(57)【要約】ａ）ラクトースまたはラクトース含有開始材料を加水分解してガラクトースとグルコースを得る工程；ｂ）得られたガラクトースをＬ−アラビノースイソメラーゼで異性化する工程；及びｃ）産物と非変換化合物をクロマトグラフィーで分離して非変換化合物をリサイクルする工程；を含む、タガトースの製造方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）ラクトースまたはラクトース含有開始材料を加水分解してガラクトースとグルコースを得る工程；
ｂ）得られたガラクトースをＬ−アラビノースイソメラーゼで異性化する工程；及び
ｃ）産物と非変換化合物をクロマトグラフィーで分離して非変換化合物をリサイクルする工程；
を含む、タガトースの製造方法。
【請求項２】
非変換ラクトースがクロマトグラフィーにより分離され、加水分解のための工程ａ）にリサイクルされる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
非変換ガラクトースがクロマトグラフィーにより分離され、異性化のための工程ｂ）にリサイクルされる、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
工程ａ）及びｂ）が一つのリアクターで実施される、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
ガラクトースがＤ−ガラクトースであり、タガトースがＤ−タガトースである、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
工程ｂ）で使用されるＬ−アラビノースイソメラーゼが好熱性である、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
工程ａ）で使用されるラクターゼが好熱性である、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
工程ｂ）で使用されるＬ−アラビノースイソメラーゼが、Bacillus属、Sulfolobus属、Thermoanaerobacter属、及びThermotoga属からなり、これらに制限されない群から由来する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項９】
Ｌ−アラビノースイソメラーゼが、Thermoanaerobacter mathraniiから由来する、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
Ｌ−アラビノースイソメラーゼが、Thermoanaerobacter mathranii DSM 11426から由来する、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
工程ａ）で使用されるラクターゼが、Bacillus属、Sulfolobus属、Thermoanaerobacter属、Thermus属、及びPyrococcus属からなり、これらに制限されない群から由来する、請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
一つ以上の使用される酵素が固定化されている、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
工程ａ）及び／またはｂ）で使用される温度が４０−９０℃である、請求項１から１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記温度が６０−９０℃である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記温度が６０−８０℃である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記温度が６５−７０℃である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記温度が６５℃である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
使用されるＬ−アラビノースイソメラーゼがThermoanaerobacter mathraniiから由来し、使用されるラクターゼがSulfolobus solfataricusから由来する、請求項４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タガトース、特にＤ−タガトースの酵素的製造に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｄ−タガトースは、非齲食原生の前生物性の特性を有する多目的な低カロリーバルク甘味料である。Ｄ−タガトースは、食品及び機能的食品、並びに医薬品において使用できる。米国特許第４７８６７２２号、第５３５６８７９号、及び第５４４７９１７号参照。
【０００３】
