(57)【要約】親和性吸着剤を有する、マイクロチップを用いた電気噴霧イオン化装置およびカラムを開示する。本発明は、マイクロチップアレイ（2）と毛管（1）を含む、またはそれらをそれぞれ独立に含むか、または組み合わされ取り付けられた状態で含む。装置またはカラムの少なくとも一部は、固定化された親和性吸着剤を有する。プロテオミクスや薬物の発見のような現代のライフサイエンスの要件を満たすように生体分子の親和捕獲を行う、上記の装置を使用する方法も提供する。
2004532392.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
親和性クロマトグラフィー吸収剤を含む流れ接触部分を有する電気噴霧装置。
【請求項２】
親和性クロマトグラフィー吸収剤が被覆層を含む、請求項1記載の装置。
【請求項３】
親和性クロマトグラフィー吸収剤が多孔性ポリマーモノリスを含む、請求項1記載の装置。
【請求項４】
流れ接触部分が、槽と流体連通する少なくとも1つの装置貫通導管を含む、請求項1記載の装置。
【請求項５】
親和性クロマトグラフィー吸収剤が、固定化された金属イオンキレート化リガンドを含む、請求項1記載の装置。
【請求項６】
固定された金属イオンキレート化リガンドが、イミノ二酢酸、ニトリロ三酢酸、またはトリス（カルボキシメチル）エチレンジアミンを含む、請求項5記載の装置。
【請求項７】
親和性クロマトグラフィー吸収剤が、分子認識に関与する有機化合物、脂肪酸、阻害剤、タンパク質、ペプチド、酵素、補酵素、受容体、親和性タグ、核酸、抗体、ビオチン、アビジン、炭水化物、レクチン、色素、またはタンパク質表面ドメインを含む固定化されたリガンド分子を含む、請求項1記載の装置。
【請求項８】
固定化されたリガンド分子が、組合せ化合物ライブラリーの潜在的な薬物の候補または潜在的な薬物の候補との混合物、ベンザミジン、D-ビオチン、ビオチン化分子、アビジン、タンパク質A、アンチセンスペプチド、アンチセンスArg-バソプレシンペプチド、トリプシン、アデノシン5'-一リン酸（5'-AMP）、インターロイキン-2受容体、ポリアミノ酸、ポリヒスチジン、ヒスチジン、リシン、コウシ胸腺のDNA断片、抗ウサギIgGヒツジ抗体、単糖、単糖誘導体、コンカナバリンA、またはチバクロンブルーF3G-Aを含む、請求項7記載の装置。
【請求項９】
流れ接触部分と流体連通するマイクロカラムをさらに含む、請求項1記載の装置。
【請求項１０】
マイクロカラム内に親和性クロマトグラフィー吸収剤をさらに含む、請求項9記載の装置。
【請求項１１】
マイクロカラム内の親和性クロマトグラフィー吸収剤が被覆層を含む、請求項10記載の装置。
【請求項１２】
マイクロカラム内の親和性クロマトグラフィー吸収剤が、多孔性ポリマーモノリスを含む、請求項10記載の装置。
【請求項１３】
マイクロカラム内の親和性クロマトグラフィー吸収剤が、固定化された金属イオンキレート化リガンドを含む、請求項10記載の装置。
【請求項１４】
固定された金属イオンキレート化リガンドが、イミノ二酢酸、ニトリロ三酢酸、またはトリス（カルボキシメチル）エチレンジアミンを含む、請求項13記載の装置。
【請求項１５】
親和性クロマトグラフィー吸収剤が、分子認識に関与する有機化合物、脂肪酸、阻害剤、タンパク質、ペプチド、酵素、補酵素、受容体、親和性タグ、核酸、抗体、ビオチン、アビジン、炭水化物、レクチン、色素、またはタンパク質表面ドメインを含む固定化されたリガンド分子を含む、請求項10記載の装置。
【請求項１６】
固定化されたリガンド分子が、組合せ化合物ライブラリーの潜在的な薬物の候補または潜在的な薬物の候補との混合物、ベンザミジン、D-ビオチン、ビオチン化分子、アビジン、タンパク質A、アンチセンスペプチド、アンチセンスArg-バソプレシンペプチド、トリプシン、アデノシン5'-一リン酸（5'-AMP）、インターロイキン-2受容体、ポリアミノ酸、ポリヒスチジン、ヒスチジン、リシン、コウシ胸腺のDNA断片、抗ウサギIgGヒツジ抗体、単糖、単糖誘導体、コンカナバリンA、またはチバクロンブルーF3G-Aを含む、請求項15記載の装置。
【請求項１７】
分析方法であって、
請求項1の電気噴霧装置を設ける段階と、
装置の流れ接触面上に親和性リガンドを選択的に固定化する段階とを含む方法。
【請求項１８】
親和性クロマトグラフィー吸収剤が、固定化された金属イオンキレート化リガンドを含む、請求項17記載の方法。
【請求項１９】
固定された金属イオンキレート化リガンドが、イミノ二酢酸、ニトリロ三酢酸、またはトリス（カルボキシメチル）エチレンジアミンを含む、請求項18記載の方法。
【請求項２０】
親和性クロマトグラフィー吸収剤が、分子認識に関与する有機化合物、脂肪酸、阻害剤、タンパク質、ペプチド、酵素、補酵素、受容体、親和性タグ、核酸、抗体、ビオチン、アビジン、炭水化物、レクチン、色素、またはタンパク質表面ドメインを含む固定化されたリガンド分子を含む、請求項17記載の方法。
【請求項２１】
固定化されたリガンド分子が、組合せ化合物ライブラリーの潜在的な薬物の候補または潜在的な薬物の候補との混合物、ベンザミジン、D-ビオチン、ビオチン化分子、アビジン、タンパク質A、アンチセンスペプチド、アンチセンスArg-バソプレシンペプチド、トリプシン、アデノシン5'-一リン酸（5'-AMP）、インターロイキン-2受容体、ポリアミノ酸、ポリヒスチジン、ヒスチジン、リシン、コウシ胸腺のDNA断片、抗ウサギIgGヒツジ抗体、単糖、単糖誘導体、コンカナバリンA、またはチバクロンブルーF3G-Aを含む、請求項20記載の方法。
【請求項２２】
装置が、流れ接触部分と流体連通し、内部に親和性クロマトグラフィー吸収剤を有するマイクロカラムをさらに含み、マイクロカラム内の流れ接触面上に親和性リガンドを選択的に固定化する段階をさらに含む、請求項17記載の方法。
【請求項２３】
マイクロカラム内の親和性クロマトグラフィー吸収剤が、固定化された金属イオンキレート化リガンドを含む、請求項22記載の方法。
【請求項２４】
固定された金属イオンキレート化リガンドが、イミノ二酢酸、ニトリロ三酢酸、またはトリス（カルボキシメチル）エチレンジアミンを含む、請求項23記載の方法。
【請求項２５】
親和性クロマトグラフィー吸収剤が、分子認識に関与する有機化合物、脂肪酸、阻害剤、タンパク質、ペプチド、酵素、補酵素、受容体、親和性タグ、核酸、抗体、ビオチン、アビジン、炭水化物、レクチン、色素、またはタンパク質表面ドメインを含む固定化されたリガンド分子を含む、請求項22記載の方法。
【請求項２６】
固定化されたリガンド分子が、組合せ化合物ライブラリーの潜在的な薬物の候補または潜在的な薬物の候補との混合物、ベンザミジン、D-ビオチン、ビオチン化分子、アビジン、タンパク質A、アンチセンスペプチド、アンチセンスArg-バソプレシンペプチド、トリプシン、アデノシン5'-一リン酸（5'-AMP）、インターロイキン-2受容体、ポリアミノ酸、ポリヒスチジン、ヒスチジン、リシン、コウシ胸腺のDNA断片、抗ウサギIgGヒツジ抗体、単糖、単糖誘導体、コンカナバリンA、またはチバクロンブルーF3G-Aを含む、請求項25記載の方法。
【請求項２７】
導管を通して複数のノズルのアレイのそれぞれのノズルと流体連通する複数の入口槽のアレイと、入口槽と流体連通する毛管とを有し、槽／導管と毛管の少なくとも一方が、少なくとも1つの固定化された親和性クロマトグラフィー吸収剤を含むモノリシックシリコンマイクロチップを含む電気噴霧装置。
【請求項２８】
親和性クロマトグラフィー吸収剤が、槽／導管と毛管の少なくとも一方の内壁上の被覆層として固定化される、請求項27記載の装置。
【請求項２９】
親和性クロマトグラフィー吸収剤が、少なくとも一つの槽／導管と毛管の内腔内の多孔性ポリマーモノリスとして固定される、請求項27記載の装置。
【請求項３０】
親和性クロマトグラフィー吸収剤が、少なくとも一つの槽／導管と毛管の内壁に共有結合または非共有付着することによって固定化される、請求項27記載の装置。
【請求項３１】
アレイが、多孔性ポリマーモノリスまたは被覆層の形の1つまたは複数の親和性クロマトグラフィー吸収剤を含む8列x12行の96個の槽／導管または16列x24行の384個の槽／導管を含む、請求項27記載の装置。
【請求項３２】
アレイが、各行または列がそれぞれの異なる親和性吸着剤を有し、一方、同じ行または列内の各槽／導管が同じ吸収剤を有するようなパターンの複数の親和性クロマトグラフィー吸収剤を含む、請求項31記載の装置。
【請求項３３】
各親和性吸着剤が、それぞれの異なる親和性リガンドを有する1つの支持マトリックスから作製される、請求項32記載の装置。
【請求項３４】
槽／導管内の親和性クロマトグラフィー吸収剤が、毛管内の親和性クロマトグラフィー吸収剤とは異なる、請求項27記載の装置。
【請求項３５】
親和性クロマトグラフィー吸収剤が、固定化された金属イオンキレート化リガンドを含む、請求項27記載の装置。
【請求項３６】
固定された金属イオンキレート化リガンドが、イミノ二酢酸、ニトリロ三酢酸、またはトリス（カルボキシメチル）エチレンジアミンを含む、請求項35記載の装置。
【請求項３７】
親和性クロマトグラフィー吸収剤が、分子認識に関与する有機化合物、脂肪酸、阻害剤、タンパク質、ペプチド、酵素、補酵素、受容体、親和性タグ、核酸、抗体、ビオチン、アビジン、炭水化物、レクチン、色素、またはタンパク質表面ドメインを含む固定化されたリガンド分子を含む、請求項27記載の方法。
【請求項３８】
固定化されたリガンド分子が、組合せ化合物ライブラリーの潜在的な薬物の候補または潜在的な薬物の候補との混合物、ベンザミジン、D-ビオチン、ビオチン化分子、アビジン、タンパク質A、アンチセンスペプチド、アンチセンスArg-バソプレシンペプチド、トリプシン、アデノシン5'-一リン酸（5'-AMP）、インターロイキン-2受容体、ポリアミノ酸、ポリヒスチジン、ヒスチジン、リシン、コウシ胸腺のDNA断片、抗ウサギIgGヒツジ抗体、単糖、単糖誘導体、コンカナバリンA、またはチバクロンブルーF3G-Aを含む、請求項37記載の方法。
【請求項３９】
分析方法であって、
請求項27の電気噴霧装置を設ける段階と、
親和捕獲によって親和性クロマトグラフィー吸収剤上に分析物を選択的に結合する段階と、
任意選択的に、固定化された分析物を化学的、酵素的、または物理的に処理する段階と、
該分析物を選択的に脱着する段階と、
該脱着された分析物を電気噴霧する段階と、
該電気噴霧された分析物を検出器に渡す段階とを含む方法。
【請求項４０】
親和性クロマトグラフィー吸収剤が、固定化された金属イオンキレート化リガンドを含む、請求項39記載の方法。
【請求項４１】
固定された金属イオンキレート化リガンドが、イミノ二酢酸、ニトリロ三酢酸、またはトリス（カルボキシメチル）エチレンジアミンを含む、請求項40記載の方法。
【請求項４２】
親和性クロマトグラフィー吸収剤が、分子認識に関与する有機化合物、脂肪酸、阻害剤、タンパク質、ペプチド、酵素、補酵素、受容体、親和性タグ、核酸、抗体、ビオチン、アビジン、炭水化物、レクチン、色素、またはタンパク質表面ドメインを含む固定化されたリガンド分子を含む、請求項39記載の方法。
【請求項４３】
