(57)【要約】いくつかの細胞種を混合した懸濁液を生成し、古典的ＭＨＣクラスＩ抗原陰性およびＩＣＡＭ−１抗原陽性の細胞を選択する方法を含む、肝前駆細胞が濃縮された細胞混合物を得る方法が開発される。非古典的ＭＨＣクラスＩ抗原の弱い発現は、肝前駆細胞のさらなる濃縮に使用できる。さらに、造血細胞のような非実質細胞よりも高く、肝実質細胞のような成熟した実質細胞よりも低い、粒状度または細胞質脂肪滴の尺度である側方散乱光のレベルを持つ前駆細胞が選択できる。さらに、単離された前駆細胞の子孫は、αフェトプロテインおよび／またはアルブミンおよび／またはＣＫ１９を発現し得る。このように単離された肝前駆細胞は、クローン増殖でき、すなわち子孫細胞群全体が１つの細胞に由来することができる。前駆細胞のクローンは、培養においては積み重なった塊またはクラスターで増殖するパターンを持つ。これらの肝前駆細胞の単離方法は、ヒトを含む任意の脊椎動物に当てはまる。肝前駆細胞群は、細胞療法、生体人工肝、遺伝子療法、ワクチン開発、ならびに無数の毒性、薬理学的、および薬学的プログラムおよび研究に有用であると期待される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つの細胞間接着分子（ＩＣＡＭ）抗原を発現し、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）クラスＩａ抗原を発現しない、分化能力を持つ両能性（ｂｉｐｏｔｅｎｔ）肝前駆細胞を含む組成物。
【請求項２】
肝前駆細胞が少なくとも１つのＭＨＣクラスＩｂ抗原を発現する請求項１記載の組成物。
【請求項３】
ＭＨＣクラスＩｂ抗原が弱く発現する、請求項２記載の組成物。
【請求項４】
ＩＣＡＭ抗原がＩＣＡＭ−１である、請求項１記載の組成物。
【請求項５】
フローサイトメトリーにおける肝前駆細胞の側方散乱光が、成熟した実質細胞の側方散乱光よりも少ない、請求項１記載の組成物。
【請求項６】
フローサイトメトリーにおける肝前駆細胞の側方散乱光が、非実質細胞の側方散乱光と、成熟した実質細胞の側方散乱光の間である、請求項１記載の組成物。
【請求項７】
肝前駆細胞が分裂し、子孫を産生する能力のある、請求項１記載の組成物。
【請求項８】
肝前駆細胞がクローン増殖する能力を示す、請求項７記載の組成物。
【請求項９】
クローン増殖が細胞外マトリックスを必要とする、請求項８記載の組成物。
【請求項１０】
子孫が積み重なったクラスターで増殖する、請求項７記載の組成物。
【請求項１１】
子孫がαフェトプロテイン、アルブミン、ＣＫ１９、またはその組み合せを発現する、請求項７記載の組成物。
【請求項１２】
子孫が肝実質細胞または胆管細胞である、請求項７記載の組成物。
【請求項１３】
肝実質細胞または胆管細胞が、さらに特定の亜集団の選択または同定に使用できる細胞接着分子を発現する、請求項１２記載の組成物。
【請求項１４】
肝前駆細胞、その子孫、またはその組み合せを含む組成物であって、肝前駆細胞およびその子孫が：
（ａ） 少なくとも１つのＭＨＣクラスＩｂ抗原を弱く発現し、
（ｂ） フローサイトメトリーで非実質細胞よりも高い側方散乱光を示し、
（ｃ） αフェトプロテイン、アルブミン、ＣＫ１９、またはその組み合せを発現する組成物。
【請求項１５】
肝前駆細胞、その子孫、またはその組み合せが、内胚葉または骨髄由来である、請求項１４記載の組成物。
【請求項１６】
内胚葉が肝臓、膵臓、肺、消化管、甲状腺、性腺、またはその組み合せから選択される、請求項１５記載の組成物。
【請求項１７】
前駆細胞がＩＣＡＭ抗原を発現する、請求項１５記載の組成物。
【請求項１８】
ＩＣＡＭ抗原がＩＣＡＭ−１である、請求項１７記載の組成物。
【請求項１９】
前駆細胞がＭＨＣクラスＩａを発現しない、請求項１５記載の組成物。
【請求項２０】
前駆細胞が少なくとも１つのＭＨＣクラスＩｂ抗原を発現する、請求項１５記載の組成物。
【請求項２１】
肝前駆細胞が濃縮された脊椎動物細胞の混合物を得る方法であって、
（ａ） 脊椎動物肝細胞を含む細胞懸濁液を得る段階、および
（ｂ） 少なくとも１つのＭＨＣクラスＩａ抗原を発現する細胞を細胞懸濁液から除去し、肝前駆細胞が濃縮された細胞混合物を提供する段階
を含む方法。
【請求項２２】
前駆細胞が濃縮された脊椎動物細胞の混合物を得る方法であって、
（ａ） 脊椎動物細胞の細胞懸濁液を得る段階、および
（ｂ） 任意の順で順番にまたは実質的に同時に、少なくとも１つのＭＨＣクラスＩａ抗原を発現する細胞を細胞懸濁液から除去し、およびＩＣＡＭ抗原陽性の細胞を細胞懸濁液から単離し、前駆細胞が濃縮された細胞混合物を提供する段階
を含む方法。
【請求項２３】
前駆細胞を同定する方法であって、
（ａ） 前駆細胞を含むと思われる細胞懸濁液を提供する段階、および
（ｂ） ＩＣＡＭ抗原を発現し、ＭＨＣクラスＩａ抗原を発現しない細胞を同定する段階
を含む方法。
【請求項２４】
肝前駆細胞が濃縮された脊椎動物細胞の混合物を得る方法であって、
（ａ） 脊椎動物の胚幹細胞を提供する段階、
（ｂ） 胚幹細胞を増殖させ、胚幹細胞の子孫を産生する段階、
（ｃ） 少なくとも１つのＩＣＡＭ抗原を発現し、ＭＨＣクラスＩａ抗原を発現しない、胚幹細胞の子孫を単離する段階
を含む方法。
【請求項２５】
ＩＣＡＭ抗原は発現するがＭＨＣクラスＩａ抗原は発現しないヒト肝前駆細胞、その子孫、またはその組み合せが濃縮された細胞の有効量を、薬学的に許容される担体で患者に投与する段階を含む、治療を必要としている患者において、肝前駆細胞を用いて肝臓の疾患または機能不全を治療する方法。
【請求項２６】
遺伝的障害を治す遺伝子を持つ両能性肝前駆細胞の有効量を、治療を必要とする患者に投与する段階を含む、治療を必要とする患者における遺伝的障害の治療方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
１． 発明の分野
本発明は造血細胞から肝細胞を区別する新規の細胞表面マーカーに関する。特に、本発明は、古典的な主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）クラスＩ抗原陰性、細胞間接着分子１（ＩＣＡＭ−１）陽性、および非古典的ＭＨＣクラスＩ 抗原弱陽性を含む、独特の表現型を持つ両能性肝前駆細胞を単離する方法に関する。さらに、本発明は本発明の方法で産生された肝前駆細胞および肝幹細胞にも関する。
【０００２】
２． 関連技術の説明
哺乳類組織の多能性前駆細胞群の同定は、臨床的および商業的に重要であり、また発生過程と組織のホメオスタシスの理解のためにも重要である。前駆細胞群は、遺伝子療法、細胞移植、および生体人工臓器の組織工学の理想的な標的である（Ｍｉｌｌａｒ， Ａ．Ｄ． １９９２ Ｎａｔｕｒｅ ３５７， ４５５； Ｌａｎｇｅｒ， Ｒ．およびＶａｃａｎｔｉ， Ｊ．Ｐ． １９９３ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６０， ９２０； Ｇａｇｅ， Ｆ．Ｈ． １９９８ Ｎａｔｕｒｅ ３９２， １８）。
【０００３】
増殖能および／または多能性の高い組織特異的な「運命づけられた」幹細胞または前駆細胞が存在することは、各々組織に合った特定の方法を用いてクローン同定した、造血幹細胞（Ｓｐａｎｇｒｕｄｅら、１９９８ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４１， ５８）、神経幹細胞（Ｄａｖｉｓ， Ａ．Ａ．およびＴｅｍｐｌｅ， Ｓ． １９９４ Ｎａｔｕｒｅ ３７２， ２６３； Ｓｔｅｍｐｌｅ， Ｄ．Ｌ．およびＡｎｄｅｒｓｏｎ， Ｄ．Ｊ． １９９２ Ｃｅｌｌ ７１， ９７３）、および上皮幹細胞（Ｊｏｎｅｓ， Ｐ．Ｈ．およびＷａｔｔ， Ｆ．Ｍ． １９９３ Ｃｅｌｌ ７３， ７１３）の研究から明らかである。これらの前駆細胞は、正常な造血、神経、または上皮組織のホメオスタシスを担う、および重度の傷害後に再生応答を担う細胞だと考えられている（Ｈａｌｌ， Ｐ．Ａ．およびＷａｔｔ， Ｆ．Ｍ． １９８９ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １０６， ６１９）。
【０００４】
哺乳類の成体の肝臓は、通常は代謝回転が遅く、静止状態の組織であるにも関わらず、高度の肝毒性による傷害または部分的肝切除の後に回復する能力が非常に高い（Ｆｉｓｈｂａｃｋ， Ｆ．Ｃ． １９２９ Ａｒｃｈ． Ｐａｔｈｏｌ． ７， ９５５）； （Ｈｉｇｇｉｎｓ， Ｇ．Ｍ．およびＡｎｄｅｒｓｏｎ， Ｒ．Ｍ． １９３１ Ａｒｃｈ． Ｐａｔｈｏｌ． １２， １８６）。マウスにおける最近の試験データでは、一連の移植実験で調べたところ、成体の実質細胞は、ほぼ無限の増殖可能性を持っていることが示唆された（Ｏｖｅｒｔｕｒｆら、１９９７ Ａｍ． Ｊ． Ｐａｔｈｏｌ． １５１， １２７３）； （Ｒｈｉｍ， Ｊ．Ａ．ら、１９９４ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６３， １１４９）。これらの実験では不均質の幹細胞群を利用しているため、観察された増殖可能性が成体の実質細胞に由来するのか、成体の実質細胞の亜集団に由来するのか、および／または非実質細胞（即ち、前駆細胞）に由来するのかを証明する能力が限定されている。さらに実験では、使用された宿主がアルブミン・ウロキナーゼ導入遺伝子またはチロシン分解酵素の欠損を持っていたため、胆管上皮分化の証拠が示されていない；このいずれの宿主も、肝細胞系を選択するような特性を持つ。したがって、このアッセイ法では両能性細胞群の試験ができなかった。
【０００５】
