(57)【要約】本発明は、実質的に純粋なマンニン−結合レクチン会合セリンプロテアーゼ−２（ＭＡＳＰ−２）ポリペプチド及びそのフラグメント、並びにそのようなポリペプチドをコードする核酸に関する。さらに、本発明は、マンナン−結合性レクチン会合セリンプロテアーゼ−２（ＭＡＳＰ−２）由来のアミノ酸配列（配列番号２）又はその機能的相同体を含んで成る実質的に純粋なポリペプチドの医薬組成物の生成のためへの使用、並びにＭＡＳＰ−２及び／又はＭＡＳＰ−２フラグメントを含んで成る医薬組成物に関する。さらに、本発明は、ＭＡＳＰ−２のインヒビター、及びそのようなインヒビターを含んで成る医薬組成物に関する。ＭＡＳＰ−２核酸発現を検出するための方法が本発明に包含される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
マンナン−結合性レクチンに会合したセリンプロテアーゼ−２（ＭＡＳＰ−２）由来のアミノ酸配列（配列番号２）又はその機能的相同体を含んで成る実質的に純粋なポリペプチドの医薬組成物の生成のためへの使用。
【請求項２】
前記ポリペプチドが、配列番号３として同定される配列を含んで成る請求項１記載の使用。
【請求項３】
前記ポリペプチドが、マンナン結合性レクチン（ＭＢＬ）と会合することができる請求項１記載の使用。
【請求項４】
前記ポリペプチドが、ラベル又はトキシンに接合される請求項１又は２記載の使用。
【請求項５】
前記ポリペプチドが、配列番号１として同定される配列又はその機能的同等物を含んで成る請求項１〜４のいずれか１項記載の使用。
【請求項６】
前記ポリペプチドが、２０ｋＤの分子質量を有する請求項１〜５のいずれか１項記載の使用。
【請求項７】
前記ポリペプチドが、配列番号２のアミノ酸３０〜４４４を含んで成る請求項１〜４のいずれか１項記載の使用。
【請求項８】
前記ポリペプチドが、５２ｋＤの分子質量を有する請求項１〜７のいずれか１項記載の使用。
【請求項９】
前記ポリペプチドが、配列番号２のアミノ酸１３８〜２９６を含んで成る請求項１〜４のいずれか１項記載の使用。
【請求項１０】
前記ポリペプチドが、セリンプロテアーゼ活性を有する請求項１〜９のいずれか１項記載の使用。
【請求項１１】
前記ポリペプチドが、ＭＢＬ補体経路機能についてインビトロアッセイにおいてＭＡＳＰ−２活性を阻害できる請求項１〜１０のいずれか１項記載の使用。
【請求項１２】
前記ポリペプチドが、配列番号３のアミノ酸１５〜６７１を含んで成る請求項１０又は１１記載の使用。
【請求項１３】
前記ポリペプチドが、配列番号２のアミノ酸１６〜２９６を含んで成る請求項１０又は１１記載の使用。
【請求項１４】
前記ポリペプチドが、配列番号２のアミノ酸３０〜２９６を含んで成る請求項１０又は１１記載の使用。
【請求項１５】
前記ポリペプチドが、ＭＡＳＰ−２活性を競争的に阻害できる請求項１〜１４いずれかに１項記載の使用。
【請求項１６】
前記ポリペプチドが、配列番号２のポリペプチドのフラグメントを含んで成り、前記ポリペプチドがＭＢＬ／ＭＡＳＰ−２を複合体化できる競争インヒビターである請求項１５記載の使用。
【請求項１７】
前記ポリペプチドが、配列番号３として同定される配列又はその機能的同等物を含んで成り、ここで位置８， ９， １０， １１， １２， １３， １４， １５， １６， １７， １８又は１９での１又は複数のアミノ酸残基がもう１つのアミノ酸残基により位置されている請求項１５又は１６記載の使用。
【請求項１８】
前記少なくとも２つのアミノ酸残基が置換されている請求項１７記載の使用。
【請求項１９】
配列番号３の位置１４でのａｒｇが、もう１つのアミノ酸により置換されている請求項１７記載の使用。
【請求項２０】
配列番号３の位置１４でのａｒｇが、小さな荷電されていないアミノ酸から成る群から選択されたアミノ酸により配置されている請求項１７記載の使用。
【請求項２１】
配列番号３の位置１４でのａｒｇが、ｇｌｙ及びａｌａから成る群から選択されたアミノ酸により置換されている請求項１７記載の使用。
【請求項２２】
前記医薬組成物が、感染の処理のためである請求項１〜２１のいずれか１項記載の使用。
【請求項２３】
前記感染が、微生物種により引き起こされる感染である請求項２２記載の使用。
【請求項２４】
前記微生物種が、菌類である請求項２３記載の使用。
【請求項２５】
前記微生物種が、酵母である請求項２３記載の使用。
【請求項２６】
前記微生物種が、細菌である請求項２３記載の使用。
【請求項２７】
前記細胞種が、少なくとも１つの抗生物質薬剤に対して耐性である請求項２６記載の使用。
【請求項２８】
前記細菌種が、多耐性である請求項２６記載の使用。
【請求項２９】
前記細菌種が、病原性である請求項２６記載の使用。
【請求項３０】
前記感染が、ウィルス感染である請求項２２記載の使用。
【請求項３１】
前記ウィルスが、レトロウィルスである請求項３０記載の使用。
【請求項３２】
前記レトロウィルスが、ヒト免疫欠損ウィルスである請求項３１記載の使用。
【請求項３３】
前記医薬組成物がさらに、少なくとも１つのマンナン−結合性レクチン（ＭＢＬ）サブユニット、又は前記少なくとも１つのマンナン−結合性レクチン（ＭＢＬ）サブユニットを含んで成る少なくとも１つのマンナン−結合性レクチン（ＭＢＬ）オリゴマーを含んで成る請求項１記載の使用。
【請求項３４】
少なくとも１つのマンナン−結合性レクチン（ＭＢＬ）サブユニット、又は前記少なくとも１つのマンナン−結合性レクチン（ＭＢＬ）サブユニットを含んで成る少なくとも１つのマンナン−結合性レクチン（ＭＢＬ）オリゴマーの、キットの部品を得るための薬剤の製造のためへの使用をさらに含んで成る請求項１記載の使用。
【請求項３５】
前記オリゴマーが、ＭＢＬのテトラマー、ペンタマー及び／又はヘキサマーから成るオリゴマーの群から好ましくは選択される請求項３３又は３４記載の使用。
【請求項３６】
前記医薬組成物が、５００ｎｇ／ｍｌ以下の血清レベルのＭＢＬによる、個人における感染の処理のためである請求項３３〜３５のいずれか１項記載の使用。
【請求項３７】
前記医薬組成物が、１００ｎｇ／ｍｌ以下の血清レベルのＭＢＬによる、個人における感染の処理のためである請求項３３〜３５のいずれか１項記載の使用。
【請求項３８】
前記医薬組成物が、５０ｎｇ／ｍｌ以下の血清レベルのＭＢＬによる、個人における感染の処理のためである請求項３３〜３５のいずれか１項記載の使用。
【請求項３９】
配列番号１として同定される配列又はその機能的相同体を含むポリペプチド。
【請求項４０】
前記ポリペプチドが、２０ｋＤの分子質量を有する請求項３９記載のポリペプチド。
【請求項４１】
前記ポリペプチドが、配列番号２のアミノ酸３０〜４４４を含んで成る請求項３９記載のポリペプチド。
【請求項４２】
前記ポリペプチドが、５２ｋＤの分子質量を有する請求項３９記載のポリペプチド。
【請求項４３】
前記ポリペプチドが、配列番号２のアミノ酸１３８〜２９６を含んで成る請求項３９記載のポリペプチド。
【請求項４４】
前記ポリペプチドが、セリンプロテアーゼ活性を有する請求項３９記載のポリペプチド。
【請求項４５】
前記ポリペプチドが、配列番号３のアミノ酸１５〜６７１を含んで成る請求項３９記載のポリペプチド。
【請求項４６】
前記ポリペプチドが、配列番号２のアミノ酸１６〜２９６を含んで成る請求項３９記載のポリペプチド。
【請求項４７】
前記ポリペプチドが、配列番号２のアミノ酸３０〜２９６を含んで成る請求項３９記載のポリペプチド。
【請求項４８】
前記ポリペプチドが、ＭＢＬ補体経路機能についてインビトロアッセイにおいてＭＡＳＰ−２活性を阻害できる請求項３９記載のポリペプチド。
【請求項４９】
前記ポリペプチドが、ＭＡＳＰ−２セリンプロテアーゼ活性を競争的に阻害できる請求項３９記載のポリペプチド。
【請求項５０】
配列番号３により同定されるような配列又はその機能的相同体を含んで成り、前記ポリペプチドがＭＢＬ／ＭＡＳＰ−２の複合体化の競争インヒビターである請求項３９記載のポリペプチド。
【請求項５１】
配列番号３として同定される配列又はその機能的相同体を含んで成り、ここで位置８， ９， １０， １１， １２， １３， １４， １５， １６， １７， １８又は１９での１又は複数のアミノ酸残基がもう１つのアミノ酸残基により位置されている請求項３９記載のポリペプチド。
【請求項５２】
前記少なくとも２つのアミノ酸残基が置換されている請求項５１記載のポリペプチド。
【請求項５３】
配列番号３の位置１４でのａｒｇが、もう１つのアミノ酸により置換されている請求項５１記載のポリペプチド。
【請求項５４】
配列番号３の位置１４でのａｒｇが、小さな荷電されていないアミノ酸から成る群から選択されたアミノ酸により配置されている請求項５１記載のポリペプチド。
【請求項５５】
配列番号３の位置１４でのａｒｇが、ｇｌｙ及びａｌａから成る群から選択されたアミノ酸により置換されている請求項５１記載のポリペプチド。
【請求項５６】
前記ポリペプチドが、ラベル又はトキシンに接合される請求項３９又は５５記載のポリペプチド。
【請求項５７】
請求項３９， ４１， ４３， ４５， ４６， ４７及び５０〜５５のいずれか１項記載のポリペプチド配列に対して少なくとも８５％同一である配列を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んで成る単離された核酸分子。
【請求項５８】
請求項５７記載の核酸分子を含んで成る核酸ベクター。
【請求項５９】
前記ベクターが発現ベクターである請求項５８記載のベクター。
【請求項６０】
調節要素をさらに含んで成る請求項５８記載のベクター。
【請求項６１】
ＭＡＳＰ−２の活性を競争阻害できる化合物又はその機能的相同体の薬剤の調製のためへの使用。
【請求項６２】
前記化合物が、ＭＡＳＰ−２の活性を競争阻害することができる請求項６１記載の使用。
【請求項６３】
前記化合物が、請求項４９〜５５のいずれか１項記載のポリペプチドである請求項６１記載の使用。
【請求項６４】
前記化合物が、ＭＡＳＰ−２と会合できるマンナン−結合性レクチン（ＭＢＬ）のフラグメントである請求項６１記載の使用。
【請求項６５】
前記化合物が、抗体生成動物にＭＡＳＰ−２ポリペプチドを投与することによって生成される抗体である請求項６１記載の使用。
【請求項６６】
前記化合物が、ＭＡＳＰ−２に対して選択的に結合する抗体である。請求項６１記載の使用。
【請求項６７】
前記抗体がモノクローナル抗体である請求項６５又は６６記載の使用。
【請求項６８】
前記抗体が、検出マーカーを含んで成る化合物にカップリングされる請求項６５又は６６記載の使用。
【請求項６９】
マンナン−結合性レクチン会合セリンプロテアーゼ−２（ＭＡＳＰ−２）由来のアミノ酸配列（配列番号２）又はその機能的相同体を含んで成る実質的に純粋な医薬組成物に生成のためのポリペプチドを含んで成る医薬組成物。
【請求項７０】
前記ポリペプチドが、配列番号３として同定される配列を含んで成る請求項６９記載の医薬組成物。
【請求項７１】
前記ポリペプチドが、マンナン結合性レクチン（ＭＢＬ）と会合することができる請求項６９記載の医薬組成物。
【請求項７２】
前記ポリペプチドが、ラベル又はトキシンに接合される請求項６９記載の医薬組成物。
【請求項７３】
請求項３９〜５５のいずれか１項記載のポリペプチドを含んで成る請求項６９記載の医薬組成物。
【請求項７４】
マンニン−結合レクチン会合セリンプロテアーゼ２（ＭＡＳＰ−２）の検出方法であって、
（ａ）生物学的サンプルを獲得し；
（ｂ）前記生物学的サンプルと、ＭＡＳＰ−２を特異的に結合するＭＡＳＰ−２ポリペプチド特異的結合パートナーとを接触せしめ；そして
（ｃ）存在するなら、前記サンプルにおけるマンニン−結合レクチン会合セリンプロテアーゼ−２の存在の表示として、前記複合体を検出することを含んで成る方法。
【請求項７５】
前記特異的結合パートナーが抗体である請求項７４記載の方法。
【請求項７６】
ＭＡＳＰ−２補体固定活性についてのアッセイを含んで成るＭＡＳＰ−２の検出方法。
【請求項７７】
生物学的サンプルにおけるＭＡＳＰ−２又はＭＡＳＰ−２活性の定量アッセイのための請求項７４又は７６記載の方法。
【請求項７８】
ＭＡＳＰ−２核酸発現の検出方法であって、請求項５７記載の核酸に対して、緊縮条件下で特異的にハイブリダイズする核酸プローブと共にサンプルを混合することによって、ＭＡＳＰ−２ポリペプチドをコードする配列を有するＲＮＡを検出することを含んで成る方法。
【請求項７９】
請求項３９〜４２及び４５〜４７のいずれか１項記載のペプチドを、患者に投与することによって、ＭＡＳＰ−２を欠失する患者を処理するための方法。
【請求項８０】
請求項５７記載の核酸を患者に投与することによって、ＭＡＳＰ−２を欠失する患者を処理するための方法。
【請求項８１】
ＭＡＳＰ−２の発現又は活性を阻害する化合物を、対象に投与することによって、ＭＡＳＰ−２の活性を阻害するための方法。
【請求項８２】
前記化合物が、ＭＡＳＰ−２アンチセンス核酸配列である請求項８１記載の方法。
【請求項８３】
ＭＢＬ及びＭＡＳＰ−２の複合体化を阻害する化合物を投与することを含んで成る請求項８１記載の方法。
【請求項８４】
ＭＡＳＰ−２をコードする核酸配列における多形現象についてのアッセイ。
【請求項８５】
サンプルにおけるＭＡＳＰ−２コードを核酸の存在を検出するための方法であって、緊縮条件下でＭＡＳＰ−２コード核酸との複合体を形成できる少なくとも１つの核酸プローブとサンプルとを混合し、そしてプローブがサンプル核酸に結合されるかどうかを決定することを含んで成る方法。
【請求項８６】
緊縮条件下でＭＡＳＰ−２コード核酸と複合体を形成できる核酸プローブ。
【請求項８７】
ＭＡＳＰ−２又はその前駆体を含んで成るポリペプチド配列における多形現象についてのアッセイ。
【請求項８８】
ＭＡＳＰ−２の異常発現に関連する障害の診断方法であって、患者から生物学的サンプルを獲得し、そして前記生物学的サンプルにおけるＭＡＳＰ−２発現を測定することを含んで成り、ここで対照に比較して、前記生物学的サンプルにおける高められた又は低められたＭＡＳＰ−２発現が、前記患者がＭＡＳＰ−２の異常発現に関連する障害を有することを示す方法。
【請求項８９】
ＭＡＳＰ−２の異常活性に関連する障害の診断方法であって、患者から生物学的サンプルを獲得し、そして前記生物学的サンプルにおけるＭＡＳＰ−２活性を測定することを含んで成り、ここで対照に比較して、前記生物学的サンプルにおける高められた又は低められたＭＡＳＰ−２活性が、前記患者がＭＡＳＰ−２の異常発現に関連する障害を有することを示す方法。
【請求項９０】
活性ＭＢＬ−複合体化ＭＡＳＰについてのアッセイ方法であって、アッセイされるべきサンプルを供給し、そして従来の補体固定経路の活性化を効果的に低めるのに十分であるが、ＭＢＬ−複合体化ＭＡＳＰの活性を実質的に妨げないほど高いイオン強度の存在下でアッセイを行うことによって、従来の補体固定経路の活性化に起因するいずれかの人工産物を実質的に低めることを含んで成る方法。
【請求項９１】
ＭＡＳＰ−２活性についてのアッセイを含んで成る、ＭＡＳＰ−２の活性の決定方法であって、
−ＭＢＬ／ＭＡＳＰ−２複合体を含んで成るサンプルを、固相に適用し、結合された複合体を獲得し、
−少なくとも１つの補体因子を、前記複合体に適用し、
−切断された補体因子の量を検出し、
−前記切断された補体因子の量を、前記ＭＡＳＰ−２の量と対比し、そして
−ＭＡＳＰ−２の活性を決定する段階を含んで成る方法。
【請求項９２】
前記固相が、マンナン被膜である請求項９１記載の方法。
【請求項９３】
前記少なくとも１つの補体因子が、ＭＢＬ／ＭＡＳＰ−２複合体により切断できる補体因子である請求項９１又は９２記載の方法。
【請求項９４】
前記少なくとも１つの補体因子が、Ｃ３、Ｃ４及びＣ５、好ましくはＣ４から選択される請求項９１〜９３のいずれか１項記載の方法。
【請求項９５】
前記切断された補体因子が、前記補体因子に対して向けられた抗体により検出される請求項９１〜９４のいずれか１項記載の方法。
【請求項９６】
前記従来の補体経路の活性化が阻害される請求項９１〜９５のいずれか１項記載の方法。
【請求項９７】
前記活性化が、高いイオン強度でアッセイを行うことによって阻害される請求項９６記載の方法。
【請求項９８】
前記塩濃度が、０．２Ｍ以上、例えば０．３Ｍ〜１０Ｍ、例えば０．５Ｍ〜５Ｍ、例えば０．７Ｍ〜２Ｍ、例えば０．９Ｍ〜２Ｍ、例えば約１．０Ｍである請求項９７記載の方法。
【請求項９９】
前記塩が、ＮａＣｌ， ＫＣｌ， ＭｇＣｌ２， ＣａＣｌ２， ＮａＩ， ＫＣｌ， ＭｇＩ２， ＣａＩ２， ＮａＢｒ， ＫＢｒ， ＭｇＢｒ２， ＣａＢｒ２， Ｎａ２Ｓ２Ｏ３， （ＮＨ４）２ＳＯ４及びＮＨ４ＨＣＯ３から選択される請求項９８記載の方法。
【請求項１００】
生物学的サンプルにおけるＭＡＳＰ−２又はＭＡＳＰ−２活性の定量的アッセイのためである請求項９１〜９９のいずれか１項記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野：
本発明は、マンナン結合性タンパク質とも呼ばれる、マンナン−結合性レクチン（ＭＢＬ）を包含する補体固定化のための生来の経路の一般的分野に関する。
【０００２】
発明の背景：
補体システムは、先天性及び適応性免疫防御の機能にとって重要な複雑に整列した酵素及び非酵素タンパク質を含んで成る（１）。最近まで、次の２種の活性化形式、すなわち抗体−抗原複合体により開始される従来の経路及び微生物の表面上の一定の構造物により開始されるもう１つの経路が知られている。補体活性化の第３の新規抗体−無関係経路が記載されている（２）。この経路は、マンナン−結合性レクチン（ＭＢＬ、マンナン−結合タンパク質、ＮＢＰとして最初に記載されている；Ｅｚｅｋｏｗｉｔｚ， アメリカ特許第５，２７０，１９９号を参照のこと）が炭水化物に結合する場合に開始される。
【０００３】
ＭＢＬは構造的に、補体の成分Ｃ１のＣ１ｑ副成分に関連し、そしてＭＢＬは従来の経路のＣ１ｒ及びＣ１ｓ成分に類似する、ＭＡＳＰ（４）又はｐ１００（５）と称する会合されるセリンプロテアーゼを通して補体システムを活性化すると思われる。この新規補体活性化経路は、ＭＢＬｅｃｔｉｎ経路と呼ばれる。この経路についての推定される機構によれば、ＭＢＬは、広範囲の種類の微生物、例えば細菌、酵母、寄生原生動物及びウィルスの表面上に見出される特定の炭水化物構造体に結合し（６）、そしてその抗微生物活性は、末端の溶菌性補体経路成分（７）又は促進性ファゴサイトーシス（８）の活性化に起因する。
【０００４】
報告によれば、血漿におけるＭＢＬのレベルが一般的に決定され得る（９， １０， １１）。ＭＢＬ欠失は、子供（１２， １３）及びたぶん、成人（１３， １４）において種々の微生物による時折の感染に対する感受性に関連している。最近の情報は、ＨＩＶ感染及びＡＩＤＳの進行に続いてのより急速な死とＭＢＬ欠失とを関連づけている（１５， １６）。ＭＢＬは、リウマチ様関節炎患者に高濃度で見出され、そして次に、補体を活性化する、ＩｇＧ（ＧＯ）のガラクトシル形に結合する（１７）。ＭＢＬ欠失はまた、再発性自然流産（１８）の素因、及びまた全身性エリテマトーデス（１９）の進行の素因と関連している。
【０００５】
第１の臨床学的再構成試験においては、再発性感染を有するＭＢＬ−欠失幼女は、精製されたＭＢＬによる感染により明らかに治療された（２０）。ＭＢＬに関する最近の再考に関しては、文献６を参照のこと。
ＭＢＬ−欠失に関連する比較的高い頻度のＭＢＬ突然変異が研究されたすべての集団に報告されている。この観察は、ＭＢＬが、ある場合、標的組織への接近を得るために、ＭＢＬを利用する一定の細胞内感染剤に対して個人をより敏感にする仮説を導いている（２１）。ＭＢＬは補体システムの非常に強力な活性化剤であるので、微生物炭水化物又は内毒素を通しての不適当な活性化は損傷性炎症応答を導くことができる（１０）。従って、集団の全体的な生存性は、広い個々の範囲のＭＢＬ濃度から有益であり得る。
【０００６】
ＭＡＳＰ−１（ＭＢＰ−会合セリンプロテアーゼ、ＭＡＳＰ）は、トリプシン及びトリプシン様セリンプロテアーゼに見出されるタイプのヒスチジンループ構造を有するが、補体経路のＣ１ｒ及びＣ１ｓに対して構造的に類似するセリンプロテアーゼである。１９個のアミノ酸の推定上のリーダーペプチド、続いて、成熟ペプチドを形成することが推定される６８０個のアミノ酸残基をコードする、ＭＡＳＰ−１コードのｃＤＮＡクローンが報告されている。
摘要は、ＭＡＳＰ−２（２２）と称する第２ＭＡＳＰの存在を報告している。
【０００７】
発明の要約：
本発明は、マンナン−結合性レクチン会合セリンプロテアーゼ−２（ＭＡＳＰ−２）由来のアミノ酸配列（配列番号２）又はその機能的相同体を含んで成る実質的に純粋なポリペプチドの医薬組成物の生成のためへの使用に関する。
本発明は、マンナン−結合性レクチン（ＭＢＬ）会合セリンプロテアーゼ（ＭＡＳＰ−２）の単離及び特徴化に関する。ＭＡＳＰ−２は、前に報告されたＭＡＳＰ（ＭＡＳＰ−１）及び２種のＣ１ｑ−会合セリンプロテアーゼ、すなわちＣ１ｒ及びＣ１ｓとのいくらかの相同性を示す。ＭＢＬは単独で、補体活性化の機能的ＭＢＬｅｃｔｉｎ経路を提供しない。
【０００８】
本発明者は、ＭＡＳＰ−２をコードするｃＤＮＡをクローン化し、そして配列決定した。さらに、本発明者は、抗−ＭＡＳＰ−２抗体を生成し、そして体液又は組織抽出物におけるＭＡＳＰ−２の評価についてのアッセイを構成した。さらに、本発明者は、ＭＢＬ／ＭＡＳＰ複合体の一部として、又はＭＢＬにより会合されない遊離ＭＡＳＰとして存在する場合、血清又は血漿におけるＭＡＳＰ−２活性の決定についての定量アッセイを構成した。
【０００９】
従って、本発明の１つの観点は、実質的に純粋なマンナン−結合性レクチン会合セリンプロテアーゼ−２（ＭＡＳＰ−２）ポリペプチド及びそのようなポリペプチドをコードする核酸を特徴とする。好ましくは、ＭＡＳＰ−２ポリペプチドは、ＭＢＬｅｃｔｉｎ補体経路機能についてのインビトロアッセイ、例えば下記に記載されるアッセイシステムの１つにおける１又は複数のＭＡＳＰ−２機能、例えばマンナン−結合性レクチン（ＭＢＬ）と会合できるその機能、セリンプロテアーゼ活性、又はＭＡＳＰ−２活性を保持する。本発明のいくつかのＭＡＳＰ−２ポリペプチド、例えば結合アッセイに使用されるそれらのポリペプチドは、アッセイにおけるそれらの存在の検出及び／又は定量化を可能ンするために、ラベルに結合され得る。適切なラベルは、シグナル（例えば、可視吸光性）を生成する酵素、蛍光団、放射性核種、等を包含する。
【００１０】
他のＭＡＳＰ−２ポリペプチドは、上記ＭＡＳＰ−２活性の１つを競争的に阻害でき、そしてそれにより、ＭＡＳＰ−２機能の評価において有用である。他のＭＡＳＰ−２ポリペプチドは、下記のように、抗体を生成するための有用な抗原又はハプテンである。ＭＡＳＰ−２活性を競争的に阻害する化合物がまた特徴づけられる。好ましくは、そのような化合物は、ＭＡＳＰ−２又はＭＡＳＰ−２のフラグメントのセリンプロテアーゼ活性を阻害することにより作用する。そのような化合物は、ＭＢＬｅｃｔｉｎ経路による補体活性化に対して決定的なＭＢＬ−ＭＡＳＰ−２相互作用を競争的に阻害するＭＢＬ又はＭＡＳＰ−２のフラグメント、及びＭＡＳＰ−２による補体因子Ｃ４及びＣ２の触媒分解を阻害する化合物、例えばペプチドフラグメントを包含することができる。
【００１１】
本発明のこの観点に従っての特定のポリペプチドは、ａ）２０Ｋの分子質量を有し、そして配列番号１［Ｔ Ｐ Ｌ Ｇ Ｐ Ｋ Ｗ Ｐ Ｅ Ｐ Ｖ Ｆ Ｇ Ｒ Ｌ Ａ Ｓ Ｐ Ｇ Ｆ Ｐ Ｇ Ｅ Ｙ Ａ Ｎ Ｄ Ｑ Ｅ Ｒ Ｒ Ｗ Ｔ Ｌ Ｔ Ａ Ｐ Ｐ Ｇ Ｙ Ｒ］として同定される配列を含むポリペプチド；ｂ）５２Ｋの分子質量を有し、そして配列番号１として同定される配列を含むポリペプチド；ｃ）図６（配列番号２）の完全アミノ酸配列を有するポリペプチドを包含する。
【００１２】
本発明のもう１つの観点は、配列番号２の配列に対して少なくとも８５％同一である配列を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んで成る単離された核酸分子を包含する。
本発明はまた、上記マンナン−結合性レクチン会合セリンプロテアーゼ−２（ＭＡＳＰ−２）プロペプチドをコードする単離された核酸配列を特徴とする。そのような核酸配列は、核酸ベクター（例えば、発現システムにおいて組換え核酸の発現を可能にする調節核酸要素を有するそれらを包含する発現ベクター）に含まれ得る。
【００１３】
本発明はまた、ＭＡＳＰ−２に選択的に結合する抗体を特徴とする。そのような抗体は、ポリクローナル及びモノクローナル抗体技法を包含する良く知られている技法のいずれかにより製造され得る。抗体は、ＭＡＳＰ−２を検出するために、アッセイにおいて使用され得るよう、検出マーカーを含んで成る化合物にカップリングされ得る。
【００１４】
ポリペプチド又は抗体は、医薬組成物中に配合され、そして下記のようにして、治療剤として投与され得る。
