(57)【要約】本発明は一般に、組換え遺伝子技術に関する。より詳細には、本発明は、核酸分子の選択および単離に用いるための組成物および方法に関する。本発明はさらに、個々の核酸分子および核酸分子の集団の調製のための方法、ならびにこれらの方法によって作製される核酸分子に関する。本発明はまた、1つまたは複数の共通の特徴（例えば、特性、活性など）を有する核酸分子を同定および/または単離するためのスクリーニングおよび/または選択の方法、ならびに1つまたは複数の特徴を共有する核酸分子の集団にも関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸分子の集団を1つまたは複数の第2の標的分子に挿入するための方法であって、
（a）1つまたは複数の組換え部位を含む少なくとも第1の核酸分子の集団を、1つまたは複数の組換え部位を含む少なくとも1つの第1の標的核酸分子と混合する段階；
（b）少なくとも第1の集団の核酸分子の一部またはすべてを、第1の標的核酸分子の一部またはすべてと組み換えさせ、それによって第2の核酸分子の集団を形成する段階；
（c）少なくとも第2の核酸分子の集団を、1つまたは複数の組換え部位を含む少なくとも1つの第2の標的核酸分子を混合する段階；および
（d）少なくとも第2の集団の核酸分子の一部またはすべてを、第2の標的核酸分子の一部またはすべてと組み換えさせ、それによって第3の核酸分子の集団を形成する段階、
を含む方法。
【請求項２】
第1の核酸分子の集団がcDNAライブラリーを含む、請求項1記載の方法。
【請求項３】
第1の核酸分子の集団がゲノムライブラリーを含む、請求項1記載の方法。
【請求項４】
第1の標的核酸分子が線状核酸分子である、請求項1記載の方法。
【請求項５】
第1の核酸分子の集団の個々の構成要素が線状核酸分子である、請求項1記載の方法。
【請求項６】
第1の標的核酸分子が2つの組換え部位によって挟まれている、請求項4記載の方法。
【請求項７】
第1の標的核酸分子が1つの組換え部位および1つの制限エンドヌクレアーゼ部位によって挟まれている、請求項4記載の方法。
【請求項８】
核酸分子の集団の個々の構成要素が2つの組換え部位によって挟まれている、請求項5記載の方法。
【請求項９】
第1の核酸分子の集団の個々の構成要素が1つの組換え部位および1つの制限エンドヌクレアーゼ部位によって挟まれている、請求項5記載の方法。
【請求項１０】
組換え部位が、以下のものからなる群より選択される1つまたは複数の組換え部位を含む、請求項1記載の方法：
（a）lox部位；
（b）psi部位；
（c）dif部位；
（d）cer部位；
（e）frt部位；
（f）att部位；ならびに
（g）組換えを起こす能力を保持している、（a）（b）（c）（d）（e）または（f）の組換え部位の変異体、バリアントおよび誘導体。
【請求項１１】
互いに組換えを行う組換え部位が、同一な7塩基対の重複領域を有するatt部位を含む、請求項10記載の方法。
【請求項１２】
互いに組換えを行う組換え部位の7塩基対の重複領域の最初の3つのヌクレオチドが、以下のものからなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項11記載の方法：
（a）AAA；
（b）AAC；
（c）AAG；
（d）AAT；
（e）ACA；
（f）ACC；
（g）ACG；
（h）ACT；
（i）AGA；
（j）AGC；
（k）AGG；
（l）AGT；
（m）ATA；
（n）ATC；
（o）ATG；および
（p）ATT。
【請求項１３】
互いに組換えを行う組換え部位の7塩基対の重複領域の最初の3つのヌクレオチドが、以下のものからなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項11記載の方法：
（a）CAA；
（b）CAC；
（c）CAG；
（d）CAT；
（e）CCA；
（f）CCC；
（g）CCG；
（h）CCT；
（i）CGA；
（j）CGC；
（k）CGG；
（l）CGT；
（m）CTA；
（n）CTC；
（o）CTG；および
（p）CTT。
【請求項１４】
互いに組換えを行う組換え部位の7塩基対の重複領域の最初の3つのヌクレオチドが、以下のものからなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項11記載の方法：
（a）GAA；
（b）GAC；
（c）GAG；
（d）GAT；
（e）GCA；
（f）GCC；
（g）GCG；
（h）GCT；
（i）GGA；
（j）GGC；
（k）GGG；
（l）GGT；
（m）GTA；
（n）GTC；
（o）GTG；および
（p）GTT。
【請求項１５】
互いに組換えを行う組換え部位の7塩基対の重複領域の最初の3つのヌクレオチドが、以下のものからなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項11記載の方法：
（a）TAA；
（b）TAC；
（c）TAG；
（d）TAT；
（e）TCA；
（f）TCC；
（g）TCG；
（h）TCT；
（i）TGA；
（j）TGC；
（k）TGG；
（l）TGT；
（m）TTA；
（n）TTC；
（o）TTG；および
（p）TTT。
【請求項１６】
段階（b）における組換えが、組換えに好都合な条件下で、第1の核酸分子の集団および第1の標的核酸分子を1つまたは複数の組換えタンパク質と混合することによって引き起こされる、請求項1記載の方法。
【請求項１７】
1つまたは複数の組換えタンパク質が、以下のものからなる群より選択される1つまたは複数のタンパク質を含む、請求項16記載の方法：
（a）Cre；
（b）Int；
（c）IHF；
（d）Xis；
（e）Hin；
（f）Gin；
（g）Cin；
（h）Tn3リゾルベース；
（i）TndX；
（j）XerC；および
（k）XerD。
【請求項１８】
1つまたは複数の組換えタンパク質が、（1）分子量が約14,000ダルトン未満であり、（2）塩基性アミノ酸残基を少なくとも15％含み、かつ（3）組換えを増強する、少なくとも1つの第2のタンパク質と混合されている、請求項16記載の方法。
【請求項１９】
1つまたは複数の第2のタンパク質が、Fis、リボソームタンパク質、またはFisもしくはリボソームタンパク質の断片を含む、請求項18記載の方法。
【請求項２０】
リボソームタンパク質が原核生物リボソームタンパク質である、請求項19記載の方法。
【請求項２１】
リボソームタンパク質が大腸菌リボソームタンパク質である、請求項20記載の方法。
【請求項２２】
大腸菌リボソームタンパク質が、S10、S14、S15、S16、S17、S18、S19、S20、S21、L14、L21、L23、L24、L25、L27、L28、L29、L30、L31、L32、L33およびL34からなる大腸菌リボソームタンパク質の群より選択される、請求項21記載の方法。
【請求項２３】
段階（d）における組換えが、組換えに好都合な条件下で、第2の核酸分子の集団および第2の標的核酸分子を1つまたは複数の組換えタンパク質と混合することによって引き起こされる、請求項1記載の方法。
【請求項２４】
1つまたは複数の組換えタンパク質が、以下のものからなる群より選択される1つまたは複数のタンパク質を含む、請求項23記載の方法：
（a）Cre；
（b）Int；
（c）IHF；
（d）Xis；
（e）Hin；
（f）Gin；
（g）Cin；
（h）Tn3リゾルベース；
（i）TndX；
（j）XerC；および
（k）XerD。
【請求項２５】
1つまたは複数の組換えタンパク質が、（1）分子量が約14,000ダルトン未満であり、（2）塩基性アミノ酸残基を少なくとも15％含み、かつ（3）組換えを増強する、少なくとも1つの第2のタンパク質と混合されている、請求項23記載の方法。
【請求項２６】
1つまたは複数の第2のタンパク質が、Fis、リボソームタンパク質、またはFisもしくはリボソームタンパク質の断片を含む、請求項25記載の方法。
【請求項２７】
リボソームタンパク質が原核生物リボソームタンパク質である、請求項26記載の方法。
【請求項２８】
リボソームタンパク質が大腸菌リボソームタンパク質である、請求項27記載の方法。
【請求項２９】
大腸菌リボソームタンパク質が、S10、S14、S15、S16、S17、S18、S19、S20、S21、L14、L21、L23、L24、L25、L27、L28、L29、L30、L31、L32、L33およびL34からなる大腸菌リボソームタンパク質の群より選択される、請求項28記載の方法。
【請求項３０】
第1の標的核酸分子がベクターである、請求項1記載の方法。
【請求項３１】
ベクターが以下のものからなる群より選択される、請求項30記載の方法：
（a）pDONR201；
（b）pDONR207；
（c）pDONR212；
（d）pDONR212(F)；および
（e）pDONR212(R)。
【請求項３２】
請求項1記載の方法によって調製された第3の核酸分子の集団を含む組成物。
【請求項３３】
請求項1記載の方法によって調製された第3の核酸分子の集団。
【請求項３４】
請求項33記載の第3の核酸分子の集団の個々の構成要素。
【請求項３５】
請求項1記載の第3の核酸分子の集団を含む宿主細胞の集団。
【請求項３６】
請求項35記載の宿主細胞の集団の個々の宿主細胞。
【請求項３７】
細菌細胞である、請求項36記載の宿主細胞。
【請求項３８】
該細菌細胞が大腸菌である、請求項37記載の宿主細胞。
【請求項３９】
真核細胞である、請求項36記載の宿主細胞。
【請求項４０】
該真核細胞が酵母細胞である、請求項39記載の宿主細胞。
【請求項４１】
該真核細胞が植物細胞である、請求項39記載の宿主細胞。
【請求項４２】
該真核細胞が動物細胞である、請求項39記載の宿主細胞。
【請求項４３】
該動物細胞が哺乳動物細胞である、請求項42記載の宿主細胞。
【請求項４４】
少なくとも1つの特定の性質、特徴または活性を有する1つまたは複数の核酸分子を同定するための方法であって、
（a）1つまたは複数の組換え部位を含む少なくとも第1の核酸分子の集団を、1つまたは複数の組換え部位を含む少なくとも1つの第1の標的核酸分子と混合する段階；
（b）少なくとも第1の集団の核酸分子の一部またはすべてを、第1の標的核酸分子の一部またはすべてと組み換えさせ、それによって第2の核酸分子の集団を形成する段階；
（c）第2の集団の他の構成要素とは異なる少なくとも1つの特定の性質、活性または特徴を有する、第2の集団の1つもしくは複数の核酸分子または部分集団を分離、同定または選択し、それによって少なくとも1つの特定の性質、活性または特徴を共有する第3の核酸分子の集団を作製する段階；
（d）少なくとも第3の核酸分子の集団を、1つまたは複数の組換え部位を含む少なくとも1つの第2の標的核酸分子と混合する段階；
（e）少なくとも第3の集団の核酸分子の一部またはすべてを、第2の標的核酸分子の一部またはすべてと組み換えさせ、それによって第4の核酸分子の集団を形成する段階；および
（f）第4の集団の他の構成要素とは異なる少なくとも1つの特定の性質、活性または特徴を有する、第4の集団の1つもしくは複数の核酸分子または部分集団を分離、同定または選択し、それによって少なくとも1つの特定の性質、活性または特徴を共有する第5の核酸分子の集団を作製する段階、
を含む方法。
【請求項４５】
段階（c）において同定される少なくとも1つの特定の性質、特徴または活性、および段階（f）において同定される少なくとも1つの特定の性質、特徴または活性が、同じ性質、特徴または活性である、請求項44記載の方法。
【請求項４６】
段階（c）において同定される少なくとも1つの特定の性質、特徴または活性、および段階（f）において同定される少なくとも1つの特定の性質、特徴または活性が、異なる性質、特徴または活性である、請求項44記載の方法。
【請求項４７】
組換え部位が、以下のものからなる群より選択される1つまたは複数の組換え部位を含む、請求項44記載の方法：
（a）lox部位；
（b）psi部位；
（c）dif部位；
（d）cer部位；
（e）frt部位；
（f）att部位；ならびに
（g）組換えを起こす能力を保持している、（a）（b）（c）（d）（e）または（f）の組換え部位の変異体、バリアントおよび誘導体。
【請求項４８】
互いに組換えを行う組換え部位が、同一な7塩基対の重複領域を有するatt部位を含む、請求項47記載の方法。
【請求項４９】
段階（c）または段階（f）において同定される少なくとも1つの特定の性質、特徴または活性が、第3または第4どちらかの核酸分子の集団の個々の構成要素の発現産物の性質、特徴または活性ではない、請求項44記載の方法。
【請求項５０】
少なくとも1つの特定の性質、特徴または活性が、以下のものからなる群より選択される性質、特徴または活性である、請求項49記載の方法：
（a）ストリンジェントな条件下で、別の核酸分子とハイブリダイズする能力；
（b）転写を活性化する能力；
（c）タンパク質と結合する能力；
（d）核酸分子の複製を開始する能力；
（e）細胞分裂中に核酸分子を分離する能力；
（f）核酸分子のウイルス粒子へのパッケージングを導く能力；および
（g）1つまたは複数の制限エンドヌクレアーゼによって切断される能力。
【請求項５１】
段階（c）または段階（f）において同定される少なくとも1つの特定の性質、特徴または活性が、コードされる発現産物の性質、特徴または活性である、請求項44記載の方法。
【請求項５２】
少なくとも1つの特定の性質、特徴または活性が、以下のものからなる群より選択される性質、特徴または活性である、請求項51記載の方法：
（a）リボザイム活性；
（b）tRNA活性；
（c）アンチセンス活性；
（d）別のポリペプチドをコードする核酸とインフレームにある核酸によってコードされる段階；
（e）免疫応答を誘導する能力；
（f）特定のリガンドに対する結合親和性を有する；
（g）タンパク質を細胞内の特定の位置に向かわせる能力；
（h）タンパク質切断を受ける能力；および
（i）翻訳後修飾を受ける能力。
【請求項５３】
少なくとも1つの特定の性質、特徴または活性を有する1つまたは複数の核酸分子を同定するための方法であって、
（a）1つまたは複数の組換え部位を含む第1の核酸分子の集団を提供する段階；
（b）集団内の他の核酸分子とは異なる少なくとも1つの特定の性質、特徴または活性を有する、第1の集団の2つまたはそれ以上の核酸分子を分離、同定または選択し、それによって少なくとも1つの特定の性質、特徴または活性を共有する少なくとも1つの第2の核酸分子の集団を作製する段階；
（d）少なくとも第2の核酸分子の集団を、1つまたは複数の組換え部位を含む少なくとも1つの標的核酸分子と混合する段階；
（e）少なくとも第2の集団の核酸分子の一部またはすべてを、標的核酸分子の一部またはすべてと組み換えさせ、それによって第3の核酸分子の集団を形成する段階；および
（f）集団内の他の核酸分子とは異なる少なくとも1つの特定の性質、特徴または活性を有する、第3の集団の1つまたは複数の核酸分子を分離、同定または選択する段階、
を含む方法。
【請求項５４】
段階（c）において同定される少なくとも1つの特定の性質、特徴または活性、および段階（f）において同定される少なくとも1つの特定の性質、特徴または活性が、同じ性質、特徴または活性である、請求項53記載の方法。
【請求項５５】
段階（c）において同定される少なくとも1つの特定の性質、特徴または活性、および段階（f）において同定される少なくとも1つの特定の性質、特徴または活性が、異なる性質、特徴または活性である、請求項53記載の方法。
【請求項５６】
組換え部位が、以下のものからなる群より選択される1つまたは複数の組換え部位を含む、請求項53記載の方法：
（a）lox部位；
（b）psi部位；
（c）dif部位；
（d）cer部位；
（e）frt部位；
（f）att部位；ならびに
（g）組換えを起こす能力を保持している、（a）（b）（c）（d）（e）または（f）の組換え部位の変異体、バリアントおよび誘導体。
【請求項５７】
互いに組換えを行う組換え部位が、同一な7塩基対の重複領域を有するatt部位を含む、請求項56記載の方法。
【請求項５８】
段階（c）または段階（f）において同定される少なくとも1つの特定の性質、特徴または活性が、第3または第4どちらかの核酸分子の集団の個々の構成要素の発現産物の性質、特徴または活性ではない、請求項53記載の方法。
【請求項５９】
少なくとも1つの特定の性質、特徴または活性が、以下のものからなる群より選択される性質、特徴または活性である、請求項58記載の方法：
（a）ストリンジェントな条件下で、別の核酸分子とハイブリダイズする能力；
（b）転写を活性化する能力；
（c）タンパク質と結合する能力；
（d）核酸分子の複製を開始する能力；
（e）細胞分裂中に核酸分子を分離する能力；
（f）核酸分子のウイルス粒子へのパッケージングを導く能力；
（g）1つまたは複数の制限エンドヌクレアーゼによって切断される能力。
（h）トポイソメラーゼによって別の核酸分子と結合する能力；
（i）別の核酸分子と連結される能力；
（j）相同組換えによって別の核酸分子と組換えを行う能力；
（k）別の核酸分子とアニーリングする能力；および
（l）部位特異的組換えによって別の核酸分子と組換えを行う能力。
【請求項６０】
段階（c）または段階（f）において同定される少なくとも1つの特定の性質、特徴または活性が、コードされる発現産物の性質、特徴または活性である、請求項53記載の方法。
【請求項６１】
少なくとも1つの特定の性質、特徴または活性が、以下のものからなる群より選択される性質、特徴または活性である、請求項60記載の方法：
（a）リボザイム活性；
（b）tRNA活性；
（c）アンチセンス活性；
（d）別のポリペプチドをコードする核酸とインフレームにある核酸によってコードされる；
（e）免疫応答を誘導する能力；
（f）特定のリガンドに対する結合親和性を有する；
（g）タンパク質を細胞内の特定の位置に向かわせる能力；
（h）タンパク質切断を受ける能力；および
（i）翻訳後修飾を受ける能力。
【請求項６２】
温度感受性表現型を宿主細胞に付与する2つまたはそれ以上の遺伝因子を含む組成物。
【請求項６３】
遺伝因子の少なくとも1つが複製起点である、請求項62記載の組成物。
【請求項６４】
複製起点が大腸菌の複製起点である、請求項63記載の組成物。
【請求項６５】
遺伝因子の少なくとも1つが抗生物質耐性マーカーである、請求項62記載の組成物。
【請求項６６】
抗生物質耐性マーカーが以下のものからなる群より選択される、請求項65記載の組成物：
（a）カナマイシン耐性マーカー；
（b）アンピシリン耐性マーカー；および
（c）ゲンタマイシン耐性マーカー。
【請求項６７】
2つまたはそれ以上の遺伝因子が同じ核酸分子上に位置する、請求項62記載の組成物。
【請求項６８】
遺伝因子の2つが同じ核酸分子上に位置する、請求項67記載の組成物。
【請求項６９】
2つの遺伝因子が200ヌクレオチド未満の介在核酸によって隔てられている、請求項68記載の組成物。
【請求項７０】
請求項1記載の方法に従って核酸分子の集団を第2の標的分子に挿入するためのキットであって、以下のものからなる群より選択される1つまたは複数の成分を含むキット：
（a）1つまたは複数の第1の核酸分子の集団；
（b）1つまたは複数の第1の標的核酸分子；
（c）1つまたは複数の第2の標的核酸分子；
（d）1つもしくは複数の組換えタンパク質、または1つもしくは複数の組換えタンパク質を含む組成物；
（e）リガーゼ活性を有する1つまたは複数の酵素；
（f）ポリメラーゼ活性を有する1つまたは複数の酵素；
（g）逆転写酵素活性を有する1つまたは複数の酵素；
（h）制限エンドヌクレアーゼ活性を有する1つまたは複数の酵素；
（i）1つまたは複数のプライマー；
（j）1つまたは複数の緩衝液；
（k）1つまたは複数のトランスフェクション試薬；
（l）1つまたは複数の宿主細胞；
（m）UDGグリコシラーゼ活性を有する1つまたは複数の酵素；
（n）トポイソメラーゼ活性を有する1つまたは複数の酵素；
（o）相同組換えを促進する1つまたは複数のタンパク質；および
（p）キットの成分を用いるための説明書。
【請求項７１】
1つもしくは複数の組換えタンパク質または1つもしくは複数の組換えタンパク質を含む組成物が、att部位間の組換えを触媒しうる、請求項70記載のキット。
【請求項７２】
1つまたは複数の組換えタンパク質を含む組成物が、BP反応、LR反応、またはBP反応およびLR反応の両方を触媒しうる、請求項71記載のキット。
【請求項７３】
第1の核酸分子の集団が、抗体分子の重鎖可変ドメインまたは軽鎖可変ドメインをコードする1つまたは複数のライブラリーを含む、請求項70記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の背景
発明の分野
本発明は一般に、組換え遺伝子技術に関する。より詳細には、本発明は、核酸分子の選択および単離に用いるための組成物および方法に関する。本発明はさらに、個々の核酸分子および核酸分子の集団の調製のための方法、ならびにこれらの方法によって作製される核酸分子に関する。本発明はまた、1つまたは複数の共通の特徴（例えば、特性、活性など）を有する核酸分子を同定および/または単離するためのスクリーニングおよび/または選択の方法、ならびに1つまたは複数の特徴を共有する核酸分子の集団にも関する。
【背景技術】
【０００２】
関連技術
部位特異的リコンビナーゼ
部位特異的リコンビナーゼは、多くの生物（例えば、ウイルスおよび細菌）に存在するタンパク質であり、エンドヌクレアーゼ特性およびリガーゼ特性の両方を備えることが示されている。これらのリコンビナーゼは（場合によっては関連タンパク質とともに）、DNA中の塩基の特異的配列を認識し、そのようなセグメントに隣接するDNAセグメント同士を交換する。リコンビナーゼおよび関連タンパク質は「組換えタンパク質」と総称される。例えば、Landy, A., Current Opinion in Biotechnology 3: 699-707 (1993)を参照されたい。
【０００３】
種々の生物由来のさまざまな組換え系が記載されている。例えば、Hoessら、Nucleic Acids Research 14(6): 2287 (1986)；Abremskiら、J. Biol. Chem. 261: 391 (1986)；Campbell, J. Bacteriol. 174(23): 7495 (1992)；Qianら、J. Biol. Chem. 267: 7794 (1992)；Arakiら、J. Mol. Biol. 225: 25 (1992)；MaeserおよびKahnmann, Mol. Gen. Genet. 230:170-176 (1991)；Espositoら、Nucl. Acids Res. 25: 3605 (1997)を参照されたい。これらの多くはリコンビナーゼのインテグラーゼファミリーに属する（Argosら、EMBO J. 5: 433-440 (1986)；Voziyanovら、Nucl. Acids Res. 27: 930 (1999)。これらの中でおそらく最も研究されているものは、バクテリオファージλ由来のインテグラーゼ/att系（Landy, A. Current Opinions in Genetics and Devel. 3: 699-707 (1993)）、バクテリオファージP1由来のCre/loxP系（HoessおよびAbremski (1990)、Nucleic Acids and Molecular Biology, Vol.4、EcksteinおよびLilley編、Berlin-Heidelberg：Springer-Verlag；pp. 90-109）および出芽酵母2μ環状プラスミド由来のFLP/FRT系（Broachら、Cell 29: 227-234 (1982)）である。
【０００４】
Backman（米国特許第4,673,640号）は、タンパク質を産生するDNAセグメントの組換えを、野生型組換え部位であるattBおよびattPを用いる酵素的な部位特異的組換えによって行うための、λリコンビナーゼのインビボでの使用を開示している。
【０００５】
HasanおよびSzybalski（Gene 56: 145-151 (1987)）は、プロモーターに隣接する野生型attP部位とattB部位との間の分子内組換えのための、インビボでのλIntリコンビナーゼの使用を開示している。これらの部位の向きは互いに対して逆であるため、これは目的の遺伝子に対するプロモーター領域の非可逆的なフリッピング（flipping）を引き起こす。
【０００６】
Palazzoloら(Gene 88: 25-36 (1990))は、クローニングされたDNA配列の外側かつ野生型loxP部位の間に位置する制限部位を含むバクテリオファージλアームを有する、ファージλベクターを開示している。Creリコンビナーゼを発現する大腸菌細胞の、これらのファージベクターへの感染は、loxP部位間の組換え、およびクローニングされたcDNAを含むプラスミドレプリコンのインビボでの切除をもたらす。
【０００７】
Posfaiら(Nucl. Acids Res. 22: 2392-2398 (1994)）は、2つの野生型FRT認識配列によって挟まれた選択マーカーを有する部分的発現ベクターをゲノムDNAに挿入するための方法を開示している。細胞内に存在するFLP部位特異的リコンビナーゼが、ベクターをゲノム中の所定の部位に組み込むために用いられる。レプリコンが機能的である条件下において、このクローニングされたゲノムDNAは増幅されうる。
【０００８】
Bebeeら（米国特許第5,434,066号）は、2つのloxP部位を含むDNAに対して、Creなどの部位特異的リコンビナーゼを部位間のインビボ組換えのために用いることを開示している。
【０００９】
Boyd（Nucl. Acids Res. 21: 817-821 (1993)）は、大腸菌宿主細胞内に存在するCre部位特異的リコンビナーゼが作用する野生型loxP部位を含む脱リン酸化されたベクターとの分子間連結を促進する条件を用いて、平滑末端DNAのクローニングを容易にするための方法を開示している。
【００１０】
Waterhouseら（国際公開公報第93/19172号およびNucleic Acids Res. 21: 2265 (1993)）は、特定の抗体の軽鎖および重鎖を種々のファージベクターのloxP部位とloxP511部位との間にクローニングし、それを新たな大腸菌細胞へのトランスフェクションに用いるインビボでの方法を開示している。Creは宿主細胞において2つの親分子（1つはプラスミド、1つはファージ）に対して作用し、2つの異なるコインテグレート（cointegrate）（loxP部位またはloxP511部位のいずれかにおける組換えにより生じる）および2つの娘分子という平衡状態にある4つの産物を生成し、その1つが所望の産物であった。
【００１１】
SchlakeおよびBode（Biochemistry 33: 12746-12751 (1994)）は、それぞれが野生型およびスペーサー変異型のFRT組換え部位によって挟まれた、規定された染色体位置で発現カセットを交換するためのインビボでの方法を開示している。部位特異的組換えのためにこのFLP/FRT系を用いることにより、二重相互乗換え（double-reciprocal crossover）が培養哺乳動物細胞において媒介されている。
【００１２】
Hartleyら（米国特許第5,888,732号）は、種々の野生型および/または変異型の組換え部位および組換えタンパク質を用いる、種々の核酸分子のインビトロおよびインビボでの組換えクローニングへの使用を含む、核酸セグメントおよび分子の組換え交換のための組成物および方法を開示している。
【００１３】
トランスポゼース
トランスポゼースという酵素ファミリーもレプリコン間の遺伝子情報の移行に用いられている。トランスポゾンは構造的にさまざまであり、単純型または複合型と記載されるが、逆方向に構成されるDNA配列によって挟まれたリコンビナーゼ遺伝子をコードすることが一般的である。トランスポゾンの組込みは、ランダムなこともあれば高度に特異的なこともある。高度に部位特異的なTn7などの代表的なものは、レプリコン間のDNAセグメントのインビボ移動に利用されている（Lucklowら、J. Virol. 67: 4566-4579 (1993)）。
【００１４】
DevineおよびBoeke(Nucl. Acids Res. 22: 3765-3772 (1994))は、DNAセグメントのインビトロでのレシピエントDNA分子への挿入のための人工トランスポゾンの構築を開示している。この系は、酵母TY1ウイルス様粒子のインテグラーゼを利用する。標準的な方法を用いて、目的のDNAセグメントをトランスポゾン様エレメントTY1の末端間にクローニングする。TY1インテグラーゼの存在下において、その結果生じるエレメントは第2の標的DNA分子中にランダムに組み込まれる。
【００１５】
組換え部位
上記の組換えタンパク質および/またはトランスポゼースによって媒介される組込み/組換え反応にとって同じく重要なものが、組込み/組換え反応に関与するDNA分子上にある認識配列であり、これはしばしば「組換え部位」と呼ばれる。これらの組換え部位は、組込みまたは組換えの初期に組換えタンパク質によって認識されて結合される、関与する核酸分子上にあるDNAの離散的な区分またはセグメントである。Creリコンビナーゼに対する認識配列はloxPであり、これは、2つの13塩基対の逆方向反復配列（リコンビナーゼ結合部位として働く）が8塩基対のコア配列を挟み込んだものから構成される34塩基対の配列である。Sauer, B., Curr. Opin. Biotech. 5: 521-527 (1994)の図1を参照のこと。認識配列の他の例には、attB、attP、attLおよびattRの配列があり、これらは組換えタンパク質λ Int.によって認識される。attBは、9塩基対のコア型Int結合部位2つおよび7塩基対の重複領域1つを含む約25塩基対の配列であり、attPは、コア型Int結合部位1つおよびアーム型Int結合部位、ならびに補助タンパク質である組込み宿主因子（IHF）、FISおよび切出し酵素（Xis）に対する部位を含む約240塩基対の配列である。Landy, Current Opinion in Biotechnology 3: 699-707 (1993)を参照のこと；参照として本明細書に組み入れられる米国特許第5,888,732号も参照されたい。
【００１６】
終止コドンおよびサプレッサーtRNA
遺伝子の終わりを知らせるには、真核生物および原核生物のどちらによっても3種類のコドンが用いられる。mRNAに転写された場合、これらのコドンは以下の配列を有する：UAG（アンバー）、UGA（オパール）およびUAA（オーカー）。ほとんどの状況では、細胞はこれらのコドンを認識するtRNA分子を含まない。このため、mRNAを翻訳しているリボソームがこれらのコドンの1つに到達すると、リボソームは停止してRNAから離脱し、mRNAの翻訳を終結する。mRNAからのリボソームの遊離は特定の因子によって媒介される（S. Mottagui-Tabar, NAR 26 (11), 2789, 1998）。インフレーム終止コドン（TAA、TAGまたはTGA）を有する遺伝子は、本来のカルボキシ末端を有するタンパク質をコードする。しかし、サプレッサーtRNAは、終止コドン以後のアミノ酸の挿入および翻訳の継続を引き起こすことができる。
【００１７】
通常であれば終止コドンであるものを認識する変異型tRNA分子は、mRNA分子の翻訳の終結を抑制し、サプレッサーtRNAと呼ばれる。このようなサプレッサーtRNAは数多く発見されている。その例には、アンバー終止コドンの翻訳終結を抑制するsupE、supP、supD、supFおよびsupZサプレッサー、オーカー終止コドンの機能を抑制するsupB、glT、supL、supN、supCおよびsupMサプレッサー、ならびにオパール終止コドンの機能を抑制するglyT、trpTおよびSu-9が非制限的に含まれる。一般に、サプレッサーtRNAは、tRNAのアンチコドンループ内に、通常は終止コドンとして機能するコドンとtRNAとの塩基対合を可能にする、1つまたは複数の変異を含む。変異型tRNAにはその同族アミノ酸残基が付き、その同族アミノ酸残基は終止コドンに遭遇した時に翻訳中のポリペプチドに挿入される。サプレッサーtRNAに関するより詳細な考察については、Eggertssonら (1988) Microbiological Review 52 (3) : 354-374およびEngleerg-Kuklaら (1996)、Escherichia coli and Salmonella Cellular and Molecular Biology、第60章、pp 909-921、Neidhardtら編、ASM Press, Washington, DCを参照されたい。
【００１８】
DNAクローニング
DNAセグメントのクローニングは、多くの研究所における日常的な手法として、かつ多くの遺伝子解析における事前に必要な工程として行われている。これらのクローニングの目的はさまざまであるが、一般的な目的としては以下の2つが考えられる： （1）大きなDNAまたはRNAセグメント（染色体、YAC、PCR断片、mRNAなど）からのDNAの最初のクローニング、これはpUC、pGem、pBlueScriptなどの比較的少数の既知のベクターにおいて行われる、および（2）これらのDNAセグメントの、機能的分析のために特殊化されたベクター中へのサブクローニング。最初のクローニングベクターからより特殊化されたベクターへのDNAセグメントの移行には、多大な時間および努力が費やされる。この移行はサブクローニングと呼ばれる。
【００１９】
クローニングのための基本的な方法は長年知られており、その間ほとんど変化していない。代表的なクローニングのプロトコールは以下の通りである：
（1）目的のDNAを1つまたは2つの制限酵素で消化する；
（2）目的のDNAセグメントが既知である場合は、それをゲル精製する；
（3）適宜、適切な制限酵素による切断、アルカリホスファターゼ処理、ゲル精製などによってベクターを調製する；
（4）切断されていないベクターおよび自己連結したベクターのバックグラウンドを排除するための適切な対照とともに、DNAセグメントをベクターに連結する；
（5）その結果得られたベクターを大腸菌宿主細胞内に導入する；
（6）選択されたコロニーを摘出し、少量の培養物を一晩増殖させる；
（7）DNAミニプレップを作製する；および
（8）単離されたプラスミドを、アガロースゲル（しばしば診断的な制限酵素消化の後に）またはPCRによって分析する。
【００２０】
DNAセグメントをサブクローニングするために使用される特殊化されたベクターは、機能的に多様である。これらには以下のものが非制限的に含まれる：種々の生物において遺伝子を発現させるためのベクター、核酸分子の発現を調節するためのベクター、タンパク質精製を補助するため、または細胞におけるタンパク質の追跡を可能にするための標識を提供するベクター、クローニングされたDNAセグメントの改変（例えば、欠失の作製）のためのベクター、プローブ（例えば、リボプローブ）の合成のためのベクター、DNAシークエンシング用のテンプレートの調製のためのベクター、タンパク質コード領域の同定のためのベクター、種々のタンパク質コード領域の融合のためのベクター、目的のDNAを大量に得るためのベクターなど。個々の研究には、目的のDNAセグメントの、いくつかの異なる特殊化されたベクター中へのサブクローニングが用いられることが一般的である。
【００２１】
サブクローニングは、DNA分子の部分集団を選択するために多数の選択基準を逐次的に用いる場合には、特に時間のかかる工程である。ベクターの基本骨格は分析しようとする核酸分子に非常にさまざまな機能を付与しうるため、集団または部分集団の内部の目的の核酸分子をこれらの特性に基づいて同定することができる。次に、これらの核酸分子の集団を単離し、さらなる部分集団の選択のために用いうる追加的な条件のセットを与える1つまたは複数の次のベクターに移行させることができる。この逐次的な選択および移行の反復プロセスにより、1つまたは複数の所定の特性、特徴または活性を有する集団または部分集団を分離、選択、同定および/または単離することができる。このアプローチを用いる場合に直面する大きな問題の一つは、選択した集団を、さらなる選択のために新たなベクターへと頻繁にサブクローニングする必要があることである。
【００２２】
当技術分野で知られているように、単純なサブクローニング（例えば、DNAセグメントが大きくなく、制限部位がサブクローニングベクターのものと適合する場合のサブクローニング）は1日で行うことができる。しかし、複雑なサブクローニングは、特に未知の配列、長い断片、毒性遺伝子、制限部位の配置が不適切、高度のバックグラウンド、酵素の純度の低さなどがかかわる場合には、数週間かかることがある。このため、DNA断片のサブクローニングはしばしば、できるだけ少ない回数で実施されるべき面倒な仕事であるとみなされる。
【００２３】
DNAセグメントのクローニングを容易にするいくつかの方法は、例えば以下の参考文献に記載されている。
【００２４】
Ferguson, J.ら（Gene 16: 191 (1981)）は、酵母DNAの断片のサブクローニング用のベクターのファミリーを開示している。これらのベクターはカナマイシン耐性をコードする。比較的長い酵母DNAセグメントのクローンを部分的に消化し、サブクローニングベクター中に連結することができる。元々のクローニングベクターがアンピシリンに対する耐性を有する場合には、選択はカナマイシンに対するものと考えられるため、形質転換の前に精製は必要でない。
【００２５】
Hashimoto-Gotoh, T.ら（Gene 41: 125 (1986)）は、ストレプトマイシン感受性遺伝子の内部に一意的なクローニング部位を有するサブクローニングベクターを開示している；ストレプトマイシン耐性のある宿主において、優性感受性遺伝子における挿入または欠失を有するプラスミドのみが、ストレプトマイシン選択に抗して生き残る。
【００２６】
したがって、制限酵素およびリガーゼを用いる従来のサブクローニング法は、時間がかかる上に信頼性も比較的低い。かなりの労働が費やされる上、2日またはそれ以上の日数の後に所望のサブクローンが候補プラスミド中に見いだされなければ、次いで、条件の変更を加えた上で全工程を繰り返されなければならない。
【００２７】
部位特異的リコンビナーゼはDNAのインビボ組換えに用いられているが、インビトロでこの種の酵素を成功裏に用いるためには、いくつかの問題が伴うと予想された。例えば、部位特異性および効率はインビトロでは異なると予想され；トポロジー的に連結された産物が予想され；DNA基質および組換えタンパク質のトポロジーがインビトロでは顕著に異なると予想された（例えば、Adamsら、J. Mol. Biol. 226: 661-73 (1992)を参照されたい）。インビボで長時間続きうる反応は、インビトロでは酵素が不活性化されるまでの著しく短い時間でしか起こらないと予想された。さらに、長時間インキュベートした後の組換え酵素の安定性は不明であり、反応に関与する核酸分子のトポロジー（すなわち、線状、らせん状、超らせん状など）についても同様であった。使用する生物学的宿主には多数のDNA組換え産物が存在し、このためにサブクローニングの信頼性、特異性または効率が不十分なものになると予想された。このため、インビトロ組換え反応は、所望のレベルの産物が得られる程度に十分に効率的ではないと予想された。
【００２８】
組換えクローニング
規定された組換え部位を用いるクローニング系は、以前に、米国特許第5,888,732号および第6,143,557号ならびに以下の関連出願において記載されている：1998年10月23日に提出された米国特許出願第09/177,387号；2000年3月2日に提出された米国特許出願第09/517,466号；および2000年12月11日に提出された米国特許出願第09/732,914号（これらはすべて明確に参照として本明細書に組み入れられる）。要約すると、本出願ならびに直前に参照した特許および出願に記載されているGATEWAY（商標）クローニングシステムは、所望の核酸分子をインビボまたはインビトロにおいてクローニングするための少なくとも1つの組換え部位を含むベクターを利用する。より詳細には、本システムは、野生型（att0）部位から変異した、バクテリオファージλ系を基盤とする1つまたは複数の部位特異的組換え部位（例えば、att1およびatt2）を含むベクターを利用する。各々の変異部位は、同じタイプのその同族パートナーatt部位（すなわち、その結合パートナー組換え部位）（例えば、attB1はattP1と、またはattL1はattR1と）に対する一意的な特異性を有し、他の変異型の組換え部位とも野生型att0部位とも交差反応しないと考えられる。部位特異性の違いにより、所望の分子のディレクショナルクローニングまたは連結が可能になり、これによって所望の配向性を持つクローニングされた分子が得られる。組換え部位によって挟まれた核酸断片のクローニングおよびサブクローニングは、GATEWAY（商標）システムを用いて、レシピエントプラスミド分子（これは時に目的ベクター(destination vector)と呼ばれる）上のatt部位によって挟まれた選択マーカー（例えば、ccdB）を置換することによって行われる。続いて、ccdB感受性宿主株の形質転換およびレシピエント分子上のマーカーに対する陽性選択により、所望のクローンを選択する。哺乳動物細胞および昆虫細胞におけるチミジンキナーゼ（TK）などのように、陰性選択のための同様の戦略（例えば、毒性遺伝子の使用）を他の生物に用いることもできる。
【００２９】
att部位のコア領域内の特定の残基を変異させることにより、多数の異なるatt部位を作製することができる。GATEWAY（商標）に用いられるatt1およびatt2部位の場合のように、各々の追加的な変異により、同じ変異を有するその同族パートナーatt部位のみと組換えを行い、他の変異型部位とも野生型att部位とも交差反応しないと考えられる一意的な特異性を有する新規att部位が作り出される可能性がある。新規な変異型att部位（例えば、attB 1〜10、attP 1〜10、attR 1〜10およびattL 1〜10）は、2000年3月2日に提出された以前の米国特許出願第09/517,466号に記載されており、これは明確に参照として本明細書に組み入れられる。
【００３０】
一意的な特異性を有する他の組換え部位（すなわち、第1の部位がその対応する部位とは組換えを行うと考えられ、異なる特異性を有する第2の部位とは組換えを行わない、または実質的に組換えを行わないと考えられる）を、本発明の実施に用いてもよい。適した組換え部位の例には、以下のものが非制限的に含まれる：loxP部位；loxP部位の変異体、バリアントまたは誘導体、例えばloxP511（米国特許第5,851,808号を参照）；frt部位；frt部位の変異体、バリアントまたは誘導体；dif部位；dif部位の変異体、バリアントまたは誘導体；psi部位；psi部位の変異体、バリアントまたは誘導体；cer部位；およびcer部位の変異体、バリアントまたは誘導体。このような組換え部位は、多数の核酸分子またはセグメントを結合または連結させるため、より詳細には、このような多数のセグメント（例えば、2、3、4、5、7、10、12、15、20、30、50、75、100、200個など）を、目的ベクターを含む任意のGATEWAY（商標）ベクターなどのような、1つまたは複数の組換え部位（例えば、2、3、4、5、7、10、12、15、20、30、50、75、100、200個など）を含む1つまたは複数のベクター（例えば、2、3、4、5、7、10、12個など）中にクローニングするために用いうる。
【００３１】
選択
選択は、所望または所定の特性、特徴または活性を有する核酸分子を入手するために用いられる最も一般的な方法の一つである。目的の核酸分子をベクター中にクローニングすると、そのベクターは特定の構造的および/または機能的な特性（例えば、発現レベルの変化、ヌクレオチド配列の追加など）を備えた目的の核酸分子を提供しうる。同様に、ベクターへの核酸分子の挿入により、ベクターの特性を変化させることができる。これらの変化した特性は、核酸分子のより複雑な集団内または部分集団内の核酸分子を選択または同定するために利用しうる。ひとたび部分集団が選択または同定されれば、その工程を、選択、分離または同定に用いるための異なる特性、特徴または活性を付与する異なるベクターで繰り返す必要があることがしばしばである。1つのベクターから異なるベクターへの変化は一般に、上記の標準的なクローニング法を用いて行われる。しかし、多数回の選択を利用する場合、または核酸の大規模集団を必要とする場合には、従来のクローニング法は効率が低く、長い時間を要する上に費用がかかるおそれがある。さらに、クローニング工程における誤りは、選択もしくは単離された核酸分子、またはその集団もしくは部分集団の完全な喪失を招き、それによってそれらの選択または単離に用いた時間および費用が無駄になるおそれがある。
【００３２】
したがって、知られている制限酵素およびリガーゼの使用を上回る利点をもたらす、核酸分子の集団、部分集団またはライブラリーの単離および操作のための代替的な方法を提供することには、長い間望まれてきた需要がある。
【発明の開示】
【００３３】
発明の概要
本発明は、個々の核酸分子および核酸分子の集団の調製のための方法、ならびにこれらの方法によって作製される核酸分子に関する。本発明はまた、1つまたは複数の共通の特徴（例えば、特性、活性など）を有する核酸分子を同定および/または単離するためのスクリーニングおよび/または選択の方法、ならびに1つまたは複数の特徴を共有する核酸分子の集団にも関する。
【００３４】
本発明はまた、核酸分子の新たな集団を作製するための、組換えクローニングによる、核酸分子の1つまたは複数の集団の、1つまたは複数の標的核酸分子への挿入または移行（インビボまたはインビトロで）を含む方法にも関する。続いて、上記のように標的核酸分子へと挿入または移行された核酸分子を、1つまたは複数の新たなまたは異なる標的核酸分子に挿入または移行させることもできる。さらに、上記の工程における各々または任意の段階で、存在する、または核酸挿入物および/もしくは標的核酸分子のいずれかによって付与される、1つまたは複数の特性または活性を同定するために、1つの核酸分子または核酸分子の集団もしくは部分集団をスクリーニングまたは選択してもよい。
【００３５】
1つの面において、本発明は、1つまたは複数の所望の標的核酸分子内への組換えクローニング（インビボまたはインビトロで）による、核酸分子の集団の一部またはすべての移行に関する。好ましくは、移行される分子の集団または部分集団は1つまたは複数の組換え部位を含み、標的核酸分子は1つまたは複数の組換え部位を含み、移行はそのような分子のそれぞれにある少なくとも1つの組換え部位の組換えによって行われる。このような組換えは、少なくとも1つの組換えタンパク質の存在下で行われることが好ましい。さらに、分子の集団または部分集団の組換えによる新たなまたは異なる標的分子内へのこのような移行は、本発明に従って任意の回数行うことができる。
【００３６】
より特定的な1つの面において、本発明は一部には、核酸分子の集団を1つまたは複数の第2の標的分子（例えば、同じまたは異なる標的分子）内に挿入または移行させるための方法であって、
（a）1つまたは複数の組換え部位を含む少なくとも第1の核酸分子の集団を、1つまたは複数の組換え部位を含む少なくとも1つの第1の標的核酸分子と混合すること；
（b）少なくとも第1の集団の核酸分子の一部またはすべてを、第1の標的核酸分子の一部またはすべてと組み換えさせ、それによって第2の核酸分子の集団を形成すること；
（c）少なくとも第2の核酸分子の集団を、1つまたは複数の組換え部位を含む少なくとも1つの第2の標的核酸分子を混合すること；および
（d）少なくとも第2の集団の核酸分子の一部またはすべてを、第2の標的核酸分子の一部またはすべてと組み換えさせ、それによって第3の核酸分子の集団を形成すること、
を含む方法に関する。
【００３７】
関連した面において、上記の段階（b）または（d）における組換えは、組換えに好都合な条件下で、第1の核酸分子の集団および第1の標的核酸分子を1つまたは複数の組換えタンパク質と混合することによって引き起こされる。
【００３８】
さらなる関連した面において、1つまたは複数の組換えタンパク質は、以下のものからなる群より選択される1つまたは複数のタンパク質を含む：
（a）Cre；
（b）Int；
（c）IHF；
（d）Xis；
（e）Hin；
（f）Gin；
（g）Cin；
（h）Tn3リゾルベース；
（i）TndX；
（j）XerC；および
（k）XerD。
【００３９】
さらに他の関連した面において、1つまたは複数の組換えタンパク質は、（1）分子量が約14,000ダルトン未満である、（2）塩基性アミノ酸残基を少なくとも15％含む、かつ（3）組換えを増強する、少なくとも1つの第2のタンパク質と混合されている。
【００４０】
いくつかの関連した面において、1つまたは複数の第2のタンパク質はFis、リボソームタンパク質、またはFisもしくはリボソームタンパク質の断片を含む。さらに、リボソームタンパク質は、原核生物リボソームタンパク質（例えば、大腸菌リボソームタンパク質S10、S14、S15、S16、S17、S18、S19、S20、S21、L14、L21、L23、L24、L25、L27、L28、L29、L30、L31、L32、L33およびL34の群から選択されるリボソームタンパク質）であってよい。
【００４１】
さらなる関連した面において、核酸分子の集団（例えば、第1の核酸分子の集団）の一部またはすべての構成要素は、合成ライブラリー、cDNAライブラリー、ゲノムライブラリー、ペプチドをコードするライブラリー、またはこれらのライブラリーの組み合わせを含む。ライブラリーが標準化された（normalized）ライブラリーであってもよい。
【００４２】
その他の関連した面において、標的核酸分子（例えば、第1または第2の標的核酸分子）の一部もしくはすべて、核酸分子の集団（例えば、第1または第2の核酸分子の集団）の個々の構成要素の一部もしくはすべて、または標的核酸分子および核酸分子の集団の個々の構成要素の両方は、線状核酸分子である。いかなるイベントにおいても、このような分子は一般的には線状、環状、超らせん状などを含む任意の形態でありうる。
【００４３】
さらに他の関連した面において、標的核酸分子の一部もしくはすべて、および/または核酸分子の集団の個々の構成要素の一部もしくはすべては、（1）少なくとも2つの組換え部位、または（2）少なくとも1つの組換え部位および少なくとも1つの制限エンドヌクレアーゼ部位、少なくとも1つのトポイソメラーゼクローニング部位、相同組換えのための少なくとも1つの部位、もしくは別の核酸分子と連結されうる少なくとも1つの他の部位、を含む。もう1つの面において、このような標的分子および/またはこのような集団のすべてまたは少なくとも一部は、（1）少なくとも2つの組換え部位、または（2）少なくとも1つの組換え部位および少なくとも1つの制限エンドヌクレアーゼ部位、少なくとも1つのトポイソメラーゼクローニング部位、相同組換えのための少なくとも1つの部位、もしくは別の核酸分子と連結されうる少なくとも1つの他の部位、によって挟まれている。
【００４４】
さらなる関連した面において、第1の核酸分子の集団の個々の構成要素は、1つの組換え部位および1つの制限エンドヌクレアーゼ部位によって挟まれている。
【００４５】
特定の態様において、本発明の方法に用いられる分子の組換え部位は、以下のものからなる群より選択される1つまたは複数の組換え部位を含みうる：
（a）lox部位；
（b）psi部位；
（c）dif部位；
（d）cer部位；
（e）frt部位；
（f）att部位；ならびに
（g）組換えを起こす能力を保持している、（a）（b）（c）（d）（e）または（f）の組換え部位の変異体、バリアントおよび誘導体。
【００４６】
関連した態様において、本発明の方法に用いられる分子の組換え部位は、同一な7塩基対の重複領域を有するatt部位を含みうる。より特定的な態様において、これらの組換え部位の7塩基対の重複領域の最初の3つのヌクレオチドは、以下のものからなる群より選択されるヌクレオチド配列を含みうる：
（a）AAA；
（b）AAC；
（c）AAG；
（d）AAT；
（e）ACA；
（f）ACC；
（g）ACG；
（h）ACT；
（i）AGA；
（j）AGC；
（k）AGG；
（l）AGT；
（m）ATA；
（n）ATC；
（o）ATG；および
（p）ATT。
【００４７】
さらなる特定の態様において、これらの組換え部位の7塩基対の重複領域の最初の3つのヌクレオチドは、以下のものからなる群より選択されるヌクレオチド配列を含みうる：
（a）CAA；
（b）CAC；
（c）CAG；
（d）CAT；
（e）CCA；
（f）CCC；
（g）CCG；
（h）CCT；
（i）CGA；
（j）CGC；
（k）CGG；
（l）CGT；
（m）CTA；
（n）CTC；
（o）CTG；および
（p）CTT。
【００４８】
さらなる特定の態様において、これらの組換え部位の7塩基対の重複領域の最初の3つのヌクレオチドは、以下のものからなる群より選択されるヌクレオチド配列を含みうる：
（a）GAA；
（b）GAC；
（c）GAG；
（d）GAT；
（e）GCA；
（f）GCC；
（g）GCG；
（h）GCT；
（i）GGA；
（j）GGC；
（k）GGG；
（l）GGT；
（m）GTA；
（n）GTC；
（o）GTG；および
（p）GTT。
【００４９】
さらなる特定の態様において、これらの組換え部位の7塩基対の重複領域の最初の3つのヌクレオチドは、以下のものからなる群より選択されるヌクレオチド配列を含みうる：
（a）TAA；
（b）TAC；
（c）TAG；
（d）TAT；
（e）TCA；
（f）TCC；
（g）TCG；
（h）TCT；
（i）TGA；
（j）TGC；
（k）TGG；
（l）TGT；
（m）TTA；
（n）TTC；
（o）TTG；および
（p）TTT。
【００５０】
特定の態様において、標的核酸分子の一部またはすべて（例えば、第1または第2の標的核酸分子）は、ベクター（例えば、pDONR201、pDONR212、pDONR212(F)、pDONR212(R)、pDONR205およびpDONR207からなる群より選択されるベクター）である。もう1つの面において、分子の集団の構成要素の一部またはすべてはベクターである。
【００５１】
さらなる特定の態様においては、核酸分子（例えば、cDNA分子）の集団を、これらの集団の個々の構成要素が一方または両方の末端に少なくとも1つの組換え部位（例えば、attL部位）を有するように調製することができる。1つの特定の面において、このような組換え部位はattL部位またはその変異体、バリアントもしくは誘導体である。さらに、これらのattL部位（またはその変異体、バリアントもしくは誘導体）を、attR部位（またはその変異体、バリアントもしくは誘導体）との組換えが生じた際に、集団の個々の構成要素が一方または両方の末端にattB部位（またはその変異体、バリアントもしくは誘導体）を有するように配置することもできる。したがって、本発明は、attL部位（またはその変異体、バリアントもしくは誘導体）を少なくとも1つの末端に含む核酸分子（例えば、cDNA分子）の集団の構築を含む。核酸分子のこのような集団は、発現クローンを作製するためにベクター中に直接挿入しうる。
【００５２】
本発明はまた、以上の方法によって調製された核酸分子の集団、ならびに、これらの核酸分子を含む組成物、これらの分子の集団の個々の構成要素、これらの集団を含む宿主細胞（例えば、原核細胞または真核細胞）の集団、および、これらの集団の個々の宿主細胞（例えば、大腸菌細胞などの個々の細菌細胞、または酵母細胞、植物細胞または動物細胞などの個々の真核細胞）も提供する。
【００５３】
本発明はさらに、少なくとも1つの特定の性質、特徴または活性を有する1つまたは複数の核酸分子を同定するための方法であって、
（a）1つまたは複数の組換え部位を含む少なくとも第1の核酸分子の集団を、1つまたは複数の組換え部位を含む少なくとも1つの第1の標的核酸分子と混合すること；
（b）少なくとも第1の集団の核酸分子の一部またはすべてを、第1の標的核酸分子の一部またはすべてと組み換えさせ、それによって第2の核酸分子の集団を形成すること；
（c）第2の集団の他の構成要素とは異なる少なくとも1つの特定の性質、活性または特徴を有する、第2の集団の1つもしくは複数の核酸分子または部分集団を分離、同定または選択し、それによって少なくとも1つの特定の性質、活性または特徴を共有する第3の核酸分子の集団を作製すること、ならびに選択的には；
（d）少なくとも第3の核酸分子の集団を、1つまたは複数の組換え部位を含む少なくとも1つの第2の標的核酸分子と混合すること；
（e）少なくとも第3の集団の核酸分子の一部またはすべてを、第2の標的核酸分子の一部またはすべてと組み換えさせ、それによって第4の核酸分子の集団を形成すること；および
（f）第4の集団の他の構成要素とは異なる少なくとも1つの特定の性質、活性または特徴を有する、第4の集団の1つもしくは複数の核酸分子または部分集団を分離、同定または選択し、それによって少なくとも1つの特定の性質、活性または特徴を共有する第5の核酸分子の集団を作製すること、
を含む方法を提供する。
【００５４】
さらに、上記の段階（a）〜（c）および/または（d）〜（f）を任意の回数にわたって繰り返してもよい。すなわち、本発明によれば、単回または複数回の組換えおよび選択または同定を行うことにより、1つまたは複数の所望の性質、活性または特徴を有する1つまたは複数の分子を入手しうる。したがって、本発明は、選択された構成要素を集団から分離および同定するための強力かつ効率的なツールを提供する。
【００５５】
関連した面において、本発明に従って同定される少なくとも1つの特定の性質、特徴または活性は、同じ性質、特徴または活性でも異なるものでもよい。さらに、少なくとも1つの特定の性質、特徴または活性が、選択、同定もしくは分離された構成要素の個々の構成要素または核酸分子の集団内に存在する他の分子の発現産物の性質、特徴または活性でなくともよい（例えば、少なくとも1つの特定の性質、特徴または活性が、標的核酸分子の性質、特徴または活性であってもよい）。加えて、少なくとも1つの特定の性質、特徴または活性が、以下のものからなる群より選択される性質、特徴または活性であってもよい（しかし、これらには限定されない）：
（a）ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、分子内（例えば、分子内「二次」構造を形成する）または別の核酸分子とハイブリダイズする能力；
（b）転写を活性化する能力；
（c）タンパク質と結合する能力；
（d）核酸分子の複製を開始する能力；
（e）細胞分裂中に核酸分子を分離する能力；
（f）核酸分子のウイルス粒子へのパッケージングを導く能力；
