(57)【要約】ＶＥＧＦ−Ｂ１８６の発現を検出し、ＶＥＧＦ−Ｂ１８６の発現の増加を測定する、あるいは、ＶＥＧＦ−Ｂ１６７の発現に対するＶＥＧＦ−Ｂ１８６の発現の増加を測定することによって、動物の腫瘍細胞の存在を検出する方法とキット。前記キットは、サンプルを受け入れるように構成された容器と、前記サンプルからＶＥＧＦ−Ｂ１８６の発現を検出するための手段とを備える。更に、抗腫瘍剤のスクリーニング方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
腫瘍を有することが疑われる動物の腫瘍細胞の存在を検出する方法であって、以下の工程を有する、
前記動物からサンプルを得る工程、
前記サンプルからのＶＥＧＦ−Ｂ１８６の発現を検出する工程、ここで、ＶＥＧＦ−Ｂ１８６の発現の検出は前記腫瘍細胞の存在を示す。
【請求項２】
腫瘍を有することが疑われる動物の腫瘍細胞の存在を検出する方法であって、以下の工程を有する、
前記動物からサンプルを得る工程、
前記サンプル中のＶＥＧＦ−Ｂ１８６の発現レベルを測定する工程、
腫瘍を有することが疑われない動物からの同等のサンプル中のＶＥＧＦ−Ｂ１８６の対照発現レベルを測定する工程、そして
前記測定発現レベルを前記対照発現レベルと比較する工程、
ここで、前記対照発現を超えるＶＥＧＦ−Ｂ１８６の発現レベルの増加の測定は腫瘍細胞の存在を示す。
【請求項３】
腫瘍を有することが疑われる動物の腫瘍細胞の存在を検出する方法であって、以下の工程を有する、
前記動物からサンプルを得る工程、
前記サンプル中のＶＥＧＦ−Ｂ１８６の発現レベルを測定する工程、
前記サンプル中のＶＥＧＦ−Ｂ１６７の発現レベルを測定する工程、そして
前記ＶＥＧＦ−Ｂ１８６の発現レベルを前記ＶＥＧＦ−Ｂ１６７の発現レベルと比較する工程、
ここで、ＶＥＧＦ−Ｂ１６７に対するＶＥＧＦ−Ｂ１８６の相対比率が２８％以上を示す比較は、腫瘍細胞の存在を示す。
【請求項４】
腫瘍を有することが疑われる動物の腫瘍細胞の存在を検出する方法であって、以下の工程を有する、
前記動物からサンプルを得る工程、
前記サンプル中のＶＥＧＦ−Ｂ１８６の発現レベルを測定する工程、
前記サンプル中のＶＥＧＦ−Ｂ１６７の発現レベルを測定する工程、そして
前記ＶＥＧＦ−Ｂ１８６の発現レベルを前記ＶＥＧＦ−Ｂ１６７の発現レベルと比較する工程、
ここで、ＶＥＧＦ−Ｂ１６７に対するＶＥＧＦ−Ｂ１８６の相対比率が５０％以上を示す比較は、腫瘍細胞の存在を示す。
【請求項５】
動物における腫瘍細胞の存在を検出するためのキットであって、以下を有する、
サンプルを受け入れるように構成された容器、そして
前記サンプル中のＶＥＧＦ−Ｂ１８６の発現を検出するための手段、
これによって、ＶＥＧＦ−Ｂ１８６の発現の検出は、腫瘍細胞の存在を示す。
【請求項６】
動物における腫瘍細胞の存在を検出するためのキットであって、以下を有する、
サンプルを受け入れるように構成された容器、
前記サンプル中のＶＥＧＦ−Ｂ１８６の発現レベルを検出するための手段、そして
前記ＶＥＧＦ−Ｂ１８６の発現レベルを、腫瘍を有さない動物中のＶＥＧＦ−Ｂ１８６の対照レベルと比較するための手段、
ここで、前記対照発現レベルを超えるＶＥＧＦ−Ｂ１８６の発現レベル増大の測定は腫瘍細胞の存在を示す。
【請求項７】
請求項１〜６の何れか１項に記載の方法であって、前記動物は哺乳動物である。
【請求項８】
請求項１〜６の何れか１項に記載の方法であって、前記動物はヒトである。
【請求項９】
請求項１〜６の何れか１項に記載の方法であって、前記動物は齧歯動物である。
【請求項１０】
抗腫瘍剤のスクリーニングの方法であって、以下の工程を有する、
腫瘍細胞に対してテスト剤を適用する工程、そして、
適当な手段によって、前記腫瘍細胞中のＶＥＧＦ−Ｂ１８６の発現の減少を検出する工程。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本出願は、シュリ・リ（Ｘｕｒｉ ＬＩ）他の名義で２０００年５月１７日に出願された同時係属の米国仮出願第６０／２０４，７４８号の優先権を主張する。
【０００２】
発明の背景
以下は、読者が本発明の理解をすることを補助するための背景情報としてのみ提供されるものであって、本発明に対する従来技術である、又は、従来技術を記載するものとして自認するものではない。
【０００３】
哺乳動物の血管系の二つの主要な構成要素は、内皮細胞と平滑筋細胞である。内皮細胞は、哺乳動物のすべての血管及びリンパ管の内表面のライニングを形成する。新しい血管の形成は、二つの異なるプロセス、即ち、脈管形成（ｖａｓｃｕｌｏｇｅｎｅｓｉｓ）又は新脈管形成 （ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ）によって起こりうる（リゾー（Ｒｉｓａｕ）Ｗ，Ｎａｔｕｒｅ  ３８６：６７１−６７４（１９９７）を参照）。脈管形成は、内皮細胞前駆体の成熟内皮細胞への元位置（インサイチュ）での分化と、初期胚の一次血管叢の形成において起こるもののような、血管を形成するためのこれらの細胞の連携作用とによって特徴付けられる。これに対して、新脈管形成、即ち、既存の血管の成長と分岐とによる血管の形成は、後の胚形成において重要であり、成体において起こる血管の成長を司る。新脈管形成は、内皮細胞の増殖、細胞外マトリクスの分解、血管の分岐、それらに続く細胞癒着事象を含む生理学的に複雑なプロセスである。成体において、新脈管形成は、厳密に制御され、正常な状況では女性の生殖系に限定される。しかしながら、新脈管形成は、組織損傷に応答してスイッチ・オンされることが可能である。また、固形腫瘍は、周囲の組織において新脈管形成を誘発させることができ、これによって、腫瘍の成長を維持し、転移の形成を容易にする（フォルクマン，ジェイ（Ｆｏｌｋｍａｎ，Ｊ．），Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．１：２７−３１，（１９９５））。複雑な新脈管形成プロセスの背後に存在する分子機構については、ほとんど理解されていない。
【０００４】
新脈管形成は、又、それが疾患の様々な後遺症に役割を果す、又は、それらに直接関わる、多数の病理状態にも関係している。いくつかの具体例として、種々の肝臓疾患に関連する新生血管形成（ｎｅｏｖａｓｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ）、糖尿病の血管新生後遺症、高血圧症の血管新生後遺症、外傷後の新生血管形成、頭部外傷の新生血管形成、慢性肝感染（例えば、慢性肝炎）の新生血管形成、高温又は低温外傷による新生血管形成、ホルモンの過多に関連する機能障害、血管腫の形成、及び血管形成術後の再狭窄が挙げられる。関節炎では、新しい毛細管が関節に侵入し、軟骨を破壊する。糖尿病においては、網膜の新しい毛細管が硝子体液に侵入し、出血と盲目状態を引き起こす（フォルクマン，ジェイ（Ｆｏｌｋｍａｎ， Ｊ．）及びシン，ワイ（Ｓｈｉｎｇ， Ｙ．）， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６７：１０９３１−１０９３４ （１９９２））。これら及びその他の疾患における脈管形成因子の役割は、まだはっきりとは確立されていない。
【０００５】
