(57)【要約】表面に局在するタンパク質、脂質およびエンドトキシンを除去するために、８５％を超えるアミロペクチンを含有する澱粉を洗浄し、澱粉を酸加水分解による分子量低下に付し、そして場合により、残留水溶性タンパク質を除去することによる、精製された非経口的投与可能な澱粉の製造。精製澱粉およびこのような澱粉に基づく微粒子。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）固体形態、特に粒子、例えば顆粒であり、そして澱粉の乾燥重量で表して８５重量％を超えるアミロペクチン含有量を有する澱粉から出発し、
ｂ）この固体澱粉を、澱粉の表面に局在するタンパク質、脂質およびエンドトキシンは溶解されるが澱粉は溶解されないままであるような条件下での洗浄に付し、そして溶解した物質から澱粉を分離し、
ｃ）その澱粉を、材料の少なくとも８０重量％が１０〜１０，０００ｋＤａの範囲内にある分子量分布が得られるような酸加水分解による分子量低下に付することを含む、
特に非経口的に、例えば注射により哺乳類、特にヒトに投与するための製薬上許容される澱粉の製造方法。
【請求項２】
残留水溶性タンパク質を澱粉から除去することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
水溶性タンパク質を、澱粉の分子量を低下する段階ｃ）を行ったのちに除去することを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
段階ａ）を、澱粉の乾燥重量で表して９５重量％を超える、好ましくは９８重量％を超えるアミロペクチン含有量を有する澱粉を用いて行う、請求項１〜３の何れか１項に記載の方法。
【請求項５】
澱粉が、ワックス様メイズ澱粉、好ましくは天然または酸加水分解澱粉である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
段階ａ）を、重量分布に基づいて５〜２５μｍの範囲の平均直径を有する澱粉粒子を用いて行う、請求項１〜５の何れか１項に記載の方法。
【請求項７】
段階ｂ）における洗浄を、アルカリ性条件下で、好ましくはアルカリとして水酸化ナトリウムを用い、そして１回またはそれ以上の段階で行う、請求項１〜６の何れか１項に記載の方法。
【請求項８】
段階ｂ）における１回または数回の洗浄を、１１〜１４の範囲のｐＨ値で、好ましくは２段階で行い、第一段階ではｐＨ１１．５〜１３のアルカリ水溶液を用い、そして第二段階を水相の導入ｐＨ値が１２．５〜１３．５の範囲にある条件下で行う、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
洗浄が、水溶性のタンパク質、脂質およびエンドトキシンを溶解するためにアルカリ水溶液を用いる段階、およびより僅かに水溶性のタンパク質を溶解するためにゼイン溶解能を有する水性溶剤を用いる段階を含む、請求項７または８に記載の方法。
【請求項１０】
ゼイン溶解能を有する溶剤が、１価または２価アルコールおよびケトン、好ましくは合計４個までの炭素原子を有するアルカノールもしくはアルキレングリコールまたは合計５個までの炭素原子を有するジアルキルケトンの水溶液から選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
溶剤が、エタノール、イソプロパノール、エチレングリコール、プロピレングリコールおよびアセトンの水溶液から選択される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
溶剤がエタノール水溶液である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
段階ｃ）における酸加水分解を、材料の少なくとも８０％が１００〜４０００ｋＤａ、好ましくは２００〜１０００ｋＤａ、特に３００〜６００ｋＤａの範囲にある分子量分布が得られるように行う、請求項１〜１２の何れか１項に記載の方法。
【請求項１４】
段階ｃ）における酸加水分解を、２０〜７０℃、好ましくは３０〜６０℃、より好ましくは４５〜５５℃、最も好ましくは約５０℃の範囲内の温度で行う、請求項１〜１３の何れか１項に記載の方法。
【請求項１５】
段階ｃ）における加水分解を、３日未満、好ましくは２日未満、より好ましくは１日未満、最も好ましくは１〜１２時間の持続時間で行う、請求項１〜１４の何れか１項に記載の方法。
【請求項１６】
段階ｃ）における加水分解を、０．１〜２０％、好ましくは０．５〜１５％、より好ましくは１〜１０％の酸濃度で行う、請求項１〜１５の何れか１項に記載の方法。
【請求項１７】
段階ｃ）における加水分解を、１〜４０％、好ましくは５〜３５％の澱粉濃度で行う、請求項１〜１６の何れか１項に記載の方法。
【請求項１８】
段階ｃ）における加水分解を、中和および／または温度低下を行うことにより終了させる、請求項１〜１７の何れか１項に記載の方法。
【請求項１９】
澱粉からの残留水溶性タンパク質の除去を、澱粉溶液をイオン交換クロマトグラフィー、好ましくはアニオン交換クロマトグラフィーに付することにより行う、請求項２〜１８の何れか１項に記載の方法。
【請求項２０】
澱粉からの残留水溶性タンパク質の除去を、電気泳動により行う、請求項２〜１８の何れか１項に記載の方法。
【請求項２１】
段階ｂ）における洗浄の前に、出発澱粉から非澱粉物質を、好ましくは篩分けおよび／または沈降作用により除去する、請求項１〜２０の何れか１項に記載の方法。
【請求項２２】
澱粉粒子よりも大きな物質を湿式篩分けにより除去し、そして澱粉粒子よりも小さな物質を沈降作用により除去する、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
４０μｍよりも大きな非澱粉物質を除去し、そして好ましくは５μｍよりも小さな非澱粉物質も除去する、請求項２１または２２に記載の方法。
【請求項２４】
段階ｃ）における酸加水分解ののちに、残留する全ての粒状の非澱粉物質を濾過により、好ましくは２０μｍフィルターを通して、場合によりその後に０．５μｍフィルターを通して除去する、請求項１〜２３の何れか１項に記載の方法。
【請求項２５】
澱粉から残留水溶性タンパク質を除去したのち、濾過を好ましくは５μｍプレフィルターおよび０．５μｍフィルターを通して行って粒状汚染物を全て除去する、請求項２〜２４の何れか１項に記載の方法。
【請求項２６】
澱粉１ｇ当たり少なくとも０．４、好ましくは少なくとも０．８ｍｌのイオン交換材料の沈降床体積をイオン交換クロマトグラフィーに用いる、請求項１９〜２５の何れか１項に記載の方法。
【請求項２７】
精製澱粉を最終乾燥段階に、好ましくは噴霧乾燥に付する、請求項１〜２６の何れか１項に記載の方法。
【請求項２８】
段階ｂ）における洗浄が、チオグリコレート溶液で洗浄して僅かに水溶性のタンパク質を除去することを含む、請求項１〜２７の何れか１項に記載の方法。
【請求項２９】
ａ）８５重量％を超えるアミロペクチン含有量を有し、該アミロペクチンの分子量が、材料の少なくとも８０重量％が１０〜１０，０００ｋＤａの範囲内となるように、酸加水分解により低下されており、
ｂ）澱粉の乾燥重量１ｇ当たり多くとも５０μｇのアミノ酸窒素、好ましくは澱粉の乾燥重量１ｇ当たり多くとも２０μｇ、より好ましくは多くとも１０μｇ、最も好ましくは多くとも５μｇのアミノ酸窒素の純度を有し、
ｃ）水に２５重量％を超える濃度で溶解することができる、
特に非経口的に、好ましくは注射により哺乳類、特にヒトに投与するための製薬上許容される澱粉。
【請求項３０】
ａ）８５重量％を超えるアミロペクチン含有量を有し、該アミロペクチンの分子量が、材料の少なくとも８０重量％が１０〜１０，０００ｋＤａの範囲内となるように、酸加水分解により低下されており、
ｂ）澱粉の乾燥重量１ｇ当たり多くとも５０μｇのアミノ酸窒素、好ましくは澱粉の乾燥重量１ｇ当たり多くとも２０μｇのアミノ酸窒素、より好ましくは多くとも１０μｍ、最も好ましくは多くとも５μｇのアミノ酸窒素の純度を有し、
