(57)【要約】本発明は、高い感度および特異性で病態を検出および判別する方法を提供する。本方法により、細胞ベースのサンプルが異常細胞を含むかどうかを決定可能であり、一定の疾患について存在する疾患の組織学的型を決定することができる。本方法は、細胞ベースのサンプルにおける分子マーカーの発現レベルおよび発現パターンの変化を検出する。パネル選択および確認手順もまた提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞ベースの診断を使用した一般的病態を検出するかまたは特定の病態を判別するためのパネルであって、一般的病態または特定の病態に関連するマーカーにそれぞれ特異的に結合する複数のプローブを含み、パネルの成分プローブによる細胞学的標本中の細胞への結合パターンにより、前記病態の存在または特定の性質を診断することを特徴とするパネル。
【請求項２】
前記一般的病態が、がんおよび感染症からなる群から選択される、請求項１のパネル。
【請求項３】
前記がんが、上皮細胞系のがん、固形腫瘍系のがん、分泌腺腫瘍系のがん、および血液系のがんからなる群から選択される、請求項２のパネル。
【請求項４】
感染性生物がウイルス、細菌、原生動物、寄生虫、または真菌類である細胞ベースの疾患からなる群から前記感染症が選択される、請求項２のパネル。
【請求項５】
前記パネルが、費用、地理的位置での一般的病態の有病率、地理的位置での特定の病態の有病率、プローブの利用可能性、および営利的検討材料からなる群から選択される重み係数の使用によって至適化される、請求項１のパネル。
【請求項６】
前記各プローブが検出可能な標識を含む、請求項１のパネル。
【請求項７】
前記プローブが抗体を含む、請求項６のパネル。
【請求項８】
前記標識が、発色団、フルオロフォア、色素、放射性同位体、および酵素からなる群から選択される、請求項６のパネル。
【請求項９】
前記標識がβ線、γ線、Ｘ線、紫外線、可視光線、赤外線、およびマイクロ波からなる群から選択される電磁放射線を使用して検出される発色団である、請求項８のパネル。
【請求項１０】
前記結合パターンを光子顕微鏡検査法を使用して検出する、請求項１のパネル。
【請求項１１】
前記光子顕微鏡検査法がγ線、Ｘ線、β線、紫外線、可視光線、赤外線、およびマイクロ波からなる群から選択される少なくとも１つの電磁放射線を使用する、請求項１０のパネル。
【請求項１２】
前記検出が肺がん用であり、前記判別を、扁平上皮がん、腺がん、大細胞がん、小細胞がん、および中皮腫について行なう、請求項３のパネル。
【請求項１３】
前記検出が性感染病であり、前記判別を、クラミジア、トリコモナス、淋病、ヘルペス、および梅毒について行なう、請求項１のパネル。
【請求項１４】
（ａ）病態に関連するマーカーのライブラリーのメンバーにそれぞれ特異的に結合するプローブ結合の感受性および特異性を決定するステップと、
（ｂ）結合パターンにより前記病態の存在または特定の性質が診断される限定された複数のプローブを選択するステップと
を含む、細胞ベースの診断を使用した患者の病態の検出または病態の判別のためのパネルの形成方法。
【請求項１５】
前記決定が、
（ａ）前記疾患を罹患していることが知られている患者由来の組織学的または細胞学的サンプルおよび前記疾患を罹患していないことが知られている患者由来の組織学的または細胞学的サンプルを、前記各プローブにそれぞれ接触させるステップと、
（ｂ）各プローブの特異的結合量を、その相補疾患マーカーが前記サンプルの細胞中に存在することが知られている遺伝子座においてその相補疾患マーカーを使用して測定するステップと、
（ｃ）前記量と前記疾患の存在または特定の性質とを相関させるステップと
を含む、請求項１４の方法。
【請求項１６】
前記選択が、１つまたは複数の統計分析法、パターン認識法、および神経回路網分析を含む、請求項１４の方法。
【請求項１７】
前記選択が重み係数の使用を含む、請求項１４の方法。
【請求項１８】
（ａ）病態に特徴的な異常細胞を含むと疑われる細胞学的サンプルに請求項１に記載のパネルを接触させるステップと、
（ｂ）前記病態の存在または特定の性質を診断する前記プローブの結合パターンを検出するステップと
を含む、疾患を検出するか病態を判別する方法。
【請求項１９】
前記細胞学的サンプルが、体液、上皮細胞ベースの器官系、細針吸引、または生検から採取された細胞サンプルである、請求項１８の方法。
【請求項２０】
前記細胞学的サンプルが喀痰である、請求項１９の方法。
【請求項２１】
前記パネルが請求項１４に記載の方法によって形成された、細胞ベースの診断を使用した一般的病態を検出するかまたは特定の病態を判別するためのパネル。
【請求項２２】
前記病態が肺がんである、請求項２１のパネル。
【請求項２３】
前記疾患マーカーが、形態学的生物マーカー、遺伝的生物マーカー、細胞周期生物マーカー、分子生物マーカー、および生化学的生物マーカーからなる群から選択される、請求項１のパネル。
【請求項２４】
前記上皮細胞系のがんが、肺（ｐｕｌｍｏｎａｒｙ）、尿路、胃腸管、または生殖管に由来する、請求項３のパネル。
【請求項２５】
前記固形腫瘍系のがんが、肉腫、乳がん、膵臓がん、肝臓がん、腎臓がん、甲状腺がん、および前立腺がんからなる群から選択される、請求項３のパネル。
【請求項２６】
前記分泌腺系のがんが、肉腫、乳がん、膵臓がん、肝臓がん、腎臓がん、甲状腺がん、および前立腺がんからなる群から選択される、請求項３のパネル。
【請求項２７】
前記血液系のがんが、白血病およびリンパ腫からなる群から選択される、請求項３のパネル。
【請求項２８】
前記病態が肺がんであり、前記プローブがＧｌｕｔ１、ＨＥＲＡ、ＦＧＦ、テロメラーゼ、ＰＣＮＡ、ＣＤ４４ｖ６、サイクリンＡ、ＨＧＦ、ＭＵＣ−１、甲状腺転写因子、ＶＥＧＦ、ＥＧＦ受容体、ＰＣＮＡ、ｎｍ２３、Ｅ−カドヘリン、Ｂｃｌ−２、サイクリンＤ１、ＲＢ、Ｎ−カドヘリン、トロンボモジュリン、およびこれらの機能的等価物からなる群から選択されるマーカーに結合する、請求項２４のパネル。
【請求項２９】
前記体液が、血液、尿、脊髄液、およびリンパからなる群から選択される、請求項１９の方法。
【請求項３０】
前記上皮細胞系の器官系が、気道、尿路、生殖管、および胃腸管からなる群から選択される、請求項１９の方法。
【請求項３１】
前記細針吸引が器官および系における固形組織型に由来する、請求項１９の方法。
【請求項３２】
前記生検が器官および系における固形組織型に由来する、請求項１９の方法。
【請求項３３】
前記器官および系が、乳房、膵臓、肝臓、腎臓、甲状腺、骨髄、筋肉、前立腺、および肺からなる群から選択される、請求項３１または請求項３２の方法。
【請求項３４】
前記形態学的生物マーカーが、ＤＮＡ倍数体、ＭＡＣ、および前悪性病変からなる群から選択される、請求項２３のパネル。
【請求項３５】
前記遺伝的生物マーカーが、ＤＮＡ付加物、ＤＮＡ変異体、およびアポトーシス指数からなる群から選択される、請求項２３のパネル。
【請求項３６】
前記細胞周期生物マーカーが、細胞増殖マーカー、分化マーカー、調節分子、およびアポトーシスマーカーからなる群から選択される、請求項２３のパネル。
【請求項３７】
前記分子生物マーカーまたは生化学的生物マーカーが、がん遺伝子、腫瘍抑制遺伝子、腫瘍抗原、成長因子および受容体、酵素、タンパク質、プロスタグランジン、ならびに接着分子からなる群から選択される、請求項２３のパネル。
【請求項３８】
前記肺がん（ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ｃａｎｃｅｒ）が、肺がん（ｌｕｎｇ  ｃａｎｃｅｒ）である、請求項２４のパネル。
【請求項３９】
前記複数のプローブがサイクリンＡまたは相関マーカーもしくはそれに機能的に関連するマーカーに結合するプローブを含む、肺がん検出用の請求項３８のパネル。
【請求項４０】
前記複数のプローブが、ＳＰ−Ｂ、ＨＥＲＡ、またはＥＲ関連（ｐ２９）または相関マーカーもしくはこれらの機能的に関連するマーカーに結合する１つまたは複数のプローブをさらに含む、請求項３９のパネル。
【請求項４１】
前記複数のプローブが、ムチン１および甲状腺転写因子１またはこれらの相関マーカーもしくは機能的に関連するマーカーを含む、他の肺がん型と腺がんを判別するための請求項３８のパネル。
【請求項４２】
前記複数のプローブが、ＶＥＧＦ、ＳＰ−Ａ、ＢＣＬ−２、ＥＲ関連（ｐ２９）、およびＧｌｕｔ３またはこれらの相関マーカーもしくは機能的に関連するマーカーに結合する１つまたは複数のプローブをさらに含む、請求項４１のパネル。
【請求項４３】
前記複数のプローブが、ＣＤ４４ｖ６およびＥＲ関連（ｐ２９）の一方もしくは両方またはこれらの相関マーカーもしくは機能的に関連するマーカーに結合するプローブを含む、他の肺がん型と扁平上皮がんを判別するための請求項３８のパネル。
【請求項４４】
前記複数のプローブが、ＶＥＧＦ、トロンボモジュリン、Ｇｌｕｔ１、およびＭＡＧＥ３、またはこれらの相関マーカーもしくは機能的に関連するマーカーに結合する１つまたは複数のプローブをさらに含む、請求項４３のパネル。
【請求項４５】
前記複数のプローブが、ＶＥＧＦ、サイクリンＡ、およびＰ１２０、またはこれらの相関マーカーもしくは機能的に関連するマーカーに結合する１つまたは複数のプローブに結合するプローブを含む、他の肺がん型と大細胞がんを判別するための請求項３８のパネル。
【請求項４６】
前記複数のプローブが、ＣＤ４４ｖ６、ＰＣＮＡ、およびＨＥＲＡまたはこれらの相関マーカーもしくは機能的に関連するマーカーに結合する１つまたは複数のプローブに結合するプローブを含む、他の肺がん型と中皮腫を判別するための請求項３８のパネル。
【請求項４７】
前記複数のプローブが、ＰＣＮＡ、ＢＣＬ−２、およびＥＧＦＲまたはこれらの相関マーカーもしくは機能的に関連するマーカーに結合する１つまたは複数のプローブに結合するプローブを含む、他の肺がん型と小細胞がんを判別するための請求項３８のパネル。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、患者の一般的病態の初期検出に関する。本発明はまた、初期段階の特異的病態の判別（識別）に関する。
【背景技術】
【０００２】
特定の病態の初期検出は、疾患がまだ局在し、その病理学的影響が解剖学的および生理学的に限定されている初期診断および初期治療によって患者の生存する見込みを非常に高めることができる。任意の試験または疾患検出法における２つの重要な評価基準は、例外および標的疾患を罹患していない患者を誤って含むことなく全罹患患者を正確に検出するためにいかに良く試験が行われるかを示すその感度（感度＝真の陽性／（真の陽性＋偽陰性））および特異性（特異性＝真の陰性／（偽陽性＋真の陰性））である。組織学的には、感度および特異性が不十分であるために、多くの診断試験が批判されている。
【０００３】
感度は、試験の試験される個体の標的疾患を正確に検出する能力の基準である。感度の不十分な試験は偽陰性（すなわち、特定の疾患を罹患しているが、罹患していないと誤って同定される個体）の比率が高い。偽陰性の潜在的な危険性は、罹患個体が一定期間診断および治療されず、その間に治療方法があるにしても有効性が低くなり得る後期まで疾患が進行し得ることである。感度の低い試験の例は、ＨＩＶのタンパク質ベースの血液検査である。疾患が十分に確立されて相当数のウイルスが血流に侵入するまでウイルスの存在が検出できないので、この試験型の感度は不十分である。対照的に、感度の高い試験の例は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用したウイルスロード検出である。この型の試験は、非常に少量のウイルスを検出することができるので、感度が高い（Ｌｅｗｉｓ，Ｄ．Ｒ．ら、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ：Ｔｈｅ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ｂｒｉｄｇｅ  Ｂｅｔｗｅｅｎ  Ｏｌｄ  ａｎｄ  Ｎｅｗ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ：Ａ  Ｗｈｉｔｅ  Ｐａｐｅｒ  ｏｎ  ｔｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ  Ｉｎｄｕｓｔｒｙ」、Ｔｈｏｍａｓ  Ｗｅｉｓｅｌ  Ｐａｒｔｎｅｒｓ、２００１年６月１３日を参照のこと）。
【０００４】
他方では、特異性は、罹患していない患者を正確に同定する試験の能力の基準である。特異性の不十分な試験は、偽陽性（すなわち、疾患を誤って同定される個体）の比率が高い。偽陽性の欠点は、患者がリスク、感情的および金銭的ストレスを伴う不必要な医療行為を強要され、患者の健康状態に悪影響を及ぼすことである。特異性の高い診断試験の開発を困難にしている疾患の特徴は、疾患機構がしばしば複数の遺伝子およびタンパク質に関連していることである。さらに、病態に関連しない理由についての一定のタンパク質が増加し得る。特異性の高い試験の例は、ｐ５３変異を検出することができる遺伝子ベースの試験である。がん細胞が存在しない限り、ｐ５３変異は決して検出されない（Ｌｅｗｉｓ，Ｄ．Ｒ．ら、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ：Ｔｈｅ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ｂｒｉｄｇｅ  Ｂｅｔｗｅｅｎ  Ｏｌｄ  ａｎｄ  Ｎｅｗ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ：Ａ  Ｗｈｉｔｅ  Ｐａｐｅｒ  ｏｎ  ｔｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ  Ｉｎｄｕｓｔｒｙ」、Ｔｈｏｍａｓ  Ｗｅｉｓｅｌ  Ｐａｒｔｎｅｒｓ、２００１年６月１３日を参照のこと）。
【０００５】
細胞マーカーは、発見することができ健康な細胞および疾患細胞を特徴付けるか識別するために使用することができる細胞内の天然に存在する分子構造である。マーカーの存在を、マーカーを視覚化によって検出し、そして／または画像処理システムを使用して定量することができる、マーカーに結合するヒトによって発明および開発されたプローブによって検出することができる。４つのクラスの細胞ベースのマーカー検出テクノロジーは、細胞病理学、血球計算、細胞遺伝学、およびプロテオミクスであり、以下に同定および記載されている。
【０００６】
細胞病理学は、専門家による染色された全細胞集団内の細胞形態学的変化の視覚的評価に依存する。例は、細胞検査および細胞病理学の専門家によるパパニコロー染色子宮頸部−膣検体の細胞学的スクリーニングおよび細胞診断である。細胞遺伝学、プロテオミクス、および血球計算と異なり、細胞病理学は定量ツールではない。これは臨床診断細胞学で最先端であるが、主観的であり、診断結果は特に初期のがん（例えば、ＡＳＣＵＳ、ＬＳＩＬ）でしばしば感度が高くないか再現性がない。
【０００７】
形態学的分析に依存する試験は、細胞および核の形状、サイズ、または染色の異常を同定するために顕微鏡で患者の細胞サンプルを観察することを含む。顕微鏡で観察した場合、正常な成熟上皮細胞は、巨大且つ十分に分化されており、核が凝縮している。しかし、形態異常症の細胞は、種々の分化段階で存在し、いくつかの細胞は異常に成熟している。最後に、浸潤がん細胞はしばしば未分化であり、細胞質が非常に少なく、核が比較的大きい。
【０００８】
形態学的分析に依存する診断試験の欠点は、細胞形態学が遅い指標であることである。形態は機能に追随するので、疾患が形態学的分析によって証明されるまでに、病態はたいてい既に危機的段階に進行している。疾患の初期段階は、分子レベルの化学的変化を含む。顕微鏡での細胞の特徴の観察によって検出可能な変化は、疾患の後期段階まで明らかではない。したがって、「分子診断」と呼ばれる分子レベルの化学的変化を測定する試験は、形態学的分析のみに依存する試験よりも早く検出する可能性が高い。
【０００９】
サイトメトリーは、溶液中の１ファイル中を移動する蛍光染色細胞のフロー微量蛍光機器分析または顕微鏡スライドガラス上に置いた染色細胞のコンピュータ支援の顕微鏡機器分析（画像サイトメトリー）に基づく。フローサイトメトリーは、白血病およびリンパ腫の免疫表現型分類を含む。画像サイトメトリーは、ＤＮＡ倍数体、悪性関連変化（Ｍａｌｉｇｎａｎｃｙ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｃｈａｎｇｅ、ＭＡＣ）、およびＳ期分析を含む。フローサイトメトリーおよび画像サイトメトリーアプローチにより、懸濁液または顕微鏡スライドガラス上の細胞を特徴付ける定量的データが得られる。フローサイトメトリーおよび画像サイトメトリーにより、細胞染色の感度および特異性ならびに使用したフロー／画像測定の特徴に依存して良好にマーカーを検出および識別結果を産生することができる。
【００１０】
１９００年代初期から中期にかけて悪性関連変化（ＭＡＣ）が定量的に観察および報告されていた（ＯＣ  Ｇｒｕｎｅｒ、「Ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃｈａｎｇｅｓ  ｍｅｔｗｉｔｈ  ｌｅｕｋｏｃｙｔｅｓ  ｉｎ  ｃｅｒｔａｉｎ  ｃａｓｅｓ  ｏｆ  ｍａｌｉｇｎａｎｔ  ｄｉｓｅａｓｅ」、Ｂｒｉｔ  Ｊ  Ｓｕｒｇ、３、５０６〜５２２、１９１６）（ＨＥ  Ｎｅｉｂｕｒｇｓ，ＦＧ  Ｚａｋ，ＤＣ  Ａｌｌｅｎ，Ｈ  Ｒｅｉｓｍａｎ，Ｔ  Ｃｌａｒｄｙ、「ｓｙｓｔｅｍｉｃ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃｈａｎｇｅｓ  ｉｎ  ｍａｔｅｒｉａｌ  ｆｒｏｍ  ｈｕｍａｎ  ａｎｄ  ａｎｉｍａｌ  ｔｉｓｓｕｅｓ」、Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎ、第７巻、Ａｎｎ  Ｍｔｇ  Ｉｎｔｅｒ  Ｓｏｃ  Ｃｙｔｏｌ  Ｃｏｕｎｃｉｌ、ｐ．１３７〜１４４、１９５９）。１９００年代半ばから１９７５年まで、頬粘膜、頬側塗抹標本（Ｎｅｉｂｕｒｇｓ，Ｆｉｎｃｈ，Ｋｌａｗｅ）、十二指腸（Ｎｉｅｂｕｒｇｓ）、肝臓（Ｅｌｉａｓ，Ｎｉｅｂｕｒｇｓ）、巨核球（Ｒａｍｓｄａｈｌ）、子宮頚管（Ｎｉｅｂｕｒｇｓ，Ｈｏｗｄｏｎ）、皮膚（Ｋｗｉｔｉｋｅｎ）、血液および骨髄（Ｎｉｅｂｕｒｇｓ）、単球および白血球（ｖａｎ  Ｈａａｓ，Ｍａｔｉｓｏｎ，Ｃｌａｕｓｅｎ）、ならびに肺および痰（Ｍａｒｔｕｚｚｉ  ａｎｄ  Ｏｐｐｅｎ  Ｔｏｔｈ）のＭＡＣが独立した定量的組織学および細胞学研究で報告された。１９７５年以前、これらの定量研究は、特定の疾患についてのＭＡＣベースの検出感度は７６％〜９７％であり、特異性は５０％〜９０％であると報告していた。１９７５年に、Ｏｐｐｅｎ  Ｔｏｔｈは、定量的喀痰分析研究で感受性７６％および特異性８１％と報告した。
【００１１】
ＭＡＣベースのプローブ分析に関する定量的観察は、２〜３０年前から始まった（Ｈ  Ｋｌａｗｅ，Ｊ  Ｒｏｗｉｎｓｋｉ、「Ｍａｌｉｇｎａｎｃｙ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｃｈａｎｇｅｓ（ＭＡＣ）  ｉｎ  ｃｅｌｌｓ  ｏｆ  ｂｕｃｃａｌ  ｓｍｅａｒｓｄｅｔｅｃｔｅｄ  ｂｙ  ｍｅａｎｓ  ｏｆ  ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ  ｉｍａｇｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ」、Ａｃｔａ  Ｃｙｔｏｌ．、１８、３０〜３３、１９７４）（ＧＬ  Ｗｉｅｄ，ＰＨ  Ｂａｒｔｅｌｓ，Ｍ  Ｂｉｂｂｏ，ＪＪ  Ｓｙｃｈｒａ、「Ｃｙｔｏｍｏｒｐｈｏｍｅｔｒｉｃ  ｍａｒｋｅｒｓ  ｆｏｒ  ｕｔｅｒｉｎｅ  ｃａｎｃｅｒ  ｉｎ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ  ｃｅｌｌｓ」、Ａｎａｌｙｔ  Ｑｕａｎｔ  Ｃｙｔｏｌ、２、２５７〜２６３、１９８０）（Ｇ  Ｂｕｒｇｅｒ，Ｕ  Ｊｕｔｔｉｎｇ，Ｋ  Ｒｏｄｅｎａｃｋｅｒ、「Ｃｈａｎｇｅｓ  ｉｎ  ｂｅｎｉｇｎ  ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｃａｓｅｓ  ｏｆ  ｃｅｒｖｉｃａｌ  ｃａｎｃｅｒ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｐｒｅｃｕｒｓｏｒｓ」、Ａｎａｌｙｔ  Ｑｕａｎｔ  Ｃｙｔｏｌ、３、２６１〜２７１、１９８１）。ＭＡＣは、頬粘膜および頬側塗抹標本（Ｋｌａｗｅ，Ｂｕｒｇｅｒ）、子宮頸部（Ｗｉｅｄ，Ｂｕｒｇｅｒ，Ｂａｒｔｅｌｓ，Ｖｏｏｉｊｓ，Ｒｅｉｎｈａｒｄｔ，Ｒｏｓｅｎｔｈａｌ，Ｂｏｏｎ，Ｋａｔｚｋｅ，Ｈａｒｏｓｋｅ，Ｚａｈｎｉｓｅｒ）、乳房（Ｋｉｎｇ，Ｂｉｂｂｏ，Ｓｕｓｎｉｋ）、膀胱および前立腺（Ｓｈｅｒｍａｎ，Ｍｏｎｔｉｒｏｎｉ）、結腸（Ｂｉｂｂｏ）、肺および痰（Ｓｗａｎｋ，ＭａｃＡｕｌａｙ，Ｐａｙｎｅ）、および鼻粘膜（Ｒｅｉｔｈ）研究における独立した定量的組織学および細胞学研究で報告され、ＭＡＣベースの感受性は７０〜８９％であり、特異性は５２〜１００％であった。Ｍａｒｅｋ  ａｎｄ  Ｎａｋｈｏｓｔｅｅｎ（１９９９、アメリカ胸部学会年次会合）は、（ａ）感度８９％および特異性９２％ならびに（ｂ）感度９１％および特異性１００％の２つの肺定量研究結果を示した。
【００１２】
明らかに、悪性関連変化（ＭＡＣ）は、画像サイトメトリーマーカー検出テクノロジーに起因する潜在的に有用なプローブである。ＤＮＡ染色核由来のＭＡＣベースの特徴は、他の分子診断プローブと組み合わせて肺がんおよび他の病態の検出および識別用の至適化分子診断パネルを作製するために使用することができる。
【００１３】
細胞遺伝学は、例えば、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリッド形成（ＩＳＨ）テクノロジーを使用した特定の染色体ベースの細胞内の変化を検出する。ＩＳＨテクノロジーは、蛍光（ＦＩＳＨ）、多色蛍光（Ｍ−ＦＩＳＨ）、または光吸収ベースの色素原画像（ＣＨＲＩＳＨ）テクノロジーに基づき得る。ＩＳＨテクノロジーのファミリーは、クローニングされた細菌細胞または培養された真核細胞中の相補ＤＮＡ配列の存在の検出にＤＮＡまたはＲＮＡプローブを使用する。ＦＩＳＨテクノロジーを、例えば、一定のがんに関連する遺伝子異常の検出に使用することができる。例には、Ｔｒｉｓｏｍｙ８およびＨＥＲ−２ｎｅｕが含まれる。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）などの他のテクノロジーを使用して、Ｂ細胞およびＴ細胞の遺伝子の再構成を検出することができる。病理学的条件が得られる原因または「誘発」分子事象が検出されるので、細胞遺伝学は高度に特異的なマーカー検出テクノロジーである。検出される事象が少ないので、細胞遺伝学は他のマーカー検出テクノロジーよりも感度が低い。ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリッド形成（ＩＳＨ）は、変異、染色体エラー、または特定の病原体によって挿入された遺伝物質などの遺伝子レベルの異常の検出に遺伝子ベースの分析を使用する分子診断法である。例えば、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリッド形成は、特定のｍＲＮＡにハイブリッド形成するようにデザインされた標識プライマーでの患者の細胞サンプルの処理によって特定のｍＲＮＡレベルを測定するステップと、非結合プライマーを洗浄して取り除くステップと、標識のシグナルを測定するステップとを含み得る。遺伝子配列の特異性により、遺伝子配列の検出を含む試験は特異性が高く、偽陽性は非常に少ないようである。しかし、細胞サンプル中の遺伝物質の量が非常に少ない可能性があるので、非常に弱いシグナルしか得られない場合がある。したがって、増幅技術を使用しないｉｎ  ｓｉｔｕハイブリッド形成試験は、特異性が低く、多数の偽陰性が得られるようである。
【００１４】
プロテオミクスは、正常または異常な細胞型集団中の固有または特定のタンパク質の過剰発現、過少発現、または有無に起因する細胞の特徴付けおよび識別に依存する。プロテオミクスには、タンパク質の同定および定量だけでなく、その局在、修飾、相互作用、化学活性、および細胞／細胞外機能の決定も含まれる。免疫化学（細胞中の免疫細胞化学および組織中の免疫組織化学（ＩＨＣ））は、抗体を用いて抗原（すなわち、プロテオーム）を定性的または定量的に（ＱＩＨＣ）に染色するために使用されるテクノロジーである。免疫染色手順は、検出指標として色素を使用する。ＩＨＣの例には、ＥＲ（エストロゲン受容体）、ＰＲ（プロゲステロン受容体）、ｐ５３腫瘍抑制遺伝子、およびＥＧＲＦ予後マーカーの分析が含まれる。プロテオミクスは、細胞遺伝学を使用して検出するための細胞遺伝学的変異または遺伝子配列変化が存在するよりもプロテオミクスを使用して検出するための多くのタンパク分子がしばしば大規模であるので、典型的には細胞遺伝学よりも感度の高いマーカー検出テクノロジーである。しかし、複数の病理学によりタンパク質の過剰発現または過少発現で類似の変化を得ることができるので、プロテオミクスは、細胞遺伝学的マーカー検出テクノロジーよりも特異性が低い可能性がある。免疫化学は、しばしばプローブ試薬として標識抗体を使用する組織切片または細胞調製物中の免疫反応物質の組織学的または細胞学的局在を含む。免疫化学を使用して、疾患マーカー上のエピトープに特異的に標識抗体（プローブ）などの薬剤での細胞の処理およびその後の非結合抗体の洗浄および標識シグナルの測定によって細胞サンプル中の疾患マーカー（特異的タンパク質）の濃度を測定することができる。免疫化学は、がん細胞が健康な細胞よりも一定の疾患マーカーレベルが異なるという性質に基づく。がん細胞中の疾患マーカーの濃度は、一般に、大きなシグナルの発生に十分なほど大きい。したがって、免疫化学に依存する試験は、感度が高く、偽陰性が少ないようである。しかし、病態に加えて、他の要因により、疾患マーカーの濃度が増減し、特定疾患の免疫化学分析に依存する試験は、特異性が低く、偽陽性の比率が高いようである。
【００１５】
本発明は、高感度且つ高特異性の非侵襲性病態の検出および判別法を提供する。本方法は、罹患細胞を含むと疑われる細胞学的サンプルを特定のマーカーにそれぞれ定量的に結合する複数の薬剤を含むプローブに接触させるステップと、プローブ剤の結合パターンを検出および分析するステップとを含む。本発明はまた、特定の疾患（または疾患群）を検出し、種々の病態を判別するためのプローブのパネルを構築および確証する方法を提供する。肺がんの検出および異なる肺がん型の判別のためのパネルの例もまた提供する。
【００１６】
ヒトの疾患は、体内の細胞、組織、器官、または系内の構造または機能を異常にする外部または内部傷害を中和するヒト器官の適応機構の不全に起因する。以下の表１に示すように、共通の原因機構によって疾患を分類することができる。
【００１７】
【表１】
2004526154.tif 000002
病態は、細胞内、細胞、組織、器官、またはヒトの解剖学的もしくは生理学的系のレベルでの異常な変化（すなわち、病理学的条件）に起因するか異常に変化する。多数の病態（例えば、肺がん）は、細胞内または細胞レベルでの異常な変化によって特徴付けられる。病態の存在および型について患者を診断するために、検体（例えば、子宮頸部ＰＡＰ塗抹標本、排尿、血液、痰、結腸洗浄液）を病態が疑われる患者から採取することができる。分子病理学は、これらの細胞ベースの疾患に関連する分子の変化を同定して診断に使用する研究分野である。
【００１８】
肺がんは、病態の存在を検出するために診断試験（例えば、分子診断パネルアッセイ）を使用してハイリスク集団および危険な状態にある個体のスクリーニングを行うことができる病態の例である。また、これらの手段によって肺がんまたは他の病態が検出された患者について、関連する診断試験を使用して特定の病態と関連する病態または同時に発症する病態を識別することができる。例えば、この肺がんの例では、さらなる分子診断パネルアッセイにより患者の病態が以下の肺がん型、すなわち、（ａ）肺の扁平上皮がん、（ｂ）肺の腺がん、（ｃ）肺の大細胞がん、（ｄ）肺の小細胞がん、または（ｅ）中皮腫の１つに一致する確率を示すことができる。細胞ベースの病態の初期の検出および判別は、患者の予後を改良する仮説的手段である。
【００１９】
がんは、その自然の過程が致命的結果を招く新生物の疾患である。がん細胞は、良性の腫瘍細胞と異なり、侵襲性および転移性を示し、高度に未分化である。がんには、癌腫（ｃａｒｃｉｎｏｍａ）および肉腫（ｓａｒｃｏｍａ）の広範な２つのカテゴリーが含まれるが、通常、癌腫と同意語として使用される。世界保健機関（ＷＨＯ）によれば、がんは毎年１０００万人以上が罹患し、６２０万人以上が死亡している。
【００２０】
がんは、実際には、事実上全ての身体の部分で発症し得る疾患の異種集団である。結果として、全てのがんまたは特定のがん型の段階でさえ異なる治療が同様に有効ではない。診断学（例えばマンモグラフィー、子宮頸部の細胞学、および血清ＰＳＡ試験）の利点により、いくつかの場合、より多数の治療選択肢が存在する場合初期段階のがんを検出可能であり、治療はより有効である傾向がある。固形腫瘍が小さく且つ局在している場合、手術のみで十分に治癒することができる。しかし、腫瘍が拡大している場合、手術の利益はせいぜい限られている。このような場合、化学療法および／または放射線治療を加えて転移性疾患を治療することができる。延命に幾らか有効であるが、転移性疾患患者の治療で治癒するのは稀である。初期応答があったとしても、時間と共に疾患は進行し、治療効果および／または副作用によって最終的に死亡する。
【００２１】
証明されていないが、一般に、初期の検出および治療により罹患率、死亡率、およびがん治療の費用が減少することが認められている。初期検出により、多くの場合、転移前に治療を開始することができる。さらに、より多数の治療の選択肢が存在するので、治癒または長期生存する著しい改善の確率が高い。
