(57)【要約】本発明は、活性および／または調節配列あるいはウイルス性成分の特異性を評価する方法に関するものであり、ウイルス性ベクターは、染色体内に１あるいはそれ以上のウイルス性配列を含む遺伝子組み換え非ヒト動物の細胞に導入される。しかしながら、上記遺伝子組み換え動物は、ウイルスの生成に必要なウイルス性配列を少なくとも１つ欠乏している。このウイルス性配列は、遺伝子組み換え動物の細胞に導入されたウイルス性ベクターを含んでおり、これによって、遺伝子組み換え動物におけるウイルス性粒子が複製する。遺伝子組み換え動物を適切な条件下で維持することで、ウイルス性粒子の生成、ウイルス性粒子が生成する細胞が、それぞれ検出され、評価される。本発明の方法はまた、動物のリガンドに対するレセプターの分布の評価に適用させることができる。本発明ではまた、本発明にかかる方法を用いた遺伝子組み換え非ヒト動物を提供する。
2004535151.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
活性および／または、調節配列あるいはウイルス性成分の特異性を評価する方法であって、
ａ）ウイルスの発生に必要なウイルス性配列を少なくとも１つ欠乏しているが、ゲノム内に１あるいはそれ以上のウイルス性配列を含んでいる遺伝子組み換え非ヒト動物の細胞に、少なくとも１つのウイルス性配列を含むウイルス性ベクターを導入することによって、遺伝子組み換え動物の細胞内にウイルス性粒子を複製する工程と、
ｂ）遺伝子組み換え動物の細胞内にウイルス性粒子が生成するように、遺伝子組み換え動物を適切な条件下で維持する工程と、
ｃ）ウイルス性粒子が生成した細胞を検出する工程とを含んでいることを特徴とする方法。
【請求項２】
ウイルス性成分が、ウイルス性表面タンパク質であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ａ）ウイルスの生成に必要なウイルス性表面タンパク質をコードする遺伝子を含むウイルス性配列を少なくとも欠乏しているが、ゲノム内に１あるいはそれ以上のウイルス性配列を含んでいる遺伝子組み換え非ヒト動物に、少なくともウイルス性配列を含んでいるウイルス性ベクターを導入することによって、遺伝子組み換え動物の細胞におけるウイルス性粒子を複製する工程であって、この際ウイルス性表面タンパク質をコードするウイルス性配列コードはこの配列の発現の際に細胞レセプターと相互作用するよう近接したタンパク質の部分の配列を含む修飾されたウイルス性表面タンパク質が生成されるようにコード化配列を含んでいる、という工程と、
ｂ）遺伝子組み換え動物の細胞内にウイルス性粒子が生成するように、遺伝子組み換え動物を適切な条件下で維持する工程と、
ｃ）ウイルス性粒子の生成された細胞を検出する工程とを含んでいることを特徴とする方法。
【請求項４】
遺伝子組み換え非ヒト動物が、哺乳動物、好ましくはげっし動物、特に好ましくはマウスであることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
遺伝子組み換え非ヒト動物が、重症複合型免疫不全（ＳＣＩＤ）マウスであることを特徴とする請求項４に記載の方法。
【請求項６】
遺伝子組み換え動物が、パッケージング信号に対するウイルス性配列コードを不完全にしていることを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
パッケージング信号に対するウイルス性配列コードが欠失されていることを特徴とする請求項６に記載の方法。
【請求項８】
遺伝子組み換え非ヒト動物のゲノム内に含まれるウイルス性配列の発現および／または翻訳が、遍在性の、恒常的に活性な調節配列によって制御されることを特徴とすることを特徴とする請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
活性および／または調節配列の特異性を評価する方法であって、ベクターに含まれる少なくとも１つのウイルス性配列の発現および／または翻訳が、解析される調節配列によって制御されることを特徴とする請求項１、２および４〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
表面遺伝子の発現および／または翻訳が、解析される調節配列によって制御されることを特徴とする請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
表面遺伝子がｅｎｖをコードする遺伝子であり、特に、広宿主性のｅｎｖに対してコードする遺伝子であることを特徴とする請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
解析される調節配列が、標的遺伝子治療に適していることを特徴とする請求項９〜１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
ウイルスの表面タンパク質の特異性の評価あるいは動物のレセプターの分布の評価において、遺伝子組み換え動物がウイルス性表面タンパク質をコードするウイルス性配列を不完全にしていることを特徴とする請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
ウイルス性表面タンパク質をコードするウイルス性配列が欠失されていることを特徴とする請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
ウイルス性ベクターに含まれるウイルス性表面遺伝子の発現および／または翻訳が、遍在性の、恒常的に活性な調節配列によって制御されることを特徴とする請求項１３または１４に記載の方法。
【請求項１６】
表面タンパク質が、標的遺伝子治療に適しているものであることを特徴とする請求項１３〜１５のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
ウイルス性配列およびウイルス性ベクターが、レトロウイルス性に由来することを特徴とする請求項１〜１６のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
遺伝子組み換え動物が、レトロウイルスベクターで形質移入されている、および／または、上記レトロウイルス性ベクターを含むレトロウイルス性粒子に感染されていることを特徴とする請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
遺伝子組み換え動物のゲノム内に含まれているレトロウイルス性ベクターおよびレトロウイルス性配列が、レトロウイルスの同じ型に由来していることを特徴とする請求項１７または１８に記載の方法。
【請求項２０】
レトロウイルス性配列が、マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）に由来していることを特徴とする請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
活性および／または調節配列の特異性の評価において、調節配列がレトロウイルス性ベクターの末端反復配列（ＬＴＲ）に挿入されていることを特徴とする請求項１７〜２０のいずれかに記載の方法。
【請求項２２】
調節配列がＬＴＲのＵ３領域に挿入されていることを特徴とする請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
レトロウイルス性ベクターが、プロモーター転換ベクターに基づいていることを特徴とする請求項１７〜２２のいずれかに記載の方法。
【請求項２４】
レトロウイルス性ベクターが、レトロウイルス性配列に加えて、非相同性遺伝子を含んでいることを特徴とする請求項１７〜２３のいずれかに記載の方法。
【請求項２５】
非相同性遺伝子が、治療的遺伝子、抗腫瘍遺伝子および／またはマーカー遺伝子であることを特徴とする請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
マーカー遺伝子が、緑色蛍光タンパク質（ｇｆｐ）遺伝子および／またはゼオシン耐性遺伝子であることを特徴とする請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
非相同性遺伝子が、内部リボゾーム侵入部位に効率よく結合していることを特徴とする請求項２４〜２６のいずれかに記載の方法。
【請求項２８】
請求項１〜２７のいずれかに記載の方法によって得られる遺伝子組み換え非ヒト動物。
【請求項２９】
ゲノム体内に１あるいはそれ以上のウイルス性配列を含んでいるが、ウイルスの発生に必要なウイルス性配列を少なくとも１つ欠乏しており、遺伝子組み換え動物の細胞へ少なくとも１つのウイルス性配列が導入されることによってウイルス性粒子を生成し、遺伝子組み換え動物において上記ウイルス性粒子を拡散することを特徴とする遺伝子組み換え非ヒト動物。
【請求項３０】
遺伝子組み換え非ヒト動物がマウスであることを特徴とする請求項２９に記載の遺伝子組み換え動物。
【請求項３１】
マウスが、重症複合型免疫不全（ＳＣＩＤ）マウスであることを特徴とする請求項３０に記載の遺伝子組み換え動物。
【請求項３２】
遺伝子組み換え動物が、表面タンパク質をコードするウイルス性配列を不完全にしていることを特徴とする請求項２９〜３１のいずれかに記載の遺伝子組み換え動物。
【請求項３３】
遺伝子組み換え動物の遺伝子に含まれているウイルス性配列の発現および／または翻訳が、遍在性の、恒常的に活性な調節配列によって制御されることを特徴とする請求項２９〜３２のいずれかに記載の遺伝子組み換え動物。
【請求項３４】
ウイルス性配列が、レトロウイルス性に由来していることを特徴とする請求項２９〜３３のいずれかに記載の遺伝子組み換え動物。
【請求項３５】
調節配列が、ＳＶ４０エンハンサーおよび／またはプロモーター、β−アクチンプロモーター、ＲＯＳＡ２６プロモーター、ＣＤＣ１０プロモーター、ユビキチンプロモーターおよび／またはＭＬＶプロモーターを含む群の要素から選ばれることを特徴とする請求項３３および３４に記載の遺伝子組み換え動物。
【請求項３６】
レトロウイルス性配列が、マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）に由来していることを特徴とする請求項３４または３５に記載の遺伝子組み換え動物。
【請求項３７】
請求項１〜２７のいずれかに記載の方法における、請求項２９〜３９のいずれかに記載の遺伝子組み換え動物の使用。
【発明の詳細な説明】
本発明は、活性および／または調節配列またはウイルス性成分の特異性を評価する方法に関するものであって、ウイルス性ベクターは、ゲノム内に１あるいはそれ以上のウイルス性配列を含んでいる遺伝子組み換え非ヒト動物に導入されている。しかしながら、上記遺伝子組み換え動物は、ウイルスの発生に必要なウイルス性配列を少なくとも１つ欠乏している。このウイルス性配列は、遺伝子組み換え動物の細胞内に導入されたウイルス性ベクターに含まれ、これにより、遺伝子組み換え動物におけるウイルス性粒子が複製される。遺伝子組み換え動物を適切な条件下で維持すると、ウイルス性粒子が生成され、このウイルス性粒子が生成された細胞は、それぞれ、検出され、評価される。本発明にかかる方法はまた、動物のリガンドに対するレセプターの分布の評価に適用することもできる。本発明はまた、本発明にかかる方法において適用可能な遺伝子組み換え動物を提供する。
【０００１】
発明の背景
