(57)【要約】本発明は、ヒトの骨芽細胞に由来する核酸分子を提供する。本核酸分子は、診断法、スクリーニングアッセイ法等の適用において、ならびにハイブリダイゼーションプローブおよびプライマーとして使用される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む単離核酸分子：
a）配列番号：1；
b）配列番号：1の相補配列；
c）配列番号：1の319〜555位のヌクレオチド；および
d）配列番号：1の319〜555位のヌクレオチドの相補配列。
【請求項２】
DNAである、請求項1記載の単離核酸分子。
【請求項３】
本質的に、以下からなる群より選択されるヌクレオチド配列からなる単離核酸分子：
a）配列番号：1；
b）配列番号：1の相補配列；
c）配列番号：1の319〜555位のヌクレオチド；および
d）配列番号：1の319〜555位のヌクレオチドの相補配列。
【請求項４】
以下からなる群より選択されるヌクレオチド配列からなる単離核酸分子：
a）配列番号：1；
b）配列番号：1の相補配列；
c）配列番号：1の319〜555位のヌクレオチド；および
d）配列番号：1の319〜555位のヌクレオチドの相補配列。
【請求項５】
以下からなる群より選択されるヌクレオチド配列に、高いストリンジェンシー条件下においてハイブリダイズする核酸分子：
a）配列番号：1；
b）配列番号：1の相補配列；
c）配列番号：1の319〜555位のヌクレオチド；および
d）配列番号：1の319〜555位のヌクレオチドの相補配列。
【請求項６】
配列番号：2のアミノ酸配列をコードする単離核酸分子。
【請求項７】
選択的ハイブリダイゼーションのための適切な条件下において、以下からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む第二の核酸分子と試料を接触させる段階を含む、試料中における核酸分子の存在についてアッセイするための方法：
a）配列番号：1；
b）配列番号：1の相補配列；
c）少なくとも約10個の近接するヌクレオチドである、配列番号：1の部分；および
d）少なくとも約10個の近接するヌクレオチドである、配列番号：1の相補配列の部分。
【請求項８】
制御配列に機能的に連結された、請求項1記載の単離核酸分子を含むベクター。
【請求項９】
請求項8記載のベクターを含む組換え宿主細胞。
【請求項１０】
単離核酸分子によってコードされるポリペプチドを調製するための方法であり、該核酸分子の発現に適した条件下において、請求項9記載の組換え宿主細胞を培養する段階を含む方法。
【請求項１１】
請求項1記載の単離核酸分子によってコードされる単離ポリペプチド。
【請求項１２】
配列番号：2のアミノ酸配列の全てまたは部分を含む単離ポリペプチド。
【請求項１３】
請求項1記載の単離核酸分子によってコードされるポリペプチド、または該ポリペプチドの部分に選択的に結合する、抗体またはその抗原結合断片。
【請求項１４】
配列番号：2のアミノ酸配列、または該アミノ酸配列の部分に選択的に結合する、抗体またはその抗原結合断片。
【請求項１５】
試料中において、請求項1記載の単離核酸分子によってコードされるポリペプチドの存在についてアッセイするための方法であり、コードされるポリペプチドに特異的に結合する抗体と該試料を接触させる段階を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
発明の背景
ヒトの骨は、吸収および再形成という反復される過程を通して連続的にリモデリングしている。その過程においては、骨芽細胞および破骨細胞が、各々、骨形成および骨吸収を主に担う細胞であると考えられている。したがって、骨形成は、骨芽細胞の増殖、分化、または活性化を刺激することによって促進される。骨芽細胞は、石灰化基質に囲まれた細胞である骨細胞に分化する。骨原性細胞の骨芽細胞への分化を司る機構についてはほとんど知られていないが、骨芽細胞の細胞再生および細胞喪失を調節する微妙な平衡関係が、異なる細胞期と細胞期との間に存在することは明らかである。
【発明の開示】
【０００２】
発明の概要
サブトラクティブディファレンシャルスクリーニングによるアプローチを用い、骨芽細胞において選択的に発現される、全長cDNAクローン（クローン番号210-22、クローン番号22としても知られる）配列を、ラットの骨芽細胞ライブラリから単離した。ヌクレオチド配列（配列番号：1；図1）からは、コードされる79アミノ酸（配列番号：2；図1）からなるタンパク質が予測される。14番目のアミノ酸から57番目のアミノ酸のアミノ酸配列は、分裂リンタンパク質90およびブレビカンコアタンパク質と42％一致する。他のアミノ酸配列は、予測されるタンパク質と有意な相同性を共有していない。本遺伝子およびその遺伝子によりコードされるタンパク質は、本明細書においてはOBP1と呼ばれる。
【０００３】
クローン番号22のcDNAをプローブとして用い、複数の組織についてノーザンブロット解析を行った。図2において示されるように、ラットの分化した骨芽細胞においては1 kBのmRNAのシグナルが非常に強く検出されたが、評価されたラットの他の組織においては検出されなかった。これらのデータは、ラットの骨芽細胞においてOBP1が選択的に発現することを示す。この発現パターンは、骨芽細胞表現型マーカーであるオステオカルシンについて以前に認められた。したがって、OBP1は、骨芽細胞についてのマーカーを提供し、重要な制御機能を有する可能性もある。分化した骨芽細胞におけるOBP1の特異的な発現は、骨形成におけるその可能な役割を示しており、したがって、OBP1の発現および／または活性を変化させることによって、骨形成の過程を変えられる可能性がある。したがって、OBP1は、骨粗しょう症および歯周病のような、骨吸収を変化させる疾患に対して、新たな診断的アプローチおよび治療的アプローチを提供することができる。
【０００４】
したがって、本発明は、配列番号：1；配列番号：1の相補配列；配列番号：1の319〜555位のヌクレオチド；および配列番号：1の319〜555位のヌクレオチドの相補配列からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む、単離核酸分子に関連する。即ち、本発明は、OBP1遺伝子のコード領域（配列番号：1の319〜555位のヌクレオチド）を含む、または、OBP1遺伝子の完全cDNA配列（配列番号：1）を含む核酸分子に関連する。本発明はまた、配列番号：1；配列番号：1の相補配列；配列番号：1の319〜555位のヌクレオチド；および配列番号：1の319〜555位のヌクレオチドの相補配列からなる群より選択されるヌクレオチド配列からなる、または本質的にそれらからなる、単離核酸分子にも関連する。本発明は、配列番号：2のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子にも関連する。
【０００５】
本発明は、配列番号：1；配列番号：1の相補配列；配列番号：1の319〜555位のヌクレオチド；および配列番号：1の319〜555位のヌクレオチドの相補配列からなる群より選択されるヌクレオチド配列に対し、高いストリンジェンシー条件下においてハイブリダイズする核酸分子にさらに関連する。
【０００６】
本発明は、試料中における、第二の核酸分子の相補的核酸分子への選択的なハイブリダイゼーションのための適切な条件下（例えば、高いストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件下）において、配列番号：1；配列番号：1の相補配列；配列番号：1の319〜555位のヌクレオチド；および配列番号：1の319〜555位のヌクレオチドの相補配列からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む第二の核酸分子と試料を接触させる段階を含む、試料中における核酸分子の存在についてアッセイするための方法をさらに提供する。本方法を用い、本発明の核酸分子は、試料中における相補的核酸分子の存在を同定するために使用することができる。相補的核酸分子は、完全に相補的な核酸分子および高度に相補的な核酸分子（即ち、高いストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件下において本発明の核酸分子にハイブリダイズするのに十分に相補的な核酸分子）を含み得る。
【０００７】
本発明はまた、制御配列に機能的に連結された本発明の単離核酸分子を含むベクター、およびベクターを含む組換え宿主細胞にも関連する。本発明は、核酸分子の発現に適した条件下にて本発明の組換え宿主細胞を培養する段階を含む、単離核酸分子にコードされたポリペプチドを調製するための方法をも提供する。
【０００８】
本発明は、本発明の単離核酸分子によってコードされる単離ポリペプチドをさらに提供する。特定の態様においては、ポリペプチドは配列番号：2のアミノ酸配列を含む。本発明はまた、配列番号：2のアミノ酸配列に対して約80％以上同一のアミノ酸配列を含む単離ポリペプチドにも関連する。
【０００９】
本発明はまた、本発明のポリペプチドに選択的に結合する抗体、またはその抗原結合断片にも関連する、および、本発明の単離核酸分子によってコードされるポリペプチドの試料中における存在についてアッセイするための方法であり、コードされるポリペプチドに特異的に結合する抗体と試料を接触させる段階を含むような方法にも関連する。
【００１０】
発明の詳細な説明
本明細書において詳細が説明されるように、本発明は、骨芽細胞において選択的に発現される単離核酸分子に関連する。ある態様においては、本発明は、配列番号：1のヌクレオチド配列を有する単離核酸分子、またはその部分（例えば、配列番号：1の319〜555位のヌクレオチド）に関連する。本発明はまた、配列番号：2のアミノ酸配列をコードする単離核酸分子、またはその部分にも関連する。
【００１１】
適切なものとして、本発明の単離核酸分子は、例えばmRNAといったRNA、またはcDNAおよびゲノムDNAといったDNAであることが可能である。DNA分子は二重鎖または単鎖であってもよく；単鎖RNAまたはDNAは、コード鎖もしくはセンス鎖、または、非コード鎖もしくはアンチセンス鎖のいずれかであってもよい。核酸分子は、遺伝子のコード配列の全てまたは部分を含んでいてもよく、イントロンおよび非コード3'配列および非コード5'配列（例えば制御配列を含む）のような付加的な非コード配列をさらに含んでいてもよい。さらに、核酸分子は、例えばポリペプチドの単離または精製を助けるためのポリペプチドをコードする配列といったマーカー配列に融合することができる。そのような配列には、限定はしないが、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ（GST）融合タンパク質をコードするもの、およびインフルエンザウイルス由来の赤血球凝集素（HA）ポリペプチドマーカーをコードするものが含まれる。
【００１２】
