(57)【要約】- 自己抗体含有体液、または自己の細胞もしくは組織調製物から抗体含有液を得、- ある群の抗体と結合するリガンドが固定された固体の担体で抗体含有液を処理し(ただし、該リガンドとして腫瘍関連抗原に対する同じイデオタイプを有する抗体もしくはその断片は使用しない)、- 該リガンドと結合する抗体を回収し、そして- 回収した抗体をワークアップして有効量が数μgから1gまでの抗体を含む自己ワクチンとする工程を特徴とする自己抗体含有ワクチンの製造方法を開示する。
2004524369.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程を特徴とする自己抗体含有ワクチンの製造方法:
-  自己抗体含有体液、または自己の細胞もしくは組織調製物から抗体含有液を得、
-  ある群の抗体と結合するリガンドが固定された固体担体で抗体含有液を処理し(ただし、該リガンドとして腫瘍関連抗原に対する同じイデオタイプを有する抗体もしくはその断片は使用しない)、
-  該リガンドと結合する抗体を回収し、そして
-  回収した抗体をワークアップして免疫原量1μg以上の抗体を含む自己ワクチンとする。
【請求項２】
以下の工程を特徴とする自己抗体含有ワクチンの製造方法:
-  個体から抗体含有液を得、
-  ある群の抗体と結合するリガンドで該液を処理し(ただし、該リガンドとして腫瘍関連抗原に対する同じイデオタイプを有する抗体もしくはその断片は使用しない)、
-  リガンドと結合していないすべての物質を分離し、
-  リガンドと結合した抗体を溶離剤で処理してリガンドと結合した抗体を溶出させ、
-  溶出液中のリガンドと結合した抗体を回収し、そして
-  得られた溶出液をワークアップして免疫原量1μg以上の抗体を含む自己ワクチンとする。
【請求項３】
免疫原量3μg〜3gの範囲の抗体を含む自己ワクチンを製造することを特徴とする請求項1または2のいずれかに記載の方法。
【請求項４】
自己免疫疾患に発生する抗体と結合する手段がリガンドとして選ばれることを特徴とする請求項1〜3のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
アレルギー性疾患に発生する抗体と結合する手段がリガンドとして選ばれることを特徴とする請求項1〜3のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
α-Gal-エピトープに対する抗体と結合する手段がリガンドとして選ばれることを特徴とする請求項1〜3のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
ヒト精子に対する抗体と結合する手段がリガンドとして選ばれることを特徴とする請求項1〜3のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
B細胞リンパ腫疾患に特異的な抗体と結合する手段がリガンドとして選ばれることを特徴とする請求項1〜3のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
体液が血清または血漿であることを特徴とする請求項1〜8のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
個体がヒトであることを特徴とする請求項1〜9のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
該リガンドが1を超える種類、特に特異性が異なる抗体と結合するリガンドから選ばれることを特徴とする請求項1〜10のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
該リガンドが免疫グロブリンのあるサブクラスと結合することを特徴とする請求項1〜11のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
該リガンドがある免疫グロブリン鎖と結合することを特徴とする請求項1〜12のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
抗体、特にモノクローナル抗体、抗原、自己抗原、ハプテン、アレルゲン、またはそれらの混合物をリガンドとして用いることを特徴とする請求項1〜13のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
ワークアップが、アジュバント、特にアルミニウム含有アジュバント、リポポリサッカライド誘導体、カルメット・ゲラン桿菌(Bacillus Calmette Guerin)、リポソーム、サポニン、およびそれらの誘導体、免疫刺激細胞、特に樹状細胞、活性化剤、好ましくはサイトカイン、特に顆粒球マクロ‐ファージ刺激因子、製剤用補助剤、特に、緩衝物質、安定化剤もしくは可溶化剤、またはこれら物質の混合物の群から選ばれる物質を加えることを含む請求項1〜14のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
タンパク質変性工程、特に熱処理を行うことを特徴とする請求項1〜15のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
請求項1〜16のいずれかに記載の方法に従って入手できることを特徴とする自己ワクチン。
【請求項１８】
免疫調節、特に望ましくない抗体活性を下方調節するための手段を生み出すための請求項17に記載の自己ワクチンの使用。
【請求項１９】
成分:
a)個体の抗体含有液からのある群の抗体と結合するためのリガンドを有する用具、
b)リガンドと結合する抗体を回収するための物質、および
c)自己ワクチンとするための回収した抗体のワークアップ剤
を含む自己ワクチンを製造するためのキット。
【請求項２０】
成分a)がリガンド、および抗体含有流動体を受け取るための容器を含むことを特徴とする請求項19に記載のキット。
【請求項２１】
容器が固体担体と結合したリガンドを含むことを特徴とする請求項20に記載のキット。
【請求項２２】
該容器が磁性ビーズを含み、さらにキットが該ビーズを局在化するための磁石を含む請求項21に記載のキット。
【請求項２３】
成分b)が抗体を精製する手段を含むことを特徴とする請求項19〜22のいずれかに記載のキット。
【請求項２４】
成分c)がアジュバントを含むことを特徴とする請求項19〜23のいずれかに記載のキット。
【請求項２５】
回収用および回収抗体のワークアップ用の単一物質、および所望により補助剤を成分b)およびc)として含むことを特徴とする請求項19〜24のいずれかに記載のキット。
【請求項２６】
該手段が回収用および回収した抗体のワークアップ用の低可溶性アルミニウム化合物を含むことを特徴とする請求項25に記載のキット。
【請求項２７】
用具a)がリガンド、手段b)およびc) を含む容器を含むことを特徴とする請求項19〜26のいずれかに記載のキット。
【請求項２８】
該用具がワクチンおよびアジュバントを含むシリンジを含むことを特徴とする請求項27に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明はワクチンの製造方法に関係する。
高等生物は、潜在的に有害な物質または微生物からそれらを保護する免疫系を特徴とする。物質(抗原)が体内に入ると、それは「異物」として認識され、免疫系の助けを借りて除去される。また、「変性」内在細胞は通常、免疫系により認識され、除去される。
【０００２】
ヒトの適応免疫系は、2つの重要な構成要素の液性免疫と細胞性免疫からなる。適応免疫反応は、BおよびTリンパ球のクローン選択に基づいており、原則として、免疫学的記憶の形成とあらゆる所望の抗原認識を可能にする。適応免疫系のこれらの特性は、一般にワクチン接種において有効に扱われる。
【０００３】
各B細胞は、限定された結合特異性を有する抗体を生成する。この抗体は、それを生成するB細胞の膜に特異的レセプターとしても存在する。異物として認識された抗原に対する液性免疫反応は、各抗原のエピトープと結合することができるような抗体を生成するそれらB細胞の選択的な活性化に基づく。抗体多様性に関して、B細胞の分化時におけるDNAの再配列が決定的役割を果たす。
