(57)【要約】Ｃａｎｄｉｄａ　ａｌｂｉｃａｎｓのような、酵母微生物のＩｎｔ１ｐタンパク質のプロペプチドに結合し得る抗体および薬剤が提供され、これらは、このような微生物によって引き起こされる感染の処置または予防方法において有用であり得る。Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓおよびＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのような、Ｉｎｔ１ｐタンパク質を発現する微生物は、宿主細胞を免疫調節する能力を示し、これは、これらの微生物の感染を可能し、繁栄および毒性化することを増強させる。本発明によれば、前記Ｉｎｔ１ｐタンパク質の活性化に関与するペプチド領域を単離し、そして標的化して、該活性化の妨害する方法を提供し、そして該Ｉｎｔ１ｐタンパク質を発現する微生物による感染の処置または予防を可能にする。本発明の一つの好ましい実施態様において、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓからの前記Ｉｎｔ１Ｐタンパク質の前記プロペプチドに結合し得る抗体または薬剤が、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓまたは該Ｉｎｔ１ｐタンパク質を発現する他の微生物によって引き起こされる感染の予防または処置のための方法に利用される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｃａｎｄｉｄａ　ａｌｂｉｃａｎｓのＩｎｔ１ｐタンパク質のプロペプチドに対して産生された単離抗体。
【請求項２】
該プロペプチドが、図１に示されるようなＩｎｔ１ｐタンパク質のアミノ酸１−２６３の配列を有する、請求項１に記載の単離抗体。
【請求項３】
前記抗体が該プロペプチドの切断を防止し得る、請求項１に記載の単離抗体。
【請求項４】
請求項１に記載の抗体を含む単離抗血清。
【請求項５】
ヒトまたは動物の患者へ有効量の請求項１に記載の抗体を投与することを含む、Ｉｎｔ１ｐタンパク質を発現する微生物による感染の処置または予防方法。
【請求項６】
該微生物がＣａｎｄｉｄａ　ａｌｂｉｃａｎｓおよびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅからなる群より選択される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
該抗体が免疫応答を生じさせるために有効なＩｎｔ１ｐの該プロペプチドの一部に対して惹起される、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
ヘパリン存在下においてＣａｎｄｉｄａ　ａｌｂｉｃａｎｓに暴露された患者を処置するための方法であって：
ヘパリンと結合してそして、該Ｉｎｔ１ｐタンパク質の活性化を減少または排除するのに有効な量の請求項１に記載の抗体を、ヒトまたは動物の患者に投与することを含む方法。
【請求項９】
有効量の請求項１に記載の単離抗体および生理学的に許容される担体、ビルクルまたは希釈剤を含む、該Ｉｎｔ１ｐタンパク質を発現する微生物からの感染の処置または予防のための薬学的組成物。
【請求項１０】
該微生物がＣａｎｄｉｄａ　ａｌｂｉｃａｎｓおよびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅからなる群より選択される、請求項９に記載の薬学的組成物。
【請求項１１】
請求項１に記載の抗体および該抗体による結合を検出するための手段を含む、診断キット。
【請求項１２】
該Ｉｎｔ１ｐプロペプチドの活性化に関与する、Ｃａｎｄｉｄａ　ａｌｂｉｃａｎｓの該Ｉｎｔ１ｐタンパク質のペプチド領域に対して産生された、単離抗体。
【請求項１３】
請求項１２に記載の単離抗体であって、ここで、該ペプチド領域が、図１に表されるアミノ酸配列の、アミノ酸１−２６３におけるプロペプチド領域、アミノ酸４３５−６３９における触媒ドメイン１、アミノ酸７３８−９４９における触媒ドメイン２、およびアミノ酸１０２２−１２３６におけるプロセッシングドメインモチーフからなる群より選択される、単離抗体。
【請求項１４】
前記抗体が該プロペプチドの切断を防止し得る、請求項１２に記載の単離抗体。
【請求項１５】
請求項１２に記載の抗体を含む単離抗血清。
【請求項１６】
有効量の請求項１２に記載の抗体をヒトまたは動物の患者に投与することを含む、該Ｉｎｔ１ｐタンパク質を発現する微生物による感染の処置または予防方法。
【請求項１７】
請求項１２に記載の抗体、および該抗体による結合を検出するための手段を含む、診断キット。
【請求項１８】
図１に表されるアミノ酸配列の、アミノ酸１−２６３におけるプロペプチド領域、アミノ酸４３５−６３９における触媒ドメイン１、アミノ酸７３８−９４９における触媒ドメイン２、およびアミノ酸１０２２−１２３６におけるプロセッシングドメインモチーフからなる群より選択される、単離ペプチド。
【請求項１９】
請求項１８に記載のペプチドを、それに対する抗体を産生し得る宿主へ導入することを含む抗体の産生方法。
【請求項２０】
請求項１８に記載のペプチドをコードする単離核酸配列。
【請求項２１】
請求項１８に記載のペプチドを患者に投与することを含む、免疫応答を誘発する方法。
【請求項２２】
免疫応答を生じさせるに有効な量の請求項１８に記載のペプチドを含むワクチン。
【請求項２３】
請求項１８に記載のペプチドに対して惹起された単離モノクローナル抗体。
【請求項２４】
請求項１２に記載の抗体を、Ｉｎｔ１ｐ−産生微生物による感染を有すると疑われる試料へ導入すること、および該抗体の該試料への結合を測定することを含む、Ｉｎｔ１ｐタンパク質を発現し得る微生物による感染を診断する方法。
【請求項２５】
前記微生物がＣａｎｄｉｄａ　ａｌｂｉｃａｎｓおよびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅからなる群より選択される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
Ｉｎｔ１ｐ活性を阻害する有効量の薬剤を投与することを含む、Ｉｎｔ１ｐタンパク質を発現する微生物によって引き起こされる感染の処置または予防方法。
【請求項２７】
該薬剤が、該Ｉｎｔ１ｐタンパク質についての活性化経路に関与する、該Ｉｎｔ１ｐタンパク質からのペプチド領域またはモチーフを調節する、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
請求項２６に記載の方法であって、ここで、該薬剤が図１に表されるアミノ酸配列の、アミノ酸１−２６３におけるプロペプチド領域、アミノ酸４３５−６３９における触媒ドメイン１、アミノ酸７３８−９４９における触媒ドメイン２、およびアミノ酸１０２２−１２３６におけるプロセッシングドメインモチーフからなる群より選択されるペプチドを調節する、方法。
【請求項２９】
該微生物がＣａｎｄｉｄａ種の酵母である、請求項２６に記載の方法。
【請求項３０】
該微生物がＣａｎｄｉｄａ　ａｌｂｉｃａｎｓおよびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅからなる群より選択される、請求項２６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明は、一般にＣａｎｄｉｄａ　ａｌｂｉｃａｎｓのＩｎｔ１ｐタンパク質のプロペプチド配列に結合し得る抗体、およびＣ．ａｌｂｉｃａｎｓのような微生物からの感染の予防および処置のために前記抗体を利用する方法、そして特に該Ｉｎｔ１ｐタンパク質のプロペプチド領域または他のサブリ―ジョンを妨害し得る薬剤および抗体、ならびにＣ．ａｌｂｉｃａｎｓのような酵母およびＩｎｔ１ｐタンパク質を発現する他の微生物からの感染の処置および予防における前記薬剤および抗体の使用に関する。
【０００２】
発明の背景
二形性の酵母、Ｃａｎｄｉｄａ　ａｌｂｉｃａｎｓは、正常な宿主および免疫系統を損傷した患者において、主要な菌類病原体である。正常な宿主において、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓによって引き起こされる疾患は軽度で、容易に処置される、表在性疾患（例、新生児における鵞口瘡；水に手を浸ける労働者における爪囲炎）から、より重篤な、慢性または反復性の感染症（例、カンジダ性膣炎）にまでおよぶ。出産年齢女性の５％が再発性のカンジダ性膣炎に罹患し（Ｈｕｒｌｅｙ，　Ｐｒｏｃ．　Ｒ．　Ｓｏｃ．　Ｍｅｄ．　７０（Ｓｕｐｐｌ．，４），１−８（１９７０））、そして事実上、全ての女性が生殖年齢の間に、最低一度のエピソードを経験するとみられている。膣炎は特に糖尿病もしくは長期にわたる抗生物質または経口避妊薬の使用歴のある他の正常な女性に、特に頻繁である。一方、膣炎の個々のエピソードを処置するのに短期間の局所的治療は有効であるが、このような薬剤は再発を予防しない。したがって、正常な宿主においてさえ、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓの感染は上皮表面で起こり得、そして再発は、現在利用できる治療によっては予防されない。
【０００３】
癌患者、移植患者、外科手術後患者、未熟児またはＨＩＶ―感染者のような免疫無防備状態の宿主において、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓは主要な菌類病原体として分類される。Ｔ―細胞機能が損なわれた好中球減少症患者において、全身的な感染を引き起こす侵入が、同様に発生し得る（Ｈｏｓｔｅｔｔｅｒ　ＭＫ，　Ｃｌｉｎｉｃａｌ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　Ｒｅｖｉｅｗｓ，　Ｊａｎ　１９９４，ｐｐ２９−４２）。この個体群において、疾患は、ＨＩＶ―感染患者における歯周炎、口腔潰瘍または食道炎のような、攻撃的な局所の感染から、脳、眼、心臓、肝臓、脾臓、腎臓または骨への二次的播種と共に、血流の複雑かつ潜在性致死的感染におよぶ。このような重大な予後は、潜在する感染および処置の両者から付帯する結果により、さらに毒性のある治療を必要とする。繰り返すが、前記感染は、一般的に上皮部位から始まり、局所防御を逃れ、そして免疫抑制をものともせずに血流に侵入する。したがって、カンジダの接着を遮るための戦略は、正常な宿主における軽度だが再発性の疾患の予防、および免疫無防備状態患者における本質的な罹患率と死亡率の低減のための幅広い適応可能性を有する。
【０００４】
Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓがヒト宿主の上皮および内皮細胞にしばしばリガンドと呼ばれる細胞外マトリックスのタンパク質を認識することによって接着することはよく知られている。これらのリガンドはフィブロネクチン、ヴィトロネクチン、フィブリノゲン、Ｃ３分解断片ｉＣ３ｂまたは短Ｃ３分解断片Ｃ３ｄのようなタンパク質を含む。Ｃ３ｄを除くこれら全てのタンパク質の認識は、アミノ酸配列、アルギニン−グリシン−アスパラギン酸（または　Ｒ−Ｇ−Ｄ）に依存することが明らかであるため、これらカンジダの接着は、脊椎動物のインテグリンのように機能すると考えられ、そして“インテグリン−様タンパク質”または、“インテグリンアナログ”と呼ばれる。