新脈管形成は、非常に多くの生理的又は病理的プロセスにおいて重要な役割を果すものである為、新脈管形成の制御に関連する要因について鋭意研究されてきた。新脈管形成の調節には、多数の増殖因子が関連していることが示されており、これらには、繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、トランスホーミング増殖因子α（ＴＧＦα）、及び肝細胞増殖因子 （ＨＧＦ）が含まれる。例えば、フォルクマン（Ｆｏｌｋｍａｎ）他、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．，２６７：１０９３１−１０９３４（１９９２）を参照。
【０００６】
内皮細胞特異的増殖因子の特定のファミリ、即ち、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦｓ）とそれらに対応するレセプタとが、内皮細胞成長及び分化の刺激と、分化細胞の或る種の機能との主要な原因となっていることが示唆された。これらの因子は、ＰＤＧＦ／ＶＥＧＦファミリのメンバであり、主として内皮レセプタチロシンキナーゼ（ＲＴＫｓ）を介して作用するものと考えられる。前記ＰＤＧＦ／ＶＥＧＦファミリの増殖因子は、システイン−ノットスーパーファミリの増殖因子に属し、それは、又、ニューロトロフィン（ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｎｓ）とトランスホーミング増殖因子−βとを含む。
【０００７】
ＰＤＧＦ／ＶＥＧＦファミリにおいて、８種類のタンパク質が同定されている。即ち、２つのＰＤＧＦ（Ａ及びＢ）と、ＶＥＧＦと、ＶＥＧＦに密接に関連する５つのメンバである。ＶＥＧＦに密接に関連する５つのメンバとは、ルードヴィッヒ・インスティテュート・フォア・キャンサー・リサーチ（Ｌｕｄｗｉｇ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）とヘルシンキ大学の国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ９６／０２９５７（ＷＯ９６／２６７３６）及び米国特許５，８４０，６９３号及び５，６０７，９１８号に記載のＶＥＧＦ−Ｂ；ジューコフ（Ｊｏｕｋｏｖ）他のＥＭＢＯ  Ｊ．１５：２９０−２９８（１９９６）、リー（Ｌｅｅ）他のＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９３：１９８８−１９９２（１９９６）及びヒューマン・ゲノム・サイエンス（Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）社の米国特許５，９３２，５４０号及び５，９３５，５４０号に記載のＶＥＧＦ−Ｃ又はＶＥＧＦ２；国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ９７／１４６９６（ＷＯ９８／０７８３２）及びアチェン（Ａｃｈｅｎ）他のＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９５：５４８−５５３（１９９８）に記載のＶＥＧＦ−Ｄ；マグリオーネ（Ｍａｇｌｉｏｎｅ）他のＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８８：９２６７−９２７１（１９９１）に記載の胎盤増殖因子（ＰｌＧＦ）；そしてヒューマン・ゲノム・サイエンス社の国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ９５／０７２８３（ＷＯ９６／３９４２１）に記載のＶＥＧＦ３である。各ＶＥＧＦファミリメンバは、ＶＥＧＦに対して３０％ないし４５％のアミノ酸配列同一性を有する。これらＶＥＧＦファミリメンバは、前記システイン−ノットモチーフを形成する８つの保存システイン残基を含むＶＥＧＦホモロジードメインを共有している。それらの活性、生理状態において、前記タンパク質は、前記８つのシステイン残基における、細胞間及び細胞内結合による、ジスルフィド結合によって形成されるダイマである。ＶＥＧＦファミリの機能的特徴としては、内皮細胞及び関連する細胞タイプに対する様々なレベルのマイトジェン活性、血管透過性の誘発、並びに、脈管形成及びリンパ管形成特性がある。
【０００８】
血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）は、複数のソースから単離されているホモダイマの糖タンパク質である。ＶＥＧＦは内皮細胞に対する高度に特異的なマイトジェン活性を示す。ＶＥＧＦは、胚時期の脈管形成及び成体期の新脈管形成中における新しい脈管形成において重要な調節機能を有する（カルメリート（Ｃａｒｍｅｌｉｅｔ）他， Ｎａｔｕｒｅ， ３８０：４３５−４３９， １９９６； フェラーラ（Ｆｅｒｒａｒａ）他， Ｎａｔｕｒｅ， ３８０： ４３９−４４２， （１９９６）， フェラーラ（Ｆｅｒｒａｒａ）及びデイビス−スミス（Ｄａｖｉｓ−Ｓｍｙｔｈ）， Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ Ｒｅｖ．， １８： ４−２５， （１９９７）でレビュー）。ＶＥＧＦが果たす役割の重要性は、一つのＶＥＧＦ対立遺伝子の不活性化によって、血管系の発達不全によって胚が致死することを示す研究に示されている（カルメリート（Ｃａｒｍｅｌｉｅｔ）他， Ｎａｔｕｒｅ， ３８０： ４３５−４３９， （１９９６）； フェラーラ（Ｆｅｒｒａｒａ）他， Ｎａｔｕｒｅ， ３８０： ４３９−４４２， （１９９６））。ＶＥＧＦの単離と性質は、既に研究されている。フェラーラ（Ｆｅｒｒａｒａ）他， Ｊ． Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍ．， ４７： ２１１−２１８， （１９９１）及びコノリー（Ｃｏｎｎｏｌｌｙ）， Ｊ． Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍ．， ４７： ２１９−２２３， （１９９１）を参照。
【０００９】
更に、ＶＥＧＦは、単球に対して強い化学誘引活性を示し、内皮細胞中でプラスミノゲン・アクチベータ及びプラスミノゲン・アクチベータ・インヒビタを誘発し、更に、微小血管透過性を誘発することができる。後者の活性により、それは、時として脈管透過性因子（ＶＰＦ）と称される。ＶＥＧＦは、又、ある種の造血細胞に対して化学走性を有する。最近の文献に、ＶＥＧＦが樹状細胞の成熟を阻止し、それによって、腫瘍に対する免疫応答の効果を低減させることが示されている（多くの腫瘍はＶＥＧＦを分泌する）（ガブリロビッチ（Ｇａｂｒｉｌｏｖｉｃｈ）他， Ｂｌｏｏｄ ９２： ４１５０−４１６６， （１９９８）； ガブリロビッチ（Ｇａｂｒｉｌｏｖｉｃｈ）他， Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５： ２９６３−２９７０， （１９９９））。
【００１０】
