(57)【要約】電位依存性ナトリウムチャンネルの哺乳動物の変異型β−１サブユニットをコードする単離された核酸分子であって、変異事象が生じており、前記変異事象は、組み立てられたナトリウムチャンネルの機能発現を、てんかんの表現型が生じるように妨げているが、ただし、前記変異事象は、コードされるポリペプチドにおけるＣ１２１Ｗ置換をもたらす変異事象ではない単離された核酸分子。【特許請求の範囲】
【請求項１】
電位依存性ナトリウムチャンネルの哺乳動物の変異型β−１サブユニットをコードする単離された核酸分子であって、変異事象が生じており、前記変異事象は、組み立てられたナトリウムチャンネルの機能発現を、てんかんの表現型が生じるように妨げているが、ただし、前記変異事象は、コードされるポリペプチドにおけるＣ１２１Ｗ置換をもたらす変異事象ではない単離された核酸分子。
【請求項２】
前記変異事象は、コードされるポリペプチドのアミノ末端ドメインの細胞外ループにおいてシステイン残基の導入をもたらす請求項１に記載の単離された核酸分子。
【請求項３】
前記変異事象は、第３エキソンに生じる請求項２に記載の単離された核酸分子。
【請求項４】
前記変異事象は、コード配列の２５３位において生じる請求項３に記載の単離された核酸分子。
【請求項５】
前記変異事象は、ＣからＴへのヌクレオチド置換である請求項４に記載の単離された核酸分子。
【請求項６】
配列番号１に示されるヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子。
【請求項７】
配列番号１に示されるヌクレオチド配列からなる単離された核酸分子。
【請求項８】
電位依存性ナトリウムチャンネルの哺乳動物の変異型β−１サブユニットである単離された哺乳動物ポリペプチドであって、変異事象が生じており、前記変異事象は、組み立てられたナトリウムチャンネルの機能発現を、てんかんの表現型が生じるように妨げているが、ただし、前記変異事象はＣ１２１Ｗ置換ではない単離されたポリペプチド。
【請求項９】
前記変異事象は、ポリペプチドのアミノ末端ドメインの細胞外ループにシステイン残基を導入する請求項８に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項１０】
前記変異事象は、８５位において生じる請求項８に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項１１】
前記変異事象は、Ｒ８５Ｃ置換である請求項１０に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項１２】
配列番号２に示されるアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチド
【請求項１３】
配列番号２に示されるアミノ酸配列からなる単離されたポリペプチド。
【請求項１４】
哺乳動物の組み立てられた電位依存性ナトリウムチャンネルである単離されたポリペプチド複合体であって、変異事象がβ−１サブユニットに生じており、前記変異事象は、組み立てられたナトリウムチャンネルの機能発現を、てんかんの表現型が生じるように妨げているが、ただし、前記変異事象は、Ｃ１２１Ｗ置換ではない単離されたポリペプチド複合体。
【請求項１５】
前記変異事象は、β−１サブユニットのアミノ末端ドメインの細胞外ループにシステイン残基を導入する請求項１４に記載の単離されたポリペプチド複合体。
【請求項１６】
前記変異事象は、β−１サブユニットの８５位において生じる請求項１５に記載の単離されたポリペプチド複合体。
【請求項１７】
前記変異事象は、Ｒ８５Ｃ置換である請求項１６に記載の単離されたポリペプチド複合体。
【請求項１８】
請求項１〜７のいずれか一項に記載の単離された核酸分子で形質転換された細胞。
【請求項１９】
請求項８〜１１のいずれか一項に規定される変異型β−１サブユニットを組み込んでいる哺乳動物のナトリウムチャンネルを含む細胞。
【請求項２０】
下記の工程を含むポリペプチドを調製する方法：
（１）請求項１８または１９に記載の細胞を、ポリペプチドを産生させるために効果的な条件のもとで培養する工程；および
（２）ポリペプチドを集める工程。
【請求項２１】
請求項２０に記載の方法により調製されるポリペプチド。
【請求項２２】
請求項８〜１３のいずれか一項に記載の単離されたポリペプチド、請求項２１に記載のポリペプチド、または請求項１４〜１７のいずれか一項に記載の単離されたポリペプチド複合体との免疫学的反応性を有する抗体。
【請求項２３】
モノクローナル抗体、ヒト化された抗体、キメラ抗体またはＦａｂフラグメント、（Ｆａｂ’）２フラグメント、Ｆｖフラグメントを含む抗体フラグメント、単鎖抗体およびシングルドメイン抗体からなる群から選択される請求項２２に記載の抗体。
【請求項２４】
てんかん、ならびにナトリウムチャンネルの機能不全と関連する他の障害を処置する方法であって、ナトリウムチャンネルが、請求項８〜１１または１４〜１７のいずれか一項に規定される変異事象を受けたとき、ナトリウムチャンネルの選択的なアゴニスト、アンタゴニストまたは調節剤をそのような処置を必要とする被験体に投与することを含む方法。
【請求項２５】
ナトリウムチャンネルの選択的なアゴニスト、アンタゴニストまたは調節剤の使用であって、ナトリウムチャンネルが、請求項８〜１１または１４〜１７のいずれか一項に規定される変異事象を受けたとき、てんかん、ならびにナトリウムチャンネルの機能不全と関連する他の障害を処置するための医薬品を製造することにおけるそのような使用。
【請求項２６】
てんかん、ならびにナトリウムチャンネルの機能不全と関連する他の障害を処置する方法であって、請求項２２または２３に記載の抗体を、そのような処置を必要とする被験体に投与することを含む方法。
【請求項２７】
てんかん、ならびにナトリウムチャンネルの機能不全と関連する他の障害を処置する方法であって、請求項１〜７のいずれか一項に規定される核酸分子の相補体（アンチセンス）であり、変異型ナトリウムチャンネルβ−１サブユニットをコードするｍＲＮＡとハイブリダイゼーションするＲＮＡ分子をコードする単離されたＤＮＡ分子を、そのような処置を必要とする被験体に投与することを含む方法。
【請求項２８】
請求項１〜７のいずれか一項に規定される核酸分子の相補体であり、変異型ナトリウムチャンネルβ−１サブユニットをコードするｍＲＮＡとハイブリダイゼーションするＲＮＡ分子をコードするＤＮＡ分子の使用であって、てんかん、ならびにナトリウムチャンネルの機能不全と関連する他の障害を処置するための医薬品を製造することにおけるそのような使用。
【請求項２９】
てんかん、ならびにナトリウムチャンネルの機能不全と関連する他の障害を処置する方法であって、請求項２２または２３に記載の抗体、または請求項１〜７のいずれか一項に規定される核酸分子の相補体であり、変異型ナトリウムチャンネルβ−１サブユニットをコードするｍＲＮＡとハイブリダイゼーションするＲＮＡ分子をコードするＤＮＡ分子を、そのような処置を必要とする被験体に、野生型ＳＣＮ１Ｂの投与との組合せで投与することを含む方法。
【請求項３０】
請求項２２または２３に記載の抗体、または請求項１〜７のいずれか一項に規定される核酸分子の相補体であり、変異型ナトリウムチャンネルβ−１サブユニットをコードするｍＲＮＡとハイブリダイゼーションするＲＮＡ分子をコードするＤＮＡ分子の使用であって、てんかん、ならびにナトリウムチャンネルの機能不全と関連する他の障害を処置するための医薬品を製造することにおいて、野生型ＳＣＮ１Ｂの使用と組み合わせたそのような使用。
【請求項３１】
候補の薬学的薬剤をスクリーニングするための、請求項８〜１３のいずれか一項に記載のポリペプチドまたは請求項１４〜１７のいずれか一項に記載のポリペプチド複合体の使用。
【請求項３２】
高処理能スクリーニング技術が用いられる請求項３１に記載の使用。
【請求項３３】
てんかん、ならびにナトリウムチャンネルの機能不全と関連する他の障害の処置に有用であるナトリウムチャンネルの活性の調節剤をスクリーニングする方法であって、下記の工程：
ａ）請求項１８または１９に記載の細胞を提供する工程；
ｂ）前記細胞を試験化合物に接触させる工程；
ｃ）前記試験化合物が、コードされるタンパク質に結合するかどうか、または前記試験化合物が、コードされるタンパク質を組み込んでいるナトリウムチャンネルの生物学的活性を調節するかどうかを検出する工程；
を含む方法であって、
タンパク質に結合する、またはコードされるタンパク質を組み込んでいるナトリウムチャンネルの生物学的活性を調節する試験化合物が、障害を処置するために有用な化合物である方法。
【請求項３４】
てんかん、ならびにナトリウムチャンネルの機能不全と関連する他の障害の処置に有用であるナトリウムチャンネルの活性の調節剤をスクリーニングする方法であって、下記の工程：
ａ）請求項８〜１３のいずれか一項に記載のポリペプチドまたは請求項１４〜１７のいずれか一項に記載のポリペプチド複合体を提供する工程；
ｂ）前記ポリペプチドまたはポリペプチド複合体を試験化合物に接触させる工程；
ｃ）前記試験化合物が、ポリペプチドまたはポリペプチド複合体に結合するかどうかを検出する工程；
を含む方法であって、
ポリペプチドまたはポリペプチド複合体に結合する試験化合物が、障害を処置するために有用な化合物である方法。
【請求項３５】
請求項３３または３４に記載の方法によって同定される化合物。
【請求項３６】
請求項３５に記載の化合物および薬学的に受容可能なキャリアを含有する薬学的組成物。
【請求項３７】
請求項１〜７のいずれか一項に規定される単離された核酸分子で形質転換された遺伝子改変の非ヒト動物。
【請求項３８】
動物は、ラット、マウス、ハムスター、モルモット、ウサギ、イヌ、ネコ、ヤギ、ヒツジ、ブタ、ならびにサルおよびチンパンジーなどのヒト以外の霊長類からなる群から選択される請求項３７に記載の遺伝子改変の非ヒト動物。
【請求項３９】
候補の薬学的化合物のスクリーニングにおける請求項３７または３８に記載の遺伝子改変の非ヒト動物の使用。
【請求項４０】
請求項１〜７のいずれか一項に記載の核酸分子を含有する発現ベクター。
【請求項４１】
てんかん、特に、熱性発作プラスである全身性てんかん、ならびにナトリウムチャンネルの機能不全と関連する他の障害の診断における請求項１〜７のいずれか一項に記載の核酸分子の使用。
【請求項４２】
てんかん、特に、熱性発作プラスである全身性てんかん、ならびにナトリウムチャンネルの機能不全と関連する他の障害の診断における請求項８〜１７のいずれか一項に規定されるポリペプチドの使用。