本発明はまた、マンナン−結合性レクチン会合セリンプロテアーゼ−２（ＭＡＳＰ−２）の検出方法を特徴とする。前記方法は、生物学的サンプルを獲得し、前記サンプルとＭＡＳＰ−２ポリペプチド特異的パートナーと接触せしめ、そして存在するなら、前記結合された複合体を、生物学的サンプルにおけるＭＡＳＰ−２の存在の表示として検出することを含んで成る。アッセイに使用される結合パートナーは抗体であり得るか、又はＭＡＳＰ−２についてのアッセイは補体固定活性について試験することができる。ＭＡＳＰ−２についてのそれらのアッセイはまた、生物学的サンプルにおけるＭＡＳＰ−２又はＭＡＳＰ−２活性の定量アッセイのために使用され得る。結合パートナーの１つは、ＭＢＫに対して特異的であり得、従ってＭＢＬ／ＭＡＳＰ−２複合体の検出を可能にする。
【００１５】
ＭＡＳＰ−２核酸発現を検出するための方法が、本発明に包含される。それらの方法は、ＭＡＳＰ−２のすべて又はそのフラグメントをコードする核酸配列に対して、緊縮条件下で特異的にハイブリダイズする核酸プローブと共にサンプルを混合することによって、ＭＡＳＰ−２ポリペプチドをコードする配列を有するＲＮＡを検出することを含んで成る。
【００１６】
本発明はまた、ＭＡＳＰ−２又はＭＡＳＰ−２活性を欠失する患者を処理するための方法を特徴とする。これは、ＭＡＳＰ−２ポリペプチド又はＭＡＳＰ−２をコードする核酸を患者に投与することによって達成される。時々、ＭＡＳＰ−２活性を阻害することが所望されるので、本発明は、ＭＡＳＰ−２の発現又は活性を阻害する化合物を患者に投与することによって、ＭＡＳＰ−２の活性を阻害するための方法を包含する。ＭＡＳＰ−２活性の阻害はまた、ＭＡＳＰ−２アンチセンス核酸配列を投与することによって達成され得る。
【００１７】
本発明は、ＭＡＳＰ−２をコードする核酸配列における多形現象についてのアッセイを特徴とする。サンプルにおけるＭＡＳＰ−２コードの核酸の存在を検出するための方法が請求されている。例として、前記方法は、緊縮条件下でＭＡＳＰ−２コード核酸との複合体を形成できる少なくとも１つの核酸プローブとサンプルとを混合し、そしてプローブがサンプル核酸に結合されるかどうかを決定することをを包含する。従って、本発明は、ＭＡＳＰ−２コードの核酸を有する複合体を緊縮条件下で形成できる核酸プローブを包含する。
【００１８】
本発明は、ＭＡＳＰ−２又はその前駆体を含んで成るポリペプチド配列での多形現象についてのアッセイを特徴とする。
ＭＡＳＰ−２アッセイは、種々の疾病、例えば感染、炎症性患者及び再発性自然流産の患者におけるＭＡＳＰ−２レベル及びＭＡＳＰ−２活性の決定のために有用である。ＭＡＳＰ−２は、ＭＡＳＰ−２機能が最適状態に及ばない場合、感染の処理のために有用であり、そしてＭＡＳＰ−２活性の阻害は、ＭＢＬｅｃｔｉｎ経路の活性により引き起こされる炎症及び悪影響の調節のために有用である。
【００１９】
“マンナン−結合性レクチン会合セリンプロテアーゼ−２”又は“ＭＡＳＰ−２”とは、“マンナン−結合タンパク質会合セリンプロテアーゼ−２”又は“マンノース結合タンパク質会合セリンプロテアーゼ”、又は配列番号２と実質的な同一性を有するいずれかの他のポリペプチドを意味する。
【００２０】
用語“タンパク質”及び“ポリペプチド”とは、長さ又は後―翻訳修飾（例えば、解糖又はリン酸化）にもかかわらず、アミノ酸のいずれかの鎖を記載するために、本明細書において使用される。従って、用語“ＭＡＳＰ−２ポリペプチド”は、十分な長さの天然に存在するＭＡＳＰ−２タンパク質、及び十分な長さの天然に存在するＭＡＳＰ−２ポリペプチド、又は天然に存在するタンパク質の特定のドメイン又は部分に対応する、組換え的に又は合成的に生成されたポリペプチドを包含する。この用語はまた、付加されたアミノ−末端メチオニン（原核細胞における発現のために有用である）を有する成熟ＭＡＳＰ−２を包含する。
【００２１】
用語“精製された”とは、本明細書において使用される場合、組換えＤＮＡ技法により生成される場合、細胞材料、ウィルス材料又は培養培地を実質的に有さず、又は化学的に合成される場合、化学的前駆体又は他の化学物質を実質的に有さない核酸又はペプチドを言及する。“単離された核酸分子”とは、生物の天然に存在するゲノムにおける配列からいずれかの手段で分離される核酸分子を意味する。従って、用語“単離された核酸分子”とは、天然に存在しない核酸分子、例えば組換えＤＮＡ技法により創造された核酸分子を包含する。
【００２２】
用語“核酸分子”とは、ＲＮＡ及びＤＮＡ、例えばｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ及び合成（例えば、化学的に合成された）ＤＮＡを包含する。一本鎖である場合、核酸はセンス鎖又はアンチセンス鎖であり得る。
本発明はまた、ＭＡＳＰ−２ポリペプチドをコードする核酸分子（例えば、配列番号２をコードする配列、例えば図６に示されるｃＤＮＡ配列のタンパク質のコード部分を有する核酸分子）に対して、好ましくは緊縮条件下でハイブリダイズする核酸分子を包含する。好ましくは、ハイブリダイズする核酸分子は、４００個、より好ましくは２００個のヌクレオチドから成る。
【００２３】
好ましくは、ハイブリダイズする核酸分子は、ＭＡＳＰ−２により占有される活性をコードし、例えばそれらはＭＢＬを結合し、そしてＭＢＬｅｃｔｉｎ補体経路における活性を有し、そしてセリンプロテアーゼとして作用することができる。
【００２４】
本明細書及び特許性請求の範囲を通して、３文字コード又は１文字コードが、天然のアミノ酸について使用される。Ｌ又はＤ形が特定されていない場合、問題のアミノ酸は天然のＬ形（Ｐｕｒｅ ＆ Ａｐｐｌ． Ｃｈｅｍ． Ｖｏｌ． ５６ （５） ｐｐ． ５９５−６２４ （１９８４） を参照のこと）、又はＤ形を有し、その結果、形成されるペプチドは、Ｌ形、Ｄ形のアミノ酸又は混合されたＬ形及びＤ形の配列から構成され得ることが理解されるべきである。特にことわらない限り、本発明のポリペプチドのＣ−末端アミノ酸は遊離カルボン酸として存在し、そしてポリペプチドのＮ−末端アミノ酸は遊離アミノ機を含んで成ることが理解されるべきである。特にことわらない限り、アミノ酸は、天然に存在しても又はしてなくても、いずれかのアミノ酸、例えばαアミノ酸、βアミノ酸及び／又はγアミノ酸から選択され得る。従って、前記グループは次のものを含んで成るが、しかしそれらだけには限定されない：Ａｌａ， Ｖａｌ， Ｌｅｕ， Ｉｌｅ， Ｐｒｏ， Ｐｈｅ， Ｔｒｐ， Ｍｅｔ， Ｇｌｙ， Ｓｅｒ， Ｔｈｒ， Ｃｙｓ， Ｔｙｒ， Ａｓｎ， Ｇｌｎ， Ａｓｐ， Ｇｌｕ， Ｌｙｓ， Ａｒｇ， Ｈｉｓ， Ａｌｂ， Ｎａｌ， Ｓａｒ， Ｏｒｎ， リシン類似体ＤＡＰ及びＤＡＰＡ．
【００２５】
本発明はまた、実質的に純粋な又は単離されたＭＡＳＰ−２ポリペプチド、好ましくはＭＡＳＰ−２の種類の機能的ドメイン又はそのフラグメントに対応するそれらのポリペプチドを特徴とする。本発明のポリペプチドは、図６に示されるアミノ酸配列に対して実質的に同一であるアミノ酸配列を包含する。
本発明のポリペプチドはまた、化学的に合成され、組換え技法により合成されるか、又はそれらは、それらが精製の標準の生化学的方法に従って、天然において発現される組織から精製され得る。
【００２６】
１又は複数のＭＡＳＰ−２の生物学的機能又は活性を有する“機能的ポリペプチド”がまた、本発明に包含される。それらの機能又は活性は、本明細書に詳細に記載される。機能的ポリペプチドはまた、それがＭＡＳＰ−２又はそのフラグメント（特に、決定因子を含むフラグメント）に対して特異的に結合する抗体の生成のための抗原として作用する場合、本発明の範囲内であると思われる。
【００２７】
機能的ポリペプチドは、本明細書に開示されるそれらのポリペプチドから修飾された一次アミノ酸配列を含むことができる。好ましくは、それらの修飾は、本明細書に記載されるように、保存性アミノ酸置換から成る。ポリペプチドは、それらの異化を促進するか又は遅延するよう（それらの半減期を高める）企画されたいずれかの態様で置換され得る。
【００２８】
用語“機能的相同体”及び“機能的同等物”とは、本明細書においては、交換可能的に使用され、そして本発明の範囲内でお互い類似するものとして理解されるべきである。本発明のポリペプチドの機能的相同体とは、ＭＡＳＰ−２活性又はＭＡＳＰ−２フラグメントの活性、例えばＭＡＳＰ−２の競争インヒビターとしての活性を発揮することができるいずれかのポリペプチド配列を含んで成ることを意味する。
【００２９】
本発明の機能的相同体は、上記で概略されたように、予定されたポリペプチド配列と少なくともいくらかの相同性を共有する、アミノ酸配列を有するポリペプチドを含んで成る。例えば、そのようなポリペプチドは、上記に概略されるように、予定されたポリペプチドと、少なくとも４０％、例えば少なくとも約５０％相同であり、例えば少なくとも６０％相同であり、例えば少なくとも約７０％相同であり、例えば少なくとも約７５％相同であり、例えば少なくとも約８０％相同であり、例えば少なくとも約８５％相同であり、例えば少なくとも約９０％相同であり、例えば少なくとも９２％相同であり、例えば少なくとも９４％相同であり、例えば少なくとも９５％相同であり、例えば少なくとも９６％相同であり、例えば少なくとも９７％相同であり、例えば少なくとも９８％相同であり、例えば少なくとも９９％相同である。
【００３０】
アミノ酸配列間の相同性は、良く知られたアルゴリズム、例えばＢＬＯＳＵＭ３０， ＢＬＯＳＵＭ ４０， ＢＬＯＳＵＭ ４５， ＢＬＯＳＵＭ ５０， ＢＬＯＳＵＭ ５５， ＢＬＯＳＵＭ ６０， ＢＬＯＳＵＭ ６２， ＢＬＯＳＵＭ ６５， ＢＬＯＳＵＭ ７０， ＢＬＯＳＵＭ ７５， ＢＬＯＳＵＭ ８０， ＢＬＯＳＵＭ ８５及びＢＬＯＳＵＭ ９０のいずれか１つのアルゴリズムを用いて計算され得る。
機能的相同性は、いずれか他のアミノ酸による１つのアミノ酸の少なくとも１つの置換を含んで成るアミノ配列を含んで成る。例えば、そのような置換は、保存性アミノ酸置換であるか、又は非保存性置換であり得る。
【００３１】
保存性アミノ酸置換は、予定されたアミノ酸グループ内の１つのアミノ酸の同じグループ内のもう１つのアミノ酸による置換であり、ここで予定されたグループ内のアミノ酸は、類似するか又は実質的に類似する特徴を示す。本明細書において適用されるような用語“保存性アミノ酸置換”の意味においては、１つのアミノ酸が、下記のものを有することによって特徴づけられるアミノ酸のグループ内のもう１つのアミノ酸により置換され得る：
【００３２】
ｉ）極性側鎖（Ａｓｐ， Ｇｌｕ， Ｌｙｓ， Ａｒｇ， Ｈｉｓ， Ａｓｎ， Ｇｌｎ， Ｓｅｒ， ｔｈｒ， Ｔｙｒ及びＣｙｓ）；
ｉｉ） 非極性側鎖（Ｇｌｙ，Ａｌａ，Ｖａｌ，Ｌｅｕ， Ｉｌｅ， Ｐｈｅ， Ｔｒｐ， Ｐｒｏ及びＭｅｔ）；
ｉｉｉ） 脂肪族側鎖（Ｇｌｙ， Ａｌａ， Ｖａｌ， Ｌｅｕ， Ｉｌｅ）；
ｉｖ） 環状側鎖（Ｐｈｅ， Ｔｙｒ， Ｔｒｐ， Ｈｉｓ， Ｐｒｏ）；
ｖ） 芳香族側鎖（Ｐｈｅ， Ｔｙｒ， Ｔｒｐ）；
ｖｉ） 酸性側鎖（Ａｓｐ，Ｇｌｕ）；
ｖｉｉ） 塩基性側鎖（Ｌｙｓ， Ａｒｇ， Ｈｉｓ）；
ｖｉｉｉ） アミド側鎖（Ａｓｎ， Ｇｌｎ）；
ｉｘ） ヒドロキシ側鎖（Ｓｅｒ， Ｔｈｒ）；
ｘ） 硫黄含有側鎖（Ｃｙｓ， Ｍｅｔ）；及び
ｘｉ） モノアミノ−ジカルボン酸又はモノアミノ−モノカルボン酸−モノアミノカルボン酸であるアミノ酸（Ａｓｐ， Ｇｌｕ， Ａｓｎ， Ｇｌｎ）。
【００３３】
非保存性置換は、いずれか他の置換である。機能的相同体の形成を導く非保存性置換は、例えばｉ）疎水性、例えば親水性残基、例えばＡｒｇ， Ｌｙｓ， Ｔｒｐ又はＡｓｐ， 又は疎水性残基により置換される親水性残基、例えば、Ｔｈｒ，Ｓｅｒ， Ｈｉｓ， Ｇｌｎ， Ａｓｎ， Ｌｙｓ， Ａｓｐ， Ｇｌｕ又はＴｒｐにより置換される疎水性残基（Ｖａｌ， Ｉｌｅ， Ｌｅｕ， Ｐｈｅ又はＭｅｔ）とは実質的に異なり；そして／又はポリペプチド主鎖配向に対するその効果、例えばもう１つの残基によるＰｒｏ又はＧｌｙの置換において実質的に異なり；そして／又はｉｉｉ）電荷、例えば正に荷電された残基、例えばＬｙｓ， Ｈｉｓ又はＡｒｇによる、負に荷電された残基、例えばＧｌｕ又はＡｓｐの置換（及び、逆もまた真である）において実質的に異なり；そして／又はｉｖ）立体的容積、例えば大きな残基、例えばＨｉｓ， Ｔｒｐ， Ｐｈｅ又はＴｙｒのマイナーな側鎖を有する残基、例えばＡｌａ， Ｇｌｙ又はＳｅｒによる置換（及び、逆もまた真である）において実質的に異なる。
【００３４】
次に、本発明の機能的相同体は、１つよりも多くのそのような置換、例えば２個のアミノ酸置換、例えば３又は４個のアミノ酸置換、例えば５又は６個のアミノ酸置換、例えば７又は８個のアミノ酸置換、例えば１０〜１５個のアミノ酸置換、例えば１５〜２５個のアミノ酸置換、例えば２５〜３０個のアミノ酸置換、例えば３０〜４０個のアミノ酸置換、例えば４０〜５０個のアミノ酸置換、例えば５０〜７５個のアミノ酸置換、例えば７５〜１００個のアミノ酸置換、例えば１００個以上のアミノ酸置換を含んで成る。
【００３５】
アミノ酸の付加又は欠失は、２〜５個のアミノ酸、例えば５〜１０個のアミノ酸、例えば１０〜２０個のアミノ酸、例えば２０〜５０個のアミノ酸の付加又は欠失であり得る。しかしながら、５０個よりも多くのアミノ酸の付加又は欠失、例えば５０〜２００個のアミノ酸の付加もまた、本発明内に包含される。
【００３６】
いずれかの変異体及びその機能的相同体を包含する本発明のポリペプチドは、１つの態様においては、５個よりも多くのアミノ酸残基、例えば１０個よりも多くのアミン酸残基、例えば２０個よりも多くのアミノ酸残基、例えば２５個よりも多くのアミノ酸残基、例えば５０個よりも多くのアミノ酸残基、例えば７５個よりも多くのアミノ酸残基、例えば１００個よりも多くのアミノ酸残基、例えば１５０個よりも多くのアミノ酸残基、例えば２００個よりも多くのアミノ酸残基を含んで成ることができる。
【００３７】
追加の因子は、本明細書において使用される手段に従って、機能的に相同体を決定する場合に考慮され得る。例えば、機能的相同体は、本発明のポリペプチドに対して特異的である抗血清と会合することができる。
さらなる態様においては、本発明は、置換しているアミノ酸の値の＋／−２．５以内、例えば＋／−２．３以内、例えば＋／−２．１以内、例えば＋／−２．０以内、例えば＋／−１．８以内、例えば＋／−１．６以内、例えば＋／−１．５以内、例えば＋／−１．４以内、例えば＋／−１．３以内、例えば＋／−１．２以内、例えば＋／−１．１以内、例えば＋／−１．０以内、例えば＋／−０．９以内、例えば＋／−０．８以内、例えば＋／−０．７以内、例えば＋／−０．６以内、例えば＋／−０．５以内、例えば＋／−０．４以内、例えば＋／−０．３以内、例えば＋／−０．２５以内、例えば＋／−０．２以内である親水性又は水治療性指数を有する置換されたアミノ酸を含んで成る機能的同等物に関する。
【００３８】
タンパク質に対して相互作用性生物学的機能を付与することにおける親水性及び水治療性アミノ酸指数の重要性は、当業界において十分に理解されている（Ｋｙｔｅ ＆ Ｄｏｏｂｉｔｔｌｅ， １９８２， 及びＨｏｐｐ． アメリカ特許第４，５５４，１０１号；それぞれ引用により本明細書に組み込まれる）。
【００３９】
本明細書において使用されるようなアミノ酸水治療性指数値は次の通りでありる：イソロイシン（＋４．５）；バリン（＋４．２）；ロイシン（＋３．８）；フェニルアラニン（＋２．８）；システイン／シスチン（＋２．５）；メチオニン（＋１．９）；アラニン（＋１．８）； グリシン（−０．４）；トレオニン（−０．７）；セリン（−０．８）；トリプトファン（−０．９）；チロシン（−１．３）；プロリン（−１．６）；ヒスチジン（−３．２）；グルタミン酸（−３．５）；グルタミン（−３．５）；アスパラギン酸（−３．５）；アスパラギン（−３．５）；リシン（−３．９）；及びアルギニン（−４．５）（Ｋｙｔｅ ＆ Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ， １９８２）。
【００４０】
アミノ酸親水性値は次の通りである：アルギニン（＋３．０）；リシン（＋３．０）；アスパラギン酸（＋３．０， ＋／−０．１）；グルタミン酸（＋３．０）， ＋／−０．１）；セリン（＋０．３）；アスパラギン（＋０．２）； グルタミン（＋０．２）；グリシン（０）；トレオニン（−０．４）；プロリン（−０．５， ＋／−０．１）；アラニン（−０．５）；ヒスチジン（−０．５）；システイン（−１．０）；メチオニン（−１．３）；バリン（−１．５）；ロイシン（−１．８）；イソロイシン（−１．８）；チロシン（−２．３）；フェニルアラニン（−２．５）；トリプトファン（−３．４）（アメリカ特許第４，５５４，１０１号）。
【００４１】
従って、アミノ酸の置換は、１つの態様においては、それらの疎水性及び親水性値、及びアミノ酸側鎖置換基の相対的類似性、例えば電荷、サイズ及び同様のものに基づいて行われ得る。種々の前述の特徴を考慮しての典型的なアミノ酸置換は、当業者に良く知られており、そして次のものを包含する：アルギニン及びリシン；グルタミン酸及びアスパラギン酸；セリン及びトレオニン；グルタミン及びアスパラギン；及びバリン、ロイシン及びイソロイシン。
【００４２】
本明細書に記載されるポリペプチド化合物の他に、立体的に類似する化合物は、ペプチド構造のキー部分を模倣するよう、及びそのような化合物がまた、本発明のポリペプチドと同じ態様で使用され得るよう配合され得る。これは、当業者に知られている設計及び化学的企画の技法により達成され得る。例えば、エステル化及び他のアルキル化が、テトラペプチド構造を模倣するために、例えばジ−アルギニンペプチド主鎖のアミノ末端を修飾するために使用され得る。すべてのそのような立体的に類似する構造体は、本発明の範囲内にあることが理解されるであろう。
【００４３】
Ｎ末端アルキル化及びＣ末端エステル化を有するペプチドはまた、本発明内に包含される。機能的同等物はまた、グリコシル化された及び共有又は凝集性接合体、例えばダイマー又は無関係な化学的成分を含んで成る。そのような機能的同等物は、当業界において知られている手段により、Ｎ−及びＣ−末端のいずれか１つ又は両者で、フラグメントに見出される基への官能価の連結により調製される。
【００４４】
従って、機能的同等物は、カルボキシル末端、アルキルアミノ、又はカルボキシル側鎖を含む残基の脂肪族又はアシルエステル又はアミドに結合されるフラグメント、例えばアスパラギン酸残基でのアルキルアミノへの接合体；ヒドロキシル基含有残基のＯ−アシル誘導体、及びアミノ末端アミノ酸又はアミノ基含有残基のＮ−アシル誘導体、例えばＭｅｔ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅを有する接合体を含むことができる。アシル基の誘導体は、アルキル成分（Ｃ３〜Ｃ１０の標準アルキルを包含する）（それにより、アルカノイル種を形成する）、及び炭素環式又は複素乾式化合物（それにより、アロイル種を形成する）の群から選択される。
【００４５】
本発明の範囲内の核酸配列の相同体は、類似する生物学的機能を有するＲＮＡ及び／又はタンパク質をコードし、そして
ａ）少なくとも５０％同一であり、例えば少なくとも６０％同一であり、例えば少なくとも７０％同一であり、例えば少なくとも７５％同一であり、例えば少なくとも９５％同一であるか、又は
ｂ）緊縮条件下で、前記核酸配列の相補的鎖にハイブリダイズすることができる核酸配列である。
【００４６】
本明細書において使用されるような緊縮条件は、例えばＳｏｕｔｈｅｒｎ Ｅ． Ｍ．， １９７５， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ９８： ５０３−５１７により記載されるようなサザンブロット及びハイブリダイゼーションに関して通常適用されるような緊縮性を示すであろう。そのような目的のためには、プレハイブリダイゼーション及びハイブリダイゼーションの段階を包含することは、通常の実施である。
【００４７】
そのような段階は通常、６×ＳＳＰＥ、５％のＤｅｎｈａｒｄｔ’ｓ、０．５％のＳＤＳ、５０％のホルムアミド、１００ｇ／ｍｌの変性されたサケ精巣ＤＮＡを含む溶液（４２℃で１８時間のインキュベーション）、次に２×ＳＳＣ及び０．５％のＳＤＳを含む洗浄液（室温で及び３７℃で）、及び０．１×ＳＳＣ及び０．５％のＳＤＳを含む洗浄液（６８℃で３０分間のインキュベーション）を用いて、Ｓａｍｂｒｏｏｋなど．， １９８９， “Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ／Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ）（引用により本明細書に組み込まれる）により記載されるようにして、行われる。
【００４８】
核酸配列の相同体はまた、付加及び／又は欠失を包含する核酸配列を包含する。そのような付加及び／又は欠失は、内在性であり、末端で存在する。付加及び／又は欠失は、１〜５個のヌクレオチド、例えば５〜１０個のヌクレオチド、例えば１０〜５０個のヌクレオチド、例えば５０〜１００個のヌクレオチド、例えば少なくとも１０〜５０個のヌクレオチド、例えば５０〜１００個のヌクレオチド、例えば少なくとも１００個のヌクレオチドのものであり得る。
【００４９】
興味あるポリペプチド又は他の化合物は、それらが天然に存在する組織物とは異なり、そして本明細書に提案される少なくとも１つの使用のために適切である場合、“実質的に純粋”であると言われる。天然に存在する物質に関して、単なるわずかに変更されている調製物は、いくぶん、有用であるが、より典型的には、調製物は、興味ある化合物に関して、少なくとも１０重量％（乾量）異なる。好ましくは、調製物は、興味ある化合物に関して、少なくとも６０重量％、より好ましくは少なくとも７５重量％、及び最も好ましくは、少なくとも９０重量％異なる。純度は、いずれかの適切な標準の方法、例えばカラムクロマトグラフィー、ポリアクリルアミドゲル電気泳動又はＨＰＬＣ分析により測定される。
【００５０】
ポリペプチド又は核酸分子は、それが対照のポリペプチド又は核酸分子の配列に対して、少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％及びより好ましくは少なくとも９５％、９８％又は９９％同一である配列を有する場合、対照のポリペプチド又は核酸分子に対して、“実質的に同一”である。
【００５１】
特定のポリペプチドが定義される長さの対照ポリペプチドに対して特定の％同一性を有すると言われる場合、その％同一性は、対照ペプチドに対してである。従って、１００個の長さのアミノ酸である対象ポリペプチドに対して５０％同一であるペプチドは、対照ポリペプチドの５０個の長さのアミノ酸に対して完全に同一である５０個のアミノ酸のポリペプチドであり得る。それはまた、その完全な長さにわたって、対照ポリペプチドに対して５０％同一である１００個の長さのアミノ酸のポリペプチドである。もちろん、多くの他のポリペプチドが、同じ基準を満たすであろう。
【００５２】
対照配列に対して１００％以下の同一性を有するポリペプチド配列の場合、非同一の位置は好ましくは（但し、必ずしも必要ではないが）、対照配列による保存性置換である。保存性置換は典型的には、次のグループによる置換を包含する：グリシン及びアラニン；バリン、イソロイシン及びロイシン；アスパラギン酸及びグルタミン酸；アスパラギン及びグルタミン；セリン及びトレオニン；リシン及びアルギニン；及びフェニルアラニン及びチロシン。
【００５３】
ポリペプチドに関しては、対照ポリペプチド配列の長さは一般的に、少なくとも１６個のアミノ酸、好ましくは少なくとも２０個のアミノ酸、より好ましくは少なくとも２５個のアミノ酸及び最も好ましくは３５個のアミノ酸、５０個のアミノ酸又は１００個のアミノ酸であろう。核酸に関しては、対照核酸配列の長さは一般的に、少なくとも５０個、好ましくは少なくとも６０個、より好ましくは少なくとも７５個、及び最も好ましくは１００個又は３００個のヌクレオチドであろう。
【００５４】
配列同一性は、配列分析ソフトウェア（例えば、ｔｈｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ， Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｅｎｔｅｒ， １７１０ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ａｖｅｎｕｅ， Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩ ５３７０５）及び、そこに特定されるようなデフォールトパラメーターを用いて、測定され得る。
【００５５】
本発明の核酸分子は、挿入体の発現を測定するであろう、下記に記載されるようなベクター中に挿入され得る。前記核酸分子及びそれらがコードするポリペプチドは、診断剤又は治療剤として直接的に使用され得るか、又は治療剤又は診断剤として臨床学的に有用である抗体を生成するために使用され得る（ポリペプチドの場合、直接的に、又は核酸分子の場合、間接的に）。従って、本発明の核酸を含むベクター、それらのベクターによりトランスフェクトされた細胞、発現されるポリペプチド、及び完全なポリペプチド又はその抗原性フラグメントのいずれかに対して生成される抗体は、好ましい態様間に存在する。
【００５６】
