(57)【要約】本発明は、転移性前立腺癌中で上方制御されたタンパク質（ＰＵＭＰＣｎ）の新規ポリペプチド及びこれらのポリペプチドをコードする核酸分子に関するものである。また、ここで提供されているのは、それら核酸配列を含むベクター及び宿主細胞、異種ポリペプチドと融合している本発明のポリペプチド配列を含むキメラポリペプチド分子、本発明のポリペプチドと結合する抗体、及び本発明のポリペプチドを生産する方法に関する。
2004524816.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）図２（配列番号：２）の約１から約４５４のアミノ酸残基の配列を含むＰＲＯ２３２０３ポリペプチドをコードするＤＮＡ分子、又は（ｂ）（ａ）のＤＮＡ分子の相補鎖と少なくとも約８０％の配列同一性を有するＤＮＡを含む単離された核酸分子。
【請求項２】
図１（配列番号：１）のヌクレオチド位置約１８８から１５４９の配列を含む請求項１に記載の単離された核酸分子。
【請求項３】
図１（配列番号：１）のヌクレオチド配列を含む請求項１に記載の単離された核酸分子。
【請求項４】
図２（配列番号：２）の約約１から約４５４のアミノ酸残基の配列をコードするヌクレオチド配列を含む請求項１に記載の単離された核酸分子。
【請求項５】
（ａ）ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−２５１３（ＤＮＡ１８５１７１−２９９４）として２０００年９月２６日付けでＡＴＣＣに寄託されたヒトタンパク質ｃＤＮＡによりコードされるものと同じ成熟ポリペプチドをコードするＤＮＡ分子、又は（ｂ）（ａ）のＤＮＡ分子の相補鎖と少なくとも約８０％の配列同一性を有するＤＮＡを含む単離された核酸分子。
【請求項６】
ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−２５１３（ＤＮＡ１８５１７１−２９９４）として２０００年９月２６日付けでＡＴＣＣに寄託されたヒトタンパク質ｃＤＮＡによりコードされるものと同じ成熟ポリペプチドをコードするＤＮＡを含む請求項５に記載の単離された核酸分子。
【請求項７】
（ａ）ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−２５１３（ＤＮＡ１８５１７１−２９９４）として２０００年９月２６日付けでＡＴＣＣに寄託されたヒトタンパク質ｃＤＮＡの全長ポリペプチドコード化配列、又は（ｂ）（ａ）のコード化配列の相補鎖と少なくとも約８０％の配列同一性を有するＤＮＡを含む単離された核酸分子。
【請求項８】
ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−２５１３（ＤＮＡ１８５１７１−２９９４）として２０００年９月２６日付けでＡＴＣＣに寄託されたヒトタンパク質ｃＤＮＡの全長ポリペプチドコード化配列を含む請求項７に記載の単離された核酸分子。
【請求項９】
図２（配列番号：２）のアミノ酸１から約４５４をコードする核酸配列の相補鎖とハイブリダイズするＤＮＡを含むＰＲＯ２３２０３ポリペプチドをコードする単離された核酸分子。
【請求項１０】
図２（配列番号：２）のアミノ酸１から約４５４をコードする核酸が、図１（配列番号：１）のヌクレオチド１８８から約１５４９を含む請求項９に記載の単離された核酸分子。
【請求項１１】
ハイブリダイゼーションが緊縮性のハイブリダイゼーション及び洗浄条件下で起こる請求項９に記載の単離された核酸分子。
【請求項１２】
少なくとも約１２０４ヌクレオチドを含み、（ａ）図２（配列番号：２）のアミノ酸残基１から約４５４の配列を含むＰＲＯ２３２０３ポリペプチドをコードするＤＮＡ分子、又は（ｂ）（ａ）のＤＮＡ分子の相補鎖と緊縮性のハイブリダイゼーション条件下でテストＤＮＡ分子をハイブリダイズし、試験ＤＮＡ分子を単離することによって生産される単離された核酸分子。
【請求項１３】
（ａ）又は（ｂ）と少なくとも約８０％の配列同一性を持つ請求項１２に記載の単離された核酸分子。
【請求項１４】
請求項１の核酸分子を含むベクター。
【請求項１５】
前記核酸分子が、ベクターで形質転換された宿主細胞によって認識されるコントロール配列と作用可能に結合する請求項１４に記載のベクター。
【請求項１６】
登録番号ＰＴＡ−２５１３（ＤＮＡ１８５１７１−２９９４）としてＡＴＣＣに寄託された核酸分子。
【請求項１７】
請求項１４に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項１８】
前記細胞がＣＨＯ細胞である請求項１７に記載の宿主細胞。
【請求項１９】
前記細胞が大腸菌である請求項１７に記載の宿主細胞。
【請求項２０】
前記細胞が酵母細胞である請求項１７に記載の宿主細胞。
【請求項２１】
前記ＰＲＯ２３２０３ポリペプチドの発現に適する条件下で請求項１７に記載の宿主細胞を培養し、細胞培養物から前記ＰＲＯ２３２０３ポリペプチドを回収することを含む、ＰＲＯ２３２０３ポリペプチドを生産する工程。
【請求項２２】
図２（配列番号：２）のアミノ酸残基約１から約４５４のアミノ酸残基の配列と少なくとも約８０％の配列同一性を含むアミノ酸配列を含む単離されたＰＲＯ２３２０３ポリペプチド。
【請求項２３】
図２（配列番号：２）のアミノ酸残基１から約４５４を含む請求項２２に記載の単離されたＰＲＯ２３２０３ポリペプチド。
【請求項２４】
ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−２５１３（ＤＮＡ１８５１７１−２９９４）として２０００年９月２６日付けでＡＴＣＣに寄託されたベクターのｃＤＮＡインサートによってコードされるポリペプチドと少なくとも約８０％配列同一性を有する単離されたＰＲＯ２３２０３ポリペプチド。
【請求項２５】
ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−２５１３（ＤＮＡ１８５１７１−２９９４）として２０００年９月２６日付けでＡＴＣＣに寄託されたベクターのｃＤＮＡインサートによってコードされる請求項２４に記載の単離されたＰＲＯ２３２０３ポリペプチド。
【請求項２６】
図２（配列番号：２）のアミノ酸残基１から約４５４の配列、又は抗−ＰＲＯ２３２０３抗体の結合部位を提供するのに十分であるその断片を含む単離されたＰＲＯ２３２０３ポリペプチド。
【請求項２７】
（ｉ）テストＤＮＡ分子を（ａ）図２（配列番号：２）のアミノ酸残基１から約４５４の配列を含むＰＲＯ２３２０３ポリペプチドをコードするＤＮＡ分子、又は（ｂ）（ａ）のＤＮＡ分子の相補鎖と緊縮性の条件下でハイブリダイズさせ、（ｉｉ）前記ポリペプチドの発現に適する条件下で前記テストＤＮＡ分子を含む宿主細胞を培養し、（ｉｉｉ）細胞培養物から前記ポリペプチドを回収することにより生産される単離されたポリペプチド。
【請求項２８】
（ａ）又は（ｂ）と前記テストＤＮＡが少なくとも約８０％の配列同一性を持つ請求項２７に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項２９】
異種のアミノ酸配列と融合したＰＲＯ２３２０３ポリペプチドを含むキメラ分子。
【請求項３０】
前記異種のアミノ酸配列がエピトープタグ配列である請求項２９に記載のキメラ分子。
【請求項３１】
前記異種のアミノ酸配列がイムノグロブリンＦｃ領域である請求項２９に記載のキメラ分子。
【請求項３２】
ＰＲＯ２３２０３ポリペプチドと特異的に結合する抗体。
【請求項３３】
前記抗体がモノクローナル抗体である請求項３２に記載の抗体。
【請求項３４】
前記抗体がヒト化抗体である請求項３２に記載の抗体。
【請求項３５】
前記抗体が抗体断片である請求項３２に記載の抗体。
【請求項３６】
前記抗体が細胞障害性剤と連結される請求項３２に記載の抗体。
【請求項３７】
前記抗体が標識と連結される請求項３２に記載の抗体。
【請求項３８】
ＰＲＯ２３２０３ポリペプチドに対するアゴニスト。
【請求項３９】
ＰＲＯ２３２０３ポリペプチドに対するアンタゴニスト。
【請求項４０】
（ａ）ＰＲＯ２３２０３ポリペプチド、（ｂ）ＰＲＯ２３２０３ポリペプチドに対するアゴニスト、（ｃ）ＰＲＯポリペプチドに対するアンタゴニスト、又は（ｄ）薬学的に受容可能な坦体と混合した抗−ＰＲＯ２３２０３抗体を含む組成物。
【請求項４１】
（ａ）Ｘが図２（配列番号：２）の２０５から２１４の任意のアミノ酸である、図２（配列番号：２）の１からＸのアミノ酸をコードするＤＮＡ分子、又は（ｂ）（ａ）のＤＮＡ分子の相補鎖と少なくとも約８０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子。
【請求項４２】
（ａ）Ｘが図２（配列番号：２）の２０５から２１４の任意のアミノ酸である、図２（配列番号：２）の１からＸのアミノ酸をコードするヌクレオチド配列、又は（ｂ）（ａ）のヌクレオチド配列の相補鎖を含む請求項３９に記載の単離された核酸。
【請求項４３】
（ａ）Ｘが図２（配列番号：２）の２０５から２１４の任意のアミノ酸である、図２（配列番号：２）の残基約１からＸのアミノ酸配列と比較して、少なくとも約８０％ポジティブであるとスコア化するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、又は（ｂ）（ａ）のヌクレオチド配列の相補鎖を含む単離された核酸。
【請求項４４】
Ｘが図２（配列番号：２）の２０５から２１４の任意のアミノ酸である、図２（配列番号：２）のアミノ酸１からＸと少なくとも約８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む単離された可溶性ＰＲＯ２３２０３ポリペプチド。
【請求項４５】
Ｘが図２（配列番号：２）の２０５から２１４の任意のアミノ酸である、図２（配列番号：２）のアミノ酸１からＸを含む請求項４２に記載の単離された可溶性ＰＲＯ２３２０３ポリペプチド。
【請求項４６】
Ｘが図２（配列番号：２）の２０５から２１４の任意のアミノ酸である、図２（配列番号：２）のアミノ酸１からＸのアミノ酸配列と比較して、少なくとも約８０％ポジティブであるとスコア化するアミノ酸配列を含む単離された可溶性ＰＲＯ２３２０３ポリペプチド。
【請求項４７】
抗−ＰＲＯ２３２０３抗体の治療上有効量を哺乳動物に投与することを含む哺乳動物の前立腺癌を治療する方法。
【請求項４８】
前記前立腺癌がアンドロゲン非依存性前立腺癌である請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記癌が前立腺由来で身体の他の部位へ転移する、請求項４７に記載の方法。
【請求項５０】
前記抗体が抗体断片である請求項４７に記載の方法。
【請求項５１】
前記抗体断片がＦａｂ断片である請求項４７に記載の方法。
【請求項５２】
前記抗体が細胞障害性剤と結合していない請求項４７に記載の方法。
【請求項５３】
前記抗体断片が細胞障害性剤と結合していない請求項５０に記載の方法。
【請求項５４】
前記抗体が細胞障害性剤と結合している請求項４７に記載の方法。
【請求項５５】
さらに前記哺乳動物に化学療法剤を投与することを含む請求項４７に記載の方法。
【請求項５６】
容器、及びその中に収容される組成物を含む製造品であって、該組成物が抗−ＰＲＯ２３２０３抗体を含み、さらに前立腺癌を治療するのに該組成物を使用できることを表示する添付文書を含んでなる製造品。
【請求項５７】
前記前立腺癌がアンドロゲン非依存性前立腺癌である請求項５６に記載の製造品。
【請求項５８】
前記添付文書が化学療法剤で患者を治療することをさらに表示する請求項５６に記載の製造品。
【請求項５９】
哺乳動物の前立腺癌の存在を診断する方法であって、前記方法が前記哺乳動物の組織を抗−ＰＲＯ２３２０３抗体と接触させ、前記組織の構成成分に対する前記抗体の結合を検出することを含んでなり、前記組織の構成成分に対する前記抗体の結合が前記哺乳動物における前立腺癌の存在を示す方法。
【請求項６０】
前記接触がエキソビボで実施される請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
容器、及びその中に収容される組成物を含む製造品であって、該組成物が抗−ＰＲＯ２３２０３抗体を含み、さらに前立腺癌の診断に該組成物を使用できることを表示する添付文書を含んでなる製造品。
【請求項６２】
哺乳動物の前立腺癌の存在を診断する方法であって、前記方法が診断用マイクロアレイをＤＮＡ１８５１７１−２９９４プローブと接触させ、正常組織と比較した場合、前立腺癌組織中での前記ＤＮＡ１８５１７１−２９９４プローブのハイブリダイゼーションを検出及び定量し、ＤＮＡ１８５１７１−２９９４が過剰発現しているかどうか決定することを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、一般的に、新規なＤＮＡの同定及び単離、及びここで「ＰＲＯ２３２０３」ポリペプチドと称される新規なポリペプチド、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｕｐｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｉｎ Ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ Ｐｒｏｓｔａｔｅ Ｃａｎｃｅｒ（転移性前立腺癌において上方制御されるタンパク質）（ＰＵＭＰＣｎ）の組換え生産に関する。
【０００２】
（発明の背景）
膜結合タンパク質及びレセプターは、多細胞生物の、特に、形成、分化及び維持において重要な役割を担っている。多くの個々の細胞の運命、例えば増殖、転移、分化又は他の細胞との相互作用は、典型的には他の細胞及び／又は直近の環境から受け取られる情報に支配される。この情報は、しばしば分泌ポリペプチド（例えば、分裂促進因子、生存因子、細胞障害性因子、分化因子、神経ペプチド、及びホルモン）により伝達され、これが次に多様な細胞レセプター又は膜結合タンパク質により受け取られ、そして解釈される。このような膜結合タンパク質及び細胞レセプターは、これらに限定されるものではないが、サイトカインレセプター、レセプターキナーゼ、レセプターホスファターゼ、細胞−細胞間相互作用に関与するレセプター、及びセレクチン及びインテグリンのような細胞接着分子を含む。例えば、細胞の増殖及び分化を制御するシグナルの伝達は、様々な細胞タンパク質のリン酸化により部分的に制御される。そのプロセスを触媒する酵素であるプロテインチロシンキナーゼは、成長因子レセプターとしても作用することができる。具体例には、線維芽細胞増殖因子レセプター及び神経成長因子レセプターが含まれる。
膜結合タンパク質及びレセプター分子は、製薬及び診断薬を含む、様々な産業上の利用性を有している。例えば、レセプターイムノアドヘシンはレセプター−リガンド間相互作用を阻止する治療薬として使用することができる。また、膜結合タンパク質は、関連するレセプター／リガンド間相互作用の可能性のあるペプチド又は小分子インヒビターをスクリーニングするために使用することもできる。
新規な天然のレセプター又は膜結合タンパク質を同定するための努力が産業界と学術界の双方によってなされている。多くの努力が、新規なレセプター又は膜結合タンパク質のコード配列を同定するために、哺乳動物の組換えＤＮＡライブラリーのスクリーニングに注がれている。
【０００３】
男性にとって、前立腺癌は肺癌に次いで２番目に最も致死率の高い癌である。前立腺癌の発症の増加は、世界的に見て最も高いものの一つであると考えられている。実際、６人に１人は浸潤性の前立腺癌を発症する。進行段階において、前立腺癌は骨に転移するが、一度転移すると、前立腺癌は通常不治の病となる。現在、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）は、スクリーニング、診断、及び前立腺癌をモニターするのに最も広く用いられる腫瘍マーカーである。しかしながら、スクリーニングのためのツールとしてのＰＳＡの広範な使用は、ＰＳＡが良性と悪性の前立腺疾患を正確に識別することができないため、問題となっている。
癌の段階に依存して、前立腺及び膀胱癌の治療は、以下に示す治療の一又は組合わせを含む：癌性組織の外科的除去、放射線療法、化学療法、前立腺癌の場合はアンドロゲン剥脱（例えば、ホルモン療法）。ホルモン療法が行われる多くの患者は、アンドロゲン非依存性の疾患に進行する。現在、外科的又は放射線療法後、再発性の疾患を発症させる前立腺癌患者の２０−４０％、又は癌が診断の時点で転移している患者にとって、有効な治療が存在しない。化学療法は、特に高齢の患者に対してその毒性の副作用を示す。特にアンドロゲン剥脱に難治性の疾患にとって、新規の形態の治療法を開発することは、前立腺癌の処置において緊急性を要することである。
【０００４】
抗体ベースの治療は、種々の癌において非常に有効であることが実証されている。例えば、ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）及びＲＩＴＵＸＡＮ（登録商標）（共にＧｅｎｅｎｔｅｃｈ， Ｓ． Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ）は、各々、乳癌及び非ホドキンリンパ腫を治療するのに有効に使用されてきた。
本発明は、従来の治療法の限界を打ち破り、以下の詳細な説明から明らかとなる付加的な利点を提供する既存の方法に代わる癌の治療法に関する。
我々は、ここにおいて、ＰＲＯ２３２０３ポリペプチドと称される新規ポリペプチドＰＵＭＰＣｎの同定及び性質決定について記載する。ＰＵＭＰＣｎの断片は既に記述されており、ＷＯ９８／３７０９３， ＷＯ９８／３７４１８， ＷＯ９９／６１４６９， ＷＯ９９／６２９４１， ＷＯ００／０４１４９， ＷＯ０１／２５２７２， Ｕ．Ｓ．６，０４８，９７０， ＷＯ９９／６２９４１及びＷＯ０１／４０２７６を参照のこと。
（発明の概要）
【０００５】
ｃＤＮＡクローン（ここにではＤＮＡ１８５１７１−２９９４と称される）がＰＵＭＰＣｎとして同定され、これは本出願において「ＰＲＯ２３２０３」と称される新規ポリペプチドをコードする。
一実施態様では、本発明は、ＰＲＯ２３２０３ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子を提供する。
一側面では、単離された核酸分子は、（ａ）図２（配列番号：２）の、約１から約４５４番目のアミノ酸残基を含む配列を有するＰＲＯ２３２０３ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、又は（ｂ）（ａ）のヌクレオチド配列の相補鎖に対して、少なくとも約８０％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８１％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８２％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８３％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８４％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８５％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８６％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８７％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８８％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８９％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９０％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９１％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９２％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９３％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９４％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９５％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９６％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９７％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９８％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９９％の核酸配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。
他の側面では、単離された核酸分子は、（ａ）図２（配列番号：２）を含む、約１から約４５４番目のアミノ酸残基の配列を有するＰＲＯ２３２０３をコードするヌクレオチド配列、又は（ｂ）（ａ）のヌクレオチド配列の相補鎖を含む。
【０００６】
他の側面では、単離された核酸分子は、（ａ）図１（配列番号：１）の、約１８８から約１５４９番目を含むヌクレオチドの配列を有するＤＮＡ分子、又は（ｂ）（ａ）のＤＮＡ分子の相補鎖に対して、少なくとも約８０％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８１％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８２％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８３％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８４％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８５％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８６％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８７％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８８％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８９％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９０％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９１％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９２％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９３％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９４％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９５％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９６％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９７％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９８％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９９％の核酸配列同一性を有しているヌクレオチド配列を含む。
さらに他の側面では、単離された核酸分子は、（ａ）図１（配列番号：１）の、約１８８から約１５４９番目を含むヌクレオチドの配列、又は（ｂ）（ａ）のヌクレオチド配列の相補鎖を含む。
【０００７】
さらなる側面では、本発明は、（ａ）ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−２５１３（ＤＮＡ１８５１７１−２９９４）として２０００年９月２６日付けでＡＴＣＣに寄託されたヒトタンパク質ｃＤＮＡによりコードされるものと同じ成熟ポリペプチドをコードするＤＮＡ 分子、又は（ｂ）（ａ）のＤＮＡ分子の相補鎖に対して、少なくとも約８０％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８１％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８２％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８３％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８４％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８５％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８６％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８７％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８８％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８９％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９０％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９１％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９２％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９３％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９４％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９５％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９６％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９７％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９８％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９９％の核酸配列同一性を有しているヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子に関する。好ましい実施態様においては、単離された核酸分子は、（ａ）ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−２５１３（ＤＮＡ１８５１７１−２９９４）として２０００年９月２６日付けでＡＴＣＣに寄託されたヒトタンパク質ｃＤＮＡによりコードされるものと同じ成熟ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、又は（ｂ）（ａ）のヌクレオチド配列の相補鎖を含む。
【０００８】
他の側面では、本発明は、（ａ）ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−２５１３（ＤＮＡ１８５１７１−２９９４）として２０００年９月２６日付けでＡＴＣＣに寄託されたヒトタンパク質ｃＤＮＡの全長ポリペプチドコード化配列、又は（ｂ）（ａ）のヌクレオチド配列の相補鎖に対して、少なくとも約８０％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８１％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８２％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８３％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８４％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８５％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８６％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８７％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８８％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８９％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９０％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９１％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９２％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９３％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９４％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９５％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９６％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９７％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９８％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９９％の核酸配列同一性を有しているヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子に関する。好ましい実施態様においては、単離された核酸分子は、（ａ）ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−２５１３（ＤＮＡ１８５１７１−２９９４）として２０００年９月２６日付けでＡＴＣＣに寄託されたＤＮＡの全長ポリペプチドコード化配列、又は（ｂ）（ａ）のヌクレオチド配列の相補鎖を含む。
【０００９】
他の側面では、本発明は、図２（配列番号：２）の１から約４５４含むアミノ酸をコードする核酸配列の相補鎖にハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む、下記に定義される活性なＰＲＯ２３２０３ポリペプチドをコードする単離された核酸分子に関する。好ましくは、ハイブリダイゼーションは緊縮性のハイブリダイゼーション及び洗浄条件下で行われる。
さらに他の側面では、本発明は、図１（配列番号：１）の約ヌクレオチド１８８から約１５４９の間を含む核酸配列の相補鎖にハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む、下記に定義される活性なＰＲＯ２３２０３ポリペプチドをコードする単離された核酸分子関する。好ましくは、ハイブリダイゼーションは緊縮性のハイブリダイゼーション及び洗浄条件下で行われる。
さらなる側面では、本発明は、少なくとも約１２０４ヌクレオチドを有し、（ａ）図２（配列番号：２）の約１から４５４を含むアミノ酸残基の配列を有するＰＲＯ２３２０３ポリペプチドをコードするＤＮＡ分子、又は（ｂ）（ａ）のＤＮＡ分子の相補鎖と緊縮性の条件下でテストＤＮＡ分子をハイブリダイズさせることにより、また、テストＤＮＡ分子が（ａ）又は（ｂ）と少なくとも約８０％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８１％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８２％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８３％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８４％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８５％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８６％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８７％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８８％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８９％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９０％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９１％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９２％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９３％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９４％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９５％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９６％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９７％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９８％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９９％の核酸配列同一性を有している場合には、テストＤＮＡを単離することによって生産される単離された核酸分子に関する。
【００１０】
本発明の他の側面は、膜貫通ドメイン欠損又は膜貫通ドメイン不活性のどちらかであるＰＲＯ２３２０３ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、又はそのようなコード化ヌクレオチド配列と相補的であるヌクレオチド配列を含み、膜貫通ドメインが、図２（配列番号：２）の配列中、暫定的にアミノ酸位置約２１０からアミノ酸位置約２３０にかけて同定される、単離された核酸分子を提供する。
この点において、本発明の他の側面は、（ａ）図２（配列番号：２）のアミノ酸１からＸをコードし、Ｘが図２（配列番号：２）の２０５から２１４の任意のアミノ酸であるＤＮＡ分子、又は（ｂ）（ａ）のＤＮＡ分子の相補鎖と少なくとも約８０％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８１％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８２％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８３％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８４％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８５％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８６％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８７％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８８％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８９％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９０％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９１％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９２％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９３％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９４％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９５％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９６％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９７％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９８％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９９％の核酸配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子に対する。特別の側面において、単離された核酸分子は、（ａ）図２（配列番号：２）のアミノ酸１からＸをコードし、Ｘが図２（配列番号：２）の２０５から２１４の任意のアミノ酸である、又は（ｂ）（ａ）のＤＮＡ分子の相補鎖である核酸配列を含む。
【００１１】
他の実施態様はＰＲＯ２３２０３ポリペプチドコード化配列の断片に対するもので、それらは、例えば、ハイブリダイゼーションプローブとして、場合によっては抗−ＰＲＯ２３２０３抗体に対する結合部位を含むポリペプチドをコードするＰＲＯ２３２０３ポリペプチドのコード化断片としての用途が見いだされる。このような核酸断片は、通常は少なくとも約２０ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約３０ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約４０ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約５０ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約６０ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約７０ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約８０ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約９０ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約１００ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約１１０ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約１２０ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約１３０ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約１４０ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約１５０ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約１６０ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約１７０ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約１８０ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約１９０ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約２００ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約２５０ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約３００ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約３５０ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約４００ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約４５０ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約５００ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約６００ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約７００ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約８００ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約９００ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約１０００ヌクレオチド長であり、ここで「約」という語の内容は参照する長さのプラス又はマイナス１０％のヌクレオチド配列長を指すことを意味する。好ましい実施態様において、ヌクレオチド配列断片は、図１（配列番号：１）に示されるヌクレオチド配列の任意のコード領域に由来する。ＰＲＯ２３２０３ポリペプチドコード化ヌクレオチド配列の新規な断片は、多くの良く知られた配列アラインメントプログラムの任意のものを用いてＰＲＯ２３２０３ポリペプチドコード化ヌクレオチド配列と他の公知のヌクレオチド配列とを整列させ、いずれのＰＲＯ２３２０３ポリペプチドコード化ヌクレオチド配列断片が新規であるかを決定することにより、日常的な手法で同定してもよい。このようなＰＲＯ２３２０３ポリペプチドコード化ヌクレオチド配列は、全てここで考慮され、過度の実験を行わずに決定することができる。また、これらのヌクレオチド分子断片、好ましくは抗−ＰＲＯ２３２０３抗体に対する結合部位を含むＰＲＯ２３２０３ポリペプチド断片によってコードされるＰＲＯ２３２０３ポリペプチド断片も考慮される。
【００１２】
他の実施態様において、本発明はＰＲＯ２３２０３又はその変異体をコードするヌクレオチド配列を含むベクターを提供する。該ベクターは前述したように同定される単離された任意の核酸分子を含んでもよい。
また、このようなベクターを含む宿主細胞も提供される。例としては、宿主細胞はＣＨＯ細胞、大腸菌、又は酵母であってもよい。ＰＲＯ２３２０３ポリペプチドの製造方法がさらに提供されており、それは、宿主細胞をＰＲＯ２３２０３の発現に適した条件下で培養し、細胞培地からＰＲＯ２３２０３を回収することを含む。
他の実施態様において、本発明は前述したように同定される単離された任意の核酸配列によりコードされる単離されたＰＲＯ２３２０３ポリペプチドを提供する。
特別な側面において、本発明は単離された天然配列のＰＲＯ２３２０３ポリペプチドであって、ある実施態様においては、図２（配列番号：２）に示す約１から約４５４の残基を含むアミノ酸配列を包含するものを提供する。
【００１３】
