(57)【要約】死リガンド、ＴＲＡＩＬによって媒介されるアポトーシスを通じて癌細胞の死を誘導するための組成物及び方法が提供される。本方法は、以下の工程：ＴＲＡＩＬ用レセプターを発現する細胞を含んでなる細胞群に発現ベクターを導入する工程を含む。発現ベクターは、その発現が好ましくベクター内の条件プロモーターによって調節されるＴＲＡＩＬをコードするポリヌクレオチド配列を含む。発現ベクターが導入される細胞は、条件プロモーターの活性化に適した条件のときＴＲＡＩＬを発現する。発現されたＴＲＡＩＬが、ＴＲＡＩＬとＤＲ４及びＤＲ５のようなレセプターとの間の相互作用を通じてＴＲＡＩＬレセプターを発現する当該細胞内で細胞死を誘導する。本方法は、部位特異的かつ用量調整様式で腫瘍を治療するのに使用することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
癌細胞のＴＲＡＩＬ媒介死を誘導する方法であって、以下の工程：
ＴＲＡＩＬ用レセプターを発現する細胞を含んでなる細胞群に、ＴＲＡＩＬをコードするポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターを導入し、発現されたＴＲＡＩＬが、ＴＲＡＩＬと前記レセプターとの間の相互作用を通じて該ＴＲＡＩＬレセプターを発現する当該細胞内で細胞死を誘導する工程を含む方法。
【請求項２】
前記ＴＲＡＩＬレセプターが膜結合型レセプターである、請求項１の方法。
【請求項３】
前記ＴＲＡＩＬレセプターがＤＲ４又はＤＲ５である、請求項２の方法。
【請求項４】
前記発現ベクターが導入される前記細胞群が、前記ＴＲＡＩＬレセプターを発現する細胞と、前記ＴＲＡＩＬレセプターを発現しない細胞との混合物を含む、請求項１の方法。
【請求項５】
前記発現ベクターが、前記ＴＲＡＩＬレセプターを発現しない細胞に導入される、請求項４の方法。
【請求項６】
前記発現ベクターが、前記ＴＲＡＩＬレセプターを発現する細胞に導入される、請求項４の方法。
【請求項７】
前記発現ベクターが、前記ＴＲＡＩＬレセプターを発現しない細胞と、前記ＴＲＡＩＬレセプターを発現する細胞に導入される、請求項４の方法。
【請求項８】
前記細胞群が固形腫瘍内に含まれている、請求項１の方法。
【請求項９】
前記固形腫瘍が、乳房、前立腺、脳、膀胱、膵臓、直腸、副甲状腺、甲状腺、副腎、頭頚部、大腸、胃、気管支及び腎臓腫瘍から成る群より選択される、請求項８の方法。
【請求項１０】
前記細胞群への発現ベクターの導入が、非経口的に、腹腔内に、静脈内に、動脈内に、経皮的に、舌下に、筋肉内に、直腸に、経頬的に、鼻腔内に、リポゾームに、吸入によって、膣に、眼内に、カテーテル若しくはステントによる局所送達によって、皮下に、脂肪内に、関節内に、クモ膜下腔内に、又は遅延放出剤形で行われる、請求項１の方法。
【請求項１１】
前記発現ベクターの導入が、前記細胞群間への該発現ベクターの直接注入によって行われる、請求項１の方法。
【請求項１２】
前記発現ベクターがプラスミドである、請求項１の方法。
【請求項１３】
前記発現ベクターがウイルスベクターである、請求項１の方法。
【請求項１４】
前記ウイルスベクターが、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、ワクシニア、レトロウイルス、及び単純ヘルペスウイルスベクターから成る群より選択される、請求項１３の方法。
【請求項１５】
前記発現ベクターが、複製−適格性又は複製−非適格性のアデノウイルスベクターである、請求項１３の方法。
【請求項１６】
前記ＴＲＡＩＬの発現が、前記ベクター内の条件プロモーターによって調節され、この条件プロモーターの活性化に適した条件のとき、前記発現ベクターが導入される細胞がＴＲＡＩＬを発現する、請求項１の方法。
【請求項１７】
前記条件プロモーターが組織特異的プロモーターである、請求項１６の方法。
【請求項１８】
前記組織特異的プロモーターが、前立腺特異的プロモーター、乳房特異的プロモーター、膵臓特異的プロモーター、大腸特異的プロモーター、脳特異的プロモーター、腎臓特異的プロモーター、膀胱特異的プロモーター、肺特異的プロモーター、肝臓特異的プロモーター、甲状腺特異的プロモーター、胃特異的プロモーター、卵巣特異的プロモーター、及び頚部特異的プロモーターから成る群より選択される、請求項１７の方法。
【請求項１９】
前記細胞群が前立腺癌細胞であり、かつ前記発現ベクターの前記条件プロモーターが前立腺特異的プロモーターである、請求項１６の方法。
【請求項２０】
前記前立腺特異的プロモーターが、ＰＳＡプロモーター、ΔＰＳＡプロモーター、ＡＲＲ２ＰＢプロモーター、プロバシン（ｐｒｏｂａｓｉｎ）プロモーター、ｇｐ９１−ｐｈｏｘ遺伝子プロモーター、及び前立腺特異的カリクレインプロモーターから成る群より選択される、請求項１９の方法。
【請求項２１】
前記発現ベクターの前記条件プロモーターが肝臓特異的プロモーターである、請求項１６の方法。
【請求項２２】
前記肝臓特異的プロモーターが、肝臓アルブミンプロモーター、α−フェトプロテインプロモーター、α１−抗トリプシンプロモーター、及びトランスフェリントランスサイレチンプロモーターから成る群より選択される、請求項２１の方法。
【請求項２３】
前記発現ベクターの前記条件プロモーターが大腸特異的プロモーターである、請求項１６の方法。
【請求項２４】
前記大腸特異的プロモーターが、炭酸脱水酵素Ｉプロモーター及び癌胎児性抗原プロモーターから成る群より選択される、請求項２３の方法。
【請求項２５】
前記発現ベクターの前記条件プロモーターが卵巣又は胎盤特異的プロモーターである、請求項１６の方法。
【請求項２６】
前記卵巣又は胎盤特異的プロモーターが、エストロゲン応答性プロモーター、アロマターゼチトクロームＰ４５０プロモーター、コレステロール側鎖切断Ｐ４５０プロモーター、及び１７α−ヒドロキシラーゼＰ４５０プロモーターから成る群より選択される、請求項２５の方法。
【請求項２７】
前記発現ベクターの前記条件プロモーターが乳房特異的プロモーターである、請求項１６の方法。
【請求項２８】
前記乳房特異的プロモーターが、Ｇ．Ｉ．ｅｒｂ−Ｂ２プロモーター、ｅｒｂ−Ｂ３プロモーター、β−カゼイン、β−ラクト−グロブリン、及びホエー酸性タンパク質プロモーターから成る群より選択される、請求項２７の方法。
【請求項２９】
前記発現ベクターの前記条件プロモーターが肺特異的プロモーターである、請求項１６の方法。
【請求項３０】
前記肺特異的プロモーターが、サーファクタントタンパク質Ｃウログロビンプロモーターである、請求項２９の方法。
【請求項３１】
前記発現ベクターの前記条件プロモーターが皮膚特異的プロモーターである、請求項１６の方法。
【請求項３２】
前記皮膚特異的プロモーターが、Ｋ−１４−ケラチンプロモーター、ヒトケラチン１プロモーター、ヒトケラチン６プロモーター、及びロイクリン（ｌｏｉｃｒｉｎ）プロモーターから成る群より選択される、請求項３１の方法。
【請求項３３】
前記発現ベクターの前記条件プロモーターが脳特異的プロモーターである、請求項１６の方法。
【請求項３４】
前記脳特異的プロモーターが、神経膠線維酸性タンパク質プロモーター、成熟星状膠細胞特異的タンパク質プロモーター、ミエリンプロモーター、及びチロシンヒドロキシラーゼプロモーターから成る群より選択される、請求項３３の方法。
【請求項３５】
前記発現ベクターの前記条件プロモーターが膵臓特異的プロモーターである、請求項１６の方法。
【請求項３６】
前記膵臓特異的プロモーターが、ビリンプロモーター、グルカゴンプロモーター、及びインスリン島アミロイドポリペプチドプロモーターから成る群より選択される、請求項３５の方法。
【請求項３７】
前記発現ベクターの前記条件プロモーターが甲状腺特異的プロモーターである、請求項１６の方法。
【請求項３８】
前記甲状腺特異的プロモーターが、チログロブリンプロモーター及びカルシトニンプロモーターから成る群より選択される、請求項３７の方法。
【請求項３９】
前記発現ベクターの前記条件プロモーターが骨特異的プロモーターである、請求項１６の方法。
【請求項４０】
前記骨特異的プロモーターが、α１コラーゲンプロモーター、オステオカルシンプロモーター、及び骨シアロ糖タンパク質プロモーターから成る群より選択される、請求項３９の方法。
【請求項４１】
前記発現ベクターの前記条件プロモーターが腎臓特異的プロモーターである、請求項１６の方法。
【請求項４２】
前記腎臓特異的プロモーターが、レニンプロモーター、肝臓／骨／腎臓アルカリ性ホスファターゼプロモーター、及びエリスロポイエチンプロモーターから成る群より選択される、請求項４１の方法。
【請求項４３】
前記条件プロモーターが誘導性プロモーターである、請求項１６の方法。
【請求項４４】
前記誘導性プロモーターが、テトラサイクリン又はドキシサイクリンによる誘導性プロモーターである、請求項４３の方法。
【請求項４５】
前記誘導性プロモーターが、ステロイドによる誘導性プロモーターである、請求項４３の方法。
【請求項４６】
前記ステロイドが、グルココルチコイド、エストロゲン、アンドロゲン、及びプロゲステロンから成る群より選択される、請求項４５の方法。
【請求項４７】
該方法が、さらに前記条件プロモーターの活性化に適した条件を引き起こす工程を含む、請求項１６の方法。
【請求項４８】
前記条件プロモーターの活性化に適した条件を引き起こす工程が、前記細胞群にテトラサイクリン又はドキシサイクリンを送達する工程を含む、請求項４７の方法。
【請求項４９】
前記条件プロモーターの活性化に適した条件を引き起こす工程が、前記細胞群に、グルココルチコイド、エストロゲン、アンドロゲン、及びプロゲステロンから成る群より選択されるステロイドを送達する工程を含む、請求項４７の方法。
【請求項５０】
前記発現ベクターが、さらにリポーター遺伝子を含む、請求項１の方法。
【請求項５１】
前記発現ベクターが、ＴＲＡＩＬとの融合タンパク質として前記リポーター遺伝子を発現させる、請求項５０の方法。
【請求項５２】
前記発現ベクターが、内部リボゾーム侵入部位（ＩＲＥＳ）又はスプライシング供与体／受容体部位の機構によってＴＲＡＩＬを有する二シストロン的な単一タンパク質として前記リポーター遺伝子を発現させる、請求項５０の方法。
【請求項５３】
前記リポーター遺伝子が緑色蛍光タンパク質をコードする、請求項５０の方法。
【請求項５４】
前記発現ベクターが、さらに調節タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含む、請求項１の方法。
【請求項５５】
前記発現ベクターが、ＴＲＡＩＬとの融合タンパク質として前記調節タンパク質を発現させる、請求項５４の方法。
【請求項５６】
前記融合タンパク質内の前記調節タンパク質が、アポトーシス信号発信リガンドの組織特異的局在化を引き起こすタンパク質である、請求項５５の方法。
【請求項５７】
前記発現ベクターが導入される前記細胞群が、癌を有する患者から採取した試料内に含まれている場合、該方法が生体外で行われる、請求項１の方法。
【請求項５８】
前記発現ベクターが導入される前記細胞群が、細胞培養内に含まれている場合、該方法が試験管内で行われる、請求項１の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の背景）
発明の分野
本発明は、癌細胞のプログラム細胞死（アポトーシス）を誘導するための組成物及び方法に係り、さらに詳細には、Ｆａｓリガンド（Ａｐｏ−１リガンド）及びＴＲＡＩＬ（Ａｐｏ−２リガンド）のようなアポトーシス信号発信リガンドを発現させる発現ベクターを用いることで腫瘍を治療するための組成物及び方法に関する。アポトーシス信号発信リガンドは、Ｆａｓ（Ｆａｓリガンド用レセプター）、及びＤＲ４又はＤＲ５（ＴＲＡＩＬ用レセプター）のようなアポトーシス媒介レセプターを発現する細胞内でアポトーシスを誘導する。
【０００２】
発明の背景
現在、癌性腫瘍の主な治療は、組織、器官、又は腺の患部の外科的除去である。例えば、現在の乳癌治療は、患部乳腺を除去後、化学及び放射線療法の併用に焦点が当てられている。しかし、高い再生率が癌性細胞の完全な根絶の主な障害である。悪性腫瘍内の癌細胞は外科的に除去できるが、周囲の組織又はリンパ節を浸潤している癌性細胞は腫瘍の再生を頻繁に引き起こすと考えられている。頻繁な腫瘍再生の１つの理由は、原発癌の発生時にすべての癌細胞を完全に除去することは非常に困難なことである。残存癌細胞は、しばしば長期間静止状態のままであり、腫瘍の休止状態と言われる。Ｍｅｌｔｚｅｒら（１９９０）“休止状態と乳癌”Ｊ．Ｓｕｒｇ．Ｏｎｃｏｌ．４３：１８１−１８８。一度原発性組織が外科的に除去されると、外科的損傷がその創傷部における迅速な組織及び血管再生を刺激しうる。これら再生プロセスが、例えば組織及び血管成長因子によってポジティブ信号を周囲組織に送る。これら因子及び迅速な増殖環境が残存腫瘍細胞の休止状態から迅速な増殖への転移を誘導し、ひいては癌の再生を引き起こす。
【０００３】
２つの基本的特徴は、すべての癌細胞で共有し；無制御細胞周期；及びプログラム細胞死、アポトーシスの経路に入れないことである。アポトーシス、つまりプログラム細胞死（ＰＣＤ）は、細胞が自殺を犯す遺伝的に制御された応答である。アポトーシスの徴候は、細胞毒性煮沸、染色質凝縮、及びＤＮＡ断片化に伴う生存力喪失である。Ｗｙｌｌｉｅら（１９８０）“細胞死：アポトーシスの意義”Ｉｎｔ．Ｒｅｖ．Ｃｙｔｏｌ．６８：２５１−３０６。アポトーシスプロセスは、組織の発生、器官の大きさと形状、及び細胞の寿命の調節に重要な役割を有する。組織及び器官発生のプロセスにおいて、アポトーシスは、脊椎動物の発生で組織モデリングの原因であるＰＣＤのほとんど又はすべてが正常組織のうちに物理的な細胞死のために始動する理由となる。アポトーシスは、免疫応答におけるネガティブ選択時のＢ及びＴ細胞血統の細胞の盛んな排除の原因でもある。
【０００４】
アポトーシスはセーフガードとして作用し、細胞及び組織の過剰成長を防止する。ＰＣＤ機構で欠陥が発生すると、細胞の寿命を延ばし、かつ腫瘍性細胞増殖に寄与しうる。また、ＰＣＤの欠陥は、免疫に基づいた破壊に対する耐性を促進し、細胞毒性薬物及び放射線に対する耐性を与える遺伝子突然変異という遺伝的な不安定性及び蓄積を許容することで発癌に寄与しうる。この徴候は、これら療法に応答しない悪性細胞内で確かに見られる。照射法、化学療法及び適切なホルモン療法はすべてある程度腫瘍細胞内にアポトーシスを誘導するが、癌細胞の成長を抑制するためには高用量の薬物又は放射線が必要であり、患者に重篤な副作用もまた及ぼしうる。
【０００５】
（発明の概要）
本発明は、癌、特に固形腫瘍を、部位特異的かつ制御された様式でＦａｓＬ及びＴＲＡＩＬのようなアポトーシス信号発信リガンドを発現させることによって治療するための新規な方法及び組成物を提供する。
一局面では、本発明は、アポトーシス媒介レセプターを発現する細胞内で死を誘導する方法を提供する。
【０００６】
一局面では、本方法は、以下の工程：アポトーシス媒介レセプターを発現する細胞を含んでなる細胞群に発現ベクターを導入する工程を含む。発現ベクターは、アポトーシス信号発信リガンドをコードするポリヌクレオチド配列を含み、その発現は、好ましくは該ベクター内の条件プロモーターによって調節される。発現ベクターが導入される細胞は、条件プロモーターの活性化に適した条件のとき、アポトーシス信号発信リガンドを発現する。発現されたアポトーシス信号発信リガンドは、アポトーシス信号発信リガンドとアポトーシス媒介レセプターとの間の相互作用を通じてアポトーシス媒介レセプターを発現する当該細胞内で細胞死を誘導する。
この実施形態によれば、アポトーシス媒介レセプターは、Ｆａｓリガンド、Ｆａｓ用レセプター、及びＴＲＡＩＬ、ＤＲ４及びＤＲ５のレセプターのような膜結合型レセプターでよい。任意に、アポトーシス媒介レセプターは、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）のレセプターでよいが、ＴＮＦはＦａｓ及びＴＲＡＩＬより高い全身毒性を有しうる。
【０００７】
また、この実施形態によれば、アポトーシス媒介リガンドは、アポトーシス媒介レセプターに結合可能ないずれのタンパク質でもよい。例えば、アポトーシス媒介リガンドは、Ｆａｓ（又はＤＲ４／ＤＲ５）に結合でき、かつＦａｓ（又はＤＲ４／ＤＲ５）を発現する細胞内でＦａｓ（又はＤＲ４／ＤＲ５）媒介アポトーシスを発信する抗体である。この抗体は、本発明の発現ベクターによって一本鎖抗体として発現し、アポトーシス媒介レセプター上のその同族抗原に結合する。
好ましくは、アポトーシス信号発信リガンドは、ＦａｓＬ及びＴＲＡＩＬのような膜タンパク質である。任意に、アポトーシス信号発信リガンドはＴＮＦでよいが、ＴＮＦはＦａｓ及びＴＲＡＩＬより高い全身毒性を有しうる。
【０００８】
また、任意に、アポトーシス信号発信リガンドは、細胞内で発現されるとアポトーシスを誘導できる非膜結合型タンパク質でもよい。このような細胞内アポトーシス信号発信リガンドの例としては、限定するものではないが、Ｂａｘ、Ｂａｄ、Ｂａｋ、及びＢｉｋが挙げられる。
本実施形態によれば、発現ベクターはプラスミドでもよい。プラスミドはリポソーム媒介送達又は形質移入の他の方法によって癌細胞に形質移入することができる。
好ましくは、発現ベクターはウイルスベクターである。ウイルスベクターは、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、ワクシニア、レトロウイルス、又は単純ヘルペスウイルスベクターでよい。
最も好ましくは、発現ベクターはアデノウイルスベクターである。アデノウイルスウイルスベクターは、複製−適格性又は複製−非適格性でよく、腫瘍部位内に投与されるアポトーシス信号発信リガンドの用量によって決まる。
【０００９】
アポトーシス信号発信リガンドの発現は、発現ベクター内の条件プロモーターによって調節される。条件プロモーターは、前立腺特異的プロモーター、乳房特異的プロモーター、膵臓特異的プロモーター、大腸特異的プロモーター、脳特異的プロモーター、腎臓特異的プロモーター、膀胱特異的プロモーター、肺特異的プロモーター、肝臓特異的プロモーター、甲状腺特異的プロモーター、胃特異的プロモーター、卵巣特異的プロモーター、及び頚部特異的プロモーターのような組織特異的プロモーターでよい。
前立腺特異的プロモーターの例としては、限定するものではないが、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）プロモーター及びその突然変異体ΔＰＳＡ、ＡＲＲ２ＰＢ及びプロバシン（ｐｒｏｂａｓｉｎ）（ＰＢ）プロモーター、ｇｐ９１−ｐｈｏｘ遺伝子プロモーター、及び前立腺特異的カリクレイン（ｈＫＬＫ２）プロモーターが挙げられる。
【００１０】
肝臓特異的プロモーターの例としては、限定するものではないが、肝臓アルブミンプロモーター、α−フェトプロテインプロモーター、α１−抗トリプシンプロモーター、及びトランスフェリントランスサイレチンプロモーターが挙げられる。
大腸特異的プロモーターの例としては、限定するものではないが、炭酸脱水酵素Ｉプロモーター及び癌胎児性抗原プロモーターが挙げられる。
卵巣又は胎盤特異的プロモーターの例としては、限定するものではないが、エストロゲン応答性プロモーター、アロマターゼチトクロームＰ４５０プロモーター、コレステロール側鎖切断Ｐ４５０プロモーター、１７α−ヒドロキシラーゼＰ４５０プロモーターが挙げられる。
乳房特異的プロモーターとしては、限定するものではないが、Ｇ．Ｉ．ｅｒｂ−Ｂ２プロモーター、ｅｒｂ−Ｂ３プロモーター、β−カゼイン、β−ラクト−グロブリン、及びＷＡＢ（ホエー酸性タンパク質）プロモーターが挙げられる。
【００１１】
肺特異的プロモーターとしては、限定するものではないが、サーファクタントタンパク質Ｃウログロビン（ｃｃ−１０、Ｃｌｌａｃｅｌｌ １０ ｋｄ タンパク質）プロモーターが挙げられる。
皮膚特異的プロモーターの例としては、限定するものではないが、Ｋ−１４−ケラチンプロモーター、ヒトケラチン１又は６プロモーター、及びロイクリン（ｒｏｉｃｒｉｎ）プロモーターが挙げられる。
脳特異的プロモーターの例としては、限定するものではないが、神経膠線維酸性タンパク質プロモーター、成熟星状膠細胞特異的タンパク質プロモーター、ミエリンプロモーター、及びチロシンヒドロキシラーゼプロモーターが挙げられる。
膵臓特異的プロモーターの例としては、限定するものではないが、ビリンプロモーター、グルカゴンプロモーター、及びインスリン島アミロイドポリペプチド（アミリン）プロモーターが挙げられる。
甲状腺特異的プロモーターの例としては、限定するものではないが、チログロブリンプロモーター、及びカルシトニンプロモーターが挙げられる。
