(57)【要約】本発明は、少なくとも一つのβ−シアノエチル保護基をオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体から除去する間の、合成オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体の修飾を防止する方法に関する。当該方法には当該オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体を少なくとも一つのアクリロニトリル捕捉剤を有するｔ−ブチルアミンのような塩基性溶液と、少なくとも一つのβ−シアノエチル保護基を除去するのに十分な温度および十分な期間の接触が含まれる。本発明は同様に合成オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体を生産する方法にも関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
アクリロニトリル捕捉剤が第一級脂肪族アミンまたは第一級脂肪族チオールを含むときには当該第一級脂肪族アミンまたは当該第一級脂肪族チオールには立体障害があるという条件で、少なくとも一つのβ−シアノエチル保護基を除去するのに十分な条件下で、β−シアノエチル保護化のオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体と少なくとも一つのアクリロニトリル捕捉剤およびハロアルカン、エステル、アルコールまたはジメチルホルムアミドからなる群より選ばれる有機溶媒を含む溶液を接触させる工程を含んでなる、オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体から少なくとも一つのβ−シアノエチル保護基を切離す際における合成オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体の修飾を実質的に防止する方法。
【請求項２】
アクリロニトリル捕捉剤が第一級脂肪族アミンまたは第一級脂肪族チオールを含むときには当該第一級脂肪族アミンまたは当該第一級脂肪族チオールには立体障害があるという条件で、少なくとも一つのβ−シアノエチル保護基を除去するのに十分な条件下で、β−シアノエチル保護化のオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体と少なくとも一つのアクリロニトリル捕捉剤を有する塩基性水溶液を接触させる工程を含んでなる、オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体から少なくとも一つのβ−シアノエチル保護基を切離す際における合成オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体の修飾を実質的に防止する方法。
【請求項３】
当該オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体と当該塩基性水溶液の接触に先立って有機溶媒および少なくとも一つのアセトニトリル捕捉剤を含む溶液とβ−シアノエチル保護化オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体との接触の工程を更に含んでなる、請求項２記載の方法。
【請求項４】
当該有機溶媒が、ピリジン、テトラヒドロフラン、アセトニトリル、ハロアルカン、エステル類、アルコールおよびジメチルホルムアミドからなる群から選択される、請求項３記載の方法。
【請求項５】
当該アクリロニトリル捕捉剤がｔ−ブチルアミンおよび当該有機溶媒がピリジンまたはアセトニトリルである、請求項４記載の方法。
【請求項６】
当該β−シアノエチル保護基をリン酸トリエステルオリゴヌクレオチドから除去する、請求項２記載の方法。
【請求項７】
当該β−シアノエチル保護基をホスホロチオエートオリゴヌクレオチド類似体から除去する、請求項２記載の方法。
【請求項８】
当該合成オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体が固体担体に共有結合で結合されている、請求項２記載の方法。
【請求項９】
当該固体担体は孔径調整のガラス、ポリスチレンまたはポリアクリルアミドである、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
当該オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体が、少なくとも一つのアクリロニトリル捕捉剤を有する塩基性溶液との接触で固体担体から切離される、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
当該アクリロニトリル捕捉剤が置換または非置換の立体障害脂肪族チオール基、置換または非置換の芳香族チオール、置換または非置換の芳香族ヒドロキシ基、置換または非置換の第二級脂肪族アミン、置換または非置換の立体障害第一級脂肪族アミンまたは置換または非置換の第一級または第二級芳香族アミンである、請求項２記載の方法。
【請求項１２】
当該アクリロニトリル捕捉剤がｔ−ブチルアミンである、請求項１１の方法。
【請求項１３】
当該塩基性溶液はアルカリ金属水酸化物またはアルカリ土類金属水酸化物を含んでなる、請求項２記載の方法。
【請求項１４】
当該塩基性溶液が水酸化アンモニウム溶液である、請求項２記載の方法。
【請求項１５】
当該水酸化アンモニウム溶液の温度が約２０℃から約１００℃である、請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
当該水酸化アンモニウム溶液の温度が約２０℃から約３５℃である、請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
当該水酸化アンモニウム溶液の温度が約２５℃である、請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
当該合成オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体を水酸化アンモニウム溶液と約０．５時間から約４８時間接触させる、請求項１４記載の方法。
【請求項１９】
当該合成オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体を水酸化アンモニウム溶液と約０．５時間から約２時間接触させる、請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体中に存在するチミンおよびグアニンである核酸塩基の合計パーセントが少なくとも約５％である、請求項２記載の方法。
【請求項２１】
オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体中に存在するチミンおよびグアニンである核酸塩基の合計パーセントが少なくとも約２５％である、請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体中に存在するチミンおよびグアニンである核酸塩基の合計パーセントが少なくとも約５０％である、請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
全ての当該核酸塩基がチミンおよびグアニンである、請求項２２記載の方法。
【請求項２４】
当該アクリロニトリル捕捉剤が第一級脂肪族アミンまたは第一級脂肪族チオールを含むときは当該第一級脂肪族アミンまたは第一級脂肪族チオールには立体障害があるという条件で、少なくとも一つのβ−シアノエチル保護基および少なくとも一つの核酸塩基保護基を除去するのに十分な条件下で、β−シアノエチル保護化のオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体と少なくとも一つのアクリロニトリル捕捉剤およびハロアルカン、エステル、アルコールまたはジメチルホルムアミドからなる群から選んだ有機溶媒を含む溶液を接触させる工程を含んでなる、オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体から少なくとも一つのβ−シアノエチル保護基および少なくとも一つの核酸塩基保護基を切離す際の、合成オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体の修飾を実質的に防止する方法。
【請求項２５】
当該アクリロニトリル捕捉剤が第一級脂肪族アミンまたは第一級脂肪族チオールを含むならば当該第一級脂肪族アミンまたは第一級脂肪族チオールには立体障害があるという条件で、少なくとも一つのβ−シアノエチル保護基および少なくとも一つの核酸塩基保護基を除去するのに十分な条件下で、β−シアノエチル保護化のオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体と少なくとも一つのアクリロニトリル捕捉剤を有する塩基性水溶液を接触させる工程を含んでなる、オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体から少なくとも一つのβ−シアノエチル保護基および少なくとも一つの核酸塩基保護基を切離す際の合成オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体の修飾を実質的に防止する方法。
