）で、物質溶液（１００μｌ）をクロマト分画した。用いた緩衝液は、０．１％のＴＦＡ（緩衝液Ａ）および７０％のアセトニトリル、０．１％のＴＦＡ（緩衝液Ｂ）であり、５％のＢにて５分間、ついで３５分かけて線形勾配にて７０％Ｂまで上昇させた。３３０ｎｍにおけるモニタリングは、２８．３分に溶出した単一主要ピークを示した。ピークに相当する分画を集めて、減圧下にて乾燥した（収量＝３ｍｇ）。ＭＡＴ９００質量分析計（ドイツ、ブレーメンのフィンニガン（Ｆｉｎｎｉｇａｎ）ＭＡＴ）を用いた陰イオンモードにおけるエレクトロスプレー質量分析による物質の解析は、Ｎ−メチル−Ｎ−プロピオン酸−４−アミノベンズアルデヒド分子量２０７．２の期待値に相当する［Ｍ−Ｈ］＝２０６．２として主要イオンを示した。
実施例２：化合物７の調製
化合物６（３ｍｇ）を水（３ｍｌ）に溶解し、ビオチン−ペンチルアミン（３０ｍｇ；ピアース）を加えた。１−エチル−３−（３−ジメチルアミノ−プロピル）カルボジイミド／Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（それぞれ、０．０３５Ｍ／０．０２８Ｍ；３ｍｌ）を加え、５０℃にて４時間加熱した。得られた溶液を減圧下にて乾燥し、実施例１に記載した分取用ＲＣＭプレップパックカラムを用いてクロマト分画した。適用した勾配は、２０％Ｂにて５分間、ついで３０分かけた６０％Ｂまでの線形上昇であった。２つの主要な成分を検出し、１つは１５分に溶出し（未反応の酸）、１つは１８分に溶出した。１８分に溶出した成分を陽イオンエレクトロスプレー質量分析により解析し、５１８．７の［Ｍ＋Ｈ］および５４０．６の［Ｍ＋Ｎａ］が示された。これらの値は、化合物７の計算した分子量、５１７．７に相当した。化合物７は４ＭのＨＣｌ中にてピロールカルボン酸と反応して、５７３ｎｍで吸収する特徴的なピンク色を生じた。
実施例３：化合物８の調製
化合物６（１ｍｇ）を０．１ＭのＭＥＳ緩衝液、ｐＨ５（１ｍｌ）に溶解し、１０倍モル過剰のシスタミン（Ｈ２Ｎ（ＣＨ２）２ＳＳ（ＣＨ２）２ＮＨ２）を加えた。ＨＣｌを用いて溶液のｐＨを５に調整し、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノ−プロピル）−カルボジイミド／Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（それぞれ、０．０３５Ｍ／０．０２８Ｍ；１ｍｌ）を加えた。溶液を５０℃にて４時間加熱した。ＨＰＬＣ、１０ｍＭのＴＦＡおよびアセトニトリルの勾配（３３０ｎｍをモニタリング）で溶出することによって、得られたアミノ化誘導体を精製した。製造元の説明書に従って、スクシンイミド−ＬＣ−ビオチン（ピアース）を用いてアミノ化誘導体のビオチン化を行い、再びＨＰＬＣにより精製した。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析により化合物８を確認した。
実施例４：骨消化物との化合物７の反応
液体窒素中にてスペックス（Ｓｐｅｘ）フリーザーミルで脱脂したヒト骨（７ｇ）を粉末化した。４℃における０．５ＭのＥＤＴＡ、ｐＨ８中での２日間の抽出を３回行うことにより、得られた粉末を脱灰し、水で洗浄して凍結乾燥した。脱灰した骨粉末（１．１ｇ）を０．１Ｍのクエン酸緩衝液、ｐＨ５に懸濁し、７０℃にて１時間加熱して三重らせん構造を変性し、４５℃に冷却した。パパイン（１００Ｕ）を加え、消化物を４時間インキュベートした。１Ｍのトリスを加えることにより消化物のｐＨを７．４に調整し、温度を３７℃に下げて、プロテアーゼＸ型（１００Ｕ）による一晩の消化を行った。完了した消化物（ピリジニウム架橋の総含量により１１０μＭのコラーゲンと推定）を凍結し、凍結乾燥し、水（７ｍｌ）に懸濁した。