【００１２】
骨特異的プロモーターの例としては、限定するものではないが、α１（Ｉ）コラーゲンプロモーター、オステオカルシンプロモーター、及び骨シアロ糖タンパク質プロモーターが挙げられる。
腎臓特異的プロモーターの例としては、限定するものではないが、レニンプロモーター、肝臓／骨／腎臓アルカリ性ホスファターゼプロモーター、及びエリスロポイエチン（ｅｐｏ）プロモーターが挙げられる。
代わりに、条件プロモーターは、テトラサイクリン及びその誘導体若しくは類似体（例えばドキシサイクリン）、グルココルチコイド、エストロゲン、アンドロゲン、及びプロゲステロンのようなステロイドのような誘導物質の存在下で活性化又は抑制される誘導性プロモーターでよい。
【００１３】
また、実施形態によれば、本方法は、さらに、細胞群にテトラサイクリン又はドキシサイクリンを送達する工程、及び細胞群に、グルココルチコイド、エストロゲン、アンドロゲン、及びプロゲステロンから成る群より選択されるステロイドを送達する工程のような、条件プロモーターの活性化に適した条件を引き起こす工程を含む。
また、実施形態によれば、発現ベクターは、さらにリポーター遺伝子を含む。発現ベクターは、リポーター遺伝子をアポトーシス信号発信リガンドとの融合タンパク質として発現させることができる。代わりに、発現ベクターは、リポーター遺伝子を内部リボゾーム侵入部位（ＩＲＥＳ）又はスプライシング供与体／受容体部位の機構によってアポトーシス信号発信リガンドを有する二シストロン的な単一タンパク質として発現させることができる。
【００１４】
リポーター遺伝子は、好ましくは緑色、黄色及び青色蛍光タンパク質のような蛍光タンパク質、さらに好ましくは緑色蛍光タンパク質をコードする。
本実施形態によれば、発現ベクターは、さらに調節タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含む。調節タンパク質は、アポトーシス信号発信リガンドとの融合タンパク質として、又は発現ベクター上の異なるプロモーターからの単一タンパク質として発現させることができる。任意に、調節タンパク質は、内部リボゾーム侵入部位（ＩＲＥＳ）及びスプライシング供与体／受容体部位の機構によってアポトーシス信号発信リガンドを有する二シストロン的な単一タンパク質として発現させることができる。
【００１５】
例えば、調節タンパク質は、アポトーシス信号発信リガンドの組織特異的局在化を引き起こすタンパク質でよい。
本発明の方法を用いて腫瘍を治療することができる。従って、アポトーシスを受けるように誘導される細胞群は固形腫瘍内に含まれる。固形腫瘍の例としては、限定するものではないが、乳房、前立腺、脳、膀胱、膵臓、直腸、副甲状腺、甲状腺、副腎、頭頸部、大腸、胃、気管支及び腎臓腫瘍が挙げられる。
発現ベクターは、薬学的に許容性のいずれの投与経路を用いても導入することができる。例えば、非経口的に、腹腔内に、静脈内に、動脈内に、経皮的に、舌下に、筋肉内に、直腸に、経頬的に、鼻腔内に、リポゾームに、吸入によって、膣に、眼内に、カテーテル若しくはステントによる局所送達によって、皮下に、脂肪内に、関節内に、クモ膜下腔内に、又は遅延放出剤形で、腫瘍細胞群中に発現ベクターを投与することができる。
【００１６】
好ましくは、発現ベクターは、腫瘍座中に該発現ベクターを直接注入することで腫瘍内に導入される。
任意に、発現ベクターが導入される細胞群が、癌を有する患者から採取した試料内に含まれるか、又は細胞培養内に含まれる場合、生体外で本方法を行うことができる。
Ｆａｓを発現する細胞とＦａｓを発現しない細胞との混合物に発現ベクターを導入することができる。
任意に、Ｆａｓを発現しない細胞に発現ベクターを導入することができる。
また、任意にＦａｓを発現する細胞に発現ベクターを導入することもできる。
任意に、Ｆａｓを発現しない細胞及びＦａｓを発現する細胞に導入することもできる。“傍観者効果”により、発現ベクターによって形質導入された当該細胞の近傍でＦａｓを発現する当該癌細胞は、Ｆａｓ−ＦａｓＬ相互作用によって殺される。
【００１７】
別の局面では、本発明は、癌細胞のアポトーシスを誘導するのに使用可能なアデノウイルス発現ベクターを提供する。本アデノウイルスベクターは、以下：条件プロモーター、及びその発現がベクター内の該条件プロモーターによって調節される膜結合型リガンドをコードするポリヌクレオチド配列を含み、このリガンドはアポトーシス媒介レセプターを発現する細胞内でアポトーシスを発信する。
また、本実施形態によれば、膜結合型リガンドは、癌細胞の表面上のアポトーシス媒介レセプターに結合できるいずれのタンパク質でもよい。好ましくは、該膜結合型タンパク質はＦａｓＬ又はＴＲＡＩＬである。任意に、膜結合型タンパク質はＴＮＦでよいが、ＴＮＦはＦａｓ及びＴＲＡＩＬよりも高い全身毒性を有しうる。
【００１８】
本実施形態によれば、アデノウイルスベクターは複製−適格性又は複製−非適格性でよく、腫瘍部位に投与されるリガンドの用量によって決まる。
リガンドの発現は、アデノウイルス発現ベクター内の条件プロモーターによって調節される。条件プロモーターは、前立腺特異的プロモーター、乳房特異的プロモーター、膵臓特異的プロモーター、大腸特異的プロモーター、脳特異的プロモーター、腎臓特異的プロモーター、膀胱特異的プロモーター、肺特異的プロモーター、肝臓特異的プロモーター、甲状腺特異的プロモーター、胃特異的プロモーター、卵巣特異的プロモーター、及び頚部特異的プロモーターのような組織特異的プロモーターでよい。
【００１９】
さらに別の実施形態では、本発明は、テトラサイクリンに応答して標的タンパク質の発現を厳密に制御するためのアデノウイルス発現ベクターを提供する。本アデノウイルス発現ベクターは、以下：テトラサイクリン応答性要素；テトラサイクリン応答性要素に結合可能なトランス活性化タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列；及びその発現がテトラサイクリン応答性要素へのトランス活性化タンパク質の結合性によって調節される標的タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含む。
この実施形態によれば、テトラサイクリン応答性要素とトランス活性化タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列は、アデノウイルスベクターと反対の末端に位置づけられる。例えば、テトラサイクリン応答性要素はアデノウイルスベクターのＥ４領域に位置づけられ、トランス活性化タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列はアデノウイルスベクターのＥ１に位置づけられる。
【００２０】
任意に、本アデノウイルスベクターはＥ３領域を含まない。
任意に、本アデノウイルスベクターはＥ４領域のＯｒｆ６以外は、アデノウイルスのＥ４領域を含まない。
標的タンパク質の発現は、テトラサイクリン又はドキシサイクリンの存在で抑制することができる。代わりに、標的タンパク質の発現は、ドキシサイクリンの存在で活性化することができる。
本実施形態によれば、標的タンパク質はＦａｓＬ及びＴＲＡＩＬのような膜結合型アポトーシス信号発信タンパク質でもよい。
本実施形態によれば、ウイルス発現ベクターは、さらにリポータータンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含むことができる。リポータータンパク質と標的タンパク質は、融合タンパク質としてコードされ、又は内部リボゾーム侵入部位（ＩＲＥＳ）又はスプライシング供与体／受容体部位の機構によって標的タンパク質を有する二シストロン的な単一タンパク質として発現されうる。
リポーター遺伝子は、好ましくは緑色、黄色及び青色蛍光タンパク質のような蛍光タンパク質、さらに好ましくは緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードする。
【００２１】
本実施形態によれば、発現ベクターはさらに調節タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含むこともできる。調節タンパク質は、アポトーシス信号発信リガンドとの融合タンパク質として発現され、又は該発現ベクター上の異なるプロモーター由来の単一タンパク質として発現されうる。任意に、調節タンパク質は、内部リボゾーム侵入部位（ＩＲＥＳ）又はスプライシング供与体／受容体部位の機構によってアポトーシス信号発信リガンドを有する二シストロン的な単一タンパク質として発現されうる。
例えば、調節タンパク質は、アポトーシス信号発信リガンドの組織特異的局在化を引き起こすタンパク質でよい。
本実施形態のアデノウイルスベクターの例としては、限定するものではないが、ｐＡｄＴＥＴ及びＡｄ／ＦａｓＬ−ＧＦＰＴＥＴが挙げられる。
【００２２】
本発明の発現ベクターは、化学療法薬（例えばアルキル化剤、抗生物質、代謝拮抗薬、ホルモン剤及び植物誘導物質）及び生体物質（例えばサイトカイン、癌ワクチン、及び遺伝療法送達腫瘍抑制遺伝子）のような他の抗癌物質と併用することもできる。例えば、癌患者に、ＴＲＡＩＬをコードする発現ベクターと、ドキソルビシンのような抗癌薬を共投与すると、該薬物によるアポトーシス阻害分子の抑制又はプロ−アポトーシス分子の上方制御を通じて、相乗的に癌細胞をＴＲＡＩＬ媒介アポトーシスに感作することで、その耐性を克服するだろう。従って、本発明の併用療法を用いることで、毒性水準下量の化学療法薬によって癌患者を治療し、なおかつ高用量の化学療法薬の使用に伴う重篤な副作用を患うことなくより良い臨床効力を達成することができる。
【００２３】
（図面の簡単な説明）
図１Ａ、１Ｂ、及び１Ｃは、それぞれｐＬＡｄ−Ｃ．ｔＴＡベクター、ｐＲＡｄ．Ｔ．ＧＦｓＬベクター、及びｒＡｄ／ＦａｓＬ−ＧＦＰＴＥＴベクターを模式的に示す。図１Ａには、ｐＬＡｄ−Ｃ．ｔＴＡベクターが示される。このプラスミドは、Ａｄ５ゲノムの最左の４５０ｂｐ、次いで強力なＣＭＶｉｅエンハンサー／プロモーター及びＭＣＳに挿入されたｐＵＨＤ１５−１由来のｔＴＡ遺伝子を含む。アダプターは、制限部位Ｘｂａ１、Ａｖｒ２及びＳｐｅ１を含み、すべてＸｂａ１と適合性の付着末端を生成する。ｒＡｄベクターへの構築後、効率的なｔＴＡ発現のためＥ１ＡポリＡを利用する。同様の戦略を用いて他の導入遺伝子を含有するｐＬＡｄベクターを構築した。図１Ｂには、ｐＲＡｄ．Ｔ．ＧＦｓＬベクターが示される。このプラスミドは、唯一のＥｃｏＲ１部位（２７３３３ｂｐ）から右側ＩＴＲ（３５９３５ｂｐ）のＡｄ５（ｓｕｂ３６０）配列を含み、Ｅ３及びＥ４を欠失している（Ｅ４のＯｒｆ６Ａは保持されている）。このダイアグラムは、ＴＲＥプロモーターと、ＦａｓＬ−ＧＦＰ融合タンパク質と、ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリＡとから成る調節性ＦａｓＬ−ＧＦＰ発現カセットの構造を示す。このカセットをＭＣＳに３５８１０ｂｐで挿入した。ｒＡｄ／ＦａｓＬ−ＧＦＰＴＥＴベクターの試験管内構築は図１Ｃに示される。ＧＦＰとＦａｓＬ読み枠との間の接合部が拡大されている。同様の戦略によって他のｒＡｄベクターを生成した。
【００２４】
図２は、  ２９３及び２９３ＣｒｍＡ細胞におけるｒＡｄベクターのタイターとＦａｓＬ活性の比較を示すグラフである。１２−ウェルプレートに１０４個の２９３又は２９３ＣｒｍＡ細胞を接種し、１日後、５のＭＯＩでｒ−Ａｄ／ＦａｓＬ、ｒＡｄＦａｓＬ−ＧＦＰＴＥＴ、又はｒＡｄ／ＬａｃＺにより感染させた。形質導入４８時間後、細胞を収集かつ溶解させた。ライセートを滴定して２９３ＣｒｍＡ細胞についてＰＦＵ／ｍｌを決定した。結果は、２セットの独立実験の平均値と平均誤差を示す。
図３は、ＴＲＡＩＬ及びＧＦＰ遺伝子が、これら２つの遺伝子の二シストロン発現を容易にするＩＲＥＳによって分離されていること以外は、図１の説明で述べたのと同様の方法によって構築されるＴＲＡＩＬ発現ベクターＡｄ．ＴＲＡＩＬ／ＧＦＰＴＥＴの構成を示す。
【００２５】
図４は、ＦａｓＬ−及びＴＲＡＩＬ−誘導アポトーシスに対する癌細胞の異なる感度を示す。癌細胞、Ａ４５９、ＨｅＬａ、ＬｎＣＰ、及びＣ３Ａを、アデノウイルス感染に対する感受性及びＦａｓＬ−及びＴＲＡＩＬ−誘導アポトーシスに対する感度について解析した。細胞を、１０のＭＯＩでＡｄＧＦＰ（左から第１列及び第２列のパネル）、Ａｄ／ＦａｓＬ−ＧＦＰＴＥＰ（第３列）及びＡｄ．ＴＲＡＩＬ／ＧＦＰＴＥＰ（第４列）によって感染させた。細胞のアデノウイルス感染の感受性は、ＧＦＰ発現細胞の数（第１列）に示され、細胞の形態は、明視野ビューに示される（第２列）。Ａｄ／ＦａｓＬ−ＧＦＰＴＥＴ及びＡｄ．ＴＲＡＩＬ／ＧＦＰＴＥＴで感染された細胞の形態は、それぞれ第３及び第４列のパネルに示される。
【００２６】
図５は、ＴＲＡＩＬ発現が非形質転換線維芽細胞内でアポトーシスを誘導しないことを示す。ＴＲＡＩＬ発現が正常細胞内でアポトーシスを誘導するかを決定するため、低継代ヒト包皮線維芽細胞を約１０のＭＯＩで、ＡｄＧＦＰ、Ａｄ／ＦａｓＬ−ＧＦＰＴＥＴ、及びＡｄ．ＴＲＡＩＬ／ＧＦＰＴＥＴによって感染させた。明視野ビューは、ＡｄＧＦＰで形質導入した線維芽細胞の正常形態を示す（パネルＧＦＰ ｈＦＦ）。ＧＦＰ発現細胞の低数によって示されるように、線維芽細胞はアデノウイルスによる不十分な感染度を示した（パネルＧＦＰ）。しかし、これら細胞はＦａｓＬ誘導アポトーシスに対しては高い感受性である（パネルＦａｓＬ）。対照的に、ＴＲＡＩＬ形質導入細胞では、５倍のＭＯＩでさえ明白なアポトーシスが観察されない（パネルＴＲＡＩＬ×５）。
【００２７】
図６は、Ｆａｓリガンドを含む本発明のアデノウイルスベクター（Ａｄ／ＦａｓＬ−ＧＦＰＴＥＴベクター）の注射でヌードマウスに移植されたヒト乳癌の成長の抑制を示す。同数の乳癌細胞を６匹のマウスの各脇腹に移植した。マウスの右脇腹の腫瘍にＡｄ／ＦａｓＬ−ＧＦＰＴＥＴベクターを注射し、同一マウスの左脇腹の腫瘍に対照ベクター、Ａｄ／ＬａｃＺを注射した。６匹のうち４匹のマウスで、１回の注射後に腫瘍集団のほとんどが消滅した（黄色矢印で示される）。２匹のマウスでは、同一マウスの対照部位上の腫瘍と比較して８０％より多く腫瘍の成長が抑制された（黒色矢印）。
【００２８】
（発明の詳細な説明）
本発明は、部位特異的かつ制御された様式でＦａｓＬ及びＴＲＡＩＬのようなアポトーシス信号発信リガンドを発現させることによって、癌、特に固形腫瘍を治療するための新規な方法及び発現ベクターを提供する。これらアポトーシス信号発信リガンドの制御された発現は、これらリガンドの非制御全身投与に伴う細胞毒性を有意に減少させるだろう。
【００２９】
本発明によれば、アポトーシス信号発信リガンド（例えばＦａｓＬ及びＴＲＡＩＬ）をコードする遺伝子を運ぶアデノウイルスベクターのような発現ベクターを薬学的に許容性の多くの投与経路によって腫瘍部位内に導入することができる。アデノウイルスによって形質導入された細胞は、好ましくは膜結合型タンパク質としてリガンドを発現する。細胞内におけるアポトーシス信号発信リガンド（例えばＴＲＡＩＬ）とアポトーシス媒介レセプター（例えばＤＲ４及びＤＲ５）との相互作用を通じて、信号伝達のカスケードが生じる。この現象が、アポトーシス信号がプロテアーゼ及びエンドヌクレアーゼのような複数のアポトーシス酵素の発現によって増幅される複数のアポトーシス経路を誘導する。リガンドとレセプターとの間の相互作用が２細胞間で起こるので、アデノウイルスで形質導入されていない腫瘍細胞は、“傍観者効果”により誘導されてアポトーシスを受けうる。この効果は、アデノウイルスで基質導入された細胞内で発現されるアポトーシス信号発信リガンドと、形質導入されていない腫瘍細胞の表面上で発現されるアポトーシス媒介レセプターとの間の特異的な相互作用に起因する。従って、本発明の方法を用いることで、細胞死滅効率は、タンパク質としてのリガンド又は該リガンドを発現する細胞の直接注入を伴う当該アプローチより高いだろう。
【００３０】
本発明の１つの重要な特徴は、アポトーシス信号発信リガンドの発現が組織特異的又は誘導性プロモーターのような条件プロモーターによって制御されることである。リガンドの発現を部位特異的に制御すること（例えば組織特異的プロモーターを用いて）及び／又は用量の柔軟な調整によって、リガンドの潜在的な全身毒性が有意に減少するだろう。
【００３１】
特に、該リガンドをコードするアデノウイルスウイルスを腫瘍部位に直接注入し、腫瘍細胞内に該リガンドを局所的に伝達することができる。送達されるリガンドの用量により、アデノウイルスベクターは複製−適格性又は複製−非適格性でよい。腫瘍内に注入されると、アデノウイルスは腫瘍細胞を形質導入し、結果として、局所的に高レベルのリガンドを発現させる。リガンドと腫瘍細胞の表面上で発現されたレセプターとの間の相互作用を通じ、リガンド誘導アポトーシスの経路に沿って複数のタンパク質と酵素の発現によってアポトーシス信号が増幅される。こうして、周囲の健康な組織損傷を最小にしながら大量の腫瘍細胞を根絶することができる。ある意味では、本発明によって提供されるこのアプローチは、“分子外科術”のようであり、癌療法薬の無差別的な非制御投与に伴う従来のアプローチよりも貴重かつ安全である。
【００３２】
本発明の方法を用いることで、初生腫瘍を根絶することができ、その間に腫瘍部位における癌細胞アポトーシスを活性化することで癌の再発を防止することができる。
一局面では、本発明は、アポトーシス媒介レセプターを発現する細胞内で死を誘導する方法を提供する。死の態様は、壊死、アポトーシス又は両者の組合せでよい。
本方法は、以下の工程：アポトーシス媒介レセプターを発現する細胞を含んでなる細胞群に発現ベクターを導入する工程を含む。発現ベクターは、その発現が好ましくは該ベクター内の条件プロモーターによって調節されるアポトーシス信号発信リガンドをコードするポリヌクレオチド配列を含む。発現ベクターが導入される細胞は、条件プロモーターの活性化に適する条件のときに、アポトーシス信号発信リガンドを発現する。発現したアポトーシス信号発信リガンドは、アポトーシス信号発信リガンドとアポトーシス媒介レセプターとの間の相互作用を通じてアポトーシス媒介レセプターを発現する当該細胞内で細胞死を誘導する。
【００３３】
本実施形態によれば、アポトーシス媒介レセプターは、Ｆａｓリガンド、Ｆａｓ用のレセプター、及びＴＲＡＩＬ、ＤＲ４及びＤＲ５のレセプターのような膜結合型レセプターでよい。任意にアポトーシス媒介レセプターは腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）でよいが、ＴＮＦはＦａｓ及びＴＲＡＩＬより高い全身毒性を有しうる。
また、本実施形態によれば、アポトーシス信号発信リガンドは、アポトーシス媒介レセプターに結合できるいずれのタンパク質でもよい。例えば、アポトーシス信号発信リガンドは、Ｆａｓ（又はＤＲ４／ＤＲ５）に結合でき、Ｆａｓ（又はＤＲ４／ＤＲ５）を発現する細胞内にＦａｓ（又はＤＲ４／ＤＲ５）媒介アポトーシスを発信する抗体である。抗体は、本発明の発現ベクターによって一本鎖抗体として発現し、アポトーシス媒介レセプター上の該抗体の同族抗原に結合することができる。
好ましくは、アポトーシス信号発信リガンドは、ＦａｓＬ及びＴＲＡＩＬのような膜タンパク質である。任意にアポトーシス信号発信リガンドはＴＮＦでよいが、ＴＮＦはＦａｓ及びＴＲＡＩＬよりも高い全身毒性を有しうる。
【００３４】
１．アポトーシス媒介レセプター及びアポトーシス信号発信リガンド
本発明によれば、アポトーシス媒介レセプターは、アポトーシス信号発信リガンドと結合するとプログラム細胞死を媒介する死レセプターである。本レセプターは、膜結合型である細胞表面レセプターでよく、又は細胞質若しくは核内にある。好ましい実施形態では、アポトーシス媒介レセプターは細胞膜結合型レセプターである。このようなアポトーシス媒介レセプターの重要な例は、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）レセプタースーパーファミリーに属する。
【００３５】
ＴＮＦレセプタースーパーファミリーは、関連するシステインリッチの細胞外ドメインの存在によって定義される。ＴＮＦレセプターの例としては、限定するものではないが、ＮＧＦ、ＢＤＮＦ、ＮＴ−３及びＮＴ−４のようなＮＴＲ／ＧＦＲ（ｐ７５）、ＴＮＦ−Ｒ１（ＣＤ１２０ａ）、ＴＮＦ−Ｒ２（ＣＤ１２０ｂ）、Ｆａｓ（ＣＤ５／Ａｐｏ−１）ＤＲ３（ＴＲＡＭＰ／ＷＳＬ−１）、ＤＲ４（ＴＲＡＩＬ−Ｒ１）、ＤＲ５（ＴＲＡＩＬ−Ｒ２）、ＤｃＲ１（ＴＲＡＩＬ−Ｒ３）、ＤｃＲ２（ＴＲＡＩＬ−Ｒ４）、ＣＤ３０、ＣＤ４０、Ｃｄ２７、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＯＸ−４０、ＬＴ−βＲ、ヒトＨＶＥＭ（ヘルペスウイルス初期媒介物質）、ＯＲＧ（オステオプロテゲリン（ｏｓｔｅｏｐｒｏｔｅｇｅｒｉｎ））／ＯＣ１Ｆ、及びＲＡＮＫが挙げられる。Ａｓｈｋｅｎａｚｉ及びＤｉｘｉｔ（１９９９）“死及びおとりレセプターによるアポトーシス制御”Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１１：２５５−２６０。