【０００５】
脊椎動物のインテグリンは、α−サブユニットおよびβ−サブユニットの二つのサブユニットから構成される。現在のところ、脊椎動物細胞において、これまでに約１４個のαおよび８個のβサブユニットが記載されている。脊椎動物インテグリンに対するモノクローナルまたはポリクローナル抗体を使用し、数人の研究者らはＣ．ａｌｂｉｃａｎｓにおけるインテグリン−様タンパク質の証拠を得た。
【０００６】
このようなタンパク質の一つはＣａｎｄｉｄａ　ａｌｂｉｃａｎｓのタンパク質Ｉｎｔ１ｐであり、このタンパク質は芽状胞子から菌糸への形態学的変換に関与する、付着因子として機能することが観察されており、かつマウスにおける毒性と関連付けられている。ＩＮＴ１／ＩＮＴ１株に起因し得る急死は、Ｉｎｔ１ｐが免疫調節的役割を持つ可能性を示唆している。マウス真菌血症モデルを使用した病因研究は、Ｉｎｔ１ｐを介する接着および菌糸形成をＣａｎｄｉｄａ　ａｌｂｉｃａｎｓ毒性と関連づけ（Ｇａｌｅ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｓｃｉｅｎｃｅ　２７９：１３５５−１３５８，　１９９８）、そして、ｉｎｔ１／ｉｎｔ１　二重破壊変異体（ｄｏｕｂｌｅ　ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ　ｍｕｔａｎｔ）（ＣＡＧ３）の静脈接種は、野生型ＩＮＴ１／ＩＮＴ１株（ＣＡＦ２）と比較した、死亡数および腎炎の減少と関係があるとされる（Ｂｅｎｄｅｌ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｍｏｌ．　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　ａｎｄ　Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ　６７：３４３−３５１，１９９９参照）。
【０００７】
しかし、攻撃的な抗菌治療にもかかわらず、播種したカンジダのような微生物からの感染の死亡率は高いままであり（Ｔｏｄｉｓｃｈｉｎｉ，　Ｊ．　Ｉｎｔｅｒｎ　Ｄｉｓ．　１：Ｓ３７−Ｓ４１，　１９９７）、また、Ｃａｎｄｉｄａ　ａｌｂｉｃａｎｓおよびＩｎｔ１ｐを発現する、他の類似の微生物によって引き起こされる疾患に対する、高い効果のある処置または予防の方法は、まだ得られていない。
【０００８】
発明の要旨
したがって本発明の目的は、Ｃｓｎｄｉｄａ　ａｌｂｉｃａｎｓおよび、Ｉｎｔ１ｐタンパク質を発現する他の類似の微生物によって引き起こされる感染を有効に処置する方法を提供することである。
【０００９】
さらに本発明の目的は、Ｃａｎｄｉｄａ　ａｌｂｉｃａｎｓによって引き起こされる感染を有効に処置または予防する方法を提供することである。
【００１０】
なおさらに本発明の目的は、プロペプチドを単離する方法および、前記プロペプチドに対する抗体の産生を通し、Ｃａｎｄｉｄａ　ａｌｂｉｃａｎｓによって引き起こされる感染の処置または予防する方法を提供することである。
【００１１】
なおさらに本発明の目的は、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓおよびＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのような、Ｉｎｔ１ｐタンパク質を発現する他の類似の微生物から該Ｉｎｔ１ｐタンパク質の特定領域を単離すること、ならびに前記領域に結合し得る薬剤および抗体を提供することである。
【００１２】
なおさらに本発明の目的は、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓおよびＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのような、前記Ｉｎｔ１ｐタンパク質を発現する他の類似の微生物から、Ｉｎｔ１ｐタンパク質の特定領域を単離すること、ならびにプロペプチドの切断を妨害し得る、または、該プロペプチドの潜在的結合部位、すなわち、抗原提示細胞またはＴ−リンパ球結合領域を遮断するために作用し得るペプチド、もしくは抗体を提供することである。
【００１３】
また本発明の目的は、Ｉｎｔ１ｐタンパク質を発現する微生物によって引き起こされる感染の予防または処置のために、Ｃａｎｄｉｄａ　ａｌｂｉｃａｎｓの該Ｉｎｔ１ｐタンパク質の活性を阻害する方法を提供することである。
【００１４】
これら、および他の目的は、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓのＩｎｔ１ｐタンパク質からの多数の特定領域の一つからペプチドを単離すること、および、これらの特定領域に結合し得、このようにして該Ｉｎｔ１ｐタンパク質の活性を妨害し得る有効量の抗体組成物または他の薬剤をヒトまたは動物の患者に投与することによって、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓまたはＩｎｔ１ｐタンパク質を発現する他の微生物からの感染の処置または予防を含む本発明によって達成される。特に、本発明は、該Ｉｎｔ１ｐタンパク質のプロペプチドの単離、およびプロペプチドに結合し得、従って該プロペプチドの切断を防止することによるような、Ｉｎｔ１ｐタンパク質の活性を妨害する方法において有用となり得、そしてこのようにＣ．ａｌｂｉｃａｎｓまたはＩｎｔ１ｐタンパク質を発現する他の微生物からの感染を予防または処置する抗体または他の薬剤の開発に関する。
【００１５】
本発明は、同様にＣ．ａｌｂｉｃａｎｓまたはＩｎｔ１ｐタンパク質を発現する微生物からの感染の予防または処置の方法において有用となるように、宿主の抗原提示細胞および／またはＴ−リンパ球へのスーパー抗原の結合を遮断するために使用され得るペプチドの産生に関する。
【００１６】
好ましい実施態様の詳細な説明
本発明に従い、本発明者らは、いくつかのＩｎｔ１ｐタンパク質の区別可能な領域を発見および単離し、ならびに、宿主においてＩｎｔ１ｐタンパク質が活性化される経路に関与する、プロペプチド領域を含む領域を妨害することによって、Ｃａｎｄｉｄａ　ａｌｂｉｃａｎｓのようなＣａｎｄｉｄａ種の酵母、およびＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのような他の微生物を含む、Ｉｎｔ１ｐタンパク質を発現する微生物からの感染の処置または予防に対して、本発明は向けられる。加えて、Ｉｎｔ１ｐタンパク質の特定領域に結合し得、したがって、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ感染の処置または予防において有用となり得る薬剤および抗体に対して、本発明は向けられる。一般的に、該プロペプチドの切断を防止し得る抗体、および／または、該プロペプチドに結合し、したがって、該Ｉｎｔ１ｐタンパク質の活性化を妨害する抗体の開発が望ましい。
【００１７】
本発明の好ましい実施態様の一つにおいて、本発明は、二つの部位すなわち、宿主細胞上の抗原提示細胞（ＭＨＣ−ＩＩ座のような）およびＴリンパ球上に結合するスーパー抗原プロペプチド上の部位と同一の配列を有する、鎖状または環状のいずれかのペプチドに関する。Ｉｎｔ１ｐタンパク質において、ＭＨＣ−ＩＩ結合ペプチドは、図１に示されるタンパク質配列の、アミノ酸２３９から２５４（プロペプチド領域１−２６３中）の領域中に現れ、そしてこの配列は図１７に示される。それゆえに、本発明に従い、任意の適当な形態（例えば、ヒトまたは動物の患者への投与に使用される薬学的に許容される組成物）における、このペプチド、または他の遮断ペプチドの使用が考えられる。したがって、これらの遮断型ペプチドは、スーパー抗原プロペプチドに結合する、前記部位を遮断する方法として宿主に投与され得、したがって、該Ｉｎｔ１ｐタンパク質によって引き起こされる感染の予防または処置に使用され得る。
【００１８】
本発明のさらなる局面において、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓのような微生物によって引き起こされる感染の処置または予防は、これらの領域によってコードされるペプチドに構造的、または他の変化を引き起こすことができ、したがってＩｎｔ１ｐタンパク質の免疫調節能を妨害し得る、前述のような特定領域における突然変異を引き起こすことによって、達成され得ると考えられる。Ｉｎｔ１ｐタンパク質の遺伝子配列およびペプチド配列は、例えば、本明細書中に参考として援用される、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．　９３（１），　３５７−３６１　（１９９６）中に以前に開示されている。加えて、Ｉｎｔ１ｐに関するさらなる情報は、係属中の米国特許出願Ｓｅｒ．Ｎｏ．０９／２６４，６０４およびＵ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．５，８８６，１５１，中に提供され、両者とも本明細書中に参考として援用される。最後に、Ｉｎｔ１ｐタンパク質のアミノ酸配列が図１に示され、ＤＮＡ配列が図２ａ−２ｂに示される。好ましい実施態様において、本発明に従ったこれらの突然変異は、プロペプチドの切断を防止し得る、または、宿主の抗原提示細胞またはＴリンパ球への前記プロペプチドスーパー抗原の結合を妨害し得るものであろう。よって、本発明に従い、これらのプロペプチド結合領域のいずれか、または両方における突然変異が好ましい。
【００１９】
