(57)【要約】本発明者らは、（ａ）（１）制御配列に作動性に連結されている、所望する遺伝子産物をコードする遺伝子、（２）ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩを使用するベクター複製をもたらす複製起点、および（３）ＤＮＡポリメラーゼＩを使用するベクター複製をもたらす複製起点を含むベクターであって、第２の複製起点がリプレッサーにより抑制され得る制御配列に作動性に連結されているベクターを有する調節された抗原送達システム（ＲＡＤＳ）を記載する。ＲＡＤＳ微生物はまた、活性化可能な制御配列に作動性に連結された、リプレッサーをコードする遺伝子を有する。記載されるＲＡＤＳは、高コピー数の複製起点の抑制が解除された後、高レベルの所望する遺伝子産物をもたらす。ＲＡＤＳは、生細菌ワクチンとして特に有用である。抑制が解除された後、高コピー数の複製起点が発現する前に遅延が存在する遅延型ＲＡＤＳシステムもまた記載される。遅延型ＲＡＤＳもまた、生細菌ワクチンとして特に有用である。これらのシステムに有用ないくつかの制御エレメント、ならびにＲＡＤＳ微生物で免疫化された脊椎動物において病原体に対する免疫性をもたらす方法もまた記載される。
2004515210.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
調節された抗原送達系（ＲＡＤＳ）を含む微生物であって、ＲＡＤＳが、
（ａ）（１）所望する遺伝子産物をコードする遺伝子を挿入するための部位；（２）ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩを使用するベクター複製をもたらす第１の複製起点（ｏｒｉ）；および（３）ＤＮＡポリメラーゼＩを使用するベクター複製をもたらす第２のｏｒｉを含むベクターであって、第２のｏｒｉが、第１のリプレッサーにより抑制され得る第１の制御配列に作動性に連結され、かつラナウェイベクターがファージの溶解遺伝子を含まないベクター、および
（ｂ）第１の活性化可能な制御配列に作動性に連結された、第１のリプレッサーをコードする遺伝子
を含む微生物。
【請求項２】
ステップ（ａ）の部位に挿入された、所望する遺伝子産物をコードする遺伝子をさらに含み、かつ所望する遺伝子産物をコードする遺伝子が第２の制御配列に作動性に連結されている請求項１に記載の微生物。
【請求項３】
第１の制御配列および第２の制御配列が同じ配列である請求項２に記載の微生物。
【請求項４】
第１の制御配列および第２の制御配列が異なる配列である請求項２に記載の微生物。
【請求項５】
リプレッサーがＬａｃＩリプレッサーおよびＣ２リプレッサーからなる群から選択され、第２の制御配列が第２のリプレッサーにより抑制され得る請求項１に記載の微生物。
【請求項６】
（ａ）ベクターがプラスミドであり、
（ｂ）所望する遺伝子産物が抗原であり、かつ
（ｃ）微生物が病原性細菌の弱毒化された誘導体である
請求項２に記載の微生物。
【請求項７】
微生物がサルモネラ菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｓｐ．）である請求項６に記載の微生物。
【請求項８】
第１の活性化可能な制御配列がａｒａＣＰＢＡＤである請求項６に記載の微生物。
【請求項９】
機能性の必須遺伝子を染色体に有しないこと、およびベクター上に必須遺伝子の組換え機能性コピーを有することからなる平衡致死宿主ベクター系をさらに含む請求項６に記載の微生物。
【請求項１０】
必須遺伝子がａｓｄ遺伝子である請求項９に記載の微生物。
【請求項１１】
ａｓｄ遺伝子が、ａｒａＣＰＢＡＤに作動性に連結されたリプレッサー遺伝子を挿入することによって不活性化されている請求項１０に記載の微生物。
【請求項１２】
ｃｙａ、ｃｒｐ、ｐｈｏＰＱ、ｏｍｐＲ、ｇａｌＥ、ｃｄｔ、ｈｅｍＡ、ａｒｏＡ、ａｒｏＣ、ａｒｏＤおよびｈｔｒＡからなる群から選択される天然遺伝子における不活性化変異をさらに含む請求項６に記載の微生物。
【請求項１３】
第１のｏｒｉがｐＳＣのｏｒｉであり、第２のｏｒｉがｐＵＣのｏｒｉである請求項６に記載の微生物。
【請求項１４】
第１の制御配列がＰ２２ＰＲであり、第１のリプレッサーがＣ２リプレッサーである請求項６に記載の微生物。
【請求項１５】
第２の制御配列がＰｔｒｃであり、第２の制御配列が第２のリプレッサーにより抑制可能であり、第２のリプレッサーがＬａｃＩリプレッサーである請求項６に記載の微生物。
【請求項１６】
第１の制御配列がＰ２２ＰＲであり、第１のリプレッサーがＣ２リプレッサーであり、第１のｏｒｉがｐＳＣのｏｒｉであり、第２のｏｒｉがｐＵＣのｏｒｉである請求項１５に記載の微生物。
【請求項１７】
ベクターが、抗原をコードする遺伝子を有するｐＭＥＧ−７７１またはその改変体である請求項１６に記載の微生物。
【請求項１８】
抗原がＥｒｙ６５およびＳｅＭからなる群から選択される請求項６に記載の微生物。
【請求項１９】
所望する遺伝子産物が真核生物の制御配列に作動性に連結されている請求項６に記載の微生物。
【請求項２０】
ΔｅｎｄＡ変異をさらに含む請求項１９に記載の微生物。
【請求項２１】
請求項１９に記載される微生物におけるベクターを含むラナウェイベクター。
【請求項２２】
遅延型ＲＡＤＳの特性を示す請求項６に記載の微生物であって、遅延型ＲＡＤＳの特性が、代謝および／または漏出によりアクチベーター分子の喪失を遅らせる変異と、リプレッサー濃度を増大させる変異または挿入と、２つ以上のリプレッサーに対する結合部位を有するベクター制御配列および／またはベクター制御配列に作用するリプレッサー分子をコードするベクター配列を含有することとからなる群から選択される変化によってもたらされる微生物。
【請求項２３】
所望の遺伝子産物を産生する方法であって、
（ａ）所望の遺伝子産物をコードする遺伝子を操作して、請求項６に記載の微生物中のベクター中に導入することにおいて、その微生物は、第１の環境条件下では第２のｏｒｉの発現を抑制するが、第２のｏｒｉの発現が第２の環境条件下で抑制解除される制御配列を含むこと；
（ｂ）ステップ（ａ）の微生物を第１の環境条件下で培養すること；および
（ｃ）ステップ（ａ）のラナウェイベクターを有する微生物を、所望の遺伝子産物を産生するのに十分な時間、第２の環境条件下で培養すること
をこの順序で含む方法。
【請求項２４】
所望する遺伝子産物が抗原である請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
第１の環境条件がアラビノースの存在を含み、第２の環境条件がアラビノースの非存在を含む請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
第１の環境条件がインビトロ培養条件を含み、第２の環境条件が脊椎動物体内での条件を含む請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
請求項２６に記載の方法であって、
（ａ）第１のｏｒｉがｐＳＣのｏｒｉであり、
（ｂ）第２のｏｒｉが、Ｐ２２ＰＲからなる抑制性の制御配列に作動性に連結されているｐＵＣのｏｒｉであり、
（ｃ）産物の制御配列がＰｔｒｃであり、
（ｄ）微生物が、第１の活性化可能な制御配列に作動性に連結された、第１のリプレッサーをコードする遺伝子を含み、その第１のリプレッサーがＣ２であり、
（ｅ）微生物が、第２の活性化可能な制御配列に作動性に連結された、第２のリプレッサーをコードする遺伝子を含み、その第２のリプレッサーがＬａｃＩであり、
（ｆ）微生物が機能性のａｓｄ遺伝子を有しない染色体を含み、ラナウェイベクターが機能性のａｓｄ遺伝子を含み、かつ
（ｇ）微生物が、ｃｙａ、ｃｒｐ、ｐｈｏＰＱ、ｏｍｐＲ、ｇａｌＥ、ｃｄｔ、ｈｅｍＡ、ａｒｏＡ、ａｒｏＣ、ａｒｏＤおよびｈｔｒからなる群から選択される天然遺伝子中に不活性化変異を含む
方法。
【請求項２８】
第１の環境条件がアラビノースの存在を含み、第２の環境条件がアラビノースの非存在を含む請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
微生物がａｒａＣＢＡＤオペロンおよび／またはａｒａＥ遺伝子における不活性化欠失をさらに含む請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
所望する遺伝子産物がＥｒｙ６５およびＳｅＭからなる群から選択される請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
所望する遺伝子産物が真核生物の制御配列に作動性に連結されている請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
脊椎動物を免疫化するためのワクチンであって、請求項６に記載の微生物を薬剤として許容可能なキャリア中に含むワクチン。
【請求項３３】
微生物がサルモネラ種である請求項３２に記載のワクチン。
【請求項３４】
請求項３２に記載のワクチンであって、
（ａ）第１のｏｒｉがｐＳＣのｏｒｉであり、
（ｂ）第２のｏｒｉが、Ｐ２２ＰＲからなる抑制性の制御配列に作動性に連結されているｐＵＣのｏｒｉであり、
（ｃ）産物の制御配列がＰｔｒｃであり、
（ｄ）第１の誘導性制御配列に作動性に連結された、第１のリプレッサーをコードする遺伝子であって、その第１のリプレッサーがＣ２である遺伝子、および
（ｅ）第２の誘導性制御配列に作動性に連結された、第２のリプレッサーをコードする遺伝子であって、第２のリプレッサーがＬａｃＩである遺伝子であるワクチン。
【請求項３５】
第１の活性化可能な制御配列および第２の誘導性制御配列がともにａｒａＣＰＢＡＤである請求項３４に記載のワクチン。
【請求項３６】
微生物がａｒａＣＢＡＤオペロンおよび／またはａｒａＥ遺伝子における不活性化欠失をさらに含む請求項３５に記載のワクチン。
【請求項３７】
脊椎動物における免疫保護を誘導する方法であって、請求項３２に記載のワクチンを脊椎動物に投与することを含む方法。
【請求項３８】
所望する遺伝子産物を脊椎動物に送達する方法であって、請求項１に記載の微生物を脊椎動物に投与することを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の背景
（１）発明の分野
本発明は、ワクチンおよび組換えＤＮＡ発現産物を調製するための材料および方法に関する。より詳細には、本発明は、プラスミドにより運ばれる遺伝子にコードされる抗原および他の組換え産物を発現させるために有用である遺伝子操作された弱毒化病原性微生物に関する。
【０００２】
（２）関連技術の記載
引用される参考文献：
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【０００３】
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【０００４】
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【００２０】
ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｉｎｃ．）。
【００２１】
Ｍｉｌｌｅｒ，Ｊｅｆｆｒｅｙ  Ｈ．（１９９２）、Ａ  ＳＨＯＲＴ  ＣＯＵＲＳＥ  ＩＮ  ＢＡＣＴＥＲＩＡＬ  ＧＥＮＥＴＩＣＳ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ。
【００２２】
Ｍｉｌｌｅｒ他編（１９９４）、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＧＥＮＥＴＩＣＳ  ＯＦ  ＢＡＣＴＥＲＩＡＬ  ＰＡＴＨＯＧＥＮＥＳＩＳ、ＡＳＭ  Ｐｒｅｓｓ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．。
【００２３】
Ｎａｋａｙａｍａ他（１９８８）、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．６：６９３。
【００２４】
Ｎｅｉｄｈａｒｄｔ他編（１９９６）、ＥＳＣＨＥＲＩＣＨＩＡ  ＣＯＬＩ  ＡＮＤ  ＳＡＬＭＯＮＥＬＬＡ：ＣＥＬＬＵＡＬＲ  ＡＮＤ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ、第２版、ＡＳＭ  Ｐｒｅｓｓ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．（特に、１１０章、１３３章、１３５章、１４１章）。
【００２５】
Ｏｇｒａ他編（１９９９）、ＭＵＣＯＳＡＬ  ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ、第２版、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ。
【００２６】
Ｐａｕｌ編（１９９９）、ＦＵＮＤＡＭＥＮＴＡＬ  ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ、第４版、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ。
【００２７】
Ｐｅｔｅｒｓ（１９９３）、ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ，Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、Ｗｍ．Ｃ．Ｂｒｏｗｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ。
【００２８】
Ｓａｍｂｒｏｏｋ他（１９８９）、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ，Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ。
【００２９】
ＳｎｙｄｅｒおよびＣｈａｍｐｎｅｓｓ（１９９７）、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＧＥＮＥＴＩＣＳ  ＯＦ  ＢＡＣＴＥＲＩＡ、ＡＳＭ  Ｐｒｅｓｓ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．。
【００３０】
Ｕｌｍｅｒ他（１９９６）、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．８：５３１〜６。
【００３１】
Ｕｍｂａｒｇｅｒ（１９７８）、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．４７：５３３。
【００３２】
米国特許第４，１９０，４９５号。
【００３３】
米国特許第４，４２４，０６５号。
【００３４】
米国特許第４，８８８，１７０号。
【００３５】
米国特許第５，２９４，４４１号。
【００３６】
米国特許第５，２７８，７４４号。
【００３７】
米国特許第５，３８９，３６８号。
【００３８】
米国特許第５，４２４，０６５号。
【００３９】
米国特許第５，４６８，４８５号。
【００４０】
米国特許第５，６５６，４８８号。
【００４１】
米国特許第５，６７２，３４５号。
【００４２】
米国特許第５，８４０，４８３号。
【００４３】
米国特許第５，８５５，８７９号。
【００４４】
米国特許第５，８５５，８８０号。
【００４５】
米国特許第５，８８８，７９０号。
【００４６】
米国特許第６，０２４，９６１号。
【００４７】
関連技術
遺伝子操作された微生物は有用性および重要性が拡がっている。このような微生物の１つの重要な使用は、免疫応答を生じさせるための生ワクチンとしての使用である。生ワクチンは、高レベルの抗原が生ワクチンにより産生されるときに最も効果的である。しかし、組換え抗原の高レベルの発現を生じさせることは微生物にとって有害である場合がある。このために、（構成的な発現システムとは対照的に、）発現が誘導、抑制解除または活性化されたときにだけ著量の組換え遺伝子の発現を可能にする制御エレメントに対して目的とする組換え遺伝子が作動性に連結されている調節された発現システムが同定され、利用されている。例として、ｃｓｐＡ遺伝子プロモーター、ｐｈｏＡ遺伝子プロモーター、ＰＢＡＤ（ａｒａＣ−ＰＢＡＤシステムにおいて）、ｔｒｐプロモーター、ｔａｃプロモーター、ｔｒｃプロモーター、λＰＬ、Ｐ２２ＰＲ、ｍａｌプロモーター、およびｌａｃプロモーターが挙げられる。これらのプロモーターは、低い温度で、低いリン酸塩レベルで、アラビノースの存在下で、低いトリプトファンレベルの存在下で、そしてラクトース（または他のｌａｃ誘導因子）の存在下で転写を媒介する。
【００４８】
遺伝子操作された微生物の１つの重要な使用は、免疫性を誘導するための生ワクチンとしての使用である。例えば、米国特許第６，０２４，９６１号、同第４，８８８，１７０号、同第５，３８９，３６８号、同第５，８５５，８７９号、同第５，８５５，８８０号、同第５，２９４，４４１号、同第５，４６８，４８５号、同第５，３８７，７４４号、同第５，８４０，４８３号、同第５，６７２，３４５号、同第５，４２４，０６５号、同第５，３７８，７４４号、同第５，８８８，７９０号、同第５，４２４，０６５号、同第５，６５６，４８８号、同第５，００６，３３５号、同第５，６４３，７７１号、同第５，９８０，９０７号、同第５，８５１，５１９号、および同第５，５２７，５２９号を参照のこと（これらはすべて参考として組み込まれる）。遺伝子操作された微生物を脊椎動物の生ワクチンとして利用しようとする場合には、いくつかの事項を考慮しなければならない。死ワクチンの利益を超える利益をもたらすために、生ワクチン微生物は、脊椎動物のリンパ組織に付着し、侵入して生存し、そして脊椎動物におけるこのような免疫エフェクター部位を抗原に長期間にわたってさらさなければならない。このような連続した刺激が行われることにより、脊椎動物の免疫系は、抗原に対する反応性が死ワクチンの場合よりも大きくなる。したがって、好ましい生ワクチンは脊椎動物の弱毒化された病原体であり、特に、腸管関連リンパ組織（ＧＡＬＴ）または気管関連リンパ組織（ＢＡＬＴ）にコロニー形成する病原体である。死ワクチンを上回るこのような弱毒化された病原体のさらなる利点は、これらの病原体はリンパ組織に接近する機構を作りあげており、したがって、脊椎動物の免疫系に対する効率的な暴露が期待され得るということである。対照的に、死ワクチンは、ワクチンが免疫系に受動的にさらされた場合に、または宿主の機構によりワクチンが免疫系に運ばれた場合に免疫刺激をもたらすだけである。
【００４９】
例えば、米国特許第５，８８８，７９９号に記載されているように、病原性細菌は、変異を導入することによって弱毒化することができ、その結果、動物宿主に感染したときに、疾患の総合的症状が誘発されないが、それでも、細菌が動物宿主体内のリンパ組織に付着し、侵入し、コロニー形成する能力を十分な時間にわたって保持して、弱毒化細菌に対する免疫応答を誘導するようにすることができる。このような弱毒化された細菌ワクチン株は、異種の病原性の細菌、ウイルス、菌類または寄生虫に由来する、プラスミド上の遺伝子または染色体に挿入された遺伝子によりコードされる外来抗原を発現するように遺伝子操作することができる。これらの組換え弱毒化細菌ワクチンは、免疫化された個体の粘膜表面に生ワクチンとして送達することができ、その結果、組換え細菌は、外来抗原を産生させ、かつ組換え弱毒化細菌ワクチンによってその抗原が発現させられる病原体による感染後も免疫化動物宿主の生存を可能にする一次免疫応答および／または保護免疫応答を誘発させる工場として、免疫化された脊椎動物のこれらのリンパ組織内で役立つようになる。
【００５０】
細菌は、ｇａｌＥの変異により影響を受けるような、グラム陰性微生物におけるリポ多糖などの表面分子の合成の環境的調節を可能にする変異を導入することによって弱毒化することができる（米国特許第５，００６，３３５号）。細菌はまた、プリンなどの核酸の構成成分、ジアミノピメリン酸（ＤＡＰ）などの細胞壁の構成成分などの特定の栄養的要求を負わす変異（米国特許第４，８８８，１７０号）、またはａｒｏの変異により引き起こされるなどの、芳香族アミノ酸およびそれに由来するビタミンに対する要求を負わす変異（米国特許第５，６４３，７７１号）を導入することによって弱毒化することができる。弱毒化のさらに別の手段が、他の遺伝子の全体的な調節を変化させる変異剤により達成される。例えば、アデニル酸シクラーゼに対する遺伝子ｃｙａおよびｃＡＭＰ受容体タンパク質に対する遺伝子ｃｒｐにおける変異を有する変異体は弱毒化されており、免疫原性である（米国特許第５，２９４，４４１号、同第５，３８９，３６８号、同第５，４６８，４８５号、同第５，８５５，８７９号および同第５，８５５，８８０号）。同様に、ｐｈｏＰＱの二成分調節システムにおける変異（米国特許第５，４２４，０６５）、ならびにｏｍｐＲ（米国特許第５，５２７，５２９号）、ｈｅｍＡ（Ｂｅｎｊａｍｉｎ他、１９９１、Ｍｉｃｒｏｂ．Ｐａｔｈｏｇ．１１：２８９〜２９５）、およびｈｔｒＡ（米国特許第５，９８０，９０７号）などの変異もまた、細菌を弱毒化し、それでも免疫原性にするために使用されている。弱毒化されている病原性細菌の変異体はすべて、同じ程度の免疫原性を必ずしも有していない。したがって、細菌を弱毒化するが、弱毒化された細菌がリンパ組織にコロニー形成する能力を損なう、したがって細菌の免疫原性を低下させる、ｒｐｏＳなどの変異を導入することが可能である。米国特許第６，０２４，９６１号を参照のこと。したがって、いくつかの弱毒化機構により、ワクチンが過度に弱毒化され、これによって、組換え弱毒化細菌ワクチンによりその抗原が発現させられる野生型病原体に対する保護的な免疫応答の誘導を可能にする十分な程度または継続期間、候補ワクチンがリンパ組織に達すること、または候補ワクチンがリンパ組織内で持続することのどちらも妨げられる。
【００５１】
発現した外来抗原に対して誘導される免疫応答は、組換え弱毒化細菌ワクチンが発現する抗原レベルに比例するので（Ｄｏｇｇｅｔｔ他、１９９３、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６１：１８５９〜１８６６；Ｓｃｈｏｄｅｌ他、１９９４、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６２：１６６９〜１６７６；Ｓｒｉｎｉｖａｓａｎ他、１９９５、Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．５３：４６２〜４７１）、多コピープラスミドベクターに外来抗原の遺伝子を置くことは、弱毒化細菌ワクチンベクターの染色体に外来抗原の遺伝子を挿入することよりもはるかに好ましい。これは、外来抗原の発現レベルが、一般には、弱毒化細菌宿主内で発現する外来抗原の遺伝子のコピー数に比例しているからである。
【００５２】
プラスミド含有組換え弱毒化細菌ワクチンは、ワクチンに対して何ら利点をもたらさない多量の抗原を産生するので、プラスミドベクターは、免疫化後、時間とともに失われることが多い（Ｃｕｒｔｉｓｓ他、１９８８、Ｖａｃｃｉｎｅ、６：１５５〜１６０）。多くの場合、免疫化された脊椎動物から単離された組換え弱毒化細菌ワクチンの１０パーセント以下が３日後〜４日後にプラスミドを保持している。このプラスミド喪失が生じたとき、免疫応答は、発現した外来抗原に対してでなく、弱毒化細菌宿主ワクチンそのものに対して大きくなる。この問題は、米国特許第５，６７２，３４５号および同第５，８４０，４８３号に記載されるような平衡致死宿主ベクター系を確立することによって解決された。そのシステムでは、環境中に多く存在せず、そして動物組織には全く存在していない必須の細胞壁成分であるジアミノピメリン酸またはＤＡＰの合成を妨げるために、変異が弱毒化細菌ワクチンの染色体に導入されている。ＤＡＰの非存在下で、ＤＡＰ要求細菌はＤＡＰ欠乏による死および溶解を受ける。この細菌はまた、染色体における変異を相補する遺伝子を含むプラスミドベクターを含有する。したがって、このようなプラスミド含有菌株は、免疫化された脊椎動物に存在するような外部からのＤＡＰ供給がないもとでＤＡＰを合成して生存することができる。その後、免疫化脊椎動物における内部リンパ器官での定着が生じ得る。１つのそのようなシステムは、β−アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼの遺伝子（ａｓｄ遺伝子）に対する欠失変異と、外来抗原の発現を生じさせるエレメントに加えて野生型のａｓｄ遺伝子を含有するプラスミドベクターとを用いている（Ｎａｋａｙａｍａ他、１９８８、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈ．６：６９３〜６９７；Ｇａｌａｎ他、１９９０、Ｇｅｎｅ、９４：２９〜３５）。外来抗原をコードするＡｓｄ＋プラスミドベクターのほかに、このようなΔａｓｄ細菌株はまた、上記に記載されるような弱毒化変異を含有する。経口投与されたとき、このような調和型致死性宿主−ベクターワクチンは、同じ様式で弱毒化されたが、外来抗原を発現しない細菌と同様に、リンパ組織に効率的に付着し、侵入し、コロニー形成する。このような平衡致死宿主ベクター系の重要なさらなる利点は、抗生物質耐性遺伝子がプラスミドベクター上に存在しないということである。これは、生ワクチンはそのような遺伝子を含有させることができないからである。
【００５３】
