(57)【要約】本発明は、生体異物を代謝する酵素ＣＹＰ２Ｄ６をコードする遺伝子中の多型を検出する方法に関する。開示された方法論は強力であり、遺伝子重複や遺伝子変換の事象の存在下で野生型配列や多型配列の存在を検出することができる。
2004528048.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
個体のシトクロムＰ−４５０  ２Ｄ６ゲノタイプを決定する方法であって、
ａ）ＣＹＰ２Ｄ６遺伝子を含むゲノムＤＮＡを個体から得ること；
ｂ）前記ゲノムＤＮＡの第１の部分を、一対のプライマーの存在下で増幅条件に置くことであって、該プライマーのうち１つがＣＹＰ２Ｄ６第１エクソンのＣ１８８Ｔ多型を有するゲノムＤＮＡにハイブリダイズし、かつＣＹＰ２Ｄ６第１エクソンの１８８位の野生型配列にはハイブリダイズせず、また増幅産物の生産がＣＹＰ２Ｄ６＊１０ゲノタイプを示すこと；から成る方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、ＣＹＰ２Ｄ６第１エクソンのＣ１８８Ｔ多型を有するゲノムＤＮＡにハイブリダイズし、かつＣＹＰ２Ｄ６第１エクソンの１８８位の野生型配列にはハイブリダイズしない前記プライマーが、配列番号４の配列を含んでいる方法。
【請求項３】
請求項１に記載の方法であって、ＣＹＰ２Ｄ６第１エクソンのＣ１８８Ｔ多型を有するゲノムＤＮＡにハイブリダイズし、かつＣＹＰ２Ｄ６第１エクソンの１８８位の野生型配列にはハイブリダイズしない前記プライマーが、配列番号４の配列を有する方法。
【請求項４】
請求項１に記載の方法であって、もう一方のプライマーが配列番号５の配列を有する方法。
【請求項５】
請求項１に記載の方法であって、
ゲノムＤＮＡの第２の部分を、一対のプライマーの存在下で増幅条件に置くことであって、該プライマーのうち１つがＣＹＰ２Ｄ６第１エクソンの１８８位の野生型配列を有するゲノムＤＮＡにハイブリダイズし、かつＣＹＰ２Ｄ６第１エクソンのＣ１８８Ｔ多型にはハイブリダイズせず、また増幅産物の生産がＣＹＰ２Ｄ６野生型ゲノタイプを示すこと；からさらに成る方法。
【請求項６】
請求項５に記載の方法であって、ＣＹＰ２Ｄ６第１エクソンの１８８位の野生型配列を有するゲノムＤＮＡにハイブリダイズし、かつＣＹＰ２Ｄ６第１エクソンのＣ１８８Ｔ多型にはハイブリダイズしない前記プライマーが、配列番号３の配列を含んでいる方法。
【請求項７】
請求項５に記載の方法であって、ＣＹＰ２Ｄ６第１エクソンの１８８位の野生型配列を有するゲノムＤＮＡにハイブリダイズし、かつＣＹＰ２Ｄ６第１エクソンのＣ１８８Ｔ多型にはハイブリダイズしない前記プライマーが、配列番号３の配列を有する方法。
【請求項８】
請求項５に記載の方法であって、もう一方のプライマーが配列番号５の配列を有する方法。
【請求項９】
請求項５に記載の方法であって、ゲノムＤＮＡの第１の部分およびゲノムＤＮＡの第２の部分から増幅産物が生産されることが、前記個体がＣＹＰ２Ｄ６＊１０ゲノタイプとＣＹＰ２Ｄ６野生型ゲノタイプのヘテロ接合であることを示す方法。
【請求項１０】
請求項５に記載の方法であって、ゲノムＤＮＡの第１の部分から増幅産物が生産され、ゲノムＤＮＡの第２の部分からは増幅産物が生産されないことが、前記個体がＣＹＰ２Ｄ６＊１０ゲノタイプのホモ接合であることを示す方法。
【請求項１１】
請求項５に記載の方法であって、ゲノムＤＮＡの第２の部分から増幅産物が生産され、ゲノムＤＮＡの第１の部分からは増幅産物が生産されないことが、前記個体が野生型ＣＹＰ２Ｄ６ゲノタイプのホモ接合であることを示す方法。
【請求項１２】
請求項１に記載の方法であって、前記個体がアジア人である方法。
【請求項１３】
ＣＹＰ２Ｄ６第１エクソンのＣ１８８Ｔ多型を有するシトクロムＰ−４５０  ２Ｄ６遺伝子の断片にハイブリダイズし、該断片の増幅を準備するが、１８８位に野生型配列を有するシトクロムＰ−４５０  ２Ｄ６遺伝子の増幅は準備しない、対立遺伝子特異的増幅プライマー。
【請求項１４】
ＣＹＰ２Ｄ６第１エクソンのＣ１８８Ｔ多型を有するシトクロムＰ−４５０  ２Ｄ６遺伝子の断片であり、その長さが１０ヌクレオチドと５０ヌクレオチドの間である、核酸分子。
【請求項１５】
請求項１４に記載の核酸分子であって、前記ＣＹＰ２Ｄ６第１エクソンのＣ１８８Ｔ多型がその核酸分子の３’末端に位置する核酸分子。
【請求項１６】
配列番号４の配列を含む、請求項１４に記載の核酸分子。
【請求項１７】
配列番号４の配列を有する、請求項１４に記載の核酸分子。
【請求項１８】
ヌクレオチド６８とヌクレオチド１２１２の間のＣＹＰ２Ｄ６遺伝子断片を含む増幅産物。
【請求項１９】
Ｃ１８８Ｔ変異を含む、請求項１８に記載の増幅産物。
【請求項２０】
ａ）ＣＹＰ２Ｄ６遺伝子を含むゲノムＤＮＡを個体から得ること；
ｂ）前記ゲノムＤＮＡの少なくとも一部分を、一対のプライマーの存在下で増幅条件に置くことであって、増幅産物を生産するために、プライマーのうち１つがＣＹＰ２Ｄ６第１エクソンのＣ１８８Ｔ多型を有するゲノムＤＮＡにハイブリダイズし、かつＣＹＰ２Ｄ６第１エクソンの１８８位の野生型配列にはハイブリダイズしないこと；から成る方法によって生産された増幅産物。
【請求項２１】
ａ）ＣＹＰ２Ｄ６遺伝子を含むゲノムＤＮＡを個体から得ること；
ｂ）前記ゲノムＤＮＡの少なくとも一部分を、一対のプライマーの存在下で増幅条件に置くことであって、増幅産物を生産するために、プライマーのうち１つがＣＹＰ２Ｄ６第１エクソンの１８８位の野生型配列を有するゲノムＤＮＡにハイブリダイズし、かつＣＹＰ２Ｄ６第１エクソンのＣ１８８Ｔ多型にはハイブリダイズしないこと；から成る方法によって生産された増幅産物。
【請求項２２】
ａ）ＣＹＰ２Ｄ６遺伝子を含むゲノムＤＮＡを個体から得ること；
ｂ）前記ゲノムＤＮＡの第１の部分を、一対のプライマーの存在下で増幅条件に置くことであって、該プライマーのうち１つがＣＹＰ２Ｄ６第１エクソンのＣ１８８Ｔ多型を有するゲノムＤＮＡにハイブリダイズし、かつＣＹＰ２Ｄ６第１エクソンの１８８位の野生型配列にはハイブリダイズせず、また増幅産物の生産がＣＹＰ２Ｄ６＊１０ゲノタイプを示すこと；
ｃ）前記ゲノムＤＮＡの第２の部分を、一対のプライマーの存在下で増幅条件に置くことであって、該プライマーのうち１つがＣＹＰ２Ｄ６第１エクソンの１８８位の野生型配列を有するゲノムＤＮＡにハイブリダイズし、かつＣＹＰ２Ｄ６第１エクソンのＣ１８８Ｔ多型にはハイブリダイズせず、また増幅産物の生産がＣＹＰ２Ｄ６野生型ゲノタイプを示すこと；
ｄ）ステップ（ｂ）および（ｃ）の増幅の結果に基づいて前記個体に医薬組成物を処方すること；から成る、個体に医薬組成物を処方する方法。
【請求項２３】
前記医薬組成物が、三環系抗うつ薬、抗不整脈薬、神経弛緩薬、モルヒネ誘導体からなるグループより選択される、請求項２２に記載の医薬組成物を処方する方法。
【請求項２４】
医薬組成物を処方するステップは、ＣＹＰ２Ｄ６酵素で代謝される医薬組成物を従来の用量よりも少なく処方することを含む、請求項２２に記載の医薬組成物を処方する方法。
【請求項２５】
前記個体がアジア人である、請求項２２に記載の医薬組成物を処方する方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、ゲノム構成に変化が存在する場合における、代謝酵素シトクロムＰ−４５０の多型の正確な検出に関する分野に属する。
