(57)【要約】本発明は（ａ）治療学的に効果的な量の成熟された樹枝状細胞及び（ｂ）薬剤学的に許容可能な担体を含む自己免疫疾患に対しての免疫治療用薬剤学的組成物及びこれを用いて自己免疫疾患を治療する方法に関するものである。【選択図】図２２
2004524374.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
治療学的に有効な量の成熟された樹枝状細胞；及び
薬剤学的に許容される担体を含む自己免疫疾患の免疫治療用薬剤学的組成物。
【請求項２】
前記自己免疫疾患は、第１型糖尿病、リューマチ関節炎、多発性硬化症、全身性紅斑性狼瘡、ショグレン症候群（Ｓｊｏｇｒｅｎ；ｓ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、皮膚硬化症、多発性筋炎、慢性活動性肝炎、混合結体組織疾患、原発性胆汁性肝硬変、悪性貧血、自己免疫甲状腺炎、特発性アディッソン（Ａｄｄｉｓｏｎ）病、白斑、グルテン感受性腸病症、グレーヴズ病（Ｇｒａｖｅｓ；ｄｉｓｅａｓｅ）、重症筋無力症、自己免疫性好中球減少症、特発性血小板減少紫斑症、肝硬変症、尋常性天疱瘡、自己免疫不妊症、グッドパスチュアー症候群（Ｇｏｏｄｐａｓｔｕｒｅ；ｓ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、水疱性類天疱瘡、円板状紅斑ルプス（ｌｕｐｕｓ）、潰瘍性大腸炎及び高密度沈着病からなる群から選択される一つであることを特徴とする請求項１に記載の自己免疫疾患の免疫治療用薬剤学的組成物。
【請求項３】
前記自己免疫疾患は第１型糖尿病またはリューマチ性関節炎であることを特徴とする請求項２に記載の自己免疫疾患の免疫治療用薬剤学的組成物。
【請求項４】
前記成熟された樹枝状細胞はＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、ＴＧＦ−β、ＩＬ−４、ＩＬ−１０またはこれらの混合物から選択されたサイトカインで未成熟樹枝状細胞を処理して準備されたものであることを特徴とする請求項１に記載の自己免疫疾患の免疫治療用薬剤学的組成物。
【請求項５】
前記成熟された樹枝状細胞は自己免疫Ｔｈ１リンパ球をＴｈ２リンパ球に転換させるかまたは新しいＴｈ２リンパ球を発生させることにより自己免疫反応を抑制することを特徴とする請求項１に記載の自己免疫疾患の免疫治療用薬剤学的組成物。
【請求項６】
前記樹枝状細胞は人間の器官、組織、骨髄または血液から分離されたものであることを特徴とする請求項１に記載の自己免疫疾患の免疫治療用薬剤学的組成物。
【請求項７】
前記樹枝状細胞は同種異形（ａｌｌｏｇｅｎｅｉｃ）樹枝状細胞であることを特徴とする請求項６に記載の自己免疫疾患の免疫治療用薬剤学的組成物。
【請求項８】
前記樹枝状細胞はリンパ性樹枝状細胞であることを特徴とする請求項７に記載の自己免疫疾患の免疫治療用薬剤学的組成物。
【請求項９】
前記リンパ性樹枝状細胞はＣＤ１１ｃ−／ＣＤ４＋樹枝状細胞であることを特徴とする請求項８に記載の自己免疫疾患の免疫治療用薬剤学的組成物。
【請求項１０】
成熟された樹枝状細胞を準備する段階；及び
治療学的に有効な量の前記成熟された樹枝状細胞及び薬剤学的に許容可能な担体を含む薬剤学的組成物を哺乳動物に投与する段階を含むことを特徴とする自己免疫疾患の免疫治療方法。
【請求項１１】
前記自己免疫疾患は第１型糖尿病、リューマチ関節炎、多発性硬化症、全身性紅斑性狼瘡、ショグレン症候群（Ｓｉｏｇｒｅｎ；ｓ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、皮膚硬化症、多発性筋炎、慢性活動性肝炎、混合結体組織疾患、原発性胆汁性肝硬変、悪性貧血、自己免疫甲状腺炎、特発性アディッソン（Ａｄｄｉｓｏｎ）病、白斑、グルテン感受性腸病症、グレーヴズ病（Ｇｒａｖｅｓ；ｄｉｓｅａｓｅ）、重症筋無力症、自己免疫性好中球減少症、特発性血小板減少紫斑症、肝硬変症、尋常性天疱瘡、自己免疫不妊症、グッドパスチュアー症候群（Ｇｏｏｄｐａｓｔｕｒｅ；ｓ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、水疱性類天疱瘡、円板状紅斑ルプス（ｌｕｐｕｓ）、潰瘍性大腸炎及び高密度沈着病からなる群から選択される一つであることを特徴とする請求項１０に記載の自己免疫疾患の免疫治療方法。
【請求項１２】
前記自己免疫疾患は第１型糖尿病またはリューマチ性関節炎であることを特徴とする請求項１１に記載の自己免疫疾患の免疫治療方法。
【請求項１３】
前記成熟された樹枝状細胞はＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、ＴＧＦ−β、ＩＬ−４、ＩＬ−１０またはこれらの混合物から選択されたサイトカインで未成熟樹枝状細胞を処理して準備されたものであることを特徴とする請求項１０に記載の自己免疫疾患の免疫治療方法。
【請求項１４】
前記成熟された樹枝状細胞は自己免疫Ｔｈ１リンパ球をＴｈ２リンパ球に転換させるかまたは新しいＴｈ２リンパ球を発生させることにより自己免疫反応を抑制することを特徴とする請求項１０に記載の自己免疫疾患の免疫治療方法。
【請求項１５】
前記樹枝状細胞は人間の器官、組織、骨髄または血液から分離されたものであることを特徴とする請求項１０に記載の自己免疫疾患の免疫治療方法。
【請求項１６】
前記樹枝状細胞は同種異形（ａｌｌｏｇｅｎｅｉｃ）樹枝状細胞であることを特徴とする請求項１５に記載の自己免疫疾患の免疫治療方法。
【請求項１７】
前記樹枝状細胞はリンパ性樹枝状細胞であることを特徴とする請求項１６に記載の自己免疫疾患の免疫治療方法。
【請求項１８】
前記リンパ性樹枝状細胞はＣＤ１１ｃ−／ＣＤ４＋樹枝状細胞であることを特徴とする請求項１７に記載の自己免疫疾患の免疫治療方法。
【請求項１９】
前記方法は追加的に交差−同種異形（ｔｒａｎｓ−ａｌｌｏｇｅｎｅｉｃ）樹枝状細胞でブースチング（ｂｏｏｓｔｉｎｇ）させる段階を含むことを特徴とする請求項１０に記載の自己免疫疾患の免疫治療方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の背景
発明の属する技術分野
本発明は自己免疫疾患の治療用薬剤学的組成物に関するものであって、より詳しくは特定樹枝状細胞を含む自己免疫疾患の治療用薬剤学的組成物及びこれを用いた治療方法に関するものである。
【０００２】
従来の技術
自己免疫（ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ）は自分の抗原に対する非正常的な免疫反応から引き起こされる。自己免疫疾患において、自己抗原を攻撃するＴ細胞が関与する疾患としては多発性硬化症（ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）、第１型糖尿病またはインシュリン依存形糖尿病及びリューマチ性関節炎（ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ ａｒｔｈｒｉｔｉｓ）などがある。（ＫＪ Ｊｏｈｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ ｉｎ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ， ｐｐ１０４−１５３（１９９９））。
【０００３】
インシュリン依存形糖尿病（ｉｎｓｕｌｉｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｄｉａｂｅｔｅｓ ｍｅｌｌｉｔｕｓ： ＩＤＤＭ）、即ち第１型糖尿病はインシュリンを生産する膵島（ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｉｓｌｅｔ）ベータ細胞が自己免疫を起こすＴ細胞により破壊されて現れる自己免疫疾患であって、グルタミン酸デカルボキシラーゼ（ＧＡＤ６５）のようなベータ細胞の特定抗原（Ｌｏｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．， Ｌａｎｃｅｔ ３４３： １６０７（１９９４）； Ｙｏｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２８４： １１８３−１１８７（１９９９））やインシュリンに対しての抗体（Ｗｉｌｌｉａｍｓ ｅｔ ａｌ．， Ｊ．Ａｕｔｏｉｍｍｕｎ． Ｎｏｖ． １３（３）： ３５７−３６３（１９９９））； Ｙｕ ｅｔ ａｌ．， Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ． ＵＳＡ， ９７（４）： １７０１−１７０６（２０００））の有無により糖尿病の発生可能性を糾明しているが、いまだにその正確な原因や免疫学的機転、遺伝的要因は明かされていない実情であり、その効果的な治療方法も開発されていない。
【０００４】
人間の第１型糖尿病に類似な動物モデルであるＮＯＤ（ｎｏｎ−ｏｂｅｓｅ ｄｉａｂｅｔｉｃ）マウス（Ｍａｋｉｎｏ ｅｔ ａｌ．， Ｅｘｐ． Ａｎｉｍ．， ２９： １−１３（１９８０））とＢＢ（ＢｉｏＢｒｅｅｄｉｎｇ）ラット（Ｌｉｋｅ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２１６： ６４４−６４６（１９８２））が開発されたが、その病因学的機転と治療法に対してはこれという成果を収め得ていない。
【０００５】
一方、Ｇｒｅｅｎらは強力な抗原提示細胞である樹枝状細胞（ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌ）が第１型糖尿病の発病と深い関連があるとの発表をし（Ｇｒｅｅｎ ｅｔ ａｌ．， Ｉｍｍｕｎｉｔｙ， ９： ９３３−９４３（１９９８））、より具体的にはＴＮＦ−α形質転換ＮＯＤの場合、膵島で局所的に ＴＮＦ−αが発現されると膵島炎が始まるが、この時、炎症初期に周りの樹枝状細胞が寄り集まって膵島−特異抗原に対するＴ細胞の活性を強力に誘導し膵島炎を加速化させて最終的に糖尿病を誘発させるという機転を提示した。
【０００６】
しかし、正常のＮＯＤマウスでの糖尿発症機転を前記Ｇｒｅｅｎらの理論から説明するには限界があった。一方、樹枝状細胞がアポトーシス（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）された細胞で非常に効果的に抗原を取ってクロス−プライム方法（ｃｒｏｓｓ−ｐｒｉｍｉｎｇ）で細胞毒性Ｔ細胞を活性化するという結果（Ａｌｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ， ３９２： ８６−８９（１９９８））が発表された。またＲｏｖｅｒｅらは（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．， １６１： ４４６７−４４７１（１９９８）； Ｊ．Ｌｅｕｋ． Ｂｉｏｌ．， ６６： ３４５−３４９（１９９９））正常マウスの場合、膵島のベータ細胞再生過程でアポトーシスされた細胞を大食細胞が主に除去し一部を未成熟状態の樹枝状細胞が除去し、この場合樹枝状細胞が膵島抗原−特異Ｔ細胞に会った場合、クローン除去（ｃｌｏｎａｌ ｄｅｌｅｔｉｏｎ）方法や非活性状態（ａｎｅｒｇｙ）を誘導して膵島抗原に対してのトレランス（ｔｏｌｅｒａｎｃｅ）を誘導するが、ＮＯＤマウスの場合再生過程でアポトーシスされるベータ細胞が多いため多量の未成熟細胞が寄り集まってこれに関与するようになりこれらの一部がアポトーシスされた細胞を除去する過程で成熟されて膵島抗原−特異Ｔ細胞を活性化させることにより強力な自己免疫性Ｔ細胞が作られ膵島が破壊されて糖尿に進行されると発表した。
【０００７】
