(57)【要約】本発明は、新規のＢ型肝炎表面抗原変異体、並びに患者の試料の中のこの変異体及び／又はそれに対する抗体を検出する方法に関する。特に、変異体は、Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）タンパク質のアミノ酸配列の１２３位におけるアミノ酸アラニンのアミノ酸トレオニンへの置換を含有している。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、並びに配列番号１、配列番号２、配列番号３及び配列番号４からなる群より選択される配列との少なくとも６５％の同一性を有するヌクレオチド配列からなる群より選択される単離されたヌクレオチド配列。
【請求項２】
配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、並びに配列番号１、配列番号２、配列番号３及び配列番号４からなる群より選択される配列との少なくとも６５％の同一性を有するヌクレオチド配列からなる群より選択されるヌクレオチド配列によりコードされた精製されたポリペプチド。
【請求項３】
配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、並びに配列番号５、配列番号６、配列番号７及び配列番号８からなる群より選択される配列との少なくとも６５％の類似性を有するアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する精製されたポリペプチド。
【請求項４】
請求項１の単離されたヌクレオチド配列を含むベクター。
【請求項５】
請求項４のベクターを含む宿主細胞。
【請求項６】
ａ）配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、並びに配列番号１、配列番号２、配列番号３及び配列番号４からなる群より選択される配列との少なくとも６５％の同一性を有するヌクレオチド配列からなる群より選択されるヌクレオチド配列を単離する工程、
ｂ）２）プロモーターに機能的に連結された１）工程（ａ）のヌクレオチド配列を含むベクターを構築する工程、
ｃ）該タンパク質の発現にとって適切な時間および条件下で、工程（ｂ）のベクターにより宿主細胞を形質転換する工程、
を含む、未結合のＴｒｐ−Ｔｒｐ−Ｉｌｅポケットを有するタンパク質を作製する方法。
【請求項７】
ａ）化合物を、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、並びに配列番号５、配列番号６、配列番号７及び配列番号８からなる群より選択される配列との少なくとも６５％の類似性を有するアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドと、化合物／ポリペプチド複合体の形成にとって十分な時間および条件下で接触させる工程、並びに
ｂ）該複合体の存在を検出し、その検出を、ｇｐ４１タンパク質と結合する化合物の存在の指標とする工程、
を含む、ｇｐ４１タンパク質と結合する化合物を検出する方法。
【請求項８】
ａ）測定可能なシグナルを生成させることができる指示試薬を、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、並びに配列番号５、配列番号６、配列番号７及び配列番号８からなる群より選択される配列との少なくとも６５％の類似性を有するアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドに、指示試薬／ポリペプチド複合体の形成にとって十分な時間および条件下で添加する工程、
ｂ）該指示試薬／ポリペプチド複合体を、化合物と、指示試薬／ポリペプチド／化合物複合体の形成にとって十分な時間および条件下で接触させる工程、並びに
ｃ）該指示試薬によって発生された測定可能なシグナルを検出し、該測定可能なシグナルを、ｇｐ４１タンパク質と結合する化合物の存在の指標とする工程、
を含む、ｇｐ４１タンパク質と結合する化合物を検出する方法。
【請求項９】
請求項３のポリペプチドに対する抗体。
【請求項１０】
ａ）配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、並びに配列番号５、配列番号６、配列番号７及び配列番号８からなる群より選択される配列との少なくとも６５％の類似性を有するアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドの少なくとも１個を、化合物混合物と、ポリペプチド／化合物複合体の形成にとって十分な時間および条件下で接触させる工程、
ｂ）あるサイズの分子量の分子のみの通過を可能にする孔を有する手段に、該混合物を通過させる工程、並びに
ｃ）該孔を通過しなかった保持されたポリペプチド／化合物複合体を検出する工程（ここにおいて、該複合体中に存在する化合物はｇｐ４１タンパク質に結合している）、
を含む、未知の結合特性を有する化合物の混合物からｇｐ４１タンパク質と結合する化合物を検出する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規のＢ型肝炎表面抗原変異体、並びに患者の試料の中のこの変異体及び／又はそれに対する抗体を検出する方法に関する。特に、この変異体は、Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）タンパク質のアミノ酸配列の１２３位におけるアミノ酸アラニンのアミノ酸トレオニンへの置換を含有している。
【背景技術】
【０００２】
Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）は、軽度の無症状感染から慢性活動性肝炎及び劇症肝炎まで、多様な疾患状態を引き起こすことが知られている。ウイルスのゲノムは、少なくとも６個の異なるウイルス遺伝子をコードするおよそ３２００塩基対の環伏の部分的に二本鎖のＤＮＡ配列である（Ｔｉｏｌｌａｉｓら、Ｎａｔｕｒｅ  ３１７：４８９−４９５（１９８５））。より具体的には、ポリメラーゼ遺伝子は、エンベロープ遺伝子と重複しており、Ｘ遺伝子及びコア遺伝子とも部分的に重複している。エンベロープ遺伝子の産物は、開始部位は異なるが終結部位は同じである３個のタンパク質からなる。これらの３個のタンパク質（即ち、スモール（Ｓ）、ミドル（Ｍ）、及びラージ（Ｌ）ＨＢｓＡｇ）は、全て、２２６アミノ酸のＳ−ＨＢｓＡｇ遺伝子配列を含有している（Ｇｅｒｌｉｃｈら、Ｖｉｒａｌ  Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  ａｎｄ  Ｌｉｖｅｒ  Ｄｉｓｅａｓｅ、Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒら編、Ｗｉｌｌｉａｍｓ−Ｗｉｌｋｅｎｓ、Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ、ＭＤ、１２１〜１３４頁（１９９１））。Ｍ−ＨＢｓＡｇは、５５アミノ酸のＰｒｅＳ２配列及び全長２８１アミノ酸のためのＳ配列を含有している。Ｌ−ＨＢｓＡｇタンパク質は、１０８アミノ酸のＰｒｅＳ１配列に加え、全長３８９アミノ酸のためのＰｒｅＳ２配列及びＳ配列を含有している。さらに、３個のエンベロープタンパク質は、各々、異なるグリコシル化の程度を示す。