【０００２】
（発明の背景）
シトクロムＰ−４５０  ＣＹＰ２Ｄ６酵素は、三環系抗うつ薬、抗不整脈薬、神経弛緩薬、モルヒネ誘導体を含む多くの薬剤の酸化を触媒する。第２２染色体上のＣＹＰ２Ｄ６遺伝子クラスターは、２つないし３つの、同族で機能を持たない偽遺伝子ＣＹＰ２Ｄ８Ｐ、ＣＹＰ２Ｄ７ＡＰ、ＣＹＰ２Ｄ７ＢＰと、その後ろに活性のある遺伝子ＣＹＰ２Ｄ６とを含んでいる。６８のＣＹＰ２Ｄ６多型対立遺伝子がＰ４５０命名委員会によって認められており、３０をこえる対立遺伝子は、プローブ薬デブリソキン（ｄｅｂｒｉｓｏｑｕｉｎｅ）、スパルテイン（ｓｐａｒｔｅｉｎｅ）、あるいはデキストロメトルファン（ｄｅｘｔｒｏｍｅｔｈｏｒｐｈａｎ）のインビトロもしくはインビボでの代謝における変化と関連がある。ＣＹＰ２Ｄ６酵素の活性に影響を及ぼす遺伝子的な変化は、超高速の（ＵＭ）、高度の（ＥＭ）、中間の（ＩＭ）、ほとんど代謝能のない（ＰＭ）表現型を生じる。機能を持たない、あるいは部分的に欠陥のあるＣＹＰ２Ｄ６対立遺伝子がホモ接合あるいはヘテロ接合である個体が上記の薬剤をより低い速度で代謝する一方、野生型の対立遺伝子（ＣＹＰ２Ｄ６＊１）や、その他ＣＹＰ２Ｄ６＊３５のような活性のある対立遺伝子、またはわずかに機能の低下したＣＹＰ２Ｄ６＊２対立遺伝子に重複を有する個体は、より速い速度で薬物を代謝する。ＣＹＰ２Ｄ６遺伝子座には、遺伝子が重複して１３コピーにまで達している例がある。
【０００３】
ＣＹＰ２Ｄ６酵素活性についての個体間の多様性に加え、多型性な代謝の出現率は異なる集団間で様々である。特に、白色人種とアジア人種の違いはＣＹＰ２Ｄ６対立遺伝子の不均一な内訳によって説明される。白色人種の７％にみられるＰＭ表現型のうち８５％の原因となっている、欠陥対立遺伝子ＣＹＰ２Ｄ６＊３とＣＹＰ２Ｄ６＊４は、中国人集団で見出されるのは１％に満たず、この集団でのＰＭの頻度の低さの説明となっている。さらに、これら２つの人種は、ＣＹＰ２Ｄ６の代謝率（ＭＲ）が正常範囲内にある場合のデブリソキン加水分解活性の平均値についても異なっている。中国人集団では、ＭＲ分布の平均はより高い値へ移行し、中間的代謝能（ＩＭ）の表現型が優位であることを示している。このＩＭ表現型は、部分的に欠陥のある対立遺伝子ＣＹＰ２Ｄ６＊１０ＡやＣＹＰ２Ｄ６＊１０Ｂと関連がある。これらは中国人集団において最も共通に見られる対立遺伝子（対立遺伝子出現頻度６１．５％）であり、ＣＹＰ２Ｄ６酵素の３４番目のコドンでプロリンからセリンへのアミノ酸置換を起こす、１８８位におけるＣからＴへのトランジション変異を含んでおり、その結果より低い代謝活性を有する不安定な酵素の生成をもたらしている。このＣ１８８Ｔ変異は、中国人集団の非喫煙者の間で肺がんのリスクが３ないし４倍低くなることや、日本人集団においてベンラファキシン（ｖｅｎｌａｆａｘｉｎｅ）の薬物動態が変動することと関連があることがわかっている。
【０００４】
ＣＹＰ２Ｄ６＊１０はＣＹＰ２Ｄ６遺伝子座に散在する４つの一塩基多型（ＳＮＰ）で構成されるハプロタイプである（第１エクソンのＣ１８８Ｔ、第２エクソンのＣ１１２７Ｔ、第３エクソンのＧ１７４９Ｃ、第９エクソンのＧ４２６８Ｃ）。このようなハプロタイプの検出が、薬物治療や生体異物に対する個体の反応についての重要な情報を提供するにもかかわらず、誤ったゲノタイプ判定を導きうる遺伝子座のゲノム構成の変化によって、ゲノタイプ分析は困難となることがある。従って、しばしば発生することが知られているＣＹＰ２Ｄ６遺伝子座のゲノム変化を有する個体について、ＣＹＰ２Ｄ６のゲノタイプを決定する正確な方法が求められている。
【０００５】
（発明の要約）
本発明は、個体からゲノムＤＮＡを取得し、そのゲノムＤＮＡの第１の部分を一対のプライマーの存在下で増幅条件に置くことにより、その個体のシトクロムＰ−４５０  ２Ｄ６のゲノタイプを決定する方法を対象とする。プライマーのうち１つは、ＣＹＰ２Ｄ６第１エクソンのＣ１８８Ｔ多型を有するゲノムＤＮＡにハイブリダイズし、かつＣＹＰ２Ｄ６第１エクソンの１８８位の野生型配列にはハイブリダイズしない。従って、この反応から増幅産物が生産されることは、ＣＹＰ２Ｄ６＊１０ゲノタイプを示している。
【０００６】
本発明の別の実施形態は、ＣＹＰ２Ｄ６の第１エクソンのＣ１８８Ｔ多型を有するシトクロムＰ−４５０  ２Ｄ６遺伝子の断片にプライマーがハイブリダイズし、該断片の増幅を準備するが、１８８位に野生型の配列を含むシトクロムＰ−４５０  ２Ｄ６遺伝子の増幅は準備しない、対立遺伝子特異的な増幅プライマーを対象とする。
【０００７】
本発明の別の実施形態は、ＣＹＰ２Ｄ６の第１エクソンのＣ１８８Ｔ多型を有し、長さが１０ヌクレオチドと５０ヌクレオチドの間の、シトクロムＰ−４５０  ２Ｄ６遺伝子の断片を含んだ核酸分子である。
【０００８】
本発明の別の実施形態は、ヌクレオチド６８とヌクレオチド１２１２の間の、ＣＹＰ２Ｄ６遺伝子の断片を含む増幅産物を対象とする。本発明の別の実施形態は、個体からゲノムＤＮＡを取得し、そのゲノムＤＮＡの少なくとも一部を、増幅産物を生産するために、プライマーのうちの１つがＣＹＰ２Ｄ６第１エクソンのＣ１８８Ｔ多型を有するゲノムＤＮＡにハイブリダイズし、かつＣＹＰ２Ｄ６第１エクソンの１８８位の野生型配列にはハイブリダイズしない、一対のプライマーの存在下で増幅条件に置くことにより生産された、増幅産物を対象とする。同様に、本発明の別の実施形態は、個体からゲノムＤＮＡを取得し、そのゲノムＤＮＡの少なくとも一部を、増幅産物を生産するために、プライマーのうちの１つがＣＹＰ２Ｄ６第１エクソンの１８８位の野生型配列を有するゲノムＤＮＡにハイブリダイズし、かつＣＹＰ２Ｄ６第１エクソンのＣ１８８Ｔ多型にはハイブリダイズしない、一対のプライマーの存在下で増幅条件に置くことにより生産された、増幅産物を対象とする。
【０００９】
本発明の別の実施形態は、個体からゲノムＤＮＡを取得し、そのゲノムＤＮＡの第１の部分を、プライマーのうちの１つがＣＹＰ２Ｄ６第１エクソンのＣ１８８Ｔ多型を有するゲノムＤＮＡにハイブリダイズし、かつＣＹＰ２Ｄ６第１エクソンの１８８位の野生型配列にはハイブリダイズしない、一対のプライマーの存在下で、増幅条件に置くことによる、個体に医薬組成物を処方する方法を対象とする。従って、増幅の結果が被験個体のゲノタイプを示すので、医薬組成物はその結果に基づいてその個体に処方される。このようなゲノタイプ決定法や、その決定法の結果に基づいた処方変更の能力は、ＣＹＰ２Ｄ６遺伝子の多型が頻出するアジアの人々に特に適している。
【００１０】
（発明の詳細な説明）
明確にするため、本特許出願におけるＣＹＰ２Ｄ６遺伝子内の部位についての全ての引用は、キムラ（Ｋｉｍｕｒａ）らにより発表された転写開始部位の最初のヌクレオチドに関連して行われる（Ａｍ． Ｊ． Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅｔ． ４５：８８９−９０４， １９８９ ）（Ｇｅｎ Ｂａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．Ｍ３３３８８）。従って、この付番方式を使用すると、開始のメチオニンをコードするコドンは８９−９１位に現れる。
【００１１】