遺伝子治療のためのウイルス性ベクターの使用、特にレトロウイルス性ベクターの使用は、現在、アメリカ合衆国およびヨーロッパの両者における様々な承認議定書の中で、治療的遺伝子を転用した選択方法として注目されている。（Ｋｏｔａｎｉ， Ｈ． ｅｔ ａｌ． １９９４， Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ５：１９−２８）。しかしながら、これら議定書の多くが、生体内に生じ、治療的遺伝子を持っているレトロウイルス性ベクターと一体となった標的細胞の感染を必要としている。そして十分に感染された細胞が、影響を受けた個々の細胞に戻される （Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ． １９９２， Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ３： ７５−９０； Ａｎｄｅｒｓｏｎ， Ｗ． Ｆ． １９９２， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５６： ８０８−８１３）。このような生体外での遺伝子治療手順は、標的細胞固体群（例えばリンパ球）が容易に単離されるといった、医学的条件の下での調整として理想的である。さらに、標的細胞の生体外感染は、使用前に安全性が厳密に調べられることで、濃縮されたウイルスの多量投与を可能にする。
【０００２】
残念ながら、容易に単離され、培養され、そして再び導入される標的細胞を含み、遺伝子治療のために応用可能な断片（ｆｒａｃｔｉｏｎ）はない。さらに、生体外遺伝子治療の複雑な技術およびこれに関連した高いコストが、事実上、生体外遺伝子治療の世界的で広範囲に渡る普及を妨げている。将来、容易で費用効果のある遺伝子治療のために、細胞を生成するレトロウイルス性ベクターの注入あるいは簡単な移植の形で、患者にウイルス性ベクターあるいはウイルス性ベクターを生成する細胞を直接投与するといった生体内での取り組みが必要であろう。
【０００３】
この種の生体内での取り組みは、当然、様々な新しい問題をもたらす。まず、そしてとりわけ、安全性に注意を向けなければならない。ウイルスはおそらく、ウイルス生成細胞の移植から生成されるので、生成されたウイルスを事前に点検する機会はないだろう。そのような系の使用に含まれる、限られた危険性の認識およびこの危険性を最小限にする新しい系の構築が重要である。
【０００４】
治療的な目的のためのレトロウイルス性ベクター自体は、一般的に、レトロウイルス性タンパク質をコードする遺伝子が、標的細胞に転移されるべき治療的遺伝子およびマーカー遺伝子に置き換わった、修飾されたベクターである。レトロウイルス性タンパク質をコードする遺伝子の置き換えによって、ウイルスは事実上ウイルスを無能にし、このウイルスの複製は不完全となる。このウイルスは、ウイルス性を欠乏しているタンパク質に修飾されたレトロウイルスを提供する成分によって救済されなければならない。この成分は、一様に多量のウイルス性タンパク質を生成する細胞株であるが、複製成分ウイルスを生成する能力を欠乏している。この細胞株は、パッケージング細胞株（ｐａｃｋａｇｉｎｇ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ）として知られており、パッケージングされる、修飾されたレトロウイルス性ベクターを可能にする遺伝子を持つ第２プラスミドによって形質移入された細胞からなる。
【０００５】
パッケージベクター（ｐａｃｋａｇｅｄ ｖｅｃｔｏｒ）を生成するために、ベクタープラスミドは、パッケージング細胞株内に形質移入される。これらの条件下で、治療遺伝子およびマーカー遺伝子の挿入された修飾レトロウイルス性ゲノムは、ベクタープラスミドから複写され、修飾されたレトロウイルス性粒子（組み換え型ウイルス性粒子）内にパッケージングされる。この組み換え型ウイルスは、それから、標的細胞を感染するために用いられる。この標的細胞内で、ベクター遺伝子および運搬されたマーカー遺伝子あるいは治療的遺伝子は、標的細胞のＤＮＡに組み込まれる。なぜなら、そのような組み換え型ウイルス性粒子によって感染された細胞には、すべてのレトロウイルス性タンパク質が存在しないからである。しかしながら、治療的遺伝子およびマーカー遺伝子を持つベクターのＤＮＡは、ＤＮＡ細胞内に組み込まれ、感染細胞にて発現する。
【０００６】
生体内での遺伝子治療の使用および安全性を実用的な点から考える上で、次に考えなくてはならないのが、レトロウイルス性ベクターのターゲティングである。ベクターによって運搬される治療的遺伝子は、すべての組織および細胞内で分別なく発現されるべきではなく、むしろ必須の標的細胞内でのみ発現されるべきであるということは明らかである。このことは、特に、特定の腫瘍細胞の除去を対象とした、転移される遺伝子が毒性遺伝子あるいは自殺遺伝子である場合に重要である。他の標的とならない細胞の除去は、当然、極めて望ましくない。
【０００７】
運搬された治療的遺伝子のターゲティングを行う、多数のレトロウイルス性ベクターシステムが記述されている（Ｓａｌｍｏｎｓ， Ｂ． ａｎｄ Ｇｕｅｎｚｂｕｒｇ， Ｗ． Ｈ． １９９３， Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ４： １２９−１４１）。これら取り組みの多くは、予め定められた細胞型に限った感染、あるいは、より多くは、特定の細胞型に対する非相同的な治療的遺伝子、あるいはマーカー遺伝子に関連した、非相同的な治療的遺伝子を用いるものである。しかしながら、遺伝子の発現の真核生物的調整（ｅｕｃａｒｙｏｔｉｃｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ）は、未だ完全に解明されていないほど非常に複雑な工程である。遺伝子の発現を制御しているＤＮＡ配列は、“調節配列”と呼ばれている。これらの配列は、一般的に、プロモーターからなる。そしてこのプロモーターにおいて、通常の転写因子、ポリメラーゼ集合体および遺伝子がタンパク質を調節する配列が、プロモーターにおける集合過程の速度を制御するために結合する。プロモーターは、一般に、遺伝子の５’末端に即座に見出される。制御タンパク質が結合する配列は、これにより、遺伝子の転写の活性や抑制を行い、さらに、遺伝子の上流に位置し、”エンハンサー”および／または”サプレッサー”と呼ばれる。高等真核生物においては、５００００以上のヌクレオチド対に亘る、点在した遺伝子の調節配列を見出すことは例外的である。けれども、このＤＮＡのほとんどが、”スペーサー”とよばれる配列であり、遺伝子制御タンパク質によって認識されない。
【０００８】
調節配列がベクター内で遺伝子の発現を引き起こすために用いられるとすれば、レトロウイルス性ベクターの限られた受容のために、核酸配列の短い伸長のものだけがベクター内に導入される。したがって、調節配列の部分だけが、ベクター内のマーカー遺伝子の発現や、治療遺伝子の発現を引き起こすために使用される。レトロウイルス性ベクター、例えば、遺伝子治療に使用可能な調節配列を得るためには、上記調節配列内の領域は、調節配列の通常の機能、特に組織特異性のために必要な領域と同じでなければならない。調節配列の活性および組織特異性を定義する精密な配列のモチーフについての知識によって、特有な応用、例えば、遺伝子治療のための最適なプロモーターの設計が可能になる。
【０００９】
しかしながら、制御領域の本質的な領域については、限られた情報しか利用できない。核酸配列に基づく機能的ドメインを予測するコンピューターモデルは利用できるが、それは予測に過ぎない。実際の機能的ドメインは異なっているかもしれなく、あるいは、単にモチーフが未だ知られていないだけかもしれない。他の方法はフットプリント法のようなタンパク質結合解析に基づいており、制御領域内の機能的な配列は、この機能的な配列と結合するタンパク質によって示される。しかしながら、この方法は、これらの配列モチーフが必須、あるいは補助的なエンハンサーやサイレンサーである場合には、この方法によってタンパク質はこれらの配列モチーフの機能と結びつかない。現在のところ利用可能であり、最も有用な調節配列の解析方法は、レポーター遺伝子解析である。この方法によれば、プロモーターの原型あるいは変異体は、レポーター遺伝子の上流で融合している。すなわち、レポーター遺伝子の中を進んだプロモーターにおいて転写を開始させるために、遺伝子は測定可能なタンパク質あるいはタンパク質活性を簡単にコードする。引き続いて、構成は細胞培養系の生細胞内に形質移入され、レポータータンパク質の量および／または活性度が決定される。しかしながら、細胞培養系における細胞は、自然状態の細胞に比べて弱いことが多い。ほとんどの細胞が不死化している、すなわち、制限されない経路の数に亘って培養することができる。しかしながら、どの経路でも細胞の特性は変化し、これら細胞は、これら細胞自身に由来する器官の典型でなくなってしまう。たとえ細胞が器官から単離されて間もない細胞、すなわち、器官の細胞と似た細胞であっても、取り囲む細胞や、自然な細胞外基質といった自然系を欠いているからである。その結果、レポーター遺伝子構成は、自然系内と同じように作用しない。したがって、自然系においてプロモーターが特異的因子の存在下で活性であっても、ある場合には細胞培養系において検査されたレポーター遺伝子構成は、逆に不活性である。したがって、生体内におけるレポーター遺伝子解析の結果は、しばしば、誤って導かれる。
【００１０】
結果として、最終的な結果を得るためには、実験動物による生体内での研究が必要である。仮に異なる細胞型でにおけるプロモーターの活性が解析されれば、調節配列に関与する遺伝子組み換え動物が使用される。遺伝子組み換え動物は、例えば、マイクロインジェクション、すなわち１細胞分裂胎芽（１−ｃｅｌｌ ｓｔａｇｅ）内への異種遺伝子構成の注入、または、移植前胎芽の、レトロウイルス性ベクターＤＮＡ（Ｇｏｒｄｏｎ Ｊ． ｅｔ． ａｌ． １９８０， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ， ＵＳＡ ７７： ７３８０−７３８４， Ｊａｅｎｉｓｃｈ Ｒ． ｅｔ ａｌ． １９８３， Ｃｅｌｌ ３２： ２０９−２１６）の注入によるものである。結果として、胎芽は、さらに、受容者となる養母の卵管／子宮に移転された後、満期になるまで発育する。結果として成熟した動物のいくらかは、ゲノム内に組み込まれた非相同的なＤＮＡを有している。仮に、遺伝子線細胞（ｇｅｒｍ ｌｉｎｅ ｃｅｌｌｓ）（卵あるいは精子）が修飾されれば、上記遺伝子細胞から発達する、すべての動物は、遺伝子細胞を含んでいる体内のすべての細胞に、異質な核酸配列を含み、そしてこの核酸配列を、その子孫となる細胞に受け渡す。そのような生殖細胞系が修飾された動物は、”遺伝子組み換え”と呼ばれ、遺伝子組み換えされた異質のＤＮＡは、”遺伝子組み換え遺伝子”と呼ばれる。遺伝子組み換え動物は決まってほとんどが特別な実験室で生成され、困難な工程であり、時間や費用がかかり、最初の試みによって単一の遺伝子組み換え動物を生成するのに失敗するため、時には繰り返さなければならない。したがって、遺伝子組み換え動物の生成に基づくプロモーターの解析にはかなりの労力が必要であり、それゆえ、１あるいは非常に限られた数のプロモーターに対してしか実施することができない。
【００１１】
