(57)【要約】（ａ）エピソーム維持系、（ｂ）強力なプロモーター／エンハンサー、（ｃ）タンパク質トランスアクチベーション系、および（ｄ）異種タンパク質をコードしているＤＮＡ：を含んでなる哺乳動物細胞遺伝子発現ベクター系。エピソーム維持およびタンパク質トランスアクチベーション系は、細胞発現系内の同じか異なるプラスミドに配置されるサブ要素を含めることができる。
2004509642.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数のプラスミドを含有し、そして
ａ．エピソーム維持系、
ｂ．強力なプロモーター／エンハンサー、
ｃ．タンパク質トランスアクチベーション系、および
ｄ．異種タンパク質をコードしているＤＮＡ：
を含んでなる、哺乳動物細胞遺伝子発現ベクター系。
【請求項２】
エピソーム維持系が要素ｏｒｉＰ要素およびＥＢＮＡ１発現遺伝子を含有する、請求項１の系。
【請求項３】
ｏｒｉＰ要素およびＥＢＮＡ１発現遺伝子が同じプラスミドに存在する、請求項１の系。
【請求項４】
ｏｒｉＰ要素およびＥＢＮＡ１発現遺伝子が別々のプラスミドに存在する、請求項１の系。
【請求項５】
ｏｒｉＰ要素がプラスミドに存在し、そしてＥＢＮＡ１タンパク質が宿主細胞中に存在する、請求項１の系。
【請求項６】
強力プロモーター／エンハンサーがＣＭＶである、請求項１の系。
【請求項７】
タンパク質トランスアクチベーション系がＴＡＴおよびＴＡＲ要素の両方を含む、請求項１の系。
【請求項８】
ＴＡＴおよびＴＡＲ要素が同じプラスミドに存在する、請求項７の系。
【請求項９】
ＴＡＴおよびＴＡＲ要素が別々のプラスミドに存在する、請求項７の系。
【請求項１０】
ＴＡＲ要素がプラスミドに存在し、そしてＴＡＴ要素が発現細胞中に存在する、請求項７の系。
【請求項１１】
タンパク質トランスアクチベーション系がＢＭＬＦ１タンパク質を含む、請求項１の系。
【請求項１２】
ＢＭＬＦ１遺伝子が同じプラスミドに存在する、請求項１１の系。
【請求項１３】
ＢＭＬＦ１遺伝子が別々のプラスミドに存在する、請求項１１の系。
【請求項１４】
ＢＭＬＦ１タンパク質が細胞において発現される、請求項１１の系。
【請求項１５】
異種タンパク質が、ＩＬ−２ＳＡおよびＩＬ−４Ｒからなる群から選ばれる、請求項１の発現ベクター系。
【請求項１６】
哺乳動物細胞系が霊長類由来である、請求項１の系。
【請求項１７】
請求項１の哺乳動物遺伝子発現ベクター系を含んでなる哺乳動物細胞系。
【請求項１８】
細胞系がＨＫＢ１１である、請求項１７の哺乳動物細胞系。
【請求項１９】
細胞系が２９３ＥＢＮＡである、請求項１７の哺乳動物細胞系。
【請求項２０】
細胞系が２９３細胞系である、請求項１７の哺乳動物細胞系。
【請求項２１】
請求項１の細胞系を用いて異種タンパク質を発現する方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
技術分野：
本発明は、一般に、哺乳動物細胞発現系における改良に関し、そして具体的には、エピソーム維持系（ｅｐｉｓｏｍａｌ　ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ　ｓｙｓｔｅｍ）、強力なプロモーター／エンハンサー、タンパク質トランスアクチベーション系および異種タンパク質をコードしているＤＮＡを包含する哺乳動物細胞遺伝子発現ベクター系に関する。
【０００２】
背景：
種々の細胞宿主、例えば微生物細胞、酵母細胞、昆虫細胞および哺乳動物細胞は、比較的短期間に少量（ミリグラム量）の特定タンパク質を生産することが可能である。また、種々の遺伝子工学的に操作された宿主細胞系由来のタンパク質が、使用される細胞に応じて種々のグリコシル化プロフィルを有するタンパク質を生成することは周知である。ある症例における製薬適用では、ヒトにおいて見いだされるものに類似するグリコシル化プロフィルを有するタンパク質を生産することが望ましい。哺乳動物細胞系は臨床上の適用に適合するグリコシル化によるタンパク質を生産するので、このことは、そのような系を用いて達成される。哺乳動物細胞を使用することの短所は、それらが、典型的には等量のタンパク質を生産するのに比較的長い期間を必要とすることである。かくして、より短期間に、より多量のタンパク質を発現できる遺伝子工学的に操作された哺乳動物細胞発現系（異種のタンパク質を発現させるために）を有することが非常に望ましいであろう。
【０００３】
種々のエピソーム維持要素が、複製を確実にするために遺伝子発現系においてベクター中に導入できることが知られている。また、遺伝子工学的に操作された系は、強力なプロモーター／エンハンサー系を含有できるし、多くの場合には含有すべきであることも周知である。さらに、遺伝子工学的に操作された細胞系が、系中にまた組み入れられる異種タンパク質をコードしているＤＮＡからのタンパク質発現を増進するために、タンパク質トランスアクチベーション系を含有できることも周知である。この背景にもかかわらず、本発明者らは、すべての要素の組み合わされた利点が異種タンパク質を発現する単一の、機能的な系において存在するように、すべて４つの上記要素または系を単一の哺乳動物細胞発現系中に組み入れるためのいかなる試みまたは示唆も知らない。驚くべきことに、上記組み合わせ物が、以下に記述される技術を用いて作成された場合に、タンパク質発現に及ぼす相乗効果を表すことが見い出された。２つの異種タンパク質（ＩＬ−２ＳＡおよびＩＬ−４ＳＡと呼ばれる）についての代表的例が以下に記述される。
【０００４】
発明の概要
本発明の哺乳動物細胞遺伝子発現ベクター系は、
（ａ）エピソーム維持系、
（ｂ）強力なプロモーター／エンハンサー、
