(57)【要約】本発明は、植物成長に影響を与えるための組成物および方法を提供する。本発明の組成物は、１つ以上のインドール−３−酢酸（ＩＡＡ）誘導体を含む。いくつかの好ましい実施形態において、本発明の組成物は、ＩＡＡの置換された誘導体を含み得る。さらに、本発明は、植物サンプルからの胚形成カルスの生成のための培地、および植物サンプルの再生のための培地を提供する。本発明はまた、培養植物サンプルおよび植物サンプルの再生のためのキットを企図する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
植物の成長に影響を与える組成物であって、該組成物は、一置換ＩＡＡ誘導体、二置換ＩＡＡ誘導体、多置換ＩＡＡ誘導体、およびこれらの混合物からなる群から選択されるＩＡＡ誘導体を含み、そしてさらに少なくとも１種のさらなる植物成長調節因子を含む、組成物。
【請求項２】
一置換ＩＡＡ誘導体を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
５−Ｂｒ−ＩＡＡを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
２，４−Ｄ、ＢＡＰ、ＡＢＡ、ゼアチンリボシド、キネチン、２ｉＰおよびジカンバからなる群から選択される１つ以上の化合物を含む、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
植物の成長に影響を与える組成物であって、該組成物は、一置換ＩＡＡ誘導体、二置換ＩＡＡ誘導体、多置換ＩＡＡ誘導体、およびこれらの混合物からなる群から選択されるＩＡＡ誘導体と、少なくとも１種のさらなる植物成長調節因子とを混合することによって形成される、組成物。
【請求項６】
一置換ＩＡＡ誘導体と、少なくとも１種のさらなる植物成長調節因子とを混合することによって形成される、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
５−Ｂｒ−ＩＡＡと、少なくとも１種のさらなる植物成長調節因子とを混合することによって形成される、請求項５に記載の組成物。
【請求項８】
５−Ｂｒ−ＩＡＡと、以下：２，４−Ｄ、ＢＡＰ、ＡＢＡ、ゼアチンリボシド、キネチン、２ｉＰおよびジカンバからなる群から選択される少なくとも１つの化合物とを混合することによって形成される、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
植物サンプルを培養するための培地であって、該培地は、一置換ＩＡＡ誘導体、二置換ＩＡＡ誘導体、多置換ＩＡＡ誘導体、およびこれらの混合物からなる群から選択されるＩＡＡ誘導体を含み、そしてさらに少なくとも１種のさらなる植物成長調節因子を含む、培地。
【請求項１０】
一置換ＩＡＡ誘導体および少なくとも１種のさらなる植物成長調節因子を含む、請求項９に記載の培地。
【請求項１１】
５−Ｂｒ−ＩＡＡおよび少なくとも１種のさらなる植物成長調節因子を含む、請求項９に記載の培地。
【請求項１２】
５−Ｂｒ−ＩＡＡと、以下：２，４−Ｄ、ＢＡＰ、ＡＢＡ、ゼアチンリボシド、キネチン、２ｉＰおよびジカンバからなる群から選択される１つ以上の化合物とを含む、請求項９に記載の培地。
【請求項１３】
植物の成長に影響を与える方法であって、該方法は、以下：
植物サンプルに、影響量の植物の成長に影響を与える組成物を適用する工程であって、該組成物は、一置換ＩＡＡ誘導体、二置換ＩＡＡ誘導体、多置換ＩＡＡ誘導体、およびこれらの混合物からなる群から選択されるＩＡＡ誘導体を含み、そしてさらに少なくとも１種のさらなる植物成長調節因子を含む、工程、
を包含する、方法。
【請求項１４】
前記植物の成長に影響を与える組成物が、一置換ＩＡＡ誘導体を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記植物の成長に影響を与える組成物が、５−Ｂｒ−ＩＡＡを含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
２，４−Ｄ、ＢＡＰ、ＡＢＡ、ゼアチンリボシド、キネチン、２ｉＰおよびジカンバからなる群から選択される１つ以上の化合物をさらに含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
植物サンプルを再生する方法であって、該方法は、以下の工程：
植物サンプルの再生を引き起こす条件下で、該植物サンプルを培地と接触させる工程であって、ここで、該培地が、一置換ＩＡＡ誘導体、二置換ＩＡＡ誘導体、多置換ＩＡＡ誘導体、およびこれらの混合物からなる群から選択されるＩＡＡ誘導体を含み、そして１種以上のさらなる植物成長調節因子をさらに含む、工程、
を包含する、方法。
【請求項１８】
前記培地が、一置換ＩＡＡ誘導体を含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記培地が、５−Ｂｒ−ＩＡＡを含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
前記培地が、２，４−Ｄ、ＢＡＰ、ＡＢＡ、ゼアチンリボシド、キネチン、２ｉＰおよびジカンバからなる群から選択される１つ以上の化合物をさらに含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
植物サンプルを再生する方法であって、該方法は、以下の工程：
カルスの形成を引き起こす条件下で、カルス形成培地と接触したサンプルを培養する工程であって、該カルス形成培地が、一置換ＩＡＡ誘導体、二置換ＩＡＡ誘導体、多置換ＩＡＡ誘導体、およびこれらの混合物からなる群から選択されるＩＡＡ誘導体を含み、そして１種以上のさらなる植物成長調節因子をさらに含む、工程；
該カルスを、該植物サンプルの再生を引き起こす条件下の培地に移す工程、
を包含する、方法。
【請求項２２】
前記カルス形成培地が、一置換ＩＡＡ誘導体を含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記カルス形成培地が、５−Ｂｒ−ＩＡＡを含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
前記カルス形成培地が、２，４−Ｄ、ＢＡＰ、ＡＢＡ、ゼアチンリボシド、キネチン、２ｉＰおよびジカンバからなる群から選択される１つ以上の化合物を含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
植物サンプルから胚形成カルスを生成するための方法であって、該方法は、以下の工程：
胚形成カルスの生成を引き起こす条件下で、該植物サンプルを、組成物と接触させる工程であって、該組成物は、一置換ＩＡＡ誘導体、二置換ＩＡＡ誘導体、多置換ＩＡＡ誘導体、およびこれらの混合物からなる群から選択されるＩＡＡ誘導体を含み、そして１種以上のさらなる植物成長調節因子をさらに含む、工程、
を包含する、方法。
【請求項２６】
前記組成物が、一置換ＩＡＡ誘導体を含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記組成物が、５−Ｂｒ−ＩＡＡを含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
前記組成物が、２，４−Ｄ、ＢＡＰ、ＡＢＡ、ゼアチンリボシド、キネチン、２ｉＰおよびジカンバからなる群から選択される１つ以上の化合物を含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
植物サンプルから胚形成カルスを生成するための方法であって、該方法は、以下の工程：
植物サンプルを、減少した温度でインキュベートする工程；
胚形成カルスの生成を引き起こす条件下で、該植物サンプルを、組成物と接触させる工程であって、該組成物は、一置換ＩＡＡ誘導体、二置換ＩＡＡ誘導体、多置換ＩＡＡ誘導体、およびこれらの混合物からなる群から選択されるＩＡＡ誘導体を含み、そして１種以上のさらなる植物成長調節因子をさらに含む、工程、
を包含する、方法。
【請求項３０】
前記組成物が、一置換ＩＡＡ誘導体を含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記組成物が、５−Ｂｒ−ＩＡＡを含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
前記組成物が、２，４−Ｄ、ＢＡＰ、ＡＢＡ、ゼアチンリボシド、キネチン、２ｉＰおよびジカンバからなる群から選択される１つ以上の化合物を含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記減少した温度が、約０℃〜約１０℃の温度である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３４】
前記減少した温度が、約４℃である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３５】
カルスから苗条を再生する方法であって、該方法は、以下の工程：
カルスを再生培地と接触させる工程であって、該生成培地が、一置換ＩＡＡ誘導体、二置換ＩＡＡ誘導体、多置換ＩＡＡ誘導体、およびこれらの混合物からなる群から選択されるＩＡＡ誘導体を含み、そして１種以上のさらなる植物成長調節因子をさらに含む、工程；ならびに
該カルスからの苗条の再生を引き起こす条件下で、該カルスをインキュベートする工程、
を包含する、方法。
【請求項３６】
前記再生培地が、一置換ＩＡＡ誘導体を含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記再生培地が、５−Ｂｒ−ＩＡＡを含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項３８】
前記再生培地が、２，４−Ｄ、ＢＡＰ、ＡＢＡ、ゼアチンリボシド、キネチン、２ｉＰおよびジカンバからなる群から選択される１つ以上の化合物を含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
形質転換された植物サンプルを再生する方法であって、該方法は、以下の工程：
胚形成カルスの形成を引き起こす条件下、カルス形成培地の存在下で、植物サンプルを培養する工程であって、ここで、該カルス形成培地が、一置換ＩＡＡ誘導体、二置換ＩＡＡ誘導体、多置換ＩＡＡ誘導体、およびこれらの混合物からなる群から選択されるＩＡＡ誘導体を含み、そして１種以上のさらなる植物成長調節因子をさらに含む、工程；
該胚形成カルスを形質転換する工程；ならびに
該植物サンプルの再生を引き起こす条件下で、該形質転換されたカルスをインキュベートする工程、
を包含する、方法。
【請求項４０】
前記カルス形成培地が、一置換ＩＡＡ誘導体を含む、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記カルス形成培地が、５−Ｂｒ−ＩＡＡを含む、請求項３９に記載の方法。
【請求項４２】
前記カルス形成培地が、２，４−Ｄ、ＢＡＰ、ＡＢＡ、ゼアチンリボシド、キネチン、２ｉＰおよびジカンバからなる群から選択される１つ以上の化合物を含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
減少した温度で、前記植物サンプルをインキュベートする工程をさらに包含する、請求項３９に記載の方法。
【請求項４４】
形質転換された植物サンプルの再生のための方法であって、該方法は、以下の工程：
植物サンプルを形質転換する工程；
該植物サンプルの再生を引き起こす条件下で、該形質転換された植物サンプルを再生培地と接触させる工程であって、ここで、該再生培地が、一置換ＩＡＡ誘導体、二置換ＩＡＡ誘導体、多置換ＩＡＡ誘導体、およびこれらの混合物からなる群から選択されるＩＡＡ誘導体を含み、そして１種以上のさらなる植物成長調節因子をさらに含む、工程、
を包含する、方法。
【請求項４５】
前記再生培地が、一置換ＩＡＡ誘導体を含む、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記再生培地が、５−Ｂｒ−ＩＡＡを含む、請求項４４に記載の方法。
【請求項４７】
前記再生培地が、２，４−Ｄ、ＢＡＰ、ＡＢＡ、ゼアチンリボシド、キネチン、２ｉＰおよびジカンバからなる群から選択される１つ以上の化合物を含む、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
請求項４４に記載の方法であって、該方法は、さらに、以下の工程：
形質転換されたカルスの生成を引き起こす条件下で、前記形質転換された植物サンプルをカルス形成培地において培養する工程；および
該形質転換されたカルスの再生を引き起こす条件下で、該形質転換されたカルスを再生培地に移す工程、
を包含する、方法。
【請求項４９】
前記カルスを増幅する工程、をさらに包含する、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記植物サンプルが、トウモロコシ、コムギ、モロコシ、サトウダイコン、ジャガイモ、ダイズ、およびイネからなる群から選択される成熟植物由来である、請求項１３、１７、２１、２５、２９、３５、３９または４４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５１】
