(57)【要約】本発明は、移植前に胎児後腎を保存する方法を示すものである。【特許請求の範囲】
【請求項１】
胎児後腎組織をＥＭＴ保存溶液と接触させることを含む、胎児後腎組織を保存する方法。
【請求項２】
該保存溶液の温度が０〜４℃の間である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
保存溶液が１またはそれ以上の成長因子を含む、請求項１記載の方法。
【請求項４】
成長因子が、組換えヒトインシュリン様成長因子Ｉ、組換えヒトインシュリン様成長因子ＩＩ、組換えヒト形質転換成長因子α、組換えヒト肝細胞成長因子、組換えヒト血管内皮細胞成長因子、組換えヒト塩基性繊維芽細胞成長因子、組換えヒト神経成長因子、レチノイン酸、コルチコトロピン放出ホルモン、タムホースフォールタンパク質、プロスタグランジンＥ１、および鉄飽和トランスフェリンから成る群から選択される、請求項３記載の方法。
【請求項５】
ＥＭＴ保存溶液と接触させた後に胎児後腎組織を移植する、請求項１記載の方法。
【請求項６】
ＥＭＴ保存溶液が１またはそれ以上の成長因子をさらに含む、請求項５記載の方法。
【請求項７】
接触時間が約１時間未満〜７日である、請求項５または６記載の方法。
【請求項８】
１またはそれ以上の成長因子と組み合わせてＥＭＴ保存溶液を含む組成物。
【請求項９】
成長因子が、組換えヒトインシュリン様成長因子Ｉ、組換えヒトインシュリン様成長因子ＩＩ、組換えヒト形質転換成長因子α、組換えヒト肝細胞成長因子、組換えヒト血管内皮細胞成長因子、組換えヒト塩基性繊維芽細胞成長因子、組換えヒト神経成長因子、レチノイン酸、コルチコトロピン放出ホルモン、タムホースフォールタンパク質、プロスタグランジンＥ１、および鉄飽和トランスフェリンから成る群から選択される、請求項８記載の組成物。
【請求項１０】
ＥＭＴ保存溶液が、少なくとも２の成長因子を含むウィスコンシン保存液である、請求項９記載の組成物。
【請求項１１】
胎児後腎およびＥＭＴ保存溶液を含む組成物。
【請求項１２】
ＥＭＴ保存溶液が１またはそれ以上の成長因子をさらに含む、請求項１１記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の分野）
本発明の分野は概して、移植前に胎児後腎組織を保存する方法に関する。
（政府援助）
本発明は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ Ｇｒａｎｔ／Ｃｏｎｔａｃｔ Ｎｏｓ． ＤＫ４５１８１およびＤＫ５３４８７からの政府援助にてなされた。合衆国政府が本発明に対して所定の権利を有し得る。
【０００２】
（発明の背景）
慢性腎不全の末期症状には米国においてだけでも３００，０００名もの人々が悩まされており、これらの人々のほとんどは、かなり割合で少なからぬ病的症状を伴う処置である透析（Ｕ．Ｓ．Ｒｅｎａｌ Ｄａｔａ Ｓｙｓｔｅｍ， （１９９９） Ａｍ． Ｊ． Ｋｉｄｎｅｙ Ｄｉｓ．， ３４： Ｓ４０−Ｓ５０）または腎臓同種移植を用いた治療を受けているが、この同種移植は、移植のために入手可能な臓器数により、制限される（Ｕ．Ｓ．Ｒｅｎａｌ Ｄａｔａ Ｓｙｓｔｅｍ， （１９９９） Ａｍ． Ｊ． Ｋｉｄｎｅｙ Ｄｉｓ．， ３４： Ｓ７４−Ｓ８６）。
【０００３】
臓器の入手可能性の低さという問題に対する解決策のひとつは、発達期の腎臓の移植（後腎同種移植または異種移植）を行うことである。同種移植（または異種移植）後腎の成体動物への移植が腎臓移植よりも有利である理由には少なくとも２つある。まず、その形成後数日間は後腎は血管構造を持たず（Ｓａｘｏｎ Ｌ ａｎｄ Ｓａｒｉｏｌａ Ｈ， （１９８７） Ｐｅｄｉａｔｒ． Ｎｅｐｈｒｏｌ．， １： ３８５−３９２）、それゆえ循環に由来する抗原提示細胞をほとんど、または全く含まない。抗原提示細胞がないことにより、同種移植後腎の免疫原性が低下されることが期待される（Ｌａｃｙ ＰＥ， ｅｔ ａｌ．， （１９８１） Ｄｉａｂｅｔｅｓ， ３０： ２８５−２９１）。第二に、移植された後腎は宿主由来の血管により部分的に血管化される点でキメラ臓器となる。内皮細胞表面上の抗原に対する抗体により開始される拒絶は、移植された臓器が宿主血管により供給される程度まで回避される。
【０００４】
腎臓機能が腎臓内または腹部内への同種後腎の移植による機能ネフロンの付加により亢進され得る可能性が調べられている（Ａｂｒａｈａｍｓｏｎ ＤＲ， ｅｔ ａｌ．， （１９９１） Ｌａｂ． Ｉｎｖｅｓｔ．， ６４：６２９−６３９； Ｒｏｂｅｒｔ Ｂ， ｅｔ ａｌ．， （１９９６） Ａｍ． Ｊ． Ｐｈｙｓｉｏｌ．， ２７１：Ｆ７４４−Ｆ７５３； Ｗｏｏｌｆ ＡＳ， ｅｔ ａｌ．， （１９９０） Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔ．， ３８：９９１−９９７； Ｂａｒａｋａｔ ＴＬ ａｎｄ Ｈａｒｒｉｓｏｎ ＲＧ （１９７１） Ｊ． Ａｎａｔ．， １１０： ３９３−４０７； Ｋｏｓｅｋｉ Ｃ， ｅｔ ａｌ．， （１９９１） Ａｍ． Ｊ． Ｐｈｙｓｉｏｌ．， ２６１：Ｃ５５０−Ｃ５５６）。しかし、これらの研究の結果は、成体ホストへの後腎の移植が移植拒絶により、困難となることを示す（Ａｂｒａｈａｍｓｏｎ ＤＲ， ｅｔ ａｌ．， （１９９１） Ｌａｂ． Ｉｎｖｅｓｔ．， ６４： ６２９−６３９）。
