(57)【要約】本発明は、膀胱平滑筋におけるＫＣＮＱカリウムチャネルの活性化による、不安定性膀胱および関連する膀胱疾患の治療に有用な化合物を選択するアッセイシステムおよび方法に関する。
2004529611.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
切迫性尿失禁、不安定性膀胱、膀胱の異常収縮、機能亢進性膀胱、反射亢進性膀胱、神経原性膀胱、または膀胱関連性感覚性切迫の治療、予防、または抑制のための化合物を選択する方法であって、
（ａ）宿主細胞において標的ＫＣＮＱタンパク質を発現させること；および、
（ｂ）該標的ＫＣＮＱタンパク質の活性を検出すること
を含む方法。
【請求項２】
宿主細胞が動物細胞である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
宿主細胞が哺乳動物の細胞である、請求項１記載の方法。
【請求項４】
宿主細胞がヒトの細胞である、請求項１記載の方法。
【請求項５】
宿主細胞がヒトの胎児の腎臓の細胞である、請求項１記載の方法。
【請求項６】
宿主細胞がＨＥＫ２９３またはＣＯＳ細胞である、請求項１記載の方法。
【請求項７】
膜電位を電気生理学的方法または蛍光法を用いて測定する、請求項１記載の方法。
【請求項８】
膀胱平滑筋中の標的ＫＣＮＱタンパク質に関して、膀胱平滑筋以外の組織中の他の標的ＫＣＮＱタンパク質に関するよりも少なくとも２倍大きな活性を示す化合物が選択される、請求項１記載の方法。
【請求項９】
膀胱平滑筋中の標的ＫＣＮＱタンパク質に関して、膀胱平滑筋以外の組織中の他の標的ＫＣＮＱタンパク質に関するよりも少なくとも１０倍大きな活性を示す化合物が選択される、請求項１記載の方法。
【請求項１０】
膀胱平滑筋中の標的ＫＣＮＱタンパク質に関して、膀胱平滑筋以外の組織中の他の標的ＫＣＮＱタンパク質に関するよりも少なくとも１００倍大きな活性を示す化合物が選択される、請求項１記載の方法。
【請求項１１】
膀胱平滑筋以外の組織中の他の標的ＫＣＮＱタンパク質に関して実質上影響を示さない化合物が選択される、請求項１記載の方法。
【請求項１２】
膀胱平滑筋中の標的ＫＣＮＱタンパク質に関して、非標的ＫＣＮＱタンパク質に関するよりも少なくとも２倍大きな活性を示す化合物が選択される、請求項１記載の方法。
【請求項１３】
膀胱平滑筋中の標的ＫＣＮＱタンパク質に関して、非標的ＫＣＮＱタンパク質に関するよりも少なくとも１０倍大きな活性を示す化合物が選択される、請求項１記載の方法。
【請求項１４】
膀胱平滑筋中の標的ＫＣＮＱタンパク質に関して、非標的ＫＣＮＱタンパク質に関するよりも少なくとも１００倍大きな活性を示す化合物が選択される、請求項１記載の方法。
【請求項１５】
非標的ＫＣＮＱタンパク質に関して実質上影響を示さない化合物が選択される、請求項１記載の方法。
【請求項１６】
膀胱平滑筋中の標的ＫＣＮＱタンパク質に関して、ＫＣＮＱタンパク質以外のカリウムチャネルを形成するタンパク質に関するよりも少なくとも２倍大きな活性を示す化合物が選択される、請求項１記載の方法。
【請求項１７】
膀胱平滑筋中の標的ＫＣＮＱタンパク質に関して、ＫＣＮＱタンパク質以外のカリウムチャネルを形成するタンパク質に関するよりも少なくとも１０倍大きな活性を示す化合物が選択される、請求項１記載の方法。
【請求項１８】
膀胱平滑筋中の標的ＫＣＮＱタンパク質に関して、ＫＣＮＱタンパク質以外のカリウムチャネルを形成するタンパク質に関するよりも少なくとも１００倍大きな活性を示す化合物が選択される、請求項１記載の方法。
【請求項１９】
ＫＣＮＱタンパク質以外のカリウムチャネルを形成するタンパク質に関して実質上影響を示さない化合物が選択される、請求項１記載の方法。
【請求項２０】
切迫性尿失禁、不安定性膀胱、膀胱の異常収縮、機能亢進性膀胱、反射亢進性膀胱、神経原性膀胱、または膀胱関連性感覚性切迫の治療、予防、または抑制のための化合物を選択する方法であって、
（ａ）宿主細胞において標的ＫＣＮＱチャネルを発現させること；および、
（ｂ）該標的ＫＣＮＱチャネルの活性を検出すること
を含む方法。
【請求項２１】
宿主細胞が動物細胞である、請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
宿主細胞が哺乳動物の細胞である、請求項２０記載の方法。
【請求項２３】
宿主細胞がヒトの細胞である、請求項２０記載の方法。
【請求項２４】
宿主細胞がヒトの胎児の腎臓の細胞である、請求項２０記載の方法。
【請求項２５】
宿主細胞がＨＥＫ２９３またはＣＯＳ細胞である、請求項２０記載の方法。
【請求項２６】
膜電位を電気生理学的方法または蛍光法を用いて測定する、請求項２０記載の方法。
【請求項２７】
膀胱平滑筋中の標的ＫＣＮＱタンパク質に関して、膀胱平滑筋以外の組織中の他の標的ＫＣＮＱタンパク質に関するよりも少なくとも２倍大きな活性を示す化合物が選択される、請求項２０記載の方法。
【請求項２８】
膀胱平滑筋中の標的ＫＣＮＱタンパク質に関して、膀胱平滑筋以外の組織中の他の標的ＫＣＮＱタンパク質に関するよりも少なくとも１０倍大きな活性を示す化合物が選択される、請求項２０記載の方法。
【請求項２９】
膀胱平滑筋中の標的ＫＣＮＱタンパク質に関して、膀胱平滑筋以外の組織中の他の標的ＫＣＮＱタンパク質に関するよりも少なくとも１００倍大きな活性を示す化合物が選択される、請求項２０記載の方法。
【請求項３０】
膀胱平滑筋以外の組織中の他の標的ＫＣＮＱタンパク質に関して実質上影響を示さない化合物が選択される、請求項２０記載の方法。
【請求項３１】
膀胱平滑筋中の標的ＫＣＮＱタンパク質に関する活性が、非標的ＫＣＮＱタンパク質に関するよりも少なくとも２倍大きな活性を示す化合物が選択される、請求項２０記載の方法。
【請求項３２】
膀胱平滑筋中の標的ＫＣＮＱタンパク質に関して、非標的ＫＣＮＱタンパク質に関するよりも少なくとも１０倍大きな活性を示す化合物が選択される、請求項２０記載の方法。
【請求項３３】
膀胱平滑筋中の標的ＫＣＮＱタンパク質に関して、非標的ＫＣＮＱタンパク質に関するよりも少なくとも１００倍大きな活性を示す化合物が選択される、請求項２０記載の方法。
【請求項３４】
非標的ＫＣＮＱタンパク質に関して実質上影響を示さない化合物が選択される、請求項２０記載の方法。
【請求項３５】
膀胱平滑筋中の標的ＫＣＮＱタンパク質に関して、ＫＣＮＱタンパク質以外のカリウムチャネルを形成するタンパク質に関するよりも少なくとも２倍大きな活性を示す化合物が選択される、請求項２０記載の方法。
【請求項３６】
膀胱平滑筋中の標的ＫＣＮＱタンパク質に関して、ＫＣＮＱタンパク質以外のカリウムチャネルを形成するタンパク質に関するよりも少なくとも１０倍大きな活性を示す化合物が選択される、請求項２０記載の方法。
【請求項３７】
膀胱平滑筋中の標的ＫＣＮＱタンパク質に関して、ＫＣＮＱタンパク質以外のカリウムチャネルを形成するタンパク質に関するよりも少なくとも１００倍大きな活性を示す化合物が選択される、請求項２０記載の方法。
【請求項３８】
ＫＣＮＱタンパク質以外のカリウムチャネルを形成するタンパク質に関して実質上影響を示さない化合物が選択される、請求項２０記載の方法。
【請求項３９】
切迫性尿失禁、不安定性膀胱、膀胱の異常収縮、機能亢進性膀胱、反射亢進性膀胱、神経原性膀胱、または膀胱関連性感覚性切迫の治療、予防、または抑制のための化合物を選択する方法であって、
（ａ）宿主細胞中で標的ＫＣＮＱチャネルを組換え発現させること、
（ｂ）物質の存在または不在下で宿主細胞の膜電位を測定すること、
（ｃ）その存在が宿主細胞の過分極を引き起こす化合物を選択すること
を含む方法。
【請求項４０】
宿主細胞が動物細胞である、請求項３９記載の方法。
【請求項４１】
宿主細胞が哺乳動物の細胞である、請求項３９記載の方法。
【請求項４２】
宿主細胞がヒトの細胞である、請求項３９記載の方法。
【請求項４３】
宿主細胞がヒトの胎児の腎臓の細胞である、請求項３９記載の方法。
【請求項４４】
宿主細胞がＨＥＫ２９３またはＣＯＳ細胞である、請求項３９記載の方法。
【請求項４５】
膜電位を電気生理学的方法または蛍光法を用いて測定する、請求項３９記載の方法。
【請求項４６】
膀胱平滑筋中の標的ＫＣＮＱタンパク質に関して、膀胱平滑筋以外の組織中の他の標的ＫＣＮＱタンパク質に関するよりも少なくとも２倍大きな活性を示す化合物が選択される、請求項３９記載の方法。
【請求項４７】
膀胱平滑筋中の標的ＫＣＮＱタンパク質に関して、膀胱平滑筋以外の組織中の他の標的ＫＣＮＱタンパク質に関するよりも少なくとも１０倍大きな活性を示す化合物が選択される、請求項３９記載の方法。
【請求項４８】
膀胱平滑筋中の標的ＫＣＮＱタンパク質に関して、膀胱平滑筋以外の組織中の他の標的ＫＣＮＱタンパク質に関するよりも少なくとも１００倍大きな活性を示す化合物が選択される、請求項３９記載の方法。
【請求項４９】
膀胱平滑筋以外の組織中の他の標的ＫＣＮＱタンパク質に関して実質上影響を示さない化合物が選択される、請求項３９記載の方法。
【請求項５０】
膀胱平滑筋中の標的ＫＣＮＱタンパク質に関して、非標的ＫＣＮＱタンパク質に関するよりも少なくとも２倍大きな活性を示す化合物が選択される、請求項３９記載の方法。
【請求項５１】
膀胱平滑筋中の標的ＫＣＮＱタンパク質に関して、非標的ＫＣＮＱタンパク質に関するよりも少なくとも１０倍大きな活性を示す化合物が選択される、請求項３９記載の方法。
【請求項５２】
膀胱平滑筋中の標的ＫＣＮＱタンパク質に関して、非標的ＫＣＮＱタンパク質に関するよりも少なくとも１００倍大きな活性を示す化合物が選択される、請求項３９記載の方法。
【請求項５３】
非標的ＫＤＮＱタンパク質に関して実質上影響を示さない化合物が選択される、請求項３９記載の方法。
【請求項５４】
膀胱平滑筋中の標的ＫＣＮＱタンパク質に関して、ＫＣＮＱタンパク質以外のカリウムチャネルを形成するタンパク質に関するよりも少なくとも２倍大きな活性を示す化合物が選択される、請求項３９記載の方法。
【請求項５５】
膀胱平滑筋中の標的ＫＣＮＱタンパク質に関して、ＫＣＮＱタンパク質以外のカリウムチャネルを形成するタンパク質に関するよりも少なくとも１０倍大きな活性を示す化合物が選択される、請求項３９記載の方法。
【請求項５６】
膀胱平滑筋中の標的ＫＣＮＱタンパク質に関して、ＫＣＮＱタンパク質以外のカリウムチャネルを形成するタンパク質に関するよりも少なくとも１００倍大きな活性を示す化合物が選択される、請求項３９記載の方法。
【請求項５７】
ＫＣＮＱタンパク質以外のカリウムチャネルを形成するタンパク質に関して実質上影響を示さない化合物が選択される、請求項３９記載の方法。
【請求項５８】
（ａ）血液−脳関門を横切らない化合物を選択すること、
（ｂ）膀胱平滑筋中の標的ＫＣＮＱタンパク質を調節する能力に関してこれらの化合物を試験すること、
（ｃ）膀胱平滑筋以外の組織中の他の標的ＫＣＮＱタンパク質に関するよりも少なくとも大きな、膀胱平滑筋中の標的ＫＣＮＱタンパク質を調節する能力を示す化合物を選択すること
を含む、化合物を選択する方法。
【請求項５９】
選択される化合物が、膀胱平滑筋以外の組織中の他の標的ＫＣＮＱタンパク質に関するよりも少なくとも２倍大きな、膀胱平滑筋中の標的ＫＣＮＱタンパク質を調節する能力を示す、請求項５８記載の方法。
【請求項６０】
選択される化合物が、膀胱平滑筋以外の組織中の他の標的ＫＣＮＱタンパク質に関するよりも少なくとも１０倍大きな、膀胱平滑筋中の標的ＫＣＮＱタンパク質を調節する能力を示す、請求項５８記載の方法。
【請求項６１】
選択される化合物が、膀胱平滑筋以外の組織中の他の標的ＫＣＮＱタンパク質に関するよりも少なくとも１００倍大きな、膀胱平滑筋中の標的ＫＣＮＱタンパク質を調節する能力を示す、請求項５８記載の方法。