他の側面において、本発明は、図２（配列番号：２）の約１から４５４を含むアミノ酸残基の配列と、少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約８１％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約８２％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約８３％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約８４％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約８５％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約８６％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約８７％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約８８％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約８９％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約９０％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約９１％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約９２％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約９３％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約９４％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約９５％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約９６％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約９７％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約９８％のアミノ酸配列同一性、そして、あるいは少なくとも約９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む単離されたＰＲＯ２３２０３ポリペプチドに関する。
【００１４】
更なる側面において、本発明は、ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−２５１３（ＤＮＡ１８５１７１−２９９４）として２０００年９月２６日付けでＡＴＣＣに寄託されたヒトタンパク質ｃＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列と、少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約８１％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約８２％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約８３％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約８４％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約８５％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約８６％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約８７％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約８８％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約８９％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約９０％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約９１％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約９２％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約９３％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約９４％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約９５％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約９６％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約９７％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約９８％のアミノ酸配列同一性、そして、あるいは少なくとも約９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む単離されたＰＲＯ２３２０３ポリペプチドに関する。好ましい実施態様において、本発明は、ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−２５１３（ＤＮＡ１８５１７１−２９９４）として２０００年９月２６日付けでＡＴＣＣに寄託されたヒトタンパク質ｃＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列を含む。
【００１５】
他の側面では、本発明は膜貫通ドメイン欠損又は膜貫通ドメイン不活性のどちらかである単離されたＰＲＯ２３２０３ポリペプチドを提供する。同一のものを生産する方法もここに記載されており、それらの方法はＰＲＯ２３２０３ポリペプチドの発現に適する条件下で適切なコード化配列核酸分子を含むベクターを包含する宿主細胞を培養し、細胞培養物からＰＲＯ２３２０３ポリペプチドを回収することを含む。
従って、本発明の一つの側面は、図２（配列番号：２）の１からＸであって、Ｘが図２（配列番号：２）の２０５から２１４の任意のアミノ酸であるアミノ酸と少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約８１％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約８２％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約８３％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約８４％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約８５％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約８６％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約８７％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約８８％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約８９％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約９０％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約９１％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約９２％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約９３％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約９４％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約９５％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約９６％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約９７％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約９８％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む単離された可溶性ＰＲＯ２３２０３ポリペプチドを示す。好ましい側面において、単離された可溶性ＰＲＯ２３２０３ポリペプチドは、図２（配列番号：２）の１からＸであって、Ｘが図２（配列番号：２）の２０５から２１４の任意のアミノ酸であるアミノ酸を含む。
【００１６】
さらに他の側面において、本発明は、図２（配列番号：２）の約１から４５４を含むアミノ酸残基の配列、又は生物学的に活性な又は抗−ＰＲＯ２３２０３抗体に対する結合部位を提供するのに十分なその断片を含み、その生物学的活性を有し、抗−ＰＲＯ２３２０３抗体に対する結合部位を提供するＰＲＯ２３２０３ポリペプチド断片の同定が、当該技術分野において周知の技術を用いる常套手段によって達成される、単離されたＰＲＯ２３２０３ポリペプチドに関する。好ましくは、ＰＲＯ２３２０３断片は天然ＰＲＯ２３２０３ポリペプチドの定性的生物学的活性を保持する。
またさらなる側面において、本発明は、（ｉ）緊縮性の条件下において、（ａ）図２（配列番号：２）の約１から約４５４を含むアミノ酸残基の配列を有するＰＲＯ２３２０３ポリペプチドをコードするＤＮＡ分子、又は（ｂ）（ａ）のＤＮＡ分子の相補鎖とテストＤＮＡ分子をハイブリダイズすることによって、及びテストＤＮＡ分子が（ａ）又は（ｂ）と少なくとも約８０％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８１％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８２％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８３％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８４％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８５％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８６％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８７％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８８％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８９％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９０％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９１％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９２％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９３％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９４％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９５％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９６％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９７％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９８％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９９％の核酸配列同一性を有している場合に、（ｉｉ）ポリペプチドの発現に適する条件下でテストＤＮＡを含む宿主細胞を培養することにより、（ｉｉｉ）該細胞培養物からポリペプチドを回収することにより、生産されるポリペプチドを提供する。
【００１７】
他の実施態様では、本発明は、異種ポリペプチド又はアミノ酸配列に融合したＰＲＯ２３２０３ポリペプチドを含んでなるキメラ分子を提供し、前述したようにＰＲＯ２３２０３ポリペプチドは任意のＰＲＯ２３２０３ポリペプチド、その変異体又は断片を含んでもよい。そのようなキメラ分子の例は、エピトープタグ配列又は免疫グロブリンのＦｃ領域に融合したＰＲＯ２３２０３ポリペプチドを含む。
その他の実施態様では、本発明は、上記のＰＲＯ２３２０３ポリペプチドに特異的に結合する後述の抗体を提供する。場合によっては、抗体はモノクローナル抗体、抗体断片又は一本鎖抗体である。本発明の一の側面において、抗−ＰＵＭＰＣｎ抗体は、配列番号：２のアミノ酸１−５０の範囲内に存在するエピトープと結合し、或いは、エピトープはアミノ酸５１−１００、又はアミノ酸１０１−１５０、又は１５１−２００、又は２０１−２５０、又は２５１−３００の範囲内に存在する。また、本発明はＰＵＭＰＣｎ（配列番号：２を参照）のアミノ酸２５−２１３の範囲内に存在するエピトープを結合するモノクローナル抗体も提供する。特定の実施態様において、実施例１３中に記載され、ＡＴＣＣ登録番号を有するｍＡｂｓ３２４８から３２５６が提供される。
一実施態様において、本発明は生きた細胞上のＰＵＭＰＣｎと結合する抗体を提供する。他の実施態様において、本発明はＰＵＭＰＣｎの細胞外ドメインと結合する抗体を提供する。本発明はインビボにおいて哺乳類細胞上のＰＵＭＰＣｎと結合して内部移行する単離された抗−ＰＵＭＰＣｎ抗体を提供する。また、これらの抗体はインビボにおいてＰＵＭＰＣｎを発現する腫瘍細胞を標的することもできる。特別な実施態様において、抗−ＰＵＭＰＣｎ抗体は、前立腺癌、肺癌を含む癌細胞上のＰＵＭＰＣｎと結合し内部移行する。また、本発明のモノクローナル抗体のいずれかによって結合されるエピトープと同じエピトープとの結合に関し競合する抗体も提供される。他の実施態様において、インビボにおいてＰＵＭＰＣｎを発現する癌細胞の増殖を阻害し、又はインビボにおいて該細胞及び該細胞を含む腫瘍に対して細胞障害性である、単離された抗−ＰＵＭＰＣｎモノクローナル抗体が提供される。
【００１８】
また、本発明は細胞障害性薬剤又は増殖阻害剤と結合した抗−ＰＵＭＰＣｎ抗体も提供する。この抗体は内部移行性、及び／又は増殖阻害性抗体である。細胞障害性薬剤は毒素、抗生剤、放射性同位体又はヌクレオチド分解酵素であってもよい。好ましい実施態様において、毒素はメイタンシノイドであり、より好ましくは図６に示される構造を持つメイタンシノイドである。
前述の実施態様中の抗−ＰＵＭＰＣｎ抗体には、無傷（全長の）抗体並びに抗体断片が含まれる。本発明の抗体は哺乳動物又はバクテリアの細胞中で生産されるものを含む。
さらに他の実施態様において、本発明は以下に定義される天然ＰＲＯ２３２０３ポリペプチドのアゴニスト及びアンタゴニストに関する。特別の実施態様において、アゴニスト又はアンタゴニストは、抗−ＰＲＯ２３２０３抗体又は小分子である。
さらなる実施態様において、本発明は、ＰＲＯ２３２０３ポリペプチドに対するアゴニスト又はアンタゴニストを同定する方法であって、ＰＲＯ２３２０３ポリペプチドを候補分子に接触させ、前記ＰＲＯ２３２０３ポリペプチドによって媒介される生物学的活性をモニターすることを含んでなる方法に関する。好ましくは、ＰＲＯ２３２０３ポリペプチドは天然ＰＲＯ２３２０３ポリペプチドである。
またさらなる実施態様において、本発明はＰＲＯ２３２０３ポリペプチド、又はここで記載されるＰＲＯ２３２０３ポリペプチドのアゴニスト又はアンタゴニスト、又は抗−ＰＲＯ２３２０３抗体を担体と組合わせて含む組成物に関する。場合によっては、担体は薬学的に受容可能な坦体である。
本発明の他の実施態様は、ＰＲＯ２３２０３ポリペプチド、そのアゴニスト又はアンタゴニスト又は抗−ＰＲＯ２３２０３抗体に反応性の状態の治療に有効な医薬の調製のための、ＰＲＯ２３２０３ポリペプチド、ここで記載されるようなそのアゴニスト又はそのアンタゴニスト、又は抗−ＰＲＯ２３２０３抗体の使用に関する。
【００１９】
さらに、本発明の別の側面は、ＰＵＭＰＣｎを発現する癌細胞を殺す方法であって、前述の実施態様のいずれかの抗−ＰＵＭＰＣｎ抗体に癌細胞を接触させ、それにより癌細胞を殺すことを含む方法である。他の側面は、哺乳動物のＰＵＭＰＣｎを発現する癌を緩和し、治療する方法であって、該哺乳動物に対して本発明の抗−ＰＵＭＰＣｎ抗体の治療的有効量を投与することを含む方法である。前述の２つの方法の好ましい実施態様において、癌は前立腺、膀胱又は肺癌であり、より好ましくは前立腺癌及び特にアンドロゲン非依存性前立腺癌細胞又は転移性前立腺癌である。これらの方法の好ましい実施態様において、抗−ＰＵＭＰＣｎ抗体はヒト又はヒト化抗体である。他の好ましい実施態様において、抗体は毒素や放射性同位体などの細胞障害性薬剤と結合する。好ましくは、図６に示される構造を有する「ＤＭ１」などのカリケアマイシン又はメイタンシノイドである。ＰＵＭＰＣｎを発現する癌を緩和する方法は、哺乳動物が少なくとも一つの化学療法剤も受容する化学療法と併せて抗−ＰＵＭＰＣｎ抗体を投与することを予想する。特別の実施態様において、化学療法剤はパクリタキセル（ＴＡＸＯＬ登録商標）又はドセタキセル、又はそれらの誘導体及び類似体などのタキサンである。
さらなる側面において、本発明は中に含まれる容器及び組成物を含む製造品であって、該組成物は前述の実施態様の抗−ＰＵＭＰＣｎ抗体を含み、該組成物がＰＵＭＰＣｎ発現癌、特に前立腺癌を緩和し又は治療するために使用され得るものであることを示す添付文書をさらに含む製造品を提供する。
【００２０】
（好適な実施態様の詳細な説明）
Ｉ．定義
ここで使用される際の「ＰＲＯ２３２０３ポリペプチド」、「ＰＲＯ２３２０３タンパク質」及び「ＰＲＯ２３２０３」という用語は、天然配列ＰＲＯ２３２０３及びＰＲＯ２３２０３ポリペプチド変異体（ここで更に詳細に定義する）を含む。ＰＲＯ２３２０３ポリペプチドは、ヒト組織型又は他の供給源などの種々の供給源から単離してもよく、組換え及び／又は合成方法により調製してもよい。
「天然配列ＰＲＯ２３２０３」は、天然由来のＰＲＯ２３２０３と同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含んでいる。このような天然配列ＰＲＯ２３２０３は、自然から単離することもできるし、組換え及び／又は合成手段により生産することもできる。「天然配列ＰＲＯ２３２０３」という用語には、特に、ＰＲＯ２３２０３の自然に生じる切断又は分泌形態（例えば、細胞外ドメイン配列）、自然に生じる変異形態（例えば、選択的にスプライシングされた形態）及び自然に生じる対立遺伝子変異体が含まれる。本発明の一実施態様において、天然配列ＰＲＯ２３２０３は、図２（配列番号：２）のアミノ酸１−４５４を含む成熟又は全長天然配列ＰＲＯ２３２０３である。また、図２（配列番号：２）に開示されるＰＲＯ２３２０３ポリペプチドは、ここではアミノ酸位置１として示されるメチオニン残基から始まることが示されているが、図２（配列番号：２）中のアミノ酸位置１の上流又は下流のいずれかに位置する他のメチオニン残基がＰＲＯ２３２０３ポリペプチドの開始アミノ酸残基として用いられ得ることは考えられることであり、またあり得ることである。
【００２１】
ＰＲＯ２３２０３ポリペプチド「細胞外ドメイン」又は「ＥＣＤ」は、膜貫通及び細胞質ドメインを実質的に有しないＰＲＯ２３２０３ポリペプチドの形態を意味する。通常、ＰＲＯ２３２０３ポリペプチドＥＣＤは、それらの膜貫通及び／又は細胞質ドメインを約１ ％未満、好ましくはそのようなドメインを約０．５ ％未満しか持たない。本発明のＰＲＯ２３２０３ポリペプチドについて同定された任意の膜貫通ドメインは、疎水性ドメインのタイプを同定するために当該分野において日常的に使用される基準に従い同定されることが理解されるであろう。膜貫通ドメインの厳密な境界は変わり得るが、最初に同定されたドメインのいずれかの末端から約５アミノ酸を越えない可能性が高い。従って、本発明の一実施態様においては、ＰＲＯ２３２２０３ポリペプチドの細胞外ドメインはアミノ酸１からＸを含み、Ｘは図２（配列番号：２）のアミノ酸２０５から２１４の任意のアミノ酸である。
【００２２】
「ＰＲＯ２３２０３変異体ポリペプチド」は、（ａ）図２（配列番号：２）に示される、ＰＲＯ２３２０３ポリペプチドの残基１から４５４、（ｂ）Ｘが図２（配列番号：２）のアミノ酸２０５から２１４の任意のアミノ酸である、図２（配列番号：２）の１からＸ、又は（ｃ）図２（配列番号：２）に示されるアミノ酸配列の他の特異的誘導断片のアミノ酸配列と少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性を有する以下で定義される活性なＰＲＯ２３２０３ポリペプチドを意味する。このようなＰＲＯ２３２０３変異体ポリペプチドは、例えば、図２（配列番号：２）のＮ−又は／及びＣ−末端並びに一又は複数の内部ドメインにおいて、１又は複数のアミノ酸残基が付加、もしくは欠失されたＰＲＯ２３２０３ポリペプチドが含まれる。通常、ＰＲＯ２３２０３変異体ポリペプチドは、（ａ）図２（配列番号：２）に示される、ＰＲＯ２３２０３ポリペプチドの残基１から４５４、（ｂ）Ｘが図２（配列番号：２）のアミノ酸２０５から２１４の任意のアミノ酸である、図２（配列番号：２）の１からＸ、又は（ｃ）図２（配列番号：２）に示されるアミノ酸配列の他の特異的誘導断片に、少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約８１％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約８２％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約８３％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約８４％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約８５％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約８６％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約８７％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約８８％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約８９％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約９０％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約９１％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約９２％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約９３％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約９４％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約９５％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約９６％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約９７％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約９８％のアミノ酸配列同一性、そして、あるいは少なくとも約９９％のアミノ酸配列同一性を有している。ＰＲＯ２３２０３変異体ポリペプチドは、天然ＰＲＯ２３２０３ポリペプチド配列を含まない。通常は、ＰＲＯ２３２０３変異体ポリペプチドは、少なくとも約１０アミノ酸長、あるいは少なくとも約２０アミノ酸長、あるいは少なくとも約３０アミノ酸長、あるいは少なくとも約４０アミノ酸長、あるいは少なくとも約５０アミノ酸長、あるいは少なくとも約６０アミノ酸長、あるいは少なくとも約７０アミノ酸長、あるいは少なくとも約８０アミノ酸長、あるいは少なくとも約９０アミノ酸長、あるいは少なくとも約１００アミノ酸長、あるいは少なくとも約１５０アミノ酸長、あるいは少なくとも約２００アミノ酸長、あるいは少なくとも約３００アミノ酸長、又はそれより長い。
【００２３】
ここに同定されるＰＲＯ２３２０３ポリペプチドに対する「パーセント（％）アミノ酸配列同一性」は、配列を整列させ、必要ならば最大のパーセント配列同一性を得るためにギャップを導入し、如何なる保存的置換も配列同一性の一部と考えずに、ＰＲＯ２３２０３配列のアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセントとして定義される。パーセントアミノ酸配列同一性を決定する目的のためのアラインメントは、当業者の技量の範囲にある種々の方法、例えばＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮ、ＡＬＩＧＮ−２又はＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウエアのような公に入手可能なコンピュータソフトウエアを使用することにより達成可能である。当業者であれば、比較される配列の完全長に対して最大のアラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、アラインメントを測定するための適切なパラメータを決定することができる。しかし、ここでの目的のためには、％アミノ酸配列同一性値は、ＡＬＩＧＮ−２プログラム用の完全なソースコードが下記の表１に提供されている配列比較プログラムＡＬＩＧＮ−２を使用することによって得られる。ＡＬＩＧＮ−２配列比較コンピュータプログラムはＧｅｎｅｎｔｅｃｈ社によって作成され、下記の表１に示したソースコードは米国著作権事務所， ワシントンＤ．Ｃ．， ２０５５９に使用者用書類とともに提出され、米国著作権登録番号ＴＸＵ５１００８７の下で登録されている。ＡＬＩＧＮ−２プログラムはＧｅｎｅｎｔｅｃｈ社、サウス サン フランシスコ， カリフォルニアから公的に入手可能であり、表１に提供されたソースコードからコンパイルしてもよい。ＡＬＩＧＮ−２プログラムは、ＵＮＩＸ（登録商標）オペレーティングシステム、好ましくはデジタルＵＮＩＸ（登録商標） Ｖ４．０Ｄでの使用のためにコンパイルされる。全ての配列比較パラメータは、ＡＬＩＧＮ−２プログラムによって設定され変動しない。
【００２４】
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【００２５】
ここでの目的に関しては、与えられたアミノ酸配列Ａの、与えられたアミノ酸配列Ｂとの、又はそれに対する％アミノ酸配列同一性（あるいは、与えられたアミノ酸配列Ｂと、又はそれに対して或る程度の％アミノ酸配列同一性を持つ又は含む与えられたアミノ酸配列Ａと言うこともできる）は次のように計算される：
分率Ｘ／Ｙの１００倍
ここで、Ｘは配列アラインメントプログラムＡＬＩＧＮ−２のＡ及びＢのアラインメントによって同一であると一致したスコアのアミノ酸残基の数であり、ＹはＢの全アミノ酸残基数である。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さと異なる場合、ＡのＢに対する％アミノ酸配列同一性は、ＢのＡに対する％アミノ酸配列同一性とは異なることは理解されるであろう。％アミノ酸配列同一性の計算の例として、表２Ａ−Ｂは、「比較タンパク質」と称されるアミノ酸配列の「ＰＲＯ」と称されるアミノ酸配列に対する％アミノ酸配列同一性の計算方法を示す。
【００２６】
表２Ａ−ＤはＡＬＩＧＮ−２配列比較コンピュータープログラムを用いて％アミノ酸配列同一性（表２Ａ−Ｂ）及び％核酸配列同一性（表２Ｃ−Ｄ）を決定するための以下に記載の方法を用いるために、仮想的な例示を示すが、ここで「ＰＲＯ」は対象の仮想的なＰＲＯ２３２０３ポリペプチドのアミノ酸配列を示し、「比較タンパク質」は対象の「ＰＲＯ」ポリペプチドが比較されるポリペプチドのアミノ酸配列を示し、「ＰＲＯ−ＤＮＡ」は対象の仮想的なＰＲＯ２３２０３コード化核酸配列を示し、「比較ＤＮＡ」は対象の「ＰＲＯ−ＤＮＡ」核酸分子が比較される核酸分子のヌクレオチド配列を示し、「Ｘ」、「Ｙ」及び「Ｚ」は各々異なる仮想的アミノ酸残基を示し、「Ｎ」、「Ｌ」及び「Ｖ」は各々異なる仮想的ヌクレオチドを示す。
【００２７】
2004524816.tif 000019
【００２８】
2004524816.tif 000020
【００２９】
特に断らない限りは、ここでの全ての％アミノ酸配列同一性値は上記のようにＡＬＩＧＮ−２配列比較コンピュータプログラムを用いて得られる。しかしながら、％アミノ酸配列同一性は、配列比較プログラムＮＣＢＩ−ＢＬＡＳＴ２（Ａｌｔｓｃｈｕｌら， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２５： ３３８９−３４０２ （１９９７））を用いて決定してもよい。ＮＣＢＩ−ＢＬＡＳＴ２配列比較プログラムは、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖからダウンロードでき、又は別な方法で米国国立衛生研究所、ベセスダ、メリーランドから得ることができる。ＮＣＢＩ−ＢＬＡＳＴ２は幾つかの検索パラメータを使用し、それら検索パラメータの全ては初期値に設定され、例えば、ｕｎｍａｓｋ＝可、鎖＝全て、予測される発生＝１０、最小低複合長＝１５／５、マルチパスｅ−値＝０．０１、マルチパスの定数＝２５、最終ギャップアラインメントのドロップオフ＝２５、及びスコアリングマトリクス＝ＢＬＯＳＵＭ６２を含む。
アミノ酸配列比較にＮＣＢＩ−ＢＬＡＳＴ２が用いられる状況では、与えられたアミノ酸配列Ａの、与えられたアミノ酸配列Ｂとの、又はそれに対する％アミノ酸配列同一性（あるいは、与えられたアミノ酸配列Ｂと、又はそれに対して或る程度の％アミノ酸配列同一性を持つ又は含む与えられたアミノ酸配列Ａと言うこともできる）は次のように計算される：
分率Ｘ／Ｙの１００倍
ここで、Ｘは配列アラインメントプログラムＮＣＢＩ−ＢＬＡＳＴ２のＡ及びＢのアラインメントによって同一であると一致したスコアのアミノ酸残基の数であり、ＹはＢの全アミノ酸残基の総数である。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さと異なる場合、ＡのＢに対する％アミノ酸配列同一性は、ＢのＡに対する％アミノ酸配列同一性とは異なることは理解されるであろう。
【００３０】
「ＰＲＯ２３２０３変異体ポリヌクレオチド」又は「ＰＲＯ２３２０３変異体核酸配列」とは、下記に定義されるような活性なＰＲＯ２３２０３ポリペプチドをコードし、（ａ）図２（配列番号：２）に示される、ＰＲＯ２３２０３ポリペプチドの残基１から４５４をコードする核酸配列、（ｂ）Ｘが図２（配列番号：２）のアミノ酸２０５から２１４の任意のアミノ酸である、図２（配列番号：２）のアミノ酸１からＸをコードする核酸配列、又は（ｃ）図２（配列番号：２）に示されるアミノ酸配列の他の特異的誘導断片をコードする核酸配列のいずれかと少なくとも約８０％の核酸配列同一性を有する核酸分子を意味する。通常、ＰＲＯ２３２０３変異体ポリヌクレオチドは、（ａ）図２（配列番号：２）に示される、ＰＲＯ２３２０３ポリペプチドの残基１から４５４をコードする核酸配列、（ｂ）Ｘが図２（配列番号：２）のアミノ酸２０５から２１４の任意のアミノ酸である、図２（配列番号：２）のアミノ酸１からＸをコードする核酸配列、又は（ｃ）図２（配列番号：２）に示されるアミノ酸配列の他の特異的誘導断片をコードする核酸配列のいずれかと少なくとも約８０％の核酸配列同一性、好ましくはあるいは少なくとも約８１％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８２％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８３％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８４％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８５％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８６％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８７％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８８％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８９％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９０％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９１％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９２％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９３％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９４％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９５％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９６％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９７％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９８％の核酸配列同一性、そして、あるいは少なくとも約９９％の核酸配列同一性を有している。ＰＲＯ２３２０３ポリヌクレオチド変異体は、天然ＰＲＯ２３２０３ヌクレオチド配列を含まない。
【００３１】
通常は、ＰＲＯ２３２０３変異体ポリヌクレオチドは、少なくとも約３０ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約６０ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約９０ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約１２０ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約１５０ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約１８０ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約２１０ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約２４０ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約２７０ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約３００ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約４５０ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約６００ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約９００ヌクレオチド長、又はそれより長い。
ここで同定されるＰＲＯ２３２０３ポリペプチドコード化核酸配列に対する「パーセント（％）核酸配列同一性」は、配列を整列させ、必要ならば最大のパーセント配列同一性を得るためにギャップを導入し、ＰＲＯ２３２０３ポリペプチドコード化核酸配列のヌクレオチドと同一である候補配列中のヌクレオチドのパーセントとして定義される。パーセント核酸配列同一性を決定する目的のためのアラインメントは、当業者の技量の範囲にある種々の方法、例えばＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮ、ＡＬＩＧＮ−２又はＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウエアのような公に入手可能なコンピュータソフトウエアを使用することにより達成可能である。当業者であれば、比較される配列の完全長に対して最大のアラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、アラインメントを測定するための適切なパラメータを決定することができる。しかし、ここでの目的のためには、％核酸配列同一性値は、後述するように配列比較コンピュータープログラムＡＬＩＧＮ−２を用いることにより得られ、ＡＬＩＧＮ−２プログラムの完全なソースコードは表１に提供されている。ＡＬＩＧＮ−２配列比較コンピュータプログラムはジェネンテク社によって作成され、下記の表１に示したソースコードは米国著作権事務所，ワシントン Ｄ．Ｃ．，２０５５９に使用者用書類とともに提出され、米国著作権登録番号ＴＸＵ５１００８７の下で登録されている。ＡＬＩＧＮ−２プログラムはジェネンテク社、サウス サン フランシスコ， カリフォルニアから公的に入手可能であり、下記の表１に提供されたソースコードからコンパイルしてもよい。ＡＬＩＧＮ−２プログラムは、ＵＮＩＸ（登録商標）オペレーティングシステム、特にデジタルＵＮＩＸ（登録商標） Ｖ４．０Ｄでの使用のためにコンパイルされる。全ての配列比較パラメータは、ＡＬＩＧＮ−２プログラムによって設定され変動しない。
【００３２】
ここでの目的に関しては、与えられた核酸配列Ｃの、与えられた核酸配列Ｄとの、又はそれに対する％核酸配列同一性（あるいは、与えられたアミノ酸配列Ｄと、又はそれに対して或る程度の％核酸配列同一性を持つ又は含む与えられた核酸配列Ｃと言うこともできる）は次のように計算される：
分率Ｗ／Ｚの１００倍
ここで、Ｗは配列アラインメントプログラムＡＬＩＧＮ−２のＣ及びＤのアラインメントによって等しく一致したスコアのヌクレオチドの数であり、ＺはＤの全ヌクレオチド数である。核酸配列Ｃの長さが核酸配列Ｄの長さと異なる場合、ＣのＤに対する％核酸配列同一性は、ＤのＣに対する％核酸配列同一性とは異なることは理解されるであろう。％核酸配列同一性の計算の例として、表２Ｃ−Ｄは、「比較ＤＮＡ」と称される核酸配列の「ＰＲＯ−ＤＮＡ」と称される核酸配列に対する％核酸配列同一性の計算方法を示す。
【００３３】
2004524816.tif 000021
【００３４】
2004524816.tif 000022
【００３５】
特に断らない限りは、ここでの全ての％核酸配列同一性値は、直上のパラグラフに示したようにＡＬＩＧＮ−２配列比較コンピュータプログラムを用いて得られる。しかしながら、％核酸配列同一性は、配列比較プログラムＮＣＢＩ−ＢＬＡＳＴ２（Ａｌｔｓｃｈｕｌら， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２５： ３３８９−３４０２ （１９９７））を用いて決定してもよい。ＮＣＢＩ−ＢＬＡＳＴ２配列比較プログラムは、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖからダウンロードでき、又は別な方法で米国国立衛生研究所、ベセスダ、メリーランドから得ることができる。ＮＣＢＩ−ＢＬＡＳＴ２は幾つかの検索パラメータを使用し、それら検索パラメータの全ては初期値に設定され、例えば、ｕｎｍａｓｋ＝可、鎖＝全て、予測される発生＝１０、最小低複合長＝１５／５、マルチパスｅ−値＝０．０１、マルチパスの定数＝２５、最終ギャップアラインメントのドロップオフ＝２５、及びスコアリングマトリクス＝ＢＬＯＳＵＭ６２を含む。
核酸配列比較にＮＣＢＩ−ＢＬＡＳＴ２が用いられる状況では、与えられた核酸配列Ｃの、与えられた核酸配列Ｄとの、又はそれに対する％核酸配列同一性（あるいは、与えられた核酸配列Ｄと、又はそれに対して或る程度の％核酸配列同一性を持つ又は含む与えられた核酸配列Ｃと言うこともできる）は次のように計算される：
分率Ｗ／Ｚの１００倍
ここで、Ｗは配列アラインメントプログラムＮＣＢＩ−ＢＬＡＳＴ２のＣ及びＤのアラインメントによって等しく一致したスコアの核酸残基の数であり、ＺはＤの全核酸残基数である。核酸配列Ｃの長さが核酸配列Ｄの長さと異なる場合、ＣのＤに対する％核酸配列同一性は、ＤのＣに対する％核酸配列同一性とは異なることは理解されるであろう。
【００３６】
他の実施態様では、ＰＲＯ２３２０３変異体ポリヌクレオチドは、活性ＰＲＯ２３２０３ポリペプチドをコードし、好ましくは緊縮性ハイブリダイゼーション及び洗浄条件下で、図２（配列番号：２）に示される完全長ＰＲＯ２３２０３ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列にハイブリダイゼーションする核酸分子である。ＰＲＯ２３２０３変異体ポリペプチドは、ＰＲＯ２３２０３変異体ポリヌクレオチドにコードされるものであってもよい。
「単離された」とは、ここで開示された種々のポリペプチドを記述するために使用するときは、その自然環境の成分から同定され分離され及び／又は回収されたポリペプチドを意味する。好ましくは、単離されたポリペプチドは天然に付随する全ての構成成分から遊離されている。その自然環境の夾雑成分とは、そのポリペプチドの診断又は治療への使用を典型的には妨害する物質であり、酵素、ホルモン、及び他のタンパク質様又は非タンパク質様溶質が含まれる。好ましい実施態様において、ポリペプチドは、（１）スピニングカップシークエネーターを使用することにより、少なくとも１５残基のＮ末端あるいは内部アミノ酸配列を得るのに充分なほど、あるいは、（２）クーマシーブルーあるいは好ましくは銀染色を用いた非還元あるいは還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥによる均一性まで精製される。単離されたポリペプチドには、ＰＲＯ２３２０３の自然環境の少なくとも１つの成分が存在しないため、組換え細胞内のインサイツのポリペプチドが含まれる。しかしながら、通常は、単離されたポリペプチドは少なくとも１つの精製工程により調製される。
【００３７】
「単離された」ＰＲＯ２３２０３ポリペプチドコード化核酸分子は、同定され、ＰＲＯ２３２０３をコードする核酸の天然源に通常付随している少なくとも１つの夾雑核酸分子から分離された核酸分子である。好ましくは、単離された核酸は天然に付随する全ての構成成分から遊離されている。単離されたＰＲＯ２３２０３コード化核酸分子は、天然に見出される形態あるいは設定以外のものである。ゆえに、単離された核酸分子は、天然の細胞中に存在するＰＲＯ２３２０３コード化核酸分子とは区別される。しかし、単離されたＰＲＯ２３２０３ポリペプチドコード化核酸分子は、例えば、核酸分子が天然細胞のものとは異なった染色体位置にあるＰＲＯ２３２０３を通常発現する細胞に含まれるＰＲＯ２３２０３コード化核酸分子を含む。
「コントロール配列」という表現は、特定の宿主生物において作用可能に結合したコード配列を発現するために必要なＤＮＡ配列を指す。例えば原核生物に好適なコントロール配列は、プロモーター、場合によってはオペレータ配列、及びリボソーム結合部位を含む。真核生物の細胞は、プロモーター、ポリアデニル化シグナル及びエンハンサーを利用することが知られている。
【００３８】
核酸は、他の核酸配列と機能的な関係にあるときに「作用可能に結合し」ている。例えば、プレ配列あるいは分泌リーダーのＤＮＡは、ポリペプチドの分泌に関与するプレタンパク質として発現されているなら、そのポリペプチドのＤＮＡに作用可能に結合している；プロモーター又はエンハンサーは、配列の転写に影響を及ぼすならば、コード配列に作用可能に結合している；又はリボソーム結合部位は、もしそれが翻訳を容易にするような位置にあるなら、コード配列と作用可能に結合している。一般的に、「作用可能に結合している」とは、結合したＤＮＡ配列が近接しており、分泌リーダーの場合には近接していて読み枠が一致していることを意味する。しかし、エンハンサーは必ずしも近接している必要はない。結合は簡便な制限酵素部位でのライゲーションにより達成される。そのような部位が存在しない場合は、従来の手法に従って、合成オリゴヌクレオチドアダプターあるいはリンカーが使用される。
【００３９】
「抗体」という用語は最も広い意味において使用され、例えば、単一の抗−ＰＲＯ２３２０３モノクローナル抗体（アゴニスト、アンタゴニスト、及び中和抗体を含む）、多エピトープ特異性を持つ抗−ＰＲＯ２３２０３抗体組成物、一本鎖抗−ＰＲＯ２３２０３抗体、及び抗−ＰＲＯ２３２０３抗体の断片を包含している（下記参照）。ここで使用される「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均一な抗体の集団、すなわち、構成する個々の抗体が、少量存在しうる自然に生じる可能性のある突然変異を除いて同一である集団から得られる抗体を称する。