上記に言及されているように、外来抗原に対する免疫応答のレベルは、一般には、組換え弱毒化細菌ワクチンによるその発現レベルに比例する。残念ながら、外来抗原の過剰発現は、増殖速度を低下させ、したがって、弱毒化細菌ワクチンがリンパ組織にコロニー形成する能力を低下させるように毒性であることが多い。その結果、免疫原性が大きく損なわれる。したがって、この理由から、ワクチンがリンパ組織にコロニー形成する能力およびリンパ組織で増殖する能力を、外来抗原を産生するその能力とともにバランスさせることが必要である。
【００５４】
組換え弱毒化細菌ワクチンの使用における重要な別の問題は、動物またはヒトに投与した後、便に流れ、そして環境において生存し、その結果、免疫化が所望されない個体の免疫化を潜在的に生じさせるようになるその潜在的能力である。この問題は、ワクチンが環境中に持続し得るように飼料中および／または飲料水中で投与され得るか、またはスプレーによって投与され、そして免疫化されることが所望される動物種以外の動物をそのようなワクチンにさらし得る農業用ワクチンについては特に重要である。したがって、本発明者らは、国際特許出願公開ＷＯ９６／４０９４７（これは参考として本明細書中に組み込まれる）に記載されるような、組換え弱毒化細菌ワクチン構築物に対する環境限定生存システム（ＥＬＶＳ）を設計した。その発明のいくつかの実施形態では、許容される環境において必須遺伝子を発現し、かつ致死性遺伝子を発現しないが、便に流れた後の周囲温度などの許容されない環境に入ったときには必須遺伝子の発現を停止させ、かつ致死性遺伝子の発現を開始させて、ワクチン構築物の死を生じさせるワクチン株が構築された。他の実施形態では、発酵装置におけるワクチン株の増殖時などの許容される環境における必須遺伝子の発現および致死性遺伝子の非発現に関連するワクチンの封じ込め特徴が、免疫化された動物宿主などの許容されない環境にワクチン株が進入した後も長期間にわたって延ばされた。そのような遅発型の環境限定生存システムは、必須遺伝子の非発現および致死性遺伝子の発現によってもたらされる死が開始される前に、ワクチンがリンパ組織に付着し、侵入し、コロニー形成することを可能にする。必須遺伝子および致死遺伝子の多くの例が国際特許公開ＷＯ９６／４０９４７に記載されているが、その中の好ましい調節型必須遺伝子は、細菌細胞壁の堅い層の必須構成成分であり、環境において、特に動物宿主において入手できないＤＡＰの生合成に必要な酵素であるβ−アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードするａｓｄ遺伝子である。それにおける好ましい致死性遺伝子は、微生物の細胞質内から発現したときに細菌の溶解を生じさせる細菌ウイルス由来の致死性遺伝子である。生物学的封じ込めがそのような発明において達成される１つの方法は、（プラスミドを維持するための）平衡致死宿主ベクター系として、そして生物学的封じ込めをもたらすＥＬＶＳとして、その両方で役立つラナウェイプラスミドベクターを用いることによる。それに開示されているように、許容される環境（例えば、発酵装置）において、細菌は非常に低いプラスミドコピー数を維持し、そしてプラスミドによりコードされる外来抗原の発現さえも停止させる。しかし、許容されない環境（例えば、免疫化された動物宿主）に進入した後しばらくして、このシステムは、プラスミドコピー数を非常に著しく増大させ、ファージにより誘導される溶解のための致死性遺伝子のコピー数を増大させる。外来抗原を規定する遺伝子のコピー数が増大するので、外来抗原の過剰発現が、細菌の死が溶解によってもたらされ得るのとほぼ同時に生じて、外来抗原を遊離させ、したがって免疫応答の誘導を増強させる。
【００５５】
上記の議論に基づいて、疾患を生じさせることなく、接種された動物に効果的に定着し、かつリンパ組織で増殖することができ、それでもなお依然として、効果的な免疫応答を誘導するために多量の外来抗原を産生する能力を有する生ワクチンが求められている。本発明は、ラナウェイベクター（ＲＡＶ）の使用および機能に基づく調節された抗原送達システム（ＲＡＤＡ）を利用することによってそのような要求を解決する。
【００５６】
発明の概要
したがって、簡単に記載すると、本発明者らは、新規なラナウェイベクター（ＲＡＶ）と、少なくとも１つの活性化可能な染色体由来のリプレッサーとを含む新規な調節された抗原送達システム（ＲＡＤＳ）であって、染色体外ベクターのコピー数が活性化刺激の除去によって引き起こされるベクターの抑制解除に応答して大きく増大するＲＡＤＳが、細菌発現システムにおいて、好ましくは、病原性微生物の弱毒化された誘導体である生細菌ワクチンにおいて都合よく利用できることを発見することに成功した。ＲＡＤＳの抑制解除可能なラナウェイ特性は、ＲＡＶのエレメントと一緒になった、染色体の活性化可能なリプレッサーに由来する。ＲＡＶの必須エレメントは、（ａ）低コピー数をもたらす第１の複製起点（ｏｒｉ）であって、好ましくはＤＮＡポリメラーゼＩＩＩを使用するベクター複製をもたらす第１のｏｒｉ；（ｂ）染色体によりコードされるリプレッサーによって抑制される第１のプロモーターに作動性に連結された第２のｏｒｉであって、好ましくはＤＮＡポリメラーゼＩを使用するベクター複製をもたらす第２のｏｒｉ；および（ｃ）染色体によりコードされるリプレッサーによってもまた抑制されることが好ましい第２のプロモーターに作動性に連結された外来遺伝子である。ワクチンとして、ＲＡＤＳは、免疫化された脊椎動物のリンパ組織を、刺激の除去に応答して、ベクターによりコードされる外来遺伝子の多量の生成物産生に対して効果的に暴露させることができる。ワクチンとしてもたらされる別の利点は、ＲＡＤＳ微生物が、低コピー数の制御のもとでインビトロで増殖し、その後、インビボでの抗原産生の増大を生じさせるために、脊椎動物に接種された後のラナウェイ条件に切り替えることができるということである。抑制解除されたラナウェイ条件のもとでは、ＲＡＤＳ微生物は、外来遺伝子産物の極めて大きい産生と共役した極めて大きいプラスミド複製活性のために機能が大きく損なわれている。その損なわれた状態のために、抑制解除されたＲＡＤＳ微生物は、一般には長期間にわたって生存することができない。したがって、ＲＡＤＳは、国際特許出願公開ＷＯ９６／４０９１７に開示されるような環境限定生存システム（ＥＬＶＳ）における抑制解除可能なプラスミド由来のファージの溶解遺伝子の非存在下でさえ、リプレッサー遺伝子を活性化する刺激にさらされないときにはＲＡＤＳ微生物が生存できない固有的な封じ込めシステムを特徴とする。
【００５７】
抑制解除されたラナウェイ状態への切り替えは、抑制解除する環境的刺激に微生物にさらした後に遅らせることができる。この「遅延型ＲＡＤＳ」において、ＲＡＶにおける抑制可能なプロモーターは、抑制する刺激が中断されたときでさえしばらくの間、ラナウェイ状態および抗原産生のその抑制を続ける。ＲＡＤＳ染色体においてリプレッサーに作動性に連結することができ、そして遅延型ＲＡＤＳにおいて有用である活性化可能なプロモーターの一例が、アラビノースに応答するａｒａＣ−ＰＢＡＤプロモーターである。アラビノースの存在がラナウェイ状態を抑制するように、ＲＡＤＳにおいてリプレッサーに連結されている場合、（脊椎動物に接種したときなどの）アラビノース非存在環境へのＲＡＤＳ細菌の移動は、細菌内部に依然として存在するアラビノースが拡散してなくなるか、または微生物によって代謝されるまで、高コピー数のｏｒｉを抑制解除しない。その遅延は、活性化刺激を代謝するその能力を除く変異を微生物においてもたらすことによって都合よく増大させることができる。これは、例示された場合では、微生物のアラビノース代謝能力を除くためのａｒａＣＢＡＤオペロンにおける変異を用いて達成することができる。この強化された遅延システムにおける増大した遅延は、アクチベーターの代謝能力が除かれているので、ラナウェイ状態への抑制解除がアクチベーターの代謝による影響をもはや受けないからである。したがって、抑制解除は微生物からのアクチベーター（アラビノース）の拡散にだけ依存する。ラナウェイ複製および／または外来遺伝子発現を変化させ、かつ／または遅らせる他の手段もまた開示される。
【００５８】
遅延ＲＡＤＳは、高コピー数に切り替わり、高レベルの抗原を産生させる前に細菌が脊椎動物のリンパ組織にコロニー形成するための時間を可能にするので、生細菌ワクチンには特に有用である。そのため、遅延型ＲＡＤＳは、鼻孔内投与されるワクチンにおいて非常に効果的である。遅延が、上記に記載されるように、リプレッサーの代謝を妨げる変異によって強化されている場合には、その遅延は、経口ワクチンが摂取され、腸管関連リンパ組織（ＧＡＬＴ）に定着し、その後、抑制解除されたラナウェイ状態が多量の抗原の産生を可能にするためには十分である。したがって、高い抗原レベルがＧＡＬＴに直接もたらされ、これにより非常に効果的な免疫応答が生じる。
【００５９】
本発明のＲＡＤＳは、好ましい病原性生ワクチンの毒性を弱めるために使用されている知られている様々な変異と組み合わせて利用することができる。ＲＡＤＳはまた、米国特許第５，６７２，３４５号に開示されるような調和型致死性システムなどのプラスミド維持システムとの完全な適合性を有する。
【００６０】
したがって、１つの実施形態において、本発明は、調節された抗原送達系（ＲＡＤＳ）を含む微生物に関する。ＲＡＤＳは、（ａ）（１）所望する遺伝子産物をコードする遺伝子を挿入するための部位；（２）ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩを使用するベクター複製をもたらす第１の複製起点（ｏｒｉ）；および（３）ＤＮＡポリメラーゼＩを使用するベクター複製をもたらす第２のｏｒｉを含む。さらに、第２のｏｒｉは、第１のリプレッサーにより抑制され得る第１の制御配列に作動性に連結されており、そしてラナウェイベクターはファージの溶解遺伝子を含まない。ＲＡＤＳはまた、第１の活性化可能な制御配列に作動性に連結された、第１のリプレッサーをコードする遺伝子を含む。好ましくは、ベクターはまた、ステップ（ａ）の部位に挿入された、所望する遺伝子産物をコードする遺伝子を含む。この場合、所望する遺伝子産物をコードする遺伝子は第２の制御配列に作動性に連結されている。第１の制御配列および第２の制御配列は同じ配列にすることができ、または異なる配列にすることができる。好ましいリプレッサーはＬａｃＩリプレッサーおよびＣ２リプレッサーであり、第２の制御配列は第２のリプレッサーによって抑制可能にすることができる。
【００６１】
好ましくは、上記に記載される微生物は、病原性細菌の弱毒化された誘導体である。また、ベクターは、好ましくはプラスミドであり、所望する遺伝子産物は抗原である。最も好ましくは、微生物はサルモネラ菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｓｐ．）である。好ましい活性化可能な制御配列はａｒａＣＰＢＡＤである。
【００６２】
上記に記載される微生物は、機能性の必須遺伝子を染色体に有しないこと、およびベクター上の必須遺伝子の組換え機能性コピーからなる平衡致死宿主ベクター系を含むことができる。必須遺伝子は、好ましくはａｓｄ遺伝子である。１つの実施形態において、ａｓｄ遺伝子は、ａｒａＣＰＢＡＤに作動性に連結されたリプレッサー遺伝子を挿入することによって不活性化される。微生物はまた、ｃｙａ、ｃｒｐ、ｐｈｏＰＱ、ｏｍｐＲ、ｇａｌＥ、ｃｄｔ、ｈｅｍＡ、ａｒｏＡ、ａｒｏＣ、ａｒｏＤおよびｈｔｒＡからなる群から選択される天然遺伝子における不活性化変異を含むことができる。
【００６３】
上記に記載される微生物において、第１のｏｒｉは、好ましくはｐＳＣのｏｒｉであり、第２のｏｒｉは、好ましくはｐＵＣのｏｒｉである。この場合、第１の制御配列は、好ましくはＰ２２ＰＲであり、第１のリプレッサーは、好ましくはＣ２リプレッサーである。さらに、第２の制御配列は、好ましくはＰｔｒｃであり、第２の制御配列は、好ましくは、ＬａｃＩリプレッサーであることが好ましい第２のリプレッサーによって抑制可能である。本発明の好ましいラナウェイベクターの一例が、抗原をコードする遺伝子を有するｐＭＥＧ−７７１である。そのようなラナウェイベクターおよび他の例示されたベクターの改変体もまた本発明の範囲に含まれる。本発明において使用される抗原の例には、Ｅｒｙ６５およびＳｅＭが挙げられる。
【００６４】
さらなる実施形態において、微生物における所望する遺伝子は、真核生物の制御配列に作動性に連結されている。このような実施形態において、微生物はまた、好ましくはΔｅｎｄＡ変異を含む。
【００６５】
本発明の微生物はまた、遅延型ＲＡＤＳの特性を示すことができる。遅延型ＲＡＤＳの特性は、好ましくは、（ａ）代謝または漏出によりアクチベーター分子の喪失を遅らせる変異と、（ｂ）リプレッサー濃度を増大させる変異または挿入と、（ｃ）２つ以上のリプレッサーに対する結合部位および／またはベクター制御配列に作用するリプレッサー分子をコードするベクター配列に対する結合部位を有するベクター制御配列の含有とからなる群から選択される変化によってもたらされる。
【００６６】
本発明はまた、所望する遺伝子産物を産生させる方法に関する。この方法は、（ａ）所望する遺伝子産物をコードする遺伝子を操作して、上記に記載される微生物のいずれかのベクターに入れること、この場合、微生物は、第１の環境条件のもとでの第２のｏｒｉの発現を抑制する制御配列を含むが、第２のｏｒｉの発現が第２の環境条件のもとでは抑制解除される；（ｂ）上記に記載される微生物を第１の環境条件のもとで培養すること；および（ｃ）微生物を、所望する遺伝子産物を産生させるために十分な時間にわたって第２の環境条件のもとで培養すること、をこの順序で含む。好ましい第１の環境条件はアラビノースの存在を含み、好ましい第２の環境条件はアラビノースの非存在を含む。第１の環境条件はインビトロ培養条件によって達成することができ、第２の環境条件は脊椎動物において達成することができる。この方法において使用される微生物はまた、ａｒａＣＢＡＤオペロンおよび／またはａｒａＥ遺伝子における不活性化欠失を含むことができる。
【００６７】
本発明はまた、脊椎動物を免疫化するためのワクチンに関する。この場合、ワクチンは、上記に記載される微生物のいずれかを薬学的に受容可能なキャリアに含む。
【００６８】
さらなる実施形態において、本発明はまた、脊椎動物における免疫保護を誘導する方法に関する。この方法は、上記のワクチンを脊椎動物に投与することを含む。
【００６９】
本発明はまた、所望する遺伝子産物を脊椎動物に送達する方法に関する。この方法は、上記の微生物のいずれかを脊椎動物に投与することを含む。
【００７０】
したがって、本発明によって達成されるいくつかの利点の中で、構成的なベクター複製および遺伝子産物の産生を抑制解除する環境条件によってラナウェイ条件が達成されるベクターおよび微生物を、生細菌ワクチンにおけるように、所望する遺伝子産物を産生させるために提供すること；抗原遺伝子産物に対する免疫保護の優れた刺激をもたらすために上記の微生物を含むワクチンを提供すること；上記のワクチンを使用することによる抗原遺伝子産物に対する免疫保護を誘導させる方法を提供すること；および所望する遺伝子産物を脊椎動物に送達する方法を提供することは、特筆され得る。
【００７１】
図面の簡単な説明
図１はＲＡＶのｐＭＥＧ−５４６およびｐＭＥＧ−７７１ならびにそれらの維持に必要な必須の染色体欠失／挿入変異を示す図である。
【００７２】
図２は調節された抗原送達システム（ＲＡＤＳ）の構成成分としてＲＡＶの維持に必要な様々な欠失変異および欠失／挿入変異、ならびに免疫原性を維持しながらそれらを無毒性にするワクチン株の弱毒化に好適な欠失変異を示す図である。
【００７３】
図３は可動性自殺ベクターｐＭＥＧ−３７５を示す図である。
【００７４】
図４はΔａｓｄＡ１９：：ＴＴａｒａＣＰＢＡＤｃ２ＴＴを送達するための自殺ベクターｐＧＥＭ−６１１を示す図である。
【００７５】
図５はΔｉｌｖＧ３：：ＴＴａｒａＣＰＢＡＤｌａｃＩＴＴを送達するための自殺ベクターｐＭＥＧ−２４９を示す図である。
【００７６】
図６はΔａｒａＢＡＤ１９２３を送達するための自殺ベクターｐＹＡ３４８４を示す図である。
【００７７】
図７はΔａｒａＥ２５を送達するための自殺ベクターｐＹＡ３４８５を示す図である。
【００７８】
図８はΔｐｈｏＰ１９１８を送達するための自殺ベクターｐＭＥＧ−５５０を示す図である。
【００７９】
図９はΔｐｈｏＰ２４を送達するための自殺ベクターｐＭＥＧ−３６８を示す図である。
【００８０】
図１０はｐＭＥＧ−２８３からのＲＡＶのｐＭＥＧ−５４６作製ならびにｐＭＥＧ−５４６およびｐＭＥＧ−１０４からのＲＡＶのｐＭＥＧ−７７１作製を示す図である。
【００８１】
図１１はｐＹＡ３５３５を得るために、ｌａｃＲＢ（ＬａｃＩリプレッサー結合）部位を、Ｐ２２ＰＲの後、ｐＵＣのＲＮＡＩＩの前に含むようにするｐＭＥＧ−７７１の改変を示す図である。
【００８２】
図１２はａｓｄの代わりにＴＴａｒａＣＰＢＡＤｃ２ＧＴＧａｓｄを有するＲＡＶのｐＭＥＧ−７７１誘導体を示す図である。
【００８３】
図１３はＥｒｙ６５抗原を規定するＲＡＶのｐＭＥＧ−５２５を示す図である。
【００８４】
図１４はＥｒｙ６５をコードするＲＡＶに対するコピー数の増大を明らかにする実験結果を示す図である。プラスミドＤＮＡは、１対１，０００希釈後のアラビノース存在またはアラビノース非存在のＬｕｒｉａ培養液で増殖させたＳ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍのＭＧＮ−９６６（ｐＭＥＧ−２８３）ベクターおよびＭＧＮ−９６６（ｐＭＥＧ−５２５）＋Ｅｒｙ６５またはＳ．ｃｈｏｌｅｒａｅｓｕｉｓのＭＧＮ−２２６７（ｐＭＥＧ−５４６）ベクターおよびＭＧＮ−２２６７（ｐＭＥＧ−５２５）＋Ｅｒｙ６５について示されている。
【００８５】
図１５は図１４に示される同じ実験の結果ではあるが、１対１，０００希釈後のアラビノース存在またはアラビノース非存在のＬｕｒｉａ培養液で増殖させたＳ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍのＭＧＮ−９６６（ｐＭＥＧ−５２５）およびＳ．ｃｈｏｌｅｒａｅｓｕｉｓのＭＧＮ−２２６７（ｐＭＥＧ−５２５）の増殖に依存したＥｒｙ６５タンパク質の増大を明らかにする結果を示す図である。
【００８６】
図１６は１対１，０００希釈後のアラビノース存在またはアラビノース非存在のＬｕｒｉａ培養液で増殖させたＳ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ株のＥｒｙ６５発現ＭＧＮ−９６６（ｐＭＥＧ−５２５）およびＭＧＮ−９６６（ｐＭＥＧ−２８３）ベクターコントロールの増殖を示すグラフである。
【００８７】
図１７はベクターコントロールＭＧＮ−９６６（ｐＭＥＧ−２８３）およびＥｒｙ６５抗原発現ＭＧＮ−９６６（ｐＭＥＧ−５２５）で免疫化されたマウスから得られた血清のウエスタンブロット分析を示す図である。
【００８８】
図１８はＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｑｕｉのＭタンパク質（ＳｅＭ）を規定するＲＡＶのｐＭＥＧ−５７３を示す図である。
【００８９】
図１９は抗原の発現が様々なプロモーターの制御下にある異なるＡｓｄ＋ベクターを含有するＳ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ株のＭＧＮ−４５９８（ｐＭＥＧ−８２５）Ｐ２２ＰＲＳｅＭ、ＭＧＮ−４５９８（ｐＭＥＧ−８２６）Ｐ２２ＰｔｒｃＳｅＭ、ＭＧＮ−２２３８（ｐＭＥＧ−５７５）λＰＬＳｅＭによるＳｅＭ発現の比較を、ＲＡＤＳのＭＧＮ−４５９８（ｐＭＥＧ−５７３）＋ＳｅＭによる発現と比較して示す図である。これは、１対１，０００希釈後のアラビノース存在またはアラビノース非存在のＬｅｎｎｏｘ培養液で６時間増殖させた菌株の総タンパク質のＰＡＧＥのクーマシー染色またはウエスタンブロットによって明らかにされる。
【００９０】
図２０はａｒａＣＰＢＡＤＧＴＧａｓｄを有するＡｓｄ＋ベクターのｐＹＡ３５３０を示す図である。
【００９１】
図２１はａｒａＣＰＢＡＤｃ２ＧＴＧａｓｄを有するＡｓｄ＋ベクターのｐＹＡ３５３１を示す図である。
【００９２】
図２２はＲＡＶに基づくＤＮＡ移入ネクターを示す図である。
【００９３】
図２３はΔｅｎｄＡ３を送達するための自殺ベクターｐＭＥＧ−７７６を示す図である。
【００９４】
発明の詳細な説明
Ａ．定義
微生物を意味する「組換え宿主細胞」、「宿主細胞」、「細胞」および他のそのような用語は交換可能に使用され、そして組換えベクターまたは他の移されたＤＮＡに対する受容体として使用され得るか、または使用されているか、または使用された細胞を示し、そしてトランスフェクションされた最初の細胞の子孫を含む。１つの親細胞の子孫は、偶発的または意図的な変異のために、ゲノムＤＮＡまたは全ＤＮＡの一方の鎖が必ずしも最初の親と完全に同一でなくてもよいことが理解される。
【００９５】
「子孫集団」は、１つの組換え細菌細胞から増殖した培養物における生きている細菌細胞の集団を意味する。別途定義されない限り、染色体外ベクター上の組換え遺伝子は、組換え遺伝子により相補される天然の必須遺伝子を有しない集団内の細胞の大部分が特定の環境（例えば、ジアミノピメリン酸（ＤＡＰ）を含まない環境）で生存することができ、かつ染色体外ベクター上の所望する遺伝子を維持および／または発現し続けることができるとき、子孫集団において「安定に維持される」。好ましくは、集団内の少なくとも９０％の細胞が、安定に維持された環境で生存する。より好ましくは少なくとも９９％の細胞が生存する。
【００９６】
「制御配列」は、制御配列が作動性に連結されているコード配列の発現を行わせるために必要なＤＮＡ配列をいう。そのため、制御配列は、リプレッサー、アクチベーター、エンハンサー、ＲＮＡポリメラーゼおよび他の転写因子の作用部位を備える。そのような制御配列の非限定的な例として、プロモーターおよびリボソーム結合部位が挙げられる。
【００９７】
細菌における遺伝子産物の発現を可能にする制御配列は、原核生物の制御配列が真核生物細胞では一般に機能しないように、そしてその逆も機能しないように、真核生物における遺伝子発現に必要な制御配列とは明らかに異なる。用語「制御配列」は、真核生物または原核生物に由来するそのような配列を包含し得る。
【００９８】
「調節因子遺伝子」は、別の遺伝子の合成速度を制御するタンパク質をコードする遺伝子である。調節因子遺伝子の一例として、リプレッサーをコードする遺伝子が挙げられる。
【００９９】
本明細書中で使用される「リプレッサー」は、調節因子遺伝子によって合成されるタンパク質であり、オペレーター座に結合して、そのオペロンの転写を阻止する。
【０１００】
本明細書中で使用される「誘導因子」は、活性化可能な制御配列を活性にさせる小さい有機分子である。
【０１０１】
「作動性に連結されている（された）」は、そのように記載された成分が、その意図された様式でそれらが機能することができる関係にある並置状態をいう。コード配列に「作動性に連結されている（された）」制御配列は、コード配列の発現が制御配列の存在によって影響され得るような方法で細胞内に存在する。
【０１０２】
「グラム陰性細菌」には、球菌、非腸内桿菌、腸内桿菌およびスピリルムが含まれる。グラム陰性細菌の属の非限定的な例として、ナイセリアリ属、スピリルム属、パスツレラ属、ブルセラ属、エルシニア属、フランシセラ属、エンテロバクター属、ヘモフィルス属、ボルデテラ属、大腸菌属、サルモネラ属、赤痢菌属、クレブシエラ属、プロテウス属、ビブリオ属、シュードモナス属、キサントモナス属、エルウィニア属、バクテロイデス属、アセトバクター属、アエロバクター属、アグロバクテリウム属、アゾトバクター属、スピリラ属、セラチア属、ビブリオ属、ミキソコッカス属、リゾビウム属、クラミジア属、リケッチア属、フソバクテリウム属、ボレリア属およびトレパネマ属が挙げられる。
【０１０３】
「グラム陽性細菌」には、球菌、非胞子形成桿菌および胞子形成桿菌が含まれる。グラム陰性細菌の属の非限定的な例として、アクチノミセス属、バチルス属、クロストリジウム属、コリネバクテリウム属、エリシペロトリクス属、ラクトバチルス属、リステリア属、ミコバクテリウム属、ノカルジア属、スタフィロコッカス属、ストレプコッカス属およびストレプトミセス属が挙げられる。
【０１０４】
「ミコバクテリア」は、その特有の染色性（すなわち、ミコバクテリアは酸性化有機溶剤による脱色に対して抵抗性である）および長鎖（約６０個の炭素）のミコール酸の存在に基づいて定義される。
【０１０５】
「変異」は、１つまたは複数のヌクレオチド塩基の変化、または１つまたは複数のヌクレオチドの配列内への挿入、または１つまたは複数のヌクレオチドの配列からの欠失、またはこれらの組合せのいずれをも特徴とするポリヌクレオチド配列の変化である。
【０１０６】
「遺伝子」は遺伝の生物学的単位である。一般に、遺伝子は、ＲＮＡ分子もしくはポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列または前記ポリヌクレオチド配列の変異体である。遺伝子は、活性なポリペプチドまたは不活性なポリペプチドに発現し得る天然に存在する配列であり得る。遺伝子はまた、遺伝子が発現され得ないように、または遺伝子が変化または短縮したポリペプチド分子またはＲＮＡ分子を発現するように、変異、例えば、点変異、挿入または欠失を含むことができる。遺伝子は様々な組換えＤＮＡ方法論により作製することができる。あるいは、遺伝子は、十分に知られている様々な合成方法によって合成することができる。
