(57)【要約】セルロース含有抽出物および植物性材料を分解しうる（エンド）キシラナーゼ活性を有する新規ポリペプチドを開示する。該ポリペプチドは隣接するキシロピラノシル単位間の内部（１−４）結合においてβ−Ｄ−キシランポリマーを開裂しうる。アミノ酸配列およびコードするＤＮＡ配列が提供され、該ポリペプチドを用いて可食性食糧および動物飼料の製造におけるセルロースが処理された。該ポリペプチドはアラビノキシラナーゼ活性およびキシロシダーゼ活性の両方を有する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）配列番号：２のアミノ酸２３から４０８までのアミノ酸配列；または
（ｉｉ）キシランを開裂しうる（ｉ）の変種；または
（ｉｉｉ）キシランを開裂しうる（ｉ）または（ｉｉ）のフラグメント
を含むキシラナーゼポリペプチド。
【請求項２】
変種（ｉｉ）が配列番号：２のアミノ酸２３から４０８までのアミノ酸配列に対して少なくとも７０または８０％の同一性を有しており、そして／あるいは（ｉｉｉ）のフラグメントが少なくとも１５０アミノ酸の長さである請求項１記載のポリペプチド。
【請求項３】
β−Ｄ−キシラン中の（１→４）結合または隣接キシロピラノシル単位を開裂する請求項１または２記載のポリペプチド。
【請求項４】
アラビノキシラナーゼおよびキシロシダーゼ活性を有するポリペプチド。
【請求項５】
（ａ）真菌；または
（ｂ）Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ属、所望によりＴａｌａｒｏｍｙｃｅｓ ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ種の生物
から得ることのできる上記いずれかの請求項に記載のポリペプチド。
【請求項６】
（ａ）配列番号：１の核酸配列または上記いずれかの請求項に記載のポリペプチドをコードする配列；
（ｂ）（ａ）で定義した配列に対して相補的である、あるいはハイブリダイゼーションする配列；
（ｃ）（ａ）または（ｂ）の配列の少なくとも１００ヌクレオチドのフラグメント；
（ｄ）（ａ）、（ｂ）または（ｃ）で定義した配列に対して少なくとも７０％の同一性を有する配列；あるいは
（ｅ）遺伝学的コードの縮重の結果として（ａ）ないし（ｄ）で定義したいすれか１の配列に対して縮重している配列
を含むポリヌクレオチド。
【請求項７】
（ｂ）におけるハイブリダイゼーションがストリンジェントな条件下のものであり、（ｃ）におけるフラグメントが少なくとも２００塩基の長さであり、そして／あるいは（ｄ）における同一性が少なくとも８０％である請求項６記載の配列。
【請求項８】
（ａ）（１）配列番号：１のヌクレオチド６９から１２２４までのコーディング配列
（２）（１）で定義した配列の相補物に対して選択的にハイブリダイゼーションする配列；または
（３）遺伝学的コードの縮重の結果として（１）または（２）に示す配列に対して縮重している配列
である、キシラナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする配列；あるいは
（ｂ）（ａ）で定義したポリヌクレオチドに対して相補的な配列
を含む請求項７記載のポリヌクレオチド。
【請求項９】
ＤＮＡ配列である請求項６ないし８のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
【請求項１０】
請求項６ないし９のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド配列を含むベクター。
【請求項１１】
請求項９記載のＤＮＡ配列が調節配列に作動可能に連結されているような発現ベクターである請求項１０記載のベクター。
【請求項１２】
請求項６ないし９のいずれかに記載のポリヌクレオチドを異種配列として含む宿主細胞。
【請求項１３】
請求項１ないし５のいずれかに記載のポリペプチドを異種蛋白として発現する宿主細胞。
【請求項１４】
請求項８のＤＮＡ配列または請求項１０のベクターで形質転換された宿主細胞。
【請求項１５】
ポリペプチドを発現させる条件下で請求項１２ないし１４のいずれかに記載の宿主細胞を培養することを特徴とする、請求項１ないし５のいずれかに記載のポリペプチドの製造方法。
【請求項１６】
請求項１ないし５のいずれか１項に記載のポリペプチドを含む組成物。
【請求項１７】
セルラーゼ、エンド−アラビナーゼ、ラムノガラクツロナーゼまたはポリガラクツロナーゼ活性を有するポリペプチドをさらに含む請求項１６記載の組成物。
【請求項１８】
植物またはキシラン含有材料を処理する方法であって、材料を請求項１ないし５のいずれか１項に記載の蛋白あるいは請求項１６または１７に記載の組成物と接触させることを特徴とする方法。
【請求項１９】
処理が、材料中のキシランを分解、加水分解または修飾し、あるいは植物細胞壁を分解または修飾することを特徴とする請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
処理が、キシロピラノシルまたはβ−Ｄ−キシランサブユニットの開裂を特徴とし、そして／あるいは材料が植物、植物パルプ、植物抽出物または可食性食糧またはそのための成分を含むものである、請求項１８または１９に記載の方法。
【請求項２１】
植物またはキシラン含有材料を請求項１ないし５のいずれか１項記載のポリペプチドまたは請求項１６または１７記載の組成物と接触させることにより得ることのできる、あるいは請求項１８ないし２０のいずれかに記載の方法により得られる処理材料。
【請求項２２】
材料の粘度を低下させ、材料に含まれるキシランを分解または加水分解し、あるいは材料の清澄度またはろ過性を改善する、請求項１８ないし２２のいずれかに記載の方法。
【請求項２３】
植物性材料の処理、ろ過性の改善および／またはキシラン含有液体の粘度の低下、アルコール性液体（例えば、ビール、ワイン）または果実または野菜ジュースのろ過性または清澄度の改善、農業残さの加水分解、製紙における材料（例えば、紙を含有）のリサイクリング、食糧の増粘および／または所望材料（例えば、コーヒー、植物油、デンプン）の抽出、植物パルプ、ジュースまたは抽出物の処理、パンのローフの体積、パンの品質の改善、あるいはドウの粘着性の低減方法における、請求項１ないし５のいずれか１項に記載のポリペプチドあるいは請求項１６または１７記載の組成物の使用。
【請求項２４】
請求項１ないし５のいずれか１項に記載のポリペプチドを含む（動物）飼料、食品または食糧。
【請求項２５】
醸造、ビールまたはワイン製造、蒸留、リサイクリング、生物メタン化、歯の衛生、皮革処理、製紙、果実または野菜ジュースまたは抽出物の処理、織物の処理または製造、パン焼きまたは製パン、花のバルブの処理、食品または食糧の製造、あるいは動物飼料における請求項１ないし５のいずれかに記載のポリペプチドの使用。
【請求項２６】
アルコール飲料、パン、ドウまたは茶である請求項２４記載の食品または食糧。
【請求項２７】
請求項１２ないし１４のいずれかに記載の細胞を含む、植物またはその一部分のごときトランスジェニック生物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明は、タラロマイセス由来のキシラナーゼのごとき新規キシラナーゼおよびセルロース中のキシランの分解におけるそれらの使用に関する。キシラナーゼは製パン、動物飼料（飼料の転換率を改善するために）および製紙において用途が見出される。
【０００２】
発明の背景
植物細胞壁の組成は複雑であり、変化に富み、数種類の炭水化物バイオポリマーを含んでいる。多糖類は主としてセルロース（植物細胞壁の主要構成成分）、ヘミセルロース（キシログルカンのごとき種々のβ−キシラン鎖）、ペクチンおよびリグニンの長い鎖の形態として見出される。最も豊富なヘミセルロースはキシランならびにアラビノキシランおよびキシログリカンのごときそれらの誘導体である。
【０００３】
植物ヘミセルロースはキシラン、アラビノキシラン、グルクロノアラビノキシランおよびキシログルカンを含む。キシラン（ＣＡＳ登録番号９０１４−６３−５）はアラビノースおよび／またはグルクロン酸残基のごとき側鎖で置換されていてもよいβ−１，４−結合したＤ−キシロピラノシル単位の骨格からなる。その構造は：
【化１】
2004509626.tif 000002
（Ｘｙｌｐ＝キシロピラノシル単位であり；Ａ＝α−（４−Ｏ）−メチル−（Ｄ−グルコノピラノシル単位でありアセチルの場合もあり、Ｂ＝α−（Ｌ−アラビノフラノシル）単位でありアセチルの場合もある）
で示される。
【０００４】
キシランは地球上の植物の乾燥重量の３０％以上を占める。それゆえキシランは、製パンから動物飼料転換率の改善および製紙に至る工業プロセスにおいて使用されている天然由来の物質の重要な構成成分である。
【０００５】
単子葉植物（例えば、穀類および牧草）と双子葉植物（例えば、クローバー、アブラナおよびダイス）の間、ならびに植物の種子と生長部分の間には基本的な相違が存在する。単子葉植物は主要ヘミセルロース骨格としてのアラビノキシラン複合体の存在により特徴付けられ、双子葉植物のヘミセルロースの主要構造はキシログルカン複合体である。より高いペクチン濃度は単子葉植物よりも双子葉植物において見られる。一般的には、種子はペクチン性物質に富むが、セルロース性物質は比較的少ない。
【０００６】
セルロース分解酵素は主な植物細胞壁物質に作用する能力を有するので、食品中の植物性材料の処理加工ならびに飼料に適用されており、あるいは食品または飼料の添加物として使用されている。
【０００７】
工業に利用できる大部分のセルロース分解酵素は、比較的低分子量で高温で中庸の安定性を有するキシラナーゼであると思われる。しかしながら、特定の用途には、比較的高い熱安定性を有するキシラナーゼを用いることが望ましい。キシラナーゼを動物飼料添加物として用いる場合には、動物飼料をペレット化させる間に高温条件を用いるので、高い熱安定性が好ましい。
【０００８】
発明の概要
植物性物質中に存在するようなβ−Ｄ−キシランを開裂することのできる新規キシラナーゼが提供される。そのキシラナーゼはアラビノキシランを加水分解することもでき（アラビノキシラナーゼ活性を有するともいえる）さらにアリール−β−Ｄ−キシロピラノシドを加水分解することもできる（キシロシダーゼ活性を有するともいえる）。
【０００９】
したがって、本発明は、（単離された）β−キシラナーゼポリペプチドを提供するものであり、該ポリペプチドは下記のものを含む：
（ｉ）配列番号：２のアミノ酸配列；または
（ｉｉ）β−Ｄ−キシランを開裂することのできる（ｉ）の変種；または
（ｉｉｉ）β−Ｄ−キシランを開裂することのできる（ｉ）または（ｉｉ）のフラグメント。
【００１０】
本発明のもう１つの態様によれば、下記のものを含むポリペプチドが提供される：
（ａ）配列番号：１の核酸配列、または本発明のポリペプチドをコードする配列；
（ｂ）（ａ）に示す配列に対して相補的な、あるいはハイブリダイゼーションする配列
（ｃ）（ａ）または（ｂ）の配列のフラグメント；
（ｄ）（ａ）、（ｂ）または（ｃ）に示す配列に対して少なくとも６０％の同一性を有する配列；または
（ｅ）遺伝学的コードの縮重の結果として（ａ）ないし（ｄ）に示す配列のいずれかに対して縮重した配列。
【００１１】
さらに本発明は下記のものを提供する：
−本発明のポリヌクレオチドを含み、本発明のポリペプチドを発現する能力を有しうる（例えば発現）ベクター；
−本発明のベクターを含む細胞系；
−本発明のポリペプチドの発現を得るのに適した条件下に本発明の細胞系を維持し、必要ならば本発明のポリペプチドを単離することを特徴とする、本発明のポリペプチドの製造方法；
−β−Ｄ−キシランを本発明のポリペプチドと接触させることを特徴とする、β−Ｄ−キシランの分解方法；ならびに
−β−Ｄ−キシランの存在下で本発明のポリペプチドを試験化合物と接触させ、次いで、活性のモジュレーションをモニターあるいは検出することを特徴とする、キシラナーゼ活性をモジュレーションする化合物の同定方法。
【００１２】
配列の簡単な説明
配列番号：１はタラロマイセス・エメルソニイ（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ）由来の本発明のキシラナーゼをコードするＤＮＡ配列である。
配列番号：２はそのキシラナーゼのアミノ酸配列である。
配列番号：３および４は配列番号：１にハイブリダイゼーションする人工ＰＣＲプライマーである。
【００１３】
発明の詳細な説明
Ａ．ポリヌクレオチド
本発明は、本発明のポリペプチドをコードする（例えば、単離されたおよび／または精製された）ポリヌクレオチドを提供する。かくして本発明は、アミノ酸配列が配列番号：２に示すものであるキシラナーゼ（例えば、アミノ酸２３から４０８までの成熟配列）をコードするポリヌクレオチドを提供する。さらに本発明は、配列番号：２に示すアミノ酸配列に対して実質的なアミノ酸配列相同性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。下記のものから選択されるポリヌクレオチドも包含される：
（ａ）配列番号：１に示すヌクレオチド配列（例えば、６９から１２２４までのポリヌクレオチド）を含むポリヌクレオチド、またはその相補物；
（ｂ）配列番号：１に示すヌクレオチド配列に（例えば、選択的に）ハイブリダイゼーションしうるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、またはそのフラグメント；
（ｃ）配列番号：１に示すヌクレオチド配列の相補物に（例えば、選択的に）ハイブリダイゼーションしうるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、またはそのフラグメント；および／または
（ｄ）遺伝学的コードの縮重の結果として（ａ）、（ｂ）または（ｃ）に示すポリヌクレオチドに対して縮重しているポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド。
【００１４】
本発明のポリヌクレオチドは下記のポリヌクレオチドも包含する：
（ａ）キシラナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであって、
（１）配列番号：１のコーディング配列（例えば、６９から１２２４までのポリヌクレオチド）であるもの；または
（２）（１）に示す配列の相補物に選択的にハイブリダイゼーションする配列であるもの；または
（３）遺伝学的コードの縮重の結果として（１）または（２）に示す配列に対して縮重している配列であるもの；あるいは
（ｂ）（ａ）に示すポリヌクレオチドに対して相補的な配列であるポリヌクレオチド。
なお、特記しないかぎり、配列番号：１という場合には、成熟コーディング配列（６９から１２２４までのポリヌクレオチド）と置き換えてもよい。
【００１５】
ハイブリダイゼーション可能な配列
用語「ハイブリダイゼーションしうる」は、バックグラウンドよりも有意に高いレベルにおいて、本発明の標的ポリヌクレオチドが、プローブとして使用される核酸（例えば、配列番号：１に示すヌクレオチド配列、またはそのフラグメントもしくはその相補物）にハイブリダイゼーションしうることを意味する。また本発明は、本発明のキシラナーゼまたはその変種をコードするヌクレオチド配列ならびにそれらに対して相補的なヌクレオチド配列を包含する。ヌクレオチド配列はＲＮＡまたはＤＮＡであってよく、よって、ゲノムＤＮＡ、合成ＤＮＡまたはｃＤＮＡを包含する。好ましくは、ヌクレオチド配列はＤＮＡ配列であり、最も好ましくはｃＤＮＡ配列である。典型的には、本発明のポリヌクレオチドは、選択的な条件下において配列番号：１の（例えば成熟）コーディング配列またはその相補物にハイブリダイゼーションしうるヌクレオチドの連続した配列を含む。当該分野においてよく知られた方法１により、かかるヌクレオチドを合成することができる。
【００１６】
本発明のポリヌクレオチドは、バックグラウンドよりも有意に高いレベルで、配列番号：１のコーディング配列またはその相補物にハイブリダイゼーションしうる。バックグラウンドハイブリダイゼーションは、例えば、ｃＤＮＡライブラリー中に存在する他のｃＤＮＡにより生じうる。典型的には、シグナルレベル（例えば、本発明のポリヌクレオチドとコーディング配列またはその相補物との間の相互作用により生じる）は、他のポリヌクレオチドと配列番号：１の（例えば成熟）コーディング配列との間の相互作用の少なくとも１０倍、好ましくは少なくとも１００倍である。相互作用の強度を、例えばプローブを３２Ｐで放射性標識することにより測定してもよい。典型的には、低いストリンジェンシー（０．３Ｍ塩化ナトリウムおよび０．０３Ｍクエン酸ナトリウム、約４０℃）、中庸のストリンジェンシー（０．３Ｍ塩化ナトリウムおよび０．０３Ｍクエン酸ナトリウム、約５０℃）または高いストリンジェンシー（０．３Ｍ塩化ナトリウムおよび０．０３Ｍクエン酸ナトリウム、約６０℃）の条件を用いて選択的ハイブリダイゼーションを達成してもよい。当該分野で知られたいずれの適当な条件下でハイブリダイゼーションを行なってもよく、指針として、低いストリンジェンシーは２ｘＳＳＣ、５５℃であってもよく、中庸のストリンジェンシーは０．５ないし１．０ｘＳＳＣ、６０℃であってもよく、高いストリンジェンシーは０．５％ ＳＤＳ存在下０．１または０．２ｘＳＳＣ、６０℃またはそれ以上（例えば６８℃）であってもよい。
【００１７】
修飾
本発明のポリヌクレオチドはＤＮＡまたはＲＮＡを含みうる。それらは１本さまたは２本鎖であってよい。それらは１個またはそれ以上の合成または修飾ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドであってもよい。ポリヌクレオチドに対する多くの異なるタイプの修飾が当該分野において知られている。これらはメチルホスホネートおよびホスホロチオエート骨格ならびに／あるいは分子の３’および／または５’末端におけるアクリジンまたはポリリジン鎖の付加を包含する。本発明の目的のために、本明細書記載のポリヌクレオチドを当該分野で利用可能ないずれの方法により修飾してもよいことが理解されるべきである。
【００１８】
当業者は、常套的方法を用いて、本発明のポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド配列に影響しないヌクレオチド置換を行なうことができ、例えば本発明のポリペプチドが発現されるべき特定の宿主生物のコドン利用を反映するものとすることができることを理解すべきである。