固定化されたリガンド分子が、組合せ化合物ライブラリーの潜在的な薬物の候補または潜在的な薬物の候補との混合物、ベンザミジン、D-ビオチン、ビオチン化分子、アビジン、タンパク質A、アンチセンスペプチド、アンチセンスArg-バソプレシンペプチド、トリプシン、アデノシン5'-一リン酸（5'-AMP）、インターロイキン-2受容体、ポリアミノ酸、ポリヒスチジン、ヒスチジン、リシン、コウシ胸腺のDNA断片、抗ウサギIgGヒツジ抗体、単糖、単糖誘導体、コンカナバリンA、またはチバクロンブルーF3G-Aを含む、請求項42記載の方法。
【請求項４４】
装置がマイクロカラムを含み、マイクロカラム内に親和性クロマトグラフィー吸収剤を有し、親和捕獲によって該マイクロカラム内の親和性クロマトグラフィー吸収剤上に分析物を選択的に結合する段階をさらに含む、請求項39記載の方法。
【請求項４５】
分析物の親和性結合、化学修飾、酵素的修飾、および物理的修飾のうちの少なくとも1つを含む、1つまたは複数の分析物の複数回の分析を行う段階をさらに含む、請求項39記載の方法。
【請求項４６】
前記親和性結合、化学修飾、酵素的修飾、または物理的修飾、および分析物の溶出が、二次元モードで行われる、請求項39記載の方法。
【請求項４７】
検出器が質量分析計である、請求項39記載の方法。
【請求項４８】
親和性クロマトグラフィー吸収剤を含むクロマトグラフィーカラム。
【請求項４９】
親和性クロマトグラフィー吸収剤が被覆層を含む、請求項49記載のカラム。
【請求項５０】
親和性クロマトグラフィー吸収剤が多孔性ポリマーモノリスを含む、請求項49記載のカラム。
【請求項５１】
親和性クロマトグラフィー吸収剤が、固定化された金属イオンキレート化リガンドを含む、請求項49記載のカラム。
【請求項５２】
固定された金属イオンキレート化リガンドが、イミノ二酢酸、ニトリロ三酢酸、またはトリス（カルボキシメチル）エチレンジアミンを含む、請求項52記載のカラム。
【請求項５３】
親和性クロマトグラフィー吸収剤が、分子認識に関与する有機化合物、脂肪酸、阻害剤、タンパク質、ペプチド、酵素、補酵素、受容体、親和性タグ、核酸、抗体、ビオチン、アビジン、炭水化物、レクチン、色素、またはタンパク質表面ドメインを含む固定化されたリガンド分子を含む、請求項49記載のカラム。
【請求項５４】
固定化されたリガンド分子が、組合せ化合物ライブラリーの潜在的な薬物の候補または潜在的な薬物の候補との混合物、ベンザミジン、D-ビオチン、ビオチン化分子、アビジン、タンパク質A、アンチセンスペプチド、アンチセンスArg-バソプレシンペプチド、トリプシン、アデノシン5'-一リン酸（5'-AMP）、インターロイキン-2受容体、ポリアミノ酸、ポリヒスチジン、ヒスチジン、リシン、コウシ胸腺のDNA断片、抗ウサギIgGヒツジ抗体、単糖、単糖誘導体、コンカナバリンA、またはチバクロンブルーF3G-Aを含む、請求項54記載のカラム。
【請求項５５】
マイクロカラムを含む、請求項49記載のカラム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、親和性吸着剤を有するマイクロチップを用いた電子噴霧イオン化装置およびカラム、ならびにこの装置およびカラムを使用する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
遺伝子活性を評価し、疾患プロセスの生物学的プロセスを含む生物学的プロセスおよび薬物の効果について説明する試みは従来、過去20年にわたってゲノミクスに焦点が当てられているが、細胞の生物学的機能のより直接的で完全で有望な理解を可能にするという理由で近年ではプロテオミクスの方が関心を集めている。プロテオミクスの研究は、特定のゲノムによってコードされた総タンパク質補体および生物学的摂動の影響の下での総タンパク質補体の変化を包括的に特性解析することを目標としている。プロテオミクスは、タンパク質の翻訳後修飾、タンパク質間の相互作用、細胞内のタンパク質の位置などの非ゲノムコード現象の研究も含む。タンパク質レベルでの遺伝子発現の研究は、最も重要な細胞活動の多くが遺伝子活性の状態ではなく細胞のタンパク質の状態によって直接規制されるため重要である。さらに、たいていの薬物はタンパク質を標的とするように設計されているため、細胞のタンパク質含有量は薬物の発見および薬物の開発作業と関連が深い。したがって、プロテオミクスから得られる情報は、薬物の標的の数を大幅に増やすことが予想される。プロテオミクスの分析に関する現在の技術は、様々なタンパク質分離技術を実施し、その後分離されたタンパク質を同定することに基づいている。現在、最も普及しているプロテオミクス研究方法は、高解像度二次元ゲル電気泳動（2Dゲル）を用いて生物学的な複雑さを分子レベルでマッピングし、その後ゲル内タンパク質分解消化技術および高感度質量分析技術によって関心対象のスポットを同定する方法である。複合生物学的材料は通常、数百個の生物分子と、直接的な質量分析を妨げる有機塩および無機塩とを含む。したがって、タンパク質分解消化および質量分析の前にかなりの試料調製段階および精製段階が必要である。2-Dゲルは現在のプロテオミクス研究で最も有力な方法の1つであるが、この方法では、労力および時間がかかり、付帯の分析物が失われ、低存在量のタンパク質またはペプチドを検出する染色感度が制限される。2-Dゲル法は再現性が不十分である。さらに、電気泳動技術は、存在量の高いタンパク質に偏り、複合タンパク質ごとに可溶性が異なることが難点である。
【０００３】
明らかに、不均質試料においてより多いタンパク質とより少ないタンパク質の両方を質量分析によって直接にかつ容易に検出する必要がある。薬物の新たな標的が急激に増えると共に、化学物質の大規模なライブラリーの利用能が急激に増加したため、スクリーニングプロセスを容易にすることのできる新しい技術も強く要求されている。
【０００４】
2-Dゲル技術の前述の欠点を解消するために、多数の試料を高速に分析する、マイクロチップを用いたいくつかの分離装置（アレイ）が開発されている。従来の分離カラムまたは装置と比べて、マイクロチップを用いた分離装置（アレイ）は、試料のスループットがより高く、試料および試薬の消費量がより少なく、薬品廃棄物の量がより少ない。このような装置は、従来の分析器具と比べて、分析を高速に行うことができ、精度および信頼性を向上させる。マイクロチップを用いた分離装置の液体流量は、たいていの用途では毎分約1ナノリットルから500ナノリットル（nL）の範囲である。キャピラリー電気泳動（CE）およびキャピラリー電気クロマトグラフィー（CEC）は、マイクロチップを用いた装置に使用される2つの主要な分離モードである。しかし、液体クロマトグラフィー（LC）は、マイクロチップを用いた装置用の主要な分離モードではなく、現在いくつかの限られた用途における注入モードに限られている。
【０００５】
最近、複合生物学的試料に低fmoleレベルから小（sub）fmoleレベルで存在するタンパク質を高速に検出して特性解析する際に生体分子相互作用分析質量分析（BIA-MS）を用いるチップを用いたプロテオミクス手法が導入されている（Nelsonら、2000 Electrophoresis 21:1153〜1163）。最も有力な技術はCiphergen's ProteinChip Array Systemで商業的に実現された表面強化レーザ脱離／イオン化飛行時間型質量分析（SELDI-TOF-MS）技術である（Merchantら、2000 Electrophoresis 21:1164〜1177」）。このシステム（アルミチップ）は、化学的（陽イオン、陰イオン、疎水性、金属など）または生化学的（抗体、DNA、酵素、受容体など）に処理された表面を、関心対象のタンパク質との特異的相互作用に使用し、その後、選択された洗浄剤によってSELDI-TOF-MS検出を行う。このシステムの能力では、試料の調製が簡単であり、オンチップ捕獲（結合）および検出によって小さな試料からタンパク質が発見され、精製され、同定され、したがって、単一のプラットフォーム上で分析およびアッセイを高速に展開することができる。従来の試料精製方法と比べて、タンパク質チップシステムの利点には、以下のことが含まれる。
1．少量の未精製の生物学的供給源がオンラインで「1段階で」分離され、高スループットの分析が行われる。
2．インサイチュー精製により、非特異的結合を除去することによって試料の損失を減らし、分析物信号抑制を軽減する。
3．標的分子が事前に濃縮されることによって、特により少ない標的化合物の場合に検出感度が高くなる。
しかし、SELDI-TOF-MSベースのタンパク質チップシステムは、タンパク質やペプチドなどの生体高分子および小さな化合物に関する一次配列および構造情報を提供することができない。このシステムは、分析物の定量分析に関して制限を有する。さらに、アレイスポット上の、レーザ光線が入射し、検出できるイオンを生成する任意の小さな点で、低密度の分析物が得られるに過ぎないので、分析物の検出レベルが限られており、かつタンパク質の範囲が限られている。検出レベルは、分子質量が15Kdaから20Kdaを超えるタンパク質の場合著しく低下する。
【０００６】
電気噴霧イオン化（ESI）は、液体試料の大気圧イオン化を可能にする。電気噴霧プロセスは、蒸発により、溶液に含まれる種を表すイオンを生成する、高電荷の液滴を生成する。質量分析計のイオンサンプリングオリフィスを用いてこれらの気相イオンを質量分析用にサンプリングすることができる。API質量分析計のイオンサンプリングオリフィスの前方の電気噴霧は、毛管から流れる液体中に存在する分析物分子によって質量分析計検出器から定量応答を生成する。電気噴霧の1つの利点は、質量分析計検出器によって測定される分析物の応答が、流体中の分析物の濃度に依存し、流体の流量には依存しないことである。溶液中の所与の濃度の分析物の応答は、質量分析計と組み合わされた電気噴霧を用いて、100μL/分の場合と流量が100nL/分の場合とで比較することができる。D.C.Galeら、Rapid Commun. Mass Spectrom 7:1017 (1993)は、分析物のイオン化効率が高くなるため、より低い流量でより高い電気噴霧感度が実現されることを示している。したがって、毎分ナノリットルの範囲の流量の流体による電気噴霧と質量分析計を組み合わせることによって、流体内に含まれる分析物に対する感度は最高になる。
【０００７】
多くの分野、特に製薬業界でより効率的で高速の分離技術に対する要求が増大しているため、カラムの圧密化と小型化の研究が始められている。近年、多孔性ポリマー連続ベッドまたはモノリスを導入または発明することによって、カラムのこのような圧密化が実現されている。Hjerten、J. Chromatography 473 (1989)、273〜275は、アクリルアミド誘導体の水溶液のインサイチュー重合によって作成されたポリマーゲル連続ベッドを開示している。SvecおよびFrechetは、巨孔(macroporous)ポリマープラグの形の分離媒体を含む連続液体クロマトグラフィーカラムを1994年および1995年に開示した（米国特許第5,334,310号および第5,453,185号）。カラムの小型化も、融合シリカ毛管内でのインサイチューラジカル重合により多孔性ポリマーモノリスを作製することによって実現されている。従来の球形ビーズではなくポリマーを用いた多孔性モノリスを有するフリットレスカラムの開発はますます重要になっている。これは、Petersら、Analytical Chemistry 70 (1998)、2288〜2295およびGusevら、J. Chromatography A、855 (1999)、273〜290に記載されているように、このようなカラムが現在のマイクロスケール液体クロマトグラフィーおよびキャピラリー電気泳動についての要件を満たすからである。プロテオミクス研究用の小型化され圧密化されたマイクロカラム／充填物と一体化されたマイクロチップ装置を提供することが望ましいと思われる。