【請求項６２】
選択される化合物が、膀胱平滑筋以外の組織中の他の標的ＫＣＮＱタンパク質に関して実質上影響を示さない、請求項５８記載の方法。
【請求項６３】
（ａ）血液−脳関門を横切らない化合物を選択すること、
（ｂ）膀胱平滑筋において標的ＫＣＮＱタンパク質を調節する能力に関してこれらの化合物を試験すること、
（ｃ）非標的ＫＣＮＱタンパク質に関するよりも大きな、膀胱平滑筋中の標的ＫＣＮＱタンパク質を調節する能力を示す化合物を選択すること
を含む、化合物を選択する方法。
【請求項６４】
選択される化合物が、非標的ＫＣＮＱタンパク質に関するよりも少なくとも２倍大きな、膀胱平滑筋中の標的ＫＣＮＱタンパク質を調節する能力を示す、請求項６３記載の方法。
【請求項６５】
選択される化合物が、非標的ＫＣＮＱタンパク質に関するよりも少なくとも１０倍大きな、膀胱平滑筋中の標的ＫＣＮＱタンパク質を調節する能力を示す、請求項６３記載の方法。
【請求項６６】
選択される化合物が、非標的ＫＣＮＱタンパク質に関するよりも少なくとも１００倍大きな、膀胱平滑筋中の標的ＫＣＮＱタンパク質を調節する能力を示す、請求項６３記載の方法。
【請求項６７】
選択される化合物が非標的ＫＣＮＱタンパク質に関して実質上影響を示さない、請求項６３記載の方法。
【請求項６８】
（ａ）血液−脳関門を横切らない化合物を選択すること；
（ｂ）膀胱平滑筋中の標的ＫＣＮＱタンパク質を調節する能力に関してこれらの化合物を試験すること；
（ｃ）ＫＣＮＱタンパク質以外のカリウムチャネルを形成するタンパク質よりも大きな、膀胱平滑筋中の標的ＫＣＮＱタンパク質を調節する能力を示す化合物を選択すること；
を含む、化合物を選択する方法。
【請求項６９】
選択される化合物が、ＫＣＮＱタンパク質以外のカリウムチャネルを形成するタンパク質よりも少なくとも２倍大きな、標的ＫＣＮＱタンパク質を調節する能力を示す、請求項６８記載の方法。
【請求項７０】
選択される化合物が、ＫＣＮＱタンパク質以外のカリウムチャネルを形成するタンパク質よりも少なくとも１０倍大きな、標的ＫＣＮＱタンパク質を調節する能力を示す、請求項６８記載の方法。
【請求項７１】
選択される化合物が、ＫＣＮＱタンパク質以外のカリウムチャネルを形成するタンパク質よりも少なくとも１００倍大きな、標的ＫＣＮＱタンパク質を調節する能力を示す、請求項６８記載の方法。
【請求項７２】
選択される化合物がＫＣＮＱタンパク質以外のカリウムチャネルを形成するタンパク質に関して実質上影響を示さない、請求項６８記載の方法。
【請求項７３】
不安定性膀胱の治療のための、動物の膀胱平滑筋において標的ＫＣＮＱタンパク質を選択的に活性化する方法であって、膀胱平滑筋中の標的ＫＣＮＱタンパク質を選択的に活性化する化合物の治療的有効量を動物に投与することを含む方法。
【請求項７４】
化合物が、膀胱平滑筋中の標的ＫＣＮＱタンパク質を、膀胱平滑筋以外の組織中の他の標的ＫＣＮＱタンパク質よりも少なくとも２倍大きく活性化する、請求項７３記載の方法。
【請求項７５】
化合物が、膀胱平滑筋中の標的ＫＣＮＱタンパク質を、膀胱平滑筋以外の組織中の他の標的ＫＣＮＱタンパク質よりも少なくとも１０倍大きく活性化する、請求項７３記載の方法。
【請求項７６】
化合物が、膀胱平滑筋中の標的ＫＣＮＱタンパク質を、膀胱平滑筋以外の組織中の他の標的ＫＣＮＱタンパク質よりも少なくとも１００倍大きく活性化する、請求項７３記載の方法。
【請求項７７】
化合物が膀胱平滑筋中の標的ＫＣＮＱタンパク質を活性化し、そして、膀胱平滑筋以外の組織中の他の標的ＫＣＮＱタンパク質に関して実質上影響を示さない、請求項７３記載の方法。
【請求項７８】
化合物が、膀胱平滑筋中の標的ＫＣＮＱタンパク質を、非標的ＫＣＮＱタンパク質に関するよりも少なくとも２倍大きく活性化する、請求項７３記載の方法。
【請求項７９】
化合物が、膀胱平滑筋中の標的ＫＣＮＱタンパク質を、非標的ＫＣＮＱタンパク質に関するよりも少なくとも１０倍大きく活性化する、請求項７３記載の方法。
【請求項８０】
化合物が、膀胱平滑筋中の標的ＫＣＮＱタンパク質を、非標的ＫＣＮＱタンパク質に関するよりも少なくとも１００倍大きく活性化する、請求項７３記載の方法。
【請求項８１】
化合物が膀胱平滑筋中の標的ＫＣＮＱタンパク質を活性化し、そして非標的ＫＣＮＱタンパク質に関して実質上影響を示さない、請求項７３記載の方法。
【請求項８２】
化合物が、膀胱平滑筋中の標的ＫＣＮＱタンパク質を、ＫＣＮＱタンパク質以外のカリウムチャネルを形成するタンパク質よりも少なくとも２倍大きく活性化する、請求項７３記載の方法。
【請求項８３】
化合物が、膀胱平滑筋中の標的ＫＣＮＱタンパク質を、ＫＣＮＱタンパク質以外のカリウムチャネルを形成するタンパク質よりも少なくとも１０倍大きく活性化する、請求項７３記載の方法。
【請求項８４】
化合物が、膀胱平滑筋中の標的ＫＣＮＱタンパク質を、ＫＣＮＱタンパク質以外のカリウムチャネルを形成するタンパク質よりも少なくとも１００倍大きく活性化する、請求項７３記載の方法。
【請求項８５】
化合物が、膀胱平滑筋中の標的ＫＣＮＱタンパク質を活性化し、そして、ＫＣＮＱタンパク質以外のカリウムチャネルを形成するタンパク質に関して実質上影響を示さない、請求項７３記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、薬化学および泌尿器学の分野、および泌尿器疾患の治療に有用な化合物を選択する方法、および、該泌尿器疾患の治療法、およびより詳細には、膀胱平滑筋におけるＫＣＮＱカリウムチャネルの活性化により、不安定性膀胱および関連する膀胱疾患の治療に有用な化合物を選択することに関するアッセイシステムおよび方法に関する。
【０００２】
本発明は、膀胱平滑筋においてＫＣＮＱカリウムチャネルを活性化することによる不安定性膀胱の治療法にも関する。本発明は、カリウムまたはＭチャネルのＫＣＮＱファミリーを調節する化合物、特に、チャネルを開放または作動する（ａｇｏｎｉｚｅ）化合物を用いて膀胱組織を調節する新規方法にも関する。本発明の方法には、不安定性膀胱、神経原性膀胱、排尿機能不全、機能亢進性膀胱、反射亢進性膀胱または排尿筋過活動としても知られる切迫性尿失禁の治療、予防、抑制および緩和が含まれる。本発明の方法には、前立腺肥大などの二次疾患に伴うものを含むストレス性および切迫性混合性尿失禁の予防および治療も含まれる。
【０００３】
（発明の背景）
膜通過性電流は、興奮性組織の活性化および機能化において重要な役割を果たす。泌尿器膀胱平滑筋において、脱分極、興奮性の収縮、および再分極は、電圧依存的イオンチャネルを経る膜貫通電流の活性化に依存する。排尿平滑筋における再分極の基礎をなす電流は、実質上全て、電荷キャリアとしてカリウムを利用するいくつかのイオンチャネルにより伝達される。これらには、過渡電流である、４−アミノピリジン感受性電流（Ｆｕｊｉｉ Ｋ， Ｆｏｓｔｅｒ ＣＤ， Ｂｒａｄｉｎｇ ＡＦ ａｎｄ Ｐａｒｅｋｈ ＡＢ． カリウムチャネルブロッカーおよびモルモットの膀胱の平滑筋におけるクロマカリム（ｃｒｏｍａｋａｌｉｍ）の効果 Ｂｒ Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ ９９： ７７９−７８５， １９９０）、遅延整流（Ｋｌｏｃｋｎｅｒ， Ｕ． ａｎｄ Ｉｓｅｎｂｅｒｇ， Ｇ． セシウムを添加した単離平滑筋細胞（モルモットの泌尿器膀胱）のカルシウム電流。Ｐｆｌｕｇｅｒｓ Ａｒｃｈ４０５： ３４０−３４８， １９８５）、ＡＴＰ依存性電流（Ｂｏｎｅｖ ＡＤ ａｎｄ Ｎｅｌｓｏｎ ＭＴ． モルモットの泌尿器膀胱からの平滑筋肉中のＡＴＰ感受性カリウムチャネル。Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ ２６４（Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ ３３）： Ｃ１１９０−Ｃ１２００，１９３３； Ｔｒｉｖｅｄｉ Ｓ， Ｓｔｅｔｚ ＳＬ， Ｐｏｔｔｅｒ−Ｌｅｅ Ｌ， ＭｃＣｏｎｖｉｌｌｅ Ｍ， Ｌｉ ＪＨ， Ｅｍｐｆｉｅｌｄ Ｊ， Ｏｈｎｍａｃｈｔ ＣＪ， Ｒｕｓｓｅｌｌ Ｋ， Ｂｒｏｗｎ ＦＪ， Ｔｒａｉｎｏｒ ＤＡ ｅｔ ａｌ．． ＺＤ６１６９のＫ−チャネル開放活性：膀胱平滑筋における８６Ｒｂの流出および３Ｈ−Ｐ１０７５の結合の効果。Ｐｈａｒｍａｃｏｌ ５０： ３８８−３９７， １９９４）、および大きなコンダクタンスのカルシウム依存性カリウム電流（ＢＫＣａ）と一致するカリブドトキシン（ｃｈａｒｙｂｄｏｔｏｘｉｎ）感受性電流（Ｚｏｇｒａｆｏｓ Ｐ， Ｌｉ ＪＨ ａｎｄ Ｋａｕ ＳＴ． モルモットからの排尿筋および門脈静脈片におけるＫ＋チャネルモジュレーターのインビトロ効果の比較。Ｐｈａｒｍａｃｏｌ ４５： ２１６−２３０， １９９２）が含まれる。これらのチャネルのいくつかは、平滑筋および他の組織の生理および機能を調節することを目的とする化合物および薬物の標的である（Ｅｄｗａｒｄｓ， Ｇ． ａｎｄ Ｗｅｓｔｏｎ， Ａ．Ｈ．： カリウムチャネルオープナーの薬理学。Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ Ｄｒｕｇｓ ａｎｄ Ｔｈｅｒ ９： １８５−１９３， １９９５）。
【０００４】
カリウムチャネルオープナー（ＫＣＯ）が、排尿筋過活動の治療に有用である可能性のあることが示唆されている（Ｆｏｓｔｅｒ ＤＣ ａｎｄ Ｂｒａｄｉｎｇ ＡＦ． モルモットの膀胱中のＢＲＬ３４９１５活性化カリウムチャネルにおけるカリウムチャネルアンタゴニストの効果。Ｂｒ Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ ９２： ７５１， １９８７）。カリウムチャネルの透過性の増加により細胞が脱分極化し、膜電位がカリウムチャネルの活性化のための閾値から離れたものとなり、そして興奮が低下する（Ｂｒａｄｉｎｇ ＡＦ．泌尿器膀胱平滑筋におけるイオンチャネル、および収縮活性のコントロール。Ｊａｐ Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ ５８ Ｓｕｐｐｌ ２： １２０Ｐ−１２７Ｐ， １９９２）。多くのカリウムチャネルオープナーが単離組織において（Ｆｕｊｉｉ ｅｔ ａｌ．， １９９０； Ｍａｌｍｇｒｅｎ Ａ， Ａｎｄｅｒｓｓｏｎ ＫＥ， Ａｎｄｅｒｓｓｏｎ ＰＯ， Ｆｏｖａｅｕｓ Ｍ ａｎｄ Ｓｊｏｇｒｅｎ Ｃ．クロマカリム（ＢＲＬ３４９１５）およびピナシジルの、正常および肥大ラットの排尿筋におけるインビトロでの効果。Ｊ Ｕｒｏｌ １４３： ８２８−８３４， １９９０； Ｇｒａｎｔ ＴＬ ａｎｄ Ｚｕｚａｃｋ ＪＳ． Ｋ＋チャネルブロッカーおよびクロマカリム（ＢＲＬ３４９１５）の、モルモット排尿平滑筋のメカニカル活性における効果。Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｅｘｐ Ｔｈｅｒａ ２６９（３）： １１５８−１１６４， １９９１）および実験的（Ｆｏｓｔｅｒ ａｎｄ Ｂｒａｄｉｎｇ， １９８７； Ｍａｌｍｇｒｅｎ Ａ， Ａｎｄｅｒｓｓｏｎ ＫＥ， Ｓｊｏｇｒｅｎ Ｃ ａｎｄ Ａｎｄｅｒｓｓｏｎ ＰＯ． ピナシジルおよびクロマカリム（ＢＲＬ３４９１５）の、不安定性膀胱のラットの膀胱機能における効果。Ｊ Ｕｒｏｌ １４２： １１３４−１１３８， １９８９； Ｗｏｊｄａｎ Ａ， Ｆｒｅｅｄｅｎ Ｃ， Ｗｏｏｄｓ Ｍ， Ｎｏｒｔｏｎ Ｗ． Ｗａｒｇａ Ｄ， Ｓｐｉｎｅｌｌｉ Ｗ， Ｃｏｌａｔｓｋｙ Ｔ， Ａｎｔａｎｅ Ｍ， Ａｎｔａｎｅ Ｓ， Ｂｕｔｅｒａ Ｊ ａｎｄ Ａｒｇｅｎｔｉｅｒｉ ＴＭ． カリウムチャネルオープナーＺＤ６１６９、セリカリムおよびＷＡＹ−１３３５３７の、ラットの単離膀胱組織およびインビボ不安定性膀胱における比較。Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｅｘｐ Ｔｈｅｒａｐ ２８９： １４１０−１４１８， １９９９）ならびに臨床的（Ｎｕｒｓｅ ｅｔ ａｌ， １９９１）両不安定性膀胱において効果を示している。しかし、これらの化合物は血管平滑筋中のチャネルをも活性化する（血管拡張を引き起こす）ので、臨床における有用性は、低血圧および頻脈を含む血流力学的副作用により厳しく制限されている。