本明細書において使用されるように、「単離」核酸分子とは、天然において通常その核酸分子に隣接する核酸から分離されたものである。ゲノムDNAに関して、「単離された」という用語は、そのゲノムDNAが天然においては関連している染色体から分離されているような核酸分子を指す。例えば、単離核酸分子は、その核酸分子が由来する細胞のゲノムDNAにおいてその核酸分子に隣接する、約5kb、4kb、3kb、2kb、1kb、0.5kbまたは0.1kb未満のヌクレオチドを含み得る。
【００１３】
さらに、cDNA分子またはRNA分子のような、本発明の単離核酸分子は、他の細胞素材、または、組換え技術によって作製された場合は培地、または、化学的に合成された場合は化学的前駆物質もしくは他の化学物質を、実質的に含まないことが可能である。しかし、核酸分子は、他のコード配列または制御配列に融合することができ、なおも単離されていると考えられ得る。ある例においては、単離素材は、ある組成物（例えば、他の物質を含む粗製抽出物）、緩衝系、または試薬混合物の一部を形成する。他の状況においては、例えばPAGEまたはHPLCのようなカラムクロマトグラフィーによって決定されるように、素材は本質的に均質になるまで精製することができる。好ましくは、単離核酸分子は、存在する全ての高分子種の少なくとも約50％、80％または90％（モルベース）を含む。
【００１４】
さらに、ベクターに含まれる組換えDNAは、本明細書において使用されるような「単離された」という定義に含まれる。同様に、単離核酸分子は、異種宿主細胞における組換えDNA分子、および溶液中における、部分的にまたは実質的に精製されたDNA分子を含む。「単離された」核酸分子はまた、本発明のDNA分子のインビボおよびインビトロにおけるRNA転写産物をも包含する。
【００１５】
ある態様においては、（例えば選択的ハイブリダイゼーションのための）高いストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件下において、本発明のヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列に、変異体がハイブリダイズする。
【００１６】
核酸分子についてのストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、当業者にはよく知られており、その開示がこれにより参照として組み入れられる、「分子生物学における最新プロトコール（Current Protocols in Molecular Biology）」（John Wiley & Sons, N.Y.(1998), 2.10.1〜2.10.16および6.3.1〜6.3.6）のような、標準の教材において見出すことができる。当業者に理解されるように、的確な条件は、経験的に、ならびに、イオン強度、温度、およびホルムアミドのような脱安定化剤またはSDSのような変性剤の濃度に依存して決定することができる。望ましいハイブリダイゼーション条件の決定において考慮される他の因子は、核酸配列長、塩基組成、ハイブリダイズする配列間のミスマッチのパーセント、および、他の非同一配列内における配列のサブセットの発生頻度を含む。したがって、2つの核酸分子間において同様の程度の同一性または類似性を維持しながら、これらのパラメータの1つまたはそれ以上を変化させることによって、同等の条件を決定することができる。典型的には、少なくとも約60％、少なくとも約70％、少なくとも約80％、少なくとも約90％または少なくとも約95％またはそれ以上互いに同一である配列が互いにハイブリダイズされたままであるような条件が使用される。限定はされないが、ある例においては、核酸分子を、6×塩化ナトリウム/クエン酸ナトリウム（SSC）中において、約45℃にてハイブリダイズさせ、続いて、0.2×SSC/0.1％SDS、室温における低いストリンジェンシー洗浄を1回またはそれ以上行うか、または0.2×SSC/0.1％SDS、42℃における中程度のストリンジェンシー洗浄を1回またはそれ以上行うか、または高いストリンジェンシーとしては、0.2×SSC/0.1％SDS、65℃にて洗浄する。
【００１７】
2つのヌクレオチド配列またはアミノ酸配列の同一性のパーセントは、最適比較のために配列のアラインメントを行うことによって決定することができる（例えば、第一配列の配列においてギャップを導入することができる）。対応する位置におけるヌクレオチドまたはアミノ酸をその後比較し、2つの配列間の同一性のパーセントを、配列によって共有される同一の位置の数の関数とする（即ち、同一性％ = 同一の位置の数／位置の総数×100）。ある態様においては、比較のためにアラインメントされた配列の長さが、参照配列の長さの少なくとも30％、好ましくは少なくとも40％、より好ましくは少なくとも60％、およびさらにより好ましくは少なくとも70％、80％、90％または95％である。2つの配列の実際の比較は、例えば数学的アルゴリズムを用いるような、よく知られた方法によって達成することができる。そのような数学的アルゴリズムの、好ましい例については、限定はされないが、カーリン（Karlin）ら、Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 90:5873〜5877(1993)において説明されている。そのようなアルゴリズムは、アルツル（Altschul）ら、Nucleic Acids Res., 25:389〜3402(1997)において説明されるように、NBLASTおよびXBLASTプログラム（バージョン2.0）に組み入れられる。BLASTおよびGapped BLASTプログラムを利用する場合、各々のプログラム（例えばNBLAST）のデフォルトパラメータを用いることができる。http://www.ncbi.nlm.nih.govを参照のこと。ある態様においては、配列比較のためのパラメータは、スコア＝ 100、ワード長＝ 12に設定してもよく、または変化させてもよい（例えば、W = 5または W = 20）。
【００１８】
配列比較のために利用される、その他の数学的アルゴリズムの、好ましい例は、限定されないが、マイヤーズ（Myers）およびミラー（Miller）のアルゴリズムである、CABIOS（1989）である。そのようなアルゴリズムは、CGC配列アラインメントソフトウェアパッケージの一部分である、ALIGNプログラム（バージョン2.0）に組み入れられる。アミノ酸配列を比較するためにALIGNプログラムを利用する場合、PAM120 重み付け残基テーブル、ギャップ長ペナルティ12、およびギャップペナルティ4を使用することができる。当技術分野においては配列解析のための付加的なアルゴリズムが知られており、トレリス（Torellis）およびロボッティ（Robotti）、Comput.Appl.Biosci.,10:3〜5(1994)において説明されるような、ADVANCEおよびADAM；および、ピアソン（Pearson）およびリップマン（Lipman）, PNAS, 85:2444〜8(1988)において説明されるFASTAを含む。
【００１９】
その他の態様においては、2つのアミノ酸配列間の同一性パーセントは、Blossom63マトリックスまたはPAM250マトリックスのいずれかを用い、およびギャップの重み付け12、10、8、6または4、および長さの重み付け2、3または4のいずれかを用い、CGCソフトウェアパッケージ（http://www.cgc.comにおいて入手可能）の中のGAPプログラムを使用して決定することができる。なおもその他の態様においては、2つの核酸配列間の同一性パーセントは、ギャップの重み付け50および長さの重み付け3を用い、CGCソフトウェアパッケージ（http://www.cgc.comにおいて入手可能）の中のGAPプログラムを使用して決定することができる。
【００２０】
本発明はまた、高ストリンジェント条件下において、本発明のヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列にハイブリダイズする断片または部分を含む単離核酸分子をも提供する。本発明の核酸断片は、少なくとも約15、好ましくは少なくとも約18、20、23または25ヌクレオチドであり、30、40、50、100、200またはそれ以上のヌクレオチド長が可能である。本明細書において説明される抗原性タンパク質または抗原性ポリペプチドをコードする、より長い断片、例えば30またはそれ以上のヌクレオチド長が有用である。
【００２１】
関連する局面においては、本発明の核酸断片は、本明細書において説明されるようなアッセイ法においてプローブまたはプライマーとして使用される。「プローブ」とは、核酸分子の相補鎖に塩基特異的な方法でハイブリダイズするオリゴヌクレオチドである。そのようなプローブは、ニールセン（Nielsen）ら、Science, 254, 1497〜1500(1991)において説明されるように、ポリペプチド核酸を含む。典型的に、プローブには、本発明のヌクレオチド配列を含む、少なくとも約15、典型的には約20〜25、およびより典型的には約40、50または75の連続したヌクレオチドの核酸分子に、高いストリンジェント条件下においてハイブリダイズするヌクレオチド配列の領域が含まれる。より典型的には、プローブは、例えば放射性同位体、蛍光化合物、酵素、または酵素補因子のような標識をさらに含む。
【００２２】
本明細書において使用されるように、「プライマー」という用語は、限定はしないが本明細書で説明される方法を含む既知の方法（例えばPCR、LCR）を用い、鋳型に従うDNA合成において開始点として作用する、単鎖オリゴヌクレオチドを指す。プライマーの適切な長さは特定の使用によるが、典型的には、約15〜30ヌクレオチドの範囲に渡る。
【００２３】
上記に説明されるような本発明の核酸分子は、標準の分子生物学的技術および配列番号：1において提供される配列情報を用いて、同定および単離することができる。例えば、核酸分子は、配列番号：1、配列番号：1の相補配列、配列番号：1の319〜555位のヌクレオチド、配列番号：1の319〜555位のヌクレオチドの相補配列、および配列番号：1の他の部分およびその相補配列に提供される配列の、1つまたはそれ以上に基づいて設計された合成オリゴヌクレオチドプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応によって、増幅および単離することができる。「PCR技術：DNA増幅についての原則および適用（PCR Technology: Principles and Applications for DNA Amplification）」（H.A.Erlich編、Freeman Press, NY, NY, 1992）；「PCRプロトコール：方法および適用の手引き（PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications）」（Innisら編, Academic Press, San Diego, CA, 1990）；マティラ（Mattila）ら、Nucleic Acids Res., 19: 4967(1991)；エカート（Eckert）ら、PCR Methods and Applications , 1:17(1991)；「PCR」（McPhersonら編、IRL Press, Oxford）；および米国特許第4,683,202号を一般に参照のこと。核酸分子は、cDNA、mRNAまたはゲノムDNAを鋳型として用いて増幅し、適切なベクターにクローニングし、DNA配列解析によって特徴付けることができる。