【００３６】
すべてのレセプターは、メンバー間に約２５％の同一性があり、リガンド結合に寄与する２−６システインリッチドメインで構成される細胞外領域を有するＩ型膜貫通タンパク質である。Ｆａｓ、ＴＮＦ−Ｒ１、ＴＲＡＩＬ−ＤＲ４、ＤＲ５、ＴＲＡＭＰ（ＤＲ３）、ＣＡＲ１は、同様の細胞質ドメインを有する。これらレセプターの細胞内領域の配列比較が、死ドメインと呼ばれる約８０個のアミノ酸の相同的な、よく保存された領域を明らかにした。Ｏｒｌｉｎｃｋ及びＣｈａｏ（１９９８）“ＴＮＦ関連リガンド及びそのレセプター”Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌ １０：５４３−５５１。死ドメインは、アポトーシスに係わる細胞性信号発信分子（アダプタータンパク質）の特異的な補充に必要である。Ｎａｇａｔａ（１９９７）“死因子によるアポトーシス”Ｃｅｌｌ ８８：３５５−３６５。
【００３７】
ＴＮＦレセプタースーパーファミリー内のレセプターに結合するリガンドとしては、限定するものではないが、ネオロトロフィン（ｎｅｏｒｏｔｒｏｐｈｉｎ）、ＴＮＦ−α、Ｆａｓリガンド（ＦａｓＬ／ＣＤ−９５Ｌ／Ａｐｏ−１Ｌ）、ＴＲＡＩＬ／Ａｐｏ−２Ｌ、ＣＤ３０Ｌ、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ２７Ｌ、４−１ＢＢＬ、ＯＸ−４０Ｌ、及びリンホトキシン（ＬＴ）α，βが挙げられる。ＬＴ−αを除き、すべてのリガンドはＩＩ型膜タンパク質として合成され；そのＮ末端は細胞質内にあり、そのＣ末端は細胞外領域に伸長している。Ｎａｇａｔａ（１９９７）“死因子によるアポトーシス”Ｃｅｌｌ ８８：３５５−３６５。細胞外ドメイン内にある約１５０個のアミノ酸の領域は、ＴＮＦファミリーのメンバー間で２０〜２５％の相同性がある。
【００３８】
リガンドの共通の特徴は、すべての活性リガンドが３つの同一サブユニットで構成され（三量体）、オリゴマー形成によってそれぞれのレセプターを活性化することである。Ｓｃｈｕｌｚｅ−Ｏｓｔｈｏｆｆら（１９９８）“死レセプターによるアポトーシス”Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２５４；４３９−４５９。ほとんどのメンバーが膜結合型分子として見つけられ；特異的メタロプロテアーゼが可溶形態を生成することができる。ＴＡＣＥと呼ばれるＴＮＦ−ａ用の亜鉛依存性メタロプロテアーゼは、このような特異的メタロプロテアーゼの一例である。Ｏｒｌｉｎｃｋ及びＣｈａｏ（１９９８）“ＴＮＦ−関連リガンド及びそのレセプター”Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌ １０：５４３−５５１。
【００３９】
２．Ｆａｓリガンド媒介アポトーシス
好ましい実施形態では、アポトーシス信号発信リガンドはＦａｓリガンドである、本発明によれば、腫瘍部位内の発現ベクターによるＦａｓリガンドの制御された発現が、Ｆａｓ−ＦａｓＬ相互作用を通じてＦａｓを発現する細胞内でアポトーシスを誘導しながら、やはりＦａｓを発現する当該正常細胞へのＦａｓリガンドの無差別攻撃に伴う副作用を最小化するだろう。
Ｆａｓ（ＡＰＯ−１、ＣＤ９５）、つまりＦａｓリガンドレセプターは、４５ｋＤａのＩ型膜タンパク質であり、ＴＮＦ／神経成長因子レセプタースーパーファミリーに属する。Ｂａｊｏｒａｔｈ，Ｊ．及びＡ．Ａｒｕｆｆｏ．（１９９７）“比較分子モデリングによるヒトＦａｓレセプターの三次元構造の予測”Ｊ．Ｃｏｍｐｕｔ Ａｉｄｅｄ Ｍｏｌ Ｄｅｓ １１：３−８；及びＷａｔａｎａｂｅ−Ｆｕｋｕｎａｇａ，Ｒ．，Ｃ．Ｉ．Ｂｒａｎｎａｎ，Ｎ．Ｉｔｏｈ，Ｓ．Ｙｏｎｅｈａｒａ，Ｎ．Ｇ．Ｃｏｐｅｌａｎｄ，Ｎ．Ａ．Ｊｅｎｋｉｎｓ及びＳ．Ｎａｇａｔａ“マウスＦａｓ抗原のｃＤＮＡ構造、発現、及び染色体配置”Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：１２７４−９。
【００４０】
Ｆａｓのリガンド、ＦａｓＬは、腫瘍壊死因子ファミリーに属する４０−ｋＤａのＩＩ型膜タンパク質である。Ｔａｋａｈａｓｈｉ，Ｔ．，Ｍ．Ｔａｎａｋａ，Ｊ．Ｉｎａｚａｗａ，Ｔ．Ａｂｅ，Ｔ．Ｓｕｄａ及びＳ．Ｎａｇａｔａ．（１９９４）“ヒトＦａｓリガンド：遺伝子構造、染色体配置及び種特異性”Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：１５６７−７４。ＦａｓＬ（及び特定の抗−Ｆａｓ抗体）のＦａｓへの結合性は、レセプターのオリゴマー形成を引き起こし、ｃａｓｐａｓｅ経路を通じて信号を送り、その結果アポトーシスによるレセプター担持細胞の迅速な死となる。Ｌａｒｓｅｎ，Ｃ．Ｐ．，Ｄ．Ｚ．Ａｌｅｘａｎｄｅｒ，Ｒ．Ｈｅｎｄｒｉｘ，Ｓ．Ｃ．Ｒｉｔｃｈｉｅ及びＴ．Ｃ．Ｐｅａｒｓｏｎ．（１９９５）“Ｆａｓ−媒介細胞毒性。Ｔ細胞−媒介免疫応答における免疫エフェクター又は免疫調節性経路？”Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ６０：２２１−４；Ｌｏｎｇｔｈｏｒｎｅ，Ｖ．Ｌ．及びＧ．Ｔ．Ｗｉｌｌｉａｍｓ．（１９９７）“Ｆａｓ−媒介アポトーシスへの関係づけにはｃａｓｐａｓｅ活性が必要である”ＥＭＢＯ．Ｊ．１６：３８０５−１２；Ｎａｇａｔａ，Ｓ．及びＰ．Ｇｏｌｓｔｅｉｎ．（１９９５）“Ｆａｓ死因子”Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６７：１４４９−５６；及びＯｇａｓａｗａｒａ，Ｊ．Ｒ．Ｗａｔａｎａｂｅ−Ｆｕｋｕｎａｇａ，Ｍ．Ａｄａｃｈｉ，Ａ．Ｍａｔｓｕｚａｗａ，Ｔ．Ｋａｓｕｇａｉ，Ｙ．Ｋｉｔａｍｕｒａ，Ｎ．Ｉｔｏｈ，Ｔ．Ｓｕｄａ及びＳ．Ｎａｇａｔａ．（１９９３）“マウス内の抗−Ｆａｓ抗体の致死的効果”［（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ Ｏｃｔ ７；３６５（６４４６）：５６８に正誤表発表］Ｎａｔｕｒｅ ３６４：８０６−９。
【００４１】
Ｆａｓはほとんどすべての細胞型で発現される。ＦａｓがＦａｓＬに結合すると、それはインターロイキン結合酵素（ＩＣＥ）又はｃａｓｐａｓｅｓのカスケード発現を通じて遺伝的にプログラムされた細胞死を活性化する。Ｃｈａｎｄｌｅｒら（１９９８）“マウス肝臓内におけるＦａｓ−誘導アポトーシスに従うｃａｓｐａｓｅ−３及びｃａｓｐａｓｅ−７の異なる細胞内分布”Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：１０８１５−１０８１８；Ｊｏｎｅｓら（１９９８）“マウス肝細胞内のＦａｓ−媒介アポトーシスはｃａｓｐａｓｅｓのプロセシング及び活性化に関与する”Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ２７：１６３２−１６４２。
リガンドとレセプターの両方が膜タンパク質なので、Ｆａｓ−誘導アポトーシスは通常細胞−細胞連絡を通じて媒介される。しかし、ＦａｓＬの可溶形態は、いくつかの細胞によっても生成され、標的細胞によっては、いくらか変化した活性を有することが分かっている。Ｔａｎａｋａ．Ｍ．，Ｔ．Ｉｔａｉ，Ｍ．Ａｄａｃｈｉ及びＳ．Ｎａｇａｔａ（１９９８）“Ｆａｓリガンドのシェディング（ｓｈｅｄｄｉｎｇ）による下方制御”［注釈参照］，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．４：３１−６；及びＴａｎａｋａ，Ｍ．，Ｔ．Ｓｕｄａ，Ｔ．Ｔａｋａｈａｓｈｉ及びＳ．Ｎａｇａｔａ（１９９５）“活性化リンパ球内におけるヒトＦａｓリガンドの機能性可溶形態の発現”ＥＭＢＯ．Ｊ．１４：１１２９−３５。
【００４２】
例えば、本発明は、細胞へのＦａｓリガンドのベクター媒介遺伝子伝達によってＦａｓを発現する腫瘍細胞（Ｆａｓ＋細胞）の死を誘導する方法を提供する。この方法では、Ｆａｓリガンドを発現するベクター形質導入細胞が、Ｆａｓ＋腫瘍細胞にアポトーシスを受けさせて死亡させる。ベクターは、注射器又はマイクロポンプで腫瘍内に注入することができ、従って腫瘍を除去するための従来の外科手術の必要を排除することができる。
ベクターによって形質導入された癌細胞によりＦａｓＬが発現される機構は多数あるだろう。癌細胞死は、いくつかの方法で誘導することができる：１）ＦａｓＬが隣接腫瘍細胞上のＦａｓに結合し、そのアポトーシスを誘導する；２）ＦａｓＬが内皮細胞のアポトーシスを誘導し、腫瘍を供給する血管を殺す；３）腫瘍細胞上のＦａｓＬの発現が周囲組織のアポトーシスを誘導し、いずれの苗床担体の腫瘍細胞も取り除く；及び４）アポトーシスが、癌再発の原因である静止腫瘍細胞を再活性化しうるポジティブ因子の放出を阻止する。
【００４３】
このアプローチの主要な利点は、Ｆａｓ−ＦａｓＬ相互作用が、ｐ５３−依存性及び非依存性経路の両方に従ういくつかのアポトーシス経路を活性化する主な信号発信現象であることである。Ｃａｌｌｅｒａ（１９９８）“再生不良性貧血由来のリンパ球内におけるｂｃｌ−２及びｐ５３の正常発現によるＦａｓ−媒介アポトーシス”Ｂｒ．Ｊ．Ｈａｅｍａｔｏｌ．１００：６９８−７０３。従って、アポトーシス信号発信は、１より多くの酵素発現のカスケードによって増幅され、アポトーシスはｐ５３又は他の細胞周期チェックポイントタンパク質に依存しない。例えば、ｐ５３遺伝子による遺伝子療法は、癌治療に非常に有望であることが分かっており（Ｂｏｕｌｉｋａｓ（１９９７）“前立腺癌の遺伝子療法：ｐ５３、自殺遺伝子、及び他の標的”Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１７：１４７１−１５０５）、ｐ５３遺伝子療法は、ｐ５３突然変異を有する腫瘍細胞の約５０〜６０％で有効である。Ｉｗａｙａら（１９９７）“節−ネガティブ乳癌の初期再発の指標としての組織学的悪性度及びｐ５３免疫反応”Ｊｐｎ Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ ２７：６−１２。
【００４４】
他の利点は、ＦａｓＬが、通常ｐ５３及びｃａｓｐａｓｅｓのような細胞内タンパク質ではなく膜結合型信号発信タンパク質であることである。細胞表面上のＦａｓＬ発現は、強力な“傍観者効果”によってアポトーシス信号を周囲の癌細胞に発信し、すべての癌細胞に治療遺伝子を送達する必要がない。従って、本発明は、現在の遺伝子療法を超えた有意な改良を与え、毒性薬物の使用を回避し、かつ腫瘍再発の防止を助ける癌治療の非外科的方法の要求を満たす。
Ｆａｓリガンドを制御された様式で発現させることによって、例えば、組織特異的又は誘導性プロモーターの制御によって、腫瘍内におけるアポトーシスを選択的に促することで腫瘍の成長を抑制でき、Ｆａｓリガンドの全身毒性を減少させることができる。
【００４５】
３．癌細胞のＴＲＡＩＬ−媒介選択的アポトーシス
ＴＲＡＩＬ、つまりＡｐｏ−２リガンドは、２８１アミノ酸、ＩＩ型膜貫通タンパク質であり、ＦａｓＬに最も密接に関連する（２８％アミノ酸相同性）。ＦａｓＬと同様に、ＴＲＡＩＬは多くの感受性腫瘍細胞系を４〜８時間で殺すことができる。対照的に、ＴＮＦは２４時間以上で腫瘍細胞系を殺す。Ｗｉｌｅｙら（１９９５）“アポトーシスを誘導するＴＮＦファミリーの新メンバーの同定及び特徴づけ”Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ３：６７３−６８２。ＴＲＡＩＬレセプター、ＤＲ４及びＤＲ５は、全長Ｆａｓレセプターのように、アポトーシス信号を媒介するためのアダプター分子（例えばＦＡＤＤ（Ｆａｓ関連死ドメイン）様のアダプター）と相互作用しうる死ドメインを含有する。
【００４６】
ＴＲＡＩＬ−媒介アポトーシスの開始は、リガンド（ＴＲＡＩＬ）でレセプターを架橋させることによる標的細胞上のこれらＤＲ４又はＤＲ５のクラスター形成に関与する。レセプターのオリゴマー形成により、ＦＡＤＤと同様のアダプター分子が、死ドメイン相互作用によって、ＤＲ４又はＤＲ５レセプタークラスターに補充される。Ｃｈｉｎｎａｉｙａｎら（１９９６）“ＴＮＦＲ−１及びＣＤ９５に関連する死−ドメイン−含有レセプター、ＤＲ３による信号伝達”Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７４：９９０−９９２。反発的レセプターＤＲ４及びＤＲ５のＴＲＡＩＬへの架橋は、おとりレセプター（ＤｃＲ１及びＤｃＲ２）で阻害することができる。Ｓｈｅｒｉｄａｎら（１９９７） “信号発信及びおとりレセプターのファミリーによるＴＲＡＩＬ誘導アポトーシスの制御”Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７７：８１８−８２１。おとりレセプターは、死信号を媒介するための機能性死ドメインを欠き、かつＤＲ４及びＤＲ５によるＴＲＡＩＬへの結合と競合できるので、ＴＲＡＩＬ−媒介アポトーシスを阻害することができる。Ｇｒｉｆｆｉｔｈら（１９９９）“モノクロナール抗体を用いたＴＲＡＩＬレセプターの機能解析”Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６２：２５９７−２６０５。
【００４７】
ＦＡＤＤと同様のＴＲＡＩＬアダプター分子は、おそらくＦＬＩＣＥ（ｃａｐａｓｅ−８）、すなわち最終アポトーシス表現型につながるｃａｓｐａｓｅ増幅カスケードを開始するアスパラギン酸特異的システインプロテアーゼに結合する死エフェクタードメインを含むだろう。Ｍｕｚｉｏ（１９９８）“タンパク質分解による信号発信：死アダプターがアポトーシスを誘導する”Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｌａｂ．Ｒｅｓ．２８：１４１−１４７。アダプターがＴＲＡＩＬレセプターＤＲ４又はＤＲ５の死ドメインに補充されると、ＦＬＩＣＥチモーゲンがＦＡＤＤ様アダプターによって接触させられ、ＦＬＩＣＥの自動切断によって活性化される。ＴＲＡＩＬレセプター−アダプター−ＦＬＩＣＥから成るＦＬＩＣＥ活性化複合体は、ＤＩＳＣ（死誘導信号発信複合体（ｄｅａｔｈ ｉｎｄｕｃｉｎｇ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｃｏｍｐｌｅｘ））と呼ばれる。Ｋｉｓｃｈｋｅｌら（１９９５）“細胞毒性−関連依存性ＡＰＯ−１（Ｆａｓ／ＣＤ９５）−関連タンパク質は、レセプターと死誘導信号発信複合体（ＤＩＳＣ）を形成する”ＥＭＢＯ Ｊ．１４；５５７９−５５８８。ＦＬＩＣＥ酵素は、引き続きそのチモーゲン型を切断することによって、ｃａｓｐａｓｅ−３及び他のｃａｓｐａｓｅｓを活性化する。Ｍａｒｔｉｎｅｚ−Ｌｏｒｅｎｚｏら（１９９８）“Ｊａｒｋａｔ及びヒト末梢血液Ｔ細胞の活性化誘導死におけるＡｐｏ−２リガンド／ＴＲＡＩＬの関与”Ｅｕｒｏ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２８：２７１４−２７２５。活性ｃａｓｐａｓｅ−３は、ＩＣＡＤ（ｃａｓｐａｓｅ−活性化デオキシ−リボヌクレアーゼのインヒビター）を切断することができ、その結果、アポトーシスの典型的な特徴である１８０〜２２０ｂｐの断片にＤＮＡを切断する活性ヌクレアーゼが遊離する。
【００４８】
ＴＲＡＩＬ発現は、種々多様なヒト組織内で検出されており、脾臓、肺及び前立腺内で最高レベルである。Ｗｉｌｅｙら（１９９５）“アポトーシスを誘導するＴＮＦファミリーの新メンバーの同定及び特徴づけ”Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ３：６７３−６８２。本発明では、正常細胞に比し、癌細胞がＴＲＡＩＬ誘導アポトーシスに対して選択的な感受性を有することが示される。例えば、ＬＮＣＡＰ（前立腺）、Ｈｅｌａ（頸部）、Ａ５４９（肺）、及びＣ３Ａ（肝臓）のようなヒト癌細胞系は、ＴＲＡＩＬ−媒介アポトーシスに感受性であるが、包皮試料由来の初生ヒト線維芽細胞は、同レベルのＴＲＡＩＬが細胞内で発現されても基本的に影響されない。従って、ＴＲＡＩＬは、ＦａｓＬに比し、より腫瘍特異的様式でアポトーシスを誘導し、ひいては生体内発現時に全身毒性が低くなりうる。
【００４９】
腫瘍細胞がＴＲＡＩＬ−媒介アポトーシスに特に感受性であることの多くの可能な理由があるだろう。１つの可能性は、健康な正常細胞が、細胞死につながる生化学的な信号発信経路を遮断するＦＬＩＣＥ−阻害タンパク質（ＦＬＩＰｓ）のような細胞内調節因子を発現しうることである。Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓら（１９９８）“ヒトメラノーマ細胞内におけるＴＲＡＩＬ−誘導アポトーシスの細胞内調節”Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６１：２８３３−２８４０。正常細胞上のＴＲＡＩＬの細胞毒性効果の欠如が、ＴＲＡＩＬへの結合でＤＲ４又はＤＲ５と競合することでＴＲＡＩＬ−媒介アポトーシスを阻害するＤｃＲ１及びＤｃＲ２のようなおとりレセプターの発現に起因する可能性もある。
本発明の方法を用いることで、アデノウイルスベクターのような条件発現ベクターによって癌細胞中にＴＲＡＩＬを導入することができ、選択的に癌細胞のアポトーシスを誘導する。ＴＲＡＩＬは正常細胞にほとんど毒性を及ぼさず、その発現は部位特異的かつ用量依存的に制御できるので、このリガンドの全身毒性は低減するだろう。
【００５０】
４．アポトーシス信号発信リガンド用発現ベクター
本発明の方法の実施に使用可能な発現ベクターは、いずれの遺伝子伝達ベクターでもよい。発現ベクターは、アポトーシス信号発信リガンド（例えばＴＲＡＩＬ）をコードするプラスミドでよい。プラスミドは、リボゾーム媒介送達又は形質移入の他の方法によって癌細胞中に形質移入することができる。
好ましくは、発現ベクターはウイルスベクターである。ウイルスベクターは、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、ワクシニア、レトロウイルス、又は単純ヘルペスウイルスベクターでよい。
【００５１】
本発明は、好ましくは部位特異的かつ制御様式で癌細胞の死を誘導するために使用するアデノウイルスベクターを提供する。アポトーシス信号発信リガンドの発現は、組織特異的プロモーター又は誘導性プロモーターを用いることで制御することができる。代わりに、アポトーシス信号発信リガンドの発現は、形質導入された細胞内で構成的でよい。アデノウイルス発現ベクターは、試験官内及び生体内の両方で広範な細胞型にアポトーシス信号発信リガンドを送達するために使用することができる。さらに、アポトーシス信号発信の発現を厳密に調節することができ、アポトーシス信号発信リガンドをコードするアデノウイルス発現ベクターの産生を促すのみならず、該リガンドの生体内発現を制御して全身毒性を最小にする手段を提供する。さらに、本発明は、外因性アポトーシス信号発信リガンドのレベル及び細胞局在化を容易かつ確実に定量化する手段をも提供する。
【００５２】
好ましい実施形態では、アデノウイルスベクターは以下：条件プロモーター、及びベクター内の該条件プロモーターによって、その発現が制御される膜結合型リガンドをコードするポリヌクレオチド配列を含み、該リガンドがアポトーシス媒介レセプターを発現する細胞内でアポトーシスを発信する。アデノウイルスベクターは、複製−適格性又は複製−非適格性でよく、腫瘍部位中に投与されるアポトーシス信号発信リガンドの用量によって決まる。
膜結合型リガンドは、癌細胞の表面上のアポトーシス媒介レセプターに結合できるいずれのタンパク質でもよい。好ましくは、膜結合型タンパク質は、ＦａｓＬ又はＴＲＡＩＬである。任意に膜結合型タンパク質はＴＮＦでよいが、ＴＮＦはＦａｓ及びＴＲＡＩＬよりも高い全身毒性を有しうる。
【００５３】
これとは別に、アデノウイルスベクターは、該リガンドが細胞に導入されると、その伝達された細胞が該リガンドを細胞内で発現するような別のタイプのアポトーシス信号発信リガンドをコードしてもよい。リガンドとアポトーシス媒介レセプターとの相互作用が細胞にアポトーシスを受けさせる。このような細胞内アポトーシス信号発信分子の例としては、限定するものではないが、Ｂａｘ、Ｂａｄ、Ｂａｋ、及びＢｉｋが挙げられる。Ａｄａｍｓら“細胞死の制御”ＷＥＨＩ Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｐｏｒｔ １９９６／１９９７。
