(57)【要約】巨大分子などの分子の核生成傾向をスクリーニングするためのシステム及び方法であって、当該分子についての結晶化条件を最適化するため、音響、静電又は音響／静電混成の浮揚に基礎を置くシステム及び方法。これによって、過飽和度の測定への制御されたアプローチが可能になり、結晶核生成条件のスクリーニングが、従来の結晶化方法と比べて微量の出発物質を用いて、数ヶ月や数年ではなく数分や数時間以内で可能になる。
2004532974.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
流体又は気体中の分子の核生成傾向をスクリーニングするための方法であって、
ｉ．  前記流体又は気体の少なくとも１つの小滴を浮揚装置で浮揚させること、
ii．  物質を送給するためのディスペンサーを用いて、前記浮揚させた小滴に少なくとも１つの物質を送給すること、
iii．  核生成傾向を検出すること、及び
iv．  前記核生成傾向を評点すること、
を含む核生成傾向スクリーニング方法。
【請求項２】
前記核生成傾向を視覚的な監視で手動式に検出する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記核生成傾向を、ラマン分光法、ラマン分光法と組み合わせた多角度光散乱、比濁法、及び照明源からなる群から選択される手段のいずれかによって検出して、前記少なくとも１つの小滴における濁度、析出物及び／又は集合体形成の定量的測定値を得る、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記小滴を、音響、静電、気流、磁気浮揚装置、及びそれらの混成装置、例えば音響−静電混成浮揚装置、からなる群からの浮揚装置を用いて浮揚させる、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
前記ディスペンサーが圧電フロースルーディスペンサーである、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記小滴に送給される物質が、タンパク質、膜タンパク質、オリゴペプチドやポリペプチドなどのペプチド、酵素、レセプタ、薬剤化合物、ＤＮＡやＲＮＡなどの核酸、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、巨大分子、巨大分子集合体、又はそれらの複合体である、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
前記小滴に送給される物質が前記核生成条件に影響を及ぼす物質である、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
前記小滴が１ｆｌ〜１００μｌの範囲にある、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
前記核生成傾向を１０ミリ秒〜１０時間の範囲内で検出する、請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
前記核生成傾向を１０ミリ秒〜５時間後に検出する、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記核生成傾向を１０ミリ秒〜３０分後に検出する、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
核生成傾向をスクリーニングするためのシステムであって、
ｉ．  少なくとも１つの小滴を所定位置に配置するための少なくとも１つの浮揚装置、
ii．  前記所定位置に配置した小滴に少なくとも１つの物質を送給するための少なくとも１つのディスペンサー、及び
iii．  前記少なくとも１つの浮揚させた小滴における核生成傾向を検出するための１以上の手段、
を含む核生成傾向スクリーニングシステム。
【請求項１３】
前記浮揚装置が、音響、静電、気流、磁気浮揚装置、及びそれらの混成装置、例えば音響−静電混成浮揚装置、からなる群から選択される、請求項１２に記載のシステム。
【請求項１４】
前記ディスペンサーが圧電ディスペンサーである、請求項１２〜１３のいずれかに記載のシステム。
【請求項１５】
前記核生成傾向を視覚的な監視で手動式に検出する、請求項１２〜１４のいずれかに記載のシステム。
【請求項１６】
前記核生成傾向を、ラマン分光法、ラマン分光法と組み合わせた多角度光散乱、比濁法、及び照明源からなる群から選択される手段のいずれかによって検出して、前記少なくとも１つの小滴における濁度、析出物及び／又は集合体形成の定量的測定値を得る、請求項１２〜１４のいずれかに記載のシステム。
【請求項１７】
前記少なくとも１つの浮揚させた小滴が１ｆｌ〜１００μｌまでの範囲にある、請求項１２〜１６のいずれかに記載のシステム。
【請求項１８】
前記少なくとも１つのディスペンサーにより前記少なくとも１つの小滴に送給される前記少なくとも１つの物質が、タンパク質、膜タンパク質、オリゴペプチドやポリペプチドなどのペプチド、酵素、レセプタ、薬剤化合物、ＤＮＡやＲＮＡなどの核酸、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、巨大分子、巨大分子集合体又は複合体である、請求項１２〜１７のいずれかに記載のシステム。
【請求項１９】
前記少なくとも１つのディスペンサーにより前記少なくとも１つの小滴に送給される前記少なくとも１つの物質が核生成傾向に影響を及ぼす物質である、請求項１２〜１７のいずれかに記載のシステム。
【請求項２０】
前記少なくとも１つの浮揚させた小滴が前記照明源の周りの所定の位置に、各浮遊する小滴を回転する光によって照明することができるようにして配置されるように、前記照明源が配列される、請求項１６に記載のシステム。
【請求項２１】
タンパク質、膜タンパク質、オリゴペプチドやポリペプチドなどのペプチド、酵素、レセプタ、薬剤化合物、ＤＮＡやＲＮＡなどの核酸、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、巨大分子、巨大分子集合体又は複合体などの分子について結晶化条件又はアモルファス段階条件をスクリーニングすることへの、請求項１２〜２０のいずれかに記載のシステムの利用。
【請求項２２】
タンパク質、膜タンパク質、オリゴペプチドやポリペプチドなどのペプチド、酵素、レセプタ、薬剤化合物、ＤＮＡやＲＮＡなどの核酸、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、巨大分子、巨大分子集合体又は複合体などの分子について結晶化条件又はアモルファス段階条件をスクリーニングすることへの、請求項１〜１１に記載の方法の利用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、流体又は気体結晶成長において分子の結晶化条件を最適化する前に核生成傾向をスクリーニングするためのシステムと方法に関し、更に詳しくは核生成傾向を同定する装置及び方法に関する。また、結晶の核生成条件をスクリーニングするためにそのようなシステム及び方法を使用することも考えられる。
【背景技術】
【０００２】
Ｘ線結晶学と生体内結晶成長
物質の３次元原子構造の決定は、純粋及び応用研究の最も重要な分野の１つである。Ｘ線結晶学として知られるこの分野は、結晶内の原子の精密な配置を決定するために結晶からのＸ線の回折を利用する。その結果から、起源のいろいろな物質の、例えば合金、塩の結晶などの原子的構造も、ならびにタンパク質と核酸の、例えばデオキシ核酸及びリボ核酸（それぞれＤＮＡ及びＲＮＡ）の構造も明らかにすることができる。科学の歴史における最大の発見のいくつかは結晶学者によってなされたものである。
【０００３】
結晶学のうちの１つの重要な、且つ急速に成長しつつある分野は、生体内結晶成長（ｂｉｏｃｒｙｓｔａｌｌｉｚａｔｉｏｎ）に関わる巨大分子結晶学であり、生体内結晶成長は、Ｇｉｅｇｅ  ｅｔ  ａｌ．（Ｐｒｏｇ．  Ｃｒｙｓｔａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔ．，  ３０：２３７，  １９９５  ），  Ｃｒｙｓｔａｌｉｓａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  （ｅｄｉｔｏｒｓ  Ｄｕｃｒｕｉｘ，  Ａ．，  ａｎｄ  Ｇｉｅｇｅ，  Ｒ．，  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，  ２０００，  ＩＳＢＮ  １９−９６３６７９−６）と、Ｃｕｒｒｅｎｔ  ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ  ｔｏ  ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｒｙｓｔａｌｌｉｓａｔｉｏｎ  （ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ，  Ａ．，  Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  １８９：１−２３，  １９９０）に記載されている、タンパク質、核酸及び巨大分子集合体の結晶化である。この研究分野において制約となっている段階は、特定の試料の最適な結晶成長条件のスクリーニングに関連している。全ての結晶化に言えることであるが、それは、核生成、成長、そして結晶の成長停止という３つの古典的な段階を伴うマルチパラメータのプロセスである。しかしながら、巨大分子の結晶化は、関連するパラメータの数がはるかに多いためと、特異な物理的−化学的性質（表１）のために、より小さな分子の結晶成長とはある意味で異なっている。一例をあげると、水性媒質中でのそれらの最適な安定性は、かなり狭い温度（タンパク質が熱的に安定でない場合）及びｐＨの範囲に制限される。しかし、無機及び有機分子との主な違いは、巨大分子の立体配座上のフレキシビリティー及び化学的多面性にあり、従って外部条件により敏感なことである。とは言え、結晶化のための合理的な方策のためには、成長のための条件を合理的な仕方で設定しなければならない。
【０００４】
表１．巨大分子の核生成、結晶化、及び／又は可溶性に影響するパラメータ
固有の物理−化学的パラメータ
・過飽和
・温度とｐＨの変動
・平衡と成長の時間と速度
・化学物質のイオン強度と純度
・拡散と対流
・サンプルと装置の体積と幾何学形状
・固体粒子、壁及び界面の影響
・密度と粘度の影響
・圧力、電場、及び磁場
・振動と音響
生化学的及び生物理的パラメータ
・物理的パラメータに対する立体配座の感受性
・配位子及び特異的添加剤の結合
・巨大分子の性質及びサンプルの老化
生物学的パラメータ
・生物的な源
・生物や細胞の生理的状態
・バクテリア汚染
巨大分子の純度
・巨大分子汚染
・配列及び立体配座の異質性
・バッチ効果
【０００５】
タンパク質はアミノ酸のポリマーであって、各分子が何千もの原子を含む。自然界には２０の必須アミノ酸があることを考えると、タンパク質分子を形成するアミノ酸の組み合わせはほとんど無数にあるということが分かる。アミノ酸配列又は一次構造にはその３次元構造を予測するために必要な情報が内在している。残念ながら、科学はまだ、この情報を一次構造から直接に取り出すことができるレベルにまで進歩していない。高磁場核磁気共鳴の分野は相当に進歩している。それでもなお、タンパク質のきわめて正確な３次元構造を生成できる唯一の方法はＸ線結晶学を応用することによる。このためには十分に秩序あるタンパク質の結晶（Ｘ線を少なくとも２．０オングストローム以上の解像度で回折する結晶）を成長させることが必要である。
【０００６】
溶解した化合物の結晶を成長させるためには、分子を含む溶液を熱力学的に不安定な過飽和の状態にしなければならない。溶質は、平衡に戻る際に結晶性又はアモルファスの状態になることがある。過飽和状態は溶媒の蒸発によって、又は温度、ｐＨ又は圧力のような物理−化学的パラメータの急激な変化によって実現することができる。過飽和は、結晶がそれから成長する結晶核の生成にとっての必要条件である。高分子電解質（例えば、タンパク質）の溶解度は複雑な関数であり、理論的にシミュレートして核生成のための条件を予測することは単純な問題ではない。従って、ある化合物の溶解度は結晶と平衡している溶液から実験的に求められる。
【０００７】
巨大分子、特に膜貫通のタンパク質は複雑なので、適当な結晶を得ることはきわめて困難なことがある。巨大分子は複雑な生物的な源から抽出され、結晶生成には精製がきわめて重要な役割を演ずる。純度は「結晶学等級の純度」でなければならないが、それは、巨大分子が正しく折り畳まれなくてはならず且つ汚染物質を含んではならないということを意味する。化学的な修飾などのミクロな異質部分を含む変性された分子又は巨大分子は、結晶成長にマイナスの影響を及ぼす。結晶化の条件を決定するためには、普通、数百乃至数千の実験を行わなければならない。ｐＨ、緩衝液のタイプ、析出剤のタイプ、タンパク質濃度、温度、等を調べる大きなマトリックスが検討される。このプロセスはきわめて時間がかかり、労力を要する。
【０００８】