ｃ）ヒドロキシエチル澱粉に存在するタイプの共有結合した追加の化学基を含まない、
特に非経口的に、好ましくは注射により哺乳類、特にヒトに投与するための製薬上許容される澱粉。
【請求項３１】
水に２５重量％を超える濃度で溶解することができる、請求項３０に記載の澱粉。
【請求項３２】
インビトロでゲル化する能力を示す、請求項２９〜３１の何れか１項に記載の澱粉。
【請求項３３】
エマルジョン系、特に二相水性系中で微粒子を形成する能力を示す、請求項２９〜３２の何れか１項に記載の澱粉。
【請求項３４】
２５ＥＵ／ｇ未満のエンドトキシン含有量を有し、そして１ｇ当たり１００個未満の微生物を含有する、請求項２９〜３３の何れか１項に記載の澱粉。
【請求項３５】
請求項１〜２３の何れか１項に記載の方法により得られる、請求項２９〜３４の何れか１項に記載の澱粉。
【請求項３６】
アミロペクチンの分子量が、１００〜４０００ｋＤａ、好ましくは２００〜１０００ｋＤａ、より好ましくは３００〜６００ｋＤａの範囲内にある、請求項２９〜３５の何れか１項に記載の澱粉。
【請求項３７】
水に３０重量％を超える、好ましくは４０重量％を超える、より好ましくは４５重量％を超える濃度で溶解することができる、請求項２９〜３６の何れか１項に記載の澱粉。
【請求項３８】
熱感受性および／または有機溶剤に不安定な物質、特にタンパク質との組み合わせを可能にするのに充分長い期間、高くとも６０℃、好ましくは２０〜４５℃、特に３０〜３７℃の温度で溶液のままである、請求項２９〜３７の何れか１項に記載の澱粉。
【請求項３９】
組み合わせを、上記の物質の生物活性を保持することができる条件で行う、請求項３８に記載の澱粉。
【請求項４０】
水に溶解したときに、１〜５５℃、特に４〜３７℃の温度で固化する、請求項２９〜３９の何れか１項に記載の澱粉。
【請求項４１】
１〜１０℃、特に約４℃の初期温度、次いで２０〜５５℃、好ましくは２５〜４０℃、特に約３７℃の温度にさらしたときに固化する、請求項４０に記載の澱粉。
【請求項４２】
澱粉が、請求項２９〜４１の何れか１項で定義した澱粉である、特に非経口的に、好ましくは注射により哺乳類、特にヒトに投与するための生物学的活性物質の担体としての澱粉に基づく微粒子。
【請求項４３】
１０〜２００μｍ、好ましくは２０〜１００μｍ、特に２０〜８０μｍの範囲の平均粒径を有する、請求項４２に記載の微粒子。
【請求項４４】
インビトロで酵素作用により溶解されるかまたはインビボで生物学的組織から除去される能力を示す、請求項４２または４３に記載の微粒子。
【請求項４５】
生物学的活性物質がタンパク質である、請求項４２〜４４の何れか１項に記載の微粒子。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【技術分野】
本発明は、哺乳類、特にヒトに経口的に投与するための製薬上許容されるような品質を有する澱粉に関する。特に、この澱粉は、生物学的活性物質の制御放出のために該物質を含有する微小球の製造に使用することができる。
【０００２】
【発明の背景】
多くの薬剤は非経口的に、特に注射により投与しなければならない。なぜならば、それらを例えば経口的もしくは経鼻的にまたは直腸経路で投与すると、分解を受けるかまたは不充分に吸収されるからである。非経口的使用を意図した薬剤処方物は、ヒトに対する使用の取締り当局によって認可されるために、多数の必要条件を満たさなければならない。従って、それは生体親和性および生物分解性でなければならず、そして全ての使用物質およびそれらの分解産物は無毒性でなければならない。加えて、注射を意図した粒状薬剤は、注射針を通過するのに充分小さいことが必要であり、これは好ましくは粒状薬剤が２００μｍよりも小さい必要があることを意味する。薬剤は調製物においてその製造もしくは貯蔵中または投与後に大きな程度で分解してはならず、そして生物学的活性形態で再現性ある動力学をもって放出されるべきである。
【０００３】
生体親和性、および無害な最終産物への生物分解性の必要条件を満たすポリマーの一つのクラスは、乳酸、グリコール酸およびこれらの混合物に基づく線状ポリエステルである。これらのポリマーは以下にＰＬＧＡとも呼ばれる。ＰＬＧＡはエステル加水分解により乳酸およびグリコール酸に分解され、そして優れた生体親和性を有することが示されている。さらに、ＰＬＧＡの無害な性質は、これらのポリマーに基づく幾つかの非経口的遅延放出調製物が米国食品医薬品局を含む取締り当局によって認可されることで例証することができる。
【０００４】
現在市販されているＰＬＧＡに基づく非経口的投与可能な遅延放出製品としては、Ｄｅｃａｐｅｐｔｙｌ ＴＭ （Ｉｂｓｅｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ）、Ｐｒｏｓｔａｐ ＳＲ ＴＭ （Ｌｅｄｅｒｌｅ）、Ｄｅｃａｐｅｐｔｙｌ（登録商標） Ｄｅｐｏｔ （Ｆｅｒｒｉｎｇ） および Ｚｏｌａｄｅｘ（登録商標） （Ｚｅｎｅｃａ） が挙げられる。これらの調製物中の薬剤は全てペプチドである。換言すれば、それらは比較的低い重合度を有するポリマーに縮合したアミノ酸から構成されており、そしてそれらは充分に明らかにされた三次元構造を有していない。次にこのことは、通常これらの製品の製造中に比較的厳しい条件の使用を可能にする。例えば、押し出しおよび後続の粉砕を利用することができるが、これらの技術はタンパク質に関してはたぶん許容されないだろう。なぜならば、タンパク質は一般的にいって、このような厳しい条件に耐えないからである。
【０００５】
従って、タンパク質に対しても制御放出調製物の要望がある。タンパク質は、それらもアミノ酸からなる点でペプチドに類似するが、その分子はより大きく、そして大部分のタンパク質は、生物学的活性および免疫原性を含むそれらの特性の多くに関して、充分に明らかにされた三次元構造に依存している。それらの三次元構造は比較的容易に、例えば高温、表面誘導変性および多くの場合に有機溶剤にさらされることによって破壊されうる。従って、本来はタンパク質の遅延放出のための優れた材料であるＰＬＧＡの使用に関する極めて重大な欠点は、有機溶剤を用いてこのＰＬＧＡを溶解する必要があることであり、タンパク質の安定性が損なわれるという危険、そしてタンパク質の立体配座の変化が患者の免疫学的反応をもたらす危険があり、この反応が阻害性抗体の形成による治療的効果の損失および毒性副作用の双方を生じうるという危険が付随する。複合タンパク質がその三次元構造を全ての点で保持しているかどうかを確実に決定することは著しく困難なので、タンパク質を立体配座の変化を誘導するかもしれない条件にさらすのを避けることは極めて重要である。
【０００６】
製造工程中のタンパク質の不安定性に関するこの固有の問題を避けるために、ＰＬＧＡ技術の改変をめざした熱心な努力にもかかわらず、この分野における進歩は極めて遅かった。その主な理由はたぶん、大部分のタンパク質の三次元構造が、用いられる製造条件に耐えるためには、またＰＬＧＡマトリックスの分解により形成される化学的酸性環境に耐えるためには、あまりにも敏感であることである。科学文献は有機溶剤にさらすためにＰＬＧＡ微小球の製造における安定性の問題に関する多数の記載を含んでいる。ＰＬＧＡマトリックスが分解する際に形成される酸性環境の一例として、約４０μｍの直径を有するＰＬＧＡ微小球のｐＨ値が１．５まで下がり、これは多くの治療上有用なタンパク質を変性させるか、そうでなければ損傷を与えるのに全く充分であることが最近示された（Ｆｕ ら， Ｖｉｓｕａｌ Ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｏｆ Ａｃｉｄｉｃ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ Ｗｉｔｈｉｎ Ｄｅｇｒａｄｉｎｇ Ｐｏｌｙ（ｌａｃｔｉｃ−ｃｏ−ｇｌｙｃｏｌｉｃ ａｃｉｄ） （ＰＬＧＡ） Ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ， Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， Ｖｏｌ． １７， Ｎｏ． １， ２０００， １００−１０６）。微小球がより大きな直径を有するならば、酸性分解産物の拡散消失がより困難になり、そして自触媒反応が強められるという事実のためにｐＨ値はさらに低下すると予想することができる。