【０００５】
成長因子も移植片拒絶を減少させ、移植片の機能を向上させるために用いられている。Ｃｚａｒｎｉｅｃｋｉらの米国特許第５１３５９１５号は、移植片を移植前の数分から数日の間、形質転換成長因子を含有する処方中に浸すことを開示する。ＴＧＦ−βによる前処理も移植片の拒絶を減少させるとの評判である。Ｈａｌｌｏｒａｎの米国特許第５７２８６７６号はインシュリン様成長因子（ＩＦＧ）を臓器移植の前、最中および後に、移植拒絶を抑制するために投与することを開示している。イヌの腎臓自家移植モデルにおいては、ＩＧＦ−Ｉを添加した保存液に取り出した腎臓を移植の前２４時間浸け、その後同じイヌに戻した場合に、移植後最初の５日間で、腎機能が顕著に改善された（Ｐｅｔｒｉｎｅｃ ｅｔ ａｌ． （１９９６）， Ｓｕｒｇｅｒｙ １２０（２）：２２１−２２６）。
【０００６】
移植拒絶を回避する他の手段には、胎児の後腎を腎臓または網に、被膜下移植することが含まれる（Ｒｏｇｅｒｓ ＳＡ， Ｌｏｗｅｌｌ ＪＡ， Ｈａｍｍｅｒｍａｎ ＮＡ， ａｎｄ Ｈａｍｍｅｒｍａｎ ＭＲ， （１９９８） Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ５４： ２７−３７）。移植後の後腎の生存、成長、分化、血管化および機能化は、腎臓の臓器形成が起こり、血管化された機能キメラ腎臓が生じることを示す。移植された後腎の成長および機能化は、後腎を成長因子に暴露した場合に高まった（Ｒｏｇｅｒｓ ＳＡ， Ｐｏｗｅｌｌ−Ｂｒａｘｔｏｎ Ｌ． ａｎｄ Ｈａｍｍｅｒｍａｎ ＭＲ， （１９９９） Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ２４： ２９３−２９８， Ｈａｍｍｅｒｍａｎ ＭＲ， （２０００） Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ５７： ７４２−７５５）。
【０００７】
発達した腎臓の移植と比べ、移植された後腎はホストによりいっそう血管化され、および免疫反応が抑制されるという点において、後腎は、ヒト腎臓同種移植の使用に対する魅力的な代替法であり得る。従って、腎臓同種移植に用いられるもの同様の、移植前の期間、後腎をインビトロで保存するための方法を開発することが有用である。
【０００８】
発明の概要
前に概説した目的に従い、本発明により胎児後腎組織（ＥＭＴ）保存溶液中に胎児後腎組織を保存する方法が提供される。このように保存された組織は、移植されると機能キメラ腎臓へと発達する。
【０００９】
本発明により、保存溶液中での保存による損傷を最少に抑える薬剤、および／または移植後の組織の機能を高める薬剤の添加または置換により変更されたＥＭＴ保存溶液中に、胎児後腎組織を保存するための方法も提供される。特に、成長因子をＥＭＴ保存溶液に添加してもよい。後腎を保存するための最適温度および時間も開示する。
【００１０】
（発明の詳細な説明）
本発明により、レシピエントへの移植前の胎児後腎の保存が可能となる。手術により取り出した後、後腎を保存溶液に入れる。保存溶液は、保存中の損傷を最少に抑え、レシピエントへの移植後に機能キメラ腎臓が後腎から発達するように設計する。
【００１１】
後腎の保存と腎臓の保存が直接類似することはあり得ないが、後腎を保存するのに用いられる保存溶液の組成は、ヒトの腎臓同種移植に対して保存中の傷害を最少に抑えることが公知の原理に基づく（ＭｃＫａｙ ＤＢ， Ｍｉｌｆｏｒｄ ＥＬ，ａｎｄ Ｓａｙｅｇｈ ＭＨ．  Ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｓｐｅｃｔｓ ｏｆ ｒｅｎａｌ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ．  Ｉｎ：  Ｔｈｅ Ｋｉｄｎｅｙ： Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｐａｔｈｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ． Ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ｂ．Ｍ． Ｂｒｅｎｎｅｒ Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ． Ｗ．Ｂ． Ｓａｕｎｄｅｒｓ， １９９６， ｐ．  ２６０２−２６５２）。
米国特許第５，９７６，５２４号および米国出願第０９／２２２，４６０号に開示されている胎児後腎を単離および移植する方法がここで適用でき、その全容を引用により組み込む。
