(57)【要約】本発明は、皮膚系統の病原体により誘導される疾患を予防し又は治療する目的のために、ヒト又は動物に投与されることが意図された、化粧品、医薬又は獣医薬用途のための組成物の製造のためのカゼイン誘導体の使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
皮膚系統の病原体により誘導される疾患を予防するか又は治療する目的のために、ヒトに又は動物に投与することが意図される、化粧品、医薬又は獣医薬用途のための組成物の製造のためにカゼイン誘導体の使用。
【請求項２】
カゼイン誘導体が、ストレプトコッカス　パイロゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、トリコフィトン　ルブルム（Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ　ｒｕｂｒｕｍ）、ピチロスポルム　オバレ（Ｐｉｔｙｒｏｓｐｏｒｕｍ　ｏｖａｌｅ）、カンジダ　アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ　ａｌｂｉｃａｎｓ）又はエム．フルフル（Ｍ．ｆｕｒｆｕｒ）のような病原体の付着を阻止することにより、皮膚系統の病原性フローラを安定化し、及び／又は調節することができる、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
カゼイン誘導体が、カゼイノグリコマクロペプチド（ＣＧＭＰ）、カゼイノグリコマクロペプチドのグリコシレート誘導体、又はカゼイノグリコマクロペプチド若しくはその誘導体の加水分解により得られた活性な生成物である、請求項１又は２に記載の使用。
【請求項４】
カゼイン誘導体が、０．０１〜１０重量％の量で用いられる、請求項１〜３のいずれか１項に記載の使用。
【請求項５】
皮膚系統の病原性フローラを安定化し、及び／又は調節することができる少なくとも１種のカゼイン誘導体を含有する化粧品、医薬又は獣医薬用途のための組成物。
【請求項６】
カゼイン誘導体が、カゼイノグリコマクロペプチド（ＣＧＭＰ）、カゼイノグリコマクロペプチドのグリコシレート誘導体、又はカゼイノグリコマクロペプチド若しくはその誘導体の加水分解により得られた活性な生成物である、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
カゼイン誘導体の０．０１重量％〜１０重量％を含有する、請求項５又は６に記載の組成物。
【請求項８】
ストレプトコッカス　パイロゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、トリコフィトン　ルブルム（Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ　ｒｕｂｒｕｍ）、ピチロスポルム　オバレ（Ｐｉｔｙｒｏｓｐｏｒｕｍ　ｏｖａｌｅ）、カンジダ　アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ　ａｌｂｉｃａｎｓ）又はエム．フルフル（Ｍ．ｆｕｒｆｕｒ）のような病原体により誘導される疾患のような、皮膚系統の疾患を示す可能性がある皮膚及び／又は粘膜の治療的又は予防的処置のために意図される、請求項５〜７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項９】
皮膚系統の疾患が、
・重複感染したアトピー性皮膚炎、膿痂疹化した湿疹、潰瘍、外傷、火傷、重複感染した炎症性座瘡のような感染合併症、
・膿痂疹、表在性毛のう炎のような多発性皮膚炎、
・脂漏性皮膚炎、でん風、
・皮膚硬化症、
・カンジダ症、
・抗生物質を用いての又は抗真菌剤を用いての治療処置に関連した疾患、
・ホルモン調節不能又はふけ状態により起こされた疾患、
である、請求項５〜８のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１０】
動物における連鎖球菌感染及び真菌感染に関連して機能障害の治療又は予防のために意図された、請求項５〜９のいずれか１項に記載の獣医薬用途のための組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明の主題は哺乳動物における皮膚生態系を安定化し、及び／又は調節するために意図された化粧品、医薬又は獣医薬用途のための組成物を製造するためのカゼイン誘導体の使用である。本発明はまた、そのような薬剤を含有する組成物に関する。
