(57)【要約】遺伝子組換え生物を製造する方法であって、（ａ）前記生物中に機能性ＤＮＡ配列を組み入れること及び（ｂ）前記生物中に非機能性ＤＮＡ配列を組み入れることによる方法であって、前記非機能性ＤＮＡ配列は、事前に定義されたコード体系の情報メッセージへの適用の結果に対応しており、前記情報メッセージは、前記機能性ＤＮＡ配列に関連しており、前記の事前に定義されたコード体系は、複数の可能な情報メッセージから複数のＤＮＡ配列中へのマッピングを提供する方法。前記機能性及び前記非機能性ＤＮＡ配列は、実用上適当な期間、生物の生殖中に連結を保っている。【特許請求の範囲】
【請求項１】
遺伝子組換え生物を製造する方法であって、
（ａ）前記生物中に機能性ＤＮＡ配列を組み入れること、及び
（ｂ）前記生物中に非機能性ＤＮＡ配列を組み入れること、
によって行い、
（ｉ）前記非機能性ＤＮＡ配列は、事前に定義されたコード体系の情報メッセージへの適用の結果に対応しており、
（ｉｉ）前記情報メッセージは、前記機能性ＤＮＡ配列に関連しており、
（ｉｉｉ）前記の事前に定義されたコード体系は、複数の可能な情報メッセージから複数のＤＮＡ配列中へのマッピングを提供し、
（ｉｖ）ＤＮＡ配列から情報メッセージへのマッピングは独自であるが、情報メッセージからＤＮＡ配列へのマッピングは、ＤＮＡ配列の多用及び調整をもたらすように、独自ではなく、
（ｖ）前記コード体系は、重複性であり、及び／又は誤りの検出及び訂正を可能にして、実用上適当な期間、コードされた情報の安定性を提供し、
（ｖｉ）前記機能性ＤＮＡ配列及び前記非機能性ＤＮＡ配列は、実用上適当な期間、生物の生殖中に連結を保っている、
上記方法。
【請求項２】
非機能性ＤＮＡ配列より前に、機能性ＤＮＡ配列が前記生物中に組み入れられる請求項１記載の方法。
【請求項３】
機能性ＤＮＡ配列より前に、非機能性ＤＮＡ配列が前記生物中に組み入れられる請求項１記載の方法。
【請求項４】
非機能性ＤＮＡ配列及び機能性ＤＮＡ配列が、同時に前記生物中に組み入れられる請求項１記載の方法。
【請求項５】
非機能性ＤＮＡ配列及び機能性ＤＮＡ配列が、同一染色体上に位置する請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
非機能性ＤＮＡ配列及び機能性ＤＮＡ配列が、組換えによる分離を防ぐのに十分近く染色体上に位置する請求項１記載の方法。
【請求項７】
非機能性ＤＮＡ配列が、イントロン又はインテインである請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
イントロン又はインテインが、関連する機能性ＤＮＡ配列内に位置する請求項７記載の方法。
【請求項９】
イントロン又はインテインが、関連する機能性ＤＮＡ配列の高度に保存された部分内に位置する請求項８記載の方法。
【請求項１０】
非機能性ＤＮＡ配列と機能性ＤＮＡ配列間のスペーサーＤＮＡ配列と連結していてもよい非機能性ＤＮＡ配列のヌクレオチド配列が、以下のテスト
（ａ）選択可能なマーカー配列と対抗選択可能なマーカー配列の間にテスト配列を各々含むＤＮＡ分子を作製すること、
（ｂ）選択可能なマーカー配列に対応する第１の試剤及び対抗選択可能なマーカー配列に対応する第２の試剤の存在下に、両試剤が有効である条件下、前記ＤＮＡ分子で形質転換された細胞を培養すること、
（ｃ）工程（ｂ）で生き残った細胞を単離すること、
（ｄ）工程（ｃ）で単離した細胞から、前記細胞の形質転換された染色体の他の領域と比較して、変異又は組換え頻度の有意な増加を示さないテスト配列を選択すること、
によって識別可能な１組のテスト配列のメンバーとして定義される請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
選択可能なマーカー配列が抗生物質耐性遺伝子の配列であり、第１の試剤が抗生物質である請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
対抗選択可能なマーカー配列がショ糖感受性遺伝子の配列であり、第２の試剤がショ糖である請求項１０又は１１に記載の方法。
【請求項１３】
細胞が細菌細胞である請求項１０〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
細胞が大腸菌細胞である請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
細胞が植物細胞、特にコナミドリムシ細胞である請求項１０〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
非機能性ＤＮＡ配列のヌクレオチド配列は、非機能性ＤＮＡ配列と機能性ＤＮＡ配列の間のスペーサーＤＮＡ配列と連結していてもよく、
（ａ）組換え易発性プロフィールを、特に宿主種のゲノムと比較して基本的に一切示さないか、又は
（ｂ）宿主ゲノムと比較して有害な相同性を基本的に一切示さない、
ように選択される、
請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
非機能性ＤＮＡ配列の遺伝的安定性は、コードされた情報メッセージが、機能性ＤＮＡ配列の機能と少なくとも同じ回数の生殖を通して存続するように選択される請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
非機能性ＤＮＡ配列は、非機能性ＤＮＡ配列と機能性ＤＮＡ配列の間のスペーサーＤＮＡ配列と連結していてもよく、二次構造を形成することができないように、及び／又は組換えもしくは変異の「ホットスポット」を含まないように選択される請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記マッピングがＤＮＡ部分から英数字まで行われる請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記マッピングがＤＮＡ３連鎖から英数字まで行われる請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
非機能性ＤＮＡ配列が、前記非機能性ＤＮＡ配列の識別及び／又は分析を可能にする、少なくとも１個の事前に定義された認識配列を備える請求項１〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
非機能性ＤＮＡ配列が、少なくとも片側で認識配列と隣接している請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
前記の１個又は複数の事前に定義された認識配列は、生物中の複数の非機能性ＤＮＡ配列の共同認識及び個別認識に対応するように設計されている請求項２１又は２２に記載の方法。
【請求項２４】
非機能性ＤＮＡが、（ｉ）同一情報メッセージをコードし、及び（ｉｉ）増大された情報安定性のためのコード体系の重複性によって可能となる、組換えを起こさないように十分に異なったヌクレオチド配列を有する２個以上のセグメント又はイントロンもしくはインテインとして存在する請求項１〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記各セグメントは、同一又は異なるＤＮＡ鎖上にあり、異なる配向性で読み取ることができる請求項２４記載の方法。
【請求項２６】
機能性ＤＮＡ配列は、両側で非機能性ＤＮＡ配列の各部分と隣接している請求項１〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記の事前に定義された認識配列と相補的なプライマーを用いる機能性ＤＮＡ配列又はその部分のＰＣＲ増幅が可能なように、前記の事前に定義された認識配列が位置している請求項２１〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
非機能性ＤＮＡ配列は、迅速な検出のために、発現可能なポリペプチドをコードする付加的ＤＮＡ配列を含む請求項１〜２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
情報メッセージが製品関連情報を含む請求項１〜２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
製品関連情報が商標を含む請求項２９記載の方法。
【請求項３１】
製品関連情報がデータベースへの参照を含む請求項２９記載の方法。
【請求項３２】
製品関連情報が日付、場所及び／又は製造者もしくは所有者の氏名を含む請求項２９記載の方法。
【請求項３３】
製品関連情報が機能性ＤＮＡ配列の存在及び／又は位置を示す請求項２９記載の方法。
【請求項３４】
生物が植物又は動物である請求項１〜３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
前記生物中への非機能性ＤＮＡ配列の前記組み入れが、前記遺伝子組換え生物の生物学的適応度に悪影響を及ぼさない請求項１〜３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
非機能性ＤＮＡ配列が、以下のテスト
（ａ）スペーサーＤＮＡ配列を介して機能性ＤＮＡ配列に接続されていてもよい前記非機能性ＤＮＡ配列を（ｉ）含まない、及び（ｉｉ）含む、前記機能性ＤＮＡ配列を含むＤＮＡ分子を作製すること、
（ｂ）前記ＤＮＡ分子を細胞中に導入することにより、スペーサーＤＮＡ配列を介して機能性ＤＮＡ配列に接続されていてもよい前記非機能性ＤＮＡ配列を（ｉ）含まない、及び（ｉｉ）含む、前記機能性ＤＮＡ配列を含むトランスジェニック細胞及び／又はトランスジェニック生物を作製すること、
（ｃ）トランスジェニック細胞及び／又はトランスジェニック生物の性能を比較することであって、前記性能は、収量、一般的生産性、生物的及び非生物的ストレスに対する抵抗性であるパラメータのうち少なくとも１つによって規定される、及び
（ｄ）前記トランスジェニック細胞又は生物の生物学的適応度に悪影響を及ぼさないスペーサーＤＮＡ配列を有していてもよい非機能性ＤＮＡ配列を識別すること、
によって識別可能な１組のテスト配列のメンバーとして定義される、
請求項３５記載の方法。
【請求項３７】
前記非機能性ＤＮＡ配列の前記組み入れが、前記遺伝子組換え生物の生態学的安全性に悪影響を及ぼさない請求項１〜３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
前記非機能性ＤＮＡ配列が、以下のテスト
（ａ）スペーサーＤＮＡ配列を介して機能性ＤＮＡ配列に接続されていてもよい前記非機能性ＤＮＡ配列を（ｉ）含まない、及び（ｉｉ）含む、前記機能性ＤＮＡ配列を含むＤＮＡ分子を作製すること、
（ｂ）前記ＤＮＡ分子を細胞中に導入することにより、スペーサーＤＮＡ配列を介して機能性ＤＮＡ配列に接続されていてもよい前記非機能性ＤＮＡ配列を（ｉ）含まない、及び（ｉｉ）含む、前記機能性ＤＮＡ配列を含むトランスジェニック細胞及び／又はトランスジェニック生物を作製すること、
（ｃ）トランスジェニック細胞及び／又は生物の性能を比較することであって、前記性能は、同種又は関連雑草種の地方在来種との異系交配優先傾向であるパラメータのうち少なくとも１つによって規定される、及び
（ｄ）前記遺伝子組換え生物の生態学的安全性に悪影響を及ぼさないスペーサーＤＮＡ配列を有していてもよい非機能性ＤＮＡ配列を識別すること、
によって識別可能な１組のテスト配列のメンバーとして定義される、
請求項３７記載の方法。
【請求項３９】
前記非機能性ＤＮＡ配列が、前記遺伝子組換え生物中の前記機能性ＤＮＡ配列の性能に悪影響を及ぼさない請求項１〜３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
前記非機能性ＤＮＡ配列が、以下のテスト
（ａ）スペーサーＤＮＡ配列を介して機能性ＤＮＡ配列に接続されていてもよい前記非機能性ＤＮＡ配列を（ｉ）含まない、及び（ｉｉ）含む、前記機能性ＤＮＡ配列を含むＤＮＡ分子を作製すること、
（ｂ）前記ＤＮＡ分子を細胞中に導入することにより、スペーサーＤＮＡ配列を介して機能性ＤＮＡ配列に接続されていてもよい前記非機能性ＤＮＡ配列を（ｉ）含まない、及び（ｉｉ）含む、前記機能性ＤＮＡ配列を含むトランスジェニック細胞及びトランスジェニック生物を作製すること、
（ｃ）２組のトランスジェニック細胞及び／又はトランスジェニック生物において、前記機能性ＤＮＡ配列の性能を比較することであって、前記性能は、転写及び翻訳能力、翻訳レベル、発現抑制感受性、配列変異性であるパラメータのうち少なくとも１つによって規定される、及び
（ｄ）前記機能性ＤＮＡ配列の性能に影響を及ぼさないスペーサーＤＮＡ配列を有していてもよい非機能性ＤＮＡ配列を識別すること、
によって識別可能な１組のテスト配列のメンバーとして定義される、
請求項３９記載の方法。
【請求項４１】