本発明はまた、ＭＡＳＰ−２を特異的に結合する抗体、例えばモノクローナル抗体及び構築された抗体を特徴とする。“特異的に結合する”とは、特定の抗原、例えば本発明のＭＡＳＰ−２ポリペプチドを認識し、そしてそれを結語するが、しかしＭＡＳＰ−２を含むサンプル、例えば生物学的サンプルにおける他の分子を実質的に認識も又はそれを結合もしない抗体を意味する。検出可能なマーカーを含んで成る化合物にカップリングされる抗体（又はそのフラグメント）の構造体は、化学的手段を包含するいずれかの技法、又は組換え技法により製造される構造体を包含する。本発明はまた、ＭＡＳＰ−２又はその機能的相同体の活性を阻害できる化合物を特徴とする。
【００５７】
ＭＡＳＰ−２の１つの活性は、補体活性化を助けることである。ＭＡＳＰ−２のもう１つの活性は、ＭＡＳＰ−２のセリンプロテアーゼ活性である。好ましくは、ＭＡＳＰ−２の活性を阻害できる化合物は、ＭＡＳＰ−２による補体活性化を阻害することができる。低い割合のＭＡＳＰのみが血清におけるＭＢＬにより会合されることを十分に理解することが重要である。従って、ＭＡＳＰ−２活性を阻害できる化合物は、ＭＢＬを活性化しないで、ＭＢＬと会合し、そしてその結果、活性ＭＡＳＰ−ＭＢＬ複合体の血清を消耗することによって、補体活性化に対して阻害効果を発揮することができる。化合物は、ＭＡＳＰ−２のフラグメントであり得、又はそれは、ＭＡＳＰ−２の変異体又はそのフラグメントであり得る。さらに、化合物は抗体であり得る。
【００５８】
本発明はまた、それぞれ、ＭＡＳＰ−２の１又は複数の機能又は活性を阻害するか又は増強できるＭＡＳＰ−２のアンタゴニスト及びアゴニストを特徴とする。適切なアンタゴニストは、小分子（すなわち、約５００以下の分子量を有する分子）、大分子（すなわち、約５００以上の分子量を有する分子）、ＭＡＳＰ−２を結合し、そして“中和する”抗体（下記のような）、１つのタンパク質、例えばＭＢＬに結合するために、生来の形のＭＡＳＰ−２と競争するポリペプチド、及びＭＡＳＰ−２の転写を妨げる核酸分子（例えば、アンチセンス核酸分子及びリボザイム）を包含することができる。ＭＡＳＰ−２のアンタゴニストはまた、小及び大分子、及び“中和”抗体以外の抗体を包含する。
【００５９】
本発明はまた、ＭＡＳＰ−２の発現を高めるか又は低めることができる（例えば、転写又は翻訳に影響を及ぼすことによって）分子を特徴とする。小分子（すなわち、約５００以下の分子量を有する分子）、大分子（すなわち、約５００以下の分子量を有する分子）、及びＭＡＳＰ−２の発現を阻害するために使用され得る核酸分子（例えば、アンチセンス及びリボザイム分子）、又はそれらの発現を増強するために使用され得る核酸分子（例えば、強いプロモーターシステムの制御下でＭＡＳＰ−２をコードする核酸配列を配置する発現構造体）、並びにＭＡＳＰ−２トランスジーンを発現するトランスジェニック動物もまた、本発明において特徴とされる。
【００６０】
本発明は、ＭＡＳＰ−２の発現又は活性に関連する疾患を処理するための方法を包含する。従って、本発明は、ＭＡＳＰ−２の過剰発現又は活性に関連する疾患を処理するための方法を包含する。そのような方法は、ＭＡＳＰ−２の発現又は活性を低める化合物を投与することを包含する。本発明はまた、ＭＡＳＰ−２の不十分な発現に関連する疾病を処理するための方法を包含する。それらの方法は、ＭＡＳＰ−２の発現又は活性を高める化合物を投与することを包含する。
【００６１】
セリンプロテアーゼ活性を“競争的に阻害する”とは、例えば変更されたＭＢＬ又はそのフラグメントの作用が、セリンプロテアーゼ活性を活性化しないで、可逆的に又は不可逆的に、ＭＡＳＰ−２ペプチドに結合できることを意味する。逆に言えば、ＭＡＳＰ−２のフラグメント、例えばＭＡＳＰ−２のＮ−末端部分を包含するポリペプチドは、損なわれていないＭＡＳＰ−２の結合を競争的に阻害し、そして従って、ＭＡＳＰ−２の活性化を効果的に阻害することができる。
本発明はまた、ＭＡＳＰ−２ポリペプチドを検出するための方法を特徴とする。そのような方法は、生物学的サンプルを獲得し；ＭＡＳＰ−２を特異的に結合する抗体と前記サンプルとを、特異的結合を可能にする条件下で接触せしめ；そして形成されるいずれかの抗体−ＭＡＳＰ−２複合体を検出することを包含する。
【００６２】
さらに、本発明は、ＭＡＳＰ−２の不適切な発現又は活性に関連する疾病の診断評価、分類及び予後のための方法及び組成物を包含する。例えば、本発明の核酸分子は、ＭＡＳＰ−２の不適切な発現、又はＭＡＳＰ−２遺伝子における突然変異を検出するための診断用ハイブリダイゼーションプローブとして使用され得る。そのような方法は、ＭＡＳＰ−２発現のレベルにより細胞を分類するために使用され得る。
他方では、核酸分子は、ＭＡＳＰ−２遺伝子における遺伝子突然変異、対立遺伝子変動及び調節欠失の同定のための診断ＰＣＲ分析のためのプライマーとして使用され得る。本発明はさらに、そのような方法の実施のための診断キットを提供する。
【００６３】
本発明は、選択された化合物の存在及び不在下でＭＡＳＰ−２の発現又は活性を評価することによって、ＭＡＳＰ−２の発現又は活性を調節する化合物を同定するための方法を特徴とする。選択された化合物の存在及び不在下でのＭＡＳＰ−２の発現又は活性のレベルの差異は、その選択された化合物がＭＡＳＰ−２の発現又は活性を調節できることを示す。発現は、当業者に良く知られている技法により、遺伝子発現（例えば、ｍＲＮＡを測定することによって）又はタンパク質発現のレベルで評価され得る。ＭＡＳＰ−２の活性は、機能的に、すなわち補体を活性化する化合物の能力をアッセイすることによって評価され得る。
【００６４】
好ましい方法及び材料は、本発明を例示するが、しかし限定しない下記実施例において記載される。当業者は、本明細書に記載される方法及び材料に類似するか又は同等であり、そして本発明の実施又は試験に使用され得る方法及び材料を認識するであろう。
【００６５】
特にことわらない限り、本明細書に使用されるすべての技法及び科学的用語は、本発明が属する当業者により通常理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載される方法及び材料に類似するか又は同等の方法及び材料は本発明の実施又は試験において使用され得るが、好ましい方法及び材料が本明細書において記載される。本明細書において言及されるすべての出版物、特許出願、特許及び他の参考文献は、引用により本明細書に組み込まれる。さらに、材料、方法及び例は、例示的であって、本発明を制限するものではない。
本発明の他の特徴及び利点は、下記特定の記載から明らかであろう。
【００６６】
配列表の簡単な説明：
配列番号１：２０ｋＤのＭＡＳＰ−２フラグメントのアミノ酸配列。
配列番号２：シグナルペプチドを包含する十分な長さのＭＡＳＰ−２のアミノ酸配列：
配列番号３：シグナルペプチドを包含しない十分な長さのＭＡＳＰ−２のアミノ酸配列：
【００６７】
好ましい態様の記載：
ＭＡＳＰ−２核酸分子：
本発明のＭＡＳＰ−２核酸分子は、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、合成ＤＮＡ又はＲＮＡであり得、そして二本鎖又は一本鎖（すなわち、センス又はアンチセンス鎖のいずれか）であり得る。それらの分子のフラグメントはまた、本発明の範囲内であると思われ、そして例えばポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）により生成され得るか、又は１又は複数の制限エンドレアーゼによる処理により生成され得る。リボ核酸（ＲＮＡ）分子は、インビトロ転写により生成され得る。好ましくは、核酸分子は、長さにかかわらず、正常な生理学的条件下で可溶性であるポリペプチドをコードする。
【００６８】
本発明の核酸分子は、天然に存在する配列、又は天然に存在するそれらの配列とは異なるが、しかし遺伝子コードの宿主のために、同じポリペプチド（例えば、配列番号２のポリペプチド）をコードする配列を含むことができる。さらに、それらの核酸分子は、ポリペプチドを単にコードする配列に制限されず、そして従って、コード配列から上流又は下流に存在する非コード配列のいくつか又はすべてを含むことができる。
【００６９】
本発明の核酸分子は、合成され（例えば、ホスホラミジットに基づく合成により）、又は生物学的細胞、例えば哺乳類の細胞から得られる。従って、核酸は、ヒト、マウス、ラット、テンジュクネズミ、ウシ、羊、ウマ、ブタ、ウサギ、サル、イヌ又はネコの核酸であり得る。それらのタイプの核酸内のヌクレオチドの組合せ又は修飾がまた包含される。
【００７０】
さらに、本発明の単離された核酸分子は、天然の状態において見出されないフラグメントを包含する。従って、本発明は、組換え分子、例えば核酸分子（例えば、ＭＡＳＰ−２をコードする単離された核酸分子）が、ベクター（例えば、プラスミド又はウィルスベクター）、又は異種細胞のゲノム（又は、天然の染色体位置以外の位置での相同細胞のゲノム）中に組み込まれているそれらの分子を包含する。従って、組換え核酸分子及び使用がさらに下記に論じられる。
【００７１】
本発明の核酸分子がアンチセンス分子をコードし、又はアンチセンス分子として作用する場合、それらはＭＡＳＰ−２の翻訳を調節するために使用され得る。核酸発現の欠失又は調節に関係する技法は、当業者に良く知られており、そしてＭＡＳＰ−２活性に関連する疾患を診断し、そして／又は処理するために使用され得る。それらの核酸分子は、それらの臨床学的有用性の分野においてさらに論じられる。
【００７２】
本発明はまた、ＭＡＳＰ−２ポリペプチドをコードする核酸分子に対して、緊縮条件下でハイブリダイズする核酸分子を包含する。本明細書に記載されるｃＤＮＡ配列（配列番号３）は、他の種における相同ポリペプチドをコードする核酸、及びヒト又は他の哺乳類におけるＭＡＳＰ−２遺伝子のスプライス変異体を包含するそれらの核酸を同定するために使用され得る。従って、本発明は、それらの核酸分子を検出し、そして単離する方法を特徴とする。それらの方法を用いて、サンプル（例えば、核酸ライブラリー、例えばｃＤＮＡ又はゲノムライブラリー）が、ＭＡＳＰ−２−特異的プローブ（例えば、少なくとも１２個の長さのヌクレオチドであるポリペプチド配列（配列番号２）をコードする、図６に示されるｃＤＮＡ配列のフラグメント）と接触せしめられる。
【００７３】
プローブは、関連するポリペプチドをコードする核酸（又はその相補的配列）に対して選択的にハイブリダイズするであろう。ＭＡＳＰ−２よりコードされるポリペプチドは他のセリンプロテアーゼに関連するので、用語“選択的にハイブリダイズする”とは、プローブが、他のセリンプロテアーゼをコードする核酸（又はその相補的配列）に対してよりも検出できるほど高い程度に、ＭＡＳＰ−２をコードする核酸（又はその相補的配列）に結合する現象を言及するために使用される。
【００７４】
少なくとも１２個（例えば、１５， ２５， ５０， １００又は２００個）のヌクレオチドを含むことができるプローブは、いくつかの標準の方法のいずれかを用いて生成され得る（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌなど．， “Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ Ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌ． Ｉ”， Ｇｒｅｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ， Ｉｎｃ．， 及びＪｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．， ＮＹ， １９８９を参照のこと）。例えば、プローブはＰＣＲ増幅方法を用いて生成され得、ここでオリゴヌクレオチドプライマーが、下記例４に記載されるように、核酸ライブラリーをスクリーンし、そしてそれにより、プローブにハイブリダイズする核酸分子（ライブラリー内の）を検出するために、プローブとして使用され得るＭＡＳＰ−２−特異的核酸配列（例えば、成熟ＭＡＳＰ−２のＮ−末端をコードする核酸）を増幅するために使用される。
【００７５】
一本鎖核酸は、二本鎖がそれらの間で形成する場合、お互いハイブリダイズすると言われる。これは、１つの核酸が、他の配列の逆及び補体である配列を含む場合に発生する（この同じ配列が、ゲノムにおけるＤＮＡのセンス鎖とアンチセンス鎖との間の天然の相互作用を生ぜしめ、そして“二重鎖”の配置に従う）。ハイブリダイズする領域間の完全な相補性は、二重鎖を形成するために必要とはされず；対合された塩基の数が使用されるハイブリダイゼーション条件下で二重鎖を維持するために十分であることが単に必要である。
【００７６】
典型的には、条件は、低い〜中位の緊縮性のものである。それらの条件は、完全に相補的な配列間の特定の相互作用を好むが、しかし完全には適合しない配列間でのいくらかの非特異的相互作用の発生を可能にする。ハイブリダイゼーションの後、核酸は、いくらかの非特異的相互作用により一緒に結合される二本鎖を解離するために、中位又は高い緊縮条件下で“洗浄”され得る（従って、それらの二本鎖を形成する核酸は完全には相補的ではない）。
【００７７】
当業界において知られているように、洗浄のための最適条件は、実験的に、しばしば緊縮性を徐々に高めることによって決定される。緊縮性に影響を及ぼすために変更され得るパラメーターは、主に温度及び塩濃度を包含する。一般的に、塩濃度が低く、且つ温度が高いほど、緊縮性は高い。洗浄は、ハイブリダイゼーション溶液の塩濃度に等しいか、又は低い塩濃度を含む溶液を用いて、低い温度（例えば、室温）で開始され得る。続く洗浄は、同じ塩濃度を有する段階的に暖かな溶液を用いて行われ得る。他の手段として、塩濃度が低められ、そして温度が洗浄段階において維持され、又は塩濃度が低められ、そして温度が高められ得る。追加のパラメーターもまた変更され得る。例えば、不安定剤、例えばホルムアミドの使用が、緊縮条件を変更する。
【００７８】
核酸がハイブリダイズされる反応においては、所定のレベルの緊縮性を達成するために使用される条件は変化するであろう。お互い８５％同一であるすべての核酸間での二本鎖の形成を可能にするであろう１組の条件は存在せず；ハイブリダイゼーションはまた、個々の核酸のユニーク特徴に依存する。配列の長さ、配列の組成（例えば、プリン様ヌクレオチドの含有量−対−ピリミジン様ヌクレオチドの含有量）、及び核酸のタイプ（例えば、ＤＮＡ又はＲＮＡ）は、ハイブリダイゼーションに影響を及ぼす。さらなる考慮は、核酸の１つが固定されるかどうかである（例えば、フィルター上に）。
【００７９】
低い緊縮条件から高い緊縮条件への進行の例は、塩含有率がＳＳＣ（塩化ナトリウム及びクエン酸ナトリウムを含む塩溶液；２×ＳＳＣは０．２×ＳＳＣよりも１０倍、より濃縮されている）の相対的多量性として与えられる場合である。核酸は、２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム；界面活性剤）において４２℃でハイブリダイズされ、そして次に、室温で０．２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ（低い緊縮性の条件のための）；４２℃で０．２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ（中位の緊縮性の条件のための）；及び６８℃で０．１×ＳＳＣ（高い緊縮性の条件のための）により洗浄される。洗浄は、与えられる条件の１つのみを用いて行われ得、又は個々の条件が使用され得る（例えば、上記に列挙される順序で、それぞれ１０〜１５分間の洗浄）。洗浄のいずれか又はすべては反復され得る。上記に言及されたように、最適条件は変化し、そして実験的に決定され得る。
【００８０】
“緊縮条件”として考慮される第２組の条件は、ハイブリダイゼーションがＣｈｕｒｃｈ緩衝液（７％ＳＤＳ， ０．５％ＮａＨＰＯ４， １ＭのＥＤＴＡ， １％ウシ血清アルブミン）において５０℃で行われ、そして洗浄が２×ＳＳＣにおいて５０℃で行われるそれらの条件である。
検出されると、核酸分子は、多くの標準技法のいずれかにより単離され得る（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋなど．， “Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”， ２ｎｄ Ｅｄ． Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， ＮＹ， １９８９を参照のこと）。
【００８１】
本発明はまた、（ａ）前述のＭＡＳＰ−２−関連のコード配列及び／又はそれらの補体（すなわち、“アンチセンス”配列）のいずれかを含む発現ベクター；（ｂ）コード配列の発現を方向づける調節要素（それらの例は下記に与えられる）に操作可能的に結合される前述のＭＡＳＰ−２−関連コード配列のいずれかを含む発現ベクター；（ｃ）ＭＡＳＰ−２をコードする核酸配列に関係しない核酸配列、例えばレポーター又はマーカーをコードする分子を、ＭＡＳＰ−２ポリペプチドをコードする配列の他に、含む発現ベクター；及び（ｄ）前述の発現ベクターのいずれかを含み、そしてそれにより、宿主細胞において本発明の核酸分子を発現する、遺伝子的に構築された宿主細胞を包含する。
【００８２】
組換え核酸分子は、可溶性ＭＡＳＰ−２をコードする配列、成熟ＭＡＳＰ−２、シグナル配列を有するＭＡＳＰ−２、又はＭＡＳＰ−２の機能的ドメイン、例えばセリンプロテアーゼドメイン、ＥＧＦドメイン、又はＭＢＬ−結合ドメインを含むことができる。十分な長さのＭＡＳＰ−２ポリペプチド、ＭＡＳＰ−２のドメイン又はそのフラグメントが、下記のように、追加のポリペプチドに融合され得る。同様に、本発明の核酸分子は、ＭＡＳＰ−２の成熟形、又は分泌を促進するポリペプチドをコードする形をコードすることができる。後者の場合、ポリペプチドは、典型的には、宿主細胞内のシグナル配列の除去により活性形に転換され得るプロタンパク質として言及される。プロタンパク質は、不活性配列の除去により、タンパク質の活性形に転換され得る。
【００８３】
上記に言及される調節要素は、次のものを包含するが、但しそれらだけには限定されない：当業者に知られており、そして調節遺伝子発現を誘導するか又は他方では、調節する、誘発性又は非誘発性プロモーター、エンハンサー、オペレーター及び他の要素。そのような調節要素は次のものを包含するが、但しそれらだけには限定されない：サイトメガロウィルスｈＣＭＶ即時初期遺伝子、ＳＶ４０の初期又は後期プロモーター、ｌａｃシステム、ｔｒｐシステム、ＴＡＣシステム、ＴＲＣシステム、ファージＡの主要オペレーター及びプロモーター領域、ｆｄコートタンパク質の制御の領域、３−ホスホグリセリン酸キナーゼのためのプロモーター、酸性ホスファターゼのプロモーター、及び酵母α−接合因子のプロモーター。
【００８４】
同様に、核酸は、追加のポリペプチド配列、例えばマーカー又はレポーターとして機能する配列をコードするハイブリッド遺伝子の一部を形成することができる。マーカー又はレポーター遺伝子の例は、次のものを包含する：β−ラクタマーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ（ｎｅｏ’， Ｇ４１８’）、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）、ヒドロマイシン−Ｂ−ホスホトランスフェラーゼ（ＨＰＨ）、チミジンキナーゼ（ＴＫ）、ｌａｃＺ （β−ガラクトシダーゼをコードする）、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）及びキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＸＧＰＲＴ）。
【００８５】
本発明の実施に関連する多くの標準方法に関して、当業者は、マーカー又はレポーターの機能を付与することができる追加の配列の追加の有用な試薬を気づくであろう。一般的に、ハイブリッドポリペプチドは、第１部分及び第２部分を含み；前記第１部分はＭＡＳＰ−２ポリペプチドであり、そして前記第２部分は、例えば上記に記載されるレポーター又は免疫グロブリン不変領域である。
【００８６】
本発明のために使用され得る発現システムは次のものを包含するが、但しそれらだけには限定されない：本発明の核酸分子を含む、組換えバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ又はコスミドＤＮＡ発現ベクターにより形質転換された微生物、例えば細菌（例えば、Ｅ．コリ及びＢ．サブチリス）；本発明の核酸分子を含む（好ましくは、ＭＡＳＰ−２の核酸配列（配列番号３）を含む）組換え酵母発現ベクターにより形質転換された酵母（例えば、サッカロミセス及びピチア）；本発明の核酸分子を含む組換えウィルス発現ベクター（例えば、バキュロウィルス）により感染された昆虫細胞システム；組換えウィルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウィルス（ＣａＭＶ）及びタバコモザイクウィルス（ＴＭＶ））に感染された、又はＭＡＳＰ−２ヌクレオチド配列を含む組換えプラスミド発現ベクター（例えば、Ｔｉプラスミド）により形質転換された植物細胞システム；又は哺乳類細胞のゲノム（例えば、メタロチオネインプロモーター）又は哺乳類ウィルス（例えば、アデノウィルス後期プロモーター及びワクシニアウィルス７．５Ｋプロモーター）由来のプロモーターを含む組換え発現構造体を有する哺乳類細胞システム（例えば、ＣＯＳ， ＣＨＯ， ＢＨＫ， ２９３， ＶＥＲＯ， ＨｅＬａ， ＭＤＣＫ， ＷＩ３８及びＮＩＨ３Ｔ３細胞）。
【００８７】
細菌システムいおいては、多くの発現ベクターが、発現される遺伝子生成物のために意図される使用に依存して、都合良く選択され得る。例えば、多量のそのようなタンパク質が、ＭＡＳＰ−２ポリペプチドを含む医薬組成物の生成、又はそれらのポリペプチドに対する抗体を生ぜしめるために生成される予定である場合、容易に精製される高レベルの融合タンパク質生成物の発現を方向づけることができるベクターが所望される。
【００８８】
そのようなベクターは次のものを包含するが、但しそれらだけには限定されない：Ｅ．コリ発現ベクターｐＵＲ２７８（Ｒｕｔｈｅｒなど．， ＥＭＢＯ　Ｊ．２：１７９１， １９５３）、ここで挿入体のコード配列は、融合タンパク質で生成されるよう、ｌａｃＺコード領域と整合してベクター中に個々に連結され得る；ｐＩＮベクター（Ｉｎｏｕｙｅ ａｎｄ Ｉｎｏｕｙｅ， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １３： ３１０１−３１０９， １９８５； Ｖａｎ Ｈｅｅｋｅ ａｎｄ Ｓｃｈｕｓｔｅｒ， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６４： ５５０３−５５０９， １９８９）；及び同様のもの。ｐＧＥＸ ベクターはまた、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）との融合タンパク質として外来性ポリペプチドを発現するために使用され得る。
【００８９】
一般的に、そのような融合タンパク質は可溶性であり、そしてグルタチオン−アガロースビーズへの吸着、続いて、遊離グルタチオンの存在下での溶出により、溶解された細胞から容易に精製され得る。ｐＧＥＸベクターは、クローン化された標的遺伝子生成物がＧＳＴ成分から開放され得るよう、トロンビン又は第Ｘａ因子プロテアーゼ切断部位を含むよう企画される。
【００９０】
昆虫システムにおいては、オートグラファ・カリホミカ（Ａｕｔｏｇａｒｐｈａ ｃａｌｉｆｏｍｉｃａ）核ポリヒドロシスウィルス（ＡｃＮＰＶ）が、外来性遺伝子を発現するためのベクターとして使用され得る。このウィルスは、スポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｎｇｉｐｅｒｄａ）細胞において増殖する。挿入体のコード配列は、ウィルスの非必須領域（例えば、多面体遺伝子）中に個々にクローン化され、そしてＡｃＮＰＶプロモーター（例えば、多面体プロモーター）の制御下に配置され得る。
【００９１】
コード配列の好結果をもたらす挿入は、多面体遺伝子の不活性化、及び妨げられていない組換えウィルス（すなわち、多面体遺伝子によりコードされるタンパク質性コードを欠いているウィルス）の生成をもたらすであろう。次に、それらの組換えウィルスが、挿入された遺伝子が発現されるスポドプテラ・フルギペルダ細胞を感染するために使用される（例えば、Ｓｍｉｔｈなど．，Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ４６： ５８４， １９８３； Ｓｍｉｔｈ， アメリカ特許第４，２１５，０５１号を参照のこと）。
【００９２】
哺乳類宿主細胞においては、多くのウィルスに基づく発現システムが利用され得る。アデノウィルスが発現ベクターとして使用される場合、本発明の核酸分子は、アデノウィルス転写／翻訳制御複合体、例えば後期プロモーター及び３分節リーダー配列に結合され得る。次に、このキメラ遺伝子が、インビトロ又はインビボ組換えにより、アデノウィルスゲノムに挿入され得る。ウィルスゲノムの非必須領域（例えば、領域Ｅ１又はＥ３）における挿入は、生存性であり、そして感染された宿主においてＭＡＳＰ−２遺伝子生成物を発現できる組換えウィルスをもたらすであろう（例えば、Ｌｏｇａｎ ａｎｄ Ｓｈｅｎｋ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ， Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ８１： ３６５５−３６５９， １９８４を参照のこと）。特定の開始シグナルがまた、挿入された核酸分子の効果的な翻訳のために必要とされる。それらのシグナルは、ＡＴＧ開始コドン及び隣接する配列を包含する。