一方、Ｂ細胞発生が抑制された形質転換マウス実験を通じて初期膵島炎発生過程に抗原提示細胞（ＡＰＣ）としてＢ細胞も重要に作用すると報告された（Ａｋａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．， Ｉｎｔ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， ９： １１５９−１１６４（１９９７）； Ｎｏｏｒｃｈａｓｈｍ ｅｔ ａｌ．， Ｄｉａｂｅｔｅｓ， ４６： ９４１−９４６（１９９７）； Ｓｅｒｒｅｚｅ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ．， １８４： ２０４９−２０５３（１９９６））。しかし、Ｇｒｅｅｎらの実験によると ＴＮＦ−α−ＮＯＤマウスモデルではＢ細胞を除去してもやはり糖尿が誘発されて（Ｇｒｅｅｎ ａｎｄ Ｆｌａｖｅｌｌ， Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎｉｏｎ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， １１： ６６３−６６９（１９９９））、同量のＴ細胞を活性化させる場合樹枝状細胞がＢ細胞に比べて１０倍以上効果的であるとの報告（Ｄｅｌｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ．， １８８： １４７３−１４８４（１９９８））、そして糖尿初期にＮＯＤマウスやＢＢラットの膵島に多量の樹枝状細胞の浸透が観察されるという数多い報告（Ｖｏｏｒｂｉｊ ｅｔ ａｌ．， Ｄｉａｂｅｔｅｓ， ３８： １６２３−１６２９（１９８９）； Ｊａｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．， Ｄｉａｂｅｔｅｓ， ４３： ６６７−６７５（１９９４）； Ｄａｈｌｅｎ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， １６０： ３５８５−３５９３（１９９８）； Ｐａｐａｃｃｉｏ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．， ７４： ４４７−４５７（１９９９）； Ｒｏｓｍａｌｅｎ ｅｔ ａｌ．， Ｌａｂ Ｉｎｖｅｓｔ．， ８０： ２３−３０（２０００）； Ｒｏｓｍａｌｅｎ ｅｔ ａｌ．， Ｌａｂ Ｉｎｖｅｓｔ．， ８０： ７６９−７７（２０００））はＢ細胞よりは樹枝状細胞が糖尿誘発初期に重要に作用していることを示唆する。その他にも自己免疫脳疾患の動物モデルであるＥＡＥ（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ）の場合、自己抗原を発現するように操作するかまたは自己抗原で表指させた樹枝状細胞を正常マウスに移す場合、同一疾病が誘導されるという研究結果（Ｌｕｄｗｉｇ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ．， １８８： １４９３−１５０１（１９９８）； Ｄｉｔｔｅｌ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， １６３： ３２−３９（１９９９））も樹枝状細胞がこのような自己免疫疾患に核心的に作用する可能性を裏付ける。
【０００８】
しかし、糖尿病と関連された樹枝状細胞の研究結果の中で最近最も関心を集めたのは正常ＮＯＤマウスの脾臓から粘着性（ａｄｈｅｓｉｖｅ）の弱い樹枝状細胞を分離してガンマ−インターフェロン（ＩＦＮ−γ）を処理した後１−４週齢のＮＯＤマウスの腹腔に注入した場合７０％程度のＮＯＤの糖尿発病率が著しく減少して２６．３％まで落ちたということである（Ｓｈｉｎｏｍｉｙａ ｅｔ ａｌ．， Ｃｌｉｎ． Ｅｘｐ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， １１７： ３８−４３（１９９９））。また彼らはＩＣＲマウスから同一な方法で分離した樹枝状細胞をＮＯＤマウスに投与しても相似の結果が得られたと発表した。またＮＯＤマウスに生後４週と６週に樹枝状細胞を重複投与した場合３０週間６匹の中で一匹も糖尿症状が現れなかった。しかしこのような樹枝状細胞の投与による予防効果は６週齢以上のＮＯＤマウスでは見えなく、１−４週齢のＮＯＤマウスにだけ予防効果があると発表した。このような研究結果は１９９２年Ｃｌａｒｅ−Ｓａｌｚｌｅｒら（Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ．， ９０： ７４１−７４８（１９９２））が発表した樹枝状細胞の糖尿予防可能性を一段階発展させたもので、Ｃｌａｒｅ−Ｓａｌｚｌｅｒらは膵臓のリンパ節から分離した樹枝状細胞をＮＯＤマウスに投与する場合他の細胞より非常に効果的な糖尿予防効果を奏したと発表した。
【０００９】
また最近ＮＯＤマウスの脾臓から樹枝状細胞を分離して人間ガンマグロブリン（ｈｕｍａｎ γ−ｇｌｏｂｕｌｉｎ： ＨＧＧ）を感作させてＮＯＤマウスに投与する場合１２匹の中で１１匹で２５週間糖尿症状が現れなく、糖尿が予防されたＮＯＤマウスから島（ｉｓｌｅｔ）を分離して培養して上層液を分析した結果ＩＬ−４とＩＬ−１０が増加し、ＩＦＮ−γやＴＮＦ−αのようなサイトカインの発現は減少を示した（Ｐａｐａｃｃｉｏ ｅｔ ａｌ．， Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ， １４１： １５００−１５０５（２０００））。しかしＨＧＧで感作されていないＤＣ投与群ではこのような予防効果を奏しなかった。前述の多くの研究結果はＮＯＤマウスの場合樹枝状細胞を人為的に活性化させる場合体内の非正常的な免疫反応を正常的に調節することができるということを示す例となり、人間の第１型糖尿患者やＮＯＤマウスの樹枝状細胞が非正常である可能性があるということを示唆する。実際第１型糖尿患者の場合や（Ｊａｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．， Ｌａｎｃｅｔ， ３４５： ４９１−４９２（１９９５）； Ｔａｋａｈａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．， Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．， １６１： ２６２９−２６３５（１９９９））ＮＯＤマウスで（Ｓｅｒｒｅｚｅ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， １５０： ２５３４−２５４３（１９９３））抗原提示細胞に問題がある可能性が数回報告されたことがあり、特に最近ＢＢラットで抗原提示細胞中樹枝状細胞の未成熟がＴ細胞の活性を効果的に調節できず糖尿が発生する可能性が報告された（Ｄｅｌｅｍａｒｒｅ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， １６２： １７９５−１８０１（１９９９））。またこのような事実と関連しＬｅｅら（Ｊ． Ｋｏｒｅａｎ Ｍｅｄ． Ｓｃｉ．， １５： ２１７−２２３（１９９９））はＮＯＤマウスの脊髄（ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ： ＢＭ）由来樹枝状細胞（ＢＭ−ＤＣ）を調査した結果ＮＯＤマウスのＢＭ−ＤＣが骨髄性樹枝状細胞によく分化されなく、表面のＩＩ型ＭＨＣ、補助活性分子（ｃｏ−ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ ｍｏｌｅｃｕｌａｅ）であるＢ７−１及びＢ７−２、そしてＣＤ４０の発現やＩＬ−１２の分泌がＣ５７ＢＬ／６マウスに比べて低いと報告した。Ｌｅｅら（１９９９）の結果はＴａｋａｈａｓｈｉら（Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， １６１： ２６２９−２６３５（１９９９））の結果を裏付けるものであって第１型糖尿患者から分離して分化させた単核球由来樹枝状細胞（Ｍｏ−ＤＣ）がＴ細胞活性を効果的に誘導できず、その理由の一つが第１型糖尿患者の場合Ｍｏ−ＤＣの表面にＢ７分子の発現が低いという点を挙げている。
【００１０】
前述のように樹枝状細胞が自己免疫疾患の一つである第１型糖尿発病と密接な関係があり、樹枝状細胞を用いた第１型糖尿の予防可能性は数回報告されたことがあるが、現在まで樹枝状細胞を用いた糖尿病の治療可能性は一件も報告されたことがない。
【００１１】
一方、リューマチ性関節炎の治療剤または軽減剤として現在まで開発されたものはメトトレキセート（ｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ）、アザチオプリン（ａｚａｔｈｉｏｐｒｉｎｅ）、シクロホスファミド（ｃｙｃｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）及びコルチコステロイド（ｃｏｒｔｉｃｏｓｔｅｒｏｉｄ）などがある（Ｊｏｈｎｓｏｎ ＣＪ， ｅｔ ａｌ．， Ａｎｎ． Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒ， ３５（４）： ４６４−４７１（２００１）， Ｓｅｙｍｏｕｒ ＨＥ ｅｔ ａｌ．， Ｂｒ． Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．， ５１（３）： ２０１−２０８（２００１））。しかし、現在まで開発されたリューマチ性関節炎治療剤の大部分は大きい副作用があり、関節損傷の発展を大いに抑制できない実情である。
【００１２】
米国特許第６，００７，８２１号にはｇｐ９６、ｈｓｐ９０及びｈｓｐ７０を含んで自己免疫疾患を治療するための組成物及び方法が開示されている。米国特許第６，０９８，６３１号にはスフィンゴミエリン（ｓｐｈｉｎｇｏｍｙｅｌｉｎ）信号伝達経路に対しての抑制剤を用いて自己免疫疾患を治療するための方法が開示されている。また、米国特許第６，１８４，２５３号には治療学的に効果的な量のトレミフェン（ｔｏｒｅｍｉｆｅｎｅ）またはこれの薬剤学的に許容可能な塩を投与して自己免疫疾患を治療する方法が開示されている。
【００１３】
本明細書全体に掛けて多数の論文及び特許文献が参照されその引用は括弧内に表示した。引用された論文及び特許文献の開示内容はその全体として本明細書に参照に挿入されて本発明が属する技術分野の水準及び本発明の内容がより明確に説明される。
【００１４】
発明の要約
本発明者らはマウス脾臓から特定樹枝状細胞亜群を分離し、適切なサイトカインで処理して成熟させた後投与すると自己免疫反応を軽減または除去することができるということを発見し、本発明を完成した。
【００１５】
従って、本発明の目的は自己免疫疾患の治療用薬剤学的組成物を提供することにある。
【００１６】
本発明の他の目的は自己免疫疾患の治療方法を提供することにある。
【００１７】
本発明による追加的な目的及び利点は詳細な説明、請求項及び図面を通じてさらに具体的に明示される。
【００１８】
発明の詳細な説明
本発明の一様態によると、本発明は（ａ）治療学的に効果的な量の成熟された樹枝状細胞及び（ｂ）薬剤学的に許容可能な担体を含む自己免疫疾患の免疫学的治療のための薬剤学的組成物を提供する。
【００１９】
本明細書で“成熟された樹枝状細胞”は表面補助活性分子（例えば、マウスでＢ７ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ， ＣＤ８０ ｏｒ ＣＤ８６）を表現しない未成熟樹枝状細胞を分離して適合なサイトカインなどでインヴィトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）またはエックスヴィヴォ（ｅｘ ｖｉｖｏ）で成熟分化させたものを意味する。樹枝状細胞は以下で必要に応じ“ＤＣ”と記載する。
【００２０】
本明細書での用語“治療”は（ａ）まだ自己免疫疾患を保有しているとは診断されていないが、このような傾向がある動物、望ましくは哺乳動物、より望ましくは人間から疾病または障害が発生されることの予防；（ｂ）自己免疫疾患の抑制、即ち発展の抑制；及び（ｃ）自己免疫疾患の軽減を意味する。
【００２１】