血管内皮増殖因子Ｂ（ＶＥＧＦ−Ｂ）は、非グリコシル化の、高塩基性の増殖因子である。ＶＥＧＦ−Ｂは、ＶＥＧＦに類似の血管形成及びその他の性質を有するが、組織における分布と発現はＶＥＧＦと異なる。特に、ＶＥＧＦ−Ｂは、心臓で強く発現し、肺では弱くしか発現せず、これに対してＶＥＧＦはその反対である（オロフソン（Ｏｌｏｆｓｓｏｎ），Ｂ他， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９３：２５７６−２５８１（１９９６））。ＲＴ−ＰＣＲアッセイによって、メラノーマ、正常皮膚、及び筋肉におけるＶＥＧＦ−Ｂ  ｍＲＮＡの存在が示された。このことは、ＶＥＧＦとＶＥＧＦ−Ｂとは、それらが多く組織において共発現するという事実にも拘わらず、機能的な相違を有する可能性があることを示唆している。遺伝子標的化研究によって、ＶＥＧＦ−Ｂ欠乏が軽い心臓表現型（ｍｉｌｄ ｃａｒｄｉａｃ ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ）と冠状脈管構造障害をもたらすことが示された（ベローモ（Ｂｅｌｌｏｍｏ）他， Ｃｉｒｃ． Ｒｅｓ． ８６：Ｅ２９−３５ （２０００））。
【００１１】
ヒトＶＥＧＦ−Ｂは、細胞レチン酸結合タンパク質タイプ−Ｉ（ＣＲＡＢＰ−Ｉ）と相互作用する可能性のある細胞タンパク質のスクリーニングによる、酵母コ−ハイブリッド相互作用トラップスクリーニング技術を使用して単離された。ヒトとマウスとの両方における、ＶＥＧＦ−Ｂのヌクレオチド及びアミノ酸配列を含む単離と特徴付けとは、ルードヴィッヒ・インスティテュート・フォア・キャンサー・リサーチ及びヘルシンキ大学のＰＣＴ／ＵＳ９６／０２９５７，米国特許第５，８４０，６９３号及び第５，６０７，９１８号、並びにオロフソン（Ｏｌｏｆｓｓｏｎ）他， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ， ＵＳＡ， ９３： ２５７６−２５８１， （１９９６）に詳細に記載されている。国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ９７／１４６９６（ＷＯ９８／０７８３２），米国特許第５，８４０，６９３号及び米国特許第５，６０７，９１８号の全開示を、ここに参考文献として合体させる。
【００１２】
ＶＥＧＦ−Ｂに対するマウスの遺伝子とヒトの遺伝子はほとんど同一であり、共に、約４ｋｂのＤＮＡの長さである。これら遺伝子は、７つのエクソンからなり、それらのエクソン−イントロン構成は、ＶＥＧＦ及びＰｌＧＦ遺伝子のそれと類似している（グリモンド（Ｇｒｉｍｍｏｎｄ）他， Ｇｅｎｏｍｅｓ Ｒｅｓ． ６：１２４−１３１（１９９６）； オロフソン（Ｏｌｏｆｓｓｏｎ）他， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７１：１９３１０−１９３１７ （１９９７）； タウンソン（Ｔｏｗｎｓｏｎ）他， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ． ２２０：９２２−９２８（１９９６））。
【００１３】
ＶＥＧＦＲ−３を発現するようにトランスフェクトされた細胞を使用して、内皮細胞特異性レセプタチロシンキナーゼＶＥＧＦＲ−３（Ｆｌｔ４）のチロシンリン酸化を引き起こす培地の能力をスクリーニングすることによって、ＶＥＧＦ−Ｃは、ＰＣ−３前立腺アデノカルシノーマ・セルライン（ＣＲＬ１４３５）の調整培地から単離された。ＶＥＧＦ−Ｃは、組換えＶＥＧＦＲ−３を用いたアフィニティ・クロマトグラフィを使用して精製され、ＰＣ−３  ｃＤＮＡライブラリからクローニングされた。その単離と特徴付けは、ジョーコブ（Ｊｏｕｋｏｖ）他， ＥＭＢＯ Ｊ．， １５： ２９０−２９８， （１９９６）に詳細に記載されている。
【００１４】
ＶＥＧＦ−Ｄは、ハイブリダイゼーションプローブとして、”Ｓｏａｒｅｓ Ｂｒｅａｓｔ ３ＮｂＨＢｓｔ”と命名されたヒトｃＤＮＡライブラリから得られた発現配列タグでのスクリーニングによって、クロンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）社から市販されているヒト胸部ｃＤＮＡライブラリから単離された（アチェン（Ａｃｈｅｎ）他， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ， ＵＳＡ， ９５： ５４８−５５３， （１９９８））。その単離と特徴付けは、国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ９７／１４６９６ （ＷＯ９８／０７８３２）に詳細に記載されている。ＰＣＴ／ＵＳ９７／１４６９６には、ＶＥＧＦ−Ｄの生物活性フラグメントの単離も記載されている。このフラグメントは、ＶＥＧＦ−Ｄアミノ酸残基９３〜２０１から成る。
【００１５】
ＶＥＧＦ−Ｄ遺伝子は成体ヒトにおいて広く発現するが、もちろん、至るところに発現するものではない。ＶＥＧＦ−Ｄは、心臓と肺と骨格筋とにおいて強く発現する。中間レベルのＶＥＧＦ−Ｄが、脾臓と、卵巣と、小腸と、結腸で発現し、より低いレベルの発現は、腎臓、すい臓、胸腺、前立腺、睾丸で起こる。脳、胎盤、肝臓又は末梢血液白血球由来のＲＮＡからはＶＥＧＦ−Ｄ  ｍＲＮＡは検出されなかった。
【００１６】
ＰｌＧＦは、限定された期間の胎盤ｃＤＮＡライブラリから単離された。その単離と特徴付けは、マグリオーネ（Ｍａｇｌｉｏｎｅ）他， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ， ＵＳＡ， ８８： ９２６７−９２７１， （１９９１）に詳細に記載されている。今のところ、その生物学的機能はよく理解されていない。
【００１７】
ＶＥＧＦ３は、結腸組織由来のｃＤＮＡから単離された。ＶＥＧＦ３は、ＶＥＧＦに対して約３６％の同一性と約６６％の類似性を有すると考えられている。ＶＥＧＦ３をコードする遺伝子の単離方法は明らかでなく、その生物活性の特徴付けは開示されていない。
【００１８】
２つのタンパク質間の類似性は、それらのタンパク質の一方のアミノ酸配列と同類アミノ酸置換とを、第２のタンパク質の配列と比較することによって決定され、これに対して同一性は、同類アミノ酸置換を含まずに決定される。
【００１９】
上述したように、前記ＰＤＧＦ／ＶＥＧＦファミリメンバは、主として、レセプタチロシンキナーゼに結合することによって作用する。一般に、レセプタチロシンキナーゼは糖タンパク質であり、特定の増殖因子（単数又は複数）が結合可能な細胞外ドメインと、通常はそのタンパク質のアルファヘリックス部分である経膜ドメインと、例えば、タンパク質リン酸化によって、レセプタが調節されることが可能な膜近傍ドメインと、レセプタの酵素成分であるチロシンキナーゼドメインと、多くのレセプタにおいて、チロシンキナーゼの基質の認識と結合とに関与するカルボキシル−末端テールとから成る。
【００２０】
２つの異なるサブクラスに属する、５つの内皮細胞特異性レセプタチロシンキナーゼ、すなわち、三つの血管内皮細胞増殖因子レセプタである、ＶＥＧＦＲ−１（Ｆｌｔ−１）、ＶＥＧＦＲ−２（ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１），ＶＥＧＦＲ−３（Ｆｌｔ４）と、そして、Ｔｉｅファミリの２つのレセプタである、Ｔｉｅ及びＴｉｅ−２（Ｔｅｋ）が同定されている。これらのレセプタは、その特異性と親和性において互いに異なる。これらのすべては、シグナル伝達に必要な、内在性のチロシンキナーゼ活性を有する。