【請求項４３】
てんかん、特に、熱性発作プラスである全身性てんかん、ならびにナトリウムチャンネルの機能不全と関連する他の障害の診断における請求項２２または２３に規定される抗体の使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
技術分野
本発明は、てんかんに関与するＳＣＮ１Ｂ遺伝子における新しい変異に関し、より詳細には、熱性発作プラスである全身性てんかん（ＧＥＦＳ＋）と関連する新しいＳＣＮ１Ｂ遺伝子変異に関する。
【０００２】
背景技術
てんかんは、集団の約３％がその生涯のあるときに冒される脳障害の多様な集まりである（Ａｎｎｅｇｅｒｓ、１９９６）。てんかん性発作は、中枢神経系のニューロン集団の損なわれた神経刺激伝達によって引き起こされる一次的な行動変化として定義することができる。これにより、様々な程度の不随意筋の収縮が生じ、多くの場合には意識がなくなる。てんかん症候群は、特徴的な症状、発作のタイプ、原因、発症年齢およびＥＥＧパターンに基づいて４０を越える異なるタイプに分類されている（国際抗てんかん連盟の分類および用語に関する委員会、１９８９年）。しかし、すべての症候群に共通する唯一の特徴は、発作として偶発的および予測不能的にその両方で現れるニューロン興奮性の持続した増大である。
【０００３】
てんかんの病因に対する遺伝的寄与が約４０％の罹患者には存在すると見積もられている（Ｇａｒｄｉｎｅｒ、２０００）。てんかん性発作は、ニューロンの同期性を最終的には乱す多数の分子的異常の終点であると考えられるので、てんかんに対する遺伝的基礎は一様でない可能性が高い。２００を越えるメンデル疾患が存在しており、これには、てんかんが表現型の一部として含まれる。これらの疾患において、発作は、脳の構造または脳機能における乱れなどの根本的な神経学的関与を示している。これに対して、てんかんが罹患者における唯一の症状発現である「純粋な」てんかん症候群もまた数多く存在する。これらは特発性と呼ばれ、てんかん症例全体の６０％以上を占める。
【０００４】
特発性てんかんは部分性および全身性のサブタイプにさらに分けられる。部分性（焦点性または局所性）のてんかん発作は限局化した皮質放電から生じており、その結果、特定の筋肉群のみが関与し、意識が保持されている場合がある（Ｓｕｔｔｏｎ、１９９０）。しかし、全身性てんかんでは、ＥＥＧ放電は、脳の皮質下領域全体が関与するように焦点を全く示さない。全身性てんかんが頻繁に遺伝するという観察は理解できるが、脳において構成的に発現しているとおそらくは考えられる遺伝子欠陥が部分性の発作を生じさせる機構はあまり明瞭ではない。
【０００５】
特発性の全身性てんかん（ＩＧＥ）は、遺伝型ヒトてんかんの最も一般的な群である。現在、ＩＧＥの２つの幅広い群が知られている：すなわち、古典的な特発性全身性てんかん（国際抗てんかん連盟の分類および用語に関する委員会、１９８９年）および熱性発作プラスである全身性てんかん（ＧＥＦＳ＋）の新しく認識された遺伝的症候群（ＳｃｈｅｆｆｅｒおよびＢｅｒｋｏｖｉｃ、１９９７；Ｓｉｎｇｈ他、１９９９）。古典的ＩＧＥは、臨床的に認識可能であるが、重複する数多くの亜症候群に分けられ、これには、小児期欠神てんかん（ＣＡＥ）、若年性欠神てんかん、若年ミオクロニー性てんかんなどが含まれる（国際抗てんかん連盟の分類および用語に関する委員会、１９８９年；Ｒｏｇｅｒ他、１９９２）。これらの亜症候群は、発症年齢および発作タイプのパターン（欠神、ミオクローヌスおよび強直間代性）によって特定される。一部の患者、特に、強直間代性発作だけを有する患者は、特異的に認識される亜症候群に合わない。神経生物学的に連続する一部であるとは未だに認識されていないが、これらを個々の症候群と見なすことに関する議論が以前に示されている（Ｂｅｒｋｏｖｉｃ他、１９８７；１９９４；ＲｅｕｔｅｎｓおよびＢｅｒｋｏｖｉｃ、１９９５）。
【０００６】
熱性発作プラスである全身性てんかん（ＧＥＦＳ＋；ＭＩＮ６０４２３６）は、１９９７年に初めて報告された（Ｓｃｈｅｆｆｅｒ＆Ｂｅｒｋｏｖｉｃ、１９９７）が、現在では一般的なてんかん症候群として認識されている（Ｓｉｎｇｈ他、１９９９；Ｂａｕｌａｃ他、１９９９；Ｐｅｉｆｆｅｒ他、１９９９；Ｓｃｈｅｆｆｅｒ他、２０００）。ＧＥＦＳ＋は家族性であるが、それぞれの家系内において臨床的に一様でないために、ＧＥＦＳ＋を別の症候群として認識することは、最初、困難であった。共通する表現型は典型的な熱性発作および熱性発作プラス（ＦＳ＋）であり、この場合、ＦＳ＋は、発熱を伴う発作が６年以上継続し、かつ／または非熱性の強直間代性発作を含む点で、典型的な熱性発作とは異なる。あまり一般的でない表現型には、欠神またはミオクロニー性発作または脱力発作を伴うＦＳ＋、そして、ミオクロニー性失立発作てんかんなどのさらにより重篤な症候群が含まれる。そのような表現型多様性が単一遺伝子における変異の分離と関連し得ることが、電位依存性ナトリウムチャンネルβ−１サブユニット遺伝子（ＳＣＮ１Ｂ）における変異の同定とともに明らかにされた（Ｗａｌｌａｃｅ他、１９９８）。この変異（Ｃ１２１Ｗ）は、保存されているシステイン残基を変化させ、推定されるジスルフィド架橋を破壊して、ＳＣＮ１Ｂサブユニットの機能をインビトロで喪失させる。機能的なＳＣＮ１Ｂサブユニットが存在しない場合、ナトリウムチャンネルαサブユニットの不活性化速度が低下し、これは、増大したナトリウム流入を生じさせることがあるが、より脱分極化した膜電位および過興奮性をもたらす。
【０００７】
さらなる研究において、ＧＥＦＳ＋の４つの家系が染色体２ｑにマッピングされた（Ｂａｕｌａｃ他、１９９９；Ｍｏｕｌａｒｄ他、１９９９；Ｐｅｉｆｆｅｒ他、１９９９；Ｌｏｐｅｓ−Ｃｅｎｄｅｓ他、２０００）。近年には、染色体２ｑにマッピングされるニューロンの電位依存性ナトリウムチャンネルα−１（ＳＣＮ１Ａ）サブユニットにおける様々な変異がＧＥＦＳ＋の家系において報告された（Ｗａｌｌａｃｅ他、２００１）。その変異（Ｄ１８８Ｖ、Ｖ１３５３ＬおよびＩ１６５６Ｍ）はすべてが、サブユニットの膜貫通セグメントの近くまたはその内部に位置する非常に保存された残基の中に存在する。ＳＣＮ１Ａにおける変異がさらなる家系においてもまた同定されている（Ｅｓｃａｙｇ他、２０００）。これらの変異（Ｔ８７５ＭおよびＲ１６４８Ｈ）は、チャンネルのゲート開閉の際に役割を有することが知られている、チャンネルの非常に保存されたＳ４膜貫通セグメントに存在する。ＳＣＮ４Ａ（Ｒ１４６０Ｈ）の同じ保存された領域におけるＲ１６４８Ｈ変異の機能的研究により、変異型チャンネルの不活性化の経時変化がわずかに遅くなっていること、そして野生型のチャンネルと比較したとき、不活性化からの回復が促進されていることが示されている（Ａｌｅｋｏｖ他、２０００）。従って、活性化および早い不活性化におけるその様々な微細な変化の組合せは、てんかんを生じさせるためには十分である。ＧＥＦＳ＋は、明らかに、強い遺伝的基礎、不完全な浸透度、ならびに遺伝的不均一性および表現型の不均一性を有する一般的な複合障害である。熱性発作が集団の３％で発生しており、そのため、この表現型は、ＧＥＦＳ＋遺伝子の結果として発生することに加えて、ＧＥＦＳ＋の家系では散発的に発生し得る（Ｗａｌｌａｃｅ、１９９８）。また、いくつかの家系では、影響が大きい常染色体優性遺伝子が分離するが、多くの場合には、双直系性などの臨床的な遺伝的証拠により、いくつかの小さい家系については、この障害が多因性であることが示唆される（Ｓｉｎｇｈ他、１９９９）。
【０００８】
ＳＣＮ１ＡおよびＳＣＮ１Ｂの変異がＧＥＦＳ＋では珍しいにもかかわらず、ＳＣＮ１Ｂ遺伝子における新規な変異が罹患家系において同定されている。従って、てんかんにおいてＳＣＮ１遺伝子が関与する頻度は、最初の予想よりも大きいと考えられる。
【０００９】
発明の開示
本発明者らは、てんかん、具体的には、熱性発作プラスである全身性てんかん（ＧＥＦＳ＋）と関連する、電位依存性ナトリウムチャンネルのβ−１サブユニット（ＳＣＮ１Ｂ）における新規な変異を同定した。
【００１０】
１つの実施形態において、本発明は、電位依存性ナトリウムチャンネルの変異型β−１サブユニットをコードする単離された哺乳動物核酸分子を提供する。この場合、変異事象が生じており、その変異事象は、組み立てられたナトリウムチャンネルの機能発現を、てんかんの表現型が生じるように妨げているが、ただし、前記変異事象は、コードされるポリペプチドにおけるＣ１２１Ｗ置換をもたらす変異事象ではない。具体的には、変異は、ＳＣＮ１Ｂのアミノ末端ドメインの細胞外ループにおいてアミノ酸位８５に存在する。
【００１１】
本発明の１つの形態において、変異はＳＣＮ１Ｂの第３エキソンに存在し、アミノ酸位８５においてシステイン残基によるアルギニン残基の置換をもたらす。このＲ８５Ｃ変異は、配列番号１に示されるようなＳＣＮ１Ｂコード配列の２５３位における、ＣからＴへのヌクレオチド置換の結果として生じる。好ましくは、変異は、熱性発作プラスである全身性てんかんの表現型をもたらす。
【００１２】
本発明のヌクレオチド配列は、様々な目的のためにこの分野で受け入れられている方法を使用して操作することができる。これらには、遺伝子産物のクローニング、プロセシングおよび／または発現の改変が含まれるが、これらに限定されない。遺伝子フラグメントのＰＣＲによる再組み立て、および合成オリゴヌクレオチドの使用により、本発明のヌクレオチド配列を操作することが可能になる。例えば、オリゴヌクレオチド媒介の部位特異的変異誘発により、新しい制限部位をもたらし、発現パターンを変化させ、そしてスプライス変化体を生じさせることなどのさらなる変異を導入することができる。
【００１３】
遺伝暗号の縮重の結果として、既知の天然に存在する遺伝子のいずれかのポリヌクレオチド配列に対する最小の類似性をいくつかが有し得る数多くのポリヌクレオチド配列を作製することができる。従って、本発明には、可能なコドン選択に基づいて様々な組合せを選択することによって作製することができるポリヌクレオチド配列の可能な変化がどれもすべて含まれる。これらの組合せは、本発明のポリヌクレオチド配列に適用されるような標準的なトリプレット遺伝暗号に従って作製され、従って、そのような変化はすべて明確に開示されていると見なすことができる。
【００１４】