【０００４】
ヒト血清には、ほとんど特異性、アイソタイプ、およびサブクラスが異なる大量の抗体が存在する。血清中の全ての免疫グロブリンの総濃度は15-20mg/mLであり、これは、ほとんど特異性が異なる約100gの免疫グロブリンが絶えず血中を循環していることを意味する。異なる特異性の全ての抗体の正確な数を示すことはできないが、1人のヒトにおける異なるB-細胞クローンのレパートリーは約109である。一般に、ある抗体は、親和性および結合活性が異なるが種々の同様の抗原と結合することができる。
【０００５】
内在性調節メカニズムの助けにより、免疫系は、これらの異なる特異性の分布と重要性に関して恒常性を維持しなければならない。このための1つの本質的メカニズムは、「イデオタイプネットワーク」である(Ann. Immunol. 125C: 373-89 (1974))。後者の結合特異性を決定する抗体の各イデオタイプに対して、抗原認識と同様に最初の抗体のイデオタイプと結合する抗イデオタイプ抗体が存在する。この説明モデルによれば、リンパ球上のイデオタイプ特異的レセプター間の相互作用が免疫系の調整を担う。免疫反応時において、抗イデオタイプ抗体は免疫反応により最初に誘導される抗体に対して生じることが示されているので、これら相互作用は明らかに実際に発生する。抗イデオタイプ抗体はあらゆる抗体に対して存在するので、リンパ球は、基本的に抗体のイデオタイプに関して寛容(耐性)ではない。
免疫系に干渉するいくつかの可能な方法がある。
【０００６】
1.  受動的抗体療法:
治療目的で、この生物中のある機能に必要な抗体を生物に供給することが可能である。この種の応用は受身免疫療法と呼ばれ、種々の医学的適応、例えば癌免疫療法(Immunol. Today (2000), 21: 403)、中毒(Toxicon (1998), 36: 823; Therapie (1994), 49: 41)、および感染症(Clin. Infect. Dis. (1995), 21: 150)に用いることができる。この場合、適切に免疫にされた動物から得られるか、または免疫グロブリン遺伝子の不死化による種々の生物学的もしくは分子生物学的技術(例えば、ハイブリドーマ技術、ファージ表現技術等など)により細胞から回収することができる抗体を用いることができる。
【０００７】
受動的抗体投与は、レシピエント生物中に投与された抗体が自然に分解するにつれて効果が低下するので、長期効果がないという欠点がある。
【０００８】
2.  能動免疫:
免疫系を調節するため、抗原による免疫を用いることができる。抗原は抗体と結合することができる分子、分子複合体、または完全な有機体である。
【０００９】
必ずしも全ての抗原が免疫反応を引き起こすとは限らない。すなわち、必ずしも全ての抗原が免疫原性であるとは限らない。ある低分子は、免疫系によって認識されず(ハプテン)、そのような低分子は、適切な形で免疫系に提示され、免疫原性となることができる。そのような方法は、免疫原性分子、いわゆる担体分子へのハプテンの結合(カップリング)である。
【００１０】
他の非免疫原性抗原は、いわゆる自己抗原、すなわち免疫系に内因性物質として認識される構造物である。そのような抗原による免疫は、通常、特異的免疫反応を生じない。腫瘍関連抗原の場合、これら抗原が実際に自己抗原であるという事実が、強力なワクチンの開発における最も大きな困難のうちの1つである。
【００１１】
完全抗原によるウイルスまたは細菌のような病原体に対する能動免疫は、病原体が弱毒化されるかもしくは死んでいる場合にのみ可能である。弱毒化した病原体には、復帰突然変異、すなわち弱毒化病原体が再び有毒型に変化するという危険性がある。そのような問題の解決法は、免疫処置目的の代用抗原として抗イデオタイプ抗体を用いることかもしれない(Int. Arch. Allergy Immunol. (1994), 105: 211)。
【００１２】
抗イデオタイプ抗体による能動免疫は、アレルギー治療にも提案されてきた(Int. Arch. Allergy Immunol. (1999), 118: 119)。
【００１３】
しかしながら、内在性抗原に対する抗体は、全てのヒトの血清中に存在し、「天然の自己抗体」と呼ばれる。
【００１４】
そのような天然の自己抗体の抗イデオタイプ抗体は、これら自己抗体の調節に関与している(Immunol. Reviews (1989), 110: 135; Eur. J. Immunol. (1993), 23: 783)。
【００１５】
不十分なイデオタイプ調節は、多くの自己免疫疾患において役割を果たすように思われる:
-  全身性エリテマトーデス(Autoimmunity (1994), 17: 149)；
-  自己免疫性甲状腺炎(Eur. J. Immunol. (1993), 23: 2945);
-  全身性血管炎(J. Autoimmunity (1993), 6: 221);
-  ギランバレー症候群(Clin. Immunol. Immunopathol. (1993), 67: 192);
-  抗VII:C因子自己免疫疾患(Proc. Natl. Acad. Sci., USA (1987), 84: 828)。
【００１６】
自己抗原に似たイデオタイプ抗体による免疫は、自己免疫疾患において既に実行されてきた(J. Rheumatol. (1999), 26:2602)。また、抗イデオタイプ抗体を誘導するためのペプチドも既に記載されている(Proc. Natl. Acad. Sci., USA (1993), 90: 8747; Immunology (1999), 96: 333)。
【００１７】
T細胞レセプターに基づく自己免疫疾患における免疫も既に提案されてきた(J. Immunol. (1990), 144: 2167、米国特許6,090,387、米国特許6,007,815)。
【００１８】
能動免疫は、毒性物質(例えば細菌毒素)に対する防御としても用いられる。この場合に毒素をワクチンとして用いるには、予めそれらをそれぞれ弱毒化または不活化しなければならない。しかしながら、そのような不活化は、免疫反応の有効性にも影響を与えるかもしれない。毒素によく似たワクチンとしての抗イデオタイプ抗体が提案されてきた(Int. J. Clin. Lab. Res. (1992) 22: 28; Clin. Exp. Immunol. (1992) 89: 378; Immunopharmacology (1993) 26: 225)。
【００１９】
単独では弱すぎるあろうワクチンを用いてより高い特異的免疫効果を達成するために、初回免疫時に抗イデオタイプ抗体を用いることも提案されてきた(Virology (1984) 136: 247)。
【００２０】
3.血液からの抗体および免疫複合体の回収:
血液から抗体を取り出す1つの可能な方法は、主として自己免疫疾患において適用された(The Lancet 10/20/1979), 824)潅流システム(米国特許5,122,112)を用いることである。しかしながら、そのような体外免疫吸着は患者への大きい負担と高い処置危険性を構成し、そのためこの方法は一般的な臨床療法に適さない。
【００２１】
現在、調節のための能動免疫は、有毒過ぎるかもしくは潜在的に感染性であるかもしれないが免疫原性でないある抗原を用いて行われるかもしれない。この問題の部分的な解決法は、免疫処置に抗イデオタイプ抗体を用いることである。しかしながら、そのような抗体は細胞培養もしくはin vitroで製造するか、またはある生物を用いて誘導し、次いでこれを別の生物に投与する必要がある。
【００２２】
従って、本発明の目的は、患者の免疫系を利用して、従来技術の欠点を克服し、種々の疾患に対する治療(処置)物質および方法を提供することである。特に、自己免疫疾患、アレルギー、および同様の障害について効率的な治療戦略を作成すべきである。
【００２３】
したがって、本発明の目的は、
-  自己抗体含有体液、または自己の細胞もしくは組織調製物から抗体含有流動体を得、
-  ある群の抗体と結合するリガンドが固定された固体の担体で抗体含有流動体を処理し(ただし、該リガンドとして腫瘍関連抗原に対する同じイデオタイプを有する抗体もしくはその断片は使用しない)、
