(57)【要約】【課題】新規なＡＭＰＫ関連セリン／スレオニンキナーゼを提供する。【解決手段】ＳＮＡＲＫと命名した新規なＡＭＰＫ関連キナーゼのクローニングおよび機能を記載する。キナーゼＳＮＡＲＫは、グルコース奪取へのストレス応答に関与する。提供されるのは、単離形態にある、ＳＮＡＲＫをコード化するげっ歯類およびヒトの遺伝子、並びにＳＮＡＲＫプロテインおよび有用な断片である。同様に提供されるのは、ＳＮＡＲＫ基質およびＳＮＡＲＫ調節因子を識別するに有用なＳＮＡＲＫ発現系およびアッセイ、並びにグルコース代謝を調節するために例えば治療用途におけるＳＮＡＲＫ調節因子として有用な抗体である。
2004505628.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１）配列番号１のラットＳＮＡＲＫプロテイン、
（２）（１）の哺乳類相同体、
（３）（１）または（２）の変異体、および
（４）ＳＮＲＡＫドメインが非相同性ＳＮＡＲＫドメインで交換されている（１）または（２）のキメラ体
からなる群より選択され、
ＳＮＡＲＫの前記変異体および前記キメラ体はＳＮＡＲＫ活性を保持し、かつ（１）または（２）と少なくとも７０％のアミノ酸同一性を有する、単離されたＳＮＡＲＫプロテイン。
【請求項２】
配列番号１のラットＳＮＡＲＫプロテインである、請求項１記載の単離されたＳＮＡＲＫプロテイン。
【請求項３】
配列番号１のラットＳＮＡＲＫプロテインのヒト相同体である、請求項１記載の単離されたＳＮＡＲＫプロテイン。
【請求項４】
配列番号１のラットＳＮＡＲＫプロテインのネズミ科相同体である、請求項１記載の単離されたＳＮＡＲＫプロテイン。
【請求項５】
検出可能に標識された形態にある、請求項１ないし４のうちのいずれか一項に記載の単離されたＳＮＡＲＫプロテイン。
【請求項６】
請求項１ないし４のうちのいずれか一項に記載のＳＮＡＲＫプロテインの免疫原性断片。
【請求項７】
請求項１ないし４のうちのいずれか一項に記載のＳＮＡＲＫプロテインの検出可能に標識された断片。
【請求項８】
請求項１ないし４のうちのいずれか一項に記載のＳＮＡＲＫプロテインをコード化する単離されたポリヌクレオチド。
【請求項９】
請求項８記載のポリヌクレオチドと、またはその相補体とハイブリダイズする識別可能に標識されたポリヌクレオチド。
【請求項１０】
請求項８記載のポリヌクレオチドを組込んでいるベクター。
【請求項１１】
前記ベクターはさらに、前記ポリヌクレオチドと操作可能に結合して宿主細胞中でそれを発現させる発現制御要素を組込んでいる、請求項１０記載のベクター。
【請求項１２】
請求項１１記載のベクターを組込んでいる宿主細胞。
【請求項１３】
請求項１２記載の宿主細胞を培養する工程を含む、ＳＮＡＲＫプロテインの産生方法。
【請求項１４】
請求項１ないし４のうちのいずれか一項に記載のＳＮＡＲＫプロテインに選択的に結合する抗体。
【請求項１５】
請求項１ないし４のうちのいずれか一項に記載のＳＮＡＲＫプロテインに選択的に結合する検出可能に標識された抗体。
【請求項１６】
ＳＮＡＲＫ活性モジュレータを識別する方法であって、
リン酸化条件下で請求項１ないし４のうちのいずれか一項に記載のＳＮＡＲＫプロテインおよびＳＮＡＲＫ基質と共にＳＮＡＲＫモジュレータの候補を培養する工程、および
その後、ＳＮＡＲＫモジュレータの候補が存在しない対照培養に対して、リン酸化が調節されたか否かを決定する工程を含む方法。
【請求項１７】
ＳＮＡＲＫ発現モジュレータを識別する方法であって、
ＳＮＡＲＫ発現を媒介する条件下で、ＳＮＡＲＫ発現のモジュレータの候補と共にＳＮＡＲＫ産生細胞を培養する工程、および
その後、ＳＮＡＲＫ発現モジュレータの候補が存在しない対照培養に対して、前記ＳＮＡＲＫ発現モジュレータの存在下でＳＮＡＲＫ遺伝子発現またはＳＮＡＲＫプロテイン産生が起こったか否かを決定する工程からなる方法。
【請求項１８】
請求項１６記載の方法に従って識別されたＳＮＡＲＫ活性のモジュレータ。
【請求項１９】
請求項１７記載の方法に従って識別されたＳＮＡＲＫ遺伝子発現モジュレータ。
【請求項２０】
細胞中のＳＮＡＲＫ活性を調節する方法であって、請求項１６記載の方法により識別されたＳＮＡＲＫ活性モジュレータを細胞中に送達する工程を含む方法。
【請求項２１】
請求項１ないし４のうちのいずれか一項に記載のＳＮＡＲＫプロテインと、ＳＮＡＲＫプロテインを哺乳類に送達するために適当なキャリアを含む組成物。
【請求項２２】
ＳＮＡＲＫ抗体と、ＳＮＡＲＫ抗体を哺乳類に送達するために適当なキャリアを含む組成物。
【請求項２３】
請求項２ないし４のうちのいずれか一項に記載のＳＮＡＲＫプロテインの活性を阻害する方法であって、
前記タンパク質を発現する細胞に、
（１）前記ＳＮＡＲＫプロテインをコード化する内因性ポリヌクレオチドとハイブリダイズしてその転写または翻訳を阻止するオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド、および
（２）前記タンパク質に結合するかまたは前記タンパク質と競合してそのリン酸化活性を阻害するポリペプチド
より選択される作用因子を送達する工程を含む方法。
【請求項２４】
請求項２ないし４のうちのいずれか一項に記載のＳＮＡＲＫプロテインの活性を高める方法であって、
前記タンパク質を発現する細胞に、
（１）前記タンパク質をコード化して、それにより前記細胞中での前記タンパク質の濃度を高める発現可能な遺伝子、および
（２）前記細胞中での前記タンパク質の存在を増加させて、それによりタンパク質活性を高めるために有効量の前記タンパク質
より選択される作用因子を送達する工程を含む方法。
【請求項２５】
ＳＮＡＲＫシグナル経路中の下流標的を識別する方法であって、
ＳＮＡＲＫプロテイン、それをコード化する遺伝子、または前記遺伝子の発現のアクチベータを細胞または組織または器官に送達し、そして
その後、処理されていない対応物に対して、前記細胞、組織または器官のプロテオミックまたはゲノミック組成についての前記投与の効果を比較して、それにより前記投与により調節されたタンパク質または遺伝子としてＳＮＡＲＫシグナル経路中の下流標的を識別することを含む方法。
【請求項２６】
（１）請求項１ないし４に記載のＳＮＡＲＫプロテイン、
（２）その断片、
（３）それに選択的な抗体、
（４）それをコード化する遺伝子、または
（５）前記遺伝子の断片
から本質的に選択された化学物質を、その上に固定化された物質。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明の分野
本発明は、分子生物学の分野およびプロテオミクスの出現しつつある分野にある。より特に、ある新規なプロテインキナーゼ、並びにドラッグデリバリーおよび医療診断におけるその用途に関する。
【０００２】
本発明の背景
プロテインキナーゼカスケードは、動物、菌類および植物の間で高度に保存されている。サッカロミセス・セレビジエからのスクロース−非発酵プロテインキナーゼ（ＳＮＦ１）およびその哺乳類対応物：ＡＭＰ活性化されたプロテインキナーゼ（ＡＭＰＫ）は、セリン／スレオニンキナーゼの系統を形成し、そして酵母および哺乳類のストレス応答系における鍵となる成分を表す［１］。キナーゼのこの系統は共通して、栄養奪取を含む細胞ストレスおよび環境のストレスに応答して活性化される。ＳＮＦ１は、炭素源利用に関係した遺伝子を抑制解除することにより、またグルコース新生、呼吸、芽胞形成、熱耐性、ペルオキシソーム生物発生および細胞サイクル調節に関係したグルコース調節された遺伝子の転写を調節することにより、グルコース奪取に応答する［２］。ＡＭＰＫは同様に、細胞内のＡＴＰ：ＡＭＰ比率における増加を生じる環境ストレスにより活性化される。活性化されたＡＭＰＫは、同化経路（例えば、脂肪酸およびコレステロールの合成）を停止し、そしてＡＴＰ生成代謝経路（例えば、脂肪酸酸化）を誘発する［１］。
【０００３】
セリン／スレオニンキナーゼのＳＮＦ１／ＡＭＰＫ系統は、植物［３〜１１］、プラスモジウム・ファルシパルム［１２］、コナミドリ虫類［１３］および哺乳類［１４〜１９］における幾つかのＳＮＦ１／ＡＭＰＫ関連プロテインキナーゼのクローニングに続いて急速に広まっている。これらプロテインキナーゼは主に、ＳＮＦ１およびＡＭＰＫの触媒ドメインでのそれらの構造的類似性に基きＳＮＦ１／ＡＭＰＫ系統に割り当てられる。利用可能な構造データおよび機能データは、ＳＮＦ１、ＡＭＰＫおよび関連キナーゼが、細胞、代謝および環境のストレスに応答して代謝、遺伝子発現および恐らくは細胞増殖を制御するシグナルカスケードの成分を表すという見解で一致する［２０］。
【０００４】
一般に、化学種：ＡＩＣＡＲ（５−アミノイミジゾール−４−カルボキシイミドリボシド）がＡＭＰＫ、並びに筋肉および肝臓のような特定組織においてインシュリン様であり得る代謝応答の下流の組を活性化することが既知である。ＡＭＰＫ系は細胞燃料計として機能するように思われ、細胞のエネルギー状態を観察し、そしてエネルギー枯渇から細胞を保護する。ＡＭＰＫが、細胞のＡＩＣＡＲ処理に続いて検出された全ての下流事象の原因であることは文献では明らかでない。そのような系はしばしば、ＡＭＰＫ系についてのＡＭＰの効果を真似るＡＩＣＡＲで細胞を処理することにより研究される。ＡＩＣＡＲは以前に、ＡＭＰＫの活性化について比較的特異的であると考えられていた。燃料代謝およびエネルギー均衡におけるＡＭＰＫカスケードの中心的な重要性を考慮し、またこのカスケードにおける不均衡から発現する多数の医療状態および障害を考慮すると、その適切な機能のために重要なそれらの成分の理解を広めるのが望ましい。
【０００５】
本発明の要約
今や、ＳＮＡＲＫと命名され、セリンスレオニンプロテインキナーゼのＳＮＦ１／ＡＭＰＫ系統の触媒ドメインに顕著な相同性を有する新規な哺乳類員のキナーゼ系統が識別された。本願で表される結果は、新規なグルコース−およびＡＩＣＡＲ調節ＳＮＡＲＫをＡＭＰＫ関連キナーゼ遺伝子系統として識別し、そしてＳＮＡＲＫが代謝ストレスへの細胞応答の新たなメディエータの候補を表すことを確認する。
【０００６】
その一つの観点において、本発明は、ＲＮＡまたはｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡを含むＤＮＡおよびその合成等価物の形態にあり、配列番号１のＳＮＡＲＫプロテイン、またはヒト染色体１ｑ３２内でコード化されたヒトＳＮＡＲＫプロテインを含むその哺乳類相同体、またはＳＮＡＲＫ活性を保持し、かつ配列番号１のＳＮＡＲＫプロテインと少なくとも７０％、例えば８０％、またより好ましくは少なくとも９０％、例えば９５〜９９％の配列同一性を有する変異体もしくはキメラＳＮＲＡＫタンパク質であるＳＮＡＲＫプロテインをコード化する単離されたポリヌクレオチドを提供する。
【０００７】
本発明により同様に提供されるのは、ＳＮＡＲＫコード化ポリヌクレオチドとハイブリダイズするポリヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドである。そのようなハイブリダイズするポリ−およびオリゴヌクレオチドは所望により検出可能に標識され、またＳＮＡＲＫコード化ポリヌクレオチドの特徴的な領域、またはそのアンチセンス変体への配列相補性を有する。このようなハイブリダイズするポリ−およびオリゴヌクレオチドは、与えられた試料中のＳＮＡＲＫコード化ポリヌクレオチドを検出するために、例えばＳＮＡＲＫコード化ｍＲＮＡまたはＤＮＡをライブラリー中で調査または増幅するために、またはイン・シトゥー（ｉｎ ｓｉｔｕ）での局在化により与えられた組織試料中でＳＮＡＲＫコード化ポリヌクレオチドを識別するために有用である。このようなハイブリダイズするポリ−およびオリゴヌクレオチドは同様に、ＳＮＡＲＫコード化ポリヌクレオチドをの内因性発現を阻止するために、例えば治療介入のためにＳＮＡＲＫ産生を調節するために有用である。本発明の態様において、オリゴヌクレオチドは、ＳＮＦ１／ＡＭＰＫ系統の他の一員の中でも、ＳＮＡＲＫに特徴的な固有のタンパク質配列を含むＳＮＡＲＫプロテインのＣ末端領域をコード化するポリヌクレオチド領域に結合するよう設計される。それ故、本発明の態様において、緊縮条件下で、固有のＣ末端領域についてコードするＳＮＡＲＫコード化ＤＮＡの領域、例えば配列番号１のアミノ酸３１０ないし６３０により構成される領域、またはその相同体の同等の領域、または少なくとも約２０個、例えば望ましくは約４０個のそのヌクレオチドを含むそのサブ領域とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドが提供される。
【０００８】
本発明のポリヌクレオチドは、他の観点において、単離された形態でまたはタンパク質結合体としてＳＮＡＲＫプロテインを産生する発現のために有用である。従って、適当な宿主中でそれを発現させるための発現制御要素と操作可能に結合したＳＮＡＲＫコード化ポリヌクレオチドを組込んでいるベクターが提供される。本発明の関連した観点において、発現可能なＳＮＡＲＫコード化ポリヌクレオチドを組込んでいる細胞宿主が提供される。同様に提供されるのは、ＳＮＡＲＫを産生するために適合された条件下でＳＮＡＲＫ産生宿主を培養する工程からなるＳＮＡＲＫ産生のための方法である。さらなる関連した観点において、ＳＮＡＲＫ産生宿主は、ＳＮＡＲＫ活性のモジュレータについてスクリーニングし、それによりインビトロで、または治療目的のためにインビボでＳＮＡＲＫ活性を調節するために有用な薬剤を識別するために有用である。
【０００９】
ＳＮＡＲＫ相同体を識別するためのプローブとして有用なオリゴヌクレオチドに含まれるのは、少なくとも約８５％である配列番号２の領域と相同性を有するようなＢＬＡＳＴデータベースにおいて報告されたヒトＥＳＴ配列である。このようなオリゴヌクレオチドは、ＮＣＩ＿ＣＧＡＰ＿Ｋｉｄ１１（ｅ−１４６のＥ値で５２５ビットをスコアする。）として報告されたｇｂ／ＡＩ４６９０３３．１／ＡＩ４６９０３３（ｔｉ７０ａ０２．ｘ１）として、およびＮＣＩ＿ＣＧＡＰ＿Ｌｕ５（ｅ−１１７のＥ値で４２６ビットをスコアする。）として報告されたｇｂ／ＡＡ９９５３６０．１／ＡＡ９９５３６０（ｏｒ７４ｂ０３．ｓ１）として参照されるものを含む。本発明はそれ故、ＳＮＡＲＫのヒト相同体であって、そのようなヒトＥＳＴ配列によりコード化されるアミノ酸配列を組込んでいるヒト相同体を包含する。本発明はさらに、ＳＮＡＲＫのヒト相同体をコード化し、そしてそのようなＥＳＴによりコード化されているアミノ酸配列、または本願においてさらに例示されるようなそれと少なくとも約９５％の同一性を有する配列を組込んでいるポリヌクレオチドを包含する。関連した観点において、本発明はさらに、ＳＮＡＲＫコード化ＤＮＡポリヌクレオチドを試料中で検出する方法であって、そのようなヒトＥＳＴ類、およびその拡張されたまたは断片化された形態が所望により標識された形態でプローブとして使用される方法を提供する。
【００１０】
その他の観点において、本発明は、単離された形態で、また所望により検出可能な標識を組込んでいるＳＮＡＲＫプロテインを提供する。そのようなＳＮＡＲＫプロテインは、配列番号１のラットＳＮＡＲＫプロテイン、ヒトＳＮＡＲＫおよびマウスＳＮＡＲＫを含むその哺乳類相同体、ＳＮＡＲＫのそのような哺乳類形態の変異体、並びに触媒ドメインのようなその領域またはドメインが交換されているそのキメラ体の形態にあり得る。ＳＮＡＲＫプロテインはさらに、例えばそれへの抗体を生じるために有用なキャリアを含み得る。さもなくば、ＳＮＡＲＫプロテインは、治療剤としての使用のために、医薬的に許容可能なキャリアと結合され得る。
【００１１】
本発明により同様に提供されるのは、例えばＮ−および／またはＣ−末端切端を有し、例えば抗体が生じさせられることができる免疫性断片を含むか、またはそのＳＮＡＲＫが内因性に関わるシグナルカスケードに関与する結合相手とのＳＮＡＲＫの結合を阻害できる領域を含み、それによりＳＮＡＲＫ活性を低下調節するＳＮＡＲＫ断片である。そのような免疫性断片は、少なくとも約２０個のアミノ酸を含み、また好ましくは配列番号１の残基３１０ないし６３０にわたるＣ末端ＳＮＡＲＫ領域または配列番号１の哺乳類相同体の対応する領域の隣接部分、または一つまたはそれより多く、例えば約１０個の保存アミノ酸置換を有するそのような領域の変異体を組込んでいる。
【００１２】
本発明の他の観点において、同様に提供されるのは、ＳＮＡＲＫに選択的に、好ましくは例えば他のＡＭＰキナーゼに対して優先的に結合する抗体である。ある態様において、これらのＳＮＡＲＫ結合抗体は、検出可能に標識された形態にあり、与えられた試料中でのＳＮＡＲＫの検出を可能にする。さもなくば、ＳＮＡＲＫ抗体は、治療目的のためにインビボで、または薬剤スクリーニングおよび関連した診断目的のためにインビトロでＳＮＡＲＫ活性を調節するために使用される。
【００１３】
その他の観点において、本発明は、ＳＮＡＲＫ活性をアッセイする方法であって、ＳＮＡＲＫプロテインの候補を入手する工程と、ＳＮＡＲＫプロテインをＳＮＡＲＫ基質とリン酸化条件下で保温する工程と、その後、リン酸化が起こったか否かを決定する工程からなり、リン酸化がＳＮＡＲＫプロテインの候補がＳＮＡＲＫ活性を有することを表す方法を提供する。本発明の関連した観点において、アッセイはＳＮＡＲＫ活性モジュレータを識別するために調節されて、ここでＳＮＡＲＫプロテイン、選択されたＳＮＡＲＫ基質およびＳＮＡＲＫ活性のモジュレータの候補はリン酸化条件下で培養され、そしてモジュレータの候補が存在しないリン酸化の度合いに対するモジュレータの候補の存在下でのリン酸化の度合いを決定し、調節活性がモジュレータが存在しないことに対するモジュレータの存在下でのリン酸化における差異により表される。
【００１４】
本発明のこれらおよび他の観点は、添付する図面を参照してより詳細に説明される。
【００１５】
図面の参照
図１：（Ａ）ラット肝臓およびヒトリンパ球から単離したゲノムＤＮＡのサウザンブロット分析。ゲノムＤＮＡ（１５μｇ）を、制限エンドヌクレアーゼＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲＩまたはＨｉｎｄＩＩＩの一つで消化した。ブロットは、ＳＮＡＲＫプロテインの３’−末端に主として対応する１．５ｋｂ断片（≒ｎｔ１４００〜２９２９）とハイブリダイズした。ＤＮＡサイズマーカーのおおよその位置を右に示す。（Ｂ）ヒトＳＮＡＲＫの染色体局在化。ラットＵＶ１２６のｃＤＮＡの４５０ｋｐ断片［２０］を、ＰＩ誘導した人工染色体（ＰＡＣ）ライブラリをスクリーニングするプローブとして使用した。プローブは一つのゲノムＰＡＣを陽性として識別し、そしてこのＰＡＣはヒト染色体１ｑ３２に地図作製された。１ｑ３２での陽性ハイブリダイズシグナル（染色体上の明点として見られる）が、双方の相同体について細胞の＞９０％で示された。
【００１６】
図２：ラットＳＮＡＲＫのヌクレオチドおよび推論されるアミノ酸配列。ＳＮＡＲＫの推論されるアミノ酸配列（配列番号１）を、一文字コードでそれぞれのコードしているヌクレオチド配列（配列番号２）の上に表す。ヌクレオチド番号帰属は右に列挙し、そしてアミノ酸番号帰属は右に下線を引いた数字として表す。タンパク質セリン／スレオニンキナーゼ触媒ドメインを四角で囲む。プロテインキナーゼＡＴＰ結合領域指定は、点線で下線を引く。セリン／スレオニンキナーゼ活性部位指定は、破線で下線を引く。
【００１７】
図３：ラットＳＮＡＲＫの推論されるアミノ酸配列とＳＮＦ１／ＡＭＰＫ系統の他の一員とのＣＬＵＳＴＡＬ・Ｗアルゴリズムを使用するアライメント。プロテインキナーゼ触媒ドメインを四角で囲む。同一の残基をアスタリスクにより示し、また保存置換基を配列の下の点により示す（“：”はスコア＞０．５の強い群の置換基を示し、また“．”は、スコア≦０．５の弱い群の置換基を示す。）。アミノ酸残基は右に番号付けする。
【００１８】
図４：（Ａ）ＳＮＡＲＫのｍＲＮＡの組織分布を表すラット組織のノーザンブロット分析。各ラット組織（固有の列の上に示す。）から単離した全ＲＮＡ１０μｇを電気泳動し、ナイロン膜に転写し、そしてタンパク質コード領域（ｎｔ０〜１９７５）に対応するＳＮＡＲＫ／ｐｃＤＮＡ３．１の断片でプローブし、そしてフィルムに露光した。２８Ｓおよび１８ＳリボソームＲＮＡの位置は、オートラジオグラフの右に示す。（Ｂ）様々なラット組織におけるＳＮＡＲＫの逆トランスクリプターゼ（転写酵素）ＰＣＲ分析。上側のパネルは、ラットの心臓（第１列）、皮膚（第２列）、脾臓（第３列）、腎臓（第４列）、肺（第５列）、肝臓（第６列）、子宮（第７列）、睾丸（第８列）およびＮＲＫＣ細胞（第９列）から生成した第一ストランドｃＤＮＡから生じたＲＴ−ＰＣＲ産生物のエチジウムブロミド染色ゲルを表す。第一ストランドＤＮＡを含まない陰性の対照反応は、プライマー産生物（第１０列）の特異性を確認するために含まれる。下側のパネルは、各組織型から生じたＲＴ−ＰＣＲ産生物のサウザン分析を表す。サウザンブロットは、そのタンパク質コード領域（ｎｔ０〜１９７５）に対応するＳＮＡＲＫの断片とハイブリダイズする。ＤＮＡサイズマーカーの移動の位置を図の右に表す。
【００１９】