１つの対立遺伝子は、ポリペプチド鎖として発現されるのに必要な全ての情報を備えたデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）の一部分で構成されている。従って、ヌクレオチド配列に違いのある対立遺伝子は、異なるポリペプチド鎖を生じたり、タンパク質を生産できないことがある。しかしながら、ヌクレオチド配列の違いが翻訳のレベルで「サイレント（ｓｉｌｅｎｔ）」であれば、異なる対立遺伝子から同一のポリペプチド鎖が生成されることもある。さらに、対立遺伝子間のヌクレオチド配列の違いが、イントロンやあるいはエクソンの非翻訳部分に起こる場合、その違いはポリペプチド鎖の配列に影響しない。
【００１２】
よって、ＤＮＡレベルで認識される対立遺伝子は、タンパク質レベルでは対立遺伝子としては現れず、同じ遺伝子の産物として現れることもある。対立遺伝子は、似てはいるが互いに異なっており、しかしゲノム上あるいは少なくとも染色体上の同一の位置を占めている。ヒトゲノムを含む哺乳類ゲノムの、二倍体という性質によって、１個体は２つの任意の染色体上の遺伝子座に２つの対立遺伝子を発現できるだけである。しかしながら、集団全体ではその遺伝子座に非常に多くの対立遺伝子を発現していることもある。２つの同一の対立遺伝子はホモ接合のゲノタイプとなり、２つの異なる対立遺伝子はヘテロ接合の遺伝情報担体となる。
【００１３】
ＣＹＰ２Ｄ６＊１０対立遺伝子を有するアジア人のサンプルの配列分析中、多くのヘテロ接合体において、１８８位のＣおよびＴのピークの高さが、一様に均等ではないことが観察された。パルスフィールドゲル分析および定量的クローニングを用いた、この偏差についての調査から、７７のアジア人サンプル中、＊１０対立遺伝子が４７％の頻度で出現していることが明らかとなった。さらに、＊１０対立遺伝子を有するヘテロ接合体のサンプルの７２％がＣＹＰ２Ｄ６遺伝子座に複数のコピーを有していた。増幅したＣＹＰ２Ｄ６＊１０対立遺伝子は、ＣＹＰ２Ｄ６＊１０対立遺伝子についてヘテロ接合またはホモ接合の個体において、低下したＣＹＰ２Ｄ６酵素活性の表現型を補償できる、多数の対立遺伝子のコピーを有し得ることが見出された。このような遺伝子重複の存在下では、あらかじめ両方の対立遺伝子を同時に増幅する必要のあるいかなるゲノタイプ分析も、ＣＹＰ２Ｄ６＊１０対立遺伝子の重複の存在下では、しばしば１８８位の野生型の配列を隠してしまう。従って、ＣＹＰ２Ｄ６遺伝子内の単純なＳＮＰのゲノタイプ分析は、その遺伝子座のゲノム構成の変化によって困難となるだろう。このことは、多くの医薬品がＣＹＰ２Ｄ６酵素によって代謝されるため、ＣＹＰ２Ｄ６ゲノタイプについて特に重要である。医薬品の効果をより良く予測するため、そしてこのような代謝の個体差に基づく医薬品副作用を潜在的に防止するため、医薬品を処方される個体のＣＹＰ２Ｄ６ゲノタイプを、ＣＹＰ２Ｄ６ゲノタイプを判断するために検査するとよい。そして処方する医薬品の選択や、処方する医薬品の量を、その個体のＣＹＰ２Ｄ６ゲノタイプに基づいて変更するとよい。このことは、ＣＹＰ２Ｄ６＊１０ゲノタイプが頻出するが、ＣＹＰ２Ｄ６＊１０の表現型を部分的に補償し、ＣＹＰ２Ｄ６酵素によって代謝される医薬品に対する個別の反応を予測するのを困難にする、ゲノムの重複という事象が起こり得るアジアの人々にとって、特に重要である。ＣＹＰ２Ｄ６酵素の変異は、がんに対する感受性の増大とも相関があることがわかっている。この感受性は、ＣＹＰ２Ｄ６酵素によって代謝される生体異物への環境暴露に伴って上昇するとみられている。実際、ＣＹＰ２Ｄ６＊１０ゲノタイプは肺がんリスクの増大と関連があることがわかっている。ある環境条件への暴露に基づいた、がんに対する個別の感受性を確かめるため、特定の個々人のＣＹＰ２Ｄ６の多型について検査することが望ましいかもしれない。従って、本発明の１つの実施形態は、対立遺伝子特異的なＣＹＰ２Ｄ６遺伝子重複の存在下でＣＹＰ２Ｄ６ゲノタイプを正確に同定する、ＣＹＰ２Ｄ６の多型について個体のゲノタイプ分析をする方法である。
【００１４】
当初はＣＹＰ２Ｄ６＊１０Ｃと呼ばれ、後にＣＹＰ２Ｄ６＊３６と改名された、ＣＹＰ２Ｄ６＊１０対立遺伝子のサブバリアントの１つは、第９エクソンにおけるＣＹＰ２Ｄ７Ｐとの遺伝子変換を除いてＣＹＰ２Ｄ６＊１０対立遺伝子と同一である。ヘテロ接合体サンプル中のこの遺伝子変換の存在は、ＣＹＰ２Ｄ６特異的な順方向プライマーと、第９エクソンに位置するＣＹＰ２Ｄ７Ｐ特異的な逆方向プライマーとからなる、一対のプライマーをデザインすることでテストされた。これらのＰＣＲプライマーセットを用いたヘテロ接合体サンプルのテストにより、ＣＹＰ２Ｄ６＊３６の存在が確認された。さらに、テストしたアジア人サンプル群の約４０％が、別の部分的なＣＹＰ２Ｄ７Ｐとの遺伝子変換によるであろう、関係のない多型領域を第１イントロンに有していることが、配列分析により明白に示された（図３）。この３０塩基対の長さの領域は、ＣＹＰ２Ｄ６野生型配列との７塩基対の違いを有している。これらの違いのため、標準的なＰＣＲ−ＲＦＬＰプライマー対は、第１イントロンに多型領域を有するいかなる対立遺伝子も増幅することができないだろう。第１イントロンのこの多型領域周辺に特異的なプライマー対をデザインすることにより、ＣＹＰ２Ｄ６遺伝子とＣＹＰ２Ｄ７Ｐ遺伝子間の遺伝子変換の存在下でＣＹＰ２Ｄ６＊１０ゲノタイプを正確に同定する、ＣＹＰ２Ｄ６多型について個体のゲノタイプ分析をする方法の開発が可能であった。
【００１５】
本発明の実施形態の１つは、中間的な増幅産物の必要なく、ゲノムＤＮＡ中の野生型配列およびＣＹＰ２Ｄ６＊１０対立遺伝子を別々に検出する、対立遺伝子特異的検定法（ＡＳＡ）である。順方向プライマーはＣＹＰ２Ｄ６＊１またはＣＹＰ２Ｄ６＊１０のどちらかに特異的であり、共通の逆方向プライマーはＣＹＰ２Ｄ６を選択するがＣＹＰ２Ｄ７ＡＰ、ＣＹＰ２Ｄ７ＢＰ、ＣＹＰ２Ｄ８Ｐは選択しない。好ましい実施形態としては、検査法は、検査の性能の対照とするために、チオプリンメチルトランスフェラーゼ（ＴＰＭＴ）遺伝子の増幅を含む。かかる検査法は、ＣＹＰ２Ｄ７遺伝子との間に第９エクソンの遺伝子変換の事象が起きているにもかかわらず、少なくとも２５倍過剰なＴ１８８のコピーの存在下で、野生型のＣ１８８配列を検出することができる、強力な検査法である。
【００１６】
対立遺伝子特異的検査法の最初のステップには、ＣＹＰ２Ｄ６遺伝子の少なくとも一部を増幅することが含まれる。増幅とはある核酸配列のさらなるコピーを生産することとして定義され、当技術分野で良く知られているポリメラーゼ連鎖反応技術（Ｄｉｅｆｆｅｎｂａｃｈ ＣＷ ａｎｄ ＧＳ Ｄｖｅｋｓｌｅｒ（１９９５）ＰＣＲプライマー、実験手引き書（ＰＣＲ Ｐｒｉｍｅｒ， ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ）、コールドスプリングハーバー出版（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ）、ニューヨーク州プレインビュー）を用いて一般的に実施される。本明細書では、「ポリメラーゼ連鎖反応」（「ＰＣＲ」）という語は、クローニングや精製を伴わずにゲノムＤＮＡ混合物中の標的配列の一部分の濃度を増大させる方法について述べた、引用により本明細書に組み込まれるＫ．Ｂ．Ｍｕｌｌｉｓの米国特許第４，６８３，１９５号および第４，６８３，２０２号の方法を指している。増幅される所望の標的配列の一部分の長さは、２つのオリゴヌクレオチドプライマーの互いに対する相対位置によって決まり、従ってこの長さは調節可能なパラメータである。その工程の反復の様子から、この方法は「ポリメラーゼ連鎖反応」（以後「ＰＣＲ」）と呼ばれる。所望の増幅された標的配列の一部分は混合物中で（濃度の面で）優位な配列となるので、「ＰＣＲ増幅された」と言われている。