【０００７】
生物学的活性物質が微小球マトリックスの生物分解中に化学的酸性環境にさらされ、そして製造工程中に有機溶剤にさらされることによって生じる問題を解決しようとする多数の試みが記載されている。分解中の酸性環境を避けるために、微小球のマトリックスとしてのＰＬＧＡを、化学的に中性の分解産物を生成するポリマーに換えようとする試みがなされており、そして生物学的活性物質が有機溶剤にさらされるのを避けるために、あらかじめ微小球を製造しておき、それらをいったん加工および乾燥してしまったときにだけ、生物学的活性物質を負荷しようとする試みが行われており、または微小球の製造中に有機溶剤を除外または制限しようとする試みがなされている。
【０００８】
一例として、比較的低分子量の高度分枝状澱粉（マルトデキストリン、平均分子量約５，０００Ｄａ）は、この澱粉を微小球に固化することのできる形態に変換するためにアクリル基との共有結合により改変され、得られたポリアクリル澱粉は、外相としてトルエン／クロロホルム（４：１）を含むエマルジョン中でのラジカル重合により粒状形態に変換された（Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｏｌｙａｃｒｙｌ Ｓｔａｒｃｈ Ｍｉｃｒｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ ａｓ Ｃａｒｒｉｅｒｓ ｆｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｎｄ Ｄｒｕｇｓ， Ａｒｔｕｒｓｓｏｎ ら， Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ， ７３， １５０７−１５１３， １９８４）。タンパク質をこれらの微小球中に閉じ込めることはできたが、製造条件はエマルジョンの製造に際して生物学的活性物質を有機溶剤および高い剪断力の両者にさらす。得られた微小球が酵素的に溶解されると、そのｐＨは中性に保持されると予想することができる。得られた微小球は多くの理由で投与には適しない。数ある中で最も重要なことは、澱粉マトリックス（Ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ Ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ ＩＶ， Ｆａｃｔｏｒｓ Ａｆｆｅｃｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ａｎｄ Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｏｌｙａｃｒｙｌ Ｓｔａｒｃｈ Ｍｉｃｒｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ， Ｌａａｋｓｏ ら， Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ ７５， ９６２−９６７， １９８６）、および澱粉分子を架橋する合成ポリマー鎖（Ｓｔｊａｅｒｎｋｖｉｓｔ Ｐ．， Ｌａａｋｓｏ Ｔ． および Ｓｊｏｅｈｏｌｍ Ｉ． （１９８９） Ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ． ＸＩＩ： Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｉｎｇ ｃｈａｉｎｓ ｉｎ ｐｏｌｙａｃｒｙｌ ｓｔａｒｃｈ ｍｉｃｒｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ， Ｊ． Ｐｈａｒｍ． Ｓｃｉ． ７８， ５２−５６）の両者の生物分解性が不完全で、かつ極めて遅いことである。さらに、これらの微小球は持続放出のために組織への注射に適するにはあまりにも小さすぎ、直径＜２μｍである。なぜならば、組織マクロファージがそれらを容易に貪食できるからである。高度分枝状澱粉にアクリル基を結合させるために、潜在的に生物分解性のエステル基を導入することによって分解速度および分解度を高めようとする試みは、意図した結果を引き起こすのに失敗し、そしてこれらのポリアクリル澱粉微小球でさえも、かなりの時間にわたってあまりにもゆっくりと、かつ不完全に分解された（ＢＩＯＤＥＧＲＡＤＡＢＬＥ ＭＩＣＲＯＳＰＨＥＲＥＳ： Ｓｏｍｅ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ Ｐｏｌｙａｃｒｙｌ Ｓｔａｒｃｈ Ｍｉｃｒｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ Ｐｒｅｐａｒｅｄ ｆｒｏｍ Ａｃｒｙｌｉｃ ａｃｅｄ Ｅｓｔｅｒｉｆｉｅｄ Ｓｔａｒｃｈ， Ｌａａｋｓｏ および Ｓｊｏｅｈｏｌｍ， １９８７ （７６）， ｐｐ． ９３５−９３９， Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ．）。
【０００９】
非化学的に改変された澱粉を用い、外相として油を用いる澱粉微小球の製造が記載されている（ＵＳ ４，７１３，２４９； Ｓｃｈｒｏｅｄｅｒ， Ｕ．， Ｃｒｙｓｔａｌｌｉｚｅｄ ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ ｓｐｈｅｒｅｓ ｆｏｒ ｓｌｏｗ ｒｅｌｅａｓｅ ａｎｄ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ， Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ， １９８５ （１１２）， １１６−１２８； Ｓｃｈｒｏｅｄｅｒ， Ｕ．， Ｃｒｙｓｔａｌｌｉｚｅｄ ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ ｓｐｈｅｒｅｓ ａｓ ａ ｓｌｏｗ ｒｅｌｅａｓｅ ｍａｔｒｉｘ ｆｏｒ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ ａｃｔｉｖｅ ｓｕｂｓｔａｎｃｅｓ， Ｂｉｏ−ｍａｔｅｒｉａｌｓ ５：１００−１０４， １９８４）。これらの場合に微小球はアセトン中での沈殿により固化され、これは生物学的活性物質を有機溶剤にさらすこと、および澱粉が物理的架橋により固化する自然の傾向を製造工程中に利用しないことの双方に導く。これは次には澱粉が水に再懸濁されたのち、そして体液にさらされたときに、このような架橋を形成しようとするであろうから、固有の不安定性を有する微小球に導く。このような油中水滴型エマルジョンを得るためには高い剪断力を必要とし、そして形成された微小球は、非経口的持続放出に適するためにはあまりにも小さすぎる。
【００１０】
ＥＰ ２１３３０３ Ａ２ には、澱粉が物理的架橋の形成により固化する自然の能力を利用し、そして生物学的活性物質を有機溶剤にさらすのを避ける目的で、これらの微小球中に物質を固定化することを利用して、特に化学的に改変されていない澱粉の微小球を二相水性系中で製造することが記載されている。明らかにされた澱粉品質と組み合わせたこの記載された方法は、完全に生物分解性の粒子を生じない。得られた粒子もまた、記載された澱粉品質があまりにも多量の外来植物性タンパク質を含有するので、注射に、特に長期間にわたる反復注射には適しない。
【００１１】