プロモーター活性の解析のために、遺伝子組み換え動物の生成を回避するために、他の方法を試した：プロモーターレポーター遺伝子構成を持つレトロウイルス性ベクターで動物を感染した。レトロウイルス性のライフサイクルにしたがって、レトロウイルス性ベクターは細胞に入り、細胞のゲノム内に組み込まれ、そして、その結果、調節配列が活性な、それらの細胞内にレポーター遺伝子が発現した。しかしながら、生体内での形質移入では、実験および治療を目的として使用される、安全なレトロウイルス性ベクターの性能は非常に低かった。それゆえ、散発的な細胞のみが結果として遺伝子組み換えされず、そしてそれゆえレポーター遺伝子を発現せず、多数の細胞に取り囲まれたレポーター遺伝子を発現する単一の細胞に形質移入される。しかしながら、感染された細胞の数が少ないために、レポーター遺伝子活性を検出するのは困難となってしまう。特に関与する調節配列がある組織において全く不活性であり、発現レベルが低く、それゆえ検出されない状態で区別するのが難しい。たとえレポーター遺伝子の発現が高いとしても、感染した細胞は見落とされるであろう。したがって、調節配列は、レトロウイルス性ベクター内にプロモーターレポーター遺伝子構成を導入することによって解析されることはない。
【００１２】
予め判っている細胞型に対しての、遺伝子の輸送のターゲティングにおけるさらなる問題は、包囲されたウイルスの感染範囲であろう。包囲されたウイルスの感染範囲は、ウイルス性表面タンパク質遺伝子（”ｅｎｖ−遺伝子”）によってコードされたウイルス性表面タンパク質と、レセプターとして作用する宿主細胞膜タンパク質との相互作用によって決定される。ウイルス由来のベクターは、ウイするの感染範囲が修飾されない限り、本来のウイルスが行うように、同じ細胞型内に遺伝子を運搬する。感染のレベルにおいてウイルスの能力を標的の特定の細胞型に結合する方法は、ウイルスの核および遺伝子情報を持つであろう“偽型”のウイルス粒子を生じさせることであり、制限された感染範囲を含む他のウイルスの表面タンパク質を生じさせることである。またウイルス性の表面タンパク質の修飾は、特定の細胞の標的感染となるであろう：ヒトの細胞が、ウイルス性表面タンパク質の結合配列と機能的に相互作用するレセプターを発現しないため、狭宿主性のレトロウイルスは、ヒトの細胞を感染させない。ウイルス性表面タンパク質の結合領域にレセプターリガンド（Ｋａｓａｈａｒａ ｅｔ ａｌ． （１９９４）， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６６， １３７３−１３７６）やその機能的な断片（Ｖａｌｓｅｓｉａ−Ｗｉｔｔｍａｎｎ ｅｔ． ａｌ． （１９９６）， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７０， ２０５９−２０６４）あるいはモノクローナル抗体（Ｒｕｓｓｅｌ ｅｔ ａｌ， （１９９３）， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２１， １０８１−１０８５） を挿入すると、特定の細胞型に対して対応したレセプターを発現する、修飾されたレトロウイルスの特定の標的となる。
【００１３】
安全性の面から、ウイルスを持つベクター（例えば、毒性のある治療遺伝子は、必要な標的細胞だけしか感染させない）を確保するために、ウイルスの感染範囲を予測することが非常に望ましい。さらには、細胞レセプターあるいは細胞リガンドの組織および細胞型分布を決定する系を有することが望ましい。
【００１４】
発明の目的
本発明の目的は、組織および／または腫瘍に特異的であり、非相同性の系（例えば、遺伝子的構造）に含まれるとしても、生体内での活性および特異性を維持する、調節配列あるいはウイルス性組成の活性および／または特異性の評価方法を改良することで、不変で費用のかからない方法を提供することにある。調節配列の例として、プロモーターおよびエンハンサーがある。ウイルス性成分は、ウイルス性表面タンパク質であることが好ましい。本発明のさらなる目的は、細胞レセプターあるいは細胞リガンドの組織および細胞型分布を決定する系を提供することにある。上記方法は遺伝子治療における治療的遺伝子およびマーカー遺伝子の発現のためのウイルス性ベクターにおいて使用される、ウイルス性成分の評価に応用される。
【００１５】
発明の詳細な説明
前記および他の目的を達成するための方法を本発明では提供する。この方法では、遺伝子組み換え非ヒト動物の細胞、好ましくは哺乳動物、より好ましくはげっし動物の細胞、そして最も好ましくはマウスの細胞に、ウイルス性ベクターが導入される。しかしながら、上記遺伝子組み換え動物は、ウイルスの発生に必要なウイルス性配列を少なくとも１つ欠乏している。これらのウイルス性配列には、遺伝子組み換え動物の細胞内に導入されたウイルス性ベクターが含まれており、これによって、遺伝子組み換え動物内で、ウイルス性粒子が複製される。遺伝子組み換え動物を適切な条件下で維持した後で、ウイルス性粒子の生成物、ウイルス性粒子が生成された細胞が、それぞれ検出され、評価される。
【００１６】
本発明にかかる方法は、調節配列の活性および／または特異性の評価に対して特に有用である。この際、ベクターに含まれる１あるいはそれ以上のウイルス性配列は、解析される調節配列によって制御される。遺伝子組み換え動物の細胞がウイルス性ベクターで形質移入される場合、あるいは、ベクターを含んでいるウイルス性粒子に感染される場合、まず初めに、少数の細胞が、それぞれ形質移入され、感染される。一般的に、遺伝子組み換え動物のすべての細胞は、形質移入可能および／または感染可能であるが、ベクターに含まれる配列および遺伝子それぞれの発現および／または翻訳は、調節配列が活性な細胞内でしか生じない。このように、例えば、細胞型あるいは組織に特異的なプロモーターが使用される場合、プロモーターがこの可能性を完全に満たすのであれば、評価を行うことができる。遺伝子組み換え動物の細胞内での発現、および、ベクター内に含まれ、ウイルス性粒子の発生に必要なウイルス性配列の翻訳のみが生じる。
【００１７】
遺伝子組み換え動物の細胞は、さらに、ウイルス性ベクターがコードしないウイルス性タンパク質を提供し、そしてこれにより、遺伝子組み換え動物の細胞はパッケージング細胞株（ｐａｃｋｉｎｇ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ）に似た機能を持つ。遺伝子組み換え動物のゲノム内に含まれるウイルス性配列によってコードされるウイルス性タンパク質は、永久的に生成されるのが好ましい。これらのウイルス性配列は、さらに、遍在性の、恒常的に活性な調節配列によって制御されることが好ましい。最も好ましくは、ＭＬＶ−プロモーターが使用されることである。しかしながら、遺伝子は、ベクター内に調節配列が含まれ、遺伝子（群）の発現あるいは翻訳を調節する細胞であって、さらにはウイルス性粒子の発生の活性に必要な細胞内のウイルス性粒子にのみ、遺伝子はパッケージングされる。その結果、遺伝子組み換え動物のこれらの細胞だけが、多数の新しいウイルス性粒子を生成し遊離する。ウイルス性粒子は、こうして他の細胞を感染させ、そしてこの工程が繰り返される。ゆえに、このような”雪だるま効果”が開始され、結果として、新しい細胞を感染させる多数のウイルス粒子を生成する。しかしながら、再度ウイルス粒子を遊離するのは、ウイルス性ベクターのプロモーターが活性な細胞のみである。
【００１８】
ベクター内に含まれる調節配列は、最も好ましくは、外膜タンパク質をコードする遺伝子の発現および／または翻訳を制御することであり、この外膜タンパク質は、最も好ましくは広宿主性のウイルス性外膜タンパク質であり、最も好ましくは、ＶＳＶ−ｇあるいはＧＡＬＶである。一般的に、”広宿”タンパク質は細胞型で非特異的なタンパク質、すなわち、これらのタンパク質は、異なる細胞型で活性であり、異なる種内でさえも活性である。したがって、広宿主性の外膜タンパク質はウイルス性ベクターに含まれ、遺伝子組み換え動物の特異的な細胞型内でのみ活性な、調節配列によって制御される。このように、これらの細胞型内だけのｅｎｖ遺伝子が発現され、翻訳され、そしてこれらの細胞型内のみのウイルス性粒子が発生されなければならない。しかしながら、広宿主性外膜タンパク質を含んでいるウイルス性粒子を遊離した後、粒子は数多くの異なる細胞型および異なる組織それぞれを感染させる。それにもかかわらず、調節配列が活性な、新たに感染された細胞のみが、さらにウイルス性粒子等を遊離する。ベクター内に含まれる調節配列の活性なそれらの細胞は、特に、ウイルス性ベクターが付加的に、例えば、緑色蛍光タンパク質（ｇｆｐ）遺伝子のようなマーカー遺伝子を含んでいるときに、簡単に検出される。したがって、調節配列が完全に細胞型特異的であるか、調節配列が非常に非特異的であるかを簡単に調べることができる。このようにして、調節配列が標的遺伝子治療に適切か否かを決定することができる。遺伝子組み換え動物のほとんどすべての細胞が、評価される調節配列を含んでいるウイルス性ベクターと感染可能であることを確かめるための他の方法として、表面タンパク質を用いる方法がある。これら表面タンパク質は、細胞レセプターに遍在性を与えるための結合サイトを含むように修飾される。好ましい具体例では、遺伝子組み換え動物は、すべての組織に特異的レセプターを発現し、そして、ウイルス性ベクター内の表面タンパク質が、対応するリガンドの結合領域に存在するように設計することである。もう一つの方法として、リガンドを発現するように動物を設計し、そして表面タンパク質を対応するレセプターに含むように、ウイルス性ベクターを設計することである。このもう一つの方法では、残りのリガンドが細胞膜に結合するように、細胞膜局在化信号（ｃｅｌｌ ｍｅｍｂｒａｎｃｅ ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ｓｉｇｎａｌ）とともに、リガンドを提供する必要がある。
【００１９】
この実施形態に従い、本発明では、
ａ）ウイルスの発生に必要なウイルス性配列を少なくとも１つ欠乏しているが、ゲノム内に１あるいはそれ以上のウイルス性配列を含んでいる遺伝子組み換え非ヒト動物の細胞に、少なくとも１つのウイルス性配列を含むウイルス性ベクターを導入することによって、遺伝子組み換え動物の細胞内にウイルス性粒子を複製する工程であり、この工程において、ウイルス性ベクター内の上記ウイルス性遺伝子の少なくとも１つが評価される調節要素の制御下にある、というという工程と、
ｂ）遺伝子組み換え動物の細胞内にウイルス性粒子が生成するように、遺伝子組み換え動物を適切な条件下で維持する工程と、
ｃ）ウイルス性粒子の生成された細胞を検出する工程とを含んでいる。
【００２０】