【００１２】
従って、本発明は「胎児後腎組織」（ＥＭＴ）保存溶液中に後腎を保存する方法に関する。後腎を保存するのに用いられるＥＭＴ保存溶液は、保存中の傷害を最少に抑えるべきである。好ましくは、ＥＭＴ保存溶液の組成には、移植後の後腎からの機能キメラ腎臓の発達に寄与する因子が含まれる。
【００１３】
保存による傷害は、ＥＭＴ保存溶液を設計することにより最少に抑えることができる。構成成分の最初の選択は、既存の保存溶液中に提供されるものにならって設計されてよい。例えば、ウィスコンシン（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）（ＵＷ）保存液は、多数の構成成分を含む。これらの構成成分は、臓器の保存に有益な特性を持つと提案されている（例えば、Ｂｒｅｎｎａｎ， ＤＣ ａｎｄ Ｌｏｗｅｌｌ， ＪＡ．：死体提供／臓器調達に関する移植前調製。Ｂｒｅｎｎａｎ， ＤＣ ａｎｄ Ｌｏｗｅｌｌ， ＪＡ．  Ｐｒｅ−ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｃａｄａｖｅｒ ｄｏｎｏｒ／ｏｒｇａｎ ｐｒｏｃｕｒｅｍｅｎｔ．  Ｉｎ： Ｐｒｉｍｅｒ ｏｎ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ． Ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ ＤＪ Ｎｏｒｍａｎ ａｎｄ ＷＮ Ｓｕｋｉ， Ａｍ． Ｓｏｃ． Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｃｉａｎｓ Ｐｒｅｓｓ， Ｔｈｏｒｏｆａｒｅ， １９９８， ｐｐ． １９７−２０４を参照されたい。）。低体温誘導性浸透膨張（ｏｓｍｏｔｉｃ ｓｗｅｌｌｉｎｇ）およびナトリウムポンプ麻痺を最小に抑えるよう提案されたＵＷ溶液中に提供される成分には、ラクトビオネート、ラフィノースおよびヒドロキシエチルスターチが含まれる。間質空間の拡張を最小に抑えるのに提案されている成分には、ヒドロキシエチルスターチが含まれる。酸素を含まないラジカルの発生を低下すると考えられているがゆえに含まれる成分には、アロプリノールおよび／またはグルタチオンがある。高エネルギーリン酸化合物の消耗を低下させるまたは防止するために、ＵＷ溶液はアデノシンを成分として含む。
【００１４】
別法として、好ましくは所定の成分が除かれる。例えば、グルコースは、細胞内アシドーシスを最小に抑えるために、ＵＷ溶液には好ましくは含まれない。
好ましい具体例では、ＥＭＴ保存溶液はＵＷ溶液、ｐＨ７．４（ＤｕＰｏｎｔ Ｐａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、ＶｉａＳｐａｎ（登録商標）の名称下に販売されている）であり、表１に示す組成を有する。
【００１５】
表１．ＥＭＴ保存溶液の組成
【表１】
2004519481.tif 000002
【００１６】
ＥＭＴ保存溶液は、その「保存性」を改良するために、化合物を省略、置換または添加することにより変更されてもよい。本明細書中、「保存性」は移植後の後腎の発達および分化を高める要素をいう。一般に化合物は、胎児の後腎が移植前にＥＭＴ保存溶液に保存され得る時間の長さを延長する特性に基づいて選択される。
【００１７】
例えば、いくつかの具体例において、ポリエチレングリコールなどの剤を、表１のＥＭＴ保存溶液中のヒドロキシエチルスターチに代えてよい。他の具体例では、電解質、トリヨードチロニン、およびコルチゾールなどの化合物を、ＥＭＴ溶液の保存性を改良するために添加してよい。
【００１８】
ＥＭＴ溶液に対するそのような変更は、表１に示す組成を有するＥＭＴ溶液、例えば、ＵＷ溶液中に保存した後腎の腎機能および／または発達を、成分の添加または削除により変更されたＥＭＴ溶液に保存された後腎と比較することにより試験することができる。好ましくは、変更により、ＥＭＴ溶液の保存性が改良される。
【００１９】
ＥＭＴ保存溶液は、また、レシピエントへ移植した場合に胎児後腎の機能を高めるべく設計される。言いかえれば、レシピエントへの移植後に腎臓の発達および／または機能を促進する化合物をＥＭＴ保存溶液に添加してもよい。腎臓の発達は、腎臓の重量、血管化および腎臓組織、例えば糸球体、細管、腎乳頭および尿管の形成により判断してよい。腎機能は、イヌリンまたはクレアチニンのクリアランスにより測定することができる。
【００２０】
好ましい具体例では、ＥＭＴ保存溶液は成長因子の添加により変更される。本明細書中に用いられる、後腎の保存に用いる「成長因子」なる語句は、移植した場合に後腎組織の腎発達または機能を促進するあらゆる分子をいう。つまり、該語句は、後腎組織の成長、増殖、および／または分化を促進する成長因子を包含する。
【００２１】
