(57)【要約】本発明は、標的細胞集団内の修飾された細胞表面上の機能的ＩＦＮＡＲ２ｃレセプター鎖の数を増加させ、次いで修飾された細胞を治療的に有効量のＩ型ＩＦＮに対して暴露させるか、あるいは内因的に産生されたＩＦＮに対して暴露させることを含んでなる、標的細胞集団中の細胞に対するＩ型インターフェロン（ＩＦＮ）の抗成長作用を増強させる方法に関する。
2004505023.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的細胞集団内の修飾された細胞の表面上の機能的ＩＦＮＡＲ２ｃレセプター鎖の数を増加させ、次いで修飾された細胞を治療的に有効量のＩ型ＩＦＮに対して暴露させることを含んでなる、標的細胞集団に対するＩ型ＩＦＮの作用を増強させる方法。
【請求項２】
前記作用が抗成長作用である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ＩＦＮＡＲ２ｃ遺伝子の遺伝子発現のアップレギュレーションにより、修飾された細胞の表面上の機能的ＩＦＮＡＲ２ｃレセプター鎖の数を増加させる、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
ＩＦＮＡＲ２ｃポリペプチドをコードする外因性遺伝子を修飾された細胞の中に導入することによって、ＩＦＮＡＲ２ｃ遺伝子の遺伝子発現のアップレギュレーションを達成する、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
ＩＦＮＡＲ２ｃ遺伝子のプロモーターを刺激する小さい分子に対して標的細胞集団の修飾された細胞を暴露させることによって、ＩＦＮＡＲ２ｃ遺伝子の遺伝子発現のアップレギュレーションを達成する、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
前記Ｉ型ＩＦＮがＩ型α−ＩＦＮ、Ｉ型β−ＩＦＮ、Ｉ型ω−ＩＦＮ、またはコンセンサスＩ型ＩＦＮである、請求項２に記載の方法。
【請求項７】
前記標的細胞集団の細胞が増殖性細胞状態に関係する細胞である、請求項２に記載の方法。
【請求項８】
増殖性細胞状態に関係する細胞が癌細胞である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
増殖性細胞状態に関係する細胞が再狭窄に関係する平滑筋である、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
ウイルスベクターを使用して、ＩＦＮＡＲ２ｃポリペプチドをコードする少なくとも１つの外因性遺伝子を、修飾された細胞に移送する、請求項４に記載の方法。
【請求項１１】
前記ウイルスベクターがレトロウイルスまたはアデノウイルスに由来する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
標的細胞集団に対するＩ型ＩＦＮの抗成長作用が少なくとも５％だけ増加される、請求項２に記載の方法。
【請求項１３】
標的細胞集団に対するＩ型ＩＦＮの抗成長作用が少なくとも１０％だけ増加される、請求項２に記載の方法。
【請求項１４】
ＩＦＮＡＲ２ｃポリペプチドをコードする外因性遺伝子およびＩ型ＩＦＮをコードする遺伝子を、同一ウイルスベクターの一部分として、標的細胞集団に送達させる、請求項１０に記載の方法。
【請求項１５】
標的細胞集団内の修飾された細胞表面上の機能的エフェクター分子レセプターの数を増加させ、次いで修飾された細胞を治療的に有効量のエフェクター分子に対して暴露させることを含んでなる、腫瘍細胞を含んでなる標的細胞集団に対するエフェクター分子の作用を増強させる方法。
【請求項１６】
エフェクター分子が成長因子またはインターロイキンである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
エフェクター分子レセプターをコードする遺伝子の遺伝子発現のアップレギュレーションにより、エフェクター分子レセプターの数を増加させる、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
エフェクター分子レセプターをコードする外因性遺伝子を修飾された細胞の中に導入することによって、エフェクター分子レセプターをコードする遺伝子の遺伝子発現のアップレギュレーションを達成する、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
エフェクター分子レセプターをコードする遺伝子のプロモーターを刺激する小さい分子に対して標的細胞集団の修飾された細胞を暴露させることによって、エフェクター分子レセプターをコードする遺伝子の遺伝子発現のアップレギュレーションを達成する、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
標的細胞集団に対するエフェクター分子の抗成長作用が少なくとも１０％だけ増加される、請求項１５に記載の方法。
【請求項２１】
標的細胞集団内の修飾された細胞表面上の機能的ＩＦＮＡＲ１レセプター鎖の数を増加させ、次いで修飾された細胞を治療的に有効量のＩ型ＩＦＮに対して暴露させることを含んでなる、標的細胞集団に対するＩ型ＩＦＮの作用を増強させる方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の背景
１９５７年における最初の発見以来、ウイルス感染を妨害する因子として本来記載されたインターフェロンは広く研究されてきている。現在、インターフェロン（ＩＦＮ）は体の自然防御系として認識され、多数のヒト疾患を治療する治療剤として首尾よく使用されている。ＩＦＮはＩ型またはＩＩ型として定義される２つのクラスに分離される。Ｉ型ＩＦＮは関係するタンパク質、ＩＦＮα、ＩＦＮβ、ＩＦＮω、ＩＦＮτおよびＩＦＮδのファミリーを包含するが、ＩＩ型ＩＦＮはＩ型ＩＦＮに対して制限された相同性を有する１つのタンパク質、ＩＦＮγから成る。
２つのレセプタータンパク質、ＩＦＮＡＲ１およびＩＦＮＡＲ２はＩ型ＩＦＮの結合に関係することが知られている。
【０００２】
発明の説明
本発明は、細胞表面上のレセプターリガンドに対する機能的レセプターの数を増加させることによって、エフェクターリガンドの作用を増強する方法に関する。本明細書において使用するとき、機能的レセプターの数を増加させることは、通常細胞により発現される量を超えた機能的レセプターの発現量を意味する。こうして、この増加は細胞表面上のレセプタータンパク質の総数を増加させるか、あるいは非機能的レセプタータンパクを機能的レセプタータンパク質で置換することによって、例えば、突然変異誘発により達成することができる。「増強」は、本明細書において使用するとき、エフェクターリガンドの作用の任意の増強を意味する。
【０００３】
１つの面において、標的細胞集団内の修飾された細胞表面上のエフェクターリガンドの機能的レセプター数を増加させ、次いで修飾された細胞を治療的に有効量のエフェクターリガンドで処理することによって、腫瘍細胞を含んでなる標的細胞集団に対するエフェクターリガンドの作用を増強させる方法に関する。本明細書において使用するとき、標的細胞集団は１または２以上の細胞を含んでなることができ、そして標的細胞集団内の修飾された細胞は標的細胞集団の１または２以上の細胞を含んでなることができる。
【０００４】