【請求項２６】
当該オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体と塩基性水溶液の接触に先立って、有機溶媒および少なくとも一つのアクリロニトリル捕捉剤を含む溶液とβ−シアノエチル保護化のオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体と接触させる工程を更に含んでなる、請求項２５記載の方法。
【請求項２７】
当該有機溶媒はピリジン、テトラヒドロフラン、アセトニトリル、ハロアルカン、エステル類、アルコールおよびジメチルホルムアミドからなる群より選択する、請求項２６記載の方法。
【請求項２８】
当該アクリロニトリル捕捉剤がｔ−ブチルアミンで、当該有機溶媒がピリジンまたはアセトニトリルである、請求項７記載の方法。
【請求項２９】
当該β−シアノエチル保護基および当該核酸塩基保護基はリン酸ジエステルオリゴヌクレオチドから除去される、請求項２５記載の方法。
【請求項３０】
当該β−シアノエチル保護基および当該核酸塩基保護基はホスホロチオエートオリゴヌクレオチド類似体から除去される、請求項２５記載の方法。
【請求項３１】
当該オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体は共有結合で固体担体に結合されている、請求項２５の方法。
【請求項３２】
当該固体担体が孔径調整のガラス、ポリスチレンまたはポリアクリルアミドである、請求項３１記載の方法。
【請求項３３】
当該オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体は少なくとも一つのアクリロニトリル捕捉剤を有する塩基性溶液との接触で固体担体から切離される、請求項３２記載の方法。
【請求項３４】
当該アクリロニトリル捕捉剤が置換または非置換の立体障害ある脂肪族チオール基、置換または非置換の芳香族チオール、置換または非置換の芳香族ヒドロキシ基、置換または非置換の第二級脂肪族アミン、置換または非置換の立体障害ある第一級脂肪族アミンまたは置換または非置換の第一級または第二級芳香族アミンである、請求項２５記載の方法。
【請求項３５】
当該アクリロニトリル捕捉剤がｔ−ブチルアミンである、請求項３４記載の方法。
【請求項３６】
当該塩基性溶液はアルカリ金属水酸化物またはアルカリ土類金属水酸化物である、請求項２５記載の方法。
【請求項３７】
当該塩基溶液が水酸化アンモニウム溶液である、請求項２５記載の方法。
【請求項３８】
当該水酸化アンモニウム溶液の温度が約２０℃から約１００℃である、請求項３７の方法。
【請求項３９】
当該水酸化アンモニウム溶液の温度が約４５℃から約６５℃である、請求項３８の方法。
【請求項４０】
当該水酸化アンモニウム溶液の温度が約５５℃である、請求項３９の方法。
【請求項４１】
当該オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体を水酸化アンモニウム溶液と約０．５時間から約４８時間接触させる、請求項３７記載の方法。
【請求項４２】
当該オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体を当該水酸化アンモニウム溶液と約６時間から約１６時間接触させる、請求項４１記載の方法。
【請求項４３】
オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体中に存在するチミンおよびグアニンである核酸塩基の合計パーセントが少なくとも約５％である、請求項２５記載の方法。
【請求項４４】
オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体中に存在するチミンおよびグアニンである核酸塩基の合計パーセントが少なくとも約２５％である、請求項４３記載の方法。
【請求項４５】
オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体中に存在するチミンおよびグアニンである核酸塩基の合計パーセントが少なくとも約５０％である、請求項４４記載の方法。
【請求項４６】
全ての当該核酸塩基がチミンまたはグアニンである、請求項４５記載の方法。
【請求項４７】
少なくとも一つの核酸塩基および少なくとも一つのβ−シアノエチル保護基を除去するのに十分な条件下で、β−シアノエチル保護化のオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体と、ｔ−ブチルアミンおよび、ハロアルカン、エステル、アルコールまたはジメチルホルムアミドからなる群より選択される有機溶媒を含む溶液を接触させる工程を含み、少なくとも一つのβ−シアノエチル保護基および少なくとも一つの核酸塩基保護基をオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体から切離しする際の、合成オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体の修飾を実質的に防止する方法。
【請求項４８】
少なくとも一つの核酸塩基および少なくとも一つのβ−シアノエチル保護基を除去するのに十分な条件下で、β−シアノエチル保護化のオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体とｔ−ブチルアミンを含有する水酸化アンモニウム溶液を接触させる工程を含む、少なくとも一つのβ−シアノエチル保護基および少なくとも一つの核酸塩基保護基をオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体から切離しする際の、合成オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体の修飾を実質的に防止する方法。
【請求項４９】
オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体と当該塩基性水溶液との接触に先立って、β−シアノエチル保護化のオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体を有機溶媒と少なくとも一つのアクリロニトリル捕捉剤を含む溶液とを接触させる工程を更に含んでなる、請求項４８記載の方法。
【請求項５０】
当該有機溶媒はピリジン、テトラヒドロフラン、アセトニトリル、ハロアルカン、エステル類、アルコールおよびジメチルホルムアミドからなる群より選択する、請求項４９記載の方法。
【請求項５１】
当該有機溶媒がピリジンまたはアセトニトリルである、請求項５０記載の方法。
【請求項５２】
当該β−シアノエチル保護基および当該核酸塩基保護基がリン酸トリエステルオリゴヌクレオチドから除去される、請求項４８記載の方法。
【請求項５３】
当該β−シアノエチル保護基および当該核酸塩基保護基がホスホロチオエートオリゴヌクレオチド類似体から除去される、請求項４８記載の方法。
【請求項５４】
当該合成オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体が共有結合で固体担体に結合している、請求項４８記載の方法。
【請求項５５】
当該固体担体が孔径調整のガラス、ポリスチレンまたはポリアクリルアミドである、請求項５４記載の方法。
【請求項５６】
当該オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体を、少なくとも一つのアクリロニトリル捕捉剤を含有する塩基溶液と接触させて固体担体から切離す、請求項５５記載の方法。
【請求項５７】
当該水酸化アンモニウム溶液の温度が約２０℃から約１００℃である、請求項４８記載の方法。
【請求項５８】
当該水酸化アンモニウム溶液の温度が約４５℃から約６５℃である、請求項５７記載の方法。
【請求項５９】
当該水酸化アンモニウム溶液の温度が約５５℃である、請求項５８記載の方法。
【請求項６０】
当該合成オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体を当該水酸化アンモニウム溶液と約０．５時間から約４８時間接触させる、請求項４８記載の方法。
【請求項６１】
当該合成オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体を当該水酸化アンモニウム溶液と約６時間から約１６時間接触させる、請求項６０記載の方法。
【請求項６２】
オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体の中に存在するチミンおよびグアニンである核酸塩基の合計パーセントが少なくとも約５％である、請求項４８記載の方法。
【請求項６３】
オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体の中に存在するチミンおよびグアニンである核酸塩基の合計パーセントが少なくとも約２５％である、請求項６２記載の方法。
【請求項６４】
オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体の中に存在するチミンおよびグアニンである核酸塩基の合計パーセントが少なくとも約５０％である、請求項６３記載の方法。
【請求項６５】
全ての当該核酸塩基がチミンまたはグアニンである、請求項６４記載の方法。
【請求項６６】
β−シアノエチル保護基を除去する間にオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの修飾を実質的に防止してオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体を製造する方法において：
ａ）少なくとも一つのβ−シアノエチル保護基を有するオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体を合成し；そして
ｂ）β−シアノエチル保護化のオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体と少なくとも一つのアクリロニトリル捕捉剤および、ハロアルカン、エステル、アルコールまたはジメチルホルムアミドからなる群から選んだ有機溶媒を含む溶液を少なくとも一つのβ−シアノエチル保護基を除去するのに十分な条件下で接触させ、ただし当該アクリロニトリル捕捉剤が第一級脂肪族アミンまたは第一級脂肪族チオールを含む場合、当該第一級脂肪族アミンまたは第一級脂肪族チオールには立体障害があり、それにより当該β−シアノエチル保護基が実質的にオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体を修飾することなしで除去される、オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体を製造する方法。
【請求項６７】
β−シアノエチル保護基の除去する間にオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの修飾を実質的に防止してオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体を製造する方法において：
ａ）少なくとも一つのβ−シアノエチル保護基を有するオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体を合成し；そして
ｂ）β−シアノエチル保護化のオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体と少なくとも一つのアクリロニトリル捕捉剤を含む塩基性水溶液を少なくとも一つのβ−シアノエチル保護基を除去するのに十分な条件で接触させ、ただし当該アクリロニトリル捕捉剤が第一級脂肪族アミンまたは第一級脂肪族チオールを含む場合、当該第一級脂肪族アミンまたは第一級脂肪族チオールには立体障害があり、それにより当該β−シアノエチル保護基が実質的にオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体を修飾することなしで除去される、オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体を製造する方法。
【請求項６８】
オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体と当該塩基性水溶液との接触に先立って、当該β−シアノエチル保護化のオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体と有機溶媒および少なくとも一つのアクリロニトリル捕捉剤を含む溶液を接触させる工程を更に含む、請求項６７記載の方法。
【請求項６９】
当該有機溶媒はピリジン、テトラヒドロフラン、アセトニトリル、ハロアルカン、エステル類、アルコールおよびジメチルホルムアミドからなる群より選択する、請求項６８記載の方法。
【請求項７０】
当該アクリロニトリル捕捉剤がｔ−ブチルアミンであり、当該有機溶媒がピリジンまたはアセトニトリルである、請求項６９記載の方法である。
【請求項７１】
当該合成オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体はホスホロアミダイト化学を用いて合成する、請求項６７記載の方法。
【請求項７２】
当該合成オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体を少なくとも一つのアクリロニトリル捕捉剤を有する塩基性水溶液と接触するとき、少なくとも一つの核酸塩基保護基が切離される、請求項７１記載の方法。
【請求項７３】
生産されたオリゴヌクレオチドがリン酸ジエステルオリゴヌクレオチドである、請求項６７記載の方法。
【請求項７４】
生産されたオリゴヌクレオチド類似体がホスホロチオエートオリゴヌクレオチド類似体である、請求項６７記載の方法。
【請求項７５】
当該合成オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体ガ共有結合で固体担体に結合されている、請求項６７記載の方法。
【請求項７６】
当該固体担体は孔径を調整したガラス、ポリスチレンまたはポリアクリルアミドである、請求項７５記載の方法。
【請求項７７】
当該オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体は少なくとも一つのアクリロニトリル捕捉剤を有する塩基性溶液と接触させて固体担体から切離される、請求項７６記載の方法。
【請求項７８】
当該アクリロニトリル捕捉剤が置換または非置換の立体障害がある脂肪族チオール基、置換または非置換の芳香族チオール、置換または非置換の芳香族ヒドロキシ基、置換または非置換の第二級脂肪族アミン、置換または非置換の立体障害がある第一級脂肪族アミン或いは置換または非置換の第一級または第二級芳香族アミンである、請求項６７記載の方法。
【請求項７９】
当該アクリロニトリル捕捉剤がｔ−ブチルアミンである、請求項７８の方法。
【請求項８０】
当該塩基性溶液はアルカリ金属水酸化物またはアルカリ土類金属水酸化物を含む、請求項６７記載の方法。
【請求項８１】
当該塩基性溶液が水酸化アンモニウム溶液である、請求項６７記載の方法。
【請求項８２】
当該水酸化アンモニウム溶液の温度が約２０℃から約１００℃である、請求項８１記載の方法。
【請求項８３】
当該水酸化アンモニウム溶液の温度が約２０℃から約３５℃である、請求項８２記載の方法。
【請求項８４】
当該水酸化アンモニウム溶液の温度が約２５℃である、請求項８３記載の方法。
【請求項８５】
当該合成オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体を水酸化アンモニウム溶液と約０．５時間から約４８時間接触させる、請求項８１記載の方法。
【請求項８６】
当該合成オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体を水酸化アンモニウム溶液と約０．５時間から約２時間接触させる、請求項８５記載の方法。
【請求項８７】
当該塩基性溶液が水酸化アンモニウム溶液である、請求項７２記載の方法。
【請求項８８】
当該水酸化アンモニウム溶液の温度が約２０℃から約１００℃である、請求項８７記載の方法。
【請求項８９】
当該水酸化アンモニウム溶液の温度が約４５℃から約６５℃である、請求項８８記載の方法。
【請求項９０】
当該水酸化アンモニウム溶液の温度が約５５℃である、請求項８９記載の方法。
【請求項９１】
当該合成オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体を水酸化アンモニウム溶液と約０．５時間から約４８時間接触させる、請求項８７記載の方法。
【請求項９２】
オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体を水酸化アンモニウム溶液と約６時間から約１６時間接触させる、請求項９１記載の方法。
【請求項９３】
オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体中に存在するチミンおよびグアニンである核酸塩基の合計パーセントが少なくとも約５％である、請求項７２の方法。
【請求項９４】
オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体中に存在するチミンおよびグアニンである核酸塩基の合計パーセントが少なくとも約２５％である、請求項９３の方法。
【請求項９５】
オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体中に存在するチミンおよびグアニンである核酸塩基の合計パーセントが少なくとも約５０％である、請求項９４の方法。
【請求項９６】
全ての当該核酸塩基がチミンまたはグアニンである、請求項９５記載の方法。
【請求項９７】
請求項１〜６５のいずれかの方法を用いたβ−シアノエチル保護化のオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体から少なくとも一つのβ−シアノエチル基の除去を含んでなる、オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体を調製する方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