ここで、モノクローナル抗体は、「キメラ」抗体を含み、それは、重鎖及び／又は軽鎖の一部が特定の種から誘導された又は特定の抗体クラス又はサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一又は相同であるが、鎖の残りの部分は他の種から誘導された又は他の抗体クラス又はサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一又は相同である抗体、並びにそれらが所望の生物学的活性を示す場合には、その抗体の断片である（米国特許第４，８１６，５６７号；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ等， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８１：６８５１−６８５５ （１９８４））。ここで対象であるキメラ抗体には、非ヒト霊長類（例えば、旧世界ザル、サルなど）から誘導した可変ドメイン抗原結合配列、及びヒト定常領域配列を含んでなる「霊長類化」抗体が含まれる。
「無傷の」抗体は、抗原結合部位並びにＣＬ及び少なくとも重鎖定常ドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３を含むものである。定常ドメインは、天然配列定常ドメイン（例えば、ヒト天然配列定常ドメイン）又はそのアミノ酸配列変異体である。好ましくは、無傷抗体は一又は複数のエフェクター機能を持つ。
ここで使用される場合、「内部移行する」抗−ＰＵＭＰＣｎ抗体とは、哺乳動物細胞上の−ＰＵＭＰＣｎ（すなわち細胞表面−ＰＵＭＰＣｎ）への結合時に細胞によって取り込まれる（すなわち入る）もののことである。もちろん、内部移行抗体には、抗体断片、ヒト又はヒト化抗体及び抗体コンジュゲートが含まれる。治療用途においてはインビボにおける内部移行が考慮される。内部移行した抗体分子の数は−ＰＵＭＰＣｎ−発現細胞、特に−ＰＵＭＰＣｎ−発現癌細胞を死滅させるのに十分な、又は適切な数である。抗体又は抗体コンジュゲートの効能に応じて、ある例においては、細胞への単一の抗体分子の取込みが、抗体が結合する標的細胞を死滅させるのに十分である。例えば、ある毒素は高い殺傷効能を有しており、抗体に結合した一分子の毒素の内部移行で、腫瘍細胞を死滅させるのに十分である。
【００４０】
哺乳動物細胞においてＰＵＭＰＣｎへの結合時に抗−ＰＵＭＰＣｎ抗体が内部移行したか否かは、種々のアッセイにより決定することができる。例えば、インビボにおける内部移行を試験するために、試験抗体を標識し、所定の細胞表面にＰＵＭＰＣｎが発現していることが知られている動物に導入する。抗体は、例えば放射標識、又は蛍光もしくは金粒子で標識することができる。このアッセイに適した動物には、ヒトＰＵＭＰＣｎ発現腫瘍移植片又は異種移植片を含むＮＣＲヌードマウス、又はヒトＰＵＭＰＣｎで形質移入した細胞が導入されたマウス、又はヒトＰＵＭＰＣｎ導入遺伝子を発現するトランスジェニックマウス等の哺乳動物が含まれる。適切なコントロールには、試験抗体を受容していない、又は関連のない抗体を受容した動物、及び目的の細胞において他の抗原に対する抗体を受容した動物が含まれ、ここでその抗体は抗原への結合時に内部移行することが知られているものである（例えば、ヒト乳房腫瘍株化細胞ＭＣＦ−７に発現したＨｅｒ２に結合するＨＥＲＣＥＰＴＩＮ）。抗体は、例えば静脈注射により動物に投与することができる。適切な間隔をあけて、動物の組織切片は公知の方法を使用するか、又は以下の実施例に記載されているようにして調製することができ、光学顕微鏡又は電子顕微鏡により、内部移行度合い、並びに細胞内の内部移行した抗体の位置が分析される。インビトロにおける内部移行に対しては、細胞を、培養培地に添加された適切な抗体の存在又は不在下で組織培養皿にてインキュベートし、所定の時点で顕微鏡分析するためにプロセシングする。細胞内の内部移行した標識化抗体の存在は、顕微鏡、又は放射標識された抗体が使用されるならばオートラジオグラフィーにより、直接可視化することができる。あるいは、定量的生化学アッセイにおいては、ＰＵＭＰＣｎ−発現細胞を含有する細胞の個体群を、放射標識された試験抗体とインビトロ又はインビボで接触させ、細胞（インビボにおいて接触させたならば、次に適当な時間の後に細胞を単離する）をプロテアーゼで処理するか、又は酸洗浄にかけて、細胞表面上の内部移行していない抗体を除去する。細胞を粉砕し、プロテアーゼ耐性の量、各バッチの細胞に関連する１分当たりの放射性カウント（ｃｐｍ）を、シンチレーションカウンターにホモジェネートを通して測定する。放射標識された抗体の既知の特定の活性に基づき、細胞当たりの内部移行した抗体分子の数は、粉砕した細胞のシンチレーションカウントから推定することができる。例えば培養皿又はフラスコの細胞培養培地に細胞を添加し、抗体に細胞が均一にさらされるように培地と抗体をよく混合することにより、好ましくは溶液形態で、細胞は抗体とインビトロで「接触させる」。培地に添加する代わりに、細胞を、所望の時間、テスト用チューブに入ったＰＢＳ等の等張液において抗体と接触させることもできる。インビボにおいては、患者に投与する場合、以下に記載する投与方法等の、試験抗体を投与するための任意の適切な方法により、細胞は抗体と接触させる。
【００４１】
インビボにおいて、抗体がＰＵＭＰＣｎを発現する細胞に結合してより速く内部移行するほど、標的ＰＵＭＰＣｎ発現細胞に対するより速い所望の殺傷又は増殖阻害効果が、例えば、細胞障害性免疫複合体によって達成され得る。好ましくは、抗−ＰＵＭＰＣｎ抗体の内部移行のキネティクスは、ＰＵＭＰＣｎ発現標的細胞の早急な殺傷に対して有利に働くようなものである。従って、抗−ＰＵＭＰＣｎ抗体が速い内部移行率、好ましくは、インビボにおける抗体の投与から２４時間以内、より好ましくは１２時間以内であることが望ましい。
試験抗体が、本発明の抗−ＰＵＭＰＣｎ抗体によって結合されるエピトープと同一のものとの結合に関し、競合し得るかどうか決定するために、クロスブロッキングアッセイ、例えば、競合エライザアッセイが実施される。典型的な競合エライザアッセイにおいて、マイクロタイタープレートの壁面上にコートされたＰＵＭＰＣｎ又は関連するその断片は、候補の競合する抗体の存在下又は非存在下でプレインキュベートされ、次いで、本発明のビオチン標識化抗−ＰＵＭＰＣｎ抗体が添加される。ウェル中のＰＵＭＰＣｎ抗原に結合した標識化抗−ＰＵＭＰＣｎ抗体の量は、アビジン−ペルオキシダーゼ結合体及び適当な基質を用いて測定される。抗体は、放射活性又は傾向標識又はその他の検出可能で測定可能な標識と共に標識化される。抗原と結合した標識化抗−ＰＵＭＰＣｎ抗体の量は、同じエピトープとの結合に関して競合する候補競合抗体（試験抗体）の能力と間接的に相関するであろう、つまり、同一のエピトープに対する試験抗体のアフィニティーが強い程、標識化抗体は抗原でコートしたウェルにほとんど結合しなくなるであろう。候補競合抗体の非存在下（但し、既知の非競合抗体の存在下でもよい）で、並行して行われるコントロールと比較して、候補抗体が少なくとも２０％、好ましくは２０−５０％、さらにより好ましくは、少なくとも５０％でＰＵＭＰＣｎ抗体の結合をブロックすることが可能ならば、抗体と競合する候補は、実質的に同じエピトープに結合するか、又は本発明抗−ＰＵＭＰＣｎ抗体と同一のエピトープとの結合に関し競合する抗体であると考えられる。本アッセイの変法が実施されて、同一の定量値を得ることが理解されるであろう。
【００４２】
「ＰＵＭＰＣｎを発現する腫瘍細胞の増殖を阻害する抗体」又は「増殖阻害」抗体は、ＰＵＭＰＣｎを発現又は過剰発現する癌細胞と結合し、その測定可能な程の増殖阻害を引き起こすものである。好ましい増殖阻害抗−ＰＵＭＰＣｎ抗体は、典型的には、試験された抗体で処理されていない腫瘍細胞であるコントロールであって、適切なコントロールと比較して、２０％より多く、好ましくは約２０％から約５０％、そしてさらに好ましくは５０％よりも多く（例えば、約５０％から約１００％）でＰＵＭＰＣｎ発現腫瘍細胞の増殖を阻害する（例えば、前立腺癌細胞）。増殖阻害は、細胞培養で約０．１から３０μｇ／ｍｌ又は約０．５ ｎＭから２００ ｎＭの抗体濃度で測定することができ、抗体への腫瘍細胞の曝露の後、増殖阻害を１−１０日で確かめる。約１μｇ／ｋｇから約１００ ｍｇ／ｋｇ体重の抗−ＰＵＭＰＣｎ抗体の投与が、最初の抗体の投与から約５日から３ヶ月内、好ましくは約５から３０日内に腫瘍の大きさ又は腫瘍細胞増殖に減少を引き起こす場合、この抗体はインビボにおいて増殖阻害的である。
「癌」及び「癌性」という用語は、典型的には調節されない細胞増殖を特徴とする、哺乳動物における生理学的状態を指すか記述する。癌の例には、これらに限定されるものではないが、癌腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫、及び白血病又はリンパ性悪性腫瘍が含まれる。このような癌のより特定の例には、扁平細胞癌（ｓｑｕａｍｏｕｓ ｃｅｌｌ ｃａｎｃｅｒ）（例えば扁平上皮細胞癌）、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺の腺癌、及び肺の扁平癌腫（ｓｑｕａｍｏｕｓ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）を含む肺癌、腹膜癌、肝細胞癌、胃腸癌を含む胃（ｇａｓｔｒｉｃ）又は腹部（ｓｔｏｍａｃｈ）癌、膵臓癌、神経膠芽細胞腫、子宮頸管癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、尿道癌、肝癌、乳癌、大腸癌、直腸癌、大腸直腸癌、子宮内膜又は子宮癌、唾液腺癌、腎臓（ｋｉｄｎｅｙ）又は腎（ｒｅｎａｌ）癌、前立腺癌、産卵口癌、甲状腺癌、肝臓癌、肛門癌、陰茎癌、黒色腫、多発性骨髄腫及びＢ−細胞リンパ腫、脳、並びに頭部及び頸部の癌、及び関連した転移が含まれる。
【００４３】
「ＰＵＭＰＣｎ発現細胞」は、細胞の表面に内因性又は形質移入されたＰＵＭＰＣｎを発現する。「ＰＵＭＰＣｎ発現癌」は、細胞表面上に存在するＰＵＭＰＣｎタンパク質を有する細胞を含む癌である。「ＰＵＭＰＣｎ発現癌」は、その細胞の表面上に十分なレベルのＰＵＭＰＣｎを生産し、抗−ＰＵＭＰＣｎ抗体はそれへ結合することができ、癌に関して治療的効果を有する。ＰＵＭＰＣｎを「過剰発現」する癌は、同じ組織型の非癌性細胞と比較して、その細胞表面に顕著により高いレベルのＰＵＭＰＣｎを有するものである。そのような過剰発現は、遺伝子増幅又は増大した転写又は翻訳によって生じ得る。ＰＵＭＰＣｎ過剰発現は、診断又は予後アッセイにおいて、細胞の表面上に存在するＰＵＭＰＣｎタンパク質の増大したレベルを評価することによって確かめ得る（例えば、免疫組織化学アッセイを介して；ＦＡＣＳ分析など）。あるいは、又は付加的に、例えば、蛍光インサイツハイブリダイゼーション；（ＦＩＳＨ；１９９８年１０月に公開のＷＯ９８／４５４７９を参照せよ）、サザン  ブロッティング、ノーザン  ブロッティング、又はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術、例えばリアルタイム定量ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）を介して、細胞のＰＵＭＰＣｎコード化核酸又はｍＲＮＡのレベルを測定してもよい。また、例えば、抗体ベースアッセイを用いて、血清のような生物学的体液中に流れている抗原を測定することによって、ＰＵＭＰＣｎ過剰発現を研究してもよい（同じく、例えば、１９９０年６月１２日に公開の米国特許第４，９３３，２９４号；１９９１年４月１８日に公開のＷＯ９１／０５２６４；１９９５年３月２８日に公開の米国特許第５，４０１，６３８号；Ｓｉａｓら．， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ １３２： ７３−８０（１９９０）を参照せよ）。上記のアッセイは別として、種々のインビボアッセイは、当業者にとって入手可能である。例えば、患者の体の中にある細胞を、例えば、放射活性アイソトープのような検出可能な標識で場合によって標識した抗体に曝してもよく、患者の細胞への抗体の結合は、例えば、放射活性の外部スキャンニングによって、又は以前に抗体へ曝した患者から取り出した生検を分析することによって評価することができる。ＰＵＭＰＣｎ発現癌には、前立腺及び肺癌が含まれる。
【００４４】
「治療する」又は「治療」又は「緩和」とは、治療上の処置及び予防的療法又は防護的療法の双方を称し、その目的は、標的である病的症状又は疾患を防ぐか又は衰え（小さく）させることである。治療を必要とするものには、疾患に罹りやすいものと同時に疾患にすでに罹っているもの、又は疾患が予防されるべきものを含む。本発明の方法に従って抗−ＰＵＭＰＣｎ抗体の治療量を投与された後に、患者が次の一つ又は複数のものについて観察可能な及び／又は測定可能な減少又は消失を示したならば、被検体又は哺乳動物は、ＰＵＭＰＣｎ発現癌に関して成功裏に「治療された」ことになる：ＰＳＡレベルの減少、癌細胞の数の減少、又は癌細胞の消失；腫瘍の大きさの減少；軟部組織及び骨への癌の広がりを含む、末梢器官への癌細胞の浸潤の阻害（すなわち、ある程度の減速及び好ましくは停止）；腫瘍転移の阻害（すなわち、ある程度の減速及び好ましくは停止）；腫瘍増殖のある程度の阻害；及び／又は特定の癌に関連している一つ又は複数の症状のある程度の緩和；疾病率及び死亡率の減少、及び生命問題の質の改善。ある程度、抗−ＰＵＭＰＣｎ抗体は、生存癌細胞の成長を防ぐ及び／又は死滅させることができ、それは、細胞増殖抑制及び／又は細胞障害性であり得る。これらの兆候又は症状の低減は、また、患者が感じることができる。
疾患において功を奏する治療及び改善を評価するための上述したパラメータは、医師によく知られている常套的な手段により、容易に測定可能である。癌治療における効能は、例えば病状の進行時間（ＴＴＰ）の評価、及び／又は応答速度（ＲＲ）の決定により測定され得る。前立腺癌に対して、治療の進行は、通常、血清ＰＳＡ（前立腺特異的抗原）レベルを測定することによる常套的な方法で評価することができ；血中のＰＳＡレベルが高くなればなる程、癌が広がっている。ＰＳＡを検出するための市販のアッセイ、例えばＨｙｂｉｔｅｃｈ Ｔａｎｄｅｍ−Ｅ及びＴａｎｄｅｍ−Ｒ ＰＳＡアッセイキット、Ｙａｎｇ ＰｒｏｓＣｈｅｃｋ ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ ａｓｓａｙ（Ｙａｎｇ Ｌａｂｓ， Ｂｅｌｌｅｖｕｅ， ＷＡ）、Ａｂｂｏｔｔ Ｉｍｘ（Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｓ， Ａｂｂｏｔｔ Ｐａｒｋ， ＩＬ）等を利用できる。転移はステージングテスト及び骨のスキャニングにより測定可能で、骨への広がりを測定するためには、カルシウムレベル及び他の酵素を試験する。またＣＴスキャンを実施して、領域内の骨盤及びリンパ節への広がりを探査することができる。胸部Ｘ線及び公知の方法による肝臓酵素レベルの測定が、肺及び肝臓へのそれぞれの転移を探査するために使用される。疾患のモニタリングのための他の常套的な方法には、経直腸的超音波検査（ＴＲＵＳ）及び経直腸的針バイオプシー（ＴＲＮＢ）が含まれる。
【００４５】
「治療的有効量」という用語は、患者又は哺乳動物の疾患又は疾病を「治療」するのに効果的な抗体又は薬剤の量を意味する。癌の場合には、治療的有効量の薬剤により、癌細胞の数が減少し；腫瘍の大きさが小さくなり；末梢器官における癌細胞浸潤が阻害され（すなわち、ある程度の遅延化、好ましくは停止）；腫瘍の転移が阻害され（すなわち、ある程度の遅延化、好ましくは停止）；ある程度、腫瘍増殖が阻害され；及び／又は癌に関連した一又は複数の徴候がある程度緩和される。上述の「治療する」の定義を参照。薬剤が癌細胞の増殖を防止し、及び／又は存在する癌細胞を死滅させるならば、それは細胞増殖抑制性及び／又は細胞障害性であり得る。
ここで用いられる際の「増殖阻害剤」は、細胞、特にＰＵＭＰＣｎ発現癌細胞の増殖を、インビトロ又はインビボで阻害する化合物又は組成物を意味する。即ち、増殖阻害剤は、Ｓ期でＰＵＭＰＣｎを過剰発現する細胞の割合を有意に減少させるものである。増殖阻害剤の例は、細胞周期の進行を（Ｓ期以外の位置で）阻害する薬剤、例えばＧ１停止又はＭ期停止を誘発する薬剤を含む。古典的なＭ期ブロッカーは、ビンカス（ビンクリスチン及びビンブラスチン）、タキサン、及びトポイソメラーゼＩＩ阻害剤、例えばドキソルビシン、エピルビシン、ダウノルビシン、エトポシド、及びブレオマイシンを含む。また、Ｇ１停止させるこれらの薬剤は、Ｓ期停止にも波及し、例えば、ＤＮＡアルキル化剤、例えば、タモキシフェン、プレドニゾン、ダカルバジン、メクロレタミン、シスプラチン、メトトレキセート、５−フルオロウラシル、及びａｒａ−Ｃである。さらなる情報は、Ｔｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ， Ｍｅｎｄｅｌｓｏｈｎ及びＩｓｒａｅｌ， 編， Ｃｈａｐｔｅｒ １， 表題「Ｃｅｌｌ ｃｙｃｌｅ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ， ｏｎｃｏｇｅｎｅｓ， ａｎｄ ａｎｔｉｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ ｄｒｕｇｓ」， Ｍｕｒａｋａｍｉ等， （ＷＢ Ｓａｕｎｄｅｒｓ： Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ， １９９５）、特にｐ１３に見出すことができる。タキサン（パクリタキセル及びドセタキセル）は、ともにイチイに由来する抗癌剤である。ヨーロッパイチイに由来するドセタキセル（ＴＡＸＯＴＥＲＥ（登録商標）、Ｒｈｏｎｅ−Ｐｏｕｌｅｎｃ Ｒｏｒｅｒ）は、パクリタキセル（ＴＡＸＯＬ（登録商標）、Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ）の半合成類似体である。パクリタキセル及びドセタキセルは、チューブリン二量体から微小管の集合を促進し、細胞の有糸分裂を阻害する結果となる脱重合を防ぐことによって微小管を安定化にする。
【００４６】
ハイブリダイゼーション反応の「緊縮性」は、当業者によって容易に決定され、一般的にプローブ長、洗浄温度、及び塩濃度に依存する経験的な計算である。一般に、プローブが長くなると適切なアニーリングのための温度が高くなり、プローブが短くなると温度は低くなる。ハイブリダイゼーションは、一般的に、相補的鎖がその融点に近いがそれより低い環境に存在する場合における変性ＤＮＡの再アニールする能力に依存する。プローブとハイブリダイゼーション可能な配列との間の所望の相同性の程度が高くなると、使用できる相対温度が高くなる。その結果、より高い相対温度は、反応条件をより緊縮性にするが、低い温度は緊縮性を低下させる。ハイブリダイゼーション反応の緊縮性の更なる詳細及び説明は、Ａｕｓｕｂｅｌら， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ， （１９９５）を参照のこと。
【００４７】
ここで定義される「緊縮性条件」又は「高度の緊縮性条件」は、（１）洗浄のために低イオン強度及び高温度、例えば、５０℃において０．０１５ Ｍの塩化ナトリウム／０．００１５ Ｍのクエン酸ナトリウム／０．１％のドデシル硫酸ナトリウムを用いるもの；（２）ハイブリダイゼーション中にホルムアミド等の変性剤、例えば、４２℃において５０％（ｖ／ｖ）ホルムアミドと０．１％ウシ血清アルブミン／０．１％フィコール／０．１％のポリビニルピロリドン／５０ｍＭのｐＨ６．５のリン酸ナトリウムバッファー、及び７５０ｍＭの塩化ナトリウム、７５ｍＭクエン酸ナトリウムを用いるもの；又は（３）４２℃における５０％ホルムアミド、５ｘＳＳＣ（０．７５ＭのＮａＣｌ、０．０７５Ｍのクエン酸ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）、０．１％のピロリン酸ナトリウム、５ｘデンハード液、超音波処理サケ精子ＤＮＡ（５０μｇ／ｍｌ）、０．１％ＳＤＳ、及び１０％のデキストラン硫酸と、４２℃における０．２ｘＳＳＣ（塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム）中の洗浄及び５５℃での５０％ホルムアミド、次いで５５℃におけるＥＤＴＡを含む０．１ｘＳＳＣからなる高緊縮性洗浄を用いるものによって同定される。
【００４８】
「中程度の緊縮性条件」は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ （Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ： Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ， １９８９に記載されているように同定され、上記の緊縮性より低い洗浄溶液及びハイブリダイゼーション条件（例えば、温度、イオン強度及び％ＳＤＳ）の使用を含む。中程度の緊縮性条件は、２０％ホルムアミド、５ｘＳＳＣ（１５０ｍＭのＮａＣｌ、１５ｍＭのクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５ｘデンハード液、１０％デキストラン硫酸、及び２０ｍｇ／ｍＬの変性剪断サケ精子ＤＮＡを含む溶液中の３７℃での終夜インキュベーション、次いで１ｘＳＳＣ中３７−５０℃でのフィルターの洗浄といった条件である。当業者であれば、プローブ長などの因子に適合させる必要に応じて、どのようにして温度、イオン強度等を調節するかを理解するであろう。
ここで使用される「過剰発現」という用語は、癌細胞のような細胞の遺伝子及び／又はそのコード化タンパク質の過剰発現を意味する。タンパク質を「過剰発現」する癌細胞とは、同じ組織型の非癌細胞と比較して、顕著により高いレベルのそのタンパク質を有する癌細胞である。
「エピトープタグ」なる用語は、ここで用いられるときは、「タグポリペプチド」に融合したＰＲＯ２３２０３ポリペプチドを含んでなるキメラポリペプチドを指す。タグポリペプチドは、その抗体が産生され得るエピトープを提供するに十分な数の残基を有しているが、その長さは融合されるポリペプチドの活性を阻害しないよう充分に短い。また、タグポリペプチドは、好ましくは、抗体が他のエピトープと実質的に交差反応をしないようにかなりユニークである。適切なタグポリペプチドは、一般に、少なくとも６のアミノ酸残基、通常は約８〜約５０のアミノ酸残基（好ましくは約１０〜約２０のアミノ酸残基）を有する。
【００４９】
ここで用いられる「イムノアドヘシン」なる用語は、異種タンパク質（「アドヘシン」）の結合特異性と免疫グロブリン定常ドメインのエフェクター機能とを結合した抗体様分子を指す。構造的には、イムノアドヘシンは、所望の結合特異性を持ち、抗体の抗原認識及び結合部位以外である（即ち「異種の」）アミノ酸配列と、免疫グロブリン定常ドメイン配列との融合物を含む。イムノアドヘシン分子のアドへシン部分は、典型的には少なくともレセプター又はリガンドの結合部位を含む隣接アミノ酸配列である。イムノアドヘシンの免疫グロブリン定常ドメイン配列は、ＩｇＧ−１、ＩｇＧ−２、ＩｇＧ−３又はＩｇＧ−４サブタイプ、ＩｇＡ（ＩｇＡ−１及びＩｇＡ−２を含む）、ＩｇＥ、ＩｇＤ又はＩｇＭなどの任意の免疫グロブリンから得ることができる。
ここでの目的に対する「活性な」及び「活性」とは、天然又は天然発生ＰＲＯ２３２０３の生物学的及び／又は免疫学的活性を保持するＰＲＯ２３２０３の形態を意味し、「生物学的」活性とは、天然又は天然発生ＰＲＯ２３２０３によって生ずる（阻害性又は刺激性の）生物学的機能であって、天然又は天然発生ＰＲＯ２３２０３が有する抗原性エピトープに対して抗体を生成する能力を除くものを意味し、「免疫学的」活性とは、天然又は天然発生ＰＲＯ２３２０３が有する抗原性エピトープに対して抗体を生成する能力を意味する。好ましい生物学的活性には、例えば、前立腺組織由来の細胞の増殖及び分化が含まれる。
「アンタゴニスト」なる用語は最も広い意味で用いられ、ここに開示した天然ＰＲＯ２３２０３ポリペプチドの生物学的活性を部分的に又は完全に阻止、阻害、又は中和する任意の分子を指す。同様に「アゴニスト」なる用語は最も広い意味で用いられ、ここに開示した天然ＰＲＯ２３２０３ポリペプチドの生物学的活性を模倣する任意の分子を指す。好適なアゴニスト又はアンタゴニスト分子は特に、アゴニスト又はアンタゴニスト抗体又は抗体断片、天然ＰＲＯ２３２０３ポリペプチドの断片又はアミノ酸配列変異体、ペプチド、有機小分子、などを含む。ＰＲＯ２３２０３ポリペプチドのアゴニスト又はアンタゴニストの同定方法は、ＰＲＯ２３２０３ポリペプチドを候補アンタゴニスト又はアゴニスト分子と接触させ、ＰＲＯ２３２０３ポリペプチドに通常は関連している１つ又は複数の生物学的活性の変化を測定することを含みうる。
「慢性」投与とは、初期の治療効果（活性）を長期間にわたって維持するようにするために、急性態様とは異なり連続的な態様での薬剤の投与を意味する。「間欠」投与とは、中断無く連続的になされるのではなく、むしろ事実上、周期的になされる処理である。
１つ又は複数の更なる治療薬と「組み合わせた」投与とは、同時（同時期）及び任意の順序での連続した投与を含む。
治療の対象のための「哺乳動物」は、ヒト、家庭及び農業用動物、動物園、スポーツ、又はペット動物、例えばイヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウサギなどを含む哺乳類に分類される任意の動物を意味する。好ましくは、哺乳動物はヒトである。
「有効量」という用語は、特定の目的の達成をもたらすＰＲＯポリペプチド及び／又はアゴニスト／アンタゴニストの濃度又は量のことである。ＰＲＯポリペプチド又はそのアゴニスト又はアンタゴニストの「有効量」は経験的に決定することができる。さらに「治療有効量」は、定められた治療効果の達成に有効なＰＲＯポリペプチド及び／又はアゴニスト／アンタゴニストの濃度又は量のことである。
この量もまた経験的に決定することができる。
【００５０】
「化学療法剤」は、癌の治療に有用な化学的化合物である。化学療法剤の例には、チオテパ及びシクロホスファミド（ＣＹＴＯＸＡＮ（登録商標））のようなアルキル化剤；ブスルファン、インプロスルファン及びピポスルファンのようなスルホン酸アルキル類；ベンゾドーパ（ｂｅｎｚｏｄｏｐａ）、カルボコン、メツレドーパ（ｍｅｔｕｒｅｄｏｐａ）、及びウレドーパ（ｕｒｅｄｏｐａ）のようなアジリジン類；アルトレートアミン（ａｌｔｒｅｔａｍｉｎｅ）、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホラミド、トリエチレンチオホスホラミド（ｔｒｉｅｔｈｙｌｅｎｅｔｈｉｏｐｈｏｓｐｈａｏｒａｍｉｄｅ）及びトリメチローロメラミン（ｔｒｉｍｅｔｈｙｌｏｌｏｍｅｌａｍｉｎｅ）を含むエチレンイミン類及びメチラメラミン類；クロランブシル、クロロナファジン（ｃｈｌｏｒｎａｐｈａｚｉｎｅ）、チョロホスファミド（ｃｈｏｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシドヒドロクロリド、メルファラン、ノベンビチン（ｎｏｖｅｍｂｉｃｈｉｎ）、フェネステリン（ｐｈｅｎｅｓｔｅｒｉｎｅ）、プレドニムスチン（ｐｒｅｄｎｉｍｕｓｔｉｎｅ）、トロフォスファミド（ｔｒｏｆｏｓｆａｍｉｄｅ）、ウラシルマスタードなどのナイトロジェンマスタード；ニトロスレアス（ｎｉｔｒｏｓｕｒｅａｓ）、例えばカルムスチン（ｃａｒｍｕｓｔｉｎｅ）、クロロゾトシン（ｃｈｌｏｒｏｚｏｔｏｃｉｎ）、フォテムスチン（ｆｏｔｅｍｕｓｔｉｎｅ）、ロムスチン（ｌｏｍｕｓｔｉｎｅ）、ニムスチン、ラニムスチン；アクラシノマイシン（ａｃｌａｃｉｎｏｍｙｓｉｎｓ）、アクチノマイシン、オースラマイシン（ａｕｔｈｒａｍｙｃｉｎ）、アザセリン、ブレオマイシン（ｂｌｅｏｍｙｃｉｎｓ）、カクチノマイシン（ｃａｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ）、カリケアミシン、カラビシン（ｃａｒａｂｉｃｉｎ）、カルミノマイシン（ｃａｒｍｉｎｏｍｙｃｉｎ）、カルジノフィリン（ｃａｒｚｉｎｏｐｈｉｌｉｎ）、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン（ｄｅｔｏｒｕｂｉｃｉｎ）、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン、ドキソルビシン、エピルビシン、エソルビシン（ｅｓｏｒｕｂｉｃｉｎ）、イダルビシン、マルセロマイシン（ｍａｒｃｅｌｌｏｍｙｃｉｎ）、マイトマイシン（ｍｉｔｏｍｙｃｉｎｓ）、マイコフェノール酸（ｍｙｃｏｐｈｅｎｏｌｉｃ ａｃｉｄ）、ノガラマイシン（ｎｏｇａｌａｍｙｃｉｎ）、オリボマイシン（ｏｌｉｖｏｍｙｃｉｎｓ）、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン（ｐｏｔｆｉｒｏｍｙｃｉｎ）、ピューロマイシン、クエラマイシン（ｑｕｅｌａｍｙｃｉｎ）、ロドルビシン（ｒｏｄｏｒｕｂｉｃｉｎ）、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン（ｔｕｂｅｒｃｉｄｉｎ）、ウベニメクス、ジノスタチン（ｚｉｎｏｓｔａｔｉｎ）、ゾルビシン（ｚｏｒｕｂｉｃｉｎ）などの抗生物質；メトトレキセート及び５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）のような抗代謝物質；デノプテリン（ｄｅｎｏｐｔｅｒｉｎ）、メトトレキセート、プテロプテリン（ｐｔｅｒｏｐｔｅｒｉｎ）、トリメトレキセート（ｔｒｉｍｅｔｒｅｘａｔｅ）のような葉酸類��体；フルダラビン（ｆｌｕｄａｒａｂｉｎｅ）、６−メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニンのようなプリン類似体；アンシタビン、アザシチジン（ａｚａｃｉｔｉｄｉｎｅ）、６−アザウリジン（ａｚａｕｒｉｄｉｎｅ）、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン（ｅｎｏｃｉｔａｂｉｎｅ）、フロキシウリジン（ｆｌｏｘｕｒｉｄｉｎｅ）、５−ＦＵのようなピリミジン類似体；カルステロン（ｃａｌｕｓｔｅｒｏｎｅ）、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトン（ｔｅｓｔｏｌａｃｔｏｎｅ）のようなアンドロゲン類；アミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタンのような抗副腎剤；フロリン酸（ｆｒｏｌｉｎｉｃ ａｃｉｄ）のような葉酸リプレニッシャー（ｒｅｐｌｅｎｉｓｈｅｒ）；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；アムサクリン（ａｍｓａｃｒｉｎｅ）；ベストラブシル（ｂｅｓｔｒａｂｕｃｉｌ）；ビサントレン（ｂｉｓａｎｔｒｅｎｅ）；エダトラキセート（ｅｄａｔｒａｘａｔｅ）；デフォファミン（ｄｅｆｏｆａｍｉｎｅ）；デメコルシン（ｄｅｍｅｃｏｌｃｉｎｅ）；ジアジコン（ｄｉａｚｉｑｕｏｎｅ）；エルフォルニチン（ｅｌｆｏｒｎｉｔｈｉｎｅ）；酢酸エリプチニウム（ｅｌｌｉｐｔｉｎｉｕｍ ａｃｅｔａｔｅ）；エトグルシド（ｅｔｏｇｌｕｃｉｄ）；硝酸ガリウム；ヒドロキシ尿素；レンチナン；ロニダミン（ｌｏｎｉｄａｍｉｎｅ）；ミトグアゾン（ｍｉｔｏｇｕａｚｏｎｅ）；ミトキサントロン；モピダモール（ｍｏｐｉｄａｍｏｌ）；ニトラクリン（ｎｉｔｒａｃｒｉｎｅ）；ペントスタチン；フェナメット（ｐｈｅｎａｍｅｔ）；ピラルビシン；ポドフィリン酸（ｐｏｄｏｐｈｙｌｌｉｎｉｃ ａｃｉｄ）；２−エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ（登録商標）；ラゾキサン（ｒａｚｏｘａｎｅ）；シゾフィラン；スピロゲルマニウム（ｓｐｉｒｏｇｅｒｍａｎｉｕｍ）；テニュアゾン酸（ｔｅｎｕａｚｏｎｉｃ ａｃｉｄ）；トリアジコン（ｔｒｉａｚｉｑｕｏｎｅ）；２，２’，２’’−トリクロロトリエチルアミン；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン（ｍａｎｎｏｍｕｓｔｉｎｅ）；ミトブロニトール；ミトラクトール（ｍｉｔｏｌａｃｔｏｌ）；ピポブロマン（ｐｉｐｏｂｒｏｍａｎ）；ガシトシン（ｇａｃｙｔｏｓｉｎｅ）；アラビノシド（「Ａｒａ−Ｃ」）；シクロホスファミド；チオテパ；タキサン、例えばパクリタキセル（ＴＡＸＯＬ（登録商標）、Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ， Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ， ＮＪ）、及びドキセタキセル（ＴＡＸＯＴＥＲＥ（登録商標）、Ｒｈｏｎｅ−Ｐｏｕｌｅｎｃ Ｒｏｒｅｒ， Ａｎｔｏｎｙ， Ｆｒａｎｃｅ）；クロランブシル；ゲンシタビン（ｇｅｍｃｉｔａｂｉｎｅ）；６−チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキセート；シスプラチン及びカルボプラチンのようなプラチナ類似体；ビンブラスチン；プラチナ；エトポシド（ＶＰ−１６）；イフォスファミド；マイトマイシンＣ；ミトキサントロン；ビンクリスチン；ビノレルビン；ナベルビン（ｎａｖｅｌｂｉｎｅ）；ノバントロン（ｎｏｖａｎｔｒｏｎｅ）；テニポシド；ダウノマイシン；アミノプテリン；キセローダ（ｘｅｌｏｄａ）；イバンドロナート（ｉｂａｎｄｒｏｎａｔｅ）；ＣＰＴ−１１；トポイソメラーゼインヒビターＲＦＳ２０００；ジフルオロメチロールニチン（ＤＭＦＯ）；レチノイン酸；エスペラミシン；カペシタビン（ｃａｐｅｃｉｔａｂｉｎｅ）；並びに上述したものの薬学的に許容可能な塩類、酸類又は誘導体が含まれる。また、この定義には、腫瘍に対するホルモン作用を調節又は阻害するように働く抗ホルモン剤、例えばタモキシフェン、ラロキシフェン（ｒａｌｏｘｉｆｅｎｅ）、４（５）−イミダゾール類を阻害するアロマターゼ、４−ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン（ｔｒｉｏｘｉｆｅｎｅ）、ケオキシフェン（ｋｅｏｘｉｆｅｎｅ）、ＬＹ１１７０１８、オナプリストーン（ｏｎａｐｒｉｓｔｏｎｅ）、及びトレミフェン（Ｆａｒｅｓｔｏｎ）を含む抗エストロゲン；及び抗アンドロゲン、例えばフルタミド（ｆｌｕｔａｍｉｄｅ）、ニルタミド（ｎｉｌｕｔａｍｉｄｅ）、ビカルタミド、ロイプロリド、及びゴセレリン；並びに上記のものの薬学的に許容可能な塩類、酸類又は誘導体が含まれる。
【００５１】
ここで用いられる「細胞障害性薬剤」という用語は、細胞の機能を阻害し又は妨害し、及び／又は細胞の破壊を引き起こす物質のことをいう。この用語は放射活性アイソトープ（例えばＡｔ２１１， Ｉ１３１， Ｉ１２５， Ｙ９０， Ｒｅ１８６， Ｒｅ１８８， Ｓｍ１５３， Ｂｉ２１２， Ｐ３２， 及びＬｕの放射性アイソトープ）、化学療法剤、及び小分子毒素又はその断片及び／又は変異体を含む、細菌性、真菌性、植物又は動物起源の酵素的に活性な毒素のようなものを含むことが意図されている。
ここで用いられる「担体」は、薬学的に許容されうる担体、賦形剤、又は安定化剤を含み、用いられる用量及び濃度でそれらに暴露される細胞又は哺乳動物に対して非毒性である。生理学的に許容されうる担体は、水性ｐＨ緩衝溶液であることが多い。生理学的に許容されうる担体の例は、リン酸塩、クエン酸塩、及び他の有機酸塩のバッファー；アスコルビン酸を含む酸化防止剤；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；タンパク質、例えば血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリン；疎水性ポリマー、例えばポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えばグリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン又はリシン；グルコース、マンノース又はデキストリンを含む単糖類、二糖類、及び他の炭水化物；ＥＤＴＡ等のキレート剤；マンニトール又はソルビトール等の糖アルコール；ナトリウム等の塩形成対イオン；及び／又は非イオン性界面活性剤、例えば、ＴＷＥＥＮ（商品名）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、及びＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商品名）を含む。
「抗体断片」は、無傷の抗体の一部、好ましくは無傷の抗体の抗原結合又は可変領域を含む。抗体断片の例は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、及びＦｖ断片；ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｉｅｓ）；直鎖状抗体（Ｚａｐａｔａら， Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ． ８（１０）： １０５７−１０６２ ［１９９５］）；一本鎖抗体分子；及び抗体断片から形成された多重特異性抗体を含む。
抗体のパパイン消化は、「Ｆａｂ」断片と呼ばれる２つの同一の抗体結合断片を生成し、その各々は単一の抗原結合部位を持ち、残りは容易に結晶化する能力を反映して「Ｆｃ」断片と命名される。ペプシン処理はＦ（ａｂ’）２断片を生じ、それは２つの抗原結合部位を持ち、抗原を交差結合することができる。
「Ｆｖ」は、完全な抗原認識及び結合部位を含む最小の抗体断片である。この領域は、密接に非共有結合した１本の重鎖と１本の軽鎖の可変領域の二量体からなる。この配置において各可変ドメインの３つのＣＤＲが相互作用してＶＨ−ＶＬ二量体の表面に抗原結合部位を決定する。正しくは、６つのＣＤＲが抗体に対する抗原結合特異性を与える。しかしながら、単一の可変ドメイン（又は抗原に特異的な３つのＣＤＲのみを含んでなるＦｖの半分）でさえ、結合部位全体よりは低い親和性であるが、抗原を認識し結合する能力を持つ。
【００５２】
また、Ｆａｂ断片は、軽鎖の定常ドメイン及び重鎖の第１の定常ドメイン（ＣＨ１）も含む。Ｆａｂ断片は、抗体ヒンジ領域からの１つ又は複数のシステインを含む重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端に幾つかの残基が付加されていることによりＦａｂ’断片と相違する。ここで、Ｆａｂ’−ＳＨは、定常ドメインのシステイン残基が遊離のチオール基を持つＦａｂ’を表す。Ｆ（ａｂ’）２抗体断片は、最初はＦａｂ’断片の対として生成され、それらの間にヒンジシステインを有する。抗体断片の他の化学的結合も知られている。
任意の脊椎動物種からの抗体（免疫グロブリン）の「軽鎖」は、それらの定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、κ及びλと呼ばれる二つの明らかに異なる型の一方に分類される。
それらの重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列によって、免疫グロブリンは異なるクラスに分類できる。免疫グロブリンの五つの主要なクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭがあり、それらの幾つかは更にサブクラス（アイソタイプ）、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ及びＩｇＡ２に分類される。
【００５３】
「一本鎖Ｆｖ」又は「ｓＦｖ」抗体断片は、抗体のＶＨ及びＶＬドメインを含み、これらのドメインは単一のポリペプチド鎖に存在する。好ましくは、Ｆｖポリペプチドは、ｓＦｖが抗原結合にとって望ましい構造の形成を可能にする、ＶＨ及びＶＬドメイン間のポリペプチドリンカーを更に含む。ｓＦｖの概説については、Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ， ｖｏｌ． １１３， Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ及びＭｏｏｒｅ編， Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ｐｐ． ２６９−３１５ （１９９４）のＰｌｕｃｋｔｈｕｎを参照のこと。
用語「ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｉｅｓ）」は、二つの抗原結合部位を持つ小型の抗体断片を指し、その断片は同じポリペプチド鎖（ＶＨ−ＶＬ）内で軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に結合した重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。同じ鎖の二つのドメイン間に対形成するには短すぎるリンカーを用いることにより、ドメインは強制的に他の鎖の相補的ドメインと対形成して二つの抗原結合部位を生成する。ダイアボディは、例えば、欧州特許第４０４，０９７号；ＷＯ９３／１１１６１；及びＨｏｌｌｉｎｇｅｒら， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ９０： ６４４４−６４４８ （１９９３）により十分に記載されている。
【００５４】
「単離された」抗体は、その自然環境の成分から同定され分離及び／又は回収されたものである。その自然環境の夾雑成分とは、その抗体の診断又は治療への使用を妨害する物質であり、酵素、ホルモン、及び他のタンパク質様又は非タンパク質様溶質が含まれる。好ましい実施態様において、抗体は、（１）ローリー法で測定した場合９５％を越える抗体、最も好ましくは９９重量％を越えるまで、（２）スピニングカップシークエネーターを使用することにより、少なくとも１５残基のＮ末端あるいは内部アミノ酸配列を得るのに充分なほど、あるいは、（３）クーマシーブルーあるいは好ましくは銀染色を用いた非還元あるいは還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥによる均一性まで精製される。単離された抗体には、抗体の自然環境の少なくとも１つの成分が存在しないため、組換え細胞内のインサイツの抗体が含まれる。しかしながら、通常は、単離された抗体は少なくとも１つの精製工程により調製される。
特定のポリペプチド又は特定のポリペプチド上のエピトープに「特異的に結合する」又は「特異的である」抗体は、他のポリペプチド又はポリペプチドエピトープとは実質的に結合せずに、特定のポリペプチド又は特定のポリペプチド上のエピトープへ結合するものである。
【００５５】
「標識」なる語は、ここで用いられる場合、「標識」抗体が生成されるように、抗体に直接又は間接的に抱合している検出可能な化合物又は組成物を意味する。標識は、それ自体検出可能でもよく（例えば、放射性標識又は蛍光標識）、又は酵素標識の場合、検出可能な基質化合物又は組成物の化学変換を触媒してもよい。
「固相」とは、本発明の抗体がそれに付着することのできる非水性マトリクスを意味する。ここに意図する固相の例は、部分的又は全体的に、ガラス（例えば、孔制御ガラス）、多糖類（例えばアガロース）、ポリアクリルアミド、ポリスチレン、ポリビニルアルコール及びシリコーンから形成されたものを含む。ある実施態様では、内容に応じて、固相はアッセイプレートのウェルを構成することができ；その他では精製カラム（例えばアフィニティクロマトグラフィーカラム）とすることもできる。また、この用語は、米国特許第４，２７５，１４９号に記載されたような、別個の粒子の不連続な固相も包含する。
「リポソーム」は、種々の型の脂質、リン脂質及び／又は界面活性剤からなる小型の小胞であり、哺乳動物への薬物（ＰＲＯ２３２０３ポリペプチド又はその抗体など）の輸送に有用である。リポソームの成分は、通常は生体膜の脂質配列に類似する二層形式に配列させる。
「マイクロアレイ」は、特異的に並べられた配列中のＤＮＡプローブを持つ基質として定義され、組織サンプル由来の標識化核酸とハイブリダイズするもの、又は特異的に並べられた配列中の個々の組織を持つ基質として定義され、標識化核酸プローブとハイブリダイズするものである。
「小分子」とは、ここで、約５００ダルトン未満の分子量を持つと定義される。
ある患者において、前立腺癌はアンドロゲン除去（例えば、ホルモン治療など）によって治療される。患者の前立腺癌がホルモン療法に耐性となる場合、癌は「アンドロゲン非依存性前立腺癌」として定義される。
【００５６】
ＩＩ．  本発明の組成物と方法
Ａ．完全長ＰＲＯ２３２０３ポリペプチド
本発明は、本出願でＰＲＯ２３２０３と（又はＵＮＱ６５０７とも）呼ばれるポリペプチドをコードする新規に同定され単離されたヌクレオチド配列を提供する。特に下記の実施例でさらに詳細に説明するように、ＰＲＯ２３２０３ポリペプチドをコードするｃＤＮＡが同定され単離された。別々の発現ラウンドで生成されたタンパク質には異なるＰＲＯ番号が与えられるが、ＵＮＱ番号は全ての与えられたＤＮＡ及びコード化タンパク質に独特であり、変わることはないことを記しておく。しかしながら、単純化のために、本明細書において、ＤＮＡ１８５１７１−２９９４によってコードされるタンパク質並びに上記のＰＲＯ２３２０３の定義に含まれるさらなる天然相同体及び変異体は、それらの起源又は調製形式に関わらず、「ＰＲＯ２３２０３」と称する。