-  該リガンドと結合する抗体を回収し、そして
-  回収した抗体をワークアップして免疫原量1μg以上の抗体を含む自己ワクチンとする工程を特徴とする自己抗体含有ワクチンの製造方法を提供することである。
【００２４】
こうして得られたワクチンは、すぐに適切な方法で患者に投与することができる。本発明の方法は、ある生物において標的抗体に対する抗体を誘導することに関して、これらはまさに使用する同じ生物の抗体を標的にするので初めに記載の問題を解決する。したがって、抗体を製造するためにin vitroで細胞を培養することも、外来ドナー生物(有機体)を用いて製造することも必要でない。標的抗体は、例えば、所望により抗イデオタイプ抗体を誘導するための抗原に特異的なab1抗体、またはab2抗体、すなわち、所望により抗イデオタイプ、すなわち実際的には抗原に対する免疫反応を生じる抗イデオタイプ抗体である。
【００２５】
同様に、プールまたは血漿プールから独創的に得られる抗体を得ることはもはや必要ではない(Zouali et al., J. Immunol. 135 (2) (1985), pp. 1091-1096参照)。種々の個体由来の抗体が回収される、プールからのそのような抗体調製物とは対照的に、本発明の抗体調製物により、治療すべき個体のイデオタイプネットワークにおける効果が完全に特異的で、より有効であり得る100%自己抗体を含むワクチンを製造することができる。
【００２６】
このように、それぞれの所望の目的を対象にした免疫系の個々の特定の調節が可能になる。独創的に作製されたワクチンと共に自己ワクチンを投与して免疫学的バランスを変化させることによって、それらB細胞の選択的な刺激が保証され、ある特異性を有する抗体が生成される。特異性は、個体から抗体を単離する方法(リガンドの選択により)により決定することができる。
【００２７】
好ましくは、もちろん、抗体含有体液は、血液、血清、リンパ液、脳脊髄液、初乳、粘液、例えば腟分泌液または鼻分泌液、悪性滲出液、ふん便または尿、さらに生検により得られた自己の細胞または組織調製物であり、これを、本質的に知られた多くの方法によりワークアップして使用に適した本発明に用いる抗体含有流動体とすることができる。本発明では、主として特に抗体含有量が高い体液を出発物質として用いるが、もちろんヒト血清または血漿が特に好ましい。
【００２８】
イデオタイプネットワークに影響を与える独創的に得られたワクチンの特異性に決定的なことは、もちろん、各場合で本発明のイムノアフィニティ精製におけるリガンドを選択することである。特異的抗体分画を回収するには、特異的モノクローナルもしくはポリクローナル抗体または抗原を用いることができよう。モノクローナル抗体またはその誘導体は、本質的に知られた方法、例えばハイブリドーマ技術、ファージ表現技術、または組換えにより製造することができる(Immunology Today, 2000, 21: 全刊行物 No.8)。例えばそれぞれ1またはそれ以上のIgG1、IgG2、IgG3、またはIgG4、またはIgA、IgG、IgM、IgE、またはIgDといった免疫グロブリンのある特定のサブクラスまたはサブタイプと結合することができるイデオタイプ非依存性リガンドも用いてよい。さらに、ある群の抗体断片または抗体鎖、例えばλまたはκ鎖、FcまたはFab断片の少なくとも部分を認識するリガンドを用いてよい。同様に適切なリガンドは、抗体のみならず対応するアイソタイプやパラグロブリンも選択的に結合することができよう。
【００２９】
本発明の方法は、さらに該リガンドとして腫瘍関連抗原および／または抗体に対する同じイデオタイプの抗体またはその断片を用いるかもしれない自己ワクチンを製造するための同様の方法と組み合わせてよい。方法を単純にするため、この場合は各リガンドを混合物として利用することが好ましい。より複雑な方法には、異なるリガンドによる体液の連続的もしくは並行処理が含まれる。それによって、例えば、細胞吸着タンパク質および／またはルイス(Lewis)Y炭水化物構造に対する特異性、またはB細胞リンパ球に対する特異性を有するある抗体分画を血清から回収することができ、次いでこれを自己ワクチン製剤として速やかに提供する。
【００３０】
B細胞リンパ腫に関連して発生する抗体を含む本発明に従って製造した自己ワクチンは、特に、正確に標的とする免疫反応を保証するため、IgG含有血清分画のあるサブクラスまたは分画のみを含む。
【００３１】
発明に従って単離するには、例えば抗体もしくは抗体断片、例えばFcまたはFab断片を用いることができる。しかしながら、リガンドは、免疫グロブリンと結合することができる他の物質、例えば免疫グロブリンのクロマトグラフィ精製用のリガンド、アフィニティペプチド、アフィニティポリペプチド、タンパク質、例えばプロテインAまたはプロテインG、または例えばイオン交換クロマトグラフィにも用いられるイオン構造物であってよい。
【００３２】
適切な固定化リガンドを選択するには、通常、得られた単離抗体分画とのリガンドもしくはリガンド-抗体複合体の望ましくない漏出(leakage)を避けることに注意する。ある場合には、存在しているかもしれない夾雑物を固定化リガンドにより分離するため抗体を連続的に精製することが望ましいかもしれない。しかしながら、あるリガンド‐抗体複合体が製造において望ましいならば、該物質の漏出も有利であるかもしれない。
【００３３】
特に高品質のワクチンの製造には、回収した抗体をクロマトグラフィ、ゲル浸透、沈澱、液相または固相、特に強磁性粒子を用いる分離、または限外ろ過／ろ過透析(diafiltration)のような既知の方法によりさらに精製することが含まれるかもしれない。
【００３４】
ワークアップ時には、例えば、それぞれ防腐剤を混合するか、もしくは、物質またはアジュバントを複合体化することにより、製剤を安定な溶液として製造する必要があるかもしれない。本発明に従って製造した自己ワクチンの保存に安定な態様は、主として患者がある時間間隔で同じ製剤にて数回免疫する場合に望ましい。
【００３５】
一方、各場合に新たに調製したワクチンを投与することは、各場合で免疫系の変化が考慮され、また例えば抗体産生細胞や感染性物質の回避(escape)突然変異体の発生を主として避けることができるという利点があるかもしれない。このため、回収した抗体を簡単なワークアップによりワクチンとすることが適切であり、せいぜい現場では正しいであろう。このように、例えば、本発明に従って製造したワクチンは、1作業日内または患者が治療されている間でも採血後速やかに適用することができよう。
【００３６】
本発明の方法のさらなる態様は、ワクチンにおいて望ましくない体液成分の枯渇に関する。このように、ある抗体とは選択的に結合しないが、付随する物質と結合し、非結合分画からある抗体を回収するためのリガンドを選ぶことができよう。
【００３７】
本発明によれば、個体により、個々のヒトまたは動物生物は抗体を含む体液または組織を有すると理解すべきである。好ましくは、もちろん、本発明の調製物は、脊椎動物、特に好ましくは哺乳動物、特にヒトに使用される。
【００３８】
イムノアフィニティ精製により抗体をを含む動物の体液(例えばヒト血清)からの抗体の単離は、当業者に知られた方法に従って実施することができる(Clin. Chem. (1999), 45: 593; J. Chem. Technol. Biotechnol. 48 (1990), 105)。固相イムノアフィニティ精製が特に好ましい。その際、特異的リガンドまたは異なるリガンドの混合物を固相上に固定化する。固相は、リガンドが、該リガンドの特異的結合特性を実質的に損失することなく結合することができる膜、ゲル、クロマトグラフィ物質もしくは同様の物質であってよい(Mol. Biotechnol. (1994) 1: 59)。
【００３９】
本発明によれば、ワクチンを即座に調製するためのすぐに使える(ready-to-use)キットを供給することができよう。このキットは、以下の成分を含む:
a)個体の抗体含有液からのある群の抗体と結合するためのリガンドを有する用具、
b)リガンドと結合する抗体を回収するための物質、および
