(57)【要約】本発明は受容体の遺伝子が導入される及び腫瘍、腫瘍転移、ウイルス感染を治療するために、血液幹細胞調製の浄化（一掃）のために、及びまた診断目的のために好適である遺伝子工学により改変されたＹＴ細胞系に関する。出願の領域は医薬分野及び製薬産業を含む。本発明の目的はＹＴ細胞系への特異的受容体の遺伝子トランスファーの方法により腫瘍細胞及び他の標的細胞を同定することである。追加の目的は新たに作出された細胞系を用いて、同定された腫瘍細胞及び他の標的細胞の溶解を引き起こすことである。本発明に係る細胞系は（腫瘍特異的又は標的細胞特異的抗体（単鎖Ｆｖ断片）の変動する領域からなる）１以上の受容体及び場合によりヒトＴ細胞受容体のゼータ−鎖に由来するシグナル鎖を含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
遺伝子移入により改変され、かつ、ヒト及び動物の疾患の治療及び診断において使用されるＹＴ細胞系であって、標的細胞を認識する受容体をコードする１又は数個の遺伝子及び、必要であれば、追加の遺伝子が上記細胞系に導入されることを特徴とする前記ＹＴ細胞系。
【請求項２】
前記受容体が、前記標的細胞上の構造を認識する認識ドメインを含むことを特徴とする、請求項１に記載のＹＴ細胞系。
【請求項３】
前記受容体が、腫瘍細胞上の構造を認識する認識ドメインを含むことを特徴とする、請求項１に記載のＹＴ細胞系。
【請求項４】
前記受容体が、ウイルス感染細胞上の構造を認識する認識ドメインを含むことを特徴とする、請求項１に記載のＹＴ細胞系。
【請求項５】
前記受容体が、自己免疫反応性免疫細胞上の構造を認識する認識ドメインを含むことを特徴とする、請求項１に記載のＹＴ細胞系。
【請求項６】
前記受容体ドメインが、腫瘍又は標的細胞（単鎖Ｆｖ断片）に特異的な抗体の可変領域から成ることを特徴とする、請求項１に記載の細胞系。
【請求項７】
前記導入された受容体が、前記細胞系ＹＴの細胞毒性活性を誘導するシグナルを仲介することができるシグナル鎖をさらに含むことを特徴とする、請求項１に記載の細胞系。
【請求項８】
前記導入された受容体のシグナル鎖が、ヒトＴ細胞受容体のゼータ−鎖に由来することを特徴とする、細胞系。
【請求項９】
前記導入された受容体のシグナル鎖が、リンカー・ドメインより前記認識ドメインに結合されることを特徴とする細胞系。
【請求項１０】
前記リンカー・ドメインが、ヒトＩｇＧ−Ｆｃ部に由来することを特徴とする細胞系。
【請求項１１】
前記受容体ドメインが、ヒト腫瘍抗原Ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ａｎｔｉｇｅｎ癌胎児抗原（ＣＥＡ）、  ｍｕｃｉｎ又はＣＤ３３に特異的に結合することを特徴とする、請求項１に記載の細胞系。
【請求項１２】
前記細胞系が、さらなる増殖を妨ぐためにガンマ照射に晒されることを特徴とする、請求項１に記載の細胞系。
【請求項１３】
１又は数個の自殺遺伝子が前記細胞系に追加的に導入され、そしてこれが、前記細胞系を特定の医薬／化学療法／物質の作用に対して感受性にさせることを特徴とする、請求項１に記載の細胞系。
【請求項１４】
受容体構築物又は複数の受容体構築物をコードする遺伝子、及び必要であれば、自殺遺伝子又は複数の自殺遺伝子がエレクトロポーレーションにより前記細胞系に導入されることを特徴とする、請求項１に記載の細胞系。
【請求項１５】
前記細胞系が、染料又は放射活性物質で標識されることを特徴とする、請求項１に記載の細胞系。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
説明