（g）1つまたは複数の制限エンドヌクレアーゼによって切断される能力；
（i）トポイソメラーゼによって（例えば、トポイソメラーゼクローニングにより）別の核酸分子と結合する能力；
（j）別の核酸分子と連結される能力；
（k）相同組換えによって別の核酸分子と組換えを行う能力；
（l）別の核酸分子とアニーリングする能力；および
（m）部位特異的組換えによって別の核酸分子と組換えを行う能力。
【００５６】
さらなる関連した面において、少なくとも1つの特定の性質、特徴または活性は、コードされる発現産物の性質、特徴または活性でありうる。例えば、少なくとも1つの特定の性質、特徴または活性は、以下のものからなる群より選択される性質、特徴または活性でありうる：
（a）リボザイム活性；
（b）tRNA活性；
（c）アンチセンス活性；
（d）別のポリペプチドをコードする核酸とインフレームにある核酸によってコードされる；
（e）免疫応答を誘導する能力；
（f）特定のリガンドに対する結合親和性を有する；
（g）タンパク質を細胞内の特定の位置に向かわせる能力；
（h）タンパク質切断を受ける能力；および
（i）翻訳後修飾を受ける能力。
【００５７】
本発明はまた、少なくとも1つの特定の性質、特徴または活性を有する1つまたは複数の核酸分子を同定するための方法であって、
（a）1つまたは複数の組換え部位を含む第1の核酸分子の集団を提供すること；
（b）集団内の他の核酸分子とは異なる少なくとも1つの特定の性質、特徴または活性を有する、第1の集団の2つまたはそれ以上の核酸分子を分離、同定または選択し、それによって少なくとも1つの特定の性質、特徴または活性を共有する少なくとも1つの第2の核酸分子の集団を作製すること；
（c）少なくとも第2の核酸分子の集団を、1つまたは複数の組換え部位を含む少なくとも1つの標的核酸分子と混合すること；
（d）少なくとも第2の集団の核酸分子の一部またはすべてを、標的核酸分子の一部またはすべてと組み換えさせ、それによって第3の核酸分子の集団を形成すること；および
（e）集団内の他の核酸分子とは異なる少なくとも1つの特定の性質、特徴または活性を有する、第3の集団の1つまたは複数の核酸分子を分離、同定または選択すること、
を含む方法も提供する。
【００５８】
本発明はさらに、インビトロスクリーニングによって検出されうる少なくとも1つの特定の性質、特徴または活性を有する1つまたは複数の核酸分子を同定するための方法であって、
（a）1つまたは複数の組換え部位を含む少なくとも第1の核酸分子の集団を、1つまたは複数の組換え部位を含む少なくとも1つの第1の標的核酸分子と混合すること；
（b）少なくとも第1の集団の核酸分子の一部またはすべてを、第1の標的核酸分子の一部またはすべてと組み換えさせ、それによって第2の核酸分子の集団を形成すること；および
（c）集団の他の構成要素とは異なる少なくとも1つの特定の性質、特徴または活性を有する、第2の集団の1つまたは複数の核酸分子を分離、同定または選択し、それによって少なくとも1つの特定の性質、特徴または活性を共有する第3の核酸分子の集団を作製すること、
を含む方法を提供する。
【００５９】
本発明はしたがって、少なくとも1つの特定の性質、特徴または活性を有する1つまたは複数の核酸分子を同定するためにインビトロスクリーニングを行う直前に記載した方法、ならびに、上記の方法によって同定される核酸分子、およびこれらの核酸分子を提供する。
【００６０】
インビトロスクリーニングによって検出されうる性質、特徴および/または活性の例には、分子内または別の核酸分子とハイブリダイズする能力、転写を活性化する能力、タンパク質と結合する能力、核酸分子の複製を開始する能力、1つまたは複数の制限エンドヌクレアーゼによって切断される能力、トポイソメラーゼによって（例えば、トポイソメラーゼクローニングにより）別の核酸分子と結合する能力、別の核酸分子と連結される能力、別の核酸分子とアニーリングする能力、部位特異的組換えによって別の核酸分子と組換えを行う能力、が非制限的に含まれる。
【００６１】
さらに、核酸分子を、コードされる発現産物に付随する性質、特徴または活性を検出するためのインビトロの方法を用いてスクリーニングすることもできる。このような発現産物の性質、特徴または活性には以下のものが非制限的に含まれる：リボザイム活性、tRNA活性、アンチセンス活性、別のポリペプチドをコードする核酸とインフレームにある核酸によってコードされること、免疫応答を誘導する能力、特定のリガンドに対する結合親和性があること、タンパク質切断を受ける能力、および翻訳後修飾を受ける能力。
【００６２】
本発明はさらに、温度感受性表現型を宿主細胞に付与する2つまたはそれ以上の遺伝因子を含む組成物を提供する。特定の態様において、遺伝因子の少なくとも1つは、複製起点（例えば、大腸菌複製起点）または抗生物質耐性マーカー（例えば、カナマイシン耐性マーカー、アンピシリン耐性マーカー、ゲンタマイシン耐性マーカーなど）である。
【００６３】
さらなる特定の態様において、温度感受性表現型を付与する2つまたはそれ以上の遺伝因子は同じ核酸分子に位置する。さらに、2つの遺伝因子が同じ核酸分子に位置する場合、これらの因子は200ヌクレオチド未満の介在核酸によって隔てられていてよい。
【００６４】
本発明はさらに、上記の方法に従って核酸分子の集団を第2の標的分子に挿入するためのキットを提供し、これらのキットは以下のものからなる群より選択される1つまたは複数の成分を含みうる：
（a）1つまたは複数の第1の核酸分子の集団；
（b）1つまたは複数の第1の標的核酸分子；
（c）1つまたは複数の第2の標的核酸分子；
（d）1つもしくは複数の組換えタンパク質、または1つもしくは複数の組換えタンパク質を含む組成物；
（e）リガーゼ活性を有する1つまたは複数の酵素；
（f）ポリメラーゼ活性を有する1つまたは複数の酵素；
（g）逆転写酵素活性を有する1つまたは複数の酵素；
（h）制限エンドヌクレアーゼ活性を有する1つまたは複数の酵素；
（i）1つまたは複数のプライマー；
（j）1つまたは複数の緩衝液；
（k）1つまたは複数のトランスフェクション試薬；
（l）1つまたは複数の宿主細胞；
（m）UDGグリコシラーゼ活性を有する1つまたは複数の酵素（例えば、Invitrogen Corp., Carlsbad, CA, カタログ番号18054-015）；
（n）トポイソメラーゼ活性を有する1つまたは複数の酵素；
（o）相同組換えを促進する1つまたは複数のタンパク質；および
（p）キットの成分を用いるための説明書。
【００６５】
特定の態様において、本キットは、att部位間の組み換えを触媒しうる、1つもしくは複数の組換えタンパク質、または1つまたは複数の組換えタンパク質を含む組成物を含む。より特定的な態様において、組成物は、BP反応、LR反応、またはBP反応およびLR反応の両方を触媒しうる、1つまたは複数の組換えタンパク質を含む。
【００６６】
関連した態様において、本発明のキットは、抗体分子の重鎖可変ドメインまたは軽鎖可変ドメインをコードする1つまたは複数のライブラリーを含む少なくとも1つの第1の核酸分子の集団を含む。
【００６７】
本発明のその他の態様は、当技術分野で知られている事柄により、以下の本発明の図面および記載により、ならびに特許の請求の範囲により、当業者には明らかである。
【００６８】
発明の詳細な説明
定義
以下の記載には、組換えDNA技術に用いられる多くの用語が広範囲に利用される。このような用語に与えられる範囲を含め、本明細書および特許請求の範囲に対して明確かつ一貫した理解が得られるように、以下の定義を提供する。
【００６９】
副産物
本明細書において用いる場合、「副産物（By-product）」という用語は、クローニングまたはサブクローニングされることが望まれるセグメントを欠く、娘分子（組換えクローニング工程の間に第2の組換えイベント後に生成される新たなクローン）のことを指す。
【００７０】
コインテグレート
本明細書において用いる場合、「コインテグレート（Cointegrate）」という用語は、親（出発）分子の両方を含む、少なくとも1つの本発明の組換え中間体核酸分子のことを指す。コインテグレートは線状でも環状でもよい。コインテグレートから、インビトロ転写翻訳系または適切な宿主細胞株、例えば大腸菌DB3.1（特に大腸菌LIBRARY EFFICIENCY（登録商標）DB3.1（商標）コンピテント細胞）を用いて、RNAおよびポリペプチドを発現させることができる。さらに、コインテグレートを、コインテグレート分子上に認められる選択マーカーを用いて選択することもできる。コインテグレートはインビトロまたはインビボでの選択を可能にするマーカーを含みうる。
【００７１】
宿主
本明細書において用いる場合、「宿主」という用語は、複製可能な発現ベクター、クローニングベクターまたは任意の核酸分子のレシピエントである、任意の原核生物または真核生物のことを指す。核酸分子は、構造遺伝子、転写調節配列（プロモーター、エンハンサー、リプレッサーなど）および/または複製起点を非制限的に含みうる。本明細書において用いる場合、「宿主」「宿主細胞」「組換え宿主」および「組換え宿主細胞」という用語は互換的に用いうる。このような宿主の例については、Maniatisら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York (1982)を参照されたい。
【００７２】
挿入物
本明細書において用いる場合、「挿入物（insert）」という用語（これはほとんどの場合、複数形の「挿入物（inserts）」と互換的に用いられる）には、本発明の方法によって操作しうる所望の核酸セグメントまたは核酸セグメントの集団（図9のセグメントA）が含まれる。挿入物および挿入物が挿入される核酸分子のサイズにはかなりの幅があってよく、決定的に重要ではないが、多くの場合、挿入物はより大きな核酸分子（例えば、ベクター、染色体など）に挿入される。例えば、図2中に「cDNA」と表記された核酸セグメント、および図9中に「挿入物」と表記された核酸セグメントは、それらが挿入されるより大きな核酸分子（すなわち、ベクター）からみれば核酸挿入物である。ほとんどの場合、挿入物は組換え部位（例えば、両端にある少なくとも1つの組換え部位）によって挟まれると考えられる。しかし、ある種の態様においては、挿入物は一端のみに組換え部位を含むと考えられる。さらに、挿入物は線状でも環状でもよい。
【００７３】
挿入物ドナー
本明細書において用いる場合、「挿入物ドナー」という語句は、挿入物を有する、本発明の2つの親核酸分子（例えば、RNAまたはDNA）のうちの1つのことを指す。ほとんどの場合、挿入物ドナー分子は、両端を組換えシグナルに挟まれた挿入物を含む。挿入物ドナーは線状でも環状でもよい。本発明の1つの態様において、挿入物ドナーは環状DNA分子であり、組換えシグナルの外側のクローニングベクター配列をさらに含む（図1を参照のこと）。挿入物の集団または核酸セグメントの集団を用いて挿入物ドナーを作製する場合、挿入物ドナーの集団が得られ、それを本発明に従って用いることができる。このような挿入物ドナー分子の例には、GATEWAY（商標）エントリーベクター（図16A〜16Bに示されたエントリーベクターなど）のほか、ライブラリークローンの作製のための1つまたは複数のattL部位（例えば、attL1、attL2など）と隣接した目的の遺伝子を含む他のベクターが非制限的に含まれる。挿入物ドナーは線状でも環状でもよく、1つまたは複数の組換え部位を含みうる。
【００７４】
産物
本明細書において用いる場合、「産物」という用語は、組換えクローニング工程の際に第2の組換えイベントの後に生成される、AおよびDの配列を含む所望の娘分子の一方のことである（図1を参照のこと）。産物は、クローニングまたはサブクローニングしようとする核酸分子を含む。本発明によれば、挿入物ドナーの集団を用いる場合には、その結果生じる産物分子の集団は挿入物ドナーの挿入物の集団の全体または一部を含むと考えられる。さらに、挿入物ドナーは一般に、挿入物ドナーの当初の挿入物の代表的な集団を含むと考えられる。産物分子は線状でも環状でもよく、1つまたは複数の組換え部位を含みうる。
【００７５】
標的核酸分子
本明細書において用いる場合、「標的核酸分子」という語句は、組換えによって目的の核酸分子（例えば、ライブラリーのcDNA分子）と結合する核酸分子のことを指す。標的核酸分子の例には、合成核酸分子、cDNA、染色体、ファージゲノム、プラスミド（例えば、目的ベクター、ドナープラスミドなど）、1つまたは複数の組換え部位を含む非核酸分子、以上のいずれかのサブポーションなどが非制限的に含まれる。標的核酸分子は一般に、少なくとも1つ（例えば、1つ、2つ、3つ、4つ、5つなど）の組換え部位を含むと考えられる。
【００７６】
転写調節配列
本明細書において用いる場合、「転写調節配列」という語句は、1つまたは複数（例えば、2、3、4、5、7、10個など）の核酸セグメントの（1）1つもしくは複数のメッセンジャーRNAまたは（2）1つもしくは複数の非翻訳RNAへの転写を調節するように作用する、任意のコンフォメーションまたは幾何学的配置にある、核酸分子上に含まれるヌクレオチドの機能的連鎖のことを指す。転写調節配列の例には、プロモーター、内部リボソーム進入部位（IRES）、エンハンサー、リプレッサーなどが非制限的に含まれる。
【００７７】
プロモーター
プロモーターは転写調節配列の一例である。プロモーターは、遺伝子の5'領域、開始コドンの近位に位置する核酸、または非翻訳RNAをコードする核酸である。隣接するDNAセグメントの転写はプロモーター領域から開始される。抑制性プロモーターの転写速度は、抑制物質に応答して減少する。誘導性プロモーターの転写速度は、誘導物質に応答して増加する。構成性プロモーターの転写速度は、一般的な代謝条件の影響下で変化しうるが、特異的に調節されていない。
【００７８】
組換え反応の効率を高めるタンパク質
（1）組換え反応の速度を高める、または（2）組換え反応によって生じる最終産物の量を増加させる、タンパク質またはペプチドのことを指す。このようなタンパク質の例には、Fisタンパク質ならびに大腸菌リボソームタンパク質S10、S14、S15、S16、S17、S18、S19、S20、S21、L14、L21、L23、L24、L25、L27、L28、L29、L30、L31、L32、L33およびL34が含まれる。そのほかの例には、組換え反応の効率を高めるタンパク質断片（例えば、Fisタンパク質断片）がある。さらなる例には、Fisが結合する核酸分子（例えば、配列番号：45または配列番号：46に示されたヌクレオチド配列を含む核酸分子）と結合し、1つまたは複数の組換え反応の効率を高めるタンパク質およびタンパク質断片がある。
【００７９】
組換えクローニングの効率を高めるのに有効な量
組換え反応の効率を高めるタンパク質またはタンパク質断片の量のことを指す。このような量を決定するための方法は以下の実施例9に示されている。一般的には、組換え反応の効率を高めるタンパク質またはタンパク質断片を、タンパク質またはタンパク質断片の非存在下で行った組換え反応と比較して1つまたは複数の組換え反応の効率の測定可能な増加（例えば、少なくとも5％、少なくとも10％、少なくとも15％、少なくとも20％、少なくとも25％、少なくとも30％、少なくとも35％、少なくとも50％などの増加）をもたらす量として含める。Fis活性、ならびに組成物が組換え反応の効率を高めるか否かの評価に用いうるアッセイの一例は、以下の実施例9で説明する「組換えアッセイ」である。
【００８０】
リボソームタンパク質
リボソームのサブユニットの構成要素である、タンパク質またはその変異体もしくは誘導体のことである。本発明によれば、リボソームは原核生物リボソームでも真核生物リボソームでもよい。リボソームの一例は大腸菌リボソームであり、これは30Sおよび50Sサブユニットを含む。
【００８１】
リボソームタンパク質断片
リボソームのサブユニットの構成要素であるタンパク質の断片である。一般に、本発明の実施に用いられるリボソームタンパク質断片は、機能的断片である。「機能的」断片とは、1つまたは複数の組換え反応（例えば、λInt組換え系の組換え反応）の賦活に関して、対応する天然のリボソームタンパク質と実質的に同じ生物活性を有する、天然のリボソームタンパク質の断片またはそのような断片の変異体もしくは誘導体のことを意味する。
【００８２】
精製された
本明細書において用いる場合、精製されたという用語は、精製される分子が、少なくともいくつかの周囲の混入物（例えば、タンパク質、核酸、糖質など）から分離されていることを意味する。したがって、精製されたという用語は、所望の分子を精製工程にかける前および後の両方の周囲の混入物の量に関する、相対的な用語である。一般に、塩、水、緩衝液などは、この定義の目的からは混入物とはみなされない。したがって、所望の核酸からの塩の除去（例えば、脱塩カラムを用いる）は、核酸分子の精製をもたらさない。「実質的に精製された」という用語は、本明細書において用いる場合、精製工程を受ける分子から当初の混入物の少なくとも90％が除去されることを指す。
【００８３】
認識配列
本明細書において用いる場合、「認識配列」という語句は、タンパク質、化合物、DNAまたはRNAの分子（例えば、制限エンドヌクレアーゼ、修飾メチラーゼまたはリコンビナーゼ）が認識して結合する特定の配列のことを指す。本発明において、認識配列は通常、組換え部位のことを指す。例えば、Creリコンビナーゼに対する認識配列はloxPであり、これは、2つの13塩基対の逆方向反復配列（これはリコンビナーゼ結合部位として働く）が8塩基対のコア配列を挟み込んだものから構成される34塩基対の配列である（Sauer, B., Current Opinion in Biotechnology 5: 521-527 (1994)の図1を参照されたい）。認識配列の他の例には、attB、attP、attLおよびattRの配列があり、これらはリコンビナーゼ酵素λインテグラーゼによって認識される。attBは、9塩基対のコア型Int結合部位2つおよび7塩基対の重複領域1つを含む約25塩基対の配列である。attPは、コア型Int結合部位1つおよびアーム型Int結合部位、ならびに補助タンパク質である組込み宿主因子（IHF）、FISおよび切出し酵素（Xis）に対する部位を含む約240塩基対の配列である（Landy, Current Opinion in Biotechnology 3: 699-707 (1993)を参照されたい）。そのような部位を、本発明の方法における産物の産生が増強されるように、本発明に従って操作することもできる。例えば、そのように操作された部位が組換え反応を非可逆的にするP1ドメインおよびH1ドメイン（例えば、attRまたはattP）を含まない場合には、何らかの方法でこれらの部位のドメインが改変されたことを示すために、このような部位はattR'またはattP'と呼ばれる。
【００８４】
組換えタンパク質
本明細書において用いる場合、「組換えタンパク質」という語句には、1つまたは複数の組換え部位（例えば、2、3、4、5、7、10、12、15、20、30、50箇所など）がかかわる組換え反応に関与する、切出しタンパク質もしくは組込みタンパク質、酵素、補助因子または関連タンパク質が含まれ、これらは野生型タンパク質（Landy、Current Opinion in Biotechnology 3: 699-707 (1993)を参照されたい）でも、それらの変異体、誘導体（例えば、組換えタンパク質配列またはその断片を含む融合タンパク質）、断片およびバリアントでもよい。組換えタンパク質の例には、Cre、Int、IHF、Xis、Flp、Fis、Hin、Gin、φC31、Cin、Tn3リゾルベース、TndX、XerC、XerD、Tn7、TnpX、Hjc、Gin、SpCCE1およびParAが含まれる。組換えタンパク質のそのほかの例には、ビブリオ・フィッシェリ（Vibrio fischeri）スーパーインテグロンInVfi部位特異的リコンビナーゼIntIA（IntIA）（例えば、GenBankアクセッション番号AY014400を参照）、キサントモナス・カンペストリス（Xanthomonas campestris pv. campestris）スーパーインテグロンInXca部位特異的リコンビナーゼIntIA（intIA）（例えば、GenBankアクセッション番号AF324483を参照）、ネズミチフス菌（Salmonella typhimurium）リコンビナーゼ、トランスポゼース（tnpA）（例えば、GenBankアクセッション番号AF117344を参照）、バクテリオファージmv4 ORFI2、リコンビナーゼ（int）（例えば、GenBankアクセッション番号U15564を参照）、淋菌（Neisseria gonorrhoeae）部位特異的リコンビナーゼ（gcr）（例えば、GenBankアクセッション番号U82253を参照）、ウェルシュ菌（Clostridium perfringens）トランスポゾンTn4451部位特異的リコンビナーゼ（tnpX）（例えば、GenBankアクセッション番号U15027を参照）、バチルス・チューリンゲンシス・モリソニ（Bacillus thuringiensis morrisoni）EG2158トランスポゾンTn5401部位特異的リコンビナーゼ（tnpl）（例えば、GenBankアクセッション番号U03554参照）、およびアナベナ属（Anabaena sp.）の発生段階に応じて調節される部位特異的リコンビナーゼ（xisF）（例えば、GenBankアクセッション番号L23220を参照）も含まれる。
【００８５】
組換え部位
本明細書において用いる場合、「組換え部位」という語句は、組換えタンパク質による組込み/組換え反応に関与する核酸分子上の認識配列のことを指す。組換え部位は、組込みまたは組換えの開始段階の間に部位特異的組換えタンパク質によって認識されて結合される、この関与する核酸分子上の離散的な部分またはセグメントである。例えば、Creリコンビナーゼに対する認識配列はloxPであり、これは2つの13塩基対の逆方向反復配列（これはリコンビナーゼ結合部位として働く）が8塩基対のコア配列を挟み込んだものから構成される34塩基対の配列である（Sauer, B., Curr. Opin. Biotech. 5: 521-527 (1994)の図1を参照のこと）。認識配列の他の例には、attB、attP、attLおよびattRの配列があり、これはリコンビナーゼ酵素λインテグラーゼによって認識される。attBは、9塩基対のコア型Int結合部位2つおよび7塩基対の重複領域1つを含む約25塩基対の配列である。attPは、コア型Int結合部位1つおよびアーム型Int結合部位、ならびに補助タンパク質である組込み宿主因子（IHF）、FISおよび切出し酵素（Xis）に対する部位を含む約240塩基対の配列である（Landy, Curr. Opin. Biotech 3: 699-707 (1993)を参照のこと）。
【００８６】
組換え部位は、任意のさまざまな公知の方法によって分子に付加しうる。例えば、組換え部位は、平滑末端連結、完全もしくは部分的にランダムなプライマーを用いて行われるPCR、組換え部位に隣接した制限部位を用いるベクター中への核酸分子の挿入、またはトポイソメラーゼクローニングの使用により、核酸分子に付加しうる（Shuman, J. Biol. Chem. 269: 32678-32684 (1994)を参照のこと、これはワクシニアDNAトポイソメラーゼを用いた分子クローニングおよびポリヌクレオチド合成を記載している；Invitrogen社2001年カタログ、pp.6-12（Invitrogen Corp., Carlsbad、CA）も参照されたい）。
【００８７】
組換えクローニング
本明細書において用いる場合、「組換えクローニング」という語句は、それによって核酸分子のセグメントまたはこのような分子の集団が、インビトロまたはインビボで、交換、挿入、置換、置き換えまたは改変を受ける、本明細書に記載の方法のことを指す。本明細書における「インビトロ」および「インビボ」とは、それぞれ、宿主細胞の外部（例えば、無細胞系において）または宿主細胞の内部（例えば、宿主細胞によって発現される組換えタンパク質を用いる）で行われる組換えクローニングのことを意味する。
【００８８】
抑制カセット
本明細書において用いる場合、「抑制カセット」という語句は、サブクローニングベクター中に存在する選択マーカーのリプレッサーを含む核酸セグメントのことを指す。
【００８９】
選択マーカー
本明細書において用いる場合、「選択マーカー」という語句は、しばしば特定の条件下で、ある分子もしくはそれを含む細胞を選択すること、またはそれを除外選択することを可能にする核酸セグメントのことを指す。これらのマーカーは、RNA、ペプチドもしくはタンパク質の産生などの（これらに限定されないが）活性をコードしうるか、またはRNA、ペプチド、タンパク質、無機および有機化合物または組成物などのための結合部位を提供しうる。選択マーカーの例には、以下のものが非制限的に含まれる：（1）通常であれば毒性のある化合物（例えば、アンピシリン、テトラサイクリン、カナマイシン、ネオマイシン、ハイグロマイシン、ゼオシン、ブラストマイシン、フレオマイシンおよびG-418などの抗生物質）に対する耐性を付与する産物をコードする核酸セグメント；（2）通常であればレシピエント細胞に存在しない産物をコードする核酸セグメント（例えば、tRNA遺伝子、栄養要求性マーカー）；（3）遺伝子産物の活性を抑制する産物をコードする核酸セグメント；（4）容易に同定可能な産物（例えば、βガラクトシダーゼ、緑色蛍光タンパク質（GFP）、黄色蛍光タンパク質（YFP）、赤色蛍光タンパク質（RFP）、シアン蛍光タンパク質（CFP）、細胞表面タンパク質、受容体タンパク質および他の細胞表面マーカーなどの表現型マーカー）をコードする核酸セグメント；（5）通常であれば細胞の生存および/または機能にとって有害な産物と結合する核酸セグメント；（6）上記の番号1〜5に記載した核酸セグメントのいずれかの活性を別の様式で阻害する核酸セグメント（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド）；（7）基質を修飾する産物と結合する核酸セグメント（例えば、制限エンドヌクレアーゼ）；（8）所望の分子（例えば、特異的タンパク質結合部位）の単離または同定に用いうる核酸セグメント；（9）通常であれば非機能性でありうる特異的なヌクレオチド配列をコードする核酸セグメント（例えば、分子の部分集団のPCR増幅のための）；（10）存在しない場合に、特定の化合物に対する耐性または感受性を直接的または間接的に付与する核酸セグメント；および/または（11）レシピエント細胞において毒性のある産物（例えば、ジフテリア毒素）または比較的毒性の弱い化合物を毒性化合物に変換する産物（例えば、単純ヘルペスチミジンキナーゼ、シトシンデアミナーゼ）をコードする核酸セグメント；（12）それを含む核酸分子の複製、分割または遺伝を阻害する核酸セグメント；および/または（13）条件的な複製機能、例えば、特定の宿主もしくは宿主細胞株における、または特定の環境条件（例えば、温度、栄養条件など）における複製、をコードする核酸セグメント。
【００９０】
したがって、「選択マーカー」という語句には、細胞の生存性とは必ずしも関連しない特定の特性（例えば、β-ガラクトシダーゼ、緑色蛍光タンパク質（GFP）、黄色蛍光タンパク質（YFP）、赤色蛍光タンパク質（RFP）、シアン蛍光タンパク質（CFP）および細胞表面タンパク質などの表現型マーカー）を有する細胞を同定するために用いうる核酸セグメントが含まれる。
【００９１】
さらに、選択はインビトロでもインビボでも行われうる。インビトロ選択は、特定の特定の性質、特徴または活性（例えば、特定のタンパク質と結合する、特定の性質、特徴または活性を有するタンパク質をコードする、など）を有する核酸分子を選択または同定するために用いうる。インビボ選択は、細菌、真菌、植物および動物を含む、任意のさまざまな生物を用いて行いうる。後生動物である生物を選択工程に用いる場合には、選択は、その生物の特定の細胞（例えば、ある器官の細胞）またはその生物の全細胞が示す表現型発現に基づいて行うことができる。
【００９２】
選択スキーム
本明細書において用いる場合、「選択スキーム」という語句は、所望の核酸分子またはそれらと接触している細胞（特に、エントリークローンもしくはベクター、目的ベクター、ドナーベクター、発現クローンもしくはベクター、任意の中間体（例えば、コインテグレートまたはレプリコン）および/または副産物を含む混合物からの、1つまたは複数の産物）の選択、富化または同定を可能にする任意の方法のことを指す。1つの面において、本発明の選択スキームは、1つまたは複数の選択マーカーに依拠する。いくつかの態様の選択スキームは少なくとも2つの構成要素を有し、これらは組換えクローニングの際に結合していても結合していなくともよい。一方の構成要素は選択マーカーである。もう一方の構成要素は、選択マーカーのインビトロもしくはインビボでの発現、または選択マーカーを保有するプラスミドを有する細胞（または核酸分子、例えばレプリコン）の生存を制御する。一般に、この制御エレメントは選択マーカーのリプレッサーまたは誘導物質と考えられるが、選択マーカーの発現を制御するための他の手段を用いることもできる。リプレッサーまたは活性化物質のいずれを用いるかは、当業者に直ちに明らかであるように、マーカーが陽性選択用または陰性選択用のいずれであるか、および種々の核酸セグメントの厳密な配列に依存する。いくつかの態様において、選択スキームは、1つまたは複数の所望の核酸分子（産物など）のみの選択または富化をもたらす。本明細書に定義するように、核酸分子を選択することには、（a）所望の核酸分子の存在に関して選択または富化すること（「陽性選択スキーム」と呼ぶ）、および（b）所望の核酸分子でない核酸分子の存在に関して除外的に選択または富化すること（「陰性選択スキーム」と呼ぶ）が含まれる。
【００９３】
1つの態様において、選択スキーム（これを逆に行うこともできる）は、3つの形態のうちの1つをとり、これについては図9で考察する。第1のものは、本明細書では選択マーカーおよびそのリプレッサーにより例示され、セグメントDを有し、かつセグメントCを欠く分子を選択する。第2のものは、セグメントCを有する分子、およびセグメントDを有する分子を除外選択する。第2の形態の想定される態様は、インビトロ反応産物を導入しようとする細胞に対して毒性のある遺伝子を保有する核酸セグメントを有すると考えられる。毒性遺伝子は、毒性遺伝子産物（毒性タンパク質またはRNA）として発現される核酸であってもよく、またはそれ自体もしくは単独で毒性があってもよい（後者の場合、毒性遺伝子はその古典的な定義である「遺伝性形質」を有すると解釈される）。
【００９４】
このような毒性遺伝子産物の例は当技術分野で周知であり、これには、アポトーシス関連遺伝子（例えば、ASK1、またはbcl-2/ced-9ファミリーのメンバー）；ヒト免疫不全ウイルス（HIV）のものを含むレトロウイルス遺伝子；NP-1などのデフェンシン、逆方向反復配列または対合パリンドローム核酸配列；φX174またはバクテリオファージT4由来のものなどのバクテリオファージ溶解性遺伝子；sacBなどの代謝産物感受性を付与する遺伝子；rpsLなどの抗生物質感受性遺伝子；pheSなどの抗菌薬感受性遺伝子；プラスミドキラー遺伝子；細菌に対する毒性のある遺伝子産物を生じる真核生物転写ベクター遺伝子、例えばGATA-1；抑制機能の非存在下で宿主を死滅させる遺伝子、例えば、kicB、ccdB、φX174 E（Liu, Q.ら、Curr. Biol. 8: 1300-1309 (1998)）；ならびに、レプリンの安定性および/または複製に負の影響を及ぼす他の遺伝子が非制限的に含まれる。または、毒性遺伝子が、制限部位などのようにインビトロで選択可能であってもよい。
【００９５】
第2の形態において、セグメントDは選択マーカーを有する。毒性遺伝子は、ベクタードナー、コインテグレートおよび副産物分子を有する形質転換体を排除すると考えられ、一方、選択マーカーは、産物を含む細胞を選択し、挿入物ドナーのみを有する細胞を除外選択するために用いることができる。
【００９６】
第3の形態は、同一の分子上にセグメントAおよびセグメントDの両方をシス的に有する細胞は選択するが、異なる分子上に両方のセグメントをトランス的に有する細胞は選択しない。この具体例としては、それぞれ1つがセグメントAおよびDの上にある2つの不活性な断片に分割されている選択マーカーが考えられる。
【００９７】
断片は、セグメントが組換えイベントによって一緒になる時にそれらが機能的な選択マーカーを再構成するように、組換え部位に対して配列される。例えば、組換えイベントは、プロモーターを構造核酸分子（例えば、遺伝子）と連結すること、構造核酸分子の2つの断片を連結すること、生存のために必要なヘテロ二量体遺伝子産物をコードする核酸分子を連結すること、またはレプリコンの部分を連結することが可能である。
【００９８】
「選択スキーム」という語句には、細胞の生存性とは必ずしも関連しない特定の特性（例えば、β-ガラクトシダーゼ、緑色蛍光タンパク質（GFP）、黄色蛍光タンパク質（YFP）、赤色蛍光タンパク質（RFP）、シアン蛍光タンパク質（CFP）および細胞表面タンパク質などの表現型マーカー）を有する細胞を同定するために細胞をスクリーニングするための方法も含まれる。ひとたびこのような細胞が同定されれば、それらを集団内の他の細胞から分離してもよい。細胞の生存性とは必ずしも関連しない特定の特性を有する細胞の同定に用いうる方法には、蛍光検出法（例えば、FACS細胞分取法）が含まれる。
【００９９】
核酸分子のインビトロ選択は、任意のさまざまな手段によって行いうる。このような手段の一例は、特定の配列を有するプライマーとハイブリダイズする分子の増幅によるものである。
【０１００】
部位特異的リコンビナーゼ
本明細書において用いる場合、「部位特異的リコンビナーゼ」という語句は、一般的に少なくとも以下の4つの活性（またはそれらの組み合わせ）を有するリコンビナーゼの一型のことを指す：（1）特異的核酸配列の認識；（2）これらの配列の切断；（3）鎖交換に関与するトポイソメラーゼ様活性またはトランスフェラーゼ活性；および（4）核酸の切断された鎖を再封するリガーゼ活性（Sauer, B., Current Oponions in Biotechnology 5: 521-527 (1994)を参照のこと）。鎖交換の機構には、DNA合成の非存在下における特異的核酸配列の切断および再結合が含まれる（Landy, A.(1989) Ann. Rev. Biochem.58: 913-949）。
【０１０１】
相同組換え
本明細書において用いる場合、「相同組換え」という語句は、類似したヌクレオチド配列を有する核酸分子が会合してヌクレオチド鎖を交換する過程のことを指す。このため、第2の核酸分子の所定の位置で相同組換えを行うのに有効な、第1の核酸分子のヌクレオチド配列は、第1の核酸分子と第2の核酸分子の所定の位置との間のヌクレオチド鎖の交換を促すヌクレオチド配列を有すると考えられる。したがって、第1の核酸は一般に、ヌクレオチド塩基対合を促す程度に、第2の核酸分子の一部に対して十分に相補的なヌクレオチド配列を有すると考えられる。
【０１０２】
相同組換えには、組換えを行う2つのパートナー核酸中の相同配列が必要であるが、何らかの特定の配列が必要なわけではない。上記の通り、例えばatt部位などの組換え部位で起こる部位特異的組換えは、本明細書でこの語句を用いる場合、「相同組換え」とはみなされない。しかし、核酸分子中に1つまたは複数の組換え部位を導入するために相同組換えを用いてもよい。さらに、配列の類似性のために、組換え部位を含む核酸分子が相同組換えを生じることもある。
【０１０３】
サブクローニングベクター
本明細書において用いる場合、「サブクローニングベクター」という語句は、適切なレプリコンを通常含む、環状または線状の核酸分子を含むクローニングベクターのことを指す。本発明において、サブクローニングベクター（図9中のセグメントD）は、最終産物中に組み込まれて、クローニングされたDNA挿入物（図9中のセグメントA）に対してまたはそれとともに作用することが望まれる、機能性および/または調節性エレメントも含みうる。また、サブクローニングベクターは、選択マーカーを含むこともでき、および/または、特定の性質、特徴もしくは活性（例えば、プロモーター活性、別の核酸セグメントとハイブリダイズする、など）を有する核酸分子であってもよい。
【０１０４】
ベクター
本明細書において用いる場合、「ベクター」という用語は、1つまたは複数の有用な生物学的または生化学的性質を挿入物に付与する核酸分子（例えば、DNA）のことを指す。その例には、プラスミド、ウイルス、ファージ、自律複製配列（ARS）、動原体、およびインビトロまたは宿主細胞における複製もしくは複製が可能な、または所望の核酸セグメントを宿主細胞内の所望の位置に運搬しうる（例えば、レトロウイルス組込みにより）、他のDNA配列が含まれる。ベクターは、その場所でベクターの本質的な生物学的機能を損なわずに決定可能な様式でDNA配列を切断することができ、その中にDNA断片をその複製およびクローニングを生じさせるためにスプライス導入することができる、1つまたは複数の制限エンドヌクレアーゼ認識部位を有しうる。ベクターはさらに、プライマー部位（例えば、PCRのための）、転写および/または翻訳開始および/または調節部位、組換えシグナル、レプリコン、選択マーカーなどを提供しうる。このため、相同組換え、転位および制限酵素の使用を必要としない所望のDNA断片の挿入方法（例えば、これらには限定されないが、PCR断片のUDGクローニング（米国特許第5,334,575号、これはその全体が参照として本明細書に組み入れられる）、T：Aクローニングなど）も、本発明に従って使用されるクローニングベクター中に断片をクローニングするために利用することができる。クローニングベクターはさらに、クローニングベクターにより形質転換がなされた細胞の同定に用いるのに適した1つまたは複数の選択マーカーを含みうる。
【０１０５】
ベクタードナー
本明細書において用いる場合、「ベクタードナー」という語句は、所望の産物の部分となる核酸ベクターを含む核酸セグメントを有する本発明の2つの親核酸分子（例えば、RNAまたはDNA）のうち1つである。ベクタードナーは、組換え部位によって挟まれた、サブクローニングベクターD（または、挿入物ドナーが既にクローニングベクターを含まない場合、これをクローニングベクターと呼ぶこともできる）およびセグメントCを含む（図9参照）。セグメントCおよび/またはDは、選択スキームに関して上に述べたように、所望の産物娘分子の選択に貢献するエレメントを含みうる。これらの組換えシグナルは同じでも異なってもよく、同一のリコンビナーゼによる作用を受けても異なるリコンビナーゼによる作用を受けてもよい。さらに、ベクタードナーは線状でも環状でもよい。このようなベクタードナー分子の例には、GATEWAY（商標）目的ベクターが含まれ、これには図17A〜17Dに示された目的ベクターなどが非制限的に含まれる。
【０１０６】
本発明のベクタードナーならびに他のベクターは、アデノウイルス、レトロウイルス、バキュロウイルス、アルファウイルス、レンチウイルス、細菌または真核細胞（例えば、酵母細胞、植物細胞、動物細胞）に由来する1つまたは複数の因子を含みうる。このような因子の例には、プロモーター、パッケージングシグナル、コード領域、および宿主細胞染色体への組込みを可能にする核酸が含まれる。本発明のベクタードナーならびに他のベクターは線状でも環状でもよい。
【０１０７】
プライマー
本明細書において用いる場合、「プライマー」という用語は、核酸分子（例えば、DNA分子）の増幅または重合化の際に、ヌクレオチドモノマーの共有結合により伸長する、一本鎖または二本鎖のオリゴヌクレオチドのことを指す。1つの面において、プライマーは、シークエンシングプライマーであってよい（例えば、汎用のシークエンシングプライマー）。もう1つの面において、プライマーは、組換え部位またはそのような組換え部位の部分を含みうる。組換え部位の部分は、目的の組換え部位の、少なくとも2塩基（または塩基対）、少なくとも5〜200塩基、少なくとも10〜100塩基、少なくとも15〜75塩基、少なくとも15〜50塩基、少なくとも15〜25塩基、または少なくとも16〜25塩基を含む。組換え部位の部分を含むプライマーを用いる場合、組換え部位の欠損部分は、新規に合成された核酸分子によるテンプレートによって提供されうる。このような組換え部位は、プライマーの一方または両方の末端および/またはその内部に位置しうる。多くの場合には、さらなる配列が、組換えを増強もしくは改良し、ならびに/または組換えの際に組換え部位を安定化するために、組換え部位に隣接するプライマーに付加される。このような安定化配列は、任意の長さの任意の配列（好ましくは、G/Cに富む配列）でありうる。このような配列のサイズはさまざまであってよく、例えば、約3〜約1000塩基、約3〜約500塩基、約3〜約100塩基、約3〜約60塩基、約3〜約25塩基、約3〜約10塩基、約3〜約10塩基、および約3〜約4塩基である。
【０１０８】
テンプレート
本明細書において用いる場合、「テンプレート」という用語は、増幅、合成またはシークエンシングを行おうとする二本鎖または一本鎖の核酸分子のことを指す。二本鎖DNA分子の場合には、これらの分子の増幅、合成またはシークエンシングを行う前に、その鎖を第1および第2の鎖へと変性させてもよく、または二本鎖分子を直接テンプレートとして用いてもよい。一本鎖テンプレートの場合には、テンプレートの少なくとも一部に対して相補的なプライマーを適切な条件下でハイブリダイズさせ、次いでポリメラーゼ活性を有する1つまたは複数のポリペプチド（例えば、2つ、3つ、4つ、5つ、または7つのDNAポリメラーゼおよび/または逆転写酵素）に、テンプレートの全体または一部に対して相補的な分子を合成させることができる。または、二本鎖テンプレートの場合、1つまたは複数のプロモーター（例えば、2つ、3つ、4つ、5つ、7つまたはそれ以上のプロモーター）を、1つまたは複数のポリメラーゼと組み合わせて用いて、そのテンプレートの全体または一部に対して相補的な核酸分子を作製することもできる。新たに合成される分子は、本発明によれば、元のテンプレートに比較して同じであるかまたは短いと考えられる。新たに合成される分子の合成または伸長の際のミスマッチ取り込みまたは鎖のずれ（slippage）は、1つまたは複数のミスマッチ塩基対を生じうる。したがって、合成される分子は、テンプレートに対して厳密に相補的である必要はない。さらに、核酸テンプレートの集団を、一般的には元のテンプレート集団の代表である核酸分子の集団を作製するために、合成または増幅の際に用いてもよい。
【０１０９】
アダプター
本明細書において用いる場合、「アダプター」という用語は、1つ以上の組換え部位（またはこのような組換え部位の部分）を含むオリゴヌクレオチドまたは核酸断片もしくはセグメント（例えば、DNA）のことを指し、本発明によれば、これを、本明細書に記載の環状または線状の挿入物ドナー分子ならびに他の核酸分子に付加することができる。組換え部位の部分を用いる場合、欠損部分は挿入物ドナー分子によって提供されうる。このようなアダプターは環状または線状分子内の任意の位置に付加されうるが、アダプターを線状分子の一方または両方の末端またはその付近に付加してもよい。さらに、アダプターを、目的の特定の核酸分子の両側に（挟み込んで）位置するように配置してもよい。本発明によれば、アダプターを、標準的な組換え技術（例えば、制限消化および連結）によって目的の核酸分子に付加しうる。例えば、分子を適切な制限酵素でまず消化し、アダプターを切断部位に付加した上で、切断部位にアダプターを含む環状分子を再形成させることにより、アダプターを環状分子に付加することができる。他の面において、アダプターを、相同組換え、RNA分子の組換えなどによって付加することもできる。または、アダプターを、線状分子の1つまたは複数の末端または分子の両端に直接連結させ、それにより、一方または両方の末端にアダプターを有する線状分子を生じさせることもできる。本発明の1つの面においては、アダプターを線状分子の集団（例えば、切断または消化されたcDNAライブラリーまたはゲノムDNA）に付加し、前記集団のすべてまたはかなりの部分が一方または両方の末端にアダプターを含む直線状分子の集団を形成させることができる。
【０１１０】
アダプタープライマー
本明細書において用いる場合、「アダプタープライマー」という語句は、1つまたは複数の組換え部位（またはこのような組換え部位の一部）を含むプライマー分子のことを指し、本発明によれば、これを、本明細書に記載の環状または線状の核酸分子に付加することができる。組換え部位の部分を用いる場合、欠損部分は本発明の核酸分子（例えば、アダプター）によって提供されうる。このようなアダプタープライマーは環状または線状分子内の任意の位置に付加されうるが、アダプタープライマーを線状分子の一方または両方の末端またはその付近に付加してもよい。アダプタープライマーは、種々の状況において、かつ増幅（例えば、PCR）、結合（例えば、酵素的結合または化学的/合成的結合）、組換え（例えば、相同組換えまたは非相同（非正統的）組換え）などを非制限的に含む種々の技法により、環状または線状の核酸分子に1つまたは複数の組換え部位またはその一部を添加するために使用されうる。
【０１１１】
ライブラリー
本明細書において用いる場合、「ライブラリー」という用語は、ヌクレオチド配列の点で異なる核酸分子（環状または線状）の収集物（例えば、少なくとも75、85、96、100、192、288、384、480、500、576、672、768、864、960、1,000、1056、1152、1248、1344、1440、1536、1632、1728、1824、2,000、3,000、5,000、10,000、15,000、20,000、30,000、50,000、70,000、80,000などの個々の核酸分子が異なる配列を含み、100ヌクレオチドを上回る配列同一性のある領域を共有しない、核酸分子の集団）のことを指す。1つの態様において、ライブラリーは、生物の核酸内容物の全体もしくは一部分もしくは有意な部分の代表物であるか（「ゲノム」ライブラリー）、または細胞、組織、器官もしくは生物において発現される核酸分子の全体もしくは一部分もしくは有意な部分（例えば、約50％、約60％、約70％、約80％、約90％、約95％など）の核酸分子の代表物のセット（cDNAライブラリーまたはそれに由来するセグメント）である。また、ライブラリーが、デノボ合成、1つまたは複数の核酸分子の変異誘発などによって作製されるランダムな配列を有する核酸分子を含んでもよい。そのようなライブラリーは、1つのベクターまたは2つもしくはそれ以上（例えば、2、3、4、5、7、10、12、15、20、30、50種など）の異なるベクターに含まれていても含まれていなくてもよい。本発明の実施に用いられるベクターは標準化されたライブラリーであってもよい。さらに、これらのライブラリーは線状または環状の分子を含みうる。
【０１１２】
さらに、本発明のライブラリーには、（1）配列の点では異なるもののベクターではない多数の核酸分子（例えば、cDNA分子、ゲノムDNA分子、合成核酸分子）、これらはベクター中に挿入されていても挿入されていなくてもよい、または（2）ヌクレオチド配列の点で異なる多数のベクターであって、ベクターではない1つまたは少数（例えば、2つ、3つ、4つなど）の核酸分子を含むベクター、が含まれうる。
【０１１３】
標準化されたライブラリー
本明細書において用いる場合、「標準化されたライブラリー」という語句は、比較的多数/より多くのコピー数として当初存在した核酸分子の数が、少数/より少ないコピー数として存在する核酸分子の数を基準として減らされたライブラリーのことを指す。ライブラリーの標準化はしばしば、高発現される遺伝子を表すライブラリーにおけるcDNA分子の数を減らすために行われる。言い換えれば、ライブラリーはしばしば、豊富に存在するRNAを表す核酸分子の数を減らすために標準化される。標準化されたライブラリーを作製するための方法は当技術分野で公知であり、例えば、米国特許第6,001,574号、第5,637,685号、第5,846,721号および第5,763,239号に記載されている（これらの全開示内容は参照として本明細書に組み入れられる）。
【０１１４】
ライブラリーを標準化するための1つの方法は、Patanjaliら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 1943-1947 (1991)に記載されている（その全開示内容は参照として本明細書に組み入れられる）。この方法では、ポリ(A)+RNAの調製物中のすべての分子をほぼ等しく表現したものを含むcDNAライブラリーを構築するために動力学的アプローチを用いる。この方法によれば、選択した範囲のサイズの、ランダムプライミングを行ったcDNA断片をベクター中にクローニングした後に、最適化された条件下で、挿入物のPCRによる増幅、変性および自己アニーリングを行う。大規模であるが完全ではないリアニーリングにより、一本鎖の画分が、さらに豊富に存在するcDNA種から除去される。
【０１１５】
例えば、Rubensteinら、Nucleic Acids Res. 18: 4833-4842 (1990)（その全開示内容は参照として本明細書に組み入れられる）は、cDNAライブラリー間のサブトラクションを可能にするサブトラクティブハイブリダイゼーションのプロトコールを記載している。本方法では、定方向性挿入物を有する一本鎖ファージミドをドライバー（driver）および標的の両方として用いる。Rubensteinらはモデル系を用いて、1回のサブトラクティブハイブリダイゼーションにより、豊富に存在する分子の5,000倍の特異的サブトラクションが生じることを明らかにした。当技術分野では同様の工程も数多く知られている。サブトラクティブハイブリダイゼーションは本発明のライブラリーの標準化に用いうる。
【０１１６】
「標準化された」ライブラリーを、一定数の核酸分子（例えば、1、2、3、4、5、10、20個など）への変異の導入によって作製することもできる。例えば、標準化されたライブラリーを、1つの核酸分子へのランダムな変異の導入によって作製することもできる。変異誘発の完了後に増幅を行うと、変異誘発がなされた個々の核酸分子はほぼ等しい割合で表現されるはずである。さらに、変異を1つまたは複数の核酸分子の一部のみに導入してもよい。例えば、ランダムな変異を、タンパク質の1つのドメインをコードする核酸分子の1つの領域に導入することもできる。このような標準化されたライブラリーは、核酸分子の変異誘発部分によって表現される配列に対して標準化されると思われる。
【０１１７】
増幅
本明細書において用いる場合、「増幅」という用語は、文脈に応じて、ポリメラーゼを用いてヌクレオチド配列のコピーの数を増加させるための任意のインビトロの方法のことを指す。核酸増幅は、DNA分子および/もしくはRNA分子またはプライマーへのヌクレオチドの取り込みをもたらし、それによってテンプレートに対して相補的な新たな分子を形成させる。形成された核酸分子およびそのテンプレートは、さらなる核酸分子を合成するためのテンプレートとして使用することができる。本明細書で用いる場合、1つの増幅反応は多数回の複製から構成されうる。DNA増幅反応には、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）、リガーゼ連鎖反応およびローリングサークル増幅が含まれる（PCT公報・ 国際公開公報第93/00447号および国際公開公報第00/15779号を参照のこと。これらの全開示内容は参照として本明細書に組み入れられる）。さらに、1つのPCR反応は、DNA分子の5〜100「サイクル」の変性および合成からなりうる。
【０１１８】
「増幅」という用語は、インビボでの核酸の産生のことも指し、これはしばしば細胞内への導入後に起こる。このため、例えば、内部でプラスミドが複製しうる細胞の形質転換によってプラスミドを増幅させることもできる。続いてこれらの細胞を培養し、「増幅された」プラスミドを続いて単離することができる。
【０１１９】
オリゴヌクレオチド
本明細書において用いる場合、「オリゴヌクレオチド」という用語は、1つのヌクレオチドのデオキシリボースまたはリボースの3'位と、隣接するヌクレオチドのデオキシリボースまたはリボースの5'位との間のホスホジエステル結合によって結合されたヌクレオチドの共有結合配列を含む、合成または天然分子のことを指す。この用語は、本明細書において用語「核酸分子」および「ポリヌクレオチド」と互換的に用いうるが、これらの用語はいずれも、その用語が明確に言及している何らかの特定の長さの核酸分子を必然的に示すわけではない。
【０１２０】
ヌクレオチド
本明細書において用いる場合、「ヌクレオチド」という用語は、塩基-糖-リン酸の結合物のことを指す。ヌクレオチドは、核酸分子（DNAおよびRNA）の単量体単位である。ヌクレオチドという用語には、リボヌクレオシド三リン酸であるATP、UTP、CTP、GTPおよびデオキシリボヌクレオシド三リン酸（例えばdATP、dCTP、dITP、dUTP、dGTP、dTTP、またはそれらの誘導体）が含まれる。このような誘導体には、例えば［γS］dATP、7-デアザ-dGTPおよび7-デアザ-dATPが含まれる。ヌクレオチドという用語は、本明細書で用いる場合、ジデオキシリボヌクレオシド三リン酸（ddNTP）およびその誘導体のことも指す。ジデオキシヌクレオシド三リン酸の例示的な例には、ddATP、ddCTP、ddGTP、ddITPおよびddTTPが非制限的に含まれる。本発明によれば、「ヌクレオチド」は標識されなくてもよく、周知の技術により検出可能なように標識されてもよい。検出可能な標識には、例えば、放射性同位体、蛍光標識、化学発光標識、生体発光標識および酵素標識が含まれる。
【０１２１】
ハイブリダイゼーション：本明細書において用いる場合、「ハイブリダイゼーション」および「ハイブリダイズすること」という用語は、二本鎖分子を生じる2つの相補的な一本鎖核酸分子（RNAおよび/またはDNA）の塩基対合のことを指す。本明細書で用いる場合、2つの核酸分子は、塩基対が完全に相補的ではなくともハイブリダイズしうる。したがって、ミスマッチ塩基は、当技術分野で周知の適切な条件を用いる場合、2つの核酸分子のハイブリダイゼーションを妨げない。いくつかの面において、ハイブリダイゼーションは「ストリンジェントな条件」下にあると言われる。「ストリンジェントな条件」とは、この語句が本明細書で用いられる場合、50％ホルムアミド、5×SSC（750mM NaCl、75mMクエン酸三ナトリウム）、50mMリン酸ナトリウム（pH 7.6）、5×デンハルト溶液、10％硫酸デキストランおよび20μg/ml変性剪断サケ精子DNAを含む溶液中での42℃での一晩のインキュベーションの後に、約65℃の0.1×SSC中でフィルターを洗浄することを意味する。
【０１２２】
本明細書で用いられる組換えDNA技術ならびに分子生物学および細胞生物学の分野で用いられる他の用語は、適用される技術分野の当業者に一般に理解されると考えられる。
【０１２３】
概要
1つの一般的な面において、本発明は、1つまたは複数（例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、50、100、500、1000、2000、5000、10000、20000、50000、100000個など）の核酸分子を1つまたは複数の他の核酸分子（例えば「標的核酸分子」）に挿入するための方法、第1の核酸分子（例えば「標的核酸分子」）に存在する1つまたは複数の核酸分子を第2の核酸分子（例えば「標的核酸分子」）に移行させるための方法、ならびに特定の性質、特徴、活性および/または特性を有する核酸およびタンパク質を同定するための選択および/またはスクリーニングの方法に関する。多くの態様において、本発明の方法は、核酸分子の集団（例えば、cDNAライブラリー）の使用および/または移行を伴う。本発明はさらに、本発明の方法によって調製される核酸分子の集団、ならびに本発明の方法によって調製および/または単離される核酸分子にも関する。
【０１２４】
本発明はさらに、一部には、核酸分子を1つまたは複数の標的核酸分子（例えば、ベクター、染色体など）に挿入するための方法、核酸分子を標的核酸分子間で移行させるための方法、ならびに特定の特徴、活性、特性および/または特性を有する核酸分子およびタンパク質のスクリーニングおよび選択の方法にも関する。
【０１２５】
さらに、本発明は一部には、1つまたは複数の核酸分子の集団または部分集団の同定および/または単離のための方法および組成物にも関する。特定の態様において、本発明の方法および組成物は、（1）核酸分子（例えば、cDNA分子）をそれらが含まれている核酸分子（例えば、ベクター）から標的核酸分子に移行させること、または（2）核酸分子（例えば、cDNA分子）を標的核酸分子に挿入することを迅速かつ効率的に行うために、GATEWAY（商標）クローニングシステム（これは、米国特許第5,888,732号；PCT公報・国際公開公報第00/52027号；1998年10月23日に提出された米国特許出願第09/177,387号；1999年11月12日に提出された米国特許出願第09/438,358号；2000年3月2日に提出された米国特許出願第09/517,466号；および2000年12月11日に提出された米国特許出願第09/732,914号（これらのすべての開示内容はその全体が参照として本明細書に組み入れられる）に詳細に記載されている）などの組換えクローニングシステムを利用する。異なる標的核酸分子はそれらが挿入された核酸分子に異なる性質、特徴または活性を付与するため（その逆も同様）、核酸分子の集団および部分集団を、本発明の方法を用いて、これらの異なる性質、特徴または活性に基づいて反復的な（例えば、逐次的な）様式で選択することができる。
【０１２６】
1つの特定の面において、本発明は、核酸分子の集団を標的核酸分子間で移行させるための方法を対象とする。詳細には、核酸分子の集団は、少なくとも1つ（例えば、1つ、2つ、3つ、4つ、5つなど）の組換え反応を用いて、1つの標的核酸分子から別の標的核酸分子へと移行される。さらに、標的核酸分子間を移行させる核酸分子の集団は一般に、集団の個々の構成要素の少なくとも1つの末端に位置する、少なくとも1つ（例えば、1つ、2つ、3つ、4つ、5つなど）の組換え部位を含むと考えられる。さらに、標的核酸分子間を移行させる核酸分子の集団は、集団の個々の構成要素の各末端に1つずつが位置する、2つの組換え部位を含みうる。本発明はさらに、本発明の方法によって作製される核酸分子の集団、ならびにこれらの集団の個々の構成要素も含む。
【０１２７】
