(57)【要約】抗原と担体と含むＴ細胞介在疾患または症状の治療のための治療用製剤が提供され、ここで該抗原は、該Ｔ細胞介在疾患または症状の病因に関連する炎症性Ｔ細胞により認識され、かつ該担体は、(a) 飽和またはシス不飽和Ｃ10〜Ｃ20脂肪族アルコール、またはＣ1〜Ｃ6アルカン酸とのそのエステル、および(b) Ｃ1〜Ｃ6アルキルエステル、少なくとも２つのヒドロキシ基を有するＣ2〜Ｃ6ポリオールとのモノエステル、およびグリセロールとのジエステルから選択される抗炎症性免疫調節物質である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗原と担体を含む、Ｔ細胞介在性の疾患または症状の治療のための治療用製剤であって、該抗原は、Ｔ細胞介在性の疾患または症状の病因に関連する炎症性Ｔ細胞により認識されるものであり、該担体は、(a) 飽和若しくはシス不飽和のＣ10〜Ｃ20脂肪族アルコール、またはそれらとＣ1〜Ｃ6アルカン酸とのエステル、並びに(b) Ｃ1〜Ｃ6アルキルエステル、少なくとも２つのヒドロキシ基を有するＣ2〜Ｃ6ポリオールとのモノエステル、およびグリセロールとのジエステルから選択される飽和若しくはシス不飽和のＣ10〜Ｃ20脂肪酸エステル、から選択される抗炎症性免疫調節物質である、上記製剤。
【請求項２】
前記担体は、飽和Ｃ10〜Ｃ20脂肪族アルコールである、請求項１の治療用製剤。
【請求項３】
前記飽和Ｃ10〜Ｃ20脂肪族アルコールは、デシルアルコール、ラウリルアルコール、ミリスチルアルコール、セチルアルコール、およびステアリルアルコールから選択される、請求項２の治療用製剤。
【請求項４】
前記担体は、シス不飽和Ｃ16〜Ｃ18脂肪族アルコールである、請求項１の治療用製剤。
【請求項５】
前記シス不飽和Ｃ16〜Ｃ18脂肪族アルコールは、オレイルアルコール、リノレイルアルコール、γ−リノレニルアルコール、およびリノレニルアルコールから選択される、請求項４の治療用製剤。
【請求項６】
前記担体は、飽和若しくはシス不飽和のＣ10〜Ｃ20脂肪族アルコールとＣ1〜Ｃ6アルカン酸とのエステルである、請求項１の治療用製剤。
【請求項７】
前記担体は、Ｃ1〜Ｃ6アルキルエステル、少なくとも２つのヒドロキシ基を有するポリオールとのモノエステル、およびグリセロールとのジエステルから選択される飽和若しくはシス不飽和のＣ10〜Ｃ20脂肪酸エステルである、請求項１の治療用製剤。
【請求項８】
前記脂肪酸部分は、飽和Ｃ10〜Ｃ20脂肪酸である、請求項７の治療用製剤。
【請求項９】
前記飽和脂肪酸は、カプリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、およびアラキジン酸から選択される、請求項８の治療用製剤。
【請求項１０】
前記脂肪酸部分は、シス不飽和Ｃ10〜Ｃ20脂肪酸である、請求項７の治療用製剤。
【請求項１１】
前記シス不飽和Ｃ10〜Ｃ20脂肪酸は、パルミトレイン酸、オレイン酸、シス−バクセン酸、リノール酸、γ−リノレン酸、リノレン酸、およびアラキドン酸から選択される、請求項１０の治療用製剤。
【請求項１２】
前記脂肪酸アルキルエステルは、オレイン酸メチルまたはオレイン酸エチルである、請求項１１の治療用製剤。
【請求項１３】
前記脂肪酸エステルは、Ｃ2〜Ｃ8アルカンジオール、グリセロールおよびサッカリドから選択されるポリオールとのモノエステルである、請求項７〜１２のいずれか１項に記載の治療用製剤。
【請求項１４】
前記アルカンジオールは、１，２−エチレングリコール、１，３−プロパンジオールおよび１，４−ブタンジオールから選択される、請求項１３の治療用製剤。
【請求項１５】
前記グリセロールとの脂肪酸モノエステルは、モノオレイン酸グリセロールである、請求項１３の治療用製剤。
【請求項１６】
前記サッカリドは、リボース、フラクトース、グルコース、ガラクトース、およびマンノースから選択されるモノサッカリドである、請求項１３の治療用製剤。
【請求項１７】
前記脂肪酸モノエステルは、モノオレイン酸マンノースである、請求項１６の治療用製剤。
【請求項１８】
前記脂肪酸エステルは、グリセロールとのジエステルである、請求項７〜１２のいずれか１項に記載の治療用製剤。
【請求項１９】
前記ジグリセリドは、ジオレイン酸グリセロールである、請求項１８の治療用製剤。
【請求項２０】
ＴH１からＴH２への個体のＴ細胞サイトカイン応答のシフトを引き起こす治療用製剤であって、Ｔ細胞介在性の疾患または症状の病因に関連する炎症性Ｔ細胞により認識される抗原と、(a) 飽和若しくはシス不飽和のＣ10〜Ｃ20脂肪族アルコール、またはそれらとＣ1〜Ｃ6アルカン酸とのエステル、並びに(b) Ｃ1〜Ｃ6アルキルエステル、少なくとも２つのヒドロキシ基を有するＣ2〜Ｃ6ポリオールとのモノエステル、およびグリセロールとのジエステルから選択される飽和若しくはシス不飽和のＣ10〜Ｃ20脂肪酸エステルから選択される抗炎症性調節物質からなる担体とを含む、上記治療用製剤。
【請求項２１】
前記担体は請求項２〜１９のいずれか１項で定義されているものである、請求項２０の治療用製剤。
【請求項２２】
ＩＬ−２またはＩＦＮ−γ  Ｔ細胞サイトカイン応答の低下と、ＩＬ−４またはＴ細胞サイトカイン応答の上昇とを引き起こす、請求項２０または２１の治療用製剤。
【請求項２３】
前記Ｔ細胞介在性の疾患は自己免疫疾患であり、前記抗原はペプチドである、請求項１〜２２のいずれか１項に記載の治療用製剤。
【請求項２４】
前記自己免疫疾患は、臓器特異的自己免疫疾患である、請求項２３の治療用製剤。
【請求項２５】
前記臓器特異的自己免疫疾患は、Ｉ型糖尿病、多発性硬化症、リウマチ様関節炎、および自己免疫甲状腺炎から選択される、請求項２４の治療用製剤。
【請求項２６】
前記多発性硬化症の病原性に関与するＴ細胞により認識される、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）またはその類似体の配列から得られるペプチドを含む、多発性硬化症の治療のための請求項２５の治療用製剤。
【請求項２７】
Ｔ細胞介在性の疾患または症状を治療するための治療用製剤を製造するための、Ｔ細胞介在性の疾患または症状の病因に関連する炎症性性Ｔ細胞により認識される抗原と一緒の、(a) 飽和またはシス不飽和のＣ10〜Ｃ20脂肪族アルコール、またはそれらとＣ1〜Ｃ6アルカン酸とのエステル、および(b) Ｃ1〜Ｃ6アルキルエステル、少なくとも２つのヒドロキシ基を有するＣ2〜Ｃ6ポリオールとのモノエステル、およびグリセロールとのジエステルから選択される抗炎症性免疫調節物質からなる担体の使用。