【００２２】
「危険な状態の」集団のスクリーニングに使用することができる試験の開発は、長い間医師の目的であった。乳がん用のマンモグラフィー、前立腺がん用のＰＳＡ試験、および子宮頸がん用のＰＡＰ塗抹標本などの幾らか成功しているが、ほとんどの場合、患者に自覚症状があり、ほぼ必ず致命的である比較的末期でがんが検出される。ほとんどのがんでは、試験および試験の組み合わせでは初期段階の疾患を罹患した患者が、費用効果が高い同定が可能なほど必ずしも感度および特異性が高くない。
【００２３】
首尾よく且つ患者、意思、および第三者の支払人に受け入れられるがんスクリーニングプログラムのために、試験は有利であり（予後を変化させる）、広範に利用可能であり、基本的医療の枠組みの範囲内で容易に行うことができなければならない。試験は比較的非侵襲性であり、適切に遵守され、感度が高く、特異性および予測値が妥当であるべきである。さらに、試験は、比較的低コストで利用可能でなければならない。
【００２４】
がんの疑いのある患者のために、診断を確認し、医師が適切な治療介入を行うために腫瘍の病期を細胞学的および臨床的に適切に設定しなければならない。しかし、がんの診断および病期設定で現在使用されているいくつかの試験（十分な感受性または特異性を欠く）は、侵襲性または費用が高すぎて集団ベースのスクリーニング試験としてのその使用が許容できない。以下に示す表２および３は、例えば、肺がん診断の感度および特異性の評価ならびに肺がんの検出に使用される診断試験の予想費用である。
【００２５】
【表２】
2004526154.tif 000003
【００２６】
【表３】
2004526154.tif 000004
【００２７】
その妥当な感度、特異性の高さ、および低コストのために、がん病変の検出および位置付けに胸部Ｘ線（Ｘ線）をしばしば使用する。しかし、大きな腫瘍は比較的容易に胸部フィルム上に視覚化されるが小さな病変の検出は困難であり、検出時にはほとんどが既に転移している。したがって、胸部Ｘ線は初期検出法としての用途に必要な感度を欠く。
【００２８】
コンピュータ連動断層撮影法（ＣＴ）は、肺小結節の確認および特徴付けに有用であり、標準的な胸部Ｘ線でしばしば見のがされるわずかな異常を検出可能である［２］。ＣＴ、特にスパイラルＣＴ法には、事前に喀痰細胞診の結果が悪いか声帯麻痺の患者に残された試験である。従来の胸部フィルムよりも感度が改良されたＣＴは、中枢気道の画像処理の重要なツールとなりつつある［３］広範な領域を試験することが可能であると同時にＣＴを心肺運動由来の人工産物に供し、ヨウ化造影剤の使用によって分解能を改良することができる。
【００２９】
スパイラルＣＴは、従来のＣＴまたはＸ線のいずれかよりも確実に初期がん病変を検出する可能性を有するより迅速且つ感度の高いＣＴ形態である。スパイラルＣＴは、初期疾患診断において非常に改良された感度を有するようである。しかし、この試験は偽陽性率が２０％と比較的感度が低い［４］。スパイラルＣＴはまた、肺がんの１／３を占める主な病変の検出感度が低い。さらに、初期試験費用が比較的安い（＄３０）が、追跡調査の費用は高い。分子診断パネルアッセイを使用した細胞学は、スパイラルＣＴで疑われる肺小結節由来の細針吸引（ＦＮＡ）または細針生検（ＦＮＢ）での評価による偽陽性の結果を最小にすることによってスパイラルＣＴ試験の特異性を改良するためにスパイラルＣＴを使用した補助試験として非常に有望である。
【００３０】
蛍光気管支鏡検査法は、従来の白色光気管支鏡検査法よりも感度が高く、中枢気道内の小さな病変の検出が有意に改善される［５］。しかし、蛍光気管支鏡検査法は周辺病変を検出することができず、気管支鏡検査者が患者の気道を検査するのに時間がかかり、且つ高価な手順である。さらに、この手順は、中程度に侵襲性であり、集団ベースのスクリーニング試験としての使用には乗り越えられない障害である。
【００３１】
陽電子断層撮影法（ＰＥＴ）は、肺内のがん細胞存在の同定に放射性グルコースを使用する感度の高い試験である［６〜８］。試験施設の設置費用は高く、現場または付近にサイクロトロンが必要である。このことが試験費用の高さと共に初期疾患検出よりもむしろ肺がん患者の病期設定へのＰＥＴスキャンの使用を制限している。
【００３２】
肺がんのスクリーニング手段として長い間使用されていたにもかかわらず、喀痰細胞診は、その感度の低さおよび疾患特異的死亡率を減少できないことから限られた成功しか収められていない。従来の喀痰細胞診では、病理学者は、悪性細胞の同定およびがんの診断に細胞形態の特徴的な変化を使用する。今日、肺がんの「危険性」があるか疑いのある患者の１５％しか喀痰細胞診を受診しておらず、５％未満が多面的評価を受けている［９］。腫瘍のサイズ、位置、分化の程度、細胞凝集、クリアランス機構の細胞および喀痰の外部環境への放出の無効性、および喀痰中の細胞の安定性の不十分さを含む多数の要因が試験を総合的に不十分にしている。
【００３３】
がん診断は、伝統的に１分子マーカーの検出に依存している。不運にも、がんは典型的には１つのマーカーで疾患の多数の形態を検出または識別できない病態である。したがって、１つのマーカーのみを認識するプローブは、ほとんど無効であることが示されている。「特効薬」診断試験の包括的検索が進行中であるが、現在、普遍的に首尾の良い特効薬プローブは見出されていない。
【００３４】
本発明の主な前提は、細胞系のがん診断およびスクリーニング、他の病態の診断および治療モニタリングを、複数を同時に標識したプローブのキットよりもむしろ１つのマーカー／プローブ分析を使用する最先端のものよりも有意に改良することである。この多重化分析アプローチは、がんが単一の疾患ではないのでがん診断に特に十分に適する。さらに、この多因子「パネル」アプローチは、がんの細胞学的および臨床的な不均一な性質に一致する。
【００３５】
細胞ベースの診断試験に対するパネルアプローチの首尾の良い実施の手がかりは、種々の病態の特徴付けおよび判別を異なるマーカーのパターンを化学的に認識することができるプローブの至適化されたパネルのデザインおよび開発である。本特許出願は、このような新規且つ至適化されたパネルの有効且つ固有のデザインおよび開発方法を記載する。
【００３６】
標本集団（例えば、喀痰細胞診用の診療現場検査用混合物）および調製物（例えば、新規の細胞学保存物および輸液ならびに液体ベースの細胞学調製物用機器）は、開発中であり、市販されるであろう。既存およびこれらの新規の方法と併せて、細胞ベースのパネルアッセイを使用したこの分子診断の首尾の良い実施により、（ａ）悪性腫瘍および他の病態の分子プロフィールが特徴付けられ、（ｂ）初期のがんおよび他の病態を検出および識別するための改良法が得られ、および（ｃ）臨床診断、予後、カスタマイズされた患者の治療、および治療モニタリングを改良する機会が与えられる。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００３７】
本発明は、細胞ベースの診断を使用して一般的病態を検出し、特定の病態を判別するためのパネルに関する。パネルは、一般的病態または特定の病態に関連するマーカーにそれぞれ特異的結合し、細胞診標本中の細胞へのパネルの成分プローブへの結合パターンが前記病態の存在または特定の性質の診断となる複数のプローブを含む。本発明はまた、細胞ベースの診断を使用した患者の病態の検出または病態の判別のためのパネルの形成方法に関する。本方法は、病態に関連するマーカーのライブラリーのメンバーにそれぞれ特異的に結合するプローブ結合の感受性および特異性を決定するステップと、結合パターンが前記病態の存在または特定の性質を診断する限定された複数のプローブを選択するステップとを含む。本方法はまた、疾患を検出するか病態を判別する方法に関する。本方法は、病態に特徴的な異常細胞を含むと疑われる細胞学的サンプルに請求項１に記載のパネルを接触させるステップと、前記病態の存在または特定の性質の診断となる前記プローブの結合パターンを検出するステップとを含む。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３８】
１．緒言
本発明は、感度および特異性の高い非侵襲性の病態を検出および判別する方法を提供する。本方法は、罹患細胞を含むと疑われる細胞学的サンプルを疾患マーカーにそれぞれ定量的に結合する複数の薬剤を含むパネルに接触させるステップと、前記薬剤の結合パターンを検出するステップとを含む。このパターンには、パネルの成分プローブの結合の局在性および密度／濃度が含まれる。本発明はまた、疾患を検出し、病態も判別するためのパネルおよび初期肺がんを検出し、異なる肺がん型を判別するためのパネルを作製する方法を提供する。パネル試験は医療で使用されている。例えば、血清分析でパネルが使用されている。しかし、細胞学的分析は各細胞および組織内の特定のマーカーの画像化および位置付けを含んでいるので、本発明の前にパネルアプローチが細胞学的サンプルに有効であることは明らかではなかった。さらに、プローブの至適化された細胞ベースの診断パネルをデザインおよび開発するために統計分析を適用することができたとしても明らかではなかった。
【００３９】
いくつかの例の細胞学ベースのスクリーニングプログラムのうちの１つは、子宮頸がんをスクリーニングするＰＡＰ塗抹標本である。５０年以上にわたりこの方法は実施され、今日、ＰＡＰ塗抹標本を受けた女性で子宮頸がんにより死亡した者はほとんどいないという事実に非常に貢献している。しかし、ＰＡＰ塗抹標本スクリーニングには欠点がある。例えば、ＰＡＰは手間がかかり、普遍的に受け入れられない。本発明のプローブパネルを使用した分子診断用細胞ベースのスクリーニング法は、これらの欠点がない。本方法は、完全に自動化できるので安価であり、この試験型への利用が増加する。
【００４０】
本発明は、特異性および感度が共に高い病態の検出および病態の判別を行う方法を提供する。本発明は、がんおよび感染症などの任意の細胞ベースの病態に適用可能である。
【００４１】
パネルは、病態の存在または特定の性質を診断する。本発明は、安い費用を維持したままでの細胞学的サンプル中の罹患細胞の迅速、正確、比較的非侵襲性、且つ容易な検出により公知の病態検出法の制限および欠点を克服する。
【００４２】
本発明のパネル作製方法の特徴は、パネルを迅速に開発することができることである。
【００４３】
病態を検出し、病態型を判別する方法での薬剤パネルの使用にはいくつかの利点が存在する。１つの利点は、病態の検出および特徴とするための薬剤パネルが十分であるので、試験の感度および特異性が増大することである。多数の病態が異なる性質を有する場合、１つの薬剤で大部分の症例を検出することはできない。
【００４４】
パネル使用のさらなる利点は、パネルの使用により特定の発現パターン（プローブの位置および密度／濃度）に基づいて種々の病態型を判別可能であることである。種々の病態は、その進行速度、治療に対する反応、および死亡率が劇的に異なり得るので、特定の型の知識が医師の適切な治療アプローチの選択の助けとなり得る。
【００４５】
２．パネル
本発明のパネルは、それぞれ疾患マーカーに定量的に結合し、パネルの成分薬剤の結合パターン（位置および密度／濃度）で病態の存在または特定の性質を診断する複数の薬剤を含む。したがって、パネルは検出パネルまたは判別パネルであり得る。検出パネルは細胞サンプル中に一般的病態が存在するかどうかを検出し、判別パネルは異なる疾患型を含む病態を罹患していることが知られている細胞サンプル中の異なる特定の病態を判別する。検出パネルと判別パネルの違いは、パネルに含まれる特定の薬剤にある。検出パネルは病態の存在を診断する結合パターンを有する薬剤を含み、判別パネルは病態の特定の性質（すなわち、各型）を決定可能な結合パターンを有する薬剤を含む。
【００４６】
定義上は、パネルは１つを超えるメンバーを含む。何故一般的病態の検出または特定の病態の判別に１つのマーカーのみのパネルよりも複数のマーカーのパネルを使用することが有利であるのかという理由は幾つか存在する。理由の１つは、健康な細胞中に存在しないが全ての疾患細胞中には存在する、正確な試験結果を得るために高い特異性および感度でその挙動を測定することができる１つのマーカーのプローブが存在する見込みがないことである。高い感度および特異性で特定の疾患を検出するこのような１つのプローブが存在する場合、既に臨床試験で使用されているだろう。さらに、これは、それぞれ臨床的に適切な試験を確実にする検出能力の範囲を得ることができる複数のプローブからなるパネル試験の方向性を持った選択である。
【００４７】
それにもかかわらず１つまたは非常に少数のプローブを含むパネル試験の構築を選択する場合、任意の理由（例えば、生物学的変動性による標本細胞の反応性の減少；多数のプローブ試薬の固有の変動性；弱い、期限切れ、または不完全なプロセシング試薬；プローブに不適切なプロセシング時間または条件；）のために、標識を行うための任意の１つのマーカー／プローブ組み合わせの失敗により、標的疾患を検出または判別する試験は壊滅的に失敗する。各パネル試験に複数の過剰なプローブを含めることにより、任意の１つのプローブの失敗が試験の壊滅的失敗の原因とならない確率が非常に高くなる。
【００４８】
プローブは、疾患マーカーに結合する任意の分子構造または基礎構造である。本明細書中で使用される、用語「薬剤」はまた、疾患マーカーに結合する分子構造または基礎構造をいうことができる。分子プローブは、特定の病態の指標となるマーカーの検出および位置付けのために生物学者および臨床医学者によって使用される自動誘導デバイスである。例えば、先に小細胞肺がんのマーカーとして同定されたタンパク質に特異的に結合する抗体を産生することができる。次いで、この抗体プローブを使用して、適切な免疫化学的プロトコールおよびインキュベーションの使用により罹患が疑われる患者の細胞および組織中の標的タンパク質マーカーを位置付けることができる。抗体プローブが化学量論（すなわち、定量）様式でその標的マーカーに結合し、色素形成または着色「タグ」で標識された場合、光学顕微鏡および画像サイトメトリーテクノロジーを使用してプローブおよび間接的にはその標的マーカーを位置付けおよび定量することができる。
【００４９】
本発明は、当業者が利用可能な任意の数の方法を使用したＤＮＡ、ＲＮＡ、またはタンパク質レベルでの分子マーカー発現の変化の検出を意図する。プローブの例は、パネル中の分子マーカーをコードする核酸配列に相補的なポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、もしくはそのフラグメントまたは核酸配列であり得る。プローブはまた、ＤＮＡ鎖などの鎖であり得る。本発明で使用される多数の抗体は、マーカー物質としての種々の細胞表面抗原または細胞内抗原に特異的である。当業者に一般的に公知の技術を使用して、抗体を合成することができる。例えば、マーカーに対する抗体の最初の惹起の後、抗体を配列決定し、その後組換え技術によって調製することができる。あるいは、抗体を購入することができる。
【００５０】
本発明の実施形態では、プローブは標識を含む。標識を含むプローブは、本明細書中でしばしば「標識プローブ」という。標識は、プローブがマーカーに結合した場合にシグナルが発生するか標識プローブをヒトによる観察または分析機器によって検出することができるようにプローブに結合することができる任意の物質であり得る。この標識を、「タグ」とも言うことができる。読み取り機器類により標識を視覚化することができる。用語「読み取り機器類」は、プローブの検出に使用される分析装置をいう。本発明によって想定される標識は、シグナルを発生してサンプル中の成分を同定することができる任意の標識である。好ましい標識には、放射性部分、蛍光発生部分、色素形成部分、または酵素部分が含まれる。したがって、可能な検出方法には、免疫細胞化学、免疫組織化学、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリッド形成、蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリッド形成、フローサイトメトリー、および画像サイトメトリーが含まれるが、これらに限定されない。標識プローブによって発生したシグナルは、医療従事者による検出に十分な強度である。
【００５１】
「マーカー」、「疾患マーカー」、または「分子マーカー」は、病態または病原体に相関する任意の分子構造または基礎構造である。用語「抗原」を、「マーカー」と交換可能に使用することができる。広義のマーカーは、特定の条件、事象、または物質の存在もしくは頻度および／または量を明らかにするか、検出するか、測定するために観察者または機器によって意図的に使用することができる生物学的指標である。例えば、ヌクレオチド塩基の特異的且つ固有の配列を、個体間および家族間の遺伝子の遺伝パターンを追跡するための遺伝子マーカーとして使用することができる。同様に、分子マーカーは細胞または組織内のその存在が特定の病態を示すタンパク質またはタンパク質フラグメントなどの特定の分子である。例えば、増殖がん細胞は同一の型の正常な細胞では見出されない新規の細胞表面タンパク質を発現することができるか、その発生量の増加または減少（例えば、それぞれ過剰発現または過少発現）を特定の病態のマーカーとして使用することができる特定の分泌タンパク質を過剰発現させることができる。
【００５２】
細胞学パネルに適切なマーカーは、核、細胞質、または細胞膜の中または上に局在する物質である。マーカーは、細胞中のこれらの任意の位置に存在するオルガネラ中に局在することもできる。核内に局在するマーカーの例には、網膜芽腫遺伝子産物（Ｒｂ）、サイクリンＡ、ヌクレオシド二リン酸キナーゼ／ｎｍ２３、テロメラーゼ、Ｋｉ−６７、サイクリンＤ１、増殖細胞核抗原（ＰＣＮＡ）、ｐ１２０（増殖関連核抗原）、および甲状腺転写因子１（ＴＴＦ−１）が含まれるが、これらに限定されない。細胞質中に局在するマーカーの例には、ＶＥＧＦ、サーファクタントアポタンパク質Ａ（ＳＰ−Ａ）、ヌクレオシドｎｍ２３、黒色腫抗原１（ＭＡＧＥ−１）、ムチン１、サーファクタントアポタンパク質Ｂ（ＳＰ−Ｂ）、ＥＲ関連タンパク質ｐ２９、および黒色腫抗原３（ＭＡＧＥ−３）が含まれるが、これらに限定されない。細胞膜中に局在するマーカーの例には、ＶＥＧＦ、トロンボモジュリン、ＣＤ４４ｖ６、Ｅ−カドヘリン、ムチン１、ヒト上皮関連抗原（ＨＥＲＡ）、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、肝細胞成長因子受容体（Ｃ−ＭＥＴ）、ＢＣＬ−２、Ｎ−カドヘリン、表皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、およびグルコース輸送物質３（ＧＬＵＴ−３）が含まれるが、これらに限定されない。細胞質オルガネラ中に存在するマーカーの例は、ミトコンドリア膜中に（一部）存在するＢＣＬ−２である。核のオルガネラ中に存在するマーカーの例は、核内に存在するｐ１２０（増殖関連核抗原）である。
【００５３】
発現が変化し、疾患進行の初期に生じ、罹患細胞の大部分で示され、７５％以上の所与の疾患型を検出可能であり、最も好ましくは９０％以上の所与の疾患型を検出可能であり、そして／または異なる疾患型の性質を判別可能であるマーカーが好ましい。
【００５４】
プローブがマーカーに結合するので、本発明のパネルをプローブのパネルまたはマーカーのパネルということができることに注目すべきである。したがって、パネルは、多数のマーカーを含み得るか、特定のマーカーに結合する多数のプローブを含み得る。一貫性をもたせるために、本発明のパネルをプローブのパネルというが、マーカーのパネルということもできる。
【００５５】
マーカーは、細胞核中の悪性腫瘍関連変化（ＭＡＣ）などの特徴または患者のがん家族歴に関連する特徴も含み得る。悪性腫瘍関連変化（すなわち、ＭＡＣ）は、典型的にはがん細胞周辺に存在する正常と考えられる細胞に生じる微視的変化である。細胞核内のこれらの異常でわずかな変化は、生物学的には核基質およびクロマチン分布パターンの変化に起因し得る。これらの変化は訓練を受けた観察者でさえ各細胞の目視では確認できないが、高度に自動化されたコンピュータ制御の高速画像サイトメトリーを使用した細胞集団の統計分析によって決定することができる。ＭＡＣ検出技術は当業者に周知であり、Ｇｒｕｎｅｒ，Ｏ．Ｃ．、Ｂｒｉｔ  Ｊ．Ｓｕｒｇ．、３、５０６〜５２２、１９１６；Ｎｅｉｂｕｒｇｓ，Ｈ．Ｅ．ら、Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎ、７ｔｈ  Ａｎｎｕａｌ  Ｍｔｇ．Ｉｎｔｅｒ．Ｓｏｃ．Ｃｙｔｏｌ．Ｃｏｕｎｃｉｌ、１３７〜１４４、１９５９；Ｋｌａｗｅ，Ｈ．Ａｃｔａ．Ｃｙｔｏｌ．、１８、３０〜３３、１９７４；Ｗｉｅｄ，Ｇ．Ｌ．ら、Ａｎａｌｔｙ．Ｑｕａｎｔ．Ｃｙｔｏｌ．、２、２５７〜２６３、１９８０；おｙびＢｕｒｇｅｒ，Ｇ．ら、Ａｎａｌｙｔ．Ｑｕａｎｔ．Ｃｙｔｏｌ．、３、２６１〜２７１、１９８１にさらに詳述されている。
【００５６】
本発明は、病態に相関する任意のマーカーを含む。各マーカー自体は、本発明の単なるツールに過ぎない。したがって、本発明は、特定のマーカーに制限されない。マーカーを分類する１つの方法は、他の分子に対するその機能的関係である。本明細書中で使用される、「機能的に関連する」マーカーは、目的のマーカーと同一の生物学的過程または経路の成分であり、目的のマーカーと共に異常発現することが当業者に公知である。例えば、多数のマーカーは、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、（血管内皮成長因子）ＶＥＧＦ、サイクリンＡ、およびサイクリンＤ１などの細胞増殖経路に関連する。他のマーカーは、Ｇｌｕｔ−１およびＧｌｕｔ−３などのグルコース輸送体である。
【００５７】
当業者は、機能的に関連するマーカーを決定する知識を十分に備えており、種々のマーカーを検索するか、マーカーの機能的挙動を決定する実験を行うことができる。制限されない例により、マーカーを、血管新生に関連する分子、膜貫通糖タンパク質、細胞表面糖タンパク質、肺サーファクタントタンパク質、核ＤＮＡ結合リンタンパク質、膜貫通Ｃａ2+依存性細胞接着分子、サイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）の調節サブユニット、ヌクレオシド二リン酸キナーゼ、リボ核タンパク質酵素、増殖正常細胞および腫瘍性細胞で発現する核タンパク質、ＤＮＡポリメラーゼδの補因子、悪性新生物中で発現される場合でさえも正常な組織でサイレンとであり、自系の腫瘍指向性および特異的細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）によって認識される遺伝子、グリコシル化分泌タンパク質、胃腸管または尿生殖管、肺サーファクタントの疎水性タンパク質、膜貫通糖タンパク質、増殖、分化、および血管新生に関連する分子、がん原遺伝子、ホメオドメイン転写因子、ミトコンドリア膜タンパク質、急速に増殖する細胞の核で見出される分子、グルコース輸送体、またはエストロゲン関連熱ショックタンパク質として分類することができる。
【００５８】
生物マーカーおよびプローブの分類には、（ａ）ＤＮＡ倍数体、ＭＡＣ、および前悪性病変を含む形態学的生物マーカー、（ｂ）ＤＮＡ付加物、ＤＮＡ変異体、およびアポトーシス指数を含む遺伝子生物マーカー、（ｃ）細胞増殖、分化、調節分子およびアポトーシスマーカーを含む細胞周期生物マーカー、および（ｄ）がん遺伝子、腫瘍抑制遺伝子、腫瘍抗原、成長因子および受容体、酵素、タンパク質、プロスタグランジンレベル、ならびに接着分子を含む分子および生化学的生物マーカーが含まれるが、これらに限定されない。
【００５９】
「病態」は、任意の細胞ベースの疾患であり得る。いくつかの実施形態では、病態はがんである。他の実施形態では、病態は感染症である。がんは、気道、尿路、胃腸管、および生殖管由来の上皮細胞系のがん；肉腫、乳がん、膵臓がん、肝臓がん、腎臓がん、甲状腺がん、および前立腺がんなどの固形腫瘍および／または分泌腫瘍系のがんおよび；白血病およびリンパ腫などの血液系のがんが含まれるがこれらに限定されない任意のがんであり得る。本発明によって検出することができるがんの例は、肺がん、膀胱がん、胃腸のがん、子宮頸がん、乳がん、または前立腺がんである。検出することができる感染症の例は、感染生物がウイルス、細菌、原生動物、寄生虫、または真菌類である細胞ベースの疾患である。感染症は、例えば、ＨＩＶ、肝炎、インフルエンザ、髄膜炎、単核細胞症、ヒト型結核菌、ならびにクラミジア、トリコモナス、淋病、ヘルペス、および梅毒などの性感染病（ＳＴＤ）であり得る。
【００６０】
本明細書中で使用される、用語「一般的病態」は、肺がん、性感染病、および免疫ベースの疾患などのいくつかの特定の疾患型を含む疾患をいう。特定の病態を、組織学的疾患型ともいう。例えば、用語「肺がん」は、扁平上皮がん、腺がん、大細胞がん、小細胞がん、および中皮腫などのいくつかの特定の疾患を含む。用語「性感染病」は、淋病、ヒト乳頭腫ウイルス（ＨＰＶ）、ヘルペス、および梅毒などのいくつかの特定の疾患を含む。用語「免疫ベースの疾患」は、全身性エリマトーデス（狼瘡）、慢性関節リウマチ、および悪性貧血などのいくつかの特定の疾患を含む。
【００６１】
本明細書中で使用される、「ハイリスク集団」は、疾患原因因子（例えば、家庭内または職場の発がん物質）の個体の群（すなわち、肺がんの「ハイリスク集団」は、喫煙、受動喫煙、および職業曝露にさらされ得る）をいう。「ハイリスク集団」中の個体はまた、遺伝性疾病素質を有し得る。
【００６２】
用語「危険な状態にある」は、無症候性であるが、家族歴または有意な曝露により病態発症リスクが有意な個体（すなわち、３０パック年を超えて喫煙している肺がんの危険性のある個体；「パック年」は１日あたりの喫煙パック数にこの曝露の年数をかけて計算した基準単位）をいう。
【００６３】
がんは、例えば、遺伝子発現の変化によって制御されずに細胞が分裂する疾患である。本発明の方法およびパネルでは、がんは任意の器官における任意の悪性増殖であり得る。例えば、がんは、肺がん、膀胱がん、胃腸がん、子宮頸がん、乳がん、または前立腺がんであり得る。各がんは、一連の疾患またはがんの組織学的型を含み得る。用語「組織学的型」は、異なる組織学のがんをいう。がんに依存して、１つまたは複数の組織学的型が存在し得る。例えば、肺がんには、扁平上皮がん、腺がん、大細胞がん、小細胞がん、および中皮腫が含まれるが、これらに限定されない。患者が罹患しているがんの組織学的型の知識は、医療従事者が疾患を位置付けおよび特徴付けて、最適な治療ストラテジーを決定するための一助となるので、非常に有用である。
【００６４】
感染症には、感染性生物がウイルス、細菌、原生動物、寄生虫、または真菌類である細胞ベースの疾患が含まれる。
【００６５】
検出および判別パネルの例は、肺がん（一般的病態）を検出するパネルならびに肺がんの全ての他の型および偽陽性に対して１つの肺がん型（特定の病態）を判別するパネルである。偽陽性には、転移性の肝臓がん、腎臓がん、または膵臓がんなどの異なる型の転移性がんを含み得る。
【００６６】
３．パネルの作製方法
患者の一般的病態を検出するか特定の病態を判別するためのパネルの作製方法は、プローブが一般的病態または特定の病態に関連するマーカーのライブラリーに結合する感度および特異性を決定するステップと、その結合パターン（局在化および密度／濃度）で前記病態の存在または特定の性質を診断する複数のプローブを選択するステップとを含む。いくつかの実施形態では、任意選択的な予備的除去および調製ステップを行う。本発明のパネルの作製方法は、既知の組織学的病変サンプル中のマーカー（すなわち、ゴールドスタンダード、最も基準になる検査）へのプローブの結合パターンを分析するステップを含む。ゴールドスタンダードデータでデザインされた分類を使用して、サイトメトリー、特に自動化サイトメトリー分類をデザインすることができる。したがって、病理学分析から選択されたマーカープローブ組を使用して、痰、細針吸引、および尿などの細胞学的サンプルから得た新規の訓練データを作成する。特定した病変から分離した細胞を、ゴールドスタンダードに類似の様式で染色する。本明細書中に記載の方法は、ゴールドスタンダードの組織学的病変サンプルに基づく診断の完全性が高いので、最良の特徴の選択において実験誤差を排除している。原則的には、パネルの作製に細胞学的サンプルを使用することが可能であるが、細胞学的サンプルは破片を含み、細胞学的サンプルの細胞を劣化させる可能性があり、病理学的診断で臨床的に確認することが困難になる可能性があるので、これはあまり望ましくない。
【００６７】
マーカーのライブラリーは、マーカー群である。ライブラリーは、任意の数のマーカーを含むことができる。しかし、いくつかの実施形態では、ライブラリー中のマーカー数は、標本サイズなどの技術的および／または経済的実用性によって制限される。例えば、いくつかの実施形態では、各標本をパネル中の全マーカーに対して試験する。したがって、マーカー数は、標本を分割し得るサンプル数よりも多くてはならない。別の技術的実用性は時間である。典型的には、ライブラリーは６０個未満のマーカーを含む。好ましくは、ライブラリーは５０個未満のマーカーを含む。より好ましくは、ライブラリーは４０個未満のマーカーを含む。最も好ましくは、ライブラリーは１０〜３０個のマーカーを含む。潜在的なパネルマーカーのライブラリーはパネルの性能を最適にする機会が与えられるように１０個を超えるマーカーを含むことが好ましい。本明細書中で使用される、「約」は、±３個のマーカーを意味する。
【００６８】
いくつかの実施形態では、種々のマーカーについての情報源およびマーカーと一般的な／特定の病態との間の相関関係の調査によってライブラリーを得る。供給源の例には、実験結果、理論的または予測分析ならびに雑誌、書籍、カタログ、およびウェブサイトなどの文字情報源が含まれる。これらの種々の情報源は、組織学または細胞学を使用することができ、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリッド形成などの細胞遺伝学；免疫組織化学などのプロテオミクス；ＭＡＣまたはＤＮＡ倍数体などのサイトメトリー；および／または形態学などの細胞病理学に依存し得る。マーカーを細胞中または細胞上のいずれかの位置に局在させることができる。例えば、マーカーを、核、細胞質、または細胞膜の中または上に局在させることができる。マーカーは、上記の任意の位置に局在するオルガネラ中に局在することもできる。
