(57)【要約】物質上に固定されたポリマー化合物を含む、殺菌性組成物を開示する。そのような殺菌性組成物を含む医療器具も開示する。一般的な物質の表面を、たとえばポリ（ビニル-N-ピリジニウム臭化物）などの抗菌性ポリカチオンで共有結合的に誘導体化する方法であって、当該方法の第１のステップが、表面のシリカナノ層によるコーティングに関与する、方法を開示する。このように誘導体化したさまざまな商用合成ポリマーは殺菌性であって、すなわち、空気中または水中のいずれかから沈着し、接触するグラム陽性およびグラム陰性細菌の最高99%までを死滅させる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
物質および前記物質に固定された化合物からなる組成物であって、前記の固定した化合物がポリマーであって、前記ポリマーが水に不溶性ではない、組成物。
【請求項２】
請求項１に記載の組成物であって、前記の固定された化合物がポリカチオンである、組成物。
【請求項３】
請求項１に記載の組成物であって、前記の固定された化合物が水溶性の脂肪親和性ポリカチオンである、組成物。
【請求項４】
請求項１に記載の組成物であって、前記の固定された化合物が前記固体物質に共有結合している、組成物。
【請求項５】
請求項１に記載の組成物であって、前記の固定された化合物がポリ（N-アルキルビニルピリジン）またはポリ（N-アルキルエチレンイミン）を含む、組成物。
【請求項６】
表面および前記表面に共有結合した化合物からなる組成物であって、前記化合物が式Iによって表され、
【化１】
2004532108.tif 000022
（式I）
当該式において
Rはそれぞれ独立に水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、アシル、アリール、カルボキシラート、アルコキシカルボニル、アリールオキシカルボニル、カルボキサミド、アルキルアミノ、アシルアミノ、アルコキシル、アシルオキシ、ヒドロキシアルキル、アルコキシアルキル、アミノアルキル、（アルキルアミノ）アルキル、チオ、アルキルチオ、チオアルキル、（アルキルチオ）アルキル、カルバモイル、尿素、チオ尿素、スルホニル、スルホナート、スルホンアミド、スルホニルアミノ、またはスルホニルオキシを表し、
R’はそれぞれ独立にアルキル、前記表面へのアルキルイデンテザー、または前記表面へのアシルテザーを表し、
Zはそれぞれ独立にCl、Br、またはIを表し、
nは約1500以下の整数である、
式で表される、組成物。
【請求項７】
請求項６に記載の組成物であって、前記テザーがアシルテザーである、組成物。
【請求項８】
請求項６に記載の組成物であって、前記テザーがアルキルイデンテザーである、組成物。
【請求項９】
請求項８に記載の組成物であって、前記アルキルイデンテザーが、-C4H8-テザーである、組成物。
【請求項１０】
請求項６に記載の組成物であって、前記表面に共有結合している前記化合物の分子量が少なくとも10,000g/molである、組成物。
【請求項１１】
請求項６に記載の組成物であって、前記表面に共有結合している前記化合物の分子量が少なくとも150,000g/molである、組成物。
【請求項１２】
請求項６に記載の組成物であって、前記表面に共有結合している前記化合物がポリ（4-ビニル-N-アルキルピリジニウム臭化物）である、組成物。
【請求項１３】
請求項６に記載の組成物であって、前記表面に共有結合している化合物がポリ（4-ビニル-N-ヘキシルピリジニウム臭化物）である、組成物。
【請求項１４】
請求項６に記載の組成物であって、前記表面が酸化シリコンの層を含む、組成物。
【請求項１５】
請求項６に記載の組成物であって、前記表面が低密度ポリエチレン（LDPE）、高密度ポリエチレン（HDPE）、ポリプロピレン（PP）、ナイロン、およびポリ（エチレンテレフタラート）（PET）からなるグループから選択される、組成物。
【請求項１６】
請求項６に記載の組成物であって、前記表面が医療器具に含まれる、組成物。
【請求項１７】
請求項１６に記載の組成物であって、前記医療器具が、ピン、ネジ、プレート、脳室心房シャント、脳室腹腔シャント、透析シャント、心臓弁、ペースメーカー、輸液用ポンプ、人工血管、ステント、縫合糸、外科用メッシュ、置換用人工器官、乳房インプラント、組織拡張器、コンタクトレンズ、瘻孔用器具、人工喉頭、気管内チューブ、気管チューブ、胃瘻チューブ、胆汁排出チューブ、胆管ステント、カテーテル、絆創膏、接着テープ、および透明プラスチック接着シートからなるグループから選択される、組成物。
【請求項１８】
表面を殺菌する方法であって、
SiO2で表面をコーティングするステップと、
前記表面上のSiO2の一部分を複数のSi-OH基を形成するために水酸化するステップと、
前記表面上の前記の複数のSi-OH基の少なくとも一部分を、トリ（アルコキシ）Si-O-（アルキル）-NH2試薬で処理することによって複数のSi-O-（アルキル）NH2基に転換するステップと、
前記表面上の前記の複数のSi-O-（アルキル）-NH2基の一部分を1,n-ジハロアルカンでアルキル化して、複数のSi-O-（アルキル）-NH-（アルキル）-ハロゲン化物基を生じるステップと、
前記複数のSi-O-（アルキル）-NH-（アルキル）-ハロゲン化物基をアミンを含有するポリマーおよびハロゲン化アルキルで処理し、前記アミン含有ポリマーを前記表面に共有結合させるステップと、
を含む、方法。
【請求項１９】
請求項１８に記載の方法であって、前記表面がポリマー表面である、方法。
【請求項２０】
請求項１９に記載の方法であって、前記ポリマー表面がLDPE、HDPE、PP、ナイロン、およびPETからなるグループから選択される、方法。
【請求項２１】
請求項１８に記載の方法であって、前記トリ（アルコキシ）Si-O-（アルキル）-NH2試薬が3-アミノプロピルトリエトキシシランである、方法。
【請求項２２】
請求項１８に記載の方法であって、前記1,n-ジハロアルカンが1,4-ジブロモブタンである、方法。
【請求項２３】
請求項１８に記載の方法であって、前記アミン含有ポリマーがポリ（4-ビニルピリジン）である、方法。
【請求項２４】
請求項１８に記載の方法であって、前記ハロゲン化アルキルが1-ブロモヘキサンである、方法。
【請求項２５】
請求項１８に記載の方法であって、前記表面がLDPE、HDPE、PP、ナイロン、およびPETからなるグループから選択され、前記トリ（アルコキシ）Si-O-（アルキル）-NH2試薬が3-アミノプロピルトリエトキシシランであって、前記1,n-ジハロアルカンが1,4-ジブロモブタンであって、前記アミン含有ポリマーがポリ（4-ビニルピリジン）であって、前記ハロゲン化アルキルが1-ブロモヘキサンである、方法。
【請求項２６】
表面を殺菌する方法であって、
SiO2で表面をコーティングするステップと、
前記表面上のSiO2の一部分を複数のSi-OH基を形成するために水酸化するステップと、
前記表面上の前記の複数のSi-OH基の少なくとも一部分を、トリ（アルコキシ）Si-O-（アルキル）-NH2試薬で処理することによって複数のSi-O-（アルキル）-NH2基に転換するステップと、
前記Si-O-（アルキル）NH2基を活性化アクリル酸でアクリル化して、複数のSi-O-（アルキル）-NHアクリル酸基を生成するステップと、
前記Si-O-（アルキル）-NHアクリル酸基をアミン含有モノマーと重合して前記表面に共有結合的に連結されたアミン含有ポリマーを形成するステップと、
前記の共有結合的に連結したアミン含有ポリマーをハロゲン化アルキルで処理するステップと、
を含む方法。
【請求項２７】
請求項２６に記載の方法であって、前記表面がポリマー表面である、方法。
【請求項２８】
請求項２６に記載の方法であって、前記ポリマー表面がLDPE、HDPE、PP、ナイロン、およびPETからなるグループから選択される、方法。
【請求項２９】
請求項２６に記載の方法であって、前記トリ（アルコキシ）Si-O-（アルキル）-NH2試薬が3-アミノプロピルトリエトキシシランである、方法。
【請求項３０】
請求項２６に記載の方法であって、前記の活性化したアクリル酸が塩化アクリロイルである、方法。
【請求項３１】
請求項２６に記載の方法であって、前記アミン含有モノマーが4-ビニルピリジンである、方法。
【請求項３２】
請求項２６に記載の方法であって、前記ハロゲン化アルキルが1-ブロモヘキサンである、方法。
【請求項３３】
請求項２６に記載の方法であって、前記表面が、LDPE、HDPE、PP、ナイロン、およびPETからなるグループから選択されるポリマー表面であって、前記トリ（アルコキシ）Si-O-（アルキル）-NH2試薬が3-アミノプロピルトリエトキシシランであって、前記活性化アクリル酸が塩化アクリロイルであって、前記アミン含有モノマーが4-ビニルピリジンであって、前記ハロゲン化アルキルが1-ブロモヘキサンである、方法。
【請求項３４】
請求項１８または２６に記載の方法であって、前記表面がグラム陽性細菌に対して殺菌性である、方法。
【請求項３５】
請求項１８または２６に記載の方法であって、前記表面がグラム陰性細菌に対して殺菌性である、方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の背景】
【０００１】
健康な生活への要望がかつてなく大きくなっており、有害な微生物を死滅させることができる物質に対して強い関心が集まっている。このような物質を用いれば、たとえばドアノブ、子供用のおもちゃ、コンピュータのキーボード、電話機などの日常的に人々が触れる日用品をコーティングして殺菌し、細菌性感染症が伝染しないようにすることもできる。通常の物質は抗菌性ではないため、改良する必要がある。たとえば、ポリ（エチレングリコール）およびそのほかの何種類かの合成ポリマーで化学的に修飾した表面は、微生物を撃退させることができる（死滅ではないものの）（Bridgett, M.J., et ak , S.P. (1992) Biomaterials 13, 411-416. Arciola, C.R., et al Alvergna, P., Cenni, E. & Pizzoferrato, A. (1993) Biomaterials 14, 1161-1164. Park, K.D.,Kim, Y.S., Han, D.K., Kim, Y.H., Lee, E.H.B., Suh, H. & Choi, K.S.  (1998) Biomaterials 19, 851-859.）。
【０００２】
代替的には、抗生物質、第4級アンモニウム化合物、銀イオンまたはヨウ素など、時間をかけて周囲の溶液に次第に放出されて微生物を死滅させる抗菌物質を、物質に染みこませることができる（Medlin, J. (1997) Environ. Health Persp. 105, 290-292; Nohr, R.S. & Macdonald, G.J. (1994) J. Biomater. Sci., Polymer Edn. 5, 607-619 Shearer, A.E.H., et al (2000) Biotechnol. Bioeng. 67, 141-146.）。これらの戦略は細菌を含む水溶液において実証されているが、流体の媒体がない空中に浮遊する細菌に対しては効果が期待できないだろう。これは放出性の物質の場合には特に言えることで、そのような物質は浸出する抗菌物質が使い果たされると効果がなくなってしまう。
【０００３】
感染症は、多くの侵襲的な外科的処置、治療処置および診断処置によく見られる合併症である。埋込式の医療用装置が関与する処置では、感染症を防ぐのは特に難しい。なぜなら細菌がバイオフィルムを形成し、対象の免疫系はその細菌を除去できなくなるからである。このような感染症は抗菌物質では処理することが困難なため、その装置を取り出さなければならないことが多く、患者に苦痛を与え、医療費も増加する。
【０００４】
体内に埋め込んで放置する物質にはいずれも、特に細菌および時に真菌などの感染症を引き起こす微生物を蓄積する表面がある。これは、バイオフィルムの形成によって生じる物と理解される。バイオフィルムは付着物の1種で、微生物が表面に付着し、水和したポリマー物質を分泌して自らの周りを取り囲む時に生じる。バイオフィルムに存在するセシル（付着状態）と呼ばれる微生物は、抗菌物質の攻撃を遮断して保護された環境で増殖する。このセシルの群集はプランクトニック（浮遊状態）とよばれる非セシル状の個体を産生し、急速に増殖して拡散する。このプランクトニック生物は侵襲的で伝染性の感染症の原因となる。抗菌療法の標的となるのはこの生物である。従来の処理法では、バイオフィルムに根ざしたセシル群を消去することができない。バイオフィルムは感染物質の貯蔵場所になっていることが多いと理解されている。バイオフィルムの生物学は、引用により本願明細書に援用する“Bacterial biofilms: a common cause of persistent infection,” J. Costerson, P. Stewart, E. Greenberg, Science 284: 1318-1322 (1999)、および“The riddle of biofilm resistance,” K. Lewis, Antimicrob. Agents Chemother., 45, 999-1007 (2001)にさらに詳述されている。
【０００５】
バイオフィルムは内部の表面または生きていない組織に発生することを好み、医療器具および血管が通っていない組織または死滅した組織に生じることが多い。バイオフィルムは死滅した骨の壊死片まおよび骨移植片に確認されており、骨髄炎と呼ばれる、さらに骨を死滅させる侵襲的な感染症を誘発する。バイオフィルムは、生来の心臓弁などの乏血管性の生組織にも確認されており、心内膜炎と呼ばれる壊滅的な感染症の原因となり、原因菌が血流にのって遠位でコロニーを形成することができるだけでなく、心臓弁そのものも破壊されることがある。埋込式の医療器具が関与する感染症には、一般的にはバイオフィルムが関与しており、セシル群が侵襲的感染症の貯蔵場所となっている。医療器具上のバイオフィルム中に微生物が存在するということは、その異物の汚染を表す。バイオフィルムによる、臨床的に認知できる宿主応答の誘導が、感染症を構成する。
【０００６】
汚染箇所からの感染症の発症は、バイオフィルムの成長および発達のナチュラル・ヒストリーと一致する。バイオフィルムは1箇所以上でゆっくり成長し、1種類以上の微生物がコロニーを形成している。バイオフィルムの発達パターンは、微生物が固体表面に付着する最初のステップ、表面に付着した微小コロニーの形成ステップ、および微小コロニーがエキソポリサッカリドに包み込まれた成熟したバイオフィルムへ分化する最後のステップが含まれる。プランクトニック細胞はプログラムされた剥離の自然パターンでバイオフィルムから放出されるため、バイオフィルムは複数の再発急性浸襲的感染の場となる。抗菌物質は典型的にはプランクトニック細胞によって生じる感染症を処理するが、バイオフィルムに保護されたセシル生物を死滅させることはできない。
【０００７】
セシル微生物は局所的な症状も引き起こし、抗原を放出し、バイオフィルムおよびその周辺領域を攻撃する免疫系を活性化する抗体の産生を刺激する。抗体と宿主免疫の防御は、バイオフィルムに入った生物が抗体および関連する免疫応答を誘発するが、これらの生物を死滅させる効果はない。免疫が活性化された宿主の細胞の細胞毒性産物は、宿主自体の組織に方向付けられることがある。この現象は口腔内でみられ、口腔内バイオフィルムが歯牙周辺の組織に炎症を起こし、歯周炎を生じることがある。この現象は、埋込式の医療器具周辺に局所的な炎症を引き起こし、および整形外科および歯科の埋込器具のゆるみによる骨吸収を引き起こすこともある。
【０００８】
宿主の防御がプランクトニック生物の拡散を制御することによって侵襲的な感染症を水際で護ることもあるが、この好ましい平衡状態は免疫系が無傷であることを前提としている。病院内の患者の多くは免疫不全で、バイオフィルム群が確立してしまうと、侵襲的な感染症を罹患しやすくなる。埋込式の医療器具が必要な患者は、期間の長短にかかわらず、同様に免疫不全である可能性がある。免疫系がうまく機能していない場合、宿主の、医療器具の周辺に汚染されたバイオフィルムが形成される最初のリスクと、周囲の組織および系にプランクトニック生物が侵入するリスクが、より大きくなる。プランクトニック生物が完全な感染症を引き起こすと、免疫不全宿主はそれを阻止および制御できなくなる確率が高くなり、死に至る可能性もある。
【０００９】
抗菌処理および宿主防御によって保護しても、バイオフィルムは典型的には感染症を繰り返し、規模の小さい局所的な症状を生じる。ひとたび確立されたバイオフィルムは、外科的にしか除去することができない。異物が微生物で汚染された場合、局所的および全身的感染を解消する唯一の方法は汚染された異物の除去であろう。その除去される物質が健康に必須である場合、同様の物質を同じ位置に交換する必要があろう。その領域の残留微生物のために、交換する物質は特に感染しやすいだろう。
【００１０】
バイオフィルムによる感染症の解消に伴う困難はよく認識されており、バイオフィルムの形成を防止または減少させるために表面または表面を浸す流体を処理するための、数多くの技術が開発されている。バイオフィルムは、医療システム、ならびに給水および食品加工施設などの公衆衛生に必須のその他のシステムに悪影響を及ぼす。バイオフィルムの形成を阻害する有機または無機物質の表面を処理する数多くの技術が提唱されている。たとえば、医療器具の表面を抗菌物質(たとえば 米国特許第 4,107,121号、4,442,133号、4,895,566号、4,917,686号、5,013,306号、4,952,419号、5,853,745号、および5,902,283号を参照)、およびその他の静菌性化合物 (たとえば米国特許第 4,605,564号、4,886,505号、5,019,096号、5,295,979号、5,328,954号、5,681,575号、5,753,251号、5,770,255号、および5,877,243号を参照)でコーティングするための様々な方法が利用されている。このような技術にもかかわらず、医療器具の汚染およびそれに起因する侵襲的な感染症は問題であり続けている。
【００１１】
感染性生物は、滅菌状態を維持するための積極的な努力にもかかわらず、医療環境のどこにでも存在する。このような生物が存在すると、入院患者および医療関係者に感染する可能性がある。このような感染は院内感染と呼ばれ、病院外で遭遇するものよりも感染力が強く異常な生物が関与していることが多い。さらに、院内での感染は、多くの抗菌物質に対して抵抗性が発達している生物が関与する確率が高い。洗浄および抗菌管理は日常的に行われているが、感染性生物は医療環境におけるさまざまな表面、特に多湿な環境に曝されているか、または流体中に含浸している表面に、容易にコロニーを形成する。手袋、エプロン、およびシールドなどの障壁物でさえも、着用者または医療環境にいるその他の者に感染を広げる。滅菌および洗浄にもかかわらず、医療環境にあるさまざまな金属または非金属物質が、バイオフィルムに包まれた危険な生物を保持し、他の宿主に伝染させることもある。
【００１２】
医療環境にあるバイオフィルムの形成を減少させるために用いるいかなる物質も、使用者にとって安全でなければならない。いくつかの殺生性物質は、バイオフィルムを阻害するのに十分な量を用いると、宿主組織に損傷を与える可能性もある。組織の局部領域に抗菌物質を導入すると、抵抗性を有する生物の形成を誘導することがあり、その生物がバイオフィルム群を形成することがあり、そのプラクトニック微生物が前述の抗菌物質に同様に抵抗性を有するようになる。さらに、抗バイオフィルム物質または防汚物質はいずれも、医療器具の健康に有益な特徴を妨害してはならない。ある特定の操作者の可操作性、柔軟性、防水性、抗張性、または圧縮耐久性であって、抗菌効果のために添加した物質によって変化することがない性質を有するように、いくつかの物質を選択する。
【００１３】
さらなる問題点として、汚染およびバイオフィルム形成を阻害するための埋込式の器具の表面に添加した物質が血栓形成性を有する可能性がある。埋込物質の一部はそれ自体が血栓形成性である。たとえば、金属、ガラス、プラスチックまたはその他の同様の表面との接触は、凝血を誘導する可能性があることが示されている。したがって、抗凝血効果を有することが知られているヘパリン化合物を、埋込の前にいくつかの医療器具に塗布している。しかし、抗菌効果と抗血栓形成効果とを組み合わせた医療用の製品は、少数しか知られていない。この組み合わせは、たとえば心臓弁、人工ポンプ装置（「人工心臓」または左心室支援装置）、人工血管、および血管ステントなどの血流中に留置する医療器具を処理するには、特に有用であろう。このような背景では、血栓が形成すると導管の血流をふさぐことがあり、さらに砕けて塞栓とよばれる破片になって下流に運ばれ、遠位の組織または器官の循環を遮断する可能性がある。
【００１４】
バイオフィルムの形成は、公衆衛生において重要な意味がある。飲料水の供給システムは、その環境が殺菌剤を含むことが多いにもかかわらず、バイオフィルムが隠れて存在することが知られている。表面と流体が接する界面があるシステムにはいずれも、バイオフィルム形成の可能性がある。空調装置用の水冷却塔は、バイオフィルムの形成に起因する公衆衛生の危険性を有することでよく知られており、レジオネラ症などの感染症の突発的な集団発生で証明されている。表面上に生じる流体の乱流では保護できない。バイオフィルムは流水またはその他の流体が通過する流路に形成し、流れの特徴を変化させ、プランクトニック生物を下流に運ぶように作用することがある。産業上の流体加工操作では、バイオフィルムにすべて起因する、機械的な遮断、熱伝導プロセスのインピーダンス、流体を用いた工業製品の生物劣化を経験してきた。バイオフィルムは血液透析チューブなどの流路、および配水管にも確認されている。バイオフィルムはまた、特定の地方自治体の貯水槽、個人所有の井戸、および細流灌漑システムに生物付着を生じており、最高200ppmの塩素処理でも影響を受けないことが確認されている。