したがって、さらに以下に示されるように、本発明は、以下に述べるＣ．ａｌｂｉｃａｎｓ　Ｉｎｔ１ｐタンパク質からの特定領域に結合し得る抗体、ならびに、Ｉｎｔ１ｐ生物を発現するこの又は他の類似の微生物によって引き起こされる感染の予防または処置のために、ヒトおよび動物の宿主においてＣ．ａｌｂｉｃａｎｓの活性の妨害における、これらの抗体使用に関する。したがって、一つの実施態様において、本発明は、少なくとも一部はＩｎｔ１ｐタンパク質、およびその免疫調節能によって引き起こされるカンジダ、および他の酵母感染の予防および処置の方法において有用となり得る、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ　Ｉｎｔ１ｐタンパク質の特定領域に対して産生された、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体のような、単離および／または精製抗体に関する。ここで使われる用語“抗体”は、Ｆａｂ免疫グロブリン発現ライブラリーの生成物を含む、Ｆａｂ断片と同様に、モノクローナル、ポリクローナル、キメラ、単鎖、二重特異性、サル化、およびヒト化または霊長類化された抗体を含み、そして、任意のこれらのタイプの抗体または抗体断片の産生は、当業者に周知である。上記に触れたように、該プロペプチドの切断の防止、または宿主細胞の結合部位、すなわち、抗原提示細胞（ＭＨＣ−ＩＩ座のような）、またはＴリンパ球上のスーパー抗原結合部位、に対し切断されたスーパー抗原の結合の妨害を含む、多くの方法のどの方法においても、Ｉｎｔ１ｐタンパク質の活性化を妨害し得る抗体の提供が望ましい。以下にさらに述べるように、これらの抗体は、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓおよび他の類似の微生物からの感染の予防または処置をするために有効な量において好ましく使用され、ならびにこれらの抗体は、本分野において周知の、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体を産生するための多くの適当な方法のどの方法においても、同様に産生される。例えば、本発明の単離ペプチドを適当な動物モデルに注射し、そしてそこから抗体を単離することによって、ポリクローナル抗体を産生することに加え、以下に述べられる、Ｉｎｔ１ｐ領域に対して向けられたモノクローナル抗体はＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ（例えば、Ｎａｔｕｒｅ　２５６：４９５−７，１９７５参照）の方法、または、本分野において公知の他の適当な方法を使用して、同様に産生され得る。本発明に従い、モノクローナルまたはポリクローナル抗体を使用して調製された抗血清が、同様に考えられ、そして当業者によって認識されるであろう多くの適当な方法において、調製され得る。
【００２０】
加えて、本発明は、これらのペプチドを妨害するために、以下の特定領域に結合し得、そして再び、毒性化するまでに該Ｉｎｔ１ｐタンパク質を発現する微生物による感染および免疫調節経路を不活性化し得る薬剤の使用に関する。最後に、該アミノ酸配列に対してであろうと、これらペプチドをコードする核酸配列に対してであろうと、これらの領域に対する突然変異もＩｎｔ１ｐタンパク質の機能を妨害し、感染性微生物を無効または毒性を低くするために利用されることが同様に考えられる。
【００２１】
本発明の一つの実施態様において、本発明は、Ｉｎｔ１ｐタンパク質のプロペプチドの単離、およびＣ．ａｌｂｉｃａｎｓ感染の処置または予防において、有用となる抗体ならびに他の薬剤の産生におけるこのプロペプチドの使用に関する。このプロペプチドは、図１に示されるように、Ｉｎｔ１ｐタンパク質のアミノ酸１−２６３を構成し、そして、ペプチドＰｅｐ２６３として同定されている。本発明者らの測定によると、該ペプチド、Ｐｅｐ２６３はＩｎｔ１ｐから放出され、そして、宿主細胞におけるＴリンパ球の活性化において主要な役割を果たす、スーパー抗原様部分を構成する。したがって、このプロペプチドに結合し得る抗体または他の薬剤はＣ．ａｌｂｉｃａｎｓおよびＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのような微生物によって引き起こされるＴリンパ球の活性化を妨害する方法において利用され得、したがって、Ｉｎｔ１ｐを発現する前記微生物からの感染の予防、処置、または毒性の減少の方法において利用され得る。とりわけ、本発明に従う該プロペプチドに対する抗体は、例えば、該プロペプチドに結合し、および／または該プロペプチドの切断を防止し、したがって、そのスーパー抗原形態における、該プロペプチドの放出を止めることにより、Ｉｎｔ１ｐタンパク質の機能を妨害し得る。
【００２２】
プロペプチドＰｅｐ２６３も、同様にアミノ酸部位１５５−１６９にヘパリン結合部位を含み、そして、生理学的用量のヘパリンによって促進される反応においてＩｎｔ１ｐのアミノ末端からこのペプチドが切断されるとき、Ｐｅｐ２６３によって、Ｔリンパ球の活性化が誘発されることが現れる。ヘパリンの非存在下において、Ｐｅｐ２６３は隠れたように見え、一般的に、Ｉｎｔ１ｐタンパク質の最初の６００アミノ酸に対する抗体、抗−ＩＮＴ６００の様な抗体によっては検出されない。しかし、ヘパリン存在下においては、Ｉｎｔ１ｐのアミノ末端が露出され、そこでＰｅｐ２６３が切断され、臨床症状（ｃｌｉｎｉｃａｌ　ｏｕｔｃｏｍｅ）に影響し、そしてＩｎｔ１ｐを発現するＣ．ａｌｂｉｃａｎｓおよびＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのような微生物の感染を引き起こし、または増強する前−炎症性サイトカイン（ｐｒｏ−ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ　ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ）の放出において、頂点に達するスーパー抗原様効果を呈する液相中に放出される。したがって、本発明に従うＰｅｐ２６３に対する薬剤および抗体はＩｎｔ１ｐタンパク質を発現する微生物における感染の予防または処置、ならびに、そこから引き起こされるＴリンパ球の活性化を排除または減少するための方法において有用となり得る。
【００２３】
図３および４の概略的な図に示されるように、“サブチリシン−様”プロプロテインコンバターゼの活性化は、最終的に該ペプチドの切断および該微生物の毒性形の活性化を導くＩｎｔ１ｐタンパク質において起こる。図３において、Ｉｎｔ１ｐタンパク質の概略的な解析は、シグナルペプチド、該プロペプチド、不活性サブチリシンおよび前記Ｐ−ドメインの存在を示す。プロセッシングまたは、“Ｐ−ドメイン”は、二塩基残基のカルボキシ末端側において該プロペプチドを切り取る（ｃｌｉｐ）ために使用され、その結果、該プロペプチドを放出する。露出したＤ−Ｈ−Ｎ−Ｓ活性部位残基は、サブチリシンセリンプロテアーゼ構造をとる。このアミノ末端プロセッシングは、図４においてさらに示され、ここでＩｎｔ１ｐのもともとの形態は、ヘパリン結合領域１５５−１６９を含む、該プロペプチドの切り取りによって変形され、そして該サブチリシン領域が同様に活性化されると同時に、切断されてスーパー抗原になる。多様なタンパク質からのＰドメインサブチリシンモチーフが、図５に示される様に比較される。図６は、結核菌ヘパリン−結合ヘマグルチン付着因子（ＨＢＨＡ）の高−親和性ヘパリン結合部位とＣａｎｄｉｄａ　ａｌｂｉｃａｎｓ　Ｉｎｔ１ｐタンパク質のヘパリン−結合部位の比較を示す。
【００２４】
このように本発明者らによって、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓおよびＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのような、このタンパク質を発現する微生物の感染性ならびに毒性の妨害のための、該タンパク質の全ての存在する標的部位によるＴリンパ球活性化に関与する、前記Ｉｎｔ１ｐの特定領域が示された。上述のように、ヘパリン結合部位を含むアミノ酸１−２６３におけるプロペプチド領域は、このプロペプチドが宿主細胞を免疫調節し得ることが示されたスーパー抗原になるため、該タンパク質から切り取られる点で活性化過程に、決定的である。本発明に従い、この領域に結合し得る抗体または他の薬剤は、このようにＴ−細胞活性化を防止するために有用になり得、このようにＩｎｔ１ｐを発現する微生物からの感染の発生の予防または処置の方法において利用され得る。
【００２５】
なお、該活性化の過程において利用される他の特定領域が、同定されており、そしてこれらのペプチドは、これらのタンパク質に結合する、または、その他の場合、Ｉｎｔ１ｐ活性化の過程を妨害し得る抗体および他の薬剤の産生において使用されるように、単離および／または精製され得る。アミノ酸１−２６３におけるプロペプチド領域に加え、これらの領域に含まれるのは、図１１に最も良く示されるように、アミノ酸４３５−６３９における触媒ドメイン１、アミノ酸７３８−９４９における触媒ドメイン２、およびアミノ酸１０２２−１２３６におけるプロセッシングドメイン（または“Ｐ−ドメイン”）モチーフである。本発明に従い、例えば上記の方法によって生産された、単離および／または精製された抗体は、前記の特定領域に対して産生され、そして前記抗体の有効量が、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓまたは該Ｉｎｔ１ｐタンパク質を発現する他の微生物からの感染の予防または処置の方法において使用され得る。同じく、本発明に従った他の処置または予防の方法は、Ｉｎｔ１ｐ活性を減少または除去するためにこれらの特定領域に結合し或いは妨害する薬剤、もしくはＩｎｔ１ｐ活性の減少または除去において、同様に有効である野生型配列のこれらの特定領域中の突然変異を含む。前述のように、最も望ましい実施態様において、これらの抗体は、例えば該ペプチド領域に結合し、そして／または該プロペプチドの切断を防止し、したがって、そのスーパー抗原形態としての該プロペプチドの放出を止めることによってＩｎｔ１ｐ活性を妨害するために機能する。
【００２６】
加えて、宿主細胞へのスーパー抗原の結合を妨害し得る、他のペプチドまたは抗体は、本発明に従って同様に提供される。前記スーパー抗原は、図１８に示されるように、例えばＭＨＣクラスＩＩ座におけるように、スーパー抗原がＴ細胞および抗原提示細胞の両方に結合する、２倍の結合システムを通して、Ｔリンパ球の活性化を可能にする。前述の領域、すなわち図１１中に示されるアミノ酸１−２６３におけるプロペプチド領域、触媒ドメイン１および２、ならびにプロセッシングドメインをコードする単離核酸が本発明に従い考えられることが、同様に考えられる。当業者によって認識されるように、本発明に従った核酸配列は、上記のようなペプチド領域と一致する図２Ａ−２Ｂ中に示される核酸配列の特定領域だけでなく、これらのアミノ酸配列をコードする全ての代替の核酸配列と一致するものを含む。本発明の単離された核酸は、これらの組換えペプチドが適当な抗体を産生するために使用され得るように、組換えの方法を通した、本発明に従う該ペプチド領域の産生を含む、多くの適当な方法において有用となる。加えて、これらの領域中の該ペプチドおよび核酸配列に対する突然変異が、これによって該Ｉｎｔ１ｐ活性化経路を妨害する代替手段の提供において、同様に有用となると考えられる。
【００２７】
感染の処置または予防の方法における、前述のＩｎｔ１ｐタンパク質の該プロペプチドおよび／または他の特定領域に結合する薬剤および抗体の使用に加え、本発明は、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓまたはＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのような微生物の存在の検出を含む様々な方法におけるこれらの抗体の使用を同様に考え、そしてこのような同様に感染し得る患者または医用素材のいずれかにおける、Ｉｎｔ１ｐを発現する微生物によって引き起こされる感染を診断するために抗体を使用することは、本発明に従い考えられる。例えば、Ｉｎｔ１ｐを発現する微生物による感染の存在を検出する、一つのこのような方法は、感染のあり得る試料を入手し、そしてＤＮＡが抽出され、沈殿および増幅され得るように前記細胞を溶解する工程を包含する。次に続く該試料の単離では、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓまたはＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの様なＩｎｔ１ｐ微生物の存在の検出のため、本発明の抗体を利用した診断アッセイが実施され得、また、試料中の前述の存在を測定するためのアッセイ技術は、当業者に周知であり、かつラジオイムノアッセイ、ウエスタンブロット分析およびＥＬＩＳＡアッセイの様な方法を含む。
