(57)【要約】対象の吸収部位での傍細胞性浸透を促進する組成物および方法を開示する。当該方法は、（ａ）有効量のホスホリパーゼＣインヒビターを、促進された傍細胞性浸透が望ましいときに対象に投与すること、および（ｂ）有効量のホスホリパーゼＣインヒビターの投与を介する吸収部位での、対象における傍細胞性浸透を促進することを含む。当該開示の組成物および方法により、対象における親水性薬物の吸収が促進される。【選択図】図１
2004532795.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象の吸収部位での傍細胞性浸透を促進する方法であって、
ａ）有効量のホスホリパーゼＣインヒビターを、促進された傍細胞性浸透が望ましいときに対象に投与すること、
ｂ）有効量のホスホリパーゼＣインヒビターの投与を介する吸収部位での、対象における傍細胞性浸透を促進すること、
を含む当該方法。
【請求項２】
ホスホリパーゼＣインヒビターが、アルキルホスホコリン、３−ニトロクマリンまたはその誘導体、３−シアノクマリンまたはその誘導体、３−ハロクマリンまたはその誘導体、３−アセトキシクマリンまたはその誘導体、クマリン−３−スルホン酸またはその誘導体、およびＮ−アルキルスクシンイミドステロイド誘導体からなる群から選択される、請求項１の方法。
【請求項３】
アルキルホスホコリンが、更に、１０から２０のメチレン基のアルキル鎖を含む、請求項２の方法。
【請求項４】
３−ハロクマリンが、３−フルオロクマリンまたはその誘導体、３−クロロクマリンまたはその誘導体、または３−ヨードクマリンまたはその誘導体である、請求項２の方法。
【請求項５】
Ｎ−アルキルスクシンイミドステロイド誘導体が、１から１０のメチレン基のアルキル鎖を含む、請求項２の方法。
【請求項６】
吸収部位が腸管上皮を含む、請求項１の方法。
【請求項７】
吸収部位が血液脳関門を含む、請求項１の方法。
【請求項８】
ホスホリパーゼＣインヒビターが、経口、頬、直腸または経皮投与用に製剤化され、結腸上皮との接触に適する型、または吸入または吸引による投与に適する型である、請求項１の方法。
【請求項９】
対象において親水性薬物の吸収を促進する方法であって、有効量のホスホリパーゼＣインヒビターを対象に、親水性薬物を当該対象に投与する前か当該投与と共に投与し、それにより促進された傍細胞性浸透が当該対象の吸収部位で生じること、および当該対象の吸収部位での親水性薬物の吸収を有効量のホスホリパーゼＣインヒビターの投与を介し促進すること、を含む当該方法。
【請求項１０】
ホスホリパーゼＣインヒビターが、アルキルホスホコリン、３−ニトロクマリンまたはその誘導体、３−シアノクマリンまたはその誘導体、３−ハロクマリンまたはその誘導体、３−アセトキシクマリンまたはその誘導体、クマリン−３−スルホン酸またはその誘導体、およびＮ−アルキルスクシンイミドステロイド誘導体からなる群から選択される、請求項９の方法。
【請求項１１】
アルキルホスホコリンが、更に、１０から２０のメチレン基のアルキル鎖を含む、請求項１０の方法。
【請求項１２】
３−ハロクマリンが、３−フルオロクマリンまたはその誘導体、３−クロロクマリンまたはその誘導体、または３−ヨードクマリンまたはその誘導体である、請求項１０の方法。
【請求項１３】
Ｎ−アルキルスクシンイミドステロイド誘導体が、１から１０のメチレン基のアルキル鎖を含む、請求項１０の方法。
【請求項１４】
吸収部位が腸管上皮を含む、請求項９の方法。
【請求項１５】
吸収部位が血液脳関門を含む、請求項９の方法。
【請求項１６】
ホスホリパーゼＣインヒビターが、経口、頬、鼻、直腸または経皮投与用に製剤化され、結腸上皮との接触に適する型、または吸入または吸引による投与に適する型である、請求項９の方法。
【請求項１７】
ａ）親水性薬物、
ｂ）ホスホリパーゼＣを阻害する量のホスホリパーゼＣインヒビター、および
ｃ）医薬的許容される担体
を含む組成物。
【請求項１８】
ホスホリパーゼＣインヒビターが、アルキルホスホコリン、３−ニトロクマリンまたはその誘導体、３−シアノクマリンまたはその誘導体、３−ハロクマリンまたはその誘導体、３−アセトキシクマリンまたはその誘導体、クマリン−３−スルホン酸またはその誘導体、およびＮ−アルキルスクシンイミドステロイド誘導体からなる群から選択される、請求項１７の組成物。
【請求項１９】
アルキルホスホコリンが、更に、１０から２０のメチレン基のアルキル鎖を含む、請求項１８の組成物。
【請求項２０】
３−ハロクマリンが、３−フルオロクマリンまたはその誘導体、３−クロロクマリンまたはその誘導体、または３−ヨードクマリンまたはその誘導体である、請求項１８の組成物。
【請求項２１】
Ｎ−アルキルスクシンイミドステロイド誘導体が、１から１０のメチレン基のアルキル鎖を含む、請求項１８の組成物。
【請求項２２】
親水性薬物を必要とする対象に対する当該親水性薬物の経口利用性を促進する組成物を製造する方法であって、
ａ）親水性薬物を提供すること、
ｂ）ホスホリパーゼＣインヒビターを提供すること、および
ｃ）親水性薬物、およびホスホリパーゼＣを阻害する量のホスホリパーゼＣインヒビターを、医薬的許容される担体と混合し、それにより、親水性薬物の経口生体利用性を促進する組成物を製造すること、
を含む当該方法。
【請求項２３】
ホスホリパーゼＣインヒビターが、アルキルホスホコリン、３−ニトロクマリンまたはその誘導体、３−シアノクマリンまたはその誘導体、３−ハロクマリンまたはその誘導体、３−アセトキシクマリンまたはその誘導体、クマリン−３−スルホン酸またはその誘導体、およびＮ−アルキルスクシンイミドステロイド誘導体からなる群から選択される、請求項２２の方法。
【請求項２４】
アルキルホスホコリンが、更に、１０から２０のメチレン基のアルキル鎖を含む、請求項２３の方法。
【請求項２５】
３−ハロクマリンが、３−フルオロクマリンまたはその誘導体、３−クロロクマリンまたはその誘導体、または３−ヨードクマリンまたはその誘導体である、請求項２３の方法。
【請求項２６】
Ｎ−アルキルスクシンイミドステロイド誘導体が、１から１０のメチレン基のアルキル鎖を含む、請求項２３の方法。
【請求項２７】
当該組成物が、経口、頬、直腸または経皮投与用に製剤化され、結腸上皮との接触に適する型、または吸入または吸引による投与に適する型である、請求項２２の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、２００１年１０月１０日出願の米国仮出願番号６０／２３９，３２８に基づき、その優先権を主張する（当該文献は引用によりすべて本明細書に含める）。
【０００２】
技術分野
本発明は、治療薬の生体利用性（ｂｉｏａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ）および脳への浸透（ｂｒａｉｎ ｐｅｎｅｔｒａｔｉｏｎ）を促進するための組成物および方法に関する。より特に、本発明は、特定の浸透を促進し、それにより対象中の治療薬の生体利用性を促進する組成物および方法に関係する。
【０００３】
略語の表
【表１】
2004532795.tif 000003
【０００４】
背景技術
効能および選択性に加え、経口生体利用性がある薬物の発見および開発が、医薬産業での重要な挑戦を提起している。細胞膜の脂質二重層中に容易に分配し得る化合物は、一般的に容易に吸収される（経細胞経路）。対照的に、親水性化合物は、実質的に細胞膜を通過できない。細胞間経路（傍細胞経路）を介する上皮の通過もまた、緊密接合として知られる細胞間接合の存在により厳密に制限される。そのため、腸管上皮は、経口投与される親水性治療薬の吸収に対する有意なバリアを保有する。
【０００５】
緊密接合は、膜貫通および細胞質性タンパク質の両方からなる高度に特殊化（ｓｐｅｃｉａｌｉｚｅｄ）されたマルチプロテイン複合体である（Ｄｅｎｋａｒ， Ｂ． Ｍ． ａｎｄ Ｎｉｇａｍ， Ｓ． Ｋ． （１９９８） ＡＭ． Ｊ． Ｐｈｙｓｉｏｌ． ２７４： Ｆ１−Ｆ９； Ｆａｎｎｉｎｇ， Ａ． Ｓ．， ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｓｏｃ． Ｎｅｐｈｒｏｌ． １０： １３３７−１３４５ （１９９９））。緊密接合の開口は、複合体細胞内シグナリング機構により制御されているように思われる（Ａｎｄｅｒｓｏｎ， Ｊ． Ｍ．， ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． １０６： １１４１−１１４９（１９９８）； Ｓａｋａｋｉｂａｒａ， Ａ．， ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． １３７： １３９３−１４０１ （１９９７））。多くのシグナリング経路は、傍細胞性浸透の調節に含まれる（例えば、チロシンキナーゼ、カルシウム、プロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ））（Ａｎｄｅｒｓｏｎ， Ｊ． Ｍ．， ａｎｄ Ｖａｎ Ｉｔａｌｌｅ， Ｃ． Ｍ．， Ａｍ． Ｊ． Ｐｈｙｓ． ２６９： Ｇ４６７−４７５ （１９９５）； Ｃｏｌｌａｒｅｓ−Ｂｕｚａｔｏ， Ｃ． Ｂ．， ｅｔ ａｌ．， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． ７６： ８５−９２ （１９９８）； Ｍｕｌｌｉｎ， Ｊ． Ｍ． ｅｔ ａｌ．， Ａｍ． Ｊ． Ｐｈｙｓｉｏｌ． ２７５： Ｃ５４４−Ｃ５５４ （１９９８）； Ｔａｉ， Ｙ． Ｈ．， ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｍｅｍｂｒ． Ｂｉｏｌ． １４９： ７１−７９ （１９９６））。しかし、この調節に付随する分子機構は、完全に解明されたわけではない。
