(57)【要約】ＬＴ−β−Ｒに対するヒト化抗体およびその使用方法を提供する。本発明は、ヒト化抗リンホトキシンβレセプター（ＬＴ−β−Ｒ）抗体、ならびに被験体（例えば、ヒト）における新形成の進行、重症度もしくは作用を処置または低減するために、これらの抗体を使用する方法を提供する。特に、本発明は、ＬＴ−β−Ｒ（例えば、ヒトＬＴ−β−Ｒ）に特異的に結合するヒト化抗体を包含する。他の実施形態において、本発明のヒト化抗体は、親抗体の結合特性を実質的に保持する。
2004532608.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト化抗リンホトキシンβレセプター（ＬＴ−β−Ｒ）抗体であって、その軽鎖相補性決定領域は、配列番号１のアミノ酸残基２４〜３４、５０〜５６および８９〜９７によって定義され、その重鎖相補性決定領域は、配列番号２のアミノ酸残基３１〜３５、５０〜６６および９９〜１０９によって定義され、該抗体はその軽鎖中の以下の残基
：Ｋ３、Ｗ４１、Ｉ４６、Ｑ６９およびＹ７１
の少なくとも一つ；または
その重鎖中の以下の残基
：Ｆ３７、Ｔ４０、Ａ４９、Ｍ８９およびＶ９３（Ｋａｂａｔ  番号付けの慣例）
の少なくとも一つを含む、ヒト化抗ＬＴ−β−Ｒ抗体。
【請求項２】
ヒト化抗リンホトキシンβレセプター（ＬＴ−β−Ｒ）抗体であって、その軽鎖相補性決定領域は、配列番号１のアミノ酸残基２４〜３４、５０〜５６および８９〜９７によって定義され、その重鎖相補性決定領域は、配列番号２のアミノ酸残基３１〜３５、５０〜６６および９９〜１０９によって定義され、該抗体はその軽鎖中の残基Ｙ７１（Ｋａｂａｔ  番号付けの慣例）を含む、ヒト化抗ＬＴ−β−Ｒ抗体。
【請求項３】
ヒト化抗リンホトキシンβレセプター（ＬＴ−β−Ｒ）抗体であって、その軽鎖相補性決定領域は、配列番号１のアミノ酸残基２４〜３４、５０〜５６および８９〜９７によって定義され、その重鎖相補性決定領域は、配列番号２のアミノ酸残基３１〜３５、５０〜６６および９９〜１０９によって定義され、該抗体はその重鎖中の残基Ｆ３７およびＡ４９（Ｋａｂａｔ  番号付けの慣例）を含む、ヒト化抗ＬＴ−β−Ｒ抗体。
【請求項４】
請求項１に記載の抗体で、前記抗体が、配列番号８のアミノ酸残基１〜１０７によって定義される軽鎖可変ドメイン配列を含む、抗体。
【請求項５】
請求項１に記載の抗体で、前記抗体が、配列番号１６のアミノ酸残基１〜１２０によって定義される重鎖可変ドメイン配列を含む、抗体。
【請求項６】
請求項４に記載の抗体で、前記抗体が、配列番号１６のアミノ酸残基１〜１２０によって定義される重鎖可変ドメイン配列をさらに含む、抗体。
【請求項７】
細胞株Ｅ４６．４（ＡＴＣＣ特許寄託名ＰＴＡ−３３５７）または細胞株Ｅ７７．４（ＡＴＣＣ特許寄託名３７６５）によって産生される抗体と同一の重鎖および軽鎖ポリペプチド配列を含む、抗体。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれかに記載の抗体で、前記抗体が、親抗体の結合特性を実質的に保持する、抗体。
【請求項９】
請求項１〜７のいずれかに記載の抗体で、前記抗体が、さらに免疫毒素と連結されている、抗体。
【請求項１０】
請求項１〜７のいずれかに記載の抗体で、前記抗体が、さらに化学療法剤と連結されている、抗体。
【請求項１１】
請求項１〜７のいずれかに記載の抗体および製薬上受け入れ可能なキャリアを含む、組成物。
【請求項１２】
ヒトにおいて新生物腫瘍の発達、重篤度または影響を処置または減少させる方法であって、該方法は、請求項１１に記載の組成物を投与する工程を包含する、方法。
【請求項１３】
細胞株Ｅ４６．４（ＡＴＣＣ特許寄託名ＰＴＡ−３３５７）または細胞株Ｅ７７．４（ＡＴＣＣ特許寄託名３７６５）によって産生される抗体の軽鎖に対するコード配列を含む、単離された核酸。
【請求項１４】
細胞株Ｅ４６．４（ＡＴＣＣ特許寄託名ＰＴＡ−３３５７）または細胞株Ｅ７７．４（ＡＴＣＣ特許寄託名３７６５）によって産生される抗体の重鎖に対するコード配列を含む、単離された核酸。
【請求項１５】
配列番号８の残基１〜１０７に対するコード配列を含む、単離された核酸。
【請求項１６】
配列番号１６の残基１〜１２０に対するコード配列を含む、単離された核酸。
【請求項１７】
細胞株Ｅ４６．４（ＡＴＣＣ特許寄託名ＰＴＡ−３３５７）または細胞株Ｅ７７．４（ＡＴＣＣ特許寄託名３７６５）の細胞。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（関連出願）
本願は、２００１年６月２１日に出願されたＵ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．６０／２９９，９８７の一部継続出願であり、Ｕ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．６０／２９９，９８７は、２００１年３月１３日に出願されたＵ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．６０／２７５，２８９の一部継続出願であり、そしてＵ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．６０／２７５，２８９は、２０００年１０月１３日に出願されたＵ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．６０／２４０，２８５の一部継続出願である。前述の各特許出願の全体の公開は、本明細書中で参考として援用される。
【０００２】
（発明の分野）
この発明は、一般にリンホトキシンβレセプター（ＬＴ−β−Ｒ）に特異的なヒト化抗体に関する。
【０００３】
（発明の背景）
リンホトキシンβレセプター（本明細書中でＬＴ−β−Ｒと称する）は、腫瘍壊死因子ファミリーのメンバーであり、これは、免疫系の発達および免疫系における多くの細胞（濾胞性樹状細胞および多くの間質細胞型を含む）の機能的維持の両方における、十分に説明されている役割を有する（Ｍａｔｓｕｍｏｔｏら，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．１５６：１３７（１９９７））。ＬＴ−β−Ｒに対する公知のリガンドとしては、ＬＴα１／β２およびＬＩＧＨＴとよばれる第２のリガンドが挙げられる（Ｍａｕｒｉら，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ８：２１（１９９８））。ＬＴ−β−Ｒの活性化は、インビボにおいて、特定の癌細胞株のアポトーシス死を誘導することが示されている（ＰＣＴ／ＵＳ９６／０１３８６）。従って、アゴニスト性ＬＴ−β−Ｒ活性化因子（例えば、特異的ヒト化抗ＬＴ−β−Ｒ抗体）による処置は、被験体（例えば、ヒト）における新形成の進行、重症度もしくは作用を処置または低減するのに有効である。
【０００４】
（発明の要旨）
本発明は、ヒト化抗リンホトキシンβレセプター（ＬＴ−β−Ｒ）抗体、ならびに被験体（例えば、ヒト）における新形成の進行、重症度もしくは作用を処置または低減するために、これらの抗体を使用する方法を提供する。
【０００５】
特に、本発明は、ＬＴ−β−Ｒ（例えば、ヒトＬＴ−β−Ｒ）に特異的に結合するヒト化抗体を包含する。この抗体は、配列番号１のアミノ酸残基２４〜３４、５０〜５６および８９〜９７により定義された軽鎖相補性決定領域および／または配列番号２のアミノ酸残基３１〜３５、５０〜６６および９９〜１０９により定義された重鎖相補性決定領域、そしてさらに、以下の軽鎖内の残基の少なくとも１つ（例えば１個、２個、３個、４個、もしくは５個）：Ｋ３、Ｗ４１、Ｉ４６、Ｑ６９、およびＹ７１；または以下の重鎖内の残基の少なくとも１つ（例えば１個、２個、３個、４個、もしくは５個）：Ｆ３７、Ｔ４０、Ａ４９、Ｍ８９、およびＶ９３（Ｋａｂａｔ番号付け法）、を含む。
【０００６】
本発明のヒト化抗体は、配列番号８のアミノ酸残基１〜１０７により定義された軽鎖可変ドメイン配列および／または配列番号１６のアミノ酸残基１〜１２０により定義された重鎖可変ドメイン配列を含み得る。ヒト化抗体はまた、細胞株Ｅ４６．４（ＡＴＣＣ特許寄託番号ＰＴＡ−３３５７）または細胞株Ｅ７７．４（ＡＴＣＣ特許寄託番号ＰＴＡ−３７６５）により産生された抗体と同じ軽鎖および／または重鎖ポリペプチド配列を含み得る。
【０００７】
他の実施形態において、本発明のヒト化抗体は、親抗体の結合特性を実質的に保持する。１つの実施形態において、本発明のヒト化抗体は、例えば、以下の機能的親和性で、ＬＴ−β−Ｒに結合する：約１ｐＭ〜約１０ｐＭ、あるいは約１０ｐＭ〜約２０ｐＭ、あるいは約２０ｐＭ〜約３０ｐＭ、あるいは約３０ｐＭ〜約４０ｐＭ、あるいは約４０ｐＭ〜約５０ｐＭ、あるいは約５０ｐＭ〜約６０ｐＭ、あるいは約６０ｐＭ〜約７０ｐＭ、あるいは約７０ｐＭ〜約８０ｐＭ、あるいは約８０ｐＭ〜約９０ｐＭ。ここで、機能的親和性は、実施例８に従って、ＦＡＣＳによって測定される。
【０００８】