他の面において、標的細胞集団内の修飾された細胞表面上のＩＦＮの機能的レセプター数を増加させ、次いで修飾された細胞を治療的に有効量のＩＦＮで処理することによって、標的細胞集団に対するＩＦＮの作用を増強させる方法に関する。ＩＦＮの作用は、例えば、抗ウイルス作用、抗成長作用、および免疫調節作用を包含する。例えば、標的細胞集団内の細胞表面上のＩＦＮＡＲ２ｃポリペプチドの発現を増加させると、標的集団の細胞に対するＩ型ＩＦＮの作用は増強されることが見出された。特に、標的細胞集団内の修飾された細胞表面上のＩ型ＩＦＮの機能的レセプター数を増加させると、標的細胞集団に対するＩ型ＩＦＮの抗成長作用を増強させることができる。
【０００５】
本明細書において使用するとき、抗成長作用は抗増殖およびアポトーシス作用、ならびに細胞死、細胞増殖の停止、または細胞増殖の遅延を生ずる任意の他の作用を包含する。抗増殖作用は、本明細書において使用するとき、例えば、細胞周期の抑制または細胞周期時間の増加、ならびにアポトーシスインデューサーの誘導、タンパク質合成、ＤＮＡ合成、またはＲＮＡ合成を消極的に調節する因子の誘導、または代謝経路のインヒビターの活性化を包含する。
【０００６】
本発明のいかなる理論にも拘束されたくないが、本発明者らはＩ型ＩＦＮが細胞に直接的に作用してＩＦＮＡＲ２ｃ発現を増加させて、これらの抗成長作用を誘発すると考える。しかしながら、また、本発明の一部分として、直接的作用の代わりにまたは直接的作用に加えて、Ｉ型ＩＦＮはバイスタンダー作用を介して抗成長作用を示すことができ、ここでＩ型ＩＦＮは細胞に作用してＩＦＮＡＲ２ｃ発現を増加させて、隣接細胞に対して抗成長作用を有する因子の分泌を誘発すると考えられる。
【０００７】
したがって、本発明は、標的細胞集団内の修飾された細胞表面上の機能的ＩＦＮＡＲ２ｃレセプター鎖の数を増加させ、次いで修飾された細胞を治療的に有効量のＩ型ＩＦＮに結合する少なくとも１種のエフェクターリガンドで処理することによって、標的細胞集団に対するＩ型ＩＦＮの抗成長作用を増強させる方法に関する。また、細胞表面上の機能的ＩＦＮＡＲ１レセプター鎖を増加させること本発明の一部分であると考えられる。Ｉ型ＩＦＮレセプターに結合する好ましいエフェクターリガンドはＩ型ＩＦＮである。
【０００８】
「修飾された細胞」は、本明細書において使用するとき、細胞表面上のエフェクターリガンドに対する機能的レセプターの発現レベルを増加させるように修飾された細胞を意味する。修飾された細胞は、レセプターリガンドに対する機能的レセプターの発現レベルをｉｎ ｖｉｖｏまたはｅｘ ｖｉｖｏにおいて増加増加させるように修飾された細胞を包含する。ｅｘ ｖｉｖｏで修飾される修飾された細胞は、ｅｘ ｖｉｖｏ修飾後、引き続いて標的細胞集団に転移させることができる。修飾された細胞は、また、比較的高いレベルのエフェクターリガンドレセプターを発現しかつ標的細胞集団に添加される、天然に存在する細胞を包含することができる。
【０００９】
本明細書において使用するとき、エフェクターリガンドは、エフェクターリガンドレセプターに結合しかつエフェクターリガンドレセプターを少なくとも部分的に活性化する、任意の分子を意味する。エフェクターリガンドは下記のものを包含するが、これらに限定されない：天然に存在するエフェクターリガンド、修飾されたエフェクターリガンド、キメラエフェクターリガンド、エフェクターリガンド模倣物、またはエフェクターリガンドレセプターに対する抗体。
【００１０】
好ましいエフェクターリガンドは、例えば、成長因子、サイトカイン、走化性因子、および造血因子を包含する。特に、好ましいエフェクターリガンドは下記のものを包含するが、これらに限定されない：ＩＦＮ；腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、例えば、ＴＮＦαおよびＴＮＦβ；インターロイキン（ＩＬ）、例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、およびＩＬ−１３；コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、例えば、顆粒球−マクロファージ−ＣＳＦ（ＧＭ−ＣＳＦ）、単球−ＣＳＦ（Ｍ−ＣＳＦ）；幹細胞因子（ＳＣＦ）；白血病抑制因子（ＬＩＦ）；表皮増殖因子（ＥＧＦ）、オンコスタチンＭ（ＯＳＭ）、ケモカインレセプター１または５（ＣＣＲ１またはＣＣＲ５）、およびその他。
【００１１】
特に好ましいエフェクターリガンドは、Ｉ型ＩＦＮレセプターに結合するエフェクターリガンド、例えば、Ｉ型ＩＦＮである。本明細書において使用するとき、Ｉ型ＩＦＮはＩＦＮα、ＩＦＮβ、ＩＦＮω、ＩＦＮτおよびＩＦＮδ、または任意の新しく定義されたＩ型ＩＦＮを包含し、それらのすべては本発明に従い使用することができる。本発明によれば、使用するＩ型ＩＦＮは、例えば、抗成長活性、抗ウイルス活性、または免疫調節活性を有する、任意のサブタイプであることができる。サブタイプは天然に存在するサブタイプまたは組換えサブタイプ、例えば、２種またはそれ以上のサブタイプのハイブリッド、またはそれらのアナローグであることができる。抗成長活性は、この分野においてよく知られている任意の技術、例えば、下記の実施例、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌ． １１９、Ｓｉｄｎｅｙ Ｐｅｓｔｋａ編、に記載されている技術により測定することができる。
【００１２】
本発明に従い使用するＩ型ＩＦＮは、最適な濃度のＩＦＮにおいて４時間インキュベートした後、ＨＴ１０８０細胞におけるチミジン組込みが５％、好ましくは１０％、最も好ましくは１５％だけ阻害されるような抗成長活性を有することが好ましい。異なるサブタイプの混合物をまた使用することができる。好ましくは、本発明に従い使用できるＩ型ＩＦＮはＩＦＮαおよびＩＦＮβを包含し、下記のものを包含するが、これらに限定されない：ＩＦＮβサブタイプ、例えば、ＩＦＮβ１ｂおよびＩＦＮβ１ａ；ＩＦＮαサブタイプ、例えば、ＩＦＮα２、ＩＦＮα５、ＩＦＮα１３、ＩＦＮα６、ＩＦＮα１４、ＩＦＮα１６、ＩＦＮα２１、ＩＦＮα１０、ＩＦＮα４６、ＩＦＮα４６、ＩＦＮα７、およびコンセンサスαＩＦＮ。
【００１３】
本発明と組み合わせて使用できるＩＦＮの例は下記のものを包含するが、これらに限定されない：ＩＦＮβ１ｂについて、「ベータセロン（Ｂｅｔａｓｅｒｏｎ）」、組換え的に産生されたヒトＩＦＮβ、ここで１７位におけるシステイン残基がセリンで置換されているもの、米国特許第４，５８８，５８５号に開示され、特許請求されているものを使用することができる。さらに、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞中で産生される、組換え的産生されたＩＦＮβ１ａを使用することもできる。
【００１４】
ＩＦＮαについて、ヒトα−ＩＦＮ産物ＩｎｔｒｏｎＴＭ（Ｓｃｈｅｒｉｎｇ−Ｐｌｏｕｇｈ）、ＲｏｆｅｎｒｏｎＴＭ（Ｈｏｆｆｍａｎ−ＬａＲｏｃｈｅ）およびＩｎｆｅｒｇｅｎＴＭ（Ａｍｇｅｎ）を使用することができる。使用できる他のＩＦＮは、コンセンサスＩ型αＩＦＮ、例えば、米国特許第４，６９５，６２３号、米国特許第４，８９７，４７１号、および米国特許第５，５４１，２９３号に記載されているものを包含する。また、本発明の一部分として使用するインターフェロンは、例えば、下記の文献に記載されているように、他の分子に結合させることによって修飾することができる。
【００１５】