【００１７】
対立遺伝子特異的であるとは、この検査法がどのＣＹＰ２Ｄ６対立遺伝子についても独立に、ＣＹＰ２Ｄ６＊１０遺伝子の有無を検出することができることを意味する。問題の核酸は、どの標準的な増幅技術を用いても核酸サンプルから増幅されうる。例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術をゲノムＤＮＡやゲノムライブラリーから直接ＣＹＰ２Ｄ６遺伝子の配列を増幅するのに用いることができる。ＰＣＲや他のインビトロの増幅方法は、例えば発現されるタンパク質をコードする核酸配列をクローニングしたり、サンプル中の所望のｍＲＮＡやＤＮＡの存在の検出、核酸の配列決定、その他の目的でプローブとして用いる核酸を作製する場合にも、有用であろう。ＰＣＲの総括についてはＰＣＲプロトコール：方法と応用の手引き（ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ： Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ． ）（Ｉｎｎｉｓ， Ｍ， Ｇｅｌｆａｎｄ， Ｄ．， Ｓｎｉｎｓｋｙ， Ｊ． ａｎｄ Ｗｈｉｔｅ， Ｔ．， ｅｄｓ．）， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、サンディエゴ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ） （１９９０）を参照のこと。
【００１８】
テンプレートのＣＹＰ２Ｄ６遺伝子、あるいはその一部は、被検個体から単離されるが、精製の必要はない。ＰＣＲ増幅の手順は、個体由来の精製ゲノムＤＮＡ、個体のゲノムＤＮＡを含む細胞破砕物、あるいはその他の純粋でないゲノムＤＮＡ供給源を用いて実施することができる。個々の被検者のゲノムＤＮＡは、白血球や上皮細胞などをはじめとした有核細胞を含む組織からのフェノール／クロロホルム抽出のような、当技術分野でよく知られた方法を用いて単離される。ゲノムＤＮＡ供給源は、テストサンプル中に存在する、バックグラウンドの非特異的なＤＮＡ以上に、ＣＹＰ２Ｄ６遺伝子の増幅を可能にするのに十分なだけ、純粋であればよい。
【００１９】
本明細書では、「プライマー」という語は、精製された制限酵素消化物の中に自然に生じるかもしくは合成により生産され、ある核酸の鎖に相補的なプライマー伸長産物の合成が誘導される条件（すなわち、ヌクレオチドと、ＤＮＡポリメラーゼのような誘導物質が存在し、かつ適切な温度とｐＨである）下に置かれると、合成の開始点として作用することができるオリゴヌクレオチドを指す。プライマーは、最大の増幅効率のためには一本鎖であることが好ましいが、替わりに二本鎖でもよい。二本鎖の場合には、プライマーは伸長産物の調製に用いる前にまずその二本の鎖を分離するべく処理される。プライマーは、オリゴデオキシリボヌクレオチドであることが好ましい。プライマーは、誘導物質の存在下で伸長産物の合成を準備するのに十分な長さでなければならない。プライマーの厳密な長さは、温度、プライマーの供給源、方法の用途を含む多くの要因に依存して決まる。
【００２０】
ＣＹＰ２Ｄ６遺伝子の問題の領域を増幅するためには、２組の異なるプライマーセットが使用される。第１のセットでは、ＣＹＰ２Ｄ６＊１に特異的な順方向プライマーが、ＣＹＰ２Ｄ６を選択するがＣＹＰ２Ｄ７ＡＰ、ＣＹＰ２Ｄ７ＢＰ、ＣＹＰ２Ｄ８Ｐは選択しない逆方向プライマーと組み合わせて用いられる。第２のセットでは、ＣＹＰ２Ｄ６＊１０に特異的な順方向プライマーが、ＣＹＰ２Ｄ６を選択するがＣＹＰ２Ｄ７ＡＰ、ＣＹＰ２Ｄ７ＢＰ、ＣＹＰ２Ｄ８Ｐは選択しない逆方向プライマーと組み合わせて用いられる。ＣＹＰ２Ｄ６を選択するがＣＹＰ２Ｄ７ＡＰ、ＣＹＰ２Ｄ７ＢＰ、ＣＹＰ２Ｄ８Ｐは選択しない逆方向プライマーは、両方の増幅反応において同じプライマーであることが好ましい。当技術分野において既知の対立遺伝子特異的プライマーを作製するいかなる手法も、この検査法に使用することができる。例えば、対立遺伝子特異的プライマーは、プライマーの３’末端に多型的な１８８位に対するミスマッチがあることを除き、ＣＹＰ２Ｄ６の配列を有するプライマーをデザインすることにより作製することができる。対立遺伝子特異的プライマーを作製する別の手段は、３’末端から２番目の位置にＣＹＰ２Ｄ６へのミスマッチを有することである。よって、プライマーは最も３’側の位置にＣまたはＴのヌクレオチドを有し、３’末端から２番目の位置にミスマッチを有するＣＹＰ２Ｄ６遺伝子の配列を有する。対立遺伝子特異的プライマーを作製するさらに別の手段は、プライマー全体、特にプライマーの最も３’側の４〜５塩基に、プライマーがその部位に存在し得る２つの対立遺伝子配列のうち１つだけにハイブリダイズするように、修飾塩基を用いることである。ＣＹＰ２Ｄ６＊１やＣＹＰ２Ｄ６＊１０遺伝子のどちらかに特異的なプライマーを作製するさらに別の手段は、プライマーの３’ヌクレオチドとして４つのＣＹＰ２Ｄ６＊１０  ＳＮＰｓのいずれか１つの部位を含む、個別のプライマーをデザインすることである。例えば、Ｃ１８８Ｔ多型を、野生型ＣＹＰ２Ｄ６＊１やＣＹＰ２Ｄ６＊１０対立遺伝子のいずれかに特異的なプライマーをデザインするのに用いてもよい。これは、プライマー配列がＣ１８８Ｔ多型のすぐ直前のＣＹＰ２Ｄ６配列に相当するような順方向または逆方向プライマーをデザインすることで実施される。プライマーの３’ヌクレオチドはＣＹＰ２Ｄ６遺伝子の１８８位に相当するようにデザインされる。３’ヌクレオチドは、プライマーの３’部位がＣＹＰ２Ｄ６遺伝子にハイブリダイズしなければ（すなわちプライマーの３’部位にミスマッチが生じれば）プライマーがＣＹＰ２Ｄ６増幅産物へと伸長されないように、ＣあるいはＴヌクレオチドとなっている。この例を用いると、順方向のＣＹＰ２Ｄ６＊１特異的プライマーは、３’が１８８位の野生型配列に相当するＣヌクレオチドで終わる、１８８位のすぐ直前のＣＹＰ２Ｄ６配列（・・・５’ＧＣＡＣＧＣＴＡＣ３’）を含むであろう。逆に、順方向のＣＹＰ２Ｄ６＊１０特異的プライマーは、３’が１８８位の多型の存在に相当するＴヌクレオチドで終わる、１８８位のすぐ直前のＣＹＰ２Ｄ６配列（・・・５’ＧＣＡＣＧＣＴＡＣ３’）を含むであろう。同様に、逆方向のＣＹＰ２Ｄ６���１特異的プライマーは、３’が１８８位の野生型配列に相当するＧヌクレオチドで終わる、１８８位のすぐ直前のＣＹＰ２Ｄ６配列（・・・５’ＧＧＣＣＴＧＧＴＧ３’）を含み、ＣＹＰ２Ｄ６＊１０特異的プライマーは、３’が１８８位の多型の存在に相当するＡヌクレオチドで終わる、１８８位のすぐ直前のＣＹＰ２Ｄ６配列（・・・５’ＧＧＣＣＴＧＧＴＧ３’）を含むであろう。対立遺伝子特異的プライマーを作製するいかなる手法も本発明の検査方法に適用可能であり、そのプライマーおよびそのプライマーを用いて個体のＣＹＰ２Ｄ６ゲノタイプを決定する方法は、ここに含まれるものである。
【００２１】