本発明の樹枝状細胞により治療の可能な自己免疫疾患は生体内での自己免疫反応により誘発される全ての疾病または疾患を含み、例えば、第１型糖尿病、リューマチ関節炎、多発性硬化症、全身性紅斑性狼瘡、ショグレン症候群（Ｓｊｏｇｒｅｎ；ｓ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、皮膚硬化症、多発性筋炎、慢性活動性肝炎、混合結体組織疾患、原発性胆汁性肝硬変、悪性貧血、自己免疫甲状腺炎、特発性アディッソン（Ａｄｄｉｓｏｎ）病、白斑、グルテン感受性腸病症、グレーヴズ病（Ｇｒａｖｅｓ；ｄｉｓｅａｓｅ）、重症筋無力症、自己免疫性好中球減少症、特発性血小板減少紫斑症、肝硬変症、尋常性天疱瘡、自己免疫不妊症、グッドパスチュアー症候群（Ｇｏｏｄｐａｓｔｕｒｅ；ｓ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、水疱性類天疱瘡、円板状紅斑ルプス（ｌｕｐｕｓ）、潰瘍性大腸炎及び高密度沈着病などがある。望ましくは、本発明の薬剤学的組成物が適用される疾病または疾患は第１型糖尿病及びリューマチ関節炎である。
【００２２】
前述のように、樹枝状細胞の糖尿予防効果は公知されているが、成熟された樹枝状細胞による第１型糖尿病治療用途は従来には全く知られていないことである。従って、成熟された樹枝状細胞を用いて第１型糖尿病に対しての効果的な治療が可能であることは新規かつ画期的なことである。一方、樹枝状細胞の第１型糖尿病を治療できるという事実は樹枝状細胞が他の自己免疫疾患に適用できる可能性を示す。
【００２３】
例えば、リューマチ関節炎は関節の炎症を特徴とする慢性全身性自己免疫疾患であって、関節の炎症は継続的に関節軟骨と骨組織に浸潤されてこれら組織の腐食をもたらす。リューマチ関節炎の誘発可能な原因抗原としては関節の主要構成成分である第２型コラーゲンがよく知られていて、これを特異組織適合抗原を有するマウスに注射する場合、リューマチ関節炎が誘発される（ＬＫ Ｍｙｅｒｓ ｅｔ ａｌ．， Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ．， １９： １８６１−１８７８（１９９７））。リューマチ関節炎の場合、発病時関節内の大食細胞や繊維芽細胞でサイトカインの生産が増加されると共にＴ細胞によるリンフォカインもＴｈ１細胞によるＩＦＮ−γとＩＬ−２生産が増加されていると報告された。このようなＴｈ１細胞から生産されたサイトカインは関節炎症状を悪化させる反面ＩＬ−４及びＩＬ−１０などのようなＴｈ２細胞により生産されたサイトカインは関節炎を予防するものとして知られてきた。またバイラスベクトルにＴｈ２型サイトカインであるＩＬ−４またはＩＬ−１０を発現させて関節炎を誘導したマウスの関節内に注射する場合、注射した足以外に他の足でも治療効果を奏したという報告もあった（ＳＨ Ｋｉｍ， ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｉｍｍｕｏｎｌ．， １６６： ３４９９−３５０５（２００１））。前記のような事実はリューマチ関節炎の発病時原因になる組織抗原のみが第１型糖尿病と相異なるだけで自己免疫の形成機転や治療機転はいずれの自己免疫疾患で共通的であるということを強力に示唆する。
【００２４】
従って、本発明で第１型糖尿病治療に使用される樹枝状細胞はリューマチ関節炎の治療にも適用される。
【００２５】
本発明で用いられる成熟されたＤＣは望ましくは生体内にある成熟されたＤＣを直接分離して利用することもできて、未成熟されたＤＣを分離した後適合なサイトカインで処理して成熟させることもできる。また、本発明で利用される樹枝状細胞は人間の器官、組織、骨髄または血液から分離されることができる。
【００２６】
前記成熟化過程で利用できるサイトカインはＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、ＴＧＦ−β、ＩＬ−１０、ＩＬ−４などがあり、最も好ましくはＩＦＮ−γである。ＩＦＮ−γを用いて成熟化する場合は、ＩＦＮ−γ１ユニット当り１０２−１０６細胞、好ましくは１０４−１０５細胞を用いて成熟化させる。
【００２７】
成熟されたＤＣによる自己免疫疾患の治療効果は成熟されたＤＣがＴｈ１型の自己免疫反応性Ｔ細胞をＴｈ２型に転換させるかまたは新しいＴｈ２型Ｔ細胞を生成させて自己免疫反応性Ｔ細胞の活性を抑制することにより現れる。
【００２８】
本発明で利用されるＤＣはｓｙｎｇｅｎｉｃ ＤＣまたはａｌｌｏｇｅｎｉｃ ＤＣ二つとも可能であるが、自己免疫疾患の治療に特に有効なＤＣはａｌｌｏｇｅｎｉｃ 樹枝状細胞である。本明細書の用語 ”ａｌｌｏｇｅｎｉｃ ＤＣ”は受容者とは異なる主組織適合性（ｍａｊｏｒ ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ； ＭＨＣ）を有する供与者から分離した樹枝状細胞である。例えば、供与者がＮＯＤマウス（Ｈ−２ｂＩＡ−ｇ７）である場合、ＢＡＬＢ／ｃマウス（Ｈ−２ｄ； Ｃ３Ｈ， Ｈ−２ｋ）から分離した樹枝状細胞を意味する。
【００２９】
また、本発明で利用されるＤＣはｌｙｍｐｈｏｉｄ ＤＣまたはｍｙｅｌｏｉｄ ＤＣ二つとも利用可能であるが、特に望ましくはｌｙｍｐｏｉｄ ＤＣの治療効果が優秀である。本発明書で用語 ”ｌｙｍｐｈｏｉｄ ＤＣ”はＴ及びＢ細胞と同じ由来のリンフォイド性樹枝状細胞として、表面抗原表現型がＣＤ１１ｂ−／ＣＤ８α＋ＤＣであることを意味し、”ｍｙｅｌｏｉｄ ＤＣ”は単核球（ｍｏｎｏｃｙｔｅ）、 大食細胞（ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ）などの細胞と同じ由来の骨髄性樹枝状細胞として表面抗原表現型がＣＤ１１ｂ＋／ＣＤ８α−であることを意味する。
【００３０】
本発明の最も好ましい具現例で、本発明の薬剤学的組成物に含まれる樹枝状細胞は表面タンパク質発現様態を基準として、人間のＣＤ１１ｃ−／ＣＤ４＋樹枝状細胞亜群である。ＣＤ１１ｃ−／ＣＤ４＋樹枝状細胞がＩＦＮ−γにより成熟化されると、ＣＤ１１ｃ−／ＣＤ４＋／ＣＤ８６＋の表面タンパク質発現様態を示す。前記樹枝状細胞亜群に対応するマウスでの亜群は下記の実施例に記載されたように、ＣＤ１１ｂ−／ＣＤ８α＋樹枝状細胞亜群である。
【００３１】
一方、本発明の最も好ましい具現例によると、本発明は（ａ）ＩＦＮ−γで前処理された成熟されたａｌｌｏｇｅｎｉｃ  ＣＤ１１ｃ−／ＣＤ４＋樹枝状細胞の治療学的有効量；及び（ｂ）薬剤学的に許容される担体を含む自己免疫疾患の治療用薬剤学的組成物を提供する。
【００３２】
本発明の薬剤学的組成物に含まれる薬剤学的に許容される担体は製剤時に通常的に利用されるものとして、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、デンプン、アカシアゴム、燐酸カルシウム、アルギネート、ゼラチン、珪酸カルシウム、微細結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水、シロップ、メチルセルロース、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、滑石、ステアリン酸マグネシウム及びミネラルオイルなどを含むが、これに限定されるものではない。本発明の薬剤学的組成物は前記成分以外に潤滑剤、湿潤剤、甘味剤、香味剤、乳化剤、懸濁剤、保存剤などを追加に含むことができる。一方、本発明の薬剤学的組成物は治療学的有効量の樹枝状細胞及び担体として生理食塩水の懸濁液からなることができ、容易に薬剤学的組成物を製造することができる。
【００３３】
本発明の薬剤学的組成物は経口または非経口で投与することができ、非経口投与である場合は静脈内注入、皮下注入、筋肉注入、腹腔注入などで投与することができる。一方、本発明の薬剤学的組成物は適用される疾患の種類により、例えば、第１型糖尿病である場合は腹腔投与が最も望ましくて、これは投与された樹枝状細胞が希釈されずに効果的に膵臓に移動することができるからである。また、本発明の薬剤学的組成物が関節炎患者に適用される場合には静脈内注射で投与されることができるが、最も望ましくは局部的に関節内注入で投与される。
【００３４】
本発明の薬剤学的組成物の適合な投与量は製剤化方法、投与方式、患者の年齢、体重、性、糖尿症状の程度、飲食、投与時間、投与経路、排泄速度及び反応感応性のような要因によって多様であり、普通の熟練された医者は所望の治療または予防に効果的な投与量を容易に決定及び処方することができる。例えば、第１型糖尿病の場合は望ましい投与量は１×１０６〜１×１０７の成熟された樹枝状細胞を腹腔内投与することであり、リューマチ性関節炎の場合の望ましい投与量は１×１０５〜１×１０６を関節内投与することである。
【００３５】
本発明の薬剤学的組成物は当該発明が属する技術分野で通常の知識を有する者が容易に実施できる方法に従って、薬剤学的に許容される担体及び／または賦形剤を用いて製剤化することにより単位容量形態に製造されるかまたは多容量容器内に入れて製造される。この際、剤型はオイルまたは水生媒質中の溶液、懸濁液または乳化液形態であるか、エリキシール剤、粉末剤、顆粒剤、錠剤またはカプセル剤の形態でもいいし、分散剤または安定化剤を追加的に含むこともできる。
【００３６】
本発明の他の様態によると、本発明は（ａ）成熟された樹枝状細胞を準備する段階；及び（ｂ）前記成熟された樹枝状細胞の治療学的有効量と薬剤学的に許容される担体を含む薬剤学的組成物を自己免疫疾患の哺乳動物に投与する段階を含む自己免疫疾患の治療方法を提供する。
【００３７】
本発明は前述のように成熟された樹枝状細胞を利用することを特徴とする。従って、本発明の治療方法に対しての内容中、前述の本発明の薬剤学的組成物と共通する内容はその記載を省略する。
【００３８】
本発明の樹枝状細胞により治療可能な自己免疫疾患は生体内での自己免疫反応により誘発される全ての疾病または疾患を含み、例えば、第１型糖尿病、リューマチ関節炎、多発性硬化症、全身性紅斑性狼瘡、ショグレン症候群（Ｓｊｏｇｒｅｎ；ｓ ｓｙｎｄｒｏｍ）、皮膚硬化症、多発性筋炎、慢性活動性肝炎、混合結体組織疾患、原発性胆汁性肝硬変、悪性貧血、自己免疫甲状腺炎、特発性アディッソン（Ａｄｄｉｓｏｎ）病、白斑、グルテン感受性腸病症、グレーヴズ病（Ｇｒａｖｅｓ；ｄｉｓｅａｓｅ）、重症筋無力症、自己免疫性好中球減少症、特発性血小板減少紫斑症、肝硬変症、尋常性天疱瘡、自己免疫不妊症、グッドパスチュアー症候群（Ｇｏｏｄｐａｓｔｕｒｅ；ｓ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、水疱性類天疱瘡、円板状紅斑ルプス（ｌｕｐｕｓ）、潰瘍性大腸炎及び高密度沈着病などがある。望ましくは、本発明の薬剤学的組成物が適用される疾病または疾患は第１型糖尿病及びリューマチ関節炎である。
【００３９】
本発明の望ましい具現例によると、本発明の治療方法に利用される成熟された樹枝状細胞は動物から直接分離した成熟した樹枝状細胞であるか、未成熟された樹枝状細胞に適切なサイトカインを処理して成熟化させたものである。本発明で利用される前記成熟された樹枝状細胞は動物、望ましくは哺乳動物、さらに望ましくは人間の器官、組織、骨髄または血液から分離したものである。
【００４０】
本発明の治療方法において、ｓｙｎｇｅｎｉｃ ＤＣまたはａｌｌｏｇｅｎｉｃ ＤＣを利用することができるが、望ましくはａｌｌｏｇｅｎｉｃ ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌを利用する。また、本発明の治療方法に利用される樹枝状細胞はｌｙｍｐｏｉｄ ＤＣが望ましく、表面タンパク質様態がＣＤ１１ｃ−／ＣＤ４＋である樹枝状細胞亜群を利用することがより望ましい。前記ＣＤ１１ｃ−／ＣＤ４＋樹枝状細胞がＩＦＮ−γにより成熟化されると、ＣＤ１１ｃ−／ＣＤ４＋／ＣＤ８６＋の表面タンパク質発現様態を示す。
【００４１】