【００６９】
いくつかの実施形態では、ライブラリーは不適切なサイズであり得る。したがって、パネルの基本的作製方法の開始前に１つまたは複数の削除ステップが必要であり得る。削除ステップは、１つまたは複数の連続的削除ステップを含み得る。１つの削除ステップは、例えば、感度および／または特異性についての任意の閾値を設定するステップを含み得る。したがって、実験によるか予測された感度および／または特異性が閾値未満である任意のマーカーを、ライブラリーから除去することができる。単独または他の削除ステップと連続して実施することができる削除ステップの他の例は、検出テクノロジーの要件、アクセスの制約、および報告された結果の非再現性に依存し得る。検出テクノロジーの要件に関して、特定のマーカーの検出に必要な機械類を利用しないことが可能である。アクセスの制約について、承認の制限により特定のマーカーに結合するプローブを得ることが困難であるか不可能である。いくつかの実施形態では、各マーカーが非常に熱心に研究されている。
【００７０】
いくつかの実施形態では、パネルの基本的作製方法の開始前に、調製ステップを行う必要があり得る。調製ステップの例には、ライブラリー中のマーカーの目的の定量的検出プロトコールを至適化するステップおよび組織学的標本を回収するステップが含まれる。マーカーの目的の定量的検出プロトコールの至適化は、当業者の範囲内である。例えば、緩衝液、試薬、ソフトウェア、および装置などの必要な試薬および消耗品を得なければならない。試薬濃度を調節することが可能である。例えば、非特異的結合が認められた場合、当業者はプローブ溶液の濃度を希釈することができる。
【００７１】
いくつかの実施形態では、組織学的標本はゴールドスタンダードである。用語「ゴールドスタンダード」は、標本の組織学および臨床診断が公知であることを意味することを当業者は知っている。ゴールドスタンダードは、しばしば「訓練」データ集合をいう。ゴールドスタンダードは、判別プロセスに寄与することができる全ての特徴の基準の集合または信頼できる評価を含む。このような特徴を、既知の病態を罹患した代表的患者数から採取したサンプルから採取する。標準サンプルは細胞学的サンプルであり得るが、これはパネル選択にはあまり望ましくない。
【００７２】
当業者に公知の任意の技術（例えば、生検）によって組織学サンプルを得ることができる。いくつかの実施形態では、患者あたりの標本サイズは、ライブラリー中の各マーカーの試験に十分な組織切片を得ることができるほどの大きさである必要がある。
【００７３】
いくつかの実施形態では、それぞれの特定の病態と診断された複数の患者から標本を得る。患者あたり１つの標本を得ることができるか、患者あたり複数の標本を得ることができる。各患者から複数の標本を得る実施形態では、手術の専門家は、１人の患者から得た各標本がこの患者から得た他の標本に類似することに依存する。コントロール患者群からも標本を得る。コントロール患者群は、健康な患者または試験される一般的または特定の病態を罹患していない患者であり得る。
【００７４】
基本的方法の第１のステップは、所望の病態に関連するマーカーのライブラリーへのプローブ結合の感度および特異性を判別することである。このステップでは、ライブラリー中の各マーカーに特異的なプローブを、患者の標本サンプルに適用する。したがって、いくつかの実施形態では、例えば、ライブラリー中に３０個のマーカーが存在する場合、各患者の標本を３０個のサンプルに分け、各サンプルを３０個のマーカーの１つに特異的なプローブで処理する。プローブは、視覚化することができる標識を含む。したがって、マーカーへのプローブの結合パターンおよびレベルを検出することができる。結合パターンおよびレベルを、定量的（すなわち、分析機器による）または定性的（病理学者などの人による）に検出することができる。
【００７５】
いくつかの実施形態では、マーカーへのプローブの結合パターンおよびレベルを検出するための客観的および／または定量的スコアリング方法を開発する。スコアリング方法を、試行錯誤によってデザインすることができる。スコアリング方法を使用して、例えば病理学者による主観的解釈を客観化する。適切なスコアリング方法の決定は、当業者の範囲内である。いくつかの実施形態では、スコアリング方法は、なし、弱い、中程度、または強いとしてマーカープローブの染色密度などの特徴を分類するステップを含み得る。別の実施形態では、これらの特徴を、顕微鏡スライド画像を操作するアルゴリズムを使用して測定することができる。スコアリング方法の例は、比率および密度を、強度を、なし＝０、弱い＝１、中程度＝２、強い＝３にランク分けし、細胞の比率を０〜５％＝０、６〜２５％＝１、２６〜５０％＝２、５１〜７５％＝３、＞７５％＝４にランク分けし、２つのグレードを掛け合わせる、１つの「Ｈスコア」に統一するものである。例えば、５０％の弱い染色＋５０％の中程度の染色のスコアは、６＝（１×２）＋（２×２）である。「Ｈスコア」に関しては、故Ｋｅｎｎｅｔｈ  Ｈｉｒｓｃｈ氏（発明者らの１人）に敬意を払う。
【００７６】
当業者は、病理学者およびサンプルに関連する潜在的先入観の最小化に関する問題に取り組むことができる。例えば、無作為化を使用して、系統的誤差を含む機会を最小にすることができる。盲検を使用して、試験者による実験の先入観を排除することができる。例えば、いくつかの実施形態では、病理学者によるばらつきを、二重盲検法によって最小にすることができる。本明細書中で使用される、「二重盲検法」は、データ収集とデータ分析が独立して行われる先入観を回避するための十分に確立された方法である。他の実施形態では、サンプルによるばらつきをサンプルの無作為化によって最小にする。例えば、病理学者がサンプルを分析する前にサンプルを無作為化する。実験プロトコールに関して無作為化することもある。いくつかの実施形態では、各サンプルを、少なくとも２人の病理学者によって分析する。各患者について、マーカーへのプローブ結合の信頼できる評価が得られる。１つの実施形態では、信頼性をチェックするために患者あたり２人の適任の病理学者によってこの診断法を行う。
【００７７】
信頼できるデザインおよび信頼できる統計評価を得るために十分なサンプル数を採取すべきである。どのようにして信頼できるデザインおよび信頼できる統計評価を得るために十分なサンプル数を得るかを決定することは当業者の範囲内である。ほとんどの標準的な分類デザインパッケージは、信頼できる評価が得られるまで性能評価の信頼性およびサンプルサイズを段階的に増大させることを決定する方法を有する。例えば、信頼できるデザインを得るために十分な評価を、２００サンプルの採取および各サンプルから評価される２７の異なる特徴を使用して行うことができる。
【００７８】
第２のステップは、制限された複数のプローブを選択することである。選択ステップは、統計分析および／またはパターン認識技術を使用することができる。選択ステップを行うために、データをデータベースに統合することができる。いくつかの実施形態では、その有効性分析の間に認められない作用方法を提供し、先入観をさらに最小にするためにプローブ数を定める。この方法によって大量のデータが得られるので、厳密な統計技術を使用する。任意の統計法を使用することができ、当業者は多数の方法のうちどれが適切であるかを同定することができる。
【００７９】
任意の数の統計分析および／またはパターン認識法を使用することができる。データ構造が最初に未知であり、異なる分類デザイン法が異なる構造にはより良く行われるので、データには少なくとも２つのデザイン法を使用することが好ましい。いくつかの実施形態では、３つの異なる方法を使用することができる。統計分析および／またはデータ集合のパターン認識の当業者は、一定の統計法が他の方法よりも有効な結果を得られる可能性が高いデータ集合構造の特徴から認識し、この場合の有効とは、所望の数のプローブを使用して一定レベルの感度および特異性を達成することを意味する。当業者は、統計分析および／または方法の有効性はデータに依存することを知っている。
【００８０】
統計分析および／またはパターン認識法の例を以下に記載する。
【００８１】
ａ）Ｃ４．５として公知の意思決定樹法。Ｃ４．５はｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｓｅ．ｕｎｓｗ．ｅｄｕ．ａｕ／〜ｑｕｉｎｌａｎ／からｆｔｐを介して利用可能な公的ドメインソフトウェアである。これは、特定の特徴への決定閾値の連続的適用によって最も良好に分類することができるデータに十分に適応している。これは、非相関データで最も効果的であり、分散が異なる類似の手段を含むデータにも対応する。Ｃ４．５パッケージを使用して、本明細書中に示す例を得た。
【００８２】
ｂ）線形判別分析。これは、クラスを最良に分離する特徴の加重組み合わせを見出すステップを含む。これらの方法は、相関データで効果的であるが、類似の手段および分散が異なるデータでは効果的ではない。必要な性能評価およびグラフ出力に依存するいくつかの統計パッケージ（ＳＰＳＳ、ＳＡＳ、およびＲ）を使用した。Ｆｉｓｈｅｒの線形判別関数を使用して、誤差率が最小の分類を得た。正準判別関数を使用して、識別閾値が変化した感度と選択性との間の妥協点を示す受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線を計算した。
【００８３】
ｃ）ロジスティック回帰。これは、線形回帰モデルの非線形変換である。従属変数をログオッズ比（ロジット）に置換する。判別分析と同様に、線形回帰は、線形モデルで見出された統計法のクラスに属する。このようなモデルは、説明変数間の線形関係に基づく。
【００８４】
十分なサンプル数を使用し、上記の技術およびソフトウェアパッケージを使用して、クラスを良好に判別する特徴の組み合わせを検索することができる。統計分析および／またはパターン認識法の他の例は、ＳＰＳＳにおける線形判別関数法ならびにＲおよびＳＡＳにおけるロジスティック回帰法である。ＳＰＳＳは、正式な製品名であり、所在地がＳＰＳＳ，Ｉｎｃ．Ｈｅａｄｑｕａｒｔｅｒｓ、２３３  Ｓ．Ｗａｃｋｅｒ  Ｄｒｉｖｅ、１１ｔｈ  ｆｌｏｏｒ、Ｃｈｉｃａｇｏ、Ｉｌｌｉｎｏｉｓ  ６０６０６（ｗｗｗ．ｓｐｓｓ．ｃｏｍ）のＳＰＳＳ，Ｉｎｃ．から利用可能である。ＳＡＳは正式な商品名であり、ＳＡＳ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｉｎｃ．、１００  ＳＡＳ  Ｃａｍｐｕｓ  Ｄｒｉｖｅ、Ｃａｒｙ、ＮＣ  ２７５１３−２４１４（ｗｗｗ．ｓａｓ．ｃｏｍ）から利用可能である。Ｒは正式な商品名であり、Ｆｒｅｅ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ’ｓ（一般公共ライセンス）（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｒ−ｐｒｏｊｅｃｔ．ｏｒｇ／）の条項にしたがってフリーソフトウェアとして利用可能である。
【００８５】
いくつかの実施形態では、相関行列が得られる。相関は、変数対の間の線形関連量を測定する。あるマーカーを使用して得たデータと別のマーカーを使用して得たデータとを相関させることによって相関行列が得られる。閾値総関数を、例えば、５０％相関に設定することができる。この場合、総関数が５０％またはそれ以上の全マーカーを、相関マーカーとみなす。
【００８６】
本発明のいくつかの実施形態では、使用者が提供した重み係数を使用して、至適化されたパネルを得ることができる。加重を、任意の係数と比較することができる。例えば、一定のマーカーを、費用、経済的な考慮、誤分類もしくは誤差率、地理的位置における一般的病態の罹患率、地理的位置における特定の病態の罹患率、プローブの冗長性および利用可能性により他のマーカーよりも加重することができる。使用者が一定のマーカーを他のマーカーよりも加重することを助長し得る費用に関連するいくつかの因子は、プローブの費用および経済的な権利の問題（ライセンス条項など）である。使用者が一定のマーカーを他のマーカーよりも加重することを助長し得る経済的検討材料に関連するいくつかの因子は、研究開発（Ｒ＆Ｄ）期間、Ｒ＆Ｄ費、Ｒ＆Ｄリスク（すなわち、プローブが作用する確率）、最終的な分析機器の費用、最終的な性能、および製品化に要する時間である。検出パネルでは、例えば、使用者がいくつかのマーカーを他のマーカーよりも加重することを助長し得る誤分類または誤差率に関連するいくつかの因子は、偽陰性を最小にすることが望ましいことである。それに対して、判別パネルでは、偽陰性を最小にすることが望ましい。使用者がいくつかのプローブを他のプローブよりも加重することを助長し得る地理上の区域における一般的または特定の病態の罹患率に関連するいくつかの因子は、いくつかの地理的位置における一定の一般的または特定の病態の発生率がいくらか関連していることである。冗長性に関して、いくつかの例では、パネル中に冗長性を有することが望ましい。例えば、いくつかの理由のためにあるプローブが検出できない場合でも、パネル中のマーカーの生物学的変動性のために、病態は他のマーカーによって検出される。いくつかの実施形態では、好ましい冗長なマーカーであるマーカーにより加重することができる。
【００８７】
本発明は、費用または供給問題により最高の組み合わせが得られない場合、特徴の利用か応性に適用できる柔軟性がある。１つの実施形態では、本発明は、別の組み合わせを見出すための利用可能な特徴に簡単に適用することができる。別の実施形態では、アルゴリズムを使用して、最小の費用に到達するための選択プロセスに含むべき費用の加重が可能な特徴を選択する。例では、回収した全マーカーから選択した組み合わせまたは経済的に好ましいプローブの群のみについてのマーカー性能の評価を示す。例はまた、どのようにしてＣ４．５パッケージを使用して費用の高さに基づいた一定のプローブの加重を減少させることができるのかを示す。これらのプローブの組み合わせは、至適な組み合わせと同様に実行することができないが、性能は、費用が有意な因子である環境では利用可能である。
【００８８】
使用したいくつかの方法により、加重をクラスに適用可能である。これは、意思決定樹デザインにより費用を至適化することができるＣ４．５で利用可能である。また、判別関数法により、所望の偽陽性確率または偽陰性確率を得るために使用することができる１パラメータ出力が得られる。異なる閾値設定のためのこれらのパラメータのプロットは、受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線として公知である。ＲＯＣ曲線は、分類の異なる閾値レベルについての真の陽性スコアに対する偽陽性の比率を評価する。
【００８９】
多数の一般的病態が不均一な性質を有する場合、集団ベースのスクリーニングとしてのその使用を正当化するために試験が十分な感度、特異性、陽性予測値（陽性予測値＝真の陽性／（真の陽性＋偽陽性））、および陰性予測値（陰性予測値＝真の陰性／（偽陰性＋真の陰性））を有することを確実にするための冗長度を有するパネルを構築することができる。しかし、局所および地域の相違により、世界市場の異なるセグメントでの試験の特定の使用を決定することができ、それにより所与の市場用の最終的なパネル試験の構築に使用した基準に有意に影響を与える。臨床的有用性の至適化が最も重要であるが、手ごろな価格（費用）、技術的能力、研究所およびヘルスケア関連企業の資金、仕事の流れの問題、労働力需要、ならびにプローブおよび標識の利用可能性がパネルで使用するマーカーの最終的な部分的選択に寄与する。周知の線形判別関数分析を使用して潜在的な全選択要因を含めて評価するが、各部分的要因は方程式の項によって示され、それぞれその部分的に決定された有意性によって加重される。この方法では、世界のある地域での使用のために至適化されたパネル試験は、異なる地域での使用のために至適化されたパネル試験とは異なり得る。
【００９０】
一旦上記の方法を使用して検出または判別パネルがデザインされると、次のステップは、既知の細胞学的サンプルを使用してパネルを検証することである。検証の前に、光学的至適化ステップを行うことができる。いくつかの実施形態では、細胞学的サンプルの採取方法を改良することができる。これは、患者からサンプルを得る方法および細胞学的サンプルを混合する方法を含む。他の実施形態では、細胞学的表示方法を改良することができる。例えば、光学的固定液（保存液）または輸送液の同定。
【００９１】
ゴールドスタンダードの組織学的サンプルを使用して作製したパネルの細胞学的サンプルの検証に使用した細胞学的サンプルは、既知の診断を使用した細胞学的サンプルである。これらのサンプルを、当業者に公知の任意の方法を使用して採取することができる。例えば、喀痰サンプルを、自発的喀痰、誘導喀痰、および喀痰を高めるための薬剤の使用によって採取することができる。サンプルをパネル中の各サンプルに接触させ、プローブの結合レベルおよびパターンを分析してパネルの性能を決定する。いくつかの実施形態では、パネルをさらに至適化する必要があり得る。例えば、パネルからプローブを除去する必要があり得る。または、パネルにさらなるプローブを付加する必要があり得る。さらに、パネル上のあるプローブを別のプローブに置換する必要があり得る。新規のプローブを付加する場合、このプローブは、相関行列から決定したものと同様の相関マーカーであり得る。あるいは、プローブは、機能的に類似のマーカーであり得る。一旦パネルが至適化されると、パネルを臨床試験におけるさらなる試験に進めることができる。
【００９２】
他の実施形態では、パネルを至適化する必要はない。細胞学的サンプルでの結果が組織学的サンプル由来の結果と相関する場合、パネルを至適化する必要はなく、パネルを臨床試験におけるさらなる試験に進めることができる。
【００９３】
４．使用方法
上記方法を使用して一旦パネルが得られた場合、パネルを細胞学的サンプルに適用することができる。方法を例示するために、がん、特に肺がんを例示する。類似のステップおよび手順を他の病態に適用する。特定の病変から分離した細胞を類似の様式で染色し、パネルを得るために使用した組織学的病変サンプルと類似の様式で細胞学的サンプル（細針吸引、痰、尿など）中で染色される。
【００９４】
本発明の基本的方法は、典型的には、２つのステップを含む。第１に、罹患細胞を含む懸濁細胞学的サンプルを、疾患マーカーをそれぞれ定量的に結合する複数の薬剤を含むパネルに接触させる。次いで、疾患マーカーへの各薬剤の結合レベルまたはパターンを検出する。検出結果を使用して、一般的疾患の存在を診断するか、特定の病態を判別することができる。任意選択的な予備ステップは、細胞学的サンプルにおける疾患の検出または病態の判別を補助する薬剤の至適化パネルを同定するステップである。
【００９５】
細胞学的標本には、血液、尿、脊髄液、およびリンパ系などの体液；気道（例えば、肺喀痰）、尿路（例えば、膀胱洗浄物）、生殖管（例えば、子宮頸部ＰＡＰ塗抹標本）、および胃腸管（例えば、結腸洗浄物）などの上皮細胞ベースの器官系；および乳房、膵臓、肝臓、腎臓、甲状腺、骨髄、筋肉、前立腺、および肺などの器官および系中の固形組織部位由来の細針吸引物；乳房、膵臓、肝臓、腎臓、甲状腺、骨髄、筋肉、前立腺、および肺などの器官および系中の固形組織部位由来の生検；ならびに外科生検由来の組織などの組織学的標本から採取した細胞サンプルを含み得るが、これらに限定されない。
【００９６】
本発明の薬剤パネルの例には、細胞学的サンプル中の悪性細胞の正確な検出が可能な任意の数の薬剤が含まれる。本発明によって確証された分子マーカーは、悪性細胞の検出を補助する任意の分子であり得る。マーカーの発現レベルまたはパターンの変化に関するいくつかの異なる基準に基づいて、パネルに含めるマーカーを選択することができる。発現の変化により、初期の腫瘍が進行し、腫瘍細胞の大部分によって示され、７５％を超える所与の腫瘍型検出可能であり、最も好ましくは９０％を超える所与の腫瘍型を検出可能であり、そして／またはがんの組織学的型を判別可能である分子マーカーが好ましい。
【００９７】
基本的方法の第１のステップは、細胞学的サンプル中の薬剤パネルの発現レベルまたはパターンの変化の検出である。このステップは、典型的には、細胞学的サンプルを標識したポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体もしくはそのフラグメントまたは核酸プローブなどの薬剤に接触させるステップと、各細胞中のシグナルを観察するステップとを含む。シグナルが変化した細胞の検出は、標識プローブが指示された分子マーカーの発現レベルの変化の指標である。この変化は、試験される組織または部位から得た非悪性細胞と比較した発現レベルの増減に基づく。
【００９８】
当業者は、細胞学的サンプル中に悪性細胞が存在するかどうかを薬剤パネルの発現レベルまたはパターンの変化の分析によって高感度および高い特異性で決定することができる。用語「感度」は、患者が臨床試験で正確に同定される条件付確率（真の陽性の結果数／（真の陽性の結果数＋偽陰性の結果数））をいう。したがって、がん検出方法の感度が高い場合、検出されるがんの比率は高い（例えば、８０％、好ましくは９０％超）。用語「特異性」は、臨床試験によって罹患していない人が正確に同定される条件付確率（すなわち、真の陰性結果数／真の陰性結果数＋偽陽性結果数）をいう。したがって、がん検査方法の特異性が高い（８０％、好ましくは９０％、より好ましくは９５％）場合、この方法で得られる偽陽性の比率は低い。「細胞学的サンプル」は、患者の細胞を含む患者から採取した任意のサンプルを含む。本発明によって想定された細胞学的サンプルの例には、体液、上皮細胞ベースの器官系洗浄物、擦過標本、ブラッシング生検、塗抹標本または滲出液、ならびに細針吸引または細針生検が含まれる。
【００９９】
本発明に記載したマーカーの使用は、適切な細胞学的サンプルを日常的に得ることができ、その後の評価のためにサンプルを適切に保存することができると考えられる。細胞学的サンプルを処理し、適切な防腐剤に保存することができる。好ましくは、細胞学的サンプルを、防腐剤を含むバイアル中に採取する。防腐剤は、細胞形態学を維持するか細胞タンパク質および核酸の分解を遮断することが公知の任意の分子または分子の組み合わせである。適切な固定を確実にするために、サンプルを採取部位で迅速に混合してサンプルを分離し、そして／または粘液などの覆い隠す物質を破壊して、細胞を防腐剤に曝露することができる。
【０１００】
一旦標本が得られると、適切な混合デバイスを使用して標本を均一にすることが望ましい。これにより、１つを超える試験部位にアリコートを送る可能性を含む複数の目的のためにアリコートを使用し、複数のスライドおよび／またはスライド上の複数の沈殿物を調製することが可能である。したがって、使用前に標本および各アリコートの最初の均一化により、各個体のスライドの細胞分布が実質的に同一であることが確実となり、あるスライドと別のスライドの結果の比較が有意になる。
【０１０１】
分析用の標本の調製は、方法（細胞単層の塗抹、遠心分離、または沈殿が含まれるが、これらに限定されない）を使用してサンプルを顕微鏡スライドに塗布するステップを含む。このような方法は、手動、半自動、または完全な自動化で行うことができる。細胞懸濁液を、吸引によってフィルター上に細胞を沈着させ、細胞の単層をさらなる評価のために処理することができる調製済みスライドに移すことができる。このプロセスの繰り返しにより、必要に応じてスライドを調製することができる。本発明は、スライドあたり１つの分子マーカーの検出を含む。スライドあたりいくつかの分子マーカーの検出も想定される。好ましくは、スライドあたり１〜６個のマーカーが検出される。いくつかの実施形態では、スライドあたり２個のマーカーが検出される。他の実施形態では、スライドあたり３個のマーカーが検出される。
【０１０２】
本発明は、当業者が利用可能な任意の多数の方法を使用したＤＮＡ、ＲＮＡ、またはタンパク質レベルでの分子マーカー発現の変化の検出を意図する。細胞学的サンプル中の分子マーカーの発現レベルまたはパターンの変化の検出は、一般に、細胞学的サンプルをパネル集団「プローブ」および標識中の分子マーカーをコードする核酸配列に相補的なポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、もしくはそのフラグメントまたは核酸配列に接触させるステップを含む。典型的には、プローブおよび標識成分は、プローブが分子マーカーと反応した場合にシグナルを発生するように作動可能に連結されている（「標識プローブ」）。本発明によって想定される標識は、シグナルを発生するか発生可能であり、サンプル中の成分を同定可能な任意の標識である。好ましい標識には、放射性部分、蛍光発生部分、色素形成部分、または酵素部分が含まれる。したがって、可能な検出方法には、免疫細胞化学；プロテオミクス（免疫化学など）；細胞遺伝学（ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリッド形成および蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリッド形成など）；放射能検出、サイトメトリー、および電界効果（ＭＡＣおよびＤＮＡ倍数体など）（自動化コンピュータ制御サイトメトリーを使用した化学量論的に染色された核ＤＮＡの定量）；および細胞病理学（形態学ベースの定量的細胞病理学など）が含まれるが、これらに限定されない。標識プローブによって発生したシグナルは、医療従事者および技術者による検出に十分な強度であることが好ましい。
【０１０３】
一旦スライドが調製されると、医療従事者は、がん診断に特徴的なマーカー発現の変化を示す細胞を同定するためにスライドを顕微鏡で観察する。医療従事者は、目的の細胞の同定に画像分析システムおよび自動化顕微鏡を使用することができる。データ分析に決定的な診断および至適な治療アプローチの選択を行えるように医師を支援する情報管理システムおよびアルゴリズムを使用することができる。医療従事者はまた、標識薬剤の存在を検出することができる機器プラットフォームを使用してサンプルを試験することができる。
【０１０４】
分子診断パネルアッセイにより、標識細胞および／または組織切片を含む１つまたは複数の顕微鏡ガラススライドが得られる。専門家による客観的且つ臨床的に有意義な結果が得られるこれらの（細胞）病理学的な多標識細胞調製物を評価する試みは、検出および理解においていかなる人も現実的に克服できない問題である。
【０１０５】
コンピュータ支援の画像処理システム（すなわち、光子顕微鏡（商標））を開発し、これを使用してプローブ標識細胞および組織の量および位置を定量的且つ再現可能に評価することができる。このような光子顕微鏡（商標）は、ロボットによるスライド操作機能、データ管理システム（例えば、医療情報）、ならびに類似の感度および制度で人の目視によって得ることができない細胞ベースのプローブ含有率および局在化データの検出および報告用の定量的デジタル（光学および電子）画像分析ハードウェアおよびソフトウェアモジュールが組み合わされている。これらのプローブデータを使用して、種々の病態についての各細胞ベースのマーカー中の関連する特徴および差異に基づいて細胞サンプルを特徴付けおよび識別することができる。
【０１０６】
本発明の方法は、分子診断パネルを細胞ベースの標本およびサンプルに適用し、その後コンピュータ支援画像処理システムを使用して分子診断パネル試験の結果を定量および報告する方法である。このような画像処理システムを使用して、所与のスライドベースのサンプルに対して複数のプローブを使用し、プローブが顕微鏡細胞学または組織学スライドで色によって識別されるのでプローブを個別に分析、定量、および報告することができる細胞ベースのサンプルを評価することができる。
【０１０７】
シグナルが適切な型であり、且つ十分な強度である場合、サンプル中の標識薬剤によって発生したシグナルを、標準的な顕微鏡またはコンピュータ支援の顕微鏡を使用して人（例えば、病理学者）が検出することができる［１６７］。コンピュータ支援の顕微鏡は、顕微鏡操作（例えば、ステージの移動、焦点合わせ）とマウス駆動コントロールとキーファンクション（例えば、スライドスキャニングパターン）のコンピュータ制御自動化とを統合した人間工学に基づくコンピュータ・インターフェース顕微鏡ワークステーションである。集中データ管理システムは、関連患者の情報ならびに全標本のスクリーングの結果および病理学者の所見を保存、体系化、および表示する。バーコード上に刻まれ、サンプルスライドに添付された識別番号は、データベース中の各サンプルを固有に識別し、元の標本および患者を関連付ける。
【０１０８】
好ましい実施形態では、サンプル中の標識薬剤によって発生したシグナルを、集中データ管理システムにインターフェースで連結された自動化画像分析システム（すなわち、光子顕微鏡）を使用して検出および定量する。光子顕微鏡は、顕微鏡操作のソフトウェアコントロールが完全に自動化されており、非常に弱いシグナルまたは放射性標識部分由来のシグナルなどの人でさえ検出不可能なシグナルの定量に適切な検出器および他の成分が組み込まれている。自動化機器による迅速な再配置およびコンピュータ支援の顕微鏡を使用した人による検査のために、検出シグナルの位置を電子的に保存する［１６８］。
【０１０９】
集中データ管理システムは、バーコード識別番号を使用して全患者およびサンプルを保存する。複数のサイトからデータを非同期的に獲得することができ、このデータは細胞学者および／または自動化分析器による複数の観察および分析に由来し得る。これらのデータは、１つの以前に均一にした患者の標本由来のアリコートを示す複数のサンプルスライドからの結果を含み得る。データの一部および全部を、報告、保管、請求書作成、および規制要件を満たすために病因の実験情報システムへまたはこれらから移す。パネル試験および人による観察から得た結果を統合した１つの総括的報告を作製し、ハードコピーまたはネットワークコンピュータもしくはインターネットで電子的に送ることができる。