【０００３】
コア遺伝子は、ヌクレオカプシドタンパク質、Ｂ型肝炎コア抗原（ＨＢｃＡｇ）をコードしている。コア遺伝子の直ぐ上流には、プレコア領域が存在する。プレコア領域の最初の１９アミノ酸は、プレコア遺伝子産物、Ｂ型肝炎ｅ抗原（ＨＢｅＡｇ）の膜への移行及び最終的な分泌のシグナルとしてはたらく。
【０００４】
ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）と同様に、ＨＢＶは、複製サイクルにおける必須の工程として逆転写酵素（ＲＴ）を使用する。しかしながら、ＲＴは、プルーフリーディング能が不充分であり、それにより高い率のヌクレオチド誤取り込みをもたらす。計算によると、このエラーを起こしやすい複製は、コピーされる１０００〜１００，０００ヌクレオチド当たり１点の置換、欠失、又は挿入をもたらすことを示唆している（Ｃａｒｍａｎら、Ｌａｎｃｅｔ  ３４１：３４９−３５３（１９９３））。ＨＢＶ表面抗原の可変性は、最初、古典的なサブタイピング研究を使用して記載された（Ｃｏｕｒｏｕｃｅら、Ｂｉｂｌｉｏｔｈｅｃａ  Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａ  ４２：１（１９７６））。
【０００５】
ＰｒｅＳ１及びＰｒｅＳ２並びに「ａ」抗原決定基を包含しているＨＢＶエンベロープ領域は、ウイルス粒子の表面上に露出しており、従って免疫監視の標的であると予想されている（Ｇｅｒｌｉｃｈら（前記））。以前に記載されたいくつかの表面抗原変異体は、共通抗原決定基及びグループ特異抗原決定基の両方を含有している「ａ」抗原決定基の抗原性に大きく影響した（Ｃａｒｍａｎら、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  １０２：７１１−７１９（１９９２））。「ａ」抗原決定基は、Ｓ−ＨＢｓＡｇのアミノ酸１００〜１６０の間に位置しており、高度に保存されたシステイン残基間のジスルフィド結合によって安定化されている複雑な三次元エピトープを示す。「ａ」抗原決定基の免疫反応性は、環状合成ペプチドを使用して部分的に模倣され得る。さらに、伝統的には、「ａ」抗原決定基は、ポリクローナル抗血清に対する反応性によって定義されていたが、モノクローナル抗体の使用によって、「ａ」抗原決定基が、少なくとも５個の部分的に重複しているエピトープからなることが示された（Ｐｅｔｅｒｓｏｎら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３２：９２０−９２７（１９８４））。文献に記載されている最も一般的な表面抗原変異体は、Ｓ−ＨＢｓＡｇのアミノ酸１４５位のグリシンのアルギニンへの置換（Ｇ−Ｒ１４５）をもたらす単一ヌクレオチド置換である。このＧ−Ｒ１４５変異は、「ａ」抗原決定基のエピトープを完全にではないが破壊する。
【０００６】
さらに、「ａ」抗原決定基のその他の変異は、サブタイプ特異的又はタイプ特異的な抗原決定基ｙ／ｄ及びｗ／ｒの損失をもたらす。また、ＰｒｅＳ１／ＰｒｅＳ２領域の大規模な欠失及び点変異の出現は、エンベロープ遺伝子の産物が、慢性感染患者において免疫選択下にあることを示唆している。さらに、ｅｎｖ遺伝子、Ｃ遺伝子、又はＰ遺伝子の中の欠失のために複製することができないＨＢＶ変異体が、ＨＢＶキャリアに由来する血漿に認められている。全てが、複製能を有するＨＢＶ型と共存している。
【０００７】
Ｏｋａｍｏｔｏらは、血漿又は無症候キャリアに由来するＰｒｅＳ／Ｓ遺伝子、Ｃ遺伝子、及びＰ遺伝子における大規模な欠失を有する変異型ゲノムが、肝臓癌細胞を用いた一過性発現系において補完されうることを証明した（Ｏｋａｍｏｔｏら、Ｐｅｄｉａｔｒｉｃ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３２：２６４−２６８（１９９２））。実際、欠損干渉粒子として作用するＨＢＶ変異体が、野生型ウイルスの複製を弱めることが示唆されている。このことは、本発明の目的がいぜん維持されていることを示している。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
上記のことを考慮すると、Ｂ型肝炎表面抗原変異体の単離は、確実に有益である。さらに、新たな変異体が、ワクチン投与及び／又は感染の間に発生する可能性がある。従って、変異型Ｂ型肝炎ウイルスの同定及び検出は、改良されたワクチン開発、及び患者の試料中のこれらの変異体の存在を決定する検出系をもたらすであろう。
【０００９】
全ての米国特許及び出版物は、参照して完全に本明細書に組み込まれる。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、配列番号１と、又は配列番号１の相補鎖と特異的にハイブリダイズする配列の断片と、少なくとも７０％の同一性を有している、単離されたヌクレオチド配列を含む。
【００１１】
さらに、本発明は、変異型Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）「ａ」抗原決定基をコードするヌクレオチド配列を含む、単離されたヌクレオチド配列を含む。ここにおいて、変異とは、単離されたヌクレオチド配列の１２３位におけるアミノ酸Ｔｈｒからアミノ酸Ａｌａへの置換である。本発明は、前記の単離されたヌクレオチド配列によってコードされた精製されたポリペプチド、及び配列番号２と少なくとも７０％の同一性を有する精製されたポリペプチドも包含する。
【００１２】
さらに、本発明は、前記単離されたヌクレオチド配列の１個またはそれ以上を含むベクター、及びこのベクターを含む宿主細胞も含む。
【００１３】
さらに、本発明は、ポリペプチドの発現にとって十分な時間および条件下で、前記宿主細胞をインキュベートする工程を含む、修飾されたＨＢＶ「ａ」抗原決定基を含むポリペプチドを作製するための方法を含む。
【００１４】
また、本発明は、変異型ＨＢｓＡｇ「ａ」抗原決定基と結合し、天然型ＨＢｓＡｇ「ａ」抗原決定基とは交差反応しない抗体を包含する。ここにおいて、変異型「ａ」抗原決定基の変異は、ＨＢｓＡｇ配列の１２３位におけるアミノ酸Ｔｈｒからアミノ酸Ａｌａへの置換である。
【００１５】
本発明は、ＨＢｓＡｇ配列の１２３位におけるアミノ酸Ｔｈｒからアミノ酸Ａｌａへの置換を含む修飾されたＨＢｓＡｇ「ａ」抗原決定基を有する、単離された変異型Ｂ型肝炎ウイルスも含む。また、本発明は、この変異型ウイルスに感染した組織培養生育細胞を含む。
【００１６】
さらに、本発明は、前記単離されたウイルス又は前記ポリペプチドのいずれか１個またはそれ以上を含む免疫原性組成物を含む。
【００１７】
本発明は、Ｂ型肝炎ウイルスのヌクレオチド配列の５６１位におけるグアニンからアラニンへの置換に起因する修飾されたＨＢｓＡｇ「ａ」抗原決定基をコードするＢ型肝炎ウイルスゲノム配列を含むポリヌクレオチドプローブも包含する。修飾されたＨＢｓＡｇ「ａ」抗原決定基をコードするゲノム配列は、配列番号１を含み得る。