本発明の治療方法において、本発明の薬剤学的組成物を投与する段階は１回の投与で実施されることもできるが、望ましくは１回の投与以後、ブースチング（ｂｏｏｓｔｉｎｇ）過程を実施することが望ましい。ブースチング過程が含まれる投与においてはｔｒａｎｓ−ａｌｌｏ−ＤＣで実施することが望ましい。用語“ｔｒａｎｓ−ａｌｌｏ−ＤＣ”は最初投与した樹枝状細胞の供与者と主組織的適合抗原性が相異なる供与者から分離した樹枝状細胞を意味する。
【００４２】
一方、投与段階での投与経路は経口または非経口で投与することができ、非経口投与である場合は静脈内注入、皮下注入、筋肉注入、腹腔注入などで投与することができる。また、前記投与段階は適用される疾患の種類によって、例えば、第１型糖尿病である場合は腹腔投与が最も望ましくて、リューマチ性関節炎に適用される場合は局部的に関節内注入が最も望ましい。
【００４３】
本発明の具体的な実施例によると、自己免疫疾患中、第１型糖尿病の発展は概念的に６段階に分けられる（Ｅｉｓｅｎｂａｒｔｈ， Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ． Ｊ． Ｍｅｄ． ３１４： １３６０−１３６８（１９８６））。（ａ）段階Ｉは糖尿病の発展に必修的な遺伝的感受性（ｇｅｎｅｔｉｃ ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ）を現すが疾病の発展には充分な条件が備えられていない段階である。（ｂ）段階ＩＩはベータ細胞に対しての自己免疫の活性化が触発される段階であり、（ｃ）段階ＩＩＩはベータ細胞が減少されてインシュリンに対しての自己抗体のような免疫学的異常及び膵島の細胞質性抗原が確認される段階である。（ｄ）段階ＩＶはベータ細胞の漸進的な減少によりインシュリン分泌が減少されるが、まだは正常的な血糖量を示す段階であり、（ｅ）段階Ｖは明白な糖尿症状（高血糖症）が確認されてベータ細胞の約９０％が破壊されて患者は生存のために外来のインシュリンを要求する段階である。（ｆ）段階ＶＩは全ての残余ベータ細胞が破壊されて、Ｃペプチットが血液から全く発見されない段階である。前述の糖尿症状の段階によると、本発明の薬剤学的組成物及び治療方法は前述の全ての段階に作用して治療的効果を奏する。望ましくは段階ＩＩ乃至段階Ｖの中のいずれか一つの段階にいる患者に適用されて、段階Ｖでも優れた治療効果を奏する。
【００４４】
以下、実施例を通じて本発明をさらに詳細に説明する。これら実施例は本発明をより具体的に説明するためのものであり、本発明の範囲がこれら実施例に限定されないことは本発明の属する技術分野で通常の知識を有する者であれば分かるだろう。
【００４５】
実施例１：マウス脾臓からＣＤ１１ｂ−／ＣＤ８α＋／ＣＤ８６−樹枝状細胞の分離
実施例１−ａ：ＣＤ１１ｂ−／ＣＤ８α＋／ＣＤ８６−樹枝状細胞の分離（方法１）
先ず、ＩＣＲまたはＢａｌＢ／ｃマウス（分譲処：大韓バイオリンク、韓国）から脾臓を分離してペトリ皿上でＰＢＳ溶液で洗浄した後、コラゲナーゼ溶液（１００ｕｎｉｔ／ｍｌ ｏｆ ＰＢＳ： Ｓｉｇｍａ Ｔｙｐｅ ＩＶ）を前記洗浄した脾臓組織に注射器で注入した。５分間の反応の後、注射針で組織を千切って脾臓細胞をコラゲナーゼ溶液上に分離した。次いで、残りの組織と脾臓細胞を５０ｍｌチューブに移した後、室温で２５分間コラゲナーゼ溶液で処理して脾臓細胞が組織からコラゲナーゼ溶液上に分離されて出るようにした。
【００４６】
その後、ＥＤＴＡを１０ｍＭ入れた後５分間室温でよく混ぜた。溶液上の脾臓細胞を遠心分離して収集した後、２％ ＦＣＳ、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ及び１０ｍＭ ＥＤＴＡが添加された冷蔵ＰＢＳに浮遊した後Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を利用した遠心分離を行って低い密度の細胞を分離した。分離された細胞を前記ＰＢＳに二回洗浄して再浮遊した後１７．５％メトリザミド（ｍｅｔｒｉｚａｍｉｄｅ：Ｓｉｇｍａ製品 ＃Ｍ−３３８３）溶液の上層に乗せて再び遠心分離して低い密度の細胞を得た。このように得られた細胞をＭＡＣＳ溶液（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ＰＢＳ， ０．５％ ＢＳＡ ａｎｄ ２ ｍＭ ＥＤＴＡ）で洗浄した後細胞の数を数えて１０７細胞当り１０μｌのＣＤ９０、ＣＤ１９及びＮＫに対する抗体に磁石粒子が付着された溶液（Ｍｉｃｒｏｂｅａｄｓ： Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ ＃１３０−０４９−１０１， １３０−０８１−６０１ 及び１３０−０５２−５０１）を添加して、６〜１２℃で１５分間細胞と反応させた後、細胞反応液をＬＳまたはＭＳカラム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ、製品 ＃１３０−０４２−４０１及び１３０−０４２−２０１）に通過させた。カラムを通過した細胞の中でＣＤ１１ｂ−／ＣＤ８α＋樹枝状細胞を分離するために前記と同一な比率でＣＤ８αに対する抗体の磁石粒子溶液（Ｍｉｃｒｏｂｅａｄｓ： Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ製品 ＃１３０−０４９−４０１）を添加、６〜１２℃で１５分間細胞と反応させてＭＳカラムを通過させた。ＭＳカラムに選択されて残っている細胞を１ｍｌのＭＡＣＳ溶液で分離してＣＤ１１ｂ−／ＣＤ８α＋／ＣＤ８６−樹枝状細胞を収得した。図１ａは本実施例の分離方法を概略的に示す。
【００４７】
実施例１−ｂ：ＣＤ１１ｂ−／ＣＤ８α＋／ＣＤ８６−樹枝状細胞の分離（方法２）
先ず、ＩＣＲまたはＢａｌＢ／ｃマウス（分譲処：大韓バイオリンク、韓国）から脾臓を分離してペトリ皿上でＰＢＳ溶液で洗浄した後、コラゲナーゼ溶液（１００ｕｎｉｔ／ｍｌ： Ｓｉｇｍａ Ｔｙｐｅ ＩＶ）を前記洗浄した脾臓組織に注射器で注入し、注射針で組織を千切って脾臓細胞をコラゲナーゼ溶液上に分離した。次いで、残りの組織と脾臓細胞を５０ｍｌチューブに移した後、室温で２５分間コラゲナーゼ溶液で処理して脾臓細胞が組織からコラゲナーゼ溶液上に分離されて出るようにした。
【００４８】
その後、ＥＤＴＡを１０ｍＭ入れた後５分間室温でよく混ぜた。溶液上の脾臓細胞を遠心分離して収集し、１０ｍｌの赤血球溶解溶液（０．１４Ｍ ＮＨ４Ｃｌ， ０．０２Ｍ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ， ｐＨ ７．２）に１０分間室温で放置して赤血球だけを選択的に溶解させた。赤血球が除去された脾臓細胞をＲＰＭＩ  １６４０−５％  ＦＢＳ培地（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）に再浮遊した後、細胞数がφ１００細胞培養容器当り１×１０８細胞を超えないように培地の嵩を合わせて、３７℃培養器で９０分間培養した。次いで、細胞培養培地を９〜１０回ピペッチングしてプレートの底に緩く付いている細胞を除去した。３７℃で予め加熱されたＲＰＭＩ １６４０培地を皿当り１０ｍｌずつ入れて前記と同様に緩く付いている細胞を除去した。再び予め加熱されたＲＰＭＩ １６４０−５％ ＦＢＳ培地を皿当り１０ｍｌずつ入れて６０分間培養した。培養の後、前記と同様に洗浄を２回繰り返した。最後の洗浄を終わらせてＲＰＭＩ １６４０−５％ ＦＢＳ培地を１０ｍｌずつ入れて１８時間乃至２４時間培養した。培養の後、培地に浮かんでいる浮遊細胞だけを収集した。プレートに緩く付いている樹枝状細胞を回収するために５ｍｌ ＲＰＭＩ １６４０−５％ ＦＢＳで洗浄した。
【００４９】
このように収集した細胞の数を数えて、１０７細胞当り１０μｌのＣＤ９０、ＣＤ１９及びＮＫに対する抗体に磁石粒子が付着された溶液（Ｍｉｃｒｏｂｅａｄｓ： Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ 製品＃１３０−０４９−１０１、１３０−０８１−６０１及び１３０−０５２−５０１）を添加して６−１２℃で１５分間細胞と反応させた後、細胞反応液をＬＳまたはＭＳカラム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ， 製品＃１３０−０４２−４０１及び１３０−０４２−２０１）に通過させた。カラムを通過した細胞中ＣＤ１１ｂ−／ＣＤ８α＋樹枝状細胞を分離するために前記と同一な比率でＣＤ８αに対する抗体の磁石粒子溶液（Ｍｉｃｒｏｂｅａｄｓ： Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ 製品＃１３０−０４９−４０１）を添加して６−１２℃で１５分間細胞と反応させてＭＳカラムを通過させた。ＭＳカラムに選択されて残っている細胞を１ｍｌのＭＡＣＳ溶液（２ｍＭ ＥＤＴＡ， ０．５％ ＢＳＡが添付された冷蔵ＰＢＳ溶液）で分離してＣＤ１１ｂ−／ＣＤ８α＋樹枝状細胞を収得した。図１ｂは本実施例の分離方法を概略的に示す。
【００５０】
実施例２：マウス脾臓からＣＤ１１ｂ−／ＣＤ８α＋／ＣＤ８６＋樹枝状細胞の分離
実施例２−ａ：ＣＤ１１ｂ−／ＣＤ８α＋／ＣＤ８６＋樹枝状細胞の分離（方法３）
先ず、ＢａｌＢ／ｃまたはＩＣＲマウス（分譲処：大韓バイオリンク、韓国）から脾臓を分離してペトリ皿上でＰＢＳ溶液で洗浄した後、コラゲナーゼ溶液（１００ｕｎｉｔ／ｍｌ： Ｓｉｇｍａ Ｔｙｐｅ ＩＶ）を前記洗浄した脾臓組織に注射器で注入し、注射針で組織を千切って脾臓細胞をコラゲナーゼ溶液上に分離した。次いで、残りの組織と脾臓細胞を５０ｍｌチューブに移した後、室温で２５分間処理して脾臓細胞が組織からコラゲナーゼ溶液上に分離されて出るようにした。
【００５１】
その後、ＥＤＴＡを１０ｍＭ入れた後５分間室温でよく混ぜた。溶液上の脾臓細胞を遠心分離して収集した後、２％ ＦＣＳ、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ及び１０ｍＭ ＥＤＴＡが添加された冷蔵ＰＢＳに浮遊した後Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を利用した遠心分離を行って低い密度の細胞を分離した。分離された細胞を前記ＰＢＳに二回洗浄して再浮遊した後、１４．５％メトリザミド（ｍｅｔｒｉｚａｍｉｄｅ：Ｓｉｇｍａ製品 ＃Ｍ−３３８３）溶液の上層に乗せて再び遠心分離して低い密度の細胞を得た。収得した脾臓細胞をＲＰＭＩ  １６４０−１０％  ＦＢＳ培地（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）に再浮遊した後、細胞数がφ１００細胞培養容器当り１×１０８細胞を超えないように培地の嵩を合わせて、３７℃培養器で９０分間培養した。次いで、細胞培養培地を９〜１０回ピペッチングしてプレートの底に緩く付いている細胞を除去した。３７℃で予め加熱されたＲＰＭＩ １６４０培地を皿当り１０ｍｌずつ入れて前記と同様に緩く付いている細胞を除去した。再び予め加熱されたＲＰＭＩ １６４０−１０％ ＦＢＳ培地を皿当り１０ｍｌずつ入れて６０分間培養した。培養の後、前記と同様に洗浄を２回繰り返した。最後の洗浄を終わらせてＲＰＭＩ １６４０−１０％ ＦＢＳ培地を１０ｍｌずつ入れて１８時間乃至２４時間培養した。培養の後、培地に浮かんでいる浮遊細胞だけを収集した。プレートに緩く付いている樹枝状細胞を回収するために５ｍｌ ＲＰＭＩ １６４０−１０％ ＦＢＳで洗浄した。このように収集した細胞の数を数えて、１０７細胞当り１０μｌのＣＤ９０、ＣＤ１９及びＮＫに対する抗体に磁石粒子が付着された溶液（Ｍｉｃｒｏｂｅａｄｓ： Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ 製品＃１３０−０４９−１０１、１３０−０８１−６０１及び１３０−０５２−５０１）を添加して６−１２℃で１５分間細胞と反応させた後、細胞反応液をＬＳまたはＭＳカラムに通過させた。カラムを通過した細胞中ＣＤ１１ｂ−／ＣＤ８α＋樹枝状細胞を分離するために前記と同一な比率でＣＤ８αに対する抗体の磁石粒子溶液（Ｍｉｃｒｏｂｅａｄｓ： Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ 製品＃１３０−０４９−４０１）を添加して６−１２℃で１５分間細胞と反応させてＭＳカラムを通過させた。ＭＳカラムに選択されて残っている細胞を１ｍｌのＭＡＣＳ溶液（２ｍＭ ＥＤＴＡ， ０．５％ ＢＳＡが添付された冷蔵ＰＢＳ溶液）で分離してＣＤ１１ｂ−／ＣＤ８α＋樹枝状細胞を収得した。図１ｃは本実施例の分離方法を概略的に示す。