（ｃ）タンパク質トランスアクチベーション系、および
（ｄ）異種タンパク質をコードしているＤＮＡ：
を含有する。
【０００５】
エピソーム維持系およびタンパク質トランスアクチベーション系は、哺乳動物細胞発現系内の同じか異なるプラスミドに配置されるサブ要素を含めることができる。好適な系では、エピソーム維持系は、ｏｒｉＰ要素（ｅｌｅｍｅｎｔ）およびＥＢＮＡ１発現遺伝子を含んでなる。好適な強力プロモーター／エンハンサーはＣＭＶであり、そして好適なタンパク質トランスアクチベーション系はＴＡＴおよびＴＡＲ要素の両方を含む。異種タンパク質の好適なＤＮＡコーディング配列は、ＩＬ−２ＳＡおよびＩＬ−４ＳＡとして知られる物質（より詳細に以下に記述される）をコードしているＤＮＡを含む。好適な哺乳動物細胞系は霊長類由来であるが、他の哺乳動物細胞系が使用されてもよい。しかしながら、好適な細胞系が下記理由のために非齧歯類でなければならないことは注意すべきである。
【０００６】
本発明の系を例証するために使用される成分が以下に記述される。
【０００７】
１．ｐＢＲ３２２に基づく発現ベクターは、哺乳動物細胞発現のためにヒトＣＭＶエンハンサー／プロモーター要素および５’−ＩＳを補足された、このプラスミドはｐＳＭ９７である（米国特許第５，８５４，０２１号に記述されている）。
【０００８】
２．ＥＢＮＡ１およびｏｒｉＰ要素、これらはエピソーム構造としてのプラスミドＤＮＡの維持を支持することができ（Ｙａｔｅｓ　ｅｔ　ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８１：３８０６−３８１０および米国特許第４，６８６，１８６号）、上記発現ベクターに付加された。
【０００９】
３．ＴＡＴ（トランスアクチベーター遺伝子）およびＴＡＲ（トランス活性化応答性配列）要素、これらは、本明細書ではＴＡＴ／ＴＡＲ要素と呼び、ＴＡＴタンパク質のトランス活性化機能を支持でき（米国特許第５，８０１，０５６号）、発現ベクターに付加されてＴＡＴ／ＴＡＲ要素と組み合わせられたｏｒｉＰ発現ベクターを得た。
【００１０】
４．エプスタイン・バールウイルス起源のＢＭＬＦ１トランスアクチベーター（Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ　ｅｔ　ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ　６０：１４０−１４８，１９８６，Ｋｅｎｎｅｙ　ｅｔ　ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ，６３：３８７０−３８７７，１９８９およびＲｕｖｏｌｏ　ｅｔ　ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　９５：８８５２−８８５７）がベクター中に挿入された。
【００１１】
特定の実施態様
材料および方法
細胞
ヒト胎児腎細胞（２９３）（ＡＴＣＣ　ＣＲＬ−１５７３）
Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）から得られた２９３ＥＢＮＡ（ＥＢＮＡ１発現性２９３細胞）
ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ｄｈｆｒ）−ネガティブＣＨＯ（チャインーズハムスター卵巣）細胞はＧｅｎｅｎｔｅｃｈ　Ｉｎｃ．から得られた。
【００１２】
ＨＫＢ１１（ＡＴＣＣ　ＣＲＬ−１２５６８）は、ヒト胎児腎（２９３Ｓ）細胞とバーキットリンパ腫起源（Ｐ３ＨＲ−１）細胞の細胞融合由来のヒト体性ハイブリッド細胞系（米国特許出願第０９／２０９，９２０号）である。
【００１３】
プラスミド構築
ＩＬ−２ＳＡは、ＷＯ９９／６０１２８に記述されているように、単一アミノ酸置換（Ｎ８８Ｒ）を有するＩＬ−２ムテインである。図１−１および１−２の個々の発現ベクターの簡単な説明は次のとおりである。
【００１４】
ｐＳＬ１６０Ｎ：ＩＬ−２ＳＡコーディング配列がｐＳＭ９７のＰｖｕＩＩ部位中に挿入され、そしてさらに、ｐＳＭ９７のＳｐｅＩ部位中にＭｃＡｒｔｈｕｒおよびＳｔａｎｎｅｒｓ（Ｊ．Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｍ　２６６：６０００−６００５，１９９１）において記述されたＨＳＡＧ１要素（ＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩフラグメント；１４４７ｂｐ）を、そしてｐＳＭ９７のＮａｅＩ部位中にＥＢＶ−ＴＲ（Ｃｈｏ　ｅｔ　ａｌ．，米国特許出願第０９／２０９，９１５号）を付加することによって改変された。
【００１５】
ｐＳＳ１７９：ＩＬ−２ＳＡコーディング配列がｐＣＥＰ４のＢａｍＨＩ／ＸｈｏＩ部位中に挿入された。
【００１６】
ｐＳＳ１７８：ＴＡＲ要素（８２ｂｐ）がｐＳＳ１７９のＩＬ−２ＳＡの上流に配置される。
【００１７】
ｐＳＳ１８５：プラスミド構築において記述された機能性ＴＡＴ要素がｐＳＳ１７８のＮｒｕＩ部位（ＴＫプロモーターの上流部位）中に挿入された。
【００１８】
ｐＳＨ２０１：イントロン配列、ＭＩＳ（〜２７０ｂｐ）が、ｐＳＳ１８５のＴＡＲ配列（ＮｏｔＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ）の３’末端に配置された。
【００１９】
ｐＳＣ２２１：ｐＳＬ１６０ＮのＨＳＡＧ要素が除去され、そしてＴＡＲ要素がＣＭＶｅ／ｐの３’末端およびＭＩＳの５’末端に配置された。
【００２０】
ｐＳＳ２２５：ＥＢＮＡ１および機能性ＴＡＴおよびｈｐｈ発現セグメントがｐＳＨ２０１から切除された。