他の実施形態において、本発明のヒト化抗体は、免疫毒素（例えば、リシンＡ鎖およびＰｓｅｕｄｏｎｏｍａｓ毒素）に連結される。本発明のヒト化抗体はまた、化学療法剤（例えば、アドリアマイシン、５ＦＵ、ビンブラスチン、アクチノマイシンＤ、エトポシド、シスプラチン、メトトレキサート、およびドキソルビシン）または放射性同位体に連結され得る。本発明はまた、例えば、免疫毒素に連結された本発明のヒト化抗体を、化学療法剤に連結された本発明のヒト化抗体と組み合わせて用いる、組み合わせ治療を包含する。本発明は、ＬＴβＲを過剰発現する腫瘍を有する哺乳動物（すなわち、ヒト）への投与に適切な組成物を包含し、この組成物は、ａ）ヒト化抗ＬＴβＲ抗体単独または免疫毒素もしくは化学療法剤に連結されたヒト化抗ＬＴβＲ抗体のいずれか、およびｂ）細胞傷害性因子を含み、その各々が、哺乳動物への投与の際に、腫瘍体積を低減させるのに有効な量で存在する。細胞傷害性因子としては、例えば、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β、ＩＬ−１、ＩＮＦ−γ、ＩＬ−２が挙げられ得る。あるいは、細胞傷害性因子は、化学療法剤によるものであり得る。化学療法剤としては、例えば、アドリアマイシン、５ＦＵ、ビンブラスチン、アクチノマイシンＤ、エトポシド、シスプラチン、メトトレキサート、およびドキソルビシンが挙げられ得る。
【０００９】
本発明の抗体は、例えば、任意のアイソタイプおよびサブタイプ（例えば、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＥ、ＩｇＡ１、およびＩｇＡ２）の全抗体（すなわち、２つの完全長軽鎖および２つの完全長重鎖を有する）であり得るか；あるいは全抗体の抗原結合フラグメント（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦｖ）であり得る。以下を含む組成物もまた、本発明に包含される：薬学的に受容可能なキャリア；配列番号８のコード配列を含む単離された核酸；配列番号１６のコード配列を含む単離された核酸；細胞株Ｅ４６．４（ＡＴＣＣ特許寄託番号ＰＴＡ−３３５７）または細胞株Ｅ７７．４（ＡＴＣＣ特許寄託番号３７６５）により産生された抗体の軽鎖のコード配列を含む単離された核酸；細胞株Ｅ４６．４（ＡＴＣＣ特許寄託番号ＰＴＡ−３３５７）または細胞株Ｅ７７．４（ＡＴＣＣ特許寄託番号３７６５）により産生された抗体の重鎖のコード配列を含む単離された核酸；配列番号８の残基１〜１０７のコード配列を含む単離された核酸；および配列番号１６の残基１〜１２０のコード配列を含む単離された核酸。
【００１０】
ヒト化抗ＬＴβＲ抗体を産生する細胞株由来の細胞もまた、本発明に包含され、例えば、細胞株Ｅ４６．４（ＡＴＣＣ特許寄託番号ＰＴＡ−３３５７）または細胞株Ｅ７７．４（ＡＴＣＣ特許寄託番号３７６５）が挙げられる。１つの実施形態において、この細胞株は、約２５０ｍｇ／Ｌ〜約３００ｍｇ／Ｌの前記抗体を産生し、あるいは、この細胞株は、約３００ｍｇ／Ｌ〜約３５０ｍｇ／Ｌの前記抗体を産生し、あるいは、この細胞株は、約３５０ｍｇ／Ｌ〜約４００ｍｇ／Ｌの前記抗体を産生し、あるいは、この細胞株は、約４００ｍｇ／Ｌ〜約４５０ｍｇ／Ｌの前記抗体を産生し、あるいは、この細胞株は、この抗体約４５０ｍｇ／Ｌ〜約５００ｍｇ／Ｌの前記抗体を産生し、あるいは、この細胞株は、約５００ｍｇ／Ｌ〜約５５０ｍｇ／Ｌの前記抗体を産生し、あるいは、この細胞株は、約５５０ｍｇ／Ｌ〜約６００ｍｇ／Ｌの前記抗体を産生する。これらの細胞株により産生された抗体の濃度は、１０日間の流加培養法からの収集力価（ｈａｒｖｅｓｔ  ｔｉｔｅｒ）としての測定値である。
【００１１】
本発明はまた、被験体（例えば、ヒト）における新形成の進行、重症度または作用を処置または低減する方法を提供し、この方法は、本発明の有効量の抗体をその被験体に投与する工程を包含する。有効量の組成物は、１回以上の投薬で投与され得る。別の実施形態において、本発明は、被験体（例えば、ヒト）における新形成の進行、重症度または作用を処置または低減する方法を提供し、この方法は、本発明の抗体および細胞傷害性因子の有効量をその被験体に投与する工程を含有する。細胞傷害性因子としては、例えば、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β、ＩＬ−１、ＩＮＦ−γ、ＩＬ−２が挙げられる。あるいは、細胞傷害性因子は、化学療法剤によるものであり得る。化学療法剤としては、例えば、アドリアマイシン、５ＦＵ、ビンブラスチン、アクチノマイシンＤ、エトポシド、シスプラチン、メトトレキサート、およびドキソルビシンが挙げられ得る。
（詳細な説明）
（配列番号）
本明細書中に言及されるヌクレオチド配列およびアミノ酸配列に、以下の配列番号を与えた：
配列番号１−ｍＣＢＥ１１重鎖可変領域のアミノ酸配列。
【００１２】
配列番号２−ｍＣＢＥ１１軽鎖可変領域のアミノ酸配列。
【００１３】
配列番号３−ヒト化ＣＢＥ１１軽鎖可変領域（バージョン１−ＶＬ＃１）の核酸配列。
【００１４】
配列番号４−ヒト化ＣＢＥ１１軽鎖可変領域（バージョン１−ＶＬ＃１）のアミノ酸配列。
【００１５】
配列番号５−ヒト化ＣＢＥ１１軽鎖可変領域（バージョン２−ＶＬ＃２）の核酸配列。
【００１６】
配列番号６−ヒト化ＣＢＥ１１軽鎖可変領域（バージョン２−ＶＬ＃２）のアミノ酸配列。
【００１７】
配列番号７−ヒト化ＣＢＥ１１軽鎖可変領域（バージョン３−ＶＬ＃３）の核酸配列。
【００１８】
配列番号８−ヒト化ＣＢＥ１１軽鎖可変領域（バージョン３−ＶＬ＃３）のアミノ酸配列。
【００１９】
配列番号９−ヒト化ＣＢＥ１１重鎖可変領域（バージョン１−ＶＨ＃１）の核酸配列。
【００２０】
配列番号１０−ヒト化ＣＢＥ１１軽鎖可変領域（バージョン１−ＶＨ＃１）のアミノ酸配列。
【００２１】
配列番号１１−ヒト化ＣＢＥ１１重鎖可変領域（バージョン２−ＶＨ＃２）の核酸配列。
【００２２】
配列番号１２−ヒト化ＣＢＥ１１軽鎖可変領域（バージョン２−ＶＨ＃２）のアミノ酸配列。
【００２３】
配列番号１３−ヒト化ＣＢＥ１１重鎖可変領域（バージョン３−ＶＨ＃３）の核酸配列。
【００２４】
配列番号１４−ヒト化ＣＢＥ１１軽鎖可変領域（バージョン３−ＶＨ＃３）のアミノ酸配列。
【００２５】
配列番号１５−ヒト化ＣＢＥ１１重鎖可変領域（バージョン４−ＶＨ＃４）の核酸配列。
【００２６】
配列番号１６−ヒト化ＣＢＥ１１軽鎖可変領域（バージョン４−ＶＨ＃４）のアミノ酸配列。
【００２７】
配列番号１７−Ｂｓｕ３６Ｉ部位を導入するためのＦＲ１プライマー。
【００２８】
配列番号１８−ＮｃｉＩ部位およびＨｐａＩＩ部位を導入するためのＦＲ２プライマー。
【００２９】
配列番号１９−Ｂｓｕ３６Ｉ部位およびＰｓｔＩ部位を導入するためのＦＲ３プライマー。
【００３０】
配列番号２０−ＳｍａＩ部位を導入するためのＦＲ２プライマー。
【００３１】
配列番号２１−ＰｖｕＩ部位を導入するためのＦＲ３プライマー。
【００３２】
配列番号２２−ＳｍａＩ部位およびＨｈａＩ部位を導入するためのＦＲ２プライマー。
【００３３】
配列番号２３−ＰｖｕＩＩ部位およびＦｓｐＩ部位を導入するためのＦＲ３プライマー。
【００３４】
配列番号２４−ＨｉｎｆＩ部位およびＮｓｉＩ部位を導入するためのＦＲ１プライマー。
【００３５】
配列番号２５−ＨａｅＩＩ部位およびＨｈａＩ部位を導入するためのＦＲ２プライマー。
【００３６】
配列番号２６−Ｂｓｕ３６Ｉ部位，ＤｄｅＩ部位，およびＰｓｔＩ部位を導入するためのＦＲ３プライマー。
【００３７】
配列番号２７−ＥｃｏＲＶ部位を導入するためのＦＲ１プライマー。
【００３８】
配列番号２８−ＲｓａＩ部位を導入するためのＦＲ３プライマー。
【００３９】
配列番号２９−ＥｃｏＲＶ部位を導入するためのＦＲ１プライマー。
【００４０】
配列番号３０−ＨｉｎｄＩＩＩ部位を導入するためのＦＲ２プライマー。
【００４１】
配列番号３１−ＲｓａＩ部位を導入するためのＦＲ３プライマー。
【００４２】
配列番号３２−定常ドメインを含む全ｈｕＣＢＥ１１軽鎖（バージョン３）
配列番号３３−定常ドメインを含む全ｈｕＣＢＥ１１重鎖（バージョン４）
（定義）
本明細書中で用いられる用語「ヒト化抗体」とは、本明細書中で、親抗体の抗原結合特性を保持または実質的に保持するが、ヒトにおいて免疫原性が低い、非ヒト抗体（代表的にはマウス）由来の抗体をいう。
【００４３】
本明細書中で用いられる用語「相補性決定領域（ＣＤＲ）」とは、Ｋａｂａｔら（１９９１）により示されたような、ネイティブ免疫グロブリン結合部位の天然Ｆｖ領域の結合親和性および特性を共に規定する、アミノ酸配列をいう。
【００４４】
本明細書中で用いられる用語「フレームワーク領域（ＦＲ）」とは、ＣＤＲ間に介入されているアミノ酸配列をいう。抗体のこれらの部分は、適切な方向にＣＤＲを保持する役目を果たす（ＣＤＲが抗原に結合するのを可能にする）。
【００４５】
本明細書中で用いられる用語「定常領域（ＣＲ）」とは、エフェクター機能を与える抗体分子の部分をいう。本発明において、マウス定常領域は、ヒト定常領域により置換されている。対象のキメラ抗体またはヒト化抗体の定常領域は、ヒト免疫グロブリンから誘導される。重鎖定常領域は、以下の５つのアイソタイプのいずれかから選択され得る：α、δ、ε、γ、またはμ。さらに、様々なサブクラス（例えば、重鎖のＩｇＧサブクラス）の重鎖は、異なるエフェクター機能を担い、従って、所望の重鎖定常領域を選択することによって、所望のエフェクター機能を有する抗体が、産生され得る。好ましい定常領域はγ１（ＩｇＧ１）、γ３（ＩｇＧ３）、およびγ４（ＩｇＧ４）である。より好ましくは、γ１（ＩｇＧ１）アイソタイプのＦｃ領域である。軽鎖定常領域は、κ型もしくはλ型、好ましくはκ型の軽鎖定常領域であり得る。
【００４６】