【００１８】
また、本発明は、前記ポリヌクレオチドプローブ及び容器を含む、変異型ＨＢＶポリヌクレオチドの存在を決定するためのキットを含む。本発明は、前記抗体を含有している容器を含む、変異型Ｂ型肝炎表面抗原又は抗体の存在を決定するためのキットも含む。さらに、本発明は、容器及び前記ポリペプチドのいずれか１個を含む、変異型Ｂ型肝炎ウイルス抗原又は抗体の存在を決定するためのキットを包含する。
【００１９】
本発明は、（ａ）変異型ＨＢＶ核酸を含有していると推測される試験試料と前記のプローブとを、プローブ／変異型ＨＢＶ核酸複合体の形成を可能にするために十分な条件下および充分な時間、反応させる工程、及び（ｂ）前記複合体を検出し、前記複合体の存在を、試料中の変異型ＨＢＶ核酸の存在の指標とする工程を含む、試験試料中の変異型ＨＢＶ核酸を検出するための方法を含む。
【００２０】
また、本発明は、（ａ）抗体を含有していると推測される試験試料と前記ポリペプチドのいずれか１個またはそれ以上とを、抗体／ポリペプチド複合体の形成を可能にするために十分な時間および条件下で接触させる工程、及び（ｂ）抗体／ポリペプチド複合体を検出し、前記複合体の存在を、試験試料中の抗体の存在の指標とする工程を含む、試験試料中のＨＢＶ抗体を検出するための方法を含む。
【００２１】
さらに、本発明は、（ａ）変異型ＨＢｓＡｇ「ａ」抗原決定基を含有していると推測される試験試料と前記抗体とを、抗原／抗体複合体の形成を可能にするために十分な時間および条件下で反応させる工程、及び（ｂ）前記抗原／抗体複合体を検出し、前記複合体の存在を、試験試料中の変異型Ｂ型肝炎表面「ａ」抗原決定基の存在の指標とする工程を含む、試験試料中の変異型Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）「ａ」抗原決定基を検出するための方法を含む。この方法は、（ｃ）抗原／抗体複合体と、検出可能なシグナルを生成させることができるシグナル生成化合物に付加された二次抗体を含むコンジュゲートとを、二次抗体／抗原／抗体複合体の形成を可能にするために十分な時間および条件下で接触させる工程、及び（ｄ）シグナル生成化合物より生成したシグナルの存在を検出し、シグナルの存在を、試験試料中の変異型Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）「ａ」抗原決定基の存在の指標とする工程をさらに含み得る。
【００２２】
本発明は、配列番号４（即ち、変異型ウイルスの「ａ」抗原決定基のヌクレオチド配列）と、又は配列番号４の相補鎖と特異的にハイブリダイズする配列の断片と、少なくとも７０％の同一性を有する、単離されたヌクレオチド配列も包含する。さらに、本発明は、この単離されたヌクレオチド配列によってコードされた精製されたポリペプチドを含む。さらに、この単離されたヌクレオチド配列を含むベクター、及びこのベクターを含む宿主細胞を含む。
【００２３】
さらに、本発明は、配列番号５と少なくとも７０％の同一性を有する、精製されたポリペプチドを含む。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２４】
本発明は、Ｓ−ＨＢｓＡｇ配列のアミノ酸１２３位におけるアミノ酸置換（即ち、ＴｈｒからＡｌａ）の結果として修飾型「ａ」抗原決定基を有している新規Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）変異体に関する。このアミノ酸置換は、ＨＢＶゲノムの５２１位における、アデニンからグアニンへのトレオニンコドン内のヌクレオチド置換に対応している。
【００２５】
特に、本発明は、変異型ウイルスの完全エンベロープ遺伝子配列をコードする配列番号１の単離されたヌクレオチド配列を含む。さらに、本発明は、ウイルスの「ａ」抗原決定基配列に相当する単離されたヌクレオチド配列（配列番号４）、及び完全変異型ウイルスの単離されたヌクレオチド配列を含む。本発明は、本発明のヌクレオチド配列との少なくとも７０％の同一性、好ましくは少なくとも８０％の同一性、より好ましくは少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列、及びそれらの相補鎖を含む。
【００２６】
「同一性」とは、２個のＤＮＡセグメントの同じ鎖（センス又はアンチセンスのいずれか）の間の同等度、一致度、又は等価度と定義される。より具体的には、配列の同一性又は同一率とは、整列化された２個の配列の間の正確なマッチの数を、短い方の配列の長さで割り、１００を掛けたものである。同一率が大きいほど、二鎖間の一致性、同等性、又は等価性が高い。核酸配列のための近似アラインメントは、Ｓｍｉｔｈ及びＷａｔｅｒｍａｎ、Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ  ２：４８２−４８９（１９８１）の局所ホモロジーアルゴリズムによって提供される。このアルゴリズムは、Ｄａｙｈｏｆｆ、Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ、Ｍ．Ｏ．Ｄａｙｈｏｆｆ編、５  ｓｕｐｐｌ．３：３５３−３５８、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．、米国によって作出され、Ｇｒｉｂｓｋｏｖ、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１４（６）：６７４５−６６７６３（１９８６）により規準化されたスコアリングマトリックスを使用して、（同一性又は類似性に関する）ペプチド配列又はタンパク質配列での使用にまで拡張され得る。核酸配列及びペプチド配列のためのこのアルゴリズムの実行は、ＢｅｓｔＦｉｔユーティリィティアプリケーションにおいてＧｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ（（マディソン、ウィスコンシン州）Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）によって提供される。この方法のためのデフォルトパラメーターは、ウィスコンシンシーケンスアナリシスパッケージプログラムマニュアル（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐａｃｋａｇｅ  Ｐｒｏｇｒａｍ  Ｍａｎｕａｌ）、バージョン８（１９９５）（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ、マディソン、ウィスコンシン州（Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）から入手可能）に記載されている。配列間の同一率又は類似率の計算に同様に適しているその他のプログラムは、この技術分野において一般に既知である。
【００２７】