図５：（Ａ）ウサギ網状赤血球溶解産物中で転写および翻訳されたＳＮＡＲＫプロテインの分析。第１および２列において、ＴＮＴ反応の１０分の１を８％ポリアクリルアミド−ＳＤＳゲル上に直接付加した。第３〜５列は、サイズ−フラクション化した免疫沈降（ＩＰ）反応である。第３および４列はそれぞれ、ＴＮＴ産生物が存在しないか、またはＴ７−ルシフェラーゼＴＮＴ産生物がＳＮＡＲＫ抗血清＃１４と共に培養された対照ＩＰ反応である。第５列は、ＳＮＡＲＫ抗血清で免疫沈降させたＳＮＡＲＫのＴＮＴを表す。ゲル電気泳動に続き、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルを固定し、乾燥し、そしてバイオマックスＭＳフィルムに強調スクリーンと共に４時間露光した。（Ｂ）安定に形質転換したＢＨＫ細胞中でのＳＮＡＲＫプロテインのウエスタン分析。ＮＲＫＣ細胞抽出物（７５０μｇ、第１列）またはＢＨＫ＋１（第２および３列）およびＢＨＫ＋１１（第４列）の５００μｇを、ＳＮＡＲＫ抗血清＃１４（第１、２および４列）または非免疫血清（第３列）で免疫沈降させ、８％ポリアクリルアミド−ＳＤＳ上で電気泳動し、そしてＰＶＤＦ膜上に転写した。ウエスタン分析を、ＳＮＡＲＫ抗血清＃１６を使用して行った。タンパク質標準の位置をｋＤａで右に表す。ＳＮＡＲＫプロテインの位置をオートラジオグラフの左に列挙した。
【００２０】
図６：ＳＮＡＲＫの自己リン酸化。ＳＮＡＲＫを、野生種ＢＨＫ、ＢＨＫ＋１およびＢＨＫ＋１１の細胞抽出物５００μｇより、ＳＮＡＲＫ抗血清＃１４（第１、２、４および６列）または非免疫血清（第３および５列）で免疫沈降させた。第６列は、ＢＨＫ＋１細胞抽出物５００μｇを含むが抗血清を含まない陰性免疫沈降反応対照である。免疫沈降物を［γ］−ＡＴＰ３２と共に３０℃で培養し、そして反応を３０分後、２×ＳＤＳ付加緩衝液の添加および５分間の煮沸により停止した。試料を８％ポリアクリルアミド−ＳＤＳゲル上で電気泳動し、そしてゲルを乾燥し、バイオマックスＭＳフィルムに露光した。
【００２１】
図７：ＳＮＡＲＫプロテインはＡＭＰＫ様ホスホトランスフェラーゼ活性を有する。ＳＮＡＲＫプロテインを、野生種ＢＨＫ、ＢＨＫ−１、ＢＨＫ＋１およびＢＨＫ＋１１細胞からの細胞溶解物５００μｇより免疫沈降させた。キナーゼアッセイを、２００μＭのＳＡＭＳペプチドを基質として使用してキナーゼ反応カクテル中で行った。ＮＲＫＣ細胞（点描四角）、野生種ＢＨＫ細胞（塗りつぶした四角）、ＢＨＫ＋１および＋１１細胞（細い平行線を引いた四角）。結果は二つの実験についての平均値±Ｓ．Ｅ．Ｍ．である（各時ｎ＝５）。比較目的のために、ＡＭＰＫα２活性をこれらの細胞系においてアッセイし、そしてそれぞれ、野生種ＢＨＫ、ＳＮＡＲＫトランスフェクションしたＢＨＫおよびＮＲＫＣ細胞系における基底成長条件下で測定されたＳＮＡＲＫ活性と同一、４倍低い、および１．５倍低いことが判明した（データは示さず）。
【００２２】
図８：（Ａ）ＡＩＣＡＲを使用するＮＲＫＣ細胞中でのＳＮＡＲＫの活性化。ＮＲＫＣ細胞を０、０．５ｍＭ、１ｍＭまたは２ｍＭのＡＩＣＡＲで１時間処理した。ＳＮＡＲＫプロテインを細胞溶解物５００μｇからＳＮＡＲＫ抗血清で免疫沈降させ、そしてキナーゼアッセイを２００μＭのＡＭＰの存在下、ＳＡＭＳペプチドを使用して行った。塗りつぶした四角は対照（０ｍＭのＡＩＣＡＲ）試料を表し、そして細い平行線を引いた四角はＡＩＣＡＲ処理した試料を表す。データを対照値（対照＝１）に対するホスホトランスフェラーゼ活性として示し、そして実験の一群当り少なくとも１０試料を有する二つの個々の実験についての平均値±Ｓ．Ｅ．Ｍ．で表す。対照値に対して＊ｐ＜０．０６。同じアッセイ条件を使用すると、基底ＡＭＰＫ−α２活性はＳＮＡＲＫ活性より１．５倍低く、またＮＲＫＣ細胞中での１ｍＭのＡＩＣＡＲでの処理により少なくとも２倍増加したことが判明した（データは示さず）。基底ＡＭＰＫα１活性は、基底ＳＮＡＲＫ活性より８８倍高いことが判明したが、ＡＩＣＡＲでの処理により促進されなかった（データは示さず）。（Ｂ）グルコース奪取から生じる野生種ＢＨＫ細胞中でのＳＮＡＲＫの活性化。野生種ＢＨＫ細胞をグルコースを含まない培地に０または９０分間暴露した。ＳＮＡＲＫを免疫沈降させ、そしてキナーゼアッセイを、ＳＡＭＳペプチドを基質として使用してＡＭＰの存在下で行った。塗りつぶした四角は対照（２５ｍＭグルコース）試料を表し、また細い平行線を引いた四角はグルコース奪取試料を表す。結果は対照値（対照＝１）に対するホスホトランスフェラーゼ活性として表し、実験の一群当り少なくとも１０試料を有する二つの個々の実験からの平均値±Ｓ．Ｅ．Ｍ．を表す。対照値に対して＊ｐ＜０．０３。野生種ＢＨＫ細胞中で測定した基底ＡＭＰＫα２活性レベルは、これらの細胞中で検出された基底ＳＮＡＲＫ活性に匹敵した（データは示さず）。
【００２３】
図９は、アミノ酸レベルで、ラットＳＮＡＲＫの１〜２５１領域を、双方インシリコスクリーニングにより識別された（Ａ）ヒトポリヌクレオチドによりコード化されたアミノ酸配列、および（Ｂ）マウスポリヌクレオチドのアミノ酸配列と比較する。各図の上部に与えられるのは、識別された相同体についての登録番号、および入手可能な対応する引用文献である。
【００２４】
図１０は、（１）（Ａ）ヒト細胞系ＨａＣａＴから単離したＳＮＡＲＫコード化ＤＮＡの配列決定により決定された配列ギャップを有するヒトゲノムデータベースとの相関、（Ｂ）ヒトｍＲＮＡデータベースとの相関を含む、ラットＳＮＡＲＫコード化ｃＤＮＡの完全配列で、および（２）（Ｃ）ヒトＥＳＴデータベースとの相関を含むラットＳＮＡＲＫプロテインのアミノ酸配列でサーチすることによる、ラットＳＮＡＲＫコード化ＤＮＡと、インシリコで識別したヒトゲノムＲＮＡまたはｃＤＮＡ起源のポリヌクレオチドとの比較を与える。図１０（Ｄ）は、ラットＳＮＡＲＫコード化ＤＮＡとＨａＣａＴ細胞系からクローニングしたヒトＳＮＡＲＫをコード化する配列との比較を与える。各図の上部に与えたのは、識別した相同体についての登録番号、および入手可能な対応する引用文献である。
【００２５】
図１１は、（１）（Ａ）マウスハイスループットゲノムデータベースとの相関、（Ｂ）マウスｎｒデータベースとの相関を含む、ラットＳＮＡＲＫコード化ｃＤＮＡの完全配列で、および（２）（Ｃ）および（Ｄ）マウスＥＳＴデータベースとの相関を含むラットＳＮＡＲＫプロテインのアミノ酸配列でサーチすることによる、ラットＳＮＡＲＫコード化ＤＮＡと、インシリコで識別されたマウスゲノムＲＮＡまたはｃＤＮＡ起源のポリヌクレオチドとの比較を与える。図１１（Ｅ）は、ラットＳＮＡＲＫコード化ＤＮＡとヘアレスマウスからクローニングしたマウスＳＮＡＲＫをコード化する配列との比較を与える。各図の上部に与えたのは、識別した相同体についての登録番号、および入手可能な対応する引用文献である。
【００２６】
本発明の詳細な説明および好ましい態様
本発明は、ＳＮＦ１／ＡＭＰＫセリン／スレオニンプロテインキナーゼの系統に関連し、ＳＮＡＲＫと命名された新規な哺乳類形態のキナーゼに関する。ある態様において、ＳＮＡＲＫプロテインは“単離された”形態で、即ち、ＳＮＡＲＫの形態が通常に関連しているタンパク質から本質的に遊離した形態で与えられる。
【００２７】
図２に示すように、ＳＮＡＲＫプロテインのラット形態は、６３０個のアミノ酸を含む（配列番号１）。図２で識別されるのは、プロテインセリン／スレオニンキナーゼ触媒ドメイン（四角で囲まれている）、プロテインキナーゼＡＴＰ結合領域指定（点線で下線が引かれている）、およびセリン／スレオニンキナーゼ活性部位（破線で下線が引かれている）を示す共通領域である。
【００２８】
ラットＳＮＡＲＫおよびＳＮＦ１／ＡＭＰＫ系統の他の一員のＣＬＵＳＴＡＬ・Ｗアルゴリズムを使用する推論されるアミノ酸配列のアライメントが図３に表される。プロテインキナーゼ触媒ドメインは四角で囲まれている。アスタリスクは同一の残基を示し、また保存置換基は配列の下の点により示される。アミノ酸残基は右に番号付けされる。それぞれの比較配列の登録番号は、ｐ７８（ＰＩＲ，ｓ２７９６６）、ｅｍｋ（ＰＩＲ，ｓ３１３３３）、ＳＩＫ（ｇｂ，ＡＢ０２０４８０）、ＳＮＦ１（ＰＩＲ，ａ２６０３０）およびＡＭＰＫ（ｇｂ，ｚ２９４８６）である。
【００２９】
このようにして、一つの態様において、本発明は配列番号１により識別されるＳＮＡＲＫプロテインを包含する。本発明はまた、ヒト相同体およびマウス相同体を含むＳＮＡＲＫ相同体、およびＳＮＡＲＫの機能活性を保持するＳＮＡＲＫの変異体およびキメラ体を包含する。ＳＮＡＲＫの変異体は、ＳＮＡＲＫリン酸化活性のようなＳＮＡＲＫ機能を損なわないアミノ酸置換、挿入または欠失を組込むことによりＳＮＡＲＫ相同体に対して異なるＳＮＡＲＫプロテインを含む。一般に、そのような変更は、ＳＮＡＲＫの一時構造の約１０％以上に影響しないだろう。例えば、アミノ酸置換、欠失または挿入は一般に、２０個以上のアミノ酸、例えば１０個以上のアミノ酸が関わらないだろう。本発明の態様において、ＳＮＡＲＫ相同体または変異体は、配列番号１を有するＳＮＡＲＫに対して少なくとも７０％、例えば少なくとも８０％の同一性を共有する。ＳＮＡＲＫのＣ末端領域はタンパク質の特に固有な領域であり、図３に表すように、その３１０〜６３０ではＳＮＦ１／ＡＭＰＫ系統の他の一員の類似して位置する領域と殆ど相同性を有さない。従って、好ましい態様において、ＳＮＡＲＫプロテインの変異体は少なくとも９０％の同一性、またより好ましくは少なくとも９５％、例えば９８％〜９９％の同一性をＳＮＡＲＫのこの３１０〜６３０領域と共有する。これ関して、好ましいＳＮＡＲＫ変異体は、Ｃ末端ＳＮＡＲＫ領域と記載した同一性を有し、かつ配列番号１のＳＮＡＲＫに対して少なくとも８０％の全体の同一性、またより好ましくは９０％のアミノ酸配列同一性を有するものである。最も好ましいＳＮＡＲＫ変異体は、それに対して少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有するものである。哺乳類ＳＮＡＲＫプロテインは、より保存されている機能性Ｎ末端キナーゼドメインと比較して、ＳＮＡＲＫプロテインのＣ末端領域においてより大きい度合いのアミノ酸変異を示し得ることが認識されている。
【００３０】
“ＳＮＡＲＫ活性”を示すタンパク質は、（１）天然のげっ歯類またはヒトＳＮＡＲＫに対する抗血清により認識され、（２）天然のげっ歯類またはヒトＳＮＡＲＫにより同様に認識されるＳＡＭＳのような合成または天然基質に対するリン酸化活性を示し、そして（３）以下の基質選択性の階級順位：ＳＡＭＳ＞ＭＢＰ＞Ｂ−カゼイン＞全ヒストン画分＞硫酸プロタミンを示すタンパク質として定義される。ＳＮＡＲＫ活性を示すそのようなタンパク質は、図２および３に概説されるように、ラットＳＮＡＲＫの保存機能性キナーゼドメイン内で、少なくとも７５％のアミノ酸同一性、またより望ましくは少なくとも９０％の同一性を示すとして、さらに構造的に特徴付けられることができる。
【００３１】
本発明の態様において、ＳＮＡＲＫプロテインは、配列番号１のヒト相同体である。ある態様において、ヒト相同体は、高い相同性（値＞２００）ＥＳＴによりコード化されたアミノ酸配列、および配列番号２のラットＳＮＡＲＫのＤＮＡに対してサーチすることによる公共のＢＬＡＳＴまたは類似データベースにおいて識別可能なゲノムクローンを組込んでいる。そのようなヒトＥＳＴの例は、登録番号ＡＩ４６９０３３．１およびＡＡ９９５３６０．１としてＧｅｎＢａｎｋにおいて報告され、そしてそれぞれＩＭＡＧＥクローン２１３７３２２および１６０１５４９として利用可能なものである。そのようなクローンの配列は、図１０においてＳＮＡＲＫコード化ＤＮＡについて遺伝子地図作製されている。本発明の特別な態様において、ＳＮＡＲＫプロテインは、その全体の配列内で、図９Ａに記載された２５１個のアミノ酸配列を組込んでいるヒト相同体、またはＳＮＡＲＫ活性を損なわないアミノ酸変更を組込んでいるその変異体である。他の特別な態様において、ヒトＳＮＡＲＫプロテインは、図１０Ａ、１０Ｂ、１０Ｃおよび１０Ｄにおいて表されたポリヌクレオチドのコード化領域の一つまたはそれ以上によりコード化されたアミノ酸配列を組込んでいる。
【００３２】
ヒトＳＮＡＲＫプロテインは、公共のドメインまたは私設のデータベースにおいて識別されたコード化された遺伝子配列により特徴付けられ、またげっ歯類およびヒトＳＮＡＲＫ内の保存ドメインに向けられた抗血清により認識される。ヒトＳＮＡＲＫプロテインは、図９で表される配列アライメントにより例示されるように、鍵となる機能性キナーゼドメインでげっ歯類ＳＮＡＲＫと７５％、また適当には、９０％のアミノ酸同一性を示すと予期される。ヒトＳＮＡＲＫプロテインはまた、下記の表１で表されるように、ラットＳＮＡＲＫにより示される同じ度合いの基質特異性を示す。
【００３３】
このようなヒト相同体をコード化する完全でかつ全長のｃＤＮＡのヌクレオチド配列の入手はさもなくば、適当なｃＤＮＡライブラリ、例えば皮膚または心臓のような筋肉組織、または本願で例示される手法においてＨａＣａＴ細胞系から入手されたケラチン合成細胞から生成されたｃＤＮＡライブラリをスクリーニングすることにより達成される。組織は望ましくは、ヒトＳＮＡＲＫ発現を誘発するように、ローゼン等［２０］により報告された方法において最初に照射される。ライブラリのスクリーニングは、ＳＮＡＲＫ配列番号２で、上記されたＥＳＴおよびゲノムＥＳＴに対応する配列で、またはそのあらゆる主要なハイブリダイズ断片で標識探査することにより達成される。さもなくば、ヒトＳＮＡＲＫ相同体は、本願で与えられるラットＳＮＡＲＫ配列を使用して、ヒトＤＮＡデータベースをスクリーニングして、ヒトＳＮＡＲＫ相同体として識別されることができる以前に未知であったヌクレオチド配列を識別するすることにより入手され得る。この可能性の一つの例として、我々は、登録番号ＡＩ４６９０３３．１およびＡＡ９９５３６０．１としてＧｅｎＢａｎｋに報告され、部分的なヒトＳＮＡＲＫコード化配列をコード化するｃＤＮＡに対応するヒトＥＳＴを識別する。ヒトＳＮＡＲＫ配列の残部は、ｃＤＮＡクローニング、ＲＴ−ＰＣＲ、または本願で提供された情報を使用するさらなる追加のデータベースサーチにより得られることができる。より特に、ヒトＳＮＡＲＫの配列コード化領域は図１０に与えられる。
【００３４】
望ましくは、ＳＮＡＲＫ変異体は、ＳＮＡＲＫにより所有される自己リン酸化の特性を保持する。そのようなＳＮＡＲＫ活性は、本願で記載される自己リン酸化アッセイを使用して評価されることができる。
【００３５】
記載したように、本発明はさらに、染色体部位１ｑ３２上にコード化されたヒト相同体、および緊縮条件下で配列番号２のＳＮＡＲＫとハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコード化された他の哺乳類相同体を含む配列番号１で識別されたＳＮＡＲＫプロテインの相同体を包含する。
【００３６】
他の態様において、本発明は、その全体の配列内に、図９Ｂで記載する２５１個のアミノ酸配列を組込んでいる配列番号１のラットＳＮＡＲＫのマウス相同体、またはＳＮＡＲＫ活性を損なわないアミノ酸変更を組込んでいるその変異体を与える。より特別な態様において、マウスＳＮＡＲＫプロテインは、図１１Ａないし１１Ｅで表されるポリヌクレオチドの非ラットコード領域の一つまたはそれ以上によりコード化されるアミノ酸配列を組込んでいる。マウスＳＮＡＲＫプロテインはまた、図９で表される配列アライメントにより例示されるように、鍵となる機能性キナーゼドメインでラットＳＮＡＲＫと７５％、また適当には９０％のアミノ酸同一性を示す。マウスＳＮＡＲＫプロテインはまた、下記の表１で表されるように、ラットＳＮＡＲＫについて特徴付けられる基質特異性の同じ度合いおよび階級順位を示す。
【００３７】
本発明はまた、ＳＮＡＲＫプロテインのキメラ変異体に関する。そのようなキメラＳＮＡＲＫプロテインは、与えられたＳＮＡＲＫプロテインの選択された領域が、ＳＮＡＲＫ相同体からの対応する領域により置換または交換されたハイブリッドＳＮＡＲＫプロテインである。交換に適当なそのような領域は、例えばキナーゼ触媒ドメイン、またはＡＴＰ−結合領域またはセリン／スレオニンキナーゼ活性部位を含み、それら全てはラットＳＮＡＲＫについて図２で表される。そのようなキメラＳＮＡＲＫプロテインは予期されるようにＳＮＡＲＫ活性を保持し、しかしそのような機能は、所望により異なるＳＮＡＲＫ背景で評価されることを可能にする。従って、本発明の態様において、ＳＮＡＲＫの一つの形態の機能性ドメインまたは領域がＳＮＡＲＫ相同体からの対応する領域により置換されているキメラＳＮＡＲＫプロテインが与えられる。
【００３８】
本発明はまた、様々な目的のために有用な、配列番号１のＳＮＡＲＫの断片、およびそれぞれ図９Ａおよび９Ｂで表されるヒトおよびマウスＳＮＡＲＫの相同性対応物断片を含む、ＳＮＡＲＫ断片を包含する。一つの態様において、本発明は、ＳＮＡＲＫエピトープに対応し、例えばラットＳＮＡＲＫのアミノ酸３１０〜６３０にわたるそのＣ末端領域内でのそのような鎖の領域、並びにヒトおよびマウスＳＮＡＲＫのような相同体の領域を含む少なくとも約５、例えば少なくとも約２０個の隣接するアミノ酸、また適当には約２００個以上までのアミノ酸を組込んでいる免疫性断片を含む。さもなくば、そのような断片は、上記されたＥＳＴにより、または特に図１０および１１で表されたヒトおよびマウスポリヌクレオチドによりコード化されたアミノ酸配列を有し得る。
【００３９】
本発明はまた、ＳＮＡＲＫをコード化する、またはＳＮＡＲＫ変異体またはキメラをコード化するポリヌクレオチドを包含する。従って、ＳＮＡＲＫ、並びにその変異体およびキメラ体のアミノ酸配列をコード化するあらゆる核酸配列は、ＳＮＡＲＫプロテインを発現する組換え分子を産生するために使用されることができる。特別な態様において、本発明は、図２でＳＮＡＲＫコード化領域として示され、そして本願で配列番号２（即ち、ヌクレオチド８３〜１９７５）と命名される核酸配列からなるポリヌクレオチドを包含する。
【００４０】
同様に本発明に包含されるのは、ヒトＳＮＡＲＫをコード化するポリヌクレオチドである。そのようなポリヌクレオチドは、ラットＳＮＡＲＫのコード領域と相同性を有する図１０で表されるその部分配列を含む。
【００４１】
本発明はまた、マウスＳＮＡＲＫをコード化するポリヌクレオチドを含む。そのようなポリヌクレオチドは、ラットＳＮＡＲＫのコード領域と相同性を有する図１１で表されるその部分配列を含む。
【００４２】
遺伝子コードの縮退の結果として、ＳＮＡＲＫをコード化する多数のヌクレオチド配列であって、幾つかはあらゆる既知および天然発生遺伝子のヌクレオチド配列に対して最小限の同一性を有するものが産生され得ることが当業者により認められる。それ故、本発明は、可能なコドン選択をベースとする組み合わせを選択することにより製作されることができるヌクレオチド配列の各々どれもこれもの可能な変異体を考慮する。これらの組み合わせは、天然発生ＳＮＡＲＫのヌクレオチド配列に適用される標準トリプレット遺伝子コードに従って為される。
【００４３】
ＳＮＡＲＫおよびその変異体をコード化するヌクレオチド配列は好ましくは、緊縮の適当に選択された条件下で天然発生ＳＮＡＲＫのヌクレオチド配列にハイブリダイズすることができるけれども、ＳＮＡＲＫまたは実質的に異なるコドン使用を有するその誘導体をコード化するヌクレオチド配列を産生することが有利であり得る。コドンは、特別なコドンが宿主により利用された頻度に従ってペプチドの発現が特に原核または真核宿主で起こる比率を増加するように選択され得る。コード化されたアミノ酸配列を変更すること無くＳＮＡＲＫをおよびその誘導体をコード化するヌクレオチド配列を実質的に変更するための他の理由は、天然発生配列から産生された転写物より望ましい特性、例えばより長い半減寿命を有するＲＮＡ転写物の産生を含む。
【００４４】
本発明はまた、ＳＮＡＲＫおよびその断片をコード化するＤＮＡ配列、またはその断片の全体として合成化学による製造を包含する。製造後、合成配列は、多くの利用可能な発現ベクターおよび細胞系中に、当該技術に良く知られている試薬を使用して挿入され得る。さらに、合成化学は、突然変異をＳＮＡＲＫをコード化する配列またはそのあらゆる断片中に導入するために使用され得る。
【００４５】
本発明により同様に包含されるのは、（１）配列番号２のＳＮＡＲＫに、またはそれぞれＳＮＡＲＫをコード化するヒトおよびマウス遺伝子内の代表的な相同性領域として図１０および１１で表されるポリヌクレオチドに、またはその相補体に、ワール，Ｇ．Ｍ．およびＳ．Ｌ．バーガー（１９８７； Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． １５２：３９９−４０７）およびキンメル，Ａ．Ｒ．（１９８７； Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． １５２：５０７−５１１）に教示されるような緊縮の様々な条件下でハイブリダイズすることができるポリヌクレオチド配列、および特に全長ＳＮＡＲＫコード化配列である。“緊縮条件”または“緊縮”は、実質的に関連する核酸配列のハイブリダイズを可能にする条件に関する。例えば、そのような条件は一般に、少なくとも約８５％の配列同一性、好ましくは少なくとも約９０％の配列同一性、より好ましくは少なくとも約９５％の配列同一性を有する配列のハイブリダイズを可能にするだろう。全長ＳＮＡＲＫコード化配列をコード化するポリヌクレオチドは、発現されたとき、自己リン酸化およびＡＩＣＡＲに対する応答を含む一つまたはそれ以上のＳＮＡＲＫ活性を有するタンパク質を生じるものである。
【００４６】