c)自己ワクチンとするための回収した抗体のワークアップ剤。
【００４０】
特に、用具a)は、手動もしくは自動作動のための容器、手段、または自動機器(automat)である。用具a)は、所望により固相担体上に固定化された荷電リガンドを含む。同様に、体液を制御された条件下で該用具中にとった後に抗体の吸着を可能にする緩衝液を含んでよい。
物質b)は、抗体をそれぞれ洗浄もしくは精製し、または脱離させるための物質もしくは物質の溶液を含む。そのなかに洗浄用緩衝液および／または溶出用緩衝液がある。さらに、本発明キットでは、抗体回収用物質中にb)として既に含まれていないかぎり、可能なアジュバントを含む製剤化剤も提供される。
【００４１】
例えば、抗体は可溶性の低いアルミニウム化合物に吸着させることができ、後者を簡単に洗浄し、再緩衝し、1つの単一用具中の最終ワクチンに調製することができる(このワクチンはアジュバントとして既にアルミニウムを含む)。その場合、本発明のキットにおいて、抗体を回収し、ワクチンをワークアップするのに別個の成分b)およびc)の代わりに、1つの単一の方法を必要とするだけである。所望により、さらなる補助物質、例えば洗浄および緩衝用物質をキットで提供してよい。
【００４２】
適切なリガンドを磁性ビーズと結合させ、磁石を用いて簡単にそれぞれ局在させるかもしくは方向付けし、または配置することができる。例えば、あるリガンドは強磁性粒子と結合し、体液を受けるための無菌容器中に提供される。磁性輸送膜もしくはロッドを容器中に配置する場合、例えばソレノイドを作動させる電気パルスにより磁石のオンとオフを切り替えることにより体液由来の抗体が結合している粒子を輸送膜上に回収することができる。次に、好ましくは磁場を維持したままで該粒子を分離することができる。洗浄処置または抗体脱離中に磁場を再び除去することができる。次に、磁石上への粒子の固定化は、それぞれ洗浄溶液と脱離抗体を分離し、回収するのにも適している。
自己ワクチンを製造するためのキットの詳細な態様には、無菌のエンドトキシン不含容器、好ましくは1回使用するために供給される単回使用容器、例えば所望により相互接続され、隔膜を備えたシリンジが含まれる(この文脈では図4参照）。
【００４３】
例えば、最初の容器は、強磁性ビーズと結合した抗体の吸着に必要なリガンドを含む。市販のビーズには、例えば活性化多孔性ガラスビーズ、例えばProsep (Millipore, Durham, UK), Dynabeads (Deutsche Dynal GmbH, Hamburg, Germany)、およびMiltenyi (Bergisch Gladbach, Germany)から得られる同じ物質がある。さらに、吸着用緩衝液は、この容器中に供給されるか、または別個に充填される。隔膜を介してヒト血清が導入される。さらに、吸着、洗浄(ありうる)、および脱離後にビーズを固定化するために、適切な磁石がこの容器中または容器上に供給される。隔膜を介して、規定量の洗浄用緩衝液を導入する。フリットを介して洗浄溶液を再度排出する。溶出用緩衝液を用いて別の溶出用容器（その中にロードしたビーズが導入される）に抗体を溶出することができる。抗体の溶出後、ビーズを輸送メンバー上に固定し、後者を溶液から除去することにより分離する。次に、製剤化手段を隔膜を介して加える。製剤化溶液をシリンジに導入し、患者への適用準備が整う。個々の容器は、それぞれ、相を分けるためのフリット、およびそれぞれ溶液または懸濁液を輸送するための1またはそれ以上の隔膜を備えている。
【００４４】
特定の態様によれば、該キットは、物質b)およびc)とリガンドを含む容器として供給される。2つの異なる物質b)およびc)の代わりに1つの単一物質の場合には、この物質を製剤にリガンドと一緒に用いるのが有利かもしれない。このように、例えば、抗体の回収にも用いられ、アジュバントとして有効なリガンドの担体を選んでよい。そのような担体には、例えば、低可溶性のアルミニウム化合物、例えばAluGelまたは水酸化アルミニウムがある。その場合、これらリガンドが回収した抗体と共に医薬製剤中に含まれるとしても、これは、それ自体がワクチン抗原として有効な抗体リガンドの場合に非常に望ましい。
個体由来の体液から得た抗体のリガンドとの結合は、バッチ法またはフロースルー法でよい。イムノアフィニティ精製は、クロマトグラフィ装置上で自動的にかまたは手動的方法により生じるかもしれない。しかしながら、該方法は固定化リガンドを含む簡単な用具により手動的、自動的、または半自動的に行われることも考えられる。
【００４５】
最終的に、個体からの抗体の独創的な単離では、所望の抗体を、身体由来の望ましくない他の物質から実質的に分離できることが必要なだけである。この目的が、例えばリガンドと抗体を反応させ、次いでリガンドと複合体化していない物質から特異的免疫複合体を分離するような、上記のイムノアフィニティ精製以外の分離方法により達成することができると考えられる。該抗体はリガンドと結合し、それぞれ、液相、コロイド溶液、エマルジョン中に、またはいわゆる免疫アフィニティ分割によって回収することができよう。
【００４６】
従って、本発明は、
-  個体から抗体含有液を得、
-  ある群の抗体と結合するリガンドで該液を処理し(ただし、該リガンドとして腫瘍関連抗原に対する同じイデオタイプを有する抗体もしくはその断片は使用しない)、
-  リガンドと結合していないすべての物質を分離し、
-  リガンドと結合した抗体を溶離剤で処理してリガンドと結合した抗体を溶出させ、
-  溶出液中のリガンドと結合した抗体を回収し、そして
-  得られた溶出液をワークアップして免疫原量1μg以上の抗体を含む自己ワクチンとする
工程を特徴とする自己抗体含有ワクチンの製造方法にも関する。
【００４７】
本発明のワクチンにより、望ましくない抗体活性は実質的に下方調節される。阻害抗体は例えば標的であり、本発明によればそれらを単離し、製剤化してこれら望ましくない阻害抗体に対するワクチンとすることができる。本発明に従って製造したワクチンは、腫瘍疾患、自己免疫疾患、アレルギー、または伝染病に関連した症候群において予防的および／または治療的適用に実質的に利用される。移植中に発生するかもしれない望ましくない免疫反応はさらなる適応分野である。
【００４８】
このように、例えば、精子に対する抗体を生じ、後天性不妊症の患者を治療することができる。これら自己抗体を腟分泌物のような体液から取り出し、本発明に従ってワクチンの製造に用いれば、このワクチンは、望ましくない抗体を抑制するため、女性患者の治療に直ちに用いることができる。得られたワクチン製剤は、特に、主として粘膜を介して取り込むことができるIgA抗体を含むであろう。したがって、好ましい送達法はそれぞれ鼻または膣投与による。
【００４９】
独創的に作られた抗体ワクチンの助けにより、女性患者のRh因子不適合反応も治療することができる。Rh陰性で、Rh陽性のヒト由来の血液または組織とそれぞれ接触した女性は、このRh因子に対する抗体を生じる。すなわち、例えば、Rh陽性の胎児を妊娠しているRh陰性の女性患者は、Rh因子に対する抗体を生じるかもしれない。これらは、Rh陽性の子供の2回目の妊娠中の不適合反応を回避するため、これらを抑制しなければならない。従って、Rh因子に対する抗体を、本発明に従って例えば血清から回収し、免疫原性のワクチンに製剤化する。好ましくは、能動免疫は、計画された妊娠前の予防法をもたらす。
【００５０】
骨髄や幹細胞のような同種(アロジェニック)物質の移植も、本発明に従って製造されたワクチンにより助けることができる。HLA抗原構造による考えられる拒絶反応は、外来性HLAに対する自己抗体を含むワクチンを投与することにより抑制することができる。
【００５１】
異種移植の準備は、移植片による考えられる不適合反応を妨げるためのさらなる応用分野である。ヒトの血清中にみられるように高力価の、既知α-Gal-エピトープに対する天然抗体は、異種移植片または同種移植片に対する急性拒絶反応の原因となる。これら天然抗α-Gal-抗体は、本発明の方法の助けによりワクチンに製剤化され、組織、骨髄、または幹細胞移植の準備ができている患者に投与される。抗α-Gal活性の下方調節は、拒絶反応の回避を助けることである。自己抗α-Gal抗体による免疫による循環抗α-Gal抗体の力価の低下は、異種移植片の生存時間の有意な増加を可能にするはずである。