【０００５】
レチガビン（Ｎ−［２−アミノ−４−（４−フルオロベンジルアミノ）−フェニル］カルバミン酸エチルエステル）は、大部分ＫＣＮＱ２／３および／またはＫＣＮＱ３／５であることが多い、膀胱中のカリウムチャネルのＫＣＮＱファミリーのメンバーを活性化することが既に記載されている（Ｗｉｃｋｅｎｄｅｎ Ａ．Ｄ．， Ｙｕ， Ｗ．， Ｚｏｕ， Ａ．， Ｊｅｇｌａ， Ｔ．， ＆ Ｗａｇｏｎｅｒ， Ｐ．Ｋ．． 新規な抗痙攣薬であるレチガビンは、ＫＣＮＱ２／Ｑ３カリウムチャネルの活性を高める。Ｍａｌｅｃ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ ５８： ５９１−６００ （２０００）； Ｗｉｃｋｅｎｄｅｎ， Ａ．Ｄ．， Ｚｏｕ， Ａ．， Ｗａｇｏｎｅｒ， Ｐ．Ｋ．， ＆ Ｊｅｌａ， Ｔ．． 哺乳動物細胞において発現されるＫＣＮＱ５／Ｑ３カリウムチャネルの特徴。Ｂｒ Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ １３２： ３８１−３８４ （２００１）； Ｒｕｎｄｆｅｌｄｔ， Ｃ．， Ｎｅｔｚｅｒ， Ｒ． 新規な抗痙攣剤レチガビンは、ヒトＫＣＮＱ２／３サブユニットでトランスフェクトしたチャニーズハムスター卵巣細胞においてＭ−電流を活性化する。Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｌｅｔｔｅｒｓ ２８２： ７３−７６ （２０００）； Ｍａｉｎ， Ｍ．Ｊ．， Ｃｒｙａｎ， Ｊ．Ｅ．， Ｄｕｐｅｒｅ， Ｊ．Ｒ．Ｂ．， Ｃｏｘ， Ｂ．， Ｃｌａｒｅ， Ｊ．Ｊ． ＆ Ｂｕｒｂｉｄｇｅ， Ｓ．Ａ． 新規抗痙攣剤レチガビンによるＫＣＮＱ２／カリウムチャネルの調節。Ｍｏｌｅｃ Ｐｈａｒｍ ５８： ２５３−２６２ （２０００））。結果は、膀胱平滑筋の収縮の阻害である。加えて、近年のデータは、ヒトの膀胱平滑筋におけるＫＣＮＱ４の存在の証拠を提供している。ＫＣＮＱ４に関する最新の知識は、それがそれ自体で機能的イオンチャネルを形成し得ること（Ｓｏｇａａｒｄ Ｓ， Ｌｊｕｎｇｓｔｒｏｎ Ｔ， Ｐｅｒｅｒｓｅｎ ＫＡ， Ｏｌｅｓｅｎ ＳＰ， Ｊｅｎｓｅｎ， ＢＳ． 哺乳動物細胞において発現されるＫＣＮＱ４チャネル：機能特性および薬理学。ＡＭ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ ２８０： Ｃ８５９−Ｃ８６６， ２００１）、またはそれがＫＣＮＱ３と結合し得ること（Ｋｕｂｉｓｃｈ Ｃ． Ｓｃｈｒｏｅｄｅｒ ＢＣ． Ｆｒｉｅｄｒｉｃｈ Ｔ． Ｌｕｔｊｏｈａｎｎ Ｂ． Ｅｌ−Ａｍｒａｏｕｉ Ａ． Ｍａｒｌｉｎ Ｓ． Ｐｅｔｉｔ Ｃ． Ｊｅｎｔｓｃｈ ＴＪ． 感覚外有毛細胞において発現される新規なカリウムチャネルであるＫＣＮＱ４は、優性遺伝の難聴患者において変異している。Ｃｅｌｌ ９６（３）： ４３７−４４６， １９９９）を示唆している。それゆえ、膀胱平滑筋におけるレチガビンの効果には、ＫＣＮＱ２／３およびＫＣＮＱ３／５により形成されるチャネルに加えて、ＫＣＮＱ４チャネルの活性化が含まれる。このチャネルの活性化により膀胱平滑筋細胞が過分極化され、次いでそうした場合に膀胱を弛緩する。これらのＫＣＮＱチャネルは心血管系には存在しないので、レチガビンおよびこれらのチャネルを活性化する他の分子は不安定性膀胱の治療に有用であり、血液動態は損なわない。
【０００６】
Ｍ−電流は、細胞の興奮の決定因子として重要な機能的役割を果たすことが示されている。近年の証拠は、ＫＣＮＱカリウムチャネルサブユニットが種々の組織においてＭ電流の活性の分子的基礎を形成することを示している。末梢交感神経における最初の報告によれば、遺伝子ファミリーは進化して、ＫＣＮＱ１〜ＫＣＮＱ５と指定される少なくとも５つの主要なサブユニットを含んでいる（Ｒｏｇｏｗｓｋｉ， Ｍ．Ａ． ＫＣＮＱ２／ＫＣＮＱ３Ｋ＋チャネルおよび癲癇の分子病因：治療との関連。ＴＩＮＳ ２３： ３９３−３９８， （２０００）； Ｊｅｎｔｓｃｈ， Ｔ．Ｊ． ニューロンＫＣＮＱカリウムチャネル；疾患に関する生理学および役割、Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖ， （２０００）におけるレビューを参照されたい）。これらのサブユニットは共に集合して、ヘテロメリックおよびホモメリックな機能性イオンチャネルを形成することが示されている。近年の報告は、両ＫＣＮＱ２およびＫＣＮＱ５がＫＣＮＱ３と集合して（Ｔｉｎｅｌ， Ｎ．， Ｌａｕｒｉｔｚｅｎ， Ｉ．， Ｃｈｏｕａｂｅ， Ｃ．， Ｌａｚｄｕｎｓｋｉ， Ｍ．， Ｂｏｒｓｏｔｔｏ， Ｍ．． ＫＣＮＱ２カリウムチャネル：スプライス変種、機能的および発生における発現。脳での位置測定およびＫＣＮＱ３との比較。ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ． ４３８： １７１−１７６（１９９８）； Ｙａｎｇ， Ｗ．， Ｐ．， Ｌｅｖｅｓｑｕｅ， Ｐ．，Ｃ．， Ｌｉｔｔｅｌｅ， Ｗ．， Ａ．， Ｃｏｎｄｅｒ， Ｍ．， Ｌ．， Ｒａｍａｋｒｉｓｈｎａｎ， Ｐ．， Ｎｅｕｂａｕｅｒ， Ｍ．， Ｇ．， Ｂｌａｎａｒ， Ｍ．， Ａ．． 遺伝性突発性癲癇の原因である２つのＫｖＬＱＴ１関連カリウムチャネルの機能性発現。Ｊ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ． ２７３： １９４１９−１９４２３ （１９９８）； Ｗａｎｇ， Ｈ．Ｓ．， Ｐａｎ， Ｚ．， Ｓｈｉ， Ｗ．， Ｂｒｏｗｎ， Ｂ．Ｓ．， Ｗｙｍｏｒｅ， Ｒ．Ｓ．， Ｃｏｈｅｎ， Ｉ．Ｓ．， Ｄｉｘｏｎ， Ｊ．Ｅ． ＆ ＭｃＫｉｎｎｏｎ， Ｄ． ＫＣＮＱ２およびＫＣＮＱ３カリウムチャネルサブユニット；Ｍ−チャネルの分子的関連物。Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８２： １８９０−１８９３， （１９９８）； Ｌｅｒｃｈｅ， Ｃ．， Ｓｃｈｅｒｅｒ， Ｃ．Ｒ． Ｓｅｅｂｏｈｍ， Ｇ．， Ｄｅｒｓｔ， Ｃ．， Ｗｅｉ， Ａ．Ｄ．， Ｂｕｓｃｈ， Ａ． Ｅ．， Ｓｔｅｉｎｍｅｙｅｒ， Ｋ． Ｊ Ｂｉｏｌｏｇｉｃ Ｃｈｅｍ （２０００）； Ｓｃｈｒｏｅｄｅｒ， Ｂ．， Ｃ．， Ｈｅｃｈｅｎｂｅｒｇｅｒ， Ｍ．， Ｗｅｉｎｒｅｉｃｈ， Ｆ．， Ｋｕｂｉｓｃｈ， Ｃ．， Ｊｅｎｔｓｃｈ， Ｔ．， Ｊ．． 脳で広く発現される新規カリウムチャネルはＭ−タイプの電流を媒介する。［Ｊｏｕｎａｌ Ａｒｔｉｃｌｅ］ Ｊ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．， ２７５： ２４０８９−２４０９５ （２０００）））、レチガビンにより活性化されることができる機能性Ｍチャネルを形成し（Ｗｉｃｋｅｎｄｅｎ Ａ．Ｄ．， Ｙｕ， Ｗ．， Ｚｏｕ， Ａ．， Ｊｅｇｌａ， Ｔ．， ＆ Ｗａｇｏｎｅｒ， Ｐ．Ｋ．． 新規な抗痙攣剤であるレチガビンは、ＫＣＮＱ２／Ｑ３カリウムチャネルの活性化を高める。Ｍｏｌｅｃ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ ５８： ５９１−６００ （２０００）； Ｗｉｃｋｅｎｄｅｎ， Ａ．Ｄ．��� Ｚｏｕ， Ａ．， Ｗａｇｏｎｅｒ， Ｐ．Ｋ．， ＆ Ｊｅｌａ， Ｔ．． 哺乳動物細胞中で発現されるＫＣＮＱ５／Ｑ３カリウムチャネルの特徴；Ｒｕｎｄｆｅｌｄｔ， Ｃ．， Ｎｅｔｚｅｒ， Ｒ． 新規抗痙攣剤レチガビンは、ヒトＫＣＮＱ２／３サブユニットでトランスフェクトしたチャニーズハムスターの卵巣細胞においてＭ電流を活性化する。Ｎｅｕｒｏｓｉｃｅｎｃｅ Ｌｅｔｔｅｒｓ ２８２： ７３−７６ （２０００）； Ｍａｉｎ， Ｍ． Ｊ．， Ｃｒｙａｎ， Ｊ．Ｅ．， Ｄｕｐｅｒｅ， Ｊ．Ｒ．Ｂ．， Ｃｏｘ， Ｂ．， Ｃｌａｒｅ， Ｊ．Ｊ． ＆ Ｂｕｒｂｒｉｄｇｅ， Ｓ．Ａ． 新規抗痙攣剤レチガビンによるＫＣＮＱ２／３カリウムチャネルの調節。Ｍｏｌｅｃ Ｐｈａｒｍ ５８： ２５３−２６２ （２０００））、そして、いずれかのアセチルコリン（Ａｄａｍｓ， Ｐ．， Ｒ．， Ｂｒｏｗｎ， Ｄ．， Ａ．， Ｃｏｎｓｔａｎｔｉ， Ａ．． ウシガエル交感神経におけるＭ電流および他のカリウム電流。Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ ３３０： ５３７−７２ （１９８２）； Ｂｒｏｗｎ， Ｄ．， Ａ．， Ａｄａｍｓ， Ｐ．， Ｒ．． 脊椎動物のニューロンにおける新規電圧感受性Ｋ＋電流のムスカリン抑制。Ｎａｔｕｒｅ ２８３： ６７３−６７６ （１９８０）； Ｓｈａｐｉｒｏ Ｍ．， Ｓ．， Ｒｏｃｈｅ， Ｊ．， Ｐ．， Ｋａｆｔａｎ， Ｅ．， Ｊ．， Ｃｒｕｚｂｌａｎｃａ， Ｈ．， Ｍａｃｋｉｅ， Ｋ．， Ｈｉｌｌｅ， Ｂ．． ニューロンのＭ電流の基礎であるＫＣＮＱ２／ＫＣＮＱ３Ｋ（＋）チャネルのムスカリン調節の再構築。Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ ２０： １７１０−１７２１ （２０００）））、リノピリジンまたはＸＥ−９９１（１０，１０−ビス（４−ピリジニルメチル）−９（１０Ｈ）−アントラセノン（Ａｉｋｅｎ， Ｓ．Ｐ．， Ｌａｍｐ， Ｂ．Ｊ． Ｍｕｒｐｈｙ， Ｐ．Ａ． ＆ Ｂｒｏｗｎ Ｂ．Ｓ．． 神経伝達物質放出エンハンサーであるリノピルジン（ＤｕＰ９９６）による、ラットＣＡ１錐体ニューロンにおけるＭ電流のスパイク頻度の調節の低下および遮断。Ｂｒ Ｊ Ｐｈａｒｍ １１５： １１６３−１１６８， （１９９５）； Ｚａｃｚｅｃ Ｒ． Ｃｈｏｒｖａｔ ＲＪ． Ｓａｙｅ ＪＡ． Ｐｉｅｒｄｏｍｅｎｉｃｏ ＭＥ． Ｍａｃｉａｇ ＣＭ． Ｌｏｇｕｅ ＡＲ． Ｆｉｓｈｅｒ ＢＮ． Ｒｏｍｉｎｇｅｒ ＤＨ． Ｅａｒｌ ＲＡ． ２つの新規な潜在的神経伝達物質放出エンハンサー、１０，１０−ビス（４−ピリジニルメチル）−９（１０Ｈ）−アントラセノンおよび１０，１０−ビス（２−フルオロ−４−ピリジニルメチル）−９（１０Ｈ）−アントラセノン：リノピルジンとの比較。Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ＆ Ｅｘｐ Ｔｈｅｒａｐ ２８５： ７２４−７３０ （１９９８））で遮断されることを示している。副交感神経系の神経伝達物質アセチルコリン（Ａｃｈ）は、膀胱平滑筋においていくつかの生理学的反応を生じることが知られている。Ａｃｈへ曝された場合の最終的な結果は、主に膜貫通および細胞内カルシウムの蓄積の流動化による平滑筋の収縮である（Ｈａｓｈｉｔａｎｉ Ｈ． Ｂｒａｍｉｃｈ ＮＪ． Ｈｉｒｓｔ ＧＤ． モルモットの泌尿器膀胱における興奮性神経筋伝達のメカニズム。Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ ５２４： ５６５−５７９ （２００��））。Ａｃｈが細胞膜貫通電位を調節することにおいて果たす役割はしかし、もっと複雑である。膀胱平滑筋のムスカリン刺激について、過分極および脱分極両方の経路が存在する。過分極は、カルシウムのスパークおよびカルシウム依存性カリウム電流の活性化に関与するメカニズムと関連する可能性がある（Ｈｅｒｒｅｒａ ＧＭ． Ｈｅｐｐｎｅｒ ＴＪ． Ｎｅｌｓｏｎ ＭＴ． 泌尿器膀胱平滑筋におけるＣａ（２＋））スパークのＢＫ（Ｃａ）チャネルに対するカップリングの電圧依存性。Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｎａｌ ｏｆ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ−Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ ２８０： Ｃ４８１−４９０（２００１））。