本発明にかかる方法によれば、”調節配列の特異性”が決定される。この文脈において“特異性”という用語は、すべての組織内、あるいは動物の特徴的な発育段階において、調節要素は活性であるか、あるいは、発育段階のある期間の間だけ、あるいは全く活性でないという事実を述べている。したがって、“制御エレメントの特異性の評価”は、制御エレメントが活性化されている細胞型および発育段階の評価を意味している。特定の細胞内でのみ制御エレメントが活性化するのであれば、上記細胞は他の細胞を次々に感染させることができるようなウイルス粒子を生成するであろう。このように、感染された細胞の数が増え（”雪だるま効果”）、最適な条件下において動物細胞の多く（理想的な場合としては、全ての細胞）が感染されるべきである。どの細胞において調節配列が活性であるかを決定する方法は、当業者には知られている。これらの細胞を同定するのに便利な方法は、調節要素の制御下で、少なくとも１つのウイルス性遺伝子を含んでいるウイルス性ベクターが、同じ調節要素の制御下でマーカー遺伝子を含むことである。これは少なくとも一つのウイルス遺伝子およびマーカー遺伝子をそれぞれコードするウイルス性ベクターの、各々の発現カセット（両方のカセットにおいて、遺伝子発現は同じ調節要素を複製することによって制御される）に含むことによって達成される。この型のベクター構成の不利な点は、ベクターゲノム内において、調節配列が２度生じることであり、これにより望ましくない組み換えが生じるかもしれないということである。従って、最も好ましい実施形態は、ただ一つの調節配列が、少なくとも一つのウイルス配列およびマーカー遺伝子の両方の発現を制御するということである。一つの発現カセットによって両方の遺伝子を発現させるためには、少なくとも一つのウイルス配列およびマーカー遺伝子の間に内的リボソーム結合部位（ＩＲＥＳ）を含むことである。ＩＲＥＳ要素は、当業者には知られている。この文脈おいては、ＥＭＣＶのようなピコルナウイルスのＩＲＥＳ要素に対する基準を設けた。さらにＩＲＥＳ要素は、以下に開示される。典型的なマーカー遺伝子は、緑色蛍光タンパク質（ｇｆｐ）をコードした遺伝子、β−ガラクトシダーゼをコードした遺伝子、または特異的な抗体が結合するタンパク質をコードした遺伝子である。マーカー遺伝子の発現を決定する方法は、当業者に知られている。調節要素の“活性”は、マーカー遺伝子の発現の量によって評価できる。
【００２１】
さらに、本発明ではウイルス性成分、特に、標的遺伝子治療において安全な媒体としてさらに使用されるべきウイルス性成分の迅速で簡単な解析のための方法を提供する。
【００２２】
細胞親和性、すなわち外膜ウイルスの、ウイルス性感染の特異性は、細胞の表面上の対応するレセプターと作用するウイルス性外膜タンパク質によって決定される。仮に対応するレセプターが遍在性であるとすれば、ウイルスは全ての細胞に感染させることができる。仮にレセプターが特定の細胞上にのみ存在しているとすれば、それらの細胞のみが、感染に対して感染性を持つ。非外膜ウイルスの場合には、細胞親和性は、ウイルス性カプシドの表面上の、特定のタンパク質によって定義される。本発明の文脈において、“表面タンパク質”という用語は、ウイルスの表面上にある全てのウイルス性タンパク質のことであり、標的細胞と相互作用し、ウイルスが細胞内に侵入するのに必要なものである。それゆえ、この用語は包膜ウイルスの外膜タンパク質と同様、細胞と接触する非外膜ウイルスのカプシドタンパク質を網羅している。表面タンパク質という用語は、修飾された表面タンパク質など、自然に発生する表面タンパク質を網羅している。”修飾された表面タンパク質”は、ウイルス性表面タンパク質内に自然には生じない細胞レセプターへの結合配列を含むために修飾された表面タンパク質である。ウイルス性表面タンパク質内で自然には生じない結合配列として、例えば、レセプターリガンド（（Ｋａｓａｈａｒａ ｅｔ ａｌ． （１９９４）， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６６， １３７３−１３７６）やその機能的な断片（Ｖａｌｓｅｓｉａ−Ｗｉｔｔｍａｎｎ ｅｔ． ａｌ． （１９９６）， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７０， ２０５９−２０６４）、あるいは、モノクローナル抗体（Ｒｕｓｓｅｌ ｅｔ ａｌ， （１９９３）， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２１， １０８１−１０８５） あるいは他のウイルス性表面タンパク質の結合領域がある。列挙された参考は、そのような結合領域がどのようにしてウイルス表面タンパク質に導入され、標的細胞の感染に行き着くかを明らかにしている。“修飾された表面タンパク質”という用語はまた、ウイルス性の表面タンパク質では自然には生じない、細胞リガンドに対する結合配列を含むために修飾された表面タンパク質も網羅している。”細胞リガンド”という用語は、細胞膜に結合しているリガンドのことをいう。この文脈において、この用語は、細胞リガンドで自然に生じることも網羅している。
【００２３】
本発明にかかる方法はまた、表面タンパク質、特にウイルスの外膜タンパク質の特異性を評価するためにも用いられる。すなわち、表面タンパク質、特にウイルスの外膜タンパク質が安全な遺伝子輸送媒体として用いられるならば、腫瘍細胞のような特別の標的細胞の細胞表面にのみ付けることが実際に可能であれば、解析することができる。次に、包膜ウイルスの表面遺伝子、すなわちｅｎｖ遺伝子について例示する。本発明の概念は、細胞との相互作用に必要なタンパク質をコードした非包膜ウイルスの遺伝子に対する方法にも似た方法で適用することができるということを当業者は理解している。その結果、 “ｅｎｖ遺伝子”、および、“ｅｎｖタンパク質”という用語は、より一般的な用語として、“表面遺伝子”、および、“表面タンパク質”それぞれで置き換えることが可能である。先にも触れたように、“表面タンパク質”、は“修飾された表面タンパク質”も、先の定義から網羅している。仮に、特異性が評価される遺伝子がｅｎｖ遺伝子であれば、すなわち、遺伝子組み換え動物の細胞内、あるいは、非機能的Ｅｎｖタンパク質、あるいは、ｅｎｖ遺伝子が完全に欠失されている場合には、Ｅｎｖタンパク質は生成されない。同様に、解析されるべき特別なｅｎｖ遺伝子はウイルス性ベクターに含まれるが、遍在性の、恒常的に活性な調節配列によって制御されることが好ましい。仮に本発明による方法が動物内のリガンドのためのレセプターの分布を評価するために使用されるなら、同様のことが同じく適用される（以下を参照）。遺伝子組み換え動物の細胞の感染もしくは形質移入の後、外膜タンパク質を構成するさらなるウイルス性粒子は生成されて遊離される。しかしながら、遺伝子組み換え動物のさらなる細胞は唯一ウイルス表面もしくは外膜タンパク質、さらにレセプターとして働く宿主細胞膜タンパク質の間に反応が起こるときに感染される。引き続き、仮にウイルスの外膜がまさに制限された感染範囲を含み、それがすなわち、治療的遺伝子の標的細胞に対する標的転移に適用可能ならば、評価されることが可能だろう。この実施形態によれば、本発明は、
ａ）ウイルスの発生に必要なウイルス性配列を少なくとも１つ欠乏しているが、ゲノム内に１あるいはそれ以上のウイルス性配列を含んでいる遺伝子組み換え非ヒト動物の細胞に、少なくとも１つのウイルス性配列を含むウイルス性ベクターを導入することによって、遺伝子組み換え動物の細胞内にウイルス性粒子を複製する工程と、
ｂ）遺伝子組み換え動物の細胞内にウイルス性粒子が生成するように、遺伝子組み換え動物を適切な条件下で維持する工程と、
ｃ）ウイルス性粒子の生成された細胞を検出する工程とを含んでいる。
【００２４】
他の実施形態によれば、本発明では、ウイルスの表面タンパク質の特異性を評価する方法を提供する。この方法は、
ａ）ウイルスの発生に必要なウイルス性配列を少なくとも１つ欠乏しているが、ゲノム内に少なくとも、ウイルス性表面タンパク質をコードする遺伝子を含んでいるウイルス性配列を含んでいる遺伝子組み換え非ヒト型動物の細胞に、ウイルスの発生に必要なウイルス性配列を含んでいるウイルス性ベクターを導入することによって、遺伝子組み換え動物の細胞内にウイルス性粒子を複製する工程と、
ｂ）遺伝子組み換え動物の細胞内にウイルス性粒子が生成するように、遺伝子組み換え動物を適切な条件下で維持する工程と、
ｃ）ウイルス性粒子の生成された細胞を検出する工程とを含んでいる。
【００２５】
この別の実施態様が、同じレセプターを使用するウイルスの感染を遮断するために表面タンパク質が細胞表面のレセプターと反応する細胞から合成されるウイルスには働かないことは、当業者には良く知られている。レトロウイルスのｅｎｖタンパク質がこの効果を持つかもしれないことは述べられてきた。すなわち、レトロウイルス性ｅｎｖ遺伝子を発現する細胞が、ウイルス性表面に対応するｅｎｖタンパク質を発現するレトロウイルスにほとんど感染性が無いことが知られている。したがって、この別の実施態様は唯一、生成された表面タンパク質が同じタンパク質をウイルス性表面に持つウイルスの感染を遮断しないウイルスシステムに働くだろう。
【００２６】
本発明による方法では、”ウイルス性表面タンパク質の特異性”を決定する。この文脈での”特異性”という用語は、ウイルス性表面タンパク質が、動物発生のいくつかあるいはすべての段階の間、全ての細胞型または特定の細胞型にのみ存在する細胞レセプターと相互作用するであろうという事実を言及している。そのため、”ウイルス性タンパク質の特異性の評価”は、評価される表面タンパク質を表面に有するウイルスに感染されることの可能な細胞の型と発生的段階との評価を意味している。感染細胞内のみおいてウイルス性粒子の生成が生じる。したがって、ウイルス性粒子の生成は、細胞がウイルス性表面に、この細胞に対して特異的なタンパク質を持つウイルスに感染したこと意味する。どの細胞が感染したのかを決定する別の方法は、検出可能な遺伝子生成物を発現するマーカー遺伝子をコードするウイルス性配列を、少なくともウイルス性表面タンパク質を含むウイルスベクターに含むことである。そのようなマーカー遺伝子の例は当業者に良く知られており、そしてとりわけ緑色蛍光タンパク質、またはβ−ガラクトシダーゼをコードする遺伝子含む。当業者はこれらの遺伝子の発現の検出、および、定量化の方法を知っている。マーカー遺伝子は、全ての細胞と細胞型の中で活性であることが望ましいプロモーターによって制御されるべきである。ウイルスベクターは、マーカー遺伝子と同じ、もしくは異なるタイプのプロモーターによって制御される、二つの離れた発現カセットに、ウイルス性表面タンパク質をコードするウイルス性配列を含んでいてもよい。望ましくはウイルス性表面タンパク質をコードしている遺伝子とマーカー遺伝子とは、一つのプロモーターからの、一つの発現カセット内に発現している。この場合、ＩＲＥＳ要素は両方の遺伝子の間に挿入されなければならない。表面タンパク質の、”活性”は、特定の細胞型または組織によって生成されるウイルス性粒子の定量化、または、マーカー遺伝子の発現の定量化によって評価される。
【００２７】
上記で指摘したように、表面タンパク質はまた、上記で定義した修飾表面タンパク質となることが可能である。望ましい実施態様では、修飾表面タンパク質は、結合部位、例えば細胞に結合するように接近している領域に、細胞レセプターに対するリガンドを持つ表面タンパク質であることである。したがって、本発明による方法は、どの細胞に表面タンパク質の結合部位に含まれるリガンドに対するレセプターが発現しているのかを評価するのに使用することができる。ウイルス性表面タンパク質に含まれるリガンドに特異的なレセプターを含むそれらの細胞だけが感染される。望ましい実施態様によると、修飾されていない表面タンパク質は、動物の細胞表面にある、対応するレセプターを持たない表面タンパク質である。修飾されていない表面タンパク質を持つウイルスは、それゆえ、動物の細胞を感染させるべきではない。この型のウイルスの一例は、狭宿主性のレトロウイルスである。あるいは、リガンド配列を細胞レセプターが存在する表面タンパク質に挿入することができる。この場合、表面タンパク質が細胞レセプターと相互作用を生じないように、リガンドを表面タンパク質の結合部位に挿入することが好ましい。修飾されたウイルス性表面タンパク質の、細胞への結合は、そうして、表面タンパク質にあるリガンドと、リガンドの細胞レセプターとの相互作用によるとされるべきである。本発明による方法はまた、仮に修飾された表面タンパク質の表面タンパク質部分が修飾されていない表面タンパク質の細胞レセプターへの残余結合を示すのであれば、適用可能である。この実施態様では、遺伝子組み換え動物を、修飾されていない表面タンパク質を発現しているベクターと感染させることや、その結果を同じ型の遺伝子組み換え動物の修飾された表面タンパク質を発現しているベクターとの感染の後に得られた結果と比較することが必要であろう。