【０００２】
当業界の状態
スタフィロコッカス　アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ）、ストレプトコッカス　パイロゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｐｙｏｇｅｎｅｓ）又はプロピオニバクテリウム　アクネス（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ａｃｎｅｓ）のような病原体の増殖又はカンジダ　アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ　ａｌｂｉｃａｎｓ）のような或る種の酵母菌の増殖は、皮膚系統の調節異常を起こす可能性があり、あるいは湿疹、カンジダ症、皮膚炎等のような皮膚又は粘膜における、なおより重大な病気を起こす可能性がある。
【０００３】
これらの病原因子に対する多くの治療の手段が知られている。抗生物質又は化学的抗菌剤及び抗真菌剤が最も慣用的に使用されている。別法として、アルデヒドタイプの局所消毒薬が選ばれる。
【０００４】
したがって、刊行された特許出願ＦＲ２７４００３９はケラチン生成細胞（ケラチノサイト）及び角質細胞にＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓのような病原体菌株の付着を阻止するために、アルデヒド類及び二官能性化合物から選ばれた物質、好ましくはグルタルアルデヒドの使用を記載している。
【０００５】
また、ヘキサクロロフェン及びその誘導体は、抗菌性物質として知られており、そしてさらに特定的にはＰｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ａｃｎｅｓに対して使用される。これらの処置は一般に費用がかかり、そして健康及び環境の両方に対して有害である。
【０００６】
別法として、微生物のある株の抗真菌性、殺菌性又は静菌性の性質を用いることからなる非毒性処置がまた知られている。
【０００７】
したがって、出願ＥＰ９９２０４４８９は、皮膚の病原性フローラを安定化し、調製することができる化粧品組成物を製造するために、皮膚細胞に関してそれらの接着能力について、及び皮膚系統の病原体の付着に関してそれらの競合的性質について選ばれたラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ミクロコッカス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ）又はビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｉｒｕｍ）の菌株の使用を記載している。
【０００８】
また、出願ＰＣＴ／ＥＰ９６／００４４１は酵母菌及び皮膚糸状菌の真菌症の治療のために抗付着活性剤として糖類及びそれらの誘導体を記載している。
【０００９】
本発明は、皮膚生態系を制御し、そして調節することができる新規な天然の非バクテリア剤を見い出すことを目的とする。
【００１０】
発明の概要
したがって、本発明は、皮膚系統の病原体により誘導される疾患を予防し又は治療する目的のために、ヒト又は動物に投与されることが意図される、化粧品、医薬又は獣医薬用途のための組成物の製造のためのカゼイン誘導体の使用に関する。
【００１１】
事実、カゼイン誘導体は、例えばＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｐｙｏｇｅｎｅｓ、トリコフィトン　ルブルム（Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ　ｒｕｂｒｕｍ）、ピチロスポルム　オバレ（Ｐｉｔｙｒｏｓｐｏｒｕｍ　ｏｖａｌｅ）、エム．フルフル（Ｍ．ｆｕｒｆｕｒ）又はＣａｎｄｉｄａ　ａｌｂｉｃａｎｓのような病原体の付着を阻止することにより皮膚系統の病原性フローラを安定化し、及び／又は調節することができたことが驚くべきことに観察された。
【００１２】
カゼイン誘導体は、カゼイノグリコマクロペプチド（ｃａｓｅｉｎｏｇｌｙｃｏｍａｃｒｏｐｅｐｔｉｄｅ）（ＣＧＭＰ）、カゼイノグリコマクロペプチド類のグリコシル化誘導体、及びカゼイノグリコマクロペプチド又はその誘導体の加水分解により得られた活性な生成物からなる群から選ばれることができる。
【００１３】