前記植物サンプルが、Ｂ７３、Ｈ９９およびＰＡ９１からなる群から選択されるトウモロコシ変種由来である、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
植物サンプルから胚形成カルスを生成するためのキットであって、該キットは、以下：
少なくとも１つの容器；および
カルス形成培地であって、ここで、該カルス形成培地が、一置換ＩＡＡ誘導体、二置換ＩＡＡ誘導体、多置換ＩＡＡ誘導体、およびこれらの混合物からなる群から選択されるＩＡＡ誘導体を含み、そして１種以上のさらなる植物成長調節因子をさらに含む、カルス形成培地、
を備える、キット。
【請求項５３】
膜ベースの液体細胞培養物に適合された少なくとも１つの容器を備える、請求項５２に記載のキット。
【請求項５４】
植物サンプルの再生のためのキットであって、該キットは以下：
少なくとも１つの容器；ならびに
再生培地であって、該再生培地が、一置換ＩＡＡ誘導体、二置換ＩＡＡ誘導体、多置換ＩＡＡ誘導体、およびこれらの混合物からなる群から選択されるＩＡＡ誘導体を含み、そして１種以上のさらなる植物成長調節因子をさらに含む、再生培地、
を備える、キット。
【請求項５５】
膜ベースの液体細胞培養物に適合された少なくとも１つの容器を備える、請求項５４に記載のキット。
【請求項５６】
カルス形成培地をさらに備える、請求項５５に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の背景）
（発明の分野）
本発明は、農業生物工学の分野に関する。詳細には、本発明は、植物の成長に影響し、そして植物組織または形質転換された植物組織から植物を再分化させる組成物および方法を提供する。
【０００２】
（関連技術）
植物成長は、種々の物理的因子または化学的因子によって影響される。物理的因子としては、利用可能な光、日長、水分および温度が挙げられる。化学的因子としては、ミネラル、硝酸塩、コファクター、栄養物質および植物成長調節因子またはホルモン（例えば、オーキシン、サイトカイニンおよびジベレリン）が挙げられる。
【０００３】
インドール−３−酢酸（ＩＡＡ）は、植物中で同定される天然に存在する植物成長ホルモンである。ＩＡＡは、インビボおよびインビトロにおける植物中の成長の増加を直接担うことが示されている。ＩＡＡによって影響される特徴としては、細胞伸長、節間距離（高さ）、葉の表面積および作物収量が挙げられる。ＩＡＡおよびＩＡＡのホルモン調節活性に類似した活性を示す他の化合物が、「オーキシン」と呼ばれる植物成長因子のクラスに含まれる。
【０００４】
植物においてオーキシンとして機能することが知られている化合物は、茎伸長を誘導するようにそして根の形成を促進するように作用する、例えば、天然に存在する植物成長調節因子である４−クロロインドール−３−酢酸（４−Ｃｌ−ＩＡＡ）を含む。ＩＡＡが、植物の多数の器官において見出される一方で、４−Ｃｌ−ＩＡＡは、Ｐｉｓｕｍ　ｓａｔｉｖｕｍの未成熟の種子および成熟した種子において存在することが示されていたが、他の器官においては示されていない（Ｕｌｖｓｋｏｖら（１９９２）１８８：１８２−１８９）。いくつかの合成オーキシンとしては、例えば、ナフタレン−１−酢酸（ＮＡＡ）、５，６−ジクロロ−インドール−３−酢酸（５，６−Ｃｌ２−ＩＡＡ）、４−クロロ−２−メチルフェノキシ酢酸（ＭＣＰＡ）；２，４−ジクロロフェノキシ酢酸（２，４Ｄ）；２，４，５−トリクロロフェノキシ酢酸（２，４，５−Ｔ）；２−（４−クロロ−２−メチルフェノキシ）プロピオン酸（ＣＭＰＰ）；４−（２，４−ジクロロフェノキシ）酪酸（２，４−ＤＢ）；２，４，５−トリクロロ安息香酸（ＴＢＡ）；および３，５−ジクロロ−２−メトキシ安息香酸（ｄｉｃａｍｂａ）が挙げられる。上記の酸全てがそれらの塩およびエステルの形態（例えば、それらのナトリウム塩、カリウム塩、アンモニウム塩、ジメチルアミン塩およびエタノールアミン塩、ならびにそれらの低級アルコールエステル）で活性である。これらの合成オーキシンの多数は、効果的な除草剤として一般に使用されており、そして、これらのいくつかは、処理された植物の形態形成に不利に影響することが公知である。
【０００５】
サイトカイニン（例えば、６−フルフリルアミノプリン（カイネチン）および６−ベンジルアミノプリン（ＢＡＰ））に基づく調製物はまた、成長刺激因子であることが公知である。しかし、サイトカイニンベースの調製物は、オーキシンと組み合わせて、最も効果的である。サイトカイニンが植物の成長周期に影響する機構は、理解されるにはほど遠いが、それらが葉の成長に影響し、そして、特定の植物において加齢を妨げることが明らかである。
【０００６】
組織培養および遺伝子操作のような方法を使用する主要作物の植物を首尾良く再生することが、この分野における一般的な目的である。植物組織培養の技術は、長年活発な研究の領域であったが、過去５〜１０年にわたって、トウモロコシ、コムギ、イネ、ダイズ、およびワタのような重要な農業作物についての再分化可能な植物組織培養手順を開発するために、強化された科学的努力がなされてきた。
【０００７】
インビトロ培養技術が、植物交配で十分に確立されている（Ｒｅｉｎｅｒｔ，Ｊ．およびＢａｊａｊ，Ｙ．Ｐ．Ｓ．編（１９７７）Ｐｌａｎｔ　Ｃｅｌｌ，Ｔｉｓｓｕｅ　ａｎｄ　Ｏｒｇａｎ　Ｃｕｌｔｕｒｅ，Ｂｅｒｌｉｎ：Ｓｐｒｉｎｇｅｒ；Ｓｉｍｍｏｎｄｓ，Ｎ．Ｗ．（１９７９）Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ　ｏｆ　Ｃｒｏｐ　Ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ，Ｌｏｎｄｏｎ：Ｌｏｎｇｍａｎ；Ｖａｓｉｌ，Ｉ．Ｋ．，Ａｈｕｊａ，Ｍ．Ｋ．およびＶａｓｉｌ，Ｖ．（１９７９）「Ｐｌａｎｔ　ｔｉｓｓｕｅ　ｃｕｌｔｕｒｅｓ　ｉｎ　ｇｅｎｅｔｉｃｓ　ａｎｄ　ｐｌａｎｔ　ｂｒｅｅｄｉｎｇ」Ａｄｖ．Ｇｅｎｅｔ．２０：１２７−２１５）。第１に、何十年の間、胚培養は、困難な種間交雑を作製することに対する価値ある補助であった。第２に、より最近のものであるが、十分に確立されているのは、茎頂点培養であり、これは、迅速なクローンの操作、ウイルスフリーのクローンの開発および遺伝子供給源保存作業において用途を見出す。両方の技術は、成長点の組織的な統合性の保持に依存する。別の頻繁に使用される技術は、組織が失われるが、多くの場合で回収され得る植物組織のインビトロ培養を含む。この型の技術の例としては、カルス、細胞、およびプロトプラスト培養を含む。培養された細胞の適用は、インビトロハイブリダイゼーションであり、これは、再分化後、種間複二倍体を生じた。この技術は、従来の手段によって作製され得ない所望の複二倍体を提供し得、そして、そのいくつかの改変体による体細胞組換えの可能性を提供する。上記技術は、広範に使用される（Ｃｈａｌｅｆｆ，Ｒ．Ｓ．（１９８１）Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　ｏｆ　Ｈｉｇｈｅｒ　Ｐｌａｎｔｓ，Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ　ｏｆ　Ｃｅｌｌ　Ｃｕｌｔｕｒｅ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ；Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｐｒｅｓｓ）。
【０００８】
植物遺伝子操作技術は、以下の工程を可能にする：（ａ）特定の遺伝子の同定；（ｂ）この遺伝子の単離およびクローニング；（ｃ）レシピエント植物宿主細胞への遺伝子の移入；（ｄ）レシピエント細胞中のＤＮＡの組み込み、転写および翻訳；ならびに（ｅ）トランスジェニック植物の増殖および使用（Ｔ．Ｋｏｓｕｇｅ，Ｃ．Ｐ．ＭｅｒｅｄｉｔｈおよびＡ．Ｈｏｌｌａｅｎｄｅｒ編（１９８３）Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｅｎｇｎｅｅｒｉｎｇ　ｏｆ　Ｐｌａｎｔｓ，２６：５−２５；Ｒｏｇｅｒｓら（１９８８）Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｆｏｒ　Ｐｌａｎｔ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａ．ＷｅｉｓｓｂａｃｈおよびＨ．Ｗｅｉｓｓｂａｃｈ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）。新しく挿入された外来遺伝子は、植物の再分化の間に安定して維持され、そして代表的なメンデル形質として子孫に伝達されることが示されている（Ｈｏｒｓｃｈら（１９８４）Ｓｃｉｅｎｃｅ　２２３：４９６、およびＤｅＢｌｏｃｋら（１９８４）ＥＭＢＯ　３：１６８１）。外来遺伝子は、それらの正常組織の特異的および発生的発現パターンを保持する。
【０００９】
成功した形質転換および再分化技術が、多数の植物種について先行技術において示されており、そして、これらの方法を使用して、種々の植物種を遺伝子的に操作する。Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ媒介形質転換系が、多数の双子葉植物種について効率的であると証明されている。例えば、Ｂａｒｔｏｎら（１９８３、Ｃｅｌｌ　３２：１０３３）は、タバコ植物の形質転換および再分化を報告しており、そして、Ｃｈａｎｇら（１９９４、Ｐｌａｎｔａ　５：５５１−５５８）は、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｔｈａｌｉａｎａの安定した遺伝子形質転換を報告した。
【００１０】
遺伝子移入のためのＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ方法がまた、単子葉植物（例えば、ＬｉｌｉａｃｅａｅおよびＡｍａｒｙｌｌｉｄａｃｅａｅ科（Ｈｏｏｙｋａａｓ−Ｖａｎ　Ｓｌｏｇｔｅｒｅｎら、１９８４，Ｎａｔｕｒｅ　３１１：７６３−７６４）およびＤｉｏｓｃｏｒｅａ　ｂｕｌｂｉｆｅｒａ（サツマイモ）（Ｓｃｈａｆｅｒら、１９８７，Ｎａｔｕｒｅ　３２７：５２９−５３２）の植物）に適用された。さらに、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍベースの形質転換方法は、重要な食用作物のイネ（Ｏｒｙｚａ　ｓａｔｉｖａ、Ｈｉｅｉら、Ｐｌａｎｔ　Ｊｏｕｒｎａｌ，６：２７１−２８２，１９９４を参照のこと）およびトウモロコシ（Ｚｅａ　ｍａｙｓ、Ｉｓｈｉｄａら、Ｎａｔｕｒｅ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１４：７４５−７５０，１９９６を参照のこと）について開発されてきた。
【００１１】
食用作物の形質転換は、代替的な方法を用いて（例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）促進性ＤＮＡ取り込み（Ｕｃｈｉｍｉｙａら（１９８６）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２０４：２０４−２０７）およびエレクトロポレーション（Ｆｒｏｍｍら（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ　３１９：７９１−７９３）（この両方は、移入標的としてプロトプラストを使用した）によって）得られた。単子葉および双子葉組織は、ＤＮＡコーティング粒子による組織のボンバードメントによって形質転換され得る（Ｗａｎｇら（１９８８）Ｐｌａｎｔ　Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１１：４３３−４３９；Ｗｕ，Ｐｌａｎｔ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９８９），ＫｕｎｇおよびＡｍｔｚｅｎ編、Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈ　Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｓｔｏｎｅｈａｍ，Ｍａｓｓ）。再分化は、イネ（Ａｂｄｕｌｌａｈら（１９８６）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　４：１０８７−１０９０）およびトウモロコシ（Ｒｈｏｄｅｓら（１９８８）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　６：５６−６０および（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ　２４０：２０４−２０７）において記載されていた。
【００１２】
（発明の簡単な要旨）