【０１１０】
いくつかの実施形態では、本発明の方法により、がんの異なる組織学的型などの異なる疾患を差別的に判別可能である。用語「組織学的型」は、特定の病態をいう。一般的な病態に依存して、１つまたは複数の組織学的型が存在し得る。例えば、肺がんには、扁平上皮がん、腺がん、大細胞がん、小細胞がん、および中皮腫が含まれるが、これらに限定されない。患者が罹患しているがんの組織学的型の知識は、医療従事者が疾患を位置付けおよび特徴付けて、最適な治療ストラテジーを決定するための一助となるので、非常に有用である。
【０１１１】
特定の病態を決定するために、特定の病態を判別することができるマーカーのパネルを選択する。例えば、分子マーカーのパネル内に、がんの特定の組織学的型の指標となる発現パターンを同定することができる。上記の方法によって、分子マーカーパネルの発現レベルの検出を行う。好ましくは、１〜２０個の分子マーカーを含むパネルを使用して、肺がんの種々の組織学的型を判別する。しかし、最も好ましくは、４〜７個のマーカーを使用する。マーカー発現に基づく異なる組織学的型の判別を補助するために意思決定樹図を開発することができる。
【０１１２】
細胞学的サンプル中の悪性細胞を検出できることに加えて、本発明は病態の分子特徴付けに有用である。このような情報は、しばしば予後に有用であり、医師による特定の患者の至適な治療アプローチの選択を支援する。さらに、本発明に記載のマーカーパネルは、患者のモニタリングにおいて、再発または疾患の治療に使用される治療の有効性の測定するいずれかに有用である。
【０１１３】
非限定的な例として、肺がん検出パネルによって肺がんの存在を検出することができ、判別パネルによって肺がんの特定の型を検出することができる。医療従事者が細胞学的サンプル中に悪性細胞が存在すると決定した場合、肺がんの組織学的型のさらなる分析を行うことができる。本発明に含まれる肺がんの組織学的型には、扁平上皮がん、腺がん、大細胞がん、小細胞がん、および中皮腫が含まれるが、これらに限定されない。図１は、肺がんの異なる組織学的型の同定用のパネルに含められる好ましいマーカーである分子マーカーを示す。「％」と示した列は、特定のマーカーを発現する腫瘍標本の比率を示す。
【０１１４】
肺がんの種々の組織学的型の決定において、マーカー発現の相対レベルを分析する。図２は、どのようにして異なるマーカーを使用してがんの異なる組織学的型を判別することができるのかを示す。この表では、ＳＱは扁平上皮がんを示し、ＡＤは腺がんを示し、ＬＣは大細胞がんを示し、ＳＣは小細胞がんを示し、ＭＥは中皮腫を示す。各細胞中に示した数は、ある細胞型の別の細胞型に対するマーカーの変化の頻度を示す。表中に含めるために、比は２．０を超えるか０．５未満でなければならない。１００を超える数は、一般に、第２のマーカーが発現されないことを示す。このような場合、分析のために分母を０．１に設定した。最後に、空白のセルは発現に相違がないか発現データが存在しないことを示す。
【０１１５】
収集されたデータの１つの分析方法は、意思決定樹図を構築することである。スキーム１〜４は、発現パターンを使用して肺がんの組織学的型の差異を決定することができるように構築することができる意思決定樹図の例である。本発明は、スキーム１〜４に示した意思決定樹図に決して限定されない。マーカー発現の相対レベルは、異なる組織学的型の悪性細胞中の分子マーカーの発現レベルより高いか、低いか、同じ（ＮＤ）であり得る。各スキームは、示した分子マーカーのパネルの使用により、肺がんの５つの組織学的型を識別可能である。
【０１１６】
例えば、スキーム１では、パネルは、ＨＥＲＡ、ＭＡＧＥ−３、トロンボモジュリン、およびサイクリン１からなる。第１のサンプルを、ＨＥＲＡに指向する標識プローブに接触させる。ＨＥＲＡ発現がコントロールよりも低い場合、試験は肺がんの組織学的型が中皮腫（ＭＥ）であることを示す。しかし、発現がコントロールより高いか同一の場合、サンプルをＭＡＧＲ−３に指向するプローブに接触させる。ＭＡＧＥ−３の発現がコントロールより低い場合、サンプルをサイクリンＤ１に指向する標識プローブに接触させ、小細胞がん（ＳＣ）または腺がん（ＡＤ）と決定することができる。ＭＡＧＥ−３の発現がコントロールよりも高いか同一である場合、サンプルをトロンボモジュリンに指向する標識プローブに接触させ、扁平表皮がん（ＳＣ）または大細胞がん（ＬＣ）と決定することができる。
【０１１７】
【化１】
2004526154.tif 000005
【０１１８】
スキーム２では、パネルは、Ｅ−カドヘリン、肺サーファクタントＢ、およびトロンボモジュリンからなる。第１のサンプルを、Ｅ−カドヘリンに対する標識プローブに接触させる。Ｅ−カドヘリン発現がコントロールよりも低い場合、試験は肺がんの組織学的型が中皮腫（ＭＥ）であることを示す。しかし、発現がコントロールより高いか同一の場合、サンプルを肺サーファクタントＢに指向するプローブに接触させる。肺サーファクタントＢ発現がコントロールより低い場合、サンプルをトロンボモジュリンに指向する標識プローブに接触させ、扁平上皮がん（ＳＱ）または大細胞がん（ＬＣ）と決定することができる。肺サーファクタントＢ発現がコントロールよりも高いか同一である場合、サンプルをＣＤ４４ｖ６に指向する標識プローブに接触させ、腺がん（ＡＤ）または小細胞がん（ＳＣ）と決定することができる。（意思決定樹図のさらなる例にはスキーム３および４を参照のこと）。
【０１１９】
【化２】
2004526154.tif 000006
【０１２０】
【化３】
2004526154.tif 000007
【０１２１】
【化４】
2004526154.tif 000008
【０１２２】
好ましい方法は、発現パターンの相違により肺がんの種々の組織学的型を判別可能な分子マーカーのパネルを使用するステップを含む。
【０１２３】
マーカー発現パターンを分析するために多数の異なる意思決定樹図を構築することができる。医師および他のヘルスケア関連企業がこの情報を使用して、患者の管理を決定し、最適な治療ストラテジーを選択することができる。
【０１２４】
５．パネル分析結果の報告
パネル分析の結果を、いくつかの方法で報告することができる。例えば、結果を、簡単な「イエスまたはノー」と報告することができる。あるいは、結果を、試験結果が相関する確率として報告することができる。例えば、検出パネル研究由来の結果は、患者が一般的病態を有するかどうかを示すことができる。パネルは特異性および感度も報告されるので、結果を、患者が一般的病態を有する確率として報告することもできる。判別パネル分析による結果は、特定の病態を判別する。結果を、特定の病態が存在するかどうかに関して「イエスまたはノー」で報告することができる。あるいは、結果を、特定の病態が存在する確立として報告することができる。１人の患者由来の標本に対していくつかの判別パネル分析を行い、存在する病態が他の可能性に関して特定の病態である可能性のプロフィールを報告することも可能である。他の可能性には、偽陽性も含み得る。
【０１２５】
存在する各特異的な病態の確率のプロフィールを作製する実施形態では、いくつかの可能な結果が存在する。例えば、全確率は非常に低い確率であることが可能である。この例では、患者の標本診断が偽陽性であると医師が結論付けることができる。約８０〜９０％であるものを除いて全可能性が低いことも可能である。この場合、試験により患者が高い確率で特定の病態を有すると医師が結論付けることが可能である。ほとんどの確率が低いが、２つの特定の病態について同様に高い確率が報告されることも可能である。この場合、医師は、正確な病態が同定されることを確実にするためにより広範なパネル試験を推奨することができる。別の可能性は、報告された全確率が低く、残りのものよりわずかに確率が高いが、８０〜９０％の範囲内よりもあまり高くない確率が存在することである。この場合、医師は、正確な病態を同定し、そして／または異なるがん型の離れた原発性腫瘍からの転移がんを排除することを確実にするためにより広範なパネル試験を推奨することができる。
【０１２６】
以下の実施例は、疾患をスクリーニングし、疾患の異なるサブタイプを判別するためのクリニックでの疾患検出パネル、疾患判別パネルの選択、パネルの確証、ならびにパネルの使用のための本発明の方法の例である。一部世界規模の保険上の重要性のためにこの実施例では肺がんを選択するが、上記の一般的開示にしたがって、類似の手順は他のがん型ならびに感染症、変性疾患、および自己免疫疾患に適用される。
【実施例】
【０１２７】
本発明の方法を使用して、肺がん検出パネルおよび１つ肺がん型に特異的な判別パネルを開発した。肺がんは、２つの主なクラスに分類することができる非常に複雑な疾患の集合体である。全肺がんの約７０〜８０％を占める非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）を、扁平上皮がん、腺がん、および大細胞がんを含む３つの主な組織学的型にさらに細分することができる。肺がん患者の残りの２０〜３０％は、小細胞肺がん（ＳＣＬＣ）である。さらに、胸膜腔の悪性中皮腫は、アスベストに曝露された個体で発症し、しばしば他の胸部構造を広範に侵襲しながら拡大する。異なる肺がん形態は、異なる肺がん領域に局在する傾向があり、異なる予後を示し、種々の治療形態に異なる反応を示す。
【０１２８】
世界保健機関（ＷＨＯ）の最新の統計（Ｇｌｏｂｏｃａｎ、２０００）によれば、肺がんは、毎年１２４万人が新規に罹患し、１１０万人が死亡している男女ともに最も一般的な致命的悪性疾患となりつつある。米国のみでも、国立がん研究所は、約１８６，０００人が肺がんを新規に罹患し、毎年この疾患により１６２，０００人が死亡し、全がん関連死の２５％を占めると報告している。米国では、肺がん患者の４０％が１年間生存するが、５年生存率はわずか１４％である。世界の他の地域では、５年生存率は非常に低い（英国では５％）。肺がんの高い死亡率は、ほとんどの患者（８５％）が治療オプションが制限されるほど進行し、疾患が転移している可能性があると診断されているという事実に寄与し得る。これらの患者は、５年生存率が、診断時の段階に依存して２〜３０％である。これは、患者が初期に診断され、５年生存率が７５％を超えるという場合と非常に対照的である。進行した肺がんの治療のために臨床実務で多数の新規の化学療法薬が導入されているという事実があるが、現在、長期生存は有意に改善されていない。初期疾患患者はおそらく手術で治癒することがきるにもかかわらず、二次悪性疾患を発症する確立が高いので有意なリスクが残される。したがって、肺がん患者のために、初期検出および治療ならびにその後の積極的なモニタリングにより、罹患率および費用を減少させる長期生存率を有意に改善する最良の機会が得られる。
【０１２９】
現在のところ、Ｘ線で病変が疑われることと患者に症状が出現していることのいずれかにより、患者は肺がんが疑われている。結果として、ほとんどの患者が比較的末期の疾患を診断される。さらに、ほとんどの方法が初期疾患の検出に関する十分な感度を欠くので、米国国立願研究所（ＮＣＩ）、国立衛生研究所の現在の方針は、有意なリスクを有する患者集団でさえも肺がんのスクリーニングを推奨している。しかし、本発明のこの実施形態では、喀痰細胞診を使用して、比較的非侵襲性で、より有効で、費用効果の高い肺がんの初期検出手段を提供する。
【０１３０】
喀痰細胞診の特異性は比較的高い。最近の研究により、経験豊かな細胞検査者は高い精度および信頼性で悪性細胞または重症形成異常細胞を認識することができることが示された［１０］。サンプルを比較的疾患が進行した患者から採取した場合、検出率は８０〜９０％ほどの高さであるが［１１、１２］、全体的には、喀痰細胞診の感度は３０〜４０％のみである［１３、１４］。標本の獲得および調製が比較的高価であり得ることを考慮すれば、喀痰細胞診の感度の低さは特に重要である。さらに、悪性疾患を検出できないことにより、治癒の機会が減少する。
【０１３１】
「危険な状態の」集団の選択もまた、スクリーニングツールとしての喀痰細胞診の価値に影響を与え得る。有意に危険な状態の個体には、肺がん診断前の個体、長期喫煙者、または喫煙経験のある個体（３０パック年超）、および長期間アスベストまたは肺発がん物質に曝された個体が含まれる。一般的な疾病素因または家族歴を有する人も「危険な状態の」集団に含まれる。このような個体は、試験の恩恵を受ける可能性がある。リスクの低い個体を含めることは検出される症例の絶対数が増加することになり得るが、医療費の実質的な増加を正当化し難い。
【０１３２】
従来の喀痰細胞診の性能を相対的に低くしている他の要因には、病変の位置、腫瘍サイズ、組織学的型、およびサンプルの質が含まれる。扁平上皮がんは、全原発性肺新生物の３１％を占める。これらの腫瘍のほとんどは区域気管支から発症し、近位肺葉および遠位亜区域枝に拡大する［１５］。この理由のために、喀痰細胞診は、これらの病変の検出で合理的に有効である（７９％）。現在、扁平表皮がんは、脱落細胞が評価により利用可能である可能性があるので、ｉｎ  ｓｉｔｕおよび放射線学的に潜在的な段階に影響を受けやすい唯一の肺がん型と考えられる［１５］。患者が胸部Ｘ線および喀痰細胞診の両方を受ける１つの大きな研究では、全肺がんの２３％が細胞診のみで検出され、これは腫瘍が初期段階であり、放射線学的に潜在性を示すことが示唆される［１６］。別の研究では［１７］、喀痰細胞診により７６％の患者で放射線学的に潜在的な腫瘍が検出された。
【０１３３】
腺がんの場合、肺周辺で腫瘍の７０％が発症し、これは悪性細胞を従来の喀痰細標本で見出される。この理由により、腺がんは喀痰細胞診で稀にしか検出されず（４５％）［１２、１８、１９］、腺がんの罹患率が特に女性で増加していることは重要な検討材料である［２０〜２２］。
【０１３４】
腫瘍サイズもまた無症候性の個体における疾患の検出のためのスクリーニング試験を考慮する場合に特に重要な因子であり、正確な診断の可能性に影響を与え得る。２４ｍｍ未満の腫瘍が真の陽性であると読み取られる機会は５０％しかないが、より大きな病変の検出確率は８４％を超える［１２］。
【０１３５】
現在の報告はまた、標本の細胞充実性が喀痰細胞診の感度に影響を与えることを示している［１４、２３］。一般に、扁平上皮がん患者で有意な腫瘍細胞数を有する標本が作製されるので、正確な診断の可能性が増大する［１４、２３］。腺がん患者については、喀痰標本中の腫瘍細胞の存在が９５％の標本で１０％未満、７５％の標本で２％未満であると報告されており、これが診断を顕著により困難にしている。
【０１３６】
分化の程度もまた、特に腺がんにおける病理学者の悪性細胞の検出能力に影響を与え得る。十分に分化した腫瘍細胞は、非新生物性気道上皮細胞に類似している頻度が高い。小細胞肺がんの場合、喀痰サンプルは、しばしば異なる外観の弱く凝集した細胞の病巣を含む。しかし、現在喀痰サンプル処理に使用されている技術は細胞を分割する傾向があり、これが診断をより困難にしている。
【０１３７】
サンプルの質は、喀痰細胞診の感度を低くし得る別の要因である。最近の報告では、被験体の７０〜８５％から適切なサンプルを得ることができることを示唆している。しかし、この測定を首尾よく行うためには患者の複数の標本を得ることが必要である［１３］。この手順は不便であり、時間がかかり、費用がかかる。患者が数日間にわたる採取を指示される頻度が高いので、患者のコンプライアンスもまた一般に低い［１３］。喫煙経験者は肺がん発症の有意な危険性を有するにもかかわらず、適切な標本が得られないという所見も同様に重要である。サンプルの保存および処理は、診断試験としての喀痰細胞診の価値に影響を与え得る別の重要な要因である。
【０１３８】
最近、適切なサンプルを獲得して適切に調製することができる場合でさえ、細胞検査者は一般に標本あたり２〜４本のスライドを観察し、典型的にはそれぞれ４分以内の検査時間である［２４］。従来の喀痰細胞診の感度が低く、高度に複雑な技術を要し、重労働であることを考慮すると、この試験が肺がんの初期検出のための集団ベースのスクリーニングでほとんど普遍的に避けられていることは驚くべきことではない［２５］。
【０１３９】
これらの技術の問題が解決されているとしても、喀痰細胞診の感度の低さは重要な問題である。偽陽性の結果の頻度が高いと、患者への潜在的に治癒可能な治療が著しく遅延し得る。より高い感度の試験を開発することができるかもしれないが、このような改良は特定の費用で実現してはならない。偽陽性数の増加により、患者が不必要でしばしば侵襲性および高価な追跡調査を受け、患者の生活の質に悪影響を与える場合がある。本発明は、肺がんの初期検出のための喀痰細胞診の使用に関連する制限を含む以前の初期がん検出方法に関連する多数の制限を克服する。
【０１４０】
肺がんは、疾患の異種集団である。集団ベースのスクリーニングとしてその使用を正当化するために必要な感度および特異性のレベルを有することを確実にするために、本発明は、例えば、パネルの開発に１０〜３０個の細胞マーカーのライブラリーの使用を想定する。本発明のライブラリーの選択は、ほとんどの場合、マーカー発現を予後の発現に関連させることを意図する肺がん患者から採取した生検標本で測定している関連化学論文の再検討および再分析に基づいた。
【０１４１】
例えば、患者の喀痰中の肺がんの初期検出、特徴付け、および／またはモニタリングに好ましいパネルには、腫瘍標本の少なくとも７５％で発現が変化するマーカーを含み得る。パネルの例には、ＶＥＧＦ、トロンボモジュリン、ＣＤ４４ｖ６、ＳＰ−Ａ、Ｒｂ、Ｅ−カドヘリン、サイクリンＡ、ｎｍ２３、テロメラーゼ、Ｋｉ−６７、サイクリンＤ１、ＰＣＮＡ、ＭＡＧＥ−１、ムチン、ＳＰ−Ｂ、ＨＥＲＡ、ＦＧＦ−２、Ｃ−ＭＥＴ、甲状腺転写因子、Ｂｃｌ−２、Ｎ−カドヘリン、ＥＧＦＲ，Ｇｌｕｔ−１、ＥＲ関連（ｐ２９）、ＭＡＧＥ−３、およびＧｌｕｔ−３から選択されるマーカーが含まれる。最も好ましいパネルには、８５％を超える腫瘍標本で発現が変化する分子マーカーが含まれる。パネルの例には、Ｇｌｕｔ１、ＨＥＲＡ、Ｍｕｃ−１、テロメラーゼ、ＶＥＧＦ、ＨＧＦ、ＦＧＦ、Ｅ−カドヘリン、サイクリンＡ、ＥＧＦ受容体、Ｂｃｌ−２、サイクリンＤ１、およびＮ−カドヘリンから選択される分子マーカーが含まれる。ＲｂおよびＥ−カドヘリンを除いて、肺がんの診断は、マーカー発現の増加に関連する。本発明で使用したプローブ／マーカーラブラリーの簡単な説明を、以下の表４に示す。以下の表中の抗体の番号は、この例を通して抗体／プローブ／マーカー数に一致することに留意すべきである。
【０１４２】
【表４】
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【０１４３】
好ましいパネル中の各分子マーカーを以下に記載する。各肺がん型についての組織中のマーカー発現の比率を列挙した表５を、この節の終わりに示す。
【０１４４】
グルコース輸送タンパク質（Ｇｌｕｔ１およびＧｌｕｔ３）［２６〜２８］
グルコース輸送体１（Ｇｌｕｔ１）およびグルコース輸送体３（Ｇｌｕｔ−３）は、至ところに発現する高親和性グルコース輸送体である。腫瘍細胞は、呼吸、グルコース取り込み、およびグルコース代謝の比率が正常細胞よりもしばしば高く、腫瘍細胞中のグルコース取り込みの増加は、グルコース輸送体によって媒介されていると考えられる。一定のＧＬＵＴイソ型の過剰発現が肺がんで報告されている。Ｇｌｕｔ１の細胞局在化は、細胞膜で認められる。ＧＬＵＴ−１およびＧＬＵＴ−３は、病態の検出に有用な疾患マーカーである。
【０１４５】
悪性細胞はグルコース取り込みが増加し、これはグルコース輸送タンパク質ファミリー（Ｇｌｕｔ）によって媒介されると考えられている。がん遺伝子および成長因子は、これらのタンパク質の発現およびその活性を調節する用である。タンパク質のＧｌｕｔファミリーメンバーは、種々のヒト組織で異なる分布パターンを示し、急速な増殖はしばしばその過剰発現に関連する。最近の証明により、高い比率のＮＳＣＬＣおよび大部分のＳＣＬＣでＧｌｕｔ１が発現することが示唆される。
【０１４６】
Ｇｌｕｔ３の発現がＮＳＣＬＣおよびＳＣＬＣの両方で比較的低いが、有意な比率の大細胞がん（３９．５％）がタンパク質を発現する。Ｉ期では、８３％が幾らかのレベルでＧｌｕｔ１を発現し、２５％の症例で７５〜１００％の細胞が染色される。これらのデータにより、Ｇｌｕｔ１の過剰発現が腫瘍進行の比較的初期の事象であることが示唆される。Ｇｌｕｔ１の免疫反応性もまた、９０％を超えるＩＩ期およびＩＩＩＡ期のがんで検出された。Ｇｌｕｔ１およびＧｌｕｔ３の免疫反応性と腫瘍識別との間に逆の相関関係も存在するようである。高レベルのＧｌｕｔ１を発現する腫瘍は、特に悪性であり、予後がよくないようである。タンパク質に対して腫瘍が陰性の場合、より良好な生存率が認められた。
【０１４７】
ヒト上皮関連抗原（ＨＥＲＡ）［２９、３０］
ＨＥＲＡは、現時点で未知の機能を有する膜貫通糖タンパク質である。ＨＥＲＡは、ほとんどの正常および悪性上皮に存在する。最近の報告では、ＨＥＲＡ発現ＮＳＣＬＣの全組織学的型で高く、これが検出マーカーとして有用であることが示唆されている。対照的に、ＨＥＲＡ発現は中皮腫に存在しないので、判別マーカーとして有用性を有することが示唆される。ＨＥＲＡの細胞における位置は、細胞表面である。
【０１４８】
塩基性線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）［３１〜３４］
塩基性線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）は、ヘパリンおよび他のグリコサミノグリカンに高い親和性を示すポリペプチド成長因子である。がんでは、ＦＧＦは強力なマイトジェンとして作用し、血管新生、分化、および増殖で役割を果たし、腫瘍進行および転移に関与する。ＦＧＦの過剰発現は、ＳＣＬＣおよび扁平表皮がんで頻繁に起こる。多くの症例では（６２％）、細胞はＦＧＦ受容体も発現し、オートクラインループの存在が示唆される。Ｉ期腫瘍の４８％がＦＧＦを過剰発現する。ＩＩ期肺がんのＦＧＦの頻度は、８４％である。成長因子またはその受容体のいずれかの発現は、予後の不十分さに関連する。Ｉ期疾患患者の５年生存率はＦＧＦを発現する患者で７３％に対し、ＦＧＦ陰性患者で８０％である。細胞膜中に細胞が局在する。
【０１４９】
テロメラーゼ［３５〜４２］
テロメラーゼは、真核生物染色体のテロメアを拡大および維持するリボ核タンパク質酵素である。これは、逆転写活性を有する触媒タンパク質サブユニット、逆転写活性を有するＲＮＡサブユニット、およびテロメア伸長のテンプレートとして作用するＲＮＡサブユニットからなる。テロメラーゼを発現しない細胞は、最終的に染色体が不安定になり、加齢し、細胞が死滅するそれぞれ細胞分裂した連続的に短縮したテロメアを有する。細胞中でテロメアは核に局在している。
【０１５０】
テロメラーゼ発現は不死化細胞および酵素で起こるようであり、活性は悪性表現型の共通の特徴である。約８０〜９４％の肺腫瘍のテロメラーゼ活性レベルが高い。さらに、過形成の７１％、化生の８０％、および異形成の８２％が酵素活性を発現する。全てのがんのｉｎ  ｓｉｔｕ（ＣＩＳ）標本が、酵素活性を示す。前悪性組織の発現レベルの低さは、おそらく、サンプル中の少数の細胞（５％および２０％）が酵素活性を発現するという事実に関連する。これは、２０〜６０％の細胞が酵素活性を発現することができる腫瘍と対照的である。限定数のサンプルに基づいて、テロメラーゼ活性の発現もまたＳＣＬＣに共通するようである。
【０１５１】
増殖細胞核抗原（ＰＣＮＡ）［４３〜５１］
ＰＣＮＡは、ＤＮＡポリメラーゼδの補因子として機能する。ＰＣＮＡは、細胞周期のＳ期およびＤＮＡ修復に関連するＤＮＡ合成中で発現する。ＰＣＮＡは、広範な正常組織および悪性組織中の増殖細胞で発現する。細胞中でＰＣＮＡは核に局在する。
【０１５２】
ＰＣＮＡの発現は、急速に分裂する細胞の共通の特徴であり、腫瘍の９８％で検出される。免疫組織化学的染色は、ＮＳＣＬＣの８３％で検出される中程度から強く染色された核である。ｐ５３陰性腫瘍の５１％で強いＰＣＮＡ染色が認められた。しかし、ＰＣＮＡ（５０％超の細胞染色）およびｐ５３（１０％超の細胞染色）が共に過剰発現させる場合、より短期間に進行して予後はよくない。肺がんの全段階で頻繁に検出される場合、ＰＣＮＡの強い染色は転移性疾患でより一般的である。ＣＩＳの３１％もまたＰＣＮＡを過剰発現する。
【０１５３】
ＣＤ４４［５１〜５８］
ＣＤ４４ｖ６は、細胞接着分子として作用する細胞表面糖タンパク質である。これは、上皮組織、中皮組織、および造血組織中の広範な正常細胞および悪性細胞に発現する。特定のＣＤ４４スプライス変異体の発現により、一定のヒト悪性疾患における転移および予後の悪さに関連することが示されている。これを扁平上皮がんおよび腺がんの検出および判別に使用されることが予想される。ＣＤ４４は腫瘍の侵襲および転移で役割を果たすと考えられる細胞接着分子である。別のスプライシングにより、いくつかの変異イソ型が発現する。一般に、ＣＤ４４発現はＳＣＬＣを欠き、ＮＳＣＬＣで可変的に発現する。扁平上皮がんでの発現レベルが最も高いので、腫瘍型の判別に利用価値がある。非新生物性組織では、気管支上皮細胞、マクロファージ、リンパ球、および肺胞上皮細胞でＣＤ４４染色が認められる。過剰発現が特に初期疾患で認められた場合、ＣＤ４４発現と腫瘍段階、再発、または生存との有意な相関関係は認められなかった。転移性病変では、扁平上皮がんの１００％および腺がんの７５％で強力なＣＤ４４ｖ６陽性を示した。これらのデータは、ＣＤ４４発現が腫瘍進行の比較的後期に変化することを示す傾向があり、初期検出マーカーとしての価値が限定され得る。最近の所見により、ＣＤ４４ｖ８−１０変異体は大部分のＮＳＣＬＣによって発現し、候補マーカーとして可能であることが示唆される。
【０１５４】
サイクリンＡ［５９〜６２］
サイクリンＡは、細胞周期の特定の時期に移行点を調節するサイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）の調節サブユニットである。これは、Ｓ期およびＧ２期に進行する間に検出可能である。細胞中でサイクリンＡは核に局在する。
【０１５５】
サイクリンおよびサイクリン依存性キナーゼからなるタンパク質複合体は、細胞周期の進行を調節するように機能する。サイクリン発現の変化は、ＣＣＤＮ１遺伝子に影響を与える遺伝子の変化に関連する。サイクリンは調節分子として作用するが、サイクリン依存性キナーゼはＲｂを活性化および不活化する触媒サブユニットとして機能する。
【０１５６】
免疫組織化学的分析により、サイクリンの過剰発現が高いＫｉ−６７標識指標によって示される細胞増殖の増加に関連することが明らかとなった。サイクリン過剰発現はＮＳＣＬＣの７５％で起こり、腫瘍進行の比較的初期に起こるようである。最近の報告では、Ｉ／ＩＩ期腫瘍の６６．７％およびＩＩＩ期腫瘍の７０．９％でサイクリンＡが過剰発現していることが示されている。核染色は、不十分に分化した腫瘍に共通している。サイクリンＡ発現は、平均生存期間および薬物耐性の発達傾向にしばしば関連している。しかし、発現の増加はドキソルビシンに対するより大きな反応にも関連している。
【０１５７】
サイクリンＤ１［６３〜７３］
サイクリンＡと同様に、サイクリンＤ１は、細胞周期の特定の時期に移行点を調節するサイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）の調節サブユニットである。サイクリンＤ１は、細胞周期のＳ期への細胞の侵入を調節する。この遺伝子は頻繁に増殖され、そして／またはその発現は広範なヒト悪性疾患で無秩序となる。サイクリンＤ１は細胞中の核に局在している。
【０１５８】
サイクリンＡと同様に、サイクリンＤ１は、細胞周期の進行を調節するように機能する。サイクリンＤ１は、細胞質で支配的に染色され、組織学的型とは無関係である。報告により、サイクリンＤ１の過剰発現は、ＮＳＣＬＣの４０〜７０％、ＳＣＬＣの８０％で起こることが示唆される。サイクリンＤ１染色は、Ｉ期腫瘍の３７．９％、ＩＩ期腫瘍の６０％、ＩＩＩ期腫瘍の５７．９％で認められた。サイクリンＤ１発現はまた、異形成組織および過形成組織で認められ、これは、これらの変化が腫瘍進行の比較的初期に起こることを証明している。サイクリンＤ１が過剰発現した患者は、平均生存期間が短く、５年生存率が低い。
【０１５９】
肝細胞成長因子受容体（Ｃ−ＭＥＴ）［７４〜７７］
Ｃ−ＭＥＴは、ＨＧＦの膜貫通受容体チロシンキナーゼをコードするがん原遺伝子である。ＨＧＦは肝細胞および内皮細胞のマイトジェンであり、上皮起源のいくつかの細胞型に対して多面発現を示す。Ｃ−ＭＥＴは細胞中の細胞表面に局在している。
【０１６０】
肝細胞成長因子／散乱因子（ＨＧＦ／ＳＦ）は、増殖、移動、および血管新生を含む複雑な分化プログラムを実行させるように広範な上皮細胞を刺激する。ＨＧＦ／ＳＦは、ｃ−ＭＥＴがん遺伝子によってコードされる受容体に結合する。正常および悪性組織の両方がＨＧＦ受容体を発現するが、ＨＧＦ／ＳＦ発現は悪性組織に限定されるようである。
【０１６１】
ヒトの肺のＨＧＦ／ＳＦ発現レベルは一般に低いが、ＮＳＣＬＣでは発現が顕著に増加する。ウェスタンブロット分析を使用して、肺がんの８８．５％のタンパク質発現が増加している。腫瘍の全組織学的型が、高濃度のタンパク質を発現した。疾患の全段階でタンパク質レベルが増加するが、最近の証明により、がん細胞に加えて、間質細胞および／または炎症細胞は成長因子賛成を担い得ることが示唆される。
【０１６２】
ムチン−ＭＵＣ−１［７８〜８２］
ムチン１は、気管気管支樹、胃腸管、および泌尿生殖管を被覆および保護する粘性ゲルの主要なタンパク質構成成分を含む高度にグリコシル化された分泌タンパク質に由来する。ムチン１は、上皮腫瘍で非定型に発現する。ムチン１は細胞中の細胞質および細胞表面に局在している。
【０１６３】
ムチンは、膜に結合しているか分泌された種々の分泌性上皮細胞によって合成される高分子量の糖タンパク質ファミリーである。気道内で、これらのタンパク質は、気管気管支樹を被覆および保護する粘性ゲルに寄与する。ムチン発現の変化は、一般に、肺がんを含む悪性疾患への変換と共に起こる。証拠により、これらの変化が細胞成長調節の変化、免疫系による認識、および腫瘍の転移可能性に寄与し得ることが示唆される。
【０１６４】