【０００６】
今日までに、幾つかの吸収エンハンサーが同定されており、それは緊密接合の調節により腸管上皮を通過する薬物候補（ｄｒｕｇ ｃａｎｄｉｄａｔｅ）の吸収を改善するものである。しかし、殆どのこれらの薬剤は、緊密接合の作用の為、効能および選択性が消失し、その為、インビボ濃度でミリモーラー（ｍＭ）を生ずる量を投与しなければならない。その濃度により、細胞毒および望ましくない副作用を生じ得る。加えて、作用の機構は、周知でないか殆ど理解されておらず、しばしば、これらの薬剤は複数の機構を介し作用する。ここで、医薬的許容される吸収エンハンサー（ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ ｅｎｈａｎｃｅｒ）は臨床的使用に利用できない。
【０００７】
従って、必要なものは、傍細胞性浸透の促進の為の効能および選択性を示す吸収エンハンサーである。更に、緊密接合調節の特性、および緊密接合調節に影響する薬剤の同定は、長年、考えられており、当分野ではずっと追求されてきた。
【０００８】
本発明の要約
対象の吸収部位での傍細胞性浸透を促進する方法を開示する。当該方法は、（ａ）有効量のホスホリパーゼＣインヒビターを、促進された傍細胞性浸透が望ましいときに対象に投与すること；および（ｂ）有効量のホスホリパーゼＣインヒビターの投与を介する吸収部位での、対象における傍細胞性浸透を促進することを含む。
【０００９】
対象における親水性薬物の吸収を促進する方法をも開示する。当該方法は、（ａ）有効量のホスホリパーゼＣインヒビターを対象に、親水性薬物を当該対象に投与する前か当該投与と共に投与し、それにより促進された傍細胞性浸透が当該対象の吸収部位で生じること；および（ｂ）当該対象の吸収部位での親水性薬物の吸収を有効量のホスホリパーゼＣインヒビターの投与を介し促進することを含む。
【００１０】
組成物および当該同一物の製造方法もまた開示する。当該製剤は、（ａ）親水性薬物；（ｂ）ホスホリパーゼＣ阻害物の有効量；および（ｃ）医薬的許容される担体が含まれる。
【００１１】
従って、新規組成物および傍細胞性浸透を調節するための方法をを提供することが本発明の目的である。当該目的は、本発明によりその全てまたはその一部が達成される。
【００１２】
本発明の目的は上述の通りであり、その他の目的は、最善の記載をした添付図面および実施例と合わせて以下の記載を見れば明らかとなる。
【００１３】
図面の簡単な説明
図１は、腸管上皮を通過する輸送の概略図である。分子は、三つの経路により、細胞膜を通過する受動拡散（経細胞経路）により；隣接細胞間の受動拡散（傍細胞経路）により；または担体仲介輸送（担体仲介経路）により、腸管上皮を通過し主に血液中に輸送される。
【００１４】
図２Ａは、本発明による構造活性関係分析のために製造したアルキルホスホコリンの構造式、式１である。六つのアルキルホスホコリンを合成または獲得し、それらは、アルキル鎖中、１０、１２、１４、１６、１８、または２０のメチレン単位を含み、すなわち、ｎ＝９、１１、１３、１５、１７または１９となる。しかし、図２Ａに示すように、ｎは８、１０、１２、１４、１６または１８ともなり得る。
【００１５】
図２Ｂは、特定のＰＬＣインヒビターＵ−７３，１２２、１−［６−［［（１７β）−３−メトキシエストラ−１，３，５（１０）−トリエン−１７−イル］アミノ］ヘキシル］−）１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン、およびその不活性類似体、Ｕ−７３，３４３、１−［６−［［（１７β）−３−メトキシエストラ−１，３，５（１０）−トリエン−１７−イル］アミノ］ヘキシル］−）−２，５−ピロリジンジオンの構造式、式２である。Ｕ−７３，１２２は、ボックス内に二重結合を含むが、Ｕ−７３，３４３は、二重結合の代わりに一重結合を含む。
【００１６】
図３は、ＭＤＣＫ細胞中でＴＥＥＲにおけるアルキルホスホコリンおよびＵ−７３，１２２の効果を示したグラフである。化合物は、上端に投与した。ＴＥＥＲは、当該化合物と共に、３７℃での３０分間のインキュベーション後に測定した。データの点は、平均±ＳＤ（ｎ＝３）を示す。化合物を示すシンボルは、△：Ｃ１２、＋：Ｃ１６および×：Ｕ−７３，１２２である。当該挿入図は、ＭＤＣＫ単層を通過するＴＥＥＲにおける３０μＭ Ｃ１６の処置時間の効果である。
【００１７】
図４は、ＭＤＣＫ細胞中のマンニトール流入におけるアルキルホスホコリンおよびＵ−７３，１２２の効果を示すグラフである。化合物および［１４Ｃ］−マンニトールを上端に投与した。輸送速度は、化合物またはビヒクルによる３０分から６０分間隔の処置の間に基底部側（１．５ｍＬ）に蓄積する［１４Ｃ］−マンニトールの量を測定することにより、モニターした。データの点は、平均±ＳＤ（ｎ＝３）を示す。化合物を示すシンボルは、△：Ｃ１２、＋：Ｃ１６および×：Ｕ−７３，１２２である。
【００１８】
図５は、ＭＤＣＫ細胞中のＡＴＰ−刺激性ＰＬＣ活性におけるアルキルホスホコリンおよびＵ−７３，１２２の効果を示すグラフである。ＭＤＣＫ単層は、２４時間３７℃で、［３Ｈ］−ミオ−イノシトールで標識した。次いで、ＭＤＣＫ細胞を３０分間３７℃で、化合物で処理した。イノシトールホスフェート産物は１００μＭ ＡＴＰで１５分間刺激した。［３Ｈ］−イノシトールホスフェートはクロマトグラフィーで単離した。次いで、［３Ｈ］−イノシトールホスフェートの量は、コネチカット州のメリデンにあるＰａｃｋａｒｄ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ Ｃｏｍｐａｎｙから購入したＰａｃｋａｒｄ Ｔｒｉ Ｃａｒｂ ４０００ Ｓｅｒｉｅｓ ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒで液体シンチレーションカウンティングにより測定した。データの点は、平均±ＳＤ（ｎ＝３）を示す。化合物を示すシンボルは、△：Ｃ１２、＋：Ｃ１６および×：Ｕ−７３，１２２である。
【００１９】
図６Ａは、アルキルホスホコリン、３−ＮＣ、およびＵ−７３，１２２のＩＣ５０（ＰＬＣ）とＥＣ１０ｘ値の間の相関関係（ｒ＝０．９８、ｐ＜０．０５）を示すグラフである。ボックス中に含まれるデータの点は、Ｕ−７３，１２２を示し、３−ＮＣのデータの点は、ＮＣと標識する。
【００２０】
図６Ｂは、アルキルホスホコリン、３−ＮＣ、およびＵ−７３，１２２のＩＣ５０（ＰＬＣ）とＥＣ１０ｘ値の間の相関関係（ｒ＝０．９５、ｐ＜０．０５）を示すグラフである。データの点は、３回の実験での３つの値での平均±ＳＤを示す。ボックス中に含まれるデータの点は、Ｕ−７３，１２２を示し、３−ＮＣのデータの点は、ＮＣと標識する。
【００２１】
図７Ａは、構造式、およびＴＥＥＲ（白）およびＡＴＰ−刺激性ＰＬＣ活性（黒）におけるＵ−７３，１２２およびＵ−７３，３４３の効果を示す棒グラフである。
【００２２】
図７Ｂは、構造式、およびＴＥＥＲ（白）およびＥＧＦ−刺激性ＰＬＣ活性（黒）における３−ニトロクマリンおよび７−ヒドロキシ−ニトロクマリンの効果を示す棒グラフである。
【００２３】
図８は、ＰＬＣ−β（黒）およびＰＬＣ−γ（白）の活性における３−ＮＣ、ＨＰＣまたはＵ−７３，１２２の効果を示す棒グラフである。ＭＤＣＫ単層は、２４時間３７℃で、［３Ｈ］−ミオ−イノシトールで標識した。次いで、ＭＤＣＫ細胞を３０分間３７℃で、３−ＮＣ、ＨＰＣまたはＵ−７３，１２２で処理した。イノシトールホスフェート産物を、１００μＭ ＡＴＰまたは２０ｎｇ／ｍｌ ＥＧＦで１５分間刺激し、それぞれＰＬＣ−βおよびＰＬＣ−γの活性をそれぞれ活性化させた。［３Ｈ］−イノシトールホスフェートをクロマトグラフィーで単離した。次いで、［３Ｈ］−イノシトールホスフェートの量は、Ｐａｃｋａｒｄ Ｔｒｉ Ｃａｒｂ ４０００ Ｓｅｒｉｅｓ ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒで液体シンチレーションカウンティングにより測定した。
【００２４】
本発明の詳細な説明
本明細書では、従来特性解析されていない機構、すなわち、酵素ホスホリパーゼＣ（ＰＬＣ）の生物学的活性の阻害を介する腸管上皮の傍細胞性浸透を調節することにより作用する新規吸収エンハンサーを開示する。ある実施態様では、構造活性関係（ＳＡＲ）は、傍細胞性浸透を増加し、ＰＬＣ活性を阻害するアルキルホスホコリンの能力として決定した。Ｍａｄｉｎ Ｄａｒｂｙ ｃａｎｉｎｅ ｋｉｄｎｅｙ（ＭＤＣＫ）細胞における傍細胞性浸透を増加し、ＰＬＣを阻害するアルキルホスホコリンの能力、輸送実験のインビトロ上皮細胞モデルは、有意に（ｐ＜０．０５）相関した。傍細胞性浸透の調節におけるＰＬＣ阻害の改善を確認する為、選択性ＰＬＣインヒビター（例えば、Ｕ−７３，１２２および３−ニトロクマリン）（それらの化合物の、緊密接合浸透を調節する能力は、本明細書で示す本発明の開示前では知られてはいなかった）を、実施例で詳細に記載するような傍細胞性浸透を増加する能力として評価した。これらＰＬＣインヒビターは、傍細胞性（緊密接合）浸透の強力なエンハンサーとなることが証明された。更に、傍細胞性浸透を増加し、ＰＬＣを阻害するＰＬＣインヒビターの能力は、これらのパラメーターを変えるアルキルホスホコリンの能力と有意に（ｐ＜０．０５）相関した。
【００２５】
これらの結果は、傍細胞性浸透がＰＬＣ阻害により増加し得ることを示す。その為、酵素ＰＬＣ（本明細書では、「ホスホリパーゼＣインヒビター」または「ＰＬＣインヒビター」という）の生物学的活性のインヒビターは、緊密接合の調節により、傍細胞性浸透を選択的に増加し得る。相応じて、ＰＬＣインヒビターは、経口投与する際に腸管上皮を通して殆ど吸収されない親水性薬物の選択的および強力な吸収エンハンサーとして使用し得る。三つのクラスの化合物が、ＰＬＣ阻害−アルキルホスホコリン、３−ニトロクマリン、およびステロイドのＣ−１７ Ｎ−アルキルスクシンイミド誘導体を介し作用する吸収インヒビターとしての使用に好ましい。