本発明は、受容体遺伝子が組み込まれ、そして、例えば、腫瘍、腫瘍転移、自己免疫疾患、ウイルス感染の治療及び診断において、及び血液幹細胞の調製の浄化（一掃）のために使用されうる、遺伝子改変されたＹＴ細胞系に関する。出願の分野は医薬及び製薬産業内である。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子改変されていない、真性のＹＴ細胞系は、Ｙｏｄｏｉ  ｅｔ  ａｌ．（Ｙｏｄｏｉ−Ｊ；Ｔｅｓｈｉｇａｗａｒａ−Ｋ；Ｎｉｋａｉｄｏ−Ｔ；Ｆｕｋｕｉ−Ｋ；Ｎｏｍａ−Ｔ；Ｈｏｎｊｏ−Ｔ；Ｔａｋｉｇａｗａ−Ｍ；Ｓａｓａｋｉ−Ｍ；Ｍｉｎａｔｏ−Ｎ；Ｔｓｕｄｏ−Ｍ；ｅｔ−ａｌ．  ＴＣＧＦ（ＩＬ  ２）−ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｉｎｄｕｃｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ（ｓ）．  Ｉ．  Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＩＬ  ２  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｏｎ  ａ  ｎａｔｕｒａｌ  ｋｉｌｌｅｒ−ｌｉｋｅ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ（ＹＴ  ｃｅｌｌｓ）．  Ｊ−Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １９８５  Ｍａｒ；１３４（３）：１６２３−３０）により最初に示された。上記細胞系は患者の血液から樹立された。それはそれ自体腫瘍又は他の標的細胞を特異的に認識し、そして溶解することはできない。
【発明の開示】
【０００３】
本発明の目的は特異的受容体をコードする遺伝子をＹＴ細胞系に移入することにより腫瘍細胞及び他の標的細胞型の認識を達成することである。さらなる目的は認識された標的細胞の溶解を達成するために樹立された細胞系を用いることからなる。
【０００４】
本発明は特許請求項にしたがって理解されるであろう。上記細胞系は遺伝子改変されるであろう、そして続いて診断及び治療において使用されうる。本発明にしたがって、腫瘍細胞及び他の標的細胞を特異的に認識する受容体をコードする遺伝子は遺伝子工学の方法により細胞系に移入されるであろう。これらの受容体構築物は腫瘍細胞及び他の標的細胞又はその部分を特異的に認識する抗体の認識部位からなるドメインを含む。ヒトＴ細胞受容体のゼータ−鎖に由来するシグナル鎖はこのドメインに結合され、そして溶解活性を仲介する。
【０００５】
本発明の利点は以下のとおりである：
−ＹＴ細胞系は受容体の遺伝子移入に適合しており、そして受容体遺伝子のトランスファーのために、例えば、腫瘍細胞及び他の標的細胞の認識及び溶解からなる新たな特性を得る。
【０００６】
−上記新規細胞系は不死化され、そしてそれゆえ制限なく入手可能である。
−上記細胞系はしたがってそれぞれの受容体を選択する方法によりさまざまな腫瘍細胞及び他の標的細胞型に適合されうる。
【０００７】
−上記細胞系はガンマ照射に暴露されたときその効果を失わない。照射は、上記細胞の致死特性に影響することなく、さらなる増殖を妨げるので、十分な量の受容体効果は１〜２日後でさえも効くことが期待されうる。
【０００８】
以下の出願の実施例は本発明をさらに説明するために提供されるであろう。
【実施例】
【０００９】
実施例
結腸癌細胞に局在する癌胎児抗原Ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｙｏｎｉｃ  Ａｎｔｉｇｅｎ（ＣＥＡ）の構造を特異的に認識する受容体が構築された。この受容体の遺伝子は遺伝子トランスファー法としてのエレクトロポーレーションでＹＴ細胞系に統合された。
【００１０】