本発明のＤＮＡ分子は、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、合成形態、および混合ポリマーを、センス鎖およびアンチセンス鎖の両方とも包含し、そして化学的もしくは生化学的に改変することができ、または当業者によって理解されるような非天然型ヌクレオチド塩基もしくは誘導体化されたヌクレオチド塩基を含むことができる。そのような改変には、標識、メチル化、インターカレーター、アルキル化体、および改変された連結が含まれる。場合により、本発明のポリヌクレオチド配列のコドン使用とは実質的に異なるコドン使用を有するヌクレオチド配列を作製することは好都合であり得る。例えば、コドンは、特定のコドンが宿主によって利用される頻度と一致させて、特定の原核生物宿主または真核生物宿主におけるペプチドの発現速度を増大させるために選択することができる。コードされるアミノ酸配列を変化させることなくヌクレオチド配列を変化させるための他の理由には、天然に存在する変異型配列から産生される転写物よりも望ましい性質（例えば、より大きい半減期など）を有するＲＮＡ転写物を産生させることが含まれる。
【００１５】
本発明にはまた、完全に合成化学によって本発明のＤＮＡ配列を製造することが含まれる。合成された配列は、好適な宿主における挿入されたコード配列の転写制御および翻訳制御に必要なエレメントを含有する発現ベクターおよび細胞系に導入することができる。これらのエレメントには、調節配列、プロモーター、５’側および３’側の非翻訳領域、ならびに本発明のポリヌクレオチドをコードする配列のより効率的な翻訳を可能にする特異的な開始シグナル（ＡＴＧ開始コドンおよびＫｏｚａｋコンセンサス配列など）を挙げることができる。開始コドンおよび上流の調節配列を含む完全なコード配列が適切な発現ベクターに挿入される場合、さらなる制御シグナルが必要でない場合がある。しかし、コード配列のみ、またはそのフラグメントが挿入される場合には、上記に記載されるような外因性の翻訳制御シグナルをベクターによって提供しなければならない。そのようなシグナルは様々な起源のものであってもよく、天然起源および合成起源の両方が可能である。発現効率は、使用される特定の宿主細胞系に対して適切なエンハンサーを含めることによって高めることができる（Ｓｃｈａｒｆ他、１９９４）。
【００１６】
本発明にはまた、本明細書中に記載される配列の相補体である核酸分子が含まれる。
【００１７】
本発明は、本発明のポリヌクレオチドまたはその変化体に由来する精製されたポリペプチドまたはタンパク質の製造を可能にする。これを行うために、宿主細胞を、上記に記載されるようなＤＮＡ分子で形質転換することができる。典型的には、前記宿主細胞は、本発明によるＤＮＡ分子を含む発現ベクターでトランスフェクションされる。様々な発現ベクター／宿主システムを、本発明のポリペプチドをコードする配列を含有し、発現させるために利用することができる。これらには、プラスミドまたはコスミドのＤＮＡ発現ベクターで形質転換された細菌などの微生物；酵母発現ベクターで形質転換された酵母；ウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）を感染させた昆虫細胞システム；あるいはマウスまたは他の動物またはヒトの組織細胞系が含まれるが、これらに限定されない。哺乳動物細胞を、プラスミドシステム、コスミドシステム、およびワクシニアウイルス発現システムなどのウイルスシステムを含む様々な発現ベクターを使用してタンパク質を発現させるために使用することができる。本発明は、用いられる宿主細胞によって限定されない。
【００１８】
本発明のポリヌクレオチド配列またはその変化体は、哺乳動物システムにおける組換えタンパク質の長期間の製造を可能にするための細胞株において安定的に発現させることができる。本発明のポリペプチドをコードする配列は、ウイルスの複製起点および／または内因性の発現エレメント、そして同じベクターまたは別のベクターにおける選択マーカー遺伝子を含有し得る発現ベクターを使用して細胞株に形質転換することができる。選択マーカーにより、選択剤に対する耐性が付与され、その存在により、導入された配列の発現に成功した細胞の増殖および回収が可能になる。安定的に形質転換された細胞の耐性クローンは、細胞タイプに対して適切な組織培養技術を使用して増殖させることができる。
【００１９】
形質転換された細胞によって産生されるタンパク質は、使用された配列および／またはベクターに依存して分泌され得るか、または細胞内に保持され得る。当業者によって理解されるように、タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有する発現ベクターは、原核生物または真核生物の細胞膜を介したタンパク質の分泌を行わせるシグナル配列を含有するように設計することができる。
【００２０】
さらに、宿主細胞系統を、挿入された配列の発現を調節するその能力について、または所望する様式で発現タンパク質をプロセシングするその能力について選ぶことができる。ポリペプチドのそのような修飾には、アセチル化、グリコシル化、リン酸化およびアシル化が含まれるが、これらに限定されない。タンパク質の「プレプロ」形態の翻訳後切断もまた、タンパク質の標的化、折り畳み、および／または活性を特徴づけるために使用することができる。翻訳後活性に対する特定の細胞装置および特徴的な機構を有する種々の宿主細胞（例えば、ＣＨＯ細胞またはＨｅＬａ細胞）を、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から得ることができ、そして外来タンパク質の正しい修飾およびプロセシングを確実にするために選ぶことができる。
【００２１】
多量の遺伝子が、抗体製造などのために必要なときには、このタンパク質の高レベルの発現を行わせるベクターを使用することができ、例えば、Ｔ５またはＴ７の誘導可能なバクテリオファージプロモーターを含有するベクターを使用することができる。本発明にはまた、タンパク質の重要な機能的ドメインを含有する融合タンパク質を作製および単離することにおける上記に記載される発現システムの使用が含まれる。これらの融合タンパク質は、結合研究、構造研究および機能研究のために、ならびに適切な抗体の作製のために使用される。
【００２２】
タンパク質を融合タンパク質として発現および精製するために、本発明の適切なポリヌクレオチド配列が、別のペプチド（例えば、グルタチオニン−ｓ−トランスフェラーゼ）をコードするヌクレオチド配列を含有するベクターに挿入される。融合タンパク質は原核生物細胞または真核生物細胞から発現および回収される。その後、融合タンパク質は、融合ベクター配列に基づくアフィニティークロマトグラフィーによって精製することができる。所望するタンパク質は、その後、融合タンパク質を酵素切断することにより得られる。
【００２３】
本発明のポリペプチドのフラグメントはまた、固相技術を使用する直接的なペプチド合成によって製造することができる。自動化された合成を、ＡＢＩ４３１Ａペプチド合成機（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）を使用することによって達成することができる。本ペプチドの様々なフラグメントを別々に合成し、その後、組み合わせて、全長の分子を得ることができる。
【００２４】
さらに別の局面により、本発明は、電位依存性ナトリウムチャンネルの変異型β−１サブユニットである単離された哺乳動物ポリペプチドを提供する。この場合、変異事象が生じており、その変異事象は、組み立てられたナトリウムチャンネルの機能発現を、てんかんの表現型が生じるように妨げているが、ただし、前記変異事象はＣ１２１Ｗ置換ではない。具体的には、変異は、ＳＣＮ１Ｂのアミノ末端ドメインの細胞外ループにおいてアミノ酸位８５に存在する。
【００２５】
本発明の１つの形態において、変異事象は、配列番号２に示されるようなＳＣＮ１Ｂタンパク質のアミノ酸位８５において、アルギニン残基がシステイン残基で置換される置換である。
【００２６】
本発明のさらに別の局面により、哺乳動物の組み立てられた電位依存性ナトリウムチャンネルである単離されたポリペプチド複合体が提供される。この場合、変異事象がそのβ−１サブユニットに生じており、その変異事象は、組み立てられたナトリウムチャンネルの機能発現を妨げている。好ましくは、変異が、このチャンネルのＳＣＮ１Ｂサブユニットのアミノ酸位８５に存在する。
【００２７】
さらなる局面において、変異はＳＣＮ１ＢにおけるＲ８５Ｃ変異である。
【００２８】
本発明の別の局面により、哺乳動物の電位依存性ナトリウムチャンネルの変異型ＳＣＮ１Ｂサブユニットであるポリペプチドを調製する方法が提供される。この方法は下記の工程を含む：
（１）上記に記載されるような核酸分子を含む発現ベクターでトランスフェクションされた宿主細胞を、ポリペプチドを産生させるために効果的な条件のもとで培養する工程；および
（２）変異型ＳＣＮ１Ｂサブユニットを集める工程。
【００２９】
変異型ＳＣＮ１Ｂサブユニットはまた、細胞によって同時発現され得るナトリウムチャンネルの別のサブユニットと会合させてもよく、それにより、会合した変異型ＳＣＮ１Ｂサブユニットが集められる。
【００３０】
本発明のさらに別の局面により、上記に記載されるプロセスの生成物であるポリペプチドが提供される。
【００３１】
実質的に精製されたタンパク質またはそのフラグメントは、その後、例えば、タンパク質の結晶のＸ線結晶学によって、または核磁気共鳴（ＮＭＲ）によって二次構造および三次構造を明らかにするために、さらなる生化学的分析において使用することができる。構造決定により、変異型ナトリウムチャンネルと相互作用させるか、あるいはナトリウムチャンネルの全体的な電荷配置または他のタンパク質との電荷相互作用を変化させるか、あるいは細胞内におけるその機能を変化させるための医薬品を合理的に設計することが可能になる。
【００３２】
てんかんに関与する新しい変異がＳＣＮ１Ｂにおいて同定されたことにより、本発明の変異型ナトリウムチャンネルβ−１サブユニットは、熱性発作プラスである全身性てんかん（これに限定されない）を含むてんかん、ならびにナトリウムチャンネルの機能不全と関連する他の障害を処置するための治療的方法を可能にすることが理解される。本発明の変異型ＳＣＮ１Ｂサブユニットはまた、上記に記載されるような障害に冒されている個体における変異した遺伝子または遺伝子産物の存在についてスクリーニングし、その存在を検出するための診断的適用において有用である。
【００３３】
治療的適用