米国特許第５００２６１２号及び第５０７８７９６号によれば、Ｄ−タガトースは、ラクターゼを使用して、ラクトースまたはラクトース含有物質をガラクトースとグルコースの混合物に加水分解し、任意にグルコースを除去し、その後ガラクトースのタガトースへの化学的異性化によって製造されている。
【０００４】
米国特許第６０５７１３５号は、ガラクトースとグルコースの混合物を調製するために加水分解する、チーズホエーまたはミルクからのＤ−タガトースの製造を記載している。グルコースは、グルコースの発酵によってガラクトースから分離され、Ｌ−アラビノースイソメラーゼを使用して異性化にかけられる。
【０００５】
【特許文献１】
米国特許第４７８６７２２号明細書
【特許文献２】
米国特許第５３５６８７９号明細書
【特許文献３】
米国特許第５４４７９１７号明細書
【特許文献４】
米国特許第５００２６１２号明細書
【特許文献５】
米国特許第５０７８７９６号明細書
【特許文献６】
米国特許第６０５７１３５号明細書
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明の第一の特徴点は、ａ）ラクトースまたはラクトース含有開始材料を加水分解してガラクトースとグルコースを得る工程、ｂ）得られたガラクトースをＬ−アラビノースイソメラーゼで異性化する工程、及びｃ）産物と非変換化合物をクロマトグラフィーで分離して非変換化合物をリサイクルする工程を含む、タガトースの製造方法が提供される。
【０００７】
本発明の第二の特徴点では、工程ａ）及びｂ）が一つのリアクターで実施される方法が提供される。
【０００８】
本発明のさらなる特徴点では、Ｄ−タガトースの製造方法が提供される。
【０００９】
本発明のまたさらなる特徴点では、工程ｂ）で使用されるＬ−アラビノースイソメラーゼが好熱性である方法が提供される。
【００１０】
本発明のまたさらなる特徴点では、工程ａ）で使用されるラクターゼが好熱性である方法が提供される。
【００１１】
本発明のまたさらなる特徴点では、工程ａ）及び／またはｂ）で使用される温度が４０−９０℃である方法が提供される。
【００１２】
本発明のまたさらなる特徴点は、添付の特許請求の範囲に示されている。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
タガトースの酵素的製造方法においてクロマトグラフィー分離とリサイクルの使用が可能であることが、驚くべきことに見出された。それによって、より高い収率とより清潔な方法が達成される。全収率、並びに各サイクルでの収率は、より高いものである。
【００１４】
この方法を使用して、いずれの非変換ラクトース及びガラクトースをもリサイクルし使用することが可能である。さらに、産物、タガトース及びいずれかの副産物、グルコースをガラクトースから分離し、他の目的のためグルコースを使用することも可能である。
【００１５】
開始材料は、いずれのラクトースまたはラクトース含有物質であっても良い。
【００１６】
ラクトースは、チーズ製造から得られる副産物である。この方法は、ラクトースという過剰に生産される低価値産物を、ヒトに対して有益な特性を有する高価値産物に変換する機会を与える。これは、ラクトースの一つの使用方法である。ラクトースの利用可能性についての機会は、長期に亘り探求されている。
【００１７】
この方法は、ラクトースの加水分解、ガラクトースのタガトースへの酵素的変換、及び任意にクロマトグラフィー分離と非変換産物のリサイクルを含む。
【００１８】
化学物質等の消費は低い。
【００１９】
副産物の生産は低い。たった一つの副産物、即ちグルコースのみが生産され、それはグルコースシロップ／パウダーとして食品に使用できる。
【００２０】
ラクトースの加水分解、並びにガラクトースの異性化のための酵素を含む一つのリアクターで、全反応を実施することが可能である。それによって工程ａ）及び工程ｂ）が組み合わされる。
【００２１】
この実施において、全反応は、ユニット当たりの収率の点で改良される。ガラクトースは、そのタガトースへの異性化によってリアクターから連続的に除去され、かくしてガラクトースの濃度は減少するが、さもなければそれはラクターゼを阻害し、ラクトースのガラクトースとグルコースへの変換の制限を引き起こす。高い反応温度のため、高濃度（Ｂｒｉｘ）でこの方法を実施することが可能である。蒸発能力は省かれ、それは再び資金と操作性に関して改良された経済性を引き起こすであろう。さらに増大した糖濃度は、保存料の使用を減少する点で効果を有する。さらに、第一のクロマトグラフィー分離は不必要となり、それは再び資金と操作性に関して改良された経済性を意味するであろう。
【００２２】