【００１５】
バイオフィルムは食品加工環境においても問題となっている。食品加工には、流体、固体材料、およびその組み合わせが関与する。たとえば、牛乳加工施設には流体の導管および表面上に流体が滞留する領域がある。現在、搾乳および牛乳加工装置の洗浄は、空気注入式の定置洗浄法で、機械的、熱的、および化学的プロセスの相互作用を使用している。さらに、乳製品自体も滅菌処理されている。チーズをつくる場合、バイオフィルムのためにチェダーチーズに乳酸カルシウムの結晶ができることがある。食肉加工および包装施設でも、同様にバイオフィルムが形成しやすい。非金属製および金属製の表面に作用することもある。食肉加工施設では、ゴム製の「フィンガー」、プラスチック製のカーテン、ベルトコンベア、内臓摘出器具、およびステンレス鋼表面上にバイオフィルムが検出されている。食品加工におけるバイオフィルムおよび微生物汚染の管理には、さらに製品の味、質感、または美しさに影響しない物質を使用する必要もあり、それが妨げになっている。
【００１６】
したがって、一般的な表面に殺菌性を持たせる必要性がある。ほとんどの物質に、その性質に関わりなく応用可能な、一般的な表面のコーティング／誘導体化の手順を開発した。
【発明の概要】
【００１７】
本願発明のある局面は、共有結合させた両親媒性化合物からなる抗菌表面に関する。いくつかの実施態様では、本願発明の表面は接触する空中の生物を除去するように作用する。いくつかの実施態様では、本願発明の表面は接触する水中の生物を除去するように作用する。いくつかの実施態様では、本願発明の表面はバイオフィルムの形成を阻害するように作用する。
【００１８】
いくつかの実施態様では、前記の共有結合させた両親媒性化合物はアンモニウムイオンを含むポリマーである。好ましい実施態様では、前記ポリマーの分子量は少なくとも10,000g/molであり、さらに好ましくは120,000g/molであり、最も好ましくは150,000g/molである。
【００１９】
いくつかの実施態様では、本願発明の表面はガラスである。いくつかのその他の実施態様では、本願発明の表面はプラスチックである。ある実施態様では、本願発明の表面はアミノ保有ガラスである。
【００２０】
いくつかの実施態様では、本願発明は前記物質に固定された物質および化合物を含む組成物であって、当該組成物において前記の固定された化合物はポリマーであって、当該ポリマーは水に不溶性ではない、組成物に関連する。いくつかの実施態様では、前記の固定された化合物はポリカチオンである。いくつかの実施態様では、前記の固定された化合物は水溶性の脂肪親和性ポリカチオンである。いくつかの実施態様では、前記の固定された化合物は前記固体物質に共有結合している。いくつかの実施態様では、前記の固定された化合物はポリ（N-アルキルビニルピリジン）またはポリ（N-アルキルエチレンイミン）を含む。
【００２１】
いくつかの実施態様では、表面に共有結合させた化合物は式Iであって
【化２】
2004532108.tif 000002
（式I）
当該式において
Rはそれぞれ別々に水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、アシル、アリール、カルボキシラート、アルコキシカルボニル、アリールオキシカルボニル、カルボキサミド、アルキルアミノ、アシルアミノ、アルコキシル、アシルオキシ、ヒドロキシアルキル、アルコキシアルキル、アミノアルキル、（アルキルアミノ）アルキル、チオ、アルキルチオ、チオアルキル、（アルキルチオ）アルキル、カルバモイル、尿素、チオ尿素、スルホニル、スルホナート、スルホンアミド、スルホニルアミノ、またはスルホニルオキシを表し、
R’はそれぞれ別々にアルキル、表面へのアルキルイデンテザー、または表面へのアシルテザーを表し、
Zはそれぞれ別々にCl、Br、またはIを表し、
nは約1500以下の整数である、
式で表される。
【００２２】
ある実施態様では、本願発明はガラス表面に共有結合させたポリ（4-ビニル-N-アルキルピリジニウム臭化物）またはポリ（メタクリルオイロキシドデシルピリジニウム臭化物）（MDPB）を含む。別の好ましい実施態様では、本願発明はガラス表面に共有結合させたN-アルキル化ポリ(4-ビニルピリジン)を含む。
【００２３】
いくつかの実施態様では、本願発明の表面上で死滅する生物は細菌である。ある実施態様では、死滅する細菌はグラム陽性細菌である。別の実施態様では、死滅する細菌はグラム陰性細菌である。
【００２４】
いくつかの実施態様では、本願発明は表面を殺菌する方法に関する。いくつかの実施態様では、殺菌する表面にはアミノ官能性が含まれる。いくつかの実施態様では、表面を殺菌する方法は、アミノ官能性を有する表面が、前記表面上に第４級アミン基を含むポリマーとの共有結合を形成するように誘導体化するステップを含む。
【００２５】
いくつかの実施態様では、殺菌する表面はアミノ官能性を有さず、前記表面上にSiO2ナノ粒子層を施し、水酸化反応でSi-OH基を形成させてから、アミノ化物質で処理してアミノ官能性を含む表面を形成させることによって、前記表面にアミノ官能性を付け加える。いくつかの実施態様では、アミノ化物質は3-アミノプロピルトリエトキシランである。
【００２６】
いくつかの実施態様では、本願発明はその表面上に共有結合させたポリマーを含む抗菌物品であって、当該物品において共有結合ポリマーが第４級アンモニウム基を含む、抗菌物品に関する。いくつかの実施態様では、抗菌物品は家庭用品である。いくつかの実施態
様では、前記抗菌物品は医療器具である。
【００２７】
A.  概要
概して、本願発明は任意の表面上における微生物の蓄積の防止であって、そのような蓄積がヒトまたは動物の健康に有害な作用を有する、微生物の蓄積の防止に関連する。特に、本願発明は、汚染に関与するヒトまたは動物の健康に影響する状況の予防に関連する。汚染イベントには、生物と表面の間の認識、生物の表面への付着、およびそれに続く生物の活動が関与する。本願明細書で理解されるとおり、バイオフィルムの形成は汚染の１種である。健康に影響を及ぼすバイオフィルムは、一般に感染性の微生物を含む。
【００２８】
健康に関連する環境では、汚染がバイオフィルムの形成の原因となることもある。バイオフィルムの形成は罹患部位の局所的汚染を生じ、侵襲的な局所感染症および全身感染症が引き起こされる可能性があると理解される。微生物は、１）宿主細胞に侵入または接触して直接細胞死を引き起こす、２）距離をおいて細胞を死滅させる内毒素または外毒素を放出するか、組織成分を分解する酵素を放出するか、または血管に損傷を与えて虚血性壊死を引き起こすことができる、３）侵入物に方向付けられているにもかかわらず、化膿、瘢痕、および過敏反応を含むさらなる組織損傷を引き起こすことがある宿主細胞の応答を引き起こす、という少なくとも3つの経路で組織を損傷させることがある。局所的か全身的かに関わらず、感染症は、微生物が宿主細胞に侵入し、組織を損傷させるかまたは宿主の防御機序を誘発するか、またはその両方が生じて、臨床的に確認可能な症状を引き起こすことである。一般的な局所症状には、疼痛、圧痛、膨潤、および機能の障害を含むことができる。一般的な全身症状には、発熱、倦怠感、および過動新血管作用を含むことができる。感染性物質が大量に血流に侵入すると、急速に致命的になることがある。
【００２９】
感染症の原因が周囲の物質を取り囲む体内のバイオフィルムである場合、それが天然に発生した物質であるか異物であるかにかかわらず、その感染症はその物質を除去しない限り制御することはできないことが多い。その物質が、乏血管性または虚血性組織のように自然に生じたものである場合、創面切除術とよばれるプロセスによって外科的に除去する。その物質が医療器具などの異物である場合、完全に取り出される。汚染物質を確実に最大限除去するために、組織の辺縁部を汚染物質とともに除去しなければならない場合もある。除去される物質が健康に必須である場合、同位置に同様の物品を代入する必要があろう。代入物は、その部位に残留する微生物のために特に感染しやすいだろう。
【００３０】
本願発明は、表面に共有結合させることができる両親媒性の化合物からなる抗菌表面に関する。いくつかの実施態様では、この表面は、細菌など、接触する空中の生物を除去するように作用する。好ましい実施態様では、その化合物は両親媒性ポリカチオンである。
【００３１】
B. 定義
便宜上、本願明細書、実施例および特許請求の範囲に用いられるいくつかの用語をここにまとめる。
【００３２】
本願明細書に記載の「生物学の」という用語は、任意の細菌、真菌、ウイルス、原虫、寄生虫、またはヒト若しくは非ヒト動物において疾患を引き起こす能力があるその他の感染性物質を意味する。
【００３３】
本願明細書に記載の「接触する」は、本願発明の化合物を表面に提供し、生物汚染物から保護する任意の方法を意味する。「接触する」には、スプレーする、湿潤させる、含浸する、浸漬する、塗布する、結合させる、もしくは付着させる、または本願発明の化合物を表面に提供するその他の方法を含んでよい。
【００３４】
「コーティング」は、任意の一時的、半透過性または透過性の層、被覆、または表面を意味する。コーティングは気体、蒸気、液体、ペースト、半流動体、または固体であってよい。さらにコーティングは液体状で塗布でき、ハードコーティング状に固化する。コーティングの例には、光沢剤、表面洗浄剤、コーキング剤、接着剤、仕上剤、塗装剤、ワックス、重合可能な組成物（フェノール樹脂、シリコーンポリマー、塩化ゴム、コールタールとエポキシの混合物、エポキシ樹脂、ポリアミド樹脂、ビニル樹脂、エラストマー、アクリル酸ポリマー、フルオロポリマー、ポリエステルおよびポリウレタン、ラテックスを含む）が含まれる。シリコーン樹脂、シリコーンポリマー（たとえばRTVポリマー）およびシリコーン熱硬化ゴムは、本願発明の使用に好適なコーティング剤で、たとえばEncyclopedia of Polymer Science and Engineering (1989) 15: 204 et seq.に説明されている。コーティングは融除可能または可溶性であってよく、そのため基質の溶解速度が、AF剤が表面に送達される速度を制御できる。コーティングはまた、非融除性コーティングであってもよく、AF剤を表面に送達するには拡散の原理に依存する。非融除性コーティングは、多孔性または非多孔性であってよい。ポリマー結合剤に自由に拡散するAF剤を含むコーティングは、「モノリシック」コーティングと呼ばれる。コーティングする表面に、たとえば膨潤または収縮などの柔軟性を提供するために、コーティングに弾性加工を施してもよい。
【００３５】
「構成要素」とは、ある器具と構造的に統合されているその器具の一部分である。構成要素は器具の表面に適用されているか、その器具の実体内に含まれているか、その器具の内部に保持されるか、または、その部分がその器具の構造の統合要素になるようなその他の任意の配置であってよい。たとえば、ペースメーカーの機械的な部分を取り囲んでいるシリコーン被覆は、ペースメーカーの構成要素である。構成要素は、器具の内腔であって、その内腔がその器具の機能全体に必須のある機能を果たしている内腔であってよい。組織拡張器の引き込み口の内腔は、組織拡張器の構成要素である。構成要素は、その器具の表面へ流体を送達させるために特異的に適合させた器具内の貯蔵部分（リザーバ）または分離した領域を意味することもある。埋込式薬物送達器具の中にある貯蔵部分は、その器具の構成要素である。
【００３６】
「送達システム」は、本願明細書に開示した防汚化合物を、バイオフィルムの形成を阻害する表面へ送達することができる、任意のシステムまたは器具または構成要素を意味する。代表的な送達システムには、十分な量のその物質が標的表面へ到達してバイオフィルムを阻害できるように、その物質のカプセル封入、製造物の実体内へのその物質の組み込み、好適な物質の基質または孔へのその物質の挿入を含んでよい。送達システムはコーティングを含んでいてもよい。送達システムは、表面への防汚化合物の送達に適合させた機械的な物質を含んでよい。送達システムを含むその他の機序は、関連の当業者に明らかであろう。
【００３７】
「包帯剤」は、病変部に適用する、もしくは感染を予防または処理するために用いられる、任意の包帯または被覆を意味する。例には、慢性創傷（褥瘡、静脈鬱滞潰瘍および火傷など）、または急性創傷用の創傷包帯、および細菌の侵入によるカテーテル性敗血症を減少させるための静脈内または鎖骨下カテーテルなどの経皮器具のための包帯が含まれる。たとえば、本願発明の組成物は、経皮穿刺部位に適用することもでき、または挿入部位に直接適用する接着性包帯の材料に組み込まれてもよい。
【００３８】
「有効な量」という文言は、定義された面積に付着する生物の数（細胞/mm2）を未処理表面に付着する数よりも有意に減少させることができる、本願明細書に開示された防汚化合物の量を意味する。特に好ましいのは、その表面に付着する生物の数を少なくとも1/2に減少させる量である。さらに好ましくは、その表面に付着する生物の数を少なくとも1/4に減少させる量であり、よりさらに好ましくは1/6に減少させる量である。本願明細書に開示された防汚化合物の有効な量は、バイオフィルムの形成を阻害し、定義された表面上での生物の成長を阻害すると考えられている。表面上の防汚化合物の効果に用いられる「阻害する」という用語には、そこに結合する生物の数を有意に減少させる任意の作用が含まれる。
【００３９】
「健康に関連する環境」という用語には、ヒトの健康の回復または維持に関与する活動が行われる環境すべてが含まれると理解される。健康に関連する環境は、ヒトの健康を直接的または間接的に回復させることを意図する活動が行われる、医療環境であってよい。手術室、医師のオフィス、病室、及び医療機器の工場はすべて医療環境の例である。その他の健康に関連する環境は、ヒトの健康を維持する活動が行われる産業活動が行われる場所または住居も含んでよい。このような活動には、食品加工、浄水、および公衆衛生が含まれる。
【００４０】
「埋込物（インプラント）」とは、ヒト体内に留置することを目的とする任意の物体で、生組織ではない。埋込物には、生組織が死滅するように加工した天然に由来する物体が含まれる。ある例では、骨移植片を加工して生細胞を除去し、その形状を宿主からの骨の内部成長のテンプレートとして利用するために維持することができる。別の例では、天然に存在するサンゴを加工してヒドロキシアパタイト調製物をつくり、いくつかの整形外科および歯科治療用に体に適用することができる。埋込物は人工の構成要素を含む物品でもあり得る。「埋込物」という用語は、ヒト体内に留置する目的の医療器具の範囲全体に適用することができる。
【００４１】
本願明細書に記載の「感染性微生物」または「感染性物質」という用語は、細菌（スタフィロコッカス属（たとえば黄色ブドウ球菌、スタフィロコッカス・エピダーミディス）（E. フェカリス）、シュードモナス属 （緑膿菌）、エシェリキア属 （E. コリ（大腸菌））、プロテウス属（P. ミラビリス）などのグラム陰性およびグラム陽性生物）、真菌（カンジダ・アルビカンスを含む）、ウイルス、および原生生物が原因または関与する疾患を意味する。
【００４２】
「医療器具」は、非天然に存在する物体であって、対象に挿入もしくは埋め込む、または対象の表面に適用する物体を意味する。医療器具は、通常ヒトの体内で認められない、金属、セラミック、ポリマー、ゲル、および流体を含む、さまざまな生体適合性物質から作られてよい。医療器具の製作に有用なポリマーの例には、シリコーン、ゴム、ラテックス、プラスチック、ポリ無水物、ポリエステル、ポリオルトエステル、ポリアミド、ポリアクリロニトリル、ポリウレタン、ポリエチレン、ポリテトラフルオロエチレン、ポリエチレンテトラフタル酸塩、およびポリファゼンなどのポリマーが含まれる。医療器具は、いくつかの種類の天然に存在する物質を使用して作製するか、または天然に存在する物質で処理してもよい。ある例では、処理したブタの心臓弁と人工物質を使った添付装置とをあわせて心臓弁を作ることができる。医療器具には、人工物質の任意の組み合わせであって、構成要素の特定の特徴のために選択された組み合わせが含まれる。たとえば、股関節インプラントは、体重を支える金属製シャフト、セラミック製人工関節、および構造物を周囲の骨に固定するためのポリマー粘着剤を含んでよい。埋込式器具とは、体外に構造物の一部がはみ出すことなく、体内に完全に埋め込むことを目的とするものである（たとえば心臓弁）。挿入式器具とは、体内に部分的に埋め込まれているが、体外に出すことを目的とする部分を有するものである。医療器具は、配置された場所に短期間、または長期間留置することを目的としてよい。たとえば股関節インプラントは、数十年間の使用が意図されている。反対に、組織拡張器は、数ヶ月しか必要でない場合もあり、その後は除去される。挿入式器具は埋込式器具よりも留置期間が短い傾向にあり、コロニー形成する可能性がある微生物との接触の機会がより多いというのがその理由の一部である。
【００４３】
「可溶性」という用語は、ほぐれるか、または溶解される能力を意味する。
【００４４】
「表面」または「（複数の）表面」という用語は、ガラス、プラスチック、金属、およびポリマーなどを含む任意の材料の任意の表面を意味することができる。コーティングした表面を含む、１種類以上の材料からつくられる表面であってもよい。
【００４５】
健康の意味合いを持つバイオフィルム形成には、医療環境に見いだされる表面および栄養、衛生、および疾患の予防といった健康に不可欠な機能に関与する産業または住居環境における表面を含む、健康に関連するすべての環境における表面を含んでよい。
【００４６】
医療環境において用いるために適合させた物品の表面は、オートクレーブ、殺生剤への曝露、照射、または酸化エチレン曝露などのガス中毒技術を用いて滅菌することができる。医療環境において見いだされる表面には、使い捨てまたは繰り返しの使用が意図されるさまざまな機器または器具の内面および外面を含む。例には、外科用メス、針、ハサミ、侵襲的外科手術または治療方または診断方法に用いられるその他の器具、人工血管、患者に流体を輸送もしくは除去するためのカテーテルおよびその他の器具、人工心臓、人工腎臓、整形外科用ピン、プレート、およびインプラントを含む埋込式医療器具、カテーテルおよびその他のチューブ（泌尿器科チューブおよび胆汁チューブ、気管内チューブ、末梢挿入式中心静脈カテーテル、透析カテーテル、長期トンネル中心静脈カテーテル、末梢静脈カテーテル、短期中心静脈カテーテル、動脈カテーテル、肺カテーテル、スワン-ガンツカテーテル、尿道カテーテル、腹膜カテーテルを含む）、尿器具（長期尿器具、組織結合尿器具、人工尿道括約筋、尿道拡張器）、シャント（心室シャント、動静脈シャントを含む）、人工器官（乳房インプラント、人工陰茎、人工血管、心臓弁、人工関節、人工喉頭、耳鼻科用インプラントを含む）、血管カテーテルポート、創傷排液管、水頭シャント、ペースメーカー、および埋込式徐細動器を含む機器などの医療用に適合した物品のスペクトラム全体が含まれる。その他の例は、当業者に容易に明らかであろう。
【００４７】
医療環境に見いだされる表面にはさらに、医療器具の部品、保健医療現場の人員が身につけるかまたは持ち運ぶ用具の部品の内面および外面も含まれる。このような表面には、医療用の手順用、または酸素の投与、ネブライザーに入った可溶性医薬品の投与、および麻酔剤の投与を含む、呼吸器官治療に用いられる医療器具、チューブ、および小型缶を調製するために用いられる、カウンタートップおよび備品も含まれる。さらに、手袋、エプロン、およびフェイスシールドなどの、医療現場における感染性生物に対する生物学的な遮蔽物としての目的を有する表面も含まれる。一般に生物学的な遮蔽物に用いられる材料は、ラテックス製かまたは非ラテックス製であってよい。ビニールは非ラテックス製の手術用手袋の材料として一般に用いられる。その他のこのような表面には、滅菌しないとされる医療用器具または歯科用器具のハンドルおよびケーブルを含むことができる。さらに、このような表面には、血液もしくは体液またはその他の危険性のある生体物質に通常遭遇する場所において見いだされるチューブおよびその他の器具の滅菌していない外部表面が含まれてよい。
【００４８】
液体と接触する表面は、特にバイオフィルムが形成しやすい。例として、加湿酸素を患者に送達するために用いる貯蔵容器およびチューブには、感染物質が生息するバイオフィルムがある可能性がある。歯科用給水装置にも、歯科に用いられる流水システムおよびエアロゾル化した水が持続的に汚染される貯水器があり、同様にその表面にバイオフィルムがある可能性がある。
【００４９】
スプレー、エアロゾル、およびネブライザーは、潜在的宿主または別の環境にバイオフィルムの断片を散布する効果が高い。バイオフィルムの断片が表面に接触しているスプレー、エアロゾル、またはネブライザーによって拡散する可能性がある表面上において、バイオフィルムの形成を予防することは、健康にとって特に重要であると理解される。
【００５０】
健康に関連するその他の表面には、浄水、貯水、および給水に関与する物品、ならびに食品加工に関与する物品の内面および外面が含まれる。健康に関連する表面にはさらに、栄養、衛生、または疾患予防の提供に関与する日用品の内面および外面を含むことができる。例には、家庭用の食品加工器具、育児用品、タンポンおよび便器が含まれる。
【００５１】
