(57)【要約】タンパク質、タンパク質断片、ポリペプチドまたはペプチドと、結合代用物との相互作用を妨害する所望の結合物質を同定するための方法。この方法は、タンパク質、タンパク質断片、ポリペプチドまたはペプチド、結合代用物、および結合物質を組合せることを含んでなる。結合代用物からのタンパク質、タンパク質断片、ポリペプチドまたはペプチドとの相互作用の低下の検出は、結合物質が相互作用を妨害することを示す。この方法で有用なタンパク質は、スレオニン（２３１）でリン酸化されたタウタンパク質、スレオニン（６６８）でリン酸化されたアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）、およびスレオニン（４８）でリン酸化されたｃｄｃ２５である。この方法で同定される化合物は、アルツハイマー病および癌の治療に有用である。
2004503747.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
タンパク質、タンパク質断片、ポリペプチドまたはペプチドと、結合代用物との相互作用を妨害する所望の結合物質を同定するための方法であって：
ａ）タンパク質、タンパク質断片、ポリペプチドまたはペプチド、結合代用物、および試験結合物質を組合せて、反応混合物を生成させ；
ｂ）タンパク質、タンパク質断片、ポリペプチドまたはペプチドと、結合代用物との結合を検出することを含んでなり、
ここでタンパク質、タンパク質断片、ポリペプチドまたはペプチドと、結合代用物との相互作用の低下は、試験結合物質が相互作用を妨害することを示す、上記方法。
【請求項２】
請求項１の方法であって、ｃ）試験結合物質の非存在下での、タンパク質、タンパク質断片、ポリペプチドまたはペプチドと、結合代用物との相互作用のレベルを対照として決定し、これを工程ｂ）で検出された相互作用レベルと比較する工程をさらに含み；こうして、所望の結合物質は、工程ｃ）で検出された相互作用のレベルと比較して、工程ｂ）の相互作用のレベルを低下させる、上記方法。
【請求項３】
タンパク質、タンパク質断片、ポリペプチドまたはペプチドは、ｔａｕ２３１Ｐ、ＡＰＰ６６８Ｐ、またはｃｄｃ２５−４８Ｐに対応するアミノ酸配列を含む、タンパク質、タンパク質断片、ポリペプチドおよびペプチドよりなる群から選択される、請求項１の方法。
【請求項４】
タンパク質、タンパク質断片、ポリペプチドまたはペプチドは、約１５またはそれ以下のアミノ酸のペプチドであり、該ペプチドはｔａｕ２３１Ｐ、ＡＰＰ６６８Ｐ、またはｃｄｃ２５−４８Ｐと少なくとも１つの同一性の領域を含む、請求項１の方法。
【請求項５】
タンパク質、タンパク質断片、ポリペプチドまたはペプチドは、約１５またはそれ以下のアミノ酸のペプチドであり、該ペプチドは少なくとも１つのリン酸化スレオニン残基を含む、請求項１の方法。
【請求項６】
結合代用物は、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、これらの断片、およびこれらの誘導体よりなる群から選択される、請求項１の方法。
【請求項７】
結合代用物は、モノクローナル抗体ＡＴ１８０、ＴＧ３、ＣＰ９、ＣＰ１０、ＣＰ１６、ＣＰ１７、ＧＦ１、ＧＦ７、ＧＦ２５、ＭＣ２、ＧＦ１０、ＧＦ１１、ＧＦ２０、ＧＦ２７、ＧＦ３、ＧＦ５、ＧＦ３１、これらの断片、およびこれらの誘導体よりなる群から選択される、請求項１の方法。
【請求項８】
ポリペプチドは、Ｐｉｎ１、その断片、その誘導体、およびＰｉｎ１に対応するペプチドよりなる群から選択される、請求項１の方法。
【請求項９】
タンパク質、タンパク質断片、ポリペプチドまたはペプチドは、ｔａｕ２３１Ｐ、ＡＰＰ６６８Ｐ、またはｃｄｃ２５−４８Ｐに対応するアミノ酸配列を含む、タンパク質、タンパク質断片、ポリペプチドまたはペプチドよりなる群から選択される、請求項２の方法。
【請求項１０】
タンパク質、タンパク質断片、ポリペプチドまたはペプチドは、約１５またはそれ以下のアミノ酸のペプチドであり、該ペプチドはｔａｕ２３１Ｐ、ＡＰＰ６６８Ｐ、またはｃｄｃ２５−４８Ｐと少なくとも１つの同一性の領域を含む、請求項２の方法。
【請求項１１】
タンパク質、タンパク質断片、ポリペプチドまたはペプチドは、約１５またはそれ以下のアミノ酸のペプチドであり、該ペプチドは少なくとも１つのリン酸化スレオニン残基を含む、請求項２の方法。
【請求項１２】
結合代用物は、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、これらの断片、およびこれらの誘導体よりなる群から選択される、請求項２の方法。
【請求項１３】
結合代用物は、モノクローナル抗体ＡＴ１８０、ＴＧ３、ＣＰ９、ＣＰ１０、ＣＰ１６、ＣＰ１７、ＧＦ１、ＧＦ７、ＧＦ２５、ＭＣ２、ＧＦ１０、ＧＦ１１、ＧＦ２０、ＧＦ２７、ＧＦ３、ＧＦ５、ＧＦ３１、これらの断片、およびこれらの誘導体よりなる群から選択される、請求項２の方法。
【請求項１４】
ポリペプチドは、Ｐｉｎ１、その断片、その誘導体、およびＰｉｎ１に対応するペプチドよりなる群から選択される、請求項２の方法。
【請求項１５】
請求項１の方法により同定される結合物質。
【請求項１６】
結合物質は、小有機分子である、請求項１５の結合物質。
【請求項１７】
結合物質は、アルツハイマー病を予防または治療するのに有用な小有機分子である、請求項１６の結合物質。
【請求項１８】
結合物質は、癌を予防または治療するのに有用な小有機分子である、請求項１６の結合物質。
【請求項１９】
請求項２の方法により同定される結合物質。
【請求項２０】
結合物質は、小有機分子である、請求項１９の結合物質。
【請求項２１】
結合物質は、アルツハイマー病を予防または治療するのに有用な小有機分子である、請求項２０の結合物質。
【請求項２２】
結合物質は、癌を予防または治療するのに有用な小有機分子である、請求項２０の結合物質。
【請求項２３】
タンパク質、タンパク質断片、ポリペプチドまたはペプチドはビオチンで標識される、請求項１の方法。
【請求項２４】
タンパク質、タンパク質断片、ポリペプチドまたはペプチドはビオチンで標識される、請求項２の方法。
【請求項２５】
タンパク質、タンパク質断片、ポリペプチドまたはペプチドはビオチンで標識され、該反応混合物は反応容器内に有り、該反応容器はアビジンで前被覆されている、請求項１の方法。
【請求項２６】
タンパク質、タンパク質断片、ポリペプチドまたはペプチドはビオチンで標識され、該反応混合物は反応容器内に有り、該反応容器はアビジンで前被覆されている、請求項２の方法。
【請求項２７】
工程ａ）の相互作用は、タンパク質、タンパク質断片、ポリペプチドまたはペプチドに結合した結合代用物の量を測定することにより決定される、請求項１の方法。
【請求項２８】
工程ａ）の相互作用は、タンパク質、タンパク質断片、ポリペプチドまたはペプチドに結合した結合代用物の量を測定することにより決定される、請求項２の方法。
【請求項２９】
少なくとも１つのタンパク質、タンパク質断片、ポリペプチドまたはペプチドと、結合代用物との相互作用を妨害する結合物質を同定するための方法であって：
ａ）ペプチドと結合代用物が互いに相互作用する条件下で、第１のタンパク質、タンパク質断片、ポリペプチドまたはペプチドを結合代用物と組合せて反応混合物を生成させ；
ｂ）反応混合物に試験結合物質を導入し；
ｃ）タンパク質、タンパク質断片、ポリペプチドまたはペプチドと、結合代用物との相互作用のレベルを検出することを含んでなり、
ここでタンパク質、タンパク質断片、ポリペプチドまたはペプチドと、結合代用物との相互作用のレベルの低下は、試験結合物質が相互作用を妨害することを示す、上記方法。
【請求項３０】
請求項２９の方法であって、ｄ）試験結合物質の非存在下での、タンパク質、タンパク質断片、ポリペプチドまたはペプチドと、結合代用物との相互作用のレベルを対照として決定し、これを工程ｃ）で検出された相互作用レベルと比較する工程をさらに含み；こうして、所望の結合物質は、工程ｄ）で検出された相互作用のレベルと比較して、工程ｃ）の相互作用のレベルを低下させる、上記方法。
【請求項３１】
タンパク質、タンパク質断片、ポリペプチドまたはペプチドは、ｔａｕ２３１Ｐ、ＡＰＰ６６８Ｐ、またはｃｄｃ２５−４８Ｐに対応するアミノ酸配列を含む、タンパク質、タンパク質断片、ポリペプチドまたはペプチドよりなる群から選択される、請求項２９の方法。
【請求項３２】
タンパク質、タンパク質断片、ポリペプチドまたはペプチドは、約１５またはそれ以下のアミノ酸のペプチドであり、該ペプチドはｔａｕ２３１Ｐ、ＡＰＰ６６８Ｐ、またはｃｄｃ２５−４８Ｐと少なくとも１つの同一性の領域を含む、請求項２９の方法。
【請求項３３】
タンパク質、タンパク質断片、ポリペプチドまたはペプチドは、約１５またはそれ以下のアミノ酸のペプチドであり、該ペプチドは少なくとも１つのリン酸化スレオニン残基を含む、請求項２９の方法。
【請求項３４】
結合代用物は、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、これらの断片、およびこれらの誘導体よりなる群から選択される、請求項２９の方法。
【請求項３５】
結合代用物は、モノクローナル抗体ＡＴ１８０、ＴＧ３、ＣＰ９、ＣＰ１０、ＣＰ１６、ＣＰ１７、ＧＦ１、ＧＦ７、ＧＦ２５、ＭＣ２、ＧＦ１０、ＧＦ１１、ＧＦ２０、ＧＦ２７、ＧＦ３、ＧＦ５、ＧＦ３１、これらの断片、およびこれらの誘導体よりなる群から選択される、請求項２９の方法。
【請求項３６】
ポリペプチドは、Ｐｉｎ１、その断片、その誘導体、およびＰｉｎ１に対応するペプチドよりなる群から選択される、請求項２９の方法。
【請求項３７】
タンパク質、タンパク質断片、ポリペプチドまたはペプチドは、ｔａｕ２３１Ｐ、ＡＰＰ６６８Ｐ、またはｃｄｃ２５−４８Ｐに対応するアミノ酸配列を含む、タンパク質、タンパク質断片、ポリペプチドまたはペプチドよりなる群から選択される、請求項３０の方法。
【請求項３８】
タンパク質、タンパク質断片、ポリペプチドまたはペプチドは、約１５またはそれ以下のアミノ酸のペプチドであり、該ペプチドはｔａｕ２３１Ｐ、ＡＰＰ６６８Ｐ、またはｃｄｃ２５−４８Ｐと少なくとも１つの同一性の領域を含む、請求項３０の方法。
【請求項３９】
タンパク質、タンパク質断片、ポリペプチドまたはペプチドは、約１５またはそれ以下のアミノ酸のペプチドであり、該ペプチドは少なくとも１つのリン酸化スレオニン残基を含む、請求項３０の方法。
【請求項４０】
結合代用物は、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、これらの断片、およびこれらの誘導体よりなる群から選択される、請求項３０の方法。
【請求項４１】
結合代用物は、モノクローナル抗体ＡＴ１８０、ＴＧ３、ＣＰ９、ＣＰ１０、ＣＰ１６、ＣＰ１７、ＧＦ１、ＧＦ７、ＧＦ２５、ＭＣ２、ＧＦ１０、ＧＦ１１、ＧＦ２０、ＧＦ２７、ＧＦ３、ＧＦ５、ＧＦ３１、これらの断片、およびこれらの誘導体よりなる群から選択される、請求項３０の方法。
【請求項４２】
ポリペプチドは、Ｐｉｎ１、その断片、その誘導体、およびＰｉｎ１に対応するペプチドよりなる群から選択される、請求項３０の方法。
【請求項４３】
請求項２９の方法により同定される結合物質。
【請求項４４】
結合物質は、小有機分子である、請求項４３の結合物質。
【請求項４５】
結合物質は、アルツハイマー病を予防または治療するのに有用な小有機分子である、請求項４４の結合物質。
【請求項４６】
結合物質は、癌を予防または治療するのに有用な小有機分子である、請求項４４の結合物質。
【請求項４７】
請求項３０の方法により同定される結合物質。
【請求項４８】
結合物質は、小有機分子である、請求項４７の結合物質。
【請求項４９】
結合物質は、アルツハイマー病を予防または治療するのに有用な小有機分子である、請求項４８の結合物質。
【請求項５０】
結合物質は、癌を予防または治療するのに有用な小有機分子である、請求項４８の結合物質。
【請求項５１】
タンパク質、タンパク質断片、ポリペプチドまたはペプチドはビオチンで標識される、請求項２９の方法。
【請求項５２】
タンパク質、タンパク質断片、ポリペプチドまたはペプチドはビオチンで標識される、請求項３０の方法。
【請求項５３】
タンパク質、タンパク質断片、ポリペプチドまたはペプチドはビオチンで標識され、該反応混合物は反応容器内に有り、該反応容器はアビジンで前被覆されている、請求項２９の方法。
【請求項５４】
タンパク質、タンパク質断片、ポリペプチドまたはペプチドはビオチンで標識され、該反応混合物は反応容器内に有り、該反応容器はアビジンで前被覆されている、請求項３０の方法。
【請求項５５】
工程ａ）の相互作用は、タンパク質、タンパク質断片、ポリペプチドまたはペプチドに結合した結合代用物の量を測定することにより決定される、請求項２９の方法。
【請求項５６】
工程ａ）の相互作用は、タンパク質、タンパク質断片、ポリペプチドまたはペプチドに結合した結合代用物の量を測定することにより決定される、請求項３０の方法。
【請求項５７】
少なくとも１つのタンパク質、タンパク質断片、ポリペプチドまたはペプチドと、結合代用物との相互作用を妨害する結合物質を同定するための方法であって：
ａ）ペプチドと結合代用物が互いに相互作用する条件下で、第１のタンパク質、タンパク質断片、ポリペプチドまたはペプチドを結合代用物と組合せて反応混合物を生成させ；
ｂ）反応混合物に試験結合物質を導入し；
ｃ）タンパク質、タンパク質断片、ポリペプチドまたはペプチドと、結合代用物との相互作用のレベルを検出することを含んでなり、
ここでタンパク質、タンパク質断片、ポリペプチドまたはペプチドと、結合代用物との相互作用のレベルの低下は、試験結合物質が相互作用を妨害することを示す、上記方法。
【請求項５８】
請求項５７の方法であって、ｄ）試験結合物質の非存在下での、タンパク質、タンパク質断片、ポリペプチドまたはペプチドと、結合代用物との相互作用のレベルを対照として決定し、これを工程ｃ）で検出された相互作用レベルと比較する工程をさらに含み；こうして、所望の結合物質は、工程ｄ）で検出された相互作用のレベルと比較して、工程ｃ）の相互作用のレベルを低下させる、上記方法。
【請求項５９】
タンパク質、タンパク質断片、ポリペプチドまたはペプチドは、ｔａｕ２３１Ｐ、ＡＰＰ６６８Ｐ、またはｃｄｃ２５−４８Ｐに対応するアミノ酸配列を含む、タンパク質、タンパク質断片、ポリペプチドまたはペプチドよりなる群から選択される、請求項５７の方法。
【請求項６０】
タンパク質、タンパク質断片、ポリペプチドまたはペプチドは、約１５またはそれ以下のアミノ酸のペプチドであり、該ペプチドはｔａｕ２３１Ｐ、ＡＰＰ６６８Ｐ、またはｃｄｃ２５−４８Ｐと少なくとも１つの同一性の領域を含む、請求項５７の方法。