【０００８】
先行技術の上記の欠点を解消するために、本発明は、従来の開示されたタンパク質チップよりも高い選択性および感度、ならびにより正確な定性分析を実現すると共に、分析物の定量分析を行う、親和性クロマトグラフィー吸収剤を有する小型化され圧密化されたマイクロカラムおよびマイクロカラムのアレイを含むマイクロチップを用いたESI装置を提供する。このESI装置は、分析物に関する追加の構造および一次配列情報を提供することもできる。他のプラットフォームでは、マイクロチップ装置は、多孔性ポリマーモノリスまたは被覆支持体の形の吸収剤を含む組み込まれるかまたは取り付けられたマイクロカラムを有する。各プラットフォームとそれらの組合せは共に、複合タンパク質試料の検出および組合せ化学物質のスクリーニングに用いられる。さらに、各プラットフォームは、タンパク質とタンパク質の相互作用、タンパク質とリガンドの相互作用を同定する際に非共有結合に使用することができる。
【発明の開示】
【０００９】
発明の概要
本発明の局面は、質量分析計に結合されて、生体分子の親和捕獲と電子噴霧イオン化の両方に使用されるマイクロチップを用いたオンライン装置を開発することである。
【００１０】
本発明の他の局面は、このような装置を生体分子の親和捕獲に用いてプロテオミクス、薬物発見、臨床診断、法医学などの現代のライフサイエンスの要件を満たす方法を提供することである。
【００１１】
本発明の他の局面は、親和性クロマトグラフィー吸収剤を含む流れ接触部を有する電気噴霧装置に関する。
【００１２】
本発明の他の局面は、電気噴霧装置を設ける段階と、装置の流れ接触面上の親和性リガンドを選択的に固定化する段階とを含む分析方法に関する。
【００１３】
本発明の他の局面は、電気噴霧装置を設ける段階と、親和捕獲によって親和性クロマトグラフィー吸収剤上に分析物を選択的に結合する段階と、任意選択的に、固定化された分析物の化学的、酵素的、または物理的処理を行う段階と、分析物を選択的に脱離する段階と、脱離された分析物を電気噴霧する段階と、電気噴霧された分析物を検出器に渡す段階とを含む分析方法に関する。
【００１４】
本発明の他の局面は、親和性クロマトグラフィー吸収剤を含むクロマトグラフィーカラムに関する。
【００１５】
本発明によれば、これらの目的は、親和性クロマトグラフィー吸収剤を有するマイクロチップを用いた電気噴霧イオン化装置によって実現されている。この装置は、槽／ノズルアレイを有するモノリシックシリコンマイクロチップと、1つのチップ槽と連通する毛管／カラムとの組合せである。親和性吸着剤は、チップ層／導管または毛管、またはその両方に固定化されている。親和性吸着剤は、流れ接触面上に親和性機能を有する多孔性ポリマーモノリスまたは表面コーティングの形である。本発明のアフィニティクロマトグラフィーは、固定化金属アフィニティクロマトグラフィー（IMAC）を含んでいる。この装置およびその使用法は、質量分析のための、各生体分子の同時親和捕獲とそれに続く電気噴霧イオン化とを実現することができる。
【００１６】
発明の詳細な説明
電気噴霧イオン化は、液体試料を大気圧イオン化するのを可能にする。電気噴霧プロセスは、蒸発により、溶液中に含まれる種を表すイオンを生成する、高電荷の液滴を生成する。質量分析計のイオンサンプリングオリフィスを用いて、これらの気相イオンを質量分析できるようにサンプリングすることができる。質量分析計のイオンサンプリングオリフィスに設けられるような抽出電極に対する正電圧が、毛管の先端にかけられると、流体中の正に荷電されたイオンは、電界によって毛管の先端にある流体の表面に移動する。質量分析計のイオンサンプリングオリフィスに設けられるような抽出電極に対する負の電圧が、毛管の先端にかけられると、流体中の負に荷電されたイオンは、電界によって毛管の先端にある流体の表面に移動する。
【００１７】
溶媒和イオンの反発力が、電気噴霧中の流体の表面張力を超えると、ある体積の流体が、毛管の先端から延びる、テイラーコーンと呼ばれる円錐体の形に引っ張られる。液体ジェットが、テイラーコーンの先端から延び、不安定になり、荷電された液滴を生成する。これらの小さな荷電された液滴は抽出電極の方へ引っ張られる。小さな液滴は高度に荷電され、液滴から溶媒が蒸発することによって、液滴中の余分な電荷が、電気噴霧された流体中の分析物分子に載る。荷電された分子またはイオンは、質量分析できるように質量分析計のイオンサンプリングオリフィスを通して引っ張られる。この現象は、たとえば、Doleら、Chem. Phys. 49:2240 (1968)やヤマシタ、J. Phys. Chem. 88:4451 (1894)に記載されている。電気噴霧を開始するのに必要な電位電圧（「V」）は、たとえばSmith、IEEE Trans. Ind. Appl. 1986、IA-22:527〜535(1986)に記載されているように、溶液の表面張力に依存する。通常、電界は約106V/m程度である。毛管の物理寸法および流体の表面張力は、電気噴霧を開始するのに必要な電界線の密度を決定する。
【００１８】
溶媒和イオンの反発力が、毛管の先端から出る流体の表面張力を圧倒するのに十分な力ではない場合、荷電が不十分な大きな液滴が形成される。流体液滴が生成されるのは、毛管から出る導電性流体または部分的に導電性の流体と電極との間に加えられる電位差が、テイラーコーンを形成する流体表面張力を上回るのに十分な差ではない場合である。
【００１９】
R.B. Cole、ISBN 0-471-14564-5、John Wiley & Sons, Inc.、New Yorkによって編集された「Electrospray Ionization Mass Spectrometry: Fundamentals, Instrumementation, and Applications」には、電気噴霧の基本的な研究の多くが要約されている。電気噴霧を支配する原理について説明するためにいくつかの数学モデルが形成されている。数式1は、接地電位に保持された対向電極から距離dの位置で印加電圧Vcを与えた場合の、半径rcの毛管の先端での電界Ecを定義する数式である。
2004532392.tif 000003
【００２０】
この毛管の先端を流れる流体のテイラーコーンおよび液体ジェットを形成するのに必要な電界Eonは次式のように近似される。
2004532392.tif 000004
上式で、γは流体の表面張力であり、θはテイラーコーンの半角であり、ε0は真空の誘電率である。数式3は、数式1と数式2を組み合わせることによって得られ、毛管から流体の電気噴霧を開始するのに必要な立上げ電圧Vonを近似する。
2004532392.tif 000005
【００２１】
数式3を調べると分かるように、必要な立上げ電圧は、対向電極からの距離よりも毛管の半径に強く依存する。
【００２２】
本発明は、CE、CEC、およびLCで一般に使用されている実質的にすべての流体の安定な電気噴霧を形成する電気噴霧装置を提供する。これらの分離用の移動相として一般に使用されている溶媒の表面張力は、100%水（γ=0.073N/m）から100%メタノール（γ=0.0226N/m）の範囲である。電気噴霧流体の表面張力が大きければ大きいほど、毛管直径が一定の場合に電気噴霧を開始するのに必要な立上げ電圧が高くなる。たとえば、先端直径が14μmの毛管は、100%水溶液を1000Vの立上げ電圧で電気噴霧する必要がある。M.S. Wilmら、Int.J. Mass Spectrom. Ion Processes 136:167〜80 (1994) の研究ではまず、流量25nL/分で外径が5μmになるように引かれた融合シリカ毛管からのナノ電気噴霧が示されている。具体的には、電気噴霧を備えた質量分析計のイオンサンプリングオリフィスから1mm〜2mmの距離において、内径が2μmで外径が5μmになるように引かれた融合シリカ毛管から、600V〜700Vで25nL/分のナノ電気噴霧を実現した。
【００２３】
API質量分析計のイオンサンプリングオリフィスの前方の電気噴霧は、毛管から流れる液体中に存在する分析物分子によって質量分析計検出器から定量応答を発生させる。電気噴霧の1つの利点は、質量分析計検出器によって測定される分析物に対する応答が流体中の分析物の濃度に依存し流体の流量には依存しないことである。所与の濃度の溶液中の分析物の応答は、質量分析計と組み合わされた電気噴霧を用いて、流量が100μL/分の場合と流量が100nL/分の場合とで比較することができる。D.C.Galeら、Rapid Commun. Mass Spectrom 7:1017 (1993)は、分析物のイオン化効率が高くなるため、より低い流量でより高い電気噴霧感度が実現されることを示している。したがって、毎分ナノリットルの範囲の流量の流体による電気噴霧と質量分析計を組み合わせることによって、流体内に含まれる分析物に対する感度は最高になる。
【００２４】
本発明は、マイクロチップを用いた分離装置をAPI-MS計器と一体化する電気噴霧装置を提供する。この一体化によって、マイクロチップ上にノズルを形成する毛管先端が制限される。このノズルは、すべての態様において、分離装置および／または電気噴霧装置を形成する基板に対して平面形状またはほぼ平面形状で存在する。この共平面形状またはほぼ平面形状が存在すると、ノズルの周りの磁界が形成されずかつ制御されない場合には、ノズルの先端から放出される電界線は強化されず、したがって、流体に比較的高い電圧を印加しないかぎり電気噴霧を実現することができない。
【００２５】
ノズルの先端での電界の制御は、微細流体マイクロチップを用いたシステムの電気噴霧を首尾よく生成するための重要な要素である。本発明は、モノリシックシリコン基板から微細製造されたノズル内およびノズルの周りにおいて電界を十分に制御すると共に形成し、密に位置させられたノズルから複数の電気噴霧を形成することができる。本発明のノズルシステムは、シリコン基板から三次元微細形状を微細加工するように設計された微小電気機械システム（「MEMS」）を用いて製造される。MEMS技術、特にディープ反応イオンエッチング（「DRIE」）は、流体を首尾よくナノ電気噴霧するノズルの形のマイクロメートル寸法の表面を形成するのに必要な垂直微細形状のエッチングを可能にする。好ましくは、シリコン装置を通って流れる流体に電位電圧を印加することによって、ノズルを囲む電界を独立に印加するために、二酸化ケイ素および窒化ケイ素の絶縁層も用いられ、かつシリコン基板に電位電圧が印加される。このようにノズル先端から出る流体とシリコン基板に電界を独立に印加すると、ノズルの先端に108V/m程度の高い電界が発生する。ノズル先端のこの高電界によって、流体の電気噴霧に特有のテイラーコーン、流体ジェット、および高電荷の流体液滴が形成される。この2つの電圧、すなわち、流体電圧および基板電圧は、このマイクロチップを用いた電気噴霧装置から安定な電気噴霧が形成されるように制御する。