好ましい成長因子には、タムホースフォール（Ｔａｍｍ Ｈｏｒｓｆａｌｌ）糖タンパク質（ＴＨＧ）、形質転換成長因子アルファ（ＴＧＦα）、インシュリン様成長因子（ＩＧＦｓ）、特にＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩなどのＥＧＦレセプターのリガンド；繊維芽細胞成長因子、特に塩基性繊維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、ビタミンＡおよび例えばレチノイン酸などのその誘導体；血管内皮細胞成長因子（ＶＥＧＦ）；肝細胞成長因子（ＨＧＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、トランスフェリン、プロスタグランジンＥ１（ＰＧＥ１）、ヒト組換えインターロイキン１０、およびコルチコトロピン放出ホルモン（ＣＲＨ）が含まれる。
【００２２】
後腎成長因子を定義するのに用いられる語のそれぞれには、所定のファミリーの全メンバーが含まれる。例えば、繊維芽細胞成長因子ファミリーは、少なくとも１５の構造的に関連したポリペプチド成長因子から成る（Ｓｚｅｂｅｎｙｉ ａｎｄ Ｆａｌｌｏｎ （１９９９） Ｉｎｔ． Ｒｅｖ． Ｃｙｔｏｌ．， １８５：４５−１０６）。
【００２３】
含まれてよい他の成長因子は、上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）およびアンフィレグリン；成長ホルモン、血小板誘導性成長因子、白血病阻害因子（ＬＩＦ）、アンジオポエチン１および２、および骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、ＴＧＦ−βおよびＴＧＦ−βファミリーの他のメンバーなどのサイトカイン（Ａｔｒｉｓａｎｏ ｅｔ ａｌ． （１９９４）， Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ １２２２：７１−８０を参照されたい）、成長ホルモン（ＧＨ）（Ｈａｍｍｅｒｍａｎ， Ｍ．Ｒ． （１９９５）， Ｓｅｍｉｎａｒｓ ｉｎ Ｎｅｐｈｒｏｌｏｇｙを参照されたい）およびセレン化ナトリウムである。
【００２４】
好ましい具体例では、以下の成長因子の１またはそれ以上をＥＭＴ保存溶液に添加する：ＩＧＦ  Ｉ；ＩＧＦ  ＩＩ；ＴＧＦα；ＨＧＦ；ＶＥＧＦ；ｂＦＧＦ；ＮＧＦ；ＲＡ；ＣＲＨ；ＴＨＧ；プロスタグランジンＥ１および鉄飽和トランスフェリン。約１ｎｇ／ｍｌから１０μｇ／ｍｌの濃度が、ほとんどの成長因子に関して、通常十分である。所定の成長因子の濃度は、滴定実験を用いて最適化することができる。
【００２５】
公知の方法を用いて、化合物の添加、置換または省略が、レシピエントに移植した際の保存された後腎の腎機能を維持および／または促進することができる時間を増すことができるかどうかを容易に決定することができる。例えば、組織分化の範囲および程度の比較を、直接移植した後腎とＥＭＴ保存溶液に保存した後腎との間で成すことができる。ある場合には、保存された後腎と直接移植された後腎の間の腎機能における違いは、イヌリンクリアランスおよび尿容量を測定することにより検出することができる。
【００２６】
加えて、保存後の固定した後腎においてＴＵＮＥＬ染色を用いて、所定の成長因子が後腎の発達および分化を高める効果を測定してもよい（Ｓｏｒｅｎｓｏｎ， ｅｔ ａｌ． （１９９５） Ａｍ． Ｊ． Ｐｈｙｓｉｏｌ．， ２６８：Ｆ７３−Ｆ８１）。
本発明の方法を用いて胎児後腎を保存すると、レシピエントへの移植後に機能キメラ腎臓が発達する。本明細書中「保存された」は、移植前のある期間、単離した胎児後腎を保存することを意味する。保存につき重要な条件には、温虚血および冷虚血の持続時間が含まれる。
【００２７】
一般に、後腎を手術により取り出すのに必要とされる時間として本明細書中に定義する「後腎温虚血」の持続時間は、２０分未満であろう。好ましい具体例において、温虚血の持続時間は、温虚血の継続を１５分未満に維持することにより最小にする。
【００２８】
同様に、後腎をＥＭＴ保存溶液中に保存してよい期間として本明細中に定義する「後腎の冷虚血」の持続時間は、１４日未満である。好ましい具体例では、冷虚血の持続時間は３日である。
胎児後腎を保存するのに用いられるＥＭＴ保存溶液の温度は冷温であることが重要である。好ましい具体例では、ＥＭＴ保存溶液の温度は０〜４℃の間に維持する。特に好ましい具体例では、ＥＭＴ保存溶液は氷冷温度である。氷冷ＥＭＴ溶液は、ＥＭＴ保存溶液を氷浴中に置くことにより得られる。
【００２９】
保存前に、後腎組織を胎児の発達の適当な段階において１またはそれ以上の適当な哺乳動物ドナーから取り出す。好ましくは、後腎組織は、後腎が形成を開始した後すぐか、および後腎内部に生じるか、後腎内または後腎外から生じるかする血管が存在する前に採取する。後腎の発達に関し、非常に後期に採取した組織、例えば、目で認識できる血管を有する組織は多くの抗原提示細胞および細胞表面抗原を含む可能性があり、および従って、レシピエントによる拒絶の脅威の多くを示す。好ましくは、採取された後腎は後腎芽、尿管芽のセグメントおよびネフロンプレカーサーを含み、糸球体を含まない。