澱粉が微粒子のための理論的に極めて適切な、おそらく理想的でさえあるマトリックス材料であることは、長い間知られている。なぜならば、澱粉は有機溶剤に溶解する必要がなく、自然に固化する傾向を有するからであり、そして体内には澱粉を内在性の天然物質に、最後にはグルコースに分解できる酵素があるからであり、そして内在性グリコーゲンとの類似性により、澱粉は非免疫原性であることが示されているからである。熱心な努力にもかかわらず、非経口的使用に適する微粒子の製造を可能にする特性を有する澱粉、およびタンパク質のような敏感な生物学的活性物質が閉じ込められるようになるのを可能にする温和な条件下で、完全に生物分解性の微粒子の製造を可能にする条件は、以前に記載されたことがない。
【００１２】
澱粉顆粒は、それらを非経口的注射にとって不適当にする不純物、例えば澱粉タンパク質を当然に含有している。精製が不充分な澱粉が故意でなく付着する場合、例えば多くの型の作業グローブに安定化された澱粉顆粒が振りかけられる操作において起こりうるように、極めて重大な二次的効果が生じることがある。澱粉顆粒もまた、許容される時間幅以内に完全に生物分解されないという理由で、反復非経口的投与には本質的に適しない。
【００１３】
可溶性ジャガイモ澱粉加水分解物から製造された澱粉微小球は、Ｌｉｎｄｂｅｒｇ Ｂ， Ｌｏｔｅ Ｋ および Ｔｅｄｅｒ Ｈ （１９８４）， Ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ ｓｔａｒｃｈ−ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ− ａ ｎｅｗ ｍｅｄｉｃａｌ ｔｏｏｌ ｉｎ ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ ａｎｄ ｄｒｕｇ ｔｈｅｒａｐｙ， Ｄａｖｉｓ Ｓ．Ｓ， Ｉｌｌｕｍ Ｌ， ＭｃＶｉｅ Ｊ．Ｇ および Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ Ｅ 編， Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ Ｂ．Ｖ．， ｐｐ． １５３−１８８ に開示されているように、ヒトへの非経口的投与に用いられている。これらの微小球は強アルカリ性条件下にエピクロルヒドリンで化学的に架橋することにより製造された。のちに澱粉によって獲得されたこの化学的改変は低下した生物分解性に導き、従って微小球はα−アミラーゼのような内在性酵素によって完全に溶解することができるが、最終産物としてのグルコースに完全には変換されない。製造方法または得られた微小球のどちらも、敏感なタンパク質の固定化に適しもしなければ、本質的に加水分解アミロースに基づくこのような酸加水分解澱粉も、完全に生物分解性の澱粉微小球の製造、またはタンパク質のような生物学的活性物質を高い負荷量で含有する澱粉微小球の製造には適しない。
【００１４】
ヒドロキシエチル澱粉（ＨＥＳ）はヒトに高い用量で代用血漿として非経口的に投与される。ＨＥＳは、概してもっぱら高度分枝状アミロペクチン、いわゆる「ワックス様メイズ」からなる澱粉からの澱粉顆粒によって製造され、分子量を低下させるために酸加水分解され、続いてアルカリ性条件下でヒドロキシエチル化され、そして約２００，０００Ｄａの平均分子量を得るために再度酸加水分解される。こののち、濾過、アセトンでの抽出および噴霧乾燥が行われる。ヒドロキシエチル化の目的は、未改変アミロペクチンがα−アミロースにより極めて急速に分解され、その循環滞留時間が約１０分なので、効果の持続時間を延長することである。ＨＥＳは生物学的活性物質を含有する完全に生分解性の微小球の製造には適しない。なぜならば、化学的改変が生物分解の速度および完全性をかなり低下させ、そして澱粉が非共有結合架橋の形成により固化する自然の傾向の消失をもたらすからである。さらに、ＨＥＳの高濃度溶液は微小球の製造に使用できるためにはあまりにも粘調すぎるようになる。これらの高い用量でのＨＥＳの使用は非経口的使用可能な澱粉を製造できることを示しているが、ＨＥＳは化学的架橋または有機溶剤での沈殿を行わずには微粒子の製造に使用できない。
【００１５】
ＷＯ ９９／００４２５ には、表面関連タンパク質の澱粉顆粒を一掃するために広い最適ｐＨを有する耐熱性タンパク質分解酵素の使用が記載されている。得られた顆粒は非経口的投与には適しない。なぜならば、それらは顆粒中に存在する澱粉タンパク質をなお含有しており、そして添加したタンパク質分解酵素の残留物が顆粒中に残されるという危険があるからである。これらの顆粒もまた、非経口的投与可能な澱粉微小球を二相水性系中で製造するためには適しない。なぜならば、それらは溶解されたのちでさえ、充分高い濃度で使用できるにためには悪い分子量分布を有し、そして微小球が得られたとしても、それらはたぶん完全に生物分解性ではないからである。
【００１６】
錠剤を製造するためのより良好な澱粉を製造する目的で、剪断作用を用いて澱粉の分子量分布を改変することが ＵＳ ５，４５５，３４２ および ＷＯ ９３／２１００８ に記載されている。得られた澱粉は澱粉タンパク質（これらは剪断作用ののちに変性された形態で存在するかもしれない）の高い含有量のために非経口的投与には適さず、そしてこの得られた澱粉もまた、非経口的投与のための生物分解性澱粉微小球の製造、またはこのような澱粉微小球を製造するための二相水性系中での使用には適しない。剪断作用は ＷＯ ９６／１００４２ に開示されているように、ヒドロキシエチル澱粉の製造にも用いられている。しかしながら同様の理由で、このようなヒドロキシエチル澱粉は上記で言及したように非経口的投与または微小球の製造の何れにも適しない。
【００１７】
従って、下記の特色を有する非経口的投与可能な澱粉調製物の製造方法が著しく望ましいであろう：
・　その方法により、実質的に完全に生物分解性で生体親和性の澱粉を製造することができ、この澱粉が非経口的投与に適し、そしてそれが分解すると化学的に中性の内在性物質が形成される方法；
・　高価で掃除と保全が必要な高圧ホモジナイザーのような装置を用いることなく、大規模に行うことのできる方法；
・　実質的に完全に生物分解性の澱粉微粒子の製造に適する非経口的に許容される澱粉。
これらのような目的および他の目的は、以下に定義する本発明により達成される。
【００１８】
【発明の詳述】
本発明の第一の態様によれば、本発明は、非経口的に、特に注射によりヒトを含む哺乳類に投与するための製薬上許容される澱粉の製造方法を提供する。
【００１９】
このような澱粉の特に興味深い応用は、例えば二相水性系中で、生物学的活性物質を高い収率で、およびその生物学的活性が保持されるような温和な条件下で微小球の中に取り込むことができる、非経口的投与可能な実質的に完全に生物分解性の澱粉微粒子を製造するためである。非経口的投与という表現は、主として、このような微粒子が適切な粒度分布、純度および生物分解性を有さねばならず、そして生物分解性でなければならないことを要すると理解される。高い収率は、形成された澱粉微粒子中に取り込まれるべき生物学的活性物質が周囲の相中または相間の界面中に拡散することができないような高濃度の溶液を澱粉が形成できなければならず、そして用いられる澱粉溶液が充分急速ではあるが制御された様式で固化して微粒子になることを意味することを意図している。驚くべきことに、本発明に係る方法によって、このような澱粉の製造が可能となることは明らかである。
【００２０】
澱粉は、ヒトへの非経口的投与に許容されない若干の不純物、特に種々の粒状の物質、タンパク質およびエンドトキシンを当然に含有する。本発明に係る方法は、非経口的使用に許容されないこれらの成分から澱粉を精製することを可能にする。このような方法に伴う困難さは、上記の成分は数が多く、それらの含有量が自然の季節変化に応じて変化することがあり、そしてそれらが広く異なる特性、例えば溶解性、物理的形態、位置などを有することである。二相水性系中での微粒子の製造にも適し、そして取締り当局に容認される澱粉のこのような製造方法を開発することは、なおいっそう複雑である。しかしながら、本発明によれば驚くべきことに、基礎澱粉および一定の特定精製段階を選択して組み合わせることによって、このような澱粉の製造が可能であることが証明された。