【００５２】
抗体の独創的な単離のためのリガンドの選択は、そのそれぞれの使用によって決まるであろう。下記に、一例として2、3の応用を示す。
【００５３】
自己免疫疾患における応用:
リガンドとしての自己抗原は、例えば、個体から自己免疫特異抗体を単離するのに用いることができよう。本発明に従って用いた後、このようにして回収した抗体は、イデオタイプ相互作用による特異自己抗体の産生の特定の下方調節を生じる個体の免疫反応を誘導することができる。
【００５４】
多くの自己免疫疾患において、自己反応性抗体の正確な特異性は知られていない。しかしながら、自己抗原を本発明の自己免疫特異的抗体を単離するためのリガンドとして用いる必要は全くない。自己免疫疾患の場合、抗体の特異性は、極めて過度な割合の量で存在し、個体から全体の免疫グロブリン分画を精製し(既知の生化学的方法に従って)、次いでそれをワクチンとして製剤化し、その後ドナー個体にそれを適用することにより、一次抗イデオタイプ抗体を過剰な割合で示される抗体特異性に対して誘導することができよう。
【００５５】
一例として、凝固因子、インスリンまたはリウマチ因子に対する阻害抗体に関連する障害に罹患した患者を本発明に従って製造したワクチンで処置する。そのために利用されるワクチンは、阻害抗体またはリウマチ因子に対する抗体を含む。
【００５６】
アレルギーにおける応用:
アレルギーに対する患者特異的抗体ワクチンを製造するには、例えば、抗-IgE抗体、または同じ特異性を有する該抗体の部分がリガンドとして考えられる。さらにアレルゲンまたはアレルゲンの部分もリガンドとして考えられる。
【００５７】
毒性物質によるアプリケーション:
個体から、毒素特異的免疫反応を誘発することができる抗体を精製するには、毒素特異的抗体をリガンドとして用いることができる。多くの場合、そのような抗体は、モノクローナル抗体として利用可能である。しかしながら、ある毒素(例えば細菌毒素または低分子毒素)とまったく特異的に結合することができる、抗体ではない他の分子を精製のためのリガンドとして使用することも考えられる。
【００５８】
もちろん、ただ1つのリガンド種の代りに、特異性が異なる2またはそれ以上のリガンドを本発明の方法により固体の担体上に固定化することができ、いくつかの結合特性についてそれぞれ豊富化するかまたは枯渇させた特異性を有する抗体(特異性の異なる抗体)を製剤中に得ることができる。同様に、本発明の多特異的ワクチンの製造において、異なる特異性を有する一連のいくつかの免疫吸着工程を配置するのが好ましい。
【００５９】
すべて同じか同様の標的物質に対する数個の異なるリガンドを有する固体担体を提供することも可能である(最も簡単な場合はある抗体のクラスに対するポリクローナル抗体混合物)。しかしながら、例えば、1つのそして同じ標的構造に対する異なるモノクローナル抗体を固体担体上に供給できることは好都合である。
【００６０】
本発明の特に好ましいリガンドは、全身性エリテマトーデス(SLE)の患者由来のds-DNAに対する患者特異的抗体を処置するための、例えば2本鎖DNAのような自己抗原である。VIII因子またはその部分は、個体からVIII因子結合抗体を高度に単離し、それから製剤化したワクチンを用いて患者の病原性抗VIII因子反応性を下方調節するためのリガンドとして用いることができる(Semin. Thromb. Hemost. (2000) 26: 151)。重症筋無力症に罹患した患者から個々の抗体を、アセチルコリンレセプターまたはその部分を用いるイムノアフィニティ精製により精製し(Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1993) 90: 8747)、これを本発明に従って自己ワクチンとして製剤化し、同じ患者に再度再ワクチン接種することができる。
【００６１】
リガンドとしてのインスリンは、自己免疫性糖尿病(I型インスリン依存性糖尿病)に対する自己ワクチンの製造に用いることができる(Diabets Metab. Res. Rev. (2000): 16: 338)。
【００６２】
ミエリン塩基性蛋白質(MBP)またはその部分は、多発性硬化症患者または他の免疫学的に引き起こされた神経障害(J. Neuroimmunol. (2001) 113: 163)用の自己ワクチンの製造にリガンドとして用いることができる。
【００６３】
種々のガングリオシドは、ギランバレー症候群(Intern. Med. (1997) 36: 599)および他のニューロパシーの患者にリガンドとして用いることができる。
【００６４】
この自己型の免疫処置の利点は、患者特異的イデオタイプが本来的に考慮されていることにある。
【００６５】
本発明に基づいたさらに好ましいリガンドは、高度に特異的なIgE分画を精製することができ、患者の特異的IgE産生細胞を阻害するために適切な免疫原性形で患者に再び投与することができる抗ヒトIgE抗体である。もちろん、特異的抗IgE抗体の部分がまだ所望の特異性を有する場合もリガンドとして用いることができる。
【００６６】
アレルギーの分野において、高度に特異的なアレルゲンまたはその部分または抗イデオタイプ抗体、またはアレルゲンによく似た他の分子をリガンドとして用いることが考えられる。
【００６７】
自己抗体のワクチン接種により誘導される免疫反応は、これら抗体の結合領域、すなわちそのイデオタイプにより決定されるであろうから、原則的にこれら抗体の断片または誘導体も、反応性出発抗体のイデオタイプを含む限り免疫目的で完全抗体分画の代わりに用いることができよう。すなわち、用語「抗体」には、同じ結合特異性を有するそのような抗体の断片または誘導体も含まれる。例として、限定されるものではないが、下記は、例えば本質的に知られた生化学的方法に従って(例えば酵素的開裂により)製造することができるF(ab)2'断片、F(ab)'断片を示す。用語「誘導体」には、例えば、例えばリポソームに取り込むために脂肪親和性を増加するために遊離アミノ官能基の脂肪酸をアミド化した抗体を用いるような本質的に知られた化学的または生化学的方法に従って製造することができる抗体誘導体が含まれる。特に、該用語には、例えば破傷風トキソイド、シュードモナス外毒素、脂質Aの誘導体、GM-CSF、IL-2、IL-12、C3dのような免疫反応を増強することができる分子を抗体または抗体断片の化学結合により製造することができる生成物も含まれる。
【００６８】
最初のワクチン接種により引き起こされた免疫学的バランスの変化は、この方法を繰り返すこと、例えばイムノアフィニティ精製により最初の自己ワクチンを回収して数週間後に、体液、例えば血液を再度採取し、再度自己ワクチンを製造し投与することによりさらに増大させることができる。このように、免疫学的バランスのそれぞれの状態が個々のワクチンにおいて常に考慮されることも保証される。この方法は、対応する特異的試験による各患者の免疫状態の進行度調節により、適切な間隔で(例えば最初は4−8週間毎、およびそれ以降は6カ月毎)繰り返し行うことができる。本明細書に記載の新規組成物、および自己抗体を用いるワクチン接種方法は、基本的に治療および予防の両目的に適している。
【００６９】
本明細書に記載の個々の自己ワクチン接種戦略の1つの一般的な利点は、各場合におけるそれぞれのワクチンが個々の体液、例えば血清から調製されるため、イデオタイプネットワークに関する各個体の免疫学的状態が考慮されるという事実にある。さらに、免疫される個体はいかなる外来抗原とも接触せずに、免疫学的バランスの調節をもたらす内在成分のみで適切な形で処理される。
【００７０】
1つの特別な応用は、免疫処置により特異的抗体が形成された患者の処置にある。次に、いわゆる高度免疫血清は、いずれ自己抗体に対する免疫反応を引き起こすための、自己ワクチンを製造するのに用いられる。
【００７１】
本発明の好ましい態様において、イムノアフィニティ精製により得られる抗体は、適切なワクチンアジュバントを用いて製剤化される。
【００７２】