特定の態様において、本発明は、第1の核酸分子（例えば、ベクター、染色体など）に存在する核酸分子（例えば、cDNAライブラリーまたはゲノムライブラリーの核酸分子）を標的核酸分子内に移行させるための工程の効率を向上させるための方法を対象とする。当業者は理解すると考えられるが、移行の効率の決定の仕方は、個々の移行工程の条件に依存する。例えば、第1の標的分子に挿入される最初の核酸分子の集団（例えば、cDNA分子）の比率を比較する場合には、標的分子間の挿入物の移行効率または異なるベクター分子の集団間の1つの挿入物の移行効率と比較して、移行効率は大きく異なると考えられる。
【０１２８】
したがって、1つの面において、本発明は、核酸分子の集団の核酸分子を第1の標的核酸分子（例えば、ベクター、染色体など）内に移行させ、第1の標的核酸分子のかなりの比率（例えば、約10％よりも多く、約20％よりも多く、約30％よりも多く、約40％よりも多く、約50％よりも多く、約60％よりも多く、約70％よりも多く、約80％よりも多く、約90％よりも多く、約95％よりも多く、約98％よりも多く、約99％よりも多く、など）が挿入物を含むようにするための方法を提供する。1つの関連した面において、第1の標的核酸分子は、ヌクレオチド配列の点で異なる分子の混合型集団を含みうる。当然ながら、挿入物を含む標的分子の比率は、組換えを起こす核酸分子の相対濃度によって異なると考えられる。例えば、核酸分子の集団の核酸分子が第1の標的核酸分子よりも過剰に存在する場合には、一般に、組換え後に挿入物を含む第1の標的核酸分子の比率は相対的に高くなると考えられる。
【０１２９】
もう1つの面において、本発明は、第1の標的核酸分子（例えば、ベクター、染色体など）に含まれる核酸分子の集団の核酸分子を第2の標的核酸分子に移行させ、移行させようとした核酸分子のかなりの比率（例えば、約10％よりも多く、約20％よりも多く、約30％よりも多く、約40％よりも多く、約50％よりも多く、約60％よりも多く、約70％よりも多く、約80％よりも多く、約90％よりも多く、約95％よりも多く、約98％よりも多く、約99％よりも多くなど）が第2の標的核酸分子内に移行されるようにするための方法を提供する。1つの関連した面において、本発明は、第1の標的核酸分子（例えば、ベクター、染色体など）に含まれる核酸分子の集団の核酸分子を第2の標的核酸分子内に移行させ、第2の標的核酸分子のかなりの比率（例えば、約10％よりも多く、約20％よりも多く、約30％よりも多く、約40％よりも多く、約50％よりも多く、約60％よりも多く、約70％よりも多く、約80％よりも多く、約90％よりも多く、約95％よりも多く、約98％よりも多く、約99％よりも多くなど）が挿入物を含むようにするための方法を提供する。言い換えれば、本発明は、核酸分子（例えば、cDNAライブラリーの分子）の、それらが内部に存在する核酸分子（例えば、ベクター、染色体など）から標的核酸分子（例えば、ベクター、染色体など）への効率的な移行のための方法を提供する。
【０１３０】
本発明はさらに、標的核酸分子ではない1つまたは少数の核酸分子の複数のコピーを第1の標的核酸分子から第2の標的核酸分子の集団へと移行させるための方法であって、第2の標的核酸分子のかなりの比率（例えば、約10％よりも多く、約20％よりも多く、約30％よりも多く、約40％よりも多く、約50％よりも多く、約60％よりも多く、約70％よりも多く、約80％よりも多く、約90％よりも多く、約95％よりも多く、約98％よりも多く、約99％よりも多くなど）が組換えを生じ、それによって1つまたは少数の核酸分子の挿入がもたらされるようにする方法を提供する。
【０１３１】
本発明の核酸移行法は、複数（例えば、2、3、4、5、6、7、8、9、10など）の標的核酸分子へと逐次的に移行される核酸分子（例えば、cDNA）をもたらしうる。例えば、1つの標的核酸分子から別の標的核酸分子へと逐次的に移行される核酸分子は、1つまたは複数（例えば、2、3、4、5、6、7、8、9、10など）の中間標的核酸分子へと移行されうる。これらの中間標的核酸分子は任意のさまざまな目的に用いうる。例えば、中間標的核酸分子を、移行される核酸分子を増幅するため、または、移行される分子に/から特定のヌクレオチド配列（例えば、組換え部位；制限部位；シグナルペプチド、エピトープタグ、1つまたは複数の酵素活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；など）を付加または除去するために用いてもよい。
【０１３２】
図1に例示的に示された工程を用いて、その個々の分子のそれぞれが一方または両方の末端に組換え部位を含む第1の核酸分子の集団（例えば、cDNAライブラリー）を、第1の組換え反応によって第1の標的核酸分子（例えば、ベクター、染色体など）に挿入し、第2の核酸分子の集団を作製する。この場合には、第1の標的核酸分子に挿入された核酸分子の集団の個々の構成要素がその後に第2の組換え反応によって第2の標的核酸分子へと移行されて第3の核酸分子の集団を形成することから、第1の標的核酸分子は中間標的核酸分子である。したがって、本発明の方法は、1つまたは複数の組換え反応（例えば、Cre/loxPおよび/またはFlp/FRT組換え系の反応）を用いる、直接的な、または1つもしくは複数の中間標的核酸分子を経由しての、1つの標的核酸分子から別の標的核酸分子への核酸分子の移行を含む。
【０１３３】
当業者は理解すると考えられるが、図1に示された一般的な工程のさまざまな変形物（その多くは本明細書に示されている）が可能であり、それらは本発明の範囲に含まれる。
【０１３４】
1つの一般的な面において、本発明は、核酸分子の集団を標的分子に挿入するための方法を対象とする。特定の態様において、これらの方法は以下を含む：
（a） 1つまたは複数（例えば、1、2、3、4、5、6、8、10など）の組換え部位を含む少なくとも1つの第1の核酸分子の集団（例えば、cDNAライブラリー）を、1つまたは複数（例えば、1、2、3、4、5、6、8、10など）の組換え部位を含む少なくとも1つの（例えば、1、2、3、4、5、6、8、10など）の第1の標的核酸分子と混合すること；
（b）少なくとも1つの第1の集団の核酸分子の一部またはすべてを、第1の標的核酸分子の一部またはすべてと組み換えさせ、それによって第2の核酸分子の集団を形成すること；
（c）少なくとも第2の核酸分子の集団を、1つまたは複数（例えば、1、2、3、4、5、6、8、10など）の組換え部位を含む少なくとも1つの第2の標的核酸分子と混合すること；および
（d）少なくとも第2の集団の核酸分子の一部またはすべてを、第2の標的核酸分子の一部またはすべてと組み換えさせ、それによって第3の核酸分子の集団を形成すること。
【０１３５】
さらに、上に言及した段階（c）および（d）を繰り返し、本明細書において中間標的核酸分子と称する一連の標的核酸分子を経由して第1の核酸分子の集団の個々の構成要素を移行させてもよい。したがって、本発明の方法によれば、第1の核酸分子の集団の個々の構成要素を1つの標的核酸分子から1つまたは複数の他の標的核酸分子に移行させうる。さらに、それぞれの移行により、新たな核酸分子の集団が形成される。
【０１３６】
以下に考察するように、本発明の実施時に行われる組換え反応に関与する核酸分子（例えば、第1の核酸分子の集団の個々の構成要素、第1の標的核酸分子など）の一方または両方は、線状でも閉環状でもよい。さらに、閉環状核酸分子は弛緩型、負の超らせん状または正の超らせん状のいずれでもよい。
【０１３７】
さらに、核酸分子の線状化のために適した部位が、組換えを起こす分子（例えば、第1の核酸分子の集団の個々の構成要素、第1の標的核酸分子など）の一方または両方に存在してもよい。このような部位の例には、組換え部位および制限酵素認識部位が含まれる。さらに、線状核酸分子を、線状集団を作製するための分子集団の全体にわたる増幅によって作製してもよい。
【０１３８】
一般に、核酸分子の線状化のために適した部位は、それが内部に存在する核酸分子が線状化され、しかも、移行される核酸分子（例えば、cDNA分子）または分子クローニングのために用いられる機能的性質、特徴もしくは活性（例えば、選択マーカー、複製起点など）を付与する核酸に対してほとんどまたは全く影響を及ぼさないように設計されると考えられる。上記のように、このような部位の例には、稀な配列を認識する組換え部位および制限部位が含まれる。これらの部位は、ほぼすべての場合に核酸が望ましい位置のみで切断されるように核酸分子を切断するために用いうる。このため、ゲノムライブラリーを含む分子の集団を例えば線状化する場合には、ライブラリーを構成する核酸分子は極めて稀な場合にしか切断されないと考えられる。さらに、用いる線状化の方法が、特定の核酸分子を移行工程から排除させる懸念がある場合には、限界消化物（limit digest）を用いてもよい。本発明のこの面に用いうる組換え部位は、本明細書の別の箇所に記載されている。
【０１３９】
稀な配列を認識し、かつ本発明に用いうる制限部位には、ISceI（Kinkら、EMBO J. 19: 5562-5566 (2000)を参照）、NotI、SfiI（Caccioら、Gene 219: 73-79 (1998)を参照）、sgfI（Kappelmanら、Gene 160: 55-58 (1995)）および出芽酵母(saccharomyces cerevisiae)のHOヌクレアーゼ（KostrikenおよびHeffron、Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 49: 89-96 (1984)、Nickoloffら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83：7831-5 (1986)を参照）が含まれる。イントロンおよびインテイン（intein）によってコードされるレアカッター酵素であるホーミングエンドヌクレアーゼ（BelfortおよびRoberts、Nucleic Acids Res. 25: 3379-3388 (1997)を参照）も本発明に用いうる。
【０１４０】
多くの場合、組換え反応は、核酸分子の集団および標的核酸分子の特定の核酸濃度で起こることが望ましいと考えられる。例えば、核酸分子の集団の核酸分子（例えば、cDNAライブラリー/発現クローン）は、約0.1ng/μl、約0.5ng/μl、約1.0ng/μl、約1.5ng/μl、約2.0ng/μl、約2.5ng/μl、約3.0ng/μl、約4.0ng/μl、約5.0ng/μl、約6.0ng/μl、約7.0ng/μl、約8.0ng/μl、約9.0ng/μl、約10ng/μl、約12ng/μl、約13ng/μl、約15ng/μl、約20ng/μl、約25ng/μl、約40ng/μl、約50ng/μl、約70ng/μl、約100ng/μl、約150ng/μl、約200ng/μl、約250ng/μl、約300ng/μl、約350ng/μl、約400ng/μl、約500ng/μl、約600ng/μl、約700ng/μl、約800ng/μl、約900ng/μlまたは約1000ng/μlを含む、さまざまな濃度で存在しうる。
【０１４１】
さらに、標的核酸分子（例えば、pDONRプラスミド、目的ベクター）も、約0.1ng/μl、約0.5ng/μl、約1.0ng/μl、約1.5ng/μl、約2.0ng/μl、約2.5ng/μl、約3.0ng/μl、約4.0ng/μl、約5.0ng/μl、約6.0ng/μl、約7.0ng/μl、約8.0ng/μl、約9.0ng/μl、約10ng/μl、約12ng/μl、約13ng/μl、約15ng/μl、約20ng/μl、約25ng/μl、約40ng/μl、約50ng/μl、約70ng/μl、約100ng/μl、約150ng/μl、約200ng/μl、約250ng/μl、約300ng/μl、約350ng/μl、約400ng/μl、約500ng/μl、約600ng/μl、約700ng/μl、約800ng/μl、約900ng/μlまたは約1000ng/μlを含む、さまざまな濃度で存在しうる。
【０１４２】
以下に考察するように、多くの場合には、核酸分子の集団は組換え反応を制約する成分であることが望ましいと考えられる。このような場合、標的核酸分子は通常、核酸分子の集団に対して過剰に存在すると考えられる。標的核酸分子と核酸分子の集団との比はかなりの幅にわたってよく、例えば、約0.1：1、約0.2：1、約0.4：1、約0.5：1、約1.0：1、約1.5：1、約2：1、約2.5：1、約3：1、約3.5：1、約4：1、約4.5：1、約5：1、約5.5：1、約6：1、約6.5：1、約7：1、約7.5：1、約8：1、約8.5：1、約9：1、約9.5：1、約10：1、約11：1、約12：1、約13：1、約14：1、約15：1、約17：1、約20：1、約22：1、約25：1、約27：1、約30：1、約35：1、約40：1、約45：1、約50：1、約60：1、約70：1、約80：1、約90：1または約100：1でありうる。
【０１４３】
1つの組換え反応に関与する最初の核酸分子（例えば、第1の核酸分子の集団、第1の標的核酸分子など）または存在する他の核酸分子が、その後の組換え反応を実質的に妨げない場合、または排除されうる（例えば、除去される、分解される、大幅に希釈されるなど）場合には、移行工程のすべてを単一チューブ内で効率的に行うことができる。図2における説明を例示を目的として用いると、発現クローンまたはpDONRプラスミドが（1）LRクロナーゼ（LR クロナーゼ）（商標）により触媒される組換え反応を実質的に妨げず、（2）この反応の発現クローン産物の同定も妨げないと考えられる場合には、例えば、エントリークローン（すなわち、第2の核酸分子の集団）の増幅を行う必要はないと考えられ、核酸のライブラリーの移行を単一チューブ内で行うことができる。
【０１４４】
1つの組換え反応に関与する核酸分子が、本発明の工程におけるその後のイベントを妨げる恐れがある1つの様式は、後に形成された核酸分子の集団の個々の構成要素とともに細胞の同時形質転換を行うことによる。ここでも図2に示した工程を例示を目的として用いると、最初の発現クローンおよびその産物である発現クローンはそれぞれアンピシリン耐性マーカーを含む。したがって、最初の発現クローンのかなりの量が存在し、細胞の形質転換を行う能力を保っていれば、最初の発現クローンは産物である発現クローンとともに細胞の同時形質転換を行うことができ、それによって行程全体の効率は低下すると考えられる。
【０１４５】
特定の核酸分子の細胞間の移行を容易にするために、接合伝達（conjugative transfer）を用いてもよい。図7に示された工程を例示を目的として用いると、この図に示されたpDONRベクターは、接合時にドナー細胞からレシピエント細胞へのベクターの移行をもたらすCDT起点（oriT）を含む。本質的には、oriTを含むベクターのみが接合時に伝達されると考えられる。接合伝達の方法は、Schaferら、米国特許第5,346,818号に記載されており、その全開示内容は参照として本明細書に組み入れられる。したがって、これらの分子の細胞間での選択的移行をもたらす構成要素を含む核酸分子、ならびに本発明の工程におけるこのような分子の使用は、本発明の範囲に含まれる。
【０１４６】
最初の核酸分子による干渉に関連して起こる可能性のある問題は、さまざまなやり方で軽減または防止することができる。例えば、組換えを起こす核酸分子の集団の濃度を、標的核酸分子の濃度よりも低く保つことが可能である。すなわち、核酸分子の集団は組換え反応における制約因子であると考えられる。さらに、第1の組換え反応を可能な限り完了に導くために、組換えタンパク質を反応混合物中に比較的高い濃度で含めることもできる。また、その後の段階で干渉する恐れのある組換え反応の産物を線状化した後に、1つまたは複数の遊離端を有する核酸分子を消化する1つまたは複数のヌクレアーゼで処理することもできる。このような酵素の例には、λエキソヌクレアーゼ、エキソヌクレアーゼI、エキソヌクレアーゼIIIおよびエキソヌクレアーゼV、ならびにU70（すなわち、ヒトヘルペスウイルス6のアルカリエキソヌクレアーゼ、GenBankアクセッション番号NP_042963を参照のこと）が含まれる。したがって、本発明は、組換え反応の産物をエキソヌクレアーゼで処理する方法を含む。さらに、標準化されたライブラリーの作製に関して述べたように、核酸分子をサブトラクティブハイブリダイゼーションによって除去してもよい。言い換えれば、本発明は、核酸分子を単離するための陰性選択システムおよび陽性選択システムの両方を提供する。
【０１４７】
さらに、最初の核酸分子による干渉に関連して起こる可能性のある問題を、標準化されたライブラリーの作製に関して上に述べたサブトラクティブハイブリダイゼーションを用いることによって軽減または防止することもできる。
【０１４８】
細胞系における1つの核酸分子の増幅を他のものよりも優先的に行うために用いうるもう1つの方法は、特定の条件下のみで働く遺伝子成分（例えば、温度感受性の遺伝子成分、条件的複製起点）の使用による。したがって、1つの面において、本発明は、ある特定の条件下でのみ細胞内で増幅されうる核酸分子を提供する。このような核酸分子を調製するために用いうる成分の例は、図6A〜6Dに例示されている。特に、以下の実施例11で考察するように、本発明者らは、カナマイシン耐性遺伝子（例えば、それぞれ図27A〜27Cおよび図28A〜28Cに示されている、pDONR212またはpDONR212(F)に含まれるカナマイシン耐性遺伝子）が、複製起点（例えば、それぞれ図27A〜27Cおよび図28A〜28Cに示されている、pDONR212またはpDONR212(F)に含まれる複製起点）に近接して位置すると、カナマイシン耐性遺伝子または複製起点のいずれかが特定の条件下で機能しなくなることを見いだした。例えば、カナマイシン耐性遺伝子が大腸菌複製起点から約165塩基対を隔てて核酸分子中に位置し、これらの成分の作用の方向が互いに外側を向く（図6Aに示された向きを参照されたい）場合には、これらの2つの遺伝因子のうち少なくとも1つは25℃〜30℃の間の温度では大腸菌細胞において機能せず、これを本明細書では「制限温度（restrictive temperature）」と呼ぶ。しかし、これらの2つの遺伝因子は37℃では機能し、これを本明細書では「許容温度（permissive temperature）」と呼ぶ。
【０１４９】
したがって、1つの一般的な面において、本発明は、温度感受性表現型を細胞に付与する遺伝因子の組み合わせを含む組成物を提供する。遺伝因子のこれらの組み合わせは、「低温」感受性（すなわち、許容温度が制限温度よりも高い）を示してもよく、または「高温」感受性（すなわち、許容温度が制限温度よりも低い）を示してもよい。さらに、遺伝因子の組み合わせが、2つまたはそれ以上（例えば、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、8つなど）の選択マーカー、転写調節配列、複製起点（例えば、接合性DNA伝達の起点；条件的複製起点、例えばプラスミドRK2およびR6Kのものなど（Easterら、J. Bacteriol. 179: 6472-6479 (1997)）などを参照のこと）および複製終結アレル（例えば、tusおよびter（Andersonら、Mol. Microbiol. 36: 1327-1335 (2000)）を参照）を含んでもよい。本発明はさらに、本発明の方法において遺伝因子の温度感受性のある組み合わせを用いるための方法、ならびにこれらの遺伝因子の組み合わせを含む宿主細胞を提供する。
【０１５０】
本発明はさらに、標的核酸分子への、または標的核酸分子間の核酸分子の移行が、複数の異なる時点または複数の異なる反応混合物もしくはチューブにおいて起こる、複数（例えば、2、3、4、5、6、8、10など）の段階および/または反応チューブにおいて行われる方法を含む。このような工程の一例は以下の実施例6に示されている。
【０１５１】
特定の態様において、上記および以下の実施例11に述べるように、本発明は、少なくとも2つの遺伝因子の温度感受性のある組み合わせであって、少なくとも2つの遺伝因子の1つが抗生物質耐性マーカー（例えば、カナマイシン耐性マーカー、アンピシリン耐性マーカー、ゲンタマイシン耐性マーカーなど）であり、少なくとも2つの遺伝因子の1つが複製起点であるような組み合わせを提供する。さらなる特定の態様において、抗生物質耐性マーカーおよび複製起点は、それらが温度感受性表現型を付与するように相互に対して位置する。特に、これらの遺伝因子、ならびに本発明の組成物および方法に用いられる他の遺伝因子は、図6A〜6Dに示された作用の方向を有する。特定の態様において、これらの作用の方向は図6Aに示されたものに対応する（すなわち、それらの作用の方向は互いに外側を向く）。
【０１５２】
図6Aおよび図27A〜27Cに示された概略図を例示を目的として用いると、カナマイシン耐性マーカーと複製起点との間に約162塩基対の間隔をおき、マーカーおよび起点の作用の方向が互いに外側を向くことにより、「低温」感受性表現型が呈示される。より詳細には、これらの因子をこのような位置に有するベクター（例えば、pDONR212およびpDONR212(F)）を含む大腸菌細胞が、カナマイシンを含む25℃および30℃のプレート上で形成するコロニーは、37℃の場合よりも少ない。
【０１５３】
したがって、特定の態様において、本発明は、遺伝因子が少なくとも1つの抗生物質耐性マーカーおよび少なくとも1つの複製起点を含む、遺伝因子の温度感受性のある組み合わせを含む組成物を提供する。さらに、これらの因子の作用の方向は、互いに外側を向いてもよく（図6A参照）、互いに内側を向いてもよく（図6C参照）、または同じ方向を向いてもよい（図6Bおよび6D参照）。
【０１５４】
一般に、温度感受性表現型を付与する複数の遺伝因子は、同じ核酸分子上にある（すなわち、シス形式にある）と考えられる。さらに、これらの因子は互いにさまざまな距離を隔てて位置しうる。例えば、これらの因子は、約5ヌクレオチド、約10ヌクレオチド、約15ヌクレオチド、約20ヌクレオチド、約30ヌクレオチド、約40ヌクレオチド、約50ヌクレオチド、約60ヌクレオチド、約80ヌクレオチド、約90ヌクレオチド、約100ヌクレオチド、約120ヌクレオチド、約140ヌクレオチド、約160ヌクレオチド、約180ヌクレオチド、約200ヌクレオチド、約230ヌクレオチドまたは約250ヌクレオチドの介在核酸によって隔てられていてよい。
【０１５５】
遺伝因子の組み合わせの温度感受性表現型はさまざまな温度で呈示されうる。さらに、具体的な制限温度および許容温度は個々の遺伝因子、およびこれらの因子によって付与される表現型を呈する細胞によって異なると考えられる。低温感受性表現型を付与する遺伝子成分の組み合わせに関して、制限温度の例には、10℃、15℃、20℃、21℃、22℃、23℃、24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃および32℃が含まれ、許容温度の例には35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃および42℃が含まれる。低温感受性表現型を付与する遺伝子成分の組み合わせに関して、許容温度の例には10℃、15℃、20℃、21℃、22℃、23℃、24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃および32℃が含まれ、制限温度の例には35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃および42℃が含まれる。
【０１５６】
特定の遺伝因子の組み合わせが温度感受性表現型を付与するか否かを判定するために用いうるアッセイには、遺伝因子を含む細胞をさまざまな温度で培養することを含むアッセイが含まれる。このようなアッセイは当業者には直ちに明らかであると考えられる。
【０１５７】
1つの核酸分子の増幅を他のものよりも優先的に行うためには、温度感受性因子のほかにも、非常に多様な遺伝因子およびシステムを用いうる。その一例は、細菌細胞では機能するが酵母細胞では機能しない複製起点である。すなわち、ベクターの混合型集団の核酸分子を酵母細胞に導入する場合には、酵母において機能する複製起点を含む分子が、そのような起点を含まないものよりも選好的に増幅されると考えられる。そのほかの因子には、単純ヘルペスチミジンキナーゼ（これは、このタンパク質を発現する細胞を除外選択するために用いうる）などの薬剤感受性マーカー、およびIPTG誘導性プロモーター（これは、内部でこのプロモーターが転写を活性化する細胞の選択または除外選択のために用いうる）が含まれる。
【０１５８】
上記の通り、図2は本発明の特定の態様を例示している。詳細には、図2は、cDNAライブラリーの核酸分子を、pDONRプラスミド中間体（中間標的核酸分子）を経由して、発現クローン（核酸分子の集団）から目的ベクター（標的核酸分子）へと移行させ、さらなる発現クローン（核酸分子の集団）を作製するための工程を示している。
【０１５９】
図2に示された工程における第1の段階は、エントリークローン（核酸分子の集団）を作製するための、cDNAライブラリーの核酸分子およびpDONRプラスミド（標的核酸分子）を含む発現クローン（核酸分子の集団）間の、BP クロナーゼ（商標）により触媒される組換え反応を含む。発現クローン（核酸分子の集団）またはpDONRプラスミド（標的核酸分子）は線状でも閉環状でもよい。さらに、閉環状核酸分子は弛緩型、負の超らせん状または正の超らせん状のいずれでもよい。超らせん状分子はそれぞれ任意の数（例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10など）の超らせんを含みうる。
【０１６０】
図2に示されたBP クロナーゼ（商標）により触媒される組換え反応（第1の組換え反応）は、Fisと呼ばれるタンパク質の存在下で起こる。Fis、ならびに多数の他のタンパク質（例えば、大腸菌リボソームタンパク質S10、S14、S15、S16、S17、S18、S19、S20、S21、L14、L21、L23、L24、L25、L27、L28、L29、L30、L31、L32、L33およびL34；1999年11月12日に提出された米国特許出願第09/438,358号号、その全開示内容は参照として本明細書に組み入れられる）は、組換え反応（例えば、BP クロナーゼ（商標）により触媒される組換え反応）の効率を高める。したがって、本発明はさらに、組換え反応を増強するタンパク質（例えば、Fis；大腸菌リボソームタンパク質S10、S14、S15、S16、S17、S18、S19、S20、S21、L14、L21、L23、L24、L25、L27、L28、L29、L30、L31、L32、L33およびL34；その他）を用いる方法を提供する。
【０１６１】
Fisの存在下で行われる組換え反応の最適化に関係する具体的なパラメーターおよび条件は以下の実施例9に示されている。組換え反応を増強するタンパク質（例えば、Fis）は、BP クロナーゼ（商標）により触媒される組換え反応、ならびに他の組換え反応において、約0.5ng/μl、約1.0ng/μl、約1.5ng/μl、約2.0ng/μl、約2.5ng/μl、約3.0ng/μl、約3.5ng/μl、約4.0ng/μl、約4.5ng/μl、約5.0ng/μl、約5.5ng/μl、約6.0ng/μl、約6.5ng/μl、約7.0ng/μl、約7.5ng/μl、約8.0ng/μl、約8.5ng/μl、約9.0ng/μl、約9.5ng/μl、約10.0ng/μl、約10.5ng/μl、約11.0ng/μl、約11.5ng/μl、約12.0ng/μl、約12.5ng/μl、約13.0ng/μl、約13.5ng/μl、約14.0ng/μl、約14.5ng/μl、約15.0ng/μl、約16.0ng/μl、約17.0ng/μl、約18.0ng/μl、約19.0ng/μl、約20.0ng/μl、約22.0ng/μl、約25.0ng/μl、約27.0ng/μl、約30.0ng/μl、約35.0ng/μlまたは約40.0ng/μlを含む、さまざまな濃度で含めることができる。したがって、本発明はさらに、組換え反応の効率を高めるタンパク質を用いる方法を含む。
【０１６２】
上記の通り、図2に示された工程の第1の段階にかかわる試薬の濃度は、かなりの範囲にわたりうる。例えば、組換え反応を触媒するために、25〜50ng/μlのIntおよび20ng/μlのIHFを含むBP クロナーゼ（商標）をさまざまな量で用いうる。BP クロナーゼ（商標）のIntタンパク質を評価基準として用いて、BP クロナーゼ（商標）を、Intが3ng/μl、5ng/μl、10ng/μl、50ng/μl、100ng/μl、200ng/μl、300ng/μl、400ng/μl、500ng/μl、700ng/μl、900ng/μl、1000ng/μl、1200ng/μl、1500ng/μl、1700ng/μl、1900ng/μlまたは2000ng/μlなどの濃度で存在するように、本発明の組換え反応に用いることができる。
【０１６３】
図2に示された工程における第2の段階は、発現クローンを再生させるための、cDNAライブラリーの核酸分子および目的ベクターを含むエントリークローンの間の、LR クロナーゼ（商標）により触媒される組換え反応を含む。エントリークローンまたは目的ベクターは線状でも閉環状でもよい。さらに、閉環状核酸分子は弛緩型、負の超らせん状または正の超らせん状のいずれでもよい。超らせん状分子は任意のｋず（例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10など）の超らせんを有しうる。
【０１６４】
多くの態様において、目的ベクターは組換えを起こす前に線状化される。したがって、目的ベクターは一般に、線状化のために用いうる部位を含むと考えられる。
【０１６５】
本発明はまた、少なくとも1つの組換え部位を含む核酸分子の集団の組換え、および組換え産物のベクターへの挿入を行うための工程も含む。さらに、ベクター中に挿入された核酸分子の集団は、続いて、他のベクターに移行される。
【０１６６】
線状核酸分子の集団（例えば、cDNAライブラリーの分子）の組換えを行うための方法に関して、本発明は、1つまたは複数の組換え部位を含む核酸分子の集団を作製するための方法、およびこれらの組換え部位の1つまたは複数の改変（例えば、図3に示されたような、attB部位のattL部位への変換）のためにこれらの分子の組換えを行うための方法を提供する。1つまたは複数の改変された組換え部位を含む、その結果生じた分子を、続いて標的核酸分子と組み換えさせて、ハイブリッド核酸分子を形成させてもよい。
【０１６７】
図3に示された工程を例示を目的として用いると、attB部位を各末端に含むcDNAライブラリーの線状分子を線状attP分子（すなわち、標的核酸分子）と組み換えさせて、attL部位またはattR部位を各末端に含むcDNA分子の集団（核酸分子の集団）を作製する。続いて、その結果生じたcDNA分子の集団を目的ベクター（標的核酸分子）と組み換えさせ、発現クローン（核酸分子の集団）を作製する。
【０１６８】
当業者は理解すると考えられるが、図3に示された工程のさまざまな変形物が可能であり、それらは本発明の範囲に含まれる。例えば、出発材料であるcDNA分子の集団が、代わりにゲノムまたは合成核酸分子を含んでもよい。さらに、出発材料である核酸分子の集団、標的核酸分子またはその両方が、（1）5'組換え部位の5'端の5'側、（2）3'組換え部位の3'端の3'側、または（3）5'組換え部位の5'端の5'側および3'組換え部位の3'端の3'側の両方、にさらなる核酸を含んでもよい。さらに、出発材料である核酸分子の集団、標的核酸分子またはその両方は閉環状でもよい。さらに、このような閉環状核酸分子は弛緩型、正の超らせん状または負の超らせん状のいずれでもよい。
【０１６９】
核酸セグメントを、本発明の実施に用いられる核酸分子の集団の個々の構成要素に付加してもよい。核酸セグメントを付加するための1つの方法は、核酸分子の集団の個々の構成要素を、付加しようとする核酸セグメントを含む他の核酸分子（例えば、ベクター）に挿入することを含む。このような工程に用いうる目的ベクターの一例は、図4に示されている。例えば、cDNAライブラリーを、attL1、attR1、attL2およびattR2部位の間の組み換えを用いて目的ベクター（すなわち、第1の標的核酸分子）に挿入して、attB部位によって隔てられた3つ（ベクターを算入するならば4つ）の別個の核酸セグメントを含む核酸分子を作製することができる。attB1、attP1、attB2およびattP2、attB3、attP3、attB4およびattP4部位のさまざまな組み合わせの間の組換えを用いて、（1）その結果生じる核酸分子の集団を第2の標的核酸分子に移行させること、または（2）2つの組換え部位の間に位置する核酸セグメントを置換することが可能である。例えば、第2の標的分子が組換え部位の間で線状化されている場合には（例えば、attP3とattP1との間で線状化されている左上方のpDONOR分子）、第2の集団の核酸分子の集団の、第2の標的核酸分子への移行が組換え時に起こり、エントリークローンが生じるように、核酸分子を設計しうる。
【０１７０】
さらに、第2の標的分子がベクターの基本骨格の間で線状化されている場合には（例えば、図4に示されたpDONOR分子におけるkanとoriとの間）、目的ベクターが作製/再生されるように核酸分子を設計しうる。例えば、図4に示された工程を例示の目的に用いると、第2の標的分子からのccdBコード領域を第2の核酸分子の集団の構成要素の内部に挿入し、1つまたは複数の組換え部位の間に存在する核酸と置き換えることができる。
【０１７１】
pDONOR分子（すなわち、第2の標的核酸分子）に存在する組換え部位に応じて、cDNA分子の集団を、隣接する補足的な核酸セグメントとともに、またはそれを伴わずに、pDONORベクターに移行させることができる。当業者は理解すると考えられるが、以上のものの任意の可能なさまざまな組み合わせが、本発明の範囲に含まれる。さらに、pDONOR分子が、移行させる核酸分子の集団の個々の構成要素と結合しうるほかの組換え部位および核酸セグメント（例えば、プロモーター活性を有する核酸セグメント）を含んでもよい。したがって、本発明はまた、核酸分子を他の核酸分子と連結させるための方法、ならびにこれらの方法によって作製される核酸分子も提供する。本発明のこの面は、特定の性質、特徴もしくは活性を有するか、または特定の性質、特徴もしくは活性を有する発現産物をコードする核酸分子を同定するために設計されたスクリーニング方法と組み合わせると特に有用である。
【０１７２】
本発明はさらに、本発明の方法の実施に用いられる核酸分子の集団の個々の構成要素への、核酸セグメントの付加も可能にする。本発明はまた、これらの集団の構成要素に付随する核酸セグメントの除去または置換も可能にする。例えば、核酸分子の集団の個々の構成要素を、複数の異なる特異性（例えば、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、8つ、9つ、10などの特異性）を有する複数の組換え部位（例えば、attP部位）を有するベクターに導入しうる。特定の性質、特徴または活性を集団の個々の構成要素に付与する核酸セグメントは、異なる組換え部位の間に含まれてもよく、さらに組換え部位を越えて存在してもよい。後者の場合には、特定の状況下では（例えば、核酸が発現産物をコードする場合）、例えば、核酸セグメントによって付与される性質、特徴または活性を阻害するために組換えを用いうる。上に述べたように、上記の核酸分子および工程の代表例は図4に示されている。
【０１７３】
本発明はまた、核酸セグメントが連結された核酸分子を構築するための方法も提供する（例えば、図4を参照）。ここでも図4に示された工程を例示を目的として用いると、第2の核酸分子の集団がひとたび作製されたところで、他の付随する核酸セグメントをライブラリーの構成要素と置換しうる。例えば、第2の核酸分子の集団がひとたび作製されたところで、これらの分子を、1つまたは複数の性質、特徴または活性を有する分子（例えば、cDNA挿入物を有する集団の構成要素）を同定するためにスクリーニングすることができる。これらの挿入物を含む核酸分子がひとたび同定されれば、核酸ライブラリーを第2の核酸分子の集団の異なる領域に挿入しうる。例えば、図4に示された第2の核酸分子の集団においてattB3とattB1部位との間に示されているプロモーターを、核酸分子のライブラリー（例えば、ゲノムライブラリー）の構成要素と置換することができる。選択的には、その結果生じた新たな核酸分子の集団を、続いて、挿入されたcDNAの発現をもたらすプロモーター活性に関してスクリーニングしてもよい。以上のもののさまざまな変形物が可能である。したがって、ある種の態様において、本発明は、ライブラリーを構築し、その後に1つまたは複数の所定の性質、特徴または活性を有するライブラリーの構成要素を同定するための1回目のスクリーニングを行い、その後に上記のスクリーニング段階によって同定されたライブラリーの構成要素に核酸分子を挿入し、その後に1つまたは複数の所定の性質、特徴または活性を有するライブラリーの構成要素を同定するための2回目のスクリーニングを行うための方法を提供する。当業者は理解すると考えられるが、核酸挿入の後にスクリーニングを行う上記の工程を、1つまたは複数の所望の性質、特徴または活性を有する1つまたは複数の核酸分子が得られるまで、複数回（例えば、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個など）繰り返すことができる。
【０１７４】
特定の態様において、最後の標的核酸分子はウイルスベクター（例えば、ヘルペスウイルスベクター、アデノウイルスベクターなど）であってよい。この種のベクターは遺伝子治療の用途に特に有用であり、これについては以下に考察する。
【０１７５】
核酸分子の集団
事実上あらゆる核酸分子の集団を本発明の実施に用いうる。このような集団の例には、ゲノム核酸ライブラリー、cDNAライブラリー、抗体分子の可変領域のライブラリー、および合成核酸分子（例えば、ペプチドをコードする合成核酸分子）のほか、これらのライブラリーの改変形態が含まれる。
【０１７６】
本発明の実施に際して用いられる核酸分子の集団は事実上あらゆる源から入手可能であり、販売供給元から購入してもよく、当技術分野で周知の方法によって調製してもよい。例えば、多様な生物学的存在（例えば、ウイルス、細菌細胞、ヒト細胞など）から調製したライブラリーを、American Type Culture Collection（ATCC）（10801 ブルヴァール大学、マナッサス、VA 20110-2209, 米国）などの供給元から入手しうる。
【０１７７】
本発明に用いるのに適した核酸分子の集団を入手しうる源には、以下のものが含まれる：ウイルス（例えば、HIV-1、HIV-2、A型肝炎ウイルス、B型肝炎ウイルス、C型肝炎ウイルス、D型肝炎ウイルス、E型肝炎ウイルス、F型肝炎ウイルスなど）、細菌（例えば、大腸菌、ネズミチフス菌、、ペスト菌、コレラ菌、ライム病ボレリア、サーマス・アクアティカス（Thermus aquaticus）、メタン生成古細菌（Methanococcus janaschii）、サーモコッカス・アイガイカス（Thermococcus aegaeicus）、スタフィロサームス・ヘレニカス（Staphylothermus hellenicus）、アクイフェックス・ピロフィリス（Aquifex pyrophilis）、テルモトガ・マリナ（Thermotoga marina）など）、真菌（例えば、クリプトコッカス・ネオフォルマンス（Cryptococcus neoformans）、カンジダ・アルビカンス（Candida albicans）、体部白癬菌（Tinea corporis）、足白鮮菌（Tinea pedis）、頭部白癬菌（Tinea capitis）、出芽酵母、ピキア酵母（Pichia pastoris）、分裂酵母など）、植物（例えば、コショウ草、セイヨウカラシナ、キャベツ、カブ、オート麦、パンコムギ、ヒマワリ、アワガエリ（Colonial bentgrass）、ナガハグサ（Kentucky bluegrass）、ホソムギ（perenial ryegrass）、コヌカグサ（creeping bentgrass）、ギョウギシバ（Bermudagrass）、バッファローグラス、エレモクロア、スイッチグラス、ニホンシバ、コースタル・パニックグラス（coastal panicgrass）、ホウレンソウ、モロコシ、タバコ、トウモロコシなど）および動物（例えば、キイロショウジョウバエ、マウス、ラット、ウサギ、ハムスター、モルモット、ブタ、ヤギ、ヒツジ、ウシ、ヒヒ、サル、チンパンジー、ヒトなど）。
【０１７８】
本発明の核酸分子の集団は、コード領域、非コード領域（例えば、プロモーター）、またはコード領域および非コード領域の両方を含みうる。さらに、コード領域は（存在する場合）、ポリペプチド発現産物または機能的RNA分子のいずれかをコードしうる。以下により詳細に説明するように、非コード領域には、転写を受ける分子上に存在する場合（すなわち、シス位に存在し、発現されうる核酸分子と機能的に結合している場合）に核酸分子の転写を制御する核酸が含まれる。
【０１７９】
特定の態様において、本発明の実施に際して用いられる核酸ライブラリーは、核酸分子の高い比率（例えば、少なくとも20％、少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％など）が抗体分子の可変領域をコードするライブラリーではない。
【０１８０】
本発明の実施に際して用いられる核酸分子の集団は、コンビナトリアルライブラリーであってもよい。当技術分野では、コンビナトリアルライブラリーの調製および使用の例が数多く知られている（例えば、Waterhouseら、Nucleic Acids Res. 21：2265-2266 (1993)、Tsurushitaら、Gene 172: 59-63 (1996)、Persson, Int. Rev. Iminunol. 10：2-3 153-163 (1993)、Chanockら、Infect. Agents Dis. 2: 118-131 (1993)、Burioniら、Res. Virol. 148: 161-4 (1997)、Leung, Thromb. Haemost. 74: 373-376 (1995)、Sandhu, Crit. Rev. Biotechnol. 12：5-6 437-62 (1992)ならびに米国特許第5,733,743号、第5,871,907号および第5,858,657号を参照されたい。これらはすべて明確に参照として本明細書に組み入れられる）。
【０１８１】
本発明の実施に際して用いられるライブラリーには、例えば、標準化されたcDNAライブラリーまたはゲノムライブラリーが含まれうる。
【０１８２】
また、本発明の実施に際して用いられるライブラリーには、例えば、本明細書で「変異誘発ライブラリー」と称する、変異誘発によって調製された、核酸分子の当初のライブラリーの変更物に対応する核酸分子も含まれうる。変異誘発ライブラリーにおける核酸分子は、例えば、ポリペプチドまたは機能的RNAをコードしうる。さらに、このようなライブラリーは、発現産物をコードすること以外の機能を有する核酸（例えば、プロモーター活性を有する核酸）を含みうる。変異誘発ライブラリーの核酸分子は、（1）配列の点で同じもしくは異なる1つもしくは複数の核酸分子、または（2）核酸分子のライブラリーからなる他の核酸セグメント、と結合させうる。変異誘発ライブラリーの核酸分子は、他の核酸セグメントと連続的に結合してもよく、非連続的に結合してもよい（例えば、介在核酸が存在してもよい）。さらに、変異誘発ライブラリーの1つまたは複数（例えば、1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個など）の核酸分子を、同じライブラリーまたは異なるライブラリーの1つまたは複数（例えば、1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個など）の構成要素と結合させてもよく、それらの構成要素は変異誘発を受けたものでも受けていないものでもよい。
【０１８３】
変異誘発ライブラリーは、低忠実度ポリメラーゼおよび/または逆転写酵素によるライブラリーの構成要素の合成を含む、当技術分野で知られた任意のさまざまな手段によって調製しうる。このため、本発明に用いるのに適した変異誘発ライブラリーを、例えば、PCRによって調製することもできる。
【０１８４】
本発明の方法および組成物に用いる1つまたは複数の核酸分子に変異誘発を施す場合、これらの分子は（1）特定の数の変異、または（2）ある平均数の変異のいずれかを含みうる。さらに、変異は核酸分子自体または発現産物（例えば、核酸分子によってコードされるポリペプチド）のいずれに関して算定してもよい。例えば、ライブラリーの核酸分子を、元のライブラリーの対応する核酸分子に対して、平均で少なくとも50％、少なくとも55％、少なくとも60％、少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％または少なくとも99％同一である核酸分子の集団が生じるように変異させてもよい。さらに、ライブラリーの核酸分子を、元のライブラリーの対応する核酸分子に対して、平均で50％〜60％、55％〜65％、60％〜70％、65％〜75％、70％〜80％、75％〜85％、80％〜90％、85％〜95％、または90％〜99％同一である核酸分子の集団が生じるように変異させてもよい。
【０１８５】
同様に、ライブラリーの核酸分子を、元のライブラリーの対応する核酸分子によってコードされるポリペプチドに対して、平均で少なくとも50％、少なくとも55％、少なくとも60％、少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％または少なくとも99％同一であるポリペプチドをコードする核酸分子の集団が生じるように変異させてもよい。さらに、ライブラリーの核酸分子を、元のライブラリーの対応する核酸分子によってコードされるポリペプチドに対して、平均で50％〜60％、55％〜65％、60％〜70％、65％〜75％、70％〜80％、75％〜85％、80％〜90％、85％〜95％または90％〜99％同一であるポリペプチドをコードする核酸分子の集団が生じるように変異させてもよい。
【０１８６】
核酸分子の変異誘発は、機能（例えば、結合特異性）の変化したタンパク質を作製するために利用されている。変異誘発はしばしば位置指定的であり、このため、タンパク質に誘導しようとする変異の意図的な選択によっては手間がかかる。例えば、Coreyら、J. Amer. Chem. Soc. 114: 1784-1790 (1992)は、位置指定変異誘発によってラットのトリプシンを改変している。チミジンキナーゼ（TK）遺伝子中の選択したコドンの部分的ランダム化も、変異型TKタンパク質を開発するための変異誘発手順として用いられている（Munirら、J. Biol. Chem. 267: 6584-6589 (1992)）。変異誘発を、エラープローン（error-prone）PCR（例えば、Leungら、Technique、1：11-15 (1989)およびCaldwellおよびJoyce、PCR Methods Applic., 2: 28-33 (1992)を参照のこと）および飽和変異誘発（例えば、Short, 米国特許第6,171,820号を参照のこと）などの方法を用いて行うこともできる。このように、核酸配列に特定の変異を導入するための方法は当技術分野で公知である。このようなさまざまな方法は、Ausubel, F.M.ら、「分子生物学における最新プロトコール（Current Protocols in Molecular Biology）」、Wiley Interscience, New York（1989-1996）に記載されている。変異をオリゴヌクレオチドに含めて設計し、これを既存のクローニングされた配列の改変のために、または増幅反応に用いることができる。ランダム変異誘発も、所望の変異型DNAまたはRNAを単離するための適切な選択方法が利用可能であれば用いうる。所望の変異の存在は、よく知られた方法による核酸の配列決定によって確認しうる。
【０１８７】
1つの面において、本発明は、1つまたは複数の終止コドンの抑制による、融合タンパク質の制御下発現を可能にする。本発明によれば、本発明の方法によって連結された1つまたは複数の核酸分子（例えば、1個、2個、3個、4個、5個、7個、10個、12個など）は、次に連結された出発分子を介した第1の出発分子からの発現が可能になるように抑制しうる、1つまたは複数の終止コドンを含みうる。例えば、第1-第2-第3のセグメントが連結したものを含む核酸分子（このような第1および第2の分子がそれぞれ終止コドンを含む場合）は、第1および第2のセグメントの終止コドンのそれぞれを抑制することにより、連結した分子によってコードされる三部分からなる融合タンパク質を発現しうる。さらに、本発明は、選択した終止コドンの抑制を変化させることにより、融合タンパク質の選択的または制御下での発現も可能にする。すなわち、第1および第2の分子の間の終止コドンを抑制するが、第1-第2-第3の分子の第2および第3の分子の終止コドンは抑制しないことにより、三部分からなる融合物ではなく、第1および第2の分子によってコードされる融合タンパク質を産生させることができる。したがって、複数の異なる終止コドンおよび抑制の可変的制御の使用により、連結された目的の出発核酸分子のすべてまたは種々の部分によってコードされる、さまざまな融合タンパク質またはその部分の作製が可能になる。
【０１８８】
1つの面においては、1つまたは複数の終止コドンを、出発核酸分子（例えば、変異誘発ライブラリーの構成要素）の1つもしくは複数の内部の、または出発分子の1つもしくは複数によって含められた組換え部位の内部の、何らかの箇所に含めてもよい。このような終止コドンは、例えば、連結された核酸セグメントのいずれかの末端またはその付近に位置しうるが、このような終止コドンが分子の内部に含まれてもよい。コード配列の全体または一部に続いて終止コドンがある場合には、その終止コドンの後に、別の核酸分子の連結を可能にする組換え部位があってもよい。このタイプのいくつかの態様においては、終止コドンを選択的にはサプレッサーtRNA分子によって抑制することもできる。サプレッサーtRNA分子をコードする遺伝子は、同じ核酸分子上に用意してもよく（図20A〜20B参照）、異なる核酸分子上に用意してもよく、またはコード配列を含む核酸分子が挿入される宿主細胞の染色体上に用意してもよい。いくつかの態様においては、サプレッサーtRNAの複数のコピー（例えば、2個、3個、4個、5個、7個、10個、12個、15個、20個、30個、50個などのコピー）を用意してもよい。さらに、いくつかの態様において、サプレッサーtRNAの転写は調節可能な（例えば、誘導可能または抑制可能な）プロモーターの制御下にあってよい。
【０１８９】
本発明の方法に用いられるライブラリーがcDNAライブラリーである場合、このライブラリーを、ライブラリーを作製するために用いられるRNA分子の5'または3'末端のいずれかに対応する核酸分子により富化してもよい。このようなライブラリーを作製するための方法は当技術分野で公知である。例えば、オリゴdTカラムを用いて、RNA分子の3'末端に通常付随するポリA領域を有する核酸分子を単離することができる。続いて、これらのRNA分子からcDNAを作製してもよい。このように、核酸のオリゴdT精製を用いて、RNAの3'末端に対応する核酸分子が富化された分子の集団を作製することができる。さらに、「cDNA末端の迅速増幅のための5' Raceシステム（5' Race System for Rapid Amplification of cDNA Ends）」（インビトロゲン社、カールズバッド、CAから入手可能、カタログ番号18374-058）などの工程を用いて、RNAの5'末端に対応する核酸分子が富化されたライブラリーを作製することもできる。RNA分子の5'および/または3'末端に対応する分子が富化されたcDNAライブラリーを作製するための方法は、PCT国際公開公報第00/66722号でも考察されており、その全開示内容は参照として本明細書に組み入れられる。
【０１９０】
本発明の方法により同定される性質、特徴および活性
本発明はさらに、少なくとも1つの同定可能な性質、特徴もしくは活性（例えば、1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個など）を有するか、または少なくとも1つの（例えば、1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個など）の同定可能な性質、特徴もしくは活性を有する1つもしくは複数（例えば、1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個など）の発現産物をコードする、核酸分子を同定するための方法を提供する。特定的な面において、本発明は、特定の性質、特徴もしくは活性（例えば、第1の標的核酸分子によってコードされるポリペプチドとインフレームにあるポリペプチドをコードする）を有するか、または特定の性質、特徴もしくは活性を有する発現産物をコードする、核酸分子を同定するための反復的スクリーニング方法を提供する。例えば、核酸分子を、1つの性質、特徴または活性（例えば、以下に述べる性質、特徴または活性）を有するものを同定するためにスクリーニングした後に、最初のスクリーニング段階によって同定された核酸分子を、同じまたは別の性質、特徴または活性を有するものを同定するために再びスクリーニングすることができる。多くの場合には、スクリーニングの対象である特定の性質、特徴もしくは活性を有するか、またはこの性質、特徴もしくは活性を有する発現性質、特徴もしくは活性をコードする核酸分子は、標的核酸分子に挿入されるか、またはスクリーニング段階の間に第1の標的核酸分子から第2の標的核酸分子へと移行されると考えられる。このようなスクリーニング段階は任意の回数（例えば、2回、3回、4回、5回、6回、7回など）繰り返すことができ。さらに、スクリーニング段階にかける核酸分子を、各スクリーニング段階の前に複数の異なる標的分子に挿入してもよい。
【０１９１】
上記のものに類似した工程を、ヌクレオチド配列の点では異なるが1つまたは少数の挿入された核酸分子を含む標的核酸分子の集団をスクリーニングするために用いることもできる。例えば、標的核酸分子を、挿入されたオープンリーディングフレームを特定の細胞種（例えば、肝細胞、白血球など）において発現する能力に関してスクリーニングすることができる。
【０１９２】
当業者は理解すると考えられるが、核酸分子は、遺伝情報をコードする能力とは区別される機能および活性を有する。さらに、本発明の方法によって同定される機能および活性は、自然下で呈示される性質、特徴または活性のみを対象とはせず、（核酸分子が改変されている場合は）改変されていない分子（例えば、cDNAライブラリーの核酸分子）によって呈示される性質、特徴または活性のみを対象ともしない。
【０１９３】
本発明の実施に際してアッセイしうる、核酸分子の性質、特徴および活性の例には、（1）ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で他の核酸分子とハイブリダイズする能力、（2）遺伝子発現を活性化する能力（例えば、遺伝子発現を、生物の細胞において構成性に、または組織特異的な様式で活性化する能力）、（3）核酸分子に対する結合親和性を示す分子（例えば、タンパク質、糖質、金属イオン、有機化合物など）と結合する能力（例えば、転写を活性化するタンパク質）、（4）核酸の複製を開始する能力（例えば、複製起点、自律複製配列、転写調節因子）、（5）細胞分裂中に核酸分子を分離する能力（例えば、動原体）、（6）相同組換えにより他の他の核酸分子に組み込まれる能力、（7）トポイソメラーゼによって別の核酸分子と結合する能力、（8）別の核酸分子と連結される能力、（9）特定の制限エンドヌクレアーゼによって消化される能力、（10）別の核酸分子とアニーリングする能力、（11）PCR用のテンプレートとして作用する能力、（12）転位に関与する能力、（13）二次構造（例えば、ヘアピンターン、tRNA様構造）を形成する能力、（14）組換え反応（例えば、部位特異的組換えおよび相同組換え）に関与する能力、（15）核酸分子（例えば、パッケージングシグナル）のウイルス粒子への「パッケージング」を導く能力、および（16）部位特異的組換えにより別の核酸分子と組換えを行う能力、が含まれる。
【０１９４】
ゲノムライブラリー、ならびに他のライブラリー（例えば、合成ライブラリー）を、ゲノム核酸に付随する性質、特徴または活性を同定するためにスクリーニングすることもできる。このような性質、特徴および活性の例には、（1）プロモーター活性、および（2）特異的または非特異的に核酸と結合する分子（例えば、タンパク質）と結合する能力が含まれる。本発明のゲノムライブラリーは、例えば、組織特異的および/または種特異的プロモーター活性を示す核酸分子を同定するために用いうる。組織特異的プロモーター因子の同定に用いうると考えられるシステムの一例は、ゲノムライブラリーの核酸を、ベクター中の緑色蛍光タンパク質（GFP）をコードする核酸領域の5'側に挿入するものである。続いて、このベクターを特定の組織（例えば、肝細胞、軟骨細胞、白血球など）または種（例えば、大腸菌、出芽酵母、アカパンカビ、アメーバ・プロテウス（Amoeba proteus）など）の細胞に挿入し、その後に細胞をGFPの発現が起こるものを同定するためにスクリーニングすることができる。細胞の生存性の増大または低下を生じさせる陽性選択システムおよび陰性選択システムを含む、さまざまな他の他の発現検出方法も用いうる。
【０１９５】
ゲノムライブラリーならびに本発明の他のライブラリーを、核酸と特異的または非特異的に結合するペプチドを同定するために用いることもできる。例えば、ランダムペプチドライブラリーを、ゲノム核酸と結合するペプチドを同定するために用いてもよい。さらに、多数のペプチドを発現する本発明のライブラリーを調製することもできる。続いて、これらのペプチドライブラリーは、特定のヌクレオチド配列を有する核酸分子と結合するペプチドをコードする核酸分子を同定するために用いうる。このようなペプチドライブラリーの調製およびスクリーニングのための方法（例えば、ファージディスプレイシステムを用いる）は、本明細書中の別の箇所に記載されている。
【０１９６】
また、核酸分子を、その発現産物（例えば、RNA、タンパク質など）の性質、特徴または活性の同定によって同定することもできる。例えば、RNA分子は、それらがポリペプチドをコードする能力とは直接関係しない数多くの機能および活性を有する。RNAに付随する活性の例には、リボザイム活性、tRNA活性、および相補的ヌクレオチド配列を有する核酸とハイブリダイズする能力（例えば、アンチセンス活性、RNAi活性）が含まれる。
【０１９７】