【０１０７】
ほとんど（９１％）の構造遺伝子は、メチオニンに対するＡＴＧコドンを最初のコドンとして使用する。しかし、よりまれ（８％）にはＧＴＧが開始コドンとして用いられ、さらによりまれ（１％）にはＴＴＧの開始コドンが使用されているが、ＣＴＧは決して使用されない。メッセンジャーＲＮＡを転写するとき、転写は＋１ヌクレオチド部位から始まり、転写ターミネーターの後で終了する。
【０１０８】
「天然遺伝子」は、野生型生物の染色体が存在するような遺伝子であり、例えば、野生型大腸菌またはサルモネラにおけるβ−アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ（Ａｓｄ）をコードする遺伝子である。
【０１０９】
本明細書中で使用される「組換え遺伝子」は、より大きい配列におけるその形態および位置が自然界では見出されない、より大きいポリヌクレオチド配列内の同定可能なポリヌクレオチド配列として定義される。組換え遺伝子として、例えば、染色体において非天然の位置に挿入されている野生型遺伝子、または天然位置における野生型遺伝子の変異体形態、またはその天然位置に他の非天然配列とともに挿入されている野生型遺伝子を挙げることができ、これらは、プラスミドと染色体との間での相同組換えで低い頻度で生じ得る。組換え遺伝子には、コード領域と、コード領域が天然には一緒に存在しない制御配列との組合せもまた含まれ得る。本明細書中で使用されるように、組換え遺伝子は、特定の遺伝子工学操作の生成物である。
【０１１０】
本明細書中で用いられている、変異型菌株に対する遺伝子記号は、Ｂｅｒｌｙｎ（第１０９章；Ｎｅｉｄｈａｒｄｔ他、１９９６）およびＳａｎｄｅｒｓｏｎ（第１１０章；Ｎｅｉｄｈａｒｄｔ他、１９９６）によって記載される記号である。トランスポゾン（特に、Ｔｎ１０）に対して使用されている記号は、Ａｌｔｍａｎ他（第１４１章；Ｎｅｉｄｈａｒｄｔ他、１９９６）において使用されている従来法に従う。
【０１１１】
「レプリコン」は、自律的に複製するＤＮＡである。自律的複製の特性は複製起点によってもたらされる。例には、プラスミドベクターおよび細菌染色体が挙げられる。
【０１１２】
「ラナウェイベクター」（「ＲＡＶ」）は、２つの複製起点を含むプラスミドなどの染色体外の複製性核酸である。一方の複製起点は低コピー数をもたらし、好ましくは、ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩを使用するベクター複製をもたらす。第２の複製起点は、好ましくは、ＤＮＡポリメラーゼＩを使用するベクター複製をもたらす。ラナウェイベクターは、コピー数を制御する制御配列の状態に依存して低コピー数または高コピー数のいずれかで微生物内で複製することができる。
【０１１３】
本発明のワクチンで処置される「個体」は、すべての脊椎動物を含むとして本明細書中では定義され、例えば、家畜動物およびヒトを含む哺乳動物、ならびに飼育されている鳥類を含む様々な種の鳥類、特に農業的に重要な鳥類である。さらに、軟体動物およびある種の非脊椎動物は原始的な免疫系を有するので、「個体」として包含される。
【０１１４】
本明細書中で使用される「形質転換」または「トランスフェクション」は、挿入のために使用される方法、例えば、直接的な取り込み（天然またはエレクトロポレーシンによる）、形質導入または接合に関わらず、外因性ポリヌクレオチドを宿主細胞に挿入することをいう。外因性ポリヌクレオチドはプラスミドとして維持され得るか、あるいは宿主ゲノム内に組み込まれ得る。
【０１１５】
「ワクチン」により、将来の危害に対する保護がもたらされるように、生きた生物の免疫系を刺激するために設計された薬剤が意味される。特定のワクチンは任意の特定の動物において効果を有してもよく、または有しなくてもよい。免疫化は、疾患に対する生物の免疫をもたらすプロセスをいう。
【０１１６】
本明細書中で使用される「免疫系」は、多細胞生物が抗原に対して反応する解剖学的な特徴および機構をいう。十分に知られているように、脊椎動物の液性免疫系は、抗原に対して特異的に結合する抗体の誘発を生じさせる。そのようにして産生される抗体は、免疫グロブリンＡ、Ｄ、Ｅ、ＧまたはＭなどの免疫学的クラスのいずれかに属し得る。特に注目されるのは、免疫グロブリンＡ（ＩｇＡ）の産生を刺激するワクチンである。これは、ＩｇＡが温血動物の分泌系によって産生される主要な免疫グロブリンであるからである。しかし、本発明のワクチンは、ＩｇＡの産生を刺激するワクチンに限定されない。例えば、下記に記載される性質のワクチンは、ＩｇＡの形成に加えて様々な他の免疫応答、例えば、細胞免疫性をもたらすことができる。抗原に対する免疫応答はよく研究され、広範囲に報告されている。免疫学の概説が、Ｒｏｉｔｔ、ＢｒｏｓｔｏｆｆおよびＭａｌｅ、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（第４版）、Ｃ．Ｖ．Ｍｏｓｂｙ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌｔｄ．、Ｌｏｎｄｏｎ（１９９８）に示される。別途示されない限り、ワクチンは、免疫応答が所望される抗原または抗原をコードする遺伝物質を発現または送達する生細菌である。
【０１１７】
本明細書中で使用される「免疫原性（の）」は、免疫応答を誘発することができることを意味する。
【０１１８】
脊椎動物は、セグメント化された骨状または軟骨状の脊椎をそのすべてが特徴とする、魚類、両生類、は虫類、鳥類、および哺乳動物を含む脊索動物門の主要な部門である脊椎動物亜門の任意のメンバーである。すべての脊椎動物種は機能的な免疫系を有しており、細胞性および／または液性の免疫応答によって抗原に対して応答する。したがって、すべての脊椎動物はワクチンに応答し得る。ワクチンは最も一般的にはヒトまたはイヌ（狂犬病ワクチン）などの哺乳動物に対して投与されるが、魚類および鳥類などの他の種類の商業的に飼育されている脊椎動物に対するワクチンも本発明の範囲内であると考えられる。
【０１１９】
本明細書中で使用される「病原体」は、疾患を生じさせ得るか、もしく正常な生理学的機能を損ない得る微生物、または疾患を生じさせる微生物の弱毒化された誘導体である。
【０１２０】
「弱毒化（された）」は、個体において疾患症状または疾患を誘発させる病原体の能力が低下している変異を有するが、個体内の適切なリンパ組織に付着し、侵入し、持続する弱毒化細菌の能力を失っていない病原体をいう。弱毒化された微生物は、例えば、長期間にわたって抗原または治療タンパク質などの特定の遺伝子産物に生物をさらすために有用である。「弱毒化（された）」は、そのような属または種の微生物が病原体としての機能を全く有し得ないことを意味するのではなく、使用されている特定の微生物が、試験されている特定の動物に関して弱毒化されていることを意味する。本発明の弱毒化された宿主細胞は、通常の場合には病原性である属または種に属し得る。弱毒化された菌株は、その病原性対応体に通常付随する疾患のすべての症状群を誘導することができない。「無毒性」が、弱毒化に対する代わりの用語として使用されることがある。
【０１２１】
本発明における目的とするリンパ組織には、腸管関連リンパ組織（ＧＡＬＴ）、気管関連リンパ組織（ＢＡＬＴ）、基底関連リンパ組織（ＮＡＬＴ）、粘膜関連リンパ組織（ＭＡＬＴ）、および結合関連リンパ組織が含まれる。
【０１２２】
本明細書中で使用される「微生物（ｍｉｃｒｏｂｅ）」または「微生物（ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ）」には、細菌、ウイルス、原生動物、および単細胞菌類が含まれる。
【０１２３】
本明細書中で使用される「ＤＮＡワクチンベクター」は、細菌細胞において増殖するプラスミドＤＮＡ分子であって、ワクチン接種（免疫化）によってＤＮＡワクチンベクターを真核生物細胞の内部に導入した後にだけ所望する遺伝子産物が発現するように、真核生物の制御配列に作動性に連結されている、所望する遺伝子産物をコードする遺伝子配列を有するプラスミドＤＮＡ分子をいう。ＤＮＡワクチンベクターは、免疫化される個体に、注射もしくはエアーガンによって投与することができ、または好ましくは、免疫化された個体の宿主細胞に進入したときにＤＮＡワクチンベクターを放出する弱毒化された細菌の使用によって投与することができる。例えば、Ｈｅｒｒｍａｎｎ他、１９９９、「粘膜免疫性に対するＤＮＡワクチン」、８０９頁〜８１６頁、ＭＵＣＯＳＡＬ  ＩＭＭＵＮＩＴＹ（第２版、Ｏｇｒａ、Ｍｅｓｔｅｃｋｙ、Ｌａｍｍ、Ｓｔｒｏｂｅｒ、ＢｉｅｎｅｎｓｔｏｃｋおよびＭｃＧｈｅｅ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、１６２８頁）；Ｕｌｍｅｒ他（１９９６）を参照のこと。
【０１２４】
Ｂ．一般的記載
別途示されない限り、本発明の実施では、この分野の技術に含まれる従来技術の細胞培養、分子生物学、微生物学、組換えＤＮＡ操作、免疫学および動物科学が用いられる。そのような技術は文献に詳しく説明されている。例えば、ＤＮＡ  ＣＬＯＮＩＮＧ、第Ｉ巻および第ＩＩ巻（Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ編、１９８５）；ＯＬＩＧＯＮＵＣＬＥＯＴＩＤＥ  ＳＹＮＴＨＥＳＩＳ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ編、１９８４）；ＮＵＣＬＥＩＣ  ＡＣＩＤ  ＨＹＢＲＩＤＩＺＡＴＩＯＮ（Ｂ．Ｄ．ＨａｍｅｓおよびＳ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編、１９８４）；Ｂ．Ｐｅｒｂａｌ、Ａ  ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ  ＧＵＩＤＥ  ＴＯ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ（１９８４）；シリーズ、ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）；ＶＥＣＴＯＲＳ：Ａ  ＳＵＲＶＥＹ  ＯＦ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ  ＶＥＣＴＯＲＳ  ＡＮＤ  ＴＨＥＩＲ  ＵＳＥＳ（Ｒ．Ｌ．ＲｏｄｒｉｇｕｅｚおよびＤ．Ｔ．Ｄｅｎｈａｒｄｔ編、１９８７、Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈｓ）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ他（１９８９）、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ，Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ；Ｓａｍｂｒｏｏｋ他（１９８９）、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ，Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ；Ａｕｓｕｂｅｌ他（１９９５）、ＳＨＯＲＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓを参照のこと。
【０１２５】
本発明は、ベクターにより運ばれる組換えの所望する遺伝子産物の微生物における産生が、ベクターのコピー数を増大させるために誘導され得るベクター制御配列を利用することによって都合よく増大させることができるという発見に基づいている。
【０１２６】
本発明は、ラナウェイベクター（ＲＡＶ）と呼ばれる染色体外ベクター、ならびに活性化可能な制御配列の制御下で合成が行われる少なくとも１つのリプレッサーをコードする遺伝子を含む微生物を利用する、調節された抗原送達システム（ＲＡＤＳ）に関する。ＲＡＶの必須エレメントは、（ａ）制御配列に作動性に連結された、所望する遺伝子産物をコードする遺伝子、（ｂ）ＤＮＡポリメラーゼＩを使用するベクター複製をもたらす第１の複製起点（「ｏｒｉ」）、（ｃ）ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩを使用するベクター複製をもたらす第２のｏｒｉである。第２のｏｒｉは、リプレッサーによって抑制され得る第１の制御配列に作動性に連結されている。
【０１２７】
ＲＡＤＳにおいて、微生物は、第１の制御配列が抑制される条件のもとで維持される。第１の制御配列は第２のｏｒｉの利用を制御するので、このような維持条件のもとでの複製は第１のｏｒｉによって制御される。しかし、第２のｏｒｉに影響を及ぼすリプレッサーが作製されない条件のもとでは、第２のｏｒｉの抑制解除が生じ、ベクター複製の制御が第２のｏｒｉに切り替わる。その場合、第２のｏｒｉは、制御されないベクター複製をもたらし、したがって、非常に多量のベクターおよびベクターにコードされる所望する遺伝子産物を産生させる。
【０１２８】
下記においてさらに議論されるように、ＲＡＤＳ微生物の好ましい使用は、生細菌ワクチンとしての使用である。そのような実施形態において、所望する遺伝子産物は抗原である。
【０１２９】
ＲＡＤＳにおいて、所望する遺伝子産物の発現レベルは、少なくとも部分的には、ベクターのコピー数を制御することによって制御される。コピー数は、２つ以上の複製起点（ｏｒｉ）をＲＡＶにおいて使用することにより制御される。
【０１３０】
十分に知られているように、ｏｒｉは、ＤＮＡ複製が開始される、染色体外ベクターの染色体上の領域である。細菌におけるプラスミド複製の総説については、Ｈｅｌｉｎｓｋｉ他、２２９５頁〜２３２４頁、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ａｎｄ  Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ，Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、第２版、Ｎｅｉｄｈａｒｄｔ他編、１９９６を参照のこと。ＣｏｌＥ１型プラスミドにおいて、複製は、ＲＮＡＩＩと呼ばれる７００塩基のプレプライマーＲＮＡの合成によって開始される。ＲＮＡＩＩの転写はｏｒｉから５５５塩基上流で開始される。転写されるとき、ＲＮＡＩＩの３’末端はｏｒｉにおいてプラスミドとのハイブリッドを形成する。このＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドの切断が複製起点において生じ、これにより、宿主のＤＮＡポリメラーゼＩによって触媒されるＤＮＡ合成のプライマーとして役立つ３’−ヒドロキシル基が露出する。ＣｏｌＥ１型レプリコンは必須の複製タンパク質を規定しないが、ＤＮＡポリメラーゼＩを要求する。ＣｏｌＥ１型プラスミドにおける複製の制御は、通常、ＲＮＡＩＩプレプライマー転写物に対して相補的である不安定なＲＮＡＩ転写物が結合することによって調節される。ＲＮＡＩは、ＲＮＡＩＩコード領域とは一致せず、しかしＲＮＡＩＩコード領域内で転写される。さらなる調節レベルが、ＲＮＡＩ転写物およびＲＮＡＩＩ転写物と相互作用してＤＮＡ複製を妨げる、プラスミド上の他のところにあるｒｏｐによりコードされるタンパク質によってもたらされる。記載されるようなＲＡＶは、ＲＮＡＩＩに対する天然のプロモーターを、過剰なＲＮＡＩＩ転写物を産生させることができ、したがって、新しいプロモーターに対するリプレッサーが存在しないときにはＣｏｌＥ１型レプリコンの制御されない複製を可能にする強力な調節型プロモーターで置換することによって得られている。
【０１３１】
本発明において使用されるｏｒｉの選択は、第１のｏｒｉがＤＮＡポリメラーゼＩＩＩ（例えば、大腸菌におけるｄｎａＥ遺伝子の生成物）による複製をもたらし、かつ第２のｏｒｉがＤＮＡポリメラーゼＩ（例えば、大腸菌におけるｐｏｌＡ遺伝子の生成物）による複製をもたらすならば、狭く限定されない。好ましくは、第１のｏｒｉは、ベクターの複製によってもたらされる何らかの不都合なことを最小限に抑えるために、低コピー数をベクターにもたらす。好ましい第１のｏｒｉはｐＳＣのｏｒｉであり、これは、大腸菌またはサルモネラ菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｓｐｐ）において染色体ＤＮＡ等価体あたり約６個〜８個のベクターコピーをもたらすことが知られている。好ましい第２のｏｒｉはｐＵＣのｏｒｉである。
【０１３２】
第２のｏｒｉは、リプレッサーによって抑制され得るプロモーターに作動性に連結されている。この目的のために好ましいプロモーターは、ＬａｃＩリプレッサーによって抑制されるＰｌａｃまたはＰｔｒｃであり、そしてＣ２２リプレッサーによって抑制されるＰ２２ＰＲである。
【０１３３】
ＬａｃＩリプレッサーおよびＣ２２リプレッサーは好ましいリプレッサーである。好ましくは、これらのリプレッサーは微生物の染色体にコードされる。リプレッサー遺伝子は、制御配列の誘導因子が存在するときにだけ、リプレッサーの合成を可能にする活性化可能な制御配列に作動性に連結されている。下記においてより詳しく議論されるように、好ましい活性化可能な制御配列はａｒａＣＰＢＡＤであり、これはアラビノースによって活性化される。したがって、リプレッサーの合成を制御するためにａｒａＣＰＢＡＤを使用するＲＡＤＳ微生物では、アラビノースの存在により、リプレッサーの発現が活性化され、これにより、第２のｏｒｉの利用が妨げられる。その場合、ベクターの複製は第１のｏｒｉの制御下にある。しかし、アラビノースが除かれると、リプレッサーはもはや作製されず、第１の制御配列が抑制解除され、ベクターのラナウェイ複製が可能になる。アラビノースによる調節はまた、遊離のアラビノースを自然界では一般に得ることができないので有用である。例えば、アラビノースは鳥類および脊椎動物の組織には存在しない。
【０１３４】
アラビノースによる調節は、遅延型ＲＡＤＳには特に有用である。下記においてより詳しく議論されるように、遅延型ＲＡＤＳでは、高コピー数のｏｒｉの誘導が、誘発後、遅れる。そのようなシステムは、ラナウェイプラスミドの複製が（例えば、アラビノースにより）開始されない条件のもとでの培養において一般には増殖させられる生細菌ワクチンには有用である。その後、細菌は脊椎動物に接種される。そのようなシステムでは、接種された細菌は、ラナウェイプラスミドの複製が開始される前にリンパ組織に定着し、これにより多量の抗原の産生が可能になる。高コピー数のｏｒｉによるラナウェイプラスミドの複製の開始が遅れることにより、高い抗原レベルおよび高いベクターレベルがもたらされることによって生じる細菌定着能力の妨害が回避される。ａｒａＣ−ＰＢＡＤによりリプレッサーの合成が制御される遅延システムは、アラビノースが存在しないときに第２のｏｒｉにラナウェイ複製を開始させるためには効果的である。これは、アラビノースがもはや供給されなくなると、アラビノース濃度が十分に低下して、ＡｒａＣタンパク質にリプレッサーとしての作用を開始させるためには時間がかかるからである。しかし、この遅延は、ａｒａＣＢＡＤオペロンがアラビノースを効率的に代謝するのであまり長くなく、したがって、迅速（約１５分以内）に、アラビノースのレベルは、リプレッサー合成が行われない点にまで低下する。それにも関わらず、このような短い遅延システムは、例えば、鼻腔内接種の場合のように、ワクチンがリンパ組織に迅速に送達され得る生細菌ワクチンでは利点をもたらすために、ラナウェイ複製の開始の十分な遅延を可能にし得る。しかし、経口接種の場合、ラナウェイ複製が、ワクチンがＧＡＬＴに達するかなり前に開始される。そのような状況では、ラナウェイベクターによって産生された抗原の多くはリンパ組織にさらされず、したがって排出される。したがって、生細菌ワクチンを経口投与する場合のように、より長い遅延が所望される状況では、強化された遅延ＲＡＤＳを利用することができる。そのようなシステムでは、一時的に生存し得る時間が、誘導因子を分解する酵素の産生を制御するオペロンにおける不活性化変異を有する微生物を利用することによって延ばされる。アラビノースが誘導因子である場合、その代謝は、ａｒａＣＢＡＤオペロンにおける不活性化欠失変異によって除くことができる。そのような欠失は、アラビノースの代謝を妨げ、アラビノース暴露が除かれた後、アラビノースのより大きい細胞内レベルをもたらす。これにより、アラビノースのレベルが十分に低下して、ＡｒａＣタンパク質にリプレッサーとしての作用を開始させるまでに、より長い遅延がもたらされる。この強化された遅延は、強化された遅延型ＲＡＤＳシステムを含む経口投与されたワクチンを、ラナウェイベクターの複製が開始される前にＧＡＬＴに定着させるためには十分である。
【０１３５】
ＲＡＶの一例として、プラスミドベクターｐＭＥＧ−７７１（図１）が挙げられる。ｐＭＥＧ−７７１は、ｃ２遺伝子およびｌａｃＩ遺伝子の転写が増殖培地中のアラビノースの存在に依存するようにａｒａＣＰＢＡＤ制御配列によってその合成が調製される、Ｐ２２Ｃ２リプレッサーと、ｌａｃオペロンのＬａｃＩリプレッサーとの２つのリプレッサータンパク質に対する遺伝子を有する細菌株で維持されなければならない。アラビノースの存在下でのａｒａＣ遺伝子産物は、それに連結されている任意の構造遺伝子のＰＢＡＤからの転写を生じさせる転写アクチベーターである。アラビノースの非存在下では、ａｒａＣ遺伝子産物は、ＰＢＡＤプロモーターに融合している構造遺伝子の転写を妨げる、ＰＢＡＤにおけるリプレッサーとして役立つ。ｐＭＥＧ−７７１を有する菌株の染色体内には、ΔａｓｄＡ１９：：ＴＴａｒａＣＰＢＡＤｃ２ＴＴおよびΔｉｌｖＧ３：：ＴＴａｒａＣＰＢＡＤｌａｃＩＴＴの欠失／挿入変異が存在する。この菌株がアラビノースの存在下で増殖するとき、ｃ２リプレッサー遺伝子が発現して、Ｃ２リプレッサーがＰ２２ＰＲに結合して、ＰＲに融合しているｐＵＣのＲＮＡＩＩ遺伝子の転写を妨げる。ＲＮＡＩＩ遺伝子は、（染色体のｐｏｌＡ遺伝子によってコードされる）ＤＮＡポリメラーゼＩの存在下で、ｐＵＣのｏｒｉにおける複製を開始する開始因子ＲＮＡを規定する。プラスミドは、染色体ＤＮＡ等価体あたり約６個のプラスミドコピーが存在するように、ｐＳＣ１０１レプリコンの制御を使用して複製を続ける。この菌株はまた、この菌株がアラビノースの存在下で増殖するときに多量のＬａｃＩリプレッサータンパク質を産生する。そのような状況において、ｌａｃＩ遺伝子産物はＰＴＲＣに結合して、このプロモーターからの転写を抑制し、その結果、ＮｃｏＩからＨｉｎｄＩＩＩまでのマルチクローニング部位内に挿入されている何らかの外来遺伝子配列が合成されなくなる。この場合、この菌株は、プラスミドコピー数が低く、かつ多量の外来タンパク質の発現ができないために、ｐＭＥＧ−７７１プラスミドベクターを維持するためのエネルギー要求が最小限であるので、発酵装置内などの培養的条件のもとで非常によく増殖する。しかし、このワクチン株が免疫化動物宿主に投与された場合、外因性のアラビノースがなく、そして細菌ワクチン細胞内のアラビノースは、その代謝のために消失するか、または細胞からの漏出によってもまた消失する。そのような条件のもとでは、Ｃ２およびＬａｃＩのリプレッサータンパク質は合成が停止させられ、そしてこれらのリプレッサーの細胞内密度が低下して、完全に調節されていない様式でのｐＵＣのｏｒｉからのプラスミドの複製を開始させるために必要なｐＵＣのＲＮＡＩＩ配列の転写だけでなく、外来抗原に対する遺伝子の転写の開始をも可能にする。したがって、所望する遺伝子産物の全体的な産生レベルは、ＰＴＲＣからの外来遺伝子の増大した転写とともに、プラスミドコピー数が増大するために大きく増大する。
【０１３６】
ＲＡＤＳのいくつかのエレメントは以前に国際特許出願公開ＷＯ９６／４０９４７に記載されていた。特にその刊行物の図８を参照のこと。しかし、そのシステムでは、ＲＡＶは、細菌ワクチンが３０度未満などの許容されない環境における生存性を保持しないようにするために主に使用されていた。これは、体温から周囲温度に移動したときに、ｃＩ８５７ベクターにより運ばれる遺伝子産物が機能的になり、その結果、ｃ２リプレッサー遺伝子の発現が停止し、これにより溶解遺伝子の抑制解除が生じるからである。
【０１３７】
ｐＭＥＧ−７７１において例示されるＲＡＶには、所望する結果を達成するために単独または他の調節エレメントとの組合せで機能する様々な調節エレメントが利用されている。ＲＡＤＳにおいて使用される調節エレメントは、ｐＭＥＧ−７７１およびその関連する宿主において使用されているエレメント（ａｒａＣＰＢＡＤ、ＰＲ、ＰＴＲＣ、ｌａｃＩリプレッサー、Ｃ２リプレッサー）に狭く限定されず、これらのエレメントは、下記に記載されるように、そしてこの分野で知られているように、類似する機能を有する他のエレメントに置換することができる。
【０１３８】