【００７９】
化合物７（５０μｇ）を骨消化物（５００μｌ）に加えた後、１２ＭのＨＣｌ（２５０μｌ）の添加によって混合物を酸性化した。室温における３０分のインキュベートの間に、溶液は、サクランボ色に変わり、質量分析は、５７１．７ｎｍにおける最大吸収の存在を示した（ピロールとの４−ジメチルアミノベンズアルデヒドの反応から生じる生成物の特徴）。１２ＭのＮａＯＨ（約２２０μｌ）ついで４０ｍＭのリン酸緩衝液（２０ｍｌ）の添加によって酸を中和した。
実施例５：化合物７とピロールペプチドとの間の共役生成物の単離
製造元（ピアース）の説明書に従って、モノマーのアビジンカラム（５ｍｌ）を調製した。実施例４の反応した骨消化物を、中性のｐＨにてゆっくりカラムに加え、６カラム容量のＰＢＳ、ついで１カラム容量の水で洗浄した。アンモニアでｐＨ２．５に調整した１Ｍの酢酸により約１ｍｌ／分にてビオチン化物質を溶出し、８つの分画（５ｍｌ）を回収した。
【００８０】
競合ＥＬＩＳＡによるビオチン化化合物の推計。モノマーアビジンカラム（実施例５）の効率を評価するために、競合ＥＬＩＳＡを開発した。イムロン４免疫アッセイプレートをＰＢＳ中のストレプトアビジン（２５ｎＭ）で３７℃にて２時間コーティングした。Ｕ底９６ウエルプレートにおいて、ＰＢＳツイーン、０．５％ＦＦＭＰ中のビオチン化ペルオキシダーゼ（シグマ；１０ｎｇ／ｍｌ；１１０μｌ）に、ＰＢＳ０．１％ツイーン、０．５％脱脂粉乳（ＦＦＭＰ；１１０μｌ）中の試料または標準物を加えた。洗浄したストレプトアビジンをコーティングしたプレートに混合した試料を移し、３７℃にて９０分間インキュベートした。ＰＢＳ／０．１％ツイーンでプレートを３回洗浄した後、ペルオキシターゼの基質（２００μｌ）テトラメチル−ベンジジンジヒドロクロリド（ＴＭＢ）を０．０５Ｍのクエン酸／リン酸緩衝液、ｐＨ５、０．０１２％ｖ／ｖの過酸化水素に加えた（０．１ｍｇ／ｍｌ）。１５分後、３Ｍの硫酸（５０μｌ）を加えることによって反応を止めた。
【００８１】
ＨＰＬＣによる単離した物質の解析。アビジンカラムから溶出した物質の容積を減らし（１００μｌ）、逆相ＨＰＬＣカラム（４．６Ｘ１００ｍｍ；Ｃ１８；粒子サイズ３μｍ）でクロマト分画した。０．１％のＴＦＡ（緩衝液Ａ）でカラムを平衡化し、７０％のアセトニトリル、０．１％のＴＦＡ（緩衝液Ｂ）で形成された線形勾配によって３５分間かけて溶出した。２１４ｎｍ、２８０ｎｍおよび３３０ｎｍにて溶出物をモニターした。ＨＰＬＣからの各分画を乾燥し、水（２μｌ）に再溶解した。その溶液（１μｌ）をα−シアノ−４−ヒドロキシ−桂皮酸（７０％のアセトニトリル、０．１％のＴＦＡ中で１０ｍｇ／ｍｌの溶液を１μｌ）と混合し、試料プレート上に乾燥させ、ブラジキニンを用いて外部補正したＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析（ボイジャー（Ｖｏｙａｇｅｒ）−ＤＥ、アプライドバイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ））により解析した。
【００８２】
各分画のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析スペクトルを図１〜図９に示す。アミノ酸組成のデータを得るには不十分な量の多数のさらに小さなペプチドがあったように、それらの構造的配置には幾分曖昧さが生じた。特に、ＧｌｕとＩｌｅ／Ｌｅｕとの間の質量差は、追加のヒドロキシル基と同等であり、分子量＝１０８６で単離されたペプチド（図１）については、曖昧さは、ヒドロキシル化された架橋が存在する可能性があることによる。