本発明の１つの局面により、てんかん、ならびにナトリウムチャンネルの機能不全と関連する他の障害を処置する方法で、ナトリウムチャンネルが、上記に記載されるような変異、より具体的には、チャンネルを構成するＳＣＮ１Ｂサブユニットのアミノ酸位８５における変異を含有するとき、ナトリウムチャンネルの選択的なアンタゴニストまたはアゴニストまたは調節剤を投与することを含む方法が提供される。
【００３４】
本発明のさらに別の局面において、ナトリウムチャンネルの選択的なアンタゴニストまたはアゴニストまたは調節剤の使用で、ナトリウムチャンネルが、上記に記載されるような変異、より具体的には、チャンネルを構成するＳＣＮ１Ｂサブユニットのアミノ酸位８５における変異を含有し、前記変異が、てんかんを含む障害の原因であるとき、その障害を処置するための医薬品を製造することにおけるそのような使用が提供される。
【００３５】
本発明の１つの局面において、好適なアゴニストまたはアンタゴニストまたは調節剤は、本発明の一部を形成する様々なＳＣＮ１Ｂ変異を含有するナトリウムチャンネルに野生型の機能を回復させるか、または変異型チャンネルが細胞機能に対して有する影響を無効にする。
【００３６】
この分野で広く知られている様々な方法を使用することにより、変異型ナトリウムチャンネルは、疾患の原因である変異型チャンネルに対して特異的な抗体を製造するために、または薬学的薬剤のライブラリーをスクリーニングして、変異型ナトリウムチャンネルと結合する薬学的薬剤を同定するために使用することができる。
【００３７】
１つの局面において、本発明の変異型ナトリウムチャンネルまたは変異型ＳＣＮ１Ｂサブユニットに特異的に結合する抗体は、アンタゴニストまたは調節剤として直接的に使用することができ、あるいは変異型ナトリウムチャンネルを発現する細胞または組織に薬学的薬剤を導くための標的化機構または送達機構として間接的に使用することができる。
【００３８】
本発明のさらにさらなる局面において、上記に記載されるようなポリペプチドとの免疫学的反応性を有するが、野生型ナトリウムチャンネルまたはそのＳＣＮ１Ｂサブユニットとは反応しない抗体が提供される。
【００３９】
詳細には、疾患の原因である本発明のＳＣＮ１Ｂサブユニット変異を含有する組み立てられたナトリウムチャンネルに対する抗体が提供される。そのような抗体には、当業者によって理解されるように、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体および単鎖抗体を挙げることができるが、これらに限定されない。
【００４０】
抗体を製造する場合、ウサギ、ラット、ヤギ、マウスおよびヒトなどを含む様々な宿主を、免疫原的性質を有する記載されるようなポリペプチドまたはその任意のフラグメントもしくはオリゴペプチドを注射することによって免疫化することができる。様々なアジュバントを、免疫学的応答を増大させるために使用することができ、これには、フロイントのアジュバント、無機ゲル（水酸化アルミニウムなど）および界面活性物質（リソレシチンなど）が含まれるが、これらに限定されない。ヒトにおいて使用されるアジュバントには、ＢＣＧ（カルメット−ゲラン菌）およびコリネバクテリウム・パルブムが含まれる。
【００４１】
変異型ナトリウムチャンネルに対する抗体を誘導するために使用されるオリゴペプチドまたはペプチドまたはフラグメントは、少なくとも５個のアミノ酸（より好ましくは、少なくとも１０個のアミノ酸）からなるアミノ酸配列を有することが好ましい。これらのオリゴペプチドまたはペプチドまたはフラグメントは、天然タンパク質のアミノ酸配列の一部分と同一であり、かつ天然に存在する小分子のアミノ酸配列全体を含有することもまた好ましい。ナトリウムチャンネルアミノ酸の短い領域を、ＫＬＨなどの別のタンパク質の領域と融合させることができ、そのようなキメラ分子に対する抗体を製造することができる。
【００４２】
変異型ナトリウムチャンネルに対するモノクローナル抗体を、連続した細胞株による抗体分子の培養での製造をもたらす任意の技術を使用して調製することができる。このような技術には、ハイブリドーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術およびＥＢＶ−ハイブリドーマ技術が含まれるが、これらに限定されない（例えば、Ｋｏｈｌｅｒ他、１９７５；Ｋｏｚｂｏｒ他、１９８５；Ｃｏｔｅ他、１９８３；Ｃｏｌｅ他、１９８４を参照のこと）。
【００４３】
抗体はまた、文献に開示されるように、リンパ球集団におけるインビボでの製造を誘導することによって、または免疫グロブリンライブラリー、もしくは非常に特異的な結合試薬のパネルをスクリーニングすることによって製造することができる（例えば、Ｏｒｌａｎｄｉ他、１９８９；Ｗｉｎｔｅｒ他、１９９１を参照のこと）。
【００４４】
変異型ナトリウムチャンネルに対する特異的な結合部位を含有する抗体フラグメントもまた作製することができる。例えば、そのようなフラグメントには、抗体分子をペプシン消化することによって製造されるＦ（ａｂ’）２フラグメント、およびＦ（ａｂ’）２フラグメントのジスルフィド架橋を還元することによって作製されるＦａｂフラグメントが含まれる。あるいは、Ｆａｂ発現ライブラリーを、所望する特異性を有するモノクローナルＦａｂフラグメントの迅速かつ容易な同定を可能にするために構築することができる（例えば、Ｈｕｓｅ他、１９８９を参照のこと）。
【００４５】
様々な免疫アッセイを、所望する特異性を有する抗体を同定するためのスクリーニングのために使用することができる。特異性が明らかにされたポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体のいずれかを使用する競合的結合アッセイまたは免疫放射測定アッセイに対する多数のプロトコルがこの分野で広く知られている。そのような免疫アッセイは、典型的には、ナトリウムチャンネルとその特異的な抗体との間における複合体形成を測定することを伴う。妨害しない２つのナトリウムチャンネルエピトープに対して反応し得る抗体を利用する２部位モノクローナル型免疫アッセイが好ましいが、競合的結合アッセイもまた用いることができる。
【００４６】
本発明のさらなる局面において、てんかん、ならびにナトリウムチャンネルの機能不全と関連する他の障害を処置する方法で、上記に記載されるＤＮＡ分子のいずれか１つの相補体（アンチセンス）であり、本発明の変異型ナトリウムチャンネルβ−１サブユニットをコードするｍＲＮＡとハイブリダイゼーションするＲＮＡ分子をコードする単離されたＤＮＡ分子を、そのような処置を必要とする被験体に投与することを含む方法が提供される。
【００４７】
典型的には、本発明のポリヌクレオチドの相補体を発現するベクターを、そのような処置を必要とする被験体に投与することができる。アンチセンス法では、アンチセンスオリゴヌクレオチドの使用、アンチセンスＲＮＡの注射、リボザイム、ＤＮＡザイム、およびアンチセンスＲＮＡ発現ベクターのトランスフェクションを含む様々な方法を使用することができる。ベクターを細胞内または組織内に導入するための多くの方法を利用することができ、それらは、インビボ、インビトロおよびエクスビボでの使用に等しく適している。エクスビボ治療の場合、ベクターを、患者から採取され、その同じ患者への自家移植のためにクローン増殖させた幹細胞に導入することができる。トランスフェクションまたはリポソーム注射またはポリカチオン性アミノポリマーによる送達を、この分野で広く知られている様々な方法を使用して達成することができる（例えば、Ｇｏｌｄｍａｎ他、１９９７を参照のこと）。
【００４８】
本発明のさらにさらなる局面において、本発明のＤＮＡ分子の相補体であり、本発明の変異型ナトリウムチャンネルβ−１サブユニットをコードするｍＲＮＡとハイブリダイゼーションするＲＮＡ分子をコードする単離されたＤＮＡ分子の使用で、てんかん、ならびにナトリウムチャンネルの機能不全と関連する他の障害を処置するための医薬品を製造することにおいてそのような使用が提供される。
【００４９】
場合により、処置に対する適切な方法は混合療法であり得る。これは、野生型ナトリウムチャンネルの形成レベルを正常なレベルに回復させることができる野生型ＳＣＮ１Ｂの投与と組み合わせて、本発明の変異型ＳＣＮ１Ｂサブユニットまたは変異型ナトリウムチャンネルに対する抗体または相補体を、その機能的作用を阻害するために投与することを伴い得る。野生型ＳＣＮ１Ｂは、相補体の投与について上記に記載されるような遺伝子治療法を使用して投与することができる。
【００５０】
従って、本発明の変異型ＳＣＮ１Ｂサブユニットまたは変異型ナトリウムチャンネルに対する抗体または相補体を野生型ＳＣＮ１Ｂの投与との組合せで投与することを含む、てんかん、ならびにナトリウムチャンネルの機能不全と関連する他の障害を処置する方法が提供される。
【００５１】
本発明のさらに別の局面において、本発明の変異型ＳＣＮ１Ｂサブユニットまたは変異型ナトリウムチャンネルに対する抗体または相補体の使用で、てんかん、ならびにナトリウムチャンネルの機能不全と関連する他の障害を処置するための医薬品を製造することにおいて、野生型ＳＣＮ１Ｂの使用と組み合わせたそのような使用が提供される。
【００５２】
さらなる局面において、好適なアゴニストまたは調節剤には、上記に記載されるようなβ−１サブユニット内の変異を含有するナトリウムチャンネルの野生型活性を回復させることができるペプチドまたはホスホペプチドまたは小さい有機化合物もしくは無機化合物を挙げることができる。
【００５３】
治療的適用に好適なプチドまたはホスホペプチドまたは小さい有機化合物もしくは無機化合物は、下記に記載されるような薬物スクリーニング適用において本発明の核酸およびペプチドを使用して同定することができる。このようなスクリーニングから同定された分子もまた、分子が、これらの変異および本発明の変異によって負わされる共通する根本的な機能的欠陥を正すことができるならば、他のナトリウムチャンネル遺伝子変異を有する罹患個体、またはナトリウムチャンネル以外の遺伝子に変異を有する個体において治療的に適用することができる。
【００５４】
従って、ナトリウムチャンネルの変異を有する個体、またはナトリウムチャンネル以外の遺伝子に変異を有する個体において、てんかん、ならびにナトリウムチャンネルの機能不全と関連する他の障害を処置する方法で、ナトリウムチャンネルの好適なアゴニストまたは調節剤である、本発明の変異型ナトリウムチャンネルサブユニットを使用して同定された化合物を投与することを含む方法が提供される。
【００５５】