下記の実施例に開示するように、ここでＤＮＡ１８５１７１−２９９４と称されるｃＤＮＡクローンがＡＴＣＣに寄託されている。該クローンの正確なヌクレオチド配列は、当業者によって当該分野の常套的な方法を用いて寄託されたクローンを配列決定することにより容易に決定することができる。予測されるアミノ酸配列は、ヌクレオチド配列から常套的技術を用いて決定できる。ここに記載したＰＲＯ２３２０３ポリペプチド及びコード化核酸について、本出願人は、現時点で入手可能な配列情報と最も良く一致するリーディングフレームであると考えられるものを同定した。
【００５７】
Ｂ．ＰＲＯ２３２０３変異体
ここに記載した完全長天然配列ＰＲＯ２３２０３ポリペプチドに加えて、ＰＲＯ２３２０３変異体も調製できると考えられる。ＰＲＯ２３２０３変異体は、ＰＲＯ２３２０３ＤＮＡに適当なヌクレオチド変化を導入することにより、及び／又は所望のＰＲＯ２３２０３ポリペプチドを合成することにより調製できる。当業者は、グリコシル化部位の数又は位置の変化あるいは膜固着特性の変化などのアミノ酸変化がＰＲＯ２３２０３の翻訳後プロセスを変えうることを理解するであろう。
天然完全長配列ＰＲＯ２３２０３又はここに記載したＰＲＯ２３２０３の種々のドメインにおける変異は、例えば、米国特許第５，３６４，９３４号に記載されている保存的及び非保存的変異についての任意の技術及び指針を用いてなすことができる。変異は、結果として天然配列ＰＲＯ２３２０３と比較してＰＲＯ２３２０３のアミノ酸配列が変化するＰＲＯ２３２０３をコードする１つ又は複数のコドンの置換、欠失又は挿入であってよい。場合によっては、変異は少なくとも１つのアミノ酸のＰＲＯ２３２０３の１つ又は複数のドメインの任意の他のアミノ酸による置換である。いずれのアミノ酸残基が所望の活性に悪影響を与えることなく挿入、置換又は欠失されるかの指針は、ＰＲＯ２３２０３の配列を相同な既知のタンパク質分子の配列と比較し、相同性の高い領域内でなされるアミノ酸配列変化を最小にすることによって見出される。アミノ酸置換は、１つのアミノ酸の類似した構造及び／又は化学特性を持つ他のアミノ酸での置換、例えばロイシンのセリンでの置換、即ち保存的アミノ酸置換の結果とすることができる。挿入及び欠失は、場合によっては１から５のアミノ酸の範囲内とすることができる。許容される変異は、配列においてアミノ酸の挿入、欠失又は置換を系統的に作成し、全長又は成熟天然配列によって示される活性に関し、得られた変異体を試験することにより決定される。
【００５８】
ＰＲＯ２３２０３ポリペプチド断片がここに提供される。このような断片は、例えば、完全長天然タンパク質と比較した際に、Ｎ−末端又はＣ−末端で切断されてもよく、又は内部残基を欠いていてもよい。ある種の断片は、ＰＲＯ２３２０３ポリペプチドの所望の生物学的活性に必須ではないアミノ酸残基を欠いている。
ＰＲＯ２３２０３断片は、多くの従来技術の任意のものによって調製してよい。所望のペプチド断片は化学合成してもよい。代替的方法は、酵素的消化、例えば特定のアミノ酸残基によって決定される部位のタンパク質を切断することが知られた酵素でタンパク質を処理することにより、あるいは適当な制限酵素でＤＮＡを消化して所望の断片を単離することによるＰＲＯ２３２０３断片の生成を含む。さらに他の好適な技術は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により、所望のポリペプチド断片をコードするＤＮＡ断片を単離し増幅することを含む。ＤＮＡ断片の所望の末端を決定するオリゴヌクレオチドは、ＰＣＲの５’及び３’プライマーで用いられる。好ましくは、ＰＲＯ２３２０３ポリペプチド断片は、図２（配列番号：２）に示した天然ＰＲＯ２３２０３ポリペプチドと少なくとも１つの生物学的及び／又は免疫学的活性を共有する。
特別の実施態様では、対象とする保存的置換を、好ましい置換との見だしにて表３に示す。このような置換が生物学的活性の変化をもたらす場合、表３に例示的置換と名前を付けた又は以下にアミノ酸分類でさらに記載するように、より置換的な変化が導入され生成物がスクリーニングされる。
【００５９】
2004524816.tif 000023
【００６０】
ＰＲＯ２３２０３ポリペプチドの機能及び免疫学的同一性の置換的修飾は、（ａ）置換領域のポリペプチド骨格の構造、例えばシート又は螺旋配置、（ｂ）標的部位の電荷又は疎水性、又は（ｃ）側鎖の嵩の維持に対する効果が有意に異なる置換基を選択することにより達成される。天然に生じる残基は共通の側鎖特性に基づいてグループに分けることができる：
（１）疎水性：ノルロイシン， ｍｅｔ， ａｌａ， ｖａｌ， ｌｅｕ， ｉｌｅ；
（２）中性の親水性：ｃｙｓ， ｓｅｒ， ｔｈｒ；
（３）酸性：ａｓｐ， ｇｌｕ；
（４）塩基性：ａｓｎ， ｇｌｎ， ｈｉｓ， ｌｙｓ， ａｒｇ；
（５）鎖配向に影響する残基：ｇｌｙ， ｐｒｏ； 及び
（６）芳香族：ｔｒｐ， ｔｙｒ， ｐｈｅ。
【００６１】
非保存的置換は、これらの分類の一つのメンバーを他の分類に交換することを必要とするであろう。また、そのように置換された残基は、保存的置換部位、より好ましくは残された（非保存）部位に導入されうる。
変異は、オリゴヌクレオチド媒介（部位特異的）突然変異誘発、アラニンスキャンニング、及びＰＣＲ突然変異誘発などの当該技術分野において公知の方法を用いて実施することができる。部位特異的突然変異誘発［Ｃａｒｔｅｒら， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， １３： ４３３１ （１９８６）； Ｚｏｌｌｅｒら， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， １０： ６４８７ （１９８７）］、カセット突然変異誘発［Ｗｅｌｌｓら， Ｇｅｎｅ， ３４： ３１５ （１９８５）］、制限的選択突然変異誘発［Ｗｅｌｌｓら， Ｐｈｉｌｏｓ． Ｔｒａｎｓ． Ｒ． Ｓｏｃ． Ｌｏｎｄｏｎ ＳｅｒＡ， ３１７： ４１５ （１９８６）］又は他の既知の技術をクローニングしたＤＮＡに実施してＰＲＯ２３２０３変異体ＤＮＡを作成することもできる。
また、隣接配列に沿って１つ又は複数のアミノ酸を同定するのにスキャンニングアミノ酸分析を用いることができる。好ましいスキャンニングアミノ酸は比較的小さく、中性のアミノ酸である。そのようなアミノ酸は、アラニン、グリシン、セリン、及びシステインを含む。アラニンは、ベータ炭素を越える側鎖を排除し変異体の主鎖構造を変化させにくいので、この群の中で典型的に好ましいスキャンニングアミノ酸である［Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ及びＷｅｌｌｓ， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２４４： １０８１−１０８５ （１９８９）］。また、アラニンは最もありふれたアミノ酸であるため典型的には好ましい。さらに、それは埋もれた及び露出した位置の両方に見られることが多い［Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ， Ｔｈｅ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ， （Ｗ．Ｈ． Ｆｒｅｅｍａｎ ＆ Ｃｏ．， Ｎ．Ｙ．）； Ｃｈｏｔｈｉａ， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， １５０：１（１９７６）］。アラニン置換が十分な量の変異体を生じない場合は、アイソテリック（ｉｓｏｔｅｒｉｃ）アミノ酸を用いることができる。
【００６２】
Ｃ．ＰＲＯ２３２０３の修飾
ＰＲＯ２３２０３の共有結合的修飾は本発明の範囲内に含まれる。共有結合的修飾の１つの型は、ＰＲＯ２３２０３ポリペプチドの標的とするアミノ酸残基を、ＰＲＯ２３２０３の選択された側鎖又はＮ又はＣ末端残基と反応できる有機誘導体化試薬と反応させることである。二官能性試薬での誘導体化が、例えばＰＲＯ２３２０３を水不溶性支持体マトリクスあるいは抗−ＰＲＯ２３２０３抗体の精製方法又はその逆で用いるための表面に架橋させるのに有用である。通常用いられる架橋剤は、例えば、１，１−ビス（ジアゾアセチル）−２−フェニルエタン、グルタルアルデヒド、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、例えば４−アジドサリチル酸とのエステル、３，３’−ジチオビス（スクシンイミジルプロピオネート）等のジスクシンイミジルエステルを含むホモ二官能性イミドエステル、ビス−Ｎ−マレイミド−１，８−オクタン等の二官能性マレイミド、及びメチル−３−［（ｐ−アジドフェニル）−ジチオ］プロピオイミダート等の試薬を含む。
他の修飾は、グルタミニル及びアスパラギニル残基の各々対応するグルタミル及びアスパルチル残基への脱アミノ化、プロリン及びリシンのヒドロキシル化、セリル又はトレオニル残基のヒドロキシル基のリン酸化、リジン、アルギニン、及びヒスチジン側鎖のα−アミノ基のメチル化［Ｔ．Ｅ． Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ， Ｐｒｏｔｅｉｎｓ： Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ， Ｗ．Ｈ． Ｆｒｅｅｍａｎ ＆ Ｃｏ．， Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ， ｐｐ．７９−８６ （１９８３）］、Ｎ末端アミンのアセチル化、及び任意のＣ末端カルボキシル基のアミド化を含む。
本発明の範囲内に含まれるＰＲＯ２３２０３ポリペプチドの共有結合的修飾の他の型は、ポリペプチドの天然グリコシル化パターンの変更を含む。「天然グリコシル化パターンの変更」とは、ここで意図されるのは、天然配列ＰＲＯ２３２０３に見られる１又は複数の炭水化物部分の欠失（存在するグリコシル化部位の除去又は化学的及び／又は酵素的手段によるグリコシル化の削除のいずれかによる）、及び／又は天然配列ＰＲＯ２３２０３に存在しない１又は複数のグリコシル化部位の付加を意味する。さらに、この文節は、存在する種々の炭水化物部分の性質及び特性の変化を含む、天然タンパク質のグリコシル化における定性的変化を含む。
【００６３】
ＰＲＯ２３２０３ポリペプチドへのグリコシル化部位の付加はアミノ酸配列の変更を伴ってもよい。この変更は、例えば、１又は複数のセリン又はトレオニン残基の天然配列ＰＲＯ２３２０３（Ｏ−結合グリコシル化部位）への付加、又は置換によってなされてもよい。ＰＲＯ２３２０３アミノ酸配列は、場合によっては、ＤＮＡレベルでの変化、特に、ＰＲＯ２３２０３ポリペプチドをコードするＤＮＡを予め選択された塩基において変異させ、所望のアミノ酸に翻訳されるコドンを生成させることを通して変更されてもよい。
ＰＲＯ２３２０３ポリペプチド上に炭水化物部分の数を増加させる他の手段は、グリコシドのポリペプチドへの化学的又は酵素的結合による。このような方法は、この技術分野において、例えば、１９８７年９月１１日に発行されたＷＯ８７／０５３３０、及びＡｐｌｉｎ及びＷｒｉｓｔｏｎ， ＣＲＣ Ｃｒｉｔ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， ｐｐ． ２５９−３０６ （１９８１）に記載されている。
ＰＲＯ２３２０３ポリペプチド上に存在する糖鎖部分の除去は、化学的又は酵素的に、あるいはグルコシル化の標的として提示されたアミノ酸残基をコードするコドンの変異的置換によってなすことができる。化学的脱グリコシル化技術は、この分野で知られており、例えば、Ｈａｋｉｍｕｄｄｉｎら， Ａｒｃｈ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ．， ２５９：５２ （１９８７）により、及びＥｄｇｅら， Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， １１８： １３１ （１９８１）により記載されている。ポリペプチド上の炭水化物部分の酵素的切断は、Ｔｈｏｔａｋｕｒａら， Ｍｅｔｈ． Ｅｎｚｙｍｏｌ． １３８：３５０ （１９８７）に記載されているように、種々のエンド及びエキソグリコシダーゼを用いることにより達成される。
ＰＲＯ２３２０３の共有結合的修飾の他の型は、ＰＲＯ２３２０３ポリぺプチドの、種々の非タンパク質様ポリマー、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコール、又はポリオキシアルキレンの一つへの、米国特許第４，６４０，８３５号；第４，４９６，６８９号；第４，３０１，１４４号；第４，６７０，４１７号；第４，７９１，１９２号又は第４，１７９，３３７号に記載された方法での結合を含む。
また、本発明のＰＲＯ２３２０３は、他の異種ポリペプチド又はアミノ酸配列に融合したＰＲＯ２３２０３を含むキメラ分子を形成する方法で修飾してもよい。
【００６４】
一実施態様では、このようなキメラ分子は、抗タグ抗体が選択的に結合できるエピトープを提供するタグポリペプチドとＰＲＯ２３２０３との融合を含む。エピトープタグは、一般的にはＰＲＯ２３２０３のアミノ又はカルボキシル末端に位置する。このようなＰＲＯ２３２０３のエピトープタグ形態の存在は、タグポリペプチドに対する抗体を用いて検出することができる。また、エピトープタグの提供は、抗タグ抗体又はエピトープタグに結合する他の型の親和性マトリクスを用いたアフィニティ精製によってＰＲＯ２３２０３を容易に精製できるようにする。種々のタグポリペプチド及びそれら各々の抗体はこの分野で良く知られている。例としては、ポリ−ヒスチジン（ポリ−ｈｉｓ）又はポリ−ヒスチジン−グリシン（ｐｏｌｙ−ｈｉｓ−ｇｌｙ）タグ；ｆｌｕ ＨＡタグポリペプチド及びその抗体１２ＣＡ５［Ｆｉｅｌｄら， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ．， ８：２１５９−２１６５ （１９８８）］；ｃ−ｍｙｃタグ及びそれに対する８Ｆ９、３Ｃ７、６Ｅ１０、Ｇ４、Ｂ７及び９Ｅ１０抗体［Ｅｖａｎら， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， ５：３６１０−３６１６（１９８５）］；及び単純ヘルペスウイルス糖タンパク質Ｄ（ｇＤ）タグ及びその抗体［Ｐａｂｏｒｓｋｙら， Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， ３（６）：５４７−５５３ （１９９０）］を含む。他のタグポリペプチドは、Ｆｌａｇペプチド［Ｈｏｐｐら， ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， ６：１２０４−１２１０（１９８８）］；ＫＴ３エピトープペプチド［Ｍａｒｔｉｎら， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２５５：１９２−１９４ （１９９２）］；α−チューブリンエピトープペプチド［Ｓｋｉｎｎｅｒら， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２６６：１５１６３−１５１６６ （１９９１）］；及びＴ７遺伝子１０タンパク質ペプチドタグ［Ｌｕｔｚ−Ｆｒｅｙｅｒｍｕｔｈら， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８７：６３９３−６３９７（１９９０）］を含む。
それに換わる実施態様では、キメラ分子はＰＲＯ２３２０３の免疫グロブリン又は免疫グロブリンの特定領域との融合体を含んでもよい。キメラ分子の二価形態（「イムノアドヘシン」とも呼ばれる）については、そのような融合体はＩｇＧ分子のＦｃ領域であり得る。免疫グロブリン融合体は、好ましくは免疫グロブリン分子内の少なくとも１つの可変領域に換えてＰＲＯ２３２０３ポリペプチドの可溶化（膜貫通ドメイン欠失又は不活性化）形態を含む。特に好ましい実施態様では、免疫グロブリン融合体は、ＩｇＧ１分子のヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３、又はヒンジ、ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３領域を含む。免疫グロブリン融合体の生産については、１９９５年６月２７日発行の米国特許第５，４２８，１３０号を参照のこと。
【００６５】
Ｄ．ＰＲＯ２３２０３の調製
以下の説明は、主として、ＰＲＯ２３２０３核酸を含むベクターで形質転換又は形質移入された細胞を培養することによりＰＲＯ２３２０３を生産する方法に関する。もちろん、当該分野においてよく知られている他の方法を用いてＰＲＯ２３２０３を調製することができると考えられる。例えば、ＰＲＯ２３２０３配列、又はその一部は、固相技術を用いた直接ペプチド合成によって生産してもよい［例えば、Ｓｔｅｗａｒｔら， Ｓｏｌｉｄ−Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ， Ｗ．Ｈ． Ｆｒｅｅｍａｎ Ｃｏ．， サン フランシスコ， カリフォルニア（１９６９）；Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ， Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ．， ８５：２１４９−２１５４ （１９６３）参照］。手動技術又は自動によるインビトロタンパク質合成を行ってもよい。自動合成は、例えば、アプライド・バイオシステムズ・ペプチド合成機（フォスター  シティー， カリフォルニア）を用いて、製造者の指示により実施してもよい。ＰＲＯ２３２０３の種々の部分は、別々に化学的に合成され、化学的又は酵素的方法を用いて結合させて完全長ＰＲＯ２３２０３を生産してもよい。
１．ＰＲＯ２３２０３をコードするＤＮＡの単離
ＰＲＯ２３２０３をコードするＤＮＡは、ＰＲＯ２３２０３ ｍＲＮＡを保有していてそれを検出可能なレベルで発現すると考えられる組織から調製されたｃＤＮＡライブラリーから得ることができる。従って、ヒトＰＲＯ２３２０３ＤＮＡは、実施例に記載されるように、ヒトの組織から調製されたｃＤＮＡライブラリーから簡便に得ることができる。またＰＲＯ２３２０３−コード化遺伝子は、ゲノムライブラリーから又は公知の合成方法（例えば、自動化核酸合成）により得ることもできる。
ライブラリーは、対象となる遺伝子あるいはその遺伝子によりコードされるタンパク質を同定するために設計されたプローブ（ＰＲＯ２３２０３に対する抗体又は少なくとも約２０−８０塩基のオリゴヌクレオチド等）によってスクリーニングできる。選択されたプローブによるｃＤＮＡ又はゲノムライブラリーのスクリーニングは、例えばＳａｍｂｒｏｏｋら， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ： Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， １９８９）に記載されている標準的な手順を使用して実施することができる。ＰＲＯ２３２０３をコードする遺伝子を単離する他の方法はＰＣＲ法を使用するものである［Ｓａｍｂｒｏｏｋら，上掲；Ｄｉｅｆｆｅｎｂａｃｈら， ＰＣＲ Ｐｒｉｍｅｒ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， １９９５）］。
【００６６】
下記の実施例には、ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング技術を記載している。プローブとして選択されたオリゴヌクレオチド配列は、充分な長さで、疑陽性が最小化されるよう充分に明瞭でなければならない。オリゴヌクレオチドは、スクリーニングされるライブラリー内のＤＮＡとのハイブリダイゼーション時に検出可能であるように標識されていることが好ましい。標識化の方法は当該分野において良く知られており、３２Ｐ標識されたＡＴＰのような放射線標識、ビオチン化あるいは酵素標識の使用が含まれる。中程度の厳密性及び高度の厳密性を含むハイブリダイゼーション条件は、上掲のＳａｍｂｒｏｏｋらに示されている。
このようなライブラリースクリーニング法において同定された配列は、ＧｅｎＢａｎｋらの公共データベース又は個人の配列データベースに寄託され公衆に利用可能とされている周知の配列と比較及びアラインメントすることができる。分子の限定された領域内又は全長に渡っての（アミノ酸又は核酸レベルのいずれかでの）配列同一性は、当該分野で知られた、及びここに記載した方法を用いて決定することができる。
タンパク質コード化配列を有する核酸は、初めてここで開示された推定アミノ酸配列を使用し、また必要ならば、ｃＤＮＡに逆転写されていないｍＲＮＡの生成中間体及び先駆物質を検出する上掲のＳａｍｂｒｏｏｋらに記述されているような従来のプライマー伸展法を使用して選択されたｃＤＮＡ又はゲノムライブラリーをスクリーニングすることによって得られる。
【００６７】
２．宿主細胞の選択及び形質転換
宿主細胞を、ここに記載したＰＲＯ２３２０３生産のための発現又はクローニングベクターで形質移入又は形質転換し、プロモーターを誘導し、形質転換体を選択し、又は所望の配列をコードする遺伝子を増幅するために適当に変性された従来の栄養培地で培養する。培養条件、例えば培地、温度、ｐＨ等々は、過度の実験をすることなく当業者が選ぶことができる。一般に、細胞培養の生産性を最大にするための原理、プロトコール、及び実用技術は、Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ： ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ， Ｍ．Ｂｕｔｌｅｒ編 （ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ， １９９１）及びＳａｍｂｒｏｏｋら， 上掲に見出すことができる。
真核生物細胞形質移入及び原核生物細胞形質移入の方法、例えば、ＣａＣｌ２、ＣａＰＯ４、リポソーム媒介及びエレクトロポレーションは当業者にとって公知のものである。用いられる宿主細胞に応じて、その細胞に対して適した標準的な方法を用いて形質転換はなされる。前掲のＳａｍｂｒｏｏｋらに記載された塩化カルシウムを用いるカルシウム処理又はエレクトロポレーションが、一般的に原核生物に対して用いられる。アグロバクテリウム・トゥメファシエンスによる感染が、Ｓｈａｗら， Ｇｅｎｅ， ２３：３１５（１９８３）及び１９８９年６月２９日公開のＷＯ８９／０５８５９に記載されているように、ある種の植物細胞の形質転換に用いられる。そのような細胞壁のない哺乳動物の細胞に対しては、Ｇｒａｈａｍ及びｖａｎ ｄｅｒ Ｅｂ， Ｖｉｒｏｌｏｇｙ， ５２：４５６−４５７ （１９７８）のリン酸カルシウム沈降法が用いられる。哺乳動物細胞の宿主系形質転換の一般的な態様は米国特許第４，３９９，２１６号に記載されている。酵母菌中への形質転換は、典型的には、Ｖａｎ Ｓｏｌｉｎｇｅｎら， Ｊ． Ｂａｃｔ．， １３０：９４６ （１９７７）及びＨｓｉａｏら， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ７６：３８２９ （１９７９）の方法に従って実施される。しかしながら、ＤＮＡを細胞中に導入する他の方法、例えば、核マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、無傷の細胞との細菌プロトプラスト融合、又はポリブレン、ポリオルニチンなどのポリカチオンなどを使用してもよい。哺乳動物細胞を形質転換するための種々の技術については、Ｋｅｏｗｎら， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ， １８５：５２７−５３７ （１９９０）及び Ｍａｎｓｏｕｒら， Ｎａｔｕｒｅ， ３３６：３４８−３５２ （１９８８）を参照のこと。
【００６８】
ここに記載のベクターにＤＮＡをクローニングあるいは発現するために適切な宿主細胞は、原核生物、酵母菌、又は高等真核生物細胞である。適切な原核生物は、限定するものではないが、真正細菌、例えばグラム陰性又はグラム陽性生物体、例えば大腸菌のような腸内細菌科を含む。種々の大腸菌株が公的に利用可能であり、例えば、大腸菌Ｋ１２株ＭＭ２９４（ＡＴＣＣ３１，４４６）；大腸菌Ｘ１７７６（ＡＴＣＣ３１，５３７）；大腸菌株Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ２７，３２５）及びＫ５７７２（ＡＴＣＣ５３，６３５）である。他の好ましい原核動物宿主細胞は、大腸菌、例えば、Ｅ． ｃｏｌｉ、エンテロバクター、エルビニア（Ｅｒｗｉｎｉａ）、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、プロテウス（Ｐｒｏｔｅｕｓ）、サルモネラ、例えば、ネズミチフス菌、セラチア、例えば、セラチア・マルセサンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃａｎｓ） 、及び赤痢菌などの腸内細菌科、並びに桿菌、例えばバチルス・スブチルス（Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ）及びバチルス・リチェニフォルミス（Ｂ． ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）（例えば、１９８９年４月１２日発行のＤＤ２６６，７１０に記載されたバチルス・リチェニフォルミス４１Ｐ）、シュードモナス、例えば緑膿菌及びストレプトマイセスを含む。これらの例は限定ではなく例示である。株Ｗ３１１０は、組換えＤＮＡ生産物発酵のための共通の宿主株であるので一つの特に好ましい宿主又は親宿主である。好ましくは、宿主細胞は最小量のタンパク質分解酵素を分泌する。例えば、株Ｗ３１１０は、細胞に外来のタンパク質をコードする遺伝子における遺伝子変異をするように修飾してもよく、そのような宿主の例としては、完全な遺伝子型ｔｏｎＡを有する大腸菌Ｗ３１１０株１Ａ２；完全な遺伝子型ｔｏｎＡ ｐｔｒ３を有する大腸菌Ｗ３１１０株９Ｅ４；完全な遺伝子型ｔｏｎＡ ｐｔｒ３ ｐｈｏＡ Ｅ１５（ａｒｇＦ−ｌａｃ）１６９ ｄｅｇＰ ｏｍｐＴ ｋａｎｒを有する大腸菌Ｗ３１１０株２７Ｃ７（ＡＴＣＣ ５５，２４４）；完全な遺伝子型ｔｏｎＡ ｐｔｒ３ ｐｈｏＡ Ｅ１５ （ａｒｇＦ−ｌａｃ）１６９ ｄｅｇＰ ｏｍｐＴ ｒｂｓ７ ｉｌｖＧ ｋａｎｒを有する大腸菌Ｗ３１１０株３７Ｄ６；非カナマイシン耐性ｄｅｇＰ欠失変異を持つ３７Ｄ６株である大腸菌Ｗ３１１０株４０Ｂ４；及び１９９０年８月７日発行の米国特許第４，９４６，７８３号に開示された変異周辺質プロテアーゼを有する大腸菌株を含む。あるいは、クローニングのインビトロ法、例えばＰＣＲ又は他の核酸ポリメラーゼ反応が好ましい。
【００６９】
原核生物に加えて、糸状菌又は酵母菌のような真核微生物は、ＰＲＯ２３２０３コード化ベクターのための適切なクローニング又は発現宿主である。サッカロミセス・セレヴィシアは、通常用いられる下等真核生物宿主微生物である。他に、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｂｅａｃｈ及びＮｕｒｓｅ， Ｎａｔｕｒｅ， ２９０： １４０ ［１９８１］； １９８５年５月２日発行の欧州特許第１３９，３８３号）；クルベロミセス宿主（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｈｏｓｔｓ）（米国特許第４，９４３，５２９号； Ｆｌｅｅｒら， Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， ９： ９６８−９７５ （１９９１））、例えばクルベロミセスラクチス（Ｋ． ｌａｃｔｉｓ）（ＭＷ９８−８Ｃ， ＣＢＳ６８３， ＣＢＳ４５７４； Ｌｏｕｖｅｎｃｏｕｒｔら， Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５４（２）： ７３７−７４２ ［１９８３］）、クルベロミセス・フラギリス（Ｋ． ｆｒａｇｉｌｉｓ）（ＡＴＣＣ １２，４２４）、クルベロミセス・ブルガリクス（Ｋ． ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）（ＡＴＣＣ １６，０４５）、クルベロミセス・ウィケラミイ（Ｋ． ｗｉｃｋｅｒａｍｉｉ）（ＡＴＣＣ ２４，１７８）、クルベロミセス・ワルチイ（Ｋ． ｗａｌｔｉｉ）（ＡＴＣＣ ５６，５００）、クルベロミセス・ドロソフィラルム（Ｋ． ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａｒｕｍ）（ＡＴＣＣ ３６，９０６； Ｖａｎ ｄｅｎ Ｂｅｒｇら， Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， ８： １３５ （１９９０））、クルベロミセス・サーモトレランス（Ｋ． ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ）及びクルベロミセス・マルキシアナス（Ｋ． ｍａｒｘｉａｎｕｓ）；ヤロウィア（ｙａｒｒｏｗｉａ）（欧州特許第４０２，２２６号）；ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）（欧州特許第１８３，０７０号； Ｓｒｅｅｋｒｉｓｈｎａら， Ｊ． Ｂａｓｉｃ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ， ２８： ２６５−２７８ ［１９８８］）；カンジダ；トリコデルマ・レーシア（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｉａ）（欧州特許第２４４，２３４号）；アカパンカビ（Ｃａｓｅら， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ７６： ５２５９−５２６３ ［１９７９］）；シュワニオマイセス（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ）、例えばシュワニオマイセス・オクシデンタリス（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ）（１９９０年１０月３１日発行の欧州特許第３９４，５３８号）；及び糸状真菌、例えば、ニューロスポラ、ペニシリウム、トリポクラジウム（Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ）（１９９１年１月１０日発行の国際公開９１／００３５７）；及びアスペルギルス宿主、例えばアスペルギルスニダランス（Ｂａｌａｎｃｅら， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ．， １１２： ２８４−２８９ ［１９８３］； Ｔｉｌｂｕｒｎら， Ｇｅｎｅ， ２６： ２０５−２２１ ［１９８３］； Ｙｅｌｔｏｎら， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８１： １４７０−１４７４ ［１９８４］）及びアスペルギルスニガー（Ｋｅｌｌｙ及びＨｙｎｅｓ， ＥＭＢＯ Ｊ．， ４： ４７５−４７９ ［１９８５］）が含まれる。ここで好ましいメチロトロピック（Ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｉｃ）酵母は、これらに限られな��が、ハンセヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、カンジダ、クロエケラ（Ｋｌｏｅｃｋｅｒａ）、ピチア（Ｐｉｃｈｉａ）、サッカロミセス、トルロプシス（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ）、及びロドトルラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）からなる属から選択されたメタノールで増殖可能な酵母を含む。この酵母の分類の例示である特定の種のリストは、Ｃ． Ａｎｔｈｏｎｙ， Ｔｈｅ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈｓ， ２６９ （１９８２）に記載されている。
【００７０】
グリコシル化ＰＲＯ２３２０３の発現に適切な宿主細胞は、多細胞生物から誘導される。無脊椎動物細胞の例としては、ショウジョウバエＳ２及びスポドプテラＳｆ９等の昆虫細胞並びに植物細胞が含まれる。有用な哺乳動物宿主株化細胞の例は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）及びＣＯＳ細胞を含む。より詳細な例は、ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株 （ＣＯＳ−７，ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５１）；ヒト胚腎臓株（２９３又は懸濁培養での増殖のためにサブクローン化された２９３細胞、Ｇｒａｈａｍら， Ｊ． Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ．， ３６：５９ （１９７７））；チャイニーズハムスター卵巣細胞／−ＤＨＦＲ（ＣＨＯ， Ｕｒｌａｕｂ及びＣｈａｓｉｎ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ７７：４２１６ （１９８０））；マウスのセルトリ細胞（ＴＭ４， Ｍａｔｈｅｒ， Ｂｉｏｌ． Ｒｅｐｒｏｄ．， ２３：２４３−２５１ （１９８０））ヒト肺細胞 （Ｗ１３８，ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７５）； ヒト肝細胞 （Ｈｅｐ Ｇ２，ＨＢ ８０６５）； 及びマウス乳房腫瘍細胞 （ＭＭＴ ０６０５６２，ＡＴＣＣ ＣＣＬ５１）を含む。適切な宿主細胞の選択は、この分野の技術常識内にある。
【００７１】
３．複製可能なベクターの選択及び使用
ＰＲＯ２３２０３をコードする核酸（例えば、ｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡ）は、クローニング（ＤＮＡの増幅）又は発現のために複製可能なベクター内に挿入される。様々なベクターが公的に入手可能である。ベクターは、例えば、プラスミド、コスミド、ウイルス粒子、又はファージの形態とすることができる。適切な核酸配列が、種々の手法によってベクターに挿入される。一般に、ＤＮＡはこの分野で周知の技術を用いて適当な制限エンドヌクレアーゼ部位に挿入される。ベクター成分としては、一般に、これらに制限されるものではないが、１つ又は複数のシグナル配列、複製開始点、１つ又は複数のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーター、及び転写終結配列を含む。これらの成分の１つ又は複数を含む適当なベクターの構築には、当業者に知られた標準的なライゲーション技術を用いる。
【００７２】
ＰＲＯ２３２０３は直接的に組換え手法によって生産されるだけではなく、シグナル配列あるいは成熟タンパク質あるいはポリペプチドのＮ−末端に特異的切断部位を有する他のポリペプチドである異種性ポリペプチドとの融合ポリペプチドとしても生産される。一般に、シグナル配列はベクターの成分であるか、ベクターに挿入されるＰＲＯ２３２０３−コード化ＤＮＡの一部である。シグナル配列は、例えばアルカリフォスファターゼ、ペニシリナーゼ、ｌｐｐあるいは熱安定性エンテロトキシンＩＩリーダーの群から選択された原核生物シグナル配列であってよい。酵母の分泌に関しては、シグナル配列は、酵母インベルターゼリーダー、アルファ因子リーダー（サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）及びクルイベロマイシス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）α因子リーダーを含み、後者は米国特許第５，０１０，１８２号に記載されている）、又は酸ホスファターゼリーダー、カンジダ・アルビカンス（Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ）グルコアミラーゼリーダー（１９９０年４月４日発行の欧州特許第３６２１７９号）、又は１９９０年１１月１５日に公開されたＷＯ９０／１３６４６に記載されているシグナルであり得る。哺乳動物細胞の発現においては、哺乳動物シグナル配列は、同一あるいは関連ある種の分泌ポリペプチド由来のシグナル配列並びにウイルス分泌リーダーのようなタンパク質の直接分泌に使用してもよい。
【００７３】
発現及びクローニングベクターは共に１つ又は複数の選択された宿主細胞においてベクターの複製を可能にする核酸配列を含む。そのような配列は多くの細菌、酵母及びウイルスに対してよく知られている。プラスミドｐＢＲ３２２に由来する複製開始点は大部分のグラム陰性細菌に好適であり、２μプラスミド開始点は酵母に適しており、様々なウイルス開始点（ＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウイルス、ＶＳＶ又はＢＰＶ）は哺乳動物細胞におけるクローニングベクターに有用である。
発現及びクローニングベクターは、典型的には、選択可能マーカーとも称される選択遺伝子を含む。典型的な選択遺伝子は、（ａ）アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキセートあるいはテトラサイクリンのような抗生物質あるいは他の毒素に耐性を与え、（ｂ）栄養要求性欠陥を補い、又は（ｃ）例えばバシリのＤ−アラニンラセマーゼをコードする遺伝子のような、複合培地から得られない重要な栄養素を供給するタンパク質をコードする。
【００７４】
哺乳動物細胞に適切な選べるマーカーの例は、ＤＨＦＲあるいはチミジンキナーゼのようにＰＲＯ２３２０３−コード化核酸を取り込むことのできる細胞成分を同定することのできるものである。野生型ＤＨＦＲを用いた場合の好適な宿主細胞は、Ｕｒｌａｕｂらにより Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ７７：４２１６ （１９８０）に記載されているようにして調製され増殖されたＤＨＦＲ活性に欠陥のあるＣＨＯ株化細胞である。酵母菌中での使用に好適な選択遺伝子は酵母プラスミドＹＲｐ７に存在するｔｒｐ１遺伝子である［Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂら， Ｎａｔｕｒｅ， ２８２：３９（１９７９）；Ｋｉｎｇｓｍａｎら， Ｇｅｎｅ， ７：１４１（１９７９）；Ｔｓｃｈｅｍｐｅｒら， Ｇｅｎｅ， １０：１５７（１９８０）］。ｔｒｐ１遺伝子は、例えば、ＡＴＣＣ番号４４０７６あるいはＰＥＰ４−１のようなトリプトファン内で増殖する能力を欠く酵母菌の突然変異株に対する選択マーカーを提供する［Ｊｏｎｅｓ， Ｇｅｎｅｔｉｃｓ， ８５：１２ （１９７７）］。
発現及びクローニングベクターは、通常、ＰＲＯ２３２０３−コード化核酸配列に作用可能に結合し、ｍＲＮＡ合成を制御するプロモーターを含む。種々の可能な宿主細胞により認識される好適なプロモーターが知られている。原核生物宿主での使用に好適なプロモーターはβ−ラクタマーゼ及びラクトースプロモーター系［Ｃｈａｎｇら， Ｎａｔｕｒｅ， ２７５：６１５ （１９７８）； Ｇｏｅｄｄｅｌら， Ｎａｔｕｒｅ， ２８１：５４４ （１９７９）］、アルカリフォスファターゼ、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系［Ｇｏｅｄｄｅｌ， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， ８：４０５７ （１９８０）； ＥＰ ３６，７７６］、及びハイブリッドプロモーター、例えばｔａｃプロモーター［ｄｅＢｏｅｒら， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８０：２１−２５ （１９８３）］を含む。細菌系で使用するプロモーターもまたＰＲＯ２３２０３をコードするＤＮＡと作用可能に結合したシャイン−ダルガーノ（Ｓ．Ｄ．）配列を有する。
【００７５】
酵母宿主と共に用いて好適なプロモーター配列の例としては、３−ホスホグリセラートキナーゼ［Ｈｉｔｚｅｍａｎ ら， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２５５：２０７３ （１９８０）］又は他の糖分解酵素［Ｈｅｓｓ ら， Ｊ． Ａｄｖ． Ｅｎｚｙｍｅ Ｒｅｇ．， ７：１４９ （１９６８）；Ｈｏｌｌａｎｄ， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， １７：４９００（１９７８）］、例えばエノラーゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース−６−リン酸イソメラーゼ、３−ホスホグリセレートムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオセリン酸イソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ、及びグルコキナーゼが含まれる。
他の酵母プロモーターとしては、増殖条件によって転写が制御される付加的効果を有する誘発的プロモーターであり、アルコールデヒドロゲナーゼ２、イソチトクロムＣ、酸フォスファターゼ、窒素代謝と関連する分解性酵素、メタロチオネイン、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、及びマルトース及びガラクトースの利用を支配する酵素のプロモーター領域がある。酵母菌での発現に好適に用いられるベクターとプロモーターは欧州特許第７３，６５７号に更に記載されている。
【００７６】
哺乳動物の宿主細胞におけるベクターからのＰＲＯ２３２０３転写は、例えば、ポリオーマウィルス、伝染性上皮腫ウィルス（１９８９年７月５日公開のＵＫ２，２１１，５０４）、アデノウィルス（例えばアデノウィルス２）、ウシ乳頭腫ウィルス、トリ肉腫ウィルス、サイトメガロウィルス、レトロウィルス、Ｂ型肝炎ウィルス及びサルウィルス４０（ＳＶ４０）のようなウィルスのゲノムから得られるプロモーター、異種性哺乳動物プロモーター、例えばアクチンプロモーター又は免疫グロブリンプロモーター、及び熱衝撃プロモーターから得られるプロモーターによって、このようなプロモーターが宿主細胞系に適合し得る限り制御される。
より高等の真核生物によるＰＲＯ２３２０３をコードするＤＮＡの転写は、ベクター中にエンハンサー配列を挿入することによって増強され得る。エンハンサーは、通常は約１０から３００塩基対で、プロモーターに作用してその転写を増強するＤＮＡのシス作動要素である。哺乳動物遺伝子由来の多くのエンハンサー配列が現在知られている（グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α−フェトプロテイン及びインスリン）。しかしながら、典型的には、真核細胞ウィルス由来のエンハンサーが用いられるであろう。例としては、複製起点の後期側のＳＶ４０エンハンサー（１００−２７０塩基対）、サイトメガロウィルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側のポリオーマエンハンサー及びアデノウィルスエンハンサーが含まれる。エンハンサーは、ＰＲＯ２３２０３コード化配列の５’又は３’位でベクター中にスプライシングされ得るが、好ましくはプロモーターから５’位に位置している。
【００７７】
また真核生物宿主細胞（酵母、真菌、昆虫、植物、動物、ヒト、又は他の多細胞生物由来の有核細胞）に用いられる発現ベクターは、転写の終結及びｍＲＮＡの安定化に必要な配列も含む。このような配列は、真核生物又はウィルスのＤＮＡ又はｃＤＮＡの通常は５’、時には３’の非翻訳領域から取得できる。これらの領域は、ＰＲＯ２３２０３をコードするｍＲＮＡの非翻訳部分にポリアデニル化断片として転写されるヌクレオチドセグメントを含む。
組換え脊椎動物細胞培養でのＰＲＯ２３２０３の合成に適応化するのに適切な他の方法、ベクター及び宿主細胞は、Ｇｅｔｈｉｎｇら， Ｎａｔｕｒｅ， ２９３：６２０−６２５ （１９８１）； Ｍａｎｔｅｉら， Ｎａｔｕｒｅ， ２８１：４０−４６ （１９７９）；欧州特許第１１７，０６０号；及び欧州特許第１１７，０５８号に記載されている。
【００７８】
４．遺伝子増幅／発現の検出
遺伝子の増幅及び／又は発現は、ここで提供された配列に基づき、適切に標識されたプローブを用い、例えば、従来よりのサザンブロット法、ｍＲＮＡの転写を定量化するノーザンブロット法［Ｔｈｏｍａｓ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ，７７：５２０１−５２０５ （１９８０）］、ドットブロット法（ＤＮＡ分析）、又はインサイツハイブリダイゼーション法によって、直接的に試料中で測定することができる。あるいは、ＤＮＡ二本鎖、ＲＮＡ二本鎖及びＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド二本鎖又はＤＮＡ−タンパク二本鎖を含む、特異的二本鎖を認識することができる抗体を用いることもできる。次いで、抗体を標識し、アッセイを実施することができ、ここで二本鎖は表面に結合しており、その結果二本鎖の表面での形成の時点でその二本鎖に結合した抗体の存在を検出することができる。