【００２１】
ｐＳＳ２２６：機能性ＴＡＴ発現要素がｐＳＳ２２５のａｍｐ−ｒ遺伝子の５’末端に挿入された。
【００２２】
図２の個々の発現ベクターの説明は次のとおりである。
【００２３】
ｐＳＳ２１０：ＢＭＬＦ１およびｈｐｈ発現性ｏｒｉＰプラスミドはプラスミド構築の節において記述された。
【００２４】
ｐＳＳ２１２：ＩＬ−２ＳＡコーディング配列がｐＳＳ２１０のＣＭＶｅ／ｐの３’末端に配置された。
【００２５】
ｐＳＳ２１３：ＴＡＲ要素がｐＳＳ２１２のＩＬ−２ＳＡの５’末端に配置された。
【００２６】
ｐＳＳ２１４：イントロン配列、ＭＩＳが、ｐＳＳ２１３のＩＬ−２ＳＡの５’末端にさらに付加された。
【００２７】
図７の個々のプラスミド構造の簡単な説明は次のとおりである。
【００２８】
ｐＳＳ２２３：このプラスミドは、基本的にはｐＳＳ２２５と同じであるが、ＩＬ−２ＳＡコーディング配列を失っている。
【００２９】
ｐＳＣ１８６：ＴＡＴコーディング配列がｐＣＥＰ４のＣＭＶｅ／ｐの３’末端に配置され、そして機能性ｈｐｈ発現セグメントが欠失された。
【００３０】
ｐＳＳ２４０：ＩＬ−２ＳＡコーディング配列がｐＳＳ２２３のＰｖｕＩＩ部位中に挿入された。
【００３１】
ｐＳＳ２４１：ＩＬ−４コーディング配列がｐＳＳ２２３のＰｖｕＩＩ部位中に挿入された。
【００３２】
機能性ｄｈｆｒ遺伝子発現をもつｐＢＲ３２２に基づく哺乳動物細胞発現ベクター（ｐＳＭ９７；Ｃｈｏ　ｅｔ　ａｌ．，米国特許第５，８５４，０２１号）。ｏｒｉＰ、ＥＢＮＡ１、およびｐＢＲ３２２に基づく機能性ｈｐｈ遺伝子発現からなるｐＣＥＰ４ベクターは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）から得られた。
【００３３】
ＴＡＲ要素の８２塩基対は、鋳型としてｐＢｅｎｎＣＡＴ（Ｇｅｎｄｅｌｍａｎ　Ｈ．Ｅ．ｅｔ　ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８３：９７５９−９７６３，１９８６）を用いてＰＣＲによって調製された。２つのプライマーは、ＴＡＲの５’末端にＫｐｎＩ部位を、そしてＴＡＲの３’末端にＨｉｎｄＩＩＩ部位を付加することによって作成され、そしてＫｐｎＩおよびＨｉｎｄＩＩＩによるｐＣＥＰ４の消化後にｐＣＥＰ４中に挿入された。機能性ＴＡＴ遺伝子発現セグメントは、ｐＳＶＴＡＴ（Ｐｅｔｅｒｌｉｎ　Ｂ．Ｍ．ｅｔ　ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８３：９７３４−９７３８，１９８６）から、それをＢａｍＨＩ（クレノウフラグメントにより改変された）およびＨｐａＩにより消化することによって調製された。
【００３４】
このフラグメントは、ＰｖｕＩＩおよびＨｐａＩによる消化後ｐＳＶ２ｎｅｏに挿入された。この機能性ＴＡＴ発現セグメントは、ＰｖｕＩＩおよびＢａｍＨＩによる消化によって容易に切り取られて、図１（ｐＳＳ１８５およびｐＳＣ２２１）に示されるようないかなる他の発現ベクター中にも挿入できる。ＢＭＬＦ１コーディング配列およびポリＡシグナル領域は、Ｂ９５／８　ＥＢＶ配列データ（Ｐ．Ｊ．Ｆａｒｒｅｌｌ，”Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ　Ｖｉｒｕｓ　Ｇｅｎｏｍｅ”ｉｎ　Ａｄｖａｎｃｅｄ　Ｖｉｒａｌ　Ｏｎｃｏｌｏｇｙ；ｅｄｉｔｅｄ　ｂｙ　Ｋｌｅｉｎ；Ｒａｖｅｎｓ　Ｐｒｅｓｓ，Ｌｔｄ．：Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　１９８９，ｐｐ１０３−１３２）の８４３０１（ＮｈｅＩ）から８２１８０（ＨｉｎｄＩＩＩ）までのＤＮＡ配列を包含するＢ９５−８　ＥＢＶから調製され、そしてｐＣＥＰ４、ＣＭＶｅ／ｐをもつベクターのＰｖｕＩＩ部位に挿入された。
【００３５】
機能性ＢＭＬＦ１発現セグメントは、このベクターからＳｐｅＩおよびＮｈｅＩによる消化によって除去され、そして新しい発現ベクターが構築された。ＩＬ−２ＳＡとして既知のインターロイキン−２ムテイン（Ｎ８８Ｒ）（特許出願ＷＯ９９６０１２８，ＩＬ−２選択性アゴニストおよびアンタゴニスト）はレポーター遺伝子として使用された。
【００３６】
トランスフェクション
静置（ｓｔａｔｉｏｎａｒｙ）トランスフェクションは、足場依存方式で増殖する細胞を用いて行われた。５％ＦＢＳ添加または血清無添加いずれかの新鮮培地４ｍｌ中、対数増殖ＨＫＢ１１細胞（１．５ｘ１０６細胞）が、６穴形式の組織培養皿（Ｃｏｒｎｉｎｇ　Ｉｎｃ．，ＮＹ）の１つのウェル中に接種され、そして加湿ＣＯ２培養器において３７℃で２時間以上プレートの底に接着させた。ＤＮＡ５μｇおよびＤＭＲＩＥ−Ｃ試薬（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）２０μｇからなるカクテル（１ｍｌ）が、製造元のプロトコールにしたがって調製され、そしてウェルに添加され、静かに混合された。プレートはＣＯ２培養器中でインキュベートされた。
【００３７】
振盪トランスフェクションは、血清不含の懸濁状態に適応された細胞を用いて行われた。新鮮培地４ｍｌ中対数増殖ＨＫＢ１１細胞（５ｘ１０６細胞）が、上記静置トランスフェクションにおけると同様に、ＤＮＡ／ＤＭＲＩＥ−Ｃ混合液１ｍｌと混合された。この６穴プレートにおいてトランスフェクションされた細胞５ｍｌが、加湿ＣＯ２培養器中の振盪器（９０−１００ｒｐｍ）において培養された。トランスフェクションされた細胞は、１：４または１：５のいずれかに分配することによってトランスフェクション後３および７日（ｄｐｔ）目に継代培養された。総培養容量は、１０ｄｐｔに初発トランスフェクション容量から２０倍まで増加された。組織培養上澄液はタンパク質の分泌レベルを決定するためにＥＬＩＳＡによって分析された。
