(57)【要約】本発明は、線維症の防止および創傷治癒の改善のためのＳｍａｄ３の阻害に関する。
2004510696.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
創傷治癒の治療用薬剤の調製のためのＳｍａｄ３阻害剤の使用。
【請求項２】
線維症の予防用薬剤の調製のためのＳｍａｄ阻害剤の使用
【請求項３】
創傷治癒の治療方法であって、
ａ）Ｓｍａｄ３阻害剤を、それを必要とする患者に投与するステップ、および
ｂ）創傷治癒の改善を測定するステップ
を含む方法。
【請求項４】
創傷治癒の治療方法であって、
ａ）創傷治癒の改善を必要とする患者を識別するステップ、および
ｂ）Ｓｍａｄ３阻害剤を、それを必要とする前記患者に投与するステップ
を含む方法。
【請求項５】
線維症の防止方法であって、
ａ）Ｓｍａｄ３阻害剤を、それを必要とする患者に投与するステップ、および
ｂ）線維症に対する防御を測定するステップ
を含む方法。
【請求項６】
線維症の防止方法であって、
ａ）線維症に対する防御を必要とする患者を識別するステップ、および
ｂ）Ｓｍａｄ３阻害剤を、それを必要とする前記患者に投与するステップ
を含む方法。
【請求項７】
創傷治癒を改善するのに使用され得る化合物を識別する方法であって、
ａ）試験Ｓｍａｄ３阻害剤を、被験体に投与するステップ、および
ｂ）創傷治癒に対する影響を測定するステップ
を含む方法であり、化合物は、創傷治癒の改善に基づいて候補物として選択される方法。
【請求項８】
線維症に対して防御するのに使用され得る化合物を識別する方法であって、
ａ）試験Ｓｍａｄ３阻害剤を、被験体に投与するステップ、および
ｂ）線維症に対する影響を測定するステップ
を含む方法であって、化合物は、線維症に対する防御に基づいて候補物として選択される方法。
【請求項９】
医薬品の製造方法であって、請求項７により識別される化合物を薬学的担体と組み合わせるステップを含む方法。
【請求項１０】
医薬品の製造方法であって、請求項８により識別される化合物を薬学的担体と組み合わせるステップを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
［発明の背景］
発明の分野
本発明は、線維症の防止および創傷治癒の改善のためのＳｍａｄ３の阻害に関する。
【０００２】
関連技術の説明
Ｓｍａｄ３およびその密接に関連するホモログ（ｈｏｍｏｌｏｇｕｅ）であるＳｍａｄ２の両方は、ＴＧＦ−β機能の細胞内媒介物であり、核転写活性化因子として作用する（Ｍａｓｓａｇｕｅ， Ｊ． ＴＧＦ−ｂｅｔａ ｓｉｇｎａｌ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ． Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ６７， ７５３−７９１ （１９９８））；（Ｄｅｒｙｎｃｋ， Ｒ．， Ｚｈａｎｇ Ｙ． ＆ Ｆｅｎｇ， Ｘ．Ｈ． Ｓｍａｄｓ： ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ａｃｔｉｖａｔｏｒｓ ｏｆ ＴＧＦ−ｂｅｔａ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ． Ｃｅｌｌ ９５， ７３７−７４０ （１９９８））。Ｓｍａｄ２およびＳｍａｄ３は、ＴＧＦ−β１、２、３およびアクチビンからの細胞内シグナル伝達を媒介し、その各々が、皮膚創傷治癒に極めて重要な細胞増殖、分化および遊走に、重要な因子として関与してきた（Ｒｏｂｅｒｔｓ， Ａ．Ｂ． ＴＧＦ−ｂｅｔａ： ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ ｅｆｆｉｃａｃｙ ｉｎ ａｎｉｍａｌ ｍｏｄｅｌｓ ｏｆ ｗｏｕｎｄ ｈｅａｌｉｎｇ． Ｗｏｕｎｄ Ｒｅｐａｉｒ Ｒｅｇｅｎ． ３， ４０８−４１８ （１９９５））；（Ｏ’Ｋａｎｅ， Ｓ． ＆ Ｆｅｒｇｕｓｏｎ， Ｍ．Ｗ．Ｊ． ＴＧＦ−ｂｅｔａ ｓ ａｎｄ ｗｏｕｎｄ ｈｅａｌｉｎｇ． Ｉｎｔ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． ２９， ６３−７８ （１９９７））。Ｓｍａｄ３がヌルのマウス（Ｓｍａｄ３ｅｘ８／ｅｘ８マウス）は、胚形成を生き抜けないＳｍａｄ２ヌルマウスとは異なり、成体へと生き抜く（Ｙａｎｇ， Ｘ．ら Ｔａｒｇｅｔｅｄ ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ ｏｆ ＳＭＡＤ３ ｒｅｓｕｌｔｓ ｉｎ ｉｍｐａｉｒｅｄ ｍｕｃｏｓａｌ ｉｍｍｕｎｉｔｙ ａｎｄ ｄｉｍｉｎｉｓｈｉｅｄ Ｔ ｃｅｌｌ ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅｎｅｓｓ ｔｏ ＴＧＦ−ｂｅｔａ． ＥＭＢＯ Ｊ． １８８， １２８０−１２９１ （１９９９））；（Ｄａｔｔｏ， Ｍ． Ｂ．ら Ｔａｒｇｅｔｅｄ ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｍａｄ３ ｒｅｖｅａｌｓ ａｎ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｒｏｌｅ ｉｎ ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｂｅｔａ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｓｉｇｎａｌ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ． Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． １９， ２４９５−２５０４ （１９９９））；（Ｚｈｕ， Ｙ．， Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ， Ｊ．Ａ．， Ｐａｒａｄａ， Ｌ．Ｆ．， ＆ Ｇｒａｆｆ， Ｊ．Ｍ． Ｓｍａｄ３ ｍｕｔａｎｔ ｍｉｃｅ ｄｅｖｅｌｏｐ ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ ｃａｎｃｅｒ）． Ｃｅｌｌ １８， ７０３−７１４ （１９９８））；（Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ， Ｍ．， Ｙａｎｇ， Ｘ．， Ｌｉ， Ｃ．， Ｘｕ， Ｘ．， ＆ Ｄｅｎｇ， Ｃ． Ｆａｉｌｕｒｅ ｏｆ ｅｘｔｒａｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ａｎｄ ｍｅｓｏｄｅｒｍ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎ ｅｍｂｒｙｏｓ ｌａｃｋｉｎｇ ｔｈｅ ｔｕｍｏｒ ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ Ｓｍａｄ２． Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９５， ９３７８−９３８３ （１９９８））。そこで、インビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）でのＳｍａｄ３シグナル伝達経路の選択的標的を識別するために、本発明者等は、野生型マウスまたは標的崩壊後にＳｍａｄ３遺伝子に関してヘテロ接合性のマウスもしくはヌルのマウスを用いて、皮膚創傷治癒でのその役割を研究した（Ｙａｎｇ， Ｘ．ら Ｔａｒｇｅｔｅｄ ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ ｏｆ ＳＭＡＤ３ ｒｅｓｕｌｔｓ ｉｎ ｉｍｐａｉｒｅｄ ｍｕｃｏｓａｌ ｉｍｍｕｎｉｔｙ ａｎｄ ｄｉｍｉｎｉｓｈｉｅｄ Ｔ ｃｅｌｌ ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅｎｅｓｓ ｔｏ ＴＧＦ−ｂｅｔａ． ＥＭＢＯ Ｊ． １８８， １２８０−１２９１ （１９９９））。
【０００３】
［発明の概要］
トランスフォーミング成長因子−β（ＴＧＦ−β）からのシグナルを伝達するＳＭＡＤタンパク質を欠如した動物の生成は、インビボでのＴＧＦ−β活性に対するＳＭＡＤタンパク質の寄与を調査するのを可能にする。本明細書で、本発明者等は、外因性ＴＧＦ−βの創傷治癒を改善する能力に基づいてなされた予測と対照的に、Ｓｍａｄ３ヌル（Ｓｍａｄ３ｅｘ８／ｅｘ８）マウスは、逆説的に、野生型マウスと比べて皮膚創傷治癒の促進を示し、再上皮形成速度の増加および単球の局所浸潤の有意な減少を特徴としていたことを報告する。Ｓｍａｄ３ｅｘ８／ｅｘ８ケラチノサイトは、成長および遊走の変化したパターンを示し、Ｓｍａｄ３ｅｘ８／ｅｘ８単球は、ＴＧＦ−βに対して選択的に鈍った走化性応答を示した。これらのデータは、本発明者等の知る限りでは、組織修復の特定経路に、およびインビボでのケラチノサイトおよび単球機能の調節においてＳｍａｄ３に関係する最初のデータである。
【０００４】
［好ましい実施形態の詳細な説明］
Ｓｍａｄ３は、ＴＧＦ−βおよびアクチビン受容体からのシグナルを核中の標的遺伝子のプロモーターへ媒介するために機能する細胞質タンパク質のＳｍａｄファミリーの成員である。ＴＧＦ−β受容体の下流にある選択的経路を識別するために、本発明者等は、Ｓｍａｄ３遺伝子を相同組換えにより崩壊させたマウスを特性化した。これらのマウスおよび同胞の野生型マウスにおける研究は、Ｓｍａｄ３の損失が、正常な創傷治癒に有益であることを示した。データは、ケラチノサイト増殖に対する特定効果を有する再上皮形成の阻害と、単球とケラチノサイトのＴＧＦ−β媒介性走化性とに、インビボでＳｍａｄ３が関与することを示す。Ｓｍａｄ３は、その欠失が再上皮形成の増大および創傷面積の縮小へと導くため、創傷治癒に対して阻害性であるインビボシグナル伝達経路を媒介することを本発明者等の結果は実証する。データは、無傷の代替的経路による外因性ＴＧＦシグナル伝達と任意に連結したインビボでのＳｍａｄ３経路の崩壊は、創傷治癒低下のすべての態様を促進させるのに治療上有用であり得ることを示す。
【０００５】
さらに、本発明者等は、線維症の誘導に対する防御的効果を有する抗線維症剤としてのＳｍａｄ３阻害剤を提案する。データは、Ｓｍａｄ３ヌルマウスが、高線量の放射線に応答した線維症から防御されることを示す。Ｓｍａｄ３の阻害剤は、放射線誘導性線維症を含めた線維症の防止における臨床的用途を有し得る。
【０００６】
定義
「単離された（ｉｓｏｌａｔｅｄ）」という用語は、物質がその本来の環境（例えば、それが天然に存在する場合は、自然環境）から取り出されることを要求する。例えば、生細胞中に存在する天然のポリヌクレオチドまたはポリペプチドは単離されていないが、天然系中の共存物質の幾らかまたはすべてと分離された同じポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、単離されている。
【０００７】
「精製された（ｐｕｒｉｆｉｅｄ）」という用語は、絶対的な純度を要求しない。むしろ、それは、その自然状態の物質純度を参照して、相対的な定義として意図される。少なくとも１桁、好ましくは２桁または３桁、より好ましくは４桁または５桁までの天然物質の精製が、明確に意図される。
【０００８】
「濃縮された（ｅｎｒｉｃｈｅｄ）」という用語は、物質の濃度が、その天然濃度（例えば）の少なくとも約２、５、１０、１００、または１０００倍、好適には０．０１重量％であることを意味する。約０．５重量％、１重量％、５重量％、１０重量％および２０重量％の濃縮調製物もまた意図される。
【０００９】
Ｓｍａｄ３遺伝子
現在のところ、９個の脊椎動物Ｓｍａｄが識別されており、これらは、様々な経路でのそれらの機能的役割に基づいてサブグループに分類されてきた。Ｓｍａｄ１、５およびＳｍａｄ８はすべて、ＢＭＰからのシグナル伝達を媒介する一方で、Ｓｍａｄ２およびＳｍａｄ３は、ＴＧＦ−βおよびアクチビンからのシグナル伝達を媒介する。ひとまとめにして、これらのＳｍａｄは、経路限定Ｓｍａｄとして知られ、ホモまたはヘテロ二量体を形成することができる。Ｓｍａｄ４は、経路限定Ｓｍａｄに対する共有へテロオリゴマー化パートナーであることがわかっており、共通の媒介物として知られている。このファミリーの最後の２つの成員であるＳｍａｄ６および７は、多くの場合、他のＳｍａｄと効果のない二量体を形成することによりＳｍａｄシグナル伝達カスケードを阻害するように作用し、したがって拮抗性Ｓｍａｄとして分類される（Ｈｅｌｄｉｎら， Ｎａｔｕｒｅ， １９９７， ３９０， ４６５−４７１； Ｋｒｅｔｚｓｃｈｍａｒ ａｎｄ Ｍａｓｓａｇｕｅ， Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｇｅｎｅｔ． Ｄｅｖ．， １９８８， ８， １０３−１１１）。
【００１０】
ヒトＳｍａｄ３の公開されたｃＤＮＡ配列は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｕ６８０１９として入手可能であり、配列番号１として提供する。推定アミノ酸配列を配列番号２として提供する。ゲノム配列もまた既知である。
【００１１】
本発明のＳｍａｄ３ヌクレオチド配列には、（ａ）配列番号１に付与したｃＤＮＡ配列、（ｂ）配列番号２に付与したアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列、（ｃ）高ストリンジェント（例えば、６５℃での０．５Ｍ　ＮａＨＰＯ４、７％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、１ｍＭ　ＥＤＴＡ中のフィルター結合性ＤＮＡへのハイブリダイゼーションおよび６８℃での０．１×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中での洗浄（Ａｕｓｕｂｅｌ Ｆ．Ｍ．ら， ｅｄｓ．， １９８９， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌ． Ｉ， Ｇｒｅｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ， Ｉｎｃ．， ａｎｄ Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ａｔ ｐ．２．１０．３）条件下で配列番号１に付与したｃＤＮＡ配列の相補体に対してハイブリダイズし、機能的に等価な遺伝子産物をコードする任意のヌクレオチド配列、および（ｄ）中程度のストリンジェント条件（例えば、４２℃での０．２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中での洗浄（上述のＡｕｓｕｂｅｌら， １９８９）のような、より低度のストリンジェント条件下で配列番号１に付与したｃＤＮＡ配列の相補体にハイブリダイズし、なお依然として機能的に等価な遺伝子産物をコードする任意のヌクレオチド配列が含まれる。Ｓｍａｄ３の機能的等価体には、他の種に存在する天然のＳｍａｄ３、および天然に存在しようと操作されたものであろうと突然変異Ｓｍａｄ３が含まれる。本発明はまた、配列（ａ）〜（ｄ）の縮重変異体も含む。
【００１２】
本発明はまた、先述のパラグラフのヌクレオチド配列（ａ）〜（ｄ）にハイブリダイズする核酸分子、好ましくはＤＮＡ分子、したがってその相補体も含む。かかるハイブリダイゼーション条件は、上述のように、高ストリンジェント条件であっても、あるいはあまり高度でないストリンジェント条件であってもよい。核酸分子がデオキシオリゴヌクレオチド（「ｏｌｉｇｏ」）である場合では、高ストリンジェント条件は、例えば３７℃（１４塩基のｏｌｉｇｏに関して）、４８℃（１７塩基のｏｌｉｇｏに関して）、５５℃（２０塩基のｏｌｉｇｏに関して）、および６０℃（２３塩基のｏｌｉｇｏに関して）での６×ＳＳＣ／０．０５％ピロリン酸ナトリウム中での洗浄を指し得る。これらの核酸分子は、例えば（Ｓｍａｄ３遺伝子核酸配列の増幅反応におけるアンチセンスプライマーのためにおよび／またはアンチセンスプライマーとして）Ｓｍａｄ３遺伝子調節に有用なＳｍａｄ３アンチセンス分子をコードするか、またはＳｍａｄ３アンチセンス分子として作用し得る。Ｓｍａｄ３遺伝子調節に関して、かかる技法は、例えば照放射線誘導性線維症および／または皮膚創傷治癒を調節するのに使用され得る。さらに、かかる配列は、リボザイムおよび／または三重らせん配列の一部ととして使用してもよく、それもまたＳｍａｄ３遺伝子調節に有用である。
【００１３】
上述のＳｍａｄ３ヌクレオチド配列のほかに、同一種に存在する完全長Ｓｍａｄ３　ｃＤＮＡもしくは遺伝子配列、および／または他の種に存在するＳｍａｄ３遺伝子のホモログが、当該技術分野で既知の分子生物学的技法により、不相応な実験をすることなく、識別および容易に単離することができる。関連種におけるＳｍａｄ３のホモログの識別は、薬剤発見の目的でヒトにより密接に関連した動物モデル系を開発するのに有用であり得る。例えば、所定の生物体に由来するｍＲＮＡから合成されたｃＤＮＡの発現ライブラリーは、その種に由来する標識ＴＧＦ−βまたはアクチビン受容体（またはＳｍａｄ３との二量体形成に関与するＳｍａｄ）を用いてスクリーニングすることができる。あるいは、かかるｃＤＮＡライブラリー、または所定の生物体に由来するゲノムＤＮＡライブラリーは、ハイブリダイゼーションまたは増幅プローブとして、本明細書中に記載のヌクレオチドを用いたハイブリダイゼーションによりスクリーニングすることができる。さらに、Ｓｍａｄ３遺伝子産物の１つまたはそれ以上のドメインに対して広範な相同性を有するタンパク質をコードするゲノム内の他の遺伝子座にある遺伝子もまた、同様の技法により識別することができる。ｃＤＮＡライブラリーの場合には、かかるスクリーニング技法は、同一種または異なる種にて代わりにスプライシングされた転写物に由来するクローンを識別することができる。
【００１４】
スクリーニングは、二重フィルターを用いたフィルターハイブリダイゼーションによるものであり得る。標識プローブは、Ｓｍａｄ３　ｃＤＮＡ配列の少なくとも１５〜３０塩基対を含有し得る。使用するハイブリダイゼーション洗浄条件は、ｃＤＮＡライブラリーが、標識配列が由来する生物体型と異なる生物体に由来する場合、低ストリンジェント条件であるべきである。マウスＳｍａｄ３プローブを用いたヒトＳｍａｄ３ホモログのクローニングに関して、例えば、ハイブリダイゼーションは、例えばＣｈｕｒｃｈの緩衝液（７％　ＳＤＳ、２５０ｍＭ　ＮａＨＰＯ４、２μＭ　ＥＤＴＡ、１％　ＢＳＡ）中で一晩、６５℃で実施され得る。洗浄は、６５℃での２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、続いて６５℃での０．１×ＳＳＣ、０．１％　ＳＤＳを用いて行われ得る。
【００１５】
低ストリンジェント条件は、当業者に既知であり、ライブラリーおよび標識配列が由来する特定の生物体によって、予想どおり変えられるだろう。かかる条件に関連するガイダンスに関しては、例えば、Ｓｍａｍｂｒｏｏｋら， １９８９， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇｓ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ， Ｎ．Ｙ．、およびＡｕｓｕｂｅｌら， １９８９， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｇｒｅｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ， Ｎ．Ｙ．を参照されたい。
【００１６】
あるいは、標識Ｓｍａｄ３ヌクレオチドを使用して、再び適切なストリンジェント条件を用いて、所定の生物体に由来するゲノムライブラリーをスクリーニングしてもよい。ヒトゲノムクローンの識別および特性化は、ヒト患者における線維症に対する防御および創傷治癒の改善のための臨床用プロトコルを設計（ｄｅｓｉｇｎ）するのに役立つ。例えば、ヒト遺伝子のイントロン／エクソン境界に隣接する領域に由来する配列を使用して、エクソン、イントロン、スプライス部位（例えば、スプライスアクセプターおよび／またはドナー部位）等の中の突然変異を検出するための増幅アッセイにおける使用のためのプライマーを設計することができる。
【００１７】
さらに、Ｓｍａｄ３遺伝子ホモログは、本明細書中に開示したＳｍａｄ３遺伝子産物内のアミノ酸配列に基づいて設計した２つの縮重オリゴヌクレオチドプライマープールを用いてＰＣＲを実施することにより、所定の生物体の核酸から単離されてもよい。反応用の鋳型は、例えばＳｍａｄ３遺伝子対立遺伝子を発現することが知られているか、もしくは発現することが疑わしいヒトまたは非ヒト細胞系あるいは組織から調製されるｍＲＮＡの逆転写により得られるｃＤＮＡであってもよい。
【００１８】
ＰＣＲ産物は、増幅配列が確実にＳｍａｄ３遺伝子の配列を表すように、サブクローニングおよび配列決定されてもよい。次に、ＰＣＲ産物を使用して、様々な方法により完全長ｃＤＮＡクローンを単離してもよい。例えば、増幅断片を標識して、それを用いて、バクテリオファージｃＤＮＡライブラリーのようなｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングしてもよい。あるいは、標識断片を使用して、ゲノムライブラリーのスクリーニングによりゲノムクローンを単離してもよい。
【００１９】
ＰＣＲ技術はまた、完全長ｃＤＮＡ配列を単離するのに利用され得る。例えば、ＲＮＡは、適切な細胞または組織源（すなわち、Ｓｍａｄ３遺伝子を発現することが知られているもの、または発現することが疑わしいもの）から、標準的手法に従って単離され得る。逆転写反応は、第１鎖合成のプライミングのための増幅断片の最も５’末端に特異的なオリゴヌクレオチドプライマーを用いてＲＮＡ上で実施され得る。次に、その結果生じたＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドを、標準的な末端転移酵素反応を用いてグアニンで「尾化（ｔａｉｌｅｄ）」してもよく、ハイブリッドをＲＮＡアーゼＨで消化してもよく、次に第２鎖合成を、ポリＣプライマーでプライミングしてもよい。したがって、増幅断片の上流にあるｃＤＮＡ配列は、容易に単離され得る。使用され得るクローニング戦略の概説に関しては、例えば上述のＳｍａｂｒｏｏｋらを参照されたい。