「相補性」とは、２個のＤＮＡセグメント間の関連性の程度と定義される。それは、一方のＤＮＡセグメントのセンス鎖が、適切な条件の下で、他方のＤＮＡセグメントのアンチセンス鎖とハイブリダイズし、二重らせんを形成する能力を測定することにより、決定される。二重らせんにおいて、一方の鎖にアデニンが現われた場合には必ず、他方の鎖にチミンが現われる。同様に、一方の鎖にグアニンが見い出される場合には必ず、他方にシトシンが見出される。２個のＤＮＡセグメントのヌクレオチド配列間の関連性が大きいほど、２個のＤＮＡセグメントの鎖の間のハイブリッド二重鎖を形成する能力は大きい。
【００２８】
本発明は、前記のヌクレオチド配列によってコードされたポリペプチドも含む。特に、本発明は、これらのアミノ酸配列との少なくとも７０％の類似性、好ましくは少なくとも８０％の類似性、より好ましくは少なくとも９０％の類似性を有する、変異型ウイルスのＨＢｓＡｇの「ａ」抗原決定基のヌクレオチド配列を含むエンベロープ遺伝子の単離されたヌクレオチド配列によってコードされたポリペプチドを包含する。さらに、本発明は、変異型「ａ」抗原決定基及び完全変異型ウイルスのヌクレオチド配列によってコードされたポリペプチド配列を含む。本発明は、これらの配列の断片も含む。
【００２９】
２個のアミノ酸配列間の「類似性」とは、両配列における一連の同一アミノ酸残基及び保存アミノ酸残基の存在と定義される。２個のアミノ酸配列間の類似性の程度が高いほど、２個の配列の一致性、同等性、又は等価性は高い。（２個のアミノ酸配列間の「同一性」とは、両配列の一連の正確に同じ又は不変のアミノ酸残基の存在と定義される。）類似率は、この技術分野において既知のプログラムを使用して、比較されたポリペプチド配列間で計算される（上記参照）。
【００３０】
本発明の趣旨からして、ヌクレオチド配列の「断片」とは、指定されたヌクレオチド配列の一領域に相当する、およそ少なくとも約６ヌクレオチド、好ましくは少なくとも約８ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも約１０ヌクレオチドから１２ヌクレオチド、さらに好ましくは少なくとも約１５ヌクレオチドから１８ヌクレオチドの連続配列と定義される。
【００３１】
さらに、本発明は、ＨＢＶ変異型ウイルスの完全表面抗原又はタンパク質をコードする単離されたヌクレオチド配列、その相補鎖を含み、さらにその配列の断片及び相補鎖を含む。本発明は、変異型ウイルスの配列との７０％の同一性、好ましくは８０％の同一性、より好ましくは少なくとも９０％の同一性を有する単離されたヌクレオチド配列も包含する。
【００３２】
本発明は、変異型ウイルスの完全表面抗原遺伝子の単離されたヌクレオチド配列によりコードされた精製されたポリペプチド、及びこの配列の断片も包含する。さらに、本発明は、それぞれ、単離されたヌクレオチド配列によりコードされた精製されたポリペプチドとの少なくとも７０％の類似性、好ましくは少なくとも８０％の類似性、より好ましくは少なくとも９０％の類似性を有する精製されたポリペプチドも包含する。
【００３３】
また、本発明は、変異型ウイルスの変異型ゲノムのヌクレオチド配列、エンベロープ遺伝子のヌクレオチド配列、ＨＢｓＡｇのヌクレオチド配列、又は「ａ」抗原決定基をコードするヌクレオチド配列に相当するか又は相補的なヌクレオチド配列と、中程度にストリンジェントな条件の下でハイブリダイズ可能な、単離されたヌクレオチド配列を含む。一本鎖型の核酸分子が、適切な温度及びイオン強度の条件の下で他の核酸分子とアニールすることができる場合に、その核酸分子は、もう一つの核酸分子と「ハイブリダイズ可能」である（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」第２版（１９８９）、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ参照）。温度及びイオン強度の条件が、ハイブリダイゼーションの「ストリンジェンシー」を決定する。「ハイブリダイゼーション」は、２個の核酸配列が相補的な配列を含有していることを必要とする。しかしながら、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーによっては、塩基間のミスマッチが起こり得る。核酸をハイブリダイズさせるための適切なストリンジェンシーは、核酸配列の長さ及び相補性の程度に依存する。そのような変数は、この技術分野において周知である。２個のヌクレオチド配列間の類似性又は相同性の程度が大きいほど、これらの配列を有する核酸のハイブリッドのためのＴｍ（即ち、融解温度）の値は大きい。１００ヌクレオチド長を超えるハイブリッドについては、Ｔｍを計算するための方程式が導出されている（Ｓａｍｂｒｏｏｋら（前記）参照）。比較的短い核酸のハイブリダイゼーションについては、ミスマッチの位置がより重要となり、オリゴヌクレオチドの長さがその特異性を決定する（Ｓａｍｂｒｏｏｋら（前記）参照）。
【００３４】
改変（即ち、ＨＢｓＡｇの１２３位におけるＴｈｒからＡｌａ）を含有しているアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列が単離された後、次いで、それは、ベクター又は構築物の使用により、原核宿主細胞（例えば、大腸菌）又は真核宿主細胞［例えば、ＨｅＬａ細胞もしくはチャイニーズハムスター卵巣細胞のような哺乳動物細胞または（Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）もしくはＳ．カールスベルゲンシス（Ｓ．ｃａｒｌｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓ）のような酵母細胞）］のいずれかに導入され得る。本発明のベクター又は構築物（例えば、プラスミド、コスミド、バクテリオファージ等）は、変異型タンパク質配列をコードするヌクレオチド配列のみならず、宿主細胞において機能性であり、ヌクレオチド配列によってコードされたタンパク質の発現を誘発することができる任意のプロモーターを含み得る。このプロモーターは、プロモーターに機能的に会合しているか又は「機能的に連結されている」。（プロモーターがコーディング配列の転写又は発現に影響する場合、このプロモーターは、このコーディング配列と「機能的に連結されている」と言う。）適切なプロモーターは、例えばＴ７、ＴＰ１、ラクターゼ、及びメタロチオネインを含み、この技術分野において周知である。ベクターは、例えば、トランスフェクション、形質転換、及びエレクトロポーレーションを含む、当業者に既知の方法により、選択された宿主細胞へ導入され得る（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版、第１〜３巻、Ｓａｍｂｒｏｏｋら編、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）参照）。次いで、この宿主細胞は、タンパク質の発現を許容する適切な条件の下で培養され、次いでこのタンパク質は回収され精製される。
【００３５】