【００２８】
本発明の文脈において、”リガンド”という用語は、細胞表面にある特異的な構造、すなわちレセプターに特異的に結合するどのようなペプチドまたはタンパク質も意味する。したがって、リガンドは、例えば成長因子、インスリンなどのホルモン、モノクローナル抗体の結合部位であり得る。”レセプター”は、リガンドと相互作用する細胞表面上の構造として定義される。したがって、レセプターはとりわけ成長因子レセプター、ホルモンレセプター、または修飾されたウイルス性表面タンパク質にある抗原結合部位に特異的な抗原であり得る。”動物でのレセプターの分布”という用語は、細胞の表面上にレセプターが発現して存在している細胞型および組織を意味する。したがって、動物でのレセプターの分布の評価は、実際には細胞の表面上にレセプターを持つ、細胞型と組織との評価である。
【００２９】
この実施形態において、本発明は、動物のレセプターの、リガンドの分布を評価する方法を提供する。この方法は、
ａ）ウイルスの発生に必要なウイルス性配列を少なくとも１つ欠乏しているが、ゲノム内に１あるいはそれ以上のウイルス性配列を含んでいる遺伝子組み換え非ヒト動物の細胞に、少なくとも１つのウイルス性配列を含むウイルス性ベクターを導入することによって、遺伝子組み換え動物の細胞内にウイルス性粒子を複製する工程であって、この工程において、ウイルス性表面タンパク質に対してコードするウイルス性配列は、リガンドに対してコードする配列を持っており、これによりこの配列の発現において、細胞レセプターと相互作用するように接近したタンパク質部分のリガンドの配列を含む修飾されたウイルス性表面タンパク質が生成される、という工程と、
ｂ）遺伝子組み換え動物の細胞内にウイルス性粒子が生成するように、遺伝子組み換え動物を適切な条件下で維持する工程と、
ｃ）ウイルス性粒子の生成された細胞を検出する工程とを含んでいる。
【００３０】
他の実施形態においては、本発明は、動物のリガンドの、レセプターの分布を評価する方法を提供する。この方法は、
ａ）ウイルスの発生に必要なウイルス性配列を少なくとも１つ欠乏しているが、ゲノム内に１あるいはそれ以上のウイルス性配列を含んでいる遺伝子組み換え非ヒト動物の細胞に、ウイルスの生成に必要な欠乏ウイルス性配列を含んでいるウイルス性ベクターを導入することで、遺伝子組み換え動物の細胞内にウイルス性粒子を複製する工程であって、この工程において、ウイルス性表面タンパク質に対してコードするウイルス性配列はリガンドに対してコードする配列を含んでおり、これにより配列の発現において、細胞レセプターと相互作用するように接近したタンパク質部分内のリガンドの配列を含む修飾されたウイルス性表面タンパク質が生成される、という工程と、
ｂ）遺伝子組み換え動物の細胞内にウイルス性粒子が生成するように、遺伝子組み換え動物を適切な条件下で維持する工程と、
ｃ）ウイルス性粒子の生成された細胞を検出する工程とを含んでいる。
【００３１】
この他の実施態様によると、修飾されたウイルス性表面タンパク質の発現は、好ましくは遍在性の、恒常的に活性な制御配列によって制御されるべきであることである。好ましい制御配列は述べられている。最も好ましいのはＭＬＶ制御配列である。
【００３２】
すでに上記で指摘したように、この他の実施態様は、仮に細胞から生成される修飾された表面タンパク質が、ウイルスを妨害するために同じレセプターを用いて細胞上のレセプターと相互作用するのであれば、ウイルスには作用しないということが当業者には良く知られている。したがって、この他の実施態様は感染されていない細胞から生成される、修飾された表面タンパク質が、同じタンパク質をウイルス性表面に持つ、ウイルスとの感染を妨害しないウイルス系にのみ作用する。
【００３３】
一般に、動物のレセプター分布の評価方法における最も好ましい実施態様は、二つの上記で要約された最も望ましいウイルス成分の特異性を評価するための方法の実施態様に関連し、その点で、ウイルス成分は、ウイルス性表面タンパク質である。
【００３４】
発明のさらなる実施態様によれば、遺伝子組み換え動物は、パッケージング信号をコードするウイルス性配列を欠乏している。このウイルス性配列は、遺伝子組み換え動物のゲノム内で全く機能しないことが最も好ましい。
【００３５】
上記ですでに簡潔に指摘したように、本発明における方法で用いられる、最も望ましい非ヒト遺伝子組み換え動物は、例えば、ＣＤ１、ＦＶＢ、ＮＭＲＩ、Ｃ５７／Ｂｌａｃｋ６、ＩＣＲ系統のマウスである。動物はおそらく健康的か、あるいは遺伝的に、代謝的に、増殖的に、あるいは他の障害を被っている。遺伝子組み換え動物は、例えば、重症複合免疫不全症（ＳＣＩＤ）マウスの場合のように、効果的な免疫システムを欠乏していることが最も好ましい。したがって、動物の免疫機構は、生成された感染性の粒子を攻撃することができない。
【００３６】
遺伝子組み換え動物の遺伝子のゲノム内に組み込まれたウイルス性配列、および、ウイルス性粒子を複製するウイルス性配列を含んでいるウイルス性ベクターは、同じウイルス性の系に由来することが好ましく、すなわち、ウイルス性配列も、ウイルス性ベクターも、非レトロウイルスあるいはレトロウイルスに由来することが好ましい。ウイルス配列およびウイルス性ベクターは、どちらもレトロウイルス性起源であることが最も好ましい。
【００３７】
レトロウイルス性ベクターは、レトロウイルス性遺伝子に基づいている。単純なレトロウイルスのレトロウイルス性遺伝子は、基本的にはＲ−Ｕ５−ｇａｇ−ｅｎｖ−Ｕ３−Ｒ構造を含んでいるＲＮＡ分子から成る。逆転写工程の間に、Ｕ５領域は、生成したＤＮＡ分子の右手末端において複製され、一方でＵ３領域は、生成したＤＮＡ分子の左手末端において複製されて配置される。その結果生じたＵ３−Ｒ−Ｕ５構造は、ＬＴＲ（末端反復配列）と呼ばれ、そのため同一であり、そしてＤＮＡ構造またはプロウイルスの両方の末端で繰り返される。プロウイルスの左手末端におけるＵ３領域は、プロモーターを収容する。このプロモーターは、左手Ｕ３とＲ領域との間の境界で開始され、右手ＲとＵ５領域との間の境界で終了するＲＮＡ転写物の合成を引き起こす。標的細胞の中で、ＲＮＡ遺伝子は上述したように再び逆転写される。
【００３８】
典型的なレトロウイルス性ベクターは、二つの完全なＬＴＲｓ−ａ５’およびａ３’ＬＴＲ−、そしてベクターの体内にあるＬＴＲの間にある、関与する配列のための挿入部位から構成される。この場合、調節配列は、上述したレトロウイルスそれぞれの配列・遺伝子と同様の調節配列に調節される、ベクターの体内に挿入される可能性がある。しかしながら、調節配列はＬＴＲの中に挿入されるのが好ましく、ＬＴＲのＵ３領域に挿入されるのがより好ましい。レトロウイルス性ベクターは、プロモーター転換（ＰｒｏＣｏｎ）ベクターであることが最も好ましい（ＰＣＴ／ＥＰ９５／０３４４５を参照）。
【００３９】
プロモーター転換ベクターにおいて、右手のＵ３領域は改変されるが、しかし、正常な左手のＵ３構造は保たれる；ベクターは、左手Ｕ３領域内に位置する、正常なレトロウイルス性プロモーターを使用するＲＮＡ内に転写される。しかしながら、生成されたＲＮＡは、改変された右手のＵ３構造しか含まない。感染された標的細胞では、逆転写の後、この改変されたＵ３構造は、レトロウイルス性構造の両端に配置される。
【００４０】
改変した領域は、Ｕ３領域の代わりにポリリンカーを持っている。そのため、それらの直接的な組織特異的発現を含むどのような調節配列も容易に挿入されることになる。このプロモーターはそのためレトロウイルス性ベクターによって運ばれる連鎖遺伝子の発現のために、標的細胞において排他的に使用される。
【００４１】
発明のこの具体的な実施態様によると、調節配列の支配下でのレトロウイルス遺伝子を構成するレトロウイルス性ベクターは、次のようにして生成されることが可能である；ＰｒｏＣｏｎベクターにおいて、レトロウイルス性遺伝子をコードするタンパク質、望ましくはｅｎｖがベクターの体内に存在する関与する調節配列は、３’−ＬＴＲのＵ３領域に挿入され、その結果生じるベクターは、パッケージング細胞に形質移入される。ＰｒｏＣｏｎ原理によると、パッケージング細胞株においては、レトロウイルス性ベクターの発現は、５’−ＬＴＲのＵ３領域に含まれる、正常な、非選択的なレトロウイルス性プロモーターによって制御される。引き続き、ベクターはレトロウイルス性粒子内にパッケージングされる。しかしながら、遺伝子組み換え動物の細胞、（この例では、ｇａｇおよびｐｏｌを表している）が上記レトロウイルス性粒子に感染される場合には、プロモーター変換が起こり、そしてｅｎｖの発現が関与する調節配列によって制御される。本発明によると、レトロウイルス性粒子の生成は、調節配列が活性化している細胞内においてのみ起こる。
【００４２】
ＰｒｏＣｏｎベクターにおいては、調節配列は、３’ＬＴＲのＵ３領域内に挿入されることが望ましい。さらに好ましくは、Ｕ３領域が調節配列によって全体的、もしくは部分的に置き換えられることである。しかしながら、調節配列はまた、３’ ＬＴＲのＵ３およびＲ領域の間にも挿入される。
【００４３】
本発明における、遺伝子組み換え動物の感染もしくは形質移入に用いられるレトロウイルス性ベクターのＬＴＲは、マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）、マウス乳腺腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）、マウス肉腫ウイルス（ＭＳＶ）、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ヒトＴ細胞白血病ウイルス（ＨＴＬＶ）、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、ネコ白血病ウイルス（ＦＥＬＶ）、牛白血病ウイルス（ＢＬＶ）、サルメイソンファイザーウイルス（ＭＰＭＶ）、およびラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）のＬＴＲを構成する群の要素から選ばれるのが好ましい。もっとも好ましくは、両ＬＴＲとも、マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）に由来することである。
【００４４】
調節配列によって制御される、評価されるべきｅｎｖ遺伝子は、ＶＳＶ−ｇ、ＬＣＭＶ−ｇ（リンパ性脈絡髄膜炎ウイルスの糖タンパク質）、あるいは異なる種の細胞への感染を可能にする、すなわち、幅広い宿主を与えるＲＤ１１４であってもよい。ｅｎｖはマウス広宿主性ｅｎｖ、すなわち、マウス種および非マウス種に由来するｅｎｖであることがさらに好ましい。最も好ましくは、ＭＬＶの広宿主性４０７０Ａｅｎｖが使用されることである。
【００４５】
発明の他の好ましい実施態様は、遺伝子組み換え動物にあるレトロウイルス性遺伝子と、レトロウイルス性ベクター内にあるレトロウイルス性遺伝子とが、同じレトロウイルスの型に由来することである。より好ましくは、レトロウイルス性ベクターのＬＴＲもまた、遺伝子と同様に同じ起源に由来することである。最も好ましくは、レトロウイルス性遺伝子およびＬＴＲｓがＭＬＶに由来することである。