【０００７】
さらに、不安定性膀胱および関連する泌尿器ならびに膀胱疾患の治療に有用な化合物を選択するための方法を開発する必要がある。本発明は、この必要性を満たし、そして、不安定性膀胱および関連する泌尿器ならびに膀胱疾患の治療に関する方法を含む。
【０００８】
（発明の概要）
本発明により、不安定性膀胱の治療のための化合物を選択する方法であって、宿主細胞中で標的ＫＣＮＱタンパク質を発現させること、および該標的ＫＣＮＱタンパク質の活性を検出することを含む方法が提供される。一具体例において、標的ＫＣＮＱタンパク質は宿主細胞または宿主系統で自然に発現もしくは過剰発現される。本発明の他の具体例では、標的ＫＣＮＱタンパク質は、宿主細胞中で組換え発現される。
【０００９】
本発明により、不安定性膀胱の治療のための化合物を選択する方法であって、宿主細胞中で標的ＫＣＮＱタンパク質を発現させること、および該標的ＫＣＮＱタンパク質の活性を検出することを含む方法であって、該検出を、物質の存在下もしくは不在下で宿主細胞の膜電位を測定し、次いでその存在が宿主細胞の膜電位に変化を引き起こすこれらの化合物を選択することにより行う方法が提供される。
【００１０】
本発明により、不安定性膀胱の治療のための化合物を選択する方法であって、宿主細胞中で標的ＫＣＮＱタンパク質を発現させること、および該標的ＫＣＮＱタンパク質の活性を検出することを含む方法であって、該検出を、物質の存在下もしくは不在下で宿主細胞を用いる蛍光法、およびその存在が蛍光の存在により証明される、該宿主細胞の過分極を引き起こす化合物を選択することにより行う方法が提供される。
【００１１】
本発明により、選択される化合物が以下の特徴を示す本方法も提供される：膀胱平滑筋中の標的ＫＣＮＱタンパク質に関して、他の組織中のＫＣＮＱタンパク質と比較して少なくとも２倍大きな活性；膀胱平滑筋中の標的ＫＣＮＱタンパク質に関して、非標的ＫＣＮＱタンパク質と比較して少なくとも２倍大きな活性；または膀胱平滑筋中の標的ＫＣＮＱタンパク質に関して、他のカリウムチャネルと比較して少なくとも２倍大きな活性。本発明の種々の具体例に関して、血液脳関門を横切らない化合物を選択してもよい。血液脳関門を漏出しながら横切るいくつかの化合物を、それらがの望ましくない副作用を示さない限り用いてもよい。後者は好ましくない。
【００１２】
本発明により、化合物を選択する方法であって、血液脳関門を横切らない化合物を選択すること；膀胱平滑筋中の標的ＫＣＮＱタンパク質を活性化する能力に関してこれらの化合物を試験すること；他の組織中の標的ＫＣＮＱタンパク質の活性化、非標的ＫＣＮＱタンパク質の活性化、または他のカリウムチャネルの活性化と比較した場合の、膀胱平滑筋中の標的ＫＣＮＱタンパク質を活性化するより大きな能力を示すこれらの化合物を選択することを含む方法が提供される。
【００１３】
本発明により、膀胱平滑筋中の標的ＫＣＮＱチャネルを選択的に活性化することによる不安定性膀胱の治療法であって、動物に化合物を投与することを含む方法であり、該化合物が膀胱平滑筋において標的ＫＣＮＱタンパク質を選択的に活性化する方法も提供される。
【００１４】
本発明は、哺乳動物において泌尿器膀胱組織を調節する方法であって、特に、泌尿器の膀胱コントロールを維持する方法のためのその使用を含む方法であって、ＫＣＮＱ１、ＫＣＮＱ２、ＫＣＮＱ３、ＫＣＮＱ４、およびＫＣＮＱ５カリウムチャネルを単独または組み合わせて含むカリウムチャネルのＫＣＮＱファミリーのアゴニストまたはオープナーとして作用する化合物の医薬的有効量を、泌尿器膀胱組織を調節すること、特に、泌尿器の膀胱コントロールを維持することを必要とする哺乳動物に投与することを含む方法に関する。本発明の特定の具体例には、ＫＣＮＱ２／３カリウムチャネルの１またはそれ以上のアゴニストまたはオープナーの、本明細書中に記載する方法における使用が含まれる。本発明の方法の他のシリーズには、ＫＣＮＱ３／５カリウムチャネルの１またはそれ以上のアゴニストまたはオープナーの使用が含まれる。本発明の方法のさらに他のシリーズには、ＫＣＮＱ４カリウムチャネルの１またはそれ以上のアゴニストまたはオープナーの使用が含まれる。
【００１５】
（図面の簡単な記載）
図１は、単離したラットの膀胱片の収縮の阻害に関するレチガビン濃度反応曲線を示すグラフである。黒丸は、２０ｍＭのＫＣｌで収縮した調製物からのデータを示し、ＩＣ５０は１．４±０．１μＭであった。白丸は、６０ｍＭのＫＣｌで収縮した調製物からのデータを示し、ＩＣ５０は２１．８±０．８μＭであった。このグラフは、ＫＣｌの濃度が高いほどカリウム駆動力が低下し、カリウムチャネルオープナーの効力が阻害されるカリウムチャネル開放メカニズムと一致する。
【００１６】
図２は、（ａ）ヒトの泌尿器膀胱、および（ｂ）ラットの泌尿器膀胱において、ＫＣＮＱｍＲＮＡ／ＧＡＤＰＨｍＲＮＡとして測定したＫＣＮＱ遺伝子発現レベルのグラフである。図２ａにおいては、定量逆転写ポリメラーゼ鎖反応（ｒｔＰＣＲ）を、ラットの膀胱平滑筋から単離したＲＮＡにおいて行った。ＫＣＮＱ１、ＫＣＮＱ３およびＫＣＮＱ５に関するメッセージが見られた。ＫＣＮＱ２またはＫＣＮＱ４に関してメッセージは存在しなかった。図２ｂにおいては、培養ヒト膀胱平滑筋細胞から単離したＲＮＡにおいてｒｔＰＣＲを行った。ＫＣＮＱ３およびＫＣＮＱ５に関するメッセージが見られた。
【００１７】
図３：ａは、単離したラットの膀胱平滑筋細胞からなぞる電流クランプのグラフである。１０μＭのレチガビンに暴露する前の静止膜電位は−４０ｍＶであった。レチガビンにより約１０ｍＭまで細胞が過分極した。この過分極は、１０μＭのＸＥ−９９１の添加により逆転した。ｂは、１００ｎＭのＡｃｈによる脱分極が後に続くレチガビン誘導性の過分極を示している、単離したラットの膀胱平滑筋からの電流クランプトレーシングのグラフである。ｃは、レチガビン前（コントロール）および後の外部電流に関する電流−電圧の関連に関するグラフである。ｄは、単離したヒト膀胱平滑筋細胞からなぞる電圧クランプの３つのグラフである。レチガビンは外部電流を増し、これは１０μＭのＸＥ−９９１により部分的に逆転した。
【００１８】
図４：ａは、４匹のラットからのシストメトログラムを示す。膀胱滲出液は０．２５％の酢酸を含み、これは、自発収縮を引き起こし、そして排尿の間隔を短くした。排尿は、レチガビン（１０ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．）投与中完全に遮断された。図４ｂは、膀胱充満中の自発収縮を示している２つのシストメトログラムを示す。レチガビン（０．１ｍｇ／ｋｇ）（１番目のシストメトログラム）により、対照と比較して、自発収縮の頻度が有意に低下した。
【００１９】
定義
ＫＣＮＱサブユニットは、α−サブユニットとして知られるカリウムチャネルの部分を形成するＫＣＮＱ全タンパク質である。
ＫＣＮＱチャネルは、少なくとも一つのＫＣＮＱサブユニットタイプ（即ち、ＫＣＮＱ１、ＫＣＮＱ２、ＫＣＮＱ３、ＫＣＮＱ４、またはＫＣＮＱ５）から成るカリウムチャネルテトラマーである。
【００２０】
ＫＣＮＱタンパク質は、Ｍ−チャネルまたはカリウムチャネルの調節に主として関与するタンパク質である、ＫＣＮＱファミリーのいずれかのタンパク質である。これらのタンパク質には、制限するものではないが、以下のタイプが含まれる：ＫＣＮＱ１（配列番号１）、ＫＣＮＱ２（配列番号２）、ＫＣＮＱ３（配列番号３）、ＫＣＮＱ４（配列番号４）、ＫＣＮＱ５（配列番号５）、ＫＣＮＱ２／３、およびＫＣＮＱ３／５、またはそのいずれかの組み合わせ。
【００２１】
「標的ＫＣＮＱタンパク質」は、膀胱平滑筋に生じるＫＣＮＱタンパク質である。好ましくは、膀胱平滑筋において他の組織よりも大きな濃度で生じるタンパク質である。例として、および制限することは意図せず、「標的ＫＣＮＱタンパク質」はＫＣＮＱ３／５またはＫＣＮＱ４である。
【００２２】
「非標的ＫＣＮＱタンパク質」は、膀胱平滑筋に生じないＫＣＮＱタンパク質である。
「他のカリウムチャネル」は、少なくとも一つのＫＣＮＱサブユニットから成るものではない全てのカリウムチャネルである。
【００２３】
（発明の詳細な記載）
本発明により、不安定性膀胱の治療のための化合物を選択する方法であって、標的ＫＣＮＱタンパク質を宿主細胞中で発現させること、および該標的ＫＣＮＱタンパク質の活性を検出することを含む方法が提供される。一具体例においては、標的ＫＣＮＱタンパク質は宿主細胞または宿主系統中で自然に発現され、または過剰発現される。本発明の他の具体例においては、標的ＫＣＮＱタンパク質は宿主細胞中で組換え発現される。
【００２４】
本発明により、不安定性膀胱の治療のための化合物を選択する方法であって、標的ＫＣＮＱタンパク質を宿主細胞中で発現させること、および該標的ＫＣＮＱタンパク質の活性を検出することを含む方法であって、該検出が、物質の存在下または不在下で宿主細胞の膜電位を測定すること、およびその存在が宿主細胞の膜電位の変化を引き起こす化合物を選択することにより行うものであるものが提供される。
【００２５】
本発明により、不安定性膀胱の治療のための化合物を選択する方法であって、標的ＫＣＮＱタンパク質を宿主細胞中で発現させること、および該標的ＫＣＮＱタンパク質の活性を検出することを含む方法であって、該検出が、物質の存在下または不在下で宿主細胞を用いる蛍光法、およびその存在が蛍光の存在により証明される宿主細胞の過分極を引き起こす化合物を選択することにより行うものであるものが提供される。
【００２６】
一具体例において、宿主細胞は動物細胞である。更なる具体例においては、宿主細胞は哺乳動物である。更なる具体例において、宿主細胞はヒトである。更なる具体例において、宿主細胞はヒトの腎臓の細胞である。更なる具体例において、宿主細胞はヒトの胎児の腎臓の細胞である。更なる具体例において、宿主細胞はＨＥＫ２９３である。別の具体例において、宿主細胞はＣＯＳである。
【００２７】
本発明において、化合物の選択は、電気生理学的方法（即ち、電流のクランピングおよび電圧のクランピング）を含む種々の常套法により測定される、標的ＫＣＮＱタンパク質またはＫＣＮＱチャネルの活性の検出に基く。一具体例においては、膜電位は蛍光法を用いて測定する。他の具体例においては、膜電流は電圧クランプ法を用いて測定する。さらに他の具体例においては、膜電圧は電流クランプ法を用いて測定する。
【００２８】
