(57)【要約】本発明は、電子データ処理デバイスを使用してクロマトグラフィ分析を自動的に実行する方法に関する。該方法は、以下の工程を含む：ｉ）以下の情報の少なくとも１つを含むデータを収集する：ａ）好ましくは有機修飾剤の少なくとも２種の異なる濃度に対する混合物の少なくとも１つの成分の滞留時間、ｂ）滞留時間が決定される温度、ｃ）混合物における少なくとも１種の成分の構造式、ｄ）溶離剤のタイプおよびその中の有機修飾剤の濃度、ｅ）分離カラムのパラメータまたはタイプ。本発明のねらいは、人手をより少くしながら、混合物の成分のすべてまたは少なくともその多くを、比較的短時間に確実に完全検出する方法とデバイスを提供することである。このために、収集されたデータは、データ記録デバイスによって取込みかつ／または完成させて、ａ）、ｂ）、ｃ）に対応する情報についてのデータが利用できない場合には、ａ）に対応する滞留時間を収集するために少なくとも第１の試験運転を定組成条件で実施し、かつ、好ましくは、有機修飾剤の別の濃度を用いて別の定組成試験運転を実施する。次いで、本方法は、ｉｉ）ｉ）の下で記録されたデータの少なくとも一部の関数関係を再生するモデルに基づいて最適化パラメータの関数として滞留時間を計算する工程であって、前記記録データもまた、モデルパラメータを設定することによって再生可能である工程、ｉｉｉ）前記最適化パラメータを変更することによって、前記モデル内で滞留時間を最適化する工程、ｉｖ）工程ｉｉｉ）によって最適化された滞留時間のパラメータを用いて、少なくとも１回のさらなるクロマトグラフィ試験を実施し、その実際の滞留時間と前記理論的に計算され、かつ最適化された滞留時間とを比較する工程、ｖ）前記滞留時間の計算値と測定値とのずれが、事前設定可能な限界値を超える場合、または２回の連続するクロマトグラフィ試験の滞留時間の差が、事前設定可能な限界値より小さい場合に、工程ｉ）〜ｉｖ）を少なくとも１回反復する工程へと進み、次回の運転に対して特別に調整すべきパラメータを、好ましくは人工知能モジュールによって決定する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
電子データ処理装置を利用してクロマトグラフィ試験を自動実施する方法であって、
ｉ）データを記録する工程であって、該データが以下の情報項目、
ａ）好ましくは有機修飾剤の少なくとも２種類の異なる濃度に対する、混合物の少なくとも１つの成分の滞留時間、
ｂ）滞留時間が確認された温度、
ｃ）前記混合物の１つまたは２つ以上の成分の構造式、
ｄ）溶質のタイプおよび、その中の有機修飾剤の濃度、
ｅ）分離カラムのパラメータまたはタイプ、
の少なくとも１つを含み、ａ）、ｂ）またはｃ）に対応する情報項目に対してデータが利用できない場合には、前記記録データは、データ記憶装置から完全または部分的に、取出しかつ／または追加することが可能であり、ａ）に対応する滞留時間を記録するために、少なくとも第１の試験運転を定組成条件で行い、好ましくは、有機修飾剤の異なる濃度についてさらなる定組成試験運転を実施する前記工程、
ｉｉ）ｉ）において記録されたデータの少なくとも一部の関数関係を再生するモデルに基づいて、最適化パラメータの関数として滞留時間を計算する工程であって、前記記録データもまた、モデルパラメータを設定することによって再生可能である前記工程、
ｉｉｉ）前記最適化パラメータを変更することによって、前記モデル内で滞留時間を最適化する工程、
ｉｖ）工程ｉｉｉ）によって最適化された滞留時間のパラメータを用いて、少なくとも１回のさらなるクロマトグラフィ運転を実施して、その実際の滞留時間と前記理論的に計算され、最適化された滞留時間とを比較する工程、および
ｖ）前記滞留時間の計算値と測定値とのずれが事前設定可能な限界値を超える場合、または２回の連続するクロマトグラフィ運転の滞留時間の差が、事前設定可能な限界値より小さい場合に、工程ｉ）〜ｉｖ）を１回または繰り返し反復する工程、
を含み、次回の運転に特別に設定すべきパラメータを、好ましくは人工知能モジュールによって決定する、前記方法。
【請求項２】
例えば、混合物の成分の構造式、分離カラムタイプおよび既知の滞留時間およびパラメータなどの手操作で入力された初期データに基づいて、工程ｉ）〜ｖ）が、データの初期入力を除いて自動的に進行する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
好ましくは中間工程において確認された値を含み、確認された最適化値をデータベースに記憶することを特徴とする、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
工程ｉｉ）の前に、記録データと記憶データを比較することを特徴とする、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
有機修飾剤の濃度、ｐＨ値および温度Ｔを最適化パラメータとして使用することを特徴とする、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
少なくとも２つの標準液を用いる試験運転を、該標準液を事前設定可能な最大時間内に互いに分離して検出できるという条件を用いて行うことによって、最大利用可能なパラメータスペースを決定する工程を特徴とする、請求項１〜５に記載の方法。
【請求項７】
工程ｉｉｉ）における最適化基準として、最大ピーク数を追加で使用する、請求項１から６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