正常な肺組織がＭＵＣ−１を発現するにもかかわらず、腺がん発症レベルの高い肺がんで有意により高いレベルの発現が見出される。時期とは無関係に染色され、喫煙経験者または非喫煙者よりも喫煙者でより一般的である。いくつかの前悪性病変もまた、ＭＵＣ−１発現が増加する。
【０１６５】
甲状腺転写因子１（ＴＴＦ−１）［８３、８４］
ＴＴＦ−１は、甲状腺特異的および肺特異的分化遺伝子を活性化するホメオドメイン転写因子のファミリーに属する。ＴＴＦ−１は細胞中の核に局在している。
【０１６６】
ＴＴＦ−１は、サイログロブリン転写を倍加することが最初に見出されたタンパク質である。最近、ＴＴＦ−１発現は、間脳および気管支肺胞上皮でも見出された。肺内でＴＴＦ−１がサーファクタントタンパク質およびクラーラ分泌タンパク質の合成を調節する転写因子として機能する。大部分の肺腺がんでＴＴＦ−１が過剰発現し、原発性肺がんと肺に移転したがんとの識別を補助することができる。ＴＴＦ−１を発現し、サイトケラチン７陽性であり、サイトケラチン２０陰性である腺がんを、９５％の感度で検出することができる。
【０１６７】
血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）［３３、６１、８５〜８９］
ＶＥＧＦは、腫瘍の進行および転移を促進する血管新生で重要な役割を果たす。ＶＥＧＦには多数の形態が存在し、２つの小さなイソ型は分泌タンパク質であり、核酸作用因子として作用し、大きな残りの２つのイソ型は細胞に会合したままである。ＶＥＧＦは細胞中の細胞質、細胞表面、および細胞外基質に局在している。
【０１６８】
血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）は、重要な血管新生因子であり、且つ内皮細胞特異的マイトジェンである。血管新生は、発現現象の後期（腫瘍の進行）で重要なプロセスであり、遠位転移進行に特に重要である。ＶＥＧＦは、オートクラインループの存在が示唆される成長因子を発現する腫瘍にしばしば存在する特異的受容体Ｆｌｔに結合する。
【０１６９】
免疫組織化学的分析により、ＶＳＧＦを発現する細胞は拡散する細胞質の染色パターンを示すことが明らかとなる。非新生物性細胞によって発現されないが、ＶＥＧＦはＮＳＣＬＣの大部分およびＳＣＬＣにより低い比率で存在する。いくつかの報告で、肺がん初期に高レベルのＶＥＧＦが認められている。
【０１７０】
ＶＥＧＦ発現は、転移の頻度に関連している。研究により、ＶＥＧＦ発現が腺がんでの予後の不十分さおよび無疾患間隔の短さの指標となるが、扁平上皮がんでは指標とならないことが示された。高レベルのＶＥＧＦを発現する群の３年および５年生存率は、低ＶＥＧＦ群の９０．９％および７７．９％とそれぞれ比較して５０％および１６．７％である。
【０１７１】
上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）［９０〜１０４］
上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）は、種々のリガンドに結合して活性化することができる膜貫通糖タンパク質である。結合により、ＤＮＡ合成、細胞増殖、および細胞分化が起こる一連の事象が開始される。ＥＧＦＲは広範な正常組織で証明されており、種々の新生物でＥＧＦＲ過剰発現が見出されている。肺の腺がんおよび大細胞がんで発現の増加が認められているが、小細胞肺がんでは認められていない。ＥＧＦＲは、細胞中の細胞表面に局在している。
【０１７２】
ＥＧＦＲは、細胞の成長および分化で重要な役割を果たす。ＥＧＦＲは、基底側細胞膜に一様に存在するが、組織学的に正常な気管支上皮の浅層でより多数存在する。これを除いて、正常組織の染色は一貫していない。最近の証明により、ＥＧＦ受容体の過剰発現は、侵襲性肺がん発症の絶対的要件ではない可能性があることが示唆される。しかし、ＥＧＦＲが過剰発現した場合、より進行した疾患ほどより染色が強い比較的初期の疾患であるようである。
【０１７３】
侵襲性がん患者について、５０〜７７％の腫瘍がＥＧＦを染色する。ＥＧＦＲの過剰発現は腺がんよりも扁平上皮がんで一般的であり、ＳＣＬＣＬで一般的である。後期の転移性疾患でＥＧＦＲレベルが最も高く、Ｉ／ＩＩ期腫瘍で認められるＥＧＦＲ濃度の約２倍である。評価により、Ｉ期腫瘍で認められたＥＧＦＲレベルが正常な組織で認められるレベルの約２倍であることが示唆される。さらに、気管支病変の４８％もまた、化生、異型、異形成、およびＣＩＳを含むＥＧＦＲ染色を示す。これらの同一のがん患者の「正常な」気管支粘膜では、症例の３９％でＥＧＦＲの過剰発現が認められたが、がんではない気管支上皮では認められなかった。さらに、ＥＧＦＲの過剰発現は、特に扁平上皮がんの症例で非喫煙者よりも喫煙者の腫瘍で頻繁に認められた。
【０１７４】
いくつかの研究によりＥＧＦＲの過剰発現が不十分な予後に関連する一方で、他の研究ではこの相関関係は得られなかった。
【０１７５】
ヌクレオシド二リン酸キナーゼ／ｎｍ２３［１０５〜１１１］
ヌクレオシド二リン酸キナーゼ（ＮＤＰキナーゼ）／ｎｍ２３は、ヌクレオシド二リン酸キナーゼである。転移の可能性の高い腫瘍細胞は、しばしばｎｍ２３タンパク質を欠くか少量しか発現しないので、ｎｍ２３タンパク質は転移抑制タンパク質として説明されて
いた。ｎｍ２３は細胞中の核および細胞質に局在している。
【０１７６】
ｎｍ２３／ヌクレオチド二リン酸／キナーゼＡ（ｎｍ２３）の発現は、発現可能性と転移可能性との間に逆の関係が存在する腫瘍進行のマーカーである。Ｉ期腫瘍がｎｍ２３を過剰発現する場合、３５ヶ月の平均追跡期間で転移は認められなかった。免疫組織化学的分析により、拡散し、細胞質に存在し、一般に悪性細胞に限定される染色が明らかとなる。肺胞マクロファージもまたタンパク質を発現する。高レベルの発現が転移可能性の低さに関連する場合、何故正常な上皮細胞がｎｍ２３を発現しないのかということに関する説明は現在存在しない。
【０１７７】
高い比率のＮＳＤＣＬＣ（特に大細胞肺がん）およびＳＣＬＣの７４％で強い染色が認められ、このタンパク質は腫瘍進行で重要な役割を果たすことが示唆される。扁平上皮がんを除いて、染色強度は、疾患の時期と共に増加する傾向がある。利用可能な証明に基づいて、ｎｍ２３はＳＣＬＣおよびＮＳＣＬＣの両方における予後因子である。
【０１７８】
Ｂｃｌ−２［１０１、１１２〜１２５］
Ｂｃｌ−２は、アポトーシス阻害で中心的役割を果たすミトコンドリア膜タンパク質である。ｂｃｌ−２の過剰発現は、プログラム細胞死が停止される細胞の一般的特徴である。Ｂｃｌ−２は、細胞中の細胞表面に局在している。
【０１７９】
Ｂｃｌ−２は、細胞分化終結の促進、非循環細胞生存の延長、および循環細胞のアポトーシスの遮断で役割を果たすと考えられるがん原遺伝子である。Ｂｃｌ−２は、Ｂａｘとのヘテロ二量体として存在するか、Ｂａｘとヘテロ二量体を形成することができる。ホモ二量体として、Ｂａｘはアポトーシスを誘導するように機能する。しかし、Ｂａｘ−ｂｃｌ−２複合体は、アポトーシスを遮断する。アポトーシスの遮断により、ｂｃｌ−２発現は、罹患細胞にいつくかの利点を付与するようである。ｂｃｌ−２発現は、薬物耐性の発達に役割を果たし得る。ｂｃｌ−２発現は、ｐ５３によって下方制御される。
【０１８０】
ｂｃｌ−２の免疫組織化学分析により、不均一な細胞質染色パターンが明らかとなる。腺がんでは、ｂｃｌ−２発現は、より小さな腫瘍（２ｃｍ未満）およびより低い増殖活性に有意に関連する。ｂｃｌ−２発現は、神経エンドクリン分化により密接に関連し、高い比率のＳＣＬＣで起こるようである。
【０１８１】
前新生物病変でｂｃｌ−２は過剰発現せず、腫瘍進行の比較的後期でｂｃｌ−２が変化することが示唆される。腫瘍細胞に加えて、基底細胞中および正常な細気管支の管腔表面上にｂｃｌ−２の免疫染色が認められたが、一般により分化した細胞型では検出されない。
【０１８２】
ｂｃｌ−２免疫反応性の改良されたＮＳＣＬＣ診断との組み合わせには、議論の余地がある。いくつかの報告により、ｂｃｌ−２を発現する腫瘍を有する患者が予後がより優れており、より長期間再発しないことが示唆される。いくつかの報告により、ｂｃｌ−２発現は転移性疾患を発症する患者が寄り少数である傾向があることが示される。扁平上皮がん患者について、ｂｃｌ−２発現は、５年生存率の改善に関連している。しかし、３年にわたる比較的大規模の研究では、特に初期疾患の患者ではｂｃｌ−２発現に関連する生存の利点は存在しなかった。
【０１８３】
エストロゲン受容体関連タンパク質（ｐ２９）［１２６］
ＥＲ関連タンパク質ｐ２９は、エストロゲン−受容体発現に相関することが認められているエストロゲン関連熱ショックタンパク質である。ｐ２９は、細胞中の細胞質に局在している。
【０１８４】
エストロゲン依存性細胞内プロセスは、正常な組織の成長調節で重要であり、悪性疾患の調節で役割を果たし得る。１つの研究では、１１１個の肺がん中１０９個（９８％）でｐ２９発現が検出された。ｐ２９発現と生存期間との関係は、男女で異なった。ｐ２９発現は、特にＩ期およびＩＩ期疾患の女性で生存率にあまり関連しなかった。男性では、ｐ２９発現と長期生存との間に相関関係は存在しなかった。
【０１８５】
網膜芽腫遺伝子産物（Ｒｂ）［６８、７３、１２３、１２７〜１４１］
網膜芽腫遺伝子産物（Ｒｂ）は、核ＤＮＡ結合リンタンパク質である。リン酸条件下でＲｂはＤＮＡ腫瘍ウイルスのがんタンパク質に結合するので、遺伝子調節タンパク質はＤＮＡ複製を阻害する。Ｒｂタンパク質は、転写の調節によって作用することができ、Ｒｂ機能の欠如により細胞成長が制御されない。Ｒｂは細胞中の核に局在している。
【０１８６】
網膜芽腫タンパク質（ｐＲｂ）は、網膜芽腫遺伝子によってコードされ、細胞周期依存性様式でリン酸化および脱リン酸化されるタンパク質である。ｐＲｂは、Ｇ０／Ｇ１期の細胞周期を調節するように機能する重要な腫瘍抑制遺伝子と考えられている。その低リン酸化状態では、ｐＲｂはＧ１期からＳ期への移行を阻害する。Ｇ１期中、サイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）がタンパク質をリン酸化する場合、ｐＲｂの成長抑制性が不活化する。ｐＲｂの高リン酸化によりＤＮＡ合成に必要な転写因子タンパク質として機能するＥ２Ｆとの複合体形成が防止される。
【０１８７】
肺がんを含む種々のがん型で網膜芽腫（Ｒｂ）遺伝子の不活化が報告されている。小細胞がんはｐＲｂを染色することができず、Ｒｂ機能の喪失を示す。概して、腫瘍の１７．６％がｐＲｂを発現できず、疾患の段階または結節の状態に関する相関関係は認められなかった。異形成気管支生検の３１％でも染色の減少が認められた。しかし、ｐＲｂ発現と異形成の重症度との間に相関関係は存在しないようである。対照的に、腫瘍の隣接領域から採取した正常な気管支上皮および細胞は、ｐＲｂ陽性の核を発現した。これらのデータより、いくつかの肺がんの発症においてＲｂタンパク質発現が初期に変化し得ることが示唆される。
【０１８８】
Ｒｂ陽性がん患者は、幾らか良好な予後を有する傾向があるが、多くの研究により、差は有意ではない。しかし、腫瘍がｐＲｂ陰性であり、且つｐ５３またはｒａｓ陽性である腺がん患者は、５年生存率が減少する。扁平上皮がんでは類似の関係は存在しない。ｐＲｂ陰性腫瘍は、Ｒｂ陽性がんよりもドキソルビシンに耐性を示す可能性がより高いと報告されている。
【０１８９】
トロンボモジュリン［１４２〜１４７］
トロンボモジュリンは、膜貫通糖タンパク質である。プロテインＣ活性化（その後プロテインＳおよびトロンビンの結合により抗凝固剤として作用する）が促進されているにもかかわらず、ＴＭの合成は、内皮細胞表面上の凝塊形成の減少に重要ないくつかの機構のうちの１つである。トロンボモジュリンは、細胞中の細胞表面に局在している。
【０１９０】
腫瘍細胞の循環による宿主血小板の凝集は、転移プロセスで重要な役割を果たすようである。トロンボモジュリンは、トロンビンによる抗凝固プロテインＣの活性化で重要な役割を果たし、血管内凝固の重要な調整物質である。正常な扁平上皮でのその発現に加えて、扁平化生、がんにｉｎ  ｓｉｔｕで、および侵襲性扁平上皮がんでトロンボモジュリンが発現する。原発性扁平上皮がんの７４％で存在するにもかかわらず、転移性病変のわずか４４％がトロンボモジュリンを染色した。これらのデータにより、進行と共にトロンボモジュリン発現は減少することが示唆される。不十分に分化した腫瘍と比較して、十分および中程度に分化した腫瘍で高レベルで発現する傾向がある。
【０１９１】
トロンボモジュリン陰性扁平上皮がん患者は、予後がより悪い傾向がある。腫瘍がタンパク質について陽性に染色された症例での６０％と比較して、トロンボモジュリン陰性患者の５年生存率は１８％である。転移性疾患への進行もまた、トロンボモジュリン陰性腫瘍でより一般的であり（３７％に対して６９％）、これらの腫瘍が胸郭外部位で発症する傾向がより高い。したがって、トロンボモジュリン発現の喪失により、扁平上皮がんの予後となるようである。ＮＳＣＬＣの後期でトロンボモジュリン発現が変化し、正常な気管支上皮細胞によってタンパク質が発現するという所見は、初期検出用マーカーとしての有用性が制限される傾向がある。しかし、中皮腫の大部分および少数の腺がんがトロンボモジュリンを発現するので、マーカーはこれらの２つの型の判別に有用である可能性がある。
【０１９２】
Ｅ−カドヘリンおよびＮ−カドヘリン［１４８〜１５１］
Ｅ−カドヘリンは、膜貫通Ｃａ２＋依存性細胞接着分子である。これは、組織構造の調節機構および組織の完全性の維持機構による細胞の成長および発達で重要な役割を果たす。Ｅ−カドヘリンは、上皮細胞の細胞内接着、上皮分極の確立、腺の分化、および層化に寄与する。多数のがんでＥ−カドヘリン発現の下方制御が認められ、これは通常疾患段階の進行および前進に関連する。Ｅ−カドヘリンは、細胞中の細胞表面に局在している。
【０１９３】
Ｅ−カドヘリンは、カルシウム依存性上皮細胞接着分子である。Ｅ−カドヘリン発現は、腫瘍の脱分化および転移ならびに患者の生存に関連している。中程度および不十分に分化した扁平上皮がんおよびＳＣＬＣで発現の減少が認められている。腺がんではＥ−カドヘリンの変化は認められなかった。さらに、腺がんはＥ−カドヘリンを発現するが、この腫瘍は、Ｎ−カドヘリンを発現するがＥ−カドヘリンを発現しない中皮腫と対照的にＮ−カドヘリンを発現することができない。したがって、これらのマーカーを使用して、腺がんと中皮腫を判別することができる。
【０１９４】
Ｅ−カドヘリン発現を使用して、扁平上皮がん患者の予後を評価することもできる。Ｅ−カドヘリンを発現する腫瘍患者の６０％が３年生存している一方で、発現が減少した患者の３６％しか３年生存していない。
【０１９５】
ＭＡＧＥ−１およびＭＡＧＥ−３［１５２〜１５６］
黒色腫抗原１（ＭＡＧＥ−１）および黒色腫抗原３（ＭＡＧＥ−３）は、正常な組織中では通常サイレントであるが、悪性新生物で発現された場合に自己腫瘍指向性および特異性細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）によって認識される遺伝子ファミリーのメンバーである。ＭＡＧＥ−１およびＭＡＧＥ−３は、細胞中の細胞質に局在している。
【０１９６】
ＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−３、およびＭＡＧＥ−４遺伝子産物は、細胞傷害性Ｔリンパ球によって認識される腫瘍関連抗原である。したがって、これらはＮＳＣＬＣの免疫療法のための標的としての有用性を有し得る。ＭＡＧＥタンパク質はまた、いくつかのＳＣＬＣによって発現されるが、正常な細胞によっては発現されない。ＭＡＧＥ発現の頻度は検出マーカーとしての使用で必要なレベル未満に減少し、組織学的型の間の発現パターンの相違により、ＭＡＧＥ発現が識別マーカーとしての有用性を有し得ることが示唆される。この有用性は、腫瘍細胞の９０％を超える扁平上皮がんの５０％がＭＡＧＥ−３を過剰発現し、腫瘍細胞の３０％が少なくとも５０％の細胞で過剰発現を示すという所見によっても支持される。
【０１９７】
核タンパク質（ｐ１２０）［１５７］
ｐ１２０（増殖関連核抗原）は、初期Ｇ１期に急速に増殖する細胞の核小体で見出される。ｐ１２０は、細胞中の核に局在している。
【０１９８】
核タンパク質ｐ１２０は、その機能が依然として解明されていない増殖関連タンパク質である。腫瘍組織では強力に染色されるが、マクロファージまたは正常組織では染色されない。ｐ１２０の過剰発現は、扁平上皮がんでより一般的であるが、腺がんまたは大細胞がんではこのマーカーは腫瘍型を判別する有用性を有し得る可能性が増大する。
【０１９９】
肺サーファクタント［８３、１５８〜１６６］
肺サーファクタントは、肺胞−液体境界の表面張力を減少させることにより、換気に必要な肺胞安定性が得られるように機能するリン脂質が豊富な混合物である。サーファクタントタンパク質は、気道で排他的に発現するようであり、肺胞ＩＩ型細胞によって産生される。非新生物性肺では、正常および過形成性肺胞ＩＩ型細胞ならびにいくつかの非線毛細気管支上皮細胞で前サーファクタントＢ免疫反応性が検出される。腺がんの６０％が強い細胞質免疫反応性を示し、腫瘍細胞の１０〜５０％がほとんど染色された。扁平上皮がんおよび大細胞がんは、前サーファクタントＢを染色できなかった。
【０２００】
サーファクタントアポタンパク質Ｂ（ＳＰ−Ｂ）は、ＩＩ型肺胞細胞によって分泌されるリン脂質およびタンパク質複合体である、肺サーファクタントを形成する４つの疎水性タンパク質のうちの１つである。肺の扁平上皮がんおよび大細胞がんならびに非肺性腺がんはＳＰ−Ｂを発現しない。ＳＰ−Ｂは細胞中の細胞質に局在している。
【０２０１】
ＳＰ−Ａは、肺胞の呼気終結での虚脱の防止に不可欠な役割を果たす肺サーファクタントタンパク質である。ＳＰ−Ａは、肺胞上皮細胞（ＩＩ型肺胞上皮細胞）の固有のマーカーであり、新生物状態でさえも抗原が保存される。ＳＰ−Ａは、細胞中の細胞質に局在している。
【０２０２】
肺サーファクタントＡは、非粘液性気管支肺胞がんに特異的なようであり、粘液型が染色されないのと比較して１００％染色される。肺サーファクタントは、肺がんと肺に転移したがんと判別する有用性を潜在的に有する。腫瘍細胞に加えて、非新生物性肺胞上皮細胞もまた、肺サーファクタントＡを染色する。肺サーファクタントＢ染色と同様に、肺サーファクタントＡは腺がんで比較的一般的であるが、他のＮＳＣＬＣ型またはＳＣＬＣ型では一般的ではない。中皮腫は肺サーファクタントＡを発現することができず、これにより、肺サーファクタントＡは腺がんと中皮腫との間の判別に有用性を有し得るということが示唆される。
【０２０３】
Ｋｉ−６７
Ｋｉ−６７は、増殖中の正常細胞および新生物細胞で発現し、静止期細胞で下方制御される核タンパク質である。Ｋｉ−６７は、細胞周期のＧ１期、Ｓ期、Ｇ２期、およびＭ期に存在するが、Ｇ０期には存在しない。一般に増殖マーカーとして使用される。Ｋｉ−６７は、細胞中の核に局在している。
【０２０４】
【表５】
2004526154.tif 000010
【０２０５】
ａ．適切なサイズのマーカーライブラリーの獲得
肺がんに相関するマーカーの適切なサイズのライブラリーを得るために、予備削除ステップが必要であった。文献中で数百を超える肺がんに相関関係を示すマーカーが公知である。文献で同定され、パネル試験に含まれる可能性が評価された候補プローブの一部には、ｂａｘ、Ｂｃｌ−２、ｃ−ＭＥＴ（ＨＧＦｒ）、ＣＤ４４Ｓ、ＣＤ４４ｖ４、ＣＤ４４ｖ５、ＣＤ４４ｖ６、ｃｄｋ２キナーゼ、ＣＥＡ（がん胎児性抗原）、サイクリンＡ、サイクリンＤ１（ｂｃｌ−１）、Ｅ−カドヘリン、ＥＧＦＲ、ＥＲ関連（ｐ２９）、ｅｒｂＢ−１、ｅｒｂＢ−２、ＦＧＦ−２（ｂＦＧＦ）、ＦＯＳ、Ｇｌｕｔ−１、Ｇｌｕｔ−２、Ｇｌｕｔ−３、Ｇｌｕｔ−４、Ｇｌｕｔ−５、ＨＥＲＡ（ＭＯＣ−３１）、ＨＰＶ−１６、ＨＰＶ−１８、ＨＰＶ−３１、ＨＰＶ−３３、ＨＰＶ−５１、インテグリンＶＬＡ２、インテグリンＶＬＡ３、インテグリンＶＬＡ６、ＪＵＮ、ケラチン、ケラチン７、ケラチン８、ケラチン１０、ケラチン１３、ケラチン１４、ケラチン１６、ケラチン１７、ケラチン１８、ケラチン１９、Ａ型ラミンズ（Ａ；Ｃ）、Ｂ型ラミンズ（Ｂ１；Ｂ２）、ＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−３、ＭＡＧＥ−４、黒色腫関連抗原クローンＮＫＩ／Ｃ３、ｍｄｍ２、ｍｉｂ−１（Ｋｉ−６７）、ムチン１（ＭＵＣ−１）、ムチン２（ＭＵＣ−２）、ムチン３（ＭＵＣ−３）、ムチン４（ＭＵＣ−４）、ＭＹＣ、Ｎ−カドヘリン、ＮＣＡＭ（中性細胞接着分子）、ｎｍ２３、ｐ１２０、ｐ１６、ｐ２１、ｐ２７、ｐ５３、Ｐ−カドヘリン、ＰＣＮＡ、網膜芽腫、ＳＰ−Ａ、ＳＰ−Ｂ、テロメラーゼ、トロンボモジュリン、甲状腺転写因子１、ＶＥＧＦ、ビメンチン、およびｗａｆ１に対する抗体が含まれる。最初のマーカーリストは、初期がん細胞の検出、異なるがん状態の細胞の判別、および標的がん細胞への標識の位置付けにおけるプローブの明らかな有効性についての最初の評価により文献から削除された。このマーカーリストでは、産生または獲得が困難であり、検出テクノロジー要件が不適切であるか、報告された結果の再現性が低いので実施が困難なマーカーの除去によってさらに削除した。全削除ステップの完了後、２７個のマーカーライブラリーを得た。
【０２０６】
ｂ．プロトコールの至適化およびゴールドスタンダード肺がんサンプルの獲得
パネル獲得前に予備調製ステップも必要であった。適切な標識を含むプローブは、業者から利用可能であった。プローブのプロトコールを、至適な客観的定量検出について分析した。例えば、ＰＣＮＡ濃度が低すぎることが決定された。最初に、ＰＣＮＡをＳ８０９緩衝液で４０００倍に希釈した。第２に、Ｓ８０９で３２００倍に希釈した。各マーカー用の至適化プロトコールを以下に示す。第２の列は標識「抗体名」であることに留意すべきである。多数の業者がマーカー名で抗体を命名しているので、ＭＯＣ−３１を除いた本リストのプローブをマーカー名によって列挙する。これらの試薬を列挙し得る別の方法は、例えば、抗ＶＥＧＦ、抗トロンボモジュリン、および抗ＣＤ４４ｖ６などであることに留意すべきである。
【０２０７】
ゴールドスタンダード組織標本を、ＵＣＬＡから得た。組織標本を、２つの供給源から得た。ヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色スライドの検査および病歴を含む標準的な手順を使用して症例を診断した。病歴および抗体マーカーを病理学者に隠し、患者の秘密を守るために、標本スライドをコード化し、任意に番号を付けた。
【０２０８】
がん性および非がん性（コントロール）組織由来の組織切片を含む標本スライドを使用した。全部で１７５種の異なる症例を分析した。この集合内で、表６に示した以下の診断で、以下の頻度を示された。
【０２０９】
【表６】
2004526154.tif 000011
【０２１０】
ｃ．分子マーカーパネルの発現レベルの決定
スライドあたり１つのプローブのみが試験されるように各症例について十分な標本スライドを調製した。一般に、特定の分子マーカーに指向する１つまたは複数の標識プローブに接触させた細胞学的サンプルを含む顕微鏡スライドを調製する。独立して、各病理学者は、Ｈ＆Ｅ染色スライドを試験して各症例を診断し、その後、各プローブ反応性スライドおよび免疫化学的に染色されたスライドを試験してプローブ結合レベルを評価し、結果を正規化データフォームに記録した。
【０２１１】
より詳細には、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織に対して免疫組織化学的染色を行った。組織切片を、ポリＬ−リジン被覆スライド上で４ミクロン厚に切断し、室温で一晩乾燥させた。組織切片の脱パラフィン処理および再水和を以下のように行った。標本から全包埋媒質を完全に除去するために、２回連続してスライドをキシレン置換（Ｈｉｓｔｏｃｌｅａｒ）浴でそれぞれ５分間インキュベートした。スライドを軽くたたいて全液体を除去し、その後２回連続して１００％の試薬グレードのアルコールを含む浴でそれぞれ３分間インキュベートした。再度スライドを軽くたたいて過剰な全液体を除去し、最後に２回連続して９５％の試薬グレートのアルコールを含む浴でそれぞれ３分間インキュベートした。９５％の最後の浴後、スライドを水道水でリンスし、水浴（ＤＡＫＯＡｕｔｏｓｔａｉｎｅｒ洗浄緩衝液、コード番号Ｓ３３０６の１０倍希釈物に相当する０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＴｒｉｓ緩衝化整理食塩洗浄緩衝液）に保持した。以下の表７は、対応する製品のコード番号を併記した本研究で使用した試薬の完全なリストを示す。本研究で使用した検出系は、ＤＡＫＯ  ＥｎＶｉｓｉｏｎ＋ＨＲＰマウス（コード番号Ｋ４００７）またはウサギ（コード番号Ｋ４００３）およびＬＳＡＢ＋ＨＲＰ（コード番号Ｋ０６９０）であった。免疫アッセイのプロトコールは、添付文書に従った。キットは、液体の２つの成分ＤＡＢ＋基質色素原（コード番号Ｋ３４６８）を含んでいた。
【０２１２】
【表７】
2004526154.tif 000012
【０２１３】
肺組織に対してこれらの抗体を至適化する前処理は重要である。酵素消化が必要な抗体のために、ＤＡＫＯプロテイナーゼＫ（コード番号Ｓ３０２０）を、室温で５分間使用した。熱誘導による標的の修正が必要な抗体は、ＤＡＫＯ標的修正溶液（コード番号Ｓ１７００）またはＤＡＫＯ高ｐＨ標的修正溶液（コード番号Ｓ３３０７）を使用して前処理した。組織を、予備加熱標的修正溶液に入れ、特定のプロトコールに依存して、９５℃の水浴で２０〜４０分間インキュベートした。次いで、組織切片を、さらに２０分間室温に冷却した。
【０２１４】
脱パラフィン処理、再水和、および組織の前処理後、全標本を３％過酸化水素溶液中でインキュベートして内因性ペルオキシダーゼ活性を停止させた。特に２つの抗体ＦＧＦおよびテロメラーゼのためにブロック試薬を使用して、非特異的バックグラウンドを最小にした。
【０２１５】
以下の表８に示すように、組織標本を、２００μｌの至適に希釈した一次抗体と共に一定時間インキュベートした。表８におけるマーカー／抗体の番号は、本明細書を通して抗体プローブおよびマーカーの番号であることに留意すべきである。次いで、スライドをＤＡＫＯ  １×自動染色緩衝液（コード番号Ｓ３３０６）で洗浄した。抗体に依存して、正確な検出系を提供した。ＤＡＫＯ  ＥｎＶｉｓｉｏｎ＋ＨＲＰおよびＬＳＡＢ＋ＨＲＰ検出系のステップおよび全インキュベーション時間を、以下の表９に示す。３，３’−ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）を使用して呈色反応を行い、反応部位に褐色沈着物が得られた。
【０２１６】
【表８】
2004526154.tif 000013
【０２１７】
【表９】
2004526154.tif 000014
【０２１８】
免疫染色後、全スライドをＤＡＫＯヘマトキシリン（コード番号Ｓ３３０２）中で３分間インキュベートし、ＤＡＫＯＭｏｕｎｔマウンティング媒質（Ｓ３０２５）を使用してカバースリップを載せた。全プロトコールを、ＩＨＣソフトウェアバージョン３．０．２を使用したＤＡＫＯ自動染色器（製造番号３４００−６６１２−０３および３４００−６１４２Ｒ−０３）にて行った。
【０２１９】
コントロールが正確に染色され、組織がインタクトであるかどうかを決定するために、光学顕微鏡下で免疫染色を調査した。スライドを標識し、箱詰めし、結果を解釈するために指定された病理学者に送った。訓練された病理学者がサンプル中に見出されるがん型または他の病変を同定した。訓練された病理学者が染色細胞の染色密度および比率の評価によりマーカープローブに対する感度を評価した。これらのスコアを、患者のデータシートに記入した。病理学者は、元の診断を隠して免疫染色で抗体マーカーを使用した。少なくとも２人の病理学者によって各スライドを読み取り、結果をデータ収集フォームに記録した。プロセスをさらに完全にするために、本方法を、第２または第３の病理学者が繰り返す。次いで、得られたスコアを照合してデータ入力エラーを確認することができる。さらなるデータにより、より良好な分類デザインが得られる。
【０２２０】
それぞれの症例について、２７個までのスライドを分析し、それぞれマーカーで染色したものを１〜１７および１９〜２８の番号でコード化した。マーカー１８（Ｃ−ＭＥＴ）染色は最適化することができなかったので、マーカー／プローブを使用しなかった。病理学者１は、全１７５症例由来のスライドを記録した。病理学者２は、９９症例由来のスライドを記録した。病理学者３は、８０症例由来のスライドを記録した。
【０２２１】
以下の表１０は、各病理学者が記録したスライドの診断数を示す。
【０２２２】
【表１０】
2004526154.tif 000015
【０２２３】
いくつかの選択した統計分析技術の目的のために、存在する全２７個のスライドを記録した症例のみを考慮する必要があった。以下の表１１は、全２７スライドからのスコアを有するとの観点から完了している各症例の診断数を示す。
【０２２４】
【表１１】
2004526154.tif 000016
【０２２５】
この表から、各病理学者は以下の全症例数を完全に記録したと結論付けることができる。病理学者１は１９９症例について全２７スライドを記録した。病理学者２は８３症例について全２７スライドを記録した。病理学者３は２３症例について全２７スライドを記録した。
【０２２６】
全がんデータポイント数は１７２である。これは、病理学者１の１１３データポイントおよび病理学者２の６０データポイントを含む。全コントロールデータポイント数は１０１である。これは、病理学者１の６２データポイントおよび病理学者２の３９データポイントを含む。
【０２２７】
図３は、コントロール組織およびがん性組織におけるプローブ７および１５のＨスコアの比較を示す。ｘ軸はＨスコアを示し、ｙ軸は特定のＨスコアを有する症例の比率を示す。Ｈスコアの差は明らかである。
【０２２８】