【００５４】
本発明の他の実施形態では、アポトーシス信号発信リガンドをコードする発現ベクターは、該リガンドの発現を調節するために使用しうる調節タンパク質のような他のタンパク質をコードすることもできる。例えば、調節タンパク質は、細胞膜上のＦａｓリガンドの組織特異的局在化をもたらし、又は代わりに非標的細胞内のＦａｓリガンドの早発性代謝回転を引き起こし、又は転写及び／又は翻訳の調節によってＦａｓＬの発現を調節することができる。
【００５５】
調節タンパク質は、発現されるタンパク質をコードする核酸と同時に、又は連続的に、細胞に送達される別の発現ベクターによってコードすることもできる。この実施形態では、２つの発現ベクターは、異なるプロモーターのような異なる配列を有して、ステロイドホルモン、例えば、当該ホルモンによって誘導されるプロモーターを調節できるグルココルチコイドホルモンの使用によってのように、該プロモーターの一方又は両方の発現を選択的に調節する薬物の投与によってのように、独立的に調節することができる。使用可能な他のステロイドホルモンとしては、限定するものではないが、エストロゲン、アンドロゲン、及びプロゲステロンが挙げられる。
【００５６】
アポトーシス信号発信リガンドは、別のタンパク質との融合タンパク質として発現してもよい。リガンドと融合されたこのタンパク質は、タンパク質の局在化、リガンドの活性化又は不活性化、リガンドの位置の監視、リガンドの単離、及びリガンドの量の定量化のような目的で使用することができる。
一実施形態では、融合タンパク質は、Ｆａｓリガンドと、蛍光タンパク質（ＦＰ）のようなリポータータンパク質とを含む。リポータータンパク質の例としては、限定するものではないが、ＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）遺伝子、ＹＦＰ（黄色蛍光タンパク質）遺伝子、ＢＦＰ（青色蛍光タンパク質）遺伝子、ＣＡＴ遺伝子、ネオ遺伝子、ハイグロマイシン遺伝子等が挙げられる。ＦａｓＬ−ＧＦＰ融合タンパク質発現構成物の例が図１に示され、さらに本明細書で説明される。
【００５７】
これとは別に、リポーター遺伝子は、内部リボゾーム侵入部位（ＩＲＥＳ）又はスプライシング供与体／受容体部位の機構によってアポトーシス信号発信リガンドを有する二シストロン的な単一タンパク質として発現されうる。
発現ベクターは、さらにアポトーシス信号発信リガンドの発現を調節できる配列をコードすることができる。例えば、該ベクターは、グルココルチコイド調節要素（ＧＲＥ）を含有し、グルココルチコイドホルモンを用いてＦａｓリガンドの発現を調節することができる。
隣接遺伝子の発現を調節できる調節配列の別の例は、Ｈ１０及びＨ１９のようなＲＮＡアプタマーを該プロモーター領域にクローン化することでＨｏｅｃｈｓｔ染料３３２５８のような薬物の投与によって該遺伝子の生体内発現を遮断することができる。Ｗｅｒｓｔｒｕｃｋら（１９９８）“小分子−ＲＮＡ相互作用による生細胞内の遺伝子発現の制御”Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８２：２９６−２９８。
【００５８】
本発明の他の実施形態では、調節配列は、Ｔｅｔ−オペロン若しくはｌａｃオペロン、又は真核細胞内で調節配列として機能しうる他のいずれかのオペロンを含む。
好ましい実施形態では、アポトーシス信号発信リガンドの発現は、テトラサイクリン調節遺伝子発現系の制御下、リガンドの発現がｔｅｔ−応答性要素によって制御され、該リガンド発現は、ｔｅｔ−応答性要素とｔｅｔトランス活性化因子の相互作用を必要とする。
さらに好ましい実施形態では、リガンド発現の厳密な制御は、Ａｄベクターを用いて達成され、ｔｅｔ−応答性要素及びトランス活性化要素は、同一ベクターの反対の端部に作られ、エンハンサーの干渉を回避する。発現は、テトラサイクリン又は、限定するものではないが、ドキシサイクリンを含むそのいずれの誘導体によっても、用量依存的様式で好都合に調節することができる。例えば、該ベクターが、ＦａｓＬ−ＧＦＰ遺伝子を細胞に効率的に試験管内送達し、その融合タンパク質の発現レベルを培養液中のドキシサイクリンの濃度によって調節することができる。このような調節系の例については、本明細書で詳細述べられる。
【００５９】
本発明の一実施形態では、プロモーターは、当業者には明かな組織特異的プロモーターであり、ＦａｓＬ及びＴＲＡＩＬのようなアポトーシス信号発信リガンドをコードする核酸の発現に対して組織特異性を与えることができる。
例えば、組織特異的プロモーターは、前立腺特異的、乳房組織特異的、大腸組織特異的、膵臓特異的、脳特異的、腎臓特異的、肝臓特異的、膀胱特異的、骨特異的、肺特異的、甲状腺特異的、胃特異的、卵巣特異的、又は頚部特異的プロモーターでよい。
組織特異的プロモーターが前立腺特異的プロモーターである場合、プロモーターとしては、限定するものではないが、ＰＳＡプロモーター、ΔＰＳＡプロモーター、ＡＲＲ２ＰＢプロモーター、ＰＢプロモーター、ｇｐ９１−ｐｈｏｘ遺伝子プロモーター、及び前立腺特異的カリクレイン（ｈＫＬＫ２）プロモーターが挙げられる。
【００６０】
組織特異的プロモーターが乳房特異的プロモーターである場合、プロモーターとしては、限定するものではないが、ＭＭＴＶプロモーター、Ｇ．Ｉ．ｅｒｂ−Ｂ２プロモーター、ｅｒｂ−Ｂ３プロモーター、β−カゼイン、β−ラクト−グロブリン、及びＷＡＢ（ホエー酸性タンパク質）プロモーターが挙げられる。組織特異的プロモーターが肝臓特異的プロモーターである場合、プロモーターとしては、限定するものではないが、肝臓アルブミンプロモーター、α−フェトプロテインプロモーター、α１−抗トリプシンプロモーター、及びトランスフェリントランスサイレチンプロモーターが挙げられる。
組織特異的プロモーターが脳特異的プロモーターである場合、プロモーターとしては、限定するものではないが、ＪＣウイルス初期プロモーター、チロシンヒドロキシラーゼプロモーター、ドーパミンヒドロキシラーゼプロモーター、脳特異的エノラーゼプロモーター、神経膠線維酸性タンパク質プロモーター、成熟星状膠細胞特異的タンパク質プロモーター、及びミエリンプロモーターが挙げられる。
【００６１】
組織特異的プロモーターが大腸特異的プロモーターである場合、プロモーターとしては、限定するものではないが、ＭＵＣ１プロモーター、炭酸脱水酵素Ｉプロモーター及び癌胎児性抗原プロモーターが挙げられる。
組織特異的プロモーターが卵巣特異的プロモーターである場合、プロモーターとしては、限定するものではないが、エストロゲン応答性プロモーター、アロマターゼチトクロームＰ４５０プロモーター、コレステロール側鎖切断Ｐ４５０プロモーター、及び１７α−ヒドロキシラーゼＰ４５０プロモーターが挙げられる。
組織特異的プロモーターが肺特異的プロモーターである場合、プロモーターとしては、限定するものではないが、サーファクタントタンパク質Ｃウログロビン（ｃｃ−１０、Ｃｌｌａｃｅｌｌ １０ ｋｄ タンパク質）プロモーターが挙げられる。
組織特異的プロモーターが皮膚特異的プロモーターである場合、プロモーターとしては、限定するものではないが、Ｋ−１４−ケラチンプロモーター、ヒトケラチン１又は６プロモーター、及びロイクリン（ｌｏｉｃｒｉｎ）プロモーターが挙げられる。
組織特異的プロモーターが膵臓特異的プロモーターである場合、プロモーターとしては、限定するものではないが、ビリンプロモーター、グルカゴンプロモーター、及びインスリン島アミロイドポリペプチド（アミリン）プロモーターが挙げられる。
組織特異的プロモーターが甲状腺特異的プロモーターである場合、プロモーターとしては、限定するものではないが、チログロブリンプロモーター、及びカルシトニンプロモーターが挙げられる。
【００６２】
組織特異的プロモーターが骨特異的プロモーターである場合、プロモーターとしては、限定するものではないが、α１（Ｉ）コラーゲンプロモーター、オステオカルシンプロモーター、及び骨シアロ糖タンパク質プロモーターが挙げられる。
組織特異的プロモーターが腎臓特異的プロモーターである場合、プロモーターとしては、限定するものではないが、レニンプロモーター、肝臓／骨／腎臓アルカリ性ホスファターゼプロモーター、及びエリスロポイエチン（ｅｐｏ）プロモーターが挙げられる。
他の組織特異的プロモーターが、ヒトゲノム計画及びヒト遺伝子発見の試みで明らかにされるだろうことに留意すべきである。これらプロモーターは、本発明の発現ベクターから組織特異的な発現を方向づけるための適切な手段として使用できるだろう。
【００６３】
さらに、当業者は、特定の細胞型に特異的なプロモーターの同定のしかたが容易にわかるだろう。例えば、異なる組織型内の遺伝子の差別的な発現を比較することで、例えば遺伝子チップ技術を用いて、１つの特定組織型でのみ発現される遺伝子を同定することができる。そして、これら遺伝子を単離し、配列決定し、異種遺伝子の組織特異的発現を作動させる能力について動物モデルで試験することができる。このような方法は、本技術の当業者の十分能力内である。組織特異的プロモーターを同定できる方法の例は、Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇら（１９９４）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ ８：２３０−２３９で見出すことができる。
【００６４】
組織特異性は、高度の組織特異性を有する発現ベクターを選択することによっても達成することができる。例えば、選択的に大腸癌に関連する細胞のような粘膜細胞を感染させるベクターを選択し、任意に座薬の使用によってのように特異的な送達手段と併用し、Ｆａｓ及びＴＲＡＩＬのようなアポトーシス信号発信リガンドをコードする核酸を当該所望の細胞に選択的に送達することができる。
【００６５】
当業者は、種々のベクターが多かれ少なかれ特定宿主に依存する適応性を有することを認識している。核酸を特定宿主に導入する特定の技法の一例は、組換えレトロウイルスゲノムをパッケージできるレトロウイルスベクター系の使用である。例えば、Ｐａｓｔａｎら（１９８８）“ＭＤＲ１ ｃＤＮＡを運ぶレトロウイルスは多剤耐性及びＭＤＣＫ細胞内におけるＰ−糖タンパク質の極性発現を与える”Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８５：４４８６；及びＭｉｌｌｅｒら（１９８６）“ヘルパーウイルス産生につながる組換えを回避するためのレトロウイルスパッケージング細胞系の再設計”Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．６：２８９５。そして、生成された組換えレトロウイルスを用いて感染させ、それによってその感染細胞にアポトーシス信号発信リガンドをコードする核酸配列を送達することができる。当然、核酸を哺乳類細胞に導入する的確な方法は、レトロウイルスベクターの使用に限定されない。アデノウイルスベクター（Ｍｉｔａｎｉら“アデノウイルスベクターによるヒト骨髄の形質導入”Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ５：９４１−９４８（１９９４））、アデノ関連ウイルスベクター（Ｇｏｏｄｍａｎら“造血性前駆細胞への組換えアデノ関連ウイルス媒介遺伝子伝達”Ｂｌｏｏｄ ８４：１４９２−１５００（１９９４））、レンチウイルスベクター（Ｎａｉｄｉｎｉら“レンチウイルスベクターによる非分裂細胞の生体内遺伝子送達及び安定な形質導入”Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７２：２６３−２６７（１９９６））、偽型レトロウイルスベクター（Ａｇｒａｗａｌら“血液由来ＣＤ３４＋細胞内における細胞周期キネティクス及びＶＳＶ−Ｇ偽型レトロウイルス媒介遺伝子伝達”Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．２４：７３８−７４７（１９９６））、ワクシニアベクター、及び物理的形質移入法（Ｓｃｈｗａｒｚｅｎｂｅｒｇｅｒら“ｃ−ｋｉｔレセプターを通じたヒト造血性前駆体細胞系への標的遺伝子伝達”Ｂｌｏｏｄ ８７：４７２−４７８（１９９６））の使用を含め、この手順には他の技術を広範に使用可能である。この発明は、これら又は他の通常使用される遺伝子伝達法のいずれとも併用することができる。本発明の好ましい実施形態では、Ｆａｓリガンドをコードする核酸を送達するための特異的なベクターは、アデノウイルスベクターを含む。
【００６６】
５．トランス調節タンパク質をコードする発現ベクター
アポトーシス信号発信リガンドの発現を調節できることが望ましいので、本発明は、標的タンパク質（例えばＦａｓＬ及びＴＲＡＩＬ）の発現を厳密に制御するために調節可能な発現用の発現ベクターをも提供する。
この発現ベクターは以下：転写調節配列；この転写調節配列に結合可能なトランス作動性調節タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列；及びその発現がトランス作動性調節タンパク質の転写調節配列への結合性によって調節される標的タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含む。
転写調節配列と、トランス作動性調節タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列は、アデノウイルスベクターの反対に位置づけられる。例えば、転写調節配列がアデノウイルスベクターのＥ４領域内に位置づけられ、トランス作動性タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列がアデノウイルスベクターのＥ１内に位置づけられる。
【００６７】
このベクターでは、標的タンパク質をコードする核酸は、操作的に転写調節配列に連結される。この標的タンパク質の発現は誘導性であり、例えば、特定の転写調節配列用の適切な活性化因子が存在しなければ、ＦａｓＬの発現又はＦａｓＬ融合は進行しないだろう。
代わりに、標的タンパク質の発現は抑制性でよく、すなわち、特定の転写調節配列用の適切なリプレッサーが存在しなければ、ＦａｓＬの発現又はＦａｓＬ融合が進行するだろう。
トランス作動性調節タンパク質が転写調節配列と相互作用して標的タンパク質の転写に作用する。転写調節配列が誘導性の場合、トランス作動性調節タンパク質はトランス活性化因子である。転写調節配列が抑制性の場合、トランス作動性因子はトランス−リプレッサーである。
【００６８】
さらに好ましい実施形態では、転写調節配列は、ｔｅｔ応答性要素（ＴＲＥ）であり、トランス作動性因子はｔｅｔ応答性トランス作動性発現要素（ｔＴＡ）である。
最も好ましい実施形態では、本発明は、ベクターＡｄ／ＦａｓＬ−ＧＦＰＴＥＴを利用する。これは、マウスＦａｓＬと緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）との融合を発現させる複製−欠失アデノウイルスベクターである。ＦａｓＬ−ＧＦＰは、野生型ＦａｓＬの全活性を保持し、同時に生細胞と固定細胞の両方で容易な可視化及び定量化を可能にする。この融合タンパク質は、テトラサイクリン調節遺伝子発現系の条件下にある。このｔｅｔ応答性要素とトランス活性化要素が同一ベクターの反対の末端に作られ、エンハンサーの干渉を回避する新規な“二重組換え体”アデノウイルスベクターを作製することで、厳密な制御が達成される。
【００６９】
ＦａｓＬ−ＧＦＰ融合の発現は、テトラサイクリン又は、限定するものではないが、ドキシサイクリンを含むそのいずれの誘導体によっても、用量依存的様式で好都合に調節することができる。このベクターは、生体内及び試験管内で効率的にＦａｓＬ−ＧＦＰ遺伝子を細胞に送達し、融合タンパク質の発現レベルは、培養液に添加され、又は被験者に投与されるドキシサイクリンの濃度によって調節することができる。以下の実施例で分かるように、Ａｄ／ＦａｓＬ−ＧＦＰＴＥＴは、ＦａｓＬ−ＧＦＰを形質転換された初生細胞系に送達し、培地内のドキシサイクリンのレベルを変えることによって当該細胞内における融合タンパク質の発現を調節することができる。ＦａｓＬ−ＧＦＰの量は、そのＧＦＰ成分の蛍光を通じて容易に検出かつ定量することができ、標的細胞及び隣接細胞内のアポトーシスのレベルと相関させることができる。
【００７０】
この全体的なｔｅｔ調節遺伝子発現系を送達するベクターデザインは、複数のベクターを用いる戦略よりも有効かつ経済的であり、タンパク質発現の調節が望まれるいずれの状況にも適用することができる。
従って、本発明は、テトラサイクリン又はテトラヒドロフラン誘導体に応じて標的タンパク質の発現を厳密に制御するための発現ベクターを提供する。この発現ベクターは以下：テトラサイクリン応答性要素；このテトラサイクリン応答性要素に結合可能なトランス活性化タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列；及びその発現がトランス活性化タンパク質のテトラサイクリン応答性要素への結合性によって調節される標的タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含む。
【００７１】
好ましい実施形態では、ベクターはウイルスベクターである。さらに好ましい実施形態では、ウイルスベクターはアデノウイルスベクターである。このアデノウイルスベクターでは、テトラサイクリン応答性要素とトランス活性化タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列は、該アデノウイルスベクターの反対の末端に位置づけられる。例えば、テトラサイクリン応答性要素がアデノウイルスベクターのＥ４領域内に位置づけられ、トランス活性化タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列がアデノウイルスベクターのＥ１内に位置づけられる。任意に、アデノウイルスベクターはアデノウイルスのＥ３領域を含まない。また任意に、アデノウイルスベクターはＥ４領域のＯｒｆ６を除きＥ４領域を含まない。
【００７２】
標的タンパク質の発現は、テトラサイクリン又はドキシサイクリンの存在で抑制することができる。代わりに、標的タンパク質の発現は、ドキシサイクリンの存在で活性化することができる。
該ベクターは、限定するものではないが、アデノ関連ウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター又はレトロウイルスベクターを含む他のいずれのタイプのウイルスベクターでもよいことに留意すべきである。
発現ベクターは、さらにリポータータンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含むことができる。リポータータンパク質と標的タンパク質を融合タンパク質としてコードし、又は内部リボゾーム侵入部位（ＩＲＥＳ）又はスプライシング供与体／受容体部位の機構によって標的タンパク質を有する二シストロン的な単一タンパク質として発現させることができる。
リポーター遺伝子は、好ましくは緑色、黄色及び青色蛍光タンパク質のような蛍光タンパク質、さらに好ましくは緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードする。
例えば、アデノウイルスベクターは、ｐＬＡｄ−Ｃ．ｔＴＡとｐＲＡｄ−ＴＧＦｓＬをＡｄ５ゲノムの一部（ｓｎｂ ３６０）に連結し、後述するように、また図１Ａ〜Ｃに示されるようなベクターＡｄ／ＦａｓＬ−ＧＦＰＴＥＴを生成することによって、融合タンパク質、ＦａｓＬ−ＧＦＰの発現用に構築することができる。
【００７３】
ＦａｓＬ−ＧＦＰ融合以外の標的タンパク質の発現は、該標的配列をコードするポリヌクレオチドでＦａｓＬ−ＧＦＰ融合配列を置き換えた同様のアデノウイルスベクター（ｐＡｄＴＥＴと呼ばれる）を用いることで調節することができる。ベクターｐＡｄＴＥＴは、図１Ａ〜ＣでベクターＡｄ／ＦａｓＬ−ＧＦＰＴＥＴの生成について述べたのと同様な方法で、ＦａｓＬ−ＧＦＰ融合配列をベクターｐＲＡｄ−ＴＧＦｓＬから除去し、この部位に標的配列を挿入し、かつその結果生じたベクターをｐＬＡｄ−Ｃ．ｔＴＡに連結することで構築できる。ベクターｐＡｄＴＥＴを利用して、厳密な調節が望まれる無制限な種々の異種タンパク質を発現させることができる。
【００７４】