一具体例において、物質は、膀胱平滑筋中の標的ＫＣＮＱタンパク質に関して他の組織中の標的ＫＣＮＱタンパク質に関するよりも大きな活性を引き起こすその能力に基いてさらに選択する。好ましくは、膀胱平滑筋中の標的ＫＣＮＱタンパク質に関して他の組織中の標的ＫＣＮＱタンパク質に関するよりも少なくとも２倍大きな活性を引き起こす物質が選択される。より好ましくは、膀胱平滑筋中の標的ＫＣＮＱタンパク質に関して他の組織中の標的ＫＣＮＱタンパク質に関するよりも少なくとも１０倍大きな活性を引き起こす物質が選択される。これ以外に、膀胱平滑筋中の標的ＫＣＮＱタンパク質に関して他の組織中の標的ＫＣＮＱタンパク質に関するよりも少なくとも２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、または９０倍大きな活性を引き起こす物質が選択される。最も好ましくは、膀胱平滑筋中の標的ＫＣＮＱタンパク質に関して他の組織中の標的ＫＣＮＱタンパク質に関するよりも少なくとも１００倍大きな活性を引き起こす物質が選択される。
【００２９】
他の具体例においては、膀胱平滑筋中の標的ＫＣＮＱタンパク質に関して非標的ＫＣＮＱタンパク質に関するよりも大きな活性を引き起こすその能力に基いてさらに物質が選択される。好ましくは、膀胱平滑筋中の標的ＫＣＮＱタンパク質に関して非標的ＫＣＮＱタンパク質に関するよりも少なくとも２倍大きな活性を引き起こす物質が選択される。より好ましくは、膀胱平滑筋中の標的ＫＣＮＱタンパク質に関して非標的ＫＣＮＱタンパク質に関するよりも少なくとも１０倍大きな活性を引き起こす物質が選択される。別に、膀胱平滑筋中の標的ＫＣＮＱタンパク質に関して非標的ＫＣＮＱタンパク質に関するよりも少なくとも２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、または９０倍大きな活性を引き起こす物質が選択される。より好ましくは、膀胱平滑筋中の標的ＫＣＮＱタンパク質に関して非標的ＫＣＮＱタンパク質に関するよりも少なくとも１００倍大きな活性を引き起こす物質が選択される。
【００３０】
他の具体例においては、標的ＫＣＮＱタンパク質に関して他のカリウムチャネルに関するよりも大きな活性を引き起こすその能力に基いてさらに物質が選択される。好ましくは、膀胱平滑筋中の標的ＫＣＮＱタンパク質に関して他のカリウムチャネルに関するよりも少なくとも２倍大きな活性を引き起こす物質が選択される。より好ましくは、膀胱平滑筋中の標的ＫＣＮＱタンパク質に関して他のカリウムチャネルに関するよりも少なくとも１０倍大きな活性を引き起こす物質が選択される。別に、標的ＫＣＮＱタンパク質に関して他のカリウムチャネルに関するよりも少なくとも２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、または９０倍大きな活性を引き起こす物質が選択される。より好ましくは、標的ＫＣＮＱタンパク質に関して他のカリウムチャネルに関するよりも少なくとも１００倍大きな活性を引き起こす物質が選択される。
【００３１】
本発明の種々の具体例に関して、標的ＫＣＮＱタンパク質またはチャネルの活性の増加の結果として選択される種々の化合物のいずれか一つを、本明細書に開示する不安定性膀胱または種々の関連膀胱疾患の治療の改良との関連を検出するビンビボまたはインビトロ分析によりさらに分析する。
【００３２】
本発明により、実質上血液脳関門を横切らない、または望ましくない副作用を引き起こすことなく血液脳関門から漏出しつつ横切る化合物を選択すること；膀胱平滑筋において標的ＫＣＮＱタンパク質を調節する能力に関してこれらの化合物を試験すること；および膀胱平滑筋中の標的ＫＣＮＱタンパク質を活性化する、他の組織において標的ＫＣＮＱタンパク質を活性化する能力よりも大きな能力を示す化合物を選択することを含む方法も提供される。
【００３３】
血液脳関門を横切ることを予測する公知の方法には、数学的手段を用いるコンピューター法、動物起源の内皮細胞培養物を用いる細胞培養法、固定人工膜カラムを用いる高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、臨界ミセル濃縮法を用いる表面活性の測定、外部ＨＰＬＣ（ｅｘｔｅｒｎａｌ ＨＰＬＣ）分析のための生きている動物の脳からの組織をサンプリングすることを含むミクロ透析法、死後のヒトの脳毛細血管の使用、およびインビボ動物試験が含まれる（Ｃｌａｒｋ， Ｄ．Ｅ．； Ｐｉｃｋｅｔｔ， Ｓ． 「薬物−類似」の予測のための評価法 Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｔｏｄａｙ ５（２）： ４９−５８， ２０００； Ｅｄｄｙ， Ｅ．Ｐ．； Ｍａｌｅｅｆ， Ｂ．Ｅ．， Ｈａｒｔ， Ｔ． Ｋ．， Ｓｍｉｔｈ， Ｐ．Ｌ． 血液−脳関門透過性を予測するインビトロモデル Ａｄｖ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖ ２３： １８５−１９８１， １９９７； Ｇｕｍｂｌｅｔｏｎ， Ｍ． ａｎｄ Ｋｅｎｎｅｔｈ Ｌ． Ａｕｄｕｓ． 血液−脳関門の透過性スクリーニングとして役立つインビトロ細胞培養物における使用における進展と制限 Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ ９０： １６８１−１６９８， ２００１）。
【００３４】
本発明により、不安定性膀胱の治療法であって、動物、好ましくは哺乳動物またはヒトに、膀胱平滑筋において標的ＫＣＮＱタンパク質を選択的に活性化する化合物を投与することを含む方法も提供される。
【００３５】
本発明の方法は、不安定性膀胱または尿失禁を患っているまたはそれに罹患しやすい哺乳動物において望ましい膀胱調節を誘導、補助、または維持するのに有用である。これらの方法には、夜尿症、夜間尿、排尿障害、および尿失禁を含む膀胱に関連する泌尿器疾患および不安定性膀胱の予防、治療または阻害が含まれる。本発明の方法を用いて治療または予防できるものには、前立腺肥大に対して二次的である不安定性膀胱がある。本明細書中に記載する化合物は、望まれる場合は常に、排尿を一時的に遅延させるのにも有用である。本発明の化合物は、膀胱を安定化する、および尿失禁、または切迫性およびストレス性混合性尿失禁とも呼ばれる切迫性尿失禁およびストレス性尿失禁の組み合わせを含む尿失禁を哺乳度物において治療または予防するのに用いてもよい。これらの方法には、前立腺肥大などの二次疾患に伴う尿失禁を予防または治療することの補助が含まれる。
【００３６】
これらの方法を用いて、レシピエントは排尿の切迫性および頻度をコントロールすることが可能となり得る。本発明の方法には、不安定性膀胱、神経原性膀胱、排尿障害、機能亢進性膀胱、排尿筋過活動、排尿筋過剰反射または無抑制膀胱としても知られる切迫性尿失禁の治療、予防、阻害および緩和が含まれる。
【００３７】
前記のように、本発明の方法には、不安定性膀胱、神経原性膀胱または反射亢進性膀胱の治療、予防、阻害または緩和が含まれる。これらの使用には、制限するものではないが、排尿の切迫性が前立腺炎、前立腺肥大、間質性膀胱炎、尿管感染または膣炎に伴う膀胱の活性および不安定性のためのものが含まれる。本発明の方法は、頻発性−切迫性症候群（Ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ−Ｕｒｇｅｎｃｙ Ｓｙｎｄｒｏｍｅ）の症状の阻害または矯正の補助のためにも用いてもよい。
【００３８】
本発明の方法は、他の薬物の投与に伴う、またはそれから生じる尿失禁、不安定性膀胱または切迫尿を治療、予防、阻害または制限するのに用いられてよい。
本発明の方法は、成人および小児科における使用を含む、泌尿器膀胱コントロールの誘導または補助、または本明細書に開示する疾患を予防または治療することを必要とするヒトにおいて、泌尿器膀胱コントロールの誘導または補助、または本明細書に開示する疾患を予防または治療するのに有用である。しかし、それらは、特にイヌおよびネコの膀胱コントロール法を含む獣医学的適用に用いてもよい。所望により、本明細書中の方法は、ヒツジ、ウシ、ブタおよびウマの品種などの牧畜動物に用いてもよい。
【００３９】
適用は、獣医学的実施において通常用いられる、常套の経口、直腸、非経口または静脈内送達法を用いてよい。家庭での使用のほとんどの場合に最も好ましいのは、当該動物に許容される咀嚼可能もしくは液体獣医学的製剤または食品材料または液体と混合してよい経口錠剤またはカプセルまたはそのままの（ｎｅａｔ）化合物または粉末もしくは顆粒医薬製剤である。
【００４０】
本明細書に用いられる、「医薬的有効量」または「治療的有効量」なる用語は、有意義な患者の利益、すなわち尿失禁または排尿に対する過剰もしくは望ましくない切迫性の治療、予防また緩和、または尿失禁の発症頻度の低下を示すのに十分な、医薬組成物の各活性成分のトータルの量または方法を意味する。単独で投与される個々の活性成分に対して用いられる場合、該用語は、その活性成分単独を意味する。組み合わせに対して用いられる場合、該用語は、組み合わせて投与されようと、連続投与されようと、または同時投与されようと、治療効果を生じる活性成分の合わせた量を意味する。
以下に記載する実施例は、例としての目的のためのものであり、および、本発明がこれらの実施例により制限されるというものではない。
【００４１】
一具体例において、本発明は、以下に詳細に記載するように、トランスフェクトした細胞の膜電位を間接的に測定することによる化合物の高処理量スクリーニング、およびリード化合物の選択を含む。
【００４２】
実施例１
高処理量スクリーニング
哺乳動物（例えば、ＨＥＫ−２９３、ＣＯＳ）細胞をＫＣＮＱカリウムチャネルに関するｃＤＮＡまたはｃＲＮＡで（持続的または一時的に）トランスフェクトする。これらの細胞は、膜電位を調節する機能ＫＣＮＱチャネルをその膜において発現および組み込んでいる。いくつかの方法を用いて膜電位を測定する。一のそのような方法は、蛍光画像プレートリーダー（ＦＬＩＰＲ）および電圧感受性蛍光色素を使用する。トランスフェクトした細胞を９６または３８４ウェルのプレートのウェルの底で生育させる。器械は、全ウェルに同時にピペッティングし、および全ウェルから同時に蛍光シグナルを記録する能力を有する。この方法において、多数の化合物を、ＫＣＮＱ−依存性の膜貫通電位を調節するその能力に関して迅速に試験することができる。トランスフェクトした細胞膜の過分極を引き起こす化合物を、種々の方法によりさらに分析する。一具体例において、蛍光画像プレートリーダー（ＦＬＩＰＲ）は電圧感受性の蛍光プローブとしてビス−オキソノール（ＤｉＢＡＣ４）を用いる。
【００４３】
一具体例において、高処理スクリーニングの後で、ＦＬＩＰＲにより選択される化合物の二次分析を、リード化合物の機能データを得るために行う。特に、二次分析は以下に、より完全に記載するように行う。
【００４４】
実施例２
インビトロ（活性）アッセイ−二次分析
単離したラット膀胱片
雄のＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（２００−４００グラム）をＣＯ２の吸入および放血により安楽死させる。その膀胱をすぐに取り出し、次いで３７℃の、以下（ｍＭ）：ＮａＣｌ（１１８．４）、ＫＣｌ（５）、ＣａＣｌ２（２．５）、ＭｇＳＯ４（１．２）、ＫＨ２ＰＯ４（１．２）、ＮａＨＣＯ３（２４．９）、およびＤ−グルコース（１１．１）を含み、Ｏ２／ＣＯ２（９５％／５％）で通気して７．４のｐＨとした生理的塩溶液（ＰＳＳ）に入れる。膀胱ドームを三角部から単離し、次いでこの組織を４−５ｍｍ幅１０ｍｍ長の小片にカットする。一端をウォータージャケット付組織浴の底に固定し、そして他方はＧｒａｓｓの等軸力変換器（Ｇｒａｓｓ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ， Ｑｕｉｎｃｙ， ＭＡ）へ固定した。組織にプレストレスを与え（０．２５〜０．５グラム）、次いで平衡化の３０分後に追加の１５ｍＭＫＣｌ（トータル２０ｍＭ）にて収縮させ、次いで再び調製物が安定に収縮するまで平衡化する。種々の化合物のいずれかを連続濃度として組織浴に直接投与する。変換器のシグナルをデジタル表示し（１２ビットの解像能）、次いで５８６−ベースのコンピューターおよびカスタムソフトウェアを用いてオンラインで分析する。自発膀胱収縮は振幅および頻度が不規則なので、濃度曲線の下の領域（ＡＵＣ）を、収縮の尺度として用いる。５分のＡＵＣ値を、各化合物濃度の組織浴への投与後３０分で調べる。