【００９３】
完全な遺伝子又はｃＤＮＡ、例えばそれ自体の開始コドン及び隣接する配列が適切な発現ベクター中に挿入される場合、追加の翻訳制御シグナルは必要とされない。しかしながら、コード配列の一部のみが挿入される場合、外因性翻訳制御シグナル、例えばＡＴＧ開始コドンが供給されるべきである。さらに、開始コドンは、完全挿入体の翻訳を確保するために所望するコード配列の読み取り枠と接合して存在すべきである。それらの外因性翻訳制御シグナル及び開始コドンは、種々の起源、例えば天然及び合成起源のものであり得る。発現の効力は、適切な転写エンハンサー要素、転写ターミネーター、等の包含により増強され得る（Ｂｉｔｔｎｅｒなど．， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ． １５３： ５１６−５４４， １９８７を参照のこと）。
【００９４】
さらに、挿入された配列の発現を調節するか、又は所望する特定の態様で遺伝子生成物を修飾し、そしてプロセッシングする宿主細胞株が選択される。タンパク質生成物のそのような修飾（例えば、グリコシル化）及びプロセッシング（例えば、切断）が、タンパク質の機能のために重要であり得る。異なった宿主細胞は、タンパク質及び遺伝子生成物の後−翻訳プロセッシング及び修飾のための特徴的且つ特異的機構を有する、適切な細胞系又は宿主システムが、発現される外来性タンパク質の正しい修飾及びプロセッシングを確保するために選択され得る。このためには、遺伝子生成物の主要転写、グリコシル化及びリン酸化の正しいプロセッシングのための細胞機能を有する真核宿主細胞が使用され得る。上記に列挙される哺乳細胞型は、適切な宿主細胞として作用するそれらである。
【００９５】
組換えタンパク質の長期の高収率生成に関しては、安定した発現が好ましい。例えば、上記ＭＡＳＰ−２配列を安定して発現する細胞系が構築され得る。複数のウィルス起点を有する発現ベクターを用いるよりもむしろ、宿主細胞は、適切な発現制御要素（例えば、プロモーター、エンハンサー配列、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位、等）、及び選択マーカーにより制御されるＤＮＡにより形質転換され得る。外来性ＤＮＡの導入に続いて、構築された細胞は、富化された培地における１〜２日間の増殖、及び続いて、選択培地への交換を可能にされる。
【００９６】
組換えプラスミドにおける選択マーカーは、選択に対する耐性を付与し、そしてプラスミドのそれらの染色体への安定した組み込み、及び細胞系中にクローン化され、そして拡張され得る焦点物の形成のための増殖を可能にする。この方法は、好都合には、ＭＡＳＰ−２を発現する細胞系を構築するために使用され得る。そのような構築された細胞系は、遺伝子生成物の内因性活性に影響を及ぼす化合物のスクリーニング及び評価において、及び治療使用のためのＭＡＳＰ−２の生成のために特に有用であり得る。それらの方法はまた、実験又は治療目的のために宿主生物中に導入される細胞を修飾するために使用され得る。
【００９７】
多くの選択システムが使用され得る。例えば、ヘルペス単純ウィルスチミジンキナーゼ（Ｗｉｇｌｅｒなど．， Ｃｅｌｌ １１：２２３， １９７７）、ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｓｚｙｂａｌｓｋａ ａｎｄ Ｓｚｙｂａｌｓｋｉ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ４８： ２０２６， １９６２）、及びアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｌｏｗｙなど．， Ｃｅｌｌ ２２： ８１７， １９８０）遺伝子が、それぞれｔｋ−， ｈｇｐｒｔ−又はａｐｒｔ−細胞において使用され得る。
【００９８】
また、抗−代謝物耐性が、次の遺伝子のための選択に基づいて使用され得る：メトトレキセートに対する耐性を付与するｄｈｆｒ（Ｗｉｇｌｅｒなど．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ７７： ３５６７， １９８０； Ｏ’Ｈａｒｅなど．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７８： １５２７， １９８１）； マイコフェノール酸に対する耐性を付与するｇｐｔ（Ｍｕｌｌｉｇａｎ ａｎｄ Ｂｅｒｇ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ７８： ２０７２， １９８１）； アミノグリコシドＧ−４１８に対する耐性を付与するｎｅｏ（Ｃｏｌｂｅｒｒｅ−Ｇａｒａｐｉｎなど．， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １５０： １， １９８１）； 及びヒグロマイシンに対する耐性を付与するｈｙｇｒｏ （Ｓａｎｔｅｒｒｅなど．， Ｇｅｎｅ ３０： １４７， １９８４）。
【００９９】
他方では、いずれかの融合タンパク質が、発現される融合タンパク質に対する抗体を用いることによって容易に精製され得る。例えば、Ｊａｎｋｎｅｃｈｔなどにより記載されるシステムは、ヒト細胞系において発現される、変性されていない融合タンパク質の容易な精製を可能にする（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ８８： ８９７２−８９７６， １９９１）。このシステムにおいては、興味ある遺伝子が、その遺伝子の読み取り枠が、６個のヒスチジン残基から成るアミノ末端標識に翻訳的に融合されるよう、ワクシニア組換えプラスミド中にサブクローン化される。組換えワクシニアウィルスにより感染された細胞化らの抽出物が、Ｎｉ２＋−ニトロ酢酸−アガロースカラム上に負荷され、そしてヒスチジン標識されたタンパク質が、イミダゾール含有緩衝液により選択的に溶出される。
【０１００】
ＭＡＳＰ−２ポリペプチド：
本発明のＭＡＳＰ−２ポリペプチドは、配列番号２に由来するアミノ酸配列を含んで成るポリペプチドである。さらに、本明細書に記載されるＭＡＳＰ−２ポリペプチドは、上記核酸分子のいずれかによりコードされるそれらであり、そしてＭＡＳＰ−２フラグメント、変異体、切断された形、及び融合タンパク質を包含する。それらのポリペプチドは、種々の用途、例えばＭＢＬｅｃｔｉｎ応答を調節できる他の細胞遺伝子生成物又は化合物の同定のための診断アッセイにおける試薬として、及びＭＢＬｅｃｔｉｎ経路の活性に関連する炎症及び一定の疾患（下記に記載される）の処理のために有用な医薬試験として、抗体の生成のために調製され得る。
【０１０１】
好ましいポリペプチド、例えば損なわれていないシグナル配列（配列番号２のアミノ酸１〜１５から延長する）を有するポリペプチドに対応するポリペプチド、ヒトＭＡＳＰ−２ポリペプチドのポリペプチド（配列番号２のアミノ酸１６〜６８６から延長する）の成熟形、及びＭＡＳＰ−２ポリペプチドの一部を表すポリペプチドは、実質的に純粋なＭＡＳＰ−２ポリペプチドである。通常の生理学的条件下で可溶性であるポリペプチドが特に好ましい。
【０１０２】
１つの態様のおいては、本発明はまた、ＭＡＳＰ−２に対して機能的に同等であるポリペプチドを包含する。機能的同等物は、配列番号１に概略されるようなＭＡＳＰ−２アミノ酸配列のフラグメントのみを含んで成る。好ましい態様においては、ＭＡＳＰ−２ポリペプチドは、下記のものから成る群から選択される：
ｉ） 配列番号１として同定される配列、又はその機能的同等物を含んで成るポリペプチド；
ｉｉ） ２０ｋＤの分子質量を有する配列番号１として同定される配列、又はその機能的同等物を含んで成るポリペプチド；
ｉｉｉ） 配列番号２のアミン３０〜４４４、又はその機能的同等物を含んで成るポリペプチド；
【０１０３】
ｉＶ） ５２ｋＤの分子質量を有する配列番号２のアミノ酸３０〜４４４、又はその機能的同等物を含んで成るポリペプチド；
ｖ） 配列番号２のアミン酸１３８〜２９６、又はその機能的同等物を含んで成るポリペプチド；
ｖｉ） セリンプロテアーゼ活性を有する配列番号２に起因するアミン酸配列、又はその機能的同等物を含んで成るポリペプチド；
ｖｉｉ） ＭＢＬ補体経路機能についてのインビトロアッセイにおいてＭＡＳＰ−２活性を阻害できる、配列番号２に由来するアミン酸配列を含んで成るポリペプチド；
【０１０４】
ｖｉｉｉ） 配列番号３のアミノ酸１５〜６７１、又はその機能的同等物を含んで成るポリペプチド；
ｉｘ） 配列番号２のアミン酸１６〜２９６、又はその機能的同等物を含んで成るポリペプチド；及び
ｘ） 配列番号２のアミノ酸３０〜２９６、又はその機能的同等物を含んで成るポリペプチド。
【０１０５】
それらのポリペプチドは、それらが生物学的シスタムにおいてＭＡＳＰ−２の１又は複数の機能を実施できることにおいて、ＭＡＳＰ−２に対して同等である。好ましいＭＡＳＰ−２ポリペプチドは、本明細書に記載されるＭＡＳＰ−２の十分に長い成熟ヒト形の活性の２０％， ４０％，５０％，７５％，８０％又は９０％を有する。そのような比較は、一般的に、ポリペプチドの等濃度が使用され、そして比較される、生物学的活性のアッセイに基づかれる。比較はまた、得ることができる最大活性の５０％に達するために必要とされるポリペプチドの量に基づかれる。
【０１０６】
機能的に同等のタンパク質は、例えば追加の、欠失された又は置換されたアミノ酸残基を含むそれらのタンパク質であり得る。置換は、関与する残基の極性、荷電、溶解性、疎水性、親水性、及び／又は両親媒性に基づいて行われ得る。典型的には、お互いによる保存性置換を提供すると思われるアミノ酸が、本発明の要約に特定される。Ｄ−アミノ酸は、ポリペプチドの半減期を改良するために導入され得る。
【０１０７】
ＭＡＳＰ−２（配列番号２）に対して機能的に同等であるポリペプチドは、当業者に良く知られているランダム突然変異誘発技法を用いて行われ得る（そして、得られる変異体ＭＡＳＰ−２タンパク質が活性について試験され得る）。しかしながら、そのようなポリペプチドは、特定部位の突然変異誘発により生成されるであろう（再び、当業者に良く知られている技法を用いて）。それらのポリペプチドは、高められた機能、すなわちＭＢＬｅｃｔｉｎ経路を活性化するより高い能力を有することができる。そのようなポリペプチドは、ＭＢＬｅｃｔｉｎ経路の免疫機能の活性を増強するために使用され得る。
【０１０８】
機能的に同等のポリペプチドを企画するためには、保存される位置と可変位置との間を区別することが有用である。これは、種々の生物から得られたＭＡＳＰ−２ ｃＤＮＡの配列を一列整列することによって行われ得る。当業者は、保存されるアミノ酸残基が機能の保存のために必要であることを理解するであろう。従って、保存される残基は変更されないことが好ましい。
ＭＡＳＰ−２コード配列内の突然変異は、選択された宿主細胞における発現のために適切であるＭＡＳＰ−２ペプチドを生成するために行われ得る。グリコシル化配列の導入はまた、変更された生物学的特徴を有するＭＡＳＰ−２ポリペプチドを生成するために使用され得る。
【０１０９】
本発明はまた、ＭＡＳＰ−２又はその前駆体を含んで成るポリペプチド配列内の多形現象のアッセイ方法を特徴とする。これは、多くの技法により達成され得る。例えば、精製されたポリペプチドが、トリプシン消化にゆだねられ、そしてその得られるフラグメントが１又は２次元電気泳動により分析される。サンプルポリペプチドの分析からの結果が、既知の配列を用いての結果に比較される。また、分析は、１又は２次元電気泳動、続く、膜への分離されたタンパク質のトランスファー（ウェスターンブロット）による生物学的サンプル（例えば、血清又は他の体液）の分離を包含する。次に、膜が、ＭＡＳＰ−２に対する抗体、続いてラベルされた第２抗体と反応せしめられる。染色パターンが、既知の配列又は修飾を有するサンプルを用いて得られるそのパターンと比較される。
【０１１０】
本発明のポリペプチドは、もう１つのポリペプチド、例えばマーカーポリペプチド又は融合パートナーに発現融合され得る。例えば、ポリペプチドは、細菌的に発現されたタンパク質の精製を促進するためにヘキサ−ヒスチジンに、真核細胞において発現されるタンパク質の精製を促進するために赤血球凝集素標識に融合され得る。本発明のＭＡＳＰ−２ポリペプチド、又はその一部がまた、変更され、その結果、それは免疫グロブリンＦｃドメインへの融合により長い循環半減期を有する（Ｃａｐｏｎなど．， Ｎａｔｕｒｅ ３３７：５２５−５３１， １９８９）。同様に、高められた安定性をインビボで有する、ＭＡＳＰ−２ポリペプチドのダイマー形が生成され得る。
【０１１１】
本発明のポリペプチドは、化学的に合成され得（例えば、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ， “Ｐｒｏｔｅｉｎｓ： Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ａｎｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ”， Ｗ．Ｈ． Ｆｒｅｅｍａｎ ＆ Ｃｏ．， ＮＹ， １９８３）、又はたぶん、より好都合には、本明細書に記載のようにして、組換えＤＮＡ技法により生成され得る。追加の案内に関しては、当業者は、次の文献を調べる：Ａｕｓｕｂｅｌなど．， （前記）；Ｓａｍｂｒｏｏｋなど．， （“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， ＮＹ， １９８９）；及び特に、化学的合成の例に関しては、Ｇａｉｔ， Ｍ．Ｊ． Ｅｄ． （“Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”， ＩＲＬ． Ｐｒｅｓｓ， Ｏｘｆｏｒｄ， １９８４）。
【０１１２】
本発明はまた、ＭＡＳＰ−２活性を競争的に阻害できるポリペプチドを特徴とする。１つの観点においては、そのようなポリペプチドは、下記から成る群から選択され得る：
ｉ）配列番号２のポリペプチドのフラグメントを含んで成るポリペプチド、ここで前記ポリペプチドはＭＢＬ／ＭＡＳＰ−２又はその機能的同等物の複合体化の競争インヒビターであり；
【０１１３】
ｉｉ） 配列番号３として同定される配列又はその機能的同等物を含んで成るポリペプチド、ここで位置８， ９， １０， １１， １２， １３， １４， １５， １６， １７， １８又は１９での１又は複数のアミノ酸残基がもう１つのアミノ酸残基により置換されており；
ｉｉｉ） 配列番号３として同定される配列又はその機能的同等物を含んで成るポリペプチド、ここで位置８， ９， １０， １１， １２， １３， １４， １５， １６， １７， １８又は１９での少なくとも２つのアミノ酸残基がもう１つのアミノ酸残基により置換されており；
ｉｖ） 配列番号３として同定される配列又はその機能的同等物を含んで成るポリペプチド、ここで位置１４でのａｒｇがもう１つのアミノ酸により置換されており；
【０１１４】
ｖ）　配列番号３として同定される配列又はその機能的同等物を含んで成るポリペプチド、ここで位置１４でのａｒｇが小さな荷電されていないアミノ酸から成る群から選択されたアミノ酸により置換されており；
ｖｉ）　配列番号３として同定される配列又はその機能的同等物を含んで成るポリペプチド、ここで位置１４でのａｒｇがｇｌｙ及びａｌａから成る群から選択されたアミノ酸により置換されており；
ｖｉｉ） ＭＡＳＰ−２又はその機能的相同体と会合できるマンナン−結合性レクチン（ＭＢＬ）のフラグメントを含んで成るポリペプチド；及び
ｖｉｉｉ） ＭＡＳＰ−２を選択的に結合する抗体。
【０１１５】
本発明はまた、ＭＡＳＰ−２（及びそれをコードする遺伝子）と相互作用し、そしてそれにより、ＭＡＳＰ−２の機能を変更するポリペプチドを特徴とする。相互作用するポリペプチドは、当業者に知られている方法を用いて同定され得る。１つの適切な方法は、タンパク質相互作用をインビボで検出する“２−ハイブリッドシステム”である（Ｃｈｌｅｎなど．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８８： ９５７８， １９９１）。この方法を実施するためのキットは、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ， ＣＡ）から入手できる。
【０１１６】
抗−ＭＡＳＰ−２抗体：
ヒトＭＡＳＰ−２ポリペプチド（又は免疫原性フラグメント又は類似体）が本発明において有用な抗体を生ぜしめるために使用され得；そのようなポリペプチドは組換え方法により生成され得るか、又は合成され得る（例えば、“Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”， 前記；Ａｕｓｕｂｅｌなど．， 前記を参照のこと）。一般的に、ポリペプチドは、Ａｕｓｕｂｅｌなど．， 前記に記載されるように、キャリヤータンパク質、例えばＫＬＨにカップリングされ、アジュバントと共に混合され、そして宿主哺乳類中に注入され得る。また、前記キャリヤーはＰＰＤであり得る。抗体は、ペプチド抗原親和性クロマトグラフィーにより精製され得る。
【０１１７】
特に、種々の宿主動物が、ＭＡＳＰ−２タンパク質又はポリペプチドによる注入により免疫化され得る。宿主動物は、ウサギ、マウス、テンジュクネズミ、ラット及び鶏を包含する。免疫学的応答を高めるために使用され得る種々のアジュバントは、宿主種に依存し、そしてフロイントアジュバント（完全及び不完全）、鉱物ゲル、例えば水酸化アルミニウム、界面活性物質、例えばリゾレシチン、プルロニック　ポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油エマルジョン、キーホールリンペットヘモシアニン及びジニトロフェノールを包含する。実質的に有用なヒトアジュバントは、ＢＣＧ（Ｂａｃｉｌｌｅ Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ）及びコリネバクテリウム・パルビウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｕｒｖｕｍ）を包含する。ポリクローナル抗体は、免疫化された動物の血清に含まれる抗体分子の異種集団である。
【０１１８】
従って、本発明内の抗体は、ポリクローナル抗体及び、さらに、モノクローナル抗体、ヒト適合された又はキメラ抗体、一本鎖抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、及びＦａｂ発現ライブラリーを用いて生成される分子、及びファージ表示技法により生成される抗体又はフラグメントを包含する。
特定の抗原に対する抗体の相同集団であるモノクローナル抗体は、上記ＭＡＳＰ−２タンパク質及び標準のハイブリドーマ技法を用いて調製され得る（例えば、Ｋｏｈｌｅｎなど．， Ｎａｔｕｒｅ ２５６： ４９５， １９７５； Ｋｏｈｌｅｒなど．， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ６：５１１， １９７６； Ｋｏｈｌｅｒなど．， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ６： ２９２， １９７６； Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇなど．， “Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｔ Ｃｅｌｌ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ”， Ｅｌｓｅｖｉｅｒ， ＮＹ， １９８１； Ａｕｓｕｂｅｌ など．， 前記を参照のこと）。
【０１１９】
特に、モノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒなど．， Ｎａｔｕｒｅ ２５６： ４９５， １９７５及びアメリカ特許第４，３７６，１１０号に記載のように、培養物における連続細胞系による抗体分子の生成を提供するいずれかの技法；ヒトＢ−細胞ハイブリドーマ技法（Ｋｏｓｂｏｒなど．， Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ ４：７２， １９８３； Ｃｏｌｅなど．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８０： ２０２６， １９８３）：及びＥＢＶ−ハイブリドーマ技法（Ｃｏｌｅなど．， “Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ”， Ａｌａｎ Ｒ． Ｌｉｓｓ， Ｉｎｃ．， ｐｐ． ７７−９６， １９８３）により得られる。
【０１２０】
そのような抗体は、ＩｇＧ， ＩｇＭ， ＩｇＥ， ＩｇＡ， ＩｇＤ及びそれらのいずれかのサブクラスを包含するいずれかの免疫グロブリンクラスのものであり得る。（鶏の場合、免疫グロブリンクラスはまた、ＩｇＹでもあり得る。）本発明のｍＡｂを生成するハイブリドーマは、インビトロ又はインビボで培養され得る。インビボで高い力価のｍＡｂを生成する能力が、これを現在好ましい生成方法にするが、しかしいくつかの場合、すなわち腹水からの標準の免疫グロブリンの存在が所望されない場合、又は論理的考慮に関与する場合、インビトロ生成が、生存動物中への癌細胞の導入を回避するために好ましいであろう。
【０１２１】
生成されると、ポリクローナル、モノクローナル又はファージ由来の抗体が、Ａｕｓｕｂｅｌなど．， 前記に記載のように、標準の方法によるウェスターンブロット又は免疫沈殿分析により、特定のＭＡＳＰ−２認識について試験される。ＭＡＳＰ−２を特異的に認識し、そしてそれに結合する抗体が本発明において有用である。例えば、そのような抗体は、動物により生成されるＭＡＳＰ−２のレベルをモニターするために（例えば、ＭＡＳＰ−２の量又は非細胞位置を決定するために）、イムノアッセイにおいて使用され得る。また、抗体は、下記に論じられるように、ＭＡＳＰ−２インヒビターとして使用され得る。
【０１２２】
好ましくは、本発明の抗体は、高く保存される領域外に存在し、そして基準、例えば高い頻度の荷電された残基により、たぶん抗原性であると思われるＭＡＳＰ−２タンパク質のフラグメントを用いて生成される。１つの特定の例においては、そのようなフラグメントは、ＰＣＲの標準技法により生成され、そして次に、ｐＧＥＸ発現ベクター中にクローン化される（Ａｕｓｕｂｅｌなど．， 前記）。融合タンパク質は、Ｅ．コリにおいて発現され、そしてＡｕｓｕｂｅｌなど．， 前記に記載のように、グルタチオンアガロース親和性マトリックスを用いて精製される。
【０１２３】
いくつかの場合、抗血清の低親和性又は特異性の可能性ある問題を最少にすることが所望される。そのような情況下で、２又は３個の融合体が個々のタンパク質のために生成され得、そして個々の融合体が少なくとも２匹のウサギ中に注射され得る。抗血清が、連続した、好ましくは少なくとも３回の追加免疫注射により生ぜしめられ得る。
抗血清がまた、組換えＭＡＳＰ−２タンパク質又は対照タンパク質、例えばグルココルチコイド受容体、ＣＡＴ又はルシフェラーゼを免疫沈殿するその能力について調べられる。
【０１２４】
抗体は例えば、診断アッセイの一部として、生物学的サンプルにおけるＭＡＳＰ−２の検出に使用され得る。抗体はまた、ＭＡＳＰ−２の発現又は局在化に対する候補体化合物の効果を測定するために、スクリーニングアッセイにおいて使用され得る。さらに、そのような抗体は、患者へのそれらの導入の前、正常な及び／又は構築されたＭＡＳＰ−２発現細胞を評価するために、記載される遺伝子治療技法に使用され得る。そのような抗体はさらに、異常ＭＡＳＰ−２活性を阻害する方法に使用され得る。
【０１２５】
さらに、適切な生物学的活性のヒト抗体分子からの遺伝子と共に、適切な抗原特異性のマウス抗体分子からの遺伝子をスプライシングすることにより“キメラ抗体”（Ｍｏｒｒｉｓｏｎなど．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８１： ６８５１， １９８４； Ｎｅｕｂｅｒｇｅｎなど．， Ｎａｔｕｒｅ， ３１２； ６０４， １９８４； Ｔａｋｅｄａなど．， Ｎａｔｕｒｅ， ３１４： ４５２， １９８４）の生成のために開発された技法が、使用され得る。キメラ抗体は、１つの分子であり、ここで異なった動物種、例えばネズミｍＡｂ由来の可変領域及びヒト免疫グロブリン不変領域を有するそれらの種から、異なった部分が誘導される。
【０１２６】
他方では、一本鎖抗体の生成について記載される技法（アメリカ特許第４，９４６，７７８号、第４，９４６，７７８号及び第４，７０４，６９２号）は、ＭＡＳＰ−２タンパク質又はポリペプチドに対する一本鎖抗体を生成するために適合され得る。一本鎖抗体は、アミノ酸架橋を通してＦｖ領域のＨ及びＬ鎖フラグメントを連結し、一本鎖ポリペプチドをもたらすことにより形成される。