従って、このペプチドは、ＧｌｙおよびＧｌｕ（α１鎖のＣ−またはＮ−テロペプチドのいずれかの）を含有してもよく、またはヒドロキシル化された架橋については、Ｇｌｙ残基は、Ｉｌｅ（α１らせんの）またはロイシン（α２らせんの）のいずれがに連結する。アミノ酸組成が判っている場合であっても、単一のＧｌｙ残基でビオチン化されたピロールを含有する分子量＝９５７（図１）のペプチドの場合と同様に、残基の正確な位置は明らかでなくてもよい。この残基は、らせんの位置（Ｎ−またはＣ−末端の重なり合い部位であることができる）で示されるが、α２（Ｉ）Ｎ−テロペプチドにも由来することができる。このピークは、別の位置のＧｌｙ含有ペプチドの混合物を含有してもよい。図５および図７で示されるＭｒ＝１０２９のペプチドは、グルタミン酸塩またはヒドロキシル化されたピロール−ロイシン／イソロイシンの同一の代替物を有することができる。Ｇｌｙの喪失（図２および図３）に相当するピークはおそらく、別個のペプチドではなくレーザー脱離のエネルギーにより喪失しているが、これらのピークは、提案されたペプチド構造について追加の証拠を提供する。その他のパネルで示されるさらに大きなペプチドの構造は曖昧ではない。
実施例６：　ピロール架橋の検出（方法１）
Ｃ８第１級アミン基を介してヌンクコバリンク（Ｎｕｎｃ Ｃｏｖａｌｉｎｋ）プレートにカルボキシル−エーリッヒ誘導体をカップリングさせた。プレート（１００μｌのＭＥＳ緩衝液、ｐＨ４．５の中、２５０ピコモル／ウエル）に誘導体を加え、ついで１００μｌの１−エチル−３−（３−ジメチルアミノ−プロピル）カルボジイミド／Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（それぞれ、０．０３５Ｍ／０．０２８Ｍ）を加えた後、プレートを５０℃に加熱し、室温で一晩放置した。プレートを吸引し、４ＭのＨＣｌにて洗浄し、水で３回洗浄した。各ウエルは６６ピコモルの同等の試薬とカップリングし、ＨＰＬＣを用いてカップリングを確認した。
【００８３】
８ＭのＨＣｌ（１１０μｌ）を加えることによって別のプレートで調製された試料（１１０μｌ）を酸性化した。ついで酸性化した試料（２００μｌ）をエーリッヒ反応プレートに加え、室温にて１時間撹拌した。プレートを吸引し、４ＭのＨＣｌで３回、水で３回、最終的にＰＢＳ／０．１％ツイーン、１０ｍＭのリジン、０．５％の脱脂粉乳（アッセイ緩衝液）で３回洗浄した。用いた抗体は、α２（Ｉ）テロペプチドに対して作製されたモノクローナル抗体（１：１０００希釈）またはイソアスパルチルα２（Ｉ）テロペプチドに対して作製された、アフィニティ精製したポリクローナル抗体（１：２５０希釈）であった。４℃にて１７時間インキュベートした後、ＰＢＳ−ツイーンによりプレートを３回洗浄し、二次抗体である、ペルオキシダーゼを結合し、１：４０００の希釈で用いるヤギ抗マウスＩｇＧとともに１時間インキュベートした。ＰＢＳ／ツイーンでプレートを３回洗浄した後、２００μｌのペルオキシターゼの基質、３，３’，５，５’−テトラメチル−ベンジジンジヒドロクロリド（ＴＭＢ）を０．０１２％ｖ／ｖの過酸化水素を含有する０．０５Ｍのクエン酸／リン酸緩衝液、ｐＨ５、に加えた（０．１ｍｇ／ｍｌ）。３Ｍの硫酸（５０μｌ）を加えることにより反応を止め、ダイナテック（Ｄｙｎａｔｅｃｈ）ＭＲ７０００プレートリーダーを用いて、４５０ｎｍにて吸収を測定した。
【００８４】
ピロール捕捉アッセイを用いて、エーリッヒプレートで反応した連続希釈の骨消化物（約１．０ナノモル／ウエルのコラーゲンで出発する）は、漸次減少していくＮＴＰ抗体との反応性を生じた（図１１）。プレート上でのピロール架橋した骨ペプチドの固定した濃度（０．１２５ナノモル／ウエル）では、連続希釈した青年期のヒト尿とのＮＴＰ抗体の予備インキュベートは、本質的に完全な発色の阻害を生じた。