また、本発明の方法を、遺伝子のインビボでのサイレンシングを可能にする核酸分子を同定するために用いることもできる。遺伝子のサイレンシングを行う方法の1つは、RNA干渉（RNAi）と命名された、二本鎖RNAの産生を必要とする（例えば、Metteら、EMBO J., 19：5194-5201 (2000)）。遺伝子のサイレンシングを行うもう1つの方法は、（1）標的遺伝子に対応するアンチセンスRNA、および（2）RNAを切断する1つまたは複数のリボザイム（例えば、ハンマーヘッド型リボザイム、ヘアピン型リボザイム、デルタリボザイム、テトラヒメナL-21リボザイムなど）を含むアンチセンスRNA/リボザイム融合物の産生を必要とする。すなわち、本発明の核酸分子の発現産物を用いて遺伝子発現のサイレンシングを行い、遺伝子サイレンシングに関連した活性を有するものを同定するために核酸分子をスクリーニングすることができる。
【０１９８】
また、コードされるポリペプチド発現産物に関連した機能または活性を有するものを同定するために核酸分子をスクリーニングすることもできる。このような機能または活性の一例は、核酸のリーディングフレームが、それと連結される核酸分子の核酸と「インフレーム」の関係にあることである。核酸の機能または活性のさらなる例には、以下のようなポリペプチドをコードすることが含まれる：（1）免疫応答または他の細胞応答を誘導する（例えば、転写を活性化する、アポトーシスを誘導する、1つまたは複数の細胞内タンパク質の安定性をもたらす、など）、（2）特定のリガンド（例えば、低分子、核酸、リガンドとしての機能、細胞表面受容体、可溶性タンパク質、金属イオン、構造因子、タンパク質相互作用ドメイン、抗体、抗原、SH3ドメインなど）に対する結合親和性を有する、（3）タンパク質を細胞内の特定の位置（例えば、ミトコンドリア、葉緑体、核、小胞体、細胞膜など）に向かわせる、（4）タンパク質を細胞からの輸出に向かわせる、（5）翻訳後修飾に関与する配列を含む（例えば、グリコシル化部位、リボシル化部位など）、（6）水溶液への種々の程度の可溶性を有する、（7）タンパク質を細胞内の特定の位置（例えば、小胞体、核など）に向かわせる、またはタンパク質を細胞からの輸出に向かわせる、（8）ウイルスの感染性を変化させる、（9）タンパク質の可溶性を変化させる（例えば、高めるまたは低下させる）、（10）他の分子（例えば、タンパク質）とともに免疫共沈する能力、および（11）酵素活性（例えば、キナーゼ活性、ホスホリラーゼ活性、ホスファターゼ活性、レダクターゼ活性、オキシダーゼ活性、スーパーオキシドジスムターゼ活性、カタラーゼ活性など）を有する。
【０１９９】
図8を例示を目的として用いると、第1の段階では、ツーハイブリッドアッセイにおいて「ベイト（bait）」タンパク質と会合するタンパク質をコードするcDNAライブラリーの構成要素を同定するための選択を用いる。ツーハイブリッドアッセイは、YavuzerおよびGoding、Gene 165: 93-96 (1995)；Vidalら、米国特許第5,955,280号；およびFieldsら、米国特許第5,283,173号、ならびに以下の実施例3に記載されている。ほとんどの場合、ツーハイブリッドアッセイは、既知のタンパク質と会合するタンパク質を同定するために用いられる。例えば、DNA結合ドメイン（例えば、Gal4結合ドメイン（Gal4 BD）、lexAなど）と結合したポリペプチドリガンドをコードする核酸分子を構築する。Gal4システムを例示を目的として用いると、続いて、DNA活性化ドメイン（例えば、Gal4活性化ドメイン（Gal4 AD）、VP22、B42など）と結合したタンパク質の混合型集団を発現する発現ライブラリー（例えば、cDNAライブラリー（完全長または部分）、タンパク質ドメインをコードする変異誘発された核酸分子のライブラリー、ランダムペプチドをコードするライブラリーなど）を調製することができる。続いて、これらの核酸の両方を、特定の条件下でGal4プロモーターによる遺伝子活性化を増殖のために必要とする酵母細胞に導入する。すると、Gal4 ADおよびGal4 BDはタンパク質：タンパク質相互作用ドメインを欠き、互いに近接した場合に転写の活性化に働くため、相互に会合するタンパク質とGal4 ADおよびGal4 BDが融合された場合にのみ、酵母細胞は増殖すると考えられる。その結果として、図8に示された工程の第1の段階により、Gal4 ADコード配列と同じリーディングフレームにあって、「ベイト」タンパク質と会合するポリペプチドをコードする核酸分子が得られる。
【０２００】
RNAの5'および3'領域に対応する分子が富化されたcDNAライブラリーのスクリーニングを、他のタンパク質ドメインと会合するタンパク質ドメインのマッピングを行うために用いることもできる。例えば、ある相互作用ドメインをコードする複数のcDNA分子を、ツーハイブリッドアッセイにおいて特定の「ベイト」タンパク質を用いて同定することができる。続いて、共通のコード領域を同定するためにこれらのcDNA分子の配列を比較する。多くの場合には、これらの共通のコード領域は、用いたベイトドメインと相互作用するドメインをコードすると考えられる。この種の工程はPCT国際公開公報第00/66722号に記載されており、その全開示内容は参照として本明細書に組み入れられる。
【０２０１】
多くの場合には（例えば、融合タンパク質を図8のようにして作製する場合）、別の核酸分子（例えば、ベクター）のコード配列に対してインフレームの関係にある核酸分子を同定または調製することが望ましいと考えられる。核酸分子には可能性として6つのオープンリーディングフレームがある：その3つは順方向であり、3つは逆方向である。多くの場合には、集団内の核酸分子のすべてまたは実質的にすべて（例えば、少なくとも95％）のリーディングフレームが、標的核酸分子に挿入された際に順方向または逆方向にあるように、組換え部位を付加することができる（例えば、適したプライマーを用いるPCRの使用による）。定方向cDNAライブラリーを調製するための方法は、例えば、OharaおよびTemple、Nucleic Acids Res. 29：E22 (2001)に記載されており、その全開示内容は参照として本明細書に組み入れられる。
【０２０２】
ここでも図8を例示のために用いると、最初の発現クローンにおけるcDNAライブラリーの構成要素はattB1部位およびattB2部位によって挟まれている。このため、これらの核酸分子の方向性は、例えば、attP1部位およびattP2部位を含む核酸分子との組換えの後にも、さらにはその後の組換え反応においても維持されると考えられる。
【０２０３】
核酸分子の定方向クローニングを行うための1つの方法は、組換え部位の配列を含み、ポリA「尾部」とハイブリダイズすると考えられる配列を含むプライマーを用いる逆転写により、分子の3'末端に組換え部位を導入することである。続いて、核酸分子を、本明細書中の別の箇所に記載された通りに一部位組換えによって標的核酸分子に導入し、その後に核酸分子の5'末端を標的核酸分子と結合させることができる。
【０２０４】
図8に示された工程の第2の段階では、第1の段階で同定された核酸分子を、エピトープタグ（すなわち、HIS6タグ）をコードするヌクレオチド配列とインフレームとなるようにベクター中に挿入して、融合タンパク質を作製する。このため、この結果生じた融合タンパク質は、エピトープタグに対する結合親和性を有する抗体とともに沈降すると考えられる。HIS6タグをコードする核酸を含むベクターに挿入されたcDNA挿入物はすべて、タグをコードするヌクレオチド配列とインフレームになるはずである。しかし、それぞれの融合タンパク質に特有の立体障害およびコンフォメーションの性質、特徴または活性のために、第2の段階で生じた核酸分子の発現産物のすべてが、エピトープタグに対する結合親和性を有する抗体とともに沈降するとは限らないと思われる。
【０２０５】
上記の通り、発現されたタンパク質を、特定の生物活性を有するものを同定するためにスクリーニングすることができる。このような活性の例には、核酸分子（例えば、DNAまたはRNA）または他のタンパク質に対する結合親和性が含まれる。特に、発現されたタンパク質を、他のタンパク質または自らに対する結合親和性を有するものを同定するためにスクリーニングすることもできる。自らに対する結合親和性を有するタンパク質は一般に、多量体または凝集体を形成しうると考えられる。自らおよび/または他のタンパク質に対する結合親和性を有するタンパク質はしばしば、抗体、スプライソソーム、多サブユニット酵素、多サブユニット酵素、リボソームなどの多タンパク質複合体を形成しうる、またはその形成に関与しうると考えられる。本発明の範囲にさらに含まれるものには、上記の発現されたタンパク質、これらのタンパク質をコードする核酸分子、これらの核酸分子を作製するための方法、これらの核酸分子を含む組換え宿主細胞を作製するための方法、これらの方法によって作製された組換え宿主細胞、および発現されたタンパク質を生産するための方法がある。
【０２０６】
容易にアッセイしうるタンパク質の特性の一例は溶解性である。例えば、GFPによって生じる蛍光は、不溶性GFP融合タンパク質が産生されると消光する。さらに、タンパク質の比較的少数のアミノ酸残基（例えば、1つ、2つ、3つ、4つなど）の変化は、適切に位置する場合、そのタンパク質の溶解性を変化させうる。このため、GFP融合タンパク質を発現するライブラリーを用いて、溶解性の変化したタンパク質およびタンパク質バリアントを単離することができる。1つの特定の例においては、GFPが単一の不溶性ポリペプチドのバリアントと融合したものを発現するように設計されたコンビナトリアルライブラリーを用いて、ポリペプチドの可溶性バリアントをコードする核酸分子を単離しうる。
【０２０７】
さらに、これらのライブラリーの核酸分子が、抗体分子の可変ドメイン（例えば、抗体の軽鎖および重鎖の可変ドメイン）をコードしてもよい。特定の態様において、本発明は、1つまたは複数の抗原に対する結合特異性を有するタンパク質をコードする核酸分子を同定するためのスクリーニング方法を提供する。
【０２０８】
ある種の特定の態様において、以上に言及した1つまたは複数のライブラリーは、抗体の軽鎖および重鎖の可変ドメインをコードするポリヌクレオチドを含む。関連した態様においては、少なくとも1つの核酸セグメントが、可変ドメインをコードする核酸の間に位置する。この介在核酸は、抗体分子の可変ドメインを連結するためのポリペプチドリンカーをコードする。特定の態様において、本発明の方法によって同定されるタンパク質複合体には、抗体分子、または少なくとも2つの一本鎖抗原結合タンパク質を含む多価抗原結合タンパク質が含まれる。
【０２０９】
抗体分子のコンビナトリアルライブラリーを調製するために、さまざまな方法が開発されている。例えば、完全または部分的な合成抗体の結合部位またはパラトープの大規模ライブラリーが、ファージミドと呼ばれる繊維状ファージディスプレイベクターを利用して構築され、多様かつ新規な免疫特異性を有するモノクローナル抗体の大規模ライブラリーが得られている。この技術は、繊維状ファージコートタンパク質の膜アンカードメインを、繊維状ファージ複製の集合段階で遺伝子産物と遺伝子を結合させるための手段として用いており、これはコンビナトリアルライブラリーからの抗体のクローニングおよび発現のために用いられている（Kangら、Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 88：4363-4366 (1991)）。抗体のコンビナトリアルライブラリーは、cpVIII膜アンカー（Kangら、Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 88：4363-4366 (1991)）およびcpIII膜アンカー（Barbasら、Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 88: 7978-7982 (1991)）の両方から作製されている。
【０２１０】
繊維状ファージを用いるコンビナトリアル抗体ライブラリーの多様性は、例えば、重鎖および軽鎖遺伝子のシャッフリングにより（Kangら、Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 88: 11120-11123 (1991)）、ライブラリーのクローニングされた重鎖遺伝子の相補性決定領域3（CDR3）を改変することにより（Barbasら、Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 89: 4457-4461 (1992)）、およびエラープローン（error-prone）ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）によってライブラリーにランダム変異を導入することにより（Gramら、Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 89: 3576-3580 (1992)）、高めることができる。さらに、コンビナトリアルライブラリーを作製するための種々のクローニングシステムが別の者によって記載されている。ファージミド上でのコンビナトリアル抗体ライブラリーの調製は、例えば、Kangら、Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 88: 4363-4366 (1991)；Barbasら、Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 88：7978-7982 (1991)；Zebedeeら、Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 89: 3175-3179 (1992)；Kangら、Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 88: 11120-11123 (1991)；Barbasら、Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 89: 4457-4461 (1992)；およびGramら、Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 89：3576-3580 (1992)に記載されており、これらのそれぞれの開示内容は参照として本明細書に組み入れられる。
【０２１１】
本発明は一般に、抗体ドメイン（例えば、免疫グロブリンの軽鎖可変ドメインおよび重鎖可変ドメイン）の多様なライブラリーの調製、およびその後の、特定の結合特異性を有する分子を同定するためのこのようなライブラリーのスクリーニングにより、新規な抗体分子および一本鎖抗原結合タンパク質を作製するための方法に関する。このような抗体分子は、1つまたは複数の抗原に対する結合親和性を示す発現産物に関するスクリーニングによって入手しうる。例えば、ライブラリーによってコードされ、繊維状ファージ（例えば、gIIIファージ）の表面に提示されるタンパク質発現産物をスクリーニングし、事前に選択した1つまたは複数の抗原と結合するものを同定することもできる。
【０２１２】
さらに、免疫グロブリンの軽鎖可変ドメインおよび重鎖可変ドメイン（すなわち、軽鎖および重鎖の可変領域）のライブラリーを組み合わせて、各種の重鎖可変鎖および軽鎖可変鎖のランダムな対合を形成させ、特殊なヘテロ二量体を生じさせることもできる。このような組み合わせは、本明細書でさらに説明するように、さまざまな手法によって実施可能であり、これには（1）単一の重鎖可変ドメインを軽鎖可変ドメインのライブラリーと組み合わせること、（2）単一の軽鎖可変ドメインを重鎖可変ドメインのライブラリーと組み合わせること、（3）ランダム化された軽鎖可変ドメインまたは重鎖可変ドメインを、それぞれ単一の重鎖可変ドメインまたは軽鎖可変ドメインと組み合わせること、（4）ランダム化された軽鎖可変ドメインまたは重鎖可変ドメインを、それぞれ重鎖可変ドメインまたは軽鎖可変ドメインのライブラリーと組み合わせること、および（5）ランダム化された軽鎖可変ドメインまたは重鎖可変ドメインを、それぞれランダム化された重鎖可変ドメインまたは軽鎖可変ドメインと組み合わせること、が含まれる。他の変法も明らかである。以上に言及した軽鎖および重鎖可変ドメインは同じタンパク質鎖でも異なるタンパク質鎖でもよい。一本鎖抗原結合タンパク質は、軽鎖および重鎖可変ドメインが単一のタンパク質鎖に存在しうる一例である。
【０２１３】
ランダム化とは一般に、変異誘発による、免疫グロブリン軽鎖可変ドメインおよび重鎖可変ドメインをコードする核酸分子のライブラリーの調製を含むことを意味する。
【０２１４】
抗体レパートリーを作製するための以上の方法の1つの変法は、軽鎖可変ドメインの核酸を重鎖可変ドメインと組み合わせたもの、特にランダム化された重鎖可変ドメインライブラリーと組み合わせたものをコードするランダム化された核酸分子の使用によるものである。本発明の他の態様は、「普遍的（universal）軽鎖」またはその軽鎖可変ドメインを利用する方法を含む。さまざまな重鎖の任意のものと複合体を形成して機能的ヘテロ二量体となる能力を有し、このため、さまざまな重鎖とともに用いうることを意味して「普遍的軽鎖」と呼ばれる免疫グロブリン軽鎖が、Barbasら、米国特許第6,096,551号に記載されており、これを本発明の方法に用いうる。1つの態様においては、1つまたは複数の抗原に対する特異性を有する抗原結合タンパク質を同定するために、ランダム化された普遍的軽鎖を重鎖または重鎖ライブラリーと組み合わせたもののスクリーニングを行う。
【０２１５】
また、本発明の核酸分子を、宿主細胞（例えば、動物細胞）において発現されると細胞遺伝子を補完するもの、または宿主細胞に表現型上の性質、特徴または活性を付与するものを同定するためにスクリーニングすることもできる。すなわち、本発明の核酸分子は、例えば、細胞のゲノム中に存在する遺伝子を置き換えるように設計された遺伝子治療ベクターを調製するため、このような遺伝子を除去するため、または異種遺伝子もしくは遺伝子の群を挿入するために用いることができる。本発明の核酸分子が1つまたは複数の遺伝子を除去または置換するように働く場合、除去または置換される1つまたは複数の遺伝子は、「正常な」表現型または異常な表現型（例えば、嚢胞性繊維症）のいずれの発現をもたらすものでもよい。さらに、遺伝子治療ベクターは安定的に維持されてもよく（例えば、相同組換えによる細胞核酸への組込み）、または細胞内で非安定的に維持されてもよい。
【０２１６】
また、本発明の核酸分子を、内因性遺伝子の発現に起因する「異常な」表現型を抑制するため、または「正常」な表現型を補完もしくは補足するために用いることもできる。異常な表現型を抑制するために設計される本発明の核酸分子の一例は、核酸分子の発現産物がドミナント/ネガティブ活性を有するものと考えられる。正常な表現型を補足するために設計される本発明の核酸分子の一例は、核酸分子の導入が、細胞に存在する遺伝子の増幅を効果的にもたらすものと考えられる。
【０２１７】
一例として、以下のものに類似したプロトコールを、遺伝子治療ベクターの設計および作製に用いることができる。cDNAライブラリーの核酸分子を、遺伝的欠陥に起因する症状発現（例えば、嚢胞性繊維症）を軽減しうる産物（例えば、CFTR）をコードする核酸分子を同定するためにスクリーニングすることもできる。これらの核酸分子は、例えば、特定の遺伝的欠陥に起因する細胞への影響を補完しうる発現産物をコードする核酸分子に関するスクリーニングによって、または特定の欠陥と関連することが知られた遺伝子に由来する配列を有するプライマーとハイブリダイズしうることによって同定しうる。さらに、本発明の工程を、遺伝的欠陥が発現する細胞において作用するプロモーター因子を同定するために用いることもできる。このようなプロモーターは構成性でも組織特異的でもよい。
【０２１８】
上記の核酸分子がひとたび同定および単離されれば、産物をコードする核酸分子をプロモーター因子と機能的に結合させることができる。さらに、機能的に結合された核酸結合物を、続いて、本明細書中の別の箇所に記載したように、遺伝子治療に適したベクター（例えば、アデノウイルスベクター）中に配置してもよい。
【０２１９】
すなわち、関連した面において、本発明は、1つまたは複数の発現産物（例えば、1つまたは複数の融合タンパク質）を発現する遺伝子治療ベクター、このようなベクターを作製するための方法、本発明のベクターを用いて遺伝子治療を行うための方法、このようなベクターの発現産物（例えば、コードされるRNAおよび/またはタンパク質）および本発明のベクターを含む宿主細胞を提供する。
【０２２０】
遺伝子治療の方法に関する一般的総説については、Goldspielら、1993, Clinical Pharmacy 12: 488-505；WuおよびWu、1991, Biotherapy 3: 87-95；Tolstoshev, 1993, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32: 573-596；Mulligan, 1993, Science 260: 926-932；ならびにMorganおよびAnderson, 1993, Ann. Rev. Biochem. 62: 191-217；May, 1993, TIBTECH 11(5): 155-215を参照されたい。用いることができる、組換えDNA技術の分野で一般的に知られた方法は、Ausubelら（編）、1993, 「分子生物学における最新プロトコール（Current Protocols in Molecular Biology）」、John Wiley & Sons, NY；およびKriegler, 1990, 「遺伝子の導入および発現、実験室マニュアル（Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual）」、Stockton Press, NYに記載されている。
【０２２１】
もう1つの特定の態様においては、本発明の抗体または他の抗原結合タンパク質をコードする核酸分子を含むウイルスベクターが用いられる。例えば、レトロウイルスベクターを用いることができる（Millerら、Meth. Enzymol. 217: 581-599 (1993)を参照されたい）。これらのレトロウイルスベクターは、ウイルスゲノムのパッケージングおよび宿主細胞DNAへの組込みに必要でないレトロウイルス配列を除去するために用いられている。遺伝子治療に用いようとする抗体をコードする核酸分子を、患者への遺伝子の送達を容易にする1つまたは複数のベクター中にクローニングする。レトロウイルスベクターに関するこれ以上の詳細は、Boesenら、Biotherapy 6: 291-302 (1994)に記載があり、これには、幹細胞の化学療法に対する抵抗性を高めることを目的にmdr1遺伝子を造血幹細胞に送達するためのレトロウイルスベクターの使用が記載されている。遺伝子治療におけるレトロウイルスベクターの使用の例証となる他の参考文献には以下のものがある：Clowesら、1994, J. Clin. Invest. 93: 644-651；Kiemら、1994, Blood 83: 1467-1473；SalmonsおよびGunzberg、1993, Human Gene Therapy 4: 129-141；およびGrossmanおよびWilson、1993, Curr. Opin. in Genetics and Devel. 3: 110-114。
【０２２２】
アデノウイルスは、遺伝子治療に用いうる別のウイルスベクターである。アデノウイルスは気道上皮に遺伝子を送達するための媒体として特に興味が持たれ、このようなベクターの使用は本発明の範囲に含まれる。アデノウイルスは通常、気道上皮を感染させ、そこで軽度の疾患を引き起こす。アデノウイルスを用いる送達システムの他の標的には、肝臓、中枢神経系、内皮細胞および筋肉がある。アデノウイルスには非分裂細胞を感染させうるという利点がある。KozarskyおよびWilson、1993, Current Opinion in Genetics and Development 3: 499-503は、アデノウイルスを用いる遺伝子治療に関する総説を提示している。Boutら、1994, Human Gene Therapy 5: 3-10は、アカゲサルの気道上皮に遺伝子を導入するためのアデノウイルスベクターの使用を示している。遺伝子治療にアデノウイルスを用いた他の事例は、Rosenfeldら、1991, Science 252: 431-434；Rosenfeldら、1992, Cell 68: 143-155；Mastrangeliら、1993, J. Clin. Invest. 91: 225-234；PCT国際公開公報第94/12649号および国際公開公報第96/17053号；米国特許第5,998,205号；ならびにWangら、1995, Gene Therapy 2: 775-783に記載されており、これらすべての開示内容はその全体が参照として本明細書に組み入れられる。1つの態様においては、アデノウイルスベクターを用いる。
【０２２３】
アデノ随伴ウイルス（AAV）およびヘルペスウイルス、ならびにこれらのウイルスから調製されたベクターも、遺伝子治療における使用が提案されている（Walshら、1993、Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 204: 289-300；米国特許第5,436,146号；Wagstaffら、Gene Ther. 5: 1566-70 (1998)）。神経細胞における遺伝子発現が望まれる用途には、ヘルペスウイルスベクターは特に有用である。
【０２２４】
遺伝子治療に対するもう1つのアプローチは、エレクトロポレーション、リポフェクション、リン酸カルシウムを介したトランスフェクションまたはウイルス感染などの方法により、組織培養下の細胞に遺伝子を移入することを含む。通常、移入の方法は、細胞への選択マーカーの移入を含む。続いて、移入された遺伝子を取り込んで発現している細胞を単離するために細胞を選択下におく。続いて、そのような細胞を患者に投与する。
【０２２５】
この態様において、核酸は、結果として生じた組換え細胞のインビボ投与の前に、細胞に導入される。このような導入は、トランスフェクション、エレクトロポレーション、微量注入、核酸配列を含むウイルスベクターまたはバクテリオファージベクターによる感染、細胞融合、染色体を介した遺伝子導入、マイクロセルを介した遺伝子導入、スフェロプラスト融合などを非制限的に含む、当技術分野で知られた任意の方法によって行うことができる。外来遺伝子の細胞への導入に関して、当技術分野ではさまざまな技法が知られており（例えば、LoefflerおよびBehr、1993, Meth. Enzymol. 217: 599-618；Cohenら、1993, Meth. Enzymol. 217: 618-644；Cline、1985, Pharmac. Ther. 29: 69-92）、レシピエント細胞の必要な発生的および生理的な機能が阻害されないという前提で、本発明に従って用いうる。これらの技法は、核酸が細胞によって発現可能であり、選択的にはその細胞の子孫にも遺伝可能であって発現可能であるように、細胞への核酸の安定的な移入をもたらす必要がある。
【０２２６】
1つの特定の態様において、遺伝子治療の目的で導入される核酸分子は、適切な転写誘導因子の有無を制御することによって核酸分子の発現を制御しうるように、コード領域と機能的に結合した誘導性プロモーターを含む。
【０２２７】
簡単に言えば、それぞれの標的核酸分子は、1つまたは複数の組換え部位（例えば、2個、3個、4個、5個、7個、10個、12個、15個、20個、30個、50個など）に加えて、プライマー部位として用いるのに適した配列（例えば、配列決定用プライマーまたは増幅プライマーなどのプライマーが、核酸の合成、増幅または配列決定を開始するためにハイブリダイズしうる配列など）、プロモーターもしくはエンハンサーなどの転写もしくは翻訳シグナルまたは調節配列、リボソーム結合部位、コザック配列、開始コドン、終止コドンなどの転写および/または翻訳終結シグナル（これは1つまたは複数のサプレッサーtRNA分子によって最適な形で抑制されうる）、複製起点、選択マーカー、およびタンパク質融合物（例えば、N末端またはカルボキシ末端）の作製に用いうるコード領域、例えばグルタチオンS-トランスフェラーゼ（GST）、β-グルクロニダーゼ（GUS）、免疫グロブリンのFc部分、抗体、ヒスチジンタグ（HIS6）、緑色蛍光タンパク質（GFP）、黄色蛍光タンパク質（YFP）、シアン蛍光タンパク質（CFP）、オープンリーディングフレーム（ORF）配列、転写活性化ドメイン、翻訳に関与するタンパク質またはドメイン、タンパク質局在化タグ、プロテアーゼ切断部位、タンパク質安定化または不安定化配列、タンパク質相互作用ドメイン、DNAの結合ドメイン、タンパク質基質、精製用タグ（例えば、エピトープタグ、マルトース結合タンパク質、ヒスチジン6タグ、グルタチオンS-トランスフェラーゼなど）、ならびに種々の分子生物学の技法において設計または使用しうる任意の他の目的配列（相同組換えに用いるため（例えば、遺伝子ターゲティングに用いるため）の配列を含む）を非制限的に含む、さまざまな配列（またはそれらの組み合わせ）を含みうる。
【０２２８】
組換え系および組換え部位
本発明に用いるための組換え部位は、組換え反応における基質として作用しうる任意の核酸であってよい。このような組換え部位は、野生型または天然の組換え部位でもよく、または改変型、バリアント、誘導型もしくは変異型の組換え部位でもよい。本発明に用いるための組換え部位の例には、λファージ組換え部位（attP、attB、attLおよびattR、ならびにそれらの変異体または誘導体など）ならびにHP1、S2、phi80、P22、P2、186、P4およびP1などの他のバクテリオファージ由来の組換え部位（loxP、loxP511などのlox部位およびそれらのバリアントを含む）が非制限的に含まれる。変異したatt部位（例えば、attB 1〜10、attP 1〜10、attR 1〜10およびattL 1〜10）は、1999年5月28日に提出された米国特許出願第60/136,744号；2000年3月2日に提出された米国特許出願第09/517,466号；およびPCT国際公開公報第00/52027号に記載されており、これらはそれぞれ明確に参照として本明細書に組み入れられる。部位特異性の違いにより、所望の分子のディレクショナルクローニングまたは連結が可能になり、それによってクローニングされた分子の所望の配向が得られる。一意的な特異性を有する他の組換え部位（すなわち、第1の部位はその対応する部位と組換えを行うが、異なる特異性を有する第2の部位とは組換えを行わないと考えられる）は当業者に知られており、本発明の実施に用いうる。これらの系に対応する組換えタンパク質を、指定された組換え部位を用いて、本発明に従って用いることができる。
【０２２９】
本発明に用いるための組換え部位および組換えタンパク質が得られる他の系には、出芽酵母由来のFLP/FRT系、リゾルベースファミリー（例えば、RuvC、γΔ、TndX、TnpX、Tn3リゾルベース、Hin、Hjc、Gin、SpCCE1、ParAおよびCin）ならびにIS231および他のバチルス・チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）転移因子が含まれる。本発明に用いるのに適した他の組換え系には、大腸菌におけるXerCおよびXerDリコンビナーゼならびにpsi、difおよびcer組換え部位が含まれる。他の適した組換え部位は、ElledgeおよびLiuに対して発行された米国特許第5,851,808号（これは明確に参照として本明細書に組み入れられる）に記載がある。本発明に用いられる組換えタンパク質および変異型、改変型、バリアントまたは誘導型の組換え部位には、米国特許第5,888,732号および第6,143,557号ならびに米国特許出願第09/438,358号（1999年11月12日に提出）、米国特許出願第60/108,324号（1998年11月13日に提出）、米国特許出願第09/732,914号（2000年12月11日に提出）、米国特許出願第09/517,466号（2000年3月2日に提出）および米国特許出願第60/136,744号（1999年5月28日に提出）に記載されたもの、ならびにインビトロゲン社、カールズバッド、CAから入手可能なGATEWAY（商標）クローニング技術に付随するものが含まれ、これらのそれぞれの全開示内容は明確に参照として本明細書に組み入れられる。組換えクローニング方法は、米国特許庁（U.S. Patent & Trademark Office）に2001年3月＿日に提出された、Espositoら、「核酸分子の組換えクローニングのための組成物および方法（Compositions and Methods for Recombinational Cloning of Nucleic Acid Molecules）」（その全開示内容は参照として本明細書に組み入れられる）にも記載されている。
【０２３０】
ある種の態様において、本発明の組成物および方法に用いられる組換え部位は、loxPおよび/またはloxP511部位を含まない。
【０２３１】
図9に一般化して示されているように、GATEWAY（商標）クローニングシステムは2つの主反応から構成される。これらの反応の第1のものであるLR反応（図10A）は、本明細書中ではデスティネーション反応として互換的に称することができ、この系の主要経路である。LR反応は、本明細書に記載のGATEWAY（商標）LRクロナーゼ（商標）Enzyme Mixなどの組換えタンパク質の混合物によって媒介される、エントリーベクターまたはエントリークローンと目的ベクターとの間の組換え反応である。図10Aに示された態様において、この反応は、目的の核酸分子（これは遺伝子、cDNA、cDNAライブラリーまたはそれらの断片のいずれでもよい）をエントリークローンから発現ベクターに移行させ、発現クローンを生じる。
【０２３２】
図10Aおよび10B中にL、R、BおよびPと表記された部位はそれぞれ、クロナーゼ（商標）の混合物（本明細書では、「クロナーゼ（商標）」または「GATEWAY（商標）LRクロナーゼ（商標）Enzyme Mix」（本明細書に記載のattL×attR組換え反応を媒介する組換えタンパク質混合物の場合）（インビトロゲン社、Cafisbad、CA、カタログ番号11791-019）または「GATEWAY（商標）BPクロナーゼ（商標）Enzyme Mix」（本明細書に記載のattB×attP組換え反応を媒介する組換えタンパク質混合物の場合）（インビトロゲン社、カールズバッド、CA、カタログ番号11789-013）とさまざまな形で呼ばれる）を構成する、バクテリオファージλ組換えタンパク質のattL、attR、attBおよびattP組換え部位である。これらの組換えクローニング反応は、協調的で高度に特異的な切断連結反応と等価である。このようにして見ると、組換えタンパク質は、例えば、エントリークローン中の目的の核酸分子の左側および右側を切断し、それを目的ベクターと連結して、新たな発現クローンを生じさせる。
【０２３３】
発現クローンにおける核酸挿入物は一般に、短いattB1およびattB2部位によって挟まれている。attL1はattR1のみと反応し、attL2はattR2のみと反応するため、核酸挿入物の向きおよびリーディングフレームはサブクローニングの全体を通じて維持される。同様に、attB1はattP1のみと反応し、attB2はattP2のみと反応する。したがって、本発明は、バリアント、断片、変異体および誘導体（特異性が変化または増強したものでもよい）を含む、本発明の組換え部位（またはそれらの部分）を用いる制御下でのクローニングまたはディレクショナルクローニングの方法にも関する。本発明はまた、さらに一般的に、任意のさまざまな組換え部位のパートナーまたは対（それぞれの組換え部位がそれに対応する組換え部位に対して特異的である、またはそれと相互作用するもの）にも関する。このような組換え部位は、任意のさまざまな必要な特異性を得るために組換え部位を変異または改変させることによって作製することができ、その非制限的な例は図13A〜13Cに記載されている。
【０２３４】
図10A〜10Bに示された態様を例示を目的として用いると、組換え反応によるアリコートを宿主細胞（例えば、大腸菌）に形質転換で導入し、適切な選択物質（例えば、アンピシリンなどの抗生物質）を含むプレートに播くと、所望のクローンを含む細胞はコロニーを形成する。反応しなかった目的ベクターは、それがアンピシリン耐性遺伝子を有していてもアンピシリン耐性コロニーを生じないが、これはそれが毒性遺伝子（例えば、ccdB）を含むためである。このように、アンピシリン耐性に対する選択によって所望の産物を有する大腸菌細胞が選択され、これは通常、アンピシリンプレート上のコロニーの90％を上回る。
【０２３５】
組換えクローニング反応を受けさせるためには、核酸挿入物（例えば、cDNAライブラリー個々の構成要素）をまずエントリーベクター中にクローニングして、エントリークローンを作製する。エントリークローンの作製のためには複数の選択肢を用いることができ、これには以下のものが含まれる：末端attB組換え部位を有するPCR配列のエントリーベクター中へのクローニング；GATEWAY（商標）クローニングシステムの組換え反応を用いること；GATEWAY（商標）クローニングシステムベクター中に調製されたライブラリーからの遺伝子を組換えによってエントリーベクター中に移行させること；標準的な組換えDNA法による、制限酵素により生じた断片およびPCR断片のエントリーベクター中へのクローニング、ならびにトポイソメラーゼクローニング。これらのアプローチについては、本明細書においてさらに詳細に考察する。
【０２３６】
GATEWAY（商標）クローニングシステムの重要な利点は、エントリークローンとして存在する目的の核酸分子（またはさらには目的の核酸分子の集団も）を、約30秒〜約60分間の任意の範囲（例えば、約1〜60分間、約1〜45分間、約1〜30分間、約2〜60分間、約2〜45分間、約2〜30分間、約1〜2分間、約30〜60分間、約45〜60分間または約30〜45分間）にわたる単純な反応で、1つまたは複数の目的ベクター中に同時並行的にサブクローニングしうることである。反応時間がさらに長い（例えば、2〜24時間または一晩）と組換え効率が高まると考えられ、、比較的長い核酸分子を用いた場合は特にそうである。さらに、得られたコロニーが高率に所望の発現クローンを有する。この工程は図11に模式的に例示されており、この図は目的の分子を同時または別個に複数の目的ベクターに移動させうる本発明の利点を示している。LR反応において、組換えを行う核酸分子の一方または両方は任意のトポロジー（例えば、線状、弛緩した環状、ニック入りの環状、超らせん状など）を有しうる。
【０２３７】
GATEWAY（商標）クローニングシステム第2の主要経路はBP反応（図10B）であり、これは本明細書においてエントリー反応またはエントリー反応と互換的に称しうる。BP反応は、発現クローンとドナープラスミド（図9における副産物の相当物）との組換えを行える。この反応は、発現クローン中の目的の核酸分子（これは線状、らせん状、超らせん状などを含む種々のトポロジーの任意のものを有しうる）をエントリーベクターに移行させ、新たなエントリークローンを生じさせる。この目的の核酸分子がエントリーベクター中にひとたびクローニングされれば、それを上記のLR反応によって新たな発現ベクターに移行させることができる。BP反応において、組換えを行う核酸分子の一方または両方は任意のトポロジー（例えば、線状、弛緩した環状、ニック入りの環状、超らせん状など）を有しうる。
【０２３８】
BP反応の1つの変形物は、増幅（例えば、PCR）または核酸合成の産物の迅速なクローニングおよび発現を可能にする。末端に25塩基対attB部位を含むプライマーを用いて合成した増幅（例えば、PCR）産物は、エントリークローニング反応のための有効な基質として作用する。このような増幅産物をドナーベクターと組み換えさせ、エントリークローンを作製することができる（図10B参照）。その結果、増幅断片を含むエントリークローンが得られる。続いて、このようなエントリークローンを（LR反応によって）目的ベクターと組み換えさせると、PCR産物の発現クローンが得られる。
【０２３９】
LR反応のそのほかの詳細は図10Aに示されている。この反応を媒介するGATEWAY（商標）LRクロナーゼ（商標）Enzyme Mixは、λ組換えタンパク質であるInt（インテグラーゼ）、Xis（切出し酵素）およびIHF（組込み宿主因子）を含む。これに対して、BP反応（図10B）を媒介するGATEWAY（商標）BPクロナーゼ（商標）Enzyme MixはIntおよびIHFのみを含む。
【０２４０】
各ベクターの組換え（att）部位は、親ベクターによって供与される2つの異なるセグメントを含む。図10Aおよび10Bに示された、各att部位の2つの部分を区分する食い違い線は、組換え反応中にIntにより生じる7塩基のスタッガードカット（staggerd cut）を表す。この構造は、エントリークローンのattL1およびattL2部位と目的ベクターのattR1およびattR2部位との間の組換えによって生じた発現クローンのattB組換え部位の配列を示した図12にさらに詳細に示されている。
【０２４１】
1つの態様において、発現クローンにおける目的の核酸分子はattB部位によって挟まれている：attB1は左側（アミノ末端）にあり、attB2は右側（カルボキシ末端）にある。Intにより生じる7塩基のスタッガードカットの左側にあるattB1は目的ベクターに由来し、スタッガードカットの右側の塩基はエントリーベクターに由来する（図12参照）。これらの配列がオープンリーディングフレームに対応するトリプレット形式で示されていることに注目されたい。エントリーベクター中にクローニングされた目的の核酸分子のリーディングフレームがattB1に関して示されたリーディングフレームと同相にあれば、目的の核酸分子とアミノ末端融合物ドメインをコードするGATEWAY（商標）クローニングシステムの任意の目的ベクターとの間にアミノ末端タンパク質融合物が作製されうる。3通りのリーディングフレームのすべてにおけるクローニングを可能にするエントリーベクターおよび目的ベクター。
【０２４２】
LR反応は、エントリークローンと種々の目的ベクターとの組換えを行うことにより、所望の目的の核酸分子の新たな発現ベクターへの移行を可能にする。しかし、LR反応またはデスティネーション反応を行わせるために、目的の核酸分子をまず、エントリークローンを作製するためのベクターに挿入してもよい。エントリークローンは図14に示したようにさまざまな手法によって作製しうる。
【０２４３】
1つのアプローチは、制限酵素およびリガーゼを用いる標準的な組換えDNA法により、目的の核酸分子を1つまたは複数のエントリーベクター中にクローニングすることである。出発（starting）DNA断片は、制限酵素消化により、またはPCR産物として作製しうる。断片はエントリーベクター中のattL1組換え部位とattL2組換え部位との間にクローニングされる。不完全消化されたエントリーベクター由来のバックグラウンドのコロニーを最小限に抑えるために付与された毒性遺伝子または「細胞死」遺伝子（例えば、ccdB）を切り出し、目的の核酸分子によって置き換える必要があることに注意されたい。
【０２４４】
エントリークローンを作製するための第2のアプローチ（図14）は、本明細書中に詳細に述べるように、エントリーベクター中にライブラリー（例えば、ゲノムライブラリー、cDNAライブラリー、合成核酸ライブラリーなど）を作製することである。続いて、このようなライブラリーを、発現スクリーニングのために、例えば、酵母細胞または哺乳動物細胞などの適切な宿主細胞内にある目的ベクターに移行させることができる。
【０２４５】
エントリークローンを作製するための第3のアプローチ（図14）は、発現ベクター中に調製したcDNA分子またはライブラリーから入手した発現クローンを用いることである。attB部位に挟まれたこのような cDNAまたはライブラリーを、BP反応を介したドナーベクターとの組換えによってエントリーベクターに導入することができる。必要に応じて、発現クローンのライブラリー全体をBP反応によってエントリーベクターに移行させることもできる。発現クローンのcDNAライブラリーを、さまざまな原核生物用および真核生物用のGATEWAY（商標）改変ベクター（例えば、pDEST1（例えば、図17A〜17Dを参照））中に構築することもできる。
【０２４６】
エントリークローンを作製するための第4の、そして最も汎用性があると考えられるアプローチ（図14）は、目的の核酸分子に関する配列を、増幅（例えば、PCR）断片のクローニングによってエントリーベクターに導入することである。DNA配列をまず、attBヌクレオチド配列の2つまたはそれ以上（例えば、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、8つ、9つ、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24または25）のヌクレオチド（図12または図13A〜13Cに示されたものを非制限的に含む）を含むプライマーを用いて増幅する（例えば、PCRによる）。選択的には、1つまたは複数、2つまたはそれ以上、3つまたはそれ以上、4つまたはそれ以上、または4つもしくは5つもしくはそれ以上の追加的な末端ヌクレオチド塩基がグアニンでありうる。続いて、attB-PCR産物を、1つまたは複数のattP部位を含み、選択的には1つまたは複数のトポイソメラーゼクローニング部位を含むドナーベクターと組み換えさせるBP反応を行うことにより、PCR産物をエントリークローンに変換することができる。
【０２４７】
さまざまなエントリークローンをこれらの方法によって作製し、多様なクローニングの選択肢に供することができる；さまざまな専用のエントリーベクターもインビトロゲン社、カールズバッド、CAから市販されている。
【０２４８】
エントリーベクターおよび目的ベクターはしばしば、核酸挿入物（例えば、cDNAライブラリーの構成要素）のアミノ末端領域がattL1部位に隣接するように構築される。エントリーベクターはattL1部位の上流にrrnB転写終結暗号を含みうる。この配列は、クローニングされた目的の核酸分子の発現を大腸菌において確実に「停止」させるため、毒性遺伝子も首尾良くクローニングを行うことができる。すなわち、エントリークローンを転写的にサイレントとなるように設計しうる。エントリーベクターが（したがってエントリークローンも）形質転換後にエントリークローンを含む宿主細胞の選択を容易にするためのカナマイシン抗生物質耐性（kanr）遺伝子も含むことに注意されたい。しかし、ある種の用途において、エントリークローンは、形質転換後にエントリークローンを含む宿主細胞の選択を容易にするための、ゲンタマイシン耐性（genr）遺伝子またはテトラマイシン耐性（tetr）遺伝子を非制限的に含む他の選択マーカーを含みうる。
【０２４９】
目的の核酸分子がエントリーベクター中にひとたびクローニングされれば、それを目的ベクターに移動させることができる。図10Aの右上方部分は目的ベクターの概略図を示している。太い矢印はクローン中の目的の核酸分子に対して作用すると思われる何らかの機能（転写または翻訳のことが多い）を表す。この例では、組換え反応の際に、毒性（例えば、ccdB）であるか増殖を阻害する産物をコードする遺伝子を含む、attR1部位とattR2部位との間の領域が、エントリークローン由来のDNAセグメントによって置換される。アンピシリン耐性（ampr）遺伝子（目的ベクターに存在したもの）を獲得し、しかも毒性産物または増殖阻害性産物をコードする遺伝子を喪失した組換え体に関する選択により、その結果生じるコロニーが高率（通常＞90％）に正しい挿入物を含むことが確実となる。
【０２５０】
目的の核酸分子を目的ベクター中に移動させるためには、目的ベクターを、所望の目的の核酸分子を含むエントリークローンと混合し、組換えタンパク質（例えば、GATEWAY（商標）LRクロナーゼ（商標）Enzyme Mix）の混合物を添加して、この混合物をインキュベートし（例えば、約25℃で約15分間、または特定の状況下、例えば、以下に述べるように長い核酸分子の移行の場合はより長い時間）、任意の標準的な宿主細胞（大腸菌などの細菌細胞；昆虫細胞、哺乳動物細胞、線虫細胞などの動物細胞；植物細胞；および酵母細胞）系統に反応混合物による形質転換を施す。用いる宿主細胞は所望の選択によって決まると考えられる（例えば、インビトロゲン社、カールズバッド、CAから販売されている大腸菌DB3.1は、ccdB細胞死遺伝子を含むクローンの生存を可能にするため、コインテグレート分子‐すなわち、エントリークローンと目的ベクターとのハイブリッドである分子を選択するために用いうる）。以下の実施例には、目的の核酸分子の移行にエントリーおよび目的ベクターを用いるための詳細およびプロトコールを提示している。
【０２５１】
このように、本発明のクローニングシステムには数多くの利点がある：
【０２５２】
目的の核酸分子がGATEWAY（商標）クローニングシステム中にひとたびクローニングされれば、それをリーディングフレームおよび向きに関して完全な信頼性のある他のベクターに対して出し入れすることができる。すなわち、エントリークローン上のattL1が目的ベクター上のattR1と組換えを行う反応が進行するため、目的の核酸分子の方向性が維持される、またはエントリークローンから目的ベクターへの移行に際してそれを制御しうる。このため、GATEWAY（商標）クローニングシステムは、目的の核酸分子のディレクショナルクローニングを行う強力かつ簡単な方法を提供する。
【０２５３】
一段階クローニングまたはサブクローニング：エントリークローンおよび目的ベクターをLRクロナーゼ（商標）と混合し、インキュベートした上で細胞の形質転換に用いることができる。
【０２５４】
attB部位をPCRプライマーに付加した後にインビトロ組換えを行うことにより、PCR産物を容易にクローニングすることができる。続いて、クローニングされた産物を、生成されたエントリークローンから目的ベクターへと直接移行させる。この工程を一段階で行ってもよい。
【０２５５】
強力な選択により高い信頼性が得られる：コロニーの90％超（しばしば99％超）が新たなベクター中に所望のDNAを含む。
【０２５６】
既存の標準的ベクターのGATEWAY（商標）クローニングシステムベクターへの変換を一段階で行える。このような工程は、大きなベクターまたはクローニング部位が少ないものには理想的である。さらに、組換え部位が短く（25塩基対）、終止コドンも二次構造も含まないように操作することができる。
【０２５７】
ハイスループット用途のため（例えば、診断目的のため、または治療薬候補のスクリーニングのため）に反応を自動化しうる。
【０２５８】
反応が経済的である：DNAはそれぞれ0.3μgを用いるとよく、制限酵素、ホスファターゼ、リガーゼおよびゲル精製は不要である。さらに、反応はミニプレップDNAで良好に進行する。
【０２５９】
複数のクローン、さらにはライブラリーを、1回の実験で1つまたは複数の目的ベクターに移行させうる。
【０２６０】
以下のものを非制限的に含む用途のために、さまざまな目的ベクターを作製しうる：
a）大腸菌におけるタンパク質発現。例えば、天然タンパク質または融合タンパク質（例えば、タンパク質精製のためのGST、HIS6、チオレドキシンなどとの融合物、または1つもしくは複数のエピトープタグとの融合物）を発現させることができる。さらに、大腸菌にタンパク質を発現させるのに有用な任意のプロモーターを用いうる。このようなプロモーターの例には、lac、trp、ptrcおよびT7プロモーターが含まれる。
b）真核細胞におけるタンパク質発現。例えば、上記のように、天然タンパク質または融合タンパク質を発現させることができる。さらに、真核細胞にタンパク質を発現させるのに有用な任意のプロモーターを用いうる。このようなプロモーターの例には、バキュロウイルスポリヘドリン、SP6、メタロチオネインI、オートグラファ核多角体ウイルス、セムリキ森林ウイルス、Tet、CMV、Gal1、Gal10およびT7プロモーターが含まれる。
c）DNA配列決定（例えば、lacプライマー、RNAプローブ、ファージミドなどを用いる）。
d）遺伝子治療。
e）発現クローニング。
f）細菌人工染色体（BAC）の作製。
g）酵母人工染色体（YAC）の作製。
h）ヒト人工染色体（HAC）の作製。
i）P1由来のレプリコン人工染色体（PAC）の作製。
【０２６１】
さまざまなエントリーベクター（標準的な組換えDNA法による組換えクローニング用エントリー）を作製しうる：
a）大腸菌に対する毒性のある遺伝子のすぐ上流での強力な転写終結。
b）3種のリーディングフレーム。
c）TEVプロテアーゼ切断部位を有するもの、または有しないもの。
d）原核生物および/または真核生物での翻訳のためのモチーフ。
e）市販のcDNAライブラリーとの適合性。
【０２６２】
ツーハイブリッドライブラリーおよびファージディスプレイライブラリーを含む、発現スクリーニングのための発現クローンcDNA（attB）ライブラリーを構築することもできる。
【０２６３】
本明細書に記載の移行反応を、記載した一段階または多段階での組換えクローニング工程を用いて行うこともできる。例えば、attB組換え部位に挟まれた最初の集団を、適切なattPベクター（例えば、pDONR201（インビトロゲン社、カールズバッド、CA, カタログ番号11798-014））およびBPクロナーゼ（商標）と混合し、attL部位によって挟まれたエントリークローンを作製する。この集団を単離し（インビボまたはインビトロで）、その後にさらなる移行反応に用いることができる。または、所望の第2のベクターバックグラウンド（目的ベクター）を、LRクロナーゼ（商標）とともに、第1のインビトロで移行された集団に直接付加して、新たなベクターバックグラウンド中に分子のさらなる集団（発現クローン中にattB部位によって挟まれたもの）を作製し、それに対して次の選択を行うこともできる。
【０２６４】
1つの態様において、最初の集団および/または生成された集団はattB1およびattB2部位によって挟まれている。もう1つの態様において、最初の集団および/または生成された集団はattL1およびattL2部位によって挟まれている。このような構成は移行される集団の向きを維持する。他の部位特異的組換え系（他のラムドイド系またはラムドイド様系、Cre/loxP、Flp/FRT、および部位特異的組換えまたは転位を媒介するとして別の箇所に大まかに記載されたものなど）を、この工程を類似の様式で行うために設計することもできる。組換え特異性の異なるlox部位は、PCT国際公開公報第01/11058号に記載されておち、その全開示内容は参照として本明細書に組み入れられる。
【０２６５】
必ずしもすべての選択スキームが、配向が維持されることを必要としているわけではない。配向の維持が必要でない場合には、目的のDNAセグメントを単一の組換え部位によって挟んでもよい（例えば、attB1-DNAセグメント-attB1）。ここでも同じく他の組換え系を適用することができ、場合によってはその方が好ましいと考えられる。開始集団または産物集団またはそれらの構成要素の同定または除去を容易にするために、これらのアプローチに追加的な選択スキームを補足してもよく（例えば、部位-cDNAセグメント-選択マーカー-部位）、そうしなくともよい。
【０２６６】
集団または部分集団をベクター（または挿入物クローン、もしくはベクターと挿入物との組み合わせ）によって与えられる機能の結果として同定または選択できるのと同じく、集団または部分集団をその後の移行の前に除外選択すること、または集団から除外することも可能と考えられる。さらに、その選択には、特定の集団が移行反応への参加から隔絶または阻害されるように移行自体を阻害し、それにより、それによっては阻害されない移行分子の集団を生じさせることが含まれうる。
【０２６７】
本発明の実施に用いうる組換え部位の代表的な例には、以上に言及したatt部位のほかに、これらの部位の改変型が含まれる。例えば、他のatt部位と特異的に組換え行うatt部位を、7塩基対重複領域の内部および付近のヌクレオチドを変更することによって構築することができる。すなわち、本発明の方法、組成物およびベクターに用いるのに適した組換え部位には、4種類の野生型λatt部位であるattB、attP、attLおよびattRのすべてで同一な15塩基対のコア領域（GCTTTTTTATACTAA（配列番号：47））の内部に1つ、2つ、3つ、4つまたはそれ以上のヌクレオチド塩基の挿入、欠失または置換を有するものが非制限的に含まれる（コア領域をさらに詳細に記載している、1996年6月7日に提出された米国特許出願第08/663,002号（現在は米国特許第5,888,732号）および1998年10月23日に提出された第09/177,387号を参照のこと。これらの開示内容はその全体が参照として本明細書に組み入れられる）。本発明の方法、組成物およびベクターにおける使用に適した組換え部位には、15塩基対のコア領域（GCTTTTTTATACTAA（配列番号：47））の内部に1つ、2つ、3つ、4つまたはそれ以上のヌクレオチド塩基の挿入、欠失または置換を有するものも含まれ、これはこの15塩基対コア領域に対して少なくとも50％同一、少なくとも55％同一、少なくとも60％同一、少なくとも65％同一、少なくとも70％同一、少なくとも75％同一、少なくとも80％同一、少なくとも85％同一、少なくとも90％同一または少なくとも95％同一である。
【０２６８】
同様に、attB1、attP1、attL1およびattR1におけるコア領域は互いに同一であり、attB2、attP2、attL2およびattR2におけるコア領域についても同様である。本発明に用いるのに適した核酸分子には、この15塩基対コア領域（GCTTTTTTATACTAA（配列番号：47））の内部に存在する7塩基対重複領域（TTTATAC、これはインテグラーゼタンパク質に対する切断部位によって定義され、鎖交換が起こる領域である）の内部に1つ、2つ、3つ、4つまたはそれ以上のヌクレオチドの挿入、欠失または置換を含むものも含まれる。このような変異体、断片、バリアントおよび誘導体の例には、以下の核酸分子が非制限的に含まれる：（1）7塩基対重複領域の1位のチミンが欠失した、またはグアニン、シトシンもしくはアデニンにより置換された核酸分子；（2）7塩基対重複領域の2位のチミンが欠失した、またはグアニン、シトシンもしくはアデニンにより置換された核酸分子；（3）7塩基対重複領域の3位のチミンが欠失した、またはグアニン、シトシンもしくはアデニンにより置換された核酸分子；（4）7塩基対重複領域の4位のアデニンが欠失した、またはグアニン、シトシンもしくはチミンにより置換された核酸分子；（5）7塩基対重複領域の5位のチミンが欠失した、またはグアニン、シトシンもしくはアデニンにより置換された核酸分子；（6）7塩基対重複領域の6位のアデニンが欠失した、またはグアニン、シトシンもしくはチミンにより置換された核酸分子；および（7）7塩基対重複領域の7位のシトシンが欠失した、またはグアニン、チミンもしくはアデニンにより置換された核酸分子；またはこの7塩基対重複領域の内部における1つまたは複数のこのような欠失および/または置換の任意の組み合わせ。上記の7塩基対コア領域のヌクレオチド配列は以下の表1に示されている。