タンパク質の３次元構造はその機能と活性を決定する。従って、この構造を知ることは医学及び薬学に応用する際に絶対に必要である。タンパク質の構造についての新しく且つますます増加する知識は、新しい薬や関連した薬を生産する能力の増大につながる。構造生物学では、複雑な構造を解き明かすための技術的必要条件がたくさん提示されており、それによって構造分析は以前に比べてずっと速やかなプロセスになっている。しかし、この学際的な研究分野の１つでは、研究は遅々としたものである。それは、構造又は機能を研究しようとしているタンパク質、タンパク質−配位子複合体、あるいは核酸との複合体の結晶化である。アカデミックな世界だけでなく、製薬産業においても、目標はゲノム配列と遺伝子産物の構造を並行して決定することであるが、そのためには結晶の生成がもっとはるかに速くならなければならない。結晶化プロセスの複雑さと多次元的な性格のために、巨大分子の結晶化は依然として時間がかかる手仕事であり、しばしば貴重で高価な物質を大量に必要とする。
【０００９】
タンパク質結晶から生成される３次元構造は分子生物学の基本的な理解に、例えばどのようにして酵素がいろいろな触媒活動を行い、化学的経路のスイッチをオンにし、あるいは循環系内で分子を輸送するのかついての理解に、大きな関わり合いをもつ。最近の数年間に、治療の目標として重要なタンパク質の構造の決定から、新しい、もっと効力の高い薬剤の合理的な設計が可能になった。
【００１０】
シンクロトロンビーム源、高速Ｘ線検出器、低温技術、及び高速コンピュータグラフィックスといったような構造生物学における最近の進歩は、３次元構造を決定する速度を革命的に高めている。しかし、依然として、Ｘ線回折法に適した質の高いタンパク質結晶を成長させるために必要な条件を決定することがボトルネックになっている。タンパク質結晶がＸ線回折法による構造分析に適したものとなるためには、直径が約０．１〜０．２ｍｍ程度の又はそれ以上の結晶を得なければならない。
【００１１】
従来の結晶化方法
現在、タンパク質などの生物的活性を有する巨大分子はいろいろな実験方法によって結晶化されている。これらの多くの方法のうち、当該技術においてに最も広く用いられている方法が３つある（Ｃｕｒｒｅｎｔ  ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ  ｔｏ  ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｒｙｓｔａｌｌｉｓａｔｉｏｎ，  ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ，  Ａ．，  Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  １８９：１−２３，  １９９０、  Ｃｒｙｓｔａｌｌｉｓａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ，  Ａ．  Ｄｕｃｒｕｉｘ  ａｎｄ  Ｒ．  Ｇｒｉｅｇ編，  Ｔｈｅ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  Ｓｅｒｉｅｓ，  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ  １９９２、  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｎｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｉｓａｔｉｏｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  −  Ａ  ｃｏｍｐａｎｉｏｎ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  １：１，  １９９０年８月）。
【００１２】
ほとんどの研究所で、蒸気拡散法が用いられている。これは、タンパク質を含む溶液の小滴をガラスのカバースリップ又はシッティングブリッジ（ｓｉｔｔｉｎｇ  ｂｒｉｄｇｅ）に適用し、蒸気拡散チャンバなどのシールしたチャンバにひっくり返していれ、そこでの条件がタンパク質小滴の過飽和を招き、タンパク質結晶の析出を開始させる方法である。
【００１３】
透析法と呼ばれる別の方法では、タンパク質溶液を半透性サイズの除去膜内に入れ、そしてその後、蒸気拡散法のために調製された貯蔵溶液におけるような適当なｐＨ、析出剤濃度等の溶液に入れる。析出剤が膜を通り抜けてタンパク質の区画へ拡散してゆくと、タンパク質の溶解度が低下して結晶が生ずる。蒸気拡散法も透析法も、所望の結果を得るためには多数の変数を広範にスクリーニングする必要があり、従って時間がかかる。
【００１４】
タンパク質結晶を成長させる更に別の方法は、ゲル結晶成長と呼ばれるものに関連する。この方法は、小さな直径のガラス細管の端にゲルを配置することを必要とする。溶液がゲル化した後、細管の一端（上端）にタンパク質溶液を入れ、他端は析出剤の溶液に浸漬する。条件を適切に選ぶと、溶液がゆっくりと拡散によって混合するにつれてタンパク質と析出剤が適切な濃度に達したゲル内のある点で結晶成長が起こる。これは拡散によって制限されるプロセスであるから、長い時間が経過した後に初めて起こり、すなわち分子の大きさと複雑さに応じて数時間経って初めて析出する。大きな分子、例えばタンパク質や複雑な巨大分子集合体などの場合、このアプローチは拡散の制限のためにあまり適当でないことがある。この方法で成長させた結晶はしばしば大きく、質が高い。適当な結晶化条件をスクリーニングするためにここで用いられるアプローチは、析出剤溶液の入ったガラス細管の多数のびんを用いることを必要とする。従って、この方法は面倒であり時間がかかる。また、いったんゲル内に結晶が生じると、それらをこわさずに取り出すことがきわめて難しいという欠点もある。
【００１５】
しかし、この手法を用いて結晶成長を達成する現在の手段は、人手によって行われるにせよロボット装置によって行われるにせよ、多少原始的であり、且つ適当な実験のやり方が見出されるまで長い一連の条件調整を必要とするため、上述の方法は通常厄介で時間がかかり非効率的である。このプロセスでの典型的なスクリーニング方法では、一般に、各組の実験についてｐＨ、緩衝液タイプ、温度、タンパク質濃度、析出剤タイプ、析出剤濃度、等の条件を変えることが必要になる。それでも、多数の条件を調整した後でも、多くの場合ごくわずかなタンパク質サンプルしか一度に調べることができない。現下において利用できる装置を使用して現在行われているとは言え、小滴垂下法などの結晶成長方法は厄介であり、時間がかかり、効率的に再現性をもってうまく実行するのが困難である。
【００１６】
内壁を有するチャンバ又は装置での結晶成長は、しばしば清浄な単結晶の生成に難点がある。多くの場合、結晶は結晶チャンバの壁で成長し、壁から取り外しその後構造を破壊せずに単結晶を取り出すのが難しい多結晶を生じる。
【００１７】
結晶化の条件を改善するいろいろな手段が、特定の結晶を成長させるために必要な具体的な条件の初期スクリーニングを迅速化することを含めて、文献に記載されている。米国特許第５６４１６８１号明細書には、１×ｇ又は微小重力環境における最適なタンパク質結晶化条件を見つけるための装置と方法が記載されている。この方法は、結晶を成長させる結晶化溶液を入れる少なくとも一対の透析チャンバを用いる拡散で制限されるプロセスを利用している。この場合の拡散はゲル化物質の量で決まるので、それは結晶の成長のための平衡を達成するのに十分な時間に影響を及ぼす。この装置は結晶成長条件のスクリーニングに有用であり、実験時間を約３〜６ヶ月に短縮するとともに実験装置も技術的に１／１０に小さくする。
【００１８】
対流、沈降を含めた重力が関係する現象、及び物質と容器との相互作用が、全て結晶成長プロセスに影響を及ぼす。それらを考慮に入れなければ、それらは生成される結晶の量と質に悪影響を及ぼしかねない。実際問題として、対流と沈降は軌道飛行の際に得られる低重力の条件下でしか完全にはなくすことができない。この場合、宇宙空間において、すなわち１ｇよりも低い又は微少重力の条件で結晶化を行うことには利点がある。１つの選択肢として、１ｇ未満で又は微小重力の環境で、例えば宇宙空間で、結晶を成長させる条件が文献に記載されている。結晶成長の際の１つの問題は、上述のとおり、結晶成長に影響する物質と容器との相互作用である。これは、結晶実験が行われる容器又はチャンバの壁での結晶成長を招き、品質の問題と壁から分離する場合の困難の原因となる。米国特許第５１７３０８７号明細書には、冷却チャンバを用いて空間で核生成が起こる場所を制御する方法が記載されており、結晶は特定の場所、すなわち容器の壁でない場所でのみ核生成され、その数も制御される。
【００１９】
宇宙空間で実験を行うことなく１ｇよりも低い環境を作る別の方法が記載されている。いろいろなタイプの浮揚システムが、例えば、静電気的又は音響的な小滴浮揚装置が知られており、例えば、Ｒｈｉｍ  ｅｔ  ａｌ．（Ｊ．  Ｃｒｙｓｔ．  Ｇｒｏｗｔｈ；  １１０：２９３，  １９９１）に記載されている。これは２つの意味でクリーンな無容器方法を可能にする。第１に、サンプルは、制御不可能な核生成を誘発することがある容器又はチャンバの壁と物理的に接触しない。第２に、制御の強さをソフトウエアでプログラムすることにより、サンプル小滴を重力の影響力の大部分から切り離すことも、実験室、例えば宇宙空間実験室などに存在することが知られている振動や衝撃の影響力から切り離すこともできる。
【００２０】
核生成
結晶化は、固体相、例えばタンパク質結晶が液体相と平衡にある相分離を確立することを目標とする。緩衝液に溶解したタンパク質に３次元格子を形成させるようにしなければならない。実際の経験から、溶液の誘電率を変化させるいろいろなタイプの析出剤によってそれができることが示される。結晶化のプロセスは３つの主な段階、すなわち核生成、成長、及び成長の停止、を有する。結晶化は核生成段階、すなわち最初の秩序ある凝集体の形成から始まり、その後に成長段階が続く。成長の停止はいくつかの原因があり得る。結晶化媒質からの巨大分子の枯渇のような明らかなものは別にすると、それは成長の欠陥から起こる。
【００２１】
結晶化実験で最も制御することが難しい段階は核生成プロセスである。核生成の速度（ｋｉｎｅｔｉｃｓ）は過飽和度の指数関数であり、ある臨界値に達しないと核は累加されない。これが核生成点に達したときである。図１に見られるように、結晶が成長するためには、臨界的な大きさの凝集体が必要である。それは、物理的条件を正確に測定することが困難であるが結晶核が生成する基盤になっている不安定な状態である。
【００２２】
未知のタンパク質について結晶化実験を準備するときの標準的な手順は、他のタンパク質のための結晶化媒質として使用できることが経験的に示されている市販の緩衝溶液を用いることである。溶液の数は、いろいろなｐＨの析出剤のいろいろな混合物と塩やポリマーのような添加剤のせいで、９０〜１００に及ぶことがある。適当なレベルのタンパク質濃度を確立する必要もあり、いろいろな物理的パラメータ、例えば温度をテストすることも必要なので、結果として実験はきわめて大量になり、厖大な量のサンプル、すなわち例えばタンパク質、核酸などの巨大分子が必要になる。
【００２３】
制約及び将来の展望
何千という遺伝子産物をクローン化し、発現させ、調べるゲノミクスにおいて、例えばＨＵＧＯ（ヒトゲノム機構）プロジェクトなどで、タンパク質の小規模の分析と迅速な結晶化を利用する将来展望は非常に大きい。新しいタンパク質の３次元構造を決定する試みはそのような完全分析の一部であり、タンパク質の結晶化は必要なステップである。更に、生理的な作用や機能を調べるために、タンパク質を単一細胞に導入することがある。
【００２４】
最終的には同定される全てのタンパク質の３次元（３Ｄ）構造を決定するために、世界中で国際的共同機関による協力事業が行われている。これには研究機関も製薬産業も参加している。タンパク質結晶学者は、例えばＳｔａｎｆｏｒｄで、きわめて効率的なシンクロトロンビーム源で高解像度の構造を大量に決定しようとしている（http://www.jcsg.org/scripts/prod/home.html参照）。これは、Ｘ線実験で用いられる個々のタンパク質又は巨大分子複合体の単結晶の形成のために必要な物理−化学的条件を速やかに予測する求めに応える新しい手段や方法が開発されていることを意味する。タンパク質ならびに核酸の結晶化スクリーニングキットが市販されている（米国カリフォルニア州Ｌａｇｕｎａ  ＮｉｇｕｅｌのＨａｍｐｔｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、www.hamptonresearch.com参照）。また、大規模な結晶化試験を準備する実際作業での人間の介入を最小にするロボットも存在する。しかし、科学者たちには、結晶成長の第１の必要条件である結晶核生成工程を迅速にスクリーニングする手段や方法がない。
【００２５】
巨大分子、例えばタンパク質の３次元構造の決定に高解像度のＸ線結晶学の方法を使用するのを制限している問題は、タンパク質の具体的な核生成条件を決定するという時間のかかるステップである。核生成条件が与えられれば、巨大分子から適切な結晶を容易に作ることができる。従って、タンパク質結晶学の分野における最近の進歩を考えると、Ｘ線結晶学のための良質のタンパク質結晶の成長について所望される条件を見つけるための非常に効率的、簡単、且つ効果的な方法及び手段であって、しかも従来技術の方法及び手段につきまとう問題を回避することもできるものを開発することがきわめて望ましく、この点で、本発明はこの必要と関心に応えるものである。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２６】