ＣＹＰ２Ｄ６＊１やＣＹＰ２Ｄ６＊１０に特異的なプライマーは、それぞれＣＹＰ２Ｄ６＊１遺伝子やＣＹＰ２Ｄ６＊１０遺伝子の存在の検出に用いることができる。従って、本発明の実施形態の１つは、ＣＹＰ２Ｄ６＊１０遺伝子の存在を検出するために対立遺伝子特異的プライマーをハイブリダイゼーションすることを用いた、個体のＣＹＰ２Ｄ６＊１０ゲノタイプを決定する方法である。プライマーおよび／またはプローブは、１０と５００の間のいずれの整数の長さも含む１０から５００ヌクレオチドの範囲にあるＣＹＰ２Ｄ６遺伝子に特異的にハイブリダイズするのに十分な、どんな長さでもよい。プライマーおよび／またはプローブは、少なくとも長さ１０ヌクレオチドか、少なくとも長さ１５ヌクレオチドか、少なくとも長さ２０ヌクレオチドか、少なくとも長さ２５ヌクレオチドか、少なくとも長さ３０ヌクレオチドか、少なくとも長さ３５ヌクレオチドか、少なくとも長さ４０ヌクレオチドか、少なくとも長さ４５ヌクレオチドか、少なくとも長さ５０ヌクレオチドか、少なくとも長さ５５ヌクレオチドか、または少なくとも長さ６０ヌクレオチドであることが望ましい。
【００２２】
本発明の好ましい実施形態では、各プライマーセットから準備されたＣＹＰ２Ｄ６対立遺伝子増幅産物が、各個体のＣＹＰ２Ｄ６＊１０ゲノタイプを決定するために比較される。ＣＹＰ２Ｄ６遺伝子の産物が、ＣＹＰ２Ｄ６＊１特異的プライマーを含む第１のプライマーセットによってのみ生産されれば、テストしたＤＮＡサンプルのゲノタイプは野生型である。このような用途に関しては、野生型という表示は、ＣＹＰ２Ｄ６＊１０ではないＣＹＰ２Ｄ６遺伝子座を定義するのに用いられる。従って、ＣＹＰ２Ｄ６＊１特異的プライマーを含む第１のプライマーセットによってのみ生産されるＰＣＲ産物は、検出された遺伝子座がＣＹＰ２Ｄ６＊１０ハプロタイプを定義する変異以外の突然変異を含みうるにもかかわらず、本方法を用いたテストにおいては野生型の結果を示す。例えば、ＰＣＲ産物がＣＹＰ２Ｄ６＊１特異的なプライマーセットによって生産され、かつＣＹＰ２Ｄ６＊１０特異的なプライマーセットによってＰＣＲ産物が全く生産されなければ、被験個体は、ＣＹＰ２Ｄ６＊１、ＣＹＰ２Ｄ６＊３５、ＣＹＰ２Ｄ６＊２、ＣＹＰ２Ｄ６＊３、ＣＹＰ２Ｄ６＊４のような他のＣＹＰ２Ｄ６ゲノタイプを有しているかもしれないという事実にも関わらず、本発明の方法による結果に関しては野生型であると同定される。従って、試験の結果報告に用いられる際の野生型は、単に被験個体にＣＹＰ２Ｄ６＊１０ゲノタイプが存在しないことを示している。ＣＹＰ２Ｄ６遺伝子の産物が、ＣＹＰ２Ｄ６＊１０特異的プライマーを含む第２のプライマーセットによってのみ生産されれば、テストしたＤＮＡサンプルのゲノタイプはＣＹＰ２Ｄ６＊１０ゲノタイプについてホモ接合である。ＣＹＰ２Ｄ６遺伝子の産物が、ＣＹＰ２Ｄ６＊１特異的プライマーを含む第１のプライマーセットと、ＣＹＰ２Ｄ６＊１０特異的プライマーを含む第２のプライマーセットの両方によって生産されれば、テストしたＤＮＡサンプルのゲノタイプはＣＹＰ２Ｄ６＊１０ゲノタイプについてヘテロ接合である。
【００２３】
本発明の別個の複数の実施形態では、ＣＹＰ２Ｄ６遺伝子の増幅方法を、同じ反応において同時に、あるいは独立の反応において別々に実施してよい。さらに増幅産物は、被験個体のＣＹＰ２Ｄ６ゲノタイプを決定するために視覚化することもできる。増幅産物が同じ反応で生成される場合、ＣＹＰ２Ｄ６＊１０の重複が起きていればＣＹＰ２Ｄ６＊１０特異的な産物が優先的に増幅される。従って、本発明の方法論では、各対立遺伝子の増幅が同じ反応で実施され、かつＣＹＰ２Ｄ６＊１０遺伝子が重複している場合には、野生型の対立遺伝子の存在は検出しないかもしれない。通常、野生型とＣＹＰ２Ｄ６＊１０の増幅が同じ反応において実施される検査では、ＣＹＰ２Ｄ６＊１０遺伝子が４あるいはそれ以下の重複を起こしている場合には被験個体のＣＹＰ２Ｄ６＊１０ゲノタイプが正確に同定される。ＣＹＰ２Ｄ６＊１０遺伝子が４をこえる重複を起こしている例では、同じ反応において対立遺伝子を増幅させると、ヘテロ接合の個体の場合に野生型の存在を隠してしまう。従って、本発明の試験の方法論の好ましい実施形態は、ＣＹＰ２Ｄ６＊１０遺伝子に重複がある場合にヘテロ接合の個体の正確な同定を確実にするため、別々の反応でＣＹＰ２Ｄ６＊１とＣＹＰ２Ｄ６＊１０の増幅を実施することを含んでいる。
【００２４】
増幅されたＤＮＡ産物の個々の部分について、問題の個々の多型の存在を検査することもできる。この検査法は、増幅産物の中の遺伝子の領域内に多型が存在することを検出する、いかなる既知の方法も含むことができる。例えば、１つあるいはそれ以上の多型の存在は、制限酵素断片長多型の分析、その領域のダイレクトシーケンス（ｄｉｒｅｃｔ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）分析、ディファレンシャルハイブリダイゼーション（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）、一本鎖立体構造多型の分析などの方法を用いて検出することができる。例えば、ＣＹＰ２Ｄ６遺伝子の第１エクソンの増幅部分は、Ｃ１８８Ｔ多型の存在について、増幅産物のシーケンシングや制限酵素断片長多型（ＲＦＬＰ）分析によってさらに分析することができる。
【００２５】
本発明の実施形態は、さらにゲノタイプ決定検査の結果に基づいて医薬組成物を処方するステップを含む。医薬組成物は、その代謝がＣＹＰ２Ｄ６＊１０変異体によって影響を受ける、いかなる組成物であってもよい。例えば、そのような医薬品には、脂溶性ベータ遮断薬、抗不整脈剤、抗うつ薬、神経弛緩薬、リスペリドン（ｒｉｓｐｅｒｉｄｏｎｅ）、デブリソキン、ベンラファキシンが含まれてもよい。ＣＹＰ２Ｄ６＊１０の表現型は、通常、ＣＹＰ２Ｄ６酵素により代謝される医薬品の代謝低下となる。従って、ＣＹＰ２Ｄ６＊１０対立遺伝子の存在を示すゲノタイプ決定検査結果から、通常、より低用量の該医薬品を処方するか、または似た性質を有し、ＣＹＰ２Ｄ６表現型の変化の影響を受けない別の医薬品を処方するということになる。処方される医薬品のより低い用量とは、従来処方されてきたであろう用量よりも低い用量である。ＣＹＰ２Ｄ６酵素により代謝される医薬品の従来の用量は良く知られている。例えば、医師用卓上参考書（Ｐｈｙｓｉｃｉａｎ’ｓ Ｄｅｓｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ）（第５６版（２００２年１月１５日）メディカルエコノミクス（Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｅｃｏｎｏｍｉｃｓ）出版）にある用量ガイドラインを参照のこと。ＣＹＰ２Ｄ６ゲノタイプ決定検査の結果に基づき医薬組成物を処方するこの方法は、特にアジアの人々にとって好ましいものである。
以下の実施例は、本発明の実施形態を説明するために提供されるものであり、請求項に述べた発明の範囲を限定するとみなされるべきものではない。
【００２６】
（実施例）
（実施例１）ＣＹＰ２Ｄ６＊１０遺伝子重複の同定
Ａ．ＤＮＡサンプルの採取
インフォームドコンセントを得たのち、シンガポール出身の７７人の健康で非血縁のボランティアから血液検体が採取された。守秘義務を保つため、全てのサンプルから個人を特定できる情報を取り除いた。ジェントラピュアジーンキット（Ｇｅｎｔｒａ  ＰｕｒｅＧｅｎｅ  ｋｉｔ）Ｋ−５０（ジェントラ（Ｇｅｎｔｒａ）社、米国ミネソタ州ミネアポリス）を用いて全血からゲノムＤＮＡを抽出した。ゲノムＤＮＡの濃度は、ピコグリーンを使用し、既知濃度のヒト胎盤ＤＮＡの標準曲線に基づいて、サイトフルオロ（ＣｙｔｏＦｌｕｏｒ）ＩＩ  蛍光光度計（パーセプティブバイオシステムズ社（ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、米国マサチューセッツ州フレーミングハム（Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ））を用いて測定した。