さらなる実施形態において、本発明のアゴニスト、アンタゴニスト、調節剤、抗体、相補的配列またはベクターはいずれも、単独で投与することができ、または他の適切な治療剤と組み合わせて投与することができる。適切な薬剤の選択は、従来の薬学的原理に従って当業者によって行うことができる。治療剤の組合せは相乗的に作用して、てんかんの処置または防止をもたらし得る。この方法を使用して、より少ない投薬量のそれぞれの薬剤を用いた治療効力を可能にすることができ、従って、有害な副作用に対する潜在的可能性を低下させることができる。
【００５６】
上記に記載された治療的方法はどれも、例えば、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ウサギ、サル、そして最も好ましくはヒトなどの哺乳動物を含む、そのような治療を必要とする任意の被験体に適用することができる。
【００５７】
薬物スクリーニング
本発明のさらに別の局面により、本発明のペプチド（具体的には、精製された変異型ナトリウムチャンネルβ−１サブユニットポリペプチド）およびこれらを発現する細胞は、様々なアッセイにおいて候補の薬学的化合物をスクリーニングするために有用である。
【００５８】
なおさらに、本発明は、候補の薬学的薬剤をスクリーニングするためのポリペプチドまたはポリペプチド複合体の使用を提供する。
【００５９】
なおさらに、本発明は、高処理能スクリーニング技術が用いられる使用を提供する。
【００６０】
本発明に従ってスクリーニングされ得る化合物には、ペプチド（可溶性ペプチドなど）、ホスホペプチド、および小さい有機分子または無機分子（天然産物または合成された化学ライブラリーおよびペプチド模倣体など）が含まれるが、これらに限定されない。
【００６１】
１つの実施形態において、スクリーニングアッセイには、本発明のポリペプチドまたはフラグメントを発現する、組換え分子で安定的に形質転換されている真核生物宿主細胞または原核生物宿主細胞を競合的結合アッセイにおいて利用する細胞型アッセイが含まれる。結合アッセイでは、変異型ナトリウムチャンネルβ−１サブユニットのポリペプチドまたはフラグメントと、試験されている化合物との間における複合体の形成が測定されるか、あるいは試験されている化合物が、変異型ナトリウムチャンネルβ−１サブユニットのポリペプチドまたはフラグメントと既知のリガンドとの間における複合体の形成を妨害する程度が測定される。
【００６２】
本発明は、形質転換された細胞、トランスフェクションもしくは注入された卵母細胞、または変異型ナトリウムチャンネルβ−１サブユニットを有する動物モデル（遺伝子組換え動物または遺伝子標的化（ノックイン）動物（下記参照）など）において本発明のポリペプチドを使用することによって化合物をスクリーニングするために特に有用である。薬物候補物を、変異型ＳＣＮ１Ｂサブユニットを発現する培養細胞（野生型ナトリウムチャンネルαサブユニットもまた発現しているはずである）に加えることができ、あるいは変異型ＳＣＮ１Ｂサブニットおよび野生型ナトリウムチャンネルαサブユニットの両方でトランスフェクションされた卵母細胞に、またはそれらの両方が注入された卵母細胞に加えることができ、あるいは変異型ＳＣＮ１Ｂサブユニットを含有する動物モデルに投与することができる。変異型ナトリウムチャンネルの活性を調節する試験化合物の能力を測定することは、例えば、チャンネルの電流（例えば、ナトリウムイオンの流れ）に対する影響を、野生型ナトリウムチャンネルを含有する細胞または動物の電流と比較して測定することによって達成することができる。細胞内の電流は、パッチ−クランプ技術（Ｈａｍｉｌｌ他（１９８１）に記載される方法）を使用して測定することができ、またはこの分野で知られているような、蛍光に基づくアッセイ（Ｇｏｎｚａｌｅｚ他（１９９９）を参照のこと）を使用して測定することができる。電流をより正常なレベルな方に変化させる薬物候補物は、てんかん、ならびにナトリウムチャンネル機能不全と関連する他の障害を処置または防止するために有用である。
【００６３】
薬物スクリーニングのための別の技術では、変異型ナトリウムチャンネルβ−１サブユニットポリペプチドまたはこれらを含有するナトリウムチャンネルに対する好適な結合親和性を有する化合物に対する高処理能スクリーニングが提供される（ＰＣＴ国際特許出願公開ＷＯ８４／０３５６４を参照のこと）。この言及された技術では、非常に多数の小さいペプチド試験化合物を、固体基体（マイクロタイタープレートなど）の表面で合成することができ、そして（単独で、またはナトリウムチャンネルαサブユニットとの複合体で）変異型ＳＣＮ１Ｂサブユニットポリペプチドとの結合についてアッセイすることができる。その後、結合した変異型ナトリウムチャンネルまたは変異型ＳＣＮ１Ｂサブユニットポリペプチドがこの分野で広く知られている方法によって検出される。この技術の変形では、本発明の精製されたポリペプチドをプレート表面に直接コーティングして、相互作用する試験化合物を同定することができる。
【００６４】
本発明ではまた、変異型ナトリウムチャンネルと特異的に結合し得る中和抗体が、それに対する結合について試験化合物と競合する競合薬物スクリーニングアッセイの使用が考えられる。このようにして、そのような抗体は、変異型ナトリウムチャンネルの抗原性決定基の１つ以上をともに有するペプチドの存在を検出するために使用することができる。
【００６５】
本発明のポリペプチドはまた、コンビナトリアルライブラリー技術の結果として開発された化合物をスクリーニングするために使用することができる。これは、ポリペプチドの活性を調節するその能力について非常に多数の異なる物質を試験する方法を提供する。ポリペプチド機能の調節剤として同定された物質はペプチド性または非ペプチド性であってもよい。非ペプチド性の「小分子」が、多くの場合には、インビボでの多くの薬学的適用のために好ましい。また、そのような物質の模倣体または模擬体を薬学的使用のために設計することができる。知られている薬学的に活性な化合物（「リード」化合物）に基づく模擬体の設計は、新規な医薬品を開発するための一般的な方法である。これは、多くの場合、元の活性な化合物が合成困難であるか、もしくは合成に費用がかかる場合に、または元の活性な化合物が好適な投与方法をもたらさない場合に望ましい。模擬体の設計では、標的の性質を決定する際に重要である、元の活性な化合物の特定の部分が同定される。化合物の活性領域を構成するこれらの部分または残基はそのファルマコホアとして知られている。ファルマコホアが見出されると、ファルマコホアの構造が、Ｘ線回折データおよびＮＭＲを含む一連の提供源から得られるデータを使用してその物理的性質に従ってモデル化される。その後、ファルマコホアを模倣する化学基を加えることができるテンプレート分子が選択される。この選択は、模擬体が容易に合成され、薬理学的に受容可能であり、インビボで分解せず、かつリード化合物の生物学的活性を保持するように行うことができる。さらなる最適化または改変を、インビボ試験または臨床試験のために有用な１つまたは複数の最終的な模擬体を選択するために行うことができる。
【００６６】
標的特異的な抗体を単離し、その後、その結晶構造を解明することもまた可能である。原理的には、この方法により、その後の薬物設計が上記に記載されたように基づき得るファルマコホアが得られる。薬理学的に活性な機能的抗体に対する抗イディオタイプ抗体（抗ｉｄ）を作製することによってタンパク質結晶学を全く避けることが可能になる場合あある。鏡像の鏡像として、抗ｉｄの結合部位が元の受容体のアナログであることが予想される。その後、抗ｉｄを使用して、化学的または生物学的に製造されたペプチドバンクからペプチドを単離することができる。
【００６７】
本発明の変異型の核酸およびポリペプチドの使用に基づく、上記に記載されるようなスクリーニング手法によって同定された化合物はまた、他のナトリウムチャンネルサブユニット変異を含む罹患個体における他の遺伝子変異によって負わされる機能的欠陥を正すことに対するその作用について試験することができる。
【００６８】
そのような化合物は、これらおよび薬学的に受容可能なキャリアを含有する薬学的組成物が本発明の一部を形成するように本発明の一部を形成する。
【００６９】
薬学的調製物
スクリーニングアッセイから同定され、かつナトリウムチャンネルの野生型活性を回復させることが示された化合物は、てんかん、ならびにナトリウムチャンネルの機能不全と関連する他の障害を処置し、または改善させるために、治療有効量で患者に投与することができる。治療有効量は、てんかんの症状の改善をもたらすために十分な化合物のそのような量を示す。
【００７０】
そのような化合物の毒性および治療効力は、細胞培養または実験動物における標準的な薬学的手法により決定することができる。これらの研究から得られたデータは、その後、ヒトにおける使用に対する一連の投薬量を定める際に使用することができる。
【００７１】
本発明に従って使用される薬学的配合物は、広く知られている１つ以上の生理学的に受容可能なキャリアまたは賦形剤または安定化剤を使用して従来の様式で配合することができる。受容可能なキャリアまたは賦形剤または安定化剤は、用いられた投薬量および濃度において非毒性であり、これらには、リン酸塩、クエン酸塩および他の有機酸などの緩衝剤；アスコルビン酸を含む抗酸化剤；低分子量（約１０残基未満）のポリペプチド；タンパク質、例えば、血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリンなど；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマーを含む結合剤；アミノ酸、例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニンまたはリシンなど；単糖類、二糖類および他の炭水化物、これには、グルコース、マンノースまたはデキストリンが含まれる；ＥＤＴＡなどのキレート化剤；糖アルコール、例えば、マンニトールまたはソルビトールなど；ナトリウムなどの塩形成対イオン；および／または非イオン性界面活性剤、例えば、ツイーン、プルロニックスまたはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などが含まれる。
【００７２】
本発明に従って使用される薬学的組成物の配合は、提案された投与経路に基づく。投与経路には、吸入投与、吹送投与（口または鼻のいずれかを介して）、経口投与、口内投与、直腸投与または非経口投与を挙げることができるが、これらに限定されない。
【００７３】
診断的適用