各患者について、診断、細胞染色率、および染色密度と共に患者分類を示すデータベースにスコアを統合する病態調査フォームにスコアを電子的に記入した。比率および密度を、強度を、なし＝０、弱い＝１、中程度＝２、強い＝３にランク分けし、細胞の比率を０〜５％＝０、６〜２５％＝１、２６〜５０％＝２、５１〜７５％＝３、＞７５％＝４にランク分けし、２つのグレードを掛け合わせる、１つの「Ｈスコア」に統合した。例えば、５０％の弱い染色＋５０％の中程度の染色のスコアは、１０＝２×２＋２×３である。これは、別のスコアリングシステムを調査した「他の（非Ｈスコア）客観的スコアリングパラメータの使用効果」というタイトルの以下の第３（ｆ）節以外分析を通して標準的なスコアリングシステムである。
【０２２９】
標準的な分類手順を使用して、最良のプローブの組み合わせを見出した。典型的には、これらの手順は、識別力試験によってランク分けし、有意性試験によって切り捨てた最良の特徴の階層を見出すための「分岐限定アルゴリズム」などの検索手順を使用する。このプロセスはまた、決定基準または最良の分類基準を定義する。
【０２３０】
これらの特徴を用いてデザインした分類の性能を、分類デザインに使用したデータから評価することができる。全デザインデータの分類への簡単な適用により、性能の評価が非常に矛盾する。
【０２３１】
本実施例で収集したデータの分析により、プローブが最適に選択され、最良にクラス分けされる。したがって、分析に少数のプローブしか必要としないパネルが得られた。しかし、データは、他のプローブの組み合わせを使用して最適に近い性能を得ることができることを示した。したがって、本発明は、費用または消耗品の問題により最良の組み合わせを得ることができないプローブを利用できるように適合可能な柔軟性を有する。いくつかの場合では、本発明を利用可能な特徴に適用して、別の組み合わせを見出すことができる。他の場合では、アルゴリズムを使用して、選択プロセスで費用がかかる特徴を低価格にするように選択することができる。
【０２３２】
データ収集および分析実験のデザインを、データ収集およびデータ分析が独立して行われる十分に確立された二重盲検法によって先入観を回避するように選択した。
【０２３３】
第１の場合では、病理学者は、従来の染色を行ったスライドを調査して診断を行った。この診断は、病態調査フォームに記入した。次いで、病理学者は、無作為の順番で、染色細胞の比率および相対染色強度の記録用のためのマーカープローブで染色したスライドを提示した。病理学者がプローブに関する情報を排除するために、スライドに番号を付けた。データを完全にチェックするために、２人の病理学者が全患者を調査した。
【０２３４】
データをデータベースに統合し、統計学者グループによって調査した。有効性分析の間、作用方法が見えないようにプローブに番号を付けた。
【０２３５】
分析の第１段階は、各患者のエントリーの比較によってデータの完全性をチェックすることであった。大きな相違が見出された場合、データエントリーをチェックし、任意の明確なエラーを修正した。説明できない相違をデータに残した。
【０２３６】
次いで、４人の統計学者が異なる統計方法がデータ中の異なる判別情報型に適合されるという事実の異なる認識技術を使用してデータを個別に分析した。
【０２３７】
最良のプローブの組み合わせの選択プロセスの第１のステップは、データを２つの集合（一方は分類デザインのための集合であり、他方は分類性能を試験するための集合である）に分けることである。デザイン（トレイン(train)）集合を使用して作製したデザインの選択により、試験集合に対して最良の性能が評価されたが、分類法をデータ構造に正規化し、訓練集合で認められた特定の場合に適合されないことを確かに結論付けることができる。
【０２３８】
信頼性を試験するために、典型的には、多数の無作為に選択した訓練データ集合および試験データ集合を使用した分析を繰り返した。このアプローチは、一般に、分類法の性能を評価する良好な評価として受け入れられている。これらの試験によりプローブ選択が一貫していない場合、このようなプローブ選択は信頼できないと報告した。
【０２３９】
ｄ．統計分析および／またはパターン認識
１．データ分析への導入
ａ．入力データ
ｉ．生データ
各患者について、診断、細胞染色率、および染色密度と共に患者分類を示すデータベースにスコアを統合する病態調査フォームにスコアを電子的に記入した。
【０２４０】
ｉｉ．計算データ
分析で使用した各プローブのスコアの有効性を、強度／比率表から計算した。比率および密度を、単純な規則Ｈ＝染色比×（３（強い染色の場合）＋２（中程度の染色の場合）＋１（弱い染色の場合））の１つの「Ｈスコア」に統合する。これは、このプローブに関連する特徴的な値である。
【０２４１】
ｉｉｉ．別の計算データパラメータ
上記のＨスコアは、Ｈスコアを超える有意な改良を得ることができない比率と強度のより良好な組み合わせ方法を見出すための階層的に分けた単純な分析であった（「他の（非Ｈスコア）客観的スコアリングパラメータの使用効果」というタイトルの以下の第３（ｆ）節）。大きなデータベースは将来はよりよい基準を抽出し得る。
【０２４２】
ｉｖ．ユーザーが供給するマーカーあたりの加重基準
本発明は、費用または消耗品の問題によ
り最良の組み合わせを得ることができない特徴を利用できるように適合可能な柔軟性を有する。例えば、本発明は、本発明を利用可能な特徴に単純に適用して、別の組み合わせを見出すことができる。あるいは、アルゴリズムを使用して、選択プロセスで費用がかかる特徴を最低の価格にするように選択することができる。マーカー性能の評価は、全マーカー収集または１つの業者のみからのマーカーから選択した組み合わせを示す。これはまた、どのようにしてＣ４．５パッケージを使用して一定のプローブの高い費用を基本とした加重を下げることができるのかということを示す。これらのプローブの組み合わせは至適な組み合わせと同様に行われないが、性能は、費用が有意な要因である環境下で受け入れられるであろう。
【０２４３】
ｖ．ユーザーが提供したクラスあたりの加重基準
使用したいくつかの方法は、クラスに加重を適用することが可能である。これは、意思決定樹が費用を至適化することができるＣ４．５で利用可能である。判別関数法により、所望の偽陽性または偽陰性の確率を得るために使用することができる１つのパラメータが出力される。異なる閾値設定のためのこれらのパラメータのプロットは、受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線として公知である。
【０２４４】
ｖｉ．検出パネル−仮説
偽陰性の確率が低いことは、所望のがん検出プロセスに望ましい（再スクリーニングが必要な偽陽性数増加による費用で陽性患者の見落としが回避されるため）。がん判別プロセスは偽陽性スコアが低いことが必要である（誤った治療を受ける患者を最小にするため）ことが予想される。
【０２４５】
許容可能な性能を達成するために６個またはそれ以上のプローブを必要とする検出パネルは費用効果が高くないことが予想された。偽陰性エラー率が５％を超える検出パネルは許容できないこともまた予想された。このボックス外に除外されるパネルは受け入れられない。この予想により、サイトメトリーパネルが本明細書中で分析した組織学ベースのパネルよりも性能が悪い可能性があることが認められる。最終目標は、エラー率が２０％未満のサイトメトリーパネルであり、これは、子宮頸部ＰＡＰ塗抹標本スクリーニングの性能とほぼ同等である。
【０２４６】
ｖｉｉ．判別パネル−仮説
６個またはそれ以上のプローブを必要とするパネルは費用効果が高くなく、２０％未満のエラー率が必要であることが予想される。このボックス外に除外されるパネルは受け入れられない。
【０２４７】
ｂ．出力データ
本発明の分析によって得られる出力は、どのようにして試験集合由来のデータが真の陽性、偽陽性、真の陰性、または偽陰性に分類されるかを示す混同行列を含んでいた。これらは、実数および比率で示すことができる。混同行列は、「性能行列」というタイトルの第２（ｄ）節で考察されている。混同行列は、どのようにして試験集合由来のデータを、真の陽性、偽陽性、真の陰性、または偽陰性に分類するのかということを示す。腺がん、扁平上皮がん、大細胞がん、中皮腫、および小細胞がんの同時判別のための意思決定樹図によって分析されたデータから得た混同行列の例を、以下の表１２に示す。
【０２４８】
【表１２】
2004526154.tif 000017
【０２４９】
・全偽分類の合計を得られた全分類数で割った混同行列中にデータをまとめたエラー率（％で示す）。
・受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線は、分類中の異なる閾値レベルについての偽陽性スコアおよび偽陰性スコアの比率（または単位確率あたり）の評価を示す。無作為選択よりも良好に判別することができない無関係の分類は、真および偽が等しく読み取られるＲＯＣ曲線を示す。この曲線以下の領域は、５０％である（確率０．５）。
・曲線下面積（ＡＵＣ）は、分類性能の全体的評価としてしばしば使用され、および最も標準的な判別機能はこのＡＵＣ図を提供する。完全な分類の曲線下面積は１００％であり、有用性のない分類のＡＵＣは５０％付近（０．５）である。
・感度および特異性（は混同行列に由来し得る）。「感度および特性」というタイトルの第２（ｄ）（ｉｉｉ）節を参照のこと。
・マーカー相関行列。図４を参照のこと。
【０２５０】
ｉ．検出パネル：組成
これらのパネルは、２つのクラス（５つのがんのいずれかの患者およびがんを罹患していない患者）に分類したデータに注目している。全てのプローブが全患者に存在するわけではない。特定の分析用の１つまたは複数のプローブを欠く場合、これらの症例をデータからはずす。したがって、分析されるプローブ数が減少する場合のために、データ集合はわずかに多い症例数を含み得る。
【０２５１】
分析に含まれるプローブ数は２７である。多くの場合、偽プローブが付加されるにもかかわらず、このプローブのために入力したデータは０と１２との間の範囲で乱数を一様に生成する乱数生成子集合に由来する。この偽プローブを、プローブ選択プロセスを確実に完全にするために初期分析の多くに含ませた。この偽プローブをあるアプローチで使用して、分析由来のプローブを段階的に排除した。偽プローブよりも情報が乏しいプローブを容易に同定して選択プロセスから排除することができる。このようなプローブの初期排除は分析を迅速にし、これらのプローブによって得られた分析結果（ノイズ）によるばらつきを減少させる。
【０２５２】
ｉｉ．検出パネルの性能
この研究からのアウトプットとして、異なる方法によって選択したプローブの組み合わせおよび混同行列の関する性能評価、％エラー率、およびＡＵＣを報告する。
【０２５３】
ｉｉｉ．検出パネル−別の組成
検出パネルを、減少したプローブ集合からも選択した。あるパネル集合では、商業的に好ましいマーカーに加重したパネルの性能基準を得た。判別プローブの新規の組み合わせを見出すために分析から最良のプローブが得られた場合に得られる性能も分析した。それ自体に対して作用する単一のプローブの性能は、非常に高いことが見出された（プローブ７）。しかし、線形判別分析を使用して評価した以下の性能図（表１３）に示すように、より多くのマーカーが吹かされたので性能が改良された。プローブの最良の部分集合を、最良部分集合ロジスティック回帰を使用して決定した。改良は、統計的に有意である。
【０２５４】
【表１３】
2004526154.tif 000018
【０２５５】
（最良部分集合ロジテック回帰を使用して決定し、）ロジスティック回帰を使用して評価した最良および二番目に最良のプローブの部分集合を以下に示す。ＡＵＣ＝ＲＯＣ曲線下面積。平均ＡＵＣは、無作為な訓練および試験区分（７０％：３０％）に対する１００回の試験の平均であることに留意すべきである。結果を、以下の表１４に示す。
【０２５６】
【表１４】
2004526154.tif 000019
【０２５７】
ｉｖ．判別パネル−組成
この研究のために、５つの分類をデザインおよび試験し、それぞれ全がん患者由来の１つのがんの存在を検出するようにデザインされている。この５つの２つ一組の系の適用により、１回を超える分析で疾患の疑いあるかまたは全くないかがわかる。このような症例を同定し、より精密な検査に供し、再試験するか別の試験レジメに供することができる。
【０２５８】
さらに、本研究におけるプローブ数は２７であり、分析数を減少させるために初期段階で偽プローブを使用した。
【０２５９】
ｖ．判別パネル−性能
上記の性能の評価を使用して、異なる技術によって発見された最良のプローブの組み合わせの性能を示した。
【０２６０】
ｖｉ．判別パネル−別の組み合わせ
商業的に好ましいプローブを含むプローブの組み合わせについて分析を繰り返した。性能は低下したが、いくつかの集合が減少した分類に使用不可能ではなかった。以下のプローブ７を含まないプローブの最良の部分集合（最良の部分集合ロジスティック回帰を使用して決定）を、表１５に示す。線形判別分析を使用して、データを評価した。
【０２６１】
【表１５】
2004526154.tif 000020
【０２６２】
（最良部分集合ロジテック回帰を使用して決定し、）ロジスティック回帰を使用して評価した最良および二番目に最良のプローブ７の部分集合を以下に示す。ＡＵＣ＝ＲＯＣ曲線下面積。平均ＡＵＣは、無作為な訓練および試験区分（７０％：３０％）に対する１００回の試験の平均であることに留意すべきである。結果を、以下の表１６に示す。
【０２６３】
【表１６】
2004526154.tif 000021
【０２６４】
２．データ分析法
この節では、使用した異なる方法由来の結果の解釈のガイドとしてのデータ構造の最初の理解を得るプロセスを記載する。
【０２６５】
ａ．ばらつきの分析
ｉ．病理学者による変動性および病理学者のスコアのプール
（１）ｔ検定
本臨床試験において、各患者のスライドを２人の病理学者が調査した。病理学者１は全患者を調査し、病理学者２もまたこの集団の約半分を調査し、病理学者３は残りを調査した。２つの独立したＨスコアでの評価を使用して、病理学者の性能の一貫性を試験することができる。
【０２６６】
容易に利用可能な統計ツールを使用して、病理学者による変動性を試験した。これは、ペアードサンプルｔ検定である。この検定は、推定値の各対の差をとり、これらを平均し、これを全分散の比として示す。次いで、ｔ検定により、この比を確率に変換し、２つのサンプル集合が同一集団に由来する尤度を評価する（Ｐ値）。
【０２６７】
この検定を、病理学者１および病理学者２によって調査された全症例ならびに病理学者１および病理学者３によって調査された全症例について各マーカープローブのスコアに適用した。２７検定を適用したので（全プローブを網羅している）、「有意な閾値」として低い値（Ｐ＝０．０１）を選択した。各プローブおよび病理学者の２つの対についてのＰスコアを示す結果を、表１７、１８、１９、および２０に示す。病理学者１および病理学者２は、病理学者１および病理学者３よりも一貫していることが明らかである。
【０２６８】
【表１７】
2004526154.tif 000022
【０２６９】
【表１８】
2004526154.tif 000023
【０２７０】
【表１９】
2004526154.tif 000024
【０２７１】
【表２０】
2004526154.tif 000025
【０２７２】
Ｈスコアは主観的であるので、境界の場合に因数を差およびノイズとする傾向がある。従って、病理学者１と病理学者２との間で統計的にスコアが異なる３つの特徴が存在するにもかかわらず、この同時データは、計測器の典型として受け入れた。病理学者１および病理学者２は、分析プロセスのために１つのデータ集合に組み合わせた。病理学者３の結果は、独立した試験目的を控えた。病理学者３のデータを使用したこのような試験は先入観にとらわれており、有意差のために標準以下の性能を示す。
【０２７３】
病理学者１および病理学者２由来のデータを、これらのデータを個別の例として考慮することによって変動性と組み合わせて、任意の１つの例の結果との間の独立度を得た。このようなデータを試験する場合、性能の推定値はより楽観的な値に偏る。これは、同一の患者由来のサンプルが試験部分集団の訓練で同時に得ることができるためである。しかし、これにより特徴の最良の組み合わせを見出すために使用したプロセスを無効にされず、性能の推定値が偏っているにすぎない。
【０２７４】
（２）Ｈスコアの分散分析
（２）バックグラウンド
各プローブ内で、Ｈスコアは、多数の理由によって変化し得る。疾患型によって常に変化する範囲でこれは有用であり、病理学者がスライドを読むことによる変動は有益である一方で、無作為の変動により、以前の２つの変動元の検出を制限する。
【０２７５】
分散分析（ＡＮＯＶＡ）は、データ中の変動元を分割し、その統計的有意性を試験する標準的な技術である。ＡＮＯＶＡは、変動の特定の源または原因に寄与し得る項の合計としてデータ集合の全変動をまとめる。
【０２７６】
ＡＮＯＶＡは、多数の統計パッケージで利用可能である。公的なドメインパッケージ「Ｒ」を選択した（「統計計算のためのＲプロジェクト」、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．Ｒ−ｐｒｏｊｅｃｔ．ｏｒｇ／）。
【０２７７】
（ｂ）目的
病理学者１および２によるＨスコアデータに対してＡＮＯＶＡ分析を行い、さらなるパネル分析のためにこのデータを１つの一貫した集合に安全に融合することができるかどうかを判断するため。
【０２７８】
（ｃ）方法
データベースから、病理学者１および２によるデータを選択した。所与のプローブについて完全なデータのみを、このプローブについてＡＮＯＶＡで使用した。
【０２７９】
気腫、肉芽腫性疾患、および間質性肺疾患のコントロールカテゴリーを共にグループ化して「正常」と呼び、因子疾患内で６つのレベルを示す。
【０２８０】
病理学者を、２つのレベルを有する因子としてコード化した（病理学者１、病理学者２）。
【０２８１】
因数：Ｄｉｓｅａｓｅ、Ｐａｔｈｏｌｏｇｉｓｔ、および相互作用項Ｄｉｓｅａｓｅ：Ｐａｔｈｏｌｏｇｉｓｔを使用して、各プローブの標準的なＡＮＯＶＡ分析を行うためのＲスクリプトを作成する。結果を以下の表２１に示す。「Ｄｆ」は、自由度と定義する。ｎ観測のデータベースでは、平均からｎ−１偏差が求められ、ｎｔｈが自動的に決定される。ｎ−１は、自由度数である。合計Ｓｑおよび平均Ｓｑは、変動の基準である。ＦはＦ分布に基づいた２つの分散の質に関する検定統計量である。Ｐｒ（＞Ｆ）は、変動性が統計的に有利であるかどうかを決定するために使用される確率である。
【０２８２】
【表２１−Ａ】
2004526154.tif 000026
【０２８３】
【表２１−Ｂ】
2004526154.tif 000027
【０２８４】
【表２１−Ｃ】
2004526154.tif 000028
【０２８５】
【表２１−Ｄ】
2004526154.tif 000029
【０２８６】
【表２１−Ｅ】
2004526154.tif 000030
【０２８７】
【表２１−Ｆ】
2004526154.tif 000031
【０２８８】
【表２１−Ｇ】
2004526154.tif 000032
【０２８９】
（ｄ）分析結果
全症例（プローブ２１を除く）では、プローブの反応を疾患に関連していた。プローブはおそらくこの目的で選択されているので、これは驚くべきことではない。病理学者に関連するプローブが反応する症例は存在しない（ｐ＝０．０５レベルで）。これは、このデータの融合が安全であり、データに対する２つの基準として２人の病理学者を使用することを示す。
【０２９０】
いくつかの症例（プローブ７、１４、１７）で、有意性が上昇する相互作用項についていくつかの証拠が存在する。これは、いくつかの疾患のスコアリングで病理学者間で幾らか相違が存在し得ることを示す。これらの症例のいくつかは、おそらく偶然の外れ値であろう。
【０２９１】
（ｅ）結論
結果は、さらなる分析のためにこのデータを融合することは安全であることを示す。データは、いくつかの症例での病理学者と疾患との間のわずかな相互作用がランダムソースを寄与するようであることを示す。
【０２９２】
ｉｉ．患者による変動性
患者による変動性を、２（ａ）（ｉ）（２）節の患者による変動性によって測定した（上記の「Ｈスコアの分散分析」を参照のこと）。
【０２９３】
ｉｉｉ．マーカーによる変動性
コントロール対がんについての各プローブのマーカースコアの分布を示すヒストグラムをプロットした（ＰａｔｈｏｌｏｇｉｓｔＤａｔａ．ｘｌｓ、ワークシート：ヒストグラム）。
【０２９４】
ｂ．マーカー相関行列分析
母相関係数（「応用多変数統計分析」、Ｒ．Ａ．Ｊｏｈｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｄ．Ｗ．Ｗｉｃｈｅｒｎ、第２版、１９８８、Ｐｒｅｎｔｉｃｅ−Ｈａｌｌ、Ｎ．Ｊ．）は、確率変数対の間の一次関数的関連量を評価する。典型的には、確率変数の分布および関連するパラメータは未知であり、母相関係数を直接計算できない。この場合、標本データから標本相関係数を計算することが可能である。図４を参照のこと。しかし、標本相関係数は、唯一の母相関係数の推定値である。さらに、標本データに基づいて計算されるので、対応する確率変数間の関係が実際に存在し得ない場合に強い正相関および逆相関を示し得ることが全く偶然に可能である（「現代初歩統計学」、Ｊ．Ｅ．Ｆｒｅｕｎｄ、第６版、１９８４、Ｐｒｅｎｔｉｃｅ−Ｈａｌｌ、Ｎ．Ｊ．）。
【０２９５】
相関係数は、ある変数の他の変数を予想する能力を評価する。しかし、強力な一次関数的関連が因果関係を意味しない。相関関数の二乗は、決定係数と呼ばれる。二変数データ集合について計算した決定係数は、他の変数に対する一次関数的関係によって説明することができるある変数の変動率を評価する。いくつかの変数を扱う場合、各対について相関係数を計算することができ、その後係数集合を、相関行列と呼ばれる行列として記載することができる。図４を参照のこと。
【０２９６】
各マーカーのＨスコアを、確率変数としてモデリングすることができる。この多変量データ集合の標本相関行列を、上記の「入力データ」節に記載の入力データから計算することができる。
【０２９７】
ｃ．パターン認識
統計パターン認識は、定量的測定に基づいてシグナルまたは幾何学的オブジェクト（特徴と呼ばれる）を分類するアプローチである。統計パターン認識により、本質的に、ｎ次元の特徴空間を目的のカテゴリーまたはクラスに対応する領域に分類する問題を減少させる。
【０２９８】
本研究で使用した三次元分類法は、データ内の異なる構造形態に対して感度が高い。
【０２９９】
意思決定樹法のために、異なるデータの組み合わせの予備分析により、検出パネルのためにＣ４．５によって決して使用されないマーカーを同定した。これらを分析から除去し、これにより、選択プロセスに対するノイズのみに寄与する疎外プローブを示すより一貫した結果が得られる。
【０３００】
同様に、検出パネルで使用したプローブの予備分析により、詳細な分析前に除去されるノイズプローブを同定した。
【０３０１】
ＳＰＳＳにおける線形判別関数法は、分析におけるマーカー数を減少させるための組み込まれた段階的プロセスを有する。典型的には、これにより、分析で使用されるプローブが２個と７個との間に減少した。
【０３０２】
ＲおよびＳＡＳでのロジスティック回帰法は、変数選択のための段階的手順を実行する。ＳＡＳでは、最良の部分集合の変数選択オプションもまた提供する。Ｒでは、回数の基づく変数選択のための発見的方法を開発するために複数の無作為検定と組み合わせた段階的方法を使用し、１００個の訓練および検定データの無作為選択において所与の特徴を使用した（それぞれ分割７０％：３０％）。１００を超える特徴の最小一致集合が得られるまで、人為的無作為特徴の度数に匹敵する度数を含む特徴を漸増的に排除した。
【０３０３】
ｉ．統計学的方法
複数の統計学的分析の観点から、高次空間中の密度関数の評価（およびこの空間の目的の領域への分割）が問題である。無作為（特徴）ベクターの分布が既知であると仮定すると、分類エラーの確率を最小にするので、理論的に最良の分類はベイズの分類である（Ｋ．Ｆｕｋｕｎａｇａ、「統計的パターン認識」、第２版、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、１９９０、３頁）。不運なことに、特に特徴空間の次元が高い場合に複雑であるので、ベイズの分類の実行は困難である。実際、より単純な助変数分類を使用する。助変数分類は、基本的な密度または判別関数に関する仮定に基づく。最も一般的なこのような分類は、線形および二次分類である。多変量統計分析では、このような分類は判別分析に分類される。判別分析技術は、多変量線形回帰モデルおよび一般化線形モデル（ロジスティック回帰および多項回帰に含まれる）に密接に関連する。
【０３０４】
（１）二項反応を使用したロジスティック回帰
（ａ）バックグラウンド
検出パネルで使用されるマーカー集合選択における問題を、二項反応を使用したロジスティック回帰問題として説明することができる。反応変数は、以下の２つのレベルの因数である。正常（がんなし）および異常（がんあり）。説明変数は、マーカーＨスコアである。
【０３０５】
がん判別パネルで使用されるマーカー集合選択における問題を、二項反応を使用したロジスティック回帰問題として説明することができる。反応変数は、以下の２つのレベルの因数である。正常（目的のがんなし）および異常（目的のがんあり）。説明変数は、マーカーＨスコアである。
【０３０６】
段階的変数選択を使用して、２つのクラスの判別に使用するための元の変数（マーカー）の部分集団を選択することができる。これはコンピュータを使用した高価な動作試験であり、コンピュータに最良に適する。いくつかの市販および公的なドメインソフトウェアパッケージ（例えば、Ｒ、Ｓ−ｐｌｕｓ、およびＳＡＳ）は、段階的ロジスティック回帰を実行する。
【０３０７】
それぞれＲおよびＳＡＳで見出された段階的変数選択手順に基づいて、特徴選択に対する２つの異なるアプローチを調査した。
【０３０８】
（ｂ）実験データ
本発明の分析で使用したデータは、病理学者１および病理学者２によって試験され、本報告のいずれかに記載されている症例についてのマーカー１〜１７および１９〜２８のＨスコアからなる。さらに、ダミーマーカー１８をデータ集合に付加した。ダミーマーカーは、均一な分布から無作為に選択した０〜１２の整数からなる。
【０３０９】
（ｃ）方法１：Ｒパッケージ（バージョン１．４．１）の使用
コンピュータ制御のモデル適合手順は、一般に、失われたデータを取り扱うことができない。これは、Ｒで使用されるｇｌｍ（一般化線形モデルのためのｇｌｍスタンド）の場合である。したがって、ｇｌｍを使用してモデルを適合させた場合、１つまたは複数の失われた値が存在する全ての症例を排除する必要がある。初期の完全モデルを適合する場合、２７個の真のマーカーおよび１つのダミーマーカーを含み、これによりデータ集合は２０２症例に減少する。観測値があまりにも少ないので、変数選択を行い、選択した変数を使用して分類を訓練し、その性能を評価するための最良の方法は、データの訓練集団および検定集団への無作為分割に対して１００回検定を行うことであることを決定した。
【０３１０】
（ｉ）データの訓練集団および検定集団への分割
各検定の開始時に、データを検定集団および訓練集団に分割する。検定集団を形成するために３０％の異常および３０％の正常を無作為に選択し、訓練集合を形成するために残りの観測値を使用することによってこれを行う。
【０３１１】
（ｉｉ）変数（マーカー）選択
各検定の開始時に、全変数（マーカー）を含む完全モデルを、訓練データに適合させる。Ｒでは、ｇｌｍを使用してロジスティック回帰モデルを適合する。使用したコードフラグメントを以下に示す。
【０３１２】
ｍｙ．ｍｏｄｅｌ＜−Ｃｌａｓｓ〜Ｘ１＋Ｘ２＋Ｘ２＋Ｘ３＋Ｘ４＋Ｘ５＋Ｘ６＋Ｘ７＋Ｘ８＋Ｘ９＋Ｘ１０＋Ｘ１１＋Ｘ１２＋Ｘ１３＋Ｘ１４＋Ｘ１５＋Ｘ１６＋Ｘ１７＋Ｘ１８＋Ｘ１９＋Ｘ２０＋Ｘ２１＋Ｘ２２＋Ｘ２３＋Ｘ２４＋Ｘ２５＋Ｘ２６＋Ｘ２７＋Ｘ２８
【０３１３】
ｍｙ．ｇｌｍ＜−（ｍｙ．ｍｏｄｅｌ、ｆａｍｉｌｙ＝ｂｉｎｏｍｉａｌ（ｌｉｎｋ＝ｌｏｇｉｔ）、ｄａｔａ＝ｔｒａｉｎｉｎｇ．ｄａｔａ）
【０３１４】
次いで、手順ｓｔｅｐＡＩＣを使用して、赤池情報量基準（ＡＩＣ）に基づいた段階的変数選択を行う。この手順は、公的に利用可能なＭＡＳＳライブラリーの一部である。このライブラリーおよび手順は、「Ｓ−ＰＬＵＳを使用した現代応用統計学」（Ｗ．Ｎ．Ｖｅｎａｂｌｅｓ  ａｎｄ  Ｂ．Ｄ．Ｒｉｐｌｅｙ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｐａｔｈｏｌｏｇｉｓｔ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９９）に記載されている。これを行うためのＲコードフラグメントを以下に示す。
【０３１５】
ｍｙ．ｓｔｅｐ＜−ｓｔｅｐＡＩＣ（ｍｙ．ｇｌｍ、ｄｉｒｅｃｔｉｏｎ＝ｂｏｔｈ）
【０３１６】
次いで、得られたモデルを、検定データに関して評価した。使用したコードフラグメントを以下に示す。
【０３１７】
ｐｒｏｂａｂｉｌｉｔｙ＿ｉｓ＿ａｂｎｏｒｍａｌ＜−
ｐｒｅｄｉｃｔ（ｍｙ．ｓｔｅｐ，ｔｅｓｔｉｎｇ．ｄａｔａ，ｔｙｐｅ＝＊ｒｅｓｐｏｎｓｅ＊）
【０３１８】
分類の性能を、誤分類の実際のエラー率（ＡＥＲ）およびＲＯＣ曲線下領域（ＡＵＣ）に関して記録する。１００回の検定後、１００個のモデルおよびその関連するＡＥＲおよびＡＵＣが残存する。度数分布表を構築し、１００個のモデルの外観を作製した各変数の回数を記録する。例を、表２２に示す。
【０３１９】
【表２２】
2004526154.tif 000033
【０３２０】
この表を使用して、マーカーを破棄するかどうかを決定する。第１に、１０以下の頻度の全マーカーを破棄する。次に、ダミーマーカーの頻度に基づいてカットオフ頻度を選択する（典型的には、これはダミーマーカーの１または１．５倍）。このカットオフ値未満の頻度の全マーカーを破棄する。次いで、ダミーマーカーを含む残りのマーカーを、別の１００回の検定の完全モデルとして使用し、削除プロセスを繰り返す。必要ならば、モデルから１つまたは複数のマーカーを排除するために、削除の厳格さを増加させることができる。必要ならば、残りのマーカーをさらに別の１００回の検定の完全モデルとして使用することができる。所望のパネルメンバー数に達した場合または現在のモデルの平均ＡＵＣ前のモデルの平均ＡＵＣよりも低い場合に、排除をやめる。