いくつかの組織学的試験により、妊娠中期の胎児の初期肝細胞が、胆管上皮および成熟幹細胞に分化する両能性の能力を持つことが確立している（Ｓｈｉｏｊｉｒｉ， Ｎ． １９９７ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ Ｒｅｓ． Ｔｅｃｈ． ３９， ３２８−３５）。肝臓の発生は、内胚葉の上皮が造心中胚葉と相互作用をした直後に、腹側前腸内胚葉から始まる（Ｄｏｕａｒｉｎ， Ｎ．Ｍ． １９７５ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｂｉｏｌ． ５３， ４２７）； （Ｈｏｕｓｓａｉｎｔ， Ｅ． １９８０ Ｃｅｌｌ Ｄｉｆｆｅｒ． ９， ２６９）。この肝臓への関係づけは、マウスでは胎齢（Ｅ） ８日で起きる。肝臓発生の最初の段階は、形態学的変化の前に、内胚葉において血清アルブミンおよびαフェトプロテインのｍＲＮＡが誘導されて、明らかになる（Ｇｕａｌｄｉ， Ｒら、１９９６ Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ． １０， １６７０）。マウス胎齢Ｅ ９．５日で、特定の細胞が増殖し、糸のような形で横中隔の間充織に侵入し、肝臓原基を形成する。その後、肝臓の質量は劇的に増加するが、質量の増加は主に造血細胞によるもので、これはマウスではＥ１０に胎児肝にコロニーを形成し（Ｈｏｕｓｓａｉｎｔ， Ｅ． １９８１ Ｃｅｌｌ Ｄｉｆｆｅｒ． １０， ２４３）、肝細胞に影響を与えて極度にゆがんだ不規則な形をとらせる（Ｌｕｚｚａｔｔｏ， Ａ．Ｃ． １９８１ Ｃｅｌｌ Ｔｉｓｓｕｅ Ｒｅｓ． ２１５， １３３）。興味深いことに、遺伝子ターゲティング変異マウスを用いた最近のデータは、いくつかの遺伝子の欠損により、Ｅ１２からＥ１５の間に、致死的な肝不全、実質細胞のアポトーシス、および／または壊死が引き起こされたことを示す（Ｇｕｎｅｓ， Ｃ．ら、１９９８ ＥＭＢＯ Ｊ． １７， ２８４６； Ｈｉｌｂｅｒｇ， Ｆ．ら、１９９３ Ｎａｔｕｒｅ ３６５， １７９１； Ｍｏｔｏｙａｍａ， Ｊ．ら、１９９７ Ｍｅｃｈ． Ｄｅｖ． ６６， ２７； Ｓｃｈｍｉｄｔ， Ｃら、１９９５ Ｎａｔｕｒｅ ３７３， ６９９）。ストレス活性化カスケード （Ｇａｎｉａｔｓａｓ， Ｓ．ら、１９９８， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９５， ６８８１； Ｎｉｓｈｉｎａ， Ｈ．ら、１９９９ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １２６， ５０５） または抗アポトーシスカスケード（Ｂｅｇ， Ａ．ら、１９９５ Ｎａｔｕｒｅ ３７６， １６７； Ｌｉ， Ｑ．ら、１９９９ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８４， ３２１； Ｔａｎａｋａ， Ｍら、１９９９ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １０， ４２１）の一部である遺伝子の破壊は、不活化された遺伝子が広く発現されるにも関わらず、肝発生をひどく損なうが、造血は損なわない。肝細胞が発生ストレスの刺激に本来感受性なのか、胎児肝自体の中の特定の微小環境がそのような破壊的な効果を引き起こすのかは明らかではない（Ｄｏｉ， Ｔ．Ｓら、１９９９ Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９６， ２９９４）。一方で、成体肝の基礎的構築は、門脈を取り囲む胆管上皮の最初の円柱の出現に依存する（Ｓｈｉｏｊｉｒｉ， Ｎ． １９９７ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ Ｒｅｓ． Ｔｅｃｈ． ３９， ３２８）。免疫組織学的には、肝内胆管上皮細胞の分化の最初の徴候は、胆汁特異的サイトケラチン（ＣＫ）の発現である。上皮細胞の細胞質中間フィラメント（ＩＦ）タンパク質であるＣＫタンパク質���、多重遺伝子族によってコードされ、組織および分化に特異的に発現される（Ｍｏｌｌ， Ｒら、１９８２ Ｃｅｌｌ ３１， １１）。成体の肝実質細胞はＣＫ１９を全く発現しないが、成体の胆管上皮細胞は発現するので、ＣＫ１９は胆汁マーカーの中で最も目を引くものの１つである。ＣＫ８とＣＫ１８のみが初期の肝細胞から成体の肝実質細胞まで通して発現される（Ｍｏｌｌ， Ｒら、１９８２ Ｃｅｌｌ ３１， １１）。マウスのＥ１４に相当するラットの発現のＥ１５．５において、胆管前駆細胞はＣＫ１８抗体およびＣＫ８抗体の両方によって強く染色され、一部の胆管前駆細胞はＣＫ１９を発現する。発生が進むに連れ、成熟しつつある胆管はＣＫ１９に加えてＣＫ７も徐々に発現し始め、アルブミンの発現を失う（Ｓｈｉｏｊｉｒｉ， Ｎら、１９９１ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５１， ２６１１）。ラットのＥ１３という早い時期の肝細胞は均一な細胞群と考えられているが、全ての初期の肝細胞が胆管上皮細胞系に分化することができるのかどうか、およびこのような運命がどのようにして決定されるのかはまだ分かっていない。レトロウイルスベクターを用いるような、決定的な系統マーキング試験は肝細胞については行われておらず、両能性肝前駆細胞の立証に必要なクローン培養条件は決定されていない。
【０００６】
クローン増殖分析の１つの大きな障害は、造血細胞の爆発的な増加であり、これにより肝細胞のエクスビボでの増殖が観察できなくなる。したがって、肝細胞の濃縮方法を用いる必要がある。胎児肝において造血細胞を分画できる表面マーカーは、詳細に調べられているが（Ｄｚｉｅｒｚａｋ， Ｅら、１９９８ Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｔｏｄａｙ １９， ２２８−３６）、肝前駆細胞のマーカーの研究はまだ初期段階で、これらはあまり決定されていない（Ｓｉｇａｌ， Ｓら、１９９４ Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ １９， ９９９）。さらに、成体肝細胞で通常使用されるエクスビボの増殖条件では、アルブミン発現のような組織特異的機能の損失を伴った分化が起きる（Ｂｌｏｃｋ， Ｇ．Ｄ．ら、１９９６ Ｊ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． １３２， １１３３）。組織特異的ｍＲＮＡを合成するやや改善した能力と、翻訳後に完全に組織特異的遺伝子を調節する能力とは、無血清で、ホルモン、増殖因子、および／または一部の細胞外マトリックス成分が定義されている混合物を用いて維持された肝細胞にのみ、見受けられる（Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ， Ｄ．Ｍ．ら、１９８４． Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． ４， １９２９； Ｅｎａｔ Ｒら、１９８４， ８１， １４１１）。しかし、増殖する胎児肝細胞は、インビボでそのような血清タンパク質の発現を維持する。
【０００７】
肝前駆細胞の他に、多くの種の胎児肝は造血前駆細胞を含んでいる。造血前駆細胞および造血細胞は、その表面に主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）抗原を発現している。ＭＨＣの命名法は、完全に標準化されてはいない。したがって、古典的ＭＨＣクラスＩ抗原は、ＭＨＣクラスＩａまたはＭＨＣクラスＩＡと呼ばれる場合もある。同様に、非古典的ＭＨＣクラスＩ抗原も、ＭＨＣクラスＩｂまたはＭＨＣクラスＩＢと呼ばれる場合もある。
【０００８】
ＭＨＣ抗原に関する研究の中で、チャッペル（Ｃｈａｐｐｅｌ）の米国特許第５，６７９，３４０号は、２つの抗原エピトープに抗体を結合することによる、ＭＨＣを含む細胞表面抗原の修飾を特許請求している。反対に、チャッペルはＭＨＣおよび他の抗原が前駆細胞の単離に使用できることを開示していない。
【０００９】
インビトロで肝実質細胞を増殖させようという試みがなされてきた。ノートン（Ｎａｕｇｈｔｏｎ）らの米国特許第５，５１０，２５４号は、生体適合性であるが生きていない材料の３次元フレームワークに依存する肝細胞の培養を特許請求している。したがって、人工的フレームワークがなく、肝前駆細胞が増殖および培養できるような培養条件には未充足の需要がある。さらに、生体人工肝臓の成分として使用したり、肝臓毒の試験、および薬物開発するために適している両能性分化能を持つ肝前駆細胞をクローニングする方法には未充足の需要がある。
【００１０】
ノートンらの米国特許第５，５５９，０２２号は、「予備細胞（ｒｅｓｅｒｖｅ ｃｅｌｌ）」の特徴付けに使用される染料であるエオシンＹに結合する肝予備細胞を特許請求している。米国特許第５，５５９，０２２号では、肝予備細胞の同定に、確立されたマーカーを使用しておらず、予備細胞のクローン増殖の方法も、生存能力のある肝予備細胞の単離に用いるマーカーも提供されていない。したがって、特異的マーカーの発現および肝実質細胞または胆管細胞のいずれかに分化する能力を含め、肝前駆細胞に必須の多くの特徴を持つ細胞の単離および培養方法には、未充足の需要がある。同様に必要なのは、肝前駆細胞をクローン増殖させる方法である。クローン増殖は、多能性肝前駆細胞の明確で厳密な区別および同定方法として必須である。
【００１１】
本発明者らは、はるかに有用な肝前駆細胞からではなく、肝実質細胞のような成熟した肝細胞を培養するのは不適当であると認識した。発明者らは肝前駆細胞の単離パラメーターおよびクローン増殖の要件を注意深く決定した。前駆細胞ならびに前駆細胞の選択および培養方法には、肝不全の患者の治療薬、および毒性物質の評価、および薬剤の評価を含め、多くの利用方法がある。
【００１２】
３． 発明の概要
本発明は、古典的ＭＨＣクラスＩ抗原（ＭＨＣクラスＩａ抗原）を発現せず、ＩＣＡＭ抗原またはＩＣＡＭ−１抗原を発現する、両能性肝前駆細胞の単離方法に関する。また、両能性肝前駆細胞は選択的に、ＭＨＣクラスＩの単形性エピトープを含む非古典的ＭＨＣクラスＩ抗原（ＭＨＣクラスＩｂ抗原）を発現する可能性がある。肝臓を含むがこれに限定されないいくつかの組織由来の前駆細胞が使用できる。したがって、本発明は、古典的ＭＨＣクラスＩ陰性で、選択的にＩＣＡＭ−１陽性の肝前駆細胞を単離する方法に関する。同様に、本発明は古典的ＭＨＣクラスＩ陽性の表現型を発現する細胞を除去することによって、ＩＣＡＭ−１陽性だが古典的ＭＨＣクラスＩ陰性の表現型を発現する前駆細胞を単離する方法に関する。非古典的ＭＨＣクラスＩの弱い発現は、前駆細胞をさらに単離するために使用できる。好ましくは、本発明は多能性肝前駆細胞の単離およびクローニング方法に関する。多能性肝前駆細胞は、任意の魚類、両生類、爬虫類、鳥類、および哺乳類を含む脊椎動物由来でよく、より好ましくは哺乳類由来である。さらにより好ましくは、多能性肝前駆細胞は、霊長類、ブタ、ラット、ウサギ、イヌ、またはマウス由来である。最も好ましくは多能性肝前駆細胞は、ヒト由来である。最も好ましい方法では、両能性肝前駆細胞である、肝前駆細胞を生成する。したがって、両能性肝前駆細胞またはその子孫は、肝細胞または胆管細胞のいずれかに分化し得る。
【００１３】
前駆細胞が濃縮された細胞群は、まず脊椎動物細胞の懸濁液を得る方法によって得られる。その後、任意の順で順番にまたは実質的に同時に、少なくとも１つのＭＨＣクラスＩａ抗原を発現する細胞、およびＩＣＡＭ抗原を発現する細胞を細胞懸濁液から除去し、前駆細胞が濃縮された細胞混合物を提供する。同様に、脊椎動物の胚幹細胞を提供し、胚幹細胞を増殖させて胚幹細胞の子孫を提供し、ＩＣＡＭ抗原を発現し、ＭＨＣクラスＩａ抗原を発現しない胚幹細胞の子孫を単離することによって、肝前駆細胞が濃縮された、脊椎動物の胚幹細胞の混合物が得られる。
【００１４】
当技術分野で周知の物理的、免疫学的、および細胞培養によるすべての分離方法は、本発明に含まれる。分離方法は、特に免疫分離を含む。免疫分離は、標識抗体との相互作用後のフローサイトメトリーでよい。免疫分離の方法には、磁性ビーズ、生分解性ビーズ、非生分解性ビーズ、ディッシュを含むパニング表面に結合している抗体を用いたアフィニティ法、およびその方法の組み合せも含まれる。