【００２８】
したがって、本発明に従った抗体は、前記微生物からの感染の予防または処置のため、もしくは研究道具としての使用のため、Ｉｎｔ１ｐ―産生微生物の特異的な検出のため使用される。前述のように、ここで使用される用語“抗体”は、Ｆａｂ免疫グロブリン発現ライブラリー産物を含む、Ｆａｂ断片はもとより、モノクローナル、ポリクローナル、キメラ、単鎖、二重特異性、サル化およびヒト化または霊長類化抗体を含む。これらいずれの型の抗体または抗体断片の産生は、当業者らに周知である。
【００２９】
同様に当業者に認識されるように、本発明の抗体は、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓまたはＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの様な酵母によって引き起こされる感染の処置または予防のためヒトまたは動物の患者への投与のために、適当な薬学的組成物に形成される。薬学的組成物は、本発明の抗体、またはこれらの有効断片を含み、生理食塩水、デキストロース、水、グリセロール、エタノール、他の治療的化合物、およびこれらの組み合わせを含む、この分野で一般的に使用される任意の適当な薬学的ビルクル、賦形剤、または担体との組み合わせにおいて、処方され得る。当業者に認識されるように、使用される特定のビルクル、賦活剤、または担体は、患者や患者の状態によって異なり、また当業者に認識されるように、多様な投与の様式は、本発明の組成物に適切となり得る。本出願において開示される、任意の薬学的組成物の適当な投与方法は、局所、経口、肛門、膣、静脈、腹腔、筋肉、皮下、鼻腔内、および皮内投与を含むが、これを制限するものではない。
【００３０】
局所投与のため、前記組成物は、軟膏剤、クリーム剤、ゲル剤、ローション剤、滴剤または液剤の形で処方される。代わりに、そのように所望される場合、感染のさらなる予防のために、創傷または外科用の包帯、縫合糸およびエアロゾルに、該組成物をしみ込ますことができる。前記組成物は、保存剤、浸透を促進するための溶剤、および皮膚緩和薬のような、通常の添加剤を含むことができる。局所処方は、同様に、クリームまたは軟膏ベース、エタノール、またはオレイルアルコールのような通常の担体を含むことができる。
【００３１】
さらに、本発明の単離された抗体、もしくは前述のような活性化断片または部分は、カンジダ−型感染または、Ｉｎｔ１ｐ−生産微生物に関連する他の感染に対する、受動または能動免疫のためのワクチンの開発において、同様に利用され得る。さらに、これらの組成物は同様に、創傷に投与され、もしくは医療器具またはｉｎ　ｖｉｖｏおよびｉｎ　ｖｉｔｒｏの高分子生物材料を覆うために使用され得る。加えて、該抗体は、ある例においては、これを投与された患者における免疫原性を少なくするため、必要に応じて改変される。例えば、患者がヒトなら、例えばＪｏｎｅｓ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｎａｔｕｒｅ　３２１：５２２−５２５（１９８６）またはＴｅｍｐｅｓｔ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　９：２６６−２７３（１９９１）に記載されるように、抗体は、ハイブリドーマ−由来抗体の相補的決定領域をヒトモノクローナル抗体に移植（ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ）することによって“ヒト化”され得る。
【００３２】
一つの実施態様において、本発明に従う前記単離ペプチドは、免疫応答を生じるために十分な量で、前述された一つまたはそれ以上の該Ｉｎｔ１ｐタンパク質を含むワクチンの調製物において使用され得る。加えて、本発明に従う抗体は、カンジダまたは他の類似の感染を処置または予防するための適当な抗体の提供において、有用となる受動ワクチンとして使用され得る。当業者によって認識されるように、ワクチンは、非経口（筋肉、皮内または皮下）投与、または鼻咽腔（すなわち鼻腔内）投与のような、多くの適当な方法における投与のためにパッケージ化（ｐａｃｋａｇｅｄ）される。多くの前記ワクチン投与の方法は、適当であるが、特定の投与方法は対処される感染の性質、および患者の状態に左右されるであろう。該ワクチンは、好ましくは、投与を促進するための薬学的に許容される担体と混合され、そして前記担体は、保存剤の有無に関わらず、水または緩衝生理食塩水のような、一般の物質を含むことができる。該ワクチンは、投与時における再懸濁（ｒｅｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ）のために凍結乾燥されるか、または溶剤中に置かれるであろう。
【００３３】
本発明に従った抗体組成物投与の好ましい用量は、酵母感染または該Ｉｎｔ１ｐタンパク質を発現する他の微生物からの感染の予防または処置において有効となる量である。当業者が認識するように、このような有効量は該感染の性質および患者の状態に、きわめて大きく左右される。上記のように、本発明に従い使用される“有効量”の抗体または薬学的薬剤は、無毒だが、望ましい予防または治療効果を生み出すのに十分な量の該薬剤を意味すると意図される。したがって必要とされる前記抗体または特定の薬剤の正確な量は、患者ごと、種、年齢および被験体の一般的状態に左右され、処置される状態の重症度、使用される特定の担体またはアジュバンド、およびその投与の方法などに依存する。したがって、任意の特定抗体組成物の“有効量”も、特定の状況に基づいて変化する。しかし、適切な有効量は、慣例的な試験のみを使用して当業者により、適用の各症例において、決定され得る。前記用量は、前記組成物を投与される個体に適合するように調節されるべきであり、そして、年齢、体重、および前記個体の代謝と共に変化する。前記組成物は、さらに、チメロサール（エチル（２−メルカプトベンゾエート−Ｓ）水銀ナトリウム塩）（（ｅｔｈｙｌ（２−ｍｅｒｃｕｐｔｏｂｅｎｚｏａｔｅ−Ｓ）ｍｅｒｃｕｒｙ　ｓｏｄｉｕｍ　ｓａｌｔ））（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）のような、安定剤または薬学的に許容される保存剤を含むことができる。
【００３４】
本発明の他の実施態様において、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓまたは他の類似の微生物に感染したと疑われる水性試料の添加によって、活性となる単一の容器に凍結乾燥されたような、適当な形態の本発明の該抗体を含む、Ｉｎｔ１ｐを発現する微生物によって引き起こされる感染の単離、および同定において有用となり得るキットがある。このようなキットは、一般的に前述のような該Ｉｎｔ１ｐタンパク質の特定領域に結合する複合体の同定を可能にする、適当な免疫検出試薬と共に、適当な形態における該抗体の収容のための適当な容器を含む。例えば、前記免疫検出試薬は、検出可能な色などを生成するビオチンまたは酵素のような、通常該抗体に結合する、または、抗原に抗体が結合する際に検出可能な結果を提供するための、他の適当な方法において利用され得る、適当な検出可能なシグナルまたはラベルを含むことができる。加えて、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓまたはＩｎｔ１ｐタンパク質を発現する他の微生物の感染を同定または診断する方法が提供され、ここで、該Ｉｎｔ１ｐタンパク質からの上記ペプチド領域に対する、一またはそれ以上の抗体が、Ｉｎｔ１ｐを発現する微生物に感染したと考えられる試料中に導入され、そして該試料への結合が観察されれば、前記感染の同定または診断が確認される。そのような結合は、例えば前述の検出可能なラベルを含む、本分野において一般的に使用される多くの適当な方法において、観察され得る。
【００３５】
要約すると、このように本発明は、Ｉｎｔ１ｐを発現する微生物の毒性の拡散に起因する活性化の経路に関わることが示される、単離および／または精製された該Ｉｎｔ１ｐタンパク質の領域を提供し、並びにこれらの特定領域に結合し得る、および／または、他の方法においてＩｎｔ１ｐ活性化の過程を妨害し得る抗体、抗血清、および他の薬剤を提供する。従ってこのような抗体および薬剤は、従って、該Ｉｎｔ１ｐタンパク質を発現するＣ．ａｌｂｉｃａｎｓまたはＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの様な微生物からの感染の、効果的な処置または予防の方法において利用され得る。
【００３６】
実施例
本発明の好ましい実施態様の局面を例示する以下の実施例が提供される。当業者らは以下の実施例に開示される当該技術が、本発明の実施において有効に機能するように本発明者らによって発見された技術を示し、またそれゆえに、その実施のための好ましい様式を構成すると考えられることを理解すべきである。しかしながら、本開示に鑑み、当業者は開示される特定の態様において多くの改変がなされ得ることを理解し、そしてまた本発明の精神および範囲から離れることなく、同様もしくは類似の結果を得る。
【００３７】
実施例１：ＩＮＴ１Ｐタンパク質の研究
Ｃｎｄｉｄａ　ａｌｂｉｃａｎｓの前記タンパク質Ｉｎｔ１ｐは、芽状胞子から菌糸への形態学的変換に関与する、付着因子として機能し、そしてマウスにおける毒性に関連する。ＩＮＴ１／ＩＮＴ１株に帰せられる急速な死は、Ｉｎｔ１ｐが免疫調節の役割を有する可能性があることを示唆している。したがって、我々は、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓの表面上のＩｎｔ１ｐ発現がＴ細胞活性化に影響するのかどうかを研究した。
【００３８】
【表１】
2004509923.tif 000002
【００３９】
培養条件
３０℃で振盪しながらＹＰＤ培地中で中対数期（ｍｉｄ−ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ　ｐｈａｓｅ）まで増殖させた芽状胞子を、サブ抑制（ｓｕｂｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ）量の０．２μｇ／ｍｌアンフォテリシンＢ（ＡＬ−Ｂａｓｓａｍ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｊ．Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ　Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ，　１５：２６３−２６９，　１９８５）を含む、ＰＢＳ中で洗浄した。酵母を、３７℃において４５分間、５００，０００細胞／ウェルでインキュベートすることによって９６ウェル培養プレートの底に接着させた。