前記非機能性ＤＮＡ配列の前記生物中への前記組み入れが、非機能性及び／又は機能性ＤＮＡ配列、及び／又は非機能性ＤＮＡ配列と機能性ＤＮＡ配列の間の連結配列の遺伝的安定性に悪影響を及ぼさない請求項１〜４０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４２】
非機能性ＤＮＡ配列が、以下のテスト
（ａ）スペーサーＤＮＡ配列を介して機能性ＤＮＡ配列に接続されていてもよい前記非機能性ＤＮＡ配列と共に、前記機能性ＤＮＡ配列を含むＤＮＡ分子を作製すること、
（ｂ）前記ＤＮＡ分子を細胞中に導入することにより、スペーサーＤＮＡ配列を介して非機能性ＤＮＡ配列に接続されていてもよい前記機能性ＤＮＡ配列を含むトランスジェニック細胞及びトランスジェニック生物を作製すること、
（ｃ）スペーサーＤＮＡ配列を介して非機能性ＤＮＡ配列に接続されていてもよい前記機能性ＤＮＡ配列の性能を分析することであって、前記性能は、性別子孫間の前記配列の予想される通常のメンデル分離、及び前記トランスジェニック生物の有性生殖の過程における前記機能性ＤＮＡ配列と前記非機能性ＤＮＡ配列の間の完全な連結配列の維持によって規定される、及び
（ｄ）前記機能性ＤＮＡ配列の遺伝的安定性又は非機能性ＤＮＡ配列と機能性ＤＮＡ配列の間の遺伝子連結配列に影響を及ぼさないスペーサーＤＮＡ配列を有していてもよい非機能性ＤＮＡ配列を識別すること、
によって識別可能な１組のテスト配列のメンバーとして定義される、
請求項４１記載の方法。
【請求項４３】
請求項１〜４２のいずれか一項に記載の方法に従って得られる、又は得られる可能性のある、トランスジェニック生物又はその一部。
【請求項４４】
請求項１〜４２のいずれか一項に記載の方法に従って生物中にＤＮＡを組み入れるためのベクター。
【請求項４５】
請求項１〜４２のいずれか一項に記載の方法に従って製造された遺伝子組換え生物を分析する方法であって、
（ａ）非機能性ＤＮＡ配列を増幅するためにＰＣＲ法を用いる、
（ｂ）前記非機能性ＤＮＡ配列と相補的な配列を有するプローブを使用する、
（ｃ）前記非機能性ＤＮＡ配列から発現されるポリペプチドを免疫学的に検出するための抗体を使用する、
（ｄ）前記非機能性ＤＮＡ配列を配列決定する、及び
（ｅ）前記の事前に定義されたコード体系を用いて情報メッセージを読み取る、
工程のうち少なくとも１つを含む、
上記方法。
【請求項４６】
多様な遺伝子組換えをなされた１組の生物のメンバーを検出する方法であって、前記の組が、
（ｉ）各メンバーは、少なくとも１つの機能性ＤＮＡ配列を含むこと、
（ｉｉ）異なるメンバーは、異なる機能性ＤＮＡ配列を含むこと、
（ｉｉｉ）各機能性ＤＮＡ配列は、その上流側で第１の事前に定義された認識配列、及びその下流側で第２の事前に定義された認識配列と隣接すること、
（ｉｖ）前記組中の第１の事前に定義された認識配列はすべて同一であること、
（ｖ）前記組中の第２の事前に定義された認識配列はすべて同一であること、
（ｖｉ）前記第１及び前記第２の事前に定義された認識配列は、前記機能性ＤＮＡ配列のＰＣＲ増幅に適合していること、
（ｖｉｉ）前記機能性ＤＮＡ配列及び前記非機能性ＤＮＡ配列は、実用上適当な期間、生物の生殖中に連結を保持していること、
によって規定され、
前記方法が、以下の
（ａ）前記遺伝子組換え生物のＤＮＡサンプルを、前記の第１及び第２の事前に定義された認識配列に対応するプライマーを用いるＰＣＲ増幅にかけてＰＣＲ産物を得る、
（ｂ）ＰＣＲ産物が工程（ａ）で得られるか否かを決定する、
（ｃ）前記サンプル中の上記で定義した組のメンバーが存在する証拠として工程（ｂ）の肯定的な結果を解釈する、及び
（ｄ）機能性ＤＮＡ配列を識別するために、工程（ａ）のＰＣＲ産物を配列決定してもよい、
工程を特徴とする、
上記方法。
【請求項４７】
前記の多様な組換えをなされた生物が、同一の種、又は同一の属であるが異なる種、又は同一の科であるが異なる属に属する請求項４６記載の方法。
【請求項４８】
事前に定義された認識配列がイントロンであり、機能性ＤＮＡ配列に前記イントロンが隣接している請求項４６又は４７に記載の方法。
【請求項４９】
請求項４６〜４８のいずれか一項に記載の方法によって検出可能な遺伝子組換え生物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子組換え生物であって、前記組換え生物中にトランスジェニック配列に関するコードされた情報メッセージを含む生物を製造する方法に関する。コードされた情報メッセージに関する適切な塩基配列の選択を可能にするテストを提供する。さらに、前記方法によって得られる又は得られる可能性のある遺伝子組換え生物を提供する。また、このような遺伝子組換え生物を分析する方法も提供する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子組換えは、技術的プロセスの１つであり、したがってプロセスそれ自体及び得られる製品に関して適切な技術的、生態学的及び経済的環境を保証するように設計された特定の規則及び規制の対象になる。そのような規則は、他の技術分野では十分に確立されており、他の目的もあるが、プロセス及び得られる製品の質の高さ及び再現性を保証し、一般社会、消費者、製造者、並びに環境を保護することが意図されている。遺伝子組換え（ＧＭ）生物は、それらが自己複製するという理由からヒトによって創出された特殊な製品である。すなわち、環境中に放出されるいかなるトランスジェニック材料も、長年にわたって存続する可能性がある。科学界は、科学的発見にあまりにも心を奪われ、遺伝子組換え植物などの遺伝子組換え生物の早期解除を主張することによって公衆衛生及び環境を無謀にも危険にさらしているとして非難されることが多い。１９９４年以来、米国では約３．５兆のトランスジェニック植物が生育されてきたが、有害という証拠は一切見いだされていない。それでもなお、遺伝子操作のプロセス及び製品としてのトランスジェニック生物に関する「Ｇｏｏｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｐｒａｃｔｉｃｅｓ」は成熟には程遠く、さらに努力しなければならない。より進んだ生物工学的プロセスの要素の１つは、製品の標識化及び登録を含む適切な技術的情報データを提供することである。
【０００３】
いくつかのグループが、遺伝子組換え生物（ＧＭＯ）を含む食品を標識化することを提唱してきた。トランスジェニック植物の一時禁止を抑える欧州連合の最近の判断は、正しい方向の前向きな動きである（Ｓｃｈｉｅｒｍｅｉｅｒ、Ｑ．２００１、Ｎａｔｕｒｅ、４０９、９６７〜９６８）。しかしながら、一時禁止に事実上遅れをとっている国々は、遺伝子組換え製品のトレーサビリティ（ｔｒａｃｅｂｉｌｉｔｙ）及び標識化に関する追加規則を要求している。
【０００４】
液体及び固体材料を含む目的物、価値のある目的物などの核酸フラグメントによる標識化は、多くの特許／特許出願に開示されてきた（ＷＯ９０１４４４１；ＥＰ４０８４２４；ＷＯ９１１７２６５；ＷＯ９４０４９１８；ＷＯ９４１６９０２を参照）。２件の特許出願（ＷＯ９６１７９５４；ＷＯ００５９９１７）は、生きていない目的物に加えて、生きている目的物を標識化するためのＤＮＡ／生体高分子の使用法を特許請求の範囲に記載している。しかしながら、これらの刊行物は、トランスジェニック生物に関しては信頼できる標識化の教示を提供していない。特に、トランスジェニック植物及び動物は、宿主染色体上のＤＮＡ挿入断片の機能性及び技術的（情報の）部分を分離するように遺伝子組換えされた。従来技術の標識化法は、ＧＭＯの多回生殖中に標識を失うという問題にも、また標識の情報内容が高い頻度で失われ、又は損なわれるという問題にも対処していない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
したがって、本発明の一問題は、ＧＭＯの曖昧でなくかつ信頼できる遺伝子標識を可能にする方法を提供することである。
【０００６】
本発明のもう１つの問題は、環境中に放出される導入遺伝子及び遺伝子組換え生物並びにそれらに由来する製品の追跡を可能にする方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
これらの目的は、遺伝子組換え生物を製造する方法であって、
（ａ）前記生物中に機能性ＤＮＡ配列を組み入れること、及び
（ｂ）前記生物中に非機能性ＤＮＡ配列を組み入れることを含み、
前記非機能性ＤＮＡ配列は、事前に定義されたコード体系の情報メッセージへの適用の結果に対応しており、前記情報メッセージは、前記機能性ＤＮＡ配列に関連しており、前記の事前に定義されたコード体系は複数の可能な情報メッセージから複数のＤＮＡ配列中へのマッピングを提供する方法によって達成される。
【０００８】
さらに、ＤＮＡ配列から情報メッセージへのマッピングは、独自であることが好ましいが、情報メッセージからＤＮＡ配列へのマッピングは、ＤＮＡ配列の多用及び調整を提供できるように独自でないことが好ましい。
【０００９】
さらに、前記コード体系は、重複性であり、及び／又は誤りの検出及び訂正を可能にして実用上適当な期間コードされた情報の安定性を提供することが好ましい。
【００１０】
さらに、前記機能性ＤＮＡ配列及び前記非機能性ＤＮＡ配列は、実用上適当な期間、生物の生殖中に連結を保っていることが好ましい。
【００１１】
さらに、本発明は、標識化機能のみを果たしその他の機能性を一切有しない特殊化したＤＮＡ配列を当該導入遺伝子の隣に付加し連結することによって、遺伝子標識及び当該導入遺伝子の追跡を可能にする方法について記載する。
【００１２】
さらに、本発明は、トランスジェニック生物の適応度に悪影響を及ぼさず、当該導入遺伝子の性能に悪影響を及ぼさない遺伝子標識の方法について記載する。さらに、本発明の標識（非機能性ＤＮＡ配列）は遺伝的に安定であり、当該導入遺伝子と安定に連結し、測定可能な生態学的危険を一切もたらさない。
【００１３】
さらに、本発明は、この方法に従って得られる又は得られる可能性のあるトランスジェニック生物を提供する。
【００１４】
我々の知る限りでは、本明細書において得られる及び本発明に記載のトランスジェニック生物は、トランスジェニック材料に関する技術的情報を提供する機能以外に生物における機能をまったく有していないＤＮＡ配列を生物中に組み入れることによって遺伝子標識化された始めての遺伝子組換え生物である。
【００１５】
さらに、本方法に従って生物中にＤＮＡを組み入れるためのベクターを提供する。
【００１６】
本発明の方法に従って製造される遺伝子組換え生物の分析方法であって、下記工程の少なくとも１つを含む前記方法を提供する。
（ａ）非機能性ＤＮＡ配列を増幅するためにＰＣＲ法を用いる工程、
（ｂ）非機能性ＤＮＡ配列と相補的な配列を有するプローブを使用する工程、
（ｃ）非機能性ＤＮＡ配列から発現されるポリペプチドを免疫学的に検出するための抗体を使用する工程、
（ｄ）非機能性ＤＮＡ配列を配列決定する工程、
（ｅ）前記の事前に定義されたコード体系を用いて情報メッセージを読み取る工程。
【００１７】
本発明の方法によれば、少なくとも２個の配列、すなわち機能性ＤＮＡ配列及び非機能性ＤＮＡ配列を生物中に導入する。
【００１８】
機能性ＤＮＡ配列は、例えば、有用な形質を生物に付与するための遺伝子又は当該遺伝子フラグメントを含む。機能性配列の機能性は、基本的に前記生物を遺伝子組換えするための理由に対応している。
【００１９】
非機能性ＤＮＡ配列は、生物の機能及び機能性ＤＮＡ配列の機能にとっては必要ないが、機能性配列と部分的に重なり合うことがある。情報メッセージは、機能性配列に関する情報を含むという理由から機能性ＤＮＡ配列に関係している。機能性配列に関する情報には、日付、場所、製造者、会社名、登録又は連続番号、機能性配列に関する他の情報を含むデータベース又はデータベースエントリへの照会、商標などが含まれることがある。非機能性配列の重要な目的は、環境又は市場に見いだされるＧＭＯを製造者、構成又は放出の日付及び場所などまでさかのぼって突き止めることである。
【００２０】
事前に定義されたコード体系は、複数の可能な情報メッセージから複数のＤＮＡ配列中へのマッピングを提供する。各々の可能な情報メッセージは、事前に定義されたコード体系の適用によってＤＮＡ配列中にマッピングすることができる。このコード体系は、独自な又は独自でないマッピングを可能にする。ＤＮＡ配列から情報メッセージへのマッピングは独自であり、情報メッセージからＤＮＡ配列へのマッピングは独自でないことが好ましい。最も広い意味では、このマッピングは、複数の許容可能な情報メッセージのセット又は複数の許容可能な情報メッセージとＤＮＡ配列のセットもしくは複数のＤＮＡ配列又はそれらの１個又は複数のサブセットとの間のどのような双対関係であってもよい。
【００２１】