【請求項２８】
前記担体は、請求項２〜１９のいずれか１項で定義されているものである、請求項２７の治療用製剤。
【請求項２９】
Ｔ細胞介在性の疾患または症状を患う患者の治療法において、患者に、Ｔ細胞介在性の疾患または症状の病因に関連する炎症性Ｔ細胞により認識される抗原と、(a) 飽和若しくはシス不飽和のＣ10〜Ｃ20脂肪族アルコール、またはそれらとＣ1〜Ｃ6アルカン酸とのエステル、並びに(b) 飽和若しくはシス不飽和のＣ10〜Ｃ20脂肪酸エステルであって、Ｃ1〜Ｃ6アルキルエステル、少なくとも２つのヒドロキシ基を有するＣ2〜Ｃ6ポリオールとのモノエステル、およびグリセロールとのジエステルから選択される該エステル、から選択される抗炎症性免疫調節物質からなる担体とを含有する治療用製剤を投与することを含む、上記方法。
【請求項３０】
担体は請求項２〜１９のいずれか１項で定義されているものである、請求項２９の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｔ細胞介在性の疾患または症状の治療のための治療用製剤に関し、特に、Ｔ細胞介在疾患または症状に関連する炎症性Ｔ細胞により認識される抗原の担体としての、脂肪族アルコール、それとＣ1〜Ｃ6アルカン酸とのエステル、または脂肪酸とアルカノールもしくはポリオールとのエステルから選択される抗炎症性免疫調節物質の使用に関する。
【０００２】
略語：ＡＡ：アジュバント関節炎；ＣＦＡ：完全フロイントアジュバント；ＥＡＥ：実験的自己免疫脳脊髄炎；ＩＦＡ：不完全フロイントアジュバント；ＭＢＰ：ミエリン塩基性タンパク質；ＭＯＧ：ミエリン乏突起神経膠細胞糖タンパク質；ＯＡ：オレイルアルコール；ＰＬＰ：プロテオ脂質タンパク質；ＳＣ：皮下に；ＴCＲ：Ｔ細胞受容体。
【背景技術】
【０００３】
リンパ球は免疫系の中心的な細胞であり、獲得免疫、並びに多様性、特異性、記憶、および自己／非自己認識からなる免疫学的属性を担っている。成熟Ｂ細胞は、その合成と膜結合免疫グロブリン（抗体）分子（抗原の受容体となる）の表示により、他のリンパ球から区別される。抗原と成熟した未感作Ｂ細胞上の膜結合抗体との相互作用により、対応する特異性を有するＢ細胞クローンの活性化及び分化が起こり、その結果、膜結合抗体が欠如しているが同じ抗原結合特異性を有する抗体分子を分泌するＢ細胞クローンが産生される。
【０００４】
Ｔリンパ球はＢリンパ球のように、抗原に対する膜受容体を有する。しかしＢ細胞上の膜結合抗体とは異なり、Ｔ細胞受容体（ＴCＲ）は遊離の抗原を認識しない。その代わりにＴCＲは、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）に属する遺伝子によりコードされる自己分子に結合した抗原のみを認識する。ほとんどのＴ細胞により認識されるためには、抗原は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）の表面、或いはウイルス感染細胞、癌細胞および移植片上にＭＨＣ分子とともに表示されなければならない。
【０００５】
Ｂ細胞のように、Ｔ細胞は識別性を示す膜分子を発現する。すべてのＴ細胞亜集団はＴCＲ（ＣＤ３を含むポリペプチドの複合体）を発現し、ほとんどは、２つの膜分子（ＣＤ４とＣＤ８）のいずれかの存在により区別することができる。膜糖タンパク質分子ＣＤ４を発現するＴ細胞は、クラスII ＭＨＣ分子に結合した抗原に限って認識し、一方、ＣＤ８（ダイマー性膜糖タンパク質）を発現するＴ細胞は、クラスＩ ＭＨＣ分子に結合した抗原に限って認識する。
【０００６】
一般にＣＤ４とＣＤ８の発現はまた、Ｔリンパ球の２つの主要な亜集団を規定する。ＣＤ４+Ｔ細胞は一般に、Ｔヘルパー（ＴH）細胞として機能し、クラスII限定される。ＣＤ８+Ｔ細胞は一般に、Ｔ細胞障害性（ＴC）細胞として機能し、クラスＩに限定される。
【０００７】
ＴH細胞は、抗原提示細胞上の抗原−クラスII ＭＨＣ複合体の認識により活性化される。活性化後、ＴH細胞は分裂し始め、それぞれ同じ抗原−クラスII ＭＨＣ複合体に特異的なエフェクター細胞のクローンを生成する。これらのＴH細胞は、Ｂ細胞、Ｔ細胞、および免疫応答に関与する他の細胞の活性化において中心的な役割を果たす種々のサイトカインを分泌する。
【０００８】
ＴH細胞により産生されるサイトカインのパターンが変化することにより、他の白血球中で発生する免疫応答のタイプを変化させることができる。このためＴH細胞は、活性化された時に分泌するサイトカインの特徴により２つの群に分類されている（MosmannとCoffman、1989）。ＴH１応答は、炎症を持続するとともに、主に特定のＴ細胞及びマクロファージを活性化するサイトカインプロフィールを生じ、一方、ＴH２応答は、主に、Ｂ細胞と抗体に依存する免疫応答とを活性化する。すなわち、ＴH１細胞は、ＩＬ−２（これはＴ細胞増殖を誘導する）やＩＦＮ−γ（これは組織炎症を仲介する）のようなサイトカインを分泌する。これに対してＴH２細胞は、ＩＬ−４（これは、Ｂ細胞を活性化して特定のＩｇＧイソタイプの抗体を分泌し、ＴH１炎症性サイトカインの産生を抑制する（Banchereauら、1994））やＩＬ−１０（これは、マクロファージによる炎症性サイトカイン産生を抑制し、その結果間接的にＴH１細胞によるサイトカイン産生を低下させ、クラスII ＭＨＣ発現をダウンレギュレートすることで抗原提示細胞に影響を与える（Mooreら、1993））を分泌する。
【０００９】
自己免疫は、Ｔ細胞またはＢ細胞の自己反応性クローンの活性化に到る、自己成分に対する免疫系の不適切な応答により生じ、内因性抗原に対する体液性または細胞性応答を生じる結果、細胞、組織および臓器に傷害を与えるものである。時に傷害は、自己免疫疾患であるアジソン病、自己免疫性貧血（例えば、自己免疫性溶血性貧血および悪性貧血）、橋本甲状腺炎および強皮症などで、抗体により引き起こされる。
【００１０】
多くの自己免疫疾患（例えば、インスリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭまたはＩ型糖尿病）、多発性硬化症、リウマチ様関節炎および自己免疫性甲状腺炎）は、内因性抗原に活性化されたＴ細胞による組織破壊が特徴である。自己抗原に対するこれらの免疫応答は、自己反応性Ｔリンパ球の持続的活性化により維持される。