カゼイノグリコマクロペプチド類（ＣＧＭＰ類）は、任意の形で用いることができ、特に、例えばカルシウム塩又はナトリウム塩の形で用いることができる。
【００１４】
本発明はまた、皮膚系統の病原性フローラを安定化し、及び／又は調節することができる少なくとも１種のカゼイン誘導体を含有する、化粧品、医薬又は獣医薬用途のための組成物に関する。
【００１５】
この組成物は特に、例えばクリーム、ローション、皮膚科学ケーキ、シャンプー又は粉末の形であることができる。
【００１６】
本組成物において含有されるＣＧＭＰ類の量は、乾燥物質含有量の０．０１重量％〜１０重量％、好ましくは０．５重量％〜５重量％であることができる。
【００１７】
本発明に従う組成物は、例えばＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ　ｒｕｂｒｕｍ、Ｐｉｔｙｒｏｓｐｏｒｕｍ　ｏｖａｌｅ又はＣａｎｄｉｄａ　ａｌｂｉｃａｎｓのような病原体により誘導される疾患のような皮膚系統の疾患を示す可能性がある、健康な、敏感な及び／又は患った皮膚及び／又は粘膜の治療的又は予防的処置のために特に意図される。
【００１８】
発明の詳細な記載
“皮膚系統（ｃｕｔａｎｅｏｕｓ　ｓｙｓｔｅｍ）”と言う用語は皮膚のすべての細胞（即ちケラチン生成細胞（ケラチノサイト））をカバーするが、しかし角質細胞もまたカバーする。
【００１９】
第１の目的に従えば、本発明は皮膚系統の病原体により誘導される疾患を予防するか又は治療する目的のためにヒト又は動物に投与されることが意図される化粧品、医薬又は獣医薬用途のための組成物の製造のためのカゼイン誘導体の使用を提案する。
【００２０】
カゼイン誘導体は、カゼイノグリコマクロペプチド（ＣＧＭＰ）、カゼイノグリコマクロペプチドのグリコシル化誘導体、又はカゼイノグリコマクロペプチドの加水分解により若しくはその誘導体の加水分解により得られた活性な生成物であることができる。
【００２１】
事実、カゼイン誘導体、及び特にカゼイノグリコマクロペプチド類（ＣＧＭＰ類）及びそれらの誘導体類が、特に例えばＳｔｒｅｐｔｒｏｃｏｃｃｕｓ　ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ　ｒｕｂｒｕｍ、Ｐｉｔｙｒｏｓｐｏｒｕｍ　ｏｖａｌｅ、Ｃａｎｄｉｄａ　ａｌｂｉｃａｎｓ、Ｍ．ｆｕｒｆｕｒのような病原体の付着を阻止することにより、皮膚系統の病原性細菌フローラを安定化するために、そして調節するために、皮膚細胞に付着する能力を有していたことが驚くべきことに観察された。
【００２２】
これらの病原体により誘導される皮膚疾患は、特に（持続的療法としての寛解期における）アトピー性皮膚炎、座瘡（アクネ）、カンジダ症、脂漏性皮膚炎、でん風、膿痂疹又は湿疹性の重複感染であることができる（表１）：
【００２３】
2004503597.tif 000002
【００２４】
皮膚系統の疾患は、また、抗生物質を用いての、抗真菌薬を用いての、治療処置に、糖尿病（カンジダ症）に、粘膜の病原性症状（膣のカンジダ症）に、慢性湿疹（恒常性平衡異常）に、敏感な皮膚（早産新生児、子供）に、（細菌の定着を促進する可能性があるホルモン調節異常に関連した）多脂肪皮膚に、又はふけ状態に、関連づけることができる。
【００２５】
本発明の好ましい態様に従えば、ＣＧＭＰ類は例えばナトリウム塩又はカルシウム塩の形で用いることができる。それらの誘導体、特にグリコシル化（例えばシアリル化（ｓｉａｌｙｌａｔｅｄ））誘導体又はそれらの加水分解の活性な生成物を用いることがまた可能である。
【００２６】
カゼイン誘導体は０．０１〜１０％、好ましくは０．５〜５％の範囲の濃度で用いることができる。
【００２７】
ミルクカッパ−カゼイン類に対してレンネット又はキモシンを作用させることにより形成されたシアリル化マクロペプチドであるＣＧＭＰが好ましく用いられる。ＣＧＭＰを調製するために、例えばＰＣＴ９８／５３７０２に記載されているような、以下の工程からなる乳漿（ホエイ）原料を処理するイオン交換方法を用いることが可能である：適当な場合、液体乳漿（ホエイ）原料のｐＨを１〜４．３の値に調節し、４．５〜５．５の安定化されたｐＨが得られるまで前記液体を、アルカリ形の、支配的に弱いアニオン樹脂と接触させ、そして次に該樹脂と、回収される液体乳漿生成物とを分離させ、そして該樹脂からＣＧＭＰを脱着させる諸工程。
【００２８】
乳漿原料として、ＣＧＭＰを含有する任意の生成物又は副生成物を用いることができ、例えば：