【０２６９】
以下の非制限的な方法は、本発明に用いうる変異部位を提供する目的で、特定の組換え部位をコードする所定の核酸分子を改変または変異させるために用いうる：
1．部位特異的な（例えば、attPを得るためのattLおよびattR）または他の（例えば、相同的な）組換え機構による、最終的に変異した核酸分子をもたらす1つまたは複数の塩基変化を含む、2つの親DNA配列の組換えによる；
2．所望の核酸分子の直接的な変異または変異誘発（部位特異的、PCR、ランダム、自発的など）による；
3．親DNA配列の変異誘発（部位特異的、PCR、ランダム、自発的など）を行い、それらを組み換えさせて所望の核酸分子を作製することによる；
4．所望のコア配列をコードするRNAの逆転写による；および
5．所望の塩基変化またはランダム塩基変化を有する配列の新規合成（化学合成）を行い、その後に当技術分野で日常的な方法に従って配列決定または機能的分析を行うことによる。
【０２７０】
変異型組換え部位の機能性は、所望の特定の特性、または選択の基盤とする性質、特徴もしくは活性に依存する手法によって示すことができる。例えば、組換え部位に翻訳終止コドンが存在しないことは、適切な融合タンパク質を発現させることによって示すことができる。相同パートナー間の組換えの特異性は、適切な分子をインビトロ反応に導入し、本明細書に記載のように、または当技術分野で知られたように、組換え産物をアッセイすることによって示しうる。組換え部位における他の所望の変異には、制限部位の有無、翻訳または転写開始シグナル、タンパク質結合部位、1つまたは複数のプロテアーゼ切断部位、特定のコード配列、および核酸塩基配列の他の既知の機能が含まれると考えられる。組換え部位における特定の機能的属性に対する遺伝学的選択スキームを公知の方法の工程に従って用いることができる。例えば、（相互作用しない部位の対から）相互作用するパートナーを得るための部位の改変は、毒性物質をコードするDNA配列の部位間の組換えを介した欠失を要求することによって達成しうると考えられる。同様に、翻訳終止配列を除去する部位、タンパク質結合部位の有無などに関する選択は、当業者によって容易に考案されうる。
【０２７１】
改変されたatt部位が構築され、それによって以下のことが示されている：（1）7塩基対の重複（TTTATAC）の最初の3つの位置に作製した置換は組換えの特異性に強く影響する、（2）最後の4つの位置（TTTATAC）に作製した置換は組換え特異性を一部しか変化させない、および（3）7塩基対の重複の外側、かつ15塩基対コア領域の内部におけるヌクレオチド置換は組換えの特異性に影響しないが、組換えの効率には影響を及ぼす。このため、本発明の核酸分子および方法は、組換え特異性に影響を及ぼす1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、8つ、10またはそれ以上の組換え部位、特に、組換え特異性に影響を及ぼす1つまたは複数の変異を有する、15塩基対コア領域内の7塩基対重複に実質的に対応しうる、1つまたは複数（例えば、1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、8つ、10、20、30、40、50など）の異なる組換え部位を含有または利用するものを含む。さらに、このような分子は、NNNATAC（ここで「N」は任意のヌクレオチド（すなわち、A、G、T、UまたはCのいずれでもよい）を指す）などのコンセンサス配列を含みうる。一般に、このコンセンサス配列における最初の3つのヌクレオチドがT/Uであれば、最初の3つのヌクレオチドの残りの2つのうち少なくとも1つはT/Uではない。
【０２７２】
各att部位（attB、attP、attLおよびattR）のコア配列は、インテグラーゼ結合部位、インテグラーゼ切断部位、および特異性を決定する配列からなる機能的単位に分けることができる。特異性決定因子は、インテグラーゼによるトップストランド切断部位の後の最初の3つの位置によって規定される。これらの3つの位置は、以下の参照配列に下線を施して示されている：CAACTTTTTTATACAAAGTTG（配列番号：48）。7塩基対重複領域の最初の3つのヌクレオチドに関して同じ配列を有する他の他のatt部位と高い特異性で組換えを行うatt部位を作製するために用いうる、これらの3つの位置の改変（64通りの組み合わせが可能）について表1に示している。
【０２７３】
（表１）組換え特異性を変化させる、att部位の7塩基対重複領域の最初の3つのヌクレオチドの改変
2004532636.tif 000002
【０２７４】
本発明の方法、組成物およびベクターに適した7塩基対のatt部位重複領域の代表的な例を表2に示している。本発明はさらに、表2に示された1つまたは複数（例えば、1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、8つ、10、20、30、40、50など）のヌクレオチド配列を含む核酸分子を含む。このため、例えば、1つの面において、本発明は、ヌクレオチド配列GAAATAC、GATATAC、ACAATACまたはTGCATACを含む核酸分子を提供する。しかし、ある種の態様においては、本発明は、本明細書中の図13A〜13Cに示されたatt部位コア領域を含む核酸分子を含まないと考えられる。
【０２７５】
（表２）本発明に用いるのに適した7塩基対のatt部位重複領域の代表例
2004532636.tif 000003
【０２７６】
上記の通り、以上に考察した3塩基対領域の3'側に位置するヌクレオチドの変更も組換え特異性に影響を及ぼす可能性がある。例えば、7塩基対重複の最後の4つの位置における変化も組換え特異性に影響を及ぼしうる。
【０２７７】
本発明はこのため、同族パートナーと組換えを行う組換え部位、さらにはこれらの組換え部位を含む分子、ならびにこれらの部位の作製、同定および使用のための方法を提供する。このような部位の同定に用いうる方法は、2000年12月11日に提出された米国特許出願第09/732,914号に記載されており、その全開示内容は参照として本明細書に組み入れられる。このような組換え部位の例には、同族パートナーと会合して組換えを行う7塩基対重複領域を含むatt部位が含まれる。このような7塩基対重複領域の個々の例のヌクレオチド配列は上記の表2に示されている。
【０２７８】
本発明のさらなる態様は、上記の表2に示された7塩基対重複領域または配列番号：47に示された15塩基対コア領域のヌクレオチド配列に対して少なくとも50％同一な、少なくとも60％同一な、少なくとも70％同一な、少なくとも75％同一な、少なくとも80％同一な、少なくとも85％同一な、少なくとも90％同一な、または少なくとも95％同一なヌクレオチド配列、さらにはこれらの任意のヌクレオチド配列に対して相補的なヌクレオチド配列、またはそれらの断片、バリアント、変異体および誘導体を含む、単離された核酸分子を含む。本発明のさらなる態様は、これらの核酸分子を含む組成物およびベクター、ならびにこれらの核酸分子を用いるための方法を含む。
【０２７９】
特定の態様においては、以下の図13A〜13Cに示されたヌクレオチド配列を有する組換え部位、ならびに図13A〜13Cに示されたヌクレオチド配列に対して少なくとも50％同一な、少なくとも60％同一な、少なくとも70％同一な、少なくとも75％同一な、少なくとも80％同一な、少なくとも85％同一な、少なくとも90％同一な、または少なくとも95％同一なヌクレオチド配列を含む組換え部位も、本発明の実施に用いうる。
【０２８０】
attP1部位およびattP2部位を含む核酸分子（attPベクターpDONR201（インビトロゲン社、カールズバッド、CA, カタログ番号11798-014）組換え宿主細胞である大腸菌DB3.1（大腸菌DB3.1（pAHKan）とも呼ばれる）は、1999年2月27日に、Collection, Agricultural Research Culture Collection（NRRL）, 1815 ノース・ユニバーシティ・ストリート、ピオリア、イリノイ 61604 米国に対して、寄託番号NRRL B-30099として寄託されている。寄託された核酸分子内のattP1部位およびattP2部位は、本明細書中の他の箇所にさらに詳細に説明する1つまたは複数の補足的な機能的配列とともに核酸カセット内に含まれている。
【０２８１】
さらに、attR1部位をリーディングフレームA、リーディングフレームBおよびリーディングフレームC中にクローニング部位と並置して含み、対応するattR2部位も含む組換え宿主細胞株である大腸菌DB3.1(pEZC15101)（リーディングフレームA）、大腸菌DB3.1(pEZC15102)（リーディングフレームB）および大腸菌DB3.1(pEZC15103)（リーディングフレームC）は、1999年2月27日に、Collection, Agricultural Research Culture Collection（NRRL）, 1815 ノース・ユニバーシティ・ストリート、ピオリア、イリノイ 61604 米国に対して、それぞれ寄託番号NRRL B-30103、NRRL B-30104およびNRRL B-30105として寄託されている。寄託された核酸分子内のattR1部位およびattR2部位は、本明細書中の他の箇所にさらに詳細に説明する1つまたは複数のさらなる機能的配列とともに核酸カセット内に含まれている。これらのベクターの変形物は、attR2部位の直後に終止コドンを含んでもよく、含まなくともよい。
【０２８２】
さらに、attL1部位をリーディングフレームA、リーディングフレームBおよびリーディングフレームC中にクローニング部位と並置して含み、対応するattL2部位も含む組換え宿主細胞株である大腸菌DB3.1(pENTR1A)（リーディングフレームA）、大腸菌DB3.1(pENTR2B)（リーディングフレームB）および大腸菌DB3.1(pENTR3C)（リーディングフレームC）は、1999年2月27日に、1999年2月27日に、Collection, Agricultural Research Culture Collection（NRRL）, 1815 ノース・ユニバーシティ・ストリート、ピオリア、イリノイ 61604 米国に対して、それぞれ寄託番号NRRL B-30100、NRRL B-30101およびNRRL B-30102として寄託されている。寄託された核酸分子内のattL1部位およびattL2部位は、本明細書中の他の箇所にさらに詳細に説明する1つまたは複数のさらなる機能的配列とともに核酸カセット内に含まれている。
【０２８３】
特定の組換え部位またはその部分をコードするヌクレオチド配列に対して、少なくとも、例えば、95％「同一な」ヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドとは、ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が、ポリヌクレオチド配列が、組換え部位をコードする参照ヌクレオチド配列の100ヌクレオチド当たり最大5つの点変異（例えば、挿入、置換または欠失）を含みうる点を除き、参照配列と同一であることを意図している。例えば、参照attB1ヌクレオチド配列（配列番号：5）に対して少なくとも95％同一なヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを得るためには、attB1参照配列中のヌクレオチドの最大5％が欠失するか別のヌクレオチドと置換されてもよく、またはattB1参照配列中の総ヌクレオチドの最大5％までの数のヌクレオチドがattB1参照配列に挿入されてもよい。参照配列に対するこれらの変異は、参照ヌクレオチド配列の5'末端もしくは3'末端の位置またはそれらの末端位置の間のどこかに生じてもよく、参照配列中の残基間に個別に分散しても、参照配列内部に1つまたは複数の連続した群として分散してもよい。
【０２８４】
実際の手段として、任意の特定の核酸分子が、例えば、所定の組換え部位のヌクレオチド配列またはその部分に対して少なくとも50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％または99％同一であるか否かは、初期配列アライメントのためにDNAsisソフトウェア（Hitachi Software, San Bruno, California）を用い、その後に多重配列アライメントのためにESEEバージョン3.0 DNA/タンパク質配列ソフトウェア（cabot@trog.mbb.sfu.ca）を用いるというように、公知のコンピュータープログラムを用いて簡便に判定しうる。または、そのような判定を、2つの配列間の最良の相同性セグメントを見いだすために局所的相同性アルゴリズム（SmithおよびWaterman, Advances in Applied Mathematics 2: 482-489 (1981)）を用いる、BESTFITプログラム（Wisconsin Sequence Analysis Package, Genetics Computer Group, University Research Park, 575 Science Drive, マディソン、WI 53711）を用いて行うこともできる。特定の配列が、本発明による参照配列に対して、例えば95％同一であるか否かを判例するために、DNAsis、ESEE、BESTFITまたは任意の他の配列アライメントプログラムを用いる場合、パラメーターは、参照ヌクレオチド配列の全長にわたって同一性の比率が計算され、参照配列中のヌクレオチド総数の最大5％までの相同性のギャップが許容されるように設定される。
【０２８５】
別に指示する場合を除き、本明細書中に示される各々の「ヌクレオチド配列」は、デオキシリボヌクレオチド（A、G、CおよびTと略記）の配列として提示される。しかし、核酸分子またはポリヌクレオチドの「ヌクレオチド配列」とは、DNA分子またはポリヌクレオチドの場合はデオキシリボヌクレオチドの配列を意図し、RNA分子またはポリヌクレオチドの場合は対応するリボヌクレオチド（A、G、CおよびU）配列を意図しており、この場合、特定されたデオキシリボヌクレオチド配列中の各々のチミジン・デオキシリボヌクレオチド（T）はリボヌクレオチド・ウリジン（U）によって置換される。すなわち、本発明は、DNAまたはRNA分子、またはハイブリッドDNA/RNA分子、およびそれらの対応する相補的DNA、RNAまたはDNA/RNA鎖の形態にある、本発明の配列に関する。
【０２８６】
1つの関連した面において、本発明はまた、組換え効率を増強する1つまたは複数の組換え部位ヌクレオチド配列、特に、コア領域に実質的に対応しうる、かつ組換え効率を高める1つまたは複数の変異を有する、1つまたは複数のヌクレオチド配列を含む核酸分子にも関する。「組換え効率を高める」配列または変異とは、変異した配列またはコア領域を含む分子の組換えを行った場合に、変異した配列またはコア領域を含まない分子（例えば、野生型の組換え部位コア領域配列を含むもの）と比較して、クローニング効率（一般的には被験配列のクローニングの成功率を決定することにより、例えば、所定のクローニング混合物に対するCFU/mlを決定することにより測定される）の増大をもたらす、組換え部位、しばしばコア領域（例えば、att組換え部位の15塩基対コア領域）における配列または変異のことを意味する。より詳細には、所定の配列または変異が組換え効率を高めるか否かは、本明細書に記載の組換えクローニングに配列または変異を用い、その配列または変異が、変異していない（例えば、野生型）配列と比較して組換えクローニング効率の向上をもたらすか否かを判定することによって判定しうる。
【０２８７】
本明細書に記載の組換え部位配列に関するヌクレオチド配列などの、本明細書中に提供する情報を用いて、1つまたは複数の組換え部位またはその部分をコードする、本発明に用いようとする単離された核酸分子を、mRNAを出発材料として用いるcDNAのクローニングなどの標準的なクローニングおよびスクリーニング手順を用いて入手することができる。このような方法には、逆転写酵素-PCR（RT-PCR）などの、PCRに基づくクローニング方法が含まれる。または、本明細書に記載の組換え部位配列を含むカセットを含むベクターを、インビトロゲン社、カールズバッド、CAから購入してもよい。
【０２８８】
本発明はまた、1つまたは複数の組換え部位配列またはその部分、および、機能的部位または構造的部位（例えば、1つまたは複数のマルチクローニング部位、1つまたは複数の転写終結部位、1つまたは複数の転写調節配列（これはプロモーター、エンハンサー、リプレッサーなどでありうる）、1つまたは複数の翻訳シグナル（例えば、分泌シグナル配列）、1つまたは複数の複製起点、1つまたは複数の融合パートナーペプチド（特に、チオレドキシン（Trx）、グルタチオンS-トランスフェラーゼ（GST）、マルトース結合タンパク質（MBP）、エピトープ、エピトープ、ハプテン、ヒスチジン6（HIS6）などの規定されたアミノ酸配列、など）、1つまたは複数の選択マーカーまたはモジュール、核局在化シグナルまたは分泌シグナルなどの局在化シグナルをコードする1つまたは複数のヌクレオチド配列、1つまたは複数の複製起点、1つまたは複数のプロテアーゼ切断部位、目的のタンパク質またはポリペプチドをコードする1つまたは複数の遺伝子または遺伝子の部分、および、1つまたは複数の5'ポリヌクレオチド伸長部（特に、組換え部位の5'末端にある、長さが約1〜約20、約2〜約15、約3〜約10、約4〜約10、または4もしくは5ヌクレオチド（例えば、グアニン、シトシン、アデニンまたはチミン残基）の範囲のヌクレオチド（例えば、グアニン残基）の伸長部）など）をコードしうる1つまたは複数のさらなるヌクレオチド配列を含む核酸分子にも関する。1つまたは複数のさらなる機能的または構造的配列は、本発明に用いられる核酸分子に含まれる1つまたは複数の組換え部位配列と隣接していてもよく、隣接していなくともよい。
【０２８９】
本発明に用いられるいくつかの核酸分子において、1つまたは複数のさらなる機能的部位または構造的部位をコードする1つまたは複数のヌクレオチド配列を、組換え部位をコードするヌクレオチド配列と機能的に結合させてもよい。例えば、本発明に用いられるある種の核酸分子は、本発明の組換え部位またはその部分をコードするヌクレオチド配列と機能的に結合したプロモーター配列、例えば、T7プロモーター、ファージλPLプロモーター、大腸菌のlac、trpまたはtacプロモーター、および当業者に知られた他の適したプロモーターなどを有しうる。
【０２９０】
本発明に用いられる核酸分子は、単離された核酸分子の形態にあってもよく、mRNAなどのRNAの形態にあってもよく、クローニングにより入手されたもしくは合成的に製造された、例えばcDNAおよびゲノムDNAを含むDNAの形態にあってもよく、またはDNA-RNAハイブリッドの形態にあってもよい。本発明に用いられる核酸分子は二本鎖でも一本鎖でもよい。一本鎖DNAまたはRNAは、センス鎖としても知られるコード鎖でもよく、またはアンチセンス鎖とも呼ばれる非コード鎖でもよい。また、本発明に用いられる核酸分子は、線状、環状、らせん状または超らせん状を含むさまざまなトポロジーを有しうる。
【０２９１】
「単離された」核酸分子とは、その天然の環境から取り出された核酸分子、DNAまたはRNAのことを意図している。例えば、ベクターに含まれる組換えDNA分子は、本発明の目的上は単離されているとみなされる。単離されたDNA分子のさらなる例には、異種宿主細胞内に維持される組換えDNA分子、および、組換えDNA法または合成化学法のいずれによって作製されたかによらず、溶液から（部分的に実質的に）精製されたそのようなDNA分子が含まれる。単離されたRNA分子には、本発明のDNA分子のインビボまたはインビトロでのRNA転写物が含まれる。
【０２９２】
また、特異的組換えを増強するため、または反応物の特異性を変更するなどのために、変異を組換え部位のヌクレオチド配列に導入することもできる。このような変異には、以下のものが非制限的に含まれる：融合タンパク質のコーディングを許容する、翻訳終止コドンを含まない組換え部位、同じタンパク質によって認識されるが塩基配列が異なる組換え部位であって、このため主としてまたは独占的に相同パートナーと反応し、意図する複数の反応を可能にする複数の組換え部位、および組換え部位のヘアピン形成を妨げる変異変異。どの特定の反応が生じるかは、反応混合物中に特定のパートナーが存在することによって特定されうる。
【０２９３】
組換え反応の増強因子
本発明はさらに、本発明の工程に用いられる組換え反応の効率を高めるための方法、ならびに組換え反応の効率を高める組成物を提供する。
【０２９４】
1つの面において、本発明は、組換え反応の効率を高めるための方法を提供する。これらの方法は、組換え効率を高める1つまたは複数（例えば、1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個など）のタンパク質を組換え反応に添加することを含む。組換え反応の効率を高めるタンパク質の例には、大腸菌リボソームタンパク質S10、S14、S15、S16、S17、S18、S19、S20、S21、L14、L21、L23、L24、L25、L27、L28、L29、L30、L31、L32、L33およびL34、さらには、少なくとも15個、少なくとも20個、少なくとも30個、少なくとも40個、少なくとも50個、少なくとも60個などのアミノ酸残基を含む、これらのタンパク質の断片が含まれる。そのほかの例には、大腸菌以外の生物に由来するリボソームタンパク質が含まれる。さらなる例には、Fisタンパク質およびFisタンパク質断片が含まれる。
【０２９５】
本発明の組成物および/または方法に用いられるFisタンパク質またはFisタンパク質断片は、非常にさまざまな生物（例えば、エシェリキア属、セラチア属、サルモネラ属、シュードモナス属、ヘモフィルス属、バシラス属、ストレプトミセス属、ブドウ球菌属、連鎖球菌属のもの、または他のグラム陽性菌もしくはグラム陰性菌を非制限的に含む細菌）から入手しうる。
【０２９６】
一般に本発明に用いられるFisタンパク質およびFisタンパク質断片の分子量は14キロダルトン（kDa）未満であると考えられる。さらに、多くの場合には、これらのタンパク質のアミノ酸残基の約2％〜約40％、約5％〜約35％、約10％〜約35％、約10％〜約30％、約15％〜約30％または約15％〜約25％は塩基性アミノ酸残基であると考えられる。「塩基性アミノ酸残基」とは、PKａSが7.0を上回るアミノ酸残基（例えば、アルギニン、リジン、ヒスチジンなど）を意味する。したがって、本発明は、上記のFisタンパク質およびFisタンパク質断片を含む組成物、ならびにこれらの組成物を本発明の方法に用いるための方法を含む。
【０２９７】
Fisタンパク質の一例は大腸菌の98アミノ酸のFisタンパク質であり、これは以下のアミノ酸配列を有する：
2004532636.tif 000004
【０２９８】
Fisタンパク質のもう1つの例は肺炎桿菌の93アミノ酸のFisタンパク質であり、これは以下のアミノ酸配列を有する：
2004532636.tif 000005
【０２９９】
Fisタンパク質のさらにもう1つの例はコレラ菌の98アミノ酸のFisタンパク質であり、これは以下のアミノ酸配列を有する：
2004532636.tif 000006
【０３００】
Fisタンパク質のもう1つの例はインフルエンザ菌の99アミノ酸のFisタンパク質であり、これは以下のアミノ酸配列を有する：
2004532636.tif 000007
【０３０１】
Fisタンパク質のさらにもう1つの例は緑膿菌の107アミノ酸のFisタンパク質であり、これは以下のアミノ酸配列を有する：
2004532636.tif 000008
【０３０２】
Fisタンパク質のさらに別の例はネズミチフス菌の98アミノ酸のFisタンパク質であり、これは以下のアミノ酸配列を有する：
2004532636.tif 000009
【０３０３】
本発明の方法には、Fisタンパク質およびFisタンパク質断片のほか、組換え反応の効率を高める、Fisタンパク質およびFisタンパク質断片のバリアント、誘導体および変異体を用いる。本発明に用いるのに適したFisタンパク質断片には、少なくとも10アミノ酸、少なくとも15アミノ酸、少なくとも20アミノ酸、少なくとも30アミノ酸、少なくとも35アミノ酸、少なくとも40アミノ酸、少なくとも45アミノ酸、少なくとも50アミノ酸、少なくとも55アミノ酸、少なくとも60アミノ酸、少なくとも70アミノ酸、少なくとも75アミノ酸、少なくとも80アミノ酸、少なくとも85アミノ酸などを含む断片が含まれる。本発明に用いるのに適したFisタンパク質断片には、約10〜20アミノ酸、約20〜30アミノ酸、約30〜40アミノ酸、約50〜60アミノ酸、約60〜70アミノ酸、約70〜80アミノ酸、約90〜100アミノ酸などを含む断片も含まれる。
【０３０４】
本発明に用いうるタンパク質には、参照用のFisタンパク質（例えば、上に示したアミノ酸配列を有するFisタンパク質）またはFisタンパク質断片に対して少なくとも65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％または99％同一なアミノ酸配列を含む、バリアント、誘導体および変異体が含まれる。
【０３０５】
参照アミノ酸配列に対して、少なくとも、例えば、65％「同一な」アミノ酸配列を有するタンパク質またはタンパク質断片とは、タンパク質配列が参照タンパク質のアミノ酸配列の100アミノ酸当たり最大35アミノ酸までの変化を含みうることを除き、タンパク質のアミノ酸配列が参照アミノ酸配列と同一であることを意図している。言い換えれば、参照アミノ酸配列と少なくとも65％同一なアミノ酸配列を有するタンパク質を得るためには、参照配列中の最大35％までのアミノ酸残基が欠失するか別のアミノ酸で置換されてもよく、または参照配列中の総アミノ酸残基の最大35％までの数のアミノ酸が参照配列中に挿入されてもよい。参照配列のこれらの変化は、参照アミノ酸配列のアミノ（-N）末端もしくは炭素（C-）末端の位置またはそれらの末端位置の間のどこかに生じてもよく、参照配列中の残基間に個別に分散しても参照配列内部に1つまたは複数の連続した群として分散してもよい。実際の手段として、所定のアミノ酸配列が参照タンパク質のアミノ酸配列と例えば少なくとも65％同一であるか否かは、公知のコンピュータプログラム、例えば核酸配列同一性の決定のための上記のプログラムなどを用いて、またはCLUSTAL Wプログラム（Thompson, J.D.ら、Nucleic Acids Res. 22: 4673-4680 (1994)）を用いて、従来通りに判定することができる。
【０３０６】
本発明の実施に用いうるFisタンパク質断片には、Fisタンパク質のN末端およびC末端の欠失変異体（例えば、配列番号：49〜54のいずれかに示されたアミノ酸配列を有するFisタンパク質）も含まれる。このようなFisタンパク質断片には、少なくとも5アミノ酸、少なくとも10アミノ酸、少なくとも15アミノ酸、少なくとも20アミノ酸、少なくとも25アミノ酸、少なくとも30アミノ酸、少なくとも35アメ`ノ酸、少なくとも40アミノ酸、少なくとも45アミノ酸、少なくとも50アミノ酸、少なくとも55アミノ酸、少なくとも60アミノ酸、少なくとも65アミノ酸、少なくとも70アミノ酸または少なくとも75アミノ酸がN末端から欠失したものが含まれる。このようなFisタンパク質断片には、少なくとも1アミノ酸、少なくとも2アミノ酸、少なくとも3アミノ酸、少なくとも4アミノ酸、少なくとも5アミノ酸、少なくとも6アミノ酸、少なくとも7アミノ酸、少なくとも8アミノ酸、少なくとも9アミノ酸または少なくとも10アミノ酸がC末端から欠失したものも含まれる。さらに、このようなFisタンパク質断片には、上記のN末端およびC末端の欠失の両方を含むタンパク質も含まれる。
【０３０７】
本発明の実施に用いうるFis欠失変異体の具体的な例には、配列番号：49のアミノ酸75〜98位、配列番号：49のアミノ酸76〜97位、配列番号：49のアミノ酸77〜96位、配列番号：49のアミノ酸78〜95位、配列番号：49のアミノ酸79〜93位または配列番号：49のアミノ酸80〜92位、ならびに他のFisタンパク質の対応する領域を含むFisタンパク質断片が含まれる。
【０３０８】
本発明はまた、本明細書で言及するFisタンパク質をコードする核酸分子のほか、本発明の工程におけるこれらの核酸分子の使用も含む。
【０３０９】
本発明の組成物には、Fisが特異的に結合する核酸と結合して、組換え反応の効率を高めるタンパク質およびタンパク質断片も含まれうる。例えば、Fisは以下のヌクレオチド配列を有する核酸と結合することが示されている：
GNTYAAWWWTTRANC（配列番号：45）、ここでR＝AまたはG、W＝AまたはT、およびY＝CまたはTである。
【０３１０】
Fisは以下のヌクレオチド配列を有する核酸とも結合する：
AGTCTGTTTTTTATGCAAAA（配列番号：46）。
【０３１１】
したがって、ある種の態様において、本発明は、（1）配列番号：45もしくは配列番号：46に示されたヌクレオチド配列を有する核酸と結合するタンパク質およびペプチド、または配列番号：45もしくは配列番号：46に示されたヌクレオチド配列（またはその部分）に1つ、2つ、3つもしくは4つの置換、欠失もしくは挿入が生じたものを有する核酸と結合するタンパク質およびペプチド、ならびに（2）組換え反応の効率を高めるタンパク質およびペプチドを用いる、組換え反応を増強するための方法を含む。
【０３１２】
本発明のFisタンパク質およびFisタンパク質断片、ならびにFisが特異的に結合する核酸と結合するタンパク質およびペプチドを調製し、融合タンパク質として用いることができる。Fisは二量体を形成すると考えられている。このため、本発明に用いうる融合タンパク質の例には、（1）配列番号：45または配列番号：46に示されたヌクレオチド配列（またはその部分）を含む核酸と結合するFisタンパク質、Fisタンパク質断片またはペプチド、および（2）多量体（例えば、ホモ二量体）の形成を促進するタンパク質またはタンパク質ドメイン、を含む融合タンパク質がある。このようなタンパク質およびタンパク質ドメインの例には、SH2ドメイン、ストレプトミセスのタンパク質DnaA、AraC、熱ショックタンパク質90などが含まれる。したがって、本発明は、上記の融合タンパク質、これらの融合タンパク質をコードする核酸分子、ならびにこれらの融合タンパク質および核酸分子を組換え反応の効率を高めるために用いるための方法を含む。
【０３１３】
Fisの存在下で行われる組換え反応の最適化に関係する具体的なパラメーターおよび条件は以下の実施例9に示されており、公知のアッセイを用いて決定することもできる。例えば、力価アッセイを用いて、精製Fisタンパク質の適切な量または抽出物の適切な量を決定することもできる。このようなアッセイについては以下の実施例の項で詳細に説明する。
【０３１４】
Fisタンパク質およびFisタンパク質断片、ならびに組換え反応の効率を高める他のタンパク質およびタンパク質断片は、組換え反応（例えば、BPクロナーゼ（商標）により触媒される組換え反応）にさまざまな濃度で含めることができ、これには、約0.5ng/μl、約1.0ng/μl、約1.5ng/μl、約2.0ng/μl、約2.5ng/μl、約3.0ng/μl、約3.5ng/μl、約4.0ng/μl、約4.5ng/μl、約5.0ng/μl、約5.5ng/μl、約6.0ng/μl、約6.5ng/μl、約7.0ng/μl、約7.5ng/μl、約8.0ng/μl、約8.5ng/μl、約9.0ng/μl、約9.5ng/μl、約10.0ng/μl、約10.5ng/μl、約11.0ng/μl、約11.5ng/μl、約12.0ng/μl、約12.5ng/μl、約13.0ng/μl、約13.5ng/μl、約14.0ng/μl、約14.5ng/μl、約15.0ng/μl、約16.0ng/μl、約17.0ng/μl、約18.0ng/μl、約19.0ng/μl、約20.0ng/μl、約22.0ng/μl、約25.0ng/μl、約27.0ng/μl、約30.0ng/μl、約35.0ng/μlまたは約40.0ng/μlが含まれる。同様に、Fisも組換え反応にさまざまな範囲で含めることができ、これには、約0.5ng/μl〜約40.0ng/μl、約0.5ng/μl〜約30.0ng/μl、約0.5ng/μl〜約15.0ng/μl、約1.0ng/μl〜約14.0ng/μl、約5.0ng/μl〜約10.0ng/μl、約7.0ng/μl〜約15.0ng/μl、約10.0ng/μl〜約15.0ng/μl、約5.0ng/μl〜約30.0ng/μl、約10.0ng/μl〜約30.0ng/μl、約20ng/μl〜約30.0ng/μl、約20ng/μl〜約35.0ng/μlまたは約20ng/μl〜約40.0ng/μlが含まれる。当然ながら、本発明の方法に用いるのに適した他の濃度および範囲は、上記の通りの、以下の実施例に詳細に述べる力価アッセイを行うことにより、過度の実験を行うことなく、当業者によって決定されうる。組換え反応の効率を高める上記の濃度および範囲のリボソームタンパク質を、効率を高めるために組換え反応に含めることもできる。したがって、本発明はさらに、組換え反応の効率を高めるタンパク質を用いる、本明細書に記載の方法を含む。
【０３１５】
ベクター
本発明はまた、本発明および/または本発明の方法において用いられる核酸の1つまたは複数を含むベクターにも関する。本発明によれば、本発明の方法に用いられるベクタードナーの構築には任意のベクターを用いうる。特に、当技術分野で知られたベクターおよび市販のもの（ならびにそれらのバリアントまたは誘導体）を、本発明の方法に用いるための、1つまたは複数の組換え部位（またはその部分）またはその変異体、断片もしくは誘導体を含むように本発明に従って操作することができる。このようなベクターは、例えば、Vector Laboratories Inc.；Promega；ノバゲン；New England Biolabs；クロンテック；Roche；Pharmacia；EpiCenter；OriGenes Technologies Inc.；ストラタジーン；Perkin Elmer；Pharmingen；およびインビトロゲン社、カールズバッド、CAから入手可能である。続いて、このようなベクターを、例えば、目的の核酸分子のクローニングまたはサブクローニングに用いることができる。特に関心対象の一般的な種類のベクターには、原核生物および/または真核生物クローニングベクター、発現ベクター、融合ベクター、ツーハイブリッドまたは逆ツーハイブリッドベクター、種々の宿主で用いるためのシャトルベクター、変異誘発ベクター、転写ベクター、遺伝子治療の用途に用いるのに適したベクター（例えば、ウイルスベクター）、大きな挿入物を収容するためのベクターなどが含まれる。
【０３１６】
関心対象の他のベクターには、ウイルス由来ベクター（M13ベクター、細菌ファージλベクター、バクテリオファージP1ベクター、アデノウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、レトロウイルスベクター、ファージディスプレイベクター、コンビナトリアルライブラリーベクター）、高、低および調節可能なコピー数のベクター、単一の宿主において組み合わせて用いるための適合性レプリコンを有するベクター（pACYC184およびpBR322）および真核生物エピソーム複製ベクター（pCDM8）が含まれる。
【０３１７】
特に関心対象のベクターには、原核生物発現ベクター、例えば、pcDNA II、pSL301、pSE280、pSE380、pSE420、pTrcHisA、BおよびC、pRSET A、BおよびC（インビトロゲン社、カールズバッド、CA）、pGEMEX-1およびpGEMEX-2（Promega, Inc.）、pETベクター（ノバゲン, Inc.）、pTrc99A、pKK223-3、pGEXベクター、pEZZ18、pRIT2TおよびpMC1871（Pharmacia, Inc.）、pKK233-2およびpKK388-1（クロンテック, Inc.）およびpProEx-HT（インビトロゲン社、カールズバッド、CA）ならびにそれらのバリアントおよび誘導体などが含まれる。目的ベクターを、真核生物発現ベクター、例えばpFastBac、pFastBac HT、pFastBac DUAL、pSFVおよびpTet-Splice（インビトロゲン社、カールズバッド、CA）、pEUK-C1、pPUR、pMAM、pMAMneo、pBI101、pBI121、pDR2、pCMVEBNAおよびpYACneo（クロンテック）、pSVK3、pSVL、pMSG、pCH110およびpKK232-8（Pharmacia, Inc.）、p3'SS、pXT1、pSG5、pPbac、pMbac、pMC1neoおよびpOG44（ストラタジーン, Inc.）およびpYES2、pAC360、pBlueBacIII A、BおよびC、pVL1392、pBsueBacIII、pCDM8、pcDNA1、pZeoSV、pcDNA3 pREP4、pCEP4およびpEBVHis（インビトロゲン社、カールズバッド、CA）ならびにそれらのバリアントまたは誘導体などが含まれる。
【０３１８】
特に関心対象の他のベクターには、pUC18、pUC19、pBlueScript、pSPORT、コスミド、ファージミド、YAC（酵母人工染色体）、BAC（細菌人工染色体）、MAC（哺乳動物人工染色体）、pQE70、pQE60、pQE9（Quiagen）、pBSベクター、PhageSriptベクター、BlueScriptベクター、pNH8A、pNH16A、pNH18A、pNH46A（ストラタジーン）、pcDNA3（インビトロゲン、カールズバッド、CA）、pGEX、pTrsfus、pTrc99A、pET-5、pET-9、pKK223-3、pKK233-3、pDR540、pRIT5（Pharmacia）、pSPORT1、pSPORT2、pCMVSPORT2.0およびpSVSPORT1（インビトロゲン社、カールズバッド、CA）ならびにそれらのバリアントまたは誘導体が含まれる。
【０３１９】
関心対象のそのほかのベクターには、pTrxFus、pThioHis、pLEX、pTrcHis、pTrcHis2、pRSET、pBlueBacHis2、pcDNA3.1/His、pcDNA3.1(-)/Myc-His、pSecTag、pEBYHis、pPIC9K、pPIC3.5K、pAO815、pPICZ、pGAPZ、pBlueBac4.5、pBlueBacHis2、pMelBac、pSinRep5、pSinHis、pIND、pIND(SP1)、pVgRXR、pcDNA2.1、pYES2、pZBrO1.1、pZErO-2.1、pCR-Blunt、pSE280、pSE380、pSE420、pVL1392、pVL1393、pCDM8、pcDNA1.1、pcDNA1.1/Amp、pcDNA3.1、pcDNA3.1/Zeo、pSe,SV2、pRc/CMV2、pRc/RSV、pREP4、pREP7、pREP8、pREP9、pREP10、pCEP4、pEBVHis、pCR3.1、pCR2.1、pCR3.1-UniおよびpCRBac（以上はインビトロゲン）；Xgt11、pTrc99A、pKK223-3、pGEX-2T、pGEX-2TK、pGEX-4T-1、pGEX-4T-2、pGEX-4T-3、pGEX3X、pGEX-5X-1、pGEX-5X-2、pGEX-5X-3、pEZZ18、pR1T2T、pMC1871、pSVK3、pSVL、pMSG、pCH110、pKK232-8、pSL1180、pNEOおよびpUC4K（以上はPharmacia）；pSCREEN-1b(+)、pT7Blue(R)、pT7Blue2、pCITE-4abc(+)、pOCUS-2、pTAg、pET-32 LIC、pET-30 LIC、pBAC-2cp LIC、pBACgus-2cp LIC、pT7Blue-2 LIC、pT7Blue-2、pET-3abcd、pET-7abc、pET-9abcd、pET-11abcd、pET-12abc、pET-14b、pET-15b、pET-16b、pET-17b、pET-17xb、pET-19b、pET-20b(+)、pET-21abcd(+)、pET-22b(+)、pET-23abcd(+)、pET-24abcd(+)、pET-25b(+)、pET-26b(+)、pET-27b(+)、pET-28abc(+)、pET-29abc(+)、pET-30abc(+)、pET-31b(+)、pET-32abc(+)、pET-33b(+)、pBAC-1、pBACgus-1、pBAC4x-1、pBACgus4x-1、pBAC-3cp、pBACgus-2cp、pBACurf-1、plg、Signal pig、pYX、Seiecta Vecta-Neo、Selecta Vecta-HygおよびSelecta Vecta-Gpt（以上はノバゲン）；pLexA、pB42AD、pGBT9、pAS2-1、pGAD424、pACT2、pGAD GL、pGAD GH、pGAD10、pGilda、pEZM3、pEGFP、pEGFP-1、pEGFP-N、pEGFP-C、pEBFP、pGFPuv、pGFP、p6xHis-GFP、pSEAP2-Basic、pSEAP2-Contral、pSEAP2-Promotor、pSEAP2-Enhancer、pβgal-Basic、pβgal-Control、pβgal-Promotor、pβgal-Enhancer、pTet-Off、pTet-On、pTK-Hyg、pRetro-Off、pRetro-On、pIRES1neo、pIRES1hyg、pLXSN、pLNCX、pLAPSN、pMAMneo、pMAMneo-CAT、pMAMneo-LUC、pPUR、pSV2neo、pYEX 4T-1/2/3、pYEX-S1、pBacPAKHis、pBacPAK-8/9、pAcUW31、BacPAK6、pTriplEx、λgt10、λgt11およびpWE15（以上はクロンテック）；Lambda ZAP II、pBK-CMV、pBK-RSV、pBluescript II KS +/-、pBluescript II SK +/-、pAD-GAL4、pBD-GAL4 Cam、pSurfscript、Lambda FIX II、Lambda DASH、Lambda EMBL3、Lambda EMBL4、SuperCos、pCR-Scrigt Amp、pCR-Script Cam、pCR-Script Direct、pBS +/-、pBC KS +/-、pBC SK +/-、PhageScript、pCAL-n-EK、pCAL-n、pCAL-c、pCAL-kc、pET-3abcd、pET-11abcd、pSPUTK、pESP-1、pCMVLacI、pOPRSVJ/MCS、pOPI3CAT、pXT1、pSGS、pPbac、pMbac、pMClneo、pMClneo Poly A、pOG44、pOG45、pFRT3GAL、pNEO3GAL、pRS403、pRS404、pRS405、pRS406、pRS413、pRS414、pRS415およびpRS416（以上はストラタジーン）が含まれる。
【０３２０】
特に関心対象のツーハイブリッドベクターおよび逆ツーハイブリッドベクターには、pPC86、pDBLeu、pDBTrp、pPC97、p2.5、pGAD1-3、pGAD10、pACt、pACT2、pGADGL、pGADGH、pAS2-1、pGAD424、pGBT8、pGBT9、pGAD-GAL4、pLexA、pBD-GAL4、pHISi、pHTSi-1、placZi、pB42AD、pDG202、pJK202、pJG4-5、pNLexA、pYESTrp、およびそれらのバリアントまたは誘導体が含まれる。
【０３２１】
特に関心対象の酵母発現ベクターには、pESP-1、pESP-2、pESC-His、pESCTrp、pESC-URA、pESC-Leu（ストラタジーン）、pRS401、pRS402、pRS411、pRS412、pRS421、pRS422およびそれらのバリアントまたは誘導体が含まれる。
【０３２２】
本発明によれば、1つまたは複数の組換え部位またはそれらの変異体、バリアント、断片もしくは誘導体をコードする1つまたは複数の核酸分子を含むベクターを、標準的な分子生物学的方法を用いて、過度の実験を行うことなく、当業者によって作製することができる。例えば、本発明のベクター、ならびに本発明に用いるのに適したベクターは、1つまたは複数の組換え部位（またはそれらの変異体、断片、バリアントまたは誘導体）をコードする1つまたは複数の核酸分子を、本明細書に記載の1つまたは複数のベクターに、例えば、Maniatisら、「分子クローニング：実験マニュアル（Molecular Cloning: A Laboratory Manual）」、Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York (1982)に記載された方法に従って導入することによって作製しうる。本発明の関連した面において、これらのベクターを、1つまたは複数の組換え部位（またはそれらの部分）をコードする1つまたは複数の核酸分子に加えて、1つまたは複数のさらなる物理的または機能的なヌクレオチド配列、例えば、1つまたは複数のマルチクローニング部位、1つまたは複数の転写終結部位、1つまたは複数の転写調節配列（例えば、1つまたは複数のプロモーター、エンハンサー、リプレッサー）、1つまたは複数の選択マーカーまたはモジュール、目的のタンパク質またはポリペプチドをコードする1つまたは複数の遺伝子または遺伝子の部分、1つまたは複数の翻訳シグナル配列、融合パートナーまたはペプチド（例えば、GST、His6またはチオレドキシン）、1つまたは複数の複製起点、および1つまたは複数の5'または3'ポリヌクレオチド尾部（得にポリ-G尾部）などをコードするもの、を含むように操作することもできる。本発明のこの面によれば、1つまたは複数の組換え部位ヌクレオチド配列（またはその部分）を、選択的には、本明細書に記載の1つまたは複数の物理的または機能的ヌクレオチド配列と機能的に結合させてもよい。
【０３２３】
本発明のこの面によるベクターには、以下のものが非制限的に含まれる：pENTR1A、pENTR2B、pENTR3C、pENTR4、pENTR5、pENTR6、pENTR7、pENTR8、pENTR9、pENTR10、pENTR11、pDEST1、pDEST2、pDEST3、pDEST4、pDEST5、pDEST6、pDEST7、pDEST8、pDEST9、pDEST10、pDEST11、pDEST12.2（pDEST12としても知られる）、pDEST13、pDEST14、pDEST15、pDEST16、pDEST17、pDEST18、pDEST19、pDEST20、pDEST21、pDEST22、pDEST23、pDEST24、pDEST25、pDEST26、pDEST27、pEXP501（pCMVSPORT6.0としても知られる、図34A〜34D）、pDONR201（図26A〜26C）、pDONR202、pDONR203、pDONR204、pDONR205、pDONR206、pDONR212（図27A〜27C）、pDONR212(F)（図28A〜28C）、pDONR212(R)（図29A〜29C）、pMAB58、pMAB62、pDEST28、pDEST29、pDEST30、pDEST31、pDEST32、pDEST33、pDEST34、pDONR207（図18A〜18C）、pMAB85、pMAB86（これらの多くはPCT国際公開公報第00/52027号に記載されている（その全開示内容は参照として本明細書に組み入れられる））、ならびにこれらのベクターのそれぞれの断片、変異体、バリアントおよび誘導体が含まれる。しかし、当業者には、本発明が、1つまたは複数の組換え部位またはその部分（またはそれらの変異体、断片、バリアントもしくは誘導体）をコードする、本発明に用いられる単離された核酸分子の1つまたは複数を含み、さらには本明細書に記載の1つまたは複数のさらなる物理的または機能的ヌクレオチド配列（これは選択的には、1つまたは複数の組換え部位またはその部分をコードする1つまたは複数の核酸分子と機能的に結合してもよい）も含みうる、本明細書中に明確には挙げていない他のベクターも含むことは理解されると考えられる。
【０３２４】
本発明に用いうるさらなるベクターには、遺伝子治療の用途に用いるのに適したベクターが含まれる。アデノウイルスは、アデノウイルスは気道上皮に遺伝子を送達するための媒体として特に興味が持たれ、このようなベクターの使用は本発明の範囲に含まれる。アデノウイルスは通常、気道上皮を感染させ、そこで軽度の疾患を引き起こす。アデノウイルスを用いる送達システムの他の標的には、肝臓、中枢神経系、内皮細胞および筋肉がある。アデノウイルスには非分裂細胞を感染させうるという利点がある。KozarskyおよびWilson、1993, Current Opinion in Genetics and Development 3: 499-503は、アデノウイルスを用いる遺伝子治療に関する総説を提示している。Boutら、1994, Human Gene Therapy 5: 3-10は、アカゲサルの気道上皮に遺伝子を導入するためのアデノウイルスベクターの使用を示している。遺伝子治療にアデノウイルスを用いた他の事例は、Rosenfeldら、1991, Science 252: 431-434；Rosenfeldら、1992, Cell 68: 143-155；Mastrangeliら、1993, J. Clin. Invest. 91: 225-234；PCT国際公開公報第94/12649号および国際公開公報第96/17053号；米国特許第6,190,907号；米国特許第6,140,087号；米国特許第6,204,060号；米国特許第5,998,205号；およびWangら、1995, Gene Therapy 2: 775-783に記載されており、これらすべての開示内容はその全体が参照として本明細書に組み入れられる。ある種の態様においては、アデノウイルスベクターが用いられる。
【０３２５】
アデノ随伴ウイルス（AAV）、レトロウイルス、レンチウイルスおよびヘルペスウイルス、ならびにこれらのウイルスから調製されたベクターも、遺伝子治療における使用が提唱されている（Walshら、1993、Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 204: 289-300；Steinbergら、Gene Ther. 7: 1392-1400 (2000)；Kordowerら、Science 290: 767-773 (2000)；米国特許第5,436,146号；Wagstaffら、Gene Ther. 5: 1566-1570 (1998)を参照のこと。これらのそれぞれの開示内容は参照として本明細書に組み入れられる）。神経細胞における遺伝子発現が望まれる用途には、ヘルペスウイルスベクターは特に有用である。
【０３２６】
ポリメラーゼ
本発明に従って用いるための、逆転写酵素活性を有するポリペプチド（すなわち、RNAテンプレートからのDNA分子の合成を触媒しうるポリペプチド）には、モロニーマウス白血病ウイルス（M-MLV）逆転写酵素、ラウス肉腫ウイルス（RSV）逆転写酵素、鳥類骨髄芽球症ウイルス（AMV）逆転写酵素、ラウス関連ウイルス（RAV）逆転写酵素、骨髄芽球症関連ウイルス（MAV）逆転写酵素、ヒト免疫不全ウイルス（HIV）逆転写酵素、レトロウイルス逆転写酵素、レトロトランスポゾン逆転写酵素、B型肝炎逆転写酵素、カリフラワーモザイクウイルス逆転写酵素、および細菌逆転写酵素が非制限的に含まれる。さらに、逆転写酵素活性を有するこれらのポリペプチドは、RNアーゼH活性が実質的に低下したもの（すなわち「RNアーゼH-」ポリペプチド）であってもよい。「RNアーゼH活性が実質的に低下した」ポリペプチドとは、野生型またはRNアーゼH＋酵素（野生型M-NMV逆転写酵素など）約20％未満、約15％未満、約10％未満、約5％未満または約2％未満のRNアーゼH活性を有する、複数のポリペプチドまたは個々のポリペプチドのことを意味する。RNアーゼH活性は、例えば、米国特許第5,244,797号、Kotewicz, M.L.ら、Nucl. Acids Res. 16：265 (1988)およびGerard, G.F.ら、FOCUS 14 (5) : 91 (1992)に記載された（これらすべての開示内容はすべて参照として本明細書に組み入れられる）、さまざまなアッセイによって測定しうる。本発明に用いるのに適したRNアーゼH-ポリペプチドには、M-NMV H-逆転写酵素、RSV H-逆転写酵素、AMV H-逆転写酵素、RAV H-逆転写酵素、MAV H-逆転写酵素、HIV H-逆転写酵素、THERMOSCRIPT（商標）逆転写酵素およびTHERMOSCRIPT（商標）II逆転写酵素、ならびにSUPERSCRIPT（商標）I逆転写酵素およびSUPERSCRIPT（商標）II逆転写酵素が非制限的に含まれ、これらは例えば、インビトロゲン社、カールズバッド、CA.から入手可能である（概論については、PCT国際公開公報第98/47912号を参照されたい）。
【０３２７】
本方法に用いるのに適した、核酸ポリメラーゼ活性を有する他のポリペプチドには、DNAポリメラーゼI、DNAポリメラーゼIII、クレノー断片、T7ポリメラーゼおよびT5ポリメラーゼなどの好熱性DNAポリメラーゼ、ならびに、サーマス・サーモフィルス（Thermus thermophilus）（Tth）DNAポリメラーゼ、サーマス・アクアティカス（Thermus aquaticus）（Taq）DNAポリメラーゼ、テルモトガ・ネポリタナ（Thermotoga neopolitana）（Tne）DNAポリメラーゼ、テルモトガ・マリティナ（Thermotoga maritima）（Tma）DNAポリメラーゼ、サーモコッカス・リトラリス（Thermococcus litoralis）（TliまたはVENT（登録商標））DNAポリメラーゼ、ピロコッカス・フリオサス（Pyrococcus furiosus）（Pfu）DNAポリメラーゼ、ピロコッカス種GB-D（またはDEEPVENT（登録商標））DNAポリメラーゼ、ピロコッカス・ウーシー（Pyrococcus woosii）（Pwo）DNAポリメラーゼ、バシラス・ステロサーモフィリス（Bacillus sterothermophilus）（Bst）DNAポリメラーゼ、スルフォロバス・アシドカルダリウス（Sulfolobus acidocaldarius）（Sac）DNAポリメラーゼ、サーモプラズマ・アシドフィルム（Thermoplasma acidophilum）（Tac）DNAポリメラーゼ、サームス・フラブス（Thermus flavus）（Tfl/Tub）DNAポリメラーゼ、サームス・ルバー（Thermus ruber）（Tru）DNAポリメラーゼ、サームス・ブロキアヌス（Thermus brockianus）（DYNAZYMB（登録商標））DNAポリメラーゼ、メタロバクテリウム・サーモオートロフィカム（Methanobacterium thermoautotrophicum）（Mth）DNAポリメラーゼを非制限的に含む耐熱性DNAポリメラーゼ、さらにはそれらの変異体、バリアントおよび誘導体が含まれる。このようなポリペプチドは、例えば、インビトロゲン社、カールズバッド、CA, New England BioLabs（ビバリー、MA）およびSigma/Aldrich（セントルイス、MO）から販売されている。
【０３２８】
宿主細胞
本発明はまた、本発明に用いられる、本発明によって選択および/または単離される、核酸分子またはベクター、特に本明細書中に詳細に記載された核酸分子およびベクターの1つまたは複数を含む宿主細胞にも関する。本発明に従って用いうる代表的な宿主細胞には、細菌細胞、酵母細胞、植物細胞および動物細胞が非制限的に含まれる。本発明に用いるのに適した細菌宿主細胞には、エシェリキア属細胞（特に大腸菌細胞、最も詳細には大腸菌株DH10B、Stbl2、DH5α、DB3、DB3.1（例えば、E.coli LIBRARY EFFICIENCY（登録商標）DB3.1（商標）コンピテント細胞；インビトロゲン社、カールズバッド、CA））、DB4およびDB5（2000年3月2日に提出された米国特許出願第09/518,188号（その開示内容はその全体が参照として本明細書に組み入れられる）を参照されたい）、バシラス属細胞（特に枯草菌および巨大菌（B. megaterium）の細胞）、ストレプトミセス属細胞、エルウィニア属細胞、クレブシエラ属細胞、セラチア属細胞（特に霊菌（S. marcessans）細胞）、シュードモナス属細胞（特に緑膿菌細胞）およびサルモネラ属細胞（特にネズミチフス菌およびチフス菌の細胞）が含まれる。本発明に用いるのに適した動物宿主細胞には、昆虫細胞（最も詳細には、キイロショウジョウバエ細胞、ヨトウガ（Spodoptera frugiperda）Sf9細胞およびSf21細胞、ならびにイラクサキンウワバ（Trichoplusa）ハイファイブ（High-Five）細胞）、センチュウ細胞（特にC.エレガンス細胞）、鳥類細胞、両生類細胞（特にアフリカツメガエル細胞）、爬虫類細胞および哺乳動物細胞（最も詳細には、CHO、COS、VERO、BHKおよびヒト細胞）が含まれる。本発明に用いるのに適した酵母宿主細胞には、出芽酵母（Saccharomyces cerevisiae）細胞およびピキア酵母（Pichia pastoris）細胞が含まれる。上記および他の適した宿主細胞は、例えば、インビトロゲン社、カールズバッド、CA, American Type Culture Collection（マナッサス、Virginia）；およびAgricultural Research Culture Collection（NRRL；ピオリア、イリノイ）から販売されている。
【０３２９】
また、本発明の方法を無細胞系に用いることもできる。本発明に用いうる無細胞系の例には、インビトロ転写および翻訳系が含まれる。
【０３３０】