本明細書中で用いられる用語「キメラ抗体」とは、２つの異なる抗体（代表的には、異なる種の抗体である）から由来する配列を含む抗体をいう。最も代表的なキメラ抗体は、ヒトおよびマウス抗体フラグメント、一般には、ヒト定常領域およびマウス可変領域を含む。
【００４７】
本明細書中で用いられる用語「免疫原性」とは、レシピエントに投与された場合に、免疫応答（体液性もしくは細胞性）を誘発する標識タンパク質または治療部分の能力の尺度をいう。本発明は、対象のヒト化抗体の免疫原性に関する。
【００４８】
免疫原性が低減されたヒト化抗体とは、親抗体（例えば、マウス抗体）と比較して低減された免疫原性を示すヒト化抗体をいう。
【００４９】
親抗体の結合特性を実質的に保持するヒト化抗体とは、このようなヒト化抗体を産生するために用いられる親抗体によって識別される抗原を特異的に結合する能力を保持する、ヒト化抗体をいう。好ましくは、ヒト化抗体は、親抗体と同じか、または実質的に同じ抗原結合親和性およびアビディティを示し得る。理想的には、抗体の親和性は、親抗体親和性の１０％以上であり、より好ましくは、約３０％以上であり、そして最も好ましくは、その親和性は、親抗体親和性の５０％以上である。抗原結合親和性をアッセイするための方法は、当該分野において周知であり、これらには、最大半減（ｈａｌｆ−ｍａｘｉｍａｌ）結合アッセイ、競合アッセイおよびスキャチャード分析が挙げられる。適切な抗原結合アッセイは、本出願に記載されている。
【００５０】
本発明は、ヒトＬＴ−β−Ｒを結合するヒト化モノクローナル抗体、および治療剤としてそれらの使用に関する。本発明はさらに、これらのヒト化抗体をコードする核酸配列、および組み換え宿主細胞におけるこれらの発現に関する。より詳細には、本発明は、ヒトＬＴ−β−Ｒに特異的に結合するマウスＣＢＥ１１由来のヒト化抗体に関する。
【００５１】
マウスＣＢＥ１１（ｍＣＢＥ１１）は、ヒトＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ融合タンパク質で免疫したマウスから単離されたマウスＩｇＧ１、κ抗体である（Ｂｒｏｗｎｉｎｇら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５４：３３（１９９５））。ｍＣＢＥ１１は、インビトロおよびインビボの両方でＬＴ−β−Ｒを機能的に活性化し（ＰＣＴ／ＵＳ９６／０１３８６）、そしてその単離および抗腫瘍特性が記載されている（Ｂｒｏｗｎｉｎｇら，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８３：８６７（１９９６））。ｍＣＢＥ１１を産生するハイブリドーマ細胞株は、以前に、本発明の出願人によってブダペスト条約の規定に従って、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）に寄託され、ＡＴＣＣ登録番号ＨＢ１１７９３を与えられた（ＰＣＴ／ＵＳ９６／０１３８６）。出願人はまた、種々のアゴニスト抗ＬＴ−β−Ｒ抗体と架橋したＬＴ−βレセプターが、ＬＴ−βレセプターを活性化する（すなわち、天然のリガンドの効果を模倣し得る）ことを示している（ＰＣＴ／ＵＳ９６／０１３８６）。次いで、レセプターの活性化は、ＬＴ−βレセプターが発現される種々のインビボ腫瘍モデルにおいて腫瘍増殖を阻害することが示されている。ＬＴ−βレセプターは、多くの癌細胞（例えば、非小細胞肺癌細胞（ＮＳＣＬＣ）、結腸直腸癌細胞（ＣＲＣ）、乳癌細胞、ならびに前立腺、胃、皮膚、胃、食道、膀胱癌細胞を含む）上で発現されることが示されている。アゴニストＬＴ−β−Ｒ抗体が阻害する腫瘍の非限定的な例としては、以下の固形の腫瘍が挙げられる：ＨＴ２９結腸腺癌、ＨＴ３子宮頚癌、Ａ３７５黒色腫、ＭＤＡ−２３１乳癌、および原発性結腸腫瘍。それゆえ、アゴニストＬＴ−β−Ｒ抗体は、ＬＴ−β−Ｒ活性化および／またはＬＴ−β−Ｒ／ＬＴ−β−Ｒリガンド相互作用の調節が所望される疾患の処置（例えば、被験者（例えば、ヒト）における新形成の進行、重症度もしくは作用の処置または低減を含む）に有用なものとする特性を有する。
【００５２】
ｍＣＢＥ１１モノクローナル抗体の結合特性を実質的に保持するために必要とされるモデル分析および復帰突然変異を含む、ｍＣＢＥ１１モノクローナル抗体のヒト化を、本明細書中に記載する。
【００５３】
（マウス可変領域のモデル分析）
ＣＤＲは、抗原を結合する可能性が最も高い残基を含み、そして再形成される抗体において保持されなければならない。ＣＤＲは、Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ  第５版、Ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，Ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｇｏｖｅｒｎｍｅｎｔ  Ｐｒｉｎｔｉｎｇ  Ｏｆｆｉｃｅ，１９９１に従う配列によって定義される。ＣＤＲは、標準的なクラスに分類され（Ｃｈｏｔｈｉａら，１９８９  Ｎａｔｕｒｅ，３４２，８７７〜８８３）、ここでは、重要な残基が、ＣＤＲループの構造的なコンホメーションの大部分を決定する。これらの残基は、ほぼ通常、再形成された抗体内に保持される。ｍＣＢＥ１１の軽鎖可変ドメインのポリペプチド配列を、ＣＤＲに下線を付して以下に示し、そしてその残基配置番号を、Ｋａｂａｔ番号付けシステムに従って示す：
【００５４】
【化１】
2004532608.tif 000003
（配列番号１）
ｍＣＢＥ１１の重鎖可変ドメインのポリペプチド配列を、ＣＤＲに下線を付して以下に示し、そしてその残基配置番号を、Ｋａｂａｔ番号付けシステムに従って示す：
【００５５】
【化２】
2004532608.tif 000004
（配列番号２）
ｍＣＢＥ１１の可変軽鎖および可変重鎖を、ＦＡＳＴＡプログラムを用いて、マウスおよびヒトのサブグループのコンセンサス配列（Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｇ．，Ｗｕ，Ｔ．Ｔ．Ｋａｂａｔ  Ｄａｔａｂａｓｅ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ：ｆｕｔｕｒｅ  ｄｉｒｅｃｔｉｏｎｓ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２９，２０５〜２０６，２００１；Ｗｕ  ａｎｄ  Ｋａｂａｔ，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１３２：２１１〜２５０（１９７０））と比較した。ｍＣＢＥ１１可変軽鎖は、１１０のアミノ酸オーバーラップにおいて７４％の同一性を有する、マウスサブグループＶのメンバーであり、ｍＣＢＥ１１可変重鎖は、１３２のアミノ酸オーバーラップにおいて７９％の同一性を有する、マウスサブグループＩＩＩｄのメンバーである。これらの可変軽鎖は、１１３のアミノ酸オーバーラップにおいて、６６％の同一性で、ヒトサブグループＩに対応する。これらの可変重鎖は、１３１のアミノ酸オーバーラップにおいて、７１％の同一性で、ヒトサブグループＩＩＩに対応する。
【００５６】
本発明のＣＤＲを、標準的なクラスに分類した。Ｌ１ループは、標準的なクラス２（１１残基のループ）に分類され、Ｌ２ループは、クラス１（７残基）に分類され、そしてＬ３ループは、クラス１（９残基）に分類される。Ｈ１ループは、クラス１（５残基）に分類され、Ｈ２ループは、クラス３（１７残基）に分類された。Ｈ３ループは、いずれの標準クラスにも属さなかった。
【００５７】
可変軽鎖と重鎖との間の境界にある残基が定義されている（Ｃｈｏｔｈｉａら，１９８５  Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１８６，６５１−６６３）。これらは、通常、再形成された抗体内に保持される。ｍＣＢＥ１１において、これらの残基のいくつかは、その境界において普通でない（すなわち、ＶＬ内のＳ３４、Ｉ４６、Ｌ８９、Ｈ９１、およびＶＨ内のＹ３５、Ｆ３７、Ｖ９３、Ｅ９５）。
【００５８】
普通でないフレームワーク残基は、Ｋａｂａｔデータベース［ＮＣＢＩ、ＮＩＨ］のｔｈｅ  Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ  １９９９バージョンにおいて、全てのマウスおよびヒトの可変鎖配列を分析することにより決定された。ｍＣＢＥ−１１特異的な相違は、これらの相違が、結合部位に近接する場合、結合活性を増強する体細胞性変異を示し得ると考えられている。結合部位からさらに離れた普通でないマウス残基および普通でないヒト残基は、これらが再形成された抗体において免疫原性エピトープを作製し得る場合、除去された。ｍＣＢＥ１１に見出される通常でないフレームワーク残基は、軽鎖内のＫ３、Ｍ１１、Ｙ１２、Ｗ４１、Ｑ６９、Ｓ７２、Ｄ８１、Ｔ８３；および重鎖内のＦ３７、Ｔ４０、Ｅ４２、Ａ４９、Ｎ７７である。これらの残基のほとんどは、ヒト化ＣＢＥ１１抗体において保持されなかったが、一方で、これらの通常でないフレームワーク残基のいくつか（例えば重鎖内のＦ３７およびＡ４９を含む）は、保持されていた。
【００５９】
（可変領域の構造モデリング）