ＳＮＡＲＫをコード化するポリヌクレオチドは、部分ヌクレオチド配列を利用し、そして当該技術に既知である様々な方法を用いて、プロモータおよび調節要素のような上流配列を検出することにより延長され得る。例えば、用いられ得る一つの方法：“制限−部位”ＰＣＲは、既知の遺伝子座に隣接する未知の配列を検索するためにユニバーサルプライマーを使用する（サルカー，Ｇ．、（１９９３） ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ａｐｐｌｉｃ． ２：３１８−３２２）。特に、ヒトＳＮＡＲＫが遺伝子地図作成された１ｑ３２領域のようなゲノムＤＮＡは、リンカー配列に対するプライマーおよび既知の領域に特異的なプライマーの存在下で最初に増幅される。増幅された配列はその後、同じリンカープライマーおよび最初のものに対して異なる特異的プライマーとの第二回のＰＣＲに供される。各回のＰＣＲの産生物は適したＲＮＡポリメラーゼで転写され、そして逆トランスクリプターゼを使用して配列決定される。
【００４７】
逆ＰＣＲもまた、既知の領域をベースとする開散プライマーを使用して配列を増幅または延長するために使用され得る（トリグリア，Ｔ．等、（１９８８） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １６：８１８６）。プライマーは、ＯＬＩＧＯ４．０６プライマー分析ソフトウェア（ナショナル・バイオサイエンセズ・インコーポレイテッド、プリムス、ミネソタ）、または他の適したプログラムのような市販で入手可能なソフトウェアを使用し、長さが２２〜３０ヌクレオチドとなり、５０％またはそれ以上のＧＣ含有量を有し、そして標的配列に約６８℃〜７２℃の温度（実際には、ＳＮＡＲＫについて５３℃（マウス）〜７２℃（延長物）の間）でアニールするように設計され得る。そのような方法は、遺伝子の既知の領域における適当な断片を生成するために、幾つかの制限酵素を使用する。断片はその後、分子内結合により環化され、そしてＰＣＲテンプレートとして使用される。
【００４８】
ＳＮＡＲＫ相同体を局在化するために使用され得る他の方法は、パーカー，Ｊ．Ｄ．等（１９９１； Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １９：３０５５−３０６０）のものである。加えて、ゲノムＤＮＡを探索するためにＰＣＲ、入れ子プライマー、およびＰＲＯＭＯＴＥＲＦＩＮＤＥＲライブラリを使用し得る（クローンテック、パロ・アルト、カリフォルニア）。この方法は、ライブラリをスクリーニングする必要を回避し、そしてイントロン／エクソン接合点を見出すことに有用である。さもなくば、また上記したように、市販で入手可能でかつ現在でのルーチンソフトウェアおよびサーチエンジンが、核酸の公共のデータベースおよびポリペプチドデータベースをサーチして、密接に一致した配列を識別することにより、例えばＳＮＡＲＫ活性を有しそうな相同性配列を識別するために使用されることができる。
【００４９】
例えば、全長ＳＮＡＲＫ相同体を見出すために全長ｃＤＮＡについてスクリーニングするとき、より大きなｃＤＮＡを含むようにサイズ選択されたライブラリを使用することが好ましい。同様に、遺伝子の５’領域を含むより多くの配列を含むので、ランダムにプライムされたライブラリが好ましい。ランダムにプライムされたライブラリの使用は、オリゴｄ（Ｔ）ライブラリが全長ｃＤＮＡを与えない状況について特に好ましいかもしれない。ゲノムライブラリは、５’非転写調節領域への配列の延長のために有用であり得る。
【００５０】
さらなるＳＮＡＲＫ相同体についてのスクリーニングは、標準ハイブリダイゼーションまたは増幅技術を組織誘導されたポリヌクレオチドライブラリに適用することにより達成することができる。広範囲にわたる様々なそのようなライブラリが市販で入手可能である。ｃＤＮＡライブラリの構築が必要である場合、確立された技術が適用される。例えば、ＳＮＡＲＫ相同体の単離は典型的に、新鮮な組織源からの全メッセンジャーＲＮＡの抽出を必要とするだろう。これに関して、睾丸およびある他の組織は内因的に欠失された形態を伴うけれども、ＳＮＡＲＫ遺伝子の単一複写は全ての組織で発現されているようであることが注目される。メッセージのｃＤＮＡの転換に続き、ライブラリが例えばバクテリアプラスミド、より典型的にはバクテリオファージ中で形成されることができる。ＤＮＡの断片を抱えるそのようなバクテリオファージは典型的に、個々のファージ小片またはコロニーが単離されることができるように、感受性Ｅ．ｃｏｌｉバクテリアのローン上にプレート化することにより成長される。ファージコロニーにより伴われるＤＮＡはその後典型的に、ニトロセルロースまたはナイロンをベースとするハイブリダイゼーション膜上に固定化され、そしてその後、注意深く制御された条件下でハイブリダイズして、特に関心のあるＤＮＡ挿入、この場合ラットＳＮＡＲＫの相同体を伴う特定のファージコロニーを識別するために、放射性（または他の）標識されたプローブ配列にハイブリダイズする。関心のある特別な遺伝子を伴うファージはその後、外来遺伝子がより容易に特徴付けられるように、ライブラリからの全ての他のファージから精製される。典型的に、遺伝子またはその一部はその後、特にそのＤＮＡ配列の完全な決定に関して、都合良くプラスミドベクター中にサブクローニングすることにより単離される。
【００５１】
本発明のヌクレオチド配列は、限定されずに、遺伝子生成物のクローニング、処理および／または発現を調節する変更を含む様々な理由のために、ＳＮＡＲＫコード化配列を変更するために当該技術に一般に知られている方法を使用して改変されることができる。ランダム断片化並びに遺伝子断片および合成オリゴペプチドのＰＣＲ再組立によるＤＮＡシャフリング（混成）は、ヌクレオチド配列を改変するために使用され得る。例えば、部位特定突然変異導入法は新規な制限部位を挿入する、グリコシル化パターンを変更する、コドン選択性を変化させる、スプライス変異体を製造する、突然変異を挿入する等のために使用され得る。
【００５２】
本発明の他の態様において、ＳＮＡＲＫをコード化する天然、変性または組換核酸配列は、融合タンパク質をコード化するために、異種配列に接合され得る。例えば、モジュレータ、即ちＳＮＡＲＫ活性の阻害剤またはアクチベータについてペプチドライブラリをスクリーニングするために、市販で入手可能な抗体により認識されることができるキメラＳＮＡＲＫプロテインをコード化することが有用であり得る。融合タンパク質はまた、ＳＮＡＲＫコード化配列と異種タンパク質配列との間に位置する開裂部位を含み、それによりＳＮＡＲＫが開裂され、そして異種部分から精製され得るように改変され得る。
【００５３】
他の態様において、ＳＮＡＲＫをコード化する配列並びにその変異体およびキメラ体は、当該技術に既知の化学方法（カルタース，Ｍ．Ｈ．等、（１９８０） Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． Ｓｙｍｐ． Ｓｅｒ． ７：２１５−２２３、ホーン，Ｔ．等、（１９８０） Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． Ｓｙｍｐ． Ｓｅｒ． ７：２２５−２３２）を使用して全体または部分的に合成され得る。さもなくば、タンパク質自身が、ＳＮＡＲＫ、またはその断片のアミノ酸配列を合成するための化学方法を使用して産生され得る。例えば、ペプチド合成は、様々な固相技術（ロバージ，Ｊ．Ｙ．等、（１９９５） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６９：２２０−２０４）を使用して行われることができ、また例えば、ＡＢＩ４３１Ａペプチド合成機（パーキン・エルマー）を使用する自動化合成が達成され得る。
【００５４】
本発明の他の観点において、ＳＮＡＲＫ、その変異体、キメラ体およびこれらの断片をコード化するポリヌクレオチド配列またはそのフラグメントは、適した宿主細胞中でのその発現に向けた組換ＤＮＡ分子において使用され得る。生物学的に活性なＳＮＡＲＫを発現するために、ＳＮＡＲＫまたはその変異体もしくはキメラ体をコード化するヌクレオチド配列は、適した発現ベクター、即ち、挿入されたコード配列の転写および翻訳のために必要な要素を含むベクター中に挿入され得る。
【００５５】
当業者に良く知られている方法は、ＳＮＡＲＫをコード化する配列並びに適した転写および翻訳制御要素を含む発現ベクターを構築するために使用され得る。これらの方法は、インビトロ組換ＤＮＡ技術、合成技術およいインビボ遺伝子組換を含む。そのような技術は、サンブルック，Ｊ．等、（１９８９） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、コールド・スプリング・ハーバー・プレス、プレーンビュー、ニューヨークおよびアウスベル，Ｆ．Ｍ．等、（１９８９） Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、ジョン・ウイリー＆サンズ、ニューヨーク、ニューヨークに記載される。
【００５６】
様々な発現ベクター／宿主系が、ＳＮＡＲＫをコード化する配列を含みそして発現するために利用され得る。これらは、限定されずに、組換バクテリオファージ、プラスミドまたはコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換されたバクテリアのような微生物、酵母発現ベクターで形質転換された酵母、ウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）で感染された昆虫細胞系、ウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス：ＣａＭＶ、タバコモザイクウイルス：ＴＭＶ）で、またはバクテリア発現ベクター（例えば、ＴｉまたはｐＢＲ３２２プラスミド）で形質転換された植物細胞系、または動物細胞系を含む。本発明は、用いられる宿主細胞により制限されない。
【００５７】
“制御要素”または“調節配列”は、ベクターエンハンサ、プロモータ、５’および３’未翻訳領域であり、宿主細胞タンパク質と相互作用して転写および翻訳を行う非翻訳領域である。そのような要素は、その強度および特異性を変更し得る。利用されるベクター系および宿主に依存して、構成的および誘導的プロモータを含むあらゆる数の適当な転写および翻訳要素が使用され得る。例えば、バクテリア系中でクローニングするとき、ＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴファージミド（ストラタジーン、ラホイラ、カリフォルニア）またはＰＳＰＯＲＴ１プラスミド（ギブコＢＲＬ）等のハイブリッドｌａｃＺプロモータのような誘導性プロモータが使用され得る。バキュロウイルスポリヘドリンプロモータは昆虫細胞中で使用され得る。植物細胞のゲノム（例えば、ヒートショック、ＲＵＢＩＳＣＯ、および貯蔵タンパク質遺伝子）から、または植物ウイルス（例えば、ウイルスプロモータまたはリーダー配列）から誘導されたプロモータまたはエンハンサは、ベクター中にクローニングされ得る。哺乳類細胞系において、哺乳類遺伝子または哺乳類ウイルスからのプロモータが好ましい。ＳＮＡＲＫをコード化する配列の複数の複写物を含む細胞系を生成する必要がある場合、ＳＶ４０またはＥＢＶをベースとするベクターが、適した選択可能マーカと共に使用され得る。
【００５８】
バクテリア系において、多数の発現ベクターが、ＳＮＡＲＫについて意図される使用に依存して選択され得る。例えば、大量のＳＮＡＲＫが抗体の誘導のために必要とされるとき、容易に精製される融合タンパク質の高濃度発現に向けたベクターが使用され得る。そのようなベクターは、限定されずに、多機能性Ｅ．ｃｏｌｉクローニングおよびＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴファージミド（ストラタジーン）のような発現ベクターを含み、そこでは、ＳＮＡＲＫをコード化する配列は、ハイブリッドタンパク質が製造されるように、β−ガラクトシダーゼのアミノ基末端Ｍｅｔおよび引き続く７残基についての配列と組み合わせてベクター、ｐＩＮベクター（バンヒーク，ＧおよびＳ．Ｍ．シュスター、（１９８９） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６４：５５０３−５５０９）等中に接合され得る。ＰＧＥＸベクター（プロメガ、マディソン、ウイスコンシン）はまた、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）との融合タンパク質として外来ポリペプチドを発現するために使用され得る。一般に、そのような融合タンパク質は可溶であり、そしてグルタチオン−アガロースビーズへの吸着、および続く遊離グルタチオンの存在下での溶出により溶解細胞から容易に精製されることができる。そのような系において作製されたタンパク質は、へパリン、トロンビン、Ｘａ因子開裂部位を含むように設計されているので、関心のあるクローニングされたポリペプチドが任意にＧＳＴ部分から開放されることができる。
【００５９】
酵母、サッカロミセス・セレビジエにおいて、α因子、アルコールオキシダーゼ、およびＰＧＨのような構成的または誘発的プロモータを含む多くのベクターが使用され得る。参考として、アウスベル等（上記）およびグラント等、（１９８７） Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． １５３：５１６−５４４を参照する。
【００６０】
昆虫系はまた、ＳＮＡＲＫを発現するために使用され得る。例えばそのような系の一つにおいて、オートグラファカリフォルニア核ポリヘロドロシスウイルス（ＡｃＮＰＶ）が、スポドプテラ・フルジベルダ細胞またはトリクロプルジア・ラルバ中で外来遺伝子を発現するためのベクターとして使用される。ＳＮＡＲＫをコード化する配列はポリヘドリン遺伝子のようなウイルスの非必須領域中にクローニングされ、そしてポリヘドリンプロモータの制御下に置かれ得る。ＳＮＡＲＫの成功した挿入は、ポリヘドリン遺伝子を不活化し、そしてコートタンパク質を失った組換ウイルスを産生するだろう。組換ウイルスはその後、例えば、ＳＮＡＲＫが発現され得るＳ．フルジベルダ細胞またはトリクロプルジア・ラルバを感染するために使用され得る（エンゲルハード，Ｅ．Ｋ．等、（１９９４） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ９１：３２２４−３２２７）。
【００６１】
哺乳類宿主細胞において、多くのウイルスをベースとする発現系が利用され得る。アデノウイルスが発現ベクターとして使用される場合、ＳＮＡＲＫをコードする配列は、後期プロモータおよび三者間リーダ配列からなるアデノウイルス転写／翻訳複合体中に接合され得る。ウイルスゲノムの非必須Ｅ１またはＥ３領域中の挿入は、感染された宿主細胞中でＳＮＡＲＫを発現することができる生存可能なウイルスを入手するために使用され得る（ローガン，Ｊ．およびシェンク，Ｔ．、（１９８４） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｓ． Ｓｃｉ． ８１：３６５５−３６５９）。加えて、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）エンハンサのような転写エンハンサは、哺乳類宿主細胞中での発現を増加するために使用され得る。
【００６２】
ヒト人工染色体（ＨＡＣ）はまたプラスミド中に含まれそして発現されることができるよりも大きなＤＮＡの断片を送達するために用いられ得る。６ないし１０ＭのＨＡＣは慣用の送達方法（リポソーム、ポリカチオン性アミノポリマー、またはビヒクル）を介して治療目的のために構築および送達される。
【００６３】
特異的な開始シグナルはまた、ＳＮＡＲＫをコード化する配列のより効率的な翻訳を達成するために使用され得る。そのようなシグナルはＡＴＧ開始コドンおよび隣接配列を含む。ＳＮＡＲＫをコード化する配列、その開始コドン、および上流配列が適した発現ベクター中に挿入される場合、追加の転写および翻訳調節シグナルは必要とされない。しかしながら、コード配列またはその断片のみが挿入されている場合、ＡＴＧ開始コドンを含む外因性翻訳制御シグナルが与えられるべきである。さらに、開始コドンは正確な読取りフレーム内にあり、全体の挿入物の翻訳を確実にするべきである。外因性翻訳要素および挿入コドンは、天然および合成の様々な起源であり得る。発現の効率は、文献（シャーフ，Ｄ．等、（１９９４） Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｐｒｏｂｌ． Ｃｅｌｌ Ｄｉｆｆｅｒ．２０：１２５−１６２）に記載されるもののような使用された特定の細胞について適したエンハンサーの包含により高められ得る。
【００６４】
加えて、宿主細胞系統は、挿入された配列の発現を調節する、または所望の様式で発現されたタンパク質を処理する能力について選ばれ得る。そのようなポリペプチドの変調は、限定されずに、アセチル化、カルボキシル化、グリコシル化、リン酸化、脂質化およびアシル化を含む。ポスト翻訳活性についての特異的細胞機構部分および特徴的な機構を有する異なる宿主細胞（例えば、ＢＨＫ、ＣＨＯ、ＨｅＬａ、ＭＤＣＫ、ＨＥＫ２９３およびＷＩ３８）は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ、ベテスダ、メリーランド）から入手可能であり、そして外来タンパク質の正確な調節および処理を確実にするために選ばれ得る。
【００６５】
組換タンパク質の長期間、高収率産生のために、安定した発現が好ましい。例えば、ＳＮＡＲＫを安定に発現する細胞系は、複製および／または外因性発現要素のウイルス起源、および同一または異なるベクターについての選択可能なマーカー遺伝子を含み得る発現ベクターを使用して形質転換され得る。ベクターの導入に続き、細胞は１〜２日間、それらが選択的培地に移される前に扶養化された培地中で成長させられる。選択可能マーカーの目的は選択への耐性を付与することであり、そしてその存在は導入された配列を成功して発現する細胞の成長および回収を可能にする。安定な形質転換細胞の耐性クローンは、細胞種に適した組織培養技術を使用して増殖され得る。
【００６６】
あらゆる数の選択系が形質転換細胞系を回収するために使用され得る。これらは、限定されずに、それぞれｔｋ．ｓｕｐ−またはａｐｒｔ．ｓｕｐ−細胞で用いられることができるヘルペスシンプレックスウイルスチミジンキナーゼ（ウィグラー，Ｍ．等、（１９７７） Ｃｅｌｌ １１：２２３−３２）およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ローウィー，Ｉ．等、（１９８０） Ｃｅｌｌ ２２：８１７−２３）遺伝子を含む。同様に、抗代謝、抗生または抗微生物耐性、例えば、メトトレキセートへの耐性を付与するｄｈｆｒ（ウィーグラー，Ｍ．等、（１９８０） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ７７：３５６７−７０）、アミノグリコシドネオマイシンおよびＧ−４１８への耐性を付与するｎｐｔ（コルベレ−ガラピン，Ｆ．等、（１９８１） Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １５０：１−１４）およびクロルスルホロンおよびホスフィノロイシンアセチルトランスフェラーゼへの耐性をそれぞれ付与するａｌｓまたはｐａｔ（ムリー、上記）は、選択のための基礎として使用されることができる。さらなる選択可能遺伝子は、例えば、細胞をトリプトファンの代わりにインドールを利用可能にするｔｒｐＢ、または細胞をヒスチジンの代わりにヒスチノールを利用可能にするｈｉｓＤ（ハルトマン，Ｓ．Ｃ．およびＲ．Ｃ．ムリガン、（１９８８） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ８５：８０４７−５１）のように記載されている。近年、アントシアニン、β−グルクロニダーゼおよびその基質ＧＵＳ、およびルシフェラーゼおよびその基質ルシフェリンであって、形質転換体を識別するためだけでなく、特異ベクター系に寄与可能な遷移または安定タンパク質発現の量を定量するために広く使用される目視可能なマーカーの使用が汎用性を獲得している（ローデス，Ｃ．Ａ．等、（１９９５） Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ５５：１２１−１３１）。
【００６７】
さもなくば、ＳＮＡＲＫをコード化する核酸配列を含み、そしてＳＮＡＲＫを発現する宿主細胞は、当業者に既知の様々な手順により識別され得る。これらの手順は、限定されずに、ＤＮＡ−ＤＮＡまたはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリダイゼーションおよび、核酸またはタンパク質の検出および／または定量のための膜、溶液、またはチップをベースとする技術を含むタンパク質バイオアッセイまたはイムノアッセイ技術を含む。ＳＮＡＲＫをコード化するポリヌクレオチド配列の存在は、断片またはＳＮＡＲＫをコード化するポリヌクレオチドの断片を使用する、ＤＮＡ−ＤＮＡまたはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリダイゼーションおよび増幅によりプローブにより検出されることができる。核酸増幅をベースとするアッセイは、ＳＮＡＲＫをコード化するＤＮＡまたはＲＮＡを含む形質転換体の検出のために、ＳＮＡＲＫをコード化する配列にをベースとするオリゴヌクレオチドまたはオリゴマーの使用を伴う。
【００６８】