【００４５】
ラット排尿筋細胞の単離
ラットの排尿筋細胞を、モルモットの排尿筋に関してすでに記載されている方法で単離する（Ｓｈｅｌｄｏｎ ＪＨ， Ｎｏｒｔｏｎ ＮＷ ａｎｄ Ａｒｇｅｎｔｉｅｒｉ ＴＭ （１９９７） ＮＳ−１６１９によるモルモット排尿筋収縮の阻害は、ＢＫＣａの活性化およびカルシウム電流の阻害と関連する。Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｅｘｐ Ｔｈｅｒａ ２８３ （３）： １１９３−１２００）。雄のＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ， Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ， Ｍａｓｓ．； ２００−４００グラム）を、ＣＯ２の吸入および放血により安楽死させる。その膀胱をすぐに取り出し、次いで以下の組成（ｍＭ）：Ｎａグルタメート（８０．０）、ＮａＣｌ（５４．７）、ＫＣｌ（５．０）、ＮａＨＣＯ３（２５．０）、ＭｇＣｌ２・２Ｈ２Ｏ（２．５）、Ｄ−グルコース（１１．８）およびＣａＣｌ２（０．２）を含み、Ｏ２−ＣＯ２９５％／５％で７．４の最終ｐＨへと通気した３７℃の生理溶液に入れる。膀胱のドームを三角部から単離し、次いで粘膜を除去する。この組織を次いで２−３ｍｍ幅の小片にカットし、次いで新鮮なバッファー中に１時間入れる。組織を次いで、前記組成＋コラーゲナーゼタイプＶＩＩＩ（１．０ｍｇ／ｍｌ）およびプロナーゼ（０．２５ｍｇ／ｍｌ）を含む１０ｍｌの単離バッファー中に移す。１０分後、単離バッファーをさらに１０分間新鮮な単離バッファーで置きかえる。組織を次いで３回、新鮮な、コラーゲナーゼおよびプロナーゼ不含溶液にて洗浄し、試験まで室温で保存する。試験のための細胞を、排尿筋組織の１−２片を２ｍｌの新鮮な単離バッファー中で、２０×／分の速度の改良したＨａｒｖａｒｄ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒポンプ（Ｈａｒｖａｒｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ， Ｓｏｕｔｈｎａｔｉｃ， ＭＡ）を取りつけた、約５ｍｌの容積を有する光沢パスツールピペット（チップの直径〜１．５ｍｍ）で５分間、粉砕することにより調製する。細胞を次いで温度調節した組織浴中３２．５℃に顕微鏡のステージ上に置き、そして、ＰＳＳを継続的に注いだ。
【００４６】
細胞電気生理学
個々の細胞の記録を、Ｌｉｓｔ−Ｍｅｄｉｃａｌ  ＥＰＣ−７パッチクランプ増幅器（Ａｄａｍｓ ＆ Ｌｉｓｔ Ａｓｓｏｃ．， Ｗｅｓｂｕｒｙ， ＮＹ）を用いて行う。ピペットの電極は２−４ＭΩのチップ抵抗を有し、および以下の組成物（ｍＭ）：ＫＣｌ（１２６．０）、ＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ（４．５）、ＡＴＰ  Ｍｇ塩（４．０）、ＧＴＰトリス塩（０．３）、クレアチンＰＯ４（１４．０）、Ｄ−グルコース（９．０）、ＥＧＴＡ（９．０）、ＨＥＰＥＳ（９．０）で満たす。ｐＨをＫＯＨで７．４へと調整する。シグナルを、５８６ベースのパーソナルコンピューターを用いて得る（３ｋＨｚの高頻度のカットオフ、１２ビットの解像度）。
確認のために、膜電気の変化をＦＬＩＰＲにて直接観察し、電圧および電流クランプ分析を記載のように行う。
【００４７】
実施例３
電流クランプの記録
細胞の静止膜電位（ＲＭＰ）を、前記の装置およびピペット溶液を用いて電流クランプにて測定する。これらの実験のために、ナイスタチンをピペット溶液（１００μｇ／ｍｌ）にさらに添加し、穿孔パッチ法（Ｋｏｒｎ， ｅｔ ａｌ， １９９１）を用いることにより記録を可能とする。安定な手段が達成された後は、ＲＭＰを５分のコントロール期間の後、５分間の薬物適用（０．３および１．０μＭ）の後に記録する。この後、種々のアンタゴニスト（リノピルジン、ＸＥ−９９１）を潅水に添加し、次いでＲＭＰをさらに５分間記録する。
【００４８】
電圧クランプ記録
全細胞の記録を、断続パッチ法を用いて行う。電流を、電圧ステップ（Ｖｈ＝−５０；Ｖｔ＝−６０から４０ｍＶ）または電圧ランプ（３．３ｍＶ／秒にて−６０〜４０ｍＭ）いずれかを用いて誘発する。正確な電圧クランププロトコルは、当該分野で周知である。安定が達成された後、コントロール電流を記録する。次に試験化合物を潅水に添加する。電流を５〜１０分間、または化合物の効果が安定状態に達するまで記録する。この後、洗浄またはアンタゴニスト（リノピルジン、ＸＥ−９９１）の潅水への添加のいずれかを行う。
膜電位および膜電流の変化がＫＣＮＱカリウムチャネルの活性化の結果として生じているものであることをさらに確認するために、ツメガエルの卵母細胞のアッセイを以下のように行う。
【００４９】
実施例４
ツメカエルの卵母細胞アッセイ
Ｘｅｎｏｐｕｓ  ｌａｅｖｉｓを、その卵母細胞が常に異なる段階（段階ＶおよびＶＩは成熟したものとみなされ、そして発現の目的のために用いられる）の卵母細胞を含むがゆえに用いる。これらの卵母細胞は非常に制限された数の内在性イオンチャネルおよびレセプターを有し、および「外来」ｍＲＮＡを容易に発現することができる。それゆえ、現代の電気生理学および細胞ならびに分子生物学においては、ツメカエルの卵母細胞におけるｍＲＮＡの発現は、哺乳動物（ヒトを含む）組織からのレセプターおよびイオンチャネルの特性を試験するための優れた手段となっている。カエルを０．３トリカインメタンスルホネート（ＭＳ２２２）にて少なくとも４５分間麻酔する。側腹切開（＜１ｃｍ）を、表皮および筋膜を貫通して行う。卵巣の遠位葉（ｄｉｓｔａｌ ｌｏｂｅ）を、鈍い、非外傷性のピンセットおよびカットを用いて取り出す。傷の各層を４−Ｏ黒色単繊維ナイロンおよびＦＳ−２カッティング針を用いて個々に閉じる。
【００５０】
取り出した後、卵母細胞を洗浄し、次いで酵素溶液とともにインキュベートすることにより分離する。ＫＣＮＱサブユニットのメッセージを有する卵を次いで注射する。数日後、チャネルタンパク質が卵母細胞膜中で発現する。膜貫通電流および電圧は、常套の２つの微小電極記録法を用いて測定することができる。
さらに公知の、利用可能な、または常套の方法を選択された化合物に用いて、機能的インビトロまたはインビボデータを得る。
【００５１】
実施例５
インビボ（効力）アッセイ
Ａ）過剰反応膀胱
Ｂｉｒｄｅｒ ａｎｄ ｄｅ Ｇｒｏａｔ（Ｂｉｒｄｅｒ ＬＡ． ｄｅ Ｇｒｏａｔ ＷＣ． ラットの下部尿管の興奮後の脊髄ニューロンにおける増加したｃ−ｆｏｓ発現 Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ １２： ４８７８−８９， （１９９２））により既に開示されているように、シストメトリー潅水中の希釈酢酸溶液を用いる感覚求心性神経の刺激により、排尿の頻度が高まる。簡単には、雌のＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（１９０−２１０ｇ）をウレタン（１ｇ／ｋｇ／１０ｍＬ、ｉ．ｐ．；１ｇ／ｋｇ／１０ｍＬ、ｓ．ｑ．）で麻酔する。気管にＰＥ２０５をカニューレ挿入し、患者の気道を確保する。外頚静脈に、化合物投与のためにＰＥ５０チュービングをカニューレ挿入する。膀胱を中線切開により露出し、次いで血管カテーテル（２４ｇ、テフロン）の末端を加熱し、次いで膀胱のドームに挿入し、次いで４−０シルクで固定する。膀胱に通常の塩水を流し、シストメトリーを行う前の１時間平衡化する。「Ｔ」コネクターを用いて、膀胱カテーテルをＳｔａｔｈａｍ圧力変換器（モデルＰ２３Ｄｂ）およびＨａｒｖａｒｄ注入ポンプへ接続する。シストメトリーの記録を、膀胱を０．２５％の酢酸を含む塩水を２．４ｍＬ／時間の速度で１時間注入しながら、Ｇｒａｓｓポリグラフにて測定する。次に、化合物を静脈投与し、シストメトリーをさらに２時間モニターする。以下のシストメトリーのパラメータを記録する：排尿間隔、排尿の程度、排尿閾値圧、膀胱容積、膀胱コンプライアンス、および充満相中の自発膀胱収縮（ＳＢＣ）の数。対照の期間は、投与前の酢酸塩水の潅流の３０分間としてとる。化合物の効果を、投与の１５分後に１０５分間分析する。
【００５２】
Ｂ（ｉ）肥大した膀胱
肥大した、不安定性膀胱を作製する方法を、Ｍａｌｍｇｒｅｎ， ｅｔ ａｌ．（Ｍａｌｍｇｒｅｎ Ａ． Ｓｊｏｇｒｅｎ Ｃ． Ｕｖｅｌｉｕｓ Ｂ． Ｍａｔｔｉａｓｓｏｎ Ａ． Ａｎｄｅｒｓｓｏｎ ＫＥ． Ａｎｄｅｒｓｓｏｎ ＰＯ．  膀胱下流出閉塞（ｉｎｆｒａｖｅｓｉｃａｌ ｏｕｔｆｌｏｗ ｏｂｓｔｒｕｃｔｉｏｎ）を有するラットにおける不安定性膀胱の膀胱計による評価 Ｊ Ｕｒｏｌｏｇｙ １３７： １２９１−４， （１９８７））により報告されているものおよびＷｏｊｄａｎ， ｅｔ ａｌ． （Ｗｏｊｄａｎ Ａ． Ｆｒｅｅｄｅｎ Ｃ． Ｗｏｏｄｓ Ｍ． Ｏｓｈｉｒｏ Ｇ． Ｓｐｉｎｅｌｌｉ Ｗ． Ｃｏｌａｔｓｋｙ ＴＪ． Ｓｈｅｌｄｏｎ ＪＨ． Ｎｏｒｔｏｎ ＮＷ． Ｗａｒｇａ Ｄ． Ａｎｔａｎｅ ＭＭ． Ａｎｔａｎｅ ＳＡ Ｂｕｔｅｒａ ＪＡ． Ａｒｇｅｎｔｉｅｒｉ ＴＭ． カリウムチャネルオープナーの比較、ＷＡＹ−１３３５３７， ＺＤ６１６９、および、ラットの単離膀胱組織およびインビボ不安定性膀胱におけるセリカリム Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｅｘｐ Ｔｈｅｒａｐ ２８９： １４１０−１４１８， （１９９９））により報告されているものから変更した。簡単には、雌のＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（１９０−２１０ｇ）を用いる。動物をイソフランで麻酔する。動物が麻酔されたら、膀胱および尿道を中線切開により露出し、次いで４−０シルク結紮糸を近位尿道の周りに、ステンレススチールロッド（１ｍｍの直径）の存在下に結びつける。ロッドを次いで取り除くと、尿道の測定された部分閉塞が生じる。腹部筋を３−０のシルクを用いて閉じ、次いで皮膚を手術用の繊維を用いて閉じる。各ラットに１５０，０００ユニットのビシリンＣ−Ｒをｉ．ｍ．で施す。続く６−９週中、膀胱の肥大および不安定が、部分的な出口の閉塞から生じる。
【００５３】
（ｉｉ）カテーテルの移植
前記動物を用いて、前記のように生じる肥大の約６−９週後、動物をイソフルランにて再び麻酔し、結紮糸を近位尿道から取り除き、次いで加熱したカテーテル（ＰＥ６０）を膀胱のドームに置き、縫糸で固める。カテーテルを首の背後の開放により、皮膚下に取り出す。腹部切開を縫合し、次いでカテーテルの遊離末端を固める。手術後、動物にビシリンＣ−Ｒ（１５０，０００ユニット／ラット、ｉ．ｍ．）の二次投与を施す。
【００５４】
（ｉｉｉ）シストメトリー評価
カテーテル移植の２日後、動物を代謝ケージに入れ、膀胱カテーテルをＳｔａｔｈａｍ圧力変換器（モデルＰ２３Ｄｂ）およびＨａｒｖａｒｄ注入ポンプの両方に、（「Ｔ」コネクターを用いて）取りつける。尿容積を、力変換器（Ｇｒａｓｓ  ＦＴＯ３）に取りつけたプラスチックビーカーを用いてモニターする。膀胱機能のシストメトリー評価を、膀胱に塩水を注入することにより（肥大の程度により１０−２０ｍＬ／ｈｒ）開始する。以下のシストメトリーパラメータを記録する：充満相中の自発膀胱収縮（ＳＢＣ）の数、排尿の幅および排尿容積。シストメトリーの記録はＧｒａｓｓポリグラフにて行い、少なくとも２の排尿間隔または２０分間を含む。次にラットを２時間安め、次いで試験化合物を経口にて胃管投与えた。第二のシストメトリーを、試験化合物の投与後約６０分にて行う。肥大した膀胱を有するビヒクル（塩水）処置した動物の別個のグループを、時間／ビヒクルコントロールとして用いる。