本発明の軽鎖および重鎖が、非重複性データベースに対して整列されて、ｍＣＢＥ１１の軽鎖および重鎖の三次元モデルを構築するために使用されるべき構造フレームが決定された。ＢＲＡＳＴを使用して、この軽鎖は、モノクローナルマウス抗体５ｇ９（１ＡＨＷ）に対して９３％の配列同一性を有することが見出された。そしてこの重鎖は、マウスのＩＧＧＡ２  Ｆａｂフラグメント（Ｆａｂ１７／９）（１ＩＦＨ）に対して８１％の配列同一性を有することが見出された。分子モデリングパッケージＳｙｂｙｌ（Ｔｒｉｐｏｓ  Ｉｎｃ．）を使用して、この軽鎖およびこの重鎖の三次元構造は、５ｇ９の軽鎖およびＩＧＧＡ２  Ｆａｂフラグメントの重鎖をそれぞれ用いて構築された。このモデルの構造の完全性は、コンソールで評価され、そして妥当であることが見出された。
【００６０】
（新形態可変領域の設計）
相同性マッチングが、ｍＣＢＥ１１  ＣＤＲを「受容する」ヒトアクセプターのフレームワークを選ぶために使用される。ＫａｂａｔデータベースおよびＮＣＢＩ，ＥＮＴＲＺ（国立衛生研究所）からの非重複性のデータベースの両方が、ソフトウェアプログラムＢＬＡＳＴを使用して検索された。ヒトアクセプターのフレームワークの選択は、 ｍＣＢＥ１１フレームワークとヒトフレームワーク（これまでのヒト化抗体からのフレームワークを除く）との間の配列同一性に基づいてなされた。
【００６１】
ヒトフレームワークの最終的な選択は、可変軽（ＶＬ）鎖（ヒトκサブグループＩ）についてはヒトの腫瘍壊死因子αに対する抗体ＴＮＦ−Ａ１’ＣＬ（ｋａｂａｔ  ＩＤ  ００４７７０）（Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓら、１９９３  ＥＭＢＯ  Ｊ．１２：７２５−７３４）から、そして可変重（ＶＨ）鎖（ヒトサブグループＩＩＩ）については特異性が知られていない抗体ＦＬＡ−ＩｇＧ’ＣＬ（ｋａｂａｔ  ＩＤ  ０４０００３）からであった。ヒトＶＬフレームワークおよびヒトＶＨフレームワークは、それらのマウスの配列と比較して１５残基および１１残基の違いを有する。
（ヒトフレームワークの復帰突然変異）
モノクローナル抗体のヒト化での最も予測不可能な手順は、親抗体の結合性質を実質的に保持すると同時に結果として生じる抗体の潜在的な免疫原性を最小にするために保持される必要がある、親抗体（すなわち、この場合には、親抗体は、マウス起源である）に由来する重要なフレームワーク残基の同定である。結合部位に近い、標準的な（ｃａｎｏｎｉｃａｌ）残基、境界面を包む（ｉｎｔｅｒｆａｃｅ−ｐａｃｋｉｎｇ）残基、普通でないマウスの残基を保持することは、特に重要である。さらに、「Ｖｅｒｎｉｅｒ  Ｚｏｎｅ」（これは、ＣＤＲが位置するプラットフォームを形成する）（ＦｏｏｔｅおよびＷｉｎｔｅｒ、１９９２  Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２４、４８７〜４９９）中の残基およびＣＤＲ  Ｈ３に近接した残基が、考慮される。親抗体に戻る変異（すなわち、ヒトフレームワーク残基からマウスへと逆に変異すること）は、本明細書中で復帰突然変異と呼ばれる。
【００６２】
新形態可変軽鎖（ｈｕ−ＣＢＥ１１  ＶＬ）の３つのバージョンおよび新形態可変重鎖（ｈｕ−ＣＢＥ１１  ＶＨ）の４つのバージョンが作られている。一般的に、第１のバージョンは、最も多くの復帰突然変異を含み、そして第３のバージョンは、ｈｕ−ＣＢＥ１１  ＶＨの第４のバージョンを除くと最も少ない復帰突然変異を含む（すなわち最もヒト化されている）。本発明は、下記の可変軽鎖（すなわち、ＶＬ＃１、ＶＬ＃２またはＶＬ＃３）から選択された可変軽鎖、および下記の可変重鎖（すなわち、ＶＨ＃１、ＶＨ＃２、ＶＨ＃２またはＶＨ＃４）から選択された可変重鎖を任意の組み合わせで有する、ｍＣＢＥ１１由来のヒト化抗体を企図する。
【００６３】
（Ａ）軽鎖：
３Ｑ（グルタミン）−＞Ｋ（リジン）。これが抗原結合またはＣＤＲの高次構造に重要であり得ることを以前の新形態実験（例えば、Ｋｏｌｂｉｎｇｅｒら、１９９３  Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇ．，６．９７１−９８０）が示したので、これは、第１のバージョンで保持される
４１Ｇ（グリシン）−＞Ｗ（トリプトファン）。第１および第２のバージョンで保持された。
【００６４】
４６Ｌ（ロイシン）−＞Ｉ（イソロイシン）。これは、境界面残基およびｖｅｒｎｉｅｒ  ｚｏｎｅ中の残基の両方であるので、第１および第２バージョンにて保持された。さらに、マウスの配列で９回そしてヒトでは１回出現する珍しい残基がある。これは可変鎖のパッキングに影響する可能性があり、ＣＤＲと接触し得る。
【００６５】
６９Ｔ（スレオニン）−＞Ｑ（グルタミン）。この残基はｖｅｒｎｉｅｒ  ｚｏｎｅ中にあり、ＣＤＲの高次構造に影響し得る。短いＴから長いＱへの変化はまた、それが抗原と接触することを意味し得る。そのＱは珍しく、マウスで５８回、そしてヒトでは２回出現する。第１のバージョンにおいて、これは保持された。
【００６６】
７１Ｆ（フェニルアラニン）−＞Ｙ（チロシン）。この残基は、正準な位置にある。そしてこの残基は、すべてのバージョンにて保持された。それはまた、ヒトの配列で比較的珍しく、２５回だけ出現する。
【００６７】
（Ｂ）重鎖
３７Ｖ（バリン）−＞Ｆ（フェニルアラニン）。第１、第２および第４のバージョンで保持された。この位置のＦは珍しく、マウスで１５回、ヒトで１８回だけ出現する。それはまた、境界面残基である。
【００６８】
４０Ａ（アラニン）−＞Ｔ（チロシン）。これは第１のバージョンで保持された。この位置の変異は、これまでの５つのヒト化実験で試みられているが、ＡからＴへの変化ではない。１つの例は、ＢｒＥ−３の表面（ｖｅｎｅｅｒｉｎｇ）におけるＡからＳへの変化であり（Ｃｏｕｔｏら、１９９４  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ、１３、２１５−２１９）、結合親和性が増加したが、理由は決定されなかった。この場合に、重鎖もまた、ヒトサブグループＩＩＩであった。
【００６９】
４９Ｓ（セリン）−＞Ａ（アラニン）。この残基はＣＤＲ下にあり、そしてｖｅｒｎｉｅｒ  ｚｏｎｅの中にあり、そしてすべてのバージョンで保持された。
【００７０】
８９Ｖ（バリン）−＞Ｍ（メチオニン）。これは、第１のバージョンで保持された。この位置は、いくつかのヒト化実験で復帰突然変異されている。これは、第１のバージョンで保持された。
【００７１】
９３Ａ（アラニン）−＞Ｖ（バリン）。この位置は、境界面残基でありかつｖｅｒｎｉｅｒ  ｚｏｎｅ中にある。これは、第１および第２のバージョンで保持された。
【００７２】
作られた可変軽鎖および可変重鎖の異なったバージョンのそれぞれのアミノ酸配列および核酸配列は以下のようである：
新形態可変軽鎖
ＣＢＥ１１の新形態可変軽鎖−バージョン１の軽鎖（ＶＬ＃１）（プラスミドｐＡＮＤ０６６）
【００７３】
【化３】
2004532608.tif 000005
配列番号：３は、上記の新形態ＶＬ＃１の核酸配列を表す。
配列番号：４は、上記の新形態ＶＬ＃１のアミノ酸配列を表す。
ＣＢＥ１１の新形態可変軽鎖−バージョン２の軽鎖（ＶＬ＃２）（プラスミドｐＡＮＤ０７０）
【００７４】
【化４】
2004532608.tif 000006
配列番号：５は、上記の新形態ＶＬ＃２の核酸配列を表す。
配列番号：６は、上記の新形態ＶＬ＃２のアミノ酸配列を表す。
ＣＢＥ１１の新形態可変軽鎖−バージョン３の軽鎖（ＶＬ＃３）（プラスミドｐＡＮＤ０７４）
【００７５】
【化５】
2004532608.tif 000007
配列番号：７は、上記の新形態ＶＬ＃３の核酸配列を表す。
配列番号：８は、上記の新形態ＶＬ＃３のアミノ酸配列を表す。
新形態可変重鎖：
ＣＢＥ１１の新形態可変重鎖−バージョン１の重鎖（ＶＨ＃１）（プラスミドｐＡＮＤ０６７）
【００７６】
【化６】
2004532608.tif 000008
配列番号：９は、上記の新形態ＶＨ＃１の核酸配列を表す。
配列番号：１０は、上記の新形態ＶＨ＃１のアミノ酸配列を表す。
ＣＢＥ１１の新形態可変重鎖−バージョン２の重鎖（ＶＨ＃２）（プラスミドｐＡＮＤ０７１）
【００７７】
【化７】
2004532608.tif 000009
配列番号：１１は、上記の新形態ＶＨ＃２の核酸配列を表す。
配列番号：１２は、上記の新形態ＶＨ＃２のアミノ酸配列を表す。
ＣＢＥ１１の新形態可変重鎖−バージョン３の重鎖（ＶＨ＃３）（プラスミドｐＡＮＤ０７５）
【００７８】
【化８】
2004532608.tif 000010
配列番号：１３は、上記の新形態ＶＨ＃３の核酸配列を表す。
配列番号：１４は、上記の新形態ＶＨ＃３のアミノ酸配列を表す。
ＣＢＥ１１の新形態可変重鎖−バージョン４の重鎖（ＶＨ＃４）（プラスミドｐＡＮＤ０９０）
【００７９】
【化９】
2004532608.tif 000011
配列番号：１５は、上記の新形態ＶＨ＃４の核酸配列を表す。
配列番号：１６は、上記の新形態ＶＨ＃４のアミノ酸配列を表す。
【００８０】
軽鎖および重鎖の異なったバージョンからなる抗体が作製され、そしてさらなる研究に使用された。たとえば、新形態ｈｕＣＢＥ１１バージョン３の可変軽鎖（ＶＬ＃３）、およびｈｕＣＢＥ１１＃４またはｈＣＢＥ１１と名づけられた新形態ｈｕＣＢＥ１１バージョン４の可変重鎖（ＶＨ＃４）からなる抗体が作製され、そしてその抗体を産生する細胞系統Ｅ４６．４およびＥ７７．４は、Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．寄託機関に預けられている（それぞれ、ＡＴＣＣ特許受託名ＰＴＡ−３３５７および３７６５）。
【００８１】