・レンネットで凝固されたカゼインの分離後に得られたスイート（ｓｗｅｅｔ）乳漿；
・例えば電気透析、イオン交換、逆浸透、電気脱イオン化又はこれらの方法の組み合わせにより、多かれ少なかれ、或る程度に鉱物質除去されたスイート乳漿又はそのような乳漿；
・スイート乳漿の濃縮物；
・例えば、電気透析、イオン交換、逆浸透、電気脱イオン化又はこれらの方法の組み合わせにより、多かれ少なかれ、或る程度に鉱物質除去されたスイート乳漿の濃縮物；
・例えば限外濾過、次いでダイアフィルトレーションにより得られた実質的にラクトースを含有しないスイート乳漿たんぱく質の濃縮物；
・スイート乳漿からのラクトース結晶化の母液；
・スイート乳漿の限外濾過透過物；
・適当な場合にカルシウムイオンを添加して、無機酸により又は生物学的酸性化により、スキムミルクの酸沈殿により得られた自然カゼインの、プロテアーゼによる、加水分解の生成物；
・プロテアーゼによるカゼイン塩の加水分解の生成物。
【００２９】
他の目的に従えば、本発明は皮膚系統の病原フローラを安定化し、及び／又は調節することができる少なくとも１種のカゼイン誘導体を含有する、化粧品、医薬又は獣医薬用途のための組成物に関する。
【００３０】
カゼイン誘導体は、カゼイノグリコマクロペプチド（ＣＧＭＰ）、カゼイノグリコマクロペプチドのグリコシル化誘導体、又はカゼイノグリコマクロペプチドの加水分解若しくはその誘導体の加水分解により得られた活性な生成物であることができる。
【００３１】
そのような組成物を調製するために、カゼイン誘導体は、所望の応用に従って変化する量で、医薬的に又は化粧品的に許容できる担体中に導入される。それは組成物の合計重量に関して０．０１〜１０％、好ましくは０．５〜５％で存在することができる。
【００３２】
本発明に従う組成物は、局所的経路又は眼の経路により投与することができる。
【００３３】
局所的経路により、本発明に従う化合物に基づく医薬組成物はまた、好ましくは皮膚の治療及び粘膜の治療のために意図され、そして軟膏、クリーム、乳液、ポマード、粉末、含浸パッド、溶液、ゲル、スプレー、ローション又は懸濁液の形で提供することができる。それらはまた、微小球又はナノ級の微小球、又は脂質類若しくは重合体小泡体、又は制御された放出を可能にする重合体パッチ又はヒドロゲルの形で提供することができる。局所投与のためのこれらの組成物は臨床の指針に依存して無水形において又は水性形においてのいずれかで提供することができる。
【００３４】
眼の経路により、それらは主として洗眼剤である。
本発明は更に特定的には、化粧品的に許容できる担体中に、上に定義されたとおりの少なくとも１種のカゼイン誘導体を含有する化粧品組成物に関する。化粧品組成物は、組成物の合計重量に対して少なくとも０．０１重量％、好ましくは０．５〜５重量％の量でＣＧＭＰを含有することができる。
【００３５】
この化粧品組成物は、身体及び毛髪衛生のために特に意図される。それは特にクリーム、乳液、ローション、ゲル、脂質類又は重合体微小球又はナノ級の微小球、又は小泡体、石鹸又はシャンプーの形で提供することができる。
【００３６】
本発明に従う組成物において、カゼイン誘導体は、レチノイド類又はコルチコステロイド類と組み合せることができ、又は抗フリーラジカル剤と組み合わせることができ、α−ヒドロキシ酸若しくはα−ケト酸又はそれらの誘導体と組み合わせることができ、又はイオンチャネル遮断薬と組み合わせることができる。
【００３７】
さらに、本発明に従う医薬及び化粧品組成物は、不活性な添加剤、もしくは薬力学的に又は化粧品的に活性でさえある添加剤又はこれらの添加剤の組み合わせを含有することができ、そして特に：湿潤剤；ヒドロキノン、アゼライン酸、カフェー酸又はコウジ酸のような脱色素剤；皮膚軟化剤；グリセロール、ＰＥＧ−４００、チアモルホリノン及びその誘導体又は尿素のような保湿剤；Ｓ−カルボキシメチルシステイン、Ｓ−ベンジルシステアミン、それらの塩及びそれらの誘導体、又は過酸化ベンゾイルのような抗脂漏薬又は抗座瘡薬；エリスロマイシン及びそのエステル、ネオマイシン、クリンダマイシン及びそのエステル、テトラサイクリンのような抗生物質；ケトコナゾール又は４，５−ポリメチレン−３−イソチアゾリノン類のような抗真菌剤；ミノキシジル（２，４−ジアミノ−６−ピペリジノピリミジン−３−オキシド）及びその誘導体、ジアゾキシド（７−クロロ−３−メチル−１，２，４−ベンゾチアジアジン１，１−ジオキシド）及びフェニトイン（５，４−ジフェニル−２，４−イミダゾリジンジオン）のような毛髪再生を促進する薬剤：非ステロイド系抗炎症剤；カロチノイド類及び特にβ−カロテン；アントラリン及びその誘導体、及び最後に５，８，１１，１４−エイコサテトライン酸及び５，８，１１−エイコサトリイン酸、それらのエステル類及びアミド類の様な抗乾癬剤を含有することができる。