【００１５】
さらに、肝前駆細胞および両能性幹細胞、ならびにその子孫は、選択的に、αフェトプロテイン、アルブミン、胎児肝由来の造血細胞よりも高い側方散乱光、または細胞が積み重なる増殖パターンを含むがこれらに限定されない他の表現型を発現する可能性がある。
【００１６】
肝幹細胞は、αフェトプロテインまたはアルブミンを発現する場合もしない場合もあるが、αフェトプロテインおよびアルブミンまたはＣＫ１９のような胆管マーカーを発現する細胞を生み出す細胞である。
【００１７】
本発明はＩＣＡＭ−１発現と組み合わせたＭＨＣクラスＩ表現型を検出する手段に肝細胞を暴露し、細胞群内でＭＨＣクラスＩ抗原を発現しない細胞を同定することによって、好ましくは肝前駆細胞である前駆細胞を同定する方法にも関する。同様に、αフェトプロテインのような、前駆細胞または肝臓の表現型の他のマーカーも検出できる。
【００１８】
さらに本発明は、古典的ＭＨＣクラスＩ陰性およびＩＣＡＭ−１陽性の表現型により特徴付けられる、肝幹細胞および前駆細胞ならびにその子孫にも関するが、これらの細胞は、選択的に古典的ＭＨＣクラスＩ弱陽性、造血細胞前駆細胞よりも高い側方散乱光、または細胞が積み重なる増殖パターンを含むがこれらに限定されない他の表現型を発現する可能性がある。子孫はαフェトプロテイン、アルブミン、またはＣＫ１９を発現する可能性がある。そのように単離された肝幹細胞および前駆細胞の子孫は、親の表現型を維持し、選択的に発生してさらなる表現型を発現する可能性がある。特に、子孫細胞は、選択的に肝実質細胞の表現型および胆管細胞の表現型を発現し得る。肝実質細胞の表現型は、特色の中でも、アルブミンの発現で特徴付けられる。胆管細胞の表現型は、特色の中でも、ＣＫ１９の発現により特徴付けられる。
【００１９】
肝前駆細胞、その子孫、または前駆細胞と子孫の組み合せの組成物は、少なくとも１つのＭＨＣクラスＩｂ抗原を弱く発現する細胞、非実質細胞よりもフローサイトメトリーで高い側方散乱光を示す細胞、およびαフェトプロテイン、アルブミン、ＣＫ１９、またはその組み合せからなるポリペプチドを発現する細胞も含み得る。組成物は、内胚葉または骨髄に由来し得る。この組成物では、内胚葉組織は、肝臓、膵臓、肺、消化管、甲状腺、性腺、またはその組み合せであり得る。
【００２０】
５． 好ましい態様の詳細な説明
本発明は前駆細胞の単離過程および前駆細胞を含む組成物である。１つの態様では、本発明は肝幹細胞および肝前駆細胞の同定、単離、およびクローン増殖の過程である。本過程は、造血細胞および他の大部分の有核細胞を特徴付けるが、肝幹細胞および前駆細胞の細胞表面には実質的に存在しない、ＩＣＡＭ−１のようなＩＣＡＭ、接着タンパク質、および古典的ＭＨＣクラスＩ抗原に特異的な抗体に対し、肝臓のような内胚葉組織に由来する混合した細胞群を暴露する段階を含む。細胞は肝臓、膵臓、肺、消化管、甲状腺、性腺を含むがこれらに限定されない任意の内胚葉組織由来、または肝臓、または生物体全体に由来するものでよい。親和性に基づく相互作用、例えばアフィニティーパニングによる方法、補体と組み合せた免疫手術による方法またはフローサイトメトリーを含む、肝幹細胞および他の初期の肝前駆細胞を単離する任意の方法が使用できる。フローサイトメトリーによる分離は、例えば非古典的ＭＨＣクラスＩ抗原のような、中間的なレベルの抗原発現に基づいても良い。より好ましい態様では、この過程には、肝細胞の特徴である細胞の粒状度または細胞質脂肪滴の量に依存するパラメーターである、比較的高い側方散乱光（ＳＳＣ）を示す細胞の選択がさらに含まれる。肝前駆細胞のＳＳＣは、造血細胞または胎児肝の間質細胞のような他の非実質細胞よりも高いが、成体肝のような成熟した実質細胞よりも低い。また、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ１４、および／またはＣＤ１１７のようなαフェトプロテイン（ＡＦＰ）陽性前駆細胞上に発現される他のマーカーも、両能性前駆細胞の単離に使用できる。同様に、非肝前駆細胞の除去のために、赤血球抗原（ヒト肝臓の赤血球細胞上のグリコフォリンＡなど）、免疫グロブリンＦｃ受容体、ＭＨＣクラスＩＩ抗原、ＡＢＯ型マーカー、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２８、ＣＤ３２、ＣＤ３６、ＣＤ４２、ＣＤ４３、ＣＤ４５、ＣＤ５６、ＣＤ５７、ＣＤ６１、ＣＤ７４、ＣＤｗ７５を含むがこれらに限定されない他のマーカーも使用できる。さらに、当技術分野で周知の他の技術も前駆細胞の単離に使用される過程の一部として使用でき、これらにはレーザー剥離を含む剥離技術、密度分離、ゾーン遠心分離を含む沈降速度分離、細胞水簸、選択的接着、テトラゾリウム塩による細胞加重を含む分子加重、大きさによるふるい分け、選択的増殖、サイトトキシンの利用を含む選択的代謝阻害、および多因子分離が含まれるがこれらに限定されない。
【００２１】
本発明の１つの好ましい態様では、前駆細胞は胎児、小児、若者、または成体から得られる。
【００２２】
本発明の１つの好ましい態様では、肝細胞は無血清のホルモン添加合成培地で選択的に増殖される。さらに、線維芽細胞または別の中胚葉細胞から派生するフィーダー細胞の層を用いて、肝細胞が選択的に培養増殖されるのが、さらに好ましい。フィーダー細胞は、ヒト、非ヒト霊長類、ブタ、ラット、またはマウスのフィーダー細胞であるのが好ましいが、任意の哺乳類、鳥類、爬虫類、両生類、魚類のフィーダー細胞でも構わない。フィーダー細胞が胚細胞であるのがより好ましいが、新生児または成体組織のフィーダー細胞でも構わない。より好ましい態様では、フィーダー細胞はクローニングされ、肝幹細胞および前駆細胞を支持する能力で選択される。さらに好ましい態様では、肝幹細胞および前駆細胞はクローン増殖条件下で培養され、それにより肝細胞としての同定がなされ、かつクローン起源の細胞群の増殖が可能となる。
【００２３】
本発明の１つの好ましい態様には、古典的ＭＨＣクラスＩ陰性およびＩＣＡＭ−１陽性の哺乳類肝前駆細胞が含まれる。両能性細胞の単離には、２色ソートが便利な方法である：ＩＣＡＭ−１陽性および古典的ＭＨＣクラスＩ陰性は、これらの細胞を定義する２つのパラメーターである。ＩＣＡＭ−１陽性細胞群には、造血、中胚葉、および成熟肝細胞が含まれる。発現の程度は、細胞の状態によって大きく変動する（例えば、活性化状態と静止状態の細胞では異なる）。古典的ＭＨＣクラスＩ抗原は、幹細胞から成熟細胞まで、全ての有核造血細胞上、および成熟肝実質細胞上に発現している（ただし成熟肝実質細胞の発現量は造血細胞よりも低い）。ラット胎児肝では、古典的ＭＨＣクラスＩ陰性細胞には：両能性肝前駆細胞、除核成熟赤血球、および同定されていない細胞群が含まれる。また、細胞は非古典的ＭＨＣクラスＩを発現していても良い。さらに、前駆細胞の子孫は、αフェトプロテイン、アルブミン、またはＣＫ１９を発現する可能性があり、細胞が互いの上に積み重なってクラスターで増殖する増殖特性を示す場合もある。
【００２４】
本発明の１つの態様では、単離された前駆細胞は分裂し、子孫を産生する能力を持つ。より好ましくは、前駆細胞は約１０以上の有糸分裂サイクルの能力を持つ。さらに好ましくは、子孫は前駆細胞または肝実質細胞および胆管細胞である。本発明の好ましい態様では、単離された肝幹細胞および前駆細胞は、上皮成長因子（ＥＧＦ）の選択的使用により、肝実質細胞または胆管細胞に運命づけられている。
【００２５】
１つの好ましい態様では、本過程には、さらにαフェトプロテインを発現し、αフェトプロテインに特異的な抗体に結合する細胞を選択する段階が含まれる。別の好ましい態様では、さらにアルブミンを合成し、アルブミンに特異的な抗体に結合する細胞を選択する段階が含まれる。
【００２６】
本発明のより好ましい態様では、単離された幹細胞および前駆細胞は、生体外の肝臓の成分として使用される。本発明のさらに好ましい態様では、単離された幹細胞および前駆細胞およびその子孫を持つ生体外の肝臓は、肝機能不全または肝不全を患う患者の生命維持に使用される。
【００２７】
本発明は、ここでは胎児由来で示される肝前駆細胞のエクスビボの増殖に必要な、特定の培養条件を開示する。本発明者らは、フィーダー細胞として理想的なことが分かったＳＴＯマウス胚細胞の亜系統を選択した。フィーダー細胞は、新規の無血清のホルモン添加合成培地（ＨＤＭ）と組み合せて使用された。この組み合せによって、細胞が悪性形質転換せずに、ラットのＥ１５肝臓から様々なラット胚肝細胞株を確立できた。発明者は肝臓組織から新しく単離された肝前駆細胞のクローナル増殖能力を決定するための、インビトロコロニー形成アッセイ（ＣＦＡ）法の開発のための、肝細胞株の使用およびＨＤＭ−ＳＴＯ共培養系を開示する。ＣＦＡと、決められたフローサイトメトリープロファイルによってソートされた細胞とを組み合せると、両能性肝前駆細胞が明らかになる。例えば、マウスのＥ１１．５に対応し、増殖能力の高いＥ１３ラットの肝臓由来の前駆細胞は、古典的ＭＨＣクラスＩ（ラットのＲＴ１Ａ領域）陰性、ＯＸ１８（ＭＨＣクラスＩ抗原上の単形性エピトープ）弱陽性、およびＩＣＡＭ−１陽性という表現型を持つ。ＲＩ１Ａ陰性およびＯＸ１８弱陽性という表現型は、非古典的ＭＨＣクラスＩ（ＭＨＣクラスＩｂ）弱陽性と同等である。本発明では、ＥＧＦが、前駆細胞コロニーの増殖と、その肝実質細胞または胆管上皮細胞としての運命との両方に影響を与えることが開示される。
【００２８】
６． 実施例
用語の説明
古典的ＭＨＣクラスＩ抗原
造血細胞上に最も強く発現しているが、主にすべての有核細胞上に見られる主要組織適合性抗原の群。抗原はＭＤＨＣクラスＩａとしても知られる。古典的ＭＨＣ抗原の名称は種により異なり、例えばヒトではＭＨＣ抗原はＨＬＡと呼ばれる。表３はいくつかの種の古典的ＭＨＣ抗原の名称を示す。
【００２９】
非古典的ＭＨＣクラスＩ抗原
１つの種の中でも異なり得る主要組織適合性抗原の群で、ＭＨＣクラスＩｂとしても知られる。非古典的ＭＨＣ抗原の名称は種により異なる。例えば、表４を参照のこと。
【００３０】
ＩＣＡＭ
細胞間接着分子−１ （ＣＤ５４）は膜糖蛋白であり、免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーである。ＩＣＡＭ−１のリガンドはβ２インテグリン、ＬＦＡ−１ （ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８） 、およびＭａｃ−１ （ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８）である。この分子は、白血球の内皮への接着にも重要である。さらに、ＩＣＡＭ−１は白血球の管外遊出にも関与する。ＩＣＡＭ−１という用語は、哺乳類に見られるこれらの分子の形を指す。ＩＣＡＭまたはＩＣＡＭ−１様という用語は、非哺乳類の脊椎動物において相同および機能的に関連したタンパク質を指すのに使われる。