【００１９】
配列番号：１の（例えば成熟）コーディング配列を、ヌクレオチド置換により、例えば１、２または３ないし１０、２５、５０または１００までの置換により修飾してもよい。別法としてあるいはさらに、１またはそれ以上の挿入および／または欠失および／または片方または両方の末端における伸長によりポリヌクレオチドを修飾してもよい。一般的には、修飾ポリヌクレオチドはキシラナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする。縮重置換を行なってもよく、そして／あるいは、例えばポリペプチドに関して後述するように修飾配列が翻訳される場合に保存的アミノ酸置換を生じさせる置換を行なってもよい。
【００２０】
ホモログ
配列番号：１（またはヌクレオチド６９−１２２４）のＤＮＡコーディング配列（例えば、その相補物）に選択的にハイブリダイゼーションしうるヌクレオチド配列は、配列番号：１のコーディング配列に対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の同一性（または相同性）を有していてもよい。このことは、少なくとも２０個、好ましくは少なくとも３０個または６０個、例えば少なくとも１００個、少なくとも２００個、より好ましくは少なくとも３００個の連続したヌクレオチドの領域に関して、あるいは最適には配列番号：１の全長に関してあてはまってもよい。
【００２１】
上で定義した相同性および最小サイズのいずれの組合せを用いて本発明のポリヌクレオチドを定義してもよいが、よりストリンジェントな組合せ（すなわち、より長い領域に関してより高い相同性）が好ましい。よって、例えば、４０個のヌクレオチドに関して少なくとも９０％の相同性を有するポリヌクレオチドと同様に、２５個、好ましくは３０個のヌクレオチドに関して少なくとも８０％または９０％の相同性を有するポリヌクレオチドは本発明の１態様を形成する。
【００２２】
ポリヌクレオチド（または蛋白）配列のホモログは、例えば、少なくとも２０、２５、３０、１００個またはそれ以上の連続したヌクレオチド（またはアミノ酸）の領域に関して、典型的には、少なくとも７０％の相同性、好ましくは少なくとも８０、９０、９５、９７または９７％の相同性を有する。アミノ酸同一性に基づいて相同性を計算してもよい（「ハードホモロジー」という場合がある）。
【００２３】
例えば、ＵＷＧＣＧパッケージはＢＥＳＴＦＩＴプログラムを提供し、該プログラムを用いて相同性を計算することができる（例えば、そのデフォールトセッティング５により使用）。ＰＩＬＥＵＰおよびＢＬＡＳＴアルゴリズムを用いて相同性を計算し、あるいは配列を並べる（例えば、デフォールトセッティング６，７により同等または対応配列を同定する）ことができる。
【００２４】
ＢＬＡＳＴ分析を行なうためのソフトウェアはＮａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｈｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ （ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）から公に利用できる。このアルゴリズムは、データベース配列中の同じ長さのワードと並置された場合に、先ず、いくつかの正の値の閾スコアＴと合致または満足する問題となる配列中の長さＷの短いワードを同定することにより高いスコアの配列ペアー（ＨＳＰｓ）を同定することを特徴とする。Ｔを隣接ワードスコア閾値という６，７。これらの初期隣接ワードのヒットはそれらを含むＨＳＰｓを見つけるための検索を開始するための種として作用する。ワードのヒットは、積算並置スコアが増加しうるかぎり各配列の両方向において拡張される。各方向におけるワードのヒットに関する拡張が以下の場合に停止される：積算並置スコアがその最大達成値から量Ｘだけ下落した場合；１またはそれ以上の負のスコアを示す残基の並置の蓄積により積算スコアがゼロまたはそれ以下になった場合；あるいはいずれかの配列の末端に達した場合。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメーターＷ、ＴおよびＸは並置の感度および速度を決定する。ＢＬＡＳＴプログラムはワード長１１、ＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックス８並置（Ｂ）５０、期待値（Ｅ）１０、Ｍ＝５、Ｎ＝４、ならびに両方の鎖の比較をデフォールトとして用いる。
【００２５】
ＢＬＡＳＴアルゴリズムは２つの配列間の類似性の統計学的分析を行なう９。ＢＬＡＳＴアルゴリズムにより提供される類似性の１の尺度は最小総確率（Ｐ（Ｎ））であり、２つのヌクレオチドまたはアミノ酸配列間の合致が偶発的に生じる確率の示度を提供する。例えば、第１の配列と第２の配列を比較した場合の最小総確率が約１未満、好ましくは約０．１未満、より好ましくは約０．０１未満、最も好ましくは約０．００１未満である場合に１の配列がもう１つの配列と類似であるとみなされる。
【００２６】
プライマーおよびプローブ
本発明のポリヌクレオチドをプライマーとして、例えば、ＰＣＲプライマー、別の増幅反応用のプライマー、プローブとして用いてもよく、あるいはポリヌクレオチドをベクター中にクローン化してもよい。かかるプライマー、プローブおよび他のフラグメントは少なくとも２０、２５、３０または４０ヌクレオチドの長さ、あるいは２０、２５、３０または４０ヌクレオチドまでの長さ、例えば、少なくとも２５、３０または４０ヌクレオチドの長さである。典型的には、それらは３０、４０、５０、６０、７０，１００、１５０、２００または３００ヌクレオチドまでの長さであり、あるいは配列番号：１の（例えば成熟）コーディング配列よりもこの数だけ短い長さである（５または１０ヌクレオチドのような数個のヌクレオチドだけ短いものであってもよい）。
【００２７】
一般的には、プライマーは、所望ヌクレオチドを段階的に製造することを包含する合成的手段により製造されるであろう。当該分野において自動的方法を用いてこれを行なう方法を容易に用いることができる。本発明のプイライマーの例を配列番号：３および４に示す。
【００２８】
一般的には、組換え法を用いて、例えば、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）クローニング法を用いてより長いポリヌクレオチドが製造されるであろう。この方法は、クローン化が望まれるキシラナーゼの領域に対するプライマー（例えば約１５ないし３０ヌクレオチド）のペアーを作成し、標的（例えば、酵母、細菌、植物、原核生物または真菌）細胞、好ましくはタラロマイセス株の細胞から得たｍＲＮＡまたはｃＤＮＡにプライマーを接触させ、所望領域の増幅を引き起こす条件下でポリメラーゼ連鎖反応を行ない、増幅されたフラグメントを単離し（例えば、アガロースゲル上で反応混合物を精製することにより）、ついで、増幅されたＤＮＡを回収することを含むであろう。適当な制限酵素認識部位を含むようにプライマーを設計して、増幅されたＤＮＡを適当なクローニングベクター中にクローン化できるようにしてもよい。
【００２９】
かかる方法を用いて本明細書に記載したキシラナーゼの全体または一部を得てもよい。配列番号：１のｃＤＮＡまたは例えばイントロンおよびプロモーター領域を含むキシラナーゼ遺伝子に対応するゲノムクローンも本発明の範囲内であり、真菌、酵母、細菌、植物または原核生物細胞からのゲノムＤＮＡから出発して同様の方法（例えば、組換え法ＰＣＲ、クローニング法）で得ることができる。
【００３０】
ポリヌクレオチドまたはプライマーは指示標識、例えば放射性または非放射性標識を担持していてもよい。適当な標識は３２Ｐまたは３５Ｓのごときラジオアイソトープ、酵素標識、あるいはビオチンのごとき他の蛋白標識を包含する。かかる標識を本発明のポリヌクレオチドまたプライマーに付加してもよく、自体公知の方法を用いて検出してもよい。
【００３１】
標識されたあるいは標識されていないポリヌクレオチドを、（例えば真菌の）試料中のキシラナーゼまたはその変種の検出あるいは配列決定のための核酸に基づく試験に使用してもよい。検出のためのかかる試験は、一般的には、ハイブリダイゼーション条件下において、ＤＮＡを含有する（疑いのある）（例えば真菌の）試料を本発明のプローブまたはプライマーと接触させ、次いで、プローブと試料中の核酸との間に形成された２本鎖を検出することを含む。ＰＣＲのごとき方法を用いて、あるいはプローブを固体支持体上に固定化し、プローブにハイブリダイゼーションしない試料中の核酸を除去し、次いで、プローブにハイブリダイゼーションした核酸を検出することによりかかる検出を行なってもよい。別法として、試料核酸を固体支持体上に固定化し、次いで、かかる支持体に結合したプローブ量を検出してもよい。
【００３２】
便利には、本発明のプローブを適当な容器中の試験キットの形態としてパッケージングしてもよい。かかるキットにおいて、プローブが固体支持体に結合されていてもよく、その場合、キットが設計されるアッセイフォーマットはかかる結合を必要とする。キットは探索すべき試料を処理するための適当な試薬を含んでいてもよく、それにより試料中の核酸にプローブがハイブリダイゼーションし、さらにキットは対照試薬、説明書等を含んでいてもよい。
【００３３】
好ましくは、ポリペプチドと同じ生物、例えば真菌、特にタラロマイセス属の真菌から本発明のポリヌクレオチドを得る。
【００３４】
本発明のポリヌクレオチドはキシラナーゼ活性を有する配列番号：１の配列の変種も包含する。付加、置換および／または欠失により変種を得てもよく、変種はβ−Ｄ−キシランポリマーを開裂する能力を有していてもよい。
【００３５】
ポリヌクレオチドの製造
配列番号：１（例えば配列番号：１の成熟コーディング配列）に対して１００％の同一性は有していないが、本発明の範囲内に属するポリヌクレオチドを多くの方法で得ることができる。よって、本明細書記載のキシラナーゼ配列の変種を、例えば本発明のポリペプチドのソースとして議論される一定範囲の生物から作成されたゲノムＤＮＡライブラリーを探索することにより得てもよい。さらに、キシラナーゼの他の真菌、植物または原核生物ホモログを得てもよく、一般的には、かかるホモログおよびそのフラグメントは配列番号：１にハイブリダイゼーションしうるであろう。他の種由来のｃＤＮＡライブラリーまたはゲノムＤＮＡライブラリーを探索し、次いで、高いストリンジェンシー（すでに述べた）の媒体条件下で配列番号：１の全体または一部を含むプローブを用いてかかるライブラリーを探索することによりかかる配列を得てもよい。配列番号：１の全体または一部を含む核酸プローブを用いて、本発明のポリペプチドのソースとして記載された他の種由来のｃＤＮＡライブラリーを探索してもよい。
【００３６】
変種および保存されたアミノ酸配列をコードするホモログ中の配列を標的にするよう設計されたプライマーを用いる縮重ＰＣＲを用いて種ホモログを得てもよい。プライマーは１またはそれ以上の縮重位置を含んでいてもよく、既知配列に対する単一配列プライマーを用いる配列のクローニングに用いるよりも低いストリンジェンシーの条件で用いられるであろう。
【００３７】
別法として、キシラナーゼ配列またはその変種の部位特異的突然変異によりかかるポリヌクレオチドを得てもよい。このことは、例えば、ポリヌクレオチド配列が発現される特定の宿主細胞に適したコドンに配列を最適化するためにサイレントコドン変化が必要とされる場合に有用でありうる。制限酵素部位を導入するために、あるいはポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドの特性または機能を変化させるために他の配列変化が望ましいかもしれない。
【００３８】
本発明は本発明のポリヌクレオチドおよびその相補物を含む２本鎖ポリヌクレオチドを包含する。
【００３９】
また本発明は、後で説明する本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドも提供する。かかるポリヌクレオチドは本発明のポリペプチドの組換え法による製造のための配列として有用であろうから、それらが配列番号：１の配列にハイブリダイゼーションしうることは必要ではないが、一般的には、ハイブリダイゼーションしうることが望ましい。さもなくば、所望ならばかかるポリヌクレオチドを上で説明したように標識し、使用し、製造してもよい。特定のプライマーを用いるＰＣＲ法３３，３４を用いることによりＤＮＡフラグメントを得てもよい。
【００４０】
Ｂ．ポリペプチド
本発明は、（例えば（実質的に）精製および／または単離された）キシラナーゼおよびその変種に関する。本発明のポリペプチドは配列番号：２のアミノ酸配列、またはその一部分（例えば位置２３から４０８までの成熟配列）、またはその変種を必須として構成されるものであってもよい。ポリペプチド上記の本発明のポリヌクレオチドによりコードされていてもよい。配列番号：２という場合には、特記しないかぎり、成熟配列のみ（残基Ａｌａ２３からＬｅｕ４０８まで）と置き換えてもよい。
【００４１】
本発明のポリペプチドはアラビノキシランおよびアリール−β−Ｄ−キシロシドの両方に対して活性を有しうる（例えば、アラビノキシリナーゼおよびキシロシダーゼ活性を有する）。
【００４２】
本発明のポリペプチドは単離形態あるいは実質的に精製された形態であってもよい。ポリペプチドを、ポリペプチドの目的および／または機能を妨害しないであろう担体または希釈剤と混合してもよく、それでも実質的に単離されているとみなされることが理解されよう。一般的には、調合物中のポリペプチドは２０重量％よりも多くを占め、例えば、調合物の３０重量％、４０重量％、５０重量％、８０重量％、９０重量％、９５重量％または９９重量％を占める。これらは比較的純粋な組成物である：いくつかの適用に関しては、ポリペプチドは組成物中１０％、５％、２％、１％まで、あるいは０．５％未満を占めてもよい。常套的手段を用いて本発明の蛋白を精製および／または合成することができる１。いくつかの処方には（例えば、非医薬用途には）、存在するポリペプチド量は少なくてもよく、例えば０．０１ないし１０％、例えば０．１ないし５％または２％または０．２ないし１％であってもよい。
【００４３】
好ましくは、キシラナーゼ活性を有する酵素をコードする遺伝子を有する微生物から本発明のポリペプチドを得ることができる。より好ましくは、微生物は真菌であり、最適には糸状菌である。よって、好ましい生物はタラロマイセス・エメルソニイ種（例えば、ＣＢＳ３９３．６４または８１４．７０）のごときタラロマイセス属のものである。
【００４４】
活性
本発明のポリペプチドは下記の特徴の１つまたはそれ以上を有し得る：
（１）β−Ｄ−キシラナーセ活性を有する；
（２）２ないし６、例えば３ないし５、最適には３．５ないし５．０の至適ｐＨ範囲を有する；
（３）５０℃ないし９５℃、例えば７０ないし９０℃、最適には７５ないし８５℃の温度において最適活性を有する；
（４）（脱糖鎖されている場合には）３０ないし５０ｋＤａ、好ましくは３５ないし４５ｋＤａ、最適には４０ないし４４ｋＤａあるいは（糖鎖付加されている場合には）５０ないし７５ｋＤａ、好ましくは５５ないし７０ｋＤａ、最適には６０ないし６６ｋＤａの分子量を有する；そして／あるいは
（５）３．０ないし３．６の等電点を有する。
【００４５】
ポリペプチドはＥＣ．３．２．１．８の活性を有しうる。好ましくは、ポリペプチドはファミリー１０（以前はＦ−タイプと呼ばれた）からのものである。
【００４６】
「キシラナーゼ活性」は、セルロースまたはβ−Ｄ−キシランポリマー（例えば、オート麦や大麦のごとき植物中に見出される）を開裂する能力として定義される。よって、該活性は、例えば隣接したキシロピラノシル末端および／または非末端単位間においてβ−Ｄ−キシランの開裂を可能にする。好ましくは、開裂は［キシロピラノシル（１−４）キシロピラノシル］結合において起こる。ポリペプチドは２つの隣接した（例えば、未置換）単位を優先的に開裂するものであってもよい。よって、それはエンド型活性を有し得る（すなわち、エンドキシラナーゼでありうる）。基質ポリマーは置換されていてもよく、置換されていなくてもよい。それは、例えば末端キシロピラノシル単位を開裂するようなエキソ型活性を有していてもよい（すなわち、エキソキシラナーゼでありうる）。好ましくは、ポリペプチドはグルカナーゼ活性を有しない。
【００４７】
本発明のポリペプチドはアラビノキシランに対して活性を有していてもよい。アラビノキシランはキシランのサブセットであり、キシロース主鎖残基のＣ−２またはＣ−３、あるいは両方に結合したＬ−アラビノ−フラノシル側鎖を有する。アラビノキシランはＣＡＳ登録番号９８５１３−１２−３を有する。それは３位に結合したα−Ｌ−アラビノース分枝を有する（１→４）−β−Ｄ−キシランという構造を有する。通常には、このタイプのキシランはオートスペルトキシラン（ｏａｔ ｓｐｅｌｔ ｘｙｌａｎ）中に見出される。
【００４８】
この活性は未処理アラビノキシランを加水分解する能力である。このことは、アラビノキシランが未処理あるいは未修飾であること、例えば、それがアラビノフラノシダーゼで処理されていないことを意味する。この酵素はアラビノース側鎖を除去することができる。本発明のポリペプチドは、以前はアラビノフラノシダーゼでは処理されなかったアラビノキシランを加水分解（開裂）することができる。
【００４９】
アラビノキシランはオートスペルト中に見出すことができ、本明細書では、ポリペプチドの活性（ＥＸＵならびにＰＡＨＢＡＨ活性）は小麦粉由来のアラビノキシラン（アラビノース：キシロースが４１：５９）に対して決定される。アラビノキシラン（基質としての）のアッセイを後の実施例において説明する。
【００５０】
本発明のポリペプチドはキシロシダーゼ活性を有していてもよく、置換された（例えば、アリール）−β−Ｄ−キシロシド（キシロピラノシドとしても知られる）を加水分解しうる。例えば、それらは４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−キシロピラノシド（ＣＡＳ登録番号６７３４−３３−４、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏから入手可能）を加水分解できるものであってもよい。この活性は基質から蛍光マーカーを遊離させる能力である。それは５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシル−β−Ｄ−キシロピラノシド（ＣＡＳ登録番号２０７６０６−５５−１）を加水分解（これに対して活性がある）するものであってもよい。アラビノキシランおよびアリール−β−Ｄ−キシロシドの両方に対する活性の組合せは普通でなく３６，３７、キシラナーゼ活性を有するポリペプチドに関する新規な活性の組合せである。