【００２１】
本発明に係る方法は、簡単には、高いアミロペクチン含有量を有する澱粉を採用し、これを表面に局在するタンパク質、脂質およびエンドトキシンの除去のために洗浄し、澱粉の分子量を酸加水分解により低下させ、そして好ましくは最初から表面に局在しない残留タンパク質も除去することからなる。
【００２２】
より具体的には、本発明に係る方法は、
ａ）固体形態、特に粒子、例えば顆粒であり、そして８５重量％を超えるアミロペクチン含有量を有する澱粉から出発し、
ｂ）この固体澱粉を、澱粉の表面に局在するタンパク質、脂質およびエンドトキシンは溶解されるが澱粉は溶解されないままであるような条件下での洗浄に供し、そして溶解した物質から澱粉を分離し、
ｃ）澱粉を、材料の少なくとも８０重量％が１０〜１０，０００ｋＤａの範囲内にある分子量分布が得られるような酸加水分解による分子量低下に供することを含む。
【００２３】
従って、本発明に係る方法に出発材料として用いられる澱粉は、大部分がアミロペクチンに基づかねばならず、すなわちアミロースの割合が小さくなければならない。この文脈で特に好ましいアミロペクチン含有量は、少なくとも９５重量％、より好ましくは少なくとも９８重量％であり、％含有量は全て澱粉の乾燥重量として表される。このような澱粉は多くの供給者から商業的に得ることができるか、またはこの技術分野で周知の方法により製造することができる。特に好ましい澱粉は、いわゆるワックス様メイズ澱粉、特に天然または部分的に酸加水分解したものである。このような澱粉は、多くの応用のために周知の方法を用いて工業的に大規模に加工される。使用できる天然ワックス様メイズ澱粉の一例は Ｃｅｒｅｓｔａｒ ０４２０１ であり、そして酸加水分解澱粉の一例は Ｃｅｒｅｓｔａｒ Ｃ＊ Ｇｅｌ ０６０９０である。これらのタイプの澱粉はそのままでは非経口的投与に適しないか、または数ある中でも不充分な純度および不充分な生物分解性のために非経口的投与のための澱粉微粒子の製造に適さず、従って製薬上許容される澱粉に加工するために本発明により処理される。
【００２４】
重量分布に基づいて５〜２５μｍの範囲の平均直径を有する澱粉粒子または澱粉顆粒を、本発明に係る方法における出発澱粉として用いることが好ましい。
【００２５】
出発澱粉を段階ｂ）における１回または数回の洗浄に供する前に、それから非澱粉物質を除去することが好ましい。これは篩分けおよび／または沈降作用により好適に行うことができる。この文脈において、澱粉粒子よりも大きな物質は例えば湿式篩分けにより除去することができ、一方、澱粉粒子よりも小さな物質は例えば沈降作用により除去される。これは適切には、４０μｍよりも大きな非澱粉物質の除去、および好ましくは５μｍよりも小さな物質の除去も伴うことができる。
【００２６】
原料澱粉を実際に顕微鏡下で調べると、通常は少量の繊維状物質を観察することができ、そして原料澱粉材料は植物残留物、挽き割り物および望ましくない性質の他の粒子を含有すると予想することができる。澱粉顆粒よりも遅く沈降物を形成する微生物およびその残留物のような粒子は、例えば反復沈降作用により除去することができる。このようにして、他の精製段階のための基礎材料として澱粉粒子の均質な母集団を得ると同時に、問題の澱粉の粒径よりも大きな粒径を有する種々の粒状物質を偶然に取り込む危険を排除することが有利である。最初の処理も後続段階において改善された濾過能をもたらす。
【００２７】
出発澱粉は比較的に安価な材料なので、この最初の段階により高い純度および信頼性ある精製方法を得るために、この段階では損失を許容することができる。非澱粉物質の除去における初期段階は時間もかかり、そして精製される材料は細菌の成長にとって良好な基質であるので、微生物の成長を可能にしないと同時に、注射可能な材料の製造に許容されねばならない条件下で問題の工程を行うことも重要である。この技術分野内には、まさにこの問題に対する多くの周知の解決策があり、例えば静菌性物質、微生物の成長を可能にしない温度、または微生物の成長を阻害する他の条件の使用がある。一つの極めて簡単な手段は、ｐＨ値を例えば約１１のレベルに調節することである。
【００２８】
段階ｂ）における洗浄は、一般的にアルカリ性条件下で、好ましくは約１１〜１４の範囲のｐＨ値で、そして１回またはそれ以上の段階で行われる。アルカリ金属水酸化物、特に水酸化ナトリウムをアルカリとして選択することが好ましい。好ましくは、少なくとも一つの段階は水溶性のタンパク質、脂質およびエンドトキシンを溶解するために用いられ、そして少なくとも一つの段階はより僅かに可溶性の物質、特にタンパク質、すなわち水単独には可溶性でないものを溶解するために溶剤が用いられる。この種の一つ物質はタンパク質ゼインである。それらの天然の状態において、ゼインの種々の変異物は全て水および希薄塩溶液に不溶性であり、これは一般的にプロラミンを規定する特性であり、そして出発澱粉はゼインを極めてしばしば著しい量（メイズ中のタンパク質含有量の約半分）で含むので、このような場合にそれらを除去することは不可欠である。
【００２９】
従って、ゼイン溶解能を有する水性溶剤を用い、より僅かに可溶性のタンパク質をこの溶剤によって除去できることが第一に重要である。この溶剤が非経口的投与可能な澱粉の製造にも許容されねばならないことは当然である。
【００３０】
ゼイン溶解能を有する上記の溶剤は、１価または２価アルコールおよびケトン、好ましくは合計４個までの炭素原子を有するアルカノールもしくはアルキレングリコールまたは合計５個までの炭素原子を有するジアルキルケトンの水溶液から選択することが好ましい。
適切なアルカノールはエタノールおよびイソプロパノール、特にエタノールであり、適切なアルキレングリコールはエチレングリコールおよびプロピレングリコールである。適切なジアルキルケトンはアセトンである。
【００３１】
下記は本発明に係る方法の初期段階に適する手順である。澱粉を水溶液、好ましくは注射用水に懸濁させ、そして典型的に有用な濃度は８０ｋｇの水当たり約１０ｋｇである。水溶液を適切なｐＨ値に、すなわち除去すべき物質を溶解すると同時に澱粉の溶解を避けようとするために調節する。適切な値は例えば約１１である。水酸化ナトリウム溶液は好ましくは比較的低い濃度で、このｐＨ値を得るためにも用いられる。同時に、添加を徐々に良く撹拌しながら行うことも有利である。特に好ましい実施形態によれば、上記の濾過のために例えば蠕動ポンプを用いて、例えば４０μｍの名目孔径を有する振動スクリーンメッシュに懸濁液をポンプ輸送する。
【００３２】
例えば大きなパドルを用いて澱粉粒子を再懸濁して均質な懸濁液を形成し、そして１〜２４時間、好ましくは３〜１４時間、最も好ましくは室温で放置して沈降させ、そして上澄み液を注意深くデカントするかまたは抜き取る。これを多数回、例えば少なくとも３回繰り返すべきである。加えて、アルカリ可溶性タンパク質の除去をさらに確実にするために、粒子を最終アルカリ溶液中で撹拌しながら長時間、例えば少なくとも２４時間放置することもできる。
【００３３】
そののちに澱粉粒子の実際の洗浄をアルカリ性条件下で行う。これはエンドトキシンも無毒化する。この手順において、種々の塩基、例えば水酸化ナトリウム、水酸化カリウムおよびチオグリコレートを単独でまたは組み合わせて使用できる。条件は一般的に、除去すべきタンパク質が可溶性のままであるが澱粉粒子は不溶性のままであるように選択され、そののち洗浄液を適切な手段で、例えば沈降作用または濾過により、好ましくは促進条件下で分離することができる。次いでこの洗浄手順を、意図した結果が得られるまで繰り返すことができる。アルカリ溶液中での澱粉粒子の適切な接触時間は、少なくとも２時間、より好ましくは少なくとも４時間である。洗浄した顆粒を洗浄液から毎回、例えば濾過またはバスケット遠心分離器での遠心分離により分離する。アルカリ濃度は、澱粉粒子を溶解することなく効果的な濃度が得られるように選択される。ｐＨ値は好ましくは１１．５〜１３の範囲の値である。典型的な濃度は、水酸化ナトリウムを用いる場合は０．０１２５Ｍであり、これは約１２のｐＨ値を与える。最も好ましい実施形態によれば、バスケット遠心分離器および約０．０１２５Ｍの水酸化ナトリウム濃度が用いられる。最初の洗浄は、例えばこれによって以前の段階で用いた物質の濃度を低下するために、バスケット遠心分離器それ自体で行うことが好ましい。次に後続の段階において、粒子を洗浄液に再懸濁させ、次いでこれを分離のためにバスケット遠心分離器に導入する。洗浄液と澱粉との典型的な比は約５：１、例えば１０ｋｇの澱粉当たり５０リットルの洗浄液である。通常は３回の洗浄で充分である。