良質の、例えばＸ線結晶学用の、タンパク質結晶を成長させるための条件を、妥当な時間枠の中で、すなわち数ヶ月とか数年ではなく分のオーダーで、且つ所望のタンパク質を大量に消費することなく見つけようとする場合に当該技術において公知の前記の不都合に鑑み、本発明は、溶液における最適な結晶化条件をスクリーニングするための新しい改良されたシステム及び方法を提供する。
【００２７】
従って、本発明の主たる目的は、流体又は気体中の分子の、結晶の成長に先行する核生成の傾向をスクリーニングするためのシステム及び方法であって、従来技術の全ての利点を有し不利な点をもたない、新しい改良されたシステム及び方法を提供することである。
【００２８】
この主たる目的を支援して、本発明の更なる目的は、Ｘ線結晶学で用いるのに十分な大きさと品質の結晶を迅速に生成する最適な巨大分子結晶成長条件をスクリーニングするためのきわめて効率的な手段を可能にする最適結晶化条件を得るための新しい改良されたシステム及び方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００２９】
これら及びその他の目的を達成するために、本発明は、流体又は気体中の分子の核生成傾向をスクリーニングするための方法に関し、この方法は流体又は気体の少なくとも１つの小滴（ｄｒｏｐｌｅｔ）を浮揚装置、例えば音響浮揚装置で浮揚させることと、物質を送給するため浮揚した小滴に圧電フロースルーディスペンサー（ｆｌｏｗ−ｔｈｒｏｕｇｈ  ｄｉｓｐｅｎｓｅｒ）によって少なくとも１つの物質を送給することと、核生成傾向を検出することと、そしてまた核生成傾向を評点することを含む。
【００３０】
更にまた、本発明は、核生成傾向をスクリーニングするためのシステムに関し、このシステムは、少なくとも１つの小滴を所定の位置に配置するための、例えば音響浮揚装置などの、少なくとも１つの浮揚装置と、所定の位置に配置した小滴に少なくとも１つの物質、例えば析出剤などを送給するための少なくとも１つのディスペンサーと、該少なくとも１つの浮揚させた小滴における核生成傾向を検出する１つ以上の手段を含む。
【００３１】
具体的に言うと、例えば、ラマン分光法、多角度光散乱、比濁法、又は照明源と顕微鏡及びカメラを使用する手動の視覚的検出、などを用いて、小滴における凝集体形成、析出又は濁度の定量的な測定値を得る、核生成傾向を検出する効率的手段を提供することが本発明の目的である。
【００３２】
本発明を用いることによって、数ヶ月とか数年ではなく、数時間又は数分以内に、しかも出発物質として非常に少ない作業体積を、例えばピコリットルの範囲の体積を用いることによってはるかに少ない量、例えば１／１０〜１／１００の少量の所望の分子を用いて、良質の結晶の生成のための最適の結晶化条件に到達する。少量の出発物質と結晶化条件をスクリーニングする迅速な手段による利点は、タンパク質など、新しい特性が分かっていない分子について作業するときに特に重要である。ここに提示する手段は高いスループットを実現し、そしてそれはＨＵＧＯのようなプロジェクトによって明らかにされる様々なタンパク質や巨大分子の厖大な量を考えると望ましいことである。発明者らは、本発明によるツールの組み合わせは、生命科学研究への時間と材料を節約する全く新しいアプローチを切り開くものであると結論を下すものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３３】
定義
「巨大分子結晶化」という用語は、例えば、タンパク質、オリゴ又はポリペプチドなどのペプチド、ＤＮＡやＲＮＡなどの核酸、及び巨大分子集合体の結晶化を意味するものである。「巨大分子集合体」というときには、タンパク質、例えば酵素などのポリマー、ポリペプチド、オリゴペプチド、核酸、炭水化物、糖タンパク質、膜タンパク質、リン脂質ポリマー、又はこれらのいずれかの共有結合又は非共有結合複合体を含めて、大きな分子、化合物又は複合体が考えられるものである。
【００３４】
「物質」という用語は、ここでは、浮揚させた小滴に加えることができる物質、例えば塩、ポリマー、アルコール、水又はタンパク質を意味するものである。この物質は、析出剤の場合のように、核生成条件に影響を及ぼすことがあり、あるいは結晶化される又は核生成がスクリーニングされる分子、例えばタンパク質でもよい。
「スクリーニングする」という用語は、多数のサンプル又は一群の対象を系統的に検出、検査、試験及び／又は評点して、特定の好ましい性質、例えば核生成傾向又は最適の核生成条件を有するものを見出すためにそれらをグループに分けたり、あるいは特定の目的のために１つ以上を選んだりすることを意味するものである。
【００３５】
「核生成」という用語は、結晶の芯、すなわち核が生成する動的プロセスを意味するものであり、すなわち、例えば蒸発により変化を誘発して、タンパク質溶液中のタンパク質、析出剤又は添加物の相対的濃度を変化させなくてはならない。
【００３６】
「核生成する」という用語は、核を形成すること、すなわち、いろいろな濃度領域において所定の析出剤によって生成する３次元、３Ｄ、の秩序ある凝集体を形成することを意味するものである。
【００３７】
「核生成相」という用語は、状態図において核生成が起こりうる領域を意味するものである。
【００３８】
「核生成傾向」という用語は、所定の条件下で分子が核生成する傾向を意味するものである。タンパク質は、３Ｄの芯、核又は微結晶、すなわちＸ線実験のためには質が低い小さな結晶を形成しなければならず、それは溶質が、用いられた条件下で固体相として分離する能力を実証するものである。核が形成された後、核は溶解してもよく、あるいは結晶又はアモルファスの析出物を形成してもよい。
【００３９】
「核生成条件」という用語は、核生成傾向、析出傾向及び／又は核生成相に影響を及ぼす条件又はパラメータを意味するものである。そのような条件やパラメータの例は表１に掲載されている。
【００４０】
「浮揚装置」という用語は、小滴に対する重力に打ち勝つ力を発生する装置を意味するものである。音響浮揚装置の場合、これは、例えば小滴を浮揚させるために、放射器と固体反射器の間に多重反射によって正確な間隔で節と腹を有する定在波を発生させることで達成される。浮揚は、超音波、レーザー光、気流、電場又は磁場を用いて得ることができる。ここでは、「超音波」又は「音響」浮揚装置というのは、超音波放射器と固体反射器を用いて定在波を発生する装置を意味するものである。静電的浮揚は電場を用いて、磁気浮揚は磁場を用いて達成される。音響／静電ハイブリッド浮揚とは、浮揚装置が超音波と電場の両方又はどちらかを用いてサンプルを浮揚させることができることを意味する。
【００４１】
「浮揚させた小滴」又は「浮揚した小滴」という用語は、流体又は気体の小滴（ｄｒｏｐ）であってその小滴に働く重力に他の力が打ち勝つような位置にあるものを意味する。
【００４２】
ここで「微小重力環境」というのは、非常に小さい重力（μｇ）の環境を意味するものである。真の微小重力環境は宇宙空間である。重力は依然として存在するが他の力がそれに打ち勝つので、浮揚は微小重力をシミュレートする。
【００４３】
「圧電ディスペンサー」という用語は、ここでは主にピコリットル範囲での、フロースルー圧電小滴ディスペンサーを意味するものである。
【００４４】
「状態図」という用語は、所定の条件下での溶液相と固体相の間の基本的関係を表す図を意味するものである。図は、所定の分子、例えばタンパク質について、所定の物理的条件下での実験による測定に基づいている。それは、状態図において区別される過飽和領域と不飽和領域を含む。この２つの領域の間の境界が溶解度の線を構成している。とは言え、溶解度を正確に決定するためには、まず結晶を入手しなければならない。簡単な状態図の一例を図２に示す。「析出図」は状態図の簡易版であって、普通は状態図から取り出す情報の一部を引き出すことができるが、結晶を作る必要はない。
【００４５】
「析出剤」という用語は、流体又は気体から他の物質を析出させるために用いられる物質を意味するものである。
【００４６】
「溶解度」とは、同じ分子の結晶と平衡状態にある溶液中の巨大分子の濃度として定義される。
【００４７】
「濁度」という用語は、懸濁液中の析出物によって生じる曇り、例えば懸濁している沈泥又は有機物による水中の曇り状態、を意味するものである。ここで用いる曇り度又は濁度は、溶液からの巨大分子の析出による。析出（沈澱）の度合いが濁度として測定される。
【００４８】
「比濁法」という用語は、水サンプルに光を通してそらされた光の量を測定することによって水サンプルの濁度を測定する方法を意味するものである。可視光に流体又は気体を通過させ、入射する放射エネルギーの一部が吸収、反射及び散乱で散逸し、残りが透過する。散乱した光の強度を、分散相に対していろいろな角度で測定することが比濁法分析の基本である。
【００４９】
「アモルファス析出」という用語は、部分的折りたたまれていない巨大分子かあるいは完全に折りたたまれていない、すなわち変性した分子からなる、凝集する可能性がある非結晶性の固体相を意味するものである。巨大分子のアモルファスな、すなわち無秩序な析出は、秩序ある結晶の対極にある。
【００５０】
浮揚法を使用する核生成のスクリーニング
浮揚させた小滴（ｄｒｏｐｌｅｔ）を用いる技術は公知である。本発明は、この技術を分子の、例えばタンパク質などの巨大分子の核生成条件のスクリーニングのために利用する。この技術を用いると、小さな容量を用いることと正確に制御することができ、小滴の溶質濃度を変えることができ、実験の間に小滴のｐＨを変えることができる。
【００５１】
本発明は、分子、例えばタンパク質の所定の析出剤による核生成傾向についての情報を速やかに引き出し、そしてその後、最適の手順と結晶化を標準的な方法で開始することができる。
【００５２】
核生成は、結晶成長よりも高い過飽和度を必要とする。界面又は壁の作用も、小滴の形状と体積も、核生成と成長の両方に影響を及ぼすことがある。従って、結晶化チャンバー又は小滴の幾何形状を定めなければならない。結晶化サンプルの音響浮揚は、油又はゲル中での無容器の結晶化と同等であることができ、これは効果的で有用であると分かっている。本発明では、音響浮揚をタンパク質の核生成条件のスクリーニングに使用する。
【００５３】
本発明を用いると、核生成スクリーニング手順に必要な時間と物質、ならびに実験装置の数は、公知の浮揚技術を用いて有意に減少する。この技術は、タンパク質や核酸のような巨大分子の如き特定の化合物の結晶化条件についての情報を与える。
【００５４】
本発明の１つの態様は、分子の核生成傾向をスクリーニングする方法であって、この方法は、流体又は気体の少なくとも１つの小滴を浮揚装置で浮揚させることと、浮揚させた小滴に少なくとも１つの物質を物質送給用のディスペンサーによって送給することと、核生成傾向を検出することと、核生成傾向を評点することとを含む。１つの態様において、核生成傾向は、ラマン分光法によって、好ましくは多角度光散乱と組み合わせて検出され、凝集体の形成、小滴の濁度又は小滴中の析出物の定量的測定値が得られる。しかし、それらの結果は、比濁法によっても得られるし、又は例１及び２に記載されているように、もっと手動式に、照明源を図４に概略を示した視覚的な読取装置と組み合わせて少なくとも１つの小滴における定量的な測定値を得ることもできる。本発明による方法は、以下で詳しく説明するように音響浮揚装置を圧電フロースルーディスペンサーとともに使用する。
【００５５】
核生成が起こる濃度領域についての知識は、本発明の方法を用いると、蒸気拡散又は透析実験からの結果を待つよりも速やかに得ることができる。
【００５６】
本発明の１つの態様では、スクリーニングからの完全な結果が１、２、３週間未満後に得られ，核生成傾向の評点は３０分、１、２、３、５、１０時間未満後に得られる。最適化された検出手段、例えばラマン分光法及び多角度光散乱と組み合わせると、核生成傾向は１０ミリ秒〜３０分後には既に検出できる。これに対して、従来技術の方法を使用すると何ヶ月もかかる。
【００５７】
Ｘ線分析用の良質の結晶を得るための最適化された条件は、大規模な結晶化手順が用いられる場合、本発明に従って、より多くの必要条件を含めることができ、より多くのより大きな形状の良質な、例えばＸ線品質の結晶が得られるように選ぶことができる。本発明により１つ以上の析出剤を注入した浮揚小滴を用いる既知の方法はまた、状態図の主要な特徴を決定する簡易化した方法を提供することもできる。その場合、もっとたくさんの実験（１０〜１５μＬの小滴体積による実験）が、タンパク質濃度の勾配にわたって溶解度を測定し、条件を最適化するために必要になるが、それでも時間と物質の節約は相当なものになる。
【００５８】
本発明では、浮揚させた小滴に図５Ａのピコリットルのフロースルーディスペンサーを用いて、核生成条件に影響を及ぼす１つ以上の析出剤、例えば塩、ＰＥＧなどのポリマー又はグリセロールなどを注入し及び／又はアルコールを加えることによって核生成相を制御する。図８は、水、５０％グリセロール、又はＰＥＧ４０００とグリセロールの混合物を、いずれの場合もディスペンサーを用いて加えたときのディスペンサーの性能を示している。図８Ａにはノズルが示されており、７Ｂには水が示され、７Ｃには２０％グリセロールが示され、図７Ｄには５０％グリセロールが示され、そして７Ｅには２０％グリセロールと２４％ＰＥＧ４０００が示されている。溶液を不安定な、過飽和の状態にするのに必要な析出剤濃度は、小滴の濁度を目で監視することによって、すなわち析出、凝集体形成、沈澱又は結晶形成することにより小滴の白化が起こるときに、測定することができる。その場合、図２に示した状態図の析出ゾーンは、添加剤の上限に到達した後に確定できる。状態図のこの領域を出発点として、同じ又は他の析出剤又は水を加えて蒸発を防いだりバランスさせたりすることで、核生成ゾーンへの入口に到達するよう微調整することができる。