本発明は、新形態ＶＨおよびＶＬの配列の等価物および改変体（すなわち、ＬＴ−β−Ｒ結合に実質的には影響しない１つ以上の保存的アミノ酸置換を含むもの）をさらに企図する。これらのヒト化可変重配列およびヒト化可変軽配列を含む、ヒト化ＬＴ−β−Ｒ抗体は、実施例に記載されるように組換え法によって得られ得る。
【００８２】
（使用）
本発明のヒト化抗ＬＴ−β−Ｒ抗体は、ＬＴ−β−Ｒ活性化が治療的に有益である疾患状態を処置することにおける使用を有する。このような状態としては、新生物を治療すること、新生物を予防すること、新生物の進行、重症度または効果を減らすことが挙げられる。
【００８３】
本発明の一つの実施形態は、治療的上有効な量の、本発明のヒト化ＬＴ−β−Ｒ抗体を含む組成物を哺乳動物に投与することによる、望ましくない細胞増殖に関連する状態についてその哺乳動物（すなわちヒト）を処置する方法である。
【００８４】
本発明の別の実施形態は、ＬＴ−β−Ｒを過剰発現する固形腫瘍（すなわち、癌腫）を有する哺乳動物（すなわちヒト）を処置する方法であり、この方法は、ＬＴ−β−Ｒに結合するヒト化ＬＴ−β−Ｒ抗体を、腫瘍体積を減らすのに有効な量でその哺乳動物に投与する工程を包含する。細胞増殖がＬＴ−β−Ｒによって調節される癌の例は、腫瘍組織ライブラリーで発現するＬＴ−β−Ｒメッセージのレベルおよび／またはＬＴ−β−Ｒリガンド（すなわちＬＴα１β２またはＬＩＧＨＴ）のメッセージのレベルをインビトロで測定することによってスクリーニングされ得る。ＬＴ−β−Ｒおよび／またはＬＴ−β−Ｒリガンド（すなわちＬＴα１β２またはＬＩＧＨＴ）のメッセージが高く発現する腫瘍組織ライブラリーは、候補である。本発明で企図される腫瘍型としては、固形腫瘍が挙げられ、固形腫瘍としては、以下のものが挙げられるがこれらには限らない：非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、結腸直腸癌（ＣＲＣ）、乳癌、ならびに前立腺癌、胃癌、皮膚癌、腹部の癌、食道癌および膀胱癌。
【００８５】
望ましくない細胞増殖に関連する状態の治療に（特に腫瘍治療において）使用される本発明のヒト化抗体は、例えば腫瘍体積の減少により測定した場合、約１０％、２０％、３０％、または４０％より大きく、そして最も有利には５０％より大きく、有利に腫瘍細胞の増殖を阻害する。このヒト化抗体は、スクリーニングを通じて得られる（例えば、実施例３の説明を参照）。例えば、本発明で使用するためのヒト化抗体は、処置していない癌細胞に対する、減少した腫瘍体積（例えば、約１０％、２０％、３０％、４０％、または５０％より大きい）に基づいて選択され得る。
【００８６】
本発明はまた、本発明のヒト化抗体および薬学的に受容可能な賦形剤を含む、薬学的組成物を提供する。たとえば適切なキャリアおよびそれらの処方は、Ｏｓｌｏらによって編集されたＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１６ｔｈｅｄ．，１９８０，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．に記載されている。代表的には、適切な量の薬学的に受容可能な塩が、処方物を等張性にするために処方物中で用いられる。このキャリアの例は、生理食塩水、リンガー溶液およびブドウ糖溶液のような、緩衝液が挙げられる。その溶液のｐＨは、好ましくは約５〜約８であり、より好ましくは約７．４〜約７．８である。さらなるキャリアとしては、固体の疎水性ポリマーの半透性マトリックスのような徐放性調整物が挙げられ、そのようなマトリックスは、例えば、リポソーム、被膜、または微小粒子のような、造形物の形態である。特定のキャリアが、例えば投与の経路および投与される薬学的組成物の濃度に依存して、より好ましくあり得ることは、当業者には明らかである。
【００８７】
投与は、注射（例えば静脈内、腹腔内、皮下、筋肉内）によってか、または有効な形態での血流への送達を請け負う注入のような他の方法によって、成し遂げられ得る。
【００８８】
本発明のヒト化抗体は、取り組まれた特定の状態を処置するために有効な用量で投与され得る。好ましい薬学的処方物および所定の適用のための治療上有効な投与レジメンの決定は、例えば、患者の体重および状態、望ましい処置の程度およびその処置について患者の許容度を考慮して、十分当業者の範囲内である。例えば、有効な投薬量は、１日あたり体重１ｋｇにつき約０．０５ｍｇ〜約１００ｍｇの範囲である。より詳細には、１日あたり体重１ｋｇにつき、約０．０５ｍｇ、０．１ｍｇ、０．２ｍｇ、０．３ｍｇ、０．４ｍｇ、０．５ｍｇ、０．６ｍｇ、０．７ｍｇ、０．８ｍｇ、０．９ｍｇ、１ｍｇ、２ｍｇ、３ｍｇ、４ｍｇ、５ｍｇ、６ｍｇ、７ｍｇ、８ｍｇ、９ｍｇ、１０ｍｇ、１５ｍｇ、２０ｍｇまたは２５ｍｇである。あるいは、１週間あたり体重１ｋｇにつき約０．０５ｍｇ〜１００ｍｇ、より詳細には、約０．０５ｍｇ、０．１ｍｇ、０．２ｍｇ、０．３ｍｇ、０．４ｍｇ、０．５ｍｇ、０．６ｍｇ、０．７ｍｇ、０．８ｍｇ、０．９ｍｇ、１ｍｇ、２ｍｇ、３ｍｇ、４ｍｇ、５ｍｇ、６ｍｇ、７ｍｇ、８ｍｇ、９ｍｇ、１０ｍｇ、１５ｍｇ、２０ｍｇまたは２５ｍｇである。あるいは、２週間あたり体重１ｋｇにつき約０．０５ｍｇ〜１００ｍｇ、より詳細には、約０．０５ｍｇ、０．１ｍｇ、０．２ｍｇ、０．３ｍｇ、０．４ｍｇ、０．５ｍｇ、０．６ｍｇ、０．７ｍｇ、０．８ｍｇ、０．９ｍｇ、１ｍｇ、２ｍｇ、３ｍｇ、４ｍｇ、５ｍｇ、６ｍｇ、７ｍｇ、８ｍｇ、９ｍｇ、１０ｍｇ、１５ｍｇ、２０ｍｇまたは２５ｍｇである。あるいは、３週間あたり体重１ｋｇにつき約０．０５ｍｇ〜１００ｍｇ、より詳細には、約０．０５ｍｇ、０．１ｍｇ、０．２ｍｇ、０．３ｍｇ、０．４ｍｇ、０．５ｍｇ、０．６ｍｇ、０．７ｍｇ、０．８ｍｇ、０．９ｍｇ、１ｍｇ、２ｍｇ、３ｍｇ、４ｍｇ、５ｍｇ、６ｍｇ、７ｍｇ、８ｍｇ、９ｍｇ、１０ｍｇ、１５ｍｇ、２０ｍｇまたは２５ｍｇである。あるいは、４週間あたり体重１ｋｇにつき約０．０５ｍｇ〜１００ｍｇ、より詳細には、約０．０５ｍｇ、０．１ｍｇ、０．２ｍｇ、０．３ｍｇ、０．４ｍｇ、０．５ｍｇ、０．６ｍｇ、０．７ｍｇ、０．８ｍｇ、０．９ｍｇ、１ｍｇ、２ｍｇ、３ｍｇ、４ｍｇ、５ｍｇ、６ｍｇ、７ｍｇ、８ｍｇ、９ｍｇ、１０ｍｇ、１５ｍｇ、２０ｍｇまたは２５ｍｇである。
【００８９】
本発明の実施は、別な様に指示されない限り、当業者の範囲内である、細胞生物学、細胞培養、分子生物学、微生物学、組換えＤＮＡ、タンパク質化学および免疫学の従来の技術を使用する。そのような技術は、文献に記載されている。例えば、以下を参照のこと：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ．（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ＦｒｉｔｓｃｈおよびＭａｎｉａｔｉｓ編），Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９；ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｖｏｌｕｍｅｓ  Ｉ  ａｎｄ  ＩＩ（Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ編），１９８５；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ編），１９８４；米国特許第４，６８３，１９５号（Ｍｕｌｌｉｓら）；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ  ａｎｄ  Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編），１９８４；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．ＨａｍｅｓおよびＳ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編），１９８４；Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編）．Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，１９８７；Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，１９８６；Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｂ．Ｐｅｒｂａｌ），１９８４；Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅｓ  １５４  ａｎｄ  １５５  （Ｗｕら、編），Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ（Ｊ．Ｈ．ＭｉｌｌｅｒおよびＭ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ編），１９８７，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ；Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（ＭａｙｅｒおよびＷａｌｋｅｒ編），Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ，１９８７；Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅｓ  Ｉ−ＩＶ（Ｄ．Ｍ．ＷｅｉｒおよびＣ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ編），１９８６；Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｅｍｂｒｙｏ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８６。