【００３８】
本発明に従う組成物はまた、パラ−ヒドロキシ安息香酸のエステルのような保存料、安定剤、水分調節剤、ｐＨ−調節剤、浸透圧修正剤、乳化剤、ＵＶ−Ａ及びＵＶ−Ｂスクリーニング剤、α−トコフェロール、ブチル化ヒドロキシアニソール又はブチル化ヒドロキシトルエンのような酸化防止剤を含有することができる。
【００３９】
本発明に従う組成物は、特に下記のような皮膚系統の疾患を示す可能性がある、健康な、敏感な及び／又は患った皮膚及び／又は粘膜の治療的又は予防的処置のために特に意図される：
【００４０】
・重複感染したアトピー性皮膚炎、膿痂疹化した湿疹、潰瘍、外傷、火傷、重複感染した炎症性座瘡のような感染性合併症；
・膿痂疹、表在性毛のう炎のような多発性皮膚炎；
・脂漏性皮膚炎、でん風；
・皮膚硬化症（頭部白癬、躯幹白癬、汗疱状白癬、ヘブラ頑癬、及び連園状白癬）；
・カンジダ症（膣、危険職業に関連した指間、糖尿病に関連した指間）；
・抗生物質を用いての又は抗真菌薬を用いての治療処置に関連した疾患；
・ホルモン調節不能（多脂肪皮膚）又はふけ状態により起こされた疾患；
・敏感な皮膚（早産新生児、子供）。
【００４１】
最終的に、本発明は上に記載された性質を有する少なくとも１種のカゼイン誘導体を含有する、動物のための獣医薬又は化粧品用途のための組成物に関する。そのような組成物は例えば乾燥又は液体シャンプー、粉末、ムース又はローションの形で提供することができる。それは例えば１０％までのＣＧＭＰ類を含有することができる。
【００４２】
獣医薬用途のための組成物は、外部寄生虫、連鎖球菌感染に起因する（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓに起因する）及び真菌感染に起因する機能障害（Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓに起因するカンジダ症及びＰ．ｃａｎｉｓに起因するピチロスポロセス（ｐｉｔｙｒｏｓｐｏｒｏｓｅｓ））により起こされる感染の治療及び予防のために意図される。
【００４３】
獣医薬組成物は、抗炎症、かゆみ止め又はふけ防止の性質を有することができる。
【００４４】
本発明は、本発明の主題を例示するために提供され、そしていかなるやり方であってもそれへの限定を構成しない、実施例の助けをかりて以下により詳細に記載される。パーセンテージは他のように記載されない限り重量により提供される。
【００４５】
例
例　１：
ＣＧＭＰの製造及びＡｓ−ＣＧＭＰの製造
１７％の乾燥物質含有量にまで予め濃縮され、次に電気透析により鉱物質除去され、強いカチオン樹脂のカラム上で脱カチオン化され、弱いアニオン樹脂のカラム上で脱アニオン化され、そして乾燥塔中で噴霧乾燥される、下に示される組成を有するスイートウシ乳漿が使用される：
【００４６】
たんぱく質類（ＣＧＭＰが包含される）　　　　１１．７％
ラクトース　　　　　　　　　　　　　　　　　８１．７％
灰分　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１％
脂質類　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１％
水　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　全体で１００にする量。
【００４７】
この鉱物質除去された乳漿粉末は、脱イオン水中に溶解化され、その溶液は３．８の初期ｐＨを有する。上記表示において、３９２ｋｇのこの溶液は４時間、弱いアニオン樹脂（ＯＨ−形に再生されたロームアンドハース社製のＩＭＡＣ　ＨＰ６６１（登録商標））の２３ｋｇの存在下に反応器中でそれをかき混ぜることにより８℃の温度で処理される。
【００４８】
４．８９でのｐＨの安定化は反応の終了を示す。次に液体を排出させ、そして樹脂を上記のとおりにして回収する。蒸発により２８％乾燥物質含有量に液体を濃縮した後に、濃縮物を乾燥塔において噴霧乾燥させる。
【００４９】
ＨＰＬＣによる濃縮物の分析は反応が初期ＣＧＭＰの８９％を取り出したことを示している。さらに、粉末は９．１％の乳漿たんぱく質を含有し、これは乳漿たんぱく質の９０％の収率に相当する。