【００１１】
自己免疫疾患は、免疫応答が単一の臓器または腺に特徴的な標的抗原に向けられ、その結果、症状はほとんどその臓器に限定される、臓器特異的自己免疫疾患、並びに免疫応答が広範囲の標的抗原に向けられ、多くの臓器や組織が関与する、全身性自己免疫疾患に分類することができる。臓器特異的自己免疫疾患の例としては、インスリン依存性糖尿病、多発性硬化症、リウマチ様関節炎、甲状腺炎、重症筋無力症があり、全身性自己免疫疾患の例としては、全身性エリテマトーデスや強皮症がある。
【００１２】
臓器特異的自己免疫疾患の一因となるのはＴH１細胞である。例えば、マウスにおいて、免疫抗原、例えばミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）またはプロテオ脂質タンパク質（ＰＬＰ）、に特異的なＣＤ４+ＴH１細胞により、実験的自己免疫脳脊髄炎（ＥＡＥ）が引き起こされるという強力な証拠がある。この疾患は、ＭＢＰまたはＰＬＰで免疫された動物のＴ細胞、またはそのような動物のクローン化Ｔ細胞系列により、次から次に他の動物に伝搬することができる。ＴH１型応答はまた、Ｔ細胞介在性の疾患または症状（例えば、接触皮膚炎）に関与しているようである（Romagnani，1994）。
【００１３】
臓器特異的自己免疫疾患の多くは、自己反応性ＣＤ４+Ｔ細胞によって発症する。これらのＴ細胞の分析により、ＴH１／ＴH２のバランスが、自己免疫が発現するかどうかに影響を及ぼすことが明らかにされた。ＴH１細胞は、自己免疫の発現に関与し、一方、いくつかのケースにおいてＴH２細胞は、疾患の誘導を防げるだけでなく、確立された疾患の進行を防げ、同種移植片寛容の誘導と維持に寄与する。
【００１４】
自己免疫疾患の治療のためにいくつかの治療アプローチが検討されている。種々の自己抗原の同定と配列決定により、自己免疫性Ｔ細胞活性を調節するための新しいアプローチが開発された。自己免疫疾患の病因に関与する全抗原またはその配列から得られるペプチドが、自己免疫疾患の治療のために提唱されている。
【００１５】
自己免疫疾患の免疫特異的な治療に適した合成ペプチドとしては、自己免疫疾患の病因に関与するＴ細胞により認識されるペプチドがある。これらのペプチドは、疾患に関与する抗原の配列内の病原性配列からなる配列を有するか、或いは、その配列中の１以上の元のアミノ酸残基が、異なるアミノ酸残基により置換されるその類似体、特にいわゆる「改変ペプチド」（これは、病原性の元の対応部分のエピトープ（すなわち、ＴCＲと接触する領域）中に単一のアミノ酸置換を含有するが、アグレトープ（すなわち、ＭＨＣと接触する領域）には変更は無い）でもよい。
【００１６】
各自己免疫疾患は、疾患に関連する抗原の配列から直接得られるか、またはそれの改変ペプチド若しくはその他の類似体である、治療で使用するための理想的なペプチドを有するであろう。すなわち、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）、ミエリン乏突起神経膠細胞糖タンパク質（ＭＯＧ）、およびプロテオ脂質タンパク質（ＰＬＰ）等の自己抗原に反応性のＴ細胞が関与する多発性硬化症（ＭＳ）のような疾患は、その治療のために、ＭＢＰ、ＭＯＧもしくはＰＬＰのペプチドまたはその類似体を必要とし；重症筋無力症は、アセチルコリン受容体からのペプチドで治療することができ；甲状腺炎は、サイログロブリンからのペプチドで治療することができ；１型糖尿病は、グルタミン酸脱炭酸酵素（ＧＡＤ）からのペプチドまたはインスリン配列からのペプチドで治療することができ；全身性エリテマトーデスは、タンパク質Ｐ５３から得られるペプチドで治療することができ；そしてギランバレー症候群は、ミエリン抗原Ｐ２からのペプチドで治療することができる。
【００１７】
近年、自己免疫疾患に関連する病原性自己抗原から得られるペプチドまたはその類似体が、その疾患の治療のために提唱されている。例えば、ヒトＭＢＰ配列から得られるペプチド（ＵＳ５，８１７，６２９、ＵＳ６，２５０，０４０）およびその類似体（ＵＳ５，９４８，７６４；ＵＳ６，３２９，４９９）が、多発性硬化症の治療用として開示され；ヒトＧＡＤの６５kDアイソフォームのおよびインスリンのペプチド類似体が、糖尿病の治療用として提唱され（それぞれＵＳ５，９４５，４０１とＵＳ６，１９７，９２６）；自己抗原またはその断片がブドウ網膜炎（uveoretinitis）の治療用として開示されている（ＵＳ５，９６１，９７７）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１８】
種々の自己免疫疾患のそれぞれにおいて、抗炎症性ＴH２表現型のＴ細胞を活性化するアジュバント中の関連ペプチドを投与することは好ましいであろう。これは、自己免疫過程を阻止させると予測される（Liblauら、1995参照）。また、自己免疫疾患の治療を必要としない場合もあるが、そのような場合でも、ＴH２表現型で特異的なＴ細胞を活性化することが有用であろう。しかし、自己抗原を必要とする治療は、治療した被験体で危険なＴH１自己免疫を活性化する可能性があるＴH１型免疫を誘導しないアジュバントで、行わなければならない。すなわち、非炎症性ＴH２型Ｔ細胞を誘導する特異的な抗原と組合せることが可能なアジュバントを明らかにするニーズがある。
【００１９】
アジュバントは、その性質上、非特異的免疫調節物質である。上記目的に適したアジュバントは、所望の抗炎症性表現型の特異的なＴ細胞の活性化を誘導するように、抗原または他の分子と治療用ワクチンの接種で組合せることができる非特異的免疫調節物質であろう。
【００２０】
Ｔ細胞介在性の疾患または症状（例えば、自己免疫疾患）の治療に適したいくつかのペプチドは、不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）として知られる鉱油の乳剤等の油ビヒクル中に含有させ、マウスの皮下（ＳＣ）に投与すると有効であることが証明された（Ben-NunとCohen, 1982）。しかし、鉱油は体内で分解されないため、ＩＦＡならびに完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ；種々の量の死滅マイコバクテリウム（Mycobacterium）を含有する鉱油の調製物）は、ヒトに使用できない。