【００５１】
変種およびホモログ
本発明のポリペプチドは配列番号：２に示すアミノ酸配列または実質的に相同的な配列、またはいずれかの配列のフラグメントを含み得、キシラナーゼ活性を有し得る。一般的には、配列番号：２に示す天然に存在するアミノ酸配列が好ましい。
【００５２】
詳細には、本発明のポリペプチドは下記のもの包含する：
ａ．配列番号：２の（成熟）ポリペプチド配列（残基２３から４０８まで）または配列番号：２の全配列；
ｂ．その天然に存在する変種または種ホモログ；あるいは
ｃ．（ａ）または（ｂ）に対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有する蛋白。
【００５３】
変種は天然に存在するものであってもよく、例えば、真菌、細菌、酵母または植物細胞中に存在するものであってもよく、配列番号：２の蛋白と実質的に同様の様式で機能しうるものであり、例えば、キシラナーゼ活性を有するものである。同様に、該蛋白の種ホモログは、天然に存在する別の種中に存在するものであり、キシラナーゼとして機能しうる同等の蛋白であろう。変種は、本発明のポリペプチドと同じ株または異なる株（しかし、同じ属または同じ種のもの）に由来する対立遺伝子変種を包含する。
【００５４】
配列番号：２のポリペプチドの製造に関して本明細書に記載した方法に従い、適当な細胞ソース、例えば、細菌、酵母、真菌または植物細胞に対してかかる方法を行なうことにより、変種および種ホモログを得ることができる。上で定義したプローブを用いて酵母、細菌、真菌または植物細胞から作成されたライブラリーを探索して、変種または種ホモログを包含するクローンを得ることもできよう。クローンを慣用的方法で処理して本発明のポリペプチドを得てもよく、自体公知の組換え法または合成法により得ることができる。
【００５５】
好ましくは、本発明のポリペプチドは配列番号：２の蛋白に対して、例えば配列番号：２の少なくとも４０、６０、１００、１５０、２００、３００または４００個の連続したアミノ酸の領域に関して、あるいは配列番号：２の全長に関して、少なくとも７０％の配列同一性、より好ましくはそれに対して少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％あるいは少なくとも９９％の配列同一性を有する。
【００５６】
よって、配列番号：２のポリペプチドおよび変種および種ホモログの配列を修飾して本発明のポリペプチドを提供することができる。アミノ酸置換、例えば、１、２または３個ないし１０、２０、３０、５０または１００個までの置換を行なってもよい。同じ数の欠失または挿入を行なってもよい。これらの変化をポリペプチドの重要な領域の外側で行なってもよく、そうすることにより依然として活性酵素を得ることができる。一般的には、修飾ポリペプチドはキシラナーゼとしての活性を保持している。
【００５７】
本発明のポリペプチドは配列番号：２の上記全長ポリペプチドおよびその変種を包含し、配列番号：２に示す配列のフラグメントも包含する。典型的には、かかるフラグメントはキシラナーゼとしての活性を保持している。フラグメントは少なくとも５０、６０、７０、８０、１００、１５０、２００または２５０アミノ酸の長さであってもよく、あるいは全長のアミノ酸（配列番号：２に示す）よりもこの数だけ短いものであってもよい。フラグメントまたは変種はβ−Ｄ−キシラン結合領域またはβ−Ｄ−キシラン開裂領域を含むかあるいはそれらを表すものである。
【００５８】
必要ならば、本発明のポリペプチドを合成手段により製造することができるが、通常には、上記のごとくそれらを組換え法により製造する。例えば、ヒスチジン残基またはＴ７タグを付加することによりそれらを修飾してしてそれらの同定または精製を促進してもよく、あるいはシグナル配列をそれらに付加することにより細胞からのそれらの分泌を促進してもよい。
【００５９】
用語「変種」は、キシラナーゼと同じ必須の特徴または基本的な生物学的機能を有しうるポリペプチドをいい、対立遺伝子変種を包含する。キシラナーゼの必須の特徴は、それがβ−Ｄ−キシラン中の１→４結合を開裂しうる酵素であるということである。キシラナーゼと同じ必須の特徴を有するポリペプチドを、後で説明するセルロース分解アッセイを用いることにより同定してもよい。
【００６０】
配列番号：２の変種は、配列番号：２から変化しているが、必ずしも天然に存在するキシラナーゼ蛋白に由来するものではない配列も包含する。これらの変種は、配列番号：２に対して何％の相同性を有するものとしてあるいはこの配列中に何個の置換を有するものとして説明されるものであってもよい。あるいはまた、変種は配列番号：１にハイブリダイゼーションするポリヌクレオチドによりコードされるものであってもよい。
【００６１】
配列番号：１の変種と同様にして変種を定義することができる。よって、変種はタラロマイセスの他の株に由来する変種配列を含んでいてもよい。キシラナーゼ活性を探し、次いで、すでに述べたようにクローニングし、配列決定することにより他のタラロマイセス株に由来する他の変種を同定することができる。変種は、そのペプチドがキシラナーゼの基本的な生物学的機能を維持しているかぎり、蛋白配列中に単一アミノ酸またはアミノ酸の群の欠失、修飾または付加を含んでいてもよい。
【００６２】
例えば、下表に従って保存的置換を行なってもよい。第２カラムの同じブロック中、好ましくは第３カラムの同じ行中のアミノ酸を互いに置換してもよい。好ましくは、置換はポリペプチドのフォールディングまたは活性に影響しないものである。
【００６３】
【表１】
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【００６４】
修飾
本発明のポリペプチドは化学的に修飾、例えば、翻訳後修飾されてもよい。例えば、それらは糖鎖付加（同じまたは異なる糖で１回またはそれ以上）されてもよく、あるいはそれらは修飾アミノ酸残基を含むものであってもよい。それらをヒスチジン残基の付加（それらの精製を促進するため）あるいはシグナル配列の付加（細胞膜中への挿入を促進するため）により修飾してもよい。ポリペプチドは１またはそれ以上の（Ｎ）アミノ−または（Ｃ）カルボキシル−末端伸長部分、例えばアミノ末端メチオニン残基、約２０〜２５残基までの小型リンカーペプチド、またはポリ−ヒスチジンまたはＴ７タグのごとき精製を促進する（小型）伸長部分、抗原性エピトープまたは（マルトース）結合ドメイン１４（例えばＣ−末端における）を有していてもよい。これらの伸長部分はリンカーを介して付加されてもよく、リンカーを介さずに付加されてもよい。
【００６５】
本発明のポリペプチドを指示標識で標識してもよい。指示標識は、ポリペプチドの検出を可能にするいずれの適当な標識であってもよい。適当な標識は、例えば１２５Ｉ、３５Ｓ、酵素、抗体、ポリヌクレオチドおよびビオチンのごときリンカーを包含する。
【００６６】
ポリペプチドを修飾して天然に存在しないアミノ酸を含むようにしてもよく、あるいはポリペプチドの安定性を増大させてもよい。蛋白またはペプチドを合成法により製造する場合、かかるアミノ酸を製造中に導入してもよい。合成または組換え法による製造後に蛋白またはペプチドを修飾してもよい。
【００６７】
本発明のポリペプチドを（１またはそれ以上の）Ｄ−アミノ酸を用いて製造してもよく、あるいは含んでいてもよい。そのような場合、本明細書で説明する慣用的なＮ ｔｏ Ｃ ｓｅｑｕｅｎｃｅを用いてアミノ酸残基を連結することができる。
多くの側鎖修飾が当該分野において知られており、本発明の蛋白またはペプチドの側鎖に施してもよい。かかる修飾は、例えば、アルデヒドとの反応、次いでＮａＢＨ４を用いる還元による還元的アルキル化によるアミノ酸の修飾、メチルアセトアミドを用いるアミジノ化あるいは無水酢酸を用いるアシル化を包含する。
【００６８】
本発明により提供される配列を、「第２世代」の酵素構築のための出発材料として用いてもよい。「第２世代」のキシラナーゼは、突然変異法（例えば、部位特異的突然変異誘発法）により変化させられた酵素であり、野生型キシラナーゼまたは本発明により製造される組換え型キシラナーゼとは異なる特性を有する。例えば、至適温度またはｐＨ、特異的活性、基質親和性、または熱安定性を変化させて、決められたプロセスにより良く適用されるようにしてもよい。
【００６９】
本発明のキシラナーゼの活性に必須のアミノ酸、そしてそれゆえ好ましくは置換のための対象であるアミノ酸を、部位特異的突然変異誘発法またはアラニン−スキャンニング突然変異法１０のごとき当該分野で知られた方法に従って同定してもよい。後者の方法において、分子の残基ごとに突然変異を導入し、得られた変異分子を生物学的活性（例えばキシラナーゼ活性）について試験して、分子の活性に重要なアミノ酸残基を同定する。核磁気共鳴、結晶学的解析または光親和性標識１１，１２，１３または分子モデリングのごとき方法により決定された結晶構造を分析することにより酵素−基質相互作用の部位を決定することもできる。
【００７０】
酵母および真菌宿主細胞の使用は、本発明の組換え発現産物に最適な生物学的活性を付与するのに必要な、かかる翻訳後修飾（例えば、蛋白分解的処理、ミリスチル化、末端切断、およびチロシン、セリンまたはスレオニンのリン酸化）を提供すると期待される。
【００７１】
本発明のポリペプチドを、それらの本来の細胞環境の外側にあるような形態で提供してもよい。よって、すでに述べたようにそれらは実質的に単離または精製されたものであってもよく、自然界においてはそれらが存在しない細胞中、例えば、他の真菌種、動物、細菌または細菌の細胞中に存在してもよい。
【００７２】
Ｃ．組換えの態様
本発明は、クローニングベクターおよび発現ベクターを包含する、本発明のポリヌクレオチドを含むベクター、ならびに例えば本発明のポリペプチドの発現が起こる条件下で適当な宿主細胞中でかかるベクターを増殖、形質転換またはトランスフェクションする方法も提供する。ポリヌクレオチドが宿主細胞のゲノムに対して異種性である本発明のポリヌクレオチドまたはベクターを含む宿主細胞も提供される。用語「異種性」は、通常には、宿主細胞について用いる場合には、天然界においてはポリヌクレオチドがその宿主細胞のゲノム中に存在せず、あるいは天然界においてはポリペプチドがその宿主により作られないことを意味する。好ましくは、宿主細胞は酵母細胞、例えば、クルイベロマイセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）属またはサッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属の酵母あるいは真菌細胞、例えばアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属の細胞である。
【００７３】
本発明のポリヌクレオチドを組換え複製可能なベクター、例えばクローニングまたは発現ベクター中に組み込むことができる。ベクターを用いて、適合する宿主細胞中で核酸を複製させてもよい。よって、さらなる態様において、本発明は、本発明のポリヌクレオチドを複製可能ベクター中に導入し、ベクターを適合する宿主細胞中に導入し、次いで、ベクターの複製を引き起こす条件下で宿主細胞を増殖させることによる、本発明のポリヌクレオチドの製造方法を提供する。ベクターを宿主細胞から回収してもよい。適当な宿主細胞は発現ベクターに関連づけて後で説明する。
【００７４】
ベクター
本発明のポリヌクレオチドを発現カセットに挿入してもよい。発現カセットまたは本発明のポリヌクレオチドが挿入されるベクターは、組換えＤＮＡ法に慣用的に使用しうるものであってよく、ベクターの選択は、それが導入される宿主細胞に依存することが多い。よって、ベクターは自律的に複製するべく、すなわち、複製が染色体の複製とは独立である染色体外エントリーとして存在するベクターであってもよく、例えばプラスミドであってもよい。あるいはまた、ベクターは、宿主細胞に導入される場合、宿主細胞ゲノム中に組み込まれ、それが組み込まれた染色体と一緒に複製されるものであってもよい。
【００７５】
好ましくは、ベクター中の本発明のポリヌクレオチドは、宿主細胞によるコーディング配列の発現を可能にする調節配列に作動可能に連結され、すなわち、ベクターは発現ベクターである。用語「作動可能に連結」は、記載された成分がそれらが予定する様式で機能することを可能にする関係において並置されていることをいう。コーディング配列に「作動可能に連結」されたプロモーター、エンハンサーまたは他の発現調節シグナルのごとき調節配列は、制御配列に適合する条件下でコーディング配列の発現が達成されるように配置され、あるいは配列が競争的に機能してそれらの目的を達成するように、例えば、転写がプロモーターにおいて開始し、ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を介して進行するように配置される。
【００７６】
ベクターはプラスミド、コスミド、ウイルスまたはファージベクターであってもよく、通常には、複製開始点、所望によりポリヌクレオチド発現のためのプロモーターおよび所望によりプロモーターのエンハンサーおよび／またはレギュレーターが提供される。ターミネーター配列が存在してもよく、ポリアデニルか配列のようなものであってもよい。ベクターは１またはそれ以上の選択可能マーカー遺伝子、例えば、アンピシリン耐性遺伝子（細菌プラスミドの場合）またはネオマイシン耐性遺伝子（哺乳動物ベクター用）を含んでいてもよい。ベクターをインビトロで用いてもよく、例えば、ＲＮＡの製造に用いてもよく、あるいは宿主細胞のトランスフェクションまたは形質転換に用いてもよい。それらは２種またはそれ以上の本発明のポリヌクレオチドを含み、例えば、過剰発現するものであってもよい。
【００７７】
好ましくは、ポリペプチドはコードするＤＮＡ配列を適当な宿主中に発現カセットの一部として導入され、発現カセット中においてＤＮＡ配列は宿主細胞中のＤＮＡ配列の発現を指令しうる発現シグナルに作動可能に連結される。適当な宿主を発現構築物で形質転換するために、当業者によく知られた形質転換手順３，４を利用することができる。発現構築物を、選択可能マーカーを担持するベクターの一部として宿主の形質転換に用いることができ、あるいは発現構築物を、別個の分子として、選択可能マーカーを担持するベクターと一緒に同時形質転換してもよい。ベクターは１またはそれ以上の選択可能なマーカー遺伝子を含んでいてもよい。
【００７８】
好ましい選択可能マーカー１５，１６としては、宿主細胞中の欠損を補完するもの、あるいは薬剤耐性を付与するものが挙げられるが、これらに限らない。それらは、例えば、アセトアミド遺伝子またはｃＤＮＡ（ａｍｄＳ、ｎｉａＤ、ｆａｃＡ遺伝子またはＡ． ｎｉｄｕｌａｎｓ、Ａ． ｏｒｙｚａｅ、またはＡ． ｎｉｇｅｒ由来のｃＤＮＡ）、あるいはＧ４１８、ヒクロマイシン、ブレオマイシン、カナマイシン、フレオマイシンまたはベノミル耐性（ｂｅｎＡ）のような抗生物質耐性を提供する遺伝子のような、大部分の糸状菌および酵母の形質転換に使用しうる汎用マーカー遺伝子を包含する。別法として、対応変異宿主株を要するオキソトロフマーカーのごとき特別な選択マーカーを用いることもでき、例えば、ＵＲＡ３（Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来または他の酵母由来の類似遺伝子）、ｐｙｒＧまたはｐｙｒＡ（Ａ． ｎｉｄｕｌａｎｓまたはＡ． ｎｉｇｅｒ由来）、ａｒｇＢ（Ａ． ｎｉｄｕｌａｎｓまたはＡ． ｎｉｇｅｒ由来）またはｔｒｐＣがある。好ましい具体例において、発現構築物の導入後に選択マーカーが形質転換された宿主細胞から欠失されて、選択マーカー遺伝子を含まないポリペプチドを産生しうる形質転換された宿主細胞が得られる２１，２２。
【００７９】
他のマーカーとしては、ＡＴＰ合成酵素、サブユニット９（ｏｌｉＣ）、オロチジン−５’−ホスフェートデカルボキシラーゼ（ｐｖｒＡ）、細菌Ｇ４１８耐性遺伝子（これを酵母に使用してもよいが、カビに使用しない）、アンピシリン体制遺伝子（Ｅ． ｃｏｌｉ）、ネオマイシン耐性遺伝子（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）およびβ−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）をコードしているＥ． ｃｏｌｉ ＵｉｄＡ遺伝子等が挙げられる。ベクターをインビトロにおいて、例えば、ＲＮＡの製造に用いてもよく、あるいは宿主細胞をトランスフェクションまたは形質転換するために用いてもよい。
【００８０】
大部分の糸状菌および酵母に関して、好ましくは、ベクターまたは発現構築物は宿主細胞のゲノム中に組み込まれて安定な形質転換を得る。しかしながら、ある種の酵母に関しては、安定かつ高レベル発現のために発現構築物が組み込まれているエピソームベクターが利用可能であり、その例としては、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ２μおよびおよびＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ由来のｐＫＤ１プラスミド由来のベクター、あるいはＡＭＡ配列（例えば、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ由来のＡＭＡ１３，２０）を含むベクターが挙げられる。発現構築物が宿主細胞ゲノムに組み込まれる場合には、構築物はゲノム中にランダムに組み込まれ、あるいは前もって決められた標的遺伝子座に相同組換えを用いて組み込まれ、その場合、好ましくは、標的遺伝子座は高度に発現される遺伝子を含む。高度に発現される遺伝子は、そのｍＲＮＡが、例えば誘導条件下において全細胞ｍＲＮＡの少なくとも０．０１％（ｗ／ｗ）を占め得る遺伝子であり、あるいはその遺伝子産物が全細胞蛋白の少なくとも０．２％（ｗ／ｗ）を占め得る遺伝子であり、あるいは分泌遺伝子産物の場合には、少なくとも０．０５ｇ／ｌのレベルで分泌され得るものの遺伝子である。適当な高度に発現される遺伝子の多くの例を後で説明する。
【００８１】
宿主細胞に関するベクターまたは発現構築物は、本発明のポリペプチドをコードする配列のコーディング鎖に対して５’末端から３’末端へと連続して互いに作動可能に連結された下記のエレメントを含んでいてもよい：