関連出願
本出願は２０００年６月１２日に出願した米国仮出願６０／２１０，７５７の利益を請求するが、その全教示は参照により本明細書に援用されている。
【０００２】
本発明の背景
アンチセンス治療用には大規模または診断／分子生物学目的用には小規模でβ−シアノエチルホスホアミダイト化学の手法を用い、オリゴヌクレオチドを固相担体で日常的に合成する。当化学作用はシリカ母体のＣＰＧビーズを固相担体として用い脱保護基および精製を容易にするために開発された。従って、当化学作用は剛性ポリスチレン母体の担体を用いてオリゴヌクレオチドを合成するように適合させた。更に、アンチセンスおよび関連治療に用いるオリゴヌクレオチドの大規模合成は、ＣＭＶ治療用のオリゴヌクレオチド類似体をＦＤＡが認可して以来重要性が増加することになった。数種の他のオリゴヌクレオチド類似体が現在臨床試験中である。現在臨床試験および他の応用のためにリン酸ジエステル或いはホスホロチオエート化ジエステル結合を伴うオリゴヌクレオチドのキログラム単位の量がβ−シアノエチルホスホアミダイト化学の手法を用いて合成されている。
【０００３】
薬学的応用面では、望まれるオリゴヌクレオチドは合成中に生じた全ての不純物から実質的に分離しなければならない。不純物は通常逆相高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）および／またはイオン交換クロマトグラフィーで除去される。しかしながら、当該望まれる生成物と構造的に同じようなこれらの不純物は、当該望まれる生成物とのそれらの構造的類似性で同じようなクロマトグラフィー移動度を有するので除去が困難である。それゆえ、望まれる生成物と同じような構造を持つ不純物が製造されないように合成方法論を改良することが望まれる。
【０００４】
本発明の概要
本発明は、合成オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体からβ−シアノエチルホスフェート保護基の切離しの間に放出されるアクリロニトリルは、オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体の求核基と反応が可能であり、望まれるオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体と構造的に類似した不純物が生成してしまうことの発見に関する。
【０００５】
本発明の方法は、オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体からの少なくとも一つのβ−シアノエチル保護基の切離しにおける合成オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体の修飾を実質的に防止する。当該方法はβ−シアノエチル保護化のオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体を、少なくとも一つのβ−シアノエチル保護基を除去するのに充分な条件下（たとえば、十分な温度および十分な時間）、有機溶媒中でアセトニトリル捕捉剤溶液と接触させることを包含する。ｔ−ブチルアミンが好ましいアセトニトリル捕捉剤である。適した有機溶媒にはピリジンのような求核溶媒、テトラヒドロフランまたはジオキサンのようなエーテル類、アセトニトリルのようなニトリル類、塩化メチレンのようなハロアルカン類、酢酸エチル、プロピオン酸メチルとプロピオン酸エチルのようなエステル類、エタノールまたはメタノールのようなアルコール類およびジメチルホルムアミドなどが含まれる。好ましい溶媒の１群にはハロアルカン類、エステル類、アルコール類およびジメチルホルムアミドが含まれる。好ましい溶媒の他の群にはピリジンおよびアセトニトリルが含まれる。
【０００６】
他の態様では、当該方法はｔ−ブチルアミンのような少なくとも一つのアセトニトリル捕捉剤を有する塩基性水溶液とβ−シアノエチル保護化のオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体との接触を包含する。当該塩基性溶液として好ましくは水性水酸化アンモニウム溶液である。当該オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体を、少なくとも一つのアセトニトリル捕捉剤を有する塩基性水溶液と、少なくとも一つのβ−シアノエチル保護基をオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体から除去するのに十分な条件下にて接触させる。
【０００７】
他の態様では、当該β−シアノエチル保護化のオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体とアセトニトリル捕捉剤を含む塩基性水溶液とを接触する前に、有機溶媒および少なくとも一つのアセトニトリル捕捉剤を含む溶液と接触させる。
【０００８】
更に、当該β−シアノエチル保護化のオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体とアセトニトリル捕捉剤を含有する当該有機または当該塩基性水溶液のいずれかを接触させると、少なくとも一つの核酸塩基保護基を除去することができる。その上、アセトニトリル捕捉剤を含有した当該有機または当該塩基性水溶液のいずれかと接触することで同時に固体担体から当該オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体の切離しができる。
【０００９】
本発明はまた当該オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体の修飾を実質的に防いでオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体を製造する方法に関する。オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体を製造する方法では、少なくとも一つのβ−シアノエチル保護基を有する当該オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体を典型的にはホスホアミダイト化学の手法を用いて合成する。合成したβ−シアノエチル保護化のオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体をその後、有機溶媒中に少なくとも一つのアセトニトリル捕捉剤を持つ溶液と少なくとも一つのβ−シアノエチル保護基を除去するのに十分な温度と十分な時間接触させる。それに代わる態様では、当該合成β−シアノエチル保護化のオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体を、少なくとも一つのβ−シアノエチル保護基を除去するのに十分な時間と十分な温度で少なくとも一つのアセトニトリル捕捉剤を有する塩基性水溶液と接触させる。他の態様では、当該合成β−シアノエチル保護化のオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体を、最初に有機溶媒中に少なくとも一つのアセトニトリル捕捉剤が存在する溶液と、次いで少なくとも一つのアセトニトリル捕捉剤を有する塩基性水溶液と、少なくとも一つのβ−シアノエチル保護基を取除くのに十分な温度において十分な期間接触させる。
【００１０】
代表的には、合成オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体を水性水酸化アンモニウム溶液と処理して当該β−シアノエチルホスフェート保護基を合成オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体から切離す。水酸化アンモニウム処理後の粗生成物のクロマトグラムは、望まれるオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体の他に追加のピークを示す。これらの異常物はチアミンまたはグアニン塩基、或いは修飾された結果脂肪族アミン基を含有するオリゴヌクレオチドに富む配列において顕著に見出される。本明細書で説明するように、水酸化アンモニウム処理後の当該粗オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体生成物のＭＡＬＤＩＴＯＦ質量スペクトルは、主な不純物はオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体の要求される質量より５２〜５４単位大きな質量を有することは、β−シアノエチル保護基を切離す際の副生成物であるアクリロニトリルによる当該望ましいオリゴヌクレオチドの修飾から由来したことを示している。
【００１１】
いかなる理論にも固執することは望まないが、当発明の方法は当該アクリロニトリルをアクリロニトリル捕捉剤と反応させてβ−シアノエチル保護基を塩基性水溶液から除く間に生じるアクリロニトリルの除去という利点を有していると考えられる。これは、一つ以上の核酸塩基がアクリロニトリルと反応するオリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチド類似体のような、切離しおよび脱保護の間に生じる構造的に望ましいオリゴヌクレオチド生成物と類似した不純物の量を減少させる。そうして、当該望ましい生成物の精製がより容易となり、当該精製した生成物がより高い回収率で得られる結果となる。