特に、ラクトースのグルコースとガラクトースへの酵素的変換、並びに同じ酵素リアクターでのガラクトースのタガトースへの異性化が示されている。T. mathraniiから得られるＬａｃＳラクターゼ酵素及びＬ−アラビノースイソメラーゼは、同一の金属イオン、バッファー、及び温度条件の下で機能できることが、初期試験により確認された。次いでこの原理は、固定化ラクターゼ及び固定化イソメラーゼでの、８００ｍＭラクトース溶液（２８％）のインキュベーションによって試験された。ＨＰＬＣによって、ラクトース、グルコース、ガラクトース、及びタガトースの各含量について、サンプルが分析された。２４時間のインキュベーションの間で、グルコースの濃度は約８００ｍＭに増大し、全てのラクトースが切断されたことを示した。ガラクトースとタガトースの濃度は、約３００ｍＭに直線的に増大した。従って、変換の度合いは、（３００／８００）×１００％＝３８％であった。
【００２３】
さらなる酵素が同じリアクターに導入でき、それはコンビリアクターと称される。
【００２４】
タガトースは特にＤ−タガトースであり、それは食品業界で高い需要が存する。
【００２５】
全てのラクターゼが工程ａ）で使用できる。例としては、Bacillus属、Sulfolobus属、Thermoanaerobacter属、Thermus属、及びPyrococcus属からなる群から由来する酵素が挙げられる。
【００２６】
全てのＬ−アラビノースイソメラーゼが工程ｂ）で使用できる。例としては、Bacillus属、Sulfolobus属、Thermoanaerobacter属、及びThermotoga属からなる群から由来する酵素が挙げられる。
【００２７】
前記酵素はいずれの形態でも使用できる。例えば、固定化酵素を使用することが可能である。
【００２８】
Biotechnological Institute, Denmarkは、使用可能なラクターゼ及びＬ−アラビノースイソメラーゼをデリバリーできる。
【００２９】
Biotechnological Institute, Denmarkは、Thermoanaerobacter mathranii、Thermoanaerobacter mathranii DSM 11426から由来する酵素を見出し試験した。彼らは、その発明を包含する米国特許出願０９／９０５，１０８を出願している。
【００３０】
Ｄ−ガラクトースに対するT. mathraniiについてのＫｍ値は、Aerobacter aerogenes、Bacillus amyloliquefaciens、Arthrobacter種、及びLactobacillus pentosusのような一般的なＬ−アラビノースイソメラーゼ生産生物から得られる酵素についての値より小さい。それ故、T. mathraniiは、より優れたアフィニティーを有する。
【００３１】
この最後に言及された酵素は、好熱性である。
【００３２】
好熱性酵素を使用する付加的な利益は、ラクトースとグルコースの可溶性がより高くなる高い反応温度を使用することが可能なことである。これは、より濃縮化産物が、本発明の酵素的方法で使用できることを意味する。これはさらに、より低い水分消費とより低い蒸発水分を意味する。これは、技術的な利益、及び加熱と冷却工程のストリームについての水とエネルギーのより低い必要性を与える。
【００３３】
好熱性酵素の使用は、さらにより高温での操作を可能にする。これは、ダメージを与える微生物の汚染の危険を減少するためより好適な衛生性を導く。さらに、ガラクトースのタガトースへの増大した変換は、アラビノースからリブロースへの変換と比較して、より高温で達成される。これらに加えて、より容易なフロー、及びより迅速な濾過のような技術的有益性もが存在するであろう。
【００３４】
かくして、工程ａ）及び／または工程ｂ）において高温での最適な収率を有する酵素を使用することが好ましい。これは通常、より迅速な反応を与えるであろう。さらに、もし酵素が好熱性または超好熱性であるならば、例えば通常の産業で普通使用される殺菌温度、または１００℃を超える温度といった高温を使用して、システムを清潔にすることが可能である。工程ａ）とｂ）の温度の間で全く差異が存在しないまたはわずかな差異のみ存在するならば、冷却及び加熱のためのエネルギーが減少する。かくして、この生産方法は、６０℃を超える温度で稼働できる。これは、微生物学的、並びに加熱及び冷却のためのスチームと塩水の消費について非常に意味を有する。
【００３５】
工程ａ）及び／またはｂ）で使用される温度は、４０−９０℃である。通常は６０−９０℃である。好ましくはこの温度は６０−８０℃、より好ましくは６５−７０℃、最も好ましくは６５℃である。しかしながら、この温度は選択された酵素に依存し、工程ａ）とｂ）で異なっても良い。上述のように、一つのリアクターで同時に両方の工程を実施することを含むいくつかの利点が、両工程で同じ温度を使用することによって達成される。
【００３６】
ガラクトースのタガトースへの化学的変換に対して、本発明の方法は、糖について最適なｐＨ値で稼働できる。これは、糖の分解産物の生産を有意に減少する。その結果、回収と経済性が改良される。典型的なｐＨ値は約７．０である。利用可能なｐＨ値及び他の反応パラメーターは、例えば米国特許第６０５７１３５号に見出される。Yamanaka, K及びWood, W.A. (1996) Methods in Enzymology 9: 596-602は、例えばＤ−ガラクトースからケトースを生産できるＬ−アラビノースイソメラーゼ酵素を生産する数多くの乳酸細菌を掲載している。