【００２６】
体循環内にある親水性薬物は、「いわゆる」血液脳関門の存在のため、脳には入ることができない。この関門は、脳に血液を供給する毛管の壁を覆う高度に特殊化した内皮により形成される。当該血液脳関門はまた、緊密接合の存在により特徴付けられる。本発明により、ＰＬＣインヒビターはまた、血液脳関門を容易には通過できない親水性化合物の中枢神経系（ＣＮＳ）の浸透のエンハンサーとしての役割をし得る。
【００２７】
Ａ．定義
以下の語句は、当分野でよく認識されている意味を有すると考えられる。しかし、以下の定義は、本発明主題の解釈を容易ならしめるため示したものである。
【００２８】
本明細書および特許請求の範囲で使用するとき、「吸収部位」なる語句は、化合物、分子または他の物質が対象の循環系または組織中に吸収される部位をいう。実のところ、吸収部位は、緊密接合が存在する任意の部位を含み得、そして、物質の吸収を促進する緊密接合での傍細胞性浸透を調節することが好ましい。その物質は、薬物化合物および内生的な化合物または分子を含み得る。典型的な吸収部位には、循環系への吸収が生ずる腸管上皮、および脳に血液を供給する毛管の壁にある高度に特殊化した内皮（中枢神経系（ＣＮＳ）の組織中への吸収が生ずる、いわゆる血液脳関門）が含まれる。
【００２９】
本明細書および特許請求の範囲で使用するとき、「傍細胞性浸透」なる語句は、細胞間経路を介する腸管にある上皮組織のような組織を通過する化合物、分子または他の物質の能力をいう。緊密接合は、浸透経路を介し上皮を通過する分子に対する効果的なバリアを供する、高度に特殊化したマルチタンパク質複合体である。当分野で行われている労力にもかかわらず、緊密接合の調節は十分に特性解析されていない。その為、本発明による緊密接合の、ある態様調節の特性解析は、長年、考えられており、当分野ではずっと追求されてきた。
【００３０】
「親水性薬物」なる語句は、水に容易に溶解し、そのため、対象の細胞膜の脂質二重層の通過が困難となる薬物をいう。細胞間経路（すなわち、浸透経路）を介する上皮組織を通る化合物の通過もまた、緊密接合の存在により、厳密に制限される。
【００３１】
本明細書および特許請求の範囲で使用するとき、「生体利用性（ｂｉｏａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ）」なる語句は、本明細書で開示のような投与後、例えば、経口、頬、鼻、非経口、直腸または経皮の投与、結腸上皮との接触に適する型の投与、または例えば肺の肺胞上皮に接触させるための吸入（ｉｎｈａｌａｔｉｏｎ）または吸引（ｉｎｓｕｆｆｌａｔｉｏｎ）（口または鼻の何れかを通して）に適する型の投与の後、対象の循環系または対象の組織中に吸収される治療剤または治療薬などの、全投与用量に対する薬剤の量をいう。
【００３２】
本明細書および特許請求の範囲で使用するとき、「ホスホリパーゼＣインヒビター」または「ＰＬＣインヒビター」なる語句は同義であり、以下に限らないが、現在同定されているＰＬＣ、ＰＬＣ−β（ベータ）およびＰＬＣ−γ（ガンマ）のイソ型および以下で同定した現在知られていないＰＬＣイソ型を含むＰＬＣ酵素の阻害において活性を有する任意の物質、分子または化合物をいう。作用の任意の特定理論により結合することは、出願人の意図するところではないが、ＰＬＣインヒビターがＰＬＣの直接阻害によるかまたはシグナリング経路に結合するＧ−プロテインの破壊を介するようなＰＬＣの間接阻害により作用し得ることを考えている。幾つかの典型的なＰＬＣインヒビターを本明細書で開示する。
【００３３】
長年にわたる特許法の慣例に従い、単数形の語句は、特許請求の範囲を含む本出願中で使用するとき、「１つまたはそれより多い」を意味する。
【００３４】
Ｂ．一般的考察
上皮性および内皮性のシートは、バリアとして作用し、多細胞性の生物体または対象の明瞭な区切りを維持する。これは、上皮細胞間、または傍細胞経路を通して、多くの高分子およびより少ない程度で小分子の移動を制限する細胞間接合により行われる。上皮を通るイオン移動でさえ、少なくなり、その為、経上皮性電気抵抗（ｔｒａｎｓｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｅｌｅｃｔｒｉｃａｌ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ）（ＴＥＥＲ）が生ずる。ある区画から他の区画への巨大分子の傍細胞性漏出は、緊密接合の形成により妨げられる（Ｄｉａｍｏｎｄ， Ｊ．， ”Ｔｈｅ Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ Ｊｕｎｃｔｉｏｎ： Ｂｒｉｄｇｅ， Ｇａｔｅ ａｎｄ Ｆｅｎｃｅ”， Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｓｔ ２０： １０−１８ （１９７７））。
【００３５】
しかし、緊密接合のバリア機能は不活発である。例えば、多くの親水性の栄養分は傍細胞性経路を通して上皮を容易に通過する（Ｂａｌｌａｒｄ， Ｓ． Ｔ．， ｅｔ ａｌ．， Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｎｕｔｒ． １５： ３５−５５ （１９９５））。その為、緊密接合は、力学型の傍細胞性浸透を調節するが、これは、上皮細胞は、緊密接合の機能を調節する能力を有することを示唆する。
【００３６】
当該緊密接合は、膜貫通および細胞質性タンパク質の両方を含む複合構造体である（Ｄｅｎｋａｒ， Ｂ． Ｍ． ａｎｄ Ｎｉｇａｍ， Ｓ． Ｋ． （１９９８） Ａｍ． Ｊ． Ｐｈｙｓｉｏｌ． ２７４： Ｆ１−Ｆ９； Ｆａｎｎｉｎｇ， Ａ． Ｓ．， ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｓｏｃ． Ｎｅｐｈｒｏｌ． １０： １３３７−１３４５ （１９９９））。これらのタンパク質の多く（例えば、オクルジン（ｏｃｃｌｕｄｉｎ）、ＺＯ−１、ＺＯ−２およびＺＯ−３）はリン酸化されるが、これは、これらタンパク質が種々のシグナルカスケードの終端であることを示唆する（Ａｎｄｅｒｓｏｎ， Ｊ． Ｍ． ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． １０６： １１４１−１１４９ （１９９８）； Ｓａｋａｋｉｂａｒａ， Ａ．， ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． １３７： １３９３−１４０１ （１９９７））。多くのシグナル経路が傍細胞性浸透の調節に含まれている（例えば、チロシンキナーゼ、カルシウム、プロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）（Ａｎｄｅｒｓｏｎ， Ｊ． Ｍ． ａｎｄ Ｖａｎ Ｉｔａｌｌｅ， Ｃ． Ｍ．， Ａｍ． Ｊ． Ｐｈｙｓ． ２６９： Ｇ４６７−Ｇ４７５ （１９９５）； Ｃｏｌｌａｒｅｓ−Ｂｕｚａｔｏ， Ｃ． Ｂ． ｅｔ ａｌ．， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． ７６： ８５−９２ （１９９８）； Ｍｕｌｌｉｎ， Ｊ． Ｍ．， ｅｔ ａｌ．， Ａｍ． Ｊ． Ｐｈｙｓｉｏｌ． ２７５： Ｃ５４４−Ｃ５５４（１９９８）； Ｔａｉ， Ｙ． Ｈ．， ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｍｅｍｂｒ． Ｂｉｏｌ． １４９： ７１−７９ （１９９６））。しかし、本発明が開示されるまで、当該調節と関連する分子機構は完全には解明されていなかった。
【００３７】
分子は、図１に概略するように、主に三つの経路で腸管上皮を通って血液中へ通過する。第一に、分子は、細胞膜を通過する受動拡散により（経細胞経路）；第二に、隣接細胞間の受動拡散（傍細胞経路）により；または、第三に担体仲介輸送（担体仲介経路）により、通過し得る。脂肪親和性分子は、経細胞経路を介する細胞膜を容易に通過する。一方、担体により認識されない親水性分子は、疎水性膜中に分配されず、その為、傍細胞経路を介し上皮バリアを浸透しなければならない。しかし、傍細胞経路を介する親水性分子の輸送は、緊密接合の存在により厳密に制限される。
【００３８】
多くの有用な治療薬は親水性であり、その為、最も好ましい薬物送達経路である経口経路を介し確実に送達されない。例えば、親水性の、広範のスペクトルの抗生物質セフォキシチン（ｃｅｆｏｘｉｔｉｎ）は、あまり腸管浸透しない動物では５％未満の経口生体利用性であり、現在ＩＶ製剤として販売されているのみである。エナラプリラート（ｅｎａｌａｐｒｉｌａｔ）、アンギオテンシン変換酵素インヒビターもまた、僅かに吸収される。この親水性薬物もまたＩＶ製剤としてのみ市販されている。
【００３９】
Ｃ．治療法
脊椎動物中の吸収部位での傍細胞性浸透を促進する方法を、本発明と関連して提供する。好ましい実施態様では、当該方法は、有効量のＰＬＣインヒビターを、促進された傍細胞性浸透が望ましいときに対象に投与すること；および有効量のＰＬＣインヒビターの投与を介する吸収部位での、対象における傍細胞性浸透を促進することを含む。
【００４０】
より好ましい実施態様では、ＰＬＣインヒビターは、以下に制限されないが、アルキルホスホコリン、３−ニトロクマリン誘導体、およびＮ−アルキルスクシンイミドステロイド誘導体からなる群から選択される。所望により、アルキルホスホコリンは更に１０から２０のメチレン基のアルキル鎖、すなわち、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０メチレン基のアルキル鎖を含み得る。当該吸収部位は、好ましくは腸管上皮を含む。他に、当該吸収部位は、血液脳関門を含み得る。