【０１２７】
特定のエピトープを認識し、そしてそれを結合する抗体フラグメントは、既知技法により生成され得る。例えば、そのようなフラグメントは、次のものを包含するが、但しそれだけには限定されない：抗体分子のペプシン消化により生成され得るＦ（ａｂ’）２フラグメント、及びＦ（ａｂ’）２フラグメントのジスルフィド架橋を還元することにより生成され得るＦａｂフラグメント。他方では、Ｆａｂ発現ライブラリーが、所望する特異性を有するモノクローナルＦａｂフラグメントの急速且つ容易な同定を可能にするために構成され得る（Ｈｕｓｅなど．， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２４６： １２７５， １９８９）。
【０１２８】
ＭＡＳＰ−２に対する抗体は、当業者は良く知られている技法を用いて、ＭＡＳＰ−２の一部に類似する抗−イディオタイプ抗体を生成するために使用され得る（例えば、Ｇｒｅｅｎｓｐａｎなど．， ＦＡＳＥＢ Ｊ． ７： ４３７， １９９３； Ｎｉｓｓｉｎｏｆｆ， Ｊ． ｉｍｍｕｎｏｌ． １４７： ２４２９， １９９１を参照のこと）。例えば、ＭＡＳＰ−２に結合し、そしてＭＡＳＰ−２のリガンドの結合を競争的に阻害する抗体は、ＭＡＳＰ−２のリガンド結合ドメインに類似し、そして従って、ＭＡＳＰ−２、例えばＭＢＬのリガンドを中和する抗−イディオタイプを生成するために使用され得る。そのような中和抗−イディオタイプ抗体又はそのような抗−イディオタイプ抗体のＦａｂフラグメントが治療レジメに使用され得る。
【０１２９】
抗体は、当業界において知られている方法によりヒト適合化され得る。例えば、所望する結合特異性を有するモノクローナル抗体は商業的にヒト適合化され得る（Ｓｃｏｔｇｅｎｅ， Ｓｃｏｔｉａｎｄ： Ｏｘｆｏｒｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ， Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ， ＣＡ）。十分なヒト抗体、例えばトランスジェニック動物において発現されるそれらの抗体はまた、本発明の特徴である（Ｇｒｅｅｎなど．， Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ７： １３−２１， １９９４； また、アメリカ特許第５，５４５，８０６号及び第５，５６９，８２５号を参照のこと；それらの両者は引用により本明細書に組み込まれる）。
【０１３０】
抗−ＭＡＳＰ−２抗体が使用される、本明細書に記載される方法は、下記障害の症状を示す患者を診断するために、臨床学的設定に便利に使用され得る、少なくとも１つの特異的ＭＡＳＰ−２ヌクレオチド配列又は本明細書に記載される抗体試薬を含んで成る、予備包装された診断キットを用いて行われ得る。
【０１３１】
ＭＡＳＰ−２の定量アッセイ：
単なる例として、定量アッセイが、体液又は器官（生検）抽出物におけるＭＡＳＰ−２の濃度の評価のために考案され得る。そのようなアッセイは、液相又は固相であり得る。例は競争性及び非競争性ＥＬＩＳＡである。後者の例として、マイクロタイターウェルが、抗−ＭＡＳＰ−２抗体により被覆され、サンプルと共にインキュベートされ、そしてＭＡＳＰ−２の存在が酵素ラベルされた抗体、続いて着色された化合物を沈殿する基質により可視化される。他方では、ラベル、例えばユウロピウムが使用され、そして検出が時間分解された蛍光分析法の使用により行われる。
【０１３２】
単独で又はＭＢＬ／ＭＡＳＰ複合体の一部として、ＭＡＳＰ−２の機能的活性のアッセイがいくつかの方法により行われ得る。ＭＢＬ／ＭＡＳＰ−２複合体についての試験の例として、試験サンプルがマンナン−被覆されたマイクロウェル上に適用され、そしてＣ４がＣ４−分解活性を評価するために添加され、又はＣ３が生成されるＣ３コンバーターゼのＣ３の分解活性を評価するために添加される。ＭＢＬ／ＭＡＳＰ複合体の一部として存在しないＭＡＳＰ−２のアッセイが同様に行われるが、しかしＭＢＬが、マンナン−被覆されたウェルヘのこの添加の前、マイクロウェル又はサンプルのいずれかに添加される。ＭＢＬの添加の前、サンプルはＭＢＬ及びＭＢＬ／ＭＡＳＰ−１及びＭＢＬ／ＭＡＳＰ−２複合体を、ビーズ結合される固相マンナンによる処理により、又は固相抗−ＭＢＬ抗体により、又は前記複合体を沈殿するが、しかし上清液にＭＡＳＰ−２を残す適切な濃度の沈殿剤、例えばＰＥＧによる処理により消耗される。アッセイは、従来の補体活性化経路及び他の補体活性化経路からの妨害を最少にするか又は排除する条件下で行われる。
【０１３３】
ＭＡＳＰ−２の活性又はＭＡＳＰ−２を排除するアッセイが、個人、特に感染又は炎症性疾患を有するそれらの個人からのサンプルにおける診断及び処理目的のために使用され得る。
【０１３４】
治療のためのＭＡＳＰ−２：
特許請求の範囲において特定される成分の治療使用は、ＭＡＳＰ−２における構成的又は一時的欠失が個人を１又は複数の感染に対して敏感に対する情況下で、又は個人が確立された感染を中和できない情況下で適用され得る。特異、本発明は、感染の処理のための薬剤の調製のためへのＭＡＳＰ−２の使用に関する。好ましくは、ＭＡＳＰ−２欠失の個人がＭＡＳＰ−２により処理されたとしても、又は血清における正常ＭＡＳＰ−２活性を有する個人も処理され得る。
【０１３５】
本発明のさらなる態様においては、ＭＡＳＰ−２は、低ＭＢＬ血清レベルを有する個人における感染の処理のための薬剤の調製のために使用され得る。そのような態様においては、医薬組成物は好ましくは、さらに、少なくとも１つのマンナン−結合性レクチン（ＭＢＬ）サブユニット、又は前記少なくとも１つのマンナン−結合性レクチン（ＭＢＬ）サブユニットを含んで成る少なくとも１つのマンナン−結合性レクチン（ＭＢＬ）オリゴマーを含んで成る。他方では、ＭＡＳＰ−２及びＭＢＬは、キットの一部として投与され得る。
【０１３６】
好ましくは、本発明のＭＢＬオリゴマーは、ＭＢＬのテトラマー、ペンタマー及び／又はヘキサマーから成るオリゴマー群から選択される。ＭＢＬは、組換え的に生成されるか、又は精製された天然に存在するＭＢＬであり得る。例えば、ＭＢＬは、引用により本明細書に組み込まれる特許出願ＰＣＴ／ＤＫ００／００２４６号又はＰＣＴ／ＤＫ００／００２４７号に開示されるＭＢＬ種のいずれかであり得る。本発明の低ＭＢＬ血清レベルは好ましくは、５００ｎｇ／ｍｌ以下のＭＢＬ血清レベル、より好ましくは１００ｎｇ／ｍｌ以下のＭＢＬ血清レベル、さらにより好ましくは５０ｎｇ／ｍｌ位かのＭＢＬ血清レベルである。
【０１３７】
また、ＭＡＳＰ−２は、投与されるＭＢＬのために利用できる十分な量のＭＡＳＰ−２を確保するために、血清ＭＢＬレベルとは無関係にＭＢＬ処理を受ける個人にも投与され得る。
ＭＡＳＰ−２又はＭＢＬ／ＭＡＳＰ複合体は、個人の免疫防御を改良するために、静脈内注入により投与され得る。
【０１３８】
本発明者は、ＭＡＳＰ−２がＭＢＬ／ＭＡＳＰ複合体の強力な抗菌活性のために必要とされ、そして従って、遺伝的に決定されるか又は獲得されたＭＡＳＰ−２の欠失が、感染に対する個人の耐性及び確立された感染を攻撃する能力を不生にするであろうと信じている。天然の又は組換えＭＡＳＰ−２による再構成は、そのような情況下での有用な処理療法である。組換えＭＡＳＰ−２は、活性を調節するために、完全な分子の形、分子の一部、又は他の構造体にいずれかの手段により結合される完全な分子又はその一部の形で存在することができる。組換え生成物は、そのようなことが所望される場合、増強された活性又は低められた活性を得るために、天然の分子と構造的同一であるか、又はわずかに変性され得る。
【０１３９】
天然の又は組換えＭＢＬによる再構成治療は、受容体がＭＢＬ／ＭＡＳＰ活性の発現のための十分なＭＡＳＰ−２を有することを必要とする。従って、ＭＡＳＰ−２は、患者が不十分なＭＡＳＰ−２活性を有する場合、治療用調製物に含まれるべきである。
ＭＡＳＰ−２は好ましくは、５０ｎｇ／ｍｌ〜１００μｇ／ｍｌ、好ましくは１００ｎｇ／ｍｌ〜８００μｇ／ｍｌ、より好ましくは５００ｎｇ／ｍｌ〜５００μｇ／ｍｌ、さらにより好ましくは７５０ｎｇ／ｍｌ〜２５０μｇ／ｍｌ、さらにより好ましくは１μｇ／ｍｌ〜１００μｇ／ｍｌ、さらにより好ましくは２μｇ／ｍｌ、最も好ましくは２μｇ／ｍｌ〜１０μｇ／ｍｌの処理されるべき個人の血清におけるＭＡＳＰ−２の濃度をもたらす用量で投与される。
本発明の医薬組成物により処理され得る感染は、いずれかの感染剤による感染であり得る。例えば、感染は、微生物種により引き起こされ得る。
【０１４０】
微生物種は菌類；酵母、細菌又は寄生体であり得る。
本発明の細胞は、次のものから成る群から選択され得る：アクロモバクター・キシロソキシダン（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ ｘｙｌｏｓｏｘｉｄａｎｓ）、Ａ． カルコアセチカス（Ａ． ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ）、好ましくはＡ．アニトラタス（Ａ． ａｎｉｔｒａｔｕｓ）、Ａ．ハエマリチカス（Ａ．ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ）、Ａ．アルカリゲネス（Ａ．ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）、及びＡ．イオフィ（Ａ．ｉｗｏｆｆｉｉ）、アクチノマイセス・イスラエリ（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ ｉｓｒａｅｌｉｉ）、アエロモナス・ヒドロフィリア（Ａｅｒｏｍｏｎｅｓ ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉａ）、アルカリゲネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）種、好ましくはＡ．フェエカリス（Ａ．ｆａｅｃａｌｉｓ）、Ａ．オドランス（Ａ．ｏｄｏｒａｎｓ）及びＡ．デニトリフィカンス（Ａ． ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）、アリゾナ・ヒンスハウィ（Ａｒｉｚｏｎａ ｈｉｎｓｈａｗｉｉ）、
【０１４１】
バチラス・アントラシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓ）、Ｂ．セレウス（Ｂ． ｃｅｒｅｕｓ）、バクテロイデス・フラギリス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｆｒａｇｌｌｉｓ）、Ｂ．メラニノゲニカス（Ｂ． ｍｅｌａｎｉｎｏｇｅｎｉｃｕｓ）、ボルデテラ・ペルツシス（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）、ボレリア・ブルグドリフェリ（Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｎｉ）、Ｂ．レキュレンチス（Ｂ． ｒｅｃｕｒｒｅｎｔｉｓ）、ブルセラ（Ｂｒｕｓｅｌｌａ）種、好ましくはＢ．アボルタス（Ｂ． ａｂｏｒｔｕｓ）、Ｂ．スイス（Ｂ． ｓｕｉｓ）、Ｂ．メリテンシス（Ｂ． ｍｅｌｉｔｅｎｓｉｓ）及びＢ．カニス（Ｂ． ｃａｎｉｓ）、カリマトバクテリム・グラヌロマチス（Ｃａｌｙｍｍａｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｒａｎｕｌｏｍａｔｉｓ）、カムピロバクター・フェタス ｓｓｐ． インテスチナリス（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｆｅｔｕｓ ｓｓｐ． Ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ）、
【０１４２】
カムピロバクター・フェタス ｓｓｐ． ジュジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｆｅｔｕｓ ｓｓｐ． Ｊｅｊｕｎｉ）、クラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ）種、好ましくはＣ．プシタシ（Ｃ． ｐｓｉｔａｃｉ）及びＣ．トラコマチス（Ｃ． ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）、クロモバクテリウム・ビオラセウム（Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｉｏｌａｃｅｕｍ）、シトロバクター（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ）種、好ましくはＣ．フレウンジ（Ｃ． ｆｒｅｕｎｄｉｉ）及びＣ．ジベルサス（Ｃ． ｄｉｖｅｒｓｕｓ）、クロストリジウム・ボツリナム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）、Ｃ．ペルフリンゲンス（Ｃ． ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）、Ｃ．ジフィシレ（Ｃ． ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）、Ｃ．テタニ（Ｃ． ｔｅｔａｎｉ）、コリネバクテリウム・ジフテリア（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ）、Ｃ．ウレセランス（Ｃ． ｕｌｃｅｒａｎｓ）、Ｃ．ハエモリチカム（Ｃ． ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｍ）及びＣ．シュードツベルキュロシス（Ｃ．ｐｓｅｕｄｏｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、
【０１４３】
コキシエラ・ブメチ（Ｃｏｘｉｅｌｌａ ｂｕｍｅｔｉｉ）、エトワルドシエラ・タルダ（Ｅｄｗａｒｄｓｉｅｌｌａ ｔａｒｄａ）、エイケネラ・コロデンス（Ｅｉｋｅｎｅｌｌａ ｃｏｒｒｏｄｅｎｓ）、エンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、好ましくはＥ．クロアカエ（Ｅ． ｃｌｏａｃａｅ）、Ｅ．アエロゲネス（Ｅ． ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）、Ｅ．ハフンラエ（Ｅ． ｈａｆｎｌａｅ）（また、ハフニア・アルビイ（Ｈａｂｎｉａ ａｌｖｅｉ）とも称する）、及びＥ．アグロメランス（Ｅ． ａｇｇｌｏｍｅｒａｎｓ）、エリスルペロスリックス・リヒュスロパチアエ（Ｅｒｙｓｌｐｅｌｏｔｈｒｉｘ ｒｈｕｓｌｏｐａｔｈｉａｅ）、エスシェリシア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、フラボバクテリウム・メニンゴセプチカム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｅｎｉｎｇｏｓｅｐｔｉｃｕｍ）、フランシセラ・ツラレンシス（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ）、フソバクテリウム・ヌクレアタム（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｎｕｃｌｅａｔｕｍ）、ガルドネレラ・バギナリス（Ｇａｒｄｎｅｒｅｌｌａ ｖａｇｉｎａｌｌｓ）、
【０１４４】
ハエモフィラス・デュクレイ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｌｕｓ ｄｕｃｒｅｙｉ）、Ｈ．インフルエンザエ（Ｈ． ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、ヘリコバクター（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ）種、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）種、好ましくはＫ．プネウモニアエ（Ｋ． ｐｎｅｕｍｏｕｉａｅ）、Ｋ．オザエナエ（Ｋ． ｏｚａｅｎａｅ）、Ｋ．リノヌクレロマチス（Ｋ．ｒｈｉｎｏｓｃｌｅｒｏｍａｔｉｓ）、レジオネラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ）種、レプトスピラ・インテロガンス（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｉｎｔｅｒｒｏｇａｎｓ）、リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、モラキセラ（Ｍｏｒａｘｅｌｌａ）種、好ましくはＭ．ラキュナタ（Ｍ． ｌａｃｕｎａｔａ）及びＭ．オスロエンシス（Ｍ． ｏｓｌｏｅｎｓｉｓ）、マイコバクテリウム・ボビス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｏｖｉｓ）、Ｍ．レプラエ（Ｍ． ｌｅｐｒａｅ）、Ｍ．ツベルキロシス（Ｍ． ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、マイコプラズマ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）種、好ましくはＭ．プネウモニアエ（Ｍ． ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、
【０１４５】
ネイセリア・ブノルホエアエ（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）、Ｎ．メニンギチジス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、１カルジア（Ｎｏｃａｒｄｉａ）種、好ましくはＮ．アステロイデネ（Ｎ． ａｓｔｅｒｏｉｄａｅ）及びＮ．ブラシリエンシス（Ｎ．ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）、パステルレリア・ハエモリチカ（Ｐａｓｔｅｒｕｒｅｌｉａ ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃａ）、Ｐ．ムルトシダ（Ｐ．ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）、ペプトコーカス・マグナス（Ｐｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍａｇｎｕｓ）、プレシオモナス・シゲロイデス（Ｐｌｅｓｉｏｍｏｎａｓ ｓｈｉｇｅｌｌｏｉｄｅｓ）、プネウモコシ（Ｐｎｕｍｏｃｏｃｃｉ）、プロテウス（Ｐｒｏｔｅｕｓ）種、好ましくはＰ．ミラビリス（Ｐ． ｍｉｒａｂｉｌｉｓ）、Ｐ．バルガリス（Ｐ． ｖｕｌｇａｒｉｓ）、Ｐ．レチゲリ（Ｐ． ｒｅｔｔｇｅｒｉ）及びＰ．モルガニ（Ｐ． ｍｏｒｇａｎｉｉ）（また、それぞれ、プロビデンシア・レトゲリ（Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ ｒｅｔｔｇｅｒｉ）及びモルガネラ・モルガニル（Ｍｏｒｇａｎｅｌｌａ ｍｏｒｇａｎｉｌ）とも呼ばれる）、
【０１４６】
プロビデンシア（Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ）種、好ましくはＰ．アルカリファシエンス（Ｐ． ａｌｃａｌｉｆａｃｉｅｎｓ）、プロビデンシア（Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ）種、好ましくはＰ．アルカリファシエンス（Ｐ． ａｌｃａｌｉｆａｃｉｅｎｓ）、Ｐ．スツアルチ（Ｐ． ｓｔｕａｒｔｉｉ）及びＰ．レトゲリ（Ｐ． ｒｅｔｔｇｅｒｉ）（また、プロテウス・レトゲリ（Ｐｒｏｔｅｕｓ ｒｅｔｔｇｅｒｉ）とも称する）、シュードモナス・アエルギノサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、Ｐ．マレイ（Ｐ． ｍａｌｌｅｉ）、Ｐ．シュードマレイ（Ｐ． ｐｓｅｕｄｏｍａｌｌｅｉ）、リケツシア（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ）、ロカリマイア・ヘンセラエ（Ｒｏｃｈａｌｉｍａｉａ ｈｅｎｓｅｌａｅ）、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）種、好ましくはＳ．エンテリジス（Ｓ． ｅｎｔｅｒｉｄｉｓ）、Ｓ．チピ（Ｓ． ｔｙｐｈｉ）及びＳ．デルビイ（Ｓ． ｄｅｒｂｙ）、及び最も好ましくは、サルモネラＤＴ１０４型のサルモネラ種、セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）種、Ｓ．マルセスセンス（Ｓ． ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）、シゲラ、
【０１４７】
シセンテリアエ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ）、Ｓ．フレクシネリ（Ｓ． ｆｌｅｘｎｅｒｉ）、Ｓ．ボイジ（Ｓ． ｂｏｙｄｉｉ）及びＳ． ソネイ（Ｓ． ｓｏｎｎｅｉ）、スピリラム・ミノル（Ｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｍｉｎｏｒ）、スタフィロコーカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）、Ｓ．エピデルミジス（Ｓ． ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）、Ｓ． サプロフィチカス（Ｓ． ｓａｐｒｏｐｈｙｔｉｃｕｓ）、ストレプトバシラス・モニリホルミス（Ｓｔｒｅｐｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｉｓ）、ストレプトコーカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、好ましくはＳ． ファエカリス（Ｓ． ｆａｅｃａｌｉｓ）、Ｓ． ファエシウム（Ｓ． ｆａｅｃｉｕｍ）、及びＳ． デュランス（Ｓ． ｄｕｒａｎｓ）、ストレプトコーカス・アガラクチアエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌｅｃｔｉａｅ）、Ｓ． プネウモニアエ（Ｓ． ｐｎｏｅｕｍｏｎｉａｅ）、Ｓ． ピロゲネス（Ｓ． ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、
【０１４８】
トレポネマ・カラテウム（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｃａｒａｔｅｕｍ）、トレポネアム・パリダム（Ｔｒｅｐｏｎｅａｍ ｐａｌｌｉｄｕｍ）、Ｔ． ペルテニュ（Ｔ． ｐｅｒｔｅｎｕｅ）、好ましくはＴ． パリダム（Ｔ． ｐａｌｌｉｄｕｍ）、ウレアプラズマ・ウレアリチカム（Ｕｒｅａｐｌａｓｍａ ｕｒｅａｌｙｔｉｃｕｍ）、ビブリオ・コレラエ（Ｖｉｂｒｌｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ）、Ｖ．バラハエモリチカス（Ｖ． ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ）、エルシニア・エンテロコリチカ（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ）及びＹ．ペスチス（Ｙ． ｐｅｓｔｉｓ）。
【０１４９】
本発明の寄生体は、次のものから成る群から選択され得る：マラリア（Ｍａｌａｒｉａ）（プラスモジウム・ファルシパラム（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）、Ｐ．ビバックス（Ｐ． ｖｉｖａｘ）、Ｐ．マラリアエ（Ｐ． ｍａｌａｒｉａｅ））、スキストソメス（Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍｅｓ）、トリパノソメス（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍｅｓ）、レルシマネア（Ｌｅｌｓｈｍａｎｉａ）、フィラリアル・レマトデス（Ｆｉｌａｒｉａ ｎｅｍａｔｏｄｅｓ）、トリコモニアシス（Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎｉａｓｉｓ）、サルコスポリジアシス（Ｓａｒｃｏｓｐｏｒｉｄｉａｓｉｓ）、タエニア（Ｔａｅｎｉａ）（Ｔ． サギナタ（Ｔ． ｓａｇｉｎａｔａ）、Ｔ．ソリウム（Ｔ． ｓｏｌｉｕｍ））、レイスマニア（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ）、トキソプラスマ・ゴンジ（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ ｇｏｎｄｉｉ）、トリキネロシス（Ｔｒｉｃｈｉｎｅｌｏｓｉｓ）（トリキネラ・スピラリス（Ｔｒｉｃｈｉｎｅｌｌａ ｓｐｉｒａｌｉｓ））又はコシジオシス（Ｃｏｃｃｉｄｉｏｓｉｓ）（エイメリア（Ｅｉｍｅｒｉａ）種）。