【００３７】
シロップ形態での本発明の産物は、タガトースシロップを直接使用できるほど純粋である。従来は、産物を精製すること、例えば不純なシロップを結晶化し、それを再び溶解または可溶化することが必要であった。
【００３８】
前述のように、Ｄ−タガトースは、ラクトース含有供給源（例えばチーズホエー、カゼインホエー、またはミルク）から製造できる。ラクトースを、固定化ラクターゼであることができるラクターゼにより、等量のガラクトースとグルコースに加水分解する。
【００３９】
ガラクトースは好ましくは、クロマトグラフィーによりグルコースから分離される。加水分解されていないラクトースが分離され、酵素カラムにリサイクルされても良い。ガラクトースは、任意に固定化されたＬ−アラビノースイソメラーゼによりタガトースに異性化される。異性化されていないガラクトースは、クロマトグラフィーにより分離されてリサイクルされて良い。Ｄ−タガトースを含む分画が結晶化される。その結晶が、母液から分離されて乾燥される。タガトースが豊富な母液は、リサイクルされて再結晶化されて良い。ヒトの食料品または他の目的でのシロップとして、生産されたタガトースを直接使用することも可能である。
【００４０】
かくして、一つまたは二つのリアクターで、高い収率で非常に純粋な形態で、タガトースを生産するためのクロマトグラフィーと組み合わせた有効な酵素的方法が見出された。この方法は、好熱性／超好熱性酵素で実施された場合、特に有利である。
【００４１】
タガトースの生産のためのこの新規な方法は非常に有効であり、非変換産物のリサイクルと組み合わされた特定の酵素的変換のため清潔である。この方法は、非常に有効であり、環境に優しい。
【実施例】
【００４２】
実施例１
再循環でのラクトースの加水分解
再循環でのガラクトースの異性化
１．限外濾過に引き続く結晶化によって、ホエーからラクトースを生産する；
２．水中のラクトースの溶液（８−４０％ＳＤ）を、高温または低温で固定化ラクターゼにより加水分解する（それぞれAspergillus oryzaeまたは好熱性生物から得られる酵素による）；
３．クロマトグラフィーにより、グルコースとガラクトースを分離する。供給物の濃度に依存して、例えば蒸発により濃縮することが必要であっても良い；
４．ラクトースと、存在すればガラクトオリゴ糖を、固定化酵素を含有するカラムにリサイクルする；
５．もしリサイクルループにおけるオリゴ糖の濃度があまりに高ければ（加水分解が十分実施されていない）、システムを流出する；
６．グルコースとガラクトースを含有する分画を、固定化ガラクトースイソメラーゼ（好熱性生物由来）により異性化する；
７．混合物を例えば蒸発により濃縮する；
８．タガトースをクロマトグラフィーにより分離する；
９．タガトース分画を濃縮し、結晶化しても良い；
１０．グルコース分画を、シロップとして販売するために濃縮しても良いし、さらに加工しても良い；
１１．ガラクトース分画を、イソメラーゼカラムにリサイクルする。
【００４３】
実施例２
再循環しないラクトースの加水分解、引き続き異性化
１．限外濾過に引き続く結晶化によって、ホエーからラクトースを生産する；
２．水中のラクトースの溶液（８−４０％ＳＤ）を、固定化ラクターゼ（Aspergillus oryzae由来の酵素）によって加水分解する；
３．約４６％のグルコース、４６％のガラクトースを含む混合物を、固定化ガラクトースイソメラーゼ（好熱性生物由来）を含むカラムに通す。約３０％のガラクトースを、タガトースに変換する；
４．産物を、濃縮とクロマトグラフィー分離により３の分画に分離する：
・第１分画は、主に非変換ガラクトースを含む。この分画を、ガラクトースイソメラーゼカラムにリサイクルする；
・第２分画は、主にタガトースを含む。この分画は結晶化のために濃縮され、またはシロップとして市販される；
・第３分画は、主にグルコースを含むが、ラクターゼ酵素により生産されるガラクトオリゴ糖、並びに非変換ラクトースを含む。この分画は、シロップとしての市販のため、または結晶化若しくは乾燥のようなさらなる加工のため濃縮される。
【００４４】
実施例３
一つのリアクターでの加水分解と異性化
１．限外濾過に引き続く結晶化によって、ホエーからラクトースを生産する；
２．水中のラクトースの溶液を、固定化ラクターゼとＬ−アラビノースイソメラーゼを含むカラムに通す；
３．産物を、濃縮とクロマトグラフィー分離により３の分画に分離する：
・第１分画は、主に非変換ガラクトースを含む。この分画を、酵素的変換のためリサイクルする；
・第２分画は、主にタガトースを含む。この分画は結晶化のために濃縮され、またはシロップとして市販される；
・第３分画は、主にグルコースを含むが、ラクターゼ酵素により生産されるガラクトオリゴ糖、並びに非変換ラクトースを含む。この分画は、シロップとしての市販のため、または結晶化若しくは乾燥のようなさらなる加工のため濃縮される。