修飾された細胞表面上の機能的エフェクターリガンドレセプターの数を種々の異なる方法で増加させることは、本発明の一部分と考えられる。例えば、ＩＦＮＡＲ２ｃ遺伝子の遺伝子発現のアップレギュレーションを使用して、細胞上のＩＦＮＡＲ２ｃレセプタータンパク質の数を増加させることができる。遺伝子発現のアップレギュレーションは、例えば、ＩＦＮＡＲ２ｃポリペプチドをコードする外因性ポリヌクレオチドを修飾された細胞の中に導入するか、あるいは修飾された細胞中の内因性ＩＦＮＡＲ２ｃ遺伝子または外因性ＩＦＮＡＲ２ｃ遺伝子の遺伝子転写に積極的に影響を与えることによって、達成することができる。
【００１６】
例えば、遺伝子発現のアップレギュレーションは、プロモーターまたは他の調節配列を直接的または間接的に刺激するか、あるいはＩＦＮＡＲ２ｃポリペプチドの産生を刺激する遺伝子を活性化することによって、達成することができる。例えば、小さい分子を使用してＩＦＮＡＲ２ｃ遺伝子のプロモーターを刺激することができる。転写をアップレギュレートする小さい分子は、この分野においてよく知られている技術により同定することができる。さらに、この分野においてよく知られている種々の方法を使用して、ＩＦＮＡＲ２ｃタンパク質をコードし、メッセンジャーＲＮＡの安定性を増加させるか、あるいはＩＦＮＡＲ２ｃポリペプチドの安定性を増加させることができる。
【００１７】
修飾された細胞表面上の機能的ＩＦＮＡＲ２ｃポリペプチドの数を増加させる好ましい方法は、ＩＦＮＡＲ２ｃポリペプチドをコードする、少なくとも１つの外因性ポリヌクレオチドを修飾された細胞の中に導入することによる。任意の外因性ＩＦＮＡＲ２ｃ遺伝子、例えば、ヒトＩＦＮＡＲ２ｃ遺伝子または任意の他の哺乳動物、例えば、マウス、ラット、およびその他のＩＦＮＡＲ２ｃ遺伝子を包含するＩＦＮＡＲ２ｃ遺伝子を本発明に従い使用することができる。全長のヒトＩＦＮＡＲ２ｃポリペプチドをコードする遺伝子のＤＮＡ配列、および対応するアミノ酸配列は、Ｌｕｔｆａｌｌａ他、１９９５、ＥＭＢＯ Ｊ． １４（２０）：５１００−５１０８；Ｄｏｍａｎｓｋｉ他、１９９５、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７０：２１６０６−２１６１１；および添付された配列番号３および４に記載されている。
【００１８】
全長のヒトＩＦＮＡＲ２ｃポリペプチドをコードする遺伝子のＤＮＡ配列、および対応するアミノ酸配列は、Ｏｗｃｚａｒｅｋ他、１９９７、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７２：２３８６５−２３８７０；および添付された配列番号１および２に記載されている。また、ヒトＩＦＮＡＲ２ｃポリペプチドをコードする遺伝子の部分的ＤＮＡ配列は、Ｎｏｖｉｃｋ、米国特許第５，８２１，０７８号、ＥＰ ０ ５８８ １７７ Ａ２、およびＥＰ ０６７６ ４１３ Ａ２に開示されている。本明細書において使用するとき、外因性ＩＦＮＡＲ２ｃ遺伝子は細胞に添加される任意のＩＦＮＡＲ２ｃ遺伝子を意味し、これらの細胞に加えて任意の内因性ＩＦＮＡＲ２ｃ遺伝子の他のコピーが包含される。
【００１９】
本発明は、標的細胞表面上の天然に存在するＩＦＮＡＲ２ｃポリペプチドの数を増加させることばかりでなく、かつまた細胞表面上の突然変異体ＩＦＮＡＲ２ｃポリペプチドを増加させることに関する。例えば、ＩＦＮＡＲ２ｃのアミノ酸配列の変化は本発明に包含される。ＩＦＮＡＲ２ｃポリペプチドは、そのタンパク質をコードするＤＮＡを変化させることによって変更することができる。同一または類似の性質を有するアミノ酸を使用する、保存的アミノ酸配列の変更は好ましい。
【００２０】
例示的アミノ酸置換は下記の変化を包含する：アラニン→セリン；アルギニン→リシン；アスパラギン→グルタミンまたはヒスチジン；アスパラギン酸塩→グルタミン酸塩；システイン→セリン；グルタミン→アスパラギン；グルタミン酸塩→アスパラギン酸；グリシン→プロリン；ヒスチジン→アスパラギンまたはグルタミン；イソロイシン→ロイシンまたはバリン；ロイシン→バリンまたはイソロイシン；リシン→アルギニン、グルタミン、またはグルタミン酸塩；メチオニン→ロイシンまたはイソロイシン；フェニルアラニン→チロシン、ロイシンまたはメチオニン；セリン→トレオニン；トレオニン→セリン；トリプトファン→チロシン；チロシン→トリプトファンまたはフェニルアラニン；バリン→イソロイシンまたはロイシン。
【００２１】
本発明のポリヌクレオチド配列は、ＩＦＮＡＲ２ｃポリペプチドをコードするＤＮＡ、ｃＤＮＡおよびＲＮＡを包含する。このようなポリヌクレオチドは、天然に存在する、合成の、および意図的に操作されたポリヌクレオチドを包含する。例えば、オールタネイトＲＮＡスプライシングパターンのために、またはＲＮＡ転写のためのオールタネイトプロモーターの使用のために、ｍＲＮＡ配列の一部分は変更されることができる。他の例として、ＩＦＮＡＲ２ｃポリヌクレオチドを部位特異的突然変異誘発に付すことができる。
【００２２】
本発明は、生物学的活性を有するＩＦＮＡＲ２ｃポリペプチドをコードする、任意のポリヌクレオチドを包含する。ＩＦＮＡＲ２ｃポリペプチドの生物学的活性は、本明細書において使用するとき、細胞表面上で発現されるとき、下記の性質の１つを有するポリペプチドを意味する：（１） Ｉ型ＩＦＮに結合する；（２） ＩＦＮＡＲ１と二量化する少なくともいくつかのＩＦＮ仲介活性を増強させることができる；（３） 抗体結合性活性、ここでＩＦＮＡＲ２ｃに対して向けられた抗体は少なくとも１つのＩＦＮ仲介活性を阻害またはブロックする。
【００２３】
本発明を実施するために適当な標的細胞集団は、ＩＦＮ仲介活性の増強から利益を受ける、任意の細胞集団を包含する。例えば、増殖性細胞状態を本発明に従い処理することができる。増殖性細胞状態は、本明細書において使用するとき、癌または新形成状態を包含する、細胞増殖を制限することが望ましい、任意の状態を意味する。癌細胞は下記のものを包含するが、これらに限定されない：ヘアリー・セル白血病、多発性骨髄腫、カポージ肉腫、頸部新形成、基底細胞癌、扁平上皮細胞癌、骨髄腫、腎細胞癌、カルチノイド腫瘍、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、頭部および頸部の腫瘍、および乳房、肺および前立腺の腫瘍、および腺癌に関係する細胞。充実腫瘍の一部分である癌細胞集団は、特に本発明の一部分として意図される。さらに、手術不能癌、例えば、脳癌、膵臓癌、および後の段階の転移性疾患は、特に本発明の一部分として意図される。
【００２４】
増殖性細胞状態に関係する細胞は、骨髄増殖性疾患に関係する細胞型を包含する。骨髄増殖性疾患の例は、例えば、慢性骨髄性白血病、真性赤血球増加症、原因不明の骨髄化生および特発性血小板血症を包含する。クロム親和性細胞は、また、冠状動脈再狭窄を包含する。冠状動脈再狭窄を治療するためのＩ型ＩＦＮの使用は、例えば、米国特許第５，６８１，５５８号に記載されている。
【００２５】
また、標的細胞集団に他の成長調節ポリペプチドを投与することと組み合わせて、本発明の方法を使用できることは本発明の一部分としてと考えられる。例えば、本発明の方法によれば、標的細胞集団に対する他の成長調節ポリペプチド、例えば、成長因子またはサイトカイン、例えば、インターロイキンの投与と組み合わせて、ＩＦＮＡＲ２ｃポリペプチドの発現レベルを増加させるように修飾された細胞を含有する標的細胞集団に、ＩＦＮを投与することができる。さらに、本発明によれば、標的細胞集団内の同一の修飾された細胞または異なる修飾された細胞上における、２種以上の型のエフェクターリガンドレセプター、例えば、Ｉ型ＩＦＮおよびインターロイキンの発現量を増加させるように、対応するエフェクターリガンドで引き続いて処理して、標的細胞集団の細胞を修飾することができる。