【００８５】
青年期の尿におけるピロール架橋を含有するペプチドがプレートと反応した場合、ＮＴＰ抗体は、いかなるテロペプチドを検出することができなかった（図１２）。これに関する可能性のある説明は、この年齢の尿で見い出される大量の異性体化していないテロペプチドは広範には架橋されない可能性があるということである。イソアスパルチル再構成したペプチドに対して作製したポリクローナル抗体がさらに年配の被験者（３０歳）の尿における捕捉ペプチドに対する反応性を示すという事実によってこのことは支持される。図１２を参照のこと。
【００８６】
ピロール架橋を有さない軟骨や皮膚に由来するペプチドは、骨消化物やポルホビリノゲン標準物に比べて、アッセイにおいてほとんど反応性を生じないことを示すことによってアッセイの特異性を立証した（図１３）。
実施例７：骨の酵素消化物に由来するピロール含有ペプチドの検出
脱塩したヒト骨のトリプシン消化物（およそ５μＭのコラーゲンを含有する０．５ｍｌ）を、ビオチン化エーリッヒ試薬（５０μｇ；０．１マイクロモル）と３ＭのＨＣｌ中にて室温で３０分間反応させた。２ＭのＮａＯＨを加えることによって試料を中和し、０．１％のツイーン２０を含有するリン酸緩衝生理食塩水、ｐＨ７．５（ＰＢＳ）で１０ｍｌに希釈した。検出プレートに加えるために、ＰＢＳ−ツイーン中で、この予備反応した混合物の連続希釈（ｘ２）を調製した。
【００８７】
コラーゲンＩ型α２鎖のＮ−テロペプチドの架橋領域を含有するオクタペプチド配列を認識するモノクローナル抗体（ＮＴＰ）で検定用微量滴定プレートをコーティングした。抗体の適当な定位を得るために、最初に、ＰＢＳ中に１μｇ／ｍｌのタンパク質を含有する０．２ｍｌの溶液を各ウエルに加えることによって抗マウスＩｇＧ（ロバで作製）をプレートにコーティングした（室温にて３時間）。ＰＢＳ−０．０５％、ツイーン２０で３回洗浄した後、ＮＴＰ抗体（ＰＢＳ中で１μｇ／ｍｌ）を加え、室温にて１時間反応させた。ＰＢＳ−ツイーンによりプレートを再び３回洗浄した。
【００８８】
予備反応した混合物の連続希釈をコーティングしたプレートに加え、室温にて２時間インキュベートした。ＰＢＳ−ツイーンによりプレートを３回洗浄し、ＰＢＳ−ツイーンで１：２０００に希釈したストレプトアビジン−西洋ワサビペルオキシダーゼ（英国、リトルチャルフォントのアマシャムｐｌｃ）を加えることによってビオチン−ピロールを検出した。１時間後、ＰＢＳ／ツイーンでプレートを３回洗浄し、０．０１２％ｖ／ｖの過酸化水素を含有する０．０５Ｍのクエン酸／リン酸緩衝液、ｐＨ５、に加えた（０．１ｍｇ／ｍｌ）２００μｌのペルオキシターゼの基質、３，３’，５，５’−テトラメチル−ベンジジンジヒドロクロリド（ＴＭＢ）の添加によって発色した。３Ｍの硫酸（５０μｌ）を加えることにより反応を止め、ダイナテック（Ｄｙｎａｔｅｃｈ）ＭＲ７０００プレートリーダーを用いて、４５０ｎｍにて吸収を測定した。
実施例８：骨の酵素消化物に由来するピロール含有ペプチドの検出（方法３）
方法２に記載されるように、ビオチン化したエーリッヒ試薬をヒトの骨コラーゲンのトリプシン処理したペプチドと反応させた。
【００８９】
検出用プレートについては、３７℃で３時間インキュベートすることにより、ストレプトアビジン（ＰＢＳ中で１μｇ／ｍｌ）によって高結合微量滴定プレート（イムロン４）をコーティングした。ＰＢＳ−ツイーンによりプレートを３回洗浄し、ＰＢＳ−ツイーン中の３％ウシ血清アルブミンとともに室温にて１時間インキュベートすることにより残っているいかなる結合部位もブロックした。ＰＢＳ−ツイーンによりプレートを再び３回洗浄した。もう１つの方法としては、例えば、英国、ベーシングストークのテルモラボシステムズ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ）のストレプトアビジン−コーティッドコンビプレートのように、すでにコーティングされたプレートが数社から市販されている。