【００５９】
その後、核生成傾向を、図５Ｂにおけるように顕微鏡に結合した白黒ビデオカメラを冷光源又は例えば６５０ｎｍ未満の低エネルギーレーザー、比濁法又は最も好ましい態様におけるように、定量的測定値を得るために多角度光散乱と組み合わせてもよいラマン分光法とともに用いることによって求めることができる。
【００６０】
得られた画像は、当業者にとっては従来から公知のフレーム取り込みカードを用いて集め、ＮＩＨ  Ｉｍａｇｅ（商標）（http://rsb.info.nih.gov/nih-image/index.html）、ＬａｂＶＩＥＷ（商標）、又はＭａｔＬａｂ（商標）などのコンピュータプログラムを用いて分析することができる。
【００６１】
超音波浮揚装置を使用して浮揚させた小滴をスクリーニングするためのシステム
核生成条件をスクリーニングするための本発明によるこのシステムは、少なくとも１つの小滴を所定の位置に配置させるための少なくとも１つの浮揚装置と、配置した小滴に少なくとも１つの物質を送給するための少なくとも１つのディスペンサーと、該少なくとも１つの浮揚させた小滴における核生成傾向を検出する１つ以上の手段を含む。
【００６２】
当業者に公知のどんな浮揚装置を用いることもでき、本発明はここで言及されるものによって限定されるものではない。本発明によるシステム及び方法で用いられる浮揚装置の例は、音響（超音波とも呼ばれる）、静電、気流、磁気浮揚装置、又はそれらの任意の混成装置、例えば音響−静電混成浮揚装置など、である。例を挙げるとすれば、ドイツ国ＥｒｌａｎｇｅｎのＤＡＮＴＥＣ／ｉｎｖｅｎｔ  Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ＧｍｂＨからのＡＰＯＳ  ＢＡ  １０などの音響浮揚装置を浮揚実験に使用することができる。超音波浮揚装置は、超音波放射器と固体反射器の間の多重反射によって等間隔の節と腹を有する定在波を発生する装置である（図３）。図３には、プロセスチャンバなしの超音波浮揚装置が示されており、１はマイクロメータ調整ねじ、２は圧電センサコネクタ、３は圧電センサ、４は反射器、５は超音波変換器、６は吸収体、そして７はＨＦ（高周波）コネクタである。
【００６３】
本発明の１つの特定の態様は、図９の機器構成を用いる。図９では、浮揚させた小滴ａが、超音波浮揚装置の超音波変換器ｂと超音波反射器ｃの間に作り出された定在波の節に捕捉されている。浮揚させた小滴への添加のために、ピコリットルの小滴出口ｄi、フロースルーチャンネルの入口ｄii及び出口ｄiiiを備えた圧電フロースルーディスペンサーが用いられる。ディスペンサーは、電圧、パルス及び関数発生器を含むディスペンサー制御ユニットｅによって操作される。浮揚させた小滴の監視のために、それに限定されるわけでなく、例えばＰｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ  Ｓｃａｎ  ＣＶ−Ｍ１０ＲＳＣ（スウェーデン国ストックホルムのＰａｒａｍｅｔｅｒ  ＡＢ）のようなＣＣＤカメラｈを備えた顕微鏡ｇを、小滴を照明するための冷光源ｆ及び小滴体積の計算と小滴の濁度の監視のためのＰＣｉと組み合わせて使用する。
【００６４】
本発明による浮揚装置は、１ｋＨｚ〜１００ＭＨｚの周波数、例えば１００〜２００ｋＨｚで作動して、体積が約１ｆｌ〜１００μｌ、例えば２５０ｎｌ〜１μｌなど、の液体小滴のような小さな対象物を定在超音波の節点で浮揚させて保持することができる。浮揚させた小滴は任意の時間間隔で固定位置に維持されるので、研究しているプロセスは周りの媒質、この場合空気、以外の接触表面の影響によって乱されることはない。
【００６５】
小滴を超音波の音場の定位置に配置するために、針、例えば１０μｌのＨａｍｉｌｔｏｎ注射器を用いることができる。他の選択肢は、当業者に公知の通常のディスペンサー、例えばマイクロピペット、ナノチップ、ハイドロニューマチックディスペンサー、「デッドエンドシューター」、等である。１つの態様では、参照によりここに組み入れられ、また下記で更に説明される、国際公開第９９／４４７４６号パンフレットに詳しく記載されたフロースルー圧電ディスペンサーが用いられる。サンプルの小滴は針の先端から毛細管、例えば米国アリゾナ州フェニックスのＰｏｌｙｍｉｃｒｏ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．によるＴＳＰ  ０２５  ３７５、又は類似品によって取り出すことができ、その後小滴を超音波音場の定位置に配置する。小滴は常に、浮揚装置の中央の真上の節点に配置する。小滴の大きさは、用途によって変えることができる。本発明の１つの態様では、小滴は５０ｐｌ〜３μｌであり、例えば平均の大きさが５０ｐｌ〜１μｌである。
【００６６】
本発明によるシステムはまた、核生成の傾向を検出する手段を含み、これは１つの態様ではラマン分光法を用いることができ、最も好ましい態様ではそれを多角度光散乱と組み合わせて用いることができる。別の態様では手動の手段を、例えば図４に示したような微小毛細管小滴体積測定、又は白黒ビデオカメラ、例えば、それだけに限定されないが、Ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ  Ｓｃａｎ  ＣＶ−Ｍ１０ＲＳＣ（スウェーデン国ストックホルムのＰａｒａｍｅｔｅｒ  ＡＢ）などのＣＣＤ（電荷結合素子）カメラを、図５Ｂのように冷光照明源付きの顕微鏡に結合したもの、又は比濁法を用いて、少なくとも１つの小滴における凝集体の形成を定量的に測定する。
【００６７】
タンパク質溶液への析出剤添加の制約の１つは、過飽和を評価する原始的な方法である、小滴の乳白光又は濁度の視覚的な監視による観測であった。１つの態様では、ラマン分光法（Ｓｃｈｗａｒｔａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｃｒｙｓｔ．  Ｇｒｏｗｔｈ  ２０３：５９９（１９９９））と多角度光散乱が小滴における濁度、析出又は凝集体の形成の定量的測定値を得るために用いられる。スクリーニングするときには、これを簡易で好適な、且つ評点するのが可能な監視方法のために顕微鏡及びビデオカメラの装備と一緒にしてもよい。
【００６８】
更に別の態様では、システムはコンピュータユニットで制御され、特にカメラは図５Ｂに示されているような制御ユニットにより制御される。カメラとシステムを制御し、且つ小滴の大きさなど、小滴を分析するために適当なプログラムは、当業者にとって明らかである。例をあげると、それだけに限定されないが、ＬａｂＶＩＥＷ（商標）（米国テキサス州オースティンのＮａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）及びＭａｔＬａｂ（商標）（米国マサチューセッツ州ＮａｔｌｉｃｋのＭａｔｈ  Ｗｏｒｋｓ  Ｉｎｃ．）などがある。このようなカメラ監視を小滴寸法の自動化された計算と結びつけることによって、例えばタンパク質レベルなどの濃度が容易に計算され、そして例えばプロットされる。このような操作も迅速化されて、核生成傾向の条件をスクリーニングする全所要時間を減少させる。１つの装置で用いられる体積計算プログラムの画像を図１０に示す。
【００６９】
システムは少なくとも１つの浮揚させた小滴、例えば２、３、４、５、６、７、８、９、１０又はそれ以上の小滴における核生成傾向の検出に最適な仕方で配置される。これは、例えば照明源に関しては、各浮揚させた小滴を回転する光で照明できるような仕方で少なくとも１つの小滴を中央照明源の周りに配置するように、配置することができる。もちろん、いくつかの小滴を配置することは並行した分析を可能にし、いくつかのタンパク質や巨大分子の核生成傾向の適切な条件を見つけるためのスクリーニングの全所要時間を短縮する。
【００７０】
浮揚させた小滴はまた、実験の部で更に説明するように溶解度の研究にも有用である。
【００７１】
フロースルー圧電ディスペンサー
フロースルー小滴ディスペンサーを用いることによって、体積のはっきりしている薬剤を浮揚させた小滴に精密に注入することができる。例えば、連続的な水の添加によって蒸発に対応してバランスを保つことができる。好ましい態様で用いられるフロースルーピコリットルディスペンサーは、シリコン微小機械加工法を用いて、ＬｕｎｄのＬｕｎｄ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙのＥｌｅｃｔｒｉｃａｌ  Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ部門の内部で開発されている。本発明による装置は、圧電エレメントにパルスを印加することによって毎秒５００個までの速度で小滴を射出することができる。実際に射出される小滴の体積はディスペンサーノズルの寸法、液体の性質、及びパルスの振幅に依存する。浮揚実験に使用されるディスペンサーは、Ｐｅｔｅｒｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（Ｊ．  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．  ７１４：３９；  １９９８）又はＮｉｌｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（Ａｎａｌ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎｓｔｒ．  Ｓｐｅｃｉａｌ  Ｉｓｓｕｅ  μ−ＴＡＳ’９６，  ９６：８８；  １９９６）に記載されているように、約４０×４０μｍの寸法のノズルを有することができ、また位置合わせを容易にするため実験の間ずっとＸＹＺ−ミクロポジショニングステージ上に取り付けることができる。１つの態様では、析出剤の添加のためのディスペンサーは、例えば１ｐｌ〜３μｌの小滴を１滴から約−９０００Ｈｚまで射出するように設定することができる。
【００７２】
浮揚させた小滴に物質を添加する別のやり方は、Ｈａｍｉｌｔｏｎ注射器を米国テキサス州オースティンのＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｇｌａｓｓ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｉｎｃ．からの５Ａ−ＳＯＣ−１００ＳＡなどの毛細管溶融シリカ針とともに使用するもので、上記のような通常のディスペンサーや同様の製品は当業者には明らかである。
【００７３】
本発明によるディスペンサーは、浮揚させた小滴に少なくとも１つの物質を添加することができ、小滴に送給される物質は核生成条件に影響を及ぼす物質であり、例えば塩、ＰＥＧ（ポリエチレングリコール）などのポリマー、グリセロール、水その他の溶媒、例えばアルコールなどの有機溶媒である。それはまた、巨大分子、例えばタンパク質、膜タンパク質、オリゴペプチドやポリペプチドなどのペプチド、酵素、レセプタ、薬剤化合物、ＤＮＡやＲＮＡなどの核酸、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、又はそれらの複合体や集合体のような、スクリーニングされる分子を送給することもできる。複合体や集合体には配位子を含めることもでき、それは１つ以上の天然の配位子、金属又は塩、あるいは薬剤化合物でもよい。
【００７４】
システム及び方法の利用
本発明による上述のシステム及び方法は、何らかの分子、例えば巨大分子に関する核生成傾向のスクリーニング、又は結晶化条件もしくはアモルファス段階条件のスクリーニング、例えばタンパク質、膜タンパク質、オリゴペプチドやポリペプチドなどのペプチド、、酵素、レセプタ、薬剤化合物、ＤＮＡやＲＮＡなどの核酸、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、巨大分子、巨大分子集合体又は複合体などの分子についての、結晶化条件又はアモルファス段階条件のスクリーニングに利用することができる。
【００７５】
アモルファス段階は、アモルファス析出物によって特徴づけられる。分子、例えば上述の巨大分子のアモルファス析出物ならびに結晶は、製薬産業において合理的な薬剤設計に利用できる。また、特定分子についてのアモルファス段階は、実際の薬剤調合物、組成物、又は薬剤組成物でも利用することができる。
【００７６】
合理的な結晶化の研究は、所定の物理的条件下での所定のタンパク質についての状態図の基礎となる実験的な測定に基づかなくてならない。
【００７７】
ある系の状態図は、固体相が形成され、また液体相と平衡するために必要な物理的パラメータを定量的に表現するものである。それは、どんな条件でアモルファス析出物が現れるか、溶質の核生成がいつ起こるか、図のどの領域で結晶が成長するか又は決して形成されないかについて、直接の情報を与える。化合物の溶解度に対するｐＨ、温度及び析出剤の依存性も決定される。同様な理由により、タンパク質を結晶化するときにも、状態図を作成することが有用であるが、巨大分子結晶学の分野ではそれが実際に行われることはめったにない。１つの理由は、貴重な物質、例えばタンパク質、膜タンパク質、オリゴペプチドやポリペプチドなどのペプチド、酵素、レセプタ、薬剤化合物、核酸、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、又はそれらの複合体もしくは集合体が、あまりに多く必要とされることである。