【００３１】
デバルキング
細胞懸濁液から、主要な細胞群を除去する過程である。胎児肝では、主要な非肝細胞系細胞は、赤血球細胞、マクロファージ、単球、顆粒球、リンパ球、巨核球、造血前駆細胞、および間質細胞である。
【００３２】
弱陽性（Ｄｕｌｌ ｐｏｓｉｔｉｖｅ）
蛍光活性化セルソートにおいて、発光強度は細胞に結合した蛍光色素結合免疫グロブリン分子の数に比例し、これは分析する細胞表面抗原の密度に比例する。抗原の表面密度または細胞内密度は１細胞あたり数個から数十万まであるので、広範囲の蛍光強度が測定される。弱陽性（または弱）の値は、経験的に決定され、多くの抗原を持つ明るい蛍光細胞の強度と、特定の抗原の発現量の低い暗い細胞の中間である。強度はゲートまたは強度の間隔でも定義できる。弱陽性の表現型は、弱く発現された抗原の特徴である。この表現型は弱いまたは低い発現とも表現される。
【００３３】
クローン増殖
細胞培養では、クローン増殖とは最初の単一の細胞が有糸分裂を繰り返し、１つの親細胞に由来する細胞のクローンを形成することである。細胞のクローンを増殖させて、細胞のコロニーまたはクラスターを形成させることができる。クローン増殖とは、単一の細胞の生存能力および有糸分裂を支持するために必要な条件も指す。これらの条件は、通常、強化されたおよび複合基礎栄養培地、無血清、特定の増殖因子およびホルモンの存在、決められた性質の細胞外マトリックスの基底、および／または１つまたは複数の増殖因子、ホルモン、またはマトリックス成分を供給する細胞の共培養を含む。
【００３４】
濃縮の条件
「除去する」という用語は、保存するまたは廃棄するために、分離、選択、および取り分けをすることを意味する。したがって、間質細胞は、これを保存するためまたは廃棄するために、任意のいくつかの方法によって、混合した細胞群から除去することができる。「単離する」という用語は、より大きな群から分離して、分けて置いておくことを意味する。したがって、前駆細胞は前駆細胞および非前駆細胞の混合群から単離することができる。「精製する」という用語は、不要な成分から分離することを意味する。
【００３５】
クラスター増殖
肝前駆細胞は、しばしば明確な特徴を示し、細胞は分裂し、互いに接近したままになる。前駆細胞は、細胞が積み重なりあったクラスターを形成する。重なった細胞の３次元塊の中の細胞は、フィーダー細胞または他の前駆細胞に隣接している。クラスターはＰコロニーまたはＰ型コロニーとも呼ばれ、細胞単層とは異なる。
【００３６】
以下の実施例は本発明を説明するものであるが、本発明はこれらの具体的な実施例によって限定されるものではない。当業者は、これらの実施例の中に、本発明を実施する手段を見いだすものと思われる。また、当業者は本発明の範囲内である別の複数の態様も認識すると思われる。
【００３７】
６．１ 肝幹細胞および肝前駆細胞の調製および分析
ラット
チャールズ・リバー・ブリーディングラボラトリー（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｂｒｅｅｄｉｎｇ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）（Ｗｉｌｍｉｎｇｏｎ， ＭＡ）から、妊娠したフィッシャー３３４ラットを入手する。時刻を設定した妊娠には、午後に動物を一緒にして、プラグが観察された朝を０日とする。成体の肝細胞には、オスのフィッシャー３３４ラット（２００〜２５０ ｇ）が使用される。
【００３８】
胎齢１５日の肝臓由来の幹細胞株の確立
胎齢１５日の胎児肝が調製される。単細胞懸濁液は、０．０５％トリプシンおよび０．５ ｍＭ ＥＤＴＡまたは１０ユニット／ｍｌサーモリシン（Ｓｉｇｍａ， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ）および１００ユニット／ｍｌデオキシリボヌクレアーゼＩ（Ｓｉｇｍａ）で肝臓を３７℃でインキュベートして得られる。細胞は、フィコール−パーク（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ， Ｕｐｐｓａｌａ， Ｓｗｅｄｅｎ）に重ね、４５０ｇで１５分間密度勾配遠心を行なう。ｔｈ１１２０−３およびｒｔｅｒ６またはｒｈｅｌ４３２１について、底部の画分の細胞を、それぞれ１７ ｍｇ／ｍｌ ＩＶ型コラーゲン（Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ， Ｂｅｄｆｏｒｄ， ＭＡ）または１２μｇ／ｍｌラミニン（Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）でコートした組織培養ディッシュに接種する。無血清のホルモン添加培地ＨＤＭは、ダルベッコ変法イーグル培地およびハムＦ１２の１：１の混合物（ＤＭＥＭ／Ｆ１２、ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ、Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ， ＮＹ）に、２０ ｎｇ／ｍｌ ＥＧＦ（Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）、５μｇ／ｍｌインスリン（Ｓｉｇｍａ）、１０−７Ｍデキサメタゾン（Ｓｉｇｍａ）、１０μｇ／ｍｌ鉄飽和トランスフェリン（Ｓｉｇｍａ）、４．４ ｘ １０−３Ｍニコチンアミド（Ｓｉｇｍａ）、０．２％ウシ血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ）、５ ｘ １０−５Ｍ ２−メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ）、７．６ μｅｑ／ｌ遊離脂肪酸、２ ｘ １０−３Ｍグルタミン（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ）、１ ｘ １０−６Ｍ ＣｕＳＯ４、３ ｘ １０−８Ｍ Ｈ２ＳｅＯ３および抗生物質を添加したものである。記載の各濃度は、培地中の最終濃度である。４週間の培養後、トリプシン処理した細胞をマイトマイシンＣで処理したＳＴＯマウス胚線維芽細胞株（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ， Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ ＭＤ）のフィーダー層上で培養する。Ｔｈ１１２０−３、ｒｔｅｒ６およびｒｈｅｌ４３２１は、胎児肝細胞の３つの独立した調製物からクローニングし、ＨＤＭを用いてＳＴＯフィーダー細胞上で維持する。細胞株の確立後、全ての培養に関してＥＧＦの濃度は１０ ｎｇ／ｍｌに低下させる。
【００３９】
Ｅ１３の胎児肝の解離
胎児肝は１０ ｍＭ ＨＥＰＥＳ， ０．８ ｍＭ ＭｇＳＯ４および１ｍＭ ＥＧＴＡ （ｐＨ ７．４）を添加した、Ｃａ＋＋フリーの氷冷ＨＢＳＳ中に切開して入れる。肝臓は１０ ｍＭ ＨＥＰＥＳ、０．８ ｍＭ ＭｇＳＯ４、および１ ｍＭ ＣａＣｌ２で調製されたＨＢＳＳ中の０．２％ ＩＶ型コラゲナーゼ（Ｓｉｇｍａ）および１６．５ユニット／ｍｌサーモリシン（Ｓｉｇｍａ）を用いて、粉砕する。３７℃で１０分間インキュベーションした後、細胞懸濁液を０．０２５％トリプシンおよび２．５ ｍＭ ＥＤＴＡ （Ｓｉｇｍａ）で１０分間消化する。その後、１ ｍｇ／ｍｌのトリプシン阻害剤（Ｓｉｇｍａ）を添加してトリプシンを抑制する。最後に、細胞を２００ユニット／ｍｌデオキシリボヌクレアーゼＩ （Ｓｉｇｍａ）で処理する。全ての実験において、肝臓１つあたり３〜５ ｘ １０５細胞が得られる。
【００４０】
成体肝細胞の単離
肝細胞を単離するために、２段階の肝臓潅流法が用いられる。潅流後、細胞を５０ｇで１分間、２回遠心し、大きな実質細胞を濃縮する。生存度はトリパンブルー排除による測定によると＞９０％である。
【００４１】
細胞接着アッセイ法
フィブロネクチン（Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）、ラミニン、およびＩＶ型コラーゲンに対する細胞の接着は、これらのタンパク質を０．３〜１０μｇ／ｍｌでコートした９６穴マイクロタイタープレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ， Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ， ＭＡ）を用いて評価する。２００ｇで１５分間のパーコール（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）密度勾配遠心によりＳＴＯ細胞を除去した後、各ウェル中で３ ｘ １０４細胞の肝細胞株ｔｈ１１２０−３、ｒｔｅｒ６、およびｒｈｅｌ４３２１をＨＤＭを用いて１０時間培養する。浮遊細胞を除去するために２回すすいだ後、テトラゾリウム塩ＷＳＴ−１を含む新しい培地（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ， Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ， ＩＮ）を添加して、生存可能な接着細胞の数を測定する。４時間後に、製造元のプロトコールにしたがって、吸光度を決定する。
【００４２】
ＳＴＯ亜系統
ＡＴＣＣから得た１００個の親ＳＴＯ細胞は、１０％の熱で不活化した胎児ウシ血清、２ ｘ １０−３Ｍグルタミン、５ ｘ １０−５Ｍ ２−メルカプトエタノール、および抗生物質を添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２中で、１００ｍｍ培養ディッシュで７日間培養する。細胞の形態および増殖速度によって、さらに解析するために４つのサブクローンが選択される。ｒｔｅｒ６のＣＦＡは４つのサブクローンで行われるが、その１つであるＳＴＯ６はマイトマイシンＣ処理後に培養プレートに接着しなくなる。１つのサブクローンＳＴＯ５はアダムス博士（Ｄｒ． Ｊ． Ｍ． Ａｄａｍｓ， Ｔｈｅ Ｗａｌｔｅｒ ａｎｄ Ｅｌｉｚａ Ｈａｌｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）から提供を受けたｐＥＦ−Ｈｌｘ−ＭＣ１ｎｅｏまたはｐＥＦ−ＭＣ１ｎｅｏによってトランスフェクトする。Ｎｄｅ Ｉ部位で線状にしたプラスミドを、ＤＯＳＰＥＲリポソームトランスフェクション試薬（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）によって細胞中に導入する。Ｇ４１８選択後、６つのクローンが単離される。各々３つのクローンがＣＦＡで分析される。
【００４３】