一般に、本発明のＲＡＤＳにおける遺伝子は、１）許容される条件または許容されない条件のもとでの転写を促進または妨げる制御配列にコード配列を連結することによって、２）ＲＡＶおよび／または宿主染色体の遺伝子の転写を促進または妨げるトランス調節エレメントの発現を調節することによって、３）高コピー数条件または低コピー数条件のいずれかのもとで活性または不活性であるように、ＲＡＶおよび／または宿主染色体の遺伝子に作用するトランス調節エレメントを適合または変化させることによって、調節することができる。本発明のＲＡＶは、システムの種々のエレメントの発現を調整するために様々なプロモーターを必要とする。温度感受性リプレッサーまたは環境特異的調節エレメントなどのいくつかのエレメントでは、誘導性プロモーター、抑制解除性プロモーターまたは活性化可能なプロモーターが使用されている。ＲＡＶにおける調節エレメントとして使用される好ましいプロモーターは、ｃｓｐＡ遺伝子プロモーター、ｐｈｏＡ遺伝子プロモーター、ＰＢＡＤ（ａｒａＣ−ＰＢＡＤシステムにおいて）、ｔｒｐプロモーター、ｔａｃプロモーター、ｔｒｃプロモーター、λＰＬ、Ｐ２２ＰＲ、ｍａｌプロモーター、およびｌａｃプロモーターが挙げられる。これらのプロモーターは、それぞれ、低い温度で、低いリン酸塩レベルで、アラビノースの存在下で、低いトリプトファンレベルの存在下で、そしてラクトース（または他のｌａｃ誘導因子）の存在下で転写を媒介する。これらのプロモーターのそれぞれおよびそれらの調節システムは十分に知られている。
【０１３９】
トランス調節エレメント。本明細書中で使用される「トランス調節エレメント」は、遺伝子の発現を調節する分子または複合体をいう。例には、制御配列においてオペレーターに結合するリプレッサー、転写の開始を生じさせるアクチベーター、およびｍＲＮＡに結合して、ｍＲＮＡの翻訳を妨げるアンチセンスＲＮＡが含まれる。本発明のＲＡＤＳにおいて使用される場合、調節されたプロモーターからの発現はプロモーター調節タンパク質によって調節される。このようなプロモーター調節タンパク質は、プロモーターからの転写を活性化または抑制するように機能し得る。好ましいトランス調節エレメントは、ｃｓｐＡ遺伝子プロモーター、ｐｈｏＡ遺伝子プロモーター、ＰＢＡＤ（ａｒａＣ−ＰＢＡＤシステムにおいて）、ｔｒｐプロモーター、ｔａｃプロモーター、ｔｒｃプロモーター、ｍａｌプロモーター、およびｌａｃプロモーターの調節を媒介するタンパク質である。
【０１４０】
別のタイプのトランス調節エレメントはＲＮＡポリメラーゼである。ＲＡＤＳの遺伝子は、特異的なＲＮＡポリメラーゼによってだけ認識されるプロモーターに遺伝子を連結することによって調節され得る。特異的なＲＮＡポリメラーゼの発現を調節することによって、遺伝子の発現もまた調節される。例えば、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼは、細菌のＲＮＡポリメラーゼによって認識されない特異的なプロモーター配列を要求する。Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を宿主細胞内に入れ、許容性環境または非許容性環境においてのみ発現するように調節することができる。Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼの発現は、次に、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼプロモーターに連結されている何らかの遺伝子を発現させる。目的とする遺伝子の発現を調節するためにＴ７ＲＮＡポリメラーゼを使用する方法の記載、ならびにこの調節に有用な核酸配列の記載は、Ｓｔｕｄｉｅｒ他、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８５：６０〜８９（１９９０）に見出される。
【０１４１】
別のタイプのトランス調節エレメントはアンチセンスＲＮＡである。アンチセンスＲＮＡは、調節しようとする遺伝子の核酸配列（これは標的配列と呼ばれる）に対して相補的である。アンチセンスＲＮＡと標的配列とのハイブリダイゼーションにより、遺伝子の発現が妨げられる。典型的には、遺伝子のｍＲＮＡに対して相補的なアンチセンスＲＮＡが使用され、その主要な作用は、ｍＲＮＡの翻訳を妨げることである。ＲＡＤＳの遺伝子の発現は、アンチセンスＲＮＡの発現を制御することによって調節することができる。アンチセンスＲＮＡの発現は、その後、目的とする遺伝子の発現を妨げる。目的とする遺伝子の発現を調節するためにアンチセンスＲＮＡを使用する方法の完全な記載が米国特許第５，１９０，９３１号に見出される。
【０１４２】
別のタイプのトランス調節エレメントは、クォールム感知（ｑｕｏｒｕｍ  ｓｅｎｓｉｎｇ）装置のエレメントである。クォールム感知は、細胞集団が高密度に達したときに遺伝子の発現を誘導するために一部の細胞によって使用される。クォールム感知システムは、特定の遺伝子の発現を誘導するために調節タンパク質と相互作用する拡散し得る化合物によって活性化される（Ｆｕｑｕａ他、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７６：２６９〜２７５（１９９４））。自己誘導因子（ａｕｔｏｉｎｄｕｃｅｒ）と呼ばれる拡散し得る化合物が転写アクチベーターと直接的に相互作用するという証拠がある。この相互作用により、アクチベーターがＤＮＡに結合し、転写を活性化することができる。それぞれのクォールム感知転写アクチベーターは、典型的には、特定の自己誘導因子によってのみ活性化されるが、アクチベーターは２つ以上の遺伝子を誘導することができる。クォールム感知調節は、転写アクチベーターとアクチベーターの機能的な結合部位を含有する遺伝子とを要求するだけであることが示されている（Ｇｒａｙ他、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７６：３０７６〜３０８０（１９９４））。このことは、クォールム感知調節が本発明のＲＡＤＳにおける遺伝子の調節に適合し得ることを示している。例えば、クォールム感知転写アクチベーターをコードする遺伝子をＲＡＤＳ宿主において発現させることができ、そしてＲＡＤＳの別の遺伝子を、クォールム感知転写アクチベーターによって制御されるプロモーターの制御下で置くことができる。これにより、同系の自己誘導因子が存在するときには、ＲＡＤＳ遺伝子が発現するが、自己誘導因子の非存在下では発現しない。そのような制御下にある遺伝子は、クォールム制御下にあると本明細書中では示される。ＲＡＤＳ宿主が自己誘導因子を産生する場合、クォールム制御下にある遺伝子は、細胞密度が大きくなったときに発現し、細胞密度が低いときには発現しない。国際特許出願公開ＷＯ９６／４０９４７に記載される必須遺伝子、致死性遺伝子、複製遺伝子および調節遺伝子を含む、ＲＡＤＳにおける遺伝子はどれも、クォールム制御下に置くことができる。ＲＡＤＳを操作するために、自己誘導因子は、例えば、内因性遺伝子（すなわち、自己誘導因子の合成に関与する遺伝子）の作用によりＲＡＤＳ宿主によって、培養培地中に、またはその両方で供給され得る。後者の場合、培地に供給される自己誘導因子は、高い細胞密度の許容される条件を模倣する。あるいは、自己誘導因子の産生または合成に必要な遺伝子をＲＡＤＳのエレメントとして含むことができる。そのような自己誘導因子遺伝子は、本明細書中で使用される調節エレメントであると見なされる。
【０１４３】
クォールム感知転写アクチベーター遺伝子およびその同系自己誘導因子の産生に必要な遺伝子の例には、ｌｕｘＲおよびｌｕｘＩ（Ｇｒａｙ他、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７６：３０７６〜３０８０（１９９４））、ｌａｓＲおよびｌａｓＩ（ＧａｍｂｅｌｌｏおよびＩｇｌｅｗｓｋｉ、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７３：３０００〜３００９（１９９１））、ｔｒａＲおよびｔｒａＩ（Ｐｉｐｅｒ他、Ｎａｔｕｒｅ、３６２：４４８〜４５０（１９９３））、ｒｈｌＩおよびｒｈｌＲ（Ｌａｔｉｆｉ他、Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１７（２）：３３３〜３４３（１９９５））、ｅｘｐＲおよびｅｘｐＩ（Ｐｉｒｈｏｒｅｎ他、ＥＭＢＯ  Ｊ  １２：２４６７〜２４７６（１９９３））がある。これらのペアの自己誘導因子には、Ｎ−（３−オキソヘキサノイル）ホモセリンラクトン（ＶＡＩ；ＬｕｘＲについて）、Ｎ−（３−オキソドデカノイル）ホモセリンラクトン（ＰＡＩ；ＬａｓＲについて）、およびＮ−（３−オキソオクタノイル）ホモセリンラクトン（ＡＡＩ；ＴｒａＲについて）が含まれる。クォールム感知転写アクチベーターによって誘導されるいくつかのプロモーターには、ｌｕｘＩプロモーター、ｌａｓＢプロモーター、ｔｒａＡプロモーター、およびｔｒａＩプロモーターがある。
【０１４４】
クォールム制御は、多数の方法での調節された抗原送達、例えば、抗原などの所望する遺伝子産物の産生を得ることによる調節された抗原送達を行うために、そして、高コピー数のｏｒｉプライマーＲＮＡＩＩ配列の非発現を、例えば、培養装置内での高細胞密度の許容される条件のもとで行い、反対の発現パターンが、例えば、細胞が動物に導入されるか、または環境に放出されたときに細胞密度が低下するに従って生じさせるために使用することができる。別の例として、ｃ２などの調節遺伝子をクォールム制御下に置くことができる。その場合、ＲＡＤＳの他のエレメントを、例えばＰ２２ＰＲを使用して、調節遺伝子の生成物の制御下に置くことができる。調節遺伝子は自己誘導因子の存在下で発現し、自己誘導因子の非存在下では発現しない。調節遺伝子がｃ２であり、ＲＡＤＳ遺伝子がＰ２２ＰＲに連結されている場合、ＲＡＤＳ遺伝子は、自己誘導因子が存在しないときに（Ｃ２タンパク質が作製されないので）発現し（すなわち、抑制解除され、そして自己誘導因子が存在するときに抑制される。必須遺伝子または複製遺伝子がクォールム制御下にある場合（自己誘導因子が発現を誘導する場合）、自己誘導因子は許容される条件下で存在し、許容されない条件下で存在しないことが好ましい。調節遺伝子がクォールム制御下にある場合、許容される条件または許容されない条件のもとでの自己誘導因子の存在または非存在は、調節遺伝子の生成物が正の調節因子または負の調節因子であるかどうかに依存する。
【０１４５】
リプレッサーまたはアンチセンスＲＮＡなどのトランス調節エレメントは、染色体またはプラスミドのどちらからでも発現させることができる。しかし、システムのプラスミド部分のサイズおよび複雑性を制限するために、これらの調節エレメントは細菌の染色体から発現させることが好ましい。
【０１４６】
温度感受性調節。ヒトまたは他の温血動物のために意図される微生物に対する好ましいタイプの調節は、温度による調節である。これは、哺乳動物および鳥類に存在する高い一定した体温と、微生物が流れた周囲環境に存在する低い変動性の温度との相違に基づく。これを達成するために、好ましいＲＡＤＳは、約３７℃での生存を保証する遺伝子を発現する。ＲＡＤＳが、動物に投与されることが意図される場合、温度に基づく任意の調節は標的動物の正常な体温を考慮に入れることが好ましい。例えば、ニワトリは体温が４１．５℃であり、ブタは体温が約４０℃である。
【０１４７】
ＲＡＤＳにおいて使用される好適な、温度により調節される遺伝子発現は、Ｎｅｉｄｈａｒｄｔ他、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．１８：２９５〜３２９（１９８４）によって記載される。高い温度で強く発現する様々な熱ショック遺伝子が十分に明らかにされている。これらの遺伝子の発現は温度により調節されるが、多くの場合、相当低い基底レベルの発現が制限的な温度で存在する（Ｊｏｎｅｓ他、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６９：２０９２〜２０９５（１９８７））。より厳密な制御を示す温度調節型プロモーターが、Ｔｏｂｅ他（Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏ．５：８８７〜８９３（１９９１））、Ｈｒｏｍｏｃｋｙｉ他（Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏ．６：２１１３〜２１２４（１９９１））およびＱｏｒｏｎｆｌｅｈ他（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７４：７９０２〜７９０９（１９９２））によって記載されている。
【０１４８】
抗原などの所望する遺伝子の場合、Ｓ．ｆｌｅｘｎｅｒｉのｖｉｒＢプロモーターを、同じプラスミドの別のところに存在するか、または異なるプラスミドに存在するか、または染色体に存在するＳ．ｆｌｅｘｎｅｒｉのｖｉｒＦの遺伝子およびプロモーターとともに使用することができる（Ｈｒｏｍｏｃｋｙｉ他（１９９２）；Ｔｏｂｅ他（１９９１））。温度による調節のためにエルシニアの二成分システムもまた使用することができる。これは、温度により調節される正のアクチベーターであるｖｉｆＦ（Ｌａｍｂｅｒｔ  ｄｅ  Ｒｏｕｖｒｏｉｔ他、Ｍｏｌｅｃ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６：３９５〜４０９（１９９２）を、ｙｏｐＨ遺伝子またはｙａｄＲ遺伝子のプロモーターとの組合せで、ｙｍｏＡによりコードされるヒストン様ＹｍｏＡタンパク質の修飾とともに、またはそのような修飾を伴うことなく含む（Ｃｏｒｎｅｌｉｓ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、１９９２））。赤痢菌属のｖｉｒＦ遺伝子はＹ．ｐｅｓｔｉｓのｌｃｒＦと等価である（Ｈｏｅ他、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７４：４２７５〜４２８６（１９９２））。多くの他のリプレッサー−プロモーターの組合せを、リプレッサーの温度感受性形態を使用することによって温度特異的な様式で遺伝子を発現させるようにすることができる。温度感受性変異型リプレッサーを得るための様々な方法が十分に確立されている。
【０１４９】
低温特異的な発現もまた、遺伝子を低温ショックプロモーターまたは低温感受性プロモーターに結合させることによって達成することができる。低温ショックプロモーターは、知られている低温ショック遺伝子から得ることができる。プロモーターを有する様々な低温ショック遺伝子が記載されている（Ｊｏｎｅｓ他（１９８７））。有用な低温ショックプロモーターの一例として、ｃｓｐＡ由来のプロモーターが挙げられる（ＶａｓｉｎａおよびＢａｎｅｙｘ、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏ．６２：１４４４〜１４４７（１９９６））。温度特異的な発現を有するプロモーターはプロモータープローブベクターによって同定することができる。そのようなベクターは、分配可能な遺伝子に由来する隣接ＤＮＡを有し、例えば、発色性基質を使用して容易に選択または同定することができる。必須遺伝子を発現させるために有用な他の低温特異的プロモーターは、Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍのｌａｃＺ融合ライブラリーにおけるβ−ガラクトシダーゼの低温感受性を有しない発現についてスクリーニングすることによって同定することができる（Ｔａｎａｂｅ他、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７４：３８６７〜３８７３（１９９２））。
【０１５０】
あまり複雑でない好ましいシステムは、バクテリオファージλのプロモーター（λＰＬおよびλＰＲ）とＣＩ８５７温度感受性リプレッサーとの相互作用を伴う。このシステムは、例えば、Ｌｉｅｂ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１６：１４９〜１６３（１９６６）により記載されている。その変異型温度感受性リプレッサーＣＩ８５７を伴うλファージのプロモーター（λＰＬおよびλＰＲ）は、毒性遺伝子の制御された発現をもたらすために発現ベクターにおいて使用される厳密に調節されるシステムを提供し（Ｏ’ＣｏｎｎｏｒおよびＴｉｍｍｉｓ、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６９：４４５７〜４４６２（１９８７））、そしてまた開始因子ＲＮＡＩＩの合成を調節して、高コピー数プラスミドベクターのＤＮＡポリメラーゼＩ依存的ｏｒｉにおけるＲＮＡ複製を開始させるために使用することができる。ｃＩ８５７遺伝子産物は、３７℃で、特に、鳥類および一部の哺乳動物において見出されるさらにより高い温度で合成されるが、不活性であり、そして３０℃以下で合成されるが、λＰＬまたはλＰＲのいずれかによってその転写が制御される遺伝子の発現を活発に抑制する。
【０１５１】
ＲＡＤＳの制御配列からの漏出発現（ｌｅａｋｙ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）を、遭遇する場合には、いくつかの方法で除くことができる。例えば、産生されるＣＩリプレッサーのレベルを、ｃＩ８５７遺伝子をＰｔｒｃなどの強力なプロモーターの制御下に置くことによって増大させることができ、したがって、過剰な温度感受性リプレッサーを提供することができる。さらに、より多くのＣＩリプレッサー結合部位をλＰＲのオペレーター領域内に導入して、許容されない温度での転写開始を低下させることができ、またはより多くのＣＩリプレッサー結合部位をプロモーターエレメントの下流に操作して入れて、より低い温度での転写を妨げることができる。さらに、調節された遺伝子に対するアンチセンスＲＮＡを、λＰＲに対して反対向きに配向している別に調節されるプロモーターから転写させることができる。
【０１５２】
アラビノースによる調節。以前に議論されたように、微生物が許容される環境から許容されない環境に移動したときに発現の切り替えを誘発させる好ましい調節システムはａｒａＣ−ＰＢＡＤシステムである。ａｒａＣ−ＰＢＡＤシステムは、低レベルのアラビノースの添加によって誘導される強力なプロモーターとして機能することが示されている厳密に制御される発現システムである（Ｇｕｚｍａｎ他、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７７（１４）：４１２１〜４１３０（１９９５）を参照のこと）。ａｒａＣ−ａｒａＢＡＤプロモーターは、一方の方向でａｒａＢＡＤ遺伝子群の発現を制御し、反対の方向でａｒａＣ遺伝子の発現を制御する二方向性のプロモーターである。便宜上、ａｒａＢＡＤ遺伝子群の発現を媒介し、ａｒａＣ遺伝子産物によって制御されるａｒａＣ−ａｒａＢＡＤプロモーターの部分を、本明細書中ではＰＢＡＤとして示す。本明細書中に記載されるベクターおよびシステムで使用される場合、ａｒａＣ遺伝子およびａｒａＣ−ａｒａＢＡＤプロモーターを有するカセットを使用することができる。このカセットは、本明細書中ではａｒａＣ−ＰＢＡＤとして示される。ＡｒａＣタンパク質は、ＰＢＡＤの正および負の両方の調節因子である。アラビノースの存在下において、ＡｒａＣタンパク質は、ＰＢＡＤの発現を可能にする正の調節エレメントである。アラビノースの非存在下では、ＡｒａＣタンパク質はＰＢＡＤの発現を抑制する。これにより、ＰＢＡＤからの発現レベルにおいて１，２００倍の差を生じさせることができる。
【０１５３】
腸内細菌は、大腸菌に由来するａｒａＣ−ａｒａＢＡＤシステムと相同的なアラビノース調節システムを含有する。例えば、大腸菌およびＳ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍのＡｒａＣタンパク質間にはアミノ酸配列レベルでの相同性があり、ＤＮＡレベルでの相同性はあまりない。しかし、ＡｒａＣタンパク質の活性には大きい特異性がある。例えば、大腸菌のＡｒａＣタンパク質は（アラビノースの存在下で）大腸菌のＰＢＡＤのみを活性化し、Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍのＰＢＡＤを活性化しない。したがって、ＲＡＤＳは、同じシステムにおいて異なる構成成分を異なるように調節するために、複数の腸内細菌に由来する複数のアラビノース調節配列を用いることができる。
【０１５４】
マルトースによる調節。高コピー数が所望されるときに発現の切り替えを誘発させる別の好ましい調節システムはｍａｌＴシステムである。ｍａｌＴは、４つのマルトース応答プロモーター（ＰＰＱ、ＰＥＦＧ、ＰＫＢＭ、およびＰＳ）の正の調節因子であるＭａｌＴをコードする。ｍａｌＴおよびｍａｌプロモーターの組合せにより、マルトースの添加によって誘導される強力なプロモーターとして機能することが示されている厳密に調節される発現システムがもたらされる（Ｓｃｈｌｅｉｆ、「２つの正に調節されるシステムのａｒａおよびｍａｌ」、１３００頁〜１３０９頁、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ａｎｄ  Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、第２版、Ｎｅｉｄｈａｒｄｔ他編、ＡＳＭ  Ｐｒｅｓｓ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．、１９９６を参照のこと）。ａｒａＣ−ＰＢＡＤシステムとは異なり、ｍａｌＴは、他のｍａｌプロモーターに機能的に結合していないプロモーター（ＰＴ）から発現する。ＰＴはＭａｌＴによって調節されない。ｍａｌＥＦＧ−ｍａｌＫＢＭプロモーターは、一方の方向でｍａｌＫＢＭ遺伝子群の発現を制御し、反対の方向でｍａｌＥＦＧ遺伝子群の発現を制御する二方向性のプロモーターである。便宜上、ｍａｌＫＢＭ遺伝子の発現を媒介し、ｍａｌＴ遺伝子産物によって制御されるｍａｌＥＦＧ−ｍａｌＫＢＭプロモーターの部分を本明細書中ではＰＫＢＭとして示し、そしてｍａｌＥＦＧ遺伝子の発現を媒介し、ｍａｌＴ遺伝子産物によって制御されるｍａｌＥＦＧ−ｍａｌＫＢＭプロモーターの部分を本明細書中ではＰＥＦＧとして示す。ＰＫＢＭの完全な誘導には、ＰＥＦＧのＭａｌＴ結合部位の存在が必要である。本明細書中に記載のベクターおよびシステム中に使用する場合、ｍａｌＴ遺伝子およびｍａｌプロモーター１個を有するカセットを使用すべきである。このカセットは、本明細書中ではｍａｌＴ−Ｐｍａｌとして示される。マルトースの存在下において、ＭａｌＴタンパク質は、Ｐｍａｌの発現を可能にする正の調節エレメントである。
【０１５５】
アラビノースおよびａｒａＣ−ＰＢＡＤを用いたように、マルトースを用いた調節は遅延型ＲＡＤＳに有用である。これは、マルトースがもはや供給されなくなると、マルトース濃度が十分に低下して、ＭａｌＴタンパク質による誘導を無効にするためには時間がかかるからである。一時的に生存し得る時間を延ばすためには、マルトース調節型ＲＡＤＳとともに使用される菌株がｍａｌオペロンの１つまたは複数のエレメントの欠失を含有することが好ましい。そのような欠失はマルトースの代謝を妨げ、マルトースのより大きい細胞内レベルを生じさせる。この結果、マルトースレベルが十分に低下して、ＭａｌＴタンパク質による誘導を無効にするまでに、より長い遅延がもたらされる。マルトースによる調節はまた、遊離のマルトースを自然界では一般には得ることができないので有用である。
【０１５６】
遅延した死
高コピー数ｏｒｉの迅速な誘導に対する代替として、ＲＡＤＳは、高コピー数ｏｒｉを抑制する因子が除かれた後の限られた時間、宿主微生物が生存し続けることができるように設計することができる。これは、本明細書中では遅延型ＲＡＤＳと呼ばれ、そして高コピー数ｏｒｉに切り替えるために環境的シグナルに宿主がさらされた後も、より低いコピー数のｏｒｉの制御下に一時的にあり続けるＲＡＶを生じさせる。ＲＡＶの高コピー数を遅らせるための好ましい機構は、ＲＡＶがラナウェイ状態に切り替わり得る前に分解または希釈されなければならないトランス調節エレメントに対する調節に基づく。そのようなシステムでは、宿主微生物を、抑制された高コピー数から、高コピー数が誘導される環境に移動させたとき、低コピー数状況を維持するトランス調節エレメントは産生を停止する。しかし、既に自由に利用できるトランス調節エレメントが十分な量で残存する限り、この低コピー数状況は引き続き有効であり得る。トランス調節エレメントの代謝回転および自由に利用できるトランス調節エレメントの量と、低コピー数状況を維持するために必要なトランス調節エレメントの量との関係に依存して、低コピー数状況は、高コピー数の環境に移された後も数世代にわたって維持され得る。そのような一時的な低コピー数の条件は、例えば、動物などの（例えば、アラビノースが存在しない）高コピー数の環境にある宿主に宿主微生物を定着させるためには有用であり得るが、無期限には持続しない。そのため、ＲＡＤＳは、国際特許出願公開ＷＯ９６／４０９４７に記載されるファージの溶解遺伝子さえも有しない封じ込めシステムである。遅延型ＲＡＤＳはまた、実施例３のように、所望する遺伝子産物が宿主細胞に対して有害であるときには有用である。さらに、遅延型ＲＡＤＳは、調和型致死性宿主システムの必須遺伝子（ａｓｄなど）をａｒａＣＰＢＡＤなどの活性化可能な制御配列に依存させて、免疫化（およびこの場合にはアラビノースの除去）を行ったときに細胞壁の弱体化をもたらすために使用することができる。実施例５を参照のこと。
【０１５７】
遅延型ＲＡＤＳにおいて使用される好ましいトランス調節エレメントは、ＡｒａＣタンパク質およびその誘導因子のアラビノースからなる。ＡｒａＣタンパク質は、アラビノースの濃度が臨界レベルよりも低くなるまで、ＰＢＡＤに作動性に連結されている高コピー数ｏｒｉを抑制し続ける。