【００３８】
ＥＬＩＳＡ
ＩＬ−２ＳＡを検出するために、Ｄｙｎａｔｅｃｈ　Ｉｍｍｕｎｏ−２丸底プレートが、０．１ＭＮａＨＣＯ２（ｐＨ８．２）バッファーを用いてラット由来の精製抗ヒトＩＬ−２（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）１μｇ／ｍｌによりコーティングされ、加湿器中で３７℃で３時間インキュベートされ、ＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０（Ｓｉｇｍａ　Ｐ−１３７９，Ｓｔ　Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）で洗浄され、そして室温で１時間ＰＢＳ／１％ＢＳＡでブロックされた。ＩＬ−２ＳＡを含有する培養上澄液および精製ＩＬ−２ＳＡのスタンダード（標準曲線としての）が、ＰＢＳ／１％ＢＳＡ（５０μｇ／ウェル）により連続に希釈され、そして室温で２時間インキュベートされた。捕捉されたＩＬ−２ＳＡは、ビオチニル化マウス抗ヒトＩＬ−２（６２．５ｎｇ／ｍｌ；ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を用いて検出され、続いてＨＲＰ−ストレプトアビジン（１２５ｎｇ／ｍｌ；Ｚｙｍｅｄ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　Ｉｎｃ．＃４３−４３２３，Ｓｏｕｔｈ　Ｓａｎ　Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）とともにインキュベートされた。全インキュベーションの間（室温で１時間インキュベーション毎に）、プレートはＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ２０により洗浄された。プレートは基質溶液テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ；Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ　＆　Ｐｅｒｒｙ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．＃５０−６５−００および５０−７６−０１，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を用いて発色させ、そして反応は１ＮＨＣｌで停止された。光学濃度（ＯＤ）は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｄｅｖｉｃｅ’ｓ　Ｖｍａｘ　Ｋｉｎｅｔｉｃ　ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ　ｒｅａｄｅｒ（Ｓ／Ｎ０４５１４，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）およびＭｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｄｅｖｉｃｅによって供給されるＳｏｆｔｍａｘプログラムを用いて４５０ｎｍ／５７０ｎｍにおいて測定された。組織培養上澄液中のＩＬ−２ＳＡ濃度は、精製ＩＬ−２ＳＡの標準曲線のＯＤに比較して決定された。
【００３９】
ヒト・インターロイキン−４（ＩＬ−４）分泌を測定するために、アッセイは、マウス抗ヒトＩＬ−４抗体（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ，Ｃａｔ．＃１８６５１Ｄ，Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）がプレートをコーティングするために使用され、そしてビオチニル化抗ラットＩＬ−４（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ，Ｃａｔ．＃１８５０２Ｄ，Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）が検出抗体として使用される以外は同様であった。精製ＩＬ−４分子がスタンダードとして使用された。
【００４０】
実施例１
ＴＡＴ／ＴＡＲ−ｏｒｉＰ発現ベクターを用いる一過性トランスフェクションアッセイにおけるタンパク質発現
ｐＢＲ３２２プラスミド中にＣＭＶｅ／ｐを有する哺乳動物細胞発現ベクターは、異種タンパク質１−２０μｇ／ｍｌの比較的高レベルの発現および分泌を示した。しかしながら、若干のタンパク質は、発現が非常に困難であった、例えばＩＬ−２ＳＡ。したがって、本発明者らは、転移されたプラスミドをエピソームとして維持するために、種々の増強要素、主にトランス活性化タンパク質およびｏｒｉＰ要素を有する種々の発現ベクターを構築した。どちらかの要素単独では一過性トランスフェクションアッセイにおいて低レベルの増加（３−５倍）を示した。本発明者らは、１つはｐＣＥＲ４ベクター中にＩＬ−２ＳＡを有し（ｐＳＳ１７９）、そして他方はｐＳＳ１７９にＴＡＴ／ＴＡＲトランス活性化要素の付加を有する（ｐＳＳ１８５）、２種の発現ベクターを構築した。両ＩＬ−２ＳＡ発現プラスミドＤＮＡ（ｐＳＳ１７９およびｐＳＳ１８５）は、制限酵素により消化され、そして両方および未切断のプラスミドの同量のＤＮＡ（各５μｇ）がトランスフェクションされた。両制限酵素消化ＤＮＡの少量が使用されて、同じ量および質（線形への１００％変換を見るために）が各トランスフェクションにおいて使用されたことを保証するために沈殿したＤＮＡの量が確認された。トランスフェクションは５％ＦＢＳを補足した培地により静置トランスフェクション法を用いて実施された。線状ＤＮＡはこの条件では複製できないので、各プラスミドの発現レベルは、線形のプラスミドがｏｒｉＰ機能を欠いているという仮定の下で分析された。ｏｒｉＰおよびＴＡＴ／ＴＡＲは増進効果をもつけれども、ＣＭＶプロモーターの調節下で別々に評価された場合、増強は一過性トランスフェクションアッセイにおいてはかなり低い（３−５倍）。