コロニーの免疫組織化学染色
培養プレートはメタノール−アセトン（１：１）で室温で２分間固定し、すすぎ、２０％のヤギ血清（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ）を含むハンクス液（Ｈａｎｋｓ Ｂａｌａｎｃｅｄ Ｓａｌｔ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ （ＨＢＳＳ））により、４℃でブロックする。αフェトプロテインとアルブミンの二重免疫組織化学のためには、プレートは抗ラットアルブミン抗体（ＩＣＮ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ， Ｃｏｓｔａ Ｍｅｓａ， ＣＡ）処理後にテキサスレッド結合抗ウサギＩｇＧ（Ｖｅｃｔｏｒ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ， ＣＡ）、およびＦＩＴＣ結合抗ラットαフェトプロテインポリクローナル抗体（Ｎｏｒｄｉｃ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， Ｔｉｌｂｕｒｇ， Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）とインキュベートする。アルブミンとＣＫ１９の二重標識には、抗αフェトプロテイン抗体の代わりに、抗ＣＫ１９モノクローナル抗体（Ａｍｅｒｓｈａｍ， Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ， Ｅｎｇｌａｎｄ）およびＦＩＴＣ結合抗マウスＩｇＧ（Ｃａｌｔａｇ， Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ， ＣＡ）が使用される。
【００４４】
フローサイトメトリー分析
細胞はＦＡＣＳｃａｎ （Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ， Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ， ＣＡ）で分析し、Ｍｏｆｌｏｗ Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ （Ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ， Ｆｏｒｔ Ｃｏｌｌｉｎｓ， ＣＯ）を用いてソートする。Ｅ１３胎児肝から得た細胞懸濁液は、非特異的抗体結合を予防するために、氷上で２０％ヤギ血清（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ）および１％硬骨類のゼラチン（Ｓｉｇｍａ）を含むＨＢＳＳとインキュベートする。すすいだ後、細胞はＦＩＴＣ結合抗ラットＲＴ１Ａａ，ｂ，ｌ抗体Ｂ５ （Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ）およびＰＥ結合抗ラットＩＣＡＭ−１抗体１Ａ２９（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）と懸濁する。一部の実験では、３色染色のため、細胞はビオチン化抗ラット単形性ＭＨＣクラスＩ抗体ＯＸ１８ （Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）で染色した後、ストレプトアビジン−レッド６７０ （ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ）による第２の染色を行なう。全ての染色は、１０ ｍＭ ＨＥＰＥＳ， ０．８ ｍＭ ＭｇＳＯ４， ０．２ ｍＭ ＥＧＴＡ、および０．２％ ＢＳＡ （ｐＨ ７．４）を含み、Ｃａ＋＋フリーの氷冷ＨＢＳＳを用いて行なう。確立された３つの細胞株は、トリプシン処理をして、パーコール密度勾配遠心によってフィーダー細胞を除去する。ラットヘパトーマ細胞株ＦＴＯ−２Ｂおよびラット肝上皮細胞株ＷＢ−Ｆ３４４ならびに成体肝細胞は、胎児肝細胞株と比較するために染色する。細胞株は、それぞれフォアニエー博士（Ｄｒ． Ｒ．Ｅ．Ｋ． Ｆｏｕｒｎｉｅｒ， Ｆｒｅｄ Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ， Ｓｅａｔｔｌｅ， ＷＡ）、およびソウ博士（Ｄｒ． Ｍ．−Ｓ． Ｔｓａｏ， Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｎｏｒｔｈ Ｃａｒｏｌｉｎａ， Ｃｈａｐｅｌ Ｈｉｌｌ， ＮＣ）から贈与された。細胞はブロックして、ＦＩＴＣ結合Ｂ５， ＯＸ１８， ＰＥ結合１Ａ２９、または抗ＦＩＴＣ結合ラットインテグリンβ１抗体Ｈａ２／５ （Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）により染色する。ＯＸ１８にはＦＩＴＣ結合抗マウスＩｇＧが使用される。マウス細胞群を排除するために、３つの胎児肝細胞株の細胞懸濁液は、ビオチン化抗マウスＣＤ９８で染色後、ストレプトアビジン−レッド６７０および抗ラットモノクローナル抗体による第２の染色を行なう。
【００４５】
肝細胞株、ソートした細胞、および成体肝細胞のＣＦＡ
肝細胞株は細胞株の維持に使用されたのと同一のＨＤＭを用いて、マイトマイシンＣ処理ＳＴＯフィーダー層上に、９．６ ｃｍ２あたり５００細胞で、３連で播く。播く前に、細胞はトリプシン処理をして、パーコール密度勾配遠心によってフィーダー細胞を除去する。培養液は２日ごとに培地を取り換えながら１０〜１４日インキュベートする。その後、αフェトプロテインおよびアルブミンの二重免疫蛍光染色が行われる。各ウェル１００コロニーを、コロニーの形態、ＰまたはＦ型、およびαフェトプロテインおよびアルブミンの発現について分析する。コロニーはＤｉｆｆ−Ｑｕｉｃｋ （Ｂａｘｔｅｒ， ＭｃＧａｗ Ｐａｒｋ， ＩＬ）を用いて染色し、各ウェルのコロニー数を数える。初代のソートした細胞および成体肝細胞のＣＦＡでは、記述のように播く細胞数を変更する。別のわずかな変更として、培養期間を１４および１７日の間に延長し、デキサメタゾンの濃度を１０−６Ｍに上昇させる。他の手順は上述のように実行される。成体肝細胞のＣＦＡでは、調製後、細胞懸濁液から、少数の肝細胞クランプが除去されない。したがって、クランプから不確定数のコロニーが作られる可能性がある。ソートした細胞上の胆管分化のＣＦＡでは、コロニーのアルブミンおよびＣＫ１９の二重免疫蛍光染色がＥＧＦの存在下または非存在下で、培養５日目に行われる。培養５日目に、ＣＫ１９＋細胞を１個を超えて持つコロニーは、ＣＫ１９＋コロニーとして数える。１０日および１５日目には、２個のＣＫ１９＋細胞のクラスターを複数含むコロニー、または３個を超えるＣＫ１９＋細胞のクラスターを１つ含むコロニーは、ＣＫ１９＋コロニーとして数える。各ウェルで約１００のコロニーが数えられる。各点は３連の染色した培養物の平均±ＳＤを表す。
【００４６】
６．２． ホルモン添加合成培地を用いた、マウス胚細胞のフィーダーを用いた胎児ラット肝細胞株の作製および解析
どれだけの期間、胎児肝細胞が維持され、エクスビボで増殖し、子孫を産生できるかを知るために、ラットＥ１５肝細胞の単純な長期培養を試みる。造血単核細胞を除去するために密度勾配遠心を行なった後、胎児肝細胞をＩＶ型コラーゲンまたはラミニンでコートした培養ディッシュおよびＨＤＭ（実施例６．１参照）を用いて培養する。細胞は４週間以上、生存する。しかし、新しくＩＶ型コラーゲンまたはラミニンでコートしたディッシュ上の２次培養では、さらには増殖しない。マイトマイシンＣ処理のＳＴＯ胚マウス線維芽細胞株を２次培養のフィーダー層として使用すると、細胞の多くの塊が増殖する。最終的に、４つの独立した実験から、いくつかの安定した肝細胞株が確立される。
【００４７】
αフェトプロテインおよびアルブミンの免疫組織分析は、細胞株のクローニングの前に、連続的に増殖する細胞群で行われる。αフェトプロテインおよびアルブミンの両方のタンパク質は、細胞群が肝細胞系起源であることを確認するマーカーとして使用される。Ｐコロニーと呼ばれる、細胞の積み重なりを形成する傾向のある細胞群は、αフェトプロテインおよびアルブミンを強く発現したが、別のクラスターはＦコロニーと呼ばれる平坦な単層を形成し、αフェトプロテインの発現は低下し、アルブミンは発現しなかった。胚マウス線維芽細胞ＳＴＯは、いずれの抗体にも反応性を示さない。さらに解析するために、Ｐ型またはＦ型のコロニーという形態的な基準により、独立した実験で、３つのクローニングされた肝細胞株が選択される（図１Ａ〜１Ｃ）。Ｒｈｅｌ４３２１（図１Ａ）は、主に小さな細胞の詰まったＰ型コロニーからなり、ｔｈ１１２０−３（図１Ｃ）は、Ｆ型コロニーの平らな単層のみを形成する。Ｒｔｅｒ６（図１Ｂ）はこの２つの表現型の中間である。興味深いことに、ｒｔｅｒ６の不均一性は、平らなコロニーを連続３回クローニングした後でも観察される。ｒｈｅｌ４３２１およびｒｔｅｒ６の単一細胞に由来するコロニーの不均一性を見るために、９．６ ｃｍ２（６穴プレートの１つのウェル）あたり５００細胞の密度で播種し、細胞をＳＴＯ線維芽細胞上で１０〜１４日培養した。その後、コロニーの形態およびαフェトプロテインおよびアルブミンの発現の解析をした。図２Ａ〜２Ｆはその結果を表す。ｒｈｅｌ４３２１（図２Ｂ）およびｒｔｅｒ６（図２Ｃ）の細胞株、ならびにクローニング前の元の細胞群（図２Ａ）は、ほぼ全てのＰ型コロニーで強くαフェトプロテインを発現するのに対して、Ｆ型コロニーでは発現しない。さらに、αフェトプロテインとアルブミンの両方の強い発現は、Ｐ型コロニーのみに観察される。クローニングされた肝細胞株の形態的違いは、Ｐ型コロニーの割合と相関している（図２Ｂおよび２Ｃ）。ｒｔｅｒ６およびｒｈｅｌ４３２１のＣＦＡのＰ型コロニーの割合は、それぞれ３３．３％（±８．６％ ＳＤ）および６５．７％（±４．０％ ＳＤ）である。１ウェルあたりの総コロニー数を数えて、クローン増殖効率（コロニー効率）を計算する。ｒｔｅｒ６およびｒｈｅｌ４３２１の効率は、それぞれ４５．７％（±１．３％ ＳＤ）および３６．４％（±１．１％ ＳＤ）である。ｔｈ１１２０−３細胞は、側面の境界にそって互いに強く接着しあっており、単細胞懸濁液の調製が、非常に困難である。しかし、ｔｈ１１２０−３細胞は、重なり合ったクラスターを形成しない（図１Ｃ）。
【００４８】
マウス肝細胞のラミニン、ＩＶ型コラーゲン、およびフィブロネクチンのような細胞外マトリックス（ＥＣＭ）タンパク質に対する接着は発生段階によって異なるため、各細胞株が特定のＥＣＭ成分に接着するときの選好性を次に調べる。成体肝細胞での所見と同様に、ＩＶ型コラーゲンはｔｈ１１２０−３の接着に最も効果的であるが（図１Ｃ）、ｒｔｅｒ６（図１Ｂ）およびｒｈｅｌ４３２１（図１Ａ）ではそれほどでもない。ラミニンはｒｈｅｌ４３２１の接着に最も有効な基質である（図１Ａ）。この選好性は、マウス胎児肝細胞の初代培養と同様である（Ｈｉｒａｔａら、１９８３）。要約すると、Ｐ型コロニーにおけるαフェトプロテインおよびアルブミンの保存された発現、ならびにｒｈｅｌ４３２１によるラミニンヘの優先した接着は、Ｐ型コロニーを産生している細胞群がより厳密に肝前駆細胞と関連していることを示唆する。