【０１５８】
ベクター
本明細書中で使用される「ベクター」は、自律的に複製する核酸ユニットをいう。本発明は、ウイルスベクター、コスミドベクター、ファージミドベクター、およびプラスミドベクターを含む任意の知られているタイプのベクターを用いて実施することができる。最も好ましいタイプのベクターはプラスミドベクターである。
【０１５９】
この分野では十分に知られているように、プラスミドおよび他のベクターは、非常に様々なプロモーター、マルチプルクローニング配列などを有し、そしてこれらのレプリコンは、合成される外来抗原の量が遺伝子コピー数の相対的な量によって制御され得るように使用することができる。例えば、ｐｌ５Ａ、ｐＢＲおよびｐＵＣのレプリコンを有するベクターを構築することができる。これらはすべて、その複製のためのＤＮＡポリメラーゼＩをコードするｐｏｌＡ遺伝子に依存する。ベクターの複製がＤＮＡポリメラーゼＩに依存するかどうかの確認を、χ１８９１（表１参照）などの、温度感受性のｐｏｌＡ変異を有する宿主においてベクターを増殖させ、そして温度の関数としてベクターの維持を調べることによって行うことができる。好ましくは、ＲＡＤシステムにおいて使用されるベクターは、ベクターの維持について選択するために抗生物質耐性を使用しない。
【０１６０】
好ましいベクターは、ＲＡＶの必須エレメントのすべて、すなわち、（ａ）制御配列に作動性に連結されている、所望する遺伝子産物をコードする遺伝子、（ｂ）低コピー数または中程度のコピー数のベクターを微生物においてもたらす複製起点（「ｏｒｉ」）、および（ｃ）高コピー数をもたらすｏｒｉを有する。任意の特定のＲＡＤＳの一部である他のエレメントを、ベクター上に、または別の適合し得るベクター上に、または宿主微生物の染色体上に存在させることができる。
【０１６１】
移入ベクター。発現産物を直接発現させるのではなく、微生物が置かれた環境における別の細胞に移すために、そしてそのような別の細胞における発現のために、微生物はＲＡＶを有することができる。本明細書中で使用される場合、移入ベクターは、ＲＡＤＳ微生物から細胞に移すことができ、そして移入ベクターによりコードされる発現遺伝子の発現を行わせる発現ベクターである。移入ベクターは、抗原、免疫調節因子、酵素、および受容細胞における遺伝子発現または細胞活性を調節する発現産物をコードする遺伝子を含む任意の発現遺伝子を含有し得ることが意図される。
【０１６２】
移入ベクターに対して好ましい受容体は、ベクターで処置された動物の細胞である。この目的のために、ＲＡＶ移入ベクターを含有するＲＡＤＳ微生物を動物に投与することができる。微生物は、移入ベクターを送達するために、動物の細胞に侵入することが好ましい。この目的のために、微生物は、動物の細胞に入ったときに溶解することが好ましい。この溶解を生じさせる好ましい方法は、国際特許出願公開ＷＯ９６／４０９４７に記載されるようなＥＬＶＳシステムである。そのシステムでは、ベクターにより運ばれる致死性遺伝子（ファージの溶解遺伝子のｌｙｓ１３およびｌｙｓ１９など）がＰ２２ＰＲに作動性に連結され、そして染色体によりコードされるＣ２リプレッサーがａｒａＣＰＢＡＤに作動性に連結されている。接種された動物内などのアラビノースが存在しない環境に菌株を導入することにより、存在するＣ２リプレッサーの希釈が生じて、致死性の遺伝子産物により細胞が殺されるようになる。さらに、移入ベクターを含むＲＡＶを有するＲＡＤＳを、調節された溶解遺伝子が染色体に挿入されているために溶解を生じさせるＥＬＶＳとして設計することができる。溶解遺伝子のそのような発現は、移入ベクターを有する脊椎動物の細胞が真核生物細胞に進入し、ラナウェイのベクター複製をもたらした後にだけ溶解が生じるように遅延した発現を示す。ＲＡＤＳに適合した新規な移入ベクターを記載する実施例６もまた参照のこと。適正に設計された場合、ＥＬＶＳシステムは、ＲＡＤＳシステムとの完全な適合性を有し、制御エレメントをともに有し得る。この場合、例えば、ＥＬＶＳにより生じる細胞の溶解により、移入ベクターが受容細胞の中に放出される。受容細胞において移入ベクター上の遺伝子を発現させるためには、発現遺伝子が、受容細胞で作動し得る発現制御配列に作動性に連結されていることが好ましい。例えば、受容細胞が動物細胞である場合、発現遺伝子は、動物において機能的なプロモーターに作動性に連結され、そしてｍＲＮＡのポリアデニル化を確実にする配列を有することが好ましい。そのような配列を操作するための様々な方法がこの分野では十分に知られている。
【０１６３】
移入ベクターはまた、受容細胞において作動し得る複製配列を含有することができる。これは移入ベクターの複製を可能にし、移入ベクターに存在する発現遺伝子の増大した発現またはより長期間の発現をもたらす。移入ベクターは、抗原の発現、および真核生物細胞におけるグリコシル化または翻訳後修飾を必要とする他のタンパク質の発現を行うためには特に有用である。この方法では、ＲＡＶ／ＥＬＶＳベクターを有する細菌細胞を、移入ベクターからタンパク質を発現させることによって真核生物のプロセシングを必要とするタンパク質の送達のために使用することができる。
【０１６４】
移入ベクターに対する好ましい使用は、動物における免疫応答を刺激するためのＲＡＤＳにおいてである。この目的のために、細菌は、動物の細胞内で発現するように設計された移入ベクターを放出するために、侵入し、その後、溶解すると思われる無毒性のサルモネラ属、赤痢菌属、エルシニア属、または非浸襲性の大腸菌属であることが好ましい。このことは、ウイルス、寄生虫に対する免疫応答、または抗原産物が真核細胞内で合成されたときだけに実現し得る何らかの方法で、抗原が、通常グリコシル化もしくは翻訳後修飾されている配偶子抗原に対する免疫応答を刺激する際には有用であり得る。
【０１６５】
移入ベクターの移入効率は、ｅｎｄＡ変異、ｒｅｃＢＣにおける変異（ｓｂｃサプレッサー変異を伴う変異または伴わない変異）、および／または他のヌクレアーゼ遺伝子における変異を含むことによって改善することができる。そのような変異は、宿主細胞が溶解するときの移入ベクターの分解を低下させることができる。移入ベクターを含有する微生物が付着し、侵入する細胞タイプおよび粘膜表面を感化することもまた可能である。これは、特定のアドヘジンおよびインバイジンの発現を阻止または開始することによって達成することができる。
【０１６６】
多くのベクターが、動物におけるＤＮＡ免疫化または細胞への導入のために知られている。そのようなベクターは、ＥＬＶＳとともにＲＡＶを含有する微生物において移入ベクターとして使用することができる。この場合、ＲＡＤＳは、そのようなベクターを細胞に導入するために有用な手段を提供する。移入ベクター上の発現遺伝子を発現させるために好ましいプロモーターには、アデノウイルス、ヘルペスウイルスおよびサイトメガロウイルスのプロモーターが挙げられる。発現遺伝子の発現はまた、細菌プロモーターを真核生物プロモーターの上流に置き、細菌株が少量の発現産物を以前から発現するようにすることによって増大させることができる。この発現産物は、細菌が溶解したときに放出される。
【０１６７】
環境限定生存システムにおいて有用であるか、または環境限定生存システムを構築するために有用である好ましい細菌宿主／菌株およびベクターを表１および表２に列挙する。
【０１６８】
【表１】
2004515210.tif 000003
2004515210.tif 000004
2004515210.tif 000005
2004515210.tif 000006
【０１６９】
【表２】
2004515210.tif 000007
2004515210.tif 000008
2004515210.tif 000009
【０１７０】
前に議論されたように、本発明の宿主細胞はまた、ポリペプチドまたはｍＲＮＡなどの所望する遺伝子産物のポリヌクレオチドをコードする所望する組換え遺伝子を有する。所望する遺伝子の選択は狭く限定されず、例えば、ウイルス、細菌、菌類または寄生虫の抗原などをコードする遺伝子を含むことができる。
【０１７１】
所望する遺伝子が本発明において有用であるためには、その遺伝子が発現されなければならない。遺伝子の発現は、その遺伝子が存在する生物の生化学的機構によって、ＤＮＡ塩基の配列でコードされる情報が、ＲＮＡ分子、ポリペプチドまたは他の生物学的分子の形態での物理的生成物に変換されることを意味する。そのようにして産生された生物学的分子は遺伝子産物と呼ばれる。本明細書中で使用される遺伝子産物の用語は、遺伝子が発現する結果として産生される任意の生物学的生成物（１つまたは複数）をいう。遺伝子産物は、例えば、ＲＮＡ分子、ペプチド、または遺伝子の最初の生成物である酵素もしくは他の分子の制御下で産生される生成物（すなわち、代謝産物）であり得る。例えば、遺伝子は、遺伝子が見出された元の細胞に対して外部の環境におけるグリカンの形成を制御する酵素にリボソームの作用によって翻訳されるＲＮＡ分子の合成を最初に制御し得る。ＲＮＡ分子、酵素およびグリカンはすべて、この用語が本明細書中で使用されているように遺伝子産物である。これらの遺伝子産物ならびに多くの他のタイプの遺伝子産物（糖タンパク質および多糖など）はいずれも、動物の免疫系に導入されたならば、抗原として作用する。糖タンパク質およびリポタンパク質を含むタンパク質の遺伝子産物は、ワクチンにおける抗原として使用される好ましい遺伝子産物である。
【０１７２】
本発明の好ましい実施形態は、上記に記載されたＲＡＤＳ微生物を生ワクチンの構成成分として使用することに関する。このような場合、所望する組換え遺伝子は、菌類、細菌、寄生虫またはウイルスの病原体の抗原をコードする。生ワクチンは、病原体に対する限局的な免疫性が重要であり、かつそのような免疫性が防御の第一線であり得る場合には特に有用である。しかし、この場合、宿主細胞が、ワクチン接種されている個体に対して弱毒化されていることが必須である。
【０１７３】
好ましくは、生ワクチンにおいて使用される宿主細胞は病原体の弱毒化された誘導体である。最も好ましくは、弱毒化された誘導体は、腸管関連リンパ組織（ＧＡＬＴ）または気管関連リンパ組織（ＢＡＬＴ）に付着し、侵入し、持続することができる。そのような弱毒化された宿主細胞は、接種された動物に持続して、長期間にわたる抗原に対する暴露を生じさせることが知られているために好ましい。そのような長期の暴露期間は、抗原に対する免疫原性応答を誘導することにおいて非常に効果的であることが知られている。
【０１７４】
弱毒化は、任意の知られている手段によって微生物にもたらすことができる。そのような手段には、化学的変異誘発、および様々な組換え遺伝子の使用が含まれる。弱毒化をもたらす好ましい方法により、宿主細胞は病原性の状態に復帰できなくなる。弱毒化を宿主細胞にもたらす最も好ましい方法は、安定な変異または遺伝子挿入を組換え方法によって導入することによる。そのような方法の非限定的な例には、下記が挙げられる：（１）芳香族アミノ酸、およびこの経路における前駆体に由来するビタミンに対する要求を負わす変異を導入すること（Ｓｔｏｃｋｅｒ他、１９８３、Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．Ｓｔａｎｄ．５３：４７〜５４；ＨｏｉｓｅｔｈおよびＳｔｏｃｋｅｒ、１９８１、Ｎａｔｕｒｅ、２９１：２３８〜９）；（２）範囲の広い調節因子に対する遺伝子を変異させること、例えば、ｃｙａおよびｃｙｐ（米国特許第５，３８９，３６８号、同第５，８５５，８７９号、同第５，８５５，８８０号、同第５，２４９，４４１号および同第５，４６８，４８５号）、ｐｈｏＰ（米国特許第５，４２４，０６５号）、ｏｍｐＲ（Ｄｏｒｍａｎ他、１９８９、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．５７：２１３６〜４０）およびｐｏｘＡ（米国特許出願第０８／８２９，４０２号）など；（３）リポ多糖（ＬＰＳ）合成に対する遺伝子を変異させること、例えば、ｇａｌＥ（Ｇｅｒｍａｎｉｅｒ他、１９７５、Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１３１：５５３〜８）など、しかし、これは単独では不十分である場合がある（Ｈｏｎｅ他、１９８８、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．５６：１３２５〜３３）；（４）深部組織における定着に必要な遺伝子を変異させること、例えば、ｃｄｔ（米国特許第５，３８７，７４４号）など；または（５）高い温度で要求されるプロテアーゼに対する遺伝子の発現を妨げること、例えば、ｈｔｒＡ（Ｊｏｈｎｓｏｎ他、１９９１、Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５：４０１〜７）など。
【０１７５】
一旦弱毒化されると、微生物は、微生物に対する免疫性を誘導するために、ワクチンの免疫原性成分として使用することができる。したがって、無毒性を含む上記に記載された宿主細胞の特徴を有する任意の微生物の使用が本発明によって考えられる。そのような微生物には、大腸菌、サルモネラ菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｓｐｐ．）、大腸菌−ネズミチフス菌（Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）ハイブリッド、赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｓｐｐ．）、エルシニア菌（Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｓｐｐ．）、パスツレラ菌（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｓｐｐ．）、レジオネラ菌（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｓｐｐ．）またはブルセラ菌（Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ｓｐｐ．）が含まれるが、これらに限定されない。好ましい微生物は、ネズミチフス菌（Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、チフス菌（Ｓ．ｔｙｐｈｉ）、パラチフス菌（Ｓ．ｐａｒａｔｙｐｈｉ）、Ｓ．ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ、腸炎菌（Ｓ．ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ）、豚コレラ菌（Ｓ．ｃｈｏｌｅｒａｅｓｉｕｓ）、Ｓ．ａｒｉｚｏｎａ、またはＳ．ｄｕｂｌｉｎなどのサルモネラ属のメンバーである。
【０１７６】
生細菌抗原送達システム。抗原送達システムとして使用される好ましい宿主は腸内細菌である。本明細書中で使用される用語「抗原送達システム」および用語「抗原送達微生物」は、抗原を産生する微生物、または抗原をコードする移入ベクターを有する微生物をいう。本明細書中で使用される「腸内細菌」は任意の腸内細菌科をいう。本明細書中に記載されている多くの好ましい遺伝子および調節エレメントは、ほとんどの腸内細菌で作動可能であり、したがって、多くの十分に開発された大腸菌調節システムおよびサルモネラ調節システムの使用を可能にする。最も好ましくは、細菌宿主は病原性サルモネラの弱毒化された誘導体である。
【０１７７】
本明細書中に記載されるシステムの１つの実施形態では、腸管関連リンパ組織（ＧＡＬＴ）または気管関連リンパ組織（ＢＡＬＴ）に付着し、侵入し、持続する、病原性微生物の弱毒化された誘導体が、病原体またはアレルゲンに対する免疫応答を刺激するために使用される遺伝子産物のキャリアとして使用される。弱毒化は、そのような属または種の微生物が疾患を決して発症させ得ないことを意味するのではなく、使用されている特定の微生物が、処置されている特定の動物に関して弱毒化されていることを意味する。微生物は、通常の場合に病原性である属、またはまさにそのような種に属し得るが、弱毒化されている菌株に属さなければならない。病原性により、疾患を生じさせ得ること、または正常な生理学的機能を損ない得ることが意味される。弱毒化された菌株は、その毒性の病原性対応体に通常的には関連する疾患の完全な症状群を誘導することができない。本明細書中で使用される微生物には、細菌、原生動物、寄生虫、単細胞菌類、および多細胞菌類が含まれる。
【０１７８】
赤痢菌属菌または細胞侵入性大腸菌は、結腸粘膜内への侵入が結腸に隣接するリンパ組織を刺激し、生殖管における強い粘膜免疫応答を刺激するようになり得るので、抗原送達システムにおいて有用であり得る。直腸免疫化は、結腸に対するリンパ節およびリンパ腺に近いことなどの解剖学的特徴のために効果的であり得る。
【０１７９】
ワクチンが抗体の誘導において効果的であるためには、ワクチン接種された動物の抗体産生機構が作用し得るような方法で、抗原性物質が放出されなければならない。したがって、遺伝子産物の微生物キャリアは動物の体内に導入されなければならない。以前に議論されたようにＧＡＬＴ細胞またはＢＡＬＴ細胞の好ましい応答を刺激するためには、微生物または遺伝子産物を、例えば、経口投与もしく胃挿管によって、または鼻腔内投与の形態で、腸管内または気管支内に直接的に導入することが好ましいが、静脈内注射、筋肉内注射、皮下注射または乳房内投与もしくは腹腔内投与もしくは膣内投与などの他のワクチン投与方法も可能である。
【０１８０】
弱毒化された微生物がワクチンとして使用される場合、抗原は、動物の免疫系に到達できるようにする必要がある。これは、キャリア微生物が死傷し、その結果、抗原分子が放出されたときに達成され得る。当然のことではあるが、溶解することなくペリプラズムの内容物を放出する「漏出」性の弱毒化された変異体の使用もまた可能である。あるいは、キャリア細胞により利用可能になる抗原を細胞の死に先立って外側の環境に産生することを制御する遺伝子を選択することができる。
【０１８１】
抗原。生きている組換えＲＡＤＳ微生物は、宿主微生物において発現し得る何らかの生成物を送達するために使用することができる。この目的のために好ましい発現産物は抗原である。例えば、抗原は、細菌感染症、ウイルス感染症、真菌感染症および寄生虫感染症から保護するための、それぞれ、細菌病原体、ウイルス病原体、真菌病原体および寄生虫病原体；抗原が配偶子特異的であるならば、受精を阻止するための配偶子；およびガンを停止させるための腫瘍抗原に由来し得る。新しく同定された生物、または疾患状態もしくは病原性状態に新しく付随する生物に由来する抗原、あるいは動物またはヒトの新しい病原体または現れた病原体（現在知られている病原体または将来同定される病原体を含む）に由来する抗原がＲＡＤＳにおいて使用され得ることが特に考えられる。さらに、ＲＡＤＳにおいて使用される抗原は、病原性生物に由来する抗原に限定されない。抗原の選択および組換え発現は、Ｓｃｈｏｄｅｌ（１９９２）およびＣｕｒｔｉｓｓ（１９９０）によって以前に記載されている。微生物の免疫原性は、サイトカイン、アジュバントおよび他の免疫調節因子に対する遺伝子をも発現する菌株を構築することによって強化および／または調節することができる。
【０１８２】
抗原の供給源として有用な微生物のいくつかの例を下記に列挙する。これらには、ペスト菌（Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｐｅｓｔｉｓ）および他のエルシニア属種（偽結核エルシニア菌（Ｙ．ｐｓｅｕｄｏｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）およびＹ．ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａなど）により引き起こされる伝染病を防止するための微生物、淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａ）により引き起こされる淋病を防止するための微生物、梅毒トレポネーマ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｐａｌｌｉｄｕｍ）により引き起こされる梅毒を防止するための微生物、ならびにトラコーマクラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）により引き起こされる目疾患だけでなく性病を防止するための微生物が含まれる。Ａ群およびＢ群の両方に由来する連鎖球菌属の種（咽頭炎または心疾患を引き起こすそのような種など）、豚丹毒菌（Ｅｒｉｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ  ｒｈｕｓｉｏｐａｔｈｉａｅ）、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、肺炎マイコプラズマ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）および他のマイコプラズマ種、インフルエンザ菌（Ｈｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ）、百日咳菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、らい菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｅｐｒａｅ）、ボルデテラ属種、大腸菌、腺疫菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｑｕｉ）、肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、ウシ流産菌（Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ａｂｏｒｔｕｓ）、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｈｅｍｏｌｙｔｉｃａおよびＰ．ｍｕｌｔｏｃｉｄａ、コレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａ）、赤痢菌属種、ボレリア属種、バルトネラ属種、ピロリ菌（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ）、カンピロバクター属種、シュードモナス属種、モラクセラ属種、ブルセラ属種、フランシセラ属種、アエロモナス属種、アクチノバチルス属種、クロストリジウム属種、リケッチア属種、バチルス属種、コクシエラ属種、エールリヒア属種、リステリア属種、ならびにＬｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ（在郷軍人病桿菌）は、抗原遺伝子を得ることができる、本発明の範囲に含まれる細菌のさらなる例である。ウイルス抗原もまたＲＡＤＳにおいて使用することができる。ウイルス抗原は、例えば、パポバウイルス属、アデノウイルス属、ヘルペスウイルス属、ポックスウイルス属、パルボウイルス属、レオウイルス属、ピコルナウイルス属、ミキソウイルス属、パラミキソウイルス属、フラビウイルス属またはレトロウイルス属に由来するウイルス（ＤＮＡウイルスまたはＲＮＡウイルスのどちらも）に対する抗原送達微生物において使用することができる。病原性の菌類、原生動物および寄生虫の抗原を使用する抗原送達微生物もまた使用することができる。
【０１８３】
いくつかのワクチン実施形態には、所望する遺伝子がアレルゲンをコードするＲＡＤＳシステムを含む微生物の利用が含まれる。そのようなワクチンは、アレルゲン性宿主を特異的に脱感作することを目的とする暴露療法において使用することができる。アレルゲンは、それにさらされた動物においてアレルギー反応を生じさせる物質である。アレルギー反応は、Ｉ型過敏症または即時過敏症としても知られているが、ある種の細胞免疫応答と一緒になったＩｇＥ産生を特徴とする脊椎動物の免疫応答である。動物の鱗屑および花粉などの多くの種々の物質がアレルゲンになり得る。個々の動物のアレルギー反応は何らかの特定のアレルゲンに対して異なる。アレルギー応答を通常的に示す動物においてアレルゲンに対する寛容性を誘導することは可能である。寛容性を誘導する方法はよく知られており、一般には、投薬量を増大させながらアレルゲンを動物に投与することを含む。
【０１８４】
組換え弱毒化サルモネラは、外来抗原に対して、したがって、外来抗原の供給源である病原体に対して強い粘膜性免疫応答、全身性免疫応答および細胞免疫応答を刺激することができる。抗原遺伝子は、高分子（例えば、機能性ポリペプチド）産生することができたか、またはその産生を調節することができた、元の生物に存在するような完全な遺伝子であることは必ずしも必要ではない。遺伝子は、抗原性生成物を産生させる際のガイドとして使用されるテンプレートとして役立ち得ることだけが必要である。生成物は、その正確な形態で元の生物において見出されなかったものであってもよい。例えば、１００アミノ酸残基を含むポリペプチド抗原をコードする機能的な遺伝子は、わずかに７５個のアミノ酸残基または１０個ものアミノ酸残基を含むペプチドが宿主細胞の細胞機構によって産生されるように、キャリア微生物に部分的に移すことができる。あるいは、特定の抗原またはそのフラグメントのアミノ酸配列が知られている場合、ＤＮＡフラグメントまたはそのアナログを、自動化された遺伝子合成装置、ＰＣＲなどによって化学合成して、前記ＤＮＡ配列を適切な発現ベクターに導入することが可能である。その適用範囲のもう一方の目的においては、１つまたはすべてが抗原性であり得るいくつかの遺伝子産物をコードするＤＮＡの長い部分である。