【００２１】
ＶＥＧＦに結合することが知られているレセプタチロシンキナーゼは、ＶＥＧＦＲ−１， ＶＥＧＦＲ−２、ＶＥＧＦＲ−３のみである。ＶＥＧＦＲ−１及びＶＥＧＦＲ−２は高い親和性でＶＥＧＦと結合し、ＶＥＧＦ−１は更にＰｌＧＦにも結合する。ＶＥＧＦ−ＢはＶＥＧＦＲ−１に高い親和性で結合するが、ＶＥＧＦＲ−２又は−３には結合しない（オロフソン（Ｏｌｏｆｓｓｏｎ）他， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ９５：１１７０９−１１７１４（１９９８）） 。ＶＥＧＦ−ＣはＶＥＧＦＲ−３のリガンドであることが示されており、それは、更にＶＥＧＦＲ−２を活性化する（ジョーコブ（Ｊｏｕｋｏｖ）他．， Ｔｈｅ ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ， １５： ２９０−２９８， （１９９６））。ＶＥＧＦ−Ｄは、ＶＥＧＦＲ−２とＶＥＧＦＲ−３との両方に結合する（アチェン（Ａｃｈｅｎ）他， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ９５： ５４８−５５３， （１９９８））。Ｔｅｋ／Ｔｉｅ−２のリガンドは、リジェネロン・ファーマシューティカル社（Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ， Ｉｎｃ．）の国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ９５／１２９３５ （ＷＯ９６／１１２６９）に記載されている。Ｔｉｅのリガンドはまだ同定されていない。
【００２２】
最近、新規な１３０〜１３５ｋＤａ  ＶＥＧＦイソ型特異性レセプタが精製され、クローニングされた（ソーカー（Ｓｏｋｅｒ）他， Ｃｅｌｌ， ９２： ７３５−７４５， １９９８）。このＶＥＧＦレセプタは、ヘパリンに対して弱い親和性を示す、エクソン７コード化配列を介してＶＥＧＦ１６５イソ型に特異的に結合することが分かった（ソーカー（Ｓｏｋｅｒ）他， Ｃｅｌｌ， ９２： ７３５−７４５， （１９９８））。驚くべきことに、このレセプタは、初期段階の神経形態形成に関与するレセプタである、ヒトのニューロピリン−１（ＮＰ−１）と同じであることが示された。ＰｌＧＦ−２も、ＮＰ−１と相互作用するようである（ミグダル（Ｍｉｇｄａｌ）他， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ， ２７３： ２２２７２−２２２７８， （１９９８））。
【００２３】
ＶＥＧＦＲ−１，ＶＥＧＦＲ−２及びＶＥＧＦＲ−３は内皮細胞における発現が異なる。一般に、ＶＥＧＦＲ−１とＶＥＧＦＲ−２とは共に、血管内皮中に発現し（オールリッチス（Ｏｅｌｒｉｃｈｓ）他， Ｏｎｃｏｇｅｎｅ， ８： １１−１８， （１９９２）； カイパイネン（Ｋａｉｐａｉｎｅｎ）他， Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ．， １７８： ２０７７−２０８８， （１９９３）； デュモン（Ｄｕｍｏｎｔ）他， Ｄｅｖ． Ｄｙｎ．， ２０３： ８０−９２， （１９９５）； フォン（Ｆｏｎｇ）他， Ｄｅｖ． Ｄｙｎ．， ２０７： １−１０， （１９９６））、ＶＥＧＦＲ−３は、ほとんど、成体組織のリンパ内皮中に発現する（カイパイネン（Ｋａｉｐａｉｎｅｎ）他， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ， ＵＳＡ， ９： ３５６６−３５７０， （１９９５））。ＶＥＧＦＲ−３は、又、腫瘍の周囲の血管系にも発現する。
【００２４】
ＶＥＧＦＲ−１は、主として発達中において内皮細胞に発現するものではあるが、それは、胚形成の初期段階中に造血前駆細胞中にも見出すことができる（フォン（Ｆｏｎｇ）他， Ｎａｔｕｒｅ， ３７６： ６６−７０， （１９９５））。成体において、単球と、マクロファージも、このレセプタを発現する（バーレオン（Ｂａｒｌｅｏｎ）他， Ｂｌｏｏｄ， ８７： ３３３６−３３４３， （１９９５））。胚においては、ＶＥＧＦＲ−１が全部ではないが、大半の脈管で発現する（ブレア（Ｂｒｅｉｅｒ）他， Ｄｅｖ． Ｄｙｎ．， ２０４： ２２８−２３９， （１９９５）； フォン（Ｆｏｎｇ）他， Ｄｅｖ． Ｄｙｎ．， ２０７： １−１０， （１９９６））。
【００２５】
ＶＥＧＦの同定と特徴付け以来、多くの重要な知見が、脈管形成因子の活性と、新規な因子の解明に集中している。初期の知見は、新脈管形成が正常な発達と生理機能とに必要であることを示した。胚形成、損傷治癒、及び黄体形成等のプロセスは、すべて、新脈管形成と脈管形成因子に関連している。例えば損傷治癒中において、ＶＥＧＦ ｍＲＮＡのレベルが増加し、これはＶＥＧＦの発現と治癒プロセスとの間の直接的相関関係を示唆している。又、ＶＥＧＦ調節の欠陥は、損傷治癒障害と関連しているかもしれない（フラン（Ｆｒａｎ）， Ｓ．他， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７０５：１２６０７−１２６１３（１９９５））。
【００２６】
別の重要な知見は、新脈管形成と腫瘍の発達との間の関連に関する。腫瘍の増殖と転移とは、共に、新脈管形成依存プロセスである（フォルクマン，ジェイ（Ｆｏｌｋｍａｎ， Ｊ．） 及び シン，ワイ（Ｓｈｉｎｇ， Ｙ．）， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６７：１０９３１−１０９３４ （１９９２））。例えば、腫瘍細胞が動物に導入されたとき、ＶＥＧＦ ｍＲＮＡの発現パターンは、壊死性の腫瘍増殖領域周辺の細胞中において最も高いレベルを示す。これらの領域内において多くの血管が見出された。これらの領域におけるＶＥＧＦの発現は、酸素付加不足の状態である低酸素血症が壊死性腫瘍中におけるＶＥＧＦの発現と放出をトリガーすることを示唆している。ＶＥＧＦ−Ｂの発現は、又、腫瘍増殖とも直接的に関連付けられている（米国特許第５，８４０，６９３号を参照）。ＶＥＧＦ−Ｂ発現は、腫瘍関連マクロファージと、更に、卵巣上皮腫瘍において特にアップレギュレートされる（ソウター（Ｓｏｗｔｅｒ）他， Ｌａｂ Ｉｎｖｅｓｔ． ７７：６０７−１４， （１９９７））。ＶＥＧＦ−Ｂ ｍＲＮＡは、アデノカルシノーマ、乳がん、リンパ腫、扁平上皮癌、メラノーマ、線維肉腫、及び神経鞘腫を含む、調べられた大半の腫瘍細胞系で検出可能である（サルベン（Ｓａｌｖｅｎ）他， Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ． １５３：１０３−８（１９９８））。
【００２７】