【００４９】
６．３ コロニー形成のためのＳＴＯサブクローンの単離；肝前駆細胞のアッセイ法
増殖能力の高い、両能性肝前駆細胞を同定するためのＣＦＡシステムを開発するために、培養系は、クローン播種密度で細胞の増殖を支持し、重要な元の肝機能を保存するものでなくてはならない。初期の肝臓発生に最も重要なマーカーのうちの２つがアルブミンおよびαフェトプロテインである。Ｆ型ではなくＰ型のコロニーがクローン増殖中にαフェトプロテインおよびアルブミンの発現を維持するので、Ｐ型コロニーを最適化する培養条件が最良である。したがって、ｒｔｅｒ６のＰ型コロニーを支持するＳＴＯサブクローンの能力が比較される。１つのクローンＳＴＯ５は、他の全ての亜系統および親株以上にＰ型コロニー形成を支持する（図２Ｄ）。ｒｈｅｌ４３２１のＣＦＡも、ＳＴＯ５が親ＳＴＯよりも有効なフィーダーであることを確認する（図２Ｅ）。Ｅ１０．５の消化管の内側を覆っている間充織細胞で発現するマウスＨ１ｘ遺伝子産物は、胎児肝細胞の増殖に必須である。Ｈ１ｘ遺伝子のｍＲＮＡ発現がＳＴＯサブクローンで分析されても、サブクローン間での発現の有意な差はない（データは示さず）。さらに、マウスＨ１ｘのＳＴＯ５中の安定なトランスフェクタントは、コロニー形成アッセイ法を改善しない（図２Ｆ）。しかし、トランスフェクタントの１つのクローンは、比較的高密度の継代で、ＳＴＯ５の元の形態をより安定的に持続させるので、このクローンはさらなる実験に使用される。
【００５０】
６．４ 表面抗原マーカーおよびコロニー形成アッセイ法を用いた、Ｅ１３胎児肝からの肝前駆細胞の同定
肝形成と大量の造血とが、胎児肝の中に共存する。これまで、造血前駆細胞の抗原性プロファイルは広く分析されてきたが、初期の肝前駆細胞の研究はまだ初期段階である。本研究で確立された３つの肝細胞株、成体肝癌細胞株（ＦＴＯ−２Ｂ）、成体ラット肝由来の上皮細胞株（ＷＢ−Ｆ３４４）、および新しく単離された成体肝細胞（図３Ａ〜３Ｘ）を用いて、肝細胞の抗原性プロファイルが分析される。ＦＴＯ−２Ｂ、ＷＢ−Ｆ３４４、および成体肝細胞と比較して、最も未熟な胎児肝細胞株ｒｈｅｌ４３２１は、古典的ＭＨＣクラスＩ（ＲＴ１Ａ１）の発現がないという点で、非常に独特である（図３Ａ）。細胞株ｔｈ１１２０−３は、ＲＴ１Ａ１（図３Ｉ）、ＯＸ１８（汎ＭＨＣクラスＩ）（図３Ｊ）、およびＩＣＡＭ−１（図３Ｋ）のパターンがｒｈｅｌ４３２１と類似しているが、ｒｔｅｒ６はＲＴ１Ａ１（図３Ｅ）およびＯＸ１８（図３Ｆ）の発現が比較的高い。さらに、異なる実験で得られた別の細胞株は、ｒｈｅｌ４３２１と同一の形態を持つが（図１Ａ〜１Ｄ）、やはりＲＴ１Ａ１−、ＯＸ１８ｄｕｌｌ、およびＩＣＡＭ−１＋である。インテグリンｂ１の発現は、全ての細胞株で類似しているが、ＲＴ１Ａａ， ｂ， １およびＩＣＡＭ−１のパターンは細胞において独特である。成体肝細胞の抗原性プロファイルはＲＴ１Ａ１＋（図３Ｕ）、ＯＸ１８＋（図３Ｖ）、およびＩＣＡＭ−１＋（図３Ｗ）である。成体ラット中では、赤血球を除く全ての骨髄細胞がＭＨＣクラスＩ分子を強く発現するので、胎児肝細胞群は、ＭＨＣクラスＩ発現によって造血細胞群から分離できる。ラットＥ１３肝臓から得られた細胞懸濁液を抗ＲＴ１Ａ１およびＩＣＡＭ−１抗体で染色する。図４Ａ１〜４Ａ２は、ＲＴ１Ａ１およびＩＣＡＭ−１の２色染色パターンを示す。どの画分に肝細胞群が含まれているかを決定するために、蛍光活性化セルソートによって５つの画分（図４Ｂ−１〜４Ｂ−５）を単離し、クローン増殖能力をＣＦＡによってスクリーニングする。図４Ｂ−１〜４Ｂ−５は、ソート後の、５つの画分の再ソート結果を表す。アルブミンおよびαフェトプロテインの発現で定義される肝細胞コロニーは、形態的にも区別可能なので、各ウェルの肝コロニーの数を数えることが可能である。肝コロニーの大部分は、ＲＴ１Ａ１ｄｕｌｌおよびＩＣＡＭ−１＋のゲートで検出され（表１、図４Ｂ−２、即ちゲート２）、Ｐ型コロニーの頻度は７５．６％（±４．９％ ＳＤ）である。ゲート１（図４Ｂ−１）は、はるかに少ないコロニー数を示し、他の画分のコロニー形成能力を持つ細胞の数はごくわずかだった。ゲート１および２では、全ての肝コロニーにおいて、αフェトプロテインおよびアルブミンの両方の発現が確認される。ゲート２の細胞に由来する一部のコロニーは、他よりも大きい。肝細胞上のＭＨＣクラスＩ発現を詳細に調べるために、細胞分画のために、ＲＴ１Ａ１、ＩＣＡＭ−１、およびＯＸ１８の３色の染色、ならびにもう１つのパラメーターとして側方散乱光（ＳＳＣ）が使用される。胎児肝細胞はＥ１１という早期の胎齢でも脂肪滴を含むので、細胞の粒状度を反映する側方散乱光（ＳＳＣ）は、造血細胞から肝細胞を分離するために有用なパラメーターである。図４Ｃ−１〜４Ｃ−５は、ゲート２に最も多数のコロニー形成細胞が含まれていることを示す。ＳＳＣに基づいてＲ２でゲートをかけると、ゲート２に対応する細胞群は明らかにＲＴ１Ａ１−およびＯＸ１８ｄｕｌｌの表現型を示す（図４Ｃ−１〜４Ｃ−５および図４Ｄ−１〜４Ｄ−４）。ＣＦＡにより、Ｒ４にはゲート２よりも多くのコロニー形成細胞が含まれることが確認される（表１）。これらの結果は、Ｅ１３ラット肝から得られたＲＴ１Ａ１−およびＯＸ１８ｄｕｌｌ、およびＩＣＡＭ−１＋細胞群の大部分が、αフェトプロテイン＋およびアルブミン＋のコロニーを生成する肝細胞であることを示唆する。これはｒｈｅｌ４３２１細胞で見られるのと同一の抗原性プロファイルである（図３Ａ〜３Ｄ）。
【００５１】
【表１】ＲＴ１ＡおよびＩＣＡＭ−１の発現に基づいてソートしたＥ１３胎児肝由来の肝コロニーの頻度
2004510432.tif 000002
【００５２】
ＳＴＯ５ｈｌｘ上でのコロニー形成培養は、Ｅ１３の胎児肝の各画分から得られる、示された数の細胞を含む。肝コロニーの数を、３連の染色した培養物から確立した（平均±ＳＤ）。コロニー形成の効率は、培養液に接種した細胞のうち、１６日の培養後に分析したところ、コロニーを形成するようになった割合を示す。
【００５３】
６．５． Ｅ１３肝細胞および成体肝細胞の異なる培養要件
Ｅ１３肝臓から得られたソートされた肝細胞の成長要件は、決められたＳＴＯ５フィーダーおよびＨＤＭを用いて調べられた。ＥＧＦは成体肝細胞の強力な増殖因子であることが以前から知られている。したがって、ソートした肝細胞のコロニー形成に対するＥＧＦの効果を調べる。ＲＴ１Ａ１− ＯＸ１８ｄｕｌｌ、ＩＣＡＭ−１＋肝細胞のコロニーサイズはＥＧＦがないと大きくなるが、成体肝細胞はＥＧＦの存在下でのみ、コロニーを生成した（図５Ａ）。さらに、成体肝細胞に由来するコロニーの形態は、通常Ｆ型であるが、ＲＴ１Ａ１−肝細胞はＥＧＦなしでＰ型コロニーを形成する。しかし、コロニー効率はＥＧＦがないとわずかに低下する（図６Ａ）。興味深いことに、ＥＧＦのない培養条件は、２種類のＰコロニー、Ｐ１およびＰ２を際立たせた。培養１２日目にはコロニーの大部分はＰ２型であるが、典型的な形態を持たないコロニーもあるので、２つのタイプを完全に区別するのは困難である。これらの結果は、胎児肝細胞および成体肝細胞は、その増殖要件ならびにＲＴ１Ａ１発現（図３および４）およびコロニーの形態において、本質的に異なることを示唆している。
【００５４】
増殖が最大に到達したと思われる培養３週間後に、ＲＴ１Ａ１− 、ＯＸ１８、およびＩＣＡＭ−１の発現を評価する。図５Ｂ〜５Ｄに示すように、ＲＴ１Ａ１の発現は誘導されず、ＯＸ１８の発現は低下している。ＩＣＡＭ−１のレベルは変化しない。さらに、単一コロニーの平均細胞数を、回収した細胞数、ラット肝細胞の割合、およびコロニー効率から計算する。見積もられる細胞数は３〜４ ｘ １０３（表２）に達する。これは、コロニーを形成する単一細胞が、この培養条件では平均で約１１〜１２回分裂したことを示す。
【００５５】
【表２】単一肝コロニーにおける細胞数の計算
2004510432.tif 000003
【００５６】
図４Ｃ−５のＲ４からソートした細胞は、６０ ｍｍまたは１００ ｍｍのディッシュでＳＴＯ５ｈｌｘフィーダー細胞上で培養した。示された期間培養した後、全ての細胞を回収し、総細胞数を計算した。ラット細胞の割合は、ラットＩＣＡＭ−１およびマウスＣＤ９８の発現に基づく、フローサイトメトリー分析による。コロニー効率は、培養に接種された細胞のうち、コロニーを形成したものの割合を示す。３連の染色した培養（平均）からのデータは、平行して行なった実験から得られた。
【００５７】
単一コロニー中の平均細胞数＝（回収した細胞の数 ｘ ラット細胞のパーセンテージ／１００）／接種した細胞の数 ｘ コロニー効率／１００）
【００５８】
６．６ ＲＴ１Ａ１−肝前駆細胞が両能性である証拠
ラット胎齢Ｅ１３において、肝細胞は成熟した肝実質細胞および胆管上皮細胞を生み出す両能性前駆細胞だと考えられる。しかし、本発明以前では、この２つの運命が単一の細胞から生ずるのかどうかを示す直接の証拠がなかった。ＲＴ１Ａ１− ＯＸ１８ｄｕｌｌ ＩＣＡＭ−１＋の胎児肝細胞がこの培養系で胆管細胞系に分化できるかどうかを知るために、胆管上皮細胞に特異的なマーカーとして抗ＣＫ１９でコロニーの染色を行なう。ＣＫ１９は、胎児肝で１５．５日以降に胆管上皮前駆細胞で発現され、この時点で細胞のアルブミン発現が消失する。ソートされたＲＴ１Ａ１− ＩＣＡＭ−１＋細胞をＥＧＦの存在下または非存在下で培養し、その運命は培養５日目にＣＫ１９およびアルブミンの発現によってモニターする。最初から５日後、ＥＧＦ処理した培養物ではＣＫ１９＋のコロニーがほとんどないが、ＥＧＦのない培養物ではＣＫ１９＋細胞を含むコロニーがいくつか見られる（図６Ａ〜６Ｂ）。ＣＫ１９の強度はかなり弱いが、ＣＫ１９＋細胞ではアルブミン発現が低下している。培養１０日目には、図６Ａ〜６Ｂに示すように、ＣＫ１９のみまたはアルブミンのみを発現するコロニーや、両方が陽性のコロニーが存在する。単一コロニーの中でのＣＫ１９＋およびアルブミン＋細胞のパターンは相反している。両方陽性のコロニーおよびＣＫ１９のみ陽性のコロニーの数は、やはりＥＧＦ非存在下のほうが高い（図６Ａ）。ＥＧＦ存在下では、１０日目には多くのコロニーがアルブミン＋細胞のみからなる（図６Ｂ）。最終的には、両方陽性のコロニーの数は、１５日目にＥＧＦ非存在下では１００％近くになる（図６Ａ）。全体では、ＥＧＦは培養を通してＣＫ１９＋のコロニーの出現を劇的に抑制する（図６Ｂ）。これらの結果は、Ｅ１３胎児肝から得たＲＴ１Ａ１−、ＯＸ１８ｄｕｌｌ、およびＩＣＡＭ−１＋細胞が、胆管細胞系に分化でき、その運命はインビトロではＥＧＦに影響されることを示唆する（図７）。
【００５９】