【００５０】
ＣＧＭＰを回収するために、樹脂は脱イオン水で、ＨＣｌの０．５％水溶液の３０リットルで、そして脱イオン水の３０リットルで連続的に洗浄され、次にＣＧＭＰは、ＮａＯＨの２％の水溶液の４０リットルで２回溶離され、そして脱イオン水の３０リットルでリンスされる。溶離液容量とリンス液容量とを合併した後に、全体は３０００ダルトンの公称のカットオフを有する膜を用いて限外濾過により２５リットルの容量に濃縮され、濃縮水は凍結乾燥され、そして９００ｇのＣＧＭＰが得られ、これは、初期のＣＧＭＰに対して８０％の収率に相当する。
【００５１】
アシアロ（Ａｓｉａｌｏ）−ＣＧＭＰ（Ａｓ−ＣＧＭＰ）はＮｅｅｓｅｒ　Ｊ．Ｒ．等、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．５６、第３２０１頁〜第３２０８頁（１９８８）により記載されたとおりにして、酵素的又は化学的脱シアリル化（ｄｅｓｉａｌｙｌａｔｉｏｎ）により得られる。
【００５２】
例　２：
カゼイン誘導体ＣＧＭＰ及びＡｓ−ＣＧＭＰを用いてＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ　ｒｕｂｒｕｍ及びＣａｎｄｉｄａ　ａｌｂｉｃａｎｓの付着を阻止するためのインビトロ試験
インビトロ付着モデルは、不死化されたヒトのケラチン生成細胞（ケラチノサイト）の単層を用いて病原性皮膚微生物の放射性同位元素標識化され且つ標準化された懸濁液のインキュベーションに基づいている（ＨａＣａＴライン：Ｂｏｕｋａｍｐ　Ｐ等、Ｊ．Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ．，１０６第７６１頁〜第７７１頁（１９８８））。
【００５３】
この付着に関してのＣＧＭＰの阻止活性は、単層上に保持された放射能を調べることにより病原体の単層及び試験されるべき化合物の単層を用いてのインキュベーションに関連して評価される。
【００５４】
ケラチン生成細胞
ＨａＣａＴ細胞は、５％ＣＯ２下に３７℃で１０％うし胎児血清を補充したＤＭＥＭ培地中で培養される。それらは、１．０Ｅ＋０４細胞／ｃｍ２の割合で６つのウェルのクラスターにおいて接種される。付着実験は、集合（コンフルエンス）後５日間行われる。それら複数の単層は、微生物を用いての培養の前にＰＢＳで３回洗浄される。
【００５５】
微生物
病原体Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ　ｒｕｂｒｕｍ及びＣａｎｄｉｄａ　ａｌｂｉｃａｎｓは、これらに特異的である標準の方法に従って、傾斜培養からの継代培養（ｓｕｂｃｕｌｔｕｒｉｎｇ）によりブロス中で培養される。ＯＤ／細菌密度関係は、連続希釈及び寒天培地上での計数に基づいて、試験された微生物の各々について確立された。
【００５６】
放射性同位元素標識化
微生物菌株の放射性同位元素標識化は培養の２４時間３Ｈ−アデニンの１００μＣｉ／１０ｍｌをＴＣＳブロス中に導入することにより得られる。次に懸濁液は３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離され、そしてＰＢＳ中で３回洗浄される。細胞の密度は、ＰＢＳ緩衝液を用いて、約２．０Ｅ＋０８ｃｆｕ／ｍｌ（５２５ｎｍでのＯＤ＝０．５）に調節される。比放射能は、懸濁液の１００μｌ上でシンチレーション計数により決定される。
【００５７】
付着アッセイ
放射性同位元素標識化微生物懸濁液の１ｍｌは３５℃で１時間培養される。単層はＰＢＳ緩衝液を用いて３回洗浄され、そして室温で３０分間１ＮのＮａＯＨの添加により溶解される。溶菌液はシンチレーションフラスコに移され、そして水酸化ヒアミン（ｈｙａｍｉｎｅ　ｈｙｄｒｏｘｉｄｅ）の１ｍｌを用いて、６０℃で１時間インキュベートされる（Ｃａｒｌｏ　Ｅｒｂａ，ｒｅｆ．４６４９５１）。３Ｈ活性は、液体シンチレーションカウンター中で計数される。各々のアッセイは三回繰り返される。プラスチック支持体への付着についての対照実験がまた行われる。
付着は、導入された放射能に対する付着された放射能の比に１００を乗じた値として定義される。
【００５８】
付着阻止アッセイ
カゼイン誘導体の溶液がＰＢＳ中で調製される。試験される濃度は０〜１０ｍｇ／ｍｌの範囲をカバーする。試験される構成は、単層上で放射性同位元素標識化された病原体及び該誘導体を同時にインキュベートすることからなる。
結果を表２、３及び４に示す。