【００２０】
Ｓｍａｄ３遺伝子配列はさらに、突然変異Ｓｍａｄ３遺伝子対立遺伝子を単離するのに使用され得る。かかる突然変異対立遺伝子は、線維症および／または創傷治癒に寄与する遺伝子型を有することが知られているか、またはそれを提唱さている個体から単離してもよい。次に、突然変異対立遺伝子および突然変異対立遺伝子産物は、以下に記載する治療上のシステムにて利用され得る。さらに、かかるＳｍａｄ３遺伝子配列は、線維症または創傷治癒に影響を及ぼし得るＳｍａｄ３遺伝子調節性（例えば、プロモーターまたはプロモーター／エンハンサー）の欠陥を検出するのに使用することができる。
【００２１】
突然変異Ｓｍａｄ３遺伝子のｃＤＮＡは、例えば当業者に既知の技法であるＰＣＲを用いて単離され得る。この場合、第１ｃＤＮＡ鎖は、突然変異Ｓｍａｄ３対立遺伝子を保有すると推定される個体にて発現されることが知られているか、または発現されることが疑わしい組織から単離したｍＲＮＡに、ｏｌｉｇｏ−ｄＴオリゴヌクレオチドをハイブリダイズして、逆転写酵素で新たな鎖を伸長することにより合成され得る。次に、ｃＤＮＡの第２鎖は、正常な遺伝子の５’末端に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを用いて合成される。次に、これらの２つのプライマーを用いて、産物をＰＣＲにより増幅し、適切なベクターでクローニングし、当業者に既知の方法によりＤＮＡ配列分析を施す。正常なＳｍａｄ対立遺伝子のＤＮＡ配列と、突然変異Ｓｍａｄ３対立遺伝子のＤＮＡ配の比較により、突然変異Ｓｍａｄ３対立遺伝子産物の機能の損失または改変を招く突然変異を確認することができる。
【００２２】
あるいは、ゲノムライブラリーは、突然変異Ｓｍａｄ３対立遺伝子を保有することが疑わしいか、または保有することが知られている個体から得られるＤＮＡを用いて構築され得るか、あるいはｃＤＮＡライブラリーは、突然変異Ｓｍａｄ３対立遺伝子を発現することが知られているか、または発現すると思われる組織由来のＲＮＡを用いて構築され得る。次に、正常なＳｍａｄ３遺伝子またはその任意の適切な断片を標識して、かかるライブラリーにて相当する突然変異Ｓｍａｄ３対立遺伝子を識別するためのプローブとして使用してもよい。次に、突然変異Ｓｍａｄ３遺伝子配列を含有するクローンを、当業者に既知の方法に従って、精製して配列分析に付してもよい。
【００２３】
さらに、発現ライブラリーは、例えばかかる突然変異対立遺伝子を保有することが疑わしいか、もしくは保有することが知られている個体にて突然変異Ｓｍａｄ３対立遺伝子を発現することが知られているか、または発現することが疑わしい組織から単離したＲＮＡから合成したｃＤＮＡを利用して構築することができる。この様式では、推定突然変異組織により作製される遺伝子産物が発現され、この欄にて以下に記載するように、正常なＳｍａｄ３遺伝子産物に対して産生された抗体と合わせた標準的な抗体スクリーニング技法を用いてスクリーニングしてもよい（スクリーニング技法に関しては、例えば、Ｈａｒｌｏｗ， Ｅ． ａｎｄ Ｌａｎｅ， ｅｄｓ．， １９８８， “Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒを参照されたい）。さらに、スクリーニングは、標識Ｓｍａｄ３融合タンパク質によるスクリーニングにより達成することができる。Ｓｍａｄ３突然変異が改変した機能を有する発現遺伝子産物を生じる結果となる（例えば、ミスセンスまたはフレームシフト突然変異の結果として）場合では、Ｓｍａｄ３に対する抗体のポリクローナル群は、突然変異Ｓｍａｄ３遺伝子産物と交差反応する可能性が高い。かかる標識抗体との反応により検出されるライブラリークローンを、当業者に既知の方法にしたがって、精製して配列分析に付すことができる。
【００２４】
本発明はまた、突然変異Ｓｍａｄ３、Ｓｍａｄ３のペプチド断片、切断型Ｓｍａｄ３、およびＳｍａｄ３融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む。これらには、次の欄に記載する突然変異Ｓｍａｄ３またはＳｍａｄ３ドメインもしくはこれらのドメインの一部に相当するペプチド、ドメインの１つまたは２つが欠失された切断型Ｓｍａｄ３、あるいはドメインのすべてまたは一部を欠如した切断型非機能的Ｓｍａｄ３をコードするヌクレオチド配列が含まれるが、これらに限定されない。融合タンパク質をコードするヌクレオチドとしては、未関連タンパク質もしくはペプチド（例えば、細胞膜にＳｍａｄ３を固着させる膜貫通配列、血流中にて生じた融合タンパク質の安定性および半減期を増加させるＩｇ　Ｆｃドメイン、あるいはマーカーとして使用することができる酵素、蛍光タンパク質、発光タンパク質）に融合した完全長Ｓｍａｄ３、切断型Ｓｍａｄ３またはＳｍａｄ３のペプチド断片が挙げられ得るが、これらに限定されない。
【００２５】
本発明はまた、（ａ）先述のＳｍａｄ３コード配列および／またはその相補体（すなわち、アンチセンス）のいずれかを含有するＤＮＡベクター、（ｂ）コード配列の発現を誘導する調節要素に操作的に関連した先述のＳｍａｄ３コード配列のいずれかを含有するＤＮＡ発現ベクター、および（ｃ）宿主細胞中にてコード配列の発現を誘導する調節要素と操作的に関連した先述のＳｍａｄ３コード配列のいずれかを含有する遺伝子的に改変された宿主細胞を含む。本明細書中で使用する場合、調節要素としては、誘導プロモーターおよび非誘導プロモーター、エンハンサー、オペレーター、ならびに発現を駆動および調節する当業者に既知の他の要素が挙げられるが、これらに限定されない。かかる調節要素としては、サイトメガロウイルスｈＣＭＶ最初期遺伝子、ＳＶ４０アデノウイルスの初期または後期プロモーター、ｌａｃ系、ｔｒｐ系、ＴＡＣ系、ＴＲＣ系、ファージＡの主なオペレーターおよびプロモーター領域、ｆｄコートタンパク質の制御領域、３−ホスホグリセリン酸キナーゼ用プロモーター、酸性ホスファターゼのプロモーター、および酵母α−接合因子のプロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。
【００２６】
特定のポリヌクレオチドは、３個の連続ヌクレオチド、４個の連続ヌクレオチド、５個の連続ヌクレオチド、６個の連続ヌクレオチド、７個の連続ヌクレオチド、８個の連続ヌクレオチド、９個の連続ヌクレオチド、１０個の連続ヌクレオチド、１１個の連続ヌクレオチド、１２個の連続ヌクレオチド、１３個の連続ヌクレオチド、１４個の連続ヌクレオチド、１５個の連続ヌクレオチド、１６個の連続ヌクレオチド、１７個の連続ヌクレオチド、１８個の連続ヌクレオチド、１９個の連続ヌクレオチド、２０個の連続ヌクレオチド、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、３１個、３２個、３３個、３４個、３５個、３６個、３７個、３８個、３９個、４０個、４１個、４２個、４３個、４４個、４５個、４６個、４７個、４８個、４９個、５０個、５１個、５２個、５３個、５４個、５５個、５６個、５７個、５８個、５９個、６０個、６１個、６２個、６３個、６４個、６５個、６６個、６７個、６８個、６９個、７０個、７１個、７２個、７３個、７４個、７５個、７６個、７７個、７８個、７９個、８０個、９０個、１００個、２００個もしくは３００個またはそれ以上の連続ヌクレオチドを有するＤＮＡ配列である。
【００２７】
Ｓｍａｄ３タンパク質およびポリペプチド
Ｓｍａｄ３タンパク質、ポリペプチドおよびペプチド断片、Ｓｍａｄ３の突然変異形態、切断型形態または欠失形態および／またはＳｍａｄ３融合タンパク質は、抗体の生成用、探索目的のための試薬としての使用、または線維症および創傷治癒の調節に関与した他の細胞性遺伝子産物の識別、線維症の防止および創傷治癒の改善にて使用することができる化合物のスクリーニングのためのアッセイにおける試薬としての使用、および線維症に対する防御およびＳｍａｄ３に関連した創傷治癒の改善にて有用な薬学的試薬としての使用を含めるが、これらに限定されない各種の用途のために調製することができる。
【００２８】
本発明のＳｍａｄ３アミノ酸配列には、アミノ酸配列、すなわちｃＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列または遺伝子によりコードされるアミノ酸配列が含まれる。さらに、他の種のＳｍａｄ３が本発明に含まれる。実際に、上欄に記載したＳｍａｄ３ヌクレオチド配列によりコードされるいかなるＳｍａｄ３も本発明の範囲内である。
【００２９】
本発明は、ＴＧＦ−βもしくはアクチビン受容体またはＳｍａｄ３との二量体形成に関与したＳｍａｄを結合する能力、これらのリガンドに対する結合親和性、Ｓｍａｄ３結合の結果として得られる生物学的効果（例えば、シグナル伝達）、Ｓｍａｄ３等価体が適切な細胞型に存在する場合の細胞代謝の変化または表現型の変化、あるいは線維症または創傷治癒の調節を含むがこれらに限定されない多数の基準により判断されるように、上欄に記載したヌクレオチド配列によりコードされるＳｍａｄ３に機能的に等価なタンパク質も含む。かかる機能的に等価なＳｍａｄ３タンパク質としては、上欄に記載したＳｍａｄ３ヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列内のアミノ酸残基の付加または置換（しかし、これらは、サイレント変化（ｓｉｌｅｎｔ ｃｈａｎｇｅ）をもたらし、したがって、機能的に等価な遺伝子産物を生産する）が挙げられるが、これらに限定されない。アミノ酸置換は、関与する残基の極性、電荷、溶解性、疎水性、親水性、および／または両親媒性における類似性に基づいて行われ得る。例えば、非極性（疎水性）アミノ酸としては、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、およびメチオニンが挙げられ、極性中性アミノ酸としては、グリシン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、およびグルタミンが挙げられ、正に荷電した（塩基性）アミノ酸としては、アルギニン、リシン、およびヒスチジンが挙げられ、負に荷電した（酸性）アミノ酸としては、アスパラギン酸およびグルタミン酸が挙げられる。ランダム突然変異は、（当業者に既知のランダム突然変異誘発技法を用いて）Ｓｍａｄ３　ＤＮＡに対して行い、得られた突然変異Ｓｍａｄ３を活性に関して試験することができるものの、Ｓｍａｄ３コード配列の部位特異的突然変異を（当業者に既知の部位特異的突然変異技法を用いて）操作して、改変した機能（例えば、ＴＧＦ−βもしくはアクチビン受容体またはＳｍａｄ３との二量体形成に関与したＳｍａｄに対する異なる結合親和性、および／または異なるシグナル伝達容量）を有する突然変異Ｓｍａｄ３を生成することができる。
【００３０】
例えば、マウス形態のＳｍａｄ３およびヒトＳｍａｄ３ホモログの同一アミノ酸残基は、同一性領域は保持されるが、可変性残基は、例えばアミノ酸残基（複数可）の欠失または挿入により、あるいは１つまたはそれ以上の異なるアミノ酸残基の置換により改変されるように、整列させることができる。可変位置での保存的改変は、機能（例えば、リガンド結合親和性もしくはシグナル伝達容量またはその両方）を保持する突然変異Ｓｍａｄ３を生産するために操作することができる。非保存的変化は、機能（例えば、リガンド結合親和性もしくはシグナル伝達容量、またはその両方）を改変するために、これらの可変位置にて操作することができる。あるいは、機能の改変が望ましい場合、保存領域（すなわち、同一アミノ酸）の欠失または非保存的改変を操作することができる。例えば、ドメインの欠失または非保存的改変（置換または挿入）は、リガンドを結合するが、シグナル伝達する力のない突然変異Ｓｍａｄ３を生産するように操作することができる。同一アミノ酸残基に対する非保存的置換は、リガンドに対する改変した結合親和性を有する突然変異Ｓｍａｄ３を生産するように操作することができる。同じ突然変異戦略を用いて、同一アミノ酸残基を整列することによる他の非ヒトＳｍａｄ３およびヒトＳｍａｄ３ホモログの整列に基づいて突然変異Ｓｍａｄ３を設計することができる。
【００３１】
Ｓｍａｄ３コード配列に対する他の突然変異は、選択した宿主細胞にて発現、スケールアップ等によりよく適合するＳｍａｄ３を生成するために行うことができる。例えば、システイン残基は、ジスルフィド架橋を排除するために、欠失され得るか、または別のアミノ酸で置換され得る。Ｎ−結合グリコシル化部位は、例えば、Ｎ−結合部位を過剰グリコシル化（ｈｙｐｅｒｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅ）することが既知の酵母宿主からより簡単に回収および生成される同種産物の発現を達成するために、改変または排除され得る。
【００３２】
Ｓｍａｄ３の１つまたはそれ以上のドメインに相当するペプチド、ならびに完全長Ｓｍａｄ３、Ｓｍａｄ３ペプチドまたは切断型Ｓｍａｄ３が未関連タンパク質に融合された融合タンパク質もまた本発明の範囲内であり、配列番号１および２に付与されるＳｍａｄ３ヌクレオチドならびにＳｍａｄ３アミノ酸配列に基づいて設計され得る。かかる融合タンパク質としては、Ｓｍａｄ３タンパク質を、またはペプチドを安定化し、インビボでの半減期を延ばすＩｇＦｃ融合タンパク質、または融合タンパク質を細胞膜に固着させる任意のアミノ酸配列への融合愈タンパク質、またはマーカー機能を提供する酵素、蛍光タンパク質もしくは発光タンパク質への融合タンパク質が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３３】
Ｓｍａｄ３ポリペプチドおよびペプチドは、化学的に合成することができる（例えば、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ， １９８３， Ｐｒｏｔｅｉｎｓ： Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ， Ｗ．Ｈ． Ｆｒｅｅｍａｎ ＆ Ｃｏ．， Ｎ．Ｙ．を参照）ものの、Ｓｍａｄ３に由来する大型ポリペプチドおよび完全長Ｓｍａｄ３自体は、Ｓｍａｄ３遺伝子配列および／またはコード配列を含有する核酸を発現するための当該技術分野で既知の技法を用いて、組換えＤＮＡ技術により好適に生産され得る。かかる方法を用いて、Ｓｍａｄ３ヌクレオチド配列ならびに適切な転写および翻訳制御シグナルを含有する発現ベクターを構築することができる。これらの方法としては、例えば、インビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）組換えＤＮＡ技法、合成技法、およびインビボ遺伝子組換えが挙げられる。例えば、上述のＳａｍｂｒｏｏｋら， １９８９， および上述のＡｕｓｕｂｅｌら， １９８９， に記載される技法を参照されたい。あるいは、Ｓｍａｄ３ヌクレオチド配列をコードすることが可能なＲＮＡは、例えば合成機を用いて化学的に合成することができる。例えば、“Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”， １９８４， Ｇａｉｔ， Ｍ．Ｊ． ｅｄ．， ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ， Ｏｘｆｏｒｄに記載される技法を参照されたい。
【００３４】
様々な宿主発現ベクター系を、本発明のＳｍａｄ３ヌクレオチド配列を発現させるのに利用してもよい。Ｓｍａｄペプチドまたはポリペプチドが可溶性である場合、ペプチドまたはポリペプチドは、培養物から、すなわちＳｍａｄ３ペプチドまたはポリペプチドが分泌されない場合には宿主細胞から、Ｓｍａｄ３ペプチドまたはポリペプチドが細胞により分泌される場合には培地から回収され得る。しかしながら、発現系はまた、インサイチュー（ｉｎ ｓｉｔｕ）にてＳｍａｄ３または機能的等価体を発現する（すなわち、細胞膜に固着された）操作宿主細胞も含む。かかる発現系からのＳｍａｄ３の精製または濃縮は、適切な洗浄剤および脂質ミセルならびに当業者に既知の方法を用いて達成することができる。しかしながら、かかる操作宿主細胞自体が、適切な状況にて使用されてもよい。
【００３５】
本発明の目的で使用され得る発現系としては、Ｓｍａｄ３ヌクレオチド配列を含有する組換えバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡまたはコスミドＤＮＡ発現バクターで形質転換した細菌（例えば、大腸菌、枯草菌）、Ｓｍａｄ３ヌクレオチド配列を含有する組換え酵母発現ベクターで形質転換した酵母（例えば、サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ピシア属（Ｐｉｃｈｉａ））のような微生物、Ｓｍａｄ３配列を含有する組換えウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）で感染させた昆虫細胞系、組換えウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）、タバコモザイクウイルス（ＴＭＶ））で感染させた植物細胞系またはＳｍａｄ３ヌクレオチド配列を含有する組換えプラスミド発現ベクター（例えば、Ｔｉプラスミド）で形質転換した植物細胞系、あるいは哺乳動物細胞のゲノム由来（例えば、メタロチオネインプロモーター）または哺乳動物ウイルス由来（例えば、アデノウイルス後期プロモーター、ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター）のプロモーターを含有する組換え発現構築物を保有する哺乳動物細胞系（例えば、ＣＯＳ、ＣＨＯ、ＢＨＫ、２９３、３Ｔ３）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３６】
細菌系では、多数の発現ベクターが、発現されるＳｍａｄ３遺伝子産物に意図される使用に応じて好適に選択され得る。例えば、大量のかかるタンパク質が生産される場合、Ｓｍａｄ３タンパク質の薬学的調製物の生成のために、あるいはＳｍａｄ３タンパク質に対する抗体を産生するために、例えば容易に精製される高レベルの融合タンパク質産物の発現を誘導するベクターが望ましい場合がある。かかるベクターとしては、融合タンパク質が生産されるようにＳｍａｄ３コード配列がｌａｃＺコード領域と、フレーム内でベクターに個々に連結され得る大腸菌発現ベクターｐＵＲ２７８（Ｒｕｔｈｅｒ ら， １９８３， ＥＭＢＯ Ｊ． ２：１７９１）、ｐＩＮベクター（Ｉｎｏｕｙｅ ＆ Ｉｎｏｕｙｅ， １９８５， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １３：３１０１−３１０９； Ｖａｎ Ｈｅｅｋｅ ＆ Ｓｃｈｕｓｔｅｒ， １９８９， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６４：５５０３−５５０９）等が挙げられるが、これらに限定されない。ｐＧＥＸベクターもまた、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）との融合タンパク質として外来ポリペプチドを発現するのに使用してもよい。一般に、かかる融合タンパク質は可溶性であり、グルタチオン−アガロースビーズへの吸着、続く遊離のグルタチオンの存在下での溶出により溶解細胞から容易に精製され得る。ＰＧＥＸベクターは、クローニングした標的遺伝子産物がＧＳＴ部分から放出され得るように、トロンビンまたは第Ｘａ因子プロテアーゼ開裂部位を含むように設計される。
【００３７】
昆虫系では、オートグラファ　カリフォルニア　核多角病ウイルス（ＡｃＮＰＶ）が、外来遺伝子を発現するためのベクターとして使用される。ウイルスは、スポドプテラ　フルギパーダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）細胞にて成長する。Ｓｍａｄ３遺伝子コード配列は、ウイルスの非必須領域（例えば、ポリヒドリン遺伝子）に個々にクローニングされ、ＡｃＮＰＶプロモーター（例えば、ポリヒドリンプロモーター）の制御下に置かれ得る。Ｓｍａｄ３遺伝子コード配列の首尾よい挿入は、ポリヒドリン遺伝子（ｐｏｌｙｈｅｄｒｉｎ ｇｅｎｅ）の不活性化、および非閉鎖組換えウイルス（すなわち、ポリヒドリン遺伝子によりコードされるタンパク質コートを欠如したウイルス）の産生を生じる結果となるであろう。次に、これらの組換えウイルスは、挿入遺伝子が発現されるスポドプテラ　フルギパーダ細胞を感染するのに使用される（例えば、Ｓｍｉｔｈら， １９８３， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ４６：５８４； Ｓｍｉｔｈ， 米国特許第４，２１５，０５１号を参照）。
【００３８】
哺乳動物宿主細胞では、多数のウイルスベースの発現系が利用され得る。アデノウイルスが発現ベクターとして使用される場合、所定のＳｍａｄ３ヌクレオチド配列は、アデノウイルス転写／翻訳制御複合体（例えば後期プロモーターおよび三連リーダー配列）に連結されてもよい。次に、このキメラ遺伝子を、インビトロまたはインビボ組換えによりアデノウイルスゲノムに挿入してもよい。ウイルスゲノムの非必須領域（例えば、領域Ｅ１またはＥ３）での挿入は、感染宿主にて生存可能であり、Ｓｍａｄ３遺伝子産物を発現することが可能な組換えウイルスを生じるであろう（例えば、Ｌｏｇａｎ ＆ Ｓｈｅｎｋ， １９８４， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８１：３６５５−３６５９を参照）。特定の開始シグナルもまた、挿入Ｓｍａｄ３ヌクレオチド配列の効率的な翻訳に必要とされ得る。これらのシグナルには、ＡＴＧ開始コドンおよび隣接配列が含まれる。それ自身の開始コドンおよび隣接配列を含む全Ｓｍａｄ３遺伝子またはｃＤＮＡが適切な発現ベクターに挿入される場合、さらなる翻訳制御シグナルは必要とされない。しかしながら、Ｓｍａｄ３コード配列の一部のみが挿入される場合には、おそらくＡＴＧ開始コドンを含む外因性翻訳制御シグナルが提供されなくてはならない。さらに、開始コドンは、全挿入物の翻訳を確実にするために、所望のコード配列のリーディングフレームと同調しなくてはならない。これらの外因性翻訳制御シグナルおよび開始コドンは、様々な起源（天然起源および合成起源の両方）であり得る。発現の効率は、適切な翻訳エンハンサー要素、翻訳ターミネーター等の含有により高められ得る（Ｂｉｔｔｎｅｒら， １９８７， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ． １５３：５１６−５４４を参照）。