宿主細胞における発現は、一過性に又は安定的に達成し得ることに注目されたい。一過性発現は、宿主細胞において機能性の発現シグナルを含有しているが、その宿主細胞において複製せず稀にしか組み込まれない導入された構築物から、又は宿主細胞が増殖性でない場合に、起こり得る。一過性発現は、目的の遺伝子と機能的に連結された制御可能プロモーターの活性を誘導することによっても達成されうるが、そのような誘導可能な系は、低い基底発現レベルを示す場合が多い。安定的な発現は、宿主ゲノムへ組み込まれることができるか、又は宿主細胞において自律複製することができる構築物の導入により達成され得る。目的の遺伝子産物の安定的な発現は、発現構築物上に存在するか、又はそれと共にトランスフェクトされた選択可能マーカーを使用し、続いてマーカーを発現している細胞を選択することによって選択され得る。安定的な発現が組み込みに起因する場合、構築物の組み込みの部位は、宿主ゲノム内にランダムに起こってもよいし、又は宿主遺伝子座の目的部位に組み換えを行なうために十分な宿主ゲノムとの相同性を有する領域を含有している構築物の使用によって目的部位組み込みを行ってもよい。構築物が内因性遺伝子座に目的部位組み込みが行なわれる場合には、転写及び翻訳の制御領域の全部又は一部が、内因性遺伝子座によって提供されてもよい。
【００３６】
上記のことを考慮すると、本発明は、ウイルスの精製されたポリペプチド（即ち、ＨＢｓＡｇのアミノ酸配列の１２３位に野生型アラニン残基ではなくトレオニン残基を有している修飾型「ａ」抗原決定基）をコードする単離されたヌクレオチド配列、変異型ウイルスのエンベロープ遺伝子の単離されたヌクレオチド配列、ウイルスのＨＢｓＡｇをコードする単離されたヌクレオチド配列、変異型ウイルスの単離されたヌクレオチド配列、この各配列によってコードされたタンパク質、いずれかのヌクレオチド配列を含むベクター、及びこのベクターが導入された宿主細胞を含む。このタンパク質は、前記のような組み換えにより、又は合成により作製され得ることにも注意されたい。さらに、このタンパク質は、ウイルス自体から精製されてもよい。
【００３７】
このポリペプチド又はこのタンパク質は、変異型ＨＢＶの目的の（１個以上の）免疫学的エピトープと結合するモノクローナル抗体及び／又はポリクローナル抗体を開発するためにも使用しうる。このような抗体を作製する方法は、当業者に周知である（例えば、Ｋｏｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎ、Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９４（１９７５）、Ｍｉｍｍｓら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １７６：６０４−６１９（１９９０）、Ｈａｍｍｅｒｉｎｇら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ、Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ、第２版、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８４）参照）。また、抗体産生を引き起こすため、本発明のポリペプチド又はタンパク質により哺乳動物を単に免疫感作してもよい。次いで、このような抗体を回収してもよい。使用されるポリペプチド又はタンパク質は、変異型ＨＢＶのエピトープを含有している。
【００３８】
前述のように、本発明は、タンパク質又はポリペプチド（即ち、抗原）、特に前記の「ａ」抗原決定基を含有しているＨＢｓＡｇを使用して、変異型ＨＢＶに対する抗体を検出する方法も含む（例えば、米国特許５，５９５，７３９号参照）。より具体的には、競合及び非競合的（例えば、イムノメトリック及びサンドイッチ）という二つの基本的なアッセイ型が存在する。いずれのアッセイにおいても、抗体又は抗原の試薬が、固相に共有結合的又は非共有結合的に付加される。共有結合的な付加のためのリンキング剤は、既知であり、固相の一部であってもよいし、又はコーティングの前にリンキング剤にされてもよい。イムノアッセイにおいて使用される固相の例は、多孔性及び非孔性の材料、ラテックス粒子、磁性粒子、微粒子（ＥＰＯ出願ＥＰ０４２５６３３の公報参照）、ビーズ、膜、マイクロタイターウェル、並びにプラスチックチューブである。固相材料の選択、及び抗原又は抗体の試薬を標識する方法は、所望のアッセイフォーマットのパフォーマンス特徴に基づき決定される。いくつかのイムノアッセイについては、標識は必要でない。例えば、抗原が、赤血球のような検出可能な粒子の上に存在する場合、反応性は凝集に基づき確立され得る。又は、抗原−抗体反応は、可視の変化（例えば、放射状の免疫拡散）をもたらすかもしれない。ほとんどの場合、イムノアッセイにおいて使用される抗体又は抗原の試薬のうちの一つが、シグナル生成化合物又は「標識」へ付加される。このシグナル生成化合物又は「標識」は、それ自体が検出可能なものであってもよいし、又は１個以上の追加の化合物と反応して検出可能な生成物を生成させるものであってもよい。このようなシグナル生成化合物の例には、色素原、放射性同位体（例えば、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３２Ｐ、３Ｈ、３５Ｓ、及び１４Ｃ）、蛍光性化合物（例えば、フルオレセイン、ローダミン）、化学発光性化合物、粒子（可視もしくは蛍光性）、核酸、錯体化剤、又は酵素（例えば、アルカリホスファターゼ、酸性ホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ、及びリボヌクレアーゼ）のような触媒が含まれる。酵素を使用する場合には、発色性、蛍光性、又は発光性の基質の添加が、検出可能なシグナルの生成をもたらす。時間分解蛍光、内部反射蛍光、増幅（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応）、及びラマン分光法のようなその他の検出系も、有用である。
【００３９】
（１）抗原を前記のような固相上に提示し、特異抗体を含有しているヒト生物学的液体を抗原と反応させ、次いで、抗原と結合した抗体を、シグナル生成化合物と結合した抗ヒト抗体により検出する、及び（２）抗ヒト抗体を固相に結合させ、特異抗体を含有しているヒト生物学的液体を、結合した抗体と反応させ、次いでシグナル生成化合物に付加された抗原を添加して、液体試料中に存在する特異抗体を検出する、という二つの一般的なフォーマットが、ヒトにおける特異抗体の力価及び型をモニタリングするために一般的に使用されている。いずれのフォーマットにおいても、抗ヒト抗体試薬は、アッセイの意図された目的に応じて、全ての抗体クラスを認識するものであってもよいし、又は特定のクラスもしくはサブクラスの抗体に特異的なものであってもよい。これらのアッセイフォーマット及びその他の既知のフォーマットは、本発明の範囲内にあるものとし、当業者に周知である。
【００４０】