（１）宿主細胞中でポリペプチドをコードするＤＮＡ配列の転写を指令しうるプロモーター配列；
（２）所望により、宿主細胞から培地中へのポリペプチドの分泌を指令しうるシグナル配列；
（３）ポリペプチドの成熟形態そして好ましくは活性形態をコードするＤＮＡ配列；ならびに好ましくは
（４）ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列の下流において転写を終結させうる転写終結領域（ターミネーター）。
【００８２】
ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列の下流には、１またはそれ以上の転写終結部位（例えば、ターミネーター）を含む３’非翻訳領域が存在してもよい。ターミネーターの起源はあまり重要でない。ターミネーターは、例えば、ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列にとり本来的なものであってもよい。しかしながら、好ましくは、酵母のターミネーターを酵母宿主細胞において用い、糸状菌のターミネーターを糸状菌宿主細胞において用いる。より好ましくは、ターミネーターは宿主細胞（ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列が発現される宿主細胞）に内在性のものである。
【００８３】
本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの向上した発現は、異種性調節領域、例えば、発現宿主からの目的蛋白の発現レベル、そして必要ならば分泌レベルを増大させるために、そして／あるいは本発明のポリペプチドの発現の誘導可能な制御を提供するために役立ちうるプロモーター、分泌リーダーおよび／またはターミネーター領域を選択することによっても達成できる。
【００８４】
本発明のポリペプチドをコードする遺伝子に本来的なプロモーターのほかに、他のプロモーターを用いて本発明のポリペプチドの発現を指令してもよい。プロモーターは、所望発現宿主における本発明のポリペプチドの発現を指令する有効性に関して選択されてもよい。
【００８５】
発現ベクターが設計される宿主細胞に適合するようにプロモーター／エンハンサーおよび他の発現調節シグナルを選択してもよい。例えば、原核プロモーターを用いてもよく、詳細には、Ｅ．ｃｏｌｉ株における使用に適した原核プロモーターを用いてもよい。哺乳動物細胞において発現を行なう場合、哺乳動物プロモーターを使用してもよい。組織特異的プロモーター、例えば、肝細胞特異的プロモーターを用いてもよい。ウイルスプロモーターを用いてもよく、例えば、Ｍｏｌｏｎｅｙマウス白血病ウイルスＬＴＲ（ＭＭＬＶ ＬＴＲ）プロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＬＴＲプロモーター、ＳＶ４０（例えばラージＴ抗原）プロモーター、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）ＩＥプロモーター、単純ヘルペスウイルスプロモーターまたはアデノウイルスプロモーター、ＨＳＶ ＩＥプロモーターのごときＨＳＶプロモーター、あるいはＨＰＶプロモーター、特にＨＰＶ上流調節領域（ＵＲＲ）プロモーターを用いてもよい。酵母プロモーターはＳ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＧＡＬ４およびＡＤＨプロモーター、Ｓ． ｐｏｍｂｅ ｎｍｔ１およびａｄｈプロモーターを包含する。哺乳動物プロモーターは、カドミウムおよびβ−ラクタムプロモーターのごとき重金属に応答して誘導されうるメタロチオネインプロモーターを包含する。組織特異的プロモーター、特に内皮細胞または神経細胞特異的プロモーター（例えば、ＤＤＡＨＩおよびＤＤＡＨＩＩプロモーター）が特に好ましい。
【００８６】
本発明の宿主細胞中での転写を指令しうる種々のプロモーター１５，１６を用いることができる。好ましくは、プロモーター配列は上で定義した高度に発現される遺伝子に由来するものである。好ましくはプロモーターが由来し、そして／あるいは発現構築物の組み込みのために前もって決定された標的遺伝子座中に含まれる好ましい高度に発現される遺伝子の例は、トリオース−ホスフェートイソメラーゼ（ＴＰＩ）、グリセルアルデヒド−ホスフェートデヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）、ホスホグリセレートキナーゼ（ＰＧＫ）、ピリベートキナーゼ（ＰＹＫまたはＰＫＩ）、アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）のごとき解糖系酵素をコードする遺伝子、ならびにアミラーゼ、グルコアミラーゼ、プロテアーゼ、キシラナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、アルコール（メタノール）オキシダーゼ、伸長因子およびリボソーム蛋白をコードする遺伝子を包含するが、これらに限らない。適当な高度に発現される遺伝子の特別な例は、例えば、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ種由来のＬＡＣ４遺伝子、ＨａｎｓｅｎｕｌａおよびＰｉｃｈｉａ由来のメタノールオキシダーゼ遺伝子（ＡＯＸおよびＭＯＸ）、Ａ． ｎｉｇｅｒおよびＡ． ａｗａｍｏｒｉ由来のグルコアミラーゼ（ｇｌａＡ）遺伝子、Ａ． ｏｒｙｚａｅのＴＡＫＡ−アミラーゼ遺伝子、Ａ． ｎｉｄｕｌａｎｓのｇｐｄＡ遺伝子およびＴ． ｒｅｅｓｅｉのセロビオヒドロラーゼ遺伝子を包含する。
【００８７】
真菌発現宿主における使用に適した強力な構成的および／または誘導可能プロモーターの例は１５，１６，３５、キシラナーゼ（ｘｌｎＡ）、フィターゼ、ＡＴＰ−合成酵素、サブユニット９（ｏｌｉＣ）、トリオースホスフェートイソメラーゼ（ｔｐｉ）、アルコールデヒドロゲナーゼ（ａｄｈＡ）、α−アミラーゼ（ａｍｙ）、アミログルコシダーゼ（ＡＧ−ｇｌａＡ遺伝子由来）、アセトアミダーゼ（ａｍｄＳ）およびグリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ（ｇｐｄ）プロモーターに関する真菌遺伝子から得ることができるものである。
強力な酵母プロモーターの例は、アルコールデヒドロゲナーゼ、ラクターゼ、３−ホスホスルセレートキナーゼおよびトリオースホスフェートイソメラーゼに関する遺伝子から得ることのできるものである。
強力な細菌プロモーターの例は、α−アミラーゼおよびＳＰｏ２プロモーターならびに細胞外プロテアーゼ遺伝子からのプロモーターである。
【００８８】
キシラナーゼをコードする遺伝子の本来的なプロモーターを、本来的なプロモーターとは異なって調節されるプロモーターに置換してもよい。
植物細胞に適したプロモーターは、ナパリンシンターゼ（ｎｏｓ）、オクトピンシンターゼ（ｏｃｓ）、マンノピンシンターゼ（ｍａｓ）、リブロース小サブユニット（ｒｉｂｉｓｃｏ ｓｓｕ）、ヒストン、コメ・アクチン、ファセオリン、カリフラワー・モザイクウイルス（ＣＭＶ）３５Ｓおよび１９Ｓならびにサーコウイルス（ｃｉｒｃｏｖｉｒｕｓ）プロモーターを包含する。これらすべてのプロモーターは当該分野において容易に利用できる。
【００８９】
さらにベクターは、真核ゲノム配列、好ましくは哺乳動物ゲノム配列、あるいはウイルスゲノム配列に対して相同的な配列を含む、ＲＮＡを生じさせるポリヌクレオチドに隣接した配列を包含する。このことは、相同組換えにより真核細胞またはウイルスゲノム中への本発明のポリヌクレオチドの導入を可能にする。詳細には、ウイルス配列により隣接された発現カセットを含むプラスミドベクターを用いて、哺乳動物細胞に本発明のポリヌクレオチドをデリバリーするのに適したウイルスベクターを得ることができる。適当なウイルスベクターの他の例は、単純ヘルペスウイルスベクター１８，１９ならびにレンチウイルス、アデノウイルス、アデノ−随伴ウイルスおよびＨＰＶウイルス（ＨＰＶ−１６またはＨＰＶ−１８のような）のごときレトロウイルスを包含する。これらのウイルスを用いる遺伝子移行法は当業者に知られている。例えば、レトロウイルスを用いて、アンチセンスＲＮＡを生じさせるポリヌクレオチドを宿主ゲノム中に安定に組み込んでもよい。対照的に、複製−欠陥アデノウイルスベクターはエピソーム性のままであり、それゆえ一時的な発現を可能にする。
【００９０】
ベクターは、アンチセンスＲＮＡを産生させるためにアンチセンス方向の本発明のポリヌクレオチドを含んでいてもよい。所望ならば、これを用いてポリペプチドの発現レベルを減じてもよい。
【００９１】
宿主細胞および発現
さらなる態様において、本発明は本発明のポリペプチドの製造方法を提供し、該方法は、ポリペプチドをコードするコーディング配列を発現させる（ベクターにより）条件下において宿主細胞（例えば、上記発現ベクターで形質転換またはトランスフェクションされたもの）を培養し、次いで、所望により発現されたポリペプチドを回収することを特徴とする。本発明のポリヌクレオチドを組換え複製可能ベクター、例えば発現ベクター中に組み込むことができる。ベクターを用いて適合する宿主細胞中で核酸を複製させてもよい。よって、さらなる具体例において、本発明は、本発明のポリヌクレオチドを複製可能ベクター中に導入し、適合する宿主細胞中にベクターを導入し、次いで、ベクターの複製を引き起こす条件下で宿主細胞を増殖させることにより本発明のポリヌクレオチドを製造する方法を提供する。ベクターを宿主細胞から回収してもよい。適当な宿主細胞は、Ｅ． ｃｏｌｉのごとき細菌、酵母、哺乳動物細胞系および他の真核細胞系、例えば、Ｓｆ９のごとき昆虫細胞および（例えば、糸状）真菌細胞を包含する。
【００９２】
好ましくは、ポリペプチドを分泌蛋白として得る。その場合、成熟形態のポリペプチドを構築物中でコードしているＤＮＡ配列はシグナル配列をコードするＤＮＡ配列に作動可能に連結される。好ましくは、シグナル配列はポリペプチドをコードするＤＮＡ配列に本来的（同種）なものである。あるいはまた、シグナル配列はポリペプチドをコードするＤＮＡ配列に対して外来性（異種）のものであり、その場合、好ましくは、シグナル配列はＤＮＡ配列が発現される宿主細胞に対して内在性である。酵母宿主細胞に適したシグナル配列の例は酵母α−因子遺伝子由来のシグナル配列である。同様に、糸状菌宿主細胞に適したシグナル配列は、例えば、糸状菌アミログルコシダーゼ（ＡＧ）遺伝子、例えば、Ａ． ｎｉｇｅｒのｇｌａＡ遺伝子に由来するシグナル配列である。これをアミログルコシダーゼ（（グルコ）アミラーゼとも呼ばれる）プロモーター自身ならびに他のプロモーターと一緒に用いてもよい。ハイブリッドシグナル配列を本発明の目的に応じて用いてもよい。
【００９３】
好ましい異種分泌リーダー配列は真菌アミログルコシダーゼ（ＡＧ）遺伝子（ｇｌａＡ−１８アミノ酸および２４アミノ酸両方のバージョン、例えばＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ由来）、α−因子遺伝子（酵母、例えばＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓおよびＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）またはα−アミラーゼ遺伝子（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）に起源を発するものである。
【００９４】
上記のごとく適当な宿主細胞中にベクターを形質転換またはトランスフェクションして本発明のポリペプチドを発現させてもよい。このプロセスは、ポリペプチドコーディング配列をベクターに発現させる条件下において上記のごとく発現ベクターで形質転換された宿主細胞を培養することを含む。
【００９５】
よって、本発明のさらなる態様は、本発明のポリヌクレオチドまたはベクターで形質転換またはトランスフェクションされた宿主細胞あるいは本発明のポリヌクレオチドまたはベクターを含む宿主細胞を提供する。好ましくは、ポリヌクレオチドはポリヌクレオチドの複製および発現のためのベクター中に担持される。細胞はベクターに適合するように選択され、例えば、原核細胞（例えば細菌細胞）、真菌細胞、酵母細胞または植物細胞であってもよい。
【００９６】
本発明のポリペプチドが他のセルロース分解酵素を実質的に含まない形態で産生されるように異種宿主を選択してもよい。このことは、通常にはかかる酵素を産生しないＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓのごとき宿主を選択することにより行なわれてもよい。
【００９７】
本発明は、本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡ配列の組換え発現による本発明のポリペプチドの製造方法を包含する。この目的のために、本発明のＤＮＡ配列を遺伝子増幅および／またはプロモーター、分泌シグナル配列のごとき発現シグナルの交換のために用いて、適当な同種または異種宿主細胞におけるポリペプチドの経済的な製造を行なうことができる。同種宿主細胞は同じ種の宿主細胞であるか、あるいはＤＮＡが得られた種と同じ種に属する変種である。
【００９８】
好ましくは、適当な宿主細胞は細菌のごとき原核微生物細胞、あるいはより好ましくは真核細胞、例えば、酵母または糸状菌のごとき真菌、あるいは植物細胞である。一般的には、酵母細胞が真菌細胞のなかでも好ましい。なぜなら、それらは操作が簡単だからである。しかしながら、いくつかの蛋白は酵母細胞からわずかしか分泌されず、あるいはいくつかの場合には正しく産生されない（例えば、酵母における過剰糖鎖付加）。これらの場合に、カビ宿主生物を選択すべきである。
【００９９】
宿主細胞はポリペプチドを過剰発現するものであってもよく、過剰発現させるための操作はよく知られている３。よって、宿主はコーディングポリヌクレオチドの２またはそれ以上のコピーを有しうる（したがってベクターは２またはそれ以上のコピーを有しうる）。
【０１００】
Ｂａｃｉｌｌｕｓ属の細菌は、培地中に蛋白を分泌させる能力のため、異種宿主として非常に適している。宿主として適する他の細菌はＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓおよびＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ細菌である。ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列の発現用宿主として好ましい酵母細胞はＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ、Ｐｉｃｈｉａ、Ｙａｒｒｏｗｉａ、およびＳｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属の酵母である。より好ましくは、酵母細胞はＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｍａｒｘｉａｎｕｓ ｖａｒ． ｌａｃｔｉｓとしても知られる）、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ、およびＳｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅからなる群より選択される。
【０１０１】
しかしながら、最も好ましいのは（糸状）真菌宿主細胞である。好ましい糸状菌宿主細胞はＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ、Ｄｉｓｐｏｒｏｔｒｉｃｈｕｍ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ、Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ、Ｔｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ、Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｏｒａ、Ｓｐｏｒｏｔｒｉｃｈｕｍ、Ｔｈｉｅｌａｖｉａ、およびＴａｌａｒｏｍｙｃｅｓ属からなる群より選択される。より好ましくは、糸状菌宿主細胞はＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｏｊａｅ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ種のもの、またはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒグループ２３のものである。これらはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｗａｍｏｒｉｉ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｔｕｂｉｎｇｅｎｓｉｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｃｕｌｅａｔｕｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｏｅｔｉｄｕｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｊａｐｏｎｉｃｕｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅおよびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｉｃｕｕｍを包含するが、これらに限らず、さらにＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｈｔｙｓｏｇｅｎｕｍ、Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ ａｌａｂａｍｅｎｓｅ、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ、Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｏｒａ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍ、Ｓｐｏｒｏｔｒｉｃｈｕｍ ｃｅｌｌｕｌｏｐｈｉｌｕｍ、Ｄｉｓｐｏｒｏｔｒｉｃｈｕｍ ｄｉｍｏｒｐｈｏｓｐｏｒｕｍおよびＴｈｉｅｌａｖｉａ ｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ種を包含する。本発明の範囲内にある好ましい発現宿主の例はＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ種２４，２５およびＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ種のごとき真菌；Ｂａｃｉｌｌｕｓ種２６，２７、例えばＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ種のごとき細菌；Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ種２８、例えばＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ２９およびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ種、例えばＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのごとき酵母である。