【００３９】
さらに、挿入配列の発現を調節するか、または所望の特定様式で遺伝子産物を修飾およびプロセシングする宿主細胞が選択され得る。タンパク質産物のかかる修飾（例えば、グルコシル化）およびプロセシング（例えば、開裂）は、タンパク質の機能に重要であり得る。種々の宿主細胞は、タンパク質および遺伝子産物の翻訳後プロセシングならびに修飾のための特徴的かつ特定のメカニズムを有する。適切な細胞系または宿主系は、発現される外来タンパク質の正確な修飾およびプロセシングを確実にするために選択され得る。この目的で、一次転写物の適切なプロセシング、遺伝子産物のグリコシル化およびリン酸化のための細胞機構を保有する真核宿主細胞を使用してもよい。かかる哺乳動物宿主細胞としては、ＣＨＯ、ＶＥＲＯ、ＢＨＫ、ＨｅＬａ、ＣＯＳ、ＭＤＣＫ、２９３、３Ｔ３、およびＷＩ３８が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４０】
組換えタンパク質の長期間の高収率生産のために、安定な発現が好ましい。例えば、上述のＳｍａｄ３配列を安定に発現する細胞系を操作してもよい。ウイルスの複製起点を含有する発現ベクターを使用するよりも、宿主細胞は、適切な発現制御要素（例えば、プロモーター、エンハンサー配列、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位等）により制御されるＤＮＡおよび選択可能マーカーで形質転換することができる。外来ＤＮＡの導入に続いて、操作細胞を濃縮培地にて１〜２日間成長させてもよく、続いて選択培地に移す。組換えプラスミド中の選択可能マーカーは、選択に対する耐性を付与し、細胞の染色体にプラスミドを安定に組み込ませ、増殖巣を形成するまで細胞を増殖させて、次にクローニングして細胞系を広げることができる。この方法は、Ｓｍａｄ３遺伝子産物を発現する細胞系を操作するのに好適に使用され得る。かかる操作細胞系は、Ｓｍａｄ３遺伝子産物の内因性活性に影響を及ぼす化合物のスクリーニングおよび評価にて特に有用であり得る。
【００４１】
単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（Ｗｉｇｌｅｒら， １９７７， Ｃｅｌｌ １１：２２３）、ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｓｚｙｂａｌｓｋａ ＆ Ｓｚｙｂａｌｓｋｉ， １９６２， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ４８：２０２６）、およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｌｏｗｙら， １９８０， Ｃｅｌｌ ２２：８１７）遺伝子を含めるが、これらに限定されない多くの選択系が、それぞれｔｋ細胞、ｈｇｐｒｔ細胞またはａｐｒｔ細胞にて使用され得る。また、代謝拮抗物質耐性は、以下の遺伝子：ｄｈｆｒ（これは、メトトレキセートに対する耐性を付与する）（Ｗｉｇｌｅｒら， １９８０， Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７７：３５６７； Ｏ’Ｈａｒｅら， １９８１， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７８：１５２７）、ｇｐｔ（これは、ミコフェノール酸に対する耐性を付与する）（Ｍｕｌｌｉｇａｎ ＆ Ｂｅｒｇ， １９８１， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７８：２０７２）、ｎｅｏ（これは、アミノグリコシドＧ−４１８に対する耐性を付与する）（Ｃｏｌｂｅｒｒｅ−Ｇａｒａｐｉｎら， １９８１， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １５０：１）、およびｈｙｇｒｏ（これは、ハイグロマイシンに対する耐性を付与する）（Ｓａｎｔｅｒｒｅら， １９８４， Ｇｅｎｅ ３０：１４７）に関する選択の基礎として使用することができる。
【００４２】
あるいは、任意の融合タンパク質は、発現される融合タンパク質の特異的な抗体を利用することにより、容易に精製され得る。例えば、Ｊａｎｋｎｅｃｈｔらにより記載される系は、ヒト細胞系で発現される未変性融合タンパク質の簡単な精製を可能にする（Ｊａｎｋｎｅｃｈｔら， １９９１， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８８：８９７２−８９７６）。この系では遺伝子のオープンリーディングフレームが６個のヒスチジン残基からなるアミノ末端タグに翻訳的に融合されるように、ワクシニア組換えプラスミドに、所定の遺伝子をサブクローニングする。組換えワクシニアウイルスに感染した細胞からの抽出物を、Ｎｉ２＋ニトリロ酢酸−アガロースカラム上に負荷して、ヒスチジンでタグ付けしたタンパク質をイミダゾール含有緩衝液で選択的に溶出させる。
【００４３】
Ｓｍａｄ３遺伝子産物はまた、トランスジェニック動物でも発現させることができる。マウス、ラット、ウサギ、モルモット、ブタ、ミニブタ、ヤギ、および非ヒト霊長類（例えば、ヒヒ、サル、およびチンパンジー）が挙げられるが、これらに限定されない任意の種の動物を、Ｓｍａｄ３トランスジェニック動物を生成させるのに使用してもよい。
【００４４】
特定のポリペプチドは、３個の連続残基、４個の連続残基、５個の連続残基、６個の連続残基、７個の連続残基、８個の連続残基、９個の連続残基、１０個の連続残基、１１個の連続残基、１２個の連続残基、１３個の連続残基、１４個の連続残基、１５個の連続残基、１６個の連続残基、１７個の連続残基、１８個の連続残基、１９個の連続残基、２０個の連続残基、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、３０個、４０個、５０個、６０個、７０個、８０個、９０個、またはそれ以上の連続残基を有するアミノ配列である。
【００４５】
Ｓｍａｄ３発現または活性を阻害する化合物に関するスクリーニングアッセイ　以下のアッセイは、Ｓｍａｄ３を阻害する化合物、Ｓｍａｄ３の細胞内タンパク質との相互作用を妨害する化合物、およびＳｍａｄ３の膜貫通タンパク質（例えば、ＴＧＦ−βおよびアクチビン受容体）との相互作用を妨害する化合物、ならびにＳｍａｄ３遺伝子の活性を阻害するか、またはＳｍａｄ３レベルを調節する化合物を識別するように設計される。さらに、Ｓｍａｄ３遺伝子調節配列（例えば、プロモーター配列）に結合し、Ｓｍａｄ３遺伝子発現を阻害し得る化合物を識別するアッセイを利用してもよい。アッセイは、標的遺伝子のプロモーターとのＳｍａｄ３の相互作用、を妨害する化合物を識別するのに利用してもよい。
【００４６】
本発明によりスクリーニングされ得る化合物としては、Ｓｍａｄ３もしくはＳｍａｄ３と相互作用する細胞内タンパク質、またはＳｍａｄ３と相互作用する膜貫通タンパク質に結合して、Ｓｍａｄ３により誘発される活性を阻害するか、あるいはＳｍａｄ３の阻害剤を模倣するペプチド、抗体およびその断片、ならびに他の有機化合物（例えば、ペプチド擬似体）、ならびにＳｍａｄ３（またはその一部）のリガンドを模倣して、Ｓｍａｄ３に結合し、それを「中和する（ｎｅｕｔｒａｌｉｚｅ）」ペプチド、抗体またはその断片、ならびに他の有機化合物が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４７】
かかる化合物としては、例えば、ランダムペプチドライブラリーの成員（例えば、Ｌａｍ， Ｋ． Ｓ．ら， １９９１， Ｎａｔｕｒｅ ３５４：８２−８４； Ｈｏｕｇｈｔｅｎ， Ｒ． ら， １９９１， Ｎａｔｕｒｅ ３５４：８４−８６）、およびＤおよび／またはＬ−配置アミノ酸から構成されるコンビナトリアルケミストリー由来の分子ライブラリーのような可溶性ペプチド、ホスホペプチド（ランダムまたは部分的縮重指向性ホスホペプチドライブラリーの成員を含むが、これらに限定されない、例えば、Ｓｏｎｇｙａｎｇ， Ｚ． ら， １９９３， Ｃｅｌｌ ７２： ７６７−７７８）、抗体（ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、抗イディオタイプ抗体、キメラ抗体または単鎖抗体、およびＦＡｂ、Ｆ（ａｂ’）２およびＦＡｂ発現ライブラリー断片、ならびにそれらのエピトープ結合性断片が挙げられるが、これらに限定されない）、ならびに小有機または無機分子が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４８】
本発明によりスクリーニングすることができる他の化合物としては、Ｓｍａｄ３遺伝子またはＳｍａｄ３との細胞内タンパク質の相互作用もしくはＳｍａｄ３との膜貫通タンパク質の相互作用の平衡を保つ幾つかの他の遺伝子の発現に（例えば、遺伝子発現に関与した調節領域または転写因子と相互作用することにより）影響を及ぼす小有機分子、またはＳｍａｄ３の活性、Ｓｍａｄ３と相互作用する幾つか他の細胞内タンパク質の活性、またはＳｍａｄ３と相互作用する幾つか他の膜貫通タンパク質の活性、またはＳｍａｄ３により調節される標的遺伝子のプロモーターの活性に影響を及ぼすような化合物が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４９】
コンピュータモデリングおよび検索技術はＳｍａｄ３発現または活性を阻害することができる化合物の識別、またはすでに識別された化合物の改良を可能にする。かかる化合物または組成物が識別されると、活性部位または領域が識別される。かかる活性部位は典型的に、Ｓｍａｄ３自体とのリガンドの相互作用ドメインのようなリガンド結合部位であり得る。活性部位は、例えば、ペプチドのアミノ酸配列、核酸のヌクレオチド配列、または関連化合物または組成物のそのリガンドとの複合体の研究などから、当該技術分野で既知の方法を用いて識別することができる。後者の場合には、化学法またはＸ線結晶法を使用して、因子上で複合体形成したリガンドが見られる場所を見つけ出すことにより活性部位を見つけ出すことができる。次に、活性部位の三次元幾何学的構造が決定される。これは、Ｘ線結晶学を含む既知の方法により実施することができ、完全な分子構造を決定することができる。他方で、固相または液相ＮＭＲを用いて、ある分子内距離を決定することができる。構造決定の任意の他の実験法を用いて、部分的または完全な構造を得ることができる。幾何学的構造は、天然または人工の複合体形成したリガンドを用いて測定してもよく、それは、決定された活性部位の構造の精度を上げることができる。実際に、Ｓｍａｄ相互作用ドメインは、翻訳リプレッサーＴＧＩＦおよびＳＩＰ１、アデノウイルス腫瘍性タンパク質Ｅ１Ａ、ならびにヒト癌遺伝子Ｓｋｉ、ＳｎｏＮおよびＥｖｉ−１を含む既知のＳｍａｄ３阻害剤に関して決定され、合理的薬剤設計の基礎として役立ち得る。
【００５０】
不完全な構造または十分正確でない構造が決定される場合、コンピュータベースの数量的モデリング方法を用いて、構造を完全にするか、またはその精度を改善することができる。タンパク質または核酸のような特定の生体高分子に特異的なパラメータ化されたモデル、分子運動計算に基づいた分子動力学モデル、熱的集合に基づいた統計力学的モデル、または組合せモデルを含む任意の認められているモデリング方法を用いてもよい。たいていの型のモデルに関して、構成原子および構成基間力を表す標準的分子力場が必要であり、物理化学で既知の力場から選択され得る。不完全な構造またはあまり正確でない実験的構造は、これらのモデリング方法により計算される完全な構造およびより正確な構造に対する制約として作用し得る。
【００５１】
最終的に、実験的に、モデリングにより、またはその組合せにより、活性部位の構造が決定されると、候補物を阻害する化合物は、それらの分子構造に関する情報とともに化合物を含有するデータベースを検索することにより識別され得る。かかる検索は、決定した活性部位構造に適合し、活性部位を規定する基と相互作用する構造を有する化合物を探し出す。かかる検索は、マニュアルであり得るが、好ましくはコンピュータ支援されている。この検索から見つけ出された化合物は、潜在的Ｓｍａｄ３阻害化合物である。
【００５２】
あるいは、これらの方法は、すでに既知の阻害化合物またはリガンドから改良された阻害化合物を識別するのに使用することができる。既知の化合物の組成は、修飾することができ、修飾の構造的効果は、新規組成に適用した上述の実験的およびコンピュータモデリング方法を用いて決定され得る。次に、改良されたフィットまたは相互作用が生じるかどうかを確定するために、改変された構造を化合物の活性部位構造と比較する。この様式で、例えば側基を変化させることによる組成の系統的変化は、改良された特異性もしくは活性を有する修飾阻害化合物またはリガンドを得るために迅速に評価され得る。
【００５３】
Ｓｍａｄ３の活性部位、およびＳｍａｄ３と相互作用する分子内および膜貫通タンパク質、および関連伝達および転写因子、ならびにＳｍａｄ３により調節される標的遺伝子のプロモーターの識別に基づいた、阻害化合物を識別するのに有用なさらなる実験的およびコンピュータモデリング方法は、当業者には明らかであろう。
【００５４】
分子モデリングシステムの例は、ＣＨＡＲＭＭおよびＱＵＡＮＴＡプログラム（Ｐｏｌｙｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ， Ｗａｌｔｈａｍ， Ｍａｓｓ．）である。ＣＨＡＲＭは、エネルギーの極小化および分子動力学的機能を実施する。ＱＵＡＮＴＡは、分子構造の構築、グラフィックモデリングおよび分析を実施する。ＱＵＡＮＴＡは、互いの分子挙動の相互作用的構築、修飾、可視化および分析を可能にする。
【００５５】
Ｒｏｔｉｖｉｎｅｎら， １９８８， Ａｃｔａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｆｅｎｎｉｃａ ９７：１５９−１６６； Ｒｉｐｋａ， Ｎｅｗ Ｓｃｉｅｎｔｉｓｔ ５４−５７ （Ｊｕｎ． １６， １９８８）； ＭｃＫｉｎａｌｙ ａｎｄ Ｒｏｓｓｍａｎｎ， １９８９， Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． Ｔｏｘｉｃｉｏｌ． ２９：１１１−１２２； Ｐｅｒｒｙ ａｎｄ Ｄａｖｉｅｓ， ＯＳＡＲ： Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−Ａｃｔｉｖｉｔｙ Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ ｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ ｐｐ． １８９−１９３ （Ａｌａｎ Ｒ． Ｌｉｓｓ， Ｉｎｃ． １９８９）； Ｌｅｗｉｓ ａｎｄ Ｄｅａｎ， １９８９ Ｐｒｏｃ． Ｒ． Ｓｏｃ． Ｌｏｎｄ． ２３６：１２５−１４０ ａｎｄ １４１−１６２、および核酸成分のためのモデル受容体に関して、Ａｓｋｅｗら， １９８９， Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． １１１：１０８２−１０９０のような多くの論文は、特定タンパク質と相互作用する薬剤のコンピュータモデリングについて概説する。化学物質をスクリーニングし、図示する他のコンピュータプログラムは、ＢｉｏＤｅｓｉｇｎ， Ｉｎｃ． （Ｐａｓａｄｅｎａ， Ｃａｌｉｆ．）、Ａｌｌｅｌｉｘ， Ｉｎｃ． （Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ， Ｏｎｔａｒｉｏ， Ｃａｎａｄａ）、およびＨｙｐｅｒｃｕｂｅ， Ｉｎｃ． （Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ， Ｏｎｔａｒｉｏ）のような会社から入手可能である。これらは、特定のタンパク質に特異的な薬剤への適用のために、本質的に設計されているが、それらは、ＤＮＡまたはＲＮＡの領域が識別されれば、その領域に特異的な薬剤の設計に適応させることができる。
【００５６】
結合を改変することができる化合物の設計および生成に関して上述したが、Ｓｍａｄ３の阻害剤である化合物に関して、天然生成物または合成化学物質、およびタンパク質を含む生物学的に活性な物質を含めた既知の化合物のライブラリーをスクリーニングすることもできる。
【００５７】
本明細書中に記載するようなアッセイにより識別された化合物は、例えば、Ｓｍａｄ３遺伝子産物の生物学的機能の精緻化にて、また線維症の防止および創傷治癒の改善のために有用であり得る。
【００５８】
Ｓｍａｄ３に結合する化合物に関するインビトロスクリーニングアッセイ
インビトロ系は、Ｓｍａｄ３と相互作用する（例えば、Ｓｍａｄ３に結合する）ことが可能な化合物を識別するように設計されてもよい。識別された化合物は、例えば、野生型および／または突然変異Ｓｍａｄ３遺伝子産物の活性を阻害するのに有用であり得るか、Ｓｍａｄ３の生物学的機能を精巧に作るのに有用であり得るか、正常なＳｍａｄ３相互作用を崩壊する化合物を識別するためのスクリーンにて利用され得るか、またはそれ自体でかかる相互作用を崩壊し得る。
【００５９】
Ｓｍａｄ３に結合する化合物を識別するのに使用されるアッセイの原理は、Ｓｍａｄ３および試験化合物の反応混合物を、２つの成分を相互作用させて結合させるのに十分な条件下にて、および十分な時間調製すること、したがって、反応混合物中から取り出すことおよび／または検出することができる複合体を形成することを含む。使用されるＳｍａｄ３種は、スクリーニングアッセイの目標に応じて多種多様であり得る。例えば、阻害剤を結合して阻害するか、または阻害剤を模倣するか、あるいはＳｍａｄ３のリガンドを模倣して、Ｓｍａｄ３に結合し、それを「中和（ｎｅｕｔｒａｌｉｚｅ）」する化合物にねらいを定める場合、完全長Ｓｍａｄ３タンパク質、ドメインに相当するペプチドまたはアッセイ系にて利点（例えば、得られる複合体の標識、単離等）を提供するタンパク質もしくはポリペプチドに融合したＳｍａｄ３ドメインを含有する融合タンパク質を利用することができる。
【００６０】
スクリーニングアッセイは、様々な方法で行うことができる。例えば、かかる方法を実施する１つの方法は、固相上へ、Ｓｍａｄ３タンパク質、ポリペプチド、ペプチドもしくは融合タンパク質、または試験物質を固着させること、および反応終了時に固相上に固着したＳｍａｄ３／試験化合物複合体を検出することを含む。かかる方法の一実施形態では、Ｓｍａｄ３反応物は、固相上に固着されてもよく、固着されない試験化合物を、直接的または間接的に標識してもよい。
【００６１】
実際に、マイクロタイタープレートは、固相として慣用的に利用され得る。固着成分は、非共有結合または共有結合により固定化され得る。非共有結合は、タンパク質溶液で固体表面を被覆し、乾燥することにより簡単に達成され得る。あるいは、固定されるべきタンパク質に特異的な固定化抗体、好ましくは、モノクローナル抗体を用いて、固体表面にタンパク質を固着させてもよい。表面は、あらかじめ調製されて保管されてよい。
【００６２】
アッセイを実施するために、非固定化成分を、固着成分を含有する被覆表面に添加する。反応が完了した後、任意の形成された複合体が固体表面上に固定化されたままであるような条件下にて、未反応成分を（例えば、洗浄により）除去する。固体表面上に固着した複合体の検出は、多数の方法で達成することができる。あらかじめ固定化されていない成分が前もって標識される場合、表面上に固着した標識の検出は、複合体が形成されたことを示す。あらかじめ固定化されていない成分を前もって標識しない場合、間接標識を用いて、例えば、あらかじめ固定化されていない成分に特異的な標識抗体を用いて（その抗体もまた直接的に標識されてもよく、あるいは標識抗Ｉｇ抗体で間接的に標識されてもよい）、表面上に固着した複合体を検出することができる。
【００６３】
あるいは、反応を液相で行い、反応性成分を未反応成分から分離して、例えば、Ｓｍａｄ３タンパク質、ポリペプチド、ペプリドもしくは融合タンパク質に特異的な固定化抗体、または溶液中で形成される任意の複合体を固着する試験化合物、および固着複合体を検出するための考え得る複合体の他の成分に特異的な標識抗体を用いて、複合体を検出することができる。
【００６４】
あるいは、細胞ベースのアッセイを用いて、Ｓｍａｄ３と相互作用する化合物を識別することができる。この目的のために、（例えば、Ｓｍａｄ３　ＤＮＡのトランスフェクションまたは形質導入により）Ｓｍａｄ３を発現する細胞系、またはＳｍａｄ３を発現するように遺伝子操作した細胞系（例えば、ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞、線維芽細胞等）を使用することができる。例えば宿主細胞により発現されるＳｍａｄ３との試験化合物の相互作用は、天然リガンドとの比較または競合により決定することができる。
【００６５】
Ｓｍａｄ３と相互作用する細胞内または膜貫通タンパク質に関するアッセイ