【００４１】
図３において示されるように、ｏｒｉＰ要素（未切断ｐＳＳ１７９）およびＴＡＴ／ＴＡＲトランスアクチベーション（切断ｐＳＳ１８５）のＩＬ−２ＳＡ分泌に及ぼす効果は、３ｄｐｔにはｐＳＳ１７９の線形からの分泌効果よりもそれぞれ２．７および６倍高かった。５ｄｐｔにおける増加倍数はそれぞれ５．６および１０であった。しかしながら、未切断ｐＳＳ１８５（インタクトのＴＡＴ／ＴＡＲトランスアクチベーションおよびｏｒｉＰ機能）は、予期せぬことに、切断ｐＳＳ１７９からのレベルよりも高いレベル（３ｄｐｔでは２６倍および５ｄｐｔでは３４倍）のＩＬ−２ＳＡ分泌を示した。
【００４２】
また、本発明者らは、同じ機能性要素からなる他のベクター構築物を試験した。ＩＬ−２ＳＡ発現ベクターｐＳＣ２２１（ＴＡＴ／ＴＡＲ−ｄｈｆｒ）、ｐＳＨ２０１（ＥＢＮＡ１を有するＴＡＴ／ＴＡＲ−ｏｒｉＰ）およびｐＳＳ２２６（ＴＡＴ／ＴＡＲ−ｏｒｉＰ　ｗ／ｏ　ＥＢＮＡ１）がＨＫＢ１１および２９３ＥＢＮＡ細胞をトランスフェクションするために使用されて、２種の宿主細胞が比較され、そしてＴＡＴ／ＴＡＲおよびＴＡＴ／ＴＡＲ−ｏｒｉＰのエピソームベクターが比較された。発現ベクターの物理的地図については図１参照。表１において示されるように、ＴＡＴ／ＴＡＲ（ｐＳＣ２２１）を超えるＴＡＴ／ＴＡＲ−ｏｒｉＰ効果（ｐＳＨ２０１）は、３ｄｐｔにおいてＨＫＢ１１細胞において〜９倍高く、そして２９３ＥＢＮＡ細胞では〜４倍高かった。この効果はエピソーム状および線状ｐＳＳ１８５を用いて観察された効果（４．４倍）に類似していた（図３）。２９３ＥＢＮＡ細胞は、ＨＫＢ１１細胞よりもやや低いＩＬ−２ＳＡの分泌レベルを示したが、ＴＡＴ／ＴＡＲ−ｏｒｉＰベクターが、ＨＫＢ１１細胞以外の細胞、ここでは２９３ＥＢＮＡ細胞において、最高のタンパク質生産のために使用できることは明らかであった。本発明者らは、ＥＢＮＡ１遺伝子を備えたＴＡＴ／ＴＡＲ−ｏｒｉＰベクターが、ＥＢＮＡ１遺伝子をもたないものよりもやや良好であることを観察した。ＨＫＢ１１および２９３ＥＢＮＡ細胞はエピソームベクターを維持するのに十分なＥＢＮＡ１タンパク質をもたないのであろうと考えられる。
【００４３】
また、同じ機能性要素からなる他のベクター構築物が試験された。ＩＬ−２ＳＡ発現ベクターｐＳＣ２２１（ＴＡＴ／ＴＡＲ−ｄｈｆｒ）、ｐＳＨ２０１（ＥＢＮＡ１を有するＴＡＴ／ＴＡＲ−ｏｒｉＰ）およびｐＳＳ２２６（ＴＡＴ／ＴＡＲ−ｏｒｉＰ　ｗ／ｏ　ＥＢＮＡ１）がＨＫＢ１１および２９３ＥＢＮＡ細胞をトランスフェクションするために使用されて、２種の宿主細胞が比較され、そしてＴＡＴ／ＴＡＲおよびＴＡＴ／ＴＡＲ−ｏｒｉＰのエピソームベクターが比較された。発現ベクターの物理的地図については図１参照。表１において示されるように、ＴＡＴ／ＴＡＲ（ｐＳＣ２２１）を超えるＴＡＴ／ＴＡＲ−ｏｒｉＰ効果（ｐＳＨ２０１）は、ＨＫＢ１１細胞において〜９倍高く、そして２９３ＥＢＮＡ細胞では〜４倍高かった。この効果はエピソーム状および線状ｐＳＳ１８５を用いて観察された効果（〜５倍）に類似していた（図２）。２９３ＥＢＮＡ細胞は、ＨＫＢ１１細胞よりもやや低いＩＬ−２ＳＡの分泌レベルを示したが、ＴＡＴ／ＴＡＲ−ｏｒｉＰ相乗効果が、また、最高のタンパク質生産についてＨＫＢ１１細胞以外の２９３ＥＢＮＡ細胞においても観察されることは明らかであった。本発明者らは、ＥＢＮＡ１遺伝子を備えたＴＡＴ／ＴＡＲ−ｏｒｉＰベクターが、ＥＢＮＡ１遺伝子をもたないものよりもやや良好であることを観察した。ＨＫＢ１１および２９３ＥＢＮＡ細胞がエピソームベクターを維持するのに十分なＥＢＮＡ１タンパク質をもたないのであろうと考えられる。
【００４４】
表１．ＴＡＴ／ＴＡＲおよびＴＡＴ／ＴＡＲ−ｏｒｉＰベクターでトランスフェクションされたＨＫＢ１１および２９３ＥＢＮＡ細胞の、３ｄｐｔにおける血清不含培地におけるＩＬ−２ＳＡ分泌についての比較
【００４５】
【表１】
2004509642.tif 000003
【００４６】
註：ＴＡＴ／ＴＡＲおよびＴＡＴ／ＴＡＲ−ｏｒｉＰによるＩＬ−２ＳＡの増加倍数は、ｐＳＣ２２１からのＩＬ−２ＳＡ生産を１と仮定して計算された。
【００４７】
実施例２
ＢＭＬＦ１−ｏｒｉＰ発現ベクターを用いる一過性トランスフェクションアッセイにおけるタンパク質発現