【００３４】
それが望ましいならば、洗浄効率は、例えば変性条件下でのゲル電気泳動により定性的に確認することができ、または例えば澱粉のアミノ酸分析により定量することができる。
【００３５】
基礎澱粉がアルカリ水溶液単独には溶解しない物質、例えばタンパク質、脂質およびエンドトキシンなどを含有するならば、ゼイン溶解能を有する上記の溶剤による洗浄に澱粉を供することによって、この物質を除去する。ここで溶液の組成は、澱粉が溶液に入ることなく問題の物質が溶解されるように選択される。このための正しい条件は通常、水相中の供給ｐＨ値が１２．５〜１３．５の範囲にある条件である。特に好ましい組成はエタノールと水に基づくアルカリ溶液との等モル混合物、例えば０．１Ｍ水酸化ナトリウムを添加した注射用水である。澱粉および用いられる洗浄液の懸濁液を形成し、これを例えば室温で４時間〜２４時間撹拌することが適切である。そののち、例えば注射用水での最終洗浄のためにスプレーノズルを装備したバスケット遠心分離器で洗浄を行うことができる。
【００３６】
上記の洗浄段階ののち、精製澱粉粒子を直接に本発明に係る方法の後続段階に供することができ、または最終段階を行う前に中間生成物の形態で貯蔵することができる。これらは例えば冷蔵または乾燥形態で貯蔵することができる。乾燥は適切な手段で、好ましくはエタノールでの洗浄後に行うことができる。
【００３７】
現在の分析仕様および分析方法によれば、アルカリ金属水酸化物での上記の洗浄は澱粉粒子に対して全く満足すべきである。しかしながら将来、例えばよりいっそう高感度の分析方法が開発されることによって必要条件が増加するならば、より僅かに可溶性のタンパク質を除去するために、段階ｂ）による洗浄をチオグリコレート溶液での洗浄によって補充することができる。チオグリコレートは、上記のタイプの基礎澱粉材料から僅かに可溶性のタンパク質、例えばケラチンを除去するのに有効であることが証明された。チオグリコレートは非経口的使用にも許容され、そして粒子から洗浄除去することができる。しかしながら、チオグリコレートを用いる場合には、それが目および皮膚の刺激物であり、そして不快な臭いを有するので注意を払う必要があるが、これらのファクターは完全に管理可能である。
【００３８】
しかしながら一般的に、洗浄段階ｂ）またはその改変は、多くの異なるクラスの非澱粉物質を除去するために用いることができる。
【００３９】
酸加水分解による澱粉の分子量低下は、特定の分子量分布が達成されるならば、本来公知の手段で行うことができる。本発明に関して貴重で重要なことは、酸加水分解によっても、本方法の他の段階と一緒になって、澱粉の非経口的投与を可能にするような高品質の澱粉を得ることが可能であることが認められた。剪断作用による分子量低下はより狭い分子量分布を与えるためより好ましいが、本発明の方法はコスト利益を与える。
【００４０】
簡単のために、加水分解に使用すべき酸の好ましい例としては塩酸が挙げられるが、他の酸が制御された様式で定義したように分子量を低下できるならば、それらを用いることもできる。
【００４１】
工程条件は、所望の分子量分布が制御された様式で達成されるように選択される。好ましい温度は２０〜７０℃、より好ましくは３０〜６０℃、よりいっそう好ましくは４５〜５５℃、最も好ましくは約５０℃の範囲内にある。特定の各澱粉および好ましい澱粉濃度のために、最も適切な条件、例えば酸濃度および反応時間は簡単な実験により決定することができる。反応は一般的に、所望の分子量に達したときに反応混合物を中和し、そして温度を低下することにより終了させる。
【００４２】
使用すべき澱粉の濃度および体積は、数ある中で、工程の規模および所望の投入量に依存する。澱粉濃度は１〜４０％、好ましくは５〜３５％であってよい。加水分解の持続時間は、しばしば３日未満、好ましくは２日未満、より好ましくは１日未満、最も好ましくは１〜１２時間である。酸の濃度は所望の分子量が得られるように、例えば０．１〜２０％、好ましくは０．５〜１５％、より好ましくは１〜１０％が選択される。
【００４３】
加水分解した澱粉を他の精製段階に供する前に、残留する粒状の非澱粉物質を溶液の濾過により除去することが好ましい。これは例えば約２０μｍまたはそれ以下の孔径を有するプレフィルター、次いで０．５μｍまたは０．４５μｍの孔径を有するフィルターをシリーズで組み合わせることにより行うことができる。澱粉を溶解するために、非経口的使用のための澱粉の製造に許容される水、最も好ましくは注射用水を用いることが好ましい。溶解は一般的に高められた温度、例えば少なくとも８０℃の温度で行われ、そして典型的な濃度は１〜２５％、例えば約１０％である。問題のフィルターを通すポンプ輸送は任意の適切な方法で行うことができる。ポンプ輸送は最も好ましくは過剰圧力で行われ、この圧力は各段階で生成し、３バールを超えないが、フィルターの機械的強度により限定される。可能なフィルターの例は Ｕｌｔｉｐｏｒ ＧＦ ２＋２０ μｍ（Ｐａｌｌ）および Ｆｌｕｏｒｏｄｙｎｅ ＩＩ（Ｐａｌｌ）である。好適な寸法は２０インチであり、カートリッジフィルターが好ましい。濾過は、澱粉が沈殿するのを避けるために高められた温度で行われるが、温度は同時にフィルター材料が耐える温度を超えないのは当然である。フィルターが目詰まりするようになった場合には、新しいフィルターに変えたのちに操作を続けることができる。
【００４４】
こうして本発明に係る酸加水分解により、澱粉の所望の分子量分布を得ることが可能である。しかしながら一般的に、剪断作用を用いた場合よりも大きな割合の低分子量成分が得られる。超高品質が要求される若干の特定用途には、必要に応じて、または薦められることとして、このような低分子量のポリサッカライドまたはオリゴサッカライドを、この分野で周知の技術、例えば限外濾過により除去できることは勿論である。
【００４５】
酸加水分解により得られる分子量分布は、好ましくは材料の少なくとも８０％が１００〜４０００ｋＤａ、より好ましくは２００〜１０００ｋＤａ、最も好ましくは３００〜６００ｋＤａの範囲にあるような分布である。
【００４６】
分子量分布は本来公知の多くの異なる方法により決定することができる。最も好ましい方法は、屈折率に基づく検出およびいわゆる多角度レーザー光散乱法 （ＭＡＬＬＳ） による検出を伴うゲル濾過に基づく。適切な装置は ＤＡＷＮ−Ｆ 多角度レーザー光散乱検出器であり、データ収集、および平均分子量および多分散性の決定に適するプログラムは ＡＳＴＲＡ ２．１１ａ であり、分子量範囲の評価に適するコンピュータプログラムは ＥＡＳＩ ６．００ である（全て Ｗｙａｔｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ から）。
【００４７】
非経口的投与に対していっそう大きな安全性限界を有する澱粉を製造するために、水溶性タンパク質も澱粉から除去され、この除去は一般的に酸加水分解段階ののちに行われる。
本発明の一つの実施形態によれば、水溶性タンパク質の除去は澱粉溶液をイオン交換クロマトグラフィーに供することによっても行われる。
【００４８】