【００１２】
本発明の詳細な説明
本発明は、β−シアノエチルホスフェート保護基の切離しの間に生じるアクリロニトリルによる合成オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体の修飾が、β−シアノエチル保護基の切離しに用いた塩基性水溶液にアクリロニトリル捕捉剤を加えることにより改善され或いは実質的に防止できるという発見に関する。その代わりとして、合成オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体のアクリロニトリルによる修飾は、β−シアノエチル保護化のオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体を有機溶媒中のアクリロニトリル捕捉剤で処理しても防止することができる。
【００１３】
β−シアノエチル保護基は典型的には合成の間にオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体のリン酸骨格鎖に付いている酸素または硫黄を保護するのに用いられる。β−シアノエチル保護基は以下の構造式で示される：
【００１４】
【化１】
2004503561.tif 000002
【００１５】
β−シアノエチル保護基は塩基性溶液の処理で除去できる。β−シアノエチル保護基の除去についての条件の詳細については、当該全教示を参照により本明細書中に援用したＳｉｎｈａ他，Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ（１９８４），１２（１１）：４５３９およびＳｉｎｈａ，米国特許第４，７２５，６７７を参照。
【００１６】
本明細書での用語“塩基性水溶液”は水溶液またはアルコール、テトラヒドロフラン、アセトニトリルおよびジメチルホルムアミドなどの水混合性有機溶媒を含有する水溶液を称する。有機溶媒が水溶液中に存在する場合、それは典型的には５０％未満の濃度である。当該塩基は典型的にはアンモニア、置換または非置換脂肪族アミン、置換または非置換芳香族アミン、アルカリ金属水酸化物或いはアルカリ土類金属水酸化物である。水性水酸化アンモニウムが好ましい塩基性溶液である。好ましい態様では、核酸塩基保護基は、少なくとも一つのアクリロニトリル捕捉剤を有する塩基性水溶液の処理で同様に除去する。
【００１７】
β−シアノエチル保護基は水酸化アンモニウムのような塩基による処理で除去されて、アクリロニトリルが生成する（例えば、スキームＩ参照）。
【００１８】
【化２】
2004503561.tif 000003
【００１９】
スキームＩにおいて、Ｘ１およびＸ２は其々別個に酸素または硫黄である。β−シアノエチル保護基を除去する間に生成するアクリロニトリルはＭｉｃｈａｅｌ受容体であるので、塩基性反応条件ではオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体にある環外または環内求核性基と反応できる。例えば、当該アクリロニトリルはスキームＩＩに示したＮ３に付加してチミジン塩基と反応できる。
【００２０】
【化３】
2004503561.tif 000004
【００２１】
当発明の方法では、少なくとも一つのアクリロニトリル捕捉剤を有する溶液でβ−シアノエチル保護基を取り除くことにより、合成オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体のシアノエチル化を改善するか、または実質的に防止する。もし少なくとも一つのβ−シアノエチル保護基の除去処理後に、望まれるオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体より５２〜５３質量単位大きい分子量を持つ不純物は存在しないか、そのような不純物の検出量が望ましいオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体と比較したとき０．５％未満であれば、少なくとも一つのβ−シアノエチル基を除去する処置の間は、アクリロニトリルによるオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体の修飾は実質的に防止されている。
【００２２】
アクリロニトリル捕捉剤は、アクリロニトリルと反応できる化合物で、アクリロニトリルが核酸塩基の求核基のようなオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体の求核基と反応できなくする。好ましくは、当該アクリロニトリル捕捉剤はβ−シアノエチル保護化のオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体のβ−シアノエチル保護基を同様に切離でき、望まれるオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体の骨格鎖（例えば、リン酸ジエステル、ホスホロチオエート、メチルホスホナートなど）を生成する。アクリロニトリル捕捉剤は好ましくは核酸塩基との反応を避けるような障害があるのがよい。例えば、非障害の第一級アミン類はシトシンおよびアデノシンと、シトシンのＮ４−アミンおよびアデノシンのＮ６−アミンを置換して反応できる（Ｈｓｉｕｎｇ他、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ（１９８３），１１（１０）：３２２７）。そこで、第一級脂肪族アミン類または第一級脂肪族チオール類であるアクリロニトリル捕捉剤は立体的に障害がなければならない。立体的障害のあるチオールまたは立体的障害のある第一級脂肪族アミンは、脂肪族の第二級または第三級炭素原子に結合するか或いは第一級炭素であれば当該第一級炭素が第二級または第三級原子または芳香族または芳香族複素環基に結合しているチオールまたはアミン基である。使用されるようなアクリロニトリル捕捉剤には置換または非置換脂肪族ヒドロキシ化合物が含まれる。好ましいアクリロニトリル捕捉剤は置換または非置換の立体的に障害のある脂肪族チオール、置換または非置換芳香族チオール、置換または非置換芳香族ヒドロキシル（例えば、フェノール）、置換または非置換第二級脂肪族アミン、置換または非置換の立体的障害のある第一級脂肪族アミン、或いは置換または非置換の第一級か第二級芳香族アミンである。より好ましくは、当該アクリロニトリル捕捉剤はｔ−ブチルアミンである。
【００２３】
アクリロニトリル捕捉剤は好ましいことにβ−シアノエチル保護基を切離すので、合成オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体の修飾はβ−シアノエチル保護化のオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体につきアクリロニトリル捕捉剤を含有する有機溶媒で十分な時間、好ましくは約０．５時間から約２時間および十分な温度、好ましくは約１５℃から約３０℃で処理し、少なくとも一つのβ−シアノエチル基を除去することで実質的に防止できる。当該アクリロニトリル捕捉剤はしばしば有機溶媒の中に約０．５％（容量／容量）から約５０％（容量／容量）、好ましくは約３％（容量／容量）から約２５％（容量／容量）、より好ましくは約１％（容量／容量）から約１５％（容量／容量）の濃度で存在する。
【００２４】
他の態様では、少なくとも一つのβ−シアノエチル保護基を有する合成オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体を少なくとも一つのアクリロニトリル捕捉剤を含有する塩基性水溶液と、少なくとも一つのβ−シアノエチル基を除去するのに十分な時間および十分な温度で接触させる。当該アクリロニトリル捕捉剤は塩基溶液の中にしばしば約０．５％（容量／容量）から約５０％（容量／容量）、好ましくは約３％（容量／容量）から約２５％（容量／容量）、より好ましくは約１％（容量／容量）から約１５％（容量／容量）の濃度で存在する。
【００２５】
オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体の核酸塩基のアミン基をアミド保護基の生成などの塩基に不安定な保護基で保護すると、少なくとも一つのアクリロニトリル捕捉剤を含有する塩基性水溶液とオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体を接触させることで当該保護基は除去できる。加えて、当該オリゴヌクレオチドをスクシンアミドリンカーまたはオキサミドリンカーなどの塩基に不安定なリンカーで固体担体に結合すれば、少なくとも一つのアクリロニトリル捕捉剤を含有する塩基性水溶液との接触で固体担体から切離すことができる。同様に、当該アクリロニトリル捕捉剤が置換または非置換の第二級脂肪族アミン或いは置換または非置換の立体的障害のある第一級脂肪族アミンのようなアミンであれば、オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体を少なくとも一つのアクリロニトリル捕捉剤を含有する有機溶剤と接触させることにより核酸塩基保護基は除去され、オリゴヌクレオチドを固体担体から切離すことができる。