【００４６】
発明の他の実施態様によると、レトロウイルス性ベクターは、レトロウイルス性遺伝子に加えて、非相同性のコード化配列を含んでいる。”非相同性”という用語は、自然状態では本質的に正常ではないＤＮＡ配列のどのような組み合わせにおいても用いられる。非相同性コード化配列は、好ましくはマーカー遺伝子、治療的遺伝子、および／または抗腫瘍遺伝子を含む群の要素から選択されることである。上記マーカー遺伝子および治療的遺伝子は、さらに好ましくは、β−ガラクトシダーゼ遺伝子、ネオマイシン遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子、ヘルペス単一性ウイルスチミジンキナーゼ遺伝子、プロマイシン遺伝子、シトシンデアミナーゼ遺伝子、チトクロームＰ４５０遺伝子、そして緑色蛍光タンパク質（ｇｆｐ）、青色蛍光タンパク質（ｂｆｐ）、黄色蛍光タンパク質（ｙｆｐ）のような蛍光マーカー遺伝子、およびゼオシン耐性遺伝子を含む群の要素から選ばれることである。
【００４７】
最も好ましくは、さらなる非相同性遺伝子は、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）に機能的に結合することである。ＩＲＥＳは、リボソームのｍＲＮＡ配列内のモチーフへの付着を促進し、それによって関連遺伝子が翻訳される。発明の実施形態によると、レトロウイルス性ベクターは、レトロウイルス性遺伝子と、ＩＲＥＳに結合するさらなる非相同性遺伝子を含んでいる。結果的に、レトロウイルス性遺伝子およびさらなる非相同性遺伝子の転写がいずれも同じ調節配列によって制御されるものの、タンパク質内に発現したｍＲＮＡのさらなる翻訳は、いずれも独立して、そして分離して行われる。
【００４８】
原則として、全ての調節配列は本発明による方法で解析されることが可能である。調節配列は、乳酸化タンパク質（ＷＡＰ）、マウス乳腺腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）、β−ラクトグロビン、ラクトアルブミン、そしてカゼイン特異的調節エレメント、および標的ヒト乳腺腫瘍に使用されるであろうプロモーターを含む群の要素を含んでいてもよいが、これらに限定されるものではない。さらに、炭酸脱水酵素プロモーター、グルコキナーゼプロモーター、ホスホグリセリン酸キナーゼプロモーター、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）を含むリンパ球特異的調節エレメントおよびプロモーター、免疫グロブリンとＭＭＴＶリンパ球特異的調節領域およびプロモーター、糖質コルチコイドホルモンへの応答性を与える、あるいはヒト乳腺に発現を指示するＭＭＴＶＰ２のようなＭＭＴＶ特異的調節エレメントおよびプロモーター、Ｔ細胞レセプター遺伝子およびＣＤ４レセプタープロモーターのようなＴ細胞に特異的な調節エレメントおよびプロモーター、免疫グロブリンプロモーターまたは組織因子プロモーターのようなｍｂ１、および腫瘍に特異的なプロモーターのようなＴ細胞に特異的な調節エレメントおよびプロモーター、癌胎児性胚性抗原（ＣＥＡ）プロモーター、および血管性内皮成長因子（ＶＥＧＦ）プロモーターのような膵臓に特異的な調節エレメントとプロモーターであってもよい。
【００４９】
本発明による方法は、遺伝子治療に使うことを意図したレトロウイルスと関連して非相同性の調節領域を解析するために使われるのが好ましい。この場合、調節配列は、非相同性配列の代わりに、またはさらに遺伝子治療に使用されるレトロウイルス性遺伝子に由来する。レトロウイルス性遺伝子の発現を引き起こす、関与する調節遺伝子は、調節配列がマーカー遺伝子、または治療的遺伝子の発現を引き起こすときには、遺伝子治療のためのレトロウイルス性ベクターの場合と全く同じように機能するのが有利である。したがって、本発明の方法によって、遺伝子治療の間に、例えば、調節配列の活性および組織特異性のレベルを予測することができる。
【００５０】
本発明は、本発明による方法によって入手可能な遺伝子組み換え非ヒト動物にも関連し、本発明による方法に適用可能な、遺伝子組み換え非ヒト動物を提供する。後者は、遺伝子に、１あるいはそれ以上のウイルス性配列を含んでいるが、ウイルスの発生に必要なウイルス性配列を少なくとも１つ欠乏している。したがって、遺伝子組み換え動物の細胞はウイルス性タンパク質を生成するけれども、レトロウイルス性遺伝子は、レトロウイルス性粒子の中に組み入れられない。なぜなら、パッケージング信号および／またはＬＴＲ領域のような、複製および／またはパッケージングに必要な配列は、成熟しているかまたは欠落しているからである。ウイルス性粒子の生成に必要な配列の導入は、ウイルス性粒子の複製だけではなく、遺伝子組み換え動物に、上記ウイルス性粒子を拡散する。
【００５１】
好ましくは、組み換え遺伝子は、多数の異なる細胞型において発現されることである。最も好ましくは、すべての細胞型において発現されることである。したがって、本発明の好ましい実施態様によれば、ウイルス性配列の発現は、遍在性の、恒常的に活性な調節配列によって引き起こされる。遺伝子組み換え動物の遺伝子に含まれるウイルス性配列がレトロウイルス性起源の場合は、上記レトロウイルス性遺伝子の発現は、ＳＶ４０エンハンサーおよび／またはプロモーター、β−アクチンプロモーター、ＲＯＳＡ２６プロモーター、ＣＤＣ１０プロモーター、あるいはユビキチンプロモーターによって制御されるのが好ましい。そして最も好ましくは、マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）プロモーターによって制御されることである。
【００５２】
好ましくは、動物が、ｇａｇおよび／またはｐｏｌに対して遺伝子組み換え的であることである。より好ましくは、ｇａｇおよび／またはｐｏｌがＭＬＶに由来していることであり、最も好ましくは、マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）プロモーターによって制御されることである。
【００５３】
本発明の要点
本発明は特に、以下を単独あるいは組み合わせたものである：
活性および／または調節配列あるいはウイルス性組成の特異性評価は、次の工程を含んでいる。
ａ）ウイルスの発生に必要なウイルス性配列を少なくとも１つ欠乏しているが、遺伝子内に１あるいはそれ以上のウイルス性配列を含んでいる遺伝子組み換え非ヒト動物の細胞に、少なくとも１つのウイルス性配列を含むウイルス性ベクターを導入することによって、遺伝子組み換え動物の細胞内にウイルス性粒子を複製する工程と、
ｂ）遺伝子組み換え動物の細胞内にウイルス性粒子が生成するように、遺伝子組み換え動物を適切な条件下で維持する工程と、
ｃ）ウイルス性粒子の生成された細胞を検出する工程。
【００５４】
動物のリガントに対するレセプターの分布を評価する方法は、以下の工程を含んでいる。
ａ）ウイルスの発生に必要なウイルス性配列を少なくとも１つ欠乏しているが、ゲノム内に１あるいはそれ以上のウイルス性配列を含んでいる遺伝子組み換え非ヒト動物の細胞に、ウイルスの生成に必要な欠乏ウイルス性配列を含んでいるウイルス性ベクターを導入することで、遺伝子組み換え動物の細胞内にウイルス性粒子を複製する工程であって、この工程において、ウイルス性表面タンパク質に対してコードするウイルス性配列はリガンドに対してコードする配列を含んでおり、これにより配列の発現において、細胞レセプターと相互作用するように接近したタンパク質部分内のリガンドの配列を含む修飾されたウイルス性表面タンパク質が生成される、という工程と、
ｂ）遺伝子組み換え動物の細胞にウイルス性粒子が生成するように、遺伝子組み換え動物を適切な条件下で維持する工程と、
ｃ）ウイルス性粒子の生成された細胞を検出する工程。
【００５５】
上記方法において、ウイルス性組成はウイルス性表面タンパク質である。
【００５６】
上述した方法において、遺伝子組み換え非ヒト動物は哺乳類、好ましくはげっし動物、最も好ましくはマウスである。
【００５７】
上記方法において、遺伝子組み換え非ヒト動物は、重症複合型免疫不全（ＳＣＩＤ）マウスである。
【００５８】
上記方法において、遺伝子組み換え動物は、パッケージング信号に対するウイルス性配列コードを不完全にしている。
【００５９】
上記方法において、パッケージング信号に対するウイルス性配列コードは欠失されている。
【００６０】
上記方法において、遺伝子組み換え動物のゲノム内に含まれるウイルス性配列の発現および／または翻訳は、遍在性の、恒常的に活性な調節配列によって制御される。
【００６１】
上記活性および／または調節配列の特異性を評価する方法において、ベクターに含まれる少なくとも１つのウイルス性配列の発現および／または翻訳が、解析される調節配列によって制御される。
【００６２】
上記方法において、遺伝子をコードするｅｎｖの発現および／または翻訳が解析される調節配列によって制御される。
【００６３】
上記方法において、ｅｎｖをコードする遺伝子の発現および／または翻訳は、解析されるべき調節配列によって制御される。
【００６４】
上記方法において、ｅｎｖコードをコードする遺伝子は、広宿主性のｅｎｖに対するものである。
【００６５】
上記方法において、解析されるべき調節配列は、遺伝子治療に適している。
【００６６】
上記ウイルスの外膜タンパク質の特異性を評価する方法において、遺伝子組み換え動物は、ｅｎｖをコードするウイルス性配列を不完全にしている。
【００６７】
上記方法において、ｅｎｖをコードするウイルス性配列は、欠失される。
【００６８】
上記方法において、ウイルス性ベクターに含まれるｅｎｖ遺伝子の発現および／または翻訳は、遍在性の、恒常的に活性な調節配列によって制御される。
【００６９】
上記方法において、外膜タンパク質は、標的遺伝子治療に適している。
【００７０】
上記方法において、ウイルス性配列およびウイルス性ベクターは、レトロウイルス性起源である。
【００７１】
上記方法において、遺伝子組み換え動物は、レトロウイルス性ベクターで形質移入される、および／または、上記レトロウイルス性ベクターを含むレトロウイルス性粒子に感染されている。
【００７２】
上記方法において、遺伝子組み換え動物のゲノム内に含まれているレトロウイルス性ベクターおよびレトロウイルス性配列は、レトロウイルスの同じ型に由来している。
【００７３】
上記方法において、レトロウイルス性配列は、マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）に由来している。
【００７４】
上記活性および／または調節配列の特異性の評価において、調節配列は、レトロウイルス性ベクターの末端反復配列（ＬＴＲ）に挿入されている。
【００７５】
上記方法において、調節配列は、ＬＴＲのＵ３−領域に挿入されている。
【００７６】
上記方法において、レトロウイルス性ベクターが、プロモーター転換ベクターに基づいている。
【００７７】
上記方法において、レトロウイルス性ベクターが、レトロウイルス性配列に加えて、非相同性遺伝子を含んでいる。
【００７８】
上記方法において、非相同遺伝子が、治療的遺伝子、抗腫瘍遺伝子および／またはマーカー遺伝子である。
【００７９】
上記方法において、マーカー遺伝子が、緑色蛍光タンパク質（ｇｆｐ）遺伝子および／またはゼオシン耐性遺伝子である。