【００３０】
後腎を採取するのに好ましい発達段階は、ドナーの種により変わる。一般には、後腎は好ましくは後腎の形成後１〜５日で採取する。好ましくは、後腎は後腎の形成後１〜４日で、およびより好ましくは後腎の形成後約２〜４日で採取する。ラットでは、後腎は２２日の妊娠期間の１２．５日目に、マウスにおいては１９日の妊娠期間の１１日目に形成される。これらの種において、マウスまたはラットのドナーの後腎を採取するために適当な期間は、典型的には後腎が形成を開始してから２〜４日の間である。好ましくは、後腎は後腎の形成開始後３日以内に採取する。
【００３１】
もっと長い妊娠期間を有する種では、後腎をその形成後に採取する好ましい期間はもっと長くあり得る。一般に、後腎を採取する期間はドナーの全妊娠期間の約４分の１未満、好ましくはドナーの全妊娠期間の約７分の１未満、およびより好ましくはドナーの全妊娠期間の約１０分の１未満である。表２は、いくつかの脊椎動物における後腎の発達の時間経過（日にて）および妊娠期間を示す。
【００３２】
【表２】
2004519481.tif 000003
【００３３】
ブタは、同等の臓器サイズおよび入手可能性のために、ヒトにとって好ましい異種ドナーである。さらに、ブタの消化、循環、呼吸および腎臓生理はヒトのものと非常に類似している。腎機能の場合、ミニブタの最大の腎臓濃縮能力（１０８０ｍＯｓｍｌ−１）、全腎臓血流（３．０−４．４ｍｌ分−１ｇ−１）および腎糸球体濾過速度（１２６−１７５ｍｌ分−１７０ｋｇ）は、ヒトのものと実質上同一である（Ｓａｃｈｓ ＤＨ （１９９４）， Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ ４３：１８５−１９１を参照されたい。）。移植拒絶の可能性を減じるべく「ヒト化された」トランスジェニックブタ由来の後腎を使用することにより、更なる利点が得られる（例えば、Ｐｉｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ． （１９９７）， Ｊ． Ｈｅａｒｔ Ｌｕｎｇ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ １６：２３１−２３９を参照されたい）。ブタの後腎は、約１０ｍｍの段階で採取する。これは、約２０日胚と３０日胚の間で生じる。ヒトの組織を移植のための同種源として用いることが可能であった。
【００３４】
後腎を、既に開示されているように手術により取り出し（Ｒｏｇｅｒｓ ｅｔ ａｌ． （１９９８）， Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔ．， ５４：２７−３７を参照されたい。）、移植するまでＥＭＴ保存溶液に入れる。移植のためには、全後腎を無傷の腎被膜と共に用いることが好ましい。レシピエントが必要とするネフロン量の増大に依存して、レシピエント当たり１またはそれ以上の後腎を用いてよい。
後腎組織を移植するために、レシピエントを手術して１または両方の腎臓を露出した。後腎移植のための手術法は、当該分野で周知である（例えば、Ｒｏｇｅｒｓ ＳＡ， Ｌｏｗｅｌｌ ＪＡ， Ｈａｍｍｅｒｍａｎ ＮＡ， ａｎｄ  Ｈａｍｍｅｒｍａｎ ＭＲ， （１９９８） Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ５４：２７−３７； Ｒｏｇｅｒｓ ＳＡ， Ｐｏｗｅｌｌ−Ｂｒａｘｔｏｎ Ｌ． ａｎｄ Ｈａｍｍｅｒｍａｎ ＭＲ， （１９９９） Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ２４：２９３−２９８， Ｈａｍｍｅｒｍａｎ ＭＲ， （２０００） Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ５７： ７４２−７５５）。
【００３５】
以下の実施例により、前記発明を用いる方法をより完全に記載し、ならびに発明の種々の態様を遂行するための最良の様式を示す。これらの実施例は、決して本発明の範囲を制限するものではなく、むしろ説明上の目的のために示すものである。本明細書に示す全引用文献は、引用により組み込む。
【００３６】
実施例
実施例１
胎児後腎の保存
方法