発現ベクターは、さらに該ベクターを含有し、かつ選択マーカーを発現する当該細胞のスクリーニングに使用できる選択マーカーを含むことができる。この方法では、該核酸又は該ベクターを含有し、かつ該選択マーカーを発現する当該細胞を、該核酸又は該ベクターを含有するが、該選択マーカーを発現しない細胞、及び該核酸又は該ベクターを含有しない細胞から容易に分離することができる。使用する特異的な選択マーカーは、当然、選択マーカーを含有せず、かつ発現しない真核細胞に対して選択するのに使用できるいずれの選択マーカーでもよい。選択は、選択マーカーが薬物耐性タンパク質をコードする遺伝子である場合のような、選択マーカーを含有かつ発現しない細胞の死に基づくことができる。真核細胞のこのような薬物耐性遺伝子の例は、ネオマイシン耐性遺伝子である。ネオマイシン耐性遺伝子を発現する細胞は、抗生物質Ｇ４１８、つまりジェネテシン７の存在下で生存できるが、ネオマイシン耐性遺伝子を含有しないか又は発現しない真核細胞は、Ｇ４１８の存在下に反して選択される。当業者は、抗生物質ハイグロマイシンＢで選択されうるｈｐｈ遺伝子、又は抗生物質ミコフェノール酸によって選択されうる大腸菌Ｅｃｏｇｐｔ遺伝子のような選択マーカーの他の例があることを認識している。従って、使用する特異的な選択マーカーは可変である。
【００７５】
選択マーカーは、該選択マーカー遺伝子を含有かつ発現する細胞を、抗生物質の存在下で成長する能力以外の手段で、該選択マーカー遺伝子を含有しないか及び／又は発現しない細胞から分離するのに使用できるマーカーでもよい。例えば、選択マーカーは、発現されると、該マーカーをコードする選択マーカーを発現する当該細胞の同定を可能にするタンパク質をコードすることができる。例えば、選択マーカーは、ルシフェラーゼタンパク質又は緑色蛍光タンパク質のような発光タンパク質をコードすることができ、該発光タンパク質をコードする選択マーカーを発現する細胞は、発光タンパク質をコードする選択マーカーを含有しないか又は発現しない当該細胞から同定することができる。代わりに、選択マーカーは、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）のようなタンパク質をコードする配列でよい。技術的に周知の方法により、ＣＡＴを産生する細胞は、ＣＡＴを産生しない細胞から容易に同定かつ区別することができる。
【００７６】
６．本発明の発現ベクターの構築
本発明の発現ベクターは、組換えＤＮＡ技術を用いることで構築できる。例えば、上述した調節性アデノウイルスベクターは、アデノウイルス５型から誘導し、アポトーシス信号発信リガンド（例えばＦａｓ及びＴＲＡＩＬ）及び転写調節配列をコードする異種配列を含むように修飾することができる。
【００７７】
当業者は、アポトーシス信号発信リガンド、及び任意に、１種又は２種以上の転写調節配列のような追加配列をコードする核酸配列を得ることができる利用可能な多くの方法があることを認識している。核酸を得る１つの方法は、組換えＤＮＡ分子を合成することで核酸を作製することによる。例えば、オリゴヌクレオチド合成手順は、本技術では日常的であり、特定タンパク質又は調節領域のオリゴヌクレオチドコーティングは、自動ＤＮＡ合成によって容易に得られる。二本鎖分子の一本鎖用核酸を合成し、その相補鎖にハイブリダイズすることができる。これらオリゴヌクレオチドを、結果として生じる二本鎖分子が、内部制限部位又は適切なベクターにクローン化するため末端に適切な５’若しくは３’オーバーハングを有するように設計することができる。相対的に大きいタンパク質又は調節領域の二本鎖分子コーティングは、まず該タンパク質又は該調節領域の特定領域をコードする数種の二本鎖分子を作製し、その後これらＤＮＡ分子を一緒に連結することで合成することができる。例えば、Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍら（１９８９）“相同体−走査突然変異誘発によって同定されたヒト成長ホルモンのレセプター及び抗体エピトープ”Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｖｏｌ．２４３，ｐｐ．１３３０−１３３６は、まずオーバーラップ及び相補合成オリゴヌクレオチドを作製し、これら断片を一緒に連結することによって、ヒト成長ホルモン遺伝子をコードする合成遺伝子を作製した。合成オリゴヌクレオチドからの１０５７塩基対合成ウシロドプシン遺伝子の合成が開示されている、Ｆｅｒｒｉｔｔｉら（１９８６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８２：５９９−６０３も参照せよ。一度適切なＤＮＡ分子が合成されると、このＤＮＡを適切なプロモーターの下流にクローン化できる。このような技法は、本技術では日常的であり、十分実証されている。
【００７８】
アポトーシス信号発信リガンドをコードする核酸を得る別の方法の例は、対応する野生型核酸が見出されている生体からそれを単離し、かつそれを適切なベクター内でクローン化することである。例えば、ＤＮＡ又はｃＤＮＡライブラリーを作製し、関心のある核酸の存在をスクリーニングすることができる。このようなライブラリーの作製及びスクリーニング方法は、技術的に周知であり、作製及びスクリーニング工程を実施するためのキットが商業的に入手可能である（例えば、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）。一度単離されると、その核酸を直接適宜のベクターにクローン化し、又は必要ならば、修飾して次のクローン化工程を容易にすることができる。このような修飾工程は日常的であり、一例は、制限部位を含有するオリゴヌクレオチドリンカーの核酸末端への付加である。一般的な方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら“分子クローニング、実験室マニュアル”Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒａｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）で述べられている。一度単離されると、標準的な実験室法、例えばＰＣＲを用いて選択されたコドンを変えることができる。
【００７９】
アポトーシス信号発信リガンドをコードする核酸を得る方法のさらに別の例は、対応する野生型核酸を含有する宿主生体内に見られる野生型核酸を前記核酸から増幅し、その増幅した核酸を適切なベクター内でクローン化することである。本技術の当業者は、標的核酸に完全には相同性でないプライマーを用いて、増幅工程が突然変異工程、例えば同時に核酸を増幅し、かつ核酸の特異的位置を変えることと併用できることを認識している。
これら組換えＤＮＡ技術を用いることで、アポトーシス信号発信リガンドをコードする複製−非適格性アデノウイルスベクターを構築することができる。例えば、ＴＲＡＩＬをコードする複合アデノウイルスベクターを構築し、腫瘍細胞の感染に使用することができる。さらにＴＲＡＩＬを有して二シストロン的に発現されるＧＦＰを含むベクターは、Ａｄ．ＴＲＡＩＬ／ＧＦＰＴＥＴと呼ばれる。
【００８０】
ベクター、Ａｄ．ＴＲＡＩＬ／ＧＦＰＴＥＴは、複数の遺伝子及び調節機構を発現させる複合アデノウイルスベクターである。このアデノウイルスベクターの構成は、図３に示される。ＩＲＥＳによって分離されたＴＲＡＩＬとＧＦＰをコードする配列が、シャトルベクターによって５型アデノウイルスゲノムの右末端（Ｅ４領域）にクローン化され、結果としてシャトルベクターｐＲＡｄＴＲＥ−ＴＲＡＩＬ／ＧＦＰが生じる。このｐＲＡｄＴＲＥ−ＴＲＡＩＬ／ＧＦＰシャトルベクターは、右ロングターミナルリピートＲ−ＴＲを含む、アデノウイルスゲノムの右末端を含有する。
別のシャトルベクター、ｐＬＡｄ−Ｃ．ｔＴＡは、５型アデノウイルスゲノムのＥ１領域内にテトラサイクリントランス活性化遺伝子ｔＴＡを含有する。このベクターｐＬＡｄ−Ｃ．ｔＴＡは、左ロングターミナルリピートＬ−ＴＲを含む、アデノウイルスゲノムの左末端と、アデノウイルスパッケージングシグナルΨをも含有する。ベクターｐＲＡｄＴＲＥ−ＴＲＡＩＬ／ＧＦＰとｐＬＡｄ−Ｃ．ｔＴＡは、両方とも線状化され、アデノウイルスのバックボーンに連結されて組換えアデノウイルスベクター、Ａｄ．ＴＲＡＩＬ／ＧＦＰＴＥＴが生成される。
【００８１】
７．投与経路及び製剤形態
アポトーシス信号発信リガンドをコードする発現ベクターは、薬学的に許容性のいずれの与経路によっても腫瘍内に導入することができる。例えば、非経口的に、腹腔内に、静脈内に、動脈内に、経皮的に、舌下に、筋肉内に、直腸に、経頬的に、鼻腔内に、リポゾームに、吸入によって、膣に、眼内に、カテーテル若しくはステントによる局所送達によって、皮下に、脂肪内に、関節内に、クモ膜下腔内に、又は遅延放出剤形で、腫瘍群中に発現ベクターを投与することができる。
当業者は、本方法のこの局面が、アポトーシス信号発信リガンド（例えばＦａｓＬ及びＴＲＡＩＬ）をコードする配列の細胞内への安定した又は一過性の導入を含むことができることを認識している。さらに、安定的又は過渡的に導入されたリガンド−コード配列は、宿主のゲノムに組み込まれるようになり又は組み込まれない。
【００８２】
当業者は、細胞中に発現ベクターを導入する正確な手順は、当然に変えることができ、かつ細胞の特有の型又はアイデンティティによって決まることを認識している。発現ベクターの細胞内への導入方法の例としては、限定するものではないが、エレクトロポレーション、細胞融合、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介形質移入、リン酸カルシウム媒介形質移入、ウイルスベクターによる形質移入、マイクロインジェクション、リポフェクション媒介形質移入、リポソーム送達、及び微粒子銃法が挙げられ、“裸のＤＮＡ”送達の種々の手順を含む。任意に、本方法は、発現ベクターが導入される細胞群が、癌を有する患者から採取した試料内にあるか又は細胞培養内にある場合、生体外で行うことができる。
【００８３】
例えば、発現ベクターは、Ｆａｓを発現する細胞とＦａｓを発現しない細胞の混合物に導入することができる。任意に、発現ベクターは、Ｆａｓを発現しない細胞に導入することができる。任意に、発現ベクターは、Ｆａｓを発現する細胞に導入することもできる。また任意に、発現ベクターは、Ｆａｓを発現しない細胞とＦａｓを発現する細胞に導入することができる。“傍観者効果”によって、発現ベクターで形質導入された細胞近傍のＦａｓを発現する癌細胞が、Ｆａｓ−ＦａｓＬ相互作用によって殺される。
アポトーシス信号発信リガンドを発現させるために使用する種々のベクター及び宿主を用いて細胞培養内又は試験管内でリガンドを発現させることができる。例えば、Ｆａｓリガンドをコードする発現ベクターは、ＣＯＳ細胞のような組織培養細胞系内に導入し、該細胞培養内で発現させることができる。この方法では、当業者は、宿主が、標的でない周囲の細胞又は組織に及ぼすアポトーシスの如何なる可能性も最小にできるような時間で、アポトーシス信号発信リガンドを発現する細胞を効率的に排除できるような、宿主生体内で制限された寿命を有する細胞型を選択することができる。
【００８４】
これとは別に、被験者の細胞を被験者から取りだし、アポトーシス信号発信リガンドをコードする発現ベクターを投与してから被験者に戻すことができる。この生体外処理手順では、被験者に不必要な副作用を及ぼすことなく、細胞を操作して、アポトーシス信号発信リガンドをコードする核酸の摂取を容易にすることができる。
アポトーシス信号発信リガンドを発現させるために用いる種々のベクターと宿主を使用して、核酸を生体内で発現させることができる。例えば、ＦａｓＬをコードする発現ベクターを真核生物宿主の細胞、好ましくは腫瘍細胞内に導入し、Ｆａｓ＋腫瘍細胞を生体内原位置で治療することができる。
【００８５】
簡単に上述したように、当業者は、宿主にベクターを選択的に投与することで特定組織を治療できることを理解している。例えば、吸入器の使用によってのようなエアロゾルを介してアデノウイルスベクターを投与すると、ベクターを選択的に肺に投与することができる。任意に、座薬を使用して、ベクターを大腸の細胞に選択的に投与することができる。
また、任意に、クリーム内のようにベクターを局所的に送達すると、ベクター又は核酸を皮膚細胞又は頚部に選択的に送達することができる。
【００８６】
当業者は、発現ベクターを特定の器官又は細胞に選択的に送達するために通常使用することができる種々の方法を理解している。例えば、発現ベクターの送達は、ベクターの選択部位への注射のような方法によって手で容易に行うことができる。例えば、直接注射を使用して、特定の脳及び／又は乳房位置にベクターを送達することができる。本発明の一実施形態では、乳癌集団内への送達にＦａｓリガンド又はＴＲＡＩＬをコードするベクターの直接注射を使用する。
本発明の方法及びベクターを用いてアポトーシス信号発信リガンドを細胞又は被験者、最も好ましくはヒトに投与して、病気状態、好ましくは癌を治療できると考えられる。本ベクターは、単独であるか、別の化合物若しくは組成物（例えば、化学療法薬）と併用するか、又はベクターに基づいた送達系の一部としてであろうが、非経口的に（例えば、静脈内に）、筋肉内注射で、腹腔内注射で、局所的に、経皮的等によって投与できるが、局所投与が特に好ましい。
【００８７】
このような核酸、組成物、ベクター等の正確な必要量は、被験者ごとに変わり、被験者の種、年齢、質量及び全身状態、治療すべき病気又は状態の重症度、使用する特定の化合物又は組成物、その投与態様等によって決まる。従って、正確な量を特定することは不可能であり或いは必要ない。しかし、当業者は、技術的に周知の方法によって適量を決定することができる。
局所投与では、本発明の組成物は、例えば、粉末、液体、懸濁液、ローション、クリーム、ゲル等のような固形、半固形又は液状剤形で、好ましくは正確な一投与量に適した剤形の医薬組成物でよい。本組成物は、通常、製薬的に許容性のキャリヤーと組み合わせて、有効量の選択された核酸、組成物、又はベクターを含むことができ、さらに他の薬剤、調合剤、キャリヤー、アジュバント、希釈剤等を含むことができる。
【００８８】
“製薬的に許容性の”とは、生物学的に又はその他の点で望ましくなくない物質、すなわち、個体に、如何なる望ましくない生物学的効果を生じさせることなく或いはそれが含まれる医薬組成物の他のいずれの成分とも有害な様式で相互作用することなく、選択された核酸、その組成物、又はベクターと共に投与することができる物質を意味する。
代替的又は追加的に、非経口投与の場合は、一般的に注射、例えば、標的細胞を有する組織又は器官に供給する血管を通じた局所潅流を含む静脈内注射を特徴とする。注射剤は、従来の形態で、液状溶液若しくは懸濁液、注射前に液体に溶解若しくは懸濁させるのに適した固体形態、又はエマルジョンとして調製することができる。非経口投与は、一定レベルの用量が維持されるような遅延放出又は持続放出系の使用にも利用できる（例えば、米国特許第３，７１０，７９５号参照）。本化合物は、Ｆａｓ＋表現型を発現する細胞若しくは組織の部位に直接注射するか、又はそれらがＦａｓ＋表現型細胞の部位に拡散若しくは循環するように注入することができる。
【００８９】
用量は、投与形態、治療すべき病気又は状態、及び個々の被験者の状態によって決まる。用量は、投与される物質、例えば核酸、核酸を含むベクター、又は他のタイプの化合物若しくは組成物にも依存する。このような用量は技術的に公知である。さらに、用量は、治療すべき特定の病気又は状態に典型的な用量に従って調整することができる。
さらに、標的細胞型の培養細胞を用いて標的細胞の生体内用量を最適化することができ、標的細胞型として同一型の培養細胞内で達成される用量を変えることによる変化を監視することができる。１回服用で十分なことが多く；しかし、所望により服用を繰り返すことができる。用量は、副作用を引き起こすほど多くてはいけない。一般的に、用量は年齢、状態、性及び患者の病気の程度にって変わり、当業者は決定することができる。用量は、如何なる合併症という場合に備えても個々の医者によって調整される。非ヒト動物の有効用量の例が実施例で提供される。技術承認処方に基づき、ヒトの有効用量は、有効と規定かつ示されている用量から日常的に計算することができる。
【００９０】
被験者の細胞への投与では、化合物又は組成物が被験者内に投与されると、当然被験者の体温に順応する。生体外投与では、化合物又は組成物は、それを培養液（標的細胞に適した）に添加し、この培地を直接細胞に添加することによってのような、細胞の生存度を維持するいずれの標準的な方法によっても投与することができる。技術的に公知なように、この方法で用いるいずれの培地も細胞が生存できなくならないように水性かつ無毒である。さらに、所望により培地は細胞の生存度を維持するための標準的な栄養物を含有することができる。
生体内投与では、本複合体を、例えば患者由来の血液試料若しくは組織試料に、又は製薬的に許容性のキャリヤー、例えば食塩水及び緩衝食塩水に添加し、かつ技術的に公知ないくつかの手段のいずれによっても投与することができる。
【００９１】
投与の他の例としては、エアロゾルの吸入、皮下若しくは筋肉内注射、該化合物が核酸若しくはタンパク質である場合、該化合物をコードする核酸配列の、被験者に移植及び後で移植するために調製された骨髄細胞中への直接形質移入、及び被験者に後で移植される器官への直接形質移入が挙げられる。
さらなる投与方法としては、特に組成物が被包されている場合の経口投与、又は特に組成物が座薬形態である場合の直腸投与が挙げられる。製薬的に許容性のキャリヤーとしては、生物学的又はその他の点で望ましくなくないいずれの物質でもよく、すなわち該物質は、如何なる望ましくない生物学的効果をも引き起こすことなく、かつそれが含まれる医薬組成物の他のいずれの成分とも有毒な様式で相互作用することなく、選択された複合物と共に個体に投与しうる。
【００９２】
特に、特定の細胞型が生体内で標的とされる場合、本明細書で述べ、かつ技術的に公知なように、例えば器官若しくは腫瘍の局所潅流によって、標的組織由来の細胞を生検し、該複合物の当該組織への移入の最適用量を試験管内で決定し、濃度及び時間長を含め、生体内用量を最適化することができる。
これとは別に、同一細胞型の培養細胞を用いて標的細胞の生体内用量を最適化することができる。例えば、腫瘍内注射の量及び割合を、コンピュータ制御ポンプ又はマイクロサーマルポンプのような制御可能ポンプを用いて制御し、腫瘍又は組織内の核酸又はベクターの割合及び分布を制御することができる。実施例４は、マウスの乳癌と脳腫瘍の両方の生体内治療で使用するＡｄ／ＦａｓＬ−ＧＦＰＴＥＴの有効用量を例示する。当業者は、これらの数字を外挿して有効なヒト用量を決定する方法が簡単に分かる。
【００９３】
生体外又は生体内使用のため、核酸、ベクター、又は組成物は、いずれの有効濃度でも投与することができる。有効濃度は、結果として形質転換表現型細胞の死滅、減少、阻害、又は防止となる当該量である。
本発明の発現ベクターは、組成物内で投与することができる。例えば、本組成物は、さらに他の薬物、調合剤、キャリヤー、アジュバント、希釈剤等を含むことができる。さらに、本組成物は、核酸又はベクターに加え、カチオン性リポソーム（例えば、ＤＯＴＭＡ、ＤＯＰＥ、ＤＣ−コレステロール）若しくはアニオン性リポソームのようなリポソームのような脂質を含むことができる。リポソームは、さらに所望により、特定細胞を標的にしやすくするためにタンパク質を含むことができる。核酸若しくはベクター及びカチオン性リポソームを含む組成物の投与は、標的器官に求心性の血管に投与し、又は気道内に吸入させて、気道の細胞を標的にすることができる。リポソームについては、例えば、Ｂｒｉｇｈａｍら，Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐ．Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１：９５−１００（１９８９）；Ｆｅｌｇｎｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４：７４１３−７４１７（１９８７）；米国特許第４，８９７，３５５号を参照せよ。さらに、核酸若しくはベクターは、マクロファージのような特異的な細胞型に標的されうるマイクロカプセルの成分として投与することができ、つまり該マイクロカプセルからの該化合物の拡散若しくは該化合物の送達が特定速度若しくは用量に設計されている。
【００９４】