【００５２】
実施例２−ｂ：ＣＤ１１ｂ−／ＣＤ８α＋／ＣＤ８６＋樹枝状細胞の分離（方法４）
先ず、ＢａｌＢ／ｃまたはＩＣＲマウス（分譲処：大韓バイオリンク、韓国）から脾臓を分離してペトリ皿上でＰＢＳ溶液で洗浄した後、コラゲナーゼ溶液（１ｍｇ／ｍｌ： Ｓｉｇｍａ Ｔｙｐｅ ＩＶ）を前記洗浄した脾臓組織に注射器で注入し、注射針で組織を千切って脾臓細胞をコラゲナーゼ溶液上に分離した。次いで、残りの組織と脾臓細胞を５０ｍｌチューブに移した後、室温で２５分間処理して脾臓細胞が組織からコラゲナーゼ溶液上に分離されて出るようにした。その後、ＥＤＴＡを１０ｍＭ入れた後５分間室温でよく混ぜた。溶液上の脾臓細胞を遠心分離して収集した後、２％ ＦＣＳ、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ及び１０ｍＭ ＥＤＴＡが添加された冷蔵ＰＢＳに二回洗浄した。洗浄した後、１匹当り１ｍｌの高密度ＢＳＡ溶液（３８％ ＢＳＡ）に再浮遊して５−６ｍｌを１５ｍｌチューブに移した。その後、１−１．５ｍｌの冷蔵ＲＰＭＩ １６４０をその上に乗せて遠心分離して低い密度の細胞を得た。２回の洗浄を行って細胞の数を数えた。
【００５３】
収得した脾臓細胞をＲＰＭＩ  １６４０−１０％  ＦＢＳ培地（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）に再浮遊した後、細胞数がφ１００細胞培養容器当り１×１０８細胞を超えないように培地の嵩を合わせて、３７℃培養器で２時間培養した。次いで、細胞培養培地を９〜１０回ピペッチングしてプレートの底に緩く付いている細胞を除去した。もう一度５ｍｌ ＲＰＭＩ １６４０の培地で洗浄を行って３７℃で予め加熱されたＲＰＭＩ １６４０−１０％ＦＣＳ培地を皿当り１０ｍｌずつ入れて１８時間培養した。培養の後、培地に浮かんでいる浮遊細胞だけを収集した。プレートに緩く付いている樹枝状細胞を回収するために５ｍｌ ＲＰＭＩ １６４０−１０％ ＦＣＳで洗浄した。
【００５４】
このように収集した細胞の数を数えて、１０７細胞当り１０μｌのＣＤ９０、ＣＤ１９及びＮＫに対する抗体に磁石粒子が付着された溶液（Ｍｉｃｒｏｂｅａｄｓ： Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ 製品＃１３０−０４９−１０１、１３０−０８１−６０１及び１３０−０５２−５０１）を添加して６−１２℃で１５分間細胞と反応させた後、細胞反応液をＬＳまたはＭＳカラムに通過させた。カラムを通過した細胞中ＣＤ１１ｂ−／ＣＤ８α＋樹枝状細胞を分離するために前記と同一な比率でＣＤ８αに対する抗体の磁石粒子溶液（Ｍｉｃｒｏｂｅａｄｓ： Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ 製品＃１３０−０４９−４０１）を添加して６−１２℃で１５分間細胞と反応させてＭＳカラムを通過させた。ＭＳカラムに選択されて残っている細胞を１ｍｌのＭＡＣＳ溶液（２ｍＭ ＥＤＴＡ， ２％ ＦＢＳが添付された冷蔵ＰＢＳ溶液）で分離してＣＤ１１ｂ−／ＣＤ８α＋樹枝状細胞を収得した。図１ｄは本実施例の分離方法を概略的に示す。
【００５５】
実施例３：本発明の分離方法によるリンフォイド性樹枝状細胞の表面タンパク質発現及び収得率調査
前記実施例１及び２で分離されたＣＤ１１ｂ−／ＣＤ８α＋樹枝状細胞の各々をＰＥ（ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ）、ＦＩＴＣ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ）などの蛍光物質で表指された単一クローン抗体（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を使用して次のように染色した後分析した：  先ず、前記実施例で分離された細胞を各々２×１０４ずつ遊細胞分析用容器（Ｆａｌｃｏｎ ２０５２： Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）に分注して、遊細胞分析溶液（ＢＳＡが最終濃度０．２％に添加された冷蔵ＰＢＳ溶液）３ｍｌを添加して遠心分離した。遠心分離後、２００μｌの遊細胞分析溶液で細胞をよく浮遊して４μｌ の蛍光物質が表指された単一クローン抗体を入れて４℃で３０分間反応させた。その後、遊細胞分析溶液３ｍｌを入れて細胞を再び遠心分離して余分の抗体を除去した。遠心分離後２００μｌ の遊細胞分析溶液に細胞をよく混合して遊細胞蛍光分析器（ＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒ ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ； Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）と遊細胞分析プログラム（ＣｅｌｌＱｕｅｓｔ ｓｏｆｔｗａｒｅ）を使用して細胞の蛍光表指程度を分析した（参照：図２）。
【００５６】
図２から確認できるように、分離された樹枝状細胞はＴ細胞、Ｂ細胞及び単核細胞の代表的な表指タンパク質であるＣＤ３、ＣＤ１９、ＣＤ１４などではほとんど染色されなかった。このような結果は前記実施例１及び２で分離された細胞がリンパ球または単核球ではなく樹枝状細胞であることを示すものである。また、実施例１で分離された樹枝状細胞は、活性化された抗原提示細胞の表面で過量発現されるＢ７分子（ＣＤ８６）もほとんど発現されなかったことからまだ未成熟段階の樹枝状細胞亜群であることを示す。反面、既存に多く利用される方法である実施例２の方法で分離する場合、Ｂ７分子（ＣＤ８６）が発現されることが分かった。しかも、実施例１でＭｅｔｈｏｄ１とＭｅｔｈｏｄ２を比較する場合、１７．５％のメトリザミドを使用するＭｅｔｈｏｄ１の場合が付着方法を使用するＭｅｔｈｏｄ１に比べて著しく多い細胞を収得することができる（約７倍）ことが分かった（参照：図３）。
【００５７】
実施例４：分離されたＣＤ１１ｂ−／ＣＤ８α＋／ＣＤ８６−樹枝状細胞にＩＦＮ−γ処理及び処理時間による生存率確認
前記実施例１のＭｅｔｈｏｄ１により分離されたＣＤ１１ｂ−／ＣＤ８α＋／ＣＤ８６−樹枝状細胞を１０％ ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ 製品 ＃２６１４０−０７９）と１００Ｕ／ｍｌのＩＦＮ−γ（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ １９３０１Ｔ）が含有されたＲＰＭＩ １６４０（ＧｉｂｃｏＢＲＬ ３１８００−０２２）培地に２×１０６細胞／ｍｌ程度浮遊させて１５時間培養した。図４から分かるように１５時間培養時、生存率は５０〜６０％であった。
【００５８】
実施例５：ＮＯＤマウスの年齢による糖尿自然発症率観察及び治療血糖水準の決定
７〜８週齢雌性ＮＯＤ／Ｌｔｊマウスを米国のジャクソン社から購入して実験動物飼育用チャンバで温度２３±２℃、相対湿度５５±１０％を維持して飼育した。飼育期間中１２時間人工照明下でマウス用ケージ（ｐｏｌｙｃａｒｂｏｎａｔｅ、ミョンジン機械）に５匹以下に入れて飼育して、水と飼料（三洋飼料、ソウル）は自由に供給した。
【００５９】
実験期間中、体重及び血糖量は１週間隔に一定な時間（１０：００）に測定して糖尿発症有無を観察した。血糖はヘパリンを処理した毛細管（Ｃｈａｓｅ， Ｒｏｃｋｗｏｏｄ、アメリカ， Ｃａｔ＃２５０１）を利用して網膜静脈（ｒｅｔｉｎａｌ ｖｅｉｎ）から採血して血糖測定器（Ｇｌｕｃｏｔｒｅｎｄ， Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ， Ｂｅｒｌｉｎ、ドイツ）を使用して測定して、体重は実験動物用秤（Ｍｅｔｔｌｅｒ、アメリカ）を使用して測定した。
【００６０】
図５ａは２４週まで総１１６匹のＮＯＤマウスの中で６７匹（５７．７５％）が糖尿が発症して、この中で血糖が２００ｍｇ／ｄｌ以上であるマウスは８０％以上がひどい糖尿に進展されるとのことを示している。図５ｂは図５ａに示された結果を要約したものである。図５ｂでｔｙｐｅ Ａは主に１０〜１２週齢に糖尿病が発生し、糖尿病進行がかなり速い型（１週以内に血糖が４００ｍｇ／ｄｌ以上に到達）であり、ｔｙｐｅ Ｂは 主に１６〜１８週齢に糖尿病が発生し、糖尿病の進行程度が比較的に遅い型（血糖が４００ｍｇ／ｄｌ以上に到達するに２週掛かる）であり、ｔｙｐｅ Ｃは主に２０週齢以上で発生して糖尿病進行程度がかなり遅い型（血糖が４００ｍｇ／ｄｌまで到達するに４週以上掛かる）である。Ｔｙｐｅ Ａ，、Ｂ、 Ｃをｄｉａｂｅｔｅｓ−ｐｒｏｎｅ（ＤＰ）といって、２４週齢以上であるにも関わらず血糖が１５０ｍｇ／ｄｌであって血糖が上昇しないマウスをｄｉａｂｅｔｅｓ−ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ（ＤＲ）マウスという。
【００６１】
下記全ての実施例では主に図５ｂのｔｙｐｅ Ｂ （１６〜２２週齢）型マウスを使用して、血糖が２００ｍｇ／ｄｌ内外の水準に観察される場合、実施例１−ａで準備した樹枝状細胞を下記の実施例６のように腹腔注射した。
【００６２】
実施例６：糖尿が発症されたＮＯＤマウスに対した樹枝状細胞の単回処理時の治療効果
実施例６−１：樹枝状細胞亜群による治療効果
前記実施例１−ａの方法により分離されたＣＤ１１ｂ−／ＣＤ８α＋／ＣＤ８６−樹枝状細胞または他の亜群の樹枝状細胞をＰＢＳで２回洗浄した後、ＰＢＳ４００μｌ当り１×１０６細胞になるように細胞数を調整してＮＯＤマウスの腹腔内に注射した。次いで、前記実施例５と同様に４週間体重及び血糖の変化を測定した。樹枝状細胞による治療効果は初期反応の評価と反応の持続時間で評価した。初期反応は樹枝状細胞の処理により血糖が２００ｍｇ／ｄｌ以下に低下された時点を意味し、持続時間は樹枝状細胞の処理により血糖が２００ｍｇ／ｄｌ以下に低下された時点から血糖が２００ｍｇ／ｄｌ以上に上昇された時点までの時間を意味する（参照；図６ａ及び図６ｂ）。
【００６３】
図６ａと図６ｂはＮＯＤマウスで各樹枝状細胞亜群を単回処理時の初期反応と反応持続時間を示した表である。図６ａ及び図６ｂの表でｓｙｎｇｅｎｉｃ ＤＣは同一な個体（ＮＯＤ ｍｏｕｓｅ）から分離したＤＣを利用した場合であり、ａｌｌｏｇｅｎｉｃ ＤＣは他の個体（ＢａｌＢ／ｃマウス）から分離したＤＣを利用した場合である。
【００６４】
図６の表から分かるように初期糖尿発症状態（Ｅａｒｌｙ ＤＭ）ではＩＦＮ−γを処理した全ての亜群の樹枝状細胞が初期反応を現している。初期反応の持続時間は最低１日から１３０日以上まで持続されることが分かる。
【００６５】
明白な糖尿が形成された時期及びその以後（Ｏｖｅｒｔ ＤＭ ＆ Ｌａｔｅ ＤＭ）に樹枝状細胞を処理する場合にはリンフォイド性ａｌｌｏｇｅｎｉｃ ＤＣにＩＦＮ−γを処理した場合にのみ初期反応を現した。特に、ＩＦＮ−γを処理した骨髄性樹枝状細胞（ｍｙｅｌｏｉｄ ＤＣ）は初期糖尿のマウスにのみ効果があり、その以後の糖尿段階では全く反応がなかったことから、リンフォイド性樹枝状細胞とは治療機転が異なると予想される。また、ＩＦＮ−γを処理したｓｙｎｇｅｎｉｃ ＤＣの場合も初期糖尿に効果があると判明された。
【００６６】
前記実験結果は樹枝状細胞を分離し適合な処理で成熟／分化させる場合ＮＯＤマウスの膵臓ベータ細胞を破壊する自己反応性Ｔ細胞を糖尿段階により一時的または長期的に調節または効果的に除去することができるということを示す。
【００６７】
実施例６−２：ＣＤ１１ｂ−／ＣＤ８α＋／ＣＤ８６−樹枝状細胞を重複投与（ｂｏｏｓｔｉｎｇ）した場合の糖尿治療効果の持続性に関する観察