【０１５０】
菌類は、クリプトコーカス・ネオホルマンス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ）、カルジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）、ススペルギラス・フミガタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）及びコシジオイドマイコシス（Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｏｍｙｃｏｓｉｓ）から成る群から選択され得る。
１つの好ましい態様においては、細菌種は、少なくとも１つの抗生物質薬剤に対して耐性であり得る。例えば、細菌種は、多耐性であり得る。１つの例においては、細菌種は病原性である。
本発明のもう１つの態様においては、感染は、ウィルスによる感染であるウィルス感染である。
【０１５１】
本発明のウィルスは、下記のものから成る群から選択され得る：アデノ関連ウィルス、アデノウィルス、鳥類感染性気管支炎ウィルス、バキュロウィルス、水痘、コロナウィルス、サイトメガロウィルス、ジステンパーウィルス、腸ウィルス、エプスタイン−バーウィルス、ネコ白血病ウィルス、フラビウィルス、口蹄疫ウィルス、Ａ型肝炎ウィルス、Ｂ型肝炎ウィルス、Ｃ型肝炎ウィルス、Ｅ型肝炎ウィルス、疱疹ウィルス、単純疱疹ウィルス、インフルエンザウィルス、ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、ＨＴＬＶ１、Ａ及びＢ型インフルエンザウィルス、Ｋｕｎｊｉｎウィルス、ラッサ熱ウィルス、ＬＣＭＶ（リンパ球脈絡髄膜炎ウィルス）、レンチウィルス、麻疹ウィルス、メンゴウィルス、モルビルウィルス、ミクソウィルス、
【０１５２】
乳頭種ウィルス、パロウィルス、パラインフルエンザウィルス、パラミクソウィルス、パルボウィルス、Ｐｏｋｏウィルス、ポリオウィルス、ポリオマー腫瘍ウィルス、仮性狂犬病ウィルス、狂犬病ウィルス、レオウィルス、ＲＳウィルス、レトロウィルス、ライノウィルス、牛疫ウィルス、ロタウィルス、Ｓｅｍｌｉｋｉ森林ウィルス、センダイウィルス、シミアンウィルス４０、シンドビスウィルス、ＳＶ５、ダニ媒介脳炎ウィルス、トガウィルス（風疹、黄熱病、デング熱）、ワクシニアウィルス、ベネズエラウマ脳脊髄炎ウィルス及び水疱性口炎ウィルス。
【０１５３】
１つの好ましい態様においては、ウィルスは、レトロウィルス、例えばヒト免疫欠損ウィルスである。
ＭＡＳＰ−２についてのアッセイ：
ＭＡＳＰ−２（又はＭＡＳＰ−２インヒビター）による治療は通常、患者からの血清又は血漿におけるＭＡＳＰ−２の推定により進められるべきである。そのようなアッセイの例は、下記に記載される。
【０１５４】
ＭＡＳＰ−２抗原についてのアッセイ：
ＭＡＳＰ−２タンパク質は便利には、標準の免疫学的方法の１つを用いて、抗原として推定される。
単なる例として、ＭＡＳＰ−２の定量ＴＲＩＦＭＡ（時間分解された免疫蛍光アッセイ）を、１）１μｇの抗−Ｃ’ ＭＡＳＰ−２抗体によるマイクロタイターウェルの被膜；２）Ｔｗｅｅｎ−２０による阻止；３）試験サンプル、例えば希釈された血漿又は血清サンプルの適用；４）Ｅｕ−ラベルされた抗−Ｎ’ ＭＡＳＰ−２抗体の適用；５）増強溶液（Ｗａｌｌａｃ Ｌｔｄ）の適用；６）時間分解された蛍光計上でのＥｕの読み取りにより構成した。
【０１５５】
（ＥＬＩＳＡによる評価は、同様にして、例えば段階４においてビオチン−ラベルされた抗−Ｎ’ＭＡＳＰ−２；段階５においてアルカリホスファターゼ−ラベルされたアビジンを用いることにより；６）基質の適用；及び７）色彩の強度を読み取り行われ得る。）個々の段階の間で、プレートは室温でインキュベートされ、そして洗浄された（但し、段階６と７との間は除く）。検量線が、任意には、１ｍｌ当たり１単位のＭＡＳＰ−２を含むと言われる、プールされた正常血漿の希釈溶液を用いて構成され得る。この第１段階のＭＡＳＰ−２アッセイに使用される抗体は、合成ペプチドに対して生ぜしめられ、そして生来のＭＡＳＰ−２とは良好には反応されなかった。従って、サンプルが、煮沸水浴上で５分間、ＳＤＳにより前処理され、そしてＳＤＳが、アッセイの前、非イオン性界面活性剤（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）により中和された。アッセイのさらなる進行は、生来のＭＡＳＰ−２と反応する抗体を使用し、ＳＤＳ処理を不必要にする。
【０１５６】
アッセイは、天然の又は組換えＭＡＳＰ−２又はその一部と反応する、ポリクローナル又はモノクローナル抗体又は組換え抗体を用いて、同様にして構成され得る。
損なわれていないＭＡＳＰ−２と又は活性化生成物と選択的に反応する抗体の使用を通して、又は分子の種々の部分に対する抗体の組合せを通して、アッセイは、ＭＢＬｅｃｔｉｎ経路のインビボ活性化の評価のために構成され得る。それらのアッセイは、この経路の活性化により引き起こされる炎症の決定のために有用であろう。
ＭＢＬ／ＭＡＳＰ複合体のＭＡＳＰ−２活性についてのアッセイ：
【０１５７】
ＭＡＳＰ−２は、補体システムを活性化するその能力により評価され得る。Ｃ４がＭＡＳＰ−２により分解され得る場合、活性チオールエステルが露出され、そしてＣ４が求核基近くに共有結合されるようになる。従って、Ｃ４ｂの実質的な部分が、被覆されたプラスチック壁に結合されるようになり、そして抗−Ｃ４抗体により検出され得る。従って、単独で、又はＭＢＬ／ＭＡＳＰ複合体の一部のＭＡＳＰ−２の機能的活性のアッセイは、いくつかの方法により行われ得る。Ｃ４を分解するＭＢＬ／ＭＡＳＰ−２の活性は、ＭＡＳＰ−２を検出するための次の方法によりアッセイされ、ここでＭＡＳＰ−２活性についてのアッセイを含んで成る前記方法は、
【０１５８】
−結合されたＭＢＬを獲得する固相に、予定された量のＭＢＬを含んで成るサンプルを適用し；
−前記結合されたＭＢＬに予定された量のＭＡＳＰ−２を適用し；
−前記複合体に少なくとも１つの補体因子を適用し；
−分解された補体因子の量を検出し；
−前記ＭＡＳＰ−２の量と前記分解された補体因子の量とを相関し；そして
−ＭＡＳＰ−２の活性を決定するか；又は
【０１５９】
−結合された複合体を獲得する固相に、予定された量のＭＢＬ／ＭＡＳＰ−２複合体を含んで成るサンプルを適用し；
−前記複合体に少なくとも１つの補体因子を適用し；
−分解された補体因子の量を検出し；
−前記ＭＡＳＰ−２の量と前記分解された補体因子の量とを相関し；そして
−ＭＡＳＰ−２の活性を決定する段階を含んで成る。
【０１６０】
ＭＡＳＰ−２活性についての定量的ＴＲＩＦＭＡが、１）１００μｌの緩衝液中、１／μｇのマンナンによりマイクロタイターウェルを被覆し；２）Ｔｗｅｅｎ−２０により阻止し；３）試験サンプル、例えば希釈された血漿又は血清サンプルを適用し；４）５μｇ／ｍｌでの精製された補体因子Ｃ４を適用し；５）３７℃で１時間インキュベートし；６）Ｅｕ−ラベルされた抗−Ｃ４抗体を適用し；７）増強溶液を適用し；そして８）時間分解された蛍光計によりＥｕを読み取ることによって構成された。（ＥＬＩＳＡによる評価は、同様にして、例えば段階６においてビオチン−ラベルされた抗−Ｃ４を適用し；７）アルカリホスファターゼ−ラベルされたアビジンを適用し；８）基質を適用し；そして９）色彩強度を読み取ることによって行われ得る。）
【０１６１】
個々の段階の間で、プレートは室温でインキュベートされ、そして洗浄され、但し段階７と８との間は除く。検量線は、任意には、１ｍｌ当たり１単位のＭＢＬ／ＭＡＳＰ−２活性を含むと言われる、１つの選択された正常血漿の希釈溶液を用いて構成され得る。アッセイは、従来の又は他の補体活性化経路によるＣ４の活性化を妨げる条件下で行われる。Ｃ４の活性化は、セリンプロテアーゼインヒビターベンズアミジンにより完全に阻害された。従来の補体経路の活性化は好ましくは、アッセイの産物を減じるために阻害される。
【０１６２】
好ましくは、阻害は高いイオン強度でアッセイを行うことによって行われ、ここで塩濃度は、０．２Ｍ以上、例えば２．５Ｍ以上、例えば０．３Ｍ〜１０Ｍ、例えば０．５Ｍ〜５Ｍ、例えば０．７Ｍ〜２Ｍ、例えば０．９Ｍ〜２Ｍ、例えば１．０Ｍ以上である。使用される塩は、アッセイのために適切ないずれか１又は複数の塩、例えばＮａＣｌ， ＫＣｌ， ＭｇＣｌ２， ＣａＣｌ２， ＮａＩ， ＫＣｌ， ＭｇＩ２， ＣａＩ２， ＮａＢｒ， ＫＢｒ， ＭｇＢｒ２， ＣａＢｒ２， Ｎａ２Ｓ２Ｏ３， （ＮＨ４）２ＳＯ４及びＮＨ４ＨＣＯ３から選択された塩であり得る。従来の経路の阻害は好ましくは、ＭＢＬ／ＭＡＳＰ複合体を妨げないが、しかしＣ１ｑｒｓ複合体を破壊する。
【０１６３】
他の経路の阻害は、アッセイを行う前、サンプルを、少なくとも５倍、例えば少なくとも１０倍、例えば少なくとも２０倍又はそれ以上に希釈することによって行われ得る。
【０１６４】
遊離ＭＡＳＰ−２活性の評価についてのアッセイ：
ＭＢＬ−欠失個人からのサンプルにおけるＭＡＳＰ−２活性の評価は、ＭＡＳＰ−フリーＢＭＬにより被覆されたウェル上で行われる。ＭＢＬを有する個人からのサンプルにおける遊離ＭＡＳＰの評価が、まず、セファロースー結合されたマンナンと共にインキュベートすることによって（１０倍に希釈された血漿又は血清３００μｌのビーズと共にインキュベートされる）、ＭＢＬ／ＭＡＳＰ−１及びＭＢＬ／ＭＡＳＰ−２複合体を除去し、そして次に、上清液を分析することによって行われる。
【０１６５】
ＴＲＩＦＭＡホルメートにおいて行われるアッセイは次の通りにして進行する：１）１００μｌの緩衝液中、１μｌのマンナンによりマイクロタイターウェルを被覆し；２）Ｔｗｅｅｎ−２０により阻止し；３）１００ｎｇ／ｍｌのＭＡＳＰ−フリーＭＢＬと共に、緩衝液中、１０００倍希釈度でのサンプルをインキュベートし、そしてウェル当たり１００μｌの混合物を適用し；４）４℃で一晩インキュベートし；４）洗浄し、そして５μｇ／ｍｌでの精製された補体因子Ｃ４を適用し；５）３７℃で１時間インキュベートし；６）Ｅｕ−ラベルされた抗−Ｃ４抗体を適用し；７）増強溶液を適用し；そして８）時間分解された蛍光分析法によりＥｕを読み取る。
【０１６６】
（ＥＬＩＳＡによる評価が、同様にして、例えば段階６においてビオチン−ラベルされた抗−Ｃ４を適用し；７）アルカリホスファターゼ−ラベルされたアビジンを適用し；８）基質を適用し；そして９）色彩強度を読み取ることによって行われ得る。）検量線が、任意には、１ｍｌ当たり１単位のＭＡＳＰ−２活性を含むと言われる、１つの選択されたＭＢＬ−欠失血漿の希釈溶液を用いて構成され得る。アッセイは、従来の又は他の補体活性化経路によりＣ４の活性化を妨げる条件下で行われる（上記を参照のこと）。
【０１６７】
ＭＡＳＰ−２活性の阻害：
ＭＡＳＰ−２の生物学的活性のインヒビターが、ＭＡＳＰ−２の補体活性化活性及び炎症活性を制御するために使用され得る。そのようなインヒビターは、Ｃ２又はＣ４の標的構造を表す基質類似体であり得る。インヒビターは、天然の又は修飾されたペプチド、又はＭＡＳＰ−２の活性を競争的に又は非競争的に阻害するいずれかの有機分子のものであり得る。インヒビターは、短い又は長い時間、循環にとどまるよう変性され、そして注射により又は経口的に与えられるよう構成され得る。インヒビターは、化学的又は酵素的方法により、天然の又は組換えＭＡＳＰ−２から生成されるＭＡＳＰ−２のフラグメントであり得る。インヒビターは、天然に存在する短形のＭＡＳＰ−２であり得る。インヒビターは、可溶性形で存在するか、又は固相にカップリングされ得る。固相は、体外血液又は血漿流動装置に使用される適合表面であり得る。
【０１６８】
微生物炭水化物又は内因性オリゴ糖は、ＭＢＬ／ＭＡＳＰ複合体の所望しない活性化を誘発し、損傷性炎症応答をもたらすことができる。この病理生理学的活性は、ＭＡＳＰ−２活性のインヒビター、例えばＰｅｆａｂｌｏｃの投与により低められ得る。また他の酵素インヒビター（ＰＭＳＦ， ベンズアミジン、等）が、ＭＡＳＰ−２活性についてＴＲＩＦＭＡにおいてアッセイされる場合、効果的であることがわかっている。明らかに、インビボ使用のためのインヒビターを企画する場合、毒性が主な考慮であり、そして高い特異性のインヒビターが広い反応性のインヒビターよりも低い毒性であると思われる。特異的インヒビターは、補体因子Ｃ４又はＣ２分子上の標的構造体を表す、ペプチド、ペプチド類似体又はペプチド誘導体を用いて生成され得る。
【０１６９】
もう１つのタイプのインヒビターは、ＭＡＳＰ−２の活性部位又はＭＡＳＰ−２上の他の構造体に対する抗体（又は抗体のフラグメント）に基づかれ、従ってＭＡＳＰ−２の活性を阻害する。ＭＡＳＰ−２に対する抗体は、好ましくは、上記で論じられた抗体である。インヒビターはまた、ＭＡＳＰ−１によりもたらされるが、ＭＡＳＰ−２の活性化の阻害に向けられ、すなわちＭＡＳＰ−２上のＭＡＳＰ−１のための標的構造体がこのタイプの適切なインヒビターである。もう１つのタイプのインヒビターは、ＭＢＬへのＭＡＳＰ−２の結合を妨げ、そしてそれにより、ＭＡＳＰ−２の活性化を妨げる。ＭＡＳＰ−２のＮ−末端の２０ｋＤａフラグメントが、このタイプの適切なインヒビターである。より特定には、ＭＢＬへのＭＡＳＰ−２の結合を仲介するポリペプチド鎖の正確な部分を特定し、そして合成ペプチド又は類似する構造体をインヒビターとして使用することができる。インヒビターは、Ｌ−アミノ酸によりＤ−アミノ酸を置換され得る。
【０１７０】
また、インヒビターは、選択分子として、ＭＡＳＰ−２又はそのフラグメントを用いて、ＳＥＬＥＸ（指数的増強によるリガンドの組織的進展）により単離されたＲＮＡ又は一本鎖ＤＮＡであり得る。ＭＡＳＰ−２のリーダー配列は本出願の他の部分に示されている。
さらに、ＭＡＳＰ−２のインヒビターは、セリンプロテアーゼインヒビター、例えばアプロチニンである。
ＭＡＳＰ−２活性は、ＭＡＳＰ−１の作用、又はＭＡＳＰ−１の活性を刺激するいずれか他の物質を通してのプロ酵素形のＭＡＳＰ−２の活性化されたＭＡＳＰ−２への転換により制御され得る。
【０１７１】
実施例
例１．ＭＡＳＰ−２の同定
カルシウム依存性態様で炭水化物に結合する、ヒト血漿タンパク質及びタンパク質複合体（すなわち、レクチン及び会合タンパク質）を、マンナン−及びＮ−アセチルグルコサミン−誘導体化されたセファロースビーズでの親和性クロマトグラフィーにより精製した。ＥＤＴＡ及び酵素インヒビターを含む緩衝液により希釈された、プールされたＣＰＤ−血漿（２．５Ｌ）を、セファロース２Ｂ ＣＬ及びマンナン−セファロールに通した。トロンビンインヒビターＰＰＡＣＫ（Ｄ−フェニルアラニン−プロイル−アルギニル−クロロメチルケトン）及びＣａＣｌ２を添加した。そのプールを、セファロース２Ｂ−ＣＬ及びマンナン−セファロースに通して、そしてマンナン−セファロースにカルシウム依存的に結合するタンパク質を、ＥＤＴＡ服務緩衝液により溶出した。溶出液を再石灰化し、ＧｌｃＮＡｃ−セファロースカラムに通し、上記のように溶出し、２０ｍｌのレクチン調製物を得た。
【０１７２】
このタンパク質調製物を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、及びＰＶＤＦ−膜上にブロットすることにより分析した。ウシレクチン調製物（２５）に対して生ぜしめられた鶏抗体いよるブロットの進展は、５２ｋＤａのＭｒを有するタンパク質、及び３２ｋＤａでのＭＢＬを表した。５２ｋＤａのバンドを、ＮＨ２−末端アミノ酸配列分析にゆだねた。配列は、前に記載されたＭＡＳＰ（ＭＡＳＰ−１）の配列との類似性を示した。１９個のＮＨ２−末端アミノ酸を表す合成ペプチドに対して生ぜしめられた抗体（抗−Ｎ’ ＭＡＳＰ−２抗血清）は、５２ｋＤａの分子、及び２０ｋＤａに対する移動度を有する分子を認識した（図１、レーン１）。非還元条件下で、７６ｋＤａのポリペプチドを、抗−Ｎ’−ＭＡＳＰ−２抗血清を用いて検出し、鎖内ジスルフィド結合の存在を示した。２０ｋＤａのポリペプチドは、５２ｋＤａのポリペプチドと同じＮＨ２−末端配列を有することが見出され、そして後者の切断された形を、たぶん表す。直接的に決定されたアミノ酸配列（ＮＨ２−末端、及び内部ペプチドのそれらの末端）が図６に示される。
【０１７３】
非還元条件下での第１の寸法及び還元条件下で第２の寸法を有する２寸法ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、７６ｋＤａのＭｒを有するジスルフィド結合されたタンパク質の一部である５２ｋＤａのポリペプチドを示した。前記タンパク質の残りの部分をたぶん表す、３１ｋＤａのポリペプチド（図１、レーン３）はまた、タンパク質のＣＯＯＨ−末端部分における配列を表す合成ペプチドに対して生ぜしめられた抗血清（抗−Ｃ’ ＭＡＳＰ−２）により、７６ｋＤａのタンパク質の一部として認識された（ｃＤＮＡ配列決定技法により測定された；下記を参照のこと）。非還元条件下で抗−Ｎ’ ＭＡＳＰ−２抗体に関して見出される７６ｋＤａのバンドもまた、抗−Ｃ’ ＭＡＳＰ−２抗体により認識された（図１、レーン４）。
【０１７４】
図１ｂは、非還元条件下での第１の寸法を包含する、２寸法でのＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。レーンを切断し、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）を含むサンプル緩衝液においてインキュベートし、もう１つのＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上に置き、そして電気泳動の後、ゲルをブロットし、そしてブロットを抗−Ｎ’ ＭＡＳＰ−２抗体により進行せしめた。分子量マーカーの位置が示される。
【０１７５】
例２．マンナン−結合性レクチンに会合したセリンプロテアーゼに対する抗体の調製
ＢＣＧ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ Ｃａｌｍｅｔｔｅ Ｇｕｅｒｉｎワクチン）により感作された動物を、Ｃ．Ｋｏｃｈ， Ｔｈｅ Ｓｔａｔｅ Ｓｅｒｕｍ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ， Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎに従って、ＰＰＤ（ツベルクリン精製されたタンパク質誘導体）に結合された合成ペプチドにより免疫化した。抗−Ｎ’ ＭＡＳＰ−１、抗−Ｃ’ ＭＡＳＰ−１及び抗−Ｎ’ ＭＡＳＰ−２と称する抗体は、それぞれ、ＭＡＳＰ−１の最初の１９個のアミノ酸残基、ＭＡＳＰ−１の最後の１９個のアミノ酸残基、及びＭＡＳＰ−２の最初の１９個のアミノ酸残基に対応するペプチドにより免疫化されたウサギからであった。鶏抗−Ｃ’ ＭＡＳＰ−２抗体は、ＭＡＳＰ−２のＣ末端部分における配列を表す２種のペプチド（残基５０５〜５２３及び５３８〜５５６）の混合物により免疫化された鶏からであった。すべてのペプチドは、カップリングのための追加のＣ末端システムを有した。抗体及び標準鶏ＩｇＧを、卵黄から精製した（２６）。
【０１７６】
モノクローナル抗−ＭＢＬ抗体、ＩｇＧ１−κ（クロン１３１−１）及び対照ＩｇＧ１−κ（クローンＭＯＰＣ２１）を、プロテインＡ親和性クロマトグラフィーにより精製した。Ｆ（ａｂ’）２ウサギ抗−ヒトＣ４及びＦ（ａｂ’）２ウサギ抗−ヒトＣ１ｑを、ウサギ抗−ヒトＣ４及びウサギ抗−ヒトＣ１ｑのペプシン消化により生成した（ＤＡＫＯ， Ｇｌｏｓｔｒｕｐ， Ｄｅｎｍａｒｋ）。ウェスターンブロットの染色に関しては、抗体を１μｇ／ｍｌで使用した。結合された鶏抗体を、ウサギ抗−鶏ＩｇＧ、続いてペルオキシダーゼ−ラベルされたヤギ抗−ウサギＩｇＧ、及び増強された化学ルミネセンス技法を用いての進行により可視化した。結合されたマウス及びウサギ抗体を、それぞれペルオキシダーゼ−ラベルされたウサギ抗−マウスＩｇＧ及びペルオキシダーゼ−ラベルされたヤギ抗−ウサギＩｇＧにより可視化した。
【０１７７】
例３．５２ｋＤａ及び２０ｋＤａのポリペプチドのアミノ酸配列決定
レクチン調製物を濃縮し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにゆだね、そしてＰＶＤＦ膜にトランスファーした。２つのストリップを、抗−ビオチンレクチン抗体により進行せしめた（２５）。ブロットの残りを、クーマシーブリリアントブルーにより染色した。全クーマシー染色されたタンパク質の約５％を表すことが判断されている、免疫染色された５２ｋＤａのバンドに対応するバンドを、切断し、そしてＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓタンパク質配列決定機上での配列決定にゆだねた。
【０１７８】
抗−Ｎ’ ＭＡＳＰ−２抗体の生成の後、類似するウェスターンブロットを、抗−Ｎ−ＭＡＳＰ−２抗体を用いて行った。この抗体により可視化された、５２ｋＤａ及び２０ｋＤａのバンドのタンパク質のＮＨ２−末端を配列決定した。ペプチドを、もう１つのブロットからの２種のバンドにおけるタンパク質のトリプシン消化により調製し、逆相クロマトグラフィーにより分別し、そして主要ピークにおけるペプチドを配列決定にゆだねた。
【０１７９】
例４．ＭＡＳＰ−２のクローニング及び配列決定
肝臓は、Ｃ１ｒ， Ｃ１ｓ及びＭＡＳＰ−１の合成の一次部位である。従って、肝臓からのＲＮＡを、得られたペプチド配列から推定されるプライマーによるＲＴ−ＰＣＲのための鋳型として使用した。ｃＤＮＡの第１鎖合成を、Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ （Ｐｈａｒｍａｃｉａ） を用いて、１．３μｇのヒト肝臓ＲＮＡにより行った。ＰＣＲを、それぞれ、アミノ酸配列ＥＹＡＮＤＱＥＲ及びＫＰＦＴＧＦＥＡから誘導された変性センス及びアンチセンスプライマーを用いて、このｃＤＮＡに対して行った。ＰＣＲプログラムを次の通りに行った：５０℃でのアニーリング（１サイクル）；５５℃でのアニーリング（１サイクル）；及び６０℃でのアニーリング（３３サイクル）。得られる３００ｂｐのＰＣＲ生成物を、ＴＡ−クローニングキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてＥ．コリプラスミドｐＣＲＩＩ中にクローン化し、そして挿入体のヌクレオチド配列を決定した。
【０１８０】
得られる３００ｂｐのＲＴ−ＰＣＲ生成物のヌクレオチド配列は、プライマーが誘導されたペプチドの配列を確かめる推定されるアミノ酸配列を有する読み取り枠（ＯＲＦ）を含んだ。このプラスミドの挿入体を、放射性ラベルし、そして市販のヒト肝臓ライブラリー（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）における合計８×１０５個のクローンをスクリーニングするためのプローブとして使用した。１６個のクローニングがハイブリダイズし、そして４個の最長のもの（ｐｈｌ−１， ２， ３及び４）を完全に配列決定した。配列分析は、すべてのクローンが同じ新規のヒトｍＲＮＡ種の逆転写物を表すことを示した。
【０１８１】
最長のクローンｐｈｌ−４は、３６ｂｐの５’未翻訳領域で開始する２４７５ｂｐ、続いて２０６１ｂｐのＯＲＦ、及びポリ−Ａ末端で終る３７８ｂｐの３’未翻訳領域を含んで成る。ｐｈｌ−４のヌクレオチド配列は、翻訳されたアミノ酸配列と共に図６に示される。配列は、ＥＭＢＬヌクレオチド配列データベースに寄託された（受託番号第ＹＯ９９２６号）。ｐｈｌ−１及びｐｈｌ−２の配列は、ｐｈｌ−４と全体的には一致するが、ｐｈｌ−３のヌクレオチド配列は、２種の位置でのｐｈｌ−４， ヌクレオチド位置１１４７でのトランスバージョン（ＧからＴ）及び位置１５１５でのトランジッション（からＴ）で、ｐｈｌ−４とは異なる。最初の変化が、ＴｙｒによるＡｓｐ３５６の置換を誘導する。すべてのクローンは単一のドナーから単離されたＲＮＡから転写された肝臓ライブラリーから単離されるので、観察される差異は、ＭＡＳＰ−２遺伝子における多形現象を表すことができ、又はライブラリーの構成の間、創造される誤差のためである。
【０１８２】
ＮＨ２−末端及びすべての配列決定されたペプチドのアミノ酸配列は、クローンｐｈｌ−４から推定される配列において同一であった。ＯＲＦは、１５個の残基のシグナルペプチドを包含する、６８６個のアミノ酸のポリペプチド鎖をコードする。シグナルペプチドを排除すると、計算されるＭｒは７４，１５３であり、これはＳＥＳ−ＰＡＧＥ上で観察される７６ｋＤａと一致し（図１）、等電点は５．４３であり、そしてモル消衰係数は１１３，６４０である（すなわち、１ｍｇ／ｍｌでのＯＤ２８０ｎｍ＝１．５４）。ＭＡＳＰ−１に比較して、その配列は、Ｎ−連結されたグルコシル化のための部位を含まない。セリンプロテアーゼにおいて活性中心のために必須である３個のアミノ酸残基（Ｈｉｓ ４６８， Ａｓｐ ５１７及びｓｅｒ ６１８）が存在する。
【０１８３】
例５．ＭＡＳＰ−１、Ｃ１ｒ及びＣ１ｓとのＭＡＳＰ−２の比較