アポトーシス媒介レセプターを発現するいずれの細胞も、特に腫瘍細胞を、本発明の方法で治療することができる。例えば、Ｆａｓは、本来表面タンパク質であり、ＦａｓＬを発現する細胞を用いて、アポトーシスのＦａｓ−ＦａｓＬ誘導により、Ｆａｓ発現細胞を治療することができる。ＦａｓＬを発現する細胞は、該細胞の表面上におけるＦａｓとＦａｓＬとの相互作用によってＦａｓ発現細胞と相互作用することができ、ひいては、ＦａｓＬ発現細胞が連絡をとれるＦａｓ発現細胞を治療することができる。さらに、ＦａｓＬ産生細胞は、Ｆａｓと相互作用し、かつＦａｓ発現細胞のアポトーシスも誘導する可溶性ＦａｓＬを産生することで、Ｆａｓ発現細胞を調節することもできる。
【００９５】
ＦａｓとＦａｓＬの相互作用は、典型的にはリガンド−レセプター結合であるが、この相互作用は、それ自体が結合していなくてもよいが、ＦａｓとＦａｓＬのいずれかの相互作用の結果として生じる何らかの細胞反応を包含する。この結果、当該同一細胞又はＦａｓリガンドを発現する二次細胞よるＦａｓＬの発現の結果生じるＦａｓによるいずれの細胞アポトーシスも考えられる。
Ｆａｓを発現するいずれも細胞も本発明の方法を用いてアポトーシスを受けさせることができるが、好ましい実施形態は、本方法を用いてＦａｓ＋腫瘍細胞にアポトーシスを受けさせることである。この実施形態では、選択的にこれら腫瘍細胞にアポトーシスを受けさせ、そして死亡させることによって腫瘍を治療することができる。
【００９６】
別の好ましい実施形態では、腫瘍は固形腫瘍であり、腫瘍の細胞を感染させ、それによってＦａｓＬを発現させることができる組換えウイルスを腫瘍に注射し、そして、ＦａｓＬ発現細胞とＦａｓ発現細胞との相互作用によって、Ｆａｓ＋細胞にアポトーシスを受けさせる。
通常アポトーシス信号発信を達成するには細胞間の連絡が必要なので、ＦａｓＬ発現細胞の作用を受けるＦａｓ発現細胞は、通常ＦａｓＬ発現細胞に隣接した細胞である。しかし、ＦａｓＬ発現細胞が周囲から分離されている場合及び／又はＦａｓＬ発現細胞が可溶性ＦａｓＬを産生する場合のように、作用を受けたＦａｓ細胞をＦａｓＬ発現細胞の中間の周囲物から取り除くことができる。
ＦａｓＬ発現細胞は、当該細胞がＦａｓ＋細胞でもある場合、自殺を引き起こすこともある。このアプローチでは、本発明の方法は、Ｆａｓ＋細胞を死亡させるが、現在ＦａｓＬを発現している腫瘍細胞も死に、それによって、そうでなければ腫瘍の復帰を引き起こしたであろう当該腫瘍細胞を除去する。
【００９７】
８．併用療法
本発明は、アポトーシス信号発信リガンドの発現と抗癌剤の投与を組み合わせた併用療法を利用する方法をも提供する。抗癌薬を共投与することで、特にＦａｓＬ又はＴＲＡＩＬ媒介アポトーシスに耐性な癌細胞内で癌細胞のアポトーシスを増強し、或いは感作できると考えられる。
癌治療の主な障害は、腫瘍細胞の薬物に対する耐性の発生及びアポトーシスに対するＦａｓＬ又はＴＲＡＩＬ感受性を呪縛しうる抗アポトーシス機構の発生である。ＴＲＡＩＬ（又はＦａｓ）耐性腫瘍細胞に、毒性水準下濃度の化学療法薬及びＴＲＡＩＬ（又はＦａｓ）を投与することが望ましく、その結果最大の腫瘍抑制と、高用量の化学療法薬の投与に伴う副作用の最小化となるだろう。
【００９８】
本発明の併用療法は、複数機構の作用によってＦａｓ又はＴＲＡＩＬ媒介アポトーシスに対する腫瘍耐性を克服することができる。化学療法薬又はサイトカインのような抗癌薬は、Ｆａｓ又はＴＲＡＩＬ媒介アポトーシスを、１）抗アポトーシス分子の抑制、及び／又は２）プロアポトーシス分子の上方制御によって感作することができる。例えば、Ｂｃｌ−ｘＬ及びＢｃｌ−２、すなわちミトコンドリアアポトーシス経路の主要インヒビターを抗癌薬によって制御することができる。植物由来の抗癌薬パクリタキセルは、Ｂｃｌ−２のリン酸化を誘導することにより、低レベルでＢｃｌ−２の活性を減じることができる。
【００９９】
さらに、薬物及びサイトカインは、プロアポトーシス分子の発現を上方制御して、ＴＲＡＩＬ媒介アポトーシスの誘導に必要な信号発信許容限界を低くすることができる。例えば、死誘導ＴＲＡＩＬレセプターの１種であるＤＲ５の発現は、遺伝毒性薬物及びＴＮＦ−αによって誘導することができる。ＤＲ５の誘導は、ｐ５３−依存及び非依存機構の両方で制御されるようである。Ｓｈｅｉｋｈら（１９９８）“死レセプターＫＩＬＬＥＲ／ＤＲ５遺伝子発現の遺伝毒性ストレス及び腫瘍壊死因子αに応じたｐ５３−依存性及び非依存性制御”Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５８：１５９３−１５９８。さらに、ｃａｓｐａｓｅｓ（ｃａｓｐａｓｅｓ−１，−２，−６，−８，及び−９）のｍＲＮＡは、γ−インターフェロンによって上方制御することができる。これらｃａｓｐａｓｅｓの上方制御は、本発明のアポトーシス信号発信リガンドの発現で誘導されるアポトーシスに対する感受性を増強するだろう。
【０１００】
種々多様な抗癌剤を本発明の発現ベクターと共に投与することができる。抗癌剤の例としては、限定するものではないが、アルキル化剤、抗生物質、代謝拮抗薬、ホルモン剤及び植物誘導物質及び生体物質が挙げられる。
アルキル化剤の例としては、限定するものではないが、ビスクロロエチラミン（窒素マスタード、例えばクロラムブシル、シクロホスファミド、イホスファミド、メクロレタミン、メルファラン、ウラシルマスタード）、アジリジン（例えばチオテパ）、アルキルアルカンスルホネート（例えばブスルファン）、ニトロソウレア（例えばカルムスチン、ロムスチン、ストレプトゾシン）、非古典的アルキル化剤（アルトレタミン（ａｌｔｒｅｔａｍｉｎｅ）、ダカルバジン、及びプロカルバジン）、白金化合物（カルボプラスチン及びシスプラチン）が挙げられる。
【０１０１】
抗生物質の例としては、限定するものではないが、アントラサイクリン（例えばドキソルビシン、ダウノルビシン、エピルビシン、イダルビシン及びアントラセンジオン）、マイトマイシンＣ、ブレオマイシン、ダクチノマイシン、プリカトマイシンが挙げられる。
代謝拮抗薬の例としては、限定するものではないが、フルオロウラシル（５−ＦＵ）、フロクスウリジン（ｆｌｏｘｕｒｉｄｉｎｅ）（５−ＦＵｄＲ）、メトトレキセート、ロイコボリン、ヒドロキシウレア、チオグアニン（６−ＴＧ）、メルカプトプリン（６−ＭＰ）、シタラビン、ペントスタチン、フルダラビンホスフェート、クラドリビン（ｃｌａｄｒｉｂｉｎｅ）（２−ＣＤＡ）、アスパラギナーゼ、及びゲムシタビン（ｇｅｍｃｉｔａｂｉｎｅ）が挙げられる。
【０１０２】
このようなホルモン剤の例は、合成エストロゲン（例えばジエチルスチベストロール）、抗エストロゲン（例えばタモキシフェン、トレミフェン、フルオキシメステロール及びラロキシフェン（ｒａｌｏｘｉｆｅｎｅ））、抗アンドロゲン（ビカルタミド、ニルタミド、フルタミド）、アロマターゼインヒビター（例えばアミノグルテチミド、アナストロゾール及びテトラゾール）、ケトコナゾール、ゴセレリンアセテート、ロイプロリド、メゲストロールアセテート及びミフェプリストンである。
植物誘導物質の例としては、限定するものではないが、ビンカアルカロイド（例えばビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンデシン、ビンゾリジン及びビノレルビン）、ポドフィロトキシン（例えばエトポシド（ＶＰ−１６）及びテニポシド（ＶＭ−２６））、カンプトセシン及びその誘導体（例えば９−ニトロ−カンプトセシン及び９−アミノ−カンプトセシン）、及びタキサン（例えばパクリタキセル及びドセタキセル）が挙げられる。
【０１０３】
生体物質の例としては、限定するものではないが、サイトカイン、腫瘍抗原に対抗するモノクロナール抗体、腫瘍抑制遺伝子、及び癌ワクチンのような免疫調節タンパク質が挙げられる。本発明の組成物と併用可能なインターロイキンの例としては、限定するものではないが、インターロイキン２（ＩＬ−２）、及びインターロイキン４（ＩＬ−４）、インターロイキン１２（ＩＬ−１２）が挙げられる。ＣＰＴと併用可能なインターフェロンの例としては、限定するものではないが、インターフェロンα、インターフェロンβ（線維芽細胞インターフェロン）及びインターフェロンγ（線維芽細胞インターフェロン）が挙げられる。このようなサイトカインの例としては、限定するものではないが、エリスロポイエチン（エポイチンα）、顆粒球−ＣＳＦ（フィルグラスチム）、及び顆粒球、マクロファージ−ＣＳＦ（サルグラモスチム）が挙げられる。サイトカイン以外の他の免疫調節剤としては、限定するものではないが、バシラスＣａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ、レバミゾール、及びオクトレオチドが挙げられる。
【０１０４】
ＣＰＴと併用可能な腫瘍抗原に対抗するモノクロナール抗体の例としては、限定するものではないが、ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）（Ｔｒａｓｔｒｕｚｕｍａｂ）及びＲＩＴＵＸＡＮ（登録商標）（Ｒｉｔｕｘｉｍａｂ）が挙げられる。
腫瘍抑制遺伝子の例としては、限定するものではないが、ＤＰＣ−４、ＮＦ−１、ＮＦ−２、ＲＢ、ｐ５３、ＷＴ１、ＢＲＣＡ１及びＢＲＣＡ２が挙げられる。
癌ワクチンの例としては、限定するものではないが、ガングリオシド（ＧＭ２）、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、α−フェトプロテイン（ＡＦＰ）、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）（大腸癌及び他の腺癌、例えば乳癌、肺癌、胃癌、及び膵臓癌によって産生される）、メラノーマ関連抗原（ＭＡＲＴ−１、ｇｐ１００、ＭＡＧＥ１，３チロシナーゼ）、パピローマウイルスＥ６及びＥ７断片、自己（ａｎｔｏｌｏｇｏｕｓ）腫瘍細胞及び同種異系腫瘍細胞の全細胞又は一部／ライセートが挙げられる。
【０１０５】
アジュバントを用いて、ＴＡＡｓに対する免疫応答を増強することができる。アジュバントの例としては、限定するものではないが、バシラスＣａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｒｉｎ（ＢＣＧ）。エンドトキシンリポ多糖類、鍵穴笠貝ヘモシアニン（ＧＫＬＨ）、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）及びシトキサン（ｃｙｔｏｘａｎ）、低用量で与えた場合腫瘍誘導抑制を低減すると考えられている化学療法薬が挙げられる。
【０１０６】
一実施形態では、アクチノマイシンＤ、すなわちＲＮＡ合成を阻害しかつＢｃｌ−ｘＬの発現を減少させる薬物を用いて、癌細胞、例えば、ＡＩＤＳに関連するカポジ肉腫（ＫＳ）内におけるＴＲＡＩＬ媒介アポトーシスを感作することができる。ＫＳは、ＨＩＶ感染によって人々に生じる最も一般的な悪性腫瘍である（ＡＩＤＳ−ＫＳ）。１５年間多くの様相が使用されてきたが、ＫＳからの治癒又は長期の完全な寛解は、現在利用できる療法様相では見込みない。Ｌｅｅ及びＭｉｔｓｕｙａｓｕ（１９９６）“ＡＩＤＳ関連カポジ肉腫の化学療法”Ｈｅｍａｔｏｌ．Ｏｎｃｏｌ．Ｃｌｉｎ．Ｎｏｒｔｈ Ａｍ．１０：１０５１−１０６８。ＡＩＤＳ−ＫＳ病変で高レベルのＢｃｌ−ｘ及びＢｃｌ−ｘＬが検出され、それらはＫＳ細胞の化学療法薬及びＮＫ細胞による殺害に対する耐性に寄与しうる。従って、ＫＳ患者に、ＴＲＡＩＬをコードする発現ベクターと、１種又は２種以上の遺伝毒性薬を共投与すると、遺伝毒性薬によるＢｃｌ−ｘ及びＢｃｌ−ｘＬレベルの抑制を通じ、相乗的にＴＲＡＩＬ媒介アポトーシスに対して癌細胞を感作することで、耐性を克服するだろう。
【０１０７】
別の実施形態では、ＴＲＡＩＬを発現させる発現ベクターとドキソルビシンを併用して、前立腺癌の患者を治療することができる。前立腺癌は、米国男性で最も流行している癌であり、一般的に進行性前立腺癌患者の生存率は低い。Ｌａｎｄｉｓら“癌統計”ＣＡ Ｃａｎｃｅｒ Ｊ．Ｃｌｉｎ．４９：８−３１。外科手術、ホルモン療法、及び化学療法により大多数の前立腺癌を根絶できるが、進行性癌転移の再発が起こりうる。ホルモン不応性の前立腺細胞は、放射線療法及び化学療法にも非感受性なので、おそらくこれら細胞は、それらが進行してさらに悪性になりながら種々の刺激によって誘発されるすべてのアポトーシスプログラムに対する耐性を発現するだろう。しかし、遺伝毒性薬とＴＲＡＩＬをコードする発現ベクターとを共投与すると、アポトーシス阻害分子の抑制又はプロアポトーシス分子の上方制御を通じてＴＲＡＩＬ媒介アポトーシスに対して前立腺癌細胞を感作することでその耐性を克服するだろう。
【０１０８】
本発明の発現ベクターは、癌（又は他の病気）を治療するためにアポトーシス信号発信リガンドを発現させる場合、癌（又は他の治療すべき病気）に対抗する他の治療薬と併用することができ、他療法薬の投与の前、その時、又はその後に投与することができる。これら療法薬は、有効であると知られ或いは決定された用量で投与することができ、また本発明のベクターによって発現されるアポトーシス信号発信リガンドの存在のため、低減用量で投与してよい。
以下の実施例で本発明をさらに詳細に説明するが、実施例には多くの変更及び変形があることが当業者には明白なので、実施例は単なる例示を意図している。
【０１０９】
（実施例）
実施例１  Ｆａｓリガンド用発現ベクター
上述しかつ図１に示される方法の例では、マウスＦａｓリガンドをコードする核酸を含有する組換えアデノウイルスを構築した。さらに、最終的に融合タンパク質が翻訳されるように、マウスＦａｓリガンドをコードし、かつクラゲ緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をもコードする核酸を含有する組換えアデノウイルスを構築した。この融合タンパク質を用い、該アデノウイルスベクターによる形質導入後の培養細胞内及び動物組織内における該タンパク質の発現及び局在化を監視した。
【０１１０】
３種の腫瘍細胞系を乳癌患者から単離したが、これらはすべて該アデノウイルスベクターによるＦａｓリガンド処理に対して高度の感受性を示した。このことは、この方法を用いて腫瘍細胞を効率的に処理、つまり殺すことができることを示している。平行実験も、Ｆａｓリガンドをコードする核酸の前立腺癌細胞内へのアデノウイルス媒介導入によって、これら細胞が完全に死滅したので、重症の前立腺癌細胞系がＦａｓ媒介アポトーシスに対して極度に感受性であることを示した。
【０１１１】
実施例２：複合アデノウイルスベクターによるＦａｓＬ−ＧＦＰ融合タンパク質の制御送達
Ｆａｓリガンド（ＦａｓＬ）は、Ｆａｓレセプターを発現する細胞内でアポトーシスを誘導し、かつ免疫応答性、変性及びリンパ球増殖性疾患及び腫瘍形成性に重要な役割を演じる。それは免疫特権部位の産生にも関与し、それゆえに遺伝子療法の分野にとって興味深い。我々は、マウスＦａｓＬと緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）の融合を発現させる複製−欠失アデノウイルスベクターの構築及び特徴づけについて述べる。ＦａｓＬ−ＧＦＰは野生型ＦａｓＬの全活性を保持し、同時に生細胞と固定細胞の両者で容易に可視化及び定量化を可能にする。この融合タンパク質は、テトラサイクリン調節遺伝子発現系の制御下にある。厳密な制御は、新規なＡ二重組換えＡｄベクターを創製することで達成され、このベクターではｔｅｔ−応答性要素とトランス活性化要素が同一ベクターの反対の末端に組み込まれ、エンハンサー干渉を回避している。発現は、テトラサイクリン又はその誘導体によって用量依存様式で好都合に調節することができる。このベクターは、試験管内で効率的にＦａｓＬ−ＧＦＰ遺伝子を送達することができ、融合タンパク質の発現レベルは、培養液内のドキシサイクリンの濃度で調節した。この調節により、ＣｒｍＡ発現細胞系内でＦａｓＬ発現を阻害することにより、該ベクターの高タイターを実現することができた。アポトーシスの誘導は、試験したすべての細胞系で示された。これら結果は、本ベクターが、癌のＦａｓＬベース遺伝子療法及びＦａｓＬ／Ｆａｓ媒介アポトーシスと免疫特権の研究の潜在的に有益なツールであることを示している。
【０１１２】
（材料及び方法）
細胞：Ｈｅｌａ及び２９３細胞は、米国代表菌株培養コレクションから得（それぞれ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ−２．１及びＡＴＣＣ ＣＲＬ−１５７３）、１０％子ウシ血清（ＢＣＳ；ＨｙＣｌｏｎｅ）及び１％ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｃｅｌｌｇｒｏ）で補充したダルベッコの変性イーグル培地（ＤＭＥＭ；Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）内で３７℃５％ＣＯ２下単層として維持した。培養ラット筋芽細胞を２０％胎児ウシ血清（ＦＢＳ：ＨｙＣｌｏｎｅ）と各１％のペニシリン／ストレプトマイシン及びファンギゾンで補充したＨ−２１（Ｃｅｌｌｇｒｏ）培地内で維持した。
【０１１３】
ＤＮＡ形質移入では、６−ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ）上にウェル毎に５×１０５個の細胞を接種し、２４時間後、製造業者の指示に従ってＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）により形質移入した。
サイトカイン応答性修飾因子Ａ（ＣｒｍＡ）発現２９３細胞系を生成するため、ｐＣｒｍＡ−Ｉ−ＮｅｏをＨＥＫ２９３細胞に形質移入した。Ｇ４１８を０．４ｇ／Ｌで４週間培地に添加することでＮｅｏ−ポジティブクローンを選択し、最後に個々のクローンを拾い上げ、増殖させ、ＦａｓＬ誘導アポトーシスに対する耐性によるＣｒｍＡ発現について分析した。
【０１１４】
プラスミド及び組換えアデノウイルスベクターの構築：ベクターｐＥＧＦＰ−１及びｐＥＧＦＰ１−Ｃ１はＣｌｏｎｔｅｃｈから得た。これらは、より明るい蛍光と“ヒト化”コドン用法を有する、野生型緑色蛍光タンパク質（ｗｔＧＦＰ）遺伝子の赤色シフト変異体を含んでいた。（Ｚｈａｎｇ，Ｇ．，Ｖ．Ｇｕｒｔｕ及びＳ．Ｒ．Ｋａｉｎ．１９９６“強化緑色蛍光タンパク質は、哺乳類細胞内の遺伝子伝達の高感度検出を可能にする”（Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ ２２７：７０７−１１）。この実施例ではこのタンパク質を“ＧＦＰ”という。Ｇｅｎｂａｎｋで入手可能なマウスＦａｓＬ ｃＤＮＡ配列は、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）ベクター内だった。ベクターｐＵＨＤ１０−３及びｐＵＨＤ１５−１（Ｇｏｓｓｅｎ，Ｍ．及びＨ．Ｂｕｊａｒｄ，“テトラサイクリン応答性プロモーターによる哺乳類細胞内の遺伝子発現の厳密な制御”Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：５５４７−５１，１９９２は、Ｃｌｏｎｔｅｃｈから入手可能である。ＧＦＰ−ＦａｓＬ融合遺伝子は、マウスＦａｓリガンドのａａ １１からａａ ２７９のＤＮＡコーティングをｐＥＧＦＰ−Ｃ１内のＧＦＰ配列のインフレーム下流に挿入して、ｐＣ．ＧＦｓｌを生成することによって構築した。ｐＣ．ＧＦｓｌからの融合遺伝子をｐＵＨＤ１０−３に挿入し、ｐ１０−３．ＧＦｓｌを生成した。ｐｃＤＮＡ３ベクター内の牛痘ウイルス（Ｃｈｏｒｄｏｐｏｘｖｉｒｉｎａｅ）サイトカイン応答性修飾因子Ａ（ｃｒｍＡ；ＣＰＶ−Ｗ２）ｃＤＮＡは、Ｇｅｎｅｔｅｃｈから入手可能である。ＣｒｍＡ遺伝子をｐｃＤＮＡ３から切除し、ｐＩＲＥＳ−Ｎｅｏベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）に挿入してｐＣｒｍＡ−Ｉ−Ｎｅｏを生成した。
【０１１５】
ＧＦＰ、ＦａｓＬ、ＦａｓＬ−ＧＦＰ及びｌａｃＺ遺伝子をＥ１シャトルベクター、ｐＬＡｄ−ＣＭＶにクローン化し、それぞれｐＬＡｄ−Ｃ．Ｇｆ、ｐＬＡｄ−Ｃ．Ｆｓｌ、ｐＬＡｄ−Ｃ．Ｇｆｓｌ及びｐＬＡｄ−Ｃ．Ｌｚ構成物を生成した（図１Ａ）。Ｔｅｔ−ＯＦＦ融合活性化タンパク質発現カセットをｐＵＨＤ１５−１から抽出し、ｐＬＡｄ−ＣＭＶｉｅに挿入し、ｐＬＡｄ−Ｃ．ｔＴＡを生成した。ＧＦＰ−ＦａｓＬ融合遺伝子発現カセットをｐ１０−３．ＧＦｓｌから切除し、ｐＲＡｄ．ｍｃｓ、すなわちＡｄ５のＥ４と右ＩＴＲとの間の導入遺伝子挿入用シャトルベクターに挿入した。その結果生じた構成物をｐＲＡｄ−Ｔ．ＧＦｓｌと命名した（図１Ｂ）。
【０１１６】
Ａｄ／ＦａｓＬ−ＧＦＰＴＥＴベクターの構築は、図１Ｃに示される。この研究で使用した他のｒＡｄゲノムは、同様の戦略を用いて構築した。すべてのベクターは、ＯＲＦ６を除きすべてのＥ４ ＯＲＦｓを欠失しているＡｄ５ｓｕｂ３６０（ΔＥ３）に基づいている（Ｈｕａｎｇ，Ｍ．Ｍ．及びＰ．Ｈｅａｒｉｎｇ．１９８９）。アデノウイルスの初期領域４読み枠６／７タンパク質が、直接複合体を通じて細胞転写因子、Ｅ２ＦのＤＮＡ結合活性を調節する。（Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ ３：１６９９−７１０）。