【請求項６１】
タンパク質、タンパク質断片、ポリペプチドまたはペプチドは、約１５またはそれ以下のアミノ酸のペプチドであり、該ペプチドは少なくとも１つのリン酸化スレオニン残基を含む、請求項５７の方法。
【請求項６２】
結合代用物は、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、これらの断片、およびこれらの誘導体よりなる群から選択される、請求項５７の方法。
【請求項６３】
結合代用物は、モノクローナル抗体ＡＴ１８０、ＴＧ３、ＣＰ９、ＣＰ１０、ＣＰ１６、ＣＰ１７、ＧＦ１、ＧＦ７、ＧＦ２５、ＭＣ２、ＧＦ１０、ＧＦ１１、ＧＦ２０、ＧＦ２７、ＧＦ３、ＧＦ５、ＧＦ３１、これらの断片、およびこれらの誘導体よりなる群から選択される、請求項５７の方法。
【請求項６４】
ポリペプチドは、Ｐｉｎ１、その断片、その誘導体、およびＰｉｎ１に対応するペプチドよりなる群から選択される、請求項５７の方法。
【請求項６５】
タンパク質、タンパク質断片、ポリペプチドまたはペプチドは、ｔａｕ２３１Ｐ、ＡＰＰ６６８Ｐ、またはｃｄｃ２５−４８Ｐに対応するアミノ酸配列を含む、タンパク質、タンパク質断片、ポリペプチドまたはペプチドよりなる群から選択される、請求項５７の方法。
【請求項６６】
タンパク質、タンパク質断片、ポリペプチドまたはペプチドは、約１５またはそれ以下のアミノ酸のペプチドであり、該ペプチドはｔａｕ２３１Ｐ、ＡＰＰ６６８Ｐ、またはｃｄｃ２５−４８Ｐと少なくとも１つの同一性の領域を含む、請求項５７の方法。
【請求項６７】
タンパク質、タンパク質断片、ポリペプチドまたはペプチドは、約１５またはそれ以下のアミノ酸のペプチドであり、該ペプチドは少なくとも１つのリン酸化スレオニン残基を含む、請求項５７の方法。
【請求項６８】
結合代用物は、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、これらの断片、およびこれらの誘導体よりなる群から選択される、請求項５８の方法。
【請求項６９】
結合代用物は、モノクローナル抗体ＡＴ１８０、ＴＧ３、ＣＰ９、ＣＰ１０、ＣＰ１６、ＣＰ１７、ＧＦ１、ＧＦ７、ＧＦ２５、ＭＣ２、ＧＦ１０、ＧＦ１１、ＧＦ２０、ＧＦ２７、ＧＦ３、ＧＦ５、ＧＦ３１、これらの断片、およびこれらの誘導体よりなる群から選択される、請求項５８の方法。
【請求項７０】
ポリペプチドは、Ｐｉｎ１、その断片、その誘導体、およびＰｉｎ１に対応するペプチドよりなる群から選択される、請求項５８の方法。
【請求項７１】
請求項５７の方法により同定される結合物質。
【請求項７２】
結合物質は、小有機分子である、請求項７１の結合物質。
【請求項７３】
結合物質は、アルツハイマー病を予防または治療するのに有用な小有機分子である、請求項７２の結合物質。
【請求項７４】
結合物質は、癌を予防または治療するのに有用な小有機分子である、請求項７２の結合物質。
【請求項７５】
請求項５８の方法により同定される結合物質。
【請求項７６】
結合物質は、小有機分子である、請求項７５の結合物質。
【請求項７７】
結合物質は、アルツハイマー病を予防または治療するのに有用な小有機分子である、請求項７６の結合物質。
【請求項７８】
結合物質は、癌を予防または治療するのに有用な小有機分子である、請求項７６の結合物質。
【請求項７９】
タンパク質、タンパク質断片、ポリペプチドまたはペプチドはビオチンで標識される、請求項５７の方法。
【請求項８０】
タンパク質、タンパク質断片、ポリペプチドまたはペプチドはビオチンで標識される、請求項５８の方法。
【請求項８１】
タンパク質、タンパク質断片、ポリペプチドまたはペプチドはビオチンで標識され、該反応混合物は反応容器内に有り、該反応容器はアビジンで前被覆されている、請求項５７の方法。
【請求項８２】
タンパク質、タンパク質断片、ポリペプチドまたはペプチドはビオチンで標識され、該反応混合物は反応容器内に有り、該反応容器はアビジンで前被覆されている、請求項５８の方法。
【請求項８３】
工程ａ）の相互作用は、タンパク質、タンパク質断片、ポリペプチドまたはペプチドに結合した結合代用物の量を測定することにより決定される、請求項５７の方法。
【請求項８４】
工程ａ）の相互作用は、タンパク質、タンパク質断片、ポリペプチドまたはペプチドに結合した結合代用物の量を測定することにより決定される、請求項５８の方法。
【請求項８５】
少なくとも１つのタンパク質、タンパク質断片、ポリペプチドまたはペプチドと、結合代用物との相互作用を妨害する結合物質を同定するための方法であって：
ａ）ペプチドと結合代用物が互いに相互作用する条件下で、結合代用物を試験結合物質と組合せて反応混合物を生成させ；
ｂ）タンパク質、タンパク質断片、ポリペプチドまたはペプチドを反応混合物に導入し；
ｃ）タンパク質、タンパク質断片、ポリペプチドまたはペプチドと、結合代用物との相互作用のレベルを検出することを含んでなり、
ここでタンパク質、タンパク質断片、ポリペプチドまたはペプチドと、結合代用物との相互作用のレベルの低下は、試験結合物質が相互作用を妨害することを示す、上記方法。
【請求項８６】
請求項８５の方法であって、ｄ）試験結合物質の非存在下での、タンパク質、タンパク質断片、ポリペプチドまたはペプチドと、結合代用物との相互作用のレベルを対照として決定し、これを工程ｃ）で検出された相互作用レベルと比較する工程をさらに含み；こうして、所望の結合物質は、工程ｄ）で検出された相互作用のレベルと比較して、工程ｃ）の相互作用のレベルを低下させる、上記方法。
【請求項８７】
タンパク質、タンパク質断片、ポリペプチドまたはペプチドは、ｔａｕ２３１Ｐ、ＡＰＰ６６８Ｐ、またはｃｄｃ２５−４８Ｐに対応するアミノ酸配列を含む、タンパク質、タンパク質断片、ポリペプチドまたはペプチドよりなる群から選択される、請求項８５の方法。
【請求項８８】
タンパク質、タンパク質断片、ポリペプチドまたはペプチドは、約１５またはそれ以下のアミノ酸のペプチドであり、該ペプチドはｔａｕ２３１Ｐ、ＡＰＰ６６８Ｐ、またはｃｄｃ２５−４８Ｐと少なくとも１つの同一性の領域を含む、請求項８５の方法。
【請求項８９】
タンパク質、タンパク質断片、ポリペプチドまたはペプチドは、約１５またはそれ以下のアミノ酸のペプチドであり、該ペプチドは少なくとも１つのリン酸化スレオニン残基を含む、請求項８５の方法。
【請求項９０】
結合代用物は、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、これらの断片、およびこれらの誘導体よりなる群から選択される、請求項８５の方法。
【請求項９１】
結合代用物は、モノクローナル抗体ＡＴ１８０、ＴＧ３、ＣＰ９、ＣＰ１０、ＣＰ１６、ＣＰ１７、ＧＦ１、ＧＦ７、ＧＦ２５、ＭＣ２、ＧＦ１０、ＧＦ１１、ＧＦ２０、ＧＦ２７、ＧＦ３、ＧＦ５、ＧＦ３１、これらの断片、およびこれらの誘導体よりなる群から選択される、請求項８５の方法。
【請求項９２】
ポリペプチドは、Ｐｉｎ１、その断片、その誘導体、およびＰｉｎ１に対応するペプチドよりなる群から選択される、請求項８５の方法。
【請求項９３】
タンパク質、タンパク質断片、ポリペプチドまたはペプチドは、ｔａｕ２３１Ｐ、ＡＰＰ６６８Ｐ、またはｃｄｃ２５−４８Ｐに対応するアミノ酸配列を含む、タンパク質、タンパク質断片、ポリペプチドまたはペプチドよりなる群から選択される、請求項８５の方法。
【請求項９４】
タンパク質、タンパク質断片、ポリペプチドまたはペプチドは、約１５またはそれ以下のアミノ酸のペプチドであり、該ペプチドはｔａｕ２３１Ｐ、ＡＰＰ６６８Ｐ、またはｃｄｃ２５−４８Ｐと少なくとも１つの同一性の領域を含む、請求項８５の方法。
【請求項９５】
タンパク質、タンパク質断片、ポリペプチドまたはペプチドは、約１５またはそれ以下のアミノ酸のペプチドであり、該ペプチドは少なくとも１つのリン酸化スレオニン残基を含む、請求項８５の方法。
【請求項９６】
結合代用物は、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、これらの断片、およびこれらの誘導体よりなる群から選択される、請求項８６の方法。
【請求項９７】
結合代用物は、モノクローナル抗体ＡＴ１８０、ＴＧ３、ＣＰ９、ＣＰ１０、ＣＰ１６、ＣＰ１７、ＧＦ１、ＧＦ７、ＧＦ２５、ＭＣ２、ＧＦ１０、ＧＦ１１、ＧＦ２０、ＧＦ２７、ＧＦ３、ＧＦ５、ＧＦ３１、これらの断片、およびこれらの誘導体よりなる群から選択される、請求項８６の方法。
【請求項９８】
ポリペプチドは、Ｐｉｎ１、その断片、その誘導体、およびＰｉｎ１に対応するペプチドよりなる群から選択される、請求項８６の方法。
【請求項９９】
請求項８５の方法により同定される結合物質。
【請求項１００】
結合物質は、小有機分子である、請求項９９の結合物質。
【請求項１０１】
結合物質は、アルツハイマー病を予防または治療するのに有用な小有機分子である、請求項１００の結合物質。
【請求項１０２】
結合物質は、癌を予防または治療するのに有用な小有機分子である、請求項１００の結合物質。
【請求項１０３】
請求項８６の方法により同定される結合物質。
【請求項１０４】
結合物質は、小有機分子である、請求項１０３の結合物質。
【請求項１０５】
結合物質は、アルツハイマー病を予防または治療するのに有用な小有機分子である、請求項１０４の結合物質。
【請求項１０６】
結合物質は、癌を予防または治療するのに有用な小有機分子である、請求項１０４の結合物質。
【請求項１０７】
タンパク質、タンパク質断片、ポリペプチドまたはペプチドはビオチンで標識される、請求項８５の方法。
【請求項１０８】
タンパク質、タンパク質断片、ポリペプチドまたはペプチドはビオチンで標識される、請求項８６の方法。
【請求項１０９】
タンパク質、タンパク質断片、ポリペプチドまたはペプチドはビオチンで標識され、該反応混合物は反応容器内に有り、該反応容器はアビジンで前被覆されている、請求項８５の方法。
【請求項１１０】
タンパク質、タンパク質断片、ポリペプチドまたはペプチドはビオチンで標識され、該反応混合物は反応容器内に有り、該反応容器はアビジンで前被覆されている、請求項８６の方法。
【請求項１１１】
工程ａ）の相互作用は、タンパク質、タンパク質断片、ポリペプチドまたはペプチドに結合した結合代用物の量を測定することにより決定される、請求項８５の方法。
【請求項１１２】
工程ａ）の相互作用は、タンパク質、タンパク質断片、ポリペプチドまたはペプチドに結合した結合代用物の量を測定することにより決定される、請求項８５の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、タウ、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）、およびｃｄｃ２５上の特異的部位に結合する化合物を発見するための試薬と方法に関する。そのような化合物は、例えばアルツハイマー病や癌の治療に有用である。
【０００２】
（関連技術の説明）
タウは、 アルツハイマー病（「ＡＤ」）患者の脳に特徴的な神経原繊維変化（ｎｅｕｒｏｆｉｂｒｉｌｌａｒｙ ｔａｎｇｌｅ）を形成するもつれ繊維対（ｐａｉｒｅｄ ｈｅｌｉｃａｌ ｆｉｌａｍｅｎｔ；ＰＨＦ）の主要な成分である。正常なタウタンパク質が修飾されてＰＨＦを生成する過程は完全には理解されていないが、これらの過程には、タウの異常なリン酸化とこのタンパク質のコンフォメーション変化の両方が関与するという点で一般的に一致している。アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）は、アルツハイマー病の神経炎斑（ｎｅｕｒｉｔｉｃ ｐｌａｑｕｅ）中に沈着している４０〜４２アミノ酸ペプチドの前駆体である。最近の多くの研究は、アルツハイマー病ではＡＰＰのタンパク質分解的切断の変化が起きて、過剰量の４０〜４２アミノ酸ペプチドが産生されることを示唆している。プロセシングにおけるこれらの変化の本質は、よくわかっていない。
【０００３】
最近の研究は、タウとＡＰＰとの間の共通の特徴が存在し、これが両タンパク質が異常になりアルツハイマー病の病理の発生の一因となる理由を説明できるかも知れないことを示唆している。タウとＡＰＰの両方とも、リン酸化が知られている領域で、異常な構造的特徴（逆ベータ回転（ｒｅｖｅｒｓｅ ｂｅｔａ ｔｕｒｎ））を有する。この構造（特にリン酸化された場合）は、タウとＡＰＰ機能を制御する多くのタンパク質の結合の認識部位となり、これらの部位へのタンパク質の異常な結合が、おそらくタウの異常なコンフォメーションの出現とＡＰＰのタンパク質分解の異常に寄与しているのであろう。
【０００４】