ワクチンでよくあるように、自己抗体分画またはその断片および誘導体は、ワクチンアジュバントと共に製剤化することができる。そのようなアジュバントにより免疫反応が増強される。アジュバントの例として、限定されるものではないが、以下のものを示す。アルミニウム含有アジュバント、特に水酸化アルミニウム(例えば、Alu-Gel)、リポポリサッカライド誘導体、カルメット・ゲラン桿菌(Bacillus Calmette Guerin)(BCG)、サポニン、およびその誘導体(例えばQS-21)、リポソーム調製物、所望によりリポソーム調製物中の、例えば破傷風トキソイド、またはインフルエンザウイルスの成分のような免疫系がすでに強い免疫反応を生じている抗原をさらに加えた製剤。
【００７３】
免疫反応を増強するには、ワクチン製剤を免疫反応の増強を助ける適切な(好ましくはヒトの)サイトカインと共に投与することもできよう。この点で、特に、それのみではないが、顆粒球マクロファージ刺激因子(GM-CSF)に言及すべきである。このサイトカインは、抗原産生細胞(例えば樹状細胞)を活性化することにより効率的な免疫反応を刺激する。
【００７４】
所望により、自己抗体分画を、本質的に知られ、公表された方法に従ってex vivo培養自己樹状細胞とインキュベーションすることもできる。次に、このようにパルスした樹状細胞を再度個々の個体に投与する。このようにして、特に効率的な免疫反応を達成することができる。
【００７５】
従って、本発明の好ましい方法において、抗体溶出液のワークアップには、アジュバント、特にアルミニウム含有アジュバント、リポポリサッカライド誘導体、カルメット・ゲラン桿菌、リポソームまたはQS-21(さらに好ましいアジュバントは、特にSinghら、Nat. Biotechnol. 17 (1999), pp. 1075-1081に記載されている)、免疫刺激細胞、特に樹状細胞または他の抗原提示細胞、活性物質、好ましくはサイトカイン、特に顆粒球マクロファージ刺激因子、製剤化補助剤、特に緩衝物質、安定化剤もしくは可溶化剤、またはこれら物質の混合物からなる群から選ばれる物質を添加することが含まれる。
【００７６】
本発明の方法の好ましい態様において、組成物に含まれる抗体はアジュバントと混合され、次いで、加熱処理、好ましくは80℃以上の温度、特に90℃〜130℃で加熱処理される。好ましくは用いるアジュバントは、アルミニウム含有アジュバントである。そのような加熱処理は、アジュバントと結合させることによりタンパク質の免疫原性部分が依然として免疫系に正しい形で提示されるようにタンパク質抗原を変性させることが可能である。今までのところ、加熱処理の利点が得られるようにタンパク質を変性させる必要はまったくない。タンパク質の熱変性が温度と該タンパク質をこの温度にかける時間に依存することが知られている。さらに、例えば、イオン強度、イオン組成、pH、混合物の活性表面のタイプと量といったさらなる物理化学的パラメーターがタンパク質の変性を引き起こす。抗体を変性しないかまたは完全には変性しない、そして／または例えばアジュバントの表面からの脱離がより少ないような他の効果を利用することができる条件は知られており、当業者があらゆる溶出液について容易に最適化することができる。
【００７７】
アジュバントを用いてワクチン製剤を製造し、次いで加熱処理するそのような方法のさらなる利点は、完全な製剤中の感染性病原体がそれぞれ弱毒化または不活化されるであろうということである。この利点は、ワクチン製剤の製造と保存および流通の両方で役割を果たすかもしれない。これにより、伝染病の既知および未知の病原体について高い安全性がもたらされる。さらに、ワクチンの微生物の保存が加熱によりなされているので、適切なパッキングにより、保存料なしで容器への充填が可能である。
【００７８】
そのような製剤のさらなる利点は、加熱により抗体の少なくとも部分が変性する可能性があるので、抗体の免疫原性が増大している可能性があることである。この増加した抗原性は、特に、免疫系により内因性タンパク質として認識されるタンパク質の免疫原性を増大させるかもしれない。
【００７９】
さらなる利点は、熱不活発による抗体-アジュバント複合体のさらなる安定化にある。すなわち、加熱処理していない抗原−アジュバント製剤と同様に、タンパク質‐抗原の脱離はもはや急速ではない。この利点は、個々の免疫処置の間隔を長くすることも可能である。
【００８０】
従って、本発明の方法に特有の態様は、溶出液に含まれるタンパク質の三次元構造の少なくとも部分を変化させる(その免疫原の特性が増大していることが好ましい)タンパク質変性工程、特に加熱処理が行われる方法に関する。
【００８１】
本発明に従って製造した組成物は、従来の方法に従って、例えばワクチンとして、皮下注射、筋肉内注射、もしくは皮内注射により投与することができよう。さらなる投与方法は、粘膜経路を介するもの、例えば鼻内もしくは経口投与によるワクチン接種である。
【００８２】
本発明は、自己ワクチンとして用いる、抗体を含む動物体液からイムノアフィニティ精製により回収した抗体を含む医薬組成物にも関する。
【００８３】
さらに、本発明は、自己免疫疾患、伝染病、種々の中毒、およびアレルギーに対する治療もしくは予防的ワクチン接種方法に関する。
従って、本発明は、本発明の方法にしたがって得られる自己ワクチンに関する。
【００８４】
本発明の目的は、独創的に作られた製剤の有効量、好ましくは数μg〜10gまでを体液を採取した個体に投与する個体の治療方法でもある。その効率は、主として免疫原性について評価されなければならない。0.01〜1mL、好ましくは0.1〜0.5mLの範囲のすぐ使える用量単位で投与することができるワクチン用量中の少なくとも1μgの抗体を使用することが奏功することがわかった。好ましい量は、主としてアジュバントの支持効果に依存し、3μg〜1g、特に好ましくは10μg〜750μg、最も好ましくは250μg〜500μgの範囲である。
【００８５】
主として、例えば、自己免疫性甲状腺炎、全身性エリテマトーデス、全身性血管炎、ギランバレー症候群、および抗VII:C因子自己免疫疾患のような自己免疫疾患、アレルギー、腫瘍性疾患、および移植の範囲内にある不適合性反応の予防、ならびに中毒(例えば細菌性毒素のような)において、この治療方法は特に有効である。
【００８６】
さらなる局面によれば本発明は、免疫調節のための手段を実現するための自己抗体調製物の使用にも関する。
【００８７】
本発明を以下の実施例および図面によりさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００８８】
(実施例)
実施例1:
本実施例は、あらゆる所望のタンパク質(今回はウシ血清アルブミン、BSA)に対する免疫系を特異的に調節することが可能であることを明らかにすることを意図している。
【００８９】
それぞれウサギ3匹からなる2群を本発明に従って調製したワクチン製剤で免疫した。
【００９０】
第1群の自己ワクチンは、アフィニティクロマトグラフィカラム(セファロース上にウサギ抗BSAを固定化)によりウサギ血清から免疫グロブリンを精製することにより調製した。第2群の自己ワクチンは、別のアフィニティクロマトグラフィカラム(特異リガンドを含まないセファロース)によりウサギ血清から免疫グロブリンを精製することにより調製した。
【００９１】
こうして得られた免疫グロブリンを、水酸化アルミニウムゲルへの吸着によりワクチンとして製剤化し、次いで各ウサギに皮下注射した。
【００９２】
採血およびワクチン接種法:
-21日:血清回収
-14日:血清回収
-7日:血清回収
-21、-14、および-7日の血清のプールから、ワクチンを精製した。
0日:血清回収
0日:免疫処置、皮下
14日:血清回収
21日:血清回収。
【００９３】
アフィニティマトリックスの調製:
第一段階では、ウサギの抗BSA血清を精製した:
【００９４】
この目的のために、ポリクローナルウサギ抗BSA抗体(0.1Mグリシン/HCl緩衝液、pH2.9；容量＝4mL)を透析用緩衝液(0.1M NaHCO3 + 0.5M NaCl、pH=8.0)(Slide-A-LyzerO 10K；Pierce/USA)で透析した。
【００９５】
方法:
・マグネチックスターラー上の、マグネチック撹拌棒を入れた800mLビーカーグラス中で、透析用緩衝液を4回入れ替えて透析を行った。