本発明の目的として考えられる多くの可能なコード体系がある。特に直接的な可能性は、各々の可能な情報メッセージ（例えば、会社名）を１個又は複数の対応するＤＮＡ配列と関連付けるコードブックによってコード体系が規定されることであろう。このコードブックは、固有の構造を有しているかどうか分からない。本発明の他の実施形態では、事前に定義されたコードブックの代わりに事前に定義されたコード体系（どれほど多数の可能な情報メッセージを対応するＤＮＡ配列中にマッピングするべきかを識別する）を用い、個々の情報メッセージについて別々に事前に定義されたマッピングを提供する。いずれにせよ、コードすることができる可能な情報メッセージの数は大きめであることが好ましく、いくつかの実施形態によっては、１０、又は１０００、又は１０００００を超えていてもよい。
【００２２】
好ましい実施形態では、情報メッセージは英数字の配列からなる。これらは塩基又は塩基の多連鎖に割り当てることができる。２連鎖（ｄｕｂｌｅｔ）、３連鎖（ｔｒｉｐｌｅｔ）、４連鎖（ｑｕａｒｔｅｔ）又は５連鎖（ｑｕｉｎｔｅｔ）のような塩基の多連鎖（ｍｕｌｔｉｐｌｅｔ）を用いることが好ましい。塩基３連鎖が最も好ましい。有利には、塩基の多連鎖は、コードすべき記号又は文字の数よりも大きなコーディング容量を有している。このようにして得られるコード体系の重複性は、例えば、遺伝子組換え生物を分析する場合又は生物生殖中のコードされた情報のより高い安定性、より幅広い多用及び生物の遺伝子組換えに関連する環境（例えば、制限部位）のような他の環境へのヌクレオチド配列の調整を提供する。コード体系の重複性の他に、所与の数までの誤りの検出及び／又は訂正を提供することによって本発明の方法の誤り防止性（ｅｒｒｏｒ  ｐｒｏｏｆｎｅｓｓ）を改善することができる他の手段が存在する。これらには、例えば、２進コードおよび折返しコード、インターリービングコード、折返しハミングコード、及びコンボルーションコード（例えば、Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｋ−Ｈａｎｄｂｕｃｈ、編：Ｐｅｃｈｅｎｂｅｒｇｅｒ及びＰｏｍｂｅｒｇｅｒ、第２版、Ｍｕｎｃｈｅｎ、Ｗｉｅｎ、Ｈａｎｓｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ、１９９９を参照）のようなブロックコードの使用法が含まれる。コードされた情報は、実用上適当な期間安定でなければならない。
【００２３】
塩基の多連鎖を使用して情報メッセージの記号をコードする場合には、複数のリーディングフレームが存在する。この場合、情報メッセージをコードするために２個以上のリーディングフレームを使用してもよい。
【００２４】
本発明の方法をできる限り広く適用可能とするために、一般的にコード体系について合意され、事前に定義されていなければならない。コード体系の合意は全国的であることが好ましい。超国家的であることがより好ましい。その場合、本発明に従って非機能性ＤＮＡ配列を組み入れることは、ＧＭＯの安全性に役立つ国際標準になると考えられる。
【００２５】
本発明による遺伝子組換え生物の機能性及び非機能性ＤＮＡ配列は、生物の生殖の過程で連結したままでいなければならない。このことは、前記配列の物理的近接によって達成することができる。機能性及び非機能性ＤＮＡ配列は、同一染色体に位置していなければならない。実用上適当な期間、乗換えなどのＤＮＡ組換えにより生殖中に分離する可能性を最小限に抑えるのに十分近接していることが好ましい。実用上適当な期間とは、２００、好ましくは１００、少なくとも５０世代の生物と大ざっぱに定義することができる。前記生物における配列中に直接、場合によりスペーサー配列によって分離された機能性及び非機能性配列を有することが事実上有用である。前述のように、これらの配列は部分的に重なり合うことがある。
【００２６】
ぎりぎりの近接は、生物に機能性及び非機能性配列を同時に組み入れることによって最も容易に達成される。しかしながら、本発明は、好ましくは次の目標とされる機能性配列の組み入れによってすでに遺伝子組換えされている生物に非機能性配列を組み入れる場合、又はその逆の場合も含む。
【００２７】
非機能性ＤＮＡ配列は、少なくとも１個の事前に定義された認識配列と併せて提供されることが好ましい。１個又は複数の認識配列は、非機能性配列の内部に位置することができる。非機能性配列は、１個又は複数の事前に定義された認識配列が少なくとも片側に隣接していることが好ましい。前記の１個又は複数の事前に定義された認識配列は、前記非機能性ＤＮＡ配列の識別を可能にする。非機能性ＤＮＡ配列は、認識配列で両側に隣接していることが最も好ましい。その場合、前記の事前に定義された認識配列と相補的なプライマーを用いるＰＣＲ増幅と、続く非機能性配列の配列決定により分析することができる。また、隣接する認識配列を用い、非機能性配列の開始及び／又は終了を決定することができる。さらに、前記の事前に定義された１個又は複数の認識配列は、遺伝子組換え生物中の複数の非機能性ＤＮＡ配列の共同認識及び個別認識を提供するように設計することができる。このことは、多重遺伝子組換え又は遺伝子標識生物が普及する場合には重要である。
【００２８】
１個又は複数の隣接配列の認識は事前に定義されていることが好ましく、すなわち、コード体系について上記で記載したように一般には合意されていることが好ましい。その場合、非機能性配列を分析し、分子生物学にたずさわる当業者によるコード体系の適用によって非機能性ＤＮＡ配列の塩基配列から情報メッセージを読み取ることができる。あるいは、非機能性ＤＮＡ配列の存在は、例えば、認識配列又は非機能性配列それ自身（の一部）を対象とするＤＮＡプローブを用いて分析することができる。
【００２９】
非機能性ＤＮＡ配列を分析する他の手段には、前記非機能性ＤＮＡ配列から発現されるポリペプチドに対する抗体の使用法がある。この場合、非機能性配列は、完全発現カセットを含むことができる。あるいは、前記生物において機能するＩＲＥＳ（リボソーム内部進入部位）エレメントにより、当該導入遺伝子並びに前記ポリペプチドを共にコードする機能的に２シストロン性のｍＲＮＡから前記ポリペプチドを翻訳することができる。これらの手段により、非機能性配列を、生物中又はそれらに由来する（加工）食品などの製品中で検出することができる。
【００３０】
非機能性配列を分析することは、（例えば、ＤＮＡプローブを使用することによる）生物における本発明による非機能性配列の存在の単なる検出であってもよく、又は非機能性配列の塩基配列又はその一部の決定又は認識を含んでもよい。さらに、分析することは、非機能性ＤＮＡ配列をデコードするためのコード体系の適用を含むことがある。
【００３１】
情報メッセージにコード体系を適用した後に、認識配列を非機能性ＤＮＡ配列に付加することができる。あるいは、情報メッセージにコード体系を適用すると同時に認識配列の機能を有する配列が非機能性配列に直接付加又は組み込まれるようにコード体系を設計することができる。この実施形態では、非機能性ＤＮＡ配列という用語は、非機能性ＤＮＡ配列の機能及び認識配列の機能を含む。
【００３２】
本発明の方法は、すべてのＧＭＯに適用することができる。しかしながら、高等植物及び動物のような高等生物に適用することが好ましい。動物の中でも哺乳類は特に好ましいが、ヒトは除外される。高等な作物が最も好ましい。
【００３３】
さらに、本発明は、ＤＮＡ分子において情報メッセージをコードする方法であって、前記ＤＮＡ分子に非機能性ＤＮＡ配列を組み入れることを含み、前記非機能性ＤＮＡ配列は事前に定義されたコード体系の情報メッセージへの適用の結果に対応しており、前記の事前に定義されたコード体系は複数の可能な情報メッセージから複数のＤＮＡ配列中へのマッピングを提供する方法を提供する。
【００３４】
また、遺伝子組換え生物を製造するための前記方法について上記に概要を述べた原理は、適用可能な場合にＤＮＡ分子中の情報メッセージをコードする本方法にも当てはまる。
【００３５】
前記ＤＮＡ分子はプラスミド又は染色体ＤＮＡであってもよい。単離されても生物中に含まれていてもよい。生物中に維持されていることが好ましい。前記情報メッセージ又は前記非機能性ＤＮＡ配列は、商標であることが最も好ましい。
【００３６】
最後に、本発明は、商標でＤＮＡ分子を標識化する方法であって、
（ａ）商標として機能することができるヌクレオチド配列を選択すること、及び
（ｂ）ＤＮＡ分子の起源への参照として検出または認識されるように前記ヌクレオチド配列を前記ＤＮＡ分子中に組み入れることを含む方法を提供する。
【００３７】
商標でＤＮＡ分子を標識化する方法は、本発明の方法の特別な適用であり、これによって事前に定義されたコード体系は、商標として機能することができるヌクレオチド配列を商標の所有者にマッピングする。
【００３８】
遺伝子組換え生物を製造する方法に従って生物中にＤＮＡを組み入れるためのベクターは、分子生物学の知られた原理に従って設計することができる。これらのベクターは、生物のゲノム中に当該ＤＮＡ配列を安定に導入できなければならない。そのようなベクターは、例えば、ウイルス起源であってもよい。植物の場合には、例えば、植物中への当該ＤＮＡのアグロバクテリウムツメファシエンスを介する組み入れを用いることができる。弾道又は粒子ガン法のように他にいくつかの形質転換法が知られている。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３９】
本明細書で、我々は、遺伝子組換え生物（ＧＭＯ）それ自体を、ＧＭＯのゲノムにＤＮＡでコードされた（技術）情報メッセージを、好ましくは導入遺伝子のような機能性ＤＮＡ配列の次に含めることによって標識化することを提案する。このような情報メッセージは、非遺伝的なコード又はコード体系に基づいていてもよく、容易に検索及び読み取ることができる。情報メッセージは、様々な量の情報を保存することができる。好ましい実施形態では、このような標識化は、ＧＭＯの世界共通のコーディング標準として適応し、遺伝子工学における法的環境をさらに規定し、それによって大衆、環境並びに製造者を保護することになろう。
【００４０】
コード体系／言語
情報メッセージの提案（技術）情報はＤＮＡ中にコードするものとし、すなわち我々は、４文字ＤＮＡ保存言語に制限される。情報メッセージの言語をできる限り利用しやすくするために英語を選択してもよい。この場合、コード体系は、２６個のラテンアルファベット文字、１０個のアラビア数字及び１個又は２個の空白／終止文字、すなわち合計３７〜３８個の（英数字の）文字を有する言語にＤＮＡの４文字（Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ）を翻訳する。ヌクレオチドの３連鎖を翻訳する自然の遺伝コードによく似たコード体系が我々に最も貢献することは明らかである。このようなコードは、４3＝６４個の文字をコードする能力を有し、本発明の目的には十分すぎるほどである。したがって、提案したコードはある程度まで重複性であり、読取りの誤りを最小限に抑え、生物生殖中の高い安定性を提供する。さらに、このコード体系は、遺伝子組換えプロセスを複雑にする制限部位などの望ましくない特徴、又はＤＮＡ挿入断片の安定性に影響を及ぼす可能性のある反復配列を含む非機能性配列の形成を避けることを可能にする。用いる言語が英単語に基づく場合には、英数字記号が変化し破損したメッセージがそれでもなお自然言語の特有な重複性により認識されるため、このコード体系はなおさら重複性となる。上記のことを考慮に入れるコード体系の一例を表１に示す。もう１つの例を表２に示すが、ここで同一の英数字をコードする３連鎖は３個の塩基すべてが異なり、当該環境に非機能性ＤＮＡ配列を適合させるためのさらなる多用及び手段を与える。
【００４１】
望ましい情報メッセージ又は英数字を、それぞれ１個のヌクレオチド配列又は塩基多連鎖によってコードすることを可能にするため、コード体系が縮重していることが最も好ましい。コード体系の縮重は、塩基４連鎖又は５連鎖を用いることによって塩基３連鎖を用いることに比べて実質的に増加させることができる。塩基４連鎖を用いることが好ましい。
【００４２】
我々は、３連鎖コドンを英数字に変換する体系などの高度組織化コード体系を好ましいコード体系であると考えているが、特定のユーザ又はデータベースキーに割り当てられた特異なヌクレオチド配列の使用に基づく他のコード体系も本発明で企図されている。特に、本発明のコード体系は、遺伝子コード又は類似のコード体系に決して制限されない。本発明の原理に従って用いることができるコード体系の数はほぼ無制限であり、併用することができる２個以上の異なるコード体系の使用も含まれる。
【００４３】
情報メッセージ