手術で切開してＥ１５Ｓｐｒａｑｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット胎児から解剖顕微鏡下で既に開示されている方法（Ｒｏｇｅｒｓ ＳＡ， Ｌｏｗｅｌｌ ＪＡ，  Ｈａｍｍｅｒｍａｎ ＮＡ， ａｎｄ Ｈａｍｍｅｒｍａｎ ＭＲ．， （１９９８） Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ５４：２７−３７）を用いて後腎を取り出し、氷冷にてＵＷ溶液中に入れた。特に示す場合には、移植された後腎の機能を高めることがすでに示されている以下の成長因子（Ｈａｍｍｅｒｍａｎ ＭＲ．， （２０００） Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ５７： ７４２−７５５； Ｈａｍｍｅｒｍａｎ ＭＲ．， （２０００） Ｐｅｄｉａｔｒｉｃ Ｎｅｐｈｒｏｌｏｇｙ １４：５１３−５１７； Ｒｏｇｅｒｓ ＳＡ， Ｐｏｗｅｌｌ−Ｂｒａｘｔｏｎ Ｌ．， ａｎｄ  Ｈａｍｍｅｒｍａｎ ＭＲ．， （１９９９） Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ２４：２９３−２９８）をＵＷ溶液に添加した（ＵＷ＋成長因子）：組換えヒトインシュリン様成長因子Ｉ（ＩＧＦ  Ｉ）（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ Ｉｎｃ． Ｓ． Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ ＣＡ）、１０−７Ｍ；組換えヒトＩＧＦ  ＩＩ（Ｂａｃｈｅｍ Ｉｎｃ．， Ｔｏｒｒａｎｃｅ ＣＡ）１０−７Ｍ；組換えヒト形質転換成長因子α（ＴＧＦα）（Ｕｐｓｔａｔｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｃ． Ｌａｋｅ Ｐｌａｃｉｄ ＮＹ）、１０−８Ｍ；組換えヒト肝細胞成長因子（ＨＧＦ）（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ， Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ ＭＮ）、１０−８Ｍ；組換えヒト血管内皮細胞成長因子（ＶＥＧＦ）（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ Ｉｎｃ．）、５μｇ／ｍｌ；組換えヒト塩基性繊維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、５μｇ／ｍｌ；組換えヒト神経成長因子（ＮＧＦ）（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ， Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ ＩＮ）、５μｇ／ｍｌ；レチノイン酸（ＲＡ）（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ ＭＯ）、１０−６Ｍ；コルチコトロピン放出ホルモン（ＣＲＨ）（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）、１μｇ／ｍｌ；タムホースフォールタンパク質（ＴＨＰ）（Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ． Ｓｔｏｕｇｈｔｏｎ， ＭＡ）、１μｇ／ｍｌ；２５ｍＭプロスタグランジンＥ１、および鉄飽和トランスフェリン（５μｇ／ｍｌ）。
【００３７】
いくつかの後腎を、氷上にてＵＶ溶液またはＵＷ溶液＋成長因子中にて４５分間インキュベートした後、麻酔した６週齢の雌の（ホスト）Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙラットの網に直接移植した。他の後腎は、１ｍｌの氷冷ＵＷ溶液またはＵＷ＋成長因子入りの２ｍｌのねじぶた付き滅菌プラスチックマイクロ遠心チューブ（Ｆｉｓｈｅｒ， Ｈｏｕｓｔｏｎ ＴＸ）中に保存した３日後に移植した。同手術中、ホストラットから１の腎臓を取り除いた。
【００３８】
特に示す場合には、移植後４週目に、網に移植された後腎の尿管と、取り出した腎臓の尿管の間で顕微鏡下微細血管手術（エンド−ツー−エンドの尿管管造瘻（断続１０−０縫合）術を施した。８週間後、残る全てのラット本来の腎臓組織（反対側の腎臓）をホストラットから取り出し、この後、意識のあるラットにおいて、膀胱留置カテーテルおよび静脈ラインを先の研究通りに置いた後、イヌリンクリアランスを測定した（Ｒｏｇｅｒｓ ＳＡ， Ｌｏｗｅｌｌ ＪＡ， Ｈａｍｍｅｒｍａｎ ＮＡ， ａｎｄ Ｈａｍｍｅｒｍａｎ ＭＲ．， （１９９８） Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ５４：２７−３７）。
【００３９】
イヌリンに関するベースライン測定は、イヌリン注入開始前に採取した尿および血液サンプルで行った。これらの「バックグラウンド値」を、イヌリン注入開始後に行った測定値から差し引いた。注入は、残る全てのラット本来の腎臓組織を取り出し、次いで膀胱中に残っている全ての尿（１０−２０μｌ）を排出した後にのみ開始した。留っている移植後腎のみが膀胱につながっている。先の研究同様、ラットは免疫抑制剤を投与されなかった（Ｒｏｇｅｒｓ ＳＡ， Ｌｏｗｅｌｌ ＪＡ， Ｈａｍｍｅｒｍａｎ ＮＡ，  ａｎｄ Ｈａｍｍｅｒｍａｎ ＭＲ．， （１９９８） Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ５４：２７−３７）。