ＶＥＧＦ／ＰＤＧＦファミリのメンバが、バリアント転写物を作り出すことが示された。ＶＥＧＦは、オルタネイティブ・スプライシングにより、異なる転写物を示すことが示された。ヒトのＶＥＧＦ遺伝子は、５種類のｍＲＮＡ種を有し（ニューフェルド（Ｎｅｕｆｅｌｄ）他， ＦＡＳＥＢ Ｊ． １３：９−２２（１９９９））、これによって、その分子質量と生物特性とが異なるタンパク質を作り出す（カルメリート（Ｃａｒｍｅｌｉｅｔ）， Ｐ．， Ｎａｔ． Ｍｅｄ． ６：３８９−３９５ （２０００））。ＶＥＧＦ−Ａ１６５イソ型が、大半の組織における主用な転写物であり、ＶＥＧＦＲ−１及びＶＥＧＦＲ−２への結合に加えて、ニューロピリン−１  レセプタに対する特有の親和性を備えたポリペプチドを作り出す。ＶＥＧＦ１２１とＶＥＧＦ１８９は、正常組織において低レベルで発現する。イソ型特異的標的化実験によって、ＶＥＧＦ１６４とＶＥＧＦ１８６とが、心血管系の出生後の成長と正常機能の維持のためにより重要であり、他方、ＶＥＧＦ１２０は、脈管形成を開始し促進することが示された（カルメリート（Ｃａｒｍｅｌｉｅｔ）他， Ｎａｔ Ｍｅｄ． ５：４９５−５０２（１９９９））。ＶＥＧＦ２０６は、主として、胚組織に発現する（ホック（Ｈｏｕｃｋ）他， Ｍｏｌ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ． ５：１８０６−１４（１９９１））のに対して、ＶＥＧＦ１４５は、腫瘍細胞系にのみ見出すことができる（ポルトラック（Ｐｏｌｔｏｒａｋ）他， Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ． ２７２：７１５１−８（１９９７））。更に、ＶＥＧＦは、又、病理状態においてはイソ型特異的に調節される。肺及び結腸ガンにおいて、ＶＥＧＦ１６５とＶＥＧＦ１２１とがアップレギュレートされ、これに対してＶＥＧＦ１８９は変わらず、このことは、悪性腫瘍におけるＶＥＧＦのイソ型特異的役割を示唆している（チェウン（Ｃｈｅｕｎｇ）他， Ｈｕｍ Ｐａｔｈｏｌ． ２９：９１０−４（１９９８））。
【００２８】
胎盤増殖因子（ＰｌＧＦ）は、三種類のイソ型を有し、それらは、組織及び成長特異的に発現する（マグリオーネ（Ｍａｇｌｉｏｎｅ）他， Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ８：９２５−３１（１９９３）； カオ（Ｃａｏ）他， Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ． ２３５：４９３−８（１９９７））。
【００２９】
現在、ｍＲＮＡのオルタネイティブ・スプライシングによって生成されたＶＥＧＦ−Ｂの２つのイソ型が認識されている（グリモンド（Ｇｒｉｍｍｏｎｄ）他， Ｇｅｎｏｍａ Ｒｅｓ． ６：１２４−１３１（１９９６）； オロフソン（Ｏｌｏｆｓｓｏｎ）他， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７１：１９３１０−１９３１７（１９９６）； タウンソン（Ｔｏｗｎｓｏｎ）他， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ． ２２０：９２２−９２８（１９９６））。それらは、細胞会合型の１６７のアミノ酸残基（ＶＥＧＦ−Ｂ１６７）と、分泌型の１８６のアミノ酸残基（ＶＥＧＦ−Ｂ１８６）である。これらイソ型は、シグナル配列を除いて１１５のアミノ酸残基の同一のＮ末端ドメインを有し、他方、Ｃ末端ドメインは異なっている。前記共通のＮ末端ドメインは、エクソン１〜５によってコード化される。残る３つのエクソンの異なる使用によって、前記２つのスプライス・イソ型が作り出される。エクソン６におけるオルタネイティブ・スプライス−アクセプタ部位を使用した、１０１ｂｐの挿入によって、ＶＥＧＦ−Ｂ１６７ ｃＤＮＡのフレームシフトとコード化領域の停止が導入される。このようにして、前記２つのＶＥＧＦ−Ｂイソ型は異なるＣ末端ドメインを有する。
【００３０】
ＶＥＧＦ−Ｂの前記２つのスプライス・イソ型の異なるＣ末端ドメインは、それらの生化学的及び細胞生物学的特性に影響を与える。ＶＥＧＦ−Ｂ１６７のＣ末端ドメインは、複数の保存システイン残基と塩基性アミノ酸残基のストレッチとにより、ＶＥＧＦの対応する領域に構造的に関係している。従って、このドメインは、高度に親水性かつ塩基性であり、従って、ＶＥＧＦ−Ｂ１６７は、その産生細胞がヘパリン又は高塩濃度で処理されない限り、分泌時に細胞会合状態に留まるであろう。前記ＶＥＧＦ−Ｂ１６７が結合した細胞会合分子は、恐らく、細胞表面又は細胞周囲ヘパリン硫酸塩プロテオグリカンである。恐らく、このイソ型の細胞会合は、その固有の塩基性Ｃ末端ドメインを介して起こるものである。
【００３１】
ＶＥＧＦ−Ｂ１８６のＣ末端ドメインは、データベース中の公知のアミノ酸配列と有意な類似性を有さない。ＶＥＧＦ−Ｂ１８６のＣ末端ドメインの疎水性は、ＶＥＧＦ−Ｂ１６７の親水性で塩基性のＣ末端ドメインと対照的である。これは、ＶＥＧＦ−Ｂ１８６はその分泌時に細胞会合状態に留まらないという観察によって支持される。最近の証拠は、このイソ型が、タンパク質分解的に処理され、これによって、このタンパク質の生物特性が調節されることを示している（オロフソン（Ｏｌｏｆｓｓｏｎ）他， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ９５：１１７０９−１１７１４（１９９８））。
【００３２】
ヒト及びマウスのＶＥＧＦ−Ｂイソ型の単離は、ルードヴィッヒ・インスティテュート・フォア・キャンサー・リサーチとヘルシンキ大学とのＰＣＴ／ＵＳ９６／０２９５７，米国特許第５，８４０，６９３号及び第５，６０７，９１８号と、オロフソン（Ｏｌｏｆｓｓｏｎ）他，， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９３：２５７６−２５８１（１９９６） とに詳細に記載されている。
【００３３】
ＶＥＧＦ−Ｂの両イソ型は、又、ＶＥＧＦとヘテロダイマを形成し、このことは、ＰＤＧＦ−様タンパク質の分子間及び分子内ジスルフィド結合に前記８つのシステイン残基の保存が関与しているという観察と一致している。更に、多くの組織においてＶＥＧＦ−ＢとＶＥＧＦとが共発現するということは、ＶＥＧＦ−Ｂ−ＶＥＧＦヘテロダイマが自然発生することを示唆している。ＶＥＧＦ−Ｂ１６７とＶＥＧＦとのヘテロダイマは細胞会合状態に留まる。これに対して、ＶＥＧＦ−Ｂ１８６とＶＥＧＦとのヘテロダイマは培地中において細胞から自由に分泌される。ＶＥＧＦは、また、ＰｌＧＦともヘテロダイマを形成する（ディサルボ（ＤｉＳａｌｖｏ）他， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７０： ７７１７−７７２３ （１９９５））。このファミリの増殖因子のメンバ間のヘテロダイマ複合体の生産によって、脈管形成又は調節分子の多種多様なアレイのためのベースを提供することが可能であるかもしれない。
【００３４】
ＶＥＧＦ−Ｂ発現調節に関する従来の研究においては、前記２つのイソ型は別々に調べられていなかった。それらがＲＴ−ＰＣＲによって別々に調べられたケースにおいては、それらは、その転写レベルを正確に反映していない。従来のデータは、種々の腫瘍及び細胞系において高いレベルのＶＥＧＦ−Ｂ発現を示している（ソウター（Ｓｏｗｔｅｒ）他， Ｌａｂ Ｉｎｖｅｓｔ． ７７：６０７−１４ ， （１９９７）； サルベン（Ｓａｌｖｅｎ）他， Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ． １５３： １０３−８（１９９８）； 及びエンホルム（Ｅｎｈｏｌｍ）他， Ｏｎｃｏｇｅｎｅ １４： ２４７５−８３（１９９７））。しかしながら、大半の研究は、前記２つのイソ型間を識別することが出来ない免疫組織化学に基づくものである。従って、ＶＥＧＦ−Ｂ１６７とＶＥＧＦ−Ｂ１８６の発現パターンと調節は不明なままである。ＶＥＧＦ−Ｂ１６７とＶＥＧＦ−Ｂ１８６の発現パターンと調節の研究は、生理学的状態と病理状態との両方においてＶＥＧＦ−Ｂが果たす役割を更に理解するために特に重要であろう。