【００２４】
他の適切な増幅法は、リガーゼ連鎖反応（LCR）（WuおよびWallace、Genomics, 4: 560(1989)、Landegrenら、Science, 241:1077(1988)を参照のこと）、転写増幅（Kwohら、Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 86:1173(1989)）、および自己維持配列複製（Guatelliら、Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 87:1874(1990)）、および核酸に基づく配列増幅（NASBA）を含む。後者の2つの増幅法は、増幅産物として単鎖RNA（ssRNA）および二重鎖DNA（dsDNA）の双方を各々、およそ30対1またはおよそ100対1の比率で生じる、等温転写に基づく等温反応に関与する。
【００２５】
増幅DNAは、放射性標識し、zap発現ベクター、ZIPLOXまたは他の適切なベクターにおいて、例えばヒト骨芽細胞のような骨芽細胞のmRNAに由来するcDNAライブラリをスクリーニングするためのプローブとして使用することができる。対応するクローンを単離してもよく、インビボ・エクシジョンに従ってDNAを得てもよく、および適切な分子量のタンパク質をコードする正確な読み枠を同定するために、当技術分野に認められている方法によって、いずれかの方向または双方向に、クローン化インサートを配列決定してもよい。例えば、本発明の核酸分子のヌクレオチド配列の直接解析は、商業的に利用可能な既知の方法を用いて達成することができる。例えば、サムブルック（Sambrook）ら、「分子クローニング、実験マニュアル（Molecular Cloning, A Laboratory Manual）」（第2版、CSHP, New York 1989）；ジスキンド（Zyskind）ら、「組換えDNA実験マニュアル（Recombinant DNA Laboratory Manual）」（Acad.Press, 1988）を参照のこと。これらの方法または同様の方法を用い、タンパク質およびそのタンパク質をコードするDNAを単離し、配列決定し、さらに特徴付けることができる。
【００２６】
本発明のアンチセンス核酸分子は、本発明のヌクレオチド配列を用いて設計し、当技術分野において既知の手法を使用した化学的合成および酵素的連結反応を用いて構築することができる。例えば、あるアンチセンス核酸分子（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド）は、天然に生じるヌクレオチドを用いて、または、分子の生物学的安定性を増加させるよう、もしくは、アンチセンス核酸とセンス核酸の間に形成された二本鎖の物理学的安定性を増加させるよう設計された、様々に修飾されたヌクレオチドを用いて、化学的に合成することができ、例えば、ホスホロチオアート誘導体およびアクリジン置換ヌクレオチドを使用することができる。または、アンチセンス核酸分子は、核酸分子がアンチセンスの方向にサブクローニングされた発現ベクターを用いて、生物学的に作製することができる（即ち、挿入された核酸分子から転写されたRNAは、関心対象の標的核酸に対してアンチセンスの方向のものとなる）。
【００２７】
一般に、単離核酸配列は、サザン解析ゲル上の分子量マーカーとして、および関連する遺伝子の位置を地図上にマッピングするために標識される染色体マーカーとして使用することができる。核酸配列はまた、遺伝子疾患を同定するために、患者における内因性DNA配列と比較するためにも使用でき、および関連DNA配列にハイブリダイズさせてその関連DNA配列を発見するため、または試料から既知の配列をサブトラクトするため等のプローブとしても使用することができる。核酸配列は、さらに遺伝子フィンガープリンティングのためのプライマーを得るために、DNA免疫化技術を用いて抗タンパク質抗体を生じさせるために使用でき、および抗DNA抗体を生じさせるための抗体、または免疫応答を誘発するための抗原として使用することができる。さらに、本発明のヌクレオチド配列は、解析、特徴付けもしくは治療的使用のために組換えタンパク質を同定し、発現させるのに使用してもよく、または構成的に、組織分化中に、もしくは疾患状態において、対応するタンパク質が発現している組織に対するマーカーとして使用することができる。
【００２８】
本発明はまた、ゲノムDNAを含む、OBP1 DNAを同定するために有用な核酸プローブの生産および同定のための実用性をも有する。骨芽細胞におけるOBP1発現の特異性により、本明細書において説明される核酸分子、ポリペプチドおよび抗体は、十分に確立された技術を用いた骨芽細胞の同定のためにも有用である。本発明の核酸分子はまた、遺伝子治療においても有用である。例えば、それらは、例えば骨芽細胞における異常なOBP1遺伝子産物の発現を変化させるために、またはOBP1の異常な発現を修正するために使用することができる。本明細書において説明される配列は、例えば骨芽細胞ではない細胞等の、OBP1の発現が通常は起こらない細胞において、OBP1の発現を引き起こすために、さらに使用することができる。
【００２９】
本発明のその他の局面は、配列番号：1および配列番号：1の相補配列（またはその部分）からなる群より選択される核酸分子を含む、核酸構築物に関係する。構築物は、本発明の配列がセンスまたはアンチセンスの方向で挿入されたベクター（例えば発現ベクター）を含む。本明細書において使用されるように、「ベクター」という用語は、それが連結された別の核酸を輸送できるような核酸分子を指す。ベクターのあるタイプは「プラスミド」であり、付加的なDNAセグメントを連結できる環状二重鎖DNAループを指す。ベクターのその他の種類としては、付加的なDNAセグメントをウイルスゲノムに連結することができるようなウイルスベクターがある。あるベクターは、そのベクターが導入された宿主細胞において自己複製できる（例えば、細菌の複製起点を有する細菌ベクターおよびエピソーム哺乳動物ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソーム哺乳動物ベクター）は、宿主細胞への導入の際に宿主細胞のゲノムに組み込まれ、それによって、宿主ゲノムと共に複製される。さらに、あるベクター、即ち発現ベクターは、動作可能に連結されている遺伝子の発現を司ることができる。一般に、組換えDNA技術において有用な発現ベクターはしばしば、プラスミドの形態にある。しかし、本発明は、同等の機能を果たすウイルスベクター（例えば、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルス）のような、発現ベクターの他の形態を含むことを意図する。
【００３０】
本発明の好ましい組換え発現ベクターには、宿主細胞で核酸分子が発現するのに適した形態にある、本発明の核酸分子が含まれる。これは、発現する核酸配列に動作可能に連結され、発現に使用される宿主細胞に基づいて選択される、1つまたはそれ以上の制御配列を、組換え発現ベクターが含むことを意味する。組換え発現ベクター内においては、「動作可能に連結された」とは、関心対象のヌクレオチド配列が、（例えば、インビトロの転写／翻訳系において、または、ベクターが宿主細胞に導入される場合は宿主細胞において）、そのヌクレオチド配列が発現しうるような方法で制御配列に連結されていること意味するものと意図される。「制御配列」という用語は、プロモーター、エンハンサーおよび他の発現調節エレメント（例えば、ポリアデニル化シグナル）を含むことを意図する。そのような制御配列は、例えば、ゴーデル（Goeddel）「遺伝子発現技術：酵素学における方法 185（Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185）」（Academic Press, San Diego, CA(1990)）において説明されている。制御配列には、多くの種類の宿主細胞においてヌクレオチド配列の構成的な発現を司るもの、およびある宿主細胞にしかヌクレオチド配列の発現を司らない（例えば、組織特異的制御配列）が含まれる。発現ベクターの設計が、形質転換される宿主細胞の選択、および所望のタンパク質の発現レベルといった因子に依存し得ることは、当業者に理解されると思われる。本発明の発現ベクターを宿主細胞に導入して、本明細書に記載されるような核酸分子によってコードされる融合タンパク質または融合ペプチドを含むタンパク質またはペプチドを産生することができる。
【００３１】
本発明の組換え発現ベクターは、例えば、大腸菌のような細菌細胞、昆虫細胞（バキュロウイルス発現ベクターを用いる）、酵母細胞または哺乳動物細胞のような、原核細胞または真核細胞における本発明のポリペプチドの発現のために設計することができる。適切な宿主細胞は、ゴーデル（上記）においてさらに議論されている。または、組換え発現ベクターは、例えばT7プロモーター制御配列およびT7ポリメラーゼを用いて、インビトロにおいて転写および翻訳することができる。
【００３２】
本発明の他の局面は、本発明の組換え発現ベクターが導入された宿主細胞に関係する。「宿主細胞」および「組換え宿主細胞」という用語は、本明細書においては同義で使用されている。そのような用語が特定の対象細胞を指すのみならず、そのような細胞の子孫細胞または潜在的な子孫細胞をも指すことが理解される。突然変異または環境的影響のいずれかによって、後続の世代にある修飾が生じる可能性があるため、そのような子孫細胞が実際には親細胞と同一ではない可能性はあるが、本明細書において使用されるような用語の範囲内にはなおも含まれる。
【００３３】
宿主細胞は、いかなる原核細胞または真核細胞であってもよい。例えば、本発明の核酸分子は、細菌細胞（例えば大腸菌）、昆虫細胞、酵母細胞または哺乳動物細胞（チャイニーズハムスター卵巣細胞(CHO)またはCOS細胞等）において発現させることができる。他の適切な宿主細胞が、当業者には知られている。
【００３４】
ベクターDNAは、従来的な形質転換技術またはトランスフェクション技術を介して原核細胞または真核細胞に導入することができる。本明細書において使用されるように、「形質転換」および「トランスフェクション」という用語は、リン酸カルシウムもしくは塩化カルシウム共沈、DEAE-デキストラン仲介のトランスフェクション、リポフェクション、またはエレクトロポレーションを含む、外来の核酸分子（例えばDNA）を宿主細胞に導入するための、当技術分野において認められる様々な技術を指すことが意図される。宿主細胞を形質転換またはトランスフェクションするための適切な方法は、サムブルックら（上記）、および他の実験マニュアルにおいて見出すことができる。
【００３５】