【００４０】
後腎を固定し、パラフィン包埋し、切片化し、次いでヘマトキシリンおよびエオシンをまさに先の研究のように用いて染色した（Ｒｏｇｅｒｓ ＳＡ， Ｌｏｗｅｌｌ ＪＡ， Ｈａｍｍｅｒｍａｎ ＮＡ，  ａｎｄ Ｈａｍｍｅｒｍａｎ ＭＲ．， （１９９８） Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ５４：２７−３７）。Ｅ１３後腎の臓器培養をダルベッコの変更イーグル媒地：ＨａｍｓＦ１２（ＤＭＥＭ：ＨＦ１２）溶液中ですでに記載されている通りに行った（Ｒｏｇｅｒｓ ＳＡ， Ｒｙａｎ Ｇ，  ａｎｄ Ｈａｍｍｅｒｍａｎ ＭＲ．， （１９９１） Ｊ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ．， １１３：１４４７−１４５４， Ｒｏｇｅｒｓ ＳＡ， Ｒｙａｎ Ｇ， ａｎｄ Ｈａｍｍｅｒｍａｎ ＭＲ．， （１９９２） Ａｍ． Ｊ． Ｐｈｙｓｉｏｌ． Ｒｅｎａｌ Ｆｌｕｉｄ Ｅｌｅｃｔｒｏｌｙｔｅ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ ２６２：Ｆ５３３−Ｆ５３９）。
表３に示すデータに関する多重比較を、Ｓｔｕｄｅｎｔ−Ｎｅｗｍａｎ−Ｋｅｕｌｓ多重比較試験を用いて行った。
【００４１】
結果
図１ａ、ｃ、ｅおよびｇには、ラットの後腎のヘマトキシリンおよびエオシン染色切片の顕微鏡写真を示す。図１ａ、ｃ、ｅおよびｇそれぞれに示す後腎に関して、図１ｂ、ｄ、ｆおよびｈではより高倍率の視野を示す。図１ａおよびｂは未分化の後腎芽（ＭＢ）および尿管芽（ＵＢ）の分枝から主として成るＥ１５後腎を示す。腎形成ゾーンを矢印で示す。図１ｃおよびｄは、氷冷ＵＷ溶液中での保存３日後のＥ１５後腎を示す。保存３日後のＥ１５後腎のサイズ（正中矢状面の径）は、非保存Ｅ１５後腎のもの（図１ａ）とほぼ同じである。１日年齢が高い胎児由来であるがゆえに予想されるように、Ｅ１６後腎（図１ｅ）はＥ１５後腎（図１ａ）よりも大きい。しかし、Ｅ１６後腎（図１ｅ）は、３日間保存されたＥ１５後腎（図１ｃ）よりも大きく、Ｅ１５後腎（図１ｂ）またはＥ１５保存後腎（図１ｄ）のいずれよりも広い腎形成ゾーン（図１ｆ矢印）を有する。
【００４２】
図１ｂに示すＥ１５後腎同様、図１ｄに示すＥ１５保存後腎は未分化の後腎芽（ＭＢ）および尿管芽の分枝から主として成る。これに対して、Ｅ１６後腎においては、もっと発達したネフロン構造、例えばＳ型体（Ｓ）を示すことができる（図１ｆ）。
【００４３】
図１ｇおよびｈに、臓器培養３日後のＥ１３ラット後腎の顕微鏡写真を示す。そのサイズは図１ａおよび１ｃに示す後腎のものとほぼ同じであるが、ネフロン構造の分化状態、例えば図１ｈに示すＳ型体などは、先の研究（Ｈａｍｍｅｒｍａｎ ＭＲ， Ｒｏｇｅｒｓ， ＳＡ ａｎｄ Ｒｙａｎ Ｇ， （１９９２）， Ａｍ． Ｊ． Ｐｈｙｓｉｏｌ． Ｒｅｎａｌ Ｆｌｕｉｄ Ｅｌｅｃｔｒｏｌｙｔｅ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ ２６２：Ｆ５２３−Ｆ５３２， １９９２； Ｒｏｇｅｒｓ ＳＡ， Ｐａｄａｎｉｌａｍ ＢＪ， Ｈｒｕｓｋａ ＫＡ， Ｇｉａｃｈｅｌｌｉ ＣＭ， ａｎｄ  Ｈａｍｍｅｒｍａｎ ＭＲ．， （１９９７）， Ａｍ． Ｊ． Ｐｈｙｓｉｏｌ．  Ｒｅｎａｌ Ｆｌｕｉｄ Ｅｌｅｃｔｒｏｌｙｔｅ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ ２７２：Ｆ４６９−Ｆ４７６）に報告されているものに匹敵し、Ｅ１５後腎（図１ｂ）またはインビトロでの保存３日後のＥ１５後腎（図１ｄ）に関して示すものよりも進んでいる。
【００４４】
ＵＷ＋成長因子に保存したＥ１５後腎は、ＵＷ溶液に保存したＥ１５後腎から組織学的に区別することができた（示していない）。
図１に示すデータでは、氷上ＵＷ溶液中での保存の３日（１８日の暦年齢）の間にＥ１５後腎が多少発達する可能性があることは除外されない。しかし、生じた発達はいずれも、低い年齢の後腎、臓器培養３日後のＥ１３後腎（１６日の暦年齢）（図１ｇおよびｈ）またはＥ１６後腎（１６日の暦年齢）（図１ｅおよびｆ）などにおいて認められるよりもかなり小さい。
【００４５】
図２には、ホストラットの腹膜に移植４週後の発達したＥ１５後腎のヘマトキシリン＆エオシン染色切片の顕微鏡写真である。後腎は移植前の３日間、ＵＷ溶液（成長因子なし）に保存した。