本発明のポリヌクレオチド配列は、てんかん、ならびにナトリウムチャンネルの機能不全と関連する他の障害を診断するために使用することができる。従って、これらの障害の診断における本発明の核酸分子の使用が考えられる。
【００７４】
本発明の別の実施形態において、診断目的のために使用することができるポリヌクレオチドには、オリゴヌクレオチド配列、ゲノムＤＮＡ分子ならびに相補的なＲＮＡ分子およびＤＮＡ分子が含まれる。ポリヌクレオチドは、生物学的サンプルにおける遺伝子発現を検出および定量するために使用することができる。診断のために使用されるゲノムＤＮＡは、血液、組織生検物、手術試料または剖検物に存在する細胞などの、身体の細胞から得ることができる。ＤＮＡを単離して、特定の配列を検出するために直接使用することができ、あるいは、ＤＮＡは、分析に先立ってポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅することができる。同様に、ＲＮＡまたはｃＤＮＡもまた、ＰＣＲ増幅とともに、またはＰＣＲ増幅を伴うことなく使用することができる。特定の核酸配列を検出するために、特異的なオリゴヌクレオチドを使用するハイブリダイゼーション、ＰＣＲマッピング、ＲＮＡｓｅ保護、および様々な他の方法を用いることができる。例えば、患者のナトリウムチャンネルサブユニットに由来する増幅産物の直接的なヌクレオチド配列決定を用いることができる。サンプルアンプリコンの配列が、ヌクレオチドの違いの存在（または非存在）を明らかにするために野生型アンプリコンの配列と比較される。また、制限酵素消化および制限酵素マッピングを、本発明に記載されるＳＣＮ１ＢサブニットにおけるＣからＴへの特異的な変異に対して用いることができる。このサブユニットのアミノ酸残基８５におけるＣからＴへのトランジションはＣｆｏＩ制限部位を破壊する。罹患個体ならびに正常なコントロールから得られたＤＮＡを、ＣからＴへのこのヌクレオチド変異を挟むオリゴヌクレオチドを使用して増幅することができる。増幅産物は、その後、野生型ＳＣＮ１ＢのＤＮＡフィンガープリントと比較するためのフィンガープリントを得るためにＣｆｏＩによって消化することができる。本発明のＣからＴへのヌクレオチド変異を含有する個体に由来するＤＮＡはこの酵素で消化することができず、しかしながら、正常な個体から増幅されたＤＮＡはＣｆｏＩで消化される。
【００７５】
本発明のさらなる局面により、てんかん、ならびにナトリウムチャンネルの機能不全と関連する他の障害を診断する際における、上記に記載されるような、ポリヌクレオチドの使用が提供される。
【００７６】
診断アッセイが、ナトリウムチャンネルを構成する変異型ＳＣＮ１Ｂタンパク質に基づき得るときには、様々な方法が可能である。例えば、診断を、ナトリウムチャンネルの一部を形成する正常型および変異型のＳＣＮ１Ｂサブユニットタンパク質の電気泳動移動度の違いをモニターすることによって達成することができる。そのような方法は、電荷置換が存在する変異体、または、挿入、欠失もしくは置換により、得られるタンパク質の電気泳動移動における著しい変化が生じている変異体を同定する際には特に有用である。あるいは、診断は、正常型タンパク質および変異型タンパク質のタンパク質分解的切断パターンの違い、または様々なアミノ酸残基のモル比の違いに基づいてもよく、あるいは遺伝子産物の変化した機能を明らかにする機能的アッセイによって基づいてもよい。
【００７７】
別の局面において、変異型ナトリウムチャンネルと特異的に結合する抗体を、障害の診断のために使用することができ、あるいは変異型ナトリウムチャンネルのアゴニストまたはアンタゴニストまたは調節剤で処置されている患者をモニターするためのアッセイにおいて使用することができる。診断目的のために有用な抗体は、治療剤について上記に記載されたのと同じ方法で調製することができる。変異型ナトリウムチャンネルを検出するための診断アッセイには、ヒト体液または細胞もしくは組織の抽出物における変異型ナトリウムチャンネルを検出するために抗体および標識を利用する方法が含まれる。抗体は、修飾とともに、または修飾を伴うことなく使用することができ、そしてレポーター分子の共有結合的または非共有結合的な結合によって標識することができる。
【００７８】
変異型ナトリウムチャンネルの存在を測定するための様々なプロトコルには、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡおよびＦＡＣＳが含まれ、そのようなプロトコルは、この分野で広く知られており、てんかん（特に、熱性発作プラスである全身性てんかん）を診断するための基礎を提供する。変異型チャンネルの発現は、試験哺乳動物被験体（好ましくは、ヒト）から採取された体液または細胞抽出物を、複合体形成に好適な条件のもとで、そのチャンネルに対する抗体と一緒にすることによって明らかにされる。複合体形成の量を、様々な方法によって、好ましくは、光度法による手段によって定量化することができる。変異型チャンネルに対して特異的な抗体は、その変異型チャンネルを発現している個体に結合するだけであり、野生型チャンネルのみを発現している個体（すなわち、正常な個体）には結合しない。これにより、疾患を診断するために基礎が確立される。
【００７９】
個体が障害に関して診断されると、効果的な処置を開始することができる。これらには、変異型チャンネルの選択的な調節剤または変異型チャンネルに対するアンタゴニスト（上記に記載されるような抗体または変異型相補体など）を投与することが含まれ得る。代わりの処置には、チャンネルの機能を正常なレベルに回復させるように、変異型チャンネルに対する選択的なアゴニストまたは調節剤を投与することが含まれる。
【００８０】
マイクロアレイ
さらなる実施形態において、本明細書中に記載されるポリヌクレオチド配列のいずれかに由来する完全なｃＤＮＡまたはオリゴヌクレオチドまたはより長いフラグメントを、マイクロアレイにおけるプローブとして使用することができる。マイクロアレイは、非常に多数の遺伝子の発現レベルを同時にモニターするために、そして遺伝子の変化体および変異および多型を同定するために使用することができる。この情報を使用して、遺伝子機能を決定することができ、障害の遺伝的基礎を理解することができ、障害を診断することができ、そして治療剤を開発し、その活性をモニターするために使用することができる。マイクロアレイは、この分野で知られている方法を使用して調製し、使用し、かつ分析することができる（例えば、Ｓｃｈｅｎａ他、１９９６；Ｈｅｌｌｅｒ他、１９９７を参照のこと）。
【００８１】
本発明のさらなる局面により、特定のナトリウムチャンネルβ−１サブユニットのヒト変異（特に、本発明において開示される変異）を同定することの結果として作製された動物モデルから得られた神経学的材料を、様々なマイクロアレイ実験において使用することができる。これらの実験は、正常なコントロールの脳組織とは対照的に、てんかんの脳組織において、特定のナトリウムチャンネルβ−１サブユニットの発現レベル、または全脳ライブラリーに由来する任意のｃＤＮＡクローンの発現レベルを同定するために行うことができる。２つの組織の間における、ナトリウムチャンネルβ−１サブユニットを含む様々な遺伝子の発現レベルの変動により、てんかんプロセスにおけるそれらの関与が、動物モデルに存在する元のナトリウムチャンネル変異の原因として、またはその変異の結果として、そのいずれかで示される。マイクロアレイは、上記に記載されるように調製することができる。
【００８２】
形質転換された宿主
本発明ではまた、本発明の核酸分子で形質転換された遺伝子改変（ノックアウト、ノックインおよび遺伝子組換え）の非ヒト動物モデルの作製が提供される。これらの動物は、ナトリウムチャンネルの機能を研究するために、ナトリウムチャンネルに関連するような疾患機構を研究するために、候補の薬学的化合物をスクリーニングするために、変異型ナトリウムチャンネルを発現する体外培養される哺乳動物細胞培養物を作製するために、そして可能性のある治療的介入を評価するために有用である。
【００８３】
本発明の動物モデルにおける使用のために好適である動物種には、ラット、マウス、ハムスター、モルモット、ウサギ、イヌ、ネコ、ヤギ、ヒツジ、ブタ、およびヒト以外の霊長類（サルおよびチンパンジーなど）が含まれるが、これらに限定されない。最初の研究のためには、ノックイン動物、ノックアウト動物および遺伝子組換え動物の作製が比較的容易であるために、それらの飼育が容易であるために、そして寿命がより短いために、遺伝子改変されたマウスおよびラットが非常に望ましい。いくつかの研究のためには、迅速なスクリーニングが可能であり、そしてはるかにより容易な取扱いがもたらされるので、遺伝子組換えされた酵母または無脊椎動物が好適であり、好まれる場合がある。より長期間の研究のためには、ヒト以外の霊長類が、ヒトとのその類似性のために所望されることがある。
【００８４】
本発明の変異型ナトリウムチャンネルに対する動物モデルを作製するために、いくつかの方法を用いることができる。これらの方法には、相同的な動物遺伝子において特定の変異を生じさせること、野生型のヒト遺伝子および／またはヒト化された動物遺伝子を相同的組換えによって挿入すること、野生型または変異型または人工のプロモーターエレメントを使用するゲノムｃＤＮＡ構築物またはミニ遺伝子ｃＤＮＡ構築物として変異型（１つの変異または多数の変異）のヒト遺伝子を挿入すること、あるいは内因性遺伝子の人工的に改変されたフラグメントを相同的組換えによって挿入することが含まれるが、これらに限定されない。これらの改変には、変異させた停止コドンの挿入、ＤＮＡ配列の欠失、またはＣｒｅリコンビナーゼなどの酵素によって認識される組換えエレメント（ｌｏｘ  ｐ部位）を含ませることが含まれる。
【００８５】
好ましい遺伝子組換えマウスまたは遺伝子標的化（ノックイン）マウスを作製するために、ナトリウムチャンネルβ−１サブユニットの変異型形態を、卵母細胞への顕微注入の標準的な技術を使用してマウスの生殖系列に挿入することができる。あるいは、内因性のナトリウムチャンネルβ−１サブユニット遺伝子を不活性化または置換することが所望されるならば、胚幹細胞を使用する相同的組換えを適用することができる。
【００８６】