タンパク質に特異的なポリクローナルまたはモノクローナル抗体を使用するＳＮＡＲＫの発現を検出および測定するための様々なプロトコルは、当該技術に既知である。例は、酵素結合したイムノソーバントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、および蛍光活性化細胞吸着（ＦＡＣＳ）を含む。ＳＮＡＲＫについての二つの非干渉エピトープに反応性のモノクローナル抗体を利用するモノクローナルベースのイムノアッセイが好ましいが、しかし競争結合アッセイが用いられ得る。これらおよび他のアッセイは、なかんずく、ハンプトン，Ｒ．等（１９９０、Ｓｅｒｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ， ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、ＡＰプレス、セントポール、ミネソタ）およびマドックス，Ｄ．Ｅ．等（１９８３， Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １５８、１２２１−１２１６）に記載されている。
【００６９】
広範囲にわたる様々な標識および共役技術が当業者に既知であり、そして様々な核酸およびアミノ酸アッセイにおいて使用され得る。ＳＮＡＲＫをコード化するポリヌクレオチドに関連する配列を検出するための標識ハイブリダイゼーションまたはＰＣＲプローブを産生するための手段は、オリゴラベリング、ニック翻訳、エンドラベリングまたは標識されたヌクレオチドを使用するＰＣＲ増幅を含む。さもなくば、ＳＮＡＲＫをコード化する配列、またはそのあらゆる断片は、ｍＲＮＡプローブの産生のためにベクター中にクローニングされ得る。そのようなベクターは当該技術に既知であり、市販で入手可能で、そしてＴ７、Ｔ３またはＳＰ６のような適したＲＮＡポリメラーゼおよび標識されたヌクレオチドの添加により、インビトロでＲＮＡプローブを合成するために使用され得る。これらの手順は、様々な市販で利用可能なキット（ファルマシア＆アップジョン、（カラマズー、ミシガン）、プロメガ（マディソン、ウイスコンシン）、およびＵ．Ｓ．バイオケミカル・コーポレイション（クリーブランド、オハイオ）を使用して行われ得る。検出の容易さのために使用され得る適したリポーター分子または標識は、放射性核種、酵素、蛍光、化学発光、または色素剤並びに基質、補助因子、阻害剤、磁性粒子等を含む。
【００７０】
ＳＮＡＲＫをコード化するヌクレオチド配列で形質転換された宿主細胞は、細胞培養からのタンパク質の発現および回収のために適した条件下で培養され得る。形質転換された細胞により産生されたタンパク質は、使用された配列および／またはベクターに依存して分泌されるかまたは細胞内に含まれ得る。当業者に理解されるように、ＳＮＡＲＫをコード化するポリヌクレオチドを含む発現ベクターは、原核または真核細胞膜を通したＳＮＡＲＫの分泌に向けたシグナル配列を含むように設計され得る。他の構築は、ＳＮＡＲＫをコード化する配列を可溶性タンパク質の精製を容易にするポリペプチドドメインをコード化するヌクレオチド配列と一緒にするために使用され得る。そのような精製容易化ドメインは、限定されずに、固定化金属での精製を可能にするヒスチジン−トリプトファンモジュールのような金属キレート化ペプチド、固定化イムノグロブリンでの精製を可能にするプロテインＡドメイン、およびＦＬＡＧ延長／親和性精製系（イムネックス・コーポレイション、シアトル、ワシントン）で利用されるドメインを含む。精製ドメインとＳＮＡＲＫとの間のファクターＸａまたはエンテロキナーゼ（インビトロゲン、サン・ディエゴ、カリフォルニア）について特異的なもののような開裂可能なリンカー配列の組込みは、精製を容易にするために使用され得る。一つのそのような発現ベクターは、ＳＮＡＲＫおよびチオレドキシンまたはエンテロキナーゼ開裂部位の前の６個のヒスチジン残基をコード化する核酸を含む融合タンパク質の発現のために与えられる。ヒスチジン残基は、ＩＭＩＡＣ（ポアタ，Ｊ．等、（１９９２） Ｐｒｏｔ． Ｅｘｐ． Ｐｕｒｉｆ． ３：２６３−２８１）に記載されるような固定化金属イオン親和性クロマトグラフィー）での精製を容易にし、一方、エンテロキナーゼ開裂部位は融合タンパク質からＳＮＡＲＫを精製するための手段を与える。融合タンパク質を含むベクターの議論は、クロル，Ｄ．Ｊ．等（１９９３， ＤＮＡ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． １２：４４４１−４５３）で与えられる。
【００７１】
組換産生に加えて、ＳＮＡＲＫの断片は、固相技術（マーフィールド，Ｊ．、（１９６３） Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． ８５：２１４９−２１５４）を使用する直接ペプチド合成により産生され得る。タンパク質合成は、手動技術を使用して、または自動により行われ得る。自動合成は、例えば、アプライド・バイオシステムズ４３１Ａペプチドシークエンサ（パーキン・エルマー）を使用して達成され得る。ＳＮＡＲＫの様々な断片が別個に化学合成され、そして化学的方法を使用して結合されて全長分子を産生する。
【００７２】
ＳＮＡＲＫの生理的および行動的役割を解明する動物モデル系は、ＳＮＡＲＫの活性が増大または減少されているか、様々な技術により発現されたＳＮＡＲＫのアミノ酸配列が変更されている形質転換動物を、生成することによって製造される。これらの技術の例は、限定されずに、１）ＳＮＡＲＫをコード化するＤＮＡの通常または突然変異体の、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、レトロウイルス形質転換または当業者に良く知られている他の手段による、適した受精胚中への形質転換動物を産生するための挿入、または２）突然変異体または通常のヒトまたはこれらの遺伝子の動物変種の、形質転換動物中の天然遺伝子座との、発現の調節またはＳＮＡＲＫ配列の構造を変更するための相同性組換を制限されずに含む。相同性組換の技術は当該技術に良く知られている。天然遺伝子を挿入された遺伝子と置換し、そして天然ＳＮＡＲＫを発現できないが、例えば動物のゲノム中の天然ＳＮＡＲＫが組替えにより置換され、トランスポータの下方発現が生じている挿入された突然変異ＳＮＡＲＫを発現する動物を産生するために有用である。マイクロインジェクションはゲノムに遺伝子を追加するが、しかしそれを除去せず、そして内因性および外因性ＳＮＡＲＫを発現する動物を、その過剰発現を誘引するために産生するために有用である。
【００７３】
例としてマウスを挙げると、形質転換動物を産生するために利用可能な一つの手段は、以下のものである：雌マウスを交配させ、そして生じた受精卵をその輸卵管から切開除去する。卵子をＭ２培地のような適した培地中で貯蔵する。ＳＮＡＲＫをコード化するＤＮＡまたはｃＤＮＡは、当該技術に良く知られている方法によりベクターから塩化セシウムで精製されたものである。誘発可能なプロモータは、導入遺伝子の発現を調節するための実験手段を与えるために、ＤＮＡのコード領域と融合され得る。
【００７４】
その他の観点において、本発明は、ＳＮＡＲＫに結合する抗体を与える。ＳＮＡＲＫに対する抗体は、当該技術に良く知られている方法を使用して生成され得る。そのような抗体は、限定されずに、ポリクローナル、モノクローナル、キメラ、一本鎖、Ｆａｂ断片、およびＦａｂ発現ライブラリにより産生された断片を含み得る。中和抗体（即ち、二量体形成を阻害するもの）は、治療使用について特に好ましい。
【００７５】
抗体の産生のために、ヤギ、ウサギ、ラット、マウス、ヒト等を含む様々な宿主が、ＳＮＡＲＫで、またはＳＮＡＲＫ変異体もしくはキメラ体、または免疫性特性を有するあらゆる断片もしくはオリゴペプチドでの注射により、免疫化され得る。宿主種に依存して、様々なアジュバントが、免疫学的応答を増大するために使用され得る。そのようなアジュバントは、限定されずに、フロイントのもの、アンモニウムヒドロキシどのような無機物ゲル、およびリゾレシチンのような界面活性物質、プルロンポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油乳液、鍵穴カサガイヘモシアニン、およびジニトロフェノールを含む。ヒトにおいて使用されるアジュバントのなかで、ＢＣＧ（バシラス・カルメット−ゲラン）およびコリネバクテリウム・パーブラムは特に好ましい。
【００７６】
ＳＮＡＲＫに対する抗体を誘発するために使用されたオリゴペプチド、ペプチドまたは断片が、少なくとも五つのアミノ酸、またより好ましくは少なくとも１０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列を有することが好ましい。それが天然タンパク質のアミノ酸配列の一部と同一であることも好ましく、また小さな天然発生分子の全アミノ酸配列を含み得る。好ましい抗体は、固有であり、また例えば、生物学データベースのコンピュータをベースとするサーチにより決定されるような他のタンパク質のアミノ酸配列と１００％の同一性を示さないＳＮＡＲＫタンパク質のアミノ酸配列に対して作られるものである。ＳＮＡＲＫアミノ酸の短い伸長は、鍵穴カサガイヘモシアニンおよびキメラ分子に対して産生される抗体のような他のタンパク質のものと融合され得る。有用なＳＮＡＲＫ断片の例は、残基３１０ないし残基６３０のラットＳＮＡＲＫのＣ末端領域、またはヒトおよびマウスＳＮＡＲＫを含むＳＮＡＲＫ相同体内の対応する領域内の少なくとも５個、より望ましくは少なくとも１０個のアミノ酸、また特に１００ないし約２００個のアミノ酸の隣接領域を含む。特に有用な断片は、図３で概説されるキナーゼ触媒ドメインＩ〜ＸＩの活性部位、並びにＡＴＰ結合ドメイン（アミノ酸６３〜８９）および活性部位指定モチーフ（ａａ１７５〜１８７）（図２）およびそれと少なくとも約９５％の同一性を共有する変異体に対応するものである。
【００７７】
ＳＮＡＲＫに対するモノクローナル抗体は、培養中での連続細胞系による抗体分子の産生を与えるあらゆる技術を使用して生成され得る。これらは、限定されずに、ハイブリドーマ技術、ヒトＢ−細胞ハイブリドーマ技術、およびＥＢＶ−ハイブリドーマ技術（コーラー，Ｇ．等、（１９７５） Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５−４９７、コズボアー，Ｄ．等、（１９８５） Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ ８１：３１−４２、コート，Ｒ．Ｊ．等、（１９８３） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ８０：２０２６−２０３０、コール．Ｓ．Ｐ．等、（１９８４） Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． ６２：１０９−１２０）を含む。
【００７８】
加えて、“キメラ抗体”の産生のために開発された技術、およびマウス抗体遺伝子をヒト抗体遺伝子へスプライシングして適した抗原特異性および生物学的活性を得ることが使用されることができる（モリソン，Ｓ．Ｌ．等、（１９８４） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ８１：６８５１−６８５５、ヌーベルガー，Ｍ．Ｓ．等、（１９８４） Ｎａｔｕｒｅ ３１２：６０４−６０８、タケダ，Ｓ．等、（１９８５） Ｎａｔｕｒｅ ３１４：４５２−４５４）。さもなくば、一本鎖抗体の産生のために記載された技術が、当該技術に既知の方法を使用して適応されて、ＳＮＡＲＫ特異性一本鎖抗体を産生し得る。関連した特異性を有するが、異なるイディオティピック組成である抗体が、ランダムコービナトリアルイムノグロブリンライブラリから鎖シャフリングすることにより生成され得る（バートン，Ｄ．Ｒ．、（１９９１） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ８８：１１１２０−３）。
【００７９】
抗体はまた、リンパ球集団中でのインビボ産生を誘発することにより、またはイムノグロブリンライブラリまたは文献（オーランディ，Ｒ．等、（１９８９） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ８６：３８３３−３８３７、ウインター，Ｇ．等、（１９９１） Ｎａｔｕｒｅ ３４９：２９３−２９９）に記載されているような高い特異性の結合剤のパネルをスクリーニングすることにより産生され得る。ＳＮＡＲＫについての特異結合部位を含む抗体断片はまた生成され得る。例えば、そのような断片は、制限されずに、抗体分子のペプシン消化により産生されることができるＦ（ａｂ’）２断片、およびＦ（ａｂ’）２断片のジスルフィド結合の還元により生成されることができるＦａｂ断片を含む。さもなくば、Ｆａｂ発現ライブラリは、所望の特性を有するモノクローナルＦａｂ断片の素早くかつ容易な識別を可能にするために構築され得る（ヒューズ，Ｗ．Ｄ．等、（１９８９） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５４：１２７５−１２８１）。
【００８０】
様々なイムノアッセイが、所望の特性を有する抗体を識別するためのスクリーニングのために使用され得る。確立された特異性を有するポリクローナルまたはモノクローナルの抗体を使用する競争結合またはイムノラジオメトリックアッセイについての数多くのプロトコルは、当該技術に良く知られている。そのようなイムノアッセイは典型的に、ＳＮＡＲＫとその特異抗体との間の複合体形成の測定を伴う。二つの非干渉ＳＮＡＲＫエピトープに反応性のモノクローナル抗体を利用するトゥーサイトモノクローナルベースドイムノアッセイが好ましいが、競争結合アッセイも用いられ得る。
【００８１】
化学的および構造的相同性は、本発明のプロテインキナーゼとＡＭＰＫ系統のプロテインキナーゼの間に存在する。さらに、本願で表される結果は、ＳＮＡＲＫ活性が機能的観点においてＡＭＰＫ系統の他の一員に属すると認められている活性と類似することを示す。それ故、ＳＮＡＲＫの発現は、燃料利用およびグルコース代謝と密接に関連し、そしてその調節はグルコースおよび他の燃料の内因性濃度に対する様々な細胞応答を制御するために有用であろう。さらに、ＡＴＰの濃度および活性化状態、およびその濃度により影響される細胞カスケードについてのＳＮＡＲＫの影響はまた、ＡＴＰにより進展させられる様々な受容体をベースとするカスケードに間接的な影響を有し得る。従って、疾病、障害およびＳＮＡＲＫの異常な発現または機能から生じる状態において、上記した技術および薬剤を使用して、その発現または活性水準を操作することにより、または内因性タンパク質水準を操作することにより、内因性のＳＮＡＲＫのアベイラビリティを増加または削減することが望ましいかもしれない。例えば、ＳＮＡＲＫの上方調節は肝臓ＣＰＴ−１を刺激し、そしてそれにより肝臓細胞および心臓および骨格筋のような他の細胞種における脂肪代謝を高めることが考えられる。同様に、筋肉細胞中でのＳＮＡＲＫの活性化は、筋肉中のＧＬＵＴ−４およびグリコーゲンを増加することが予期される。これらの効果は、筋肉細胞がインスリンで処理されたときに観察されるものと同様であろう。それ故、ＳＮＡＲＫの活性化は、グルコースの筋肉中への取り込みを高め、そしてそれにより、血清グルコースを減じるであろうインスリン様効果を表し、糖尿病およびコレステロールまたはトリグリセリドの高い水準を導くある種のリポタンパク質産生の障害の治療のために望ましい効果を有すると予期される。一般に、ＳＮＡＲＫはＧＬＵＴ−４、ヘキソキナーゼおよび筋肉グリコーゲンの増加した産生を含む細胞へのＡＩＣＡＲの投与に続く日に見られる効果を導くために有用であろうと予想される（例えば、ホルメス等、Ａｍ． Ｊ． Ｐｈｙｓｉｏｌ．， １９９９， １９９０−１９９５およびウインダー等、Ｊ． Ａｐｐ． Ｐｈｙｓｉｏｌ．， ２０００， ８８：２２１９−２２２６参照）。ＳＮＡＲＫは従って、異常な燃料利用および代謝または環境のストレスへの応答を伴う様々な障害についての示唆を有する。
【００８２】
ＳＮＡＲＫはまたさらに、ｃＡＭＰゲート塩素チャネルのようなイオンチャネルを含み、また嚢胞繊維症膜伝達調節剤（ＣＦＴＲ）を含んでいる特定のｃＡＭＰゲート受容体からの応答に影響するだろうと考えられる。特に、ＳＮＡＲＫはこの経路に関係し、そして、ＡＭＰＫプロテインについて考えられているように（ハローズ，Ｊ．、Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． ２０００， １０５（１２）：１７１１−１７２１）、ＣＦＴＲの過剰機能化を阻害することにより嚢胞繊維症の治療において治療上有用であり得る。
【００８３】
一つの態様において、ＳＮＡＲＫまたはその変異体、キメラ体または断片が、ＳＮＡＲＫの減少した発現と関連する疾病の予防または治療のために患者に投与され得る。他の態様において、ＳＮＡＲＫに特異的な作用剤が、限定されずに上記で列挙した疾病を含む疾病を予防または治療のために患者に投与され得る。他のさらなる態様において、ＳＮＡＲＫ、またはその断片もしくは誘導体を発現できるベクターが、限定されずに上記で列挙した疾病を含む疾病を予防または治療のために患者に投与され得る。
【００８４】
さらなる態様において、ＳＮＡＲＫの発現および活性を減少する拮抗剤が、ＳＮＡＲＫの増加した発現と関連すると予期される疾病を予防または治療のために患者に投与され得る。例えば、過剰グルコース利用、増加したグルコース取り込み、または減少したグルコース産生により特徴付けられる障害は、低血糖症を生じ得る。本発明の一つの観点において、ＳＮＡＲＫ拮抗剤が、低血糖症を被っている患者における燃料産生を増加する、グルコース摂取を減少する、また血液グルコールの濃度を増大するために投与され得る。
【００８５】
一つの観点において、ＳＮＡＲＫに特異的に結合する抗体は、拮抗剤として直接に、またはＳＮＡＲＫを発現する細胞または組織に医薬剤をもたらすための標的または送達機構として間接的に使用され得る。
【００８６】
他の態様において、ＳＮＡＲＫをコード化するポリヌクレオチドの相補体を発現するベクターが、限定されずに上記で列挙した疾病を含む疾病を治療または予防するために患者に投与され得る。
【００８７】
一つの観点において、ＳＮＡＲＫを特異的に結合する抗体が、拮抗剤として直接に、またはＳＮＡＲＫを発現する細胞または組織に医薬剤をもたらすための標的または送達機構として間接的に使用され得る。
【００８８】
さらなる態様において、ＳＮＡＲＫまたはその変異体、キメラ体もしくは断片が、例えばグルコース代謝を進めるＳＮＡＲＫ媒介されたシグナルカスケードの活性化を刺激するために細胞に添加され得る。特に、ＳＮＡＲＫは、培養中の細胞またはインビボの細胞に、リポソーム、ウイルスをベースとするベクター、または電気インジェクションを使用して、細胞増殖および組織もしくは器官の再生を促進する目的で添加され得る。特に、ＳＮＡＲＫは、細胞、細胞系、組織または器官のインビトロまたはエキソビボでの培養に、外因性または自己由来の移植における使用のための細胞増殖を刺激するために添加され得る。
【００８９】
本発明の観点において、ＳＮＡＲＫ活性をアッセイする方法であって、ＳＮＡＲＫプロテインの候補をＳＮＡＲＫ基質とリン酸化条件下で保温し、そしてその後リン酸化の程度を測定することからなる方法が提供される。ＳＮＡＲＫプロテインの候補は、リン酸化が下記の表１で表される基質選択性の階級順位で検出された場合、ＳＮＡＲＫ活性を有すると確認される。同様に、アッセイは、モジュレータの候補をＳＮＡＲＫプロテインおよびＳＮＡＲＫ基質の双方と共にリン酸化反応条件下で保温し、そしてその後、モジュレータの候補が、モジュレータ候補が存在しない対照培養に関してリン酸化を変更したか否かを決定することによりＳＮＡＲＫ活性のモジュレータ候補をスクリーニングおよび識別するために精査されることができる。ＳＮＡＲＫ活性の作用剤は、リン酸化における増加により識別され、一方、拮抗剤は、対照培養に対するリン酸化の減少により識別される。この方法において、適当なＳＮＡＲＫ基質は、本願で識別されるＳＡＭＳペプチドのような関連ＡＭＰＫプロテインによりリン酸化されることが既知である殆どの基質を含む。アッセイは、ＳＮＡＲＫ断片および抗体、炭水化物等を含む小分子ペプチドのライブラリに対して行われることができる。
【００９０】
他の態様において、ＳＮＡＲＫアクチベータまたは阻害剤が特定の細胞および組織中で発現されることができ、そして続いて、ジーンチップおよびプロテオミクステクニックが、さらなる操作のために引き続いて起こり易いＳＮＡＲＫシグナル経路における下流標的を識別するために使用されることができる。それ故、本発明はさらに、細胞および組織中でＳＮＡＲＫ活性のメディエータ、アクチベータまたはインアクチベータとして働き得る一つまたはそれ以上の以前に識別されているかまたは新規な遺伝子およびタンパク質を定義するための方法を与える。
【００９１】
他の態様において、本発明の治療タンパク質、拮抗剤、抗体、作用剤、相補配列またはベクターのいずれかが、他の適した治療剤と組合せて投与され得る。組合せ治療での使用について適した薬剤の選択は、当業者により慣用の医薬理論に従って為され得る。治療剤の組合せは相乗的に作用して、上記した様々な障害の治療または予防を為す。このアプローチを使用して、各薬剤のより低量の投薬量での治療効力を達成し、それ故、悪い副作用についての潜在性を減じることができるかもしれない。