「グラム陽性細菌」という用語は当業に認識されている用語で、細胞壁の構造の一部としてペプチドグリカンとともにポリサッカリド、および／またはテイコ酸を有することによって特徴づけられ、グラム染色法で青紫色反応をすることによって特徴づけられる。代表的なグラム陽性細菌には、アクチノマイセス属、炭疽菌、ビフィドバクテリウム属、ボツリヌス菌、ウェルシュ菌、クロストリジウム属、破傷風菌、ジフテリア菌、コリネバクテリウム・ジェイケイウム、エンテロコッカス・フェカリス、エンテロコッカス・フェシウム、ブタ丹毒菌、ユーバクテリウム属、ガルドネレラ・バジナリス、ゲメラ・モルビロルム、乳酸菌属、マイコバクテリウム・アブセッサス、マイコバクテリウム・アビウム複合体、マイコバクテリウム・ケロネ、マイコバクテリウム・フォルトウイートウム、マイコバクテリウム・ヘモフィリウム、マイコバクテリウム・カンサシー、マイコバクテリウム・レプラ、マイコバクテリウム・マリナム、マイコバクテリウム・スクロフラセウム、マイコバクテリウム・スメグマチス、マイコバクテリウム・テレ、結核菌、マイコバクテリウム・ウルセランス、ノカルジア属、ペプトコッカス・ニガー、ペプトコッカス属、プロプリオニバクテリウム属、黄色ブドウ球菌、スタフィロコッカス・アウリキュラリス、スタフィロコッカス・キャピティス、スタフィロコッカス・コーニー、スタフィロコッカス・エピダーミディス、スタフィロコッカス・ヘモリティカス、スタフィロコッカス・ホミニス、スタフィロコッカス・ルグダネンシス、スタフィロコッカス・サッカロリティカス、スタフィロコッカス・サプロフィティカス、スタフィロコッカス・シュレイフェリ、スタフィロコッカス・シミランス、スタフィロコッカス・ワーネリ、スタフィロコッカス・キシロサス、ストレプトコッカス・アガラクティエ（B群レンサ球菌）、ストレプトコッカス・アンギノサス、ストレプトコッカス・ボビス、ストレプトコッカス・キャニス、ストレプトコッカス・エクイ、ストレプトコッカス・ミレリ、ストレプトコッカス・ミティオー、ストレプトコッカス・ミュータンス、肺炎レンサ球菌、ストレプトコッカス・ピオゲネス（A群レンサ球菌）、ストレプトコッカス・サリバリウス、ストレプトコッカス・サングイスが含まれる。
【００５２】
「グラム陰性細菌」という用語は当業に認識されている用語で、細菌の各細胞の周囲に二重膜が存在することによって特徴づけられる細菌である。代表的なグラム陰性細菌には、アシネトバクター・カルコアセチカス、アクチノバチルス・アクチノマイセテムコミタンス、エロモナス・ハイドロフィラ、アルカリゲネス・キシロソキシダンス、バクテロイデス、バクテロイデス・フラジリス、バルトネラ・バシリフォルミス、ボルデテラ属、ボレリア・ブルグドルフェリー、ブランハメラ・カタルハリス、ブルセラ属、カンピロバクター属、クラミジア・ニューモニエ、クラミジア・シッタシ、クラミジア・トラコマチス、クロモバクテリウム・ビオラセウム、シトロバクター属、エイケネラ・コローデンス、エンテロバクター・エロゲネス、大腸菌、フラボバクテリウム・メニンゴセプチカム、フソバクテリウム属、ヘモフィラス・インフルエンザ、ヘモフィラス属、ヘリコバクター・ピロリ、クレブシエラ属、レジオネラ属、レプトスピラ属、モラキセラ・カタルハリス、モルガネラ・モルガニイ、マイコプラズマ・ニューモニエ、ナイセリア・ゴノロエ、ナイセリア・メニンギティディス、パスツレラ・マルトシダ、プレジオモナス・シゲロイデス、プレボテラ属、プロテウス属、プロビデンシア・レトゲリ、緑膿菌、シュードモナス属、リケッチア・プロワツェキイ、リケッチア・リケッチイ、ロカリメア属、サルモネラ属、サルモネラ・タイフィ、セラチア・マーセセンス、シゲラ属、トレポネーマ・カラテウム、梅毒菌、トレポネーマ・パリドダム・エンデミカム、トレポネーマ・パーテヌエ、ベイロネラ属、コレラ菌、ビブリオ・バルニフィカス、エルシニア・エンテロコリティカ、ペスト菌が含まれる。
【００５３】
両親媒性分子または化合物は当業に認識される用語あって、分子または化合物の一端が極性であり、もう一端が無極性である分子または化合物である。
【００５４】
「極性」という用語は当業に認識されている。極性化合物は、非対称の電荷分布を有する物質を含有する。一般に、非極性物質は非極性分子を溶解し、極性物質は極性分子を溶解する。たとえば、極性物質の水はその他の極性物質を溶解する。両親媒性化合物は、水性溶媒に可溶である部分、および水性溶媒に不溶である部分を有する。
【００５５】
「リガンド」という用語は、レセプター部位に結合する化合物を意味する。
【００５６】
本願明細書に用いられる「ヘテロ原子」という用語は、炭素または水素以外の任意の元素である原子を意味する。好ましいヘテロ原子は、ホウ素、窒素、酸素、リン、硫黄およびセレンである。「電子吸引基」という用語は当業に認識されており、隣接する原子の価電子を置換基が引き付ける傾向であって、すなわち置換基が隣接する原子と比べて電気的に陰性であることを意味する。電子吸引能の程度は、ハメットシグマ（σ）定数によって定量化される。この公知の定数は、たとえばJ. March, Advanced Organic Chemistry, McGraw Hill Book Company, New York, (1977 edition) pp. 251-259など、多くの参考文献に記載されている。ハメット定数の値は、一般に、電子供与基の場合は負(NH2の場合はσ[P] = - 0.66)、電子吸引基の場合は正（ニトロ基の場合はσ[P] = 0.78）の値であって、ここでσ[P]はパラ置換を示す。例示的な電子吸引基には、ニトロ、アシル、ホルミル、スルホニル、トリフルオロメチル、シアノ、および塩化物などが含まれる。例示的な電子供与基には、アミノ、およびメトキシなどが含まれる。
【００５７】
「アルキル」という用語は、直鎖アルキル基、分岐鎖アルキル基、シクロアルキル（脂環式）基、アルキル置換シクロアルキル基、およびシクロアルキル置換アルキル基を含む、飽和脂肪酸基のラジカルを意味する。好ましい実施態様では、直鎖または分岐鎖アルキルは、骨格に30個以下の炭素原子を有し（たとえば直鎖の場合C1乃至C30、分岐鎖の場合C3乃至C30）、さらに好ましくは20個以下である。同様に、好ましいシクロアルキルには、その環構造に3乃至10個の炭素原子を有し、さらに好ましくはその環構造に5、6、または7個の炭素を有する。
【００５８】
特に炭素数に指定のない限り、本願明細書に用いられる「低級アルキル」という用語は上述のアルキル基であるが、1乃至10個の炭素原子を有し、さらに好ましくはその骨格構造に1乃至6個の炭素原子を有する。同様に、「低級アルケニル」および「低級アルキニル」は、同様の鎖長を有する。好ましいアルキル基は低級アルキルである。好ましい実施態様では、本願明細書にアルキルと示された置換基は低級アルキルである。
【００５９】
本願明細書に記載の「アラルキル」という用語は、アリール基（たとえば芳香族基またはヘテロ芳香族基）で置換されたアルキル基を意味する。
【００６０】
「アルケニル」および「アルキニル」は、長さおよび可能な置換について上述のアルキルと同様であるが、それぞれ少なくとも１つの二重結合または三重結合を含む、不飽和脂肪酸基を意味する。
【００６１】
本願明細書に記載の「アリール」という用語は、たとえばベンゼン、ピロール、フラン、チオフェン、イミダゾール、オキサゾール、チアゾール、トリアゾール、ピラゾール、ピリジン、ピラジン、ピリダジン、およびピリミジンなど、0乃至4個のヘテロ原子を含む5、6、および7員環単環芳香族基が含まれる。環構造にヘテロ原子を有するこれらのアリール基は、「アリールへテロ環」または「ヘテロ芳香族」とも呼ばれることがある。芳香族環は、たとえばハロゲン、アジド、アルキル、アラルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヒドロキシル、アルコキシル、アミノ、ニトロ、スルフヒドリル、イミノ、アミド、ホスホン酸塩、ホスフィン酸塩、カルボニル、カルボキシル、シリル、エーテル、アルキルチオ、スルホニル、スルホンアミド、ケトン、アルデヒド、エステル、ヘテロシクリル、芳香族基またはヘテロ芳香族基、-CF3、または-CNなどの上述の置換基で1箇所以上を置換されてよい。「アリール」という用語には、２つの隣接する環（この環は「融合環」である）において２つ以上の炭素を共有する２つ以上の環を有する複素環系であって、当該複素環系において少なくとも１つの環が芳香族で、たとえばもう１つの環がシクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキニル、アリール、および／またはヘテロシクリルであってよい、複素環系も含まれる。
【００６２】
オルト、メタ、パラという用語は、それぞれ、1,2-、1,3-、および1,4-２基置換ベンゼンに適用する。たとえば、1,2-ジメチルベンゼンおよびオルトジメチルベンゼンは同義語である。
【００６３】
「ヘテロシクリル」または「ヘテロシクリル基」という用語は、3乃至10員環構造を意味し、さらに好ましくは3乃至7員環を意味し、その環構造には1乃至4個のヘテロ原子が含まれる。ヘテロ環は複素環であってもよい。ヘテロシクリル基には、たとえば、チオフェン、チアントレン、フラン、ピラン、イソベンゾフラン、クロメン、キサンテン、フェノキサチイン、ピロール、イミダゾール、ピラゾール、イソチアゾール、イソキサゾール、ピリジン、ピラジン、ピリミジン、ピリダジン、インドリジン、イソインドール、インドール、インダゾール、プリン、キノリジン、イソキノリン、キノリン、フタラジン、ナフチリジン、キノキサリン、キナゾリン、シンノリン、プテリジン、カルバゾール、カルボリン、フェナントリジン、アクリジン、ピリミジン、フェナントロリン、フェナジン、フェナルサジン、フェノチアジン、フラザン、フェノキサジン、ピロリジン、オキソラン、チオラン、オキサゾール、ピペリジン、ピペラジン、モルホリン、ラクトン、アゼチジノンおよびピロリジノンなどのラクタム、スルタム、ならびにスルトンが含まれる。ヘテロシクリル環は、たとえばハロゲン、アルキル、アラルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヒドロキシル、アミノ、ニトロ、スルフヒドリル、イミノ、アミド、ホスホン酸塩、ホスフィン酸塩、カルボニル、カルボキシル、シリル、エーテル、アルキルチオ、スルホニル、ケトン、アルデヒド、エステル、ヘテロシクリル、芳香族またはヘテロ芳香族基、-CF3、または-CNなど、上述の置換基で1つ以上の位置を置換してもよい。
【００６４】
「複素環」または「複素環基」という用語には、たとえば「融合環」などの2つの隣接する環が2つ以上の炭素を共有する２つ以上の環（たとえばシクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキニル、アリールおよび／またはヘテロシクリル）を意味する。隣接していない原子で連結されている環は、「架橋」環という。複素環の各環は、たとえばハロゲン、アルキル、アラルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヒドロキシル、アミノ、ニトロ、スルフヒドリル、イミノ、アミド、ホスホン酸塩、ホスフィン酸塩、カルボニル、カルボキシル、シリル、エーテル、アルキルチオ、スルホニル、ケトン、アルデヒド、エステル、ヘテロシクリル、芳香族またはヘテロ芳香族基、-CF3、または-CNなど、上述の置換基で置換されてもよい。
【００６５】
本願明細書で用いられる「炭素環」という用語は、環の各原子が炭素である芳香族環または非芳香族環を意味する。
【００６６】
本願明細書に用いられる「ニトロ」という用語は-NO2を意味し、「ハロゲン」という用語は-F、-Cl、-Br、または-Iを意味し、「スルフヒドリル」という用語は-SHを意味し、
「ヒドロキシル」は-OHを意味し、および「スルホニル」という用語は-SO2-を意味する。
【００６７】
「アミン」および「アミノ」という用語は当業に認識されており、たとえば一般式
【化３】
2004532108.tif 000003
で表すことができる基であって、
当該一般式においてR9、R10および R’10はそれぞれ原子価の法則で許容される基を独立に表す基、
などの非置換アミンまたは置換アミンの両方を意味する。
【００６８】
「アシルアミノ」という用語は当業に認識されており、一般式
【化４】
2004532108.tif 000004
で表すことができる基であって、
当該一般式においてR9は上述の通りであって、R’11は水素、アルキル、アルケニル、または&#8209;(CH2)m-R8であって、ここでmおよびR8 は上述の通りである、
基を意味する。
【００６９】
「アミド」という用語はアミノ置換カルボニルとして当業に認識されており、一般式
【化５】
2004532108.tif 000005
で表すことができる基を含み、
当該一般式においてR9、R10は上述の通りである。アミドの好ましい実施態様は、不安定なこともあるイミドを含まないだろう。
【００７０】
「アルキルチオ」という用語は、上述のアルキル基であって、そこに結合する硫黄ラジカルを有するアルキル基を意味する。好ましい実施態様では、「アルキルチオ」基は-S-アルキル、-S-アルケニル、-S-アルキニル、および-S&#8209;(CH2)m-R8のうちの１つによって表され、ここでmおよびR8は上述の通りである。代表的なアルキルチオ基には、メチルチオ、およびエチルチオなどが含まれる。
【００７１】
「カルボニル」という用語は当業に認識されており、一般式
【化６】
2004532108.tif 000006
で表すことができる基であって、
当該一般式においてXは結合であるか、または酸素もしくは硫黄を表し、R11は水素、アルキル、アルケニル、&#8209;(CH2)m-R8または薬学的に許容される塩を表し、R’11は水素、アルキル、アルケニルまたは&#8209;(CH2)m-R8を表し、ここでmおよびR8は上述の通りである、
基が含まれる。Xが酸素であってR11 またはR’11が水素ではない場合、前記式は「エステル」を表す。Xが酸素であってR11が上述の通りである場合、前記基は本願明細書ではカルボキシ基を意味し、特にR11が水素である場合、前記式は「カルボン酸」を表す。Xが酸素であってR’11が水素である場合、前記式は「ギ酸塩」を表す。一般に、前記式の酸素原子を硫黄に置換すると、前記式は「チオカルボニル」基を表す。Xが硫黄であってR11およびR’11が水素でない場合、前記式は「チオールエステル」を表す。Xが硫黄であってR11が水素である場合、前記式は「チオールカルボン酸」を表す。Xが硫黄であってR’11が水素である場合、前記式は「チオールギ酸塩」を表す。それに対して、Xが結合であってR11が水素でない場合、前記式は「ケトン」基を表す。Xが結合であってR11が水素である場合、前記式は「アルデヒド」基を表す。
【００７２】
本願明細書で用いる「アルコキシル」または「アルコキシ」という用語は、上述の通り、アルキル基であって、そこに結合した酸素ラジカルを有するアルキル基を意味する。代表的なアルコキシル基にはメトキシ、エトキシ、プロピルオキシ、およびtert-ブトキシなどが含まれる。「エーテル」は、２つの炭化水素が酸素によって共有結合している。したがって、アルキルをエーテルにするアルキル置換基は、-O-アルキル、-O-アルケニル、-O-アルキニル、mおよびR8が上述の通りである-O-(CH2)m-R8の１つで表すことができるアルコキシルであるか、またはアルコキシに類似している。
【００７３】
「スルホン酸塩」という用語は当業に認識されており、一般式
【化７】
2004532108.tif 000007
で表すことができる基であって、
当該一般式においてR41は電子対、水素、アルキル、シクロアルキル、またはアリールである、
基が含まれる。
【００７４】
トリフリル、トシル、メシル、およびノナフリルという用語は当業に認識されており、それぞれトリフルオロメタンスルホニル、p-トルエンスルホニル、メタンスルホニル、およびノナフルオロブタンスルホニル基を意味する。トリフル酸エステル、トシル酸エステル、メシル酸塩エステル、およびノナフル酸塩エステルという用語は当業に認識されており、それぞれトリフルオロメタンスルホン酸エステル、p-トルエンスルホン酸エステル、メタンスルホン酸エステル、およびノナフルオロブタンスルホン酸エステル官能基および前記基を含む分子を意味する。
【００７５】
Me、Et、Ph、Tf、Nf、Ts、Msという略語は、それぞれ、メチル、エチル、フェニル、トリフルオロメタンスルホニル、ノナフルオロブタンスルホニル、p-トルエンスルホニル、およびメタンスルホニルを表す。当業の有機化学者が使用するさらに包括的な略語のリストは、Journal of Organic Chemistry各巻の第１号に記載されており、このリストは一般にStandard List of Abbreviationsという表題の表に記されている。前記リストに含まれる略語、および当業の有機化学者が使用するすべての略語は、引用によって本願明細書に援用する。
【００７６】
「硫酸塩」という用語は当業に認識されており、一般式
【化８】
2004532108.tif 000008
で表すことができる基であって、
当該一般式において、R41は上述の通りである、
基を含む。
【００７７】
「スルホニルアミノ」という用語は当業に認識されており、一般式
【化９】
2004532108.tif 000009
で表すことができる基を含む。
【００７８】
「スルファモイル」という用語は当業に認識されており、一般式
【化１０】
2004532108.tif 000010
で表すことができる基を含む。
【００７９】
本願明細書に記載の「スルホニル」という用語は、一般式
【化１１】
2004532108.tif 000011
で表すことができる基であって、
当該一般式においてR44は、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、またはヘテロアリールからなるグループから選択される、
基を意味する。
【００８０】
本願明細書に記載の「スルホキシド」という用語は、一般式
【化１２】
2004532108.tif 000012
で表すことができる基であって、当該一般式においてR44は、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アラルキル、またはアリールからなるグループから選択される基を意味する。
【００８１】
たとえば、アミノアルケニル、アミノアルキニル、アミドアルケニル、アミドアルキニル、イミノアルケニル、イミノアルキニル、チオアルケニル、チオアルキニル、カルボニル置換アルケニルまたはアルキニルを生成するために、アルケニル基およびアルキニル基に類似する置換を施すことができる。
【００８２】
本願明細書に記載の通り、たとえばアルキル、m、nなどの各表現の定義は、任意の構造において１回を超えて現れる場合、該構造内の他の場所にある場合にはその定義とは独立であることを意図する。
【００８３】
「置換」および「〜で置換された」には、このような置換が置換原子および置換基の許容された原子価に従っており、置換の結果たとえば転位、環化、除去などによって自然発生的に転換を起こさない安定な化合物が得られるという、暗黙の条件が含まれることを意図する。
【００８４】
本願明細書に記載の「置換された」という用語には、有機化合物のおいて許容される置換基すべてが含まれることを意図する。広範囲の局面では、許容される置換基には、有機化合物の非環式および環式、分岐または非分岐、炭素環式またはヘテロ環式、芳香族および非芳香族置換基が含まれる。具体的な置換基には、たとえば上述のものが含まれる。許容される置換基は、１つ以上の同一のまたは異なる適切な有機化合物であってよい。本願発明の目的のために、窒素などのヘテロ原子は、水素置換基、および／またはヘテロ原子の原子価を満たす本願明細書に記載の有機化合物の許容される任意の置換基を有してよい。本願発明は有機化合物の許容される置換基によってどのようにも制限されることを意図しない。
【００８５】
本願明細書に記載の「保護基」という用語は、潜在的に反応性がある官能基を望ましくない化学転換から保護する、一時的な置換基を意味する。このような保護基の例には、カルボン酸、アルコールのシリルエーテル、アルデヒドおよびケトンのアセタールおよびケタールが含まれる。保護基化学の分野は概説されている(Greene, T.W.; Wuts, P.G.M.Protective Groups in Organic Synthesis, 2nd ed.; Wiley:  New  York, 1991)。
【００８６】
意図される上述の化合物の等価物には、上述の化合物にそのほかの点で対応する、および上述の化合物の一般的な特性と同一の特性（たとえば鎮痛薬としての機能）を有する化合物であって、化合物のオピオイドレセプターへの結合の効率に悪影響を与えないような、置換基の１つ以上の簡単なバリエーションがある、化合物が含まれる。一般に、本願発明の化合物は、たとえば後述のような一般的な反応スキームに具体的に示される方法によって、またはそれを改変した方法によって、入手が容易な開始物質、試薬および従来の合成手順を用いて調製してもよい。これらの反応には、それ自体は知られているが本願明細書では言及しない変異体を使用することもできる。
【００８７】
本願発明の目的のために、化学元素はCAS version, Handbook of Chemistry and Physics, 67th Ed., 1986-87の内表紙に記載のPeriodic Table of the Elements（周期表）にしたがって同定する。
【００８８】
C.  化合物
本願発明のある局面は、共有結合した両親媒性化合物からなる抗菌表面に関する。いくつかの実施態様では、本願発明の表面は接触する空中の生物を除去するように作用する。いくつかの実施態様では、本願発明の表面は接触する水中の生物を除去するように作用する。いくつかの実施態様では、本願発明の表面はバイオフィルムの形成を阻害するように作用する。