本発明の主な目的は、１つ以上のインドール−３−酢酸（ＩＡＡ）誘導体を含む成長影響性組成物を提供することである。本発明の組成物は、種々の植物種において、多数の成長影響性応答を誘導する際に重要な役割を果たす。適切なＩＡＡ誘導体は、１９９６年１１月２９日に出願された、表題Ａｕｘｉｎｉｃ　Ａｎａｌｏｇｕｅｓ　ｏｆ　Ｉｎｄｏｌｅ−３−Ａｃｅｔｉｃ　Ａｃｉｄの米国特許出願番号０８／７５８，４１６において記載され、これは、本明細書中に参考文献として詳細に援用される。いくつかの好ましい実施形態において、本発明の組成物は、ＩＡＡの置換された誘導体を含み得る。本発明のＩＡＡの誘導体は、ＩＡＡ分子において１つ以上の置換を含み得る。いくつかの好ましい実施形態において、ＩＡＡ誘導体は、一置換のＩＡＡ分子であり得る。いくつかの好ましい実施形態において、本発明のＩＡＡ誘導体は、二置換のＩＡＡであり得る。いくつかの好ましい実施形態において、本発明のＩＡＡ誘導体は、多重置換のＩＡＡ分子であり得る。この誘導体は、酸、エステル、アミドまたは塩の形態であり得る。いくつかの好ましい実施形態において、本発明は、ＩＡＡの２、４、５、６、または７位に置換基を有する一置換ＩＡＡを含む成長影響性組成物を意図し、ここで、置換基は、ハロゲン、アルキル基、アルコキシ基、アシル基、およびアシルアミド基または１〜１０個の炭素を有するアシルオキシ基であり得る。いくつかの好ましい実施形態において、ＩＡＡ誘導体は、ＩＡＡの２、４、５、６、または７位の２つに置換基を有する二置換ＩＡＡ誘導体であり得、ここで、置換基は、同一であるかまたは異なり得、そしてハロゲン、アルキル基、アルコキシ基、アシル基、およびアシルアミド基または１〜１０個の炭素を有するアシルオキシ基であり得る。いくつかの好ましい実施形態において、ＩＡＡ誘導体は、ＩＡＡの２、４、５、６、または７位の３つ以上に置換基を有する多重置換ＩＡＡ誘導体であり得、ここで、置換基は、同一であるかまたは異なり得、そしてハロゲン、アルキル基、アルコキシ基、アシル基、およびアシルアミド基または１〜１０個の炭素を有するアシルオキシ基であり得る。いくつかの好ましい実施形態において、本発明の組成物は、植物成長影響性応答を達成するために十分な量で、酸、エステル、アミドまたは塩の形態で、ＩＡＡ誘導体５−ブロモインドール−３−酢酸（５−ＢｒＩＡＡ）を含み得る。本発明は、単子葉植物および双子葉植物の両方で成長に影響する５−ＢｒＩＡＡの使用を意図する。
【００１３】
植物成長に影響を及ぼすための組成物を提供することもまた本発明の目的であり、この組成物は、植物成長に影響する応答を達成するために、１つ以上のインドール−３−酢酸（ＩＡＡ）誘導体を、１つ以上のさらなる植物成長調節因子（例えば、オーキシン、サイトカイニン、ジベレリン、アブシジン酸など）との混合物で、様々な植物に対する広範な適用のための限定された割合および濃度で含む。一局面において、この組成物は、１つ以上の一置換ＩＡＡ誘導体および／または１つ以上の二置換ＩＡＡ誘導体および／または１つ以上の多置換ＩＡＡ誘導体、あるいはそれらの混合物を含み得、かつ１つ以上のさらなる植物成長調節因子（例えば、１つ以上のオーキシン、１つ以上のサイトカイニン、１つ以上のジベレリン、１つ以上のアブシジン酸、およびそれらの混合物など）をさらに含み得る。いくつかの実施形態において、この組成物は、１つ以上の一置換ＩＡＡ誘導体および／または１つ以上の二置換ＩＡＡ誘導体および／または１つ以上の多置換ＩＡＡ誘導体を含み得、かつ（２，４−ジクロロフェノキシ）酢酸（２，４−Ｄ）、６−ベンジルアミノプリン（ＢＡＰ）、アブシン酸（ＡＢＡ）、ゼアチンリボシド、キネチン、（２−イソペンチル）アデニン（２ｉＰ）およびジクマンバ（ｄｉｃｍａｍｂａ）からなる群から選択される１つ以上の化合物をさらに含み得る。いくつかの実施形態において、この組成物は、一置換ＩＡＡ誘導体を含み得、かつ１つ以上のオーキシン、１つ以上のサイトカイニン、１つ以上のジベレリン、１つ以上のアブシジン酸およびそれらの混合物からなる群から選択される少なくとも１つの植物成長調節化合物をさらに含み得る。いくつかの実施形態において、この組成物は、５−ＢｒＩＡＡを含み得、かつ１つ以上のオーキシン、１つ以上のサイトカイニン、１つ以上のジベレリン、１つ以上のアブシジン酸およびそれらの混合物からなる群から選択される少なくとも１対の植物成長調節化合物をさらに含み得る。いくつかの実施形態において、この組成物は、５−ＢｒＩＡＡを含み得、かつ２，４−Ｄ、ＢＡＰ、ＡＢＡ、ゼアチンリボシド、キネチン、２ｉＰおよびジクマンバからなる群から選択される少なくとも１つの化合物をさらに含み得る。いくつかの実施形態において、この組成物は、５−ＢｒＩＡＡ、２，４−Ｄ、ＢＡＰおよびＡＢＡを含み得る。いくつかの実施形態において、この組成物は、５−ＢｒＩＡＡ、ゼアチンリボシドおよびＡＢＡを含み得る。特定の実施形態において、本発明は、植物の成長に影響を与える、５−ＢｒＩＡＡおよびサイトカイニンを含む組成物で例示される。
【００１４】
一局面において、本発明は、１つ以上の一置換ＩＡＡ誘導体および／または１つ以上の二置換ＩＡＡ誘導体および／または１つ以上の多置換ＩＡＡ誘導体、あるいはそれらの混合物を、１つ以上のさらなる植物成長調節因子（例えば、１つ以上のオーキシン、１つ以上のサイトカイニン、１つ以上のジベレリン、１つ以上のアブシジン酸およびそれらの混合物など）と混合することによって形成される組成物を提供する。いくつかの実施形態において、この組成物は、１つ以上の一置換ＩＡＡ誘導体および／または１つ以上の二置換ＩＡＡ誘導体および／または１つ以上の多置換ＩＡＡ誘導体を、２，４−Ｄ、ＢＡＰ、ＡＢＡ、ゼアチンリボシド、キネチン、２ｉＰおよびジクマンバからなる群から選択される１つ以上の化合物と混合することによって形成され得る。いくつかの実施形態において、この組成物は、一置換ＩＡＡを、１つ以上のオーキシン、１つ以上のサイトカイニン、１つ以上のジベレリン、１つ以上のアブシジン酸およびそれらの混合物からなる群から選択される植物成長調節化合物と混合することによって形成され得る。いくつかの実施形態において、この組成物は、５−ＢｒＩＡＡを、１つ以上のオーキシン、１つ以上のサイトカイニン、１つ以上のジベレリン、１つ以上のアブシジン酸およびそれらの混合物からなる群から選択される植物成長調節化合物と混合することによって形成され得る。いくつかの実施形態においてこの組成物は、５−ＢｒＩＡＡを、２，４−Ｄ、ＢＡＰ、ＡＢＡ、ゼアチンリボシド、キネチン、２ｉＰおよびジクマンバからなる群から選択される植物成長調節化合物と混合することによって形成され得る。いくつかの実施形態において、この組成物は、５−ＢｒＩＡＡ、２，４−Ｄ、ＢＡＰおよびＡＢＡを混合することによって形成され得る。いくつかの実施形態において、この組成物は、５−ＢｒＩＡＡ、ゼアチンリボシドおよびＡＢＡを混合することによって形成され得る。
【００１５】
本発明のさらなる目的は、植物成長に影響を与えるための培養培地を提供することであり、この培地は、１つ以上のインドール−３−酢酸（ＩＡＡ）誘導体、および植物発生または組織再生の間に植物を保持し、またはビヒクルとして働き、それにより１つ以上のインドール−３−酢酸（ＩＡＡ）誘導体が適用され得る培地の成分としての１つ以上のさらなる植物成長調節因子（例えば、１つ以上のオーキシン、サイトカイニン、ジベレリンおよび／またはアブシジン酸）の混合物を含む。一局面において、この培地は、１つ以上の一置換ＩＡＡ誘導体および／または１つ以上の二置換ＩＡＡ誘導体および／または１つ以上の多置換ＩＡＡ誘導体、あるいはそれらの混合物を含み得、かつ１つ以上のさらなる植物成長調節因子（例えば、１つ以上のオーキシン、１つ以上のサイトカイニン、１つ以上のジベレリン、１つ以上のアブシジン酸およびそれらの混合物など）をさらに含み得る。いくつかの実施形態において、この培地は、１つ以上の一置換ＩＡＡ誘導体および／または１つ以上の二置換ＩＡＡ誘導体および／または１つ以上の多置換ＩＡＡ誘導体を含み得、かつ２，４−Ｄ、ＢＡＰ、ＡＢＡ、ゼアチンリボシド、キネチン、２ｉＰおよびジクマンバからなる群から選択される１つ以上の化合物をさらに含み得る。いくつかの実施形態において、この培地は、一置換ＩＡＡ誘導体を含み得、かつ１つ以上のオーキシン、１つ以上のサイトカイニン、１つ以上のジベレリン、１つ以上のアブシジン酸およびそれらの混合物からなる群から選択される少なくとも１つの植物成長調節化合物をさらに含み得る。いくつかの実施形態において、この培地は、５−ＢｒＩＡＡを含み得、かつ１つ以上のオーキシン、１つ以上のサイトカイニン、１つ以上のジベレリン、１つ以上のアブシジン酸およびそれらの混合物からなる群から選択される少なくとも１つの植物成長調節化合物をさらに含み得る。いくつかの実施形態において、この培地は、５−ＢｒＩＡＡを含み得、かつ２，４−Ｄ、ＢＡＰ、ＡＢＡ、ゼアチンリボシド、キネチン、２ｉＰおよびジクマンバからなる群から選択される少なくとも１つの化合物をさらに含み得る。いくつかの実施形態において、この培地は、５−ＢｒＩＡＡ、２，４−Ｄ、ＢＡＰおよびＡＢＡを含み得る。いくつかの実施形態において、この培地は、５−ＢｒＩＡＡ、ゼアチンリボシドおよびＡＢＡを含み得る。特定の実施形態において、本発明は、植物の成長に影響を与える５−ＢｒＩＡＡおよびサイトカイニンを含む組成物で例示される。
【００１６】
本発明の目的は、植物サンプルから、カルス、好ましくは胚形成カルスを形成するための培地を提供することである。いくつかの実施形態において、このカルス形成培地は、オーキシン、サイトカイニン、ジベレリンおよびアブシジン酸からなる群から選択されるカルス誘導量の１つ以上の植物成長調節化合物を含み得る。いくつかの好ましい実施形態において、このカルス形成培地は、１つ以上の一置換ＩＡＡ誘導体および／または１つ以上の二置換ＩＡＡ誘導体および／または１つ以上の多置換ＩＡＡ誘導体、あるいはそれらの混合物を含み、かつ１つ以上のさらなる植物成長調節因子（例えば、１つ以上のオーキシン、１つ以上のサイトカイニン、１つ以上のジベレリン、１つ以上のアブシジン酸、およびそれらの混合物など）をさらに含み得る。いくつかの実施形態において、このカルス形成培地は、１つ以上の一置換ＩＡＡ誘導体および／または１つ以上の二置換ＩＡＡ誘導体および／または１つ以上の多置換ＩＡＡ誘導体を含み得、かつ２，４−Ｄ、ＢＡＰ、ＡＢＡ、ゼアチンリボシド、キネチン、２ｉＰおよびジクマンバからなる群から選択される１つ以上の化合物をさらに含み得る。いくつかの実施形態において、このカルス形成培地は、５−ＢｒＩＡＡ、および１つ以上のオーキシン、１つ以上のサイトカイニン、１つ以上のジベレリン、１つ以上のアブシジン酸およびそれらの混合物からなる群から選択される植物成長調節化合物を含む。いくつかの実施形態において、このカルス形成培地は、５−ＢｒＩＡＡ、および２，４−Ｄ、ＢＡＰ、ＡＢＡ、ゼアチンリボシド、キネチン、２ｉＰおよびジクマンバからなる群から選択される植物成長調節化合物を含む。いくつかの実施形態において、このカルス形成培地は、５−ＢｒＩＡＡ、２，４−Ｄ、ＢＡＰおよびＡＢＡを含む。いくつかの実施形態において、この培地は、５−ＢｒＩＡＡを含み得る。
【００１７】
本発明の目的は、植物サンプルの再生のための培地を提供することである。いくつかの実施形態において、この植物サンプルは、カルス、好ましくは、胚形成カルスであり得る。いくつかの実施形態において、この培地は、オーキシン、サイトカイニン、ジベレリンおよびアブシジン酸からなる群から選択される再生誘発量の１つ以上の植物ホルモンを含み得る。いくつかの好ましい実施形態において、この再生培地は、１つ以上の一置換ＩＡＡ誘導体および／または１つ以上の二置換ＩＡＡ誘導体および／または１つ以上の多置換ＩＡＡ誘導体、あるいはそれらの混合物を含み、かつ１つ以上のさらなる植物成長調節因子（例えば、１つ以上のオーキシン、１つ以上のサイトカイニン、１つ以上のジベレリン、１つ以上のアブシジン酸およびそれらの混合物など）をさらに含む。本発明のいくつかの実施形態において、この再生培地は、１つ以上の一置換ＩＡＡ誘導体および／または１つ以上の二置換ＩＡＡ誘導体および／または１つ以上の多置換ＩＡＡ誘導体、およびそれらの混合物を含み得、かつ２，４−Ｄ、ＢＡＰ、ＡＢＡ、ゼアチンリボシド、キネチン、２ｉＰおよびジクマンバからなる群から選択される１つ以上の化合物をさらに含み得る。いくつかの実施形態において、この再生培地は、５−ＢｒＩＡＡ、ならびに１つ以上のオーキシン、１つ以上のサイトカイニン、１つ以上のジベレリン、１つ以上のアブシジン酸およびそれらの混合物からなる群から選択される植物成長調節化合物を含む。いくつかの実施形態において、この再生培地は、５−ＢｒＩＡＡ、ゼアチンリボシドおよびＡＢＡを含む。
【００１８】