【００９０】
以下の実施例は、本発明を例証するために提供され、そして本発明の限定として解釈されるべきではない。
（実施例）
（実施例１）
（ｃｈＣＢＥ１１の構築および発現）
重鎖および軽鎖のマウスＣＢＥ１１の可変領域をコードするｃＤＮＡを、ｍｕＣＢＥ１１可変領域がヒトＩｇＧ１およびκの定常領域に結合されているマウス−ヒトキメラ（ｃｈＣＢＥ１１）の発現のためのベクターを構築するために用いた。重鎖キメラの構築のために、ＣＢＥ１１重鎖サブクローンｐＥＡＧ９７０に由来する０．３６ｋｂのＰｓｔＩ−ＢｓｔＥＩＩフラグメントを、５ａ８重鎖プラスミドｐＬＣＢ７（５ａ８は、Ｂｉｏｇｅｎでこれまでに特徴付けされた分子的にクローン化した、ＣＤ−４特異的ｍＡｂである）に由来する２．８２ｋｂの脱リン酸化ＰｓｔＩ−ＢｓｔＥＩＩベクターフラグメントにサブクローン化し、マウスの重鎖シグナル配列およびスプライスドナー部位をｍｕＣＢＥ１１重鎖可変領域に付加した。ｐＥＡＧ９７９と呼ばれるこのプラスミドでは、重鎖の成熟Ｎ末端は、エドマン分解由来の精製した信頼できるＣＢＥ１１重鎖のＮ末端配列とは２つの残基分異なっている。なぜなら、このＮ末端は、ＰＣＲの間にプライマー決定したからである。この重鎖のＮ末端を補正するために、ｐＥＡＧ９７９を、製造者の推薦する手順に従ってＡｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ＵＳＥの変異誘発キットを用いて、独自部位除去（ＵＳＥ）の変異誘発に供した。導入されたＡｖａＩＩ変化、ＰｓｔＩ変化、およびＲｓａＩ変化についてスクリーニングすることによって、変異プラスミドを同定した。結果として生じたプラスミドｐＥＡＧ９８１中の重鎖配列を、ＤＮＡ配列決定によって確認した。ｐＥＡＧ９８１由来の０．４４ｋｂのＮｏｔＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ重鎖可変ドメインおよびヒトＩｇＧ１定常領域を含むプラスミドｐＥＡＧ９６４由来の１．２１ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ−ＮｏｔＩフラグメントを、ｐＣＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）ＥＢＶ発現ベクター由来のプラスミドｐＣＨ２６９のＮｏｔＩ部位にサブクローン化して、プラスミドｐＥＡＧ９８３を作製した。
【００９１】
軽鎖キメラの構築のために、プラスミドｐＭＤＲ９８５由来の０．１１ｋｂのＮｏｔＩ−ＥｃｏＲＶフラグメントおよびＣＢＥ１１軽鎖可変ドメインプラスミドｐＥＡＧ９６７に由来する０．３７ｋｂのＥｃｏＲＶ−ＢａｍＨＩフラグメントを、ＳｔｒａｔａｇｅｎｅのｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ＋クローニングベクターに由来する２．９４ｋｂの脱リン酸化ＮｏｔＩ−ＢａｍＨＩベクターフラグメントにサブクローン化して、結果として生じるプラスミドｐＥＡＧ９７８中でマウス軽鎖シグナル配列および５’ＮｏｔＩ部位を付加した。このプラスミドを、信頼できるＣＢＥ１１の軽鎖のＮ末端に一致するＶ３Ｋ置換をコードする変異誘発プライマーおよび軽鎖可変ドメインの３’末端にＢｇｌＩＩ部位を導入された変異誘発プライマーを用い、製造者の推薦する手順に従ってＡｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ＵＳＥ変異誘発キットを用いて、ＵＳＥ変異誘発に供した。変異プラスミドを、導入されたＢｇｌＩＩ部位変化、ＥｃｏＲＶ部位変化、およびＭｓｅＩ部位変化についてスクリーニングすることによって確認した。結果として生じたプラスミドｐＥＡＧ９８０中の軽鎖配列を、ＤＮＡ配列決定によって確認した。ｐＥＡＧ９８０由来の０．４１ｋｂのＮｏｔＩ−ＢｇｌＩ軽鎖可変ドメインフラグメントおよびヒトκ軽鎖定常ドメインを含むプラスミドｐＥＡＧ９６３由来の０．６８ｋｂのＢｃｌＩＩ−ＮｏｔＩフラグメントを、ｐＣＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）ＥＢＶ発現ベクター由来のプラスミドｐＣＨ２６９のＮｏｔＩ部位にサブクローン化して、プラスミドｐＥＡＧ９８２を作製した。
【００９２】
発現ベクター（ｃｈＣＢＥ１１重鎖ベクターｐＥＡＧ９８３およびｃｈＣＢＥ１１軽鎖ベクターｐＥＡＧ９８２）を、２９３−ＥＢＮＡ細胞に同時トランスフェクトし、そしてトランスフェクトされた細胞を、抗体分泌および抗体特異性について試験した（空ベクタートランスフェクト細胞およびｃｈ５ｃ８（Ｂｉｏｇｅｎでこれまでに特徴付けされ、分子的にクローン化された、ＣＤ１５４特異的ｍＡｂ）トランスフェクト細胞が、コントロールとして役立った）。細胞溶解物全体および馴化培地からのプロテインＡ免疫沈降物のウエスタンブロット分析（抗ヒト重鎖抗体および抗ヒト軽鎖抗体で発色させた）は、ｃｈＣＢＥ１１トランスフェクト細胞がｃｈ５ｃ８トランスフェクト細胞と同様のレベルで、軽鎖および重鎖を合成しそして効率的に分泌することを示した。トランスフェクトされた細胞由来の馴化培地を用いて染色されたＬＴ−β−Ｒ発現ＨＴ−２９細胞のＦＡＣＳ分析は、ｃｈＣＢＥ１１抗体が結合し、そしてｍｕＣＢＥ１１と類似する染色パターンを産生することを示した、一方、モックトランスフェクト細胞およびｃｈ５ｃ８トランスフェクト細胞由来の馴化培地は、ＨＴ−２９細胞上のＬＴ−β−Ｒを染色することを失敗したことを示した。一過性トランスフェクションから産生されたキメラＣＢＥ１１を、精製した。そしてこのキメラが、ＬＴ−β−Ｒ発現Ａ３７５黒色腫細胞によるＩＬ−８分泌を誘導すること、およびヌードマウスでＷｉＤＲｒ腺癌細胞の増殖を阻害することを、実証した。
【００９３】
（実施例２）
（ｈｕＣＢＥ１１の構築および発現）
ヒト化ＣＢＥ１１（ｈｕＣＢＥ１１）を産生するための造りなおされた可変ドメインの設計を、上述のとおり行った。ヒトレセプターフレームワークの選択は、ホモロジーマッチングによった：軽鎖に対しては、ヒトκサブグループＩ  ｍＡｂ  ＴＮＦ−Ａ１（Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓら、１９９３）、および重鎖に対しては、ヒトサブグループＩＩＩ  ｍＡｂ  ＦＬＡ−ＩｇＧ（Ｍａｌｉｓａｎら、１９９６）。可変軽鎖の各々について三つのバージョンおよび造りなおされた可変重鎖の四つのバージョンを設計した。一般的に、最初のバージョンがマウスドナー配列への最多の復帰突然変異を含み、一方で最後のバージョンは、最小の復帰突然変異を含む（すなわち、最も「ヒト化された」バージョン）。
【００９４】
ｈｕＣＢＥ１１可変領域を、出発テンプレートとしてｃｈＣＢＥ１１可変ドメインプラスミドを使用して、製造業者推奨プロトコールに従ってアマシャムファルマシアバイオテクＵＳＥ変異誘発キットを使用し、ユニーク部位消失（ＵＳＥ）変異誘発によって作製した。フレームワーク（ＦＲ）の変化についての変異誘発プライマーを以下に記載する。ヒトレセプターフレームワーク（軽鎖に対してＫａｂａｔデータベース＃００４７７０および重鎖に対してＫａｂａｔ＃０４０００３）のｃＤＮＡ配列を用い、サイレント変異を、変異されたプラスミドの同定を容易にするための制限酵素部位変化を生じさせるために導入した。変異されたプラスミドを導入された制限酵素部位変化についてスクリーニングすることによって同定した。結果として得られるプラスミド中の可変領域ｃＤＮＡ配列を、ＤＮＡシーケンシングによって確認した。
【００９５】
ＶＨ＃１は、以下のプライマーとともにｐＥＡＧ９８１テンプレートを使用した：ＦＲ１プライマー
【００９６】
【化１０】
2004532608.tif 000012
（配列番号１７）で、これはＢｓｕ３６Ｉ部位を導入する；ＦＲ２プライマー
【００９７】
【化１１】
2004532608.tif 000013
（配列番号１８）で、これはＮｃｉＩ部位およびＨｐａＩＩ部位を導入する；およびＦＲ３プライマー
【００９８】
【化１２】
2004532608.tif 000014
（配列番号１９）で、これはＢｓｕ３６Ｉ部位およびＰｓｔＩ部位を導入し、ＲｓａＩ部位を除去する。結果として得られるＶＨ＃１プラスミドを、ｐＡＮＤ０６７と称した。
【００９９】
ＶＨ＃２は以下のプライマーとともにｐＡＮＤ０６７テンプレートを使用した：ＦＲ２プライマー
【０１００】
【化１３】
2004532608.tif 000015
（配列番号２０）で、これはＳｍａＩ部位を導入する；およびＦＲ３プライマー
【０１０１】
【化１４】
2004532608.tif 000016
（配列番号２１）で、これはＰｖｕＩＩ部位を導入する。結果として得られるＶＨ２＃プラスミドを、ｐＡＮＤ０７１と称した。
【０１０２】
ＶＨ＃３は以下のプライマーとともにｐＡＮＤ０６７テンプレートを使用した：ＦＲ２プライマー
【０１０３】
【化１５】
2004532608.tif 000017