【００８９】
いくつかの実施態様では、前記の共有結合した両親媒性の化合物は、アンモニウムイオンを含むポリマーである。好ましい実施態様では、前記ポリマーの分子量は少なくとも10,000g/モルであって、さらに好ましくは120,000g/モルであって、最も好ましくは150,000g/モルである。
【００９０】
いくつかの実施態様では、本願発明の表面はガラスである。いくつかの他の実施態様では、本願発明の表面はプラスチックである。ある実施態様では、本願発明の表面はアミノ含有ガラスである。
【００９１】
いくつかの実施態様では、前記表面に共有結合した化合物は式Iであって、
【化１３】
2004532108.tif 000013
（式I）
当該式において
Rはそれぞれ独立に水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、アシル、アリール、カルボン酸エステル、アルコキシカルボニル、アリールオキシカルボニル、カルボキサミド、アルキルアミノ、アシルアミノ、アルコキシル、アシルオキシ、ヒドロキシアルキル、アルコキシアルキル、アミノアルキル、（アルキルアミノ）アルキル、チオ、アルキルチオ、チオアルキル、（アルキルチオ）アルキル、カルバモイル、尿素、チオ尿素、スルホニル、スルホン酸エステル、スルホンアミド、スルホニルアミノ、またはスルホニルオキシを表し、
R’はそれぞれ独立にアルキル、表面へのアルキルイデンテザー、または表面へのアシルテザーを表し、
Zはそれぞれ独立にCl、Br、またはIを表し、
nは約1500以下の整数である、
式によって表される。
【００９２】
好ましい実施態様では、本願発明はガラス表面に共有結合したポリ（4-ビニル-N-アルキルピリジニウム臭化物）またはポリ（メタクリロイルオキシドデシルピリジニウム臭化物）（MDPB）を含む。別の好ましい実施態様では、本願発明はガラス表面に共有結合したN-アルキル化ポリ（4-ビニルピリジン）を含む。
【００９３】
いくつかの実施態様では、本願発明の表面で死滅する生物は細菌である。ある実施態様では、死滅する細菌はグラム陽性細菌である。別の実施態様では、死滅する細菌はグラム陰性細菌である。
【００９４】
反応性アミノ基を含有する表面の修飾
ある実施態様では、前記表面をグラフト共重合で修飾する。この場合（方法A）、前記表面は、NH2ガラススライドをアシル化剤でアシル化して二重結合を導入することによって調製する。ある実施態様では、前記アシル化剤は塩化アクリロイルである。この次に、たとえば4-ビニルピリジンなどの共重合剤で共重合する。ポリビニルピリジン、PVPなどの固定化ポリマーは、その表面に生黄色ブドウ球菌の懸濁液をスプレーすると、未処理のNH2ガラススライドの場合とほぼ同数の黄色ブドウ球菌が生存することが認められた。
【００９５】
前記表面を作るための最終ステップは、ガラスに結合させたポリマー鎖に陽性電荷を導入するステップである。たとえば、PVPピリジン環は、7つの直鎖臭化アルキル（プロピルからヘキサデシルまでの鎖長）によって、N-アルキル化されていてよい。この方法は、例１に例示する。この方法は、ほぼ直線状に表面に結合した直鎖ポリマーを生じる傾向がある。
【００９６】
得られたスライド表面を、その表面にスプレーした接触する黄色ブドウ球菌を死滅させる能力に関して検査した。図２に見られるとおり、プロピル化、ブチル化、ヘキシル化、およびオクチル化した固定PVP鎖は、生細菌細胞の数を顕著に減少させるのに有効であり、最も有効だったのはヘキシルPVPで94±4%減少させることができた（図１の右部分）。反対に、臭化デシル乃至ヘキサデシルによってN-アルキル化した固定PVP、および非アルキル化鎖は、完全に無効であった（図２）。
【００９７】
挙動パターンはアルキル化PVPスライドの外観と相関があることがある。非アルキル化、デシル、ドデシル、およびヘキサデシルPVP修飾スライドはすべて混濁したが（400nmの吸光度A400は約0.1）、オクチルPVP修飾スライドは混濁の程度がはるかに軽く（A400=0.03）、プロピル、ブチル、およびヘキシルPVP修飾スライドは透明（A400=0.002）だった。濁度は前記表面上に形成されたポリマーの凝集塊を反映し、そのような凝集塊は明らかに細菌細胞と相互作用ができない。非アルキル化固定化PVP鎖、および長いアルキル基で修飾した前記PVP鎖は、疎水性相互作用のために互いに付着しやすいが、反対に短いアルキル基で修飾した固定化PVP鎖の場合、このような相互作用は、正電荷ポリマーの静電気反発を克服するほど強くない。
【００９８】
ヘキシルPVP（本願明細書では方法Aによって調製されたものを意味する）を用いて、別のグラム陽性細菌であるS.エピダーミディスならびに２種類のグラム陽性細菌である大腸菌および緑膿菌に対する、この表面の殺菌効果を調べる。前二者は、NH2ガラススライド状にスプレーしたところ黄色ブドウ球菌（図１左部分）と同一のサイズのコロニーを形成したが、緑膿菌のコロニーはそれよりも大きいが区別できた。表１に見られるように（方法A）、ヘキシルPVPスライドにスプレーした後に３種類すべての細菌が形成したコロニーの数は、無修飾のNH2ガラスと比較して1/100に減少した。
【表１】
2004532108.tif 000014
【００９９】
別の実施態様では、前記表面は、前記表面をハロゲン化アルキル基を用いてアルキル化することによって調製する。その後、この反応性アルキル基をポリマーの結合に用いる。このポリマー鎖をさらにアルキル化して、陽電荷を増加させた。この方法で、前記表面に共有結合した分岐および環状ポリマーが主に得られる。
【０１００】
たとえば、NH2ガラススライドを1,4-ジブロモブタンでアルキル化して反応性ブロモブチル基を導入した。この反応性ブロモブチル基は後でPVPの結合に用いられる。結合したPVP鎖の陽電荷を増加させるために、この鎖をさらに臭化ヘキシル（方法Aで最適であることが認められた、図２参照）でN-アルキル化した。黄色ブドウ球菌細胞をスプレーし、空気乾燥して培養した後、得られたヘキシルPVPスライド（本願明細書では方法Bによって調製したものを意味する）は、基本的には図１の右側に示されたものと同様に見えた。NH2ガラススライドと比較して、沈着した黄色ブドウ球菌細胞の94±3%が死滅した（表１の１行目、最右列）。
【０１０１】
固定化ポリマーの分子量は、前記表面の抗菌特性に重要であることがわかった。たとえば、短いPVP鎖を用いて方法Bで調製したヘキシルPVPスライドであって、160,000g/モルのかわりに60,000g/モルのものでは、沈着した黄色ブドウ球菌細胞の62±8%しか死滅しなかった。
【０１０２】
残りの表１のデータを検討したところ、方法Bでは、S.エピダーミディス、緑膿菌、および大腸菌に対して、方法Aで得たスライド表面と同様に致死的なスライド表面を得たことが明らかである。
【０１０３】
殺菌物質の放出によって細菌を死滅させる前述の物質は、周囲の溶液に放出されるために、最終的には活性物質が枯渇する。本願発明の方法を用いて固定化した抗菌ポリマーがガラス表面から浸出するかどうかを検査するために、方法AおよびBで調製したヘキシルPVPスライドをポリスチレン製のシャーレにおき、黄色ブドウ球菌の水性懸濁液を、そのシャーレと非抗菌ポリスチレン上に同様にスプレーした。空気乾燥させて成長寒天下でインキュベートしたところ、両方のヘキシルPVPガラススライド上には数個（約3個／cm2）のコロニーしか成長しなかったが、その周囲のシャーレ上にははるかに多数のコロニー（60±10個／cm2）が成長したことが観察された。殺菌物質が放出されていれば典型的に見られるヘキシルPVPスライドの周囲の抑制ゾーンがなかったことから（23）、固定化された殺菌ポリマーヘキシルPVPがスライドから浸出していない、つまり、細菌はスライドの表面に接触した場合のみ死滅することが示唆される。
【０１０４】
空中の細菌を死滅させる能力の特異性を調べるために、黄色ブドウ球菌細胞の懸濁液を、金属、合成および天然ポリマー、およびセラミックを含むさまざまな一般的な物質の乾燥表面にスプレーした。すべての場合における生存コロニーの数を、NH2ガラス上の数と比較した。表２に見られるとおり、調査した物質のいずれも、スプレー後に生存する細菌細胞の量を有意に減少させることはなかった。
【表２】
2004532108.tif 000015
【０１０５】
活性アミノ基を含有しない表面の修飾
多様な物体を殺菌性にすることが望ましいと考えられることから、任意の物質に適用することが可能な表面の誘導体化アプローチが開発された。抗菌活性をそれ自体が示さない通常の商用合成ポリマー、つまり、ポリオレフィン、ポリアミド、およびポリエステルが、このアプローチをテストするために用いられた。高密度ポリエチレン（HDPE）製のスライドを最初の標的として選択した。このポリマーには、他の多くの物質と同様に、容易な化学修飾に好適な反応基がない。したがって、我々は、燃焼化学蒸着技術によって、極薄シリカ層でコーティングすることにし。Schinkinger, B., Petzold, R., Tiller, H.-J. & Grundmeier, G. Chemical structure and morphology of ultrathin combustion CVD layers on zinc coated steel. Appl. Surf. Sci. 179, 79-87 (2001)。これを実施するために、0.6%のテトラメチルシランおよび7:3のプロパン-ブタン（Pyrosil（登録商標））の圧縮混合物を収容するペン状トーチを使用した（図４ステップ1）。この混合物が空気中で燃焼すると、テトラメチルシランが酸化して2乃至5nmのSiO2ナノ粒子が形成され、炎があたる表面をその粒子で被覆する。Tiller, H. J., Goebel, R., Magnus, B., Garschke, A. & Musil, R. A new concept of metal-resin adhesion using an intermediate layer of silicon oxide (SiOx)-carbon. Thin Solid Films 169, 159-168 (1989)。得られた高密度で厚さが約100nmの、化学的にガラスに似たSiO2層（ポリシルオキサン）は、その後、原材料の性質には無関係に、均一な状態に容易に化学修飾することができる。Schinkinger, B., Petzold, R., Tiller, H.-J. & Grundmeier, G. Chemical structure and morphology of ultrathin combustion CVD layers on zinc coated steel. Appl. Surf. Sci. 179, 79-87 (2001).  Tiller, H. J., Goebel, R., Magnus, B., Garschke, A. & Musil, R. A new concept of metal-resin adhesion using an intermediate layer of silicon oxide (SiOx)-carbon. Thin Solid Films 169, 159-168 (1989).  Tiller, H.J., Kaiser, W.D., Kleinert, H. & Goebel, R. The Silicoater method improves bond strength and resistance to aging. Adhaesion 33, 27-31 (1989).  Tiller, H. J., Goebel, R. & Gutmann, N. Silicate coupling layer for metal to polymer adhesion improvement.  Physical-chemical fundamentals and technological importance. Makromol. Chem., Macromol. Symp. 50, 125-135 (1991)。
【０１０６】
HDPE表面の外観は、SiO2コーティングを施した後も変化しなかった。このようなSiO2層の架橋度はガラスの場合よりも低く、沈着プロセス後の環境から吸収した水によって水和することによって、たくさんのSi-OH基が形成する。Schinkinger, B., Petzold, R., Tiller, H.-J. & Grundmeier, G. Chemical structure and morphology of ultrathin combustion CVD layers on zinc coated steel. Appl. Surf. Sci. 179, 79-87 (2001)。無修飾のポリマーが非常に疎水性であるのと対照的に、コーティングされたHDPE表面は、このSi-OH基のために親水性であることが期待される。この差を定量化するために、表面上の水滴がなす接触角度を測定した。これは物質の親水性を決定する一般的な方法である。David, J. The idea of water repellency. Text. Inst. Ind. 4, 293-5 (1966)。これを実施するために、蒸留水0.1mLをHDPE表面においた。得られた水滴の核とその下の表面がなす角度は約120°と推定され、疎水性物質をしめした。同量の蒸留水をSiO2コーティングしたHDPEにのせた場合には、水は表面に広がり、接触角度は10°未満で、表面の親水性の性質を反映していた。独立に、HDPEスライド状のSiO2層は、X線光電子スペクトルでケイ素および酸素シグナルを検出し、その存在を確認した。
【０１０７】
次に、SiO2コーティングHDPEスライド表面に3-アミノプロピルトリエトキシシランを反応させて、その表面にアミノ基を導入した（図４ステップ２）。これはガラス表面のアミノ化の標準的な方法である。Bisse, E., Scholer, A. & Vonderschmitt, D.J. A new method for coupling glucose dehydrogenase to glass tubes activated with titanium tetrachloride. FEBS Lett. 138,  316-318 (1982)。その後、NH2官能化HDPEスライドを1,4-ジブロモブタンでアルキル化して、ブロモアルキル基を導入し（図４ステップ３）、1-ブロモヘキサンの存在下でPVPと反応させた（図４ステップ４）。使用した条件下では、PVP鎖のピリジン基は、表面に結合したブロモアルキルでは少ししかアルキル化されず（鎖１本あたりピリジン基は約1,500）、大半が1-ブロモヘキサンによってアルキル化されている。Tiller, J.C., Liao, C.-J., Lewis, K. & Klibanov, A.M. Designing surfaces that kill bacteria on contact. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.  98, 5981-5985 (2001)。ヘキシルPVP誘導体化ポリエチレンスライド上のピリジニウム基の数を決定するために、分光光度法で蛍光を滴定したところ、8.2±1.9nmol/cm2で、ヘキシルPVP修飾NH2ガラスで測定した場合と同様である。Tiller, J.C., Liao, C.-J., Lewis, K. & Klibanov, A.M. Designing surfaces that kill bacteria on contact. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.  98, 5981-5985 (2001)。
【０１０８】
前述のコーティング／誘導体化アプローチの一般性は、２種類の他の産業用ポリオレフィンである低密度ポリエチレン（LDPE）およびポリプロピレン（PP）、ならびにポリアミドナイロンおよびポリエステルポリ（エチレンテレフタラート）（PET）を修飾して確認した。図４に示すとおり、これらすべての合成ポリマーを誘導体化することに成功し、ピリジニウム基の表面密度は8.5±1.8 (LDPE)、7.2±2.1 (PP)、8.0±1.1 (ナイロン)、および7.5±0.9(PET) nmol/cm2で、HDPEと同様の値を示した。次いで、すべてのヘキシルPVP誘導体化スライドを、接触する空中の細菌を死滅させる能力に関して、HDPEから検査し始めた。
【０１０９】
空中の細菌の自然な沈着をシミュレートするために、偏在的な病原であるグラム陽性細菌の黄色ブドウ球菌を蒸留水に懸濁した懸濁液をスライド表面にスプレーし、そのスライドを乾燥させた。Xiong, Y., Yeaman, M.R. & Bayer, A.S. Linezolid: A new antibiotic. Drugs Today 36, 529-539 (2000)。このスライドを既述の通り栄養寒天下で一晩インキュベートし、生存細菌細胞の数をコロニー計数によって計数した。Tiller, J.C., Liao, C.-J., Lewis, K. & Klibanov, A.M. Designing surfaces that kill bacteria on contact. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.  98, 5981-5985 (2001)。図5a左に見られるとおり、多数の容易に区別できる細菌コロニーを無修飾HDPEスライド上に成長させた。SiO2コーティングまたはNH2官能化HDPEスライド上に成長させたコロニーの数（図４）は基本的に同数で、この修飾は黄色ブドウ球菌には毒性がないことを示している。反対に、ヘキシルPVP修飾HDPEスライド上にスプレーした場合、沈着細菌細胞の96±3%が非生存であった（図5a右、および表３）。
【０１１０】
【表３】
2004532108.tif 000016
【０１１１】
細菌の蒸留水懸濁液（黄色ブドウ球菌は106細胞/mL、大腸菌は105細胞/mL）を、ヘキシルPVP修飾ポリマースライド上にスプレーし、そのスライドを2分間空気乾燥させて、細菌成長培養液に入った0.7%寒天下で一晩インキュベートした。その後、コロニーを計数した。同一の方法で計数した対応する無修飾ポリマースライドの生細胞の数（すなわち死滅した細菌が0%）を標準として用いた。使用したポリマー物質の略称は以下の通りである。LDPE-低密度ポリエチレン、HDPE-高密度ポリエチレン、PP-ポリプロピレン、およびPET-ポリ（エチレンテレフタラート）。すべての実験は少なくとも２回ずつ行われ、得られた誤差は標準偏差を示す。
【０１１２】
ヘキシルPVPで誘導体化したLDPE、PP、ナイロンおよびPETを空中の黄色ブドウ球菌を死滅させる能力について同様にテストした。表３に見られるように、すべての場合において、形成した細菌コロニーの数は、対応する無修飾スライド上に成長させたものと比較して1/10乃至1/30に減少した。
【０１１３】
次に、ヘキシルPVP誘導体化表面が代表的なグラム陰性細菌である大腸菌を死滅させる効率についてテストした。図5b左に見られるとおり、HDPEスライドにスプレーして成長させた大腸菌コロニーの多くは、同条件下で成長させた黄色ブドウ球菌よりも低密度であるものの、区別可能である。ヘキシルPVPで誘導体化した表面では、その数は97±3%減少した（図5b右および表３）。表３の最終行に記載されている残りのデータを検討したところ、LDPE、PP、ナイロンおよびPETスライドをヘキシルPVP修飾すると、空中にいる状態から沈着した後の生存大腸菌細胞が、対応する無修飾スライドと比較して1/20乃至1/50に同様に減少した。
【０１１４】
本願発明の方法を用いて固定化したヘキシルPVP鎖がスライド表面から浸出するか（および沈着した細菌をそのときだけ死滅させる可能性があるか）どうかをテストするために、修飾HDPEスライドをポリスチレンシャーレにおいて、黄色ブドウ球菌細胞の水性懸濁液をそのスライドとポリスチレン（非抗菌）表面にスプレーした。空気乾燥して成長寒天下でインキュベートしたところ、ヘキシルPVP修飾HDPEスライド上には少数のコロニーしか成長しなかった（4±2個/cm2）のに対し、スライド周囲のシャーレ表面にははるかに多数のコロニーが成長しており（85±5個/cm2）、スライドの直近も同様であった。殺菌物質の放出の特徴であるヘキシルPVPスライド周囲の抑制ゾーンがないことから、このスライドから固定化ポリカチオンは浸出しておらず、空中の細菌はスライド表面に接触して死滅することが示されている。Kawabata, N. & Nishiguchi, M. Antibacterial activity of soluble pyridinium-type polymers. Appl. Environ. Microbiol. 54, 2532-2535 (1988)。
【０１１５】
別の重要な疑問は、ヘキシルPVP誘導体化スライドが水中の細菌も死滅させることができるかどうかであった。流れる水溶液中の状況を実験的にシミュレートするために、ポリマースライドを細菌のPBS懸濁液、pH7.0中に垂直に配置し、得られたシステムを37℃で緩やかに撹拌した。2時間インキュベーションした後、このスライドを滅菌バッファで洗浄して付着しなかった細菌を除去し、上述の条件下で約1時間、滅菌PBS中でインキュベートし、一時的に付着した細菌を不可逆的に分離または付着させた。.  Wiencek, K.M. & Fletcher, M. Bacterial adhesion to hydroxyl- and methyl-terminated alkanethiol self-assembled monolayers. J. Bacteriol. 177, 1959-1966 (1995)。このスライドをPBSで洗浄後、ただちに固体成長寒天層で覆い、37℃で一晩インキュベートした。このように、本当に結合した細菌細胞すべてはスライド表面に捕捉されており、生存し続けている細胞を増殖させてコロニーを形成させることができる。