【００４０】
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、ヘパリン化血をＦｉｃｏｌｌ−ｈｙｐａｑｕｅ遠心分離によって得た。洗浄したＰＢＭＣｓを、１０％ヒトＡＢ血清、Ｌ−グルタミン、ピルビン酸ナトリウム、非必須アミノ酸、および、Ｃａｎｄｉｄａ　ａｌｂｉｃａｎｓを芽状胞子期に維持するために、０．２μｇ／ｍｌアンフォテリシンＢで補充された、ＲＰＭＩ１６４０中に懸濁した。
【００４１】
ＰＢＳ／アンフォテリシンＢの除去に際し、２．５×１０６細胞／ｍｌの２００λＰＢＭＣを、前記接着性芽状胞子に加えることによって、共培養を開始した。培養は、３７℃、５％二酸化炭素において１−７日間、インキュベーションされた。ＰＢＭＣ±スーパー抗原ＴＳＳＴ−１、およびマイトジェンＰＨＡを含むコントロールウェルを、同様に設けた。ＭＨＣクラスＩＩ阻害の効果を、共培養前に、抗―ＨＬＡ−ＤＲ抗体をＰＭＢＣｓに加えることによって、評価した。好適である場合、ＣＤ３細胞を、細胞分離カラムを使用して、＞９７％純度に単離した。ＭＨＣクラスＩＩを発現する抗原提示細胞（ＡＰＣ）を、プラスチック接着によって単離した。ＡＰＣｓの抗原プロセッシング能は、０．３％パラホルムアルデヒドで前処理することによって、完全に破壊した。
【００４２】
フローサイトメトリー
適切な時間点において採取された培養物を、ＩＬ２ＲおよびＣＤ３、それぞれに対するモノクローナル抗体を複合化した（ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ）ＦＩＴＣおよびＰＥとともに室温で１０分間染色して、Ｔ細胞活化を評価した。同じく、Ｔ細胞サブセットＣＤ４およびＣＤ８、加えてＶｂｅｔａ２およびＶｂｅｔａ８を、サイクロームおよびＰＥでラベルされたＭａｂｓを使用することによって、それぞれ解析した。細胞は、ＦＡＣＳ　Ｖａｎｔａｇｅ（ＢＤ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，　Ｓａｎ　Ｊｏｓｅ，　ＣＡ．）を使用するフローサイトメトリーによって定量した。データ解析を、ＷｉｎＭＤ１　ｖｅｒｓｉｏｎ　２．８　ソフトウェアを使用して行った（Ｄｒ．　Ｊｏｓｅｐｈ　Ｔｏｔｔｅｒ，　Ｓｃｒｉｐｐｓ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，　Ｌａｊｏｌｌａ，　ＣＡ　より好意的に供給された）。
【００４３】
方法
５人の健常な志願者からのＰＢＭＣｓを、ＣＡＦ２　ＩＮＴ１／ＩＮＴ１、またはＣＡＧ３　ｉｎｔ１／ｉｎｔ１芽状胞子のいずれかと共に、１〜７日の間、共培養した。ＣＤ３陽性個体群中のＩＬ２受容体陽性細胞は、各時間点における活性化Ｔ細胞の頻度を示す。５個体への試験は、４日目までは、ＣＡＦ２共培養に対する活性化Ｔ細胞の頻度が有意に高いことを示した。活性化Ｔ細胞のクラスターは、ＩＮＴ１／ＩＮＴ１芽状胞子と共培養されたＰＢＭＣｓの４日目までは、同様に優勢だった。類似の実験条件下において、ｉｎｔ１／ｉｎｔ１芽状胞子は、これらのＴ細胞活性化クラスターを誘導しない。
【００４４】
一人の提供者からのＰＢＭＣｓを単独、またはＣ．ａｌｂｉｃａｎｓ株ＣＡＦ２，ＣＡＧ１、ＣＡＧ３、もしくはＨＬＣ−５４と共に５日間培養した。ｉｎｔ１／ｉｎｔ１ヌル突然変異体であるＣＡＧ３株のみが、非刺激コントロールレベル以上に、Ｔ細胞の活性化し得なかった。
【００４５】
ＰＢＭＣｓを１０μｇ／ｍｌＰＨＡ、４μｇ／ｍｌＴＳＳＴ−１、またはＣＡＦ２もしくはＣＡＧ３いずれかの５００，０００芽状胞子と共に、培養した。それぞれの培養条件は、処置しないまま放置されたか、または１０μｇ／ｍｌの抗−ＨＬＡ−ＤＲ抗体、もしくはアイソタイプコントロールと共にインキュベートされたかのいずれかであった。ＣＤ３陽性細胞を、フローサイトメトリーによって、ＩＬ２受容体のアップレギュレーションについて解析した。マイトジェン活性化がＭＨＣクラスＩＩに独立であることから、予想されていたように、ＰＨＡによるＴ細胞活性化は、抗−ＨＬＡ−ＤＲ抗体によって影響を受けなかった。しかしＴＣＲのＶｂｅｔａ２への結合および、クラスＩＩのベータ鎖が活性化に必要とされることから、スーパー抗原ＴＳＳＴ−１への応答は、有意に抑制された。抗−ＨＬＡ−ＤＲ抗体は、ＣＡＦ２　ＩＮＴ１／ＩＮＴ１と共培養したＴ細胞上のＩＬ２Ｒのアップレギュレーションを有意に低下させたが、ＣＡＧ３　ｉｎｔ１／ｉｎｔ１と共にしたものはそうならず、Ｉｎｔ１ｐ−仲介Ｔ細胞活性化におけるＭＨＣクラスＩＩ分子の役割を示唆している。
【００４６】
上記に記載される培養物を、ヒトＩＬ２と培養の最後の２４時間の間、拡大した。培養物を、Ｔ細胞Ｖｂｅｔａ２サブセットまたはＶｂｅｔａ８サブセットのいずれかの拡大について、フローサイトメトリーによって解析した。ＣＡＦ２の芽状胞子の使用と同様に前記Ｖｂｅｔａ２サブセットの有意な拡大がＶｂｅｔａ２特異的スーパー抗原ＴＳＳＴ−１との活性化において起こったが、ＣＡＧ３とでは起こらなかった。Ｖｂｅｔａ８　Ｔ細胞の頻度は、全ての条件について非活性化コントロールに類似した。したがって、少なくともＩｎｔ１ｐを発現するＣ．ａｌｂｉｃａｎｓによる該Ｖｂｅｔａ２サブセットの優先的な拡大が存在する。
【００４７】
ＣＡＦ２　ＩＮＴ１／ＩＮＴ１または、ＣＡＧ３　ｉｎｔ１／ｉｎｔ１芽状胞子のいずれかと共培養したＰＢＭＣｓを、フローサイトメトリーによってＣＤ４およびＣＤ８Ｔ細胞の頻度を測定するために試験した。ＣＤ４：ＣＤ８細胞の比は、ＣＡＦ２　ＩＮＴ１／ＩＮＴ１によって拡大されたＴ細胞については＜１：１であり、一方、他の全ての活性化条件では、比＞１：１であった。提供者の一人のＶｂｅｔａ２　Ｔ細胞サブセットにおいて明らかである、該ＣＤ４：ＣＤ８比のＣＡＦ２調節は、活性化−誘導ＣＤ４Ｔ細胞損失におけるＩｎｔ１ｐの役割を明示する。
【００４８】
Ｔ細胞（２．５×１０５）を、０．３％パラホルムアルデヒドで前処理、もしくは処理されないＡＰＣ（２．５×１０５）存在下において、５００，０００ＣＡＦ２芽状胞子、または４μｇ／ｍｌＴＳＳＴ−１と共に培養した。この場合、抗原を処理するためにＡＰＣｓを発現するＭＨＣクラスＩＩ不能にもかかわらず、ＣＡＦ２　ＩＮＴ１／ＩＮＴ１芽状胞子によるＴ細胞活性化が、起こった。同じく、ＴＳＳＴ−１による活性化は、ＡＰＣのパラホルムアルデヒド固定によって阻害されなかった。
【００４９】
まとめると、中対数期（ｍｉｄ−ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ　ｐｈａｓｅ）における株ＣＡＦ２　ＩＮＴ１／ＩＮＴ１、およびＣＡＧ３　ｉｎｔ１／ｉｎｔ１からの同数のＣ．ａｌｂｉｃａｎｓ芽状胞子を、５人の健常な志願者から単離されたＰＢＭＣｓと共にインキュベーションした。ＣＤ３細胞上のＩＬ２受容体アップレギュレーションを、フローサイトメトリーによってモニターした。ＩＬ２受容体を発現するＣＤ３細胞のパーセンテージは、ＣＡＦ２芽状胞子（４２．０＋／−６．３）を使用した活性化の方が、ＣＡＧ３（３．８＋／−１．０）、ｐ＝０．００５のものより有意に大きかった。ＨＬＡ−ＤＲに対する抗体は、ＣＡＦ２によって活性化されるＴ細胞上のＩＬ２受容体発現を阻害したが、ＣＡＧ３によるＴ細胞活性化には、全く影響を有しなかった。予備データは、ＣＡＦ２によるＶｂｅｔａ２　Ｔ細胞活性化に対する優先性を示す。ＣＤ４：ＣＤ８サブセットの解析は、ＣＡＧ３芽状胞子によるＴ細胞活性化が、ヒトＩＬ２と共に拡大されたコントロールＴ細胞に類似する正常ＣＤ４：ＣＤ８比（２：１）を有することを明らかにした。しかし、Ｉｎｔ１ｐ−発現ＣＡＦ２芽状胞子とのインキュベーションの後、前記ＣＤ４；ＣＤ８比は、ＣＤ４Ｔ細胞数の低減によって、低下した（＜１：１）。したがって、Ｔリンパ球の特異的Ｖｂｅｔａサブセットの活性化、およびＣＤ４細胞の枯渇は、これによってＩｎｔ１ｐを有する（Ｉｎｔ１−ｂｅａｒｉｎｇ）Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓが、細胞−仲介免疫応答を調節する二つの機構である。
【００５０】
上記の実験の結果より、以下の結論を引き出すことができる：
タンパク質Ｉｎｔ１ｐを発現するＣａｎｄｉｄａ　ａｌｂｉｃａｎｓ芽状胞子は、ヒトＴリンパ球を活性化するが、一方、Ｉｎｔ１ｐ表面発現を欠く芽状胞子は、活性化させない。
【００５１】
抗−ＨＬＡ−ＤＲ抗体によるＩＬ２受容体のアップレギュレーションの阻害は、Ｉｎｔ１ｐ誘導Ｔ細胞活性化におけるＭＨＣクラスＩＩへの依存を示す。
【００５２】
Ｉｎｔ１ｐ発現芽状胞子によるＴ細胞活性化は、ＡＰＣパラホルムアルデヒド固定への抵抗性によって示されるように、抗原プロセッシングに独立である。
【００５３】
Ｉｎｔ１ｐを発現するＣａｎｄｉｄａ　ａｌｂｉｃａｎｓは、Ｖｂｅｔａ２Ｔ細胞サブセットを優先的に活性化する。
【００５４】
Ｉｎｔ１ｐによる、活性化に誘導されるＣＤ４Ｔ細胞の欠失は、Ｃａｎｄｉｄａ　ａｌｂｉｃａｎｓが宿主の免疫応答を調節し得る機構である。
【００５５】
実施例２：Ｉｎｔ１ｐタンパク質の追加研究、およびＣａｎｄｉｄａ　ａｌｂｉｃａｎｓからのプロペプチドの単離
Ｃａｎｄｉｄａ　ａｌｂｉｃａｎｓにおけるＩＮＴ１遺伝子、および病因におけるその重要性
数年前、我々は、接着、培地−依存性フィラメンテーション（ｆｉｌａｍｅｎｔａｔｉｏｎ）、および毒性を仲介するＭｒ１８８ｋＤａのタンパク質をコードする、Ｃａｎｄｉｄａ　ａｌｂｉｃａｎｓ遺伝子ＩＮＴ１を同定した。例えば、本明細書中に参考として援用される、Ｇａｌｅ　ｅｔ　ａｌ．，　ＰＮＡＳ　９３：３５７−６１　（１９９６）；　Ｇａｌｅ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｓｃｉｅｎｃｅ　２７９：１３５５−５８　（１９９８）参照。とりわけ、両方のＩＮＴ１対立遺伝子（遺伝子型　ＩＮＴ１／ＩＮＴ１）を発現する１０５の野生型Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓの尾静脈注射を与えられたＩＣＲマウスは、１１日目までに１００％死亡率を示したが、ホモ接合重複破壊（ｄｏｕｂｌｅ　ｄｉｓｒｕｐｔａｎｔ）遺伝子型　ＩＮＴ１／ｉｎｔ１）を与えられたマウスの９０％が生存した。ヘテロ接合ミュータント（遺伝子型　ＩＮＴ１／ｉｎｔ１）、またはリ−インテグラント（ｒｅ−ｉｎｔｅｇｒａｎｔ）（遺伝子型　ｉｎｔ１／ｉｎｔ１／ＩＮＴ１）を与えられた動物は、中間の死亡率（４０％生存）を有した。適切に等しく複製し、そして血清中の繊維状増殖を経た全ての株、また、血液、腎臓、または肝臓におけるＣＦＵには、全く違いがみられなかった（３６）。したがって、複製、フィラメンテーション、または臓器への播種における欠損は、Ｉｎｔ１−依存性死亡率を説明しなかった。
【００５６】