【００２６】
シリコンおよびシリコンを用いた材料の電気的特性はよく知られている。シリコン基板の表面上で成長させられるかまたは該表面に沈着した二酸化ケイ素および窒化ケイ素を使用すると電気絶縁特性が得られることもよく知られている。二酸化ケイ素層および窒化ケイ素層を、形成されたノズルを有するモノリシックシリコン電気噴霧装置に組み込むと、モノリシックシリコン基板からエッチングされた微細形状内および該微細形状の周りの電界が強化される。これは、ノズルから出る流体とノズルの周りの領域とに独立に電圧を印加することによって行われる。二酸化ケイ素層は、炉内で熱によって所望の厚さに成長させることができる。窒化ケイ素は、低圧化学蒸着（「LPCVD」）を用いて沈着させることができる。これらの表面上に金属をさらに蒸着し、装置の表面上に電位電圧を印加するのを可能にすることができる。二酸化ケイ素と窒化ケイ素は共に、電気絶縁体として働き、装置の表面に印加される電位電圧とは異なる電位電圧を基板に印加するのを可能にする。二酸化ケイ素層の重要な特徴は、この層が、シリコン基板と、二酸化ケイ素と、装置に接触する任意の流体試料との間に水分障壁を形成することである。窒化ケイ素は、水およびイオンが二酸化ケイ素層を通ってシリコン基板まで拡散して、流体とシリコン基板との間に絶縁破壊を生じさせるのを防止する。シリコンを用いた装置に化学的機能を与えるために二酸化ケイ素、金属、およびその他の材料の追加の層を窒化ケイ素層上にさらに沈着させることができる。
【００２７】
質量分析技術は、翻訳修飾タンパク質を含むタンパク質を複合試料から検出し同定する場合に分析速度、高い感度、高い選択性、高い精度をうまく組み合わせるという点で現在のプロテオミクス研究においてますます中心的な役割を果たしている。マイクロチップを用いた分離プラットフォームが注目されており、微量の利用可能な試料から多数の試料を迅速に分析する分離プラットフォームの開発がなされている。最近、質量分析用の電気噴霧イオン化ベースのモノリシックマイクロチップ装置が開発されている（Schultzら、2000Anal Chem 72:4058〜4063）。この電気噴霧装置は、ディープ反応イオンエッチングおよびその他の標準半導体技術を用いてシリコンウェハの平面状表面から内径10μmのノズルをエッチングすることによって、モノリシックシリコン基板から製造されていた。ウェハを貫通してノズルの先端から、ウェハの反対側の平面状表面にエッチングされた槽まで導管が延びていた。各マイクロチップは、2.55mmのピッチを有するノズル／槽の8x12アレイを有している。マイクロチップ装置は、チップ上に試料を直接沈着させ、その後飛行中再構成（on-a-fly reconstitution）プロセスを実行することによって、5 femol程度の少ないトリプシン断片および1 femol程度の少ない全タンパク質を検出する機能を有することが実証された（Corso、Zhangら、「Proceedings of the 48th ASMS Conference on Mass Spectrometry and Allied Topics」、カリフォルニア州ロングビーチ、2000年6月11日〜15日）。ステンレス製取付けブラケットを用いてマイクロチップを保持し、質量分析計イオンサンプリングオリフィスの前方にマイクロチップアレイを正確に位置させるのに用いられる翻訳ステージに取り付けた。
【００２８】
適切な電気噴霧装置およびチップならびにその製造方法は、2000年12月22日に出願され、参照としてその全体が本明細書に組み入れられる、「Multiple Electrospray Device, Systems and Methods」と題する、Schultzらの米国特許出願第09/748,518号に記載されている。ESIベースのマイクロチップアレイを親和性吸着剤と共に使用することの利点には、試料が容易に調製されると共に、微量の分析物がチップ上で捕獲され、その後、直接オンライン検出が行われることを含む。この方法では、単一のプラットフォーム上で分析が高速に行われ、インサイチュー精製によって試料の損失が少なくなり、標的分子を特異的に蓄積することによって存在量の少ない分析物に対する検出感度が高くなる。ESIベースのチップ装置は、標的分析物に関する配列情報および構造情報を得ることができ、定量分析機能を実現できるという点で、SELDI-TOF-MSベースのタンパク質チップに勝る利点を有する。ESIチップ装置は、SELDI-TOF-MSベースの装置と比べて検出感度を高めることもできる。ESIチップ内の各槽／ノズルにあるすべての標的分析物は、液体環境に止まり、容易に溶出され質量分析計に向けられる。さらに、本発明は、ESIチップアレイの槽に嵌入できる親和性吸着剤を有する追加の導電毛管カラムを組み込んでいる。この組合せは、カラム内の1-D親和性分離の融通性を向上させると共に、ESIチップ装置のオンライン脱塩および検出を可能にする。さらに、この組合せによって複合試料の2-Dアフィニティクロマトグラフィー分離を行う機能も実現される。
【００２９】
本発明は、チップアレイと取り付けられた流れ供給管との組合せを含んでいる。チップアレイと流れ供給管のいずれかまたは両方は、組み込み多孔性ポリマーモノリスまたは表面コーティングの形の親和性吸着剤を有している。特に、好ましい態様について以下に説明する。
【００３０】
一態様では、本発明は、槽／ノズルアレイを有するシリコンマイクロチップと、チップ槽上に取り付けられるかまたはチップ槽上に嵌入された毛管との組合せである（図1に示されているような）マイクロチップを用いた装置を提供する。このシリコンチップには、その槽／導管のそれぞれに組込み形成されるかまたはインサイチュー形成された多孔性ポリマーモノリスが充填されており、多孔性ポリマー表面に親和性リガンドが固定化されている。
【００３１】
第2の態様では、本発明は、槽／ノズルアレイを有するシリコンマイクロチップと、チップ槽上に取り付けられるかまたはチップ槽上に嵌入された毛管との組合せである（図2に示されているような）マイクロチップを用いた装置を提供する。このシリコンチップは、その槽／導管表面上に親和性吸着剤が被覆または固定化されている。取り付けられた毛管内に固定化された親和性吸着剤は存在しない。
【００３２】
第3の態様では、本発明は、槽／ノズルアレイを有するシリコンマイクロチップと、チップ槽上に取り付けられるかまたはチップ槽上に嵌入された毛管との組合せである（図3に示されているような）装置を提供する。取り付けられた毛管には、組込み形成されるかまたはインサイチュー形成された多孔性ポリマーモノリスが充填されており、多孔性ポリマー表面に親和性リガンドが固定化されている。チップ槽／導管内に固定化された親和性吸着剤は存在しない。
【００３３】
第4の態様では、本発明は、槽／ノズルアレイを有するシリコンマイクロチップと、チップ槽上に取り付けられるかまたはチップ槽上に嵌入された毛管との組合せである（図4に示されているような）マイクロチップを用いた装置を提供する。取り付けられた毛管は、その内壁上に親和性吸着剤が被覆または固定化されている。チップ槽／導管内に固定化された親和性吸着剤は存在しない。
【００３４】
第5の態様では、本発明は、槽／ノズルアレイを有するシリコンマイクロチップと、チップ槽上に取り付けられるかまたはチップ槽上に嵌入された毛管との組合せである（図5に示されているような）マイクロチップを用いた装置を提供する。シリコンチップには、その槽／導管のそれぞれに組込み形成またはインサイチュー形成された多孔性ポリマーモノリスが充填されている。取り付けられた毛管にも、組込み形成またはインサイチュー形成された多孔性ポリマーモノリスが充填されている。すべての多孔性ポリマー表面に親和性リガンドが固定化されている。
【００３５】
第6の態様では、本発明は、槽／ノズルアレイを有するシリコンマイクロチップと、チップ槽上に取り付けられるかまたはチップ槽上に嵌入された毛管との組合せである（図6に示されているような）マイクロチップを用いた装置を提供する。シリコンチップは、その槽／導管のそれぞれに組込み形成またはインサイチュー形成された多孔性ポリマーモノリスが充填されており、多孔性ポリマー表面に親和性リガンドが固定化されている。取り付けられた毛管にはその内壁に親和性吸着剤が被覆または固定化されている。
【００３６】
第7の態様では、本発明は、槽／ノズルアレイを有するシリコンマイクロチップと、チップ槽上に取り付けられるかまたはチップ槽上に嵌入された毛管との組合せである（図7に示されているような）マイクロチップを用いた装置を提供する。シリコンチップは、その槽／導管表面に親和性吸着剤が被覆または固定化されている。取り付けられた毛管には組込み形成またはインサイチュー形成された多孔性ポリマーモノリスが充填されており、多孔性ポリマー表面には親和性リガンドが固定化されている。
【００３７】
第8の態様では、本発明は、槽／ノズルアレイを有するシリコンマイクロチップと、チップ槽上に取り付けられるかまたはチップ槽上に嵌入された毛管との組合せである（図8に示されているような）マイクロチップを用いた装置を提供する。シリコンチップは、その槽／導管表面に親和性吸着剤が被覆または固定化されている。取り付けられた毛管にも、その内壁に親和性吸着剤が被覆または固定化されている。
【００３８】
第9の態様では、上記の第1、第2、第5、第6、第7、および第8の態様に記載されたシリコンチップの槽／導管に、1つまたは複数の親和性吸着剤が固定化されている。好ましい態様として、図9は、8x12アレイを有するチップの槽側を示しており、（垂直方向の）8つのカラムは8つの異なる親和性吸着剤を有しており、一方、（水平方向の）各カラムは同じ吸収剤を有している。これらの異なる親和性吸着剤は、それぞれの異なる親和性リガンドを有する1つの支持マトリックスから作製することができる。これらの異なる親和性吸着剤は、構造的／機能的に無関係であっても、構造的／機能的な関係を有してもよい。たとえば、それぞれの異なる固定化されたリガンド分子は、同じ組合せライブラリーの化学物質であっても、同じタンパク質ファミリーのそれぞれの異なるタンパク質メンバーであっても、同じタンパク質ファミリーのそれぞれの異なるメンバーの断片であってもよい。
【００３９】
第10の態様では、装置内の取り付けられた毛管は吸収剤を備えていてもいなくもよい。ある構成（図5〜8）において取り付けられた毛管とチップ槽／導管が共に親和性吸着剤を含んでいる場合、取り付けられた毛管内の固定化された親和性リガンド分子は、チップ槽／導管内の親和性リガンド分子と同じであっても異なっていてもよい。毛管内の固定化された親和性リガンドとチップアレイ内の固定化された親和性リガンドが異なる場合、二次元（2-D）アフィニティクロマトグラフィーを行うことができる。
【００４０】