滞留時間を計算かつ最適化するために、ピークに属する滞留時間が最適化パラメータと比較して表されている２次元グラフにおいて、ピークを同定することに基づくピーク追跡戦略を使用することを特徴とする、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
２次元表示滞留時間対有機修飾剤の濃度の接続線に対して、Ｃを有機修飾剤の濃度として、次式、ｌｎＴ／ｄＣ＜０、が真である場合にのみ、ピークどうしを互いに同一であるとして対応づけることを特徴とする、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
同一と思われる成分のピーク面の相対ずれが、事前設定された限界値を超える場合に、ピークどうしが同一ではないと見なすことを特徴とする、請求項８または９に記載の方法。
【請求項１１】
スペクトルパラメータのずれが事前設定された限界値を超える場合に、ピークどうしを、同一と見なさないことを特徴とする、請求項８〜１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
少なくとも１種の代替固定相（代替カラム材料）に対して、滞留時間を、可変パラメータと関係させて計算かつ／または最適化する工程をさらに含む、請求項１〜１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
第１のカラム材料および／または溶離液を用いるよりも、最適化基準がよく満たされることが、モデルによって予測される場合に、異なるカラムおよび／または異なる溶離液への自動変更を行うことを特徴とする、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
すべての試験運転および最適化されたクロマトグラフィ運転における、事前設定データおよびパラメータ、ならびに関連する滞留時間、ピーク数およびピーク面を、それらが同じ系（混合物、溶離液、カラム）に関係する場合には、互いに対応づけて記憶することを特徴とする、請求項１〜１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
入力データおよび／または運転の結果を、記憶データと比較し、データどうしが事前設定の限界内で一致すれば、この系に対する最良の運転の記憶データを、次の運転に使用することを特徴とする、請求項１〜１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
クロマトグラフィ試験を自動実行かつ最適化するデバイスであって、
ａ）クロマトグラフィ分離カラム、
ｂ）混合物用の入口チャンバ、
ｃ）溶離液用の供給装置、
ｄ）クロマトグラフィカラムの出口にある検出計測ユニット、
ｅ）データの自動および／または手操作記録用のデータ記録ユニット、
を備えるデバイスにおいて、
ｆ）前記データ記録ユニットに、システムの最新の記録データに基づいて、（さらなる）クロマトグラフィ運転のための最適化パラメータを計算する最適化ユニットが割り当てられているとともに、
ｇ）制御装置およびパラメータセンサを設けて、前記計算された最適化パラメータが、前記制御装置によって自動的に設定されるとともに、この設定を用いて自動クロマトグラフィ運転が行われるように、前記制御装置が前記最適化ユニットに接続されていることを特徴とする、前記デバイス。
【請求項１７】
最適化および／または最適化データの決定のために、それが人工知能の原理にしたがって作動するモジュールを含むことを特徴とする、請求項１６に記載のデバイス。
【請求項１８】
最適化パラメータの探索において、いわゆるモンテカルロ最適化が実施されることを特徴とする、請求項１６または１７に記載のデバイス。
【請求項１９】
基準最大ピーク数、ピークの分離およびパラメータ選択の全体時間限界を評価し、それらから特有のパラメータを推論するモジュールが設けられていることを特徴とする、請求項１８に記載のデバイス。
【請求項２０】
異なるカラム材料および／または異なる溶離液に移行させるために、交換装置を設けたことを特徴とする、請求項１〜１９のいずれかに記載のデバイス。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、電子データ処理装置を利用してクロマトグラフィ試験を自動実行し、かつ最適化するための方法およびデバイスに関し、該方法は、
ｉ）以下の情報項目、
ａ）好ましくは有機修飾剤の少なくとも２種の異なる濃度に対する、混合物の少なくとも１つの成分の滞留時間、
ｂ）滞留時間が確認された温度、
ｃ）前記混合物の成分の構造式、
ｄ）溶質のタイプおよび、その中の有機修飾剤の濃度、
ｅ）分離カラムのパラメータまたは種類およびタイプ、
の少なくとも１つを含むデータを記録する工程を含む。
【０００２】
対応するデバイスは、クロマトグラフィカラムまたは分離カラム、混合物用の入口チャンバ、溶離液供給装置、クロマトグラフィカラムの出口にある計測ユニット、およびデ−タを自動および／または手操作で入力するためのデータ記録ユニットを有する。
対応する方法およびデバイスは、従来技術において公知であるとともに、販売されており、例えばMerck KGaAによって「LaChrom」の名称で市販されている。