【００８０】
上記方法において、非相同遺伝子が、内部リボゾーム侵入部位に効率よく結合している。
【００８１】
上記方法によって得られる遺伝子組み換え非ヒト型動物。
【００８２】
ゲノム体内に１あるいはそれ以上のウイルス性配列を含んでいるが、ウイルスの発生に必要なウイルス性配列を少なくとも１つ欠乏しており、遺伝子組み換え動物の細胞へ少なくとも１つのウイルス性配列が導入されることによってウイルス性粒子を生成し、遺伝子組み換え動物において上記ウイルス性粒子を拡散する遺伝子組み換え動物。
【００８３】
上記遺伝子組み換え非動物において、遺伝子非ヒト動物が哺乳類、好ましくはげっし動物、最も好ましくはマウスである。
【００８４】
上記遺伝子組み換え動物において、マウスは、重症複合免疫不全症（ＳＣＩＤ）マウスである。
【００８５】
上記遺伝子組み換え動物が、ウイルス性配列コード化ｅｎｖを欠乏している。
【００８６】
上記遺伝子組み換え動物において、遺伝子組み換え動物のゲノム内に含まれるウイルス性配列の発現および／または翻訳が、遍在性の、恒常的に活性な調節配列によって制御される。
【００８７】
上記遺伝子組み換え動物において、ウイルス性配列はウイルス性起源である。
【００８８】
上記遺伝子組み換え動物において、調節配列は、調節配列が、ＳＶ４０エンハンサーおよび／またはプロモーター、β−アクチンプロモーター、ＲＯＳＡ２６プロモーター、ＣＤＣ１０プロモーター、ユビキチンプロモーターおよび／またはＭＬＶプロモーターを含む群の要素から選ばれる。
【００８９】
上記遺伝子組み換え動物において、レトロウイルス性配列は、マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）起源である。
【００９０】
図：
図１は、中間クローニングプラスミドおよび半複製的なレトロウイルスベクターを概略的に示す。略語：ＣＭＶ：ヒトサイトメガロウイルス中間初期プロモーター；ｅｎｖ：ウイルス性被覆遺伝子；ｅＧＦＰ：増強緑色蛍光タンパク質遺伝子；ＩＲＥＳ；Ｅｎｃｅｐｈａｌｏ ｍｙｏｃａｒｄｉｔｉｓウイルス内部リボソーム侵入部位；ＳＶ４０−ｎｅｏ（ＳＶ−４０プロモーター／エンハンサー制御下におけるネオマイシン耐性遺伝子）；ｇｆｐ／ｚｅｏ：ゼオシン耐性遺伝子と緑色蛍光タンパク質をコードする遺伝子の融合；ｃｙｐ／ｚｅｏ：（チトクロームｐ４５０ ２Ｂ１−ゼオシン耐性融合遺伝子）の融合；ＬＴＲ：末端反復配列；ψ、レトロウイルスパッケージング信号  ＭＭＴＶ；マウス乳腺腫瘍ウイルス
実施例
以下の例で、本発明をさらに説明する。提供する実施例は、当業者によってよく理解されるだろう。しかしながら、本発明の技術の応用性は、この実施例に限定されるものではない。
【００９１】
１．ＭＬＶに基づいた半複製的レトロウイルス性ベクターｐＬＥＩＧＺ、ｐＬＥＩＧＺＭ、ｐＬＥＩＣＺおよびｐＬＥＩＣＺＭの合成
半複製的レトロウイルス性ベクター（図１）は、多くの異なるクローニングベクターと中間ベクターに由来する（図１）。
【００９２】
最初の中間生成物を得るために、基本となるクローニングベクターｐＩＲＥＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）（これはＥＭＣＶ（Ｅｎｃｅｐｈａｌｏ ｍｙｏｃａｒｄｉｔｉｓウイルス）からの内部リボソーム侵入部位を持っている）を、Ｍ１ｕＩで直線化し、プラスミドｐＡＬＦの消化によって得られた２１１８ｂｐのｅｎｖ遺伝子断片に結合した（Ｃｏｓｓｅｔ， Ｆ． Ｋ．， Ｔａｋｅｕｃｈｉ， Ｙ．， Ｂａｔｔｉｎｉ， Ｊ． −Ｌ， Ｗｅｉｓｓ， Ｒ． Ａ．， Ｃｏｌｌｉｎｓ， Ｍｍ Ｋ． Ｌ． １９９５； Ｊｏｕｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ６９， ７４３０−７４３６）。この最初の中間生成物を、長さ８２１４ｂｐのｐＣＥＩと名づけた。次に、ｐＣＥＩＧＺおよびｐＣＥＩＣＺベクターを作成するために、前駆体プラスミドｐＣＥＩが、ｇｆｐ／ｚｅｏカセットまたはｃｙｐ／ｚｅｏカセットを挿入するために、それぞれＸｂａｌで直線化した。ｇｆｐ／ｚｅｏ融合遺伝子カセットは、酵素ＲｓｒＩＩ／ＢｓｅＲＩによる発現ベクターｐＴｒａｃｅｒＳＶ４０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の消化、および、１１４８ｂｐ断片の単離によって得た。同時に、ヌクレオチド１５〜３７７（Ｇｅｎｂａｎｋアクセスナンバーは、Ｘ９０６３９）由来のＳｔｒｅｐｔｏａｌｌｔｅｉｃｈｕｓ ｈｉｎｄｕｓｔａｎｕｓブレオマイシン遺伝子に融合した、ヌクレオチド２５〜１４５８（ＧｅｎｂａｎｋアクセスナンバーＭ３７１３４）由来のラットチトクロームＰ４５０ ２Ｂ１遺伝子を含んでいるｃｙｐ／ｚｅｏ融合遺伝子を生成した。直線化されたプラスミドｐＣＥＩ内への、ｇｆｐ／ｚｅｏカセットの挿入は、結果としてベクターｐＣＥＩＧＺとなり、直線化されたプラスミドｐＣＥＩへのｃｙｐ／ｚｅｏカセットの挿入は、結果としてベクターｐＣＥＩＣＺとなった。
【００９３】
プラスミドｐＰＥＩＧＺ、ｐＣＥＩＧＺを作成ために、ｐＣＥＩＧＺをＰｓｔｌ／Ｎｏｔｌで消化した。その結果、他の中から、ｅｎｖ−ＩＲＥＳ−ｇｆｐ／ｚｅｏカセットを含む４１８５ｂｐの断片が生じた。同時に、レトロウイルス性ベクターｐＬＸＳＮｅＧＦＰ（Ｋｌｅｉｎ， Ｄ．， Ｉｎｄｒａｃｃｏｌｏ， Ｓ．， ｖｏｎ Ｒｏｍｂｓ， Ｋ．， Ａｍａｒｏｄｉ， Ａ．， Ｓａｌｍｏｎｓ， Ｂ．， Ｇｕｅｎｚｂｕｒｇ Ｗ． Ｈ． １９９７； Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒｅａｐｙ  ４， １２５６−１２６０）をＲｓｒｌｌ／ＥｃｏＲＩで消化し、得られた４８０８ｂｐの断片を製造者の説明書にしたがってＴ４ＤＮＡポリメラーゼ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で平滑末端化し、４１８５ｂｐの断片に結合した。
【００９４】
プラスミドｐＬＥＩＧＺの合成と同時に、ＰｒｏＣｏｎに基づいた版（Ｓａｌｌｅｒ， Ｒ． Ｍ．， Ｏｅｚｂｕｅｒｋ， Ｆ．， Ｓａｌｍｏｎｓ， Ｂ． Ｇｕｅｎｚｂｕｒｇ， Ｗ． Ｈ． １９９８； Ｊｏｕｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７２， １６９９−１７０３）を合成した。ｐＬＥＩＧＸＭと呼ばれるこのプラスミドはｐＬＥＩＧＺに非常に良く似ているが、３’−ＬＴＲにおけるＭＬＶ−Ｕ３領域の代わりに、非相同性ＭＭＴＶプロモーター領域を持っている。そのため、レトロウイルス性ベクター内の遺伝子の発現は、ｐＬＥＩＧＺＭ形質移入細胞内のＭＬＶプロモーター領域によって引き起こされるが、ＬＥＩＧＺＭ形質移入細胞内のＭＭＴＶプロモーターによって引き起こされる。プラスミドｐＬＥＩＧＺＭは、プラスミドｐＬＥＳＮ１ａＭのＲｓｒＩＩ／ＥｃｏＲＩ制限消化物由来の５２８３ｂｐ断片との結合反応において、ｐＣＥＩＧＺの４１８５ｂｐのＰｓｔｌ／Ｎｏｔｌ断片を用いて合成した。このプラスミドは、プライマーＢｉ０１（５’ＧＣＣＴＣＧＧＣＣＴＣＴＧＡＧＣＴＡＴＴ−３’）およびＢｉ０２（５’−ＡＴＡＴＣＣＧＣＧＧＧＣＴＡＧＣＴＴＧＣＣＡＡＡＣＣＴ−３’）を用いたｐＬＸＳＮＥＧＦＰ断片を含む１０２５ｂｐのネオマイシン遺伝子ＰＣＲ増幅によって得た。この断片をＳａｃＩＩとＨｉｎｄＩＩＩで切り取り、ｐＬＸＰＣＭＴＶｅＧＦＰの５７８７ｂｐのＳａｃＩＩ／ＨｉｎｄＩＩ断片に結合した。このプラスミドはｅＧＦＰ遺伝子を含むｐＥＧＦＰ−１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）の８６２ｂｐのＳｍａＩ／ＨｐａＩ断片を、ＨｐａＩで直線化されたプラスミドＰＬＸＰＣＭＴＶの中に挿入することで得た。プラスミドｐＬＸＰＣＭＴＶはＳａｃＩＩでプラスミドｐＬＸ１２５を部分的に消化し、直線化されたベクターをＴ４ポリメラーゼで処理、再結合して得た。そのため、５’ＬＴＲの５’末端にあるＳａｃＩＩ部位は破壊され、そして３’ＬＴＲの５’末端にあるＳａｃＩＩ部位が一つになった。プラスミドｐＬＸＳＮの３５３４ｂｐのＢａｍＨＩ／ＡＦｌＩＩＩ断片を結合して、プラスミドｐＬＸ１２５を作成した（Ｓａｌｌｅｒ， Ｒ． Ｍ． １９９４， Ｄｏｃｔｏｒａｌ Ｔｈｅｓｉｓ， Ｌｕｄｗｉｇ−Ｍａｘｉｍｉｌｉａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｍｕｎｉｃｈ， Ｇｅｒｍａｎｙ）。
【００９５】
ベクターｐＬＥＩＣＺとｐＬＥＩＣＺＭを含むチトクロームＰ４５０ ２Ｂ１遺伝子を作るために、プラスミドｐＣＥＩＣＺを制限酵素ＮｈｅＩおよびＮｏｔＩで消化し、４６６３ｂｐ断片を結果として得た。この断片は、ｅｎｖ−ＩＲＥＳ−ｃｙｐ／ｚｅｏカセットを含んでいるが、プラスミドｐＬＸＳＮＮＥＧＦＰにある４８０８ｂｐのＲｓｒＩＩ／ＥｃｏＲＩ断片に結合され、結果としてベクターｐＬＥＩＣＺを得た。ｅｎｖ−ＩＲＥＳ−ｃｙｐ／ｎｅｏカセットの、プラスミドｐＬＥＳＮ１ａＭのＲｓｒＩＩ／ＥｃｏＲＩ制限消化物由来の５２８３ｂｐ断片に対する結合は、結果としてベクターｐＬＥＩＣＺＭを得た。
【００９６】
全ての制限消化物、平滑末端化終末化と結合反応は、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓの酵素を用いて、製造者の説明書に従って行った。遺伝子組み換えは、同じＬｉｆｅ Ｔｅｃｈｉｎｏｌｏｇｉｅｓから得たＥ． ｃｏｌｉ ＭＥ ＤＨ５αバクテリアを用いて行った。
【００９７】
全ての合成物はｉｎ ｖｉｔｒｏで、可動化アッセイによるｅｎｖ−ｇｅｎｅ発現で解析した：５×１０５ ２９３ｇａｇｐｏｌ半パッケージング細胞、これは２９３細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １５７３）をｐＧａｇＰｏｌＧＰＴで形質移入することで得た（Ｍａｒｋｏｗｉｔｚ， Ｄ．， Ｇｏｆｆ， Ｓ．， Ｂａｎｋ， Ａ． １９８８； Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ６２， １１２０−１１２４）のだが、テストのため３μｇのベクターで、そして３μｇのｐＬＸＳＮｅＧＦＰで形質移入した。形質移入は、供給者（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐｈａｒｍａｃｉａ）の説明書にしたがってカルシウム−フォスファテート形質移入方法を用いて行った。ｅｎｖ遺伝子が発現した場合、ベクターＰＬＸＳＮｅＧＦＰベクターを保持するウイルス粒子が得られるはずである。２４時間後、形質移入細胞をリン酸塩バッファー生理食塩水で二回洗い、新鮮な３ｍｌの培養液（ＤＭＥＭ＋５％ＦＣＳ）を加えた。形質移入して４８時間後、１ｍｌの培地上澄みを４×１０５ ＮＩＨ／３Ｔ３標的細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１６５８）を感染するために用いた。感染細胞の数をＦＡＣＳ（表１）で４８時間後に解析した。
【００９８】
表１は、異なるＦＡＣＳ解析による、一時的な形質移入よび感染の後の、効果的な形質移入および感染の結果を示している。
【００９９】
【表１】
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【０１００】