【００７８】
簡単な状態図を図２に示す。当業者が用いる標準的な手順ではこれは考慮されず、それが更に、大規模な一連の実験の結果がランダムになる一因となる。状態図は、タンパク質結晶を合理的な仕方で成長させるために必要な基本的且つ最も重要な知識の１つを提供する。状態図は、特定のタンパク質の結晶化条件が少なくともある程度まで既に知られている場合に最も効率的且つ最も広範に決定できる。未知のタンパク質の場合にはそうなっていないので、浮揚法を用いるのが状態図の一部を決定するために有利になろう。例１で、本発明による浮揚法を用いて核生成傾向がスクリーニングされた後のＺ１／Ｚ２の状態図が提示される。
【００７９】
状態図の簡易版が析出図（ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ  ｄｉａｇｒａｍ）であって、それでは状態図から得られる情報の一部を引き出すことができるが、完全な結晶を形成する必要はない。
【００８０】
小滴の処理
本発明によるシステム及び方法は、無接触のミクロ環境を作り出すために、超音波浮揚などのような浮揚のための装置に基礎を置いている。特別に設計されたフロースルーディスペンサーによって、ピコリットル（ｐｌ）スケールの送給システムが実現される。必要とされる量が少なく、接触する表面がないということが、この浮揚システムを巨大分子結晶化のスクリーニングにきわめて有用なものにしている。タンパク質溶液の１滴を浮揚装置に入れ、そしてディスペンサーを使って析出剤をこの体積中へ高い精度で注入する。液滴の蒸発を利用し、また添加量を変える可能性を利用して、浮揚させた小滴の組成をタンパク質、添加物、及び析出剤の濃度に関して容易に変えて、単一の実験で濃度の全範囲をスクリーニングすることが可能になる。この方法は、時間、労力、及び材料の節約になる。
【００８１】
顕微鏡画像技術を用いて、液滴体積を絶えず制御し、液滴内での凝集体形成の定性的な情報を得る。
【００８２】
図４には、核生成傾向をスクリーニングするときに液滴を手動で処理する方法の概略が示されている。これは、１の注射器、例えばＨａｍｉｌｔｏｎ注射器の針から小滴を垂れ下がらせること、２の溶融シリカ毛細管によって針から小滴を取り去ること、小滴を溶融シリカ毛細管から垂れ下がらせること、４の超音波場に所定の位置に小滴を配置すること、５の超音波場から液滴を取り出すこと、６の溶融シリカ毛細管の所定の位置に小滴を配置して定位させ微小毛細管に吸い込ませること、７の小滴を充填された微小毛細管の顕微鏡観察と体積の測定を行うこと、そして微小毛細管の中身を微量滴定プレートに移すことを含む。小滴の処理は、上述のディスペンサーで行っても、あるいはマイクロピペット又はナノピペットを用いて行ってもよい。
【００８３】
核生成傾向のスクリーニングを利用するタンパク質結晶化条件の最適化
図５ＡとＢは、タンパク質溶液の小滴を浮揚させて保持するために音響浮揚装置を用いる核生成条件をスクリーニングするための機器構成を示す。添加のために２つの異なるフロースルーディスペンサーが用いられる。１つは析出剤の添加のためのものであり、もう１つは希釈実験で水を添加するためのものである。
【００８４】
本発明の１つの態様をテストし、浮揚法のアプローチを利用してタンパク質をスクリーニングする。ギ酸デヒドロゲナーゼ（ＦＤＨ）は、遺伝学的に変性されたきわめて溶けやすいタンパク質であって、それからは回折の研究に十分良質の結晶はこれまで得られていない。サンプルは、ドイツ国ハンブルグのＲｏｂ  Ｍｅｉｊｅｒｓ，  ＥＭＢＬが快く提供してくれた。ＦＤＨはＮＡＤ依存酵素で、その構造はＮＡＤ複合体として以前に解明されており、それをＮＡＤＰ+−結合タンパク質に変換するために部位指定の突然変異誘発が行われた。ＦＤＨを使用して、他の方法を用いて以前に試みられた浮揚法についての同様の条件をチェックした。突然変異体のＦＤＨを、ＮＡＤＰ+複合体及び配位子なしの両方として、グリセロールの存在下及び不在下でテストした。イオン依存性を調べるために、浮揚法を用いて多数の析出用溶液をスクリーニングした。最大１μＬの体積のタンパク質サンプル溶液の小滴を音響浮揚装置の所定の位置に配置した。
【００８５】
タンパク質溶液を１０μＬのＨａｍｉｌｔｏｎ注射器に保持し、１μＬの液滴を取り出して超音波音場に移した。次に、析出剤をフロースルーピコリットルディスペンサーを使って浮揚させた小滴に注入した。米国カリフォルニア州Ｌａｇｕｎａ  ＮｉｇｕｅｌのＨａｍｐｔｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈからの溶液キットを使用した。全ての薬剤を実験の前に滅菌濾過した。
【００８６】
最初に、溶液を不安定な過飽和状態にするために必要な析出剤濃度を、液滴濁度（析出により起こる液滴の白化）の目視による監視によって、０〜６０分以内、例えば０〜１５分以内、又は早くも約３０〜１２０秒後に、測定した。
【００８７】
突然変異体のＦＤＨでは、実験の開始時点で、硫酸アンモニウムが天然タンパク質の結晶生成の場合のように析出剤として使用するのが不可能であることが分かった。更に、従来技術の方法を用いた先行実験から、有機溶剤よりもポリマーが析出剤として良好であることが示唆された。従って、析出剤の選択は主に、イミダゾール緩衝液中で中性ｐＨでありいろいろなタイプの添加剤を使用するＰＥＧ  ４０００に限定された。添加剤の選択には、結晶化には酢酸アンモニウムが不可欠であるという先行の経験が指針となった。突然変異体のＦＤＨはヒスチジンタグを持っているので、ヒスチジンに結合できることがコバルトイオンを添加する根拠になった。
【００８８】
浮揚法を用いた実験からは、先行して他の方法を用いて得られたのと同じ結果が得られた。リン酸塩緩衝液（ｐＨ７）中の７．９ｍｇ／ｍＬの突然変異体ＦＤＨは、０．０２Ｍの酢酸アンモニウム（ｐＨ６．５）中において１６％のＰＥＧ  ４０００で析出させたときに１週間以内に結晶を生じることが分かった。Ｈ2Ｏ中１６％のＰＥＧ  ４０００で９．１ｍｇ／ｍＬのタンパク質を析出させたときも結晶が、この場合は２日以内に、得られた。グリセロールを含むタンパク質サンプル（２０％グリセロール）で行った実験ではタンパク質の結晶は生じず、その代わりに析出剤が結晶化した。
【００８９】
突然変異体ＦＤＨの場合、用いた析出剤により溶液で核生成が起こらなかったので、グリセロールは使用するのが不適当であると判明した。使用する析出剤のタイプに関わりなく、グリセロールの存在下では核生成は起こらない。これに対して、グリセロールが存在しない場合、核生成が起こり、結晶が形成された。実験からはまた、核生成は酢酸アンモニウムの存在下でも不存在下でも起こりうることが示される。テストした条件下では、コバルトイオンの添加はタンパク質の結晶を生ぜず、代わりにピンクの球晶、多分Ｃｏ−結晶、が形成された。共同因子（ｃｏ−ｆａｃｔｏｒ）と変異体ＦＤＨの複合体は核生成傾向を示さなかったが、得られた結果は、新しい結晶化実験をどんな条件及びどんな濃度範囲で開始すべきかという指針として利用できる。実験により、複合体が析出するか又は溶液中に残る条件のはっきりとした指標がもたらされた。
【００９０】
これらの結果は、約０．５ｍｇのタンパク質を用い、液滴の濁度、例えば析出により起こる液滴の白化を目視で監視して、浮揚法により２週間以内に得られた。濁度の個々の読み取りは１５分以内に行われた。これに対して、標準的な方法を使用する実験では、１００ｍｇのタンパク質を１年間使用して同じ結果が得られた。
【００９１】
タンパク質溶液への析出剤の添加の１つの制約は、過飽和を評価する原始的な方法である目視での小滴の乳白光、又は濁度の監視による観測であった。好ましい態様においては、濁度、小滴中での析出物又は凝集体の形成の定量的な測定値を得るためにラマン分光法（Ｓｃｈｗａｒｔａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｃｒｙｓｔ．  Ｇｒｏｗｔｈ  ２０３：５９９（１９９９））と多角度光散乱を使用する。これは、スクリーニングするときに容易に且つ好適に、また評点できる形で監視するために顕微鏡及びビデオカメラ装置と組み合わせてもよい。
【００９２】
随意に、システムをコントロールするとともに、例えば小滴の大きさを、浮揚装置から小滴を取り出さずに計算するために、ＰＣなどのコンピュータを使用してもよい。
【００９３】
実験
物質と方法−一般的説明
使用したタンパク質
ウマ伝染性貧血ウイルスｄＵＴＰａｓｅ（ＥＩＡＶ  ｄＵＴＰａｓｅ）、１０ｍＭ  ＭＯＰＳ緩衝液ｐＨ７．２中に２０ｍｇ／ｍＬ及びＭＯＰＳ緩衝液ｐＨ７．０中に６８ｍｇ／ｍＬ、及びＥ．  ｃｏｌｉ  ｄＵＴＰａｓｅ、１０ｍＭ  ＭＯＰＳ緩衝液ｐＨ７中５０ｍｇ／ｍＬ（スウェーデン国ＬｕｎｄのＬｕｎｄ  ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙのＲｅｂｅｃｃａ  Ｐｅｒｓｓｏｎ博士からいただいたもの）。タイチン（ｔｉｔｉｎ）のＺ１／Ｚ２ドメイン（ドイツ国Ｏｕｔｓｔａｔｉｏｎ  Ｈａｍｂｕｒｇ、ＥＭＢＬのＭａｒｔｉｎ  Ｆｏｒｓｔｅｒからいただいたもの）、１ｍＭ  ＮａＮ3入りＨ2Ｏ中に６０ｍｇ／ｍＬ。Ｄ−セリン−デヒドラターゼ（Ｄ−ＳＨ）、Ｈ2Ｏ中に６０ｍｇ／ｍＬ（Ｏｂｍｏｌｏｖａ，  Ｇ．，  Ｔｅｐｌｙａｋｏｖ，  Ａ．，  Ｈａｒｕｔｙｕｎｙａｎ，  Ｅ．，  Ｗａｈｌｅｒ，  Ｇ．  ＆  Ｓｃｈｎａｃｋｅｒ，  Ｋ．  Ｄ．，  Ｃｒｙｓｔａｌｌｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｙ  Ｘ−ｒａｙ  Ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  Ｄ−ｓｅｒｉｎｅ  Ｄｅｈｙｄｒａｔａｓｅ  ｆｒｏｍ  Ｅ．  ｃｏｌｉ，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２１４：６４１−６４２（１９９０））。
【００９４】
析出溶液
タンパク質の結晶化用の標準的な蒸気拡散実験で用いられるＨａｍｐｔｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（米国カリフォルニア州Ｌａｇｕｎａ  Ｎｉｇｕｅｌ）から市販されているキット（Ｃｒｙｓｔａｌ  ｓｃｒｅｅｎ  １  （ＨＲ２−１１０）及びＣｒｙｓｔａｌ  Ｓｃｒｅｅｎ  ｃｒｙｏ  （ＨＲ２−１２２））をテストした。
【００９５】
別のアプローチは、“Ｓｔｕｒａ  ｆｏｏｔｐｒｉｎｔｉｎｇ  ｓｏｌｕｂｉｌｉｔｙ  ｓｔｒａｔｅｇｙ”（Ｓｔｕｒａ，  Ｅ．Ａ．，  Ｎｅｍｅｒｏｗ，  Ｇ．Ｒ．  ＆  Ｗｉｌｓｏｎ，  Ｉ．Ａ．，  Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｃｒｙｓｔａｌｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｏｍｐｌｅｓｅｓ，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｒｙｓｔａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  １２２：２７３−２８５（１９９２））を酵素Ｄ−セリン−デヒドラターゼに関する表４に従って我々の目的に合わせて修正したものに従うものであった。ＰＥＧ溶液は、イミダゾールの２Ｍ溶液とリンゴ酸の２Ｍ溶液から混合して、所望のｐＨにし０．１Ｍに希釈した０．１Ｍイミダゾール・リンゴ酸緩衝液で調製した。硫酸アンモニウム溶液は、０．１Ｍイミダゾール・リンゴ酸緩衝液で所定のｐＨ範囲にわたり（そして必要な場合には調整して）調製した。リン酸塩溶液は、４Ｍ  ＮａＨ2ＰＯ4と４Ｍ  Ｋ2ＨＰＯ4からｐＨ７．０となるように調製した。ｐＨは、リン酸を用いて６．５に、またＮａＯＨを用いてｐＨ８に調整した。クエン酸塩溶液は、０．０１Ｍホウ酸ナトリウム緩衝液中で調製した。ｐＨ７．２の２Ｍマロン酸ナトリウムと０．１％ＮａＮ3を全ての溶液に加えた（ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ｓａｌｔｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｃｒｙｓｔａｌｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  １０：４１８−４２２（２００１））。
【００９６】
【表１】
2004532974.tif 000003
【００９７】
テストしたそのほかの析出剤溶液は、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ緩衝液中でｐＨ範囲７．５〜９．５にわたる１．５Ｍ硫酸アンモニウム、０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ緩衝液中でｐＨ範囲６．５〜８．５にわたる１．５Ｍ硫酸アンモニウム、ｐＨ５．５の場合水中及びｐＨ８．４の場合０．３Ｍ  Ｔｒｉｓ／Ｈ2ＳＯ4中の１．５Ｍ硫酸アンモニウム、０．１Ｍ  Ｈｅｐｅｓ中の７０％  ＭＰＤ  （Ｆｌｕｋａ  ｍｉｃｒｏｓｅｌｅｃｔ）から調製された、ｐＨ７．５の、２２．５％  ＭＰＤ、及び１５ｍＭ  ＭｇＣｌ2中の３０％（ｗ／ｖ）グリセロールであった。
【００９８】