タンパク質−タンパク質相互作用を検出するのに適切な任意の方法は、Ｓｍａｄ３と相互作用する膜貫通タンパク質または細胞内タンパク質を識別するのに使用され得る。使用され得る伝統的な方法には、免疫共沈降、架橋およびＳｍａｄ３タンパク質と相互作用する溶解産物中のタンパク質を識別するための、細胞溶解産物または細胞溶解産物から得られるタンパク質とＳｍａｄ３タンパク質のグラジエントまたはクロマトグラフィカラムによる同時精製がある。これらのアッセイに関して、使用されるＳｍａｄ３成分は、完全長Ｓｍａｄ３タンパク質、Ｓｍａｄ３のドメインに相当するペプチド、またはＳｍａｄ３のドメインを含有する融合タンパク質であり得る。いったん単離されれば、かかる細胞内または膜貫通タンパク質を識別することができ、次にそれは、標準的技法と合わせて使用して、それが相互作用するタンパク質を識別することができる。例えば、Ｓｍａｄ３タンパク質と相互作用する細胞内または膜貫通タンパク質のアミノ酸配列の少なくとも一部は、例えばＥｄｍａｎ分解技法により、当業者に既知の技法を用いて確認することができる（例えば、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ， １９８３， Ｐｒｏｔｅｉｎｓ： Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ， Ｗ．Ｈ． Ｆｒｅｅｍａｎ ＆ Ｃｏ．， Ｎ．Ｙ．， ｐｐ．３４−４９を参照）。得られたアミノ酸配列は、かかる分子内および膜貫通タンパク質をコードする遺伝子配列をスクリーニングするのに使用することができるオリゴヌクレオチド混合物の生成用の指標として使用され得る。スクリーニングは、例えば標準的なハイブリダイゼーションまたはＰＣＲ技法により達成され得る。オリゴヌクレオチド混合物の生成およびスクリーニングに関する技法は既知である（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ ら， １９８９， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｇｒｅｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ， Ｎ．Ｙ．， ａｎｄ ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ： Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ， １９９０， Ｉｎｎｉｓ， Ｍ． ら， ｅｄｓ． Ａｃａｄｅｍｉｎ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを参照）。
【００６６】
さらに、Ｓｍａｄ３タンパク質と相互作用する膜貫通または細胞内タンパク質をコードする遺伝子の同時識別をもたらす方法を使用してもよい。これらの方法としては、例えば、標識Ｓｍａｄ３タンパク質またはＳｍａｄ３ポリペプチド、ペプチドまたは融合タンパク質（例えば、マーカー（例えば、酵素、蛍光、発光タンパク質または色素）またはＩｇ−Ｆｃドメインと融合させたＳｍａｄ３ポリペプチドまたはＳｍａｄ３ドメイン）を用いた、λｇｔ１１ライブラリーの抗体探査の既知の技法と同様の様式での、発現ライブラリーの探査が挙げられる。
【００６７】
インビボにてタンパク質相互作用を検出する一方法であるツーハイブリッドシステムについて、単なる説明の目的で、限定することを意図しないで詳述する。このシステムの１つの型は、記載があり（Ｃｈｉｅｎら， １９９１， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８８：９５７８−９５８２）、またＣｌｏｎｔｅｃｈ（Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ， Ｃａｌｉｆ．）から市販されている。このアッセイは、生理学的であろうと薬理学的であろうと、Ｓｍａｄ３と相互作用するタンパク質を識別する。
【００６８】
簡潔に述べると、かかる系を利用して、一方のプラスミドがＳｍａｄ３、Ｓｍａｄ３ポリペプチド、ペプチドまたは融合タンパク質をコードするＳｍａｄ３ヌクレオチド配列に融合された転写活性化因子タンパク質のＤＮＡ結合ドメインをコードするクレオチドから構成され、他方のプラスミドがｃＤＮＡライブラリーの一部としてこのプラスミドに再結合された未知のタンパク質をコードするｃＤＮＡに融合された転写活性化因子タンパク質の活性化ドメインをコードするヌクレオチドから構成されるツーハイブリッドタンパク質をコードするプラスミドが構築される。ＤＮＡ結合ドメイン融合プラスミドおよびｃＤＮＡライブラリーは、調節領域が転写活性化因子の結合部位を含有するレポーター遺伝子を含有するサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の株へ形質転換される。どちらかのハイブリッドタンパク質のみでは、レポーター遺伝子の転写を活性化することはできない。ＤＮＡ結合ドメインハイブリッドは、活性化機能を提供しないので活性化することができず、活性化ドメインハイブリッドは、活性化因子の結合部位に局在化することができないので活性化することはできない。ツーハイブリッドタンパク質の相互作用は、機能的活性化因子タンパク質を再構成し、レポーター遺伝子の発現をもたらし、それはレポーター遺伝子産物に関するアッセイにより検出される。
【００６９】
ツーハイブリッドシステムまたは関連方法論は、「囮（ｂａｉｔ）」遺伝子産物と相互作用するタンパク質に関して活性化ドメインライブラリーをスクリーニングするのに使用されてもよい。一例として、また限定することを意図しないで、Ｓｍａｄ３は、囮遺伝子産物として使用されてもよい。全ゲノムまたはｃＤＮＡ配列は、活性化ドメインをコードするＤＮＡに融合される。このライブラリーおよびＤＮＡ結合ドメインに融合された囮Ｓｍａｄ３遺伝子産物のハイブリッドをコードするプラスミドを酵母レポーター株に同時形質転換し、レポーター遺伝子を発現するものに関して得られた形質転換をスクリーニングする。例えば、限定することを意図しないで、Ｓｍａｄ３（またはＳｍａｄ３のドメイン）のオープンリーディングフレームのような囮Ｓｍａｄ３遺伝子配列は、ＧＡＬ４タンパク質のＤＮＡ結合ドメインをコードするＤＮＡに翻訳的に融合されるように、ベクターにクローニングされ得る。これらのクローンを精製して、レポーター遺伝子発現を担うライブラリープラスミドを単離する。次に、ＤＮＡシーケンシングを用いて、ライブラリープラスミドによりコードされるタンパク質を識別する。
【００７０】
囮Ｓｍａｄ３遺伝子産物と相互作用するタンパク質が検出されるべき細胞系のｃＤＮＡライブラリーは、当該技術分野で日常的に実施される方法を用いて作製され得る。本明細書中に記載の特定の系にしたがって、例えば、ｃＤＮＡ断片は、ＧＡＬ４の転写活性化ドメインに翻訳的に融合されるように、ベクターに挿入され得る。このライブラリーは、ＧＡＬ４活性化配列を含有するプロモーターにより駆動されるｌａｃＺ遺伝子を含有する酵母株に、囮Ｓｍａｄ３遺伝子−ＧＡＬ４融合プラスミドとともに同時形質転換することができる。囮Ｓｍａｄ３遺伝子産物と相互作用するＧＡＬ４転写活性化ドメインに融合されたｃＤＮＡコードタンク質は、活性ＧＡＬ４タンパク質を再構成し、それによりＨＩＳ３遺伝子の発現を駆動するであろう。ＨＩＳ３を発現するコロニーを、ヒスチジンを欠如した培地に基づく半固形寒天を含有するペトリ皿上でのそれらの成長により検出することができる。次に、ｃＤＮＡをこれらの株から精製して、当該技術分野で日常的に実施される技法を用いて、囮Ｓｍａｄ３遺伝子相互作用タンパク質を生産および単離するのに使用することができる。
【００７１】
Ｓｍａｄ３／分子内高分子相互作用またはＳｍａｄ３／膜貫通抗分子相互作用を妨害する化合物に関するアッセイ
Ｓｍａｄ３と相互作用する高分子は、この説明の目的で、「リガンド（ｌｉｇａｎｄｓ）」と称される。これらのリガンドは、Ｓｍａｄ３シグナル伝達経路に、したがって、創傷治癒および線維症でのＳｍａｄ３の役割に関与する可能性が高い。したがって、Ｓｍａｄ３の活性の調節に有用であり、Ｓｍａｄ３活性に関連した創傷治癒および線維症を制御し得るＳｍａｄ３とのかかるリガンドの相互作用を妨害するか、またはそれを崩壊する化合物を識別することが望ましい。
【００７２】
Ｓｍａｄ３とそのリガンドとの間の相互作用を妨害する化合物を識別するのに使用されるアッセイ系の基本原理は、Ｓｍａｄタンパク質、ポリペプチド、ペプチドまたは融合タンパク質、およびリガンドを含有する反応混合物を、これら２つを相互作用させて結合させるのに十分な条件下にて、かつ十分な時間調製すること、したがって複合体を形成することを含む。阻害活性に関して化合物を試験するために、反応混合物は、試験化合物の存在下および非存在下にて調製される。試験化合物は、最初に反応混合物に含有されてもよく、あるいはＳｍａｄ３部分およびそのリガンドの添加後の時点で添加されてもよい。対照反応混合物は、試験化合物なしで、またはプラセボとともにインキュベートされる。次に、Ｓｍａｄ３部分とリガンドとの間の任意の複合体の形成を検出する。対照反応中で複合体を形成するが、試験化合物を含有する反応混合物中で形成しないことは、その化合物が、Ｓｍａｄ３と相互作用リガンドとの相互作用を妨害することを示す。さらに、試験化合物および正常Ｓｍａｄ３タンパク質を含有する反応混合物内での複合体形成を、試験化合物および突然変異Ｓｍａｄ３を含有する反応混合物内での複合体形成と比較してもよい。この比較は、突然変異体の相互作用を崩壊するが、正常なＳｍａｄ３タンパク質の相互作用を崩壊しない化合物を識別することが望ましい場合に、重要であり得る。
【００７３】
Ｓｍａｄ３およびリガンドの相互作用を妨害する化合物に関するアッセイは、不均一または均一方式で実施され得る。不均一アッセイは、固相上へＳｍａｄ３部分産物またはリガンドを固着すること、および反応終了時に固相上に固着した複合体を検出することを含む。均一アッセイでは、全反応は、液相で行われる。どちらのアプローチでも、反応物の添加順序は、試験される化合物に関する種々の情報を得るために変更することができる。例えば、競合により相互作用を妨害する試験化合物は、試験物質の存在下にて反応を実施することにより、すなわちＳｍａｄ３部分および相互作用リガンドより前に、またはそれと同時に、試験化合物を反応混合物に添加することにより識別することができる。あるいは、予め形成された複合体を崩壊させる試験化合物、例えば、複合体から成分の１つを置き換えた、高い結合定数を有する化合物は、複合体が形成された後、試験化合物を反応混合物に添加することにより試験することができる。様々な方式について、以下に簡潔に記載する。
【００７４】
不均一アッセイ系では、Ｓｍａｄ３部分または相互作用リガンドのいずれかを固体表面上に固着する一方で、非固着種を直接的または間接的に標識する。実際に、マイクロタイタープレートが、慣用的に利用されている。固着種は、非共有結合または共有結合により固定化され得る。非共有結合は、Ｓｍａｄ３遺伝子産物またはリガンドの溶液で固体表面を被覆し、乾燥することで簡単に達成され得る。あるいは、固着されるべき種に特異的な固定化抗体を、固体表面に種を固着するのに使用してもよい。表面は、あらかじめ調製されて、保管されてもよい。
【００７５】
アッセイを実施するために、固定化種のパートナーは、試験化合物とともにまたはそれなしで、被覆表面に曝露される。反応完了後、未反応成分を（例えば、洗浄により）除去して、形成された任意の複合体を固体表面上に固定化されたままの状態であろう。固体表面上に固着した複合体の検出は、多数の方法で達成され得る。非固定化種があらかじめ標識されている場合、表面上に固定化された標識の検出は、複合体が形成されたことを示す。非固定化種があらかじめ標識されない場合、間接的標識を用いて、例えば、最初に固定化されていない種に特異的な標識抗体（その抗体もまた、例えば直接的に標識されるかまたは標識抗Ｉｇ抗体で間接的に標識され得る）を用いて、表面上に固着した複合体を検出することができる。反応成分の添加順序に応じて、複合体形成を阻害する試験化合物、または予め形成した複合体を崩壊させる試験化合物を検出することができる。
【００７６】
あるいは、反応は、試験化合物の存在下または非存在下にて、液相で行い、反応生成物を未反応成分と分離して、例えば溶液中に形成される任意の複合体を固着する、結合成分の１つに特異的な固定化抗体、および固着複合体を検出するための他のパートナーに特異的な標識抗体を用いて複合体を検出することができる。また、液相への反応物の添加順序に応じて、複合体を阻害する試験化合物または予め形成した複合体を崩壊させる試験化合物を識別することができる。
【００７７】
本発明の代替的実施形態では、均一アッセイを使用することができる。このアプローチでは、Ｓｍａｄ３部分および相互作用性リガンドが予め形成された複合体が調製され、そこでＳｍａｄ３またはそのリガンドのどちらかが標識されるが、標識により発生するシグナルは複合体の形成により消失する（例えば、米国特許第４，１０９，４９６号、Ｒｕｂｅｎｓｔｅｉｎ、イムノアッセイのためにこのアプローチを利用する）。予め形成された複合体から種の１つと競合して置き換わる試験物質の添加は、バックグラウンドを超えるシグナルの発生をもたらすであろう。このようにして、Ｓｍａｄ３／リガンド相互作用を崩壊させる試験物質を識別することができる。
【００７８】
特定の実施形態では、Ｓａｍｄ３融合は、免疫のために調製され得る。例えば、Ｓｍａｄ３、またはペプチド断片（例えば、ドメインに相当する）は、その結合活性は得られる融合タンパク質にて維持されるように、ｐＧＥＸ−５Ｘ−１のような融合ベクターを用いてグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）遺伝子に融合することができる。相互作用性リガンドは、当該技術分野で日常的に実施されている方法を用いて、精製してモノクローナル抗体を産生するのに使用することができる。この抗体は、例えば当該技術分野で日常的に実施される方法により、放射性同位体１２５Ｉで標識することができる。不均一アッセイでは、例えばＧＳＴ−Ｓｍａｄ３融合タンパク質は、グルタチオン−アガロースビーズに固着することができる。次に、相互作用および結合を起こすような様式で、試験化合物の存在下または非存在下にて、相互作用リガンドを添加することができる。反応期間の終了時に、未結合物質を洗い落とすことができ、標識モノクローナル抗体を系に添加して、複合体形成した成分に結合させることができる。Ｓｍａｄ３遺伝子産物と相互作用リガンドとの間の相互作用は、グルタチオン−アガロースビーズに関連した状態の放射活性量を測定することにより検出することができる。試験化合物による相互作用の首尾よい阻害は、測定した放射能の減少をもたらすであろう。
【００７９】
あるいは、ＧＳＴ−Ｓｍａｄ３融合タンパク質および相互作用リガンドを、固体グルタチオン−アガロースビーズの非存在下にて液体中で一緒に混合することができる。種を相互作用させている間、または相互作用させた後に、試験化合物を添加することができる。次に、この混合物をグルタチオン−アガロースビーズに添加することができ、未反応物質を洗い落とす。また、Ｓｍａｄ３／リガンド相互作用の阻害の度合いは、標識抗体を添加して、ビーズに関連した放射能を測定することにより検出することができる。
【００８０】
本発明の別の実施形態では、これらの同一技法は、完全長タンパク質の１つまたは両方の代用として、Ｓｍａｄ３および／または相互作用性リガンド（リガンドがタンパク質である場合）の結合ドメインに相当するペプチド断片を用いて使用され得る。当該技術分野で日常的に実施される任意の多数の方法を使用して、結合部位を識別および単離することができる。これらの方法としては、タンパク質の１つをコードする遺伝子の突然変異誘発、および免疫共沈降アッセイでの結合の崩壊に関するスクリーニングが挙げられるが、これらに限定されない。それぞれのタンパク質をコードする遺伝子の配列解析は、相互作用結合に関与したタンパク質の領域に相当する突然変異を明らかにするであろう。あるいは、上記の方法を用いて１つのタンパク質を固体表面に固着させて、トリプシンのようなタンパク質分解酵素で処理したその標識リガンドと相互作用およびそれに結合させることができる。洗浄後、結合ドメインを含む短い標識ペプチドは固体物質と結合した状態にさせ、単離してアミノ酸シーケンシングにより識別することができる。また、相互作用性リガンド用の遺伝子コードがいったん得られれば、短い遺伝子断片を、タンパク質のペプチド断片を発現するように操作することができ、続いてそれを、結合活性に関して試験して、精製または合成することができる。
【００８１】
例えば、限定すると意図されずに、Ｓｍａｄ３遺伝子産物は、ＧＳＴ−Ｓｍａｄ３融合タンパク質を作製し、それをグルタチオンアガロースビーズに結合させることにより、上述のように固体物質に固着させることができる。相互作用性リガンドは、３５Ｓのような放射性同位体で標識し、トリプシンのようなタンパク質分解酵素で開裂することができる。次に開裂産物を、固着ＧＳＴ−Ｓｍａｄ３融合タンパク質に添加して、結合させることができる。未反応ペプチドを洗い落とした後、相互作用リガンド結合ドメインを表す標識結合物質を溶出させ、精製し、既知の方法によりアミノ酸配列に関して解析する。このようにして識別されたペプチドは、合成的に、あるいは組換えＤＮＡ技術を用いて適切な促進性タンパク質に融合して生産することができる。
【００８２】
一実施形態では、「リガンド（ｌｉｇａｎｄ）」は、受容体活性化時にＳｍａｄ３ヘテロニ量体化するＳｍａｄ４である。別の実施形態では、「リガンド」は、ＳＡＲＡ（受容体活性化用Ｓｍａｄアンカー）であり、これは、細胞質シグナルトランスデューサーＳｍａｄ３を強化する。さらなる実施形態では、「リガンド」は、Ｓｍａｄ３のための同族ＤＮＡ結合部位である。Ｓｍａｄ　ＭＨ２ドメインは、Ｓｍａｄ依存性転写活性化活性の座位であり、Ｓｍａｄタンパク質のオリゴマー化ならびに他の転写因子とのヘテロマー形成を招くタンパク質−タンパク質相互作用の部位である。したがって、さらなる実施形態では、Ｓｍａｄ３のＭＨ２ドメインは、本明細書中に記載するアッセイにて、Ｓｍａｄ３自体と置換される。
【００８３】
線維症を防止するか、または創傷治癒を改善する化合物の識別のためのアッセイ
上欄に記載したようなアッセイ技法により識別される結合化合物を含むが、これに限定されない化合物を、線維症を防止する能力、および創傷治癒を改善する能力に関して試験することができる。上述のアッセイは、Ｓｍａｄ３活性に影響を及ぼす化合物（例えば、Ｓｍａｄ３に結合して、天然のリガンドの結合を阻害して、活性化を阻止する（アンタゴニスト）か、または活性化の阻害剤を模倣する（アゴニスト）化合物、およびＳｍａｄ３の天然リガンドに結合して、リガンドの活性を中和する化合物）、またはＳｍａｄ３遺伝子活性に影響を及ぼす化合物（Ｓｍａｄ３遺伝子発現に影響を及ぼすことによる、完全長または切断型のＳｍａｄ３の発現が調節され得るように、スプライシング事象に影響を及ぼすか、またはそれを妨害する分子（例えば、タンパク質または小有機分子）を含む）を識別することができる。しかしながら、記載するアッセイはまた、Ｓｍａｄ３シグナル伝達を阻害する化合物（例えば、上流または下流のシグナル伝達事象に影響を及ぼす化合物）も識別することができる。Ｓｍａｄ３遺伝子および／またはＳｍａｄ３遺伝子産物が関与するＳｍａｄ３シグナル伝達経路での別のステップに影響を及ぼし、この同一経路に影響を及ぼすことにより、線維症および創傷治癒に対するＳｍａｄ３の影響を調節し得るかかる化合物の識別および使用は、本発明の範囲内である。かかる化合物は、線維症の防止および創傷治癒の改善の方法の一部として使用することができる。
【００８４】
本発明は、線維症を防止するためのかかる能力および創傷治癒を改善するためのかかる能力を示す化合物の識別のための細胞ベースのアッセイおよび動物モデルベースのアッセイを含む。
【００８５】
細胞ベース系は、線維症を防止し、創傷治癒を改善するように作用し得る化合物を識別するために使用することができる。かかる細胞系としては、例えば、Ｓｍａｄ３遺伝子を発現する細胞系のような組換え細胞または非組換え細胞を挙げることができる。例えば、単球細胞、ケラチノサイト細胞、あるいは単球またはケラチノサイトに由来する細胞系を使用することができる。
【００８６】
かかる細胞系を利用する際に、曝露した細胞におけるかかる線維症に対する防御および創傷治癒の改善に関連した細胞表現型（例えば、変化した遊走およびＴＧＦ−βに対する選択的走化性応答）を誘発するのに十分な濃度にて、十分な時間、線維症に対して防御する能力および創傷治癒を改善する能力を示すことが疑わしい化合物に、細胞を曝露させてもよい。曝露後、細胞をアッセイして、例えばＳｍａｄ３　ｍＲＮＡ転写物に関して（例えば、ノーザンブロット分析により）、または細胞中で発現されるＳｍａｄ３タンパク質に関して、細胞溶解産物をアッセイすることにより、Ｓｍａｄ３遺伝子の発現の変化を測定することができ、Ｓｍａｄ３遺伝子の発現を阻害する化合物は、治療薬として優れた候補物である。あるいは、細胞を検査して、線維症または創傷治癒低下に関連した１つまたはそれ以上の細胞表現型が、線維症に対する防御および創傷治癒の改善に関連した細胞表現型のように変化したかどうかを確定する。さらには、Ｓｍａｄ３がその一部であるシグナル伝達経路の成分の発現および／または活性、あるいはＳｍａｄ３シグナル伝達経路自体の活性をアッセイすることができる。
【００８７】
例えば、曝露後に、細胞溶解産物を、非曝露対照細胞に由来する溶解産物と比較して、宿主細胞タンパク質の存在に関してアッセイすることができる。これらのアッセイ系中の特定Ｓｍａｄ３標的遺伝子の発現を阻害する試験化合物の能力は、試験化合物が、Ｓｍａｄ３活性化により開始されるシグナル伝達を阻害することを示す。細胞溶解産物は、ウェスタンブロットを用いて容易にアッセイすることができる。すなわち、宿主細胞タンパク質を、ゲル電気泳動により分離し、転写して、抗宿主細胞タンパク質検出抗体（例えば、放射標識、蛍光、酵素等のようなシグナル発生化合物で標識した抗宿主細胞タンパク質検出抗体）を用いて探索する。あるいは、特定の宿主細胞タンパク質が標的宿主細胞タンパク質に特異的な抗体を用いて固定化されるＥＬＩＳＡ方式を使用することができ、固定化宿主細胞タンパク質の存在または非存在は、標識二次抗体を用いて検出される。さらに別のアプローチでは、カルシウムイオン流のようなイオン流は、Ｓｍａｄ３により刺激されたシグナル伝達の終点として測定することができる。さらなるアプローチでは、その同族ＤＮＡ結合部位へのＳｍａｄ３結合を妨害する化合物に関するアッセイは、ＪｕｎＢプロモーター中のＳｍａｄ結合要素として識別された配列の４つの繰り返しにより駆動される、（ＳＢＥ）４−ルシフェラーゼレポーターのような特定のレポーター構築物を利用する。
【００８８】