【０１０２】
本発明の宿主細胞は植物細胞を包含し、それゆえ本発明は、本発明の１またはそれ以上の細胞を含有する植物およびその一部分のごときトランスジェニック生物を包含する。細胞は異種性であって本発明のポリペプチドを発現するものであってもよく、あるいは同種性であって本発明の１またはそれ以上のポリペプチドを含むものであってもよい。それゆえトランスジェニック（あるいは遺伝子操作された）植物は、そのゲノム中に挿入された（例えば安定に）本発明の１またはそれ以上のポリペプチドをコードする配列を有していてもよい。知られた方法、例えば、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓのＴｉまたはＲｉプラスミドを用いて植物細胞の形質転換を行なうことができる。したがってプラスミド（またはベクター）は植物に感染するのに必要な配列を含んでいてもよく、Ｔｉおよび／またはＲｉプラスミドの誘導体を用いてもよい。
【０１０３】
別法として、葉、根または茎のごとき植物の一部分の直接感染を行なうこともできる。この方法において、感染させられる植物は、例えばナイフで植物を切ることによりあるいは針で植物を刺すことによりあるいは研磨剤で植物をこすることにより傷をつけることができる。次いで、傷にＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍを接種する。その後植物または植物の一部分を適当な媒体上で成長させ、成熟植物を得る。一般的には修飾植物への形質転換細胞の再生を、知られた方法、例えば、抗生物質を用いて形質転換された若枝を選択し、次いで、適当な栄養分、植物ホルモン等を含有する媒体上で若枝をサブカルチャーすることにより行なうことができる１７。
【０１０４】
宿主細胞の培養および組換え体の生産
さらに本発明は、キシラナーゼまたはその変種を発現するように修飾された細胞を包含する。かかる細胞は一時的なあるいは好ましくは安定な高等真核細胞系、例えば哺乳動物細胞または昆虫細胞、下等真核細胞、例えば酵母および（例えば糸状）真菌細胞あるいは原核細胞、例えば細菌細胞を包含する。
【０１０５】
本発明の蛋白を細胞系または膜上に、例えばバキュロウイルス発現系において一時的に発現させることも可能である。本発明の蛋白の発現に適合したかかる系も本発明の範囲内である。
【０１０６】
本発明によれば、本発明の１またはそれ以上のポリヌクレオチドで形質転換された微生物発現宿主を慣用的な栄養発酵培地で培養することにより本発明のポリペプチドの製造を行なうことができる。
【０１０７】
当該分野で知られた方法を用いて本発明による組換え宿主細胞を培養してもよい。ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列の発現を行なうためのプロモーターと宿主細胞、培地のそれぞれの組み合わせが利用可能である。所望細胞密度またはポリペプチド力価に達した後、培養を停止し、既知方法を用いてポリペプチドを回収する。
【０１０８】
発酵培地は、炭素源（例えばグルコース、マルトース、糖蜜等）、窒素源（例えば硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、塩化アンモニウム等）、有機窒素源（例えば酵母エキス、麦芽エキス、ペプトン等）および無機栄養源（例えばホスフェート、マグネシウム、カリウム、亜鉛、鉄等）を含有する既知の培地を包含しうる。最適には、誘導物質（例えばセルロース、ペクチン、マルトース、マルトデキストリンまたはキシロガラクツロナン）を含んでいてもよい。
【０１０９】
適当な培地の選択は発現宿主に応じたものであってもよく、そして／あるいは発現構築物の調節に必要なものに応じたものであってもよい。かかる培地は当業者に知られている。所望ならば、培地は他の潜在的な汚染混入微生物よりも形質転換発現宿主に好まれるさらなる成分を含んでいてもよい。
【０１１０】
発酵を０．５〜３０日の期間行なうことができる。バッチ、連続またはフェドバッチプロセスであってもよく、適当には、０ないし４５℃の温度範囲で、例えば２ないし１０のｐＨにて発酵を行なうことができる。好ましい発酵条件は、２０ないし３７℃の範囲の温度、３ないし９の間のｐＨである。通常には、発現宿主および発現される蛋白の選択に基づいて適当な条件を選択する。
【０１１１】
発酵後、必要ならば、遠心分離または濾過により発酵ブロスから細胞を除去することができる。発酵停止後、あるいは細胞除去後、慣用的手段により本発明のポリペプチドを回収し、所望ならば、精製し単離してもよい。
【０１１２】
Ｄ．キシラナーゼの使用および植物またはセルロース（例えばキシラン）含有材料の処理方法
キシラナーゼ活性を有する本発明のポリペプチドを用いて真菌またはパルプおよび植物抽出物を包含する植物性材料を処理してもよい。例えば、それらを用いて穀物、野菜、果実またはそれらの抽出物を処理してもよい。都合よくは、本発明のポリペプチドを、バッファーを包含する適当な（固体または液体）担体または希釈剤と混合して組成物／酵素調合物を得る。ポリペプチドを担体に結合あるいは担体と混合してもよく、例えば固体担体に固定化してもよい。かくして本発明はさらなる態様において、本発明のポリペプチドを含む組成物を提供する。これは包装、輸送および／または保存に適した形態であってもよく、好ましくは、キシラナーゼ活性が保持されているものである。組成物はパスタ、液体、エマルジョン、粉末、フレーク、顆粒、ペレットまたは他の押し出し成形された形態であってもよい。
【０１１３】
さらに組成物は１種またはそれ以上の酵素、例えば、エンド−アラビナーゼおよびラムノガラクツロナーゼを包含するペクチナーゼ、セルラーゼ、（他の）キシラナーゼ、ガラクツロナーゼ、マンナーゼおよび／またはキシログルカナーゼのごとき付加的成分を含んでいてもよい。典型的には、ポリペプチドは液体または乾燥形態のいずれかとして安定に処方される。典型的には、所望により例えば安定化バッファーおよび／または保存料を含む組成物として製品を製造する。組成物は、植物性材料またはセルロースを消化できる他の酵素、例えば、他のセルラーゼ、例えば（β−Ｄ−）グルカナーゼを含んでいてもよい。特定の適用例には、固体マトリックスへの酵素の固定化あるいは固体担体粒子上または中への酵素の取り込みが好ましいかもしれない。組成物は種々の他の植物性材料分解酵素、例えばセルラーゼおよび他のペクチナーゼを含んでいてもよい。
【０１１４】
それゆえ、本発明のポリペプチドおよび組成物を、植物性材料を処理して植物または真菌材料の細胞壁のセルロース構成成分を分解または修飾する方法に使用してもよい。よって、さらなる態様において、本発明は植物細胞壁の分解または修飾方法を提供し、該方法は植物または真菌細胞壁を本発明のポリペプチドまたは組成物と接触させることを特徴とする。
【０１１５】
また本発明は植物性材料の処理方法を提供し、該方法は、植物性材料を本発明のポリペプチドまたは組成物と接触させて（植物性）材料中のセルロースを分解または修飾することを特徴とする。好ましくは、植物性材料は植物パルプまたはジュースのごとき植物抽出物である。
【０１１６】
詳細には、好ましくは、分解は植物細胞壁のセルロース成分のキシランサブユニットを開裂することを特徴とする。好ましくは、植物性材料は穀物、野菜、果実または野菜または果実パルプまたは抽出物である。さらに本発明は、植物性材料を本発明のポリペプチドまたは組成物と接触させることにより得ることのできる加工植物性材料を提供する。
【０１１７】
また本発明は植物抽出物の粘度を低下させる方法も提供し、該方法は、植物抽出物中に含まれるセルロース（またはキシラン）を分解するに有効な量の本発明のポリペプチドまたは組成物に植物抽出物を接触させることを特徴とする。
【０１１８】
植物およびセルロース含有材料は植物パルプ、植物の一部分および植物抽出物を包含する。本発明の文脈において、植物性材料からの抽出物は、抽出（機械的および／または化学的）、処理加工によりあるいは他の分離法により植物性材料から得ることのできる物質である。抽出物はジュース、ネクター、ベース、またはそれらから作られる濃縮物であってもよい。植物性材料は野菜、例えばニンジン、セロリー、タマネギ、マメ類またはマメ科植物（ダイズ、エンドウ）または果実、例えば梨果または種子果実（リンゴ、ナシ、マルメロ等）、ブドウ、トマト、柑橘類（オレンジ、レモン、ライム、マンダリン）、メロン、プルーン、サクランボ、クロスグリ、アカスグリ、ラズベリー、イチゴ、クランベリー、パイナップルおよび他の熱帯果実、樹木およびその一部分（例えば、花粉、マツ由来）、または穀物（オート麦、オオムギ、コムギ、トウモロコシ、コメ）を包含し、あるいはこれらに由来するものであってもよい。材料（加水分解される）は農業による残さであってもよく、例えば、サトウキビパルプ、トウモロコシの穂軸、麦わら、（挽かれた）堅果の殻、またはリサイクル可能な材料、例えば（使用済みの）紙であってもよい。
【０１１９】
よって、本発明のポリペプチドを用いて、植物パルプおよび植物抽出物を包含する植物性材料を処理することができる。それらを用いて液体または固体食糧または可食性食糧成分を処理してもよく、あるいはそれらをコーヒー、植物油脂、デンプンの抽出に、または食品における増粘剤として使用してもよい。
【０１２０】
典型的には、本発明のポリペプチドを上記組成物／酵素調合物として用いる。一般的には、例えば、植物性材料を破砕または粉砕するような機械的処理加工により得ることのできる植物パルプに組成物を添加する。植物と組成物とのインキュベーションを、典型的には、１０分ないし５時間、例えば３０分ないし２時間、好ましくは約１時間行なう。処理加工温度は好ましくは１０〜５５℃、例えば１５ないし２５℃、最適には約２０℃であり、処理すべき材料１トンあたり１０〜３００ｇ、好ましくは３０〜７０ｇ、最適には約５０ｇの酵素を使用することができる。使用されるすべての酵素またはそれらの組成物は植物パルプに続けてあるいは同時に添加することができる。酵素調合物の組成に応じて、植物性材料を先ず水に浸し（ピューレの状態にまで）あるいは液化させてもよい。本発明のポリペプチドを用いて、抽出物の収率、抽出物の粘度および／または抽出物の品質のごとき処理加工パラメーターを改善することができる。
【０１２１】
別法として、あるいは上記に加えて、本発明のポリペプチドを、植物パルプを圧搾または液化することにより得られる生ジュースに添加してもよい。使用量、温度および保持時間に関してパルプと同様のやり方で生ジュースの処理を行なう。さらに、上記の他の酵素を使用してもよい。典型的なインキュベーション条件は前の段落にて説明したものであり、その後ジュースを遠心分離または（限外）濾過して最終生成物を得る。
【０１２２】
本発明のポリペプチドで処理した後、（最終）生成物を、例えば１００℃で１分ないし１時間、本発明のポリペプチドを不完全あるいは完全に不活性化させる条件下で熱処理することができる。
【０１２３】
本発明のポリペプチドを含む生成物を果実または野菜ピューレを製造する間に使用してもよい。
【０１２４】
本発明のポリペプチドを、醸造、ワイン製造、蒸留または製パンに使用してもよい。それゆえ、それをワインおよびビールのごときアルコール飲料の製造に使用してもよい。例えば、それはろ過性および清澄度（ビール、麦芽汁またはワインの）を改善しうる。本発明の蛋白は、例えば有機材料起源の蒸留廃棄物を微生物バイオマスに生物変換する場合において、ブロスまたは培地からの溶解した有機物質の除去を促進しうる。キシラナーゼは、液化（例えばα−アミラーゼを用いる）により製造される穀物由来のグルコースシロップのろ過性を改善しそして／あるいは粘度を低下させうる。
【０１２５】
製パンにおいて、本発明のポリペプチドはドウ構造を改善し、その粘着性または柔軟性を修飾し、ローフ堆積および／またはパンの中身の構造を改善し、あるいは破壊、せん断またはパンの中身の品質のごときテクスチャー特性を改善しうる。小麦粉１ｋｇあたり１００ないし３０００、例えば１５０ないし２０００、最適には２００ないし１６００ＥＸＵの量の本発明のポリペプチドを添加してもよい。
【０１２６】
本発明のポリペプチドはそのキシラナーゼ活性のために多くの産業領域において用途がある。これらはアルコール製造のみならずバイオメタン化、製パンおよびベーキング、歯の衛生（例えば、歯または口腔用組成物）、皮革の処理または製造、製紙、医薬品、茶、織物の製造または処理、ならびに廃棄物処理における用途を包含する。それゆえ、本発明の１の態様は、本発明のポリペプチドを含む食品または食糧、例えば、アルコール飲料、パン、ドウまたは茶である。本発明のポリペプチドは、植物性材料（例えばバルブ）を処理し、特に寄生虫、ダニおよびネマトーダを抑制するために、好ましくは１種またはそれ以上の殺真菌剤とともに水性組成物中（例えば熱水中）に存在してもよい。本発明のポリペプチドはキシランを消化できるので、それらを食品または食糧（例えば、ヒトが食べるもの）に添加してもよい。また本発明は、本発明のポリペプチドおよび医薬上または獣医学上許容される担体を含む医薬および獣医学的組成物も包含する。
【０１２７】
本発明のポリペプチドは抗真菌活性も示す。それらは真菌細胞壁を分解でき、それゆえ真菌細胞を溶解して細胞に穴をあけるために使用できる。このことにより菌体内蛋白が放出されうる。このようにして本発明のポリペプチドを用いて酵母および／または真菌抽出物を調製してもよい。
【０１２８】
Ｅ．動物の飼料
さらに本発明は、１種またはそれ以上の本発明のポリペプチドを含む食糧または動物飼料組成物または添加物にも関する。ポリペプチドはその本来の濃度とは異なる濃度で飼料中に存在していてもよい。好ましい量は飼料１ｋｇあたり０．６ないし３５、例えば１．５ないし１５、好ましくは３ないし１５ｍｇである。適当には、本発明のポリペプチドは１０００ないし５００００ＥＸＵ／ｋｇ飼料、例えば２５００ないし２５０００ＥＸＵ／ｋｇ飼料、最適には５０００ないし２００００ＥＸＵ／ｋｇ飼料で飼料中に存在する。
【０１２９】
また本発明は、動物飼料組成物の製造方法にも関し、該方法は、適当にはキシランを含有する１種またはそれ以上の可食性飼料物質または成分に本発明のポリペプチドを添加することを特徴とする。本発明のポリペプチドを、飼料物質または成分とは別個に動物飼料組成物に添加することができ、あるいは他の飼料添加物と別個にまたは混合して添加することもできる。本発明のポリペプチドは飼料物質または成分の１つの必須部分でありうる。
【０１３０】
本発明のポリペプチドを、セルロースが豊富な動物飼料に添加して植物細胞壁の分解を改善し、動物による植物栄養の改善された利用に繋げてもよい。プレソーキングまたはウェットダイエットが好ましい場合には本発明のポリペプチドを飼料または貯蔵牧草に添加してもよい。有利には、本発明のポリペプチドは飼料中インビボにおいてセルロースを分解し続けることができる。一般的には、本発明の真菌によるポリペプチドは、特に低い至適ｐＨを有し、動物の胃のような酸性条件下でも重要な栄養を遊離させることができる。また本発明は、１種またはそれ以上の本発明のポリペプチドを含む（例えば、動物用）飼料または食糧を企図する。本発明のポリペプチドを、大豆由来の牛乳置換物（代替品）の製造の間に使用してもよい。これらの牛乳置換物はヒトおよび動物の両方により消費されうる。これらの牛乳置換物の製造中における典型的な問題は大豆スラリーの高粘性であり、乾燥固形分１０ないし１５％にまでスラリーを希釈する必要が生じ、望ましくない。本発明のポリペプチドを含有する酵素調合物をスラリーに添加し、あるいはスラリー加工中に添加して、高濃度の乾燥固形分（典型的には４０ないし５０％）における処理加工を可能にすることができる。酵素を、例えば大豆由来のセイボリー製品の製造に使用してもよい。
【０１３１】
組成物はさらに（特に、動物飼料に使用するための処方する場合）１種またはそれ以上のイオノフォア、酸化剤、界面活性剤、ルーメン保護アミノ酸、酵素エンハンサーまたはエサを与えられた動物の胃腸管において本来的に生じうる酵素を含んでいてもよい。
【０１３２】
反芻動物または単胃動物（例えば、家禽またはブタ）用の飼料（貯蔵牧草を包含）に添加する場合、飼料はオオムギ、コムギ、トウモロコシ、ライムギもしくはオートムギのごとき穀物またはコムギフスマまたはトウモロコシフスマのごとき穀物副産物、またはダイズおよび他のマメ類のごとき他の植物性材料を含んでいてもよい。酵素は植物細胞壁の分解を有意に改善でき、動物によるより良好な植物の利用につながる。結果として、成長および／または飼料変換率が改善されうる。本発明のポリペプチドを飼料に添加（直接添加または添加物もしくは成分として添加）してもよく、あるいはそのかわりに処理された飼料成分（例えば、セルロース／キシラン）を添加してもよい。
【０１３３】
本発明の蛋白は飼料（キシラン含有）の粘度を低下させうる：蛋白はインビボにおいてキシランを加水分解し続けることができる。本発明の蛋白は、動物の胃中のごとき非常に酸性の条件下においても活性がありうるので、動物飼料に特に適用可能である。
【０１３４】