ポリエチレングリコール（ＰＥＧ  ４００及びＰＥＧ  ４０００）はＨａｍｐｔｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈからのもの、イミダゾールはＦｌｕｋａからのもの、ＮａＨ2ＰＯ4、Ｋ2ＨＰＯ4、硫酸アンモニウム、クエン酸ナトリウム、ＭｇＣｌ2、及びＮａＮ3はＭｅｒｃｋからのもの、トリス（ヒドロキシメチル）−アミノメタン（Ｔｒｉｓ）とＨＥＰＥＳ−Ｎａ−塩（Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−Ｎ’−２−エタンスルホン酸−Ｎａ−塩）はＳｅｒｖａ  Ｆｅｉｎｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ  からのものであった。全ての化学薬剤は入手できる最高純度のものであった。
【００９９】
装置の構成
装置の構成を図９に示す。タンパク質溶液の小滴は、超音波浮揚装置ＡＰＯＳ  ＢＡ  １０（ドイツ国ＥｒｌａｎｇｅｎのＤＡＮＴＥＣ／ｉｎｖｅｎｔ  Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ＧｍｂＨ）の定在波の節点に捕捉される。この音響浮揚装置は、１００ｋＨｚの周波数で作動し、超音波放射器と固体反射器の間の多重反射によって等間隔の節と腹を持つ定在波を発生する。
【０１００】
シリコン微細機械加工法を使用して社内で開発されたフロースルー小滴ディスペンサーを、析出剤と水を添加するために用いる。ディスペンサーの小滴は、それぞれ長さ１３ｍｍ、幅６ｍｍ、厚さ２５０μｍの２つの微細構造シリコンプレートを接合して形成されるフロースルーチャンネルから射出される。フロースルーチャンネルは８ｍｍ×２ｍｍ×５０μｍという寸法で、体積は１μｌである。チャンネルの中央に、突出したピラミッド状のノズルが形成されている。多層圧電エレメントが、ノズルに対向するチャンネル壁に結合されている。圧電エレメントに短い電圧パルスを印加することにより、それが伸長してチャンネル内に押し入り、液体中の圧力パルスを発生させる。圧力の増加がノズル内の液体を加速して小滴が射出される。このプロセスを最高で数ｋＨｚに達する速度で繰り返すことができる。射出される小滴の体積はノズルの寸法、電圧パルスの形、そして表面張力、粘度及び密度のような液体のパラメータに依存する。ディスペンサーと応用例は、ほかのところにもっと広範囲にわたり記載されている（Ｐｅｔｅｒｓｓｏｎ  Ｍ，  Ｗａｈｌｕｎｄ  ＫＧ  ＆  Ｎｉｌｓｓｏｎ，  Ｓ．，  Ｍｉｎｉａｔｕｒｉｚｅｄ  ｏｎ−ｌｉｎｅ  ｓｏｌｉｄ−ｐｈａｓｅ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ｉｎ  ｃａｐｉｌｌａｒｙ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，  Ｊ．  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．  Ａ，  ８４１：２４９−２６１（１９９９）、（Ｏｎｎｅｒｆｊｏｒｄ，  Ｐ．，  Ｎｉｌｓｓｏｎ，  Ｊ．，  Ｗａｌｌｍａｎ，  Ｌ．，  Ｌａｕｒｅｌｌ，  Ｔ．＆  Ｍａｒｋｏ  Ｖａｒｇａ，  Ｇ．，  Ｐｉｃｏｌｉｔｅｒ  ｓａｍｐｌｅ  ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｉｎ  ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ  ｕｓｉｎｇ  ａ  ｍｉｃｒｏｍａｃｈｉｎｅｄ  ｓｉｌｉｃｏｎ  ｆｌｏｗ−ｔｈｒｏｕｇｈ  ｄｉｓｐｅｎｓｅｒ，  Ａｎａｌ．  Ｃｈｅｍ．  ７０：４７５５−４７６０（１９９８）、（Ｌａｕｒｅｌｌ，  Ｔ．，  Ｗａｌｌｍａｎ，  Ｌ．，  ＆  Ｎｉｌｓｓｏｎ，  Ｊ．，  Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ａ  ｓｉｌｉｃｏｎ  ｍｉｃｒｏｆａｂｒｉｃａｔｅｄ  ｆｌｏｗ−ｔｈｒｏｕｇｈ  ｄｉｓｐｅｎｓｅｒ  ｆｏｒ  ｏｎ−ｌｉｎｅ  ｐｉｃｏｌｉｔｒｅ  ｓａｍｐｌｅ  ｈａｎｄｌｉｎｇ，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｍｅｃｈａｎｉｃｓ  ａｎｄ  Ｍｉｃｒｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ９：３６９−３７６（１９９９）、（Ｓａｎｔｅｓｓｏｎ，  Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｉｒｂｏｒｎｅ  Ｃｅｌｌ  Ａｎａｌｙｓｉｓ，  Ａｎａｌ．  Ｃｈｅｍ．  ７２：３４１２−３４１８（２０００）、（Ｇａｓｐａｒ，  Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．  Ａ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  ｅｍｚｙｍｅ  ｍｉｃｒｏｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ｆｏｒｍｅｄ  ｂｙ  ｍｅａｎｓ  ｏｆ  ａ  ｆｌｏｗ−ｔｈｒｏｕｇｈ  ｍｉｃｒｏｄｉｓｐｅｎｓｅｒ，  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ７３：４２５４−４２６１（２００１）。浮揚実験で用いたディスペンサーは寸法が４０×４０μｍのノズルを有し、そして位置合わせを容易にするために実験全体にわたってＸＹＺ−マイクロポジショニングステ���ジに取り付けた。浮揚実験の間、析出剤添加のためのディスペンサーは６５ピコリットルの小滴を５０Ｈｚの速度で連続して射出するように設定された。液滴の体積が浮揚させるのに大きすぎるようになると、又は目に見える濁度に達したときに、添加を停止した。
【０１０１】
液滴の濁度の監視
液滴の濁度を監視するために、スウェーデン国ＬｕｎｄのＢｅｒｇｓｔｒｏｍｓ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓからの顕微鏡、Ｓｃｈｏｔｔからの冷光源、及びＮａｔｉｏｎａｌ  ＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓからのＣＣＤカメラとフレームグラバーを使用した。実験の間、液滴体積を図１０に示されているようにＬａｂＶＩＥＷ（商標）環境で作成されたコンピュータプログラムを用いて計算した。
【０１０２】
体積測定
液滴体積の計算のために、図１０に示されているようにＬａｂＶＩＥＷ（商標）環境でコンピュータプログラム作成した。
【０１０３】
浮揚スクリーニング手順
約１μｌの液滴を音響浮揚装置で浮揚させる。液滴は、適当な容積のＨａｍｉｌｔｏｎ注射器を用いるか、又はフロースルーディスペンサーを用いて、浮揚装置の所定の位置に配置することができる。フロースルーディスペンサーは、更に、浮揚させた小滴に析出剤や他の物質を添加するため、及び溶解目的で水を添加するために用いられる。液滴を、コンピュータに接続されたＣＣＤカメラにより、顕微鏡を通して連続的に監視する。顕微鏡画像を用いて、液滴体積の常時管理を実現し、液滴内の凝集体形成についての定性的な情報が得られる。液滴を、濁度すなわち光散乱の性質の変化について視覚的に調べ、そして液滴体積を連続的に計算して任意の時点における浮揚させた小滴のタンパク質及び析出剤濃度が得られる。浮揚スクリーニング実験で浮揚させたタンパク質液滴の一連の画像を図１１に示す。実験の間に液滴の体積と濁度が変化して、所定の条件下での液滴成分の析出挙動についての情報を与える。タンパク質及び析出剤濃度の関係を、図１２ＡとＢの析出図に示す。これらの図は、浮揚実験の際に、更なる実験ではどんな濃度を調べるのがよいかを決定するために用いられが、主には、スクリーニング実験の後で微小結晶をもたらすと予期される適切な過飽和度を選ぶために用いられる。結晶化実験はバッチ様式で計画されて点検される。
【０１０４】
バッチの結晶化
バッチの結晶化法では、巨大分子と１つ以上の析出剤をいろいろな比率で混合し、そして閉じたチャンバ内において一定の温度と圧力で放置して平衡させる。他の２つの方法の場合と同様に、多数のパラメータを調べて初めて巨大分子が核生成する濃度条件が見つかる。
【０１０５】
最適化実験
浮揚スクリーニング試験とバッチの結晶化試験の後、最適な単結晶成長の条件を見つけるために最適化試験が必要である。この段階でどの種類の結晶化方法を用いるかは、選択した好ましいものに大きく依存する。
【０１０６】
微小結晶形成の検証
図１２に例示されている析出図から、それぞれ巨大分子の全面的な析出が起こり及び低い過飽和度に到達する、巨大分子と析出剤の濃度についての上限及び下限が得られる。核生成が起こるためには過飽和についての臨界値が必要なので、結晶化実験の条件の最初の選択はこれらの２つの境界値の間で行われる。所定容量の巨大分子を適当な容量の析出剤と混合して、一定の選択された値に対応する最終濃度にする。通常は、２〜４μｌの小滴をその間の最少でも２点についてテストする。混合した溶液を小さな容器に入れてパラフィンオイルで覆い、放置して平衡させる。
【０１０７】
高倍率の顕微鏡で液滴を調べることによって、微小結晶が生じたかどうかが容易に明らかになる。微小結晶の形成の所要時間は数分から数日までにわたることができる。
【０１０８】
（例１）浮揚を使用する核生成のスクリーニング後に得られた部分状態図
背景
タンパク質断片Ｚ１／Ｚ２は、筋タンパク質タイチンの２つのドメインを構成する。サンプルはドイツ国ハンブルグ、ＥＭＢＬのＭａｔｔｈｉａｓ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ教授から提供を受けた。サンプルの理論的なｐＩ値は５．４１、分子量は２０６８９Ｄａであった。サンプル濃度は、Ｈ2Ｏ中に〜６０ｍｇ／ｍＬで、全部で１６０μＬの量が利用できた。以前に結晶化した条件は事前には分からなかった。実験は、状態図の析出ゾーンと核生成領域の間の境界を決定するのを目標としていた。硫酸アンモニウムを絶えず析出剤として使用し、タンパク質濃度は中性のｐＨで２０〜６０ｍｇ／ｍＬの範囲にあった。
【０１０９】
原理
フロースルーピコリットル（ｐｌ）ディスペンサー（図５）を用いて、析出剤を浮揚させた小滴に注入した。溶液を不安定な過飽和状態にするのに必要な析出剤濃度を、最初に小滴の濁度（析出により起こる小滴の白化）を目で監視して決定した。それによって添加の上限にただちに到達し、状態図の析出ゾーンが確立された。状態図のこの領域を出発点として、その後析出剤や水の添加を微調整して核生成ゾーンへの進入を調節するようにした。
【０１１０】
実験設備
体積が最大で１μＬのタンパク質サンプル溶液の小滴を音響浮揚装置に入れた。タンパク質溶液を１０μＬのＨａｍｉｌｔｏｎ注射器内に保持して、１μＬの小滴を取り出し、溶融シリカ毛細管（ＴＳＰ  ０２５  ３７５，米国アリゾナ州フェニックスのＰｏｌｙｍｉｃｒｏ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ）に移してから、超音波音場の所定の位置に配置した（図４）。毛細管を用いたのは、針からの小滴の離脱を容易にするためであった。
析出剤は表３に従って添加した。
【０１１１】
物質
キット（米国カリフォルニア州Ｌａｇｕｎａ  ＮｉｇｕｅｌのＨａｍｐｔｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）からの既製品の溶液を使用した。全ての薬剤を実験前に滅菌濾過し、一部はディスペンサーの必要条件に合わせるため希釈した。
【０１１２】
結晶化実験に用いたタンパク質を、標準のＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて電気泳動法により純度についてテストした。
立体ズーム顕微鏡Ｎｉｋｏｎ  ＳＭＺ  ８００、スウェーデン国ＬｕｎｄのＢｅｒｇｓｔｒｏｍ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ  ＡＢ。
【０１１３】
分析
浮揚実験の後、小滴を超音波音場から溶融シリカ毛細管により取り出し、５μＬのガラス毛細管（英国ＣｈｅｓｈｉｒｅのＤｒｕｍｍｏｎｄ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌｔｄ）に移し，顕微鏡の下に置いて小滴の体積を測定した（図４）。これに先立ち、小滴の体積と毛細管の長さとの関係をいろいろな大きさ及び組成の小滴を用いた校正手順で割り出した。ガラス毛細管の中身を微量滴定プレートの液だめに移し（図４）、そして小滴をパラフィンオイルで覆って小滴の蒸発とその結果生じる小滴組成の変化を防ぐようにした。小滴をただちに顕微鏡下で観察してアモルファス析出物の存在を点検した。
【０１１４】
結果を評価するために、表２による評点リストを使用した。この評点リストは小滴の視覚的検査に基づいている。普通、評点リストはＸ線回折データを基にしているが、そのアプローチはこの実験では実際のところ使用するのが不可能である。
【０１１５】
結果を表２に示されている評点リストに従って評点し、小滴濃度を計算した。プレートの読み取りを１週間の実験の間行った。
【０１１６】
【表２】
2004532974.tif 000004
【０１１７】
結果及び検討