【００４１】
対象における親水性薬物の吸収を促進する方法もまた開示する。好ましい実施態様では、当該方法は、有効量のＰＬＣインヒビターを対象に、親水性薬物を当該対象に投与する前か当該投与と共に投与し、それにより促進された傍細胞性浸透が当該対象の吸収部位で生じること；および当該対象の吸収部位での親水性薬物の吸収を有効量のホスホリパーゼＣインヒビターの投与を介し促進することを含む。
【００４２】
より好ましい実施態様では、ＰＬＣインヒビターが、以下に制限されないが、アルキルホスホコリン、３−ニトロクマリン誘導体、およびＮ−アルキルスクシンイミドステロイド誘導体からなる群から選択される。所望により、アルキルホスホコリンは更に１０から２０のメチレン基のアルキル鎖、すなわち、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０メチレン基のアルキル鎖を含み得る。当該吸収部位は、好ましくは腸管上皮を含む。他に、当該吸収部位は、血液脳関門を含み得る。
【００４３】
本明細書で使用するとき、「有効」量または用量は、対象の母集団のうちの多数が有効であるかまたは有効範囲内にあり、そしてＰＬＣ活性を調節および／または対象での吸収が改善するのに十分であるものをいう。更に、本発明により、選択性および効力のあるＰＬＣインヒビターである化合物を同定し、当該化合物は、傍細胞性浸透の調節に使用し得る最初の証明を提供した。その為、本発明により、当該化合物は、ミリモーラー濃度とは全く異なるインビボ濃度であるマイクロモーラー（μＭ）を供する用量で投与し得る。典型的なインビボ濃度は、１μＭ未満から約１００μＭまでの範囲であり得、以下に限らないが、２、４、５、１０、２５、５０または７５μＭのような中間濃度（ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ）を含み得る。その為、非特異的活性および高ミリモーラー濃度に付随する望ましくない副作用、例えば細胞毒性が、本発明の方法および組成物で避けられる。
【００４４】
その為、本発明の開示を見た後は、当業者ならば、特定の製剤および当該組成物を用いる投与方法、ならびに対象の伸長、体重、症状の重篤度、および処置すべき疾患の段階を考慮して、対象への有効用量を選択することができる。
【００４５】
単位用量を、例えば、一日１から４回、投与し得る。好ましくは、有効量のＰＬＣインヒビターを対象に、親水性薬物を当該対象に投与する前か当該投与と共に投与する。親水性薬物を当該対象に投与すると共にＰＬＣインヒビターを投与する場合、ＰＬＣインヒビターおよび親水性薬物は単一製剤で対象に投与されることが好ましい。当該用量は、投与経路および化合物または化合物群を含む組成物の製剤による。更に、本発明の開示を見た後は、当業者ならば、用いる製剤の組合せ、対象の年齢および体重、および処置すべき病状の重篤度により、投与量の常套的調整または変更を行う必要があり得ることを理解するであろう。
【００４６】
そのような調整または変更、ならびにその調節または変更を行う時点およびその仕方の評価は、医薬分野の当業者に既知である。評価のパラメーターおよび技術は、対象および疾患の重篤度により変わり得る。特に有用な評価技術には、以下に限らないが、本明細書で示した実施例中で開示したアッセイが含まれる。
【００４７】
多くの実施態様における本発明で処置する対象は望ましくはヒトであるが、哺乳類（「対象」なる語句に含まれることを意図する）を含む本発明が全ての脊椎動物種に有効であることを本発明の原理が示していると理解される。本文中、哺乳類には、促進された傍細胞性浸透が望ましい任意の哺乳類種、特に酪農および家内飼育している哺乳類の種族を含むと理解される。
【００４８】
本発明の方法は、温血性脊椎動物の処置に特に有用である。その為、本発明は、哺乳類および鳥類に好ましくは適する。
【００４９】
より特に、予期されるのは、ヒトのような哺乳類、ならびに絶滅の危機に瀕した重要な哺乳類（シベリアンタイガーのような）、ヒトにとって商業的に重要な哺乳類（ヒトによる消費のため農場で飼育する動物）および／または社会的に重要な哺乳類（ペットとしてまたは動物園で飼われている動物）、例えば、ヒト以外の肉食動物（猫および犬のような）、ブタ（子ブタ、飼いブタおよび野生のイノシシ）、反芻動物（ウシ（ｃａｔｔｌｅ）、ウシ（ｏｘｅｎ）、ヒツジ、キリン、シカ、ヤギ、バイソンおよびラクダのような）、およびウマ（例えば、競走馬）の処置である。また、予期されるのは、絶滅の危機に瀕した種類の鳥、動物園で飼われている種類の鳥（例えば、ダチョウ）、ならびに食用の鳥、およびより特に家畜の鳥、すなわち、シチメンチョウ、ニワトリ、アヒル、ガチョウ、ホロホロチョウなどのような飼鳥類（それらはまたヒトにとって商業的に重要性がある）の処置を含む、鳥類の処置である。その為、予期されるのは、以下に限らないが、飼育しているブタ（子ブタおよび飼いブタ）、反芻動物、ウマ、飼鳥類などを含む家畜の処置である。
【００５０】
Ｄ．ＰＬＣインヒビター化合物
好ましいアルキルホスホコリンは、図２Ａに示すような式２の化合物（式中、ｎ＝８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０）を含む。典型的なホスホコリン合成技術は、米国特許番号５，２０８，２２３および５，１４４，０４５に開示されている（それらの内容は全て引用により本明細書に加える）。
【００５１】
ヘキサデシルホスホコリン（Ｃ１６）は、細胞内および生化学アッセイにおけるＰＬＣの阻害が見られた（Ｂｅｒｋｏｖｉｃ， Ｄ．， ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｅｘｐ． Ｔｈｅｒ． Ｏｎｃ． １： ３０２−３１１ （１９９６）； Ｐａｗｅｌｃｙｚｋ， Ｔ． ａｎｄ Ｌｏｗｅｎｓｔｅｉｎ， Ｊ． Ｍ．， Ｂｉｏｃｈｍ． Ｐｈａｒｍ． ４５： ４９３−４９７ （１９９９））。以下に限らないが、長いアルキル鎖および双性イオン性機能を含む構造的特徴を有するＣ１６は、ＭＤＣＫ細胞単層を通過する傍細胞性浸透が強力に増加することが判明した。その為、Ｃ１６の類似体を、１０から２０メチレン単位で鎖長が変わるように合成した（図２Ａ、式１）。これらの類似体の効能を測定した。ＰＬＣ阻害と傍細胞性浸透の変化との関係は、明らかに確証された。
【００５２】
好ましい３−ニトロクマリンは、３−ニトロクマリンエステルおよびエーテルを含み、当該エステルまたはエーテル結合は、３−ニトロクマリン核の６つの位置である。典型的なエーテル類似体には、７−ヒドロキシ−ヘプタノキシ−３−ニトロクマリンおよび６−ヒドロキシヘキサオキシ−３−ニトロクマリンが含まれる。典型的なエステル誘導体には、ヘプタノイルおよびヘキサノイル３−ニトロクマリンが含まれる。他の典型的な３−ニトロクマリンを以下の表１に示しており、それには、３−ニトロクマリン自体、６−ヒドロキシ−３−ニトロクマリン、６−アセトキシ−３−ニトロクマリン、６−オクタノイル−３−ニトロクマリン、６−（１０−ウンデセノイル）−３−ニトロクマリンおよび６−（８−ヒドロキシ−オクタノキシ）−３−ニトロクマリンが含まれている。誘導体は、以下に限らないが、Ｐｅｒｒｅｌｌａ ｅｔ ａｌ．， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ （１９９４） ３７ （１４）： ２２３２−２２３７（引用により本明細書に加える）に開示のものを含む標準的合成アプローチを用い合成され得る。
表１−置換３−ニトロクマリン（式３）＊
【化１】
2004532795.tif 000004
＊更に、３−シアノクマリン、３−ハロクマリン（３−Ｆ、３−Ｃｌ、３−Ｉ）、３−アセトキシクマリン、およびクマリン−３−スルホン酸の同一誘導体（表１で例示）もまた含まれている。その為、他の置換基、Ｒ４は、本発明により、上記式３の３の位置に提供され、すなわち、上記ニトロ基で置換される炭素原子である。その為、Ｒ４は、ニトロ基（−ＮＯ２）、シアノ基（−ＣＮ）、−Ｆ、−Ｃｌまたは−Ｉのようなハロゲン、アセトキシ基、すなわち、ＯＣＯＣＨ３−、またはスルホン酸基、すなわち、−ＳＯ３Ｈを含み得る。
【００５３】
好ましくは、ステロイドのＮ−アルキルスクシンイミド誘導体は、図２Ｂに示すような式１の構造を含む。好ましくは、Ｒ１は１から１０までのメチレン基の範囲のメチレン鎖、すなわち１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０メチレン基であり、Ｒ２は以下に限らないが、−ＯＣＨ３、−ＯＨおよびＨを含む群から選択される。
【００５４】
本発明により用い得る他のＰＬＣインヒビター組成物には、１９９９年８月２４日にＭａｙｈｕｅらにより公開の米国特許番号５，９４２，２４６に開示のリポソーム組成物；１９９５年７月４日にＳｍｉｔｈらにより公開の米国特許番号５，４３０，０５０に開示のヒスピドスペルミジン（ｈｉｓｐｉｄｏｓｐｅｒｍｉｄｉｎ）組成物；および１９９６年１２月３日にＳａｉｔｏらにより公開の米国特許番号５，５８０，９５６に開示のＰＬＣ阻害ペプチドが含まれる（それらはそれぞれ引用により全て本明細書中に含める）。他の適当なホスホリパーゼインヒビターには、１９９６年５月２１日にＧｉｂｂｓらにより公開の米国特許番号５，５１９，１６３に開示のアルファヒドロキシホスホネート化合物が含まれる。
【００５５】
Ｅ．医薬製剤
本発明により、本明細書で「ＰＬＣインヒビター」としてまた称する、ＰＬＣ生物学的活性を阻害する薬剤および物質を、医薬組成物としての投与に適用する。好ましい医薬組成物には、親水性薬物、有効量のＰＬＣインヒビター、および医薬的許容される担体が含まれる。
【００５６】