【０１１７】
ウイルスベクターの増殖：Ａｄ５Ｅ１ａ及びＥ１ｂ機能をトランスに与える２９３細胞（Ｇｒａｈａｍ，Ｆ．Ｌ．，Ｊ．Ｓｍｉｌｅｙ，Ｗ．Ｃ．Ｒｕｓｓｅｌｌ及びＲ．Ｎａｉｒｎ；“ヒトアデノウイルス５型由来のＤＮＡで形質転換されたヒト細胞系の特徴”（Ｊ Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ ３６：５９−７４，１９７７）をＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ法によってｒＡｄベクターＤＮＡを含有する連結混合物で形質移入した。形質移入された細胞をアデノウイルス関連細胞変性効果（ＣＰＥ）が観察されるまで（通常７〜１４日）維持し、観察された時点で細胞を収集した。そして、標準法でベクターの増殖及び増幅を行った。株を２９３又は２９３ＣｒｍＡ細胞について滴定し、プラークを記録し、ＰＦＵ／ｍｌとしてベクター収量を決定した。妥当な場合、ＧＦＰ蛍光又はＸ−ガル染色によってもベクターを滴定した。両ケースで、タイター推定値はＰＦＵ／ｍｌと良く一致した。
【０１１８】
ウエスタンブロット解析：１０ｃｍプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ）に１０６個の初生ラット筋芽細胞を接種した。２４時間後、プレートをＡｄ／ＦａｓＬ−ＧＦＰＴＥＴ又は対照ベクターにより、２の感染多重度（ＭＯＩ）で感染させた。感染後２４時間でプレートをＰＢＳで２回洗浄した。細胞を集め、５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．８）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、２％ＳＤＳ、０．１％ブロモフェノールブルー、１ｍＭ ＰＭＳＦ（Ｓｉｇｍａ）、５０μｇ／ｍｌロイペプチン（Ｓｉｇｍａ）、２μｇ／ｍｌアプロチニン（Ｓｉｇｍａ）及び１ｎｇ／ｍｌペプスタチン（Ｓｉｇｍａ）を含有する２００μｌの細胞溶解緩衝液に溶解させた。試料を５分間煮沸し、８％ＳＤＳ−ＰＡＧＥミニゲル（ＢｉｏＲａｄ）のレーン毎に初期量（１０６細胞）の１／１０を装填し、２０ｍＡで３時間流した。ヒト組換えＦａｓＬ（Ｃ末端）はＳａｎｔａ Ｃｒｕｚ研究室から得た。このタンパク質を半乾燥ゲル伝達装置（ＢｉｏＲａｄ）を用いてニトロセルロース膜（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）に伝達した。１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１４０ｍＭ ＮａＣｌ、３％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ、５％（ｗ／ｖ）粉乳、０．２％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ−２０（Ａｍｒｅｓｃｏ，Ｓｏｌｏｎ，ＯＨ）及び０．０２％（ｗ／ｖ）ナトリウムアジド（Ｓｉｇｍａ）を含有する溶液内でのインキュベーション（３７℃で２時間）によって膜を遮断した。ポリクロナールウサギ抗−ＦａｓＬ抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）を遮断溶液で１：１００に希釈し、周囲温度で２時間、膜と共にインキュベートした。ブロットを１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）及び１４０ｍＭ ＮａＣｌ溶液で２回洗浄してから、１：１００００希釈したＨＲＰＯ（Ｃａｌｔａｇ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）と接合されたヤギ抗−ウサギＩｇＧと共にインキュベートした。ブロットをＥＣＬ試薬内（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ）で一晩中発育させ、Ｋｏｄａｋ Ｘ線フィルムで可視化した。
【０１１９】
アポトーシスの検出：培養付着細胞内でのアポトーシスの初期検出は、インサイツ細胞死検出キット，ＡＰ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を利用して製造業者の指示に従って達成した。このキットは、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ媒介ｄＵＴＰニック末端−標識化（ＴＵＮＥＬ）プロセスを利用してフリー３’−ＯＨ ＤＮＡ末端にフルオレッセインを取り込み、それをアルカリ性ホスファターゼに接合された抗−フルオレッセイン抗体で検出した。基質反応後、染色された細胞は、光学顕微鏡を用いて可視化できる。
【０１２０】
結果：
ＦａｓＬ及びＦａｓＬ−ＧＦＰタンパク質の機能解析：Ｆａｓリガンド−ＧＦＰ（ＦａｓＬ−ＧＦＰ）融合タンパク質が全ＦａｓＬ活性を保持することを実証するため、Ｆａｓ媒介アポトーシスに感受性の細胞内への一過性ＤＮＡ形質移入を用いて、ＦａｓＬ及びＦａｓＬ−ＧＦＰタンパク質の機能を解析かつ比較した。Ｈｅｌａ細胞の三通りのウェルを、ＦａｓＬ、ＧＦＰ−ＦａｓＬ又は対照としてのガラクトシダーゼを発現させるベクターで形質移入した。形質移入２４時間後、細胞を固定し、ＴＵＮＥＬキットを用いてアポトーシスについて解析した。典型的には、ｐｃＤＮＡ３−ＬａｃＺで形質移入された細胞のＸ−ガル染色によって決定されるように、１０〜２５％の形質移入効率が達成された。ＦａｓＬ又はＦａｓＬ−ＧＦＰのどちらかを発現させるベクターで形質移入された多数のＨｅｌａ細胞が典型的なアポトーシス形態（膜小疱形成及び付着の喪失のような）を示し、かつＴＵＮＥＬ分析でポジティブ染色した。対照プラスミドで形質移入された細胞はほとんどアポトーシスを受けなかった。ＦａｓＬ−ＧＦＰベクターで形質移入されたウェル内のアポトーシス細胞の数は、ＦａｓＬベクターで形質移入されたアポトーシス細胞の数と同様に再現性があり、野生型タンパク質と融合タンパク質が比較可能な活性を有することを示唆している。
【０１２１】
アデノウイルスベクターの構築及び特徴づけ：我々の目標は、ＦａｓＬ発現を調節できる大量のアデノウイルスベクターを生成することだった。この調節は、標的細胞内におけるＦａｓＬ発現のレベルの制御を可能にし、ひいてはその生物学的効果の研究を促進させた。さらに、２９３細胞内で構成的にＦａｓＬ又はＦａｓＬ−ＧＦＰを発現させるｒＡｄベクターの増幅は、ＦａｓＬ発現がウイルス産生細胞のアポトーシスを引き起こすので、低タイターを生じさせると予想される。Ｍｕｒｕｖｅ，Ｄ．Ａ．，Ａ．Ｇ．Ｎｉｃｏｌｓｏｎ，Ｒ．Ｃ．Ｍａｎｆｒｏ，Ｔ．Ｂ．Ｓｔｒｏｍ，Ｖ．Ｐ．Ｓｕｋｈａｔｍｅ及びＴ．Ａ．Ｌｉｂｅｒｍａｎｎ（１９９７）“Ｆａｓリガンドのアデノウイルス媒介発現は、全身投与後の肝臓アポトーシス及び生体外感染膵島同種異系移植片及び同系移植片のアポトーシスを誘導する”Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ８：９５５−６３。制御されたＦａｓＬ−ＧＦＰ発現を達成するため、ＦａｓＬ−ＧＦＰがＴＲＥプロモーターから発現されるＡｄ／ＦａｓＬ−ＧＦＰＴＥＴベクターを設計した。Ｇｏｓｓｅｎ，Ｍ．及びＨ．Ｂｕｊａｒｄ（１９９２）“テトラサイクリン応答性プロモーターによる哺乳類細胞内の遺伝子発現の厳密な制御”Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：５５４７−５１。我々は、ＣＭＶｉｅプロモーター作動型ｔＴＡ遺伝子（“ｔｅｔ−ｏｆｆ”要素）をＡｄ５ Ｅ１領域及び右ＩＴＲ近傍のＴＲＥ制御ＦａｓＬ−ＧＦＰ融合遺伝子に挿入した。
【０１２２】
この戦略は、以下の考察に基づいている。第１に、この戦略は、以前に述べられていたように２つのＡｄベクターを用いるのではなく、単一のベクターによって全体的なｔｅｔ調節発現系を送達する。Ｈａｒｄｉｎｇ，Ｔ．Ｃ．，Ｂ．Ｊ．Ｇｅｄｄｅｓ，Ｄ．Ｍｕｒｐｈｙ，Ｄ．Ｋｎｉｇｈｔ及びＪ．Ｂ．Ｕｎｅｙ（１９９８）“アデノウイルステトラサイクリン調節系による脳内のスイッチング導入遺伝子発現”注釈参照、Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １６：５５３−５。単一ベクターの使用は、標的細胞へのより効率的な送達及びタンパク質発現のより均一な調節を可能にする。この戦略は、ＣＭＶｉｅプロモーターとＴＲＥプロモーターとのエンハンサー要素間の最高の可能な分離をも達成し、ＦａｓＬ−ＧＦＰタンパク質のバックグラウンド（非調節）発現を最小化する（図１Ｂ及び１Ｃ）。Ａｄ５ゲノムの右端にＴＲＥプロモーターを配置することで、Ａｄ５パッケージング信号内に位置するＥ１Ａエンハンサー要素について同様の結果を得た。Ｈｅａｒｉｎｇ，Ｐ．及びＴ．Ｓｈｅｎｋ，１９８３。アデノウイルス５型のＥ１Ａ転写制御領域は、重複したエンハンサー要素を含有する。Ｃｅｌｌ ３３：６９５−７０３。これら要素は、Ｅ１領域にクローン化されているいくつかのプロモーターと相互作用すると報告されている。Ｓｈｉ，Ｑ．，Ｙ．Ｗａｎｇ及びＲ．Ｗｏｒｔｏｎ（１９９７）“アデノウイルスベクター内における細胞性プロモーターの特異性及び活性の調節”Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ８：４０３−１０。
【０１２３】
本発明で使用する組換えアデノウイルスベクターのゲノムは、図１Ｃに概略的に図示されているように、試験管内大規模連結反応で構築した。これらゲノムをゲル精製し、２９３細胞に形質移入し、結果として生じた培養をウイルス誘導ＣＰＥが観察されるまで増殖させた。β−ガラクトシダーゼ又はＧＦＰを発現させるベクターの場合、ＦａｓＬ又はＦａｓＬ−ＧＦＰを発現させるベクターよりもかなり初期の時点でＣＰＥが現れ、おそらくアデノウイルスベクター複製がＦａｓＬ活性によって有害的に影響されたことを示しているだろう。確立した方法に従って初生ベクター株を増幅し、組換えアデノウイルスＤＮＡを抽出し、制限酵素消化による構造的統合性について調べた。
２９３細胞内のＡｄ／ＦａｓＬ及びＡｄ／ＦａｓＬ−ＧＦＰＴＥＴのタイターは、Ａｄ／ＬａｃＺ又はＡｄ／ＧＦＰのタイターより通常３０〜１００倍低い。ＡｄベクターのタイターとＦａｓＬ活性の比較は、これらベクターが２９３ＣｒｍＡ細胞内で産生される場合の該ベクターの収率の実質的な改善（８〜１２倍）を示した（図２）。図２に示されるように、２９３又は２９３ＣｒｍＡ細胞内の対照ベクターＡｄ／ＬａｃＺの増幅は、基本的に同じ収率となった。引き続き、ＦａｓＬ活性による全ベクターの生成及び増幅を２９３ＣｒｍＡ細胞内で行った。
【０１２４】
アデノウイルス媒介ＦａｓＬ発現によるアポトーシスの誘導：当該アデノウイルス媒介ＦａｓＬ発現を機能的に説明するため、Ｈｅｌａ細胞に異なったＭＯＩでＡｄ／ＦａｓＬ−ＧＦＰＴＥＴを形質導入した。形質導入後２４時間で、アポトーシスについて細胞を解析した。Ａｄ／ＦａｓＬ−ＧＦＰＴＥＴで感染された細胞は、典型的なアポトーシス形態を示した。アポトーシス細胞の数はベクタータイターの増加と共に上昇した。対照的に、同一ＭＯＩで対照ベクターＡｄ／ＬａｃＺにより形質導入したプレートは過剰の未形質導入対照内でアポトーシス細胞を生成しなかった。形質導入の全体的な効率は、Ｘ−ガル染色によって決定し、ＭＯＩの増加によるβ−ガラクトシダーゼポジティブ細胞数の増加を示した。アポトーシス細胞の数が、検出可能なＧＦＰフルオレッセイン、又は同時に形質導入されたＸ−ガル染色細胞の数よりも顕著に多いことを観察した。従って、該ベクターで感染されないが、感染された細胞に隣接する細胞のアポトーシスは、感染細胞の表面上のＦａｓＬと隣接細胞上のＦａｓレセプターとの相互作用によって引き起こされる。
【０１２５】
ＦａｓＬ−ＧＦＰ融合タンパク質の検出及び細胞局在化：野生型ＦａｓＬはＩＩ型膜タンパク質である。ＦａｓＬ−ＧＦＰ融合タンパク質も細胞膜に標的にされることを実証するため、ＦＩＴＣフィルターセットを備えた蛍光顕微鏡を用いて生細胞内で検出できる、そのＧＦＰ成分の蛍光を利用した。この方法を用い、ｒＡｄベクターから発現されるときにＦａｓＬ−ＧＦＰ融合タンパク質の発現及び細胞局在化を観察した。Ｈｅｌａ細胞内では、ＦａｓＬ−ＧＦＰの発現がＧＦＰの検知許容限界に近いタンパク質レベルでアポトーシスを引き起こす。その結果、ＦａｓＬ−ＧＦＰの発現を初生ラット筋芽細胞内で解析し、ＦａｓＬ誘導アポトーシスに対してかなり耐性であることが分かった。高レベルのＦａｓＬ−ＧＦＰ発現は、１０のＭＯＩでＡｄ／ＦａｓＬ−ＧＦＰＴＥＴを感染後２４時間の筋芽細胞内で検出することができる。ＦａｓＬ−ＧＦＰの膜関連発現は、大多数の形質導入細胞内で明かである。対照的に、ＧＦＰ自体の蛍光パターンは、細胞の細胞質内に一様に分布し、しばしば核から排除される。この局在化の相異は、高倍率の形質導入２９３ＣｒｍＡ細胞内でも明白である。これら結果は、ＦａｓＬ−ＧＦＰ融合タンパク質が細胞表面に方向づけられ、そこで野生型ＦａｓＬの様式と類似の様式でＦａｓレセプターと相互作用できることを示している。
【０１２６】
ｒＡｄベクター由来のＦａｓＬ−ＧＦＰ発現の調節：本ベクターが標的細胞内でｒＡｄベクターによって生成されるＦａｓＬ活性の量を調節する能力を有することを示すため、タンパク質の合成と機能の両レベルについて、誘導又は非誘導下のＦａｓＬ発現のレベルを実証するための実験を行った。Ａｄ／ＦａｓＬ−ＧＦＰＴＥＴベクターでは、ＦａｓＬ−ＧＦＰ融合タンパク質の発現は、ｔｅｔＲ−ＶＰ１６融合タンパク質（構成的に同一ベクターから発現される；図１Ｃ参照）の最小ＣＭＶｉｅプロモーターのｔｅｔ−オペレーター上流の七量体への結合によって活性化されるように設計される。Ｇｏｓｓｅｎｎ，Ｍ．及びＨ．Ｂｕｊａｒｄ（１９９２） “テトラサイクリン応答性プロモーターによる哺乳類細胞内の遺伝子発現の厳密な制御”Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：５５４７−５１。細胞内のドキシサイクリンの存在が、濃度依存様式でこの結合ひいてはＦａｓＬ−ＧＦＰの発現を阻害するだろう。
【０１２７】
まず、ウエスタンブロット解析を用いて形質導入細胞内で産生されるＦａｓＬ−ＧＦＰの量を決定した。初生ラット筋芽細胞をＡｄ／ＦａｓＬ−ＧＦＰＴＥＴにより２のＭＯＩで感染させ、この細胞をドキシサイクリン、すなわちテトラサイクリン誘導体の非存在下又は存在下で培養した。低いＭＯＩを選択して、該ベクターの単一コピーで形質導入される細胞数を最大にした。４８時間後、細胞を溶解させ、そのライセートを、ＦａｓＬの細胞外ドメインに対抗するポリクロナール抗体を用いてウエスタンブロット法で解析した。ｗｔＦａｓＬの予想サイズより大きい単一の特異バンドが検出された。このバンドの強度は、ドキシサイクリンの濃度増加により低減し、０．５ｍｇ／Ｌ以上の濃度のドキシサイクリン存在下で培養した細胞ライセートではバンドを検出できなかった。対照ベクターで形質導入した細胞ではＦａｓＬ−特異性バンドは観察されなかった。分解又は切断産物に対応するより小さいバンドは、細胞ライセート内でも培養液上清内でも検出されなかった。これらの結果は、Ａｄ／ＦａｓＬ−ＧＦＰＴＥＴベクターから細胞内で産生されたＧＦＰ−ＦａｓＬタンパク質は、培養液内のドキシサイクリンの濃度によって調節することができ、かつこのタンパク質は安定で、細胞表面上で一度も明白な切断を受けないことを示している。
【０１２８】
我々は、ＦａｓＬ活性、すなわちＦａｓポジティブ標的細胞内でのアポトーシスの誘導の調節をも解析した。Ｈｅｌａ細胞のウェルをＡｄ／ＦａｓＬ−ＧＦＰＴＥＴにより２のＭＯＩで形質導入し、種々の濃度のドキシサイクリン存在下で培養した。形質導入後２４時間で、アポトーシス表現型について細胞を解析した。結果は、Ａｄ／ＦａｓＬ−ＧＦＰＴＥＴで形質導入した細胞内におけるアポトーシスの誘導は、ドキシサイクリンによって調節できることを確証している。
【０１２９】
我々が選択する調節タンパク質発現系では、ドキシサイクリンの存在が用量依存様式でｔＴＡのＴＲＥへの結合を阻害し、かつＦａｓＬ−ＧＦＰ転写を止める。我々は、Ｅ１領域に構成的に発現される活性化因子を挿入し、かつＦａｓＬ−ＧＦＰ発現カセットをＡｄ５のＥ４プロモーターと右ＩＴＲとの間の新規なクローニング部位に挿入することを選んだ。これは、この配置が、アデノウイルスのパッケージング領域内に存在するＥ１Ａエンハンサー及びＴＲＥ上のｔＴＡプロモーター内のＣＭＶｉｅエンハンサーの効果を最小にし、それゆえにインヒビターの存在下で該融合タンパク質のバックグラウンド発現を減少させるからである。この系は、アデノウイルスベクターの関係で見事に遂行し、ＦａｓＬ−ＧＦＰの発現は、細胞培養液内のドキシサイクリン濃度を変えることで効率的に調節することができる。
【０１３０】
実験中に、２９３細胞がＦａｓＬ誘導アポトーシスに感受性であることを観察した。この効果が作用して、ＦａｓＬを発現させるｒＡｄベクターのタイターを有意に制限する。このことは、調節し、或いは組織特異的プロモーターを使用してＦａｓＬタンパク質を発現させる場合でさえ、２９３細胞内におけるベクター複製中の高レベルのタンパク質発現は避けられないので真実である。この問題を克服するため、構成的にＣｒｍＡを発現する２９３細胞系を生成した。このタンパク質は特異的に作用して、Ｆａｓアポトーシス経路に欠くことができない調節性ｃａｓｐａｓｅｓの活性を阻害する。この細胞内でＦａｓＬ含有ベクターを生成することでベクタータイターを有意に改善した。
【０１３１】
要するに、我々はテトラサイクリン調節遺伝子発現系の制御下で新規なＦａｓＬ−ＧＦＰ融合タンパク質を発現させるｒＡｄベクターを開発かつ試験した。このベクターは、タンパク質発現を好都合に調節しながら、多種の分裂及び非分裂細胞へ高いタイターと効率で導入遺伝子送達すること、及び生細胞と固定細胞の両方で該融合タンパク質を容易に検出することを併せ持つ。このベクターは、免疫学、移植術及び癌療法による病気の治療用の有益なツールである。
【０１３２】
実施例３：Ｆａｓリガンド融合遺伝子のアデノウイルス送達による傍観者遺伝子療法
この実施例は、前立腺癌にパラ分泌／自己分泌機構を通じてアポトーシス（プログラム細胞死）を受けさせるＦａｓリガンド融合遺伝子アプローチを利用する１種の傍観者遺伝子療法について述べる。この研究は、前立腺癌（ＰＣａ）の治療の新規かつ強力な療法を提供する。さらに、転移性病気の治療用ウイルスの非経口送達を可能にする組織特異的プロモーターを用いて、前立腺又は他のいずれの組織に対する特異性も達成することができる。
【０１３３】
我々の療法アプローチは、Ｅ１Ａ、Ｅ３及びＥ４について欠失された第２世代アデノウイルスで、Ｆａｓリガンド（ＣＤ９５Ｌ−融合遺伝子）を送達かつ発現させることである。ＣＤ９５Ｌ発現は、Ｔｅｔオペレーターによって制御され、試験管内及び生体内ドキシサイクリン調節を可能にする。この提案で使用するＣＤ９５Ｌは、そのＮ末端で１０個のアミノ酸が切断され、かつ強化ＧＦＰのＣ末端への４−アミノ酸リンカーで枠内に融合されているマウスＣＤ９５Ｌ ｃＤＮＡである。
表１は、５種のＰＣａ細胞系を用いたデータを示し、一般的にＰＣａ細胞系はＣＨ−１１アゴニスト活性に対して耐性であることを示す文献報告を確証する（Ｈｅｄｌｕｎｄら Ｔｈｅ Ｐｒｏｓｔａｔｅ ３６：９２−１０１，１９９８；及びＲｏｋｈｌｉｎらＣａｎ．Ｒｅｓ．５７：１７５８−１７６８，１９９７）。対照的に、我々は、現在までに試験した全５種のＰＣａ細胞系におけるＡｄＧＦＰ−ＦａｓＬ及びＣ２−セラミドの感受性を実証する。
【０１３４】