実施例６−１のように樹枝状細胞の単回処理による効果はマウスの状態によって最高１３０日程度まで血糖降下効果を奏した場合もあったが、大部分の場合、その効果が一時的であった。従って、単回処理による初期反応評価で最も優れた効果を奏したと評価されるａｌｌｏｇｅｎｅｉｃ ｌｙｍｐｈｏｉｄ ＣＤ１１ｂ−／ＣＤ８α＋／ＣＤ８６−ＤＣをＩＦＮ−γ処理で活性化させた後、重複投与（ｂｏｏｓｔｉｎｇ）して長期間または永久的効果を誘導するための試みを次のように実施した。
【００６８】
１７〜２３週齢の糖尿発症ＮＯＤ ５匹にＩＣＲまたはＢａｌｂ／ｃから分離されたａｌｌｏｇｅｎｅｉｃ ｌｙｍｐｈｏｉｄ ＣＤ１１ｂ−／ＣＤ８α＋／ＣＤ８６−ＤＣにＩＦＮ−γを処理して前記実施例６−１と同様に投与した後、血糖の上昇時点或いは上昇以前にｂｏｏｓｔｉｎｇした。図６ｃの表から分かるように、同一なａｌｌｏｇｅｎｅｉｃ ＤＣだけでｂｏｏｓｔｉｎｇする場合は非常に一時的効果だけが現れた。しかし、ａｌｌｏｇｅｎｅｉｃ ＤＣを変化させていく場合（ｔｒａｎｓ−ａｌｌｏ−ＤＣ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ： Ｂａｌｂ／ｃ ｔｏ ＩＣＲ， Ｂａｌｂ／ｃ ｔｏ Ｃ３Ｈ ｏｒ ＩＣＲ ｔｏ Ｂａｌｂ／ｃ）は２回のブースチングだけで充分長期間の血糖降下効果を得ることができた。図６ｃの表でＩＣＲマウスから分離したＤＣだけでも充分効果が得られたのはＩＣＲマウスが非近交系（ｏｕｔｂｒｅｄ）であるため充分ｔｒａｎｓ−ａｌｌｏ−ＤＣ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ効果を奏したためであると考えられる。
【００６９】
実施例６−３：ＩＦＮ−γの単独投与による糖尿治療効果の確認
前記実施例６−１から分かるように、ＩＦＮ−γは樹枝状細胞による糖尿治療効果に必修的であることが確認された。従って、本発明者らはＩＦＮ−γ単独でも糖尿治療効果が得られるかを調べた。前記実施例５のＮＯＤマウスに直接ＩＦＮ−γを１匹当り６００Ｕで投与して治療可能性を調査した結果、６匹中１匹だけが一時的に治療可能性を示したが死亡し、その他のマウスでは治療効果が全くなかった。これは樹枝状細胞にＩＦＮ−γを処理して得られる糖尿治療効果はＩＦＮ−γを投与して得られる免疫反応ではなく、前記実施例６−１から確認した樹枝状細胞の糖尿治療効果は全身性というよりは局部的な免疫反応から得られる結果であることを示す。
【００７０】
実施例７：樹枝状細胞による糖尿治療の組織病理学的確認
実施例７−１：膵島のＨ＆Ｅ染色による確認
前記実施例５の糖尿初期ＮＯＤマウスにａｌｌｏｇｅｎｅｉｃ ＩＦＮ−γが処理されたリンフォイド性ＣＤ１１ｂ−／ＣＤ８α＋／ＣＤ８６−樹枝状細胞を前記実施例６−１と同様にマウス１匹当り１×１０６細胞で腹腔内に注射し、４週後マウスを脊椎脱骨させて安楽死させ膵臓を摘出した。次いで、１０％中性ホルマリン溶液に２４時間固定させて、アルコール脱水及びパラフィン包埋過程を経て組織薄切機（Ｚｅｉｓｓ Ｓｕｐｅｒ Ｃｕｔ ２０５０， Ｂｅｒｌｉｎ， Ｇｅｒｍａｎｙ）で４μｍ厚さの切片を製作した。その後、ヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色して（Ｓｈｉｎｏｍｉａ ｅｔ ａｌ．， Ｃｌｉｎ． Ｅｘｐ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， １１７：３８−４３（１９９９））光学顕微鏡（Ｎｉｃｏｎ）で膵島炎（ｉｎｓｕｌｉｔｉｓ）程度を観察した（参照：図７）。
【００７１】
添付図７でＮＯＤ−ＤＭは樹枝状細胞を処理していないマウスでの膵島炎の程度を示したものであって、糖尿発症後、ただ１週で初期の膵島炎（Ａ， ｉｎｓｕｌｉｔｉｓ ｓｃｏｒｅ １）から膵島炎が急激に進展された膵島（Ｂ， ｉｎｓｕｌｉｔｉｓ ｓｃｏｒｅ ３）とベータ細胞が全部破壊されてＴ細胞が膵島全体を占めしている様子（Ｃ， ｉｎｓｕｌｉｔｉｓ ｓｃｏｒｅ ４）が全て観察された。反面樹枝状細胞で治療された群の膵島の場合は、膵島炎が観察されてはいたが、若干のＴ細胞浸潤の跡が見えるだけでそれ以上膵島炎の跡は見られなく、その程度が微弱な形態（Ａ， ｉｎｓｕｌｉｔｉｓ ｓｃｏｒｅ １）と膵島縁にのみＴ細胞がひどく浸潤（ｉｎｆｉｌｔｒａｔｅｄ）された形態（Ｂ， ｉｎｓｕｌｉｔｉｓ ｓｃｏｒｅ ２）が観察されて、高血糖状態の対照群に比べて膵島の中心部が正常的な形態で残っている様子（Ｃ， ｉｎｓｕｌｉｔｉｓ ｓｃｏｒｅ ０）が相当部分観察された。時々Ｔ細胞が浸潤して入った跡が見えるが大部分そのような跡は消えて正常的な膵島の様子を示した。
【００７２】
実施例７−２：膵島のインシュリン染色による確認
膵島のインシュリン分泌を免疫化学的に観察するために摘出した膵臓を１０％中性ホルマリン溶液に２４時間固定した後、アルコール脱水及びパラフィン包埋過程を経た。次いで、４μｍ厚さの組織切片を製作してインシュリン分泌細胞（膵島ベータ細胞）に対して次のようにアビジン−バイオチン複合体方法で膵島に対する免疫組織化学的染色を実施した：組織内の内因性過酸化酵素の活性を抑制するためにメタノールに過酸化水素水を１％濃度で添加した溶液で切片された膵臓組織を３０分間反応させて、インシュリンに対する抗体（ｇｕｉｎｅａ ｐｉｇ ａｎｔｉ−ｐｏｒｃｉｎｅ ｉｎｓｕｌｉｎ； Ｄａｋｏ ｃｏ．， Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ、デンマーク）を１：４００に希釈して組織に処理した後４℃の湿潤チャンバで２４時間反応させた。２次抗体としてバイオチンが結合された抗−モルモット抗体（ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ ａｎｔｉ−ｇｕｉｎｅａ ｐｉｇ ＩｇＧ； Ｖｅｃｔｏｒ、アメリカ）を使用し、３次反応は酵素が結合されたアビジン溶液（ａｖｉｄｉｎ−ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ； Ｖｅｃｔｏｒ、アメリカ）を使用した。各々の染色過程は１０％正常山羊血清（Ｓｉｇｍａ， Ｓ−２００７）が含有された０．１ ＭのＰＢＳで進行した。抗原抗体反応の後３，３；−ジアミノベンジジン（ＤＡＢ， Ｓｉｇｍａ， Ｄ８００１）を蒸留水に０．３ｍｇ／ｍｌ溶解させて添加し発色直前に過酸化水素水０．００３％を処理して発色させた後、光学顕微鏡下で発色過程を観察しながら適切な時期に反応を停止させて、免疫組織化学的染色の後にはマイアスヘマトキシリン溶液で鑑別染色した後、脱水過程を経て顕微鏡で観察し写真撮影した（参照：図８）。
【００７３】
添付図８でＮＯＤ−ＤＭで示した連続３枚の写真は初期糖尿が形成されたＮＯＤマウスの樹枝状細胞を投与していない膵島のインシュリン免疫染色結果であり、ＮＯＤ−ＤＣで表示された連続２枚の写真は初期糖尿が形成されたＮＯＤマウスにＩＦＮ−γが処理されたａｌｌｏｇｅｎｅｉｃ ｌｙｍｐｈｏｉｄ ＣＤ１１ｂ−／ＣＤ８α＋／ＣＤ８６−樹枝状細胞を投与して血糖が２０日間調節されたマウス膵島のインシュリン免疫染色結果である。
【００７４】
図８から分かるように、対照群ＮＯＤマウス（樹枝状細胞が投与されていない）の場合は初期糖尿発症後１〜２週内に小島は膵島炎でほとんど破壊されてインシュリン分泌が非常に微弱であるか（参照：図８のＮＯＤ−ＤＭ−Ａ、Ｂ）ほとんど観察されない（参照：図８のＮＯＤ−ＤＭ−Ｃ）糖尿末期状態に至る。しかし、樹枝状細胞で治療されたＮＯＤマウスの場合は、小島の一部が破壊されなく残っている様子が多く発見されてこれら残っている小島は正常的にインシュリンを分泌していることが観察された（参照：図８のＮＯＤ−ＤＣ−Ａ、Ｂ）。一方、これら治療群ではインシュリンに陽性反応を示す膵島が膵臓道管及び外分泌部で多数観察されて樹枝状細胞治療後、膵島新生が継続的に進行されていることが観察された（参照：図８のＮＯＤ−ＤＣ−Ａ）。
【００７５】
実施例８：ＣＭＴＭＲ及びＣＭＦＤＡ染色で染色された樹枝状細胞及び自己免疫性Ｔ細胞のｉｎ ｖｉｖｏで移動位置調査
ＣＭＴＭＲ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅ製品 ＃ｃ−２９２６）及びＣＭＦＤＡ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅ製品 ＃ｃ−２９２５）を１０ｍＭで溶解した後、使用直前血清及び他の補助物が全く入っていないＲＰＭＩ １６４０培地で最終濃度が２μＭになるように希釈して細胞の移動位置を調べるために使用した。細胞の移動位置を調べるために明白に糖尿が発症したＮＯＤマウスを屠殺してナイロンウールを用いて脾臓からＴ細胞を分離して使用し、樹枝状細胞は実施例１のＭｅｔｈｏｄ １のように分離したリンフォイド性または骨髄性樹枝状細胞を使用した。染色時１０６細胞当り１００μｌのＣＭＴＭＲ及びＣＭＦＤＡ溶液を使用して３７℃で１５分間反応させて細胞を２回洗浄した。次いで、細胞を再び新しいＲＰＭＩ培地に浮遊させた後３７℃で３０分間放置して、細胞内に浸透したＣＭＴＭＲ及びＣＭＦＤＡが再び細胞膜を透過できないような物質に転換させた。その後、ＣＭＦＤＡで染色された自己免疫性Ｔ細胞３×１０６個をＰＢＳ２００μｌに浮遊してＮＯＤマウスの尻尾静脈に注射して、ＣＭＴＭＲで染色されたリンフォイド性樹枝状細胞または骨髄性樹枝状細胞１×１０６個の細胞をＰＢＳ ４００μｌに各々浮遊しＮＯＤマウス腹腔内に注射して４８時間後にマウスを屠殺し膵臓を摘出して組織凍結培地（Ｔｉｓｓｕｅ ｆｒｅｅｚｉｎｇ ｍｅｄｉａ： Ｊｕｎｇ， Ｎｕｓｓｌｏｃｈ、ドイツ、 Ｃａｔ＃ ０２０１ ０８９２６）で冷凍して冷凍切片機（Ｃｒｙｏｓｔａｔ， Ｌｅｉｃａ ＣＭ１５１０−３， Ｌｕｓｓｌｏｏｈ、ドイツ）で５μｌ厚さの組織切片を製作して直接多焦点顕微鏡（Ｂｉｏ−Ｒａｄ ＭＲＣ １０２４ＥＳ， Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、アメリカ）で観察した（参照：図９）。
【００７６】
添付図９で、ＬＤＣ＋Ｔはリンフォイド性ＤＣ及び自己免疫性Ｔ細胞を投与したＮＯＤマウスに対しての写真であり、ＭＤＣ＋Ｔはｍｙｅｌｏｉｄ ＤＣ及び自己免疫性Ｔ細胞を投与したＮＯＤマウスに対しての写真である。図９で、ＤＬＮは離隔のリンパ節、ＰＩは膵島の周辺部、Ｓｐｌは脾臓、ＰＬＮは膵臓リンパ節そしてＴｈｙは胸腺組織に各々該当する凍結薄片の単位面積当り蛍光の程度を示した写真である。図９から分かるように、ＮＯＤマウスに腹腔投与されたＩＦＮ−γで１５時間培養したＣＤ１１ｂ−／ＣＤ８α＋／ＣＤ８６−樹枝状細胞及びＣＤ１１ｂ＋／ＣＤ８α−／ＣＤ８６−樹枝状細胞は膵臓リンパ節に一番多く位置して、次は脾臓、胸腺、膵島そして腹腔から遠く離れたところに単位面積当り移動した細胞数が一番多いことを確認した。自己免疫性Ｔ細胞も樹枝状細胞の移動位置に共存していることが観察されて、腹腔注射した樹枝状細胞は主に自己免疫疾患が発生した所と胸腺で主に作用していることを強力に示唆する。
【００７７】
実施例９：膵臓リンパ節で膵島抗原−特異細胞の培養及び培養液でサイトカイン発現測定
前記実施例６−１でＩＣＲマウスのＩＦＮ−γで処理されたＣＤ１１ｂ−／ＣＤ８α＋樹枝状細胞の単回投与により糖尿が治療されたＮＯＤマウスの治療後、膵島ベータ細胞に対する自己免疫反応の変化を観察するために次のように実験を行った。
【００７８】
実施例９−１：膵島抗原−特異リンパ節細胞の増殖及び膵島分離
ＩＣＲマウスのＩＦＮ−γで処理されたＣＤ１１ｂ−／ＣＤ８α＋樹枝状細胞１×１０６個を投与した初期糖尿のＮＯＤマウスと樹枝状細胞を投与していない初期糖尿が発症されたＮＯＤマウスから各々膵臓を摘出しリンパ節を分離してリンパ節細胞を得た後、５％の牛胎児血清が添加されたＤＭＥＭ培地に浮遊した後、プレートにウェル当り５×１０５細胞が入るように分注した。
【００７９】