【００２６】
当発明の方法では、当該オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体は、典型的には最大約４８時間までアクリロニトリル捕捉剤を含有する塩基性水溶液と接触させる。典型的には、当該塩基性水溶液は約２０℃から約１００℃の温度である。オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体につきアクリロニトリル捕捉剤を含有する塩基性水溶液と接触させる時間の長さおよび当該溶液の温度は、除去すべき核酸塩基保護基があるかないか、および使用する核酸塩基保護基の型に依存する。例えば、アデニンおよびシトシンのアミン基がベンゾイル保護基で保護され、グアニンのアミンがイソブチリル保護基で保護されている場合、塩基性水溶液とオリゴヌクレオチドの接触の十分な時間および温度は約６時間から約１６時間、約４５℃から約６５℃で好ましくは５５℃である。しかしながら、迅速に脱保護する基が用いている場合（アデニンおよびグアニンのアミン基にはフェノキシアセチルおよびシトシンのアミン基にはイソブチリル）は約２時間から約４時間、室温で十分である。除去する核酸塩基保護基がなければ、約０．５時間から約２時間、２０℃から３５℃であり好ましくは２５℃でβ−シアノエチル保護基の除去、ある有利な態様では固体担体からオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体を除去するのに一般的には十分である。
【００２７】
上で検討したように、β−シアノエチル保護化のオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体は有機溶媒中のアクリロニトリル捕捉剤溶液と処理すればβ−シアノエチル保護基が除去でき、当該アクリロニトリル捕捉剤が第二級脂肪族アミンまたはｔ−ブチルアミンのような立体的に障害のある第一級脂肪族アミンであれば当該オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体から核酸塩基保護基を除去し、当該固体担体からオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体を切離すことができる。アクリロニトリル捕捉剤を含有する有機溶液につき核酸塩基保護基を除去し固体担体からオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体を切離すのに使用するときは、当該β−シアノエチル保護化のオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体は約３５℃から約１００℃に加熱した当該有機溶液と約６時間から約１６時間接触させる。好ましくは、当該オリゴヌクレオチドを当該有機溶液と約６時間から約１６時間接触させ、当該有機溶液を好ましくは約４５℃から約６５℃に加熱する。
【００２８】
他の態様では、先ず当該β−シアノエチル保護化のオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体はアクリロニトリル捕捉剤含有の有機溶媒でβ−シアノエチル基を切離すための上記条件で、アクリロニトリル捕捉剤を含有する有機溶媒と接触させることができる。その後当該オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体は、アクリロニトリル捕捉剤含有の塩基性水溶液を用いて上記のβ−シアノエチル基切離し用の条件下で少なくとも一つのアクリロニトリル捕捉剤を含有する塩基性水溶液と接触させる。
【００２９】
核酸塩基には天然で生じるアデニン、グアニン、シトシン、チミンおよびウラシルなどの塩基および７−デアザグアニン、７−デアザ−８−アザグアニン、７−デアザアデニン、７−デアザ−８−アザアデニン、７−デアザ−６−オキソプリン、６−オキソプリン、３−デアザアデノシン、２−オキソ−５−メチルピリミジン、２−オキソ−４−メチルチオ−５−メチルピリミジン、２−チオカルボニル−４−オキソ−５−メチルピリミジン、４−オキソ−５−メチルピリミジン、２−アミノ−プリン、５−フルオロウラシル、２，６−ジアミノプリン、８−アミノプリン、４−トリアゾロ−５−メチルチミン、５−メチルシトシン、５−プロピンシトシン、５−プロピンウラシルおよび４−トリアゾロ−５−メチルウラシルなどの修飾塩基が含まれる。
【００３０】
保護された核酸塩基は当該塩基の反応性官能基が核酸塩基保護基で保護されている核酸塩基である。典型的には、核酸塩基はアミン保護基で保護することができるアミン基を有している。アミン保護基は当技術分野の当事者には良く知られている。アミン保護基の例としては、Ｇｒｅｅｎ他、Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ　Ｇｒｏｕｐｓ　ｉｎ　Ｏｒｇａｎｉｃ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（１９９１），Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，ページ３０９〜４０５を参照すればよく、その教示は参照により本明細書に援用してある。好ましくは、アミンはアミドとして保護される。アデニンおよびシトシンのアミン基は典型的にはベンゾイル保護基で保護され、グアニンのアミン基は典型的にイソブチリル保護基で保護される。しかしながら、他の保護スキームを用いてもよい。例えば、迅速な脱保護のためにはアデニンおよびグアニンのアミン基はフェノキシアセチル基で保護ができ、シトシンのアミン基はアセチルまたはイソブチリル基で保護できる。核酸塩基保護基の除去で元の官能基を生じる除去条件は用いた保護基に依存する。アミド基の生成でアミノ基を保護する場合は、それは典型的に当該オリゴヌクレオチドを濃水酸化アンモニウム溶液にて約２０℃から約６５℃で約２時間から約４８時間処理して除去する。
【００３１】
合成オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体は化学的に合成されるもので、生物原料から抽出するものではない。当発明の方法は特に、例えば少なくとも核酸塩基の約５％がチミンかグアニンであるオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体のようなチミンおよび／またはグアニン核酸塩基に富む合成オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体に有用である。好ましくは、オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体の核酸塩基の少なくとも約１０％がグアニンまたはチミンである。より好ましくは、少なくとも当該核酸塩基の約２５％がグアニンまたはチミンである。更により好ましくは、少なくとも当該核酸塩基の約５０％がグアニンまたはチミンである。大層好ましくは、当該核酸塩基が全てグアニンまたはチミンである。
【００３２】
オリゴヌクレオチド合成用の固体担体はオリゴヌクレオチド合成に用いる試薬に不溶な有機または無機高分子である。代表的に、オリゴヌクレオチド合成には固体担体として剛性ポリスチレンまたは孔径調整したガラスシリカを用いる。更に、ペプチドの固相剛性に通常使用されるようなミクロ細孔またはソフトゲル担体、特にポリアクリルアミド担体を望ましければ使用してもよい。好ましいポリアクリルアミド担体はアミン官能基化担体で、カタログ名ＰＬ−ＤＭＡで販売されている市販で入手可能な担体（Ｐｏｌｙｍｅｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）のように、特にアクリロイル−サルコシンメチルエステル、Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミドおよびビス−アクリロイルエチレンジアミンの共重合で調製される担体由来のものである。当該担体の調製用の手順はＡｔｈｅｒｔｏｎ，　Ｅ．およびＳｈｅｐｐａｒｄ，　Ｒ．　Ｃ．がＳｏｌｉｄ　Ｐｈａｓｅ　Ｐｅｐｔｉｄｅ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ，（１９８４）　ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ　ａｔ　Ｏｘｆｏｒｄ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｐｒｅｓｓに記述したが、当該ミクロ細孔担体は参照により本明細書に援用してある。そのような担体上の官能基はメチルエステルで、メチルエステルは最初にエチレンジアミンのようなアルキルアミンとの反応で第一級アミン官能性に転換させる。
【００３３】