【００２７】
Ｂ．ゲノムＤＮＡ配列のポリメラーゼ連鎖反応増幅
全てのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅は、パーキンエルマージーンアンプＰＣＲキット（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  ＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲ  ｋｉｔ）（パーキンエルマーシータス社（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｃｅｔｕｓ）、  米国コロラド州ノーウォーク）を用い、製品取扱説明書に従って、Ｔａｑ  Ｇｏｌｄ  ＤＮＡポリメラーゼと１００ｎｇのゲノムＤＮＡをテンプレートとして含む５０μｌの反応液中で実施した。各ＰＣＲのマグネシウム濃度は、実験により最適化した。以下のプライマーを、ＰＣＲ−ＲＦＬＰ検査に用いた：ＦＷＤ＝順方向。ＲＥＶ＝逆方向。
【００２８】
ＦＷＤ  ５’ＣＣＡＴＴＴＧＧＴＡＧＴＧＡＧＧＣＡＧＧＴＡＴＧ３’（配列番号１）、
ＲＥＶ  ５’ＣＡＣＣＡＴＣＣＡＴＧＴＴＴＧＣＴＴＣＴＧＧＴ３’（配列番号２）。
【００２９】
各反応において、マグネシウム濃度は１．５ｍＭとした。次にＰＣＲ産物をＨｐｈＩで消化し、２％アガロースゲルで泳動した。対立遺伝子特異的増幅（ＡＳＡ）検査法には、マスターミックスバッファー（Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ  Ｂｕｆｆｅｒ）Ｅ（エピセンターテクノロジー社（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、米国ウィスコンシン州マディソン）を以下のプライマーとともに用いた：
【００３０】
ＦＷＤ（野生型）  ５’ＧＧＧＣＴＧＣＡＣＧＣＴＡＣＣ３’（配列番号３）または
ＦＷＤ（＊１０）  ５’ＴＧＧＧＣＴＧＣＡＣＧＣＴＡＣＴ３’（配列番号４）
ＲＥＶ  ５’ＡＧＣＴＣＧＧＡＣＴＡＣＧＧＴＣＡＴＣ３’（配列番号５）。
【００３１】
内部対照遺伝子のプライマーは：
ＦＷＤ  ５’ＣＴＣＡＴＣＴＣＣＴＧＡＡＡＧＴＣＣＣＴＧＡＴＡ３’（配列番号６）
ＲＥＶ  ５’ＣＣＣＡＧＧＴＣＴＣＴＧＴＡＧＴＣＡＡＡＴＣＣ３’（配列番号７）。
【００３２】
ＣＹＰ２Ｄ６の第１、第２、第３および第９エクソンをシーケンシングするためのＰＣＲテンプレートは、１ｍＭマグネシウムと以下のプライマーを用いて取得した：
【００３３】
第１エクソン、プライマー対Ａ：
ＦＷＤ  ５’ＡＧＧＴＡＴＧＧＧＧＣＴＡＧＡＡＧＣＡＣＴＧ３  ’（配列番号８）
ＲＥＶ  ５’ＡＧＧＡＣＧＴＣＣＣＣＣＡＡＡＣＣ３’（配列番号９）
第１エクソン、プライマー対Ｂ：
ＦＷＤ  ５’ＣＣＴＧＣＣＴＧＧＴＣＣＴＣＴＧＴＧＣ３’（配列番号１０）
ＲＥＶ  ５’ＣＧＴＧＧＧＴＣＡＣＣＡＧＣＧＣ３’（配列番号１１）
第２エクソン
ＦＷＤ  ５’ＡＣＣＣＡＣＧＧＣＧＡＧＧＡＣＡ３’（配列番号１２）
ＲＥＶ  ５’ＣＴＡＧＴＧＣＡＧＧＴＧＧＴＴＴＣＴＴＧＧＣ３  ’（配列番号１３）
第３エクソン
ＦＷＤ  ５’ＣＴＡＡＴＧＣＣＴＴＣＡＴＧＧＣＣＡＣ３’（配列番号１４）
ＲＥＶ  ５’ＧＧＡＧＴＧＧＴＴＧＧＣＧＡＡＧＧ３’（配列番号１５）
第９エクソン
ＦＷＤ  ５’ＡＧＣＴＴＣＴＣＧＧＴＧＣＣＣＡＣＴ３’（配列番号１６）
ＲＥＶ  ５’ＡＣＧＴＡＣＣＣＣＴＧＴＣＴＣＡＡＡＴＧＣ３’（配列番号１７）。
【００３４】
ＣＹＰ２Ｄ６＊３６特異的ＰＣＲ増幅は、１ｍＭマグネシウムで以下のプライマーを用いて実施した：
ＦＷＤ  ５’ＧＧＣＡＡＧＡＡＧＧＡＴＴＧＴＣＡＧＧ３’（配列番号１８）
ＲＥＶ  ５’ＧＧＣＧＴＣＣＡＣＧＧＡＧＡＡＧＣ３’（配列番号１９）。
【００３５】
熱サイクルは、ＰＣＲ装置ジーンアンプ（ＧｅｎｅＡｍｐ）ＰＣＲシステム９７００（パーキンエルマー社）を用い、９５℃で１０分間の初期変性ステップ、次に９５℃で３０秒間の変性、６０℃で４５秒間のプライマーアニーリング、７２℃で２分間のプライマー伸長を３５サイクル、次に７２℃で５分間の最終伸長として実施したが、以下を例外とした：ＲＦＬＰ用のＰＣＲテンプレートは、６５℃で３０サイクルで増幅した；第３エクソンのアニーリング温度には６２℃を用いた；ＡＳＡ  ＰＣＲは６４℃で３０サイクルとした；ＣＹＰ２Ｄ６＊３６特異的産物を増幅するためには５８℃と４０サイクルを用いた。
【００３６】
Ｃ．ＤＮＡシーケンシング
ＰＣＲ産物は、マイクロコン１００（Ｍｉｃｒｏｃｏｎ−１００）カラム（ミリポア社、米国マサチューセッツ州ベッドフォード）を用いたスピンカラム精製によりシーケンシング用に調製した。サイクルシーケンス（Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）は、ＡＢＩプリズムジクロロローダミンターミネーターサイクルシーケンシングレディリアクションキット（ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ｄＲｈｏｄａｍｉｎｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ）（アプライドバイオシステムズ社、米国カリフォルニア州フォスターシティ）を用い、製品取扱説明書に従って、ＰＣＲ装置ジーンアンプＰＣＲシステム９６００（パーキンエルマー社）で実施した。シーケンシング反応は、９６℃で２０秒間、５０℃で２０秒間、６０℃で４分間の３０サイクルで実施し、その後エタノール沈殿した。サンプルは５０℃で約１５分間蒸発乾固し、２μｌのローディングバッファー（５：１  脱イオン化ホルムアミド：５０ｍＭ  ＥＤＴＡ  ｐＨ８．０）に再懸濁し、６５℃まで５分間加熱し、配列決定のため、製品取扱説明書に従ってＡＢＩ３７７型核酸分析装置を用いて４％ポリアクリルアミド／６Ｍ尿素ゲルで電気泳動した。
【００３７】
少なくとも１つのＣＹＰ２Ｄ６＊１０対立遺伝子について、中国人集団の対照サンプルの配列を照合したところ、ＣＹＰ２Ｄ６第１エクソン１８８位のヘテロ接合体の間で、ピーク比の高さが均一でないことが明らかとなった。蛍光に基づく配列検出で得られたエレクトロフェログラムは、ヘテロ接合体のピーク比と同じように再現性が高い（＋／−１０％）。この分析結果から明らかなように、ヘテロ接合体のサンプルはピーク比に基づきＴ＝Ｃ、Ｔ＞ Ｃ、Ｔ＞＞Ｃ、Ｔ＞＞＞ Ｃのように分類することができる（図１Ａ参照）。プライマー結合部位の１つに位置する多型を原因とした、対立遺伝子増幅の差異の可能性をなくすため、２つの異なるプライマー対（ＡとＢ）を用いて第１エクソンを増幅した。１８８位の不均一なピーク比がいずれの増幅でも認められた。さらに、ＣＹＰ２Ｄ６＊１０がＣＹＰ２Ｄ６遺伝子座に散在する４つのＳＮＰｓ（第１エクソンのＣ１８８Ｔ、第２エクソンのＣ１１２７Ｔ、第３エクソンのＧ１７４９Ｃ、第９エクソンのＧ４２６８Ｃ）からなるハプロタイプであるため、すべてのサンプルの第２、第３および第９エクソンをシーケンスし、そして図１Ｂに示すように、１８８位に認められるピーク比の均一性の同様の欠如が１１２７位、１７４９位、４２６８位にも存在することが発見された。しかしながら、４２６８位については多少の不整合が認められ、より具体的には、１８８位においてＣのピークより大きいＴのピークを示すヘテロ接合体のうちの一部は４２６８位においてはＧ＝Ｃであった。ヘテロ接合体のうち７２％はＣのピークより大きいＴのピークを有すると見積もられた。