ＢＭＬＦ１は、元来、乱交雑トランスアクチベーターとして知られていた（Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ　ｅｔ　ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｏｌ　６０：１４０−１４８，１９８６）。その後、このタンパク質が転写後トランスアクチベーターであることが見い出された（Ｋｅｎｎｅｙ　ｅｔ　ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｏｌ、６３：３８７０−３８７７、１９８９）、そして最近では、イントロンのない遺伝子発現のためのトランスアクチベーターとして、そしてイントロン結合の遺伝子発現に対するインヒビターとして記述された（Ｒｕｖｏｌｏ　ｅｔ　ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　９５：８８５２−８８５７）。本発明者らは、哺乳動物の遺伝子発現（ＩＬ−２ＳＡ）のトランス活性化機能についてＢＭＬＦ１タンパク質を試験した。ｐＳＳ２１０のＣＭＶｅ／ｐの下流に挿入された５’−ＩＳをもたないＩＬ−２ＳＡコーディング配列がｐＳＳ２１２である。ＩＬ−２ＳＡ発現性コーディング配列は、ＩＬ−２ＳＡの５’末端にＴＡＲ配列を付加することによって改変され（ｐＳＳ２１３）、そしてさらにｐＳＳ２１３のＩＬ−２ＳＡの５’末端にイントロン配列（ＭＩＳ）を付加することによって改変されて、ベクターｐＳＳ２１４がもたらされた。個々の発現ベクターの物理的地図については図２参照。静置一過性トランスフェクションアッセイは、ＢＭＬＦ１タンパク質が、イントロンに関係なくＩＬ−２ＳＡ発現を、血清含有培地を用いてＨＫＢ１１では３−４倍（表２）、そしてＣＨＯ細胞では１０−２０倍（表３）増進したことを示した。
【００４８】
表２．血清含有培地において種々のＩＬ−２ＳＡ発現ベクターでトランスフェクションされたＨＫＢ１１細胞からのＩＬ−２ＳＡ生産（３ｄｐｔ）の比較
【００４９】
【表２】
2004509642.tif 000004
【００５０】
註：ＢＭＬＦ１によるＩＬ−２ＳＡ生産の増加倍数は、ｐＳＳ１７９からのＩＬ−２ＳＡ生産を１と仮定することによって３実験の平均から計算された。
【００５１】
図３に記述されるように、ｐＳＳ２１２、ｐＳＳ２１３およびｐＳＳ２１４は、それぞれ、イントロン−レス、ＴＡＲを有するイントロン−レス、およびＴＡＲ−ＭＩＳを分子の５’末端に備えたＩＬ−２ＳＡ発現セグメントを有する。
【００５２】
表３．血清含有培地において種々のＩＬ−２ＳＡ発現ベクターでトランスフェクションされたＣＨＯ細胞からのＩＬ−２ＳＡ生産（３ｄｐｔ）の比較
【００５３】
【表３】
2004509642.tif 000005
【００５４】
註：増加倍数および発現ベクターは表２に記述されている。
【００５５】
実施例３
長時間の一過性トランスフェクションアッセイにおけるタンパク質生産
より多量のタンパク質を作成するために、本発明者らは、トランスフェクション後１０日までの長時間培養においてｏｒｉＰプラスミドにおけるこれらのトランス活性化タンパク質を試験した。この実験では、ＩＬ−２ＳＡの基本発現ベクター（ｐＳＬ１６０Ｎ）、ＴＡＴ／ＴＡＲトランス活性化要素を補足したＩＬ−２ＳＡ発現ベクター（ｐＳＣ２２１）、ｏｒｉＰ要素のみを有するＩＬ−２ＳＡ発現ベクター（ｐＳＳ２２５）および両ＴＡＴ／ＴＡＲトランス活性化要素およびｏｒｉＰ要素を有するＩＬ−２ＳＡ発現ベクター（ｐＳＳ１８５）が使用された。プラスミド構造の物理的地図については図１参照。血清不含懸濁条件に適合されたＨＫＢ１１細胞が、先に記述された振盪トランスフェクション法の下でトランスフェクションされた。トランスフェクションされた細胞は、トランスフェクション後１０日間をとおして、３ｄｐｔおよび７ｄｐｔにおいて２回、４−５倍に分配することによって血清不含培地を用いて継代培養された。総トランスフェクション培養容量は２０−２５倍に増加された。
【００５６】
本発明者らは、ｏｒｉＰ効果およびＴＡＴ／ＴＡＲトランスアクチベーション効果（表４）が、図３に示されたデータとはやや異なることを観察したが、これは、ｏｒｉＰプラスミドＤＮＡの線形（例えば、線状化ｐＳＳ１７９およびｐＳＳ１８５）およびｏｒｉＰ要素をもたないプラスミド構造（例えば、ｐＳＬ１６０ＮおよびｐＳＳ２２１）の種々のプラスミド状態によって説明することができる。例えば、線状ｐＳＳ１７９の基礎発現ベクターは、ｐＳＬ１６０Ｎにより同じ結果を示すと推測され、そしてｐＳＳ１８５は、プラスミド構造を線状化することによって妨げられたｏｒｉＰ機能のために、ｐＳＣ２２１と同じであると推測された。しかしながら、ＴＡＴ／ＴＡＲおよびｏｒｉＰ機能の合体された効果は類似していた。この長時間培養において、表４に示されるように、タンパク質発現（ＩＬ−２ＳＡ力価）に見られる増加は、発現レベルの激しい低下もなく維持された。長時間の一過性トランスフェクション（１０日）におけるｐＳＳ１８５（ＴＡＴ／ＴＡＲおよびｏｒｉＰ要素を含有するＩＬ−２ＳＡ発現ベクター）からのＩＬ−２ＳＡ生産の総収量は、５ｘ１０６初発細胞数を用いてトランスフェクションされたＤＮＡ５μｇから顕著に高いタンパク質収量（４６０．８μｇ）を示したが、一方、同じ量のＤＮＡおよび細胞を用いる３日培養における非最適化発現ベクター（ｐＳＬ１６０Ｎ）は、標準発現ベクターを用いて１０ｄｐｔにはタンパク質２８．８μｇおよび３ｄｐｔには１．４μｇを収穫できるだけである。
【００５７】
この系は、タンパク質の効率的生産の用途では容易にスケールアップされることが示された、例えば、５０ｘ１０６ＨＫＢ１１細胞（５０ｍｌ培養）がｐＳＳ１８５５０μｇによりトランスフェクションされた場合、最終培養容量１リットルをもつトランスフェクション後１０日目にはタンパク質約５ｍｇを得ることができた。経験的に、この効果は比例的であり、そして振盪フラスコを用いるＤＮＡ５００μｇからのタンパク質の生産は、６穴形式でＤＮＡ５μｇを用いる標準トランスフェクションにおいて見いだされるよりも約１００倍多いことが見いだされた。この大規模トランスフェクションの結果は、この長時間スケールアップトランスフェクション系を用いるＤＮＡ調製およびトランスフェクション試薬の費用が、初発材料（ＤＮＡ、トランスフェクション試薬および細胞）を２０−２５倍多く使用する標準トランスフェクション系に較べて、節約できることを示している。
【００５８】