最も好ましい実施形態によれば、陰荷電の水溶性タンパク質を除去するためにアニオン交換クロマトグラフィーが用いられる。段階ｂ）で除去され、そして主に澱粉粒子の表面に存在する物質からなっていたタンパク質および他の汚染物とは異なり、イオン交換クロマトグラフィーによる主な問題は、最初から澱粉粒子の内部に位置しており、従って最初の精製では大部分アクセスできなかったタンパク質を除去することである。この精製に必要なイオン交換材料の量は、必要に応じて実験により容易に滴定することができる。しかしながら一般的に、従来用いられてきたよりも多量のイオン交換材料の使用が好ましいことが示された。これまで普通であったよりも多量のイオン交換材料を用いることにより、イオン交換材料からの種々の成分の溶離は、澱粉中の該成分を通常の場合よりも高い濃度にすることがある。従ってこの場合、非経口的使用に許容される成分の溶離だけを生じさせるイオン交換材料を選択すべきである。適切なイオン交換材料の一例は Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ａｍｅｒｓｈａｍ）である。この工程はカラムの使用およびバッチ法の双方で行うことができる。後者の場合、イオン交換材料を澱粉溶液に懸濁させ、これを次いで適切な手段で、例えば濾過によって分離する。
【００４９】
イオン交換クロマトグラフィーに適する条件は、通常は製造業者が発行する指示書および科学文献に記載されている。この技術の工程パラメーターの合理的な相違を用いて同じ結果を達成することが一般的に可能であり、従ってこれらの条件は典型的な非限定的実施例によって説明されるだけである。Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ の使用に適する条件は、例えば約４５℃で１０ｍＭ炭酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ９．８である。必要に応じて、より強い緩衝液を使用できるが、その場合にはクロマトグラフィーののちに脱塩段階を挿入すべきである。イオン交換材料の量は、澱粉１ｇ当たり少なくとも０．４ｍｌ、好ましくは少なくとも０．８ｍｌの沈降したイオン交換材料床体積であるべきであり、大きさの順位としては、室温で問題の緩衝液中で膨潤した体積として計算して、澱粉の乾燥重量１ｇ当たり例えば０．４〜１．１であるべきである。イオン交換材料は従来法により洗浄または再生すべきである。しかしながら適切な方法は、例えば１Ｍ水酸化ナトリウムを用いて室温で約１時間処理し、次いで２床体積の注射用水ですすぎ、そして合計２床体積の２Ｍ塩ナトリウムですすぎ、４回の追加を展開することである。そののち、この手順を１回繰り返すことができる。次いで導電率が２ｍＳ／ｃｍ未満になるまで、注射用水を用いてすすぎを行い、そしてｐＨおよび導電率の両者が安定化するまで、１床体積の１００ｍＭ炭酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ９．８を用い、次いで１０ｍＭ炭酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ９．８を用いて平衡化を２回行う。イオン交換はバッチ法によって行うことができ、これは例えば４５℃で少なくとも４時間〜４８時間まで続く。実際上の理由で、イオン交換を一夜行うことがしばしば選択される。イオン交換は、イオン交換材料の完全性が保存されるように、おだやかに撹拌しながら好適に行われる。次いでイオン交換マスは適切な手段で、例えば適切な流出口フィルターを備えたクロマトグラフィーカラムに懸濁液を導入することにより澱粉溶液から分離される。次いで澱粉溶液のｐＨ値を中和する。揮発性または不安定な緩衝物質を用いる場合には、例えば、後続の噴霧乾燥（このとき緩衝物質が分解するかまたは気体相に変換することがある）の間に生じる過度なアルカリ条件が防止されるように、ｐＨ値を中性よりも数ｐＨ単位低下させるべきである。
【００５０】
特許請求した別の実施形態によれば、水溶性タンパク質の除去は電気泳動操作によって行われる。このような操作は電気泳動に公知の原理に従って行うことができ、これは例えば、澱粉を上記の電気泳動にゲルの形態で供することを一般的に意味する。
【００５１】
水溶性タンパク質を除去したのち、好ましくは濾過を行ってその間に生じた粒状汚染物を除去する。この目的に適する多数のフィルターが市販されている。適切な構成は５μｍプレフィルターおよび０．５μｍ最終フィルターである。適切な寸法はプレフィルターでは２０インチ、最終フィルターでは１０インチである。適切なフィルターの例は Ｐｒｏｆｉｌｅ Ｓｔａｒ（Ｐａｌｌ）および Ｓｔａｒ Ｃｌｅａｒ（Ｐａｌｌ）であり、これは陽に荷電している。
【００５２】
精製した澱粉は貯蔵する前に最終乾燥段階に供することが適切である。これに関して特に好ましい乾燥方法は噴霧乾燥であるが、本来公知の他の方法、例えば凍結乾燥または真空乾燥も適している。噴霧乾燥においては、過度に高い温度および／またはあまりにもアルカリ性のｐＨ値のために生じる望ましくない二次反応なしに、材料が充分に乾燥されるように条件を選択すべきである。この文脈で用いられる典型的な温度は、入口温度として約２００℃、および出口温度として約１２０℃である。出口温度は澱粉溶液のポンプ輸送速度によって容易に制御することができる。
【００５３】
澱粉は、通常の室温を超えない温度で暗い乾燥条件で貯蔵すれば、長期間保存することができる。非経口的使用を意図した微小球の製造に澱粉を用いる前に、澱粉を例えば注射用水に溶解し、そして滅菌する。好ましい滅菌方法はオートクレーブ処理である。他の滅菌方法、例えば無菌濾過も可能である。
【００５４】
澱粉の純度は本来周知の方法で決定することができる。定性的評価を得るためには、ゲル電気泳動が変性条件下で好ましく用いられ、次いで染色される。より定量的なデータを得るためには、例えばアミノ酸分析、元素分析または窒素選択的検出器によって窒素含有量を決定することができる。アミノ酸分析は、これが澱粉のタンパク質含有量に関する定量的データを与え、そしてこれが澱粉の有用性に対する最も重要なファクターなので好ましい。この方法はアミノ酸窒素含有量を５０ｐｐｍまで、適切には２０ｐｐｍ未満、好ましくは１０ｐｐｍ未満、より好ましくは５ｐｐｍ未満、さらには２ｐｐｍ未満までも減少させることができ、この含有量は、特に反復非経口的投与における良好な安全性ファクターを与え、そしてヒドロキシエチル澱粉（これは血漿増量剤として非経口的に使用され、そして日量で体重１ｋｇに基づいて少なくとも１００倍だけ、澱粉粒子に意図した最大量を超えることがある）のアミノ酸窒素含有量と同等であるかまたはそれより低い。インプットタンパク質成分に対する抗体の産生（これ自体は科学文献に記載されている）ののち、これらの成分を定量するための高感度の免疫学的方法を使用することが可能である。
【００５５】
本発明の第二の態様によれば、本発明はまた、新規な製薬上許容される澱粉を提供する。この澱粉は、
ａ）８５重量％を超えるアミロペクチン含有量を有し、該アミロペクチンの分子量が、材料の少なくとも８０重量％が１０〜１０，０００ｋＤａの範囲内となるように、酸加水分解により低下されており、
ｂ）澱粉の乾燥重量１ｇ当たり多くとも５０μｇのアミノ酸窒素、好ましくは澱粉の乾燥重量１ｇ当たり多くとも２０μｇ、より好ましくは多くとも１０μｍ、最も好ましくは多くとも５μｍのアミノ酸窒素の純度を有し、
ｃ）水に２５重量％を超える濃度で溶解することができること
を特徴としている。
【００５６】
「水に溶解することができる」という表現は、澱粉に対する従来法（これは例えば少なくとも８０℃に加熱すること、そしてまた緩衝した水溶液に溶解することを一般的に伴う）による溶解を意味することを意図している。
【００５７】
本発明の別の態様によれば、本発明は、
ａ）８５重量％を超えるアミロペクチン含有量を有し、該アミロペクチンの分子量が、材料の少なくとも８０重量％が１０〜１０，０００ｋＤａの範囲内となるように、酸加水分解により低下されており、
ｂ）澱粉の乾燥重量１ｇ当たり多くとも５０μｇのアミノ酸窒素、好ましくは澱粉の乾燥重量１ｇ当たり多くとも２０μｇ、より好ましくは多くとも１０μｍ、最も好ましくは多くとも５μｍのアミノ酸窒素の純度を有し、
ｃ）ヒドロキシエチル澱粉に存在するタイプの共有結合した追加の化学基を含まない、