【００５５】
レチガビンの使用およびＫＣＮＱを標的として確立している他の実験
この報告においては、レチガビンが単離したＫＣｌ−もしくはカルバコル−収縮ラット膀胱片を弛緩することができること、およびこの弛緩がリノピルジンまたはＸＥ−９９１いずれかにより逆転し得ることを示す。定量ｒｔＰＣＲを用いて、ラット膀胱においてＫＣＮＱ１、３および５、および培養ヒト膀胱平滑筋細胞においてＫＣＮＱ３および５の発現を同定した。最高レベルの発現が、ラットにおいてＫＣＮＱ５＞ＫＣＮＱ１＞ＫＣＮＱ３として、ヒト細胞においてＫＮＣＱ５＞ＫＣＮＱ３として認められた。Ｍ電流の活性は、単離したラットおよびヒトの膀胱平滑筋細胞中の再分極した電流に関するレチガビン誘導性の増加の存在により立証された。レチガビン依存性の電流および過分極は、リノピリジンまたはＸＥ−９９１またはアセチルコリンいずれかの組織浴への添加により逆転した。最終的に、膀胱のシストメトリーにより、レチガビンがラットの神経原性膀胱モデルにおいて、投与量依存様式で自発膀胱収縮および排尿を阻害することができることを明らかにした。
【００５６】
現在、ＫＣＮＱ誘導性Ｍ電流チャネルが神経、心臓（Ｂａｒｈａｎｉｎ， Ｊ．， Ｌｅｓａｇｅ， Ｆ．， Ｇｕｉｌｌｅｍａｒｅ， Ｅ．， Ｆｉｎｋ， Ｍ．， Ｌａｚｄｕｎｓｋｉ， Ｍ．， Ｒｏｍｅｙ， Ｇ．． Ｋ（Ｖ）ＬＱＴ１およびｌｓＫ（ｍｉｎＫ）タンパク質は結合してＩ（Ｋｓ）心臓カリウム電流を形成する。Ｎａｔｕｒｅ ３８４： ７８−８０（１９９６）； Ｓａｎｇｕｉｎｅｔｔｉ， Ｍ．， Ｃ．， Ｃｕｒｒａｎ， Ｍ．， Ｅ．， Ｚｏｕ， ＡＡ．， Ｓｈｅｎ， Ｊ．， Ｓｐｅｃｔｏｒ， Ｐ．， Ｓ．， Ａｔｋｉｎｓｏｎ， Ｄ．， Ｌ．， Ｋｅａｔｉｎｇ， Ｍ．， Ｔ．． Ｋ（Ｖ）ＬＱＴ１およびｍｉｎＫ（ＩｓＫ）タンパク質の、心臓Ｉ（Ｋｓ）カリウムチャネルに対するコアッセンブリー． Ｎａｔｕｒｅ ３８４： ８０−８３ （１９９６））および骨格筋（Ｓｃｈｒｏｅｄｅｒ， Ｂ．， Ｃ．， Ｈｅｃｈｅｎｂｅｒｇｅｒ， Ｍ．， Ｗｅｉｎｒｅｉｃｈ， Ｆ．， Ｋｕｂｉｓｃｈ， Ｃ．， Ｊｅｎｔｓｃｈ， Ｔ．， Ｊ．． ＫＣＮＱ５，脳で広く発現された新規カリウムチャネルはＭ−タイプの電流を媒介する。Ｊ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２７５： ２４０８９−２４０９５ （２０００））組織において同定されている。ＱＴ延長症候群および心不整脈（ＫＣＮＱ１；Ｓａｎｇｕｉｎｅｔｔｉ ｅｔ ａｌ）、良性家族性新生児痙攣（ＫＣＮＱ２およびＫＣＮＱ３（Ｂｉｅｒｖｅｒｔ， Ｃ．， Ｓｃｈｒｏｅｄｅｒ， Ｂ．， Ｃ．， Ｋｕｂｉｓｃｈ， Ｃ．， Ｂｅｒｋｏｖｉｃ， Ｓ．， Ｆ．， Ｐｒｏｐｐｉｎｇ， Ｐ．， Ｊｅｎｔｓｃｈ， Ｔ．， Ｊ．， Ｓｔｅｉｎｌｅｉｎ， Ｏ．， Ｋ．． ヒト新生児癲癇におけるカリウムチャネル． Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７９： ４０３−４０６ （１９９８）； Ｓｉｎｇｈ， Ｎ． Ｓ．， Ｃｈａｒｌｉｅｒ， Ｃ．， Ｓｔａｕｆｆｅｒ， Ｄ．， ＤｕＰｏｎｔ， Ｂ．， Ｒ．， Ｌｅａｃｈ， Ｒ．， Ｊ．， Ｍｅｌｉｓ， Ｒ．， Ｒｏｎｅｎ， Ｇ．， Ｍ．， Ｂｊｅｒｒｅ， Ｉ．， Ｑｕａｔｔｌｅｂａｕｍ， Ｔ．， Ｍｕｒｐｈｙ， Ｊ．， Ｖ．， ＭｃＨａｒｇ， Ｍ．， Ｌ．， Ｇａｇｎｏｎ， Ｄ．， Ｒｏｓａｌｅｓ， Ｔ．， Ｏ．， Ｐｅｉｆｆｅｒ， Ａ．， Ａｎｄｅｒｓｏｎ， Ｖ．， Ｅ．， Ｌｅｐｐｅｒｔ， Ｍ．． 新規カリウムチャネル遺伝子、ＫＣＮＱ２は、新生児の遺伝性癲癇において変異している。Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １８： ２５−２９ （１９９８）； Ｃｈａｒｌｉｅｒ， Ｃ．， Ｓｉｎｇｈ， Ｎ．， Ａ．， Ｒｙａｎ， Ｓ．， Ｇ．， Ｌｅｗｉｓ， Ｔ．， Ｂ．， Ｒｅｕｓ， Ｂ．， Ｅ．， Ｌｅａｃｈ， Ｒ．， Ｊ．， Ｌｅｐｐｅｒｔ， Ｍ．．突発性癲癇ファミリーにおける新規ＫＱＴ様カリウムチャネル遺伝子における点変異． Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １８： ５３−５５ （１９９８））および無症候性常染色体優性難聴（ＫＣＮＱ４（Ｋｕｂｉｓｃｈ， Ｃ．， Ｓｃｈｒｏｅｄｅｒ， Ｂ．， Ｃ．， Ｆｒｉｅｄｒｉｃｈ， Ｔ．， Ｌｕｔｊｏｈａｎｎ， Ｂ．， Ｅｌ−Ａｍｒａｏｕｉ， Ａ．， Ｍａｒｌｉｎ， Ｓ．， Ｐｅｔｉｔ， Ｃ．， Ｊｅｎｔｓｃｈ Ｔ．， Ｊ．， ＫＣＮＱ４、感覚外有毛細胞において発現される新規カリウムチャネルは遺伝性難聴患者において変異している。Ｃｅｌｌ ９６： ４３７−４４６ （１９９９��； Ｃｏｕｃｋｅ， Ｐ．， Ｊ．， Ｖａｎ Ｈａｕｗｅ， Ｐ，．， Ｋｅｌｌｅｙ， Ｐ．， Ｍ．， Ｋｕｎｓｔ， Ｈ．， Ｓｃｈａｔｔｅｍａｎ， Ｉ．， Ｖａｎ Ｖｅｌｚｅｎ， Ｄ．， Ｍｅｙｅｒｓ， Ｊ． Ｅｎｘｉｎｋ， Ｒ．， Ｊ．， Ｖｅｒｓｔｒｅｋｅｎ， Ｍ．， Ｄｅｃｌａｕ， Ｆ．， Ｍａｒｒｅｓ， Ｈ．， Ｋａｓｔｕｒｙ， Ｋ．， Ｂｈａｓｉｎ， Ｓ．， ＭｃＧｕｉｒｔ， Ｗ．， Ｔ．， Ｓｍｉｔｈ， Ｒ．， Ｊ．， Ｃｒｅｍｅｒｓ， Ｃ．， Ｗ．， Ｖａｎ ｄｅ Ｈｅｙｎｉｎｇ， Ｐ．， Ｗｉｌｌｉｅｍｓ， Ｐ．， Ｊ．， Ｓｍｉｔｈ， Ｓ．， Ｄ．， Ｖａｎ Ｃａｍｐ．， Ｇ．． ＫＣＮＱ４遺伝子の変異は、４つのＤＦＮＡ２ファミリーにおける常染色体優性難聴の原因である。Ｈｕｍａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ８： １３２１−１３２８ （１９９９）））を含む多くの症候群がこれらのタンパク質の欠損に関連している。しかしながら、今日まで、膀胱平滑筋を含む他の組織タイプにおいてＫＣＮＱ電流に関する証拠は報告されていない。ここに示すデータにより、膜電位および膀胱平滑筋の機能化に寄与するＫＣＮＱに基くＭ電流の存在の分子学的ならびに生理学的証拠が提供される。
【００５７】
既に記載されているように（Ｗｏｊｄａｎ， Ａ．， Ｆｒｅｅｄｅｎ， Ｃ．， Ｗｏｏｄｓ， Ｍ．，Ｏｓｈｉｒｏ， Ｇ．， Ｓｐｉｎｅｌｌｉ．， Ｗ． ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｅｘｐ Ｔｈｅｒａｐ ２８９： １４１０−１４１８ （１９９９））、雄のＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットからラットの膀胱片を単離し、次いでそれを２０ｍＭのＫＣｌで前収縮した。ＫＣＮＱチャネルアゴニストレチガビンを濃度を増しながら組織浴に添加し、そして、濃度曲線下の領域を分析した。レチガビンは濃度依存様式で自発収縮を阻害し、ＩＣ５０＝１．４±０．１μＭ（ｎ＝４、図１）であった。薬物の効果はＡＴＰ−感受性Ｋ＋チャネルブロッカー、グリブリド（１０μＭ）により逆転しなかったが、１０μＭのＭ電流インヒビター、リノピルジンまたは選択的ＫＣＮＱチャネルブロッカーＸＥ−９９１により、９４．８±１７．５％アンタゴナイズされた。
【００５８】
別の研究において、単離したラットの膀胱片を６０ｍＭのＫＣｌで前収縮した（図１）。この条件下の収縮の阻害に関するＩＣ５０は、２０ｍＭのＫＣｌで得られたＩＣ５０よりも有意に大きかった（２１．８±０．８μＭ；ｎ＝４）（ｐ＜０．０５）。
【００５９】
ムスカリン性アゴニストカルバコル（２００ｎＭ）で収縮した膀胱片の３番目のセットにおいて、レチガビンは、３．５±０．９ｎＭ（ｎ＝１４）のＩＣ５０で収縮の濃度依存性の阻害を生じた。２０および６０ｍＭＫＣｌ脱分極間のＩＣ５０の差は、カリウムチャネル開放メカニズムと一致する。ＡＴＰ依存性のＫ＋チャネルアンタゴニストグリブリドの不能および、レチガビンの効果をアンタゴナイズするリノピリジンまたはＸＥ−９９１の能力は、膀胱平滑筋の収縮が、ＫＣＮＱチャネルの活性化により阻害されることを示唆する。
【００６０】
次に、定量逆転写酵素ポリメラーゼ鎖反応（ｒｔＰＣＲ）を用いて、ラットの膀胱においてＫＣＮＱサブユニットの組成をプローブした。データ（ｒｔＰＣＲ）は、パーセントＲＮＡ／ＧＡＰＤＨ  ＲＮＡレベルとして示す。最高レベルの発現が、ＫＣＮＱ５遺伝子を用いて認められた（０．２±０．１ｎｇＫＣＮＱ５ｍＲＮＡ／ＧＡＰＤＨｍＲＮＡ）。ＫＣＮＱ１は０．０７±０．１ｎｇのｍＲＮＡ／ＧＡＰＤＨｍＲＮＡのレベルを示し、一方、ＫＮＣＱ３は０．０１±０．０１ｎｇのｍＲＮＡ／ＧＡＰＤＨｍＲＮＡにて算定された。ＫＣＮＱ２またはＫＣＮＱ４遺伝子に関してはいずれもシグナルは認められなかった（図２ｂ）。培養ヒト膀胱平滑筋細胞におけるＫＣＮＱサブユニットの組成は、ＫＣＮＱ５（０．０７±０．０６０１ｎｇ  ｍＲＮＡ／ＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡ）およびＫＣＮＱ３（１．５×１０−３±０．１×１０−３ｎｇ  ｍＲＮＡ／ＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡ）であった。ＫＣＮＱ１、ＫＮＣＱ２またはＫＣＮＱ４のこれらの細胞における発現の証拠はなかった。
【００６１】
電流に関するデータにより、ＫＣＮＱ２およびＫＣＮＱ３サブユニットがレチガビンによりアゴナイズされ得るヘテロ多重結合チャネルを形成することが示唆される。ＫＣＮＱ３およびＫＣＮＱ５は、同様にレチガビンに感受性のある機能イオンを形成するとも考えられる。ＫＣＮＱ４は、レチガビンにより活性化され得るＫＣＮＱ３またはとヘテロ結合イオンチャネルと共にヘテロ多重結合を形成し得る（Ｓｃｈｒｏｄｅｒ， Ｒ． Ｌ．， Ｊｅｓｐｅｒｓｅｎ， Ｔ．， Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈｅｒｓｅｎ， Ｐ．， Ｓｔｒｏｂａｅｋ， Ｄ．， Ｊｅｎｓｅｎ， Ｂ． ｅｔ ａｌ． ＢＭＳ−２０４３５２およびレチガビンによるＫＣＮＱ４チャネルの活性化 Ｎｅｕｒｏｐｈａｒｍａｃｏｌ ４０： ８８８−８９８ （２００１））。前記データにより、ラットおよびヒトの膀胱平滑筋においてＫＣＮＱｍＲＮＡの発現に関する分子学的証拠が提供される。このメッセージにより形成されるイオンチャネルの活性化は、膀胱平滑筋のレチガビン誘導性の弛緩と一致する。
【００６２】