【０１１６】
図6a左に見られるとおり、HDPEスライドに付着させた黄色ブドウ球菌細胞は容易に区別できるコロニーを数多く形成する。SiO2-またはNH2-修飾HDPEスライドのいずれについても、付着後に成長した細胞コロニーの数に顕著な減少が認められることはなかった。しかし、図6a右に見られるとおり、ヘキシルPVP修飾HDPEスライド上に成長した黄色ブドウ球菌コロニーの数は、98±1%減少した（表４も参照）。
【０１１７】
【表４】
2004532108.tif 000017
【０１１８】
細菌のPBS懸濁液、pH7.0（黄色ブドウ球菌は2x106細胞/mL、および大腸菌は4x106細胞/mL）を、37℃で2時間撹拌下でヘキシルPVP修飾ポリマー表面に付着させた。このスライドを滅菌PBS、pH7.0で洗浄し、滅菌PBS中で1時間37℃で振とうし、再びPBSで洗浄して、細菌成長培養液の1.5%寒天下で一晩インキュベートして、コロニーを計数した。N.d.は「測定できず」を意味する。これは、付着した細菌細胞は、対象スライド上で成長はするが区別できるコロニーを形成しないためである。その他の条件については、表３の脚注を参照されたい。
【０１１９】
ヘキシルPVP誘導体化LDPE、PP、ナイロン、およびPETも、接触する水中の細菌を死滅させることができることが、さらに証明された。表４のデータは、誘導体化した場合（図４）、付着した生存黄色ブドウ球菌細胞の数がすべてのポリマースライド上で97乃至99%減少していることを示す。同様に、修飾ポリマースライドは、水中の大腸菌に対しても有効であることがわかった。図6b左に見られるとおり、水性懸濁液から無修飾HDPEに付着した大腸菌は、成長寒天の被覆下で多数の区別できるコロニーを成長させている。LDPE、ナイロン、およびPET上のコロニーもの外観は同様であったが、PP上では区別できるコロニーはなかった。HDPEをヘキシルPVPで誘導体化した場合、生存する付着大腸菌細胞の数は97±2%に減少した（図6b右、表４）。その他の修飾ポリマーも、生存する付着大腸菌細胞の数が対応する無修飾スライドと比較して劇的な減少を示し、LDPE、PETおよびナイロンで観察された死滅率は98乃至99%であった（表４、最終行）。
【０１２０】
水中細菌に対するヘキシルPVP修飾スライドの殺菌特性を決定するための実験条件が空中の場合と異なったため、我々は、スライドから培養液中へのポリカチオンの放出を再度テストした。これを実施するために、ヘキシルPVP修飾HDPEスライドを滅菌PBS中に入れて37℃で2時間振とうしながらインキュベートし、取り出してから、残りの溶液へ黄色ブドウ球菌細胞を加えた。得られた懸濁液を再度37℃で2時間振とうし、生存する細菌細胞の数を、それを成長寒天上に広げて計数し、その後、一晩37℃でインキュベートした。観察された細胞コロニーの数は（42±2）104個/mLで、対照における数［（48±7）104個/mL］と一致した。したがって、細菌付着実験中にヘキシルPVP修飾HDPEスライドから抗菌物質の明らかな放出はなく、確かに水中の細菌は誘導体化した表面に接触させて死滅するに違いない。
【０１２１】
細菌の攻撃のメカニズム
本願明細書に記載のつなぎとめた両親媒性ポリカチオンおよび可溶性カチオン性抗菌物質は、おそらく同様の細菌攻撃のメカニズムを共有している。ポリミキシンBおよび動物の抗菌性カチオン性ペプチドなどのポリカチオンは、リポポリサッカリドネットワークの陰性電荷表面をともにつかんでいる二価のカチオンを置き換えて、緑膿菌および大腸菌などのグラム陰性細菌の外膜を破壊する(Vaara, M. (1992) Microbiol Rev. 56, 395-411)。これは、それだけでも致死的な結果を生じるのに十分であるかもしれない。つなぎとめられたポリマーのカチオン基は、外膜の透過障壁を破壊した後、さらに内膜まで透過して、漏れを生じる可能性もある。このような「自己促進した透過」とそれに続く内膜の損傷は、ポリミキシンについて記述されている。グラム陽性細菌である黄色ブドウ球菌およびS.エピダーミディスに対して固定化したポリカチオンが作用するには、おそらく、カチオン基が原形質膜に到達するために薄い細胞膜を透過する必要がある。塩化ベンズアルコニウムまたはビグアニジンクロレキシジンなどの両親媒性カチオン性防腐剤のグラム陽性細菌に対する殺菌作用は、主に原形質膜の破壊による( Denton, G.W. (2001) in Disinfection, Sterilization, and Preservation, ed. Block, S.S.(Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia))。黄色ブドウ球菌の細胞壁の厚さは約30nmである(Friedrich, C.L., Moyles, D., Beveridge, T.J. & Hancock, R.E. (2000) Antimicrob. Agents Chemother. 44, 2086-2092.)。なぜなら、N-ヘキシル化PVP（方法A）の推定平均長さは19nmだが、これよりも明らかに短いものおよび長いものもあり、長いものが細胞壁を透過することができるからである。
【０１２２】
医学的応用
このような表面の修飾は、数多くの他の物質にも容易に行うことができる。簡単な定期的な洗浄によって、死んで沈着した細胞が取り除かれ、このような表面を回復できるだろう。
【０１２３】
体外から体内に配置したいずれの物質も、細菌による生物学的な汚染、およびそれに続くバイオフィルムの形成が生じやすい。したがって、本願発明による化合物は、初めから微生物による汚染からこのような物質を防御することができる。さらに、このような技術によって、汚染に抵抗性がある天然および合成の物質であって、特にすでに感染を受けている物質、または感染すると特に壊滅的な影響を受ける可能性がある解剖学的な部位におくことを目的とする物質との交換に適している物質を作るために用いることもできる。
【０１２４】
天然に由来する加工物質は、一般に、患者自身の組織を内殖するための構造を提供するために体内に配置される。例には、鉱質除去した骨材料、およびヒドロキシアパタイトが含まれる。このような材料は、患者の組織に完全に浸透するかまたは置換されて、その間、外因性物質が患部において望ましい形状または構造的なサポートを維持することになっている。これらの物質自体は非生体および無血管である。これらの物質に微生物がコロニー形成してバイオフィルムを形成すると、それらの除去が必要になることがある。その物質を取り出すと、維持されている形状または構造が破壊され、組織による成長の進展が無駄になる。本願発明の化合物をこれらの物質に適用すると、バイオフィルム形成およびその影響への抵抗性を増強することができる。
【０１２５】
いくつかの天然に由来する加工物質は、当業者によって、本願発明の化合物の適用または取り込みに特に好適になるように決定されるだろう。ある物質は、液浸およびコーティングを含む様々な方法で本願発明において請求する化合物と接触させることができる。その物質に隙間がある場合には、AF化合物は液体またはゲルとしてそこに入ることができる。繊維性の調製物は、その繊維を前記化合物でコーティングすることもできる。ヒドロキシアパタイトの再構築ブロックなどの固体状の物質は、さらなる保護のために前記化合物のコーティング剤で塗装することができる。このような適用の一時的な方法は、これらの物質に適切である。なぜなら、体内には一時的にしか存在せず、再吸収も置換もされないためである。
【０１２６】
人工物質のみ、または天然由来物質との混合物を使用した埋込式医療器具は、表面コーティングかまたは混入によって化合物で処理することができる。金属は、その生物学的な特性を維持しながら、表面コーティング剤で処理することが好適であると考えられる。本願発明のいくつかの実施態様では、金属は塗料か、または本願発明の化合物を混入させたポリマーまたはセラミックスの接着層で処理してよい。この方法で処理したいくつかの実施態様は、たとえばピン、ネジ、プレート、または人工関節の部品など、整形外科的な用途に好適であるかもしれない。生物学的な用途の金属の表面の処理方法は、関連する業界に公知である。金属以外のその他の物質は、医学的用途が必要とするような本願発明に従った化合物の表面コーティング剤で処理することができる。
【０１２７】
埋込式器具は、本願発明の化合物の混入に好適な物質を含んでよい。成分に本願発明の化合物が混入している実施態様には、ポリマー、セラミック、およびその他の物質が含まれる。人工物質からつくられる物質は、体内に配置されると吸収されるようにすることもできる。このような物質は、生体吸収性物質と呼ばれる。たとえば、ポリグリコール酸ポリマーは、縫合糸および整形外科用器具をつくるために用いることができる。当業者は、物質を医療用の用途の成型物をつくるために用いられるポリマーに混入する技術に精通しているであろう。AF剤は、付着剤、セメント、もしくは接着剤か、または体内の構造物の固定もしくは体構造への埋込物の接着に用いられるその他の物質に混入することもできる。例には、体内に整形外科用または歯科用人工器官を付着するために使用するポリメチルメタクリル酸エステル、およびその関連化合物が含まれる。本願発明の化合物があると、付着剤、セメント、または接着剤と接触する構造物へのバイオフィルムの形成を減少させることができる。代替的には、本願発明の化合物は、成型物をコーティングするか、または成型物に浸透させることができる。このような組成物では、前記成型物は、化合物またはその機能的部分を周囲環境に拡散させ、それによって器具の汚染を防止することができる。微小カプセルを有する化合物をその物質に埋め込むこともできる。化合物を混入した物質は、その一部を後述する広範囲の医療器具の製造に応用することができる。その他の例は、実施者または当業者に容易に理解されるであろう。
【０１２８】
ある実施態様では、本願発明の化合物は、生命維持に必要な機能を代替または回復するために永久に所定の位置に放置されることを意図するいくつかの医療器具に適用または組み込まれてよい。ある例では、脳室心房シャントまたは脳室腹腔シャントは、正常な排出路が障害された患者の脳において脳髄液の集合を防止するために講じられる。シャントが機能する限り、脳内への液の蓄積を防止し、正常な脳の機能を継続させることができる。シャントが機能を停止すると、液が蓄積して脳を圧迫し、場合によっては生死に関わることがある。シャントが感染すると、脳の中心部分に感染が侵入し、これもまた生死に関わる合併症となる。このシャントは一般にはシリコーンエラストマーまたは別のポリマーを製作の一部分として含む。シリコーンは、本願発明に従った化合物と組み合わせるのに特に好適であると理解されている。
【０１２９】
生命の維持に重要な意味を持つもう一つのシャントは透析用シャントで、これは前腕の動脈と静脈を連結するポリマー管であって、透析用装置によって血流を洗浄できる手段を腎不全患者に提供する。これは高流量の導管であるにもかかわらず、バイオフィルムの形成とそれに続く感染が生じやすい。シャントが感染すると、除去および交換が必要になる。透析は一生続くプロセスであり、シャントを適用することができる部位の数は限られているため、シャントの除去の際に感染性の合併症を避けることが望ましい。本願発明の化合物の埋込またはシャント材料とのその他の接触には、この望ましい効果がある。
【０１３０】
人工物質を含む心臓弁は、危険な人工弁心内膜炎の合併を生じやすいと理解されている。一度発症すると、死亡率は70%にまで達する。この症状の発症にはバイオフィルムが完全に関与している。現在、確立した汚染に対する唯一の治療法は、抗菌剤の大量投与療法および器具の外科的除去である。汚染された弁はただちに置換しなければならない。なぜなら心臓が機能しなくなるからである。最近汚染された領域に新しい弁を挿入するため、置換した弁も人工弁心内膜炎を罹患する。本願発明の化合物からなる人工心臓弁は、人工弁心内膜症の発症および再発を減少すると考えられる。本願発明の化合物は心臓弁の合成部分または天然由来部分に適用することができる。
【０１３１】
ペースメーカーおよび埋込式人工徐細動器は一般に、他の合成物質と組合わせた金属部分を含む。シリコーンなどのポリマー物質でコーティングしてある場合もあるこれらの機器は、典型的に、胸郭内または血管内までのびたワイヤーまたはその他の電気機器を用いて、皮下または筋肉内に埋め込む。この器具に微生物がコロニーを形成して感染した場合、それを除去しなければならない。新しい器具は異なる位置に置換することができるが、体内の適切な埋込部位は限られた数しかない。本願発明の化合物を含む器具は、汚染および感染を阻害するか、またはそのリスクを実質的に減少させると考えられる。
【０１３２】
薬理学的な物質を体内に送り込むために一時的または永久に体内に埋め込む器具は、金属部分を他の合成物質と組み合わせて含むことができる。このような器具は薬物注入ポンプと呼ばれ、完全に埋め込むかまたは部分的に埋め込むことができる。この機器はポリマー物質で部分的または完全に覆われていてよく、導管または管として他のポリマーが含まれていてよい。本願発明のAF剤をこれらの器具または器具自体に用いられる物質に課したコーティング物質に混入すると、その導管または管は汚染および感染を阻害すると考えられる。
【０１３３】
同等に生命の維持に必要なのが、閉塞した動脈をバイパスするかまたは損傷した動脈を置換することを目的とした、各種の人工血管およびステントである。テフロン、ダクロン、ゴアテックス（登録商標）、発泡ポリテトラフルオロエチレン（e-PTFE）、および関連物質からつくられた人工血管は、体内の任意の腫瘍血管に使用するために入手可能である。たとえば一般に、人工血管を脚部の血管のバイパス、および損傷した大動脈の置換に用いられる。人工血管は、バイパスまたは置換を施す領域の上流または下流にある正常な血管の端部または側部に縫いつけることによって所定の位置に挿入する。そのため、血液は正常領域から人工血管へ流れてその他の正常血管へ輸送される。人工血管素材で覆った金属フレームを含むステントも、損傷した血管を修復するために血管内に適用することができる。
【０１３４】
人工血管を正常血管に固定するために使用し、血管またはその他の構造を縫合するための縫合物質も、感染を隠し持っていることがある。このような目的に使用される縫合糸は一般に、プロレン、ナイロン、またはその他の単繊維状非吸収性物質でつくられている。縫合糸から始まる感染症は、人工血管に広がる可能性もある。本願発明の化合物を含む縫合物質は、感染に対する高い抵抗性を有するだろう。
【０１３５】
手術の一般的な原則として、異物が感染した場合、感染を制御できるようにその異物を除去する必要がある可能性が高い。たとえば、縫合糸が感染する場合、感染を制御できるように外科的に除去する必要があると考えられる。いかなる施術部位も創傷感染を生じやすい。創傷感染は組織の深部にまで浸透し、手術の一部として用いられた外来性物質を巻き込むこともある。たとえば、ヘルニアは一般に、障害部分にメッシュと呼ばれるプラスチック製のスクリーニング物質を縫合して修復する。メッシュを配置した部分に広がる創傷感染は、メッシュそのものも巻き込み、そのメッシュを除去しなければならない。本願発明の化合物を含む手術用メッシュは、感染に対する高い抵抗性を有するだろう。手術用メッシュはゴアテックス（登録商標）、テフロン、ナイロン、およびマーレックス（登録商標）などの物質からつくられる。手術用メッシュは、深い創傷を閉じるため、または体腔の包囲を強化するために用いられる。感染したメッシュを除去すると、修復できない障害が残り、生命を脅かす結果となる。このような物質の感染の回避は、手術において最も重要である。メッシュおよび関連物質に使用された物質は、本願発明の請求する化合物を含むように作ることができる。
【０１３６】
身体部分に対する構造的な安定性を回復することを目的とするいくつかの埋込式機器は、本願発明の化合物で有利に処理することができる。例をいくつか後述し、その他は当業者が容易に特定できるであろう。骨または関節または歯牙を置換するために用いられる埋込式器具は、解剖学的な部位にある正常構造の人工器官または代替物として働く。金属およびセラミックは一般に整形外科用および歯科用人工器官として用いられる。インプラントはポリメチルメタクリル酸エステルなどのセメントで所定の位置に固定してよい。人工関節の表面はシリコーンまたはテフロンなどのポリマーで作ることができる。手指、足指、または手首用の人工関節全体は、ポリマーで作ることができる。
【０１３７】
本願発明の化合物を含む医療用人工器官は、感染およびそれに続く局所感染を減少させ、局所組織の破壊を伴う埋込物の除去の必要を未然に防ぐかまたは減少することが期待されるだろう。特に骨および靱帯などの局所組織を破壊すると、組織床が代替人工器官を支持するのに適さなくなる可能性がある。さらに、周囲の組織に汚染微生物が存在すると、代替人工器官の再汚染が容易になる可能性がある。構造的な人工器官の汚染および感染の繰り返しによる影響は深刻である。人工器官がない領域の修復のために大規模な再建手術が必要になることもあり、その場合遊離骨移植または関節固定術などが含まれる可能性もある。さらに、これらの二次的な再建作業によって感染性の合併症が生じないという保証はできない。万一、四肢のいずれかの切断術をした場合、最大の障害は、構造的な人工器官の汚染および感染による転帰である。
【０１３８】
いくつかの埋込式器具は、美容用または再構築用に体輪郭を回復または向上することを意図する。このような器具の公知の例は乳房用インプラントで、ゲルまたは液体が入ったシリコーンエラストマーでできた袋状物である。永久化粧用または再構築用を目的とするそのほかのポリマー性インプラントもある。固体状シリコーンブロックまたはシートを輪郭の欠陥のために挿入することもできる。その他の天然に存在するまたは合成の生体材料は、同様の用途用に入手できる。頭蓋顔面の外科的再構築には、元来の骨輪郭の再構築に用いられる技術に加えて、重度に変形した顔輪郭を回復するための埋込式器具を要してもよい。これらの機器および当業に公知のその他の関連する器具は、硫酸エステルAF剤でコーティングまたは含浸し、汚染、感染、およびそれに続く除去のリスクを減少させるのに好適である。
【０１３９】
組織拡張器は食塩水を徐々に充填するのに適応したシリコーンエラストマーでできた袋で、この充填プロセスによってそれを覆う組織を引き延ばし、他の再構築の用途に用いることができる大きな面積の組織を生じる。組織拡張器はたとえば、乳房切除術後に乳房再構築の1ステップとして行われ、胸壁の皮膚および筋肉を拡張するために用いることができる。組織拡張器はまた、火傷患者の著しい皮膚損失領域を再構築するために用いることもできる。組織拡張器は通常、一時的な使用を目的とする。被覆組織は、一度十分に拡張すれば、伸びて被覆しようとする障害部分を被覆する。拡張した組織を置き換える前に組織拡張器をはずすと、時間をかけて得られた拡張部分がすべて失われ、組織は拡張前の状態にほぼ戻ってしまう。組織拡張器をはずす時期が早すぎる場合に最も多い理由が、感染である。この器具は食塩水で何回も膨張させなければならず、遠隔の充填器具に経皮的に導入されて拡張器と連結している。この器具の細菌汚染は、通常、経皮膨張プロセスから生じると考えられる。一度、汚染が確立してバイオフィルムが形成されると、局所感染が生じやすい。感染を制御するために、再構築作業を中止して拡張器を取り外さなければならない。通常、新しい組織拡張器の患部への再挿入は、何ヶ月も遅延させることが推奨される。これらの器具に用いられるシリコーンエラストマーは、硫酸エステルAF剤との混合が特に好適である。これらの物品の製造にこの硫酸エステルAF剤を使用すれば、細菌汚染、バイオフィルムの形成、およびそれに続く局所感染の発生を減少することができると考えられる。
【０１４０】
挿入式器具には、体に適用するか、または自然もしくは人工の侵入部位から体内に部分的に挿入される合成物質からつくられた物質が含まれる。体に適用する物品の例には、コンタクトレンズおよび瘻孔用器具が含まれる。人工喉頭は挿入式器具として理解される。この器具は気道にあり、部分的に体外に露出していて、部分的に周囲の組織に固定されている。気管内または器官チューブ、胃瘻チューブ、またはカテーテルは、一部が体内にあって一部が体外に露出している挿入式器具の例である。気管内チューブは既存の自然な開口部を通す。気管チューブは人工的につくった開口部を通す。このような状況のいずれかにおいて、器具上にバイオフィルムが形成されると、より外部の解剖学的部位からより内部の解剖学的部位にむかって器具に沿って微生物が侵入する。さらに内部の解剖学的部位に向かって微生物が侵入すると、一般に局所および全身的な感染症を引き起こす。
【０１４１】
たとえば、ソフトコンタクトレンズ上へのバイオフィルムの形成は、コンタクトレンズ関連の隔膜感染症の危険因子と理解されている。目そのものがバイオフィルムの生成による感染症になりやすい。コンタクトレンズそのものおよびコンタクトレンズケースに抗菌物質を混入すると、バイオフィルムの形成を減少させ、感染のリスクを減少させることができる。硫酸エステルAF剤を定期的に点眼する眼科用製剤に混入することもできる。
【０１４２】
別の例では、バイオフィルムは、中耳腔換気用チューブおよび人工喉頭に由来する感染の原因であると理解される。バイオフィルムはさらに、気管開口術チューブおよび気管内チューブにも潜んでおり、病原性細菌が比較的滅菌状態の肺の遠位気道に侵入してしまう。この器具は、バイオフィルムの形成およびそれに続く感染性合併症を減少させるための、硫酸エステルAF剤の混入または局所適用に適合している。