【００９２】
ＳＮＡＲＫの拮抗剤または阻害剤は、当該技術に一般に知られている方法を使用して産生され得る。特に、精製されたＳＮＡＲＫは、抗体を産生するかまたは医薬剤のライブラリをスクリーニングして、ＳＮＡＲＫを特異結合するものを識別するために使用され得る。拮抗剤または阻害剤はさらに、ＳＮＡＲＫのリン酸化を阻害する分子、またはＳＮＡＲＫタンパク質の脱リン酸化反応を刺激する分子として識別されることができる。ＳＮＡＲＫ拮抗剤は、例えばラットＳＮＡＲＫについて図２で表される機能性キナーゼドメインが部位特異的アミノ酸変更により損なわれて、基質結合のための内因性かつ機能性のＳＮＡＲＫと競争する不活性ＳＮＡＲＫ変異体を生成するＳＮＡＲＫ変異体を含み得る。さもなくば、拮抗剤はＳＮＡＲＫプロテインに結合し、それによりその細胞効果を及ぼすに要求される機能活性を妨げる分子として識別され得る。そのようなＳＮＡＲＫ活性の拮抗剤はさらに、ＳＮＡＲＫ活性を失っているが、その基質についてＳＮＡＲＫと競争するＳＮＡＲＫのペプチド断片を含み得る。そのような拮抗剤フラグメントは、一つまたは双方の末端を短縮するＳＮＡＲＫの欠失分析により、または例えば典型的にまたは他の方法でＳＮＡＲＫを開裂して、その後リン酸化反応アッセイにおいて検査されて拮抗剤を識別し、また同様に所望により作用剤を識別することもできるフラグメントの生成により識別され得る。
【００９３】
本発明の他の態様において、ＳＮＡＲＫをコード化するポリヌクレオチド、またはそのいかなる断片もしくは相補体は、治療目的のために使用され得る。一つの観点において、ＳＮＡＲＫをコード化するポリヌクレオチドの相補体は、ｍＲＮＡの転写をブロックするために望ましい刺激において使用され得る。特に、細胞は、ＳＮＡＲＫをコード化するポリヌクレオチドに相補的な配列で形質転換され得る。それ故、相補体分子または断片は、ＳＮＡＲＫ活性を調節するか、または遺伝子機能の調節を達成するために使用され得る。そのような技術は今や当該技術に良く知られており、センスまたはアンチセンスのオリゴヌクレオチドまたはより大きな断片はＳＮＡＲＫをコード化する配列のコード領域または制御領域に沿った様々な位置から設計されることができる。
【００９４】
レトロウイルス、アデノウイルス、ヘルペスまたはバクシニアウイルスから、または様々なバクテリアプラスミドから誘導された発現ベクターは、ヌクレオチド配列の標的器官、組織または細胞集団への送達のために使用され得る。当業者に良く知られている方法は、ＳＮＡＲＫをコード化する遺伝子のポリヌクレオチドに相補的である核酸配列を発現するであろうベクターを構築するために使用されることができる。これらの技術は、サムブルック等（上記）とアウスベル等（上記）との双方において記載されている。
【００９５】
ＳＮＡＲＫをコード化する遺伝子は、ＳＮＡＲＫをコード化するポリペプチドまたはその断片を高濃度で発現する発現ベクターで細胞または組織を形質転換することにより生産されることができる。そのような構築物は、細胞中に未翻訳のセンスまたはアンチセンス配列を導入するために使用され得る。ＤＮＡ中への組込みが存在せずとも、そのようなベクターは、それらが内因性ヌクレアーゼにより不活化されるまで、ＲＮＡ分子を転写し続け得る。一時的な発現は、非複製ベクターで一月またはそれ以上、また適した複製要素がベクター系の一部であればより長く続き得る。
【００９６】
上述したように、遺伝子発現の調節は、ＳＮＡＲＫをコード化する遺伝子の５’または調節領域（シグナル配列、プロモータ、エンハンサおよびイントロン）を制御するように相補配列またはアンチセンス分子（ＤＮＡ、ＲＮＡまたはＰＮＡ）を設計することにより入手されることができる。例えば、開始部位から−１０と＋１０位置の間の転写開始部位から誘導されたオリゴヌクレオチドが好ましい。同様に、阻害剤は“三重螺旋”塩基対方法論を使用して達成されることができる。三重螺旋対形成は、ポリメラーゼ、転写因子または調節分子の結合のために十分に開く二重螺旋の能力の阻害を引き起こす。三重螺旋ＤＮＡを使用する近年の治療の進歩は、文献（ギー，Ｊ．Ｅ．等、（１９９４）Ｉｎ：フーバー，Ｂ．Ｅ．およびＢ．Ｉ．カル、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃ Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ、フューチュラ・パブリッシング・コーポレイション、マウント・キスコ、ニューヨーク）に記載されている。相補配列またはアンチセンス分子はまた、翻訳体をリボソームに結合させないことにより、ｍＲＮＡの翻訳をブロックするように設計され得る。
【００９７】
リボザイム、即ち酵素性ＲＮＡ分子はまた、ＲＮＡの特異開裂を触媒するために使用され得る。リボザイム作用の機構は、相補標的ＲＮＡへのリボザイム分子の配列特異的ハイブリダイゼーション、および続くエンドヌクレアーゼ開裂を伴う。使用され得る例は、ＳＮＡＲＫをコード化する配列のエンドヌクレアーゼ開列を特異的かつ効率的に触媒できる改変されたハンマーヘッドモチーフリボザイム分子を含む。
【００９８】
あらゆる潜在的なＲＮＡ標的内の特異的リボザイム開裂部位は最初、以下の配列：ＧＵＡ、ＧＵＵおよびＧＵＣを含むリボザイム開裂部位について標的分子を調査することにより識別される。一度識別されると、開裂部位を含む標的遺伝子の領域に対応する１５個と２０個との間のヌクレオチドの短いＲＮＡ配列が、オリゴヌクレオチドを操作不能にし得る二次構造特徴について評価され得る。標的の候補の適性はまた、リボヌクレアーゼ保護アッセイを使用して相補オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションへの接近可能性を試験することにより評価され得る。
【００９９】
本発明の相補性リボ核酸分子およびリボザイムは、核酸分子の合成について当該技術に既知のあらゆる方法により生成され得る。これらは、固相ホスファアミダイト化学合成のようなオリゴヌクレオチドを化学合成するための技術を含む。さもなくば、ＲＮＡ分子は、ＳＮＡＲＫをコード化するＤＮＡ配列のインビトロおよびインビボ転写により生成され得る。そのようなＤＮＡ配列は、Ｔ７またはＳＰ６のような適当なＲＮＡポリメラーゼプロモータで広範囲にわたる様々なベクター中に組込まれ得る。さもなくば、構成的または誘発的に相補ＲＮＡを合成するこれらのｃＤＮＡ構築物は、細胞系、細胞または組織中に導入されることができる。ＲＮＡ分子は、分子内安定性および半減寿命を増加するために変性され得る。可能な変性は、制限されずに、分子のＳ’および／または３’末端でのフランキング配列の追加または分子の骨格内でのホスホジエステラーゼ結合でなくホスホロチオエートまたは２’−Ｏ−メチルの使用を含む。この概念はＰＮＡの産生において固有であり、またイノシン、クエノシンおよびウィブトシン、並びにアセチル−、メチル−、チオ−および同様に変性された形態のアデニン、シチジン、グアニン、チミンおよびウリジンであって、内因性エンドヌクレアーゼにより容易に認識されないような通常でない塩基の組込みにより分子の全てにおいて拡張されることができる。
【０１００】
細胞または組織中にベクターを導入する多くの方法が利用可能であり、そしてインビボ、インビトロおよびエキソビボでの使用について等しく適している。エキソビボ治療のために、ベクターは患者から採取された幹細胞中に導入され、そして同じ患者に自家移植し戻すためにクローン増殖され得る。トランスフェクション、リポソーム接種またはポリカチオン性アミノポリマー（ゴールドマン，Ｃ．Ｋ．等、（１９９７） Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １５：４６２−６６、参照により本願に組込まれる）による送達は、当該技術に良く知られている方法を使用して達成され得る。
【０１０１】
上記されたあらゆる治療方法は、例えば愛玩動物、家禽、家畜、霊長類、また最も好ましくはヒトのような哺乳類を含む、そのような治療の必要なあらゆる患者に適用され得る。
【０１０２】
本発明のさらなる態様は、上記で議論されたあらゆる治療効果のために、医薬的に許容可能なキャリアと組合された医薬組成物の投与に関する。そのような医薬組成物は、ＳＮＡＲＫ、ＳＮＡＲＫに対する抗体、ＳＮＡＲＫの擬態剤、作用剤、拮抗剤または阻害剤からなり得る。組成物は単独でまたは安定化化合物のような少なくとも一つの他の薬剤と組合せて投与されることができ、限定されずに、食塩水、緩衝食塩水、デキストロースおよび水を含む無菌生体適合性医薬キャリア中で投与され得る。組成物は単独で、または他の試薬、薬剤またはホルモンと組合せて患者に投与され得る。
【０１０３】
本発明において利用される医薬組成物は、制限されずに、経口、静脈内、筋肉内、動脈内、骨髄内、髄腔内、室内、皮下、腹腔内、鼻腔内、腸内、局所、舌下または直腸手段を含むあらゆる数々の経路により投与され得る。
【０１０４】
活性有効成分に加えて、この医薬組成物は、医薬的に使用されることができる製剤への活性化合物の加工を容易にする賦形剤および補助剤を含む適当な医薬的に許容可能なキャリアを含み得る。配合および投与のための技術についてのさらなる詳細は、レミントンズ・ファーマシューティカル・サイエンス（マック・パブリッシング・コーポレイション、イーストン、ペンシルバニア）の最新版において見出され得る。
【０１０５】
経口投与のための医薬組成物は、当該技術に良く知られている医薬的に許容可能なキャリアを使用し、経口投与のために適当な投薬量で形成されることができる。そのようなキャリアは、医薬組成物が、タブレット、ピル、カプセル、液、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁液等として患者による経口摂取のために配合されることを可能にする。
【０１０６】
経口使用のための医薬製剤は、活性化合物と固形賦形剤とを組合せ、所望により生じた混合物を粉砕し、そして例えばタブレットを入手するためには、所望により適当な補助剤を添加した後に、顆粒の混合物を加工することを通して入手されることができる。適した賦形剤は、炭水化物およびタンパク質充填剤、例えば、ラクトース、スクロース、マンニトールまたはソルビトールを含む糖、トウモロコシ、小麦、米、ジャガイモまたは他の植物からの澱粉、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースまたはナトリウムカルボキシメチルセルロースのようなセルロース、アラビックおよびトラガカントを含むガム、およびゼラチンおよびコラーゲンのようなタンパク質である。所望により、架橋されたポリビニルピロリドン、寒天、アルギニン酸またはアルギニン酸ナトリウムのようなその塩のような崩壊剤または可溶化剤が添加され得る。
【０１０７】
非経口投与のために適当な医薬配合物は、水溶液中で、好ましくはハンク溶液、リンガー溶液または生理緩衝食塩水のような生理的に適合可能な緩衝液中で配合され得る。水性接種懸濁液は、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、ソルビトールまたはデキストランのような懸濁液の粘度を増加する物質を含み得る。加えて、活性化合物の懸濁液は、適した油性接種懸濁液として製剤され得る。適した親油性溶媒またはビヒクルは、胡麻油のような脂肪油、エチルオレエートまたはトリグリセリドのような合成脂肪酸エステル、またはリポソームを含む。非脂質ポリカチオン性アミノポリマーはまた、送達のために使用され得る。所望により、懸濁液はまた適当な安定剤または化合物の溶解度を増大して高濃度の溶液の生成を可能にする薬剤を含み得る。
【０１０８】
局所または鼻腔内投与のために、浸透されるべき特別な障壁に適した浸透剤が配合物中に使用される。そのような浸透剤は一般に当該技術に既知である。本発明の医薬組成物は、当該技術に既知の方法において、例えば慣用の混合、溶解、顆粒化、乳化、カプセル化、捕捉または凍結乾燥処理により製造され得る。
【０１０９】
医薬組成物は塩として提供されることができ、そして限定されずに、塩酸、硫酸、酢酸、乳酸、酒石酸、マレイン酸、コハク酸等を含む多くの酸で形成されることができる。水中または他のプロトン性溶媒中でより溶解する傾向にある塩は、対応する遊離塩基形態である。他の場合、好ましい製剤は、以下：１〜５０ｍＭのヒスチジン、０．１％〜２％のスクロース、および２％〜７％のマンニトールのいずれかまたは全てを、４．５ないし５．５のｐＨ範囲で含むことができ、使用する前に緩衝液と組み合わせられる凍結乾燥粉末であり得る。
【０１１０】
あらゆる化合物について、ＳＮＡＲＫ活性化合物の治療有効投薬量は、例えば新生細胞の細胞培養アッセイで、または通常はマウス、ウサギ、イヌまたはブタである動物モデルで最初に概算されることができる。動物モデルはまた、適した濃度範囲および投薬の経路を決定するために使用され得る。そのような情報はその後、有用な投薬量およびヒトにおける投与経路を決定するために使用されることができる。
【０１１１】
治療有効投薬量は、症状または状態を改善する活性有効成分、例えばＳＮＡＲＫまたはその断片、ＳＮＡＲＫの抗体、ＳＮＡＲＫの作用剤、拮抗剤または阻害剤の量に関する。治療効力および毒性は細胞培養または実験動物における標準医薬手順、例えばＥＤ５０（集団の５０％において治療有効な投薬量）およびＬＤ５０（集団の５０％に致死性の投薬量）により決定され得る。治療効果と毒性効果との間の投薬比率が治療指数であり、そして比率ＬＤ５０／ＥＤ５０として表現されることができる。大きな治療指数を示す医薬組成物が好ましい。細胞培養アッセイおよび動物研究から得られたデータは、ヒト使用のための投薬量範囲を規格化することに使用される。そのような組成物中に含まれる投薬量は好ましくは、殆どまたは全く毒性を有さないＥＤ５０を含む循環濃度の範囲内である。投薬量は、この範囲内で、用いられる投薬形態、患者の感度および投薬の経路に依存して変化する。
【０１１２】
正確な投薬量は、治療を必要とする患者に関連する因子の知見の下、臨床医により決定されるだろう。投薬量および投与は、活性部分の十分な水準を与えるように、または所望の効果を維持するように調節される。考慮され得る因子は、疾病状態の深刻さ、患者の一般的な健康状態、患者の年齢、体重および性別、食事、投与の時間および頻度、薬剤組合せ、反応感度および治療に対する耐性／応答を含む。長期間作用する医薬組成物は、特定の配合物の半減寿命およびクリアランス率に依存して３ないし４日毎、毎週または２週間に１回投与され得る。
【０１１３】
通常の投薬量は、投与の経路に依存して、０．１ないし１０００００マイクログラム、約１ｇの全投薬量までで変化し得る。特定の投薬量および送達の方法についての指針は文献において与えられ、そして当該技術の臨床医に一般に利用可能である。当業者は、タンパク質またはその阻害剤よりもヌクレオチドについて異なる配合物を用いるであろう。同様に、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの送達は、特定の細胞、条件、位置などに特異的であろう。
【０１１４】
他の観点において、ＳＮＡＲＫを特異的に結合する抗体は、ＳＮＡＲＫの発現により特徴付けられる状態または疾病の診断のために、またはＳＮＡＲＫ、作用剤、拮抗剤または阻害剤で治療された患者を観察するためのアッセイにおいて使用され得る。診断目的のために有用な抗体は、治療について上記されたものと同じ方法で生成され得る。ＳＮＡＲＫについての診断アッセイは、抗体および標識を利用して、ヒトの体液または細胞または組織の抽出物中のＳＮＡＲＫを検出する方法を含む。抗体は変性を伴ってまたは伴わずに使用されることができ、また共役的または非共役的にそれとリポーター分子とを結合することにより標識され得る。当該技術に既知である広範囲にわたる様々なリポータ分子が使用され、その幾つかは上記されている。
【０１１５】
ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡおよびＦＡＣＳを含むＳＮＡＲＫを測定するための様々なプロトコルが当該技術に既知であり、そしてＳＮＡＲＫ発現の変更された水準または異常な水準を検出するための基礎を与える。ＳＮＡＲＫ発現についての通常値または標準値は、通常の哺乳類対象、好ましくはヒトから採取した体液または細胞抽出物をＳＮＡＲＫに対する抗体と、複合体形成のための適当な条件下で組合せることにより確立される。標準の複合体形成の量は、様々な方法、好ましくは光度計手段により定量され得る。対照および生検組織からの疾病試料中で発現されたＳＮＡＲＫの量は、標準値と比較される。標準値と対照値の間の偏差が、疾病を診断するためのパラメータを確立する。
【０１１６】
本発明の他の態様において、ＳＮＡＲＫをコード化するポリヌクレオチドは、診断目的のために使用され得る。使用され得るポリヌクレオチドは、オリゴヌクレオチド配列、相補性ＲＮＡおよびＤＮＡ分子、およびＰＮＡを含む。ポリヌクレオチドは、ＳＮＡＲＫの発現が疾病と相関し得る生検組織中での遺伝子発現を検出および定量するために使用され得る。診断アッセイは、ＳＮＡＲＫの不在、存在および過剰発現を区別するために、また治療介入の間のＳＮＡＲＫ水準の調節を観察するために使用され得る。
【０１１７】
一つの観点において、ＳＮＡＲＫまたは密接に関連した分子をコード化するゲノム配列を含むポリヌクレオチド配列を検出することができるＰＣＲプローブとのハイブリダイゼーションは、ＳＮＡＲＫをコード化する核酸配列を識別するために使用され得る。プローブの特異性、即ち、非常に特異的な領域、例えば５’調節領域の１０個の固有なヌクレオチド、または少し特異性な領域、例えば３’コード領域またはＳＮＡＲＫのＣ末端の３２０個のアミノ酸についてコードする領域から製造されたか否か、およびハイブリダイゼーションまたは増幅（最高、高、中または低）は、プローブがＳＮＡＲＫ、対立遺伝子または関連配列を天然発生配列のみを識別したか否かを決定するだろう。さもなくば、また特にヒト診断のために、プローブは図１０で図示されたヒト配列の全てまたは検出可能な部分の一つを有するポリヌクレオチドの存在を表すか、またはその相補体を表すことができる配列を有し得る。
【０１１８】
プローブはまた関連配列の検出のために使用されることができ、また好ましくは、ＳＮＡＲＫコード化配列のいずれかからのヌクレオチドの少なくとも５０％を含むべきである。本発明のハイブリダイゼーションプローブはＤＮＡまたはＲＮＡであることができ、また配列番号２のヌクレオチド配列、その相補体またはそのＲＮＡ等価物から、またはプロモータ、エンハンサ要素、および天然発生ＳＮＡＲＫのイントロンを含むゲノム配列から誘導され得る。有用なそのような配列は、対応するヒトＤＮＡを検出するために図１０で図解される。本発明の態様において、そのようなプローブは適当に、配列番号２の核酸残基１〜１０００に広がる領域をベースとする。さもなくば、プローブは、ラットＳＮＡＲＫのＣ末端の３２０個のアミノ酸についてコードする領域をベースとする。
【０１１９】
ＳＮＡＲＫをコード化するＤＮＡのための特異的なハイブリダイゼーションプローブを産生するための手段は、ＳＮＡＲＫまたはＳＮＡＲＫ誘導体をコード化する核酸配列のｍＲＮＡプローブの産生のためのベクター中へのクローニングを含む。そのようなベクターは当該技術に既知であり、市販で入手可能であり、そして適したＲＮＡポリメラーゼおよび適した標識されたヌクレオチドの添加によりインビトロでＲＮＡプローブを合成するために使用され得る。ハイブリダイゼーションプローブは、例えば３２Ｐまたは３５Ｓのような放射性核、またはアビジン／ビオチン結合系を介してプローブに結合されたアルカリホスファターゼのような酵素標識等の様々なレポーター基により標識され得る。
【０１２０】
ＳＮＡＲＫをコード化するポリヌクレオチド配列は、ＳＮＡＲＫの増加した発現または減少した発現と関連した状態、障害または疾病の診断のために使用され得る。そのような状態または疾病の例は、糖尿病を含む燃料利用、また特にグルコース代謝に関連するもの、並びにのう胞繊維症を含むｃＡＭＰ駆動チャネルの異常機能に関連するものを含む。ＳＮＡＲＫをコード化するポリヌクレオチド配列は、サウザンまたはノーザン分析、ドットブロット、または他の膜をベースとする技術において、ＰＣＲ技術において、または患者生検からの液または組織を利用するディップスティック、ピン、ＥＬＩＳＡ分析またはマイクロアレイにおいて使用されて、変更されたＳＮＡＲＫ発現を検出する。そのような定性方法または定量方法は当該技術に良く知られている。
【０１２１】
特別な観点において、ＳＮＡＲＫをコード化するヌクレオチド配列およびその断片は、様々な代謝障害、特に上記されるものの活性化または誘発を検出するアッセイにおいて有用であり得る。ＳＮＡＲＫをコード化するヌクレオチド配列は、標準の方法により標識化され、そして患者からの液または組織試料に、ハイブリダイゼーション複合体の形成に適当な条件下で添加され得る。適当な保温期間の後、試料が洗浄され、そしてシグナルが定量され、そして標準値と比較される。生検試料または抽出試料中でのシグナルの量が比較する対照試料のものから顕著に変更された場合、ヌクレオチド配列が試料中のヌクレオチド配列とハイブリダイズし、そして試料中のＳＮＡＲＫをコード化するヌクレオチド配列の変更された水準の存在は、関連した疾病の存在を示す。そのようなアッセイはまた、動物研究、臨床試行、または個々の患者の治療の観察において、特定の治療処置レジメの効力を評価するために使用され得る。
【０１２２】