卵母細胞への注入の場合、１コピー以上の変異型ナトリウムチャンネルβ−１サブユニット遺伝子を受精直後のマウス卵母細胞の前核に挿入することができる。その後、この卵母細胞は偽妊娠の養育親に再び移植される。生きて生まれたマウスは、その後、特定のヒトサブユニット遺伝子配列の存在に対する尾のＤＮＡまたは他の組織に由来するＤＮＡの分析を使用して、組み込まれた遺伝子についてスクリーニングすることができる。導入遺伝子は、ＹＡＣ、ＢＡＣ、ＰＡＣまたは他の染色体ＤＮＡフラグメントとして注入される完全なゲノム配列、天然のプロモーターもしくは異種のプロモーターのいずれかを有する完全なｃＤＮＡ、またはコード領域のすべてと、最適な発現のために必要であることが見出されている他のエレメントとを含有するミニ遺伝子のいずれかであり得る。
【００８７】
本発明のさらに別の局面により、候補の薬学的化合物のスクリーニングについて上記に記載されるような、遺伝子改変された非ヒト動物の使用が提供される（上記薬物スクリーニングを参照のこと）。これらの動物はまた、てんかん、および／またはナトリウムチャンネルの機能不全と関連する他の障害を処置するための、上記に記載されるように本発明から同定される化合物を含む様々な候補薬学的化合物の評価（例えば、治療効力、毒性、代謝）のためにも有用である。
【００８８】
多数の先行技術刊行物が本明細書中では参照されているが、この参照は、オーストラリアまたは任意の他の国において、これらの文書のいずれかがこの分野における共通する一般的な知識の一部を形成することを認めるものでないことが理解されることは明らかなことである。
【００８９】
本明細書および請求項の全体を通して、用語「含む（“ｃｏｍｐｒｉｓｅ”、“ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ”および“ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ”）」は、文脈により他のことが要求される場合を除き、非排他的な意味で使用されている。
図面の簡単な説明
図１は、Ｒ８５Ｃ変異を含有する家系に対するＧＥＦＳ＋系図を示す。この変異を含有する個体が示されている。最初の発端者には、Ｐとして印が付けられている。
図２は、本研究で同定されたＳＣＮ１Ｂ変異の配列決定軌跡図を示す。罹患個体に対する配列決定軌跡図が、Ｃ→Ｔのヌクレオチド変化を示す上段パネルにより表され、一方、下段パネルには、正常者の配列決定軌跡図が示される。
図３は、ＳＣＮ１Ｂ変異の周囲のナトリウムチャンネルアミノ酸アラインメントを示す。８５位におけるＳＣＮ１Ｂの非常に保存されたアルギニンアミノ酸は四角で囲まれている。このアミノ酸は、免疫グロブリン遺伝子スーパーファミリーのメンバーでは多く保存されているが、他のＳＣＮＢサブユニットでは保存されていない。
【００９０】
発明を実施するための態様
実施例１
罹患家系メンバーの臨床診断
３世代にわたる４名の家系メンバーからなる一群が、熱性発作プラスである全身性てんかん（ＧＥＦＳ＋）の表現型が存在するために調べられた（系図については図１を参照のこと）。
【００９１】
発端者（Ｐ）が日常的な臨床業務から確認された。この発端者には、１人の一親等の罹患者および多数の二親等の罹患者がいる。これまでに研究されたこれらの家系メンバーにおいて、すべての罹患者がＦＳ＋の表現型を有し、そしてまれに起こる（５〜１０の範囲）の熱性発作および無熱性の強直間代性発作が１５ヶ月〜２歳の間で始まったが、２名の年長の罹患者では、中期小児期および１３歳以降早い時期までにそれぞれ止んだ。全員が知能的には正常であり、他の点でも健康である。拡大された家系には、その表現型がＧＥＦＳ＋と一致する非常に多数の他の個体（約１３名）が存在することが知られている。この家系には近親婚関係者は知られていない。
【００９２】
実施例２
ＳＣＮ１Ｂの変異研究
一本鎖高次構造多型（ＳＳＣＰ）分析および配列決定を、疾患の原因となる変異を同定するためにＧＥＦＳ＋の罹患者に対して行った。
【００９３】
ＳＳＣＰのために使用されたプライマーはその５’末端がＨＥＸで標識された。プライマーは、ＳＣＮ１Ｂの各エキソンの増幅を可能にするために、隣接するＳＣＮ１Ｂイントロン内において設計された（表１および配列番号３〜１２）。典型的なＰＣＲ反応が、３０ｎｇの患者ＤＮＡを使用して１０μｌの総容量で行われた。ＰＣＲ反応は、１回の処理サイズに依存して９６ウエルプレートまたは０．５ｍｌチューブで行われた。ＰＣＲ反応液には、６７ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．８）；１６．５ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４；６．５μＭのＥＤＴＡ；１．５ｍＭのＭｇＣｌ２；２００μＭの各ｄＮＴＰ；１０％のＤＭＳＯ；０．１７ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ；１０ｍＭのβ−メルカプトエタノール；１５μｇ／ｍｌの各プライマーおよび１００Ｕ／ｍｌのＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼが含まれた。第１エキソン、第２エキソン、第４エキソンおよび第５エキソンについては、ＰＣＲ反応が、９４℃で３０秒間、６０℃で３０秒間、そして７２℃で３０秒間の１０サイクル、それに続く、９４℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、そして７２℃で３０秒間の２５サイクルを使用して行われた。７２℃で１０分間の最後の伸長反応がその後に行われた。第３エキソンについては、ＰＣＲ反応が、９４℃で３０秒間、６２℃で３０秒間、そして７２℃で３０秒間の３５サイクルを、７２℃で１０分間の最後の伸長反応とともに使用して行われた。５０％（ｖ／ｖ）のホルムアミド、１２．５ｍＭのＥＤＴＡおよび０．０２％（ｗ／ｖ）のブロモフェノールブルーを含む２０μｌの負荷用色素を完了した反応液に加え、続いて、反応液を、架橋比が３５：１（アクリルアミド：ビス−アクリルアミド）である、２％のグリセロールを含有する非変性の４％ポリアクリルアミドゲルで泳動した。ゲルの厚さは１００μｍであり、幅が１６８ｍｍで、長さが１６０ｍｍであった。ゲルを、ＧｅｌＳｃａｎ２０００システム（Ｃｏｒｂｅｔｔ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、オーストラリア）を製造者の説明書に従って使用して、周囲温度において、１２００ボルトおよび約２０ｍＡで泳動した。続いて、結果を、ＯＮＥ−Ｄｓｃａｎゲル分析ソフトウエアパッケージ（Ｓｃａｎａｌｙｔｉｃｓ  Ｉｎｃ．）を使用して分析した。
【００９４】
高次構造の変化を示したＰＣＲ産物を続いて配列決定した。これには、最初に、５’ＨＥＸの付加を有しないプライマーを使用して関連するアンプリコンを再増幅し、その後、配列決定用のＰＣＲ増幅テンプレートを、製造者の手順に基づいてＱｉａＱｕｉｃｋ  ＰＣＲプレップ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して精製することが伴った。精製されたＳＣＮ１Ｂアンプリコンを配列決定するために使用されたプライマーは、最初の増幅工程のために使用されたプライマーと同一であった。それぞれの配列決定反応について、２５ｎｇのプライマーおよび１００ｎｇの精製されたＰＣＲテンプレートが使用された。ＢｉｇＤｙｅ配列決定キット（ＡＢＩ）が、すべての配列決定反応のために、製造者の説明書に従って使用された。生成物はＡＢＩ３７７シーケンサーで泳動され、ＥｄｉｔＶｉｅｗプログラムを使用して分析された。
【００９５】
合計で５３名の非関連のＧＥＦＳ＋患者が、蛍光ＳＳＣＰ分析および配列決定によってスクリーニングされた。調べられた１７名の特発性ＧＥＦＳ＋症例では変異が見出されなかった。調べられた３６家系のうち、３つの家系が点変異をＳＣＮ１Ａに有することが見出され（Ｗａｌｌａｃｅ他、２００１）、２つの家系がＣ１２１Ｗ変異をＳＣＮ１Ｂに含有することが見出され（Ｗａｌｌａｃｅ他、１９９８）、１つの家系（図１）に、配列番号１によって表されるような２５３位におけるＣからＴへのヌクレオチド変異による第３エキソン内の新規なＳＣＮ１Ｂ変異が同定された。このヌクレオチド変化は、配列番号２によって表されるようなコードされるタンパク質の８５位においてアルギニンアミノ酸残基のシステイン残基への置換をもたらしている。これらの変化はいずれも、コントロール集団には存在しなかった。
【表１】
2004535178.tif 000002
【００９６】
実施例３
新規なＳＣＮ１Ｂ変異の特徴づけ
本発明のＣからＴへのヌクレオチド変化はＣｆｏＩ制限酵素部位の破壊をもたらす。これにより、この変異を含有する個体におけるてんかんを診断するための手段が提供される。例えば、試験される個体から得られたＤＮＡを、第３エキソンのＳＳＣＰ分析において使用されたようなプライマー（配列番号７および８）を用いて増幅することができる。得られる増幅ＤＮＡを続いて精製し、そして制限酵素ＣｆｏＩで消化することができる。ＣからＴへのヌクレオチド変化を含有する増幅物はこの酵素によって消化されず、これに対して、野生型の個体から得られた増幅物は、増幅産物が消化されるために、罹患者の増幅物と比較してサイズが減少する。
【００９７】
Ｃ１２１ＷおよびＲ８５Ｃの両方のＳＣＮ１Ｂ変異において、アミノ酸の置換がタンパク質の細胞外のアミノ末端ドメインに生じている。電位依存性ナトリウムチャンネルβサブユニット（β−１、β−２）は、１つの膜貫通領域と、突出した細胞外アミノ末端ドメインとを有する内在性膜タンパク質である。組換えナトリウムチャンネルβ−１サブユニットは、ゲート開閉挙動および様々なαサブユニット（脳のイソ型を含む）の発現レベルに対する著しい調節作用を発揮することが明らかにされている（Ｉｓｏｍ他、１９９２；Ｍａｋｉｔａ他、１９９４）。ゲート開閉調節に対するβ−１サブユニットの機能的作用は、細胞外ドメインに主に存在する様々な構造に依存している（ＭｃＣｏｒｍｉｃｋ他、１９９８；Ｍａｋｉｔａ他、１９９６）。細胞外ドメインには、神経細胞接着分子（コンタクチン）の対応する領域に対して、また免疫グロブリン遺伝子スーパーファミリーの他のメンバーの対応する領域に対して大きな程度のアミノ酸類似性を有する１つの免疫グロブリン様折り畳みモチーフが含まれる（Ｉｓｏｍ他、１９９５；ＭｃＣｏｒｍｉｃｋ他、１９９８）。このモチーフは、ＳＣＮ１Ｂ内のＣｙｓ１２１を含む２つの非常に保存されたシステイン残基の間における１つの推定されるジスルフィド架橋によって構造的に維持されている。従って、Ｃ１２１Ｗ変異は、細胞外ドメインの二次構造を変化させ得るジスルフィド架橋の破壊をもたらしていると考えられる。興味深いことに、本発明の好ましい実施形態を構成する新規なＳＣＮ１Ｂ変異（Ｒ８５Ｃ）により、アルギニン残基がシステイン残基で置換される。このシステイン残基の存在は、正常なジスルフィド架橋の形成または未だ明らかにされてない他の機構を妨げることによってイオンチャンネルの機能発現に影響を及ぼし得る。