さらに、線維症に対する防御および創傷治癒の改善のための動物ベース系は、例えば、線維症の防御および創傷治癒の改善が可能な化合物を識別するために使用され得る。かかる動物モデルは、線維症に対する防御および創傷治癒の改善にて効果的であり得る薬剤、医薬品、治療薬および介入の識別のための試験基質として使用され得る。例えば、曝露した動物モデルにて線維症に対する防御または創傷治癒の改善を誘発するのに十分な濃度にて、十分な時間、線維症の防御および創傷治癒の改善が可能であることが疑わしい化合物を、動物モデルに曝露してもよい。曝露に対する動物の応答を、放射線防護または皮膚創傷治癒を評価することによりモニターすることができる。介入に関しては、線維症の任意の態様に対して防御するか、または創傷治癒の任意の態様を改善する任意の治療が、線維の防御および創傷治癒の改善におけるヒト治療用介入のための候補物としてみなされるべきである。試験薬剤の投与量は、以下の欄にて議論するように、用量応答曲線を得ることにより求められ得る。
【００８９】
線維症を防止するか、もしくは創傷治癒を改善するためのＳｍａｄ３発現またはＳｍａｄ３活性の阻害
Ｓｍａｄ３を中和するか、またはＳｍａｄ３遺伝子の発現（転写または翻訳）を阻害する任意の方法を使用して、線維症に対して防御し、また創傷治癒を改善することができる。かかるアプローチは、創傷の大きさを低減するため、慢性の治癒されない創傷を治療するため、外科手術上の傷を塞ぐことを促進するため、創傷の上皮形成を加速するため、潰瘍（例えば、弱性壊死潰瘍、糖尿病性潰瘍、および静脈鬱血潰瘍）を治療するため、自家皮膚移植片の成長を改善するため、また重症火傷の患者の回復を早めるために使用され得る。かかる方法はまた、慢性炎症に起因する線維症、例えば、肺線維症、糸球体硬化症、および肝硬変に対する抵抗性の付与に、放射線により誘発される線維症に対する防御に、高線量放射線に遭遇したと思われる軍隊の成員のサポートに、例えば癌患者における放射線治療の用量増大の容認に、また瘢痕組織の蓄積の減少に有用であり得る。
【００９０】
例えば、Ｓｍａｄ３に結合して、それを「中和」する、可溶性ペプチド、タンパク質、融合タンパク質、または抗体（抗イディオタイプ抗体を含む）の投与は、線維症を防御し、また創傷治癒を改善するのに使用することができる。この目的のために、ＴＧＦ−βまたはアクチビン受容体の細胞質ドメイン（またはＳｍａｄ３との二量体形成に関与するＳｍａｄのドメイン）に相当するペプチドを利用することができる。あるいは、ＴＧＦ−βまたはアクチビン受容体の細胞質ドメイン（または、Ｓｍａｄ３との二量体形成に関与するＳｍａｄのドメイン）を模倣し、Ｓｍａｄ３を中和する抗イディオタイプ抗体、または抗イディオタイプ抗体のＦａｂ断片を使用することができる。かかるＳｍａｄ３ペプチド、タンパク質、融合タンパク質、抗体、抗イディオタイプ抗体またはＦａｂは、Ｓｍａｄ３を中和し、線維症に対して防御するか、または創傷治癒を改善するのに十分な量で、被験体に投与される。
【００９１】
一実施形態では、ペプチド、タンパク質、融合タンパク質、抗体、抗イディオタイプ抗体またはＦａｂは、細胞透過性化合物である。代替的実施形態では、細胞は、例えば、裸の（ｎａｋｅｄ）ＤＮＡまたはＲＮＡ、プラスミド、コスミド、ＹＡＣ、エレクトロポレーション、リポソーム等の使用を含むがこれらに限定されない形質導入（レトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルスなどのウイルスベクターを用いて）または形質転換手法により、ペプチド、タンパク質、融合タンパク質、抗体、抗イディオタイプ抗体またはＦａｂ用のコード配列を細胞へ導入するための組換えＤＮＡ技法を用いて遺伝子操作される。コード配列は、遺伝子産物の発現を達成するために、強力な構成的プロモーターまたは誘導プロモーター、あるいは組織特異的プロモーターの制御下に置かれ得る。遺伝子産物を発現する操作細胞は、インビトロで生産して、例えば全身的に、腹腔内的に、皮膚創傷治癒の部位にて、患者に導入され得るか、または細胞は、マトリックスに組み込まれて体内移植され得て、例えば遺伝子操作された細胞は、皮膚移植片の一部として移植することができる。あるいは、遺伝子産物を発現する操作細胞は、インビボ遺伝子治療アプローチに従って生産することができる。
【００９２】
好ましい実施形態では、モノクローナル抗体は、３つの異なる方法の１つで生産される。それらは、マウス抗体として生成され得て、次に、ヒト抗体遺伝子による組換えにより「ヒト化（ｈｕｍａｎｉｚｅｄ）」される（Ｋｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ， Ｎａｔｕｒｅ ２５６， ４９５ （１９７５）； Ｗｉｎｔｅｒ ａｎｄ Ｈａｒｒｉｓ， Ｔｒｅｎｄｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． Ｓｃｉ． １４， １３９ （１９９３）； ａｎｄ Ｑｕｅｅｎら， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８６， １００２９ （１９８９））。あるいは、ヒト免疫細胞を移植したヌードマウスにてヒト抗体を生産する（Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎ ａｎｄ Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ， Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｔｏｄａｙ ８， ３９１ （１９９６））。最終的に、抗体はまた、フェースディスプレイ技法により作製することもできる（Ｈｕｓｅら， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４６， １２７５ （１９８９）； Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら， Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ４， １ （１９９８）； ａｎｄ Ｒｏｄｉ ａｎｄ Ｍａｋｏｗｓｋｉ， Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １０， ８７ （１９９９））。
【００９３】
抗体の産生に関して、様々な宿主動物が、Ｓｍａｄ３、Ｓｍａｄ３ペプチド、Ｓｍａｄ３の機能的等価体または突然変異体を注射することにより免疫され得る。かかる宿主動物としては、幾つか例を挙げると、ウサギ、マウスおよびラットが挙げられるが、これらに限定されない。宿主種に依存して、免疫学的応答を増大するために、フロイント（完全および不完全）、水酸化アルミニウムのような鉱物ゲル、リゾレシチン、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、オイルエマルジョン、キーホールリンペットヘモシアニン、ジニトロフェノールのような界面活性物質、およびＢＣＧ（カルメット・ゲラン桿菌）およびコリネバクテリウム・パルバム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ）のような潜在的に有用なヒトアジュバントを含むが、これらに限定されない様々なアジュバントを使用してもよい。ポリクローナル抗体は、免疫動物の血清に由来する抗体分子の異種集団である。
【００９４】
特定抗原に対する抗体の同種集団であるモノクローナル抗体は、培養での連続細胞系による抗体分子の産生を提供する任意の技法により得られ得る。これらとしては、Ｋｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎのハイブリドーマ技法（１９７５， Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５−４９７；および米国特許第４，３７６，１１０号）、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技法（Ｋｏｓｂｏｒら， １９８３， Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ ４：７２； Ｃｏｌｅら， １９８３， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８０：２０２６−２０３０）、およびＥＢＶ−ハイブリドーマ技法（Ｃｏｌｅら， １９８５， Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ， Ａｌａｎ Ｒ． Ｌｉｓｓ， Ｉｎｃ．， ｐｐ．７７−９６）が挙げられるが、これらに限定されない。かかる抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびそれらの任意のサブクラスを含む任意の免疫グロブリンクラスであってもよい。本発明のｍＡｂを産生するハイブリドーマは、インビボまたはインビトロで培養されてもよい。インビボでの高力価のｍＡｂの産生により、これを現在好ましい産生方法にしている。
【００９５】
さらに、適切な生物活性を有するヒト抗体分子由来の遺伝子とともに適切な抗原特異性を有するマウス抗体分子由来の遺伝子をスプライシングすることにより「キメラ抗体」の産生のために開発された技法（Ｍｏｒｒｉｓｏｎら， １９８４， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．， ８１：６８５１−６８５５； Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら， １９８４， Ｎａｔｕｒｅ， ３１２：６０４−６０８； Ｔａｋｅｄａら， １９８５， Ｎａｔｕｒｅ， ３１４：４５２−４５４）を使用することができる。キメラ抗体は、マウスｍＡｂに由来する可変部およびヒト免疫グロブリン定常部を有するもののような、種々の部分が異なる動物種に由来する分子である。
【００９６】
あるいは、単鎖抗体の産生について記載される技法（米国特許第４，９４６，７７８号； Ｂｉｒｄ， １９８８， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３−４２６； Ｈｕｓｔｏｎら， １９８８， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８５：５８７９−５８８３；ａｎｄ Ｗａｒｄら， １９８９， Ｎａｔｕｒｅ ３３４：５４４−５４６）は、Ｓｍａｄ３遺伝子産物に対する単鎖抗体を産生するのに適応され得る。単鎖抗体は、アミノ酸架橋によりＦｖ領域の重鎖断片および軽鎖断片を連結して、単鎖ポリペプチドを生じることにより形成される。
【００９７】
特定エピトープを認識する抗体断片は、既知の技法により生成され得る。例えば、かかる断片には、抗体分子のペプシン消化により産生され得るＦ（ａｂ’）２断片、およびＦ（ａｂ’）２断片のジスルフィド架橋を減少させることにより生成され得るＦａｂ断片が挙げられるが、これらに限定されない。あるいは、所望の特異性を有するモノクローナルＦａｂ断片の迅速かつ容易な識別を可能にするために、Ｆａｂ発現ライブラリーが構築され得る（Ｈｕｓｅら， １９８９， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２４６：１２７５−１２８１）。
【００９８】
また、Ｓｍａｄ３のリガンドに対する抗体は、当業者に既知の技法を用いて、これらのリガンドを「模倣する（ｍｉｍｉｃ）」抗イディオタイプ抗体を生成するために利用され得る（例えば、Ｇｒｅｅｎｓｐａｎ ＆ Ｂｏｎａ， １９８３， ＦＡＳＥＢ Ｊ ７（５）：４３７−４４４； ａｎｄ Ｎｉｓｓｉｎｏｆｆ， １９９１， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １４７（８）：２４２９−２４３８を参照）。例えば、ＴＧＦ−βまたはアクチビン受容体の細胞質ドメイン（またはＳｍａｄ３との二量体形成の関与するＳｍａｄのドメイン）に結合して、ＴＧＦ−βまたはアクチビン受容体（またはＳｍａｄ３との二量体形成に関与するＳｍａｄ）へのＳｍａｄ３の結合を競合的に阻害する抗体は、これらのリガンドを「模倣する（ｍｉｍｉｃ）」抗イディオタイプ、したがって、Ｓｍａｄ３を結合して中和する抗イディオタイプを生成するのに使用することができる。かかる中和抗イディオタイプまたはかかる抗イディオタイプのＦａｂ断片は、Ｓｍａｄ３を中和して、線維症に対して防御し、創傷治癒を改善するための治療レジメン（ｒｅｇｉｍｅｎ）にて使用することができる。
【００９９】
代替的実施形態では、線維症を防止して、創傷治癒を改善するための介入は、例えば、Ｓｍａｄ３　ｍＲＮＡ転写物の翻訳を阻害もしくは防止するためのアンチセンスまたはリボザイムアプローチ、Ｓｍａｄ３遺伝子の転写を阻害するための三重らせんアプローチ、あるいはＳｍａｄ遺伝子またはその内因性プロモーターを不活性化または「ノックアウト（ｋｎｏｃｋ ｏｕｔ）」するための標的相同組換えを用いて、内因性Ｓｍａｄ３遺伝子発現レベルを低減させることにより設計することができる。送達技法は、好ましくは、全身性アプローチ用に設計され得る。あるいは、本明細書中に記載するアンチセンス、リボザイムまたはＤＮＡ構築物は、標的細胞を含有する部位、例えば、皮膚創傷治癒の部位に直接投与され得る。
【０１００】
アンチセンスアプローチ（ａｎｉｔｓｅｎｓｅ ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ）は、Ｓｍａｄ３　ｍＲＮＡに相補的なオリゴヌクレオチド（ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれか）の設計を含む。アンチセンスヌクレオチドは、相補的Ｓｍａｄ３　ｍＲＮＡ転写物に結合し、翻訳を防止するであろう。絶対的な相補性が好ましいが、必要ではない。本明細書で称する場合、ＲＮＡの一部に「相補的な（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ）」配列は、ＲＮＡとハイブリダイズすることが可能であるのに十分な相補性を有し、安定な二重鎖を形成する配列を意味し、したがって、二重鎖アンチセンス核酸の場合には、二重鎖ＤＮＡの一本鎖を試験してもよく、あるいは三重鎖形成をアッセイしてもよい。ハイブリダイズする能力は、アンチセンス核酸の相補性の度合いおよび長さに依存するであろう。一般に、ハイブリダイズする核酸が長いほど、それはＲＮＡとの塩基ミスマッチを多く含有し、安定な二重鎖（または場合によっては三重鎖）を依然として形成する。当業者は、ハイブリダイズした複合体の融点を測定するための標準的な方法を用いて、ミスマッチ（ｍｉｓｍａｔｃｈ）の許容度を確認することができる。
【０１０１】
メッセージの５’末端（例えば、ＡＵＧ開始コドンを含む５’非翻訳配列）に相補的なオリゴヌクレオチドは、翻訳を阻害する際に最も効率的に作用すべきである。しかしながら、ｍＲＮＡの３’非翻訳配列に相補的な配列も同様に、ｍＲＮＡの翻訳を阻害する際に効果的であることが最近示されてきた。一般に、Ｗａｇｎｅｒ， Ｒ．， １９９４， Ｎａｔｕｒｅ ３７２：３３３−３３５を参照されたい。したがって、５’または３’非翻訳のＳｍａｄの非コード領域に相補的なオリゴヌクレオチドは、内因性Ｓｍａｄ３　ｍＲＮＡの翻訳を阻害するためのアンチセンスアプローチにて使用することができる。ｍＲＮＡの５’非翻訳領域に相補的なオリゴヌクレオチドは、ＡＵＧ開始コドンの相補体を含むべきである。ｍＲＮＡコード領域に相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドはまた、本発明により使用され得る。Ｓｍａｄ３　ｍＲＮＡの５’領域、３’領域、またはコード領域にハイブリダイズするように設計されようと、アンチセンス核酸は、少なくとも６ヌクレオチド長であるべきであり、好ましくは、６〜約５０ヌクレオチド長の範囲のオリゴヌクレオチドである。特定の態様では、オリゴヌクレオチドは、少なくとも６個のヌクレオチド、少なくとも１７個のヌクレオチド、少なくとも２５個のヌクレオチド、または少なくとも５０個のヌクレオチドである。
【０１０２】
標的核酸の選択に関わらず、アンチセンスオリゴヌクレオチドの、遺伝子発現を阻害する能力を定量化するために、まずインビトロ研究が実施されるのが好ましい。これらの研究は、オリゴヌクレオチドのアンチセンス遺伝子阻害と非特異的生物学的効果とを区別する対照を利用することが好ましい。これらの研究は、内部対照ＲＮＡまたはタンパク質のレベルと、標的ＲＮＡまたはタンパク質のレベルを比較することも好ましい。さらに、アンチセンスオリゴヌクレオチドを用いて得られる結果を、対照オリゴヌクレオチドを用いて得られる結果と比較することを意図する。対照オリゴヌクレオチドは、試験オリゴヌクレオチドとほぼ同じ長さであり、オリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列は、標的配列への特異的ハイブリダイゼーションを防止するのに必要なアンチセンス配列だけ異なることが好ましい。
【０１０３】
オリゴヌクレオチドは、一本酸または二本鎖のＤＮＡもしくはＲＮＡ、あるいはそれらのキメラ混合物または誘導体または修飾型であり得る。オリゴヌクレオチドは、例えば分子の安定性、ハイブリダイゼーション等を改良するために、塩基部分、糖部分またはリン酸バックボーン（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂａｃｋｂｏｎｅ）にて修飾され得る。オリゴヌクレオチドは、ペプチド（例えば、インビボで宿主細胞受容体を標的とするため）、細胞膜を通過しての輸送を促進する作用物質（例えば、Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら， １９８９， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ８６：６５５３−６５５６； Ｌｅｍａｉｔｒｅら， １９８７， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ８４：６４８−６５２； １９８８年１２月１５日に公開されたＰＣＴ国際公開第８８／０９８１０号を参照）、または他のバリア、ハイブリダイゼーション誘発開裂剤（例えば、Ｋｒｏｌら， １９８８， Ｂｉｏ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ６：９５８−９７６を参照）、またはインターカレート剤（例えば、Ｚｏｎ， １９８８， Ｐｈａｒｍ． Ｒｅｓ． ５：５３９−５４９を参照）のような他の付随群を含んでもよい。この目的のために、オリゴヌクレオチドは、別の分子、例えば、ペプチド、ハイブリダイゼーション誘発架橋剤、輸送剤、ハイブリダイゼーション誘発開裂剤等に結合されてもよい。
【０１０４】
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４−アセチルシトシン、５−（カルボキシヒドロキシメチル）ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、β−Ｄ−ガラクトシルクェオシン、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−アデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、β−Ｄ−マンノシルクェオシン、５’−メトキシカルボキシメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、ワイブトキソシン、プソイドウラシル、クエオシン（ｑｕｅｏｓｉｎ）、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、５−メチル−２−チオウラシル、３−（３−アミノ−３−Ｎ−２−カルボキシプロピル）ウラシル、（ａｃｐ３）ｗ、および２，６−ジアミノプリンを含むが、これらに限定されない群から選択される少なくとも１つの修飾塩基部分を含んでもよい。
【０１０５】
アンチセンスオリゴヌクレオチドはまた、アラビノース、２−フルオロアラビノース、キシルロース、およびヘキソースを含むが、これらに限定されない群から選択される少なくとも１つの修飾糖部分を含んでもよい。
【０１０６】
さらに別の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホルアミドチオエート、ホルホルアミデート、ホスホルジアミデート、メチルホスホネート、アルキルホスホトリエステル、およびホルムアセタールまたはその類縁体からなる群から選択される少なくとも１つの修飾リン酸バックボーンを含む。
【０１０７】
本発明のオリゴヌクレオチドは、例えば、自動ＤＮＡ合成機（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ， Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ， ｅｔｃ．で市販されているもののような）を用いて、当該技術分野で既知の標準的方法により合成され得る。例として、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは、Ｓｔｅｉｎ等の方法（１９８８， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １６：３２０９）により合成されてもよく、メチルホスホネートオリゴヌクレオチドは、制御孔ガラスポリマー支持体（Ｓａｒｉｎら， １９８８， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ８５：７４４８−７４５１）等を用いて調製することができる。
【０１０８】
アンチセンス分子は、インビボでＳｍａｄ３タンパク質を発現する細胞、例えば、皮膚創傷治癒の部位に送達されるべきである。アンチセンスＤＮＡまたはＲＮＡを細胞に送達するための多数の方法が開発されてきた。例えば、アンチセンス分子は、組織部位に直接注射され得るか、あるいは所望の細胞を標的とするように設計した修飾アンチセンス分子（例えば、標的細胞表面上に発現された受容体もしくは抗原を特異的に結合するペプチドまたは抗体に結合したアンチセンス）は、全身的に投与され得る。
【０１０９】