一方、別途にＮＯＤマウスの膵島を摘出してベータ細胞を分離し超音波粉砕機で破砕した後、前記リンパ節細胞が入っているウェルに２．５×１０４または５×１０４細胞分量の破砕物（ＣＥＱ； ｃｅｌｌｓ ｏｆ ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ）を膵島抗原（ｉｓｌｅｔ ａｎｔｉｇｅｎ）として添加して９６時間培養しながら上清液に分泌されたＩＦＮ−γ（Ｔｈ１ 免疫反応の指標としてのサイトカイン）及びＩＬ−４（Ｔｈ２ 免疫反応の指標としてのサイトカイン）の生成量をサンドイッチ−ＥＬＩＳＡ方法で下記実施例９−２のように測定した。
【００８０】
前記膵島は次のように分離した：先ず、ＮＯＤマウスに体重１００ｇ当り１ｍｌの２０％ウレタン（Ｕｒｅｔｈａｎｅ）を腹腔投与して麻酔させた後、腹腔を切開して膵臓にコラゲナーゼＰを注入した後、一定時間が経過してから膵臓を摘出した。次いで、膵臓を３７℃で状態により１０分ほど放置した後、分解された膵臓から流れてきた細胞を収集した。前記細胞をＰＢＳで２回遠心分離で洗浄した後、比重１．０８６のファイコール（Ｆｉｏｌｌ）を添加して均一に浮遊させて溶液上層に比重１．０７６のＦｉｃｏｌｌ ４ｍｌ及び比重１．０５３のＦｉｃｏｌｌ ２ｍｌを順に湛えた。次いで、４℃ ８００ｇで１０分間遠心分離して比重１．０７６及び比重１．０５３の間に集まった膵島（ｉｓｌｅｔ）を気を付けて収去し、ＰＢＳで２回洗浄した後３７℃ ＣＯ２培養器で一日培養して翌日顕微鏡下で膵島を収穫した。
【００８１】
実施例９−２：ＥＬＩＳＡによるサイトカインの定量
ＩＬ−４及びＩＦＮ−γの生成はＥｎｄｏｇｅｎ（Ｗｏｂｕｒｎ， ＭＡ． アメリカ）で提供する試薬と材料（Ｍａｔｃｈｅｄ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐａｉｒｓ）を利用してサンドイッチ−ＥＬＩＳＡ方法で次のように測定した：先ず、９６−ウェル丸い底部プレートのウェルを１００μｌ（２μｇ／ｍｌ）のコーティング抗体（Ｅｎｄｏｇｅｎ、アメリカ）で１０〜１４時間室温でコーティングした後、ウェルを洗浄した。次いで、２００μｌの分析緩衝液（ＰＢＳ ｗｉｔｈ ４％ ＢＳＡ， ｐＨ ７．２−７．４）を添加して室温で１時間反応させた。その後、３回洗浄した後、一定比率で希釈した試料と標準溶液を５０μｌずつ二重に１時間反応させて５０μｌ（２５０μｇ／ｍｌ）のバイオチン−表指２次抗体を添加して１〜２時間反応させた。それからウェルを洗浄した後、１：１２，０００の比率で希釈したＨＲＰ−結合ストレプタビジン（ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ； Ｅｎｄｏｇｅ、アメリカ）１００μｌを添加して暗い所で３０分間反応させた。次いで、洗浄用緩衝液で洗浄した後、ＴＭＢ基質（Ｓｉｇｍａ， Ｔ−３４０５）を利用して３０分間反応させて２Ｍの硫酸を添加し反応を終了した。その後、５７０ｎｍで吸光度を測定して標準溶液を基準に計算し発現された量を決定した（参照：図１０ａ及び１０ｂ）。
【００８２】
添付図１０ａは樹枝状細胞を処理していない前記実施例５の初期糖尿発症を現すマウスから分離されたリンパ節細胞で生成されたサイトカインであり、図１０ｂは樹枝状細胞により糖尿が治療されたマウスから分離されたリンパ節細胞で生成されたサイトカインである。図１０ａから確認できるように、樹枝状細胞を処理していない対照群の場合には膵島抗原の存在下でリンパ節細胞の培養時ＩＦＮ−γ発現だけが観察されてＩＬ−４はほとんど発現されなかった。一方、図１０ｂから確認できるように、樹枝状細胞の投与により糖尿が治療されたＮＯＤマウスの場合、抽出した膵臓リンパ節細胞培養で膵島抗原の濃度に比例してＩＦＮ−γだけではなくＩＬ−４の発現も大いに増加した。
【００８３】
前記実験結果は樹枝状細胞の処理により糖尿初期Ｔｈ１型の自己免疫反応性Ｔ細胞中相当数がＴｈ２型に転換されるかまたは新しく膵島抗原特異的なＴｈ２型が発生して自己免疫反応性Ｔ細胞の活性を抑制することにより膵島炎の進展を防ぎ、糖尿症状が治療される可能性を示す。
【００８４】
実施例１０：電子顕微鏡を利用したＣＤ１１ｂ−／ＣＤ８α＋樹枝状細胞の形態観察
前記実施例１と同様にＩＣＲマウスからＣＤ１１ｂ−／ＣＤ８α＋／ＣＤ８６−樹枝状細胞を分離してＰＢＳで洗浄した後、２％パラホルムアルデヒド（ｐａｒａｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ）と２．５％グルタルアルデヒド（ｇｌｕｔａｒａｌｄｅｈｙｄｅ）混合液（４℃、ｐＨ ７．２）で２時間前固定（ｐｒｅ−ｆｉｘａｔｉｏｎ）して０．１Ｍ ＰＢＳで３回洗浄した。次いで、同一緩衝溶液と１：１に混合した１％ ＯｓＯ４（４℃， ｐＨ ７．２）で１時間後固定（ｐｏｓｔ−ｆｉｘａｔｉｏｎ）した。固定が終わった実験材料を同一緩衝溶液を使用して充分洗浄し、エタノールで濃度を増加させながら（３０％、５０％、７０％、８０％、９０％、９５％、無水Ｉ、無水ＩＩ）脱水した。脱水が終わった試料はプロピレンオキシドで置換し透明化（ｃｌｅａｒｉｎｇ）させた後、エポン−アラルジト（Ｅｐｏｎ−Ａｒａｌｄｉｔｅ）混合液（Ｐｏｌｙ／Ｂｅｄ ８１２ Ｅｍｂｅｄｄｉｎｇ Ｍｅｄｉａ， Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｉｎｃ．）で包埋して６０℃で２８時間熱重合させた。
【００８５】
包埋された組織はウルトラマイクロトム（ＬＫＢ−Ｖ）を用いて先ず準超薄切片（ｓｅｍｉｔｈｉｎ ｓｅｃｔｉｏｎ）で製作した後、１％ヴォラクス（ｖｏｒａｘ）に溶解された１％トルイジンブルー（ｔｏｌｕｉｄｉｎｅ ｂｌｕｅ）でホットプレート（６０℃）上で染色して、光学顕微鏡で観察した。次いで、超薄切片（ｔｈｉｎ ｓｅｃｔｉｏｎ）を製作してニッケルグリッドに付着させた後、ウラニルアセテート（ｕｒａｎｙｌａｃｅｔａｔｅ）とリッドシトレード（ｌｅａｄ ｃｉｔｒａｔｅ）で二重染色してＪＥＭ １００ ＣＸ−ＩＩ型（ＪＥＯＬ Ｃｏ．， 日本国）透過電子顕微鏡で８０ｋＶで観察及び撮影した（参照：図１１）。
【００８６】
添付図１１で、ＡパネルはＩＦＮ−γが処理されていないＣＤ１１ｂ−／ＣＤ８α＋／ＣＤ８６−樹枝状細胞に対したものであり、ＢパネルはＩＦＮ−γが処理されたＣＤ１１ｂ−／ＣＤ８α＋樹枝状細胞に対したものである。図１１で確認できるように、ＩＦＮ−γが処理されていない細胞の場合は最初分離された時と同一に小胞体がよく発達されており、核膜と染色体の構造がはっきりと観察されたが、ＩＦＮ−γを処理した細胞の場合は小胞体の構造が消えて形質球（ｐｌａｓｍａｓｙｔｏｉｄ） の形態も顕著に変えて、核膜の区分がぼやけて染色体も解けて消える様子を示し、しかも細胞膜は樹枝状の突起が多く現れる形態学的所見を示した。前記形態的変化は一般的に成熟された樹枝状細胞に現れる現象であって、ＩＦＮ−γ処理で未成熟段階のリンパ性樹枝状細胞が起源は異なるが活性化された骨髄性樹枝状細胞のように成熟された樹枝状細胞の形態に分化されることを示すものである。
【００８７】
実施例１１：正常人の血液からＣＤ１１ｃ−／ＣＤ４＋／ＣＤ８６−樹枝状細胞の分離
マウスのＣＤ１１ｂ−／ＣＤ８α＋樹枝状細胞亜群は人間では現れない表現型である。これに、本発明者らはＣＤ１１ｂ−／ＣＤ８α＋樹枝状細胞に対応される人間の樹枝状細胞を次のような根拠に基づいてＣＤ１１ｃ−樹枝状細胞であると判断した：図１２でＡ ｐａｎｅｌ は人間の末梢血液から分離したＣＤ１１ｃ−樹枝状細胞そしてＢ ｐａｎｅｌはＣＤ１１ｃ＋樹枝状細胞の形態学的特徴を示すものである。図１２はＣＤ１１ｃ−樹枝状細胞の電子顕微鏡的形態を従来の文献（Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １６３： ３２５０−３２５９（１９９９））から抜粋したものであって、小胞体（ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃ ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ； ＥＲ）の発達、分明な核膜及び染色体の形態などの電子顕微鏡的所見がＣＤ１１ｂ−／ＣＤ８α＋樹枝状細胞と非常に類似である（参照：図１２のＡ）。また、ＣＤ１１ｃ−樹枝状細胞がリンパ性樹枝状細胞として免疫調節及び免疫抗原に関与する可能性を示した研究結果（Ｏ；Ｄｏｈｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ．， Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ８２： ４８７−９３（１９９４））も本発明者らの結論を裏付けるものである。つまり、前述の事実に基づいて本発明者らは人間の血液からＣＤ１１ｃ−樹枝状細胞を次のように分離した（参考；図１ｅ−ｆ）：
【００８８】
実施例１１−１：ＰＭＢＣからの分離
ＭＡＣＳ社の血液樹枝状細胞分離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ 製品＃４６８−０１）で提示する方法を変形して次のように人間の血液からＣＤ１１ｃ−樹枝状細胞を分離した：先ず、正常人の血液をリュカフェレシス（ｌｅｕｋａｐｈｅｒｅｓｉｓ）して得た白血球濃縮液をＰＢＳ溶液で３倍希釈した後、３０ｍｌ当り１０ｍｌのファイコール−ハイパク（Ｈｙｐａｑｕｅ）を容器の底に添加して２０００ｇで３０分間常温で遠心分離して中間層に集まる細胞層を収穫した。次いで、収穫した細胞をＰＢＳ溶液で３回連続的に洗浄して、この過程で遠心分離速度は１６００ｇ、１２００ｇ及び９００ｇに順次的に緩めて５分間ずつ進行した。このように分離されたＰＢＭＣ（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ ｃｅｌｌｓ）の細胞数を測定した後、各２．５×１０８−３×１０８個のＰＢＭＣから次のような方法でＣＤ１１ｃ−樹枝状細胞を分離した（図１ｅ）。
【００８９】
先ず、前記分離された２．５×１０８−３×１０８個のＰＢＭＣを２０ｍｌのＭＡＣＳ溶液（２ｍＭ ＥＤＴＡ， ０．５％ ＢＳＡが添付された冷蔵ＰＢＳ溶液）で洗浄した。次いで、全体の嵩が１．２ｍｌになるようにＭＡＣＳ溶液で調整して細胞を均一に混合した後、血液樹枝状細胞分離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ 製品＃４６８−０１）で提供するＦｃＲブロッキング溶液０．４ｍｌとヘプテン；Ａｂカクテルを０．４ｍｌ入れて冷蔵状態で２０分間反応させた。その後、 ４０ｍｌのＭＡＣＳ溶液で２回洗浄して遠心分離を実施し、遠心分離時ごとに細胞上等液を陰圧を使用して最大限除去した。その後、全体の嵩が３．６ｍｌになるように細胞にＭＡＣＳ溶液を添加して細胞を均一に混合した後、ＭＡＣＳ抗−ヘプテン磁石玉溶液０．４ｍｌとよく混合して冷蔵状態で２０分間反応させた。別途に、冷蔵状態のＣＳカラム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ 製品＃１３０−０４１−３０５）を磁性分離台（ＶａｒｉｏＭＡＣＳ： Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ 製品＃１３０−０９０−２８２）に固定して６０ｍｌのＭＡＣＳ溶液でカラムを洗浄した。
【００９０】
前記反応の終わった２ｍｌの細胞溶液を前記ＣＳカラムに通過させて３０ｍｌのＭＡＣＳ溶液で洗浄した後、カラムに付着されなく抜け出た細胞を収去した。次いで、細胞数を測定して遠心分離し上等液を除去した。その後、１０７個の細胞当り７０μｌになるようにＭＡＣＳ溶液でよく混合して１５μｇのＣＤ１１ｃ抗体（１μｇ／μｌ： ＢＤ製品 ＃３０４８０Ｄ）及び７０μｌのＣＤ１４抗体を入れて冷蔵状態で２０分間反応させた。その後、３ｍｌのＭＡＣＳ溶液で２回洗浄して遠心分離を実施し、遠心分離時ごとに細胞上等液を最大限除去した。次いで、全体の嵩が７０μｌになるように細胞をＭＡＣＳ溶液で均一に混合した後、マウスＩｇＧ特異的抗体が付着された磁石玉溶液（Ｇｏａｔ Ａｎｔｉ−Ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ ＭｉｃｒｏＢｅａｄｓ： Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ 製品＃１３０−０４８−４０１）３０μｌと混合して１５分間４−６℃で反応させた。その後、３ｍｌのＭＡＣＳ溶液を入れて遠心分離し細胞に付いていない磁石玉をできるだけ完全に除去した。