【００５９】
2004503597.tif 000003
【００６０】
2004503597.tif 000004
【００６１】
2004503597.tif 000005
【００６２】
ＣＧＭＰ及びＡｓ−ＣＧＭＰは、例えばＳｔｒｅｐｔｏｃｕｃｃｕｓ　ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ　ｒｕｂｒｕｍ、Ｃａｎｄｉｄａ　ａｌｂｉｃａｎｓのような病原体の付着を阻止する能力を有している。したがって、それらは皮膚系統の病原性細菌フローラを安定化するか又は調節することができる。
【００６３】
例　３：
ＣＧＭＰによるＭ．ｆｕｒｆｕｒの付着の阻止のための体外（エクスビボ）試験
材料及び方法
動物：７〜８週令であり、そして約３０ｇの体重を有している１５匹のＳＫＨ雌マウスが、Ｃ．Ｒｉｖｅｒにより提供された。５匹が異なる局所適用を試験する各々のグループのために用いられた。
【００６４】
接種物の調製
Ｍ．ｆｕｒｆｕｒの懸濁液は、マウスにおいてのその接種のために調製される。そのために、菌株１の傾斜予備培養が１８〜２４時間３５℃で固体培地（ＡＥＳ、ＡＥＢ　１２２　８５９）上で行われる。培養の後に、細菌は滅菌食塩水溶液の１０ｍｌ中に再懸濁され、次に１０分間３０００ｒｐｍで遠心分離後に回収される。上澄み液を次に除去し、そしてペレットを食塩水溶液の１０ｍｌ中に取り上げる。この方法を２回繰り返す。接種物懸濁液は、滅菌食塩水溶液の４ｍｌ中で洗浄された細菌を再懸濁することにより調製される。５２５ｎｍでのＯＤは、約０．１４に再調節される。それは約１０８ｃｆｕ／ｍｌを含有する。
【００６５】
マウスの接種
ねずみの皮膚は、９５％エタノール（Ｍｅｒｃｋ）を用いて脇腹上で脱脂される。接種物１．０Ｅ＋０．７ｃｆｕ／ｍｌ及び試験されるべき生成物（溶液中に１％、２％、３％及び５％でのＣＧＭＰ）の、５０／５０混合物を含有する懸濁液の５０μｌは、脱脂された領域（６．２５ｃｍ２）上にミクロピペットを用いてゆっくりと適用された。接種された部位は滅菌プラスチック包帯（Ｄｅｒｍａｆｉｌｍ　３３　ｘ　１５，ｒｅｆ．３８．３０１５、Ｖｙｇｏｎ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）下に閉塞することにより保護される。
【００６６】
病変部位における生存可能な細菌の計数
懸濁液の適用の４時間後に、フォレン（ｆｏｒｅｎｅ）（Ａｂｂｏｔ　Ｆｒａｎｃｅ）を用いて麻酔下にマウスは殺される。接種された部位は、ブロック（直径１２ｍｍ）として切開される。取り出された皮膚の生体組織検査材料は細かに砕かれ、そしてＰｏｌｙｔｒｏｎ（ＰＴ２１００、Ｂｉｏｂｌｏｃｋ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）（５分間５ｒｐｍ）を用いて滅菌食塩水溶液の２ｍｌ中にホモジェナイズされる。
【００６７】
ホモジェナイズされた組織の１ｍｌのサンプルを滅菌食塩水溶液の９ｍｌに加え、この混合物の０．１ｍｌを１０倍希釈法を用いて培地Ｎｏ．１１０で培養する。３５℃で４８時間培養後、発現したコロニーを計数し、そしてそのＣＦＵ（コロニー形成単位）を決定する。
【００６８】
結果
結果を表５に示す。
2004503597.tif 000006
【００６９】
例　４：
ボデイローション
以下の組成：８．０％の鉱油、５．０％のパルミチン酸イソプロピル、２．０％のジイソステアリン酸ポリグリセリル−３、４．０％のオクチルドデカノール、０．３％のカルボマー、０．２％のココイルグルタミン酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ　ｃｏｃｏｙｌｇｌｕｔａｍａｔｅ）、１０％で、１．２％の水酸化ナトリウム、保存料、香料、例１において調製されたＣＧＭＰの０．５〜５％、を有するボディローションが調製される。その混合物は水を用いて１００％に調節される。
【００７０】
このようにして得られたボディローションは、病原体に対するその付着防止の性質の故に、病原性の皮膚フローラを安定化し、及び／又は調節することが意図される。
【００７１】
例　５：
シャンプー
以下の組成：７％のラウリル硫酸ナトリウム、２％のコカミドプロピルベタイン（ｃｏｃａｍｉｄｏｐｒｏｐｙｌｂｅｔａｉｎ）、２％のラウリルスルホこはく酸ナトリウム、塩化ナトリウム、保存料、香料及び３％の例１において調製されたＣＧＭＰ、を有するシャンプーが調製される。それらの混合物は水を用いて１００％に調節される。