より好ましくは、ＰＬＣインヒビターは、以下に制限されないが、アルキルホスホコリン、３−ニトロクマリン、表１の脚注で示した他の３−置換クマリン、およびＮ−アルキルスクシンイミドステロイド誘導体からなる群から選択される。所望により、アルキルホスホコリンは更に、１０から２０のメチレン基のアルキル鎖、すなわち、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０メチレン基のアルキル鎖を含む。
【００５７】
組成物を必要とする対象への親水性薬物の経口生体利用性を促進する当該組成物を製造する方法をも提供する。好ましい実施態様では、当該方法は、親水性薬物を提供すること；有効量のＰＬＣインヒビターを提供すること；ならびに親水性薬物および有効量のＰＬＣインヒビターを医薬的許容される担体と混合し、それにより、親水性薬物の経口生体利用性を促進する組成物を製造することを含む。
【００５８】
より好ましくは、ＰＬＣインヒビターは、以下に限定されないが、アルキルホスホコリン、３−ニトロクマリン、およびＮ−アルキルスクシンイミドステロイド誘導体からなる群から選択される。また、より好ましくは、アルキルホスホコリンは更に、１０から２０のメチレン基のアルキル鎖、すなわち、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０メチレン基のアルキル鎖を含み、そしてＮ−アルキルスクシンイミドステロイドは、１から１０のメチレン基のアルキル鎖、すなわち、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０メチレン基のアルキル鎖を含む。
【００５９】
製剤および製造の技術は、当分野で一般的に述べられており、例えば、１９９４年７月５日にＳｅｉｐｐらにより公開の米国特許番号５，３２６，９０２、１９９３年８月１０日にＭａｒｎｅｔｔらにより公開の米国特許番号５，２３４，９３３、および１９９３年１２月２３日にＪｏｈｎｓｏｎらにより公開の国際特許番号９３／２５５２１参照（それらの文献は引用によりすべて本明細書に加える）。
【００６０】
上記目的の為、同定物質は、通常、全身的にまたは部分的に、通常、経口または非経口的投与により投与され得る。投与すべき用量は、年齢、体重、症状、望ましい傍細胞性浸透促進効果、投与経路および処置期間などに基づき決定する。治療処置の分野の当業者ならば、有効治療のための適当な投与計画を決定するための適当な手法および技術を認識するだろう。更なる技術指示をもまた以下に示す実施例で提供する。種々の組成物および投与形式を提供し、それらは一般的に当分野に知られている。投与のための他の組成物は、１つまたはそれより多い作用物質を含む坐薬を含み、既知の方法で製造し得る。
【００６１】
そのため、本発明による医薬組成物は、１つまたはそれより多い生理学的に許容される担体または賦形剤で製剤化され得る。そのため、本発明に使用の化合物は、経口、頬、鼻、非経口、直腸または経皮の投与、結腸上皮との接触に適する型の投与、または例えば肺の肺胞上皮に接触させるための吸入（ｉｎｈａｌａｔｉｏｎ）または吸引（ｉｎｓｕｆｆｌａｔｉｏｎ）（口または鼻の何れかを通して）に適する型の投与用に製剤化され得る。投与はまた、任意の他の効果的な技術により行われ得る。
【００６２】
経口投与の場合、医薬組成物は、結合剤（例えば、アルファ化メイズデンプン（ｐｒｅｇｅｌａｔｉｎｉｚｅｄ ｍａｉｚｅ ｓｔａｒｃｈ）、ポリビニルピロリドンまたはヒドロキシプロピルメチルセルロース）、充填剤（例えば、ラクトース、微結晶性セルロースまたはリン酸水素カルシウム）、滑沢剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルクまたはシリカ）、崩壊剤（例えば、ポテトデンプンまたはグリコールデンプンナトリウム）または湿潤剤（例えば、ドデシル硫酸ナトリウム）のような医薬的に許容される賦形剤を用い通常の技術で製造した、例えば、錠剤またはカプセルの型となり得る。当該錠剤は、当分野に既知の方法により被覆され得る。
【００６３】
経口投与用の液体製剤は、例えば、溶液、シロップまたは懸濁液の型となり得るか、それらは、使用前に水または他の適当なビヒクルにより構成する乾燥製品として提供され得る。その液体製剤は、懸濁剤（例えば、ソルビトールシロップ、セルロース誘導体または水素化食用油）、乳化剤（例えば、レクチンまたはアカシア）、非水性ビヒクル（例えば、アーモンド油、油性エステル、エチルアルコールまたは分別化植物油）、および保存剤（例えば、メチルまたはプロピル−ｐ−ヒドロキシベンゾエートまたはソルビン酸）のような医薬的に許容される添加剤を用い通常の技術により製造され得る。当該製剤には、適当な緩衝塩、香料、着色剤および甘味料をも含み得る。経口投与用の製剤は適当に製剤化され、作用化合物の放出を調節し得る。頬投与（ｂｕｃｃａｌ ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）の場合、当該組成物は、通常の手法で製剤化された錠剤またはトローチ剤の型となり得る。
【００６４】
本発明による投与方法には、例えば、ボラス注射または連続注入（ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ ｉｎｆｕｓｉｏｎ）による、注射により非経口的に投与し得る。注射のための製剤化は、添加保存剤を伴うかまたは伴わない、アンプルまたは複数用量コンテナー（ｍｕｌｔｉ−ｄｏｓｅ ｃｏｎｔａｉｎｅｒ）などの単位用量型となり得る。注射剤は、特に血液脳関門を通る治療薬の中枢神経系への送達に使用することを意図される。
【００６５】
当該方法に使用する組成物は、油性または水性ビヒクル中で懸濁液、溶液またはエマルジョンのような型となり得、懸濁剤、安定化剤および／または分配剤のような製剤化製剤を含み得る。他に、作用成分は、使用前に、適当なビヒクル、例えば滅菌パイロジェンフリー水で構成される粉末型となり得る。当該化合物はまた、例えば、ココアバターまたは他のグリセリドのような通常の坐薬ベースを含む、坐薬または持続性浣腸剤（ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ ｅｎｅｍａｓ）のような直腸用組成物（ｒｅｃｔａｌ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ）中に製剤化され得る。前記製剤化に加えて、当該化合物はまた、移植または注射のための製剤として製剤化し得る。そのため、例えば、当該化合物は、適当な重合性もしくは疎水性の物質またはイオン交換樹脂で製剤化され得るか、例えば僅かに溶解する塩のような僅かに溶解する誘導体として製剤化され得る。
【００６６】
実施例
以下の実施例は、本発明の好ましい態様を示すために含まれるものである。以下の実施例の特定の態様は、本発明の実施において十分に行われる本発明者により見られるかまたは予期される技術および手法に関し述べたものである。これらの実施例は、本発明者の標準的な研究での実施での使用を介し解説される。本発明の開示および当業者の一般的レベルの観点から、当業者ならば、以下の実施例は例示のみを目的としており、多くの変化、修飾および変更が本発明の要旨および本発明の範囲から出発することなく行い得ると評価するであろう。
【００６７】
実施例のための物質および方法
試薬
ＭＤＣＫ上皮細胞系株ＩＩは、Ｌｉｎｅｂｅｒｇｅｒ Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｎｔｅｒ（Ｃｈａｐｅｌ Ｈｉｌｌ， Ｃｈａｐｅｌ Ｈｉｌｌ， Ｎｏｒｔｈ Ｃａｒｏｌｉｎａに住所を有するＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｎｏｒｔｈ Ｃａｒｏｌｉｎａ）を介しＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから得た。Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−２−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）は、Ｌｉｎｅｂｅｒｇｅｒ Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｎｔｅｒ（Ｃｈａｐｅｌ Ｈｉｌｌに住所を有するＵＮＣ）より得た。Ｈａｎｋ’ｓ Ｂａｌａｎｃｅｄ Ｓａｌｔ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＨＢＳＳ）は、Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ ｏｆ Ｈｅｒｎｆｏｒｄ， Ｖｉｒｇｉｎｉａから得た。細胞培養試薬は、Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ， Ｎｅｗ ＹｏｒｋのＧｉｂｃｏ ＢＲＬから得た。ＴＲＡＮＳＷＥＬＬ（商標）マルチウェルプレートおよびインサート（１２ウェル／プレート、３μｍ孔および１．０ｃｍ２領域、ポリカーボネート）は、Ｃｏｓｔａｒ ｏｆ Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ， Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓから得た。［１４Ｃ］−マンニトールおよび［３Ｈ］−ミオ−イノシトールは、Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＭｉｓｓｏｕｒｉのＡｍｅｒｉｃａｎ Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓから得た。ドデシルホスホコリンは、Ａｌａｂａｓｔｅｒ， ＡｌａｂａｍａのＡｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓから得た。ＡＧ１−Ｘ８ホルマートカラムは、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ， ＣａｌｉｆｏｒｎｉａのＢｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから得た。すべての他の化合物および試薬は、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， Ｍｉｓｓｏｕｒｉから得た。