表４．血清含有条件下で種々の発現ベクターを用いる長時間そしてスケールアップの一過性トランスフェクション系におけるＩＬ−２ＳＡ生産の比較
【００５９】
【表４】
2004509642.tif 000006
【００６０】
註：総収量は、容量（ｍｌ）でのＩＬ−２ＳＡ力価の倍率を示す。
【００６１】
ｐＳＬ１６０Ｎ：ｄｈｆｒベクターにおけるＩＬ−２ＳＡコーディング配列
ｐＳＳ２２１：　ＴＡＴ／ＴＡＲベクターにおけるＩＬ−２ＳＡコーディング配列
ｐＳＳ２２５：　ｏｒｉＰベクターにおけるＩＬ−２ＳＡコーディング配列
ｐＳＳ１８５：　ＴＡＴ／ＴＡＲ−ｏｒｉＰベクターにおけるＩＬ−２ＳＡコーディング配列。
【００６２】
細胞は３ｄｐｔでは１：４に、そして７ｄｐｔでは１：５に分配された。
【００６３】
実施例４
薬物選別下でのタンパク質発現
ｏｒｉＰ、ｐＳＳ１７８およびｐＳＳ１７９（プラスミドの物理的地図については図１参照）からのＩＬ−２ＳＡ発現が、さらに長時間、より大規模なタンパク質を生産するために薬物耐性細胞を得るための薬物選別下で試験され、そしてＴＡＴ／ＴＡＲ−ｏｒｉＰベクター、ｐＳＳ１８５からのＩＬ−２ＳＡ発現と比較された。血清不含の条件下で振盪フラスコにおいて増殖するＨＫＢ１１細胞が、６穴形式を用いて３種の発現ベクターによりトランスフェクションされた。トランスフェクション後３日目に、トランスフェクションされた細胞は、ハイグロマイシンＢ（ＨｙｇＢ）１００μｇ／ｍｌを補足した血清（５％）含有培地２０ｍｌ中に２ｘ１０６細胞で振盪フラスコに接種された。細胞はこの同じ選別培地を用いて１週間に２回継代培養された。細胞は遠心分離され、そして最初の３継代では同容量の新鮮培地に再懸濁された。この最初の選別期の後、細胞培養は細胞密度５ｘ１０５細胞／ｍｌを維持することによって継代培養された。各継代からのＩＬ−２ＳＡ生産力価がＥＬＩＳＡによって測定された。４週後の生産においてｐＳＳ１８５からのＩＬ−２ＳＡ生産性は、ｐＳＳ１７８およびｐＳＳ１７９からの生産性より、１０倍を超える高い力価において維持されていた（図６）。これらの結果は、薬物選別系の下では、ｏｒｉＰ要素を一緒に含有するＴＡＴ／ＴＡＲトランス活性化要素が、ｏｒｉＰベクター、ｐＳＳ１７８およびｐＳＳ１７９からのＩＬ−２ＳＡ生産性と比較した場合、はるかに高い生産性を示すことを表している。
【００６４】
実施例５
ハイスループットトランスフェクションのためのＴＡＴ／ＴＡＲ−ｏｒｉＰ系
ＴＡＴ／ＴＡＲ−ｏｒｉＰ発現ベクターが、予期せぬ高いタンパク質の発現を示したが、ベクターのサイズは高いハイスループットクローニングに使用するには大きすぎる。したがって、本発明者らは、発現ベクターを２つの機能性群に分けた。主たるクローニングベクター（５．９ｋｂ）は、ｏｒｉＰベクター、ｐＳＳ２２３においてＣＭＶｅ／ｐ、ＴＡＲ、ＭＩＳ、クローニング部位（ＰｖｕＩＩ）およびポリＡシグナルからなる。ＴＡＴ発現ｏｒｉＰベクター（８．７ｋｂ）ｐＳＣ１８６プラスミドは、コ・トランスフェクションされるプラスミドであった。ハイスループットスクリーニングのための一過性トランスフェクションアッセイにおいて、本発明者らは、問題の遺伝子をもつｐＳＳ２２３　５μｇおよびＴＡＴ発現ｏｒｉＰプラスミドｐＳＣ１８６　１μｇを転移することができる。図７に示されるように、ＩＬ−２ＳＡおよびＩＬ−４コーディング配列がｐＳＳ２２３のＰｖｕＩＩクローニング部位中に挿入された。得られるプラスミドは、それぞれｐＳＳ２４０およびｐＳＳ２４１である。ＨＫＢ１１細胞は、血清不含条件下で振盪トランスフェクション方式においてｐＳＳ２４０もしくはｐＳＳ２４１　５μｇおよびｐＳＣ１８６　１μｇをコ・トランスフェクションされた。本発明者らは、ｏｒｉＰベクター（ｐＳＳ２２５）を超えるＴＡＴ／ＴＡＲ−ｏｒｉＰベクター（ｐＳＳ１８５）（表４）におけるように、コ・トランスフェクションアッセイにおいて３−５倍増加という類似の結果（表５）を観察した。この結果は、２つの機能的に分けられたプラスミドのコトランスフェクション法が、両ＴＡＴ／ＴＡＲおよびｏｒｉＰ要素からなる単一の発現ベクターのトランスフェクションと等価であることを示している。
【００６５】
表５．ＴＡＲ−ｏｒｉＰベクターからのタンパク質生産（μｇ／ｍｌ）の、ＴＡＴ−ｏｒｉＰベクターとのコトランスフェクションからのそれとの比較
【００６６】
【表５】
2004509642.tif 000007
【００６７】
註：増加倍数は、単独トランスフェクションの値を超えるコトランスフェクション値から計算された。
【００６８】
検討
哺乳動物細胞によって発現される異種タンパク質は、通常、非哺乳動物細胞から発現されるタンパク質よりも、タンパク質を特性決定するために、より良好またはより望ましい量を有し、かくして哺乳動物細胞が好適である。しかしながら、哺乳動物細胞によって生産されるタンパク質の量は、通常他の系よりも少ない。上記問題を補うために、本発明者らは、一過性トランスフェクション系を最適化して「安定した行路（ｆａｓｔ　ｔｒａｃｋ）」のタンパク質生産を作成した。本結果は、次のような多くのファクターに基づいている：
１．血清不含の懸濁状態に適合された最適化ＨＫＢ１１細胞宿主。
【００６９】
２．血清不含培地を用いる振盪トランスフェクション法。この方法では、本発明者らは、最適増殖条件下で、より大きい初発細胞密度を使用することができ、これに続いて、より多くのタンパク質を生産するできる。静置トランスフェクションでは、モノレアーとして増殖する細胞の非最適増殖条件のために、１ウェル当たり１．５ｘ１０６以上の細胞をトランスフェクションのために使用することができなかった。トランスフェクションのためにモノレアー細胞（例えばＣＨＯ細胞）を使用する場合、トランスフェクションされる培養物の振盪状態が、理由は完全には明らかではないが、非振盪状態以上よりも多くのタンパク質分泌（２−３倍）を提供する。