哺乳動物細胞の安定的なトランスフェクションのために、使用される発現ベクターおよびトランスフェクション技術によって、細胞のほんの小さな分画のみが外来DNAをゲノム中に組み込めるということが知られている。組み込まれたこれらの配列を同定および選択するために、一般に、（例えば、抗生物質に対する耐性について）選択可能なマーカーをコードする遺伝子を、関心対象の遺伝子と共に宿主細胞に導入する。好ましい選択可能なマーカーには、G418、ハイグロマイシンおよびメトトレキサートのような薬剤への耐性を与えるものが含まれる。選択可能なマーカーをコードする核酸分子は、本発明の核酸分子と同じベクター上にて宿主細胞に導入してもよく、または、別々のベクター上にて導入してもよい。導入された核酸分子によって安定的にトランスフェクションされた細胞は、薬剤選択（例えば、選択可能なマーカー遺伝子を組み入れた細胞は生き残るが、一方で他の細胞は死滅する）によって同定することができる。
【００３６】
培養における、原核宿主細胞または真核宿主細胞のような本発明の宿主細胞は、本発明のポリペプチドを産生（即ち発現）するために使用することができる。したがって、本発明は、本発明の宿主細胞を用いてポリペプチドを生産するための方法をさらに提供する。ある態様において、本方法は、ポリペプチドが産生されるように、適切な培地中で本発明の宿主細胞（本発明のポリペプチドをコードする組換え発現ベクターが導入されている）を培養する段階を含む。その他の態様においては、本方法は、培地または宿主細胞からポリペプチドを単離する段階をさらに含む。
【００３７】
本発明の宿主細胞はまた、非ヒトトランスジェニック動物を作製するためにも使用することができる。例えば、ある態様においては、本発明の宿主細胞は、本発明の核酸分子が導入された受精卵母細胞または胚性幹細胞である。そのような宿主細胞はその後、外因性ヌクレオチド配列がゲノムに導入されている非ヒトトランスジェニック動物、または、  内因性ヌクレオチド配列が変化している相同組換え動物を作製するために使用することができる。そのような動物は、ヌクレオチド配列およびその配列によってコードされるポリペプチドの機能および／または活性を研究するために、ならびにそれらの活性の調節物質を同定および／または評価するために有用である。本明細書において使用されるように、「トランスジェニック動物」とは、その動物個体の1つまたはそれ以上の細胞が導入遺伝子を含む非ヒト動物であり、好ましくは哺乳動物、より好ましくはラットまたはマウスのようなげっ歯動物である。トランスジェニック動物の他の例には、ヒトではない霊長類、ヒツジ、イヌ、ウシ、ヤギ、ニワトリおよび両生類が含まれる。導入遺伝子は、トランスジェニック動物を発生させる細胞のゲノムに組み込まれ、成熟動物個体のゲノム中に残る外因性DNAであり、このことにより、トランスジェニック動物の1つまたはそれ以上の細胞型または組織において、コードされる遺伝子産物の発現を司る。本明細書において使用されるように、「相同組換え動物」とは、動物個体の発生以前に、例えばその動物の胚細胞等の動物の細胞に導入された外因性DNA分子と、内因性遺伝子との間の相同組換えによって、内因性遺伝子が変化している、非ヒト動物であり、好ましくは哺乳動物、より好ましくはマウスである。
【００３８】
胚操作、および、マイクロインジェクション法により、トランスジェニック動物、特にマウスのような動物を生み出すための方法は、当技術分野においては慣例的なものとなっており、例えば、米国特許第4,736,866号および同第4,870,009号、米国特許第4,873,191号、および、ホーガン（Hogan）「マウス胚の操作（Manipulating the Mouse Embryo）」（Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.,1986）において説明されている。相同組換えベクターおよび相同組換え動物を構築するための方法は、ブラッドリー（Bradley）、Current Opinion in Bio/Technology 2:823〜829(1991)、および、PCT公報国際公開公報第90/11354号、同第91/01140号、同第92/0968号および同第93/04169号においてさらに説明されている。本明細書において説明される非ヒトトランスジェニック動物のクローンは、ウィルマット（Wilmut）ら、Nature, 385: 810〜813(1997)およびPCT公報国際公開公報第97/07668号および同第97/07669号において説明される方法に従って作製することもできる。
【００３９】
本発明はまた、本発明の核酸分子によってコードされる単離ポリペプチドおよびその変異体および断片をも提供する。例えば、上記に説明されるように、ヌクレオチド配列は、本発明のポリペプチドをコードするcDNAをクローニングおよび発現させるためのプライマーを設計するために使用することができる。ある態様においては、ポリペプチドは、配列番号：2のアミノ酸配列またはその部分を含む。
【００４０】
本明細書において使用されるように、ポリペプチドは、組換え細胞および非組換え細胞から単離された場合はそれが細胞素材を実質的に含まない場合に、または、化学的に合成された場合は化学的前駆物質もしくは他の化学物質を含まない場合に、「単離された」または「精製された」と言われる。しかし、ポリペプチドは、細胞においては通常は関連のない別のポリペプチドに連結することができ、それでもなお「単離された」または「精製された」状態である。
【００４１】
本発明のポリペプチドは、均質になるまで精製することができる。しかし、ポリペプチドが均質になるまで精製されていない調製物が有用であることは理解される。重大な特徴は、他の成分がかなりの量存在していても、調製物において、ポリペプチドの所望の機能が許容されるものであることである。したがって、本発明は、様々な程度の純度を包含する。ある態様においては、「実質的に細胞素材を含まない」という語は、約30％（乾燥重量％）未満の他のタンパク質（即ち、混入タンパク質）、約20％未満の他のタンパク質、約10％未満の他のタンパク質、または約5％未満の他のタンパク質を有するような、ポリペプチドの調製物を含む。
【００４２】
ポリペプチドが組換えによって作製される場合、同様に、それが実質的に培地を含まないことも可能である、即ち、培地がタンパク質調製物の容量の約20％未満、約10％未満、または約5％未満に相当する。「化学的前駆物質または他の化学物質を実質的に含まない」という語には、ポリペプチド合成に関与する化学的前駆物質または他の化学物質からポリペプチドが分離されているような、ポリペプチドの調製物が含まれる。ある態様においては、「化学的前駆物質または他の化学物質を実質的に含まない」という語には、約30％（乾燥重量％）未満の化学的前駆物質もしくは他の化学物質、約20％未満の化学的前駆物質もしくは他の化学物質、約10％未満の化学的前駆物質もしくは他の化学物質、または、約5％未満の化学的前駆物質もしくは他の化学物質を有するような、ポリペプチドの調製物が含まれる。
【００４３】
ある態様においては、ポリペプチドは、例えば配列番号：2またはその部分のような、配列番号：1およびその相補配列および部分からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含む。しかし、本発明はまた、配列変異体をも包含する。変異体は、ある生物における同じ遺伝子座によってコードされる、実質的に相同なタンパク質、即ち対立遺伝子変異体を含む。変異体はまた、ある生物における他の遺伝子座に由来するが、配列番号：1ならびにその相補配列および部分からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む核酸分子によってコードされるポリペプチドに対して実質的な相同性を有するタンパク質をも包含する。変異体は、これらのポリペプチドに実質的に相同または同一であるが、別の生物に由来するようなタンパク質、即ちオルソログをも含む。変異体はまた、化学的合成によって作製された、これらのポリペプチドに実質的に相同または同一であるようなタンパク質をも含む。変異体はまた、組換え法によって作製された、これらのポリペプチドに実質的に相同または同一であるようなタンパク質をも含む。
【００４４】
本明細書において使用されるように、アミノ酸配列が少なくとも約45〜55％、典型的には少なくとも約70〜75％、より典型的には少なくとも約80〜85％、および最も典型的には約93％またはそれ以上より相同または同一である場合、2つのタンパク質（またはそのタンパク質の領域）は、実質的に相同または同一である。本発明に従って、実質的に相同なアミノ酸配列は、より特定的に上述されるようなストリンジェントな条件下において配列番号：1にハイブリダイズする核酸分子またはその部分によってコードされる。
【００４５】
2つのアミノ酸配列または2つの核酸配列の、相同性パーセントまたは同一性パーセントを決定するために、最適比較のための配列アラインメントを行う（例えば、一方のタンパク質または核酸分子の配列に対し、他方のタンパク質または核酸分子との最適なアラインメントのために、ギャップを導入することができる）。対応するアミノ酸位置またはヌクレオチド位置におけるアミノ酸残基またはヌクレオチドをその後比較する。一方の配列における位置が、他方の配列における対応する位置と同じアミノ酸残基またはヌクレオチドによって占有されている場合は、その分子はその位置において相同である。本明細書において使用されるように、アミノ酸または核酸の「相同性」とは、アミノ酸または核酸の「同一性」と同等である。2つの配列間の相同性パーセントは、それらの配列によって共有される同一位置の数の関数となる（即ち、相同性パーセント = 同一位置の数／位置の総数×100）。
【００４６】
本発明は、本発明の核酸分子によりコードされるポリペプチドによって果たされるのと同じ機能の1つまたはそれ以上を果たすように、同一性の程度はより低いが十分な類似性があるようなポリペプチドをも包含する。類似性は、保存的アミノ酸置換によって決定される。そのような置換は、ポリペプチドにおける一定のアミノ酸を、同様の特性を有する別のアミノ酸によって置換するものである。保存的置換は、表現型としてはサイレントである可能性が高い。保存的置換として典型的に認められるのは、脂肪族アミノ酸Ala、Val、Leu、およびIleの間で、あるアミノ酸から別のアミノ酸への置き換え；水酸残基SerとThrとの互換；酸性残基AspとGluとの交換；アミド残基AsnとGlnとの間の置換；塩基性残基LysとArgとの交換；および芳香族残基Phe、Tyr間の置き換えである。いずれのアミノ酸の変化が表現型としてサイレントである可能性が高いかに関する手引きは、ボウイー（Bowie）ら、Science 247: 1306〜1310(1990)において認められる。
【００４７】