アルツハイマー病の神経原繊維変化は、スレオニン２３１でリン酸化されたタウを含有し、これは、このような症例の脳組織を、いくつかの異なるモノクローナル抗体の１つを使用して染色することにより証明される（ビンセント（Ｖｉｎｃｅｎｔ）ら、アルツハイマー病の有糸分裂変化？、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ， １３２， ４１３−４２５， １９９６；ビンセント（Ｖｉｎｃｅｎｔ）ら、有糸分裂性ホスホエピトープはアルツハイマー病のもつれ繊維対に先行する、Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ Ａｇｉｎｇ １９， ２８７−２９６， １９９８）。この部位のリン酸化はまた、精製ＰＨＦから単離されたタウの配列決定により、直接証明されている（ハセガワ（Ｈａｓｅｇａｗａ）ら、アルツハイマー病脳中のタウのタンパク質配列と質量スペクトル分析、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．　２６７， １７０４７−１７０５４， １９９２）。１９９８年に、ジチャ（Ｊｉｃｈａ）らは、ＴＧ３と呼ぶモノクローナル抗体（その結合は、タウのリン酸化とタンパク質のコンフォメーションの両方に感受性がある）（ジチャ（Ｊｉｃｈａ）ら、アルツハイマー病のもつれ繊維対を認識するコンフォメーションとリン酸化依存性抗体、Ｊ． Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ． ６９， ２０８７−２０９５， １９９７）を使用して、スレオニン２３１の領域中のタウのコンフォメーションもまた異常であることを証明した。タウ分子のこの領域は、ｆｙｎ（リー（Ｌｅｅ）ら、タウはｓｒｃファミリーの非受容体チロシンキナーゼと相互作用する、Ｊ Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ． １１１， ３１６７−３１７７， １９９８）、ＰＬＣ−ガンマ（フワング（Ｈｗａｎｇ）ら、タウタンパク質とアラキドン酸の共同作用によるホスホリパーゼＣ−ガンマの活性化、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７１， １８３４２−１８３４９， １９９６）、ＰＰＩ（リャオ（Ｌｉａｏ）ら、タンパク質ホスファターゼ１は微小管関連タンパク質タウにより微小管を標的としている、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７３， ２１９０１−２１９０８， １９９８）、ＰＰ２Ａ（ソンタク（Ｓｏｎｔａｇ）ら、Ｍｕｍｂｙ ＭＣ． タンパク質ホスファターゼ２Ａによるタウのリン酸化状態と微小管結合活性の制御、Ｎｅｕｒｏｎ． １７， １２０１−１２０７， １９９６）、キネシン（ｋｉｎｅｓｉｎ）（ジャンクシク（Ｊａｎｃｓｉｋ）ら、タウタンパク質はキネシンに結合し、微小管によるその活性化を調節する、Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ４， ４１７−４２９， １９９６；ジョンソン（Ｊｏｈｎｓｏｎ）ら、正常およびアルツハイマー病脳中のタウタンパク質：アップデート、Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｒｅｖｉｅｗ， ３， １２５−１４１， １９９８）、およびＰｉｎ１（ルー（Ｌｕ）ら、プロリルイソメラーゼＰｉｎ１はアルツハイマー病関連リン酸化タウの生物機能を回復する、Ｎａｔｕｒｅ， ３９９， ７８４−７８８， １９９９）を含むいくつかのタンパク質の結合のための部位であることを、多くの異なる研究が証明している。これらのタンパク質の１つであるＰｉｎ１については、結合がスレオニン２３１のリン酸化に依存し、他のタンパク質の結合が同様に影響を受ける可能性がある直接的証拠がある。リン酸化タウへのＰｉｎ１の結��もまた、タウのコンフォメーションを変化させることが証明されており、他のタンパク質の結合の際もこれが起きる可能性がある。正常な脳ではおそらく、この部位でのタウの低レベルのリン酸化が起きているが、スレオニン２３１のリン酸化の程度は、アルツハイマー病では大幅に上昇している。このリン酸化の有害な結果を予防することは、本出願に記載の方法の１つの目的である。
【０００５】
スレオニン２３１（「ｔｈｒ２３１」）の周りのタウの領域とＡＰＰのスレオニン６６８（「ｔｈｒ６６８」）の周りの領域の間に構造的類似性が存在することは、スレオニンのリン酸化後に、両方の部位にモノクローナル抗体ＭＣ２が結合することにより最初に証明された。同様にタンパク質Ｐｉｎ１は、それぞれ両方のタンパク質から得られたホスホペプチドに結合する。このデータは、本来はほとんどまたは全く配列相同性が無いタンパク質からのこれらの２つの領域の間の、有意な構造的類似性を示唆する。これらの領域は同様のコンフォメーションを取っている可能性があり、ｔｈｒ６６８の周りのＡＰＰタンパク質の領域が逆ベータ回転構造を取っているという証拠が発表されている（シェン（Ｓｈｅｎ）ら、基本的な有糸分裂性ペプチジル−プロリルイソメラーゼＰｉｎ１は、有糸分裂特異的ホスホタンパク質に結合しかつ制御する、Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ． １２， ７０６−７２０， １９９８）。タウのｔｈｒ２３１の近くに同じ構造的特徴が存在するという証拠も得られている。
【０００６】
タウのコンフォメーション変化はもつれＰＨＦ形成の前に起き、繊維形成の結果ではないことはわかっている。タウのコンフォメーション変化は、ＡＤ脳のニューロン内の最も早期の検出可能な変化の１つであることで、当業者は一般的に一致している（ハイマン（Ｈｙｍａｎ）ら、Ａｌｚ−５０抗体はアルツハイマー病関連ニューロン変化を認識する、Ａｎｎ Ｎｅｕｒｏｌ ２３； ３７１−３７９， １９８８；カーメル（Ｃａｒｍｅｌ）ら、アルツハイマー病病理のモノクローナル抗体Ａｌｚ５０の選択性の構造的基礎、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７１， ３２７８９−３２７９５， １９９６；ジチャ（Ｊｉｃｈａ）ら、Ａｌｚ−５０とＭＣ−１（もつれ繊維対に対して作成した新しいモノクローナル抗体）は組換えタウ上のコンフォメーションエピトープを認識する、Ｊ． Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， ４８， １２８−１３２， １９９７；ジチャ（Ｊｉｃｈａ）ら、アルツハイマー病中で見いだされるものに類似のタウのコンフォメーション変種の形成のための配列要件、Ｊ． Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． Ｒｅｓ， ５５， ７１３−７２３， １９９９；ジチャ（Ｊｉｃｈａ）ら、アルツハイマー病のもつれ繊維対を認識するコンフォメーションとリン酸化依存性抗体、Ｊ． Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ． ６９， ２０８７−２０９５， １９９７）。また、リン酸化がこれらのコンフォメーション変化に関連することも証明されている。
【０００７】
ｔｈｒ２３１上のタウの１つの具体的なリン酸化もまた、ＡＤの経過の非常に早期に、おそらくコンフォメーション変化が検出可能になる時またはその近くで、起きるようである。タウのホスホスレオニン２３１を検出する特定のモノクローナル抗体が、リン酸化タウ中のコンフォメーション変化を証明するために利用されており、このタンパク質中のリン酸化とコンフォメーション変化の関連を示唆している（ジチャ（Ｊｉｃｈａ）ら、アルツハイマー病のもつれ繊維対を認識するコンフォメーションとリン酸化依存性抗体、Ｊ． Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ． ６９， ２０８７−２０９５， １９９７）。さらにｔｈｒ２３１でのリン酸化は、精製ＰＨＦから単離されたタウを配列決定することにより、直接証明されている（ハセガワ（Ｈａｓｅｇａｗａ）ら、アルツハイマー病脳中のタウのタンパク質配列と質量スペクトル分析、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．　２６７， １７０４７−１７０５４， １９９２）。
【０００８】
タウ分子のこの領域が、ｆｙｎ（リー（Ｌｅｅ）ら、タウはｓｒｃファミリーの非受容体チロシンキナーゼと相互作用する、Ｊ Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ． １１１， ３１６７−３１７７， １９９８）、ホスホリパーゼＣ（「ＰＬＣ］）−ガンマ（フワング（Ｈｗａｎｇ）ら、タウタンパク質とアラキドン酸の共同作用によるホスホリパーゼＣ−ガンマの活性化、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７１， １８３４２−１８３４９， １９９６）、タンパク質ホスファターゼＩ（「ＰＰＩ」）（リャオ（Ｌｉａｏ）ら、グンダーセン（Ｇｕｎｄｅｒｓｅｎ ＧＧ）、タンパク質ホスファターゼ１は微小管関連タンパク質タウにより微小管を標的としている、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７３， ２１９０１−２１９０８， １９９８）、タンパク質ホスファターゼ２Ａ（「ＰＰ２Ａ」）（ソンタク（Ｓｏｎｔａｇ）ら、タンパク質ホスファターゼ２Ａによるタウのリン酸化状態と微小管結合活性の制御、Ｎｅｕｒｏｎ． １７， １２０１−１２０７， １９９６）、キネシン（ｋｉｎｅｓｉｎ）（ジャンクシク（Ｊａｎｃｓｉｋ）ら、タウタンパク質はキネシンに結合し、微小管による活性化を調節する、Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ３， ４１７−４２９， １９９６；ジョンソン（Ｊｏｈｎｓｏｎ）ら、正常およびアルツハイマー病脳中のタウタンパク質：アップデート、Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｒｅｖｉｅｗ， ３， １２５−１４１， １９９８）、およびＰｉｎ１（ルー（Ｌｕ）ら、プロリルイソメラーゼＰｉｎ１はアルツハイマー病関連リン酸化タウの生物機能を回復する、Ｎａｔｕｒｅ， ３９９， ７８４−７８８， １９９９）を含むいくつかのタンパク質の結合のための部位であることを、多くの異なる研究が証明している。
【０００９】
Ｔｈｒ６６８は、ＡＰＰのＣ末端領域（細胞内であると考えられているこのタンパク質の領域）中に存在し、このタンパク質の大部分は、細胞膜を通過して細胞外スペースに飛び出している。細胞内Ｃ末端領域は、ＧｏとＦｅ６５を含むいくつかのタンパク質と相互作用することが報告されている（クレンケ（Ｋｒｏｅｎｋｅ）ら、ベータアミロイド前駆体タンパク質の細胞質ドメイン配列を含有するペプチドの溶液コンフォメーション、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３６， ８１４５−８１５２， １９９７）。この領域のリン酸化は、アルツハイマー病のプラーク中に沈着したＡＰＰのタンパク質分解処理と４０〜４２アミノ酸ペプチドの分泌を変化させることも報告されている（クレンケ（Ｋｒｏｅｎｋｅ）ら、前述；ウィーバー（Ｗｅａｖｅｒ）ら、ＮＭＲスペクトル法により解明されたアルツハイマー病のモノクローナル抗体ＴＧ３反応性と特異性のためのコンフォメーション要件。Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ， 抄録＃４４８．１０、１９９９；ルッソ（Ｒｕｓｓｏ）ら、アルツハイマー病のベータアミロイド前駆体タンパク質のサイトゾルドメインを中心としたＦｅ６５とタンパク質ネットワーク。ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ． ４３４， １−７， １９９８）。
【００１０】
この分野で数年間主流である「アミロイドカスケード仮説」は、脳でのベータアミロイドの沈着が、神経変性ともつれ（ｔａｎｇｌｅ）の形成を引き起こすと提唱しているが、この直接的な実験的証明は困難である（セルコー（Ｓｅｌｋｏｅ ＤＪ．）、ベータアミロイド前駆体タンパク質の細胞生物学とアルツハイマー病の遺伝学、定量生物学に関するコールドスプリングハーバーシンポジウム、６１：５８７−５９６， １９９６；デービース（Ｄａｖｉｅｓ， Ｐ．）：アミロイドではなく神経異常がアルツハイマー病の痴呆の原因である、ＡＬＺＨＥＩＭＥＲ’Ｓ ＤＩＳＥＡＳＥの３２７〜３３３頁、カッツマン（Ｋａｔｚｍａｎ）ら編、ラーベンプレス（Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ）、ニューヨーク州、１９９４）。若年で脳中に多数のベータアミロイド沈着を示すトランスジェニックマウスは、高齢になっても顕著なタウの病態の証拠を示さず、神経原繊維変化形成の証拠を示さないことが、注目される（ホルコウム（Ｈｏｌｃｏｍｂ）ら、変異体アミロイド前駆体タンパク質とプレゼニリン（ｐｒｅｓｅｎｉｌｉｎ）１トランス遺伝子の両方を有するトランスジェニックマウスの加速されたアルツハイマー型表現型、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ４：９７−１００， １９９８）。その結果、アミロイドカスケード仮説は、最近変更されている。ベータアミロイドの細胞内蓄積（プラーク中の細胞外沈着ではなく）が、ＡＤ病態に至ると示唆されている（スコブロンスキー（Ｓｋｏｖｒｏｎｓｋｙ）ら、経時的に培養物中に蓄積する不溶性アミロイドベータタンパク質の新規神経内プールの検出、Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １４１：１０３１−１０３９， １９９８；ヤング（Ｙａｎｇ）ら、Ａベータ１〜４２で処理したアミロイド前駆体タンパク質トランスフェクション細胞中の不溶性の新たに合成されたＡベータ−４２の細胞内蓄積、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７４：２０６５０−２０６５６， １９９９）。
【００１１】
ベータアミロイドは、より大きなタンパク質であるアミロイド前駆体タンパク質（すなわち、ＡＰＰ）の切断により生成する。このタンパク質はニューロン中に豊富に存在し、ニューロン内で合成されるもののほとんどは、ベータアミロイドペプチド領域の中心近くで切断され、その分子のより大きなＮ末端断片が分泌され、そしておそらくはより小さなＣ末端断片が細胞内に保持される（セルコー（Ｓｅｌｋｏｅ ＤＪ．）、ベータアミロイド前駆体タンパク質の細胞生物学とアルツハイマー病の遺伝学、定量生物学に関するコールドスプリングハーバーシンポジウム、６１：５８７−５９６， １９９６；セルコー（Ｓｅｌｋｏｅ ＤＪ．）、細胞生物学をアルツハイマー病の治療の進歩に応用すること、Ｎａｔｕｒｅ ３９９：Ａ２３−３１， １９９９）。この切断は、アルファセクレターゼ（ａｌｐｈａ−ｓｅｃｒｅｔａｓｅ）と呼ぶまだ同定されていないプロテイナーゼにより触媒される。アルファセクレターゼ切断は、ベータアミロイドドメイン内で起きるため、分泌性処理後のこのペプチドの産生と沈着は不可能である。ベータアミロイドペプチドを放出するためには、ＡＰＰの２つの異なる切断が必要であり、ベータアミロイドペプチドのＮ末端を生成するベータセクレターゼ切断と、Ｃ末端を生成する１つ以上のガンマセクレターゼ切断である。正常細胞中で生成される少なくとも一部のベータアミロイドペプチドは、分泌される。ＡＰＰ分子の残りの運命は不明である。近年、ベータおよびガンマセクレターゼが注目されており、最近ベータセクレターゼがクローン化された（バッサー（Ｖａｓｓａｒ）ら、膜貫通アスパラギン酸プロテアーゼＢＡＣＥによるアルツハイマー病アミロイド前駆体タンパク質のベータセクレターゼ切断、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８６：７３５−７４１， １９９９）。ＡＰＰからのベータアミロイドの産生を制御する可能性のある機構が、近年大きな関心を集めており、新規の制御機構の候補が最近同定された。
【００１２】