従って、上記のことを考慮すると、本発明は、（ａ）抗体を含有していると推測される試験試料を、修飾型「ａ」抗原決定基を含み、従ってＴｈｒからＡｌａへの置換を含む抗原又はタンパク質（例えば、ＨＢｓＡｇ、「ａ」抗原決定基、又は完全ウイルス）と接触させる工程、（ｂ）複合体の存在を検出し、それにより試験試料中に存在する抗体を検出する工程を含む、試験試料中の変異型ＨＢＶに対する抗体を発見する方法を含む。より具体的には、本発明は、（ａ）抗体を含有していると推測される試験試料を、抗原と、抗体／抗原複合体の形成を可能にするために十分な時間および条件下で接触させる工程、（ｂ）検出可能なシグナルを生成させることができるシグナル生成化合物に付加された（タンパク質に対する）抗体を含むコンジュゲートを、該コンジュゲートが結合した抗体に結合するために十分な時間および条件下で、得られた抗体／抗原複合体に添加する工程、（ｃ）該シグナル生成化合物より生成したシグナルを検出することにより、試験試料中に存在する可能性のある抗体の存在を検出する工程を含む、試験試料中の変異型ＨＢＶに対する抗体を検出する方法を含む。抗原と結合する対照又は標準物質が使用されてもよい。
【００４１】
さらに、本発明は、試験試料中に存在する可能性のある抗体の存在を検出するためのもう一つの方法を含む。この方法は、（ａ）抗体を含有していると推測される試験試料を、試料中の該抗体に特異的な抗抗体（即ち、抗変異型ＨＢＶ抗体又はその断片）と、抗抗体／抗体複合体の形成を可能にするために十分な時間および条件下で接触させる工程、及び（ｂ）試験試料中に存在する可能性のある抗体の存在を検出することを含む。（このような抗抗体は、商業的に入手可能であり、例えば、本発明のタンパク質又は免疫原に対して産生された抗変異型ＨＢＶ抗体の精製されたミュー鎖により哺乳動物を免疫感作することにより作出されてもよい。）
より具体的には、この方法は、（ａ）抗体（即ち、抗変異型ＨＢＶ抗体）を含有していると推測される試験試料を、該抗体に特異的な抗抗体と、抗抗体／抗体複合体の形成を可能にするために十分な時間および条件下で接触させる工程、（ｂ）検出可能なシグナルを生成させることができるシグナル生成化合物に付加されたタンパク質（即ち、修飾型「ａ」抗原決定基を含む抗原）を含むコンジュゲートを、該コンジュゲートが結合した抗体と結合することを可能にするために十分な時間および条件下で、得られた抗抗体／抗体複合体に添加する工程、及び（ｃ）該シグナル生成化合物より生成したシグナルを検出することにより、試験試料中に存在する可能性のある抗体の存在を検出する工程を含み得る。抗抗体に対する抗体を含む対照又は標準物質が使用されてもよい。
【００４２】
本発明は、試験試料中の変異型ＨＢＶに対する抗体の存在を検出するための第三の方法も包含する。この方法は、（ａ）抗変異型ＨＢＶ抗体を含有していると推測される試験試料を、該抗体に特異的な抗抗体と、抗抗体／抗体複合体の形成を可能にするために十分な時間および条件下で接触させる工程、（ｂ）タンパク質（即ち、修飾型「ａ」抗原決定基を含む抗原又はタンパク質、例えば表面抗原）を、該抗原が抗体と結合することを可能にするために十分な時間および条件下で、得られた抗抗体／抗体複合体に添加する工程、及び（ｃ）検出可能なシグナルを生成させることができるシグナル生成化合物に付加された、該抗原に対するモノクローナル又はポリクローナル抗体を含む組成物を含むコンジュゲートを、得られた抗抗体／抗体／抗原複合体に添加する工程、及び（ｄ）シグナル生成化合物より生成したシグナルを検出することにより、試験試料中に存在する可能性のある抗体の存在を検出する工程を含む。この場合にも、抗抗体に対する抗体を含む対照又は標準物質が使用されてもよい。
【００４３】
本発明のモノクローナル抗体の１個またはそれ以上が、本発明の変異型ＨＢＶタンパク質に対する抗体の検出のための競合プローブとして使用し得ることも注目すべきである。例えば、本発明の変異型ＨＢＶタンパク質は、固相上にコーティングされ得る。次いで、変異型抗原に対する抗体を含有していると推測される試験試料が、シグナル生成化合物及び少なくとも１個の本発明のモノクローナル抗体を含む指示試薬と共に、試験試料と指示試薬との固相への抗原／抗体複合体または指示指薬と固相への抗原／抗体複合体の形成に十分な時間および条件下でインキュベートされ得る。モノクローナル抗体の固相との結合の減少が測定され得る。確証された陰性ＨＢＶ試験試料より生成したシグナルと比較した、測定されたシグナルの減少は、試験試料中の抗ＨＢＶ抗体の存在を示す。
【００４４】
プローブに関して、例えばウイルスを保有していると推測される対象者の血清の中のウイルスゲノムの存在の検出において、又は供与された血液をウイルスの存在に関してスクリーニングするため、ハイブリダイゼーションプローブとして有用である約８ヌクレオチドから１０ヌクレオチド又はそれ以上のＤＮＡオリゴマーを合成するため、本発明の核酸配列を使用することが可能である。本発明の核酸配列は、ウイルス感染中に産生された抗体の存在に関する診断試薬として使用され得る変異型ＨＢＶ特異ポリペプチドの設計及び作製も可能にする。
【００４５】
プライマーも、本発明の核酸配列を使用して開発され得る。
【００４６】
本発明の抗体又はそれらの断片は、試験試料中の変異型ＨＢＶタンパク質（又はそれに対応する核酸配列）の存在を決定するための様々な診断アッセイにおいて利用され得ることにも注目されたい。例えば、本発明のタンパク質（即ち、修飾型「ａ」抗原決定基を含む抗原又はポリペプチド）のうちの１個またはそれ以上に対する抗体は、抗体／抗原複合体の形成に十分な時間および条件下で試験試料に添加され得る。そのような複合体が検出された場合には、抗原（即ち、タンパク質）が試験試料中に存在する。
【００４７】
さらにもう一つの方法において、固相上にコーティングされたポリクローナルもしくはモノクローナルの抗変異型ＨＢＶ抗体もしくはその断片、又はこれらの抗体の組み合わせが、第一の混合物を形成するため、変異型ＨＢＶタンパク質を含有していると推測される試験試料と接触させられる。次いで、この混合物が、抗原（即ち、タンパク質）／抗体複合体の形成に十分な時間および条件下でインキュベートされる。次いで、シグナル生成化合物が付加されている、変異型ＨＢＶ領域（例えば、本明細書に記載されたウイルスの「ａ」抗原決定基）と結合するモノクローナルもしくはポリクローナルの抗体もしくはその断片、又はこれらの抗体の組み合わせを含む指示試薬が、第２混合物を形成するため、抗原／抗体複合体と接触させられる。次いで、この第２混合物が、抗体／抗原／抗体複合体の形成に十分な時間および条件下でインキュベートされる。シグナル生成化合物より生成した測定可能なシグナルの存在を検出することにより、試料中の、固相上に捕捉された変異型ＨＢＶタンパク質の存在が決定される。試料中の変異型タンパク質又は抗原の量は、生成したシグナルに比例する。
【００４８】
