(57)【要約】【課題】本発明は、ビブリオ・メチニコビ（Ｖｉｂｒｉｏ ｍｅｔｓｃｈｎｉｋｏｖｉｉ）ＫＳ１から由来したアルカリ性蛋白質分解酵素活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子断片とプラスミドの安定性向上に関与するｐａｒ遺伝子を含有した組換えベクタを製造し、その組換えベクタを導入した大腸菌、ビブリオ・メチニコビ（Ｖｉｂｒｉｏ ｍｅｔｓｃｈｎｉｋｏｖｉｉ）の形質転換体及びこれら形質転換体内における組換えプラスミドの安定性を向上させる方法を提供する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
組換えプラスミドにおいて、アルカリ性蛋白質分解酵素遺伝子ｖａｐｋをクローニングした組換えプラスミドｐＳＢＣｍ（ＫＣＣＭ−１０１４２）にｐａｒ遺伝子をクローニングしてプラスミドの安定性が向上することを特徴とする組換えプラスミドｐＳＰ１。
【請求項２】
請求項１に記載の組換えプラスミドｐＳＰ１の製造方法であって、ビブリオアルカリ性蛋白質分解酵素遺伝子ｖａｐｋを有するプラスミドｐＳＢＣｍ（ＫＣＣＭ−１０１４２）のＰｖｕＩＩ、ＨｉｎｃＩＩの切断位にプラスミドの安全性を高める機能を有するｐａｒ遺伝子を組換えることを特徴とするアルカリ性蛋白質分解酵素遺伝子ｖａｐｋとｐａｒ遺伝子を含む組換えプラスミドｐＳＰ１を製造する方法。
【請求項３】
請求項１に記載の組換えベクタｐＳＰ１を含む形質転換された宿主細胞。
【請求項４】
前記形質転換された宿主細胞が大腸菌またはビブリオ・メチニコビ（Ｖｉｂｒｉｏ ｍｅｔｓｃｈｎｉｋｏｖｉｉ）であることを特徴とする請求項３に記載の形質転換された細胞。
【請求項５】
請求項３または請求項４に記載の形質転換された菌株を利用してアルカリ性蛋白質分解酵素ＶａｐＫを生産する方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、すでに報告されたビブリオアルカリ性蛋白質分解酵素生産菌株にアルカリ性蛋白質分解酵素遺伝子ｖａｐｋを有する組換えプラスミドに形質転換し、形質転換された組換えビブリオ内における組換えプラスミドの安定性の向上に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ビブリオアルカリ性蛋白質分解酵素は、蛋白質をアミノ酸により分解する酵素を言い、アルカリ性蛋白質分解酵素の活性を有する微生物は多様である。これにはバシラス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、セラチア属（Ｓｅｒｒａｔｉａ）などが代表的に用いられている。
【０００３】
前記菌株を利用したアルカリ性蛋白質分解酵素の生産において主要な点は、アルカリ性蛋白質分解酵素の活性が高いことであり、これは生産工程の経済性に非常に重要な要素である。
【０００４】
アルカリ性蛋白質分解酵素の活性を高めるために遺伝工学技術を利用してアルカリ性蛋白質分解酵素をコードする遺伝子を含有した組換えベクタを製造し、組換えベクタの形質転換体を製造してアルカリ性蛋白質分解酵素の活性を増加させる研究が進行されており、最近の研究には組換えベクタを利用した形質転換体の製造においてプラスミドの安定性はアルカリ性蛋白質分解酵素の生産に直接的な影響を及ぼすことができるため、組換えプラスミドの安全性を高める研究が進行された。
【０００５】