【０３２１】
排除プロセスを例示するために、上記の表を考慮する。検出パネルデータを使用して、表を得た。影をつけた入力は、排除後に保持されたマーカーを示す。以下の完全モデルを使用して、別の１００回の検定を行った。
【０３２２】
ｍｙ．ｍｏｄｅｌ＜−Ｃｌａｓｓ〜Ｘ６＋Ｘ７＋Ｘ８＋Ｘ１２＋Ｘ１６＋Ｘ１８＋Ｘ２３＋Ｘ２５
【０３２３】
また、度数分布表（表２３）を構築する。
【０３２４】
【表２３】
2004526154.tif 000034
【０３２５】
影をつけた入力は、排除後に保持されたマーカーを示す（４７のカットオフを使用）。以下の完全モデルを使用して、別の１００回の検定を行った。
【０３２６】
ｍｙ．ｍｏｄｅｌ＜−Ｃｌａｓｓ〜Ｘ６＋Ｘ７＋Ｘ８＋Ｘ１２＋Ｘ１８＋Ｘ２３＋Ｘ２５
【０３２７】
また、度数分布表（表２４）を構築する。
【０３２８】
【表２４】
2004526154.tif 000035
【０３２９】
この点では、５０のカットオフを選択する。影をつけたエントリーは、５メンバーパネル用の残りのマーカーを示す。各ステップでは、平均ＡＵＣは以下のように増加する。９４．３７％→９５．４５％→９５．７８％。
【０３３０】
（ｉｉｉ）パネル性能の評価
パネル性能を評価するために、前述と同様であるが、段階的選択手順を使用しないで１００回の検定を行った。各検定では、ＡＵＣ、感度、および特異性を記録する。上記の検出パネルの例について、結果を以下に示す。
【０３３１】
【数１】
2004526154.tif 000036
【０３３２】
まとめると、パネルの感度は９７．３７％であり、特異性は９７．４９％である。ＲＯＣ下領域は９６．０１％である。
【０３３３】
（ｄ）方法２：ＳＡＳ（バージョン８．２）の使用
手順ＬＯＧＩＳＴＩＣを使用して、ＳＡＳにおけるロジスティック回帰を行うことができる。反応変数が二段因数である場合、下旬はバイナリロジットモデル（ｆａｍｉｌｙ＝ｂｉｎｏｍｉａｌ  ａｎｄ  ｌｉｎｋ＝ｌｏｇｉｔを有するＲにおけるｇｌｍに等価）に適合する。ＳＡＳは、特定されたモデルの全ての失われた多変量観測値を自動的に排除する。Ｒと異なり、ＳＡＳは、最良の部分集合変数選択手順を行うことができる。これを行うために必要なＳＡＳ中のコードフラグメントを以下に示す。
【０３３４】
【数２】
2004526154.tif 000037
【０３３５】
この手順を、全データ集合に適用する。パラメータＢＥＳＴ＝２８は、ＳＡＳに最良の２８個の１変数モデル、最良の２８個の２変数モデル、最良の２８個の３変数モデル、最良の２８個の２８変数モデルまでを見出すように命令する。
【０３３６】
（ｉ）パネル性能の評価
方法１に記載の手順を使用して、各パネルの性能を評価する。検出パネルデータから以下の表２５を作成した。個の表は、２つの最良の１、２、３、４、および５マーカーパネルの結果のみを列挙している。
【０３３７】
【表２５】
2004526154.tif 000038
【０３３８】
（２）線形判別分析
（ａ）バックグラウンド
市販の統計パッケージＳＰＳＳは、単純の線形判別関数でデザインおよび検定を行う手順を有する。
【０３３９】
一般的に使用される方法は、フィッシャーの線形判別関数である。これにより、良好にクラスを分離する特徴空間中の超平面が見出される。クラス分布が異なる手段を有するが多変量ガウス分布に類似しているという２つのクラスの問題のために、この分類により至適な性能が得られる。この方法を多クラス問題に発見的に拡大することができるが、本研究ではこれを適用しなかった。
【０３４０】
本方法は、そのアプローチが単純であるが、多数の特徴を含むデータ集合に関連する問題に対して強い（約２００個の例（症例）のみを含むデータ集合で問題を生じる本発明者らの症例数２７中のプローブ）。
【０３４１】
このパッケージは、判別プロセスに十分に起用する特徴の同定手順を有する。この「段階的方法」により、判別特徴のほとんどが最初に見出される。他の特徴を連続的に付加し、分類に対して評価する。組み合わせを調査し、それによりより良い組み合わせが見出された場合に最初に選択される特徴を最終的に排除することができる。統計検定により残りの特徴が分類プロセスに確実に起用しないことが示されるまで、特徴数を漸増させる。
【０３４２】
ｌｅａｖｅ−ｏｎｅ−ｏｕｔ法の使用により、性能を評価する。これにより、データ集合から１サンプルを取り出し、訓練集合を形成する。残りのサンプルを、検定集合として保持し、分類に適用し、得られた分類を混同行列で累算する。データ中の症例についてこの手順を繰り返す。この手順により性能が公平に評価されるが、評価は高度に分散している。
【０３４３】
方法
ＳＰＳＳは分析のために適切なデータ集合を選択し、「Ａｎａｌｙｚｅ」を選択し、「Ｃｌａｓｓｉｆｙ」を選択し、「Ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｎｔ．．．」を選択し、表上で「Ｆｉｓｈｅｒｓ  ｍｅｔｈｏｄ」、「ｌｅａｖｅ  ｏｎｅ  ｏｕｔ  ｔｅｓｔｉｎｇ」および「ｕｓｅ  ｓｔｅｐｗｉｓｅ  ｍｅｔｈｏｄ」を選択する。診断を「ｇｒｏｕｐｉｎｇ  ｖａｒｉａｂｌｅ」として入力し、全特徴を「ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ」として入力する。分析を完了するために「ＯＫ」を入力する。他のパラメータのための事前にセットした値を、集合として残した。
【０３４４】
分析出力は、分析で使用した特徴、正準判別関数、混同行列、および正確な分類率（エラー率約１）のリストを示す。
【０３４５】
ＲＯＣ曲線を計算するために、正準判別関数を選択した特徴に適用して新規の特徴を得る。ＳＰＳＳでは、ＲＯＣ曲線をプロットするためにグラフを使用する。
【０３４６】
ｉｉ．階層的方法：意思決定樹
（１）背景
意思決定樹の学習は、帰納的推論のための最も広く使用されている実践的方法の１つである。これは、ノイズデータに強く、離接的発現を学習することができる分類法である（Ｔｏｍ  Ｍ．Ｍｉｔｃｈｅｌｌ、「機械学習」、ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ＮＹ、１９９７）。
【０３４７】
最も一般的で利用しやすい機械学習パッケージは、「Ｃ４．５」であり、そのソースコードが（Ｊ．Ｒｏｓｓ  Ｑｕｉｎｌａｎ、「Ｃ４．５：機械学習プログラム、」Ｍｏｒｇａｎ  Ｋａｕｆｍａｎ、Ｓａｎ  Ｍａｔｅｏ  ＣＡ、１９９３）で公開されている。
【０３４８】
意思決定樹が訓練されている場合（訓練データ）、１つのデータが、最良に決定するためにこの節点で使用されるようにデータに帰する決定樹の各節点でアルゴリズムを決定する。したがって、この樹が完全に構築された場合、他を使用および無視するように帰するいくつかの集合が選択される。本発明者らの出願では、分子プローブから得た基準を処理するための意思決定樹を使用して、意思決定樹は、プローブパネルおよびデータ分類を最良に説明するプローブスコアの組み合わせ方法を有効に選択した。パネル性能を公平に評価するために、得られた意思決定樹により、訓練で使用されていないデータが評価されるはずである。これを行うための１つの標準的な技術は、相互検証である。１０倍の相互検証を使用した。
【０３４９】
相互検証は、限られたデータを最良に使用する技術である。１０倍の相互検証では、データを１０個のほぼ等しいサイズの区画に分割し、各区画にわたりクラス中のほぼ同数の症例を含むように配慮する。次いで、意思決定樹を区画１に組み合わせて検定した区画２〜９に対して訓練し、区画２に組み合わせて検定した区画１、３〜９に対して訓練し、データによる保持試験集合を循環させて１０の試験を一度に行う。この様式では、保持データに関してのみ試験が行われるので公平であり、全データが１回で正確に検定されるので、全データ集合にわたるエラー率の総計を計算することができる。
【０３５０】
通常、意思決定樹は、訓練データが非常に良好に適合するまで構築され、その後「ノイズ」の枝葉の除去により決定樹から「削除する」。これにより、意思決定樹の未知のデータを作成する能力が改良され、決定樹が良好な性能を得るために不可欠となる。Ｃ４．５パッケージは、２つの意思決定樹の削除方法（第１の標準的な意思決定樹削除アルゴリズムおよび第２の基準抽出アルゴリズム）を含む。一般に、意思決定樹ベースの方法により、このデータに対するより優れた結果が得られる。したがって、基準ベースの方法を報告しない。
【０３５１】
（２）データの作成
いずれかに記載のように、正常組織および５つの異なるがん（腺がん、大細胞がん、中皮腫、小細胞がん、および扁平上皮がん）に対する種々のプローブの反応に対するデータを得た。プローブ１〜２８のＨスコアならびに病理学者（病理学者１および病理学者２）をデータベースから抽出し、フラットデータファイルに入力した。意思決定樹のために、染色に対する疾患の効果が個別に認められるように各データポイント（同一の物理スライドに対して２つの病理学者による）を得た。これにより分類の性能がわずかに陽性に偏り得るが、パネル選択に影響を及ぼさないはずである。
・気腫、肉芽腫性疾患、および間質性肺疾患のコントロールカテゴリーをともにグループ化し、「正常」と呼んだ。
・パネル検出のために、がんを共にグループ化し、「異常」と呼び、これにより２クラス問題が生じた。
・１つの判別パネルのために、５クラス問題を得るために正常な症例をデータから除去した。
・保持判別パネルのために、各がんを保持し、その後残りのがんを「他」にグループ化し、５つの２クラス問題の集合を得た。
【０３５２】
Ｃ４．５には、データを説明し、分析に含まれる「名前」ファイルが必要である。判別パネルの名前ファイルの例を表２６に示す。
【０３５３】
【表２６】
2004526154.tif 000039
【０３５４】
プローブ１８はデータから失われており、全デザインで「無視」と設定した。設定により、名前ファイル中の「無視」という設定は、プローブのパネルからの簡単且つ有効なトリミング方法であり、データ分析で使用する。
【０３５５】
（３）データ分析
Ｃ４．５で供給されている「ｘｖａｌ．ｓｈ」スクリプトを使用して、各データ集合に１０倍相互検証を行った。パッケージに対する基準（デフォルト）パラメータを使用する。相互検証は、小さなデータ集合を訓練および検定する分類法のために開発された技術である。これには、データをＮ同等サイズの区画に無作為に分割するステップを含む。次いで、分類を、Ｎ−１区画に対して訓練し、残りの区画に対して検定する。これをＮ回繰り返す。
【０３５６】
１つの相互検証（ＣＶ）検定で訓練した意思決定樹は、別（選択されたプローブおよび樹の係数の両方が異なる）で得られた決定樹と異なり得るので、各プローブを１０検定中の樹によって選択した回数を計算した。
【０３５７】
排除した樹中で１０回のＣＶ検定中５回またはそれ以上起こらない任意のプローブを「無視」と設定することにより第１のプローブ選択を行った。
次いで、この小さな候補プローブ集合を使用した相互検証を繰り返した。排除した樹中で１０回のＣＶ検定中５回またはそれ以上起こらない任意のプローブを「無視」と設定することにより第２のプローブ選択を行った。任意のさらなるプローブが脱落した場合、第３のＣＶ検定を行った。
【０３５８】
種々の検定によってパネルを選択し、エラー性能の評価を、結果表に示す。意思決定樹分析についてのパネル性能を、以下の表２７に示す。
【０３５９】
【表２７】
2004526154.tif 000040
【０３６０】
小細胞肺がんと残りの４つのがん型を判別するための意思決定樹構造の例を、以下の表２８および２９に示す。
【０３６１】
Ｃ４．５アウトップフォーマット
【表２８】
2004526154.tif 000041
【０３６２】
【表２９】
2004526154.tif 000042
【０３６３】
段階的線形判別についてのパネル性能を、以下の表３０に示す。
【０３６４】
【表３０】
2004526154.tif 000043
【０３６５】
段階的線形判別についてのパネル性能を、以下の表３１に示す。
【０３６６】
【表３１】
2004526154.tif 000044
【０３６７】
ｉｉｉ．神経回路網および別法
人工神経回路網（ＡＮＮ）は、本発明と組み合わせて特徴の選択および分類のデザインに容易に適用することができる候補パターン認識技術である。しかし、このような技術は、データ構造の洞察およびＬＤＦが与える方法で特定のプローブへの影響がほとんどない。この理由のために、このアルゴリズムのクラスを本研究では使用しなかった。ＬＤＦは、線形判別関数（その結果が分類を決定するための閾値である特徴の線形組み合わせ）を困難にする。
【０３６８】
この技術クラスには、多層パーセプトロン（ＭＬＰ）、Ｂａｃｋ−Ｐｒｏｐ、Ｋｏｈｏｎｅｎの自己組織化マップ、学習ベクトル量子化、Ｋ最近隣法、および遺伝的アルゴリズムが含まれる。
【０３６９】
ｉｖ．特集
（１）仮説
・線形判別分析
・２つのクラスについての共分散行列は等しいと仮定する。
・２つのクラスが多変量正規分布である場合のみ、誤分類コストを最小にする。
・説明変数が絶対的というよりもむしろ連続的であると仮定する（本研究では、Ｈスコアは絶対的であり、実際には（すなわち、自動化系では）、強度を連続的スケールで測定することができる）。
・ロジスティック回帰（２項式一般化線形モデル）
Ｖｅｎｅｒａｂｌｅｓ  ａｎｄ  Ｒｉｐｌｅｙ、第７章、（「Ｓ−ＰＬＵＳを使用した現代応用統計学」（Ｗ．Ｎ．Ｖｅｎａｂｌｅｓ  ａｎｄ  Ｂ．Ｄ．Ｒｉｐｌｅｙ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９９））を参照のこと。
【０３７０】
（２）マーカーの拒絶（除外）
判別分析および回帰手順のコンピュータ制御の実行には、段階的変数選択手順（例えば、ＲのｓｔｅｐＡＩＣ）が含まれる。これらの手順を、説明変数として使用するための変数の最良の部分集合を選択するようにデザインする。実際、これらの手順の段階的性質により、予想のために最良の変数が選択される保証はない（Ｊｏｈｎ  ａｎｄ  Ｗｉｃｈｅｒｎ、２９９頁）。にもかかわらず、このような手順は、マーカー選択および除外の基本となる。
【０３７１】
（３）ペアワイズ検定
多クラス分類のデザインにおける固有の問題は、「応用多変数統計分析」、Ｒ．Ａ．Ｊｏｈｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｄ．Ｗ．Ｗｉｃｈｅｒｎ、第２版、１９８８、Ｐｒｅｎｔｉｃｅ−Ｈａｌｌ、Ｎ．Ｊ．で考察されている。これは、いくつかの個別の２クラス分類（判別パネル）が開発される動機が存在する。
【０３７２】
（４）パネル比較における冗長性の考慮
「線形モデルは古典的統計の中心をなし、依然として統計実務の大部分の基礎である。」「Ｓ−ＰＬＵＳを使用した現代応用統計学」（Ｗ．Ｎ．Ｖｅｎａｂｌｅｓ  ａｎｄ  Ｂ．Ｄ．Ｒｉｐｌｅｙ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９９）。線形モデルは、ｔ検定、分散分析（ＡＮＯＶＡ）、回帰分析、および判別分析を含む種々の多変量法の基礎である。説明変数は、一次項としてモデルに入れても入れなくても良い。これもまた、真の（非線形）ロジスティック回帰である。ロジスティック回帰モデルは、単純に線形回帰モデルの非線形変換であり、従属変数を、ログオッズ比（ロジット）に置換される。まとめると、これらの統計学的方法は、説明変数間の一次の関係に基づく。したがって、パネルにおける冗長性を追求するための１つの手段は、高い相関変数（マーカー）を同定することである。類似の性能を達成するために、パネル中のあるマーカーを他のマーカーに置換することも可能であり得る。
【０３７３】
パネルにおける冗長性を追求するための別の手段は、「最良の部分集合」の回帰分析を行うことである。目的の全説明変数を有する開始モデルが存在する場合、目的は、最良の１変数回帰モデル、最良の２変数回帰モデルなどを見出すことである。この方法を、ＳＡＳ統計学的パッケージで行った。
【０３７４】
（５）加重スコアの使用
（ａ）商業的および臨床的考慮
ストラテジーおよび商業的要因、費用、利用可能性、使いやすさを含む多くの理由のために、パネル中の一定のプローブの選択を促進して他の選択にペナルティーを科し、同時にパネルサイズおよび性能に対してこれを交換することが好ましい。
【０３７５】
（ｂ）属性負担
背景知識の組み込み（Ｍ．Ｎｕｎｅｚ、「背景知識の使用」、Ｍａｃｈｉｎｅ  Ｌｅａｒｎｉｎｇ、６、２３１〜２５０、１９９１）およびロボットセンサーからの情報獲得のための費用の相違（Ｍ．Ｔａｎ，、「ロボットにおける分類知識およびその適用の費用重視の学習」、Ｍａｃｈｉｎｅ  Ｌｅａｒｎｉｎｇ、１３、７〜３３、１９９３）などの他の文脈中の機械学習文献でこのような属性加重法（意思決定樹における）が提案されている。
【０３７６】
文献中で「Ｃ４．５」（Ｊ．Ｒｏｓｓ  Ｑｕｉｎｌａｎ、「Ｃ４．５：機械学習プログラム」、Ｍｏｒｇａｎ  Ｋａｕｆｍａｎｎ、ＣＡ、１９９３）として公知の標準的な機械学習ソフトウェアパッケージのマイナーチェンジによってこれらの費用重視のアルゴリズムが実行されている。便利には、このアプローチの後に、Ｎｕｎｅｚの「ＥＧ２」アルゴリズムを実施した。
【０３７７】
Ｃ４．５意思決定樹構築段階では、アルゴリズムは、それぞれ利用可能な分割属性を比較し、情報収集を最大する１つの分割属性Ｇｉを選択する。ＥＧ２アルゴリズムでは、属性ｉ（Ｃｉ）の情報費用を組み込んだ（２Gi−１）／（Ｇｉ＋１）を最大にする。加重ベクトルは、ユーザーによって推測的に設定される必要がある。
【０３７８】
（ｉ）コード修正
Ｃ４．５ソースコードを、Ｍ．Ｎｕｎｅｚ（背景知識の使用、Ｍａｃｈｉｎｅ  Ｌｅａｒｎｉｎｇ、６、２３１〜２５０、１９９１）によって提案された経済的な生成子「ＥＧ２」アルゴリズムを実行する容易修正した。
【０３７９】
Ｃ４．５パッケージの正確な修正を、以下に示す。
以下のファイル「Ｒ８／Ｓｒｃ／ｃｏｎｔｉｎ．ｃ」（Ｊ．Ｒｏｓｓ  Ｑｕｉｎｌａｎ、「機械学習用Ｃ４．５プログラム」、Ｍｏｒｇａｎ  Ｋａｕｆｍａｎｎ、ＣＡ、１９９３）中のラインの後に、
【数３】
2004526154.tif 000045
以下の新規のライン
【数４】
2004526154.tif 000046
を挿入する。ユーザーによって維持されている次のファイル由来の費用属性のベクターを以前に読み出していた。
【０３８０】
（ｉｉ）実験方法
商業的に好ましいプローブを以下に示す：２、４、５、６、８、１０、１１、１２、１６、１９，２０、２２、２３、２８。
【０３８１】
例示の目的で、費用により上記プローブが商業的に好ましいと仮定すると、この費用を考慮して検出パネルを再選択することが望ましい。
【０３８２】
修正Ｃ４．５意思決定樹ソフトウェアを使用して、商業的に好ましいプローブにペナルティー０を与え、商業的に好ましくないプローブにペナルティー２を与えた。修正Ｃ４．５アルゴリズムを使用して、１０倍相互検証パネル選択法（いずれかに記載）を行った。
【０３８３】
（ｉｉｉ）結果
標準的な意思決定樹検出パネルは、プローブ３、７、１９、２５、２８からなる。得られたパネルメンバーは、２、６、７、１０、１９、２５、２８であり、商業的に好ましい２つのプローブＰ７およびＰ２５のみを使用する。このデータについてのより優れた性能のために費用が上昇したにもかかわらず、これらのプローブを本方法で選択したことに留意のこと。パネルは、現在より大きくない、最初の５プローブに対して７プローブである。このデータに対するパネル性能において証明可能な低下は存在しないが、性能はプローブ費用の低下に対する代替物として現在最適には及ばない。
【０３８４】
（ｉｖ）結論
パネル選択方法へのプローブの使用費用の組み込みのための簡単な方法を確立した。
（ｃ）誤分類費用
（ｉ）バックグラウンド
多くの理由のために、異なる種類の分類エラーにかかる費用は変化し得ることを留意して至適パネルを選択することが望ましい。例えば、ある疾患（例えば、大細胞がん）に対する感度が増加したパネルを選択することが望ましく、混同行列中のいずれかでの特異性および感度の減少に対してこれを交換することが望ましい。
【０３８５】
理論的には、全ての可能な費用の組み合わせを組み込むために（混同行列と同一の次元の）誤分類費用行列が必要であり得る。実際に、不一致の費用（デフォルト）を入力する。
【０３８６】
市販の意思決定樹ソフトウェアＳｅｅ５（ＲｕｌｅＱｕｅｓｔ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐｔｙ  Ｌｔｄ，３０  Ａｔｈｅｎａ  Ａｖｅｎｕｅ，Ｓｔ  Ｉｖｅｓ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｉｓｔ  ３ＳＷ  ２０７５，Ａｕｓｔｒａｌｉａを参照のこと。（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｒｕｌｅｑｕｅｓｔ．ｃｏｍ）は、この可能性が組み込まれており、以下の証明で使用した。
【０３８７】
（ｉｉ）目的
標準的な同時判別パネル（いずれかに記載）は、以下のメンバーからなる。Ｐ２、３、４、５、１２、１４、１６、１９、２２、２３、２８。以下に評価した混同行列を示す。
【０３８８】
【表３２】
2004526154.tif 000047
【０３８９】
大細胞がんの感度は、２６％と低かった。新規にデザインしたパネルでこの感度を増大させたい場合、以下の方法を使用することができる。
【０３９０】
（ｉｉｉ）方法
以下の費用ファイルは作成した。
【０３９１】
【表３３】
2004526154.tif 000048
【０３９２】
このファイルは、因子１０によって他の任意のがんとして大細胞がんの判別を加重する。これは、このクラスの検出感度を増大させる傾向があるが（性能はいくらか低下する）、完全な分類を確実に加重することができない。
【０３９３】
標準的な意思決定樹パネル選択方法を適用した（Ｃ４．５の代わりにＳｅｅ５を使用）。
【０３９４】
（ｉｖ）結果
新規のパネルメンバーを以下に示す。Ｐ２、３、４、５、６、９、１２、１４、１６、１７、２５、２８。以下のように性能を評価した。
【０３９５】
【表３４】
2004526154.tif 000049
【０３９６】
上記は、大細胞がんの評価された感度は本発明により４８％に増加したことを示す。
【０３９７】
（ｖ）結論
誤分類による異なる費用をパネル選択方法に組み込むために簡単な方法を示した。
【０３９８】
ｄ．性能行列
各方法の性能を評価を示す分析によって得られた出力には以下が含まれる。
【０３９９】
ｉ．ＲＯＣ分析
受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線は、分類中の異なる閾値レベルについての偽陽性スコアおよび偽陰性スコアの比率（または単位確率あたり）の評価を示す。無作為選択よりも良好に判別することができない無関係の分類は、真および偽が等しく読み取られるＲＯＣ曲線を示す。この曲線以下の領域は、５０％である（確率０．５）。
【０４００】
曲線下面積（ＡＵＣ）は、分類性能の全体的評価としてしばしば使用され、最も商業的な判別関数パッケージはこの数字を計算する。完全な分類の曲線下面積は１００％であり、有用性のない分類のＡＵＣは５０％付近（０．５）である。
【０４０１】
ｉｉ．混同行列：数および比率
混同行列は、どのようにして試験集合由来のデータを分類するのかを示す。ペアワイズ検定のために、これらは真の陽性スコア、偽陽性スコア、真の陰性スコア、または偽の陰性スコアである。これらを、実数および比率で示すことができる。１つのパネルのみで固有の診断を行うことを意図する多重パネルのために、混同行列は、それぞれ正確な分類の数値を示す。例えば、小細胞がんが小細胞がんとして検出される度に、行列に斜線を１本入力する。不正確なスコア；例えば、小細胞がんが扁平上皮がんと何回同定されたかを行列の適切な非対角要素に入力する。エラー率を使用して、全偽分類の合計を全分類数で割ったものとして（％で示す）混同行列にデータをまとめる。
【０４０２】
ｉｉｉ．感度および特異性
特異性は、任意の定義が無効な症例を排除する範囲をいう。特異性が低いと定義される場合、偽陽性である可能性が高い。これは、本当に障害が存在しない場合に障害を有する個体を標識することを意味する。感度は、任意の定義が有効な症例を含む範囲をいう。感度が低いと定義される場合、偽陰性の可能性が高い（障害が存在する個体が障害を有さないと誤って診断される個体）。
【０４０３】
３．データ分析および結果
ａ．サンプルサイズおよび変動性
・病理学者１および病理学者２のデータ集合を組み合わせた３５４症例のうち、２０２症例のみが各マーカーについＨスコアを有していた（変数または特徴）。
・少数の完全な観測値および多数の変数により問題が評価される（次元の過程）。したがって、分類の確率で使用した変数の数を排除する必要がある。
・少数の観測値のために、個別の訓練集合および検定集合にデータを分割するのは賢明ではない（分類性能の確実な評価に必要）。この理由のために、最サンプリング法（相互検証および多重無作為検定）を使用する必要があった。
・各がん型の観測値が非常に少数であるので、がん判別のための多クラス分類のデザインは困難である。
【０４０４】
ｂ．除外マーカー
上記の方法を使用してマーカーを除外した。除外したマーカーは、パネル中で非選択と示される。
【０４０５】
ｃ．検出パネルの組成
ｉ．選択マーカープローブ
３つ全ての方法のための選択マーカープローブを図５にまとめる。
【０４０６】
ｉｉ．最小選択マーカー集合
パネル検出のために、プローブ７は１つのマーカーについて最良の検出性能を送達することが明らかである。より多数のプローブを使用して信頼できるパネルを得ることができるかどうかを調査するためにプローブの組み合わせを分析した。
【０４０７】
（１）方法
ロジスティック回帰法により、性能基準（フィッシャーのスコア）に関してサブセットを最良に分類することが可能である。この分析を使用して、１〜５個のプローブの組み合わせを選択した。フィッシャーの線形判別関数およびロジットモデル（ロジスティック回帰）を使用して、これらの組み合わせの性能を示した。データを上に示す。
【０４０８】
（２）結論
プローブ７は、それ自体が分類として十分に機能するが、プローブ７を使用の決定は、プローブ７の偽陰性スコアが高いことである。分類としてフィッシャーの線形判別関数を使用して最良の性能を示すものは、プローブ７および１６であった。他の組み合わせを使用してパネル間の結果が変動することにより、より多数の特徴を付加されたノイズが分類スコアを改良する重要な任意の可能性を示すことが示唆される。不正確に記録された少数のサンプルは、これらのより稀な事象の統計が十分にとれていないことを示す。多数の症例を使用してデザインした分類により、分類がより良好にデザイン可能である。異なる分類を使用したプローブの最良の組み合わせを選択する技術により、データ構造に依存して異なる最良のパネルを作製することができる。
【０４０９】
ｉｉｉ．補足マーカー
異なるプローブの利用可能性に適合するようにパネルをデザインすることができることを示す。これらの部分集団の選択に以下の異なる方法を使用することができる。意思決定樹、ロジスティック回帰、および線形判別関数。データは上に示している。
【０４１０】
方法
ＳＰＳＳを使用して、フィッシャーの線形判別関数を、制限するために制限を適用したパネルから得たスコアに適用した。例えば、全てのプローブは１つの業者に由来する。また、特徴の最良の組み合わせを見出すために、段階的選択を選択した。Ｌｅａｖｅ−Ｏｎｅ−Ｏｕｔ相互検証検定を使用して性能を評価した。
【０４１１】
ｉｖ．別のマーカー：生体作用機構（機能的に等価なマーカー）
当業者は、機能的に等価なマーカーを決定することができる。パネルで使用したマーカーの機能的挙動を、本明細書を通して記載する。
【０４１２】
ｖ．マーカーの局在化
本研究で使用した種々のマーカーの局在化を、本明細書中のいずれかに記載する。
【０４１３】
ｖｉ．パネル性能
３つの方法の性能を上に示す。
【０４１４】
ｖｉｉ．パネル性能の解釈の制限
・データ集合が小さく、再サンプリング法を使用する必要があるので、分類を過剰に訓練することは危険である（データが密接に適合しすぎる）。
・喀痰細胞診サンプルが組織学的確証研究で分析された細胞の代表である適当な数の細胞が含まれるかどうかは明らかではないので、細胞学的標本を使用したパネル性能は正確な予測が困難である。それにもかかわらず、適切な細胞サンプルサイズを有する場合、至適化パネルは細胞学的標本と同様の挙動することが予想される。
【０４１５】
ｄ．判別パネルの組成
ｉ．全がん用の１つの５ウェイパネル
３つの分析技術のうち、意思決定樹のみが１つの５ウェイパネルに影響を受ける。したがって、全肺がん型を同時に分類するための１つの意思決定樹を構築した。パネルメンバーを、図５に示す。パネル性能を上記のパネル性能表に示す。
【０４１６】
ｉｉ．他の全がん型に対して１つの肺がん型を判別するためのパネル
線形判別関数は、同時多クラス判別の実施には十分に適合しない。プールした全がん集合から１つのがんを個別に判別するようにそれぞれデザインされた５つの個別の分類の性能を分析した。このような組み合わせは、１つの候補がんを含む症例を区別する可能性はないが、２つまたは複数の候補がんを含む１つの症例を分類する可能性を有する。これは、さらなる調査のための矛盾する症例の同定において潜在的な利点を有する。
【０４１７】
全がん型のための１つの判別パネルの全エラー率がわずかに高いことが認められた（５ウェイ分類）。上記のパネル性能データでは、４つの他のがんの可能性から１つのがんを同定するようにそれぞれデザインされた５ペアワイズ分類の性能を示す。このアプローチは、意思決定樹および線形判別関数を使用した分析に影響を受ける。この技術は、適用した場合に所見が不明瞭であり、１人の患者のために２つまたはそれ以上の診断が得られ、さらなる臨床調査が示唆される。この技術は、所見が得られる可能性がなく、さらなる調査が示唆される（おそらく、検出パネルを使用した再試験）。
【０４１８】
ｉｉｉ．検出パネル由来の偽陽性症例の可能性を明らかにするためのパネル