６．７ ＩＣＡＭおよび古典的ＭＨＣクラスＩエピトープに対する抗体を用いたヒトおよび非ヒト肝前駆細胞の単離
古典的ＭＨＣクラスＩ抗原の分子構造および生物機能は、脊椎動物間で高度に保存されており、ＩＣＡＭ抗原についても同様である。しかし、ＭＨＣ抗原は、無脊椎動物には見られない。ＭＨＣ抗原は、脊椎動物種では最も詳しく研究された分子である。ＩＣＡＭ抗原に関する情報は限られているが、ＩＣＡＭ抗原の生物機能は、ヒト、マウス、およびラットのような多くの哺乳類において保存されている。今までのところ、ＩＣＡＭ−１のｃＤＮＡはヒト、チンパンジー、マウス、ラット、イヌ、およびウシからクローニングされている。配列データからの結論は、全ての種において分子構造が高度に保存されているというものである。したがって、特定の種におけるＩＣＡＭ−１に特異的な抗体、および表に記載された、指定のＭＨＣクラスＩ抗原に対する抗体を選択することによって、肝前駆細胞が濃縮された細胞群を単離することができる。
【００６０】
【表３】主要組織適合性抗原：名称
2004510432.tif 000004
【００６１】
ＯＸ１８はラットＭＨＣクラスＩ抗原の単形性エピトープを認識する。したがって、抗体は古典的ＭＨＣクラスＩに加えて非古典的ＭＨＣクラスＩも認識する。非古典的ＭＨＣクラスＩ遺伝子座の数は同じ種でも変動するので、その正確な数はどの種でも決定されていない。したがって、将来、これらの種の亜集団で、非古典的ＭＨＣクラスＩとして新しい遺伝子座が発見される可能性がある。
【００６２】
本発明の１つの態様は、肝前駆細胞の表現型を予測する方法である。この特徴は、種々の種において鍵となる細胞表面マーカーの表に示されている。
【００６３】
【表４】本発明に基づく、肝前駆細胞のマーカー
2004510432.tif 000005
【００６４】
６．８ ラットの両能性肝前駆細胞の解析および成体肝細胞との比較
【表５】ラット細胞における細胞表面および内部マーカー
2004510432.tif 000006
ＥＧＦ＝培養物に添加すると、細胞を肝細胞系に誘導し、胆管細胞系の発生を阻止する上皮成長因子。ＥＧＦの非存在下では、胆管および肝細胞系の両方に自然に分化する。
＊ 他の研究者らが、成体肝細胞および成体胆管上皮はＣＤ４４Ｈ（Ｃｒｕｉｓｈａｎｋ ＳＭら、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｐａｔｈｏｌ １９９９ ５２：７３０−７３４）およびＣＤ９０（Ｇｏｒｄｏｎ ＧらＡｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ １５７：７７１−７８６）陰性であることを示した。
＊＊ 成体肝実質細胞は、上述の培養条件で、過形成性の増殖によって増殖できる。
＊＊＊ ＣＫ１９はインビボでは成体肝実質細胞では発現しない。しかし、成体肝細胞の任意の培養物では、ある程度のＣＫ１９を発現する細胞が１つまたは２つ観察されるが、明らかな培養条件による誘導性はなく、陽性細胞と陰性細胞の間に形態的区別はない。これはインビボにおける胎児肝、および両能性肝細胞および他の胎児肝細胞の培養における所見とは対照的である。
【００６５】
６．９ ヒト胎児肝細胞の抗原フェノタイピング
ヒト胎児肝細胞は、ＣＤ１４に対する抗体で染色する。ＨＬＡ （ＡＢＣ） ｖｓ ＣＤ１４の２色セルソートによっていくつかの細胞群が同定される。これらの細胞群には、中程度にＨＬＡ染色され、かつＣＤ１４染色されないという特徴のＲ２と呼ばれる群、ならびに高度にＣＤ１４染色され、かつ高度にＨＬＡ染色されるという特徴のＲ３と呼ばれる別の群が含まれる。αフェトプロテインの染色をすると、Ｒ３細胞はαフェトプロテイン陽性で、Ｒ２には２つの亜集団が含まれ、そのうちの１つのみがＡＦＰ陽性である。
【００６６】
６．１０　非古典的ＭＨＣクラスＩ、αフェトプロテイン、アルブミン、およびＣＫ１９を含む発現マーカーに対する抗体を用いたヒト肝前駆細胞のさらなる単離
単形性エピトープを選択するために、ＨＬＡクラスＩ単形性エピトープに対するフルオレセイン結合抗体と細胞懸濁液とをインキュベートする。当業者は、テキサスレッドを含め、任意の他の多くの蛍光色素がフルオレセインの代わりに使用できることを認識するものと思われる。代わりに、細胞の標識には間接的免疫蛍光も使用できる。すなわち、１次抗体が作られた種の免疫グロブリンに対する抗体に蛍光標識を結合する。細胞試料は、様々な市販のまたはカスタム化した任意のセルローター装置を用いて、ハイスループットな蛍光活性化セルソートによりソートする。標識した抗単形性エピトープによって中間または弱い蛍光を示す肝前駆細胞を選択する。
【００６７】
ラット肝前駆細胞が濃縮された組成物は、ＣＤ４４Ｈに対する抗体を用いて、肝細胞懸濁液をソートすることによって都合よくソートできる。高レベルの側方散乱光を示す肝細胞も、ＣＤ４４Ｈおよびαフェトプロテインを発現する。特に、αフェトプロテインを発現する細胞は、より高いレベルのＣＤ４４Ｈを発現する。反対に、低レベルの側方散乱光を持つ肝細胞は、ＣＤ４４を高いレベルでは発現しない。
【００６８】
高レベルの側方散乱光を示す肝細胞は、αフェトプロテインの発現に、ＣＤ９０に依存する差が見られない。しかし、低レベルの側方散乱光を示す細胞は、αフェトプロテインの発現に、ＣＤ９０に依存する差が見られる。特に、αフェトプロテインを発現する細胞は、ＣＤ９０の発現レベルも、より高い。
【００６９】
代わりに、ＨＬＡ−Ａ２、ＨＬＡ−Ｂ２７、およびＨＬＡ−Ｂｗ２２を含むがこれらに限定されない多形性エピトープに特異的な抗体が、肝前駆細胞の同定および単離に使用される。
【００７０】
また、ＨＬＡ−Ｇ、ＨＬＡ−Ｅ、およびＨＬＡ−Ｆを含む非古典的ＨＬＡクラスＩ抗原に特異的な抗体が、その抗原を発現する肝前駆細胞の同定および単離に使用される。
【００７１】
これらの方法は、非哺乳類肝前駆細胞に容易に適用できることは明らかである。
【００７２】
６．１１． αフェトプロテイン、アルブミン、非古典的ＭＨＣクラスＩおよびＣＫ１９を含む発現マーカーに対する抗体を用いたハイスループットアフィニティ単離法を使用する、ヒト肝前駆細胞のさらなる単離
単離プロトコールを模式的に以下に示す：
ヒト肝前駆細胞の単離の図
物理的方法および／または酵素消化によるヒト組織からの単一細胞懸濁液の調製
↓
赤血球を排除するための、溶解溶液を用いたデバルキング
↓
古典的ＭＨＣクラスＩ ＨＬＡ−Ａ、 Ｂ、およびＣを高レベルに発現する非完前駆細胞群のネガティブ除去
↓
ＩＣＡＭ−１を発現する肝前駆細胞の単離
↓
ＨＬＡ−Ｅ， Ｆ， Ｇ， Ｈ， Ｊ， Ｘを含む非古典的ＭＨＣクラスＩの弱い発現による、肝前駆細胞のさらなる単離
↓
非実質細胞と比較して高い側方散乱光、αフェトプロテイン、アルブミン、またはＣＫ１９を発現する子孫の産生性、またはクローン増殖能力、または工程の組み合せによる、肝前駆細胞のさらなる単離
【００７３】
赤血球細胞成分のデバルキングおよび排除のための他の方法も都合良く使用でき、これらの方法は間質細胞群の一部も減らすことができる。これらの方法には、パーコール勾配による分画、グリコフォリンＡ、ＣＤ４５，またはその両方に対する抗体を用いた特異的な除去が含まれる。また、これらの方法には、沈降速度、例えばフィコールのようなパーコール以外の密度勾配による分離、ゾーン遠心、および細胞水簸が含まれる。これらの方法によって、赤血球細胞、倍数体の肝実質細胞、造血細胞、および間質細胞が除去される。
【００７４】
ＩＣＡＭ−１陽性で古典的ＭＨＣクラスＩ抗原陰性の細胞群の単離は、肝前駆細胞を同定するために非古典的ＭＨＣクラスＩを含む他のマーカーを用いてさらに解析される。また、これらの前駆細胞の子孫は、肝前駆細胞の特徴として以前から知られているマーカーであるαフェトプロテインおよび／またはアルブミンのような細胞質タンパク質に対する抗体で標識される。αフェトプロテインおよびアルブミンは、生存可能な細胞の選択には使用できない肝前駆細胞の周知のマーカーの代表である。これは、これらのタンパク質で細胞を標識するためには細胞を透過性にする必要があり、そのために生存可能性が損なわれるためである。しかし、１つの細胞群から得た細胞試料は、αフェトプロテイン、アルブミン、およびサイトケラチンに関して調べることができる。それにより、細胞群全体の特性が推定される。しかし、細胞表面マーカー（例、ＩＣＡＭ−１陽性、ＯＸ−１８弱陽性、古典的ＭＨＣクラスＩ陰性）およびクローン増殖能力と、細胞質マーカーであるαフェトプロテイン、アルブミン、またはＣＫ１９とに高度の相関があることは、表面マーカーのみで選択して、生存可能な細胞が単離できることを示す。
【００７５】
６．１２． 側方散乱光を用いたヒト肝前駆細胞のさらなる単離
側方散乱光自身で、肝前駆細胞というような細胞の種類を同定することはできない。しかし、これはマーカーに関する蛍光活性化セルソートのような他の手段による選択の補助として、非常に有用である。古典的ＭＨＣクラスＩのような特定のマーカーによって同定された細胞群について、その側方散乱光の特性によって規定される亜集団に注目する必要がある（図４Ｃ参照）。
【００７６】
成熟した肝細胞は高度に粒状であり（非常に高い側方散乱光を示す）；肝前駆細胞は粒状度では中程度であり；非実質細胞群は肝前駆細胞よりも粒状度が低いことを認識するのは重要である。ほぼ全てが非実質細胞および肝前駆細胞からなる胎児組織由来の細胞では、肝前駆細胞が最も高い粒状度を有する。肝前駆細胞は、フローサイトメトリーで粒状度が中程度の細胞群として選択される。
【００７７】
ヒト肝前駆細胞が濃縮された組成物は、ＣＤ１４に対する抗体と、ヒトのＭＨＣであるＨＬＡに対する抗体とを組み合せて使用して、肝細胞懸濁液をソートすることによっても、都合良く調製できる。免疫選択の全ての方法が、同様に適用できる。特定の例として、フローサイトメトリーが細胞の単離に使用される：相対的に中間レベルのＨＬＡを発現しＣＤ１４を発現しないＲ２と呼ばれる細胞、および比較的高いレベルのＨＬＡおよびＣＤ１４を発現するＲ３と呼ばれる細胞である。Ｒ２細胞は、さらにαフェトプロテインの発現により、２つの亜集団があることで特徴付けられる。Ｒ３細胞は、αフェトプロテインを発現する細胞のみからなることで特徴付けられる。
【００７８】
６．１３． グリコフォリンＡまたはＣＤ４５に対する抗体を用いたネガティブ選択による、非肝前駆細胞の除去
肝前駆細胞は、モノクローナル抗体（ヒトのグリコフォリンＡ）およびモノクローナル抗体がなければ赤血球に対するポリクローナル抗血清を使用して、赤血球細胞から区別される。また、白血球共通抗原（ＣＤ４５）を発現する細胞も、古典的ＭＨＣクラスＩ抗原を発現する。したがって、ＣＤ４５は齧歯類の肝前駆細胞を同定するために使用できる抗原ではないが、古典的ＭＨＣクラスＩによるネガティブ選択の代わりとしてまたは補足として、指定されない場合は使用できる。
【００７９】
６．１４． 肝癌の同定および治療に対する応答