上記の態様では、装置のチップノズルは、ESI/MS検出用の質量分析計などの検出器と相互接続された固有の電気噴霧プローブとして使用される。順次1つのチップノズルが質量分析計のイオンサンプリングオリフィスに位置させられ、毛管／カラムはチップの裏側で1つの槽に嵌入されている。
【００４１】
上記のすべての態様で、多孔性ポリマーモノリスは様々な固定化された親和性リガンド用の支持体として働く。ポリマーを用いた毛管モノリシックカラムをHPLCおよびキャピラリー電気クロマトグラフィーに関して準備する方法を、本発明で使用できるように適応させることができる。このようなポリマーモノリスの例には、米国特許第5,334,310号および第5,334,310（FrechetおよびSvec）に記載され、J. クロマトグラフィ（Chromatography）A、855 (1999)、273〜290（Gusevら）によって紹介されたモノリスが含まれる。これらの文献は参照としてその全体が本明細書に組み入れられる。このようなモノリスを準備するプロセスは、Advion BioSciences, Inc.、かつてのAdvanced BioAnalytical Services, Inc. （ニューヨーク州イサカ）で、この会社の権利取得済みの米国特許および本明細書に記載された公開された他の文献に基づいて修正されており、この会社から適切なモノリスを入手することができる。
【００４２】
好ましい態様として、モノリスは、熱またはUV光に関連するあるポロジェン（porogen）および開始剤の存在下でモノマーのラジカル重合を行うことによって槽／導管または毛管内にインサイチュー形成される。重合に用いられるモノマーは好ましくは、1つまたは2つのモノビニルモノマーとマルチビニルモノマー（架橋剤）である。好ましいモノビニルモノマーにはスチレン、塩化ビニルベンジル、酢酸ビニル、アルキルメタクリレート、グリシジルメタクリレートが含まれる。好ましい架橋剤には、ジビニルベンゼンおよびエチレングリコールジメタクリレートが含まれ、総モノマー混合物中の架橋剤の比は好ましくは約20v/v%から約50v/v%である。ポロジェンは様々な溶媒または溶媒の組合せであってよい。好ましいポロジェンは、比較的極性の低い有機溶媒（アルコール、たとえば、1-プロパノール）とより極性の高い有機溶媒（たとえば、ホルムアミド）の混合物である。各モノマーとポロジェンの比は、好ましくは約40:60v/vである。好ましい開始剤は、総重合液体中の濃度が約0.2w/v%から約0.5w/v%である2'2-アゾビシソブチロニトリルおよび過酸化ベンゾイルである。重合は、約45℃から約80℃で約8時間から約24時間にわたって加熱し、重合混合物を含む内腔が密封された場合に不活性ガスをパージするという好ましい条件の下で行われる。他の条件を変更せずに、波長が約200nmから約400nmのUV光によって室温で重合を行ってもよい。結果として得られる多孔性ポリマーモノリスは、好ましい孔径が約1μmから約3μmであり、多孔度が約45v/v%から約65v/v%である。
【００４３】
本発明では、好ましいモノリスは、架橋剤として約10%から約50%のジビニルベンゼンを有する分子比のポリ（塩化ビニルベンジル-co-ジビニルベンゼン）（PVBC/DVB）である。内部孔径分布および多孔度は、モノリスを準備するプロセスに応じて異なる。PVBC/DVBモノリスは、壁表面の物理的特性および化学的特性に応じて、チップ槽／導管および毛管の内壁に共有結合しても、単に該壁に物理的に取り付けても／付着させてもよい。槽／導管または毛管に形成されたモノリスが、モノリス本体とその保持面との間に隙間が無くて機械的に安定していることが重要である。融合シリカ毛管に共有結合されたPVBC/DVBモノリスは、まずHuangおよびHorvath、Journal of Chromatography A、788 (1997) 155〜164によって導入された方法によって毛管の内壁をシラン化することによって準備することができる。
【００４４】
上記のすべての態様で、槽／導管または毛管の内壁上の表面コーティングは、様々な固定化された親和性リガンド用の支持体として働く。このチップは、絶縁用のある表面コーティングを有するシリコンである。槽／導管の内壁を、固定化された吸収剤に適合させるようにチップに追加のコーティング層を塗布することができる。毛管は、融合シリカ、ステンレススチール、または様々なポリマーで作られている。毛管の内径は約20μmから約380μmであることが好ましい。内側の表面を被覆された毛管をHPLC、キャピラリー電気泳動、およびキャピラリー電気クロマトグラフィーに関して準備する方法を本発明で使用できるように適応させることができる。被覆層の材料には、シリカ、アガロース、および様々な合成ポリマーが含まれる。被覆層の取付けには、槽／導管の壁への共有結合または単なる物理的な取付けが含まれる。好ましい態様として、被覆層は、モノマーと開始剤の混合物を含む薄膜を熱またはUV光を用いてラジカル重合させることによってインサイチュー形成される。融合シリカ毛管に共有結合されたPVBC/DVB層は、Huangら、Journal of Chromatography A、858 (1999) 91〜101によって導入された方法を用いて準備することができる。重合に用いられるモノマーは、好ましくは1つまたは2つのモノビニルモノマーとマルチビニルモノマー（架橋剤）である。好ましいモノビニルモノマーにはスチレン、塩化ビニルベンジル、酢酸ビニル、アルキルメタクリレート、グリシジルメタクリレートが含まれる。好ましい架橋剤には、ジビニルベンゼンおよびエチレングリコールジメタクリレートが含まれ、総モノマー混合物中の架橋剤の比は好ましくは約20v/v%から50v/v%である。混合物にはポロジェンを添加しなくてよい。好ましい開始剤は、総重合液体中の濃度が約0.2w/v%から約0.5w/v%である2'2-アゾビシソブチロニトリルおよび過酸化ベンゾイルである。重合は、約45℃から約80℃で約8時間から約24時間にわたって加熱し、重合混合物を含む内腔が密封された場合に不活性ガスをパージするという好ましい条件の下で行われる。他の条件を変更せずに、波長が約200nmから約400nmのUV光によって室温で重合を行ってもよい。結果として得られるポリマー被覆層は、好ましい厚さが約5μm未満である。場合によっては、毛管の内壁を、支持体としてのインサイチュー形成された合成ビニルポリマー以外の材料に共有結合するか、または物理的に取り付けてもよい。親和性リガンド分子は、毛管の内壁の表面がこの壁への結合に関して化学的に活性である場合に、この壁に直接結合することができ、これによってコーティング手順が簡略化されるが、通常親和捕獲に関する表面能力が低下する。
【００４５】
上記のすべての態様で、多孔性ポリマーモノリスおよびコーティングの形のすべての支持体は、その表面上に様々な固定化された親和性機能を有する。様々な親和性機能をそれぞれの異なる支持面上にグラフト重合または固定化して、固定化金属アフィニティクロマトグラフィー（IMAC）を含むアフィニティ液体クロマトグラフィー用の固定相を確立する方法を、本発明で使用できるように適応させることができる。親和性機能を固定化する方法は様々であり、リガンド自体の化学的性質と、スペーサアームが必要であるかどうかに依存する。好ましい態様として、固定化されたリガンド分子は、分子の認識に関与する有機化合物、阻害剤、ビオチン、タンパク質、ペプチド、酵素、補酵素、受容体、親和性タグ、核酸、抗体、炭水化物、レクチン、色素、およびタンパク質表面ドメインから選択される。好ましい固定化されたリガンドには、有機化合物の例として、組合せ化合物ライブラリーの潜在的な薬物候補または潜在的な薬物候補を含む混合物、阻害剤の例としてベンザミジン、ビオチンの例としてD-ビオチンまたはビオチン化された分子、タンパク質の例としてアビジンまたはタンパク質Aが含まれる。好ましい固定化されたリガンドには、ペプチドの例としてアンチセンスペプチド（たとえば、アンチセンスArg-バソプレシンペプチド）、酵素の例としてトリプシン、補酵素の例としてアデノシン5'-一リン酸（5'-AMP）、受容体の例としてインターロイキン-2受容体、親和性タグの例としてポリアミノ酸（たとえば、ポリヒスチジン）、アミノ酸の例としてヒスチジンまたはリシン、核酸の例としてコウシ胸腺のDNA断片、抗体の例として抗ウサギIgGヒツジ抗体、炭水化物の例として単糖またはその誘導体、レクチンの例としてコンカナバリンA（Con A）、色素の例としてチバクロンブルーF3G-Aも含まれる。他の好ましい態様では、イミノ二酢酸（IDA）、ニトリロ三酢酸（NTA）、トリス（カルボキシメチル）エチレンジアミン（TED）などの金属キレートリガンドが支持体上に固定化される。これらのキレートリガンドは、金属イオン、特にNi(II)、Cu(II)、Zn(II)、Co(II)、Ca(II)、Mg(II)などの二価イオン、およびFe(III)やGa(III)などの三価イオンにしっかりと結合する。キレートリガンドの構造は、金属イオンが、結合後、そのすべての配位圏に占有されるわけでないような構造である。このような余分な配位部位は水または緩衝液分子によってわずかに占有され、次いで、タンパク質、抗体、またはその他の親和性分子上のより強力に錯体化する部位で置き換えることができる。
【００４６】
上記のすべての態様で、本発明は、この装置を使用する方法を提供する。好ましい態様では、毛管／カラムの入口内の液体は質量分析計の高電圧電源に接続され、一方、（すべてのシリコン表面上に絶縁コーティングを有する）チップは、そのシリコン本体上で高電圧電源のグラウンドに接続される。マイクロポンプを用いて非導電毛管を通じて装置の毛管／カラム入口に液体が供給される。ガス圧または様々なシリンジポンプを有する小形バイアルのような他の液体供給システムを用いることもできる。自動操作を用いても用いなくてもよいが、液体供給システムを通して毛管／カラムに試料を添加することができる。
【００４７】
他の態様では、本発明は、この装置を用いて標的分析物分子の親和性結合を行う方法を提供する。分別されていない試料中の標的分析物は、装置内の固定化された吸収剤に特異的に結合するように最適化される。最適化された溶液状態は、所望の分析物の良好な可溶性をもたらすだけでなく、移動相と固定相の親和性相互作用（化学的または生化学的な結合または物理的な付着）を著しく推進する。一般に、固定化された親和性機能を有しても有さなくてもよいが、流れ接触面は、分別されていない試料を添加する前に、最適化された溶液と平衡化される。
【００４８】