【００２６】
本発明は、また、増殖性細胞状態を治療する遺伝子療法を提供する。このような療法は、例えば、標的細胞集団の修飾された細胞の中にＩＦＮＡＲ２ｃ遺伝子を導入し、次いで修飾された細胞をＩ型ＩＦＮまたはＩＦＮレセプターに対する任意の他のエフェクターリガンドで処理することによって、達成されるであろう。ＩＦＮレセプターに対するリガンドは外因的に添加するか、あるいは内因的に産生することができる。
【００２７】
ＩＦＮＡＲ２ｃ遺伝子は、任意の有効な方法で、例えば、ベクターまたは他の送達ビヒクルを使用して、または裸のＤＮＡとして、生物に送達させることができる。ＤＮＡ送達ビヒクルは、ウイルスベクター、例えば、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、およびレトロウイルスのベクターを包含することができる。例えば、下記の文献を参照のこと：Ｂｉｌｂａｏ他、１９９８、Ｔｕｍｏｒ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ３：５９−７９；Ｙｉａ−ＨｅｒｔｕａｌａおよびＭａｒｔｉｎ、２０００、Ｌａｎｃｅｔ ３５５：２１３−２２２；Ｃｈｕ他、１９９４、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １：２９２−２９９；Ｃｏｕｔｕｒｅ他、１９９４、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ　５：６６７−６７７；Ｅｉｖｅｒｈａｎｄ他、１９９５、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ２：３３６−３４３。また、適当な非ウイルスベクターは、ＤＮＡ−脂質複合体、例えば、リポソーム仲介またはリガンド／ポリ−Ｌ−リシン複合体、例えば、アシアログリコ−タンパク質−仲介送達系を包含する。
【００２８】
例えば、下記の文献を参照のこと：Ｆｅｉｇｎｅｒ他、１９９４、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６９：２５５０−２５６１；Ｄｅｒｏｓｓｉ他、１９９５、Ｒｅｓｔｏｒ． Ｎｅｕｒｏｌ． Ｎｅｕｒｏｓ． ８：７−１０；およびＡｂｃａｌｌａｈ他、１９９５、Ｂｉｏｌ． Ｃｅｌｌ ８５：１−７。 レトロウイルスベクターを誘導することができるレトロウイルスは下記のものを包含するが、これらに限定されない：マロネーマウス白血病ウイルス（ＭｏＭｕＬＶ）、ハーベイネズミ肉腫ウイルス（ＨａＭｕＳＶ）、ネズミ乳房腫瘍ウイルス（ＭｕＭＩＶ）、およびラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）。また、リガンド、またはリガンドをコードする遺伝子は、ＩＦＮＡＲ２ｃポリペプチドをコードする遺伝子と一緒に、遺伝子治療送達ビヒクルの中に含めることは、本発明の一部分であると考えられる。
【００２９】
ベクターを宿主に局所的にまたは全身的に投与する。典型的には、ベクターを静脈内注射することによって投与する。適当なウイルス力価は、多数の因子、例えば、選択した特定のベクター、宿主、投与モード、使用するプロモーターの強度、および治療している疾患の発病度に依存するであろう。マウスについて、アデノウイルスは好ましくは注射として約５．０×１０６〜約１０×１０６プラーク形成単位（ＰＦＵ）／ｇ体重の投与量範囲である。好ましい投与量範囲は少なくとも約６〜９×１０６ ＰＦＵ／ｇ体重、より好ましくは少なくとも約６．７〜８．６×１０６ ＰＦＵ／ｇ体重である。
【００３０】
増加したレベルのＩＦＮＡＲ２ｃ遺伝子を発現する修飾された細胞を含有する動物は、修飾された細胞を含有する標的細胞集団に対するＩ型ＩＦＮの作用を研究するために有効なモデルである。本発明は、特にヒトにおける遺伝子治療に関する。また、家庭のペットおよび農場の動物を包含する、動物における遺伝子治療の使用は、本発明の一部分であると考えられる。
【００３１】
Ｉ型ＩＦＮ、または他のリガンドを純粋な形態で、または適当な医薬組成物として投与することは、受け入れられている投与モードを介して実施することができる。Ｉ型ＩＦＮは局所的にまたは全身的に投与することができる。投与は、例えば、経口的、経鼻的、非経口的、局所的、経皮的、または経直腸的に実施することができる。Ｉ型ＩＦＮは固体または半固体の投与形態、凍結乾燥した粉末、または液体の投与形態、例えば、錠剤、坐剤、丸剤、柔らかい弾性および硬質ゼラチンカプセル剤、粉末、溶液、懸濁液、またはエアゾール、またはその他、好ましくは正確な投与量の単一投与ために適当な単位投与形態で投与することができる。
【００３２】
典型的には、薬学上の状態は慣用の担体または賦形剤およびＩ型ＩＦＮを含むであろう。また、組成物は他の薬剤、薬学的物質、担体、アジュバント、およびその他を含むことができる。薬剤を送達する本発明の方法の簡単な概観については下記の文献を参照のこと：Ｌａｎｇｅｒ、１９９０、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：１５２７−１５３３、これは引用することによって本明細書の一部とされる。
【００３３】
Ｉ型ＩＦＮを投与する好ましい経路は、好都合な毎日の投与養生法を使用する、非経口的投与である。このような非経口的投与のために、ヒトβ−ＩＦＮは薬学上許容される組成物は、例えば、下記の文献に記載されているように処方することができる：米国特許第４，４６２，９４０号、米国特許第４，５８８，５８５号および米国特許第４，９９２，２７１号。
【００３４】
「治療的に有効量の」は、本明細書において使用するとき、標的細胞集団において抗増殖作用を誘導するために十分なＩ型ＩＦＮの量を意味する。この使用に有効な量は、もちろん、治療する状態および被検体の体重および一般的状態に依存するであろう。種々の考察は下記の文献に記載されている：例えば、Ｇｉｌｍａｎ他（編者（１９９０） Ｇｏｏｄｍａｎ ａｎｄ Ｇｉｌｍａｎ’ｓ：Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｂａｓｅｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、第８版、Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ；およびＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１７版（１９９０）、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ、ペンシルベニア州イーストン、それらの各々は引用することによって本明細書の一部とされる。
【００３５】
ヒトにおいてＩ型ＩＦＮの治療的に有効な投与量は、例えば、約０．０５ ｍｇベータセロン〜約０．２５ ｍｇのベータセロンであり、皮下的に１日置きに投与される。当業者は、他のβ−ＩＦＮ生成物を包含する、他のインターフェロンの治療的に有効な量を日常的に決定することができる。
【００３６】