偽陽性症例（検出パネル由来）および５つのがん型を判別するようにさらなるパネルを訓練することができる。これは、不正確に異常と分類された検出パネル由来の各症例を選択するステップを含む。これは、専用の分類をこれらの「特別な」症例を検出する「より困難な」問題に対して訓練する。しかし、これは、理論的に信頼できる課題であり、これら４つの症例および集団のみが得られる分析用のデータ集合は、存在していないと考えられる。
【０４１９】
ｉｖ．選択マーカー
３つ全ての方法のための選択マーカープローブを、図５にまとめている。
【０４２０】
ｖ．最小選択マーカー集合
このトピックは、以下の「異なる方法を使用した類似の結果によって証明されたアプローチの信頼性」で取り組んでいる。
【０４２１】
ｖｉ．補足マーカー
このトピックは、以下の「異なる方法を使用した類似の結果によって証明されたアプローチの信頼性」で取り組んでいる。
【０４２２】
ｖｉｉ．別のマーカー：作用の生物学的機構
当業者は、機能的に等価なマーカーを決定することができる。パネルで使用したマーカーの機能的挙動を、本明細書を通して記載する。
【０４２３】
ｖｉｉｉ．マーカーの局在化
本研究で使用した種々のマーカーの局在化を、本明細書中のいずれかに記載する。
【０４２４】
ｉｘ．パネル性能
３つの方法の性能を図５にまとめている。
【０４２５】
ｅ．加重パラメータの効果
前に考察したユーザーが提供するマーカーおよび病態（クラス）の加重基準に加えて、２値加重スキームを使用することもできる。例えば、全ての非ＤＡＫＯ供給プローブに「０」を加重し、全てのＤＡＫＯ供給プローブに「１」を加重し、至適化パネルはＤＡＫＯ供給プローブのみを含む。これは、自社製品のみを使用して分子診断パネルキットを開発および市場に出そうとしている任意の業者における重要な製品デザイン能力である。
【０４２６】
ｆ．他の（非Ｈスコア）客観的スコアリングパラメータの使用効果
ｉ．バックグラウンド
以下の表３２に示すように、病態調査シートは以下のボックス集合を含む。
【０４２７】
【表３５】
2004526154.tif 000050
【０４２８】
標準的なスコアリングシステムは、強度を、なし＝０、弱い＝１、中程度＝２、強い＝３にランク分けし、細胞の比率を０〜５％＝０、６〜２５％＝１、２６〜５０％＝２、５１〜７５％＝３、＞７５％＝４にランク分けし、２つのグレードを掛け合わせる、「Ｈスコア」を使用する。例えば、５０％の弱い染色＋５０％の中程度の染色のスコアは、１０＝２×２＋２×３である。
【０４２９】
ｉｉ．方法
反応が以下の低、中、および高に分けられる別のスコアリング法を分析した。
（ａ）５０％を超える細胞が中程度またはそれ以上染色される場合→高
（ｂ）５０％を超える細胞が染色されない場合→低
（ｃ）その他→中
【０４３０】
意思決定樹検出パネル選択法を、Ｈスコアの代わりにこの３レベルの因子を使用して繰り返した。これにより、意思決定樹は必要に応じて各節で３つに枝分かれした。
【０４３１】
ｉｉｉ．結果
選択されたパネルは以下であった。プローブ３、７、１０、１１、１６、１９、２０、２８。以下のように性能を評価した。
【０４３２】
【表３６】
2004526154.tif 000051
【０４３３】
これを、Ｈスコアを使用した基準性能と比較すべきである。
【０４３４】
【表３７】
2004526154.tif 000052
【０４３５】
ｉｖ．結論
・実質的な性能の低下が認められる（提案した別のスコアリングシステムを使用した場合、よりパネルが大きく、感度が低く、特異性が低い）。
・連続変数（０〜１２の範囲）としてのＨスコアの処理により、試験したデータに対するパネル選択は最適に近いようである。
・多数の他の可能なスコアリングシステムを試験したが、実験的に試験したパネルデザイン方法および開発方法に実行および適用可能なようである。
【０４３６】
４．肺がん検出および判別パネル
上記実施例で決定した肺がん検出および判別パネルの例を以下に列挙する。以下に列挙したパネルは特定のプローブを示し、各特異的プローブを相関するプローブまたは機能的に関連するプローブに置換することができることに留意すべきである。
【０４３７】
検出（制限なし）
・１つまたは複数のさらなるプローブと組み合わせた抗サイクリンＡ
・抗サイクリンＡ、抗ヒト上皮関連抗原（ＭＯＣ−３１）
・抗サイクリンＡ、抗ＥＲ関連Ｐ２９
・抗サイクリンＡ、抗成熟サーファクタントアポタンパク質Ｂ
・抗サイクリンＡ、抗ヒト上皮関連抗原（ＭＯＣ−３１）、抗ＶＥＧＦ
・抗サイクリンＡ、抗ヒト上皮関連抗原（ＭＯＣ−３１）、抗成熟サーファクタントアポタンパク質Ｂ
・抗サイクリンＡ、抗成熟サーファクタントアポタンパク質Ｂ、抗ヒト上皮関連抗原（ＭＯＣ−３１）、抗ＶＥＧＦ
・抗サイクリンＡ、抗成熟サーファクタントアポタンパク質Ｂ、抗ヒト上皮関連抗原（ＭＯＣ−３１）、抗サーファクタントアポタンパク質Ａ
・抗サイクリンＡ、抗成熟サーファクタントアポタンパク質Ｂ、抗ヒト上皮関連抗原（ＭＯＣ−３１）、抗ＶＥＧＦ、抗サーファクタントアポタンパク質Ａ
・抗サイクリンＡ、抗成熟サーファクタントアポタンパク質Ｂ、抗ヒト上皮関連抗原（ＭＯＣ−３１）、抗ＶＥＧＦ、抗サイクリンＤ１
・１つまたは複数のさらなるプローブと組み合わせた抗サイクリンＡ、１つまたは複数のさらなるプローブと組み合わせた抗ヒト上皮関連抗原（ＭＯＣ−３１）
・１つまたは複数のさらなるプローブと組み合わせた抗サイクリンＡ、抗ＥＲ関連Ｐ２９
・１つまたは複数のさらなるプローブと組み合わせた抗サイクリンＡ、抗成熟サーファクタントアポタンパク質Ｂ
・１つまたは複数のさらなるプローブと組み合わせた抗サイクリンＡ、抗ヒト上皮関連抗原（ＭＯＣ−３１）、抗ＶＥＧＦ
・１つまたは複数のさらなるプローブと組み合わせた抗サイクリンＡ、抗ヒト上皮関連抗原（ＭＯＣ−３１）、抗成熟サーファクタントアポタンパク質Ｂ
・１つまたは複数のさらなるプローブと組み合わせた抗サイクリンＡ、抗成熟サーファクタントアポタンパク質Ｂ、抗ヒト上皮関連抗原（ＭＯＣ−３１）、抗ＶＥＧＦ
・１つまたは複数のさらなるプローブと組み合わせた抗サイクリンＡ、抗成熟サーファクタントアポタンパク質Ｂ、抗ヒト上皮関連抗原（ＭＯＣ−３１）、抗サーファクタントアポタンパク質Ａ
・１つまたは複数のさらなるプローブと組み合わせた抗サイクリンＡ、抗成熟サーファクタントアポタンパク質Ｂ、抗ヒト上皮関連抗原（ＭＯＣ−３１）、抗ＶＥＧＦ、抗サーファクタントアポタンパク質Ａ
・１つまたは複数のさらなるプローブと組み合わせた抗サイクリンＡ、抗成熟サーファクタントアポタンパク質Ｂ、抗ヒト上皮関連抗原（ＭＯＣ−３１）、抗ＶＥＧＦ、抗サイクリンＤ１
【０４３８】
検出（ＷＯ／Ｏ抗サイクリンＡ）
・１つまたは複数のさらなるプローブと組み合わせた抗Ｋｉ−６７
・抗ＶＥＧＦ、抗ヒト上皮関連抗原（ＭＯＣ−３１）、抗ＴＴＦ−１、抗ＥＧＦＲ、抗増殖細胞核抗原、および抗成熟サーファクタントアポタンパク質Ｂからなる群から選択された任意の１つのプローブと組み合わせた抗Ｋｉ−６７
・抗ＶＥＧＦ、抗ヒト上皮関連抗原（ＭＯＣ−３１）、抗ＴＴＦ−１、抗ＥＧＦＲ、抗増殖細胞核抗原、および抗成熟サーファクタントアポタンパク質Ｂからなる群から選択された任意の２つのプローブと組み合わせた抗Ｋｉ−６７
・抗ＶＥＧＦ、抗ヒト上皮関連抗原（ＭＯＣ−３１）、抗ＴＴＦ−１、抗ＥＧＦＲ、抗増殖細胞核抗原、および抗成熟サーファクタントアポタンパク質Ｂからなる群から選択された任意の３つのプローブと組み合わせた抗Ｋｉ−６７
・抗ＶＥＧＦ、抗ヒト上皮関連抗原（ＭＯＣ−３１）、抗ＴＴＦ−１、抗ＥＧＦＲ、抗増殖細胞核抗原、および抗成熟サーファクタントアポタンパク質Ｂからなる群から選択された任意の４つのプローブと組み合わせた抗Ｋｉ−６７
・抗ＶＥＧＦ、抗ヒト上皮関連抗原（ＭＯＣ−３１）、抗ＴＴＦ−１、抗ＥＧＦＲ、抗増殖細胞核抗原、および抗成熟サーファクタントアポタンパク質Ｂからなる群から選択された任意の５つのプローブと組み合わせた抗Ｋｉ−６７
・抗Ｋｉ−６７、抗ＶＥＧＦ、抗ヒト上皮関連抗原（ＭＯＣ−３１）、抗ＴＴＦ−１、抗ＥＧＦＲ、抗増殖細胞核抗原、および抗成熟サーファクタントアポタンパク質Ｂ
・抗ＶＥＧＦ、抗ヒト上皮関連抗原（ＭＯＣ−３１）、抗ＴＴＦ−１、抗ＥＧＦＲ、抗増殖細胞核抗原、抗成熟サーファクタントアポタンパク質Ｂ、および１つまたは複数のさらなるプローブからなる群から選択された任意の１つのプローブと組み合わせた抗Ｋｉ−６７
・抗ＶＥＧＦ、抗ヒト上皮関連抗原（ＭＯＣ−３１）、抗ＴＴＦ−１、抗ＥＧＦＲ、抗増殖細胞核抗原、抗成熟サーファクタントアポタンパク質Ｂ、および１つまたは複数のさらなるプローブからなる群から選択された任意の２つのプローブと組み合わせた抗Ｋｉ−６７
・抗ＶＥＧＦ、抗ヒト上皮関連抗原（ＭＯＣ−３１）、抗ＴＴＦ−１、抗ＥＧＦＲ、抗増殖細胞核抗原、抗成熟サーファクタントアポタンパク質Ｂ、および１つまたは複数のさらなるプローブからなる群から選択された任意の３つのプローブと組み合わせた抗Ｋｉ−６７
・抗ＶＥＧＦ、抗ヒト上皮関連抗原（ＭＯＣ−３１）、抗ＴＴＦ−１、抗ＥＧＦＲ、抗増殖細胞核抗原、抗成熟サーファクタントアポタンパク質Ｂ、および１つまたは複数のさらなるプローブからなる群から選択された任意の４つのプローブと組み合わせた抗Ｋｉ−６７
・抗ＶＥＧＦ、抗ヒト上皮関連抗原（ＭＯＣ−３１）、抗ＴＴＦ−１、抗ＥＧＦＲ、抗増殖細胞核抗原、抗成熟サーファクタントアポタンパク質Ｂ、および１つまたは複数のさらなるプローブからなる群から選択された任意の５つのプローブと組み合わせた抗Ｋｉ−６７
・抗Ｋｉ−６７、抗ＶＥＧＦ、抗ヒト上皮関連抗原（ＭＯＣ−３１）、抗ＴＴＦ−１、抗ＥＧＦＲ、抗増殖細胞核抗原、抗成熟サーファクタントアポタンパク質Ｂ、および１つまたは複数のさらなるプローブ
【０４３９】
商業的に好ましいプローブの検出
・１つまたは複数のさらなるプローブと組み合わせた抗Ｋｉ−６７
・１つまたは複数のさらなるプローブと組み合わせた抗ＴＴＦ−１
・１つまたは複数のさらなるプローブと組み合わせた抗ＥＧＦＲ
・１つまたは複数のさらなるプローブと組み合わせた抗増殖細胞核抗原
・抗Ｋｉ−６７、抗ＴＴＦ−１、抗ＥＧＦＲ、および抗増殖細胞核抗原からなる群から選択される２つのプローブ
・抗Ｋｉ−６７、抗ＴＴＦ−１、抗ＥＧＦＲ、および抗増殖細胞核抗原からなる群から選択される３つのプローブ
・抗Ｋｉ−６７、抗ＴＴＦ−１、抗ＥＧＦＲ、および抗増殖細胞核抗原
・抗Ｋｉ−６７、抗ＴＴＦ−１、抗ＥＧＦＲ、および抗増殖細胞核抗原、および１つまたは複数のさらなるプローブからなる群から選択される２つのプローブ
・抗Ｋｉ−６７、抗ＴＴＦ−１、抗ＥＧＦＲ、および抗増殖細胞核抗原、および１つまたは複数のさらなるプローブからなる群から選択される３つのプローブ
・抗Ｋｉ−６７、抗ＴＴＦ−１、抗ＥＧＦＲ、抗増殖細胞核抗原、および１つまたは複数のさらなるプローブ
【０４４０】
腺がんおよび他の肺がん型の判別
・抗ムチン１および抗ＴＴＦ−１
・抗ＶＥＧＦ、抗サーファクタントアポタンパク質Ａ、抗ＢＣＬ−２、抗ＥＲ関連Ｐ２９、および抗Ｇｌｕｔ３からなる群から選択される任意の１つのプローブと組み合わせた抗ムチン１および抗ＴＴＦ−１
・抗ＶＥＧＦ、抗サーファクタントアポタンパク質Ａ、抗ＢＣＬ−２、抗ＥＲ関連Ｐ２９、および抗Ｇｌｕｔ３からなる群から選択される任意の２つのプローブと組み合わせた抗ムチン１および抗ＴＴＦ−１
・抗ＶＥＧＦ、抗サーファクタントアポタンパク質Ａ、抗ＢＣＬ−２、抗ＥＲ関連Ｐ２９、および抗Ｇｌｕｔ３からなる群から選択される任意の３つのプローブと組み合わせた抗ムチン１および抗ＴＴＦ−１
・抗ＶＥＧＦ、抗サーファクタントアポタンパク質Ａ、抗ＢＣＬ−２、抗ＥＲ関連Ｐ２９、および抗Ｇｌｕｔ３からなる群から選択される任意の４つのプローブと組み合わせた抗ムチン１および抗ＴＴＦ−１
・抗ＶＥＧＦ、抗サーファクタントアポタンパク質Ａ、抗ムチン１、抗ＴＴＦ−１、抗ＢＣＬ−２、抗ＥＲ関連Ｐ２９、および抗Ｇｌｕｔ３
・抗ムチン１、抗ＴＴＦ−１、および１つまたは複数のさらなるプローブ
・抗ＶＥＧＦ、抗サーファクタントアポタンパク質Ａ、抗ＢＣＬ−２、抗ＥＲ関連Ｐ２９、抗Ｇｌｕｔ３、および１つまたは複数のさらなるプローブからなる群から選択される任意の１つのプローブと組み合わせた抗ムチン１および抗ＴＴＦ−１
・抗ＶＥＧＦ、抗サーファクタントアポタンパク質Ａ、抗ＢＣＬ−２、抗ＥＲ関連Ｐ２９、抗Ｇｌｕｔ３、および１つまたは複数のさらなるプローブからなる群から選択される任意の２つのプローブと組み合わせた抗ムチン１および抗ＴＴＦ−１
・抗ＶＥＧＦ、抗サーファクタントアポタンパク質Ａ、抗ＢＣＬ−２、抗ＥＲ関連Ｐ２９、抗Ｇｌｕｔ３、および１つまたは複数のさらなるプローブからなる群から選択される任意の３つのプローブと組み合わせた抗ムチン１および抗ＴＴＦ−１
・抗ＶＥＧＦ、抗サーファクタントアポタンパク質Ａ、抗ＢＣＬ−２、抗ＥＲ関連Ｐ２９、抗Ｇｌｕｔ３、および１つまたは複数のさらなるプローブからなる群から選択される任意の４つのプローブと組み合わせた抗ムチン１および抗ＴＴＦ−１
・抗ＶＥＧＦ、抗サーファクタントアポタンパク質Ａ、抗ムチン１、抗ＴＴＦ−１、抗ＢＣＬ−２、抗ＥＲ関連Ｐ２９、抗Ｇｌｕｔ３、および１つまたは複数のさらなるプローブ
【０４４１】
扁平上皮がんおよび他の肺がん型の判別
・１つまたは複数のさらなるプローブと組み合わせた抗ＣＤ４４ｖ６
・抗ＶＥＧＦ、抗トロンボモジュリン、抗Ｇｌｕｔ１、抗ＥＲ関連Ｐ２９、および抗黒色腫関連抗原３からなる群から選択される任意の１つのプローブと組み合わせた抗ＣＤ４４ｖ６
・抗ＶＥＧＦ、抗トロンボモジュリン、抗Ｇｌｕｔ１、抗ＥＲ関連Ｐ２９、および抗黒色腫関連抗原３からなる群から選択される任意の２つのプローブと組み合わせた抗ＣＤ４４ｖ６
・抗ＶＥＧＦ、抗トロンボモジュリン、抗Ｇｌｕｔ１、抗ＥＲ関連Ｐ２９、および抗黒色腫関連抗原３からなる群から選択される任意の３つのプローブと組み合わせた抗ＣＤ４４ｖ６
・抗ＶＥＧＦ、抗トロンボモジュリン、抗Ｇｌｕｔ１、抗ＥＲ関連Ｐ２９、および抗黒色腫関連抗原３からなる群から選択される任意の４つのプローブと組み合わせた抗ＣＤ４４ｖ６
・抗ＣＤ４４ｖ６、抗ＶＥＧＦ、抗トロンボモジュリン、抗Ｇｌｕｔ１、抗ＥＲ関連Ｐ２９、および抗黒色腫関連抗原３
・抗ＶＥＧＦ、抗トロンボモジュリン、抗Ｇｌｕｔ１、抗ＥＲ関連Ｐ２９、抗黒色腫関連抗原３、および１つまたは複数のさらなるプローブからなる群から選択される任意の１つのプローブと組み合わせた抗ＣＤ４４ｖ６
・抗ＶＥＧＦ、抗トロンボモジュリン、抗Ｇｌｕｔ１、抗ＥＲ関連Ｐ２９、抗黒色腫関連抗原３、および１つまたは複数のさらなるプローブからなる群から選択される任意の２つのプローブと組み合わせた抗ＣＤ４４ｖ６
・抗ＶＥＧＦ、抗トロンボモジュリン、抗Ｇｌｕｔ１、抗ＥＲ関連Ｐ２９、抗黒色腫関連抗原３、および１つまたは複数のさらなるプローブからなる群から選択される任意の３つのプローブと組み合わせた抗ＣＤ４４ｖ６
・抗ＶＥＧＦ、抗トロンボモジュリン、抗Ｇｌｕｔ１、抗ＥＲ関連Ｐ２９、および抗黒色腫関連抗原３、および１つまたは複数のさらなるプローブからなる群から選択される任意の４つのプローブと組み合わせた抗ＣＤ４４ｖ６
・抗ＣＤ４４ｖ６、抗ＶＥＧＦ、抗トロンボモジュリン、抗Ｇｌｕｔ１、抗ＥＲ関連Ｐ２９、抗黒色腫関連抗原３、および１つまたは複数のさらなるプローブ
【０４４２】
大細胞がんおよび他の肺がん型の判別
・１つまたは複数のさらなるプローブと組み合わせた抗ＶＥＧＦ
・抗ＶＥＧＦおよび抗ｐ１２０
・抗ＶＥＧＦおよび抗Ｇｌｕｔ３
・抗ＶＥＧＦ、抗ｐ１２０、および抗サイクリンＡ
・抗ＶＥＧＦ、抗ｐ１２０、および１つまたは複数のさらなるプローブ
・抗ＶＥＧＦ、抗Ｇｌｕｔ３、および１つまたは複数のさらなるプローブ
・抗ＶＥＧＦ、抗ｐ１２０、抗サイクリンＡ、および１つまたは複数のさらなるプローブ
【０４４３】
中皮腫および他の肺がん型の判別
・１つまたは複数のさらなるプローブと組み合わせた抗ＣＤ４４ｖ６
・１つまたは複数のさらなるプローブと組み合わせた抗増殖細胞核抗原
・１つまたは複数のさらなるプローブと組み合わせた抗ヒト上皮関連抗原（ＭＯＣ−３１）
・１つまたは複数のさらなるプローブと組み合わせた抗ＣＤ４４ｖ６、抗増殖細胞核抗原、および抗ヒト上皮関連抗原（ＭＯＣ−３１）からなる群から選択される２つのプローブ
・抗ＣＤ４４ｖ６、抗増殖細胞核抗原、抗ヒト上皮関連抗原（ＭＯＣ−３１）、および１つまたは複数のさらなるプローブ
【０４４４】
小細胞がんおよび他の肺がん型の判別
・１つまたは複数のさらなるプローブと組み合わせた抗増殖細胞核抗原
・１つまたは複数のさらなるプローブと組み合わせた抗ＢＣＬ−２
・１つまたは複数のさらなるプローブと組み合わせた抗ＥＧＦＲ
・抗増殖細胞核抗原、抗ＢＣＬ−２、および抗ＥＧＦＲからなる群らか選択される２つのプローブ
・抗増殖細胞核抗原、抗ＢＣＬ−２、および抗ＥＧＦＲ
・１つまたは複数のさらなるプローブと組み合わせた抗増殖細胞核抗原、抗ＢＣＬ−２、および抗ＥＧＦＲからなる群らか選択される２つのプローブ
・抗増殖細胞核抗原、抗ＢＣＬ−２、抗ＥＧＦＲ、および１つまたは複数のさらなるプローブ
【０４４５】
腺がん、扁平表皮がん、大細胞がん、中皮腫、および小細胞がんの同時判別
・抗ＶＥＧＦ、抗トロンボモジュリン、抗ＣＤ４４ｖ６、抗サーファクタントアポタンパク質Ａ、抗増殖細胞核抗原、抗ムチン１、抗ヒト上皮関連抗原（ＭＯＣ−３１）、抗ＴＴＦ−１、抗Ｎ−カドヘリン、抗ＥＧＦＲ、および抗増殖細胞核抗原から選択される２つまたはそれ以上のプローブ
・抗ＶＥＧＦ、抗トロンボモジュリン、抗ＣＤ４４ｖ６、抗サーファクタントアポタンパク質Ａ、抗増殖細胞核抗原、抗ムチン１、抗ヒト上皮関連抗原（ＭＯＣ−３１）、抗ＴＴＦ−１、抗Ｎ−カドヘリン、抗ＥＧＦＲ、および抗増殖細胞核抗原
・１つまたは複数のさらなるプローブと組み合わせた抗ＶＥＧＦ、抗トロンボモジュリン、抗ＣＤ４４ｖ６、抗サーファクタントアポタンパク質Ａ、抗増殖細胞核抗原、抗ムチン１、抗ヒト上皮関連抗原（ＭＯＣ−３１）、抗ＴＴＦ−１、抗Ｎ−カドヘリン、抗ＥＧＦＲ、および抗増殖細胞核抗原から選択される２つまたはそれ以上のプローブ
・１つまたは複数のさらなるプローブと組み合わせた抗ＶＥＧＦ、抗トロンボモジュリン、抗ＣＤ４４ｖ６、抗サーファクタントアポタンパク質Ａ、抗増殖細胞核抗原、抗ムチン１、抗ヒト上皮関連抗原（ＭＯＣ−３１）、抗ＴＴＦ−１、抗Ｎ−カドヘリン、抗ＥＧＦＲ、および抗増殖細胞核抗原
【０４４６】
５．結論
ａ．分子診断へのパネルアプローチの有効性
ｉ．非直感的解決
コントロール対がんについての各プローブのマーカースコアの分布を示すヒストグラムをプロットした（ＰａｔｈｏｌｏｇｉｓｔＤａｔａ．ｘｌｓ、ワークシート：ヒストグラム）。特定のパネルのためのプローブの直感的選択では有効性は明らかではなく、記載の本発明によれば明白な方法を使用しなくても有効な組み合わせを得ることができることがこれらのヒストグラムから明らかである。
【０４４７】
ｉｉ．変化した産物適用の至適化
ｉｉｉ．異なる方法を使用した類似の結果によって証明されるアプローチの信頼性
本報告の主部における種々の分析によって得られ、表および図にまとめた結果の精査により、以下の所見を示す。
【０４４８】
１．各プローブの性能の慎重な精査によっても任意の１つのプローブのみよりも良好に作用し得る明白なプローブ組み合わせは得られない。
２．評価した３つ全ての分類方法を類似の特徴集合に対して精査した。ある分類が別の分類よりも優先し得るデータ構造による小さな相違が認められた。
３．これらの方法の１つを使用してデザインした全分類は、独立した病理学者からのデータを試験した場合に良好な性能が得られることを示し、これはデザインプロセス中では認められない。これは本発明において信頼性が高かった。
４．プローブ７のみを基本とした検出プローブの性能が高かった。
５．プローブ７をプローブ１６または２５と組み合わせた場合、より良好な性能が得られる。
６．他のプローブのプローブ７との組み合わせは性能が改善されるようであるが、捕捉した余剰の症例数は提示できないほど低く、このようにしてデザインした分類は一般化できなかった。
７．プローブ７以外のプローブから選択したパネルの性能は、ヒトスクリーニングを使用した現在の実務と比較していくらは判別され十分によいが、おそらく明日の臨床診断細胞学において自動化サイトメーターには十分ではないだろう（図６を参照のこと）。
８．プローブの他の組み合わせは、有用であり得るが、性能が低い。
９．いくつかのプローブが利用不可能である場合、本発明によりプローブの組み合わせを選択可能である。これを、商業的に好ましいプローブのみの集合に基づいた分類デザインによって例示した。図７を参照のこと。
１０．本発明によれば、高価なプローブを加重することが可能である。これらのプローブを分析からすべて排除するよりも、その寄与が重要な場合はこのプローブをパネルに含めることが可能である。
１１．本発明によれば、他のがん型から１つの肺がん型を判別することができる１つの肺がん型特異的判別をデザインすることが可能である。
１２．５つのがんを分類するための１つのパネルの性能の分析により判別は可能であるが、他のがんから１つのがんを判別するようにそれぞれデザインされた５つのパネルの集合よりも全エラー率が悪かった。
１３．５つの２ウェイ分類の組み合わせを使用して非常に有用な判別が得られた。
１４．共通のプローブ集合を５つの判別パネルのための３つの分類法によって選択し、この結果も信頼できる。
１５．腺がん単離用のプローブは、１、１４、１９、２０、２５、および２７である。
１６．扁平上皮がん単離用のプローブは、１、２、３、２４、２５、および２６である。
１７．大細胞がん単離用のプローブは、１および７、または１、および２１である。
１８．中皮腫単離用のプローブは、３、１２、および１６である。
１９．小細胞がん単離用のプローブは、１２、２０および２３である。
２０．全がんを同時に認識するためのプローブは、１、２、３、４、１２、１４、１９、２２、２３、および２８である。
２１．本発明によって定義された多ペアワイズパネル使用の利点は、疑いのある症例は５つの任意のパネルでは記録することができず、２つまたはそれ以上のパネルで紛らわしい症例を示すことができることである。このような変則な報告は、細胞学者にさらなる分析が必要であることを警告する。
【０４４９】
ｉｖ．危険管理研究
本研究で適用した全検定は、本質的に統計であった。小さな性能の改良に基づいて選択したプローブは、新規のデータで検定した場合統計的に変動する。結果の信頼性を得るために、病理学者１および病理学者２のデータに対する線形判別分析から出現した最良の分類を検定した。病理学者３のデータは病理学者１および病理学者２のデータと統計的に異なるので、病理学者３のデータを使用して検定した場合に良好な性能が得られた場合、これは非常に有望であることを思い出すべきである。
【０４５０】
（１）未知のデータでの検定についての報告−検出パネル
（ａ）方法
上記の「検出パネルの組成」というタイトルの節では、特徴７および１６を使用して良好な性能が得られることを示した。ＳＰＳＳを使用して、７および１６についてＨスコアが報告された病理学者３のデータを選択した。次いで、変換および計算を使用して、新規の特徴として正準判別関数を作成した。次いで、この特徴のみの性能を検定した。
【０４５１】
（ｂ）結果
病理学者１および病理学者２のデータならびに病理学者３のデータに対してデザインした分類の検定結果を示す。プローブ７および１６に対する線形判別関数を使用して分類をデザインした。病理学者２正準関数は、＝０．９６５*プローブ７−０．２９８*プローブ１６であった。
【０４５２】
【表３８】
2004526154.tif 000053
【０４５３】
これは、以下に示したプローブ７のみに対する病理学者３のデータの分類よりも良好である。
【０４５４】
【表３９】
2004526154.tif 000054
【０４５５】
（ｃ）結論
これにより、プローブ７および１６に基づく２プローブ分類はプローブ７のみよりも良好であるという確信が得られる。
【０４５６】
（２）未知のデータでの検定についての報告−判別パネル
（ａ）バックグラウンド
以下に、ＬＤＦを使用して病理学者１および病理学者２のデータを使用してデザインし、未知の病理学者３のデータを使用して検定した分類の性能を報告した。デザイン段階の数は比較的小さく、検定データの数もまた小さいので、第１および第２の集合に対する性能の変動性が良好であると予想することができる。
【０４５７】
（ｂ）方法
ＳＰＳＳでは、「パターン認識」というタイトルの節で導いた正準判別関数を確立し、５つ全てのがんクラスについて病理学者３のデータを検定した。
【０４５８】
（ｃ）結果
中皮腫ＬＤＦ＝プローブ３ｓｃ*．３８５−プローブ１２ｓ*．３１７＋プローブ１６ｓ*１．００６
【０４５９】
【表４０】
2004526154.tif 000055
【０４６０】
小細胞がんＬＤＦ＝プローブ１２ｓ*．５７５−プローブ２０ｓ*．４０８−プローブ２２ｓ*．４２３＋プローブ２３ｓ*．３４４
【０４６１】
【表４１】
2004526154.tif 000056
【０４６２】
扁平上皮がんＬＤＦ＝プローブ１ｓｃ*．３２８−プローブ２ｓｃ*．２９５＋プローブ３ｓｃ*．７４１＋プローブ２４ｓ*．４９０＋プローブ２５ｓ*．３９３＋プローブ２６ｓ*．４２６
【０４６３】
【表４２】
2004526154.tif 000057
【０４６４】
大細胞がんＬＤＦ＝プローブ１ｓｃ*．８４７−プローブ７ｓｃ*．４５２
【０４６５】
【表４３】
2004526154.tif 000058
【０４６６】
非常に少数の大細胞がんの症例を用いてデザインおよび検定した分類の性能は低いが有用であり、この結果は依然として非常に有望である。
腺がんＬＤＦ＝プローブ４ｓｃ*．５１５−プローブ５ｓｃ*．２９９−プローブ４ｓ*．４８５−プローブ１９ｓ*．３４７＋プローブ２０ｓ*．７２３＋プローブ２５ｓ*．３２７＋プローブ２７ｓ*．３２７
【０４６７】
【表４４】
2004526154.tif 000059
【０４６８】
（ｄ）結論
これらの分類の性能が未知のデータの適用に耐えたことに留意することは非常に有望である。これにより、各がんを検出する能力において非常に高い確信が得られる。
【０４６９】
（３）異なる患者および病理学者由来のデータの訓練および検定
信頼性についての「最終の最終」試験として、ＬＤＦを、病理学者１および病理学者２の両方によって調査されたデータを訓練した。これには、病理学者３によって調査されたデータは除かれている。したがって、病理学者３＋病理学者１のデータによって調査されたデータに対する検定は偏見がない。以前に、検定および訓練のための同一の患者由来のデータを使用した検定プロセスは偏りがある。
【０４７０】
ＬＤＦにより、含まれないプローブ４以外の特徴についての同一の集合が得られた。ＬＤＦ＝プローブ１ｓｃ*．２８８＋プローブ７ｓｃ*．８４６−プローブ１５ｓ*．２４９−プローブ１６ｓ*．５３４
【０４７１】
【表４５】
2004526154.tif 000060
【０４７２】
なお、妥当な結果であるが、類似の結果でもあり、しかし曲線下面積は小さく、病理学者３のデータのみに対してプローブ７のみを得た。
【０４７３】
【表４６】
2004526154.tif 000061
【０４７４】
［参照文献］
【表４７−Ａ】
2004526154.tif 000062
【表４７−Ｂ】
2004526154.tif 000063
【表４７−Ｃ】
2004526154.tif 000064
【表４７−Ｄ】
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【表４７−Ｅ】
2004526154.tif 000066
【表４７−Ｆ】
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【表４７−Ｇ】
2004526154.tif 000068
【表４７−Ｈ】
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【表４７−Ｉ】
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【表４７−Ｊ】
2004526154.tif 000071
【表４７−Ｋ】
2004526154.tif 000072
【表４７−Ｌ】
2004526154.tif 000073
【表４７−Ｍ】
2004526154.tif 000074
【図面の簡単な説明】
【０４７５】
【図１】肺がんの異なる組織学的型を同定するためのパネル中に含まれる好ましいマーカーである分子マーカーを示す図である。「％」と示した列は、特定のマーカーを発現する腫瘍標本の比率を示す。
【図２】異なるマーカーを使用して肺がんの特定の型を判別することができる可能性のある方法を示す図である。ＳＱは扁平上皮がんを示し、ＡＤは腺がんを示し、ＬＣは大細胞がんを示し、ＳＣは小細胞がんを示し、ＭＥは中皮腫を示す。各細胞中に示した数は、ある細胞型の別の細胞型に対するマーカーの変化の頻度を示す。表中に含めるために、比は２．０を超えるか０．５未満でなければならない。１００を超える数は、一般に、第２のマーカーが発現されないことを示す。このような場合、分析のために分母を０．１に設定した。最後に、空白のセルは発現に相違がないか発現データが存在しないことを示す。
【図３】コントロール組織とがん性組織におけるプローブ７および１５のＨスコアの比較を示す図である。ｘ軸はＨスコアを示し、ｙ軸は症例の比率を示す。
【図４】相関により変数の対の直線的関係が測定される相関行列を示す図である。この行列中の相関数が５０％またはそれ以上の全マーカーを、相関マーカーとみなす。
【図５】検出パネルの構成、ペアワイズ判別パネル組成、および同時判別パネル組成を示す図である。意志決定樹分析、ステップワイズＬＲ、およびステップワイズＬＤを使用したパネル組成を示す。
【図６】プローブとしてプローブ７が含まれない検出パネル組成を示す図である。意志決定樹分析、ステップワイズＬＲ、およびステップワイズＬＤを使用したパネル組成を示す。
【図７】市販の好ましいプローブのみを使用した検出パネル組成を示す図である。意志決定樹分析、ステップワイズＬＲ、およびステップワイズＬＤを使用したパネル組成を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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