しかしながら、内因性ｍＲＮＡの翻訳を阻害するのに十分なアンチセンスの細胞内濃度を達成することは、多くの場合困難である。したがって、好ましいアプローチでは、アンチセンスオリゴヌクレオチドが強力なｐｏｌＩＩＩまたはｐｏｌＩＩプロモーターの制御下に置かれた組換えＤＮＡ構築物を利用する。患者にて標的細胞をトランスフェクトするためのかかるＤＮＡ構築物の使用は、内因性Ｓｍａｄ３転写物と相補的塩基対を形成し、それによりＳｍａｄ３　ｍＲＮＡの翻訳を防止する十分量の一本鎖ＲＮＡの翻訳をもたらす結果となるであろう。例えば、ベクターは、細胞に取り込まれて、アンチセンスＲＮＡの転写を誘導するように、インビボで導入され得る。かかるベクターは、所望のアンチセンスＲＮＡを生産するように転写され得る限りは、エピソームにとどまることができるか、または染色体に組み込まれるようになり得る。かかるベクターは、当該技術分野で標準的な組換えＤＮＡ技術方法により構築され得る。ベクターは、哺乳動物での複製および発現に使用される、プラスミド、ウイルス、または当該技術分野で既知の他のものであり得る。アンチセンスＲＮＡをコードする配列の発現は、哺乳動物、好ましくはヒト細胞にて作用するための、当該技術分野で既知の任意のプロモーターによるものであり得る。かかるプロモーターは、誘導性または構成的であり得る。かかるプロモーターとしては、ＳＶ４０初期プロモーター領域（Ｂｅｒｎｏｉｓｔ ａｎｄ Ｃｈａｍｂｏｎ， １９８１， Ｎａｔｕｒｅ ２９０：３０４−３１０）、ラウス肉腫ウイルスの３’末端反復配列に含有されるプロモーター（Ｙａｍａｍｏｔｏら， １９８０， Ｃｅｌｌ ２２：７８７−７９７）、ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター（Ｗａｇｎｅｒら， １９８１， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ７８：１４４１−１４４５）、メタロチオネイン遺伝子の調節配列（Ｂｒｉｎｓｔｅｒら， １９８２， Ｎａｔｕｒｅ ２９６：３９−４２）等が挙げられるが、これらに限定されない。創傷を含む様々な適切な刺激により誘導される発現を有するケラチン系ベクターのような上皮特異的プロモーターが望ましい場合がある。プラスミド、コスミド、ＹＡＣまたはウイルスベクターのいずれの型も、組織部位、例えば、皮膚創傷治癒の部位に直接導入され得る組換えＤＮＡ構築物を調製するのに使用され得る。あるいは、所望の組織を選択的に感染するウイルスベクターを使用することができ（例えば、皮膚に関しては、パピローマウイルスベクターが使用され得る）、そのような場合には、投与は、別の経路により（例えば、全身的に）達成されてもよい。
【０１１０】
Ｓｍａｄ３　ｍＲＮＡ転写物を触媒的に開裂するように設計されたリボザイム分子もまた、Ｓｍａｄ３　ｍＲＮＡの翻訳およびＳｍａｄ３の発現を防止するのに使用することができる（例えば、１９９０年１０月４日に公開されたＰＣＴ国際公開第９０／１１３６４号； Ｓａｒｖｅｒら， １９９０， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４７：１２２２−１２２５を参照）。部位特異的認識配列にてｍＲＮＡを開裂するリボザイムは、Ｓｍａｄ３　ｍＲＮＡを破壊するために使用され得るものの、ハンマーヘッド型リボザイム（ｈａｍｍｅｒｈｅａｄ ｒｉｂｏｚｙｍｅｓ）の使用が好ましい。ハンマーヘッド型リボザイムは、標的ｍＲＮＡと相補的塩基対を形成するフランキング領域（ｆｒａｎｋｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ）により指示される位置にてｍＲＮＡを開裂する。唯一の要件は、標的ｍＲＮＡが以下の２つの塩基：５’−ＵＧ−３’の配列を有することである。ハンマーヘッド型リボザイムの構築および生産は、当該技術分野で既知であり、Ｈａｓｅｌｏｆｆ ａｎｄ Ｇｅｒｌａｃｈ， １９８８， Ｎａｔｕｒｅ， ３３４：５８５−５９１により十分に記載されている。ヒトＳｍａｄ３　ｃＤＮＡのヌクレオチド配列内には多数の潜在的ハンマーヘッド型リボザイム開裂部位が存在する。好ましくは、リボザイムは、開裂認識部位が、Ｓｍａｄ３　ｍＲＮＡの５’末端付近に位置するように、すなわち、効率的に増加させて非機能性ｍＲＮＡ　転写物の細胞内蓄積を最低限に抑えるように操作される。
【０１１１】
本発明のリボザイムはまた、テトラヒメナ　サーモフィラ（Ｔｅｔｒａｈｙｍｅｎａ Ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）（ＩＶＳまたはＬ−１９　ＩＶＳ　ＲＮＡとして既知）にて自然に存在し、Ｔｈｏｍａｓ Ｃｅｃｈおよび共同者により詳細に記載されているＲＮＡエンドリボヌクレアーゼ（以下「Ｃｅｃｈ型リボザイム（Ｃｅｃｈ−ｔｙｐｅ ｒｉｂｏｚｙｍｅ）」）を含む（Ｚａｕｇら， １９８４， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２２４：５７４−５７８； Ｚａｕｇ ａｎｄ Ｃｅｃｈ， １９８６， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２３１：４７０−４７５； Ｚａｕｇら， １９８６， Ｎａｔｕｒｅ， ３２４：４２９−４３３； 公開済国際特許出願第８８／０４３００号（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐａｔｅｎｔｓ Ｉｎｃ．）； Ｂｅｅｎ ａｎｄ Ｃｅｃｈ， １９８６， Ｃｅｌｌ， ４７：２０７−２１６）。Ｃｅｃｈ型リボザイムは、標的ＲＮＡ配列にハイブリダイズする８塩基対活性部位を有しており、それ以降で標的ＲＮＡの開裂が起こる。本発明は、Ｓｍａｄ３に存在する８塩基対活性部位配列を標的とするＣｅｃｈ型リボザイムを含む。
【０１１２】
アンチセンスアプローチのように、リボザイムは、（例えば、高められた安定性、ターゲティング等のために）修飾オリゴヌクレオチドから構成され得て、インビボでＳｍａｄ３を発現する細胞、例えば、皮膚創傷治癒の部位に送達されるべきである。好ましい送達方法は、極力な構成的ｐｏｌＩＩＩまたはｐｏｌＩＩプロモーターの制御下にあるリボザイムを「コード（ｅｎｃｏｄｉｎｇ）」するＤＮＡ構築物を使用することを含み、その結果、トランスフェクトした細胞は内因性Ｓｍａｄ３メッセージを破壊して翻訳を阻害するのに十分量のリボザイムを生産するであろう。アンチセンス分子と異なり、リボザイムは触媒性であるため、効率のためにより低い細胞内濃度が要される。
【０１１３】
内因性Ｓｍａｄ３遺伝子発現はまた、標的相同組換えを用いてＳｍａｄ３遺伝子もしくはそのプロモーターを不活性化または「ノックアウト（ｋｎｏｃｋ ｏｕｔ）」することにより減少され得る（例えば、Ｓｍｉｔｈｉｅｓら， １９８５， Ｎａｔｕｒｅ ３１７：２３０−２３４； Ｔｈｏｍａｓ ＆ Ｃａｐｅｃｃｈｉ， １９８７， Ｃｅｌｌ ５１：５０３−５１２； Ｔｈｏｓｍｐｓｏｎら， １９８９ Ｃｅｌｌ ５：３１３−３２１を参照）。例えば、内因性Ｓｍａｄ３遺伝子（Ｓｍａｄ３遺伝子のコード領域または調節領域）に相同性のＤＮＡに隣接する突然変異非機能性Ｓｍａｄ３タンパク質（または完全に未関連のＤＮＡ配列）は、インビボでＳｍａｄ３を発現する細胞をトランスフェクトするために、選択可能マーカーおよび／またはネガティブ選択可能マーカーありまたはなしで使用することができる。標的相同組換えによるＤＮＡ構築物の挿入は、Ｓｍａｄ３遺伝子の不活性化をもたらす。組換えＤＮＡ構築物が、適切なウイルスベクター（例えば、皮膚創傷治癒の部位へのインビボ送達用のパピローマウイルスベクター、または自家皮膚移植片のインビトロ形質転換用のレトロウイルスベクター）を用いて所要の部位に直接投与されるか、あるいは標的とされる場合には、このアプローチは、ヒトでの使用に許容される。
【０１１４】
あるいは、内因性Ｓｍａｄ３遺伝子発現は、Ｓｍａｄ３遺伝子の調節領域（すなわち、Ｓｍａｄ３プロモーターおよび／またはエンハンサー）に相補的なデオキシリボヌクレオチオド配列を標的として、体内の標的細胞においてＳｍａｄ３遺伝子の転写を防止する三重らせん構造を形成することにより減少され得る（一般に、Ｈｅｌｅｎｅ， Ｃ． １９９１， Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓ．， ６（６）：５６９−８４； Ｈｅｌｅｎｅ， Ｃ．ら， １９９２， Ａｎｎ， Ｎ．Ｙ． Ａｃｃａｄ． Ｓｃｉ．， ６６０：２７−３６； ａｎｄ Ｍａｈｅｒ， Ｌ．Ｊ．， １９９２， Ｂｉｏａｓｓａｙｓ １４（１２）：８０７−１５を参照）。
【０１１５】
本発明のさらに別の実施形態では、Ｓｍａｄ３の活性は、線維症に対して防御し、創傷治癒を改善するための「優性ネガティブ（ｄｏｍｉｎａｎｔ ｎｅｇａｔｉｖｅ）」アプローチを用いて減少され得る。この目的のために、欠陥Ｓｍａｄ３タンパク質をコードする構築物は、適切な標的細胞にてＳｍａｄ３の活性を低減するための遺伝子治療アプローチにて使用することができる。例えば、ドメインまたはドメインの一部が欠失されたか、または突然変異されたＳｍａｄ３の宿主細胞発現を誘導するヌクレオチド配列は、高線量の放射線曝露または皮膚創傷治癒の部位にて細胞に導入することができる（上述の遺伝子治療により）。あるいは、標的相同組換えを利用して、高線量の放射線曝露または皮膚創傷治癒の部位にて被験体の内因性Ｓｍａｄ３遺伝子にかかる欠失または突然変異を導入することができる。操作細胞は、非機能性Ｓｍａｄ３（すなわち、天然のリガンドの結合が可能であるが、シグナル伝達が不可能なＳｍａｄ３）を発現するであろう。高線量の放射線曝露または皮膚創傷治癒の部位でのかかる操作細胞は、ＴＧＦ−βに対する高度の応答を実証するはずであり、線維症に対する防御および創傷治癒の改善をもたらす。
【０１１６】
薬学的調製物および投与方法
Ｓｍａｄ３遺伝子発現またはＳｍａｄ３活性に影響を及ぼすと確定される化合物を、線維症に対する防御および創傷治癒の改善のために、治療上有効な用量にて患者に投与することができる。治療上有効な用量は、線維症に対する防御および創傷治癒の改善をもたらすのに十分な化合物量を指す。本発明の化合物は一般に、ヒトを含む動物に投与される。
【０１１７】
有効用量
かかる化合物の毒性および治療上の有効性は、例えばＬＤ５０（集団の５０％に対する致死用量）およびＥＤ５０（集団の５０％にて治療上有効な用量）を決定するための、細胞培養または実験動物での標準的な薬学的手法により決定することができる。毒性と治療上の効果との用量比が、治療指数であり、それは、ＬＤ５０／ＥＤ５０の比として表すことができる。大きな治療指数を示す化合物が好ましい。有毒な副作用を示す化合物を用いてもよいが、未感染細胞に対する損傷の可能性を最低限に抑えるために、罹患組織部位にかかる化合物を標的とする送達系を設計する措置を取り、それにより副作用を低減すべきである。
【０１１８】
細胞培養アッセイおよび動物研究から得られるデータは、ヒトでの使用のための投与量範囲を処方するのに使用することができる。かかる化合物の投与量は、好ましくは、毒性がほとんどまたは全くなしでＥＤ５０を含む循環濃度範囲内で存在する。投与量は、使用する投薬形態および使用する投与経路に依存して、この範囲内で変化し得る。本発明に方法で使用される任意の化合物に関して、治療上有効な用量は、細胞培養アッセイから最初に推定することができる。用量は、細胞培養で決定される場合のＩＣ５０を含む循環血漿濃度範囲（すなわち、症状の最大の半分を阻害する試験化合物濃度）を達成するために動物モデルにて処方され得る。かかる情報は、ヒトでの有用な用量をより正確に決定するのに使用され得る。血漿中レベルは、例えば高速液体クロマトグラフィーにより測定され得る。
【０１１９】
特定用途での活性化合物の正確な好ましい量は、利用される特定化合物、配合される特定組成物、適用様式、ならびに特定位置および治療される生物体に応じて変化することが理解されるであろう。所定の宿主のための投与量は、例えば、対象化合物と既知の薬剤の特異的活性の通例の比較により、例えば適切な従来の薬理学的プロトコルを用いて、従来の考察を使用して決定することができる。
【０１２０】
配合および使用
本発明の薬理学的に活性な化合物は、患者、例えばヒトを含む哺乳動物への投与のための薬剤を製造するためのガレノス式薬剤調合の従来法に従って加工することができる。
【０１２１】
本発明の化合物は、従来の賦形剤、すなわち、非経口適用、経腸的（例えば、経口）適用または局所適用に適切であり、活性化合物と有害に反応しない薬学的に許容可能な有機または無機担体物質と混合して使用され得る。適切な薬学的に許容可能な担体としては、水、塩溶液、アルコール、アラビアゴム、植物油、ベンジルアルコール、ポリエチレングリコール、ゼラチン、ラクトース、アミロースまたはデンプンのような炭水化物、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ケイ酸、粘性パラフィン、香油、脂肪酸モノグリセリドおよびジグリセリド、ペンタエリスリトール脂肪酸エステル、ヒドロキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドン等が挙げられるが、これらに限定されない。薬学的組成物は、滅菌することができ、望ましい場合には、助剤、例えば、活性物質と有害に反応しない、潤滑剤、防腐剤、安定剤、湿潤剤、乳化剤、浸透圧に影響を与える塩、緩衝液、着色剤、香料物質および／または芳香性物質等と混合され得る。それらはまた、望ましい場合には、他の活性物質（例えば、ビタミン）と組み合わせ得る。
【０１２２】
非経口適用に関して、特に適切なのは、注射可能な滅菌溶液、好ましくは油性または水性溶液、ならびに懸濁液、乳濁液、または坐薬を含む移植片である。アンプルは、簡便な単位用量である。
【０１２３】
経腸的適用に関して、特に適切なのは、錠剤、糖剤、液体、ドロップ、坐薬、またはカプセルである。甘味媒質を用いたシロップ、エリキシル等を使用することができる。
【０１２４】
持続性または有向性放出組成物は、リポソーム中への含有または適切な担体、例えばＤＭＳＯを用いた経皮パッチへの組込みにより配合され得る。これらの化合物を凍結乾燥して、例えば注射用生成物の調製用に、得られた凍結乾燥物を使用することもまた可能である。
【０１２５】
局所適用に関して、局所適用に適合性の担体を含み、好ましくは水よりも大きな動的粘度を有する噴霧不可能な形態、粘性〜半固形形態または固形形態として使用される。適切な配合物としては、溶液、懸濁液、乳濁液、クリーム、軟膏、粉末、リニメント剤、膏薬、エーロゾル等が挙げられるが、これらに限定されず、それらは、望ましい場合、滅菌されるか、または助剤、例えば防腐剤、安定剤、湿潤剤、緩衝液または浸透圧に影響を与える塩等と混合される。局所適用に関して、好ましくは固体または液体不活性担体物質と組み合わせた有効成分がスクイーズボトル（ｓｑｕｅｅｚｅ ｂｏｔｔｌｅ）中に、または加圧した揮発性の通常ガス性の推進剤（例えば、フレオン）と混合して詰められた噴霧可能なエーロゾル調製物もまた適切である。
【０１２６】
組成物は、望ましい場合には、有効成分を含有する１つまたはそれ以上の単位投薬形態を含有するパック（ｐａｃｋ）またはディスペンサー装置にて与えられてもよい。パックは例えば、ブリスター包装のような金属ホイルまたはプラスチックホイルを含んでもよい。パックまたはディスペンサー装置には、投与のための指示書を添えてもよい。
【０１２７】
創傷治癒促進を導くＳｍａｄ３崩壊
全層切開創傷（Ａｓｈｃｒｏｆｔ， Ｇ．Ｓ． ら エストロゲンはＴＧＦ−β１レベルの増加に関連した皮膚創傷治癒を促進する（Ｅｓｔｒｏｇｅｎ ａｃｃｅｌｅｒａｔｅｓ ｃｕｔａｎｅｏｕｓ ｗｏｕｎｄ ｈｅａｌｉｎｇ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ａｎ ｉｎｃｒｅａｓｅ ｉｎ ＴＧＦ−ｂｅｔａ １ ｌｅｖｅｌｓ）． Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ． ３， １２０９−１２１５ （１９９７））後、創傷治癒の速度は、健常なＳｍａｄ３ｅｘ８／ｅｘ８マウスにて著しく促進され（表１）、野生型マウスでの５日目に対してヌルマウスでは創傷後２日目までに完全な再上皮形成が生じ（図１ｂ）、また創傷治癒面積の有意な減少（図１ａ）および創傷幅の有意な減少が見られた。全細胞数（線維芽細胞および炎症細胞）は、Ｓｍａｄ３ｅｘ８／ｅｘ８マウスの創傷にて著しく減少し、野生型対照と比較して、中間的な数がヘテロ接合性マウスに存在した（図１ｃ）。単球マーカー用の免疫染色と合わせた切片のギムザ染色は、好中球および単球の両方がＳｍａｄ３ｅｘ８／ｅｘ８マウスの初期の創傷にほとんど存在しないことを示した。Ｓｍａｄ３ｅｘ８／ｅｘ８マウスの創傷面積は、野生型マウスの面積よりも有意に小さく、肉芽組織の量の減少があらゆる時点で存在した。創傷の縮小が、再上皮形成および筋線維芽細胞作用の相対的寄与により生じ、したがって、Ｓｍａｄ３ｅｘ８／ｅｘ８マウスでの再上皮形成の促進および／または創傷線維芽細胞の収縮性の増加がおそらくこの表現型に寄与する。この観察は、中心の肉芽組織は創傷閉鎖に重要でない場合があることを示すこれまでの異論の多い研究を確証する（Ｇｒｏｓｓ， Ｊ． ら Ｏｎ ｔｈｅ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ｓｋｉｎ ｗｏｕｎｄ ”ｃｏｎｔｒａｃｔｉｏｎ”： ａ ｇｒａｎｕｌａｔｉｏｎ ｔｉｓｓｕｅ ”ｋｎｏｃｋｏｕｔ” ｗｉｔｈ ａ ｎｏｒｍａｌ ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ． Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９２， ５９８２−５９８６ （１９９５））。
【０１２８】
【表１】
2004510696.tif 000003
【０１２９】
創傷治癒応答に対する外因性ＴＧＦ−βの影響
創傷部位での脱顆粒血小板から放出されるＴＧＦ−βは、創傷治癒に関与する多様な細胞型のそれぞれに対する広範囲な影響を有し、その多様な細胞型のそれぞれにより分泌される。具体的には、これらの細胞としては、皮膚バリアの再構成を担うケラチノサイト、マトリックス産生を担う線維芽細胞、および初期段階で創傷に浸潤し、ＴＧＦ−βを含む多くの一連の細胞制御サイトカインを分泌する単球が挙げられる（Ｒｏｂｅｒｔｓ， Ａ．Ｂ． ＴＧＦ−ｂｅｔａ： ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ ｅｆｆｉｃａｃｙ ｉｎ ａｎｉｍａｌ ｍｏｄｅｌｓ ｏｆ ｗｏｕｎｄ ｈｅａｌｉｎｇ． Ｗｏｕｎｄ Ｒｅｐａｉｒ Ｒｅｇｅｎ． ３， ４０８−４１８ （１９９５））； （Ｏ’Ｋａｎｅ， Ｓ． ＆ Ｆｅｒｇｕｓｏｎ， Ｍ．Ｗ．Ｊ． ＴＧＦ−ｂｅｒａ ａｎｄ ｗｏｕｎｄ ｈｅａｌｉｎｇ． Ｉｎｔ． Ｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． ２９， ６３−７８ （１９９７））。本発明者等は、ヌルマウスの創傷における単球数の顕著な減少を観察したため、治癒表現型の一部は、これらの炎症細胞により分泌される強力な単球化学誘引物質であるＴＧＦ−βのレベルの減少の二次的なものであることを提唱した（Ｗａｈｌ， Ｓ．Ｍ． ら Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｔｙｐｅ ｂｅｔａ ｉｎｄｕｃｅｓ ｍｏｎｏｃｙｔｅ ｃｈｅｍｏｔａｘｉｓ ａｎｄ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ． Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８４， ５７８８−５７９２ （１９８７））。さらに、動物モデルでの単球の減少は、ＴＧＦ−β分泌でのこれらの細胞の役割と一致して、線維症応答の減少を引き起こす（Ｌｅｉｂｏｖｉｃｈ， Ｓ．Ｊ． ＆ Ｒｏｓｓ， Ｒ． Ｔｈｅ ｒｏｌｅ ｏｆ ｔｈｅ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ ｉｎ ｗｏｕｎｄ ｒｅｐａｉｒ． Ａ ｓｔｕｄｙ ｗｉｔｈ ｈｙｄｒｏｃｏｒｔｉｓｏｎｅ ａｎｄ ａｎｔｉｍａｃｒｏｐｈａｇｅ ｓｅｒｕｍ． Ａｍ． Ｊ． Ｐａｔｈｏｌ． ７８，７１−１００ （１９７５））； （ＭｃＣａｒｔｎｅｙ−Ｆｒａｎｃｉｓ， Ｎ．， ＆ Ｗａｈｌ， Ｓ．Ｍ． Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｂｅｔａ： ａ ｍａｔｔｅｒ ｏｆ ｌｉｆｅ ａｎｄ ｄｅａｔｈ． Ｊ． Ｌｅｕｋ． Ｂｉｏｌ． ５５， ４０１−１０９ （１９９４））。ＴＧＦ−βは、おそらく血小板α−顆粒から放出されるＴＧＦ−βを提示するすべての動物の血清中で同等のレベルで存在する（図２ａ）が、ヌルマウスは、特に３日目に、創傷白血球でのＴＧＦ−βイソ型の免疫染色の減少およびＴＧＦ−β１　ＲＮＡレベルの減少を示し（図２ｂ）、局所的なＴＧＦ−β１量の減少が、これらのマウスの異常創傷治癒表現型に寄与するという本発明者等の仮説を支持した。
【０１３０】