（配列番号２２）でこれはＳｍａＩ部位およびＨｈａＩ部位を導入する；およびＦＲ３プライマー
【０１０４】
【化１６】
2004532608.tif 000018
（配列番号２３）で、これはＰｖｕＩＩ部位およびＦｓｐＩ部位を導入する。結果として得られるＶＨ＃３プラスミドを、ｐＡＮＤ０７５と称した。
【０１０５】
ｈｕＣＢＥ１１重鎖に対する発現ベクターを、ｐＡＮＤ０６７、ｐＡＮＤ０７１、またはｐＡＮＤ０７５から０．４４ｋｂのＮｏｔＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ重鎖可変ドメインフラグメントを、およびプラスミドｐＥＡＧ９６４から１．２１ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ−ＮｏｔＩフラグメント（これは、ヒトＩｇＧ１定常領域を含む）をサブクローニングすることにより作製し、これらをｐＣＥＰ４ＥＢＶ発現ベクター由来プラスミドｐＣＨ２６９のＮｏｔＩ部位にサブクローニングし、重鎖発現ベクターｐＡＮＤ０６９（ＶＨ＃１）、ｐＡＮＤ０７３（ＶＨ＃２）、およびｐＡＮＤ０７７（ＶＨ＃３）を生成した。
【０１０６】
ＶＬ＃１は以下のプライマーとともにｐＥＡＧ９８０テンプレートを使用した：ＦＲ１プライマー
【０１０７】
【化１７】
2004532608.tif 000019
（配列番号２４）で、これはＨｉｎｆＩ部位およびＮｓｉＩ部位を除去する；ＦＲ２プライマー
【０１０８】
【化１８】
2004532608.tif 000020
（配列番号２５）で、これはＨａｅＩＩおよびＨｈａＩ部位を導入する；およびＦＲ３プライマー
【０１０９】
【化１９】
2004532608.tif 000021
（配列番号２６）で、これはＢｓｕ３６Ｉ部位、ＤｄｅＩ部位、およびＰｓｔＩ部位を導入した。結果として得られるＶＬ＃１プラスミドを、ｐＡＮＤ０６６と称した。
【０１１０】
ＶＬ＃２は以下のプライマーとともにｐＡＮＤ０６６テンプレートを使用した：ＦＲ１プライマー
【０１１１】
【化２０】
2004532608.tif 000022
（配列番号２７）で、これはＥｃｏＲＶ部位を導入した；およびＦＲ３プライマー
【０１１２】
【化２１】
2004532608.tif 000023
（配列番号２８）で、これはＲｓａＩ部位を導入した。結果として得られるＶＬ＃２プラスミドを、ｐＡＮＤ０７０と称した。
【０１１３】
ＶＬ＃３は以下のプライマーとともにｐＡＮＤ０６６テンプレートを使用した：ＦＲ１プライマー
【０１１４】
【化２２】
2004532608.tif 000024
（配列番号２９）で、これはＥｃｏＲＶ部位を導入する；ＦＲ２プライマー
【０１１５】
【化２３】
2004532608.tif 000025
（配列番号３０）で、これはＨｉｎｄＩＩＩ部位を導入し、ＮｃｏＩ部位およびＳｔｙＩ部位を除去する；およびＦＲ３プライマー
【０１１６】
【化２４】
2004532608.tif 000026
（配列番号３１）で、これはＲｓａＩ部位を導入する。結果として得られるＶＬ＃３プラスミドを、ｐＡＮＤ０７４と称する。
【０１１７】
ｈｕＣＢＥ１１軽鎖についての発現ベクターを、ｐＡＮＤ０６６、ｐＡＮＤ０７０、またはｐＡＮＤ０７４から０．４１ｋｂのＮｏｔＩ−ＢｇｌＩＩ軽鎖可変ドメインフラグメントを、およびプラスミドｐＥＡＧ９６３から０．６８ｋｂのＢｃｌＩ−ＮｏｔＩフラグメントを（これは、ヒトκ軽鎖定常ドメインを含む）サブクローニングすることによって作製し、ｐＣＥＰ４ＥＢＶ発現ベクター由来プラスミドｐＣＨ２６９のＮｏｔＩ部位にサブクローニングし、軽鎖発現ベクターｐＡＮＤ０６８（ＶＬ＃１）、ｐＡＮＤ０７２（ＶＬ＃２）、およびｐＡＮＤ０７６（ＶＬ＃３）を生成した。
【０１１８】
発現ベクターを、２９３−ＥＢＮＡ細胞に共トランスフェクトし、トランスフェクトされた細胞を抗体分泌および特異性に対してテストした（ネガティブコントロールとして、空ベクタートランスフェクト細胞が提供された）。全細胞溶解物および馴化培地由来のプロテインＡ免疫沈降物のウエスタンブロット解析（抗ヒト重鎖抗体および抗ヒト軽鎖抗体を用いて発色された）によって、ｈｕＣＢＥ１１トランスフェクト細胞はｃｈＣＢＥ１１トランスフェクト細胞と似たレベルで重鎖および軽鎖を合成し、効率的に分泌することが示された。トランスフェクト細胞からの馴化培地で染色したＬＴ−β−Ｒ発現ＨＴ−２９細胞のＦＡＣＳ解析は、ｈｕＣＢＥ１１＃３  ｍＡｂが、ｃｈＣＢＥ１１に対して、ｈｕＣＢＥ１１＃１  ｍＡｂおよびｈｕＣＢＥ１１＃２  ｍＡｂよりも弱く結合することを示した（以下の表１）。ここで、ｈｕＣＢＥ１１＃１（ＶＨ＃１を有するＶＬ＃１）、ｈｕＣＢＥ１１＃２（ＶＨ＃２を有するＶＬ＃２）およびｈｕＣＢＥ１１＃３（ＶＨ＃３を有するＶＬ＃３）。混合共トランスフェクションおよび調和共トランスフェクションによって、この減少はＶＨ＃３に起因し得ることが示唆された。このＶＨ＃３は２つのフレームワーク残基でＶＨ＃２と異なった：それはＦＲ２  Ｆ３７ＶおよびＦＲ３  Ｖ９３Ａである。これらの変化それぞれの個々の寄与を調査するために、新規重鎖発現ベクターを構築した。プラスミドｐＡＮＤ０８９、ＶＨ２＃のＦ３７Ｖ改変体を、ｐＡＮＤ０７５から３１１ｂｐのＮｏｔＩ−ＰｓｔＩフラグメントを、ｐＡＮＤ０７１から１２６ｂｐのＰｓｔＩ−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントを、およびプラスミドｐＥＡＧ９６４から１．２１ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ−ＮｏｔＩフラグメントを、ｐＣＥＰ４ＥＢＶ発現ベクター由来プラスミドｐＣＨ２６９のＮｏｔＩ部位へサブクローニングすることによって作製した。プラスミドｐＡＮＤ０９０、ＶＨ＃２のＶ９３Ａ改変体を、ｐＡＮＤ０７１から３１１ｂｐのＮｏｔＩ−ＰｓｔＩフラグメントを、ｐＡＮＤ０７５から１２６ｂｐのＰｓｔＩ−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントを、およびプラスミドｐＥＡＧ９６４から１．２１ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ−ＮｏｔＩフラグメントを、ｐＣＥＰ４ＥＢＶ発現ベクター由来プラスミドｐＣＨ２６９のＮｏｔＩ部位へサブクローニングすることによって作製した。これらＨ２／Ｈ３キメラ重鎖を、ＶＬ＃２またはＶＬ＃３とともに２９３−ＥＢＮＡ細胞へ共トランスフェクトさせた。ＦＡＣＳ解析は、Ｖ９３Ａ  Ｈ２改変体がＶＬ＃３と対合した場合、ＬＴ−β−Ｒ結合を回復することを示した（上記表１を参照のこと）。ｐＡＮＤ０７６およびｐＡＮＤ０９０対合は、ｈｕＣＢＥ１１＃４と称された（上記表１を参照のこと）。
【０１１９】
ｃｈＣＢＥ１１およびｈｕＣＢＥ１１のバージョン＃１〜＃４による２９３−ＥＢＮＡ細胞の共トランスフェクションはスケールアップし、馴化培地を採集した。抗体をプロテインＡ−セファロース上で精製した。精製したｍＡｂを活性に対してアッセイした。
【０１２０】
【表１】
2004532608.tif 000027
一過的にトランスフェクトした細胞由来の馴化培地を、氷上で３０分間インキュベートし、ＦＡＣＳ緩衝液（５％ＦＢＳおよび０．０５％アジ化ナトリウムを含むＰＢＳ）で細胞を二回洗浄し、氷上で３０分間、ＦＡＣＳ緩衝液中で、Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｅｓ，Ｉｎｃ．のＰＥ複合抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）で染色し、ＦＡＣＳ緩衝液で細胞を二回洗浄し、そして解析のためにＦＡＣＳ緩衝液中に懸濁することによってＨＴ−２９細胞を染色するために使用した。相対ＭＦＩとは、ｃｈＣＢＥ１１に対して観測されたＭＦＩに対して規格化された平均ＭＦＩのことをいう。示したデータは、二つの独立したトランスフェクションの平均を表す。
【０１２１】
（実施例３）
（Ａ３７５細胞におけるＩＬ−８アゴニズム）
精製したｍＡｂを活性に対してアッセイした。Ａ３７５ヒトミエローマ細胞におけるＩＬ−８放出アッセイの結果を図１に示す。そのアッセイは、抗ＬＴ−β−Ｒ抗体のＡ３７５ヒトミエローマ細胞表面上に発現したＬＴ−β−Ｒとの結合の際に放出されたＩＬ−８の量を測定する。Ａ３７５細胞を、可溶性抗体またはヤギ抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）コートウェル上に捕捉された抗体のいずれかを含む９６ウェルプレートへ１０５／ｍｌとなるようにプレートに植えた。この培養プレートを一晩インキュベートした。馴化培地を採集し、ＥＬＩＳＡによってＩＬ−８に対して解析した。
【０１２２】
（実施例４）
（ＷｉＤｒ細胞における細胞毒性）
抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃコートウェル上の可溶性抗ＬＴ−β−Ｒ抗体とともにＷｉＤｒ大腸癌細胞を使用した細胞毒性アッセイの結果は、図２に示されるように、抗ＬＴ−β−Ｒ抗体が癌細胞中で細胞毒性を増加することを示す。ＷｉＤｒ細胞を、可溶性抗体またはヤギ抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）コートウェル上に捕捉された抗体のいずれかを含む９６ウェルプレートへ８０ｕｎｉｔｓ／ｍｌ  ｈｕＩＦＮγ存在下で６×１０４／ｍｌとなるようにプレートに植えた。この培養プレートを５日間インキュベーションした。ＭＴＴを４時間加え、結果として得られる沈殿を１０ｍＭ  ＨＣｌ中の１０％ＳＤＳとともに一晩インキュベーションすることによって溶解し、Ｏ．Ｄ．をマイクロプレートリーダーで読み取った。