あるいは、遺伝子の発現は、遺伝子産物の発現を直接的に定量する免疫学的な方法、例えば細胞又は組織切片の免疫組織化学的染色及び細胞培養又は体液のアッセイによって、測定することもできる。試料液の免疫組織化学的染色及び／又はアッセイに有用な抗体は、モノクローナルでもポリクローナルでもよく、任意の哺乳動物で調製することができる。簡便には、抗体は、天然配列ＰＲＯ２３２０３ポリペプチドに対して、又はここで提供されるＤＮＡ配列をベースとした合成ペプチドに対して、又はＰＲＯ２３２０３ ＤＮＡに融合し特異的抗体エピトープをコードする外因性配列に対して調製され得る。
【００７９】
５．ポリペプチドの精製
ＰＲＯ２３２０３の形態は、培地又は宿主細胞の溶菌液から回収することができる。膜結合性であるならば、適切な洗浄液（例えばトリトン−Ｘ１００）又は酵素的切断を用いて膜から引き離すことができる。ＰＲＯ２３２０３の発現に用いられる細胞は、凍結融解サイクル、超音波処理、機械的破壊、又は細胞溶解剤などの種々の化学的又は物理的手段によって破壊することができる。
ＰＲＯ２３２０３を、組換え細胞タンパク又はポリペプチドから精製することが望ましい。適切な精製手順の例である次の手順により精製される：イオン交換カラムでの分画；エタノール沈殿；逆相ＨＰＬＣ；シリカ又はカチオン交換樹脂、例えばＤＥＡＥによるクロマトグラフィー；クロマトフォーカシング；ＳＤＳ−ＰＡＧＥ；硫酸アンモニウム沈殿；例えばセファデックスＧ−７５を用いるゲル濾過；ＩｇＧのような夾雑物を除くプロテインＡセファロースカラム；及びＰＲＯ２３２０３のエピトープタグ形態を結合させる金属キレート化カラムである。この分野で知られ、例えば、Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ， １８２（１９９０）；Ｓｃｏｐｅｓ， Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ： Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ， Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （１９８２）に記載された多くのタンパク質精製方法を用いることができる。選択される精製過程は、例えば、用いられる生産方法及び特に生産される特定のＰＲＯ２３２０３の性質に依存する。
【００８０】
Ｅ．ＰＲＯ２３２０３の用途
ＰＲＯ２３２０３をコードするヌクレオチド配列（又はそれらの補体）は、ハイブリダイゼーションプローブとしての使用を含む分子生物学の分野において、染色体及び遺伝子マッピングにおいて、及びアンチセンスＲＮＡ及びＤＮＡの生成において種々の用途を有している。また、ＰＲＯ２３２０３核酸も、ここに記載される組換え技術によるＰＲＯ２３２０３ポリペプチドの調製に有用である。
【００８１】
完全長天然配列ＰＲＯ２３２０３遺伝子（配列番号：１）又はその一部は、完全長ＰＲＯ２３２０３ ｃＤＮＡの単離又は図１に開示した天然ＰＲＯ２３２０３配列に対して所望の配列同一性を持つ更に他のｃＤＮＡ（例えば、ＰＲＯ２３２０３の自然発生変異体又は他の種からのＰＲＯ２３２０３をコードするもの）の単離のためのｃＤＮＡライブラリー用のハイブリダイゼーションプローブとして使用できる（配列番号：１）。場合によっては、プローブの長さは約２０〜約５０塩基である。ハイブリダイゼーションプローブは、少なくとも部分的には、配列番号：１のヌクレオチド配列の新規な領域から誘導してもよく、それらの領域は、過度の実験をすることなく、天然配列ＰＲＯ２３２０３のプロモーター、エンハンサー成分及びイントロンを含むゲノム配列から決定され得る。例えば、スクリーニング法は、ＰＲＯ２３２０３遺伝子のコード化領域を周知のＤＮＡ配列を用いて単離して約４０塩基の選択されたプローブを合成することを含む。ハイブリダイゼーションプローブは、３２Ｐ又は３５Ｓ等の放射性ヌクレオチド、又はアビジン／ビオチン結合系を介してプローブに結合したアルカリホスファターゼ等の酵素標識を含む種々の標識で標識されうる。本発明のＰＲＯ２３２０３遺伝子に相補的な配列を有する標識されたプローブは、ヒトｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ又はｍＲＮＡのライブラリーをスクリーニングし、そのライブラリーの何れのメンバーがプローブにハイブリッド形成するかを決定するのに使用できる。ハイブリダイゼーション技術は、以下の実施例において更に詳細に記載する。
【００８２】
本出願で開示する任意のＥＳＴ配列は、プローブと同様に、ここに記載した方法で用いることができる。
ＰＲＯ２３２０３核酸の他の有用な断片は、標的ＰＲＯ２３２０３ ｍＲＮＡ（センス）又はＰＲＯ２３２０３ ＤＮＡ（アンチセンス）配列に結合できる一本鎖核酸配列（ＲＮＡ又はＤＮＡのいずれか）を含むアンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドを含む。アンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドは、本発明によると、ＰＲＯ２３２０３ ＤＮＡのコード化領域の断片を含む。このような断片は、一般的には少なくとも約１４ヌクレオチド、好ましくは約１４から３０ヌクレオチドを含む。与えられたタンパク質をコードするｃＤＮＡ配列に基づく、アンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドを制御する能力は、例えば、Ｓｔｅｉｎ及びＣｏｈｅｎ（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ４８： ２６５９： １９８８）及び ｖａｎ ｄｅｒ Ｋｒｏｌら，（ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ６： ９５８， １９８８）に記載されている。
【００８３】
アンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドの標的核酸配列への結合は二重鎖の形成をもたらし、それは、二重鎖の分解の促進、転写又は翻訳の中途での停止を含む幾つかの方法の一つ、又は他の方法により、標的配列の転写又は翻訳を阻止する。よって、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＰＲＯ２３２０３タンパク質の発現を阻止するのに用いられる。アンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドは、修飾糖−ホスホジエステル骨格（又は他の糖結合、ＷＯ９１／０６６２９に記載のもの等）を有するオリゴヌクレオチドをさらに含み、そのような糖結合は内因性ヌクレアーゼ耐性である。そのような耐性糖結合を持つオリゴヌクレオチドは、インビボで安定であるが（即ち、酵素分解に耐えうるが）、標的ヌクレオチド配列に結合できる配列特異性は保持している。
センス又はアンチセンスオリゴヌクレオチドの他の例は、ＷＯ９０／１００４８に記載されているもののような、有機部分、及びオリゴヌクレオチドの標的核酸配列への親和性を向上させる他の部分、例えばポリ−（Ｌ−リジン）に共有結合したオリゴヌクレオチドを含む。さらにまた、エリプチシン等のインターカレート剤、アルキル化剤又は金属錯体をセンス又はアンチセンスオリゴヌクレオチドに結合させ、アンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドの標的ヌクレオチド配列への結合特異性を改変してもよい。
【００８４】
アンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドは、例えば、ＣａＰＯ４−媒介ＤＮＡ形質移入、エレクトロポレーションを含む任意の遺伝子転換方法により、又はエプスタイン−バーウイルスなどの遺伝子転換ベクターを用いることにより、標的核酸配列を含む細胞に導入される。好ましい方法では、アンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドは、適切なレトロウイルスベクターに挿入される。標的核酸配列を含む細胞は、インビボ又はエキソビボで組換えレトロウイルスベクターに接触させる。好適なレトロウイルスベクターは、これらに限られないが、マウスレトロウイルスＭ−ＭｕＬＶから誘導されるもの、Ｎ２（Ｍ−ＭｕＬＶから誘導されたレトロウイルス）、又はＤＣＴ５Ａ、ＤＣＴ５Ｂ及びＤＣＴ５Ｃと命名されたダブルコピーベクター（ＷＯ９０／１３６４１参照）を含む。
また、センス又はアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＷＯ９１／０４７５３に記載されているように、リガンド結合分子との結合体の形成により標的ヌクレオチド配列を含む細胞に導入してもよい。適切なリガンド結合分子は、これらに限られないが、細胞表面レセプター、増殖因子、他のサイトカイン、又は細胞表面レセプターに結合する他のリガンドを含む。好ましくは、リガンド結合分子の結合体形成は、リガンド結合分子がその対応する分子又はレセプターに結合する、あるいはセンス又はアンチセンスオリゴヌクレオチド又はその複合体の細胞への侵入を阻止する能力を実質的に阻害しない。
【００８５】
あるいは、センス又はアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＷＯ９０／１０４４８に記載されたように、オリゴヌクレオチド−脂質複合体の形成により標的核酸配列を含む細胞に導入してもよい。センス又はアンチセンスオリゴヌクレオチド−脂質複合体は、好ましくは内因性リパーゼにより細胞内で分解される。
また、プローブは、ＰＣＲ技術に用いて、密接に関連したＰＲＯ２３２０３コード化配列の同定のための配列のプールを作成することができる。
また、ＰＲＯ２３２０３をコードするヌクレオチド配列は、そのＰＲＯ２３２０３をコードする遺伝子のマッピングのため、及び遺伝子疾患を持つ個体の遺伝子分析のためのハイブリダイゼーションプローブの作成にも用いることができる。ここに提供されるヌクレオチド配列は、インサイツハイブリダイゼーション、既知の染色体マーカーに対する結合分析、及びライブラリーでのハイブリダイゼーションスクリーニング等の周知の技術を用いて、染色体及び染色体の特定領域にマッピングすることができる。
ＰＲＯ２３２０３のコード化配列が他のタンパク質に結合するタンパク質をコードする場合（例えば、ＰＲＯ２３２０３がレセプターである場合）、ＰＲＯ２３２０３は、結合相互作用に関与している他のタンパク質又は分子を同定するためのアッセイに用いることができる。このような方法により、レセプター／リガンド結合性相互作用の阻害剤を同定することができる。このような結合性相互作用に含まれるタンパク質も、ペプチド又は小分子阻害剤又は結合性相互作用のアゴニストのスクリーニングに用いることができる。また、レセプターＰＲＯ２３２０３は関連するリガンドの単離にも使用できる。スクリーニングアッセイは、天然ＰＲＯ２３２０３又はＰＲＯ２３２０３のレセプターの生物学的活性に似たリード化合物の発見のために設計される。このようなスクリーニングアッセイは、化学的ライブラリーのハイスループットスクリーニングにも使用可能なアッセイを含み、小分子候補薬剤の同定に特に適したものとする。考慮される小分子は、合成有機又は無機化合物を含む。アッセイは、この分野で良く知られ特徴付けられているタンパク質−タンパク質結合アッセイ、生物学的スクリーニングアッセイ、免疫検定及び細胞ベースのアッセイを含む種々の型式で実施される。
【００８６】
また、ＰＲＯ２３２０３又はその修飾型をコードする核酸は、トランスジェニック動物又は「ノックアウト」動物のいずれかを産生することに使用でき、また、これらは治療的に有用な試薬の開発やスクリーニングに有用である。トランスジェニック動物（例えばマウス又はラット）とは、出生前、例えば胚段階で、その動物又はその動物の祖先に導入された導入遺伝子を含む細胞を有する動物である。導入遺伝子とは、トランスジェニック動物が発生する細胞のゲノムに組み込まれたＤＮＡである。一実施形態では、ＰＲＯ２３２０３をコードするｃＤＮＡは、ＰＲＯ２３２０３をコードするＤＮＡを発現する細胞を含むトランスジェニック動物を作製するために使用するゲノム配列及び確立された技術に基づいて、ＰＲＯ２３２０３をコードするゲノムＤＮＡをクローン化するために使用することができる。トランスジェニック動物、特にマウス又はラット等の特定の動物を産生する方法は、当該分野において常套的になっており、例えば米国特許第４，７３６，８６６号や第４，８７０，００９号に記述されている。典型的には、特定の細胞を組織特異的エンハンサーでのＰＲＯ２３２０３導入遺伝子の導入の標的にする。胚段階で動物の生殖系列に導入されたＰＲＯ２３２０３コード化導入遺伝子のコピーを含むトランスジェニック動物はＰＲＯ２３２０３をコードするＤＮＡの増大した発現の影響を調べるために使用できる。このような動物は、例えばその過剰発現を伴う病理学的状態に対して保護をもたらすと思われる試薬のテスター動物として使用できる。本発明のこの態様においては、動物を試薬で治療し、導入遺伝子を有する未治療の動物に比べ病理学的状態の発症率が低ければ、病理学的状態に対する治療上の処置の可能性が示される。
【００８７】
あるいは、ＰＲＯ２３２０３の非ヒト相同体は、動物の胚幹細胞に導入されたＰＲＯ２３２０３をコードする変更ゲノムＤＮＡと、ＰＲＯ２３２０３をコードする内在性遺伝子との間の相同的組換えによって、欠損した又は変更されたＰＲＯ２３２０３コード化遺伝子を有するＰＲＯ２３２０３「ノックアウト」動物を作成するために使用できる。例えば、ＰＲＯ２３２０３をコードするｃＤＮＡは、確立された技術に従い、ＰＲＯ２３２０３をコードするゲノムＤＮＡのクローニングに使用できる。ＰＲＯ２３２０３をコードするゲノムＤＮＡの一部は、組込みをモニターするために使用可能な選択マーカーをコード遺伝子のような他の遺伝子によって欠失させたり、置換させることが可能である。典型的には、ベクターは無変化のフランキングＤＮＡ（５’と３’末端の両方）を数キロベース含む［例えば、相同的組換えベクターについてはＴｈｏｍａｓ及びＣａｐｅｃｃｈｉ， Ｃｅｌｌ， ５１：５０３（１９８７）を参照のこと］。ベクターは胚幹細胞に（例えばエレクトロポレーションによって）導入し、導入されたＤＮＡが内在性ＤＮＡと相同的に組換えられた細胞が選択された［例えば、Ｌｉら， Ｃｅｌｌ， ６９：９１５（１９９２）参照］。選択された細胞は次に動物（例えばマウス又はラット）の胚盤胞内に注入されて集合キメラを形成する［例えば、Ｂｒａｄｌｅｙ， Ｔｅｒａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａｓ ａｎｄ Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ， Ｅ． Ｊ． Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ， ｅｄ． （ＩＲＬ， Ｏｘｆｏｒｄ， １９８７）， ｐｐ． １１３−１５２参照のこと］。その後、キメラ性胚を適切な偽妊娠の雌性乳母に移植し、期間をおいて「ノックアウト」動物を作り出す。胚細胞に相同的に組換えられたＤＮＡを有する子孫は標準的な技術により同定され、それらを利用して動物の全細胞が相同的に組換えられたＤＮＡを含む動物を繁殖させることができる。ノックアウト動物は、ＰＲＯ２３２０３ポリペプチドの欠乏によるある種の病理的状態及びその病理的状態の進行に対する防御能力によって特徴付けられる。
【００８８】
また、ＰＲＯ２３２０３ポリペプチドをコードする核酸は遺伝子治療にも使用できる。遺伝子治療用途においては、例えば欠陥遺伝子を置換するため、治療的有効量の遺伝子産物のインビボ合成を達成するために遺伝子が導入される。「遺伝子治療」とは、１回の処理により継続的効果が達成される従来の遺伝子治療と、治療的に有効なＤＮＡ又はｍＲＮＡの１回又は繰り返し投与を含む遺伝子治療薬の投与の両方を含む。アンチセンスＲＮＡ及びＤＮＡは、ある種の遺伝子のインビボ発現を阻止する治療薬として用いることができる。短いアンチセンスオリゴヌクレオチドを、細胞膜による制限された取り込みに起因する低い細胞内濃度にもかかわらず、それが阻害剤として作用する細胞中に移入できることは既に示されている（Ｚａｍｅｃｎｉｋら， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８３： ４１４３−４１４６ ［１９８６］）。オリゴヌクレオチドは、それらの負に荷電したリン酸ジエステル基を非荷電基で置換することによって取り込みを促進するように修飾してもよい。
【００８９】
生存可能な細胞に核酸を導入するための種々の技術が存在する。これらの技術は、核酸が培養細胞にインビトロで、あるいは意図する宿主の細胞においてインビボで移入されるかに応じて変わる。核酸を哺乳動物細胞にインビトロで移入するのに適した方法は、リポソーム、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、細胞融合、ＤＥＡＥ−デキストラン、リン酸カルシウム沈殿法などを含む。現在好ましいインビボ遺伝子移入技術は、ウイルス（典型的にはレトロウイルス）ベクターでの形質移入及びウイルス被覆タンパク質−リポソーム媒介形質移入である（Ｄｚａｕら， Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １１， ２０５−２１０（１９９３））。幾つかの状況では、核酸供給源を、細胞表面膜タンパク質又は標的細胞に特異的な抗体、標的細胞上のレセプターに対するリガンド等の標的細胞を標的化する薬剤とともに提供するのが望ましい。リポソームを用いる場合、エンドサイトーシスを伴う細胞表面膜タンパク質に結合するタンパク質、例えば、特定の細胞型向性のキャプシドタンパク質又はその断片、サイクルにおいて内部移行を受けるタンパク質に対する抗体、細胞内局在化を標的とし細胞内半減期を向上させるタンパク質が、標的化及び／又は取り込みの促進のために用いられる。レセプター媒介エンドサイトーシスは、例えば、Ｗｕら， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６２， ４４２９−４４３２ （１９８７）； 及びＷａｇｎｅｒら， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８７， ３４１０−３４１４ （１９９０）によって記述されている。遺伝子作成及び遺伝子治療のプロトコールの概説については、Ａｎｄｅｒｓｏｎら， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５６， ８０８−８１３ （１９９２）を参照のこと。
【００９０】
ここに記載したＰＲＯ２３２０３ポリペプチドをタンパク質電気泳動目的の分子量マーカーとして用いてもよい。
ここに記載したＰＲＯ２３２０３ポリペプチド又はその断片をコードする核酸分子は、染色体の同定に有用である。この点において、実際の配列データに基づく染色体マーキング試薬は殆ど利用可能ではないため、新規な染色体マーカーの同定が必要である。本発明の各ＰＲＯ２３２０３核酸分子は染色体マーカーとして使用できる。
また、本発明のＰＲＯ２３２０３ポリペプチド及び核酸分子は組織タイピングに使用でき、本発明のＰＲＯ２３２０３ポリペプチドは、同じ型の正常組織に比較して疾患性組織において、一方の組織で他方に比較して異なる発現をする。ＰＲＯ２３２０３核酸分子には、ＰＣＲ、ノーザン分析、サザン分析及びウェスタン分析のプローブ生成のための用途が見出されるであろう。
【００９１】
ここに記載したＰＲＯ２３２０３ポリペプチドは治療薬として用いてもよい。本発明のＰＲＯ２３２０３ポリペプチドは、薬学的に有用な組成物を調製するのに知られた方法に従って製剤され、これにより、このＰＲＯ２３２０３生成物は薬学的に許容される担体媒体と混合される。治療用製剤は、凍結乾燥された製剤又は水性溶液の形態で、任意的な製薬上許容可能なキャリア、賦形剤又は安定剤と、所望の精製度を有する活性成分とを混合することにより（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， １６ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｏｓｏｌ， Ａ． Ｅｄ．， ［１９８０］）、調製され保管される。許容される担体、賦形剤又は安定剤は、用いる投与量及び濃度ではレシピエントに対して無毒性であり、リン酸、クエン酸及び他の有機酸等の緩衝液；アスコルビン酸を含む抗酸化剤；低分子量（残基数１０個未満）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン又は免疫グロブリン等のタンパク質；ポリビニルピロリドン等の親水性重合体；グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン又はリジン等のアミノ酸；グルコース、マンノース又はデキストリン等の単糖類、二糖類又は他の炭水化物；ＥＤＴＡ等のキレート剤；マンニトール又はソルビトール等の糖アルコール；ナトリウム等の塩形成対イオン；及び／又はＴＷＥＥＮ（商品名）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商品名）又はＰＥＧ等の非イオン性界面活性剤を含む。
【００９２】
インビボ投与に使用される製剤は滅菌されていなくてはならない。これは、凍結乾燥及び再構成の前又は後に、滅菌フィルター膜を通す濾過により容易に達成される。
ここで、本発明の製薬組成物は一般に、無菌のアクセスポートを具備する容器、例えば、皮下注射針で貫通可能なストッパーを持つ静脈内バッグ又はバイアル内に配される。
投与経路は周知の方法、例えば、静脈内、腹膜内、脳内、筋肉内、眼内、動脈内又は病巣内経路での局所投与などの注射又は注入、又は徐放系による。
本発明の製薬組成物の用量及び望ましい薬物濃度は、意図する特定の用途に応じて変化する。適切な用量又は投与経路の決定は、通常の内科医の技量の範囲内である。動物実験は、ヒト治療のための有効量の決定についての信頼できる指針を提供する。有効量の種間スケーリングは、Ｔｏｘｉｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｎｅｗ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ， Ｙａｃｏｂｉら， 編， Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ １９８９， ｐｐ． ４２−９６のＭｏｒｄｅｎｔｉ， Ｊ． 及びＣｈａｐｐｅｌｌ， Ｗ． 「Ｔｈｅ ｕｓｅ ｏｆ ｉｎｔｅｒｓｐｅｃｉｅｓ ｓｃａｌｉｎｇ ｉｎ ｔｏｘｉｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ」に記載された原理に従って実施できる。
【００９３】
ＰＲＯ２３２０３ポリペプチド又はそのアゴニスト又はアンタゴニストのインビボ投与が用いられる場合、正常な投与量は、投与経路に応じて、哺乳動物の体重当たり１日に約１０ ｎｇ／ｋｇから１００ ｍｇ／ｋｇまで、好ましくは約１μｇ／ｋｇ／日から１０ ｍｇ／ｋｇ／日である。特定の用量及び輸送方法の指針は文献に与えられている；例えば、米国特許第４，６５７，７６０号、第５，２０６，３４４号、又は第５，２２５，２１２号参照。異なる製剤が異なる治療用化合物及び異なる疾患に有効であること、例えば一つの器官又は組織を標的とする投与には、他の器官又は組織とは異なる方式で輸送することが必要であることが予想される。
ＰＲＯ２３２０３ポリペプチドの投与を必要とする任意の疾患又は疾病の治療に適した放出特性を持つ製剤でＰＲＯ２３２０３ポリペプチドの持続放出が望まれる場合、ＰＲＯ２３２０３ポリペプチドのマイクロカプセル化が考えられる。持続放出のための組換えタンパク質のマイクロカプセル化は、ヒト成長ホルモン（ｒｈＧＨ）、インターフェロン−（ｒｈＩＦＮ−）、インターロイキン−２、及びＭＮ ｒｇｐ１２０で成功裏に実施されている。Ｊｏｈｎｓｏｎら， Ｎａｔ． Ｍｅｄ．， ２： ７９５−７９９ （１９９６）； Ｙａｓｕｄａ， Ｂｉｏｍｅｄ． Ｔｈｅｒ．， ２７： １２２１−１２２３ （１９９３）； Ｈｏｒａら， Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， ８： ７５５−７５８ （１９９０）； Ｃｌｅｌａｎｄ， 「Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｉｎｇｌｅ Ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ Ｖａｃｃｉｎｅｓ Ｕｓｉｎｇ Ｐｏｌｙｌａｃｔｉｄｅ Ｐｏｌｙｇｌｙｃｏｌｉｄｅ Ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ」Ｖａｃｃｉｎｅ Ｄｅｓｉｇｎ： Ｔｈｅ Ｓｕｂｕｎｉｔ ａｎｄ Ａｄｊｕｖａｎｔ Ａｐｐｒｏａｃｈ， Ｐｏｗｅｌｌ 及び Ｎｅｗｍａｎ編， （Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ： Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９９５）， ｐ．４３９−４６２； ＷＯ９７／０３６９２， ＷＯ９６／４００７２， ＷＯ９６／０７３９９；及び米国特許第５，６５４，０１０号。
【００９４】
これらのタンパク質の持続放出製剤は、ポリ−乳酸−グリコール酸（ＰＬＧＡ）コポリマーを用い、その生体適合性及び広範囲の生分解特性に基づいて開発された。ＰＬＧＡの分解生成物である乳酸及びグリコール酸は、ヒト身体内で即座にクリアされる。さらに、このポリマーの分解性は、分子量及び組成に依存して数ヶ月から数年まで調節できる。Ｌｅｗｉｓ， 「Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｒｅｌｅａｓｅ ｏｆ ｂｉｏａｃｔｉｖｅ ａｇｅｎｔｓ ｆｒｏｍ ｌａｃｔｉｄｅ／ｇｌｙｃｏｌｉｄｅ ｐｏｌｙｍｅｒ」： Ｍ． Ｃｈａｓｉｎ及び Ｒ． Ｌａｎｇｅｒ （編）， Ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ ａｓ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ （Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ： Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９９０）， ｐｐ． １−４１。
本発明は、ＰＲＯ２３２０３ポリペプチドに類似する（アゴニスト）又はＰＲＯ２３２０３ポリペプチドの効果を阻害する（アンタゴニスト）ものを同定するための化合物のスクリーニング方法も包含する。アンタゴニスト候補薬のスクリーニングアッセイは、ここに同定した遺伝子にコードされるＰＲＯ２３２０３ポリペプチドと結合又は複合体形成する化合物、又は他にコード化ポリペプチドの他の細胞性タンパク質との相互作用を阻害する化合物を同定するために設計される。このようなスクリーニングアッセイは、それを特に小分子候補薬の同定に適したものにする、化学的ライブラリーのハイスループットスクリーニングに適用可能なアッセイを含む。
該アッセイは、タンパク質−タンパク質結合アッセイ、生化学的スクリーニングアッセイ、イムノアッセイ、及び細胞ベースのアッセイで、この分野で知られたものを含む種々の方式で実施される。
アンタゴニストについての全てのアッセイは、それらが候補薬をここで同定された核酸にコードされるＰＲＯ２３２０３ポリペプチドと、これら２つの成分が相互作用するのに十分な条件下及び時間で接触させることを必要とすることにおいて共通する。
【００９５】
結合アッセイにおいて、相互作用は結合であり、形成された複合体は単離されるか、又は反応混合物中で検出される。特別な実施態様では、ここに同定された遺伝子にコードされるＰＲＯ２３２０３ポリペプチド又は候補薬が、共有又は非共有結合により固相、例えばマイクロタイタープレートに固定化される。非共有結合は、一般的に固体表面をＰＲＯ２３２０３ポリペプチドの溶液で被覆し乾燥させることにより達成される。あるいは、固定化されるＰＲＯ２３２０３ポリペプチドに特異的な固定化抗体、例えばモノクローナル抗体を、それを固体表面に固着させるために用いることができる。アッセイは、固定化成分、例えば固着成分を含む被覆表面に、検出可能な標識で標識されていてもよい非固定化成分を添加することにより実施される。反応が完了したとき、未反応成分を例えば洗浄により除去し、固体表面に固着した複合体を検出する。最初の非固定化成分が検出可能な標識を有している場合、表面に固定化された標識の検出は複合体形成が起こったことを示す。最初の非固定化成分が標識を持たない場合は、複合体形成は、例えば、固定化された複合体に特異的に結合する標識抗体によって検出できる。
【００９６】
候補化合物が相互作用するがここに同定した遺伝子にコードされる特定のＰＲＯ２３２０３ポリペプチドに結合しない場合、そのポリペプチドとの相互作用は、タンパク質−タンパク質相互作用を検出するために良く知られている方法によってアッセイすることができる。そのようなアッセイは、架橋、同時免疫沈降、及び勾配又はクロマトグラフィーカラムを通す同時精製などの伝統的な手法を含む。さらに、タンパク質−タンパク質相互作用は、Ｃｈｅｖｒａｙ及びＮａｔｈａｎｓ［Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８９， ５７８９−５７９３ （１９９１）］に開示されているように、Ｆｉｅｌｄｓ及び共同研究者ら［Ｆｉｅｌｄｓ及びＳｏｎｇ， Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ） ３４０， ２４５−２４６ （１９８９）； Ｃｈｉｅｎら， Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８８， ９５７８−９５８２ （１９９１）］に記載された酵母ベースの遺伝子系を用いることによってモニターすることができる。酵母ＧＡＬ４などの多くの転写活性化剤は、２つの物理的に別個のモジュラードメインからなり、一方はＤＮＡ結合ドメインとして作用し、他方は転写活性化ドメインとして機能する。前出の文献に記載された酵母発現系（一般に「２−ハイブリッド系」と呼ばれる）は、この特性の長所を利用し、並びに２つのハイブリッドタンパク質を用い、一方では標的タンパク質がＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメインに融合し、他方では候補となる活性化タンパク質が活性化ドメインに融合している。ＧＡＬ１−ｌａｃＺリポーター遺伝子のＧＡＬ４活性化プロモーターの制御下での発現は、タンパク質−タンパク質相互作用を介したＧＡＬ４活性の再構成に依存する。相互作用するポリペプチドを含むコロニーは、β−ガラクトシダーゼに対する色素生産性基質で検出される。２−ハイブリッド技術を用いた２つの特定なタンパク質間のタンパク質−タンパク質相互作用を同定するための完全なキット（ＭＡＴＣＨＭＡＫＥＲ（商品名））は、Ｃｌｏｎｔｅｃｈから商業的に入手可能である。また、この系は、特定のタンパク質相互作用に含まれるタンパク質ドメインのマッピング、並びにこれら相互作用にとって重要なアミノ酸残基の特定へ拡大適用することができる。
【００９７】
ここで同定されたＰＲＯ２３２０３ポリペプチドをコードする遺伝子と細胞内又は細胞外成分との相互作用を阻害する化合物は、次のように試験できる：通常、反応混合物は、遺伝子産物と細胞外又は細胞内成分を、これら２つの生成物の相互作用及び結合が可能な条件下及び時間に渡って含むように調製される。候補化合物が結合を阻害する能力を試験するために、反応は試験化合物の不存在及び存在下で実施される。さらに、プラシーボを第３の反応混合物に添加してポジティブコントロールを提供してもよい。混合物中に存在する試験化合物と細胞内又は細胞外成分との結合（複合体形成）は上記のようにモニターされる。試験化合物を含有する反応混合物ではなく、コントロール反応における複合体の形成は、試験化合物が、遺伝子産物であるＰＲＯ２３２０３ポリペプチドとその結合パートナーとの相互作用を阻害することを示す。
【００９８】
アンタゴニストをアッセイするためには、特定の活性についてスクリーニングされる化合物とともにＰＲＯ２３２０３ポリペプチドを細胞へ添加してもよく、ＰＲＯ２３２０３ポリペプチド存在下における対象活性を阻害する化合物の能力は、化合物がＰＲＯ２３２０３ポリペプチドのアンタゴニストであることを示す。あるいは、ＰＲＯ２３２０３ポリペプチドと膜結合ＰＲＯ２３２０３ポリペプチドレセプター又は組換えレセプターを有する潜在的アンタゴニストを競合的阻害アッセイに適した条件下で結合させることによって、アンタゴニストを検出してもよい。放射活性などでＰＲＯ２３２０３ポリペプチドを標識することが可能であり、潜在的アンタゴニストの有効性を判断するためにレセプターに結合したＰＲＯ２３２０３ポリペプチド分子の数を利用することができる。レセプターをコードする遺伝子は、当業者に知られた多くの方法、例えばリガンドパンニング及びＦＡＣＳソートによって同定できる。Ｃｏｌｉｇａｎら， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎ．， １（２）： 第５章（１９９１）。好ましくは、発現クローニングが用いられ、ポリアデニル化ＲＮＡがＰＲＯ２３２０３ポリペプチドに反応性の細胞から調製され、このＲＮＡから生成されたｃＤＮＡライブラリーがプールに分配され、ＣＯＳ細胞又はＰＲＯ２３２０３ポリペプチドに対して反応性ではない他の細胞の形質移入に使用される。スライドガラスで増殖させた形質移入細胞を、標識したＰＲＯ２３２０３ポリペプチドで暴露する。このＰＲＯ２３２０３ポリペプチドは、ヨウ素化又は部位特異的タンパク質キナーゼの認識部位の封入を含む種々の手段で標識できる。固定及びインキュベーションの後、スライドにオートラジオグラフィ分析を施す。ポジティブプールを同定し、相互作用サブプール化及び再スクリーニング工程を用いてサブプールを調製して再形質移入し、最終的に推定レセプターをコードする単一のクローンを生成する。
【００９９】
レセプター同定の代替的方法として、標識ＰＲＯ２３２０３ポリペプチドをレセプター分子を発現する細胞膜又は抽出調製物に光親和性結合させることができる。架橋材料をＰＡＧＥで分離し、Ｘ線フィルムへ暴露する。レセプターを含む標識複合体を切り出し、ペプチド断片へ分解し、タンパク質マイクロ配列決定を施すことができる。マイクロ配列決定から得たアミノ酸配列は、推定レセプターをコードする遺伝子を同定するｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングする縮重オリゴヌクレオチドプローブの一組の設計に用いられる。
アンタゴニストの他のアッセイでは、レセプターを発現する哺乳動物細胞又は膜調製物を、候補化合物の存在下で標識ＰＲＯ２３２０３ポリペプチドとともにインキュベートする。次いで、この相互作用を促進又は阻止する化合物の能力を測定する。
潜在的なアンタゴニストのより特別な例は、免疫グロブリンとＰＲＯ２３２０３ポリペプチドとの融合体に結合するオリゴヌクレオチド、特に、限定しないが、ポリ−及びモノクローナル抗体及び抗体断片、一本鎖抗体、抗−イディオタイプ抗体、及びこれらの抗体又は断片のキメラ又はヒト化形態、並びにヒト抗体及び抗体断片を含む抗体を含んでいる。あるいは、潜在的アンタゴニストは、密接に関連したタンパク質、例えば、レセプターを認識するが効果を与えず、従ってＰＲＯ２３２０３ポリペプチドの作用を競合的に阻害するＰＲＯ２３２０３ポリペプチドの変異形態であってもよい。
【０１００】
他の潜在的なＰＲＯ２３２０３ポリペプチドアンタゴニストは、アンチセンス技術を用いて調製されたアンチセンスＲＮＡ又はＤＮＡ構築物であり、例えば、アンチセンスＲＮＡ又はＤＮＡ分子は、標的ｍＲＮＡにハイブリッド形成してタンパク質翻訳を妨害することによりｍＲＮＡの翻訳を直接阻止するように作用する。アンチセンス技術は、トリプルへリックス形成又はアンチセンスＤＮＡ又はＲＮＡを通して遺伝子発現を制御するのに使用でき、それらの方法はともに、ポリヌクレオチドのＤＮＡ又はＲＮＡへの結合に基づく。例えば、ここでの成熟ＰＲＯ２３２０３ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列の５’コード化部分は、約１０から４０塩基対長のアンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドの設計に使用される。ＤＮＡオリゴヌクレオチドは、転写に含まれる遺伝子の領域に相補的であるように設計され（トリプルへリックス−Ｌｅｅら， Ｎｕｃｌ， Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．， ６： ３０７３ （１９７９）； Ｃｏｏｎｅｙら， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２４１： ４５６ （１９８８）； Ｄｅｒｖａｎら， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２５１： １３６０ （１９９１）参照）、それによりＰＲＯ２３２０３ポリペプチドの転写及び生成を防止する。アンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドはインビボでｍＲＮＡにハイブリッド形成してｍＲＮＡ分子のＰＲＯ２３２０３ポリペプチドへの翻訳を阻止する（アンチセンス−Ｏｋａｎｏ， Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．， ５６： ５６０ （１９９１）； Ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｓ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ （ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ： Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ， ＦＬ， １９８８））。上記のオリゴヌクレオチドは、細胞に輸送され、アンチセンスＲＮＡ又はＤＮＡをインビボで発現させて、ＰＲＯ２３２０３ポリペプチドの生産を阻害することもできる。アンチセンスＤＮＡが用いられる場合、翻訳開始部位、例えば標的遺伝子ヌクレオチド配列の−１０から＋１０位置の間から誘導されるオリゴデオキシリボヌクレオチドが好ましい。
【０１０１】
潜在的アンタゴニストは、ＰＲＯ２３２０３ポリペプチドの活性部位、レセプター結合部位、又は成長因子又は他の関連結合部位に結合し、それによりＰＲＯ２３２０３ポリペプチドの正常な生物学的活性を阻止する小分子を含む。小分子の例は、これらに限られないが、小型ペプチド又はペプチド様分子、好ましくは可溶性ペプチド、及び合成非ペプチジル有機又は無機化合物を含む。
リボザイムは、ＲＮＡの特異的切断を触媒できる酵素的ＲＮＡ分子である。リボザイムは、相補的標的ＲＮＡへの配列特異的ハイブリッド形成、次いで内ヌクレオチド結合分解性切断により作用する。潜在的ＲＮＡ標的内の特異的リボザイム切断部位は、既知の技術で同定できる。更なる詳細は、例えば、上掲のＲｏｓｓｉ， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｂｉｏｌｏｇｙ ４：４６９−４７１ （１９９４）及びＰＣＴ公報番号、ＷＯ９７／３３５５１（１９９７年９月１８日公開）を参照。
【０１０２】
転写阻害に用いられるトリプルヘリックス形成における核酸分子は一本鎖でデオキシヌクレオチドからなる。これらのオリゴヌクレオチドの基本組成は、フーグスチン塩基対則を介するトリプルヘリックス形成を促進するように設計され、それは一般に二重鎖の一方の鎖上のプリン又はピリミジンの相当量の伸展を必要とする。さらなる詳細は、例えば、ＰＣＴ公報番号、ＷＯ９７／３３５５１、上掲を参照。
これらの小分子は、上記で検討したスクリーニングアッセイの１つ又は複数の任意のものにより及び／又は当業者に良く知られた他の任意のスクリーニング技術により同定できる。
ＰＲＯ２３２０３ポリペプチド、それらのコード化核酸、及び抗−ＰＲＯ２３２０３抗体に関する潜在的な使用は、前立腺組織由来の腫瘍の検出及び／又は治療におけるものである。
【０１０３】
Ｆ．抗−ＰＲＯ２３２０３抗体
本発明は、さらに抗−ＰＲＯ２３２０３抗体を提供するものである。抗体の例としては、ポリクローナル、モノクローナル、ヒト化、二重特異性及びヘテロコンジュゲート抗体が含まれる。
また、本発明の抗−ＰＵＭＰＣｎ抗体は、種々の非治療的な適用をも有する。前立腺癌をスクリーニングし、診断するためのツールとしてのＰＳＡの使用は、議論の余地があるという事実に鑑み、本発明の抗−ＰＵＭＰＣｎ抗体は、ＰＵＭＰＣｎ発現癌の診断及び進行度の判断（例えば、放射線画像診断において）に関し有用である。また、この抗体は、細胞からＰＵＭＰＣｎの精製又は免疫沈降、エライザ又はウェスタンブロットなどのインビトロにおけるＰＵＭＰＣｎの検出及び定量、他の細胞の精製におけるステップとして混合された細胞の集団からＰＵＭＰＣｎを発現する細胞を殺傷し、除去するためにも有用である。
本発明の抗−ＰＵＭＰＣｎ抗体は哺乳動物におけるＰＵＭＰＣｎ発現癌を治療し、又は一又複数の癌の症状を緩和するために有用である。前記癌には、例えば前立腺癌転移などの転移性癌が含まれる。該抗体は、哺乳動物細胞中でＰＵＭＰＣｎを発現する癌細胞の少なくとも一部に結合することが可能で、好ましくはＨＡＭＡ応答を誘起しないか又は最小限に抑えるものである。好ましい実施態様においては、抗体は、細胞上のＰＵＭＰＣｎと結合して、インビトロ又はインビボにおいて、ＰＵＭＰＣｎを発現する腫瘍細胞を破壊又は殺傷し、そのような腫瘍細胞の増殖を阻害する。そのような抗体には、そのままの形態の抗−ＰＵＭＰＣｎ抗体（特定の薬剤を結合していない）が含まれる。細胞障害性又は細胞増殖阻害性を持つそのままの形態の抗体は、腫瘍細胞破壊において、抗体をさらに有効にする細胞障害性剤と共に利用することができる。抗−ＰＵＭＰＣｎ抗体に対して、細胞障害性は、後述するような免疫コンジュゲートを形成するために細胞障害性剤を抗体に結合させることにより与えられる。細胞障害性剤又は増殖阻害剤は、好ましくは小分子である。カリケアマイシン又はメイタンシノイド及びそれらの類似体又は誘導体が好ましい。
【０１０４】
本発明は、本発明の抗−ＰＵＭＰＣｎ抗体及び担体を含んで成る組成物を提供する。癌の治療目的のために、そのような治療を必要としている患者に対し該組成物を投与することができ、該組成物は、免疫コンジュゲート又はそのままの形態で存在する一又は複数の抗−ＰＵＭＰＣｎ抗体を含み得る。さらなる実施態様において、該組成物は化学療法剤を含む細胞障害性又は増殖阻害剤などの他の治療剤と組合わせてこれらの抗体を含み得る。また、本発明は、本発明の抗−ＰＵＭＰＣｎ抗体及び担体を含んでなる製剤も提供する。一実施態様において、製剤は薬学的に受容可能な坦体を含む治療剤である。
【０１０５】
１．ポリクローナル抗体
抗−ＰＲＯ２３２０３抗体はポリクローナル抗体を含む。ポリクローナル抗体の調製方法は当業者に知られている。哺乳動物においてポリクローナル抗体は、例えば免疫剤、及び所望するのであればアジュバントを、１つ又は複数回注射することで発生させることができる。典型的には、免疫剤及び／又はアジュバントを複数回皮下又は腹腔内注射により、哺乳動物に注射する。免疫剤は、ＰＲＯ２３２０３ポリペプチド又はその融合タンパク質を含みうる。免疫剤を免疫化された哺乳動物において免疫原性が知られているタンパク質に抱合させるのが有用である。このような免疫原タンパク質の例は、これらに限られないが、キーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシサイログロブリン及び大豆トリプシンインヒビターが含まれる。使用され得るアジュバントの例には、フロイント完全アジュバント及びＭＰＬ−ＴＤＭアジュバント（モノホスホリル脂質Ａ、合成トレハロースジコリノミコラート）が含まれる。免疫化プロトコールは、過度の実験なく当業者により選択されるであろう。
【０１０６】
２．モノクローナル抗体
あるいは、抗−ＰＲＯ２３２０３抗体はモノクローナル抗体であってもよい。モノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎ， Ｎａｔｕｒｅ， ２５６：４９５ （１９７５）に記載されているようなハイブリドーマ法を使用することで調製することができる。ハイブリドーマ法では、マウス、ハムスター又は他の適切な宿主動物を典型的には免疫剤により免疫化することで、免疫剤に特異的に結合する抗体を生成するか或いは生成可能なリンパ球を誘発する。あるいは、リンパ球をインビトロで免疫化することもできる。