【００３５】
以上述べた全ての参考文献をここに参考文献として合体させる。
【００３６】
発明の要旨
本発明は、ＶＥＧＦ−Ｂ１８６の発現を検出するか、もしくは、ＶＥＧＦ−Ｂ１８６の発現の増加を測定することによって、動物の腫瘍細胞の潜在的存在を検出するための方法とキットに関する。
【００３７】
その態様の１つにおいて、本発明は、腫瘍を有することが疑われる動物の腫瘍細胞の存在を検出する方法を提供する。この方法は、前記動物からサンプルを得る工程と、前記サンプルからのＶＥＧＦ−Ｂ１８６の発現を検出する工程とを有し、ここで、ＶＥＧＦ−Ｂ１８６の発現の検出は前記腫瘍細胞の存在を示す。
【００３８】
あるいは、前記方法は、前記動物からサンプルを得る工程と、前記サンプルからのＶＥＧＦ−Ｂ１８６の発現を検出する工程と、そして、前記サンプルからの前記発現レベルをこの特定のサンプルによって正常に発現するＶＥＧＦ−Ｂ１８６の発現レベルと比較する工程とを有し、これによって、前記正常発現を超えるＶＥＧＦ−Ｂ１８６の発現の増加の検出は、前記腫瘍細胞の存在を示す。
【００３９】
前記サンプルは、血漿、血清又は組織サンプルとすることができる。
【００４０】
ＶＥＧＦ−Ｂ１８６は、イムノアッセイ、例えば、放射性又は酵素−結合され、検出可能な標識によって標識化されたＶＥＧＦ−Ｂ１８６に対するモノクローナル抗体を使用して検出することができる。これらのアッセイにおいては、可溶性又は固定化されたＶＥＧＦＲ−１および／又は特異的抗体の使用を含むことができる。前記抗体は、適当な、画像化用の、超磁性、常磁性、高電子密度、エコジェニック（ｅｃｏｇｅｎｉｃ）又は放射性又は非放射性剤に結合させることができる。放射性剤／標識の具体例としては、１２５Ｉ又は３２Ｐ等の放射性原子又は基がある。非放射性剤／標識の具体例としては、ホースラディシュペルオキシダーゼ等の酵素標識、あるいは、フルオレセイン−５−イソチオシアネート（ＦＩＴＣ）等の螢光測定標識がある。標識化は、直接的又は間接的、共有結合性又は非共有結合性のものとすることができる。
【００４１】
ＶＥＧＦ−Ｂ１８６の発現レベルは、ＲＮＡＳＥ保護分析などの方法によって測定することができる。
【００４２】
尚、前記サンプルからの発現レベルと、その特定のサンプルによって正常に発現するＶＥＧＦ−Ｂ１８６の発現レベルとの比較とは、正常発現を有するそのサンプルが、腫瘍を有することが疑われる動物から得られるものと、例えば、肺組織等の同じタイプで、例えば、ヒトなどの同じ種のサンプルであるということを意味する。
【００４３】
別の態様において、本発明は、動物における腫瘍細胞の存在を検出するためのキットを提供する。このキットは、サンプルを受け入れるように構成された容器と、前記サンプルからＶＥＧＦ−Ｂ１８６の発現を検出するための手段とを有し、これによって、ＶＥＧＦ−Ｂ１８６の発現は腫瘍の増殖を示す。
【００４４】
あるいは、前記キットは、サンプルを受け入れるように構成された容器と、前記サンプルからＶＥＧＦ−Ｂ１８６の発現を検出するための手段と、そして、この特定のサンプルからのＶＥＧＦ−Ｂ１８６の正常発現レベルを測定するための手段とを有し、これによって、前記正常発現を超えるＶＥＧＦ−Ｂ１８６の発現の増加の測定は、前記腫瘍の増殖を示す。
【００４５】
前記検出手段は、好ましくは、上述したような検出可能標識によって標識化されたＶＥＧＦ−Ｂ１８６に対するモノクローナル抗体である。
【００４６】
尚、「この特定のサンプルからのＶＥＧＦ−Ｂ１８６の正常発現レベル」という文言は、その発現レベルが、腫瘍を有することが疑われるが、但しその、特定のサンプルにおいては腫瘍の増殖を持たない動物から得られたものと、例えば、肺組織等の同じタイプで、例えば、ヒトなどの同じ種のサンプルから測定される、又は、測定された、ということを意味する。
【００４７】
前記測定手段は、特定のポリペプチドの発現レベルを測定するために使用可能なＲＮＡＳＥ保護分析などのいかなる方法であってもよく、あるいは、上に定義したこの「特定のサンプル」からのＶＥＧＦ−Ｂ１８６の前記正常発現レベルを提供するチャート又はリストであってもよい。
【００４８】
更に別の態様において、本発明は、抗腫瘍剤のスクリーニングの方法を提供する。この方法は、腫瘍細胞に対してテスト剤を適用する工程と、そして、適当な手段によって、前記腫瘍細胞中のＶＥＧＦ−Ｂ１８６の発現の減少を検出する工程とを有する。
【００４９】
好適実施例の詳細説明
例１：  ＶＥＧＦ−Ｂ１６７は成体と胚との両方において発現する主要なイソ型である
定量ＲＮＡＳＥ保護分析を使用して、前記２つのＶＥＧＦ−Ｂイソ型の分布と発現レベルを測定した。約３８０ｂｐのマウスＶＥＧＦ−Ｂ ｃＤＮＡフラグメントを、エクソン３， ４， ５， ６Ａ， ６Ｂ（ボックスがそれぞれのエクソンを示す図１を参照）をカバーするマウスＶＥＧＦ−Ｂ遺伝子（ＭＭＵ５２８２０）のＳｐｅ Ｉ及びＰｓｔ Ｉ消化によって作り出した。このフラグメントをクローニングし、テンプレートとして使用してＲＮＡプローブを作成した。製造業者のプロトコルに従って、ＲＮＡポリメラーゼ（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ））及び３２Ｐ−ＵＴＰ（アマシャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ））を使用してリボプローブを作成した。このプローブを使用して、エクソン６Ａの欠如により、前記ＶＥＧＦ−Ｂ１８６から前記ＶＥＧＦ−Ｂ１６７イソ型を識別することができる。ＲＮＡＳＥ保護分析（ＲＰＡ， アンビオン（Ａｍｂｉｏｎ））を使用して、種々の組織における種々の遺伝子の発現レベルを定量化した。簡単に説明すると、３０μｇの細胞全ＲＮＡを４５℃で前記リボプローブにハイブリダイズさせ、その後ＲＮＡＳＥ消化を行った。前記細胞全ＲＮＡは、コムチンスキ（Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ）及びサッチ（Ｓａｃｃｈｉ）， Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ． １６２：１５６−９（１９８７）に記載されているグアニジウムチオシアネート／酸フェノール方法を使用して作成し、−８０℃で保存した。前記消化生成物を、６％ポリアクリルアミドゲル上で分離し、シグナルを、蛍光イメージャを使用して測量した。図２に見られるように、ＲＮＡＳＥ保護分析は、３０μｇ細胞全ＲＮＡを使用したとき、２１０及び７０ｂｐフラグメントの存在と、ＶＥＧＦ−Ｂ１８６から派生する３８６ｂｐフラグメントの不在とによって示されるように、ＶＥＧＦ−Ｂ１６７イソ型のみが検出可能であることを示した。このことは、ＶＥＧＦ−Ｂ１６７イソ型が高レベルで発現するのに対して、ＶＥＧＦ−Ｂ１８６イソ型はあったとしても非常に低いレベルでしか発現しないことを示している。ＶＥＧＦ−Ｂ１６７の転写レベルを、内部対照としてベータ−アクチン（アンビオン（Ａｍｂｉｏｎ））を使用し、蛍光イメージャによって定量した。