ＡＰＰのＣ末端は、動物の脳中、および細胞培養物中でリン酸化されることが知られている（オーイシ（Ｏｉｓｈｉ）ら、アルツハイマー病のアミロイド前駆体タンパク質の細胞質ドメインは、成体ラットの脳と培養細胞中でＴｈｒ６５４、Ｓｅｒ６５５およびＴｈｒ６６８でリン酸化される、Ｍｏｌ Ｍｅｄ ３：１１１−１２３， １９９７；スズキ（Ｓｕｚｕｋｉ）ら、アルツハイマー病アミロイド前駆体タンパク質のリン酸化と代謝の細胞周期依存性制御、ＥＭＢＯ Ｊ． １３：１１１４−１１２２， １９９４）。ＡＰＰのＣ末端のリン酸化が、少なくともアルファセクレターゼ部位での切断速度を制御することが示唆されている（カポラソ（Ｃａｐｏｒａｓｏ）ら、タンパク質リン酸化はアルツハイマー／Ａ４アミロイド前駆体タンパク質の分泌を制御する、ＰＮＡＳ ８９：３０５５−３０５９， １９９２）。主に、ＡＰＰ中のリン酸化部位に対する特異的モノクローナル抗体は最近まで利用不可能であったために、この分野では利用可能な情報はほとんど無い。
【００１３】
Ｔｈｒ６６８は、ｃｄｃ２リン酸化の好適な部位であると報告されている（スズキ（Ｓｕｚｕｋｉ）ら、アルツハイマー病アミロイド前駆体タンパク質のリン酸化と代謝の細胞周期依存性制御、ＥＭＢＯ Ｊ． １３：１１１４−１１２２， １９９４）。興味深いことに、ｃｄｃ２（ｃｄｋ１とも呼ぶ）は、タウのｔｈｒ２３１リン酸化で研究されているすべてキナーゼのうちで最も効率的である（ジチャ（Ｊｉｃｈａ）ら、アルツハイマー病のもつれ繊維対を認識するコンフォメーションとリン酸化依存性抗体、Ｊ． Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ． ６９， ２０８７−２０９５， １９９７）。ｃｄｃ２５活性は、ＡＤ患者の脳中でアップレギュレートされ、ｃｄｃ２は神経原繊維変化に、特にその生成の初期に、関与していることが示唆されている（ビンセント（Ｖｉｎｃｅｎｔ）ら、アルツハイマー病脳の変性ニューロン中の有糸分裂性ｃｄｃ２／サイクリンβ１キナーゼの異常な発現、Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． １７：３５８８−３５９８， １９９７）。このキナーゼは、細胞周期の非常に重要なレギュレーターとして知られており、有糸分裂後の細胞（例えば、ニューロン）中のｃｄｃ２キナーゼの出現は予想外であった。この研究が、いわゆるアルツハイマー病の「有糸分裂仮説」に至り、これは、有糸分裂後ニューロン中の細胞周期の異常な活性化が、神経原繊維変化形成と細胞変性に関与すると提唱している（マクシー（ＭｃＳｈｅａ）ら、アルツハイマー病の細胞周期レギュレーターｐ１６とｃｄｋ４の異常な発現、Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈ． １５０：１９３３−１９３９， １９９７；ナギー（Ｎａｇｙ）ら、アルツハイマー病の海馬中の細胞周期マーカー、Ａｃｔａ Ｎｅｕｒｏｐａｔｈ． ９４：６−１５， １９９７；ナギー（Ｎａｇｙ）ら、アルツハイマー病と他の神経変性症状における海馬中の細胞分裂マーカーの発現、Ａｃｔａ Ｎｅｕｒｏｐａｔｈ． ９３：２９４−３００， １９９７；イレンバーガー（Ｉｌｌｅｎｂｅｒｇｅｒ）ら、生細胞中のタウタンパク質の内因性および細胞周期依存性リン酸化：アルツハイマー病における意味、Ｍｏｌｅｃ Ｂｉｏ Ｃｅｌｌ ９， １４９５−１５１２， １９９８）。
【００１４】
最近の研究は、もつれ形成と神経変性に、細胞周期の第２の主要なレギュレーターも参加しているかも知れないことを示唆している。Ｐｉｎ１は、セリンまたはスレオニンがリン酸化された場合のみ、タンパク質中のセリン／スレオニン−プロリン結合に結合し異性体化するプロリルイソメラーゼである。すべての真核細胞中では、正常な有糸分裂が必須である（ヤッフェ（Ｙａｆｆｅ）ら、配列特異的かつリン酸化依存性のプロリン異性体化：有糸分裂制御機構の可能性、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７８：１９５７−１９６０， １９９７；ルー（Ｌｕ）ら、有糸分裂のレギュレーターに必須のヒトペプチジル−プロリルイソメラーゼ、Ｎａｔｕｒｅ ３８０：５４４−５４７， １９９６）。ペプチド基質中のＰｉｎ１により認識される配列は、タウ中の配列と極めて類似しており、Ｐｉｎ１がｔｈｒ２３１の周りのタウ配列に強く結合することが発見されたが、ただしこれはスレオニンがリン酸化されている時のみである（ルー（Ｌｕ）ら、プロリルイソメラーゼＰｉｎ１はアルツハイマー病関連リン酸化タウの生物機能を回復する、Ｎａｔｕｒｅ， ３９９， ７８４−７８８， １９９９）。
【００１５】
Ｐｉｎ１は、有糸分裂中のタンパク質キナーゼ活性化のタイミングが、細胞周期を介して確実に順序よく進行するように制御する役割を果たしている。有糸分裂をしている細胞中のＰｉｎ１活性の主要な標的は、ｃｄｃ２活性の重要なレギュレーターであるｃｄｃ２５ホスファターゼである（クレンショー（Ｃｒｅｎｓｈａｗ）ら、有糸分裂生ペプチジル−プロリルイソメラーゼであるＰｉｎ１はＣｄｃ２５およびＰｌｘ１と相互作用する、ＥＭＢＯ Ｊ １７：１３１５−１３２７， １９９８；シェン（Ｓｈｅｎ）ら、基本的な有糸分裂性ペプチジル−プロリルイソメラーゼＰｉｎ１は有糸分裂特異的ホスホタンパク質に結合しかつ制御する、Ｇｅｎｅｓ ＆ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １２， ７０６−７２０， １９９８）。Ｃｄｃ２５は、チロシン１５上の阻害性リン酸化を排除することにより、ｃｄｃ２の活性化を行っている。Ｃｄｃ２５は、それ自体リン酸化により活性化され、いくつかのリン酸化部位が同定されている（すなわち、スレオニン４８）（ストラウスフェルト（Ｓｔｒａｕｓｆｅｌｄ）ら、哺乳動物細胞へのヒトｃｄｃ２５Ｃの微量注入によるｐ３４ｃｄｃ２タンパク質キナーゼの活性化。有糸分裂時にリン酸化される部位上のｐ３４ｃｄｃ２によりｃｄｃ２５Ｃをあらかじめリン酸化する必要性、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６９：５９８９−６０００， １９９４；イズミ（Ｉｚｕｍｉ）ら、ｃｄｃ２５ホスファターゼ中のｃｄｃ２リン酸化部位の除去はＭ期の開始を阻止する、Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ Ｃｅｌｌ ４：１３３７−１３５０， １９９３）。これらの１つ以上で、Ｐｉｎ１結合は、ｃｄｃ２５のコンフォメーションを変化させ、活性化を阻害し、こうしてｃｄｃ２の活性化を遅らせる。
【００１６】
正常な有糸分裂細胞中では、この阻害は一過性であり、ｃｄｃ２５中のコンフォメーション変化は可逆性である。従って、有糸分裂中のｃｄｃ２５に及ぼすＰｉｎ１の作用は、このホスファターゼの活性化のタイミングを制御することであり、従ってｃｄｃ２の作用の正確なタイミングを制御することである。このタイミングを破壊することは、有糸分裂中の細胞にとって破滅的であり、アポトーシスまたは他のあまり解析されていない機序による死滅を引き起こす（シュスター（Ｓｈｕｓｔｅｒ）ら、細胞質分裂のタイミングを特定するパラメータ、Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １４６：９８１−９９２， １９９９；クレアノア（Ｃｒｅａｎｏｒ）ら、分裂酵母シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）の細胞周期中のＢサイクリンｐ５６ｃｄｃ１３とホスファターゼｐ８０ｃｄｃ２５の動力学、Ｊ Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ １０９：１６４７−１６５３， １９９６）。
【００１７】
興味深いことに、ｃｄｃ２でリン酸化されたタウへのＰｉｎ１の結合は、このタンパク質のコンフォメーションを変化させることが証明された。さらなる研究により、Ｐｉｎ１は、ＡＤ脳から単離されＡＤ脳組織切片中の神経原繊維変化と同時局在化しているリン酸化タウに、強く結合していることが証明された（ルー（Ｌｕ）ら、プロリルイソメラーゼＰｉｎ１はアルツハイマー病関連リン酸化タウの生物機能を回復する、Ｎａｔｕｒｅ， ３９９， ７８４−７８８， １９９９）。リン酸化タウへのＰｉｎ１の結合はまた、タウのコンフォメーションを変化させることが証明され、これはまた、他のタンパク質へのＰｉｎ１の結合でも起きる可能性がある（シェン（Ｓｈｅｎ）ら、基本的な有糸分裂性ペプチジル−プロリルイソメラーゼＰｉｎ１は有糸分裂特異的ホスホタンパク質に結合しかつ制御する、Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ． １２， ７０６−７２０， １９９８）。正常な脳では、この部位でタウの低レベルのリン酸化が起きるが、スレオニン２３１のリン酸化の程度は、アルツハイマー病脳では大幅に上昇している。ｔｈｒ２３１でのｃｄｃ２によるタウのリン酸化が、Ｐｉｎ１の結合を引き起こし、このタンパク質がタウのコンフォメーションを変化させてＰＨＦを形成し、次にこれが凝集して神経原繊維変化になると考えることができる。細胞死滅は、タウの異常またはＰｉｎ１の枯渇ともつれへの隔離により起きるかも知れない。この考えは、タウのリン酸化とコンフォメーション変化（両方とも、ＡＤの神経異常の早期事象であることが確立されている）の両方を結びつける説明となる。
【００１８】
タンパク質と、ホスホスレオニン６６８を含有するＡＰＰのＣ末端領域との相互作用を妨害する結合物質は、ＡＰＰのタンパク質分解処理と、４０〜４２アミノ酸ペプチドの産生に大きな作用を有することが予測される。このような結合物質は、ＡＤ病態の出現速度を遅らせるのに有用である可能性がある。タウとＡＰＰのそれぞれｔｈｒ２３１およびＴｈｒ６６８の周りの構造的類似性を考慮すると、いずれかの部位と相互作用することができる単一の結合物質が同定される可能性がある。そのような結合物質は、ＡＤの現在利用可能な治療法に対して大きな利点を有するであろう。しかしこのような結合物質は、現在入手できていない。
【００１９】
すなわち、当該分野において、例えばタウ、ＡＰＰ、ｃｄｃ２と、そのそれぞれの結合パートナーとの複合体の形成を妨害する結合物質（すなわち、化合物）に対するニーズが存在する。そのような結合物質は、例えば、ＡＤおよび／または癌の出現または進行を阻害するのに有用である。Ｐｉｎ１とＰｉｎ１の標的（例えば、タウとＡＰＰ）の相互作用を妨害し、こうしてＰｉｎ１または他のタンパク質がこれらの標的タンパク質に近づくことを阻止する結合物質を測定するための、試薬と方法として、ある系の例が本明細書で提供される。このような阻止は、異常な症状、例えばタウの疾患関連コンフォメーション、ＡＰＰの異常なタンパク質分解処理、およびＡＤの病態の形成を防止すると期待される。
【００２０】
（発明の要約）
本発明は、例えばアルツハイマー病（ＡＤ）や癌のような疾患の、予防または治療に有用な結合物質の同定と単離のための、試薬と方法を提供する。この結合物質は、少なくとも２つのタンパク質、ポリペプチド、ペプチド、これらの断片および／またはこれらの誘導体の、相互作用を妨害することができる。典型的には、少なくとも第１または第２のタンパク質、ポリペプチド、ペプチド、これらの断片および／またはこれらの誘導体が、互いに相互作用（すなわち、結合し、従って互いのまたは両方の機能に影響を与える）し、例えばＡＤまたは癌の病態の一因となる。本発明は、このような相互作用を妨害する結合物質（すなわち、化合物）を同定するための試薬と方法を提供する。
【００２１】
ある実施態様において、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、これらの断片および／またはこれらの誘導体は、結合代用物により示される。ペプチドの結合パートナー（すなわち、ペプチドと相互作用することが知られているポリペプチド）に対応する結合代用物が、測定法で使用される、高処理系が提供される。結合代用物は、任意のタンパク質、ポリペプチド、ペプチド、これらの断片、これらの誘導体、またはタンパク質の機能を少なくとも実質的に保持または模倣する任意の他の化合物でよい。結合代用物とペプチドとの相互作用の、結合物質による妨害が測定される。ペプチドと結合代用物との相互作用を妨害する結合物質は、「所望の」結合物質として選択される。そのような結合物質は、疾患の診断、予防および治療で使用するようにさらに開発される。ある実施態様では、ポリペプチド自体が結合代用物と見なされる。
【００２２】
ある実施態様において、ペプチドと結合代用物とを含む反応混合物に、試験結合物質が加えられる。別の実施態様において、試験結合物質、ペプチドおよび結合代用物が、反応混合物に同時に加えられる。さらに別の実施態様において、まず結合代用物と結合物質が反応させられ、次に反応混合物にペプチドが加えられる。これらの任意の実施態様において、ペプチドと結合代用物との相互作用に及ぼす試験結合物質の影響が測定される。相互作用の阻害（ペプチドと結合代用物との結合の低下により示される）は、試験結合物質が所望の結合物質であることを示す。タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、これらの断片、またはこれらの誘導体を使用しても、これらの方法が適していることを理解されたい。
【００２３】
ある実施態様において本発明は、ペプチド、結合代用物、および試験結合物質を組合せて反応混合物を生成し；ペプチドと結合代用物との結合を検出することによる、ペプチドと結合代用物との相互作用を妨害する所望の結合物質を同定するための方法を提供し；ここで、ペプチドと結合代用物との相互作用の低下は、試験結合物質が相互作用を妨害することを示す。本発明の別の態様は、試験結合物質の非存在下でのペプチドと結合代用物との相互作用のレベルが対照として測定され、検出すべき相互作用のレベルと比較される、対照反応を含めることに関する。所望の結合物質は、対照反応中で検出される相互作用のレベルと比較して、相互作用のレベルを低下させる。すでに記載したように、結合代用物の代わりに反応性ポリペプチドを使用してもよい。以下の説明から、他の非限定例は明らかであろう。
【００２４】
（詳細な説明）
本明細書において、「ｔｈｒ２３１」は、タウのスレオニン２３１を意味し、「ｔｈｒ６６８」はＡＰＰのスレオニン６６８を意味し、「ｔｈｒ４８」はｃｄｃ２５のスレオニン４８を意味する。さらに「ｔｈｒ２３１Ｐ」はリン酸化ｔｈｒ２３１を意味し、「ｔｈｒ６６８Ｐ」はリン酸化ｔｈｒ６６８を意味し、ｔｈｒ４８Ｐはリン酸化ｔｈｒ４８を意味する。さらに「ｔａｕ２３１Ｐ」は、ｔｈｒ２３１Ｐを含むタウポリペプチドを意味し、「ＡＰＰ６６８Ｐ」は、ｔｈｒ６６８Ｐを含むＡＰＰポリペプチドを意味し、ｃｄｃ２５−４８Ｐは、ｔｈｒ４８Ｐを含むｃｄｃ２５ポリペプチドを意味する。「ｔａｕ２３１Ｐ」は、ｔｈｒ２３１Ｐを含むタウポリペプチドを意味し、「ＡＰＰ６６８Ｐ」は、ｔｈｒ６６８Ｐを含むＡＰＰポリペプチドを意味し、ｃｄｃ２５−４８Ｐは、ｔｈｒ４８Ｐを含むｃｄｃ２５ポリペプチドを意味する。ｔａｕ２３１Ｐ、ＡＰＰ６６８Ｐ、およびｃｄｃ２５−４８Ｐという用語は、それぞれリン酸化タウ、リン酸化ＡＰＰ、またはリン酸化ｃｄｃ２５の、完全長、断片または誘導体を意味することもある。