ＳＮＡＲＫの発現に関連する疾病の診断についての基礎を与えるために、発現についての通常または標準プロファイルが確立される。これは、動物またはヒトである通常の対象から採取した体液または細胞抽出物を、ＳＮＡＲＫをコード化する配列またはその断片と、ハイブリダイゼーションまたは増幅に適当な条件化で組合せることにより達成される。標準のハイブリダイゼーションは、通常の対象から得られた値を、既知量の実質的に純粋なポリヌクレオチドが使用される実験からのものと比較することにより定量され得る。通常の試料から得られる標準値は、疾病に症候性である患者からの試料から得られた値と比較され得る。標準値と対象値との間の偏差は、疾病の存在を確立するために使用される。
【０１２３】
一度疾病が確立され、そして治療プロトコルが開始されると、ハイブリダイゼーションアッセイは、患者における発現の水準が通常の患者において観察されるものに近づき始めるか否かを評価するために、定例基調で繰り返され得る。連続したアッセイから得られる結果は、数日から数ヶ月の範囲内にある期間にわたる治療の効力を表すために使用され得る。
【０１２４】
糖尿病に関して、個人からの生検組織中の比較的多量の転写体の存在は、疾病の発達についての素因を示すことがきるか、または実際の臨床上の症候の出現の前に疾病を検出するための手段を与え得る。同様に、ＳＮＡＲＫコード化ポリヌクレオチドとの、または突然変異を伴うことが予期される領域について特異的なプローブとのハイブリダイゼーションによる異常なＳＮＡＲＫ遺伝子の検出は、ＳＮＡＲＫ遺伝子中での遺伝子異常を有する患者を識別するために使用されることができる。この種のより確定的な診断は、健康専門家が予防的手段または攻撃的治療を用い、それにより状態の発達またはさらなる進行を予防することを可能にし得る。
【０１２５】
ＳＮＡＲＫをコード化する配列から設計されたオリゴヌクレオチドについてのさらなる診断的使用は、ＰＣＲの使用を伴い得る。そのようなオリゴマーは、化学合成されるか、酵素により生成されるか、またはインビトロで産生され得る。オリゴマーは好ましくは、二つのヌクレオチド配列、センス配向（５’＞３’）を有する一つ、およびもう一つのアンチセンス配向（３’＞５’）を有するものからなり、特定の遺伝子または状態の識別のために最適化された条件下で用いられるであろう。同じ二つのオリゴマー、オリゴマーの分岐した組、またはオリゴマーの縮退プールが、密接に関連したＤＮＡまたはＲＮＡ配列の検出および／または定量のために、あまり厳密でない条件下で用いられ得る。
【０１２６】
ＳＮＡＲＫの発現を定量するために同様に使用され得る方法は、放射性標識化またはビオチニル化ヌクレオチド、制御核酸の共増幅、および実験結果が組込まれている標準曲線を含む（メルビー，Ｐ．Ｃ．等、（１９９３） Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ， １５９：２３５−２４４、デュープラ，Ｃ．等、（１９９３） Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２１２：２２９−２３６）。多数の試料の定量の速度は、関心のあるオリゴマーが様々な希釈度で存在し、そして分光応答または色度応答が素早い定量を与えるＥＬＩＳＡフォーマットでアッセイを行うことにより加速され得る。
【０１２７】
さらなる態様において、本願に記載されたポリヌクレオチド配列のいずれかから誘導されたオリゴヌクレオチドは、マイクロアレイの標的として使用され得る。マイクロアレイは、多数の遺伝子の発現水準を同時に観察するために（転写イメージを製造するために）、また遺伝子変異体、突然変異体および多形を識別するために使用されることができる。この情報は、遺伝子機能を決定して、疾病の遺伝子的基礎を理解し、疾病を診断し、そして治療剤の活性を増大および観察するために使用され得る。
【０１２８】
一つの態様において、マイクロアレイは、その全てが引用により本願明細書に組込まれるＰＣＴ出願ＷＯ９５／１１９９５（チー等）、ロックハート，Ｄ．Ｊ．等（１９９６； Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈ． １４：１６７５−１６８０）、およびシェナ等（１９９６； Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ９３：１０６１４−１０６１９）に記載される方法に従って生成および使用され得る。
【０１２９】
マイクロアレイは好ましくは、固体支持体に結合されている多数の固有な一本鎖核酸配列、通常は合成アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはｃＤＮＡの断片からなる。オリゴヌクレオチドは好ましくは、約６〜６０ヌクレオチド長、より好ましくは１５〜３０ヌクレオチド長、また最も好ましくは約２０ヌクレオチド長である。ある種のマイクロアレイについて、７〜１０ヌクレオチド長のみであるオリゴヌクレオチドを使用するのが好ましいかもしれない。マイクロアレイは、既知の５’または３’配列をカバーするオリゴヌクレオチドを含むか、または全長配列をカバーするオリゴヌクレオチド、または配列の長さに沿った特別な範囲から選択される固有なオリゴヌクレオチドを含み得る。マイクロアレイで使用されるポリヌクレオチドは、少なくとも配列の断片が既知である関心のある遺伝子または遺伝子類に特異的であるか、または特定の細胞種、発達または疾病状態に共通である一つまたはそれ以上の識別されていないｃＤＮＡに特異的であるオリゴヌクレオチドであり得る。ある特別な状況において、マイクロアレイ上でオリゴヌクレオチドの対を使用することが適し得る。“対”は、好ましくは配列の中心に位置する一方のヌクレオチドを除いて同一であるだろう。対のうちの第二オリゴヌクレオチド（一方により整合されないもの）は、対照として働く。オリゴヌクレオチド対の数は２ないし百万の範囲内である。
【０１３０】
マイクロアレイのための既知の配列に対するオリゴヌクレオチドを産生するために、関心のある遺伝子が、ヌクレオチド配列の５’末端で、またはより好ましくは３’末端で開始するコンピュータアルゴリズムを使用して検査される。アルゴリズムは、遺伝子に固有であり、ハイブリダイゼーションに適当な範囲内のＧＣ含有量を有し、そしてハイブリダイゼーションと干渉し得る予期された二次構造のない定義された長さのオリゴマーを識別する。オリゴマーは、基材上の設計された範囲で、光指向化学的方法を使用して合成される。基材は、紙、ナイロンまたは他の種類の膜、濾紙、チップ、スライドガラスまたはあらゆる他の適当な固体支持体であり得る。
【０１３１】
他の観点において、オリゴヌクレオチドは、参照によりその全体が本願に組み入れられるＰＣＴ出願ＷＯ９５／２５１１１６（バルデシュビーラー等）に記載されるように、化学結合手順およびインクジェット適用装置を使用することにより基材の表面で合成され得る。他の観点において、ドット（またはスロット）ブロットに類似した“グリッド化された”アレイが、ｃＤＮＡフラグメントまたはオリゴヌクレオチドを、基材の表面に、真空系、熱、ＵＶ、機械的または化学的結合手順を使用して配列および結合されるために使用され得る。アレイは、手動により、または利用可能な装置（スロットブロット装置またはドットブロット装置）、材料および機械（ロボティック装置を含む）を使用して製造されることができ、また８、２４、９６、３８４、１５３６または６１４４個のオリゴヌクレオチド、またはそれを市販で入手可能な設備の効率的な使用に導く２ないし百万のあらゆる他の多重度を含み得る。
【０１３２】
マイクロアレイを使用して試料分析を行うために、生体試料からのＲＮＡまたはＤＮＡがハイブリダイゼーションプローブにされる。ｍＲＮＡが単離され、またｃＤＮＡが産生され、そしてアンチセンスＲＮＡ（ａＲＮＡ）を作製するためのテンプレートとして使用される。ａＲＮＡは、蛍光ヌクレオチドの存在下で増幅され、そして標識されたプローブがマイクロアレイと共に保温されて、プローブ配列がマイクロアレイの相補性オリゴヌクレオチドにハイブリダイズする。培養条件は、ハイブリダイゼーションが正確な相補性の調和または様々な度合いのより低い相補性で生じるように調節される。ハイブリダイズしないプローブの除去後、蛍光の濃度およびパターンを決定するためにスキャナが使用される。スキャンされたイメージが検査され、相補性の度合いおよびマイクロアレイ上での各オリゴヌクレオチド配列の相対的発生量を決定する。生体試料は、あらゆる体液（例えば、血液、尿、唾液、痰、胃液等）、培養された細胞、生検または他の組織生成物から得られ得る。検出系は、不在、存在、および別個の配列の全てについてのハイブリダイゼーションの量を同時に測定するために使用され得る。このデータは、大規模相関研究または試料間の配列、突然変異体、変異体または多形の機能分析のために使用され得る（フーラー，Ｒ．Ａ．等、（１９９７） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ９４：２１５０−５５）。
【０１３３】
本発明の他の態様において、ＳＮＡＲＫをコード化する核酸配列はまた、天然発生ゲノム配列を遺伝子地図作製するために有用であるハイブリダイゼーションプローブの生成のために使用され得る。配列は、特定の染色体に、染色体の特定の領域に、またはプライス，Ｃ．Ｍ．、（１９９３） Ｂｏｏｄ Ｒｅｖ． ７：１２７−１３４、およびトラスク，Ｂ．Ｊ．、（１９９１） Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ． ７：１４９−１５４に概説されるようなヒト人工染色体（ＨＡＣ）、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、バクテリア人工染色体（ＢＡＣ）、バクテリアＰ１構築物または単一染色体ｃＤＮＡライブラリのような人工染色体構築物に遺伝子地図作製され得る。
【０１３４】
蛍光イン・シトゥーハイブリダイゼーション（ベルマ等（１９８８）Ｈｕｍａｎ Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ： Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、ペルガモン・プレス、ニューヨーク、ニューヨークに記載されるＦＩＳＨ）は、他の物理的染色体遺伝子地図作製技術およびゲノム遺伝子地図データと相関され得る。ゲノム遺伝子地図データの例は、様々な化学雑誌において、またはオンライン・メンデリアン・インヘリタンス・イン・マン（ＯＭＩＭ）において見出されることができる。生理的染色体遺伝子地図上でのＳＮＡＲＫをコード化する遺伝子の位置と特定疾病、または特定疾病に対する疾病素因との間の相関は、遺伝疾病と関連するＤＮＡの領域の境界を定めるために役立ち得る。本発明のヌクレオチド配列は、正常、保有者または罹病した個人の間の遺伝子配列における差異を検出するために使用され得る。
【０１３５】
染色体生成物のイン・シトゥーハイブリダイゼーションおよび確立された染色体マーカーを使用する結合分析のような物理的遺伝子地図作製技術は、遺伝子地図を拡張するために使用され得る。マウスのような他の哺乳類種の染色体上での遺伝子の位置はしばしば、特定のヒト染色体の番号および腕部が知られていなくとも、関連したマーカーを表し得る。新たな配列は、物理的遺伝子地図作製することにより、染色体腕部、またはその一部に割り当てられることができる。これは、位置クローニングまたは他の遺伝子発見技術を使用して疾病遺伝子についてサーチしている調査者に価値のある情報を与える。一度疾病および症候群が遺伝子結合により特定のゲノム領域、例えばＡＴないし１１ｑ２２〜２３（ガッチ，Ｒ．Ａ．等、（１９９８） Ｎａｔｕｒｅ ３３６：５７７−５８０）に大まかに位置決定されると、その範囲に遺伝子地図作製するあらゆる配列が、さらなる調査のための関連遺伝子または調節遺伝子を表し得る。本発明のヌクレオチド配列はまたは、転座、反転等により正常、キャリア、罹病した個人による遺伝子位置における差異を検出するために使用され得る。
【０１３６】
本発明の他の態様において、ＳＮＡＲＫ、その触媒または免疫原性断片またはそのオリゴペプチドは、いずれの様々な薬剤スクリーニング技術における化合物のライブラリをスクリーニングするために使用されることができる。そのようなスクリーニングにおいて用いられる断片は、溶媒中で遊離し、固体支持体に固定され、細胞表面上に有され、または細胞内に局在化され得る。ＳＮＡＲＫと試験される薬剤との間の結合複合体の形成が、測定され得る。
【０１３７】
使用され得る薬剤スクリーニングのための他の技術は、公開されたＰＣＴ出願ＷＯ８４／０３５６４で記載されるような、関心のあるタンパク質に適当な結合親和性を有する化合物のハイスループットスクリーニングを与える。この方法において、ＳＮＡＲＫに適用されるように、多数の異なる小さな試験化合物が、プラスチックピン、または幾つかの他の表面のような固体基材上で合成される。試験化合物は、ＳＮＡＲＫまたはその断片と反応させられ、そして洗浄される。結合されたＳＮＡＲＫはその後、当該技術に良く知られた方法により検出される。精製されたＳＮＡＲＫはまた、上記した薬剤スクリーニング技術での使用のためにプレート上に直接塗布されることができる。さもなくば、非中和抗体がペプチドを捕捉し、そして固体基材上に固定化するために使用されることができる。
【０１３８】
他の態様において、ＳＮＡＲＫを特異的に結合できる中和抗体がＳＮＡＲＫを結合するための試験化合物と競争する、競争薬剤スクリーニングアッセイを使用し得る。この方法において、抗体は、一つまたはそれ以上のＳＮＡＲＫとの抗原性決定因子を共有するあらゆるペプチドの存在を検出するために使用されることができる。
【０１３９】
実施例
材料および方法
化学種および材料　−
放射性化学種は、ＩＣＮバイオケミカルズ（カリフォルニア、米国；［３２Ｐ］−α−ｄＡＴＰ（＞３０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ））、アマーシャム・ファルマシア・バイオテック（バイデューフェ、ケベック；［３２Ｐ］−γ−ＡＴＰ（＞５０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ））またはＮＥＮライフ・サイエンセズ（ギュルフ、カナダ国；［３５Ｓ］−メチオニン（＞１０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ））から購入した。細胞培養消耗品、コンサート核酸精製およびスーパースクリプト予備増幅系は、カナディアン・ライフ・テクノロジー（バーリントン、オンタリオ）から入手した。ＴＯＰＯ・ＴＡクローニングキットおよびｐｃＤＮＡ３．１ベクターは、インビトゲン（サンディエゴ、カリフォルニア）から購入した。ナイロンおよびＰＶＤＦ膜、Ｔ７−シークエンシングキット、ＧＳＴ遺伝子融合系およびプロテインＡセファロースＣＬ４Ｂは、アマーシャム・ファルマシア・バイオテックからのものである。ＴＮＴ結合した網状赤血球溶解物系は、プロメガ（マディソン、ウイスコンシン）からのものである。ブラッドフォードＤＣプロテインアッセイキットは、バイオラッド（ミッソーガ、カナダ）から購入した。ＮＥＮルネッサンス増大化学発光（ＥＣＬ）試薬プラスキットおよびコダック・バイオマックスＭＳおよびＭＬフィルムは、マンデル・サイエンティフィック（ギュルフ、オンタリオ）から購入した。化学種およびプロテアーゼ阻害剤の大部分は、バイオショップ（オークビル、オンタリオ）から購入した。脱リン酸化したミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）は、アップステートバイオテクノロジー（ニューヨーク、ニューヨーク、米国）から入手した。脱リン酸化したＢ−カゼイン、全ヒストンおよび硫酸プロタミンは、シグマ−アルドリッチ（オークビル、オンタリオ、カナダ）から購入した。プロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）およびｃＡＭＰ−依存プロテインキナーゼ（ＰＫＡ）阻害剤ペプチドは、サンタクルーズ・バイオテクノロジー（サンタクルーズ、カリフォルニア、米国）により供給された。ＳＡＭＳペプチドは、プロテイン・シンセシス・ファシリティ（ホスピタル・フォー・シック・チルドレン、トロント、オンタリオ、カナダ国）により合成された。ＡＭＰＫａ２抗体は親切にもネイル・ルデルマン博士（ボストン、マサチューセッツ、米国）により提供された。
【０１４０】
細胞培養および照射　−
新生ラットケラチン合成細胞（ＮＲＫＣ）および乳児ハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞を、以前に記載されたように［２１、２２］増殖させた。細胞を１０ｃｍ皿に、１×１０６ＮＲＫＣ細胞または３×１０６ＢＨＫ細胞の密度で種付けし、そして２〜３日間、実験の前に培養した。培地を除去し、そして低血清培地、即ち、０．１％の新生子牛血清（ＣＳ）、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシンおよび１００単位／ｍＬのペニシリンを含むＤＭＥＭで置換し、そして１８時間（ＢＨＫ細胞）または１．５時間（ＮＲＫＣ細胞）、各実験の前に培養した。グルコース奪取を、２５ｍＭグルコースを対照プレートについて使用したのを除き、以前に記載されたように行った［１０］。
【０１４１】
ＤＮＡおよびＲＮＡ分析　−
ＳＮＡＲＫのｃＤＮＡの配列決定を、Ｓｐ６およびＴ７プライマーで、シークエナーゼＴ７ＤＮＡポリメラーゼキットを使用して、またはヨーク・ユニバーシティ・コア・シークエンシング・ファシリティ（トロント、カナダ国）によりアプライド・バイオシステムズ・シークエンサ−ストレッチ・モデルおよびＴａｑポリメラーゼ・ダイ・ジオキシ停止剤サイクル配列決定方法を使用して行った。クラスター状多重配列アライメントを、ＭＢＳ−アライナープログラムを使用して行った。ＲＮＡを単離し、そしてノーザンブロッティングおよびＲＴ−ＰＣＲにより以前に記載されたように分析した［２３］。全長のＳＮＡＲＫのｃＤＮＡを［α−Ｐ３２］−ＡＴＰでランダムプライミング技術［２４］により標識し、そしてノーザン分析およびサウザン分析のためのプローブとして以前に記載されたように使用した［２３］。
【０１４２】
逆トランスクリプターゼ−ＰＣＲ　−
第一ストランドｃＤＮＡを、スーパースクリプト予備増幅システムおよび以下のプライマー：５’−ＣＣＧＧＡＴＣＣＡＴＧＧＡＧＴＣＧＧＴＧ−ＧＣＣＴＴＡＣＡＣ−３’および５’−ＣＣＧＧＡＴＣＣＣＴＡＡＧＡＧＴＴＣＣＣＣＡＧ−ＡＣＴＣＡ−３’（広げられたＳＮＡＲＫ配列）を使用して生成して、ＳＮＡＲＫ転写体を増幅した。ＰＣＲをパーキン・エルマー・ジーンアンプ２４００ＰＣＲシステムで、ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼを使用して、５０μＬの最終容積で行った。以下の条件を使用した：９４℃で５分間の変性、１分間の９４℃、１分間の５９℃および２分間の７２℃からなる３５サイクル、および７２℃で１０分間の最終延長。ＰＣＲ反応物の半分を、１％アガロースゲル上に載せ、そしてナイロン膜上に固定化し、そしてその後上記したようにプローブ検査した。ＰＣＲ産生物を、ＴＯＰＯ・ＴＡクローニングキットを使用してサブクローニングし、そしてＳＮＡＲＫ・ＰＣＲ産生物の識別を確認するために配列決定した。
【０１４３】
ヒト染色体遺伝子地図作製　−
部分的なヒトＳＮＡＲＫゲノム断片の単離に続き、染色体局在化を、蛍光イン・シトゥーハイブリダイズ（ＦＩＳＨ）［２５］により、プロピジウムヨージドおよび４’、６−ジアミジン−２−フェニルインドールジヒドロクロリド（ＤＡＰＩ）で後染色した正常ヒト網状赤血球染色体に対して行った。
【０１４４】
ＳＮＡＲＫのｃＤＮＡのクローニング　−
ＳＮＡＲＫの全体のオープンリーディングフレームを含む全長クローンを、ラットの肺、腎臓およびケラチン合成細胞から単離したオーバーラッピングクローンを使用して生成した。ラットＳＮＡＲＫの完全なオープンリーディングフレームをｐｃＤＮＡ３．１ベクター中にサブクローニングした。
【０１４５】
ヒトＳＮＡＲＫのクローニングを以下のように完了した：ヒトケラチン合成細胞系、ＨａＣａＴは、形質転換された表現系を発現するが、非腫瘍発生性のままである成人ヒト皮膚からの不死化上皮細胞系である（ボウカンプ，Ｐ．等、１９８８， Ｊ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． １０６：７６１−７）。全細胞ＲＮＡをＨａＣａＴ細胞から、以前に記載されたように（チグウィン，ＪＭ等、１９７９， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １８：５２９４−９９）単離し、そして第一ストランドｃＤＮＡを、スーパースクリプト予備増幅システム（カナディアン・ライフ・テクノロジー、バーリントン、オンタリオ）を使用して生成した。逆トランスクリプターゼ−ポリメラーゼ鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を、ＨａＣａＴ第一ストランドｃＤＮＡ、ＳＮＡＲＫセンス−ストランドプライマー（ｎｔ２４０〜２６０、５’−ｔｇａｇｇｃａｃｃｇｃｔａｃｇａｇｔｔｃｃ−３’）およびアンチセンスストランドプライマー（ｎｔ９１８〜９３８、５’−ａｃｃｇｇａｔｃａｇｇｃｃａｃａｇｇｃａｔ−３’）を使用し、ＳＮＡＲＫ転写体の６９８ｂｐ領域を増幅するために行った。ＲＴ−ＰＣＲをパーキン・エルマー・ジーンアンプ２４００ＰＣＲシステムで、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（カナディアン・ライフ・テクノロジー、バーリントン、オンタリオ）を使用し、５０μＬの最終容積で行った。以下の条件を使用した：９４℃で５分間の変性、１分間の９４℃、１分間の５９℃および２分間の７２℃からなる３５サイクル、および７２℃で１０分間の最終延長。生じたＰＣＲ反応物の半分を、サイズ分離により１％アガロースゲル上で分析した。６９８ｂｐバンドをアガロースゲルから切り出し、そしてＤＮＡをコンサート核酸精製システム（カナディアン・ライフ・テクノロジー、バーリントン、オンタリオ）を使用して溶出した。ＰＣＲ産生物を、ＴＯＰＯ・ＴＡクローニングキット（インビトロゲン、サンディエゴ、カリフォルニア）を使用してサブクローニングし、そして配列決定をＡＣＧＴシークエンシング（トロント、オンタリオ）により、Ｔ７およびＭ１３プライマーで行った。配列アライメントおよびＨａＣａＴおよびラットＳＮＡＲＫの配列の比較を、ＤＮＡＳＩＳプログラム（ヒタチ・ソフトウェア・エンジニアリング）を使用して行った。