また、ＩＦＮＡＲ２ｃポリペプチドをコードする遺伝子を、Ｉ型ＩＦＮをコードする遺伝子と組み合わせて、標的細胞集団に送達させることは、本発明の一部分であると考えられる。ＩＦＮＡＲ２ｃ遺伝子およびＩ型ＩＦＮ遺伝子は、標的集団の同一の細胞または異なる細胞に送達させることができる。ＩＦＮＡＲ２ｃ遺伝子は、Ｉ型ＩＦＮ遺伝子と同一の組成物および／または同一のベクターの中に送達させることができる。例えば、Ｉ型ＩＦＮ遺伝子およびＩＦＮＡＲ２ｃ遺伝子を同一ウイルスベクター、例えば、アデノウイルスベクターの一部分として送達させることができる。さらに、また、ＩＦＮ遺伝子を標的集団の細胞に隣接する細胞に送達させることは本発明の一部分であると考えられる。さらに、Ｉ型ＩＦＮを発現する細胞を標的細胞集団の中に、またはその付近に移入することによって、Ｉ型ＩＦＮを標的細胞に送達させることができる。
【００３７】
それ以上詳しく説明しないで、当業者は、以上の説明を使用して、本発明を完全に利用すると考えられる。したがって、下記の好ましい特定の態様は単に例示であり、いかなる方法においても本発明の範囲を限定するものと解釈すべきではない。
上記および下記の実施例において、すべての温度は未補正のセ氏であり、そして特記しない限り、すべての部および百分率は重量による。
すべての引用された特許、特許出願、および刊行物は引用することによって本明細書の一部とされる。
【００３８】
実施例
実施例１
ＩＦＮＡＲ２ｃ遺伝子でトレンスフェクトされた細胞は、増強されたレベルの高いアフィニティーのＩ型ＩＦＮレセプターを発現する。
ＩＦＮα２のリン酸化された形態を使用するリガンド結合アッセイにより、高いアフィニティーのＩ型ＩＦＮレセプターの発現について、ＩＦＮＡＲ２ｃ遺伝子でトレンスフェクトされた、３つの細胞系統を評価した。ＩＦＮＡＲ１およびＩＦＮＡＲ２ｃの両方が細胞表面上で発現されるときにのみ、高いアフィニティーのリガンド結合が起こることが以前に証明された（Ｒｕｓｓｅｌｌ−Ｈａｒｄｅ他、１９９５、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７０：２６０３３−２６０３６）。
【００３９】
したがって、リガンド結合を使用して、ＩＦＮＡＲ２ｃ遺伝子でトレンスフェクトされた細胞系統の表面上のＩＦＮＡＲ２ｃレセプタータンパク質の発現を確認した。使用した細胞系統は次の通りであった：
（ｉ）　ＨＴ１０８０細胞。ヒト肺線維肉腫細胞系統（ＡＴＣＣ Ｎｏ． ＣＣＬ−１２１）。
（ｉｉ）　Ｕ５Ａ細胞。Ｕ５Ａ細胞はＨＴ１０８０に由来し、ＩＦＮＡＲ２ｃタンパク質発現の欠如について選択されたＨＴ１０８０細胞である。Ｕ５Ａ細胞はＩ型ＩＦＮに対して応答する能力を欠如する（Ｐｅｌｌｅｇｒｉｎｉ他、１９８９、Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． ９：４６０５−４６１２；Ｌｕｔｆａｌｌａ他、ＥＭＢＯ Ｊ． １４：５１００−５１０８）。
（ｉｉｉ）　ＭＤＡ２３１細胞。ヒト乳房上皮腺癌細胞系統（ＡＴＣＣ Ｎｏ． ＨＴＢ−２６）。
ＨＴ１０８０およびＭＤＡ２３１細胞系統はアメリカン・タイプ・ティッシュー・カルチャー（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ）から購入し、そしてすべての細胞系統は３７℃において５％ＣＯ２中で成長させた。
【００４０】
スーパーフェクト（Ｓｕｐｅｒｆｅｃｔ）（Ｑｉａｇｅｎ， Ｉｎｃ．）を使用して、全長または突然変異体の形態のヒトＩＦＮＡＲ２ｃを含有する発現プラスミドで細胞をトランスフェクトした。ＩＦＮＡＲ２ｃトランケーション突然変異またはチロシン→フェニルアラニン突然変異をコードする遺伝子を含有するプラスミドを以前に記載されているように構築した（Ｄｏｍａｎｓｋｉ他、１９９７、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７２：２６３８８−２６３９３；Ｎａｄｅａｕ他、１９９９、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７４：４０４５−４０５２）。安定なトレンスフェクトされた細胞系統をＧ４１８（１．０ ｍｇ／ｍｌ）中で選択した。選択後、個々のクローンを取り上げ、拡張させ、ＩＦＮＡＲ２ｃ ｃＤＮＡに対して特異的なイントロンスパニングプライマーを使用するＰＣＲにより確認した。陽性クローンをさらに拡張させ、Ｉ型ＩＦＮに結合する能力について試験した。
【００４１】
Ｃｒｏｚｅ他、１９９６、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７１：３３１６５−３３１６８に本質的に記載されているように、リガンド結合アッセイを実施した。比活性３．０×１０８ ＩＵ／ｍｇを有するＩＦＮαをペプロ・テク・インコーポレーテッド（Ｐｅｐｒｏ Ｔｅｃｈ Ｉｎｃ．、ニュージャージー州ロッキイヒル）から入手し、以前に記載されているように（Ｃｒｏｚｅ他、１９９６、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７１：３３１６５−３３１６８）、ＩＦＮα２を６０〜６２μＣｉ／μｇにリン酸化した。リン酸化ＩＦＮα２（１７６ ｐＭの濃度において）を２００，０００細胞に９０分間添加することによって、リガンド結合を分析した。１００倍過剰の非標識化ＩＦＮα２を添加することによって、非特異的結合を測定した。スキャッチャード解析により、結合データを解析した。
【００４２】
親ＨＴ１０８０細胞は比較的高いアフィニティー（Ｋｄ−２９０ ｐＭ）でＩＦＮα２に結合し、そしてスキャッチャード解析により９，０００レセプター部位／細胞が測定された。野生型ＩＦＮＡＲ２ｃ遺伝子（ＨＴｂｅｔａＬ．１、ＨＴｂｅｔａＬ．２、およびＨＴｂｅｔａＬ．４）トランスフェクトされたＨＴ１０８０細胞のこれらの安定なクローンをＩＦＮα２結合について分析した。クローンのうちの２つ、ＨＴｂｅｔａＬ．１およびＨＴｂｅｔａＬ．２は、親ＨＴ１０８０細胞よりも約８倍多いリガンド（３４〜３７ ｐＭの結合）に結合したが、第３クローン（ＨＴｂｅｔａＬ．４）は親ＨＴ１０８０細胞よりもほぼ２倍多いリガンド（１１〜１２ ｐＭの結合）に結合した（第１図、パネルＡ）。
【００４３】
また、ヒト乳房腺癌細胞系統ＭＤＡ２３１の細胞系統を野生型ＩＦＮＡＲ２ｃ遺伝子でトラスフェクトした。２つの安定なクローン、ＭＤＡｂｅｔａＬ．１およびＭＤＡｂｅｔａＬ．２をＩＦＮα２結合について分析した。親ＭＤＡｂｅｔａＬ．１細胞系統は比較的低いレベルのＩＦＮα２（２〜３ ｐＭ）に結合した。トラスフェクトしたクローンの各々は親ＭＤＡｂｅｔａＬ．１細胞系統よりもほぼ１０倍多いＩＦＮα２に結合した（第１図、パネルＢ）。
【００４４】
野生型ＩＦＮＡＲ２ｃ遺伝子、および３つのトランケーション突然変異体（Ｒ２．４６２、Ｒ２． ４１７、Ｒ２．３４６）および完全なチロシン→フェニルアラニン置換突然変異体（Ｒ２．Ｙ−Ｆ） （配列番号３の位置２６９、３０６、３１６、３１８、３３７、４１１および５１２におけるチロシンのフェニルアラニンによる置換）を包含する、４つの突然変異した遺伝子で、ＩＦＮＡＲ２ｃレセプタータンパク質を発現しないＵ５Ａ細胞をトランスフェクトした。
【００４５】
野生型ＩＦＮＡＲ２ｃ遺伝子でトラスフェクトしたＵ５Ａ細胞は、親ＨＴ１０８０細胞よりも１３倍多いＩＦＮに結合した（第１図、パネルＣ）。Ｒ２．４６２またはＲ２．３４６トランケーション突然変異体、または（Ｒ２．Ｙ−Ｆ）欠失突然変異体を発現する安定なクローンは、ＨＴ１０８０細胞よりも５〜１０倍多いレベルでＩＦＮに結合した（第１図、パネルＣ）。Ｒ２． ４１７トランケーション突然変異体を発現する安定なクローンは、ＨＴ１０８０細胞とほぼ同一レベルでＩＦＮに結合した（約９０００結合部位）。