本発明のさらなる目的は、植物成長に影響を与える方法を提供することであり、この方法は、１つ以上の一置換ＩＡＡ誘導体および／または１つ以上の二置換ＩＡＡ誘導体および／または１つ以上の多置換ＩＡＡ誘導体、あるいはそれらの混合物を含み、かつ１つ以上のさらなる植物成長調節因子（例えば、１つ以上のオーキシン、１つ以上のサイトカイニン、１つ以上のジベレリン、１つ以上のアブシジン酸およびそれらの混合物など）をさらに含む、有効量の植物成長影響組成物を、植物サンプルに適用する工程を包含する。本発明のいくつかの実施形態において、この組成物は、１つ以上の一置換ＩＡＡ誘導体および／または１つ以上の二置換ＩＡＡ誘導体および／または１つ以上の多置換ＩＡＡ誘導体、およびそれらの混合物を含み得、かつ２，４−Ｄ、ＢＡＰ、ＡＢＡ、ゼアチンリボシド、キネチン、２ｉＰおよびジクマンバからなる群から選択される１つ上の化合物をさらに含み得る。いくつかの実施形態において、この組成物は、５−ＢｒＩＡＡ、および１つ以上のオーキシン、１つ以上のサイトカイニン、１つ以上のジベレリン、１つ以上のアブシジン酸およびそれらの混合物からなる群から選択される植物成長調節化合物を含む。特定の実施形態において、本発明は、植物の成長に影響を与える、５−ＢｒＩＡＡおよびサイトカイニンを含む組成物で例示される。いくつかの実施形態において、この方法は、植物サンプルを、植物成長に影響を与える組成物の存在下でインキュベートする工程をさらに包含する。いくつかの実施形態において、この植物サンプルは、植物全体、植物部位、植物細胞、植物組織、植物種子またはそれらのいずれかの一部であり得る。いくつかの好ましい実施形態において、この植物サンプルは、トランスジェニック植物の全体または一部である。
【００１９】
植物サンプルから植物を再生する方法であって、植物由来のサンプルを提供する工程、植物サンプルの再生を生じさせる条件下で再生培地と接触させてサンプルを培養する工程、を包含する方法を提供することが、本発明の目的であり、この再生培地は、１種以上の一置換ＩＡＡ誘導体および／または１種以上の二置換ＩＡＡ誘導体および／または１種以上の多置換ＩＡＡ誘導体あるいはそれらの混合物を含み、そしてさらに、１種以上のさらなる植物成長調節因子（例えば、１種以上のオーキシン、１種以上のサイトカイニン、１種以上のジベレリン、１種以上のアブシジン酸、およびそれらの混合物など）を含む。本発明のいくつかの実施形態において、再生培地は、１種以上の一置換ＩＡＡ誘導体および／または１種以上の二置換ＩＡＡ誘導体および／または１種以上の多置換ＩＡＡ誘導体を含み得、そしてさらに、２，４−Ｄ、ＢＡＰ、ＡＢＡ、ゼアチンリボシド、キネチン、２ｉＰおよびジクマンバからなる群から選択される１以上の化合物を含み得る。いくつかの実施形態において、この再生培地は、５−ＢｒＩＡＡならびに１種以上のオーキシン、１種以上のサイトカイニン、１種以上のジベレリン、１種以上のアブシジン酸、およびそれらの混合物からなる群から選択される、食物成長調節化合物を含む。いくつかの実施形態において、この再生培地は、５−ＢｒＩＡＡ、ゼアチンリボシド、およびＡＢＡを含む。いくつかの実施形態において、この植物組織サンプルが、成熟植物組織からに由来し得る。適切な植物としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：トウモロコシ、コムギ、モロコシ、サトウダイコン、ジャガイモ、ダイズ、イネおよび食物源として一般に栽培されている他の食物。いくつかの実施形態において、この植物組織は、成熟トウモロコシ種子に由来する。他の実施形態において、この方法は、このサンプルの切取り前に低温で植物をインキュベートする工程をさらに包含し得る。いくつかの実施形態において、この培養工程は、膜ベースの液体培養物中で実施される。
【００２０】
分化した植物組織由来の植物を再生する方法であって、植物由来のサンプル（このサンプルは、分化した植物組織を含む）を提供する工程、カルスの形成を生じさせる条件下でカルス形成培地と接触させてサンプルを培養する工程、およびこのカルスから植物を再生させる工程、を包含する方法を提供することが、本発明の目的であり、このカルス形成培地は、１種以上の一置換ＩＡＡ誘導体および／または１種以上の二置換ＩＡＡ誘導体および／または１種以上の多置換ＩＡＡ誘導体あるいはそれらの混合物を含み、そしてさらに、１種以上のさらなる植物成長調節因子（例えば、１種以上のオーキシン、１種以上のサイトカイニン、１種以上のジベレリン、１種以上のアブシジン酸、およびそれらの混合物など）を含む。いくつかの実施形態において、カルス形成培地は、１種以上の一置換ＩＡＡ誘導体および／または１種以上の二置換ＩＡＡ誘導体および／または１種以上の多置換ＩＡＡ誘導体を含み得、そしてさらに、２，４−Ｄ、ＢＡＰ、ＡＢＡ、ゼアチンリボシド、キネチン、２ｉＰおよびジクマンバからなる群から選択される１以上の化合物を含み得る。いくつかの実施形態において、このカルス形成培地は、５−ＢｒＩＡＡ、ならびに１種以上のオーキシン、１種以上のサイトカイニン、１種以上のジベレリン、１種以上のアブシジン酸、およびそれらの混合物からなる群から選択される、植物成長調節化合物を含む。いくつかの実施形態において、このカルス形成培地は、５−ＢｒＩＡＡ、ならびに２，４−Ｄ、ＢＡＰ、ＡＢＡ、ゼアチンリボシド、キネチン、２ｉＰおよびジクマンバからなる群から選択される植物成長調節化合物を含む。いくつかの実施形態において、カルス形成培地は、５−ＢｒＩＡＡ、２，４−Ｄ、ＢＡＰおよびＡＢＡを含む。いくつかの実施形態において、この方法は、カルスの再生を生じさせる条件下で再生培地にカルスを移動させる工程をさらに包含し得、この再生培地は、１種以上の一置換ＩＡＡ誘導体および／または１種以上の二置換ＩＡＡ誘導体および／または１種以上の多置換ＩＡＡ誘導体あるいはそれらの混合物を含み、そしてさらに、１種以上のさらなる植物成長調節因子（例えば、１種以上のオーキシン、１種以上のサイトカイニン、１種以上のジベレリン、１種以上のアブシジン酸、およびそれらの混合物など）を含む。本発明のいくつかの実施形態において、再生培地は、１種以上の一置換ＩＡＡ誘導体および／または１種以上の二置換ＩＡＡ誘導体および／または１種以上の多置換ＩＡＡ誘導体ならびにそれらの混合物を含み得、そしてさらに、２，４−Ｄ、ＢＡＰ、ＡＢＡ、ゼアチンリボシド、キネチン、２ｉＰおよびジクマンバからなる群から選択される１以上の化合物を含み得る。いくつかの実施形態において、再生培地は、５−ＢｒＩＡＡ、ならびに１種以上のオーキシン、１種以上のサイトカイニン、１種以上のジベレリン、１種以上のアブシジン酸、およびそれらの混合物からなる群から選択される植物成長調節化合物を含む。いくつかの実施形態において、この再生培地は、５−ＢｒＩＡＡ、ゼアチンリボシド、およびＡＢＡを含む。いくつかの実施形態において、このカルス形成培地は、再生培地と異なる。いくつかの実施形態において、この植物サンプルは、成熟植物組織に由来し得る。適切な植物としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：トウモロコシ、コムギ、モロコシ、サトウダイコン、ジャガイモ、ダイズ、イネおよび一般に栽培されている他の食物。いくつかの実施形態において、この植物サンプルは、成熟トウモロコシ種子の全てまたは一部を含み得る。いくつかの実施形態において、この方法は、この再生培地にカルスを移動させる前に、カルスを増幅するさらなる工程を含み得る。他の実施形態において、この方法は、サンプルを切除する前に、低温で植物組織をインキュベートする工程をさらに包含し得る。いくつかの実施形態において、低温は、約０℃〜約２０℃、好ましくは、約０℃〜約１０℃、より好ましくは、約０℃〜約５℃、そして最も好ましくは、約４℃であり得る。いくつかの実施形態において、この培養工程は、膜ベースの液体培養物中で実施される。
【００２１】
植物サンプル由来の胚形成カルスの生成のための方法を提供することが、本発明の目的である。いくつかの実施形態において、この方法は、植物サンプルを提供する工程、１種以上の一置換ＩＡＡ誘導体および／または１種以上の二置換ＩＡＡ誘導体および／または１種以上の多置換ＩＡＡ誘導体あるいはそれらの混合物、およびさらに１種以上のさらなる植物成長調節因子（例えば、１種以上のオーキシン、１種以上のサイトカイニン、１種以上のジベレリン、１種以上のアブシジン酸、およびそれらの混合物など）を含む組成物と植物サンプルを接触させる工程、ならびに胚形成カルスの形成を生じさせる条件下でサンプルを培養する工程を包含する。いくつかの実施形態において、この組成物は、１種以上の一置換ＩＡＡ誘導体および／または１種以上の二置換ＩＡＡ誘導体および／または１種以上の多置換ＩＡＡ誘導体を含み得、そして２，４−Ｄ、ＢＡＰ、ＡＢＡ、ゼアチンリボシド、キネチン、２ｉＰおよびジクマンバからなる群から選択される、１以上の化合物をさらに含み得る。いくつかの実施形態において、この組成物は、５−ＢｒＩＡＡならびに１種以上のオーキシン、１種以上のサイトカイニン、１種以上のジベレリン、１種以上のアブシジン酸、およびそれらの混合物からなる群から選択される植物成長調節化合物をさらに含む。いくつかの実施形態において、この組成物は、５−ＢｒＩＡＡならびに２，４−Ｄ、ＢＡＰ、ＡＢＡ、ゼアチンリボシド、キネチン、２ｉＰおよびジクマンバからなる群から選択される植物成長調節化合物を含む。いくつかの実施形態において、この組成物は、５−ＢｒＩＡＡ、２，４−Ｄ、ＢＡＰおよびＡＢＡを含む。いくつかの好ましい実施形態において、この組成物は、５−ＢｒＩＡＡを含み得る。いくつかの実施形態において、このサンプルは、成熟植物に由来し得る。適切な植物としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：トウモロコシ、コムギ、モロコシ、サトウダイコン、ジャガイモ、ダイズ、イネおよび一般に栽培されている他の食物。いくつかの実施形態において、植物サンプルは、トウモロコシに由来し得る。いくつかの実施形態において、このサンプルは、種子、または種子の一部である。いくつかの実施形態において、この植物サンプルは、トウモロコシ種子に由来し得る。いくつかの実施形態において、この植物サンプルは、Ｂ７３、Ｈ９９およびＰＡ９１からなる群から選択されるトウモロコシ変種由来の種子または種子の一部であり得る。
【００２２】
植物サンプルからの胚形成カルスの生成のための方法を提供することが、本発明の目的であり、ここで、この方法は、植物サンプルを提供する工程、低温でサンプルをインキュベートする工程、カルス形成培地の存在下で植物サンプルを培養する工程、およびカルスからの植物を再生する工程を包含し、ここで、このカルス形成培地は、１種以上の一置換ＩＡＡ誘導体および／または１種以上の二置換ＩＡＡ誘導体および／または１種以上の多置換ＩＡＡ誘導体あるいはそれらの混合物、およびさらに、１種以上のさらなる植物成長調節因子（例えば、１種以上のオーキシン、１種以上のサイトカイニン、１種以上のジベレリン、１種以上のアブシジン酸、およびそれらの混合物など）を含む。いくつかの実施形態において、カルス形成培地は、１種以上の一置換ＩＡＡ誘導体および／または１種以上の二置換ＩＡＡ誘導体および／または１種以上の多置換ＩＡＡ誘導体を含み得、そしてさらに、２，４−Ｄ、ＢＡＰ、ＡＢＡ、ゼアチンリボシド、キネチン、２ｉＰおよびジクマンバからなる群から選択される１以上の化合物を含み得る。いくつかの実施形態において、このカルス形成培地は、５−ＢｒＩＡＡ、ならびに１種以上のオーキシン、１種以上のサイトカイニン、１種以上のジベレリン、１種以上のアブシジン酸、およびそれらの混合物を含む。いくつかの実施形態において、このカルス形成培地は、５−ＢｒＩＡＡ、ならびに２，４−Ｄ、ＢＡＰ、ＡＢＡ、ゼアチンリボシド、キネチン、２ｉＰおよびジクマンバからなる群から選択される植物成長調節化合物を含む。いくつかの実施形態において、このカルス形成培地は、５−ＢｒＩＡＡ、２，４−Ｄ、ＢＡＰ、およびＡＢＡを含む。いくつかの好ましい実施形態において、この培地は、５−ＢｒＩＡＡを含み得る。いくつかの実施形態において、このサンプルの一部は、サンプルが低温でインキュベートされた後に、切取られそして培養され得る。いくつかの実施形態において、低温は、約０℃〜約２０℃、好ましくは、約０℃〜約１０℃、より好ましくは、約０℃〜約５℃、そして最も好ましくは、約４℃であり得る。いくつかの実施形態において、この植物サンプルは、成熟植物由来であり得る。適切な植物としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：トウモロコシ、コムギ、モロコシ、サトウダイコン、ジャガイモ、ダイズ、イネおよび一般に栽培されている他の食物。いくつかの実施形態において、この植物サンプルは、トウモロコシ由来であり得る。いくつかの実施形態において、この植物サンプルは、種子または種子の一部である。いくつかの実施形態において、この植物サンプルは、トウモロコシ種子に由来し得る。いくつかの実施形態において、この植物サンプルは、Ｂ７３、Ｈ９９およびＰＡ９１からなる群から選択されるトウモロコシの変種由来であり得る。いくつかの実施形態において、インキュベーション工程は、４℃で約１日〜１０間実施され得る。いくつかの実施形態において、このインキュベーション工程は、４日間実施され得る。
【００２３】