変異ポリペプチドは、1つまたはそれ以上の置換、欠失、挿入、逆位、融合、および切断またはこれらのうち任意の組み合わせによって、アミノ酸配列において異なり得る。さらに、変異ポリペプチドは、完全に機能的であってもよく、または1つまたはそれ以上の活性において機能を欠損していてもよい。完全に機能的な変異体は、典型的に、保存的変異、または決定的ではない残基もしくは決定的ではない領域における変異のみを含む。機能的な変異体はまた、機能に変化をもたらさないような、または有意ではない変化をもたらすような、類似したアミノ酸の置換をも含み得る。または、そのような置換は、ある程度、機能に正または負に影響を与え得る。非機能的な変異体は、典型的に、1つまたはそれ以上の非保存的アミノ酸の置換、欠失、挿入、逆位、もしくは切断、または決定的な残基もしくは決定的な領域における置換、挿入、逆位、もしくは切断を含む。
【００４８】
機能のために必須であるアミノ酸は、部位特異的突然変異誘発またはアラニンスキャンニング突然変異誘発（Cunninghamら、Science, 244: 1081〜1085(1989)）のような、当技術分野において既知の方法によって同定することができる。後者の手法は、分子中のあらゆる残基において単一のアラニン突然変異を導入するものである。その結果生じる突然変異分子はその後、インビトロにおける生物学的活性またはインビトロにおける増殖活性について調べられる。ポリペプチド活性のために決定的な部位も、結晶化、核磁気共鳴または光親和性標識のような構造解析によって決定することができる（Smithら、J.Mol.Biol., 224:899〜904(1992)；de Vosら、Science, 255:306〜312(1992)）。
【００４９】
本発明はまた、本発明のポリペプチドのポリペプチド断片をも含む。断片は、配列番号：1を含む核酸分子、またはその部分およびその相補配列によってコードされるポリペプチドに由来することが可能である。しかし、本発明は、本明細書において説明されるポリペプチドの変異体の断片をも包含する。本明細書において使用されるように、断片は、少なくとも6つの近接したアミノ酸を含む。有用な断片は、ポリペプチドの生物学的活性の1つまたはそれ以上を保持するもの、および、ポリペプチド特異的な抗体を生み出すための免疫原として使用できる断片を含む。
【００５０】
生物学的に活性な断片（例えば、6、9、12、15、16、20、30、35、36、37、38、39、40、50、100アミノ酸またはそれ以上のアミノ酸長であるペプチド）は、例えばシグナルペプチド、細胞外ドメイン、1つまたはそれ以上の膜貫通セグメントまたはループ、リガンド結合領域、ジンクフィンガードメイン、DNA結合ドメイン、アシル化部位、グリコシル化部位、またはリン酸化部位のような、既知の方法を用いたポリペプチド配列の解析によって同定されているドメイン、セグメント、またはモチーフを含み得る。
【００５１】
断片は、別個である（他のアミノ酸またはポリペプチドに融合されていない）こと、または、より大きなポリペプチド内にあることが可能である。さらに、幾つかの断片が、単一のより大きなポリペプチド内に含まれることが可能である。ある態様においては、ある宿主における発現のために設計されたある断片は、ポリペプチド断片のアミノ末端に融合された異種のプレまたはプロポリペプチド領域、および、断片のカルボキシル末端に融合された付加的な領域を有し得る。
【００５２】
したがって本発明は、キメラタンパク質または融合タンパク質を提供する。これらは、そのポリペプチドに実質的に相同ではないアミノ酸配列を有する異種タンパク質に機能的に連結された本発明のポリペプチドを含む。「機能的に連結された」とは、ポリペプチドタンパク質および異種タンパク質がインフレームで融合されていることを示す。異種タンパク質は、ポリペプチドのN末端またはC末端に融合することができる。ある態様においては、融合タンパク質は、ポリペプチドの機能にそれ自体は影響を与えない。例えば、融合タンパク質は、ポリペプチド配列がGST配列のC末端に融合された、GST融合タンパク質であることが可能である。他の種類の融合タンパク質には、限定されないが、例えばβガラクトシダーゼ融合タンパク質、酵母ツーハイブリッドGAL 融合タンパク質、ポリHis融合タンパク質およびIg融合タンパク質のような、酵素的融合タンパク質が含まれる。そのような融合タンパク質、特にポリHis融合タンパク質は、組換えポリペプチドの精製を容易にする可能性がある。ある宿主細胞（例えば哺乳動物宿主細胞）においては、タンパク質の発現および／または分泌は、異種シグナル配列を用いることによって増大し得る。したがって、その他の態様においては、融合タンパク質は、そのN末端に異種シグナル配列を含む。
【００５３】
EP-A-O 464 533号は、免疫グロブリン定常領域の様々な部分を含む融合タンパク質について開示する。Fcは、治療および診断において有用であり、したがって、例えば、改善された薬物動態特性をもたらす（欧州特許第0232 262号（EP-A 0232 262））。創薬においては、例えば、ヒトのタンパク質は、アンタゴニストを同定するハイスループットスクリーニングアッセイ法のために、Fc部分と融合されてきた。ベネット（Bennett）ら、Journal of Molecular Recognition, 8:52〜58(1995)およびヨハンソン（Johanson）ら、The Journal of Biological Chemistry, 270, 16:9459〜9471(1995)。したがって、本発明は、本発明のポリペプチド、および、様々なサブクラス（IgG、IgM、IgA、IgE）の免疫グロブリンの重鎖または軽鎖の定常領域の様々な部分を含む可溶性の融合タンパク質をも包含する。
【００５４】
キメラタンパク質または融合タンパク質は、標準の組換えDNA技術によって作製することができる。例えば、異なるタンパク質配列をコードするDNA断片を、従来技術に従ってインフレームで共に連結反応する。その他の態様においては、融合遺伝子を、自動DNAシンセサイザーを含む従来技術によって合成することができる。または、2つの連続した核酸断片の間に相補的な突出部を生じさせるアンカープライマーを用いて、核酸断片のPCR増幅を実行し、それを後にアニーリングおよび再増幅して、キメラ核酸配列を生み出すことができる（Ausubelら、「分子生物学における最新プロトコール(Current Protocols in  Molecular Biology, 1992)」を参照のこと）。さらに、融合部分（例えばGSTタンパク質）を既にコードしている多くの発現ベクターが、商品として入手可能である。本発明のポリペプチドをコードする核酸分子は、融合部分がポリペプチドタンパク質にインフレームで連結されるように、そのような発現ベクターにクローニングすることができる。
【００５５】
単離ポリペプチドは、骨芽細胞のような、それを天然に発現する細胞から精製することができる、それを発現するように変化させられた（組換え）細胞から精製することができる、または、既知のタンパク質合成法を用いて合成することができる。ある態様においては、タンパク質は組換えDNA技術によって作製される。例えば、ポリペプチドをコードする核酸分子は、発現ベクターにクローニングされ、発現ベクターは、宿主細胞に導入され、宿主細胞においてタンパク質が発現される。タンパク質はその後、標準のタンパク質精製技術を用いた適切な精製計画によって細胞から単離することができる。
【００５６】
一般には、本発明のポリペプチドまたはタンパク質は、当技術分野において認められている方法を用い、SDS-PAGEゲルまたは分子ふるいゲルろ過カラム上にて分子量マーカーとして使用することができる。本発明のポリペプチドは、抗体を生み出すために、または、免疫応答を引き出すために使用することもできる。本ポリペプチドはまた、生物学的液体中における、それが結合するタンパク質または分子（例えば、受容体またはリガンド）のレベルを定量的に決定するためのアッセイ法において、例えば標識された試薬のような試薬として使用することができる。本ポリペプチドはまた、構成的に、組織分化中に、または疾患状態において、対応するタンパク質が優先的に発現している細胞または組織に対するマーカーとして使用することもできる。ポリペプチドは、例えば相互作用検出アッセイ法などにおいて、例えば受容体もしくはリガンドのような、対応する結合パートナーを単離するために使用することができ、および結合相互作用を有するペプチドまたは小分子のアンタゴニストまたはアゴニストについてスクリーニングするために使用することができる。
【００５７】
その他の局面においては、本発明は、例えば配列番号：1の全てまたは部分を含む核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を有するような、本発明のポリペプチドおよびポリペプチド断片に対する抗体を提供する。本明細書において使用されるような「抗体」という用語は、免疫グロブリン分子および免疫学的に活性な免疫グロブリン分子の部分、即ち、抗原に特異的に結合する抗原結合部位を含む分子を指す。本発明のポリペプチドに特異的に結合する分子は、そのポリペプチドまたはその断片に結合するが、天然にそのポリペプチドを含む、例えば生物学的試料のような試料中の他の分子には実質的に結合しないような分子である。免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分の例は、抗体をペプシンのような酵素で処理することにより作製することができる、F(ab)およびF(ab')2断片を含む。本発明は、本発明のポリペプチドに結合するポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を提供する。本明細書において使用されるように、「モノクローナル抗体」または「モノクローナル抗体組成物」という用語は、本発明のポリペプチドの特定のエピトープと免疫反応できるただ一種のみの抗原結合部位を含む抗体分子集団を指す。したがって、モノクローナル抗体組成物は、典型的には、それが免疫反応する本発明の特定のポリペプチドについて単一の結合親和性を表す。
【００５８】
ポリクローナル抗体は、上記に説明されるように、例えば本発明のポリペプチドまたはその断片のような、望ましい免疫原によって適した被験者を免疫化することによって調製することができる。免疫化された被験者における抗体価は、固定化ポリペプチドを使用した酵素結合免疫吸着検定法（ELISA）を用いるような、標準技術によって、経時的にモニタリングすることができる。望ましい場合は、ポリペプチドに対して標的指向する抗体分子を哺乳動物から（例えば血液から）単離し、IgG分画を得るために、プロテインAクロマトグラフィーのようなよく知られた技術によって、さらに精製することができる。例えば抗体価が最高となった時点のような、免疫化後の適切な時点において、被験者から抗体産生細胞を得て、コーラー（Kohler）およびミルステイン（Milstein）, Nature, 256: 495〜497(1975)によって最初に説明されたハイブリドーマ技術、ヒトB細胞ハイブリドーマ技術（Kozborら、Immunol. Today, 4:72(1983)）、EBVハイブリドーマ技術（Coleら,「モノクローナル抗体および癌治療（Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy）」（Alan R.Liss, Inc., 77〜96(1985)））、またはトリオーマ技術のような、標準技術によってモノクローナル抗体を調製するために使用することができる。ハイブリドーマを作製するための技術は、よく知られている（「免疫学における最新プロトコール（Current Protocols in Immunology）」（Coliganら(編), John Wiley & Sons, Inc., New York, NY(1994)）を広く参照のこと）。簡潔に言えば、不死化細胞系列（典型的には骨髄腫）を、上記に説明されるような免疫原を用いて免疫化された哺乳動物に由来するリンパ球（典型的には脾細胞）に融合し、その結果得られるハイブリドーマ細胞の培養上清をスクリーニングし、本発明のポリペプチドに結合するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを同定する。