ｃＤＮＡ配列から推定されるアミノ酸配列は、ＭＡＳＰ−１、Ｃ１ｒ及びＣ１ｓのそれらの配列と相同である（図２）。注目すべきは、ドメイン機構は、１つの（１ｒ／Ｃ１ｓ−様ドメイン、１つの上皮成長因子−様（ＥＧＦ−様）ドメイン、続いて第２のＣ１ｒ／Ｃ１ｓ−様ドメイン、２種の補体制御タンパク質（ＣＣＰ）ドメイン及びセリンプロテアーゼドメインを特徴とするそれらの４種のタンパク質に共有する。上皮成長因子−様ドメインにおけるカルシウム結合モチーフに関与するキー残基は、得られる配列、並びにＭＡＳＰ−１， Ｃ１ｒ及びＣ１ｓに存在する。さらに、活性部位セリンの６個の残基の前の基質特異性関連残基は、すべての４種のタンパク質におけるアスパラギン酸である。
【０１８４】
ＭＡＳＰ−１、Ｃ１ｒ及びＣ１ｓはすべて、残基Ａｒｇと、第２ＣＣＰドメインとセリンプロテアーゼドメインとの間に位置するＩｌｅとの間のペプチド結合の分解により活性化される。得られるポリペプチド鎖（最大のものは“Ｈ鎖”として言及され、そして最小のものは“Ｌ鎖”として言及される）は、ジスルフィド結合により一緒に維持される。類似性によれば、本発明者の結果は、還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥの後、ＭＡＳＰ−２のＮ−末端に対する抗体により認識される５２ｋＤａのポリペプチドが、ＭＡＳＰ−２のＨ鎖であり、ところがＭＡＳＰ−２の−Ｃ末端に対する抗体により認識される３１ｋＤａのポリペプチドがＬ鎖であることを示す。図２において見出されるように、Ａｒｇ及びＩｌｅは、第２のＣＣＰドメインとプロテアーゼドメインとの間の予測される位置でＭＡＳＰ−２に存在する。
【０１８５】
前記４種のタンパク質間での同一性及び類似性を、図２における一列整列に基づいて研究した。６の偏りを突然変異データマトリックス（２５０ＰＡＭＳ）の個々の頃に付加し、そして６の分解ペナルティーを使用した。すべての４種の種における同一の残基は、星印により示される。Ｃ１ｒ／Ｃ１ｓ−様ドメイン、ＥＧＦ−様ドメイン及びＣＣＰドメインの開始は、配列上に示されている。一列整列されたシステインは濃く示されている。Ｈ鎖及びＬ鎖を生成する、Ａｒｇ残基とＩｌｅ残基との間の可能性ある分解部位は、セリンプロテアーゼドメインが開始する部位と同一である。
【０１８６】
セリンプロテアーゼにおける活性中心のために必須である３個のアミノ酸残基（Ｈｉｓ ４６８， Ａｓｐ ５１７及びＳｅｒ ６１８）は、（◇）により示される。ＭＡＳＰ−１のヒスチジン−ループにおけるシステインは、（▽）により示される。ペプチドのアミノ酸配列決定により得られる配列は下線が引かれている。タンパク質間の同一性（図２）は、すべて、３９％〜４５％であり、そして機能的関連性の手掛かりを与えない。タンパク質間での類似する性質の残基及び同一の残基を考慮しての類似性（図３ｂ）は、３９％〜５２％であり、そして最小の類似性はＭＡＳＰ−１とＣ１ｓとの間であり（３９％）、そして最高の類似性はＭＡＳＰ−１とＣ１ｒとの間（５２％）、及びＭＡＳＰ−２とＭＡＳＰ−２との間（５２％）である。
【０１８７】
ＭＡＳＰ−２は、Ｃ１ｒ（４６％）及びＣ１ｓ （４７％）との類似性を示す。相対的同一性は機能的関連性に関して手掛かりを与えないが、Ｃ１ｓとＭＡＳＰ−２との間の類似性評点は、Ｃ１ｓとＭＡＳＰ−１との評点よりも有意に高く、そしてＭＡＳＰ−１は、Ｃ１ｓに対してよりもＣ１ｒに対してより類似し、このことは、Ｃ１ｓと同じようにＭＡＳＰ−２がＣ２及びＣ４分解酵素であることを示唆する。配列のいくつかの特徴は、ＭＡＳＰ−２、Ｃ１ｒ及びＣ１ｓがＭＡＳＰ−２前駆体からの遺伝子重複及び分岐により進化したことを示唆する。ＭＡＳＰ−１配列のみが、トリプシン−様セリンプロセアーゼの特徴であるヒスチジンループを含む（２７）。
【０１８８】
活性部位セリンは、ほとんどのセリンプロテアーゼにおけるように、ＭＡＳＰ−１におけるＴＣＮコドン（Ｎは、Ａ， Ｔ， Ｇ又はＣである）によりコードされ、そしてＭＡＳＰ−２、Ｃ１ｒ及びＣ１ｓにおいては、それはＡＧＹコドン（ここで、ＹはＴ又はＣである）によりコードされる。ＭＡＳＰ−１を包含する、ほとんどのセリンプロテアーゼにおいては、プロリン残基が、活性部位セリンから下流の第３位置で見出され、そして異なったアミノ酸がＭＡＳＰ−２， Ｃ１ｓ及びＣ１ｒに見出される（ＭＡＳＰ−２及びＣ１ｓにおけるアラニン、Ｃ１ｒにおけるバリン）。それらの類似性に基づいて、ＭＡＳＰ−２の触媒ドメインがＣ１ｒ及びＣ１ｓにおけるように単一のエキソンによりコードされ、そしてＭＡＳＰ−１を包含する（２８）ほとんど他のセリンプロテアーゼが分解したエキソンを有することを予測できる。
【０１８９】
例６．ＭＢＬ／ＭＡＳＰ複合体
上記レクチン調製物を、モノクローナル抗−ＭＢＬ抗体により被覆されたマイクロタイターウェルにおいて、又は負の対照として、同じサブクラスの非特異的モノクローナル免疫グログリンにより被覆されたウェルにおいてインキュベートした。抗体により捕獲されたタンパク質を溶出し、そしてＳＤＳ−ＰＡＧＥ／ウェスターンブロットにより分析した。その結果（図３ａ）は、結合ＭＢＬの他に、抗−ＭＢＬ抗体がＭＡＳＰ−１及びＭＡＳＰ−２の両者を捕獲することを示す。マイクロタイターウェルを、モノクローナル抗−ＭＢＬ又は対照モノクローナルネズミＩｇＧ１により被覆し、２種の異なったレクチン調製物（ａ及びｂ）のいずれか１つと共にインキュベートし、そして結合されたタンパク質を溶出し、そして還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥ、及びウェスターンブロットにより分析した。
【０１９０】
ブロットａを、抗−ＭＢＬ抗体により、ブロットｂを抗−Ｃ’ ＭＡＳＰ−１抗体により、そしてブロットＣを、抗−Ｎ’ ＭＡＳＰ−２抗体により進行せしめた。レーン１は分別されなかったレクチン調製物ａを表す。レーン３及び４は、抗−ＭＢＬ抗体により被覆され、そしてレクチン調製物ｂ及びａと共にそれぞれインキュベートされたウェルからの溶出物を表し、そしてレーン２及び５は、標準ＩｇＧにより被覆され、そしてレクチン調製物ｂ及びａと共にそれぞれインキュベートされたウェルからの溶出物を表す。
【０１９１】
Ｓｕｐｅｒｏｓｅ ６Ｂ ＣＬ上でのレクチン調製物のゲル透過クロマトグラフィー（ＧＰＣ）からの画分を、ＭＢＬ、 ＭＡＳＰ−１及びＭＡＳＰ−２について分析した（図３ａ）。レクチン調製物を、カルシウム含有緩衝液におけるＳｕｐｅｒｏｓｅ ６カラム上でのＧＰＣにゆだねた。ＭＢＬは７５０ｋＤａのＭｒに対応する体積（Ｖｅ）での主要ピーク及び３５０ｋＤａに対応する位置での小さなピークにおいて溶出された。パネルＡは、モノクローナル抗−ＭＢＬ抗体を用いてのウェスターンブロットによる画分の分析の結果を示す。
【０１９２】
約６０ｋＤａでのバンドはすべてのＭＢＬ調製物において見られ、そして試験される抗−ＭＢＬ抗体（モノクローナル及びポリクローナル）により認識され、そして従って、たぶん、３２ｋＤａのポリペプチド鎖の非還元性ダイマーを表す。パネルＢは、抗−Ｎ’ ＭＡＳＰ−２抗体（３２ｋＤａの上方バンドを展開する）、続いて、抗−Ｃ’ ＭＡＳＰ−１抗体（３１ｋＤａの下方バンドを展開する）を用いての同じ分析を示す。純粋に技術的な理由のために、２０ｋＤａの切断されたＭＡＳＰ−２がこの図に見られず、ここでブロットは抗−ＭＡＳＰ−２及び抗−ＭＡＳＰ−１とのインキュベーション間で部分的に切除されている。クロマトグラム上の矢印は、空隙率（１）及び次のマーカータンパク質ＩｇＭのための溶出位置（２）、Ｃ１ｑ（３）、チログロブリン（４）、ＩｇＧ（５）及び血清アルブミン（６）を示す。
【０１９３】
ＭＡＳＰ−１及びＭＡＳＰ−２は、主として高分子量ＭＢＬと共に同時溶出する。ｐＨ６でのＭＢＬ調製物のクロマトグラフィー処理は、ＭＡＳＰ−１又はＭＡＳＰ−２がＭＢＬにより会合されなかったことを示した。Ｔａｎなど．， （１９９６， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｊ． ３１９： ３２９−３３２） を参照のこと。
【０１９４】
例７．補体活性化
従来の補体活性化経路及びＭＢＬ−開始される経路は、Ｃ４及びＣ２の酵素活性化を通してのＣ３転換複合体Ｃ４ｂ２ｂの生成を包含する。Ｃ１複合体（Ｃ１ｑｒ２ｓ２）においては、この特定のプロテアーゼ活性は、Ｃ１ｒによる酵素の活性化の後、Ｃ１ｓにより示される。Ｃ４の活性化に基づいて、反応性チオールエステルが暴露され、そしてＣ４ｂがアミノ又はヒドロキシル基近くに共有結合する。
【０１９５】
ＭＡＳＰ−２及びＭＡＳＰ−２、並びにＣ１ｒ及びＣ１ｓのＣ４活性化能力を比較した。これは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、続いてウェスターンブロットにより、Ｃ１調製物及びＭＢＬ／ＭＡＳＰ調製物を分解することによって達成された。ブロットを、３７℃でのヒト血清とのインキュベーション、続く抗−Ｃ４抗体を用いての折出したＣ４ｂの検出により、Ｃ４転換活性について試験した。
【０１９６】
Ｃ１を、ＩｇＧ−カップリングされたセファロースビーズを４℃でヒト血清と共にインキュベートすることにより精製した。ビーズを洗浄し、そしてＣ１ｒ及びＣ１ｓの活性化のために３７℃で３０分間、インキュベートした。ビーズを非還元性サンプル緩衝液に懸濁し、そして煮沸しないで、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、続いて、ＳＤＳの存在下でのブロットにゆだねた。類似するブロットは、酵素インヒビターの存在下で生成されたＭＢＬ調製物から製造された（Ｔｈｅ Ｓｔａｔｅ Ｓｅｒｕｍ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ， Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ）。
【０１９７】
ブロットのストリップを、Ｂｉｏｒｅｘ７０上での分別によりＣ１ｑを消耗された、１．１％（ｖ／ｖ）のヒトＭＢＬ−欠失血清と共に３７℃で３０分間インキュベートした。ブロットを、ビオチニル化されたＦ（ａｂ’）２抗−Ｃ４抗体、続いてペルオキシダーゼ−ラベルされたストレプタビジン及び発光試薬により展開した。同目的のブロットを、血清とのインキュベーションの間、存在するセリンプロテアーゼインヒビター（アミノエチルベンゼンスルホニルフルオリド）により処理した。他のストリップを抗体により直接的に展開した。
【０１９８】
図４の結果は、Ｃ４がＭＡＳＰ−２バンドに対応する位置で折出し、そしてＣ４折出はＭＡＳＰ−１に応答する位置で観察されなかったことを示す。ＭＡＳＰ−１は、それがそれぞれ約３０ｋＤａ及び７０ｋＤａで２つのバンドとして出現する（示されていない）還元条件下で、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより示されるような活性化された状態で存在した。観察されるＣ４活性化及び折出はセリンプロテアーゼインヒビターにより阻害された（図４）。Ｃ４を活性化する活性は、ＭＢＬ／ＭＡＳＰが精製方法を通して添加される酵素インヒビターの存在下で調製される場合、検出され得なかったことがまた観察された。Ｃ１の調製物を同様にして分析し、そして酵素インヒビターにより阻害されるＣ４折出が、使用される技法により分離されない、Ｃ１ｒ及びＣ１ｓに対応する位置で観察された。
【０１９９】
図４は、Ｃ１ｓ及びＭＡＳＰ−２によるＣ４の活性化を示すウェルターンブロットの表示である。パネルＡは、非還元条件下で、及び電気泳動の前、サンプルを加熱しないで分離されたＣ１のウェスターンブロットを示す。レーン１を抗−Ｃ１ｓ抗体により展開した。レーン２を、ヒト血清、続いて抗−Ｃ４抗体と共にインキュベートした。レーン３はレーン２と同じであったが、但し血清とのインキュベーションの間、セリンプロテアーゼインヒビターが存在した。
【０２００】
パネルＢは、Ａにおけるようにして分離されたＭＢＬ調製物のウェスターンブロットを示す。レーン１は抗−Ｎ’ ＭＡＳＰ−１により、レーン２は抗−Ｎ’ ＭＡＳＰ−２により展開された。レーン３を、ヒト血清、次に抗−Ｃ４と共に３７℃でインキュベートした。レーン４においては、ブロットを、セリンプロテアーゼインヒビターと共にプレインキュベートし、そして血清とのインキュバーションはまた、インヒビターの存在下で行われた。ＭＡＳＰ−１は、グリコシル化のために（１７）、ＭＡＳＰ−２よりも高いＭｒ、及び９個の長いアミノ酸のポリペプチドを示す。
【０２０１】
本発明の結果は、内在性免疫系のＭＢＬｅｃｔｉｎ経路を通しての補体活性化と補体活性化の従来の経路を通してのその活性化との間での類似性を強調する（図５）。従来の経路を通しての活性化は脊椎動物においてのみ見出される特定の免疫応答に関連し、そしてＭＢＬｅｃｔｉｎ経路及び他の経路は、外来性生物の内因性認識に依存し、そして従って、たぶん特定の免疫系の進化を実際より早くする。すべての経路は、微生物表面に共有結合し、そして補体のエフェクター機能を仲介する、中心補体Ｃ３のＣ３ｂへの活性化に集中する。
【０２０２】
従来の及びＭＢＬｅｃｔｉｎ経路においては、開始分子複合体は、リガンドとの反応に基づいて、２種の会合されるセリンプロテアーゼ（それぞれ、ＭＡＳＰ−１及びＭＡＳＰ−２、又はＣ１ｒ及びＣ１ｓ）を活性化する、オリゴマーリガンド−結合成分（それぞれ、ＭＢＬ又はＣ１ｑ）から構成される。
【０２０３】
参考文献
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【０２０４】
６）Ｔｕｒｎｅｒ， Ｍ．Ｗ． Ｍａｎｎｏｓｅ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｌｅｃｔｉｎ： ｔｈｅ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｍｏｌｅｃｕｌｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｉｎｎａｔｅ ｉｍｍｕｎｅ ｓｙｓｔｅｍ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｔｏｄａｙ， １７， ５３２−５４０ （１９９６）．
７）Ｋａｗａｓａｋｉ， Ｎ．， Ｋａｗａｓａｋｉ， Ｔ． ＆ Ｙａｍａｓｈｉｎａ， Ｉ． Ａ ｓｅｒｕｍ ｌｅｃｔｉｎ （ｍａｎｎａｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ） ｈａｓ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｂａｃｔｅｒｉｃｉｄａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． １０６， ４８３−４８９ （１９８９）．
８）Ｋｕｈｌｍａｎ，Ｍ．， Ｊｏｉｎｅｒ， Ｋ． ＆ Ｅｚｅｋｏｗｉｔｚ， Ｒ．Ａ．Ｂ． Ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｍａｎｎｏｓｅ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ ａｓ ａｎ ｏｐｓｏｎｉｎ． Ｊ． ＥＸＰ． Ｍｅｄ． １６９， １７３３−１７４５ （１９８９）．
９）Ｓｕｍｉｙａ， Ｍ． など． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂａｓｉｓ ｏｆ ｏｐｓｏｎｉｃ ｄｅｆｅｃｔ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｄｅｆｉｃｉｅｎｔ ｃｈｉｌｄｒｅｎ Ｌａｎｃｅｔ ３３７， １５６９−１５７０ （１９９１）．
１０）Ｌｉｐｓｃｏｍｂｓ， Ｒ．Ｊ． など．， Ｈｉｇｈ ｆｒｅｑｕａｎｃｉｅｓ ｉｎ Ａｆｒｉｃａｎ ａｎｄ ｎｏｎ−Ａｆｒｉｃａｎ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｔｈｅ ｍａｎｎｏｓｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ｇｅｎｅ． Ｈｕｍ． Ｍｏｌ． Ｇｅｎｅｔ． １． ７０９−７１５ （１９９２）．
【０２０５】
１１）Ｍａｄｓｅｎ Ｈ．Ｏ． など．， Ａ ｎｅｗ ｆｒｅｑｕｅｎｔ ａｌｌｅｌｅ ｉｓ ｔｈｅ ｍｉｓｓｉｎｇ ｌｉｎｋ ｉｎ ｔｈｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ ｏｆ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｍａｎｎａｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ． Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｌｃｓ ４０， ３７−４４ （１９９４）．
１２）Ｓｕｐｅｒ， Ｍ．， Ｔｈｉｅｌ， Ｓ．， Ｌｕ， Ｊ．， Ｌｅｖｉｎｓｋｙ， Ｒ．Ｊ． ＆ Ｔｕｍｅｒ， Ｍ．Ｗ． Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｏｆ ｌｏｗ ｌｅｖｅｌｓ ｏｆ ｍａｍｍａｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ｗｉｔｈ ａ ｃｏｒｎｍｏｎ ｄｅｆｅｃｔ ｏｆ ｏｐｓｏｎｉｓａｔｉｏｎ． Ｌａｎｃｅｔ ｉｉ， １２３６−１２３９ （１９８９）．
１３）Ｇａｒｒｅｄ， Ｐ．， Ｍａｄｓｅｎ， Ｈ．Ｏ．， Ｈｏｆｍａｎｎ， Ｂ． ＆ Ｓｖｅｊｇａａｒｄ， Ａ． ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ ｏｆ ｈｏｍｏｚｙｇｏｓｉｔｙ ｏｆ ａｂｎｏｒｍａｌ ｍａｎｎａｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ−ｐｒｏｔｅｉｎ ａｌｌｅｌｅｓ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｓｕｓｐｅｃｔｅｄ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ． Ｌａｎｃｅｔ ３４６， ９４１−９４３ （１９９５）．
１４）Ｓｕｍｍｅｒｆｉｅｌｄ， Ｊ．Ａ． など． Ｍａｎｎｏｓｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ｇｅｎｅ ｍｕｔａｉｏｎｓ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｕｎｕｓｕａｌ ａｎｄ ｓｅｖｅｒｅ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ ｉｎ ａｄｕｌｔｓ． Ｌａｎｃｅｔ ３４５， ８８８−８８９ （１９９５）．
１５）Ｎｉｅｌｓｅｎ， Ｓ．Ｌ．， Ａｎｄｅｒｓｅｎ， Ｐ．Ｌ．， Ｋｏｃｈ， Ｃ．， Ｊｅｎｓｅｎｉｕｓ， Ｊ．Ｃ． ＆ Ｔｈｉｅｌ． Ｓ． Ｔｈｅｌｅｖｅｌ ｏｆ ｔｈｅ ｓｅｒｕｍ ｏｐｓｏｎｉｎ， ｍａｎｎａｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎ ＨＩＶ−１ ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｐａｔｉｅｎｔｓ． Ｃｌｉｎ． Ｅｘｐ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １００， ２１９−２２２ （１９９５）．
【０２０６】
１６）Ｇｅｒｒｅｄ， Ｐ．， Ｍａｄｓｅｎ， Ｈ．Ｏ．， Ｂａｌｓｌｅｖ， Ｕ．， Ｈｏｆｍａｎｎ， Ｂ．， Ｐｅｄｅｒｓｅｎ， Ｃ．， Ｇｅｒｓｔｏｆｔ， Ｊ． ａｎｄ Ｓｖｅｊｇａａｒｄ， Ａ． Ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ ｔｏ ＨＩＶ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＡＩＤＳ ｉｎ ｒｅｌａｔｉｏｎ ｔｏ ｖａｒｉａｎｔ ａｌｌｅｌｅｓ ｏｆ ｍａｎｎｏｓｅ−ｂｌｎｄｉｎｇ ｌｅｃｔｉｎ， Ｌａｎｃｅｔ ３４９， ２３６−２４０ （１９９７）．
１７）Ｍａｌｈｏｔｒａ， Ｒ． Ｗｏｒｍａｌｄ， Ｍ．Ｒ．， Ｒｕｄｄ， Ｐ．Ｍ．， Ｆｉｓｃｈｅｒ， Ｐ．Ｂ．， Ｄｗｅｋ， Ｒ．Ａ． ａｎｄ Ｓｉｍ， Ｒ．Ｂ． Ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ ｃｈａｎｇｅｓ ｏｆ ＩｇＧ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ ａｒｔｈｒｌｔｉｓ ｃａｎ ａｃｔｉｖａｔｅ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ ｖｉａ ｔｈｅ ｍａｎｎｏｓｅ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ． Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ． １， ２３７−２４３ （１９９５）．
１８）Ｋｉｌｐａｔｒｉｃｋ， Ｄ．Ｃ．， Ｂｅｖａｎ， Ｂ．Ｈ． ａｎｄ Ｌｉｓｔｏｎ， Ｗ．Ａ． Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ ｍａｎｎａｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ａｎｄ ｒｅｃｕｒｒｅｎｔ ｍｉｓｃａｒｒｉａｇｅ． Ｍｏｌ． Ｈｕｍ． Ｒｅｐｒｏｄ． １， ２５０１−２５０５ （１９９５）．
１９）Ｄａｖｉｅｓ，Ｅ．Ｊ．， Ｓｎｏｗｄｅｎ， Ｎ．， Ｈｉｌｌａｒｂｙ， Ｍ．Ｃ．， Ｃａｒｔｈｙ， Ｄ． Ｇｒｅｎｎａｎ， Ｄ．Ｍ．， Ｔｈｏｍｓｏｎ， Ｗ． ａｎｄ Ｏｌｌｉｅｒ， Ｗ．Ｅ．Ｒ． Ｍａｎｎｏｓｅ−ｂｌｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ｇｅｎｅ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ ｉｎ ｓｙｓｔｅｍｉｃ ｌｕｐｕｓ ｅｒｙｔｈｅｍａｔｏｓｕｓ． Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ． ３８， １１０−１１４ （１９９５）．
２０）Ｊｅｎｓｅｎｉｕｓ， Ｊ．Ｃ． Ｍａｎｎａｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｌｅｃｔｉｎ （ＭＢＬ）： Ｆｒｏｍ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎｓ ｏｎ ｆｉｓｈ ａｎｄ ｃｈｉｃｋｅｎｓ ｔｏ ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ ｔｈｅｒａｐｙ ｉｎ ａｎ ｉｎｆａｎｔ ｗｉｔｈ ｓｅｖｅｒｅ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ． Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， ８６， Ｓｕｐｐｌ． １， １００， ａｂｓｔｒａｃｔ （１９９５）．
【０２０７】
２１）Ｇｅｒｒｅｄ， Ｐ．， Ｍａｄｓｅｎ， Ｈ．Ｏ．， Ｋｕｒｔｚｈａｌｓ， Ｊ．Ａ．， など． Ｄｉａｌｌｅｌｉｃ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ ｍａｙ ｅｘｐｌａｉｎ ｖａｒｌａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｂｌｏｏｄ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｍａｎｎａｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｉｎ Ｅｓｋｉｍｏｓ ｂｕｔ ｎｏｔ ｉｎ ｂｌａｃｋ Ａｆｒｉｃａｎｓ， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔ． １９． ４０３−４１２ （１９９２）．
２２）Ｔｈｉｅｌ， Ｓ．， Ｊｅｎｓｅｎ， Ｔ．Ｖ．， Ｌａｕｒｓｅｎ， Ｓ．Ｂ．， Ｗｉｌｌｉｓ， Ａ． ａｎｄ Ｊｅｎｓｅｎｉｕｓ， Ｊ．Ｃ． Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｎｅｗ ｍａｎｎａｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｓｅｒｉｎｅ ｐｒｏｔｅａｓｅ （ＭＡＳＰ−２）． Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ８６， Ｓｕｐｐｌ． １， １０１ （１９９５）．