本発明の1つまたは複数の核酸分子および/またはベクターを含む宿主細胞を作製するために、本発明の核酸分子および/またはベクターを本明細書に記載の宿主細胞に導入するための方法は、当業者にはよく知られていると考えられる。例えば、本発明の核酸分子および/またはベクターを、感染、形質導入、トランスフェクションおよび形質転換という周知の技法を用いて宿主細胞に導入することができる。本発明の核酸分子および/またはベクターは単独で導入してもよく、または他の核酸分子および/またはベクターとともに導入してもよい、または、本発明の核酸分子および/またはベクターを、沈降物（例えば、リン酸カルシウム沈降物）または脂質との複合物として宿主細胞に導入することもできる。エレクトロポレーション法を、本発明の核酸分子および/またはベクターを宿主に導入するために用いてもよい。同様に、そのような分子を、大腸菌などの化学的にコンピテントな細胞に導入することもできる。ベクターがウイルスである場合には、それをインビトロでパッケージ化するかパッケージング細胞に導入し、パッケージングされたウイルスを細胞に形質導入してもよい。したがって、本発明のこの面に従って、本発明の核酸分子および/またはベクターを宿主に導入するために適した非常にさまざまな技法（例えば、微粒子銃による射入（ballistic bombardment）、エレクトロポレーション、リポフェクションなど）が当業者に周知であり、慣用されている。このような技法は、例えば以下のものに詳細に概説されている：Sambrook, J.ら、「分子クローニング、実験マニュアル（Molecular Cloning, a Laboratory Manual」第2版、Cold Spring Harbor, NY：Cold Spring Harbor Laboratory Press, pp. 16.30-16.55 (1989)、Watson, J.D.ら、「組換えDNA（Recombinant DNA）」第2版、New York：W.H. Freeman and Co., pp. 213-234 (1992)、およびWinnacker, E.、「遺伝子からクローンへ（From Genes to Clones）」、New York：YCH Publishers (1987)（これらは、これらの技法を詳述している多くの実験マニュアルの例示であり、これらはその全体が関連する開示内容に関して参照として本明細書に組み入れられる）。
【０３３１】
ポリペプチド
もう1つの面において、本発明は、本発明によって選択および/または単離された核酸分子によってコードされるポリペプチド（本発明に用いられる核酸分子のすべての可能なリーディングフレームによってコードされるポリペプチドおよびアミノ酸配列を含む）、ならびにこのポリペプチドの作製方法に関する。本発明のポリペプチドには、精製または単離された天然物、化学合成手順の生成物、および原核生物宿主または真核生物宿主（例えば、細菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞、哺乳動物細胞、鳥類細胞および高等植物細胞を含む）から組換え技術によって産生された産物が含まれる。
【０３３２】
本発明のポリペプチドは、合成有機化学がかかわるものなどの方法によって、または組換え法（例えば、本発明に用いられるベクターまたは単離された核酸分子を含む本発明の宿主細胞の1つまたは複数を用いる方法）によって作製しうる。本発明によれば、ポリペプチドは、本発明の宿主細胞（これは、本発明に用いられる1つまたは複数の核酸分子（これは発現ベクター中に含まれうる）を含む）を、本発明の核酸分子によってコードされるポリペプチドが宿主細胞によって産生されるように、本発明の核酸分子に含まれるヌクレオチド配列の発現に好ましい条件下で培養することによって産生されうる。本明細書において用いる場合、「ヌクレオチド配列の発現に好ましい条件」または「ポリペプチドの産生に好ましい条件」には、所定の宿主細胞による組換えポリペプチドの産生のために必要とされる最適な生理的（例えば、温度、湿度など）および栄養学的（例えば、培養培地、イオン）条件が含まれる。原核（細菌）細胞、哺乳動物細胞、昆虫細胞、酵母細胞、および植物細胞を含む、種々の宿主細胞のためのこのような最適条件は、当業者に知られており、例えば、Sambrook, J.ら、「分子クローニング、実験マニュアル（Molecular Cloning, A Laboratory Manual」第2版、Cold Spring Harbor, NY：Cold Spring Harbor Laboratory Press, pp. 16.30-16.55 (1989)、Watson, J.D.ら、「組換えDNA（Recombinant DNA）」第2版、New York：W.H. Freeman and Co.、およびWinnacker, E.-L.、「遺伝子からクローンへ（From Genes to Clones）」、New York：YCH Publishers (1987)に記載されている。
【０３３３】
いくつかの面においては、本発明のポリペプチドを単離または精製し（例えば、以下に述べる抗体の作製のために）、本発明のポリペプチドを単離された形態で産生させることが望ましいと思われる。本発明のポリペプチドは、硫酸アンモニウム沈殿またはエタノール沈殿、酸抽出、陰イオン交換クロマトグラフィーまたは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーおよびレクチンクロマトグラフィーを含む、当技術分野において慣用的なタンパク質精製の周知の方法によって組換え細胞培養物から回収および単離されうる。例えば、本発明の方法によって作製されたポリペプチド上のHis6またはGST融合タグは、当業者によって知られているように、His6またはGSTタグを有するポリペプチドと結合する適切なアフィニティークロマトグラフィーマトリックスを用いて単離されうる。本発明のポリペプチドには、精製された天然物、化学合成手順の生成物、および原核生物宿主または真核生物宿主（例えば、細菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞、哺乳動物細胞、鳥類細胞および高等植物細胞を含む）から組換え技術によって産生された産物が含まれる。組換え産生手順に用いられる宿主に応じて、本発明のポリペプチドをグリコシル化されることもあればグリコシル化されないこともある。さらに、本発明のポリペプチドは、場合によっては、宿主媒介プロセスの結果として修飾メチオニン残基を最初に含むこともある。
【０３３４】
単離された本発明のポリペプチドには、本発明に用いられる組換え部位をコードする核酸分子の1つまたは複数を含むポリヌクレオチドのリーディングフレームの1つまたは複数によってコードされるアミノ酸配列を含むものが含まれ、これには、図13A〜13Cに示されたヌクレオチド配列（またはそれらに対して相補的なヌクレオチド配列）を有するattB1、attB2、attP1、attP2、attL1、attL2、attR1およびattR2、またはそれらの断片、バリアント、変異体および誘導体をコードするもの；本明細書に記載の寄託されたクローンに含まれるポリヌクレオチドによってコードされる完全なアミノ酸配列；図13A〜13Cに示された本発明の組換え部位配列をコードするヌクレオチド配列（またはそれらに相補的なヌクレオチド配列）を有するポリヌクレオチドと、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列；または以上のポリペプチドの部分または断片を含むペプチドもしくはポリペプチド、が含まれる。本発明はまた、組換え部位ヌクレオチド配列または寄託されたクローンによってコードされるポリペプチドと結合した（一般的にはペプチジル結合によって新生ポリペプチドを形成する）1つまたは複数の補足的なアミノ酸を有するさらなるポリペプチドにも関する。このような補足的なアミノ酸残基には、1つまたは複数の機能的ペプチド配列、例えば1つまたは複数の融合パートナーペプチド（例えば、GST、HIS6、Trxなど）などが含まれうる。
【０３３５】
本明細書において用いる場合、「タンパク質」「ペプチド」「オリゴペプチド」および「ポリペプチド」という用語は、同義語とみなされ（一般的に理解されているように）、各用語は文脈の要求に応じて互換的に用いることができ、以下の特定の文脈で別に規定されていないかぎり、ペプチジル結合によって結合した2つまたはそれ以上のアミノ酸、5つまたはそれ以上のアミノ酸、10またはそれ以上のアミノ酸の連鎖を示しうる。当技術分野で一般に理解されているように、本明細書中のすべてのペプチドの式または配列は、左から右に書かれ、アミノ末端からカルボキシ末端への方向で書かれる。
【０３３６】
「単離された」ポリペプチドまたはタンパク質とは、その天然の環境から取り出されたポリペプチドまたはタンパク質のことを意図している。例えば、宿主細胞内で発現される組換えによって作製されたポリペプチドおよびタンパク質は、本発明の目的上は単離されているとみなされ、例えば、SmithおよびJohnson、Gene 67: 31-40 (1988)に開示された一段階精製法などの任意の適した技法によって実質的に精製された天然型または組換えポリペプチドについても同様である。
【０３３７】
ポリペプチドの構造または機能に重大な影響を及ぼすことなく、本発明のポリペプチドのいくつかのアミノ酸配列が変化しうることは、当業者には認識されていると考えられる。このような配列の違いを考える場合には、タンパク質には構造および活性を決定する重要な領域があることを忘れてはならない。一般に、類似の機能を遂行する残基を用いるならば、三次構造を形成する残基を置換することは可能である。別の例において、変化がポリペプチドの決定的でない領域で起こる場合には、残基の型はまったく重要でないこともある。
【０３３８】
したがって、本発明はさらに、本明細書に記載のポリペプチドに対して実質的な構造的相同性を示すか、またはこれらのポリペプチドの特定の領域（例えば、以下で考察する部分）を含む対立遺伝子バリアントを含む、本発明のポリペプチドのバリアントにも関する。このような変異体は、欠失、挿入、逆位、反復および型置換（例えば、1つの親水性残基によって別のものを置き換えること、しかし、原則として、強い疎水性のものを強い親水性のものでは置換しない）を含みうる。小さな変化またはこのような「中性」または「保存的」アミノ酸置換は、一般に活性にほとんど影響を及ぼさない。
【０３３９】
代表的な保存的置換には、脂肪族アミノ酸Ala、Val、LeuおよびIleの間での、1つの残基の別の残基への置換；水酸化残基SerおよびThrの交換；酸性残基AspおよびGluの交換；アミド化残基AsnおよびGlnの間の置換；塩基性残基LysおよびArgの交換；ならびに芳香族残基PheおよびTyrの間の置換がある。
【０３４０】
したがって、本発明のポリペプチドの断片、誘導体または類似体（例えば、本明細書に記載の組換え部位のヌクレオチド配列によってコードされるペプチドを含むもの）は、（i）1つまたは複数のアミノ酸残基が保存性アミノ酸残基または非保存性アミノ酸残基（好ましくは、保存性アミノ酸残基）で置換されたもの、このような置換されたアミノ酸残基は遺伝暗号によってコードされてもよく、遺伝暗号によってコードされないアミノ酸（例えば、デスモシン、シトルリン、オルニチンなど）でもよい；（ii）1つまたは複数のアミノ酸残基が、アミノ酸の通常の「R」基に加えて、置換基（例えば、リン酸基、水酸基、硫酸基または他の基）を含むもの；（iii）成熟ポリペプチドが別の化合物、例えば、ポリペプチドの半減期を延長する化合物（例えば、ポリエチレングリコール））と融合しているもの；または（iv）さらなるアミノ酸が成熟ポリペプチド（例えば、免疫グロブリンFc領域ペプチド、リーダーまたは分泌配列、成熟ポリペプチドの精製のために使用される配列（例えば、GST配列）またはプロタンパク質配列）と融合しているもの、であってよい。このような断片、誘導体および類似体は本発明に含まれるものとし、本明細書中の教示および本発明の時点における当技術分野の状態から、当業者の技能の範囲内にある。
【０３４１】
本発明のポリペプチドは単離された形態で提供可能であり、実質的に精製されていてもよい。組換えにより産生された型の本発明のポリペプチドは、SmithおよびJohnson、Gene 67: 31-40 (1988)に記載された一段階法によって実質的に精製することができる。本明細書において用いる場合、「実質的に精製された」という用語は、混入タンパク質（すなわち、本明細書に記載の個々のポリペプチド、その断片、改変体、変異体または誘導体ではないタンパク質）の少なくとも50％、好ましくは少なくとも60％、70％、または75％、およびより好ましくは、少なくとも80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、または99％（重量％で）が調製物から除去された、本発明の個々の調製物を意味する。
【０３４２】
本発明のポリペプチドには、本明細書に記載のポリペプチドに対して、少なくとも約50％同一な、少なくとも60％同一な、少なくとも65％同一な、少なくとも約70％同一な、少なくとも約75％同一な、少なくとも約80％同一な、少なくとも約85％同一な、少なくとも約90％同一な、少なくとも約95％同一な、少なくとも約96％同一な、少なくとも約97％同一な、少なくとも約98％同一な、または少なくとも約99％同一なポリペプチドが含まれる。例えば、本発明のattB1含有ポリペプチドには、図13A〜13Cに示された核酸配列（またはこれに相補的な核酸配列）を有するattB1のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドの3つのリーディングフレームによってコードされるポリペプチドに対して、本明細書に記載の寄託されたcDNAクローンに含まれるポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドに対して、または、図13A〜13Cに示された核酸配列（またはこれに相補的な核酸配列）を有するattB1のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドに対して、少なくとも約50％同一な、少なくとも60％同一な、少なくとも65％同一な、より好ましくは、少なくとも約70％同一な、少なくとも約75％同一な、少なくとも約80％同一な、少なくとも約85％同一な、少なくとも約90％同一な、少なくとも約95％同一な、少なくとも約96％同一な、少なくとも約97％同一な、少なくとも約98％同一な、または少なくとも約99％同一なポリペプチドが含まれる。図13A〜13Cに示された本発明のattB2、attP1、attP2、attL1、attL2、attR1およびattR2ポリペプチドに対して、少なくとも約65％同一な、少なくとも約70％同一な、少なくとも約75％同一な、少なくとも約80％同一な、少なくとも約85％同一な、少なくとも約90％同一な、少なくとも約95％同一な、少なくとも約96％同一な、少なくとも約97％同一な、少なくとも約98％同一な、または少なくとも約99％同一な類似のポリペプチドを調製することもできる。本発明のポリペプチドには、少なくとも5、10、15、20、または25アミノ酸を有する、上記のポリペプチドの一部または断片も含まれる。
【０３４３】
本発明の所定のポリペプチドの参照アミノ酸配列に対して、少なくとも、例えば、65％「同一な」アミノ酸配列を有するポリペプチドとは、ポリペプチド配列が本発明の所定のポリペプチドの参照アミノ酸配列の100アミノ酸当たり35アミノ酸までの変化を含みうることを除き、ポリペプチドのアミノ酸配列が参照配列と同一であることを意図している。言い換えれば、参照アミノ酸配列と少なくとも65％同一なアミノ酸配列を有するポリペプチドを得るためには、参照配列中の最大35％までのアミノ酸残基が欠失するか別のアミノ酸で置換されてもよく、または参照配列中の総アミノ酸残基の最大35％までの数のアミノ酸が参照配列中に挿入されてもよい。参照配列のこれらの変化は、参照アミノ酸配列のアミノ（-N）末端もしくは炭素（C-）末端の位置またはそれらの末端位置の間のどこかに生じてもよく、参照配列中の残基間に個別に分散しても参照配列内部に1つまたは複数の連続した群として分散してもよい。実際の手段として、所定のアミノ酸配列が本発明の所定のポリペプチドの参照アミノ酸配列と例えば少なくとも65％同一であるか否かは、既知のコンピュータプログラム、例えば核酸配列同一性の決定のための上記のプログラムなどを用いて、またはCLUSTAL Wプログラム（Thompson, J.D.ら、Nucleic Acids Res. 22: 4673-4680 (1994)）を用いて、従来通りに判定することができる。
【０３４４】
もう1つの面において、本発明は、本発明のポリペプチドのエピトープ含有部分を含むペプチドまたはポリペプチドを提供し、これは、本発明のポリペプチドの1つまたは複数と特異的に結合する抗体（特にモノクローナル抗体）を産生するために用いうる。このポリペプチド部分のエピトープは、本発明のポリペプチドの免疫原性エピトープまたは抗原性エピトープである。「免疫原性エピトープ」は、全タンパク質が免疫原である場合、抗体応答を誘発するタンパク質の一部として定義される。これらの免疫原性エピトープは、分子上の少数の遺伝子座に限定されると考えられている。一方で、抗体が結合しうるタンパク質分子の領域は、「抗原エピトープ」と定義される。タンパク質の免疫原性エピトープの数は、抗原エピトープの数より一般に少ない（例えば、Geysenら、Proc. Natl. Acad. Sci.USA 81: 3998-4002 (1983)を参照のこと）。
【０３４５】
抗原エピトープを含有する（すなわち、抗体が結合しうるタンパク質分子の領域を含む）ペプチドまたはポリペプチドの選択については、タンパク質配列の一部を模倣する比較的短い合成ペプチドが、通常、部分的に模倣されたタンパク質と反応する抗血清を誘発しうることが周知である（例えば、Sutcliffe, J.G.ら、Science 219: 660-666 (1983)を参照のこと）。タンパク質反応性血清を誘発しうるペプチドは、タンパク質の一次配列としてしばしば表現されており、これらは一連の単純な化学的規則によって特徴付けることができ、インタクトなタンパク質の免疫優性領域（すなわち、免疫原性エピトープ）にもアミノ末端もしくはカルボキシ末端にも限定されない。極度に疎水性であるペプチドおよび残基数が6以下であるペプチドは一般に、模倣タンパク質と結合する抗体の誘導に関して有効でない；より長いペプチド、特にプロリン残基を含むペプチドが通常は有効である（Sutcliffe, J.G.ら、Science 219: 660-666 (1983)）。
【０３４６】
上記の指針に従ってデザインされた本発明のエピトープ含有ペプチドおよびポリペプチドはしばしば、本発明のポリペプチドのアミノ酸配列に含まれる少なくとも5アミノ酸、少なくとも7アミノ酸、少なくとも10アミノ酸、少なくとも15アミノ酸、少なくとも20アミノ酸、少なくとも25アミノ酸の配列を含むと考えられる。しかし、本発明のポリペプチドのアミノ酸配列のより大きな部分を含み、約30〜約50個のアミノ酸、またはそれまでの任意の長さを含み、本発明の所定のポリペプチドの総アミノ酸配列を含む、ペプチドまたはポリペプチドも、本発明のエピトープ含有ペプチドまたはポリペプチドと考えられ、模倣タンパク質と反応する抗体を誘導するのに有用である。
【０３４７】
当業者は同じく理解すると考えられるが、本発明のポリペプチドおよび本明細書に記載のそのエピトープ含有断片を、GST、His6、Trxおよび免疫グロブリン（Ig）の定常ドメインの部分を非制限的に含む1つまたは複数の融合パートナータンパク質またはペプチドまたはその部分と融合させ、キメラポリペプチドまたは融合ポリペプチドを作製することができる。これらの融合ポリペプチドは、分析または診断（ハイスループットを含む）の形式に用いるための、本発明のポリペプチドの精製を容易にする（欧州特許第0 394 827号；Trauneckerら、Nature 331: 84-86 (1988)））。
【０３４８】
抗体
もう1つの面において、本発明は、本発明の方法によって作製された抗体および他の抗原結合タンパク質（例えば、一本鎖抗原結合タンパク質）に関する。1つの関連した面において、本発明は、1つもしくは複数の組換え部位核酸配列もしくはその部分のすべてのリーディングフレームによってコードされる1つもしくは複数のポリペプチドを認識して結合する、または、att部位（attB1、attB2、attP1、attP2、attL1、attL2、attR1、attR2などを含む）、lox部位（例えば、loxP、loxP511など）、FRTなど、またはそれらの変異体、断片、バリアントおよび誘導体を含む、1つもしくは複数の組換え部位核酸配列またはその部分を認識して結合する、1つもしくは複数の核酸分子に関する。概論については、参照としてその全体が本明細書に組み入れられる、米国特許第5,888,732号を参照されたい。本発明の抗体はポリクローナル、モノクローナルまたは合成性のいずれでもよく、さまざまな任意の方法によって調製してもよく、当技術分野で周知の方法によるさまざまな種であってよい。例えば、米国特許第5,587,287号；Sutcliffe, J.G.ら、Science 219: 660-666 (1983)；Wilsonら、Cell 37：767 (1984)；およびBittle, F.J.ら、J. Gen. Virol. 66: 2347-2354 (1985)を参照されたい。本明細書に記載のポリペプチドまたは核酸分子の任意のものに対して特異的な抗体、例えば、本明細書に記載の、または寄託されたクローンに含まれる、組換え部位ヌクレオチド配列または1つもしくは複数の核酸分子によってコードされるポリペプチドの1つまたは複数と特異的に結合する抗体、融合ポリペプチドに対する抗体（例えば、本明細書に記載したような、融合パートナータンパク質の1つまたは複数と、本発明の組換え部位ポリペプチドの1つまたは複数との融合ポリペプチドとの結合）などを、本発明のインタクトのポリペプチドまたはポリヌクレオチド、またはその1つもしくは複数の抗原性ポリペプチド断片に対して産生させることができる。
【０３４９】
本明細書において用いる場合、「抗体」（Ab）という用語は、以下に述べるような特別な状況を除き、「ポリクローナル抗体」または「モノクローナル抗体」（mAb）という用語と互換的に用いうる。これらの用語は、本明細書において用いる場合、本発明のポリペプチドまたは核酸分子、またはそれらの一部と特異的に結合しうる、インタクトな分子ならびに抗体断片（例えば、FabおよびF（ab'）２断片のような）を含むことを意味する。このため、本発明のインタクトな抗体に加えて、Fab、F（ab'）２および本明細書に記載の抗体の他の断片、ならびに本発明の1つまたは複数のポリペプチドまたはポリヌクレオチドと結合する他のペプチドおよびペプチド断片も、本発明の範囲に含まれると解釈される。このような抗体断片は一般に、パパイン（Fab断片を産生する）またはペプシン（F（ab'）2断片を産生する）などの酵素を用いる、インタクトな抗体のタンパク質分解によって作製される。抗体断片およびペプチドまたはペプチド断片を、組換えDNA技術の適用または合成化学によって作製することもできる。
【０３５０】
本発明のこの面によるポリクローナル抗体は、本明細書に記載の本発明のポリペプチドもしくは核酸分子または標準的な技法によるその部分の1つまたは複数により、動物を免疫化することにより作製しうる（例えば、Harlow, E.およびLane, D.、「抗体：実験マニュアル（Antibodies: A Laboratory Manual）」、Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press (1988)；Kaufman, P.B.ら、「生物学および医学における分子的および細胞的方法のハンドブック（Handbook of Molecular and Cellular Methods in Biology and Medicine）」、Boca Raton, Florida：CRC Press、pp.468-469 (1995)を参照されたい）。
【０３５１】
本発明のこの面によるモノクローナル抗体（または本発明のポリペプチドの1つまたは複数と結合するその断片）は、ハイブリドーマ技術を用いて作製しうる（Kohierら、Nature 256：495 (1975)；Kohlerら、Eur. J. Immunot. 6：511 (1976)；Kohlerら）、Eur. J. Immunol. 6：292 (1976)；Hammerlingら、「モノクローナル抗体およびT細胞ハイブリドーマ（Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas）」、Elsevier, N.Y., pp.563-681 (1981)）。
【０３５２】
ファージディスプレイ技術を用いて、ポリペプチドをファージの表面に提示することもできる（米国特許第6,190,908号；米国特許第6,194,183号を参照されたい）。さらに、ファージディスプレイシステムを、ポリペプチドを改変し、改変されたポリペプチドを機能的活性に関してスクリーニングするために、本発明の実施において用いてもよい。例えば、ファージディスプレイライブラリーを、抗体分子と結合するものを同定するためにスクリーニングすることができる。
【０３５３】
本発明の抗体を、代替的には、例えば、固相に固定化された抗体を用いるクロマトグラフィーおよび他の免疫学的手順を容易にするために固相と結合させうることは、当業者には理解されると考えられる。このような手順に含まれるものには、本発明に用いられる抗体分子によってコードされる1つもしくは複数のエピトープを含むポリペプチド（これは融合ポリペプチドまたは本明細書に記載の他の本発明のポリペプチドでもよい）を単離もしくは精製するための、または1つもしくは複数の組換え部位本発明の配列もしくはその部分を含むポリヌクレオチドを単離もしくは精製するための、本発明の抗体の使用が含まれる。例えば本発明の抗体が固相支持体に結合されたものを用いる、アフィニティークロマトグラフィーによる、ポリペプチド（および、類推により、ポリヌクレオチド）の単離および精製のための方法は、当技術分野では周知であり、当業者にはよく知られていると考えられる。
【０３５４】
支持体
1つの面において、本発明は、核酸分子の集団を標的核酸分子と連結するための方法であって、（1）標的核酸分子、（2）少なくとも1つの組換え部位をそれぞれが含む核酸分子、または（3）核酸分子の集団の個々の構成要素が支持体と結合している方法を提供する。本発明はさらに、核酸分子を支持体から遊離させるための方法を提供する。核酸の遊離は、組換えおよび1つまたは複数の制限エンドヌクレアーゼによる消化を含む、任意のさまざまな手段によって行いうる。
【０３５５】
図32に示された工程を例示を目的として用いると、組換え部位（例えば、attR2部位）を含む核酸分子を、固体支持体（例えば、ビーズ）と結合させる。続いて、集団の個々の構成要素が少なくとも1つの組換え部位（例えば、attL2部位）が含む、核酸分子の集団（例えば、cDNA分子またはベクター中に含まれるcDNA分子）を、支持体と結合した核酸分子の組換え部位（例えば、attR2部位）と組み換えさせ、集団の構成要素を新たな組換え部位（例えば、attP2部位）を介して支持体と結合させる。続いて、核酸分子を支持体から遊離させ、これらの分子を別のベクターに組み入れるために第2の組換え反応を用いる。その後、必要に応じて、当技術分野で知られた手段（例えば、連結、相同組換え、トポイソメラーゼクローニングなど）を用いて、組換えを生じたベクターを環状化してもよい。
【０３５６】
以上に考察したものと類似した工程が図33に示されており、ここでは組換え部位を含む核酸分子を支持体に結合させるためにビオチンおよびアビジンを用いている。これらの組換え部位は、他の核酸分子を支持体に結合させるために用いられるものである。
【０３５７】
当業者は理解すると考えられるが、本発明の実施において核酸分子を支持体と結合させるためには任意のさまざまな手段を用いうる。さまざまなこのような手段を以下により詳細に述べている。さらに、以上の任意のさまざまなもの、またはその変法を実施してもよい。例えば、1つまたは複数の初回の組換え反応を、組換えを生じた核酸分子を支持体に結合させる前に行ってもよい。さらに、例えば、2つの核酸分子を組換え反応によって連結させ、分子の一方がビオチン部分を含む場合には、これらの分子をその後にアビジン（これは支持体に直接結合させうる）との会合によって支持体に結合させることもできる（図35〜37参照）。当業者は理解すると考えられるが、このような核酸分子を支持体と結合させるために、他の任意のさまざまな手段を用いることもできる。さらに、特定の場合には、上記のものに類似した工程を、核酸分子が支持体と結合された上で生じる組換えを用いずに、核酸分子を精製するために用いることもできる。例えば、核酸分子を支持体との結合の前に組換えによって作製することが可能である。さらに、支持体との結合後に、1つまたは複数の制限エンドヌクレアーゼによる消化により、核酸分子を遊離させることができると考えられる。
【０３５８】
本発明の核酸分子を支持体と結合させることには、支持体を洗浄し、結合していない試薬を除去しうるという利点がある。ここでも図32および33に示された工程を例示のために用いると、cDNA分子または集団の他の核酸分子が固体支持体にひとたび結合させると、反応していない試薬を洗浄によって除去しうる。このため、核酸分子を支持体から遊離させる前に、結合/反応していない分子（例えば、ベクターおよびcDNA分子）および試薬を除去することができる。したがって、本発明は、核酸分子の集団の構成要素を、タンパク質、塩、糖質、界面活性剤、他の核酸分子（例えば、RNA、ベクター、プライマーなど）などの混入物から分離するための方法を提供する。
【０３５９】
さらに、上記の通り、支持体からのcDNA分子の遊離は任意のさまざまな手段によって行いうる。図32および33は、組換え反応の利用によるこれらの分子の遊離を示しているが、例えば、制限エンドヌクレアーゼによる消化によって遊離を実現させてもよい。
【０３６０】
組換えを支持体上で行う本発明のさらなる態様は図35〜37に示されている。これらの例のそれぞれにおいて、核酸分子は、ビオチンとアビジンとの相互作用を介して支持体（すなわち、ビーズ）と結合されている。続いて、核酸分子の集団の個々の構成要素を含む核酸セグメントを、組換えによって支持体から遊離させる。
【０３６１】
したがって、1つの面において、本発明は、支持体上で核酸分子の集団の組換えを行うための方法を提供する。特定の関連した態様において、本発明はさらに、核酸分子を精製するための方法であって、それらを支持体に結合させること、および望ましくない材料（すなわち、混入物）を洗浄して除去することによる方法を提供する。したがって、1つの一般的な面において、本発明は、核酸分子を精製するための方法であって、これらの分子を支持体に連結させた後に、非結合材料を除去し、核酸分子を支持体から遊離させることによる方法を提供する。本発明はさらに、本発明の方法によって精製された核酸分子の集団、およびこれらの核酸分子の集団を含む支持体を提供する。
【０３６２】
本発明による使用に適した支持体は、1つまたは複数の組換え部位またはその部分を含む核酸分子を結合させるのに適した任意の支持体またはマトリックスであってよい。これらの核酸分子は、任意の技法、または当技術分野で周知の技法の任意の組み合わせにより、本発明の支持体に付加することまたは結合させること（共有的または非共有的に）ができる。本発明の支持体には、ニトロセルロース、ジアゾセルロース、ガラス、ポリスチレン（マイクロタイタープレートを含む）、ポリ塩化ビニル、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリビニリデンジフルオライド（PVDF）、デキストラン、セファロース、寒天、デンプンおよびナイロンが含まれうる。本発明の支持体は、ビーズ、フィルター、膜、シート、フリット、プラグ、カラムを含む、任意の形態または構成をとりうる。また、支持体には、12ウェルプレート、24ウェルプレート、48ウェルプレート、96ウェルプレートおよび384ウェルプレートなどのマルチウェルチューブ（マイクロタイタープレートなど）も含まれうる。ビーズは例えば、ガラス、ラテックスまたは磁性材料でできたものでよい（磁性ビーズ、常磁性ビーズまたは超常磁性ビーズ）。
【０３６３】
核酸を支持体に結合させるための方法は記載されている（例えば、米国特許第5,436,327号、米国特許第5,800,992号、米国特許第5,445,934号、米国特許第5,763,170号、米国特許第5,599,695号および米国特許第5,837,832号）。例えば、ジスルフィド修飾オリゴヌクレオチドを、ジスルフィド結合を用いて支持体と共有結合させることができる（Rogersら、Anal. Biochem. 266: 23-30 (1999)を参照されたい）。さらに、ジスルフィド修飾オリゴヌクレオチドが、固相合成を用いたペプチド核酸（PNA）であってもよい（Aldrian-Herradaら、J. Pept. Sci. 4: 266-281 (1998)を参照されたい）。したがって、1つまたは複数の組換え部位またはその部分を含む核酸分子を、1つまたは複数の支持体に付加し、核酸、タンパク質または他の分子および/または化合物を本発明の組換え方法によってこのような支持体に付加することができる。核酸の目的の分子との結合は当技術分野で知られており、このため、当業者は、本発明による支持体に対する結合のための組換え部位（またはその部分）を含む分子および/または化合物を作製することができる。
【０３６４】
本質的には、想定されるあらゆる支持体を本発明に用いうる。支持体は生物性、非生物性、有機性、無機性またはこれらの任意の組み合わせであってよく、粒子、鎖、沈降物、ゲル、シート、チューブ、球、容器、キャピラリー、パッド、薄片、フィルム、プレート、スライドなどとして存在しうる。支持体は円板状、正方形、球状、環状などの任意の好都合な形状をとりうる。支持体は平坦であることが好ましいが、さまざまな別の表面構成をとってもよい。例えば、支持体は、合成または他の反応のために用いうる隆起または陥凹した領域を含みうる。支持体およびその表面は、その上で本明細書に記載の反応を行うための剛性支持体を形成することが好ましい。また、支持体およびその表面は、適切な光吸収特性が得られるように選択される。例えば、支持体は重合ラングミュア・ブロジェット膜、官能基を付したガラス、Si、Ge、GaAs、GaP、SiO2、SIN4、改変シリコン、または（ポリ）テトラフルオロエチレン、（ポリ）ポリビニリデンジフルオライド、ポリスチレン、ポリカーボネートなどの多岐にわたるゲルもしくはポリマーのいずれか1つ、またはそれらの組み合わせであってもよい。他の支持体材料も、本開示を吟味することにより、当業者には直ちに明らかになると考えられる。1つの好ましい態様において、支持体は平板ガラスまたは単結晶シリコンである。
【０３６５】
したがって、本発明は、核酸分子を結合させるための支持体を調製するための方法を提供する。いくつかの態様において、これらの核酸分子は、その末端の1つまたは複数（例えば、1つ、2つ、3つまたは4つ）に組換え部位を有すると考えられる。いくつかのさらなる態様においては、1つの核酸分子を支持体または支持体の特定の部分に直接結合させ、1つまたは複数のさらなる核酸分子を、支持体と直接結合した核酸分子との結合を介して支持体に間接的に結合させることが考えられる。このような場合、支持体と直接結合させた核酸分子は、より大きな核酸分子を周囲に構築させる核形成部位となる。
【０３６６】
本発明はさらに、特定の性質、特徴または活性を有する分子を同定するために、核酸分子の集団（例えば、核酸ライブラリー）をスクリーニングするための方法を提供する。核酸分子を支持体に結合させることによって形成可能であり、このようなスクリーニング方法に用いうる組成物の例には「遺伝子チップ」があり、これは当技術分野ではしばしば「DNAマイクロアレイ」または「ゲノムチップ」とも呼ばれる（米国特許第5,412,087号および第5,889,165号、ならびにPCT国際公開公報第97/02357号、国際公開公報第97/43450号、国際公開公報第98/20967号、国際公開公報第99/05574号、国際公開公報第99/05591号および国際公開公報第99/40105号を参照されたい。これらの開示内容はその全体が参照として本明細書に組み入れられる）。例えば、同じ特異性を有する組換え部位（例えば、attP1、attP2、attP3、attP4部位）をそれぞれが含む核酸分子を、遺伝子チップ上の例えば特定の位置（すなわち、アドレス）に配置し、同じ特異性を備えた組換え部位を有する核酸分子が群として集まったチップを作製することができる。このようなチップは、チップに付随した組換え部位（例えば、attP1、attP2、attP3、attP4部位）と組換えを行うと考えられる組換え部位（例えば、attB1、attB2、attB3、attB4部位）を有する核酸分子が、組換えによってチップと結合しうる位置を有すると考えられる。
【０３６７】
上記のようなチップがひとたび調製されれば、チップに結合した組換え部位と組換えを行いうる組換え部位（例えば、attB1、attB2、attB3、attB4部位）を含む1つまたは複数の核酸分子の集団を、組換えを促す条件下で、チップと接触させることができる。遺伝子チップに結合した核酸分子の組換え部位と、集団の個々の構成要素のものとの間の組換えにより、チップと結合した集団の個々の構成要素が得られると考えられる。さらに、組換え反応の特異性のために、チップを多数の異なる核酸分子（例えば、異なる特異性を備えた組換え部位を有する核酸分子）と一度に接触させ、同じ配列または非常に類似した配列（例えば、互いに同一性が95％を上回る配列）を有する核酸分子が特定の位置にクラスター化したチップを作製することもできる。続いて、チップに結合した核酸分子を当技術分野で知られた工程に用いることができる。
【０３６８】
上記のものなどのチップの作製に用いうる特異性の数を増やすために、多数の組換え系の成分を用いることもできる。例えば、チップは、attP部位およびlox部位を有する核酸分子を含みうる。上記の通り、さまざまな組換え特異性を有するlox部位が、PCT国際公開公報第01/11058号（これはその全開示内容が参照として本明細書に組み入れられる）に開示されている。したがって、本発明は、同じ組換え特異性を有する核酸分子が特定の位置（例えば、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、80、85、90、95、100、120、140、160、180、200、240、280、300、240、380、400、450、500、550、600、650、700、75、800、850、900、950、1,000などのアドレス）にまとまって配置された遺伝子チップを提供する。これらの「包括的な」遺伝子チップは、その後、同族組換え部位を有する核酸分子が組換えを介して結合したチップを調製するために用いうる。
【０３６９】
他の態様において、同じまたは異なる組換え特異性を備えた組換え部位を有する核酸分子を、遺伝子チップまたはそのサブポーション上の位置にランダムに配置してもよい。続いて、チップに結合した分子の組換え部位と組換えを行いうる組換え部位を含むチップを1つまたは複数の核酸分子の集団と、組換えを促す条件下で接触させることができる。その代わりに、核酸分子の集団を、同族部位を有する核酸分子を結合させた遺伝子チップの部分のみと接触させてもよい。
【０３７０】
本発明はしたがって、組換えによって核酸分子を支持体に結合させるための方法、さらには本発明の方法によって調製された支持体、および特定の性質、特徴または活性を有する核酸分子を同定するためにこれらの支持体を用いるための方法を提供する。
【０３７１】
本発明の遺伝子チップを、特異性の異なる組換え部位を同定するために用いることもできる。例えば、組換え部位を含む核酸分子に変異誘発（例えば、ランダム変異誘発）を施した後、変異誘発を受けた核酸分子をチップのさまざまな位置に配置し、1つまたは複数のさらなる組換え部位と組換えを起こすものを同定するためにスクリーニングすることができる。例えば、組換え部位（例えば、attL1部位）を含む核酸分子にランダム変異誘発を施すことができる。続いて、その結果生じた個々の核酸分子を増幅し、チップ上の特定の位置に配置する。続いて、チップを、組換えを促す条件下で、（1）異なる組換え部位、または（2）同じ組換え部位（例えば、attR1部位）のいずれかを含む核酸分子に曝露させ、組換えが起こった位置を同定するための評価を行う。続いて、組換え反応にかかわった核酸分子の配列決定を行い、組換え部位のヌクレオチド配列を決定することができる。本発明はさらに、上記のような工程によって同定される組換え部位も含む。
【０３７２】
本発明の核酸アレイがアドレス指定可能であることは、特定のヌクレオチド配列を含む核酸分子と結合する分子または化合物をアレイに結合させうることを意味する。すなわち、タンパク質および他の核酸などの成分を、本発明の核酸アレイ中の特定のアドレス指定可能な位置に結合させることができる。
【０３７３】
本発明はしたがって、特定の組換え特異性を有する核酸分子が特定の領域に配置された核酸アレイを調製するための方法を提供する。本発明はさらに、本発明の方法によって調製されたアレイ、組換え反応を用いて核酸分子をこのようなアレイに結合させるための方法、特定の性質、特徴または活性を有する核酸分子を同定するためにこのようなアレイをスクリーニングするための方法、および本発明の方法によって同定された核酸分子も提供する。
【０３７４】
キット
本発明はまた、本発明の核酸分子、ポリペプチド、ベクター、宿主細胞および抗体の作製に用いうるキットも提供する。本発明はさらに、核酸分子の標的核酸分子への挿入のため、核酸分子の標的核酸分子間の移行のため、および本発明の逐次的選択方法に用いうるキットも提供する。
【０３７５】
本発明のこの面によるキットは、1つまたは複数の容器を含んでよく、この容器は本発明の核酸分子、プライマー、ポリペプチド、ベクター、宿主細胞または抗体の1つまたは複数を含みうる。特に、本発明のキットは、以下からなる群から選択される1つまたは複数の成分（またはそれらの組み合わせ）を含みうる：1つまたは複数の組換えタンパク質（例えば、Int）または補助因子（例えば、IHFおよび/またはXis）またはそれらの組み合わせ、1つまたは複数の組換えタンパク質または補助因子またはそれらの組み合わせを含む1つまたは複数の組成物（例えば、GATEWAY（商標）LRクロナーゼ（商標）Enzyme MixまたはGATEWAY（商標）BPクロナーゼ（商標）Enzyme Mix）、1つまたは複数の目的ベクター分子（本明細書に記載のものを含む）、1つまたは複数のエントリークローンまたはエントリーベクター分子（本明細書に記載のものを含む）、1つまたは複数のプライマー核酸分子（特に、本明細書に記載されたもの）、1つまたは複数の宿主細胞（例えば、コンピテント細胞（例えば、大腸菌細胞）、酵母細胞、動物細胞（哺乳動物細胞、昆虫細胞、線虫細胞、鳥類細胞、魚類細胞などを含む）、植物細胞、および特に大腸菌 DB3、DB3.1（好ましくは、大腸菌ライブラリー EFFICIENCY（登録商標）DB3.1（例えば、大腸菌LIBRARY EFFICIENCY（登録商標）DB3.1（商標）コンピテント細胞；インビトロゲン社、カールズバッド、CA）、DB4およびDB5；2000年3月2日に提出された米国特許出願第09/518,188号（この開示内容はその全体が参照として本明細書に組み入れられる）を参照のこと。
【０３７６】
関連した面において、本発明のキットは、1つまたは複数の組換え部位またはその部分をコードする1つまたは複数の核酸分子（例えば、本発明の1つまたは複数の組換え部位（または、その部分）をコードするヌクレオチド配列を含む1つまたは複数の核酸分子）、特に、本明細書に記載の寄託されたクローンに含まれる核酸分子の1つまたは複数を含みうる。また、本発明のこの面によるキットは、本発明の1つもしくは複数の単離された核酸、本発明の1つもしくは複数のベクター、本発明の1つもしくは複数のプライマー核酸分子、および/または本発明の1つもしくは複数の抗体を含みうる。
【０３７７】
本発明のキットはさらに、本発明の核酸分子、ポリペプチド、ベクター、宿主細胞または抗体との組合せにおいて有用な1つまたは複数のさらなる成分を含む1つまたは複数のさらなる容器を含んでよく、これには1つまたは複数の緩衝液、1つまたは複数の界面活性剤、核酸ポリメラーゼ活性を有する1つまたは複数のポリペプチド、逆転写酵素活性を有する1つまたは複数のポリペプチド、1つまたは複数のトランスフェクション試薬、1つまたは複数のヌクレオチドなどが含まれうる。1つの関連した面において、本発明のキットは、選択のための1つまたは複数の試薬、例えば、酵素、基質、リガンド、阻害剤、標識、抗体、プローブまたはプライマーなどを含みうる。このようなキットは、本発明の核酸分子、プライマー、べクター、宿主細胞、ポリペプチド、抗体および組成物を用いる任意のプロセス、例えば、核酸分子を合成する方法において（例えば、PCRなどの増幅を介して）、核酸分子をクローニングする方法において（例えば、本明細書に記載の組換えクローニングを介して）などに都合よく用いうる。
【０３７８】
当業者に知られている情報に鑑みて、本明細書中に含まれる本発明の説明から、本明細書に記載した方法および用途に対する他の適切な改変および適合化が直ちに明らかであること、ならびにそれを本発明の発明およびその任意の態様から逸脱することなく行いうることは、関連技術分野の当業者には理解されると考えられる。本発明をここまで詳細に説明してきたが、これは以下の実施例を参照することによってより明確に理解されると考えられる。この実施例は、例示の目的のみで含まれるものであり、本発明を限定することは意図していない。
【０３７９】
2000年12月11日に提出された米国特許出願第09/732,914号；1995年6月7日に提出された米国特許出願第08/486,139号；1996年6月7日に提出された米国特許出願第08/663,002号（現在は米国特許第5,888,732号）；1999年1月20日に提出された米国特許出願第09/233,492号；米国特許第6,143,557号；1997年10月24日に提出された米国特許出願第60/065,930号；1998年10月23日に提出された米国特許出願第09/177,387号；1999年4月22日に提出された米国特許出願第09/296,280号；1999年4月22日に提出された米国特許出願第09/296,281号；1998年11月13日に提出された米国特許出願第60/108,324号；1999年11月12日に提出された米国特許出願第09/438,358号；2000年10月25日に提出された米国特許出願第09/695,065号；1999年11月2日に提出された米国特許出願第09/432,085号；1999年3月2日に提出された米国特許出願第60/122,389号；1999年3月23日に提出された米国特許出願第60/126,049号；1999年5月28日に提出された米国特許出願第60/136,744号；1999年3月2日に提出された米国特許出願第60/122,392号；および1999年10月25日に提出された米国特許出願第60/161,403号の全開示内容は、参照として本明細書に組み入れられる。
【０３８０】
実施例
実施例1：LR反応を用いる2つの核酸セグメントの同時クローニング
本発明の方法を用いて、2つの核酸セグメント（その一方または両方が、1つまたは複数の核酸分子の集団の個々の構成要素であってよい）を単一の反応でクローニングすることができる。本発明の方法は、第1および第2の組換え部位によって挟まれた第1の核酸セグメント（例えば、HIS6タグをコードする核酸）を提供する段階、第3および第4の組換え部位によって挟まれた第2の核酸セグメント（例えば、cDNAライブラリーの構成要素）を提供すること（この際、第1または第2の組換え部位のいずれかは第3または第4の組換え部位と組換えを行いうる）、2つの核酸セグメントが組換えを行って単一の核酸分子となるように組換え反応を行うこと、およびその単一の核酸分子をクローニングすることを含む。
【０３８１】
図19を参照すると、組換え部位によって挟まれた2つの核酸セグメントが提供される。当業者は、核酸セグメントを離散的な断片またはより大きい核酸分子の部分として提供することができ、これは環状でもよく選択的には超らせん状または線状でもよいことを理解すると考えられる。部位は、反応性部位の対（reactive pair of sites）の一方の構成要素が2つのセグメントのそれぞれに隣接するように選択することができる。
【０３８２】
「反応性部位の対」とは、適切な酵素および補助因子の存在下で組換えを行いうる2つの組換え部位のことを意味する。例えば、いくつかの態様においては、1つの核酸分子がattR部位を含み、もう1つのものがattR部位と反応するattL部位を含むことが考えられる。LR反応の産物は2つの分子であり、その一方はattB部位を含み、もう一方はattP部位を含むため、連結後に2つの出発核酸セグメントがattB部位またはattP部位を含む核酸分子によって隔てられるように、出発（starting）attL部位およびattR部位の向きを配置することが可能である。
【０３８３】
いくつかの態様において、部位は、組換え反応後に2つの出発核酸セグメントがattB部位によって隔てられるように配置しうる。他の態様において、他の組換え系由来の組換え部位を用いることもできる。例えば、いくつかの態様において、組換え部位の1つまたは複数はlox部位または誘導体でありうる。いくつかの態様においては、複数の組換え系由来の組換え部位を同じ構築物中に用いうる。例えば、組換え部位の1つまたは複数がatt部位であり、他のものがlox部位であってもよい。異なる組換え系に由来する部位（例えば、Flp部位、Fip部位の誘導体など）のさまざまな組み合わせが当業者に想定されると思われ、このような組み合わせは本発明の範囲に含まれると考えられる。
【０３８４】
図19に示されているように、核酸セグメントA（DNA-A）を一意的な特異性を有する組換え部位、例えばattL1部位およびattL3部位によって挟み込み、核酸セグメントB（DNA-B）を組換え部位attR3およびattL2によって挟み込むことができる。例示のために、セグメントはDNAとして示している。これは、本発明の実施に用いられる核酸をDNAに限定し、他の核酸を除外するものと見なされるべきではない。さらに、本実施例および以後の実施例において、組換え部位の命名（すなわち、L1、L3、R1、R3など）は単に、用いる組換え部位が異なる特異性を有することを伝えることを意図しており、本発明を言及した特定の部位の使用に限定するものと見なされるべきではない。当業者は、例示した特定の部位の対を他のものに容易に置き換えうると考えられる。
【０３８５】
attR3部位およびattL3部位は反応性部位の対を構成する。一意的な組換え部位を有する他の対を、核酸セグメントを挟み込むために用いてもよい。例えば、lox部位を1つの反応性対として用い、もう1つの反応性対がatt部位であって、適した組換えタンパク質を反応に含めてもよい。同様に、以上に考察した組換え部位をさまざまな組み合わせで用いることもできる。この態様における唯一の決定的な特徴は、各セグメントを挟み込む組換え部位のうち、反応性部位の対（この例ではLR対L3およびR3）の一方の構成要素が一方の核酸セグメント上に存在し、反応性対のもう一方の構成要素がもう一方の核酸セグメント上に存在することである。
【０３８６】
この2つのセグメントを、適切な酵素および目的ベクターと接触させる。
【０３８７】
目的ベクターは2つの組換え部位によって挟まれた適した選択マーカーを含む。いくつかの態様において、選択マーカーは陰性選択マーカー（毒性遺伝子、例えば、ccdBなど）であってよい。目的ベクター中の1つの部位は核酸セグメントの一方に存在する1つの部位と適合し、目的ベクター中に存在する他方の適合部位は他の核酸セグメント上に存在すると考えられる。
【０３８８】
2つの出発核酸セグメントの間の組換えが起こらないと、どの出発核酸セグメントも目的ベクター中の両方の部位と適合性のある組換え部位を有しない。このため、どの出発核酸セグメントも目的ベクター中に存在する選択ベクターを置き換えることはできない。
【０３８９】
反応混合物を約25℃で約5分間〜約48時間インキュベートする。反応混合物のすべてまたは一部を用いてコンピテント微生物の形質転換を行い、微生物を所望の構築物の存在に関してスクリーニングする。
【０３９０】
いくつかの態様において、目的ベクターは陰性選択マーカーを含み、形質転換された微生物は目的ベクター上に存在した陰性選択マーカーに対する感受性を有する。形質転換された微生物を、所望の組換え産物を含まない微生物が除外される陰性選択を許容する条件下で増殖させる。
【０３９１】
図19において、結果的に生じた所望の産物は、attB3部位によって隔てられたDNA-AおよびDNA-Bからなり、目的ベクターの基本骨格中にクローニングされる。この態様において、2つの断片を組み換えさせ、組み合わされた断片を目的ベクターに挿入するために同じタイプの反応（すなわち、LR反応）を用いることもできる。
【０３９２】
いくつかの態様においては、核酸セグメントの1つまたは複数の向きを調整することは必要ではなく、同じ特異性を有する組換え部位をセグメントの両端に用いうると考えられる。
【０３９３】
図19を参照すると、セグメントBに対するセグメントAの向きが特に重要でなければ、セグメントAの両端を逆方向反復配列の向きにあるL1部位によって挟み込み、セグメントAと連結させるセグメントBの末端にR1部位を付与することが可能と考えられる。これは、セグメントAとBとの間のコンビナトリアルライブラリーの形成に際して複雑性を高める上で有用と思われる。すなわち、セグメントの連結はさまざまな向きで行え、連結されるセグメントの一方または両方が1つまたは複数のライブラリーに由来する場合には、ランダムな向きにあるハイブリッド分子を含む新たな集団またはライブラリーを本発明に従って構築しうると考えられる。
【０３９４】
しかし、本実施例では、2つの出発核酸セグメント間の組換えは目的ベクターとの組換え反応の前に起こることが示されており、組換え反応の順序は重要ではない。すなわち、いくつかの態様においては、セグメント間の組換えを行い、組み合わされたセグメントを単離することが望ましいと考えられる。組み合わされたセグメントは直接用いることもでき、例えば、増幅しても、配列決定を行ってもよく、またはSykesらによる教示の通りに線状発現因子として用いてもよい（Nature Biotechnology 17: 355-359 (1999)）。いくつかの態様においては、連結されたセグメントをTawfikらによる教示の通りに封入し（Nature Biotechnology 16: 652-656 (1998)）、その後に1つまたは複数の望ましい性質、特徴または活性に関してアッセイしてもよい。いくつかの態様においては、一方のセグメント上のT7プロモーターまたはSP6プロモーターなどのプロモーターを含む、組み合わされたセグメントをRNAのインビトロ発現のために用いてもよい。インビトロで発現されたこのようなRNAを、選択的には、ウサギ網状赤血球溶解液などのインビトロ翻訳系において翻訳させることもできる。したがって、ある種の態様において、本発明の核酸分子は目的ベクター中に挿入されなくともよい。さらに、それぞれが組換え部位を一方の末端に含む核酸セグメントを、トポイソメラーゼクローニングなどの方法により、組換え部位を含まない末端に連結することもできる。
【０３９５】
選択的には、連結されたセグメントをさらに目的ベクターと反応させ、組み合わされたセグメントをベクター中に挿入することもできる。場合によっては、セグメントの一方およびベクターを含む中間体を単離することが望ましいと考えられる。セグメントをベクターに挿入するためには、2つのセグメントを連結する組換え反応がセグメントと目的ベクターとの組換え反応の前または後のいずれで起こるかは、本発明の実施にとって特に重要ではない。
【０３９６】
本発明によれば、2つの出発核酸セグメントの両方が単一の分子として連結された核酸分子を作製するために、3つの組換え反応のすべて（すなわち、セグメントAと目的ベクターとの反応、セグメントBと目的ベクターとの反応、およびセグメントAとセグメントBとの反応）を起こさせることができる。いくつかの態様において、組換え部位は、ベクター中への挿入後に、連結されたセグメントを挟み込んだ組換え部位が反応性部位の対を形成し、連結されたセグメントを適した組換えタンパク質を用いた隣接部位の反応によってベクターから切り出しうるように選択される。他の態様において、セグメントAおよびBはそれぞれ一方の末端のみに組換え部位を有する。続いて、これらのセグメントの「遊離」端を、任意のさまざまな方法によって連結する。例えば、末端の一方または両方をトポイソメラーゼ分子と共有結合させ、続いてそれを2つのセグメントの連結に用いる。トポイソメラーゼを利用するクローニング方法は、例えば、インビトロゲン社2001年カタログ（インビトロゲン 2001 Catalog）、pp.6-12（インビトロゲン社、カールズバッド、CA）に記載されている。
【０３９７】
図19を参照すると、セグメントB上のL2部位が、セグメントBに対して逆向きのL1部位（すなわち、組換え部位がセグメントに隣接していないことを示すボックスの長い部分）によって置換され、ベクター中のR2部位が逆向きのR1部位によって置換されれば、組換え反応によってベクター中にattP1部位が生じると考えられる。続いて、attP1部位は連結されたセグメントの他の末端上のattB1部位と反応しうると考えられる。このように、連結されたセグメントを、BP反応のために適した組換えタンパク質を用いて切り出すことができる。
【０３９８】
本発明のこの態様は、コンビナトリアルライブラリーの構築に特に適している。いくつかの態様において、図19中の核酸セグメントのそれぞれはライブラリーを表し、そのそれぞれはスクリーニングしようとする既知または未知の核酸配列を有しうる。いくつかの態様において、セグメントの1つまたは複数は、所定のペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質のアミノ酸配列の1つまたは複数の置換物をコードする配列を有しうる。いくつかの態様において、各セグメントは、タンパク質ドメイン、またはタンパク質ドメインの配列のさまざまな置換物を表すライブラリーをコードする配列を有しうる。例えば、1つのセグメントが抗体軽鎖の変異型の可変ドメインのライブラリーを表し、他方のセグメントが変異型の抗体重鎖のライブラリーを表してもよい。このため、組換えにより、配列の特有の組み合わせ（したがって、特有の結合特異性）をそれぞれが含む可能性のある分子（例えば、抗体、一本鎖抗原結合タンパク質など）の集団が生じると考えられる。
【０３９９】