【００２５】
本明細書において「結合物質」という用語は、疾患の過程に関与する１つ以上のタンパク質（または、ポリペプチド、ペプチド、タンパク質に対応する断片および／または誘導体）に対する結合特異性を有する化合物または分子を意味する。好適な実施態様において、適切な結合物質は、１つのタンパク質が他のタンパク質に結合することを阻害する化合物である。適切な結合物質には、特に限定されないが、抗体およびその誘導体、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質および小分子（例えば、約１０００ｇ／ｍｏｌ未満の有機分子）がある。適切な結合物質は、当該分野で公知の方法を使用して調製される。結合物質は、タンパク質の相互作用に関連する疾患を治療するのに有用である。
【００２６】
診断または治療される疾患には、特に限定されないが、例えば癌およびアルツハイマー病（ＡＤ）がある。本明細書において、癌は、正常な細胞調節の喪失が、無制限な増殖、分化の欠如、および局所組織へ侵入する能力や転移能力の上昇を引き起こす、任意の細胞の悪性腫瘍と定義される。癌は、あらゆる年齢であらゆる臓器のあらゆる組織で発生する。癌は、遺伝疾患であるか、または環境因子もしくは感染性物質により引き起こされる。癌はまた、これらの組合せからも生じる。本発明を使用する目的において、癌という用語は、新生物および前癌状態の細胞の両方を含む。
【００２７】
ある実施態様において本発明は、タンパク質（例えば、タウ、ＡＰＰ、および／またはｃｄｃ２５）と、これらのそれぞれの結合パートナー（すなわち、タウおよびＰｉｎ１）との相互作用を、妨害する結合物質を発見するための、試薬と方法に関する。別の実施態様において本発明は、あるタンパク質と別のタンパク質との相互作用を破壊もしくは阻害する化合物の型の、結合物質の同定に関する。本発明のある実施態様において、結合物質は、Ｐｉｎ１とタウおよび／またはＡＰＰ（ＡＤと関連することが知られているタンパク質）との相互作用を妨害する。別の実施態様においてＰｉｎ１は、癌の発生または進行に関連するタンパク質（例えば、ｃｄｃ２５）と相互作用する。本発明の方法を使用して同定される結合物質は、Ｐｉｎ１とこのようなタンパク質との相互作用を妨害するように使用され、こうしてＡＤまたは癌の進行を予防または抑制する。本明細書に記載の方法は、多くの異なるタンパク質に適用可能であり、Ｐｉｎ１への言及は単に例示的なもので非限定的であることは、当業者に理解されるであろう。
【００２８】
本発明のタンパク質、タンパク質断片またはペプチドに結合する、抗体および抗体断片のような結合物質は、本発明の範囲内である。抗体は、単一特異的ポリクローナル抗体を含むポリクローナル抗体；モノクローナル抗体（ｍＡｂ）；組換え抗体；キメラ抗体；ヒト化抗体、例えばＣＤＲ移植抗体；ヒト抗体；単一鎖抗体；および／または２特異的抗体；ならびにその断片；変種；または誘導体でもよい。抗体断片には、本発明のタンパク質、タンパク質断片またはペプチド上のエピトープに結合する抗体の部分を含む。このような断片の例には、完全長抗体の酵素的切断により生成されるＦａｂおよびＦ（ａｂ’） 断片がある。他の結合断片には、組換えＤＮＡ技術（例えば、抗体可変領域をコードする核酸配列を含有する組換えプラスミドの発現）により生成されるものがある。
【００２９】
本発明の診断法および系で使用される抗体分子の例は、完全な免疫グロブリン分子、実質的に完全な免疫グロブリン分子、およびパラトープを含有する免疫グロブリン分子の部分（Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２およびＦ（ｖ）として当該分野で公知の部分を含む）がある。抗体のＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２部分は、公知の方法により、実質的に完全な抗体で、それぞれパパインおよびペプシンのタンパク質分解反応により調製される（例えば、テオフィロポラス（Ｔｈｅｏｆｉｌｏｐｏｌｏｕｓ）とディキソン（Ｄｉｘｏｎ）の米国特許第４，３４２，５６６号を参照）。Ｆａｂ’抗体部分も公知であり、Ｆ（ａｂ’）２から、２つの重鎖部分を連結しているジスルフィド結合を例えばメルカプトエタノールで還元して、次に生じるタンパク質メルカプタンをヨードアセトアミドのような試薬でアルキル化することにより産生される。完全な抗体分子を含有する抗体が好適であり、本明細書において例として使用される。
【００３０】
ポリペプチドに対する抗体の調製は、当該分野で公知である（スタウト（Ｓｔａｕｄｔ）ら、Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ．， １５７：６８７−７０４ （１９８３）、またはストクリフェ（Ｓｕｔｃｌｉｆｆｅ， Ｊ．Ｇ．）の米国特許第４，９００，８１１号を参照されたい、この教示内容は参照することにより本明細書に組み込まれる）。簡単に説明すると、本発明の抗体組成物を産生するために、実験室哺乳動物に、免疫的有効量の本発明のポリペプチドを接種する。こうして誘導された抗ポリペプチド抗体分子を、次に哺乳動物から採取し、ポリペプチドと、対応する組換えタンパク質との両方に免疫特異的なものを、当該分野で公知の技術（例えば、免疫親和性クロマトグラフィー）により所望の程度まで単離する。
【００３１】
抗体の特異性を増強するために、好ましくは固相結合免疫ポリペプチドを使用して、免疫親和性クロマトグラフィーにより抗体を精製する。抗体に、固相結合免疫ポリペプチドを、ポリペプチドが抗体分子と免疫反応して固相結合免疫複合体を形成するのに充分な時間、接触させる。結合した抗体を、標準法により複合体から分離する。
【００３２】
約３５以下のアミノ酸残基を含有するポリペプチドについては、抗体の産生を誘導するためには、担体に結合したペプチドを使用することが好ましい。１つ以上の追加のアミノ酸残基を、ポリペプチドのアミノ末端またはカルボキシ末端に付加して、担体へのポリペプチドの結合を助けることができる。ポリペプチドのアミノ末端またはカルボキシ末端で加えられるシステイン残基は、ジスルフィド結合を介して結合体を形成するのに特に有用であることがわかっている。しかし、結合体を調製するための当該分野で公知の他の方法を使用することもできる。現在当該分野で公知のポリペプチド結合法または活性化官能基による結合が、特に適用可能である。例えば、アウラメアス（Ａｕｒａｍｅａｓ）ら、Ｓｃａｎｄ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｖｏｌ． ８， Ｓｕｐｐｌ． ７：７−２３ （１９７８） および米国特許第４，４９３，７９５号、３，７９１，９３２号および３，８３９，１５３号を参照されたい。さらに、指定部位結合反応を行って、結合後のポリペプチド配向による活性の喪失を最小にすることができる。例えば、ロッドウェル（Ｒｏｄｗｅｌｌ）ら、Ｂｉｏｔｅｃｈ．， ３：８８９−８９４ （１９８５）、および米国特許第４，６７１，９５８号を参照されたい。追加の結合法の例には、マイケル（Ｍｉｃｈａｅｌ）付加反応生成物、グルタルアルデヒドのようなジアルデヒドの使用（クリプステイン（Ｋｌｉｐｓｔｅｉｎ）ら、Ｊ． Ｉｎｆｅｃｔ． Ｄｉｓ．， １４７：３１８−３２６ （１９８３）など）、または担体へのアミド連結を形成するための水溶性カルボジイミドの使用のようなカルボジイミド技術の使用がある。あるいはヘテロ官能性架橋剤ＳＰＤＰ（Ｎ−スクシニミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート）を使用して、ペプチド（カルボキシ末端システインが導入されている）を結合することができる。
【００３３】
有用な担体は当該分野で公知であり、一般にタンパク質自体である。このような担体の例には、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、エデスチン、サイログロブリン、アルブミン（例えば、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）またはヒト血清アルブミン（ＨＳＡ））、赤血球（例えば、ヒツジ赤血球（ＳＲＢＣ））、破傷風毒素、コレラ毒素、ならびにポリアミノ酸（例えば、ポリＤ−リジン；Ｄ−グルタミン酸）などがある。担体の選択は、接種物質の最終的用途に依存し、特には本発明に関係ない基準に基づく。例えば、担体は、接種される特定の動物で有害な反応を生じないものを選択すべきである。
【００３４】
本接種物質は、有効量の免疫原性量のポリペプチド（一般には担体に結合した結合体として）を含有する。免疫性ポリペプチドに対する免疫応答を誘導するのに充分な単位服用量当たりのポリペプチドの有効量は、特に、接種される動物の種、動物の体重、および選択される接種法に依存することは、当該分野で公知である。接種物質は典型的には、１回の接種当たり約１０マイクログラム（μｇ）から約５００ミリグラム（ｍｇ）、好ましくは１回の投与当たり約５０マイクログラムから約５０ミリグラムのポリペプチド濃度を含有する。接種物質に関する「単位服用量」という用語は、動物の単位服用量として適した物理的に分かれた単位を意味し、各単位は、必要な希釈剤（すなわち、担体またはビヒクル）と組合せる所望の免疫原作用を生成するように計算された、活性物質のあらかじめ決められた量を含有する。本発明の接種物質の新規な単位服用量の規定は、（ａ）活性物質のユニークな性質と達成される特定の免疫作用、および（ｂ）動物で免疫的使用のためのこのような活性物質を混合する技術に内在する限界（本明細書で詳細に開示される、これらは本発明の特徴である）に規定され、これに直接依存する。
【００３５】
接種物質は、典型的には乾燥固体ポリペプチド−結合体から、ポリペプチド−結合体を、生理学的に許容される希釈剤（例えば、水、食塩水またはリン酸緩衝化生理食塩水）に分散して、水性組成物を形成させることにより、調製される。接種物質はまた、希釈剤の一部としてアジュバントを含有してもよい。完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）、不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）およびミョウバンのようなアジュバントは当該分野で公知であり、いくつかの業者から市販されている。
【００３６】
こうして産生された抗体は、特に、組織切片または体液試料のような試料中のポリペプチドを検出するために、本発明の方法および系で使用することができる。ポリペプチドの機能を阻害する抗ポリペプチド抗体を、本明細書に記載のような治療法でインビボで使用することもできる。好適な抗ポリペプチド抗体は、モノクローナル抗体である。「モノクローナル抗体」という用語は、その種々の文法的形態で、特定のエピトープと免疫反応することができる抗体結合部位の１つのみの種を含有する抗体分子の集団を意味する。従ってモノクローナル抗体は典型的には、それが免疫反応するエピトープに対して、単一の結合親和性を示す。従ってモノクローナル抗体は、それぞれが異なるエピトープに免疫特異的な複数の抗体結合部位を有する抗体分子（例えば、２特異的モノクローナル抗体）を含有してもよい。本発明の好適なモノクローナル抗体は、本発明のポリペプチドと免疫反応する抗体分子を含む。さらに好ましくはモノクローナル抗体はまた、組換え法で産生された全タンパク質と免疫反応する。
【００３７】
モノクローナル抗体は典型的には、１種類の抗体分子のみを分泌（産生）するハイブリドーマと呼ぶ単一の細胞のクローンにより産生される抗体からなる。ハイブリドーマ細胞は、抗体産生細胞とミエローマもしくは他の自己永続性細胞株とを融合することにより形成される。そのような抗体の調製は、コーラー（Ｋｏｈｌｅｒ）とミルスタイン（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ）、Ｎａｔｕｒｅ， ２５６：４９５−４９７ （１９７５） により最初に記載され、その開示内容は参照することにより本明細書に組み込まれる。こうして産生されたハイブリドーマ上清は、ポリペプチドと免疫反応する抗体分子の有無についてスクリーニングすることができる。
【００３８】
簡単に説明すると、モノクローナル抗体組成物が産生されるハイブリドーマを形成するために、ミエローマもしくは他の自己永続性細胞株を、本明細書に記載のポリペプチド中に存在するような、抗原で超免疫した哺乳動物の脾臓から得られたリンパ球と融合される。ポリペプチド誘導ハイブリドーマ技術は、ニマン（Ｎｉｍａａｎ）ら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８０：４９４９−４９５３ （１９８３）により記載され、その開示内容は参照することにより本明細書に組み込まれる。ハイブリドーマを調製するために使用されるミエローマ細胞株は、リンパ球と同じ種に由来することが好ましい。典型的には、１２９ＧＩＸ＋ 株のマウスが好適な哺乳動物である。本発明での使用に適したマウスミエローマには、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ロックビル、メリーランド州）から、ＣＲＬ１５８０とＣＲＬ１５８１で入手できる、それぞれヒポキサンチン−アミノプテリン−チミジン感受性（ＨＡＴ）細胞株Ｐ３Ｘ６３−Ａｇ８．６５３、およびＳｐ２／０−Ａｇ１４がある。脾臓細胞は典型的には、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）１５００を使用して、ミエローマ細胞と融合される。融合されたハイブリッドは、ＨＡＴに対する感受性により選択される。本発明のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）を使用して同定される。
【００３９】