【００５０】
図３に、３０μｇの細胞全ＲＮＡを使用した種々の組織由来のＶＥＧＦ−Ｂ１６７の測定された発現レベルをリストする表を提供する。最も高レベルの発現は正常成体マウス組織の心臓、骨格筋、及び横隔膜にあり、これに対して、大半の他の組織においては低い発現レベルをみることができる。すべての値は、前記内部対照であるベータ−アクチンに対して正規化された任意数である。
【００５１】
ＶＥＧＦ−Ｂのこの発現パターンが発達特異的であるか否かを確認するために、異なる発達段階の胚と他の胚組織とから抽出されたＲＮＡを使用して同じ実験を行った。図４は、これらの組織においても、ＶＥＧＦ−Ｂ１６７イソ型が優勢な転写物であることを示している。２１０及び７０ｂｐフラグメントの存在と、３８０ｂｐフラグメントの不在とによって示されるように、ＶＥＧＦ−Ｂ１６７が、胚及びその他の組織において発現する主要なイソ型である。このアッセイでは、３０μｇの細胞全ＲＮＡを使用した。正常成体組織と胚マウス組織との両方を、収集後すぐに凍結し、使用するまで−８０℃で保存した。
【００５２】
例２：  ＶＥＧＦ−Ｂ１８６は、組織特異的に低レベルで発現する
３０μｇの細胞全ＲＮＡを使用してＶＥＧＦ−Ｂ１８６を検出することができなかったので、成体マウス組織のＶＥＧＦ−Ｂ１８６の発現を調べるために、例１と同じプローブ及び同じ方法を使用したＲＰＡアッセイにおいて１００μｇのＲＮＡを使用した。図５は、１００μｇのＲＮＡが使用されたとき、テストされた組織の一部において、ＶＥＧＦ−Ｂ１８６から派生した３８０ｂｐのフラグメントが弱く検出可能であることを示している。前記３８０ｂｐフラグメントは、内部対照としてベータ−アクチンを使用した蛍光イメージャによって定量した。ＶＥＧＦ−Ｂ１８６発現の結果も図３に提供されている。ＶＥＧＦ−Ｂ１８６は、心臓、骨格筋、横隔膜、結腸、腎臓、脳及び肺において発現し、その他の組織においては検出不能である。尚、ＶＥＧＦ−Ｂ１６７イソ型は、調べられた組織の大半において発現するのに対して、ＶＥＧＦ−Ｂ１８６は限られた数の組織に存在することは注目すべきである。従って、ＶＥＧＦ−Ｂ１８６イソ型は、組織特異的に、成体マウス組織において低レベルで発現する。これらの結果は、これらＶＥＧＦ−Ｂの２つのイソ型の異なる遺伝子制御、そして恐らくは異なる生物機能が存在するということを示している。ＶＥＧＦ−Ｂの前記２つのイソ型の遺伝子制御は、発達特異的というよりも、組織特異的である。
【００５３】
前記２つのイソ型の相対的発現レベルを比較するために、ＶＥＧＦ−Ｂ１８６／ＶＥＧＦ−Ｂ１６７の比率を、前記３８０ｐｂバンドと２１０ｂｐバンドの強度を比較することによって計算した。この比較を図３に示す。データは、心臓、腎臓及び結腸に最高比率が見られ、それが約２５％であることを示している。しかしながら、導入された放射性に比例する、前記２つの保護フラグメントの長さの差を考慮に入れると、ＶＥＧＦ−Ｂ１８６の発現レベルは、その最も高レベル発現の組織においてもＶＥＧＦ−Ｂ１６７のそれの約１４％であり、他の器官においてはそれよりも更に低い。
【００５４】
例３：  ＶＥＧＦ−Ｂ１８６は、マウス腫瘍細胞系においてアップレギュレートされる
腫瘍細胞系におけるＶＥＧＦ−Ｂの前記２つのイソ型の発現パターンを調べるために、線維肉腫（Ｔ２４１）、メラノーマ（Ｂ１６）、ルイス肺癌（ＬＬＣ）、及びラット神経膠腫（ＢＴ４Ｃ）を含む、種々のマウス腫瘍細胞系から抽出された細胞全ＲＮＡ（各３０μｇ）をこの研究で使用した。ＲＰＡアッセイを、例１と同じ方法で行った。驚くべきことに、テストしたすべての細胞系でＶＥＧＦ−Ｂ１８６イソ型が高レベルで発現し、ＶＥＧＦ−Ｂ１８６イソ型のアップレギュレートを示している（例６を参照）。定量化のための内部対照としてベータ−アクチンを使用した。ＶＥＧＦ−Ｂ１８６／ＶＥＧＦ−Ｂ１６７の相対比率は５０％以上であり、これは正常組織において観察されるものよりも遥かに高い。
【００５５】
例４：  ＶＥＧＦ−Ｂ１８６は、ヒトメラノーマ細胞系で高レベルに発現する
ヒト腫瘍細胞系におけるＶＥＧＦ−Ｂの前記２つのイソ型の発現を見るために、約４５０ｂｐのヒトＶＥＧＦ−Ｂ（Ｕ５２８１９）ｃＤＮＡフラグメントを、Ｓａｃ Ｉ消化によって作成した。このフラグメントをクローニングし、テンプレートとして使用して、例１と同じ研究方法を使用したＲＮＡＳＥ保護分析のＲＮＡプローブを作成した。３０μｇの細胞全ＲＮＡを使用して、２２種類の異なるヒトメラノーマ細胞系を調べた。グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）を定量化のための内部対照として使用した。テストされた細胞系の大半において、ＶＥＧＦ−Ｂ１８６とＶＥＧＦ−Ｂ１６７との両方が高レベルで発現し、平均４２％の１８６／１６７比を示すことを、図７の上パネルが示している（図７の比較表を参照）。総ＶＥＧＦ−Ｂ発現レベルを、両イソ型を組み合わせ、前記内部対照であるＧＡＰＤＨに対して正規化することによって定量化した。前記すべての細胞系においてＶＥＧＦ−Ｂの両方のイソ型が存在し、例３，６，１０及び２２においてよりレベルが高い。比較として、前記ヒトＶＥＧＦ１６５イソ型（Ｘ６２５６８）の約６５０ｂｐのｃＤＮＡフラグメントを使用して、ＶＥＧＦ−Ａ発現を調べた。このフラグメントを、クローニングし、テンプレートとして使用してＲＮＡプローブを作成した。図８に示されているように、ＶＥＧＦ−Ａ１６５イソ型は、２つの保護されたバンドとして、完全に保護されたＶＥＧＦ−Ａ１６５イソ型、そして他のイソ型由来のエクソン１〜５領域を提供するものと予想される。図８のボックスは、ＶＥＧＦ−Ａの各エクソンである。図７の下パネルに見られるように、比較的安定的であるＶＥＧＦ−Ｂのそれと対照的に、ＶＥＧＦ−Ａは劇的に異なる転写レベルで、すべての細胞系において発現する。ＶＥＧＦ−Ａは、サンプル５，７，１１，１６，２０において高レベルで発現するのに対して、ＶＥＧＦ−Ｂ発現レベルは前記平均値以下である（図７の比較表を参照）。このＶＥＧＦ−ＡとＶＥＧＦ−Ｂとの相反的発現レベルは、互いに対する補償的役割を示しているかもしれない。
【００５６】
例５： ヒトの良性及び悪性のクロム親和性細胞腫におけるＶＥＧＦ−ＢとＶＥＧＦ−Ａの発現
ＶＥＧＦ−ＢとＶＥＧＦ−Ａのイソ型特異的発現を、例１及び４に記載したものと同じ方法を使用して、ヒトの良性及び悪性のクロム親和性細胞腫において調べた。図９の上パネルは、ＶＥＧＦ−Ｂ１８６が、約４９％の平均ＶＥＧＦ−Ｂ１８６／ ＶＥＧＦ−Ｂ１６７比で、類似の高いレベルで、良性腫瘍と悪性腫瘍との両方において高レベルで発現していることを図示している（図９の比較表を参照。）。総ＶＥＧＦ−Ｂ発現レベルは、良性サンプルと悪性サンプルとにおいて類似している。このことは、悪性腫瘍の発達中におけるＶＥＧＦ−Ｂ１８６の前提的役割を示しているのかもしれない。図９の下パネルは、ＶＥＧＦ−Ａが類似のレベルで両グループにおいて発現することを図示している。
【００５７】
例６：  ＶＥＧＦ−Ｂタンパク質の両イソ型がＢ１６メラノーマ細胞において発現する