有用なメッセージ内容及び長さを規定するため、市場に出ている他の既存製品との類似物を製造することができる。通常、機械、例えばコンピュータの裏に製造業者／会社の名前、製造年月日、製造場所、プロダクトモデル及び製造番号などのデータが見いだされる。遺伝子組換えにおける状況がおおむね類似していると仮定すれば（恐らく、我々は、生産者であるかどうか分からないが登録された製品所有者の氏名、及び近未来にわたって保存されるかもしれない１個の付加的メッセージ区分を加えたいと思うであろう）、我々は、ここしばらくの間の十分なメッセージ長はおよそ３〜１０語程度であり、各々が工業界の複雑さを反映するのに十分なコーディング容量を有するという結論に達する。しかしながら、それよりかなり長いメッセージも可能である。したがって、ＤＮＡでコードされた情報により、誰にでも利用可能な十分な一般的情報、並びに生産者の詳細なデータベース、又は政府機関の特殊なデータベースなどの他の媒体上に保存された情報への参照が得られるであろう。工業製品のラベル上に現在用いられている平均した単語長を考えると、我々は、塩基３連鎖が用いられる場合には、３００個のヌクレオチドに相当する合計約１００個くらいの英数字のメッセージ長に帰着する。しかしながら、もっと長い情報メッセージがコードされていてもよい。
【００４４】
したがって、非機能性ＤＮＡ配列は、本発明の方法によって製造される遺伝子組換え生物に関連する情報を含むことができる。前記の製品関連情報は、以下の群から選択される機能性ＤＮＡに関する情報又はその他の情報、すなわち商標、データベースへの参照、日付、場所、生産者又は所有者の氏名、並びに機能性ＤＮＡ配列の存在及び／又は位置に関する情報を含むことができる。
【００４５】
読取り開始／終止
ＤＮＡでコードされた情報メッセージの技術的に簡単かつ信頼できる読取りに関しては、便利かつ普遍的な開始及び終止シグナルを必要とすることが好ましい。ＤＮＡ操作の技術の現況を考慮すると、当該メッセージＤＮＡ（非機能性ＤＮＡ配列）の容易な増幅が可能であり、広く合意されかつ標準として宣言される短い（長さがおよそ１８〜３０個のヌクレオチド）事前に定義された認識配列の独自なセットが最も役に立つ。したがって、増幅プライマーは、情報メッセージをコードするＤＮＡ上の領域の開始及び終了の決定を可能にするであろう。前記の事前に定義された認識配列及びそれぞれのプライマーは、遺伝子組換え生物中で独自であるために十分な長さであることが好ましい。
【００４６】
前記の１つまたは複数の事前に定義された認識配列を有する非機能性ＤＮＡ配列は、１本の連続するＤＮＡのストレッチからなることが好ましい。あるいは、非機能性ＤＮＡ配列は、２本以上のＤＮＡのストレッチからなることがあり、すなわち、他のＤＮＡ配列によって中断していてもよい。前記非機能性ＤＮＡ配列は、機能性ＤＮＡ配列又はその一部によって中断していてもよい。したがって、機能性ＤＮＡ配列は、非機能性ＤＮＡ配列のストレッチ又は一部分が両側に隣接していてもよい。さらに、非機能性ＤＮＡ配列の事前に定義された認識配列は、機能性ＤＮＡ配列が場合により非機能性ＤＮＡ配列と一緒にＰＣＲによって増幅され、配列決定によって分析されるように機能性ＤＮＡ配列に隣接していてもよい。機能性ＤＮＡ配列のこのような配列決定は、機能性ＤＮＡ配列に関するさらなる情報を提供することができる。この実施形態は、非機能性ＤＮＡ配列が（ｉ）同一情報をコードし、及び（ｉｉ）組換えの原因とならないように十分に異なっていることが好ましいヌクレオチド配列を有する２、３個又はそれ以上のセグメントを有する実施形態と有利に併用することができる（下記参照）。この場合、機能性ＤＮＡ配列は、前記非機能性ＤＮＡ配列の前記セグメントに隣接していてもよい。
【００４７】
複数メッセージ
生物を２回以上遺伝子組換えし、２個以上の標識又は非機能性ＤＮＡ配列を得ることができる。複数標識化の問題点は、異なるメッセージ開始配列のセット、すなわち縮重しかつ可能なすべての開始を検出する配列、及び縮重の少ない又は独自である他の一連の配列を作成することによって容易に解決する。この場合、ＰＣＲによるいずれのデコーディングも、縮重する配列から始まり、多重に組換え及び標識化された生物が当たり前になった場合には、複数の縮重の少ないプライマーを含むことになろう。メッセージの保存領域は、ＰＣＲ分析のプライマー付加部位としての機能を果たすのに十分長く、例えば１８から２０個の塩基対でなければならない。しかしながら、不必要に長い保存領域は、同じ座に位置する複数のメッセージの場合には望ましくない組換えの原因になるかもしれない。
【００４８】
メッセージの遺伝的安定性
情報メッセージ（技術情報）をコードするための非機能性ＤＮＡ配列は、安定した状態を保って生成中に機能性ＤＮＡ配列（例えば、当該導入遺伝子）に連結し、実用上適当な期間、情報の質の劣化が存在しないことが望ましい。非機能性ＤＮＡ配列の遺伝的安定性は、コードされた情報メッセージが、機能性ＤＮＡ配列の機能と少なくとも同じ回数の遺伝子組換え生物の生殖を通して存続するほど安定であることが好ましい。これらの要件を満たすため、非機能性ＤＮＡ配列のヌクレオチド配列を、場合により非機能性ＤＮＡ配列と機能性ＤＮＡ配列の間に用いるスペーサーＤＮＡ配列と同時に、基本的に組換え易発性プロフィールを、特に宿主種のゲノムに比較して一切示さず、及び／又は基本的に宿主ゲノムとの有害な類似性を一切示さないように選択することが好ましい。
【００４９】
より具体的には、非機能性ＤＮＡ配列は、二次構造を形成することができないように、及び／又は組換えもしくは変異「ホットスポット」として知られている配列、例えば、「ヘアピン」構造又はパリンドローム又は繰返し配列／逆繰返し配列を含まないように組換えすることが好ましい。同様に、非機能性ＤＮＡ配列と機能性ＤＮＡ配列の間に用いられるＤＮＡスペーサー配列は、同じ注意をして組み換えなければならない。この目的で、様々なヌクレオチド配列データベースの検索を用い（例えば、Ｂｌａｓｔ  Ｓｅａｒｃｈ）、推定上のどの「組換え又は変異ホットスポット」も、又は非機能性ＤＮＡ配列及び／又はスペーサーＤＮＡ配列中の常在性遺伝子又は宿主生物の導入遺伝子との相同性も識別することができる。分子生物学のための様々な検索及び分析ツールのリストは、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｐｈｙｓ．ｕｎｉ−ｄｕｅｓｓｅｌｄｏｒｆ．ｄｅ／ＢｉｏＮｅｔ／Ｐｅｄｒｏ／ｒｅｓｅａｒｃｈ＿ｔｏｏｌｓ．ｈｔｍｌから利用できる。このような検索の例を実施例３で紹介する。非機能性ＤＮＡ配列と機能性ＤＮＡ配列の間の組換えの頻度をさらに軽減するため、両者間の物理的距離は短く保たれなければならず、技術的に可能な限り短いことが好ましい。機能性ＤＮＡ配列と非機能性ＤＮＡ配列の間の距離は、１００００個のヌクレオチドより短く保たれなければならず、１０００個のヌクレオチドより短いことが好ましい。
【００５０】
さらに、本発明は、組換え頻度および非機能性ＤＮＡ配列の変異性を実験的に測定する方法を提供する（実施例４を参照）。この方法によれば、非機能性ＤＮＡ配列のヌクレオチド配列は、場合により非機能性ＤＮＡ配列と機能性ＤＮＡ配列の間に挿入されるスペーサーＤＮＡ配列と同時に、以下のテストで識別可能なテスト配列のセットのメンバーとして定義される。
（ａ）各々が、選択可能なマーカー配列と対抗選択可能なマーカー配列の間にテスト配列を含むＤＮＡ分子を作製すること；
（ｂ）選択可能なマーカー配列に対応する第１の試剤及び対抗選択可能なマーカー配列に対応する第２の試剤の存在下に、両試剤が有効である条件下、前記ＤＮＡ分子で形質転換された細胞を培養すること；
（ｃ）工程（ｂ）で生き残った細胞を単離すること；
（ｄ）工程（ｃ）で単離した細胞から、前記細胞の形質転換された染色体の他の領域と比較して変異又は組換え頻度の著しい増加を示さないテスト配列を選択すること。
【００５１】
この方法によれば、ヌクレオチド配列の異なる２個以上の非機能性ＤＮＡ配列は、コード体系の縮重を利用する望ましい情報メッセージのために作製される。すなわち、テスト配列のセットが作製される。この場合、テスト配列のセットの各メンバーが上記テストの対象となる。遺伝子組換え生物を製造する前記方法の場合には、テスト配列の前記セットのメンバーは、非機能性ＤＮＡ配列として選択され、望ましい又は低い組換え頻度及び／又は変異性を示す。また、前記テストは、好適なスペーサーＤＮＡ配列又は非機能性ＤＮＡ配列とスペーサーＤＮＡ配列との好適な組合せを識別するためにも用いることができる。
【００５２】
前記テストは、本発明の方法に従って遺伝子組換えされる生物における状況ができる限り良好にシミュレートされるように設計されることが好ましい。一方、多くの多細胞生物の長い世代時間、例えば多くの作物の場合の１年は避けることが好ましい。したがって、前記テストは、多細胞生物ではなく細胞培養中の細胞について行われることが好ましい。前記テストは、簡単さという理由から、細菌細胞、特に大腸菌の細胞について行われることがより好ましい。しかしながら、遺伝子組換えされる生物が植物の場合には特に、コナミドリムシ（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ）のような単細胞植物の細胞を選択してもよい。
【００５３】
非機能性ＤＮＡ配列におけるランダムミスセンス変異からの情報メッセージの保護を強化する他の可能性は、例えば、（ｉ）同じ情報をコードし、及び（ｉｉ）組換えの原因とならないように十分に異なるヌクレオチド配列を有することが好ましい２、３個またはそれ以上のセグメントを有する非機能性ＤＮＡ配列を用いることによって情報メッセージの重複性を増やすことである。前記セグメントは、イントロンであってもよい。前記セグメントは、同一又は異なるＤＮＡ鎖上にあってもよく、異なる方向性で読み取ることができる。様々なヌクレオチド配列を有し同じ情報メッセージをコードする様々な非機能性ＤＮＡ配列セグメントの使用は、コード体系の縮重によって可能である。前記セグメントの１つにおいて情報メッセージを破損させる変異又は組換えイベントは、変異していないセグメントによってコードされる前記情報メッセージの１つ又は複数の破損されていないコピーを放出するはずである。
【００５４】
実施例２では、表１のコード体系の縮重は、情報メッセージを複製し、配列反復を作製することなくランダムな「ミスセンス」からの保護レベルを強化するために用いられる。「情報反復（ｒｅｐｅａｔ）」（保存領域）は、配列同一性が６８％である不完全逆方向反復（セグメント）によってコードされていると記載されている。しかしながら、これらの反復中に一様に分布する３２％のミスマッチは、生理的条件におけるこれらの反復間の相互作用の可能性をほぼゼロにしている。情報反復を用いると、可能性のあるＤＮＡ変異の大部分、すなわちヌクレオチド置換と内部欠失を共に検出することが可能である。
【００５５】
表２に例示したコード体系を用いることにより、情報メッセージをコードするための全体的な自由度及び多用を強化しながら、情報反復の配列同一性をさらに軽減することができる。英数字をコードするのに塩基４連鎖を用いた場合には、コード体系の特に高度な縮重を得ることができる。
【００５６】
本明細書で企図されている別の代替案は、「情報反復」を作製するために異なるコードを用い、任意の核酸反復の作製を少しでも避けることである。情報反復の使用は、メッセージの全長が技術的に操作可能な限界内に十分あることから、容易に適応させることができる。
【００５７】
情報メッセージの誤り防止を強める他の可能性は、単一塩基の代わりに好ましくは同一塩基の多連鎖を使用することである。一例として、表１による文字Ｂをコードする塩基配列ＧＣＧの代わりに、塩基配列ＧＧＧＣＣＣＧＧＧを用いることができる。塩基の倍加、３倍加又は４倍加は、この実施形態の好ましい代替案である。３倍加が好ましい。このようなコード体系は、遺伝子組換え生物の生殖中に起きる可能性のある点変異を容易に識別し、非機能性ＤＮＡ配列から情報メッセージをデコードして補正することができるという利点を有する。さらに、挿入又は欠失変異によるフレームシフトが起きた場合であっても、非機能性ＤＮＡ配列のリーディングフレームを識別することは容易である。
【００５８】