【０１４６】
マウスＳＮＡＲＫのクローニングを以下のようにして完了した：ヘアレスマウスを安楽死させ、そして腎臓を切開し、そしてＲＮＡ抽出について処理した（クリグウィン，ＪＭ等、１９７９， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １８：５２９４−９９）。全細胞ＲＮＡを単離し、そして第一ストランドｃＤＮＡをスーパースクリプト予備増幅系（カナディアン・ライフ・テクノロジーズ、バーリントン、オンタリオ）を使用して生成した。逆トランスクリプターゼ−ポリメラーゼ鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）をマウス腎臓第一ストランドｃＤＮＡを使用して行い、ＳＮＡＲＫセンスストランドプライマー（ｎｔ２４０〜２６０、５’−ｔｇａｇｇｃａｃｃｇｃｔａｃｇａｇｔｔｃｃ−３’）および、アンチセンスストランドプライマー、１）５’−ａｃｃｇｇａｔｃａｇｇｃｃａｃａｇｇｃａｔ−３’（ｎｔ９１８〜９３８）または２）５’−ｃｃａｇｔｔｇａｃｃｃａｃｃａａｔｇａｃｔｇｇ−３’（ｎｔ９８７〜１００１）を使用し、ＳＮＡＲＫ転写体の１）６９８ｂｐ領域または２）７６１ｂｐ領域を増幅した。ＲＴ−ＰＣＲをパーキン・エルマー・ジーンアンプ２４００ＰＣＲシステムで、ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼ（ストラタジーン、カリフォルニア、米国）２．５ユニットを使用して５０μＬの最終容積で行った。以下の条件を使用した：９４℃で５分間の変性、１分間の９４℃、１分間の５３℃および２分間の７２℃からなる３０サイクル、および７２℃で２０分間の最終延長。生じたＰＣＲ反応産生物をサイズ分離により１％アガロースゲル上で分析した。ＰＣＲ産生物をアガロースゲルから切り出し、そしてＤＮＡをコンサート核酸精製システム（カナディアン・ライフ・テクノロジー、バーリントン、オンタリオ）を使用して溶出した。ＰＣＲ産生物を、ＴＯＰＯ・ＴＡクローニングキット（インビトロゲン、サンディエゴ、カリフォルニア）を使用してサブクローニングし、そして配列決定をＡＣＧＴシークエンシング（トロント、オンタリオ）により、Ｔ７およびＭ１３プライマーで行った。配列アライメント並びにＨａＣａＴ配列およびラットＳＮＡＲＫ配列の比較を、ＤＮＡＳＩＳプログラム（ヒタチ・ソフトウェア・エンジニアリング）を使用して行った。
【０１４７】
抗血清の生成　−
２０３残基（配列番号２のヌクレオチド８５８〜１４６７に相当）を含むポリペプチドを、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）融合タンパク質として発現し、ポリアクリルアミド電気泳動により精製し、そして三匹のウサギ（コカリコ・バイオロジカルズ、米国）を免疫するために使用した。ポリクローナルアンチ−ＳＮＡＲＫ抗血清を収集し、そしてウエスタンブロット分析および免疫沈降反応のために使用した。
【０１４８】
インビトロ転写および翻訳　−
ＳＮＡＲＫ／ｐｃＤＮＡ３．１プラスミド構築物を、インビトロ転写および翻訳についてのテンプレートとして使用した。ＴＮＴ結合網状赤血球溶解物系を製造者プロトコルに従って使用した。３５Ｓ−ＳＮＡＲＫおよび３５Ｓ−ルシフェラーゼ（系対照）の免疫沈降反応（ＩＰ）［２９］を、下記するＴＮＴ反応物２μＬで行った。２×ＳＤＳ−ローディング緩衝液（２５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ＰＨ６．８、４％（ｗ／ｖ）のＳＤＳ、２０％（ｗ／ｖ）のグリセロール、０．０４％（ｗ／ｖ）のブロモフェノールブルー）１２μＬを、１０％ポリアクリルアミド／ＳＤＳゲル上での電気泳動の前に複合体に添加した。ゲルを乾燥し、そしてその後コダック・バイオマックス・ＭＳフィルムに露光した。
【０１４９】
タンパク質抽出、免疫沈降反応およびウエスタン分析　−
細胞培養物を擦り落とし、そして以前に記載されたように溶解物緩衝液中で均一化した［２７］。全タンパク質濃度をブラッドフォードＤＣタンパク質アッセイによりアッセイした。免疫沈降反応を、ＩＰ反応におけるＮａＣｌの最終濃度が１５０ｍＭであることを除き、以前に記載されたように全タンパク質５００μｇで行った［１０］。免疫複合体試料のウエスタン分析を、８％ポリアクリルアミド／ＳＤＳゲル上での電気泳動、および続くＰＶＤＦ膜上でのタンパク質の移行および固定化により行った。膜を０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０（ＴＢＳＴ）を有するＴｒｉｓ緩衝食塩水（０．５ＭのＴｒｉｓ、１．５ＭのＮａＣｌ）中の２％ゼラチンで２時間ブロックし、ＳＮＡＲＫ抗血清（ＴＢＳＴ中での１：１６００希釈）で４時間培養し、そしてその後、ホースラディッシュペルオキシダーゼ結合アンチ−ラビットＩｇＧ（アマーシャム・ファルマシア・バイオテック）の二次抗体で１時間保温した。徹底的な洗浄後、膜をＥＣＬで６０秒間現像し、そしてコダック・バイオマックスＭＬフィルムに露光した。タンパク質の等しい使用量をポンセオーＳでの染色により確認した。
【０１５０】
キナーゼアッセイ　−
抗血清での免疫沈降反応に続き、キナーゼアッセイを免疫沈降させたＳＮＡＲＫおよび様々な基質（ＭＢＰ、Ｂ−カゼイン、全ヒストン画分、硫酸プロタミンおよび合成ペプチド基質（ＨＭＲＳＡＭＳＧＬＨＬＶＫＲＲ、“ＳＡＭＳ”ペプチド）で行うことにより、ＳＮＡＲＫ活性を分析した。ＳＡＭＳペプチドでのキナーゼアッセイは本質的に、三回の洗浄を５００ｍＭのＮａＣｌを含むＩＰ緩衝液で為し、そして続いてキナーゼアッセイ緩衝液での最終洗浄を為したことを除いて、記載されたように行った［２８、２９］。基質特異性を決定するために（ＳＡＭＳペプチド以外の基質で）行ったキナーゼアッセイについては、反応は、３０ｕｇの基質、５００ｍＭのＰＫＡ阻害剤ペプチドおよび１ｕＭのＰＫＣ阻害剤ペプチドを含んでいた。活性を免疫沈降反応に供した溶解物の１ミリグラム当りのＳＭＡＳペプチド／分の中に組込まれたリン酸塩のｆｍｏｌ引くブランク反応（細胞溶解物およびプロテインＡ−セハロースのみ）で得られた活性として計算した。
【０１５１】
細胞トランスフェクション　−
安定なＳＮＡＲＫトランスフェクションされた細胞系を、以前に記載されたようなＤＮＡ移入のリン酸カルシウム媒介方法を使用し、成功した移入体について選択するためにＧ４１８を使用して生成した［３０］。
【０１５２】
結果
サウザンブロット分析は、ラットとヒトとのゲノムＤＮＡ試料の双方において、哺乳類ゲノムにおけるＳＮＡＲＫの単一コピーと一致する単一模様のハイブリダイズバンドのを表した（図１Ａ）。ＳＮＡＲＫのヒト染色体局在化を、単離したラットＳＮＡＲＫのｃＤＮＡ断片をヒトＰ１−誘導人工染色体（ＰＡＣ）ライブラリとハイブリダイズさせることにより検査した。この実験は、ヒトＳＮＡＲＫ相同体をヒト染色体１ｑ３２に局在化する単一にハイブリダイズしたＰＡＣクローンを識別した（図１Ｂ）。１ｑ３２での陽性のハイブリダイゼーションシグナルは、中期細胞の＞９０％において記された。
【０１５３】
元々の部分的ｃＤＮＡ［２０］をプローブとして使用して、２９２９個のヌクレオチドを含む全長ｃＤＮＡクローンを、ヌクレオチド８３で始まり位置１９７５で終了する１８９３個のヌクレオチドからなる単一の未中断ＯＲＦで単離した（図２）。ＯＲＦは６３０個のアミノ酸（ａａ）からなり、６９．９５キロダルトン（ｋＤ）の予期された分子量および９．３５の理論ｐＩを有する推論上のタンパク質をコード化していた。タンパク質のアミノ（Ｎ）−末端領域（ａａ５７〜３０８）の推論されたアミノ酸配列の他の既知のタンパク質との比較は、ＳＮＦ１プロテインキナーゼ［３１］およびＡＭＰＫ［３２］のそれぞれの触媒ドメイン内で、４８％および５０％の同一性（ＢＬＯＳＵＭ６２マトリクスによりスコアされた保存置換を含むことにより６８％の相似性）を表し、ＳＮＦ１／ＡＭＰＫ−Ｒｅｌａｔｅｄ・Ｋｉｎａｓｅ、即ち、ＳＮＡＲＫの記号を付す（図３）。ＳＮＡＲＫはセリン／スレオニンプロテインキナーゼ［３３］において保存されている全１１個の触媒サブドメインを含む（図３）。プロサイトプログラムを使用するＳＮＡＲＫの触媒ドメインの分析は、プロテインキナーゼＡＴＰ−結合領域指定（ａａ６３〜８９）およびセリン／スレオニンプロテインキナーゼ活性部位指定（ａａ１７５〜１８７）（図２）を明らかにした。ＳＮＡＲＫのカルボキシル（Ｃ）末端での配列は特徴的であり、そして他のＳＮＦ１／ＡＭＰＫ系統員のＣ末端配列と良く保存されていない。不安定性指数は、プロトパラム・ツールプログラムを使用して５８．４０であると計算され、ＳＮＡＲＫを不安定タンパク質として分類した。
【０１５４】
ノーザン分析は、ＳＮＡＲＫのＲＮＡ転写体がラット腎臓において最も豊富であることを示した（図４Ａ）。ＲＴ−ＰＣＲは、ＲＮＡ中の二つのＳＮＡＲＫのｃＤＮＡ産生物を、ラットの心臓、皮膚、脾臓、肺、子宮、肝臓および新生児ラットケラチン合成細胞系から検出した（図４Ｂ）。二つの異なるＳＮＡＲＫのＲＴ−ＰＣＲ産生物が幾つかの組織からクローニングされ、配列決定され、そして本物のＳＮＡＲＫ（１４３７ｂｐ）または内部欠失されたＳＮＡＲＫ（−Δ）転写体（１２４７ｂｐ）をコード化することが見出された。ラット腎臓が損なわれていないＳＮＡＲＫ転写体を支配的に含み、また睾丸は１２４７ｂｐ−Δ転写体のみを発現するけれども、損なわれていないのとΔ−との双方のＳＮＡＲＫ転写体は、皮膚、脾臓、肺、子宮および肝臓で検出された。ＳＮＡＲＫ−Δ転写体は、キナーゼドメインＩとＩＩの部分にわたる５７ｂｐのフレーム内欠失、および最大酵素活性に関わる固有のリシン残基を含むキナーゼドメインＩＸ〜ＸＩにおける１３３ｂｐのフレーム外削除を含む。ＳＮＡＲＫ−Δ転写体の翻訳は、〜４１５アミノ酸の未成熟に終了されたタンパク質の発生を与えると予期される。内部削除されたラットＡＭＰＫ転写体はまた報告されている［３４７］。配列番号２のＳＮＡＲＫコード化ＤＮＡをベースとする本発明のプローブはそれ故、組織試料中で異常なＳＮＡＲＫコード化ＤＮＡを識別するために有用であり、そして異常グルコース代謝に関連した障害を表す患者から入手したＤＮＡ試料を特徴付けるために診断的に使用されることができる。
【０１５５】
全長ＳＮＡＲＫのｃＤＮＡテンプレートを使用する［３５Ｓ］−メチオニンの存在下でのインビトロ転写および翻訳は、ＳＮＡＲＫ抗血清（第５列）により免疫沈降された約７６ｋＤの主なタンパク質産生物を生じる（図５Ａ、第１列）。およそ７６〜８０ｋＤのサイズを有する明らかに検出できるタンパク質の二重線は、ＳＮＡＲＫトランスフェクションされたＢＨＫ細胞の二つの別個のクローン（ＢＨＫ＋１およびＢＨＫ＋１１）においてＳＮＡＲＫ抗血清を使用して検出された（図５Ｂ、第１および３列）が、非免疫血清では検出されなかった（図５Ｂ、第２列）。
【０１５６】
ＳＮＡＲＫが自己リン酸化できるか否かを評価するために、免疫沈降されたＳＮＡＲＫを［３２Ｐ］−γ−ＡＴＰと共に保温し、そして反応産生物をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により検査した（図６）。自己リン酸化産生物は野生種ＢＨＫ細胞（第１列）からの免疫沈降された内因性ＳＮＡＲＫの試料中で検出されなかったけれども、一つの大きなリン酸化バンド、恐らくタンパク質二重線が、免疫沈降反応物においてＳＮＡＲＫトランスフェクションされたＢＨＫ細胞（図６、第２および４列）から検出された。リン酸化バンドのサイズは、ウエスタン分析によりこれらの細胞系において検出されたＳＮＡＲＫのサイズ（≒７６〜８０ｋＤ）に相当する。さらに、リン酸化されたタンパク質は、非免疫血清での免疫沈降反応に続く細胞抽出物（第３および５列）または抽出物を含むが血清を含まない試料（第６列）中に観察されなかった。これらの結果は、ＳＮＡＲＫがインビトロで自己リン酸化できるプロテインキナーゼであることを示す。このアッセイはまた、ＳＮＡＲＫ変異体がＳＮＡＲＫの自己リン酸化特性を保持しているか否かを決定するために適当である。
【０１５７】
免疫沈降されたＳＮＡＲＫプロテインがインビトロでタンパク質基質をリン酸化する能力を有するか否かを決定するために、キナーゼアッセイを、脱リン酸化されたＭＢＰ、脱リン酸化されたβ−カゼイン、全ヒストン画分、硫酸プロタミン、およびＳＡＭＳペプチド、ＡＭＰＫによりリン酸化されたラットアセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ中の部位に対応する良く確定されたＡＭＰＫ基質［２８］を含む基質の候補を使用して行った。ＰＫＡおよびＰＫＣのペプチド阻害剤はこれらの反応中に含まれて、これらの酵素によるこれらの基質のリン酸化を排除した。ＮＲＫＣ細胞溶解物から免疫沈降されたＳＮＡＲＫで行ったアッセイにおいて、ＳＮＡＲＫはＳＡＭＳペプチドをリン酸化できたが、ＭＢＰ、β−カゼイン、全ヒストン画分および硫酸プロタミンをリン酸化するその能力は最小であった。ＳＡＭＳペプチド基質をリン酸化するＳＮＡＲＫの能力は、ＰＫＡおよびＰＫＣ阻害剤の存在により影響されず、観察されたキナーゼ活性はＰＫＡまたはＰＫＣによるＳＡＭＳペプチドのリン酸化によらないことを示した。結果を以下の表に表す。
【０１５８】
【表１】
2004505628.tif 000003
【０１５９】
ＳＮＡＲＫ抗血清でのＮＲＫＣ細胞溶解物５００ｕｇの免疫沈降反応を上記したように行った。ホスホトランスフェラーゼ活性を、ＳＡＭＳペプチド（２５０ｕＭ）、または１μＭのＰＫＣ阻害剤および５００ｎＭのＰＫＡ阻害剤ペプチドの存在下での脱リン酸化したＭＢＰ、脱リン酸化されたβ−カゼイン、全ヒストン画分または硫酸プロタミン３０ｕｇでアッセイした。ホスホトランスフェラーゼ活性は、３０℃で免疫沈降反応に供したタンパク質１ｍｇ当り、ＳＡＭＳペプチド／分に移行されたリン酸塩のｆｍｏｌで表す。結果は１群当り少なくとも８試料を有する二つの個々のアッセイについての平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．である。＊全ての他の基質と比較したｐ＜０．０１。
【０１６０】
ＳＡＭＳペプチドで野生種ＢＨＫ細胞からの免疫沈降されたＳＮＡＲＫについて行われたキナーゼアッセイは、低い基底水準のＳＡＭＳホスホトランスフェラーゼ活性を与えた（図７Ａ、塗りつぶされた四角）。対照的に、ＳＮＡＲＫトランスフェクションされたＢＨＫ細胞（ＢＨＫ＋１）およびラットＮＲＫＣ細胞中で検出された基底ＳＮＡＲＫホスホトランスフェラーゼ活性はそれぞれ、野生種ＢＨＫ細胞（図７、塗りつぶされた四角）中で見出された水準よりもそれぞれ３．４倍および２倍高く、その理由は、ＡＭＰＫ−α抗体が、ＳＮＡＲＫトランスフェクションしたＢＨＫ細胞中でのＳＮＡＲＫ抗血清よりも４倍低いＳＡＭＳホスホトランスフェラーゼ活性を免疫沈降反応したからであり（データは示されていない）、このアッセイ系において検出されたホスホトランスフェラーゼ活性はＳＮＡＲＫキナーゼ活性に特異的なようである。ＳＮＡＲＫ抗血清はラット骨格筋中のＡＭＰＫイソフォームと交差反応せず、またＡＭＰＫ−α２抗体はＳＮＡＲＫトランスフェクションしたＢＨＫ細胞中でのあらゆる検出可能なＳＡＭＳホスホトランスフェラーゼ活性を免疫沈降反応せず、これらの発見は、ＳＮＡＲＫがＡＭＰＫ様キナーゼ活性を示すことを表す。
【０１６１】
上記したキナーゼアッセイは、ＳＮＡＲＫの機能性変異体、およびそのリン酸化特性を保持するＳＮＡＲＫのキメラ体を認識するために有用である。キナーゼアッセイはまた、試験された基質し対して階層的にその基質活性を保持するＳＮＡＲＫの変異体およびキメラ体を識別するために有用である。即ち、全てのＳＮＡＲＫプロテイン、即ち、野生種（例えば、ラットＳＮＡＲＫおよびその哺乳類相同体）、変異体またはキメラ体にしろ、そのキナーゼ基質に関して上記の表１で表されるリン酸化活性の階級順位を示すだろう。
【０１６２】
ＡＭＰＫは、細胞ＡＴＰの枯渇およびＡＭＰの上昇を導く環境ストレスにより活性化される［１］。ＳＮＡＲＫ活性についての細胞ストレスの効果を評価するために、野生種ＢＨＫ、ＳＮＡＲＫトランスフェクションされたＢＨＫおよびＮＲＫＣ細胞系中でのＳＮＡＲＫホスホトランスフェラーゼ活性についてのＡＭＰの効果が検査された。野生種およびＳＮＡＲＫトランスフェクションされた細胞溶解物が２００μＭのＡＭＰの存在下でアッセイされたとき、ＳＮＡＲＫホスホトランスフェラーゼ活性における顕著な変化は観察されないけれども、ＳＮＡＲＫホスホトランスフェラーゼ活性はＮＲＫＣ細胞中で１．７倍（ｐ＜０．００１）増加した（図７、細い平行線を引かれた四角）。
【０１６３】
アデノシン類似体、５−アミノイミジゾール−４−カルボキシアミドリボシド（ＡＩＣＡＲ）は、高グルコース濃度の存在下でさえＡＭＰＫ活性を刺激する手段を与え、そしてＡＭＰＫカスケードについてのＡＭＰの効果を真似る［３５、３６］。面白いことに、ＳＮＡＲＫ活性は、１ｍＭのＡＩＣＡＲで１時間処理したＮＲＫＣ細胞（図８Ａ、細い平行線を引かれた四角）中で、未処理ＮＲＫＣ細胞（塗りつぶされた四角）中で測定されたＳＮＡＲＫ活性と比較して２．８倍誘発された。ＡＩＣＡＲは細胞中に取り込まれ、そしてアデノシンキナーゼによりアロステリック活性化とＡＭＰＫキナーゼを介したＡＭＰＫのリン酸化との双方についてのＡＭＰの効果を真似るリン酸化されたモノリン酸形態（ＺＭＰ）に転換されるので、このデータは、ＳＮＡＲＫがＡＭＰＫにより上昇した細胞ＡＭＰに応答して共役的に修飾されることができることを意味する。
【０１６４】
培養培地中のグルコースの濃度は、酵母細胞中でのＳＮＦ１活性［３７、３８］と膵臓β−細胞中でのＡＭＰＫ活性［１０］との双方の重要なモジュレータである。グルコースを９０分間奪った野生種ＢＨＫ細胞でアッセイされたＳＮＡＲＫ活性は、２５ｍＭグルコース中で培養されたＢＨＫ細胞で測定された活性水準（塗りつぶされた四角）より２．６倍高かった（ｐ＜０．０３、図８Ｂ、細い平行線を引かれた四角）。この結果は、ＳＮＡＲＫ活性が酵母ＳＮＦ１およびラットＡＭＰＫと類似した方法［１０、３８］で、グルコース奪取に応答することを示唆する。さらに、免疫反応性ＳＮＡＲＫは、ヒト膵臓の外分泌小室および内分泌小室に局在化された。この発見と一致するのは、ラットＩＮＳ−１（インスリノーマ）、マウスαＴＣ（グルカゴノーマ）およびハムスターＩｎＲ１Ｇ９（グルカゴノーマ）細胞系からの細胞溶解物のウエスタン分析であり、ＳＮＡＲＫトランスフェクションされたＢＨＫ細胞において見出されたサイズ（即ち、およそ８０ｋＤａ）に対応するＩＮＳ−１およびαＴＣ細胞系中でのＳＮＡＲＫ免疫活性タンパク質を表した。８０ｋＤａのＳＮＡＲＫプロテインはハムスター細胞系ＩｎＲ１Ｇ９中で検出されていないけれども、およそ１０６ｋＤａに移動したタンパク質が、ＩｎＲ１Ｇ９とＳＮＡＲＫトランスフェクションされたＢＨＫ細胞との双方中で検出された。このより大きなタンパク質は、異なるポスト翻訳変性を受けたＳＮＡＲＫの形態を表すのかもしれない。
【０１６５】
この研究は、ヒト染色体１ｑ３２に局在化されるＳＮＦ１／ＡＭＰＫ系統のセリン／スレオニンキナーゼの一員のクローニングを記載する。３．５ｋｂのＳＮＡＲＫのｍＲＮＡは、セリン／スレオニンキナーゼに特徴的なアミノ酸モチーフを含む７６〜８０ｋＤａのタンパク質をコード化する。ＳＮＡＲＫのｍＲＮＡ転写体は、ＲＴ−ＰＣＲにより検査された殆ど全ての組織で検出可能であり、それ故、ＡＭＰＫ［２８、３４］のように、ＳＮＡＲＫは細胞特異的キナーゼではない。非キナーゼタンパク質の発生を与えることが予期されるＳＮＡＲＫ（−Δ）転写体を含む二つのＳＮＡＲＫのＲＮＡのイソフォームの検出は、ＳＮＡＲＫ発現および細胞型における局在化の将来の研究において、全長ＳＮＡＲＫの検出に特異的なプローブまたはプライマーを使用することの重要性を際立たせる。同様に、ＡＭＰＫとＳＮＡＲＫとの双方は、ＡＭＰＫにより特異的にリン酸化されるアセチルＣｏ−Ａカルボキシラーゼ上の部位から誘導されたＳＡＭＳペプチド基質をリン酸化できる。重要なのは、我々の研究においてＳＮＡＲＫ自己リン酸化およびキナーゼ活性の分析のために使用された抗血清は、ＡＭＰＫに相同性を示さないＳＮＡＲＫのカルボキシ末端領域におけるペプチド配列に対して向けられている。考え合わせると、構造データおよび機能データは、ＳＮＦ１／ＡＭＰＫ系統のキナーゼの新たな哺乳類の一員としてＳＮＡＲＫを確立する。