修飾されたキシラナーゼを（外部から）添加するための特に好ましい方法は、本発明のポリペプチドをトランスジェニック植物性材料および／または（例えばトランスジェニック）種子として添加することである。かくしてポリペプチドは異種遺伝子発現により合成され得、例えば、適当な植物発現シグナル、例えば種子特異的プロモーターのごとき組織特異的プロモーターの制御下の所望酵素をコードする遺伝子が植物発現ベクター中にクローン化され得る。その後、ポリペプチドをコードする遺伝子を含有する発現ベクターを植物細胞中に形質転換し、形質転換された細胞を植物体への再生に関して選択することができる。かくして得られたトランスジェニック植物を成長させ収穫し、次いで、異種（その植物にとり異種）ポリペプチドを含む植物の部分をそのままあるいはさらに処理加工した後１の組成物に含ませることができる。酵素の（異種）発現のための一般的方法は、酵素の種子特異的発現のための方法を包含し、それらは知られている３０。異種ポリペプチドはトランスジェニック植物の種子に含まれていてもよく、あるいは植物の他の部分、例えば根、茎、葉、木部、花、樹皮および／または果実に含まれていてもよい。植物は単子葉植物または双子葉植物であってよい。適当な植物は、オートムギ、オオムギ、コムギ、トウモロコシおよびコメのごとき穀類を包含する。好ましくは、本発明のポリヌクレオチドは植物ゲノム中に安定に組み込まれる。
【０１３５】
トランスジェニック植物性材料の形態、例えばトランスジェニック種子の形態のポリペプチドの添加には、酵素を利用できるものにするため、あるいは少なくともその利用度を改善するために、植物性材料の処理加工を必要とするかもしれない。かかる処理加工法は種々の機械的方法（例えば、粉砕および／または磨砕）または押し出しもしくは伸長のごとき熱機械的処理を包含しうる。
【０１３６】
よって、本発明は、単胃動物または非反芻動物における成長および／または飼料変換率を促進する方法にも関し、該方法は本発明のポリペプチドを動物に与えることを特徴とする。適当な動物は、ブタ（または子豚）、家禽（ニワトリ、シチメンチョウのごとき）、幼獣または子牛または水性（例えば海洋）動物（例えば魚）のごとき家畜、単胃動物および／または非反芻動物を包含する。
【０１３７】
セルロース分解酵素の分析
キシラナーゼをモジュレーションしうるアゴニストまたはアンタゴニストとして作用しうる化合物を同定するためのスクリーニング方法において本発明のポリペプチドを使用することも本発明の範囲内である。一般的には、かかるスクリーニング方法は、本発明のポリペプチドを試験化合物と接触させ、次いで、活性を測定すること、あるいは試験化合物とともに本発明の化合物をインキュベーションし、次いで、キシラナーゼ活性のモジュレーションを検出することを含む。本発明のポリペプチドに結合する作用剤の結合アッセイにより同定されうる。
【０１３８】
調べたい基質に本発明の細胞を発現する細胞を接触させ、そしてポリペプチドにより媒介される効果をモニターすることにより、モジュレーター活性を決定することができる。ポリペプチドを発現する細胞をインビトロで使用してもよく、好ましくは、組換えポリペプチドを発現する細胞を用いてインビトロでアッセイを行なう。
【０１３９】
本明細書記載のアッセイおよび標準物質はキシラナーゼ活性の同定および確認を可能にするものである。これらのアッセイを用いて他のセルロース分解酵素、例えば、キシラナーゼ活性を有する酵素を検出することができる。このアッセイに使用可能な基質はキシランを包含する。
【０１４０】
本発明のもう１つの態様はセルロースを分解しうるポリペプチドの同定または検出のためのアッセイである。活性はキシラナーゼであってもよく、あるいはペクチンリアーゼ、ポリガラクツロナーゼ、エステラーゼ、セルラーゼ、キシログルカナーゼ、ガラクトナーゼ、アラビナーゼまたはラムノガラクツロナーゼであってもよい。アッセイは：
（ａ）候補化合物（通常はポリペプチド）のための基質として適当な基質（上記のような）を用意し；次いで
（ｂ）基質を候補化合物と接触させ、次いで、キシラナーゼ活性の生成物が生成されるかどうかを検出する
ことを特徴とする。
【０１４１】
上記アッセイを用いてキシラナーゼ活性のモジュレーターを同定することができる。かかる化合物は果実の軟化を抑制することができ、そのことによりより良好な果実の香りおよび発色が可能となり、さらに陳列および／または輸送中の寿命も長くすることができる。したがってこれらのアッセイを用いて、果実の軟化を抑制しうる本発明のポリペプチドの阻害剤を同定してもよい。
【０１４２】
本発明の１の態様の好ましい特徴および特性を、必要な変更を加えて別の態様に適用することができる。
【０１４３】
下記実施例を参照して本発明を説明するが、実施例は本発明を説明するだけのものであり、限定するものではない。
【０１４４】
実施例
一般的方法
ＤＮＡ単離、ゲル電気泳動、酵素による核酸の制限的修飾、サザン分析、Ｅ． ｃｏｌｉの形質転換、コロニーリフトおよびフィルターハイブリダイゼーション等のごとき標準的な分子クローニング法を標準的な方法１，２を用いて行なった。合成オリゴデオキシヌクレオチドをＩＳＯＧＥＮ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ （Ｍａａｒｓｅｎ， Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）から得た。Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ３７３Ａ ＤＮＡシーケンサーにて供給者の指示に従ってＤＮＡ配列の分析を行なった。
ＥＣＬＴＭ直接核酸標識および検出システム（Ａｍｅｒｓｈａｍ ＬＩＦＥ ＳＣＩＥＮＣＥ， Ｌｉｔｔｌｅ Ｃｈａｌｆｏｎｔ， Ｅｎｇｌａｎｄ）により、あるいは標準的な放射性標識法１によりＤＮＡ標識およびハイブリダイゼーションを行なった。
【０１４５】
実施例１：Ｔ． ｅｍｅｒｓｏｎｉｉからのＲＮＡの単離およびｃＤＮＡの合成
Ｔ． ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ株ＣＢＳ３９３．６４をキシランによる誘導条件下で培養した。数個の時点でＭｉｒａｃｌｏｔｈ ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ ｗｒａｐを用いて濾過することにより菌糸および培養上清を得た。脱無機質化された水で菌糸を十分に洗浄し、ペーパータオルに挟んで絞って過剰な水分を除去した。選択された時点（培養上清中のセルラーゼ測定値に基づく）で得た菌糸を液体窒素中で即座に凍結し、乳鉢と乳棒を用いて細紛にまで磨砕した。得られた粉末を滅菌済み５０ｍｌチューブに移し、秤量した：磨砕した１〜１．２ｇの菌糸のそれぞれに１０ｍｌのＴＲＩｚｏｌ試薬（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）を添加した（チューブ１本あたり最大２５ｍｌ）。即座に菌糸粉末を激しく混合することにより可溶化させ（１分間ボルテックス）、次いで、時々混合しながら室温で５分間インキュベーションした。０．２倍（もとのＴＲＩｚｏｌに対して）体積のクロロホルム（かくしてもともと使用した１０ｍｌの各ＴＲＩｚｏｌにつき２ｍｌ）を添加し、ボルテックスし、次いで、室温で１０分間放置した。その後、混合物を４℃で６０００ｇにて３０分遠心分離した。上の水相を新たなチューブに移し、０．５倍体積（もとのＴＲＩｚｏｌに対して）のイソプロピルアルコールを添加することにより（かくしてもともと使用した１０ｍｌの各ＴＲＩｚｏｌにつき５ｍｌ）全ＲＮＡを沈殿させた。室温で１０分間沈殿させた後、６０００ｇで３０分遠心分離することによりＲＮＡを回収した。上清を除去し、ＲＮＡペレットを１倍体積の７０％エタノールですすいだ。エタノール除去後、ＲＮＡペレットを風乾した。乾燥したＲＮＡペレットを３ｍｌのＧＴＳ（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ，ｐＨ７．５，４Ｍチオシアン酸グアニジニウム，０．５％ラウリル硫酸ナトリウム）バッファーに溶解した。ＲＮＡ１０μｌを用いて核酸の品質および濃度を決定した。
【０１４６】
ノーザン分析を行なって３、単離ＲＮＡをさらに精製した１，３。ｍＲＮＡの単離のためには、ＰＨＡＲＭＡＣＩＡ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ （カタログ番号２７−９２５８−０２）の改変プロトコル（遠心分離のかわりに重力フローを使用）を用いた３。ＤＮＡ合成のため、大きな変更点として以前記載されたように３ｐＧＢＦＩＮベクターを使用するために多くの最適化を行なったこと以外は製造者の指示に従いＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ＫＩＴを用いた。
ＴＣＡ沈殿により合成ｃＤＮＡ量を評価し、次いで、アルカリ性アガロースゲル３で電気泳動することにより分析を行なった。
【０１４７】
実施例２：Ｔ． ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ ｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡライブラリーの調製
実施例１で得たｃＤＮＡプールを平滑末端化し、アダプターに連結し、制限酵素消化を行なった３。
発現ベクターｐＧＢＦＩＮ−１１３中のｃＤＮＡのクローニングにはｃＤＮＡの５’末端のＥｃｏＲＩ部位および３’−末端のＸｈｏＩ部位の存在が必要である。それゆえ、発現ベクターに不可欠なセットを満足させるために第１鎖プライミングオリゴヌクレオチドおよび使用アダプター配列（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を選択した。
【０１４８】
得られたｃＤＮＡをＳＥＰＨＡＲＯＳＥ ＣＬ−２Ｂマトリックスによるサイズ分画により分離し、それにより得られた個々のサイズのプールを非変性ゲル電気泳動３により分析した。０．５ｋｂおよび１．０ｋｂのカットオフで得られた２つのｃＤＮＡのプールをそれぞれ、ｐＧＢＦＩＮ−１１中のｃＤＮＡライブラリーの構築のために選択した。ｐＧＢＦＩＮ−１１に関して、完全に二重消化された（ＥｃｏＲＩ−ＸｈｏＩで）ｐＧＢＦＩＮ−１１のプール（バックグラウンドライゲーション＜１％）を調製した。選択したｃＤＮＡプールをｐＧＢＦＩＮ−１１ベクター中に連結し、Ｅ． ｃｏｌｉ ＸＬ１０−Ｇｏｌｄ細菌細胞中に形質転換して２つの一次ｃＤＮＡライブラリーを得た。２つのプールの形質転換頻度は両方とも＞１．０ｘ１０６であった。
【０１４９】
両方のＥ． ｃｏｌｉ ｃＤＮＡライブラリーのフラクションからコロニーをランダムに選択し、プラスミドＤＮＡを単離した。このプラスミドＤＮＡの分析により、ｃＤＮＡライブラリーが９０ないし９５％のパーセンテージでインサートを有することが示された。
【０１５０】
さらにそのうえ、ライブラリーのフラクションからコロニーリフトを行なって、ついで、得られたフィルターを、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子をコードするＴ． ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ ｇｐｄＡ遺伝子とハイブリダイゼーションさせた。次に、プラスミドＤＮＡを単離し、制限分析により、すべてのプラスミドが正しい方向に単一インサートを含むことが示された。これらのＴ． ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ ｇｐｄＡを含むプラスミド中のｃＤＮＡの５’末端の配列決定により、５８％よりも多いものが完全長であることが示された。
【０１５１】
実施例３：Ａ． ｎｉｇｅｒへの発現ライブラリーの形質転換
以前記載されたようにしてＥ． ｃｏｌｉ ｃＤＮＡライブラリーからＤＮＡを単離した。全プラスミドＤＮＡをＮｏｔＩにて３７℃で４時間消化してＥ． ｃｏｌｉ由来のプラスミド配列を除去した。精製後、ＤＮＡを滅菌脱無機質化水に溶解した。
１回の形質転換につき１．５ｘ１０７ないし３．０ｘ１０７個のプロトプラストおよび１０μｇのプラスミドＤＮＡを用いて複数のＡ． ｎｉｇｅｒ ＤＳ２９７８の形質転換を行なった。アセトアミドを単一Ｎ−源とした場合の増殖によりａｍｄＳ選択マーカーの存在に関して形質転換体を選択した。ａｍｄＳ選択マーカーおよびｃＤＮＡ発現カセットの両方が組み込みカセット中に存在するので、アセトアミドでの増殖はｃＤＮＡ発現カセットの存在を示すものである。
【０１５２】
３０℃で約７〜１０日インキュベーション後、１００００個の形質転換体を精製した：Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ形質転換体を、形質転換プレートから、１ウェルあたり１５０μｌの固体選択培地（ＳＭ）（１０００ｍｌあたり：０．５２ｇ ＫＣｌ，１．５２ｇ Ｋ２ＨＰＯ４，０．５２ｇ ＭｇＳＯ４，２０ｇグルコース，１ｇアセトアミド，０．１Ｍ ＭＥＳバッファー，１５ｇ寒天，１ｍｌの微量元素溶液（１リットルあたり２．２ｇ ＺｎＳＯ４／７Ｈ２Ｏ，１．１ｇ Ｈ３ＢＯ３，０．５ｇ ＦｅＳＯ４／７Ｈ２Ｏ，０．１７ｇ ＣｏＣｌ２／６Ｈ２Ｏ，０．１６ｇ ＣｕＳＯ４／７Ｈ２Ｏ，０．１５ｇ ＮａＭｏＯ４／２Ｈ２Ｏ，５．０ｇ ＥＤＴＡ，ｐＨ６．５を含有），ｐＨ５．５）を入れた９６ウェルＭＴＰマスタープレート（ＭＰｓ）にロボット（ＦＬｅｘｙｓＴＭ ｃｏｌｏｎｙ ｐｉｃｋｅｒ ａｕｔｏｍａｔｅｒ）を用いて移した。形質転換体をＳＭ培地で５日間３４℃で増殖させた。かくして得られたＭＰｓのセットを用いてＭＴＰｓに接種して増殖およびその後の酵素検出用とし、ｃＤＮＡライブラリーのバックアッププレート（ＢＰｓ）にも接種し、−８０℃で保存した。
【０１５３】
実施例４：Ｔ． ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ発現ライブラリーの分析
５日間増殖させたＭＰｓを複製鋳型として用い、０．０７５％のＡＺＣＬ−キシランを含有する（１リットルあたり：０．５２ｇ ＫＣｌ，１．５２ｇ Ｋ２ＨＰＯ４，０．５２ｇ ＭｇＳＯ４，２０ｇグルコース，１ｇアセトアミド，０．１Ｍ ＭＥＳバッファー，１５ｇ寒天，１ｍｌの微量元素溶液（１リットルあたり２．２ｇ ＺｎＳＯ４／７Ｈ２Ｏ，１．１ｇ Ｈ３ＢＯ３，０．５ｇ ＦｅＳＯ４／７Ｈ２Ｏ，０．１７ｇ ＣｏＣｌ２／６Ｈ２Ｏ，０．１６ｇ ＣｕＳＯ４／７Ｈ２Ｏ，０．１５ｇ ＮａＭｏＯ４／２Ｈ２Ｏ，５．０ｇ ＥＤＴＡ，ｐＨ６．５を含有），ｐＨ５．５，０．７５ｇ ＡＺＣＬ−キシラン（Ｍｅｇａｚｙｍｅ， Ａｕｓｔｒａｌｉａ）を含有する）新鮮な選択培地（ＳＭ）プレートにプレートをレプリカした。
【０１５４】
接種後、プレートを３４℃で４８時間インキュベーションし、次いで、６５℃で６時間インキュベーションした。高温インキュベーションの前後でプレートを評点付けした。キシラナーゼ活性を示す陽性コロニーは青色拡散ハロを示した。
【０１５５】
この一次スクリーニングから得た陽性キシラナーゼクローンを新鮮なＳＭ培地に再接種し、３４℃で５日間増殖させた。次いで、かくして得られた鋳型プレートを選択培地および０．０７５％（ｗ／ｖ）ＡＺＣＬ−キシラン（Ｍｅｇａｚｙｍｅ）含有選択培地にレプリカした。ＡＺＣＬ−キシランプレートをすでに説明したように処理した。
【０１５６】
ＳＭプレートを３４℃で４８時間インキュベーションし、次いで、１リットルの５０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７）中に調合されたオートスペルトキシラン（ｏａｔ ｓｐｅｌｔ ｘｙｌａｎ）（５ｇアガロース、０．５ｇオートスペルトキシラン（Ｓｉｇｍａ ｒｅｆ：Ｘ０６２７））を含有する上層寒天で満たした。上層寒天が固化してから、プレートを６５℃で４時間置いた。活性を可視化するために、プレートをコンゴーレッド溶液（１リットルのリン酸バッファーｐＨ７．０中コンゴーレッド１０ｇ）で１５分間染色した。染色溶液を捨て、プレートを１Ｍ ＮａＣｌで洗浄した。この洗浄工程を２回繰り返した。（コンゴーレッドの）赤色バックグラウンド上に薄青色のクリアランスハロを形成することにより陽性コロニーが出現した。最終的に９個の陽性キシラナーゼコロニーが同定された。
【０１５７】
キシラナーゼプレートアッセイにおいて同定されたキシラナーゼ産生Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ形質転換体を振盪フラスコ培養３で増殖させた。増殖５日目に培地試料を取り、下記のようにしてキシラナーゼ活性を分析した。
上清（必要な場合には前もって希釈した）を０．２５Ｍ酢酸ナトリウムバッファー，ｐＨ４．５にて５倍希釈した。希釈された上清２０μｌをマイクロタイターディッシュに移し、５０μｌの基質（４％（ｗ／ｖ）Ｒｅｍａｚｏｌ Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｂｌｕｅ ＲＢＢ−Ｘｙｌａｎ（脱無機質化水に７０℃にて溶解））を添加し、ピペッティングを繰り返すことにより十分に混合した。反応混合物を室温で３０分インキュベーションした。２００μｌの９６％エタノールを添加し、室温１０分インキュベーションすることにより反応を停止した。反応が終結した後、マイクロタイタープレートをＢｅｃｋｍａｎ ＧＰＫ遠心分離機で２５００ｒｐｍ、室温で１０分間遠心分離した。１００μｌの上清を新たなマイクロタイタープレートディッシュに移し、青色の吸光度を、Ａｎｔｈｏｓｒｅａｄｅｒ （Ｐｒｏｔｏｎ ａｎｄ Ｗｉｌｔｏｎ）で６２０ｎｍにおいて分光学的に測定した。０．２５Ｍ酢酸バッファーｐＨ４．５に溶解したキシラナーゼ標準物質を用いたキャリブレーション曲線から比活性を計算した。
【０１５８】
実施例５：陽性形質転換体の遺伝学的分析
実施例４で同定された陽性（再確認された）形質転換体を液体培地で増殖させ、菌糸を得て、糸状菌からのＤＮＡ単離用のＰｕｒｅｇｅｎｅ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ （Ｂｉｏｚｙｍ Ｂ．Ｖ．）を用いて全（染色体）ＤＮＡを単離した。供給者のプロトコルに従ってＤＮＡの単離および精製を行なったが、わずかに改変して行なった：蛋白沈殿工程３および４を繰り返した。
【０１５９】
プライマー１２２０７（配列番号：４）および１１９３７（配列番号：３）を用いるＰＣＲ反応において染色体ＤＮＡを鋳型として使用して、染色体ＤＮＡ中に組み込まれた発現カセット中に存在するインサートを増幅した。