表３と図６は、タイチン断片Ｚ１／Ｚ２について浮揚法で得られた結果を示している。テストされたＨ2Ｏ中のタンパク質断片Ｚ１／Ｚ２の最初の小滴は、ｐＩに対応するｐＨの水中のＺ１／Ｚ２がＨ2Ｏ中の２Ｍ  （ＮＨ4）2ＳＯ4（ｐＨ５．５）を加えると速やかに析出することを示した。濁るようになるには、０．６Ｍの塩が必要であった。１５ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度を用いた場合、結果は、溶液を状態図におけるいろいろなゾーンを通過させるために必要な濃度をはっきりと示している。
【０１１８】
【表３】
2004532974.tif 000005
【０１１９】
【表４】
2004532974.tif 000006
【０１２０】
顕微鏡での観察でも、最初にアモルファス析出物を示した液滴のいくつかは５〜１５分後に透明になることが明らかになり、それによりこのタンパク質の非常に溶解しやすい性質がはっきりした。これらのデータから、結晶化条件についての推奨データをドイツ国ハンブルグのＥＭＢＬチームに渡した。その後、硫酸リチウムを析出剤として用いて結晶の形成が観測されたことが明らかにされ、このことから、浮揚実験が示すようにＺ１／Ｚ２は（ＮＨ4）2ＳＯ4で析出させても結晶化できるように思われる。
【０１２１】
最適化条件を推奨できるためには、溶液から析出ゾーンを分離するデータがあると有益である。タンパク質範囲１０〜４０ｍｇ／ｍＬ（ｐＨ７）について部分的状態図を作成したが、その結果ははっきりと区別されるゾーンを示している（図６）。結晶に関してのタンパク質濃度を測定できなかったので、この部分的状態図の溶解度曲線は決定するのが不可能であった。この場合の推奨は、２０〜４０ｍｇ／ｍＬの範囲で、約０．５Ｍの塩濃度で作業をするということである。
【０１２２】
浮揚させた小滴の濃度を計算しなければならないので、小滴の体積決定が不可欠である。ミクロ毛細管を使用することは液滴の体積を測定するための簡単で安価な方法である。しかし、小滴が毛細管の中に引き込まれずに毛細管の先端につかまる傾向のあることが知られている。失敗する割合はほぼ５回に１回である。これは、浮揚装置から小滴を直接毛細管に引き込もうとすると起こりやすい。最良の方法は、浮揚装置から小滴を溶融シリカ毛細管で取り出して、その後で小滴をミクロ毛細管内に引き込むことであると思われる（図４参照）。しばしば小さな気泡が小滴中に形成されるので、毛細管から微量滴定プレートに移すことは別の問題を引き起こす。これらの気泡は小滴の監視を妨げ、そして調査中の核生成プロセスに変化を引き起こすこともある。
【０１２３】
過飽和度の監視を一層よくするために、例２におけるように顕微鏡と結合した白黒ビデオカメラを水滴の照明のための冷光源と組み合わせて用いてもよい。これは、適当なコンピュータプログラムと組み合わせると、データ収集と分析を簡単化し迅速化する。ＮＩＨ  Ｉｍａｇｅという名称の画像分析用のコンピュータプログラムがこの用途に適している。このプログラムは、インターネットで無償で入手できる（更なる情報とダウンロードの指示については、http://rsb.info.nih.gov/nih-image/index.htmlを参照）。小滴の濁度もこのように観測する方が容易である。
【０１２４】
（例２）ビデオとフレームグラビングを用いるＥ．ｃｏｌｉ  ｄＵＴＰａｓｅの核生成傾向のスクリーニング
背景
ｄＵＴＰａｓｅはＤＮＡ合成を調節する酵素であって、薬剤設計のための標的として用いられる。この酵素は既に結晶化されており、その構造が決定されている（Ｃｅｄｅｒｇｒｅｎ−Ｚｅｐｐｅｎｚａｕｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  ３５５：７４０（１９９２）、Ｄａｕｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔ．，  Ｄ５４：７３５（１９９８）、及びＤａｕｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２８５：６５５（１９９９））。
【０１２５】
原理
Ｅ．ｃｏｌｉ  ｄＵＴＰａｓｅは、ｐＨ４〜５で容易に結晶を形成するが、中性又はそれ以上のｐＨでは形成しない。５〜１０ｍｇ／μｌの間のタンパク質濃度を使用する多くの試みが失敗した。核生成傾向をスクリーニングした。Ｅ．ｃｏｌｉ  ｄＵＴＰａｓｅ酵素を用いて顕微鏡とビデオカメラを装備したシステムをテストした。
【０１２６】
実験設備
実験設備と装置は実施例１で概説したのと同じである。Ｅ．ｃｏｌｉ  ｄＵＴＰａｓｅでの実験を、例１のような顕微鏡体積評価アプローチを用いて行った。浮揚させたタンパク質溶液の小滴の異なる実験段階における画像を図７に示す。Ｅ．ｃｏｌｉ  ｄＵＴＰａｓｅの核生成傾向をビデオとフレームグラビングを用いてスクリーニングした。
【０１２７】
物質
タンパク質サンプルは実験１によって調製され、ｐＨ７．５の０．１Ｍ  Ｈｅｐｅｓ緩衝液中での濃度が３１ｍｇ／ｍＬであった。析出剤溶液として、ｐＨ７．５の０．１Ｍ  ＨＥＰＥＳ緩衝液中の７０％メチルペンタンジオール（ＭＰＤ）を使用した。
【０１２８】
インターライントランスファータイプの、１／２''フォーマットのプログレッシブスキャンＣＣＤセンサ付き白黒ＣＣＤ（電荷結合素子）ビデオカメラ（スウェーデン国ストックホルムのＰａｒａｍｅｔｅｒ  ＡＢのＰｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ  Ｓｃａｎ  ＣＶ−Ｍ１０ＲＳＣ）。
イメージグラバーＩＭＡＱ  ＰＣＩ−４０８  （スウェーデン国ＳｏｌｎａのＳｗｅｄｅｎ  ＡＢのＮａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）。
立体ズーム顕微鏡Ｎｉｋｏｎ  ＳＭＺ  ８００、スウェーデン国ＬｕｎｄのＢｅｒｇｓｔｒｏｍ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ  ＡＢ。
【０１２９】
分析
ＭＰＤを小滴に０〜３０％の濃度範囲で加え、全濃度範囲について小滴の光散乱特性を評価した。
結果を表２に示されている評点リストに従って評点した。
【０１３０】
結果及び検討
実験のいろいろな段階における浮揚させたタンパク質溶液の小滴の画像を図７に示す。Ａでは、浮揚装置に入れた最初の小滴の画像が示されている。この小滴は、ｐＨ７．５の０．１Ｍ  Ｈｅｐｅｓ中に１５ｍｇ／ｍＬのＥ．ｃｏｌｉ  ｄＵＴＰａｓｅの溶液からなる。振動によって誘発された小滴中の流れがはっきりと見られる。Ｂでは、ＭＰＤを小滴濃度２０％まで添加した後に小滴中に２相系が形成し始めている。結晶化のため、小滴をオイルの下で微量滴定プレートに配置した。７日後に大きな結晶が形成され、核生成領域に到達したと考えられ、浮揚実験の間に結晶が同定された。Ｃでは、ＭＰＤを小滴濃度３０％まで添加した後，２相系が完全に生じている。別の、同一の実験で、この状態にされた小滴を結晶成長のためオイル下で微量滴定プレートに配置した。２日後に微小結晶が形成され、核生成領域に到達したと考えられ、実験の間に結晶が同定された。各条件について核生成傾向を０〜１５分後に、ほとんどは最初の２以内に、スクリーニングする。この実験で本質的に分かったことは、１５ｍｇ／μｌより上で結晶が形成されるということであった。
【０１３１】
これらの結果から、本発明によるシステムはタンパク質の核生成領域を迅速に確定するのに有効であると考えられる。標準的な方法と比べた時の大きな利点は、タンパク質の小滴が状態図のいろいろなゾーン（タンパク質溶液、２相系、析出物等）を通過するのを直接観察するのが可能なことである。標準的な方法とは対照的に、タンパク質が特定の析出剤といろいろな濃度でどのように反応するかについての全ての必要な情報を、１μＬのタンパク質溶液の単一の小滴を用いて得ることができる。
【０１３２】
（例３）スクリーニング実験中の浮揚させたＤ−セリン−デヒドラターゼ小滴の一連の画像
物質及び方法、実験設備は、一般的な物質及び方法の説明によるものと同じである。
【０１３３】
結果
スクリーニング実験中の浮揚させたＤ−セリン−デヒドラターゼ液滴の一連の画像を図１１ａ〜ｆに示し、ａは最初のタンパク質液滴、ｂは「限界」の、過飽和の最初の徴候、ｃ〜ｅは過飽和のいろいろな段階、そしてｆはタンパク質の完全な析出を示している。液滴の形と大きさの違いは、添加及び／又は蒸発の際の液滴体積の変動による。これらの画像は６．３倍の倍率で記録された。画像は３０〜６０秒毎に記録され，約６回の記録が行われた。全実験時間は１０分であった。
【０１３４】
（例４）Ｄ−セリン−デヒドラターゼの析出グラフ
物質及び方法、実験設備は、一般的な物質及び方法の説明により行われた。
【０１３５】
検証及びバッチ実験
浮揚スクリーニングの後、タンパク質の核生成と結晶成長が図１２の析出グラフから選ばれた条件の下で起こるかどうか、もし起こるとしたら、どの程度、そしてどの品質のものになるかを確定するために、バッチ実験を行った。
【０１３６】
単結晶の成長のための条件を見つけるには最適化試験が必要であり、最適化実験をサンプルを提供したグループによって行った。Ｄ−セリン−デヒドラターゼについてのこれらの対照実験はオイルの下での結晶化を使用して行われ、図１３に示されている。
【０１３７】
結果
硫酸アンモニウムをｐＨ７．０で析出剤として用いたときのいろいろな濃度でのＤ−セリン−デヒドラターゼの析出限界を示す析出グラフの例を図１２Ａに示す。得られた析出グラフは、明確なスクリーニング目的のために、すなわち核生成傾向のおおまかな関係を確立し、更なるバッチ実験でその後用いられる情報を得るために用いられる。迅速であること、操作の容易さ、及び物質の消費が少ないことが有利とされる。
【０１３８】
図１２ＢとＣは、浮揚スクリーニング法で得られた析出グラフを示しており、図１２ＢはｐＨ７．０のＰＥＧ  ４０００によるＤ−セリン−デヒドラターゼの析出傾向を示している。その後、これらの結果をオイルの下での結晶化実験のための条件を選ぶのに利用した。図１２Ｃは、浮揚スクリーニングとバッチ実験の両方からの結果を示す組み合わせた析出グラフを示している。３０ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度と２０％ＰＥＧ  ４０００を用いて単結晶が得られるということが確認された。適切な条件を見つけて単結晶を得るのに全部で５０４μｇの量のタンパク質が必要であり、浮揚スクリーニング用に８４μｇ、オイルの下での結晶化実験用に４２０μｇが必要であった。
【０１３９】
Ｄ−セリン−デヒドラターゼについての対照及びバッチ実験はオイルの下での結晶化を使用して行われ、図１３に示されている。タンパク質と析出剤の液滴を、２４の液だめのプラスチックプレートに４μＬの体積として調製して、各液滴を２０〜５０μＬのパラフィンオイルで覆い、放置して平衡させた。結晶の画像をオイルの下での結晶化を使用して得て、上述の浮揚スクリーニング法を使用して条件を確立した。図１３で、Ｄ−セリン−デヒドラターゼの濃度は２８ｍｇ／ｍｌであり、硫酸アンモニウムはｐＨ７．０で０．９Ｍである。その後、最適化実験を行って結晶の大きさと質を微調整する。
【０１４０】
一般的評価、検討及び結論
スクリーニング法の評価
液滴の蒸発、ならびに添加の量を変えられることを利用して、浮揚させた小滴の組成をタンパク質、添加剤及び析出剤濃度に関して容易に変更して、１回の実験の範囲内で濃度の全範囲をスクリーニングするのを可能にする。この方法は、時間、労力、及び物質の節約になる。
【０１４１】
測定器、ディスペンサー及び浮揚装置の評価
このシステムは核生成条件を決定するのに明らかに有用である。浮揚装置はタンパク質を破壊せず、安定な浮揚を可能にし、析出を液滴内で行うことができる。
【０１４２】
音響的に浮揚させた小滴においては、結晶核が生成するが再び溶解することがある（Ｉｓｈｉｋａｗａ，  Ｙ．  ＆  Ｋｏｍａｄｅ，  Ｓ．，  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ａｃｏｕｓｔｉｃ  ａｎｄ  ｅｌｅｃｔｒｏｓｔａｔｉｃ  ｌｅｖｉｔａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｃｏｎｔａｉｎｅｒｌｅｓｓ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｒｙｓｔａｌｌｉｓａｔｉｏｎ，  ＦＵＪＩＴＳＵ  Ｓｃｉ．  Ｔｅｃｈ．  Ｊ．  ２９：３３０−３３８（１９９３））。静電浮揚装置（Ｒｈｉｍ，  Ｗ．  ＆  Ｃｈｕｎｇ，  Ｓ．，  Ｃｏｎｔａｉｎｅｒｌｅｓｓ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｒｙｓｔａｌ−Ｇｒｏｗｔｈ  Ｍｅｔｈｏｄ，  Ｊ．  Ｃｒｙｓｔ．  Ｇｒｏｗｔｈ  １１０：  ２９３−３０１（１９９１））又は静電−音響混成浮揚装置（Ｃｈｕｎｇ，  Ｓ．  Ｋ．  ＆  Ｔｒｉｎｈ，  Ｅ．  Ｈ．，  Ｃｏｎｔａｉｎｅｒｌｅｓｓ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｒｙｓｔａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｉｎ  ｒｏｔａｔｉｎｇ  ｌｅｖｉｔａｔｅｄ  ｄｒｏｐｓ，  Ｊ．  Ｃｒｙｓｔ．  Ｇｒｏｗｔｈ  １９４：３８４−３９７（１９９８））を使用することが、スクリーニング法において同様に有用であり、従って再び溶解することがない核を形成し、存続する結晶も形成する可能性をもたらすであろう。
【０１４３】