本発明のモノクローナル抗体はまた、適切なポリペプチド特異性の抗体分子を産生し分泌するハイブリドーマを含有する栄養培地を含む、モノクローナルハイブリドーマ培養を開始することにより産生することができる。培養は、ハイブリドーマが培地中に抗体分子を分泌するのに必要な条件下でかつ必要な時間維持される。次に、細胞含有培地が採取される。次に抗体分子を、公知の技術により単離することができる。これらの組成物の調製に有用な媒体は、当該分野で公知であり、市販されており、合成培地、近交系マウスなどがある。合成培地の例は、４．５ｇｍ／ｌグルコース、２０ｍＭグルタミン、および２０％胎児牛血清を補足したダルベッコー最小基本培地（ＤＭＥＭ；ダルベッコー（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ）ら、Ｖｉｒｏｌ． ８：３９６ （１９５９））がある。近交系マウス株の例は、Ｂａｌｂ／ｃである。モノクローナル抗体、ハイブリドーマ細胞、ハイブリドーマ細胞培養物を産生する他の方法もまた、公知である（例えば、免疫学的レパートリーからモノクローナル抗体を単離する方法、サストリー（Ｓａｓｔｒｙ）ら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８６：５７２８−５７３２ （１９８９）；およびフセ（Ｈｕｓｅ）ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２４６：１２７５−１２８１ （１９８９）を参照）。
【００４０】
本発明のモノクローナル抗体は、本発明の抗体について開示したものと同じ方法で使用することができる。例えば、このモノクローナル抗体は、本明細書で開示された治療法、診断法、またはインビトロ法（ここでは、本発明のポリペプチドとの免疫反応が好ましい）で使用することができる。また本発明により、ハイブリドーマ細胞、および本発明のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞を含有する培養物が企図される。
【００４１】
またファージ表示（ｐｈａｇｅ ｄｉｓｐｌａｙ）法を使用して、本発明のポリペプチドに対して反応性の抗体を単離することができる。細菌に感染するウイルス（バクテリオファージまたはファージ）の表面上の抗体断片の表示は、広範な親和性と動力学特性を有するヒトｓＦｖを産生することを可能にする。ファージの表面上の抗体断片を表示（ファージ表示（ｐｈａｇｅ ｄｉｓｐｌａｙ））するために、抗体断片遺伝子が、ファージ表面タンパク質（ｐＩＩＩ）をコードする遺伝子中に挿入され、抗体断片−ｐＩＩＩ融合タンパク質が、ファージ表面上で発現される（マカファーティ（ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ）ら（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ， ３４８：５５２−５５４；フーゲンブーム（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ）ら（１９９１）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， １９：４１３３−４１３７）。例えば、抗リゾチーム抗体（Ｄ１．３）のＶＨおよびＶＬドメインをコードするｓＦｖ遺伝子を、ファージ遺伝子ｐＩＩＩに挿入して、ｐＩＩＩのＮ末端に結合したＤＩ．３ ｓＦｖを有するファージが産生され、こうしてリゾチームに結合することができる「融合」ファージを産生する（マカファーティ（ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ）ら（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ， ３４８：５５２−５５４）。さらなる詳細については当業者は、クラックソン（Ｃｌａｃｋｓｏｎ）ら（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ， ３５２：６２４−６２８）、（マークス（Ｍａｒｋｓ）ら（１９９２）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， １０：７７９−７８３）、マークス（Ｍａｒｋｓ）ら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， １０：７７９−７８５ （１９９２） も参照されたい。この場合、抗体断片遺伝子は、免疫哺乳動物から単離され、ファージ表示系（ｐｈａｇｅ ｄｉｓｐｌａｙ ｓｙｓｔｅｍ）に挿入される。次に、ポリペプチドに反応性の抗体を含有するファージが単離され、公知の技術を使用して性状解析される。ケンブリッジ抗体技術グループｐｌｃ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｇｒｏｕｐ ｐｌｃ）（英国）のような公知のところから、ファージ表示（ｐｈａｇｅ ｄｉｓｐｌａｙ）により抗体を生成するためのキットとサービスが得られる。
【００４２】
別の実施態様は、「キメラ」抗体であり、ここでは、重鎖および／または軽鎖の一部は、特定の種から得られるかまたは特定の抗体クラスまたはサブクラスに属する抗体中の対応する配列と、同一であるかまたは相同的であり、鎖の残りの部分は、別の種から得られるかまたは別の抗体クラスまたはサブクラスに属する抗体中の対応する配列と、同一であるかまたは相同的である。また、所望の生物活性を示す限り、このような抗体の断片も含まれる。米国特許第４，８１６，５６７号；モリソン（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ）ら、１９８５， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ８１：６８５１−５５を参照されたい。
【００４３】
別の実施態様において本発明のモノクローナル抗体は、「ヒト化」抗体である。非ヒト抗体をヒト化する方法は、当該分野で公知である。米国特許第５，５８５，０８９号および５，６９３，７６２号を参照されたい。一般に、ヒト化抗体は、ヒトではない供給源から、そこに導入された１つ以上のアミノ酸残基を有する。ヒト化は例えば、当該分野で記載されている方法を使用して（ジョーンズ（Ｊｏｎｅｓ）ら、１９８６、Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５２２−２５；リーチマン（Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ）ら、１９９８、Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３−２７；バーホーエン（Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ）ら、１９８８、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：１５３４−３６）、ヒト抗体の対応する領域の代わりに、げっ歯類の相補性決定領域（ＣＤＲ）の少なくとも一部を使用して、行うことができる。
【００４４】
また、ポリペプチドに結合するヒト抗体が本発明に包含される。内因性免疫グロブリン産生の非存在下で、ヒト抗体のレパートリーを産生することができるトランスジェニック動物（例えば、マウス）を使用して、随時担体に結合したポリペプチド抗原（すなわち、少なくとも６個の連続アミノ酸を有する）で免疫して、そのような抗体が産生される。例えば、ジャコボビッツ（Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ）ら、１９９３、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ９０：２５５１−５５；ジャコボビッツ（Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ）ら、１９９３、Ｎａｔｕｒｅ ３６２：２５５−５８；ブルッガーマン（Ｂｒｕｇｇｅｒｍａｎｎ）ら、１９９３、Ｙｅａｒ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏ． ７：３３を参照されたい。ある方法において、重鎖および軽鎖免疫グロブリンをコードする内因性遺伝子座を無能化し、ヒト重鎖および軽鎖タンパク質をコードする遺伝子座をそのゲノム中に挿入することにより、そのようなトランスジェニック動物が作成される。次に、部分的に修飾した動物（すなわち、完全ではない修飾を有するもの）を異種交配して、所望の免疫系修飾のすべてを有する動物を得る。免疫原を投与すると、これらのトランスジェニック動物は、ヒト（例えば、マウスではない）アミノ酸配列を有する抗体（これらの抗原に対して免疫特異的な可変領域を含む）を産生する。ＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ９６／０５９２８号およびＰＣＴ／ＵＳ９３／０６９２６号を参照されたい。追加の方法は、米国特許第５，５４５，８０７号、ＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ９１／２４５号およびＰＣＴ／ＧＢ８９／０１２０７号、およびＥＰ公報５４６０７３Ｂ１号および５４６０７３Ａ１号に記載されている。ヒト抗体はまた、宿主細胞中で組換えＤＮＡを発現することにより、または本明細書に記載のようにハイブリドーマ細胞中で発現することにより、産生することができる。
【００４５】
別の実施態様において、ヒト抗体は、ファージ表示（ｐｈａｇｅ ｄｉｓｐｌａｙ）ライブラリーから産生することもできる（フーゲンブーム（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ）ら、１９９１、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２２７：３８１；マークス（Ｍａｒｋｓ）ら、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２２２：５８１）。これらのプロセスは、繊維性バクテリオファージの表面上に抗体レパートリーの表示による免疫選択、および目的の抗原への結合によるファージの以後の選択を模倣する。そのような方法の１つが、ＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ９８／１７３６４号に記載されており、これは、そのようなアプローチを使用して、ＭＰＬ−およびＭＳＫ−受容体の高親和性および機能性アゴニスト性抗体の単離を記載する。
【００４６】
キメラ、ＣＤＲ移植、およびヒト化抗体は、典型的には組換え法により産生される。抗体をコードする核酸が、宿主細胞に導入され、本明細書に記載の材料と方法を使用して発現される。好適な実施態様において、抗体は、哺乳動物宿主細胞（例えば、ＣＨＯ細胞）中で産生される。モノクローナル（例えば、ヒト）抗体は、宿主細胞中で組換えＤＮＡを発現することにより、または本明細書に記載のハイブリドーマ細胞中で発現することにより産生してもよい。
【００４７】
本発明の抗ポリペプチド抗体は、ポリペプチドの検出と定量のために、例えば、競合結合測定法、直接および間接サンドイッチ測定法、および免疫沈降測定法（ソラ（Ｓｏｌａ）、モノクローナル抗体：技術のマニュアル、１４７−１５８（シーアールシープレスインク（ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ．）、１９８７）のような任意の公知の測定法で使用される。抗体は、使用される測定法に適した親和性で、ポリペプチドに結合するであろう。
【００４８】
本発明の結合物質は、治療薬として使用してもよい。これらの治療薬は一般に、ポリペプチドの少なくとも１つの生物活性を増強または低下させる点で、それぞれアゴニストまたはアンタゴニストである。ある実施態様において本発明のアンタゴニスト抗体は、ポリペプチドに特異的に結合することができ、かつポリペプチドの機能活性をインビボまたはインビトロで阻害または排除することができる、抗体またはその結合断片である。好適な実施態様において、結合物質（例えば、アンタゴニスト抗体）は、ポリペプチドの機能活性を、少なくとも約５０％、および好ましくは少なくとも約８０％阻害するであろう。別の好適な実施態様において、結合物質は、ポリペプチド結合パートナー（リガンドまたは受容体）と相互作用して、ポリペプチド活性をインビトロまたはインビボで阻害または排除することができる、抗ポリペプチド抗体でもよい。アゴニストおよびアンタゴニスト抗ポリペプチド抗体を含む結合物質は、当該分野で公知のスクリーニング測定法により同定される。
【００４９】
前述したように、結合物質は抗体分子を含有してもよい。本発明の抗体は典型的には、哺乳動物を、本発明のタンパク質、タンパク質断片、またはペプチド（すなわち、タウ、ＡＰＰ、ｔａｕ２３１Ｐ、ＡＰＰ６６８Ｐ）（まとめてポリペプチドと呼ぶ）を含有する接種物質で免疫して、こうして、免疫ポリペプチドに対して免疫特異性を有する哺乳動物抗体分子を誘導することにより、産生される。次に抗体分子を哺乳動物から採取し、公知の方法（例えば、ＤＥＡＥセファロースまたはプロテインＧ）を使用して所望の程度まで単離してＩｇＧ画分を得る。
【００５０】
ｔａｕ２３１Ｐ、ＡＰＰ６６８Ｐ、および／またはこれらを代表するホスホペプチドに結合することができる抗体の例を、本明細書に提示する。例えば、ＡＴ１８０、ＴＧ３、ＣＰ９、ＣＰ１０、ＣＰ１６、ＣＰ１７、ＧＦ１、ＧＦ７、ＧＦ２５、ＭＣ２、ＧＦ１０、ＧＦ１１、ＧＦ２０、ＧＦ２７、ＧＦ３、ＧＦ５、ＧＦ３１、およびポリクローナル抗体（スズキ（Ｓｕｚｕｋｉ）ら、アルツハイマー病アミロイド前駆体タンパク質のリン酸化と代謝の細胞周期依存性制御、ＥＭＢＯ Ｊ． １３：１１１４−１１２２， １９９４）が、本明細書に提示されるか、または当該分野で既に記載されている。これらの抗体は、ｔａｕ２３１Ｐ、ＡＰＰ６６８Ｐ、および／またはこれらを代表するホスホペプチドに結合するのに有用である。特に、ＭＣ２は、リン酸化タウとＡＰＰの両方に結合する。ＧＦ１０、ＧＦ１１、ＧＦ２０、およびＧＦ２７は、好ましくはＡＰＰ６６８Ｐに結合する。抗体ＧＦ３とＧＦ５は、好ましくはｔａｕ２３１Ｐに結合する。ＧＦ３１は、ｔａｕ２３１ＰまたはＡＰＰ６６８Ｐに対応するペプチドに結合することができる。ｔａｕ２３１Ｐ、ＡＰＰ６６８Ｐ、および／またはその代表的ホスホペプチドに結合するのに適した、本発明の実施に有用な、他の多くの抗体がある。そのような抗体分子は、本発明に包含される。
【００５１】
ある実施態様において本発明は、適当な結合物質の同定法を提供する。例えば本発明は、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、これらの断片、またはこれらの誘導体；第２のタンパク質、ポリペプチド、ペプチド、これらの断片、またはこれらの誘導体（すなわち、第１のタンパク質と相互作用するタンパク質、またはその適当な結合代用物）；試験結合物質を一緒にし；そして第１と第２のタンパク質、ポリペプチド、ペプチド、これらの断片、またはこれらの誘導体の相互作用を検出して、試験結合物質が相互作用を妨害するかどうかを決定する方法を提供する。