本発明者らは、すでに「洗濯洗剤用アルカリ性蛋白質分解酵素ＶＡＰＫ、これをコードする遺伝子組換え発現ベクタおよび形質転換された菌株」において菌株としてビブリオ・メチニコビＫＳ１および組換え発現ベクタとしてｐＳＢＣｍを特許出願したことがあり（大韓民国特許出願番号１９９９−１２５８８）、本発明では前記ベクタおよび菌株を全面的に参照した。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明者らはビブリオ・メチニコビ（Ｖｉｂｒｉｏ ｍｅｔｓｃｈｎｉｋｏｖｉｉ）ＫＳ１から分離したアルカリ性蛋白質分解酵素遺伝子を含有した組換えベクタを製造し、この組換えベクタにプラスミド安全性を高めるためにプラスミドの安全性を高める遺伝子であるｐａｒ遺伝子を組換えた。これをビブリオに形質転換し、プラスミドの安定性が増加した形質転換体を開発した。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明は、アルカリ性蛋白質分解酵素遺伝子ｖａｐｋをクローニングした組換えプラスミドｐＳＢＣｍ（ＫＣＣＭ−１０１４２）にｐａｒ遺伝子をクローニングし、プラスミドの安定性が向上した組換えプラスミドｐＳＰ１を提供する。
【０００８】
また、本発明はビブリオアルカリ性蛋白質分解酵素遺伝子ｖａｐｋを有するプラスミドｐＳＢＣｍ（ＫＣＣＭ−１０１４２）のＰｖｕＩＩ、ＨｉｎｃＩＩの切断位にプラスミドの安全性を高める機能を有するｐａｒ遺伝子を組換えてアルカリ性蛋白質分解酵素遺伝子ｖａｐｋとｐａｒ遺伝子を含む組換えプラスミドｐＳＰ１を製造する方法を提供する。
【０００９】
また、本発明は前記組換えベクタｐＳＰ１を含む形質転換された宿主細胞を提供する。
【００１０】
また、本発明は前記形質転換された宿主細胞が大腸菌またはビブリオ・メチニコビ（Ｖｉｂｒｉｏ ｍｅｔｓｃｈｎｉｋｏｖｉｉ）である形質転換された細胞を提供する。
【００１１】
また、本発明は前記形質転換された菌株を利用してアルカリ性蛋白質分解酵素ＶａｐＫを生産する方法を提供する。
【００１２】
【発明の実施の形態】
本発明は、アルカリ性蛋白質分解酵素ＶａｐＫをコードする遺伝子ｖａｐｋを遺伝子組換え技術を用いてプラスミドの安全性を高めるｐａｒ遺伝子と組換え、これを含有した形質転換体を開発して形質転換体内における組換えプラスミドの安定性を向上させる方法を提供する。
【００１３】
本発明では、アルカリ性蛋白質分解酵素をコードする遺伝子を分離するためにビブリオ・メチニコビＫＳ１を培養した後、細胞を収穫して破砕し、固形物を遠心分離により除去した無細胞助酵素液からビブリオの染色体ＤＮＡを得た。前記から得られた染色体ＤＮＡを制限酵素で切切断して遺伝子運搬体であるベクタに組換え、ｐＳＢＣｍ、ｐＳＰ１などの組換えプラスミドを製造し、これを大腸菌にクローニングした。
【００１４】
製造されたｐＳＢＣｍ組換えプラスミドをまず大腸菌にクローニングし、アルカリ性の条件下で蛋白質分解酵素測定を行い、アルカリ性蛋白質分解酵素の発現を確認した。一般的に知られている通り、外来遺伝子の大腸菌内の発現率は非常に低いものであり、このような事実は本研究でも同一であった。
【００１５】
これに、本発明者は上記の組換えプラスミドをビブリオに導入した。しかし、ビブリオ内におけるプラスミドの安定性が低くて安全性を高めるためにプラスミドの安全性を高める遺伝子であるｐａｒ遺伝子を含有した組換えプラスミドｐＳＰ１を作り、これをビブリオに形質転換した。その結果、ｐａｒ遺伝子を含有しない組換えプラスミドｐＳＢＣｍに比べてプラスミドの安定性が約４０％程度向上していることを確認した。
【００１６】
本発明に使用された菌株であるビブリオ・メチニコビＫＳ１は、ビブリオ・メチニコビＲＨ ５３０ Ｎ−４−８菌株（韓国種菌協会に１９９８年２月２３日付でＫＦＣＣ−１１０３０に寄託）を突然変異原にしてＮ，Ｎ−ニトロソグアニチン（ＮＴＧ）を処理し、生産収率を２倍以上向上させた改良菌株としてＫｏｒｅａｎ Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｃｅｎｔｅｒ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓに１９９８年１２月１５日付で寄託番号ＫＣＣＭ−１０１４１として寄託された菌株である。