ディスペンサーはいろいろな析出剤溶液とともに使用するのに有効であることが示された。コンピュータプログラムが必要な精度で液滴体積を計算して、析出図を作成するために必要な情報である液滴内の成分の濃度を与えることができる。
【０１４４】
析出剤溶液の評価及びその選び方
Ｃｒｙｓｔａｌ  ｓｃｒｅｅｎ  １（ＨＲ２−１１０）は、まばらなマトリックスサンプリング手法を用いて広範囲のｐＨ、塩、及び析出剤を迅速にテストすることに基礎を置くものである（Ｓｐａｒｃｅ  ｍａｔｒｉｘ  ｓａｍｐｌｉｎｇ：  Ａ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｃｒｙｓｔａｌｌｉｓａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ，  Ｊａｎｃａｒｉｋ，  Ｊ．，  Ｋｉｍ，  Ｓ．  Ｈ．，  Ａｐｐｌ．  Ｃｒｙｓｔ．  ２４：４０９−４１１，１９９１）。更に、Ｃｒｙｓｔａｌ  Ｓｃｒｅｅｎ  ｃｒｙｏ（ＨＲ２−１２２）は、フラッシュ凍結を含む結晶の取扱い手順を考慮に入れ、従って低温保護剤、この場合いろいろな濃度のグリセロールを必要とする（Ｇａｒｍａｎ，  Ｅ．  Ｆ．  ＆  Ｍｉｔｃｈｅｌｌ，  Ｅ．  Ｐ．，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ  ２９，  ５８４−５８６（１９９６））。別のアプローチは、“Ｓｔｕｒａ  ｆｏｏｔｐｒｉｎｔｉｎｇ  ｓｏｌｕｂｉｌｉｔｙ  ｓｔｒａｔｅｇｙ”（Ｓｔｕｒａ，  Ｅ．  Ａ．，  Ｎｅｍｅｒｏｗ，  Ｇ．  Ｒ．  ＆  Ｗｉｌｓｏｎ，  Ｉ．  Ａ．，  Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｃｒｙｓｔａｌｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｒｙｓｔａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  １２２：２７３−２８５  （１９９２））を我々の目的に合わせてＤ−ＳＨについて表４によって修正したものに従うことであった。他のタンパク質に関しては、そのタンパク質の性質についての知識が析出剤の実際の選択を決定した。ＨＬＡＤＨ（ウマ肝臓アルコールデヒドロゲナーゼ）をモデル物質として使用して、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ緩衝液中の１．５Ｍ硫酸アンモニウムを析出剤として用いｐＨ範囲７．５〜９．５にわたって室温で装置をテストした。Ｅ．ｃｏｌｉ  ｄＵＴＰａｓｅの場合、使用した析出剤溶液は、ｐＨ７．５の０．１Ｍ  Ｈｅｐｅｓ中の２２．５％ＭＰＤ、及び１５ｍＭ  ＭｇＣｌ2中の３０％（ｗ／ｖ）グリセロールであった。Ｚ１／Ｚ２の場合、１．５Ｍ硫酸アンモニウム（ｐＨ５．５の場合には水中、及びｐＨ８．４の場合には０．３Ｍ  Ｔｒｉｓ／Ｈ2ＳＯ4中）を析出剤として使用した。
【０１４５】
一般に任意のタンパク質に関して、析出剤を選ぶ時には３つのカテゴリー、すなわち塩、ポリマー、及び粘性アルコール（２−メチル−２，４−ペンタンジオール）が選択される。タンパク質の特性についての知識がｐＨの範囲及び必要な添加剤を決定する。スクリーニングはできるだけ単純であるべきであり、可能ならば水に溶解したタンパク質を手に入れるのが好ましい。
【０１４６】
体積測定／濁度評価の評価
顕微鏡とビデオをコンピュータに接続し、液滴の大きさを測定しそして更にタンパク質や析出剤などのような添加される物質の濃度を計算するための計算プログラムを用いて自動化された調査は、処理を簡単にし核生成条件をスクリーニングする全所要時間を短縮する。更に、大きさの測定のために小滴を浮揚装置から取り出す必要がないので、このシステム及び方法は時間を節約するだけでなく、物質の節約にもなり、すなわちきわめて経済的な方法である。
【図面の簡単な説明】
【０１４７】
【図１】結晶成長に必要な核生成の臨界的大きさを示す概略図である。
【図２】簡単な２次元状態図の一例を示す図である。
【図３】プロセスチャンバなしで示した超音波浮揚装置の一例を示す図であり、１はマイクロメータ調整ねじ、２は圧電センサコネクタ、３は圧電センサ、４は反射器、５は超音波変換器、６は吸収体、７はＨＦコネクタである。
【図４】手動の小滴操作法を示す図である。
【図５Ａ】音響浮揚装置を、物質、例えば水と析出剤を小滴に添加するための２つのフロースルーディスペンサーとともに用いる核生成条件のスクリーニングのための機器構成を示す図である。
【図５Ｂ】白黒ビデオカメラを顕微鏡に結合して用いる小滴体積の監視と制御のための機器構成ユニットを示す図である。
【図６】浮揚法で確立されたタイチンのタンパク質断片、Ｚ１／Ｚ２、の部分状態図を示す。ｘ軸は硫酸アンモニウム濃度を示し、ｙ軸は巨大分子濃度を示す。緩衝系（イミダゾール／リンゴ酸塩、０．２Ｍ）及びｐＨ７を用いた。
【図７】実験の異なる段階での浮揚させたタンパク質溶液の小滴の画像を、図７Ｂに示した核生成段階を含め７Ａ、７Ｂ、及び７Ｃに示している。
【図８】水とグリセリンを用いたディスペンサーの性能を示す図である。図８Ａにはノズルが示され、７Ｂには水が示され、７Ｃには２０％グリセロールが示され、７Ｄには５０％グリセロールが示され、７Ｅには２０％グリセロールと２４％  ＰＥＧ４０００が示されている。
【図９】タンパク質の核生成条件を浮揚法でスクリーニングするための機器構成を示す図である。浮揚させた小滴（ａ）は、音響浮揚装置の超音波変換器（ｂ）と超音波反射器（ｃ）の間に作り出された定在波の節点に捕捉される。浮揚させた小滴に添加するために、ピコリットルの小滴出口（ｄi）、フロースルーチャンネルの入口（ｄii）と出口（ｄiii）を備えた圧電フロースルーディスペンサーが用いられる。ディスペンサーは、電圧、パルス及び関数発生器を含むディスペンサー制御ユニット（ｅ）によって操作される。浮揚させた小滴の監視のために、ＣＣＤカメラ（ｈ）を備えた顕微鏡（ｇ）が、小滴を照明するための冷光源（ｆ）及び小滴体積の計算と小滴濁度の監視のためのＰＣ（ｉ）と組み合わせて用いられる。
【図１０】ＬａｂＶＩＥＷ（商標）で作られた体積計算プログラムを用いているときの画面のスナップショットを示す図である。
【図１１】スクリーニング実験中に浮揚させたＤ−セリン−デヒドラターゼの小滴の一連の画像を示す図であり、ａは最初のタンパク質小滴、ｂは「限界（ｌｉｍｉｔ）」の、最初の析出の徴候、ｃ〜ｅは析出、そしてｆは完全析出物である。小滴の形と大きさの違いは、添加及び／又は蒸発の際の小滴体積の変動によりものである。これらの画像は６．３倍の倍率で得られた。
【図１２Ａ−１２Ｃ】１２Ａは、硫酸アンモニウムをｐＨ７．０で析出剤として用いたときのいろいろな濃度でのＤ−セリン−デヒドラターゼの析出傾向を示す析出グラフの一例を示す。１２Ｂは、浮揚スクリーニング法によって得られた、ｐＨ７．０でのＰＥＧ  ４０００によるＤ−セリン−デヒドラターゼの析出傾向を示す析出グラフを示す。次にこれらの結果を用いてオイルの下での最適化実験のための条件を選んだ。１２Ｃは、浮揚スクリーニング法と最適化実験の両方からの結果を示す組み合わせ析出グラフを示す。３０ｍｇ／ｍｌというタンパク質濃度と２０％のＰＥＧ  ４０００  を用いて単結晶が得られるということが立証された。
【図１３】硫酸アンモニウムを７．０のｐＨで用いた浮揚スクリーニング法を使用して確立された条件とオイルの下での結晶化とを使用して得られたＤ−セリン−デヒドラターゼの多結晶の画像を示す図である。この画像は、２８ｍｇ／ｍｌのＤ−セリン−デヒドラターゼ及び０．９Ｍの硫酸アンモニウムに対応する。
【図１】
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【図２】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図８】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【国際公開パンフレット】
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【手続補正書】
【提出日】平成15年1月31日(2003.1.31)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
流体又は気体中の分子の核生成傾向をスクリーニングするための方法であって、
ｉ．  前記流体又は気体の少なくとも１つの小滴を浮揚装置で浮揚させ、当該浮揚装置が気流浮揚装置又は音響−静電混成浮揚装置であること、
ii．  物質を送給するためのディスペンサーを用いて、前記浮揚させた小滴に少なくとも１つの物質を送給し、当該ディスペンサーが圧電フロースルーディスペンサーであること、
iii．  核生成傾向を、ラマン分光法、又はラマン分光法と組み合わせた多角度光散乱、又は比濁法により検出すること、及び
iv．  前記核生成傾向を評点すること、
を含む核生成傾向スクリーニング方法。
【請求項２】
前記核生成傾向を、顕微鏡及びカメラを使用する視覚的な監視で手動式に検出して、前記小滴における集合体形成、析出又は濁度の定量的測定値を得る工程を更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記小滴に送給される物質が、タンパク質、膜タンパク質、オリゴペプチドやポリペプチドなどのペプチド、酵素、レセプタ、薬剤化合物、ＤＮＡやＲＮＡなどの核酸、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、巨大分子、巨大分子集合体、又はそれらの複合体である、請求項１〜２のいずれかに記載の方法。
【請求項４】
前記小滴に送給される物質が前記核生成条件に影響を及ぼす物質である、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
前記小滴が１ｆｌ〜１００μｌの範囲にある、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記核生成傾向を１０ミリ秒〜１０時間の範囲内で検出する、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
前記核生成傾向を１０ミリ秒〜５時間後に検出する、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記核生成傾向を１０ミリ秒〜３０分後に検出する、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
核生成傾向をスクリーニングするためのシステムであって、
ｉ．  少なくとも１つの小滴を所定位置に配置するための少なくとも１つの浮揚装置であって、気流浮揚装置又は音響−静電混成浮揚装置である浮揚装置、
ii．  前記所定位置に配置した小滴に少なくとも１つの物質を送給するための少なくとも１つのディスペンサーであって、圧電フロースルーディスペンサーであるディスペンサー、及び
iii．  前記少なくとも１つの浮揚させた小滴における核生成傾向を検出するための１以上の手段であって、当該核生成傾向をラマン分光法、又はラマン分光法と組み合わせた多角度光散乱、又は比濁法により検出する手段、
を含む核生成傾向スクリーニングシステム。
【請求項１０】
前記核生成傾向を顕微鏡及びカメラを使用する視覚的な監視で手動式に更に検出して、前記小滴における集合体形成、析出又は濁度の定量的測定値を得る、請求項９に記載のシステム。
【請求項１１】
前記少なくとも１つの浮揚させた小滴が１ｆｌ〜１００μｌまでの範囲にある、請求項９〜１０のいずれかに記載のシステム。
【請求項１２】
前記少なくとも１つのディスペンサーにより前記少なくとも１つの小滴に送給される前記少なくとも１つの物質が、タンパク質、膜タンパク質、オリゴペプチドやポリペプチドなどのペプチド、酵素、レセプタ、薬剤化合物、ＤＮＡやＲＮＡなどの核酸、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、巨大分子、巨大分子集合体又は複合体である、請求項９〜１１のいずれかに記載のシステム。
【請求項１３】
前記少なくとも１つのディスペンサーにより前記少なくとも１つの小滴に送給される前記少なくとも１つの物質が核生成傾向に影響を及ぼす物質である、請求項９〜１２のいずれかに記載のシステム。
【請求項１４】
タンパク質、膜タンパク質、オリゴペプチドやポリペプチドなどのペプチド、酵素、レセプタ、薬剤化合物、ＤＮＡやＲＮＡなどの核酸、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、巨大分子、巨大分子集合体又は複合体などの分子について結晶化条件又はアモルファス段階条件をスクリーニングすることへの、請求項９〜１３のいずれかに記載のシステムの利用。
【請求項１５】
タンパク質、膜タンパク質、オリゴペプチドやポリペプチドなどのペプチド、酵素、レセプタ、薬剤化合物、ＤＮＡやＲＮＡなどの核酸、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、巨大分子、巨大分子集合体又は複合体などの分子について結晶化条件又はアモルファス段階条件をスクリーニングすることへの、請求項１〜８に記載の方法の利用。
【国際調査報告】
2004532974.tif 000078
2004532974.tif 000079
2004532974.tif 000080