【００９０】
予備反応した混合物の連続希釈をストレプトアビジンでコーティングしたプレートに加え、室温で２時間インキュベートした。ＰＢＳ−ツイーンによりプレートを３回洗浄し、ＮＴＰモノクローナル抗体（ＰＢＳ−ツイーン中で１：１０００希釈）を添加した後、４℃にて１８時間プレートをインキュベートした。ＰＢＳ−ツイーンによりプレートを３回洗浄し、二次抗体である、１：４０００の希釈で使用する、ペルオキシターゼを結合したヤギ抗マウスＩｇＧとともに１時間インキュベートした。ＰＢＳ−ツイーンによりプレートを３回洗浄した後、ＴＭＢにより発色させ、前に記載したように、プレートリーダーを用いて４５０ｎｍにて最適な濃さの読み取りを行った。
実施例９：骨コラーゲンのペプチドからのピロール含有抗原の調製
カテプシンＫによる消化によって粉末化し、脱灰したヒトの骨からペプチドを調製した。２ｍＭのＥＤＴＡおよび２ｍＭのジチオスレイトールを含有する１．０ｍｌの５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ５．０に骨（１０ｍｇ）を懸濁し、１００μｌのＰＢＳに溶解した０．１ｍｇの組換えカテプシンＫを加えた後、穏かに撹拌しながら、３７℃にて２４時間、消化を継続した。消化物を遠心（１３，０００ｇ）して未消化の組織を除き、０．２Ｍの酢酸で平衡化し、溶出したセファデックスＧ２５カラム（１．０Ｘ１２ｃｍ）で上清溶液を脱塩した。骨ペプチドを含有する分画をプールし、凍結乾燥し、３ＭのＨＣｌ中のビオチン化したジスルフィドエーリッヒ試薬と室温にて３０分間反応させた。２ＭのＮａＯＨを加えることにより溶液を中和し、ＰＢＳにより１０ｍｌに希釈した。
【００９１】
製造元の説明書に従って調製した不動化アビジン（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ社）の５ｍｌカラムに骨消化物−エーリッヒの共役物を適用し、１０ｍＭのジチオスレイトールを含有するＰＢＳでカラムを洗浄し、２３０ｎｍにてカラム溶出物をモニターすることによって位置決定した。プールした分画をＰＢＳに対して透析し、還元剤を除いた。この物質を等量のアジュバントと混合し、ウサギおよびマウスの免疫に直接用いた。
【図面の簡単な説明】
【図１】ピロール架橋を含有するペプチドの質量分析のスペクトルを示すグラフ
【図２】図１と同様のグラフ
【図３】図１と同様のグラフ
【図４】図１と同様のグラフ
【図５】図１と同様のグラフ
【図６】図１と同様のグラフ
【図７】図１と同様のグラフ
【図８】図１と同様のグラフ
【図９】図１と同様のグラフ
【図１０】方法１、方法２および方法３を模式的に表す図
【図１１】様々な希釈における骨ペプチドのピロール捕捉の差異を示すグラフ
【図１２】イソアスパルチルテロペプチドに特異的な検出抗体を用いた様々に希釈した生体試料におけるピロールの捕捉を示す図
【図１３】消化し、固相化したコラーゲン含有組織に関するピロール捕捉測定を示すグラフ
【図１４】ＮＴＰモノクローナル抗体で検出された、ビオチン−ＥＲ反応した骨消化物またはストレプトアビジンをコーティングしたプレートの連続希釈に関する結果を示すグラフ
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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