【００１７】
本発明に使用されたｐＳＢＣｍ組換えプラスミドは、大腸菌Ｔｏｐ１０Ｆ’を宿主にして国際寄託機関であるＫｏｒｅａｎ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｅｎｔｅｒ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓに１９９８年１２月１５日付で寄託番号ＫＣＣＭ−１０１４２として寄託された。
本発明は、以下の実施例を通じて具体的に例示する。
【００１８】
＜実施例１＞
アルカリ性蛋白質分解酵素遺伝子ｖａｐｋをクローニングしたｐＳＢＣｍの製造
ビブリオ・メチニコビＫＳ１を下記表１の組成からなる培地を利用して３０℃で培養した後、細胞を回収して破砕した。この破砕液を遠心分離した（６，０００ｒｐｍ）後、上澄液を回収して染色体ＤＮＡを回収し、制限酵素であるＨｉｎｄＩＩＩで切取って運搬体であるベクタ（ｐＫＦ３）に組換えて２．９Ｋｂのアルカリ性蛋白質分解酵素遺伝子（これをｐＳＢＣｍと言う）をクローニングした。クローニング時に使用された制限酵素であるＨｉｎｄＩＩＩで処理した後、１％アガロースゲル電気泳動を行った。電気泳動したゲルを染色薬（エチジウムブロマイド）により染色した。アガロースゲル電気泳動を通じて分析した結果、アルカリ性蛋白質分解酵素遺伝子がクローニングされていることを確認した（図１，２）。
【００１９】
【表１】
2004504033.tif 000003
【００２０】
ＬＳＣ培地組成
＜実施例２＞
アルカリ性蛋白質分解酵素遺伝子ｖａｐｋとｐａｒ遺伝子を含有した組換えベクタｐＳＰ１の製造
ビブリオアルカリ性蛋白質分解酵素遺伝子ｖａｐｋを含有したプラスミドであるｐＳＢＣｍの安全性を高めるためにプラスミドの安全性を高める機能を有するｐａｒ遺伝子をｐＳＢＣｍのＰｖｕＩＩ、ＨｉｎｃＩＩサイトに組換え、アルカリ性蛋白質分解酵素遺伝子とｐａｒ遺伝子を含有した組換えプラスミドであるｐＳＰ１を製造した（図３）。
【００２１】
＜実施例３＞
アルカリ性蛋白質分解酵素遺伝子を含有した組換えベクタを大腸菌に形質転換
実施例１および実施例２の２．９Ｋｂのアルカリ性蛋白質分解酵素遺伝子ｖａｐｋを含む組換えプラスミドｐＳＢＣｍ、ｐＳＰ１を大腸菌に導入するために大腸菌ＨＢ１０１をＬＢ培地で培養した後、１００ｍＭ塩化カルシウムを添加して０℃で１５分間放置した後、再度遠心分離して菌体を回収した。菌体を更に１００ｍＭ塩化カルシウム溶液で懸濁した後、０℃で５分間放置し、ｐＳＢＣｍプラスミドを入れて０℃で１時間放置した後、４２℃で９０秒間熱衝撃を加えた後、更に０℃で５分間放置し、ＬＢ培地１ｍｌを入れた後、クロラムフェニコール（３４μｇ／ｍｌ）が含まれたＬＢ培地に塗抹し、３７℃で培養した。
【００２２】
＜実施例４＞
ビブリオ・メチニコビＥＳＵＥＩ形質転換
アルカリ性蛋白質分解酵素遺伝子を含有した組換えプラスミドをビブリオ・メチニコビＫＳ１に形質転換するためにエレクトロポレーション（Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）方法を使用した。
【００２３】