本発明の親和性吸着剤は、本明細書で開示するプロセスに従ってアフィニティクロマトグラフィーカラムおよびマイクロカラムに適用することができる。他の態様では、本発明は、取り付けられた毛管／カラムとチップアレイの両方、またはそのいずれかの流れ接触面上のドッキングされた関心対象の分析物を首尾よく脱離させるのを可能にする方法を含む。通常、未精製の試料が添加された後、前述の最適化された溶液を用いて流れ接触面が完全に洗浄される。多重試料添加が必要である場合、存在量の少ない標的については洗浄段階の反復を適用することができる。捕獲された標的は、極めて高いpHもしくは極めて低いpHまたはその両方を有する有機水溶液または緩衝液を用いて脱離され溶出される。または、システイン、メルカペタノール、DTTなどの競合化合物または還元剤を含む添加液を用いて脱離され溶出される。溶出された標的を含む溶液は、装置のノズル導管から出て、ESI/MSまたはESI/MS/MS検出を受ける。小さな化合物およびペプチドは、MS/MS分析によって直接検出し同定することができる。取り付けられた毛管が吸収剤を有さない単なる開放チューブであり（図1および2）、チップアレイが各行または列に複数の親和性吸着剤を有する（図9）場合、この装置は、1つまたは複数の分析物の複数の分析に用いることができ、その場合、添加条件および溶出条件は、それぞれの行または列ごとに異なる。通常、未精製の試料を複数回添加すると、存在量が非常に少ない分析物を検出し同定する助けになりうる。添加段階および洗浄段階中に、ノズル側にワットマン（Whatman）紙を当てることによって余分の廃液を吸い取り、その後の、ノズルを介したESI/MS分析における可能性のある相互汚染を回避することができる。吸収剤の各行または列ごとに、選択性しきい値を大きくするように、それほどストリンジェントでないものからよりストリンジェントなものへと差次的溶出が順序正しく行われる。この差次的溶出の結果として、ESI/MS検出のためのそれほどストリンジェントではない洗浄および溶出の下で、チップ槽／導管内の吸収剤の活性表面上に、共有される同様の物理的特性、化学的特性、生化学的特性を有する化合物または高分子が保持される。固定化された吸収剤に対する強い表面親和性を有する特定の分析物のみが、ストリンジェントな条件によって濃縮され溶出される。この差次的溶出は、複数の活性表面上で様々な精製条件を検討する場合に有用であり、組合せ化学物質をスクリーニングし、同じタンパク質ファミリーまたはペプチドファミリーからそれぞれの異なるタンパク質メンバーまたはペプチドメンバーを同定する場合に特に有用である。
【００４９】
他の態様では、本発明は、捕獲された分析物をオンラインで化学的、酵素的、および物理的に処理する方法を含む。関心対象の分析物が装置の流れ接触面上に結合された後、結合された分析物をさらに特性解析する他の方法として、溶出の前に一連の異なる化学的、生化学的、または物理的修飾が行われる。その後、修飾された分析物の一部をさらに除去する洗浄段階が実行され、次いで、吸収剤に結合された分析物の残りの部分が溶出され、イオン化され、マイクロチップ装置のノズルを通して電気噴霧される。関心対象の分析物に対するこの捕獲後オンライン修飾は、分析物を同定するための追加の確認を可能にするだけでなく、分析物およびその成分の一次構造、二次構造、三次構造、または四次構造を解明する直接的な証拠を与える。たとえば、リン酸化されたタンパク質が、チップアレイの1行／列内の吸収剤上にキレートされたこのタンパク質のリン酸基を通じて結合される場合、タンパク質全体を溶出し、その後ESI/MS分析を行うと、分析物を同定するための情報はほとんど生成されない。しかし、チップの1行／列内に同じ親和性吸着剤を含む異なる槽は、それぞれの目的の多重マイクロカラムとして働くことができる。たとえば、タンパク質が添加されたそのようなある「多重マイクロカラム」は、嵌入された毛管によりエンドプロテアーゼ消化溶液を供給することによってオンラインタンパク分解消化に用いることができる。結果として得られたペプチドマッピングを直接検出すると共に、選択された1つのペプチドの配列をESI/MS/MSによって決定することによって、タンパク質が明確に同定される。または、結合されていないペプチドを洗い流す洗浄段階の後、ホスファターゼを用いても用いなくてもよいが、リン酸基を含む残りのペプチドをさらに処理し、次いで残りのペプチドを脱離し分析すると、リン酸基の部位特異的位置に関する情報が得られる。この方法を用いて、リン酸化修飾だけでなく、脱リン酸化、グリコシル化、システイン残基反応、部位特異的修飾（ヒスチジン残基など）、およびリガンド結合を含む、いくつかの種類の配列特異的翻訳後修飾を確認することもできる。
【００５０】
本発明の他の態様は、二次元アフィニティクロマトグラフィーによって標的分析物の種類を分離する方法を含む。図5〜8に示されているように、2-Dカラムは毛管カラムとチップアレイを組み合わせることによって設けられる。このような2-D親和性分離モードは、構造的に密に関連する分析物を効率的に特性解析する潜在的なオプションを与える。通常、毛管カラムは、連続的な同様の分析物結合にそれほど特異的ではなくまたそれほど適してもいない吸収剤を含み、一方、チップアレイは、保持されている種類の分析物の二次親和性分離により特異的であるかまたはより適している吸収剤を含んでいる。
【００５１】
本発明の他の態様は、マイクロチップを用いた装置、および化学物質と生体分子を2-D分離する方法も含む。この装置は、槽／ノズルアレイを有するシリコンマイクロチップと、チップ槽上に取り付けられた毛管との組合せである。取り付けられた毛管には、組込み形成またはインサイチュー形成された多孔性ポリマーモノリスが充填されている。ポリマー表面にはイオン交換基（SO3-、CO2-、NR3+、DEAEなど）が共有固定化されている。シリコンチップには、その槽／導管のそれぞれに組込み形成またはインサイチュー形成された多孔性ポリマーモノリスが充填されている。多孔性ポリマーモノリス表面には、アルキル基C4〜C18が共有結合されている。したがって、毛管カラムは、分子の荷電状態に基づいて混合物試料を分離するイオン交換カラムとして働き、一方、シリコンチップは試料精製と電気噴霧イオン化の両方に用いられる疎水性吸着カラムとして働く。それぞれの異なる濃度の対イオン（塩）による段階別の溶出の下で分離された標的分子を含む溶出液は、濃度の低い対イオンから濃度の高い対イオンへと槽アレイに供給される。その結果、マイクロチップのそれぞれの異なる槽内の分離された分子は電気噴霧され、ESI/MSによって同定される。
【００５２】
本発明の一局面は、複数のタンパク質またはペプチドを、試料の特定の成分に結合する能力に関してスクリーニングし、検出し、同定する装置および方法を提供する。このようなタンパク質またはペプチドは、存在量が少なく、質量分析計に結合された従来の2-Dゲルで検出し同定するのは困難である。このようなタンパク質またはペプチドは、翻訳後修飾されているまたは翻訳後修飾されていない。このようなタンパク質またはペプチドは、構造的に高次のかつ機能的に超分子のアセンブリの高分子認識を行うことができる。このようなタンパク質およびペプチドは、特定の生理学的状態または病理学的状態に応答して上方または下方に制御される生体マーカーである。
【００５３】
本発明の他の局面は、診断および法医学の分野で、アッセイ中の複数の分析物が疾患条件または「マーカー」分子の存在または生物における病原体の存在を示す場合に使用する装置および方法を提供する。
【００５４】
本発明の他の局面は、薬物のスクリーニングにおいて、潜在的な薬物の候補を、複数のタンパク質に結合するかまたはそれらのタンパク質と他の方法で相互作用する能力について直接スクリーニングする場合に用いることができる。さらに、複数の潜在的な薬物の候補が、1つまたは複数の固定化されたタンパク質（受容体、酵素、および抗体など）に結合するかまたはそれらのタンパク質と相互作用する能力についてスクリーニングされる。
【００５５】
本明細書で本発明を例示するために引用されるものであり、本発明を制限するために引用されるものではない以下の実施例において、本発明をさらに説明する。
【００５６】
実施例1
本実施例は、固定化金属アフィニティクロマトグラフィー（IMAC）に適した表面化学的性質をもたらす、毛管またはチップ槽／導管内の多孔性PVBC/DVBモノリスまたは被覆されたPVBC/DVB層の表面修飾の手順を含んでいる。図10に示されているように、PVBC/DVB支持体の表面をジエチルイミノ酢酸に反応させ、次いで、水酸化ナトリウム水溶液で加水分解する。
【００５７】
アセトニトリルに20%(v/v)ジエチルイミノ二酢酸（DIDA）を溶かした溶液を調製し、ヘリウム発泡によって脱気する。この溶液を毛管に満たし、チップ槽／導管にPVBC/DVB支持体を充填する。次いで、チップ槽／導管および毛管を密封する。密閉された容器内の溶液にチップおよび毛管を浸漬させてもよい。その後、チップを炉に入れ、80℃で24時間加熱する。チップおよび毛管から溶液を除去した後、チップおよび毛管をアセトニトリルおよび水で洗浄する。同様に、次いで、チップおよび毛管に1M NaOHの溶液を満たすかまたはこの溶液にチップおよび毛管を入れ、炉で再び80℃で16時間加熱する。最後に、チップおよび毛管をそれぞれ、水、メタノール、0.1M HCl、および水で洗浄する。
【００５８】
実施例2
本実施例は、アフィニティクロマトグラフィーに適した表面化学的性質をもたらす、毛管またはチップ槽／導管内の多孔性PVBC/DVBモノリスまたは被覆されたPVBC/DVB層の表面修飾の手順を含んでいる。図11に示されているように、PVBC/DVB支持体の表面を水酸化ナトリウム水溶液で加水分解し、ヒドロキシル基が濃縮された疎水性表面を形成し、その後、以下に修正される、架橋されたアガロースを活性化する公開済みの方法（Bethellら、The Journal of Biological Chemistry、254(8) (1979) 2572〜2575）における手順を実行する。
【００５９】
PVBC/DVB支持体を有する毛管およびチップ槽／導管に1M NaOH水溶液を満たす。次いで、チップ槽／導管および毛管を密封する。密閉された槽内の溶液にチップを浸漬させることもできる。したがって、毛管およびチップ槽／導管を炉に入れ、80℃で24時間加熱する。チップおよび毛管から溶液を除去した後、水および水を含まないアセトニトリルでチップおよび毛管を完全に洗浄する。
【００６０】
5%(w/v)1,1'-カルボニルジイミダゾル（CDI）を含む新たに調製されたアセトニトリル溶液により、加水分解したPVBC/DVB表面を室温で30分間処理する。再びアセトニトリルで洗浄した後、表面を、ある濃度の抗体またはpH10の、水に溶かしたアフィナント（affinant）に4℃で反応させる。抗体または他のアフィナントは、CDIで活性化されたPVBC/DVB表面上に共有結合できるように一次アミン官能基を有する。
【００６１】
実施例3
以下に、実施例1で調製された、固定化されたイミノ二酢酸およびその後の金属イオンを含む親和性吸着剤を有する装置を使用する適用例を示す。
【００６２】