細胞の電気生理学的研究は、前記のＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（２００−３００グラム）の膀胱から（Ｗｏｊｄａｎ， Ａ．， Ｆｒｅｅｄｅｎ， Ｃ．， Ｗｏｏｄｓ， Ｍ．， Ｏｓｈｉｒｏ， Ｇ．， Ｓｐｉｎｅｌｌｉ， Ｗ． ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ ＥｘｐＴｈｅｒａｐ ２８９： １４１０−１４１８ （１９９９））、およびヒトの膀胱、一次細胞培養物（Ｃｏｌｎｅｔｉｃｓ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ）から、電圧および電流クランプ法両方を用いて（Ｈａｍｍｉｌｌｉ， Ｏ， Ｐ．， Ｍａｒｔｙ， Ａ．， Ｎｅｈｅｒ， Ｅ．， Ｓａｋｍａｎｎ， Ｂ． ＆ Ｓｉｇｗｏｒｔｈ， Ｆ．， Ｊ． ：細胞および細胞遊離膜パッチからの高解像電流記録のための改良されたパッチクランプ法。Ｐｆｌｕｇｅｒｓ Ａｒｃｈ ３９１： ８５−１００ （１９８１））行った。ラットの細胞において、平均の、コントロール休止膜電位（ＲＭＰ）は、−２９．０±４．５ｍＶであった。１０μＭのレチガビンへ曝した後、−４３．０±３．５ｍＶへの有意な（ｐ＜０．５、ｎ＝３）の過分極があった。過分極は、洗浄または１０μＭのＸＥ−９９１の添加により完全に逆転した（図３ａ）。興味深いことに、ＸＥ−９９１は細胞を、その最初のＲＭＰ未満に脱分極し、これは、ＫＣＮＱ電流が正常な膜電位の決定要因であることを示す。レチガビン誘導性の過分極は、１００ｎＭのＡｃｈの適用によってもアンタゴナイズされることができた（図３ｂ）。電圧クランプ試験により、−５０および８０ｍＶ間の試験電位にて外部電流におけるレチガビン誘導性の増加が明らかであった（図３ｂ、ｃ；ｎ＝５）。外部電流の増加は、１００ｎＭのイベリオトキシンに対しては感受性はなかった（Ｇａｌｖｅｚ， Ａ． ｅｔ ａｌ．： サソリｂｕｔｈｕｓ ｔａｍｕｌｕｓの毒からの高コンダクタンスのカルシウム活性化カリウムチャネルのための、ユニークな、潜在的ピペリジルプローブの精製および特定。Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２６５： １１０８３−１１０９０（１９９０））（ＩｂＴｘ）が、リノピルジン（５０μＭ）またはＸＥ−９９１（１０μＭ）によって部分的に逆転した（データは示していない）。培養ヒト膀胱平滑筋細胞は、−８．０±２．８ｍＶの静止膜電位にてより脱分極した。レチガビンに曝すことにより、これらの細胞は１１±１．１ｍＶ（ｎ＝３）まで過分極し、および外部電流が増した（図３ｄ）。これらの変化はＸＥ−９９１により部分的に逆転し得た。
【００６３】
これらのデータにより、ＫＣＮＱチャネルオープナーレチガビンにより活性化されることができるラットおよびヒト膀胱平滑筋における外部電流の存在が立証される。この電流の活性化は、ＡｃｈおよびＫＣＮＱチャネルブロッカーリノピルジンおよびＸＥ−９９１により遮断される過分極と関連した。膀胱平滑筋におけるレチガビン依存性の外部電流は、他の組織においてＭ電流に関して報告されているものと電気生理学的および薬理学的に一致していると結論づけることができる。
【００６４】
ラットの膀胱の排尿頻度（０．２５％酢酸を含む潅水により高められる（Ｂｉｒｄｅｒ， Ｌ．Ａ．， ＆ ｄｅＧｒｏａｔ， Ｗ．， Ｃ．． ラットの下位尿管の刺激後に増加する脊髄ニューロンにおけるｃ−ｆｏｓの発現 Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃ １２： ４８７８−４８８９ （１９９２）））は、投与量依存（０．１−１０ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．）様式でレチガビンにより阻害された。１０ｍｇ／ｋｇで、排尿は投与された動物の１００％で遮断され、母集団ＥＤ５０は１−２ｍｇ／ｋｇ（ｎ＝５−８）であった。排尿の遮断は９０分まで続いた（図４ａ）。シストメトログラムは高程度の自発収縮を示し、これはレチガビンの投与に感受性があったが、これにより完全には排尿は遮断されなかった。１ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．にて自発収縮が４３．５±１４．１％阻害された（ｐ＜０．０５）。
【００６５】
概要
Ｍ−電流は、種々の組織において重要な機能的役割を果たすことが示された。遺伝子ファミリーは少なくとも５つの主なサブユニット−ＫＣＮＱ１からＫＮＣＱ５を含む。これらのサブユニットは、同時集合して機能的ヘテロマーイオンチャネルおよびホモマーイオンチャネルを形成することが示されている。Ｍ−電流の平滑筋における唯一の先の証拠は、ヒキガエルの胃の平滑筋において報告されている（Ｓｉｍｓ， Ｓ．， Ｔ．， Ｓｉｎｇｅｒ Ｊ．， Ｊ．， ＆ Ｗａｌｓｈ， Ｊ．， Ｖ．． 平滑筋細胞におけるＭ−電流のアンタゴニストアドレナリン−ムスカリン調節 Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９： １９０−１９３ （１９９８））。本出願人のデータにより、ラットおよびヒトの膀胱の平滑筋におけるＭ電流に関する生理学的および薬理学的証拠が提供され、そして、ＫＣＮＱカリウムチャネルがこの電流の基礎であることを示している分子的証拠が提供される。出願人らは、ＫＣＮＱチャネルアゴニスト、レチガビンが、前収縮した単離したラットの膀胱片を弛緩させることができることを示した。グリブリドの添加は弛緩をアンタゴナイズしなかったという事実は、レチガビンがＡＴＰ依存性のカリウムチャネルの活性化によっては作用しないということを示唆する。定量ｒｔＰＣＲを用いて、ラットにおいてはＫＣＮＱ１、３および５に関してｍＲＮＡの発現が、ヒトの膀胱においてはＫＣＮＱ３および５の発現が同定された。電気生理学的評価は、Ｍ−電流ブロッカーリノピルジンおよびＫＣＮＱチャネルアンタゴニストＸＥ−９９１によりアンタゴナイズされるレチガビン誘導性の外部電流および過分極を明らかにした。これらのデータにより、膀胱平滑筋の興奮の重要な決定要因であることが明らかであるＫＣＮＱ媒介Ｍ電流に関する証拠が提供される。出願人は、このチャネルは、切迫性尿失禁に伴う膀胱過活動の治療の新規な分子的標的を示し得ると信じる。
【００６６】
方法
ラットの膀胱片を、既に記載されているように単離および調製した（Ｗｏｊｄａｎ， Ａ．， Ｆｒｅｅｄｅｎ， Ｃ．， Ｗｏｏｄｓ， Ｍ．， Ｏｓｈｉｒｏ， Ｇ．， Ｓｐｉｎｅｌｌｉ， Ｗ． ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ ＥｘｐＴｈｅｒｐ ２８９： １４１０−１４１８ （１９９９））。調製物を２０または６０ｍＭのＫＣｌまたは２００ｎＭのカルバコルいずれかで収縮した。濃度曲線下の５分の領域を、レチガビンの各濃縮物の添加後２０分で、１２ビットのＤ／Ａおよび５８６ベースのパーソナルコンピューターランニングカストムソフトウェアを用いて得た。ＫＣＮＱサブユニットに関するメッセージを、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ（登録商標）７７００Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｔａｑｍａｎ）を用いてプローブした。フォーワードおよびリバースプライマーおよびＴａｑｍａｎプローブを、ＮＣＢＩデータベース内に記載されているヒトのＫＣＮＱ１−５およびラットのＫＣＮＱ１−４に関して公開されているＲＮＡ配列を用いて設計した。ラットのＫＣＮＱ５に関する配列は現在のところ公開されていないので、公知のマウスのＫＣＮＱ５配列を用いてラットの発現配列タグ（ＥＳＴ）のＢＬＡＳＴ分析により、プローブおよびプライマーを設計した。相同ＥＳＴ配列から、３８４塩基対の隣接配列を構築した。プローブおよびプライマーをこの配列に対して設計した。出願人のラットＫＣＮＱ５プローブおよびプライマーのＢＬＡＳＴ分析は、マウスおよびヒトのＫＣＮＱ５配列に関して選択的であった。ＰＣＲ産物をゲル電気泳動により確認した（データは示していない）。電気生理学のための細胞を、既に記載されているように（Ｗｏｊｄａｎ ｅｔ ａｌ．， １９９９）ラットの膀胱平滑筋から調製した。ヒトの膀胱平滑筋細胞は、Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡから得た。細胞をトリプシンを用いて培養物から取り出し、次いで直接記録チャンバーに加えた。全記録を３２℃にて行い、ｐＣＬＡＭＰ（Ａｘｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）ソフトウェアを用いて５８６ベースのパーソナルコンピューターにおいて得た。電流クランプの記録を、既に記載されているようにニスタチンの添加（ａｃｃｅｓｓ）を用いて行った（Ｗｏｊｄａｎ ｅｔ ａｌ．）。ラットの膀胱のシストメトリーを、既に記載されているように行った（Ｗｏｏｄｓ， Ｍ．， Ｃａｒｓｏｎ， Ｎ．， Ｎｏｒｔｏｎ Ｎ．， Ｗ．， Ｓｈｅｌｄｏｎ Ｊ．， Ｈ．， ＆ Ａｒｇｅｎｔｉｅｒｉ Ｔ．， Ｍ．． ラットの実験的膀胱過剰反射および不安定性膀胱におけるベータ３−アドレナリン性レセプターアゴニストＣＬ−３１６２４３の効果 Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｕｒｏｌｏｇｙ １６６： １１４２−１１４７（２００１））。記録を、ＰｏｗｅｒＬａｂ  ＭＬ７９５（１６ビットＡ／Ｄ）データ取得システムを用いて得、次いでオフラインで分析した。
本明細書に記載する公開文献は、引用により組み込む。
【図面の簡単な説明】
【図１】単離したラットの膀胱片の収縮の阻害に関するレチガビン濃度反応曲線を示すグラフである。黒丸は、２０ｍＭのＫＣｌで収縮した調製物からのデータを示し、ＩＣ５０は１．４±０．１μＭであった。白丸は、６０ｍＭのＫＣｌで収縮した調製物からのデータを示し、ＩＣ５０は２１．８±０．８μＭであった。このグラフは、ＫＣｌの濃度が高いほどカリウム駆動力が低下し、カリウムチャネルオープナーの効力が阻害されるカリウムチャネル開放メカニズムと一致する。
【図２】（ａ）ヒトの泌尿器膀胱、および（ｂ）ラットの泌尿器膀胱において、ＫＣＮＱｍＲＮＡ／ＧＡＤＰＨｍＲＮＡとして測定したＫＣＮＱ遺伝子発現レベルのグラフである。図２ａにおいては、定量逆転写ポリメラーゼ鎖反応（ｒｔＰＣＲ）を、ラットの膀胱平滑筋から単離したＲＮＡにおいて行った。ＫＣＮＱ１、ＫＣＮＱ３およびＫＣＮＱ５に関するメッセージが見られた。ＫＣＮＱ２またはＫＣＮＱ４に関してメッセージは存在しなかった。図２ｂにおいては、培養ヒト膀胱平滑筋細胞から単離したＲＮＡにおいてｒｔＰＣＲを行った。ＫＣＮＱ３およびＫＣＮＱ５に関するメッセージが見られた。
【図３】ａは、単離したラットの膀胱平滑筋細胞からなぞる電流クランプのグラフである。１０μＭのレチガビンに暴露する前の静止膜電位は−４０ｍＶであった。レチガビンにより約１０ｍＭまで細胞が過分極した。この過分極は、１０μＭのＸＥ−９９１の添加により逆転した。ｂは、１００ｎＭのＡｃｈによる脱分極が後に続くレチガビン誘導性の過分極を示している、単離したラットの膀胱平滑筋からの電流クランプトレーシングのグラフである。ｃは、レチガビン前（コントロール）および後の外部電流に関する電流−電圧の関連に関するグラフである。ｄは、単離したヒト膀胱平滑筋細胞からなぞる電圧クランプの３つのグラフである。レチガビンは外部電流を増し、これは１０μＭのＸＥ−９９１により部分的に逆転した。
【図４】ａは、４匹のラットからのシストメトログラムを示す。膀胱滲出液は０．２５％の酢酸を含み、これは、自発収縮を引き起こし、そして排尿の間隔を短くした。排尿は、レチガビン（１０ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．）投与中完全に遮断された。ｂは、膀胱充満中の自発収縮を示している２つのシストメトログラムを示す。レチガビン（０．１ｍｇ／ｋｇ）（１番目のシストメトログラム）により、対照と比較して、自発収縮の頻度が有意に低下した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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