カルスから苗条を再生する方法あって、再生培地とカルスとを接触させる工程およびこのカルスから苗条の再生を生じさせる条件下でカルスをインキュベートする工程、を包含する方法を提供することが、本発明の目的である。いくつかの実施形態において、この培地は、オーキシン、サイトカイニン、ジベレリンおよびアブシジン酸からなる群から選択される、再生誘導量の１以上の植物ホルモンを含み得る。いくつかの好ましい実施形態において、この再生培地は、１種以上の一置換ＩＡＡ誘導体および／または１種以上の二置換ＩＡＡ誘導体および／または１種以上の多置換ＩＡＡ誘導体あるいはそれらの混合物を含み、そしてさらに、１種以上のさらなる植物成長調節因子（例えば、１種以上のオーキシン、１種以上のサイトカイニン、１種以上のジベレリン、１種以上のアブシジン酸、およびそれらの混合物など）を含む。本発明のいくつかの実施形態において、この再生培地は、１種以上の一置換ＩＡＡ誘導体および／または１種以上の二置換ＩＡＡ誘導体および／または１種以上の多置換ＩＡＡ誘導体およびそれらの混合物を含み得、そしてさらに、２，４−Ｄ、ＢＡＰ、ＡＢＡ、ゼアチンリボシド、キネチン、２ｉＰおよびジクマンバからなる群から選択される１以上の化合物を含み得る。いくつかの実施形態において、この再生培地は、５−ＢｒＩＡＡ、ならびに１種以上のオーキシン、１種以上のサイトカイニン、１種以上のジベレリン、１種以上のアブシジン酸、およびそれらの混合物からなる群から選択される植物成長調節化合物を含む。いくつかの実施形態において、この再生培地は、５−ＢｒＩＡＡ、ゼアチンリボシド、およびＡＢＡを含む。いくつかの実施形態において、このカルスは、成熟植物由来であり得る。適切な植物としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：トウモロコシ、コムギ、モロコシ、サトウダイコン、ジャガイモ、ダイズ、イネおよび一般に栽培されている他の食物。いくつかの実施形態において、このカルスは、トウモロコシ由来であり得る。いくつかの実施形態において、このカルスは、種子または種子の一部由来であり得る。いくつかの実施形態において、このカルスは、トウモロコシ種子由来であり得る。いくつかの実施形態において、このカルスは、Ｂ７３、Ｈ９９およびＰＡ９１からなる群から選択される、トウモロコシ変種由来であり得る。
【００２４】
形質転換植物の再生のための方法を提供することが本発明の目的であり、この方法は、植物サンプルを提供する工程、カルス形成培地の存在下で植物サンプルを培養する工程であって、このカルス形成培地が、１つ以上のモノ置換ＩＡＡ誘導体および／または１つ以上のジ置換ＩＡＡ誘導体および／または１つ以上の多置換ＩＡＡ誘導体またはこれらの混合物を含み、そして胚形成カルスを産生するために、１つ以上のさらなる植物成長調節因子（例えば、１つ以上のオーキシン、１つ以上のサイトカイニン、１つ以上のジベレリン、１つ以上のアブシジン酸およびこれらの混合物など）をさらに含む工程、このカルスを形質転換する工程およびカルスの再生を引き起こす条件下でこの形質転換されたカルスをインキュベートする工程を包含する。いくつかの実施形態において、カルス形成培地は、１つ以上のモノ置換ＩＡＡ誘導体および／または１つ以上のジ置換ＩＡＡ誘導体および／または１つ以上の多置換ＩＡＡ誘導体を含み得、そして２，４−Ｄ、ＢＡＰ、ＡＢＡ、ゼアチンリボシド、キネチン、２ｉＰ、およびジクマンバ（ｄｉｃｍａｍｂａ）からなる群より選択される１つ以上の化合物をさらに含み得る。いくつかの実施形態において、カルス形成培地は、５−ＢｒＩＡＡならびに１つ以上のオーキシン、１つ以上のサイトカイニン、１つ以上のジベレリン、１つ以上のアブシジン酸およびこれらの混合物からなる群より選択される植物成長調節化合物を含む。いくつかの実施形態において、カルス形成培地は、５−ＢｒＩＡＡならびに２，４−Ｄ、ＢＡＰ、ＡＢＡ、ゼアチンリボシド、キネチン、２ｉＰ、およびジクマンバからなる群より選択される植物成長調節化合物を含む。いくつかの実施形態において、カルス形成培地は、５−ＢｒＩＡＡ、２，４−Ｄ、ＢＡＰおよびＡＢＡを含む。いくつかの実施形態において、この方法は、さらに、カルスの再生を引き起こす条件下でカルスを再生培地に移す工程を包含し、この再生培地は、１つ以上のモノ置換ＩＡＡ誘導体および／または１つ以上のジ置換ＩＡＡ誘導体および／または１つ以上の多置換ＩＡＡ誘導体またはこれらの混合物を含み、そして１つ以上のさらなる植物成長調節因子（例えば、１つ以上のオーキシン、１つ以上のサイトカイニン、１つ以上のジベレリン、１つ以上のアブシジン酸およびこれらの混合物など）をさらに含む。本発明のいくつかの実施形態において、再生培地は、１つ以上のモノ置換ＩＡＡ誘導体および／または１つ以上のジ置換ＩＡＡ誘導体および／または１つ以上の多置換ＩＡＡ誘導体およびこれらの混合物を含み、そして２，４−Ｄ、ＢＡＰ、ＡＢＡ、ゼアチンリボシド、キネチン、２ｉＰ、およびジクマンバからなる群より選択される１つ以上の化合物をさらに含み得る。いくつかの実施形態において、再生培地は、５−ＢｒＩＡＡならびに１つ以上のオーキシン、１つ以上のサイトカイニン、１つ以上のジベレリン、１つ以上のアブシジン酸およびこれらの混合物からなる群より選択される植物成長調節化合物を含む。いくつかの実施形態において、再生培地は、５−ＢｒＩＡＡ、ゼアチンリボシド、およびＡＢＡを含む。いくつかの実施形態において、カルス形成培地は、再生培地とは異なる。いくつかの実施形態において、植物組織サンプルは、成熟植物組織から誘導され得る。適切な植物としては、限定しないが、トウモロコシ、コムギ、モロコシ、サトウダイコン、ジャガイモ、ダイズ、イネ、および通常栽培される他の植物が挙げられる。いくつかの実施形態において、植物サンプルは、トウモロコシから誘導され得る。いくつかの実施形態において、植物サンプルは、種子または種子の一部分であり得る。いくつかの実施形態において、植物サンプルは、トウモロコシの種子から誘導され得る。いくつかの実施形態において、植物サンプルは、Ｂ７３、Ｈ９９、およびＰＡ９１からなる群より選択されるトウモロコシの品種由来の種子または種子の一部であり得る。いくつかの実施形態において、この方法は、カルスを再生培地に移す前にこのカルスを増幅させるさらなる工程を包含し得る。他の実施形態において、この方法は、さらに、サンプルの切除の前に低下した温度で植物組織をインキュベートする工程を包含し得る。いくつかの実施形態において、低下した温度は、約０℃〜約２０℃、好ましくは約０℃〜約１０℃、より好ましくは約０℃〜約５℃、そして最も好ましくは約４℃であり得る。いくつかの実施形態において、１つ以上の工程が、膜に基づく液体培養物中で実行される。
【００２５】
形質転換植物の再生のための方法を提供することが本発明の目的であり、この方法は、植物サンプルを提供する工程、植物サンプルを形質転換する工程、ならびにこの植物サンプルをカルス形成培地の存在下で培養して形質転換されたカルスを生成する工程であって、このカルス形成培地が、１つ以上のモノ置換ＩＡＡ誘導体および／または１つ以上のジ置換ＩＡＡ誘導体および／または１つ以上の多置換ＩＡＡ誘導体またはこれらの混合物を含み、そして１つ以上のさらなる植物成長調節因子（例えば、１つ以上のオーキシン、１つ以上のサイトカイニン、１つ以上のジベレリン、１つ以上のアブシジン酸およびこれらの混合物など）をさらに含む工程、ならびにこのカルスの再生を引き起こす条件下でこの形質転換されたカルスをインキュベートする工程を包含する。いくつかの実施形態において、カルス形成培地は、１つ以上のモノ置換ＩＡＡ誘導体および／または１つ以上のジ置換ＩＡＡ誘導体および／または１つ以上の多置換ＩＡＡ誘導体を含み得、そして２，４−Ｄ、ＢＡＰ、ＡＢＡ、ゼアチンリボシド、キネチン、２ｉＰ、およびジクマンバからなる群より選択される１つ以上の化合物をさらに含み得る。いくつかの実施形態において、カルス形成培地は、５−ＢｒＩＡＡならびに１つ以上のオーキシン、１つ以上のサイトカイニン、１つ以上のジベレリン、１つ以上のアブシジン酸およびこれらの混合物からなる群より選択される植物成長調節化合物を含む。いくつかの実施形態において、カルス形成培地は、５−ＢｒＩＡＡならびに２，４−Ｄ、ＢＡＰ、ＡＢＡ、ゼアチンリボシド、キネチン、２ｉＰ、およびジクマンバからなる群より選択される植物成長調節化合物を含む。いくつかの実施形態において、カルス形成培地は、５−ＢｒＩＡＡ、２，４−Ｄ、ＢＡＰおよびＡＢＡを含む。いくつかの実施形態において、この方法は、さらに、カルスの再生を引き起こす条件下でカルスを再生培地に移す工程を包含し、この再生培地は、１つ以上のモノ置換ＩＡＡ誘導体および／または１つ以上のジ置換ＩＡＡ誘導体および／または１つ以上の多置換ＩＡＡ誘導体またはこれらの混合物を含み、そして１つ以上のさらなる植物成長調節因子（例えば、１つ以上のオーキシン、１つ以上のサイトカイニン、１つ以上のジベレリン、１つ以上のアブシジン酸およびこれらの混合物など）をさらに含む。本発明のいくつかの実施形態において、再生培地は、１つ以上のモノ置換ＩＡＡ誘導体および／または１つ以上のジ置換ＩＡＡ誘導体および／または１つ以上の多置換ＩＡＡ誘導体およびこれらの混合物を含み得、そして２，４−Ｄ、ＢＡＰ、ＡＢＡ、ゼアチンリボシド、キネチン、２ｉＰ、およびジクマンバからなる群より選択される１つ以上の化合物をさらに含み得る。いくつかの実施形態において、再生培地は、５−ＢｒＩＡＡならびに１つ以上のオーキシン、１つ以上のサイトカイニン、１つ以上のジベレリン、１つ以上のアブシジン酸およびこれらの混合物からなる群より選択される植物成長調節化合物を含む。いくつかの実施形態において、再生培地は、５−ＢｒＩＡＡ、ゼアチンリボシド、およびＡＢＡを含む。いくつかの実施形態において、カルス形成培地は、再生培地とは異なる。いくつかの実施形態において、植物組織サンプルは、成熟植物組織から誘導され得る。適切な植物としては、限定しないが、トウモロコシ、コムギ、モロコシ、サトウダイコン、ジャガイモ、ダイズ、イネ、および通常栽培される他の植物が挙げられる。いくつかの実施形態において、植物サンプルは、トウモロコシから誘導され得る。いくつかの実施形態において、植物サンプルは、種子または種子の一部分であり得る。いくつかの実施形態において、植物サンプルは、トウモロコシの種子から誘導され得る。いくつかの実施形態において、植物サンプルは、Ｂ７３、Ｈ９９、およびＰＡ９１からなる群より選択されるトウモロコシの品種由来の種子または種子の一部であり得る。いくつかの実施形態において、この方法は、カルスを再生培地に移す前にこのカルスを増幅させるさらなる工程を包含し得る。他の実施形態において、この方法は、さらに、サンプルの切除の前に低下した温度で植物組織をインキュベートする工程を包含し得る。いくつかの実施形態において、低下した温度は、約０℃〜約２０℃、好ましくは約０℃〜約１０℃、より好ましくは約０℃〜約５℃、そして最も好ましくは約４℃であり得る。いくつかの実施形態において、１つ以上の工程が、膜に基づく液体培養物中で実行される。
【００２６】
形質転換植物の再生のための方法を提供することが本発明の目的であり、この方法は、植物サンプルを提供する工程、植物サンプルを形質転換する工程、ならびにこの植物サンプルを再生培地（１つ以上のモノ置換ＩＡＡ誘導体および／または１つ以上のジ置換ＩＡＡ誘導体および／または１つ以上の多置換ＩＡＡ誘導体またはこれらの混合物を含み、そして１つ以上のさらなる植物成長調節因子（例えば、１つ以上のオーキシン、１つ以上のサイトカイニン、１つ以上のジベレリン、１つ以上のアブシジン酸およびこれらの混合物など）をさらに含む）の存在下で培養する工程を包含する。本発明のいくつかの実施形態において、再生培地は、１つ以上のモノ置換ＩＡＡ誘導体および／または１つ以上のジ置換ＩＡＡ誘導体および／または１つ以上の多置換ＩＡＡ誘導体およびこれらの混合物を含み得、そして２，４−Ｄ、ＢＡＰ、ＡＢＡ、ゼアチンリボシド、キネチン、２ｉＰ、およびジクマンバからなる群より選択される１つ以上の化合物をさらに含み得る。いくつかの実施形態において、再生培地は、５−ＢｒＩＡＡならびに１つ以上のオーキシン、１つ以上のサイトカイニン、１つ以上のジベレリン、１つ以上のアブシジン酸およびこれらの混合物からなる群より選択される植物成長調節化合物を含む。いくつかの実施形態において、再生培地は、５−ＢｒＩＡＡ、ゼアチンリボシドおよびＡＢＡを含む。いくつかの実施形態において、植物組織サンプルは、成熟植物組織から誘導され得る。適切な植物としては、限定しないが、トウモロコシ、コムギ、モロコシ、サトウダイコン、ジャガイモ、ダイズ、イネ、および通常栽培される他の植物が挙げられる。いくつかの実施形態において、植物サンプルは、トウモロコシから誘導され得る。いくつかの実施形態において、植物サンプルは、種子または種子の一部分であり得る。いくつかの実施形態において、植物サンプルは、トウモロコシの種子から誘導され得る。いくつかの実施形態において、植物サンプルは、Ｂ７３、Ｈ９９、およびＰＡ９１からなる群より選択されるトウモロコシの品種由来の種子または種子の一部であり得る。他の実施形態において、この方法は、さらに、サンプルの切除の前に低下した温度で植物組織をインキュベートする工程を包含し得る。いくつかの実施形態において、低下した温度は、約０℃〜約２０℃、好ましくは約０℃〜約１０℃、より好ましくは約０℃〜約５℃、そして最も好ましくは約４℃であり得る。いくつかの実施形態において、１つ以上の工程が、膜に基づく液体培養物中で実行される。
【００２７】