原理的には、公知のシステムは、分析物、すなわち混合物の個々の成分が適切に既知である場合には、確実かつ迅速に機能する。例えば薬剤などの混合物の特定の組成を確認および／または除外する問題、すなわち、例えば製造工程において容易に形成される、ある不要副産物が混合物中に含まれている場合には、これに対して、経験値に基づいて、特定のクロマトグラフィ条件を、標準として設定して、少なくとも部分的に自動的に進行するようにすることができる。任意の不要成分と同様に、求める成分は既知であるので、対応する経験値に基づいて生成されたクロマトグラムを用いて、個々のバンドを、明確にその成分に割り当てることができるとともに、バンド下方に得られる面領域によって定量評価も可能である。
【０００３】
修正すべきパラメータは、例えば溶離液の温度および組成である。実用上、最も重要である、いわゆる「逆相クロマトグラフィ」の場合には、溶離液は、例えば水と非極性溶媒、例えばメタノールまたはアセトニトリルとの混合物とすることができる。非極性溶媒は、技術用語では「有機修飾剤」とも呼ばれる。いわゆる「固定相」すなわちクロマトグラフィカラム内に収容される材質は、一般に、高度に多孔質の固体、または固体顆粒または粒子のパックであり、この固体相の表面も同様に非極性であり、この目的で、任意選択で非極性材料の被覆が施されている。分析物は、固体相の表面に蓄積し、クロマトグラフィカラムを通過する溶離液による通し洗浄および／または通し加圧の結果として、ある期間内に、成分が固体相の表面から離脱し、溶離液とともにクロマトグラフィカラムの出口で排出される。クロマトグラフィ運転を開始してから、クロマトグラフィカラムの出口に成分が出現するまでの経過時間は、この成分の「滞留時間」と呼ばれる。クロマトグラフィカラム中での滞留時間に影響を与える重要なパラメータが、水と有機修飾剤との混合比、言い換えると溶離液中での有機修飾剤の濃度である。最後に、さらに別のパラメータとして、カラム材料の、材質すなわち表面組成、および有孔率および／または粒径が、重要な役割を果たす。
【０００４】
入口チャンバに導入される混合物は、最初にカラム材料中に大量に吸着される。次いで溶離液によって、個々の成分との反応、およびそれらの成分のカラムとの反応に応じて、カラム材料から個々の成分が分離されて、それらが徐々にクロマトグラフィカラムの出口へと移送される。一方では、個々の分析物と溶離液との間、他方では分析物とカラム材料との間における溶解度および反応エネルギーが異なることによって、成分は溶離液中で異なる速度で分離され、したがってやはり異なる速度でカラム中、およびカラム外へ移送される。これによって、個々の成分が互いに分離され、これらの成分が連続的にカラムの出口から外に、計測セルを通過して移送される。所与の濃度における溶解度が大きく異なる場合には、これは、溶解度の高い成分はカラムの出口に比較的迅速に現われるのに対して、溶解度の非常に低い成分は、溶離液によって分離されてカラムの出口に移送されるまでに非常に長い時間がかかるので、クロマトグラフィ運転の持続時間に影響を与える。この場合には、クロマトグラム、これは例えば時間の関数としてのセル中のＵＶ吸収に他ならないが、これが非常に引き延ばされる可能性があり、したがって多大な時間を要し、それに加えて、非常に遅くに現われるバンドまたはピークが、際立って平坦化されて、そのために認識が困難となる。
【０００５】
このようなことは一般に、いわゆる有機修飾剤の濃度を増加させることによって起こるものである。有機修飾剤の濃度を高めると、混合物の成分が、クロマトグラフィカラムから分離されて溶離液によって移送される確率が増大する。しかしながら、これによって、異なる成分が、ほとんど同時にクロマトグラフィカラムの出口に現われる可能性もあり、その結果として、対応するバンドは、互いに明確に分離されなくなり、特にバンド下方の面（surface）は、十分に正確に記録されなくなる可能性がある。
【０００６】
特定の製品の一貫する品質だけを確認するための、定型的なクロマトグラフィ運転の場合には、大きな問題もなく正しいパラメータを設定することが可能であるが、その組成が既知でないか、または部分的にしか分からない混合物の場合には、パラメータの設定が相当な問題となる。既知の物質または定型的な試験の場合には、経験値、すなわち主としてカラム材料、設定すべき温度、および有機修飾剤の濃度を基にして、最適パラメータが選択される。
混合物の各成分が、分離されたバンドとしてその他の成分によって生成されるバンドと明確に区別ができて、さらにクロマトグラフィ運転に要する全体時間が最短となるパラメータが、「最適」とみなされる。
【０００７】
結果的に「理想的」クロマトグラムは、近接して連続する一連のバンドからなり、これらのバンドは互いに完全に分離されており、この場合に、第１のバンドが、クロマトグラフィ運転の開始後、できる限り早く現われる必要がある。「バンド」または「ピーク」は、例えばＵＶ吸収によって生成することができ、クロマトグラフィカラムから出る溶離液が、その中に溶解した材料と共に計測セル中に誘導されて、この計測セルは、一方からＵＶ光を照射され、セルの反対側には、ＵＶ光用の検出器が配設されて、これを利用して、混合物の、セルを通過して流れる溶離液中に含まれた成分のＵＶ吸収を記録することができる。当然ながら、個々の溶解成分を検出する、その他の方法も、マススペクトロメトリ試験を含み、考え付くことができる。
【０００８】
クロマトグラムの長すぎる持続時間、およびバンド分離の不良の両方を回避するために、多くの場合に、クロマトグラフィ運転中に有機修飾剤の濃度を変化させる（いわゆる、傾斜溶離クロマトグラフィ）。開始時には、一般に有機修飾剤の濃度は低くし、この濃度を、例えばクロマトグラフィ運転の終了まで連続的に高める。しかし、濃度勾配を一定にしておくのではなく、より顕著に変化させたり、また、例えば段階的に濃度を変化させたり、または限定された時間だけ連続的に変化させ、それ以外は一定濃度で進行させるのが便利であることが多い。