【００５９】
リンパ球と不死化細胞系列とを融合するために使用される多くの既知のプロトコールの任意のものは、本発明のポリペプチドに対するモノクローナル抗体を生み出すために適用することができる（例えば、「免疫学における最新プロトコール（Current Protocols in Immunology）」、上記；Galfreら、Nature, 266:55052(1977)；R.H.Kenneth, 「モノクローナル抗体：生物学的解析の新たな局面（Monoclonal Antibodies:A New Dimension In Biological Analyses）」（Plenum Publishing Corp., New York, New York(1980)）；およびLerner, Yale J.Biol.Med., 54:387〜402(1981)を参照のこと）。さらに、当業者には、そのような方法には、同様に有用となるような多くの変法が認められることが理解される。
【００６０】
モノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマの調製の代わりに、本発明のポリペプチドに対するモノクローナル抗体は、そのポリペプチドに結合する免疫グロブリンライブラリの構成要素を単離するために、そのポリペプチドを用いて組換え免疫グロブリンコンビナトリアルライブラリ（例えば、抗体ファージディスプレイライブラリ）をスクリーニングすることによって、同定し、単離することができる。ファージディスプレイライブラリを作製し、スクリーニングするためのキットが市販されている（例えば、ファルマシア組換えファージ抗体システム(Pharmacia Recombinant Phage Antibody System), カタログ番号27-9400-01；およびストラタジーン(Stratagene)SurfZAP(商標)ファージディスプレイキット、カタログ番号240612）。さらに、抗体ディスプレイライブラリの作製およびスクリーニングにおいて特に使用できる方法および試薬の例は、例えば、米国特許第5,223,409号；PCT公報国際公開公報第92/18619号；PCT公報国際公開公報第91/17271号；PCT公報国際公開公報第92/20791号；PCT公報国際公開公報第92/15679号；PCT公報国際公開公報第93/01288号；PCT公報国際公開公報第92/01047号；PCT公報国際公開公報第92/09690号；PCT公報国際公開公報第90/02809号；Fuchsら、Bio/Technology, 9:1370〜1372（1991）；Hayら、Hum.Antibod.Hybridomas, 3:81〜85（1992）；Huseら、Science, 246:1275〜1281（1989）；Griffithsら、EMBO J., 12:725〜734（1993）において見出すことができる。
【００６１】
さらに、標準の組換えDNA技術を用いて作製することができる、ヒト部分および非ヒト部分の両方を含むキメラモノクローナル抗体およびヒト化モノクローナル抗体のような組換え抗体は、本発明の範囲内にある。そのようなキメラモノクローナル抗体およびヒト化モノクローナル抗体は、当技術分野において既知の組換えDNA技術によって作製することができる。
【００６２】
一般に、本発明の抗体（例えば、モノクローナル抗体）は、親和性クロマトグラフィーまたは免疫沈降法のような標準技術によって本発明のポリペプチドを単離するために使用することができる。ポリペプチド特異的な抗体は、細胞からの天然ポリペプチド、および、宿主細胞において発現された、組換えにより作製されたポリペプチドの精製を容易にすることができる。さらに、本発明のポリペプチドについて特異的な抗体は、ポリペプチドの発現の量およびパターンを評価するため、（例えば、細胞溶解産物、細胞上清、または組織試料において）ポリペプチドを検出するために使用することができる。抗体は、例えば、与えられた治療プログラムの有効性を決定するためのような臨床試験法の部分として、組織におけるタンパク質レベルをモニタリングするために、診断的に使用することができる。検出は、抗体を検出可能な物質に結合することによって容易にすることができる。検出可能な物質の例には、様々な酵素、補欠分子族、蛍光物質、発光物質、生物発光物質、および放射性物質が含まれる。
【００６３】
本明細書において同定されるヌクレオチド配列（および対応する完全遺伝子配列）の部分または断片は、ポリヌクレオチド試薬として多数の方法において使用することができる。例えば、これらの配列は以下のために使用することができる：(i)それら各々の遺伝子を染色体上にマッピングする；および、したがって、遺伝病に関連する遺伝子領域を位置付ける；(ii)微小生物学的試料から個体を同定する（組織型決定）；および(iii)生物学的試料の法医学的同定を支援する。
【００６４】
本発明はまた、生物学的試料の状況（例えば、血液、血清、細胞、組織）において、タンパク質および／または核酸の発現、および、本発明のタンパク質の活性を決定し、それにより、個体が異常な発現もしくは活性に関連する疾患もしくは障害を有するかどうか、または、異常な発現もしくは活性に関連する障害を発達させるリスクを有するかどうかを決定する診断アッセイ法にも関係する。本発明はまた、本発明のタンパク質または核酸分子の活性または発現に関連する障害を個体が発達させるリスクを有するかどうかを決定するための、予後的（または予測的）アッセイ法をも提供する。
【００６５】
本明細書において説明される方法によって治療または診断されることが可能な障害は、限定されないが、大理石骨病、骨硬化症、ピクノディスオストーシス、骨髄硬化症、高ホスファターゼ症、進行性骨幹形成異常、メロレオストーシス、オステオポイキリー、内前頭骨過骨症、スクレロストーシス、マックキューン-オールブライト（Mc Cune-Albright）症候群および脊椎骨端形成異常を含む、骨密度の増加によって特徴付けられる疾患；変形性関節症、マロトー-ラミー（Maroteaux-Lamy）症候群および骨粗しょう症を含む、骨密度の減少によって特徴付けられる障害；ならびに、骨形成不全症、頭蓋骨縫合早期癒合症、骨軟化症および鎖骨頭蓋骨形成不全症、および骨肉腫のような骨癌を含む、骨形成の障害を含む。さらに、本明細書において説明される方法は、癌、神経性食思不振症、および自己免疫障害に関連する骨の障害の治療または診断のために有用となり得る。さらに、本発明は、骨芽細胞の細胞機能／細胞活性における一次変化によって特徴付けられる疾患（例えば、骨化性線維腫および線維性形成異常、骨芽細胞腫および類骨骨腫、および骨肉腫）、ならびに、異常な骨芽細胞の細胞機能／細胞活性が二次効果である、骨を冒す疾患または全身状態（例えば、先端巨大症、高カルシウム血症、原発性または続発性上皮小体機能亢進症、甲状腺機能亢進症、または骨のパジェット病）の治療を提供する。加えて、本発明は、異常な骨芽細胞の細胞機能／細胞活性が病原性の骨変化に寄与する、骨代謝における限局性の変化に関連する疾患を治療するために使用することができる。例えば、本発明は、歯周病（限局性、炎症誘導性の骨減少）、慢性関節リウマチおよび変形性関節症（限局性、炎症誘導性の骨減少）、限局性骨粗しょう症、肥満細胞症、多発性骨髄腫、および様々な腫瘍の骨転移を治療するために使用することができる。
【００６６】
例えば、特定の遺伝子における突然変異を、生物学的試料においてアッセイすることができる。そのようなアッセイ法は、本発明の核酸分子もしくはタンパク質の発現もしくは活性によって特徴付けられる、またはそれに関連する障害の発症以前に、個体を予防的に治療するために、予後的または予測的な目的で使用することができる。
【００６７】
本発明のその他の局面は、臨床試験において、本発明のタンパク質の発現または活性に対する作用物質（例えば薬剤、化合物）の影響をモニタリングすることに関係する。
【００６８】
これらの作用物質および他の作用物質は、以下の節においてさらに詳細を説明する。
【００６９】
診断アッセイ法
生物学的試料中における、本発明のタンパク質または核酸分子の存在または不在を検出するためのある典型的な方法は、被験者から生物学的試料を得る段階、および、生物学的試料中におけるタンパク質または核酸分子の存在が検出されるように、タンパク質またはタンパク質をコードする核酸分子（例えばmRNA,ゲノムDNA）を検出できる化合物または作用物質と、その生物学的試料を接触させる段階に関与する。mRNAまたはゲノムDNAを検出するのに好ましい作用物質は、本明細書において説明されるmRNA配列またはゲノムDNA配列にハイブリダイズできる標識核酸プローブである。核酸プローブは、例えば、全長核酸分子、または、少なくとも15、30、50、100、250もしくは500ヌクレオチド長であり、ストリンジェントな条件下において適切なmRNAもしくはゲノムDNAに特異的にハイブリダイズするのに十分なオリゴヌクレオチドのような、その部分であることが可能である。例えば、核酸プローブは、配列番号：1、または配列番号：1の相補配列、またはその部分の、全てまたは部分であることが可能である。本発明の診断アッセイ法において使用するための他の適切なプローブについては、本明細書において説明される。
【００７０】
ある態様においては、本発明のタンパク質を検出するための作用物質は、そのタンパク質に結合できる抗体、好ましくは、検出可能な標識を有する抗体である。抗体は、ポリクローナル抗体、またはより好ましくはモノクローナル抗体であることが可能である。完全な抗体またはその断片（例えばFabまたはF(ab')2）を使用することができる。プローブまたは抗体に関して、「標識された」という用語は、プローブまたは抗体に検出可能な物質を結合する（即ち物理的に連結する）ことによって、プローブまたは抗体を直接的に標識すること、および、直接的に標識された別の試薬との反応性によってプローブまたは抗体を間接的に標識することを包含すると意図される。間接的な標識の例には、蛍光標識された二次抗体を用いた一次抗体の検出、および、蛍光標識されたストレプトアビジンによって検出できるような、ビオチンによるDNAプローブの末端標識が含まれる。「生物学的試料」という用語は、被験者から単離された、組織、細胞および生物学的液体、および、被験者内に存在する組織、細胞および液体を含むことを意図される。つまり、本発明の検出法は、インビトロおよびインビボにおいて、生物学的試料における本発明のmRNA、タンパク質、またはゲノムDNAを検出するために使用することができる。例えば、mRNAの検出のためのインビトロの技術は、ノーザンハイブリダイゼーションおよびインサイチューのハイブリダイゼーションを含む。タンパク質の検出のためのインビトロの技術は、酵素結合免疫吸着検定法（ELISA）、ウェスタンブロット法、免疫沈降法および免疫蛍光検査法を含む。ゲノムDNAの検出のためのインビトロの技術は、サザンハイブリダイゼーションを含む。さらに、タンパク質の検出のためのインビボの技術は、標識抗タンパク質抗体を被験者に導入することを含む。例えば、抗体は、標準の画像化技術によって被験者におけるその存在および位置を検出することができる、放射性マーカーを用いて標識することができる。