他の好ましい実施形態では、非機能性ＤＮＡ配列をイントロン又はインテインとして設計することができる。イントロンが好ましい。前記イントロン又はインテインは、関連する機能性ＤＮＡ配列内に置くことが好ましい。機能性ＤＮＡ配列と非機能性ＤＮＡ配列の間の連結配列を保存するためには特に、最も保護されている高度に保存された、又は機能的に最も大事なその一部分内に置くことができる。また、異なる塩基配列を有するが、コーディング縮重によって可能な同一情報メッセージをコードすることが好ましいいくつかの（例えば、３つの）異なるイントロンを用いることも可能である。非機能性ＤＮＡ配列のＰＣＲ増幅に用いることができる事前に定義された認識配列が前記イントロンの一部であってもよい。グループＩ及びグループＩＩのイントロンを組換えする方法は当技術分野で知られている。詳細は、以下の文書及び本明細書に引用する参考文献中に見いだすことができる。Ａｙｒｅ他（１９９９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９６、３５０７〜３５１２；Ｖａｌａｄｋｈａｎ及びＭａｎｌｅｙ（２００１）Ｎａｔｕｒｅ  ４１３、７０１〜７０７；Ｈａｇｅｎ及びＣｅｃｈ（１９９９）ＥＭＢＯ  Ｊ．１８、６４９１〜６５００；ＵＳ６１４３５０３；ＵＳ６０１０９０４；ＵＳ６０１５７９４）。非機能性ＤＮＡ配列としてのインテインの場合には、発現された非機能性ＤＮＡ配列又はその一部はポリペプチドであり、抗体によって検出することができる。各々が事前に定義されたポリペプチドを認識することができる特異的抗体のセットは、例えば、部品キットとして提供することができる。検出された各ポリペプチド−抗体反応は、前に合意された情報メッセージを示すことができる。インテインを組換える方法は、当技術分野で知られている。詳細は、以下の文書及び本明細書に引用する参考文献中に見いだすことができる。Ｌｅｗ他（１９９８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３、１５８８７〜１５８９０；Ｌｉｕ（２０００）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．３４、６１〜７６；Ｋｅｎｎｅｔｈ他（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９５、３５４３〜３５４８）。
【００５９】
本発明の方法では、前記非機能性ＤＮＡ配列の前記生物中への前記組み入れは、非機能性及び／又は機能性ＤＮＡ配列及び／又は非機能性ＤＮＡ配列と機能性ＤＮＡ配列間の連結配列の遺伝的安定性に悪影響を及ぼしてはならない。この目的で、実験的テストが提供され、非機能性ＤＮＡ配列は、以下のテストで識別可能なテスト配列のセットのメンバーとして定義される。
（ａ）場合によりスペーサーＤＮＡ配列を介して機能性ＤＮＡ配列に接続された前記非機能性ＤＮＡ配列と共に前記機能性ＤＮＡ配列を含むＤＮＡ分子を作製すること；
（ｂ）前記ＤＮＡ分子を細胞中に導入し、場合によりスペーサーＤＮＡ配列を介して非機能性ＤＮＡ配列に接続された前記機能性ＤＮＡ配列を含むトランスジェニック細胞及びトランスジェニック生物を作製すること；
（ｃ）場合によりスペーサーＤＮＡ配列を介して非機能性ＤＮＡ配列に接続された前記機能性ＤＮＡ配列の性能を分析すること（前記性能は、性別子孫（ｓｅｘｕａｌ  ｐｒｏｇｅｎｙ）中の前記配列の予想される通常のメンデル分離（ｓｅｇｒｅｇａｔｉｏｎ）及び前記トランスジェニック生物の有性生殖の過程における前記機能性ＤＮＡ配列と前記非機能性ＤＮＡ配列の間の完全な連結の維持によって規定される）、及び
（ｄ）前記機能性ＤＮＡ配列又は非機能性ＤＮＡ配列と機能性ＤＮＡ配列の間の遺伝的連結の遺伝的安定性に影響を及ぼさない、場合によりスペーサーＤＮＡ配列を有する非機能性ＤＮＡ配列を識別すること。
【００６０】
非機能性ＤＮＡ配列の生物学的中立性／生態学的安全性
Ａ．機能性ＤＮＡ配列（導入遺伝子）の性能に対する非機能性ＤＮＡ配列の影響
非機能性ＤＮＡ配列及び当該導入遺伝子をコードするＤＮＡ（機能性ＤＮＡ配列）の物理的近接は、遺伝子組換え生物中の当該導入遺伝子の性能にいろいろ影響を及ぼすことがあり、それらの大部分は望ましくないであろう。この点について特に興味深いパラメータの一部には、結合したＤＮＡ挿入断片の遺伝的安定性；当該導入遺伝子の転写及び翻訳に対する非機能性ＤＮＡ配列の直接的又は間接的影響、特に発現レベルの阻害；導入遺伝子の発現抑制を引き起こす可能性などが含まれる。これらの影響の大部分は、２群のトランスジェニック生物、すなわち（ａ）当該導入遺伝子並びに非機能性ＤＮＡ配列を共に有し、場合によりそれらの間にスペーサーを含む生物、及び（ｂ）導入遺伝子のみを有する生物の直接評価によって監視／測定することができる。この種の問題点の大部分を回避するため、この場合もまた配列データベースの検索を前もって行い、真核生物において発現抑制を引き起こすことが知られているウイルス配列によく似た配列などの配列の偶発的な（ｉｎａｄｖｅｒｔａｎｔ）生成を最小限に抑えなければならない。特殊な場合では、スペーサー及び非機能性ＤＮＡ配列が望ましくない影響、例えば、発現エンハンサー又はインスレーターとしての機能さえ有することがある。
【００６１】
さらに、本発明は、機能性ＤＮＡ配列の性能に対する非機能性ＤＮＡ配列の影響を分析するための実験的テストであって、以下の工程を含むテストを提供する。
（ａ）場合によりスペーサーＤＮＡ配列を介して機能性ＤＮＡ配列に接続された前記非機能性ＤＮＡ配列を（ｉ）含まない及び（ｉｉ）含む前記機能性ＤＮＡ配列を含むＤＮＡ分子を作製すること；
（ｂ）前記ＤＮＡ分子を細胞中に導入し、場合によりスペーサーＤＮＡ配列を介して機能性ＤＮＡ配列に接続された前記非機能性ＤＮＡ配列を（ｉ）含まない及び（ｉｉ）含む前記機能性ＤＮＡ配列を含むトランスジェニック細胞及びトランスジェニック生物を作製すること；
（ｃ）２セットのトランスジェニック細胞及び／又はトランスジェニック生物において前記機能性ＤＮＡ配列の性能を比較すること（前記性能は、以下のパラメータ、すなわち転写及び翻訳能力、翻訳レベル、発現抑制感受性、配列変異性のうち少なくとも１つによって規定される）、及び
（ｄ）前記機能性ＤＮＡ配列の性能に影響を及ぼさない、場合によりスペーサーＤＮＡ配列を有する非機能性ＤＮＡ配列を識別すること。
【００６２】
コード体系の縮重を用い、ヌクレオチド配列は異なるが同じ望ましい情報メッセージをコードするいくつかの非機能性ＤＮＡ配列を作製することができる。遺伝子組換え生物を製造する前記方法のために、上記テストで最も適した特性を示す非機能性ＤＮＡ配列を選択することができる。
【００６３】
このテストは、本発明の方法によって遺伝子組換えされる種の細胞及び／又は生物について行うことが好ましい。前記の種の生物の長い世代時間を避けなければならない場合には、細胞培養で前記テストを行うことができる。
【００６４】
Ｂ．非機能性ＤＮＡ配列の遺伝的及び生理学的中立性
本発明では、非機能性ＤＮＡ配列の存在は、それを含む遺伝子組換え生物の生物学的適応度に悪影響を及ぼしてはならない。本発明の好ましい実施形態では、非機能性ＤＮＡ配列は発現、例えば、転写及び／又は翻訳されてはならない（ポリペプチドに翻訳される、又は少なくとも転写される技術情報を我々が欲する場合を除き）。一切の翻訳を回避するため、我々は、６個の翻訳終止コドン（各ＤＮＡ鎖当たり３個、各リーディングフレームに１個）を非機能性ＤＮＡ配列に隣接させ、「漏出（ｌｅａｋｙ）」転写プロセスによって非機能性ＤＮＡ配列が転写される場合であっても翻訳産物の生成を不可能にすることを提案する。推定上のプロモーター、転写又は翻訳エンハンサー又は非機能性ＤＮＡ配列中の常在性遺伝子及び導入遺伝子との相同性については、様々な利用可能な配列データベースに対する検索、例えば、Ｂｌａｓｔ  Ｓｅａｒｃｈによる検索を用いることが望ましい（分子生物学のための様々な検索及び分析ツールのリストは、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｐｈｙｓ．ｕｎｉ−ｄｕｅｓｓｅｌｄｏｒｆ．ｄｅ／ＢｉｏＮｅｔ／Ｐｅｄｒｏ／ｒｅｓｅａｒｃｈ＿ｔｏｏｌｓ．ｈｔｍｌから利用できる）。実施例３では、非機能性ＤＮＡ配列の存在並びに常在性遺伝子の発現及びその結果として宿主の適応度にうっかりして影響を及ぼす可能性のある常在性ｍＲＮＡと相補的な宿主ＲＮＡフラグメントとの相同性を避けるために検索が行われる。しかしながら、データベース検索は、ゲノムが完全に配列決定された生物にほとんど限定され、検索結果は、他の生物に関するすべての既存の相同性を検出することはできないと思われる。この問題点に対処するため、厳密性の異なる様々な条件で宿主ＤＮＡのサザンブロット又はドットブロットハイブリダイゼーション分析用のハイブリダイゼーションプローブとして非機能性ＤＮＡ配列も使用することができる（Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｆｒｉｔｓｃｈ  ＆  Ｍａｎｉａｔｉｓ、１９８９、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎ．Ｙ．）。
【００６５】
さらに、遺伝子組換え生物の生物学的適応度に対する非機能性ＤＮＡ配列の望ましくない影響を識別するため、上記（Ａ）に記載したテストに類似する実験的テストを行うことができる。前記トランスジェニック細胞及び／又はトランスジェニック生物の性能は、工程（ｃ）における以下のパラメータ、すなわち収量、一般的生産性、生物的及び非生物的ストレスに対する抵抗などのうち少なくとも１つによって評価される。
【００６６】
Ｃ．生態学的安全性
本発明で企図されている組換えは、生態学的に危険又は安全でないと思われる特性の成分を一切有しない遺伝子組換え生物をもたらすものでなければならない。このような不注意な影響の可能性は極めて薄い。なぜならば、技術標識に実際上必要とされる比較的短い長さのＤＮＡによって、生態学的に優れた害虫又は「スーパー雑草」を劇的に生みだすように前記非機能性ＤＮＡ配列が生物の性能を変化させることはありそうにないからである。また、本発明で企図されている非機能性ＤＮＡ配列の長さは余りにも短いため、生物において独立した遺伝的又は生物学的機能を示す（プロモーターとして機能する、又は自己複製物、ウイルス様ベクターになる）、又はある種類の生物から別の生物への水平移行のような機能を獲得することができない。
【００６７】
本発明は、非機能性ＤＮＡ配列の生態学的安定性を評価するための実験的テストを提供する。このテストは、上記の項目（Ａ）及び（Ｂ）に記載のテストと類似した方法で行うことができる。前記トランスジェニック細胞及び／又はトランスジェニック生物の性能は、工程（ｃ）において比較され、前記性能は、以下のパラメータ、すなわち同種又は関連雑草種の地方在来種との異系交配優先傾向のうち少なくとも１つによって規定される。前記テストは、温室内で植物について行われることが好ましい。
【００６８】
技術的考慮事項
技術的には、重複するプライマーの組を用いることによってＤＮＡのコーディングストレッチ（ｃｏｄｉｎｇ  ｓｔｒｅｔｃｈ）（非機能性ＤＮＡ配列）の合成を漸進的に行うことができる。このことは、極めて長いプライマーの合成を必要とせず、どのような標準的分子生物学実験室においても行うことができる。２個のレアカット制限酵素切断部位（例えば、Ｎｏｔ１）に隣接していることが好ましい最後のＰＣＲ産物は、図１に示すように、小さなハイコピープラスミドベクター（例えば、ｐＵＣ又はｐＢＳ科）中にクローニングすることができる。このベクターでは、ＤＮＡのストレッチ中にコードされた情報メッセージは、重なり合っていないが２つの反対方向で同一位置から開始する２個のリン酸化されたカスタムプライマー（プライマーＣ及びＤ、図１）を用いることによって容易にアップデートすることができる。これらのプライマーは、コーディングストレッチ中にすべての必要な変化を導入することができる。このような変化を有するＰＣＲ産物は、ＤＮＡポリメラーゼ１のＫｌｅｎｏｗフラグメントで処理し、再連結して大腸菌中に形質転換することができる。このコーディングストレッチは、標準的分子生物学技法を用い、いかなる当該ベクター中にも容易に再クローニングすることができる。非生物学的情報をコードするＤＮＡのストレッチは、非機能性ＤＮＡ配列の隣接する認識配列と相補的なプライマー（プライマーＡ及びＢ、図１）を用いることによって、遺伝子組換え生物中で（又は、常に痕跡のＤＮＡを有するため、そのような生物からの産物であっても）検出することができる。プライマーの３'末端におけるテンプレートとのミスマッチはＰＣＲを進行させないことを考慮すると、（非機能性配列の）可変コーディングコア領域中へのプライマーＡ及びＢの延長は、同一ＧＭＯ又はその誘導体中の２個以上の異なる標識の検出を可能にする。ＰＣＲ産物をサブクローニング又は直接配列決定し、非生物学的情報をデコードすることができ、それによってＧＭＯ−由来の産物においてもＧＭの識別が可能である。
【００６９】
ポリペプチド中に翻訳することができるメッセージフラグメントの追加
ＧＭＯの検出をさらに容易にするため、情報メッセージをコードする領域は、生物の遺伝子機構によって発現可能な情報を含むセグメントもコードすることができる。このような情報は、転写及び翻訳後に、高速かつ敏感な免疫学的技法によって容易に検出可能であり、当該生物のトランスジェニック性を示す短い普遍的なポリペプチドを産生することができる。この手法では、前のパラグラフで十分に概説したように、付加されたポリペプチドの生物学的中立性などの問題に前もって対処しなければならない。
【００７０】