【００２１】
本発明者らは以前、植物および／または動物起源の１０〜２０％トリグリセリド、植物および／または動物起源の１．２〜２．４％のリン脂質、２．２５〜４．５％の浸透圧調節物質、０〜０．５％の抗酸化剤、および無菌水を総量１００mlに含む代謝可能な脂肪乳剤（例えば、イントラリピッド（Intralipid）およびリポフンディン（Lipofundin）として知られている脂質乳剤）が、Ｔ細胞介在性疾患または症状（例えば、自己免疫疾患）の治療のために、特異的な抗原とともに使用できることを見い出した（ＷＯ９７／０２００１６）。
【００２２】
ＵＳ５，０１９，３８３には、少なくとも１２個の炭素原子からなる１つ以上のアルキル基もしくはアルケニル基、または他の親油性物質に結合したペプチドを含む合成ワクチンであって、該アルキル基または該アルケニル基が、ペプチド残基のＮ末端アミノ基および／またはＣ末端カルボキシル基に結合した多官能性基の１つ以上の官能基に結合した脂肪酸残基である合成ワクチンが記載されている。
分解可能で抗炎症性免疫調節物質として作用する、ペプチド治療の有効なビヒクルを発見することが、非常に望まれている。
【課題を解決するための手段】
【００２３】
（発明の概要）
本発明において、特定の長鎖脂肪族アルコール、それらとＣ1〜Ｃ6アルカン酸とのエステル、または長鎖脂肪酸とアルカノールおよびポリオールとの特定のエステルが、抗炎症性免疫調節物質として作用し、それによって、自己免疫疾患の治療のために、好ましくはＴH２型免疫応答を必要とするＴ細胞介在性免疫作用のために、Ｔ細胞を活性化する特異抗原と供にアジュバントとして使用できることが見い出された。
【００２４】
従って、一の実施態様において本発明は、抗原及び担体を含む、Ｔ細胞介在性の疾患または症状の治療のための治療用製剤において、該抗原が、該Ｔ細胞介在性の疾患または症状の病因に関連する炎症性Ｔ細胞により認識されるものであり、該担体が、(a) 飽和若しくはシス不飽和のＣ10〜Ｃ20脂肪族アルコール、またはそれらとＣ1〜Ｃ6アルカン酸とのエステル、および(b) 飽和若しくはシス不飽和のＣ10〜Ｃ20脂肪酸エステルであって、Ｃ1〜Ｃ6アルキルエステル、少なくとも２つのヒドロキシ基を有するＣ2〜Ｃ6ポリオールとのモノエステル、およびグリセロールとのジエステルから選択される該エステルから選択される抗炎症性免疫調節物質である。
【００２５】
本発明の担体と伴に使用される抗原は、自己免疫疾患、または他のＴ細胞介在性の疾患もしくは症状の病因に関連する炎症性Ｔ細胞により認識されるものであり、ペプチド抗原であっても非ペプチド抗原であってもよい。
他の一の実施態様において本発明は、ＴH１からＴH２へ個体のＴ細胞サイトカイン応答のシフトを引き起こす上記の治療用製剤に関する。
さらなる実施態様において本発明は、ＩＬ−２および／またはＩＦＮ−γ  Ｔ細胞サイトカイン応答の低下と、ＩＬ−４および／またはＩＬ−１０  Ｔ細胞サイトカイン応答の上昇とを引き起こす上記の治療用製剤に関する。
【００２６】
さらに他の一の実施態様において本発明は、Ｔ細胞介在性疾患または症状を治療するための治療用製剤を製造するための、Ｔ細胞介在性の疾患または症状の病因に関連する炎症性Ｔ細胞により認識される抗原と一緒の、(a) 飽和若しくはシス不飽和のＣ10〜Ｃ20脂肪族アルコール、またはそれらとＣ1〜Ｃ6アルカン酸とのエステル、および(b) 飽和若しくはシス不飽和のＣ10〜Ｃ20脂肪酸エステルであって、Ｃ1〜Ｃ6アルキルエステル、少なくとも２つのヒドロキシ基を有するＣ2〜Ｃ6ポリオールとのモノエステル、およびグリセロールとのジエステルから選択される該エステルから選択される抗炎症性免疫調節物質の使用に関する。
【００２７】
さらに他の一の実施態様において本発明は、Ｔ細胞介在性の疾患または症状を患う患者の治療法において、該患者に、該Ｔ細胞介在性の疾患または症状の病因に関連する炎症性Ｔ細胞により認識される抗原と、(a) 飽和若しくはシス不飽和のＣ10〜Ｃ20脂肪族アルコール、またはそれらとＣ1〜Ｃ6アルカン酸とのエステル、および(b) 飽和若しくはシス不飽和のＣ10〜Ｃ20脂肪酸エステルであって、Ｃ1〜Ｃ6アルキルエステル、少なくとも２つのヒドロキシ基を有するＣ2〜Ｃ6ポリオールとのモノエステル、およびグリセロールとのジエステルから選択される該エステル、から選択される抗炎症性免疫調節物質の脂質乳剤からなる生物学的に活性な担体とを含有する、治療用製剤を投与することを含む、方法に関する。
【００２８】
（発明の詳細な説明）
本明細書の説明と特許請求の範囲において「担体」と「アジュバント」という用語は同義で使用され、所望の抗炎症性表現型の特異的なＴ細胞の活性化を誘導するための治療用ワクチンにおいて、抗原と組合せることができる非特異的免疫調節物質を意味する。
【００２９】
本発明は、Ｔ細胞介在性の疾患または症状の治療のための治療用製剤の製造のための、該Ｔ細胞介在性の疾患または症状の病因に関連する炎症性Ｔ細胞により認識される抗原と伴に用いる、アジュバントとして有用な抗炎症性免疫調節物質を提供する。
【００３０】
本発明で使用されるアジュバントは、(a) 飽和若しくはシス不飽和のＣ10〜Ｃ20脂肪族アルコール、またはそれらとＣ1〜Ｃ6アルカン酸とのエステル、並びに(b) 飽和若しくはシス不飽和のＣ10〜Ｃ20脂肪酸エステルであって、Ｃ1〜Ｃ6アルキルエステル、少なくとも２つのヒドロキシ基を有するＣ2〜Ｃ6ポリオールとのモノエステル、およびグリセロールとのジエステルから選択される該エステル、から選択される抗炎症性免疫調節物質である。
【００３１】
本発明の一の好適な実施態様において、アジュバントは、長鎖の飽和若しくは不飽和のＣ10〜Ｃ20、好ましくはＣ16〜Ｃ20、最も好ましくはＣ18の脂肪族アルコールである。本発明で使用可能な飽和脂肪族アルコールの例としては、特に限定されないが、デシルアルコール、ラウリルアルコール、ミリスチルアルコール、ステアリルアルコール、および好ましくはセチルアルコール（パルミチルアルコールとしても知られている）がある。不飽和脂肪族アルコールは、シス型の１つ以上の２重結合、および１６〜１８個の炭素原子を有するものが好ましく、特に限定されないが、例えばオレイルアルコール（シス−９−オクタデセノール）、リノレイルアルコール（シス−９，１２−オクタデカジエノール）、γ−リノレニルアルコール（シス−６，９，１２−オクタデカトリエノール）、およびリノレニルアルコール（シス−９，１２，１５−オクタデカトリエノール）がある。好適な実施態様において、脂肪族アルコールは、セチルアルコール、リノレニルアルコール、または最も好ましくはオレイルアルコールである。