本発明の方法で使用するまたは製造するオリゴヌクレオチドにはリン酸ジエステル体（例えば、デオキシリボ核酸およびリボ核酸）またはオリゴヌクレオチド類似体が含まれる。オリゴヌクレオイド類似体とは本明細書では化学的に修飾されたヌクレオチドを含有するＤＮＡまたはＲＮＡオリゴヌクレオチド分子を意味すると解釈する。例えば、オリゴヌクレオチド類似体は、７−デアザグアニン、７−デアザ−８−アザグアニン、７−デアザアデニン、７−デアザ−８−アザアデニン、７−デアザ−６−オキソプリン、６−オキソプリン、３−デアザアデノシン、２−オキソ−５−メチルピリミジン、２−オキソ−４−メチルチオ−５−メチルピリミジン、２−チオカルボニル−４−オキソ−５−メチルピリミジン、４−オキソ−５−メチルピリミジン、２−アミノ−プリン、５−フルオロウラシル、２，６−ジアミノプリン、８−アミノプリン、４−トリアゾロ−５−メチルチミン、５−メチルシトシンおよび４−トリアゾロ−５−メチルウラシルのような修飾された核酸塩基を有することができる。オリゴヌクレオチド類似体は同様に糖部分で修飾できる。例えば、当該糖部分のヒドロキシ基を２’−Ｏ−メチル基の付加で修飾できるし、または当該糖は天然生成のＤ−リボースまたはＤ−デオキシリボースの代わりにＬ−リボースまたはＬ−デオキシリボースにできる。オリゴヌクレオチド類似体には同様に当該ホスファート骨格鎖にて修飾を受けたオリゴヌクレオチドも含まれる。例えば、ホスホロチオエート、メチルホスファートまたはメチルホスホナートはオリゴヌクレオチドの類似体である。オリゴヌクレオチド類似体は、オリゴヌクレオチド類似体の合成に少なくとも一つのβ−シアノエチル保護基を用いるならば、ＰＮＡ（Ｅｇｈｏｌｍ他、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．（１９９２），１１４：１８９５参照）またはモルホリノアンチセンスオリゴマー（ＳｕｍｍｅｒｔｏｎおよびＷｅｌｌｅｒ，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ　ａｎｄ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ　Ｄｒｕｇ　Ｄｅｖ．（１９９７），７：１８７参照）のような非核酸分子であるオリゴヌクレオチドの一部を有することができる。更に、オリゴヌクレオチド類似体には３’−または５’−末端を、例えばフルオロセインまたはローダミンのような蛍光色素、アルキルアミンまたは保護チオールアルキルリンカーのようなリンカー、アクリジンのようなインターカレータ、コレステリンのような細胞取り込みを増加させる基、ジニトロフェノールのようなハプテン或いはビオチンまたはジゴキシゲニンのような標識またはレポーター基で修飾されたオリゴヌクレオチドがなりうる。
【００３４】
脂肪族チオール基、脂肪族ヒドロキシ基または脂肪族アミン基は、置換または非置換脂肪族基に共有結合したチオール、ヒドロキシまたはアミン基である。第一級脂肪族アミンは一つの脂肪族基に結合したアミンである（例えば、ｔ−ブチルアミン）。第二級脂肪族アミンは二つの脂肪族基に結合したアミンである（例えば、ジイソプロピルアミン、モルホリンまたはピペラジン）。立体的障害のある第一級脂肪族アミンまたは立体的障害のある脂肪族チオールは、脂肪族第二級または第三級炭素原子、或いは第一級炭素であれば少なくとも第二級または第三級原子または芳香族または芳香族複素環基に結合したような第一級炭素に結合したアミンまたはチオールである。ｔ−ブチルアミンは脂肪族第三級炭素原子に結合したアミン基の一例である。ｓ−ブチルアミンは脂肪族第二級炭素原子に結合したアミン基の一例である。ベンジルメルカプタンは芳香族基に同様に結合した第一級炭素に結合したチオールの一例である。
【００３５】
本明細書で用いる脂肪族基には、完全飽和または１つ以上の非共役二重結合を含む直鎖または分岐Ｃ１〜Ｃ１８炭化水素、或いは完全飽和またはチオール、ヒドロキシまたはアミン基に結合している少なくとも一つの炭素が二重結合の部分でないとして一つ以上の非共役二重結合を含有する環式Ｃ３〜Ｃ１８炭化水素が含まれる。低級アルキル基は直鎖または分岐Ｃ１〜Ｃ８炭化水素或いは完全飽和のＣ３〜Ｃ８環式炭化水素である。立体的障害のある脂肪族チオール、脂肪族ヒドロキシル、第二級脂肪族アミンまたは立体障害のある第一級脂肪族アミンであるアクリロニトリル捕捉剤の脂肪族基は好ましくは低級アルキル基である。
【００３６】
脂肪族基は置換されていることもありえるし非置換でもありえる。脂肪族基に対して適する置換基には、置換または非置換芳香族基、置換または非置換芳香族複素環基、置換または非置換複素環式アルキル基、ハロゲン化芳香族基、ハロゲン化低級アルキル（例えば、トリフルオロメチルおよびトリクロロメチル）、−Ｏ−（脂肪族基または置換脂肪族基）、−Ｏ−（芳香族基または置換芳香族基）、ハロ、シアノ、ニトロ、−Ｓ−（脂肪族または置換脂肪族基）および−Ｓ−（芳香族または置換芳香族）が含まれる。
【００３７】
本明細書に用いる用語“ハロアルカン”には、完全に飽和していて１から１８のハロ基を含有している直鎖または分岐Ｃ１〜Ｃ８炭化水素が含まれる。更に、用語“ハロアルカン”には、完全飽和していて１から１６のハロ基を含有する環式Ｃ３〜Ｃ１８炭化水素が含まれる。ハロ基にはフルオロ、クロロ、ブロモおよびヨード基が含まれる。
【００３８】
芳香族基には、炭素環式系（例えば、フェニル）および縮合多環式、縮合炭素環式系（例えば、ナフチル、アンスラセニルおよび１，２，３，４−テトラヒドロナフチル）が含まれる。
【００３９】
エステルには以下の式で表される基が含まれる：
【００４０】
【化４】
2004503561.tif 000005
【００４１】
式中、ＲおよびＲ１は各々、各自に脂肪族基、芳香族基またはアリールアルキル基である。
アルコールには以下の式で表される基が含まれる：
【００４２】
【化５】
2004503561.tif 000006
【００４３】
式中、Ｒ２は脂肪族基である。
本明細書で使用するアリールアルキル基には、好ましくは１から約６の炭素原子を有する脂肪族基で部分に結合した芳香族置換基が含まれる。
【００４４】
本明細書で用いる芳香族複素環基には、ヘテロアリール環系（例えば、チエニル、ピリジル、ピラゾール、イソキサゾリル、チアジアゾリル、オキサジアゾリル、インダゾリル、フラン類、ピロール類、イミダソール類、ピラゾール類、トリアゾール類、ピリミジン類、ピラジン類、チアゾール類、イソキサゾール類、イソチアゾール類、テトラゾール類またはオキサジアゾール類）および炭素環式芳香族環、炭素環式非芳香族環またはヘテロアリール環が一つ以上の他のヘテロアリール環（例えば、ベンゾ（ｂ）チエニル、ベンズイミダゾール、インドール、テトラヒドロインドール、アザインドール、インダゾール、キノリン、イミダゾピリジン、プリン、ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジンおよびピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン）と縮合したヘテロアリール環系が含まれる。
【００４５】
本明細書に用いた、複素環式アルキル基は非芳香族環式系で、５から７の原子を有していて、窒素、酸素または硫黄のような少なくとも一つのヘテロ原子を含む。複素環式アルキル基の例にはモルホリン類、ピペリジン類およびピペラジン類が含まれる。
【００４６】
芳香族基、芳香族複素環基または複素環式アルキル基について適した置換基にはハロ、ニトロ、シアノ、ハロゲン化低級アルキル基、低級アルキルエーテルおよび低級アルキルチオエーテルが含まれる。
【００４７】
本発明の他の態様はオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体を製造する方法である。製造の方法には、オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体と少なくとも一つのアクリロニトリル捕捉剤を有する塩基性水溶液を、少なくとも一つのβ−シアノエチル保護基を除去するのに十分な温度と十分な時間接触させるオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体の合成の工程が含まれる。
【００４８】