【００７２】
このようにして調製されたシャンプーは、病原性頭皮フローラを調節する性質を有する。それは特にふけ状態の処置において示される。
【００７３】
例　６：
医薬組成物
病原性皮膚フローラを調節する性質を有する医薬組成物を得るために、以下の組成を有する脂肪相及び水性相が調製される：
【００７４】
例１において調製されたＣＧＭＰ　　　　　　　　　　　　　１％
脂肪相：
アラキジルベヘニルアルコール／アラキジルグルコシド　　　３％
イソヘキサデカン　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　７％
スイートアーモンドオイル　　　　　　　　　　　　　　　　３％
シアバター　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　２％
Ｂ．Ｈ．Ｔ．　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　０．０５％
プロピルＰＯＢ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　０．０５％
水性相：
水　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１００％にするのに十分な量
グリセリン　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　５％
メチルＰＯＢ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　０．１％
【００７５】
脂肪相及び水性相を７５℃に加熱する。次に１０００ｒｐｍでＲａｙｎｅｒｉ装置を用いてかき混ぜながら、脂肪相に水性相を加えることにより乳化が行われる。乳化の３０分後に、混合物はＰｏｌｙｔｒｏｎ（速度４〜５）を用いて１分間ホモジェナイズされる。
【００７６】
例　７：
医薬組成物
例６における方法と同じ方法で調製されるが、以下の組成を有する組成物が調製される：
【００７７】
例１において調製されたＣＧＭＰ　　　　　　　　　　　　　１％
脂肪相：
ステアリン酸グリセリル及びステアリン酸ＰＥＧ１００　　　５％
イソヘキサデカン　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　８％
シアバター　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　５％
Ｂ．Ｈ．Ｔ．　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　０．０５％
ＤＣ　１５０３　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１％
水性相：
水　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１００％にするのに十分な量
グリセリン　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　３％
Ｃａｒｂｏｐｏｌ　９８１　　　　　　　　　　　　　　　　０．２％
Ｌｕｂｒａｊｅｌ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　５％
フェノキシエタノール　　　　　　　　　　　　　　　　　　１％
水酸化ナトリウム　　　　　　　　　　　　ｐＨ６にするのに十分な量
【００７８】
例　８：
動物のためのシャンプー
以下の組成：５％のラウリル硫酸ナトリウム、２％のコカミドプロピルベタイン（ｃｏｃａｍｉｄｏｐｒｏｐｙｌｂｅｔａｉｎ）、２％のラウリルスルホこはく酸ナトリウム、２％の塩化ナトリウム、１．５％　ＰＥＧ−７グリセリルココエート（ＰＥＧ−７　Ｇｌｙｃｅｒｙｌ　Ｃｏｃｏａｔｅ）、０．７５％のプロピレングリコール、パンテノール、グリセリン、燐酸二ナトリウム、保存料、香料、及び２％の例１において調製されたＣＧＭＰ、を有する動物のためのシャンプーが調製される。その混合物は水を用いて１００％に調節される。
このようにして調製されたシャンプーは動物の皮膚系統の病原性フローラを調節する性質を有している。
【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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