1．上述のように多孔性ポリマーモノリスの表面に固定化されたイミノ二酢酸（IDA）基によってMg(II)イオンをキレートする。2mM Mg(II)を用いても用いなくてもよいが、以下の1μM ddNTP試料を用いて、最初はIDAを固定化した手製のマイクロカラムまたはマイクロチップ装置が適切に機能するかどうかを試験し、かつ装置の結合能力を試験した。長さが12cmで内径が180μmのモノリスIDAカラムを三重四極子マイクロマスクアトロII（triple quadruple Micromass Quattro II)（イングランド、チェシア）質量分析プローブに接続し、移動相50%のメタノール−0.1%の酢酸でカラムを平衡化した。1μM ddNTPと2mM Mg(Ac)2の10μLの混合物を自動試料インジェクターを通してカラムに注入した。移動相を流量30μL/分で質量分析計に供給した。ddNTPをカラムを通過させ、質量分析プローブで検出した。質量分析計はZ噴霧源を備えており、負イオンMS/MS選択的反応監視（SRM）モードで操作した。Z噴霧脱溶媒和温度および毛管電圧はそれぞれ、400℃および3000Vであった。衝突エネルギーは35Vであり、各遷移ごとの休止時間は200msであった。各ddNTP基ごとに、ddCTP、m/z370.1→m/z79.0；ddTTP、m/z385.1→m/z79.0；ddATP、m/z394.1→m/z79.0；ddGTP、m/z410.1→m/z79.0の各SRM遷移をモニターした。図12は、ddNTP試料のSRM MS/MS質量スペクトルを示している。ESI/MS分析の前にIDAマイクロカラムによる処理を施さないMg(II)を含むddNTP試料は、（図12IIに示されるように）Mg(II)イオンが存在することによってddNTP遷移イオンが著しく抑制されることを示した一方、IDAが固定化された多孔性ポリマーで処理した同じ試料は、標準ddNTP試料（Mg(II)が存在しない。図12I）およびPIERCEの、固定化されたIDAで処理された試料（図12III）と同じ、ddNTP遷移イオンの信号強度を示した（図12IV）。このことは、反応溶液中のMg(II)がマイクロカラムのモノリス表面にキレートされたことを示している。上記の条件の下での、上記のカラムのMg(II)への結合能力は、多孔性ポリマーモノリス層体積1mL当たり2mモルである。
【００６３】
2. hisに富むペプチド、タンパク質、およびレクチン（ConA）の親和捕獲のために、毛管カラムとマイクロチップ装置の両方でIDAによってCu(II)をキレートする。最初は、上記のモノリスIDAカラムを試験した。内径381μm x 4.7cmのモノリスIDAカラムを、ESI/MS検出のためにマイクロポンプシステムおよびマイクロマス（Micromass）LCT-TOF-MS（イングランド、チェシア）質量分析計に接続した。100μLの40mM Cu(Ac)2を注入することによってカラムに事前にCu(II)を充填した。カラム内の余分のCu(II)を蒸留水で除去し、カラムを100μLの1M NaClで平衡化した。平衡化緩衝液に溶かした1 pmoleの各アンギオテンシンI（1295.7Da）、アンギオテンシンII（1045.5Da）、Leu−エンケファリン（555.3Da）、Met-エンケファリン（573.2Da）、およびオキシトシン（1006.4Da）を含む合成ペプチドの混合物をカラムに充填した。次いで、カラムを、1M NaClで洗浄し、ESIマイクロチップ槽に嵌入するのに用いられる長さが10cmで内径が125μmのPS-DVBモノリスステンレスカラムに接続した。次いで、結合されたペプチドを、pH7.0の100mMイミダゾル／0.5M NaClでIDA-Cu(II)カラムからPS-DVBカラムまで溶出した。次いで、PS-DVBカラムを5%アセトニトリル−0.1%酢酸で洗浄し、その後、0.1%酢酸を含む5%から50%のアセトニトリルからのオンライン勾配溶出をESIチップ装置によって10分かけて行い、LCT質量分析計によって検出した。PS-DVBカラムに1400Vの電気噴霧電圧を印加した。LCT質量分析計を正イオンモードで操作し、1秒イオン積分時間を用いて質量分析データを取得した。図14に示されているように、5ペプチド混合物中にヒスチジン残基を含む2つのペプチド（アンギオテンシンIおよびアンギオテンシンII）をすべて捕獲して質量分析計によって検出し、一方、ヒスチジンを含まない残りの3つのペプチドをIDA-Cu(II)カラムにおいて洗浄したところ、検出できなかった。比較のために、5ペプチド混合物を含む対照試料の質量スペクトルを図13に示した。
【００６４】
ウマの心臓のミオグロビンやレクチンなどのタンパク質には銅キレートも最適である。上記で指摘したのと同じカラムを用いて、4-5表面ヒスチジンを含むミオグロビンを選択的に結合し、したがって、ペルオキシダーゼとシトクロムcとα1酸糖タンパク質とキモトリプシノゲンAの混合物からミオグロビンを親和性分離する。ペプチド混合物について上記で説明したのと同様の条件を用いてミオグロビンを添加し溶出した後、MS分析を行う。または、IDA-Cu(II)モノリスカラム内の結合されたミオグロビンに対して、pH8.0の50mM重炭酸アンモニウムと10mM DTTおよび2Mグアニジン-HClとから成るトリプシン溶液を添加し、30分〜60分間インキュベートすることによって、インサイチュー（カラム上）酵素消化を行うことができる。結果として得られるトリプシン断片を、PS-DVB-C18モノリスとpH7.0の100mMイミダゾル／0.5M NaClを含むステンレススチールカラム（内径125μm x 10cm）に溶出した。次いで、PS-DVB-C18カラムを0.1%酢酸−0.01%ヘプタフルオロブチル酸で洗浄し、0.1%酢酸−0.01%ヘプタフルオロブチル酸を含む0%→40%→70%アセトニトリルによるオンライン勾配溶出をESIチップ装置によって0→10→15分かけて行い、LCT-TOF質量分析計によって検出した。図15に示されている結果は、大部分のミオグロビントリプシン断片が基線分離を有し、ミオグロビンの検出された範囲が80%を超えていることを示している。
【００６５】
ConA分子は、固定相の銅(II)-IDA官能基にしっかりと結合することのできる広く使用されているレクチンである。したがって、ConAが、荷電済みのCu(II)カラムに添加し、アダプタとして働いている状態で、実施例4で詳しく説明するように、非グリコシル化分析物を含む混合物からグリコシル化タンパク質を分離し、ESI/MSによって同定することができる。ConA/Cu(II)-IDAカラムを得るために、pH7.0の10mMリン酸緩衝液に溶かしたConA溶液（1mg/mL）をCu(II)-IDAカラム上に添加し、10mMリン酸緩衝液、pH7.0の100mM NaClで余分なConAを洗浄する。関心対象のグリコル化タンパク質を分離した後、アンモニウムイオンやグリシンのような余分な競合剤を含む溶出剤、またはpHが3.0よりも低い溶出剤を用いて、ConAをカラムから除去することができる。
【００６６】
3．細胞の未精製の溶解物からクローニングされたHISタグタンパク質の親和性分離のために、前述のカラムにNi(II)イオンをキレートする。過剰な50mM EDTA溶液でカラムを洗浄することによって、カラム内の銅イオンを除去する。次いで、カラムを過剰なNiCL2で処理し、その後、pH7.0の20mMリン酸ナトリウムおよび0.2M塩化ナトリウムを含む平衡化緩衝液で処理することによって、カラムに再びニッケルを添加する。カラムへの添加には、試験モデル試料、すなわち、C末端にある6HISタグ付きコリスミ酸ムターゼ／プレフェネートデヒドロゲナーゼを含む大腸菌溶解物を用いる。非特異的結合タンパク質を完全に洗浄した後、溶出緩衝液のpHを低下させることによって関心対象の標的タンパク質を溶出する。したがって、次いで、上記のHISタグ付きタンパク質を精製し、ESI/MSによって同定する。または、結合されたHISタグ付きタンパク質をトリプシンによってインサイチュー消化してもよく、結果として得られたトリプシン断片を溶出しESI/MSによって同定した。
【００６７】
4．リン酸化タンパク質およびペプチドを特性解析するために、モノリスIDAカラムにFe(III)イオンまたはGa(III)イオンをキレートする。上記のモノリス-Cu(II)カラムを使用した。pH8.5の50mM EDTAによって金属Cu(II)を剥離した。カラムを水で完全に洗浄した後、カラムに再び40mM FeCl3を添加した。余分な金属イオンを水で洗い流した後、添加液（0.5%酢酸）でカラムを平衡化させた。ウシのβカゼインのトリプシン消化物（10 pmol）を1%酢酸で酸性化させ、カラムへ添加した。次いで、カラムを20%アセトニトリル−0.1%酢酸で洗浄し、次いで蒸留水で洗浄した。50μLの2%水酸化アンモニウムでホスホペプチドを溶出した。溶出された試料を、蒸発後、0.1%酢酸を含む10μLの50%メタノール中に再懸濁させ、マイクロチップ装置によって直接注入分析を施した。この結果（図16）は、モノリスIDA-Fe(III)カラムで処理した後、β−カゼイントリプシン消化物のすべての非ホスホペプチドが洗浄され、質量が2060.8の1つのホスホペプチドのみが蓄積され、質量分析計によって検出されたことを示した。プロトン付着物に加えて、2倍に荷電されたこのイオンへのNaおよびKによる一連の付加物も、比較的大量に検出された。このことは、ホスホペプチドの特徴と一致する。または、溶出の前に、結合されたホスホペプチドを、カラム内のコウシの腸のホスファターゼ（CIP）で処理する。次いで、脱リン酸ペプチドをESI/MSまたはESI/MS/MSによって直接検出する。CIP処理を行っても行わなくてもよいが、ペプチドの質量をMS/MSデータと比較すると、特異的なリン酸部位を決定することができる。
【００６８】
実施例4
これは、実施例1で調製された、固定化されたレクチン（ConA）リガンドを含む親和性吸着剤を有する装置の適用例である。
【００６９】
取り付けられた毛管または／およびチップ槽／導管内の固定化されたConAリガンドを用いてグリコシル化タンパク質およびペプチドの親和捕獲を行う。表面固定化されたレクチン（ConA）を用いると、ConA-Cu(II)-IDAとグリコシル化されたタンパク質との可能な金属相互作用を無くすことができる。まず装置（毛管カラムもしくはチップ槽／導管またはその両方を含む）を10mMリン酸緩衝液、pH7.0の100mM NaClで平衡化し、1pmoleのβ−ラクトグロビン、リボヌクレアーゼA、リゾチーム、グルコースオキシダーゼの混合物をカラムに添加する。グリコシル化を伴わない3つの上記のタンパク質を、ただちに平衡化緩衝液によって溶出し、質量分析計によって検出し、同時に、グルコースオキシダーゼをConA固定相上に吸収させる。30%メタノール−0.1%酢酸によってさらに溶出を行った後、グルコースオキシダーゼを溶出しESI/MSによって検出する。または、固定されたグリコシル化されたタンパク質に対するオンライントリプシン消化および様々なグリコシダーゼによる消化によって、グリコシル化されたペプチドとグリコシル化された部位を同定するための追加の情報を得ることができる。
【００７０】
実施例5
これは、実施例2で調製された、固定化された抗体を含む親和性吸着剤を有する装置の適用例である。
【００７１】
この装置を用いて、診断および法医学分野の生体マーカーを検出する。抗ヒトウサギラクトフェリンポリクローナル抗体を装置内に固定化することによって、初期試験を行う。タンパク質Aカラムまたはタンパク質Gカラムを通じて市販の抗体をさらに精製することができる。装置内の固定化された抗ヒトウサギラクトフェリンポリクローナル抗体を20mMリン酸、pH7.0の0.15M NaClで平衡化する。精製されたヒトラクトフェリン（1 pmole）を直接装置に注入するか、または装置に注入できるように血漿または尿試料中にする。まず添加液で、次いでpH7.0の5mM酢酸アンモニウムで完全に洗浄した後、0.1%酢酸−30%メタノールを含む溶出緩衝液を加え、ESI/MSによって検出されるヒトラクトフェリンを溶出する。実際には、前述の装置によって任意の生体マーカー分析物を検出する場合、市販の二次抗体、たとえば抗ウサギヒツジigG抗体、タンパク質A、タンパク質Gを、分析物を同定する汎用固定化抗体として装置上に固定化する。この場合、まず、関心対象の分析物に対する一次抗体を、添加液を用いて装置に添加し、次いで、上記でESI/MS同定に関して説明したように試料の添加および溶出を行う。または、複数の異なる一次抗体をマイクロチップのそれぞれの異なる行槽または列槽に添加し、装置を用いて分析物の複数回の分析を行うことができる。