この問題に対処するために、本発明者等は、創傷直前に局所用ＴＧＦ−β１を塗布した。ＴＧＦ−β１での処置後、炎症細胞数は、ヘテロ接合体では増加したが、Ｓｍａｄ３ｅｘ８／ｅｘ８損傷では増加せず、Ｓｍａｄ３がＴＧＦ−β媒介性走化性に重要であり得ることを示した。単球漸増には影響を及ぼさなかったにもかかわらず、Ｓｍａｄ３ｅｘ８／ｅｘ８マウスの創傷へのＴＧＦ−βの添加は、マトリックス沈着を増大させ、単球がＴＧＦ−βの産生により間接的にマトリックス沈着に影響を与えることを示した従来の研究を確証した（Ｐｉｅｒｃｅ， Ｇ．Ｆ．ら Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｂｅｔａ ｒｅｖｅｒｓｅｓ ｔｈｅ ｇｌｕｃｏｃｏｒｔｉｃｏｉｄ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｗｏｕｎｄ−ｈｅａｌｉｎｇ ｄｅｆｉｃｉｔ ｉｎ ｒａｔｓ： ｐｏｓｓｉｂｌｅ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｉｎ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ ｂｙ ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ． Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８６， ２２２９−２２３３ （１９８９））。外因性ＴＧＦ−β１は、Ｓｍａｄ３ｅｘ８／ｅｘ８マウスにおけるＴＧＦ−β１の局所レベルの減少がこれらの動物におけるマトリックス沈着の減少を生じるという概念と一致して、線維芽細胞数の増加の徴候なしに、とりわけヌルマウスおよびヘテロ接合性マウスにて、マトリックス沈着を刺激した。さらに、これらのデータは、ヌルマウスの創傷におけるＴＧＦ−β受容体の発現が、マトリックス産生に適していることを示す（図２ｃ）。ＳＭＡＤシグナル伝達経路は、コラーゲン発現に重要であり得るが、一方フィブロネクチン（マトリックス）合成は、ｃ−Ｊｕｎ（ＳＭＡＤ非依存性）経路を通じてＴＧＦ−βにより誘発され得る（Ｖｉｎｄｅｖｏｇｈｅｌ， Ｌ． ら ＳＭＡＤ３／４−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｔｙｐｅ ＶＩＩ ｃｏｌｌａｇｅｎ ｇｅｎｅ （ＣＯＬ７Ａ１） ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｂｙ ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｂｅｔａ） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９５， １４７６９−１４７７４ （１９８８））； （Ｃｈｅｎ， Ｓ．Ｊ． Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｙｐｅ Ｉ ｃｏｌｌａｇｅｎ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｓｋｉｎ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ ｂｙ ＴＧＦ−ｂｅｔａ： ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ ｏｆ Ｓｍａｄ３）． Ｊ． Ｉｎｖｅｓｔ． Ｄｅｒｍａｔｏｌ． １１２， ４９−５７ （１９９９））； （Ｈｏｃｅｖａｒ， Ｂ．Ａ．， Ｂｒｏｗｎ， Ｔ．Ｌ． ＆ Ｈｏｗｅ， Ｐ．Ｈ． ＴＧＦ−ｂｅｔａ ｉｎｄｕｃｅｓ ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｔｈｒｏｕｇｈ ａ ｃ−Ｊｕｎ Ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌ Ｋｉｎａｓｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ， Ｓｍａｄ４−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｐａｔｈｗａｙ． ＥＭＢＯ Ｊ． １８， １３４５−１３５６ （１９９９））。これと一致して、本発明者等のデータもまた、インビボでの初期線維芽細胞マトリックス産生でのＳｍａｄ３非依存性経路を含意する。
【０１３１】
局所単球流入の減少を引き起こすメカニズム
Ｓｍａｄ３が、単球機能にて潜在的に重要であるように思われるため、本発明者等は、これらの観察を引き起こすメカニズムに焦点を当てた。循環単球が損傷／炎症の部位に浸潤する場合、それらはまず、局所化学誘引物質シグナルに応答して、内皮基底膜を横断しなくてはならない。インビボにて、ＴＧＦ−βのフェムトモル濃度は循環血中単球により最も強力な既知の化学誘引物質応答を誘発するので、ＴＧＦ−βは、この応答では重要な因子である（Ｗａｈｌ， Ｓ．Ｍ．ら トランスフォーミング成長因子β型は、単球走化性および成長因子産生を誘発する（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｔｙｐｅ ｂｅｔａ ｉｎｄｕｃｅｓ ｍｏｎｏｃｙｔｅ ｃｈｅｍｏｔａｘｉｓ ａｎｄ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ）． Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８４， ５７８８−５７９２ （１９８７））； （Ｗｉｓｅｍａｎ， Ｄ．Ｍ．， Ｐｏｌｖｅｒｉｎｉ， Ｐ．Ｊ．， Ｋａｍｐ， Ｄ．Ｗ． ＆ Ｌｅｉｂｏｖｉｃｈ， Ｓ．Ｊ． Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ−ｂｅｔａ（ＴＧＦ−ｂｅｔａ） ｉｓ ｃｈｅｍｏｔａｃｔｉｃ ｆｏｒ ｈｕｍａｎ ｍｏｎｏｃｙｔｅｓ ａｎｄ ｉｎｄｕｃｅｓ ｔｈｅｉｒ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ． １５７， ７９３−８００ （１９８８））。観察された創傷単球数の減少を引き起こすメカニズムを調査するために、本発明者等は、単球走化性、ならびに単球の内皮を横切っての遊走および接着にて潜在的に重要なＴＧＦ−βにより調節される細胞接着分子の発現に対するＳｍａｄ３欠失の影響を確定した（Ｗａｈｌ， Ｓ．Ｍ．， Ａｌｌｅｎ， Ｊ．Ｂ．， Ｗｅｅｋｓ， Ｂ．Ｓ．， Ｗｏｎｇ， Ｈ．Ｌ． ＆ Ｋｌｏｔｍａｎ， Ｐ．Ｅ． Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｂｅｔａ ｅｎｈａｎｃｅｓ ｉｎｔｅｇｒｉｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｔｙｐｅ ＩＶ ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｍｏｎｏｃｙｔｅｓ）． Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９０， ４５７７−４５８１ （１９９３））。培養Ｓｍａｄ３ｅｘ８／ｅｘ８単球は、ＴＧＦ−β１に対する特異的走化性の有意な減少を示したが、Ｇタンパク質媒介性応答である古典的な化学誘引物質ｆＭｅｔ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ（ＦＭＡＰ）には一般に遊走しなかった（図３ａ）。Ｓｍａｄ３ｅｘ８／ｅｘ８単球はまた、ＴＧＦ−β受容体ＩＩ（ＴＧＦ−βＲＩＩ）レベルのＴＧＦ−β媒介性増加にもかかわらず、自己分泌様式でＴＧＦ−β１発現をアップレギュレート（ｕｐｒｅｇｕｌａｔｅ）できないことを示した（図３ｂ）。このデータは、ＴＧＦ−β１およびその受容体の調節は別個に起こり得て、Ｓｍａｄ３は、ＴＧＦ−β１発現の誘発に関与し、Ｓｍａｄ−３非依存性経路（Ｓｍａｄ２またはＭＡＰキナーゼを含むもののような）が受容体発現を調節することを示す。Ｓｍａｄ３非依存性事象はまた、単球によるインテグリンのＴＧＦ−β媒介性発現に関与し得る（図３ｃ）。
【０１３２】
Ｓｍａｄ３ヌルマウスの創傷で観察された単球数の初期の減少が創傷治癒の表現型に寄与するという仮説を試験するために、本発明者等は、Ｓｍａｄ３ｅｘ８／ｅｘ８創傷に、野生型マウス由来の抽出したての単球を塗布した。創傷時での野生型単球の直接添加は、ＴＧＦ−βの注射の効果と同様の効果を有する。すなわち、Ｓｍａｄ３ｅｘ８／ｅｘ８の創傷でのマトリックス沈着の減少は、Ｓｍａｄ３ｅｘ８／ｅｘ８線維芽細胞のそれ自体でマトリックスタンパク質を産生する能力の減損を反映しないが、代わりにＳｍａｄ３ｅｘ８／ｅｘ８マウスの創傷におけるＴＧＦ−βレベルの減少に起因する（ＴＧＦ−βレベルの減少は、減少した単球浸潤の直接的な結果そのものである）。単球の注射もＴＧＦ−βの注射も再上皮形成に影響を及ぼさず、そこでこれらの２つの効果：マトリックス沈着および再上皮形成は区別され得る。本発明者等は、インテグリンアップレギュレーション（ｉｎｔｅｇｒｉｎ ｕｐｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ）に関して応答する能力を保持するにも関わらず、単球浸潤の減少が、初期ＴＧＦ−β１走化性シグナルに対するＳｍａｄ３ｅｘ８／ｅｘ８単球による応答の欠如に関連することを示唆する。続いて、これらの事象は、細胞数の減少だけでなく、ＴＧＦ−β１のオートクリン産生の非存在に対して二次的なものであるという特徴であるＴＧＦ−βの局所レベルの減少を引き起こす。
【０１３３】
創傷再上皮形成におけるＳｍａｄ３の役割
再上皮形成は、皮膚バリアの再形成という理由だけでなく、創傷縮小での役割の理由から、最適な創傷治癒にとって重要であるため、本発明者等は、このプロセスに対するＳｍａｄ３崩壊の影響をさらに研究した。インビトロでは、ＴＧＦ−βの効果は、逆説的である：インテグリン媒介性ケラチノサイト遊走が高まる一方で、ケラチノサイト増殖は阻害される（Ｚａｍｂｒｕｎｏ，Ｇ． ら Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ−ｂｅｔａ １ ｍｏｄｕｌａｔｅｓ ｂｅｔａ １ ａｎｄ ５ ｉｎｔｅｇｒｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ａｎｄ ｉｎｄｕｃｅｓ ｔｈｅ ｄｅ ｎｏｖｏ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ａｌｐｈａ ｖ ｂｅｔａ ６ ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒ ｉｎ ｎｏｒｍａｌ ｈｕｍａｎ ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅｓ： ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｗｏｕｎｄ ｈｅａｌｉｎｇ． Ｊ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． １２９， ８５３−８６５ （１９９５））。さらに、再上皮形成に対する外因性ＴＧＦ−βの役割の研究は、投与量、投与動態学、および選択モデルに応じて相反する結果を生み出した（Ｍｕｔｏｅ， Ｔ．Ａ．， Ｐｉｅｒｃｅ， Ｇ．Ｆ．， Ｍｏｒｉｓｈｉｍａ， Ｃ． ＆ Ｄｅｕｅｌ， Ｔ．Ｆ． Ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ−ｉｎｄｕｃｅｄ ａｃｃｅｌｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｉｓｓｕｅ ｒｅｐａｉｒ ｔｈｒｏｕｇｈ ｄｉｒｅｃｔ ａｎｄ ｉｎｄｕｃｔｉｖｅ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｉｎ ａ ｒａｂｂｉｔ ｄｅｒｍａｌ ｕｌｃｅｒ ｍｏｄｅｌ）． Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． ８７， ６９４−７０３ （１９９１））； （Ｈｅｂｄａ， Ｐ．Ａ． Ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ−ｂｅｔａ ａｎｄ ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｏｎ ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｃｅｌｌ ｏｕｔｇｒｏｗｔｈ ｆｒｏｍ ｐｏｒｃｉｎｅ ｓｋｉｎ ｅｘｐｌａｎｔ ｃｕｌｔｕｒｅｓ）． Ｊ． Ｉｎｖｅｓｔ． Ｄｅｒｍａｔｏｌ． ９１， ４４０−４４５ （１９８８））。ここで、３日目の野生型およびヘテロ接合性マウスにおける類似の創傷幅の存在にも関わらず、この時点までに、ヘテロ接合性マウスでは完全な再上皮形成が起き、ケラチノサイトにおけるインビボでのＴＧＦ−βシグナル伝達は、最終的に再上皮形成の阻害を引き起こすＳｍａｄ３依存性プロセスであることを示した。このシグナル伝達経路におけるＳｍａｄ３の特異性を評価するために、本発明者等は、Ｓｍａｄ２ヘテロ接合体における創傷治癒表現型も分析した。これらのマウスの創傷は、３日目でのＳｍａｄ３ヘテロ接合体および野生型マウスに見られたのと同様の創傷幅および面積を生じるように治癒する（図１）。しかしながら、Ｓｍａｄ３ヘテロ接合体と対照的に、Ｓｍａｄ２ヘテロ接合体の創傷は、再上皮形成しなかった（図１ｂ）。これらの結果は、Ｓｍａｄ３は、Ｓｍａｄ２とは異なるインビボ上皮生物学に対して影響し得ることを示す。Ｓｍａｄ２およびＳｍａｄ３はインビトロで過剰発現されると、時折交換可能に機能するように見えるが、直接ＤＮＡに結合し、Ｅｖｉ−１のような癌遺伝子およびビタミンＤ３受容体のよな核受容体と相互作用するＳｍａｄ３の特有の能力は、これら２つのＳＭＡＤが、インビボで別個の標的遺伝子を調節し��ることを示す（Ｙａｎａｇｉｓａｗａ， Ｋ． ら Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｂｙ Ｓｍａｄ３ ａｎｄ ｄｏｗｎ−ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｍａｄ３ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ ＴＧＦ−ｂｅｔａ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｎｏｒｍａｌ ｌｕｎｇ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ． Ｏｎｃｏｇｅｎｅ １７， １７４３−１７４７ （１９９８）； （Ｄｅｎｎｌｅｒ， Ｓ．， Ｈｕｅｔ， Ｓ ＆ Ｇａｕｔｈｉｅｒ， Ｊ．Ｍ． Ｓｈｏｒｔ ａｍｉｎｏ−ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｉｎ ＭＨ１ ｄｏｍａｉｎ ｉｓ ｒｅｓｐｏｎｓｉｂｌｅ ｆｏｒ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ ｂｅｔｗｅｅｎ Ｓｍａｄ２ ａｎｄ Ｓｍａｄ３）． Ｏｎｃｏｇｅｎｅ １８， １６４３−１６４８ （１９９９））； （Ｕｌｌｏａ， Ｌ．， Ｄｏｏｄｙ， Ｊ． ＆ Ｍａｓｓａｇｕｅ， Ｊ． Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ−ｂｅｔａ／ＳＭＡＤ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｂｙ ｔｈｅ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−ｇａｍｍａ／ＳＴＡＴ ｐａｔｈｗａｙ． Ｎａｔｕｒｅ ３９７， ７１０−７１３ （１９９９））； （Ｙａｎａｇｉｓａｗａ， Ｊ． ら， Ｃｏｖｅｒｇｅｎｃｅ ｏｆ ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ−ｂｅｔａ ａｎｄ ｖｉｔａｍｉｎ Ｄ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｐａｔｈｗａｙｓ ｏｎ ＳＭＡＤ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｃｏａｃｔｉｖａｔｏｒｓ． Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８３， １３１７−１３２１ （１９９９））； （Ｋｕｒｏｋａｗａ， Ｍ． ら Ｔｈｅ ｏｎｃｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｖｉ−１ ｒｅｐｒｅｓｓｅｓ ＴＧＦ−ｂｅｔａ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｂｙ ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ Ｓｍａｄ３． Ｎａｔｕｒｅ ２， ９２−９６ （１９８８））。この概念は、それらの各ヌル表現型における顕著な差異により支持される（Ｙａｎｇ， Ｘ． ら Ｔａｒｇｅｔｅｄ ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ ｏｆ ＳＭＡＤ３ ｒｅｓｕｌｔｓ ｉｎ ｉｍｐａｉｒｅｄ ｍｕｃｏｓａｌ ｉｍｍｕｎｉｔｙ ａｎｄ ｄｉｍｉｎｉｓｈｉｅｄ Ｔ ｃｅｌｌ ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅｎｅｓｓ ｔｏ ＴＧＦ−ｂｅｔａ． ＥＭＢＯ Ｊ． １８， １２８０−１２９１ （１９９９））； （Ｄａｔｔｏ， Ｍ．Ｂ． ら Ｔａｒｇｅｔｅｄ ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｍａｄ３ ｒｅｖｅａｌｓ ａｎ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｒｏｌｅ ｉｎ ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｂｅｔａ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｓｉｇｎａｌ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ ｂｉｏｌ． １９， ２４９５−２５０４ （１９９９））； （Ｚｈｕ， Ｙ．， Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ， Ｊ．Ａ．， Ｐａｒａｄａ， Ｌ．Ｆ．， ＆ Ｇｒａｆｆ， Ｊ．Ｍ． Ｓｍａｄ３ ｍｕｔａｎｔ ｍｉｃｅ ｄｅｖｅｌｏｐ ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ ｃａｎｃｅｒ． Ｃｅｌｌ １８， ７０３−７１４ （１９９８））；（Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ， Ｍ．， Ｙａｎｇ， Ｘ．， Ｌｉ， Ｃ．， Ｘｕ， Ｘ．， ＆ Ｄｅｎｇ． Ｃ． Ｆａｉｌｕｒｅ ｏｆ ｅｘｔｒａｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ａｎｄ ｍｅｓｏｄｅｒｍ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎ ｅｍｂｒｙｏｓ ｌａｃｋｉｎｇ ｔｈｅ ｔｕｍｏｒ ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ Ｓｍａｄ２． Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ��� Ｓｃｉ ＵＳＡ ９５， ９３７８−９３８３ （１９９８））。
【０１３４】
再上皮形成に対するＳｍａｄ３のインビボ効果を引き起こすメカニズムを識別するために、本発明者等は、創傷修復にとって決定的なケラチノサイト機能、すなわち遊走および増殖が、Ｓｍａｄ３崩壊により改変されるかどうかを試験した。ケラチノサイトにおけるＴＧＦ−β受容体の発現レベルは、Ｓｍａｄ３遺伝子型に非依存的であるものの、Ｓｍａｄ３ｅｘ８／ｅｘ８ケラチノサイトは、ＴＧＦ−β１に応答してＴＧＦ−β発現をアップレギュレートする能力が欠如していた（図４ａ）。Ｓｍａｄ３は細胞成長阻害に関与しているため、本発明者等は、Ｓｍａｄ３ｅｘ８／ｅｘ８マウスにおける再上皮形成の増大は、増殖能力の増大の二次的なものであり得ると推論した（Ｄａｔｔｏ， Ｍ．Ｂ． ら Ｔａｒｇｅｔｅｄ ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｍａｄ３ ｒｅｖｅａｌｓ ａｎ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｒｏｌｅ ｉｎ ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｂｅｔａ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｓｉｇｎａｌ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ ｂｉｏｌ． １９， ２４９５−２５０４ （１９９９））。培養では、Ｓｍａｄ３ヌルマウスに由来する一次ケラチノサイトは、ＴＧＦ−βにより成長阻害に対する感受性の減少を示した（図４ｂ）。これらの見解は、野生型細胞と比較したヌル細胞における創傷縁での（ブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）の組込みにより判断されるような）基底ケラチノサイト増殖の増加に相当した（図４ｂ）。その結果は、高レベルの外因性ＴＧＦ−βが、ヘテロ接合体および野生型ケラチノサイトの成長を等しく阻害することができることを示す。しかしながら、本発明者等は、炎症性応答は、野生型応答と比較して依然として鈍いので、ヘテロ接合性マウスにおける皮膚創傷の再上皮形成に関する中間結果は、（野生型レベルと比較して）生産された内因性ＴＧＦ−βレベルの減少に起因すると解釈する。
【０１３５】