移植前にインビトロで保存していないＥ１５後腎に関してすでに示されているように（Ｒｏｇｅｒｓ ＳＡ， Ｌｏｗｅｌｌ ＪＡ， Ｈａｍｍｅｒｍａｎ ＮＡ， ａｎｄ Ｈａｍｍｅｒｍａｎ ＭＲ．， （１９９８），  Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ５４：２７−３７）、移植された発達した保存後腎は腎臓の形をしている（図２ａ）。尿管（ｕ）が存在する。皮質は、分化したように見える糸球体（ｇ）および近位尿細管（ｐｔ）および遠位尿細管（ｄｔ）を含む（図２ｂ）。髄質は分化した集合管（ｃｄ）を含む（図２ｃ）。
直接、または成長因子含有ＵＷ溶液若しくは不含ＵＷ溶液に保存した３日後に移植した後腎において、重量、尿容量およびイヌリンクリアランスを、移植１２週後に測定した。
【００４６】
ＵＷ溶液に成長因子を添加した場合（成長因子を含まない場合と比較して）、直接移植された後腎に関しては重量が増加したが、保存の３日後に移植した後腎においては増加しなかった（表３）。イヌリンクリアランスの際に測定された尿容量は、保存された後腎に関し、全他のグループと比較して、ＵＷ溶液へ成長因子を添加することにより有意に増加した。
【００４７】
イヌリンクリアランスは、μｌ／分／１００ｇラット体重として示した。ラットの体重はイヌリンクリアランス測定時、グループ間で異ならなかった（表３）。直接移植された発達した後腎のクリアランス（０．４３±０．０６μｌ／分／１００ｇ）または成長因子不含ＵＷ溶液に保存した３日後のクリアランス（０．３８±０．０８μｌ／分／１００ｇ）は、ＳＤ−ＳＤ移植腎臓に対して既に測定されているクリアランス（Ｒｏｇｅｒｓ ＳＡ， Ｌｏｗｅｌｌ ＪＡ， Ｈａｍｍｅｒｍａｎ ＮＡ， ａｎｄ Ｈａｍｍｅｒｍａｎ ＭＲ．， （１９９８） Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ５４：２７−３７； Ｒｏｇｅｒｓ ＳＡ， Ｐｏｗｅｌｌ−Ｂｒａｘｔｏｎ Ｌ． ａｎｄ Ｈａｍｍｅｒｍａｎ ＭＲ．， （１９９９）  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ２４：２９３−２９８； Ｒｏｇｅｒｓ ＳＡ， Ｌｉａｐｉｓ Ｈ， ａｎｄ Ｈａｍｍｅｒｍａｎ ＭＲ．， （２００１） Ａｍ． Ｊ． Ｐｈｙｓｉｏｌ． Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ ２８０： Ｒ１３２−Ｒ１３６）に匹敵した。ＵＷ溶液に成長因子を添加することで、直接移植された発達した後腎において測定されたイヌリンクリアランス（１．１±０．２μｌ／分／１００ｇ）または保存３日後に移植された後腎において測定されたイヌリンクリアランス（１．２±０．２μｌ／分／１００ｇ）は、成長因子に暴露しなかった後腎の全グループにおいて測定されたクリアランスと比較して増加した（表３）。
【００４８】
【表３】
2004519481.tif 000004
【００４９】
実施例２
胎児後腎の保存における成長因子の効果
方法
実施例１に記載するように、後腎を手術にて摘出し、次いで成長因子含有または成長因子不含氷冷ＵＷ溶液中に入れた。添加濃度および成長因子は実施例１に示すもの同様であった。保存の１、５または７日後、後腎を実施例１に記載したように移植した。機能キメラ腎臓への後腎の発達は、実施例１に示したように測定した。
【００５０】
結果
表４に示すように、成長因子不含ＵＷ溶液において５または７日間保存した後腎はいずれも移植がおこらなかった。これに対して、ＵＷ溶液＋成長因子に５または７日間保存された５の後腎の１つは機能腎臓へと発達した。
【００５１】
【表４】
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【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、Ｅ１５ラット胎児起源（ａ、ｂ）；ＵＷ溶液中の保存３日後のＥ１５ラット胎児起源（ｃ、ｄ）；Ｅ１６ラット胎児起源（ｅ、ｆ）；または３日間の臓器培養物中で生育させたＥ１３後腎起源（ｇ、ｈ）の後腎のヘマトキシリンおよびエオシン染色正中矢状面切片の顕微鏡写真を示す。後腎芽（ＭＢ）、尿管芽（ＵＢ）の分枝セグメントおよび発達期のネフロンＳ型体を示す。矢印は腎臓組織を形成するゾーンを示す。顕微鏡写真は１０を越す実験の典型例である。倍率は、ａ、ｃ、ｅおよびｇは（ａ）、およびｂ、ｄ、ｆおよびｈは（ｂ）。
【図２】図２はホスト腹腔に移植した４週間後の発達したＥ１５後腎のヘマトキシリンおよびエオシン染色切片の顕微鏡写真を示す。後腎を移植前の３日間、ＵＷ溶液に保存した。ａ）尿管（ｕ）を示す。ｂ）糸球体（ｇ）、（矢先で）輪郭をたどった刷子縁膜を有する近位尿細管（ｐｔ）および遠位尿細管（ｄｔ）を示す。ｃ）分化した集合管を示す（ｃｄ）。
顕微鏡写真は１０を越す実験の典型例である。倍率は、（ａ）および（ｂ）および（ｃ）に記載している。
【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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