【０１８５】
複数の抗原を、組換えの無毒性サルモネラ属菌株によって発現させることができる。さらに、Ｂ細胞エピトープを構成するか、または免疫応答が所望される抗原の領域を規定する抗原または抗原の一部分でさえ、キャリアタンパク質に対する融合体として発現させることができる。この場合、キャリアタンパク質は、強い無差別的なＴ細胞エピトープを含有し、かつ／またはアジュバントとして役立ち、かつ／または抗原の提示を促進して、すべての場合に、抗原もしくはその構成成分の一部に対する免疫応答を増強する。これは、弱毒化された菌株による発現のためにそのような融合体を規定するようにＤＮＡ配列を遺伝子操作することによって容易に達成することができる。破傷風毒素フラグメントＣ、ＣＴ−Ｂ、ＬＴ−ＢおよびＢ型肝炎ウイルスコアに対する融合体がこのような目的に対して特に有用であるが、他のエピトープ提示システムもこの分野では十分に知られている。
【０１８６】
発現遺伝子が免疫応答の誘発において効果的であるためには、その発現遺伝子が発現されなければならない。これは上記に記載されるように達成され得る。抗原送達微生物が個体の免疫化において効果的であるためには、抗原性物質が、ワクチン接種された動物の免疫系が作用し得るような方法で放出されなければならない。したがって、生きている無毒性微生物を動物の体内に導入しなければならない。以前に議論されたようにＧＡＬＴ細胞またはＢＡＬＴ細胞の好ましい応答を刺激するためには、微生物または遺伝子産物を、例えば、経口投与もしく鼻腔内投与もしくは胃挿管によって、またはエアロゾルの形態で腸管内または気管支内に直接的に導入することが好ましいが、静脈内注射、筋肉内注射、皮下注射または乳房内投与もしくは腹腔内投与もしくは直腸内投与もしくは膣内投与などの、抗原送達微生物の他の投与方法も可能である。
【０１８７】
抗原送達組成物。抗原送達微生物の好ましい使用は、送達された抗原に対する免疫応答を刺激するためのワクチンとしてである。生きた組換えサルモネラワクチン菌株を用いた好適な動物宿主における経口免疫化は、腸管関連リンパ組織（ＧＡＬＴ）またはパイエル板における定着をもたらし、これにより、サルモネラ抗原および組換えサルモネラにより合成された外来抗原の両方に対する全身的な粘膜免疫応答の誘導がもたらされる（Ｃｕｒｔｉｓｓ他、Ａｄｖ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．２５１：３３〜４７（１９８９））。ワクチン菌株が腸間膜リンパ節、肝臓および脾臓にさらに進入することにより、サルモネラ抗原および組換えサルモネラにより作製された外来抗原に対する全身性免疫応答および細胞性免疫応答の誘導が増強される（ＤｏｇｇｅｔｔおよびＣｕｒｔｉｓｓ（１９９２））。したがって、組換えの無毒性サルモネラワクチンを経口免疫化のために使用することにより、免疫系の３つの支系のすべてが刺激される。これは、粘膜表面に定着し、かつ／または粘膜表面を浸入する感染性病原体に対して免疫化するときには特に重要である。
【０１８８】
ワクチンにより、生きている生物の免疫系を刺激して、免疫応答が生じるようにするために使用される薬剤が意味される。好ましくは、ワクチンは、生きている生物の免疫系を刺激して、将来の害からの保護をもたらすようにするために十分である。免疫化は、Ｔリンパ球が病原体を殺傷し、かつ／または生物においてそうするように他の細胞（例えば、食細胞）を活性化する継続した高レベルの抗体および／または細胞性免疫応答を誘導するプロセスをいう。そのようなプロセスは、生物が以前にさらされた病原体または抗原に対するものである。表現「免疫系」は異物の存在に対する単細胞生物の応答（すなわち、インターフェロン産生）を包含し得るが、本明細書中で使用されているように、この表現は、生物の細胞または生物の細胞外液に浸入する抗原性物質に対して多細胞生物が応答する解剖学的特徴および機構に限定される。そのようにして産生された抗体は、免疫グロブリンＡ、Ｄ、Ｅ、ＧまたはＭなどの免疫学的クラスのいずれかに属し得る。特に注目されるのは、免疫グロブリンＡ（ＩｇＡ）の産生を刺激するワクチンである。これは、ＩｇＡが温血動物の分泌系によって産生される主要な免疫グロブリンであるからである。しかし、本明細書中に記載されるワクチンは、ＩｇＡの産生を刺激するワクチンに限定されない。例えば、本明細書中に記載される性質のワクチンは、ＩｇＡの形成に加えて広範囲の他の免疫応答、例えば、細胞性および液性の免疫性をもたらし得る。抗原に対する免疫応答はよく研究され、広く報告されている。免疫学の概説が、Ｐａｕｌ編（１９９９）、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、第４版、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ：Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ，Ｓｉｔｅｓ他、Ｂａｓｉｃ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｌａｎｇｅ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｂｏｏｋｓ、Ｌｏｓ  Ａｔｌｏｓ、ＣＡ、１９９４）、およびＯｒｇａ他、Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｍｕｃｏｓａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、１９９４）に示される。粘膜免疫性はまた、Ｏｇｒａ他編（１９９９）、Ｍｕｃｏｓａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（第２版、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ）によって記載されている。
【０１８９】
本発明のワクチンで処置される個体は、すべての脊椎動物、例えば、家畜およびヒトを含む哺乳動物、飼育されている鳥類を含む鳥類の様々な種（特に、農業的に重要な鳥類）を含むとして、本明細書中では規定される。好ましくは、個体は温血動物である。
【０１９０】
免疫応答を誘発させるために必要な生組換えワクチンの投薬量は、クローン化されている組換え発現産物の抗原性によって変化し、既存のワクチンの典型的な免疫応答を誘導するために十分な投薬量にすることだけが必要である。日常的な実験により、必要とされる投薬量が容易に確立される。経口投与されるワクチンの典型的な最初の投薬量は、免疫化される個体のサイズおよび年齢に依存して、１×１０７ＣＦＵ〜１×１０１１ＣＦＵであり得る。多数回の投薬を施すこともまた、所望するレベルの保護免疫性をもたらすために必要に応じて使用することができる。ワクチンが懸濁される薬学的キャリアは、接種された動物に対して非毒性であり、かつキャリア生物または抗原性遺伝子産物と適合し得る任意の溶媒またはカプセル化用固体物質であり得る。好適な薬学的キャリアには、通常の生理的食塩水などの液体キャリア、および生理学的濃度またはそれに近い濃度の他の非毒性の塩、およびヒトに対して使用されない固体キャリア（タルクまたはスクロースなど）、または動物飼料が挙げられる。アジュバントを、所望する場合には抗原性を高めるために加えることができる。気管支を介して投与するために使用される場合、ワクチンは、好ましくは、エアロゾルの形態で与えられる。
【０１９１】
病原体に由来する遺伝子産物による免疫化はまた、病原体に由来する組換え遺伝子により規定される遺伝子産物を発現させるためのキャリアとして作用する病原性微生物の弱毒化された誘導体による前免疫化と組み合わせて使用することができる。そのような非経口的免疫化は、そのような病原体由来の遺伝子産物に対する分泌性免疫系が、ＧＡＬＴまたはＢＡＬＴのリンパ様細胞を刺激するために病原体由来の遺伝子産物を発現するキャリア微生物による免疫化によって抗原刺激されると、分泌性免疫応答の発現を高めるための追加抗原刺激として役立ち得る。増強された応答は、二次的応答、追加抗原刺激応答、または既往性応答として知られており、宿主の長期間の免疫保護をもたらす。追加抗原刺激による免疫化は多数回繰り返すことができ、有益な結果が得られている。
【０１９２】
抗原送達微生物は、粘膜性免疫応答を刺激する経路によって、すなわち、経口的、鼻腔内、膣内、および直腸内に投与することが好ましいが、このような微生物はまた、筋肉内に、静脈内に、そして他の非経口的経路で送達することができる。抗原送達微生物の投与はまた、精製された抗原性成分の非経口的投与と組み合わせることができる。ガンを抑制または処置するためにＥＬＶＳが使用される場合には、ＥＬＶＳを非経口的に投与することが好ましい。
【０１９３】
有用な宿主菌株に対するＲＡＤＳの適合化。Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍの無毒性菌株は、マウス、ニワトリ、およびブタにおいて完全に無毒化され、かつ非常に免疫原性であることが知られており、毒性野生型菌株の致死量の１０，０００倍での感染に対する保護免疫性を誘導する。同様に、Ｓ．ｃｈｏｌｅｒａｅｓｕｉｓの無毒性菌株は、マウスおよびブタにおいて弱毒化され、免疫原性であり、そしてまた十分な保護免疫性をもたらす。Ｓ．ｄｕｂｌｉｎの無毒性菌株が単離され、試験されて、子ウシにおいて無毒性で、免疫原性で、かつ保護的であることが見出されている。弱毒化されたＳ．ｔｙｐｈｉ菌株もまた構築され、そしてヒト志願者における顕著な免疫応答を誘導することが見出されている。Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ（コレラ菌）およびＳｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉ（フレクスナー赤痢菌）の弱毒化された誘導体もまた構築され、そしてヒト志願者における顕著な免疫応答を誘導するワクチンとして使用されている。Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｏｖｉｓ  ＢＣＧ株もまた、ヒトを経口免疫化するために使用されている。弱毒化されたＬｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓもまた、マウスを免疫化するための生ワクチンとして使用されている。関連する毒性の野生型菌株による感染に対して動物およびヒトの宿主を免疫化するためのワクチンとして役立つことに加えて、上記微生物の弱毒化された誘導体もまた、様々な外来抗原を発現するようにそれらを遺伝子操作することによって抗原送達ベクターとして使用することができる。これらの抗原は、細菌、ウイルス、菌類および寄生虫の病原体に由来し得るか、またはアレルゲンであり得るか、または避妊用ワクチンにおける配偶子特異的抗原もしくは抗ガンワクチンにおける腫瘍抗原であり得る。これらの組換え無毒性生ワクチンによる動物宿主および／またはヒト宿主の免疫化は、外来抗原に対して、そして外来抗原を規定する遺伝子が単離された病原体に対して、またはアレルゲンに対して、または精子もしくは卵に対して、または腫瘍細胞に対して、それぞれ、粘膜性、全身性および細胞性の免疫応答を誘導することが知られている。
【０１９４】
細菌病原体は、上記に記載されているように、または当業者に知られているように、様々な遺伝子における欠失変異を導入することによって弱毒化することができる。これらの菌株はどれも、本明細書中に開示されている種類のＲＡＤＳを導入するために好適であるが、様々な改変が、グラム陽性細菌においてこのシステムを作動可能にするために必要である。具体的には、これらの改変は、この分野では知られているように、ｍＲＮＡの翻訳を可能にするシャイン−ダルガルノ配列の改変、および転写をより効率的にさせるためのプロモーター配列におけるわずかな変化を必要とする。
【０１９５】
上記に開示されているタイプの生ワクチンの動物への投与は、任意の知られている技術または標準的な技術によって行うことができる。これらの技術には、経口摂取、胃挿管、または気管支−鼻腔噴霧が含まれる。これらの方法はすべて、生ワクチンをＧＡＬＴ細胞またはＢＡＬＴ細胞に容易に到達させることができ、かつ抗体形成を誘導することができ、そして好ましい投与方法である。キャリア微生物を動物の血流に到達させることができる静脈内注射などの他の投与方法も受容可能であり得る。静脈内注射、筋肉内注射または乳房内注射もまた、下記に記載されるように、本発明の他の実施形態とともに受容可能である。
【０１９６】
好ましい投与方法は経口摂取、エアロゾル噴霧および胃挿管であるので、好ましいキャリア微生物は、ワクチン接種される動物の腸管または気管支のリンパ上皮構造のいずれにも優先的にコロニー形成する種に属する微生物である。好ましくは、このような菌株は、腸内病原性菌株を遺伝子操作することによって作製された、腸内病原性菌株の弱毒化された誘導体である。パイエル板に定着し、したがって、ＩｇＡの産生を直接的に刺激する菌株が最も好ましい。動物において、このような菌株には、サルモネラ属の特定の菌株、およびパイエル板にコロニー形成するサルモネラ−大腸菌ハイブリッドが含まれる。
【０１９７】
必要な投薬量は遺伝子産物の抗原性により変化し、既存のワクチンの典型的な免疫応答を誘導するために十分な量にすることだけが必要である。日常的な実験により、必要とされる量が容易に確立される。ワクチンの典型的な最初の投薬量は０．００１〜０．１ｍｇ抗原／ｋｇ体重であり得るが、増大した量または多数回の投薬も、所望するレベルの保護をもたらすために必要に応じて使用される。
【０１９８】
ワクチンが懸濁または溶解される薬学的キャリアは、接種された動物に対して非毒性であり、かつキャリア生物または抗原性遺伝子産物と適合し得る任意の溶媒または固体であり得るか、そのような物質にカプセル化され得る。好適な薬学的キャリアには、通常の生理的食塩水などの液体キャリア、および生理学的濃度またはそれに近い濃度の他の非毒性の塩、およびヒトに対して使用されない固体キャリア（例えば、タルク、スクロースおよび農場動物用飼料など）が挙げられる。アジュバントを、所望する場合には抗原性を高めるために加えることができる。気管支を介して投与するために使用される場合、ワクチンは、好ましくは、エアロゾルの形態で与えられる。
【０１９９】
病原体に由来する遺伝子産物による免疫化もまた、病原体に由来する組換え遺伝子により規定される遺伝子産物を発現させるためのキャリアとして作用する病原性微生物の弱毒化された誘導体による前免疫化と組み合わせて使用することができる。そのような非経口的免疫化は、そのような病原体由来の遺伝子産物に対する分泌性免疫系が、ＧＡＬＴまたはＢＡＬＴのリンパ様細胞を刺激するために、所望する遺伝子産物を発現するキャリア微生物による免疫化によって抗原刺激されると、分泌性免疫応答の発現を高めるための追加抗原刺激として役立ち得る。増強された応答は、二次的応答、追加抗原刺激応答または既往性応答として知られており、宿主の長期間の免疫保護をもたらす。追加抗原刺激による免疫化は多数回繰り返すことができ、有益な結果が得られている。
【０２００】
本発明の他の実施形態において、病原性微生物の組換え弱毒化誘導体を、接種された動物において治療的である遺伝子産物を動物宿主において発現させるために使用することができる。そのような生成物の非限定的な例として、免疫応答を調節するリンホカインまたはサイトカイン（Ｓａｌｔｚｍａｎ他、１９９６、Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏ．Ｔｈｅｒ．Ｒａｄｉｏｌ．Ｐｈａｒｍ．１１：１４５〜１５３；Ｓａｌｔｚｍａｎ他、１９９７、Ｊ．Ｐｅｄｉａｔｒｉｃ．Ｓｕｒｇ．３２：３０１〜３０６；Ｗｈｉｔｔｌｅ他、１９９７、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４６：１０２９〜１０３８、１９９７；Ｄｕｎｓｔａｎ他、１９９６、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６４：２７３０〜２７３６）、受精能力を停止させるための精子特異的自己抗原および卵特異的自己抗原（米国特許第５，６５６，４８８号）、凝固因子などの血液産物、特異的抗体、例えば、腫瘍または病原体（ウイルス、菌類、寄生虫または細菌など）に結合する特異的抗体；宿主において十分に産生されていない増殖因子、必須酵素または構造タンパク質、望ましくない遺伝子産物（例えば、腫瘍転移または腫瘍の血管形成に必須な遺伝子産物；病原体が疾患を生じさせるために必須な遺伝子産物）をコードする核酸を切断または不活性化するリボザイムまたはアンチセンスＲＮＡ、あるいは固形腫瘍を有する個体においてプロドラッグを腫瘍細胞塊内で毒性薬物に変換する能力を有する酵素（Ｐａｗｅｌｅｋ他、１９９７、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５７：４５３７〜４４）が挙げられる。
【０２０１】
本発明の無毒性微生物は、ＧＡＬＴ、腸管膜リンパ節および脾臓を含む様々な免疫適格性の構造体を横断することができるので、そのような微生物はまた、様々な免疫調節性産物を産生させることによって免疫系を調節するために使用することができる。したがって、免疫調節性のタンパク質またはペプチドをコードする１つまたは複数の遺伝子を、微生物が適切な免疫適格性組織に常在することができ、そして所望する遺伝子産物を発現して、宿主の免疫応答を抑制、強化または改変するように、所望する遺伝子として弱毒化微生物に組換え的に導入することができる。免疫調節性分子の非限定的な例として、コロニー刺激因子（マクロファージ、顆粒球、または混合体）、マクロファージケモトキシン、マクロファージ阻害因子、白血球阻害因子、リンホカイン、芽球形成因子、インターフェロン、およびインターロイキンが挙げられる。
【０２０２】
弱毒化された微生物の誘導体もまた本発明の範囲内であると考えられる。誘導体とは、前記に宿主細胞の基本的な機能発現を保持している、一塩基または多塩基の置換、欠失、挿入または反転を含む無毒性菌株の有性的または無性的に誘導される子孫および変異体を意味する。
【０２０３】
本発明の好ましい実施形態が下記の実施例に記載される。本発明の請求項の範囲に含まれる他の実施形態が、本明細書中に開示されているように、本発明の明細書または実施を検討することから当業者には明らかになる。本明細書は、実施例とともに、単に例示として見なされるだけであることを意図しており、本発明の範囲および精神は、冒頭の特許請求の範囲によって示される。
【０２０４】
実施例
実施例１
ＲＡＶ用の弱毒化された抗原送達宿主としての細菌宿主菌株の構築
ＲＡＤＳは、実施例２に記載されるようなＲＡＶ構築物の存在、および許容されない条件に対して許容される条件のもとでのＲＡＶ上の遺伝子の調節を可能する染色体欠失変異（挿入を伴うことが多い）の存在に依存する。図２における欠失／挿入変異１および２が、記載されたほとんどのＲＡＶの維持のためには一般に必要であるが、欠失／挿入変異２が、下記の実施例に記載されるＲＡＶの１つの維持および機能には十分である。ΔａｓｄＡ１９：：ＴＴａｒａＣＰＢＡＤｃ２ＴＴおよびΔｉｌｖＧ３：：ＴＴａｒａＣＰＢＡＤｌａｃＩＴＴなどの変異の導入が自殺ベクターの使用によって最もよく達成される。上記に述べられているように、ａｒａＣＰＢＡＤ調節システムは、ＰＢＡＤプロモーターから始まる転写のアクチベーターとして作用し、したがってｃ２および／またはｌａｃＩのｍＲＮＡの翻訳後に、リプレッサータンパク質産物のＣ２および／またはＬａｃＩの合成を生じさせるＡｒａＣタンパク質に、遊離の糖として供給されたアラビノースが結合することを可能にする。ＴＴａｒａＣＰＢＡＤｃ２ＴＴ生成物の分子構築、およびａｓｄ遺伝子の１２４４ｂｐ欠失へのその挿入、ならびにＴＴａｒａＣＰＢＡＤｌａｃＩＴＴ構築物の分子遺伝的構築およびΔｉｌｖＧ３変異へのその挿入は国際特許出願公開ＷＯ９６／４０９４７に記載されている（ｉｌｖＧ３変異は国際特許出願公開ＷＯ９６／４０９４７ではΔｒｅｌＡ３と誤って名付けられていることには留意しなければならない）。これらの分子構築物は、ｐＭＥＧ−３７５（図３）などの自殺ベクター内に置くことができる。この場合、自殺ベクターは、自殺ベクターが染色体に挿入されている一次組換え体を選択するためのアンピリシン耐性遺伝子およびクロラムフェニコール耐性遺伝子を有し、そしてまたスクロースの加水分解に必要なレバンスクラーゼをコードするｓａｃＢ遺伝子を有する。後者は、願わくば対立遺伝子置換に関連した二次的な組換え事象により自殺ベクターを失っている組換え体の選択を可能にする。自殺ベクターはまた、組み込まれているＩｎｃＰ接合性プラスミドを有する菌株からのその可動化および接合を可能にするＩｎｃＰプラスミド由来のｍｏｂ配列を含む。ｐＭＥＧ−３７５はまた、プラスミドＲ６Ｋに由来する複製起点を有する。この複製起点は、遺伝子ｐｉｒに依存しており、ＭＧＮ−６１７（表１）などの自殺ベクタードナー菌株の染色体にバクテリオファージλのプロファージで導入される。ΔａｓｄＡ１９：：ＴＴａｒａＣＰＢＡＤｃ２ＴＴがｐＭＥＧ−３７５に挿入されたとき、自殺ベクターｐＭＥＧ−６１１（図４）が得られる。ｐＭＥＧ−６１１は、形質転換またはエレクトロポレーションのどちらによっても自殺ベクター接合性ドナー菌株ＭＧＮ−６１７（表１）に導入することができる。ＭＧＮ−６１７はまた、ＤＡＰに対する絶対的要求を生じさせるΔａｓｄ変異を有する。したがって、ｐＭＥＧ−６１１（図４）などの自殺ベクターを含有するＭＧＮ−６１７は、ＤＡＰの存在下でχ３７６１などの好適なＳ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ受容菌株と接合させることができ、そしてプラスミドベクター上のａｓｄ遺伝子に隣接する相同的な配列と、染色体上の相同的な配列との間での１回の相互乗��えによってｐＭＥＧ−６１１自殺ベクターを受け継いだ接合体は、アンピシリン耐性およびクロラムフェニコール耐性の生存体になる（ＤＡＰはこの選択培地には含まれず、その結果、自殺ベクターに対して許容性であるＭＧＮ−６１７細胞は溶解により生存できない）。１回の乗換えによるこれらの組込み体は、アンピリシンまたはクロラムフェニコールを含有するが、ＤＡＰを含まない培地における再画線培養によって精製することができる。その後、これらの薬物耐性単離体の少量の培養物を調製して、５％スクロースおよびＤＡＰを含有する培地で平板培養することができる（その結果、ΔａｓｄＡ１９：：ＴＴａｒａＣＰＢＡＤｃ２ＴＴ変異を受け継ぐ細胞が生存する）。自殺プラスミドが細菌の染色体に依然として存在する場合、細菌は死傷するが、これに対して、自殺ベクターを染色体から切り出す２回目の乗換え事象が生じた場合、細菌は生存し、コロニーを形成する。２回目の乗換え事象が、最初の乗換え事象に関与していたように、ａｓｄ欠失変異の反対側で生じた場合、対立遺伝子置換が生じ、その結果、今度は、染色体内の野生型ａｓｄ＋対立遺伝子がΔａｓｄＡ１９：：ＴＴａｒａＣＰＢＡＤｃ２ＴＴ欠失／挿入変異で置換される。ＤＮＡプローブの使用および好適なオリゴヌクレオチドプローブを用いたＰＣＲの使用によって、構築物が染色体に安定に存在することの証明を確認することができる。これには、野生型ａｓｄ＋対立遺伝子の非存在が含まれる。この場合、細菌は、ＤＡＰに対する絶対的な要求性を有している。
【０２０５】
ΔｉｌｖＧ３：：ＴＴａｒａＣＰＢＡＤｌａｃＩＴＴ欠失／挿入変異を導入するための対立遺伝子置換のために使用される自殺ベクターがｐＭＥＧ−２４９（図５）として示されている。ｐＭＥＧ−２４９の自殺ベクター部分は、クロラムフェニコール耐性遺伝子が存在しない点でｐＭＥＧ−６１１の自殺ベクター部分とわずかに異なるが、自殺ベクター構築物の他の性質は同じであり、自殺ベクタードナー菌株ＭＧＮ−６７１から接合させることができる。
【０２０６】
前に述べられているように、変異１および２（図２）を有する細菌宿主におけるＲＡＶは、アラビノースを含む培地から、アラビノースを含まない培地に移動させたとき、極めて迅速にラナウェイ複製を開始して、増殖を２世代の内に停止させることができる。アラビノース利用速度を低下させる１つの方法は、変異３（すなわち、ΔａｒａＢＡＤ１９２３）を含めることである。この変異により、アラビノースを分解する酵素に対する構造遺伝子が除かれ、したがって、細胞内に取り込まれたアラビノースが、漏出するか、またはそれぞれのその後の細胞分裂時に濃度が低下するまで細胞内に留まる。したがって、変異１、２、および３（図２）を有する細菌菌株は、外因性アラビノースの非存在下で、図１に示されるような変異１および２のみを有する菌株に対する場合よりも長い時間の後でラナウェイ複製を開始する。図６には、ΔａｒａＢＡＤ１９２３欠失変異を、構築しようとする菌株の染色体に送達するための自殺ベクターｐＹＡ３４８４が示されている。対立遺伝子交換を達成するための手順は、ΔａｓｄＡ１９：：ＴＴａｒａＣＰＢＡＤｃ２ＴＴ欠失／挿入変異について詳しく上記に記載されている通りである。しかし、５％スクロースの存在下での平板培養は、１％アラビノース（および菌株がΔａｓｄＡ１９：：ＴＴａｒａＣＰＢＡＤｃ２ＴＴ変異をも有する場合にはＤＡＰ）を含有するマッコンキー−Ａｒａ平板で行われる。対立遺伝子置換の成功は、Ａｒａ−非発酵性単離体を同定するために３７℃で１６時間のインキュベーションを行った後に平板を調べることによって認識される。