本発明はまた、本発明の方法を実行するためのキットに関し、特に、カルス（好ましくは、胚形成カルス）を再生する際における使用のためのキットに関する。いくつかの好ましい実施形態において、本発明は、植物サンプルの形質転換および／または再生のためのキットを提供し得る。このようなキットは、１つ以上の容器、１つ以上の培地形成処方物、固体支持体（例えば、膜および／または寒天）を含み得る。このようなキットは、必要に応じて、１つ以上の適切な緩衝液、１つ以上のサイトカイニン、および１つ以上のオーキシンからなる群より選択される１つ以上のさらなる成分を含み得る。
【００２８】
本発明の他の好ましい実施形態は、以下の図面、本発明の記載を考慮して、そして特許請求の範囲を考慮して、当業者に明かである。
【００２９】
（発明の詳細な説明）
（定義）
以下の記載において、生物工学の当業者によって通常使用される多数の用語が広範に使用される。明細書および特許請求の範囲（このような用語に与えられる範囲を含む）の明確かつより一貫した理解を提供するために、以下の定義が提供される。
【００３０】
本明細書中で使用される用語ＩＡＡ誘導体または５−ブロモインドール−３−酢酸または５−ＢｒＩＡＡは、遊離酸形態だけではなく、ＩＡＡ誘導体または５−ＢｒＩＡＡのアミド、エステル、または塩の形態をいう。適切なＩＡＡ誘導体は、１９９６年１１月２９日に出願されたＡｕｘｉｎｉｃ　Ａｎａｌｏｇｕｅｓ　ｏｆ　Ｉｎｄｏｌｅ−３−Ａｃｅｔｉｃ　Ａｃｉｄと題された米国特許出願第０８／７５８，４１６号（本明細書中において参考として具体的に援用される）に記載される。ＩＡＡ誘導体または５−ＢｒＩＡＡの意味には、例えば、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、ジメチルアミン、エタノールアミンなどの塩およびアミドおよび低級アルキルエステルのような、塩およびエステル誘導体を含む。
【００３１】
本明細書中に使用される場合、用語「植物成長調節因子」または「ホルモン」は、植物の成長に影響を与えるホルモンとして作用する天然に存在する化合物または合成化合物をいう。重要な成長調節因子は、オーキシン、サイトカイニン、アブシジン酸およびジベレリンによって例示される。
【００３２】
用語「オーキシン」は、本明細書中に使用される場合、植物の成長に影響を与える植物成長調節因子をいう。オーキシンは、例えば、インドール−３−酢酸（ＩＡＡ）、インドール−３−酪酸（ＩＢＡ）、２，４−ジクロロフェノキシ酢酸（２，４−Ｄ）、ナフタレン酢酸（ＮＡＡ）、５，６−ジクロロインドール−３−酢酸（５，６−Ｃｌ２−ＩＡＡ）などの化合物によって例示される。
【００３３】
用語「サイトカイニン」は、本明細書中に使用される場合、植物の成長に影響を与える植物成長調節因子をいう。サイトカイニンは、例えば、６−ベンジルアミノプリン（ＢＡＰ）、Ｎ６（Δ２−イソペンテニル）アデニン（２ｉＰ）、イソペンテニルピロリン酸（ｉｐｐ）、６−（４−ヒドロキシ−３−メチル−２−トランスブテニルアミノ）プリン（ゼアチン）、６−フルフリルアミノプリン（キネチン）などの化合物によって例示される。化合物は、バイオアッセイを用いてオーキシン活性に関して試験され得る（例えば、Ａｖｅｎａ　ｓａｔｉｖａの子葉鞘の伸長（Ｂｏｔｔｇｅｒら（１９７８）Ｐｌａｎｔａ　１４０：８９）またはハクサイの根の成長阻害（Ｍａｒｕｍｏら（１９７４）Ｐｌａｎｔ　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｓｕｂｓｔａｎｃｅ，４１９頁，Ｈｉｒｏｋａｗａ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ｃｏ．，Ｉｎｃ．，Ｔｏｋｙｏ）または緑豆の胚軸膨張（Ｍａｒｕｍｏら（１９７４）前出）。サイトカイニン活性は、当該分野で周知であるような植物の成長促進を評価するために設計されたアッセイ（例えば、タバコアッセイなど）において測定され得る（Ｓｋｏｏｇら（１９６７）Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍ　６：１１６９−１１９２；Ｍｏｒｒｉｓ（１９８６）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ．３７：５０９−５３８；Ｈｏｒｇａｎ（１９８４）Ａｄｖａｎｃｅｄ　Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ．（Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｍ．Ｂ．編）５３−７５頁，Ｐｉｔｍａｎ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｌｏｎｄｏｎ；ＬｅｔｈａｍおよびＰａｌｎｉ（１９８３）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ．３４：１６３−１９７；ならびにＣｈｅｎ（１９８１）Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ　ａｎｄ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ　ｏｆ　Ｃｙｔｏｋｉｎｉｎｓ（Ｇｕｅｒｎ，Ｊ．およびＰｅａｕｄ−Ｌｅｎｏｅｌ，Ｃ．編，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ，３４−４３頁）。サイトカイニン／オーキシンの濃度比のバリエーションは、植物の成長の増殖を特定の組織で優先的に生じさせる。例えば、高いサイトカイニン／オーキシン比は、苗条の成長を促進し、オーキシンに対して低いサイトカイニンの比は、根の成長を促進する（Ｄｅｐｉｃｋｅｒら（１９８３）Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　ｏｆ　Ｐｌａｎｔｓ、Ｔ．Ｋｏｓｕｎｇｅ，Ｃ．Ｐ．ＭｅｒｅｄｉｔｈおよびＡ．Ｈｏｌｌａｅｎｄｅｒ編、Ｐｌｅｎｕｍ　Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ，１５４頁）。
【００３４】
用語「培地」または「培養培地」は、本明細書中に使用される場合、生育力を維持し、植物サンプルの成長および／または再生を支持し得る組成物をいう。一般的に使用される培地としては、ＭＳ培地（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤから市販される）およびＮ６培地（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯから市販される）が挙げられる。
【００３５】
用語「植物サンプル」は、本明細書中に使用される場合、全体の植物または植物の一部をいう。この用語は、植物の部位、植物の細胞、植物の組織、外植片、植物の種子、または植物の種子の一部を含むようであるが、これらに限定されない。この用語はさらに、懸濁培養物または組織培養物の形態の植物（カルス、プロトプラスト、胚、器官、オルガネラなどの培養物が挙げられるが、これらに限定されない）を意図する。
【００３６】
植物、植物サンプルおよび／または植物組織に関する場合の用語「形質転換した（形質転換された）」は、本明細書中に使用される場合、植物、植物サンプルおよび／または植物組織への外来核酸の導入をいう。外来核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡおよびＲＮＡの混合物または１つ以上の分子がリボヌクレオチドおよびデオキシリボヌクレオチドの両方を含むハイブリッドであり得る。
【００３７】
用語「トランスジェニック植物」または「トランスジェニック植物組織」は、本明細書中に使用される場合、個々の植物細胞に導入される外来核酸分子を用いて安定に形質転換された、植物または植物組織をいう。
【００３８】
用語「発現」は、ＤＮＡ分子からのＲＮＡの合成をいう。一過性発現は、有限期間のみ生じる発現である。一般的に、一過性発現は、ＤＮＡの導入直後に宿主細胞に導入されたＤＮＡ分子から生じる発現をいうために使用される。
【００３９】
用語「遺伝子操作」は、本明細書中に使用される場合、外来（しばしばキメラの）遺伝子の、生存した全体の植物に再生し得る１つ以上の植物細胞への導入をいう。従って、いくつかの場合、生成された植物は、自己授粉するか、または同じ種の別の植物と交雑授粉され得、その結果、生殖細胞系に保有される外来遺伝子は、農業的に有用な植物品種に導入されるかまたはこれに交配され得る。
【００４０】
用語「再生」は、本明細書中に使用される場合、培養植物サンプルまたは培養植物単位（例えば、葉のディスク（ｌｅａｆ　ｄｉｓｃ）、種子など）からの、少なくとも１つの新規に発生または再生された植物組織（例えば、根、苗条、カルスなど）の生成をいう。
【００４１】
用語「再生の割合」「％再生」または「再生率」は、本明細書中に使用される場合、組織培養された植物単位の総数の百分率としての、少なくとも１つの新規に発生または再生された組織を生成する組織培養された植物単位の数をいう（例えば、（新規に発生した組織を有する植物単位の数／植物単位の総数）×１００）。
【００４２】
用語「植物成長に影響を与える（こと）」または「増殖に影響を与える（こと）」または「影響を与える因子（ａｆｆｅｃｔｏｒ）」または「影響」は、本明細書中に使用される場合、成長調節因子の非存在下で観察されることに対して、全体的な植物成長のいくつかの特徴を改善または変化させる多数の植物応答のうちの任意の１つをいい、これには、発根を含む種子の出芽刺激、苗条の抑制、細胞増殖の促進、カルス成長の刺激などが挙げられる、これらに限定されない。
【００４３】
用語「有効量」は、本明細書中に使用される場合、植物に投与される植物成長調節因子またはホルモンである化合物が種々の植物成長応答のうちの１つ以上を刺激または引き起こすような、この化合物の量または濃度をいう。植物成長応答としては、幹の伸長の誘導、根の形成の促進、カルス形成の刺激、葉の成長の増強、種子の出芽刺激、多数の植物および植物の一部の乾燥重量含有量の増加などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００４４】
句「膜に基づく液体培養」とは、本明細書中に使用される場合、植物サンプルを培養する方法をいい、ここで、サンプルは、液体培地の頂部でフロートによって支持される膜の頂部に配置される。この技術のより詳細な議論は、Ｌｉｎら，Ｉｎ　ｖｉｔｒｏ，３１：３０Ａ（１９９５）およびＬｉｎら，Ｆｏｃｕｓ　１７（３）：９５（１９９５）に提供される。この技術は、Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ　ＭＤから市販される試薬および装置を用いて実行され得る。
【００４５】
本発明は、ＩＡＡ誘導体（特に５−ＢｒＩＡＡ）が、植物成長に影響を与える化合物としての有用性を有するという発見に関する。５−ＢｒＩＡＡは、単子葉植物および双子葉植物の両方においてオーキシンとして機能する際にＩＡＡよりも優れていることが見いだされた。従って、本発明は、少なくとも１つのＩＡＡ誘導体を含む植物の成長に影響を与えるための新規組成物を意図する。いくつかの実施形態において、本発明の新規組成物は、５−ＢｒＩＡＡを含む。
【００４６】
いくつかの好ましい実施形態において、本発明の新規組成物の成長効果は、植物組織からの胚発生カルスの生成を刺激することである。例えば、５−ＢｒＩＡＡは、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｔｈａｌｉａｎａ由来の緑色カルスの再生を刺激する際に、ＩＡＡよりも２倍と４倍との間でより有効であった。Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ組織培養の応答に関する先行技術の教示である「カルス誘導および再生の頻度は、根に関して高く、葯および幹に関して低く、そして葉の外植片に関して最も低い」ということを考慮すると、５−ＢｒＩＡＡの効果はいっそう顕著である。本発明に従って、５−ＢｒＩＡＡは、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｔｈａｌｉａｎａの葉からの再生に関して１００％の効率を提供する（米国特許第５，６７４，７３１号を参照のこと）。
【００４７】
いくつかの好ましい実施形態において、本発明の新規組成物の成長効果は、植物サンプルの再生の刺激であり得る。本発明の組成物は、植物サンプルの再生に関する先行技術の組成物よりも、予想外に優れている。５−ＢｒＩＡＡの優位性はまた、単子葉植物の再生において観察された。単子葉植物（例えば、イネ）から組織再生を得るために使用された先行技術の方法は、約３ヶ月および２つ以上の異なる培養培地での未成熟な種子のインキュベーションを必要とする。対照的に、オーキシンとして５−ＢｒＩＡＡを使用する本発明に従って、成熟な種子に由来するイネの胚性カルスからの苗条の再生は、約１ヶ月半で得られ、５−ＢｒＩＡＡおよびサイトカイニン（例えば、ＢＡＰ）を含むインキュベーション培地を１つのみ必要とし、１００％の再生率をもたらした。植物組織およびトランスジェニック植物組織からの再生を示すために実行された全てのアッセイにおいて、５−ＢｒＩＡＡは、オーキシンとして機能して、ＩＡＡ（当該分野のオーキシンの標準物）と少なくとも同様に、そして多くの場合ＩＡＡよりも良好に、成長を刺激した。