他の態様において、セグメントの一方が単一の核酸配列であり、他方がライブラリーであってもよい。組換えの結果、そのすべてが共通の1つの部分を有し、他の部分はさまざまな配列の集団が生じると考えられる。このタイプの態様は、融合構築物のライブラリーの作製に有用と考えられる。例えば、DNA-Aは発現を導くための調節配列（すなわち、プロモーター）および精製用タグをコードする配列を含みうる。適した精製用タグには、グルタチオンS-トランスフェラーゼ（GST）、マルトース結合タンパク質（MBP）、エピトープ、エピトープ、ハプテン、ヒスチジン6（HIS6）などの規定されたアミノ酸配列が非制限的に含まれる。DNA-Bは目的のタンパク質の変異型のライブラリーを含みうる。その結果生じた構築物を、酵素活性またはリガンド結合などの所望の特性に関してアッセイすることができる。
【０４００】
または、DNA-Bが、結果的に生じる融合分子の共通部分を含んでもよい。いくつかの態様において、上記の方法は、プロモーター領域または転写終結シグナルと構造遺伝子のそれぞれ5'末端または3'末端との融合を促し、例えば、組織特異的プロモーターを構造遺伝子に付加することにより、さまざまな細胞環境における発現用に設計された発現カセットを作製するために用いうる。
【０４０１】
いくつかの態様において、セグメントの1つまたは複数がランダムペプチドライブラリーの構成要素をコードする配列であってもよい。このアプローチは、例えば、特定の望ましい特性を備えた分子の集団を作製するために用いうると考えられる。例えば、1つのセグメントがDNA結合ドメインをコードする配列を含み、他方のセグメントがランダムタンパク質ライブラリーを表すことが考えられる。その結果生じた集団を、目的の標的遺伝子の発現を修飾する能力に関してスクリーニングすることができる。他の態様においては、両方のセグメントがランダムタンパク質ライブラリーの構成要素をコードする配列であり、その結果生じた合成タンパク質（例えば、融合タンパク質）を、例えば、特異的リガンドもしくは受容体との結合または何らかの酵素活性を有するといった任意の望ましい特性に関してアッセイしうると思われる。
【０４０２】
以上に示したように、ドメインと呼ばれるタンパク質の領域は一般に、タンパク質にさまざまな機能的活性を付与する。タンパク質に活性を付与するドメインは、当技術分野で非常に多く知られている（例えば、SH2ドメイン、ジンクフィンガードメイン、NADPH結合ドメイン、アポトーシス誘導ドメイン、elF4A結合ドメイン、IGF結合ドメイン、DNA結合ドメイン、UBXドメイン、透明帯ドメイン、p53コアドメイン、Srcホモロジー2ドメインなど）。本発明の方法は、このようなドメインをコードする変異誘発を受けた核酸分子の作製およびスクリーニングを行って、特定の性質、特徴または活性を有するポリペプチドをコードするものを同定するために用いうる。
【０４０３】
核酸セグメントがアミノ酸配列をコードする必要はない。例えば、セグメントの両方が、タンパク質には翻訳されないRNA分子の転写を導いてもよい。これはtRNA分子、リボザイムおよびアンチセンス分子の構築のために有用と思われる。または、一方のセグメントが非翻訳RNA分子の転写を導き、他方がタンパク質をコードしてもよい。例えば、DNA-Aがタンパク質発現を増強させる非翻訳リーダー配列、例えば脳心筋炎ウイルスリーダー配列（EMCリーダー）などの転写を導き、DNA-Bが目的のペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質をコードしてもよい。いくつかの態様において、リーダー配列を含むセグメントは、アミノ酸配列をコードする配列をさらに含んでもよい。例えば、DNA-AがEMCリーダー配列および精製タグに対応する核酸配列を有し、DNA-Bが目的のペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質をコードする核酸配列を有してもよい。
【０４０４】
以上の工程は、一本鎖抗原結合タンパク質のコンビナトリアルライブラリーの調製に特に有用である。一本鎖抗原結合タンパク質の調製のための方法は当技術分野で公知である（例えば、PCT国際公開公報第94/07921号を参照のこと。その全開示内容は参照として本明細書に組み入れられる）。DNA-Aが例えば、抗体軽鎖の可変ドメインの変異型をコードし、DNA-Bが例えば、抗体軽鎖の可変ドメインの変異型をコードすることが可能である。さらに、DNA-AとDNA-Bとの間の介在核酸は、軽鎖および重鎖を連結するためのペプチドリンカーをコードしうる。続いて、特定の抗原と結合する分子を産生するものを同定するために、一本鎖抗原結合タンパク質を発現する細胞をスクリーニングすることができる。
【０４０５】
以上のもののさまざまな変法が可能である。例えば、以上に例示した構築物を用いる代わりに、図19に示したものに類似した構築物を、組換え部位に埋め込まれたリンカーペプチドコード領域とともに用いうると考えられる。これは以上に考察した組換え部位に埋め込まれた機能の一例であり、これは本発明の範囲に含まれる。
【０４０６】
もう1つの例として、それぞれが2つの抗体軽鎖または2つの抗体重鎖から構成される一本鎖抗原結合タンパク質を作製することもできる。これらの一本鎖抗原結合タンパク質は会合して多価抗原結合複合体を形成するように設計しうる。図19に示された構築物を再び例示のために用いると、DNA-AおよびDNA-Bはそれぞれ、例えば、抗体軽鎖の可変ドメインの変異型をコードしうる。類似のベクター中の同じ部位、または4つの核酸挿入物の挿入用に設計されたクター中の別の部位で、DNA-AおよびDNA-Bはそれぞれ、例えば、抗体重鎖の可変ドメインの可変型をコードしうると考えられる。続いて、例えば、特定の抗原に対する特異性を有する多価抗原結合複合体を産生するものを同定するために、両方の一本鎖抗原結合タンパク質を発現する細胞をスクリーニングすることができる。
【０４０７】
したがって、本発明の方法は、例えば、特定のエピトープに対する特異性を有する抗原結合タンパク質（例えば、抗体、および/または重鎖可変ドメインもしくは軽鎖可変ドメインを含む抗体断片もしくは抗体断片複合体）を産生する細胞を同定する目的で、コンビナトリアルライブラリーを調製およびスクリーニングするために用いることができる。また、本発明の方法は、抗原結合タンパク質を調製するための方法、および本発明の方法によって調製された抗原結合タンパク質。
【０４０８】
さらに、1つまたは複数の抗原に対する高い親和性を示す抗原結合タンパク質をコードする核酸分子を調製および同定するために、反復アプローチを行ってもよい。例えば、特定の抗原に対する親和性を示す抗原結合タンパク質をコードする核酸分子を同定するために、コンビナトリアルライブラリーをスクリーニングする。さらに、特定の抗原に対する親和性を有する抗原結合タンパク質の1つの成分を形成する軽鎖可変ドメインまたは重鎖可変ドメインをコードする核酸がひとたびされれば、抗原に対する親和性の増大を示す抗原結合タンパク質を入手するために任意の回数の工程を行いうる。例えば、以下の核酸によってコードされる抗原結合タンパク質を、親和性の増大したタンパク質をコードするものを同定するためにスクリーニングすることができる：
1．1つのドメイン（すなわち、軽鎖可変ドメインまたは重鎖可変ドメイン）をコードする核酸が変化せずに保たれ、他のドメインをコードする核酸が1回または複数回の変異誘発を受けるもの。
2．1つのドメイン（すなわち、軽鎖可変または重鎖可変ドメイン）をコードする核酸が変化せずに保たれ、可変ドメインをコードするライブラリーの核酸分子が不変ドメインをコードする核酸と組み合わされるもの。
3．両方のドメインをコードする核酸が変異誘発を受けるもの。
【０４０９】
以上の工程によって生じた核酸分子から調製された抗原結合タンパク質を、続いて、所望の性質、特徴または活性（例えば、特定の抗原に対する結合親和性）を有するタンパク質を同定するためにスクリーニングすることができる。さらに、所望の性質、特徴または活性を有する抗原結合タンパク質を作製するために複数回の選択（例えば、変異誘発の後にスクリーニングを行う）を用いてもよい。
【０４１０】
本発明のさらなる変法を例示するために図19を用いると、この図に示された組換え部位を形成する1つまたは複数の核酸セグメントを除去し、他の性質、特徴または活性を分子に付与する核酸を含めてもよい。例えば、図19中に「L3」および「R3」と記されたDNA-AおよびDNA-B上の領域の一方または両方を、相互の組換えは行わないが依然として2つのセグメントの連結は許容する核酸によって置換することができる。このような核酸の例には、（1）トポイソメラーゼを介したクローニングを許容する核酸、（2）互いにアニーリングする「付着末端」、（3）「付着末端」を作製するために用いうる制限エンドヌクレアーゼ認識部位、および（4）相同組換えに関与しうる核酸、が含まれる。したがって、本発明は、特定の部位での組換えを含み、他の部位での組換え以外の手段による核酸セグメントの連結を含む、複数の核酸分子のクローニングのための方法を含む。
【０４１１】
さらに、図19に示された表現の延長として、任意のさまざまな核酸セグメントを本発明の方法によって連結すること、標的分子に挿入すること、および/または、続いてさらなる標的分子に移行させることもできる。さらに、上記の通り、複数の核酸分子を互いに連結する場合に、これらの分子のすべてが組換えによって互いに連結される必要はない。例えば、3つの核酸セグメントを5'から3'の向きに以下の通りに連結するとする：1-2-3。セグメント1は5'末端および3'末端の両方に組換え部位を有しうる。さらに、5'組換え部位は標的核酸分子の第1の組換え部位と組換えを行え、3'組換え部位はセグメント2の5'末端の組換え部位と組換えを行える。セグメント2は5'末端に第1の組換え部位を有し、第2の組換え部位は内部にある。この5'組換え部位はセグメント1の3'組換え部位と組換えを行える。セグメント3は、標的核酸分子の第2の組換え部位と組換えを行える3'組換え部位を有する。すると、組換えにより、セグメント1、2および3は標的核酸分子に挿入される。さらに、セグメント2および3を連結などの工程を用いて連結してもよい。
【０４１２】
実施例2：融合タンパク質を作製するためのサプレッサーtRNAの使用
上記の組換えクローニング法により、組換え部位によって挟まれた核酸（例えば、cDNAライブラリーの構成要素）の、1つのベクターから1つまたは複数の他のベクターへの迅速な移動が可能になる。この組換えイベントは部位特異的であるため、核酸の向きおよびリーディングフレームをベクターに対して制御することができる。この制御のために、核酸挿入物上に存在する配列とベクター上に存在する配列との間の融合物の構築は容易である。
【０４１３】
また、部位特異性により、複数の核酸セグメントを連結して連続した核酸分子を形成し、その後に、このような連続した分子をベクターに挿入すること、ならびにこのような連続した分子をベクター間で移行させることも可能になる。
【０４１４】
一般論として、核酸は4つの形態として発現されうる：アミノ末端およびカルボキシ末端の両方が天然型のもの、いずれか一端が改変されたもの、または両端が改変されたものである。移行させる核酸分子（例えば、cDNAライブラリーの構成要素）を含む構築物は、オープンリーディングフレームまたはORFのN末端にメチオニンATGコドン、カルボキシ末端に終止コドンを含みうる（すなわち、ATG-ORF-stop）。しばしば、発現可能な核酸構築物は翻訳開始配列tisを含むと考えられ、これは遺伝子の発現を可能にするATGの上流に位置しうる（すなわち、tis-ATG-ORF-stop）。この種の構築物により、天然のクローニングされていないタンパク質と同じアミノ酸をアミノ端およびカルボキシ端に含むタンパク質をコードする核酸の発現が可能になる。このような構築物をアミノ末端タグ、例えばOSTとインフレームに融合させると、タグはそれ自体のtisを有すると考えられるため、tis-ATG-セグメント-tis-ATG-ORF-stopとなり、ORFのtisを含む塩基はタグとORFとの間でアミノ酸に翻訳されると考えられる。さらに、mRNAの内部にもある程度のレベルの翻訳開始が予想されるため（すなわち、ORFのATGの箇所で、しかしタグのATGではない）、ある程度の量の天然タンパク質の発現が所望のタンパク質に混入することとなる。
DNA（小文字）：tis1-atg-tag-tis2-atg-orf-stop
RNA（小文字、イタリック体）：tis1-atg-tag-tis2-atg-orf-stop
タンパク質（大文字）：ATG-TAG-TIS2-ATG-ORF（tis1およびstopは翻訳されない）＋混入ATG-ORF（ORFの翻訳がtis2で開始）。
【０４１５】
組換えクローニングを用いると、当業者が、目的のORFのC末端および/またはN末端への核酸のインフレーム融合を可能にする組換え部位に隣接してタグをコードする核酸を含むベクターを構築することは容易である。
【０４１６】
多数のクローンをさまざまなベクター中に迅速に作製することができたとして、当技術分野には、構築物自体を操作する必要なしに、単一のクローニングされた核酸が発現されうる様式の数をできるだけ増やしたいという需要がある。本発明は、終止コドンでの翻訳の終結を抑制するための1つまたは複数のサプレッサーtRNAを用いた、核酸挿入物の発現産物に対するC末端および/またはN末端融合物の制御下発現のための材料および方法を提供することにより、この需要を満たす。したがって、本発明は、核酸分子が組換え部位に挟まれて調製される材料および方法を提供する。
【０４１７】
構築物は、終止コドン（これは選択的には目的のタンパク質をコードする核酸のC末端にある）をコードする配列とともに調製される。いくつかの態様において、終止コドンは遺伝子と近接して、例えば、発現可能な核酸に隣接した組換え部位の内部に位置しうる。核酸挿入物は組換えにより、さまざまなC末端またはN末端タグ（例えば、GFP、GST、His Tag、GUSなど）を最終発現産物に付与しうるさまざまなベクターへと移行されうる。終止コドンが発現産物のカルボキシ末端に位置する場合、非抑制条件（すなわち、サプレッサーtRNAが発現されない）下では、「天然」のカルボキシ末端アミノ酸配列を有する産物の発現が起こり、一方、抑制条件下ではカルボキシ融合タンパク質を有する産物の発現が起こる。本発明は、UAG終止コドンを認識するように変異した特殊なチロシンtRNA遺伝子（tyrT）であるアンバーサプレッサーsupFを用いて例証されている。他のサプレッサーおよび他の終止コドンも本発明の実施に用いうることを当業者は認識すると考えられる。また、当業者は、サプレッサーtRNA分子を適切なアミノ酸残基によって荷電させることが必要な場合があることも認識すると考えられる。これは、アミノアシル-tRNAシンテターゼの活性を調節することによってインビボで行いうる。
【０４１８】
本実施例において、抑制性tRNAをコードする遺伝子は、核酸挿入物を発現させるためのベクター中に組み込まれている。他の態様において、サプレッサーtRNAの遺伝子は、宿主細胞のゲノム中にあってもよい。さらに他の態様において、サプレッサーの遺伝子は別個のベクター上にあってトランス的に提供されてもよい。このタイプの態様において、サプレッサー遺伝子を含むベクターは、発現可能な核酸を含むベクターと適合するように選択された複製起点を含んでもよい。この種の適合性ベクターの選択および調製は当業者の技能の範囲内にある。当業者は、サプレッサーtRNAをトランス的に提供するために適切なベクターの選択には適切な抗生物質耐性マーカーの選択が含まれうることを理解していると考えられる。例えば、核酸挿入物の発現産物を発現するベクターが1つの抗生物質に対する抗生物質耐性マーカーを含む場合には、サプレッサーtRNAを提供するために用いられるベクターは第2の抗生物質に対する耐性をコードしてもよい。これにより、両方のベクターを含む宿主細胞の選択が可能になる。
【０４１９】
いくつかの態様においては、サプレッサーtRNAの複数のコピーが、上記の態様のすべてにおいて提供されうる。例えば、サプレッサーtRNAをコードする遺伝子の複数のコピーを含む宿主細胞が提供されうる。または、同じまたは異なるプロモーターの下にあるサプレッサーtRNAコード配列の複数のコピーを、核酸挿入物と同じベクター中に提供してもよい。いくつかの態様において、サプレッサーtRNAの複数のコピーは、核酸挿入物を含めるために用いるものとは異なるベクター中に提供される。他の態様においては、サプレッサーtRNA遺伝子1つまたは複数のコピーを、目的のタンパク質をコードする核酸を含むベクター上、および/または別のベクター上、および/または宿主細胞のゲノム中、または以上の組み合わせとして提供してもよい。サプレッサーtRNA遺伝子の複数のコピーが提供される場合、遺伝子は同じプロモーターから発現させても異なるプロモーターから発現させてもよく、それは目的のタンパク質をコードする核酸を発現させるために用いられるプロモーターと同じでも異なってもよい。
【０４２０】
いくつかの態様においては、2つまたはそれ以上の異なるサプレッサーtRNA遺伝子が提供されうる。このタイプの態様においては、個々のサプレッサーの1つまたは複数を複数のコピーとして提供してよく、特定のサプレッサーtRNA遺伝子のコピーの数は別のサプレッサーtRNA遺伝子のコピー数と同じでも異なってもよい。それぞれのサプレッサーtRNA遺伝子は、任意の他のサプレッサーtRNA遺伝子とは独立して、目的の核酸を発現させるために用いるベクター上、および/または異なるベクター上、および/または宿主細胞のゲノム中に提供されうる。いくつかの態様においては、所定のtRNA遺伝子を複数の場所に提供してもよい。例えば、サプレッサーtRNAの1つのコピーを目的の核酸を含むベクター上に提供し、1つまたは複数のさらなるコピーをさらなるベクター上および/または宿主細胞のゲノム中に提供してもよい。サプレッサーtRNA遺伝子の複数のコピーが提供される場合、遺伝子は同じプロモーターから発現させても異なるプロモーターから発現させてもよく、それは目的のタンパク質をコードする核酸を発現させるために用いられるプロモーターと同じでも異なってもよく、異なるtRNA遺伝子を発現させるために用いられるプロモーターと同じでも異なってもよい。
【０４２１】
図20A〜20Bを参照すると、GUS遺伝子がTAGコドンによって隔てられてGST遺伝子とインフレーム様式でクローニングされている。このプラスミドは、サプレッサーtRNAを発現するsupF遺伝子も含む。プラスミドは宿主細胞に導入され、GUS遺伝子の約60％がGSTタグを含む融合タンパク質として発現された。対照実験において、supF遺伝子を含まないベクターから発現させた場合、同じGUS-終止コドン-GST構築物を含むプラスミドは検出可能な量の融合タンパク質を発現しなかった。この例において、supF遺伝子はGUS-GST融合物を含むmRNAの一部として発現された。tRNAは一般により長いRNA分子からプロセシングされるため、この種の構築物は本発明のサプレッサーtRNAを発現させるために用いうる。他の態様において、tRNA配列を含むRNAを、目的の遺伝子を含むmRNAと別個に発現させることもできる。
【０４２２】
本発明のいくつかの態様において、核酸挿入物、およびサプレッサーtRNAを発現する遺伝子を、同じプロモーターによって制御してもよい。他の態様において、核酸挿入物をサプレッサーtRNAとは異なるプロモーターによって発現させることもできる。当業者は、特定の状況においては、サプレッサーtRNAおよび/または核酸挿入物の発現を、調節可能なプロモーターを用いて制御することが望ましいことを理解すると考えられる。例えば、核酸挿入物および/またはサプレッサーtRNAを発現する遺伝子を、lacプロモーターまたはその誘導体、例えばtacプロモーターなどのプロモーターによって制御することができる。示した態様において、核酸挿入物およびサプレッサーtRNA遺伝子はいずれもT7 RNAポリメラーゼプロモーターから発現される。T7 RNAポリメラーゼの誘導により、目的の発現可能な核酸（この場合にはGUS）およびサプレッサーtRNAを発現するsupF遺伝子の両方の、1つのRNA分子の部分としての発現が誘発される。
【０４２３】
いくつかの態様においては、サプレッサーtRNA遺伝子の発現が、目的の発現可能な核酸のものとは異なるプロモーターの制御下にあってもよい。いくつかの態様においては、核酸挿入物の発現の前にサプレッサー遺伝子を発現させることも可能と思われる。これにより、サプレッサーのレベルを、終止コドンの抑制による融合タンパク質の発現を可能にするためにそれが必要とされる前に、高レベルに高めることが可能になると考えられる。例えば、IPTGで誘導されるプロモーターによってサプレッサー遺伝子が制御される本発明の態様においては、核酸挿入物はT7 RNAポリメラーゼプロモーターによって制御され、T7 RNAポリメラーゼの発現はIPTG以外の誘導シグナル、例えばNaClによって誘導されるプロモーターによって制御され、これはT7 RNAポリメラーゼ遺伝子の誘導およびそれに続く目的の発現可能な核酸の発現の前に、IPTGによるサプレッサーtRNA遺伝子の発現を誘発することが可能と思われる。いくつかの態様において、サプレッサーtRNAの発現は、T7 RNAポリメラーゼ遺伝子の誘導の約15分間〜約1時間前に誘導されると考えられる。1つの態様において、サプレッサーtRNAの発現は、T7 RNAポリメラーゼ遺伝子の誘導の約15分間〜約30分前に誘導されると考えられる。示した具体的な例において、T7 RNAポリメラーゼ遺伝子の発現は、塩誘導性プロモーターの制御下にある。塩誘導性プロモーターの制御下にあるT7 RNAポリメラーゼ遺伝子の誘導性コピーを有する細胞系は、インビトロゲン社、カールズバッド、CAから、BL21SI株の名称で販売されている。
【０４２４】
いくつかの態様においては、核酸挿入物およびサプレッサーtRNAの発現を、フィードバックループの形式に設計することができる。例えば、核酸挿入物をT7 RNAポリメラーゼプロモーターの制御下に置き、サプレッサー遺伝子をT7プロモーターおよびlacプロモーターの両方の制御下に置き、T7 RNAポリメラーゼ遺伝子自体はT7プロモーターおよびlacプロモーターの両方によって転写させ、T7 RNAポリメラーゼ遺伝子も通常のチロシン終止コドン、例えば28番目のコドン（883中）の代わりにアンバー終止変異コドンを持たせることができる。サプレッサーのレベルが明らかな抑制が得られる程度に十分に高くなるまでは、活性のあるT7 RNAポリメラーゼは生じない。その後、T7ポリメラーゼがサプレッサー遺伝子ならびに自らを発現するために、ポリメラーゼの発現が急速に増大する。他の態様においては、サプレッサー遺伝子のみがT7 RNAポリメラーゼプロモーターから発現される。このタイプの態様では、過剰な量のT7 RNAポリメラーゼを産生させることなく、高レベルのサプレッサーが得られると考えられる。他の態様において、T7 RNAポリメラーゼ遺伝子は複数のアンバー終止変異を有する（例えば、図20B参照）。この場合は、活性のあるT7 RNAポリメラーゼが産生されるまでに、より高いレベルのサプレッサーが必要と考えられる。
【０４２５】
本発明のいくつかの態様においては、複数のサプレッサーtRNAによって抑制される複数の終止コドンがあることが望ましいと思われる。図21を参照すると、目的のタンパク質のN末端および/またはC末端融合物の同じ構築物からの調節性発現を可能にするためのベクターを構築することができる。第1のタグ配列（図21中のタグ1）は図中に矢印で示されたプロモーターによって発現される。タグ配列は、タグと同じリーディングフレーム内に終止コドンを含む。終止コドン1はタグ配列中の任意の箇所に位置してよく、タグ配列のC末端またはその付近に位置してもよい。また、終止コドンは組換え部位RS１または内部リボソーム進入配列（IRES）の内部に位置してもよい。構築物は、終止コドン2を含む目的の発現可能な核酸（GENE）も含む。第1のタグおよび核酸挿入物は同じリーディングフレーム内にあってよいが、第1のタグのフレームシフトを引き起こして目的の発現可能な核酸と同じリーディングフレームにする配列を含めることも本発明の範囲に含まれる。終止コドン2は目的の発現可能な核酸と同じリーディングフレームにあり、遺伝子のコード配列の末端またはその付近に位置しうる。選択的には、終止コドン2は組換え部位RS２の内部に位置しうる。構築物は、目的の発現可能な核酸と同じリーディングフレーム内にある第2のタグ配列（これは図21中にTAG2として示されている）も含み、選択的には、第2のタグ配列は第2のタグと同じリーディングフレーム内に終止コドン3を含む。構築物の第2のタグのコード配列の後に転写終結暗号を含めてもよい（図21には示されていない）。終止コドン1、2および3は同じでも異なってもよい。いくつかの態様において、終止コドン1、2および3は異なる。1および2が異なる態様においては、適切なサプレッサーtRNAの発現を変化させることにより、同じ構築物を用いてN末端融合物、C末端融合物および天然タンパク質を発現させることができる。例えば、天然タンパク質を発現させるためには、サプレッサーtRNAを全く発現させず、タンパク質の翻訳をIRESによって制御する。N末端融合物が望まれる場合には終止コドン1を抑制するサプレッサーtRNAを発現させ、C末端融合物を産生させるためには終止コドン2を抑制するサプレッサーtRNAを発現させる。場合によっては、二重タグ標識がなされた目的のタンパク質を発現させることが望ましいと思われ、この場合には終止コドン1および終止コドン2の両方を抑制するサプレッサーtRNAを発現させるとよい。
【０４２６】
実施例3：既知の標的タンパク質と相互作用するタンパク質の同定
DP1タンパク質はE2Fファミリーの補助転写因子と相互作用することが知られており、後者の構成要素は数多く知られている（例えば、HarbourおよびDean、Nat. Cell. Biol. 2：E65 (2000)；MullerおよびHelm、Biochim. Biophys. Acta 14：1470 (2000)；Ohtani K, Front. Biosci. 1：4 (1999)を参照されたい）。pDBLeu（酵母ツーハイブリッドベクター）の誘導体であるベクターpMAB32は、完全長ヒトDP1のコード領域がDP1のN末端でGAL4 DNA結合ドメイン（Gal4 DB）と融合されたものをコードするDNAを含む。
【０４２７】
マウス脳RNAに由来するcDNAライブラリーをベクターpMAB58中に構築した。。このベクターRC適合性のある大腸菌/酵母ツーハイブリッドシャトルベクターであり、GAL4の活性化ドメイン（Gal4 AD）を含む。その結果生じるライブラリーではcDNA集団の5'末端にGal4 ADが融合され、cDNAがattB部位によって挟まれる（attB1およびattB2：Gal4 ADattB1-cDNA-attB2）。このライブラリーはランダムな5'末端を含むため、Gal4 AD融合物に対する正しいリーディングフレームにあるのはライブラリーの1/3に過ぎないことに留意されたい。attB1部位はAD融合ドメインおよびattB1部位が同じリーディングフレーム内にあるように配置される。
【０４２８】
酵母株MaV203は、ツーハイブリッド分析に用いるための3つのGAL4反応性レポーター遺伝子を含む。第1の選択では、GAL4 AD領域と融合されたcDNAの集団を、ヒトDP1タンパク質とGAL4 DBとの融合物に対してスクリーニングする。合計約1.5×10６個の形質転換体を分析し、そのうち約106個のコロニーがHIS3レポーター遺伝子を誘導することが見いだされた。これらのコロニーは、DP1と相互作用するタンパク質をコードすると推定される部分集団である。PCR分析により、これらの相互作用体候補の少なくとも一部はE2F因子であり、このため確かな相互作用タンパク質であることが示された。これらの予備的な結果に基づき、E2F1、E2F4およびE2F5の候補である部分集団を酵母から単離し、大腸菌に導入した。初回選択は相互作用タンパク質（活性化ドメイン-cDNAタンパク質融合物として）を同定するために開発されたため、その結果得られるサブセットはcDNAGal4 ADとインフレームにあるcDNAを含むことに注意されたい。従って、このcDNAもattB1とインフレームにあると予想される。
【０４２９】
第2の選択をこの部分集団に対して行い、HIS6融合タグまたはOST融合タグと融合させた場合にも大腸菌においてタンパク質を発現しうるものを同定するために、DP1と相互作用するクローンをさらに選択した。このために、以上のように選択したDNAを大腸菌から単離し、適切なattPベクター（pDONR201）およびBPクロナーゼ（商標）とともにインビトロでインキュベートした。一晩インキュベートした後に、T7 RNAポリメラーゼプロモーターおよびN末端HIS6タグまたはN末端GST-融合タグをコードする目的ベクター（attR）DNAおよびLRクロナーゼ（商標）を添加した。その結果得られたクローンは、DP1と相互作用するタンパク質をコードするDNAセグメントを、今回は大腸菌株BL21SI内にあるHis6融合ベクター中にある形で含んでおり、これは塩誘導性プロモーターの制御下にあるT7 RNAポリメラーゼをコードしていた。
【０４３０】
各反応による2つのランダムなコロニーを液体培地中で増殖させた後に、NaClの添加によってタンパク質を発現するように誘導させた。一定の発現期間の後に、細胞を可溶化し、誘導されたタンパク質に対応するクーマシー染色タンパク質バンドの同定のために試料をSDS-ポリアクリルアミドゲルにかけた。E2F1およびE2F4のGST融合物およびHIS融合物の両方に関して、誘導された試料中に新規バンドが観察された（しかし、誘導していない試料では観察されなかった）。DNA配列解析により、これらのタンパク質をコードするcDNAの5'末端はattB1およびADとの適切なリーディングフレーム内にあることが判明した。これらの融合タンパク質の予想分子量は、タンパク質ゲル状の誘導バンドと一致していた。対照的に、検討したEF5クローンのGST融合物およびHIS融合物に関してはタンパク質発現は観察されなかった。これらのクローンのDNA配列解析により、E2F1およびE2F4クローンと同様に、E2F5クローンは発現を許容する予想されたリーディングフレーム内にあることが示された。アッセイしたE2F5の別の独立したクローンについても同様の結果が観察された。このように、DP1と相互作用するタンパク質に関する選択によって代表物E2F1、E2F4およびE2F5が得られ、第2の選択（GST融合物またはHIS融合物としての大腸菌内でのタンパク質発現）を課すことによってサブセットE2F1およびE2F5が得られた。
【０４３１】
実施例4：ハイブリダイゼーションによるインビトロ選択
ベクターpCMVSPORT6.0（図34A〜34D）は、マルチクローニング部位を挟み込んだattB1部位およびattB2部位を含む。このベクター中に構築した複雑度の高い（個員（individual）が10６種を上回る）cDNAライブラリーを、7回膜貫通型ヘリックスタンパク質をコードする構成要素の候補を同定するために用いる。まず、この種のタンパク質において高度に保存されているドメインに対応する縮重オリゴヌクレオチドを設計する。代表的なタンパク質はヒトβ-2アドレナリン受容体に類似すると思われる（例えば、GenBankアクセッション番号M15169を参照）。このオリゴヌクレオチドとの液体ハイブリダイゼーションを以前に記載された方法に従って行い（例えば、米国特許第5,759,778号を参照）、プローブとハイブリダイズするcDNAを単離して、二本鎖とした上で形質転換によって大腸菌に導入する。その結果得られたクローンをプールし、培養して、DNAを調製する。この結果得られた混合物は、確かな7回膜貫通型ヘリックスタンパク質をコードする可能性のある、元のライブラリーの部分集団である。この混合物はさらに、7回膜貫通型ヘリックスタンパク質ではないがプローブに対してDNA配列の相同性を有する他のタンパク質、および偽陽性のものを含む。この集団からプラスミドDNAを調製し、緩衝液およびBPクロナーゼ（商標）の存在下で、attP部位を含むベクター（例えば、pDONR201、インビトロゲン社、カールズバッド、CA, カタログ番号11798-014）と反応させて、エントリークローンの集団を作製する（これは大腸菌内に回収することができる）。
【０４３２】
または、このインビトロ混合物の試料を、緩衝液およびLRクロナーゼ（商標）の存在下で目的ベクター（attR部位を含む）と直接反応させ、緑色蛍光タンパク質（GFP）とのN末端融合物をコードするベクター中にcDNAを有する発現クローン（attB部位を含む）を作製することもできる。引き続いて、この集団を形質転換によって大腸菌に導入し、その結果生じた形質転換体のプールからDNAを調製して、哺乳動物細胞に導入する。その結果生じたトランスフェクト細胞を、GFPが膜に局在するクローンに関して調べる。この選択により、縮重オリゴヌクレオチドプローブとのハイブリダイゼーションによって単離され、さらにGFPと機能的なN末端融合物を生じ（すなわち、OFPおよびattB1との適切なリーディングフレーム内にある）、細胞膜に局在化された、cDNAライブラリーに由来する個員が同定される。この集団からの個員をDNA配列決定によって分析することが可能である（直接的に、または組換えクローニングを介したより望ましいベクター中への移行後に）。または、所望の性質、特徴または活性を有するクローンにさらに選択を行うこともできる：GFP-cDNA融合物が膜に局在している細胞の部分集団からDNAを回収し、大腸菌に導入する。その結果得られた形質転換体のプールからのDNAを、マウスのインビボ感染を行って、7回膜貫通型受容体タンパク質と推定されるものの欠陥を補完する、または目的の表現型を付与するクローンを選択するために、アデノウイルスを基盤とするベクター中に移行させる（これは、エントリークローンのプールをまず単離した後にBPクロナーゼ（商標）反応でpDONR201（インビトロゲン社、カールズバッド、CA, カタログ番号11798-014）と反応させることによって、またはこの反応物の一部を緩衝液、アデノウイルス-目的ベクターおよびLRクロナーゼ（商標）の混合物に直接移す単一反応によって行える）。その結果得られたマウスからDNAを単離して大腸菌内に回収する、または、PCRおよびベクター配列由来のcDNAを挟み込むことがわかっているプライマーを用いてcDNA挿入物を増幅する。その結果得られたPCR産物はattB1部位およびattB2部位によって挟まれるため、このPCR産物をpDONR201およびBPクロナーゼ（商標）を用いてクローニングし、さらに選択に用いること、または特徴分析を直接行うことができる。
【０４３３】
実施例5：PCRにより作製されたライブラリーのスクリーニング
400種の遺伝子の集成物を、PCRならびにattB1（5'オリゴ）およびattB2（3'オリゴ）を含むオリゴヌクレオチドを用いて増幅する。オープンリーディングフレームは翻訳開始シグナルATGから翻訳終止コドンまでにわたり、その野生型終止コドンはアミノ酸を挿入するために改変され、そのためにC末端タンパク質融合が可能である。その結果得られたPCR産物を、BPクロナーゼ（商標）による組換えクローニングを用いてpDONR201中に移行させ、大腸菌内にあるエントリークローンの集成物を作製する。その結果得られたエントリークローンを、それぞれ約50種のエントリークローンを含む8つのプールにまとめ、それらのプールからDNAを調製する。
【０４３４】
各プールを、組換えクローニング（LRクロナーゼ（商標）を含む反応による）を用いて、大腸菌に用いられるccdB対抗選択マーカーが哺乳動物細胞における直接選択を可能にするマーカー（例えば、単純ヘルペスチミジンキナーゼ）に置換されたレトロウイルス目的ベクター中に移行させる。このインビトロ反応混合物をパッケージング細胞系にトランスフェクトし、感染性ウイルス（エントリークローンに由来するcDNAの集団を含む）を用いて、特定の転写因子の活性化に誘導に応答してレポーター遺伝子を発現するように設計されたレシピエント細胞系を感染させる。その結果、レポーターを発現する細胞により、さまざまなシグナル伝達経路のいずれかを活性化する能力を有するcDNAが特定される。レポーター遺伝子の誘導に関して陽性シグナルを示す細胞をプールし、ゲノムDNAを調製した上で、レトロウイルスに収容されたcDNAを、レトロウイルス配列によるPCR増幅を用いて増幅する。その結果生じたPCR産物はcDNAに隣接したattB1およびattB2を含み、これらはBPクロナーゼ（商標）およびpDONR201（インビトロゲン社、カールズバッド、CA, カタログ番号11798-014）との反応で組換えクローニングを用いてクローニングされる。この混合物からのエントリークローンをプールすると、これは特定のシグナル伝達経路を活性化しうるタンパク質をコードする部分集団を表す。
【０４３５】
エントリークローンのこの集団を、LRクロナーゼ（商標）を用いて、T7 RNAポリメラーゼ応答性プロモーターを含む目的ベクターに移行させ、その結果得られた反応混合物を、T7 RNAポリメラーゼを含むインビトロ転写/翻訳反応物に添加する。この抽出物からの試料を、放射標識NTPの利用能および既知の基質をリン酸化する能力により、キナーゼ活性を有するタンパク質の存在に関してアッセイする。このようにして、この工程により、特定のシグナル伝達経路を誘導し、キナーゼ活性を有するORFのサブセットの選択がもたらされる。
【０４３６】
実施例6：ベクター間のライブラリーの移行
第I部：移行用のライブラリーの調製
pCMVSPORT6.0（図34A〜34D）中にクローニングしたヒト脳組織由来の発現クローンライブラリーDNAを、260nmでのO.D.値に基づいて25ng/μlに希釈した。続いて、50ng、100ngおよび200ngのDNAを含む試料（それぞれ2μl、4μlおよび8μl）のそれぞれを、ライブラリーDNAの質を確かめるために1％臭化エチジウム（EtBr）染色アガロースゲルに通した。ライブラリーのタイプに応じて、DNAは一般に5〜8kbの超らせん状スメアとして泳動し、約6kbが最も多かった。DNAの大半は超らせん状プラスミドの単量体として泳動し、組換えを生じていないベクターDNAはほとんどまたは全く含まれなかった。
【０４３７】
ライブラリーDNAの濃度がO.D.の読み取り値から算出したよりも低いと思われる場合には、元のライブラリー貯蔵物のアリコートに0.4倍容量の30％PEG 8000/1.8M NaCl溶液を添加し、十分に混合した上で13,000rpm、室温で15分間遠心することによってPEG沈殿を行った。続いてDNAを10mM Tris-HCl pH 7.5、1.0mM EDTA（TE）中に溶解し、その後にDNAを再びTBで、260nmでのO.D.値に基づいて25ng/μlに希釈した。希釈したDNAを上記の通りに再びEtBr染色アガロースゲルに通し、ライブラリーDNAの質を再び評価した。
【０４３８】
25ng/μlのライブラリーDNAの2つのアリコートをそれぞれ1/10および1/100に希釈して2.5ng/μlおよび0.25ng/μlにした。続いて、各チューブの1μl（25ng、2.5ngおよび0.25ngの全DNA）をエレクトロポレーションによりDH10B Electromax細胞に導入した。2mlのS.O.C.培地（インビトロゲン社、カールズバッド、CA, カタログ番号15544-034）を形質転換物のそれぞれに添加し、その後に混合物を37℃で1時間振盪した。続いて、DNAの総量をコロニー形成単位/ng（CFU/ng）に換算して決定するために、これらの希釈した形質転換物（25ngについては10-４および10-５、2.5ngについては10-３および10-４、0.25ngについては10-２および10-3）の100μlをampプレートに播いた。pUC DNAの形質転換効率10１０CFU/μgに基づくと、一般に約3×10６CFU/ngが存在した。ライブラリーDNAのコロニー生成量が正確でないと思われる場合には、ライブラリーDNAの濃度を約75×10６CFU/μlに調整した。
【０４３９】
第II部：単一チューブ反応
BP反応は以下の通りに設定した：
【０４４０】
【表３】
2004532636.tif 000010
【０４４１】
以上の反応混合物を含むチューブを25℃で一晩インキュベートした。続いて、3μlのプロテイナーゼ-K（2mg/ml）を各反応チューブに添加し、その後にチューブを十分に混合して、37℃で10分インキュベートした。続いて、反応チューブを75℃で10分間インキュベートすることによってプロテイナーゼKを熱失活させた。続いて5μlの各試料を1％Sybr Goldゲルに通し、その後に線状6.5kb副産物バンドが存在するか否かによってBP反応の効率を判定した。このゲルでは一般に線状12〜14kbのコインテグレート分子も同定された。さらに、ほとんどの場合にはライブラリーDNAのシフトがみられ、サイズが6〜8kbから4〜6kbに減少していた。
【０４４２】
続いて、エキソヌクレアーゼ処理のために以下の反応混合物を設定した：
【０４４３】
【表４】
2004532636.tif 000011
【０４４４】
反応チューブを42℃で30分間インキュベートした。その後、80℃で15分間インキュベートすることによってエキソヌクレアーゼ反応を停止させた。続いて、100μlのTEおよび600μlのエタノール/酢酸ナトリウムを添加し、13,000×rpm、室温で15分間遠心することによってDNAをエタノール沈殿させた。その結果得られたDNA沈殿物を30μlのTE中に溶解し、その1μlをElectromax DH10B細胞へのエレクトロポレーションに用いた。続いて2mlのS.O.C.培地を各形質転換物に添加し、37℃で1時間振盪した。反応5については、100μlの非希釈形質転換物をkanプレートに播き、100μlの10-３および10-４希釈物をampプレートに播いた。反応1、2、3および4については、100μlの10-３および10-４希釈物をkanプレートに播き、100μlの10-２および10-３希釈物をampプレートに播いた。
【０４４５】
2つのLR反応を、表5に示したように、エキソヌクレアーゼ処理によるBP反応1、2、3および4のために設定した。
【０４４６】
【表５】
2004532636.tif 000012
【０４４７】
以上の反応混合物を含むチューブを25℃で一晩インキュベートした。続いて、1μlのプロテイナーゼK溶液をクロナーゼ（商標）非添加反応物に添加し、3μlのプロテイナーゼK溶液をクロナーゼ（商標）添加反応物に添加した。続いてチューブを混合し、37℃で10分インキュベートした。続いて、反応混合物の各5μlを1％Sybr Goldゲルに通して、各反応の効率を評価した。各反応混合物の2μlをElectromax DH10B細胞のエレクトロポレーションに用いた。続いて細胞を2mlのS.O.C.培地中で37℃にて1時間浸透した。クロナーゼ（商標）非添加反応物については、100μlの10-３および10-４希釈物をkanプレートに播き、100μlの10-２および10-３希釈物をampプレートに播いた。クロナーゼ（商標）添加反応物については、100μlの10-２および10-３希釈物をkanプレートに播き、100μlの10-３および10-４希釈物をampプレートに播いた。選択的には、反応混合物中の核酸をエタノール沈殿させ、エレクトロポレーションの前に濃縮することが可能である。
【０４４８】
一晩インキュベートした後にコロニーを算定した。クロナーゼ（商標）非添加LR反応物におけるamp CFU（ampプレート上のコロニー数によって決定）を、クロナーゼ（商標）LR添加反応物におけるamp CFUと比較した。（1）新たな発現クローンと出発材料の発現クローンの数との比、および（2）挿入物の平均サイズを確認するために、クローンチェッカー分析およびコロニーPCRを行った。
【０４４９】
第III部：二段階/チューブ反応および代替的な単一チューブ反応
cDNAライブラリーのライブラリーを、Concert High Purity Plasmid Maxiprep System（インビトロゲン社 カールズバッド、CA, カタログ番号11451）を用いて大腸菌から精製した。0.8倍容量の15％PEG 8000/0.9M NaCl溶液を添加することにより、10μlのライブラリーDNAを沈殿させた。その結果得られた溶液を十分に混合し、微量遠心管に入れて13,000rpm、室温で15分間遠心した。上清を注意深く除去し、ペレット中のDNAを100μlのTE中に溶解した。DNA濃度をOD 260の読み取り値によって測定した。その後、ライブラリーDNAを約25ng/μlに希釈した。
【０４５０】
A．BP反応
BP反応混合物は以下の通りに調製した：
BPクロナーゼ（商標）を氷上で解凍し、使用前に十分に混合した。以下の成分からなるSupermixを室温で調製した：
線状pDONRプラスミド（250ng/μl）  10μl
BPバッファー  15μl
Fis溶液（80ng/μl）  5μl
【０４５１】
【表６】
2004532636.tif 000013
【０４５２】
反応物のチューブを室温で混合し、25℃で48時間インキュベートした。続いて、2μlのプロテイナーゼ-K（2mg/ml）を反応チューブ1、2、3および4に添加し、1μlのプロテイナーゼ-K（2mg/ml）を反応チューブ5および6に添加した。すべてのチューブをピペッティングにより十分に混合し、37℃で10分間インキュベートした。1μlの各試料を、Cell-Poratorエレクトロポレーションシステム（インビトロゲン社PCT公報・国際公開公報）を用いるエレクトロポレーションによって25μlのElectromax DH10B細胞（インビトロゲン社、カタログ番号18290-015）に導入し、反応チューブ1、2、3および4内の残りの21μlは-20℃で保存した。1mlのS.O.C.を各形質転換混合物に添加し、37℃で1時間インキュベートした。
【０４５３】
反応チューブ4および6の形質転換混合物の100μlの系列希釈物（10-３、10-４および10-５）をS.O.C.により作製した。これらの希釈物を、出発ライブラリーにおけるクローン数を判定するためにLB amp（100μg/μl）プレートに播いた。反応チューブ1、2、3および5の形質転換混合物の100μlの系列希釈物（10-１、10-２、10-３および10-４）もS.O.C.により作製し、エントリーライブラリーおよび残留した出発ライブラリーにおけるクローン数を評価するために、LB amp（100μg/ml）およびLB kan（50μg/ml）プレートに播いた。これらのプレートを37℃で一晩インキュベートした。
【０４５４】
移行が成功した場合には一般に、50％を上回る変換が示され、残留した出発ライブラリーは2％未満であった。変換率および残留率の決定には以下の式を用いた：
変換率＝［クロナーゼ（商標）反応によるKANコロニー数（反応1、2、3、5）（×）希釈係数］/［クロナーゼ（商標）非添加反応によるAMPコロニー数（反応4、6）（×）希釈係数］（×）［出発ライブラリーのμg数（反応4、6）/出発ライブラリーのμg数（反応1、2、3、5）］
出発ライブラリーの残留率＝クロナーゼ（商標）反応によるAMPコロニー数（反応1、2、3、5）（×）希釈係数/（Kanコロニー数（反応1、2、3、5）（×）希釈係数）
【０４５５】
エントリークローンの力価が最も高く、出発ライブラリーの残留率が最も低い反応を、以下に示す段階に用いるために選択した。
【０４５６】
B．エントリーライブラリーの構築
BP反応によって少なくとも1000万個のエントリークローンを作製するのに十分なDNAをエレクトロポレーションにより細胞に導入した。エレクトロポレーションを行った25μlのElectroMax DR10B細胞に1mlのS.O.C.を添加し、続いて37℃で1時間振盪した。その結果得られた形質転換混合物の50μlを採取し、S.O.C.中に10-２、10-３、10-４および10-５に希釈した。続いて、その結果得られた混合物の100μlをLB ampプレートおよびLB kanプレートに播き、37℃で一晩インキュベートした。残りの希釈していない形質転換反応物（エントリーライブラリー）には滅菌グリセロールを最終濃度15％として添加し、この混合物は後に用いるまで-80℃で保存した。
【０４５７】
エントリーライブラリーの力価は、上記のようにしてLB kanプレート上に形成されたコロニー数を算定することによって算出した。続いて、凍結貯蔵物からの1000万コロニー形成単位（CFU）を、カナマイシン（50μg/ml）を含むLB 50mlに添加した。この混合物をOD６００が1.0に達するまで37℃で振盪した（約6時間）。続いて、培養物を遠心し、ペレットを後に用いるまで-80℃で保存した。
【０４５８】
エントリーライブラリーを含むペレットを室温で解凍し、Concert High Purity Plasmid Midiprep System（インビトロゲン社 カールズバッド、CA, カタログ番号11451）を用いてDNAを単離した。続いて、DNAをTE中に再懸濁し、260nmでのO.D.を読み取ってDNA濃度を測定した。
【０４５９】
5μgのエントリーライブラリーDNAを、0.8倍容量の15％PEG 8000/0.9M NaCl溶液を添加することによって沈殿させた。その結果得られた溶液を十分に混合し、微量遠心管に入れて室温で（13,000rpm）15分間遠心した。上清を注意深く除去し、ペレット中のDNAを50μlのTE中に溶解した。260nmでのO.D.を再び読み取ってDNA濃度を測定した。
【０４６０】
C．エントリーライブラリーを発現ライブラリーに移行させるためのLR反応
0.5μgのエントリーライブラリーDNAを25ng/μlに希釈し、エントリーライブラリーの残りの部分を-20℃で保存した。
【０４６１】
LR反応混合物は以下の通りに調製した：
以下の成分からなるSupermixを室温で調製した：
線状目的ベクター（150ng/μl）  12μl
LRバッファー  14μl
水  22μl
【０４６２】
【表７】
2004532636.tif 000014
【０４６３】
反応混合物を室温で丁寧に混合し、25℃で一晩インキュベートした。続いて、試料を2μlのプロテイナーゼKにより37℃で10分間処理した。
【０４６４】
1μlの反応チューブ1、2、3および4を、25μlのElectromax DH10B細胞にエレクトロポレーションにより導入した。1mlのS.O.C.も反応チューブ1、2、3および4に添加し、チューブを37℃で1時間浸透した。100μlの各形質転換混合物を採取し、10-２、10-３、10-４および10-５の希釈物をS.O.C.中に調製した。希釈物の100μlをLB ampプレートおよびLB kanプレートに播いた。反応チューブ1、2、3および4内の残りの21μlは-20℃で保存した。
【０４６５】
移行が成功した場合には一般に、50％を上回る変換が示され、残留した出発ライブラリーは10％前後であった。変換率および残留率の決定には以下の式を用いた：
変換率＝クロナーゼ（商標）反応によるAMPコロニー数（反応2、4）（×）希釈係数/（クロナーゼ（商標）非添加反応によるKANコロニー数（反応1、3）（×）希釈係数）
出発ライブラリーの残留率＝クロナーゼ（商標）反応によるKANコロニー数（反応2、4）（×）希釈係数/（AMPコロニー数（反応2、4）（×）希釈係数）
【０４６６】
反応チューブ2から少なくとも1000万個の発現クローンを作製するのに十分なDNAをエレクトロポレーションにより細胞に導入した。エレクトロポレーションを行った25μlのElectroMax DR10B細胞に1mlのS.O.C.を添加し、続いてこれを37℃で1時間振盪した。この形質転換混合物の50μlを採取し、これを用いてS.O.C.中に10-２、10-３、10-４および10-５の希釈物を調製した。続いて、その100μlをLB ampプレートおよびLB kanプレートに播き、37℃で一晩インキュベートした。残りの希釈していない形質転換反応物（発現ライブラリー）には滅菌グリセロールを最終濃度15％として添加した。これらの混合物は後に用いるまで-80℃で保存した。
【０４６７】
D．発現ライブラリーの分析
発現ライブラリーの分析は以下の通りに行った。
【０４６８】
力価分析
LB ampプレートおよびLB kanプレート上のコロニーを算定して、変換効率および総コロニー生成量（コロニー形成単位（CFU）数とも呼ばれる）を評価した。
【０４６９】
サイズ評価（sizing）
LB ampプレート上の44個のコロニーをランダムに選択して取り出し、新たな発現ライブラリークローンと出発cDNAライブラリークローンとの比を確認し、挿入物の平均サイズが変化していないことを確かめた。
【０４７０】
挿入物のサイズ評価のために用いうる方法には、発現ベクターとハイブリダイズするプライマーを用いるcDNA挿入物のPCR増幅、ならびにプラスミドDNAのミニプレップ調製後にEcoRIおよびNotI制限エンドヌクレアーゼによる消化を行うことが含まれる。
【０４７１】
実施例7：プラスミド間のライブラリーの移行
DNA断片のライブラリーまたは集団を1つのプラスミド基本骨格から別のものに移行させる場合には、元の分子集団の表現が移行後にも移行反応の前と本質的には同じく保たれるような効率で移行反応を行うことが一般に有利である。複雑度の高い分子集団を、考えられる最も高いレベルの反応効率（集団内の全分子の100％近い効率での、または完全な移行）で移行させることが有利である。
【０４７２】
GATEWAY（商標）システムは複雑な分子集団の移行を促すために理想的に適している。GATEWAY（商標）発現クローンとして既に樹立されたcDNAライブラリーが現時点でも数多く存在する。これらの発現クローンはcDNA挿入物を挟み込んだattB部位を含んでいる。このため、発現クローンライブラリーの移行における第1の段階はBP反応を必要とすると考えられる。その後にエントリークローン産物を、選択した目的ベクターとのLR反応に用いる。
【０４７３】
BP反応の効率は、超らせん状attP分子からなるDNA基質を線状attB分子と反応させた場合に最も高い。分子を特定の部位で線状化する一般的な手法の一つは、制限エンドヌクレアーゼでプラスミドを消化切断することである。しかし、必ずしもすべての発現クローンライブラリーが適切な制限部位とは限らず、酵素によって同じく切断されるためにこの方法では移行されない挿入物分子もあると考えられる。超らせん状attB分子を反応の基質として用いうるようにBP反応を最適化することが有利と考えられる。これは反応を単純化するとともに、すべての発現クローンライブラリーに一般的に適用可能であると考えられる。
【０４７４】
実験1：BP反応におけるDNAトポロジーの検討
発現クローン（線状および超らせん状）をBP反応においてattP DONORベクター（線状および超らせん状）と反応させた。2つの異なる発現クローンDNA（lacZα断片およびtetR挿入物を含む）の2つの異なる濃度（25fmolおよび50fmol）でのクローニング効率を標準的なBP反応条件（300ng attPプラスミド、4μlのBPクロナーゼ（商標）、20μlの反応容積中）下で比較した。反応効率は一晩のインキュベーション後にゲル電気泳動および形質転換により評価した（表8のデータを参照）。
【０４７５】
（表８）BP反応におけるコロニー生成量（形質転換当たりのコロニー数として表示）
2004532636.tif 000015
【０４７６】
この実験は、超らせん状attB発現クローンが、線状attP DONORプラスミドと最も高い効率で反応しうることを示している。
【０４７７】
実験2：組換え反応へのFisの投入
Fisタンパク質はBP反応の生産量を増大させうることが示されている。このため、Fisタンパク質の影響を、発現クローンDNAを用いるBP反応において検討した。反応物は、Fisタンパク質の存在下（20μlの反応物中に24ng）および非存在下で、300ngの超らせん状または線状のattP DONORプラスミドを200ngの超らせん状または線状のTet発現クローンDNAと反応させることによって調製した。その結果を表9にまとめた。
【０４７８】
（表９）BP反応におけるFisタンパク質の影響
2004532636.tif 000016
【０４７９】
この実験は、1時間の反応後には線状attP DONORベクターのクローニング効率は超らせん状ベクターよりもはるかに低いが、十分な時間を与えればこの差は最小限に抑えられることを示している。Fisタンパク質は、線状および超らせん状のいずれのattP DONORプラスミドとの反応も刺激するが、Fisの効果は線状attPプラスミドの場合に最も大きい。
【０４８０】
実施例8：超らせん状attB発現クローンを用いる単一チューブ反応の最適化
第1のATGコドンを欠失したlacZオープンリーディングフレーム（ORF）を含むエントリークローン（pENTR201-no ATG-LacZ、pENTR201に由来）を構築した。続いて、lacZ ORFを、LR反応を介して異なる目的ベクターに移行させた。X Galプレートに播くことにより、このlacZ ORFをpDEST2（pEXP2-no ATG-LacZ、2000年3月2日に提出された米国特許出願第09/517,466号の図22を参照）およびpDEST8（pEXP8-no ATG-LacZ、インビトロゲン社、カールズバッド、CA, カタログ番号11804-010）中にクローニングした場合には青色コロニーが生じるが、pDEST6（pEXP6-no ATG-LacZ、2000年3月2日に提出された米国特許出願第09/517,466号の図26を参照）およびpDEST14（pEXP14 no ATG-LacZ、インビトロゲン社、カールズバッド、CA, カタログ番号11801-016）中にクローニングした場合には白色コロニーが生じることが観察された。すなわち、これらのlacZ発現クローンを用いると、1つの目的ベクターから別のものへの単一チューブ移行の効率を、X-Gal上へのプレーティングのみによって評価することができる。
【０４８１】
以上の実施例7で示されたように、超らせん状の発現クローンDNAは、線状attP DONORベクターおよびFisタンパク質を用いるBP反応において最も高い効率で反応する。さらに、新たな目的ベクターへの挿入物の移行を最適化するには、単一チューブ反応の産物に混入する出発発現クローンDNAの量を最小限に抑えるために、出発発現クローンDNAの量を制限する必要があると考えられる。単一チューブ反応における移行の効率を最大にするために必要な線状pDONRベクターおよびBPクロナーゼの最適な量を明らかにするために、以下の実験を用いた。
【０４８２】
（表１０）最終容積20μl中で40ngのpEXP8-no ATG-LacZを用いたBP反応
2004532636.tif 000017
【０４８３】
この実験は、300ngのpDONRプラスミドを用いると、生じるエントリークローンの最大数はプラトーに達するが、pDONRプラスミドをさらに追加し、BPクロナーゼをさらに追加することにより、反応する発現クローンは増加することを示している。