ＩＮＴ１−発現Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓはＴリンパ球を活性化するがｉｎｔ１ノックアウト株は活性化しない
そこで我々は、“なぜ、ＩＮＴ１の存在がマウスにおける死に関係するのだろうか？”と問うた。他の菌類と異なり、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓは、マイコトキシンを生産しないが、利用可能な証拠に基づき、我々は、コードされたタンパク質Ｉｎｔ１ｐ、またはそのいくつかの部分がスーパー抗原かもしれないという可能性を考えた。
【００５７】
五人の正常提供者からの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ’ｓ）を、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ遠心分離によって得、１０％ヒトＡＢ血清、Ｌ−グルタミン、ピルビン酸ナトリウム、非必須アミノ酸、および、細菌の管形成を妨げるために、０．２μｇ／ｍｌアンフォテリシンＢで補充された、ＲＰＭＩ１６４０中に懸濁した。図７参照。ＰＢＭＣ’ｓを、ＩＮＴ１／ＩＮＴ１　Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓの１０５芽状胞子、または同数のｉｎｔ１／ｉｎｔ１　Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ（ホモ接合重複破壊）と共に、１〜７日間（ｎ＝７　実験）、３７℃、５％二酸化炭素中においてインキュベートした。スーパー抗原ＴＳＳＴ−１（８００μｇ／ウェル）、またはマイトジェンＰＨＡをコントロールとして役立てた。Ｔｗｏ−ｃｏｌｏｒフローサイトメトリーを使用し、前記ＩＬ２−受容体（ＣＤ２５）を発現するＣＤ３陽性細胞のパーセンテージをプロットした。
【００５８】
結果
Ｔリンパ球の有意な活性化は、培養の最初の３日間は、全くみられなかったが、４〜７日目にかけて、ＩＮＴ１／ＩＮＴ１　Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓと共にインキュベートしたＰＢＭＣ’ｓは、リンパ球活性化のマーカーである、ＣＤ３＋細胞上のＩＬ−２受容体（ＣＤ２５）の発現における、有意な増加を示した。この同じ提供者のＰＢＭＣ’ｓは、前記ｉｎｔ１／ｉｎｔ１重複破壊（ｄｏｕｂｌｅ　ｄｉｓｒｕｐｔａｎｔ）と共にインキュベーションしたとき、該ＩＬ−２受容体の発現は増加しなかった。これらの結果は、Ｉｎｔ１ｐは、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓによるＴリンパ球の活性化に必要であることを示す。
【００５９】
活性化Ｔリンパ球は、主に前記ＣＤ４サブセットであり、そして、共培養の後、７−１０日の間に除去される。全ての提供者において、３日目に１．８；１から２．２：１までおよんだ前記ＣＤ４／ＣＤ８比は、７日目までには、逆転した。
【００６０】
Ｔリンパ球のＩＮＴ１−関連活性化は、ＭＨＣクラスＩＩ抗体によって遮断され得る
ＰＢＭＣ’ｓを、マイトジェンＰＨＡ、スーパー抗原ＴＳＳＴ−１、ＩＮＴ１／ＩＮＴ１　Ｃ．ａｌｂｉａｎｓ、またはｉｎｔ１／ｉｎｔ１　Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓの刺激の前に、ＨＬＡ−ＤＲに対するモノクローナル抗体と共にプレ−インキュベーションした。Ｔ細胞活性化（ＩＬ−２受容体ＣＤ２５のアップレギュレーション）をＴｗｏ−ｃｏｌｏｒフローサイトメトリーによって測定し、そしてＹ−軸上にプロットした。図８参照。
【００６１】
結果：ＭＨＣクラスＩＩＨＬＡ−ＤＲに対する抗体は、毒性ショック毒素ＴＳＳＴ−１、およびＩＮＴ／１ＩＮＴ１　Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓによって誘導されたＴリンパ球活性化を、有意に阻害した。抗−ＨＬＡ−ＤＲ抗体は、Ｔ細胞マイトジェンＰＨＡ（その効果について抗原提示細胞を必要としない）により、またはｉｎｔ１／ｉｎｔ１　Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓにより誘発されるＴリンパ球の活性化を遮断しなかった。これらの結果は、ＴＳＳＴ−１またはＩＮＴ１／ＩＮＴ１　Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓによって刺激されたＴリンパ球の活性化応答における、ＭＨＣクラスＩＩの関与を裏付けた。
【００６２】
Ｉｎｔ１ｐへの応答におけるＴリンパ球活性化は、抗原プロセッシング、または抗原提示細胞（ＡＰＣ’ｓ）による提示を必要としない
ＡＰＣ’ｓをグラスウールカラムによってＰＢＭＣ’ｓから分離し、そしてリンパ球と共培養に返す前に、０．３％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）で前処理した。ＴＳＳＴ−１およびＩＮＴ１／ＩＮＴ１　Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓを刺激物として使用した。ＰＦＡの非存在下、Ｔリンパ球の４４％は、刺激物としてのＩＮＴ１／ＩＮＴ１　Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓで活性化され；ＰＦＡ存在下では、４３％が活性化された。ＴＳＳＴ−１を刺激物として用い、Ｔリンパ球の６０％が、ＡＰＣ’ｓのＰＦＡ処理が無いときに活性化され；ＰＦＡ存在下では、５６％が活性化された。したがって、ＰＦＡ処理は、ＴＳＳＴ−１、またはＩＮＴ１／ＩＮＴ１　Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓへの応答におけるＴリンパ球活性化を阻害しなかった。ロイペプチンおよびペプスタチンを抗原プロセッシング、および提示を阻害するために使用したとき、それぞれ、ＴＳＳＴ−１、およびＩＮＴ１／ＩＮＴ１　Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓへの応答におけるリンパ球活性化は、阻害されなかった。これらの結果は、Ｉｎｔ１ｐによるリンパ球活性化は、ＡＰＣ’ｓによる提示および抗原プロセッシングに独立であることを示す。
【００６３】
可溶性スーパー抗原ＴＳＳＴ−１およびＩｎｔ１ｐによる同一Ｖβサブセットの拡大
ＴＳＳＴ−１（８００μｇ）、ＩＮＴ１／ＩＮＴ１　Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ、ｉｎｔ１／ｉｎｔ１　Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ、およびＰＨＡでのＰＢＭＣ’ｓ刺激の後、Ｖβサブセットの拡大を測定した。活性化されていないＰＭＢＣ’ｓをコントロールとして役立てた（図９）。
【００６４】
結果：　野生型Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ（ＩＮＴ１／ＩＮＴ１）またはＴＳＳＴ−１とのＰＢＭＣ’ｓのインキュベーションは、Ｔ−リンパ球のＶβ２（黒バー）を選択的に拡大したが、Ｖβ８サブセット（白バー）はそうならなかった。リンパ球をｉｎｔ１／ｉｎｔ１　Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ（重複破壊）またはフィトヘマグルチンと共にインキュベートしたとき、Ｖβ２サブセットの有意な拡大は全くなかった。これらの予備実験は、ＴＳＳＴ−１およびＩｎｔ１ｐへの応答におけるＶβサブセット特異性を示す：ＩＮＴ１＋株およびｉｎｔ１−株の比較は、Ｖβ２サブセットの拡大がＩＮＴ１−依存性であることを裏付ける。
【００６５】
前−炎症性サイトカインの放出
末梢血単核細胞を５×１０５ＩＮＴ１／ＩＮＴ１　Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ芽状胞子で刺激し、２、４および６日目の上清中のＴＮＦα、ＩＬ−６およびＩＬ−４の産生を測定した。下記の表にみられるように、ＩＮＴ１／ＩＮＴ１　Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓは、十分に特徴付けられるスーパー抗原、スタフィロコッカス・エンテロトキシン（ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌ　ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｎ　Ｂ）（ＳＥＢ）による誘導に匹敵する、ＴＮＦαおよびＩＬ−６の上昇に伴う、ｉｎ　ｖｉｔｒｏでのＴｈ１応答を主に誘導した。Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓまたはＳＥＢに対する応答において、ＩＬ−４の生産は、実質的になかった。興味深いことに、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓに対する前記ＴＮＦαの応答は、４０倍の変動を見せ（高応答体＝７０１４ｐｇ／ｍｌ　２日目；低応答体＝１６５ｐｇ／ｍｌ　２日目）、一方で、ＳＥＢに対する応答は、これら２人の提供者において、有意には異ならなかった。さらによりよく一致したＳＥＢに対する応答の一つの理由は、可溶タンパク質としての、その使用があり得るが、もう一つの可能性のある解釈は、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓへの応答が、異なるＭＨＣクラスＩＩアレル、異なるＶβサブセット、または異なるＴ細胞活性化およびアポトーシスの動態に関与しているということである。仮説２は、この可能性に取り組む。
【００６６】
【表２】
2004509923.tif 000003
【００６７】
ＩＮＴ１を発現するＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅとの同一の効果
他のカンジダの抗原に加え、これらの効果を評価するために、我々は、ガラクトース誘導性プロモーターの制御下にあるＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　ＹＰＨ５００において、ＩＮＴ１を発現した。ＩＮＴ１を、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　ＹＰＨ５００の形質転換のために、プラスミドｐＢＭ２７２中にライゲーションした；この結果として生じたプラスミドをｐＣＧ０１と命名した。Ｉｎｔ１ｐの発現は、２％ガラクトースで誘導される。ｐＢＭ２７２と共に形質転換したＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅを、コントロールとして役立てた。フローサイトメトリー上でＩＬ−２受容体のアップレギュレーションによって測定された、提供者のＰＭＢＣ’ｓの約２５％は、ＩＮＴ１を発現するＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅとの共培養後、活性化された；ベクターのみと形質転換したＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅと共培養の後は、全くアップレギュレーションは起こらなかった。これらの効果は、ＨＬＡ−ＤＲに対する抗体によって遮断され得た。前記Ｖβ２サブセットは、ＩＮＴ１を発現するＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅによって、優先的に拡大される；ベクターのみと形質転換したＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅに対する応答において、Ｖβ２またはＶβ８サブセットの拡大は、全く示されなかった。