２３）Ｔｈｉｅｌ，Ｓ．， Ｊｅｎｓｅｎ， Ｔ．Ｖ．， Ｌａｕｒｓｅｎ， Ｓ．Ｂ．， Ｗｉｌｌｉｓ， Ａ．， Ｒｅｌｄ， Ｋ．Ｂ．Ｍ．， Ｈａｎｓｅｎ， Ｓ． ａｎｄ Ｊｅｎｓｅｎｉｕｓ， Ｊ．Ｃ． ｌｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｎｅｗ ｍａｎｎａｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｌｅｃｔｉｎ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｓｅｒｉｎｅ ｐｒｏｔｅａｓｅ （ＭＡＳＰ−２）． Ｍｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， ３３， Ｓｕｐｐｌ． １， ９１ （１９９６）．
２４）Ｊｅｎｓｅｎ， Ｔ．Ｖ．， Ｓｔｏｖｅｒ， Ｃ．， Ｐｏｕｌｓｅｎ， Ｋ．， Ｌａｕｓｅｎ， Ｓ．Ｂ．， Ｅｇｇｉｅｔｏｎ．， Ｐ．， Ｒｅｉｄ， Ｋ．Ｂ．Ｍ．， Ｗｉｌｌｉｓ， Ａ．， Ｓｃｈｗａｅｂｌｅ， Ｗ．， Ｌｕ， Ｊ．， Ｈｏｌｍｓｋｏｖ， Ｕ．， Ｊｅｎｓｅｎｉｕｓ， Ｊ．Ｃ． ａｎｄ Ｔｈｉｅｌ， Ｓ． Ｃｌｏｎｉｎｇ ｏｆ ｃＤＮＡ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ａ ｈｕｍａｎ ＭＡＳＰ−ｌｉｋｅ ｐｒｏｔｅｉｎ （ＭＡＳＤＰ−２）． Ｍｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， ３３， Ｓｕｐｐｌ． １， ８１ （１９９６）．
２５）Ｂａａｔｒｕｐ， Ｇ．， Ｔｈｉｅｌ， Ｓ．， ｌｓａｇｅｒ， Ｈ．， Ｓｖｅｈａｇ， Ｓ．Ｅ． ＆ Ｊｅｎｓｅｎｉｕｓ， Ｊ．Ｃ． Ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｉｏｎ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｐｌａｓｍａ ｏｆ ａ ｌｅｃｔｉｎ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｎａｌｏｇｏｕｓ ｔｏ ｔｈａｔ ｏｆ ｂｏｖｌｎｅ ｃｏｎｇｌｕｔｉｎｉｎ， Ｓｃａｎｄ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２６， ３５５−３６１ （１９８７）．
【０２０８】
２６）Ｊｅｎｓｅｎｉｕｓ， Ｊ．Ｃ．， Ａｎｄｅｒｓｅｎ， Ｉ．， Ｈａｕ， Ｊ．， Ｃｒｏｎｅ， Ｍ． ＆ Ｋｏｃｈ， Ｃ． Ｅｇｇｓ； ｃｏｎｖｅｎｉｅｎｔｌｙ ｐａｃｋａｇｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｙｏｌｋ ＩｇＧ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ ４６， ６３−６６ （１９８１）．
２７）Ｓａｔｏ， Ｔ．， Ｅｎｄｏ， Ｙ．， Ｍａｔｓｕｓｈｉｔａ， Ｍ． ＆ Ｆｕｊｉｔａ， Ｔ． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｈａｒａｃｔａｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｎｏｖｅｌ ｓｅｒｉｎｅ ｐｒｏｔｅａｓｅ ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ ｓｙｓｔｅｍ ｂｙ ｍａｎｎｏｓｅ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ． Ｉｎｔ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ６， ６６５−６６９ （１９９４）．
２８）Ｅｎｄｏ． Ｙ．， Ｓａｔｏ， Ｔ．， Ｍａｔｓｕｓｈｉｔａ， Ｍ． ＆ Ｆｕｊｉｔａ， Ｔ． Ｅｘｏｎ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ ｇｅｎｅ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｍａｎｎｏｓｅ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｓｅｒｉｎｅ ｐｒｏｔｅａｓｅ ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ： ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｗｉｔｈ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ Ｃ１ｒ ａｎｄ Ｃ１ｓ ｇｅｎｅｓ． Ｉｎｔ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ９， １３５５−１３５８ （１９９６）．
２９）Ｔａｎ， Ｓ．Ｍ．， Ｃｈｕｎｇ， Ｍ．Ｃ．Ｍ．， Ｋｏｎ， Ｏ．Ｌ．， Ｔｈｉｅｌ， Ｓ． Ｌｅｅ， Ｓ．Ｈ． ＆ Ｌｕ， Ｊ． Ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔｓ ｏｎ ｔｈｅ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｍａｎｎａｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｌｅｃｔｉｎ ａｎｄ ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｔｓ Ｃａ２＋−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ａ Ｃ１ｓ−ｌｉｋｅ ｓｅｒｉｎｅ ｐｒｏｔｅａｓｅ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｊ． ３１９， ３２９−３３２ （１９９６）．
３０）Ｂａｒｔｏｎ， Ｇ， Ｊ． Ｐｒｏｔｅｉｎ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ａｎｄ ｆｌｅｘｉｂｌｅ ｐａｔｔｅｎ ｍａｔｃｈｉｎｇ． Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． ４０３−４２８ （１９９０）．
【０２０９】
３１）Ｔａｋａｄａ， Ｆ．， Ｔａｋａｙａｍａ， Ｙ．， Ｈａｔｓｕｓｅ， Ｈ． ＆ Ｋａｗａｋａｍｉ， ｍ． Ａ ｎｅｗ ｍｅｍｂｅｒ ｏｆ Ｃ１ｓ ｆａｍｉｌｙ ｏｆ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｆｏｕｎｄ ｉｎ ａ ｂａｃｔｅｒｉｃｉｄａｌ ｆａｃｔｏｒ， Ｒａ−ｒｅａｃｔｉｖｅ ｆａｃｔｏｒ， ｉｎ ｈｕｍａｎ ｓｅｒｕｍ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ， Ｃｏｍｍ． １９６， １００３−１００９ （１９９３）．
３２）Ｊｏｕｒｎａｔ， Ａ． ＆ Ｔｏｓｉ， Ｍ． Ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｏｆ ｆｕｌｌ−ｌｅｎｇｔｈ ｃＤＮＡ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ｔｈｅ ｐｒｅｃｕｒｓｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ Ｃ１ｒ， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｊ． ２４０， ７８３−７８７ （１９８６）．
３３）Ｌｙｔｕｓ， Ｓ．Ｐ．， Ｋｕｒａｃｈｉ， Ｋ．， Ｓａｋａｒｉａｓｓｅｎ， Ｋ． Ｓ． ＆ Ｄａｖｉｅ， Ｅ．Ｗ． Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｃＤＮＡ ｃｏｄｉｎｇ ｆｏｒ ｈｕｍａｎ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ Ｃ１ｒ． Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２５， ４８５５−４８６３ （１９８６）．
３４）Ｍａｃｋｉｎｎｏｎ，Ｃ．Ｍ．， Ｃａｒｔｅｒ， Ｐ．Ｅ．， Ｓｍｙｔｈ， Ｓ．Ｊ．， Ｄｕｎｂａｒ， Ｂ． ＆ Ｆｏｔｈｅｒｇｉｌｌ， Ｊ．Ｅ． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ ｏｆ ｃＤＮＡ ｆｏｒ ｈｕｍａｎ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ Ｃ１ｓ． Ｔｈｅ ｃｏｍｐｌｅｔｅ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ． Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． １６９， ５４７−５５３ （１９８７）．
３５）Ｔｏｓｌ， Ｍ．， Ｄｕｐｏｎｃｈｅｌ， Ｃ．， Ｍｅｏ， Ｔ． ＆ Ｊｕｌｉｅｒ， Ｃ． Ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｃＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ Ｃｌｓ ａｎｄ ｃｌｏｓｅ ｐｈｙｓｉｃａｌ ｌｉｎｋａｇｅ ｏｆ ｔｈｅ ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｇｅｎｅｓ Ｃ１ｓ ａｎｄ Ｃｌｒ． Ｂｉｏ−ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２６， ８５１６−８５２４ （１９８７）．
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１ａ−１ｂは、糖親和性クロマトグラフィーにより精製されたヒト血漿タンパク質のウェスターンブロットを示す。
【図２】
図２は、ＭＡＳＰ−２（クローンｐｈｌ−４）、ＭＡＳＰ−１（１７， ２２）、 Ｃ１ｒ （２３， ２４） 及びＣ１ｓ（２５， ２６）のアミノ酸配列の配列一列整列を示す。
【図３】
図３ａ−３ｂは、ＭＢＬ、ＭＡＳＰ−１及びＭＡＳＰ−２間で形成される分子複合体を示す結果を示す。
【図４】
図４ａ−４ｂは、Ｃ１ｓ及びＭＡＳＰ−２によるＣ４の活性化を示すウェルターンブロットを示す。
【図５】
図５は、補体活性化の３種の経路を示す。
【図６】
図６は、ＭＡＳＰ−２のｃＤＮＡ配列及び推定されるアミノ酸配列を示す。
【図１】
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【図２】
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【図４】
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【図５】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004504027.tif 000082
【手続補正書】
【提出日】平成14年10月16日(2002.10.16)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
マンナン−結合性レクチンに会合したプロテアーゼ−２（ＭＡＳＰ−２）由来のアミノ酸配列（配列番号２）又はその機能的相同体を含んで成る実質的に純粋なポリペプチドの医薬組成物の生成のためへの使用であって、前記機能的相同体が配列番号２に示される配列と少なくとも６０％の相同性を有する配列を含んで成り、そして／又は
ｉ）マンナン−結合性レクチン（ＭＢＬ）と会合でき、そして／又は
ｉｉ）セリンプロテアーゼ活性であり得、そして／又は
ｉｉｉ）ＭＢＬｅｃｔｉｎ補体経路機能についてのインビトロアッセイにおいてＭＡＳＰ−２活性であり得るポリペプチドである、ことを特徴とする使用。
【請求項２】
前記ポリペプチドが、配列番号３として同定される配列を含んで成る請求項１記載の使用。
【請求項３】
前記ポリペプチドが、マンナン結合性レクチン（ＭＢＬ）と会合することができる請求項１記載の使用。
【請求項４】
前記ポリペプチドが、ラベル又はトキシンに接合される請求項１又は２記載の使用。
【請求項５】
前記ポリペプチドが、配列番号１として同定される配列又はその機能的同等物を含んで成る請求項１〜４のいずれか１項記載の使用。
【請求項６】
前記ポリペプチドが、２０ｋＤの分子質量を有する請求項１〜５のいずれか１項記載の使用。
【請求項７】
前記ポリペプチドが、配列番号２のアミノ酸３０〜４４４を含んで成る請求項１〜３のいずれか１項記載の使用。
【請求項８】
前記ポリペプチドが、５２ｋＤの分子質量を有する請求項１〜７のいずれか１項記載の使用。
【請求項９】
前記ポリペプチドが、配列番号２のアミノ酸１３８〜２９６を含んで成る請求項１〜３のいずれか１項記載の使用。
【請求項１０】
前記ポリペプチドが、セリンプロテアーゼ活性を有する請求項１〜９のいずれか１項記載の使用。
【請求項１１】
前記ポリペプチドが、ＭＢＬ補体経路機能についてインビトロアッセイにおいてＭＡＳＰ−２活性を阻害できる請求項１〜１０のいずれか１項記載の使用。
【請求項１２】
前記ポリペプチドが、配列番号３のアミノ酸１５〜６７１を含んで成る請求項１０又は１１記載の使用。
【請求項１３】
前記ポリペプチドが、配列番号２のアミノ酸１６〜２９６を含んで成る請求項１０又は１１記載の使用。
【請求項１４】
前記ポリペプチドが、配列番号２のアミノ酸３０〜２９６を含んで成る請求項１０又は１１記載の使用。
【請求項１５】
前記ポリペプチドが、ＭＡＳＰ−２活性を競争的に阻害できる請求項１〜３いずれかに１項記載の使用。
【請求項１６】
前記ポリペプチドが、配列番号２のポリペプチドのフラグメントを含んで成り、前記ポリペプチドがＭＢＬ／ＭＡＳＰ−２を複合体化できる競争インヒビターである請求項１５記載の使用。
【請求項１７】
前記ポリペプチドが、配列番号３として同定される配列又はその機能的同等物を含んで成り、ここで位置８， ９， １０， １１， １２， １３， １４， １５， １６， １７， １８又は１９での１又は複数のアミノ酸残基がもう１つのアミノ酸残基により位置されている請求項１５又は１６記載の使用。
【請求項１８】
前記少なくとも２つのアミノ酸残基が置換されている請求項１７記載の使用。
【請求項１９】
配列番号３の位置１４でのａｒｇが、もう１つのアミノ酸により置換されている請求項１７記載の使用。
【請求項２０】
配列番号３の位置１４でのａｒｇが、小さな荷電されていないアミノ酸から成る群から選択されたアミノ酸により配置されている請求項１７記載の使用。
【請求項２１】
配列番号３の位置１４でのａｒｇが、ｇｌｙ及びａｌａから成る群から選択されたアミノ酸により置換されている請求項１７記載の使用。
【請求項２２】
前記医薬組成物が、感染の処理のためである請求項１〜２１のいずれか１項記載の使用。
【請求項２３】
前記感染が、微生物種により引き起こされる感染である請求項２２記載の使用。
【請求項２４】
前記微生物種が、菌類である請求項２３記載の使用。
【請求項２５】
前記微生物種が、酵母である請求項２３記載の使用。
【請求項２６】
前記微生物種が、細菌である請求項２３記載の使用。
【請求項２７】
前記細菌種が、少なくとも１つの抗生物質薬剤に対して耐性である請求項２６記載の使用。
【請求項２８】
前記細菌種が、多耐性である請求項２６記載の使用。
【請求項２９】
前記細菌種が、病原性である請求項２６記載の使用。
【請求項３０】
前記感染が、ウィルス感染である請求項２２記載の使用。
【請求項３１】
前記ウィルスが、レトロウィルスである請求項３０記載の使用。
【請求項３２】
前記レトロウィルスが、ヒト免疫欠損ウィルスである請求項３１記載の使用。
【請求項３３】
前記医薬組成物がさらに、少なくとも１つのマンナン−結合性レクチン（ＭＢＬ）サブユニット、又は前記少なくとも１つのマンナン−結合性レクチン（ＭＢＬ）サブユニットを含んで成る少なくとも１つのマンナン−結合性レクチン（ＭＢＬ）オリゴマーを含んで成る請求項１記載の使用。
【請求項３４】
少なくとも１つのマンナン−結合性レクチン（ＭＢＬ）サブユニット、又は前記少なくとも１つのマンナン−結合性レクチン（ＭＢＬ）サブユニットを含んで成る少なくとも１つのマンナン−結合性レクチン（ＭＢＬ）オリゴマーの、キットの部品を得るための薬剤の製造のためへの使用をさらに含んで成る請求項１記載の使用。
【請求項３５】
前記オリゴマーが、ＭＢＬのテトラマー、ペンタマー及び／又はヘキサマーから成るオリゴマーの群から好ましくは選択される請求項３３又は３４記載の使用。
【請求項３６】
前記医薬組成物が、５００ｎｇ／ｍｌ以下の血清レベルのＭＢＬによる、個人における感染の処理のためである請求項３３〜３５のいずれか１項記載の使用。
【請求項３７】
前記医薬組成物が、１００ｎｇ／ｍｌ以下の血清レベルのＭＢＬによる、個人における感染の処理のためである請求項３３〜３５のいずれか１項記載の使用。
【請求項３８】
前記医薬組成物が、５０ｎｇ／ｍｌ以下の血清レベルのＭＢＬによる、個人における感染の処理のためである請求項３３〜３５のいずれか１項記載の使用。
【請求項３９】
配列番号１により同定されるようなアミノ酸配列又はその機能的相同体を有するポリペプチドであって、前記相同体が配列番号１に示される配列に対して少なくとも６０％の相同性を有するアミノ酸配列を含んで成るポリペプチド。
【請求項４０】
配列番号２の残基３０〜４４４からのアミノ酸配列又はその機能的相同体を有するポリペプチドであって、前記相同体が配列番号２に示される配列に対して少なくとも６０％の相同性を有するアミノ酸配列を含んで成るポリペプチド。
【請求項４１】
前記ポリペプチドが、配列番号２の残基３０〜２９６からのアミノ酸、又はそのフラグメント又は変異体を含んで成る請求項４０記載のポリペプチド。
【請求項４２】
前記ポリペプチドが、配列番号２の残基１３８〜２９６からのアミノ酸、又はそのフラグメント又は変異体を含んで成る請求項４０記載のポリペプチド。
【請求項４３】
配列番号３の残基１５〜６７１からのアミノ酸配列又はその機能的相同体を有するポリペプチドであって、前記相同体が配列番号３に示される配列に対して少なくとも６０％の相同性を有するアミノ酸配列を含んで成るポリペプチド。
【請求項４４】
配列番号２の残基１６〜２９６からのアミノ酸配列又はその機能的相同体を有するポリペプチドであって、前記相同体が配列番号２に示される配列に対して少なくとも６０％の相同性を有するアミノ酸配列を含んで成るポリペプチド。
【請求項４５】
配列番号３により同定されるような配列に対して少なくとも６０％の相同性を有するアミノ酸配列を含んで成る、ＭＢＬ／ＭＡＳＰ−２の複合体化の競争インヒビターであるポリペプチド。
【請求項４６】
配列番号３として同定される配列又はその機能的相同体を含んで成り、ここで位置８， ９， １０， １１， １２， １３， １４， １５， １６， １７， １８又は１９での１又は複数のアミノ酸残基がもう１つのアミノ酸残基により位置されている請求項４５記載のポリペプチド。
【請求項４７】
前記少なくとも２つのアミノ酸残基が置換されている請求項４５記載のポリペプチド。
【請求項４８】
配列番号３の位置１４でのａｒｇが、もう１つのアミノ酸により置換されている請求項４５記載のポリペプチド。
【請求項４９】
配列番号３の位置１４でのａｒｇが、小さな荷電されていないアミノ酸から成る群から選択されたアミノ酸により配置されている請求項４５記載のポリペプチド。
【請求項５０】
配列番号３の位置１４でのａｒｇが、ｇｌｙ及びａｌａから成る群から選択されたアミノ酸により置換されている請求項４５記載のポリペプチド。
【請求項５１】
前記ポリペプチドが、ＭＢＬｅｃｔｉｎ補体経路機能についてのインビトロアッセイにおけるＭＡＳＰ−２活性であり得る請求項３９〜５０のいずれか１項記載のポリペプチド。
【請求項５２】
前記ポリペプチドが、ＭＡＳＰ−２セリンプロテアーゼ活性を競争的に阻害できる請求項３９〜５０のいずれか１項記載のポリペプチド。
【請求項５３】
前記ポリペプチドが、ラベル又はトキシンに接合される請求項３９〜５２のいずれか１項記載のポリペプチド。
【請求項５４】
請求項３９〜５０のいずれか１項記載のポリペプチド配列に対して少なくとも８５％同一である配列を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んで成る単離された核酸分子。
【請求項５５】
請求項５４記載の核酸分子を含んで成る核酸ベクター。
【請求項５６】
前記ベクターが発現ベクターである請求項５５記載のベクター。
【請求項５７】
調節要素をさらに含んで成る請求項５５記載のベクター。
【請求項５８】
ＭＡＳＰ−２の活性を競争特異的に阻害できる化合物の薬剤の調製のためへの使用。
【請求項５９】
前記化合物が、補体因子Ｃ２またはＣ４のペプチドフラグメントである請求項５８記載の使用。
【請求項６０】
前記化合物が、請求項３９〜５０のいずれか１項記載のポリペプチドである請求項５８記載の使用。
【請求項６１】
前記化合物が、ＭＡＳＰ−２と会合できるマンナン−結合性レクチン（ＭＢＬ）のフラグメントである請求項５８記載の使用。
【請求項６２】
前記化合物が、抗体生成動物にＭＡＳＰ−２ポリペプチドを投与することによって生成される抗体である請求項５８記載の使用。
【請求項６３】
前記化合物が、ＭＡＳＰ−２に対して選択的に結合する抗体である。請求項５８記載の使用。
【請求項６４】
前記抗体がモノクローナル抗体である請求項６３記載の使用。
【請求項６５】
前記抗体が、検出マーカーを含んで成る化合物にカップリングされる請求項６２〜６４のいずれか１項記載の使用。
【請求項６６】
マンナン−結合性レクチンに会合したセリンプロテアーゼ−２（ＭＡＳＰ−２）由来のアミノ酸配列（配列番号２）又は配列番号２に示される配列と少なくとも６０％の相同性を有するアミノ酸配列を含んで成るその機能的相同体を含んで成る実質的に純粋なポリペプチドを含んで成る医薬組成物。
【請求項６７】
前記ポリペプチドが、配列番号３として同定される配列を含んで成る請求項６６記載の医薬組成物。
【請求項６８】
前記ポリペプチドが、マンナン結合性レクチン（ＭＢＬ）と会合することができる請求項６６記載の医薬組成物。
【請求項６９】
前記ポリペプチドが、ラベル又はトキシンに接合される請求項６６記載の医薬組成物。
【請求項７０】
請求項３９〜５２のいずれか１項記載のポリペプチドを含んで成る請求項６６記載の医薬組成物。
【請求項７１】
活性ＭＢＬ−複合体化ＭＡＳＰについてのアッセイ方法であって、アッセイされるべきサンプルを供給し、そして従来の補体固定経路の活性化を効果的に低めるのに十分であるが、ＭＢＬ−複合体化ＭＡＳＰの活性を実質的に妨げないほど高いイオン強度の存在下でアッセイを行うことによって、従来の補体固定経路の活性化に起因するいずれかの人工産物を実質的に低めることを含んで成る方法。
【請求項７２】
ＭＡＳＰ−２活性についてのアッセイを含んで成る、ＭＡＳＰ−２の活性の決定方法であって、
−ＭＢＬ／ＭＡＳＰ−２複合体を含んで成るサンプルを、固相に適用し、結合された複合体を獲得し、
−少なくとも１つの補体因子を、前記複合体に適用し、
−切断された補体因子の量を検出し、
−前記切断された補体因子の量を、前記ＭＡＳＰ−２の量と対比し、そして
−ＭＡＳＰ−２の活性を決定する段階を含んで成る方法。
【請求項７３】
前記固相が、マンナン被膜である請求項７２記載の方法。
【請求項７４】
前記少なくとも１つの補体因子が、ＭＢＬ／ＭＡＳＰ−２複合体により切断できる補体因子である請求項７１〜７３のいずれか１項記載の方法。
【請求項７５】
前記少なくとも１つの補体因子が、Ｃ３、Ｃ４及びＣ５、好ましくはＣ４から選択される請求項７４記載の方法。
【請求項７６】
前記切断された補体因子が、前記補体因子に対して向けられた抗体により検出される請求項７２〜７６のいずれか１項記載の方法。
【請求項７７】
前記従来の補体経路の活性化が阻害される請求項７２〜７７のいずれか１項記載の方法。
【請求項７８】
前記活性化が、高いイオン強度でアッセイを行うことによって阻害される請求項７７記載の方法。
【請求項７９】
前記塩濃度が、０．２Ｍ以上、例えば０．３Ｍ〜１０Ｍ、例えば０．５Ｍ〜５Ｍ、例えば０．７Ｍ〜２Ｍ、例えば０．９Ｍ〜２Ｍ、例えば約１．０Ｍである請求項７８記載の方法。
【請求項８０】
前記塩が、ＮａＣｌ， ＫＣｌ， ＭｇＣｌ２， ＣａＣｌ２， ＮａＩ， ＫＣｌ， ＭｇＩ２， ＣａＩ２， ＮａＢｒ， ＫＢｒ， ＭｇＢｒ２， ＣａＢｒ２， Ｎａ２Ｓ２Ｏ３， （ＮＨ４）２ＳＯ４及びＮＨ４ＨＣＯ３から選択される請求項７９記載の方法。
【請求項８１】
生物学的サンプルにおけるＭＡＳＰ−２又はＭＡＳＰ−２活性の定量的アッセイのためである請求項７２〜８０のいずれか１項記載の方法。
【国際調査報告】
2004504027.tif 000083
2004504027.tif 000084
2004504027.tif 000085
2004504027.tif 000086
2004504027.tif 000087
2004504027.tif 000088