【０１２３】
（実施例５）
造りなおされたｈｕＣＢＥ１１バージョン３軽鎖可変部（ＶＬ＃３）および造りなおされたｈｕＣＢＥ１１バージョン４重鎖可変部、すなわちｈｕＣＢＥ１１＃４またはｈｕＣＢＥ１１、からなる抗体を作製し、そしてこの抗体を産生するこの細胞株を、Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．寄託機関に寄託した（ＡＴＣＣ特許寄託名ＰＴＡ−３３５７）。軽鎖および重鎖それぞれの全ポリペプチド配列（定常ドメインを含む）は、以下のとおりである：
成熟ｈｕＣＢＥ１１バージョン３軽鎖の配列（配列番号３２）：
【０１２４】
【化２５】
2004532608.tif 000028
ＣＤＲは下線を付され、復帰突然変異Ｆ７１Ｙは太字化され、定常ドメインは括弧を付される。成熟ｈｕＣＢＥ１１バージョン４重鎖の配列（配列番号３３）：
【０１２５】
【化２６】
2004532608.tif 000029
2004532608.tif 000030
ＣＤＲは下線を付され、復帰突然変異Ｖ３７ＦおよびＳ４９Ａは太字化され、定常ドメインは括弧を付される。
【０１２６】
生後６週間のヌードマウスに、１００μｇの抗ＬＦＡ３抗体（１Ｅ６）、１００μｇの抗ＬＴＢＲ抗体（ｈｕＣＢＥ１１＃４）を腹膜内注射するか、または注射しなかった（コントロール）。その後、この動物に１×１０６ＷＩＤＲ大腸腺癌細胞を皮下注射した。ｈｕＣＢＥ１１＃４処置マウスは、１００μｇの抗体で毎週再処置し、ｍＣＢＥ１１動物は、１４日目のみに再処置した。腫瘍の大きさを毎週測定し、腫瘍球の体積を計算した（図３）。腫瘍が２．０ｃｍ３（直径１６ｍｍ）の体積に達した時点で、動物を屠殺し、それらの死を生存チャートに書き留めた（図４）。
【０１２７】
（実施例６）
生後６週間のヌードマウスに１００μｇの抗ＬＴＢＲ抗体（ｈｕＣＢＥ１１＃４）を腹膜内注射する、または注射しない（コントロール）のどちらかを行った。その後、すべての動物に１×１０６ＷＩＤＲ大腸腺癌細胞を皮下注射した。ｈｕＣＢＥ１１＃４処置マウスを１００μｇのｈｕＣＢＥ１１＃４で毎週再処置した。腫瘍の大きさを毎週測定し、腫瘍球の体積を計算した。示した腫瘍の体積は、１０体のコントロール動物および８体のｈｕＣＢＥ１１＃４処置動物の平均を表す（図５）。毎週のｈｕＣＢＥ１１＃４による処置によって、ヌードマウスに皮下移植されたＷＩＤＲ腫瘍の増殖速度が有意に阻害される。２１日目まで抗体で処置された動物は、処置の停止の２週間後、減衰した癌成長速度を示し続ける。
【０１２８】
（実施例７）
（ｈｕＣＢＥ１１＃４は、前もって増殖したＷＩＤＲ腫瘍の増殖を遅延させ、ＷＩＤＲ腫瘍を有するヌードマウスの生存を増加する）
１０６ＷＩＤＲ細胞を、ヌードマウス中で１０日間皮下的に前もって増殖させた。このマウスはＰＢＳまたは毎週ｈｕＣＢＥ１１＃４または一週おきのｍＣＢＥ１１のいずれかの皮下注射を受けた。腫瘍の重量は、幅および長さの測定から計算し、２０００ｍｇ以上の腫瘍を有する動物を屠殺し、屠殺時での腫瘍の重量は、統計的平均化に続けて入れられた。エラーバーは標準誤差を表す。腫瘍の重量は以下の式を使用して計算した：（幅×幅×長さ）／２＝腫瘍重量（ｍｇ）。この結果を図６にグラフ化し、ｈｕＣＢＥ１１＃４がインビボで前もって増殖した腫瘍を遅くし得ることを示す。
【０１２９】
加えて、腫瘍を増殖させ、上記のように処置し、動物の生存パーセントを測定した。この結果を図７にグラフ化し、ｈｕＣＢＥ１１＃４が前もって増殖した腫瘍を有するマウスにおいてインビボで長期の生存を誘導し得ることを示す。
【０１３０】
（実施例８）
（抗体親和性測定）
ＨＴ−２９細胞をＬ−グルタミン、非必須アミノ酸、ピルビン酸ナトリウムおよび１０％胎児ウシ血清を補ったＤＭＥＭ中で増殖させた。細胞をＰＢＳで一度洗浄し、２０ｍＭ  ＥＤＴＡを加えたＰＢＳと５分間室温でインキュベートすることによって、細胞はプレートから取り除いた。細胞を５分間１０００ｒｐｍ（１１０×ｇ）で遠心分離し、ＰＢＳ中に１×１０７細胞／ｍＬの濃度に再懸濁した。
【０１３１】
ＨｕＣＢＥ１１＃４抗ＬＴβＲ抗体およびネガティブコントロールとしてのヒト化抗ＣＤ４０Ｌを、ＰＢＳ中に希釈し、１２点の連続１：４希釈液を２．３７ｐＭ〜１０μＭの最終濃度幅に作製した。１００μＬの細胞懸濁液および１００μＬの抗体希釈液を、９６ウェルＶ底マイクロタイタープレートの各々のウェルへ一緒に加えた。この抗体および細胞を４℃で２時間インキュベートした。このプレートを４℃で１０分間、１０００ｒｐｍ（１１０×ｇ）で遠心分離した。この上清を捨て、細胞ペレットを冷ＰＢＳで６回洗浄した。
【０１３２】
ヤギ抗ヒトＩｇＧフィコエリスリン複合体（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）をＰＢＳ中に１：１００で希釈し、２００μＬを各々のウェルに加えた。この細胞を４℃で１時間この二次抗体とインキュベートし、上記のように遠心分離し、冷ＰＢＳ中で一度洗浄した。その後、この細胞をポリスチレンテストチューブに移動させた。蛍光強度をＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｕｒ装置（Ｂｅｃｋｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）で測定した。
【０１３３】
抗ＣＤ４０Ｌ非特異的結合コントロールに対する染色の平均蛍光強度値を、Ｄｅｌｔａ  Ｇｒａｐｈにおいて抗体濃度に対してプロットした。この値を直線に対してフィットさせ、各々の抗体濃度に対する理論的非特異的結合値をｈｕＣＢＥ１１＃４希釈系列の各々のデータ点から引き算した。
【０１３４】
その後、これら特異的蛍光強度値を、対数スケールでｈｕＣＢＥ１１＃４濃度に対してプロットした。結果として得られる曲線は、釣鐘型で対称性があり、高濃度で抗体結合の自己阻害を反映する。この曲線の左半分を、抗体の機能的親和性を見出すために４つのパラメーターの方程式にフィットさせた。結果として得られる曲線フィットは、ｈｕＣＢＥ１１＃４のＨＴ−２９への結合について６０ｐＭのＥＣ５０値を与える。
【０１３５】
本発明のポリペプチド、組成物および方法において、本発明の精神または範囲からそれることなく、様々な改変および変更が、なされ得ることは当業者に明らかである。従って、本発明は、添付された請求項およびそれらの均等物の範囲内にある限り本発明の改変および変更を包含することが意図される。
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は、ＷｉＤｒ細胞に対する細胞傷害性のグラフを示す。ｍＣＢＥ１１（マウス）（菱形）、ｈｕＣＢＥ１１＃２（軽鎖のバージョン２（ＶＬ＃２）および重鎖のバージョン２）（ＶＨ＃２）を含むヒト化抗ＬＴ−β−Ｒ抗体）（丸）、ｈｕＣＢＥ１１＃４（軽鎖のバージョン３（ＶＬ＃３）および重鎖のバージョン４（ＶＨ＃４）を含むヒト化抗ＬＴ−β−Ｒ抗体）（星形）。
【図２】
図２は、Ａ３７５細胞に対するＩＬ−８アゴニズムのグラフを示す。ｍＣＢＥ１１（菱形）、ｈｕＣＢＥ１１＃２（軽鎖のバージョン２（ＶＬ＃２）および重鎖のバージョン２（ＶＨ＃２）を含むヒト化抗ＬＴ−β−Ｒ抗体）（丸）、ｈｕＣＢＥ１１＃４（軽鎖のバージョン３（ＶＬ＃３）および重鎖のバージョン４（ＶＨ＃４）を含むヒト化抗ＬＴ−β−Ｒ抗体）（星形）。
【図３】
図３は、腫瘍体積対グラフ投与日を示す。ｍＣＢＥ１１（三角）、ｈｕＣＢＥ１１＃４（軽鎖のバージョン３（ＶＬ＃３）および重鎖のバージョン４（ＶＨ＃４）を含むヒト化抗ＬＴ−β−Ｒ抗体）（丸）、未処置（四角）。
【図４】
図４は、動物の生存率対腫瘍注射後の日数のグラフを示す。ｍＣＢＥ１１（三角）、ｈｕＣＢＥ１１＃４（軽鎖のバージョン３および重鎖のバージョン４を包含するヒト化抗ＬＴ−β−Ｒ抗体）（丸）、未処置（四角）。
【図５】
図５は、腫瘍体積対注射後の日数のグラフを示す。ＨｕＣＢＥ１１＃４（軽鎖のバージョン３（ＶＬ＃３）および重鎖のバージョン４（ＶＨ＃４）を含むヒト化抗ＬＴ−β−Ｒ抗体）（丸）、および未処置のコントロール（四角）。
【図６】
図６は、増殖前腫瘍体積対処置後の日数のグラフを示す。コントロール（四角）；以下の異なる投与量でｈｕＣＢＥ１１＃４（軽鎖のバージョン３（ＶＬ＃３）および重鎖のバージョン４（ＶＨ＃４）を含むヒト化抗ＬＴ−β−Ｒ抗体）：５００μｇ（丸）、１００μｇ（三角）、および２０μｇ（菱形）；ｍＣＢＥ１１（×）。
【図７】
図７は、増殖前腫瘍を有する動物の生存率対処置後の日数のグラフを示す。コントロール（四角）；異なる投与量のｈｕＣＢＥ１１＃４（軽鎖のバージョン３（ＶＬ＃３）および重鎖のバージョン４（ＶＨ＃４）を包含するヒト化抗ＬＴ−β−Ｒ抗体）：５００μｇ（丸）、１００μｇ（三角）、および２０μｇ（菱形）；ｍＣＢＥ１１（×）。
【図８】
図８は、平均蛍光強度対ｈｕＣＢＥ１１＃４濃度の対数プロットにおけるグラフを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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