免疫剤は、典型的には対象とするＰＲＯ２３２０３ポリペプチド又はその融合タンパク質を含む。一般にヒト由来の細胞が望まれる場合には末梢血リンパ球（「ＰＢＬｓ」）が使用され、あるいは非ヒト哺乳動物源が望まれている場合は、脾臓細胞又はリンパ節細胞が使用される。次いで、ポリエチレングリコール等の適当な融合剤を用いてリンパ球を不死化株化細胞と融合させ、ハイブリドーマ細胞を形成する［Ｇｏｄｉｎｇ， Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， （１９８６） ｐｐ． ５９−１０３］。不死化株化細胞は、通常は、形質転換した哺乳動物細胞、特に齧歯動物、ウシ、及びヒト由来の骨髄腫細胞である。通常、ラット又はマウスの骨髄腫株化細胞が使用される。ハイブリドーマ細胞は、好ましくは、未融合の不死化細胞の生存又は増殖を阻害する一又は複数の物質を含有する適切な培地で培養される。例えば、親細胞が、酵素のヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴ又はＨＰＲＴ）を欠いていると、ハイブリドーマの培地は、典型的には、ヒポキサチン、アミノプテリン及びチミジンを含み（「ＨＡＴ培地」）、この物質がＨＧＰＲＴ欠乏性細胞の増殖を阻止する。
【０１０７】
好ましい不死化株化細胞は、効率的に融合し、選択された抗体生成細胞による安定した高レベルの抗体発現を支援し、ＨＡＴ培地のような培地に対して感受性である。より好ましい不死化株化細胞はマウス骨髄腫株であり、これは例えばカリフォルニア州サンディエゴのＳａｌｋ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｃｅｌｌ Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ Ｃｅｎｔｅｒやヴァージニア州マナッサスのアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションより入手可能である。ヒトモノクローナル抗体を生成するためのヒト骨髄腫及びマウス−ヒト異種骨髄腫株化細胞も開示されている［Ｋｏｚｂｏｒ， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， １３３：３００１ （１９８４）、Ｂｒｏｄｅｕｒら， Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ， Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ， Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， （１９８７） ｐｐ． ５１−６３］。
次いでハイブリドーマ細胞が培養される培養培地を、ＰＲＯ２３２０３に対するモノクローナル抗体の存在について検定する。好ましくは、ハイブリドーマ細胞によって生成されたモノクローナル抗体の結合特異性は免疫沈降又はラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）や酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）等のインビトロ結合検定法によって測定する。このような技術及びアッセイは、当該分野において公知である。モノクローナル抗体の結合親和性は、例えばＭｕｎｓｏｎ及びＰｏｌｌａｒｄ， Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， １０７：２２０ （１９８０）によるスキャッチャード解析法によって測定することができる。
【０１０８】
所望のハイブリドーマ細胞が同定された後、クローンを限界希釈法によりサブクローニングし、標準的な方法で増殖させることができる［Ｇｏｄｉｎｇ， 上掲］。この目的のための適当な培地には、例えば、ダルベッコの改変イーグル培地及びＲＰＭＩ−１６４０倍地が含まれる。あるいは、ハイブリドーマ細胞は哺乳動物においてインビボで腹水として増殖させることもできる。
サブクローンによって分泌されたモノクローナル抗体は、例えばプロテインＡ−セファロース法、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー法、ゲル電気泳動法、透析法又はアフィニティークロマトグラフィー等の従来の免疫グロブリン精製方法によって培養培地又は腹水液から単離又は精製される。
【０１０９】
また、モノクローナル抗体は、組換えＤＮＡ法、例えば米国特許第４，８１６，５６７号に記載された方法により作成することができる。本発明のモノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、常套的な方法を用いて（例えば、マウス抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合可能なオリゴヌクレオチドプローブを使用して）、容易に単離し配列決定することができる。本発明のハイブリドーマ細胞はそのようなＤＮＡの好ましい供給源となる。ひとたび単離されたら、ＤＮＡは発現ベクター内に配することができ、これが宿主細胞、例えばサルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、あるいは免疫グロブリンタンパク質を生成等しない骨髄腫細胞内に形質移入され、組換え宿主細胞内でモノクローナル抗体の合成をすることができる。また、ＤＮＡは、例えば相同マウス配列に換えてヒト重鎖及び軽鎖定常ドメインのコード配列を置換することにより［米国特許第４，８１６，５６７号；Ｍｏｒｒｉｓｏｎら， 上掲］、又は免疫グロブリンコード配列に非免疫グロブリンポリペプチドのコード配列の一部又は全部を共有結合することにより修飾することができる。このような非免疫グロブリンポリペプチドは、本発明の抗体の定常ドメインに置換でき、あるいは本発明の抗体の１つの抗原結合部位の可変ドメインに置換でき、キメラ性二価抗体を生成する。
【０１１０】
抗体は一価抗体であってもよい。一価抗体の調製方法は当該分野においてよく知られてる。例えば、一つの方法は免疫グロブリン軽鎖と修飾重鎖の組換え発現を含む。重鎖は一般的に、重鎖の架橋を防止するようにＦｃ領域の任意の点で切断される。あるいは、関連するシステイン残基を他のアミノ酸残基で置換するか欠失させて架橋を防止する。
また、一価抗体の調製にはインビトロ法が適している。抗体の消化による、その断片、特にＦａｂ断片の生成は、当該分野において知られている慣用的技術を使用して達成できる。
【０１１１】
３．ヒト及びヒト化抗体
非ヒト抗体をヒト化する方法は、当該技術分野において周知である。通常、ヒト化抗体は、非ヒトのソースから導入される一又は複数のアミノ酸残基を有する。こららの非ヒトアミノ酸残基は、しばしば「移入」残基と称され、典型的には「移入」可変ドメインから得られる。ヒト化は、本質的にＷｉｎｔｅｒ及びその共同研究者［Ｊｏｎｅｓ等， Ｎａｔｕｒｅ， ３２１：５２２−５２５ （１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ等， Ｎａｔｕｒｅ， ３２２：３２３−３２７ （１９８８）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ等， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２３９：１５３４−１５３６ （１９８８）］の方法に従い、齧歯類のＣＤＲ又はＣＤＲ配列で対応するヒト抗体の配列と置換することにより実施することができる。従って、そのような「ヒト化」抗体はキメラ抗体であり（米国特許第４，８１６，５６７号）実質的にヒト可変ドメインそのものが対応する非ヒト種由来の配列で置換されているわけではない。実際には、ヒト化抗体は、典型的に幾つかのＣＤＲ残基及びおそらく幾つかのＦＲ残基が齧歯類抗体の類似部位由来の残基によって置換されているヒト抗体である。
【０１１２】
本発明の抗−ＰＲＯ２３２０３抗体は、さらにヒト化抗体又はヒト抗体を含む。非ヒト（例えばマウス）抗体のヒト化形とは、キメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖あるいはその断片（例えばＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（抗体’）２あるいは抗体の他の抗原結合サブ配列）であって、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含むものである。ヒト化抗体はレシピエントの相補性決定領域（ＣＤＲ）の残基が、マウス、ラット又はウサギのような所望の特異性、親和性及び能力を有する非ヒト種（ドナー抗体）のＣＤＲの残基によって置換されたヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）を含む。幾つかの例では、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク残基は、対応する非ヒト残基によって置換されている。また、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にも、移入されたＣＤＲもしくはフレームワーク配列にも見出されない残基を含んでいてもよい。一般に、ヒト化抗体は、全てあるいはほとんど全てのＣＤＲ領域が非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、全てあるいはほとんど全てのＦＲ領域がヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のものである、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの全てを実質的に含む。ヒト化抗体は、最適には免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）、典型的にはヒトの免疫グロブリンの定常領域の少なくとも一部を含んでなる［Ｊｏｎｅｓら， Ｎａｔｕｒｅ， ３２１：５２２−５２５ （１９８６）； Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら， Ｎａｔｕｒｅ， ３３２：３２３−３２９ （１９８８）； 及びＰｒｅｓｔａ， Ｃｕｒｒ． Ｏｐ Ｓｔｒｕｃｔ． Ｂｉｏｌ．， ２：５９３−５９６ （１９９２）］。
【０１１３】
抗体がヒトの治療用途を意図している場合、抗原性及びＨＡＭＡ反応（ヒト抗−マウス抗体）を低減するには、ヒト化抗体を生成する際に使用するヒトの軽重両方の可変ドメインの選択が非常に重要である。いわゆる「ベストフィット」法では、齧歯動物抗体の可変ドメインの配列を既知のヒト可変ドメイン配列のライブラリー全体に対してスクリーニングする。次に齧歯動物のものと最も近いヒトＶドメイン配列を同定し、ヒト化抗体のヒトフレームワーク領域（ＦＲ）として受け入れる（Ｓｉｍｓほか， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， １５１：２２９６ （１９９３）；Ｃｈｏｔｈｉａら， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， １９６：９０１（１９８７））。他の方法では、軽又は重鎖の特定のサブグループのヒト抗体全てのコンセンサス配列から誘導される特定のフレームワーク領域を使用する。同じフレームワークをいくつかの異なるヒト化抗体に使用できる（Ｃａｒｔｅｒほか， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８９：４２８５ （１９９２）；Ｐｒｅｓｔａほか， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， １５１：２６２３（１９９３））。
さらに、抗体を、抗原に対する高親和性や他の好ましい生物学的性質を保持してヒト化することが考慮される。この目標を達成するべく、ある方法に従って、親及びヒト化配列の三次元モデルを使用して、親配列及び様々な概念的ヒト化産物の分析工程を経てヒト化抗体を調製する。三次元免疫グロブリンモデルは一般的に入手可能であり、当業者にはよく知られている。選択された候補免疫グロブリン配列の推定上の三次元立体配座構造を図解し、表示するコンピュータプログラムは購入可能である。これら表示を見ることで、候補免疫グロブリン配列の機能における残基のありそうな役割の分析、すなわち候補免疫グログリンの抗原との結合能力に影響を及ぼす残基の分析が可能になる。このようにして、例えば標的抗原に対する親和性が高まるといった、望ましい抗体特性が達成されるように、ＦＲ残基をレシピエント及び移入配列から選択し、組み合わせることができる。一般的に、高頻度可変領域残基は、直接かつ最も実質的に抗原結合性に影響を及ぼしている。
ヒト化抗−ＰＵＭＰＣｎ抗体の種々の形態が考えられる。例えばヒト化抗体は、免疫コンジュゲートを生成するために１つ又は複数の細胞障害剤（類）と結合していてもよい抗体断片、例えばＦａｂであってもよい。また、ヒト化抗体は無傷抗体、例えば無傷ＩｇＧ１抗体であってもよい。
【０１１４】
また、ヒト抗体は、ファージ表示ライブラリー［Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ及びＷｉｎｔｅｒ， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， ２２７：３８１（１９９１）；Ｍａｒｋｓら， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， ２２２：５８１ （１９９１）］を含むこの分野で知られた種々の方法を用いて作成することもできる。また、Ｃｏｌｅら及びＢｏｅｒｎｅｒらの方法も、ヒトモノクローナル抗体の調製に利用することができる［Ｃｏｌｅら， Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ， Ａｌａｎ Ｒ． Ｌｉｓｓ． ｐ．７７（１９８５）及びＢｏｅｒｎｅｒら， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， １４７（１）：８６−９５（１９９１） ］。同様に、ヒト抗体はヒト免疫グロブリン座位をトランスジェニック動物、例えば内在性免疫グロブリン遺伝子は部分的又は完全に不活性化されたマウスに導入することにより産生することができる。投与の際に、遺伝子再配列、組立、及び抗体レパートリーを含むあらゆる観点においてヒトに見られるものに非常に類似しているヒト抗体の生産が観察される。このアプローチは、例えば米国特許第５，５４５，８０７号；同第５，５４５，８０６号；同第５，５６９，８２５号；同第５，６２５，１２６号；同第５，６３３，４２５号；同第５，６６１，０１６号、及び次の科学文献：Ｍａｒｋｓら， Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０， ７７９−７８３ （１９９２）； Ｌｏｎｂｅｒｇら， Ｎａｔｕｒｅ ３６８ ８５６−８５９ （１９９４）； Ｍｏｒｒｉｓｏｎ， Ｎａｔｕｒｅ ３６８， ８１２−１３ （１９９４）； Ｆｉｓｈｗｉｌｄら， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １４， ８４５−５１ （１９９６）； Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １４， ８２６ （１９９６）； Ｌｏｎｂｅｒｇ及びＨｕｓｚａｒ， Ｉｎｔｅｒｎ． Ｒｅｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １３ ６５−９３ （１９９５）に記載されている。また、ヒト抗体は、インビトロで活性化されたＢ細胞によっても生産される（米国特許第５，５６７，６１０号及び５，２２９，２７５を参照のこと）。
【０１１５】
４．二重特異性抗体
二重特異性抗体は、少なくとも２つの異なる抗原に対して結合特異性を有するモノクローナル抗体、好ましくはヒトもしくはヒト化抗体である。本発明の場合においては、結合特異性の一方はＰＲＯ２３２０３に対してであり、他方は任意の他の抗原、好ましくは細胞表面タンパク質又はレセプター又はレセプターサブユニットに対してである。
二重特異性抗体を作成する方法は当該技術分野において周知である。伝統的には、二重特異性抗体の組換え生産は、二つの重鎖が異なる特異性を持つ二つの免疫グロブリン重鎖／軽鎖対の同時発現に基づく［Ｍｉｌｓｔｅｉｎ及びＣｕｅｌｌｏ， Ｎａｔｕｒｅ， ３０５：５３７−５３９ （１９８３）］。免疫グロブリンの重鎖と軽鎖を無作為に取り揃えるため、これらハイブリドーマ（クアドローマ）は１０種の異なる抗体分子の潜在的混合物を生成し、その内の一種のみが正しい二重特異性構造を有する。正しい分子の精製は、アフィニティークロマトグラフィー工程によって通常達成される。同様の手順が１９９３年５月１３日公開のＷＯ９３／０８８２９、及びＴｒａｕｎｅｃｋｅｒら， ＥＭＢＯ Ｊ．，１０：３６５５−３６５９ （１９９１）に開示されている。
【０１１６】
所望の結合特異性（抗体−抗原結合部位）を有する抗体可変ドメインを免疫グロブリン定常ドメイン配列に融合できる。融合は、好ましくは少なくともヒンジ部、ＣＨ２及びＣＨ３領域の一部を含む免疫グロブリン重鎖定常ドメインとのものである。少なくとも一つの融合には軽鎖結合に必要な部位を含む第一の重鎖定常領域（ＣＨ１）が存在することが望ましい。免疫グロブリン重鎖融合をコードするＤＮＡ、及び望むのであれば免疫グロブリン軽鎖を、別々の発現ベクターに挿入し、適当な宿主生物に同時形質移入する。二重特異性抗体を作成するための更なる詳細については、例えばＳｕｒｅｓｈら， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ， １２１：２１０（１９８６）を参照されたい。
ＷＯ９６／２７０１１に記載された他の方法によれば、一対の抗体分子間の界面を操作して組換え細胞培養から回収されるヘテロダイマーの割合を最大にすることができる。好適な界面は抗体定常ドメインのＣＨ３領域の少なくとも一部を含む。この方法では、第１抗体分子の界面からの１つ又は複数の小さいアミノ酸側鎖がより大きな側鎖（例えばチロシン又はトリプトファン）と置き換えられる。大きな側鎖と同じ又は類似のサイズの相補的「キャビティ」を、大きなアミノ酸側鎖を小さいもの（例えばアラニン又はスレオニン）と置き換えることにより第２の抗体分子の界面に作り出す。これにより、ホモダイマーのような不要の他の最終産物に対してヘテロダイマーの収量を増大させるメカニズムが提供される。
【０１１７】
二重特異性抗体は、全長抗体又は抗体断片（例えば、Ｆ（ａｂ’）２二重特異性抗体）として調製できる。抗体断片から二重特異性抗体を産生する技術もまた文献に記載されている。例えば、化学結合を使用して二重特異性抗体を調製することができる。Ｂｒｅｎｎａｎら，  Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２２９：８１ （１９８５） は無傷の抗体をタンパク分解性に切断してＦ（ａｂ’）２断片を産生する手順を記述している。これらの断片は、ジチオール錯体形成剤亜砒酸ナトリウムの存在下で還元して近接ジチオールを安定化させ、分子間ジスルフィド形成を防止する。産生されたＦａｂ’断片はついでチオニトロベンゾエート（ＴＮＢ）誘導体に転換される。次に、Ｆａｂ’−ＴＮＢ誘導体の一つをメルカプトエチルアミンでの還元によりＦａｂ’−チオールに再転換し、他のＦａｂ’−ＴＮＢ誘導体の等モル量と混合して二重特異性抗体を形成する。作られた二重特異性抗体は酵素の選択的固定化用の薬剤として使用することができる。
大腸菌からＦａｂ’断片を直接回収でき、これは化学的に結合して二重特異性抗体を形成することができる。Ｓｈａｌａｂｙら， Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ．， １７５：２１７−２２５ （１９９２）は完全にヒト化された二重特異性抗体Ｆ（ａｂ’）２分子の製造を記述している。各Ｆａｂ’断片は大腸菌から別個に分泌され、インビトロで定方向化学共役を受けて二重特異性抗体を形成する。このようにして形成された二重特異性抗体は、正常なヒトＴ細胞及びＥｒｂＢ２レセプターを過剰発現する細胞に結合可能で、ヒト乳房腫瘍標的に対するヒト細胞障害性リンパ球の細胞溶解活性の誘因となる。
【０１１８】
組換え細胞培養から直接的に二重特異性抗体断片を作成し分離する様々な方法もまた記述されている。例えば、二重特異性抗体はロイシンジッパーを使用して生産されている。Ｋｏｓｔｅｌｎｙら， Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． １４８（５）：１５４７−１５５３ （１９９２）。Ｆｏｓ及びＪｕｎタンパク質からのロイシンジッパーペプチドを遺伝子融合により二つの異なった抗体のＦａｂ’部分に結合させる。抗体ホモダイマーをヒンジ領域で還元してモノマーを形成し、ついで再酸化して抗体ヘテロダイマーを形成する。この方法はまた抗体ホモダイマーの生産に対して使用することができる。Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒら， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ９０：６４４４−６４４８ （１９９３）により記述された「ダイアボディ」技術は二重特異性抗体断片を作成する別のメカニズムを提供した。断片は、同一鎖上の２つのドメイン間の対形成を可能にするには短かすぎるリンカーにより軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を結合してなる。従って、一つの断片のＶＨ及びＶＬドメインは他の断片の相補的ＶＬ及びＶＨドメインと強制的に対形成させられ、２つの抗原結合部位を形成する。単鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）ダイマーの使用により二重特異性抗体断片を製造する他の方策もまた報告されている。Ｇｒｕｂｅｒら， Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５２：５３６８ （１９９４）を参照されたい。
二価より多い抗体も考えられる。例えば、三重特異性抗体を調製することができる。Ｔｕｔｔら Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． １４７：６０（１９９１）。
【０１１９】
例示的な二重特異性抗体は、ここに与えられたＰＲＯ２３２０３ポリペプチドの２つの異なるエピトープに結合しうる。あるいは、抗−ＰＲＯ２３２０３ポリペプチドのアームは、特定のＰＲＯ２３２０３ポリペプチド発現細胞に細胞防御メカニズムを集中させるように、Ｔ細胞レセプター分子（例えばＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ２８、又はＢ７）等の白血球上のトリガー分子又はＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）及びＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）等のＩｇＧ（ＦｃγＲ）に対するＦｃレセプターに結合するアームと組合わせてもよい。また、二重特異性抗体は特定のＰＲＯ２３２０３ポリペプチドを発現する細胞に細胞障害性薬を局在化させるためにも使用されうる。これらの抗体はＰＲＯ２３２０３結合アーム及び細胞障害性薬又は放射性キレート化剤、例えばＥＯＴＵＢＥ、ＤＰＴＡ、ＤＯＴＡ、又はＴＥＴＡと結合するアームを有する。対象となる他の二重特異性抗体はＰＲＯ２３２０３ポリペプチドに結合し、そしてさらに組織因子（ＴＦ）に結合する。
【０１２０】
５．多価抗体
多価抗体は、抗体が結合する抗原を発現する細胞により、二価抗体よりも早く内部移行（及び／又は異化）されうる。本発明の抗体は、３又はそれ以上の抗原結合部位を有する多価抗体（ＩｇＭクラス以外のもの）であり得（例えば四価抗体）、抗体のポリペプチド鎖をコードする核酸の組換え発現により容易に生成することができる。多価抗体は二量化ドメインと３又はそれ以上の抗原結合部位を有する。好ましい二量化ドメインはＦｃ領域又はヒンジ領域を有する（又はそれらからなる）。このシナリオにおいて、抗体はＦｃ領域と、Ｆｃ領域のアミノ末端に３又はそれ以上の抗原結合部位を有しているであろう。ここで、好ましい多価抗体は３ないし８、好ましくは４の抗原結合部位を有する（又はそれらからなる）。多価抗体は少なくとも１つのポリペプチド鎖（好ましくは２つのポリペプチド鎖）を有し、ポリペプチド鎖（類）は２又はそれ以上の可変ドメインを有する。例えば、ポリペプチド鎖（類）はＶＤ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＤ２−（Ｘ２）ｎ−Ｆｃを有し、ここでＶＤ１は第１の可変ドメインであり、ＶＤ２は第２の可変ドメインであり、ＦｃはＦｃ領域のポリペプチド鎖の一つであり、Ｘ１及びＸ２はアミノ酸又はポリペプチドを表し、ｎは０又は１である。例えば、ポリペプチド鎖（類）は：ＶＨ−ＣＨ１−フレキシブルリンカー−ＶＨ−ＣＨ１−Ｆｃ領域鎖；又はＶＨ−ＣＨ１−ＶＨ−ＣＨ１−Ｆｃ領域鎖を有し得る。ここで多価抗体は、好ましくは少なくとも２つ（好ましくは４つ）の軽鎖可変ドメインポリペプチドをさらに有する。ここで多価抗体は、例えば約２〜約８の軽鎖可変ドメインポリペプチドを有する。ここで考察される軽鎖可変ドメインポリペプチドは軽鎖可変ドメインを有し、場合によってはＣＬドメインをさらに有する。
【０１２１】
６．ヘテロコンジュゲート抗体
ヘテロコンジュゲート抗体もまた本発明の範囲に入る。ヘテロコンジュゲート抗体は、２つの共有結合した抗体からなる。このような抗体は、例えば、免疫系細胞を不要な細胞に対してターゲティングさせるため［米国特許第４，６７６，９８０号］及びＨＩＶ感染の治療のために［ＷＯ９１／００３６０；ＷＯ９２／２００３７３；ＥＰ０３０８９］提案されている。この抗体は、架橋剤に関連したものを含む合成タンパク化学における既知の方法を使用して、インビトロで調製することができると考えられる。例えば、ジスルフィド交換反応を使用するか又はチオエーテル結合を形成することにより、免疫毒素を作成することができる。この目的に対して好適な試薬の例には、イミノチオレート及びメチル−４−メルカプトブチリミデート、及び例えば米国特許第４，６７６，９８０号に開示されたものが含まれる。
【０１２２】
７．エフェクター機能の加工
本発明の抗体を、例えば癌治療における抗体の有効性を向上させるためにエフェクター機能について改変することが望ましい。例えば、システイン残基をＦｃ領域に導入し、それにより、この領域に鎖間ジスルフィド結合を形成するようにしてもよい。そのようにして生成された同種二量体抗体は、向上した内部移行能力及び／又は増加した補体媒介細胞殺傷及び抗体−依存性細胞性細胞障害性（ＡＤＣＣ）を有する可能性がある。Ｃａｒｏｎら， Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １７６： １１９１−１１９５ （１９９２）及びＳｈｏｐｅｓ， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １４８： ２９１８−２９２２ （１９９２）参照。また、向上した抗腫瘍活性を持つ同種二量体抗体は、Ｗｏｌｆｆら， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５３： ２５６０−２５６５ （１９９３）に記載されている異種二官能性架橋を用いて調製することができる。あるいは、抗体は、２つのＦｃ領域を有するように加工して、それにより補体溶解及びＡＤＣＣ能力を向上させることもできる。Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎら， Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ ３： ２１９−２３０ （１９８９）参照。
【０１２３】
８．免疫コンジュゲート
また、本発明は、化学治療薬、毒素（例えば、細菌、真菌、植物又は動物由来の酵素活性毒素、又はその断片）などの細胞障害性薬、あるいは放射性同位体（即ち、放射性コンジュゲート）と抱合している抗体を含む免疫複合体に関する。
このような免疫複合体の生成に有用な化学治療薬を上述した。用いることのできる酵素活性毒素及びその断片には、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合活性断片、（緑膿菌からの）エキソトキシンＡ鎖、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデクシン（ｍｏｄｅｃｃｉｎ）Ａ鎖、α−サルシン、シナアブラギリタンパク質、ジアンチン（ｄｉａｎｔｈｉｎ）タンパク質、ヨウシュヤマゴボウタンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、及びＰＡＰ−Ｓ）、ツルレイシインヒビター、クルシン（ｃｕｒｃｉｎ）、クロチン（ｃｒｏｔｉｎ）、サパオナリア・オフィシナリス（ｓａｐａｏｎａｒｉａ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）インヒビター、ゲロニン（ｇｅｌｏｎｉｎ）、ミトゲリン（ｍｉｔｏｇｅｌｌｉｎ）、レストリクトシン（ｒｅｓｔｒｉｃｔｏｃｉｎ）、フェノマイシン（ｐｈｅｎｏｍｙｃｉｎ）、エノマイシン（ｅｎｏｍｙｃｉｎ）及びトリコテセン（ｔｒｉｃｏｔｈｅｃｅｎｅ）が含まれる。放射性コンジュゲート抗体の生成には、様々な放射性ヌクレオチドが利用可能である。例としては、２１２Ｂｉ、１３１Ｉ、１３１Ｉｎ、９０Ｙ及び１８６Ｒｅが含まれる。
【０１２４】
抗体及び細胞障害性薬の複合体は、種々の二官能性タンパク質カップリング剤、例えば、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオール）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの二官能性誘導体（ジメチルアジピミデートＨＣＬ等）、活性エステル（ジスクシンイミジルスベレート等）、アルデヒド（グルタルアルデヒド等）、ビス−アジド化合物（ビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミン等）、ビス−ジアゾニウム誘導体（ビス−（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）−エチレンジアミン等）、ジイソシアネート（トリエン２，６−ジイソシアネート等）、及びビス−活性フッ素化合物（１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン等）を用いて作成できる。例えば、リシン免疫毒素は、Ｖｉｔｅｔｔａら， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３８： １０９８ （１９８７）に記載されているように調製することができる。カーボン−１４−標識１−イソチオシアナトベンジル−３−メチルジエチレントリアミン五酢酸（ＭＸ−ＤＴＰＡ）は、放射性ヌクレオチドの抗体への抱合のためのキレート剤の例である。ＷＯ９４／１１０２６参照。
他の実施態様では、腫瘍の予備標的化で使用するために、抗体は「レセプター」（ストレプトアビジン等）に抱合されてもよく、抗体−レセプター複合体は患者に投与され、次いで清澄化剤を用いて未結合複合体を循環から除去し、次に細胞障害性薬（例えば、放射性ヌクレオチド等）に抱合された「リガンド」（アビジン等）を投与する。
【０１２５】
メイタンシン及びメイタンシノイド
好ましい一実施態様では、本発明の抗−ＰＵＭＰＣｎ抗体（全長又は断片）は一又は複数のメイタンシノイド分子と結合している。
メイタンシノイドは、チューブリン重合を阻害するように作用する分裂阻害剤である。メイタンシンは、最初、東アフリカシラブＭａｙｔｅｎｕｓ ｓｅｒｒａｔａから単離されたものである（米国特許第３，８９６，１１１号）。その後、ある種の微生物がメイタンシノイド類、例えばメイタンシノール及びＣ−３メイタンシノールエステルを生成することが発見された（米国特許第４，１５１，０４２号）。合成メイタンシノール及びその誘導体及び類似体は、例えば米国特許第４，１３７，２３０号；同４，２４８，８７０号；同４，２５６，７４６号；同４，２６０，６０８号；同４，２６５，８１４号；同４，２９４，７５７号；同４，３０７，０１６号；同４，３０８，２６８号；同４，３０８，２６９号；同４，３０９，４２８号；同４，３１３，９４６号；同４，３１５，９２９号；同４，３１７，８２１号；同４，３２２，３４８号；同４，３３１，５９８号；同４，３６１，６５０号；同４，３６４，８６６号；同４，４２４，２１９号；同４，４５０，２５４号；同４，３６２，６６３号；及び同４，３７１，５３３号に開示されており、その開示は出典を明示してここに取り込まれる。
【０１２６】
抗−ＰＵＭＰＣｎ抗体−メイタンシノイドコンジュゲート（免疫コンジュゲート）
抗−ＰＵＭＰＣｎ抗体−メイタンシノイドコンジュゲートは、抗体又はメイタンシノイド分子のいずれの生物学的活性もほとんど低減することなく、メイタンシノイド分子に抗−ＰＵＭＰＣｎ抗体を化学的に結合させることにより調製される。１分子の毒素／抗体であっても、無傷の抗体の使用において細胞障害性を高めることが予想されているが、抗体分子当たり、平均３−４のメイタンシノイド分子が結合したものは、抗体の機能又は溶解性に悪影響を与えることなく、標的細胞に対する細胞障害性を向上させるといった効力を示す。メイタンシノイドは当該技術分野でよく知られており、公知の技術で合成することも、天然源から単離することもできる。適切なメイタンシノイドは、例えば米国特許第５，２０８，０２０号、及び他の特許、及び上述した非特許文献に開示されている。好ましいメイタンシノイドは、メイタンシノール、及び種々のメイタンシノールエステル等の、メイタンシノール分子の芳香環又は他の位置が修飾されたメイタンシノール類似体である。
例えば、米国特許第５，２０８，０２０号又は欧州特許第０４２５２３５Ｂ１号、及びＣｈａｒｉら， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， ５２：１２７−１３１（１９９２）に開示されているもの等を含む、抗体−メイタンシノイドコンジュゲートを作製するために、当該技術で公知の多くの結合基がある。結合基には、上述した特許に開示されているようなジスルフィド基、チオエーテル基、酸不安定性基、光不安定性基、ペプチターゼ不安定性基、又はエステラーゼ不安定性基が含まれるが、ジスルフィド及びチオエーテル基が好ましい。
【０１２７】
抗体とメイタンシノイドとのコンジュゲートは、種々の二官能性タンパク質カップリング剤、例えばＮ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオナート（ＳＰＤＰ）、スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシラート、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステル類の二官能性誘導体（例えばジメチルアジピミダートＨＣＬ）、活性エステル類（例えば、スベリン酸ジスクシンイミジル）、アルデヒド類（例えば、グルタルアルデヒド）、ビスアジド化合物（例えば、ビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミン）、ビス−ジアゾニウム誘導体（例えば、ビス−（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）エチレンジアミン）、ジイソシアネート（例えば、トリエン−２，６−ジイソシアネート）、及び二活性フッ素化合物（例えば、１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン）を使用して作製することができる。特に好ましいカップリング剤には、ジスルフィド結合のために提供されるＮ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）（Ｃａｒｌｓｓｏｎ等， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｊ． １７３：７２３−７３７［１９７８］）及びＮ−スクシンイミジル−４−（２−ピリジルチオ）ペンタオエート（ＳＰＰ）が含まれる。
リンカーは結合の種類に応じて、種々の位置でメイタンシノイド分子に結合し得る。例えば、従来からのカップリング技術を使用してヒドロキシル基と反応させることによりエステルリンカーを形成することができる。反応はヒドロキシル基を有するＣ−３位、ヒドロキシメチルで修飾されたＣ−１４位、ヒドロキシル基で修飾されたＣ−１５位、及びヒドロキシル基を有するＣ−２０位で生じる。好ましい実施態様において、結合はメイタンシノール又はメイタンシノールの類似体のＣ−３位で形成される。
【０１２８】
カリケアマイシン
対象の他の免疫コンジュゲートには、一又は複数のカリケアマイシン分子と結合した抗−ＰＵＭＰＣｎ抗体が含まれる。抗生物質のカリケアマイシンファミリーはサブ−ピコモルの濃度で二重鎖ＤＮＡの破壊を引き起こすことができる。カリケアマイシンファミリーのコンジュゲートの調製については、米国特許第５，７１２，３７４号、同５，７１４，５８６号、同５，７３９，１１６号、同５，７６７，２８５号、同５，７７０，７０１号、同５，７７０，７１０号、同５，７７３，００１号、同５，８７７，２９６号（全て、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｙａｎａｍｉｄ Ｃｏｍｐａｎｙ）を参照のこと。使用可能なカリケアマイシンの構造類似体には、限定するものではないが、γ１Ｉ、α２Ｉ、α３Ｉ、Ｎ−アセチル−γ１Ｉ、ＰＳＡＧ及びθＩ１（Ｈｉｎｍａｎら， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， ５３：３３３６−３３４２（１９９３）、Ｌｏｄｅら． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， ５８：２９２５−２９２８（１９９８）及び上述したＡｍｅｒｉｃａｎ Ｃｙａｎａｍｉｄの米国特許）が含まれる。抗体が結合可能な他の抗腫瘍剤は、葉酸代謝拮抗薬であるＱＦＡである。カリケアマイシン及びＱＦＡは双方とも、細胞内に作用部位を有し、原形質膜を容易に通過しない。よって抗体媒介性内部移行によるこれらの薬剤の細胞への取込により、細胞障害効果が大きく向上する。
【０１２９】
他の細胞障害剤
本発明の抗−ＰＵＭＰＣｎ抗体と結合可能な他の抗腫瘍剤には、ＢＣＮＵ、ストレプトゾイシン、ビンクリスチン及び５−フルオロウラシル、米国特許第５，０５３，３９４号、同５，７７０，７１０号に記載されており、集合的にＬＬ−Ｅ３３２８８複合体として公知の薬剤のファミリー、並びにエスペラマイシン（ｅｓｐｅｒａｍｉｃｉｎｅ）（米国特許第５，８７７，２９６号）が含まれる。
使用可能な酵素活性毒及びその断片には、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合活性断片、（緑膿菌からの）エキソトキシンＡ鎖、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデクシン（ｍｏｄｅｃｃｉｎ）Ａ鎖、α−サルシン、シナアブラギリタンパク質、ジアンチン（ｄｉａｎｔｈｉｎ）タンパク質、ヨウシュヤマゴボウタンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、及びＰＡＰ−Ｓ）、ツルレイシインヒビター、クルシン（ｃｕｒｃｉｎ）、クロチン（ｃｒｏｔｉｎ）、サパオナリア・オフィシナリス（ｓａｐａｏｎａｒｉａ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）インヒビター、ゲロニン（ｇｅｌｏｎｉｎ）、ミトゲリン（ｍｉｔｏｇｅｌｌｉｎ）、レストリクトシン（ｒｅｓｔｒｉｃｔｏｃｉｎ）、フェノマイシン（ｐｈｅｎｏｍｙｃｉｎ）、エノマイシン（ｅｎｏｍｙｃｉｎ）及びトリコテセン（ｔｒｉｃｏｔｈｅｃｅｎｅｓ）が含まれる。例えば、１９９３年１０月２８日公開のＷＯ９３／２１２３２号を参照のこと。
さらに本発明では、抗体と核分解活性（ｎｕｃｌｅｏｌｙｔｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ）を有する化合物（例えばリボヌクレアーゼ又はＤＮＡエンドヌクレアーゼ、例えばデオキシリボヌクレアーゼ；ＤＮアーゼ）との間に形成される免疫コンジュゲートが考慮される。
【０１３０】
腫瘍を選択的に破壊するため、抗体は高い放射性を有する原子を含有してよい。放射性原子をコンジュゲートした抗−ＰＵＭＰＣｎ抗体を生成するために、種々の放射性同位体が利用される。例として、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２、Ｐｂ２１２及びＬｕの放射性同位体が含まれる。コンジュゲートが診断用に使用される場合、それはシンチグラフィー研究用の放射性原子、例えばｔｃ９９ｍ又はＩ１２３、又は核磁気共鳴（ＮＭＲ）映像（磁気共鳴映像、ｍｒｉとしても公知）用のスピン標識、例えばヨウ素−１２３、ヨウ素−１３１、インジウム−１１１、フッ素−１９、炭素−１３、窒素−１５、酸素−１７、ガドリニウム、マグネシウム又は鉄を含有し得る。
放射−又は他の標識が、公知の方法でコンジュゲートに導入される。例えば、ペプチドは生物合成されるか、又は水素の代わりにフッ素−１９を含む適切なアミノ酸前駆体を使用する化学的なアミノ酸合成により合成される。標識、例えばｔｃ９９ｍ又はＩ１２３、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８及びＩｎ１１１は、ペプチドのシステイン残基を介して結合可能である。イットリウム−９０はリジン残基を介して結合可能である。ＩＯＤＯＧＥＮ法（Ｆｒａｋｅｒら（１９７８） Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ． ８０：４９−５７）は、ヨウ素−１２３の導入に使用することができる。他の方法の詳細は、「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｓｃｉｎｔｉｇｒａｐｈｙ」（Ｃｈａｔａｌ， ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ １９８９）に記載されている。
【０１３１】
抗体と細胞障害剤のコンジュゲートは、種々の二官能性タンパク質カップリング剤、例えばＮ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオナート（ＳＰＤＰ）、スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシラート、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステル類の二官能性誘導体（例えばジメチルアジピミダートＨＣＬ）、活性エステル類（例えば、スベリン酸ジスクシンイミジル）、アルデヒド類（例えば、グルタルアルデヒド）、ビスアジド化合物（例えば、ビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミン）、ビス−ジアゾニウム誘導体（例えば、ビス−（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）エチレンジアミン）、ジイソシアネート（例えば、トリエン−２，６−ジイソシアネート）、及び二活性フッ素化合物（例えば、１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン）を使用して作製することができる。例えば、リシン免疫毒素は、Ｖｉｔｅｔｔａら， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３８：１０９８（１９８７）に記載されているようにして調製することができる。炭素−１４標識１−イソチオシアナトベンジル−３−メチルジエチレン−トリアミン五酢酸（ＭＸ−ＤＴＰＡ）が抗体に放射性ヌクレオチドをコンジュゲートするためのキレート剤の例である。ＷＯ９４／１１０２６号を参照されたい。リンカーは細胞中の細胞障害剤の放出を容易にするための「切断可能リンカー」であってよい。例えば、酸不安定性リンカー、ペプチターゼ過敏性リンカー、光不安定性リンカー、ジメチルリンカー又はジスルフィド含有リンカーが使用され得る（Ｃｈａｒｉら， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， ５２：１２７−１３１（１９９２）；米国特許第５，２０８，０２０号）。
別法として、抗−ＰＵＭＰＣｎ抗体及び細胞障害剤を含有する融合タンパク質は、例えば組換え技術又はペプチド合成により作製される。ＤＮＡの長さは、コンジュゲートの所望する特性を破壊しないリンカーペプチドをコードする領域により離間しているか、又は互いに隣接しているコンジュゲートの２つの部分をコードする領域をそれぞれ含有する。