図１は細胞系に導入された受容体の構造組成を示す。上記受容体の重要な成分の１は特異的単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）断片である。この断片はＣＥＡ構造を特異的に認識するヒト化抗体ＢＷ４３１の変動する領域からなる。ペプチドリンカーは上記断片を溶解活性を仲介するヒトＴ細胞受容体のゼータ−（ζ）−鎖に結合する。
【００１１】
この受容体を備えたＹＴ細胞系はその後結腸の腫瘍細胞に対するその溶解（殺害）活性について試験された。図２は上記受容体遺伝子でトランスフェクトされたＹＴ細胞系が細胞表面上にヒトＣＥＡを提示する細胞系ＭＣ３２Ａはもちろん、ヒト結腸癌細胞系ＬＳ１７４Ｔ及びＳＷ１２２２を溶解することを示す。上記の特異的受容体構築物が導入されていないが、他の非関連遺伝子（ｍｏｃｋ、ｓｃＰｈＯｘ−ｈＦｃζ）が代わりに導入された、コントロールＹＴ細胞系は通常の標準にしたがって行われた51Ｃｒ放出分析において腫瘍細胞を顕著に溶解することはできなかった。
【００１２】
さらに、ＣＥＡ受容体遺伝子の移入により改変され、そしてガンマ−照射によりその増殖において阻害された細胞系から生ずる腫瘍溶解の効果は、マウス腫瘍モデルにおいて試験された。図３はＣＥＡを有する腫瘍細胞ＭＣ３２ＡがＣＥＡを認識する遺伝子改変されたＹＴ細胞系と共にマウスに適用されたとき、腫瘍成長が妨げられたことを示す。比較すると、上記マウスは非関連遺伝子をトランスフェクトされ、そしてその後付随して上記腫瘍細胞で適用されたコントロールＹＴ細胞系よりも長く生きた。
【００１３】
そのように遺伝子改変されたＹＴ細胞系は、それらを上記腫瘍又は存在する転移に直接適用することにより又は体系的な静脈内適用の方法により、ヒトＣＥＡを有する腫瘍の治療において使用されうる。遺伝子改変されたＹＴ細胞系は腫瘍上のＣＥＡを認識し、そしてこれらの腫瘍細胞を溶解する。溶解は上記受容体に「組み込まれた（ｂｕｉｌｔ  ｉｎｔｏ）」シグナル鎖により仲介される。上記細胞系は幹細胞の調製又は他の調製内で、又は本発明に属する細胞が好適に（例えば、色素又は放射活性物質で）標識される場合、例えば、静脈内適用に続いて腫瘍細胞及び転移の検出のための診断において、腫瘍細胞を認識する及び溶解するのに使用されうる。
【００１４】
図の説明（凡例）：
【００１５】
図１−特異的融合受容体の図示
上記受容体のＮ’末端にＹＴ細胞の表面上の受容体発現に必要とされるシグナルペプチドがある。上記受容体は柔軟なペプチドリンカーにより結合される抗体（示された実施例中のヒト化ＣＥＡ特異的抗体ＢＷ４３１）の変動する領域、上記ｓｃＦｖ断片及び細胞膜（示される実施例中のヒト抗体（ＩｇＧ−Ｆｃ）のＦｃ部分）の間のスペーサー、及びヒトＴ細胞受容体のζ−鎖のシグナル誘導部分からなる特異的単鎖Ｆｖ−（ｓｃＦｖ−）断片からなる。
【００１６】
図２−ＣＥＡ特異的融合受容体ｓｃＢＷ４３１−ｈＦｃζが遺伝子移入の方法により導入された、ＹＴ細胞によるＣＥＡ発現腫瘍細胞系の溶解を決定するための51Ｃｒ放出分析
上記ＹＴ細胞系はヒトＣＥＡに特異的である受容体ｓｃＢＷ４３１−ｈＦｃζの遺伝子移入により改変された。上記ＹＴ細胞の細胞毒性はそれらの表面上にヒトＣＥＡを提示する、細胞系ａ）ＭＣ３２Ａに対して、及び結腸癌細胞系ｂ）ＬＳ１７４Ｔ及びｃ）ＳＷ１２２２に対して試験された。ブランクベクター（ｍｏｃｋ）又は腫瘍細胞構造を認識することができない融合受容体ｓｃＰｈＯｘ−ｈＦｃζでトランスフェクトされたＹＴ細胞はコントロールとして役割を果たした。
【００１７】
図３−Ｎｏｄ／ＳＣＩＤマウス実験
０日目、ＭＣ３２Ａ腫瘍細胞はＣＥＡ特異的ＹＴ細胞（ＹＴ−ｓｃＢＷ４３１−ｈＦｃζ）又はｐｈＯｘ−特異的ＹＴ細胞（ＹＴ−ｓｃＰｈＯｘ−ｈＦｃζ）と共に又はＹＴ細胞なしにＮｏｄ／ＳＣＩＤマウスの皮膚下に注入された。使用されたＹＴ細胞はさらなる成長を妨げるために以前に放射に暴露された。図はａ）腫瘍成長、及びｂ）上記細胞の注入後の生存率を示す。１ｃｍ3より大きい腫瘍を有する動物は動物保護規則を遵守して殺し、そして死亡したものとして分類した。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