【００６８】
【表３】
2004509923.tif 000004
【００６９】
これらの実験は、タンパク質Ｉｎｔ１ｐの存在が、野生型Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓおよび形質転換したＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの両方において、スーパー抗原−様効果に関連することを示した。これらは、可溶性スーパー抗原（ＴＳＳＴ−１）と、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓのＩＮＴ１＋またはｉｎｔ１−株のいずれかと比較したため、不完全な実験である；それにもかかわらず、前記結果は、スーパー抗原−様効果が、ＩＮＴ１＋　Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓと関連したという、いくつかの兆候を提供する。しかし、ほとんどのスーパー抗原が、２２−２９ｋＤａの分泌タンパク質であり、そしてその非グリコシル化形態において、１８８ｋＤａの予測質量を有することから、我々は、Ｉｎｔ１ｐの制限されたプロテオリシスが、スーパー抗原として役立ち得る可溶性ポリペプチドを産生するかもしれないと仮説をたてた。
【００７０】
プロテオリシスの可能性がある機構として、我々は、Ｉｎｔ１ｐが、ＭＭＴＶのように、プロプロテインコンバターゼによって切断されるかもしれないという可能性を考えた。セリンエンドペプチターゼ、プロプロテインコンバターゼのサブセットがプロプロテイン、またはチモーゲンを一つまたは最大二つの特定の切断部位における制限プロテオリシスによって、それらの活性断片に切断する。真核生物において、これらの酵素は、“サブチリシン−様プロプロテインコンバターゼ”またはＳＰＣ’ｓと呼ばれる。ほとんどのＳＰＣ’ｓは、自家触媒であり、そしてそれらの特異的な基質を切断し得る前に、それらのプロペプチドの切断によって活性化されなければならない。プロプロテインコンバターゼの一つのモデルを図１０に提供し、そして標準的な切断部位を矢印によって示す。
【００７１】
ほとんどのプロプロテインコンバターゼは、ちょうど一対の二塩基アミノ酸（最もしばしばＫＲまたはＫＫ）のまさにＣ−末端の標準的切断部位によって区別される、プロペプチドドメインを含む、いくつかの高度に保存された特徴を現す。触媒ドメインは、Ｄ−Ｈ−Ｎ−Ｓ［Ａｓｐ−Ｈｉｓ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ］の活性部位配列をもつ約３３０アミノ酸にわたり、その中で、開始Ｄ（ｉｎｉｔｉａｔｉｎｇ　Ｄ）には、ＤＸが続く。このＤＤＸモチーフは、他の系（例、インテグリン）におけるＲＧＤトリペプチドの結合のための認識部位となることが示された；しかし、この相互作用は、未だにプロプロテインコンバターゼと共に調査されていない。触媒ドメインは、単独またはタンデムに生じる。最後に、プロセッシングドメイン（またはＰ−ドメイン）は、同様にＤ−Ｈ−Ｎ−Ｓモチーフを含むが、７個の公知のＳＰＣ’ｓのうち６個において、ＲＧＤトリペプチドが、ＮとＳの間に挿入されている。ＲＧＤモチーフは、プロペプチドの切断に必須である；該ＲＧＤトリペプチドの部位特異的突然変異誘発（ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ　ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）が、チモーゲンプロセッシングを阻害し、プロセッシングされていないタンパク質の細胞転送を誤った方向に導く。
【００７２】
図１１において、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓにおけるＩｎｔ１ｐ配列と前記プロプロテインコンバターゼに必須なモチーフの比較を示し、この解析は、残基２６３における二塩基性切断部位、２つの推定触媒ドメイン、および、可能性のあるＰドメインにおけるＲＧＤ配列の正確な位置を含む興味をひかれるいくつかの部位を開示する。我々の実験室で開発した特異的ウサギ抗−ペプチドポリクローナル抗体によって認識される領域が、括弧内に示される。
【００７３】
上清の活性化におけるＩｎｔ１ｐからのアミノ末端ペプチドの同定
後の実験は、指数的に複製するＩＮＴ１／ＩＮＴ１　Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓまたはＩｎｔ１−発現　Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅからの上清は、Ｔリンパ球活性化における酵母細胞と全く同じくらい活性であり、そして全ての活性は５０ｋＤａ以下の重さのタンパク質のプールに包含されていた。実際、上清タンパク質のたった５００ｐｍｏｌｅが、Ｔリンパ球の活性化のために役立つ。
【００７４】
ヘパリン存在下におけるＩｎｔ１ｐ中の隠されたアミノ末端ドメインの露出
胃腸管におけるＣ．ａｌｂｉｃａｎｓのコロニー形成は、スーパー抗原様効果を誘導しないことから、我々は、真菌血症に関連するいくつかの環境因子が、Ｉｎｔ１ｐからのこれら＜５０ｋＤａアミノ末端ポリペプチドの放出を促進するのではないかと、仮定した。ヘパリンは、自家触媒を増強し、およびチモーゲンからのプロペプチドの切断を促進することが知られている。これらの効果は、ヘパリンがスーパー抗原として役立つかもしれないＩｎｔ１−由来断片の放出を促進する可能性を示唆している。この可能性は、ヘパリンが血管内カテーテルをしている患者において、常に存在する挿入物（ｉｎｆｕｓａｔｅ）であることから、より重要である。
【００７５】
これらの実験のため、ＩＮＴ１／ＩＮＴ１　Ｃ．ａｌｂｉａｎｓ芽状胞子を、ヘパリンの非存在下または存在下においてインキュベーションした；第二の二価陽イオン結合部位に対するポリクローナル抗体（抗−ＣＢＳ２）、またはアミノ末端の最初の６００アミノ酸に対するポリクローナル抗体（抗−ＩＮＴ６００）のフローサイトメトリーを、これらのドメインの存在を検出するために使用した（これらの抗体によって認識されるドメインは図１１を参照）。
【００７６】
結果：ヘパリン非存在下において（図１２−左パネル）、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ芽状胞子は、抗−ＣＢＳ２（灰色領域）と蛍光発光強度を表したが、抗−ＩＮＴ６００とは蛍光発光をしなかった。しかし、ヘパリン添加では、かなりの抗−ＩＮＴ６００を用いた蛍光が、そのとき検出できた（右パネル）。これらの結果は、ヘパリンが隠れたアミノ末端ドメインを露出し、そして切断の影響を受けやすくしたということを示唆した。もし、我々が正しいなら、Ｉｎｔ１ｐの切断されたアミノ末端断片が、ヘパリン存在下において増殖する生物の上清に見つかり、ヘパリン非存在下においては見つからないはずである。
【００７７】
培養上清中におけるＩｎｔ１ｐアミノ末端断片の非存在はヘパリンによって促進される
図１３は、ヘパリン非存在下または存在下において増殖し、Ｉｎｔ１ｐアミノ末端（抗−ＩＮＴ６００）、第二の二価陽イオン結合部位（抗−ＣＢＳ２）、またはＲＧＤドメイン（抗−ＲＧＤ）に対するウサギポリクローナル抗体でプローブしたＩＮＴ１−発現Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅからの上清のウェスタンブロットである。
【００７８】
結果：　抗−ＣＢＳ２（パネル２）または抗−ＲＧＤ（パネル３）でプローブされた上清は、ヘパリン非存在下または存在下において同一のバンドパターンを示した。しかし、抗−ＩＮＴ６００で上清をプローブすると、ヘパリン存在下において３時間増殖させた生物の上清中にのみ、２７ｋＤａおよび４４ｋＤａの二つの新たな断片を示した。ヘパリン非存在下において、これらの断片は、１８時間またはそれ以上の後、かなり減少したレベルにおいて現れた。したがって、ヘパリンは、この上清における２つのＩｎｔ１ｐアミノ末端ポリペプチドの出現を促進した。この２７ｋＤａおよび４４ｋＤａ断片を含む上清は、Ｔリンパ球を活性化したが、一方、他の上清はしなかった。
【００７９】
Ｉｎｔ１ｐスーパー抗原様断片の局在
前述の実験から、我々は、Ｉｎｔ１ｐのアミノ−末端断片（Ｍｒ２７または４４ｋＤａ）がヘパリン存在下において露出され、切断され、ＩＮＴ１−発現Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの上清中に検出され得たという、付随的な証拠を得た。もし、ＭＭＴＶからのスーパー抗原ｖＳＡＧ７によって起こるように、ヘパリンが、プロプロテインコンバターゼによるＩｎｔ１ｐの切断を促進するのなら、２６３アミノ酸を含むアミノ−末端断片はＩｎｔ１ｐから放出されるべきである（図１１）。Ｉｎｔ１ｐの最初の２６３アミノ酸の質量の予備的な概算は、３５ｋＤａで、グルコシル化されて４２ｋＤａに増加する。我々は、したがって、ここで後にＰｅｐ２６３と呼ぶ、Ｉｎｔ１ｐの最初の２６３アミノ酸がスーパー抗原様成分を構成する可能性を試験した。
【００８０】
Ｐｅｐ２６３が、ＩＮＴ１／ＩＮＴ１　Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓおよびＩＮＴ１−発現Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅに観察されたようなスーパー抗原様効果の原因であるという直接の証拠を得るため、我々は、Ｐｅｐ２６３を組換え、Ｈｉｓ−タグ　タンパク質として、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ中に発現させ、そして、そのＴリンパ球活性化、およびＶβサブセットの拡大についての効果を評価した。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅが、リポポリサッカリドの活性化効果を防ぐために、発現にはＥ．ｃｏｌｉが好ましい。Ｉｎｔ１ｐのアミノ酸１から２６３をコードするＣ．ａｌｂｉｃａｎｓのゲノムＤＮＡを、ＰＣＲによって増幅し、３’末端の６Ｘ−Ｈｉｓタグ（ｔａｇｅ）にインフレーム（ｉｎ−ｆｒａｍｅ）でライゲーションした。このコンストラクトを、ＢｍａＨ１／Ｓａｌ１断片としてｐＢＭ２７２中に挿入し、そして、プロテアーゼ欠損株であるＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　ＢＪ３５０１中のガラクトース−誘導性プロモーターから発現させた。このＨｉｓ−タグ融合タンパク質は、溶解物中に現れた（図１４、レーン１）。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ溶解物は、ニッケルカラムでクロマトグラフされ、そして、イミダゾールグラディエント（０−５００ｍＭ　イミダゾール）によってニッケルカラムから溶出されたＨｉｓ−タグ　タンパク質を検出するために、ドットブロット（ｄｏｔｂｌｏｔ）における抗−Ｈｉｓ　Ｍａｂを使用した。Ｈｉｓ−タグ化Ｐｅｐ２６３は、３００ｍＭイミダゾール濃度において、３００−１および３００−２画分中に溶出した（図１４，レーン２および３）。追加の濾過工程は、ウェスタン上で抗−Ｈｉｓ抗体に反応する（図１４、レーン５）、銀染色（図１４、レーン４）上の４４ｋＤａの単一バンドを生じた。これらの技術の使用は、マイクログラム量の推定スーパー抗原を生み出した。