【０２０７】
上記に述べられているように、アラビノースの代謝的分解を妨げる変異３を有する菌株では、アラビノースの存在下で増殖した細胞によって取り込まれたアラビノースの一部を漏出させ得ることが可能である。このため、ΔａｒａＥ２５変異（図２）である変異７を、自殺ベクターｐＹＡ３４８５（図７）を使用する菌株に導入することができる。ａｒａＥ遺伝子はアラビノースに対する低親和性の輸送タンパク質をコードしており、その非存在下では、より高濃度のアラビノースがａｒａＣＰＢＡＤ調節シグナルの発現のために必要とされるが、一旦内在化されると、アラビノースは細菌細胞からあまり効率的に漏出しない（Ｓｃｈｌｉｅｆ他、１３００頁〜１３０９頁（Ｎｅｉｄｈａｒｄｔ他））。したがって、変異１および２（図２）に加えてΔａｒａＢＡＤ１９２３およびΔａｒａＥ２５の変異を有する細菌菌株では、ＲＡＶのラナウェイ複製が、アラビノースを含む培地から、アラビノースを含まない培地に移動したときにさらに大きく遅れる。そのような菌株の構築においては、ΔａｒａＥ２５変異をΔａｒａＢＡＤ１９２３変異に先立って導入することが必要である。これは、ΔａｒａＥ２５変異を有する細菌はアラビノースを依然として発酵して、非常に遅いが、マッコンキー−Ａｒａ平板での色の変化を生じさせることができるからである。このため、３７℃で１６時間だけのインキュベーションの後でマッコンキー−Ａｒａ平板（５％スクロース、１％アラビノースおよび場合によってはＤＡＰを含有する）を調べることが重要である。それよりも長いインキュベーションは差異を妨げる。これは、ΔａｒａＥ２５対立遺伝子を有する細胞が最終的には十分なアラビノースを代謝して、野生型ａｒａＥ対立遺伝子を有する細胞からのコロニーにより示される色反応と識別できない色反応を生じさせるのに十分な酸を産生するからである。ΔａｒａＢＡＤ１９２３対立遺伝子を、ΔａｒａＥ２５変異を含む菌株に導入することにおける成功の認識は直接的である。３７℃で４０時間のインキュベーションの後で調べられたコロニーは、ΔａｒａＥ２５の親の場合にはＡｒａ＋表現型を示し、一方、ΔａｒａＥ２５変異およびΔａｒａＢＡＤ１９２３変異を有する二重変異体はアラビノースを発酵することができず、表現型がＡｒａ−であるからである。
【０２０８】
ＲＡＶ発現時期の調節におけるさらにより大きい遅れに対する菌株のさらなる改変を、変異３（図２）を２段階で改変することによって達成することができる。最初に、ΔａｒａＢＡＤ１９２３対立遺伝子が、ａｒａＢ遺伝子のいくつかのＮ末端アミノ酸をコードする配列を除くために改変され、そしてＮｃｏＩクローニング部位で置換され、この部位への他の遺伝子の挿入が可能になり、変異ΔａｒａＢＡＤ１９２４が作製される。これに関して、ΔａｒａＢＡＤ１９２４変異は、ａｒａＣＰＢＡＤプロモーター以外のアラビノースオペロンのすべての部分が欠失していることに留意しなければならない。したがって、改変されたΔａｒａＢＡＤ１９２４対立遺伝子（変異４、図２）は、ＡＴＧ開始コドンをコードするＮｃｏＩ部位を使用して様々な外来遺伝子が挿入され得る染色体内において天然のａｒａＣＰＢＡＤの等価体である。そのような誘導体の１つである変異５（図２）は、Ｐ２２ｃ２リプレッサー遺伝子をコードする。別の場合には、図２の変異６において、挿入は、ｃ２リプレッサー遺伝子およびｌａｃＩリプレッサーの両方を有し、ΔａｒａＢＡＤ１９２６対立遺伝子をもたらす。これらの両方の場合において、Ｃ２またはＣ２およびＬａｃＩのリプレッサータンパク質のレベルは、変異１および２（図２）のように、リプレッサー遺伝子の１コピーを有するだけの細胞に存在する濃度の２倍になるはずである。これらの二重リプレッサー遺伝子は、Ｃ２抑制可能なｐＵＣのＲＮＡＩＩ遺伝子、およびＲＡＶ上の外来抗原に対するＬａｃＩ抑制可能なＰｔｒｃ制御される遺伝子を抑制解除する時間をさらに遅らせる。
【０２０９】
候補ワクチン株は、動物宿主またはヒト宿主に対して無毒性にする変異を有して、それでもなお免疫原性を保持しなければならない。Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍを他のサルモネラ属血清型と同様に弱毒化することにおいて効果的である変異、および大きい免疫原性とともにそれらを生じさせる変異には、ΔｐｈｏＰ１９８９変異およびΔｐｈｏＰ２４変異（図２における変異８および９）などのｐｈｏＰＱオペロンにおける変異（米国特許第５，４２４，０６５号；Ｍｉｌｌｅｒ他、１９８９）が含まれる。対立遺伝子置換によりΔｐｈｏＰ１９８９対立遺伝子を導入するための自殺ベクターがｐＭＥＧ−５５０として図８に示され、そして対立遺伝子置換によりΔｐｈｏＰ２４変異を導入するための自殺ベクターが図９に示される。これらのｐｈｏＰ変異のいずれかを導入することの成功は、ｐｈｏＮ遺伝子によりコードされる非特異的な酸性ホスファターゼがｐｈｏＰ変異体では合成されないこと（Ｋｉｅｒ他、１９７９）についてスクリーニングすることによって達成される。これは、発色性のホスファターゼ基質のα−ナフチルホスファートを用いて軟寒天重層アッセイを使用することによって達成される（Ｋｉｅｒ他、１９９９、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１３８：１５５〜１６１）。変異型対立遺伝子が存在することに対する明確な証明が、欠失部のサイズを解明するためのＰＣＲ、ｐｈｏＰ配列が存在しないことを示すためのＤＮＡプローブハイブリダイゼーション、およびΔｐｈｏＰ変異に伴う表現型に対するスクリーニングを使用して達成される。このような表現型には、非特異的な酸性ホスファターゼを合成できないこと（Ｋｉｅｒ他、１９７９）；ポリミキシンＢ感受性；およびマクロファージによる死傷を受けやすいこと（Ｆｉｅｌｄｓ他、１９８９）が含まれる。
【０２１０】
ＲＡＤＳにおいて使用されるＲＡＶの構築
ＲＡＶのｐＭＥＧ−７７１（図１０）は、ｌａｃプロモーターを含むｐＭＥＧ−５４６（図１０）のＥａｇＩ−ＸｈｏＩフラグメントを除き、ｐＭＥＧ−１０４（図１０、および米国特許出願第０８／７６１，７６９号の図４）に由来するＰ２２ＰＲで置換することによって得られる。ｐＭＥＧ−５４６をＥａｇＩで消化し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼで処理して末端を平滑化し、次いでＸｈｏＩで消化する。これにより、Ｐｌａｃが除かれる。その後、ｐＭＥＧ−１０４をＨｉｎｄＩＩＩで消化して、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端化し、そしてＳａｌＩで消化する。５ＳＴ１Ｔ２転写ターミネーターおよびＰ２２ＰＲを含むｐＭＥＧ−１０４のこのフラグメントを、切断されたｐＭＥＧ−５４６に平滑末端連結して、ｐＭＥＧ−７７１（図１０）を作製する。ｐＭＥＧ−７７１は、アラビノースにより調節されるラナウェイ発現を生じさせるために、変異１および２（図２）と、変異３または５または６などの他の変異とを、場合によっては実施例１に記載されるような変異とともに含む宿主菌株と一緒に使用することができる。別のＲＡＶであるｐＭＥＧ−５４６（図１に記載される）は、ｉｌｖＧ３：：ＴＴａｒａＣＰＢＡＤｌａｃＩＴＴ欠失／挿入変異２（図２）内にコードされるｌａｃＩ遺伝子産物によって抑制され得る調節シグナルのすべてを有する。この場合、ｐＵＣのＲＮＡＩＩＡ転写物は、ＬａｃＩの非存在下では転写的に活性であり、ｐＵＣ様式の調節されない複製を生じさせるｌａｃプロモーター（Ｐｌａｃ）の制御下にある。さらに、ｐＭＥＧ−５４６における外来遺伝子の挿入部位は、転写開始において非常に効率的であり、かつＬａｃＩリプレッサータンパク質によってもまた抑制され得るハイブリッド型ｔｒｐ−ｌａｃプロモーターであるＰｔｒｃに隣接して、その下流にある（Ｂｒｏｓｓｉｕｓ，Ｊ．他（１９８４）、Ｇｅｎｅ、２７：１６１〜１７２）。ｐＭＥＧ−５４６は、ｐＭＥＧ−７７１のように、ｐＳＣ１０１の複製起点を有し、したがって、ＲＡＶ宿主菌株がアラビノース存在培地で増殖するとき、染色体ＤＮＡ等価体あたり５コピー〜６コピーのｐＭＥＧ−５４６が存在するだけであり、そしてこの低いコピー数のために、またＰｔｒｃから下流のマルチプルクローニング部位にクローン化されている外来抗原に対する何らかの遺伝子の発現が低いために、この菌株は非常に良好に増殖する。
【０２１１】
ワクチン株を免疫化された動物に導入したときにラナウェイベクターの複製発現の開始時期を遅らせる別の方法はリプレッサーの抑制能を高めることである。この増大した抑制は、その後、ｐＵＣのＲＮＡＩＩ転写物を作製するために、ｐＭＥＧ−７７１（図１）内のＰ２２ＰＲからの転写が開始されるまでの時間を遅らせる。これを達成するための１つの方法は、Ｐ２２Ｃ２リプレッサーおよびＬａｃＩリプレッサーの両方が、ｐＵＣのＲＮＡＩＩ転写物の合成を導く転写を阻止するように、ＬａｃＩリプレッサー結合部位（ｌａｃＲＢ）をＰ２２ＰＲの一部として挿入することによる。ｐＭＥＧ−７７１の改変体としてのそのような構築物が図１１に示されている。
【０２１２】
国際特許出願公開ＷＯ９６／４０９４７の図８には、ｐＭＥＧ−５４６（図１０）の特性を有するが、Ｐ２２ファージの溶解遺伝子ｌｙｓ−１３およびｌｙｓ−１９をもＰ２２ＰＲの制御下に含み、その結果、アラビノース存在培地からアラビノース非存在培地に移動することによって、Ｐ２２ｃ２遺伝子発現の停止はＣ２リプレッサーを低下させ、そしてＲＡＶ上のファージの溶解遺伝子の転写をもたらし、究極的には細菌の溶解および死を生じさせるラナウェイ溶解封じ込めベクターが示されている。ファージの溶解遺伝子を有する高コピー数プラスミドの発現に関する今日までの観測結果は、ストリンジェントな抑制のもとでさえ、転写によるある程度の漏出が生じ、集団内の一部の細胞の溶解による死が生じていることを明らかにしている。したがって、本発明者らは、細菌細胞壁の堅い層の必須構成成分であるＤＡＰの合成に必要な必須遺伝子ａｓｄの合成を停止させることによって遅れて開始する溶解を用いた。これは、ａｓｄのｍＲＮＡの翻訳効率を低下させるために、したがって、合成されるＡｓｄ酵素のレベルを低下させるために、ａｓｄ遺伝子の開始コドンがＡＴＧからＧＴＧに変化しているＴＴａｒａＣＰＢＡＤｃ２ＧＴＧａｓｄ配列を作製することによって達成された。ｐＭＥＧ−７７１のこの改変体が図１２に示されている。具体的には、ｐＹＡ３５３１（図２１）に由来する２．５ｋｂのＢｇｌＩＩ−ＮｄｅＩのＴＴａｒａＣＰＢＡＤｃ２ＧＴＧａｓｄＤＮＡフラグメントが、１位をＢｇｌＩＩで、そして８２７位をＮｄｅＩで部分消化されたｐＭＥＧ−７７１（図１）にサブクローン化される。その後、合成された転写ターミネーターが、Ｐｔｒｃプロモーターの前に位置するＢｇｌＩＩ部位に挿入され、図１２に示されるプラスミドが得られる。本発明者らは、ｃ２遺伝子を有しない同じ構築物を有しているが、ｃ２遺伝子がＲＡＶ上のＰ２２ＰＲの近くに存在することにより、ＰＲから開始される転写の抑制効率が高められている。これに関して、λおよびＰ２２などのバクテリオファージでは、リプレッサー遺伝子と、リプレッサーが結合するプロモーターとが隣接しており、したがって抑制効率を高めていることに留意しなければならない。これは、明らかに、リプレッサー遺伝子産物の作用部位に近いＤＮＡテンプレートにｍＲＮＡが依然として結合しているポリリボソームにおいてタンパク質が合成されるという事実のためである。アラビノースが排出され、そしてＲＡＶ上のａｒａＣＰＢＡＤプロモーターからの転写が停止するようなときに、ａｓｄのｍＲＮＡは合成を停止し、そしてＧＵＧ開始コドン（これはＤＮＡ配列ではＧＴＧとしてコードされている）によるその翻訳が十分でないために、Ａｓｄ酵素は制限的になり、数世代後に、細胞はＤＡＰ欠損による死を受け始める。プラスミドコピー数が、ｐＳＣ１０１レベルから、ＲＡＶ発現の誘導後に染色体ＤＮＡ等価体あたりのプラスミドＤＮＡが数百コピーを超える調節されないレベルになったときにこのような死が達成される程度は、今後、評価されなければならない。ａｓｄ遺伝子のｍＲＮＡの翻訳効率をさらに低下させるためのさらなる改変は、シャイン−ダルガルノ配列をＡＧＧＡからＡＡＧＡまたはＡＧＡＡに変化���せることである。
【０２１３】
実施例３
Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ  ｒｈｕｓｉｏｐａｔｈｉａｅ（豚丹毒菌）の感染および疾患を防止するためのＲＡＤＳの構築および評価
Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ  ｒｈｕｓｉｏｐａｔｈｉａｅは、丹毒を発症させ、晩年には関節炎を生じさせ得る、ブタおよび七面鳥のグラム陽性病原体である（Ｗｏｏｄ，Ｒ．Ｌ．（１９８４）、Ｊ．Ａｍ．Ｖｅｔ．Ｍｅｄ．Ａｓｓｏｃ．１８４：９４４〜９４９）。以前の研究により、Ｅｒｙ６５またはＳｐａＡ．１と名付けられた６５ｋＤａの表面抗原が同定されている（Ｓｈｉｍｏｊｉ，Ｙ．他、１９９９、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６７：１６４６〜１６５１）。この抗原は、Ｅ．ｒｈｕｓｉｏｐａｔｈｉａｅ抗原投与に対する保護免疫性をもたらすためにアジュバントとともに動物に注射することができる。Ｅｒｙ６５タンパク質に対するモノクローナル抗体（Ｍａｂ）もまた存在し、これは、生菌Ｅ．ｒｈｕｓｉｏｐａｔｈｉａｅによる抗原投与に対抗する、Ｍａｂが注入された動物に対する受動的な保護をもたらし得る（Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ，Ｌ．他、１９９７、米国特許第５，６２５，０３８号）。
ｅｒｙ６５遺伝子全長の大腸菌およびＳ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍにおける発現は極めて毒性である傾向を有している。これは、おそらくは、天然のグラム陽性細菌宿主で機能するのと同じくらいにはグラム陰性細菌では機能しないシグナルペプチドのためであるが、より可能性のあることは、大腸菌およびサルモネラ属における細胞質膜に対する親和性を有し、それにより電子輸送および代謝的に良好な健康状態を損ないやすい非常に疎水性のＣ末端ドメインのためである。この問題に対する１つの解決法は、アラビノースが存在しない環境においてワクチン株が持続するまで発現を遅らせて、アラビノースを消耗させ、これにより、リプレッサーの低下を生じさせ、ｐＵＣ起点からのラナウェイ複製およびクローン化された遺伝子インサートの高レベルの発現が可能になるように、Ｅｒｙ６５抗原をＲＡＶで発現させることである。ｐＭＥＧ−５２５（図１３）は、図１４に示されているように、シグナル配列に対するコード領域を含むＥｒｙ６５のコード領域を含有するＲＡＶである。これは、ｐＭＥＧ−４４６（Ｅ．ｒｈｕｓｉｏｐａｔｈｉａｅのＥ１−６Ｐに由来するｅｒｇ６５をコードする１８８１ｂｐのＮｃｏＩ−ＨｉｎｄＩＩＩのＰＣＲフラグメントを含むｐＹＡ３３３２ベクター）に由来する２．５ｋｂのＢｓｔＥＩＩ−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントとして、ＢｓｔＥＩＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ消化されたラナウェイベクターのｐＭＥＧ−２８３にクローン化されている。ｐＭＥＧ−５２５がＳ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍまたはＳ．ｃｈｏｌｅｒａｅｓｕｉｓのいずれかに置かれたとき、プラスミドコピー数は、アラビノース存在培地からアラビノース非存在培地に移動させた後の時間の関数として時間依存的に増大する。プラスミドＤＮＡの量が、Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ  ＭＧＮ−９６６におけるｐＭＥＧ−２８３またはＳ．ｃｈｏｌｅｒａｅｓｕｉｓ  ＭＧＮ−２２６７におけるｐＭＥＧ−５４６のいずれかのベクターのみのコントロールＲＡＶの場合には、ＭＧＮ−９９６またはＭＧＮ−２２６７のいずれかにおいてＥｒｙ６５抗原をコードするＲＡＶのｐＭＥＧ−５２５（図１４）のプラスミドＤＮＡ量と比較して実質的に増大していることもまた明らかである。したがって、Ｅｒｙ６５の毒性が、誘導時に依然としてある程度認められる。これにも関わらず、Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍおよびＳ．ｃｈｏｌｅｒａｅｓｕｉｓの両方におけるＥｒｙ６５タンパク質の合成は、アラビノース存在培地からアラビノース非存在培地に移動させた後の時間の関数として非常に実質的に増大している（図１５）。図１６において明らかにされるように、Ｅｒｙ６５抗原を規定するＲＡＶを有するＳ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍのＭＧＮ−９９６（ｐＭＥＧ−５２５）株は、アラビノースが存在するならば、外来抗原をコードしないコントロールＲＡＶを含有する同質遺伝子的なＭＧＮ−９６６（ｐＭＥＧ−２８３）株と同様に等しく増殖している。しかし、０．２％アラビノースを含有するＬｕｒｉａ  Ｂｅｒｔａｎｉ培養液で１２時間〜１６時間増殖させた非通気培養物をアラビノース非存在Ｌｕｒｉａ  Ｂｅｒｔａｎｉ培養液に１／１，０００希釈した後では、Ｅｒｙ６５抗原の発現は増殖速度を急激に低下さ���、最終的には、その後、死をもたらし、生存細菌は増殖できなくなっている（図１６）。
【０２１４】
上記に記載される菌株を、０．２％アラビノースを含有するＬｕｒｉａ  Ｂｅｒｔａｎｉ培養液で１．０のＯＤ６００まで増殖させ、そしてＲｏｍｐｕｎおよびＫｅｔａｓｅｔで鎮静化させた、体重が約２０ｇのＢＡＬＢ／ｃマウスに鼻腔内投与した。０日目および３１日目に約１０５ＣＦＵのＳ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍのＭＧＮ−９６６（ｐＭＥＧ−５２５）ワクチン株で免疫化されたマウスは、Ｅ．ｒｈｕｓｉｏｐａｔｈｉａｅのＳＥ−９株の抽出物においてサイズが約６５ｋＤａであるタンパク質に対する、免疫化マウス由来の血清を用いたウエスタンブロットによって検出されるように、２８日目に単回の免疫化を行った後に強い免疫応答を示す（図１７）。この抗体応答は、免疫化した４８日後に認められるように、３１日目の追加免疫刺激による免疫化の後、さらにより大きくなっている（図１７）。１１８ＣＦＵのＥ．ｒｈｕｓｉｏｐａｔｈｉａｅ  Ｅ１−Ｐ６株の皮下致死量によるこれらの免疫化マウスの抗原投与は、表３に示されるように、ベクターのみのコントロールマウスに対して、１００％の保護を明らかにした。このことは、Ｅｒｙ６５に対する検出可能な免疫応答またはＥ．ｒｈｕｓｉｏｐａｔｈｉａｅの致死性抗原投与に対する保護のいずれをももたらすことができなかったサルモネラにおける別の発現ベクターにおける完全なＥｒｙ６５抗原を使用して行われた以前の研究とは対照的であった。
【０２１５】
【表３】
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【０２１６】
実施例４
Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｑｕｉ（腺疫菌）の感染および疾患を防止するためのＲＡＤＳの構築および評価
Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｑｕｉは、腺疫と呼ばれる、競走馬および他のウマ科動物の非常に重い病気を引き起こす（Ｎａｒａ，Ｐ．他（１９８３）、Ａｍ．Ｊ．Ｖｅｔ．Ｒｅｓ．４４：５２９〜５３４）。さらにより悪いことに、免疫複合体病の出血性紫斑病があり、これはより若いときのＳ．ｅｑｕｉ感染の結果である（Ｇａｌａｎ，Ｊ．およびＪ．Ｔｉｍｏｎｅｙ（１９８５）、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１３５：３１３４〜３１３７）。Ｓ．ｅｑｕｉは、Ａ群連鎖球菌のように、抗食作用性であり、したがってＳ．ｅｑｕｉ感染の成立を高める主要な毒性の決定因子であるＭタンパク質を表面に産生する。Ｓ．ｅｑｕｉのＭタンパク質（ＳｅＭ）に対する抗体はオプソニン性であり、Ｓ．ｅｑｕｉの申し分のない食作用および殺傷を促進する（Ｇａｌａｎ，Ｊ．およびＪ．Ｔｉｍｏｎｅｙ（１９８５）、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．４７：６２３〜６２８）。したがって、ＳｅＭに対する抗体応答は、ウマのＳ．ｅｑｕｉ感染を防止することにおいて非常に保護的である可能性がある。Ｓ．ｅｑｕｉのＳｅＭタンパク質をコードするＲＡＶのｐＭＥＧ−５７３が図１８に示されている。このＲＡＶは、ＳｅＭクローンｐＳＥＭ０６に由来するＳｅＭコード領域の中央部を含む、ＳｅＭ４４４−４７４のＧＣＧＡＡＣＴＣＴＧＡＧＧＴＴＡＧＴＣＧＴＡＣＧＧＣＧＡＣＴＣおよびＳｅＭ１２６５−１２３３のＴＴＧＡＴＣＡＡＴＴＴＣＴＧＣＴＡＡＴＴＴＴＴＧＡＧＣＣＡＴＴＴＣのプライマーが隣接するＰＣＲフラグメントをｐＭＥＧ−５４６のＮｃｏＩ部位およびＢａｍＨＩ部位にクローン化することによって得られた。ｐＭＥＧ−５７３は、ラナウェイ表現型およびＳｅＭ発現を抑制するために、染色体上におけるΔｉｌｖＧ３：：ＴＴａｒａＣＰＢＡＤｌａｃＩＴＴ欠失／挿入変異（図２）の存在に依存するだけである。ＳｅＭに対するワクチン株はまた、ΔｐｈｏＰ１９１８またはΔｐｈｏＰ２４のいずれかの弱毒化欠失変異（変異８および９、図２）を含有する。プラスミドベクターでのＳｅＭ発現がｐＢＲ系プラスミドにおけるＰ２２ＰＲまたはＰｔｒｃまたはλＰＬのいずれかの転写制御下にあったか、あるいはＲＡＶにおけるＰｔｒｃであるｐＭＥＧ−５７３の制御下にあった種々の弱毒化されたサルモネラワクチン株によるＳｅＭ発現レベルの比較が図１９に示されている。菌株は、この比較のために、０．２％アラビノースを含む非通気Ｌｕｒｉａ  Ｂｅｒｔａｎｉ培養液培養物から１／１，０００希釈した後、０．２％アラビノースの存在または非存在のいずれかのＬｕｒｉａ  Ｂｅｒｔａｎｉ培養液において６時間増殖させた。その後、１ミリリットルの細胞をペレット化して、総タンパク質を、図１９に示されるように、クーマシーブルーを用いた染色による分析のために、またはＳｅＭ特異的抗体を用いたウエスタンブロット分析のためのニトロセルロースへの転写のためにＳＤＳＰＡＧＥで泳動した。ＳｅＭタンパク質の量が、ＲＡＶのｐＭＥＧ−５７３を有する細菌菌株ＭＧＮ−４５９８（ｐＭＥＧ−５７３）では、それ以外の宿主−ベクター菌株のいずれかに存在するよりも実質的に多いことがこの実験から容易に明らかである。これらの菌株におけるすべてのプラスミドが、ｐＭＥ���−３７５に見出される同じＳｅＭコード領域を含有すること、そして得られたＳｅＭ発現レベルが、ＭＧＮ−４５９８（ｐＭＥＧ−８２５）Ｐ２２ＰＲ、ＭＧＮ−４５９８（ｐＭＥＧ−８２６）ＰｔｒｃまたはＭＧＮ−２２３８（ｐＭＥＧ−５７５）λＰＬ（すべてｐＢＲ系プラスミドに基づく）において調べられた他の強いプロモーターのいずれについてもクーマシーゲルで検出できないことを考えて、ＲＡＶ構築物のみがこれまでに動物で評価された。
【０２１７】
ＲＡＶのＳｅＭワクチン株の免疫原性が、麻酔することなく０日目および２８日目に約１０７ＣＦＵの各菌株が鼻腔内に与えられたＢＡＬＢ／ｃマウスで初めて評価された。低レベル（１，０００ＣＦＵ未満）のワクチン株が免疫化７２時間後に免疫化マウスの肺およびパイエル板から回収されただけであり、同様に、３日後の免疫化マウスの糞にはまれにしか検出されなかった。検出された血清学的なＩｇＧのＳｅＭ特異的抗体応答は、表４に示されるように、すべての菌株がＳｅＭ抗原に対する強い抗体免疫応答を誘導したことを示していた。
【０２１８】
【表４】
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【０２１９】
この情報に基づいて、その後、ウマでの研究を、標的動物におけるＳｅＭ抗原に対する血清学免疫応答を評価するためにウマに投与された同じ菌株を使用して行った。ウマを、約１０８ＣＦＵの示されたそれぞれの菌株で０日目および１４日目に免疫化した。その後、血清および鼻腔洗浄物を集めて、表５および表６に示されるようにＳｅＭ特異的抗体について評価した。これらのデータにより、評価されているウマの多くにおいて、ＳｅＭ抗原に対するバックグラウンドが、マウスで認められたよりも大きいことが明らかにされ、そしてまた異なる動物間におけるＳｅＭに対する免疫応答の変動もより大きいことが明らかにされた。しかし、明らかな血清ＩｇＧ応答がＭＧＮ−４５９８（ｐＭＥＧ−５７３）Ａｒａ＋形質導入体による免疫化ウマの３頭およびＭＧＮ−４５９８（ｐＭＥＧ−５７３）による免疫化ウマの１頭において依然として存在する。ＳｅＭに対する鼻腔洗浄物のＩｇＡ応答（表６）は、免疫化前のウマにおけるＳｅＭバックグラウンドが高いという点で類似しているが、ＭＧＮ−４５９８（ｐＭＥＧ−５７３）Ａｒａ＋形質導入体による免疫化ウマの２頭およびＭＧＮ−４５９８（ｐＭＥＧ−５７３）による免疫化ウマの３頭はＳｅＭに対するＩｇＡ応答を有するようである。研究されたマウスおよび研究されたウマはともに、アラビノースの利用能を除くための菌株の改変を伴うか、またはそのような改変を伴わない、鼻腔内免疫化用のＲＡＶ型ＳｅＭワクチンの使用を支持している。