【００７１】
ある態様においては、生物学的試料は、被験者に由来するタンパク質分子を含む。または、生物学的試料は、被験者に由来するmRNA分子または被験者に由来するゲノムDNA分子を含み得る。好ましい生物学的試料は、従来的な方法によって被験者から単離された血清試料または肺組織生検材料である。
【００７２】
その他の態様においては、本方法は、対照被験者から対照生物学的試料を得る段階、生物学的試料中におけるタンパク質、mRNA、またはゲノムDNAの存在が検出されるように、本発明のタンパク質、mRNA、またはゲノムDNAを検出できる化合物または作用物質と対照試料を接触させる段階、および、対照試料中におけるタンパク質、mRNA、またはゲノムDNAの存在を、被験試料中におけるタンパク質、mRNA、またはゲノムDNAの存在と比較する段階にさらに関与する。
【００７３】
本発明はまた、生物学的試料中における本発明のタンパク質または核酸分子の存在を検出するためのキットをも包含する。例えば、本キットは、生物学的試料中のタンパク質またはmRNAを検出できる、標識された化合物または作用物質；試料中における量を決定するための方法；および試料中における量を基準と比較するための方法を含み得る。化合物または作用物質は、適切な容器中に包装することができる。本キットは、タンパク質または核酸分子を検出するためのキットの使用についての使用説明書をさらに含み得る。
【００７４】
本明細書において説明される診断法は、本発明のタンパク質および核酸分子の異常な発現もしくは活性に関連する疾患もしくは障害を有する、または、疾患もしくは障害を発達させるリスクを有する被験者を同定するために、さらに利用することができる。例えば、前述の診断アッセイ法または以下のアッセイ法のような、本明細書において説明されるアッセイ法は、増殖障害、分化障害または発生障害、または造血障害のような、タンパク質もしくは核酸の発現もしくは活性に関連する障害を有する、または、障害を発達させるリスクを有する被験者を同定するために利用することができる。または、予後アッセイ法は、特に骨の分化疾患または増殖性疾患（例えば癌）を有する、または、疾患を発達させるリスクを有する被験者を同定するために利用することができる。したがって、本発明は、本発明のタンパク質または核酸分子の異常な発現または活性に関連する疾患または障害を同定するための方法であり、被験試料が被験者から得られ、タンパク質または核酸分子（例えばmRNA、ゲノムDNA）が検出されるような方法であり、本発明のタンパク質もしくは核酸配列の異常な発現もしくは活性に関連する疾患もしくは障害を有する、または、疾患もしくは障害を発達させるリスクを有する被験者について、タンパク質または核酸分子の存在が診断的となるような方法を提供する。本明細書において使用されるように、「被験試料」とは、関心対象の被験者から得られた生物学的試料を指す。例えば、被験試料は、生物学的液体（例えば血清）、細胞試料（例えば骨芽細胞）、または組織試料であることが可能である。
【００７５】
本発明は、調節物質、即ち、本明細書において説明される核酸分子、ポリペプチドまたはタンパク質に結合する、または、例えば、本発明の核酸分子、ポリペプチドもしくはタンパク質の発現もしくは活性に対して刺激効果もしくは阻害効果を有する、候補化合物もしくは被験化合物または候補作用物質もしくは被験作用物質（例えば、アンチセンス、ポリペプチド、ペプチド模倣物、小分子または他の薬剤）を同定するための方法（本明細書においては「スクリーニングアッセイ法」とも呼ばれる）を提供する。
【００７６】
ある態様においては、本発明は、本明細書において説明されるタンパク質またはポリペプチドまたは生物学的に活性なその部分に結合する、またはその活性を調節する、候補化合物または被験化合物をスクリーニングするためのアッセイ法を提供する。本発明の被験化合物は、以下を含む、当技術分野において既知のコンビナトリアルライブラリ法における多数のアプローチのうち任意のものを用いて得ることができる：生物学的ライブラリ；空間的に指定可能な平行固体相または溶液相ライブラリ；デコンボリューションを必要とする合成ライブラリ法；「1ビーズ1化合物」ライブラリ法；および、親和性クロマトグラフィー選択を用いた合成ライブラリ法。生物学的ライブラリアプローチは、ポリペプチドライブラリに限定される一方、他の4つのアプローチは、ポリペプチド、非ペプチドオリゴマーまたは小分子の化合物ライブラリに適用可能である（Lam, K.S., Anticancer Drug Des., 12:145(1997)）。
【００７７】
ある態様においては、アッセイ法は、コードされるポリペプチド（例えば、受容体のような細胞表面タンパク質）を発現する細胞を被験化合物と接触させ、被験化合物のポリペプチドへの結合能を決定する、細胞に基づくアッセイ法である。例えば、細胞は、骨芽細胞由来のもののような、哺乳動物起源のものが可能である。被験化合物のポリペプチドへの結合能を決定する段階は、例えば、直接的または間接的に、125I、35S、14C、または3Hによる標識を検出することによって被験化合物のポリペプチドへの結合を決定することができるように、および、放射線放出の直接計測またはシンチレーション計数によって放射性同位体を検出できるように、放射性同位体標識または酵素的標識と被験化合物とを結合することにより達成することができる。または、被験化合物は、例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、またはルシフェラーゼを用いて酵素的に標識し、適切な基質の産物への転換を決定することによって酵素標識を検出することができる。
【００７８】
相互作用する物質のいずれも標識せずに、被験化合物の、ポリペプチドと相互作用する能力を決定することもまた、本発明の範囲内にある。例えば、マイクロフィジオメーターは、被験化合物またはポリペプチドのいずれも標識せずに、被験化合物のポリペプチドとの相互作用を検出するために使用することができる。マッコネル（McConnell, H.M.）ら、Science, 257:1906〜1912（1992）。本明細書において使用されるように、「マイクロフィジオメーター」（例えばCytosensor(商標)）は、光処理電位差センサー（LAPS）を用いて、細胞がその環境を酸性化する速度を測定する解析装置である。この酸性化速度における変化は、リガンドとポリペプチドの間の相互作用の指標として用いることができる。
【００７９】
ある態様においては、アッセイ法は、本明細書において説明される、コードされたタンパク質（例えば受容体）を細胞表面上にて発現する細胞を、ポリペプチドリガンドまたは生物学的に活性なその部分と接触させて、アッセイ混合物を形成する段階、被験化合物とアッセイ混合物を接触させる段階、および、被験化合物の、ポリペプチドと相互作用する能力を決定する段階を含み、被験化合物の、ポリペプチドと相互作用する能力を決定する段階は、リガンドまたは生物学的に活性なその部分の、ポリペプチドに結合する能力と比較して、被験化合物の、優先的にポリペプチドと結合する能力を決定する段階を含む。
【００８０】
その他の態様においては、アッセイ法は、本明細書において説明される特定の標的分子を発現する細胞を被験化合物と接触させる段階、および、被験化合物の、標的分子の活性を調節するまたは変化させる（例えば刺激するまたは阻害する）能力を決定する段階を含む、細胞に基づくアッセイ法である。被験化合物の、標的分子の活性を調節する能力を決定する段階は、例えば、既知のリガンドの、標的分子と結合するまたは相互作用する能力を決定することによって達成することができる。なおもその他の態様においては、本発明のアッセイ法は、本発明のタンパク質または生物学的に活性なその部分を被験化合物と接触させ、タンパク質または生物学的に活性なその部分への被験化合物の結合能を決定する、細胞を含まないアッセイ法である。被験化合物のタンパク質への結合は、上記に説明されるように、直接的または間接的のいずれかにて測定することができる。ある態様においては、アッセイ法は、タンパク質または生物学的に活性なその部分を、そのタンパク質と結合する既知の化合物と接触させて、アッセイ混合物を形成させる段階、アッセイ混合物を被験化合物と接触させる段階、および、被験化合物の、そのタンパク質と相互作用する能力を決定する段階を含む。
【００８１】
被験化合物の、タンパク質と相互作用する能力を決定する段階は、既知の化合物と比較して、被験化合物の、優先的にそのタンパク質または生物学的に活性なその部分と結合する能力を決定する段階を含む。
【００８２】
その他の態様においては、アッセイ法は、本発明のタンパク質または生物学的に活性なその部分を被験化合物と接触させ、被験化合物の、タンパク質または生物学的に活性なその部分の活性を調節するまたは変化させる（例えば刺激するまたは阻害する）能力を決定する、細胞を含まないアッセイ法である。被験化合物の、タンパク質の活性を調節する能力を決定する段階は、例えば、直接的な結合の測定について上記に説明される方法の1つにより、既知の標的分子へのタンパク質の結合能を決定することによって、達成することができる。代替の態様においては、被験化合物の、本発明のタンパク質の活性を調節する能力を決定するには、そのタンパク質の、標的分子の活性をさらに調節する能力を決定することによって達成されうる。例えば、適切な基質に対する標的分子の触媒活性／酵素活性を、以前に説明されたように測定することができる。
【００８３】
なおもその他の態様においては、細胞を含まないアッセイ法は、本発明のタンパク質または生物学的に活性なその部分を、そのタンパク質に結合する既知の化合物と接触させて、アッセイ混合物を形成させる段階、被験化合物とアッセイ混合物を接触させる段階、および、被験化合物の、そのタンパク質と相互作用する能力を決定する段階に関与し、被験化合物の、タンパク質と相互作用する能力を決定する段階は、そのタンパク質の、標的分子に優先的に結合するまたは標的分子の活性を調節する能力を決定する段階を含む。
【００８４】