【００４８】
本発明の成長に影響を与える組成物は、１つ以上のインドール−３−酢酸（ＩＡＡ）誘導体を、必要に応じて１つ以上のさらなる成長調節因子（例えば、オーキシン、サイトカイニン、ジベレリン、アブシジン酸など）を含む混合物中に含み得る。いくつかの好ましい実施形態において、５−ＢｒＩＡＡまたは５−ＢｒＩＡＡおよび１つ以上のさらなる植物成長調節因子（例えば、オーキシン、アブシジン酸、サイトカイニン、ジベレリンなど）との混合物は、キャリアまたは補助栄養因子と混合され得る。ＢＡＰ、２ｉＰおよびキネチンの使用は、本発明の特定の実施形態において例示される。当該分野で公知の他のサイトカイニンまたは他の植物成長調節因子が、５−ＢｒＩＡＡと共に使用されて、本発明の成長に影響を与える組成物を作製し得ることが、意図される。１つより多くのサイトカイニンまたは異なる植物成長調節因子（例えば、ジベレリンなど）が、５−ＢｒＩＡＡと混合されて、本発明の成長を増強する組成物を作製し得ることがまた、意図される。同じく、植物成長調節因子の選択は、特定の植物の成長を特徴付けるインキュベーションまたは適用サイクルの異なる段階で変化し得る。植物成長調節因子は、当該分野で公知であり、Ｓｋｏｏｇら（１９６７）Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　６：１１６９−１１９２およびＴｈｅｏｌｏｇｉｓ（１９８９）Ｐｌａｎｔ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＫｕｎｇおよびＡｒｎｔｚｅｎ編）Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈ　Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｓｔｏｎｅｈａｍ，Ｍａｓｓに記載されるように、これらとしては、ＢＡＰ、２ｉＰ、ｉｐｐ、ゼアチン、キネチン、ジベレリンなどが挙げられるがこれらに限定されない。
【００４９】
本発明の実施は、広範な種々の植物成長応答を意図し、これらとしては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：種子の発芽の刺激および休眠状態の破壊；収量の増加；果実の熟成および色生成の促進；開花および果実の増加；苗条形成の刺激；カルス発生の誘導；発根の誘導および細胞増殖の発生；種々の植物種の耐久性の増加；ならびに多数の植物および植物の一部の乾燥重量含有量の増加。これらの応答の分類に加えて、正味の結果が、農業および園芸の作物もしくは種子の成長に影響を与えるかまたはこれらの任意の有利な特性もしくは所望の特性を最大化する限り、植物、種子、果実または野菜の任意の他の改変は、本発明の実施によって達成された有利な応答の範囲内に含まれることが意図される。
【００５０】
植物組織培養物への本発明の増殖を促進する化合物の適切な適用は、苗条、根またはカルスの再生を誘導することが示された。この効果は、単子葉植物種および双子葉植物種の両方において例示され、そして広範な種々の植物に適用可能である。
【００５１】
本発明の組成物は、トランスジェニック植物からの植物再生のためにさらに利用された。
【００５２】
一般的に、植物の遺伝子操作は、２つの相補的なプロセスを含む。最初のプロセスは、特異的に特徴付けられた型の１つ以上の植物細胞の遺伝子形質転換を含む。形質転換によって、外来遺伝子（代表的には、キメラ遺伝子構築物）は、代表的にベクター（このベクターは、目的の遺伝子を培養物中の植物細胞のゲノムに移入させる能力を有する）の補助を介して個々の植物細胞のゲノムに導入される。次いで、第２のプロセスは、この形質転換された植物細胞の性的に有能な（ｓｅｘｕａｌｌｙ　ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ）全体の植物への再生を含む。形質転換プロセスも再生プロセスも、１００％成功する必要はないが、妥当な割合の細胞が形質転換されて全体の植物に再生され得るように、妥当な程度の信頼性および再現性を有さなければならない。
【００５３】
これら２つのプロセス（形質転換および再生）は、相補的でなければならない。これら２つのプロセスの相補性は、形質転換プロセスによって首尾よく遺伝子的に形質転換される組織が、首尾よく植物全体に再生され得るような型および特徴のものでなければならず、そして首尾よく植物全体に再生され得るように十分に健常であり、反応能があり、かつ活力がなければならないようなものでなければならない。
【００５４】
首尾よい形質転換および再生技術は、単子葉植物および双子葉植物に対して、先行技術において実証されてきた。例えば、タバコ植物の形質転換および再生は、Ｂａｒｔｏｎら、Ｃｅｌｌ　３２：１０３３（１９８３年４月）において報告されており、一方で綿花の再生は、Ｕｍｂｅｃｋの米国特許第５，００４，８６３号（１９９１年４月２日発行）において、記載されている。さらに、イネの形質転換および再生は、Ａｂｄｕｌｌａｈら（１９８６）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　４：１０８７−１０９０によって記載され、一方でトウモロコシは、Ｒｈｏｄｅｓら（１９８８）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　６：５６−６０およびＳｃｉｅｎｃｅ　２４０：２０４−２０７に記載されるように形質転換および再生された。さらに、成熟種子に由来する培養物からのトウモロコシの再生は、米国特許第４，８０６，４８３号（１９８９年２月２１日発行）に示されており、そして未熟胚由来の培養物からの再生は、米国特許第５，１３４，０７４号（１９９２年７月２８日発行）に示されている。
【００５５】
双子葉植物種の細胞の形質転換のために最も通常使用される方法論は、植物病原体Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓの使用を包含する。Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍにより媒介される形質転換は、いくつかの単子葉植物において達成されたが、Ｗｕ，Ｐｌａｎｔ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９８９）３５−５１頁，Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈ　Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｓｔｏｎｅｈａｍ，Ｍａｓｓによって記載されるように、遺伝子移入の他の方法（例えば、ポリエチレングリコール法、エレクトロポレーション、直接注入、粒子ボンバードメントなど）が、より効果的であった。本発明は、植物の再生工程を包含する形質転換の任意の方法を用いて、有用である。
【００５６】
特定の実施形態において、本発明は、培養物中の植物組織の遺伝的形質転換を想定する。いくつかの実施形態において、これらの組織は、葉円盤（ｌｅａｆ　ｄｉｓｃ）または胚軸外植片由来であり得る。形質転換された組織は、植物全体に再生され得る植物組織構造を形成するよう誘導され得る。他の実施形態において、本発明は、成熟種子由来の培養物における組織の形質転換を考慮する。形質転換された組織は、植物全体に再生され得る。いくつかの実施形態において、この組織は、成熟トウモロコシ種子由来であり得る。
【００５７】
いくつかの実施形態において、本発明の形質転換技術は、Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓのＴｉプラスミドを利用する技術であり得る。Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ培養物を形質転換ビヒクルとして使用する際には、形質転換された組織の正常な非腫瘍形成性分化が可能であるように、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍの非腫瘍形成性株をベクターキャリアとして使用することが、最も有利である。効果的であるためには、一旦、植物細胞に導入されると、目的の外来遺伝子を含むキメラ構築物は、植物細胞において目的の遺伝子の転写を引き起こすために効果的なプロモーターおよびポリアデニル化配列または転写制御配列（これらもまた、植物細胞において認識される）を含み得る。植物細胞において効果的であることが公知のプロモーターとしては、ＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍのＴ−ＤＮＡから単離されたノパリンシンターゼプロモーター、およびカリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーターが挙げられる。他の適切なプロモーターが、当該分野において公知である。形質転換された細胞が培養物中で形質転換されていない細胞から選択され得るように、目的の外来遺伝子を保有するベクターが、１つ以上の選択マーカー遺伝子をも内部に含むこともまた好ましい。多くの用途において、好ましいマーカー遺伝子は、抗生物質抵抗性遺伝子および／または除草剤抵抗性遺伝子を含み、その結果、適切な抗生物質および／または除草剤を使用して、形質転換された細胞を、形質転換されていない細胞から分離および選択し得る。
【００５８】
このような目的の外来遺伝子を含むベクターの構築の詳細は、植物遺伝子工学の当業者に公知であり、そしてタバコ、ペチュニアおよび他のモデル植物種において以前に効果的であることが実証された実施と、本質的に異ならない。外来遺伝子は、明らかに、マーカー遺伝子として（Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎら（１９８７）ＥＭＢＯ　Ｊ．６：３９０１−３９０７）、または植物細胞において何らかの所望の効果を達成するように、選択されるべきである。この効果は、成長の促進、病気抵抗性、植物形態もしくは植物産物品質の変化、または遺伝子操作によって達成され得る他の任意の変化であり得る。キメラ遺伝子構築物は、１つ以上の外因性タンパク質の発現をコードし得るか、または負鎖ＲＮＡの転写を引き起こして、病気プロセスまたは所望でない内因性植物機能のいずれかを制御または阻害し得る。
【００５９】
植物組織に対して形質転換および再生のプロセスを開始するためには、最初に組織の表面を滅菌して、得られる培養物の不注意な汚染を防止することが必要である。この組織が種子である場合には、これらの種子を、殺真菌薬を含む適切な発芽培地において発芽させ得る。発芽の４〜１０日後、未熟植物の胚軸部分を除去し、そして１片につき平均約０．５センチメートルの小さな断片に切断する。この胚軸外植片を安定化させ、そして液体または寒天の植物組織培養培地において、生存を維持する。
【００６０】
一旦、これらの組織を滅菌すると、これらの組織に、形質転換能のある非腫瘍形成性Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍの懸濁培養物をすぐに接種し得る。接種プロセスは、短時間（例えば、２日間）にわたって、室温（すなわち、２４℃）で続けられる。
【００６１】
接種時間の終了時に、残りの処理された組織を選択寒天培地に移し得る。この培地は、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍに対して毒性であるが植物組織に対しては毒性ではない、１つ以上の抗生物質を、培養物中に残っている任意のＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍを殺傷するに十分な濃度で含む。このような培地において使用するために適した抗生物質としては、カルベニシリン、セフォタキシムなど（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍに対する殺菌薬として）、およびカナマイシン、ハイグロマイシン、ＰＰＴなど（形質転換された植物組織に対する選択的抗生物質として）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６２】
ここで組織は、その通常の成分に加えて選択因子を含む組織培養培地において、培養される。この選択因子（本明細書中においてはカナマイシンにより例示される）は、形質転換されていない細胞に対しては毒性であるが、この選択因子に対する遺伝抵抗性を組み込まれ、そしてこの抵抗性を発現する、形質転換された細胞に対しては、毒性ではない。適切な組織培養培地は、抗生物質ありまたはなしで植物ホルモン５−ＢｒＩＡＡおよびサイトカイニンが添加された、ＭＳ培地である。生存している形質転換された組織は、二次培地に移されて、組織再生を誘導され得る。従って、この生存している形質転換された組織は、本発明の再生技術、または他の任意の代替の植物再生プロトコルを介して、植物全体に再生され続ける。
【００６３】