【０２２０】
【表５】
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【０２２１】
【表６】
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【０２２２】
実施例５
ＲＡＤに使用することを目的とするＲＡＶの構築
国際特許公開ＷＯ９６／４０９４７では、記載されたＲＡＶは、ベクターが致死性遺伝子の代表例としてファージの溶解遺伝子を発現したか、またはａｓｄ遺伝子などの必須遺伝子を発現できなかったような封じ込め特徴を含有する。本発明者らは、高コピー数ベクター（ｐＢＲおよびｐＵＣ）に存在するａｓｄ遺伝子が、−３５または−１０のプロモーター配列の非存在下でさえ、十分なＡｓｄタンパク質が作られ、Δａｓｄ染色体変異を有する菌株の生存を持続させることを可能にするには十分に高頻度に転写されることを発見した。したがって、ａｒａＣＰＢＡＤａｓｄ構造およびｐＢＲのｏｒｉを有するｐＹＡ３３５０などのプラスミドベクターは、ＤＡＰおよびアラビノースを含まない培地で増殖させることができる。これは、ａｓｄ遺伝子が、ＤＡＰの非存在下で増殖を持続させるために十分なＡｓｄタンパク質を細胞に作らせることを可能にするために十分に転写されることが多いからである。ほとんど（９１％）の構造遺伝子は、メチオニンに対するＡＴＧコドンを最初のコドンとして使用している。しかし、よりまれ（８％）にはＧＴＧが開始コドンとして用いられ、さらによりまれ（１％）にはＴＴＧが開始コドンとして用いられているが、ＣＴＧは決して用いられていない。したがって、本発明者らは部位特異的変異誘発法を使用して、ｐＹＡ３４５０におけるａｓｄ遺伝子の開始コドンをＡＴＧからＧＴＧに変更してｐＹＡ３５３０（図２０）を作製した。ａｒａＣＰＢＡＤＧＴＧａｓｄ配列を有するｐＹＡ３４５０がＭＧＮ−０２３（表１）などのΔａｓｄ菌株に導入された場合、ＤＡＰが存在しないときにはアラビノースの存在に対する絶対的な要求性が存在する。ｐＹＡ３４５０の別の変化体では、本発明者らは、ａｓｄ遺伝子の発現を適度に低下させ、そしてまたＣ２リプレッサーの発現をＰ２２ＰＲに対するその抑制作用部位に近いプラスミド配列から生じさせるために、Ｐ２２ｃ２遺伝子をＰＢＡＤとａｓｄ遺伝子との間に挿入した（実施例２を参照のこと）。このベクターはｐＹＡ３４８８と名付けられ、その後、部位特異的変異誘発法に供され、ａｓｄ開始コドンがＡＴＧからＧＴＧに変更された。これにより、図２１に示されるｐＹＡ３５３１が得られた。ｐＹＡ３５３０に由来するａｒａＣＰＢＡＤＧＴＧａｓｄ配列またはｐＹＡ３５３１に由来するａｒａＣＰＢＡＤｃ２ＧＴＧａｓｄ配列はどちらも、ａｒａＣＰＢＡＤｃ２ＧＴＧａｓｄ配列を有する図１２に示されるなどのプラスミドを得るために、ａｓｄ遺伝子の代わりにｐＭＥＧ−７７１（図１）にサブクローン化することができる。より具体的には、図１２に示されるプラスミドに由来するＰｔｒｃＭＣＳ５ＳＴ１Ｔ２カセットを含む７００ｂｐのＢｇｌＩＩフラグメントが、ｐＶＡＸ１（Ｉｎｖｉｔｏｇｅｎ）に由来するＰＣＲ増幅された９２０ｂｐのＢＳＧｐＡのＤＮＡフラグメントによって置換され、図２２に示されるプラスミドが作製される。この構築物を有する菌株は、アラビノースが存在しない免疫化された動物またはヒトの体内に進入した後では、ラナウェイベクター複製発現がＰＴＲＣの制御下にある外来抗原の過剰発現とともに強化されるので、細胞壁が弱くなるはずである。この結果、ＲＡＶの発現が十��に遅れたＲＡＤＳワクチン株になるはずである。これは、ｃ２リプレッサー遺伝子がＲＡＶベクター上に含まれるからであり、そして変異１および２、３、５または６および７ならびに変異８または９のいずれか（図２）が宿主染色体に含まれ、その結果、ワクチン株が、鼻腔内または経口的に動物またはヒトに投与されたとしても、リンパ器官に付着し、浸入し、コロニー形成するために十分な時間および生育機会をアラビノースの非存在下で有するようなるからである。
【０２２３】
実施例６
様々な病原体の抗原をコードする環状プラスミドＤＮＡ（いわゆる移入プラスミド）を、抗原遺伝子が得られた病原体に対する免疫性の誘導を刺激するために動物宿主に導入することができる（Ｕｌｌｍｅｒ他、ＡＳＭ  Ｎｅｗｓ、６２：４７６〜４７９、１９９６；Ｕｌｌｍｅｒ他、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．８：５３１〜５３６、１９９６；Ｗｈａｌｅｎ、Ｅｍｅｒｇ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．２：１６８〜１７５、１９９６；Ｒｏｂｉｎｓｏｎ、Ｖａｃｃｉｎｅ、１５：７８５〜７８７、１９９７）。ＤＮＡワクチンは、何らかの病原体の抗原を規定する遺伝子情報が、免疫化された宿主によって、転写および翻訳に対する宿主の装置を使用して発現させられるように発現システムを使用する。このことは、ウイルス、菌類および寄生虫の抗原を発現させるためには特に重要であると考えられる。これらの抗原は、多くの場合、グリコシル化されているが、真核生物宿主で合成されたときにだけグリコシル化され、弱毒化細菌抗原送達宿主などの原核生物で発現したときには決してグリコシル化されない。最初、ＤＮＡワクチンは注射によって筋肉組織に投与されたが、他の注射部位もまた使用されている。ごく最近では、ＤＮＡワクチンは、ＤＮＡでコーティングされた金ビーズの皮膚組織内または粘膜組織内への進入を促進するために、パーティクルガンを使用して投与されている。ＤＮＡワクチンベクターは、発酵装置において増殖させた組換え大腸菌株で増殖させられ、そのような組換え大腸菌株から単離される。
【０２２４】
Ｓｉｚｅｍｏｒｅ他（Ｓｃｉｅｎｃｅ、２７０：２９９〜３０２、１９９５；Ｖａｃｃｉｎｅ、１５：８０４〜８０７、１９９７）は、大腸菌のβ−ガラクトシダーゼを発現するように操作されたＤＮＡワクチンベクターを有する、Δａｓｄ変異を伴うフレクスナー赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｅｒｉ）２ａの１５Ｄ株の使用を記載した。この赤痢菌菌株は、真核生物細胞に浸入したときにジアミノピメリン酸が存在しないことによる死を生じさせるΔａｓｄ変異のために弱毒化されていた。この菌株は、培養されている真核生物細胞の細胞質または免疫化マウスに付着し、浸入し、その中で溶解した後にＤＮＡワクチンベクターを細胞内に送達することができた。より近年には、他の研究者は、ＤＮＡワクチンベクターを有するＳ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ菌株を使用して、自発的または動物宿主依存的な様式による溶解を生じさせている（Ｐｏｗｅｌｌ他、国際特許出願公開ＷＯ９６／３４６３１、１９９６；Ｐａｓｃａｌ他、Ｂｅｈｒｉｎｇ．Ｉｎｓｔ．Ｍｉｔｔ．９８：１４３〜１５２、１９９７；Ｄａｒｊｉ他、Ｃｅｌｌ、９１：７６５〜７７５、１９９７）。溶解が自発的である場合には、細菌菌株は、菌株を弱毒化させる１つまたは複数の欠失変異を有することが必要であった。赤痢菌属、サルモネラ属および浸襲性大腸菌は、腸上皮細胞（腸細胞）に付着および浸入するのではなく、ＧＡＬＴに重なるＭ細胞に付着し、浸入する能力が大きく強化されていることが知られている。Ｍ細胞層をすべてが有するＮＡＬＴ、ＢＡＬＴ、ＣＡＬＴおよびＧＡＬＴにおける外来抗原の送達または外来抗原の産生は、全身性免疫性だけでなく、粘膜性免疫応答の誘導を生じさせる。粘膜性免疫応答は、粘膜表面にコロニー形成するか、または粘膜表面を通って浸入する感染性病原体の非常に大多数に対して保護的であるので、したがって、ＤＮＡワクチンベクターは、サルモネラ属、赤痢菌属、大腸菌属またはこれらの属のいずれか２つの間でのハイブリッドによって送達され得ることが予想される。これらの微生物は、ＮＡＬＴ、ＣＡＬＴ、ＢＡＬＴおよびＧＡＬＴのリンパ組織に重なるＭ細胞に付着し、浸入する優れた能力を有しており、そのようなリンパ組織において、その後、マクロファージおよび樹状細胞などの抗原提示細胞に接近する。免疫応答は、免疫化された動物がさらされている抗原の量に対して、より大きくまたはより小さく比例するので、真核生物細胞内で発現させられる外来抗原に対するコード配列のコピー数を増大させるＤＮＡワクチンベクターを送達するための手段は、誘導される免疫応答を最大にすることにおいて有益であることが予想される。実際には、ＤＮＡワクチンベクターを受容した真核生物細胞の約２％のみが、ＤＮＡワクチンベクターに挿入されている外来遺伝子によりコードされる遺伝子産物を機能的に発現するだけである。したがって、原核生物細胞内ではなく、真核生物細胞内のみでの挿入されている外来遺伝子の発現のために改変されているラナウェイベクターを送達する弱毒化されたＲＡＤＳの使用により、ＤＮＡワクチンベクターによる免疫化効率が著しく改善される。
【０２２５】
従来、本発明者らは、市販され、そして免疫化された動物宿主およびヒト宿主に導入されたワクチンの一部として抗生物質耐性遺伝子を産生させることに対する懸念を緩和するために、薬物耐性遺伝子がＳ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍのａｓｄ遺伝子で置換されているｐＣＭＶβおよびｐＶＡＸ−１の両方に由来するＤＮＡワクチンベクターを用いてきた。しかし、本発明の場合には、プラスミドベクターがラナウェイ増幅したとき、システムが、免疫化された動物宿主体内の真核生物細胞内で溶解を受けるようにＲＡＶを伴うＲＡＤＳを設計することが重要になっている。したがって、図１２に示され、実施例５に記載されるプラスミドベクターは、ａｒａＣＰＢＡＤＰ２２ｃ２ＳＤＧＴＧａｓｄカセットを有しているので、元となるプラスミド構築物として役立つ。変異１（図２）、すなわち、ΔａｓｄＡ１９：：ａｒａＣＰＢＡＤｃ２変異／挿入を有する細菌細胞内におけるこのＲＡＶの維持は、アラビノースの存在下での増殖に依存している。アラビノースの非存在下では、ラナウェイ複製が始まるが、またＡｓｄ酵素の合成が停止し、これは、ＤＡＰを合成することができないため、弱体化した細胞壁をもたらす。ＤＡＰのプールもまた、タンパク質合成のために必要なリシンにＤＡＰが変換されることによって急激に枯渇する。図１２に示されるプラスミドを有する細菌細胞で産生されるＡｓｄ酵素分子の数は、添加されたＤＡＰが存在しないもとでの生存性を維持するためにちょうど十分であることを指摘しなければならない。これは、ＧＴＧ開始コドンのためにａｓｄコード配列の翻訳効率が低いからである。移入ＲＡＶとして使用される好適な移入ベクターを構築するために、ＰＴＲＣＭＣＳ５ＳＴ１Ｔ２転写ターミネーターカセットが除かれ、そして市販のＤＮＡワクチンベクターｐＶＡＸ−１に由来するｐＣＭＶＭＣＳウシ成長ホルモンポリアデニル化特性で置換されている。改変されたｐＭＥＧ−７７１に由来する得られた移入ベクターが図２２に示されている。この移入ＲＡＶは様々な弱毒化された細菌菌株に導入され、ＲＡＤＳを作製することができる。細菌宿主菌株は、変異１および２（図２）を有し、そしてラナウェイ複製の表現型発現における所望するレベルの遅延に依存して、変異３、５または６および７（図２）を有する。細菌宿主菌株を弱毒化するために、変異８または９（図２）などの弱毒化変異を含むことができるが、様々な他の弱毒化変異のいずれも使用することができる。細菌が、図２２に示される移入ＲＡＶなどの移入ベクターを放出するために溶解した場合、ペリプラズム空間に存在するエンドヌクレアーゼＩと遭遇することになり、この酵素により、環状プラスミドＤＮＡは、エキソヌクレオチド分解的消化を後に受ける鎖状フラグメントに切断され得る。したがって、本発明者らは、Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、ＳＬ１３４４のχ３３３９株に由来するエンドヌクレアーゼＩをコードするｅｎｄＡ遺伝子をクローン化し、規定された内部欠失を作製して、図２３に示されるｐＭＥＧ−７７６と名付けられた自殺ベクターを構築した。この自殺ベクターは、ｐＭＥＧ−７７６が得られたｐＭＥＧ−３７５（図３）の特徴のすべてを有しており、そして対立遺伝子置換によってΔ���ｎｄＡ変異を、移入ＲＡＤを送達するために使用される細菌宿主菌株の染色体に導入するために上記の方法を当業者が使用することを可能にしている。
【０２２６】
図２２の移入ＲＡＶは、Ｐｃｍｖプロモーターの後のマルチプルクローニング部位（ＭＣＳ）を使用して、外来抗原をコードする配列を挿入するために改変される。このような外来抗原に対する遺伝子は、真核生物宿主におけるその発現が真核生物宿主の翻訳後修飾装置から利益を受け得る、ウイルス、菌類および寄生虫の病原体に由来することが好ましい。これは、グリコシル化などによるそのような翻訳後修飾を受ける保護抗原に関する場合には特に重要である。
【０２２７】
図２２に示されるタイプの、外来抗原をコードする移入ベクターはまた、変異１および２（図２）を、それ以外にも、ペリプラズム空間におけるエンドヌクレアーゼＩの存在を除くためのｅｎｄＡ３変異とともに有するだけの大腸菌株などの弱毒化されていない細菌宿主によって産生させることができる。この構築物は、アラビノースの存在下で発酵装置において増殖させることができ、そしてラナウェイ複製がアラビノースの除去後および／またはアラビノースの完全な利用後に生じ、非常に多量のプラスミドＤＮＡが生じる。このプラスミドＤＮＡは、上記に記載されるように、注射、パーティクルガンなどによって送達されるＤＮＡワクチンとして集められ、使用することができる。重要な特徴は、抗生物質耐性遺伝子が存在しないということである。これにより、発酵装置内における細菌の増殖時に使用される抗生物質によってＤＮＡワクチンが汚染される可能性が除かれる。
【０２２８】
図２２に示されるタイプのＤＮＡワクチンベクターの別の重要な利点は、免疫応答を高めることが知られている特徴的なＣｐＧ配列が存在するということである（Ｋｒｉｅｇ、Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．１２８：１２８〜１３３、１９９６）。多くの研究室における研究により、いくつかのＣｐＧ配列が、高い抗体産生をもたらすＢ細胞応答を刺激するために特に重要であることが見出されている。これに関して、多くのＤＮＡワクチンベクターに含まれる、カナマイシンに対する抗生物質耐性遺伝子は、このような好ましいＣｐＧ配列のいずれも有していない。一方、本明細書中に記載されるベクターに含まれるＳ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍのａｓｄ遺伝子は、ＤＮＡワクチンベクターの免疫原性を強く高める２つの天然のＣｐＧ配列を有している。さらに、Ｐ２２ｃ２遺伝子配列には、ＤＮＡワクチンベクターの免疫原性を同様に強く高める、さらに２つの天然のＣｐＧ配列が含まれる。したがって、図２２に示される移入ＲＡＶは、ベクターにクローン化され、そして免疫化された動物宿主内の真核生物細胞において発現する外来遺伝子の免疫原性を高める数多くの特徴を有している。そのようなＤＮＡワクチンベクターにおけるＳ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍのａｓｄ遺伝子の使用が米国特許第５，８４０，４８３号に記載されている。
【０２２９】
本明細書中に引用されているすべての参考文献は、それらによりその全体が参考として組み込まれる。本明細書中における参考文献の議論は、その著者によってなされている主張を要約することを単に意図するものであり、したがって、いずれかの参考文献が先行技術を構成することを認めるものではない。本出願人らは、引用されている参考文献の正確さおよび妥当性に対して異議をとなえる権利を留保する。
【図面の簡単な説明】
【図１Ａ】
ＲＡＶのｐＭＥＧ−５４６およびｐＭＥＧ−７７１ならびにそれらの維持に必要な必須の染色体欠失／挿入変異を示す図である。
【図１Ｂ】
ＲＡＶのｐＭＥＧ−５４６およびｐＭＥＧ−７７１ならびにそれらの維持に必要な必須の染色体欠失／挿入変異を示す図である。
【図２Ａ】
調節された抗原送達システム（ＲＡＤＳ）の構成成分としてＲＡＶの維持に必要な様々な欠失変異および欠失／挿入変異、ならびに免疫原性を維持しながらそれらを無毒性にするワクチン株の弱毒化に好適な欠失変異を示す図である。
【図２Ｂ】
調節された抗原送達システム（ＲＡＤＳ）の構成成分としてＲＡＶの維持に必要な様々な欠失変異および欠失／挿入変異、ならびに免疫原性を維持しながらそれらを無毒性にするワクチン株の弱毒化に好適な欠失変異を示す図である。
【図３】
可動性自殺ベクターｐＭＥＧ−３７５を示す図である。
【図４】
ΔａｓｄＡ１９：：ＴＴａｒａＣＰＢＡＤｃ２ＴＴを送達するための自殺ベクターｐＧＥＭ−６１１を示す図である。
【図５】
ΔｉｌｖＧ３：：ＴＴａｒａＣＰＢＡＤｌａｃＩＴＴを送達するための自殺ベクターｐＭＥＧ−２４９を示す図である。
【図６】
ΔａｒａＢＡＤ１９２３を送達するための自殺ベクターｐＹＡ３４８４を示す図である。
【図７】
ΔａｒａＥ２５を送達するための自殺ベクターｐＹＡ３４８５を示す図である。
【図８】
ΔｐｈｏＰ１９１８を送達するための自殺ベクターｐＭＥＧ−５５０を示す図である。
【図９】
ΔｐｈｏＰ２４を送達するための自殺ベクターｐＭＥＧ−３６８を示す図である。
【図１０Ａ】
ｐＭＥＧ−２８３からのＲＡＶのｐＭＥＧ−５４６作製ならびにｐＭＥＧ−５４６およびｐＭＥＧ−１０４からのＲＡＶのｐＭＥＧ−７７１作製を示す図である。
【図１０Ｂ】
ｐＭＥＧ−２８３からのＲＡＶのｐＭＥＧ−５４６作製ならびにｐＭＥＧ−５４６およびｐＭＥＧ−１０４からのＲＡＶのｐＭＥＧ−７７１作製を示す図である。
【図１１】
ｐＹＡ３５３５を得るために、ｌａｃＲＢ（ＬａｃＩリプレッサー結合）部位を、Ｐ２２ＰＲの後、ｐＵＣのＲＮＡＩＩの前に含むようにするｐＭＥＧ−７７１の改変を示す図である。
【図１２】
ａｓｄの代わりにＴＴａｒａＣＰＢＡＤｃ２ＧＴＧａｓｄを有するＲＡＶのｐＭＥＧ−７７１誘導体を示す図である。
【図１３】
Ｅｒｙ６５抗原を規定するＲＡＶのｐＭＥＧ−５２５を示す図である。
【図１４】
Ｅｒｙ６５をコードするＲＡＶに対するコピー数の増大を明らかにする実験結果を示す図である。
【図１５】
図１４に示される同じ実験の結果ではあるが、１対１，０００希釈後のアラビノース存在またはアラビノース非存在のＬｕｒｉａ培養液で増殖させたＳ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍのＭＧＮ−９６６（ｐＭＥＧ−５２５）およびＳ．ｃｈｏｌｅｒａｅｓｕｉｓのＭＧＮ−２２６７（ｐＭＥＧ−５２５）の増殖に依存したＥｒｙ６５タンパク質の増大を明らかにする結果を示す図である。
【図１６】
１対１，０００希釈後のアラビノース存在またはアラビノース非存在のＬｕｒｉａ培養液で増殖させたＳ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ株のＥｒｙ６５発現ＭＧＮ−９６６（ｐＭＥＧ−５２５）およびＭＧＮ−９６６（ｐＭＥＧ−２８３）ベクターコントロールの増殖を示すグラフである。
【図１７】
ベクターコントロールＭＧＮ−９６６（ｐＭＥＧ−２８３）およびＥｒｙ６５抗原発現ＭＧＮ−９６６（ｐＭＥＧ−５２５）で免疫化されたマウスから得られた血清のウエスタンブロット分析を示す図である。
【図１８】
Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｑｕｉのＭタンパク質（ＳｅＭ）を規定するＲＡＶのｐＭＥＧ−５７３を示す図である。
【図１９】
抗原の発現が様々なプロモーターの制御下にある異なるＡｓｄ＋ベクターを含有するＳ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ株のＭＧＮ−４５９８（ｐＭＥＧ−８２５）Ｐ２２ＰＲＳｅＭ、ＭＧＮ−４５９８（ｐＭＥＧ−８２６）Ｐ２２ＰｔｒｃＳｅＭ、ＭＧＮ−２２３８（ｐＭＥＧ−５７５）λＰＬＳｅＭによるＳｅＭ発現の比較を、ＲＡＤＳのＭＧＮ−４５９８（ｐＭＥＧ−５７３）＋ＳｅＭによる発現と比較して示す図である。
【図２０】
ａｒａＣＰＢＡＤＧＴＧａｓｄを有するＡｓｄ＋ベクターのｐＹＡ３５３０を示す図である。
【図２１】
ａｒａＣＰＢＡＤｃ２ＧＴＧａｓｄを有するＡｓｄ＋ベクターのｐＹＡ３５３１を示す図である。
【図２２】
ＲＡＶに基づくＤＮＡ移入ネクターを示す図である。
【図２３】
ΔｅｎｄＡ３を送達するための自殺ベクターｐＭＥＧ−７７６を示す図である。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【手続補正書】
【提出日】平成13年10月5日(2001.10.5)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２１６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２１６】
実施例４
Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｑｕｉ（腺疫菌）の感染および疾患を防止するためのＲＡＤＳの構築および評価
Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｑｕｉは、腺疫と呼ばれる、競走馬および他のウマ科動物の非常に重い病気を引き起こす（Ｎａｒａ，Ｐ．他（１９８３）、Ａｍ．Ｊ．Ｖｅｔ．Ｒｅｓ．４４：５２９〜５３４）。さらにより悪いことに、免疫複合体病の出血性紫斑病があり、これはより若いときのＳ．ｅｑｕｉ感染の結果である（Ｇａｌａｎ，Ｊ．およびＪ．Ｔｉｍｏｎｅｙ（１９８５）、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１３５：３１３４〜３１３７）。Ｓ．ｅｑｕｉは、Ａ群連鎖球菌のように、抗食作用性であり、したがってＳ．ｅｑｕｉ感染の成立を高める主要な毒性の決定因子であるＭタンパク質を表面に産生する。Ｓ．ｅｑｕｉのＭタンパク質（ＳｅＭ）に対する抗体はオプソニン性であり、Ｓ．ｅｑｕｉの申し分のない食作用および殺傷を促進する（Ｇａｌａｎ，Ｊ．およびＪ．Ｔｉｍｏｎｅｙ（１９８５）、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．４７：６２３〜６２８）。したがって、ＳｅＭに対する抗体応答は、ウマのＳ．ｅｑｕｉ感染を防止することにおいて非常に保護的である可能性がある。Ｓ．ｅｑｕｉのＳｅＭタンパク質をコードするＲＡＶのｐＭＥＧ−５７３が図１８に示されている。このＲＡＶは、ＳｅＭクローンｐＳＥＭ０６に由来するＳｅＭコード領域の中央部を含む、ＳｅＭ４４４−４７４のＧＣＧＡＡＣＴＣＴＧＡＧＧＴＴＡＧＴＣＧＴＡＣＧＧＣＧＡＣＴＣ（配列番号１）およびＳｅＭ１２６５−１２３３のＴＴＧＡＴＣＡＡＴＴＴＣＴＧＣＴＡＡＴＴＴＴＴＧＡＧＣＣＡＴＴＴＣ（配列番号２）のプライマーが隣接するＰＣＲフラグメントをｐＭＥＧ−５４６のＮｃｏＩ部位およびＢａｍＨＩ部位にクローン化することによって得られた。ｐＭＥＧ−５７３は、ラナウェイ表現型およびＳｅＭ発現を抑制するために、染色体上におけるΔｉｌｖＧ３：：ＴＴａｒａＣＰＢＡＤｌａｃＩＴＴ欠失／挿入変異（図２）の存在に依存するだけである。ＳｅＭに対するワクチン株はまた、ΔｐｈｏＰ１９１８またはΔｐｈｏＰ２４のいずれかの弱毒化欠失変異（変異８および９、図２）を含有する。プラスミドベクターでのＳｅＭ発現がｐＢＲ系プラスミドにおけるＰ２２ＰＲまたはＰｔｒｃまたはλＰＬのいずれかの転写制御下にあったか、あるいはＲＡＶにおけるＰｔｒｃであるｐＭＥＧ−５７３の制御下にあった種々の弱毒化されたサルモネラワクチン株によるＳｅＭ発現レベルの比較が図１９に示されている。菌株は、この比較のために、０．２％アラビノースを含む非通気Ｌｕｒｉａ  Ｂｅｒｔａｎｉ培養液培養物から１／１，０００希釈した後、０．２％アラビノースの存在または非存在のいずれかのＬｕｒｉａ  Ｂｅｒｔａｎｉ培養液において６時間増殖させた。その後、１ミリリットルの細胞をペレット化して、総タンパク質を、図１９に示されるように、クーマシーブルーを用いた染色による分析のために、またはＳｅＭ特異的抗体を用いたウエスタンブロット分析のためのニトロセルロースへの転写のためにＳＤＳＰＡＧＥで泳動した。ＳｅＭタンパク質の量が、ＲＡＶのｐＭＥＧ−５７３を有する細菌菌株ＭＧＮ−４５９８（ｐＭＥＧ−５７３）では、それ以外の宿主−ベクター菌株のいずれかに存在するよりも実質的に多いことがこの実験から容易に明らかである。これらの菌株における���べてのプラスミドが、ｐＭＥＧ−３７５に見出される同じＳｅＭコード領域を含有すること、そして得られたＳｅＭ発現レベルが、ＭＧＮ−４５９８（ｐＭＥＧ−８２５）Ｐ２２ＰＲ、ＭＧＮ−４５９８（ｐＭＥＧ−８２６）ＰｔｒｃまたはＭＧＮ−２２３８（ｐＭＥＧ−５７５）λＰＬ（すべてｐＢＲ系プラスミドに基づく）において調べられた他の強いプロモーターのいずれについてもクーマシーゲルで検出できないことを考えて、ＲＡＶ構築物のみがこれまでに動物で評価された。




【国際調査報告】
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2004515210.tif 000139