【０００９】
さらに、変化パラメータとして温度も利用可能であることから、混合物に多くの成分が含まれるほど、またその混合物に関して既知のことが少なくなるほど、クロマトグラフィ運転の制御は複雑になる。該して未知の混合物を用いると、高価で長時間の試験運転が必要となり、そのようなクロマトグラフィ装置のユーザは、中間結果と可能であれば長年の経験とに基づいて、どのパラメータを、いつ変化させるべきかを決定している。これは、非常に時間を要すると同時に、多大な工数を必要とするプロセスであるだけでなく、非常に誤差を生じ易いプロセスであり、その理由は、クロマトグラフィ運転の持続時間が長くなるのを制限して、プロセスを加速するために、直感と経験に基づくパラメータの変更が実施されることが多く、このために、見分けのつかない一致したバンドが発生することが多く、その結果としてある成分が同定されないか、またはまったく見つからなくなるからである。
従来技術においては、この方法の自動化は、これまでのところクロマトグラフィ装置のユーザが、１組のパラメータを選択かつ入力し、次いで、この選択されたパラメータを用いてクロマトグラフィ装置によって自動運転が実施される程度であった。このために、非常に多数の試験運転が通常、必要であり、また選択されたパラメータのすべてが、意味のある結果を生むわけではなかった。すなわち最良の結果は、得られたクロマトグラムから、人手で読み取る必要があった。
【００１０】
この従来技術と比較して、本発明の目的は、より少ない工数を必要としながら、混合物のすべての成分、またはできる限り多くの成分を、比較的短時間に確実に完全記録することができる、クロマトグラフィ試験の方法およびデバイスを創造することである。
【００１１】
この目的は、請求項１に記載の方法および請求項１６に記載のデバイスによって達成される。
本発明による方法は、全般的に以下の工程を提案する：
ｉ）データを記録する工程であって、該データが以下の情報項目、
ａ）好ましくは有機修飾剤の少なくとも２種類の異なる濃度に対する、混合物の少なくとも１つの成分の滞留時間、
ｂ）滞留時間が確認される温度、
ｃ）前記混合物の１つまたは２つ以上の成分の構造式、
ｄ）溶質のタイプおよび、その中の有機修飾剤の濃度、
ｅ）分離カラムのパラメータまたはタイプ、
の少なくとも１つを含み、ａ）、ｂ）またはｃ）に対応する情報項目に対してデータが利用できない場合には、前記記録データは、データ記憶装置から完全または部分的に、取出しかつ／または追加することが可能であり、ａ）に対応する滞留時間を記録するために、少なくとも第１の試験運転を定組成条件で行い、好ましくは、有機修飾剤の異なる濃度についてさらなる定組成試験運転を実施する前記工程、
ｉｉ）ｉ）において記録されたデータの少なくとも一部の関数関係を再生するモデルに基づいて、最適化パラメータの関数として滞留時間を計算する工程であって、前記記録データもまた、モデルパラメータを設定することによって再生可能である前記工程、
ｉｉｉ）最適化パラメータを変更することによって、前記モデル内で滞留時間を最適化する工程、
ｉｖ）工程ｉｉｉ）によって最適化された滞留時間のパラメータを用いて、少なくとも１回のさらなるクロマトグラフィ運転を実施して、実際の滞留時間と前記理論的に計算されて最適化された滞留時間とを比較する工程、および
ｖ）前記滞留時間の計算値と測定値とのずれが事前設定可能な限界値を超える場合、または２回の連続するクロマトグラフィ運転の滞留時間の差が、事前設定可能な限界値より小さい場合に、工程ｉ）〜ｉｖ）を１回または繰り返し反復する工程であり、
上記のすべての工程は、初期のデータ入力を除き、自動的かつ独立に、人工知能モジュールを備えるデータ処理装置の制御下で進行する。
【００１２】
滞留時間は、例えばｐＨ値またはイオン強度などのその他のパラメータによっても影響される可能性があることが、当業者には知られている。本発明においては、これらのパラメータを、一括して最適化パラメータと呼ぶ。
混合物がほんの少数の成分だけからなり、有機修飾剤の特定の濃度におけるそれらの成分の滞留時間が既知である場合には、一般に、成分のそれぞれが明らかに異なる滞留時間を有し、その結果としてクロマトグラムの対応するピークが、互いに明確に分離されて、しかも成分の最長の滞留時間ができる限り短く保たれるように、濃度、濃度パターンおよび／または温度を設定することは比較的容易である。
【００１３】
しかしながら、成分の数が比較的多く、かつ滞留時間が異なるか、場合によっては明確に異なる、濃度関係および／または温度関係を有する場合には、系全体を管理するのが急速に困難となり、豊富な経験をもってしてもユーザの決定によって最適化できるのは運のよいときのみである。本発明によれば、このような場合に対して、数学的処理を利用して、モデル中の設定可能な変数の関数として、すなわち利用可能なデータの少なくとも一部をパラメータまたは計測値として含むモデルに基づいて、滞留時間を選択することによって最適化を実行することを提案する。有機修飾剤の濃度および／またはモデル中の温度を変化させることによって、滞留時間が結果的に最適化されるが、ここで、所与の濃度において実際に計測された滞留時間が、モデル中で正確に再生されなくてはならないことが理解できる。これは一般に、さらなる最適化に対して一定であると仮定されるモデルパラメータを適合させることによって行われる。人工知能モジュールが最終的に、どのパラメータが最適と見なされるかを決定し、それに対応する命令を制御ユニットに送る。