要約すると、メッセージの生物学的中立性／生態学的安全性及び遺伝的安定性に対しては、上記及び実施例３及び４に記載の設計及び配列分析の方法によって対処することができる。また、技術情報も、トランスジェニック生物に通常必要とされる付加的テストを受けることができる。通常、前記テストは、高度な類似性及びテストされる導入遺伝子の性質に極めて左右される相違を有し、例えば、除草剤に抵抗する植物は、害虫から保護される植物とは異なる方法で評価される。導入遺伝子発現に対する非機能性ＤＮＡ配列の影響は、技術情報の有無のみが異なるトランスジェニック生物の簡単な比較によって評価することができる。製品開発者による評価は、世界中の環境専門家によって開発された原則に準拠して行われる（Ｕ．Ｓ．Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｕｎｃｉｌ、１９８９、遺伝子組換え生物の実地試験（Ｆｉｅｌｄ  Ｔｅｓｔｉｎｇ  Ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｓｍｓ）：判断の枠組み（Ｆｒａｍｅｗｏｒｋ  ｆｏｒ  Ｄｅｃｉｓｉｏｎｓ）．Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｏｎ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ  ａｎｄ  Ｐｌａｎｔｓ  ｉｎｔｏ  ｔｈｅ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ．Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、Ｄ．Ｃ．；Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｅｃｏｎｏｍｉｃ  Ｃｏｏｐｅｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ、１９９２、生物工学に関する安全性の考慮事項（Ｓａｆｅｔｙ  ｃｏｎｓｉｄｅｒａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、ＯＥＣＤ、Ｐａｒｉｓ、５０ｐｐ；Ｇｏｖｅｒｎｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｃａｎａｄａ、１９９４、新規な形質を有する植物の環境安全性を決定するための評価基準（Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ｃｒｉｔｅｒｉａ  ｆｏｒ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  ｓａｆｅｔｙ  ｏｆ  ｐｌａｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｎｏｖｅｌ  ｔｒａｉｔｓ）．Ｄｉｒ９４０８、Ｄｅｃ．１６、１９９４．Ｐｌａｎｔ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ、Ｐｌａｎｔ  Ｉｎｄｕｓｔｒｙ  Ｄｉｒｅｃｔｏｒａｔｅ、Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ａｇｒｉ−ｆｏｏｄ  Ｃａｎａｄａ）。これらの評価の結果は、バイオテクノロジー製品の販売を最終的に承認するべきか否かを決定するためにデータを評価するＥＰＡ、ＵＳＤＡ、ｔｈｅ  Ｆｏｏｄ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ及び世界中の他の規制機関に送られる。このような評価には様々なパラメータを含めることができる。
【００７１】
例えば、ＵＳ  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅのｔｈｅ  Ａｎｉｍａｌ  ａｎｄ  Ｐｌａｎｔ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｉｎｓｐｅｃｔｉｏｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅ（ＡＰＨＩＳ）によって審査される標準データパッケージには、以下の領域における情報が普通含まれる（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃａｓｔ−ｓｃｉｅｎｃｅ．ｏｒｇ／ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ／２０００１０１１．ｈｔｍを参照）。
【００７２】
組成分析。研究者は、植物の組成又は生態学的影響を有する可能性のある生理機能のいかなる変化も探索する。例えば、現存する毒物の増加は、作物を常食とする可能性のある野生動物に関する懸念を引き起こすであろう。
【００７３】
発芽／休眠。幅広い温度設定で行われるこれらの試験は、バイオテクノロジー種子が従来の種子と異なるか否かを検査する。例えば、休眠が増加した種子は、冬の間土壌中に生き残る能力が高くなり、雑草性などのマイナス効果につながる可能性がある。
【００７４】
種子バンクの寿命。これらの試験は、種子が土壌中の様々な深さ、保存又は参照収蔵試料中に生き残るかどうかを決定する。
【００７５】
成長及び生殖。バイオテクノロジー植物及び従来の植物について成長及び生殖の様々な特徴を比較する。例えば、トウモロコシは、初期発芽数（ｅａｒｌｙ  ｓｔａｎｄ  ｃｏｕｎｔ）、花粉散布（ｐｏｌｌｅｎ  ｓｈｅｄ）までの日数、シルキングまでの日数、穂高（ｅａｒ  ｈｅｉｇｈｔ）、草高、成熟までの日数、落穂数、穀物水分、検査重量、収量、及び他の因子について検査するであろう。これらの多くの特徴は、新たな植物変種についてルーチン的に評価される。どのような相違も、組換え植物に生態学的優位性（ｅｄｇｅ）をもたらし、又は野生動物に影響を及ぼすかどうかを判断するために評価されるであろう。
【００７６】
異系交配。これらの作物に特異的な評価は、新しい遺伝子の挿入が植物の雑草になる能力を増加させるか否かを検査する。例えば、ダイズは、米国において野生種を有しないことから、野生種への異系交配は、生物工学によって開発された新しいダイズ変種について米国では問題にならない。適合性の野生植物が存在する場合には、ＡＰＨＩＳは、防虫などの具体的形質の移行が野生植物に他の植物を上回る利点をもたらすか否かを考慮する。また、ＡＰＨＩＳの評価に基づき、ＥＰＡは、野生種との異系交配が可能と考えられる孤立した地理的領域におけるＢｔ作物の栽植を禁止した（例えば、ハワイにおける綿の野生種）。メキシコにおけるトランスジェニック変種から伝統的な在来種へのトウモロコシ導入遺伝子の移行を立証した最近のデータに鑑みて（Ｑｕｉｓｔ  ＆  Ｃｈａｐｅｌａ、Ｎａｔｕｒｅ、４１４、５４１〜５４２（２００１））、異系交配パターンの具体的評価も重要と思われる。
【００７７】
適応度の評価。多くの農作物は、何年にも渡る伝統的な交雑育種のため、高度に管理された農業環境の外で生き残るように適応していない。バイオテクノロジー作物を評価する際に、ＡＰＨＩＳは、遺伝子の挿入が、定着し、野生植物を侵略（ｏｕｔｃｏｍｐｅｔｅ）する、言い換えれば雑草になる植物の能力を改善するか否かを考慮する。
【００７８】
アレロパシー能力。自然では、一部の植物は、他の植物に対して殺草作用を有することがある。ＡＰＨＩＳは、作物に新しい遺伝子を挿入することがこのようなアレロパシー能力を作物にもたらすか否かを検査する。
【００７９】
野外観察。複数の場所における複数年の野外試験は、土壌、水、野生動物又は他の植物に対する予想外の影響を観察する機会を提供する。しかしながら、我々は、本発明の非機能性ＤＮＡ配列それ自体には、そのような徹底した分析は必要なく、それはＲＮＡ／タンパク質レベルでの発現が前記配列の設計によって十分に制御することができるためであると考えている。通常、トランスジェニック生物に必要なテストは、非機能性ＤＮＡ配列のためのテストとしての役割を果たすはずである。毒性試験は、製品中に翻訳される可能性のある非機能性ＤＮＡ配列の特定の場合にのみ必要かもしれない。
【００８０】
さらに、本発明は、多種多様に遺伝子組換えされた生物のセットのメンバーを検出する方法であって、前記セットが以下の通り規定され、
（ｉ）各メンバーは、少なくとも１つの機能性ＤＮＡ配列を含む；
（ｉｉ）異なるメンバーは、異なる機能性ＤＮＡ配列を含む；
（ｉｉｉ）各機能性ＤＮＡ配列は、その上流側で第１の事前に定義された認識配列と、及びその下流側で第２の事前に定義された認識配列と隣接する；
（ｉｖ）前記セット中の第１の事前に定義された認識配列はすべて同一である；
（ｖ）前記セット中の第２の事前に定義された認識配列はすべて同一である；
（ｖｉ）前記第１及び前記第２の事前に定義された認識配列は、前記機能性ＤＮＡ配列のＰＣＲ増幅に適合している；
（ｖｉｉ）前記機能性ＤＮＡ配列及び前記非機能性ＤＮＡ配列は、実用上適当な期間、生物の生殖中に連結を保っている；
前記方法の特徴が以下の工程である方法を提供する。
（ａ）前記遺伝子組換え生物のＤＮＡサンプルを、前記の第１及び第２の事前に定義された認識配列に対応するプライマーを用いるＰＣＲ増幅にかけてＰＣＲ産物を得る工程；
（ｂ）ＰＣＲ産物が工程（ａ）で得られるか否かを決定する工程；
（ｃ）前記サンプル中の上記で定義したセットのメンバーが存在する証拠として工程（ｂ）の肯定的な結果を解釈する工程；及び
（ｄ）機能性ＤＮＡ配列を識別するために工程（ａ）のＰＣＲ産物を場合により配列決定する工程。
【００８１】
この方法により、同一プライマーを用いるＰＣＲ増幅によって様々な遺伝子組換え生物を検出することができる。前記ＰＣＲにより、事前に定義された認識配列が両側に隣接する導入遺伝子を増幅することができる。ＰＣＲ産物の生成は、導入遺伝子が遺伝子的に付与された生物を識別する。前記導入遺伝子は、ＰＣＲ産物を配列決定することによって識別することができる。前記の事前に定義された認識配列は、トランスジェニック植物を生産する前記方法について記載したように、一般的に合意されていることが好ましい。同一配列の事前に定義された認識配列は、多種多様に遺伝子組換えされた生物のセット中の導入遺伝子の隣接配列として用いられる。各々の前記の事前に定義された認識配列は、生物のゲノム中に天然にほとんど存在する可能性がないことが好ましい。前記セットのメンバーは、異なる導入遺伝子を含むという点で異なっていることが好ましい。あるいは又はさらに、前記セットの前記メンバーは、異なる分類学的科、異なる属であるが同一の科、異なる種であるが同一の属、又は異なる変種であるが同一の種に属するという点でさらに異なっていてもよい。前記メンバーが同一の種に属している場合には、異なる導入遺伝子によって組み換えられている。本方法の生物は、植物、特に高等作物であることが好ましい。多種多様に遺伝子組換えされた生物における同一の事前に定義された認識配列の使用は、前記セットのメンバーを検出するための同一プライマーの使用を可能にする。
【００８２】
また、前記の検出方法によって検出可能な遺伝子組換え生物を提供する。
【００８３】
【表１】
2004532631.tif 000002
【００８４】
【表２】
2004532631.tif 000003
【実施例１】
【００８５】
コーディングプロトコル
表１に提案した生物学的コードを用い、非生物学的文字の情報をコードして使用することができる。コードするべき少なくとも３７個の英数字（英語の場合には２６個のアルファベット文字、１個のスペース記号及び１０個の数字）が存在し、６４個の３連鎖コドンのみが使用可能であることを考慮し、文字に１個又は２個のコドンを指定する選択は、具体的な文字の予想される使用頻度に基づいている。結果として、一部の文字は、１個の３連鎖コドンのみを有する。最も頻繁に使用される文字としてスペース記号は２個のコドンを有する。しかしながら、我々は、コードされた情報の始めにスペース記号の第１のコドン（ＡＴＧ）を、コードされた情報の終わりにスペース記号の第２のコドン（ＴＴＣ）を用いることを推奨する。コードされた情報の中間におけるスペース記号の選択は自由に選択するものとし、制限部位の生成又は他の望ましくない結果を避ける必要性によってのみ優先度を決定することができる。
【実施例２】
【００８６】
非生物学的文字の情報を有するトランスジェニック植物の作製及び分析
この実施例では、表１のコード体系を用いる。合成ＤＮＡは、Ｇｅｎａｒｔ社（Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）によって「ライゲーション産物」として合成された。翻訳された製品は、「Ｉ．ＣＡＮ．ＧＥＮＥＴＩＣＳ．ＮＥＣ．ＶＥＲＯ．ＴＥＲＲＡＥ．ＦＥＲＲＥ．ＯＭＮＥＳ．ＯＭＮＩＡ．ＰＯＳＳＵＮＴ」、続いて（反対方向のフレームにおいて）「ＳＣＩＴＥＮＥＧ．ＮＡＣ．Ｉ」と読み取る。ラテン語「ＮＥＣ．ＶＥＲＯ．ＴＥＲＲＡＥ．ＦＥＲＲＥ．ＯＭＮＥＳ．ＯＭＮＩＡ．ＰＯＳＳＵＮＴ」の翻訳は、「Ｎｅｉｔｈｅｒ  ｃａｎ  ｅｖｅｒｙ  ｓｏｉｌ  ｂｅａｒ  ｅｖｅｒｙ  ｆｒｕｉｔ」を意味する（Ｖｅｒｇｉｌ、「Ｇｅｏｒｇｉｃａ」、２、１０９）。両ＤＮＡ鎖上にコードされた同一テキストの２つの隣接配列（「Ｉ．ＣＡＮ．ＧＥＮＥＴＩＣＳ」）は、技術情報をコードする配列の保存部分を表す。