【００６８】
細胞培養
輸送研究の場合、輸送実験のモデルである、雄のコッカースパニエルの通常の近傍の上皮腎細胞から得られるＭＤＣＫ細胞（Ｃｈｏ， Ｍ． Ｊ．， ｅｔ ａｌ． （１９８９） Ｐｈａｒｍ． Ｒｅｓ． ６： ７１−７７）は、ＴＲＡＮＳＷＥＬＬ（商標）マルチウェルプレートで増殖させた。それぞれのウェルに、２００，０００細胞をシードした。次いで、当該細胞を細胞培地（１０％胎児ウシ血清（ＦＢＳ）および１％ＮＥＡＡを加えた１％抗生物質を有するＭＥＭ）中で増殖させ、３７℃および５％ＣＯ２で維持した。コンフルエント細胞を４日間増殖させ、安定ＴＥＥＲの確立により証明されるように上皮細胞単層中に区別した。
【００６９】
経上皮性電気抵抗（ＴＥＥＲ）の測定
ＴＥＥＲ（Ω・ｃｍ２のように表す）は、緊密接合の機能的完全性（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ）の測定の役割をなす。ＴＥＥＲは、ＥＶＯＭ Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ Ｔｉｓｓｕｅ Ｖｏｌｔｏｈｍｅｔｅｒ（Ｗｏｒｌｄ Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ， Ｓａｒａｓｏｔａ， Ｆｌｏｒｉｄａ）およびＥｎｄｏｈｍ−１２電極（Ｗｏｒｌｄ Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ， Ｓａｒａｓｏｔａ， Ｆｌｏｒｉｄａ）により測定される。ＭＤＣＫ細胞のＴＥＥＲ値は、１５０−２５０Ω・ｃｍ２の範囲で機能性単層（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｍｏｎｏｌａｙｅｒ）を形成する。
【００７０】
傍細胞性マーカーとしてのマンニトール
マンニトール、親水性化合物は、上皮膜を容易には通過できず、傍細胞性経路を介し上皮を横切らなければならない。そのため、上皮を通過するマンニトール流入は、傍細胞性経路の浸透性を反映したものである。マンニトールの検出は、［３Ｈ］または［１４Ｃ］放射標識となる。
【００７１】
ＴＥＥＲ上のアルキルホスホコリンの効果の決定
実験は、化合物またはビヒクルを含む、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４（輸送緩衝液）を加えたＨＢＳＳ０．５ｍＬを、ＴＲＡＮＳＷＥＬＬ（商標）マルチウェルプレートの先端に加えることにより開始した。細胞単層は３７℃でインキュベーション視、ＴＥＥＲ値は、３０分後測定した。それぞれの実験からのデータは、ビヒクルからの応答を正規化し、３回行った３実験の平均±ＳＤとして示した。
【００７２】
ＴＥＥＲにおけるアルキルホスホコリンの効果は、数種の濃度で評価し、未処理対照に関しＴＥＥＲ中で５０％減少の要因となる濃度をＥＣ５０として定義した（Ｌｉｕ， Ｄ． Ｚ．， ｅｔ ａｌ．， （１９９９） Ｊ． Ｐｈａｒｍ． Ｓｃｉ． ８８： １１６１−１１６８； Ｌｉｕ， Ｄ． Ｚ． ｅｔ ａｌ． （１９９９） Ｊ． Ｐｈａｒｍ． Ｓｃｉ． ８８： １１６９−１１７４）。
【００７３】
マンニトール輸送におけるアルキルホスホコリンの効果の測定
細胞単層の緊密接合の完全性は、実験前のＴＥＥＲ測定でモニターした。輸送実験は、先端培地を、化合物またはビヒクル、および［１４Ｃ］−マンニトールを含む輸送緩衝液０．５ｍＬと置換することにより開始した。［１４Ｃ］−マンニトールの濃度は、２５μＭ（５５ｍＣｉ／ｍｍｏｌ）であった。輸送速度は、２回の３０分間隔の間に基底部側（１．５ｍＬ）中に蓄積した［１４Ｃ］−マンニトールの量を測定することによりモニターした。輸送された放射標識［１４Ｃ］−マンニトールの量は、コネチカット州のメリデンにあるＰａｃｋａｒｄ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ Ｃｏｍｐａｎｙから購入したＰａｃｋａｒｄ Ｔｒｉ Ｃａｒｂ ４０００ Ｓｅｒｉｅｓ ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒで液体シンチレーションカウンティングにより測定した。すべての輸送実験は、シンク条件下で行った（輸送実験は、［１４Ｃ］−マンニトールの総量の１０％未満が任意の所定時間、基底部側に存在した）。［１４Ｃ］−マンニトールの輸送におけるアルキルホスホコリンの効果を、ビヒクル処理細胞中の［１４Ｃ］−マンニトールの輸送に正規化し、３回行った３実験の平均±ＳＤとして示した。ＥＣ１０ｘは、ビヒクル処理した対照に関し、マンニトール流入で１０倍の増加の要因となる化合物の濃度により決定した。
【００７４】
細胞アッセイによる、ＰＬＣ活性の測定
ＭＤＣＫ細胞中のＰＬＣの活性の測定は、従前に開示された方法（Ｓｃｈａｃｈｔｅｒ， Ｊ． Ｂ．， ｅｔ ａｌ． （１９９７） Ｎｅｕｒｏｐｈａｒｍ． ３６： １１８１−１１８７）の適応により測定した。ＭＤＣＫ細胞を１２ウェルプレート中に４００，０００細胞／ウェルでシードし、その後、４日間培養した。次いで、ＭＤＣＫ細胞単層を、２４時間３７℃で［３Ｈ］−ミオ−イノシトール（イノシトールフリー培地０．４ｍｌ中に１．６μＣｉ／ｗｅｌｌ）で標識した。アッセイは、化合物を伴うかまたは伴わない１００ｍＭ ＬｉＣｌを含む２５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．３）１００μｌを細胞に直接加えることによりインキュベーターから取除いた標識細胞において開始した。その後、当該細胞は、３０分間３７℃でインキュベーションした。このインキュベーションの終了直後、ＡＴＰ（最終濃度：１００μＭ）またはＥＧＦ（２０ｎｇ／ｍｌ）を加えた。
【００７５】
次いで、細胞を３７℃で１５分間インキュベーションし、［３Ｈ］−イノシトールホスフェートを蓄積させた。インキュベーションは、培地を吸引し、１０ｍＭ 煮沸ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）１ｍｌを添加することにより、終了した。上清は、［３Ｈ］−イノシトールホスフェートのクロマトグラフィー単離用のＡＧ１×８ホルマートカラムに適用した（Ｂｅｒｒｉｄｇｅ， Ｍ． Ｊ．， ｅｔ ａｌ．， （１９８３） Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｊ． ２１２： ４７３−４８２）。［３Ｈ］−イノシトールホスフェートの量は、Ｐａｃｋａｒｄ Ｔｒｉ Ｃａｒｂ ４０００ Ｓｅｒｉｅｓ ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒで液体シンチレーションカウンティングにより測定した。それぞれの実験からのデータは、１００μＭ ＡＴＰまたは２０ｎｇ／ｍｌ ＥＧＦで観察される応答を正規化し、３回行った３実験の平均±ＳＤとして示した。ＩＣ５０（ＰＬＣ）は、ＡＴＰ−またはＥＧＦ−刺激性の、［３Ｈ］−イノシトールホスフェートの蓄積で５０％減少の要因となる化合物の濃度により測定した。
【００７６】
アルキル鎖長の異なるアルキルホスホコリンの合成
アルキルホスホコリンは、アルコールを２−ブロモエチル−ジクロロホスフェートでリン酸化（Ｈｉｒｔ， Ｒ．， ａｎｄ Ｂｅｒｃｈｔｏｌｄ， Ｒ． （１９５８） Ｐｈａｒｍａ． Ａｃｔａ． Ｈｅｌｖ． ３３： ３４９−３５６）し、その後、臭素をトリメチルアミンで置換（Ｈａｎｓｏｎ， Ｗ． Ｊ．， ｅｔ ａｌ．， （１９８２） Ｌｉｐｉｄｓ １７： ４５３−４５９； Ｓｕｒｌｅｓ， Ｊ． Ｒ．， ｅｔ ａｌ． （１９９３） Ｌｉｐｉｄｓ ２８： ５５−５７）することにより合成した。
【００７７】
データ分析
対となっていないデータのＳｔｕｄｅｎｔ ｔ−テストを用い測定すると、未処理ＭＤＣＫ細胞単層と処理ＭＤＣＫ細胞単層の平均±ＳＤ間で有意な相違があった（ｐ＜０．０５）。ＰＬＣ活性と傍細胞性浸透との間の関係は、線形回帰分析により測定され、その相関は、ピアソン相関係数（Ｐｅａｒｓｏｎ ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ）で表す。
【００７８】
実施例１
ＭＤＣＫ細胞を通過するＴＥＥＲにおけるアルキルホスホコリンの効果
ＴＥＥＲにおけるアルキルホスホコリンの効果は、ＭＤＣＫ細胞単相の１０分間および３０分間の処理から評価した。１０分後、アルキルホスホコリンシリーズの殆どの化合物（非毒性濃度）は、ＴＥＥＲを有意には減少しなかった（ｐ＞０．０５）。３０分後、すべてのアルキルホスホコリンが濃度依存の方法でＴＥＥＲを減少した（図３−明らかなように、このシリーズのＣ１２およびＣ１６化合物のみを示す）。例えば、ＴＥＥＲにおける３０μＭ Ｃ１６の効果は、１０分間遅延し、次いで、ＴＥＥＲは、２時間に渡り対照値の１０％未満まで定速滴下する（図３挿入図）。アルキルホスホコリンでの長期処理による可能性ある非特異的効果を避けるため、傍細胞性浸透の有意な増加の要因となる最も短い処置時間（すなわち、３０分間の処置）を更なる実験用に選択した。
【００７９】