【００９１】
次いで、細胞を０．５ｍｌのＭＡＣＳ溶液によく混合した後ＭＳカラムに通過させて磁性表指された細胞を除去した。カラムを０．５ｍｌのＭＡＣＳ溶液で３回洗浄した後、磁性表指されていない細胞を遠心分離して収去した。全体の嵩が０．２ｍｌになるようにＭＡＣＳ溶液で調整して遠心分離された細胞を均一に混合した後、血液樹枝状細胞分離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ 製品＃４６８−０１）で提供するＣＤ４磁石玉溶液０．２ｍｌと混合して冷蔵状態で３０分間反応させた。次いで、８ｍｌのＭＡＣＳ溶液を入れて遠心分離して細胞に付いていない磁石玉をできるだけ完全に除去した後、細胞を０．５ｍｌのＭＡＣＳ溶液によく混合した後ＭＳカラムに通過させて磁性表指されていない細胞を除去した。その後、カラムを０．５ｍｌのＭＡＣＳ溶液で３回洗浄して、カラムに付着された細胞を選択的に収去するためにカラムを磁性分離台（ＶａｒｉｏＭＡＣＳ： Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ 製品＃１３０−０９０−２８２）から分離した。その後、前記カラムを１５ｍｌ遠心分離容器の上に載せて１ｍｌのＭＡＣＳ溶液を添加した後、注射器ピストンで圧力を加えてカラム内に残っている細胞を遠心分離容器に収去した。このように磁性で選択された細胞を再びＭＳカラム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ 製品＃１３０−０４２−２０１）に通過させて磁性表指されていない他の細胞をもう一度除去した。次いで、０．５ｍｌのＭＡＣＳ溶液で３回洗浄した後、前述と同様にＭＳカラムに選択されて残っている細胞を１ｍｌのＭＡＣＳ溶液で分離した。最終的に、遠心分離で細胞を収集して、遊細胞蛍光測定方法によりＣＤ１１ｃ−／ＣＤ４＋／ＣＤ８６−樹枝状細胞の分離純度を確認した。
【００９２】
実施例１１−２：脾臓細胞からの分離
人間の脾臓細胞からＣＤ１１ｃ−樹枝状細胞を分離する方法はＭＡＣＳ社の血液樹枝状細胞分離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ 製品＃４６８−０１）で提示する方法を変形して次のようにＣＤ１１ｃ−樹枝状細胞を分離した：
【００９３】
先ず、コラゲナーゼ処理方法で人間の脾臓細胞を遊離した後、ＰＢＭＣ分離時使用する標準化されたＦｉｃｏｌｌ遠心分離条件下で遠心分離して、境界層にある脾臓細胞を収穫してＰＢＳ溶液で洗浄する。分離された脾臓細胞中３×１０８個だけを２０ｍｌのＭＡＣＳ溶液（２ｍＭ ＥＤＴＡ， ０．５％ ＢＳＡが添付された冷蔵ＰＢＳ溶液）で洗浄した。次いで、全体の嵩が１．２ｍｌになるようにＭＡＣＳ溶液で調整して細胞を均一に混合した後、前述の血液樹枝状細胞分離方法と同一な方法でＣＤ１１ｃ−／ＣＤ４＋／ＣＤ８６−樹枝状細胞を分離した（図１ｆ）。一方、ＣＤ１１ｃ＋細胞を除去する段階を省略した場合にも約８６％純度ＣＤ１１ｃ−／ＣＤ４＋／ＣＤ８６−樹枝状細胞を分離することができた。
【００９４】
実施例１２：第１型糖尿病患者に対する樹枝状細胞の治療効果
前記実施例１１で分離されたＣＤ１１ｃ−／ＣＤ４＋／ＣＤ８６−樹枝状細胞を前記実施例４と同様にＩＦＮ−γで処理する。次いで、ＣＤ１１ｃ−／ＣＤ４＋樹枝状細胞の培養物を遠心分離機で沈澱させた後、上等液を捨てて生理食塩水を添加する。その後、第１型糖尿病患者の腹腔内に注射する。それから、血糖量の変化を測定して糖尿症状の治療効果を確認する。
【００９５】
実施例１３：コラーゲンで誘発したリューマチ関節炎モデルマウスで樹枝状細胞の治療効果
実施例１３−１：ＤＢＡ／１マウスでコラーゲンでリューマチ関節炎の誘発
５〜６週齢の雄性ＤＢＡ／１マウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， アメリカ）を利用する。牛第ＩＩ型コラーゲン（Ｓｉｇｍａ、アメリカ）を０．０５Ｍアセト酸溶液に最終濃度２ｍｇ／ｍｌになるように添加した後、攪拌器を使用して４℃で一晩中溶解させる。溶解したコラーゲンを同一容量の完全フロイントのアジュバント（ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｆｒｅｕｎｄ；ｓ ａｄｊｕｖａｎｔ： ＣＦＡ）に混合して、マウス当り１００μｇを尻尾の始まり部位に皮内注射する。３週後１００μｇのコラーゲンを同一容量の不完全フロイントのアジュバント（ｉｎｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｆｒｅｕｎｄ；ｓ ａｄｊｕｖａｎｔ： ＩＦＡ）に溶解して同一部位に注射する。最初投与後４週に４０μｇのＬＰＳを腹腔内に投与して関節炎発症を同期化させる（参照：ＳＨ Ｋｉｍ， ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｉｍｍｕｏｎｌ．， １６６： ３４９９−３５０５（２００１））。
【００９６】
実施例１３−２：樹枝状細胞亜群の関節炎治療効果の確認
前記実施例１と同一な方法で正常のＤＢＡ／１マウスの脾臓からＣＤ１１ｂ−／ＣＤ８α＋／ＣＤ８６−樹枝状細胞を分離して、前記実施例２と同様にＩＦＮ−γで処理した後、前記実施例１２−１のマウスの足の関節内に局所投与して関節炎治療効果を確認する。
【００９７】
関節炎の中等度評価は下記のような方法で点数化して評価することにより樹枝状細胞の治療効果を検証する（ＳＨ Ｋｉｍ， ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｉｍｍｕｏｎｌ．， １６６： ３４９９−３５０５（２００１））：中等度０：浮腫や腫脹がない場合；中等度１：足筋骨や足首関節に局限された軽い浮腫と発赤；中等度２：足首関節から足筋骨にかけての軽い浮腫と発赤；中等度３：足首関節から中足骨にかけての中等度の浮腫と発赤；及び、中等度４：足首から足指全体にかけてのひどい浮腫と発赤、特に足首及び足指の奇形と強直が発生した場合。
【００９８】
平均関節炎指数（Ｍｅａｎ ａｒｔｈｒｉｔｉｓ ｉｎｄｅｘ）＝全体マウスの４足の中等度の合／全体マウスの数
関節炎が発生した足の平均（％）＝中等度２以上の関節炎が発生した足の数／全体足の数×１００
浮腫度＝全体マウスの４足の厚さの合／全体マウスの数
【００９９】
実施例１３−３：治療効果の組織学的検査
前記実施例１３−２でＣＤ１１ｂ−／ＣＤ８α＋樹枝状細胞が投与されたマウスの足関節を新鮮に分離して１０％中性ホルマリン溶液に２４時間固定した後、１５％ ＥＤＴＡと３０％グリセリンが含まれた溶液で脱カルシウム（ｄｅｃａｌｃｉｆｉｃａｔｉｏｎ）させて、一般的なアルコール脱水及びパラフィン包埋過程を経てから５μｍの厚さで切薄してヘマトキシリンとエオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色して骨腐食度と単核球浸潤程度を観察して治療程度を評価する（参照：ＳＨ Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．， Ｊ．Ｉｍｍｕｏｎｌ．， １６６：３４９９−３５０５， （２００１））。
【０１００】
実施例１４：リューマチ関節炎患者に対する樹枝状細胞の治療効果
前記実施例１０で分離されたＣＤ１１ｃ−／ＣＤ４＋／ＣＤ８６−樹枝状細胞を前記実施例４と同様にＩＦＮ−γで処理する。次いで、ＣＤ１１ｃ−／ＣＤ４＋樹枝状細胞の培養物を遠心分離機で沈澱させた後、上等液を捨てて生理食塩水を添加する。その後、リューマチ関節炎患者の関節内に注射する。その後、関節炎の治療効果を確認する。
【０１０１】
以上、本発明の望ましい具現例を詳細に記述したが、当業界の通常の知識を有する者にとっては、このような具体的な技術はただ望ましい具現例に過ぎなく、これに本発明の範囲が限定されないことは明らかである。従って、本発明の実質的な範囲は添付された請求項とその等価物により定義されると言える。
【０１０２】
本発明は自己免疫疾患の免疫治療用薬剤学的組成物を提供する。また、本発明は自己免疫疾患の治療方法を提供する。本発明の薬剤学的組成物及び治療方法は第１型糖尿病及びリューマチ性関節炎のような多様な自己免疫疾患の治療に利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１ａは本発明に係る特定樹枝状細胞亜群を分離する一つの方法を示した概略図である。
【図２】図１ｂは本発明に係る特定樹枝状細胞亜群を分離する一つの方法を示した概略図である。
【図３】図１ｃは本発明に係る特定樹枝状細胞亜群を分離する一つの方法を示した概略図である。
【図４】図１ｄは本発明に係る特定樹枝状細胞亜群を分離する一つの方法を示した概略図である。
【図５】図１ｅは本発明に係る特定樹枝状細胞亜群を分離する一つの方法を示した概略図である。
【図６】図１ｆｈ本発明に係る特定樹枝状細胞亜群を分離する一つの方法を示した概略図である。
【図７】図２ａは本発明の方法１による実施例で分離された樹枝状細胞の表面タンパク質の発現様態のＦＡＣＳ結果を示したグラフである。
【図８】図２ｂは本発明の方法２による実施例で分離された樹枝状細胞の表面タンパク質の発現様態のＦＡＣＳ結果を示したグラフである。
【図９】図２ｃは本発明の方法３による実施例で分離された樹枝状細胞の表面タンパク質の発現様態のＦＡＣＳ結果を示したグラフである。
【図１０】図２ｄは本発明の方法４による実施例で分離された樹枝状細胞の表面タンパク質の発現様態のＦＡＣＳ結果を示したグラフである。
【図１１】図３は本発明の分離方法によるＣＤ１１ｂ−／ＣＤ８α＋／ＣＤ８６−樹枝状細胞の収得率を示したグラフである。
【図１２】図４は本発明の分離方法によるＣＤ１１ｂ−／ＣＤ８α＋／ＣＤ８６−樹枝状細胞をＩＦＮ−γの処理下で培養した場合の生存率を示したグラフである。
【図１３】図５ａはＮＯＤマウスで年齢による血糖量の変化を示したグラフである。
【図１４】図５ｂはＮＯＤマウスで年齢による糖尿病の発展様態を示したグラフである。
【図１５】図６ａは本発明による樹枝状細胞を１回注入した後初期反応を分析した表であって、数値は初期反応を現したマウスの百分率であり、括弧内の数値は実験に使用された全体マウスの数である。
【図１６】図６ｂは各樹枝状細胞亜群の注入によるＮＯＤマウスで初期反応及び正常血糖症が維持される期間を示した表である。
【図１７】図６ｃは各樹枝状細胞亜群の注入及びブースチング注入によるＮＯＤマウスでの正常血糖症が維持される期間を示した表である。
【図１８】図７は本発明による樹枝状細胞の糖尿病に対しての治療的効果を示す膵島のヘマトキシリン及びエオシン染色写真である。
【図１９】図８は本発明による樹枝状細胞の糖尿病に対しての治療的効果を示すインシュリンの免疫組織化学的染色写真である。
【図２０】図９は樹枝状細胞及び自己免疫Ｔリンパ球のｉｎ ｖｉｖｏ移動を示す写真である。
【図２１】図１０ａ初期糖尿発症されたＮＯＤマウスから分離した膵臓リンパ節細胞に膵島抗原を処理した後、ＩＬ−４及びＩＦＮ−γの変化を示したグラフである。
【図２２】図１０ｂは本発明により糖尿病が治療されたＮＯＤマウスから分離した膵臓リンプ節細胞で免疫反応の転換を示すＩＬ−４及びＩＦＮ−γの変化グラフである。
【図２３】図１１はＩＦＮ−γを処理した後のＣＤ１１ｂ−／ＣＤ８α＋樹枝状細胞の形態的変化を示した写真である。
【図２４】図１２は人間の末梢血から分離されたＣＤ１１ｃ−樹枝状細胞及びＣＤ１１ｃ＋樹枝状細胞の形態的変化を示した写真である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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