【００３２】
他の一の実施態様において本発明のアジュバントは、酢酸、プロピオン酸、酪酸、吉草酸、およびカプリン酸のような、上記の脂肪族アルコールとＣ1〜Ｃ6アルカン酸とのエステルである。
さらなる実施態様において本発明のアジュバントは、飽和若しくはシス不飽和のＣ10〜Ｃ20脂肪酸のエステルであって、該エステルが、Ｃ1〜Ｃ6アルキルエステル、少なくとも２つのヒドロキシ基を有するＣ2〜Ｃ6ポリオールとのモノエステル、およびグリセロールとのジエステルから選択され、グリセロールの３つのヒドロキシ基の１つまたは２つは、該飽和若しくはシス不飽和の長鎖脂肪酸でエステル化されているものである。
【００３３】
Ｃ10〜Ｃ20脂肪酸は、好ましくはＣ16〜Ｃ20脂肪酸であり、最も好ましくはＣ18脂肪酸である。一の実施態様において、Ｃ10〜Ｃ20脂肪酸は飽和しており、特に限定されないが、例えばカプリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、およびアラキジン酸である。他の一の実施態様においてＣ10〜Ｃ20脂肪酸は、シス−不飽和脂肪酸であり、特に限定されないが、例えばパルミトレイン酸（シス−９−ヘキサデセン酸）、オレイン酸（シス−９−オクタデセン酸）、シス−バクセン酸（シス−１１−オクタデセン酸）、リノール酸（シス−９，１２−オクタデカジエン酸）、γ−リノレン酸（シス−６，９，１２−オクタデカトリエン酸）、リノレン酸（シス−９，１２，１５−オクタデカトリエン酸）、およびアラキドン酸（シス−５，８，１１，１４−エイコサテトラエン酸）である。一の好適な実施態様において、脂肪酸はオレイン酸である。
【００３４】
飽和若しくはシス不飽和のＣ10〜Ｃ20脂肪酸のアルキルエステルは、アルキル鎖中に１〜６個の炭素原子を有してもよく、特に限定されないが、メチルまたはエチルであってもよい。好適な実施態様において、アルキルエステルはオレイン酸メチルまたはオレイン酸エチルである。
【００３５】
さらなる実施態様において本発明のアジュバントは、飽和若しくはシス不飽和のＣ10〜Ｃ20脂肪酸と少なくとも２つのヒドロキシ基を有するポリオール（例えばＣ2〜Ｃ6アルカンジオール、グリセロールまたはサッカリド）とのモノエステルである。
【００３６】
Ｃ2〜Ｃ8アルカンジオールは、好ましくは２〜４個、最も好ましくは２個の炭素原子を有し、１，２−エチレングリコール、１，３−プロパンジオールおよび１，４−ブタンジオールとすることができる。そのようなエステルの例としては、モノオレイン酸１，２−エチレングリコールがある。
【００３７】
サッカリドは、例えば特に限定されないが、リボース、フラクトース、グルコース、ガラクトース、またはマンノースのようなモノサッカリドとすることができる。そのようなエステルの例としては、モノオレイン酸マンノースがある。
【００３８】
本発明の他の一の実施態様において、アジュバントは、グリセロールとＣ10〜Ｃ20脂肪酸とのモノエステルまたはジエステルである。モノグリセリド（例えば、グリセロールモノオレアート）の場合、生じるエステルは２つのフリーのヒドロキシル基を有する。ジグリセリドは１つのフリーのヒドロキシル基を有し、他の２つのヒドロキシル基は、２分子のＣ10〜Ｃ20脂肪酸でエステル化されているか（例えば、ジオレイン酸グリセリル）、またはヒドロキシル基の１つは、Ｃ10〜Ｃ20脂肪酸の１つの分子でエステル化され、他の１つのヒドロキシル基は、特に限定されないが、脂肪族Ｃ2〜Ｃ6カルボン酸（例えば酢酸、プロピオン酸、酪酸およびヘキサン酸）等の１分子の別のカルボン酸でエステル化されている。
【００３９】
本発明の抗炎症性免疫調節物質は、治療される疾患または症状に関与するＴ細胞が活性である抗原性物質とともにワクチンアジュバントとして使用すると脂質乳剤を形成し、治療前のＴH１ Ｔ細胞応答から治療後のＴH２ Ｔ細胞応答へのシフトを仲介する。この知見は、そのような脂質乳剤が、ＴH１介在性の疾患または症状を治療するためのワクチンにおいて使用できる免疫寛容原性生物活性担体であることを証明する。そのようなワクチンにおいて、抗原は、治療効果に対する免疫学的特異性を付与し、一方、本発明の生物学的活性担体は、生物学的な効果（すなわち、ＴH１→ＴH２シフト）を付与する。本発明の生物学的活性担体により仲介されるシフトのために、ある範囲の自己反応性を有する疾患は、Ｔ細胞サイトカインシフトを誘導することができる単一の抗原／担体組合せで治療することができる。
【００４０】
抗原と抗炎症性免疫調節物質アジュバントとを含む治療用製剤の本発明における好適な用途は、ＴH１細胞により仲介される臓器特異的自己免疫疾患の治療である。そのような疾患としては、特に限定されないが、多発性硬化症、Ｉ型糖尿病、リウマチ様関節炎、および甲状腺炎のような自己免疫疾患がある。
【００４１】
製剤で使用される抗原は、当該自己免疫疾患の病原性に関連する炎症性Ｔ細胞により認識される抗原であり、疾患過程に関与する全タンパク質、そのようなタンパク質の配列から得られるペプチド、病原性自己抗原ペプチドのエピトープにおいて単一のアミノ酸置換を有する改変ペプチド、または疾患に関連する炎症性Ｔ細胞により認識される他のペプチドとすることができる。
【００４２】
すなわち多発性硬化症の治療については、抗原は、ＭＢＰ、ＭＯＧもしくはＰＬＰ、またはヒトＭＢＰ配列から得られるペプチド（例えばＵＳ５，８１７，６２９に記載されているペプチドＭＢＰ（７５−９５）、ＭＢＰ（８６−９５）、およびＭＢＰ（８２−９８））、或いはＵＳ５，９４８，７６４と６，２３９，４９９に記載されているこれらの類似体、またはＭＯＧペプチドもしくはＰＬＰペプチドおよびこれらの類似体とすることができる。抗原はまた、ＭＢＰと機能的に交差反応し、抗原提示においてＭＨＣクラスII抗原に対しＭＢＰと競合することができるコポリマー１、すなわちＣｏｐ１（４つのアミノ酸からなるランダムコポリマー：チロシン−グルタミン酸−アラニン−リジン）とすることもできる。一般的にグラチラマーアセテート（Glatiramer acetate）として知られている酢酸塩の形態において、Ｃｏｐ１は、いくつかの国で商品名COPAXONE（登録商標）（テバファーマシューチカルズ社（Teva Pharmaceuticals Litd.）、ペタチクバ（Petah Tikva）、イスラエル）で、ＭＳの治療について認可されている。