本発明の上記のアッセイ法の1つ以上の態様においては、一方または双方のタンパク質の非複合形態からの複合形態の分離を容易にするために、および、アッセイ法の自動化を適合させるために、タンパク質またはその標的分子のいずれかを固定化することが望ましい。被験化合物のタンパク質への結合、または候補化合物の存在下または不在下におけるタンパク質の標的分子との相互作用は、反応物を含むのに適した任意の容器において達成することができる。そのような容器の例には、マイクロタイタープレート、試験管、および微量遠心管が含まれる。ある態様においては、一方または双方のタンパク質をマトリックスに結合させるドメインを加える融合タンパク質（例えば、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ融合タンパク質）を提供することができる。
【００８５】
その他の態様においては、本発明の核酸分子の発現調節物質は、候補化合物と細胞を接触させ、細胞における適切なmRNAまたはタンパク質の発現を決定するような方法において同定される。候補化合物の存在下における適切なmRNAまたはタンパク質の発現レベルを、候補化合物の不在下におけるmRNAまたはタンパク質の発現レベルと比較する。候補化合物をその後、この比較に基づき、発現調節物質として同定することができる。例えば、mRNAまたはタンパク質が、候補化合物の存在下において、その不在下におけるものより強い（統計学的に有意により強い）発現を示す場合、その候補化合物は、mRNAまたはタンパク質の発現の刺激物質または増強物質として同定される。または、mRNAもしくはタンパク質が、候補化合物の存在下において、その不在下におけるものより弱い（統計学的に有意により弱い）発現を示す場合、その候補化合物は、mRNAまたはタンパク質の発現の阻害剤として同定される。細胞におけるmRNAまたはタンパク質の発現レベルは、mRNAまたはタンパク質の検出について本明細書において説明される方法によって決定することができる。
【００８６】
本発明は、上記に説明されるスクリーニングアッセイ法によって同定される新規の作用物質にさらに関係する。したがって、適切な動物モデルにおいて、本明細書において説明されるように同定される作用物質をさらに使用することは本発明の範囲内にある。例えば、本明細書において説明されるように同定されるある作用物質（例えば、調節物質、アンチセンス核酸分子、特異的抗体、またはタンパク質結合パートナー）は、そのような作用物質を用いた治療の有効性、毒性、または副作用を決定するために、動物モデルにおいて使用することができる。または、本明細書において説明されるように同定されるある作用物質は、そのような作用物質の作用機構を決定するために、動物モデルにおいて使用することができる。さらに、本発明は、上記にて説明されるスクリーニングアッセイ法によって同定される新規の作用物質の、本明細書において説明されるような治療のための使用に関係する。
【００８７】
本発明は、本発明のタンパク質または核酸分子の異常な発現または活性に関連する障害のリスクを有する（または感受性がある）、または障害を有する、被験者を治療するための、予防的方法および治療的方法の双方を提供する。ある局面においては、本発明は、本発明の遺伝子またはタンパク質の発現または少なくとも1つの活性を調節するある作用物質を被験者に投与することによって、被験者において、本発明の遺伝子またはタンパク質の異常な発現または活性に関連する疾患または状態を予防する方法を提供する。異常な遺伝子の発現またはタンパク質の活性によって引き起こされる、またはそれが寄与する疾患のリスクを有する被験者は、例えば、本明細書において説明されるような診断アッセイ法または予後アッセイ法の任意のものまたは組み合わせによって同定することができる。予防薬の投与は、疾患または障害が予防されるように、またはその代わりに、その進行が遅延されるように、異常を特徴とする症状の症状発現以前に行うことができる。異常の種類によって、例えば、被験者の治療のために、アゴニスト作用物質またはアンタゴニスト作用物質を使用することができる。適切な作用物質は、本明細書において説明されるスクリーニングアッセイに基づいて決定することができる。
【００８８】
本発明のその他の局面は、治療的な目的のために、本発明の遺伝子またはタンパク質の発現または活性を調節する方法に関係する。本発明の調節法は、その細胞と関連する特定のタンパク質の1つまたはそれ以上の活性を調節するある作用物質と細胞とを接触させる段階に関与する。タンパク質の活性を調節する作用物質は、核酸分子またはタンパク質、本明細書において説明されるタンパク質の天然に生じる標的分子、ポリペプチド、ペプチド模倣物、または他の小分子のような、本明細書において説明されるような作用物質でありうる。ある態様においては、作用物質は、1つまたはそれ以上のタンパク質の活性を刺激する。そのような刺激作用物質の例は、活性タンパク質、および、そのタンパク質をコードする、細胞に導入された核酸分子を含む。その他の態様においては、作用物質は、1つまたはそれ以上のタンパク質の活性を阻害する。そのような阻害作用物質の例は、アンチセンス核酸分子および抗タンパク質抗体を含む。これらの調節法は、（例えば細胞を作用物質と培養することによって）インビトロにおいて実行してもよく、または、その代わりに、（例えば作用物質を被験者に投与することによって）インビボにおいて実行してもよい。そのようなものとして、本発明は、本発明のタンパク質または核酸分子の異常な発現または活性によって特徴付けられる疾患または障害を有する個体を治療する方法を提供する。ある態様においては、本方法は、本発明の遺伝子またはタンパク質の発現または活性を調節する（例えば上方制御または下方制御する）作用物質（例えば、本明細書において説明されるスクリーニングアッセイ法によって同定される作用物質）、または作用物質の組み合わせを投与する段階に関与する。その他の態様においては、本方法は、タンパク質または核酸分子の、減少した、または異常な、発現または活性を補償する療法として、本発明のタンパク質または核酸分子を投与する段階に関与する。
【００８９】
タンパク質の活性の刺激は、そのタンパク質が異常に下方制御されている、および／または、タンパク質の活性を増加させることが有益な効果をもたらす可能性が高い状況において望ましい。同様に、タンパク質が異常に上方制御されている、および／または、タンパク質の活性を減少させることが有益な効果をもたらす可能性が高い状況においては、タンパク質の活性を阻害することが望ましい。そのような状況のある例は、異常な発生または細胞分化により特徴付けられるような障害を被験者が有する場合である。本明細書において説明されるスクリーニングアッセイ法により同定されるような、タンパク質の活性（例えば、遺伝子発現）に対する刺激効果または阻害効果を有する、本発明の分子、および作用物質、または調節物質は、異常なタンパク質活性に関連する障害（例えば、増殖性障害または発生障害）を（予防的にまたは治療的に）治療するために、個体に投与することができる。
【００９０】
本発明は、以下非限定的な例によってさらに説明される。本明細書において言及される全ての刊行物の開示は、その全体を参照として本明細書に組み入れられる。
【００９１】
実施例
サブトラクティブプローブ調製物
5μgのE9.5胚頭部mRNA（即ち、前骨芽細胞の供給源）を、ランダムプライマーを用いて逆転写した。32P-dCTPの取り込みを行いながら、42℃において1時間、反応を行わせた。沈降後、0.1 M NaOH中において反応産物を再懸濁し、65℃において20分間インキュベートし、RNA鋳型を加水分解した。0.1 M酢酸を用いてプローブを中和し、および、Sephadex G-50においてサイズ分画した。「ドライバー」としてのビオチン化RNAを、E9.5胚体から頭部を含まずに（即ち、胴部のみで）調製した。cDNAプローブを、10倍過剰なビオチン化mRNAとハイブリダイズさせた。沈降したcDNA-RNA混合物を、10〜20μlのH2O中において再懸濁し、100℃にまで1分間加熱した。等しい容量の2×ハイブリダイゼーション緩衝液（1.0％ドデシル硫酸ナトリウムを含む12×SSC）を加え、65℃にて20〜24時間、混合物をインキュベートした。等しい容量のHEPES緩衝液（10 mM HEPES；pH 7.5、1 mM EDTA）の添加に続き、20μgのストレプトアビジンを加え、混合物を氷上にて10分間インキュベートした。アビジンと複合体形成させたビオチン化RNAおよびRNA-cDNA二本鎖を、フェノール-クロロホルムによる反復抽出によって除去した。水相のcDNAプローブ（「サブトラクティブプローブ」）をエタノールを用いて沈殿させ、ディファレンシャルスクリーニングにおける使用以前に、同一の条件下において、上記に説明されるような二順目のサブトラクションに供した。
【００９２】
ディファレンシャルスクリーニング
骨芽細胞cDNAライブラリ（Lambda-ZAP System, Stratagene）に由来する総計5×105クローンを、本試験においてスクリーニングした。組換えバクテリオファージのプラークを写し取ることにより、1×104個を各々含む145 mmプレートから二つ組のフィルターを作製し、等量のサブトラクションによって得たプローブ、または動物の胴部に由来する対照プローブを用いて、これらを並行してハイブリダイズさせた。フィルターは、ハイブリダイズさせ、洗浄し、続いてフィルムに露光した。対応するフィルターからのフィルムを重ね合わせることによって、頭部（前骨芽細胞源）特異的クローンを同定した。示差的な発現を確証するために、およびプラークの精製のために、一次スクリーニングにおいて選択されたクローンを、低密度にて1回再スクリーニングした。
【００９３】
配列解析
ABI377シーケンサーを用いてOBP1 cDNAクローンを配列決定した。国立バイオテクノロジー情報センター（National Center for Biotechnology Information）データベースに存在する既知の配列とヌクレオチド配列をBLASTアルゴリズムによって比較した。
【００９４】
ノーザンハイブリダイゼーション
サブトラクティブディファレンシャルスクリーニングからの結果を確証するために、ならびに、OBP1の組織および細胞における分布、サイズおよび量を決定するために、ノーザンハイブリダイゼーションを使用した。
【００９５】
本発明は、好ましいその態様に関して特に示され、説明されてきたが、添付の特許請求の範囲によって定義されるような本発明の精神および範囲から逸脱することなく、その中で形態および詳細において様々な変化を与え得ることは、当業者には理解される。
【図面の簡単な説明】
【００９６】
【図１】OBP1 cDNAのヌクレオチド配列（配列番号：1）、および、推定されるOBP1のアミノ酸配列（配列番号：2）を示す。
【図２】複数の組織の、OBP1 mRNAの発現についてのノーザンブロット解析を示す。
【図１】
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【図２】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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2004524011.tif 000047