得られた菌糸をＮＯＶＯｚｙｍｅではなく５ｍｇ／ｍｌの濃度のＧｌｕｃａｎｅｘＴＭ （Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ）にて引き続き処理すること以外は既知プロトコル４の適応バージョンに従って形質転換体に関する直接ＰＣＲを行なった。
ＰＣＲ反応物は最終体積５０μｌ中にｅＬＯＮＧａｓｅＴＭＢバッファー（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｂｒｅｄａ， Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）、ｄＮＴＰｓ（各２００μｌ）、１μｌのｅＬＯＮＧａｓｅＴＭＥｎｚｙｍｅ Ｍｉｘ、１〜５μｌの鋳型、および１０〜３０ｐｍｏｌの各オリゴを含んでいた。購入した各バッチについてオリゴの最適量を実験的に決定した。平均して、１０ないし３０ｐｍｏｌを使用した。各サイクル条件で反応を行なった：１ｘ（２分）９４℃、３５ｘ（１分９４℃、１分５５℃、６分７２℃）、１ｘ（７分７２℃）。試料をアガロースゲルに乗せてＰＣＲ生成物の分析を行なった。
【０１６０】
かくして得られたＰＣＲ生成物をＥ． ｃｏｌｉ ｐｃｒ２．１クローニングベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， 供給者の指示に従って）中にサブクローニングし、プラスミドｐＧＢＸＥＡ−１を得た。ｐＧＢＸＥＡ−１を有するＥ． ｃｏｌｉ株をＣｅｎｔｒａａｌ Ｂｕｒｅａｕ ｖｏｏｒ Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓ， Ｂａａｒｎｍ ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓに寄託し、受託番号ＣＢＳ １０２１８３を付与された。
サブクローニングされたＰＣＲ生成物を配列決定した。得られたコーディング領域のヌクレオチド配列を配列番号：１に示し、蛋白の推定アミノ酸配列を配列番号：２に示す。この蛋白をＸＥＡと命名した。
【０１６１】
実施例６：Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ ｅｍｅｒｓｏｎｉｉのキシラナーゼの特徴付け
本明細書のエンドキシラナーゼ単位（ＥＸＵ）の定義
キシラナーゼ活性の単位（ＥＸＵ）を、アッセイ条件下で１分間に４．５３μｍｏｌの還元糖（キシロース当量として測定）を遊離させる酵素（Ａｓｐ． ｎｉｇｅｒ由来のエンドＩ エンド−１，４−β−キシラナーゼ３１）の量と定義する。アッセイ条件は下記のとおり：１００ｍＭのクエン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ３．５）中小麦粉由来の５ｍｇ／ｍｌのアラビノキシラン（Ｍｅｇａｚｙｍｅ， Ａｕｓｔｒａｌｉａ， ２／１１ Ｐｏｎｄｅｒｏｓａ Ｐａｒａｄｅ， Ｗａｒｒｉｅｗｏｏｄ ＮＳＷ ２１０１）、温度４０℃、反応時間６０分。１Ｍ ＮａＯＨを添加することにより反応を停止した。試料をＦｅ−ＩＩＩ−ヘキサシアニドとともに沸騰水中１５分インキュベーションした後、比色法により４２０ｎｍにおいて検出を行なった。１．１７ｇのＫＦｅ（ＣＮ）および１９．５ｇの無水炭酸ナトリウムを１リットルの水に溶解することによりヘキサシアノフェレート試薬を作成した。
【０１６２】
粘度測定アッセイ
上記のキシラナーゼの絶対的な測定に加えて、一定量の酵素を添加した場合のコムギアラビノキシラン（Ｍｅｇａｚｙｍｅ， Ａｕｓｔｒａｌｉａ， ２／１１ Ｐｏｎｄｅｒｏｓａ Ｐａｒａｄｅ， Ｗａｒｒｉｅｗｏｏｄ ＮＳＷ ２１０１）溶液の粘度の低下による相対的な方法を用いた。コムギアラビノキシランを０．４２５Ｍのクエン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ３．５）に溶解して８．３ｍｇ／ｍｌの濃度とした。基質を５５℃で１０分インキュベーションした。次いで、少量の酵素（０．０１〜０．０５単位／ｍｌ）を添加し、反応を進行させた。６０分の反応時間後、既知ＥＸＵ活性のＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒエンド−キシラナーゼ３１標準物質とともにインキュベーションしたリファレンスに対して試料の粘度を測定した。標準に対するＥＸＵで示される絶対活性を、上記のごとくＦｅ−ＩＩＩ−ヘキサシアニドを用いる還元糖法により測定した。Ｈａａｋｅ落下球粘度測定装置を用いて手動で粘度を測定した。
【０１６３】
還元糖活性分析
ＸＰＵ決定による酵素活性を、４−ヒドロキシ安息香酸ヒドラジド（ＰＡＨＢＡＨ）を用いて還元糖を検出することにより測定した。１ＸＰＵの活性は、ｐＨ５．０、６０℃で１５分コムギアラビノキシランから還元糖を生成させた場合において１分間あたり１マイクロｍｏｌの還元糖を遊離させるに必要な酵素の量と定義される（Ｄ（＋）キシロースのキャリブレーション曲線を用いた）。これは、以下の改変がＰＡＨＢＡＨ試薬に施された既知アッセイ３２である：０．０５Ｍクエン酸三ナトリウム、０．１Ｍ Ｎａ２ＳＯ３、０．０２Ｍ ＣａＣｌ２、０．５Ｍ ＮａＯＨおよび０．１Ｍ ｐ−ヒドロキシ安息香酸ヒドラジド（ＰＡＨＢＡＨ）。最終ｐＨは１２であった。室温で保存されたアルカリ性溶液中ＰＡＨＢＡＨを含有する試薬を１日以内に使用する。吸光度を４２０ｎｍで測定した。酵素溶液のかわりに１００μｌの０．１Ｍ酢酸ナトリウムバッファーを添加することによりブランクを調製した。１００μｌの（希釈された）酵素溶液を４００μｌの０．１Ｍ酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ５．０）中０．３５％コムギアラビノキシラン（Ｍｅｇａｚｙｍｅ）と混合することによりキシラナーゼ活性をアッセイした。基質の入ったエッペンドルフカップを６０℃で５分間プレインキュベーションした。酵素溶液を添加することにより反応を開始した。１．０ｍｌのＰＡＨＢＡＨ試薬を添加してから１５分後に反応を停止させた。エッペンドルフカップを１００℃で５分間加熱し、ついで、氷上で冷却した。試料を適当な速度で遠心分離して、例えば、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｍｉｃｒｏｆｕｇｅ Ｅでフルスピードで１分間遠心分離して、固体物質を沈殿させた。吸光度を４２０ｎｍで測定した。酵素溶液のかわりに１００μｌを添加することによりブランクを調製した。測定範囲は０．０１〜０．１ＸＰＵ／ｍｌである。
【０１６４】
キシラナーゼの精製
１０．４５ｇの硫酸アンモニウムを４３ｍｌの無細胞ブロスに添加し、Ａｋｔａ ｅｘｐｌｏｒｅｒ １００ （Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ） カラムを用いるエチルセファロースＴＭカラムに乗せた：１５ＥＴＨソース（コード１７−０１４６−０１，Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）（Ｄ＝１．６ｃｍｌ＝４．８ｃｍ，Ｖ＝９．６ｍｌ）。１００ｍＭ酢酸ナトリウムおよび４０％飽和硫酸ナトリウム、ｐＨ５．０でカラムを平衡化した。溶出にはリニアグラジエントを用い、２０カラム体積で１００ｍＭクエン酸ナトリウム（ｐＨ５．０）までとした。フラクションサイズ：５ｍｌ。流速：１０ｍｌ／分。モニター波長：２８０、２５４、２１４ｎｍ。フラクションをキシラナーゼに関して試験し、ＨＰＬＣ−サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）で分析した。
【０１６５】
大部分の純粋なキシラナーゼフラクションを、下記条件のセファクリルＳ２００カラムに添加した。装置：Ａｋｔａ ｅｘｐｌｏｒｅｒ １００ （Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）。カラム：ＨｉＰｒｅｐ １６／６０ セファクリルＳ２００ＨＲ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）。１００ｍＭ酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ５．０）で平衡化および溶出を行なった。流速：１ｍｌ／分。フラクションサイズ：４ｍｌ。モニター波長：２８０、２５４、２１４ｎｍ。溶出フラクションの純度をＨＰＬＣ−ＳＥＣ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびネイティブＰＡＧＥにより分析した。
【０１６６】
蛋白濃度
ＯＤ２８０を測定することにより蛋白濃度を決定した。Ｔ． ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ由来の（成熟）キシラナーゼは１１個のＴｒｐ残基（位置７２、１０８、１１５、１２１、１４８、３００、３０２、３０８、３２２、３７７および３８５）および２３個のＴｙｒ残基（位置３６、５１、１０９、１４１、１４６、１６１、１６７、１６９、１７４、１９２、１９３、１９６、２００、２１８、２８１、３０６、３１６、３２６、３３２、３４８、３９５、４０３および４０４）を含む。算出されたモル吸光係数は８９５３０Ｍ−１・ｃｍ−１であった。分子量は４１６３７ｇ／ｍｏｌであった。１ｍｇ／ｍｌのＸＥＡのＯＤ２８０は２．１５であった。
【０１６７】
Ｔ． ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ由来のキシラナーゼ（ＸＥＡ）の比活性
４０℃および６０℃において還元糖ＰＡＨＢＡＨ法を用いて比活性を決定した。ＸＥＡの比活性はこれら２つの温度においてそれぞれ１５０ＸＰＵおよび５００ＸＰＵであった。ＯＤ２８０を分析することにより蛋白濃度を決定した。
【表２】
2004509626.tif 000004
【０１６８】
Ｎ−末端配列
精製成熟ＸＥＡのＮ−末端アミノ酸配列は以下のものであることがわかった：Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ａｌａ（成熟配列においてこの最初のＡｌａ残基は配列番号：１のＡｌａ２３である）。
【０１６９】
等電点（ＩＥＰ）
装置：Ｐｈａｓｔ ｓｙｓｔｅｍ （Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）、ＩＥＦ ３−９ Ｐｈａｓｔｇｅｌｓ （Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）。製造者により提供された標準的なＰｈａｓｔ ｓｙｓｔｅｍプロトコルに従ってゲルを操作し、染色した（クマシ）。ＰｈａｓｔＧｅｌ ＩＥＦ３−９を用いる等電点フォーカシングにより決定されたＩＥＰは約３．３であった。
【０１７０】
分子量
Ｐｈａｓｔ ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）、Ｐｈａｓｔｇｅｌｓ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）、ＳＤＳ−ｂｕｆｆｅｒ ｓｔｒｉｐｓ／ｎａｔｉｖｅ ｂｕｆｆｅｒ ｓｔｒｉｐｓ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動を行なった。
試料処理：１体積のバッファー（５００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ６．８，１０％ ＳＤＳ、０．１％ブロモ−フェノールブルー）を４体積の試料と混合し、３分間煮沸した。標準的なＰｈａｓｔ ｓｙｓｔｅｍ法に従ってゲルを操作し、染色した（クマシまたは銀）。分子量マーカー（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いるＳＤＳ−ＰＡＧＥ上の分子量は約６３ｋＤであった。アミノ酸組成に基づいて算出された分子量は４１６３７ダルトンである。
【０１７１】
さらに、ゲル濾過分子量標準物質（ＢＩＯＲＡＤ， カタログ番号１５１−１９０１）を用いるゲル透過クロマトグラフィーにより分子量を決定した。高品質−ＳＥＣにより決定された分子量は４２ｋＤであった（ＴＳＫ Ｇ３０００ＳＷ（カタログ番号０５１０３，Ｔｏｓｏ Ｈａａｓ）カラムを用いてＨＰ−ＳＥＣを行なった。室温において流速１ｍｌ／分の０．１Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ７）で試料を溶出した。２８０ｎｍで検出を行なった。）。ＳＤＳ−ＰＡＧＥで観察された高い分子量は過大評価によるものと思われる。それはキシラナーゼの糖鎖付加により生じた可能性がある。
【０１７２】
脱糖鎖
５μｌの精製酵素（約５ｍｇ／ｍｌ）を２０μｌの０．５％ ＳＤＳおよび２５μｌの１％メルカプトエタノールと混合した。冷却後、１Ｍリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．０）中の２０μｌのＮ−グリコシダーゼＦ（５００Ｕ／ｍｌ）および２０μｌの３％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を添加した。その後、３７℃で一晩インキュベーションし、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにて脱糖鎖を分析した。アミノ酸配列は２つの糖鎖付加位置を示唆する（Ａｓｎ５６およびＡｓｎ１２３、配列番号：２参照）。
ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、Ｎ−グリコシダーゼＦ処理されたキシラナーゼがさらに泳動し、未処理または前処理（ＳＤＳおよびβ−メルカプトエタノールとともに煮沸）されたキシラナーゼよりも分子量が低いことが示される。それゆえ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで観察された驚くほど高い分子量はおそらく糖鎖付加により生じたのであろう。
【０１７３】
ｐＨおよび温度プロファイル
異なるｐＨおよび温度において無細胞ブロスをキシラナーゼ活性に関して分析した。ｐＨ４および種々の温度（表１Ａ参照）あるいは６０℃および異なるｐＨ（表１Ｂ参照）においてＰＡＨＢＡＨを用いる還元糖法によりキシラナーゼ活性を分析した。表１Ａは、ＸＥＡの至適温度が約８０℃であることを示す。表１ＢはＸＥＡの至適ｐＨがｐＨ４とｐＨ５の間であることを示す（数値欄が２つあるが、実験を２回行なったからである）。
【０１７４】
【表３】
2004509626.tif 000005
【０１７５】
【表４】
2004509626.tif 000006
【０１７６】
熱安定性
変性温度の示差走査熱量測定（ＤＳＣ）分析
ＤＳＣを用いてＸＥＡの変性温度を決定した。用いた測定条件は酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ５）、２〜４ｍｇ／ｍｌおよび２．５度／分の加熱速度であった。ＸＥＡの変性温度（Ｔｄ）は８０．１℃であることがわかった。
【０１７７】
Ｔ５０の測定
Ｔ５０は２０分インキュベーション後に５０％の残存活性がある温度であり、それゆえ熱安定性の尺度である。下記のようにしてＴ５０インキュベーションを行なった。最終キシラナーゼ濃度がＰＡＨＢＡＨ試験の測定範囲（ＸＰＵ単位）に入るようにキシラナーゼ試料を希釈した。次いで、それを、特異的結合およびチューブ表面での変性を避けるために１ｍｇ／ｍｌのＢＳＡを含有する０．１Ｍ酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ５．０）で希釈した。サーモミキサー中でバッファーを６０、７０、８０、８５および９０℃で前もって加熱し、その後キシラナーゼを添加した。試料を２０分加熱し、氷中で冷却した。ＰＡＨＢＡＨ試験を用いて活性を測定した。
【０１７８】
示された温度で２０分インキュベーション後の残存活性をインキュベーションされなかった対照と比較して表２に示す。この表から、Ｔ５０が８２℃であると推定できる。
【０１７９】
【表５】
2004509626.tif 000007
【０１８０】
さらに、ＥＤＴＡ存在下において異なるｐＨでＴ５０を測定した。結果を表３に示す。
【表６】
2004509626.tif 000008
表３：　 ＸＥＡの安定性に対するｐＨおよび金属イオンの影響　（１ｐＨ７および８： 低温域においてデータが少なすぎた）
ＸＥＡはｐＨ４からｐＨ５までのｐＨ領域で最も安定である。ｐＨ３．５未満およびｐＨ５．５より高いと熱安定性が低下し始めるが、現在知られている真菌キシラナーゼの大部分のものよりも有意に良好である。ＥＤＴＡの存在はＴ５０に影響しない。このことは、ＸＥＡの安定性は、ＥＤＴＡにより複合体化される正の金属イオンに依存しないことを意味する。
【０１８１】
実施例７：動物飼料におけるＴａｌａｒｏｍｙｃｅｓのキシラナーゼ（ＸＥＡ）の使用
オスのブロイラー（Ｃｏｂｂ）を用いて試験を行なった。生後１日目から５日目まではフロアペン（ｆｌｏｏｒ ｐｅｎ）中で飼育し、市販ブロイラー−スターター飼料を与えた。生後５日目に個々の体重に基づいて動物をランダムに５４個のケージに分けた。生後５〜１９日目にケージ１個につき１５羽のブロイラーを飼育した。１９日目にケージ１個あたりの動物数を１２羽に減らした。６個のケージを１つの処理に割り当てた。ケージが実験単位であるので、このことは１つの処理につき６つの同じ系があったことを意味する。
【０１８２】
スリーティアー（ｔｈｒｅｅ−ｔｉｅｒ）ケージシステムを用いて人工的に加熱、照明および換気されたブロイラーハウス中にケージをセットアップした。各ケージは０．９８ｍ２のフロアスペースを有し、ワイヤーフロア（ｗｉｒｅ ｆｌｏｏｒ）を有していた。部屋を２４時間／日照明したが、試験期間中は光の強度を徐々に低下させた。温度も徐々に低下させた：最初の１週間は２８℃、最終週は２３℃。試験期間中の湿度は約６０％に維持した。通常のワクチン接種プログラムに従って感染性気管支炎およびニューキャッスル病に対するワクチンを動物に接種した。
【０１８３】
試験において９種の処理を行なった。コムギをベースとする食餌には酵素を添加しなかったか（対照）、あるいは約２５００、５０００、１００００または２５０００ＥＸＵ／ｋｇ飼料に等しい量のＴａｌａｒｏｍｙｃｅｓエンドキシラナーゼ（ＸＥＡ）または対照としてＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒエンドキシラナーゼ（エンドＩ、ＤＳＭ Ｎ．Ｖ．，Ａｇｒｉ Ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔｓ， Ｄｅｌｆｔ， Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓから市販されているエンド−１，４−β−エンドキシラナーゼ３１）を添加した。エサに混ぜる前にプレミックス中に混合された顆粒化製品の形態で酵素をエサに添加した。食餌をペレットの形態で任意に動物に与えた。ペレット化プロセスの間、ペレットの温度は約７０℃を超えなかった。水も自由に飲ませた。