【００４３】
Ｉ型糖尿病（ＩＤＤＭ）の治療のためには、ペプチドは、グルタミン酸脱炭酸酵素（ＧＡＤ）もしくはＵＳ５，９４５，４０１に記載のようなＧＡＤペプチド類似体、またはインスリンペプチド類似体（１２、１３、１５および／または１６位で改変され、ＵＳ６，１９７，９２６に記載のようにさらに改変することができる元のインスリンＢ鎖配列の残基９〜２３を含むペプチド）から得られる。
【００４４】
他の自己免疫疾患の治療のためには、ペプチドは、疾患に関連する抗原またはそのペプチド類似体の配列から得られる。すなわち甲状腺炎の治療のためには、ペプチドは、サイログロブリンの配列から得られ；リウマチ様関節炎のためには、自己抗原は、コラーゲンIIまたはマイコバクテリウム（Mycobacterium）（例えば、結核菌（Mycobacterium tuberculosis））から得られ（例えばアジュバント関節炎でＴリンパ球により認識されるマイコバクテリアのエピトープを構成するｈｓｐ６０として知られている６０kDaの熱ショックタンパク質、または対応するヒトＨＳＰ６０もしくはそれらのペプチドから得られる）；重症筋無力症の治療のためには、ペプチドは、アセチルコリン受容体の配列、またはＵＳ６，０６６，６２１に記載のようなその類似体から得られ；全身性エリテマトーデスの治療のためには、ペプチドは、タンパク質Ｐ５３の配列から得られ；ギランバレー症候群の治療のためには、ペプチドはミエリン抗原Ｐ２の配列から得られる。
【００４５】
抗原は、非ペプチド抗原でもよい。本発明で使用できる非ペプチド抗原の例としては、特に限定されないが、リン脂質症候群の治療のためのリン脂質、アテローム性動脈硬化症の治療のためのコレステロール、全身性エリテマトーデスの治療のためのＤＮＡ分子がある。
【００４６】
抗原がペプチドであることは決定的に重要ではない。すなわち、例えば皮膚感作と炎症を引き起こすＴH１介在性のアレルギー応答（例えば、接触皮膚炎）は、刺激抗原と、ＴH１型からＴH２型へのサイトカイン応答のシフトを引き起こす本発明の生物活性担体とを含有するワクチンにより、治療することができる。その結果、患者は、抗原に対して上昇した抗体レベルを有し続けるが、皮膚刺激を引き起こす炎症性Ｔ細胞応答は抑制される。
【００４７】
従って、本発明の免疫寛容原性生物活性担体は、Ｔ細胞が攻撃している抗原の寛容を引き起こすことが好ましい時はいつでも、すなわちＴ細胞介在性の症状（特にＴH１細胞介在性の症状）を制限するためにワクチンが使用される時はいつでも、使用することができる。どの抗原が移植片拒絶または移植片対宿主反応病における応答を活性化しているかが決定されるなら、そのような抗原を本発明の担体とともに投与することにより、そのような疾患でＴ細胞が活性である多くの抗原の全体的複雑さにもかかわらず、好ましくない炎症性ＴH１応答から、より好ましいＴH2応答へのシフトを促進すると予測される。
【００４８】
ペプチドによる活性化後のサイトカインのＴ細胞分泌を測定するには、患者の末梢血から得たリンパ球を、インビトロ活性化測定法で試験する。末梢血リンパ球は、フィコ−ハイパーク（fico-hypaque）上のヘパリン化全血から単離され、５〜５０μg/mlの試験ペプチドと伴に培養される。培養したＴ細胞からの上清を、異なる時点で採取し、種々のサイトカインの活性について、ＥＬＩＳＡまたは生物測定法により試験する。
【００４９】
長鎖脂肪族アルコールおよびそのエステルならびに特定の脂肪酸エステルが、Ｔ細胞活性化のためにアジュバントとして有効に使用されるという本発明の知見は、全く予想外である。同様に、これらの調製物が免疫寛容原性生物活性な抗炎症性免疫調節物質であるという発見もまた、全く予想外である。
【００５０】
抗原を加え、アジュバントとして本明細書に記載の免疫調節物質を使用する利点は、治療を防御性ＴH２免疫応答を誘導するのに必要な比較的小さな暴露に限定することができるという事実である（こうして誘導された特異的ＴH２免疫は、疾患を活発に抑制する）。抗原無しでは、炎症を持続的に抑制するためには、免疫調節物質の投与を絶えず行わなければならず、治療を停止すると疾患が再発すると考えられる。抗炎症剤単独の連続投与の長期作用は、好ましくないかも知れない。従って、本発明の免疫調節物質と特異的抗原とを組合せることにより、炎症性過程の活性でかつ特異的な制御を誘導することが有利である。
【００５１】
本明細書で引用されるすべての米国特許および他の文献は、参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる。
【００５２】
本発明を、以下の非限定な例により例示する。
【実施例】
【００５３】
（実施例１）オレイルアルコールと他の物質の抗炎症効果−アジュバント関節炎（ＡＡ）に対する防御
本発明の物質の抗炎症活性を試験するのに使用されるモデルの１つは、ラットのある株を結核菌（Mycobacterium tuberculosis）の抗原で免疫することによりラットで誘導される関節の実験的疾患であるアジュバント関節炎である（Pearson, 1956）。この疾患は、ヒトの関節炎症状（例えば、リウマチ様関節炎、ライテル症候群における反応性関節炎、強直性脊椎炎、および免疫系により仲介されると考えられる他の関節の炎症）のモデルとなる（Pearson, 1964）。アジュバント関節炎はまた、一般に細胞介在性の自己免疫反応、移植片拒絶およびアレルギー反応を含む免疫介在性の炎症のモデルとなる。例えばアジュバント関節炎を抑制できる治療薬としては、免疫抑制剤、例えばコルチコステロイド、シクロスポリンＡ（Jaffeら, 1989；Pollockら, 1989）、アザチオプリン、および自己免疫疾患の治療に広く使用されている他の免疫抑制剤がある。従って、治療薬によるアジュバント関節炎の抑制は、その物質が、広く抗炎症剤として有用である可能性を示す。
【００５４】