【００３８】
Ｄ．シーケンシング上の相違の確認
１つのＴ＞＞Ｃ（８６１）ヘテロ接合体と１つのＴ＝Ｃ（８７０）ヘテロ接合体からＰＣＲ産物をクローニングし、各対立遺伝子の型から生成されたＴクローンの数とＣクローンの数を確認することにより、この不均一なピーク比が何らかのシーケンシング上の人為的な結果によるものではないことが確認された。各クローン化サンプルあたり６４コロニーを拾った。サンプル８７０由来のコロニーのうち５２％について１８８位にＣを有することが見出され、サンプル８６１由来のコロニーのうち３０％だけが同じ部位にＣを有していた。不均一なシーケンシングのピーク比は、一部の個体により多くの遺伝子コピー数をもたらす、多型的な遺伝子の重複の結果であることもありうる。
【００３９】
Ｅ．クローニング
ＣＹＰ２Ｄ６第１エクソンの１８８位に多型部位を有する領域を含むＤＮＡ断片を、すでに述べたプライマーおよびＰＣＲ条件を用いて、サンプル８６０および８７１から単離したゲノムＤＮＡ１００ｎｇよりＰＣＲ増幅した。次にＰＣＲ産物を、製品取扱説明書に従い、ＴＡベクターｐＣＲ２．１（インビトロジェン社、  カリフォルニア州カールズバッド）へのサブクローニングに直接用いた。ＣＹＰ２Ｄ６挿入配列を有するこれらのベクターは、ＰＣＲ産物のシーケンシングやプローブの作製に用いることができた。
【００４０】
（実施例２）増加した遺伝子コピー数の検証
Ａ．ゲノムＤＮＡの消化
２つの野生型サンプル（＊１／＊１）、Ｔ＞＞Ｃピーク比を有する２つのヘテロ接合体＊１／＊１０、１つの＊１０／＊１０ホモ接合体をＸｂａＩで消化した。それぞれについて、１０マイクログラムのゲノムＤＮＡを、ＸｂａＩを用いて３７℃で一晩消化した。
【００４１】
Ｂ．ブロッティングとハイブリダイゼーション
消化したサンプルを、パルスフィールドゲル装置（バイオラッドラボラトリーズ社、カリフォルニア州ハーキュリーズ）を用い製品取扱説明書に従って１２時間、０．５×  ＴＢＥ緩衝液中で１％シーケム（ＳｅａＫｅｍ）ＬＥアガロースゲル（ＦＭＣバイオプロダクツ社、米国メイン州ロックランド）で電気泳動し、０．４Ｍ  ＮａＯＨ／１Ｍ  ＮａＣｌのトランスファー緩衝液中でハイボンドＮプラス（Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ  Ｐｌｕｓ）メンブレン（アマシャムファルマシアバイオテク社、米国ニュージャージー州ピスカータウェイ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ））に移し取り、ＵＶ架橋および真空オーブンでの加熱乾燥により固定した。ブロットを７％ＳＤＳ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１０ｇ／Ｌ  ウシ血清アルブミンを含む５００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液中で６５℃で１時間プレハイブリダイズし、次に、ゲル精製し、放射標識した、５００ｂｐのＰＣＲで作られたＣＹＰ２Ｄ６プローブでハイブリダイズした。標識後、プローブはＧ−５０セファデックススピンカラム（アマシャムファルマシアバイオテク社）で精製し、プレハイブリダイズしたブロットに添加し、６５℃で一晩ハイブリダイズさせた。ブロットは３ｍＭ  ＮａＣｌと０．１％ＳＤＳを含む３０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液で６５℃で１５分間、１回洗浄し、次に１．５ｍＭ  ＮａＣｌと０．１％ＳＤＳを含む１５ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液で６５℃で１５分間洗浄し、最後に０．７５ｍＭ  ＮａＣｌと０．１％ＳＤＳを含む７．５ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液で６５℃で１５分間洗浄した。ハイブリダイゼーションのバンドはオートラジオグラフィーにより示された。
【００４２】
ＸｂａＩは、ＣＹＰ２Ｄ６およびその偽遺伝子ＣＹＰ２Ｄ７Ｐを含む２９Ｋｂの制限酵素断片と、偽遺伝子ＣＹＰ２Ｄ８Ｐを含む３．５Ｋｂの断片とを生じることが知られている。ＣＹＰ２Ｄ６と２つの偽遺伝子に高い相同性があることと（＞８０％）、使用したハイブリダイゼーション条件からすると、プローブはこの３つの遺伝子座に等しくハイブリダイズするはずである。２つのハイブリダイゼーションのバンド（２９および３．５Ｋｂ）がホモ接合体から認められた一方、ヘテロ接合体と＊１０ホモ接合体はその他に約４４Ｋｂのバンド（図２）を示し、そのサイズは１つまたは２つの余分なＣＹＰ２Ｄ６遺伝子のコピーが存在するということと一致する。
【００４３】
（実施例３）ＣＹＰ２Ｄ６＊１０に関連した遺伝子重複の構造
１８８位（第１エクソン）、１１２７位（第２エクソン）、１７４９位（第３エクソン）において他のピークより大きな１つのピークを示すヘテロ接合体のほとんどは、第９エクソンの４２６８位については同様の不均一なピーク比を示さない。考えられる解釈の１つは、この場合、重複が１７４９位と４２６８位の間で終わっているということである。別の可能性は、これらのヘテロ接合体では、第９エクソンのＰＣＲ産物が、第９エクソンの多数のコピーのうち２つだけを増幅して生成されているということである。このようなことは、遺伝子重複を有するサンプル中で、１あるいはそれ以上のコピー数のＣＹＰ２Ｄ６＊１０対立遺伝子について、ＣＹＰ２Ｄ６とＣＹＰ２Ｄ７Ｐの間で第９エクソンに遺伝子変換の事象が起きていれば、生じうることである。このような遺伝子変換の事象が起きていたとすれば、第９エクソンの４２６８位を含むＰＣＲ産物は、ＣＹＰ２Ｄ６特異的プライマーを用いた時には増幅されなかっただろう。当初はＣＹＰ２Ｄ６＊１０Ｃと呼ばれ後にＣＹＰ２Ｄ６＊３６と改名された、ＣＹＰ２Ｄ６＊１０対立遺伝子のサブバリアントの１つは、第９エクソンにおけるＣＹＰ２Ｄ７Ｐとの遺伝子変換を除いてＣＹＰ２Ｄ６＊１０対立遺伝子と完全に同一であることが知られている。これらのヘテロ接合体のサンプルにこのような遺伝子変換が存在することが、ＣＹＰ２Ｄ６特異的な順方向プライマーと、第９エクソンに位置するＣＹＰ２Ｄ７Ｐ特異的な逆方向プライマーからなるプライマー対をデザインすることにより検証された。表１は、ホモ接合体＊１／＊１（８５７）、Ｃのピークより大きなＴのピークを有するヘテロ接合体（８６１）、２つのホモ接合体＊１０／＊１０（８６６および８７３）から得た結果を示している。ホモ接合体＊１／＊１はこの混成プライマー対で増幅しなかったが、その他の４サンプルは増幅し、ＣＹＰ２Ｄ６＊３６対立遺伝子の存在が確認された。
【００４４】
【表１】
2004528048.tif 000003
【００４５】
（実施例４）ＣＹＰ２Ｄ６＊１０ゲノタイプ決定検査法の開発
Ａ．標準検査法のバリデーション