【００１４】
本発明による方法の応用は、混合物におけるほんの少数の成分だけが既知であり、大多数が未知である場合には、より困難となる。これらの成分に対して、有機修飾材の特定の濃度における特定の滞留時間を知るか、または代替的に、もしくは追加で、混合物の成分の構造式を知ることができる。このようなデータに基づいて、やはり理論モデルを基礎として、この理論モデルを用いて種々の濃度におけるすべての既知成分の滞留時間、および時間の関数として最適化された有機修飾剤の濃度を計算する。特に、例えば所定の温度において２つの成分を互いに分離することが困難であるが、同時にそれらの滞留時間が明確に異なる温度パターンを示す場合には、追加の最適化パラメータとして温度を使用することもできる。
【００１５】
構造式または滞留時間に関して利用可能なデータがまったくない場合には、試験運転を定組成条件下、すなわち有機修飾剤の一定濃度において、簡単に実行する。
好ましくは、２回目の試験運転を、有機修飾剤の第２の濃度において実行する。通常、それぞれのクロマトグラフに、両濃度において少なくともいくつかのバンドが現われる。混合物を適当な入口チャンバに導入し、任意選択で過去の利用可能なデータを入力するときから始まって、プロセスは全自動で運転され、そのような自動化プロセス用に対応するデバイスが、混合物用の入口チャンバ、溶離液供給装装置およびクロマトグラフィカラムの出口における計測ユニットを備えるクロマトグラフィカラムの基本構成に加えて、設計される。デバイスはまた、自動および／または手動でのデータ入力のためのデータ記録装置と、システムの最近の記録データに基づいて、（さらに別の）クロマトグラフィ運転のための最適化パラメータを計算する、関連する最適化ユニットと、最適化ユニットにおいて確認されたパラメータを自動的に設定し、自動的に確認されたプロセスに従ってパラメータを制御するために設けられた、制御装置およびパラメータセンサとを有する。
【００１６】
２回の試験運転が実行された場合には、２つのクロマトグラムの計測バンドを互いに、または特定の成分に対して対応づけてみてもよい。混合物の個々の各成分に対して標準液を用い、かつそれぞれの個別標準液のみを用いて実験を実施することによって、明確な対応づけが達成できる。このためには、純度が＞８０％の、個々の成分の標準液を使用するのが好ましい。この方法は、知能化されたピーク追跡戦略を使用することによって改善することができる。好ましいバージョンにおいて、好適なモデルは、有機修飾剤の濃度が増大するとともに滞留時間が減少することを、便宜的に仮定している。さらに、クロマトグラムのバンドの下に存在する面（surface）を利用することができる。このことは必然的に、クロマトグラフィカラムには毎回、同一量の混合物が導入されること、または少なくとも導入された量が正確にわかっており、混合物が一定の組成を有することを仮定している。ピークの対応づけは、成分のスペクトル特性によって実行することもできる。これらのピーク追跡戦略の結果として、必要とする標準液の数を２つに低減することが可能となり、最初にこれらの標準液を用い、その後に混合物を用いて最適化実験を実行することができる。
【００１７】
次いで最適化ユニットは、その系の異なる成分についての、記録された滞留時間の濃度パターンに基づいて、最適化パラメータを再び計算し、これがさらなるクロマトグラフィ運転において設定される。実際に計測される滞留時間を、先に計算された時間と比較し、基本として用いたモデルパラメータを、今度はモデルが実際に計測された滞留時間を再生するように適合させる。このように適合されたモデル「定数」に基づいて、クロマトグラフィ運転の最適化パラメータ（濃度パターンおよび／または温度）を計算し、再び設定することができる。毎回計算される最適化されたパラメータ、それから計算される滞留時間、および同じ設定パラメータを用いて、次に計測される滞留時間も、データ記録装置に自動的に記録されるとともに、混合物に、対応するクロマトグラフィ運転の反復順序、設定順序および計測値が明確に割り当てられるように配置されて記憶される。このような系列の最後には、最適化パラメータを用いるクロマトグラフィ運転を行ない、最終的に最適化されるパラメータについて選択される基準は、例えば、最大数のバンドまたはピークが分離されて記録され、かつ所定の時間限界を超えないことであり、ここで時間限界は、記録されたピーク数に依存する時間とすることもできる。データ記憶は、必要であれば、所定の混合物に対する最終の最適化パラメータの組に限定することもできる。
【００１８】
選択する別の最適化基準としては、２回または３回以上の反復クロマトグラフィ運転に基づいて得られた、滞留時間および／またはパラメータの変化が、互いにわずかしか変わらず、したがって、さらなる反復による最適化によってもわずかな改善しか得られないと予測されるという条件にすることもできる。
本発明による方法は、混合物の成分の構造式、分離カラムタイプおよびすでに分かっている滞留時間などの既知データの初期入力を除いて、完全自動で実行が可能である。前述のように、基本的に設定可能なパラメータは、有機修飾剤の濃度および温度である。
【００１９】