近交系の８〜１０週齢のルイスラット（ハーランオラック社（Harlan-Olac Limited）、ブラックソーン（Blackthron）、オキソン（Oxon）、英国）を、既に記載されているように（Pearson, 1956）、ＩＦＡ（シグマ（Sigma））中の１mg/０．１mlの死滅結核菌（Mycobacterium tuberculosis）（シグマ（Sigma））により尾の基部で免疫することにより、ＡＡを誘導した。１２〜１４日後、肢体に関節炎の発現が認められ、既に記載されているように、（Holoshitzら, 1983）、四肢のそれぞれの炎症の重症度を０〜４のスケールで点数を付け、これを統計して０〜１６のスケールで評価した。関節炎のピークは通常、免疫の約２６日後に観察された。
【００５５】
対照ラットは、処理しなかったかまたは食塩水を注射して処理した。免疫抑制の陽性対照は、誘導の１２日後から１日置きにコルチコステロイド剤であるデキサメタゾン（２００μｇ）を腹腔内投与して治療したラットの群を含めることにより得た。ＡＡの誘導の１４日前またはＡＡの誘導の１２日後に、免疫調節物質を皮下投与した。炎症が最大の日に測定した炎症の阻害パーセントを、以下のように計算した：
（試験群の平均最大スコア／対照群の平均最大スコア）×１００％
【００５６】
１００μlずつのモノオレイン酸グリセロール、オレイルアルコール、リノレニルアルコール、セチルアルコール、モノオレイン酸マンノース、オレイン酸エチルおよびオレイン酸メチルを用いた実験では、オレイン酸が効果が無いにも拘らずこれらのすべてが効果的であり、６６％を超える炎症阻害を示した。結果を表１に要約する。２つのさらなる実験は、５００μlのオレイルアルコールが炎症を９６％及び９１％抑制することを示した。
【００５７】
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【００５８】
（実施例２）異なる用量のオレイルアルコールによるＡＡに対する防御
ＡＡにおけるオレイルアルコールの用量応答効果を調べるために、実施例１に記載のようにＡＡの誘導の１４日前に１回、オレイルアルコールを１０、５０、１００または５００μlの用量でルイスラットに皮下投与した。
図１は、オレイルアルコールの用量応答効果を示す。オレイルアルコールの用量が増加すると関節炎を抑制することがわかる。疾患がピークの日（２６日目）に、炎症が１４％（１０μl）、６１％（５０μl）、７８％（１００μl）および９０％（５００μl）抑制された。
【００５９】
（実施例３）ＥＡＥの治療におけるアジュバントとしての免疫調節物質の使用
上記実施例１で試験したオレイルアルコールと他の化合物は、強力な抗炎症性免疫調節物質であることを証明したので、ここでは、Ｔ細胞介在性疾患の治療のために、Ｔ細胞介在性疾患（例えば、自己免疫疾患）の病原性に関与する炎症性Ｔ細胞により認識される抗原とともに用いて、アジュバントとしてのこれらの効果を試験することを目的とする。
【００６０】
ＣＦＡ中のＭＢＰでルイスラットを免疫して、ＥＡＥを誘導することができる。この目的のために、７〜９週齢のメスのルイスラットに、ＣＦＡ（シグマ（Sigma））中の２５μｇのモルモット（guinea pig）ＭＢＰ（総５０μｇ）を各足蹠に注入して免疫した。疾患は、免疫後約１２日で発現し、中枢神経系の炎症による種々の程度の麻痺を特徴とする。ラットを、４段階のスケールで麻痺についてスコアを付けた：０、麻痺無し；１、尾の脱力（たれる）；２、後足の麻痺；３、後足と前足の麻痺；４、重症の全身麻痺（Lorentzenら、1995）。
【００６１】
ＥＡＥは、ＭＢＰ分子を確定する抗原決定基を認識するＴ細胞により引き起こされる。ルイスラットの主要なＭＢＰ決定基は、ＭＢＰの配列７１〜９０からなるペプチド（以後ｐ７１−９０ペプチド）により構成される。
【００６２】
脳炎誘発性ＭＢＰ  ｐ７１−９０ペプチドを本発明のアジュバントとともに投与した場合でもＥＡＥの発現も阻害するかどうかを調べるために、ルイスラット（５〜８匹の群）を、１００μlのパラフィン油中のオレイルアルコールまたは本発明の他の免疫調節物質に乳化したｐ７１−９０ペプチド、またはパラフィン油中の免疫調節物質単独（ペプチド無し）を、ＭＢＰ免疫の日（０日目）と５日後（５日目）、またはＭＢＰによる免疫の１４日前と７日前に皮下注射して治療した。ＥＡＥに対するｐ７１−９０／オレイルアルコールまたは他の免疫調節物質による治療効果は、疾患の発症率と重症度を測定することにより評価される。最大麻痺の程度の低下は、パラフィン油中のｐ７１−９０ペプチドまたはペプチドの無い免疫調節物質とパラフィン油による対照治療と比較して、当該免疫調節物質と伴に乳剤中に存在するｐ７１−９０  ＭＢＰペプチドのような関連ペプチドが、ラットのＥＡＥを調節できることを示す。
【００６３】
（実施例４）ＡＡの治療におけるアジュバントとしての免疫調節物質の使用
ルイスラット（７〜９週齢のメス）に、上記実施例１に記載のように１mgの死滅結核菌（Mycobacterium tuberculosis）（シグマ（Sigma）：１０mg/mlの０．１ml）を含有するＩＦＡを尾の基部に免疫して、ＡＡを誘導する。関節の炎症の程度を、０〜１６のスケールで等級を付ける。
【００６４】
ＡＡの治療のために、５〜８匹のメスのルイスラットの群（７〜９週齢）を、ＡＡの誘導後に、ＰＢＳ中の、またはパラフィン油中の１００μlオレイルアルコール若しくは本発明の他の免疫調節物質に乳化した、１００μｇの組換えｈｓｐ６０（ルイスラットアジュバント関節炎中でＴリンパ球により認識されるマイコバクテリアエピトープ（Van Edenら、1988））、或いはパラフィン油中の免疫調節物質単独（ペプチド無し）を用いて、ＡＡ誘導の日（０日目）と７日後（＋７日目）、または誘導日の１４日前（−１４日目）と誘導日の７日前（−７日目）に皮下注射により治療した。関節炎に対する効果を、実施例１に記載のように測定する。
【００６５】
（実施例５）Ｉ型糖尿病の治療における免疫調節物質の使用
糖尿病ＮＯＤマウスモデルにおいて、膵臓中のインスリン産生β細胞の自己免疫破壊はＴリンパ球により仲介される。５〜８週齢で膵臓ランゲルハンス島の周りに炎症性浸潤が発現し、１４〜２０週齢でインスリン欠乏と明白な糖尿病を引き起こすβ細胞破壊が明らかになり、３５〜４０週齢までにほとんど１００％のメスＮＯＤマウスが罹患する。
【００６６】
治療は、オレイルアルコールまたは本発明の他の免疫調節物質と伴に製剤中に依存する６０kDaのｈｓｐペプチドｐ２７７またはその類似体ｐ２７７（Val6−Val11）（ＷＯ９７／２００１６に記載されている）を用いて行うことができる。（但し、オレイルアルコール中のｐ２７７（Val6−Val11）については後述する）。
【００６７】