【００５２】
ある実施態様において、第１と第２のタンパク質、タンパク質断片またはペプチドが相互作用する（すなわち、互いに結合する）条件下で、成分を一緒にして単一の反応混合物とする。試験結合物質を含有しない対照試料を使用してもよい。試験結合物質とともに、第１と第２のタンパク質、タンパク質断片またはペプチドを含有する別の試料を調製してもよい。第１のタンパク質、または断片、またはペプチドへの、第２のタンパク質、ポリペプチド、ペプチド、これらの断片、またはこれらの誘導体の結合の、試験結合物質による阻害は、結合物質がさらなる試験をする資格があることを示す。実験試料中の結合レベルを対照試料と比較して、相互作用が阻害、増強、または影響を受けたかどうかを調べてもよい。ある実施態様において、第１のタンパク質、タンパク質断片またはペプチドへの、第２のタンパク質、タンパク質断片またはペプチドの結合の、試験結合物質による阻害は、結合物質がさらなる試験をする資格があることを示す。別の実施態様において、第１のタンパク質、タンパク質断片またはペプチドへの、第２のタンパク質、タンパク質断片またはペプチドの結合の、試験結合物質による増強は、結合物質がさらなる試験をする資格があることを示す。種々の反応条件を試験して、第１と第２のタンパク質、タンパク質断片またはペプチドの相互作用における試験結合物質の作用を調べてもよい。さらに、本発明の実施において、第１と第２のタンパク質、タンパク質断片またはペプチドの任意の組合せを使用してもよい。例えば、反応の第１のポリペプチドメンバーがタンパク質で、反応の第２のポリペプチドメンバーがペプチドでもよい。これらの実施態様の他の変法は、当業者により理解されるであろう。
【００５３】
ある実施態様において測定法は、別のポリペプチドまたは結合代用物が結合する基質として、タンパク質、タンパク質断片またはペプチドを使用する。ある実施態様において、タウ、ＡＰＰ、および／またはｃｄｃ２５の少なくとも一部と類似したアミノ酸配列を有するペプチドが使用される。アミノ酸の類似性は、複数のペプチド中にある（すなわち、タウと類似性を有するペプチドＡ、ＡＰＰと類似性を有するペプチドＢ、およびｃｄｃ２５と類似性を有するペプチドＣ）か、またはタウ、ＡＰＰおよび／またはｃｄｃ２５の１つ以上と同一性の領域を有する単一のペプチドにあってもよい。好適な実施態様において、ペプチドは、少なくとも、タウのｔｈｒ２３１（「ｔｈｒ２３１」）、ＡＰＰのｔｈｒ６６８（「ｔｈｒ６６８」）、ｃｄｃ２５のｔｈｒ４８（「ｔｈｒ４８」）を含む。より好適な実施態様において、ペプチドは、ｔｈｒ２３１および／またはｔｈｒ６６８および／またはｔｈｒ４８を、これらの部位を囲む天然に存在するアミノ酸残基とともに含む。さらに好適な実施態様において、ペプチドは、ｔｈｒ２３１および／またはｔｈｒ６６８および／またはｔｈｒ４８に対応するアミノ酸でリン酸化される。ペプチドの例は、特に限定されないが、ビオチン−ＫＫＶＡＶＶＲ（ホスホ）ＴＰＰＫＳＰＳＳ（配列番号１）（ｔａｕ２３１Ｐに対応する）、ビオチン−ＶＥＶＤＡＡＶ（ホスホ）ＴＰＥＥＲＨＬＳ（配列番号２）（ＡＰＰ６６８Ｐに対応する）、またはビオチン−ＶＣＰＤＶＰＲ（ホスホ）ＴＰＶＧＫＦＬＧ（配列番号３）（ｃｄｃ２５−４８Ｐに対応する）を含む。当業者は理解できるように、任意の適当なタンパク質、タンパク質断片またはペプチドが使用できる。
【００５４】
第２のタンパク質、タンパク質断片、ポリペプチドまたはペプチドもまた、本発明の実施に使用することができる。第２のタンパク質、タンパク質断片、ポリペプチドまたはペプチドは、第１のタンパク質、タンパク質断片、ポリペプチドまたはペプチドと相互作用することが好ましい。第２のタンパク質、タンパク質断片、ポリペプチド、ペプチド、これらの断片またはこれらの誘導体は、インビボで存在するように、修飾された型（すなわち、リン酸化、硫酸化、グリコシル化など）の第１のタンパク質、タンパク質断片またはペプチドと相互作用することが、好ましい。この修飾は、例えば組換え発現系で、そのような第１のタンパク質、ポリペプチド、ペプチド、これらの断片またはこれらの誘導体の必要後に、または第１のタンパク質、ポリペプチド、ペプチド、これらの断片またはこれらの誘導体の合成生産後にインビトロ法を使用してもよい。そのような修飾は当該分野で公知であり、本発明に包含される。
【００５５】
ペプチドがタウ、ＡＰＰまたはｃｄｃ２５から得られる好適な実施態様において、ペプチドとのタンパク質の相互作用は、ｔｈｒ２３１および／またはｔｈｒ６６８および／またはｔｈｒ４８に関連している。さらに好適な実施態様において、タンパク質はｔａｕ２３１Ｐおよび／またはＡＰＰ６６８Ｐおよび／またはｃｄｃ２５−４８Ｐと相互作用する。本法で使用されるタンパク質の例は、Ｐｉｎ１である（例えば、ＡＴＣＣ＃５５５７８４のコード配列を参照されたい）。
【００５６】
結合代用物の例は、Ｐｉｎ１のような第２のタンパク質に対応する、ペプチドのような化合物である。「対応する」とは、結合代用物が、第１のタンパク質、タンパク質断片、ポリペプチドまたはペプチドに、例えばＰｉｎ１と同じかまたは似た部位で結合することを意味する。結合代用物は、対応するタンパク質と同じ配列を有しても有さなくてもよい。例えば、結合代用物は、Ｐｉｎ１と配列同一性を共有するか、または異なる配列であるが同じかまたは類似の生物活性を有するものでもよい。従って結合代用物は、第２のタンパク質（すなわち、Ｐｉｎ１）のように、第１のタンパク質、タンパク質断片、ポリペプチドまたはペプチドと同じかまたは類似の相互作用を形成することができる。いくつかの実施態様において、結合代用物はまた、第２のタンパク質自体（すなわち、Ｐｉｎ１）、またはその断片もしくは誘導体でもよい。他の好適な実施態様において、結合代用物は、抗体、例えばモノクローナル抗体またはポリクローナル抗血清でもよい。他の適当な結合代用物は、当業者により理解されるであろう。
【００５７】
上記したように、Ｐｉｎ１はまたタウおよびＡＰＰと相互作用することが知られている。例えばＰｉｎ１はタウのリン酸化スレオニン２３１に結合することが知られている。さらに、Ｐｉｎ１は、タウならびにＡＰＰから得られたホスホペプチドに結合することが知られている。本発明は、Ｐｉｎ１のようなタンパク質と、タウおよびＡＰＰのようなタンパク質との相互作用を妨害する結合物質を同定するための試薬と方法を提供する。タウおよびＡＰＰと、タンパク質との相互作用はＡＤと相関しているため、そのような相互作用の防止または妨害は、疾患を有するものが望むものである。結合物質の例は、抗体ＧＦ３であり、これは、ｔａｕ２３１ＰまたはＡＰＰ６６８Ｐに対応するペプチドに結合し、Ｐｉｎ１とこれらのペプチドとの結合を妨害する。他の適当な結合物質もまた、本発明により包含される。
【００５８】
タンパク質と、ｔｈｒ６６８Ｐを含有するＡＰＰのＣ末端領域との相互作用を妨害する結合物質は、ＡＰＰのタンパク質分解処理に大きな影響を与え、従って４０〜４２アミノ酸ペプチドの産生に大きな影響を与えると予測される。そのような結合物質は、アルツハイマー病の病理の進行速度を遅らせるのに有用である可能性がある。適切なスレオニンの領域中でのタウとＡＰＰとの構造の類似性のために、両方の部位と相互作用する結合物質が同定される可能性がある。そのような結合物質は、そのような構造の形成に関与する主要なタンパク質の両方に影響を与えることにより、異常病的構造（プラークともつれ）の進展を防止または遅延させると予測されるため、ＡＤの他の可能な治療法に対して大きな利点を有するであろう。
【００５９】
本明細書で提供される方法はまた、ｃｄｃ２５の機能を妨害する結合物質の同定に関する。
【００６０】
ある実施態様において、本発明は、これらの経路に影響を与える結合物質に関する。Ｐｉｎ１とｃｄｃ２５との結合を阻害する結合物質が好ましい。Ｐｉｎ１タンパク質自体または適当な結合代用物を使用して、そのような結合物質を同定してもよい。例えば、Ｐｉｎ１とｃｄｃ２５は、タンパク質間の相互作用が起きるのに適した条件下でインキュベートしてもよい。次に試験結合物質を加え、Ｐｉｎ１とｃｄｃ２５との相互作用に及ぼす試験結合物質の作用を測定する。相互作用は、例えば試験結合物質の存在下または非存在下でｃｄｃ２５に結合したＰｉｎ１の量を検出することにより測定される。試験結合物質に暴露した後のｃｄｃ２５に結合したＰｉｎ１の量の低下は、その結合物質が好ましいものであり、Ｐｉｎ１とｃｄｃ２５との相互作用を阻止するのに有用であることを示す。他の実施態様において、Ｐｉｎ１の配列または結合活性に対応するペプチドのような結合代用物を使用してもよい。適当なペプチドは、Ｐｉｎ１結合ドメインまたはＰｉｎ１の結合を模倣するドメインを有するもの、例えばモノクローナル抗体またはその誘導体（すなわち、Ｆａｂ断片）であろう。そのようなペプチドは、Ｐｉｎ１とほぼ同様にｃｄｃ２５と相互作用するなら、適しているであろう。この測定法の他の変法は、当業者により理解されるであろう。
【００６１】
ある実施態様において、第１のタンパク質、タンパク質断片、ポリペプチドまたはペプチドは、ビオチンまたは他の適当な標識物で標識される。例えば標準的方法を使用して、ｔａｕ２３１Ｐ、ＡＰＰ６６８Ｐ、またはｃｄｃ２５４８Ｐを含むペプチドを、ビオチンで標識してもよい。次に、ビオチン化ペプチドは、アビジン被覆反応容器（例えば、９６ウェルプレート）に結合させる。第１のタンパク質、ポリペプチド、ペプチド、これらの断片またはこれらの誘導体（すなわち、ｔａｕ２３１Ｐ、ＡＰＰ６６８Ｐ、またはｃｄｃ２５４８Ｐ）は、例えばリン酸化により、標準的方法を使用して単離されるかまたはインビトロで修飾される（ジチャ（Ｊｉｃｈａ）ら、アルツハイマー病のもつれ繊維対を認識するコンフォメーションとリン酸化依存性抗体、Ｊ． Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ． ６９， ２０８７−２０９５， １９９７）。他の適当な標識物および標識法も使用でき、これらは当該分野で公知である。
【００６２】
反応は好ましくは、マイクロタイタープレートのような適当な容器中で起きる。好ましくはプレートは、少なくとも９６ウェルを有するが、より多くのウェル（例えば、３８４ウェルまたは１５２６ウェル）を有するプレートも、大量スクリーニング測定法に適している。プレートは好ましくは、適当な固体かつ不活性な物質（例えば、ポリスチレンまたはポリプロピレン）で作成される。本発明を実施するのにプレートを使用する前に、アビジン、ストレプトアビジンなどの物質で被覆してもよい。これは、第１のタンパク質が例えばビオチンで標識されている場合に、特に有用である。
【００６３】
ＡＤまたは癌のような疾患の診断、予防または治療で使用するために、本発明の結合物質は、経口的、非経口的に、吸入噴霧により、直腸的に、または局所的に、通常の薬剤学的に許容される担体、アジュバントおよびビヒクルを含有する用量単位調製物として投与される。本明細書において非経口という用語は、皮下、静脈内、筋肉内、動脈内、注入法、または腹腔内を含む。薬剤の直腸投与のための坐剤は、薬剤を適当な非刺激性賦形剤（例えば、常温では固体であり、直腸温度で液体となり、従って直腸中で溶けて薬剤を放出する、カカオバターおよびポリエチレングリコール）と混合することにより調製することができる。
【００６４】
本発明の結合物質および本発明の組成物で神経疾患を治療するための投与法は、例えば疾患のタイプ、患者の年齢、体重、性、医学的症状、症状の重症度、投与経路、および使用される特定の化合物のような種々の因子に基づく。従って投与法は、大きく変化するが、標準的方法を使用してルーチンで決定することができる。
【００６５】
本発明の薬剤活性のある結合物質（すなわち、化合物）は、薬剤学の常法に従って処理して、患者（ヒトおよび他の哺乳動物を含む）に投与するための医薬を製造することができる。経口投与のために、医薬組成物は、例えばカプセル剤、錠剤、懸濁剤、または液剤の形でもよい。医薬組成物は、好ましくは一定量の結合物質を含有する単位服用型で作成される。ヒトまたは他の哺乳動物のための適切な１日用量は、患者の症状および他の要因により大きく変化するが、再度、ルーチン法で決定することができる。結合物質はまた、食塩水、ブドウ糖、または水を含む適当な担体との組成物として注射により投与してもよい。
【００６６】
適当な分散剤または湿潤剤および懸濁剤を使用して、公知の方法に従って、注射調製物（例えば、無菌の注射可能な水性または油性懸濁物）を調製してもよい。無菌の注射調製物はまた、非毒性の非経口的に許容される希釈剤または溶媒（例えば、１，３−ブタンジオール中の溶液）主の無菌注射溶液または懸濁剤でもよい。使用される許容されるビヒクルおよび溶媒には、水、リンゲル液、および等張の塩化ナトリウム溶液がある。さらに、無菌の固定油が常法により、溶媒または懸濁媒体として使用される。この目的のために、任意の無刺激の固定油（合成のモノ−またはジグリセリドを含む）が使用される。さらに、オレイン酸のような脂肪酸が、注射剤の調製に使用される。
【００６７】
本発明の結合物質の活性成分の適当な局所的用量は、１日に１〜４回、好ましくは２回または３回投与される。局所的投与のために、結合物質は、０．００１％〜１０％ｗ／ｗ、１％〜２重量％の調製物を含有してもよいが、最大１０％ｗ／ｗを含有してもよいが、好ましくは５％ｗ／ｗ以下、およびさらに好ましくは製剤の０．ｌ％〜１％である。局所的投与に適した製剤は、皮膚の通過に適した液体または半液体調製物（例えば、塗布剤、ローション剤、軟膏剤、クリーム剤、またはペースト剤）、および目、耳、または鼻への投与に適した滴剤がある。
【００６８】
医薬組成物は、固体型（顆粒、粉末または坐剤を含む）、または液体型（例えば、溶液、懸濁液、またはエマルジョン）で作成してもよい。医薬組成物は、滅菌のような通常の薬剤的操作を受けるか、および／または保存剤、安定剤、湿潤剤、乳化剤、緩衝剤などの通常アジュバントを含有してもよい。経口投与用の固体剤形には、カプセル剤、錠剤、丸剤、散剤、および顆粒剤がある。そのような固体剤形において、活性化合物は、少なくとも１つの不活性希釈剤（例えば、ショ糖、乳糖、またはデンプン）と混合してもよい。そのような剤形はまた、常法に従って、不活性希釈以外の追加の物質（例えば、ステアリン酸マグネシウムのような滑沢剤）を含有してもよい。カプセル剤、錠剤、および丸剤の場合、剤形は緩衝剤を含有してもよい。錠剤と丸剤は、さらに腸溶コーティングで調製してもよい。経口投与用の液体剤形は、薬剤学的に許容されるエマルジョン、液剤、懸濁剤、シロップ剤、およびエリキシル剤があり、当該分野で通常使用される不活性希釈剤（例えば、水）を含有する。そのような組成物はまた、アジュバント（例えば、湿潤剤、甘味剤、香味剤、および芳香剤）を含有してもよい。