細胞毒性の割合はＭＴＳ分析によって決定した。要するに、細胞を１ｍｌの培養液を有する１２−ウェルプレート内に接種した。処理前に、細胞を７５％集密に成長させ、５００ｎｇ／ｍｌのＣＨ−１１抗−Ｆａｓ抗体、５００ｎｇ／ｍｌの正常マウス血清又は３０μＭのＣ２−セラミドのどれかで処理した。アデノウイルス形質導入のため、約１×１０５個の細胞／ウェルをＡｄ／ＣＭＶＧＦＰ又はＡｄ／ＧＦＰ−ＦａｓＬＴＥＴによって１０〜１０００のＭＯＩで処理した。各細胞系で、ポジティブ対照は未処理のままにし、１ｍｌの培地をネガティブ対照として用いた。細胞を最大の細胞死滅のため３７℃で４８時間インキュベートした。培養液を吸引し、１ウェル当たり０．５ｍｌの新鮮な培養液＋１００μｌのＣｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ ９６７ Ａｑｕｅｏｕｓ Ｏｎｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔｔと交換した。細胞をさらに１〜３時間３７℃でインキュベートした。インキュベーション後、１２０μｌの培養液を９６−ウェルプレート内に入れ、Ｖｍａｘキネティックマイクロプレートリーダーを用いて４９０ｎｍにおける吸収示度を得た。細胞毒性の割合は以下のように計算した：％細胞毒性＝［１−（実験ウェルのＯＤ／ポジティブ対照ウェルのＯＤ）］×１００。セラミド分析のため、１×１０４個の細胞／ウェルを９６−ウェルプレート内に接種した。翌朝細胞を洗浄し、血清のないＲＰＭＩ１６４０内で１００μｌの３０μＭジヒドロ−又はＣ２−セラミド（１０ｍＭの原料からメタノールに希釈した）と共にインキュベートした。２４時間後、２０μｌのＣｅｌｌｔｉｔｅｒ ９６７ Ａｑｕｅｏｕｓ Ｏｎｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔを各ウェルに添加し、プレートをさらに１〜４時間インキュベートした。上述したように吸収度及び％細胞毒性を決定した。各実験で、データ点は３通り行った。
【０１３５】
結果：
明らかに、表１で解析した５種のＰＣａ細胞系は大部分ＣＨ−１１に対して非感受性である。Ｃ２−セラミドに対する感受性は、３０μＭ用量で比較的均一であり、該アポトーシス経路が無傷であることを示唆している。最も重要なことは、すべての細胞系がＡｄＧＦＰ−ＦａｓＬ投与に応答性であり、ＤＵ１４５は最低の感受性であることである。
【０１３６】
これら実験でいくつかの重要な点が達成さてる。まず、我々はＦＡＣＳ解析により、使用したすべての系で、ＣＤ９５（Ｆａｓレセプター）がすべての候補ＰＣａ細胞系について発現されたことを示す。第２に、我々は、Ｆａｓレセプター遮断抗体（ＺＢ４）がＡｄＧＦＰ−ＦａｓＬによるアポトーシスの誘導を阻止しないことを示す。我々は、この実験を数回種々の用量のＺＢ４で行い、その結果常に該ウイルスは該抗体の存在下又は非存在下で同程度のアポトーシスを誘導した。これは、新規に合成したＣＤ９５−ＣＤ９５Ｌがおそらくゴルジ体内で（Ｂｅｎｎｅｔｔら Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８４２：２９０−２９３，１９９８）原形質膜に近づいて或いは細胞表面に到着してプレフォーム型かつ機能性アポトーシス信号発信複合体として相互作用しうることを示唆している。第３に我々の結果はＰＣａ内のアポトーシスの誘導を促進したアデノウイルスの固有特性がないことを示す。これは、対照ウイルス（ＡｄＣＭＶＧＦＰ）プラス５００ｎｇ／ｍｌのＣＨ−１１でＰＣａを感染させることによって実証した。結果は、ＣＨ−１１でもやはりアポトーシスの誘導に失敗したことと示す。これら結果は、アポトーシスは、ＣＤ９５Ｌの細胞内発現に向けられたウイルスが生じ、かつこれがウイルス依存性でない場合、ＣＤ９５＋−ＣＨ−１１耐性ＰＣａ細胞系内でのみアポトーシスが生じることを示している。
【０１３７】
情報の最後かつ最適な部分は、被験者に致死性を与えずにＡｄＧＦＰ−ＦａｓＬＴＥＴを投与できるかどうかに関係する。このことは、２×１０８ｐｆｕ程度の低用量のウイルスが非経口投与された場合マウスを殺すので、非常に重要である。この問題に焦点を当てるため、ＰＰＣ１の異種移植片をＢａｌｂｃ ｎｕ／ｎｕマウス内で発育させ、種々の用量のＡｄＣＭＶＧＦＰ対照又はＡｄＧＦＰ−ＦａｓＬウイルスで処理した。この単一用量研究から、腫瘍細胞成長が遅延され或いは停止されることが判った。さらに、ウイルスで処理した１４匹の動物は、該ウイルスによって死亡しなかった。要するに、我々は、我々のＡｄ５送達系内のＧＦＰ−ＦａｓＬ融合タンパク質がＰＣａ治療に有望な強力な療法を有すると結論する。
【０１３８】
ドキシサイクリンによって上方制御されているＡｄＧＦＰ−ＦａｓＬの変形の発生
本ウイルスは、ＰＣａの正所に投与されるように設計される。ウイルスが腫瘍を逃れて体に入る場合、十分なウイルスが細網内皮系（ほとんど肝臓）に達するとそれは致命的だろう。ドキシサイクリン（ｄｏｘ）の投与によって、ＡｄＧＦＰ−ＦａｓＬからのＣＤ９５Ｌの発現を下方制御し、この危険を回避することができる。“非常に低い”基礎活性を示すドキシサイクリンによって誘導されるウイルスベクターは、実施例１で述べたＴｅｔ調節性要素を用いて構築される。このベクターは、ｄｏｘの非存在下でＧＦＰ−ＦａｓＬ発現に関して完全に抑制され、１０ｎｇ／ｍｌで誘導が開始され、１００〜５００ｎｇ／ｍｌで最大誘導される。これは、ヒトで容易に達成できる用量である（典型的な投与量レベルで１〜３μｇ／ｍｌ）。副作用が観察された場合、ｄｏｘ投与を終了する。しかし、ドキシサイクリンは１６時間という血清半減期を有しており、ｄｏｘをＦａｓリガンドの下方制御発現に加えることは、非経口投与で数分以内に有効量のドキシサイクリン用量を迅速に達成できるので、患者の副作用の治療に良いと考えられる。必要ならば、ＰＥＳＴ信号を加えると分解を早めることができる（Ｃｌｏｎｔｅｃｈカタログ参照）。
【０１３９】
方法：
我々は、本Ｔｅｔレセプター及びオペレーター系をｒＴＳｋｉｄＢ／Ｃ及びｒｔＴＡ系（Ｆｒｅｕｎｄｌｉｅｂら，Ｊ．Ｇｅｎｅ Ｍｅｄ．１：４−１２，１９９９）と交換する。既に前立腺特異的プロモーター（ＰＳＡ、ＰＳＡＤＢａｍ、ＰＢ及びＡＲＲＰＢ２、Ａｐｐｅｎｄｉｘ）をウイルス（ＣＭＶｉｅを交換）に挿入して、前立腺上皮細胞のみがｒｔＴＡを調節可能な組織特異性を達成できることを指摘した。すべてのウイルスは野生型アデノウイルスに対してネガティブであるとＰＣＲで判断される３Ｘプラーク精製試料から標準的な方法で成長させる。すべてのウイルスは、構成的に牛痘ウイルスサイトカイン応答性修飾因子、ｃｒｍＡを発現するＨＥＫ２９３パッケージング細胞系内で１μｇ／ｍｌのドキシサイクリンの存在下で成長させる。Ｒｕｂｉｎｃｈｉｋら。これは、パッケージング細胞系内におけるＧＦＰ−ＦａｓＬ誘導アポトーシスの阻止に必要である。ウイルスは、常にＣｓＣｌ上の等密度遠心法で精製し、クロマトグラフィーで脱塩し、ろ過で濃縮して−８０℃で小アリコートのＰＢＳ １０％グリセロール内で凍結保存した。ウイルスは一度だけ解凍し、麻酔下、上述したように１５μｌ／分で注入によって、又はツベルクリンシリンジで尾静脈を介して動物に投与される。腫瘍及び動物組織を凍結切片用に収集し、妥当な場合は、固定かつ包埋し、かつＨ＆Ｅにより、アポトーシスについてＴＵＮＥＬ分析により解析し、適切な場合は、免疫染色によって好中球浸潤及びＧＦＰ発現を決定する。
【０１４０】
Ｂａｌｂｃ ｎｕ／ｎｕマウスにおける前立腺癌異種移植片上の最初のＡｄＧＦＰ−ＦａｓＬＴｅｔｄ（ｄｏｘ下方制御された）の試験。この実験は、毒性及び効率パラメーターの両方を立証するために行う。具体的には、７５〜１００ｍｍ３の腫瘍内に用量を１×１０９〜５×１０１０ｐｆｕに増やしてＡｄＧＦＰ−ＦａｓＬＴｅｔｄを注入して以下のことを決定する：Ａ）１回用量及び４日ごとに投与して３回用量で正所投与後７５％以上腫瘍体積を減少させるのに必要な最低成功用量。腫瘍は、ＣＤ９５Ｌ感受性ＰＰＣ１、中間的な感受性のＬｎＣＡＰ Ｃ２−４、及びより耐性のＤｕ１４５細胞系から発生される。投与の他のパラメーターは、常に腫瘍寛解である終末点を有する結果に基づいて発生する。Ｂ）正所性投与後の最高耐性ウイルス用量（５×１０１０ｐｆｕまで）。Ｃ）腫瘍が後に（６〜１２カ月）同一又は別の部位（Ｃ４−２）に再発するかどうかの決定。Ｄ）５０％のマウスが生存する静脈内（尾静脈）投与される最高用量。Ｅ）Ｄのデータを用いて、ドキシサイクリン投与の動物生存に及ぼす影響及びドキシサイクリン保護の持続時間（Ｂａｌｂｃ ｎｕ／ｎｕマウスはＣＴＬ応答性を持たないので、アデノウイルスは長時間生存しうる）。片側ｔ−検定を用いる統計解析を利用する。Ｆ）ＦＡＣＳ解析を用いて経時的に１μｇ／ｍｌ ｄｏｘの存在下ＧＦＰ（ＧＦＰ−ＦａｓＬ融合として）を監視することによるＫ５６２細胞（ＣＤ９５Ｌ耐性、表１参照）内でのＧＦＰ−ＦａｓＬの半減期の決定。
上記Ｂ１と同セットの実験を上述したように構築したＴｅｔ誘導性ウイルスについて行う。
【０１４１】
正常な実験室ビーグルに投与したＡｄＧＦＰ−ＦａｓＬＴｅｔｕ（上方制御されている）及びＡｄＧＦＰ−ＦａｓＬＴｅｔｄ（下方制御されている）の毒性試験。ＰＣａでは多数の動物モデルがあるが、イヌモデル以外に病理学及び解剖学でヒト病気を良く表すモデルはない。最近、ヒトＡｄＲＳＶｂｇａｌ（血清型５）アデノウイルスが前立腺癌細胞を含むイヌ上皮細胞を試験管内及び生体内の両方で感染することが示された。Ａｎｄｒａｗｉｓｓら Ｐｒｏｓｒａｔｉｃ Ｃａｎ．Ｐｒｏｓｔａｔｉｃ Ｄｉｓ．２：２５−３５，１９９９。免疫無防備状態マウス（Ｂａｌｂｃ ｎｕ／ｎｕ）に対してイヌ（免疫適格性）内での本発明のＡｄ／ＧＦＰ−ＦａｓＴＥＴの比較は、この遺伝子療法アプローチのヒトＩ相治験をさらに援助する。
【０１４２】
次のセクションでは、Ａｄ／ＧＦＰ−ＦａｓＬＴＥＴのホルモン前立腺への正所送達が、側枝損傷が最小又は無く安全であるかを調べるために性的に成熟な正常イヌについて実験を行う。
精製濃縮アデノウイルス（上方及び下方の両制御されたＡｄＧＦＰ−ＦａｓＬＴＥＴ及びリポーターウイルスＡｄ／ＣＭＶ−ＬａｃＺすべて血清型５）を腹部外科的アプローチによってイヌ前立腺の一葉に注入する。このアプローチは、前立腺の直接可視化がこの最初の一連の実験でウイルスをより正確に導入できると考えられるので、経直腸的導入にとって好ましい。第２に、イヌ前立腺の高い血管性特質のため、直接可視化は、針跡を局所的な組織粘着及び指圧で封止して注入部位からのウイルス漏れを防止することを可能にする。これら結果に基づき、３Ｄ超音波誘導経直腸導入を用い、本提案ヒトアプローチの１つを模倣する。
【０１４３】
一定の４００ｕｌの容積で５×１０９、１×１０１０、及び５×１０１０のウイルス用量を用い：２匹のイヌの１セットはＡｄ／ＣＭＶ−ＬａｃＺを５×１０１０ｐｆｕで受け、ウイルス伝播の組織化学的監視を可能にする。最初の７２時間、苦痛の如何なる徴候についてもイヌを精密に監視する。糞便を集め、ＰＣＲでウイルス発散について解析する。尿もｆｏｌｅｙカテーテルで集め、発散ウイルスに対してかつＰＣＲによって２９３細胞について分析する。７日目に（ウイルス用量ごとに２匹のイヌ）ナトリウムペントバルビタールで安楽死させ、上述したように処理する。（Ａｎｄｒａｗｉｓｓら，Ｐｒｏｓｔａｔｉｃ Ｃａｎ．Ｐｒｏｓｔａｔｉｃ Ｄｉｓ．２：２５−３５，１９９９）。全組織の試料をＯＣＴ内で凍結させ、残りを固定かつ組織学のために処理するか（ｔｕｎｅｌ、免疫組織化学）、又はＤＮＡ抽出及びウイルス特異的プライマーを用いるＰＣＲ用に−８０℃で凍結保存する。Ａｄ／ＣＭＶ−ＬａｃＺ群のＬａｃＺの発現を調べ、全身性ウイルス伝播を監視する。
【０１４４】
実施例４：Ａｄ／ＧＦＰ−ＦａｓＬＴＥＴの腫瘍内導入は、マウスの乳癌及び脳腫瘍成長を抑制する。
この実験では、１０６個のＭＣＦ−７細胞をＢａｌｂｃ ｎｕ／ｎｕマウスの左右対称に移植した（図６）。腫瘍サイズが直径５ｍｍに達したとき、Ｈａｒｖａｒｄ注入ポンプを用いて１０分にわたって１分当たり１５μｌで２×１０９ｐｆｕ Ａｄ／ＧＦＰ−ＦａｓＬＴＥＴをマウスの右側の腫瘍に、又は２×１０９ｐｆｕ ＡｄＬａｃＺを左側に注入した。注入後３週間で、Ａｄ／ＦａｓＬ−ＧＦＰＴＥＴを注入した全腫瘍が、対照処理腫瘍に比し、腫瘍の約８０〜１００％の退化を示した。特に、処理した６匹のマウスのうち４匹で、１回の注射後ほとんどの腫瘍集団が消失した（黄色矢印で示される）。６匹のマウスの他の２匹では、同一マウスの対照側の腫瘍と比べて８０％より多く腫瘍成長小塊を抑制した。対照的に、Ａｄ／ＬａｃＺを注入したすべての腫瘍は、移植後３週間で直径約２ｃｍに成長した。数匹のマウスの残留腫瘍の組織学的解析は、浸潤性免疫細胞及び見掛け上癌細胞が残存していない線維芽細胞のみ示した。このことは、ＦａｓＬ誘導アポトーシスを乳癌の新規な治療として使用できることを実証している。
【０１４５】
同様に、１０６個のＳＦ７６７細胞をＢａｌｂｃ ｎｕ／ｎｕマウスに左右対称に移植した。腫瘍サイズが直径５ｍｍに達したとき、Ｈａｒｖａｒｄ注入ポンプを用いて１０分にわたって１分当たり１５μｌで２×１０９ｐｆｕ Ａｄ／ＧＦＰ−ＦａｓＬＴＥＴをマウスの右側の腫瘍に、又は２×１０９ｐｆｕ ＡｄＬａｃＺを左側に注入した。腫瘍の抑制は、未処理腫瘍に比べ処理腫瘍内で約８０〜１００％だった。対照的に、Ａｄ／ＬａｃＺを注入したすべての腫瘍は、移植後３週間で直径約２ｃｍに成長した。このことは、ＦａｓＬ誘導アポトーシスを脳癌の新規な治療として使用できることを示している。
【０１４６】
実施例５：試験管内でのＦａｓＬ−及びＴＲＡＩＬ−誘導アポトーシスに対する癌細胞の感受性の比較
この実験では、種々の癌細胞系（前立腺、頸部及び肝臓癌由来）のＦａｓＬ−及びＴＲＡＩＬ−誘導アポトーシスに対する感受性を試験管内で比較した。
ＴＲＡＩＬ用発現ベクター、Ａｄ．ＴＲＡＩＬ／ＧＦＰＴＥＴを用いてこれら癌細胞内でＴＲＡＩＬを発現させた。Ａｄ．ＴＲＡＩＬ／ＧＦＰＴＥＴの構成は図３に示されている。Ａｄ／ＦａｓＬ−ＧＦＰＴＥＴと同様、このベクターはＥ１領域内のＣＭＶプロモーターで作動されるトランス活性化因子と、Ｅ４領域内のＴＲＥプロモーターの制御下のＴＲＡＩＬ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰ発現カセットとを含有するので、培養液へのドキシサイクリンの添加で、ＴＲＡＩＬとＧＦＰの両発現を調節することができる。脳心筋炎ウイルスの内部リボゾーム侵入部位（ＩＲＥＳ）は、同一ｍＲＮＡ転写物由来の２個の遺伝子の発現を可能にする。ＧＦＰはアポトーシスタンパク質ＴＲＡＩＬに融合されないが、その発現はＴＲＡＩＬの発現に相関する。ＴＲＡＩＬはＧＦＰ及びＩＲＥＳ配列の前にあるので、その発現レベルは、ＧＦＰの数倍になるはずである。Ｌｉｕら（２０００）“所定レベルで複数遺伝子を安定的に発現する哺乳類細胞の生成”Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２８０：２０−２８。このことは、ＧＦＰ発現をＵＶ顕微鏡で観察できる細胞内における高レベルのＴＲＡＩＬ発現を保証する。
【０１４７】
ＴＲＡＩＬ発現が癌細胞のアポトーシスを誘導できるかどうかを決定するため、ＴＲＡＩＬを４種の癌細胞系：ＬＮＣａＰ（前立腺）、Ｈｅｌａ（頸部）、Ａ５４９（肺）、及びＣ３Ａ（肝臓）に形質導入した。これら細胞をＡｄ／ＦａｓＬ−ＧＦＰＴＥＴにより、１０の同一ＭＯＩで感染させた。これらすべての細胞は、ＴＲＡＩＬ誘導アポトーシスに対して異なるレベルの感度で感受性を示し、感受性は癌細胞のＦａｓＬに対する感受性より低かった。この観察を確認するため、ＦａｓＬ−ＧＦＰとＴＲＡＩＬのアポトーシスを誘導する効率を平行実験で比較した。癌細胞をＡｄ／ＧＦＰ、Ａｄ／ＦａｓＬ−ＧＦＰＴＥＴ及びＡｄ．ＴＲＡＩＬ／ＧＦＰＴＥＴによって類似のＭＯＩで感染させた。ＦａｓＬ感受性の研究と同様に（前述した）、これら細胞の感度をＧＦＰ発現細胞の数によって解析し、ＦａｓＬ及びＴＲＡＩＬ誘導アポトーシスに対する感度は、この最初の実験の細胞形態学に基づいて決定した。図４にパネル“ＴＲＡＩＬ”示されるように、細胞は異なるレベルのアポトーシスを示した。試験した全細胞で、Ａｄ．ＴＲＡＩＬ／ＧＦＰＴＥＴ感染ウェル内でＡｄ／ＦａｓＬ−ＧＦＰＴＥＴ（“ＦａｓＬ”と標識されるパネル）で感染された細胞よりも少ない細胞がアポトーシスを受けており、ＬＮＣａＰ、Ｈｅｌａ、Ａ５４９及びＣ３Ａ細胞がＴＲＡＩＬ誘導アポトーシスよりＦａｓＬに対して感受性であることを示唆している。
【０１４８】
実施例６．アデノウイルス媒介ＴＲＡＩＬ発現は癌細胞内でアポトーシスを誘導するが、正常線維芽細胞内では誘導しない。
ＴＲＡＩＬ腫瘍療法の主な利点の１つは、ＴＲＡＩＬ発現は、正常細胞に対する毒性がＦａｓＬの毒性よりずっと低いにもかかわらず、腫瘍細胞内でアポトーシスを誘導すると想定されることである。この“腫瘍特異性”を試験するため、正常なヒト線維芽細胞をＡｄ．ＴＲＡＩＬ／ＧＦＰＴＥＴにより約１０のＭＯＩで形質導入した。包皮試料から初生初期継代ヒト線維芽細胞を得、そのＡｄ／ＦａｓＬ−ＧＦＰＴＥＴ及びＡｄ．ＴＲＡＩＬ／ＧＦＰＴＥＴベクターによって誘導されるアポトーシスに対する感受性について試験した。初生ヒト線維芽細胞はＦａｓＬ−ＧＦＰ誘導アポトーシスに対してかなり感受性なので、低形質導入効率でさえ、その大部分が標準的なアポトーシス形態を示した（図５、パネルＦａｓＬ）。対照的に、ＴＲＡＩＬを発現させるアデノウイルスベクターで形質導入した初生線維芽細胞は、ＦａｓＬ−ＧＦＰの送達に用いたＭＯＩより５倍高いＭＯＩでさえ、基本的に影響を受けなかった（図５，パネルＴＲＡＩＬＸ５）。従って、ＴＲＡＩＬは、本アデノウイルスベクター由来の高い発現レベルでさえ、正常細胞内で有意なアポトーシスを誘導しないという知見を確証する。この結果は、ＴＲＡＩＬのベクター媒介腫瘍内送達はＦａｓＬよりずっと安全であることを示唆している。
【０１４９】
本発明を、その特定実施形態の特有な詳細に関連して述べたが、このような詳細は、特許請求の範囲に包含される範囲通りかつその範囲まで以外に、本発明の範囲に関する制限とみなすことを意図いたものではない。
この出願全体を通じ、種々の出版物が参照されている。この発明が関係する技術の状態をより完全に述べるため、これら出版物の開示はその全体が参照によってこの出願に取り込まれる。
【０１５０】
表１：抗−Ｆａｓ抗体、Ｃ２−セラミド（２２時間）又はＡｄ／ＧＦＰ−ＦａｓＬＴＥＴのどれかで４８時間処理した前立腺癌細胞系内のＦａｓ媒介細胞毒性（％細胞毒性として表現される−ＳＤ）
【表１】
2004526666.tif 000002
＊ＭＯＩ １０、ＨＭＯＩ １０００。全実験で、Ｎ＝３（ＴＳＵ及びＰＣ−３を用いるセラミド実験のＮ＝２以外）。細胞毒性のパーセントはＭＴＳ分析を用いて決定した。要するに、細胞を１ｍｌの培養液を有する１２−ウェルプレート内に接種した。処理前に細胞を７５％集密まで成長させ、５００ｍｇ／ｍｌ ＣＨ−１１ 抗−Ｆａｓ抗体、５００ｎｇ／ｍｌの正常マウス血清又は３０μＭ Ｃ２−セラミドで処理した。アデノウイルス形質導入のため、約１×１０５個の細胞／ウェルをＡｄＣＭＶＧＦＰ又はＡｄＧＦＰＦａｓＬＴＥＴにより１０〜１０００のＭＯＩで処理した。各細胞系で、ポジティブ対照を未処理のまま残し、１ｍｌの培養液をネガティブ対照として使用した。最大の細胞死滅のため、細胞を１８時間３７℃でインキュベートした。培養液を吸引し、ウェル当たり０．５ｍｌの新鮮な培養液＋１００μｌのＣｅｌｌＴｉｔｅｒ ９６ ＡＱｕｅｏｕｓ Ｏｎｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔと交換した。インキュベーション後１２０μｌの培養液を９６ウェルプレートに入れ、Ｖｍａｘキネティックマイクロプレートリーダーを用いて４９０ｎｍにおける吸収示度を得た。細胞毒性の割合は以下のように計算した：％細胞毒性＝［１−（実験ウェルのＯＤ／ポジティブ対照ウェルのＯＤ）］×１００。セラミド分析のため、１×１０４個の細胞／ウェルを９６−ウェルプレートに接種した。翌朝細胞を洗浄し、血清のないＲＰＭＩ １６４０内で１００μｌの３０μＭジヒドロ−又はＣ２−セラミド（１０ｍＭの原料からメタノールに希釈した）と共にインキュベートした。２４時間後、２０μｌのＣｅｌｌｔｉｔｅｒ ９６ ＡＱｕｅｏｕｓ Ｏｎｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔを各ウェルに添加し、プレートをさらに１〜４時間インキュベートした。上述したように吸収度及び％細胞毒性を決定した。各実験で、データ点は三通り行った。
【図面の簡単な説明】
【図１Ａ】
ｐＬＡｄ−Ｃ．ｔＴＡベクターを模式的に示す。
【図１Ｂ】
ｐＲＡｄ．Ｔ．ＧＦｓＬベクターを模式的に示す。
【図１Ｃ】
ｒＡｄ／ＦａｓＬ−ＧＦＰＴＥＴベクターを模式的に示す。
【図２】
２９３及び２９３ＣｒｍＡ細胞におけるｒＡｄベクターのタイターとＦａｓＬ活性の比較を示すグラフである。
【図３】
ＴＲＡＩＬ発現ベクターＡｄ．ＴＲＡＩＬ／ＧＦＰＴＥＴの構成を示す。
【図４】
ＦａｓＬ−及びＴＲＡＩＬ−誘導アポトーシスに対する癌細胞の異なる感度を示す。
【図５】
ＴＲＡＩＬ発現が非形質転換線維芽細胞内でアポトーシスを誘導しないことを示す。
【図６】
ヌードマウスに移植された乳癌のアポトーシス誘導を示す。
【図１Ａ】
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【図１Ｃ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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