さらに、試験試料中の変異型ＨＢＶタンパク質の存在を検出するため、異なる方法を使用することも可能である。より具体的には、固体支持体と結合した（前記のような）ポリクローナルもしくはモノクローナルの抗変異型ＨＢＶ抗体又はそれらの組み合わせと、試験試料と、シグナル生成化合物が付加されている変異型ＨＢＶ抗原（例えば「ａ」抗原決定基を含む表面抗原又は「ａ」抗原決定基単独）と特異的に結合するモノクローナルもしくはポリクローナルの抗体（もしくはそれらの断片）又はこれらの抗体の組み合わせを含む指示試薬とが、混合物を形成するために接触させられる。この混合物は、抗体／抗原／抗体複合体の形成に十分な時間および条件下でインキュベートされる。シグナル生成化合物より生成した測定可能なシグナルを検出することにより、固相上に捕捉された本発明の変異型ＨＢＶタンパク質が決定される。試験試料中の変異型ＨＢＶタンパク質の量は、生成したシグナルに比例する。
【００４９】
同時アッセイにおいて変異型ＨＢＶに対する抗体及び／又は抗原の存在を検出することも可能であることに注目されたい。より具体的には、試験試料が、固相に付加された第１分析物に特異的な第１結合メンバーを含む第１分析物の捕捉試薬、及び第２分析物に特異的な第１結合メンバーを含む第２分析物の捕捉試薬と、同時に接触させられる。（対の結合メンバーとは、化学的又は物理的な手段によって、対の第２分子と特異的に結合する分子と定義される。）このようにして、混合物が形成される。次いで、この混合物が、捕捉試薬／第１分析物複合体及び捕捉試薬／第２分析物複合体の形成に十分な時間および条件下でインキュベートされる。次いで、これらの複合体は、シグナル生成化合物で標識された第１分析物に特異的な結合対のメンバーを含む指示試薬、及びシグナル生成化合物で標識された第２分析物に特異的な結合対のメンバーを含む指示試薬と接触させられる。第２の混合物が形成される。次いで、この第２の混合物は、捕捉試薬／第１分析物／指示試薬複合体及び捕捉試薬／第２分析物／指示試薬複合体の形成にとって十分な時間および条件下でインキュベートされる。試験試料中の１個またはそれ以上の分析物の存在の指標として、いずれか又は両方の固相の上に形成された複合体に関して生成したシグナルを検出することにより、１個またはそれ以上の分析物の存在が決定される。
【００５０】
本発明は固相診断アッセイの使用を開示しているが、本発明のタンパク質が非固相診断アッセイにおいて利用されることも企図される。これらのアッセイは、当業者に周知であり、本発明の範囲内にあると見なされる。
【００５１】
さらに、本発明は、本発明のタンパク質及び医薬適合性のアジュバント（例えばフロイントアジュバント又はリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ））を含むワクチンも含む。そのようなワクチンは、哺乳動物において抗体を産生させることが望まれる場合に投与され得る。同様に、本発明は、配列が真核生物宿主において産生された場合に粒子を形成することができるアミノ酸配列を有する非変異型ＨＢＶポリペプチド、及び本発明の変異型ＨＢＶのエピトープ（例えば「ａ」抗原決定基）を含む変異型ＨＢＶ感染に対して免疫原性の粒子を含む。
【００５２】
キットも、本発明の範囲内に含まれる。より具体的には、本発明は、抗体の存在を決定するためのキットを含む。特に、試験試料中の抗体の存在を決定するためのキットは、ａ）タンパク質（即ち、抗原）、及びｂ）検出可能なシグナルを生成させることができるシグナル生成化合物に付加された（試験試料中の抗体に対する）抗体を含むコンジュゲート、を含む。このキットは、対照又は標準物質を含有していてもよい。
【００５３】
本発明は、試験試料中の抗体を検出するためのもう一つの型のキットも含む。このキットは、ａ）試験試料中の抗体（即ち、変異型ＨＢＶに応答して産生されたもの）に特異的な抗抗体、及びｂ）タンパク質（即ち、ＴｈｒからＡｌａへの置換を含有している「ａ」抗原決定基、又は「ａ」抗原決定基を含む表面抗原のようなポリペプチド）を含み得る。タンパク質と結合する試薬を含む対照又は標準物質が含まれていてもよい。より具体的には、キットは、ａ）試料中の抗体に特異的な抗抗体、及びｂ）検出可能なシグナルを生成させることができるシグナル生成化合物に付加されているタンパク質を含むコンジュゲートを含みうる。この場合にも、このキットは、タンパク質と結合する試薬を含む対照又は標準物質を含有していてもよい。
【００５４】
さらに、本発明の単離されたヌクレオチド配列、及び配列同一性に関する前記の関連配列も、プライマー及びプローブを作出するために使用され得る。このプローブは、試験試料中の核酸を検出するために使用可能であり、このプライマーは増幅目的のため使用可能である。
【００５５】
アッセイの最適化のためのそのようなプローブの設計は、充分に当業者の知識の範囲内にある。一般に、最大の特異性が望まれる場合には、核酸プローブは非保存領域から開発され、例えば多重遺伝子ファミリーの異なるメンバーと、又は近縁種において密接に関連しているヌクレオチド領域に関してアッセイされる場合には、核酸プローブは保存領域から開発される。
【００５６】
本発明のプローブ（ヌクレオチド配列）は、例えば、本発明のものと関連しているその他のアンチセンスオリゴヌクレオチドを発見するために使用され得る。従って、プローブは、Ｃｈｋ１ヌクレオチド配列の一部とハイブリダイズする。その一部は、次いで、例えば治療目的のために利用され得る。
【００５７】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）において利用するためのプライマーは、本発明の核酸配列を使用して開発され得る（米国特許４，６８３，１９５号及び米国特許４，６８３，２０２号参照）。ＰＣＲは、核酸又はその混合物に含まれている所望の核酸配列を増幅するための技術である。このプライマーは、各々、標的核酸を鋳型として使用して、ポリメラーゼによって伸長される。伸長産物は、最初の標的鎖からの解離された後、標的配列となる。次いで、新たなプライマーが、ハイブリダイズさせられ、ポリメラーゼによって伸長され、そのサイクルが、標的配列分子の数を増加させるために繰り返される。
【００５８】
本発明は、変異型ＨＢＶに感染した、組織培養によって増殖させられた細胞、及び単離された変異型Ｂ型肝炎ウイルス自体も包含する。さらに、本発明は、弱毒化又は不活化されたウイルスを含む免疫原性組成物を含む。
【００５９】
本発明は、以下の非制限的な実施例の使用によって例示され得る。
【実施例１】
【００６０】
Ｔｈｒ１２３からＡｌａ  ＨＢｓＡｇ変異体の単離
ＤＮＡ単離