【００４６】
実施例２
細胞をＩＦＮＡＲ２ｃ遺伝子でトランスフェクトすることによる、ＩＦＮβ１ｂの抗増殖作用に対するＵ５Ａ細胞およびＨＴ１０８０細胞の感受性の増強。
野生型および突然変異体ＩＦＮＡＲ２ｃ遺伝子でトラスフェクトしたＵ５Ａ細胞を、Ｕ５Ａ細胞と比較して、ＩＦＮβ１ｂの抗増殖作用に対する感受性について試験した。また、野生型ＩＦＮＡＲ２ｃ遺伝子でトラスフェクトしたＨＴ１０８０細胞を、ＨＴ１０８０細胞と比較して、ＩＦＮβおよびＩＦＮαの抗増殖作用に対する感受性について試験した。チミジン組込みアッセイを使用して、細胞をＩＦＮβ１ｂの抗増殖作用に対する感受性について試験した。
【００４７】
細胞を２４ウェルの培養プレートに２×１０４細胞／ウェル、１ ｍｌ／ウェルの密度で播種し、ヒトＩＦＮβ１ｂと１０００ ＩＵ／ｍｌの濃度において２４時間インキュベートした。ヒトＩＦＮβ１ｂ（比活性２．５×１０７ ＩＵ／ｍｇ）を下記の文献に記載されているように産生させた：Ｒｕｓｓｅｌ−Ｈａｒｄｅ、１９９５、Ｊ． Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｒｅｓ． １５：３１−３７。０において、トリチウム化チミジン（［メチル−３Ｈ］チミジン、比活性＝４０〜６０ Ｃｉ／ｍｍｏｌ、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ）を含有する完全培地を添加した。１０時間後、トリチウム化チミジンの組込みを下記の方法により測定した。細胞をリン酸緩衝生理食塩水、次いで１０％トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）、次いで１００％エタノールで洗浄した。放射能の組込みを測定する前に、細胞を１ Ｍの水酸化カリウム中で可溶化し、可溶化された細胞をエコルム（Ｅｃｏｌｕｍｅ）シンチレーション流体と混合して、トリチウム化チミジンの組込みを測定した。
【００４８】
野生型ＩＦＮＡＲ２ｃ遺伝子でトラスフェクトしたＵ５Ａ細胞はＩＦＮβ１ｂの抗増殖作用に対して極めて感受性であったが、Ｕ５Ａ細胞は感受性でなかった（第２図）。残基４６２においてトランケートされたタンパク質をコードする突然変異体ＩＦＮＡＲ２ｃ遺伝子でトラスフェクトしたＵ５Ａ細胞は、また、ＩＦＮβ１ｂの抗増殖作用に対して感受性であった。他の２つの突然変異体、Ｒ２．４１７またはＲ２．２４６、およびＲ２．Ｙ−Ｆ突然変異体（上の実施例１に記載した）はＩ型ＩＦＮに対して非応答性であった。
【００４９】
したがって、残基４１７を過ぎたＩＦＮＡＲ２ｃレセプターのトランケーションまたは細胞内領域の中に存在するチロシンのすべての除去（Ｒ２．Ｙ−Ｆ突然変異体）は、２つのＩ型ＩＦＮレセプタータンパク質を含有する細胞を、Ｉ型ＩＦＮの抗増殖作用に対して不感受性とする。しかしながら、ＩＦＮＡＲ２ｃタンパク質の遠位の５３残基（Ｒ２．２４６）の除去はＩ型ＩＦＮのレセプター仲介抗増殖作用に対して効果を明らかにもたない。ＩＦＮＡＲ２ｃレセプタータンパク質を通常レベルで発現するＨＴ１０８０細胞は、ＩＦＮβ１ｂの抗増殖作用に対してわずかに弱く感受性である。
【００５０】
【表１】
2004505023.tif 000003
【００５１】
実施例３
ＩＦＮＡＲ２ｃを増強されたレベルで発現する、ＩＦＮＡＲ２ｃでトラスフェクトしたＨＴ１０８０細胞は、Ｉ型ＩＦＮβおよびＩ型ＩＦＮα両方に対して感受性であった。
ＨＴ１０８０細胞、および野生型ＩＦＮＡＲ２ｃ遺伝子でトラスフェクトしたＨＴ１０８０細胞（ＨＴｂｅｔａＬ．２細胞）を、アァマー・ブルー （Ａｌａｍａｒ Ｂｌｕｅ ＴＭ）アッセイ（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ ＃ＤＡＬ １１００）により比較して、ミトコンドリア活性を測定した。細胞を６ウェルの皿の中にサブコンフルエント密度でプレートし、０、５０、５００または５０００ ＩＵ／ｍｌのＩＦＮβ１ｂと０、２４または４８時間インキュベートした。
【００５２】
種々の時点において、アァマー・ブルー試薬を細胞に添加し（１：１０希釈）、細胞上で３０分間インキュベートした。３０分後、還元された／蛍光アァマー・ブルーを蛍光プレートリーダーで検出した。ＨＴ１０８０細胞およびＨＴｂｅｔａＬ．２細胞の両方は、ＩＦＮβ１ｂに対して投与量および時間依存的応答を示した。しかしながら、ＨＴ１０８０細胞と対照的に、ＨＴｂｅｔａＬ．２細胞は２４〜４８時間から成長し続けない。ＨＴ１０８０細胞の増殖性速度はＩＦＮβ１ｂにより減少するが、細胞数は増加市続ける。対照的に、ＨＴｂｅｔａＬ．２細胞は経時的に実際に細胞数を減少させる。この減少は多分ＨＴｂｅｔａＬ．２細胞において誘導されるアポトーシス細胞死のためである。
【００５３】
上の実施例２に記載したチミジン組込みアッセイにより、５０００ ＩＵ／ｍｌのヒトＩＦＮβ１ｂ（ベータセロン）およびヒトＩＦＮα２の両方を使用して、ＩＦＮＡＲ２ｃ遺伝子でトラスフェクトしたＨＴ１０８０細胞に対するＩＦＮβおよびＩＦＮαの両方の比較を実施した（第４図）。この比較により、試験した両方のＩＦＮはトラスフェクトした付着末端結合に対して抗成長作用を有することが証明された。
【００５４】
また、アァマー・ブルーアッセイを使用して、ＩＦＮＡＲ２ｃ遺伝子でトラスフェクトしたＨＴ１０８０細胞（ＨＴｂｅｔａＬ．２）に対する、変化する濃度のヒトＩＦＮβ１ｂおよびＩＦＮα２の抗成長作用を比較した（第５図）。また、この比較により、ＩＦＮβはＩＦＮαよりも大きい抗成長作用を有し、そして２つのＩＦＮ間の作用の差はＩＦＮのより高い濃度においていっそう顕著であることが証明された。
【００５５】
実施例４
ＩＦＮＡＲ２ｃでトラスフェクトしたＨＴ１０８０細胞およびＭＤＡ２３１細胞は、親細胞系統よりも、Ｉ型ＩＦＮの抗増殖作用に対して非常にいっそう感受性であった。
ＨＴ１０８０細胞はヒト線維肉腫に由来する上皮様細胞である。ＩＦＮＡＲ２ｃを増強されたレベルで発現する、ＨＴ１０８０細胞に由来する安定なト細胞系統レンスフェクトされた（ＨＴｂｅｔａＬ．２）を、ＩＦＮβ１ｂで処理した後、形態学的変化について検査した（表１）。細胞を６ウェルの皿の中にプレートし、次いでＩＦＮβ１ｂで５００ ＩＵ／ｍｌの濃度において処理した。
【００５６】
２日後、未処理細胞は細胞のコンフルエントカーペットを形成した（第６図、パネルＡ）。ＩＦＮβ１ｂで処理した細胞は成長せず、より少ない細胞は処理前よりも処理後に明らかであった（第６図、パネルＢ）。より高い倍率において、処理した細胞の形態学は細胞がアポトーシスを行っていることを示した（第６図、パネルＣ（２０×）およびパネルＤ（４０×））。処理した細胞は、球形「アポトーシス体」における細胞タンパク質およびＤＮＡの脱落するレムナントであるように思われた。ＨＴ１０８０細胞はＨＴｂｅｔａＬ．２細胞のようにＩＦＮβ１ｂ処理によりひどく影響を受けず、そしてアポトーシス体はＩＦＮβ１ｂ処理ＨＴ１０８０細胞において観測されなかった（第６図、パネルＢ）。
【００５７】