【００７０】
３．転移されたプラスミドをエピソームとして維持できるｏｒｉＰ要素、ならびにタンパク質発現を増進できるトランスアクチベーション要素を同時に用いる最適化発現ベクター。
【００７１】
４．この改良されたトランスフェクションのもっとも決定的な部分および予期せぬ結果は、タンパク質発現のためのｏｒｉＰ要素およびＴＡＴ／ＴＡＲトランスアクチベーション要素の組み合わせであり、そして単一のベクターまたはトランスフェクション系におけるそのような組み合わせ物は先行技術では示唆されていなかった。
【００７２】
ＣＨＯ細胞を用いる実験は、ＴＡＴ／ＴＡＲ−ｏｒｉＰトランスアクチベーション系において非効率的データを得た後、そして次の公表された情報に基づき、強くは追求されなかった。ｏｒｉＰプラスミドは、齧歯類細胞では効率的に複製せず（Ｙａｔｅｓ　ｅｔ　ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ　３１３：８１２−８１５，１９８５およびＭｉｚｕｇｕｃｈｉ　ｅｔ　ａｌ．，ＦＥＢＳ　ｌｅｔｔ　４７２：１７３−１７８，２０００）、そしてＣＨＯ細胞はＴＡＴ／ＴＡＲトランスアクチベーション系についての細胞因子を欠いている（Ａｌｏｎｓｏ　ｅｔ　ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ　６６：４６１７−４６２１，１９９２およびＷｉｍｍｅｒ　ｅｔ　ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　２５５：１８２−１８９，１９９９）。
【００７３】
前記開示が示されれば、ここに改変が当業者にとって起きることは考えられる。したがって、前記実施例は具体的説明として考慮されるべきであり、本明細書に開示された本発明の範囲は次の請求項によってのみ限定されるべきであると意図される。
【図面の簡単な説明】
【図１−１および１−２】
発現ベクターの最適化のトランスフェクション研究のために使用されるインターロイキン−２ムテイン（ＩＬ−２ＳＡと呼ばれる）発現ベクターの物理的地図を示し、これは、組み合わされたｏｒｉＰとＴＡＴ／ＴＡＲ要素を含有した。
【図２】
ＢＭＬＦトランスアクチベーション効果のトランスフェクション研究のために使用される発現ベクターの物理的地図を示す。
【図３】
ｏｒｉＰ効果、ＴＡＴ／ＴＡＲトランスアクチベーション効果およびＴＡＴ／ＴＡＲトランスアクチベーション＋ｏｒｉＰ効果を特定し、そして比較するために使用される一過性トランスフェクションアッセイにおけるＩＬ−２ＳＡ分泌の増進を示す図である。ｏｒｉＰ機能が制限酵素を用いる線状化の後に失われ、そして線状化ｐＳＳ１８５に類似しているので、本発明者らはＩＬ−２ＳＡ発現レベルのベースラインとして線状化ｐＳＳ１７９を仮定したことに注目。
【図４】
長時間培養におけるＣＨＯ細胞からのＩＬ−２ＳＡ分泌に及ぼすＢＭＬＦ１トランスアクチベーション効果を示す。３ｄｐｔにおいて、細胞はトリプシンで処理され、そして５％ＦＢＳを補足した新鮮な培地を有するウェルにおいて同数の細胞で接種された。ｐＳＳ１７９でトランスフェクションされたＣＨＯ細胞からのＩＬ−２ＳＡの分泌レベルは、４−７ｄｐｔをとおして３ｄｐｔのそれと同様に維持された。しかしながら、ｐＳＳ２１２，２１３および２１４でトランスフェクションされたＣＨＯ細胞からのＩＬ−２ＳＡ発現レベルは、４ｄｐｔ後には、３ｄｐｔにおいて示されたＢＭＬＦ１トランスフェクション活性のいかなる増進効果も示さなかった。
【図５】
薬物選別下の長時間培養におけるＨＫＢ１１細胞からのＩＬ−２ＳＡ分泌に及ぼすＢＭＬＦ１トランスアクチベーション効果を示す。ｐＳＳ２１２，２１３および２１４でトランスフェクションしたＨＫＢ１１細胞からの、３ｄｐｔにおいて見られたＢＭＬＦ１トランスアクチベーション効果は、ＨｙｇＢ添加後失われたが、ＴＡＴ／ＴＡＲ効果は図６において示されるように薬物選別下で維持された。
【図６】
ハイグロマイシンＢ選別下のＨＫＢ１１細胞からのＩＬ−２ＳＡ分泌に及ぼすＴＡＴ／ＴＡＲトランスアクチベーション効果を示す。トランスフェクションされた細胞は本文記載のように維持された。
【図７】
ハイスループット発現についてコトランスフェクション研究のために使用された発現ベクターの物理的地図を示す。
【図１Ａ】
2004509642.tif 000008
【図１Ｂ】
2004509642.tif 000009
【図２】
2004509642.tif 000010
【図３】
2004509642.tif 000011
【図４】
2004509642.tif 000012
【図５】
2004509642.tif 000013
【図６】
2004509642.tif 000014
【図７】
2004509642.tif 000015
【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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2004509642.tif 000071
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004509642.tif 000072
2004509642.tif 000073
【国際調査報告】
2004509642.tif 000074
2004509642.tif 000075
2004509642.tif 000076
2004509642.tif 000077