【０１６６】
その触媒ドメイン内で、ＳＮＡＲＫはＳＮＦ１／ＡＭＰＫ系統のプロテインキナーゼに最も密接に関連し、アミノ酸水準で高度の相同性を有する。ＳＮＦ１／ＡＭＰＫプロテインキナーゼ系統の一員は進化を通して高度に保存されており、そしてこの系統の代表的な一員、ＳＮＦ１およびＡＭＰＫは一般に、各々異なる種類のストレスに応答するけれども、ストレス応答系において鍵となる代謝センサーを表すと考えられる。ＡＭＰＫは、運動およびグルコース奪取［１０、３９］を含む環境ストレスおよび細胞ストレスにより活性化される［１］。これらのストレスは、細胞ＡＴＰを枯渇させ、そしてアデニレートキナーゼ反応を介して、ＡＭＰＫ活性を活性化するためのスイッチとして働くＡＭＰを上昇させる。ＳＮＡＲＫ活性がＡＭＰとＡＩＣＡＲとの双方への暴露により刺激されることができるという発見は、ＡＭＰＫシグナルカスケードのように、ＳＮＡＲＫが細胞ＡＭＰの濃度に敏感であることを示唆する。
【０１６７】
地上の日光の主成分であるため、ＵＶＢは皮膚細胞についての細胞ストレスの一定の発生源であるけれども、ＵＶＢにより誘発される分子シグナル機構は完全に理解されていない。ＵＶＢがケラチン合成細胞中でｃ−ＪｕｎＮＨ２末端キナーゼ（ＪＮＫ）を顕著に活性化し、そしてシグナル導入を媒介する膜関連プロテインキナーゼＣイソフォームの真皮細胞中でのサイトゾルから膜への転位、並びに細胞外調節されたキナーゼ（ＥＲＫ）およびＪＮＫの活性化を通したアポトーシスを誘発する。加えて、ＦＫＢＰ／ＦＲＡＰ／ｐ７０Ｓ６ＫシグナルカスケードはＵＶＢ誘発されたＤＮＡ損傷および修復により調節された経路として認識される。さらに、ＵＶＢは、タイプＩＩインターロイキン−８受容体（ＣＸＣＲ−２）の下方調節を介して過増殖皮膚障害におけるケラチン合成細胞の成長阻害を誘発する。これらおよび他の研究は、ＵＶＢシグナルが膜関連とサイトゾルとの双方のシグナル経路を介して核へ導入され、多数の皮膚効果を生じる主張を支持する。ＵＶＢ照射へのこれらの応答が、ケラチン合成細胞中で細胞内での代謝平衡を再確立する試みにおいてＳＮＡＲＫを活性化するＡＴＰ：ＡＭＰ比率混乱を導き得る。
【０１６８】
記載したように、ＳＮＡＲＫ活性は培地中のグルコースの濃度により調節されることができる。これは、膵臓β−細胞中のＡＭＰＫが細胞外グルコース濃度に応答して調節されることを表す最近の実験［１０］と一致する。膵臓β細胞系のグルコース奪取は、グルコース除去の３０分以内でＡＭＰＫ活性の＞５倍の活性化を生じる［１０］。ＡＭＰＫ活性化は、低濃度の細胞外グルコースから生じる細胞ＡＭＰ／ＡＴＰ比率における大幅な増加に関連し、そしてインシュリン分泌と逆に相関した。逆に、ＡＭＰＫ活性は、ＭＩＮ６β細胞中でグルコース濃度が増化することにより阻害され、またＡＭＰＫ複合体の免疫中和反応は、インビトロにおけるグルコース調節された遺伝子転写を減少する［４０］。ＳＮＡＲＫ免疫反応性はまた、ヒトランゲルハンス島およびげっ歯類ランゲルハンス島の細胞系に局在化されるので、ＳＮＡＲＫは低血糖のような代謝ストレスに応答する小島細胞のモジュレータのようである。
【０１６９】
本願で引用された文献は引用により組込まれ、以下に列挙される。
１．Ｈａｒｄｉｅ ｅｔ ａｌ， １９９８， Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， ６７：８２１．
２． Ｃａｒｌｓｏｎ， １９９９， Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎｉｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．， ２：２０２
３．Ａｌｄｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ， １９９１， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８８：８６０２
４．Ｌｅ Ｇｕｅｎ ｅｔ ａｌ， １９９２， Ｇｅｎｅ， １２０：２４９
５．Ｂｏｕｌｙ ｅｔ ａｌ， １９９９， Ｐｌａｎｔ Ｊ．， １８：５４１
６．Ｈａｎｎａｐｐｅｌ ｅｔ ａｌ， １９９５， Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， ２７：１２３５
７．Ｈａｌｆｏｒｄ ｅｔ ａｌ， １９９２， Ｐｌａｎｔ Ｊ．， ２：７９１
８．Ｍｕｒａｎａｋａ ｅｔ ａｌ， １９９４， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ．， １４：２９５８
９．Ｔａｋａｎｏ ｅｔ ａｌ， １９９８， Ｍｏｌ． Ｇｅｎ． Ｇｅｎｅｔ．， ２６０：３８８
１０．Ｓａｌｔ ｅｔ ａｌ， １９９８， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｊ．， ３３５：５３３
１１．Ｓｕｇｄｅｎ ｅｔ ａｌ， １９９９， Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．， １２０：２５７
１２．Ｂｒａｃｃｈｉ ｅｔ ａｌ， １９９６， Ｍｏｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｐａｒａｓｉｔｏｌ．， ７６：２９９
１３．Ｄａｖｉｅｓ ｅｔ ａｌ， １９９９， Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ， １１１：１１７９
１４．Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ， １９９９， ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．， ４５３：１３５
１５．Ｂｅｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ， １９９６， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， ２３５：７３６
１６．Ｈｅｙｅｒ ｅｔ ａｌ， １９９７， Ｍｏｌ． Ｒｅｐｒｏｄ． Ｄｅｖ．， ４７：１４８
１７．Ｒｕｉｚ ｅｔ ａｌ， １９９４， Ｍｅｃｈ． Ｄｅｖ．， ４８：１５３
１８．Ｉｎｇｌｉｓ ｅｔ ａｌ， １９９３， Ｍａｍｍ． Ｇｅｎｏｍｅ， ４：４０１
１９．Ｇａｒｄｎｅｒ ｅｔ ａｌ， ２０００， Ｇｅｎｏｍｉｃｓ， ６３：４６
２０．Ｒｏｓｅｎ ｅｔ ａｌ， １９９５， Ａｍ． Ｊ． Ｐｈｙｓｉｏｌ．， ２６８：Ｃ８４６
２１．Ｒｏｓｅｎ ｅｔ ａｌ， １９９０， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．， ５０：２６３１
２２．Ｙｕｓｔａ ｅｔ ａｌ， １９９９， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２７４：３０４５９
２３．Ｓｈａｈｍｏｌｋｙ ｅｔ ａｌ， １９９９， Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍ Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌ．， ７０：３４１
２４．Ｆｅｉｎｂｅｒｇ ＆ Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎ， １９８３， Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， １３２：６
２５．Ｌｉｃｈｔｅｒ ｅｔ ａｌ， １９９０， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２４７：６４
２６．Ｉｐ ＆ Ｄａｖｉｓ， １９９８， Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．， １０：２０５
２７．Ｓａｌｔ ｅｔ ａｌ， １９９８， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｊ．， ３３４：１７７
２８．Ｄａｖｉｅｓ ｅｔ ａｌ， １９８９， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， １８６：１２３
２９．Ｄａｌｅ ｅｔ ａｌ， １９９５， ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．， ３６１：１９１
３０．Ｃｈｅｎ ＆ Ｏｋａｙａｍａ， １９８８， ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ， ６：６３２
３１．Ｃｅｌｅｎｚａ ＆ Ｃａｒｓｏｎ， １９８６， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２３３：１１７５
３２．Ｃａｒｌｉｎｇ ｅｔ ａｌ， １９９４， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２６９：１１４４２
３３．Ｈａｎｋｓ ＆ Ｈｕｎｔｅｒ， １９９５， ＦＡＳＥＢ Ｊ．， ９：５７６
３４．Ｇａｏ ｅｔ ａｌ， １９９５， Ｂｉｏｃｈｉｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ．， １２６６：７３
３５．Ｃｏｒｔｏｎ ｅｔ ａｌ， １９９５， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， ２２９：１９５０９
３６．Ｈｅｎｉｎ ｅｔ ａｌ， １９９６， Ｂｉｏｃｈｉｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ．， １２９０：１９７
３７．Ｗｏｏｄｓ ｅｔ ａｌ， １９９４， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２６９：１９５０９
３８．Ｗｉｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ， １９９６， Ｃｕｒｒ． Ｂｉｏｌ．， ６：１４２６
３９．Ｗｉｎｄｅｒ ＆ Ｈａｒｄｉｅ， １９９６， Ａｍ． Ｊ． Ｐｈｙｓｉｏｌ．， ２７０：Ｅ２９９
４０．ｄａ Ｓｉｌｖａ ｅｔ ａｌ， ２０００， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ９７：４０２３
【図面の簡単な説明】
【図１】図１：（Ａ）ラット肝臓およびヒトリンパ球から単離したゲノムＤＮＡのサウザンブロット分析。ゲノムＤＮＡ（１５μｇ）を、制限エンドヌクレアーゼＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲＩまたはＨｉｎｄＩＩＩの一つで消化した。ブロットは、ＳＮＡＲＫプロテインの３’−末端に主として対応する１．５ｋｂ断片（≒ｎｔ１４００〜２９２９）とハイブリダイズした。ＤＮＡサイズマーカーのおおよその位置を右に示す。（Ｂ）ヒトＳＮＡＲＫの染色体局在化。ラットＵＶ１２６のｃＤＮＡの４５０ｋｐ断片［２０］を、ＰＩ誘導した人工染色体（ＰＡＣ）ライブラリをスクリーニングするプローブとして使用した。プローブは一つのゲノムＰＡＣを陽性として識別し、そしてこのＰＡＣはヒト染色体１ｑ３２に地図作製された。１ｑ３２での陽性ハイブリダイズシグナル（染色体上の明点として見られる）が、双方の相同体について細胞の＞９０％で示された。
【図２】図２：ラットＳＮＡＲＫのヌクレオチドおよび推論されるアミノ酸配列。ＳＮＡＲＫの推論されるアミノ酸配列（配列番号１）を、一文字コードでそれぞれのコードしているヌクレオチド配列（配列番号２）の上に表す。ヌクレオチド番号帰属は右に列挙し、そしてアミノ酸番号帰属は右に下線を引いた数字として表す。タンパク質セリン／スレオニンキナーゼ触媒ドメインを四角で囲む。プロテインキナーゼＡＴＰ結合領域指定は、点線で下線を引く。セリン／スレオニンキナーゼ活性部位指定は、破線で下線を引く。
【図３】図３：ラットＳＮＡＲＫの推論されるアミノ酸配列とＳＮＦ１／ＡＭＰＫ系統の他の一員とのＣＬＵＳＴＡＬ・Ｗアルゴリズムを使用するアライメント。プロテインキナーゼ触媒ドメインを四角で囲む。同一の残基をアスタリスクにより示し、また保存置換基を配列の下の点により示す（“：”はスコア＞０．５の強い群の置換基を示し、また“．”は、スコア≦０．５の弱い群の置換基を示す。）。アミノ酸残基は右に番号付けする。
【図４】図４：（Ａ）ＳＮＡＲＫのｍＲＮＡの組織分布を表すラット組織のノーザンブロット分析。各ラット組織（固有の列の上に示す。）から単離した全ＲＮＡ１０μｇを電気泳動し、ナイロン膜に転写し、そしてタンパク質コード領域（ｎｔ０〜１９７５）に対応するＳＮＡＲＫ／ｐｃＤＮＡ３．１の断片でプローブし、そしてフィルムに露光した。２８Ｓおよび１８ＳリボソームＲＮＡの位置は、オートラジオグラフの右に示す。（Ｂ）様々なラット組織におけるＳＮＡＲＫの逆トランスクリプターゼ（転写酵素）ＰＣＲ分析。上側のパネルは、ラットの心臓（第１列）、皮膚（第２列）、脾臓（第３列）、腎臓（第４列）、肺（第５列）、肝臓（第６列）、子宮（第７列）、睾丸（第８列）およびＮＲＫＣ細胞（第９列）から生成した第一ストランドｃＤＮＡから生じたＲＴ−ＰＣＲ産生物のエチジウムブロミド染色ゲルを表す。第一ストランドＤＮＡを含まない陰性の対照反応は、プライマー産生物（第１０列）の特異性を確認するために含まれる。下側のパネルは、各組織型から生じたＲＴ−ＰＣＲ産生物のサウザン分析を表す。サウザンブロットは、そのタンパク質コード領域（ｎｔ０〜１９７５）に対応するＳＮＡＲＫの断片とハイブリダイズする。ＤＮＡサイズマーカーの移動の位置を図の右に表す。
【図５】図５：（Ａ）ウサギ網状赤血球溶解産物中で転写および翻訳されたＳＮＡＲＫプロテインの分析。第１および２列において、ＴＮＴ反応の１０分の１を８％ポリアクリルアミド−ＳＤＳゲル上に直接付加した。第３〜５列は、サイズ−フラクション化した免疫沈降（ＩＰ）反応である。第３および４列はそれぞれ、ＴＮＴ産生物が存在しないか、またはＴ７−ルシフェラーゼＴＮＴ産生物がＳＮＡＲＫ抗血清＃１４と共に培養された対照ＩＰ反応である。第５列は、ＳＮＡＲＫ抗血清で免疫沈降させたＳＮＡＲＫのＴＮＴを表す。ゲル電気泳動に続き、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルを固定し、乾燥し、そしてバイオマックスＭＳフィルムに強調スクリーンと共に４時間露光した。（Ｂ）安定に形質転換したＢＨＫ細胞中でのＳＮＡＲＫプロテインのウエスタン分析。ＮＲＫＣ細胞抽出物（７５０μｇ、第１列）またはＢＨＫ＋１（第２および３列）およびＢＨＫ＋１１（第４列）の５００μｇを、ＳＮＡＲＫ抗血清＃１４（第１、２および４列）または非免疫血清（第３列）で免疫沈降させ、８％ポリアクリルアミド−ＳＤＳ上で電気泳動し、そしてＰＶＤＦ膜上に転写した。ウエスタン分析を、ＳＮＡＲＫ抗血清＃１６を使用して行った。タンパク質標準の位置をｋＤａで右に表す。ＳＮＡＲＫプロテインの位置をオートラジオグラフの左に列挙した。
【図６】図６：ＳＮＡＲＫの自己リン酸化。ＳＮＡＲＫを、野生種ＢＨＫ、ＢＨＫ＋１およびＢＨＫ＋１１の細胞抽出物５００μｇより、ＳＮＡＲＫ抗血清＃１４（第１、２、４および６列）または非免疫血清（第３および５列）で免疫沈降させた。第６列は、ＢＨＫ＋１細胞抽出物５００μｇを含むが抗血清を含まない陰性免疫沈降反応対照である。免疫沈降物を［γ］−ＡＴＰ３２と共に３０℃で培養し、そして反応を３０分後、２×ＳＤＳ付加緩衝液の添加および５分間の煮沸により停止した。試料を８％ポリアクリルアミド−ＳＤＳゲル上で電気泳動し、そしてゲルを乾燥し、バイオマックスＭＳフィルムに露光した。
【図７】図７：ＳＮＡＲＫプロテインはＡＭＰＫ様ホスホトランスフェラーゼ活性を有する。ＳＮＡＲＫプロテインを、野生種ＢＨＫ、ＢＨＫ−１、ＢＨＫ＋１およびＢＨＫ＋１１細胞からの細胞溶解物５００μｇより免疫沈降させた。キナーゼアッセイを、２００μＭのＳＡＭＳペプチドを基質として使用してキナーゼ反応カクテル中で行った。ＮＲＫＣ細胞（点描四角）、野生種ＢＨＫ細胞（塗りつぶした四角）、ＢＨＫ＋１および＋１１細胞（細い平行線を引いた四角）。結果は二つの実験についての平均値±Ｓ．Ｅ．Ｍ．である（各時ｎ＝５）。比較目的のために、ＡＭＰＫα２活性をこれらの細胞系においてアッセイし、そしてそれぞれ、野生種ＢＨＫ、ＳＮＡＲＫトランスフェクションしたＢＨＫおよびＮＲＫＣ細胞系における基底成長条件下で測定されたＳＮＡＲＫ活性と同一、４倍低い、および１．５倍低いことが判明した（データは示さず）。
【図８】図８：（Ａ）ＡＩＣＡＲを使用するＮＲＫＣ細胞中でのＳＮＡＲＫの活性化。ＮＲＫＣ細胞を０、０．５ｍＭ、１ｍＭまたは２ｍＭのＡＩＣＡＲで１時間処理した。ＳＮＡＲＫプロテインを細胞溶解物５００μｇからＳＮＡＲＫ抗血清で免疫沈降させ、そしてキナーゼアッセイを２００μＭのＡＭＰの存在下、ＳＡＭＳペプチドを使用して行った。塗りつぶした四角は対照（０ｍＭのＡＩＣＡＲ）試料を表し、そして細い平行線を引いた四角はＡＩＣＡＲ処理した試料を表す。データを対照値（対照＝１）に対するホスホトランスフェラーゼ活性として示し、そして実験の一群当り少なくとも１０試料を有する二つの個々の実験についての平均値±Ｓ．Ｅ．Ｍ．で表す。対照値に対して＊ｐ＜０．０６。同じアッセイ条件を使用すると、基底ＡＭＰＫ−α２活性はＳＮＡＲＫ活性より１．５倍低く、またＮＲＫＣ細胞中での１ｍＭのＡＩＣＡＲでの処理により少なくとも２倍増加したことが判明した（データは示さず）。基底ＡＭＰＫα１活性は、基底ＳＮＡＲＫ活性より８８倍高いことが判明したが、ＡＩＣＡＲでの処理により促進されなかった（データは示さず）。（Ｂ）グルコース奪取から生じる野生種ＢＨＫ細胞中でのＳＮＡＲＫの活性化。野生種ＢＨＫ細胞をグルコースを含まない培地に０または９０分間暴露した。ＳＮＡＲＫを免疫沈降させ、そしてキナーゼアッセイを、ＳＡＭＳペプチドを基質として使用してＡＭＰの存在下で行った。塗りつぶした四角は対照（２５ｍＭグルコース）試料を表し、また細い平行線を引いた四角はグルコース奪取試料を表す。結果は対照値（対照＝１）に対するホスホトランスフェラーゼ活性として表し、実験の一群当り少なくとも１０試料を有する二つの個々の実験からの平均値±Ｓ．Ｅ．Ｍ．を表す。対照値に対して＊ｐ＜０．０３。野生種ＢＨＫ細胞中で測定した基底ＡＭＰＫα２活性レベルは、これらの細胞中で検出された基底ＳＮＡＲＫ活性に匹敵した（データは示さず）。
【図９】図９は、アミノ酸レベルで、ラットＳＮＡＲＫの１〜２５１領域を、双方インシリコスクリーニングにより識別された（Ａ）ヒトポリヌクレオチドによりコード化されたアミノ酸配列、および（Ｂ）マウスポリヌクレオチドのアミノ酸配列と比較する。各図の上部に与えられるのは、識別された相同体についての登録番号、および入手可能な対応する引用文献である。
【図１０】図１０は、（１）（Ａ）ヒト細胞系ＨａＣａＴから単離したＳＮＡＲＫコード化ＤＮＡの配列決定により決定された配列ギャップを有するヒトゲノムデータベースとの相関、（Ｂ）ヒトｍＲＮＡデータベースとの相関を含む、ラットＳＮＡＲＫコード化ｃＤＮＡの完全配列で、および（２）（Ｃ）ヒトＥＳＴデータベースとの相関を含むラットＳＮＡＲＫプロテインのアミノ酸配列でサーチすることによる、ラットＳＮＡＲＫコード化ＤＮＡと、インシリコで識別したヒトゲノムＲＮＡまたはｃＤＮＡ起源のポリヌクレオチドとの比較を与える。図１０（Ｄ）は、ラットＳＮＡＲＫコード化ＤＮＡとＨａＣａＴ細胞系からクローニングしたヒトＳＮＡＲＫをコード化する配列との比較を与える。各図の上部に与えたのは、識別した相同体についての登録番号、および入手可能な対応する引用文献である。
【図１１】図１１は、（１）（Ａ）マウスハイスループットゲノムデータベースとの相関、（Ｂ）マウスｎｒデータベースとの相関を含む、ラットＳＮＡＲＫコード化ｃＤＮＡの完全配列で、および（２）（Ｃ）および（Ｄ）マウスＥＳＴデータベースとの相関を含むラットＳＮＡＲＫプロテインのアミノ酸配列でサーチすることによる、ラットＳＮＡＲＫコード化ＤＮＡと、インシリコで識別されたマウスゲノムＲＮＡまたはｃＤＮＡ起源のポリヌクレオチドとの比較を与える。図１１（Ｅ）は、ラットＳＮＡＲＫコード化ＤＮＡとヘアレスマウスからクローニングしたマウスＳＮＡＲＫをコード化する配列との比較を与える。各図の上部に与えたのは、識別した相同体についての登録番号、および入手可能な対応する引用文献である。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１０Ｄ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１１Ｄ】
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【図１１Ｅ】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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2004505628.tif 000141
【国際調査報告】
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