このシリーズのすべてのアルキルホスホコリンが、濃度依存の方法でＴＥＥＲを減少し、それによって、最大濃度で、すべてのアルキルホスホコリンが、ＴＥＥＲを対照値の２０％未満に減少した（図３）。ＴＥＥＲを５０％（ＥＣ５０）減少するアルキルホスホコリンの濃度に相当するアルキルホスホコリンの効力が顕著に変化した（表２）。興味あることに、有意なもの（ｐ＜０．０５）を産するアルキル鎖中の僅かな変化により、これらの化合物のＥＣ５０は変化する。例えば、Ｃ１６およびＣ１２は、アルキル鎖で４メチレン単位が異なっているが、それぞれのＥＣ５０値は、おおよそ２５倍異なっている。ＭＤＣＫ細胞を通過する傍細胞性浸透をアルキルホスホコリンが増加することを確認するため、マンニトール流入を増加するアルキルホスホコリンの能力を決定した。
【００８０】
実施例２
ＭＤＣＫ細胞を通過するマンニトール流入におけるアルキルホスホコリンの効果
ＭＤＣＫ細胞単層を通過するマンニトール流入におけるアルキルホスホコリンの影響をまた、時間の関数としてモニターした。３０分未満のこれらの化合物の処理は、ＭＤＣＫ細胞単層を通過するマンニトール流入を有意に（ｐ＜０．０５）は増加しなかった。この結果は、ＴＥＥＲがＭＤＣＫ細胞単層の通過を有意に（ｐ＜０．０５）減少する前の、事前に決定した時間のアルキルホスホコリンによる処理（例えば、３０分間の処理）の好ましいステップに相当する。そのため、マンニトール流入の測定は、３０分間のアルキルホスホコリン処理後すぐに始め、６０分間のアルキルホスホコリン処理前にすぐに停止した（すなわち、３０〜６０分間の間隔で広がる測定）。
【００８１】
アルキルホスホコリンは、濃度依存の手法でマンニトール流入を増加した（図４、明らかにするため、この一連のＣ１２およびＣ１６化合物のみを示す）。マンニトール浸透におけるこれらの化合物の最大効果は、高濃度でアルキルホスホコリンが飽和応答（ｓａｔｕｒａｂｌｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ）を生じないため、得られない。そのため、傍細胞性浸透を増加するこれらの化合物の能力を、マンニトール流入を１０倍（ＥＣ１０ｘ）増加する化合物の濃度により比較した（Ｌｉｕ， Ｄ． Ｚ．， ｅｔ ａｌ． （１９９９） Ｊ． Ｐｈａｒｍ． Ｓｃｉ． ８８： １１６１−１１６８； Ｌｉｕ， Ｄ． Ｚ．， ｅｔ ａｌ． （１９９９） Ｊ． Ｐｈａｒｍ． Ｓｃｉ． ８８： １１６８−１１７４）。
【００８２】
対照値よりも１０倍増加するマンニトール流入は、ＥＤＴＡにより得られた最大マンニトール流入の５０％に相当する（Ｌｉｕ， Ｄ． Ｚ．， ｅｔ ａｌ． （１９９９） Ｊ． Ｐｈａｒｍ． Ｓｃｉ． ８８： １１６９−１１７４）。アルキルホスホコリンのＥＣ１０ｘを表２に要約する。これらの化合物のＥＣ１０ｘは、アルキルホスホコリンで達成されるＥＣ１０ｘ値を有するウェルに相当する。
【００８３】
実施例３
ＰＬＣ活性を阻害するアルキルホスホコリンの能力を決定するため、イノシトールホスフェートのレベルにおいて、ＡＴＰ−仲介増加を阻害するこれらの化合物の能力を決定した。しかし、基底からのカウントと、ＭＤＣＫ細胞単層からの［３Ｈ］−イノシトール−ホスフェートの、ＡＴＰで刺激されるレベルとの間の分離は、ＰＬＣ活性を阻害するアルキルホスホコリンの能力の信頼ある測定に対して僅か（約１．５倍）である。この分離を増大させるため、Ｐ２Ｙ２レセプターをコードしたプラスミドをトランスフェクトしたＭＤＣＫ細胞を用いた。Ｐ２Ｙ２レセプターはＰＬＣを活性化させるＧ−タンパク質結合レセプターである（Ｐａｗｅｌｃｚｙｋ， Ｔ．， ａｎｄ Ｌｉｏｗｅｎｓｔｅｉｎ， Ｊ．Ｍ． （１９９３） Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｐｈａｒｍ． ４５： ４９３−４９７）。基底からのカウントと、Ｐ２Ｙ２レセプターを発現するＭＤＣＫ細胞単層からの［３Ｈ］−イノシトール−ホスフェートの、ＡＴＰで刺激されるレベルとの間の分離は、おおよそ３倍増加し相違した（基底からのカウント、および［３Ｈ］−イノシトール−ホスフェートの、ＡＴＰで刺激されるレベルは、それぞれ２００から４００、および７００から１２００ｃｐｍの範囲である）。
【００８４】
ＰＬＣ阻害が、ＭＤＣＫ細胞中の傍細胞性浸透を増加するアルキルホスホコリンの能力と関連するかどうか決定するため、イノシトールホスフェート産物中のＡＴＰ−刺激性増加を減少するアルキルホスホコリンの能力をも測定した（図５、明らかとするため、この一連のＣ１２およびＣ６化合物のみを示す）。ＰＬＣ活性を５０％（ＩＣ５０（ＰＬＣ））阻害するアルキルホスホコリンの濃度に相当するアルキルホスホコリンの効力は、変化した（表２）。これらの化合物由来のＰＬＣ阻害の最大値（ｆｕｌｌ ｅｘｔｅｎｔ）も変化した。例えば、Ｃ１０（このシリーズの傍細胞性浸透のエンハンサーの効力は小さい）は、Ｃ１０がイノシトールホスフェート産物中のＡＴＰ−刺激性増加を５０％減少させるため、表２に含まれていない。更に、Ｃ１２による処置の最大値のＰＬＣ阻害は５０％であった。この結果は、Ｃ１０およびＣ１２は、このシリーズで傍細胞性浸透のエンハンサーの効力が小さいため、驚くことではない。ＰＬＣを阻害する能力（すなわち、ＩＣ５０（ＰＬＣ））に相関する傍細胞性浸透（すなわち、ＥＣ１０ｘおよびＩＣ５０）を増加するアルキルホスホコリンの能力をも決定した。一般的に、傍細胞性浸透のエンハンサーの効力の小さいアルキルホスホコリンは、ＰＬＣのインヒビターの効力も小さい（表２）。この観察は、ＥＣ１０ｘおよびＩＣ５０（ＰＬＣ）（図６Ａ）と、ＥＣ５０およびＩＣ５０（ＰＬＣ）（図６Ｂ）間の有意な（ｐ＜０．００１）陽性相関の決定により確認した。データポイントは、これらの相関の何れかからは顕著には変わらなかった（両相関でｒ＞０．９４）。そのため、これらの相関は、傍細胞性浸透を増加するアルキルホスホコリンの能力が、ＰＬＣ活性を阻害するこれらの化合物の能力と関連することを示す。
【００８５】
アルキルホスホコリンの効力が小さいため、傍細胞性促進の効力が小さいため、傍細胞性促進（すなわち、ＥＣ５０およびＥＣ１０ｘ）の効力とＰＬＣ阻害（すなわち、ＩＣ５０（ＰＬＣ））との間の分離はより大きくなった（表２）。例えば、Ｃ１６のＩＣ５０（ＰＬＣ）およびＥＣ１０ｘ、アルキルホスホコリンシリーズの最も効力のあるエンハンサーは、僅かに異なるが、Ｃ１２のＩＣ５０およびＥＣ１０ｘ、アルキルホスホコリンシリーズの効力の小さいエンハンサーの１つは、顕著に異なる（表２）。この関係はまた、ＩＣ５０（ＰＬＣ）およびＥＣ１０ｘと、ＩＣ５０（ＰＬＣ）およびＥＣ５０との相関関係で説明され、この場合、これらの相関関係はｌｏｇ−ｌｏｇスケールで直線となる。そのため、これらの相関関係は、傍細胞性浸透を増加する効力の小さいエンハンサーの能力は、ＰＬＣを阻害する当該エンハンサーの能力に殆ど依存せず、他の非特異的な効果（すなわち、細胞膜における細胞溶解効果および減少した細胞生存能力）により依存する。
【００８６】
実施例４
ＭＤＣＫ細胞を通過する傍細胞性浸透における構造的に非関連ＰＬＣインヒビターの効果
増加した傍細胞性浸透が、ＰＬＣ阻害の結果であるかどうか更に確証するため、傍細胞性浸透を増加する選択性ＰＬＣインヒビター（例えば、Ｕ−７３，１２２および３−ニトロクマリン）（構造はそれぞれ図７Ａおよび７Ｂ参照）の能力を決定した。傍細胞性浸透を増加するこれら選択性ＰＬＣインヒビターの能力は従前には示されていなかった。Ｕ−７３，１２２および３−ニトロクマリンが、ＰＬＣを阻害しＭＤＣＫ細胞単層の傍細胞性浸透を増加するアルキルホスホコリンの能力と有意に（ｐ＜０．０５）相関するかどうかもまた決定した。
【００８７】
傍細胞性浸透の増加がＰＬＣ阻害に依存することを確認するため、ＴＥＥＲを減少し、マンニトール流入を増加する選択性ＰＬＣインヒビター、Ｕ−７３，１２２（Ｂｌｅａｓｄａｌｅ， Ｊ． Ｅ．， ｅｔ ａｌ．，（１９８９） Ａｄｖ． Ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ Ｔｈｒｏｍｂｏｘａｎｅ Ｌｅｕｋｏｔ． Ｒｅｓ． １９： ５９０−５９３）を決定した。Ｕ−７３，１２２は、強力にＴＥＥＲを減少し、ＭＤＣＫ細胞単層を通してマンニトール流入を増加する（図３、図４および表２）。一方、陰性対照化合物、Ｕ−７３，１２２は、ＴＥＥＲまたはＡＴＰ−刺激性ＰＬＣ活性を増加しなかった（図７Ａ）。これらの化合物間の活性の相違は、１つの二重結合により構造が異なることから、顕著である（図２Ｂ）。共同発明者の知る限りでは、Ｕ−７３，１２２は、最も効力のある傍細胞性浸透のエンハンサーの１つである。更に、傍細胞性浸透を増加するＰＬＣ、３−ニトロクマリンの構造的に関連のない他のインヒビターの能力もまた、説明した。ＰＬＣの阻害（ＩＣ５０（ＰＬＣ）および傍細胞性浸透の促進（ＥＣ５０およびＥＣ１０ｘ）に関し、Ｃ１６アルキルホスホコリンとおおよそ同程度の効力がある。この結果により、ＰＬＣ阻害は、ＭＤＣＫ細胞中の傍細胞性浸透の増加と相関することが確認される。
【００８８】
最終的に、傍細胞性浸透を増加し、ＰＬＣを阻害するＵ−７３，１２２および３−ニトロクマリンの能力が、これらのパラメーターを変化するアルキルホスホコリンの能力と相関するかどうか、決定した。従前に、ＭＤＣＫ細胞中でＰＬＣ活性を５０％阻害する（図５および表２）Ｕ−７３，１２２の濃度が報告されている（Ｌｏｃｋｈａｒｔ， Ｌ．Ｋ．， ａｎｄ ＭｃＮｉｃｏｌ， Ａ． Ｊ． （１９９９） Ｐｈｒｍ． Ｅｘｐ． Ｔｈｅｒ． ２８９： ７２１−７２８）。Ｕ−７３，１２２および３−ニトロクマリンのＥＣ５０およびＥＣ１０ｘ、およびＩＣ５０（ＰＬＣ）の値は、アルキルホスホコリンのこれらの値と有意に（ｐ＜０．０５）相関した（図６Ａおよび６Ｂ）。この証明により、傍細胞性浸透の調節におけるＰＬＣの改善が確認された。
【表２】
2004532795.tif 000005
【００８９】