【００７２】
実施例6
実施例2で調製された、固定化された酵素を含む親和性吸着剤を有する装置を用いてオンライン消化、試料精製、さらにESI/MSによる同定を行う。この装置では、取り付けられた毛管カラムに、プロテアーゼのメンバーであるトリプシンが固定化されており、一方、チップアレイには、その槽／導管に疎水性静止相が固定化されている。
【００７３】
毛管カラムをpH8.0の50mM重炭酸アンモニウム、10mM DTT、および4M尿素で平衡化する。精製されたシトクロムc試料（1 pmole）を室温で5分間にわたってカラムに添加する。次いで、消化されたペプチドを、pH7.0の5mM酢酸アンモニウムによってチップ槽の吸収剤に溶出する。この場合、ペプチドが疎水性吸収剤上に結合し、試料が精製される。最後に、50%(v/v)メタノールおよび0.1%酢酸を含む水溶液を用いてシトクロムcのトリプシン断片を溶出し、ESI/MSによって検出する。
【００７４】
実施例7
結合された分析物にインサイチューの酵素処理および化学処理を施すことによって、分析物のオンライン特性解析を行う他の方法が実現される。実施例3のミオグロビンやウシのβ−カゼインなどの金属相互作用、または実施例4のグルコースオキシダーゼなどのグリコシル化相互作用によって分析物が毛管カラム内に結合された場合に、トリプシン溶液（pH8.0の50mM重炭酸アンモニウム、10mM DTT、および4M尿素）をカラムに添加しカラム上で消化を行うことによって、結合されたタンパク質をトリプシンでさらに処理することができる。次いで、結果として得られたトリプシン断片を、効率的な分離を行うように勾配溶出のために第2のPS-DVB-C18カラムに溶出する（図15参照）か、または、実施例6に記載されているように試料を精製し、その後溶出し、トリプシン断片のESI/MS同定を行うように、pH7.0の5mM酢酸アンモニウムを含む疎水性固定相を含むチップ槽に直接溶出する。実施例3および4に示されているように、CIPやグリコシダーゼのような他の酵素を加え、結合されたリン酸化またはグリコシル化されたペプチドを除去しさらに同定することもできる。
【００７５】
実施例8
本発明の装置を用いて、マイクロカラムプラットフォームとマイクロチッププラットフォームとの間での、吸着と結合された分析物に対する酵素修飾と脱着とを組み合わせることによって二次元親和性分離を行う。たとえば、金属相互作用によってカラム内に結合されたタンパク質を、実施例7に記載されたように、トリプシンによって酵素処理し、疎水性固定相を含むチップアレイに溶出して試料を精製し、オンライン分離、試料精製、質量検出を可能にすることができる。または、ヒスチジン表面タンパク質用のCu(II)が充填されたマイクロカラムとグリコシル化タンパク質用のConAが固定化されたマイクロチップ槽を組み合わせることによって、混合物試料からヒスチジン含有グリコタンパク質のみを断片化することができる。タンパク質およびペプチド用のFe(III)が充填されたカラムとConAが添加されたマイクロチップ槽／導管の両方を、リン酸化修飾とグリコシル化修飾の両方と組み合わせることによって、追加の2-D親和性分離を行うこともできる。
【００７６】
本発明を例示のために詳しく説明したが、このような詳細が例示のためのものに過ぎず、当業者には、特許請求の範囲によって定義される本発明の趣旨および範囲から逸脱せずに本発明に様々な変形を加えられることを理解されたい。
【図面の簡単な説明】
【００７７】
【図１】嵌入された毛管を有するチップアレイの槽およびそれが延ばされたノズル導管の断面図である。チップ槽／導管には、組込み形成またはインサイチュー形成された多孔性ポリマーモノリスが充填されており、多孔性ポリマー表面は親和性リガンドで固定化されている。取り付けられた毛管には固定化された親和性吸着剤は存在しない。
【図２】嵌入された毛管を有するチップアレイの槽およびそれが延ばされたノズル導管の断面図である。チップ槽／導管には、親和性吸着剤が被覆または固定化されている。取り付けられた毛管には固定化された親和性吸着剤は存在しない。
【図３】嵌入された毛管を有するチップアレイの槽およびそれが延ばされたノズル導管の断面図である。毛管には、組込み形成またはインサイチュー形成された多孔性ポリマーモノリスが充填されており、多孔性ポリマー表面は親和性リガンドで固定化されている。チップ槽／導管には固定化された親和性吸着剤は存在しない。
【図４】嵌入された毛管を有するチップアレイの槽およびそれが延ばされたノズル導管の断面図である。毛管には親和性吸着剤が被覆または固定化されており、一方、チップ槽／導管には、固定化された親和性吸着剤は存在しない。
【図５】嵌入された毛管を有するチップアレイの槽およびそれが延ばされたノズル導管の断面図である。チップ槽／導管には、組込み形成またはインサイチュー形成された多孔性ポリマーモノリスが充填されている。取り付けられた毛管にも、組込み形成またはインサイチュー形成された多孔性ポリマーモノリスが充填されている。すべての多孔性ポリマー表面に親和性リガンドが固定化されている。
【図６】嵌入された毛管を有するチップアレイの槽およびそれが延ばされたノズル導管の断面図である。チップ槽／導管には、組込み形成またはインサイチュー形成された多孔性ポリマーモノリスが充填されており、多孔性ポリマー表面に親和性リガンドが固定化されている。毛管には親和性吸着剤が被覆または固定化されている。
【図７】嵌入された毛管を有するチップアレイの槽およびそれが延ばされたノズル導管の断面図である。チップ槽／導管には、親和性吸着剤が被覆または固定化されている。毛管には組込み形成またはインサイチュー形成された多孔性ポリマーモノリスが充填されており、多孔性ポリマー表面には親和性リガンドが固定化されている。
【図８】嵌入された毛管を有するチップアレイの槽およびそれが延ばされたノズル導管の断面図である。チップ槽／導管には、親和性吸着剤が被覆または固定化されている。取り付けられた毛管にも、その内壁に親和性吸着剤が被覆または固定化されている。
【図９】8x12アレイを有するチップの槽側を示しており、（垂直方向の）8つのカラムは8つの異なる親和性吸着剤を有しており、一方、（水平方向の）各カラムは同じ吸収剤を有している。
【図１０】固定化金属アフィニティクロマトグラフィー（IMAC）に適した表面の化学的性質をもたらす、実施例1の毛管またはチップ槽／導管内の多孔性ポリ（塩化ビニルベンジル-co-ジビニルベンゼン）（PVBC/DVB）モノリスまたは被覆されたPVBC/DVB層の表面修飾の概略図である。
【図１１】アフィニティクロマトグラフィーに適した表面の化学的性質をもたらす、実施例2の毛管またはチップ槽／導管内の多孔性PVBC/DVBモノリスまたは被覆されたPVBC/DVB層の表面修飾の概略図である。
【図１２】イミノ二酢酸基が固定化された多孔性ポリマーモノリスで事前に処理された実施例3のジデオキシヌクレオチド（ddNTPs）試料の選択された反応監視（SRM）MS/MS質量スペクトルと、該多孔性ポリマーモノリスなしで事前に処理された実施例3のジデオキシヌクレオチド（ddNTPs）試料の選択された反応監視（SRM）MS/MS質量スペクトルを示す図である。
【図１３】0.1%酢酸を含む50%メタノール／50%水に、マイクロチップ電気噴霧装置によって5ペプチド混合物（各成分が1μM）を注入して得られた質量スペクトルを示し、対照として働く図である。上の図は、1分間の取得にわたる総イオン電流（TIC）を示し、下の図は、1分間データを加算した結果として得られる5ペプチド混合物の質量スペクトルを示している。挿入断片は、この研究で使用された5つのペプチドのアミノ酸配列を示している。
【図１４】5ペプチド混合物（各成分が1 pmol）を、イミノ二酢酸（IDA）が固定化されたモノリスPEEKカラム（内径381μm x 4.7 cm）上に載せ、ポリ（スチレン-co-ジビニルベンゼン）（PS-DVB）モノリスを含むステンレススチール（内径125μm x 10 cm）に直接溶出し、その後、0.1%酢酸を含む5〜50%のアセトニトリルからのオンライン勾配溶出をマイクロチップ電気噴霧装置によって10分かけて行った結果として得られる質量スペクトルを示す図である。上の図は、3.5分間の取得にわたる勾配溶出のTICクロマトグラムを示している。下の図は、3.5分間のデータを加算した結果として得られる溶出成分の質量スペクトルを示している。
【図１５】マイクロチップ電気噴霧装置に結合されたPS-DVB-C18モノリスを含むステンレススチールカラム（内径125μm x 10 cm）上での0.6 pmolのミオグロビントリプシン消化物のLC-ESI-MS分析によって得られたTICクロマトグラムおよびから抽出イオンクロマトグラムを示す図である。移動相：A＝0.1% v/v酢酸および0.01% v/vヘプタフルオロブチル酸の水溶液、B＝0.1% v/v酢酸および0.01% v/vヘプタフルオロブチル酸のアセトニトリル溶液。勾配プログラムは、流量300nL/分で、0分→10分→15分で0%→40%→70%とした。
【図１６】アフィニティクロマトグラフィー後のβ−カゼイントリプシン消化物を、モノリシックIDA-Fe(III)固定相を含むPEEKカラム（内径381μm x 4.7 cm）上に注入し、ホスホペプチドを分離することによって得られた質量スペクトルを示す図である。上の図は、マイクロチップ電気噴霧装置による1分間の取得にわたる、0.1%酢酸を有する50%メタノール／50%水中の0.5μMβ−カゼイントリプシン消化物の質量スペクトルを示しており、対照として働く。矢印で示されているピークは、β−カゼインのトリプシン断片である。m/z1030からm/z1048の間の領域の拡大図である挿入断片は、2倍荷電状態の対照試料で検出された単同位体質量2060.8284 Daを有するホスホペプチド（β−カゼイン48〜61から得られたもの、FQpSEEQQQTEDELQDK）のスペクトルを示している。下の図は、10 pmolのβ−カゼイントリプシン消化物を、IDA-Fe(III)モノリシックカラムを通過させ、2%NH4OHによって溶出し、0.1%酢酸を含む10μLの50%メタノール／50%水中に再懸濁させ、マイクロチップ装置によって注入分析した結果として得られた質量スペクトルを示している。挿入断片は、2倍に荷電されたホスホペプチドイオンがプロトン付着物だけでなくNa付加物も有することを示している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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