非古典的ＨＬＡクラスＩ抗原、ＩＣＡＭ−１、およびαフェトプロテインを含む肝前駆細胞の同定に使用したマーカーは、肝癌の治療の成功を明らかにするために、肝癌の解析に使用できる。一般に、癌は幹細胞および初期の前駆細胞群の形質転換体である。しかし、これらの形質転換体はしばしば正常な細胞にも存在する抗原性マーカーの発現を保持している。これらの抗原性マーカーによって識別される肝癌は、癌の種々の治療様式（例、化学療法薬、放射線、およびアジュバント療法）に対して異なる応答をする癌を同定できる。
【００８０】
６．１５． 胚幹細胞の同定および選択
本明細書に記述されるマーカーおよび選択方法は、特定の運命への胚幹（ＥＳ）細胞の分化を特徴付けるためにも使用できる。ＥＳ細胞は任意の組織の再生に使用できる万能幹細胞として普及している。しかし、組織にＥＳ細胞を注入した過去の研究では、腫瘍が発生し、中には悪性のものもあった。ＥＳ細胞が臨床で使用される唯一の方法は、これを運命づけられた幹細胞へ分化させ、それからその運命づけられた幹細胞を注入することである。したがって、胚幹細胞は、増殖して子孫を形成できる培養条件で維持される。ＥＳ子孫は、古典的ＭＨＣクラスＩおよびＩＣＡＭ−１抗原に対する抗体とインキュベートした後、フローサイトメトリーにかける。肝前駆細胞の基準に適合するＥＳ子孫を細胞培養によって増殖させる。我々が同定したマーカーは、運命づけられた幹細胞の肝臓の運命を決めるために使用できる。
【００８１】
６．１６． 遺伝子療法と組み合せた使用
本明細書で同定される肝前駆細胞のマーカーは、遺伝子療法のための細胞群の同定に使用される。現在まで、成熟した細胞群を標的とした遺伝子療法は、しばしば全くまたはあまり機能しなかった。現在までの遺伝子療法の大きな成功は、造血前駆細胞群におけるエクスビボの遺伝子療法である。したがって、肝臓のためのエクスビボの遺伝子療法は、我々のプロトコールによって単離された肝臓に運命づけられた幹細胞および前駆細胞を用いて行われる。また、「標的を定めた注入ベクター」を用いる遺伝子療法は、肝前駆細胞を標的とするものに集中することによって改善される。これらの方法によって、血友病、呼吸鎖複合体Ｉ欠損、フェニルケトン尿症、ガラクトース血症、肝腎性高チロシン血症、遺伝性果糖不耐性、ウィルソン病、ヘモクロマトーシス、小胞体蓄積症、高シュウ酸尿症Ｉ型およびＩＩＩ型、β−ヒドロキシ−δ５−Ｃ２７−ステロイドデヒドロゲナーゼ欠損、糖原病（グルコース−６−ホスファターゼ、グルコース−６−フォスフェートトランスロカーゼ、脱分枝酵素、肝ホスホリラーゼおよびホスホリラーゼ−ｂ−キナーゼの欠損を含む）、脂肪酸酸化または転移欠損（器質性酸性尿症、アシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ欠損を含む）、ポルフィリン症、およびビリルビンウリジンジフォスフェートグルクロニルトランスフェラーゼを含む、代謝における先天性のエラーが改善できる。
【００８２】
肝前駆細胞は、以下のようにして遺伝子療法に使用できる：
【００８３】
フェニルケトン尿症（ＰＫＵ）は肝臓のフェニルアラニンヒドロキシラーゼ（ＰＡＨ）の欠損によって引き起こされる常染色体劣性の疾患である。ＰＡＨは、コファクターとしてテトラヒドロビオプテリンを用いてフェニルアラニンからチロシンへの変換を触媒する。ＰＫＵの患者は、体液中のフェニルアラニン量が上昇するために、重篤な精神遅滞、および皮膚、髪、および目の色素沈着低下を示す。厳格な食事制限によって、血清フェニルアラニンレベルは低下するが、思春期または成人期初期におけるコンプライアンスの低下でさえ、精神的または行動機能の低下を引き起こす。遺伝子療法技術は、ＰＫＵの食事療法に代わるものの１つである。ＰＫＵの変異マウスＰａｈｅｎｕ２の開発によって、この手法の試みが容易になった。現在のところ、３つのベクターシステム、組換えアデノウイルス、レトロウイルス、およびＤＮＡ／タンパク質複合体が開発されている。アデノウイルスを介した遺伝子移入の効果は、組換えウイルスに対する宿主の免疫応答のために、注入後短期間しか継続しなかった。組換えレトロウイルスおよびＤＮＡ／タンパク質複合体はインビトロでＰＡＨ欠損肝実質細胞に効果的に形質導入するが、主に肝臓にうまく再移植される細胞数が少ない理由で、エクスビボの手法の臨床的有用性は限定されている。増殖能力の高い肝前駆細胞を利用すると、上述のような問題が解決される。
【００８４】
自己肝前駆細胞を用いたエクスビボ遺伝子療法の図
ＰＫＵ患者（または実験ではＰＡＨ欠損マウス、Ｐａｈｅｎｕ２）からの肝前駆細胞の単離
↓
ウイルスまたは非ウイルス法による、Ｇ４１８選択のためのネオマイシン耐性遺伝子およびヒトＰＡＨ ｃＤＮＡを用いた細胞の形質導入
↓
フィーダー細胞上でのネオマイシン耐性遺伝子を含む細胞のＧ４１８を用いた７〜１４日間のエクスビボ増殖
↓
ディスパーゼにより細胞を採集。このプロナーゼはフィーダーにはきかない。したがって、ＰＡＨ ｃＤＮＡおよびネオマイシンを持つ肝前駆細胞のみが培養物から回収される。
↓
門脈または脾臓から宿主肝臓へ細胞を注入
【００８５】
６．１７ 細胞療法における両能性肝前駆細胞の使用
異種細胞移植療法を評価するために、ラットの肝不全モデルが使用される。肝不全は、１０匹のオスラット（体重１２５〜１６０ ｇ）の実験群で肝臓の約７０％を外科的に除去し、総胆管を結紮することでモデルを作製する。年齢および性別が一致するラット１０匹の疑似対照群は、同様に麻酔し、正中線開腹術、肝臓の操作を行なうが、胆管の結紮と肝切除は行なわない。
【００８６】
肝前駆細胞が濃縮された細胞群は、上述のように調製される。簡単に述べると、１２匹の胎児（胎齢１４日）ラットの肝臓を無菌的に除去し、さいの目に切り、カルシウムもマグネシウムも含まないハンクス液ｐＨ ７．０中１ ｍＭ ＥＤＴＡですすぎ、０．５ ｍｇ／ｍｌコラゲナーゼを含むハンクス液中で２０分間までインキュベートして、ほぼ単細胞懸濁液を作製する。
【００８７】
両能性肝前駆細胞は、上述の任意の方法で調製される。
【００８８】
肝切除または擬似手術後３日目に、実験群および疑似対照群のラットに５ ｍｍの腹部切開を施し、脾臓を露出する。実験群および疑似対照群の動物の各々半分を無作為に選択し、両能性肝前駆細胞組成物を直接脾臓に０１．１ ｍｌずつ注入する。全ての切開は外科用ステープルで閉じる。異なる動物群に投与される細胞の数は、約１０３〜約１０１０個、特に１０３， １０４， １０５， １０６， １０７， １０８， １０９、および１０１０個であり得る。免疫抑制剤サイクロスポリンＡを体重１ ｋｇあたり１ ｍｇで毎日腹腔内投与する。
【００８９】
ビリルビン、γグルタミルトランスフェラーゼ、およびアラニンアミノトランスフェラーゼ活性は、肝切除または疑似肝切除の２日前、および術後３、７、１４、および２８日にモニターする。体重、水分摂取、および目視による嗜眠状態も同じ日程で記録する。肝切除の２８日後に、全ての生存している動物を殺して、脾臓および肝臓の組織学的評価を行なう。
【００９０】
上述の実施例は、例示のためのみに説明されており、本発明の範囲または態様を制限するものではない。上記に特に説明されていない他の態様も、当業者にとって明らかであると思われる。しかし、そのような他の態様も、本発明の範囲および精神に含まれると考えられる。したがって、本発明は添付の特許請求の範囲によってのみ、正しく限定される。
【図面の簡単な説明】
【図１Ａから１Ｃ】１５日目の胎児ラットの肝臓から得た肝細胞株の特徴付けである。
【図２Ａから２Ｆ】フィーダー細胞上のコロニー形成アッセイ結果である。
【図３Ａから３Ｘ】成体肝細胞中の様々な細胞株上のラット細胞表面抗原の発現である。
【図４Ａ１から４Ｄ４】Ｅ１３胎児ラットの肝臓の表現型分析を表す。
【図５Ａから５Ｄ】ＥＧＦ存在下および非存在下での肝臓コロニーの特徴付けである。
【図６Ａから６Ｂ】ＲＴ１Ａ１−肝細胞上のＣＫ１９発現の誘導を表す。
【図７】ＳＴＯ５フィーダー細胞上の肝臓コロニー形成の模式図である。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図３Ｆ】
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【図３Ｇ】
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【図３Ｈ】
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【図３Ｉ】
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【図３Ｊ】
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【図３Ｋ】
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【図３Ｌ】
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【図３Ｍ】
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【図３Ｎ】
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【図３Ｏ】
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【図３Ｐ】
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【図３Ｑ】
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【図３Ｒ】
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【図３Ｓ】
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【図３Ｔ】
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【図３Ｕ】
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【図３Ｖ】
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【図３Ｗ】
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【図３Ｘ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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2004510432.tif 000098
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