ＩＦＮＡＲ２ｃを増強されたレベルで発現する、ＭＤＡ２３１に由来する２つの安定なトレンスフェクトされた細胞系統（ＭＤＡｂｅｔａＬ．１およびＭＤＡｂｅｔａＬ．２）を、ＩＦＮβ１ｂで処理した後、形態学的変化について検査した（表１）。親ＭＤＡ２３１細胞の成長は、第７図、パネルＡ（未処理親細胞）およびパネルＢ（処理親細胞）において示すように、ＩＦＮβ１ｂ処理によりほんのわずかに改良された。対照的に、ＭＤＡｂｅｔａＬ．２細胞は、第７図、パネルＣ（未処理細胞）およびパネルＤ（処理細胞）において示すように、５００ ＩＵ／ｍｌのＩＦＮβ１ｂで処理したとき、成長が著しく阻害された。
【００５８】
増強されたレベルのＩＦＮＡＲ２ｃを発現するＨＴ１０８０細胞と同様に、ＭＤＡｂｅｔａＬ．２細胞もまた、ＩＦＮβ１ｂで処理したとき、形態学的にアポトーシスを行うように見えた。形態学的変化を評価することはＨＴ１０８０細胞におけるよりもＭＤＡ２３１細胞においていっそう困難であった。なぜなら、正常のＭＤＡ２３１細胞は形状が丸いように見える傾向があるが、ＨＴ１０８０細胞は通常平らな三角形として成長するからである。しかしながら、増強されたアポトーシス作用は、Ｉ型ＩＦＮで処理するとき、ＭＤＡｂｅｔａＬ．２細胞において観測された。
【００５９】
実施例５
増強されたレベル上のＩＦＮＡＲ２ｃタンパク質を発現するＨＴ１０８０細胞およびＭＤＡ２３１細胞をＴＵＮＥＬアッセイにより確認して、ＩＦＮβ１ｂで処理した後、細胞がアポトーシスを行うことを確認した。
【００６０】
アポトーシスを指示する、フラグメント化核ＤＮＡを標識化するためにＴｄＴ仲介ｄＵＴＰニック末端標識化（ＴＵＮＥＬ）アッセイを使用して、処理した細胞においてアポトーシスを測定した（Ｉｎ Ｓｉｔｕ Ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）。ＴＵＮＥＬアッセイにおいて、アポトーシスを行う細胞核中で発生する、発生したフラグメント化ＤＮＡの末端に、蛍光ＦＩＴＣ標識化ＵＴＰヌクレオチドを転移させた。アポトーシス細胞は蛍光顕微鏡下に輝いた緑色に染色される。４日間の処理後、４％パラホルムアルデヒドを含有する１×ＰＢＳ中で６ウェルの細胞培養プレート中の細胞を室温において１時間固定した。
【００６１】
次いで、細胞をメタノール中の０．３％Ｈ２Ｏ２で室温において１時間処理した。次いで細胞をＰＢＳ中の０．３％トリトンＸ−１００で室温において３０分間透過化し、次いでＰＢＳで２回洗浄した。固定し、透過化した細胞を乾燥し、細胞の視野をＰＡＰペン（Ｂｉｏｇｅｎｅｘ）により円で囲んだ。次いで、次のようにして、アポトーシス核を蛍光標識（ＦＩＴＣ）で酵素的に標識化した。細胞を３７℃において１００ μｌの染色試薬（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）（４５０ μｌの標識溶液 ＋ ５０ μｌの酵素溶液）と４５分間インキュベートした。染色した細胞をＰＢＳで２回洗浄し、次いで蛍光顕微鏡下に画像形成した。
【００６２】
未処理のトレンスフェクトされた細胞は制限されたＴＵＮＥＬ陽性核を示した（第８図；パネルＡ、輝いた図面；パネルＢ、蛍光顕微鏡）。ＩＦＮβ１ｂで処理されたトレンスフェクトされた細胞は、緑色ＴＵＮＥＬ陽性核のカーペットを示し、細胞の大きい画分がアポトーシスの最終段階にあることを指示した（第８図；パネルＣ、輝いた図面；パネルＤ、蛍光顕微鏡）。未処理細胞におけるＴＵＮＥＬ陽性核の小さい画分は、低いレベルのＩ型ＩＦＮの内因的産生を反映することがある。ＨＴ１０８０親細胞は、ＩＦＮβ１ｂ処理後のアポトーシスの徴候を全く示さず、これはＴＵＮＥＬ陽性核の完全な欠如により指示される（第８図；パネルＥ、輝いた図面；パネルＦ、蛍光顕微鏡）。
【００６３】
ＭＤＡ２３１細胞のＴＵＮＥＬアッセイにより得られた結果は、ＨＴ１０８０細胞を使用して得られた結果に類似した。未処理の、トレンスフェクトされたＭＤＡ２３１細胞（ＭＤＡｂｅｔａＬ．２）は制限された数のＴＵＮＥＬ陽性核を示した（第９図；パネルＡ、輝いた図面；パネルＢ、蛍光顕微鏡）。ＩＦＮβ１ｂで処理し、トラスフェクトしたＭＤＡ２３１細胞（ＭＤＡｂｅｔａＬ．２）は、緑色ＴＵＮＥＬ陽性核のカーペットを示し、細胞の大きい画分がアポトーシスの最終段階にあることを指示した（第９図；パネルＣ、輝いた図面；パネルＤ、蛍光顕微鏡）。親ＭＤＡ２３１細胞は、５００ ＩＵ／ｍｌのＩＦＮβ１ｂで４日間処理したとき、アポトーシスの小さい徴候のみを示した（第９図；パネルＣ、輝いた図面；パネルＤ、蛍光顕微鏡）。未処理ＭＤＡｂｅｔａＬ．２細胞におけるＴＵＮＥＬ陽性核の画分は、低いレベルのＩ型ＩＦＮの内因的産生を反映することがある。
【００６４】
実施例６
ＩＦＮＡＲ２ｃでトラスフェクトしたヒト腫瘍細胞系統は、親細胞系統よりも、ＩＦＮβ１ｂのｉｎ ｖｉｖｏ抗成長活性に対していっそう感受性であった。
ヌードマウスの尾静脈の中にＬＯＸヒト骨髄腫細胞を注射すると、注射後４週において肺の中に規定された腫瘍を発生させるであろう。このモデルを使用して、増強されたレベルのＩＦＮＡＲ２ｃタンパク質を発現する腫瘍細胞をＩＦＮβ１ｂで処理する有効性を評価した。
【００６５】
ヌードマウス（１５匹／グループ）に、親ＬＯＸ細胞またはＩＦＮＡＲ２ｃレセプタータンパクをコードする遺伝子でトラスフェクトしたＬＯＸ細胞を注射した。１日置きに、注射後２日に出発して、マウスに２００ μｇのベータセロンまたは等しい体積（２００ μｌ）の生理食塩水を注射した。注射後２８日に、マウスを殺し、マウスの肺を取出し、均質化した。ＤＮＡをプロテイナーゼＫ消化により抽出し、次いでクイアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）カラムで精製した。プライマーおよびヒトＣＣＲ５遺伝子に対して特異的であるプローブを使用してＴａｑＭａｎＴＭ ＰＣＲにより、肺中のヒトＤＮＡの量（ＬＯＸ親またはＬＯＸ−ＩＦＮＡＲ２ｃ腫瘍細胞の測度）を定量した。精製されたヒトゲノムＤＮＡを使用して、標準的曲線を作成した。
【００６６】
ＬＯＸ親細胞またはＬＯＸ−ＩＦＮＡＲ２ｃ細胞の両方は全身的ベータセロンのｉｎ ｖｉｖｏ抗成長活性に対して感受性であり、そしてＩＦＮＡＲ２ｃでトラスフェクトしたＬＯＸ細胞は増強された感受性を示した。
【００６７】
ヌードマウスの大腿筋肉の中にＭＤＡ２３１細胞を注射すると、注射後２週において規定された腫瘍を発生させるであろう。このモデルを使用して、増強されたレベルのＩＦＮＡＲ２ｃタンパク質を発現する腫瘍細胞をＩＦＮβ１ｂで処理する有効性を評価した。ヌードマウスに、親ＭＤＡ２３１細胞またはＩＦＮＡＲ２ｃレセプタータンパクをコードする遺伝子でトラスフェクトしたＭＤＡ２３１細胞を注射した。マウスを殺し、腫瘍のサイズを測定することによって、注射したマウスにおける腫瘍増殖を阻害する、全身的に投与されたＩＦＮβ１ｂの作用を評価する。
【００６８】
本発明の一般的にまたは特定的に説明した反応物および／または操作条件を、先行する実施例において使用したそれらの代わりにを使用することによって、先行する実施例を反復することができる。
以上の説明から、当業者は容易に確認することができるように、本発明の精神および範囲から逸脱しないで、種々の変更および変化を行って、それを種々の用途および条件に適応させることが可能である。
【図面の簡単な説明】
【図１】
第１図は、高いアフィニティーのＩ型ＩＦＮレセプターを高いレベルで発現するＩＦＮＡＲ２ｃ遺伝子でトランスフェクトした細胞を示す、１系列のヒストグラムである。データは３つの別々の点の平均を表し、そして標準誤差は平均の１０％より小さい。１００倍過剰の非標識化ＩＦＮの存在下に、非特異的結合を測定した。パネルＡはトランスフェクトされたＨＴ１０８０細胞を使用して得られた結果を示す。パネルＢはトランスフェクトされたＭＤＡ２３１細胞を使用して得られた結果を示す。パネルＣは、ＩＦＮＡＲ２ｃ遺伝子のトランケーション突然変異体でトランスフェクトされた細胞を包含する、ＩＦＮＡＲ２ｃを発現しないＵ５Ａ細胞を使用して得られた結果を示す。