他の実施態様において、腫瘍の事前ターゲティングに利用するために、「レセプター」（例えばストレプトアビジン）に抗体をコンジュゲートし、ここで抗体−レセプターコンジュゲートを患者に投与し、続いてキレート剤を使用し、循環から未結合コンジュゲートを除去し、細胞障害剤（例えば放射性ヌクレオチド）にコンジュゲートする「リガンド」（例えばアビジン）を投与する。
【０１３２】
抗体依存性酵素媒介性プロドラッグ治療法（ＡＤＥＰＴ）
また、本発明の抗体は、プロドラッグ（例えばペプチジル化学療法剤、ＷＯ８１／０１１４５号を参照）を活性な抗ガン剤に転化させるプロドラッグ活性化酵素に抗体をコンジュゲートさせることにより、ＡＤＥＰＴにおいて使用することができる。例えばＷＯ８８／０７３７８及びＵＳ４，９７５，２７８を参照されたい。
ＡＤＥＰＴに有用な免疫コンジュゲートの酵素成分には、より活性な細胞毒形態に転化するように、プロドラッグに作用し得る任意の酵素が含まれる。
限定するものではないが、この発明の方法に有用な酵素には、ホスファート含有プロドラッグを遊離の薬剤に転化するのに有用なアルカリ性ホスファターゼ；スルファート含有プロドラッグを遊離の薬剤に転化するのに有用なアリールスルファターゼ；非毒性５−フルオロシトシンを抗ガン剤５−フルオロウラシルに転化するのに有用なシトシンデアミナーゼ；プロテアーゼ、例えばセラチアプロテアーゼ、サーモリシン、サブチリシン、カルボキシペプチダーゼ及びカテプシン（例えば、カテプシンＢ及びＬ）で、ペプチド含有プロドラッグを遊離の薬剤に転化するのに有用なもの；Ｄ−アミノ酸置換基を含有するプロドラッグの転化に有用なＤ−アラニルカルボキシペプチダーゼ；炭水化物切断酵素、例えばグリコシル化プロドラッグを遊離の薬剤に転化するのに有用なノイラミニダーゼ及びβガラクトシダーゼ；βラクタムで誘導体化された薬剤を遊離の薬剤に転化させるのに有用なβラクタマーゼ；及びペニシリンアミダーゼ、例えばそれぞれフェノキシアセチル又はフェニルアセチル基で、それらのアミン性窒素において誘導体化された薬剤を遊離の薬剤に転化するのに有用なペニシリンＶアミダーゼ又はペニシリンＧアミダーゼが含まれる。あるいは、「アブザイム」としてもまた公知の酵素活性を有する抗体を、遊離の活性薬剤に本発明のプロドラッグを転化させるために使用することもできる（例えば、Ｍａｓｓｅｙ， Ｎａｔｕｒｅ ３２８：４５７−４５８（１９８７）を参照）。抗体−アブザイムコンジュゲートは、ここで記載されているようにして、腫瘍細胞個体群にアブザイムを送達するために調製することができる。
この発明の酵素は、当該分野においてよく知られている技術、例えば上で検討したヘテロ二官能性架橋試薬を使用することにより、抗−ＰＵＭＰＣｎ抗体に共有的に結合させることができる。あるいは、本発明の抗体の少なくとも抗原結合領域を本発明の酵素の少なくとも機能的に活性な部位に結合せしめてなる融合タンパク質を、当該技術においてよく知られている組換えＤＮＡ技術を使用して作成することができる（Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら， Ｎａｔｕｒｅ ３１２：６０４−６０８（１９８４））。
【０１３３】
９．免疫リポソーム
また、ここに開示する抗体は、免疫リポソームとして調製してもよい。抗体を含むリポソームは、Ｅｐｓｔｅｉｎら， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８２： ３６８８ （１９８５）；Ｈｗａｎｇら， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ７７： ４０３０ （１９８０）； 及び米国特許第４，４８５，０４５号及び第４，５４４，５４５号に記載されたような、この分野で知られた方法で調製される。向上した循環時間を持つリポソームは、米国特許第５，０１３，５５６号に開示されている。
特に有用なリポソームは、ホスファチジルコリン、コレステロール及びＰＥＧ−誘導ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ−ＰＥ）を含む脂質組成物での逆相蒸発法によって生成される。リポソームは、所定サイズのフィルターを通して押し出され、所望の径を有するリポソームが生成される。本発明の抗体のＦａｂ’断片は、Ｍａｒｔｉｎら， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２５７： ２８６−２８８ （１９８２）に記載されているように、ジスルフィド交換反応を介してリポソームに抱合され得る。化学治療薬（ドキソルビシン等）は、場合によってはリポソーム内に包含される。Ｇａｂｉｚｏｎら， Ｊ． Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ． ８１（１９） １４８４ （１９８９）参照。
【０１３４】
１０．抗体の製薬組成物
ここで同定されるＰＲＯ２３２０３ポリペプチドに特異的に結合する抗体、並びに上記に開示したスクリーニングアッセイによって同定された他の分子は、種々の疾患の治療のために、製薬組成物の形態で投与することができる。
ＰＲＯ２３２０３ポリペプチドが細胞内にあり、全抗体が阻害剤として用いられる場合、取り込める抗体が好ましい。しかし、リポフェクション又はリポソームも抗体、又は抗体断片を細胞に導入するのために使用できる。抗体断片が用いられる場合、標的タンパク質の結合ドメインに特異的に結合する最小阻害断片が好ましい。例えば、抗体の可変領域配列に基づいて、標的タンパク質配列に結合する能力を保持したペプチド分子が設計できる。このようなペプチドは、化学的に合成でき、及び／又は組換えＤＮＡ技術によって生成できる。例えば、Ｍａｒａｓｃｏら， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９０， ７８８９−７８９３ （１９９３）参照。
ここでの製剤は、治療すべき特定の徴候に必要な場合に１つ以上の活性化合物、好ましくは互いに悪影響を及ぼさない相補的活性を持つものも含んでよい。あるいは、又はそれに加えて、組成物は、細胞障害性薬、サイトカイン、化学療法剤又は増殖阻害剤を含んでもよい。これらの分子は、適切には、意図する目的に有効な量の組み合わせで存在する。
【０１３５】
また、活性成分は、例えばコアセルベーション技術により又は界面重合により調製されたマイクロカプセル、例えば、各々ヒドロキシメチルセルロース又はゼラチン−マイクロカプセル及びポリ（メタクリル酸メチル）マイクロカプセル中、コロイド状薬物送達系（例えば、リポソーム、アルブミン小球、マイクロエマルション、ナノ粒子及びナノカプセル）中、又はマイクロエマルション中に包括されていてもよい。これらの技術は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ， 上掲に開示されている。
インビボ投与に使用される製剤は無菌でなけらばならない。これは、滅菌濾過膜を通した濾過により容易に達成される。
徐放性製剤を調製してもよい。徐放性製剤の好適な例は、抗体を含有する固体疎水性ポリマーの半透性マトリクスを含み、このマトリクスは成形された物品、例えばフィルム、又はマイクロカプセルの形状である。除放性マトリクスの例は、ポリエステル、ヒドロゲル（例えば、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）又はポリ（ビニルアルコール））、ポリルアクチド（米国特許第３，７７３，９１９号）、Ｌ−グルタミン酸及びγ−エチル−Ｌ−グルタメート、非分解性エチレン−酢酸ビニル、ＬＵＰＲＯＮ ＤＥＰＯＴ（商品名）（乳酸−グリコール酸コポリマーと酢酸リュープロリドの注射可能な小球）などの分解性乳酸−グリコール酸コポリマー、及びポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシブチル酸を含む。エチレン−酢酸ビニル及び乳酸−グリコール酸などのポリマーは分子を１００日に渡って放出することができるが、ある種のヒドロゲルはより短時間でタンパク質を放出してしまう。カプセル化された抗体が身体内に長時間残ると、それらは３７℃の水分に露出されることにより変性又は凝集し、その結果、生物学的活性の低下及び起こりうる免疫原性の変化をもたらす。合理的な方法は、含まれる機構に依存する安定化について工夫することができる。例えば、凝集機構がチオ−ジスルフィド交換を通した分子間Ｓ−Ｓ結合形成であると発見された場合、安定化はスルフヒドリル残基の修飾、酸性溶液からの凍結乾燥、水分含有量の制御、適切な添加剤の付加、及び特異的ポリマーマトリクス組成物の開発によって達成されうる。
【０１３６】
Ｇ．抗−ＰＲＯ２３２０３抗体の用途
本発明の抗−ＰＲＯ２３２０３抗体は様々な有用性を有している。例えば、抗−ＰＲＯ２３２０３抗体は、ＰＲＯ２３２０３の診断アッセイ、例えばその特定細胞、組織、又は血清での発現の検出に用いられる。競合的結合アッセイ、直接又は間接サンドウィッチアッセイ及び不均一又は均一相で行われる免疫沈降アッセイ［Ｚｏｌａ， Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ， ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ． （１９８７） ｐｐ． １４７−１５８］等のこの分野で知られた種々の診断アッセイ技術が使用される。診断アッセイで用いられる抗体は、検出可能な部位で標識される。検出可能な部位は、直接又は間接に、検出可能なシグナルを発生しなければならない。例えば、検出可能な部位は、３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓ又は１２５Ｉ等の放射性同位体、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン又はルシフェリン等の蛍光又は化学発光化合物、あるいはアルカリホスファターゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ又はセイヨウワサビペルオキシダーゼ等の酵素であってよい。抗体に検出可能な部位を抱合させるためにこの分野で知られた任意の方法が用いられ、それにはＨｕｎｔｅｒら， Ｎａｔｕｒｅ １４４：９４５ （１９６２）；Ｄａｖｉｄら， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， １３： １０１４ （１９７４）；Ｐａｉｎら， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈ．， ４０：２１９ （１９８１）；及びＮｙｇｒｅｎ， Ｊ． Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ． ａｎｄ Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．， ３０：４０７ （１９８２）に記載された方法が含まれる。
【０１３７】
また、抗−ＰＲＯ２３２０３抗体は、組換え細胞培養又は天然供給源からのＰＲＯ２３２０３のアフィニティー精製にも有用である。この方法においては、ＰＲＯ２３２０３に対する抗体を、当該分野でよく知られている方法を使用して、セファデックス樹脂や濾紙のような適当な支持体に固定化する。次に、固定化された抗体を精製するＰＲＯ２３２０３を含む試料と接触させた後、固定化された抗体に結合したＰＲＯ２３２０３以外の試料中の物質を実質的に全て除去する適当な溶媒で支持体を洗浄する。最後に、ＰＲＯ２３２０３を抗体から脱離させる他の適当な溶媒で支持体を洗浄する。
ＰＲＯ２３２０３ポリペプチド、そのためのコード化核酸、及び抗−ＰＲＯ２３２０３抗体に関する潜在的な用途は、前立腺組織由来の腫瘍の検出及び／又は治療にある。
【０１３８】
抗−ＰＵＭＰＣｎ抗体による治療
本発明によると、細胞表面上のＰＵＭＰＣｎに結合する抗−ＰＵＭＰＣｎ抗体は、アンドロゲン非依存性前立腺癌又はアンドロゲン依存性前立腺癌及び関連する転移などのＰＵＭＰＣｎ発現癌細胞を治療するために用いられる。抗−アンドロゲン治療に反応を示さない場合、患者はアンドロゲン非依存性前立腺癌であると診断され、アンドロゲン依存性前立腺癌であると診断される患者は、抗−アンドロゲン治療に対して反応性を有する。通常、そのような癌はＰＵＭＰＣｎ発現細胞を含むため、抗−ＰＵＭＰＣｎ抗体がそれに結合できるようになる。かかる癌はＰＵＭＰＣｎ分子の過剰発現によって特徴付けられるが、本出願は、さらにＰＵＭＰＣｎ過剰発現癌であるとみなされない癌の治療方法も提供する。
現在のところ癌の段階に依存して、前立腺癌の治療に、以下の治療剤の一又は組合わせが含まれる：癌性組織を除去するための手術、放射線治療、アンドロゲン除去（例えば、ホルモン治療）、及び化学療法。抗−ＰＵＭＰＣｎ抗体は、化学療法の毒性及び副作用に対してあまり耐性でない高齢の患者、放射線治療が有用性に限界を持つ転移性疾患、及びアンドロゲン除去治療に対して耐性である前立腺癌への対応に関し、特に望ましいものである。本発明の腫瘍標的及び内部移行性抗−ＰＵＭＰＣｎ抗体は、疾患の初期診断又は再発の間におけるＰＵＭＰＣｎ発現癌を緩和するのに有用である。治療上の適用に関し、抗−ＰＵＭＰＣｎ抗体は単独で、又は、例えばホルモン、抗血管形成剤、又は放射標識化合物、又は手術、凍結療法、及び／又は、特に前立腺癌について、また特に細胞の減少が達成できない場合には、放射線療法と組合わせて使用することができる。抗−ＰＵＭＰＣｎ抗体治療は、従来の治療の他の形態と併せて、継続的に従来の治療の前又は後に行われてもよい。タキソテール（登録商標）（ドセタキセル）、タキソール（登録商標）（パリクタキセル）、エストラムスチン（ｅｓｔｒａｍｕｓｔｉｎｅ）及びミトキサントロンなどの化学療法薬は、転移性及びホルモン不応性の前立腺癌を治療するために、特に危険の少ない患者において使用される。癌、特に、アンドロゲン非依存性及び／又は転移性前立腺癌を治療し緩和するための本発明の本方法において、前記の化学療法剤の一又は複数による治療と併せて、癌患者は抗−ＰＵＭＰＣｎ抗体を投与される。特に、パリクタキセル及び修飾された誘導体（例えば、ＥＰ０６００５１７を参照のこと）との組合わせ治療が考慮される。抗−ＰＵＭＰＣｎ抗体は、化学療法剤における治療上効果的な投与量で投与されるであろう。他の実施態様において、抗−ＰＵＭＰＣｎ抗体は、パクリタキセルなどの化学療法剤の活性及び効果を増強するために、化学療法と併せて投与される。米医薬品便覧（Ｐｈｙｓｉｃｉａｎｓ’ Ｄｅｓｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ）（ＰＤＲ）には、種々の癌の治療において使用されているこれらの薬剤の投与量が開示されている。前述の治療上有効な化学療法剤の用法及び投与量は、治療される特定の癌、疾患の程度及び当該技術分野の医師にとって知られている他の因子に依存し、医師によって決定することが可能である。
【０１３９】
特定の一実施態様において、細胞障害性剤がコンジュゲートされた抗−ＰＵＭＰＣｎ抗体を含む免疫コンジュゲートが患者に投与される。好ましくは、ＰＵＭＰＣｎタンパク質に結合した免疫コンジュゲートは、細胞によって内部移行され、その結果、結合した癌細胞の殺傷において免疫コンジュゲートの治療的効果を増大させる。好ましい実施態様において、細胞障害性剤は、癌細胞中の核酸を標的し又は妨害する。かかる細胞障害性剤の例は、上述されており、メイタンシノイド、カリケアミシン、リボヌクレアーゼ及びＤＮＡエンドヌクレアーゼを包含する。
抗体−ＰＵＭＰＣｎ抗体又は免疫コンジュゲートは、例えば、ボーラスのような静脈投与、又は一定期間の継続的注入、筋肉内、腹腔内、脳脊髄内、皮下、関節内、滑膜内、くも膜下腔内、口腔内、局所的、又は吸入経路などの既知の方法に従ってヒト患者に対して投与される。抗体の静脈内又は皮下投与が好ましい。
他の治療計画を抗−ＰＵＭＰＣｎ抗体の投与と組合せてもよい。組合せ投与には、別々の調製物又は単一の医薬製剤を使用する同時投与、及び好ましくは両方（又は全ての）活性剤が同時にその生物学的活性を働かせる時間がある、いずれかの順での連続投与が含まれる。このような組合せ治療により、結果として相乗的治療効果が生じることが好ましい。
また、特定のガンに関連した他の腫瘍抗原に対する抗体の投与と共に、抗−ＰＵＭＰＣｎ抗体又は抗体類の投与を組合せることが望ましい。
【０１４０】
他の実施態様では、本発明の抗体治療方法は、異なる化学療法剤の混合物の同時投与を含む、抗−ＰＵＭＰＣｎ抗体（又は抗体類）と一又は複数の化学療法剤又は増殖阻害剤との組合せ投与を含む。このような化学療法剤の調製及び投与スケジュールは製造者の注意書きに従い使用されるか、又は熟練した実務者により経験的に決定される。このような化学療法の調製及び投与スケジュールは、Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ Ｓｅｒｖｉｃｅ Ｍ．Ｃ．Ｐｅｒｒｙ編， Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ， Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ， ＭＤ（１９９２）に記載されている。
抗体は、抗ホルモン化合物、例えばタモキシフェン等の抗−エストロゲン化合物、例えば；抗プロゲステロン、例えばオナプリストン（ｏｎａｐｒｉｓｔｏｎｅ）（欧州特許６１６８１２号を参照）；又は抗アンドロゲン、例えばフルタミドを、このような分子に対して既知の用量で組合せてもよい。治療される癌がアンドロゲン非依存性癌である場合、患者は予め抗アンドロゲン治療を受け、癌がアンドロゲン非依存性になった後、抗−ＰＵＭＰＣｎ抗体（及び場合によってはここに記載した他の薬剤）を患者に投与してもよい。
【０１４１】
疾患の予防又は治療のための投与量及び方式は、公知の基準に従い、医師により選択されるであろう。抗体の適切な用量は、治療される疾患の種類、疾患の重症度及び過程、抗体を防止目的で投与するのか治療目的で投与するのか、過去の治療、患者の臨床歴及び抗体の応答性、手当てをする医師の裁量に依存するであろう。抗体は一度に又は一連の処置にわたって患者に適切に投与される。好ましくは、抗体は静脈注入又は皮下注射により投与される。疾患の種類及び重症度に応じて、例えば一又は複数の別個の投与又は連続注入のいずれであれ、体重当たり約１μｇ／ｋｇないし５０ ｍｇ／ｋｇ（例えば０．１−１５ ｍｇ／ｋｇ／用量）の抗体が患者への最初の投与量の候補である。投薬計画は、約４ ｍｇ／ｋｇ、続いて１週間に約２ ｍｇ／ｋｇの抗−ＰＵＭＰＣｎ抗体の維持用量で投与することを含む。しかしながら、他の投薬計画も有効であろう。上述した因子に応じて、典型的な一日の投与量は約１μｇ／ｋｇから１００ ｍｇ／ｋｇあるいはそれ以上の範囲である。数日間又はそれ以上の繰り返し投与の場合、状態によっては、疾患の徴候の望ましい抑制が生じるまで処置を維持する。この治療の進行状態は、医師又は他の当業者に公知の基準をベースにした通常の方法やアッセイで容易にモニターされる。
以下の実施例は例示するためにのみ提供されるものであって、本発明の範囲を決して限定することを意図するものではない。
米国優先権主張番号６０／２３５，４５１は、その全体出典明示によりここに取り込む。本明細書中で引用した全ての特許及び参考文献の全体を、出典明示によりここに取り込む。
【０１４２】
（実施例）
実施例で言及されている全ての市販試薬は、特に示さない限りは製造者の使用説明に従い使用した。ＡＴＣＣ登録番号により以下の実施例及び明細書全体を通して特定されている細胞の供給源はアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション、マナッサス、バージニアである。
【０１４３】
実施例１
ヒトＰＲＯ２３２０３をコードするｃＤＮＡクローンの単離
発現配列タッグ（ＥＳＴ）ＤＮＡデータベース（ＬＩＦＥＳＥＱ（登録商標），Ｉｎｃｙｔｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ，パロアルト，カリフォルニア）を検索し、ＧＥＰＩＳによってＥＳＴ配列を同定した。遺伝子発現プロファイリング インシリコ（ＧＥＰＩＳ）は、新規治療標的に関する対象の遺伝子の性質決定を行うバイオインフォーマティック手法である。ＧＥＰＩＳは、大量のＥＳＴ配列及びライブラリー情報を上手く利用し、遺伝子発現プロファイルを確定する。ＧＥＰＩＳは、遺伝子の発現レベルがＥＳＴデータベースにおける発生数と比例相関するとの前提に基づいており、Ｉｎｃｙｔｅ社 ＥＳＴの関連データベースとＧｅｎｅｎｔｅｃｈ社の知的財産情報を、厳密で統計学的に有意な方法で統合することにより作動する。ＧＥＰＩＳは極めて特別な分析又は広範なスクリーニング課題のいずれかを実施するように設定することができるが、本実施例においては、新規腫瘍抗原を同定し、クロス確認するために使用される。初期スクリーニングのために、ＧＥＰＩＳはライブラリーから配列に移行するのに使用される。Ｉｎｃｙｔｅ社の全データーベースは、そのライブラリー情報に基づく配列をクラスター化するために使用された。乳房、大腸、肺及び前立腺は、特定された標的組織である。この初期のクラスター中に見出される配列は、その後、ドメインを含む分泌及び膜貫通に関してスクリーニングされた。残りの配列は、その後、新規性に関しスクリーニングされ、個々の配列が同定された。その後、最後のステップにおいて、各個々の配列についてＧＥＰＩＳスクリーニングが行われ、この時期は配列からライブラリーに移行し、その結果、オリジナルの標的組織における発現プロファイルを実証する（図３）。このタイプのスクリーニングバイオインフォーマティクスを使用して、ＤＮＡ１８２７５３が同定され、この配列を用いて設計されたＰＣＲプライマーは、全長クローンに関し、ライブラリーをスクリーニングするのに使用された。
【０１４４】
ｃＤＮＡライブラリーの構築のためのＲＮＡはヒト前立腺組織から単離した。ヒトＰＲＯ２３２０３をコードするｃＤＮＡクローンの単離に用いたｃＤＮＡライブラリーは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡからのもの等の市販試薬を用いて標準的な方法によって作成した。ｃＤＮＡは、ＮｏｔＩ部位を含むオリゴｄＴでプライムし、平滑末端でＳａｌＩヘミキナーゼアダプターに結合させ、ＮｏｔＩで切断し、ゲル電気泳動でおよそのサイズ分類し、そして適切なクローニングベクター（ｐＲＫＢ又はｐＲＫＤ等；ｐＲＫ５ＢはＳｆｉＩ部位を含まないｐＲＫ５Ｄの前駆体である；Ｈｏｌｍｅｓら， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２５３： １２７８−１２８０ （１９９１）参照）に、特有のＸｈｏＩ及びＮｏｔＩ部位において、所定の方向でクローニングした。
上述のＥＳＴ配列に基づくオリゴヌクレオチド配列は、その後：１）目的の配列を含むｃＤＮＡライブラリーをＰＣＲにより同定するため、及び２）ＰＲＯ２３２０３の全コード化配列のクローンを単離するためのプローブの使用のために合成された。順方向及び逆方向のＰＣＲプライマーは、通常、２０から３０ヌクレオチドの範囲であり、しばしば、長さ約１００−１０００のＰＣＲ産物を生じさせるように設計される。プローブ配列は、典型的には、４０−５５ｂｐである。全長クローンのための幾つかのライブラリーをスクリーニングするために、Ａｕｓｕｂｅｒｌ等， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， 上掲に従いＰＣＲプライマー対を用いて、ライブラリー由来のＤＮＡがＰＣＲ増幅によってスクリーニングされた。ポジティブなライブラリーは、その後、プローブ及びプライマー対の一つを使用して、目的の遺伝子をコードするクローンを単離するために使用された。
【０１４５】
用いられたオリゴヌクレオチドプローブは以下の通りである：
順方向ＰＣＲプライマー ５’−ＧＡＴＡＴＴＴＧＴＴＴＣＴＣＡＡＣＡＴＧＧＣＴＴＡＴＣＡＧＣＡＧＧ−３’  （配列番号：３）
逆方向ＰＣＲプライマー ５’−ＴＣＴＣＴＧＡＣＣＴＴＣＴＣＡＴＣＧＧＴＡＡＧＣＡＧＡＧＧ−３’ （配列番号：４）ハイブリダイゼーションプローブ
５’−ＴＣＴＴＴＴＧＣＡＧＣＴＴＴＧＣＡＧＡＴＡＣＣＣＡＧＡＣＴＧＡＧＣＴＧＧＡＡＣＴＧＧＡ−３’  （配列番号：５）
ヌクレオチド位置１８８−１９０に見かけの翻訳開始部位及びヌクレオチド位置１５５０−１５５２に翻訳停止シグナルを持つ一つのオープンリーディングフレームを含んだ全長クローンが同定された（図１、配列番号：１）。予想されるポリペプチド前駆体は、４５４アミノ酸長で、およそ５２００８ダルトンの計算上の分子量を有し、約８．８３のｐＩが見積もられた。図２（配列番号：２）に示される全長ＰＲＯ２３２０３配列は、種々の重要なポリペプチドドメインの存在を証明し、すぐ下に示されるようなこれらの重要なポリペプチドドメインに対して与えられる位置は、上述のごとく、おおよそのものである。
シグナルペプチド：無し
膜貫通ドメイン：
２１０−２３０
２５６−２７８
３０２−３２１
３６０−３８２
３９１−４１２
４３０−４５０
Ｎ−グリコシル化部位：２５６−２５９
ｃＡＭＰ−及びｃＧＭＰ−依存性プロテインキナーゼリン酸化部位：２９−３２
チロシンキナーゼリン酸化部位：４１６−４２４
Ｎ−ミリストイル部位．
８−１３
２４−２９
３４−３９
１９３−１９８
２７４−２７９
ＥＣＤ及びＩＣＤは、おそらく上記予想されるＴＭｓを表すアミノ酸の外に存在するのであろう。
クローンＤＮＡ１８５１７１−２９９４はＡＴＣＣに２０００年９月２６日に寄託されており、ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−２５１３が付与されている。
図２（配列番号：２）に示される全長配列のＡＬＩＧＮ−２配列アライメント分析を用いたタンパク質データーベース（バージョン３５．４５ ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ ３５）の分析は、ＰＲＯ２３２０３アミノ酸配列と以下の配列：ＡＫ００１６９１＿１との間における配列同一性を証明した。
【０１４６】
実施例２
ハイブリダーゼーションプローブとしてのＰＲＯ２３２０３の使用
以下の方法は、ハイブリダイゼーションプローブとしてのＰＲＯ２３２０３コード化ヌクレオチド配列の使用について記述する。
全長又は成熟ＰＲＯ２３２０３のコード化配列を含むＤＮＡは、ヒト組織ｃＤＮＡライブラリー又はヒト組織ゲノムライブラリー中において相同なＤＮＡ（天然に生じるＰＲＯ２３２０３変異体をコードするものなど）に関しスクリーニングするためのプローブとして用いられる。
いずれかのライブラリーＤＮＡを含むフィルターのハイブリダイゼーション及び洗浄は、以下の高い緊縮性の条件下にて実施される。放射性標識化ＰＲＯ２３２０３由来のプローブのフィルターに対するハイブリダイゼーションは、５０％ ホルムアミド， ５ｘ ＳＳＣ， ０．１％ ＳＤＳ， ０．１％ ピロリン酸ナトリウム， ５０ｍＭ リン酸ナトリウム， ｐＨ ６．８， ２ｘ デンハード溶液及び１０％ 硫酸デキストランの溶液中、４２℃で２０時間実施される。フィルターの洗浄は０．１ｘ ＳＳＣ及び０．１％ ＳＤＳの水溶液中にて４２℃で実施される。
全長天然配列ＰＲＯ２３２０３をコードするＤＮＡと望ましい配列同一性を有するＤＮＡは、その後、当該技術分野において標準的な技術を用いて同定された。
【０１４７】
実施例３
大腸菌におけるＰＲＯ２３２０３の発現
この実施例は、大腸菌中における組み換え発現によるＰＲＯ２３２０３の非グリコシル化型の調製を例証する。
ＰＲＯ２３２０３コード化ＤＮＡ配列は選択されたＰＣＲプライマーを利用して最初に増幅される。このプライマーは、選択された発現ベクター上の制限酵素部位に対応する制限酵素部位を含まなければならない。様々な発現ベクターを使用することができる。適したベクターの例としては、アンピシリン及びテトラサイクリン耐性に対する遺伝子を含むｐＢＲ３２２（大腸菌由来；Ｂｏｌｉｖａｒら， Ｇｅｎｅ， ２：９５ （１９９７）を参照のこと）がある。ベクターは制限酵素によって消化され、脱リン酸化される。次いで、ＰＣＲ増幅配列がベクターにライゲーションされる。ベクターは好ましくは抗生物質耐性遺伝子、ｔｒｐプロモーター、ポリｈｉｓリーダー（最初の６つのＳＴＩＩコドン、ポリｈｉｓリーダー、及びエンテロキナーゼ切断部位を含む）、ＰＲＯ２３２０３コード領域、ラムダ転写集結因子及びａｒｇＵ遺伝子をコードする配列を含む。
【０１４８】
次いで、Ｓａｍｂｒｏｏｋら， 上記に記載されている方法を用いて選択された大腸菌株を形質転換するために、このライゲーション混合物を利用した。形質転換体をＬＢプレート上でのその増殖能力によって同定し、次いで抗生物質耐性コロニーを選択する。プラスミドＤＮＡを単離し、それを制限酵素分析及びＤＮＡ配列決定によって確認することができる。
選択されたクローンを、抗生物質が補填されたＬＢブロスのような液体培地で一晩かけて増殖させることができる。この一晩の培養を、引き続きより大きなスケールでの培養を播種するために使用してもよい。細胞を所望の光学密度になるまで増殖させると、その間に発現プロモーターが作用し始める。
更に数時間、細胞を培養した後に、遠心分離によって細胞を収集することが可能である。遠心分離によって得られた細胞ペレットは、当該分野で公知の様々な薬剤を使用して可溶化でき、次いで、この溶解したＰＲＯ２３２０３タンパク質を、タンパク質の堅固な結合を可能にする条件下において金属キレート化カラムを用いて精製すること可能である。
【０１４９】
以下の手法を用いて、ポリ−Ｈｉｓタグ形態でＰＲＯ２３２０３を大腸菌で発現させてもよい。ＰＲＯ２３２０３をコードするＤＮＡを選択したＰＣＲプライマーを用いて最初に増幅した。このプライマーは、選択された発現ベクターの制限酵素部位に対応する制限酵素部位、及び効率的で信頼性のある翻訳開始、金属キレートカラムでの迅速な精製、及びエンテロキナーゼでのタンパク質分解的除去を与える他の有用な配列を含む。次いで、ＰＣＲ増幅されたポリ−Ｈｉｓタグ配列を発現ベクターへ結合させ、これを株５２（Ｗ３１１０ ｆｕｈＡ（ｔｏｎＡ） ｌｏｎ ｇａｌＥ ｒｐｏＨｔｓ（ｈｔｐＲｔｓ） ｃｌｐＰ（ｌａｃＩｑ））に基づく大腸菌宿主の形質転換に使用した。形質転換体を、最初に５０ｍｇ／ｍｌのカルベニシリンを含有するＬＢ中で、３０ＥＣで振盪しながら３−５のＯ．Ｄ．６００に達するまで増殖させた。ついで培養液をＣＲＡＰ培地（３．５７ｇの（ＮＨ４）２ＳＯ４、０．７１ｇのクエン酸ナトリウム・２Ｈ２Ｏ、１．０７ｇのＫＣｌ、５．３６ｇのＤｉｆｃｏ酵母抽出物、５００ｍＬ水中の５．３６ｇのＳｈｅｆｆｉｅｌｄ ｈｙｃａｓｅ ＳＦ、並びに１１０ｍＭのＭＰＯＳ、ｐＨ７．３、０．５５％（ｗ／ｖ）のグルコース及び７ｍＭのＭｇＳＯ４の混合で調製）中にて５０−１００倍希釈し、３０℃で振盪によって約２０−３０時間増殖させた。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより発現を確認するために試料を取り出し、細胞がペレットとなるようにバルク培地を遠心分離した。精製及びリフォールディングまで、細胞ペレットを凍結させた。
【０１５０】
０．５から１Ｌの発酵（６−１０ｇペレット）からの大腸菌ペーストを、７Ｍのグアニジン、２０ｍＭのトリス、ｐＨ８バッファー中で１０容量（ｗ／ｖ）で再懸濁させた。固体硫酸ナトリウム及びテトラチオン酸ナトリウムを添加して最終濃度を各々０．１Ｍ及び０．０２Ｍとし、溶液を４℃で終夜撹拌した。この工程により、すべてのシステイン残基が亜硫酸によりブロックされた変性タンパク質が生じる。溶液をＢｅｃｋｍａｎ Ｕｌｔｒａｃｅｎｔｉｆｕｇｅ中で４０，０００ｒｐｍで３０分間濃縮した。上清を金属キレートカラムバッファー（６Ｍのグアニジン、２０ｍＭのトリス、ｐＨ７．４）の３−５容量で希釈し、透明にするために０．２２ミクロンフィルターを通して濾過する。透明抽出物を、金属キレートカラムバッファーで平衡化させた５ｍｌのＱｉａｇｅｎ Ｎｉ−ＮＴＡ金属キレートカラムに充填した。カラムを５０ｍＭのイミダゾール（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ， Ｕｔｒｏｌ ｇｒａｄｅ）を含む更なるバッファー、ｐＨ７．４で洗浄した。タンパク質を２５０ｍＭのイミダゾールを含有するバッファーで溶離した。所望のタンパク質を含有する画分をプールし、４℃で保存した。タンパク質濃度は、そのアミノ酸配列に基づいて計算した吸光係数を用いて２８０ｎｍにおけるその吸収により見積もった。
【０１５１】
試料を２０ｍＭのトリス、ｐＨ８．６、０．３ＭのＮａＣｌ、２．５Ｍの尿素、５ｍＭのシステイン、２０ｍＭのグリシン及び１ｍＭのＥＤＴＡからなる新たに調製した再生バッファー中で徐々に希釈することによって、タンパク質を再生させた。リフォールディング容量は、最終的なタンパク質濃度が５０￣１００マイクログラム／ｍｌとなるように選択した。リフォールディング溶液を４℃で１２−３６時間ゆっくり撹拌した。リフォールディング反応はＴＦＡを採取濃度０．４％（約３のｐＨ）で添加することにより停止させた。タンパク質をさらに精製する前に、溶液を０．２２ミクロンフィルターを通して濾過し、アセトニトリルを最終濃度２−１０％で添加した。再生したタンパク質を、Ｐｏｒｏｓ Ｒ１／Ｈ逆相カラムで、０．１％ＴＦＡの移動バッファーと１０￣８０％のアセトニトリル勾配での溶離を行うことでクロマトグラフにかけた。Ａ２８０吸収を持つ画分のアリコートをＳＤＳポリアクリルアミドゲルで分析し、相同な再生タンパク質を含有する画分をプールした。一般的に、殆どの正しく再生したタンパク質形態は、これらの形態が最もコンパクトであり、その疎水性内面が逆相樹脂との相互作用から遮蔽されているので、アセトニトリルの最低濃度で溶離される。凝集した種は通常、より高いアセトニトリル濃度で溶離される。誤って再生したタンパク質を所望の形態から除くのに加えて、逆相工程は試料からエンドトキシンも除去する。
所望の再生したＰＲＯ２３２０３ポリペプチドを含有する画分をプールし、溶液に向けた窒素の弱い気流を用いてアセトニトリルを除去した。タンパク質を、透析又は調製バッファーで平衡化したＧ２５ Ｓｕｐｅｒｆｉｎｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）樹脂でのゲル濾過及び滅菌濾過により、０．１４Ｍの塩化ナトリウム及び４％のマンニトールを含む２０ｍＭのＨｅｐｅｓ、ｐＨ６．８に調製した。
【０１５２】
実施例４
哺乳動物細胞におけるＰＲＯ２３２０３の発現
この実施例は、哺乳動物細胞における組み換え発現による潜在的にグリコシル化した形態のＰＲＯ２３２０３の調製を例証する。
発現ベクターとしてベクターｐＲＫ５（１９８９年３月１５日公開のＥＰ３０７，２４７参照）を用いた。場合によっては、ＰＲＯ２３２０３ ＤＮＡを選択した制限酵素を持つｐＲＫ５に結合させ、上記のＳａｍｂｒｏｏｋ等に記載されたようなライゲーション方法を用いてＰＲＯ２３２０３ ＤＮＡを挿入させる。得られたベクターは、ｐＲＫ５−ＰＲＯ２３２０３と呼ばれる。
一実施態様では、選択された宿主細胞は２９３細胞でもよい。ヒト２９３細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ １５７３）は、ウシ胎児血清及び場合によっては滋養成分及び／又は抗生物質を添加したＤＭＥＭなどの培地中で組織培養プレートにおいて増殖させて集密化した。約１０μｇのｐＲＫ５−ＰＲＯ２３２０３ＤＮＡを約１μｇのＶＡ ＲＮＡ遺伝子コード化ＤＮＡ［Ｔｈｉｍｍａｐｐａｙａら， Ｃｅｌｌ， ３１：５４３ （１９８２））］と混合し、５００μｌの１ｍＭ トリス−ＨＣｌ、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．２２７Ｍ ＣａＣｌ２に溶解させた。この混合物に、５００μｌの５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．３５）、２８０ｍＭ ＮａＣｌ、１．５ｍＭ ＮａＰＯ４を一滴づつ添加し、２５℃で１０分間析出物を形成させた。析出物を懸濁し、２９３細胞に加えて３７℃で約４時間定着させた。培地を吸引し、２ｍｌのＰＢＳ中２０％グリセロールを３０秒間添加した。２９３細胞は、次いで無血清培地で洗浄し、新鮮な培地を添加し、細胞を約５日間インキュベートした。
【０１５３】
形質移入の約２４時間後、培地を除去し、培地（のみ）又は２００μＣｉ／ｍｌ３５Ｓ−システイン及び２００μＣｉ／ｍｌ３５Ｓ−メチオニンを含む培地で置換した。１２時間のインキュベーションの後、条件培地を回収し、スピンフィルターで濃縮し、１５％ＳＤＳゲルに添加した。処理したゲルを乾燥させ、ＰＲＯ２３２０３ポリペプチドの存在を現す選択された時間にわたってフィルムにさらした。形質転換した細胞を含む培地に、更なるインキュベーションを施し（無血清培地で）、培地を選択されたバイオアッセイで試験した。
これに換わる技術において、ＰＲＯ２３２０３は、Ｓｏｍｐａｒｙｒａｃら， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．， １２：７５７５ （１９８１）に記載されたデキストラン硫酸法を用いて２９３細胞に一過的に導入される。２９３細胞は、スピナーフラスコ内で最大密度まで増殖させ、７００μｇのｐＲＫ５−ＰＲＯ２３２０３ ＤＮＡを添加する。細胞は、まずスピナーフラスコから遠心分離によって濃縮し、ＰＢＳで洗浄した。ＤＮＡ−デキストラン沈殿物を細胞ペレット上で４時間インキュベートした。細胞を２０％グリセロールで９０秒間処理し、組織培地で洗浄し、組織培地、５μｇ／ｍｌウシインシュリン及び０．１μｇ／ｍｌウシトランスフェリンを含むスピナーフラスコに再度導入した。約４日後に、条件培地を遠心分離して濾過し、細胞及び細胞片を除去した。次いで発現されたＰＲＯ２３２０３を含む試料を濃縮し、透析及び／又はカラムクロマトグラフィー等の選択した方法によって精製した。
他の実施態様では、ＰＲＯ２３２０３をＣＨＯ細胞で発現させることができる。ｐＲＫ５−ＰＲＯ２３２０３は、ＣａＰＯ４又はＤＥＡＥ−デキストランなどの公知の試薬を用いてＣＨＯ細胞に形質移入することができる。上記したように、細胞培地をインキュベートし、培地を培養培地（のみ）又は３５Ｓ−メチオニン等の放射性標識を含む培地に置換することができる。ＰＲＯ２３２０３ポリペプチドの存在を同定した後、培地を無血清培地に置換してもよい。好ましくは、培地を約６日間インキュベートし、次いで条件培地を収集する。次いで、発現されたＰＲＯ２３２０３を含む培地を濃縮して、任意の選択した方法によって精製することができる。
【０１５４】
また、エピトープタグＰＲＯ２３２０３は、宿主ＣＨＯ細胞において発現させてもよい。ＰＲＯ２３２０３はｐＲＫ５ベクターからサブクローニングしてもよい。サブクローン挿入物は、ＰＣＲを施してバキュロウイルス発現ベクター中のポリ−ｈｉｓタグ等の選択されたエピトープタグを持つ枠に融合できる。ポリ−ｈｉｓタグＰＲＯ２３２０３挿入物は、次いで、安定なクローンの選択のためのＤＨＦＲ等の選択マーカーを含むＳＶ４０誘導ベクターにサブクローニングできる。最後に、ＣＨＯ細胞をＳＶ４０誘導ベクターで（上記のように）形質移入した。発現を確認するために、上記のように標識化を行ってもよい。発現されたポリ−ｈｉｓタグＰＲＯ２３２０３を含む培地は、次いで濃縮し、Ｎｉ２＋−キレートアフィニティクロマトグラフィー等の選択された方法により精製できる。  またＰＲＯ２３２０３は、一過性発現法によりＣＨＯ及び／又はＣＯＳ細胞で、他の安定な発現方法によりＣＨＯ細胞で発現させてもよい。
ＣＨＯ細胞における安定な発現は以下の方法を用いて実施された。タンパク質は、それぞれのタンパク質の可溶化形態のコード配列（例えば、細胞外ドメイン）がＩｇＧ１のヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ２ドメインを含む定常領域配列に融合したＩｇＧ作成物（イムノアドヘシン）、又はポリ−Ｈｉｓタグ形態として発現された。
【０１５５】
ＰＣＲ増幅に続いて、対応するＤＮＡを、Ａｕｓｕｂｅｌら， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｕｎｉｔ ３．１６， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ （１９９７）に記載されたような標準的技術を用いてＣＨＯ発現ベクターにサブクローニングした。ＣＨＯ発現ベクターは、対象とするＤＮＡの５’及び３’に適合する制限部位を有し、ｃＤＮＡの便利なシャトル化ができるように作成される。ベクターは、Ｌｕｃａｓら， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２４： ９， １７７４−１７７９ （１９９６）に記載されたようにＣＨＯ細胞での発現を用い、対象とするｃＤＮＡ及びジヒドロフォレートレダクターゼ（ＤＨＦＲ）の発現の制御にＳＶ４０初期プロモーター／エンハンサーを用いる。ＤＨＦＲ発現は、形質移入に続くプラスミドの安定な維持のための選択を可能にする。
所望のプラスミドＤＮＡの１２マイクログラムを、市販の形質移入試薬Ｓｕｐｅｒｆｅｃｔ（登録商標）（Ｑｉａｇｅｎ）， Ｄｏｓｐｅｒ（登録商標）及びＦｕｇｅｎｅ（登録商標）（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）約１千万のＣＨＯ細胞に導入する。細胞は、上記のＬｕｃａｓ等に記載されているように増殖させた。約３ｘ１０７細胞を、下記のような更なる増殖及び生産のためにアンプル中で凍結させた。
【０１５６】
プラスミドＤＮＡを含むアンプルを水槽に配して解凍し、ボルテックスにより混合した。内容物を１０ｍＬの媒質を含む遠心管にピペットして、１０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。上清を吸引して細胞を１０ｍＬの選択培地（０．２μｍ濾過ＰＳ２０、５％の０．２μｍ透析濾過ウシ胎児血清を添加）中に懸濁させた。次いで細胞を９０ｍＬの選択培地を含む１００ｍＬスピナーに分ける。１−２日後、細胞を１５０ｍＬの選択培地を満たした２５０ｍＬスピナーに移し、３７℃でインキュベートする。さらに２−３日後、２５０ｍＬ、５００ｍＬ及び２０００ｍＬのスピナーを３ｘ１０５細胞／ｍＬで播種した。細胞培地を遠心分離により新鮮培地に交換し、生産培地に再懸濁させた。任意の適切なＣＨＯ培地を用いてもよいが、実際には１９９２年６月１６日に発行された米国特許第５，１２２，４６９号に記載された生産培地を使用した。３Ｌの生産スピナーを１．２ｘ１０６細胞／ｍＬで播種した。０日目に、細胞数とｐＨを測定した。１日目に、スピナーをサンプルし、濾過空気での散布を実施した。２日目に、スピナーをサンプルし、温度を３３℃に変え、３０ｍＬの５００ｇ／Ｌのグルコース及び０．６ｍＬの１０％消泡剤（例えば３５％ポリジメチルシロキサンエマルション、Ｄｏｗ Ｃｏｒｎｉｎｇ ３６５ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｇｒａｄｅ Ｅｍｕｌｓｉｏｎ）をとった。生産を通して、ｐＨは７．２近傍に調節し維持した。１０日後、又は生存率が７０％を下回るまで、細胞培地を遠心分離で回収して０．２２μｍフィルターを通して濾過した。濾過物は、４℃で貯蔵するか、即座に精製用カラムに充填した。
【０１５７】
ポリ−Ｈｉｓタグ作成物について、タンパク質はＮｉ−ＮＴＡカラム（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて精製した。精製の前に、イミダゾールを条件培地に５ｍＭの濃度まで添加した。条件培地を、０．３ＭのＮａＣｌ及び５ｍＭイミダゾールを含む２０ｍＭのＨｅｐｅｓ，ｐＨ７．４バッファーで平衡化した６ｍｌのＮｉ−ＮＴＡカラムへ４−５ｍｌ／分の流速によって４℃でポンプ供給した。充填後、カラムをさらに平衡バッファーで洗浄し、タンパク質を０．２５Ｍイミダゾールを含む平衡バッファーで溶離した。高度に精製されたタンパク質は、続いて１０ｍＭのＨｅｐｅｓ、０．１４ＭのＮａＣｌ及び４％のマンニトール， ｐＨ６．８を含む貯蔵バッファー中で２５ｍｌのＧ２５ Ｓｕｐｅｒｆｉｎｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いて脱塩し、−８０℃で貯蔵した。
イムノアドヘシン（Ｆｃ含有）作成物を、以下の通りに条件培地から精製した。条件培地を、２０ｍＭのリン酸ナトリウムバッファー，ｐＨ６．８で平衡化した５ｍｌのプロテインＡカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）へポンプ注入した。充填後、カラムを平衡バッファーで強く洗浄した後、１００ｍＭのクエン酸， ｐＨ３．５で溶離した。溶離したタンパク質は、１ｍｌの画分を２７５μＬの１Ｍトリスバッファー，ｐＨ９を含む管に回収することにより即座に中性化した。高度に精製されたタンパク質は、続いてポリ−Ｈｉｓタグタンパク質について上記した貯蔵バッファー中で脱塩した。均一性はＳＤＳポリアクリルアミドゲルとエドマン（Ｅｄｍａｎ）分解によるＮ−末端アミノ酸配列決定により評価した。
【０１５８】
実施例５
酵母菌でのＰＲＯ２３２０３の発現
以下の方法は、酵母菌中でのＰＲＯ２３２０３の組換え発現を記載する。
第１に、ＡＤＨ２／ＧＡＰＤＨプロモーターからのＰＲＯ２３２０３の細胞内生産又は分泌のための酵母菌発現ベクターを作成する。ＰＲＯ２３２０３をコードするＤＮＡ及びプロモーターを選択したプラスミドの適当な制限酵素部位に挿入してＰＲＯ２３２０３の細胞内発現を指示する。分泌のために、ＰＲＯ２３２０３をコードするＤＮＡを選択したプラスミドに、ＡＤＨ２／ＧＡＰＤＨプロモーターをコードするＤＮＡ、天然ＰＲＯ２３２０３シグナルペプチド又は他の哺乳動物シグナルペプチド、又は、例えば酵母菌α因子又はインベルターゼ分泌シグナル／リーダー配列、及び（必要ならば）ＰＲＯ２３２０３の発現のためのリンカー配列とともにクローニングすることができる。