（原文に記載なし）
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際公開パンフレット】
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2004528036.tif 000014
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004528036.tif 000015
【手続補正書】
【提出日】平成15年7月30日(2003.7.30)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
遺伝子移入により改変され、かつ、ヒト及び動物の疾患の治療及び診断において使用されるＹＴ細胞系であって、対応の標的細胞を特異的に認識する１又は数個の受容体をコードする外来遺伝子及び、必要であれば、追加の遺伝子が組み込まれることを特徴とする前記ＹＴ細胞系。
【請求項２】
前記受容体が、前記対応の標的細胞上の構造を特異的に認識する認識ドメインを含むことを特徴とする、請求項１に記載のＹＴ細胞系。
【請求項３】
前記受容体が、腫瘍細胞上の構造を特異的に認識する認識ドメインを含むことを特徴とする、請求項１に記載のＹＴ細胞系。
【請求項４】
前記受容体が、ウイルス感染細胞上の構造を特異的に認識する認識ドメインを含むことを特徴とする、請求項１に記載のＹＴ細胞系。
【請求項５】
前記受容体が、自己免疫反応性免疫細胞上の構造を特異的に認識する認識ドメインを含むことを特徴とする、請求項１に記載のＹＴ細胞系。
【請求項６】
前記受容体ドメインが、腫瘍又は標的細胞（単鎖Ｆｖ断片）に特異的な抗体の可変領域から成ることを特徴とする、請求項１に記載の細胞系。
【請求項７】
前記導入された受容体が、前記細胞系ＹＴの細胞毒性活性を誘導するシグナルを仲介することができるシグナル鎖をさらに含むことを特徴とする、請求項１に記載の細胞系。
【請求項８】
前記導入された受容体のシグナル鎖が、ヒトＴ細胞受容体のゼータ−鎖に由来することを特徴とする、細胞系。
【請求項９】
前記導入された受容体のシグナル鎖が、リンカー・ドメインより前記認識ドメインに結合されることを特徴とする細胞系。
【請求項１０】
前記リンカー・ドメインが、ヒトＩｇＧ−Ｆｃ部に由来することを特徴とする細胞系。
【請求項１１】
前記受容体ドメインが、ヒト腫瘍抗原Ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ａｎｔｉｇｅｎ癌胎児抗原（ＣＥＡ）、  ｍｕｃｉｎ又はＣＤ３３に特異的に結合することを特徴とする、請求項１に記載の細胞系。
【請求項１２】
前記細胞系が、さらなる増殖を妨ぐためにガンマ照射に晒されることを特徴とする、請求項１に記載の細胞系。
【請求項１３】
１又は数個の自殺遺伝子が前記細胞系に追加的に導入され、そしてこれが、前記細胞系を特定の医薬／化学療法／物質の作用に対して感受性にさせることを特徴とする、請求項１に記載の細胞系。
【請求項１４】
受容体構築物又は複数の受容体構築物をコードする遺伝子、及び必要であれば、自殺遺伝子又は複数の自殺遺伝子がエレクトロポーレーションにより前記細胞系に導入されることを特徴とする、請求項１に記載の細胞系。
【請求項１５】
前記細胞系が、染料又は放射活性物質で標識されることを特徴とする、請求項１に記載の細胞系。
【国際調査報告】
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