【０１４３】
別の例では、血管に接続するための多様な血管カテーテルを作製する。一時的な静脈カテーテルを遠位に配置する一方で、中心静脈カテーテルをより近位の大静脈に配置する。カテーテルシステムには、経皮的に装着されハブが体外にあるもの、およびアクセスポートが皮下に埋め込まれたものを含んでよい。長期用中央静脈カテーテルの例には、ヒックマンカテーテルおよびポート・ア・カス（Port-a-cath）が含まれる。カテーテルでは、液体、栄養、および医薬品の注入が可能で、さらには診断研究用の採血または血液もしくは血液製剤の輸血をすることもできる。このようなカテーテルにはバイオフィルムが形成しやすく、特定の静脈内に長く滞留させるほどバイオフィルムの形成が増加する。血管接続用器具内にバイオフィルムが形成すると、そのバイオフィルムから周囲の血流へ浮遊性生物が放出されて、血液感染性感染症の発症につながることがある。さらに、バイオフィルムが器具そのものを閉塞して機能停止の原因となることもある。カテーテルが感染した場合、または閉塞が解消されない場合、カテーテルを取り出さなければならない。一般に、この器具を使用する患者は重度の医学的症状に苦しんでいる。このような患者は、器具の取り出しおよび交換に絶える力に乏しい。さらに、血管にアクセスする部位の数は限られている。カテーテルの配置を繰り返す患者は、新しいカテーテルが簡単に安全に配置できる部位を使い果たしていることもある。硫酸エステルAF剤のカテーテル材料への混入、またはこの薬剤のカテーテル材料への適用によって、汚染およびバイオフィルム形成が減少し、それにより器具の開通性を持続させて感染性合併症のリスクを最小に抑えることができる。
【０１４４】
別の例では、正常な胆管システムが阻害されるか、または外科的操作から回復する場合、胆汁を胆管から体外へ排出するために胆汁排出チューブを用いる。排出チューブはプラスチックか他のポリマー製であってよい。胆管ステントは一般にプラスチック材料でつくられ、胆管の1路に挿入し、管を開いた状態にして胆汁を底に通す。胆管システムに付着した細菌やバイオフィルムの形成の結果生じた胆砂は、胆管ステントの遮断を引き起こすことが認められている。膵臓ステントは、膵管を開いた状態にするか、または膵偽膿胞を排出するために配置されるが、これも膵砂によって閉塞することがある。さらにバイオフィルムは、胆汁排出チューブに沿った胆管の奥の方への感染の広がりにも関与する。胆管に感染が広がると、胆管炎と呼ばれる危険な感染症状を発症することがある。本願発明の化合物を胆汁排出チューブおよび胆管ステントを作製するために用いる材料に混入すると、バイオフィルムの形成が減少し、したがって閉塞および感染のリスクを減少させることができる。
【０１４５】
別の例では、腹腔から注入してその後除去する液体を用いて腎不全患者の体内の排出物質を除去するために、腹膜透析カテーテルが用いられる。この形態の透析は、一部の腎不全患者にとっては血液透析の代替法となる。腹膜透析カテーテルの表面上にバイオフィルムが形成すると、閉塞および感染が生じる可能性がある。腹腔に侵入する感染症は腹膜炎と呼ばれ、特に危険な感染症の１種である。腹膜透析カテーテルは一般にポリエチレンなどのポリマー材料でつくられているが、硫酸エステルAF剤でコーティングするかまたは含浸すれば、バイオフィルムの形成を減少させることができる。
【０１４６】
さらに別の例では、尿システムの排出を提供するための、多様な泌尿器科用カテーテルが存在する。このカテーテルは、自然な尿道の開口部に挿入して膀胱内を排出することもでき、または医原的に作製した挿入部位に尿道システムを通すように適合させることができる。腎瘻チューブおよび恥骨上膀胱穿刺チューブは後者の例である。カテーテルは尿管を開いた状態にするために半永久的に尿管に配置する。このようなカテーテルは尿管ステントと呼ばれる。泌尿器科用カテーテルは多様なポリマー生成物から作ることができる。ラテックス管およびゴム管が用いられているが、シリコーンも用いられている。すべてのカテーテルにはバイオフィルムが形成しやすい。このため、尿管感染の上行の問題が生じ、バイオフィルムが近位に広がり病原性生物が伝搬するか、またはバイオフィルムの中に常在するプランクトニック生物が組織および血流を侵襲する能力のある浮遊性生物を増やす可能性がある。一般に尿管中の生物は、全身に広がると致命的な血流感染症を生じる能力があるグラム陰性細菌である。このような生物が尿管に限定して存在する場合の感染症でも、疼痛および高熱を伴い、危険であることがある。尿管感染症は、腎盂腎炎と呼ばれる腎感染症を引き起こすことがあり、腎機能を脅かす可能性もある。硫酸エステルAF剤を混入すると、バイオフィルムの形成が抑制され、これらの感染性合併症の可能性を減少させると考えられる。
【０１４７】
泌尿器科用カテーテルが遭遇するさらなる合併症はエンクラステーションで、これはカルシウム、マグネシウム、およびリンを含む無機化合物がカテーテルの内腔に沈着して、内腔を閉塞するプロセスである。このような無機化合物は、カテーテル表面のバイオフィルムに常在するいくつかの細菌の作用によって生じると理解されている。硫酸エステルAF剤の作用によってバイオフィルム形成が減少すると、エンクラステーションの減少とそれに続く泌尿器科用カテーテルの閉塞の減少に寄与すると考えられる。
【０１４８】
AF剤で処理できる他のカテーテル様器具もある。たとえば、外科用ドレーン、胸部チューブ、およびヘモバックス（hemovacs）などをバイオフィルム形成を障害する物質で有利に処理することができる。このような器具の他の例は、当業者が精通しているであろう。
【０１４９】
体に適用する物質は、本願明細書に開示するAF化合物に有利に用いることができる。包帯剤には、それ自体にAF化合物を混入することができ、皮膚表面に直接適用するフィルムまたはシート状であってよい。さらに、本願発明のAF化合物は、包帯剤または皮膚に取り付ける器具を貼り付けるための粘着剤または接着剤に混入することができる。たとえば瘻孔接着剤または医療級粘着剤は、特定の医学的背景に適切なAF剤を含むように調剤されてよい。瘻孔接着剤は、皮膚を過剰に傷害しないで瘻孔バッグおよび同様の器具を皮膚に接着するために使用する。このような器具中および周囲の皮膚上に感染生成物が存在するため、これらの器具はAF剤でのコーティング、またはAF剤の混入に特に適している。その他の添付器具も同様に処理することができる。絆創膏、粘着テープ、および透明プラスチック粘着シートはさらなる例であって、粘着剤もしくはその物体を固定するために使用するその他の接着剤へのAF剤の混入、またはその物体の１成分としてのAF剤の混入は、皮膚への刺激および感染を減少させるのに有効であると考えられる。
【０１５０】
この上述の例は、医療器具への本願化合物の用途の多様性を具体化するために提供される。その他の例はこの分野の当業者によって容易に想像されるであろう。本願発明の範囲は、汚染の存在が健康に関連する有害な結果をもたらすすべての表面を包含することを意図する。上述の例は、本願発明の技術が適用可能であると理解される実施態様を代表する。その他の実施例は当業者および関連する技術の施行者に明らかであろう。本願発明の実施態様は、抗菌効果または費用効果が高い使用を向上させるために、現在利用されている殺菌療法との併用と互換性があってよい。本願発明の化合物を有する適切な賦形剤の選択は、それぞれの医学的用途の特性によって決定されるであろう。抗菌性を促進するための医学的環境における用途のその他の例は、関連する当業者によって容易に想像されるであろう。
【０１５１】
以上、本発明を概略的に解説したところで、以下の実施例を参照されれば尚一層容易に理解されよう。但し以下の実施例は単に本発明の特定の局面及び実施態様の描写を目的として含まれたのであり、本発明を限定することは意図していない。
【０１５２】
表面の誘導体化
【０１５３】
実施例１：
方法Ａ
NH2ガラス製スライド（アミノプロピルトリメトキシシランで被膜した顕微鏡用スライド）を、1mLのトリエチルアミンを含有する90mLの無水ジクロロメタン内に配置した。４℃まで冷却した後、10mLの塩化アクリロイルを加え、この反応混合液を低温室で一晩攪拌し、その後室温で２時間、攪拌した。アシル化したそのNH2ガラス製スライドをメタノール／トリエチルアミン混合液（1:1、v/v）及びメタノールですすいだ。このアクリロイル化の前（6.6±0.1×10-10mol／cm2）及び後（3.3±0.2×10-10mol／cm2）のガラス製スライド表面上のNH2基をピクリン酸滴定を用いて判定したところによると（１７）、表面に結合したアミノ基の半分ほどが塩化アクリロイルと反応していた。次に、このガラスに結合したアクリロイル部分を4-ビニルピリジンと共重合体化させた。過塩素酸（90 mL の20% 水溶液）を脱気し、30 mgのCe(SO4)2をアルゴン下で加えた。１時間の攪拌後、アクリロイル化したガラス製スライドをこの溶液内に配置し、15 mLの蒸留したばかりの4-ビニルピリジンをアルゴン下で加え、その反応混合液を室温で３時間、攪拌した。スライドに化学的に付着しなかったPVPをピリジン、N,N-ジメチルホルミド、及びメタノールで洗い落とした。その直後に、PVPを付着させた状態のスライドを臭化アルキルの10% (v/v)ニトロメタン溶液内に配置した。その後その反応混合液を７５℃で７２時間、攪拌すると、ピリジン環の90%を越えるものがN-アルキル化していた(19)。その結果得られたポリカチオン-誘導体化PVP-スライドをメタノール及び蒸留水ですすぎ、空気乾燥した。
【０１５４】
実施例２
方法Ｂ
NH2-ガラス製スライドを9 mLの 1,4-ジブロモブタン、90mLの無水ニトロメタン、及び0.1 mLのトリエチルアミンを含有する混合液中に浸漬した。６０℃で２時間、攪拌した後、このスライドを取り出し、ニトロメタンでよくすすぎ、空気乾燥し、9 g の PVP (分子量で60,000又は160,000 g/mol)の90 mLのニトロメタン/臭化ヘキシル(10:1, v/v)溶液内に配置した。この反応混合液を７５℃で２４時間、攪拌した後、そのスライドをアセトンですすぎ、メタノールでよくすすぎ（付着していないポリマを取り除くため）、空気乾燥した。文献(14)によると、これらの条件下ではPVPのピリジン環の96%を越えるものがN-アルキル化するはずである。
【０１５５】
表面分析
実施例３
化学修飾したガラス製スライドをフルオレセイン（Na塩）の1%蒸留水溶液に５分間、浸漬した。これらの条件下では該染料は四級アミノ基には結合する (20)が、３級又は１級のものには結合しない（我々は、PVPで修飾した又はNH2のガラス製スライドはフルオレセインを吸着しないことを見出した）。蒸留水ですすいだ後、着色したスライドを25 mLの界面活性剤セチルトリメチル-塩化アンモニウムの0.1%蒸留水溶液中に配置し、１０分間振盪して染料を脱着させた。その結果得られた水溶液の吸光度を501 nmで測定した（10% の100mM水性リン酸緩衝液、pH 8.0、を加えた後）。個別に判定されたこの溶液中のフルオレセインの吸光度は77 mM-1cm-1であることが判明した。
【０１５６】
重合体含有量の判明している様々なヘキシル-PVP-フィルム(160,000 g/mol、アルキル化の程度＞95% を着色したところ、フルオレセイン結合の化学量論比はほぼ染料１分子当たり７単位のヘキシル-PVP単量体であることが見出された。付着したヘキシル-PVPの以下の量が判定された（重合体のうち90%をこえるものがヘキシル化したと想定して）：5.8±3.0μg/cm2（方法Ａ）；2.8±1.0μg/cm2（方法Ｂ、分子量160,000 g/molのPVP)；及び0.4±0.05μg/cm2 (方法Ｂ、分子量60,000 g/molのPVP)。方法Ａで固定したヘキシル-PVPの場合、付着したポリカチオンの最低の鎖長は61±30単量体単位であると推定した。
【０１５７】
抗菌物質感受性の判定
実施例４
スタフィロコッカス-アウレウス(ATCC、株33807)、スタフィロコッカス-エピデルミディス（野生型）、シュードモナス-アエルギノーサ（野生型）、又はエシェリヒア-コリ（ZK 605)を0.1 Mの水性PBS緩衝液 (pH 7.0、ほぼ1011個の細胞／mL)に入れた懸濁液（100μL）を、50 mLの酵母-デキストロース・ブロス（Cunliffe et al. (21)の解説通りに調製したもの）を無菌のエルレンマイヤー・フラスコで加えた。この懸濁液を200 rpmで振盪しながら６乃至８時間、３７℃でインキュベートした。遠心分離(2,700 rpm、10分間)後、その細菌細胞を蒸留水で洗浄し、また蒸留水中に濃度が1 mL 当たり106個(E. coliの場合107）になるように再懸濁させた。
【０１５８】
次に細菌懸濁液をガラス製スライド (又は他の表面)に、ヒュームフード中で市販のクロマトグラフィ噴霧器 (VWR)を用いて (噴霧速度は10 mL/分)で噴霧した。空気下で２分間、乾燥させた後、このスライドをペトリ皿内に配置し、成長寒天 (酵母-デキストロース・ブロスによる0.7%寒天をオートクレーブし、３７℃まで冷ましたもの）を加えた。このペトリ皿に蓋をし、密閉し、３７℃で一晩、インキュベートした。
【０１５９】
実施例５
該細菌を蒸留水中に懸濁させ、スライドの表面に噴霧して、会話、くしゃみ、咳又は単なる呼吸など、細菌感染の伝播の一般的な方法である空中浮遊細菌の付着を模倣した。感染表面上の生存細菌細胞の数を判定するために、２分間空気乾燥後のスライドを成長寒天下でインキュベートした。増殖可能な細菌であれば、計数可能なコロニーをこれらの条件下で形成する。感染性グラム陽性細菌であるスタフィロコッカス-アウレウスを最初の実験に用いた。次に、NH2-ガラス製スライドを塩化アクリロイルでアシル化して二重結合を導入し、続いて4-ビニルピリジンと共重合させた。このような固定されたPVPでは、細菌懸濁液をその表面に噴霧した後の生存S.アウレウス細胞数が、普通のNH2-ガラス製スライドとほぼ同じ数になることが判明している。最後のステップは、ガラスに付着させたPVP鎖に正電荷を持たせることである。この目的のために、当該重合体のピリジン環を７個の直線状の臭化アルキル（鎖長はプロピルからヘキサデシルまでのもの）でN-アルキル化した。そのスライドを、それらに噴霧されるS.アウレウス細胞を接触時に殺菌する能力について調べた。図２に見られるように、プロピル化、ブチル化、ヘキシル化、及びオクチル化した固定されたPVP鎖は、生存細菌細胞数を減少させる上で著しく効果的であり、最も効果的だったヘキシル-PVPは、94±4% の減少をもたらすことができた（図１の右側部分を参照されたい）。
【０１６０】
実施例６
ヘキシル-PVPで修飾したガラス製スライド表面（以下、方法Ａで調製したものと言及する）を用いて、我々はこの表面の殺菌効果を、S.エピデルミディスという別のグラム陽性細菌や、E. coli及びP.アエルギノーサといった２種のグラム陰性細菌についても調べた。NH2ガラス製スライドに噴霧したとき、最初の二者はS.アウレウスと同じ大きさのコロニーを形成した（図１、左側部分）が、他方、P.アエルギノーサのコロニーはより大型であるが、尚判別可能であった。表１に見られるように（方法Ａ）、ヘキシル-PVP-スライドに噴霧後に形成された三種の細菌のコロニー数はいずれも、普通のNH2ガラスに比較して１００分の１以上に減少していた。
【０１６１】
細菌を蒸留水に入れた懸濁液（最初の３つの細菌は106細胞／mL、そして最後の１つは107細胞／mL）を、ヘキシル-PVP-修飾ガラス表面に噴霧し、２分間空気乾燥し、細菌成長培地に入れた0.7%寒天で一晩インキュベートし、コロニーを計数した。市販のNH2-ガラス製スライドで同じ態様で得られた生存細胞の数を標準として用いた（即ち細菌のうちの0%が殺菌される）。
【０１６２】
実施例７
ガラス製スライド上に固定された、PVPベースのポリカチオンの抗菌特性を、1,4-ジブロモブタンでアルキル化して反応性のブロモブチル基を導入し、その後このブロモブチル基を用いてPVPを付着させたNH2-ガラス製スライドを用いて様々な手法で分析した。こうして得られた表面では、噴霧後のS.アウレウス細胞を殺菌できなかった。付着したPVP鎖の正電荷を増すために、これらの鎖を臭化ヘキシルでさらにN-アルキル化した。S.アウレウス細胞を噴霧し、空気乾燥し、培養したヘキシル-PVP-スライド（以下、方法Ｂで調製したものと言及する）は、図１の右側部分に示すものとほぼ同じに見えた。NH2-ガラス製スライドに比較して、付着したS.アウレウス細胞の94±3% が殺菌された（表１の最後のコラム、１行目）。
【０１６３】
細菌を蒸留水に入れた懸濁液（最初の３つの細菌は106細胞／mL、そして最後の１つは107細胞／mL）を、ヘキシル-PVP-修飾ガラス表面に噴霧し、２分間空気乾燥し、細菌成長培地に入れた0.7%寒天で一晩インキュベートし、コロニーを計数した。市販のNH2-ガラス製スライドで同じ態様で得られた生存細胞の数を標準として用いた（即ち細菌のうちの0%が死ぬ）。
【０１６４】
表面の誘導体化
実施例８
HDPEスライド (7.5×2.5cm、ネバダ州レノ、ポリマー・プラスチックス社）をイソプロピルアルコール中で５分間、音波処理し、この溶媒ですすぎ、８０℃で３０分間、乾燥させた。次に、手持ち式バーナ（ドイツ、ジェナ、SurAインスツルメンツ社）の炎の正面（酸化）部分をこのスライド表面に向けて１５秒間、扇いで当て、スライドを一晩、空気下で保管した。このバーナの圧縮混合ガスは0.6% (v/v)のテトラメチルシランを混合プロパン／ブタン (7:3, v/v)(Pyrosir（R))中に含んでいた。こうしてSiO2で被覆されたそのHDPEスライドを次に3-アミノプロピルトリエトキシシラン（ウィスコンシン州ミルウォーキー、アルドリッチ・ケミカル社）を無水トルエンに入れた20%溶液中に配置し、攪拌しながら室温で３時間、インキュベートし、トルエン及びメタノールですすぎ、空気下で一晩、乾燥させた。Bisse, E., Scholer, A. & Vonderschmitt, D.J. A new method for coupling glucose dehydrogenase to glass tubes activated with titanium tetrachloride. FEBS Lett. 138, 316-318 (1982)。次に、このNH2官能性化HDPEスライドを、10 mLの1,4-ジブロモブタン、0.1 mLのトリエチルアミン、及び90 mLのニトロメタンの混合液で、一緒に攪拌しながら６０℃で５時間、処理し、ニトロメタンですすいだ後、9 gのPVP (分子量は160,000g/mol) を81 mLのニトロメタン及び10 mLの1-ブロモヘキサン（すべてアルドリッチ社）に入れた調製したばかりの溶液を加えた。７５℃での９時間の攪拌後、スライドをメタノール及び蒸留水で十分にすすぎ、空気乾燥させた。LDPE (ポリマー・プラスチック社）、PP、ナイロン（6/6型) (オハイオ州クリーブランド、プラスチック・マテリアル社）、及びPET (ニュージャージー州ミルヴィル、ホイートン社）製のスライド（すべて大きさは7.5×2.5cm）を、PETは最後のステップで７５℃ではなく６０℃で処理したこと以外、同じプロトコルに従って誘導体化した。
【０１６５】
表面分析
実施例９
SiO2で被覆されたHDPEスライドのＸ線光電子スペクトルを、Kratos Axis Ultra インスツルメンツ（ニューヨーク州ニューヨーク、クレイトス・アナリティカル社）を用い、150 W A1  Kα単色光分光器源を用いて記録した。
【０１６６】
実施例１０
ヘキシル-PVP-誘導体化スライドをフルオレセイン（ミズーリ州セントルイス、シグマ・ケミカル社）の1%蒸留水溶液中に配置し、５分間振盪し、水で十分にすすぎ、塩化セチルトリメチルアンモニウムの0.25%水溶液（アルドリッチ社）中に配置した。５分間振盪した後、10% (v/v)の0.1 M 水性リン酸緩衝液、pH 8.0、をこの溶液に加え、吸光度を501 nmで測定し、表面上のピリジニウム基の数を先に解説された通りに計算した。Tiller,J.C., Liao, C.-J., Lewis, K. & Klibanov, A.M. Designing surfaces that kill bacteria on contact. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.  98, 5981-5985 (2001)。
【０１６７】
抗菌効力の判定
実施例１１
S.アウレウス（ヴァージニア州マナサス、ATCC、株33807）又は E.coli (ハーバード・メディカル・スクールのゲイリー・ボナー博士より提供の株 ZK 650）を0.1 Mの水性リン酸緩衝液、pH 7.0 (ほぼ1011 細胞/mL) に入れた懸濁液を、50 mLの酵母-デキストロース・ブロス(Cunliffe 氏らが解説したように調製したもの) に、無菌のエルレンマイヤー・フラスコで加えて細菌を培養した。 Cunliffe, D., Smart, C.A., Alexander, C. & Vulfson, E.N. Bacterial adhesion at synthetic surfaces. Appl. Environ. Microbiol. l65, 4995-5002 (1999)。この懸濁液を200rpmで振盪させながら６乃至８時間、３７℃でインキュベートした。
【０１６８】