ＮＯＤメスマウスを、０．１mlのＰＢＳまたはオレイルアルコールの脂質乳剤中の１００μｇのｐ２７７（Val6−Val11）で治療する。６ヶ月齢で糖尿病の発生と抗ｐ２７７（Val6−Val11）抗体の産生を追跡する。糖尿病は、持続性の高血糖症として診断され、ベックマン（Beckman）グルコースアナライザーIIで、１週間毎に少なくとも２回、１１mmol/lを超えるグルコースレベルが測定される。ペプチドによる治療の成功は、正常な血液グルコース濃度（１１mmol/l未満）の維持、膵臓ランゲルハンス島内炎症（インスリン炎）の緩解、およびＴＨ２型免疫応答の指標としての治療用ペプチドに対する抗体の誘導により測定される。
【００６８】
ｐ２７７（Val6−Val11）ペプチドを用いる治療による糖尿病からの防御は、そのペプチドに対するＴＨ２免疫応答に依存する。このため、ｐ２７７（Val6−Val11）免疫マウスでＥＬＩＳＡにより抗体産生を測定する。マキシソープ（Maxisorp）マイクロタイタープレート（ヌンク（Nunc））を１０μg/mlのｐ２７７（Val6−Val11）ペプチドで１８時間被覆し、非特異結合を７％ミルク粉末で２時間ブロックする。マウス血清（１：５０に希釈）を２時間結合させ、アルカリホスファターゼ抗マウスＩｇＧ（セロテック（Serotec））を２時間、そしてｐ−ニトロフェニルリン酸基質（シグマ（Sigma））を３０分加えて、特異的結合を検出する。発色強度を、ＥＬＩＳＡリーダー（アントス（Anthos））によりＯＤ＝４０５nmで測定する。ＰＢＳ中のｐ２７７（Val6−Val11）で免疫したＮＯＤマウスは、全く抗体応答を示さず、オレイルアルコール中のｐ２７７（Val6−Val11）で免疫したマウスはペプチド特異抗体を発現し、治療効果が、自己免疫Ｔ細胞により産生される主要なサイトカイン中のシフトに由来することを示唆する。
【００６９】
前記したように、ＴＨ１細胞は、ＩＬ−２（これはＴ細胞増殖を誘導する）およびＩＦＮ−γ（これは組織炎症を仲介する）のようなサイトカインを分泌し、ＴＨ２細胞は、ＩＬ−４（これは、Ｂ細胞が特定の抗体イソタイプ、主にＩｇＧ１とＩｇＧ２ｂを産生するのを「助ける」）、ＩＬ−１０、およびＩＬ−５（これは組織炎症を弱める）のような他のサイトカインを分泌する。
【００７０】
ＴＨ１からＴＨ２型応答へのシフトの可能性を、ｐ２７７（Val6−Val11）治療後に産生される抗体のイソタイプの分析により証明する。ＮＯＤマウス（３ヶ月齢）の群を、上記のように油中のｐ２７７（Val6−Val11）またはＰＢＳで治療する。各マウスの血清を、治療（１群１２〜１５匹のマウス）後のｐ２７７（Val6−Val11）に対する抗体のイソタイプについて測定する。抗体イソタイプは、イソタイプ特異的発現抗体試薬（サザンバイオテクノロジーアソシエーツ（Southern Biotechnology Associates）、バーミンガム、アラバマ州）を用いてＥＬＩＳＡ測定法を使用して検出する。治療後に発現する抗ｐ２７７抗体の抗体イソタイプの分析は、それら抗体が、ＩＬ−４を産生するＴＨ２ Ｔ細胞に依存する、ＩｇＧ１とＩｇＧ２クラスのみに限定されていることを示すため、免疫調節物質を用いる治療がＴＨ１からＴＨ２へのシフトを誘導することが確認される。ＴＨ１型のＩｇＧ２ａ抗体は産生されない。治療で使用される特異的ペプチドに対する抗体の発現は、自己免疫Ｔ細胞応答が、傷害性のＴＨ１炎症性モードから、無害な抗体を産生し、炎症と組織傷害を抑制するＴＨ２  Ｔ細胞応答にシフトしたことを示す。
【００７１】
サイトカインスイッチの存在を確認するために、ｐ２７７（Val6−Val11）に反応性のＴ細胞により産生されるサイトカインを、ｐ２７７（Val6−Val11）−オレイルアルコール治療マウスと対照マウスとで測定する。Ｔ細胞分裂促進因子であるコンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）を使用して、対照として総脾臓Ｔ細胞を活性化する。
【００７２】
１０匹のＮＯＤマウス（３ヶ月齢）の群を、オレイルアルコール中のｐ２７７（Val6−Val11）またはオレイルアルコール中のＰＢＳで治療する。５週間後、マウスの脾臓を取り出し、脾臓細胞をプールする。脾臓細胞をＣｏｎＡまたはｐ２７７（Val6−Val11）と２４時間（ＩＬ−２とＩＬ−４分泌について）または４８時間（ＩＬ−１０とＩＦＮ−γ分泌について）インキュベートする。培養上清中のサイトカインの存在を、ファーミンゲン（Pharmingen）サイトカインＥＬＩＳＡプロトコールに従ってファーミンゲン（Pharmingen）ペア抗体を使用して、ＥＬＩＳＡにより定量する。ファーミンゲン（Pharmingen）組換えマウスサイトカインを、較正曲線のための標準物質として使用する。簡単に説明すると、平底９６ウェルマイクロタイタープレートを、ラット抗マウスサイトカインモノクローナル抗体（ｍＡｂ）で４℃で１８時間被覆し、培養上清または組換えマウスサイトカインを４℃で１８時間加える。プレートを洗浄し、ビオチン化ラット抗マウスサイトカインｍＡｂを室温で４５時間加え、次に充分洗浄し、アビジン−アルカリホスファターゼを加えた。プレートを洗浄し、発色原基質（ｐ−ニトロフェニルリン酸）を加え、試料をＥＬＩＳＡリーダーで４０５nmで読む。対照マウスの脾臓細胞は、ｐ２７７（Val6−Val11）とのインキュベートでとＩＬ−２とＩＦＮ−γを分泌するが、ｐ２７７（Val6−Val11）もしくはＣｏｎＡに対してＩＬ−４もしくはＩＬ−１０はほとんど産生しない。ＩＬ−２とＩＦＮ−γ産生の低下に関連するｐ２７７（Val6−Val11）−オレイルアルコール治療マウス中のｐ２７７（Val6−Val11）に対するＩＬ−１０とＩＬ−４の産生の有意な上昇は、ＴＨ１からＴＨ２様挙動へのシフトを確証する。
【００７３】
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【図面の簡単な説明】
【００７４】
【図１】図１は、アジュバント関節炎（ＡＡ）に及ぼすオレイルアルコール（ＯＡ）の用量応答効果を示す。異なる用量のＯＡを、ラットの皮下にＡＡ誘導の１４日前に一回投与した。
【図１】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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