【００６９】
本発明の結合物質は、単一の活性薬物として投与することができるが、本発明の１つ以上の化合物または他の物質と組合せて使用してもよい。組合せとして投与される時、治療薬は、同時にまたは異なる時に与えられる別の組成物として調製するか、または治療薬は、単一の組成物として与えることができる。
【００７０】
例
例１
タウのホスホスレオニン２３１（ｔａｕ２３１Ｐ）および／またはＡＰＰのホスホスレオニン６６８（ＡＰＰ６６８Ｐ）に結合する抗体
Ａ．材料と方法
スレオニン２３１上でリン酸化されたタウペプチドに結合する化合物を同定するために、９６ウェルプレートまたは３８６ウェルプレートを、２０ｍＭ　Ｋ２ＨＰＯ４／１０ｍＭ　ＫＨ２ＰＯ４、１ｍＭ　ＥＤＴＡ、０．８％　ＮａＣｌ、０．０１％　ＮＡＮ３（ｐＨ７．２）中のノイラビジン（Ｎｅｕｒａｖｉｄｉｎ）で、タンパク質濃度５μｇ／ｍｌを使用して被覆する。ＥＬＩＳＡプレート中のすべての容量は、５０μｌであるが、保存の場合は、２００μｌを加える。被覆後、プレートを、２％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有する１０ｍＭトリス塩基、１５０ｍＭ　ＮａＣｌ（ｐＨ７．４）（ＴＢＳ）でインキュベートし、４℃で保存する。こうして調製したプレートは、数週間安定である。
【００７１】
タンパク質タウから得られるペプチドは、以下を使用した：
ビオチン−ＫＫＶＡＶＲ（ホスホ）ＴＰＰＫＳＰＳＳ（配列番号１）
ペプチドを、２％ＢＳＡを含有するＴＢＳ中で０．５マイクロモルの濃度に希釈し、５０μｌ／ウェルを加え、次に室温で１時間インキュベートした。非結合ペプチドを、０．５％ツイーン２０を含有するＴＢＳで洗い流す。結合について試験する化合物を、１００マイクロモル〜０．０１ナノモルの範囲の濃度でＴＢＳと混合し、各ウェルに５０μｌを加える。室温で１時間後、非結合化合物を吸引して除去する。ホスホエピトープと特異的に反応する抗体溶液を、プレートの各ウェルに加える。この点で有用な抗体は、ＡＴ１８０、ＴＧ３、ＣＰ９、ＣＰ１０、ＣＰ１６、ＣＰ１７、ＧＦ１、ＧＦ３、ＧＦ５、ＧＦ２５、およびＧＦ３１である。上記と実質的に類似の配列を含有するホスホペプチドに対して産生したポリクローナル抗体も有用である。室温で３０分後、非結合抗体を、０．５％ツイーン２０を含有するＴＢＳで洗い流す。西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）に結合したヤギ抗マウスＩｇまたはヤギ抗ウサギＩｇの溶液（１％ＢＳＡ含有ＴＢＳ中２μｇ／ｍｌ）とインキュベートし、過剰の抗体を、０．５％ツイーン２０を含有するＴＢＳで洗い流すことにより、結合抗体が検出される。着色産物または蛍光産物を生成することができる基質（すなわち、ＡＢＴＳ基質溶液（バイオラッドラボラトリーズ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、ヘーキュレス（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ）、カリホルニア州））を添加して、ＨＲＰ活性を測定する。ペプチドのリン酸化エピトープに結合した化合物は、抗体がこの部位に近づくことを妨害し、色の形成を低下させる。
【００７２】
タウのホスホスレオニン２３１への化合物の結合の特異性は、同じ方法を使用して確立されるが、ｔａｕ２３１ホスホペプチドは、タウまたは他のタンパク質の配列から得られる無関係のホスホペプチドで置換され、これらの配列に結合する化合物が、適当な抗体により測定される。有用なホスホペプチド／モノクローナル抗体の組合せ例は以下の通りである：
ＡＴＲＩＰＡＫ（ホスホ）ＴＰＰＡＰＫＴＰ（タウ１７５Ｐ；配列番号４）、ＣＰ１８により結合
ＳＧＹＳＳＰＧ（ホスホ）ＳＰＧＴＰＧＳＲ（タウ２０２Ｐ；配列番号５）、ＣＰ１３により結合
ＧＳＲＳＲＴＰ（ホスホ）ＳＬＰＴＰＰＴＲ（タウ２１４Ｐ；配列番号６）、ＣＰ３により結合
ＤＴＳＰＲＨＬ（ホスホ）ＳＮＶＳＳＴＧＳ（タウ４０９Ｐ；配列番号７）、ＰＧ５により結合
【００７３】
これらのホスホペプチドは、上記の方法と同じ方法を使用して、適切な抗体を使用して、ｔａｕ２３１Ｐペプチドの代わりに使用され、随時ビオチン化されてよい。ｔａｕ２３１Ｐに特異的に結合した化合物は、配列番号５〜８には結合せず、従って、適切な抗体の結合を低下させるであろう。
【００７４】
ＡＰＰの配列に対応するホスホペプチドを使用して、上記方法を実施することも可能である。１つのそのようなペプチドの配列を以下に示す：
ビオチン−ＶＥＶＤＡＡＶ（ホスホ）ＴＰＥＥＲＨＬＳ（配列番号２）
【００７５】
ＴＧ３抗体の代わりに、ＡＰＰのホスホスレオニンに特異的なモノクローナル抗体が使用される。上記のものと同じ抗体検出試薬と方法が使用される。この点で有用な抗体の例は、特に限定されないが、ＧＦ１、ＧＦ３、ＧＦ５、ＧＦ７、ＧＦ１２、ＧＦ２５、およびＧＦ３１である。実質的に類似のホスホペプチドに対して反応性のポリクローナル抗体も有用である。
【００７６】
別の方法は、ｃｄｃ２５から得られるホスホペプチドに関する。上記と同じ方法が使用されるが、ホスホペプチドはｃｄｃ２５から得られ、例えば以下のものである。
ビオチン−ＶＣＰＤＶＰＲ（ホスホ）ＴＰＶＧＫＦＬＧ（配列番号３）
【００７７】
ＴＧ３抗体の代わりに、ｃｄｃ２５のホスホスレオニン４８に特異的なモノクローナル抗体が、同じ抗体試薬と方法とともに使用される。この点で有用な抗体の例は、特に限定されないが、ＧＦ１とＧＦ２５である。実質的に類似のホスホペプチドに対して反応性のポリクローナル抗体も有用である。
【００７８】
Ｂ．実験結果
スレオニン２３１の近くのタウの領域（ｔｈｒ２３１）とスレオニン６６８の近くのＡＰＰの領域（ｔｈｒ６６８）の間に存在する構造的類似性は、両方の部位を含む合成ホスホペプチドへの、モノクローナル抗体ＭＣ２の結合により初めて証明された（図１）。同様に、タンパク質Ｐｉｎ１は、両方のタンパク質から得られたホスホペプチドに結合する（図２）。このデータは、本来はほとんどまたは全く配列相同性を持たないタンパク質からのこれらの２つの領域の間の構造類似性の強い証拠を提供する。タンパク質のこれらの領域は、同様のコンフォメーションを取らなければならず、スレオニン６６８の周りのＡＰＰタンパク質の領域は、逆ベータ回転構造を取るという公表された証拠（シェン（Ｓｈｅｎ）ら、基本的な有糸分裂性ペプチジル−プロリルイソメラーゼＰｉｎ１は有糸分裂特異的ホスホタンパク質に結合しかつ制御する、Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ． １２， ７０６−７２０， １９９８）があり、スレオニン２３１の周りのタウの領域に、同じ構造的特徴が存在するという証拠が得られている。
【００７９】
タウとＡＰＰタンパク質のそれぞれｔｈｒ２３１とｔｈｒ６６８領域をさらに調べるために、当業者に公知のようにＫＬＨに結合した合成ホスホペプチドを使用して、タウのホスホスレオニン２３１部位とＡＰＰのホスホスレオニン６６８部位の両方に対するモノクローナル抗体を作成した。ｔｈｒ６６８Ｐ部位に対する抗体は開示されている（スズキ（Ｓｕｚｕｋｉ）ら、アルツハイマー病アミロイド前駆体タンパク質のリン酸化と代謝の細胞周期依存性制御、ＥＭＢＯ Ｊ． １３：１１１４−１１２２， １９９４）。
【００８０】
抗体ＧＦ１０、ＧＦ１１、ＧＦ２０、およびＧＦ２７は、ｔｈｒ２３１ホスホペプチドを認識することなく、ＡＰＰ６６８ホスホスレオニンホスホペプチドを特異的に認識する（図３）。追加の「ＭＣ２様」抗体（すなわち、ＧＦ３とＧＦ５）は、両方の配列を認識することがわかった（図４）。ＡＴ１８０、ＴＧ３、ＣＰ９、ＣＰ１０、ＣＰ１６、ＣＰ１７、ＧＦ１、およびＧＦ２５に含まれるｔａｕ２３１Ｐを特異的に認識する別のシリーズの抗体が入手できる。
【００８１】
本明細書に記載のいくつかの抗体（すなわち、ＧＦ３、ＧＦ５、およびＧＦ３１）は、ｔａｕ２３１Ｐとｔｈｒ６６８Ｐ部位の両方を認識したが、試験したいくつかの他のホスホペプチドは認識しなかった。これらの結果は、これらの部位の間にアミノ酸配列相同性が無いにもかかわらず、これらのホスホエピトープが、コンフォメーションの類似性を共有する可能性が高いことを示唆する。タウとＡＰＰのこれらの領域からのペプチドコンフォメーションのＮＭＲ試験は、両方のペプチドの構造に異常な逆ベータ回転があることを示唆する（クレンケ（Ｋｒｏｅｎｋｅ）ら、ベータアミロイド前駆体タンパク質の細胞質ドメイン配列を含有するペプチドの溶液コンフォメーション、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３６， ８１４５−８１５２， １９９７；ウィーバー（Ｗｅａｖｅｒ）ら、ＮＭＲスペクトル法により解明されたアルツハイマー病のモノクローナル抗体ＴＧ３反応性と特異性のためのコンフォメーション要件。Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ， 抄録＃４４８．１０、１９９９）。
【００８２】
ＡＰＰのｔｈｒ６６８ホスホエピトープに対するモノクローナル抗体ＧＦ７は、ＡＤ症例の脳組織の特異的染色を示す。標識は神経内であり、ｔａｕ２３１ホスホエピトープ特異的抗体ＴＧ３を用いた染色を示すことが知られている領域と同じ領域中に見いだされる。ＡＤ症例からの組織を使用した２重標識免疫細胞化学は、両方のホスホエピトープが海馬の同じニューロンに蓄積することを示す（データは示していない）。このデータは、タウとＡＰＰの両方が、アルツハイマー病の過程の初期にｃｄｃ２５（または類似のキナーゼ）によりリン酸化されることを強く示唆する。
【００８３】
例２
ｔａｕ２３１Ｐおよび／またはＡＰＰ６６８Ｐに結合する化合物を同定するための測定法
タウとＡＰＰホスホエピトープの見かけの類似性のために、Ｐｉｎ１がｃｄｃ２５によるリン酸化後に、両方のタンパク質に結合するかどうかを調べる研究を行った。スレオニン２３１の近くの他配列とスレオニン６６８の近くのＡＰＰの両方から得られるホスホペプチドは両方とも、高い親和性でＰｉｎ１に結合する。この事実は、Ｐｉｎ１と、タウおよびＡＰＰとの相互作用を妨害する結合物質を同定するための測定法の開発に結びついた。
【００８４】
タウとＡＰＰホスホペプチドがビオチン化され、ノイトラビジン（Ｎｅｕｔｒａｖｉｄｉｎ）被覆９６ウェルＥＬＩＳＡプレート上に固定化した測定法を確立した。ＧＦ３１抗体は、ｔａｕ２３１Ｐよりは低い親和性で、ｔａｕ２３１ＰとＡＰＰ６６８Ｐホスホペプチドの両方を認識する（図５Ａ）。タウホスホペプチドに対するこの低い親和性は、極めて高感度の測定法（ここで、このビオチン化ペプチドの低濃度（３０ｎＭ）は、ノイトラビジン被覆９６ウェルプレートとインキュベートされる）を開発することにより、利用されている。５ｎＭ範囲のＧＦ３１の濃度は、そのようなプレート上の強固なシグナルを与え、結合は、タウペプチドに対して高親和性を有する抗体ＴＧ３の存在に対して、非常に高感度である（図５Ｂ）。測定法の再現性を示す二重測定を図５Ｂに示す。タウホスホペプチドに対するＴＧ３の親和性は、他の研究から２５ｎＭであると推定され、阻害は、この濃度より２オーダー低い抗体の濃度を用いて容易に検出される。
【００８５】
第２段階の測定法も提供され、ＧＦ３１／ｔａｕ２３１Ｐ測定法で発見された結合物質をさらにスクリーニングするのに有用である。この測定法は、ｔａｕ２３１ＰペプチドへのＧＦ３１の結合を阻害する結合物質は、タウとＡＰＰホスホペプチドの両方にＰｉｎ１が結合することもｏ阻止することを確認するのに有用である。この測定法は、ｔａｕ２３１ＰまたはＡＰＰ６６８ＰペプチドへのＰｉｎ１の結合を調べる（図６）。この測定法で使用するための適切な濃度のｔａｕ２３１Ｐ、ＡＰＰ６６８ＰおよびＰｉｎ１が決定されている。このデータは、２つの異なる濃度でＰｉｎ１がＡＰＰ６６８Ｐペプチドに結合することを示す。図が示すように、ＧＦ３１がインヒビター化合物である可能性がある。すなわち、この測定法は、ＡＰＰ６６８Ｐペプチドに結合する低濃度の化合物の存在に対して、頑強でありかつ高感度である。
【００８６】
リン酸化タウおよび／またはＡＰＰ上の特異的Ｐｉｎ１結合部位に結合する化合物を発見するために開発された技術は、ｃｄｃ２５上のリン酸化部位に結合しかつＰｉｎ１が結合することを阻止する化合物を発見するのに、同様に充分適用できる。抗癌スクリーニングのために、ｃｄｃ２５−４８Ｐが使用される：ビオチン−ＶＣＰＤＶＰＲ（ホスホ）ＴＰＶＧＫＦＬＧ（配列番号３）、適切な抗体（すなわち、ＧＦ１またはＧＦ２５）により。すなわち、すべての３つのタンパク質上のＰｉｎ１結合部位を認識するモノクローナル抗体が産生されている。これらの抗体が適切なｃｄｃ２５部位へ結合することを阻止する結合物質（すなわち結合代用物）は、有糸分裂を妨害する化合物の開発に対する新規なアプローチを提供するであろう。
【００８７】
本発明の好適な型を図面で示し記載したが、好適な型の変更態様は当業者には明らかであるため、本発明は、記載した具体的な型に決して限定されるものではなく、請求の範囲に記載のように限定されるものであることを理解されたい。
【図面の簡単な説明】
【図１】
モノクローナル抗体ＭＣ２と、リン酸化スレオニン２３１部位を取り込んだタウペプチド（ｔａｕ２３１Ｐ）、およびリン酸化スレオニン６６８部位を取り込んだＡＰＰペプチド（ＡＰＰ６６８Ｐ）との相互作用を示す結合曲線。ＭＣ２は、それぞれの非リン酸化ペプチドに結合しない。
【図２】
ｔａｕ２３１ＰおよびＡＰＰ６６８ＰとのＰｉｎ１相互作用を示す結合曲線。Ｐｉｎ１は、それぞれの非リン酸化ペプチドに結合しない。
【図３】
ＡＰＰ６６８Ｐと反応性の抗体。Ａ．抗体ＧＦ１０。Ｂ．抗体ＧＦ１１。Ｃ．抗体ＧＦ２０。Ｄ．抗体ＧＦ２７。
【図４】
ｔａｕ２３１ＰおよびＡＰＰ６６８Ｐに反応性の抗体。Ａ．抗体ＧＦ３。Ｂ．抗体ＧＦ５。
【図５】
Ａ．タウおよびＡＰＰホスホペプチドへのＧＦ３１の結合。Ｂ．ｔａｕ２３１ＰへのＧＦ３１結合の、ＴＧ３による阻害。
【図６】
ＡＰＰ６６８ＰへのＰｉｎ１結合のＧＦ３１阻害。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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