混合物のわずかな数の成分だけが標準液として利用可能な場合には、標準液として存在する成分が関係するパラメータスペースを超えないことを条件に、基礎として用いたモデル内で、残りの成分についての滞留時間を計算かつ／または最適化する。そのようなパラメータスペースは、すべての場合に所定の時間制限内に成分（少なくとも２種）が記録されなくてはならないので、例えば有機修飾剤の可能な濃度についての制約を含む。それを用いても２つの既知の成分を互いに明確に分離できない、パラメータ条件も除外される。次いで、設定しようとするパラメータを、さらに残りの範囲においてのみ探索する必要がある。３種以上の成分が標準液として利用可能な場合にも、もちろんこの状況は同様である。
【００２０】
試験運転を実施するとき、また反復過程における別のクロマトグラフィ運転の間に、計測されるクロマトグラムのピークまたはバンド数も全体として記録される。確認された最大ピーク数から開始して、記録ピーク数が結果として減少しない条件でのみ、最適化のためにさらにパラメータを変更する。このことは、利用可能なパラメータスペースにかなりの制約を与え、したがって最適化を明らかに加速する。
滞留時間を計算して最適化するためには、いわゆるピーク追跡戦略を使用するのが好ましく、この戦略は、２次元のグラフにおいてピークを同定することに基づいており、このグラフでは、ピークに属する滞留時間が有機修飾剤の濃度の関数として表されている。これには、特定の２次元表現は必要ではなく、そのようなグラフは、純粋に数学的、かつ抽象的に記録し分析することもできることがわかる。このプロセスにおいて、滞留時間または滞留時間の自然対数が、有機修飾剤の濃度が増加すると減少する関数である場合にのみ、異なるパラメータを用いて記録された２つのピークが、同一の成分に属すると見なすという条件を特に用いる。
【００２１】
ピーク同定のさらに別の基準としては、ピークの下に含まれる面（surface）の類似性がある。これによると、所定の有機修飾剤の濃度において、ピーク面における相対差が所定限界値を超えると、２つのピークは同一ではない、または同じ成分に属さないと見なされる。さらに、これらのピークを生成している成分のスペクトル特性が同一であるか、または非常に類似している場合には、２つのピークを、同一と見なすことができる。したがって、スペクトル特性における差が所定の限界値を超える場合には、２つのピークは同一ではない、または同じ成分に属さないと見なされる。
【００２２】
この方法の改善は、少なくとも１つの代替固定相、すなわち代替カラム材料について滞留時間を計算し、かつそれらを可変パラメータに関して最適化することによっても可能である。これは、最初に考慮されるカラム材料について満足な結果が得られない場合、すなわち不相応に長い滞留時間を受け入れなくてはならないか、または混合物の成分のすべては記録されない場合に、便利である。この場合には、別の溶離液を考慮することもできるとともに、同一または異なる溶離液を備える、異なるクロマトグラフィに変更することもできる。第１のカラム材料および第１の有機修飾剤または溶離剤に基づいて確認されたモデルパラメータを、ある制約つきで、新規なカラム材料および新規な溶離液に対するモデルパラメータに移行させるか、または変換することができる。それによって最適化時間は、第２のカラム材料および／または第２の溶離液に対しても同様に、かなり短縮することができる。したがって便宜的には、そのような異なるクロマトグラフィカラムまたは異なる溶離液への移行は、最初に前述のモデルに基づいてのみ理論上で行い、次いで、この理論的な基礎によって実行された最適化が、最初に使用されたクロマトグラフィカラムまたは溶離液に対して明確な改善を約束するときにのみ、変更を行うのが好ましい。本発明による方法を用いると、パラメータ、すなわち時間または温度の関数としての有機修飾剤濃度が、最適化の過程において任意選択で実行される種々のクロマトグラフィ運転中に、自動的に設定される。したがって、ユーザは、系または対応するクロマトグラフィシステムをある間隔でモニタをするだけでよく、記憶されたデータは、便宜上、プロトコルの形態で記録されて、スクリーンまたはその他の再生媒体上に示される。
【００２３】
クロマトグラフィ運転および設定すべきパラメータの決定には、人工知能モジュールを便宜的に使用するが、このモジュールは、例えば、ピーク分離と全体持続時間との間の妥協点を見出す能力がある。このような人工知能モジュールはまた、最適化にも使用することができる。最適パラメータの探索においては、例えば、いわゆるモンテカルロ最適化法を実施することができる。
【００２４】
滞留時間の計算は、あるデータが既知であるかどうかに応じて、異なるモデルに従って実施する。１つのモデルは、ソルバテック(solvatic)モデルとも呼ばれ、式ｌｎｋ’＝ａ（Ｖ２／３）＋ｂ（ΔＧ）＋ｃで定義され、ここでｋ’は、むだ時間によって調整される滞留時間に対応する、いわゆるキャパシティファクタであり、Ｖは探索する成分の分子の体積、ΔＧはその分子の水との反応エネルギーであり、ａ、ｂ、ｃは溶媒／溶離液系のパラメータである。ａ、ｂ、ｃは、溶媒／溶離液系の較正によって得られるが、ＶおよびΔＧは、最適化処理の過程で、計測値を使用して調整される。さらに、滞留時間に対する経験モデルを、単に、式ｌｎｋ’＝ａ＋ｂｘ＋ｃｘ２＋．．．による多項式を使用する適合によって、使用することも可能であり、ここでｋ’は先述のキャパシティタファクタであり、ｘはクロマトグラフィ法に応じて、次のように定義される。
逆相クロマトグラフィ  ｘ＝Ｃ（Ｃ＝濃度）
順相クロマトグラフィ  ｘ＝ｌｎ（Ｃ）
イオン交換クロマトグラフィ  ｘ＝ｌｎ（Ｃ）
緩衝液のｐＨ値  ｘ＝ｐＨ
温度  ｘ＝１／Ｔ
【００２５】