【０４８４】
（表１１）pEXP 8-no ATG-LacZ（青色）を用いたpEXP14 no ATG-La cZ（白色）への単一チューブ反応
2004532636.tif 000018
【０４８５】
以上に示された結果に基づき、本発明者らは、ライブラリー移行プロトコールにおいて、600ngの線状attP DONORプラスミドおよび8μlのBPクロナーゼを用いることを選択した。
【０４８６】
実施例9：大腸菌Fisタンパク質はバクテリオファージλIntによる組込み型組換えを刺激する
背景
Fisは、大腸菌およびネズミチフス菌ならびに他の多くの原核生物に認められる98アミノ酸のホモ二量体タンパク質である。これは最初、DNAインベルターゼのファミリーによって行われるDNA組換え反応の調節に役割を果たすことから同定された（Johnson, R.C.ら(1986) Cell 46: 531-9ならびにKoch, C.およびKahmann, R. (1986) J. Biol. Chem. 261: 15673-8）。Fisは、細胞内でさまざまな調節機能を担い、大腸菌核様体を形成するタンパク質-DNA塊の一部としてしばしば単離される、NAPSまたは核様体（nucleoid）関連タンパク質として知られるタンパク質のグループに属する（Pan, C.Q.ら (1996) J. Mol. Biol. 264: 675-95）。このファミリーの大半のメンバーは、DNA基質の屈曲、ループ形成または縮合を含む、特異的または非特異的なDNA相互作用に関与すると思われる。Fisの他の役割は後になって同定されたが、これには、多数のプロモーターの転写活性化因子（Nilsson, L.ら (1990) EMBO J. 9: 727-34；Ross, W.ら (1990) EMBO J. 9: 3733-42；Xu, J.およびJohnson, R.C. (1995) J. Bacteriol. 177: 5222-31）、別のプロモーターのセットのリプレッサー（Ball, C.A.ら (1992) J. Bacteriol. 174: 8043-56；Koch, C.ら (1991) Nucl. Acids Res. 19: 5915-22；Xu, J.およびJohnson, R.C. (1995) J. Bacteriol. 177: 938-47）、DNA複製（Filutowicz, M.ら (1992) J. Bacteriol. 174: 398-407）および細胞分裂/染色体分離（Paull, T.T.およびJohnson, R.C. (1995) J. Biol. Chem. 270: 8744-54）のための補助因子、ならびにバクテリオファージλの部位特異的組換えに関与する因子（Thompson, J.F.ら (1987) Cell 50: 901-8；Ball, C.A.およびJohnson, R.C. (1991) J. Bacteriol. 173: 4027-31；Ball, C.A.およびJohnson, R.C. (1991) J. Bacteriol. 173: 4032-8）としての機能が含まれる。Fisの細胞レベルは大腸菌の細胞周期の間に、増殖段階および栄養分の入手可能性に依存して大きく変動する（Ball, C.A.ら (1992) J. Bacteriol. 174: 8043-56；Thompson, J.F.ら (1987) Cell 50: 901-8）。計算により、対数増殖期の間は、染色体に沿って500塩基対毎に結合するのに十分なFisが細胞内に存在すると予想されている。しかし、細胞が静止期に入るかまたは栄養分を除去すると、Fisのレベルはほとんど検出不能な量まで低下する（Ball, C.A.ら (1992) J. Bacteriol. 174: 8043-56）。
【０４８７】
FisはインビトロでDNAと非特異的に結合しうるが、逆方向反復配列と大まかに類似した15塩基対の縮重コンセンサス配列を有する一連の部位に対する親和性はそれよりもかなり高い（Pan, C.Q.ら (1996) J. Mol. Biol. 264: 675-95；Bruist, M.F.ら (1987) Genes Dev. 1: 762-72；Bokal, A.J.ら (1995) J. Mol. Biol. 245: 197-207）。
【０４８８】
DNAフットプリント法により、本タンパク質とこれらの15塩基対のFis結合部位内のDNAとが明らかに接触していることが示されている；しかし、DNA配列のみではFis結合親和性の予測因子としては不十分と考えられ、局所のDNA構造が任意のFis結合部位の活性に影響を及ぼす可能性がある。Fisは特異的に結合するとDNAを屈曲させ、この屈曲の程度は個々のFis結合部位に依存するように思われる（Thompson, J.F.およびLandy, A. (1988) Nucl. Acids Res. 16: 9687-9705.；Pan, C.Q.ら (1996) Biochemistry 35: 4326-33）。種々のDNA基質を用いたさまざまな実験により、屈曲角は45度〜90度の範囲であることが観察されている（Thompson, J.F.およびLandy, A. (1988) Nucl. Acids Res. 16: 9687-9705）。
【０４８９】
λ部位特異的組換えにおけるFisの役割はThompsonらによって最初に同定され、彼らは至適レベル以下のλXisタンパク質の存在下でFisによるインビトロでのλ切出しが20倍に刺激されることを観察した（Thompson, J.F.ら(1987) Cell 50: 901-8）。Xisの飽和レベルでは、Fisはインビトロでの切り出しに作用を及ぼさないように思われる。この作用の説明の一部としては、2つのタンパク質に対する結合部位が重複していることが考えられる。2つのXis結合部位、X1およびX2は組換え基質のattRアームにあり、X2部位はFisコンセンサス配列とかなり重複している。FisおよびXisには、Xis単独の場合と全く同様に、結合における協同性が観察されている；事実、FisはXisの濃度が限定的な場合には完全にXisの代わりになるように思われる（Thompson, J.F.ら(1987) Cell 50：901-8）。
【０４９０】
BallおよびJohnson（Ball, C.A.およびJohnson, R.C. (1991) J. Bacteriol. 173: 4027-31；Ball, C.A.およびJohnson, R.C. (1991) J. Bacteriol. 173: 4032-8）による遺伝学的証拠により、Fisはファージλの切除を誘発しうるだけでなく、溶原性もFisの存在によって増強されることが示されている。これらの実験は、F部位に変異のあるファージ、および/またはFisを欠失した大腸菌を用いてインビボで行われ、Fisが欠失すると溶原化の頻度が15分の1に低下することが示された（Ball, C.A.およびJohnson, R.C. (1991) J. Bacteriol. 173: 4032-8）。この低下は一部には、非組換え関連イベントにおける調節因子としてのFisが存在しないためと考えられる。しかし、Xis結合には影響を及ぼさずにFis結合を失わせるF部位の変異であっても溶原化頻度の2〜3分の1への低下をもたらしたことから、Fisは切除に加えて組込みにも役割を果たすことが示唆される。組込みに関して検討するためにFisを用いてインビトロで行われた実験では、反応に対するFisの影響は同定されなかった（Thompson, J.F.ら (1987) Cell 50: 901-8）。
【０４９１】
組換えを誘発するためのFisの使用の例
200〜500nMのFisを標準的なBPクロナーゼ（商標）GATEWAY（商標）反応物に添加することにより、組換え産物の形成および生成コロニー数の最適な刺激が得られると考えられる。同程度のレベルのFisは、BP基質のトポロジーが逆になった反応、すなわち線状P基質および超らせん状B基質（ライブラリー移行）を用いる反応も刺激すると考えられる。いずれの場合にも、BPクロナーゼ（商標）反応のための標準的な反応条件を用いうる。同じ至適範囲のFisは、単一のP組換え部位およびB組換え部位を含む組換え反応も、Fisの非存在下における反応と同じ反応条件下で刺激すると考えられる。
【０４９２】
Fisによる組換えの刺激レベルの概要
A．一部位組換え反応
Fisによる最適な刺激は、200〜500nMの範囲のFisおよび5nM DNAで観察される。Fisは、基質のトポロジーにかかわらず、すべての一部位組込み反応を刺激する。超らせん状attPおよび線状attB部位を用いる標準的な反応は、比較的低レベルのIntの存在下で最大10倍に刺激される。超らせん状attBおよび線状attP部位を用いる逆トポロジーの反応は、種々の塩濃度で最大5倍に刺激される。線状attPと線状attB部位との間の反応はFisによって最大3倍に刺激される。
【０４９３】
B．二部位組換え反応（GATEWAY（商標））
Fisによる最適な刺激は、200〜500nMの範囲のFisおよび5nM DNAで観察される。FisはBP反応産物の形成を、条件に応じて最大3倍に刺激する。コインテグレートの形成は影響を受けないため、この刺激は全面的にコインテグレートの分解の刺激に起因するように思われる。標準的なGATEWAY（商標）反応は、通常用いられるのと同じ条件下で、単にFisを反応物に添加することによって刺激しうる。逆トポロジーのGATEWAY（商標）反応（線状のP、超らせん状のB）では、Fisは産物の生成を幾分刺激するが、コインテグレートへと変換される出発物質B基質の量を著しく増加させる。
【０４９４】
結果
Fisの産生
大腸菌fis遺伝子を、pLDE15中の、熱誘導性λcI857リプレッサーの制御下にあるλPLプロモーターの下流にクローニングした。この構築物は42℃で誘導するとFisを高レベルで発現したことから、精製プロトコールの検討のために一連の抽出物を作製した。
【０４９５】
1リットルの培養物から2〜3mgの精製（＞90％）Fisが得られると考えられる最終的なプロトコールを開発した。本手順は、粗抽出物を形成させるための超音波処理に続いて、ヘパリン硫酸によるクロマトグラフィー、さらにその後にMono Sによるイオン交換クロマトグラフィーを含む。精製されたタンパク質は少量の副次的不純物を含んでおり、これはおそらくは、精製前に抽出物を加熱することにより（Fisは沸点でも最長10分間は完全に耐熱性であるため）、または塩の完全希釈によるFisの結晶化により、除去しうると考えられる。文献中にはこれらのいずれの方法も用いられている。最終的なFis試料を、50％グリセロールおよび0.5M NaClを含む緩衝液中で透析し、複数のチューブに分割して-20℃または-80℃で保存した。精製したFisを、文献中に発表されたものと類似のゲル遅延アッセイを用いて、活性に関してアッセイしたところ、得られた見かけのKd値は10〜30nMであることが明らかになった。
【０４９６】
切出し型組換えに対するFisの影響
インビトロでの切出しに対するFisの影響を、超らせん状pEZ11104（attL）および線状化pRCAT1（attR）を用いる二部位LRアッセイを用いて評価した。図22に示した通り、Xisが高レベルの場合には、Fisタンパク質の量の増加に伴って組換え産物の量は幾分刺激された。しかし、Xisレベルの低下に伴ってFisの刺激は増強し、Xisレベルが極めて低い場合、Fisによる最大限の刺激は10〜15倍に達した。Fisによる最大限の刺激は、20μlの反応物につきFisが30〜125ngの間で起こるように思われた。コインテグレートは産物へと急速に変換されるため、Fisがコインテグレートの形成および分解の両方に影響を及ぼすか否かを分析することは困難である；しかし、いずれの段階にも刺激が観察される可能性が高く、刺激レベルは同程度であるように思われる。
【０４９７】
組込み型コインテグレート分解に対するFisの影響
図23は、超らせん状pDONR201（attP）および線状化pBGFP1（attB）を用いる二部位BPアッセイに対するFis添加の影響を示している。至適レベルのFis（同じく30〜120ng/反応）の存在下では、組換え産物の比率は2〜4倍に高まる。また、Fisによる刺激の程度は塩濃度が高いほど大きいが、これは通常、コインテグレートの分解には不適な条件である。Fisの存在下では、いかなる塩濃度でもコインテグレート形成に対して観察しうる影響はない（非提示データ）。
【０４９８】
図24は、塩濃度の影響をより詳細に分析している。この場合もFisによる刺激がすべての塩濃度で認められるが、Fisの存在しない対照が塩濃度により著しい影響を受けたため、塩濃度がより高い場合のFisによる刺激の程度ははるかに大きい。25mM NaClではFisはほぼ2倍に刺激させるが、75mMおよび100mM NaClではFisによる刺激は7倍を上回る。しかし、より高い塩濃度で、組換え産物の量が、25mM NaClでFisにより刺激される最適な組換えを上回る場合はない。
【０４９９】
組込み型組換えに対するFisの影響
実験により、attP（pATTP2）が超らせん状でattB（pATTB2）が線状である標準的な条件下で、塩濃度が高くても低くても、Fisは一部位PxB組換えに影響を及ぼさないことが示されている。しかし、Intレベルが最適濃度を下回れば（図25）、Fisはこの反応を最大10倍に刺激しうる。線状化pATTP2および線状化pATTB2を用いると、Fisは種々の塩濃度で組換えを2〜3倍に刺激し、これはコインテグレート分解反応に関して認められた結果と非常に類似している。Fisによる最も顕著な影響は、超らせん状pATTB2と線状pATTP2との間の反応に対するものであるように思われる。この反応は通常の条件下では極めて乏しく、低濃度塩条件でも検出可能な量の産物はほとんど認められない。しかし、Fisの存在下では、図28に示されているように、組換えが強く刺激される。
【０５００】
考察
Fisはλ部位特異的組換えにおいて役割を果たすことが知られている。インビトロでの役割はタンパク質が限定されている状況下のみで観察されており、このような条件は、主な機能がファージDNAの一分子を導入するか切り出す単一の組換えイベントを行うことにあり、大量のプラスミド基質の組換えは触媒しない系にとっては非常に人工的である。インビボでのデータは、Fisがファージλの組込み型組換えおよび切出し型組換えの両方に本質的な役割を果たすことを示唆している。Fisの非存在下でファージの溶解が50分の1に大幅に低下し、溶原化頻度が15分の1に低下することは、Fisがインビボで必要なことを明らかに示している。溶解におけるFisの役割は、インビトロ実験を用いて見いだされた結果とある面では類似しているが、溶原化におけるFisの役割を説明することはかなり困難である。BallおよびJohnsonによって得られた15倍の刺激の一部はFisの細胞における他の役割によるとみることができるが、F部位が変異してもほぼ3倍の刺激が観察されており、これは組換えの刺激と直接関係しているに違いない。
【０５０１】
本研究の結果から、組込みの際にインビボで観察される刺激の源と思われるものが特定された。attP基質が超らせん状でない場合はインビトロで2〜3倍の影響が明らかに認められる。超らせん形成エネルギーは、組換えの開始前に形成される必要のある、インタソームとして知られるタンパク質-DNA構造が正しく確立されるために不可欠であることが知られている。この議論は、超らせん状でないattP基質に関してインビトロで観察される組換え効率がはるかに低いことを説明するために用いられている。しかし、細胞内のDNAは、単離されたプラスミドDNAに認められる高レベルの超らせんほどには超らせん化していないことが広く示されている。
【０５０２】
Johnsonは、このような高い超らせんが存在しない条件下で組込みを増強するためにFisを細胞において用いうるという概念を最初に提唱した（Ball, C.A.およびJohnson, R.C. (1991b) J. Bacteriol. 173: 4032-8）。多くの核封入体関連タンパク質が核封入体のDNA凝縮に関与するように思われるという事実からみて、FisがDNAと結合してそれを屈曲させる能力が、超らせん形成によるDNAの凝縮を高度に模倣することは可能であり、このようなイベントは、高度の超らせんの非存在下においてもインタソーム形成を可能にすると思われる。これは、最適条件を下回るInt濃度で観察される、Fisによる刺激の説明にもなると考えられる。細胞内では、Intレベルが、実験室でのインビトロ組換え反応に用いられた人工的な高濃度よりもはるかに低い可能性が高いため、Fisは「標準的な」組換え反応が進行するためにも必要である可能性がある。
【０５０３】
F部位変異体に、Fisによる組込みのより強い刺激を促す能力があることも、以上に提唱した役割に対するもう1つの証拠である。より強固なFis結合はより効率的なDNA凝縮、および組込み刺激の増大をもたらす可能性が高いと考えられる。これらの効果が反応速度論レベルで認められるか否か、すなわちFisの添加がインタソーム形成の速度を直接上昇させるかという点は現時点では不明である。初期の研究では、線状attP/超らせん状attB反応の初期速度がFisの存在下で上昇する方向性が示されており、Fisが実際にインタソーム形成レベルで反応速度論的に作用する可能性が示唆されている。
【０５０４】
Fisが、両方の基質が線状である反応と比べて、線状P/超らせん状B反応をより高度に刺激させるように思われる理由は全く明らかでない。組込み型インタソーム形成はattP上のみで起こり、attBの捕捉は対合過程における最終段階と考えられている。この場合に、attBの超らせん状態がインタソーム形成の結果にどれほど影響しうるかは不明である。そうではなくて、FisのattBとの相互作用が、attB部位を何らかの様式でインタソームに到達しやすくさせる、または対合後の下流の段階、例えば第一鎖切断後の異性化を補助するという可能性もある。
【０５０５】
実験方法
オリゴヌクレオチド‐オリゴヌクレオチドはLife Technologiesから入手した。
2004532636.tif 000019
【０５０６】
組換えアッセイプラスミド
pATTP2は、λattP部位をpUC19中にクローニングすることによって構築した。pATTB2は、大腸菌attB部位をpUC19中にクローニングすることによって構築した。pDONR201（Life Technologies）はattP1部位およびattP2部位をccdB遺伝子に隣接した状態で含む。pEZ11104はattL1部位およびattL2部位をCAT遺伝子に隣接した状態で含む。pBGFP2は、GFP遺伝子に隣接するattB1部位およびattB2部位を含むPCR断片がpUC19に挿入されたものである。pRCAT1は、attR1部位およびattR2部位ならびにCAT/ccdBカセットを含むpEZC8402の断片がpUC19に挿入されたものである。
【０５０７】
大腸菌Fisのクローニング
fis遺伝子は大腸菌DH10B株の染色体DNAから、Platinum Taq Hi Fidelity、および遺伝子の5'末端および3'末端に対応するプライマー（DE46およびDE49）を用いてPCR増幅した。5'プライマーは、fis遺伝子の開始点の前に強力なシャイン・ダルガルノ開始配列が付与されるように構築した。PCR産物を消化して、熱誘導性λCI８５７遺伝子の制御下にあるλPＬプロモーターを有する高コピー数発現ベクターであるpRAD19中にクローニングした。陽性クローン（pLDE15）を、変異が存在しないことを確認するための配列確認を行った上で、大腸菌BL21に発現のために導入した。
【０５０８】
大腸菌Fisタンパク質の導入
pLDE15を含む細胞を、100μg/mlアンピシリンを加えた2mlのLB中にて30℃で一晩増殖させ、新たな培地2ml中に希釈した上で、OD６００が0.7となるまで増殖させた。この培養物を2本のチューブに分け、一方は30℃に保ち、もう一方には42℃による誘導を2時間行った。2時間後に、培養物を遠心処理してローディングバッファー中に再懸濁し、SDS-PAGEにより分析した。誘導した細胞はすでに部分的に溶解した外観を示し、Fisの著しい過剰発現はこれらの条件下では大腸菌に対して致死的であることが示唆された。誘導した試料は、分子量12kDa前後に極めて明瞭な過剰発現タンパク質バンドを示した。
【０５０９】
大腸菌Fisタンパク質の精製
一晩培養したpLDE15の培養物5mlを、フェルンバッハフラスコに入った1リットルのLB＋Amp中に希釈して、OD６００が0.7になるまで30℃で増殖させ、42℃による誘導を2時間行い、遠心処理を行った。7.5gの湿細胞を入手し、これを-80℃で凍結した。細胞を解凍して、50mM Tris-HCl、pH 8.0、5mM EDTA、10％グリセロール、1M NaClおよび1mM DTTを含む15mlの緩衝液中に再懸濁した。細胞液に1/2インチのチップを用いる超音波処理を45秒間、4回行い、細胞片を30,000×g、40分間の遠心処理によって除去した。抽出物は-80℃で保存した。15mlの抽出物を35mlのバッファーA（20mM Tris-HCl、pH 8.0、1mM EDTA、10％グリセロール、1mM DTT）で希釈し、Pharmacia Hitrap Heparinカラム（2×1mlの連続カラム）に流速0.25ml/分でかけた。カラムを10CVの400mM NaCl（バッファーA中）で洗い、400mMから800mM NaCl（バッファーA中）までの15CVの勾配によって溶出させた。Fisの幅広いピークがSDS-PAGEによって検出され、Fisを含む画分をプールして、200mM NaClを含むバッファーAに対して透析した。この試料を、同じ緩衝液により平衡化した1ml Pharmacia Hitrap Mono Sカラムにかけた。カラムを15CVの200mM NaCl（バッファーA中）で洗い、200mMから1M NaCl（バッファーA中）までの20CVの勾配によって溶出させた。2つのピークがカラムから検出され、このうち第2の鋭いピークがFisタンパク質のほとんどを表していた。最も清澄な画分をプールし、クーマシー染色によれば＞90％Fisを含む試料を得た。20mM Tris-HCl、pH 8.0、1mM EDTA、50％グリセロール、1mM DTT、0.5M NaClを含むFis貯蔵バッファー中での透析後に、1mg/ml濃度の精製Fisが得られた。Fisは-80℃または-20℃で保存した。
【０５１０】
Fis活性アッセイ
Fis活性を検討するためのゲル遅延アッセイを開発した。λattP配列からなるPCR産物を、プライマーDE9およびDE10を用いて増幅した。400塩基対の産物をAvaIで切断し、大腸菌DNAポリメラーゼIのクレノー断片を用いて、両端を３２P-dCTPで標識した。反応は、20μlの反応物中に20mM Tris-HCl、pH 8.0、5％グリセロール、25mM NaCl、200μg/mlサケ精巣DNA、1.17ng（10,000cpm/fmol）PCR産物という最終的な条件下で行った。タンパク質を添加し、室温で10分間結合させて、試料をNovex 6％ゲル遅延ゲルにローディングし、0.5×TBEバッファー中にて100Vで60分間泳動させた。ゲルを乾燥させ、Phosphorimagerにより2〜3時間露光して可視化した。競合DNAの非存在下では複数のシフトがアッセイ中に観察された。しかし、競合物の存在下では単一の個別のシフトが観察され、これによって見かけのKd値の算出が可能になった。これらのPCR産物はやや不純で分解産物を含んでおり、このため、得られた値はある程度の誤差を含む傾向がある；しかし、見かけのKdは10〜30nMと考えられ、これはλF部位を用いて発表された値とよく合致する。このことは、この種のゲル遅延アッセイが精製Fisタンパク質の活性の有効な検査手段となることを示唆する。
【０５１１】
放射性アッセイ基質
組換えアッセイ用の線状基質をクレノー充填反応によって標識した。線状化基質（1μg）を0.5単位のクレノーポリメラーゼ、1mM dATP、1mM dGTP、1mM dTTPおよび30pCiの３２P-dCTPとともに14分間インキュベートし、1mM dCTPを添加してさらに1分間インキュベートした上で、Concert PCR精製カラムを用いてDNAを精製し、50μl TEにて溶出させた。
【０５１２】
組換えアッセイ
一部位組換え反応物（20μl）は、25mM Tris-HCl、pH 8.0、1mM EDTA、6mMスペルミジン、15％グリセロールおよび75mM NaCl（他に指示する場合を除く）、100fmoleの各基質および約30,000cpmの32P標識線状基質から構成した。標準的な組込み反応物は、80ng THFおよび150ng Intから構成した。切出し反応物は、35ng IHF、50ng Xisおよび150ng Intから構成した。反応物を25℃で45分間インキュベートし、50μg/mlプロテイナーゼKの添加によって停止させ、65℃で15分間加熱し、0.7％アガロースゲルによる電気泳動を行った。ゲルを乾燥させ、Molecular Dynamics phosphorimagerにより可視化した。組換えレベルは、ImageQuantを用いた基質バンドおよび産物バンドの定量化によって判定した。GATEWAY（商標）（2部位）反応も、標準的なBP反応に4mMスペルミジンおよび25mM NaClを含め、標準的なLR反応に7.5mMスペルミジンおよび75mM NaClを含めた点を除き、同様に行った。
【０５１３】
実施例10：BPクロナーゼ（商標）反応におけるFisの使用
BP組換え反応を、50fmolの超らせん状pDONR201、75mM NaCl、7.5mMスペルミジン、2μlのBP貯蔵バッファー（5mM EDTA、1mg/ml BSA、22mM NaCl、5mMスペルミジン、25mM Tris-HCl、pH 7.5）および2μlのBPクロナーゼ（商標）（40ng/μl Int、20ng/μl IHF、pH 7.5）を含む20μlの反応混合物中において室温で60〜120分間行った。BPクロナーゼ（商標）により触媒される組換え反応の効率を高めるFisの至適濃度は約150nMであることが明らかになった。
【０５１４】
さらに、上記の反応条件により、標準的な反応物（すなわち、300ng pDONR DNA、100ng attB DNA、4μl BPクロナーゼ（商標）、4μl BPバッファー、20μlの反応物の場合）と類似したコロニー生成が得られており、必要な酵素およびベクターDNAの量は半分である。
【０５１５】
標準的なBP組換え反応において、Fisの添加は、標準的なBP反応物と比較してコロニー生成量の3倍の増加をもたらす。
【０５１６】
Fisは、線状組換え反応によれば線形的である第2の組換え反応（コインテグレート分解）の速度を刺激することによって作用を発揮することが知られている。
【０５１７】
理論に拘束されることは望んでいないが、線状核酸分子および超らせん核酸分子を用いるBP組換え反応の全体的な効率は以下の通りである：
超らせん状P×線状B＞線状P×超らせん状B＞線状P×線状B＞超らせん状P×超らせんB
【０５１８】
実施例11：ライブラリー移行条件の最適化
A．attB cDNAライブラリーの構築
GATEWAYライブラリーの構築および移行に伴う一つの問題は、attB cDNAがBP反応では一般に限定されており、コロニー生成量が最大になるように標準的なBP反応条件を最適化する必要がある点である。
【０５１９】
この問題に対する解決策の一つは、限定的な量のattB cDNAとの反応に用いる超らせん状attP DONORベクターを少なくし、BPクロナーゼ（商標）を少なくして、Fisタンパク質を含めることである。例えば、20ngのattB cDNAをクローニングするための最適なBP反応物は、75ngのattP DONORベクター、0.75μlのBPクロナーゼ（商標）および84nM Fisタンパク質を20μlの反応容積中に含んでいた。attB1.6部位およびattB2.10部位の使用により、コロニー生成量が改善され、挿入物の平均サイズが増加した。
【０５２０】
B．発現クローンライブラリーの移行
Gatewayライブラリーの移行はBP反応に線状attBおよび超らせん状attP分子を用いた場合に最も効率が高く、ライブラリーDNAの線状化のために制限酵素を用いるといくつかの挿入物が切断される。しかし、線状P分子を用いる場合、BP反応の効率は、限定的な量の超らせん状発現クローンDNA（50ng/20μl反応物）、過剰量の線状attP DNA（450ng〜600ng/20μl反応物）を用い、反応を一晩かけて進行させることによって高めることができる。より多くのBPクロナーゼ（商標）（最大8μl/20μl反応物）およびFisタンパク質を用いることは、出発クローンによる同時形質転換および移行されたライブラリーへの混入を減らすために、出発ライブラリーのより多くを反応させて消失させるのに有用である。
【０５２１】
C．BP反応物のエレクトロポレーション後のコロニー生成量
pENTR201クローン（pDONR201を用いて調製したエントリークローン；図26A〜26C参照）のエレクトロポレーション後のKanコロニー生成量は予想された数の10％であった。これらのデータは、pENTR201-ampエントリークローンDNAを用いたエレクトロポレーションによるampコロニーおよびkanコロニーの生成量の比較に基づく。ampコロニーおよびkanコロニーの生成量は化学的形質転換後は同一であるため、この現象はエレクトロポレーションに特異的である。
【０５２２】
コロニー生成量を増加させるには2種類の方法を用いうる。第1のものはS.O.C.培地の回収容積を増やすことである。これを行ったところ、以下のデータが得られた：
2004532636.tif 000020
【０５２３】
第2の方法は、pDONR201をpDONR212に置き換えることである（図27A〜27C）。pENTR212ampクローンにより生じたkanコロニーは1mlのS.O.C.培地回収を用いた場合はampコロニーに対して80％であり、2mlのS.O.C.培地回収を用いた場合はampコロニーに対して100％であった。
【０５２４】
D．pENTR212クローンの不均一なコロニーサイズ
pENTR201ライブラリークローンは均一なサイズのコロニーを生じるが、pENTR212ライブラリークローンは不均一なサイズのコロニーを生じることが明らかになった。pDONR212の起点を完全なpUC起点へと置換することにより（図28A〜28C）、この問題は解決された。pENTR212ライブラリークローンは低温感受性表現型を示した。詳細には、この種のライブラリーのクローンは30℃ではコロニーを形成しないが、37℃ではコロニーを形成する。複製起点の置換は、新たな起点を元のものと同じ向きに配置した場合には表現型を変化させなかった。しかし、起点を逆の向きに挿入すると温度感受性は大きく低下した（この構築物の描写については図29A〜29Cを参照されたい）。
【０５２５】
E．最初のエントリークローンライブラリーの増幅
pENTR212エントリークローンライブラリーは、挿入物の平均サイズを著しく減少させずに増幅することはできないことが明らかになった。この影響は、起点を完全なpUC起点に置換することによってほとんど解消された。その後、その結果得られたベクターを含む細胞の半固形培地における選択には300μg/mlカナマイシンが必要となった。
【０５２６】
F．単一チューブ反応
エントリークローン中間体の増幅のための別の選択肢としては、「単一チューブ」反応で、BP反応の産物を目的ベクターに直接移行させることが可能である。しかし、単一チューブ反応の効率は低いことがあり、結果も一定しない可能性がある。
【０５２７】
BP反応混合物のエキソヌクレアーゼ処理、エタノール沈殿、LR4バッファー条件（すなわち、51mM Tris-HCl（pH7.5）、1mM EDTA、1mg/mlウシ血清アルブミン、76mM NaCl、7.5mMスペルミジン）を用いたLR反応の設定は、いずれも移行効率および結果の再現性を高めることが示された。場合によっては、エキソヌクレアーゼ処理の段階を省略してもよい。
【０５２８】
ここまで本発明をある程度詳細に、理解を明確にするための図および実施例によって十分に記載してきたが、本発明の範囲またはそのいずれの特定の態様にも影響を及ぼさずに、条件、配合および他のパラメーターの広範囲かつ等価な範囲内で本発明を改変または変更することにより、本発明を実施しうること、ならびにこのような改変または変更が添付の特許請求の範囲内に含まれることが意図されることは、当業者に明らかであると考えられる。
【０５２９】
本明細書において言及されたすべての刊行物、特許および特許出願は、本発明が属する当該分野の当業者のレベルを示しており、これらは、それぞれの個々の刊行物、特許または特許出願が参照として組み入れられるように特定的および個別に示されている場合と同程度に、参照として本明細書に組み入れられる。
【０５３０】
さらに、以下の文書はそれらの全体が参照として本明細書に組み入れられる：1995年6月7日に提出された米国特許出願第08/486,139号（現在は放棄）；1996年6月7日に提出された米国特許出願第08/663,002号（現在は米国特許第5,888,732号）；1998年1月12日に提出された米国特許出願第09/005,476号（現在は米国特許第6,171,861号）；1997年10月24日に提出された米国特許出願第60/065,930号；1998年10月23日に提出された米国特許出願第09/177,387号；1999年4月22日に提出された米国特許出願第09/296,280号（現在は米国特許第6,277,608号）；1999年3月2日に提出された米国特許出願第60/122,389号；1999年3月22日に提出された米国特許出願第60/122,392号；1999年3月23日に提出された米国特許出願第60/126,049号；米国特許出願第09/233,493号（現在は米国特許第6,143,557号）；1999年11月12日に提出された米国特許出願第09/438,358号；2001年4月19日に提出された米国特許出願第60/284,528号；1999年5月28日に提出された米国特許出願第60/136,744号；1999年11月2日に提出された米国特許出願第09/432,085号；2000年2月4日に提出された米国特許出願第09/498,074号；1998年11月13日に提出された米国特許出願第60/108,324号；1999年11月12日に提出された米国特許出願第09/438,358号；2000年3月2日に提出された米国特許出願第09/517,466号；2000年12月11日に提出された米国特許出願第09/732,914号；およびPCT国際公開公報第00/52027号。
【図面の簡単な説明】
【０５３１】
【図１】本発明の1つの一般的な方法を示している。詳細には、第1の核酸分子の集団（例えば、cDNA分子）を標的核酸分子（「第1の標的分子」と表記）と混合する。示された第1の核酸分子の集団の個々の構成要素および/または第1の標的分子は、1つまたは複数の組換え部位を有する。このような部位の1つは、第1の標的分子上に「挿入部位」と表記されている。第1の核酸分子の集団の個々の構成要素は、組換え反応（「第1の組換え」と表記）によって標的分子内に挿入され、選択的には、1つまたは複数の選択、同定または単離の段階を受け、それによって第2の核酸分子の集団（「第2の集団」と表記）を形成する。続いて、第2の核酸分子の集団を、第2の標的核酸分子（「第2の標的分子」と表記）と混合する。続いて、第2の核酸分子の集団の核酸挿入物は、組換え反応（「第2の組換え」と表記）によって第2の標的核酸分子へと移行され、選択的には、1つまたは複数の選択、同定または単離の段階を受け、それによって第3の核酸分子の集団（「第3の集団」と表記）を形成する。
【図２】attB部位に挟まれたcDNAライブラリーの核酸分子の移行による発現クローンの作製のための、本発明の工程の一例を示している。cDNAライブラリーの核酸分子は当初、アンピシリン耐性マーカー（「amp」と表記）、複製起点（「ORI」と表記）、およびベクターの線状化に用いうる部位（「切断部位」と表記）を含む超らせん状プラスミド中に存在する。続いて、cDNAライブラリーの核酸分子を、Fisタンパク質の存在下におけるBP反応により、線状pDONRプラスミド（「pDONOR」とも略記される）（attP部位、複製起点およびカナマイシン耐性マーカー（「kan」と表記）を含む）中に挿入する。この反応によって生じる産物はエントリークローンである。続いて、cDNAライブラリーの核酸分子をLR反応によってエントリークローンから目的ベクターに移行させ、新たな発現クローンを作製することができる。当業者は理解すると考えられるが、cDNAライブラリー以外の核酸分子の集団（例えば、ゲノムライブラリー、合成ライブラリーなど）を同様の工程に用いてもよい。
【図３】attB部位に挟まれたcDNAライブラリーの核酸分子の移行による発現クローンの作製のための、本発明の工程のもう1つの例を示している。この場合には、cDNAライブラリーおよびattP部位ドナー分子は線状である。BPクロナーゼ（商標）により触媒される組換えにより、attL部位に挟まれたライブラリーのcDNA分子が生じる。続いて、cDNA分子をLRクロナーゼ（商標）により触媒される組換えによって目的ベクター中に挿入し、新たな発現クローンを作製する。当業者は理解すると考えられるが、cDNAライブラリー以外の核酸分子の集団を同様の工程に用いてもよい。
【図４】attL1およびattL2部位によって挟まれた核酸分子の挿入およびその後の移行のために用いうる目的ベクターの概略図である。LRクロナーゼ（商標）により触媒される組換えを用いてベクター中に挿入しうる、attL1およびattL2部位によって挟まれたcDNA分子も示されている。その後に、例えば任意のattPドナープラスミドとの組換えを用いて、目的ベクターまたはエントリークローンの新たな集団を作製することができる。例えば、ベクター（例えば、kanとoriとの間）の基本骨格に切断が加えられた線状pDONOR分子を、目的ベクター（例えば、この図に示された第1の標的分子）の作製/再生に用いてもよい。当業者は理解すると考えられるが、cDNAライブラリー以外の核酸分子の集団を同様の工程に用いてもよい。さらに、組換えを受ける分子はいずれも線状でも閉環状でもよい。
【図５】attB部位および核酸切断に用いうる部位（「切断部位2」と表記）によって挟まれたcDNAライブラリーの核酸分子の移行による発現クローンの作製のための、本発明の工程の一例を示している。この例において、切断部位2は、「制限酵素2」と称する制限エンドヌクレアーゼによって切断される部位である。cDNAの集団は、組換えおよび連結を併用することによって移行される。当業者は理解すると考えられるが、cDNAライブラリー以外の核酸分子の集団を同様の工程に用いてもよい。
【図６Ａ−６Ｄ】それぞれが複製起点（ORI）およびカナマイシン耐性マーカー（Kan）を含む、核酸セグメントを示している。これらの遺伝因子のそれぞれは機能に関して特有の方向性があり、それらは矢印によって示されている。
【図７】特定の核酸セグメントを有する核酸分子の選択のために接合伝達を用いる選択工程を示している。この場合にはoriTが接合性DNA伝達（CDT）の起点である。このため、接合時にある細胞から別の細胞に伝達されるのはoriTを含む核酸分子のみと考えられる。当業者は理解すると考えられるが、cDNAライブラリー以外の核酸分子の集団を同様の工程に用いてもよい。
【図８】特定の性質を有するcDNA分子を同定するための、本発明の二段階式の選択およびスクリーニングの工程を示している。本工程の第1の段階の一部として、cDNAライブラリーのcDNA分子を用いて発現クローンを作製する。Gal1プロモーターは、ベクター中に挿入されたcDNAライブラリーの分子の一方の端に位置する。ガラクトース4遺伝子活性化ドメイン（Gal4 AD）をコードする核酸はGal1プロモーターとcDNA挿入物との間に位置する。続いて、発現クローンのライブラリーを酵母細胞に挿入し、「ベイト（bait）」タンパク質と会合するタンパク質（すなわち、「プレイ（prey）」タンパク質）をコードするcDNAを同定するためのツーハイブリッドアッセイを用いて選択を行う。ツーハイブリッドアッセイシステムは、例えば、YavuzerおよびGoding、Gene 165: 93-96 (1995)；Vidalら、米国特許第5,955,280号；およびFieldsら、米国特許第5,283,173号に記載されており、これらのそれぞれの全開示内容は参照として本明細書に組み入れられる。
上記のツーハイブリッド選択工程によって同定されたcDNAライブラリーのcDNAを、続いて、T7プロモーターとcDNA挿入物との間に位置するHIS6タグをコードする核酸を含む別のベクターに移行させる。続いて、これらのベクターを細胞に挿入し、融合タンパク質を発現させ、その結果得られたタンパク質を、相互作用タンパク質と推定されるものを含む抽出物の存在下における免疫沈降によって沈降させる。当業者は理解すると考えられるが、cDNAライブラリー以外の核酸分子の集団を同様の工程に用いてもよい。
【図９】本発明の実施に用いうる組換えクローニング工程の一般的な説明を示している。その目標は、新たなサブクローニングベクターDを、本来のクローニングベクターBと交換することである。すなわち、ある種の態様においては、ADを選択し、かつすべての他の分子（コインテグレートを含む）を除外選択することが望ましい。四角印と丸印は、組換え部位（例えば、loxP部位（loxP部位など）、att部位など）である。さらに、セグメントDは、発現シグナル、タンパク質融合ドメイン、薬剤マーカー、複製起点、またはDNAのマッピングもしくは配列決定のために特殊化された機能を含みうる。コインテグレート分子はセグメントDをセグメントA（挿入物）に隣接して含み、それによってセグメントDにおける機能的エレメントが挿入物と並列されることに注意されたい。このような分子は、セグメントB＋Dにおける選択マーカーを選択することにより、インビトロ（例えば、プロモーターがインビトロ転写/翻訳のための遺伝子と隣接して位置する場合）またはインビボ（例えば、ccdB含有ベクターが増殖可能な細胞における単離の後）において直接用いることができる。当業者は理解すると考えられるが、この一段階式の組換えクローニング工程は、本発明の想定されるいくつかの用途に有用である。
【図１０】本明細書において「GATEWAY（商標）クローニングシステム」と称する組換えクローニングシステムの説明である（図10A）。この図は、本明細書中で「LR反応」または「LRクロナーゼ（商標）反応」とも称する「デスティネーション反応」を介した発現クローンの生成を示している。attL1部位およびattL2部位との間に位置する目的のDNA分子（例えば、遺伝子）を含むkanｒベクター（「エントリークローン」と表記）を、attR1部位とattR2部位との間に位置する毒性遺伝子または「細胞死」遺伝子を含むampｒベクター（「目的ベクター」と表記）と、GATEWAY（商標）LRクロナーゼ（商標）Enzyme Mix（Int、IHFおよびXisの混合物）の存在下で反応させる。25℃で約60分間のインキュベーションの後には、この反応により、attB1部位とattB2部位との間に位置する目的のDNA分子を含むamp'発現クローン、およびkanｒ副産物分子、ならびに中間産物が生じる。続いて、反応混合物を宿主細胞（例えば、大腸菌）に形質転換により導入し、細胞をアンピシリン含有培地にプレーティングしてampｒコロニーを摘出することにより、目的の核酸分子を含むクローンを選択することもできる。
図10Bは、本明細書中で「BP反応」または「BPクロナーゼ（商標）反応」とも称する「エントリー反応」を介したエントリークローンの生成を示している。この図に示した例では、attB1部位とattB2部位との間に位置する目的のDNA分子（例えば、遺伝子）を含むampｒ発現ベクターを、attP1部位とattP2部位との間に位置する毒性遺伝子または「細胞死」遺伝子を含むkanｒドナーベクターと、GATEWAY（商標）BPクロナーゼ（商標）Enzyme Mix（IntおよびIHFの混合物）の存在下で反応させる。25℃で約45分間のインキュベーションの後には、この反応により、attL1部位とattL2部位との間に位置する目的のDNA分子を含むkanｒエントリークローン、およびampｒ副産物分子が生じる。続いて、エントリークローンを宿主細胞（例えば、大腸菌）に形質転換により導入し、細胞をカナマイシン含有培地にプレーティングしてkanｒコロニーを摘出することにより、エントリークローン（このため目的の核酸分子）を含むクローンを選択することもできる。この図はkanｒドナーベクターの使用の一例を示しているが、本明細書中に考察するように、ゲンタマイシン耐性マーカーまたはテトラマイシン耐性マーカーなどの他の選択マーカーを含むドナーベクターを用いることも可能である。
【図１１】さまざまな発現クローンを作製するための、エントリークローンからの核酸分子の、さまざまな種類の目的ベクターへのクローニングの概略説明図である。図10に示したLR反応を介した、所定のエントリークローンとさまざまな種類の目的ベクター（図示せず）との間の組換えにより、さまざまな用途および宿主細胞種に用いるための種々の発現クローンが生じる。
【図１２】発現クローンを作製するための目的ベクター中へのサブクローニング後のattB1部位およびattB2部位の配列を示している。それぞれの組換え部位の1つのリーディングフレームが示されている。各部位の7塩基対の重複領域も示されている。
【図１３Ａ−１３Ｃ】本発明の方法および組成物に用いるのに適した数多くのatt部位（配列番号：1〜36）を示している。配列は慣例的に5'から3'の向きに記載されている。各部位の7塩基対の重複領域は下線によって示されている。
【図１４】組成物および本発明の方法を用いてエントリークローンを作製するための4通りの手法に関する概略説明図である：（1）制限酵素およびリガーゼを用いる；（2）attLエントリーベクター中に作製されたcDNAライブラリーから出発する；（3）BP反応を介してattB発現ベクター中に作製されたライブラリーからの発現クローンを用いる；および（4）BP反応を介した、末端にattB部位を有するPCR断片の組換えクローニング。アプローチ3および4は、kanｒ、genｒ、tetｒなどの選択マーカーを有するエントリークローンをもたらすドナーベクター（ここにはattPベクター、例えば、pDONR201（インビトロゲン社、カールズバッド、CA, カタログ番号11798-014）またはpDONR207（図19A〜19C参照）などとして示されている）との組換えに依拠する。エントリークローンの作製のためにさまざまな別の方法（例えば、トポイソメラーゼクローニング）を用いてもよい。
【図１５】BP反応を用いるPCR産物のクローニングのための方法の概略説明図である。25塩基対の末端attB部位（＋4つのグアニン残基）を有するPCR産物が、BP反応のための基質として示されている。遺伝子のattB-PCR産物とドナーベクター（これはkanｒを運ぶエントリーベクターを供与する）との組換えにより、PCR産物を含むエントリークローンが作製される。
【図１６】エントリーベクターpENTR1Aのプラスミド基本骨格（図16A）およびヌクレオチド配列（図16B、配列番号：37）を示している。種々のエントリーベクターに関する、プラスミドの詳細な地図、配列ならびに構造的および機能的特徴の概略説明図は、1998年10月23日に提出された米国特許出願第09/177,387号；2000年3月2日に提出された米国特許出願第09/517,466号；およびPCT国際公開公報第00/52027号に開示されており、それらの開示内容はその全体が参照として本明細書に組み入れられる。
【図１７Ａ−１７Ｄ】デスティネーションプラスミドpDEST1の物理的地図（図17A）およびヌクレオチド配列（図17B〜17D、配列番号：38）を示す。
【図１８Ａ−１８Ｃ】BP反応においてゲンタマイシン耐性マーカーを供与するドナープラスミドpDONR207の物理的地図（図18A）およびヌクレオチド配列（図18B〜18C、配列番号：39）を示す。
【図１９】LR組換え反応を行うことによって2つの核酸セグメントをクローニングするための本発明の使用に関する概略図である。
【図２０Ａ】プラスミド中に挿入された核酸によってコードされるポリペプチドにC末端融合物を付与するための構築物を示したプラスミド地図である。SupFはサプレッサー機能をコードする。このため、supFが発現されると、GUS-GST融合タンパク質が産生される。この分子の変形物は、GUS（または任意の他の核酸セグメント）が本質的にはあらゆるポリペプチドと融合したものを発現させるために用いうる。
【図２０Ｂ】遺伝子の抑制および発現の両方を制御するための方法の概略図である。T7 RNAポリメラーゼ遺伝子は、チロシンコドンの代わりに、1つまたは複数（2つの場合を示している）のアンバー終止コドン（「am」と表記）を含む。誘導性プロモーターからの漏出性（非誘導性）転写では、活性のあるT7 RNAポリメラーゼの産生を引き起こすのに十分なsupFは生じない。誘導を受けると、十分なsupFが産生されて活性のあるT7 RNAポリメラーゼが生じ、これがsupFの発現を増大させ、それがさらにT7 RNAポリメラーゼの発現を増大させる。T7 RNAポリメラーゼはさらに遺伝子の発現を誘導する。さらに、supFの発現は、介在性アンバー終止コドンの抑制により、遺伝子発現産物へのC末端タグの付加をもたらす。
【図２１】関心対象の遺伝子のN末端および/またはC末端融合物の作製のための構築物を示したプラスミド地図である。丸数字はアンバー、オーカーまたはオパール終止コドンを表している。これらの終止コドンの抑制は、N末端、C末端または両末端での融合タグの発現をもたらす。抑制がなければ、天然型のタンパク質が産生される。
【図２２】Fisによる一部位LR組換え反応の刺激に関する実験を示している。反応（20μl）は、100fmolのpATTL2および100fmolのpATTR2-BamHI基質を用いて行った（以下の実施例9における「実験方法」の項参照）。所定のFis濃度で観察された組換え産物の比率をXisの3つの異なる濃度に対してプロットした。産物の比率は、産物バンドにおける放射能の量を基質バンドおよび産物バンドにおける放射能の量の合計によって除算することによって決定した。
【図２３】Fisによる二部位BP組換え反応の刺激に関する実験を示している。反応（20μl）は、100fmolのpDONR201および100fmolのpBGFP2-XhoI基質を用いて行った（以下の実施例9における「実験方法」の項参照）。所定のFis濃度で観察された組換え産物の比率を、NaClの2つの異なる濃度に対してプロットした。産物の比率は、産物バンドにおける放射能の量を基質、コインテグレートおよび産物のバンドにおける放射能の量の合計によって除算することによって決定した。
【図２４】Fisによる二部位BP組換え反応の刺激に対する塩濃度の影響に関する実験を示している。反応（20μl）は、100fmolのpDONR201および100fmolのpBGFP2-XhoI基質を用いて行った（以下の実施例9における「実験方法」の項参照）。所定のNaCl濃度で観察された組換え産物の比率を、Fisの3つの異なる濃度に対してプロットした。示したデータは3回の実験の平均であり、標準偏差をエラーバーとして示している。
【図２５】Fisによる一部位BP組換え反応の刺激が比較的低いInt濃度でも認められることを示した実験を示している。反応（20μl）は、100fmolのpATTP2および100fmolのpATTB2-HindIII基質を用いて行った（以下の実施例9における「実験方法」の項参照）。所定のInt濃度で観察された組換え産物の比率を、3つの異なるFis濃度に対してプロットした。
【図２６Ａ−２６Ｃ】デスティネーションプラスミドpDONR201の物理的地図（図26A）およびヌクレオチド配列（図26B〜26C、配列番号：40）を示す。
【図２７Ａ−２７Ｃ】デスティネーションプラスミドpDONR212物理的地図（図27A）およびヌクレオチド配列（図27B〜27C、配列番号：41）を示す。
【図２８Ａ−２８Ｃ】完全長のpUCプラスミド由来の複製起点を含む、デスティネーションプラスミドpDONR212(F)の物理的地図（図28A）およびヌクレオチド配列（図28B〜28C、配列番号：42）を示す。
【図２９Ａ−２９Ｃ】は、完全長のpUCプラスミド由来の複製起点をpDONR212(F)とは逆の向きに含む、デスティネーションプラスミドpDONIR212(R)の物理的地図（図29A）およびヌクレオチド配列（図29B〜29C、配列番号：43）を示す。
【図３０】組換え部位に挟まれたcDNA分子を含む環状化ベクターの作製のための、本発明の工程の一例を示している。詳細には、一部位組換えを用いて、cDNA分子を線状化ベクターに結合させる。続いて、組換え部位を含まないcDNA分子の一方の末端をベクターの遊離端と結合させて分子を環状化する。環状化は、相同組換え、アニーリング、連結またはトポイソメラーゼ（例えば、ワクシニアウイルストポイソメラーゼ；米国特許第5,766,891号を参照、その全開示内容は参照として本明細書に組み入れられる）の使用を含む、任意のさまざまな手段によって行いうる。
【図３１】2つの核酸セグメントを標的核酸分子に挿入し、その後にこれらの2つの核酸セグメントを連結して環状核酸分子を作製するための、本発明の工程の一例を示している。「RS」という略号は組換え部位のことである。さらに、RS1およびRS2は組換え特異性の異なる組換え部位である。核酸セグメントAおよびBは、任意のさまざまな手段（例えば、相同組換え、アニーリング、部位特異的組換え、トポイソメラーゼクローニングなど）によって相互に連結されうる。核酸セグメントAおよびBのいずれか一方または両方は、例えば、1つまたは複数のライブラリー（例えば、コンビナトリアルライブラリー）の個々の構成要素であってよい。さらに、多くの態様において、相互に連結される核酸セグメントは、組換えクローニングによる、結合したセグメントの他の標的核酸分子への移行を可能にする組換え部位によって挟まれると考えられる。
【図３２】組換え反応を用いて、核酸分子を支持体に結合させてそれから除去することができる、本発明の工程の一例を示している。多くの態様において（例えば、ビーズを単一チューブ反応に用いる場合）、第1の核酸分子の集団は、第2の標的分子に対して過剰（例えば、2、5、10、15、20倍過剰など）であると考えられる。
【図３３】組換え反応を用いて、核酸分子を支持体に結合させてそれから除去することができる、本発明の工程のもう1つの例を示している。この場合も、多くの態様において（例えば、ビーズを単一チューブ反応に用いる場合）、第1の核酸分子の集団は第2の標的分子に対して過剰（例えば、2、5、10、15、20倍過剰など）であると考えられる。
【図３４Ａ−３４Ｄ】attBクローニングベクターpCMVSPORT6.0の物理的地図（図34A）およびヌクレオチド配列（図34B〜34D、配列番号：44）を示す。
【図３５】支持体に結合した核酸分子を組換え反応を用いて遊離させる、本発明の工程のもう1つの例を示している。制限エンドヌクレアーゼは「RE」と略記されている。ストレプトアビジンは「SA」と略記されている。複製起点は「ori」と略記されている。カナマイシン耐性マーカーは「kan」と略記されている。アンピシリン耐性マーカーは「amp」と略記されている。ターミナルトランスフェラーゼを用いて、ビオチンを、制限エンドヌクレアーゼによって線状化されたベクターに結合させる。
【図３６】支持体に結合した核酸分子を組換え反応を用いて遊離させる、本発明の工程のさらにもう1つの例を示している。略号は上記の図35の場合と同じである。
【図３７】支持体に結合した核酸分子を組換え反応を用いて遊離させる、本発明の工程の別の例を示している。略号は上記の図35の場合と同じである。制限エンドヌクレアーゼ3および4は、attP部位を制限してattLおよびattR部位が生じさせるものとして示されている。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１７Ｃ】
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【図１７Ｄ】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１８Ｃ】
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【図１９】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６Ａ】
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【図２６Ｂ】
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【図２６Ｃ】
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【図２７Ａ】
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【図２７Ｂ】
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【図２７Ｃ】
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【図２８Ａ】
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【図２８Ｂ】
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【図２８Ｃ】
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【図２９Ａ】
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【図２９Ｂ】
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【図２９Ｃ】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４Ａ】
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【図３４Ｂ】
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【図３４Ｃ】
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【図３４Ｄ】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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