【０１８４】
生後５〜１９日目および生後５〜３３日目の期間に関して体重増加（ＢＷＧ）および飼料変換比（ＦＣＲ）を決定した。
【表７】
2004509626.tif 000009
＊ エサはオランダにおいて通常レベルのビタミンおよび微量無機物を含有していた。抗生物質成長促進剤およびコクシジウム抑制剤はエサに添加しなかった。
【０１８５】
この試験の結果を表５に示す。結果は２つの期間におけるブロイラーの平均ＢＷＧおよびＦＣＲを示す。酵素添加は活性単位（ＥＸＵ）で示す。ＢＷＧが増加するにつれＦＣＲが減少する。ＦＣＲは成長に必要なエサ量（ｇ）だからである。
【表８】
2004509626.tif 000010
酵素含有食餌に関しては、１４日間の実験期間後および全実験期間後の両方において成長およびＦＣＲが有意に（Ｐ＜０．０５）改善された。酵素使用量の間にはわずかしか相違が見られなかったが、ＸＥＡ酵素は市販酵素と同等に（それより良好でないとしても）良好であった。
【０１８６】
実施例８：Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ ｅｍｅｒｓｏｎｉｉのエンドキシラナーゼ（ＸＥＡ）の製パン性能
標準的な製パンプロセスにおいて３５００ｇの小麦粉（約２１℃における８０％ Ｋｏｌｉｂｌｉおよび２０％ Ｉｂｉｓ小麦粉（Ｍｅｎｅｂａ， Ｈｏｌｌａｎｄ）の混合物）、７７ｇの圧縮（Ｋｏｎｉｎｇｓ）酵母、７０ｇの食塩、２５ｐｐｍのアスコルビン酸、１０ｐｐｍの真菌α−アミラーゼＦｅｒｍｉｚｙｍｅＴＭＰ２００（ＤＳＭ Ｎ．Ｖ．， Ｂａｋｅｒｙ Ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔｓ， Ｄｅｌｆｔ， Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）および異なる量のエンドキシラナーゼＸＥＡ酵素および２０３０ｍＬの水（８〜１５℃）をスピナルミキサー（Ｈｏｂａｒｔ）で２分間（スピード１）混合し、次いで約６分間（スピード２）混合して１２５Ｗｈ（ワット−アワー）のエネルギーを導入することによりチンブレッド（ｔｉｎ ｂｒｅａｄ）の製造を行なった。ドウ温度は２８℃であった。熟練したパン職人の手によりドウの機械加工性を分析した。
【０１８７】
ドウ混合直後に、ドウを各８７５ｇの６つの片に分け、丸めて、３４℃でＲＨ（相対湿度）８５％のプルーフィングキャビネット中で３５分間プルーフした。この期間の終わりにドウを成形し、平鍋に入れ、３８℃でＲＨ８７％のプルーフィングキャビネット中で７５分の最終プルーフを与えた。その後、十分にプループされたドウを電気オーブン中２１０℃で３０分焼く。室温まで冷却後、ナタネ油置換法によりパンのローフの体積を決定した。室温で密封ポリエチレン袋中に１６〜２４時間保存した後、熟練したパン職人がパンの中身の品質を評価した。結果を表６に示す。
【０１８８】
【表９】
2004509626.tif 000011
【０１８９】
ドウの品質は非常に良好であった。最大のエンドキシラナーゼＸＥＡ使用量においてのみ、ドウの取り扱いにおいてわずかに粘着性であった。しかしながら、このわずかな粘着性はドウの機械加工性に影響しなかった。エンドキシラナーゼＸＥＡを含有するすべてのドウは非常に柔軟で、取り扱いが容易であった。
これらの製パン結果から、からまりの体積および中身の品質の両方に関してパンの品質改善においてエンドキシラナーゼＸＥＡは非常に有効であると結論された。ローフの体積が大きいにもかかわらず、中身の構造は依然として非常に規則正しく、細やかであった。
【０１９０】
実施例９および比較実施例１０：Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ酵素（ＸＥＡ）とＡｓｐ． ｎｉｇｅｒ由来のエンドキシラナーゼとの製パン性能の比較
オランダチンブレッド製造（Ｄｕｔｃｈ ｔｉｎ ｂｒｅａｄ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ）において、ＸＥＡの製パン性能を、現在用いられている真菌Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ由来のエンドキシラナーゼと比較した。Ａ． ｎｉｇｅｒのエンドキシラナーゼはその純粋な市販の形態、すなわちＦｅｒｍｉｚｙｍｅＴＭＨＳＰ６０００として供給された。ＦｅｒｍｉｚｙｍｅＴＭＨＳＰは製パンに適用される良好な酵素であるが、それはドウに粘着性を付与する可能性があり、十分なパンのローフの体積を常に増加させるとは限らない。
異なる量のエンソキシラナーゼＸＥＡまたはＦｅｒｍｉｚｙｍｅＴＭＨＳＰ６０００を用いたこと以外は実施例７の正確な手順を繰り返した。
結果を表７に示す。
【０１９１】
【表１０】
2004509626.tif 000012
＃ ひとかたまりの体積が大きすぎてパンの形態がマッシュルーム型になった。
【０１９２】
結果から、エンドキシラナーゼＸＥＡがドウに粘着性を付加せず、パンのローフの体積を改善し、ＦｅｒｍｉｚｙｍｅＴＭＨＳＰを導入することにより得られるよりも大きな体積となったことが明らかである。そのうえ、ＦｅｒｍｉｚｙｍｅＴＭＨＳＰのかわりにＸＥＡを使用した場合には、一定レベルのローフ体積に達するにはより少量のエンドキシラナーゼ単位／ｋｇ小麦粉で足りる。破壊およびせん断特性は同等の体積において類似していた。ＸＥＡを添加することにより得られたパンの中身の構造はＦｅｒｍｉｚｙｍｅＴＭＨＳＰを用いて得られたものと少なくとも同様に良好であった。
全体的に見ると、エンドキシラナーゼＸＥＡは、ＦｅｒｍｉｚｙｍｅＴＭＨＳＰを用いるドウおよび製パンにおけるいくつかの問題を解決するものである。粘着性がドウに導入されず、パンのローフの体積が大きく、パンの中身の構造は体積が大きいにもかかわらず依然として規則正しく細やかであった。
【０１９３】
実施例１１：ペレット化安定性試験
コーンスターチ（４５４３ｇ）をＥｒｗｅｋａＴＭＺ−捏ね機に導入した。次いで、本発明のキシラナーゼを含有する１０６９ｇの限外濾過形態の発酵物（バッチＸＥＡ５０２−８ｍ、４３５５３ＥＸＵ／ｇおよび６．７％乾燥物質を有する）を混合中にデンプンに添加して約１５０００ＥＸＵ／ｇ（９４％乾燥物質まで乾燥させた場合）を有する湿混合物を得た。液体を添加した後、さらに１０分間混合を続けた。
【０１９４】
減圧乾燥チャンバー（４０℃）において、混合物を１２時間乾燥させて９４．５％乾燥物質とした。次いで、それをＥｒｗｅｋａＴＭＦｒｅｅｗｉｔｔミル中で１ｍｍのふるいを通して粉砕した。これが実施例１１Ａであった。
【０１９５】
ＬｙｘａｓａｎＴＭＢａｔｃｈ ＯＰ ００３６（ＤＳＭ Ｎ．Ｖ．， Ｂａｋｅｒｙ Ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔｓ， Ｄｅｌｆｔ， Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓから市販されているエンド−１，４−β−エンドキシラナーゼ３１を含有）を用いて同じレシピを繰り返した。５８８５ｇのデンプンで、４２５５０ＥＸＵ／ｇおよび３．７％乾燥物質を有する１９８４ｇのＵＦ（限外濾過物）を添加した。この混合物を９４％乾燥物質まで乾燥させ、実施例１１Ａと同様に混合した（このことは比較実施例１１Ｂを形成する）。
【０１９６】
第３の試料はＢｉｏｆｅｅｄ Ｗｈｅａｔ ＣＴと呼ばれる市販のコーティングされた製品であり、Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ， Ｄｅｎｍａｒｋから市販されている。これはＴｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ ｌａｎｕｇｉｎｏｓｉｓ由来のＧ型キシラナーゼを含有し、脂質コーティングを有する（比較実施例１１Ｃ）。
【０１９７】
３つの異なる温度におけるペレット化試験において３つの試料すべてを試験した。動物飼料（組成を下表８に示す）に酵素混合物を２つの異なる濃度、０．２４％（１１Ａ）および０．１％（１１Ｂ、１１Ｃ）で添加した。混合した後、コンディショナー中で飼料を６５℃まで、７５℃まで、あるいは８５℃まで蒸気加熱し、次いで、直径５ｍｍの穴を有する６５ｍｍ厚のダイ−プレートに通してペレット化させた。それを即座に冷却した。そしてペレット中の残存活性を測定し、安定性試験の結果を表９に示す。
【０１９８】
【表１１】
2004509626.tif 000013
【０１９９】
【表１２】
2004509626.tif 000014
【０２００】
表からわかるように、高温（８５℃）での安定性に関し、本発明のＸＥＡ蛋白は現在市販されている製品よりもかなり良好な安定性の結果を生じた。
【０２０１】
実施例１２：アリール−β−Ｄ−キシロシドに対する活性
２種の基質５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシル−β−Ｄ−キシロピラノシド（ＣＡＳ登録番号２０７６０６−５５−１、Ｘ−ｂ−Ｄ−ｘｙｌともいう）および４−ウンベリフェリル−β−Ｄ−キシロピラノシド（ＣＡＳ登録番号６７３４−３３−４、４−ＭＵ−ｂ−Ｄ−ｘｙｌともいう）を用いてキシロシダーゼ活性のスクリーニングに使用した。それらを培地に直接添加した。ライブラリーを構成する株を９６ウェルプレートフォーマットに組織化した。マスタープレートは容易に検出培地上にレプリカされた。１０Ｎ ＫＯＨでｐＨを６に合わせたＸ−ｂ−Ｄ−ｘｙｌまたは４−ＭＵ−ｂ−Ｄ−ｘｙｌのいずれか（それぞれ濃度２００ｍｇ／ｌおよび１５０ｍｇ／ｌ）を含有する選択培地（０．５２ｇ／ｌ ＫＣｌ，１．５２ｇ／ｌ Ｋ２ＨＰＯ４，０．５２ｇ／ｌ ＭｇＳＯ４，２％グルコース，１０ｍＭアセトアミド，１／１０００微量元素溶液（２．２ｇ ＺｎＳＯ４／７Ｈ２Ｏ，１．１ｇ Ｈ３ＢＯ３，０．５ｇ ＦｅＳＯ４／７Ｈ２Ｏ，０．１７ｇ ＣｏＣｌ２／６Ｈ２Ｏ，０．１６ｇ ＣｕＳＯ４／７Ｈ２Ｏ，０．１５ｇ ＮａＭｏＯ４／２Ｈ２Ｏ，５．０ｇ ＥＤＴＡ，ＫＯＨでｐＨ６．５に調節し、０．４５μｍフィルターで滅菌），ＫＯＨ（１０Ｎ）でｐＨを６に調節）でライブラリーを増殖させた。Ｘ−ｂ−Ｄ−ｘｙｌを前もって最小体積のジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）に溶解した。プレートを３３℃で４８時間インキュベーションし、次いで、６５℃で６時間インキュベーションした。６５℃で６時間インキュベーションの前後でプレートを評点付けした。活性の存在を示す空色ハロの存在または不存在に基づいてＸ−ｘｙｌプレートを直接分析した。４−ＭＵ−ｘｙｌプレート上のキシロシダーゼ活性の検出は、プレートを３１０ｎｍの波長のＵＶ光の下に置くことによりチェックした。陽性クローンは青色蛍光ハロに囲まれて出現した。
【０２０２】
文献
１．　Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ． （１９８９） ”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：　 Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ”， ２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ
２．　Ｉｎｎｉｓ ｅｔ ａｌ． （１９９０） ”ＰＣＲ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ， ａ ｇｕｉｄｅ ｔｏ ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ” Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ．
３．　ＷＯ−Ａ−９９／３２６１７
４．　ｖａｎ Ｚｅｉｊｌ， Ｃ． ｅｔ ａｌ． （１９９８） Ｊ． ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ５９： ２２１−２２４
５．　Ｄｅｖｅｒｅｕｘ ｅｔ ａｌ （１９８４） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １２， ｐ３８７−３９５
６．　Ａｌｔｓｃｈｕｌ Ｓ． Ｆ．　（１９９３） Ｊ Ｍｏｌ Ｅｖｏｌ ３６：２９０−３００
７．　Ａｌｔｓｃｈｕｌ， Ｓ， Ｆ ｅｔ ａｌ （１９９０） Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２１５：４０３−１０
８．　Ｈｅｎｉｋｏｆｆ ａｎｄ Ｈｅｎｉｋｏｆｆ （１９９２） Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ ８９：１０９１５−１０９１９）
９．　Ｋａｒｌｉｎ ａｎｄ Ａｌｔｓｃｈｕｌ （１９９３） Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９０： ５８７３−５７８７
１０．　Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ ａｎｄ Ｗｅｌｌｓ， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２４４， １０８１−１０８５， １９８９
１１．　ｄｅ Ｖｏｓ ｅｔ ａｌ． （Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２５５， ３０６−３１２， １９９２）
１２．　Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ． （Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， ２２４， ８９９−９０４， １９９２）
１３．　Ｗｌｏｄａｖｅｒ ｅｔ ａｌ． （ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．， ３０９， ５９−６４， １９９２）
１４．　Ｆｏｒｄ ｅｔ ａｌ， Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ， ２， ９５−１０７， １９９１
１５．　Ｇｏｏｓｅｎ ｅｔ ａｌ， ”Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｇｅｎｅ Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ ｉｎ Ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ Ｆｕｎｇｉ：　ａｎ ｏｖｅｒｖｉｅｗ” ｉｎ：　Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍｙｃｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌ． ４ （１９９２）
１６．　Ｒｏｍａｎｏｓ ｅｔ ａｌ， Ｙｅａｓｔ ８：４２３−４８８ （１９９２）
１７．　ＥＰ−Ａ−０，４４９，３７５
１８．　ＷＯ−Ａ−９８／０４７２６
１９．　ＷＯ−Ａ−９８／３０７０７
２０．　Ａｌｅｎｋｓｏ ａｎｄ Ｃｌｕｔｔｅｒｂｕｃｋ， Ｆｕｎｇａｌ Ｇｅｎｅｔ． Ｂｉｏｌ ２１： ３７３−３９７ （１９９７）
２１．　ＥＰ−Ａ−０，６３５，５７４
２２．　ＷＯ−Ａ−９８／４６７７２
２３．　Ｒａｐｅｒ ａｎｄ Ｆｅｎｎｅｌｌ， Ｔｈｅ Ｇｅｎｕｓ Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ， Ｔｈｅ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ Ｃｏｍｐａｎｙ， Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ， ｐｐ ２９３−３４４， １９６５
２４．　ＥＰ−Ａ−０，１８４，４３３
２５．　ＥＰ−Ａ−０，２８４，６０３
２６．　ＥＰ−Ａ−０，１３４，０４８
２７．　ＥＰ−Ａ−０，２５３，４５５
２８．　ＥＰ−Ａ−０，０９６，３４０
２９．　ＥＰ−Ａ−０，３０１，６７０
３０．　ＥＰ−Ａ−０，４４９，３７５
３１．　ＥＰ−Ａ−０，４６３，７０６ （Ｇｉｓｔ−ｂｒｏｃａｄｅｓ Ｂ．Ｖ．）
３２．　Ｌｅｖｅｒ， Ｍ．， Ｐｏｗｅｌｌ， Ｊ．Ｃ．， Ｋｉｌｌｉｐ， Ｍ．， Ｓｍａｌｌ， Ｃ．Ｗ． （１９７３） Ｊ． Ｌａｂ． Ｃｌｉｎ． Ｍｅｄ．８２：６４９−６５５
３３．　ＵＳ−Ａ−４，６８３，２０２
３４．　Ｓａｉｋｉ ｅｔ ａｌ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９： ４８７−４９１ （１９８８）
３５．　Ｄａｖｉｅｓ ｅｔ ａｌ， ”Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ：　５０ ｙｅａｒｓ ｏｎ”， Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｉｎ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ， ２９： ５２７−５６０ （１９９４）
３６．　Ｔｕｏｈｙ ｅｔ ａｌ， Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ． ２９０： ５１５−５２３ （１９９３）
３７．　Ｔｕｏｈｙ ｅｔ ａｌ， Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ５０： ３７−４２ （１９９５）
（ここに記載したすべての文献を参照により本明細書に一体化させる）
【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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