・次に、試料を遠心して濃縮した(Centricon 10K(Amicon)を用いる)。終量：0.4-0.6mL。
【００９６】
活性化CH-セファロースへの固定化:
材料:
・活性化CH-セファロース4B; Pharmacia Biotech(コードNo.17-0490-01)
・リガンド: ポリクローナル抗BSA抗体(カップリング用緩衝液中、6.6mg/mL)
・カップリング用緩衝液: 0.1M NaHCO3 + 0.5M NaCl、pH=8.0
・1mM HCl
・1Mエタノールアミン溶液
・0.1M トリス-HCl (トリス(ヒドロキシメチル)-アミノメタン)緩衝液、pH=8.0
・0.1M トリス-HCl緩衝液 + 0.5M NaCl、pH=8.0
・0.1M アセテート緩衝液 + 0.5M NaCl、pH=4.0
【００９７】
カップリング法:
0.25gの凍結乾燥CH-セファロース4Bを1mM HCl約20mLに懸濁し、1mM HCl 50mLで洗浄し、次いでカップリング用緩衝液50mLで洗浄した。セファロースを50mL Falconチューブに移し、抗体溶液を加えた。ゲル:緩衝液比=1:2でカップリング用の適切な懸濁液となる。懸濁液を約1時間振盪した。過剰の抗体をカップリング用緩衝液3x10mLで洗浄して除去した。残る活性結合部位を、シェーカー上で1Mエタノールアミンと1時間インキュベーションしてブロックした。次に、シェーカー上で0.1Mトリス-HCl緩衝液(pH=8.0)でセファロースを1時間インキュベーションし、以下のサイクルで洗浄した：0.1Mアセテート緩衝液(pH=4.0) + 0.5M NaCl、次いで0.1Mトリス-HCl緩衝液(pH=8.0) + 0.5M NaClで洗浄。洗浄サイクルは3回行った。
【００９８】
第2群のウサギのためのアフィニティマトリックスの調製:
第2群(コントロール群)のためのアフィニティマトリックスを上記と同じ方法に従って作製した。抗体溶液の代りに、緩衝液のみを用いた。このように活性化セファロースは、エタノールアミンでブロックされるのみである。
【００９９】
自己ワクチンの製造:
各ウサギの血清各10mL(-21、-14、および-7日のプール)を各アフィニティマトリックスで精製した(0.5mLカラム容量)。
【０１００】
材料:
適用緩衝液:PBS + 0.2M NaCl、pH=7.2
溶出用緩衝液:0.1Mグリシン/HCl緩衝液、pH=2.0。
【０１０１】
方法:
カラムへの適用は、+4℃、インキュベーション時間30分で行った。洗浄は、適用緩衝液で行った(1洗浄工程=5mL、5洗浄工程)。
【０１０２】
溶出用緩衝液1mLを用いて溶出した。
溶出液をカーボネート溶液(0.5M NaHCO3)で中和し、このように精製したタンパク質をサイズ排除クロマトグラフィにより分析した。
【０１０３】
サイズ排除クロマトグラフィ:
クロマトグラフィは、DIONEX-HPLCシステムを用いるZORBAX GF-250カラムにより行った。定量的標準として、以下の免疫グロブリンを用いた:
- ヒトIgG標準(20mg/mL;Sandoglobulin、3.590.009.0)
- ヒトIgM標準(1.1mg/mL; SIGMA、cat.I-8260)
カラム:ZORBAX GF250 (PN:884973.901)
ランニング用緩衝液:220mMol NaPO4緩衝液、pH7.0 + 10%アセトニトリル
流速:1,000mL/min
波長:214nm
バンド幅:5nm
注入容量:50μL
【０１０４】
水酸化アルミニウムを含む製剤:
精製、中和免疫グロブリンのワクチンとしての製剤化は以下の方法に従って行った:
各ワクチンについて、Centricon限外ろ過ユニット(Centricon 10K、Amicon, USA)を用いた。最初に、限外ろ過ユニットを洗浄した（1mM リン酸ナトリウム緩衝液、0.86%NaCl、pH6(NBK)の遠心による）。次に、緩衝液400μLおよびアルハイドロゲル(27μL(400μLにつき)、Superfos, Denmark)を充填し、中和した溶出液を加え、遠心し、洗浄し(緩衝液5mL)、終量を約300μLとした。次に、ワクチンを再懸濁し、緩衝液で396μLとし、チメロサールストック溶液(10mg/mL、Sigma)を4μL加え、次いでその350μLを容器に無菌充填した。個々のワクチンのタンパク質濃度は、それぞれ40-50μgであった。
【０１０５】
BSA-ELISA:
次のサンプルをELISAで分析した:0日、および14日および21日のプール。ELISAプレート(NUNC, Maxisorp (F=96); Denmark)をBSA溶液100μL(ウェルあたり)でコートした。(BSA溶液:BSA(SIGMAカタログNo.A-7638);コーティング緩衝液中10μg/mL)。サンプルを37℃で1時間インキュベーションした。洗浄後、PBS(200μL/ウェル)中の5%乾燥ミルクでブロックした。インキュベーション:37℃で30min。
【０１０６】
洗浄法:
- コーティング、ブロッキング、およびサンプルインキュベーション後:洗浄用緩衝液で6回、第4回後1分間インキュベーション。
- コンジュゲート後:洗浄用緩衝液で4回、染色用緩衝液で2回。
【０１０７】
血清サンプルを連続希釈した(2%乾燥ミルク/PBS中)。サンプル希釈物(100μL/ウェル)を37℃で1時間インキュベーションした。陽性コントロールおよびELISAの定量評価の標準として、アフィニティ精製に用いたポリクローナルウサギ抗BSA血清の希釈系を用いた。洗浄後、酵素コンジュゲート(抗ウサギIg HRP(Nordic Immunology, #4694))を適切な希釈(1:1000希釈緩衝液)(100μL/ウェル)で適用した。37℃で30分間インキュベーション後、再度洗浄し、基質を加え(ウェルあたり:100μLのTMB Microwell1(BioFX、カタログNo:TMBW-0100-01、#0034302))、適切な染色後に反応を止め(30%H2SO4 50μL/ウェルを用いて)、次いで染色を光度計(450nm)で測定した。各希釈系の最大吸収の1/2の力価を測定した。個々のウサギのゼロ血清(0日；＝免疫時)に対する力価の相対変化を図2に示す。抗BSAアフィニティクロマトグラフィにより調製した自己ワクチンを投与されたウサギはBSA-ELISAにおいて著しい力価の変動を示すことが認識できる。
【０１０８】
実施例2:
本実施例は、個体に既に存在している免疫反応を特異的に下げることができることを示すであろう。この目的で、モノクローナル抗体(HE2、マウス-IgG2a)で免疫し、マウス-IgG2aに対する強いIgG免疫反応を発現したアカゲザルを用いた。このサルの血清を、マウスIgG2a(HE2)がリガンドとして固定化されたイムノアフィニティカラム上で精製した。このようにして精製した免疫グロブリンは、水酸化アルミニウムを用いてワクチンとして製剤化し、ドナーサルの皮下に接種した。免疫時(ワクチン接種前)およびその2週間後に、マウスIgG2aに対する特異的免疫反応を測定するため採血した。
【０１０９】
材料および方法:
ELISA用マイクロタイタープレート:Immuno Plate F96 MaxiSorp (Nunc)
2004524369.tif 000003
2004524369.tif 000004
【０１１０】
実施:
本明細書に記載の自己ワクチン接種方法は、マウスIgG2aに対する強い免疫反応を与えたアカゲザルを用いて試験した(0.5mLの1mMホスフェート緩衝液pH6.0/155mM NaCl中の水酸化アルミニウム1.67mgで吸収した0.5mg マウスIgG2a(HE2)をそれぞれ1、15、29、および57日にアカゲザルの皮下にワクチン接種した)。種々の時点の血清を、ELISAによるマウスIgG2a特異抗体について試験した(下記参照)。ワクチン接種計画終了時の抗体は主としてIgG形であった。このアカゲザルから、末梢血10mLを採取し、それから血清を回収した。このアカゲザルの血清から抗体分画をイムノアフィニティ精製するため、最初に以下のプロトコールにしたがってイムノアフィニティマトリックスを調製した。
【０１１１】