腫瘍細胞におけるＶＥＧＦ−Ｂのタンパク質合成を確認するために、Ｂ１６マウスメラノーマ細胞に対して間接的免疫螢光法顕微鏡検査を行った。Ｂ１６マウスメラノーマ細胞は、間接的免疫螢光法顕微鏡検査の１日前に、各ウェルに対して１００，０００細胞の密度で、殺菌されたカバースリップ上の６−ウェルディシュに播種された。ＶＥＧＦ−Ｂの位置確認を、アンダーソン（Ａｎｄｅｒｓｓｏｎ）他， Ｊ Ｖｉｒｏｌ．， ７１：４７１７−２７ （１９９７）に記載のように行った。ＶＥＧＦ−Ｂ１６７とＶＥＧＦ−Ｂ１８６の異なるＣ末端に向けられたイソ型特異性抗体を使用した。これらＶＥＧＦ−Ｂ１６７及びＶＥＧＦ−Ｂ１８６特異性抗体を、２０ｍｇ／ｍｌの濃度に希釈し、他方、小胞体（ＥＲ）特異性マーカであるカルネキシン（サンタ・クルス・バイオテクノロジ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ））を１：５０の希釈で使用した。ウサギＩｇは、フルオレセイン  イソチオシアネート（ＦＩＴＣ）−結合抗−ウサギＩｇＧ抗体によって可視化され、これは緑色の染色として見える。ヤギＩｇは、テトラメチル  イソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）−結合抗−ヤギＩｇＧ抗体によって可視化され、これは赤色の染色として見える。免疫螢光を、Ｚｅｉｓｓ Ａｘｉｏｐｈｏｔ蛍光顕微鏡を使用して検出した。
【００５８】
ＶＥＧＦ−Ｂ１６７及びＶＥＧＦ−Ｂ１８６特異性抗体は以下のようにして作成した。それぞれＶＥＧＦ−Ｂ１６７及びＶＥＧＦ−Ｂ１８６のＣ末端をコードするエクソン６Ｂ又はエクソン６Ａ−ＢのＰＣＲフラグメントを作成した。ＶＥＧＦ−Ｂ１６７に対して、センスプライマ５’ＡＣＧＴＡＧＡＴＣＴＡＧＣＣＣＣＡＧＧＡＴＣＣＴＣ（配列識別番号：１）とアンチセンスプライマ５’ＡＣＧＴＧＡＡＴＴＣＴＣＡＧＣＣＣＣＧＣＣＣＴＴＧＧＣＡ（配列識別番号：２）を使用した。ＶＥＧＦ−Ｂ１８６に対しては、センスプライマ５’ＡＣＧＴＡＧＡＴＣＴＡＧＧＧＴＴＧＣＣＡＴＡＣＣＣ（配列識別番号：３）とアンチセンスプライマ５’ＡＣＧＴＧＡＡＴＴＣＴＣＡＧＴＴＧＡＣＧＧＣＧＣＴＧＧＧＴ（配列識別番号：４）を使用した。前記両センスプライマは、Ｂｇｌ ＩＩ制限部位を含み、前記両アンチセンスプライマはクローニングのためのＥｃｏ ＲＩ部位を含んでいた。前記フラグメントを、ｐＧＥＸ−２Ｔベクタ（ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ））にクローニングした。ＧＳＴ−融合タンパク質を、製造業者（ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ））の推奨に従って作成した。精製タンパク質を使用して、アーセ（Ａａｓｅ）他， Ｄｅｖ Ｄｙｎ．， ２１５：１２−２５（１９９９）に記載されているように、ウサギを免疫した。ＶＥＧＦ−Ｂ１６７抗体を、前記ＧＳＴ融合タンパク質に対して親和性精製し、ＶＥＧＦ−Ｂ１８６抗体をバキュロウイルス由来タンパク質に対して親和性精製した。親和性精製されたＶＥＧＦ−Ｂ抗体の特異性を、アーセ（Ａａｓｅ）他， Ｄｅｖ Ｄｙｎ．， ２１５：１２−２５（１９９９）に記載されているように、バキュロウイルス−感染Ｓｆ９細胞によって生産され、１２．５％ ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離された還元ＶＥＧＦ−Ｂ１６７及びＶＥＧＦ−Ｂ１８６タンパク質を使用した免疫ブロッティングによってテストした。図１０は、前記ＶＥＧＦ−Ｂ１６７及びＶＥＧＦ−Ｂ１８６特異性抗体がそのそれぞれのイソ型とのみ反応することを示している。
【００５９】
図１１Ａ〜１１Ｆは、ｍＶＥＧＦ−Ｂ及びカルネキシンの二重免疫螢光染色の間接的免疫蛍光法顕微鏡検査の結果を示している。図１１Ａと１１Ｄは、前記Ｂ１６細胞における両イソ型の強い染色を示している。図１１Ｂと１１Ｅは、ＥＲ特異性マーカであるカルネキシンの染色を示している。図１１Ｃと１１Ｆは、ＶＥＧＦ−Ｂの発現がカルネキシンと共局在化することを示している。従って、これは、ＶＥＧＦ−Ｂの両イソ型がＢ１６メラノーマ細胞において発現することを示している。
【００６０】
これらの結果を総合すると、正常組織におけるＶＥＧＦ−Ｂ１６７の高い発現レベルと腫瘍細胞系におけるＶＥＧＦ−Ｂ１８６イソ型のアップレギュレートとに鑑みて、腫瘍細胞系における、ＶＥＧＦ−Ｂ１６７の維持的役割と、ＶＥＧＦ−Ｂ１８６の潜在的な成長促進的役割が示される。
【００６１】
以上の説明及び例は、本発明を単に例示する目的で記載されたものであって、限定的であることを意図されるものではない。当業者は、本発明の精神及び本質を取り入れたここに開示された実施例の改変に想到するであろから、本発明は、添付の請求項の範囲内のすべて及びそれらの均等物を含むものと解釈されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は、ＲＮＡＳＥ保護分析に使用されるマウスＶＥＧＦ−Ｂの２つのイソ型のためのＲＮＡプローブの略図である。
【図２】
図２は、３０μｇの細胞全ＲＮＡを使用して前記２つのマウスＶＥＧＦ−Ｂイソ型の分布と発現レベルを測定するための前記ＲＮＡＳＥ保護分析の結果を図示している。
【図３】
図３は、それぞれ、３０μｇと１００μｇの細胞全ＲＮＡを使用した、種々の組織からのマウスＶＥＧＦ−Ｂ１６７及びマウスＶＥＧＦ−Ｂ１８６の測定発現レベルと、更に、それら種々の組織についてＶＥＧＦ−Ｂ１６７発現レベルに対するＶＥＧＦ−Ｂ１８６発現レベルの比率とをリストする表を提供している。
【図４】
図４は、異なる発達段階の胚及び他の胚組織から抽出された３０μｇの細胞全ＲＮＡを使用して前記２つのマウスＶＥＧＦ−Ｂイソ型の発現レベルを測定するためのＲＮＡＳＥ保護分析の結果を図示している。
【図５】
図５は、１００μｇの細胞全ＲＮＡを使用して前記２つのマウスＶＥＧＦ−Ｂイソ型の分布と発現レベルを測定するためのＲＮＡＳＥ保護分析の結果を図示している。
【図６】
図６は、３０μｇの細胞全ＲＮＡを使用してマウス腫瘍細胞系の前記２つのマウスＶＥＧＦ−Ｂイソ型の発現レベルを測定するためのＲＮＡＳＥ保護分析の結果を図示している。
【図７】
図７は、３０μｇの細胞全ＲＮＡを使用してヒト腫瘍細胞系の前記２つのヒトＶＥＧＦ−Ｂイソ型の発現レベルを測定するためのＲＮＡＳＥ保護分析の結果を図示している。
【図８】
図８は、前記ＲＮＡＳＥ保護分析に使用されたヒトＶＥＧＦのイソ型のためのＲＮＡプローブの略図である。
【図９】
図９は、ヒトの良性及び悪性のクロム親和性細胞腫の２つのヒトＶＥＧＦ−Ｂイソ型とＶＥＧＦ−Ａイソ型の発現レベルを測定するためのＲＮＡＳＥ保護分析の結果を図示している。
【図１０】
図１０は、そのそれぞれのイソ型とのＶＥＧＦ−Ｂ１６７及びＶＥＧＦ−Ｂ１８６特異性抗体の結合を図示している。
【図１１】
図１１Ａ〜１１Ｆは、Ｂ１６マウスメラノーマ細胞のＶＥＧＦ−Ｂのタンパク質合成を確認するための、ｍＶＥＧＦ−Ｂ及びカルネキシンの間接的免疫螢光法顕微鏡検査の結果を図示している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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