【００８７】
ライゲーション産物（構築オリゴのＰＣＲ産物からなる）をｐＩＣＢＶ１０中のＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩフラグメント（図５）としてクローニングすると、プラスミドｐＩＣ４１００が得られた。挿入配列は配列決定によってチェックした。このプラスミドをアグロバクテリウムＧＶ３１０１株中に固定化し、形質転換に使用した。
【００８８】
プラスミドｐＩＣ４１００のＴ−ＤＮＡ（図２）を、Ｂｅｎｔ他（１９９４、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２８５、１８５６〜１８６０）によって記載されているようにシロイヌナズナ（Ｃｏｌ−０）植物中に導入した。真空浸透の３週間後に種子を採取し、滅菌して５０ｍｇ／Ｌカナマイシンを含有するＧＭ＋１％グルコース培地上で形質転換体についてスクリーニングした（Ｖａｌｖｅｋｅｎｓ他、１９８８、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８５、５５３６〜５５４０）。また、アグロバクテリウムを介するリーフディスク形質転換プロトコル（Ｈｏｒｓｈ他、１９８５、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２２７、１２２９〜１２３１）を用い、ｐＩＣ４１００のＴ−ＤＮＡをタバコにも導入した。カナマイシン選択を適用することによってトランスジェニックタバコ植物を回収した。また、シロイヌナズナ及びタバコの形質転換は、選択可能マーカーを含むがＤＮＡでコードされた技術情報を含まないプラスミドｐＩＣＢＶ１０（図５）についても行った。各植物種について１構築物当たり２０個の一次形質転換体が得られ（合計８０種のトランスジェニック植物で）、植物適応度、導入遺伝子発現、安定性などに対するＤＮＡでコードされた技術情報の影響を判定するため比較分析に用いた。２種類の異なるプラスミド（ｐＩＣ４１００及びｐＩＣＢＶ１０）による形質転換実験は、同一条件で成長した同一植物材料を用い、並行して行った。また、形質転換体の選択も、対照（ｐＩＣＢＶ１０）及びテストされる（ｐＩＣ４１００）プラスミドについて同一条件下で行った。実験からは、形質転換の頻度が対照及びテストされたベクターについて同等であることが立証された。また、対照植物と技術情報を有する植物との間には表現型の差は存在しなかった。このことは、対照植物と比較しても、形質転換頻度及び植物適応度に対するＤＮＡでコードされた技術情報の検出可能な影響は存在しないことを示している。
【００８９】
また、我々は、細菌宿主及び植物宿主内のＤＮＡでコードされた技術情報の安定性もテストした。プライマーの下記セットを用い、２３１ｂｐのＤＮＡフラグメントを増幅した。
Ｆ１（５'−ＧＴＣ  ＧＡＣ  ＴＧＡ  ＡＴＡ  ＴＡＡ  ＴＧＣ  ＧＣＡ  ＡＡＣ  ＴＧ−３'）
Ｒ１（５'−ＧＡＡ  ＴＴＣ  ＴＡＡ  ＡＴＣ  ＴＧＡ  ＴＧＴ  ＧＣＡ  ＡＡＴ  ＴＡＡ  ＧＧ−３'）
【００９０】
ＰＣＲ用のテンプレートとして、ＰＣＲ混合物５０μｌ当たり細菌懸濁液１μｌ又は植物組織の小塊を使用した。ＰＣＲ用の植物組織は、Ｋｌｉｍｙｕｋ及び共同研究者（１９９３、Ｐｌａｎｔ  Ｊ．、３、４９３〜４９４）による記載の通り調製した。大腸菌懸濁液は、適切な選択（５０μｇ／ｍｌカルベニシリン）と共に新たに接種したＬＢ培地中で２時間成長後、ＰＣＲ用に採取した。アグロバクテリウム懸濁液は、一夜培養液（５０μｇ／ｍｌリファンピシン、５０μｇ／ｍｌカルベニシリンを含むＬＢ）から採取した。ＰＣＲ条件は以下の通りとした。９４℃で２０秒；６０℃で２０秒；７２℃で１分を３５サイクル。
【００９１】
メッセージに隣接する不完全逆方向反復が存在するにもかかわらず、大腸菌及びアグロバクテリウムツメファシエンスの分析したクローンすべて並びにｐＩＣ４１００  Ｔ−ＤＮＡを有する一次形質転換体すべて（２０種類のタバコ及び２０種類のシロイヌナズナ一次形質転換体を分析した）において当該ＤＮＡフラグメントが検出された。植物組織からのＰＣＲ産物についての配列分析を行った。ＤＮＡでコードされた技術情報に誤りは一切検出されなかった。また、２種のシロイヌナズナ一次形質転換体の同系交配子孫（ｓｅｌｆ−ｐｒｏｇｅｎｙ）から、ＰＣＲ産物を用いて同一の配列分析も行った。ＤＮＡ配列の変化は検出されなかった。
【実施例３】
【００９２】
望ましくない配列の存在についてのＤＮＡでコードされた技術情報の分析
データベース中の配列と一致／類似する配列の存在を検出する最も簡単な方法は、ブラスト検索を行うことである。我々は、図３に示す配列を用い公共データベースを検索した。ＢｌａｓｔＮ及びＢｌａｓｔＸ検索の結果を付録１に示す。ＢｌａｓｔＮ検索の結果は、哺乳類、キイロショウジョウバエ及びアスペルギルスパラジティクスからの配列（ｃＤＮＡ配列）と一致する短いＤＮＡ配列のストレッチ（１９〜２１ｂｐ）の存在を示した。しかしながら、植物ＤＮＡ配列との相同性は検出されなかった。ＢｌａｓｔＸ検索のみがシロイヌナズナの仮定上の（ｈｙｐｏｔｅｔｉｃａｌ）タンパク質との著しい相同性を示し、４１個のアミノ酸残基をコードするＤＮＡストレッチを包含している。しかしながら、技術的ＤＮＡのこのストレッチは、様々な位置で推定上の翻訳産物の連続性を妨げる３個の終止コドンを含んでおり、それによってシロイヌナズナの仮定上のタンパク質との相同性を有する人工タンパク質の合成を不可能にしている。
【実施例４】
【００９３】
ＤＮＡでコードされた技術情報内の組換え頻度の測定
ＤＮＡでコードされた技術情報によって包含される領域及び機能性ＤＮＡのような１個または複数の導入遺伝子から技術情報を含むＤＮＡを分離するリンカーＤＮＡにおける組換え頻度を測定することが望ましい。このことは、組換え「ホットスポット」の偶発的生成を回避するのに役立つことができる。このような目的のために設計された構築物の一般的スキームを図４に示す。テストされるＤＮＡ配列は、選択可能なマーカー（抗生物質に対する耐性を付与する遺伝子）と対抗選択可能なマーカー（化学物質に対する感受性を付与する、条件付きで致死な的遺伝子）との間に挿入することができる。抗生物質（アンピシリン、ゲンタマイシン、テトラサイクリン、カナマイシン、ネオマイシン、ハイグロマイシンなど）に対する耐性を付与するどの細菌遺伝子も選択的マーカーとしての役割を果たすために選択されるであろう。対抗選択可能なマーカーの選択としては、ショ糖感受性を付与する枯草菌ｓａｃＢ遺伝子を用いることができる（Ｓｔｅｉｎｍｅｔｚ他、１９８３、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．、１９１、１３８〜１４４；Ｒｅｃｏｒｂｅｔ他、１９９３、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、５９、１３６１〜１３６６）。組換えイベントは、適切な抗生物質及びショ糖を含有する培地上で細菌を培養することによって選択することができる。組換えを介して失った、又は不活性（変異）型のｓａｃＢ遺伝子を有する細菌細胞のみが生き残るはずである。このような生き残ったコロニーをＰＣＲ分析に用い（プライマーＡ及びＢ、図４）ＤＮＡフラグメントにコードされた技術情報が関与する組換えイベントの頻度をチェックすることができる。この頻度をベクターの残りの部分における組換え頻度と比較して分析された領域内の組換え「ホットスポット」の存在を判定することができる。
【００９４】
2004532631.tif 000004
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【図面の簡単な説明】
【００９５】
【図１】非生物学的情報をコード及びアップデートするためのベクターを示す図である。ベクターの塗りつぶされた領域は、プライマーＡ及びＢによりコーディング（塗られていない）領域を増幅するために指定された保存領域に相当する。プライマーＣ及びＤは、コーディング領域内の情報をアップデートする／置き換えるために設計される。
【図２】植物の形質転換のための非生物学的情報をコードするベクターｐＩＣ４１００を示す。
【図３】開始−終止ＯＲＦの略図（ＤＮＡＳＴＡＲプログラム）と併せて非生物学的情報をコードするベクターｐＩＣ４１００からの配列を示す。
【図４】ＤＮＡでコードされた技術情報内の組換え頻度をテストするためのベクターを示す。  ＳＭ−選択可能なマーカー；  ＣＳＭ−対抗選択可能又はネガティブ選択マーカー  ＭＣＳ−複数のクローニング部位；  Ａ及びＢ−「技術的」ＤＮＡを増幅するためのＰＣＲプライマー。
【図５】バイナリーベクターｐＩＣＢＶ１０を示す。
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際公開パンフレット】
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【手続補正書】
【提出日】平成15年8月13日(2003.8.13)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
遺伝子組換え生物の機能性ＤＮＡ配列を標識及び追跡する方法であって、
（ａ）前記生物中に機能性ＤＮＡ配列を組み入れること、
（ｂ）前記生物中に非機能性ＤＮＡ配列を組み入れること、
によって遺伝子組換え生物を製造することを含み、
（ｉ）前記非機能性ＤＮＡ配列は、事前に定義されたコード体系の情報メッセージへの適用の結果に対応しており、
（ｉｉ）前記情報メッセージは、前記機能性ＤＮＡ配列に関連しており、
（ｉｉｉ）前記の事前に定義されたコード体系は、複数の可能な情報メッセージから複数のＤＮＡ配列中へのマッピングを提供し、
（ｉｖ）ＤＮＡ配列から情報メッセージへのマッピングは独自であるが、情報メッセージからＤＮＡ配列へのマッピングは、ＤＮＡ配列の多用及び調整をもたらすように、独自ではなく、
（ｖ）前記コード体系は、重複性であり、及び／又は誤りの検出及び訂正を可能にして、実用上適当な期間、コードされた情報の安定性を提供し、
（ｖｉ）前記機能性ＤＮＡ配列及び前記非機能性ＤＮＡ配列は、実用上適当な期間、生物の生殖中に連結を保っている、及び
（ｃ）機能性ＤＮＡ配列を非機能性配列を用いて追跡する、
上記方法。
【請求項２】
非機能性ＤＮＡ配列より前に、機能性ＤＮＡ配列が前記生物中に組み入れられる請求項１記載の方法。
【請求項３】
機能性ＤＮＡ配列より前に、非機能性ＤＮＡ配列が前記生物中に組み入れられる請求項１記載の方法。
【請求項４】
非機能性ＤＮＡ配列及び機能性ＤＮＡ配列が、同時に前記生物中に組み入れられる請求項１記載の方法。
【請求項５】
非機能性ＤＮＡ配列及び機能性ＤＮＡ配列が、同一染色体上に位置する請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
非機能性ＤＮＡ配列及び機能性ＤＮＡ配列が、組換えによる分離を防ぐのに十分近く染色体上に位置する請求項１記載の方法。
【請求項７】
非機能性ＤＮＡ配列が、イントロン又はインテインである請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
イントロン又はインテインが、関連する機能性ＤＮＡ配列内に位置する請求項７記載の方法。
【請求項９】
イントロン又はインテインが、関連する機能性ＤＮＡ配列の高度に保存された部分内に位置する請求項８記載の方法。
【請求項１０】
非機能性ＤＮＡ配列と機能性ＤＮＡ配列間のスペーサーＤＮＡ配列と連結していてもよい非機能性ＤＮＡ配列のヌクレオチド配列が、以下のテスト
（ａ）選択可能なマーカー配列と対抗選択可能なマーカー配列の間にテスト配列を各々含むＤＮＡ分子を作製すること、
（ｂ）選択可能なマーカー配列に対応する第１の試剤及び対抗選択可能なマーカー配列に対応する第２の試剤の存在下に、両試剤が有効である条件下、前記ＤＮＡ分子で形質転換された細胞を培養すること、
（ｃ）工程（ｂ）で生き残った細胞を単離すること、
（ｄ）工程（ｃ）で単離した細胞から、前記細胞の形質転換された染色体の他の領域と比較して、変異又は組換え頻度の有意な増加を示さないテスト配列を選択すること、
によって識別可能な１組のテスト配列のメンバーとして定義される請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
選択可能なマーカー配列が抗生物質耐性遺伝子の配列であり、第１の試剤が抗生物質である請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
対抗選択可能なマーカー配列がショ糖感受性遺伝子の配列であり、第２の試剤がショ糖である請求項１０又は１１に記載の方法。
【請求項１３】