本発明の方法は、カルス（好ましくは、胚形成カルス）の、植物サンプルからの生成のための方法を包含する。植物サンプルからのカルスの生成の効率は、このサンプルを低温でのインキュベーションに供することによって、増加し得ることが、予測に反して見出された。低温とは、インキュベーションの温度が室温より低いことを意味する。いくつかの実施形態において、サンプルは、約０℃〜約１５℃、好ましくは、約０℃〜約１０℃、そしてより好ましくは、約０℃〜約５℃の温度で、インキュベートされ得る。他の実施形態において、植物サンプルは、凍結され得る。低温でのインキュベーションは、植物サンプルからのカルスの生成を刺激するに十分な時間にわたって実施され得る。いくつかの実施形態において、インキュベーションは、約１時間〜約１０日間、好ましくは、約１日間〜約７日間、そしてより好ましくは、約４日間実施され得る。いくつかの実施形態において、インキュベーションは、サンプルが周囲大気に曝露している間に実施され得る。例えば、サンプルは、冷蔵庫内でインキュベートされ得る。いくつかの実施形態において、インキュベーションは、サンプルが液体に曝露している間に実施され得る。いくつかの実施形態において、サンプルは、水中に浸漬されている間に低温でインキュベートされ得る。他の実施形態において、サンプルは、塩および／または緩衝剤の溶液中に浸漬されている間に、低温でインキュベートされ得る。いくつかの実施形態において、サンプルは、植物の成長に影響を与える化合物を含む溶液に浸漬され得る。いくつかの実施形態において、サンプルは、１種以上の本発明のＩＡＡ誘導体（例えば、５−ＢｒＩＡＡ）を含む溶液中で、低温でインキュベートされ得る。
【００６４】
本発明の実施において使用される成長に影響を与える組成物の正確な量は、所望の応答の型、使用される処方物および処理される植物の型に依存する。本発明は、約５０．０と０．００１との間、そして好ましくは、約５．０と０．０５との間、そしてより好ましくは、約２．０と０．２５との間の、サイトカイニン濃度対オーキシン濃度の比の使用を意図する。成長に影響を与える化合物の濃度は、代表的に、約１μｇ／ｍＬ〜約１００ｍｇ／ｍＬ、好ましくは約５００μｇ／ｍＬ〜約１０ｍｇ／ｍＬ、そしてより好ましくは、約１ｍｇ／ｍＬ〜約５ｍｇ／ｍＬの範囲内である。
【００６５】
本発明の成長を増強する組成物の活性成分として使用される、化学化合物は、先行技術において周知のプロセスによって調製され得るか、または容易に利用可能な供給源から市販で入手され得る。
【００６６】
本発明の組成物は、植物種の任意の発達段階において適用されて、使用される濃度、使用される処方物、および処理される植物種の型に依存して、成熟の間中植物ホルモンまたは維持効果を得、そして初期の発達段階の間に損傷した組織において、再成長を促進し得る。
【００６７】
本発明の組成物は、好ましくは、特定の補助的栄養剤または他の植物成長調節因子と、特定の相乗的な成長増強応答を種々の型の植物において達成するために正確な割合で組み合わせられて使用される。本発明の組成物は、さらに、殺真菌薬と組み合わせて使用されて、種々の植物の病気抵抗性を増加させ得、天然の病気の免疫性を調節する酵素および植物のプロセスに影響を与えることによって、この植物組織を、病原体による侵入に対して抵抗性にする。本発明の組成物は、それ自体では植物に有毒な活性を本質的に有さないが、これらは時々、除草剤と組み合わせて使用されて、所望でない植物を除草剤に対してより感受性にするために、このような植物の成長に刺激を与え得る。しかし、本発明の実施において達成される結果を、農作物および園芸作物、ならびに多年生家庭植物種および一年生家庭植物種における成長増強応答とみなすことが、好ましい。
【００６８】
以下の実施例は、種々の植物種に対する本発明の好ましい組成物の適用によって実現され得る、広範な植物成長応答の例示である。それにもかかわらず、本発明が活性成分のこれらの最適な比に限定されることは意図されない。なぜなら、当業者は、本明細書中上記に記載される本発明の組成物が、効果的な成長エンハンサーであることを見出すからである。また、本発明による組成物を、本明細書中に具体的には示されない他の植物、種子、果実および野菜と組み合わせて使用する、改善された結果の認識は、容易に当業者の能力の範囲内であることを、当業者は容易に想到するはずである。以下の実施例は、本発明の範囲を限定することなく、本発明の有用性を説明する役に立つ。
【００６９】
本明細書中に記載される方法および適用に対する、他の適切な改変および適合が明らかであり、そして本発明の範囲からもそのいかなる実施形態からも逸脱することなくなされ得ることが、関連分野の当業者に容易に明らかである。本発明を詳細に記載したが、本発明は、以下の実施例を参照してさらに明瞭に理解される。これらの実施例は、本発明を説明するためのみの目的で本明細書中に組み込まれ、そして本発明を制限することは意図されない。
【００７０】
（実施例１）
（培養培地の調製）
ＭＳ塩ベースの培地については、ＧＩＢＣＯ　ＢＲＬ　Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ　ａｎｄ　Ｓｋｏｏｇ（ＭＳ）Ｃｏｍｐｌｅｔｅ　Ｍｅｄｉｕｍ−５０Ｘ　Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ（カタログ番号１０４９４−０１１）を用いた。２０ｍｌの各々の成分、Ｓａｌｔ　Ｉ、Ｓａｌｔ　ＩＩおよびＡｃｉｄ　Ｓｏｌｕｂｌｅを、メンブレンに基づく液体増殖様式のために、９４０ｍｌの滅菌水と混合した。培養を半固体様式で行う場合は、０．８％アガーまたは０．２５％Ｇｅｌｒｉｔｅ（Ｓｉｇｍａ．カタログ番号Ｇ１９１０）のいずれかを、この混合物中に加えた。Ｎ６塩＋Ｂ５ビタミンについては、ＣＨＵ（Ｎ６）基本塩混合物（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｃ１４１６）を１ｍｌのＧａｍｂｏｒｇのビタミン溶液（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｇ１０１９）と混合し、最終容量１Ｌの培地調製物とした。
【００７１】
基本培地に植物成長調節混合物の１つを補充した。この培地に添加した調節因子およびこの培地中のその最終濃度を、表１に示す。
【００７２】
【表１】
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（実施例２）
（培養用の植物組織サンプルの調製）
スイートコーン（トウモロコシ）（Ｚｅａ　ｍａｙｓ）の種子をＵＳＤＡ、Ｉｏｗａから入手した。登録番号は、ＰＡ９１についてＡｍｅｓ１９３２５；Ｈ９９についてＡｍｅｓ　１５９３１、そしてＶ９２４−６についてＰＩ　５５０４７３である。トウモロコシの種子を最初に３０分間、穏やかに攪拌しながら滅菌水中に入れておくことによって滅菌した。次いで、この種子を９５％アルコールに１分間浸した。このアルコール溶液を取り除いて、種子を枝付きフラスコ中に入れた。１５％の市販の漂白剤＋０．１％　Ｔｗｅｅｎ（登録商標）（ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート）の溶液を用意して、このフラスコに添加した。振盪しながら２０分間この種子に真空を付与した。真空を取り除き、そしてさらに２５分間振盪を続けた。この種子をクリーンフード中で滅菌水により３回リンスした。いくつかの実施形態では、この種子を、室温で滅菌水にさらに５日間浸漬してもよい。他の実施形態では、この種子を室温で１日間浸漬し、その後滅菌水中で４℃でインキュベートしてもよい。
【００７３】
この時点で、胚は、解剖顕微鏡下で種子から切り取られ得る。この胚は３つの切片（頂部、中間部、根部）に切断され得、ここで中間切片は、図１に示すように、頂部および根部切片の一部を有する。
【００７４】
（実施例３）
（組織サンプルからの胚形成性カルスの生成）
好ましい実施形態において、種子由来の成熟胚の中間切片を、胚形成性カルス形成の刺激用の異なる成長調節因子混合物を含む、ＭＳ培地上に配置し得る。この中間切片は、この根部領域が培地に接触するように、または傍らに配置されるべきであり、ただし決して上下逆には配置されるべきではない。次いで、この切片を６〜８週間、暗野で２５℃でインキュベートする。
【００７５】
成長調節因子の種々の混合物を、それらが胚形成性カルスの形成を刺激する能力について試験した。ＰＡ９１成熟種子（２０〜３０種子）を、上記のように、表面滅菌し、切り取って、異なる植物成長調節因子混合物を含有するＭＳ培地上に移した。表２に示す結果は、２ヶ月間、暗野における室温での組織のインキュベーション後に得られた。
【００７６】
【表２】
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ＳＥＣＦ−１で観察された刺激効果が、他のトウモロコシの品種でも見られるか否かを決定するため、多数の異なる品種を試験した。成熟種子（２０〜３０種子）を、上記のように、表面滅菌し、切り取って、異なる植物成長調節因子混合物を含有するＮ６＋Ｂ５ビタミン培地上に移した。表３に示す結果は、２ヶ月間、暗野における室温での組織のインキュベーション後に得られた。数値は、それぞれの処理において胚形成性カルスを形成した組織サンプルの％の数値である。
【００７７】
【表３】
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凝固試薬の型および塩培地の組成物の関数として形成された胚形成性カルスの％値を比較した。ＰＡ９１成熟種子（２０〜３０種子）を、上記のように、表面滅菌し、切り取って、植物成長調節因子混合物ＳＥＣＦ−３を含有する異なる培地上に移した。メンブレンに基づく液体培養を以下のとおり実施した：ＰＡ９１成熟種子（２０〜３０種子）を、Ｌｉｎら（ＦＯＣＵＳ　１７，９５，１９９５）に記載のように、表面滅菌し、切り取って、メンブレンに基づく液体培養中のＬｉｆｅＲａｆｔメンブレン上で培養した。表４に示す結果は、２ヶ月間、暗野における室温での組織のインキュベーション後に得られた。
【００７８】
【表４】
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胚形成性カルス形成に対する温度の効果を検討した。上記のように、トウモロコシ種子ＰＡ９１の表面滅菌後、この種子を５日間室温で滅菌水に浸した。これらの種子の胚形成性カルス形成能力を、４℃で４日間、次に胚の切り取りの前に室温で１日滅菌水に浸漬した種子と比較した。切り取った胚をＳＥＣＦ−１混合物を補充したＮ６塩＋Ｂ５ビタミン培地上に移し、そして２ヶ月間室温で暗野週でインキュベートした。結果を表５に示す。
【００７９】
【表５】
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いくつかの実施形態において、形成されたカルスを増殖することが所望され得る。胚形成性カルス形成の後、このカルスを、カルス増殖用の２ｍｇ　２，４−Ｄを含有するＭＳ塩＋Ｎ６塩ベースの培地上に移し得る。このカスルを１ヶ月間２５℃で、暗野でインキュベートし得る。
【００８０】
（実施例４）
（胚形成性カルスからの苗条の再生）
上記のように準備した胚形成性カルスを、異なる植物成長調節因子混合物を含有する、新しい苗条再生培地に移し得る。この胚形成性カルスを、苗条再生のために、２〜３週間、２５℃で、１６時間光および８時間暗野のサイクルでインキュベートし得る。再生した苗条を、さらなる植物成長のための植物成長調節因子混合物を含有しないＭＳ培地上に移し得る。胚形成性カルスからの苗条の再生に対する、異なる植物成長調節因子混合物の効果を検討した。上記のように準備した胚形成性カルスを、示した苗条再生培地の存在下でインキュベートし、その結果を表６に示す。
【００８１】
【表６】
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ここで、理解の明確化のために例示および実施例の方法によって、ある程度詳細に本発明を記載してきたが、本発明およびその任意の特定の実施形態の範囲に影響を及ぼすことなく、広範かつ等価な範囲の条件、処方物および他のパラメーター内で、本発明を改変または変化することによって、同等の内容が実施され得ること、ならびにこのような改変または変化が、添付の特許請求の範囲内に包含されることが意図されていることは当業者には明白である。
【００８２】
本明細書中に言及されたすべての刊行物、特許および特許出願は、本発明が属する当業者の技術のレベルを示すものであり、そして各個々の刊行物、特許または特許出願が、参考として援用されるべきことが特におよび個々に示されているのと同じ程度まで参考として本明細書に援用される。
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は、本発明の方法に従った培養のための適切な組織サンプルの切除を示すトウモロコシ種子の概略的な表示である。
【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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