表面が空中浮遊細菌を殺菌する能力を先に解説された通りに検査した。Tiller, J.C., Liao, C.-J., Lewis, K. & Klibanov, A.M. Designing surfaces that kill bacteria on contact. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.  98, 5981-5985 (2001)。細菌細胞を2,700 rpm で１０分間遠心分離し、蒸留水ですすぎ、S.アウレウスについては濃度が1mL当たり106細胞になるように、そしてE. coliについては105になるように再懸濁させた。細菌細胞濃度は、540nmでの1.0の光学密度が1mL当たり約109個の細胞に等しいと想定して評価した。Hogt, A.H.,Dankert, J. & Feijen, J. Adhesion of coagulase-negative staphylococci to methacrylate polymers and copolymers. J. Biomed. Mater. Res. 20, 533-545 (1986)。次に細菌懸濁液をポリマースライド上にヒューム・フード内で市販のクロマトグラフィ噴霧器（マサチューセッツ州ボストン、VWR）を用いて噴霧（噴霧速度は約10mL／分）した。空気下で２分間、乾燥させた後、スライドをペトリ皿内に配置し、成長寒天（酵母-デキストロース・ブロスによる0.7%寒天をオートクレーブし、３７℃に冷ましたもの）を加えた。この皿に蓋をし、密閉し、３７℃で一晩、インキュベートした。成長した細菌コロニーを、コロニーとポリマー・スライドとの間のコントラストを増幅するライトボックス（オハイオ州クリーブランド、ピッカー・インターナショナル社）で計数した。ナイロンの場合、細菌コロニーをインキュベート後に染色した。1 mg のクリスタル・バイオレット（シグマ社）を100mLの蒸留水に溶解させ、感染後のスライドを覆う成長寒天に、表面が完全に塗れるまで加えた。この手法を２時間後に繰り返した。着色したコロニーが５時間以内に可視となった。
【０１６９】
水系細菌に関してポリマをテストする場合は、細菌細胞を2,700rpmで１０分間、遠心分離し、pH 7.0のPBSで２回洗浄し、同じ緩衝液に再懸濁させ、PBS1mL当たり2×106個の細胞（E. coliの場合4×106個）になるまで希釈した。プラスチック製スライドを45mLのこの懸濁液内に配置し、200rpm及び３７℃で振盪しながら２時間、インキュベートし、スライドを滅菌PBSに浸漬することで３回洗浄し、すぐに固い成長寒天(細菌成長培地に入れた1.5%寒天をオートクレーブし、ペトリ皿に注ぎ入れ、室温の減圧下で一晩乾燥させたもの）から切りだしたスラブで覆い、密閉したペトリ皿で３７℃で一晩、インキュベートした。この細菌コロニーを上述したように計数した。
【０１７０】
実施例１２
ポリ（ビニル-N-ヘキシルピリジニウム）で誘導体化したポリマー表面は空中浮遊細菌、水系細菌及び付着細菌を殺菌する
市販の材料の表面を、設計された抗菌ポリカチオンであるポリ（ビニル-N-ピリジニウムブロミド）で共有結合的に誘導体化するための簡便な方法が開発された。この方法において、一番目の鍵となるステップは、シリカのナノ層で表面を被覆することを含む。この態様で誘導体化された多種の市販の合成ポリマが殺菌性となる。これらは接触したグラム陽性及びグラム陰性細菌を、空中又は水中で付着したかに関係なく、最高で99%殺菌する。
【０１７１】
我々は、長鎖の疎水性ポリカチオン鎖による共有結合的被覆を含む、殺菌表面を作製するための新規な非放出的戦略を発見した。重要なことは、後者の長鎖疎水性ポリカチオン鎖が、静電的反発により疎水性の鎖間凝結に対抗し、尚かつ細菌細胞膜を貫通できるような電荷及び疎水性に微調整されていなければならないことである。その結果、ポリ(ビニル-N-ヘキシルピリジニウムブロミド) (ヘキシル-PVP)で共有結合的に修飾したガラス製スライドは、空中浮遊細菌の99%を越えるものを殺菌することが見出された。この実施例では、我々は、通常の合成ポリマを含め、大幅に拡大されたこのような殺菌材料の範囲を実証するものである。そうする中で、その性質に関係なく、大半の材料に応用できるであろう一般的な表面被覆／誘導体化法が発見された。具体的には、５つの代表的な本来は非殺菌性の市販のポリマをヘキシル-PVPで誘導体化したものが、空中又は水系を通じて表面上に付着したグラム陽性及びグラム陰性細菌の90乃至99%を殺菌することが実証された。
【０１７２】
材料
フルオレセイン（Na塩）及びクリスタル・バイオレットをシグマ・ケミカル社から購入した。3-アミノプロピルトリエトキシシラン、1-ブロモヘキサン、セチルトリメチル塩化アンモニウム、ポリ(4-ビニルピリジン) (PVP) (分子量は160 kg/mol)、及び、本研究で用いる他の全ての化学物質（分析用及び純正）は、アルドリッチ・ケミカル社から得、それ以上の精製を行わずに用いた。高密度ポリエチレン(HDPE)、低密度ポリエチレン (LDPE)、ポリプロピレン(PP)、及びナイロン 6/6 は、ポリマー・プラスチックス社（ネバダ州レノ）から提供され、そしてポリ（エチレンテレフタレート）（PET）はウィートン社（ニュージャージー州ミルヴィル）から提供された。0.6%(v/v) テトラメチルシランをプロパン/ブタン (7:3,v/v) に入れた混合物（Pyrosil（R))を含有する手持ち式バーナをSurA インスツルメンツ社（ドイツ、ジェバ）から得た。
【０１７３】
表面の誘導体化
HDPEスライド(7.5 x 2.5 cm)をイソプロピルアルコール中で５分間、音波処理し、この溶媒ですすぎ、８０℃で３０分間、乾燥させた。次に、手持ち式バーナの炎の前面（酸化）部分をスライド表面に向かって１５秒間扇いで当て、このスライドを空気下で一晩、保管した。次に、SiO2で被覆されたこのHDPEスライドを3-アミノプロピルトリエトキシシランを無水トルエンに入れた20%溶液中に配置し、攪拌しながら室温で３時間、インキュベートし、トルエン及びメタノールですすぎ、空気下で一晩、乾燥させた(Bisse et al., 1982)。次に、このNH2-官能性化HDPEスライドを 10 mL の1,4-ジブロモブタン、0.1 mL のトリエチルアミン、及び90 mL のニトロメタン の混合物で、攪拌しながら６０℃で５時間処理し、ニトロメタンですすいだ後、調製したばかりの9 gの PVPを81 mLのニトロメタン及び10 mL の1-ブロモヘキサンに溶かした溶液を加えた。７５℃で９時間攪拌した後、スライドをメタノール及び蒸留水で十分にすすぎ、空気下で乾燥させた。LDPE製、PP製、ナイロン製、及びPET製のスライド（大きさはすべて7.5×2.5cm）を、PETでは最後のステップで７５℃ではなく６０℃で処理したこと以外、同じプロトコルに従って誘導体化した。
【０１７４】
Ｘ線電子分光法
SiO2で被覆されたHDPEスライドのＸ線光電スペクトルを、Kratos Axis Ultra インスツルメンツ（ニューヨーク州ニューヨーク、クレイトス・アナリティカル社）を用い、150 W A1  Kα単色光分光器源を用いて記録した。
【０１７５】
表面のピリジニウム基の滴定
ヘキシル-PVP-誘導体化スライドをフルオレセインの1%蒸留水溶液中に配置し、５分間振盪し、水で十分にすすぎ、セチルトリメチル塩化アンモニウムの0.25%水溶液中に配置した。５分間振盪した後、 10% (v/v) の 0.1 M 水性リン酸緩衝液、pH 8.0、を該溶液に加え、吸光度を501 nmで測定し、表面上のピリジニウム基の数を先に解説されている通りに計算した。
【０１７６】
抗菌効力の判定
S.アウレウス（ヴァージニア州マナサス、ATCC、株33807）又はE.coli（ハーバード・メディカル・スクール、ゲイリー・ボナー博士より提供の株ZK 650）を0.1Mの水性PBS緩衝液、pH7.0（ほぼ1011細胞/mL）に溶かした懸濁液（100μL）を50mLの酵母-デキストロース・ブロス（Cunliffe et al., 1999が解説した通りに調製したもの）に、無菌のエルレンマイヤー・フラスコで加えて細菌を培養した。この懸濁液を200rpm及び３７℃で６−８時間、振盪した。
【０１７７】
空中浮遊菌を表面が殺菌する能力を先に解説された (Tiller et al., 2001)通りにテストした。細菌細胞を2,700 rpm で１０分間、遠心分離し、蒸留水で洗浄し、S.アウレウスについては1mL当たり106個細胞の濃度に、そしてE. coliについては105個になるように再懸濁させた。細菌細胞濃度は、540nmでの光学密度1.0が1mL当たり約109個の細胞に等しいと想定して評価した(Hogt et al.,1986)。次に細菌懸濁液をポリマー・スライドに、ヒューム・フード中で市販のクロマトグラフィ噴霧器 (マサチューセッツ州ボストン、VWR）、（噴霧速度は約10 mL/分)を用いて噴霧した。空気下で２分間、乾燥させた後、スライドをペトリ皿内に配置し、成長寒天 (酵母-デキストロース・ブロスによる0.7%寒天をオートクレーブし、３７℃に冷却したもの）を加えた。この皿に蓋をし、密閉し、３７℃で一晩、インキュベートした。成長した細菌コロニーを、コロニーとポリマー・スライドとの間のコントラストを増幅するライト・ボックス（オハイオ州クリーブランド、ピッカー・インターナショナル社）で計数した。ナイロンの場合、細菌コロニーをインキュベート後に染色した。1 mg のクリスタル・バイオレットを100mLの蒸留水に溶解させ、感染後のスライドを覆う成長寒天に、表面が完全に塗れるまで加えた。この手法を２時間後に繰り返した。着色したコロニーが５時間以内に可視となった。
【０１７８】
水系細菌に関してポリマをテストする場合は、細菌細胞を2,700rpmで１０分間、遠心分離し、pH 7.0のPBSで２回洗浄し、同じ緩衝液に再懸濁させ、PBS 1mL当たり2×106個の細胞（E. coliの場合4×106個）になるまで希釈した。プラスチック製スライドを45mLのこの懸濁液内に配置し、200rpm及び３７℃で２時間、振盪し、スライドを滅菌PBSに浸漬することで３回洗浄し、すぐに固い成長寒天(細菌成長培地による1.5%寒天をオートクレーブし、ペトリ皿に注ぎ入れ、室温の減圧下で一晩乾燥させたもの）から切りだしたスラブで覆い、密閉したペトリ皿で３７℃で一晩、インキュベートした。この細菌コロニーを上述したように計数した。
【０１７９】
結果及び議論
多数の多様な物体を殺菌性にすることが望ましいと考えられるため、我々は任意の物質に応用できる可能性のある表面誘導体化法を選択した。我々は、ポリオレフィン、ポリアミド、及びポリエステルといった、それ自体では何ら抗菌活性を示さない普通の市販の合成ポリマでこの方法をバリデートした。高密度ポリエチレン（HDPE）製のスライドを最初のターゲットとして選択した。このポリマは、他の多くの物質と同様、簡単な化学修飾に適した反応基を欠く。従って我々はそれを燃焼化学蒸着技術 (Schinkinger et al., 2001)により超薄シリカ層で被覆することに決めた。我々はこの目的のために（図４のステップ１番）0.6% テトラメチルシラン 及び 7:3 プロパン-ブタン の圧縮混合物(Pyrosil(R))を含有するペン様のトーチを利用した。この混合物が空中で燃焼すると、テトラメチルシランが酸化して、炎が当たった表面を被覆する2〜5-nmのSiO2粒子が形成される(Tiller et al., 1989)。その結果できる、化学的にはガラス（ポリシロキサン）に似た密な〜100nm厚のSiO2層 (Schinkinger et al., 2001; Tiller et al., 1989) は、その後、バルク材料の性質に関係なく均一な態様で容易に化学修飾することができる (Tiller et al., 1989 and 1991)。
【０１８０】
HDPE表面の視覚的な外見はこのSiO2被覆法後も変わらなかった。このようなSiO2層の架橋の程度は、ガラスのそれよりも低く、数多くのSi-OH基が、蒸着プロセス後に環境から吸着される水分の水和化で形成される(Schinkinger et al., 2001)。これらのSi-OH 基のために、被覆されたHDPE表面は、疎水性の高い未修飾のポリマとは対照的に親水性であると予測される。この違いを定量するために、我々は、物質の水親和性を判定する通常の方法である、表面上の水滴が形成する接触角の測定を行った (David, 1966)。この目的のために 0.1 mLの蒸留水をHDPE表面上に置いた。その結果できた水滴の中心とその下の表面との間の角度は、疎水性の物質を示す１２０度ほどであると推定された。同じ量の蒸留水を、SiO2で被覆したHDPEに乗せたところ、表面上に広がった水及び接触角は１０度未満であり、表面の親水性を反映した。それとは別個に、HDPEスライド上のSiO2層の存在を、Ｘ線電子分光スペクトルで検出された珪素シグナル及び酸素シグナルで確認した。
【０１８１】
次に、ガラス表面をアミン化する標準的な方法である、SiO2で被覆したHDPEスライド表面を3-アミノプロピルトリエトキシシラン（図４のステップ２番）に反応させることで、アミノ基を該スライド表面に導入した(Bisse et al., 1982)。次にNH2官能性化HDPEスライドを1,4-ジブロモブタンでアルキル化して、ブロモアルキル基を導入し(図４のステップ３番）、次にこれをPVPに1-ブロモヘキサン (図４のステップ４番)の存在下で反応させた。用いた条件下では、PVP鎖のピリジン基（ほぼ1,500基）のうちのごく僅かが、表面に結合したブロモアルキルによりアルキル化し、その大半は1-ブロモヘキサンによりアルキル化する (Tiller et al., 2001)。ヘキシル-PVPで誘導体化したHDPEスライド上のピリジニウム基の数を、フルオレセインで分光光度法で滴定すると、8.2±1.9 nmol/cm2であると判定され、ヘキシル-PVPで修飾されたNH2ガラスで観察されるものと同様である (Tiller et al., 2001)。
【０１８２】
他の２つの工業用ポリオレフィンである低密度ポリエチレン（LDPE）及びポリプロピレン（PP）や、ポリアミドナイロン及びポリエステルポリ（エチレンテレフタレート）（PET）を修飾することにより、前述のナノ被覆／誘導体化法の普遍性を確認した。これらの合成ポリマはすべて、図４に示すように成功裡に誘導体化され、HDPEのそれと同じ様なピリジニウム基の表面密度である-8.5±1.8 (LDPE)、7.2±2.1 (PP)、8.0±1.1 (ナイロン）、及び7.5±0.9 (PET) nmol／cm2を示した。次に、すべてのヘキシル-PVP-誘導体化スライドを、HDPEを手始めに、接触した空中浮遊菌を殺菌する能力について調べた。
【０１８３】
空中浮遊菌の天然の付着や、細菌の接触性の付着をシミュレーションするために、汎存病原菌グラム陽性細菌スタフィロコッカス-アウレウスを蒸留水に入れた懸濁液 (Xiong et al., 2000)をスライド表面に噴霧して後者を乾燥させた。次にそのスライドを先に解説された (Tiller et al., 2001)通りに栄養寒天下で一晩、インキュベートし、生存細菌細胞の数をコロニー計数で判定した。図５aの左側に見るように、多数の容易に識別可能な細菌コロニーが未修飾のHDPEスライド上では成長していた。SiO2で被覆した又はNH2で官能性化したHDPEスライド上で成長したコロニー数（図４）は基本的に同じであり、これらの修飾はS.アウレウスにとって有毒でないことが示された。それとは驚くほど対照的に、ヘキシル-PVPで修飾したHDPEスライドに噴霧した場合、付着した細菌細胞の96±3%が死滅する、即ち非生存となった（図５a、右側及び表１）。
【０１８４】
【表５】
2004532108.tif 000018
【０１８５】
細菌の蒸留水懸濁液 (S.アウレウスの場合106細胞／mL、そしてE. coliの場合105細胞／mL) をヘキシル-PVP-修飾ポリマー・スライドに噴霧し、後者を２分間、空気乾燥させ、細菌成長培地による0.7%寒天で一晩、インキュベートした。その後コロニーを計数した。対応する未修飾のポリマー・スライドで同じ態様で得られた生存細胞の数を標準として用いた（即ち、細菌のうちの0%が殺菌される）。実験はすべて、少なくとも二重にして行い、表記した誤差は標準偏差を示す。
【０１８６】
ヘキシル-PVPで誘導体化したLDPE、PP、ナイロン、及びPETを、空中浮遊菌であるS.アウレウスを殺菌する上でのそれらの能力について同様にテストした。表１に見られるように、いずれの場合でも、形成された細菌コロニーの数は、対応する未修飾のスライド上で成長したものに比較して１０乃至３０分の１に減少した。
【０１８７】
次に我々は、代表的なグラム陰性細菌であるエシェリヒア-コリに対するヘキシル-PVP-誘導体化表面の殺菌効率をテストした。図５b、左側に見られるように、噴霧後にHDPEスライド上で成長した数多くのE. coliコロニーは、同じ条件下で成長させたS.アウレウスのそれよりも密度こそ低いが、それでも尚識別可能である。ヘキシル-PVPによる表面誘導体化によりこれらの数は97±3% （図５b、右側、及び表１）、減少した。表１の最後の行の残りのデータを調べると、LDPE、PP、ナイロン、及びPETスライドをヘキシル-PVPで修飾しても、同様に、対応する未修飾のスライドに比較したときに２０乃至５０分の１への生存E.coli細胞の減少が、それらの空中浮遊状態からの付着後に見られることが分かる。
【０１８８】
我々の方法を用いて固定したヘキシル-PVP鎖がスライド表面から浸出できるかどうか（そしておそらくはそのことによってのみ、付着した細菌を殺菌できる）を調べるために、修飾されたHDPEスライドをポリスチレン製ペトリ皿内に配置し、S.アウレウス細胞の水性懸濁液をその上や、（非抗菌性の）ポリスチレン製表面上に噴霧した。空気乾燥及び成長寒天でインキュベートすると、ヘキシル-PVP-修飾されたHDPEスライド上ではごく僅か（1cm2当たり4±2）のコロニーが成長していたのに対し、それより遙かに多い数のコロニー（1cm2当たり85±5) が、周囲のペトリ皿の表面に、スライドの直近にまでも成長していた。殺菌性物質の放出の特徴である阻止域(Kawabata and Nishiguchi, 1988)がヘキシル-PVP-スライド周囲にないことは、固定されたポリカチオンが、スライドから浸出しないこと、即ち空中浮遊菌が実際にスライド表面に接触した時に殺菌されていることを示唆している。
【０１８９】
もう一つの重要な疑問は、ヘキシル-PVP-誘導体化スライドが水系細菌も殺菌できるかどうかである。流れる水溶液を実験的にシミュレーションするために、ポリマー・スライドを細菌のPBS、pH7.0、懸濁液中に垂直に配置し、こうして出来た系を３７℃で優しく攪拌した。２時間のインキュベート後、スライドを無菌緩衝液で洗浄して付着しなかった細菌を取り除いた後、滅菌PBS中で上に概説した条件下で１時間、インキュベートして、付着した細菌を試験的に不可逆的に脱離又は付着させた (Wiencek and Fletcher, 1995)。このスライドをPBSですすいだ後、それをすぐに固い成長寒天の層で覆い、３７℃で一晩、インキュベートした。この方法により、すべて本当の意味で付着した細菌細胞がスライド表面上に捕獲されたことになり、尚生存性のものは増殖してコロニーを形成することができる。
【０１９０】
図６a、左側、に見られるように、HDPEスライドに付着させたS.アウレウス細胞は、多数の容易に識別可能なコロニーを形成する。SiO2-又は NH2-で修飾したHDPEスライドのいずれも、付着後に成長する細菌コロニー数に大きな減少を示さなかった。しかしながら、図６a、右側に示すように、ヘキシル-PVPで修飾されたHDPEスライドで成長したS.アウレウス・コロニーの数は、98±1%低下した (表２も参照されたい)。
【０１９１】
【表６】
2004532108.tif 000019
【０１９２】
細菌をPBS、pH7.0に入れた懸濁液(S.アウレウスの場合2×106細胞／mL、そしてE.coliの場合4×106細胞／mL ）を３７℃で２時間、振盪しながらヘキシル-PVPで修飾したポリマー表面に付着させた。このスライドを滅菌PBS、pH7.0ですすぎ、それを３７℃で１時間、振盪し、再度それをすすぎ、細菌成長培地による1.5%寒天下で一晩インキュベートし、コロニーを計数した。N.d. は、付着した細菌細胞が成長はするが、識別可能なコロニーをコントロール・スライド上で形成しないために、「判定できず」を表す。他の条件については、表１の脚注を参照されたい。
【０１９３】
さらに、ヘキシル-PVPで誘導体化されたLDPE、PP、ナイロン、及びPETは接触した水系細菌を殺菌できることが実証された。表２のデータは、誘導体化により（図４）、付着した生存S.アウレウス細胞の数は97乃至99%、すべてのポリマー・スライドについて減少することを示している。同様に、修飾されたポリマー・スライドは、水系E. coliについても効果的であることが判明した。図６b、左側に見られるように、水性懸濁液から未修飾のHDPEスライドに付着したE. coli細胞は、多数の識別可能なコロニーを成長寒天のカバーの下に成長させる。LDPE、ナイロン、及びPETの上のコロニーは似ていたが、ppの上に識別可能なコロニーはなかった。HEPEをヘキシル-PVPで誘導体化すると、付着する生存E. coli細胞の数は、97±2%急に落ちる (図６b、右側、及び表２）。もう一方の修飾されたポリマーも、対応する未修飾のスライドに比較して、付着する生存E. coli細胞の数を劇的に減少させ、LDPE、PET、及びナイロンについては98乃至99%の殺菌効率が観察された（表２、最後の行）。
【０１９４】