酵母菌株ＡＮＴＩＢＯＤＹ１１０酵母菌株は、次いで上記の発現プラスミドで形質転換し、選択された発酵培地中で培養できる。形質転換した酵母菌上清は、１０％トリクロロ酢酸での沈降及びＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分離で分析し、次いでクマシーブルー染色でゲルの染色をすることができる。
続いて組換えＰＲＯ２３２０３は、発酵培地から遠心分離により酵母菌細胞を除去し、次いで選択されたカートリッジフィルターを用いて培地を濃縮することによって単離及び精製できる。ＰＲＯ２３２０３を含む濃縮物は、選択されたカラムクロマトグラフィー樹脂を用いてさらに精製してもよい。
【０１５９】
実施例６
バキュロウイルス感染昆虫細胞でのＰＲＯ２３２０３の発現
以下の方法は、バキュロウイルス感染昆虫細胞中におけるＰＲＯ２３２０３の組換え発現を記載する。
ＰＲＯ２３２０３コードする配列を、バキュロウイルス発現ベクターに含まれるエピトープタグの上流に融合させた。このようなエピトープタグは、ポリ−ｈｉｓタグ及び免疫グロブリンタグ（ＩｇＧのＦｃ領域など）を含む。ｐＶＬ１３９３（Ｎｏｖａｇｅｎ）などの市販されているプラスミドから誘導されるプラスミドを含む種々のプラスミドを用いることができる。簡単には、ＰＲＯ２３２０３又はＰＲＯ２３２０３コード配列の所定部分、例えば膜貫通タンパク質の細胞外ドメインをコードする配列又はタンパク質が細胞外である場合の成熟タンパク質をコードする配列などが、５’及び３’領域に相補的なプライマーでのＰＣＲにより増幅される。５’プライマーは、隣接する（選択された）制限酵素部位を包含していてもよい。生産物は、次いで、選択された制限酵素で消化され、発現ベクターにサブクローニングされる。
組換えバキュロウイルスは、上記のプラスミド及びＢａｃｕｌｏＧｏｌｄ（商品名）ウイルスＤＮＡ（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ（「Ｓｆ９」）細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １７１１）中にリポフェクチン（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬから市販）を用いて同時形質移入することにより作成される。２８℃で４−５日インキュベートした後、放出されたウイルスを回収し、更なる増幅に用いた。ウイルス感染及びタンパク質発現は、Ｏ’Ｒｅｉｌｌｅｙら， Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｏｘｆｏｒｄ： Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ （１９９４）に記載されているように実施した。
【０１６０】
次に、発現されたポリ−ｈｉｓタグＰＲＯ２３２０３は、例えばＮｉ２＋−キレートアフィニティクロマトグラフィーにより次のように精製される。抽出物は、Ｒｕｐｅｒｔら， Ｎａｔｕｒｅ， ３６２：１７５−１７９ （１９９３）に記載されているように、ウイルス感染した組み換えＳｆ９細胞から調製した。簡単には、Ｓｆ９細胞を洗浄し、超音波処理用バッファー（２５ｍＬのＨｅｐｅｓ， ｐＨ７．９；１２．５ｍＭのＭｇＣｌ２；０．１ｍＭ ＥＤＴＡ；１０％グリセロール；０．１％のＮＰ−４０；０．４ＭのＫＣｌ）中に再懸濁し、氷上で２回２０秒間超音波処理した。超音波処理物を遠心分離で透明化し、上清を充填バッファー（５０ｍＭリン酸塩、３００ｍＭのＮａＣｌ、１０％グリセロール、ｐＨ７．８）で５０倍希釈し、０．４５μｍフィルターで濾過した。Ｎｉ２＋−ＮＴＡアガロースカラム（Ｑｉａｇｅｎから市販）を５ｍＬの総容積で調製し、２５ ｍＬの水で洗浄し、２５ ｍＬの充填バッファーで平衡させた。濾過した細胞抽出物は、毎分０．５ ｍＬでカラムに充填した。カラムを、分画回収が始まる点であるＡ２８０のベースラインまで充填バッファーで洗浄した。次に、カラムを、結合タンパク質を非特異的に溶離する二次洗浄バッファー（５０ｍＭリン酸塩；３００ｍＭのＮａＣｌ、１０％グリセロール、ｐＨ６．０）で洗浄した。Ａ２８０のベースラインに再度到達した後、カラムを二次洗浄バッファー中で０から５００ｍＭイミダゾール勾配で展開した。１ｍＬの分画を回収し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び銀染色又はアルカリホスファターゼ（Ｑｉａｇｅｎ）に複合したＮｉ２＋−ＮＴＡでのウェスタンブロットで分析した。溶離したＨｉｓ１０−タグＰＲＯ２３２０３を含む画分をプールして充填バッファーで透析した。
あるいは、ＩｇＧタグ（又はＦｃタグ）ＰＲＯ２３２０３の精製は、例えば、プロテインＡ又はプロテインＧカラムクロマトグラフィーを含む公知のクロマトグラフィー技術を用いて実施できる。
【０１６１】
実施例７
ＰＲＯ２３２０３に結合する抗体の調製
この実施例は、ＰＲＯ２３２０３に特異的に結合できるモノクローナル抗体の調製を例示する。
モノクローナル抗体の生産のための技術は、この分野で知られており、例えば、上記のＧｏｄｉｎｇに記載されている。用いられ得る免疫原は、精製ＰＲＯ２３２０３、ＰＲＯ２３２０３を含む融合タンパク質、細胞表面に組換えＰＲＯ２３２０３を発現する細胞を含む。免疫原の選択は、当業者が過度の実験をすることなくなすことができる。
Ｂａｌｂ／ｃ等のマウスを、完全フロイントアジュバントに乳化して皮下又は腹腔内に１−１００マイクログラムで注入したＰＲＯ２３２０３免疫原で免疫化する。あるいは、免疫原をＭＰＬ−ＴＤＭアジュバント（Ｒｉｂｉ Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， ハミルトン， モンタナ）に乳化し、動物の後フットパッドに注入してもよい。免疫化したマウスは、次いで１０から１２日後に、選択したアジュバント中に乳化した付加的免疫源で追加免疫する。その後、数週間、マウスをさらなる免疫化注射で追加免疫する。抗ＰＲＯ２３２０３抗体の検出のためのエライザアッセイで試験するために、レトロオービタル出血からの血清試料をマウスから周期的に採取してもよい。
【０１６２】
適当な抗体力価が検出された後、抗体に「ポジティブ（陽性）」な動物に、ＰＲＯ２３２０３静脈内注射の最後の注入をすることができる。３から４日後、マウスを屠殺し、脾臓細胞を取り出した。次いで脾臓細胞を（３５％ポリエチレングリコールを用いて）、ＡＴＣＣから番号ＣＲＬ１５９７で入手可能なＰ３Ｘ６３ＡｇＵ．１等の選択されたマウス骨髄腫株化細胞に融合させた。融合によりハイブリドーマ細胞が生成され、次いで、ＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、及びチミジン）培地を含む９６ウェル組織培養プレートに蒔き、非融合細胞、骨髄腫ハイブリッド、及び脾臓細胞ハイブリッドの増殖を阻害した。
ハイブリドーマ細胞は、ＰＲＯ２３２０３に対する反応性についてのエライザでスクリーニングされる。ＰＲＯ２３２０３に対する所望のモノクローナル抗体を分泌する「ポジティブ（陽性）」ハイブリドーマ細胞の決定は、技術常識の範囲内である。
陽性ハイブリドーマ細胞を同系のＢａｌｂ／ｃマウスに腹腔内注入し、抗ＰＲＯ２３２０３モノクローナル抗体を含む腹水を生成させる。あるいは、ハイブリドーマ細胞を、組織培養フラスコ又はローラーボトルで増殖させることもできる。腹水中に生成されたモノクローナル抗体の精製は、硫酸アンモニウム沈降、それに続くゲル排除クロマトグラフィ−を用いて行うことができる。あるいは、抗体のプロテインＡ又はプロテインＧへの親和性に基づくアフィニティクロマトグラフィーを用いることもできる。
【０１６３】
実施例８
特異的抗体を用いたＰＲＯ２３２０３ポリペプチドの精製
天然又は組換えＰＲＯ２３２０３ポリペプチドは、この分野の種々の標準的なタンパク質精製方法によって精製できる。例えば、ｐｒｏ−ＰＲＯ２３２０３ポリペプチド、成熟ポリペプチド、又はｐｒｅ−ＰＲＯ２３２０３ポリペプチドは、対象とするＰＲＯ２３２０３ポリペプチドに特異的な抗体を用いた免疫親和性クロマトグラフィーによって精製される。一般に、免疫親和性カラムは抗ＰＲＯ２３２０３ポリペプチド抗体を活性化クロマトグラフィー樹脂に共有結合させて作成される。
ポリクローナル免疫グロブリンは、硫酸アンモニウムでの沈殿又は固定化プロテインＡ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＬＫＢ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ， Ｎ．Ｊ．）での精製のいずれかにより免疫血清から調製される。同様に、モノクローナル抗体は、硫酸アンモニウム沈殿又は固定化プロテインＡでのクロマトグラフィーによりマウス腹水液から調製される。部分的に精製された免疫グロブリンは、ＣｎＢｒ−活性化セファロース（商品名）（Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＬＫＢ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）等のクロマトグラフィー樹脂に共有結合される。抗体が樹脂に結合され、樹脂がブロックされ、誘導体樹脂は製造者の指示に従って洗浄される。
【０１６４】
このような免疫親和性カラムは、可溶化形態のＰＲＯ２３２０３ポリペプチドを含有する細胞からの画分を調製することによるＰＲＯ２３２０３ポリペプチドの精製において利用される。この調製物は、界面活性剤の添加又はこの分野で公知の方法により分画遠心法を介して得られる全細胞又は細胞成分画分の可溶化により得られる。あるいは、シグナル配列を含む可溶化ＰＲＯ２３２０３ポリペプチドは、細胞が増殖する培地中に有用な量で分泌される。
可溶化ＰＲＯ２３２０３ポリペプチド含有調製物は、免疫親和性カラムを通され、カラムはＰＲＯ２３２０３ポリペプチドの好ましい吸着を可能ならしめる条件下（例えば、洗浄剤存在下の高イオン強度バッファー）で洗浄される。次いで、カラムは、抗体／ＰＲＯ２３２０３ポリペプチド結合を分解する条件下（例えば、約２−３といった低ｐＨ、高濃度の尿素又はチオシアン酸イオン等のカオトロープ）で溶離され、ＰＲＯ２３２０３ポリペプチドが回収される。
【０１６５】
実施例９
薬物スクリーニング
本発明は、ＰＲＯ２３２０３ポリペプチド又はその結合断片を種々の薬物スクリーニング技術において使用することによる化合物のスクリーニングにとって特に有用である。そのような試験に用いられるＰＲＯ２３２０３ポリペプチド又は断片は、溶液中に遊離した状態でも、固体支持体に固定されても、細胞表面に担持されていても、或いは細胞内に位置していてもよい。薬剤スクリーニングの１つの方法では、ＰＲＯ２３２０３ポリペプチド又は断片を発現する組換え核酸で安定に形質移入される真核生物又は原核生物宿主細胞を利用する。薬剤は、そのような形質移入細胞に対して、競合的結合アッセイによってスクリーニングされる。生存可能又は固定化形態のいずれかによって、このような細胞は標準的な結合アッセイで使用できる。例えば、ＰＲＯ２３２０３ポリペプチド又は断片と試験される試薬の間での複合体の形成を測定してよい。あるいは、試験する試薬によって生ずるＰＲＯ２３２０３ポリペプチドとその標的細胞又は標的レセプターとの間の複合体形成における減少を試験することもできる。
従って、本発明は、ＰＲＯ２３２０３ポリペプチド関連疾患又は障害に影響を与えうる薬剤又は任意の他の試薬のスクリーニング方法を提供する。これらの方法は、当該分野で良く知られている手法により、その試薬をＰＲＯ２３２０３ポリペプチド又は断片に接触させ、（Ｉ）試薬とＰＲＯ２３２０３ポリペプチド又は断片との間の複合体の存在について、又は（ｉｉ）ＰＲＯ２３２０３ポリペプチド又は断片と細胞との間の複合体の存在について検定することを含む。これらの競合結合アッセイでは、ＰＲＯ２３２０３ポリペプチド又は断片が典型的には標識される。適切なインキュベーションの後、遊離なＰＲＯ２３２０３ポリペプチド又は断片を結合形態のものから分離し、遊離又は未複合の標識の量が、特定の試薬がＰＲＯ２３２０３ポリペプチドに結合する又はＰＲＯ２３２０３ポリペプチド／細胞複合体を阻害する能力の尺度となる。
【０１６６】
薬剤スクリーニングのための他の技術は、ポリペプチドに対して適当な結合親和性を持つ化合物についてのハイスループットスクリーニングを提供し、１９８４年９月１３日に公開されたＷＯ８４／０３５６４に詳細に記載されている。簡単に述べれば、多数の異なる小型ペプチド試験化合物が、プラスチックピン等の固体支持体又は幾つかの他の表面上で合成される。ＰＲＯ２３２０３ポリペプチドに適用すると、ペプチド試験化合物はＰＲＯ２３２０３ポリペプチドと反応して洗浄される。結合したＰＲＯ２３２０３ポリペプチドはこの分野で良く知られた方法により検出される。精製したＰＲＯ２３２０３ポリペプチドは、上記の薬剤スクリーニング技術に使用するためにプレート上に直接被覆することもできる。さらに、非中和抗体は、ペプチドを捕捉し、それを固体支持体上に固定化するのに使用できる。
また、本発明は、ＰＲＯ２３２０３ポリペプチドに結合可能な中和抗体がＰＲＯ２３２０３ポリペプチド又はその断片について試験化合物と特異的に競合する競合薬剤スクリーニングアッセイも考慮する。この方法において、抗体は、ＰＲＯ２３２０３ポリペプチドで、１つ又は複数の抗原決定基を持つ任意のペプチドの存在を検出するのに使用できる。
【０１６７】
実施例１０
合理的薬物設計
合理的薬物設計の目的は、対象とする生物学的活性ポリペプチド（例えば、ＰＲＯ２３２０３ポリペプチド）又はそれらが相互作用する小分子、例えばアゴニスト、アンタゴニスト、又はインヒビターの構造的類似物を製造することである。これらの例の任意のものが、ＰＲＯ２３２０３ポリペプチドのより活性で安定な形態又はインビボでＰＲＯ２３２０３ポリペプチドに機能を促進又は阻害する薬物の創作に使用できる（参考、Ｈｏｄｇｓｏｎ， Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， ９： １９−２１ （１９９１））。
１つの方法において、ＰＲＯ２３２０３ポリペプチド、又はＰＲＯ２３２０３ポリペプチド−インヒビター複合体の三次元構造が、ｘ−線結晶学により、コンピュータモデル化により、最も典型的には２つの方法の組み合わせにより決定される。分子の構造を解明し活性部位を決定するためには、ＰＲＯ２３２０３ポリペプチドの形状及び電荷の両方が確認されなければならない。数は少ないが、ＰＲＯ２３２０３ポリペプチドの構造に関する有用な情報が相同タンパク質の構造に基づいたモデル化によって得られることもある。両方の場合において、関連する構造情報は、類似ＰＲＯ２３２０３ポリペプチド様分子の設計又は効果的なインヒビターの同定に使用される。合理的な薬剤設計の有用な例は、Ｂｒａｘｔｏｎ及びＷｅｌｌｓ， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ３１： ７７９６−７８０１ （１９９２）に示されているような向上した活性又は安定性を持つ分子、又はＡｔｈａｕｄａら，Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， １１３： ７４２−７４６ （１９９３）に示されているような天然ペプチドのインヒビター、アゴニスト、又はアンタゴニストとして作用する分子を含む。
【０１６８】
また、上記のような機能アッセイによって選択された標的特異的な抗体を単離しその結晶構造を解明することもできる。この方法は、原理的には、それに続く薬剤設計が基礎をおくことのできるファーマコア（ｐｈａｒｍａｃｏｒｅ）を生成する。機能的な薬理学的に活性な抗体に対する抗−イディオタイプ抗体（抗−ｉｄｓ）を生成することにより、タンパク質結晶学をバイパスすることができる。鏡像の鏡像として、抗−ｉｄｓの結合部位は最初のレセプターの類似物であると予測できる。抗−ｉｄは、次いで、化学的又は生物学的に製造したペプチドのバンクからペプチドを同定及び単離するのに使用できる。単離されたペプチドは、ファーマコアとして機能するであろう。
本発明によって、Ｘ線結晶学などの分析実験を実施するために十分な量のＰＲＯ２３２０３ポリペプチドが入手可能である。さらに、ここに提供したＰＲＯ２３２０３ポリペプチドアミノ酸配列の知識は、Ｘ線結晶学に代わる又はそれに加わるコンピュータモデル化技術で用いられるガイダンスを提供する。
【０１６９】
実施例１１
Ｔａｑｍａｎ（商標登録）分析によるＰＵＭＰＣｎの発現
最初の研究として、正常並びに腫瘍組織及び細胞から調製されたヒトｃＤＮＡライブラリー［図４］中でのＰＵＭＰＣｎの発現は、Ｔａｑｍａｎ（商標登録）により分析された。各ｃＤＮＡライブラリーの５０ナノグラムが使用された。ＰＵＭＰＣｎの３’末端に対する以下のプライマーがＴａｑｍａｎ分析に使用された。
順方向プライマー（１９ｍｅｒ）：ＧＣＣＡＧＣＣＧＧＣ ＡＧＧＴＴＴＡＴＡ（配列番号：６）
逆方向プライマー（１９ｍｅｒ）：ＡＴＴＣＡＡＣＴＧＧ ＣＧＧＧＣＡＡＧＴ（配列番号：７）
プローブ（２６ｍｅｒ）：ＴＧＣＡＧＣＡＡＣＡ ＡＴＡＴＴＣＡＡＧＣ ＧＣＧＡＣＡ（配列番号：８）
ＴａｑＭａｎ（登録商標）反応は、Ｔａｑ ＤＮＡ ポリメラーゼ酵素の５’エキソヌクレアーゼ活性を実時間でモニターするために用いる、蛍光ＰＣＲをベースにした技術である。２つのオリゴヌクレオチドプライマーは、ＰＣＲ反応の特有なアンプリコンを生産するために使用される。３つ目のオリゴヌクレオチドは、又はプローブは、２つのＰＣＲプライマー間に位置するヌクレオチド配列を検出するために設計される。該プローブはＴａｑ ＤＮＡ ポリメラーゼ酵素では伸長させることができず、レポーター蛍光色素と消光蛍光色素で標識化される。プローブ上で２つの蛍光色素が近接して存在すると、任意のレーザーによって誘起されたレポーター蛍光色素からの発光は消光蛍光色素によって消光される。増幅反応の間、Ｔａｑ ＤＮＡ ポリメラーゼ酵素は、テンプレート依存的にプローブを切断する。生じたプローブ断片は、溶液中で解離し、放出されたレポーター蛍光色素からのシグナルは、第二のフルオロフォアーの消光効果を受けなくなる。レポーター色素の一分子は、合成された新規分子の各々から解放され、消光されないレポーター色素の検出は、データの解釈の基礎を提供する。ＴａｑＭａｎ（登録商標）の結果はデルタ（Δ）Ｃｔ単位で報告した。ＴａｑＭａｎ（登録商標）アッセイデータは、最初にＣｔ、又は閾値サイクルとして表された。これは、レポーターのシグナルが蛍光のバックグラウンドレベル以上に蓄積するサイクルとして定義される。ΔＣｔ値は、癌を正常なヒトのものと比較する場合に、開始時のコピーの相対的数の定量値として使用される。１単位は１ＰＣＲサイクル又は正常に対して約２倍の増幅に相当し、２単位は４倍、３単位は８倍増幅等々に相当する。
β−アクチンの発現に対して基準化されたＴａｑＭａｎ（登録商標）の結果は、図４及び図５に示す。図４において、他の組織におけるＰＵＭＰＣｎの発現は、正常前立腺（１．０の値を示す前立腺）における発現と対比して示される。図４において、ＰＵＭＰＣｎは、大腸並びに肺腫瘍及び肝臓腫瘍においても検出される発現と共に、前立腺において高度に発現される。図５は、図４に示される非前立腺ｃＤＮＡライブラリーのサブセット中の正常組織に対する腫瘍組織のＰＵＭＰＣｎの発現倍率を示す。ＰＵＭＰＣｎは肺、食道及び肺腫瘍において過剰発現されることが認められる。
Ｔａｑｍａｎ分析の結果の検討に従い、より明確な検討を提供するために、インサイツハイブリダイゼーションが種々の正常及び癌性組織に対して実施された。ここで見られる発現パターンは、後述の実施例１２に記載されるインサイツハイブリダイゼーション分析結果と一致した。
【０１７０】
実施例１２
インサイツハイブリダイゼーションによるＰＵＭＰＣｎの発現
インサイツハイブリダイゼーションは、細胞又は組織調製物内での核酸配列の検出及び局在化のための強力で多用途の技術である。例えば、遺伝子発現部位の同定、転写物の組織分布の分析、ウイルス感染の同定及び局在化、特定ｍＲＮＡ合成及び染色体マッピングにおける追跡に有用である。インサイツハイブリダイゼーションは、Ｌｕ及びＧｉｌｌｅｔｔ， Ｃｅｌｌ Ｖｉｓｉｏｎ １： １６９−１７６ （１９９４）のプロトコールの最適な変法に従って、ＰＣＲにより生成されたα−３３Ｐリボプローブを用いて実施された。簡単には、ホルマリン固定、パラフィン包埋ヒト組織を切片化し、脱パラフィンし、プロテイナーゼＫ（２０ｇ／ｍｌ）で１５分間３７℃で脱タンパクし、さらに上掲のＬｕ及びＧｉｌｌｅｔｔに記載されたようにインサイツでハイブリダイゼーションを行った。α−３３Ｐ ＵＴＰ−アンチセンスリボプローブを、いずれかの末端にＴ３及びＴ７ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを有するように設計されたＰＣＲ産物から生成し、５５℃で終夜ハイブリダイゼーションする。スライドをＫｏｄａｋ ＮＴＢ２核トラックエマルションに浸漬して４週間露出する。
【０１７１】
リボプローブ合成
６．０μｌ（１２５ｍＣｉ）の（Ａｍｅｒｓｈａｍ ＢＦ １００２， ＳＡ＜２０００ Ｃｉ／ｍｍｏｌ）をスピード真空乾燥させた。乾燥α−３３Ｐ ＵＴＰを含む各チューブに以下の成分を添加した：２．０ｍｌの５ｘ転写バッファー；１．０μｌのＤＴＴ（１００ｍＭ）；２．０μｌのＮＴＰ混合物（２．５ｍＭ： １０μ； １０ｍＭのＧＴＰ， ＣＴＰ ＆ ＡＴＰ＋１０μｌのＨ２Ｏ）；１．０μｌのＵＴＰ（５０μＭ）；１．０μｌのＲｎａｓｉｎ；１．０μｌのＤＮＡテンプレート（１μｇ）；１．０μｌのＨ２Ｏ
チューブを３７℃で１時間インキュベートし、１．０μｌのＲＱ１ＤＮａｓｅを添加し、次いで３７℃で１５分間インキュベートした。９０μｌのＴＥ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．６／１ｍＭのＥＤＴＡ ｐＨ８．０）を添加し、混合物をＤＥ８１紙にピペットした。残りの溶液をＭｉｃｒｏｃｏｎ−５０（商品名）限外濾過ユニットに添加し、プログラム１０を用いてスピンさせた（６分間）。濾過ユニットを第２のチューブ上に逆に装着し、プログラム２を用いてスピンさせた（３分間）。最終回収スピンの後、１００μｌのＴＥを添加した。１μｌの最終生成物をＤＥ８１紙にピペットし６ｍｌのＢｉｏｆｌｕｏｒ ＩＩ（商品名）中、Ｂｅｃｋｍａｎ ＬＳ５０００ ＴＤシンチレーションカウンターでカウントした。
プローブをＴＢＥ／尿素ゲル上で泳動させた。１−３μｌのプローブ又は５μｌのＲＮＡ ＭｒｋＩＩＩを３μｌの泳動用バッファーに添加した。加熱ブロック上で９５℃に３分間加熱した後、プローブを即座に氷上に置いた。ゲルのウェルをフラッシングし、試料を添加し、１８０−２５０ボルトで４５分間泳動した。ゲルをｓａｒａｎラップ中にラップし、−７０℃のフリーザー内で増感スクリーンと共にＸＡＲフィルムに１時間から終夜露出した。
【０１７２】
ハイブリダイゼーション
凍結切片の前処理。  スライドをフリーザーから取り出し、アルミニウムトレイに配置して室温で５分間解凍した。トレイを５５℃のインキュベータに５分間配置して凝結を減らした。スライドを蒸気フード内において４％パラホルムアルデヒド中で５分間固定し、０．５ｘＳＳＣで５分間室温で洗浄した（２５ｍｌ ２０ｘＳＳＣ ＋  ９７５ｍｌ  ＳＱ  Ｈ２Ｏ）。０．５μｇ／ｍｌのプロテイナーゼ中、３７℃で１０分間の脱タンパクの後（２５０ｍｌの予備加熱したＲＮａｓｅ不含ＲＮＡｓｅバッファー中の１０ｍｇ／ｍｌストック１２．５μｌ）、切片を０．５ ｘ ＳＳＣで１０分間室温で洗浄した。切片を、７０％、９５％、１００％エタノール中、各２分間脱水した。
パラフィン包埋切片の前処理。スライドを脱パラフィンし、ＳＱ Ｈ２Ｏ中に配置し、２ ｘ ＳＳＣで室温において各々５分間２回リンスした。切片を２０μｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫ（２５０ｍｌのＲＮａｓｅ無しＲＮａｓｅバッファー中１０ｍｇ／ｍｌを５００μｌ；３７℃、１５分間）−ヒト胎児又は８ ｘプロテイナーゼＫ（２５０ｍｌのＲＮａｓｅバッファー中１００μｌ、３７℃、３０分間）−ホルマリン組織で脱タンパクした。続く０．５ ｘ ＳＳＣでのリンス及び脱水は上記のように実施した。
【０１７３】
プレハイブリダイゼーション。  スライドをＢｏｘバッファー（４ ｘ ＳＳＣ、５０％ホルムアミド）−飽和濾紙で列を作ったプラスチックボックスに並べた。組織を５０μｌのハイブリダイゼーションバッファー（１０％硫酸デキストラン、５０％ホルムアミド、２Ｘ ＳＳＣ）で被覆し、４２℃で１−４時間インキュベートした。
ハイブリダイゼーション。  スライド当たり１．０ ｘ １０６ｃｐｍのプローブ及び１．０μｌのｔＲＮＡ（５０ ｍｇ／ｍｌストック）を９５℃で３分間加熱した。スライドを氷上で冷却し、スライド当たり４８μｌのハイブリダイゼーションバッファーを添加した。ボルテックスの後、５０μｌの３３Ｐ混合物をスライド上のプレハイブリッド５０μｌに添加した。スライドを５５℃で終夜インキュベートした。
洗浄。  洗浄は、２ ｘ ＳＳＣ、ＥＤＴＡで２ ｘ １０分間、室温で実施し（４００ｍｌの２０ ｘ ＳＳＣ＋１６ ｍｌの０．２５Ｍ  ＥＤＴＡ、Ｖｆ＝４Ｌ）、次いでＲＮａｓｅＡ処理を３７℃で３０分間行った（２５０ｍｌ ＲＮａｓｅバッファー中１０ｍｇ／ｍｌを５００μｌ＝２０μｇ／ｍｌ）。スライドを２ ｘ １０分間、ＥＤＴＡで室温において洗浄した。緊縮性洗浄条件は次の通り：５５℃で２時間、０．１ ｘ ＳＳＣ、ＥＤＴＡ（２０ｍｌの２０ｘＳＳＣ＋１６ｍｌのＥＤＴＡ、Ｖｆ＝４Ｌ）。
【０１７４】
ヒト及びチンプについての研究が、ＰＵＭＰＣｎの３’セグメントに対するプローブを用いて実施された。ＰＣＲプライマーは、（３３Ｐ）放射活性標識した一本鎖相補的リボプローブのインビトロにおける転写のためのテンプレートとして役立ち得る遺伝子部分を増幅するために設計された。センス（コントロール用）リボプローブは、正方向ＰＣＲプライマーの５’末端に付加されたＴ７プロモーターのための２７ヌクレオチド配列を認識する、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを用いる転写によって生成される。アンチセンス（実験用）リボプローブは、逆方向ＰＣＲプライマー５’末端に付加されたＴ３プロモーターのための２７ヌクレオチド配列を認識する、Ｔ３ＲＮＡポリメラーゼを用いる転写によって生成される。第一研究［ＩＳＨ２０００−１２１］ＰＵＭＰＣｎプローブは、ＤＮＡ１８５１７１−２９９４［配列番号１］のヌクレオチド１１４９−１５０３をカバーするように設計された。
正方向プライマー（配列番号９）：
５’ ＧＧＡＴＴＣＴＡＡＴ ＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴ ＡＴＡＧＧＧＣＣＴＧ ＣＴＴＡＣＣＧＡＴＣ ＡＧＡＡＧＧＴＣ ３’
逆方向プライマー（配列番号１０）：
５’ ＣＴＡＴＧＡＡＡＴＴ ＡＡＣＣＣＴＣＡＣＴ ＡＡＡＧＧＧＡＧＧＣ ＡＡＡＡＣＡＡＧＡＧ ＣＡＡＧＡＡＣＡ ３’
プローブ配列は：
５’ ＣＴＧＣＴＴＡＣＣＧＡＴＧＡＧＡＡＧＧＴＣＡＧＡＧＡＧＡＴＡＴＴＴＧＴＴＴＣＴＣＡＡＣＡＴＧＧＣＴＴＡＴＣＡＧＣＡＧＧＴＴＣＡＴＧＣＡＡＡＴＡＴＴＧＡＡＡＡＣＴＣＴＴＧＧＡＡＴＧＡＧＧＡＡＧＡＡＧＴＴＴＧＧＡＧＡＡＴＴＧＡＡＡＴＧＴＡＴＡＴＣＴＣＣＴＴＴＧＧＣＡＴＡＡＴＧＡＧＣＣＴＴＧＧＣＴＴＡＣＴＴＴＣＣＣＴＣＣＴＧＧＣＡＧＴＣＡＣＴＴＣＴＡＴＣＣＣＴＴＣＡＧＴＧＡＧＣＡＡＴＧＣＴＴＴＡＡＡＣＴＧＧＡＧＡＧＡＡＴＴＣＡＧＴＴＴＴＡＴＴＣＡＧＴＣＴＡＣＡＣＴＴＧＧＡＴＡＴＧＴＣＧＣＴＣＴＧＣＴＣＡＴＡＡＧＴＡＣＴＴＴＣＣＡＴＧＴＴＴＴＡＡＴＴＴＡＴＧＧＡＴＧＧＡＡＡＣＧＡＧＣＴＴＴＴＧＡＧＧＡＡＧＡＧＴＡＣＴＡＣＡＧＡＴＴＴＴＡＴＡＣＡＣＣＡＣＣＡＡＡＣＴＴＴＧＴＴＣＴＴ ＧＣＴＣＴＴＧＴＴＴＴＧＣＣ−３’（配列番号１１）
【０１７５】
ヒトに関する研究はＰＵＭＰＣｎの５’部分に対するプローブを用いて繰り返された。このプローブは該遺伝子の３’部分に対するプローブと同じ結果を与えた。この２番目の研究において用いられるプローブはＤＮＡ１８５１７１［配列番号１］のヌクレオチド１４−５６６をカバーするように設計された。
正方向プライマー（配列番号１２）：
５’ ＧＧＡＴＴＣＴＡＡＴ ＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴ ＡＴＡＧＧＧＣＡＴＧ ＧＡＡＣＡＧＴＡＴＡ ＴＧＧＡＡＡＧＣ ３’
逆方向プライマー（配列番号１３）：
５’ ＣＴＡＴＧＡＡＡＴＴ ＡＡＣＣＣＴＣＡＣＴ ＡＡＡＧＧＧＡＣＴＧ ＧＧＴＡＣＴＧＧＴＴ ＴＡＴＣＣＴＣ
プローブ配列は：５’ ＡＴＧＧＡＡＣＡＧＴＡＴＡＴＧＧＡＡＡＧＣＴＣＣＣＡＡＧＡＡＡＧＴＧＡＡＧＡＧＡＧＧＡＡＡＴＴＧＧＡＡＡＡＴＴＧＴＧＡＧＴＧＧＡＣＣＴＴＣＴＧＡＴＡＣＴＧＣＴＣＣＴＣＣＴＴＧＣＧＴＧＧＡＡＡＡＧＧＧＧＡＡＡＧＡＡＣＴＧＣＡＴＧＣＡＴＡＴＴＡＴＴＣＡＧＣＧＴＣＣＴＡＴＡＴＴＣＡＡＡＧＧＡＴＡＴＴＣＴＴＧＧＴＧＡＴＣＴＴＧＧＡＡＧＴＧＴＣＣＧＴＡＴＣＡＴＧＧＡＡＴＣＡＡＴＣＴＣＴＡＴＧＡＴＧＧＧＡＡＧＣＣＣＴＡＡＧＡＧＣＣＴＴＡＧＴＧＡＡＡＣＴＴＧＴＴＴＡＣＣＴＡＡＴＧＧＣＡＴＡＡＡＴＧＧＴＡＴＣＡＡＡＧＡＴＧＣＡＡＧＧＡＡＧＧＴＣＡＣＴＧＴＡＧＧＴＧＴＧＡＴＴＧＧＡＡＧＴＧＧＡＧＡＴＴＴＴＧＣＣＡＡＡＴＣＣＴＴＧＡＣＣＡＴＴＣＧＡＣＴＴＡＴＴＡＧＡＴＧＣＧＧＣＴＡＴＣＡＴＧＴＧＧＴＣＡＴＡＧＧＡＡＧＴＡＧＡＡＡＴＣＣＴＡＡＧＴＴＴＧＣＴＴＣＴＧＡＡＴＴＴＴＴＴＣＣＴＣＡＴＧＴＧＧＴＡＧＡＴＧＴＣＡＣＴＣＡＴＣＡＴＧＡＡＧＡＴＧＣＴＣＴＣＡＣＡＡＡＡＡＣＡＡＡＴＡＴＡＡＴＡＴＴＴＧＴＴＧＣＴＡＴＡＣＡＣＡＧＡＧＡＡＣＡＴＴＡＴＡＣＣＴＣＣＣＴＧＴＧＧＧＡＣＣＴＧＡＧＡＣＡＴＣＴＧＣＴＴＧＴＧＧＧＴＡＡＡＡＴＣＣＴＧＡＴＴＧＡＴＧＴＧＡＧＣＡＡＴＡＡＣＡＴＧＡＧＧＡＴＡＡＡＣＣＡＧＴＡＣＣＣＡＧ−３’（配列番号１４）
【０１７６】
結果
一連の良性の前立腺、原発性前立腺癌、及び転移性前立腺癌を含む組織パネル中；及び種々の部位由来の腫瘍アレイ中で、ＤＮＡ１８５１７１−２９９４の高い発現が認められる。ハイブリダイゼーションシグナルは、肺、大腸、膀胱、前立腺及び子宮内膜において見られる。種々の部位由来の正常組織のアレイ中で、ハイブリダイゼーションシグナルは前立腺線及び卵巣において認められる。全ての組織は同時にハイブリダイズされ；強度にはバラツキがあるものの、前立腺組織中でのシグナルは一貫しており、しばしば比較的非常に高かったことを付言しておく。
表４に、組織パネル中の相対的シグナル強度としてのＰＵＭＰＣｎ発現をまとめてある。一連の良性前立腺、原発性前立腺癌、及び転移性前立腺癌を含む組織パネル中で、ＤＮＡ１８５１７１−２９９４の高い発現が認められた。ハイブリダイゼーションシグナルは、正常前立腺中で認められた。前立腺組織のアレイ中で、最も高いシグナル強度はしばしば転移性腫瘍と関連づけられた。我々は、ＤＮＡ１８５１７１−２９９４及び前立腺組織でのみ高度に発現されることが既に示されているコントロール分子を定量した。発現レベルは、３３Ｐ標識ハイブリダイゼーションプローブのホスホイメージャー分析によって分析された。組織アレイの各エレメント由来のＤＮＡ１８５１７１−２９９４シグナルは、同じエレメント由来のコントロールシグナルで割った。ＤＮＡ１８５１７１−２９９４／コントロールの比率は、原発性癌の集団と比較して転移性癌の集団では３倍高かった。従って、ＤＮＡ１８５１７１−２９９４は、転移性腫瘍に対し、特に魅力的な標的となるだろう。
【０１７７】
2004524816.tif 000024
2004524816.tif 000025
【０１７８】
実施例１３
ＰＵＭＰＣｎに対するモノクローナル抗体
細胞株及びトランスフェクション−２９３細胞はヒト不死化胎児性腎臓細胞株（ＡＴＣＣ照会番号ＣＲＬ１５７３であり、ＰＣ−３はヒト前立腺癌細胞株（ＡＴＣＣ照会番号ＣＲＬ１４３５）、そしてＳＶ−Ｔ２はマウス胎児性線維芽細胞株である。生育条件はＡＴＣＣのガイドラインに従った。全ての細胞株に対し、１μｇ ＤＮＡ又は３μｇ ＤＮＡがＥｆｆｅｃｔｅｎｅ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて６−ウェル又は１０ ｃｍディッシュの中にそれぞれトランスフェクトされた。細胞はトランスフェクション後４８時間で回収又は固定された。
ｃＤＮＡコンストラクト−アミノ酸１−４５４を含む全長ＰＵＭＰＣｎ（ＤＮＡ＃１８５１７１）は、ＳＶ４０＃１８５１７１由来のブラント化されたＸｂａＩ／ＰｓｔＩ断片として、ｍｙｃエピトープを含むｐＣＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の修飾されたもののＥｃｏＲＶサイトにサブクローニングされた。アミノ酸１−１９４を含んだＭｙｃ ５’側ＰＵＭＰＣｎ及びアミノ酸１９３−４５４を含んだＭｙｃ ３’側ＰＵＭＰＣｎは、ＢａｍＨＩで切断されたｐＣＤＮＡ３ ｍｙｃ全長ＰＵＭＰＣｎに由来し、各々、ＢａｍＨＩによって切断されたｐＣＤＮＡ３ ｍｙｃにサブクローニングされるか又は元のベクター中へ再環状化した。全長ｇＤ ＰＵＭＰＣｎのコンストラクトは、そのアミノ末端にｇＤエピトープタグを有しアミノ酸１−４５４をコードし、ＸｈｏＩ／ＸｂａＩで切断したｇＤ ｖｅｃ８０６中へｐＣＤＮＡ３ ｍｙｃの全長ＰＵＭＰＣｎ由来のＳａｌ／ＸｂａＩ断片（ｍｙｃタグを除去したもの）をサブクローニングすることによって誘導された。タグ化されない全長ＰＵＭＰＣｎは、ＣＭＶプロモーターの制御下で、ｐＣＤＮＡ３．１−（Ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ）のＸｈｏＩ／ ＮｏｔＩ部位へｐＣＤＮＡ３ ｍｙｃ全長ＰＵＭＰＣｎ ＳａｌＩ／ＮｏｔＩ断片（ｍｙｃタグを除去したもの）をサブクローニングすることによって構築された。全てのコンストラクトは、ＡＢＩシークエンサーを用いたＤＮＡ配列決定により確認された。
【０１７９】
抗体及び免疫学的手法−メスのＢａｌｂ／ｃマウスを、ｍｅｔ， Ｌｙｓで始まりｔｒｐ， ａｒｇで終止するアミノ酸２５−２１３に相当するＮ末端断片［図２；配列番号２を参照のこと］で免疫した。マウスは、フットパッドの静脈内にインジェクトした。モノクローナルＡｂｓは、免疫用ペプチドに対するエライザによってスクリーニングされた。エライザでポジティブだったクローンは、更にウェスタンブロット分析及び免疫組織化学（ＩＨＣ）によって更にテストした。
ＬｎＣＡＰヒト前立腺癌細胞のフレッシュに凍結された切片、そしてホルマリン固定、パラフィン包埋された切片は、ＩＨＣにより調べられた。以前実施されたインサイツハイブリダイゼーションにおいて、ＬｎＣＡＰ細胞がＰＵＭＰＣｎ ｍＲＮＡの高いレベルを呈することを示したが、同等のレベルが前立腺癌種の組織切片で検出された。一次抗体として抗−ＰＵＭＰＣｎモノクローナルを用いたアビジン−ビオチン／ペルオキシダーゼ複合体法により、ＩＨＣが実施された。
ｍｙｃエピトープに対するモノクローナル抗体はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入した；ｇＤエピトープに対するモノクローナル抗体は、５Ｂ６ ｍＡｂ（Ｇｎｅｎｅｎｔｅｃｈ）である。ウェスタン分析に対して、あらかじめ成形されたゲル（Ｎｏｖｅｘ）を説明書に従って使用してＳＤＳ−ゲル電気泳動を行うことにより、およそ５０μｇの全可溶性タンパク質又は全細胞溶解物を分離し、ＰＶＤＦ膜にブロットした。可溶性タンパク質溶解物はトランスフェクトされた細胞を５倍容のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００バッファー［２０ｍＭ ｔｒｉｓ−ＨＣｌ， ｐＨ８．０， １％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００， １３７ｍＭ ＮａＣｌ， １０％グリセロール， １ｍＭ ＥＧＴＡ， １．５ｍＭ ＭｇＣｌ２， １ｍＭ ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ（ＤＴＴ）， １ｍＭ バナジン酸ナトリウム， ５０ｍＭ ＮａＦ， １ｍＭ Ｐｅｆａｂｌｏｃ， 各１０μｇ／ｍｌのアプロチニン， ペプスタチン及びロイペプチン］中に溶解させ、１４，０００ ｒｐｍで１０分間遠心することにより沈殿を除いた。全細胞溶解物は１ＸＳＤＳサンプルバッファーに直接溶解させることにより調製した。ウェスタンブロッティングにおいて、抗体は最終濃度２μｇ／ｍｌで使用し、ＥＣＬシステム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を用いて増感させた。固定された全細胞中のタグ化ＰＵＭＰＣｎの免疫蛍光検出は、カバーグラス上で生育させ、４％パラホルムアルデヒドで固定し、各エピトープタグに対するマウスモノクローナル抗体を用いて染色された２９３又はＰＣ−３細胞に対して実施された。該細胞は、ＦＩＴＣ又はＴｅｘａｓ Ｒｅｄ標識二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｓ）のいずれかにより視覚化され、核の検出のためにＤＡＰＩで同時染色した。
【０１８０】
２９３及びＰＣ−３細胞は６ウェルディッシュ中のカバースリップ上にプレーティングされ、Ｅｆｆｅｃｔｅｎｅを用いてｍｙｃでタグ化された全長ＰＵＭＰＣｎ、ｍｙｃ ＰＵＭＰＣｎ ５’， ｍｙｃ ＰＵＭＰＣｎ ３’， 及びｇＤ ＰＵＭＰＣｎでトランスフェクトされた。トランスフェクト後２４時間で、培地を交換し更に２４時間インキュベートした。細胞は、４％パラホルムアルデヒドを用いて室温で１０分間固定し、ＰＢＳで４回洗浄し、使用するまでホイル中、４℃にて保存した。カバースリップは抗−ｍｙｃ又は抗−ｇＤ反応活性に対し染色し、ＦＩＴＣ結合ロバ抗−マウス抗体を用いて視覚化した。
２９３， ＰＣ−３及びＳＶ−Ｔ２細胞が、Ｅｆｆｅｃｔｅｎｅを用いてｍｙｃでタグ化された全長ＰＵＭＰＣｎ、ｍｙｃ ＰＵＭＰＣｎ ５’， ｍｙｃ ＰＵＭＰＣｎ ３’， 及びｇＤ ＰＵＭＰＣｎでトランスフェクトされた。トランスフェクト後２４時間で、培地を交換し更に２４時間インキュベートした。トランスフェクトされた細胞は、上述のように溶解し、エピトープタグ化ＰＵＭＰＣｎの発現に関し解析された。
ＰＵＭＰＣｎ（アミノ酸２５−２１３）のＮ末端断片に対して調製されたモノクローナル抗体は、初めに免疫原として使用された組換体ＰＵＭＰＣｎとの結合についてテストされ、次に、以下の細胞株：２９３、ＳＷ４８０、Ｃｏｌｏ２０５、ＨＰＡＣ、ＳＷ７８０、ＬｕＣＡＰ及びＨＰＡＦＩＩ、から調製された基準化された細胞溶解物中の内在性ＰＵＭＰＣｎの存在についてテストされた。
結果
Ｎ末端断片アミノ酸２５−２１３に対して調製されたモノクローナル抗体は以下のものである：
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【０１８１】
ＩＨＣによってテストされたクローン（ハイブリドーマ細胞株）は、３２４８ （２Ｈ６．２．１）， ３２４９ （３Ａ９．２．１）， ３２５０ （３Ｂ４．２．１）， ３２５１ （３Ｈ９．１．１）， ３２５２ （５Ｄ１１．１．１）， ３２５３ （５Ｆ１２．１．１）， ３２５４ （５Ｇ９．１．１）， ３２５５ （６Ｂ４．１．１）， ３２５６ （７Ｂ６．２．１）であった。ＩＨＣは、ＭＡｂ ３２４８， ３２４９， ３２５１， ３２５３ 及び３２５５によるフレッシュに凍結された切片中のＬｎＣＡＰ細胞原形質膜に関連した中程度から強い免疫反応性を示した。ホルマリン固定、パラフィン包埋されたＬｕＣＡＰ細胞切片中で、ＭＡｂｓ３２４８及び３２４９は原形質膜に特異的に局在したポジティブな免疫反応性を示した。この膜局在化は、配列分析による予想した膜貫通構造と整合し、アクセス可能な治療標的としてのＰＵＭＰＣｎの妥当性を支持する。ここで記述されるモノクローナル抗体は、組織切片中のＰＵＭＰＣｎの局在及び発現レベルを示すために使用され得る。
上記実施例中の結果から、ＤＮＡ１８５１７１−２９９４に対する抗体及びハイブリダイゼーションプローブは、ＰＵＭＰＣｎを発現する腫瘍中のＤＮＡ１８５１７１−２９９４を検出するために有用である。そのまま又は細胞障害性剤と結合した抗体は、癌の治療において有用であるが、この癌は細胞表面上にＰＵＭＰＣｎを発現させ、特に前立腺癌である。他の場合において、転移性腫瘍が前立腺組織由来である場合、ＤＮＡ１８５１７１−２９９４に対する抗体及びハイブリダイゼーションプローブは、検出において有用である。さらなる場合において、ＤＮＡ１８５１７１−２９９４に対する抗体は、その後身体の他の部位へ転移する前立腺由来の腫瘍の治療において有用であろう。
【０１８２】
材料の寄託
次の材料をアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション， １０８０１  ユニバーシティ・ブルバード、マナッサス、バージニア２０１１０−２２０９米国（ＡＴＣＣ）へ寄託した：
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【０１８３】
これらの寄託は、特許手続き上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約及びその規則（ブダペスト条約）の規定に従って行われた。これは、寄託の日付から３０年間、寄託の生存培養物が維持されることを保証するものである。寄託物はブダペスト条約の条項に従い、またジェネンテク社とＡＴＣＣとの間の合意に従い、ＡＴＣＣから入手することができ、これは、何れが最初に来ようとも、関連した米国特許の発行時又は任意の米国又は外国特許出願の公開時に、寄託培養物の後代を永久かつ非制限的に入手可能とすることを保証し、米国特許法第１２２条及びそれに従う特許庁長官規則（特に参照番号８８６ＯＧ６３８の３７ＣＦＲ第１．１４条を含む）に従って権利を有すると米国特許庁長官が決定した者に子孫を入手可能とすることを保証するものである。
本出願の譲受人は、寄託した材料の培養物が、適切な条件下で培養されていた場合に死滅もしくは損失又は破壊されたならば、材料は通知時に同一の他のものと速やかに取り替えることに同意する。寄託物質の入手可能性は、特許法に従いあらゆる政府の権限下で認められた権利に違反して、本発明を実施するライセンスであるとみなされるものではない。
上記の文書による明細書は、当業者に本発明を実施できるようにするために十分であると考えられる。寄託した態様は、本発明のある側面の一つの説明として意図されており、機能的に等価なあらゆる作成物がこの発明の範囲内にあるため、寄託された作成物により、本発明の範囲が限定されるものではない。ここでの材料の寄託は、ここに含まれる文書による説明が、そのベストモードを含む、本発明の任意の側面の実施を可能にするために不十分であることを認めるものではないし、それが表す特定の例証に対して請求の範囲を制限するものと解釈されるものでもない。実際、ここに示し記載したものに加えて、本発明を様々に変形することは、前記の記載から当業者にとっては明らかなものであり、添付の請求の範囲内に入るものである。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、天然配列ＰＲＯ２３２０３をコードするヌクレオチド配列（ヌクレオチド１８８−１５４９）を含むｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：１）を示し、該ヌクレオチド配列（配列番号：１）は、ここで「ＤＮＡ１８５１７１−２９９４」として表されるクローンである。また、開始及び停止コドンのそれぞれの位置が、太文字及び下線で示されている。
【図２】図２は、配列番号：１のコード化配列に由来する天然配列ＰＲＯ２３２０３ポリペプチドのアミノ酸（配列番号：２）を示す。
【図３】図３は、ＤＮＡ１８５１７１−２９９４［実施例１に記載］に関するＧＥＰＩＳの結果を示す。組織のタイプは図の端に示されている。相対的存在量はＹ軸にプロットされ、有意ａな発現があるかどうか決定される。Ｘ軸は組織からヒットする状態、腫瘍（ＴＵＭ）、その他（ＯＴＨ）、非腫瘍組織（ＮＯＮ）、転移性（ＭＥＴ）、炎症性の（ＩＮＦ）をリスト化してある。
【図４ａ】図４ａは、実施例１１に記載されているように、幾つかのヒトｃＤＮＡライブラリー中の正常前立腺に関するＰＵＭＰＣｎの発現を示す。
【図４ｂ】図４ｂは、実施例１１に記載されているように、幾つかのヒトｃＤＮＡライブラリー中の正常前立腺に関するＰＵＭＰＣｎの発現を示す。
【図５】図５は、実施例１１に記載されているように、ヒトｃＤＮＡライブラリー中の腫瘍と正常組織間のＰＵＭＰＣｎ遺伝子の発現倍率差を示す。
【図６】図６は、「ＤＭ１」で示されるメイタンシノイドの構造を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４ａ】
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【図４ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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