【００４５】
実施例４
固定化ラクターゼ及び固定化イソメラーゼでの、ラクトースのタガトースへの一反応リアクターでの変換
Sulfolobus solfataricus由来のβ−グリコシダーゼコード遺伝子(Moracci M, Ciaramella M, 及びRossi M. [2001] Methods in Enzymology vo. 330, p. 201-15)を、大腸菌でクローン化し発現した。この遺伝子を、Sulfolobus solfataricus株Ｐ２由来の精製染色体ＤＮＡを使用して、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により単離した。ＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩについてのさらなる制限部位を含むプライマーをデザインし、断片についての完全なコード配列を生成し、それを標準的な発現プラスミドｐＥＴ３ａ(Novagen)にクローン化した。
【００４６】
酵素を発現する大腸菌細胞を培養し、遠心分離により回収し、フレンチプレッシャーセルで溶解し、米国特許第４，３５４，１０５号に記載されたようにグルタルアルデヒドとポリエチレンイミンで架橋した。固定化酵素を、遠心分離とペレットの凍結乾燥により回収した。固定化ラクターゼの活性は、１５００ユニット／乾燥重量ｇであった。１ユニットは、３０−％（ｗ／ｖ）のラクトースの溶液における、６５℃で１分当たり１マイクロモルのグルコースを放出する酵素の量として定義された。
【００４７】
Thermoanaerobacter mathraniiから得たＬ−アラビノースイソメラーゼ遺伝子を、米国特許出願０９／９０５．１０８(Biotechnological Institute, Denmark)に記載されたように、クローン化して大腸菌で発現した。
【００４８】
酵素を発現する大腸菌細胞を培養し、遠心分離により回収し、フレンチプレッシャーセルで溶解し、米国特許第４，３５４，１０５号に記載されたようにグルタルアルデヒドとポリエチレンイミンで架橋した。固定化酵素を、遠心分離とペレットの凍結乾燥により回収した。固定化Ｌ−アラビノースイソメラーゼの活性は、５０ユニット／乾燥重量ｇであった。１ユニットは、３０−％（ｗ／ｖ）のガラクトースの溶液における、６５℃で１分当たり１マイクロモルのＤ−タガトースを生産する酵素の量として定義された。
【００４９】
２０ｍｇの固定化ラクターゼ、８０ｍｇの固定化イソメラーゼ、０．３０ｇのラクトース（３０％、８７５ｍＭ）、２５ｍＭのＫ−マレアートバッファー、ｐＨ６．９、及び５ｍＭのＭｎＣｌ２を含む１ミリリットルアッセイ混合物を、６５℃でインキュベートした。酵素を含まないコントロールサンプルを同様に処理した。定期的にサンプルを取りだし、グルコース、ガラクトース、及びタガトースの濃度を、Aminex HPX-87Cカラム(Bio-Rad)と屈折率検出器(Waters 410)を使用する高圧液体クロマトグラフィーにより測定した。移動相を脱イオン化し、水を脱気し、カラム温度は８５℃であり、流速は０．６ｍｌ／分であった。
【００５０】
図４に示されるように、グルコース濃度は２４時間で約８００ｍＭに増大し、ほぼ全てのラクトースがガラクトースとグルコースに加水分解されたことを示した。タガトースの濃度は２４時間で約３００ｍＭに直線的に増大し、３００ｍＭ／８００ｍＭ＝３８％の生物学的変換を示した。
【００５１】
表
S. solfataricus由来の固定化ｌａｃＳラクターゼと、T. mathranii由来のａｒａＡイソメラーゼでの、ラクトースのタガトースへの変換
【表１】
2004535205.tif 000002
【図面の簡単な説明】
【００５２】
【図１】図１は、実施例１の方法を模式的に示す図である。
【図２】図２は、実施例２の方法を模式的に示す図である。
【図３】図３は、実施例３の方法を模式的に示す図である。
【図４】図４は、実施例４の結果を示す図である。
【図１】
2004535205.tif 000003
【図２】
2004535205.tif 000004
【図３】
2004535205.tif 000005
【図４】
2004535205.tif 000006
【国際公開パンフレット】
2004535205.tif 000007
2004535205.tif 000008
2004535205.tif 000009
2004535205.tif 000010
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2004535205.tif 000021
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2004535205.tif 000024
2004535205.tif 000025
2004535205.tif 000026
【国際調査報告】
2004535205.tif 000027
2004535205.tif 000028