【図２】
第２図は、機能的ＩＦＮＡＲ２ｃ遺伝子を使用するトランスフェクションによりレスキュウーされたＵ５Ａ細胞が、非トランスフェクトＨＴ１０８０細胞に比較して、ＩＦＮβ１ｂの抗増殖活性に対して極めて感受性であることを示す。データは３つの別々の点の平均を表し、そして標準誤差は平均の１５％より小さい。
【図３】
第３図は、ＨＴ１０８０細胞およびＩＦＮＡＲ２ｃ遺伝子でトランスフェクトしたＨＴ１０８０細胞（ＨＴｂｅｔａＬ．２）がＩＦＮβ１ｂのインキュベート時間およびＩＦＮβ１ｂの濃度の両方に対して感受性であるが、ＨＴｂｅｔａＬ．２細胞が増強された感受性を示すことを表すヒストグラムである。
【図４】
第４図は、チミジン組込みアッセイを使用する、ＨＴ１０８０細胞およびＩＦＮＡＲ２ｃ遺伝子でトランスフェクトされたＨＴ１０８０細胞に対する、５０００国際単位（「ＩＵ」／ ｍｌのヒトＩＦＮβ１ｂ（ベータセロン）またはヒトＩＦＮα２の抗成長作用を比較するヒストグラムである。
【図５】
第５図は、アァマー・ブルー （Ａｌａｍａｒ Ｂｌｕｅ）アッセイを使用する、ＩＦＮＡＲ２ｃ遺伝子でトランスフェクトされたＨＴ１０８０細胞に対する、ＩＦＮβ１ｂおよびＩＦＮα２の抗成長作用を比較するヒストグラムである。
【図６】
第６図は、細胞をＩＦＮβ１ｂで処理した後、ＩＦＮＡＲ２ｃでトランスフェクトされたＨＴ１０８０（ＨＴｂｅｔａＬ．２）細胞の写真画像を示す。パネルＡ〜Ｄは次の通りである：パネルＡ、未処理細胞（倍率１０×）；パネルＢ、処理された細胞（倍率１０×）；パネルＣ、処理された細胞（倍率２０×）；およびパネルＤ、処理された細胞（倍率４０×）。細胞を５００ ＩＵ／ ｍｌのＩＦＮβ１ｂで処理した。
【図７】
第７図は、細胞をＩＦＮβ１ｂで処理した後、ＩＦＮＡＲ２ｃでトランスフェクトされたＭＤＡ２３１細胞の写真画像を示す。パネルＡおよびＢは未処理および処理された親ＭＤＡ２３１細胞をそれぞれ１０×に拡大して示す。パネルＣおよびＤは処理されたおよび未処理のＩＦＮＡＲ２ｃでトランスフェクトされたＭＤＡ２３１細胞をそれぞれ１０×に拡大して示す。細胞を５００ ＩＵ／ ｍｌのＩＦＮβ１ｂで処理した。
【図８】
第８図は、１系列の顕微鏡画像であり、ＩＦＮＡＲ２ｃレセプタータンパク質をコードする遺伝子でトランスフェクトされたＨＴ１０８０細胞（ＨＴｂｅｔａＬ．２細胞）のＩＦＮβ１ｂ処理の効果のアポトーシスアッセイ（ＴＵＮＥＬアッセイ）の結果を示す。パネルＡ〜Ｄは次の通りである：パネルＡおよびＢ、未処理ＨＴｂｅｔａＬ．２細胞、それぞれ、輝いた視野および蛍光顕微鏡の視野；パネルＣおよびＤ、ＩＦＮβ１ｂ処理ＨＴｂｅｔａＬ．２細胞、それぞれ、輝いた視野および蛍光顕微鏡の視野；パネルＥおよびＦ、親ＨＴ１０８０細胞、それぞれ、輝いた視野および蛍光顕微鏡の視野。輝いた視野の画像のパネルＡ、Ｂ、およびＥは８０％より大きいコンフルエントの細胞層を表す。ＦＩＴＣ標識化ヌクレオチドを使用して、アポトーシスの特徴を示すＤＮＡフラグメントを標識化した（パネルＢ、ＤおよびＦ）。細胞を５００ ＩＵ／ ｍｌのＩＦＮβ１ｂで処理した。パネルＡ〜Ｆについての倍率は１０×であった。
【図９】
第９図は、１系列の顕微鏡画像であり、ＩＦＮＡＲ２ｃレセプタータンパク質をコードする遺伝子でトランスフェクトされたＭＤＡ２３１細胞（ＭＤＡｂｅｔａＬ．２細胞）のＩＦＮβ１ｂ処理の効果のアポトーシスアッセイ（ＴＵＮＥＬアッセイ）の結果を示す。パネルＡ〜Ｆは次の通りである：パネルＡおよびＢ、未処理ＭＤＡｂｅｔａＬ．２細胞、それぞれ、輝いた視野および蛍光顕微鏡の視野。パネルＣおよびＤ、ＩＦＮβ１ｂ処理ＭＤＡｂｅｔａＬ．２細胞、それぞれ、輝いた視野および蛍光顕微鏡の視野。パネルＥおよびＦ、親ＭＤＡ２３１細胞、それぞれ、輝いた視野および蛍光顕微鏡の視野。輝いた視野の画像のパネルＡ、Ｂ、およびＥは８０％より大きいコンフルエントの細胞層を表す。ＦＩＴＣ標識化ヌクレオチドを使用して、アポトーシスの特徴を示すＤＮＡフラグメントを標識化した（パネルＢ、ＤおよびＦ）。細胞を５００ ＩＵ／ ｍｌのＩＦＮβ１ｂで処理した。パネルＡ〜Ｆについての倍率は１０×であった。
【図１０】
第１０図は、マウス肺接種モデルを使用する、ＬＯＸヒト骨髄腫細胞およびＬＯＸ−ＩＦＮＡＲ２ｃ細胞（機能的ＩＦＮＡＲ２ｃ遺伝子でトランスフェクトされたＬＯＸ細胞）に対するＩＦＮβ１ｂ（ベータセロン）のｉｎ ｖｉｖｏ抗成長活性を示すヒストグラムである。ＬＯＸ−ＩＦＮＡＲ２ｃ細胞は、腹腔内に１日置きに投与した２００ μｇのベータセロンに対して増強された感受性を示した。
【図１】
2004505023.tif 000004
【図２】
2004505023.tif 000005
【図４】
2004505023.tif 000006
【図５】
2004505023.tif 000007
【図６】
2004505023.tif 000008
【図７】
2004505023.tif 000009
【図８】
2004505023.tif 000010
【図９】
2004505023.tif 000011
【図１０】
2004505023.tif 000012
【国際公開パンフレット】
2004505023.tif 000013
2004505023.tif 000014
2004505023.tif 000015
2004505023.tif 000016
2004505023.tif 000017
2004505023.tif 000018
2004505023.tif 000019
2004505023.tif 000020
2004505023.tif 000021
2004505023.tif 000022
2004505023.tif 000023
2004505023.tif 000024
2004505023.tif 000025
2004505023.tif 000026
2004505023.tif 000027
2004505023.tif 000028
2004505023.tif 000029
2004505023.tif 000030
2004505023.tif 000031
2004505023.tif 000032
2004505023.tif 000033
2004505023.tif 000034
2004505023.tif 000035
2004505023.tif 000036
2004505023.tif 000037
2004505023.tif 000038
2004505023.tif 000039
2004505023.tif 000040
2004505023.tif 000041
2004505023.tif 000042
2004505023.tif 000043
2004505023.tif 000044
2004505023.tif 000045
2004505023.tif 000046
2004505023.tif 000047
2004505023.tif 000048
【国際調査報告】
2004505023.tif 000049
2004505023.tif 000050
2004505023.tif 000051
2004505023.tif 000052
2004505023.tif 000053