細胞が細菌細胞である請求項１０〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
細胞が大腸菌細胞である請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
細胞が植物細胞、特にコナミドリムシ細胞である請求項１０〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
非機能性ＤＮＡ配列のヌクレオチド配列は、非機能性ＤＮＡ配列と機能性ＤＮＡ配列の間のスペーサーＤＮＡ配列と連結していてもよく、
（ａ）組換え易発性プロフィールを、特に宿主種のゲノムと比較して基本的に一切示さないか、又は
（ｂ）宿主ゲノムと比較して有害な相同性を基本的に一切示さない、
ように選択される、
請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
非機能性ＤＮＡ配列の遺伝的安定性は、コードされた情報メッセージが、機能性ＤＮＡ配列の機能と少なくとも同じ回数の生殖を通して存続するように選択される請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
非機能性ＤＮＡ配列は、非機能性ＤＮＡ配列と機能性ＤＮＡ配列の間のスペーサーＤＮＡ配列と連結していてもよく、二次構造を形成することができないように、及び／又は組換えもしくは変異の「ホットスポット」を含まないように選択される請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記マッピングがＤＮＡ部分から英数字まで行われる請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記マッピングがＤＮＡ３連鎖から英数字まで行われる請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
非機能性ＤＮＡ配列が、前記非機能性ＤＮＡ配列の識別及び／又は分析を可能にする、少なくとも１個の事前に定義された認識配列を備える請求項１〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
非機能性ＤＮＡ配列が、少なくとも片側で認識配列と隣接している請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
前記の１個又は複数の事前に定義された認識配列は、生物中の複数の非機能性ＤＮＡ配列の共同認識及び個別認識に対応するように設計されている請求項２１又は２２に記載の方法。
【請求項２４】
非機能性ＤＮＡが、（ｉ）同一情報メッセージをコードし、及び（ｉｉ）増大された情報安定性のためのコード体系の重複性によって可能となる、組換えを起こさないように十分に異なったヌクレオチド配列を有する２個以上のセグメント又はイントロンもしくはインテインとして存在する請求項１〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記各セグメントは、同一又は異なるＤＮＡ鎖上にあり、異なる配向性で読み取ることができる請求項２４記載の方法。
【請求項２６】
機能性ＤＮＡ配列は、両側で非機能性ＤＮＡ配列の各部分と隣接している請求項１〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記の事前に定義された認識配列と相補的なプライマーを用いる機能性ＤＮＡ配列又はその部分のＰＣＲ増幅が可能なように、前記の事前に定義された認識配列が位置している請求項２１〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
非機能性ＤＮＡ配列は、迅速な検出のために、発現可能なポリペプチドをコードする付加的ＤＮＡ配列を含む請求項１〜２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
情報メッセージが製品関連情報を含む請求項１〜２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
製品関連情報が商標を含む請求項２９記載の方法。
【請求項３１】
製品関連情報がデータベースへの参照を含む請求項２９記載の方法。
【請求項３２】
製品関連情報が日付、場所及び／又は製造者もしくは所有者の氏名を含む請求項２９記載の方法。
【請求項３３】
製品関連情報が機能性ＤＮＡ配列の存在及び／又は位置を示す請求項２９記載の方法。
【請求項３４】
生物が植物又は動物である請求項１〜３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
前記生物中への非機能性ＤＮＡ配列の前記組み入れが、前記遺伝子組換え生物の生物学的適応度に悪影響を及ぼさない請求項１〜３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
非機能性ＤＮＡ配列が、以下のテスト
（ａ）スペーサーＤＮＡ配列を介して機能性ＤＮＡ配列に接続されていてもよい前記非機能性ＤＮＡ配列を（ｉ）含まない、及び（ｉｉ）含む、前記機能性ＤＮＡ配列を含むＤＮＡ分子を作製すること、
（ｂ）前記ＤＮＡ分子を細胞中に導入することにより、スペーサーＤＮＡ配列を介して機能性ＤＮＡ配列に接続されていてもよい前記非機能性ＤＮＡ配列を（ｉ）含まない、及び（ｉｉ）含む、前記機能性ＤＮＡ配列を含むトランスジェニック細胞及び／又はトランスジェニック生物を作製すること、
（ｃ）トランスジェニック細胞及び／又はトランスジェニック生物の性能を比較することであって、前記性能は、収量、一般的生産性、生物的及び非生物的ストレスに対する抵抗性であるパラメータのうち少なくとも１つによって規定される、及び
（ｄ）前記トランスジェニック細胞又は生物の生物学的適応度に悪影響を及ぼさないスペーサーＤＮＡ配列を有していてもよい非機能性ＤＮＡ配列を識別すること、
によって識別可能な１組のテスト配列のメンバーとして定義される、
請求項３５記載の方法。
【請求項３７】
前記非機能性ＤＮＡ配列の前記組み入れが、前記遺伝子組換え生物の生態学的安全性に悪影響を及ぼさない請求項１〜３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
前記非機能性ＤＮＡ配列が、以下のテスト
（ａ）スペーサーＤＮＡ配列を介して機能性ＤＮＡ配列に接続されていてもよい前記非機能性ＤＮＡ配列を（ｉ）含まない、及び（ｉｉ）含む、前記機能性ＤＮＡ配列を含むＤＮＡ分子を作製すること、
（ｂ）前記ＤＮＡ分子を細胞中に導入することにより、スペーサーＤＮＡ配列を介して機能性ＤＮＡ配列に接続されていてもよい前記非機能性ＤＮＡ配列を（ｉ）含まない、及び（ｉｉ）含む、前記機能性ＤＮＡ配列を含むトランスジェニック細胞及び／又はトランスジェニック生物を作製すること、
（ｃ）トランスジェニック細胞及び／又は生物の性能を比較することであって、前記性能は、同種又は関連雑草種の地方在来種との異系交配優先傾向であるパラメータのうち少なくとも１つによって規定される、及び
（ｄ）前記遺伝子組換え生物の生態学的安全性に悪影響を及ぼさないスペーサーＤＮＡ配列を有していてもよい非機能性ＤＮＡ配列を識別すること、
によって識別可能な１組のテスト配列のメンバーとして定義される、
請求項３７記載の方法。
【請求項３９】
前記非機能性ＤＮＡ配列が、前記遺伝子組換え生物中の前記機能性ＤＮＡ配列の性能に悪影響を及ぼさない請求項１〜３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
前記非機能性ＤＮＡ配列が、以下のテスト
（ａ）スペーサーＤＮＡ配列を介して機能性ＤＮＡ配列に接続されていてもよい前記非機能性ＤＮＡ配列を（ｉ）含まない、及び（ｉｉ）含む、前記機能性ＤＮＡ配列を含むＤＮＡ分子を作製すること、
（ｂ）前記ＤＮＡ分子を細胞中に導入することにより、スペーサーＤＮＡ配列を介して機能性ＤＮＡ配列に接続されていてもよい前記非機能性ＤＮＡ配列を（ｉ）含まない、及び（ｉｉ）含む、前記機能性ＤＮＡ配列を含むトランスジェニック細胞及びトランスジェニック生物を作製すること、
（ｃ）２組のトランスジェニック細胞及び／又はトランスジェニック生物において、前記機能性ＤＮＡ配列の性能を比較することであって、前記性能は、転写及び翻訳能力、翻訳レベル、発現抑制感受性、配列変異性であるパラメータのうち少なくとも１つによって規定される、及び
（ｄ）前記機能性ＤＮＡ配列の性能に影響を及ぼさないスペーサーＤＮＡ配列を有していてもよい非機能性ＤＮＡ配列を識別すること、
によって識別可能な１組のテスト配列のメンバーとして定義される、
請求項３９記載の方法。
【請求項４１】
前記非機能性ＤＮＡ配列の前記生物中への前記組み入れが、非機能性及び／又は機能性ＤＮＡ配列、及び／又は非機能性ＤＮＡ配列と機能性ＤＮＡ配列の間の連結配列の遺伝的安定性に悪影響を及ぼさない請求項１〜４０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４２】
非機能性ＤＮＡ配列が、以下のテスト
（ａ）スペーサーＤＮＡ配列を介して機能性ＤＮＡ配列に接続されていてもよい前記非機能性ＤＮＡ配列と共に、前記機能性ＤＮＡ配列を含むＤＮＡ分子を作製すること、
（ｂ）前記ＤＮＡ分子を細胞中に導入することにより、スペーサーＤＮＡ配列を介して非機能性ＤＮＡ配列に接続されていてもよい前記機能性ＤＮＡ配列を含むトランスジェニック細胞及びトランスジェニック生物を作製すること、
（ｃ）スペーサーＤＮＡ配列を介して非機能性ＤＮＡ配列に接続されていてもよい前記機能性ＤＮＡ配列の性能を分析することであって、前記性能は、性別子孫間の前記配列の予想される通常のメンデル分離、及び前記トランスジェニック生物の有性生殖の過程における前記機能性ＤＮＡ配列と前記非機能性ＤＮＡ配列の間の完全な連結配列の維持によって規定される、及び
（ｄ）前記機能性ＤＮＡ配列の遺伝的安定性又は非機能性ＤＮＡ配列と機能性ＤＮＡ配列の間の遺伝子連結配列に影響を及ぼさないスペーサーＤＮＡ配列を有していてもよい非機能性ＤＮＡ配列を識別すること、
によって識別可能な１組のテスト配列のメンバーとして定義される、
請求項４１記載の方法。
【請求項４３】
請求項１〜４２のいずれか一項に記載の方法に従って得られる、又は得られる可能性のある、トランスジェニック生物又はその一部。
【請求項４４】
請求項１〜４２のいずれか一項に記載の方法に従って製造された遺伝子組換え生物を分析する方法であって、
（ａ）非機能性ＤＮＡ配列を増幅するためにＰＣＲ法を用いる、
（ｂ）前記非機能性ＤＮＡ配列と相補的な配列を有するプローブを使用する、
（ｃ）前記非機能性ＤＮＡ配列から発現されるポリペプチドを免疫学的に検出するための抗体を使用する、
（ｄ）前記非機能性ＤＮＡ配列を配列決定する、及び
（ｅ）前記の事前に定義されたコード体系を用いて情報メッセージを読み取る、
工程のうち少なくとも１つを含む、
上記方法。
【請求項４５】
多様な遺伝子組換えをなされた１組の生物のメンバーを検出する方法であって、前記の組が、
（ｉ）各メンバーは、少なくとも１つの機能性ＤＮＡ配列を含むこと、
（ｉｉ）異なるメンバーは、異なる機能性ＤＮＡ配列を含むこと、
（ｉｉｉ）各機能性ＤＮＡ配列は、その上流側で第１の事前に定義された認識配列、及びその下流側で第２の事前に定義された認識配列と隣接すること、
（ｉｖ）前記組中の第１の事前に定義された認識配列はすべて同一であること、
（ｖ）前記組中の第２の事前に定義された認識配列はすべて同一であること、
（ｖｉ）前記第１及び前記第２の事前に定義された認識配列は、前記機能性ＤＮＡ配列のＰＣＲ増幅に適合していること、
（ｖｉｉ）前記機能性ＤＮＡ配列及び前記非機能性ＤＮＡ配列は、実用上適当な期間、生物の生殖中に連結を保持していること、
によって規定され、
前記方法が、以下の
（ａ）前記遺伝子組換え生物のＤＮＡサンプルを、前記の第１及び第２の事前に定義された認識配列に対応するプライマーを用いるＰＣＲ増幅にかけてＰＣＲ産物を得る、
（ｂ）ＰＣＲ産物が工程（ａ）で得られるか否かを決定する、
（ｃ）前記サンプル中の上記で定義した組のメンバーが存在する証拠として工程（ｂ）の肯定的な結果を解釈する、及び
（ｄ）機能性ＤＮＡ配列を識別するために、工程（ａ）のＰＣＲ産物を配列決定してもよい、
工程を特徴とする、
上記方法。
【請求項４６】
前記の多様な組換えをなされた生物が、同一の種、又は同一の属であるが異なる種、又は同一の科であるが異なる属に属する請求項４５記載の方法。
【請求項４７】
事前に定義された認識配列がイントロンであり、機能性ＤＮＡ配列に前記イントロンが隣接している請求項４５又は４６に記載の方法。
【請求項４８】
請求項４５〜４７のいずれか一項に記載の方法によって検出可能な遺伝子組換え生物。
【国際調査報告】
2004532631.tif 000057
2004532631.tif 000058
2004532631.tif 000059