各々その全体が引用により本明細書に組み込まれているＷａｎｇら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂａｓｉｓ ｏｆ ｇｅｎｅｔｉｃ ｖａｒｉａｔｉｏｎ ｉｎ ｄｅｂｒｉｓｏｑｕｉｎ ｈｙｄｒｏｘｙｌａｔｉｏｎ ｉｎ Ｃｈｉｎｅｓｅ ｓｕｂｊｅｃｔｓ： ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ ｉｎ ＲＦＬＰ ａｎｄ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ＣＹＰ２Ｄ６． Ｃｌｉｎ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． Ｔｈｅｒ． ５３：４１０−１８， １９９３）やＧａｏ＆Ｚｈａｎｇ（Ｇａｏ Ｙ， Ｚｈａｎｇ Ｑ． Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ ｏｆ ｔｈｅ ＧＳＴＭ１ ａｎｄ ＣＹＰ２Ｄ６ ｇｅｎｅｓ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ ｔｏ ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ ｉｎ Ｃｈｉｎｅｓｅ． Ｍｕｔａｔ． Ｒｅｓ． ４４４：４４１−４９， １９９９）によって発表された標準的な方法に基づきＰＣＲ−ＲＦＬＰ検査法を開発し、検証する過程において、一部のゲノタイプは、シーケンシング結果と比較すると、ＰＣＲ−ＲＦＬＰ検査法により誤って同定されることが発見された。より具体的には、一部のヘテロ接合体がホモ接合体（＊１０／＊１０）であると報告される一方、ホモ接合体の野生型サンプルの一部が全く増幅できなかった。ＰＣＲ−ＲＦＬＰ検査法で用いたのとは異なるプライマー対を使用したシーケンシング検証試験により、アジア人の被験サンプルの約４０％が第１イントロンに多型領域を有していることがはっきりと示された（図３）。この多型領域はＣＹＰ２Ｄ７Ｐへの部分的な遺伝子変換によるものかもしれない。この３０ｂｐ長の領域は、７塩基対のＣＹＰ２Ｄ６野生型配列との差異を含んでおり、これらの差異はＰＣＲ−ＲＦＬＰ検査法用のＣＹＰ２Ｄ６特異的プライマーをデザインするのに用いられた。従って、そのＰＣＲ−ＲＦＬＰプライマー対は第１イントロンに多型領域を含むどんな対立遺伝子も増幅しないであろう。さらに、同時に両方の対立遺伝子をあらかじめ増幅する必要のあるいかなる検査法も、ＣＹＰ２Ｄ６＊１０対立遺伝子の重複の存在下では１８８位の野生型の配列を隠してしまう可能性がある。検証済みのＰＣＲ−ＲＦＬＰは、重複の数が４あるいはそれ以下のときには正しく機能することが確認されている。しかしながら、重複の数が４をこえるときには、このテストでは野生型の配列を検出しないだろう。
【００４６】
Ｂ．発明の方法のバリデーション
中間ＰＣＲ産物の必要なしにゲノムＤＮＡ中の野生型配列とＣＹＰ２Ｄ６＊１０対立遺伝子を独立に検出する、対立遺伝子特異的検査法（ＡＳＡ）がテストされた（図４）。順方向プライマーはＣＹＰ２Ｄ６＊１またはＣＹＰ２Ｄ６＊１０に特異的であり、共通の逆方向プライマーはＣＹＰ２Ｄ６を選択し、ＣＹＰ２Ｄ７ＡＰ、ＣＹＰ２Ｄ７ＢＰ、ＣＹＰ２Ｄ８Ｐは選択しなかった。検査法の性能を調整するため、この検査にはチオプリンメチルトランスフェラーゼ（ＴＰＭＴ）遺伝子の増幅も含まれている。図５は、様々な重複の程度をシミュレートするために、ＣＹＰ２Ｄ６＊１とＣＹＰ２Ｄ６＊１０のＤＮＡサンプルを様々な比率で混合した実験の結果を示している。図５に示されるように、ＣＹＰ２Ｄ６＊１のＣＹＰ２Ｄ６＊１０対立遺伝子に対する比が低い場合でも、野生型のＣＹＰ２Ｄ６＊１対立遺伝子の存在は本発明のゲノタイプ決定検査法により検出された。これらの結果は、このＣＹＰ２Ｄ６＊１０対立遺伝子特異的検査法が、少なくとも２５倍過剰なコピー数のＴ１８８配列の存在下でも野生型のＣ１８８配列を検出できる、強力な検定法であることを示している。
【００４７】
「１つの」存在という語は１つあるいはそれ以上の存在を指すものであり、２つあるいはそれ以上の存在の混合物である存在を含んでいる、ということに注意すべきである。従って、「１つの」、「１つまたはそれ以上の」、「少なくとも１つの」という語はここでは互換的に用いられている。「備えている（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」「含んでいる（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」「有している（ｈａｖｉｎｇ）」という語が互換的に用いられていることについても、注意すべきである。
【００４８】
本発明の種々の実施形態が詳細に説明されてきたが、それらの実施形態の変更形態や適合形態について当業者が思いつくであろうことは明らかである。しかしながら、そのような変更形態や適合形態は、請求項に述べたような本発明の精神や範囲に含まれていると理解されるべきものである。
【図面の簡単な説明】
【図１】異なるピーク比を示すエレクトロフェログラムの比較。Ａ）ＣＹＰ２Ｄ６第１エクソンの１８８位のピーク比。Ｂ）第２、第３、第９エクソンのそれぞれ１１２７位、１７４９位、４２６８位のピーク比。
【図２】ＣＹＰ２Ｄ６第１イントロンにおける、正常な（野生型の）ヌクレオチド配列と共通な変異型のヌクレオチド配列との比較。
【図３】パルスフィールドゲル電気泳動分析によるＣＹＰ２Ｄ６＊１０遺伝子重複の確認。２つのホモ接合体＊１／＊１（レーン１および２）、２つのヘテロ接合体＊１／＊１０（レーン３および４）、１つのホモ接合体＊１０／＊１０（レーン５）由来の、ＸｂａＩで消化したゲノムＤＮＡサンプルを、非特異的ＣＹＰ２Ｄプローブでハイブリダイズした。２９Ｋｂと４４ＫｂのバンドはＣＹＰ２Ｄ６とＣＹＰ２Ｄ７Ｐを、３．５Ｋｂのバンドは偽遺伝子ＣＹＰ２Ｄ８Ｐを含んでいる。
【図４】＊１０／＊１０、＊１／＊１、＊１／＊１０サンプルの対立遺伝子特異的増幅（ＡＳＡ）。レーン１、３、５は＊１特異的な順方向プライマーを用いたＡＳＡ検査の結果を示す。レーン２、４、６は＊１０特異的な順方向プライマーを用いたときの結果を示す。対照（ｃｏｎｔｒｏｌ）遺伝子はＴＰＭＴである。
【図５】ＣＹＰ２Ｄ６＊１０  ＡＳＡを用いた混合実験。レーン１および１０：分子量マーカー。レーン２：等量の＊１／＊１および＊１０／＊１０のゲノムＤＮＡをＰＣＲテンプレートとして用いた。レーン３−９：様々なＤＮＡ比の＊１／＊１および＊１０／＊１０のゲノムＤＮＡを用いた。比率（ｒａｔｉｏ）は下部に示した。
【図６】ＣＹＰ２Ｄ６＊１０関連の遺伝子重複の考えられる原因：ホモ接合体＊１０／＊１０においてＣＹＰ２Ｄ７ＰとＣＹＰ２Ｄ６＊１０の間に不等交差が起き、ＣＹＰ２Ｄ７Ｐ−ＣＹＰ２Ｄ６＊３６−ＣＹＰ２Ｄ６＊１０遺伝子座（左下）と、ＣＹＰ２Ｄ７Ｐの第８または第９エクソンからＣＹＰ２Ｄ６の第７または第８エクソンにわたる欠失を有する遺伝子座（右下）を生じる。
【図１】
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【図２】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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