ＫＳ１菌株を前記培地で３０℃で培養した後、細胞を遠心分離で回収（６，０００ｒｐｍ、１０分、４℃）し、１／２０体積のＨ−緩衝溶液（２００ｍＭ Ｓｕｃｒｏｓｅ、１ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１０％ ｇｌｙｃｅｒｏｌ）で懸濁した。これを２回繰り返した後、８０μｌのＨ−緩衝溶液に再懸濁する。この懸濁液に組換えプラスミドを添加した後、０．２ｃｍキュベットに入れてＧＥＮＥ ＰＵＬＳＥＲ ＩＩ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｃｏ．）を使用して１，５００Ｖ、１０μＦ、２００Ωで電気衝撃を与え、前記培地６００μｌを添加して３０℃で培養した後、２５μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールが添加された寒天培地でビブリオ形質転換体を選別した。
【００２４】
＜実施例５＞
組換えビブリオ形質転換体におけるアルカリ性蛋白質分解酵素組換えプラスミドの安定性測定
ｐａｒ遺伝子を含有した組換えベクタ形質転換体とｐａｒ遺伝子を含有しない組換えベクタ形質転換体間の組換えプラスミド安定性を測定するため、組換えビブリオ・メチニコビｐＳＢＣｍと組換えビブリオ・メチニコビｐＳＰ１を２５μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールが含有された前記培地に入れて１８時間の間種培養（ｓｅｅｄ ｃｕｌｔｕｒｅ）した後、クロラムフェニコールを入れていない前記培地で本培養を遂行した。本培養中に組換えプラスミドの安定性を調べるために一定時間の単位で細胞培養液を１２．５μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールが含有された寒天培地と含有されていない寒天培地に塗抹し、３０℃で２０時間培養した後、寒天培地上に生成されたコロニーの数によりプラスミドの安定性を測定した（表２）。
【００２５】
安定性測定式は以下の通りである。
【００２６】
プラスミド安定性（％）＝（Ａ／Ｂ）×１００
−　Ａ：１２．５μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含有した寒天培地上に生成されたコロニーの数；
−　Ｂ：クロラムフェニコールを含有しない寒天培地上に生成されたコロニーの数
【００２７】
【表２】
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【００２８】
組換えビブリオ・メチニコビｐＳＢＣｍ菌株と組換えビブリオ・メチニコビｐＳＰ１菌株のプラスミド安定性
【００２９】
【発明の効果】
本発明の方法により提供されるアルカリ性蛋白質分解酵素コーディング遺伝子ｖａｐｋ組換えベクタの安定性向上方法は、本菌株であるビブリオ・メチニコビを利用したアルカリ性蛋白質分解酵素の生産に有用に使用され得る。
【図面の簡単な説明】
【図１】アルカリ性蛋白質分解酵素遺伝子ｖａｐｋを含む組換えプラスミドｐＳＢＣｍの電気泳動写真
【図２】アルカリ性蛋白質分解酵素遺伝子ｖａｐｋを含有した組換えプラスミドｐＳＢＣｍの制限酵素地図
【図３】アルカリ性蛋白質分解酵素遺伝子ｖａｐｋとｐａｒ遺伝子を含有した組換えプラスミドｐＳＰ１の制限酵素地図
【符号の説明】
Ｍ　サイズマーカー；
１　１線組換えプラスミドｐＳＢＣｍ
２　２線組換えプラスミドｐＳＢＣｍ／ＨｉｎｄＩＩＩ
−　２．２Ｋｂの運搬体ベクタｐＫＦ３
−　２．９Ｋｂのビブリオアルカリ性蛋白質分解酵素遺伝子
【国際公開パンフレット】
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2004504033.tif 000008
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【国際調査報告】
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