（表１の説明：２９３ｇｐ９Ｔ半パッケージング細胞を上記のプラスミドで形質移入した。形質移入した細胞の上澄みを含むウイルスを用いてＮＩＨ細胞を感染させたときに、これらの細胞をＦＡＣＳ解析（ＦＡＣＳ１）の対象とした。感染された細胞のＦＡＣＳ解析（ＦＡＣＳ ２）を、４８時間後に行った。数字は緑の割合を示す（ｇｆｐ陽性細胞）。
【０１０１】
ＩＲＥＳエレメントおよびｇｆｐ／ｚｅｏ−融合カセットの機能を、ｚｅｏｃｉｎ耐性の群体の選択によって評価した。少なくとも１００群体の集団が確立され、これらをＦＡＣＳ解析の対象とした。興味深いことに、６３％のｚｅｏ耐性細胞が、ｇｆｐ遺伝子を発現する。
【０１０２】
２．  レトロウイルス粒子の産生
５μｇのプラスミドＤＮＡを２９３ｇａｇ／ｐｏｌ半パッケージング細胞に形質移入することで、組み換えレトロウイルス性粒子の生成を行った。２９３ｇａｇ／ｐｏｌ半パッケージング細胞を、２９３の細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １５７３）をｐＧａｇＰｏｌＧＰＴ、または、ＰＡ３１７（Ｍｉｌｌｅｒ， Ａ． Ｄ．， Ｂｕｔｔｉｍｏｒｅ， Ｃ． １９８６， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ６： ２９８５−２９０２）のような通常のパッケージング細胞で形質移入することで得た。その目的のため、形質移入の２４時間前に、５×１０５個のパッケージング細胞を、３ｃｍのシャーレに播いた。形質移入は製造業者（ＣｅｌｌＰｈｅｃｔ形質移入キット； Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｍａｃｉａ）から提供された説明書に従って行った。１８時間後、培養液を除去し、細胞をＰＢＳで二回洗うことで新鮮な培養液を得た。形質移入の４８時間後、細胞をトリプシンで処理し、クローンを得るため、および／または、組み換えレトロウイルス粒子を安定に生成するという選択のために希釈した。
【０１０３】
感染実験として、感染させる４８時間前に、１／１０６のプロデューサー細胞を３ｃｍのシャーレに播いた。２４時間後、培培養液を除去し、１ｍｌの新鮮な培養液を加えた。さらに、この時点で、２／１０５のレシピエント細胞を３ｃｍシャーレに置いた。４５ｕｍフィルターを通じてろ過された、１ｍｌのウイルス含有培養液を用いて標的細胞の感染を行った。最終濃度８ｕｍ／ｍｌの培養液に、ポリブレンを加えた。感染の６時間後、３ｍｌの新鮮な培養液をそれぞれのシャーレに加えた。感染して７２時間後に、ＦＡＣＳ解析でｅＧＦＰプロモーターの発現を測定した。
【０１０４】
３．  ｇａｐ／ｐｏｌ発現を合成するｐＴｏｐｏＧａｇＰｏｌの合成
プラスミドｐＧａｇＰｏｌＧＰＴの長鋳型ＰＣＲ由来のＭＬＶ ｇａｇ／ｐｌ発現カセットおよび複製ベクターｐＣＲ−ＸＬ−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の結合によって、ベクターｐＴＯＰＯｇａｇｐｏｌの発現を作成した。プラスミドｐＧａｇＰｏｌＧＴＰ（Ｍａｒｋｏｗｉｔｓ， Ｄ．， Ｇｏｆｆ， Ｓ．， Ｂａｎｋ， Ａ． １９８８， Ｊｏｕｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ６２： １１２０−１１２４）のｇａｇ／ｐｏｌコード領域の発現は、ＭＬＶ ＬＴＲプロモーター領域をラットリポコルチンエンハンサー／プロモーターに相同的な、４１２ｂｐ配列に５’融合したものによって制御される。この発現カセットは長鋳型ＰＣＲで、リポコルチンのエンハンサー／プロモーターの最初に特異的なプライマーＧＰＴｒａｎｓＨｉｎ（５’ＣＴＧＴＧＡＴＡＡＡＣＴＡＣＣＧＣＡＴＴＡ−３’）と、ポリアデニル化信号の終わりに特異的なＧＰＴｒａｎｓＲｕｅｃｃｋ２（５’ ＧＴＴＡＴＴＧＣＡＧＣＴＴＡＴＡＡＴＧＧ−３’）プライマーのプライマーで単離した。ＰＣＲは結果的に６７３１ｂｐの断片となった。断片を０．８％アガロースゲル上で動作して精製し、ＤＮＡバンドを切り出し、そしてＤＮＡをＱｉａｑｕｉｃｋプロトコル（Ｑｉａｇｅｎ）で抽出した。４０ｎｇのＰＣＲ断片と１０ｎｇのクローニングベクターｐＣＲ−ＸＬ−ＴＯＰＯとを混合し、室温で五分間保温した。１μｌの６倍ＴＯＰＯクローニング停止溶液を加えることによって結合を停止した。”Ｏｎｅ Ｓｈｏｔ”コンピテントバクテリア（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を選択されたクローニング混合物とカナマイシン耐性群体とで遺伝子組み換えした。プラスミドＤＮＡは準備された制限酵素ＥｃｏＲＩ， ＸｈｏＩ， ＸｂａＩ， ＳｐｅＩでそれぞれ消化した。最終的に、正確なプラスミドは、ｐＴＯＰＯＧａｇＰＯＬに設計された。
【０１０５】
このプラスミドの機能性を評価するため、ＮＩＨ細胞およびＨｅＬａ細胞を、５μｇのプラスミドｐＴＯＰＯＧａｇＰｏｌ、ＭＬＶ遺伝子発現カセットを構成するｐＡＬＦ（Ｃｏｓｓｅｔ， Ｆ． −Ｌ．， Ｔａｋｅｕｃｈｉ， Ｙ．， Ｂａｔｔｉｎｉ， Ｊ． −ｌ．， Ｗｅｉｓｓ， Ｒ． Ａ．， Ｃｏｌｌｉｎｓ Ｍ． Ｋ． Ｌ １９９５， Ｊｏｕｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ６９： ７４３０−７４３６）、ＧＦＰ発現レトロウイルス性ベクターを構成するｐＬＸＳＮｅＧＦＰ（Ｋｌｅｉｎ， Ｄ．， Ｉｎｄｒａｃｃｏｌｏ， Ｓ．， ｖｏｎ Ｒｏｍｂｓ， Ｋ．， Ａｍａｄｏｒｉ， Ａ．， Ｓａｌｍｏｎｓ， Ｂ．， Ｇｕｅｎｚｂｕｒｇ， Ｗ． Ｈ． １９９７， Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ４； １２５６０−１２６０）で形質移入した。４８時間後、４×１０５個のＮＩＨ細胞およびＨｅＬａ細胞を、形質移入された細胞培養液上澄みで感染させた。７２時間後に、ｅＧＦＰを解析するＦＡＣＳでウイルス力価を測定した。プラスミドＰＯＴＰＯｇａｌｐｏｌを使う実験は、コントロールとして、プラスミドｐＧａｇＰｏｌＧＰＴを用いる実験と同じ力価値を生じ、ベクターｐＴＯＰＯＧａｇＰｏｌ内に、ｇａｇ／ｐｏｌ発現カセットの完全な機能を示す。
【０１０６】
４． ｇａｇ／ｐｏｌ遺伝子組み換えマウスの生成
ｇａｇ／ｐｏｌ遺伝子組み換えマウスの確立として、上記ｇａｇ／ｐｏｌ発現カセットを得るために、プラスミドｐＴＯＰＯＧａｇＰｏｌをＮｓｉＩで消化した。０．８％アガロースゲル上で消化混合物を生成し、６８４５ｂｐの断片で切り取り、ＱｉａＥｘｌｌゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ）でＤＮＡを抽出した。引き続き、１２％のＰＥＧ６０００、１．５Ｍ ＮａＣｌでＤＮＡを沈殿させ、ｄｄＨ２Ｏで再び懸濁し、−２０℃で保存した。
【０１０７】
８−１０週齢のオスのＢ６ＣＢＡＦ−１ハイブリッドマウスの精管を切除し、二週間後、それぞれのマウスを、５−８週齢のメスＣＤ−１マウスと、ホルモン処理をすることなく雑種配合した。偽妊娠レシピエントマウスをＤＮＡ注入接合体に用いた。
【０１０８】
過排卵ドナーを提供するために、１５０μｌのＮａＣｌ溶液内の７．５Ｉ． Ｅ． ＰＭＳＧ（妊娠雌馬血清ゴナドトロピン、ｅＣＧ）を、４−５週齢メスＣＤ−１マウスに腹腔内注入した。４８時間後、５ Ｉ． Ｅ． ｈＣＧで排卵を誘起し、ドナーのメスをＣＤ−１マウスと雑種配合した。ｈＣＧ（ヒト絨毛性ゴナドトロピン）処理の１６時間後、雑種配合したメスを安楽死させた。受精した接合体は、３７℃で三分間、ＰＢＳ／１０％ ＦＣＳの１ｍｇ／ｍｌヒアルロニダーゼを用いて、引き続き未受精卵からキュムラス細胞を分離し、用意した。パラフィン油でカバーしたＰＢＳ／２％ ＦＣＳの滴下の下で、接合体を３７℃で保存した。
【０１０９】
ガラスキャピラリーを用いてそれぞれの接合体の核に、１〜２ｐｌの微小注入溶液（１０００−２０００ ＤＮＡコピー）を注入した。それぞれのドナーマウスの卵管内に、１２〜１５個の微小注入した接合体を移した。マウス子孫の遺伝子組み合え具合を、次に説明するようにして解析した。
【０１１０】
陽性のファウンダーマウスをＣＤ１の野生種動物と雑種配合することによって、遺伝子組み換え系統を確立した。
【０１１１】
マウスゲノムＤＮＡ由来のリポコルチン−ＬＴＲ−ｇａｇ配列のＰＣＲ増幅によって、推定上の遺伝子組み換えマウスのスクリーニングを行った。マウスの尾部末端を切り取り、そしてミラーら（Ｍｉｌｌｅｒ， Ｓ． Ａ．， Ｄｙｋｅｓ， Ｄ． Ｄ．， Ｐｏｌｅｋｙ， Ｈ． Ｈ． １９８８， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １６，， ２１５）による塩析法で、ゲノムＤＮＡを調整した。最終的に、ＤＮＡを３００μｌの無菌水で溶解した。プライマーｇａｇｐｏｌ−ｓｃｒｅｅｎ（５’−ＴＧＣＧＣＴＧＣＴＧＡＧＡＡＧＣＣＡＧＴ−３’）およびｇａｇｐｏｌ−ｓｃｒｅｅｎ２（５’−ＴＴＧＴＧＡＧＣＧＡＴＣＣＧＣＴＣＧＡＣ−３’）を用いて、１μｌをＰＣＲの対象とした。陽性サンプルは、アガロース電気泳動で特異的な１１１５ｂｐの信号を生じた。
【０１１２】
さらに、選択したサンプルをサザンブロット解析の対象とした。２０μｇのＤＮＡをＳｓｐＩ／ＮｏｔＩで消化し、アガロース電気泳動で分離し、ナイロン膜（Ｚｅｔａ Ｐｒｏｂｅ， Ｂｉｏｒａｄ）に移した。続いて、移送効率を見積もるために、ブロットしたゲルをエチジウムブロマイドで染色した。２×ＳＳＣ（３Ｍ ＮａＣｌ， ０．３Ｍ Ｔｒｉ−ｓｏｄｉｕｍ−ｃｉｔｒａｔｅ ｘ ２Ｈ２Ｏ， ｐＨ ７．５−８．０）で１０分間、３回膜を洗い、空気で乾かした。ＤＮＡを紫外線交差結合により、膜に固定した。６８℃で２時間プレハイブリダイゼーション（６ｘ ＳＳＣ； ５ｘ Ｄｅｎｈａｒｄｔａ’ｓ； ０．５％ ＳＤＳ； ５０μγ／ｍｌ サケ精子ＤＮＡ）行った後、導入遺伝子に特異的なプローブで、膜を６８℃で一晩ハイブリダイズした。続いて、２ｘ ＳＳＣ， ０．１％ ＳＤＳで６８℃で２０分間、膜を二回洗い、０．１％ ＳＳＣ， ０．１％ＳＤＳで１５分間、６８℃で一回洗った。最後に、膜をホスホイメージャープレート（Ｆｕｊｉ）に暴露した。
【０１１３】
導入遺伝子に特異的なプローブを得るために、リポコルチンプロモーター断片の一部、ＭＬＶプロモーター、そしてｇａｇコーディング領域の一部を持つ２０８８ｂｐ断片を生成するＳｓｐＩおよびＮｏｔＩで、プラスミドｐＴＯＰＯｇａｇ／ｐｏｌを消化した。アガロース電気泳動で断片を精製し、そして製造業者の説明書に従って、ランダムプライマーＤＮＡラベリングシステムキット（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いた初回抗原刺激を用いて、ａｌｐｈａ−３２Ｐ−ｄＣＴＰで、５０μｇの断片を標識した。標識されたプローブを、製造業者の説明書に従って、ＢｉｏＳｐｉｎ−３０カラム（ＢｉｏＲａｄ）で精製した。ハイブリダイゼーション後に十分な信号を得るために、最小限の４×１０８ ｃｐｍ／μｇ ＤＮＡの特異的な活性を、ハイブリダイゼーション反応に用いた。
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は、中間クローニングプラスミドおよび半複製的なレトロウイルスベクターを概略的に示す図である。
【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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