９９０５２５１６９として同定された（そして、Ａｇｅｎｃｅ  Ｆｒａｎｃａｉｓｅ  ｄｅ  Ｓｅｃｕｒｉｔｅ  Ｓａｎｉｔａｉｒｅ  ｄｅｓ  Ｐｒｏｄｕｉｔｓ  ｄｅ  Ｓａｎｔｅ、６  ｒｕｅ  Ａｌｅｘａｎｄｒｅ  Ｃａｂａｎｅｌ、７５７３９  Ｐａｒｉｓ  Ｃｅｄｅｘ  １５、Ｆｒａｎｃｅに寄託されている）フランス人試料の一部１００ｕｌを解凍させ、新鮮に調製されたダイジェストミクスチャー（Ｄｉｇｅｓｔ  Ｍｉｘｔｕｒｅ）（１６．６７ｍＭトリス（ｐＨ８．０）、１６．６７ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．００）、０．８３％ＳＤＳ、１．６７ｍｇ／ｍｌプロテイナーゼＫ）（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．、セントルイス、ミズーリ州（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ））１５０ｕｌを１．６ｍｌシリコン処理ミクロチューブに添加した。試料をボルテックス処理し、６０℃で２時間インキュベートし、次いで１０分間微量遠心した（３７４３バイオフュージ（Ｂｉｏｆｕｇｅ）ローター（Ｂａｘｔｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｂａｘｔｅｒ  Ｐａｒｋ、ＩＬ）において１２，０００ｒｐｍ）。上清を除去し、フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール（２５／２４／１）［シグマＰ−３８０３］２５０ｕｌを添加し、混合物を３０秒間激しくボルテックス処理し、次いで１０分間再び微量遠心した。界面材料を避けつつ上部の水相を除去し、抽出を繰り返した。０．１倍容量の３Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液［Ｓｉｇｍａ  Ｓ−７８９９］及び２倍容量の無水エタノール［ＭｃＣｏｒｍｉｃｋ  ６５０５−００−１０５−００００］を添加することにより、ＤＮＡを沈殿させた。試料をボルテックス処理し、少なくとも３０分間−２０℃に保持し、次いで１５分間微量遠心した。ペレットのエリアを乱さないように注意しながら、上清を除去した。７０％エタノール２５０ｕｌでペレットを洗浄し、次いで５分間遠心分離した。再び洗浄工程を繰り返し、次いで室温でおよそ５分間ペレットを空気乾燥させた。ピペットチップを使用してペレットエリアを再懸濁させ、激しくボルテックス処理することにより、水［Ｓｉｇｍａ  Ｗ−４５０２］４０ｕｌにペレットを再懸濁させた。ミクロチューブに試料ＩＤ＃及び日付を記し、４℃で保管した。
【００６１】
ＰＣＲ増幅
パーキンエルマージーンアンプ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  ＧｅｎｅＡｍｐ）キット［Ｎ８０８−０１４３］（Ｎｏｒｗａｌｋ、ＣＴ）及びパーキンエルマー（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）９６００サーモサイクラーを使用して、完全表面抗原遺伝子（ｐｒｅＳ１／ｐｒｅＳ２／Ｓ）のネスティッドＰＣＲ増幅を実施した。一次増幅においては、以下の条件を用いて、ＨＢＶプライマー２８４４Ｆ及び８８３Ｒを使用して、抽出されたＤＮＡ  ５ｕｌを増幅した：
ＰＣＲ  １  ｒｘｎ．
プライマー１        １．２５ｕｌ
プライマー２        １．２５ｕｌ
１０×緩衝液        ２．５ｕｌ
ＭｇＣｌ２溶液      ２．０ｕｌ
ｄＮＴＰ混合物      ２．５ｕｌ
Ｈ２０              １０．４ｕｌ
Ｔａｑ              ０．１２５ｕｌ
チューブ１本当たり  ２０ｕＬ
試料＝５ｕＬ  ＤＮＡ、全容量＝２５ｕｌ。
【００６２】
以下の方法を使用して、ＰＥ９６００において上記の混合物を増幅した：（９４℃２分／９４℃３０秒−５０℃３０秒−７２℃６０秒［１０サイクル］／９５℃３０秒−６０℃３０秒−７２℃６０秒［３０サイクル］／７２℃１０分／４℃浸漬）。
２次増幅においては、以下の条件の下でＨＢＶプライマー２８２２Ｆ及び８５０Ｒを使用して、ＰＣＲ  １  ｒｘｎ．混合物１ｕｌをさらに増幅した。
【００６３】
ＰＣＲ  ２  ｒｘｎ．
プライマー３      １．２５ｕｌ
プライマー４      １．２５ｕｌ
１０×緩衝液      ２．５ｕｌ
ＭｇＣｌ２溶液      ２．０ｕｌ
ｄＮＴＰ混合物      ２．５ｕｌ
Ｈ２Ｏ              １４．４ｕｌ
Ｔａｑ              ０．１２５ｕｌ
チューブ１本当たり  ２４ｕｌ
試料＝１ｕＬ  ＰＣＲ１  ｒｘｎ．、全容量＝２５ｕｌ。
【００６４】
以下の方法を使用して、ＰＥ９６００においてＰＣＲ２混合物を増幅した：（９４℃２分／９４℃３０秒−５０℃３０秒−７２℃６０秒［１０サイクル］／９５℃３０秒−６０℃３０秒−７２℃６０秒［３０サイクル］／７２℃１０分／４℃浸漬）。
【００６５】
次いで、ＰＣＲ２産物を、適切なサイズ標準と共に１％アガロースゲル電気泳動にかけた。およそ１，２５０塩基対に相当する主要バンドを切り出し、キアクイック（ＱＩＡｑｕｉｃｋ）ゲル抽出キット［２８７０４］（Ｑｉａｇｅｎ  Ｉｎｃ．、Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ、ＣＡ）を使用して単離した。
【００６６】
ＤＮＡ配列決定
精製されたＰＣＲ産物を、９個のＨＢＶプライマー２８２２Ｆ、３１３５Ｆ、５６Ｆ、２５１Ｒ、４４８Ｆ、４７１Ｒ、６２３Ｆ、７１４Ｒ、及び８５０Ｒを使用して、ＡＢＩ  ３７３自動ＤＮＡシーケンサーで配列決定した。シーケンサー（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ）ソフトウェアを使用して、９個の配列コンティグを１個の配列へと組み立てた。試料は、以下の３個の置換が見出されるＨＢＶサブタイプａｙｗ２遺伝子型Ｄ配列を含有していることが示された。
【００６７】
１）ＴｈｒからＡｌａ１２３（Ｈ１６６エピトープに影響する）
２）ＴｒｐからＬｅｕ１９９（「ａ」抗原決定基の外部）
３）ＳｅｒからＴｈｒ２０７（「ａ」抗原決定基の外部）
【図面の簡単な説明】
【００６８】
【図１】本発明の変異型ＨＢＶウイルスから単離された完全エンベロープ遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号１）を示す図である。変異型「ａ」抗原決定基のヌクレオチド配列は、全長エンベロープ配列の塩基４９２〜６７５によって表される。
【図２】全長変異型ＨＢｓＡｇエンベロープタンパク質のアミノ酸配列（配列番号２）を示す図である。
【図３】サブタイプａｙｗ２野生型ＨＢＶウイルスのスモールＨＢｓＡｇエンベロープタンパク質のアミノ酸配列（配列番号３）を表す図である。
【図４Ａ】変異型及び野生型のａｙｗ２スモールエンベロープタンパク質のヌクレオチド配列のアライメント及び翻訳を表す図である。
【図４Ｂ】変異型及び野生型のａｙｗ２スモールエンベロープタンパク質のヌクレオチド配列のアライメント及び翻訳を表す図である。
【図５】変異型「ａ」抗原決定基のヌクレオチド配列（即ち、全長エンベロープ配列の塩基４９２〜６７５）（配列番号４）を示す図である。「ａ」抗原決定基は、Ｓ（スモール）ＨＢｓＡｇのアミノ酸１００〜１６０の間に存在する。
【図６】図５に示されたヌクレオチド配列によってコードされた変異型「ａ」抗原決定基の対応するポリペプチド配列（即ち、Ｓ（スモール）ＨＢｓＡｇタンパク質配列のアミノ酸１００〜１６０）（配列番号５）を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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