【００８１】
組換えＰｅｐ２６３によるＴリンパ球の活性化
１００ピコグラムのＰｅｐ２６３を、その後、３つのそれぞれの反応において５×１０６ＰＢＭＣ’ｓと共にインキュベートした：（ａ）可溶性ペプチドとしての精製Ｐｅｐ２６３；（ｂ）組織−培養ウェルの底に結合した精製Ｐｅｐ２６３；（ｃ）プロテインＡセファロースビーズに共有結合連結した抗−Ｈｉｓ抗体によって固定された精製Ｐｅｐ２６３。３００ｍＭイミダゾールで溶出された非Ｈｉｓ−タグ化タンパク質の画分はコントロールとして使用した。
【００８２】
結果：　未活性化Ｔリンパ球（３つの各グループの一番左のバー）または、Ｈｉｓタグを含まない溶出ペプチドと共にインキュベートしたＴ細胞（３つの各グループの真ん中のバー）は、ＩＬ−２受容体のアップレギュレーションをしなかった。対比して、たった１００ピコグラムの可溶性Ｐｅｐ２６３が、Ｔリンパ球を活性化した（アスタリスクで示す）；ＩＬ−２受容体のアップレギュレーションは、コントロールの画分に比べ、二倍高かった。Ｐｅｐ２６３による相当な活性化は、３日目に起こり、完全な生物体で観察されていたより、１日早い（図７参照）。マイクロタイタープレートに結合された、またはプロテインＡビーズに連結されることによって固定されたＰｅｐ２６３は、Ｔリンパ球を活性化できなかった。これらの結果は、Ｐｅｐ２６３は、我々が完全なＣ．ａｌｂｉｃａｎｓ細胞で観察したものを凌ぐほど、Ｔリンパ球を活性化し得ることを示す。Ｐｅｐ２６３がＶβサブセットを拡大することを確認するための実験は、この提案に含まれる。
【００８３】
カンジダ血症におけるＩｎｔ１ｐの関与モデル
Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓタンパク質Ｉｎｔ１ｐが、ヒトＴリンパ球にスーパー抗原様効果を発揮するという、予備的な証拠を発表した。ＩＬ−２受容体（ＣＤ２５）のアップレギュレーションによって測定されるような、Ｔリンパ球の活性化は、抗原プロセッシングおよび提示に依存せず、ＭＨＣクラスＩＩに対する抗体によって遮断することができ、そして、Ｖβ２サブセットの拡大を生じる。Ｔリンパ球の活性化は、生理学的用量のヘパリンによって促進される反応において、Ｉｎｔ１ｐの該アミノ末端から切断される２６３アミノ酸ペプチドである、Ｐｅｐ２６３によって誘発され得る。ピコグラムのＰｅｐ２６３投入は、Ｔリンパ球の活性化能力において、ＩＮＴ１／ＩＮＴ１　Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓまたはＩＮＴ１−発現Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅと同等である。ほとんどの微生物スーパー抗原と同様に、Ｐｅｐ２６３は可溶性のときに活性であり、マイクロタイタープレート、または抗体−コートされたビーズに結合しているときは活性ではない。
【００８４】
図１６は、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ真菌血症におけるＩｎｔ１ｐの明白な役割を図式化する。ヘパリン非存在下において（パネルＡ）、Ｉｎｔ１ｐの最初の２６３アミノ酸（Ｐｅｐ２６３）は隠されており、そして抗−ＩＮＴ６００抗体によって検出され得ない（図１２）。ヘパリン存在下においてのみ（パネルＢ）、Ｉｎｔ１ｐのアミノ末端が露出し、その部分においてＰｅｐ２６３が切断され、そして、体液相（パネルＣ）中に放出され、そこで臨床的な結果に影響する前炎症性サイトカインの放出が最高点に達する、スーパー抗原様効果を発揮する。Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓによって遊離される他のスーパー抗原、またはＰｅｐ２６３のより小さな断片が、スーパー抗原様効果を有する可能性がある一方、Ｐｅｐ２６３の活性およびこれらの相互作用の適用は、ＮＩＣＵ新生児における、カンジダ血症の問題に適用の可能性がある。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓからの前記Ｉｎｔ１ｐタンパク質のアミノ酸配列を表す。
【図２】図２Ａおよび２Ｂは、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓからのＩｎｔ１ｐタンパク質をコードする核酸配列を示す。
【図３】図３は、シグナルペプチド、該プロペプチド、不活性サブチリシン、およびＰ−ドメインの存在を示す、一般的なプロプロテインコンバターゼの活性化および活性化の方法の概略的な表示である。
【図４】図４は、サブチリシン領域が同様に活性化されると同時に切断されてスーパー抗原となるＩｎｔ１ｐプロペプチドのクリッピング（ｃｌｉｐｐｉｎｇ）を図解する、一般的なプロプロテインコンバターゼと比較したＩｎｔ１ｐタンパク質の概略的な表示である。
【図５】図５は、種々のタンパク質からのＰ−ドメインサブチリシンモチーフを示す。
【図６】図６は、結核菌ヘパリン−結合ヘマグルチン付着因子（ＨＢＨＡ）の高−親和性ヘパリン−結合部位と、Ｃａｎｄｉｄａ　ａｌｂｉｃａｎｓのＩｎｔ１ｐタンパク質のヘパリン−結合部位との比較を示す。
【図７】図７は、ＩＮＴ１／ＩＮＴ１芽状胞子（四角）または、ｉｎｔ１／ｉｎｔ１芽状胞子（菱形）と共にインキュベーションした後のＴリンパ球の活性化を表す。五人の正常成人提供者からのデータを示す。＊Ｐ＜０．０５。
【図８】図８は、ＰＨＡ、ＴＳＳＴ−１、ＩＮＴ１／ＩＮＴ１　Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓまたはｉｎｔ１／ｉｎｔ１　Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓへの応答における、リンパ球活性化についての、ＭＨＣクラスＩＩ抗原決定基ＨＬＡ−ＤＲ（黒カラム）に対する抗体の効果を表す。無関係なマウスＩｇＧ（ハッチングされたバー）をアイソタイプコントロールとした。＊Ｐ＜０．０４
【図９】図９は、Ｖβサブセット刺激に対する、ＴＳＳＴ−１、ＩＮＴ１／ＩＮＴ１　Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ、ｉｎｔ１／ｉｎｔ１　Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓおよびフィトヘマグルチニンの効果を示す。非活性化Ｔリンパ球をコントロールとした。＊Ｐ＜０．０５
【図１０】図１０は、一般的なプロプロテインコンバターゼ領域を示す、概略的な図である。
【図１１】図１１は、ある抗−ペプチドポリクローナル抗体によって認識される領域の同定を含む本発明に従う、Ｉｎｔ１ｐペプチド領域の概略的な表示である。
【図１２】図１２は、ヘパリン不存在（左パネル）または２単位のヘパリン存在下（右パネル）における、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ芽状胞子が対数期まで増殖した時の、Ｉｎｔ１ｐ表面−露出（ｓｕｒｆａｃｅ−ｅｘｐｏｓｅｄ）ドメインのフローサイトメトリーを図解する。Ｘ軸は蛍光ｌｏｇ−スケール（ｌｏｇ−ｓｃａｌｅ）を表す；Ｙ軸はパーセント酵母蛍光発光（ｐｅｒｃｅｎｔ　ｙｅａｓｔｓ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｉｎｇ）を表す。ハッチングされた領域−抗ＩＮＴ６００との蛍光。グレー領域−抗ＣＢＳ２との蛍光。ウサギＩｇＧとインキュベートしたＣ．ａｌｂｉｃａｎｓ細胞の蛍光をコントロールとした−点線。
【図１３】図１３は、ヘパリンの不存在または存在下において増殖し、Ｉｎｔ１ｐアミノ末端（抗−ＩＮＴ６００）、第二の二価陽イオン結合部位（抗−ＣＢＳ２）、またはＲＧＤドメイン（抗−ＲＧＤ）に対するウサギポリクローナル抗体でプローブしたＩＮＴ１−発現Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅからの上清のウェスタンブロットである。
【図１４】図１４は、Ｐｅｐ２６３の精製を示すイムノブロットである。銀染色レーン　１−４。ウェスタンブロットレーン　５および６。レーン１−Ｐｅｐ２６３の発現後のＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ溶解物；レーン２−ニッケルカラムからの画分３００−１；レーン３−画分３００−２；レーン４−等質性へのＰｅｐ２６３の精製；レーン５は、ウェスタンブロット上で抗−Ｈｉｓ抗体と反応させた、銀染色（ｓｉｌｖｅｒ　ｓｔｒａｉｎ）（レーン４）上の４４ｋＤａの単一バンドを示す。
【図１５】図１５は、可溶性抗原として（３つのバーの最も左）、プレートに結合する抗原として（中央のグループ）、またはプロテインＡビーズに連結した抗−Ｈｉｓ抗体に結合する抗原として（右のグループ）存在するＰｅｐ２６３への応答における、Ｔリンパ球のＩＬ−２受容体（Ｙ軸）アップレギュレーションのパーセントグラフ表示である。
【図１６】図１６は、カンジダ血症におけるＩｎｔ１ｐの関与についてのモデルの概略的な表示である。
【図１７】図１７は、本明細書中に参考として援用される、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ　１８３：１１０５−１１１０（１９９６）中に開示された、Ｉｎｔ１ｐタンパク質、およびマイコプラズマ関節炎におけるＭＨＣ−ＩＩ結合部位を示す。
【図１８】図１８は、プロペプチドが切断された後に産生されるスーパー抗原を通した抗原提示細胞への、Ｔ−リンパ球の結合を示す。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【国際公開パンフレット】
2004509923.tif 000024
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【国際調査報告】
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