合成されるオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体が少なくとも一つのβ−シアノエチル保護基を持つとすれば、当該オリゴヌクレオチドは当技術分野の当事者には既知である固相および液相法の両方が含み、オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体を合成する方法のいかなる法法によっても合成できる。典型的にはオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体はホスホアミダイト化学の手法（Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ，Ｍ．Ｈ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８５），２３０：２８１参照，この全教示は参照により本明細書中に援用されている）を用いて合成される。オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体を合成する他の方法には、リン酸ジエステルおよびリン酸トリエステル法（Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ，Ｍ．Ｈ．，Ａｃｃ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．（１９８０），１３：１５５；Ｉｔａｋｕｒａ他，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９８４），５３：３２３；Ｋｈｏｒａｎａ他，　Ｊ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９７２），７２：２０９；Ｋｈｏｒａｎａ他、Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．（１９６６），３１：３９参照，この全教示は参照により本明細書中に援用されている）またはＨ−ホスホナート法（Ａｎｄｒｕｓ他、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔ．（１９８８），２９：８６１；Ｆｒｏｅｈｌｅｒ，Ｂ．Ｃ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔ．（１９８６ａ），２７：５５６５；Ｆｒｏｅｈｌｅｒ，Ｂ．Ｃ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔ．（１９８６ｂ），２７：５５７５；Ｇｒｅｇｇ他、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔ．（１９８７），２７：４０５１参照、この全教示は参照により本明細書中に援用されている）。好ましい態様では、オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体の一部はホスホアミダイト化学の手法で合成でき、当該オリゴヌクレオチドの異なる一部はリン酸ジエステル法、リン酸トリエステル法またはＨ−ホスホナート法などの他の方法で合成できる。より好ましい態様では、当該オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体は全体につきホスホアミダイト化学の手法を用いて合成される。
【００４９】
【実施例】
実験
実施例１：比較による脱保護基の結果
各々３１のチミジン塩基を有するリン酸ジエステルオリゴヌクレオチドおよびホスホロチオエートオリゴヌクレオチドを、ホスホアミダイト化学の手法の標準プロトコールに従い、ＤＮＡ合成装置８９０９Ｅｘｐｅｄｉｔｅ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）において剛性ポリエチレン固体担体で二つの別々のバッチを合成した。当該５’−ジメトキシトリチル保護基は合成サイクルの最後まで残存した。鎖伸長の最後に完全に保護したリン酸ジエステルまたはホスホロチオエートオリゴヌクレオチドを伴った固体担体を３つの部分に分けた。各部分は別々に（ｉ）濃水酸化アンモニウム、（ｉｉ）の濃水酸化アンモニウム中の１０％（容量／容量）ｔ−ブチルアミンまたは（ｉｉｉ）濃水酸化アンモニウム中の５％（容量／容量）ＤＴＴにて５０℃で１６時間処理した。これらの試料はイオン交換ＨＰＬＣおよびＭＡＬＤＩＴＯＦ質量分析で分析した（リン酸ジエステルオリゴヌクレオチドにつき得た結果について図１Ａ〜図１Ｃおよび図２Ａ〜２Ｃ参照）。当該リン酸ジエステルおよび当該ホスホロチオエート試料において当該ＨＰＬＣクロマトグラムは、水酸化アンモニウムで処理した試料の部分は生成物ピークの後ろに近接して追加ピークの存在を示した。水酸化アンモニウムおよびアクリロニトリル捕捉剤で処理した当該試料における他の二つの部分では、追加ピークはほとんど存在しなかった。
【００５０】
固体担体から濃水酸化アンモニウムで切離した３１塩基長のポリチミジンリン酸ジエステルのＭＡＬＤＩＴＯＦ質量スペクトル（図２Ａ参照）は望んでいる生成物を表す９３６８．３２のピークを示した。更に、９３９０．５６および９４０９．４６のピークは其々望んでいる生成物のナトリウム塩およびカリウム塩を示す。９４２３．０８の質量を持つシアノエチル化リン酸ジエステルが相当量存在する。対照的に、水酸化アンモニウムと１０％（容量／容量）ｔ−ブチルアミン（図２Ｂ）または水酸化アンモニウムと５％（容量／容量）ＤＴＴ（図２Ｃ）で固体担体から切離した３１塩基長ポリチミジンリン酸ジエステルの中にはシアノエチル化リン酸ジエステルを表す９４２３．０８のピークは存在しない。
【００５１】
実施例２：　二工程の脱保護基法
各々３１チミジン塩基長を有するリン酸ジエステルオリゴヌクレオチドおよびホスホロチオエートオリゴヌクレオチドを、ホスホアミダイト反応作用の標準プロトコールに従ってＤＮＡ合成装置８９０９Ｅｘｐｅｄｉｔｅ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で剛性ポリスチレン固体担体にて二つの別々のバッチで合成した。合成サイクルの最後まで５’−ジメトキシトリチル保護基は残存した。鎖伸長の最後に全保護化リン酸ジエステルまたはホスホロチオエートオリゴヌクレオチドが付いた固体担体につき１５％ｔ−ブチルアミンを含有するアセトニトリル溶液で４５分間処理した。それからリン酸ジエステルまたはホスホロチオエートオリゴヌクレオチドが結合した担体を濃水酸化アンモニウム中の１０％（容量／容量）ｔ−ブチルアミンで５０℃、１６時間別々に処理した。これらの試料はイオン交換ＨＰＬＣおよびＭＡＬＤＩＴＯＦ質量分析で分析したが、図１Ｂおよび図２Ｂに示すように当該リン酸ジエステルオリゴヌクレオチドにつき同様の結果を与えた。
【００５２】
【発明の効果】
均等論
本発明は、その好ましい態様に関して詳しく示し、説明したが、当技術分野の当事者であれば添付した請求項で囲んだ当発明の範囲から外れることなしに形式および細部を種々に変化できることは理解できるであろう。
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１Ａ、１Ｂおよび１Ｃは以下に説明するようなイオン交換ＨＰＬＣクロマトグラムである。カラムのタイプはＤＮＡ　ＰＡＣ　ＰＡ−１００（カラム　ｓ／ｎ：１３０５）である。溶離液Ａは２５ｍＭ　Ｔｒｉｓ　ｐＨ８。溶離液Ｂは２５ｍＭ　Ｔｒｉｓ，３７５ｍＭ　ＮａＣｌＯ４　ｐＨ８。当該システム名はＩＥＸ２。チャネル描写（Ｃｈａｎｎｅｌ　Ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎ）は２６０ｎｍである。傾斜溶離法は流速１．５ｍｌ／分にて４０分で溶離液Ｂを１０から６０％であり温度４５℃である。
図１Ａは、水酸化アンモニウムにて５０℃で１６時間処理してポリスチレン固体担体から切離し、脱保護基化した３１個のチミン塩基を有するリン酸ジエステルオリゴヌクレオチドのイオン交換ＨＰＬＣクロマトグラムである。
図１Ｂは、５０℃で１６時間水酸化アンモニウム中の１０％ｔ−ブチルアミンで処理して固体担体から切離し、脱保護基化した図１Ａのリン酸ジエステルと同じ合成バッチから得たリン酸ジエステルオリゴヌクレオチドのイオン交換ＨＰＬＣクロマトグラムである。
図１Ｃは、５０℃で１６時間水酸化アンモニウム中の５％ＤＴＴ（ジチオスレイトール）で処理して固体担体から切離し、脱保護基化した図１Ａのリン酸ジエステルと同じ合成バッチから得たリン酸ジエステルオリゴヌクレオチドのイオン交換ＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図２】
図２Ａは、図１Ａのリン酸ジエステルオリゴヌクレオチドのＭＡＬＤＩＴＯＦ質量スペクトルである。ＰＳＩ　ＮＨ４ＯＨ切離し．方法はＤＮＡ１である。モードは直線であった。当該加速電圧は２５０００であった。当該グリッド電圧は９２．５００％であった。当該ガイドワイア電圧は０．１５０％であった。平均スキャンは１５６であった。圧力は３．０９ｅ〜０７であった。レーザーは２６２０。負イオンはオフ。低質量ゲートは５００．０であった。遅延は２５０オンであった。
図２Ｂは図１Ｂのリン酸ジエステルオリゴヌクレオチドのＭＡＬＤＩＴＯＦ質量スペクトルである。ＰＳＩ　ＮＨ４ＯＨ＋１０％ｔ−ブチルアミン方法はＤＮＡ１であった。モードは直線であった。加速電圧は２５０００であった。グリッド電圧は９２．５００％であった。ガイドワイア電圧は０．１５０％であった。平均スキャンは５４であった。圧力は３．０５ｅ〜０７であった。レーザーは２６２０。負イオンはオフ。低質量ゲートは５００．０であった。遅延は２５０オンであった。
図２Ｃは図１Ｃにおけるリン酸ジエステルオリゴヌクレオチドのＭＡＬＤＩＴＯＦ質量スペクトルである。ＰＳＩ　ＮＨ４ＯＨ＋ＤＴＴ切離し。方法はＤＮＡ１であった。モードは直線であった。加速電圧は２５０００であった。グリッド電圧は９２．５００％であった。ガイドワイア電圧は０．１５０％であった。平均スキャンは５４であった。圧力は３．０５ｅ〜０７であった。レーザーは２６２０。負イオンはオフ。低質量ゲートは５００．０であった。遅延は２５０オンであった。
【図１】
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【図２】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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