全ての手順は、無菌条件下で行った。7.5gのCH-セファロース4B(Pharmacia)を1mM HCl 20mL中に15分間懸濁した。次に、ゲルを、シンターガラスフィルターAG3上で1mM HCl 1L、次いでカップリング用緩衝液200mLで洗浄した。ネズミ抗体HE2(マウスIgG2a) 100mgをカップリング用緩衝液5Lで透析し、カップリング用緩衝液で5mg/mLに調整した。この溶液を密閉容器中でゲル懸濁液と混合した。ゲル：緩衝液比1:2でカップリングに適した懸濁液が得られた。次に、過剰のリガンドをカップリング用緩衝液3x30mLで洗浄除去した。残る反応基を1Mエタノールアミンと4℃で1時間インキュベーションしてブロックした。次に、ゲルを室温で1時間、0.1Mトリス-HCl緩衝液で回転させた。最後に、ゲルを交互pHの緩衝液で3サイクル洗浄した。各サイクルは、0.5M NaClを含む0.1M酢酸ナトリウム緩衝液(pH4)、次いで0.5M NaClを含む0.1Mトリス-HCl緩衝液(pH8)からなった。ゲルを4℃で保存した。アカゲザルの血清からの抗体分画のイムノアフィニティ精製は無菌条件下で以下のプロトコールに従って行った。イムノアフィニティ精製はFPLC系(Pharmacia)を用いて行った。上記プロトコールに従って得られたゲル1mLをPharmacia HR5/5カラムに充填した。血清5mLを精製用緩衝液Aで1:10に希釈した。この溶液を1mL/minでカラムに注ぎ入れ、再度検出器のUVベースライン(280nm)に達するまで、精製用緩衝液Aで洗浄した。次に、結合免疫グロブリンを精製用緩衝液Bで溶出し、脱離直後に分画を1M Na2HPO4で中和した。このように精製した抗体分画50μLを、サイズ排除カラム(SEC、Zorbax 250GF)で分析した。ランニング用物質として220mMホスフェート緩衝液(pH7) + 10%アセトニトリルを用いた。抗体分画の全量は約40μgであった(SECにより標準との比較により決定)。このように回収した抗体分画について、抗体HE2(アフィニティ精製用のリガンドとして使用した)との結合をELISAで試験した。アフィニティ精製に用いるマウスIgG2a(抗体HE2；結合用緩衝液中、10μg/mlの溶液)の100μLの部分標本を、37℃で1時間、マイクロタイタープレートのウェル中でインキュベーションした。プレートを洗浄用緩衝液Aで6回洗浄した後、ブロッキング用緩衝液A各200μLを加え、次いで37℃で30分間インキュベーションした。上記のごとくプレートを洗浄した後、希釈用緩衝液Aで1:4〜1：65000に希釈した、試験するアフィニティ精製抗体および陰性コントロールとして同濃度の正常ヒト免疫グロブリンの部分標本各100μLを37℃で1時間インキュベーションした。上記のごとくプレートを洗浄した後、希釈用緩衝液Aで1:1000に希釈したパーオキシダーゼ結合ヤギ抗ヒトIg抗体(Zymed)各100μLを37℃で30分間インキュベーションした。プレートを洗浄用緩衝液Aで4回、次いで染色用緩衝液で2回洗浄した。抗体の結合を特異的基質100μLを加えて証明し、約3分後に停止用溶液各50μLを加えて着色反応を止めた。評価は、490nmで光学密度(OD)を測定することにより行った(参照測定の波長は620nmである)。アフィニティ精製抗体分画はマウスIgG2a抗体と顕著な結合を示したが、正常なヒト免疫グロブリンは実質的に結合しない。
【０１１２】
アフィニティ精製により得られた抗体分画を以下のプロトコールに基づき、水酸化アルミニウムをアジュバントに用いて製剤化した。
アフィニティクロマトグラフィ(抗体約40μgを含む)後に得られた抗体溶液3mLを水酸化アルミニウム(水性懸濁液；Alhydrogel、Superfos)1mgと混合し、次いで懸濁液を「FILTRON」遠心チューブ(Microsep(登録商標)、カットオフ10KD)を用い4000xgで30分間遠心した。次に、これを製剤用緩衝液各1mLで2回スラリーとし、4000xgで30分間遠心した。該懸濁液に製剤用緩衝液を充填して0.5mLとし、こうして得られた懸濁液を容器に無菌充填した。血清、上記自己ワクチンを回収したアカゲザルの背部皮下にこのワクチンを接種した。この最初のワクチン接種前に、血液5mLを血清回収用に採血した(免疫反応を特徴づけるための出発値を決定するため)。2週間後に再度血液10mLを血清回収用に採血した。
【０１１３】
この免疫したサルの血清免疫グロブリンのマウスIgG2aとの結合を上記のごとくELISAで測定した。図3に示すように、自己ワクチンで免疫後、マウスIgG2a反応性は低下する。
【図面の簡単な説明】
【０１１４】
【図１】ワクチン回収のダイアグラムを示す。
【図２】それぞれ、リガンドとして抗ウシ血清アルブミンまたはセファロースを介して調製した自己ワクチンで免疫処置後の特異的抗体反応性の変化を示す。
【図３】リガンドとしてマウス-IgG2aを介して調製した自己ワクチンで免疫後の特異的抗体反応の変化を示す。
【図４】磁性粒子を用いて自己ワクチンを製造するための容器系を示す。
【図１】
2004524369.tif 000005
【図２】
2004524369.tif 000006
【図３】
2004524369.tif 000007
【図４】
2004524369.tif 000008
【国際公開パンフレット】
2004524369.tif 000009
2004524369.tif 000010
2004524369.tif 000011
2004524369.tif 000012
2004524369.tif 000013
2004524369.tif 000014
2004524369.tif 000015
2004524369.tif 000016
2004524369.tif 000017
2004524369.tif 000018
2004524369.tif 000019
2004524369.tif 000020
2004524369.tif 000021
2004524369.tif 000022
2004524369.tif 000023
2004524369.tif 000024
2004524369.tif 000025
2004524369.tif 000026
2004524369.tif 000027
2004524369.tif 000028
2004524369.tif 000029
2004524369.tif 000030
2004524369.tif 000031
2004524369.tif 000032
2004524369.tif 000033
2004524369.tif 000034
2004524369.tif 000035
2004524369.tif 000036
2004524369.tif 000037
2004524369.tif 000038
2004524369.tif 000039
2004524369.tif 000040
2004524369.tif 000041
2004524369.tif 000042
2004524369.tif 000043
2004524369.tif 000044
2004524369.tif 000045
2004524369.tif 000046
2004524369.tif 000047
2004524369.tif 000048
2004524369.tif 000049
2004524369.tif 000050
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004524369.tif 000051
2004524369.tif 000052
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004524369.tif 000053
2004524369.tif 000054
【国際調査報告】
2004524369.tif 000055
2004524369.tif 000056
2004524369.tif 000057
2004524369.tif 000058
2004524369.tif 000059
2004524369.tif 000060
2004524369.tif 000061
2004524369.tif 000062