係数ａ、ｂ、ｃは、既知の、または計測された値が正しく再生されるように設定される、モデルパラメータである。もちろん、所与の系に対して、両方のモデルを互いに組み合わせて、あるいは互いに独立に適用することが可能であり、ソルバテック(solvatic)モデルは当然ながら、個々の成分または、それらの構造式もしくは分子パラメータが既知である場合にのみ使用可能である。記述した方法は、先行する実験の結果に基づいて、次の実験のためのパラメータを設定することを可能にする人工知能モジュールを使用すれば、さらに改善される。
【００２６】
さらに記述はしないが、当業者であれば、上記の説明を最も広い範囲で使用できるということも仮定している。したがって、好ましいバージョンおよび実施例は、単に説明のためのものであり、いかなる意味でも開示を限定するものではないことを理解すべきである。
上記および以後にリストする、すべての出願、特許、刊行物および、対応する出願ＤＥ１０１２８５４６．９を、本願に参照として組み入れる。
本発明のさらなる利点、特徴および可能な応用は、以下の一実施態様の提示から得られる。
【００２７】
原理的に、いくつかの異なる開始条件がある。１つの初期状態は、例えば、少なくともいくつかの成分の構造式が既知であることが特徴である。次いで、特定のカラム型式および有機溶媒に対する滞留時間を、ソルバテック(solvatic)モデルによって評価することができる。次に、それに対応して設定される条件による、試験運転を行う。別のシナリオによれば、成分に対して既知の構造式はなく、かつ混合物は本質的に未知である。この場合には、最初に、代表的なカラム材料および代表的な有機溶媒を用いて試験を実施することができる。この試験が成功しない場合には、異なるカラム型式と有機溶媒を試し、最初に定組成条件、すなわちそれぞれの場合に有機溶媒の濃度を低すぎないように選択して固定するか、さらに好ましくは、それぞれ明確に異なる有機修飾剤の濃度を用いて、２回の試験を実施する。
【００２８】
図１は、例として、７種のスルホンアミドを、定組成条件で、有機修飾剤の第１の濃度で求めたクロマトグラフを示す。しかし、明確に区別できるのは、６つのピークだけである。図２は、同じ系に対して、より低い濃度の第２の有機修飾剤を用いた結果である。ここでも、明確に区別できるのは６つのピークだけである。図２における第１のピークの２重構造、および図１の第２のピークにおける不規則性は、このクロマトグラムには解明されていない、さらに少なくとも１種の分析物が、混合物中に隠されていることを示している。
【００２９】
構造式が既知の場合には、ソルバテック(solvatic)滞留モデルを、固有の基礎として使用する。構造が既知の場合には、システムは、ＶおよびΔＧの値を既知の方法で自動的に計算する（１．S.V. Galushko, J. of Chromatography, 552 (1991), 91-102、２．S.V. Galushko, A.A. Kamenchuk, G.L. Pit, J. of Chromatography A, 660 (1994) 47-59）。溶媒または溶離液および固定相によって決定されるパラメータａ、ｂ、ｃは、混合物または個々の成分からの既知の標準系を用いる較正によって得られる。さらなる計算のために、パラメータａ、ｂ、ｃは不変のままとして、構造式から滞留時間が直接的に得られるようにする。パラメータａ、ｂ、ｃの濃度依存性によって、すべての成分を互いに分離して合理的な時間内に記録すれば、いくつかの成分を含む混合物の最適濃度を計算することも可能である。
【００３０】
次いで、対応して計算されたパラメータを用いて試験運転を実施する。次いで、モデルが実際に測定された時間と一致するまで、試験結果を用いてモデルパラメータの改善と滞留時間の新規計算を行う。次いで最適化された分子パラメータＶおよびΔＧ、および最適クロマトグラフィ運転のための設定パラメータを、将来に使用するために記憶する。構造が既知でない場合には、経験モデルを使用する。最初に第１の運転を定組成条件で実施する。次いで、第２の運転を有機修飾剤の異なる濃度で実施し、この第２の濃度は、第１の運転の結果に応じて、明確に高く、または明確に低く選択する。第２の運転をも実施して、データを記録した後に、最初に線形モデルを使用する場合、すなわち上記の多項式、ｌｎｋ’＝ａ＋ｂｘ＋ｃｘ２．．．において、係数ａおよびｂだけをゼロでないと仮定する。
【００３１】
これから最適化された条件が、新規に計算され、さらなる試験運転を実施する。次いで利用可能になる合計３つの計測値に基づいて、２次式モデルを使用すること、すなわちパラメータｃもゼロではないと仮定することが可能となる。その前回確認された最適定組成濃度から開始して、最適勾配形状を確認することによって、さらなる最適化を行う。このシステムは、乱数原理（random principle）に従って多数の対応する勾配分布を生成することができ、それぞれの場合に、前回に確認され、最適化されたモデルパラメータを用いて、個々の成分の関連するクロマトグラムまたはバンドの位置を計算し、ここで、適切な最適化基準（例えば、すべての隣接するピーク間の間隔の積を、最長滞留時間の２乗で除したもの）を選択し、次いで、いわゆる「モンテカルロ法」を使用して、乱数原理による最適分布が確認される。例えば、濃度は一定であるかまたは増加しているかの、いずれかのみであるという条件などの、追加の境界条件によって、最適の勾配分布の発見が容易になる。
【００３２】
その結果、少なくとも以下のデータの少なくとも一部が、最適化の過程で得られる。
１）最適定組成条件
２）線形勾配を有する最適条件