再上皮形成のさらなる態様は、化学誘引物質勾配に応答したマトリックス成分を通過した細胞遊走を含む。Ｓｍａｄ３ｅｘ８／ｅｘ８ケラチノサイトは、条件培地に存在する成長因子に対する正常な応答を維持しながら、マトリックスへの接着の減少およびＴＧＦ−βおよびケラチノサイト成長因子（ＫＧＦ）に対する遊走を示した（図４ｃ）。サイトカインの増加数および代替的シグナル伝達経路は、ＳＭＡＤ活性に影響を及ぼすことがわかっており（Ｕｌｌｏａ， Ｌ．， Ｄｏｏｄｙ， Ｊ／ ＆ Ｍａｓｓａｇｕｅ， Ｊ． Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ−ｂｅｔａ／ＳＭＡＤ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｂｙ ｔｈｅ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−ｇａｍｍａ／ＳＴＡＴ ｐａｔｈｗａｙ． Ｎａｔｕｒｅ ３９７， ７１０−７１３ （１９９９））； （Ｙａｎａｇｉｓａｗａ， Ｊ． ら， Ｃｏｖｅｒｇｅｎｃｅ ｏｆ ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ−ｂｅｔａ ｎａｄ ｖｉｔａｍｉｎ Ｄ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｐａｔｈｗａｙｓ ｏｎ ＳＭＡＤ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｃｏａｃｔｉｖａｔｏｒｓ． Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８３， １３１７−１３２１ （１９９９））； （Ｋｕｒｏｋａｗａ， Ｍ． ら Ｔｈｅ ｏｎｃｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｖｉ−１ ｒｅｐｒｅｓｓｅｓ ＴＧＦ−ｂｅｔａ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｂｙ ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ Ｓｍａｄ３）． Ｎａｔｕｒｅ ２， ９２−９６ （１９８８））； （ｄｅ Ｃａｅｓｔｅｃｋｅｒ， Ｍ．Ｐ． ら Ｓｍａｄ２ ｔｒａｎｓｄｕｃｅｓ ｃｏｍｍｏｎ ｓｉｇｎａｌｓ ｆｒｏｍ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｓｅｒｉｎｅ−ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ ａｎｄ ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｋｉｎａｓｅｓ． Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ． １２， ５８７−５９２ （１９９８）、そこで、ＫＧＦは、Ｓｍａｄ３シグナル伝達経路との相互作用による、野生型細胞に対するその影響の幾つかを媒介し得ることが可能である。インテグリンは、細胞遊走を媒介する際に極めて重要であるので、本発明者等は、ケラチノサイトによりＴＧＦ−β誘導性インテグリン発現にＳｍａｄ３が必要とされ得ると結論付けた。外因性ＴＧＦ−β１は、ヌル細胞においてβ１インテグリンの発現をアップレギュレートしたが、α５サブユニットの発現をアップレギュレートしなかった。これは、フィブロネクチンを横切っての遊走の低下のための基本的なメカニズムを表し得る（図４ｄ）。この効果は、単球における改変されたＳｍａｄ３シグナル伝達の効果と異なり、特定の遺伝子標的に対するＳｍａｄ３崩壊の影響が細胞の状況に依存し、一般化することができないことを示す。本発明者等はまた、ケラチノサイトに特異的な細胞接着分子、すなわちＥ−カドヘリンおよびシンデカン−１（ｓｙｎｄｅｃａｎ−１）に対するＳｍａｄ３崩壊の影響を評価した。両方の発現レベルは、基本的に、またＴＧＦ−β処置後に、すべての表現型で等しかった。したがって、創傷治癒の状況では、Ｓｍａｄ３ｅｘ８／ｅｘ８マウスにおける再上皮形成の増加の１つの考え得るメカニズムは、Ｓｍａｄ３非依存性プロセスにおけるＴＧＦ−βおよびＫＧＦ以外の成長因子により刺激される遊走性応答とともに、ＴＧＦ−βに存在下にて、（野生型ケラチノサイトと比較して）増加したケラチノサイト増殖を含���得る。これらのデータは、インビボ再上皮形成を促進する際に初期増殖応答の重要性を示し、それは、Ｓｍａｄ３依存性経路により阻害されるようである。
【０１３６】
Ｓｍａｄ３崩壊は、放射線誘発性線維症に対する防御を引き起こす
６週齢の雄野生型またはＳｍａｄ３ヌル同腹子の右大腿部を放射線に曝露させた。左脚を内部対照として使用した。この初期実験では、マウスは、照射されないか、あるいは単一線量にて３０または６０Ｇｙを与えた。照射後２週目および５週目にマウスを殺害した。１ｃｍ間隔のタトゥマークを用いて、皮膚の縮小を評価し、ねじり試験を用いて、脚の収縮性を測定した。皮膚および筋肉の切片を、組織学用に中性緩衝ホルマリン中に固定した。
【０１３７】
照射の２週間後の皮膚の組織学の分析は、Ｓｍａｄ３ヌルマウスの皮膚が放射線の損傷性影響に対して抵抗性があることを実証した。野生型マウスの左大腿部の照射されていない皮膚と６０Ｇｙの照射した右大腿部の皮膚の比較は、高線量の放射線に起因して表皮および毛包の重症の過形成を示した。対照的に、Ｓｍａｄ３ヌルマウスの照射した大腿部の皮膚では穏やかな過形成が見られただけであり、毛包は正常に見えた。密集結合組織（瘢痕）面積は、Ｓｍａｄ３ヌルの皮膚と比較して、照射した野生型において面積が大きかった。炎症性応答もまた、野生型マウスではより強力であった。これらのデータは、Ｓｍａｄ３は、放射線損傷に対する内皮／皮膚毛包細胞の応答にて必須の役割を果たし、Ｓｍａｄ３を欠如した細胞は、放射線誘発性損傷に対して抵抗性であることを確立する。
【０１３８】
単一６０Ｇｙ線量の放射線への曝露の５週後の同腹子の野生型またはＳｍａｄヌル雄マウスの照射した右大腿部の写真を撮った。野生型マウスの皮膚は、肥厚し、縮小し（２つのタトゥマークの距離により測定される）、照射した領域にわたって毛の再成長が欠如していた。著しく対照的に、Ｓｍａｄ３ヌルマウスの皮膚は、正常な柔軟性、色素を保持し、照射した領域にわたって毛の再成長を示した。これらの観察は、Ｓｍａｄ３の損失が線維症、瘢痕化および脱毛のような、高線量の長期の影響を防止するという結論を支持する。
【０１３９】
単一６０Ｇｙ線量の放射線への曝露の５週後に、同腹子の野生型またはＳｍａｄ３ヌル雄マウスの照射した右大腿部の皮膚の組織学を分析した。検査した２匹の野生型および２匹のＳｍａｄ３ヌルマウスは、多様な応答状態を示した。それにもかかわらず、パターンを明瞭に理解することができた。平均して、表皮過形成の度合いは、野生型マウスで有意に高かった。さらに、Ｓｍａｄ３ヌルマウスにおける穏やかな過形成の領域は非常に限られていた一方で、野生型マウスでは、表皮関与の領域は、非常に広範であり、一様であった。これらの観察は、Ｓｍａｄ３崩壊が放射線誘発性線維症に対する防御を引き起こすという結論をさらに支持する。
【０１４０】
［実施例］
創傷治癒実験
相同組換えによるＳｍａｄ３遺伝子の標的崩壊により、Ｓｍａｄｅｘ８／ｅｘ８マウスを生成した。標的胚幹細胞クローンを生殖細胞系伝達に注射した。標的崩壊のためヘテロ接合性のマウスを交雑させて、ホモ接合性の子孫を作製した（Ｙａｎｇ， Ｘ． ら Ｔａｒｇｅｔｅｄ ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ ｏｆ ＳＭＡＤ３ ｒｅｓｕｌｔｓ ｉｎ ｉｍｐａｉｒｅｄ ｍｕｃｏｓａｌ ｉｍｍｕｎｉｔｙ ａｎｄ ｄｉｍｉｎｉｓｈｅｄ Ｔ ｃｅｌｌ ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅｎｅｓｓ ｔｏ ＴＧＦ−ｂｅｔａ． ＥＭＢＯ Ｊ． １８８， １２８０−１２９１ （１９９９））。４８匹の４〜６週齢のマウス（Ｓｍａｄ３野生型、ヘテロ接合体、およびヌルマウス）をメトキシフルオランで麻酔し、背側を剪毛して、アルコールで清浄化した。４つの１ｃｍの等距離の全層切開創傷を、皮膚および皮筋に作製した。動物のサブセットに関して、創傷前に切開されるべき領域に媒質（ＰＢＳ＋４ｍＭ　ＨＣｌ）またはＴＧＦ−β１（１μｇ）５０μｌを皮下注射するか、あるいは未操作のままにした。部位の偏りを確実になくすために、処置を交替で行った。創傷後１日目、２日目、３日目および５日目に傷を収集して、組織学および免疫染色用に二等分するか、ＲＮＡ分析用に液体窒素用に中にスナップ凍結（ｓｎａｐ−ｆｒｏｚｅｎ）した。さらに、１０匹の健常なＳｍａｄ２ヘテロ接合体マウス（４〜６週齢）に上述のように１ｃｍ切開創傷を作り、３または５日目に創傷を切除した。ＢｒｇＵ組込みの分析のために、１５０ｍｇ／ｋｇのＢｒｄＵ溶液（Ｓｉｇｍａ）を腹腔内に１時間注射して、マウスを殺害し、モノクローナルマウス抗ＢｒｄＵ抗体（ＤＡＫＯ）で組織を染色した。Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅキット（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いてＴＧＦ−βの血清レベルを測定した。
【０１４１】
組織学、免疫細胞化学および画像分析
１０％緩衝ホルマール生理食塩水中に固定した創傷組織から組織学的切片を調製して、パラフィンに包埋した。７μｍ切片をヘマトキシリンおよびエオキシン、マッソン三色またはギムザで染色するか、またはＴＧＦ−β１、２および３（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）またはフィブロネクチンに対する抗体（それらは、ＰＢＳ中での１：２０希釈で用いた）による免疫組織化学に付した。創傷領域（血餅より下、皮筋より上で測定される）および再上皮形成の、画像分析および単位面積当たりの細胞数の定量化を、記載（Ａｓｈｃｒｏｆｔ， Ｇ．Ｓ． ら Ｅｓｔｒｏｇｅｎ ａｃｃｅｌｅｒａｔｅｓ ｃｕｔａｎｅｏｕｓ ｗｏｕｎｄ ｈｅａｌｉｎｇ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ａｎ ｉｎｃｒｅａｓｅ ｉｎ ＴＧＦ−ｂｅｔａ １ ｌｅｖｅｌｓ． Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ． ３， １２０９−１２１５ （１９９７））のようにＯｐｔｉｍａｓプログラムを用いて行った。
【０１４２】
骨髄単球の培養および走化性アッセイ
４〜６週齢の雄マウスの大腿骨および坐骨から、骨髄を収集した。２成分段階的勾配（Ｃａｒｄｉｎａｌ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ Ｉｎｃ．， Ｓａｎｔａ Ｆｅ）を用いて単核細胞を単離して、記載（Ｆｅｌｄｍａｎ， Ｇ． ら， ＳＴＡＴ５Ａ−ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ ｍｉｃｅ ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅ ａ ｄｅｆｅｃｔ ｉｎ ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ−ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ ｃｏｌｏｎｙ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ． Ｂｌｏｏｄ． ９０， １７６８−１７７６（１９９７））のように、単球コロニー刺激因子（１０ｎｇ／ｍｌ）で４〜７日間インキュベートした。４００ｍｌのＦＭＬＰ（１μＭ）、対照培地またはＴＧＦ−β（１ｐｇ／ｍｌ）を含有する三重反復試験用ウェルにて、１２ウェル走化性チャンバ（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｃｏｓｔａｒ Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ Ｐｌａｔｅ）で単球の走化性を刺激した。１００μｌ当たり３×１０５の最終濃度で走化性緩衝液（０．５％ＢＳＡを用いたハンクの緩衝液）中に単球を再懸濁させて、上部チャンバに１００μｌを添加して、加湿雰囲気（５％ＣＯ２）にて３７℃で９０分間単球をインキュベートした。膜（孔径３μｍ）を通過して遊走した細胞を走化性固定液（ＰＢＳ中の１００ｍＭ　ＥＤＴＡおよび１０％ホルムアルデヒド）４０μｌ中に固定して、Ｃｏｕｌｔｅｒカウンターを用いて５００μｌ容量中で計数した。単球を使用した創傷治癒実験のために、野生型マウスから取り出した骨髄単球をＰＢＳ中に再懸濁させて、０．５×１０６細胞（またはＰＢＳ媒質のみ）を切開されるべき部位に皮下注射した。注射直後に、１ｃｍ全層切開を（上述のように）作製して、創傷後３日目に創傷を切除した。
【０１４３】
ケラチノサイト接着／遊走および増殖アッセイ
Ｓｍａｄ３ヘテロ接合性成体の交配からの新生マウスの皮膚から、標準的な方法によりケラチノサイトを単離した（Ｄｌｕｇｏｓｚ， Ａ．Ａ．， Ｇｌｉｃｋ， Ａ．Ｂ．， Ｔｅｎｎｅｎｂａｕｍ， Ｔ．， Ｗｅｉｎｂｅｒｇ， Ｗ．Ｃ． ＆ Ｙｕｓｐａ， Ｓ．Ｈ． Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｅｐｄｅｒｍａｌ ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅｓ ｆｏｒ ｏｎｃｏｇｅｎｅ ｒｅｓｅａｒｃｈ． Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． ２５４， ３−２０ （１９９５））。抗生物質とともに、８％キレックス処理ウシ胎児血清、０．２ｍＭ　ＣａＣｌ２のＥＭＥＭ培地で細胞を平板培養し、次に、０．０５ｍＭ　ＣａＣｌ２を有する同一培地に交換した。遊走アッセイのために、細胞をトリプシン処理して、洗浄して、無血清ＥＭＥＭ中に１×１０６／ｍｌ細胞になるように再懸濁させた。走化性チャンバの上部ウェル（Ｎｅｕｒｏ Ｐｒｏｂｅ Ｉｎｃ．）に５×１０４細胞を添加し、この上部ウェルを、フィブロネクチン／コラーゲン−Ｉ被覆膜により下部チャンバにある試験培地（これは、１ｎｇ／ｍｌにて野生型ケラチノサイト、ＫＧＦまたはＴＧＦ−β１からの条件培地のＥＭＥＭである）から分離した。３７℃で５時間後に膜を通って遊走した細胞を、Ｄｉｆｆ−Ｑｕｉｃｋを用いて染色して、Ｌｅｉｔｚ光学顕微鏡を用いて得られたビデオ画像から計数した。各値は、三重反復試験用ウェルから遊走した細胞の平均数を表す。増殖アッセイに関して、２４ウェル組織培養トレーにてウェル１つ当たり８０，０００細胞にて細胞を播種し、３日間増殖させた。ブタＴＧＦ−β１（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を様々な濃度で２０時間添加して、さらに４時間、１μＣｉ［３Ｈ］チミジンをウェルに律動的に送った。ＤＮＡ中に組み込まれた放射能を、確立された方法により測定した（Ｄａｎｉｅｌｐｏｕｒ， Ｄ． ら Ｉｍｍｕｎｏｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｔｗｏ ｆｏｒｍｓ ｏｆ ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ−ｂｅｔａ （ＴＧＦ−ｂｅｔａ １ ａｎｄ ＴＧＦ−ｂｅｔａ ２） ｓｅｃｒｅａｔｅｄ ｂｙ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｃｕｌｔｕｒｅ）． Ｊ． Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ． １３８， ７９−８６ （１９８９））。各値は、三重反復試験用ウェルの平均を表す。
【０１４４】
細胞接着分子およびＴＧＦ−βアイソ型の発現
背側領域由来の創傷組織（未創傷隣接組織による汚染を回避するために顕微解剖した）および正常皮膚を均質化して、トリゾールを用いて全ＲＮＡを抽出した。さらに、単球およびケラチノサイトから、同様の様式で全ＲＮＡを抽出した。ポリメラーゼ連鎖反応による逆転写を、以下のプライマーを用いて行った（バンド強度は、ケラチノサイト／単球ハウスキーピング遺伝子ＨＰＲＴ（ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼの強度に対して正規化した）；α，インテグリン、５’−ＣＡＴＴＴＣＣＧＡＧＴＣＴＧＧＧＣＣＡ（配列番号３）および５’−ＴＧＧＡＧＧＣＴＴＧＡＧＣＴＧＡＧＣＴＴ（配列番号４）；β１インテグリン、５’−ＴＧＴＴＣＡＧＴＧＣＡＧＡＧＣＣＴＴＣＡ（配列番号５）および５’−ＣＣＴＣＡＴＡＣＴＴＣＧＧＡＴＴＧＡＣＣ（配列番号６）；細胞内接着分子（ＩＣＡＭ）、５’−ＴＴＣＡＡＣＣＣＧＴＧＣＣＡＡＧＣＣＣＡＣＧＣＴ（配列番号７）および５’−ＧＣＣＡＧＣＡＣＣＧＴＧＡＡＴＧＴＧＡＴＣＴＣＣ（配列番号８）、Ｅ−カドヘリン、５’−ＴＣＡＧＣＡＣＣＣＡＣＡＣＡＣＡＴＡＣＡ（配列番号９）および５’−ＧＣＡＴＴＴＴＣＴＣＡＧＧＡＡＧＣＡＧＧ（配列番号１０）、シンデカン−１、５’−ＧＡＴＣＣＣＡＡＡＧＣＣＡＣＴＧＴＧＴＴ（配列番号１１）および５’−ＡＣＡＣＴＧＴＧＧＡＡＣＣＡＧＣＣＴＴＣ（配列番号１２）。さらに、ＲＮアーゼ防御アッセイは、３μｇの全ＲＮＡにてマルチプローブ鋳型を用いて製造業者の指示書（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）に従って行い、蛍光体イメージングを用いて発色させた。バンド強度は、画像解析プログラム（Ｉｍａｇｅ Ｑｕａｎｔ， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ）を用いて、サイトカインおよび受容体鋳型の両方に関して、ケラチノサイト単球ハウスキーピング遺伝子（ｈｏｕｓｅｋｅｅｐｉｎｇ ｇｅｎｅ）Ｌ３２の強度に対して正規化した。すべてのデータを、スチューデントｔ検定または分散解析により解析した。
【０１４５】
実施形態および実施例を参照して本発明について記載してきたが、様々な変更が本発明の精神から逸脱することなくなされ得ることは理解されるべきである。したがって、本発明は、併記の特許請求の範囲によってのみ制限される。本明細書中で引用したすべての参照文献は、参照により本明細書に明白に援用される。
【図面の簡単な説明】
【図Ａ】
図Ａは、創傷治癒を改善するための内因性Ｓｍａｄ３の提唱された阻害である。慢性創傷は、再上皮形成の遅延と炎症の増加を特徴とする。これらの創傷に対するＴＧＦ−βの適用は、さらにケラチノサイト増殖を阻害し、単球および好中球漸増を刺激することにより、治癒を弱める。反対に、Ｓｍａｄ３発現を抑制する作用物質での慢性創傷の治療は、再上皮形成を刺激し、炎症を阻害し、ＴＧＦ−βの局所レベルを減少させると予測されるであろう。かかる創傷に対する外因性ＴＧＦ−βの続く適用は、Ｓｍａｄ３非依存性経路を介したマトリックス沈着を刺激するが、Ｓｍａｄ３依存性経路に影響を与えないであろう。
【図１】
図１は、Ｓｍａｄ３−ヌルマウスにおける創傷治癒の促進は、単球応答の減少に関連することを表す。図１ａは、画像解析を用いて創傷面積を求めたものである。結果は、平均値±ｓ．ｅ．ｍ．であり、各時点および群に関してｎ＝１０である。野生型と比較して＊Ｐ＜０．０５（スチューデントｔ検定）。ｄは日数である。図１ｂは、再上皮形成は、上部創傷幅と比較した新しい表皮により移動した距離の百分率として求めたものである。結果は、平均値±ｓ．ｅ．ｍ．であり、各時点および群に関してｎ＝１０である。野生型と比較して＊Ｐ＜０．０５。Ｓ２　ＨＴは、Ｓｍａｄ２ヘテロ接合体である。図１ｃは、単位面積当たりの細胞数を、創傷後１日目および３日目に定量化したものである。結果は、平均値±ｓ．ｅ．ｍ．であり、各時点および群に関してｎ＝１０である。野生型と比較して＊Ｐ＜０．０５。
【図２】
図２は、ＴＧＦ−β１のＳｍａｄ３＋への添加は、再上皮形成に対する影響はないが、マトリックス産生を高めることを示す。図２ａは、ＴＧＦ−β１の血清レベルは、表現型間で有意に異ならないことを示す。各群に関してｎ＝８である。図２ｂは、ＴＧＦ−β１の発現は、Ｓｍａｄ３ヌルおよびへテロ接合創傷組織にて著しく減少することを示す。示した値は、プールされた全メッセンジャーＲＮＡレベルに対して表される。一群当たりｎ＝９である。３日目に、野生型およびヌル組織にて発現は検出されなかった。ＲＮアーゼ防御アッセイは、創傷後１〜３日からのＴＧＦ−β２およびＴＧＦ−β３の発現の減少を示し、表現型間に差異はなかった。図２ｃは、ＴＧＦ−βＩＩの発現は検出可能であったが、Ｓｍａｄ３ヌルおよびヘテロ接合体マウスの１日目の創傷では減少したことを示す。Ｉ型受容体は、すべての試料にてどうにか検出可能であった。示した値は、プールされた全ｍＲＮＡレベルに対して表されている。一群当たりｎ＝９である。
【図３】
図３は、Ｓｍａｄ３は、ＴＧＦ−β誘導性単球走化性およびＴＧＦ−β発現に必要とされることを示す。図３ａは、Ｓｍａｄ３−ヌル単球は、野生型細胞に比較して、ＴＧＦ−β１にに対する走化性の有意な減少を示すが、古典的な化学誘引物質ｆＭｅｔ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ（ｆＭｅｔ）に対する正常な応答を示したことを示す。示したデータは、５回の実験の平均値±ｓ．ｅ．ｍ．である。培地のみと比較して＊Ｐ＜０．０１。図３ｂは、Ｓｍａｄ３ヌル単球でのＴＧＦ−β自体によるＴＧＦ−β１発現のアップレギュレーションの低下を示す。示したデータは、４回の実験の平均値±ｓ．ｅ．ｍ．である。培地のみと比較して＊Ｐ＜０．０１。示した値は、全ｍＲＮＡレベルに対して表される。ＷＴ＋、ＨＴ＋およびＮｕｌｌ＋は、ＴＧＦ−βで２４時間処置した細胞を示す。図３ｃは、インテグリンα５インテグリンの発現は、すべての遺伝子型の単球でのＴＧＦ−β処置によりアップレギュレートされることを示す。＊Ｐ＜０．０５。値は、ハウスキーピング遺伝子ＨＰＲＴから発現されるｍＲＮＡレベルに対して表される。
【図４】
図４は、Ｓｍａｄ３欠失が、ケラチノサイトの増殖および誘導を調節することを示す。図４ａは、ＴＧＦ−β１が、ケラチノサイトにてそれ自身の発現を調節することを示す。この応答は、Ｓｍａｄ３−ヌル細胞では見られない。各群にてｎ＝２０の動物である。Ｃは、対照培地である。＊Ｐ＜０．０５（対照に対する処置）。図４ｂは、ＴＧＦ−β１が、Ｓｍａｄ３−ヌル細胞での部分的応答とともに、野生型およびヘテロ接合体ケラチノサイトの成長を阻害することを示す。［３Ｈ］Ｔｄｒは、トリチウムチミジンである。図４ｃは、Ｓｍａｄ３−ヌルケラチノサイトのＴＧＦ−β１およびＫＧＦへの遊走が、野生型細胞と比較して有意に減少したことを示す。＊＊Ｐ＜０．０１（Ｓｍａｄ３−ヌル突然変異体およびヘテロ接合体に対する野生型）。＊Ｐ＜０．０１（Ｓｍａｄ３−ヌル細胞に対する野生型）。条件培地（ＣＭ）に対するヌル細胞の応答は、野生型細胞の応答と同じであった。図４ｄは、ＴＧＦ−β１に応答したインテグリンα５の発現は、ヌルケラチノサイトにて低下し、インテグリンβ１のアップレギュレーションを維持していた。＊Ｐ＜０．０１（未処置細胞に対する処置細胞）。シンデカン−１およびＥ−カドへリンは、すべての試料で弱く発現し、表現型または処置間では有意な差異は観察されなかった。
【図Ａ】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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