水系細菌に対するヘキシル-PVPで修飾されたスライドの殺菌性を判定する実験条件は、空中浮遊菌に対するものと異なったため、我々は再度、スライドから培地へのポリカチオンの放出をテストした。この目的のために、ヘキシル-PVPで修飾されたHDPEスライドを２時間、滅菌PBS中で３７℃で振盪しながらインキュベートし、取り出し、S.アウレウス細胞を残りの溶液に加えた。その結果出来た懸濁液を再度、３７℃で２時間、振盪し、生存細菌細胞の数を、それを成長寒天で増殖させた後、３７℃で一晩インキュベートすることで、判定した。1mL当たり（42±4）×104個という、観察された細菌コロニー数は、コントロールのもの[(48±7)×104]と一致した。従って、細菌付着実験中、ヘキシル-PVPで修飾されたHDPEスライドからの抗菌物質の放出はほとんど認められず、水系細菌は当該の誘導体化表面に実際に接触した時に殺菌されたはずである。
【０１９５】
表面に付着させたポリカチオン鎖の殺菌機序はおそらく、それが細菌膜に貫通して細胞の損傷及び死を引き起こすステップを含むと思われる(Tiller et al., 2001)。このモデルに定量的な側面を加えるために、HDPEスライドをヘキシル-PVPでポリカチオンの表面密度を様々にして誘導体化し、空中浮遊性又は水系のS.アウレウス細胞に対する抗菌効率を上述のように測定した。図７に見られるように、表面のピリジニウム基密度が、空中浮遊菌に関しては1cm2当たり3ナノモルほど、そして水系のものに関しては1cm2当たり6ナノモルを越えたときにのみ、殺菌効果が現れ、その後の増加はない。これら二者の曲線の違いは、おそらくは、噴霧した細菌細胞が、溶液中のものとは対照的に、表面から脱離できす、従ってより低いピリジニウム基密度でも殺菌されるという事実が原因であろう。これらの観察は、材料の殺菌能力は、ポリカチオンによるその表面の被覆密度に決定的に依存していることを示している。
【０１９６】
最後に我々は、通常の材料に応用可能な抗菌性ポリマーヘキシル-PVPで表面を誘導体化する一般的な方法を開発した。合成ポリマーHDPE、LDPE、PP、ナイロン、及びPETのヘキシル-PVPで修飾された表面は、最高で99%の接触-付着S.アウレウス及びE. coli細胞を殺菌する。この方法は、数多くの製品を、乾燥状態及び湿潤状態の両方で殺菌性にする上で有用なはずである。定期的な洗浄によって容易に表面を復活させることができるであろう。
【０１９７】
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【０１９８】
実施例１３
表面に付着させたポリ(ビニル-N-ヘキシルピリジニウム)鎖の殺菌作用の考察
シリカでナノ被覆し、長鎖ポリ(ビニル-N-ヘキシルピリジニウム)で誘導体化したポリエチレン・スライドの表面は永久的に殺菌性となる。それはヒト病原性スタフィロコッカス-アウレウスの（空中浮遊及び水系の両方の）野生型及び抗生物質耐性株の９０乃至９９％を殺菌する。作製される材料は、カチオン性の防腐剤に対する耐性機序で唯一判明しているものである多剤耐性ポンプを発現する株にも同様に致死性である。
【０１９９】
日用品に使用できる、もともと殺菌性の材料を作製できれば、より健康な生活にとって大きな前進であろう。最近我々 (Tiller et al. 2001 and 2002)は、特定の長鎖疎水性ポリカチオンをガラス又はプラスチックの表面に固定すると、後者は接触した細菌を効率的に殺菌する能力を獲得することを発見した。具体的には、ポリ(ビニル-N-ヘキシルピリジニウム) (ヘキシル-PVP) で共有結合により被覆した多種の表面は、エアロゾルを介して付着し（その後乾燥し）たか、又は、水溶液から付着したかに関係なく、グラム陽性及びグラム陰性の両方の大半の細菌を殺菌することが見出された。
【０２００】
本研究で我々はさらに、この潜在的に有用な現象を調べた。具体的には、ヘキシル-PVPで誘導体化させたポリエチレン表面は、抗生物質耐性のものも含め、野生型及び変異型の汎存病原性細菌スタフィロコッカス-アウレウスに対して等しく致死的であることが確認された。死んだ細胞は容易に除去でき、表面は洗剤で洗えば完全に回復させることができる。対数増殖期に回収されたS.アウレウス細胞は、静止期のものと同様に、この殺菌作用に対して感受性がある。
【０２０１】
材料
本研究で用いたS.アウレウス株のリストを表３に挙げる。0.6% (v/v) テトラメチルシランをプロパン/ブタン混合物 (7:3, v/v)中に含有する (Pyrosil（R）) 手持ち式バーナは SurA インスツルメンツ社（ドイツ、ジェナ）から得た。高密度ポリエチレンシートはポリマー・プラスチック社から購入した。ポリ(4-ビニルピリジン) (PVP) (分子量160,000 g/mol)、3-アミノプロピルトリエトキシシラン、1,4-ジブロモブタン、1-ブロモヘキサン、及び他のすべての化学物質及び溶媒はアルドリッチ・ケミカル社から得、それ以上の精製を行わずに用いた。
【０２０２】
【表７】
2004532108.tif 000020
【０２０３】
表面の修飾
ポリエチレン製スライド(7.5×2.5 cm)をイソプロピルアルコール中で５分間、超音波処理し、８０℃で乾燥させた。手持ち式バーナの炎の前面（酸化）部分をスライド表面に１５秒間、煽って当て、スライドを空気下で一晩、保管した。SiO2で被覆されたそのスライドを3-アミノプロピルトリエトキシシランを無水トルエンに溶かした20%溶液で室温で３時間かけてアミン化させた。アミン化したスライドを9 mLの1,4-ジブロモブタン、90 mL の無水ニトロメタン、及び0.1 mLのトリエチルアミンを含有する溶液中に攪拌しながら６０℃で５時間、浸漬した後、それを9 g のPVP、10 mLの1-ブロモヘキサン, 及び81 mLのニトロメタンの調製したばかりの溶液中に配置した。７５℃で９時間、攪拌した後、スライドをメタノール及び蒸留水で十分にすすぎ、空気下で乾燥させた。
【０２０４】
抗菌効率の判定
細菌を酵母-デキストロース・ブロス(Cunliffe et al. 1999) 中で３７℃で200rpmで通気しながら６乃至８時間、成長させた。一晩の培養物から採った接種材料を0.1 M PBS に移した(約1011細胞／mL)後、1:500の希釈度になるように成長培地に導入した。
【０２０５】
空中浮遊細菌懸濁液を先に解説(Tiller et al. 2001)された通りに調製した。その細菌細胞を5,160×g で１０分間、遠心分離し、蒸留水で２回、洗浄した。蒸留水中濃度106細胞／mLの細菌懸濁液をスライドの表面にほぼ10 mL／分の速度でヒューム・フード中で噴霧した。空気下で２分間、乾燥させた後、スライドをペトリ皿内に配置し、成長寒天(酵母-デキストロース・ブロスによる0.7%寒天をオートクレーブし、３７℃に冷ましたもの）を加えた。このペトリ皿を密閉し、３７℃で一晩、インキュベートした。成長した細菌コロニーをライト・ボックスで計数した。
【０２０６】
水系細菌の懸濁液を以下のように調製した：細菌細胞を5,160×gで１０分間、遠心分離し、pH7.0のPBSで２回、洗浄し、同じ緩衝液中に再懸濁させ、2×106細胞／mLになるように希釈した。スライドを45mLの該懸濁液中に浸漬し、200rpmで振盪しながら３７℃で２時間、インキュベートした後、滅菌PBSで３回、すすぎ、それを１時間、インキュベートした。そのスライドをすぐに固形成長寒天(酵母-デキストロース・ブロスによる1.5%寒天をオートクレーブし、ペトリ皿に注ぎ入れ、減圧下で一晩、室温で乾燥させたもの）で覆った。その後細菌コロニーを計数した。
【０２０７】
ピリジニウムを含有するモノマー及びポリマーの合成
ピリジン(10 mL)、臭化ヘキシル (18 mL)、及びトリエチルアミン (0.1 mL) を122 mLのトルエンに溶解させ、この溶液を７５℃で９時間、攪拌した。次にこの溶媒を減圧下で取り除いた。こうして得られたN-ヘキシルピリジニウムブロミドをヘキサンで４回、洗浄し、真空下で一晩、乾燥させた。
【０２０８】
ポリ(4-ビニルピリジン) (5.25 g)、ヨウ化メチル (13 mL)、及びトリエチルアミン (0.1 mL) を87 mLのニトロメタンに溶解させ、この溶液を７５℃で９時間、攪拌した。室温まで冷却した後、溶媒を取り除き、100mLのトルエンを残渣に加えた。トルエンに不溶性のポリ(4-ビニル-N-メチルピリジニウムアイオダイド)を濾過により回収し、トルエン及びアセトンで洗浄し、乾燥させた。
【０２０９】
結果＆議論
我々は、ポリ(ビニル-N-アルキルピリジニウム)鎖で誘導体した表面の殺菌作用の機序及び実用性に関するいくつかの疑問に答えを出している(Tiller et al. 2001 and 2002)。例えば、市販の高密度ポリエチレンの大型シートから切り出した7.5×2.5cmのスライドをシリカのナノ層で被覆した後、先に解説された(Tiller et al. 2002)ように160,000-g／molヘキシル-PVPを共有結合により付着させた。作製されたスライドの抗菌活性を一般的な病原性S.アウレウスについて、２つの異なる特徴（「空中浮遊」及び「水系」と呼ばれる）でテストした。空中浮遊菌の場合、細菌細胞の水性懸濁液をスライドに噴霧した後乾燥させ、成長寒天を上に載せ、３７℃でインキュベートし、細菌コロニーの数を計数した。水系の場合、スライドを細菌細胞の水性懸濁液に浸漬し、そこで３７℃でインキュベートし、洗浄し、固形成長寒天で覆い、再度３７℃でインキュベートした後、細菌コロニーの数を計数した。
【０２１０】
野生型S.アウレウス細胞を空中浮遊菌の方法で未修飾の高密度ポリエチレン・スライドの表面に付着させ、上述のように培養した場合、その後308±16個のコロニーが3.75cm2の前面部分に検出された。同じ実験を、シリカで被覆したスライドと、さらにアミン化もさせたものでも行ったところ、対応する細菌コロニーの数は、それぞれ、339±2及び228±2だった。このように三種類の異なる表面に付着した細菌細胞はいずれも、高率で生存した。対照的に、同一の手法をヘキシル-PVPで誘導体化したスライドに応用したところ、僅かに14±1個の細菌コロニーが、3.75-cm2の前面部分に観察され、即ち未修飾のスライドに比較して5±1%だった。同様に、水系S.アウレウス細胞の場合、最初のポリエチレン・スライドに比較して僅かに4±2%のコロニーが、ヘキシル-PVPを固定した表面上で計数された。これらの95%＋という殺菌効率は、ヘキシル-PVPで修飾された表面に関して前に発見されたもの (Tiller et al. 2001 and 2002)と同じである。
【０２１１】
次に我々は、上述のヘキシル-PVPによる表面保護の耐久性という疑問に対処した。この目的のために、生存S.アウレウス細胞から成長させたコロニーを計数後に、このヘキシル-PVPで誘導体化したスライドを0.1 M セチルトリメチル塩化アンモニウム水溶液で洗浄した後、蒸留水ですすぐことで、それらを完全に取り除いた。こうして洗浄されたスライドを空中浮遊性又は水系S.アウレウスのいずれかの付着に再利用した。同一に洗浄された未修飾のポリエチレン・スライドのものに比較したときの、形成されたコロニーのパーセンテージはそれぞれ4±1%及び2±1%だった。このように、洗剤で洗浄しても、固定化されたヘキシル-PVPの殺菌効力には何の影響もない。
【０２１２】
本明細書及び他所の両方でのこれまでの我々の研究では (Tiller et al. 2001 及び2002)、実験で用いた細菌細胞はいずれも、それらの増殖曲線の静止期にあった。増殖の対数期にある細胞が、表面に付着させたヘキシル-PVP鎖の抗菌作用に等しく感受性があるかどうかを確立することに関心があった。こうして我々は、S.アウレウスを発酵させて、細胞濃度を時間の関数として観察した。その結果出たデータは古典的なＳ字状曲線 (Ingraham et al. 1983)となり、我々の条件下では６時間後に静止期に完全に達した（方法の項を参照されたい）。前のように６乃至８時間後に細菌細胞を回収する代わりに、我々はちょうど４時間後、即ちそれらの対数成長期中に、回収した。これらの空中浮遊菌及び水系菌の細胞をヘキシル-PVPで誘導体化させたスライドに付着させると、得られた細菌効率は（未修飾のポリエチレン・スライド上の同じ細胞に比較したときの）、それぞれ5±2%及び2±1%、即ち、静止期（上を参照されたい）の細胞で観察された値と同一、であった。
【０２１３】
多剤耐性（MDR）細菌株は、ヒトの健康にとって大きな脅威である (Levy 1998, Lewis et al. 2001)。これを念頭に、我々は固定化されたヘキシル-PVPがこのような株にも効果的かどうかをテストした。この目的のために、これまで用いたS.アウレウスの野生株（ATCC 33807)に加え、我々は三種類の別々の抗生物質耐性株(Kluytmans et al. 1997) - ATCC 700698 (メチシリンに耐性）、ATCC BAA-38 (メチシリン、ペニシリン、ストレプトマイシン、及びテトラサイクリンに耐性）及びATCC BAA-39 (ペニシリン、テトラサイクリン、イミペネム、セファクロール、オキサシリン、トブラマイシン、セファレキシン、セフロキシム、ゲンタマイシン、アモキシシリン、クリンダマイシン、エリスロマイシン、及びセファマンドールに耐性）を調べた。図８に見られるように、ヘキシル-PVPで被覆したポリエチレン・スライドは、空中浮遊菌又は水系菌に関係なく、これらの細菌株にも同様に致死性であり、いずれの場合でもその殺菌効率は90%を遙かに越えた。固定化されたヘキシル-PVP鎖は、細菌細胞壁／膜を貫通し、おそらくはこうして自己分解を起こさせることでそれらの殺菌効果を果たすのだと考えられる (Tiller et al. 2001)。
【０２１４】
他のすべての細菌研究 (Lewis 1994, Lewis et al. 2001)と同様、S.アウレウスは細胞から多様な毒性化合物を吐き出すいくつかのMDRポンプを持つ。例えばNorA MDRポンプは細胞を、通常の殺菌剤塩化ベンザルコニウムを含む数多くの両親媒性カチオンから細胞を保護する (Ng et al. 1994)。こうして、MDRポンプをコードするnor A遺伝子をノックアウトしたS.アウレウスの変異株はこのような化合物に実質的により大きな感受性を有する (Hsieh et al. 1998)。ヘキシル-PVPはベンザルコニウムと同様、疎水性の四級アンモニウムカチオンであるため、我々は固定化されたヘキシル-PVPに対するnorA変異株の感受性をテストすることに決めた。この実験の結果を図９Ａに示す。ポンプのない変異体に対する殺菌効率は、空中浮遊菌及び水系菌について、そのポンプ・コンピテントな親に対する効率−それぞれ 95±2% 及び97±1%、よりも幾分高く、99±1%だったことが窺える。
【０２１５】
天然の伝染性プラスミドから発現させた付加的なMDRポンプ（QacA＋と指定する）をその親に比較して持つS.アウレウス株で、我々は同様な実験を行った。この株は、固定化ヘキシル-PVPに対して、そのポンプ欠損型である親（図２Ｂ）よりも僅かに高い耐性を有し、空中浮遊菌及び水系菌変異型でそれぞれその親の92±3%及び94±3%に対し、96±2%及び98±1%だった。
【０２１６】
MDRを欠損する／過剰発現する株の間で、ヘキシル-PVPに対する感受性で観察される違いが、このように大変小さいことは、ポリマー型である当該防腐剤は、前記ポンプでは効果的に排出されないことを示唆している。あるいは、N-ヘキシルピリジニウムは、MDRの基質ではないのかも知れない。これらの可能性を判別するために、細胞をN-ヘキシルピリジニウムブロミドの水溶液で処理し、最小阻止濃度(MIC) を判定した。この化合物は大変弱い抗菌物質であることが判明し、野生型S.アウレウスに対するMICは4mg/mLであった（表４）。この値は従来の防腐剤塩化ベンザルコニウムのそれの１，０００倍を越える（表４）。株のN-ヘキシルピリジニウムに対する感受性はそれらのMDRの状況に応じて違いがあった。このように、norA株のMICは0.5 mg/mLであり、そしてQacA+株のそれは4 mg/mLを上回った。これは量的には、これらの株の塩化ベンザルコニウムへの感受性の違いに似ており、N-ヘキシル-ピリジニウムは弱い抗菌物質ではあるが、MDRにとっては理にかなった基質であることを示している。水溶性のポリ(ビニル-N-メチルピリジニウムアイオダイド)を代わりにテストした場合(これまで我々の研究ではその固定化型で用いていたヘキシル-PVP自体は水溶性でなく、従ってMIC研究では使用できなかったことに留意されたい）、MIC値は75μg/mLという、単量体型の前駆体N-ヘキシルピリジニウムブロミドのそれよりもかなり低い値であることが判明した。テストした株の間で、この化合物のMIC値に違いはなかった。このように、防腐剤を重合体化すると、その性質に対して２つの結果、即ち、その効力を高めることと、MDRポンプの作用に対してそれを非感受性とすること、がもたらされるようである。
【０２１７】
【表８】
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【０２１８】
耐性の発生は新しい抗菌薬を販売するときの大きな懸念である。MDRによる排出は、疎水性のカチオン性防腐剤に対する耐性機序で唯一知られているものである(Lewis 2001, Severina et al. 2002)。我々の発見は、表面に付着させたヘキシル-PVPに対する耐性はこのような機序を通じては発生するとは考えられないことを示している。
【０２１９】
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【０２２０】
引用による援用
ここで言及したすべての公開文献及び特許の全文を、個々の公開文献又は特許を引用をもって援用することを具体的かつ個別に示すのと同様に、引用を持ってここに援用することとする。矛盾がある場合、ここに提供したあらゆる定義も含む本出願を優先させることとする。
【０２２１】
同等物
当業者であれば、慣例的な実験を行うのみで、ここに解説した本発明の具体的な実施態様の同等物を数多く認識され、又は確認できることであろう。このような同等物は以下の請求の範囲の包含するところと意図されている。
【図面の簡単な説明】
【０２２２】
【図１】市販のNH2-ガラススライド（左）およびヘキシル-PVP修飾スライド（右）に黄色ブドウ球菌細胞の水性懸濁液（蒸留水1mLに対して細胞約106個）をスプレーし、２分間空気乾燥して、37℃で一晩、細菌成長培地の0.7%寒天下でインキュベートした様子を示す。
【図２】さまざまな直鎖臭化アルキルでN-アルキル化したPVPで修飾したガラススライドの感染表面上に成長させた黄色ブドウ球菌コロニーの、市販用NH2-ガラススライド上に成長させたコロニー数に対する割合を示す。
【図３】方法Aによって調製した本願発明の化合物を示す。
【図４】燃焼化学蒸気沈着法を用いたSiO2ナノ層でコーティングするステップと、3-アミノプロピルトリエトキシシランで処理するステップと、1,4-ジブロモブタンでアルキル化するステップと、1-ブロモヘキサンの存在下でヘキシル-PVPで誘導体化するステップと、の４ステップを含む、ポリ（ビニル-N-ヘキシルピリジニウム臭化物）（ヘキシル-PVP）によるポリマー表面の誘導体化を図示する。
【図５】市販用HDPEスライド（左）およびヘキシル-PVP誘導体化スライド（右）に、（a）黄色ブドウ球菌または（b）大腸菌細胞の水性懸濁液（蒸留水1mLに対して細胞約106個）をスプレーし、２分間空気乾燥して、37℃で一晩、細菌成長培地の0.7%寒天下でインキュベートした様子の写真を示す。
【図６】市販用HDPEスライド（左）およびヘキシル-PVP誘導体化スライド（右）に、（a）黄色ブドウ球菌または（b）大腸菌細胞を水性PBS、pH7.0懸濁液（PBS1mLに対して細胞約106個）から付着させ、PBSで洗浄し、37℃で一晩、細菌成長培地の1.5%寒天下でインキュベートした様子の写真を示す。
【図７】ヘキシル-PVP誘導体化HDPEの、表面上に沈着した空中（黒丸）または水中（白丸）黄色ブドウ球菌細胞に対する死滅効率を、ピリジニウム基の表面密度の関数として示す。マイナスの割合は修飾したスライドに付着した細菌細胞数が非修飾スライド上よりも多いことに対応する。
【図８】黄色ブドウ球菌の野生種およびさまざまな抗菌物質耐性株に対する、ヘキシル-PVP共有結合的にコーティングしたポリエチレンスライドの殺菌活性をグラフで示す。空中（グレーの棒）または水中（斜線の棒）のいずれかの細菌懸濁液をスライド表面に沈着させた。平均死滅効率値からの標準偏差は、エラーバーで表す。
【図９】黄色ブドウ球菌親／突然変異株２組に対する、ヘキシル-PVPで共有結合的にコーティングしたポリエチレンスライドの殺菌活性をグラフで示す。１組目（A）では、突然変異体はnorA遺伝子（ノックアウトされている）によってコードされたMDRポンプが欠損しているが、それ以外が同一の親株はそれを有している。２組目（B）では、親株にはqacA遺伝子によってコードされるMDRポンプが欠損しており、プラスミドを有する株はそれを有している。
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図７】
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【図９】
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【図１】
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【図６】
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【図８】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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