３）異なる滞留モデルに基づくステップ状に変化する勾配を有する、異なる勾配分布
最適な条件は、しばしば定組成条件であることが多く、初期の低濃度から、非常に急な勾配で、かつほとんど急峻に、高い濃度に移行することがわかる。
【００３３】
最適化に必要な時間は、もちろんのこと、分析しようとする成分または化合物の数に依存する。通常、従来式のカラム上では、５つの成分を有する混合物に対する条件を最適化するのに、１０〜１２時間を必要とする。分子パラメータＶおよびΔＧが既知の場合には、最適化はさらに迅速に行える。本発明による方法およびそれに対応するデバイスは、とりわけ、オペレータによる外部の計測を必要とすることなく、いくつかのパラメータが入力されて、システムが開始されるとすぐに、自動的に進行するという利点がある。
【００３４】
以下に示す実施例は、標準液を２つだけ用いた、７種のスルホンアミドに対するクロマトグラフィの自動最適化を示している。２種類の標準液は、スルファチアゾールおよびスルファメラシル（sulfameracil）である。Purospher STAR RP18eを溶媒として、０．００５Ｍリン酸塩緩衝液ｐＨ＝３．５を溶離液として使用した。
検出波長２７０ｎｍ
温度  ３０℃
流速  １．０ｍｌ／ｍｉｎ
注入量  １０μｌ
むだ時間  ０．４分
新溶媒上での洗浄時間  ６．０分
開始濃度  ８０％
遅れ時間  １．２５分
【００３５】
これらの試験条件下でスルファチアゾールおよびスルファメラチルに対して、９回の連続する試験運転を実施し、溶離液の濃度を、８０％から開始して、６０、４０、２５、１９、１３、８から６％へと運転毎に低減し、さらに１２％での運転を実施した。毎回、ピークの通過までの時間を計測するとともに、それぞれの場合に、ピーク解像度係数および計測による係数Ｋ’ｍａｘ、すなわち最大標準化持続時間（Ｔ−ＴＯ）／ＴＯを、Ｔ＝滞留時間、ＴＯ＝むだ時間として計測した。両ピークは、それぞれの場合に下は濃度８％まで観察され、解像度係数ＲＳは、０．０８から０．１９、０．８２、０．９６、１．６２、２．４６、３．８２へと連続的に改善された。濃度をさらに６％まで低減すると、スルファチアゾールのピークが見えなくなった。前回の８％に比較して濃度を増加させると、解像度係数がわずかに低下するとともに、最大標準化滞留時間ｋ’ｍａｘが低下した。
【００３６】
したがって、濃度８％において最良の定組成条件が計測された。その後、混合物全体を用いて運転を実施した。消去基準は、単位面積あたりピーク面３０，０００であった（例えばμＶｓ）。１８回の運転で、濃度をステップ状に８０％から、７１％、６３％、５５％、４９％、４５％、３５％、２８％、２５％、２２％、１９％、１６％、１３％、１０％、７％、５％に低減し、再び８％および１２％に上げた。滞留時間、ピーク幅、ピーク面およびピークの理論的プレート数を確認した。同様に、ペア解像度および標準化滞留時間も、クロマトグラムから確認した。定組成濃度１９％が最良の値を与えることがわかった。
【００３７】
その次に始めて、例えば表面、滞留時間およびピークのスペクトルデータを考慮して、例えば線形滞留モデルを構築した。
各運転の間に、８０％濃度で約２５０秒間の溶離をつねに実施した。
前述の試験から得られた２つのクロマトグラムを、すでに言及した図１および２に示してある。図２は、定組成条件に対する最適値である。次いで、システムは、溶離液の勾配を設定することによって試験運転を修正する。このために、線形滞留モデルが構築され、これは計測された滞留時間、ピーク面およびスペクトルデータを考慮する。これに基づいて、多段勾配が探索されて、さらなる運転で使用される。この例を図３、４、および５に示してある。
【００３８】
前回の試験で得られた７つのピークのすべてが、すべての場合において、受容できる時間内に現れ、互いに容易に分離可能であり、かつ解像可能であるように、クロマトグラフィ条件を選択することが重要である。したがって、ピーク数に加えて重要な基準は、ペア解像度のパラメータである。図３に示す勾配パターンに対して、明確に認識できる７つのピークに加えて、基準ピークペアに対してペア解像度のパラメータ３．５１１、および最大滞留時間約１７．５分が得られた。図４による勾配パターンの場合には、最大滞留時間はちょうど１９分であり、また改善されたペア解像度４．３４１も得られた。さらに改善されたペア解像度の値４．５０６が、図５に最終的に示した勾配パターンに対して得られた。確認された最大滞留時間１９．２分は、すべての場合に、許容できる範囲であり、その結果、さらなる試験運転が、それよりも良いペア解像度を示さず、せいぜい最大滞留時間のわずかな低下を示すだけであったので、本実施例における図５（勾配パターン）に示すクロマトグラフィ条件を最適として選択した。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】定組成条件下で、有機修飾剤の第１の濃度で求めた７種のスルホンアミドのクロマトグラフを示す図である。
【図２】図１と同じ系に対して、より低い濃度の第２の有機修飾剤を用いた結果を示す図である。
【図３】溶離液の勾配を設定することによって試験運転を修正した結果を示す図である。
【図４】溶離液の勾配を設定することによって試験運転を修正した結果を示す図である。
【図５】溶離液の勾配を設定することによって試験運転を修正した結果を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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