【００９８】
現在、ＧＥＦＳ＋の遺伝的不均一性が広く明らかにされている。５３名の患者からなるパネルにおけるＳＣＮ１ＢおよびＳＣＮ１Ａのスクリーニングは、１７名の孤立型ＧＥＳＦ＋症例では変異が全く見出されなかったことを示している。しかし、残る３６名の家族性症例でのこれらの遺伝子のそれぞれにおけるＧＥＦＳ＋発生変異の頻度は約１７％（６／３６）以下であった。これらの２つのナトリウムチャンネル遺伝子によって引き起こされるＧＥＦＳ＋症例の割合が低いことは、他の遺伝子が関与していることを示している。明かな候補には、ニューロンの他のナトリウムチャンネル、およびナトリウムチャンネルと相互作用するタンパク質が含まれる。ＳＣＮ１Ｂが、熱性発作に対する原因であると考えられる多くの遺伝子の１つであることが確認されたことにより、より大きな診断精度、より正確な遺伝子カウンセリング、そして熱性発作および全身性てんかんを処置するためのより合理的な根拠が可能になる。
【００９９】
実施例４
変異型ＳＣＮ１Ｂサブユニットおよびこれを含むナトリウムチャンネルの分析
下記の方法が、変異型ＳＣＮ１Ｂサブユニットおよびこれを含むナトリウムチャンネルの構造および機能を明らかにするために使用される。
【０１００】
分子生物学的研究
全体として、または個々の変異型β−１サブユニットを介して本発明の変異型ナトリウムチャンネルが既知のタンパク質および未知のタンパク質と結合する能力を調べることができる。酵母ツーハイブリッドシステムなどの手法が、何らかの機能的パートナーを発見し、同定するために使用される。酵母ツーハイブリッド法の基となる原理は、真核生物の多くの転写活性化因子は、酵母における転写活性化因子を含めて、２つの異なるモジュール状ドメインからなるということである。１つが、特定のプロモーター配列に結合するＤＮＡ結合ドメインであり、もう１つが、ＤＮＡ結合部位の下流にある遺伝子をＲＮＡポリメラーゼＩＩ複合体に転写させる活性化ドメインである。いずれのドメインも単独で転写を活性化することができないので、両方のドメインが転写活性化のためには必要である。酵母ツーハイブリッド法では、目的とする遺伝子またはその一部（えさ）が、ＤＮＡ結合ドメインを有するペプチドに対する融合体として発現されるような様式でクローン化される。別の遺伝子または多数の遺伝子（ｃＤＮＡライブラリーに由来する遺伝子など）（標的）が、活性化ドメインに対する融合体として発現されるようにクローン化される。目的とするタンパク質がその結合パートナーと相互作用することにより、ＤＮＡ結合性のペプチドが活性化ドメインと一緒になり、レポーター遺伝子の転写が開始される。第１のレポーター遺伝子により、相互作用するタンパク質を含有する酵母細胞が選択される（このレポーターは、通常、選択培地における増殖のために要求される栄養学的遺伝子である）。第２のレポーターが確認のために使用される。これは、相互作用するタンパク質に応答して発現するが、通常、生育のためには要求されない。
【０１０１】
ナトリウムチャンネルと相互作用する遺伝子およびタンパク質の性質もまた、これらのパートナーがまた薬物発見のための標的とすることができるように調べることができる。
【０１０２】
構造研究
本発明のＳＣＮ１Ｂ組換えタンパク質は、細菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞および／または哺乳動物細胞において産生させることができ、そして結晶学研究およびＮＭＲ研究において使用することができる。タンパク質の分子モデル化ならびにこれらを含むナトリウムチャンネルのモデル化と一緒にすることにより、構造に基づく薬物設計を容易にすることができる。
【０１０３】
実施例５
ポリクローナル抗体の作製
抗体を、変異型ＳＣＮ１Ｂタンパク質と選択的に結合させ、そして変異型ＳＣＮ１Ｂタンパク質を野生型タンパク質から区別するために作製することができる。変異誘発を受けたエピトープに対して特異的な抗体は、薬学的薬剤の治療的可能性を評価するために薬学的薬剤で処理されている細胞についてスクリーニングするための細胞培養アッセイにおいて特に有用である。
【０１０４】
ポリクローナル抗体を調製するために、ＳＣＮ１Ｂのアミノ酸配列に対して相同的な短いペプチドを設計することができる。そのようなペプチドは、典型的には、長さが１０アミノ酸〜１５アミノ酸である。これらのペプチドは、他の受容体サブユニットに対する相同性が最も小さい領域において設計されるべきであり、そしてまた、モノクローナル抗体製造などのさらなる下流側の実験における種間の相互作用を避けるために、マウスのオルソログに対する相同性が悪くなければならない。その後、合成ペプチドを、ＰＩＥＲＣＥＴＭキット（ＰＩＥＲＣＥ）などの市販のキットとともに提供される標準的なプロトコルを使用してビオチン（スルホ−ＮＨＳ−ＬＣビオチン）にコンジュゲート化することができる。続いて、ビオチン化ペプチドは溶液中でアビジンと複合体化され、そしてそれぞれのペプチド複合体について、２羽のウサギが、投与と投与との間に３週間の間隔で４回の抗原投与（２００μｇ／投与）で免疫化される。最初の投与物はフロイント完全アジュバントと混合され、一方、その後の投与物はフロイント免疫アジュバントと一緒にされる。免疫化が完了した後、ウサギは試験採血され、血清の反応性が、元のペプチドの連続希釈物を用いたドットブロットによってアッセイされる。ウサギが、免疫化前の血清と比較して著しい反応性を示す場合、免疫血清がさらなる実験のために分離され得るように、ウサギは屠殺され、血液が集められる。
【０１０５】
変異型β−１サブユニットに対する抗体は、様々な組織における変異型形態の存在および相対的レベルを検出するために使用することができる。
【０１０６】
実施例６
モノクローナル抗体の作製
モノクローナル抗体を下記の様式で調製することができる。完全な変異型ＳＣＮ１Ｂサブユニットタンパク質または変異型ＳＣＮ１Ｂサブユニットペプチドを含む免疫原がフロイントアジュバントにおいてマウスに注射される、この場合、それぞれのマウスには、１０μｇ〜１００μｇの免疫原の４回の注射が施される。４回目の注射の後、マウスから採取された血液サンプルが、免疫原に対する抗体の存在について調べられる。免疫マウスは屠殺され、その脾臓が摘出され、単一細胞懸濁物が調製される（ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、１９８８）。脾臓細胞はリンパ球の供給源として役立ち、リンパ球は、その後、永久的に生育するミエローマパートナー細胞と融合される（ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ、１９７５）。細胞は９６ウエルプレートに２×１０５細胞／ウエルの密度で置床され、個々のウエルが生育について調べられる。これらのウエルは、その後、野生型または変異型のサブユニット標的タンパク質を使用するＥＬＩＳＡまたはＲＩＡによってＧＡＢＡ受容体サブユニット特異的抗体の存在について試験される。陽性ウエルの細胞は拡大培養され、そしてモノクローナル性を明らかにし、かつ確認するためにサブクローン化される。所望する特異性を有するクローンを拡大培養し、マウスにおける腹水物として増殖させ、その後、プロテインＡセファロースを使用するアフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーまたはこれらの技術の変法および組合せを使用した精製が行われる。
【０１０７】
2004535178.tif 000003
2004535178.tif 000004
【国際公開パンフレット】
2004535178.tif 000005
2004535178.tif 000006
2004535178.tif 000007
2004535178.tif 000008
2004535178.tif 000009
2004535178.tif 000010
2004535178.tif 000011
2004535178.tif 000012
2004535178.tif 000013
2004535178.tif 000014
2004535178.tif 000015
2004535178.tif 000016
2004535178.tif 000017
2004535178.tif 000018
2004535178.tif 000019
2004535178.tif 000020
2004535178.tif 000021
2004535178.tif 000022
2004535178.tif 000023
2004535178.tif 000024
2004535178.tif 000025
2004535178.tif 000026
2004535178.tif 000027
2004535178.tif 000028
2004535178.tif 000029
2004535178.tif 000030
2004535178.tif 000031
2004535178.tif 000032
2004535178.tif 000033
2004535178.tif 000034
2004535178.tif 000035
2004535178.tif 000036
2004535178.tif 000037
2004535178.tif 000038
2004535178.tif 000039
2004535178.tif 000040
2004535178.tif 000041
2004535178.tif 000042
2004535178.tif 000043
2004535178.tif 000044
2004535178.tif 000045
2004535178.tif 000046
2004535178.tif 000047
2004535178.tif 000048
2004535178.tif 000049
2004535178.tif 000050
2004535178.tif 000051
2004535178.tif 000052
2004535178.tif 000053
2004535178.tif 000054
【国際調査報告】
2004535178.tif 000055
2004535178.tif 000056