＊結果は、３回の実験での３つの値での平均±ＳＤを示している。
【００９０】
実験例５
Ｕ７３１２２およびＨＰＣによる、ＰＬＣのイソ酵素ファミリー選択性阻害
Ｕ−７３，１２２は、ＰＬＣイソ酵素ファミリー−βを選択的に阻害すると報告されている（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ． １９９１）。本開示はまた、ＨＰＣがＡＴＰ−刺激性ＰＬＣ−β活性の強力なインヒビターであるという事実によりＨＰＣはＰＬＣ−βのインヒビターであることを示す（図５）。そのため、本実施例では、ＰＬＣ−βのＨＰＣおよびＵ−７３，１２２の選択性対ＰＬＣ−γの他のＰＬＣイソ酵素の選択性を決定した。しかし、ＡＴＰ−刺激性ＰＬＣ−β活性を阻害するＵ−７３，１２２およびＨＰＣは、ＥＧＦ−刺激性ＰＬＣ−γ活性に全く効果がなかった（図８）。従前に述べられているように、これらの化合物は、ＭＤＣＫ細胞単層を通過する緊密接合浸透の強力なエンハンサーである。そのため、ＰＬＣ−βの阻害は、ＭＤＣＫ細胞単層を通過する緊密接合浸透の増加に関連する。
【００９１】
実施例６
ＰＬＣ−γのイソ酵素ファミリー選択性阻害は、緊密接合浸透の増加に関連する  この実施例では、ＰＬＣ−γ、３−ニトロクマリン（３−ＮＣ）の既知インヒビター（Ｐｅｒｅｌｌａ ｅｔ ａｌ．， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ （１９８４） ３７ （１４）： ２２３２−２２３７）は、ＭＤＣＫ細胞単層中のＰＬＣ−βに対し阻害活性のない、ＰＬＣ−γの選択性インヒビターであることがわかった（図８）。緊密接合浸透を増加し、ＥＧＦ−刺激性ＰＬＣ−γ活性を阻害する（ＰＬＣ−γの阻害を示唆する）この化合物はまた、緊密接合浸透と関連する。従前にはＰＬＣを阻害するとは報告されていなかった３−ＮＣ、７−ヒドロキシ−３−ニトロクマリン（ＯＨ−３−ＮＣ）（図７Ｂ）の構造的に類似する類似体（Ｐｅｒｒｅｌａ ｅｔ ａｌ．， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ （１９９４） ３７ （１４）： ２２３２−２２３７）は、５００μＭ濃度であっても緊密接合浸透を増加せず（図７Ｂ）、これは、緊密接合浸透を増加する３−ＮＣの能力がＰＬＣ−γによるものであることを示唆する。
【００９２】
傍細胞性浸透の調節におけるＰＬＣ−依存経路の改善の証明が増しつつある。しかし、本発明の開示は、ＰＬＣ阻害と傍細胞性浸透との間の直接の関連を最初に確立したことである。更に、傍細胞性浸透の最も強力なエンハンサーの１つ（すなわち、Ｕ−７３，１２２）を同定した。そのため、本発明は、傍細胞性浸透を増大する試薬の能力よる機構の解明を提供し、緊密接合の調節の新規洞察を生ずる。
【００９３】
参考文献
以下に列挙した参考文献および本明細書中で引用したすべての参考文献は、追加、解説、背景の提供、または本明細書で用いた方法、技術および／または組成物を教授する程度に引用により本明細書に含める。
【表３】
2004532795.tif 000006
【表４】
2004532795.tif 000007
【表５】
2004532795.tif 000008
【００９４】
米国特許番号５，９４２，２４６
米国特許番号５，４３０，０５０
米国特許番号５，５８０，９５６
米国特許番号５，５１９，１６３
米国特許番号５，２０８，２２３
米国特許番号５，１４４，０４５
米国特許番号５，３２６，９０２
米国特許番号５，２３４，９３３
国際公開第９３／２５５２１
【００９５】
本発明の種々の詳細が、本発明の範囲から出発することなく変化することが理解される。更に、前記記載は、特許請求の範囲により定義される本発明を解説のみを目的としており、本発明を制限する目的でない。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、腸管上皮を通過する輸送の概略図である。
【図２】図２は、アルキルホスホコリンの構造式、ならびに特定のＰＬＣインヒビターＵ−７３，１２２、１−［６−［［（１７β）−３−メトキシエストラ−１，３，５（１０）−トリエン−１７−イル］アミノ］ヘキシル］−）１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン、およびその不活性類似体、Ｕ−７３，３４３、１−［６−［［（１７β）−３−メトキシエストラ−１，３，５（１０）−トリエン−１７−イル］アミノ］ヘキシル］−）−２，５−ピロリジンジオンの構造式である。
【図３】図３は、ＭＤＣＫ細胞中でＴＥＥＲにおけるアルキルホスホコリンおよびＵ−７３，１２２の効果を示したグラフである。
【図４】図４は、ＭＤＣＫ細胞中のマンニトール流入におけるアルキルホスホコリンおよびＵ−７３，１２２の効果を示すグラフである。
【図５】図５は、ＭＤＣＫ細胞中のＡＴＰ−刺激性ＰＬＣ活性におけるアルキルホスホコリンおよびＵ−７３，１２２の効果を示すグラフである。
【図６】図６は、アルキルホスホコリン、３−ＮＣ、およびＵ−７３，１２２のＩＣ５０（ＰＬＣ）とＥＣ１０ｘ値の間の相関（ｒ＝０．９８、ｐ＜０．０５）を示すグラフ、ならびにアルキルホスホコリン、３−ＮＣ、およびＵ−７３，１２２のＩＣ５０（ＰＬＣ）とＥＣ１０ｘ値の間の相関（ｒ＝０．９５、ｐ＜０．０５）を示すグラフである。
【図７】図７は、構造式、およびＴＥＥＲ（白）およびＡＴＰ−刺激性ＰＬＣ活性（黒）におけるＵ−７３，１２２およびＵ−７３，３４３の効果を示す棒グラフ、ならびに構造式、およびＴＥＥＲ（白）およびＥＧＦ−刺激性ＰＬＣ活性（黒）における３−ニトロクマリンおよび７−ヒドロキシ−ニトロクマリンの効果を示す棒グラフである。
【図８】図８は、ＰＬＣ−β（黒）およびＰＬＣ−γ（白）の活性における３−ＮＣ、ＨＰＣまたはＵ−７３，１２２の効果を示す棒グラフである。
【図１】
2004532795.tif 000009
【図３】
2004532795.tif 000010
【図４】
2004532795.tif 000011
【図５】
2004532795.tif 000012
【図７】
2004532795.tif 000013
【図８】
2004532795.tif 000014
【国際公開パンフレット】
2004532795.tif 000015
2004532795.tif 000016
2004532795.tif 000017
2004532795.tif 000018
2004532795.tif 000019
2004532795.tif 000020
2004532795.tif 000021
2004532795.tif 000022
2004532795.tif 000023
2004532795.tif 000024
2004532795.tif 000025
2004532795.tif 000026
2004532795.tif 000027
2004532795.tif 000028
2004532795.tif 000029
2004532795.tif 000030
2004532795.tif 000031
2004532795.tif 000032
2004532795.tif 000033
2004532795.tif 000034
2004532795.tif 000035
2004532795.tif 000036
2004532795.tif 000037
2004532795.tif 000038
2004532795.tif 000039
2004532795.tif 000040
2004532795.tif 000041
2004532795.tif 000042
2004532795.tif 000043
2004532795.tif 000044
2004532795.tif 000045
2004532795.tif 000046
2004532795.tif 000047
2004532795.tif 000048
2004532795.tif 000049
2004532795.tif 000050
2004532795.tif 000051
2004532795.tif 000052
2004532795.tif 000053
2004532795.tif 000054
2004532795.tif 000055
2004532795.tif 000056
2004532795.tif 000057
2004532795.tif 000058
2004532795.tif 000059
2004532795.tif 000060
2004532795.tif 000061
2004532795.tif 000062
2004532795.tif 000063
2004532795.tif 000064
2004532795.tif 000065
2004532795.tif 000066
2004532795.tif 000067
2004532795.tif 000068
2004532795.tif 000069
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004532795.tif 000070
2004532795.tif 000071
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004532795.tif 000072
2004532795.tif 000073
【国際調査報告】
2004532795.tif 000074
2004532795.tif 000075
2004532795.tif 000076
2004532795.tif 000077
2004532795.tif 000078
2004532795.tif 000079
2004532795.tif 000080
2004532795.tif 000081