製薬上許容される澱粉を提供する。
【００５８】
「ヒドロキシエチル澱粉に存在するタイプの共有結合した追加の化学基を含まない」という表現は、澱粉が天然澱粉に存在する基だけを含み、そして例えばヒドロキシエチル澱粉のようには改変されていないことを意味することを一般的に意図している。
加えて、上記の全ての態様による澱粉は、インビトロで自然にゲル化する能力を示すことが好ましい。
【００５９】
別の実施形態によれば、上記の澱粉は、エマルジョン系、特に二相水性系中で微粒子を形成する能力を示すことが好ましい。
別の実施形態は、２５ＥＵ／ｇ未満のエンドトキシン含有量を有する澱粉に関し、そしてもう一つの実施形態は、１ｇ当たり１００個未満の微生物、より好ましくは１ｇ当たり１０個未満の微生物を含有する澱粉に関する。
【００６０】
澱粉のさらに他の好ましい実施形態は、下記のとおりである。
水に３０重量％を超える、好ましくは４０重量％を超える、より好ましくは４５重量％を超える濃度で溶解することができる澱粉。
熱感受性および／または有機溶剤に不安定な物質、特にタンパク質との組み合わせを可能にするのに充分長い期間、高くとも６０℃、好ましくは２０〜４５℃、特に３０〜３７℃の温度で溶液のままである澱粉。この組み合わせは、該物質の生物分解性を保持できる条件下で行うことが好ましい。
水に溶解したときに、１〜５５℃、特に４〜３７℃の温度で固化する澱粉。
１〜１０℃、特に約４℃の初期温度、次いで２０〜５５℃、好ましくは２５〜４０℃、特に約３７℃の温度にさらしたときに固化する澱粉。
【００６１】
この澱粉の他の特に好ましい実施形態については、本発明に係る方法に関して上記で説明した実施形態が参照され、この理由で、これらの説明をここで繰り返す必要はない。
新規な澱粉の主な応用分野は、本質的に完全に生物分解性の微粒子を製造するためである。
しかしながら、本発明の第三の態様によれば、本発明はまた、特に非経口的に、好ましくは注射により哺乳類、特にヒトに投与するための生物学的活性物質の担体としての澱粉に基づく微粒子を提供し、この澱粉は上記で定義した澱粉である。
【００６２】
このような微粒子は、１０〜２００μｍ、好ましくは２０〜１００μｍ、特に２０〜８０μｍの範囲の平均粒径を有することが好ましい。従って、微粒子という用語は、この技術で公知の一定の大きさの粒子のための一般的名称として用いられる。微粒子の一つのタイプは実質的に球形を有する微小球のタイプであるが、微粒子という用語は、このような理想的な球形からのずれを包含することができる。公知のマイクロカプセルという表現も、先行技術による微粒子という表現によって包含される。
【００６３】
このような微粒子の好ましい実施形態は、インビトロで酵素作用により溶解され、そしてインビボで生物学的組織から除去される能力を示す粒子によって示される。
【００６４】
これまで述べてきたことから、特に興味深い生物学的活性物質はタンパク質であることが明らかであろうが、本発明は原則として、非経口的投与に使用できる全ての活性物質、例えば（ポリ）ペプチド、（ポリ）ヌクレオチド、プラスミドおよびＤＮＡに適用できることは当然である。しかしながら、本発明は敏感性および不安定性の問題が存在する場合に特に興味深い。
【００６５】
上記のタイプの生物学的活性物質の例は、成長ホルモン、エリスロポエチン、インターフェロン（α、β、γ型）、ワクチン、上皮細胞成長ホルモン、因子 ＶＩＩＩ、ＬＨＲＨ類似体、インスリン、マクロファージコロニー刺激因子、顆粒球コロニー刺激因子およびインターロイキンである。
【００６６】
非タンパク質薬剤タイプの有用な生物学的活性物質は、次の群から選択することができる：
抗腫瘍剤、抗生物質、抗炎症剤、抗ヒスタミン剤、鎮静剤、筋肉弛緩剤、抗てんかん剤、抗抑うつ剤、抗アレルギー調製物、気管支拡張剤、強心剤、抗不整脈剤、血管拡張剤、抗糖尿剤、抗凝固剤、止血剤、麻酔剤およびステロイド。
【００６７】
一般的に微小球、マイクロカプセルまたは微粒子の構造、およびこれらの製造のために存在する種々の方法に関しては、公知の文献が参照される。しかしながら本発明に係る澱粉は、「微粒子」と題するスウェーデン特許出願第０００３６１５−２に記載されたタイプの微粒子の製造に特に適することが証明された。これの詳細については該スウェーデン特許出願が参照される。
以下の非限定的な実施例により本発明をさらに説明する。これらの実施例において、本文のその他と同様に別に述べない限り、示される％は重量％に関する。
【００６８】
【実施例】
実施例１
７５リットルの注射用水中１０ｋｇの濃度を有する澱粉懸濁液（ワックス様メイズ、Ｃｅｒｅｓｔａｒ Ｃ＊ ｇｅｌ ０６０９０）を撹拌しながら調製する。均質な懸濁液が形成されたらすぐに、０．２５Ｍ水酸化ナトリウム溶液を１１．０±０．２のｐＨ値が得られるまで加え、次いでこれに注射用水をさらにつぎ足して全量８０リットルにする。この懸濁液を約５２０ｍｌ／分の流速で湿潤篩を通してポンプ輸送した。この澱粉懸濁液を Ｍｕｅｌｌｅｒ 容器中に一夜放置して沈降させ、翌日に１８リットルの懸濁液が残るまで上部の液をサイホンでデカントする。７２リットルの注射用水をつぎ足したのち、ｐＨ値を必要に応じて水酸化ナトリウム溶液の添加により少なくとも１０．５に調節する。この懸濁液を１２時間放置し、そののち上部の液をデカントした。これを一夜沈降させてもう１回繰り返す。次いで注射用水中の０．０１２５Ｍ水酸化ナトリウム溶液を用いて、最初は４５リットルの溶液を用いてバスケット遠心分離器でフィルターケーキをすすぎ、次いで溶液に懸濁させ、バスケット遠心分離器での遠心分離により溶液を除去することによって澱粉顆粒を洗浄した。後者の段階をもう１回繰り返す。次いで澱粉顆粒を０．１Ｍ水酸化ナトリウムおよびエタノールの等モル溶液を用いて４時間浸出し、そののちバスケット遠心分離器により溶液を分離する。この浸出を１回繰り返し、そののち澱粉顆粒を４０リットルの注射用水で２回洗浄する。澱粉懸濁液のｐＨ値を１Ｍ塩酸で６．４±１に調節し、５０リットルの注射用水を用いてバスケット遠心分離器で洗浄する。
得られた澱粉顆粒を好ましい酸溶液に懸濁させ、所望の分子量が得られるまで反応を続ける。
【００６９】
次いでこの澱粉を、孔径２０および２μｍの２０インチプレフィルター、および０．４５μｍフィルターを通して濾過する。次いで炭酸水素ナトリウムを１０ｍＭの最終濃度まで添加し、そしてｐＨ値を０．５だけ調節して９．８にすることによって澱粉溶液のｐＨを調節する。次いで残留タンパク質を Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）上のイオン交換クロマトグラフィーにより３．７リットルの全床体積を用いて除去する。イオン交換材料は予め膨潤させておき、１床体積の１Ｍ水酸化ナトリウムで、次いで２床体積の注射用水で、そののち床体積の半量の２Ｍ塩化ナトリウム溶液の３倍を流して洗浄すべきである。この全体の順序をもう１回繰り返し、そののちイオン交換材料を導電率が２ｍＳ／ｃｍ未満になるまで注射用水ですすいだ。ｐＨ値および導電率が安定化するまで、２床体積の１００ｍＭ炭酸ナトリウム、ｐＨ９．８、次いで１０ｍＭ炭酸水素ナトリウムを用いて平衡化を行う。イオン交換材料および澱粉を混合し、４５℃で上部に取り付けたアンカー撹拌器でゆっくり撹拌しながら約１５時間保持し、次いでイオン交換材料をクロマトグラフィーカラムに集めることにより分離する。床体積は圧力を３バール未満に保つために必要な沈降可能な床体積の約１．５倍に保持する。ｐＨ値を６．４に調節したのち、プレフィルター（ＰＡＬＬ ｆｉｌｔｅｒ ｃａｒｔｒｉｄｇｅ Ｐｒｏｆｉｌｅ ｓｔａｒ ５μｍ、直径２０インチ）および最終フィルター（ＰＡＬＬ ｆｉｌｔｅｒ ｃａｒｔｒｉｄｇｅ Ｐｒｏｆｉｌｅ ｓｔａｒ ０．５μｍ、直径１０インチ）を予め熱注射用水のポンプ輸送により予熱したのち、これらのフィルターを通してイオン交換澱粉を濾過する。最後に、澱粉溶液を２００℃の入口温度および１２０〜１２５℃の出口温度で噴霧乾燥する。
澱粉のタンパク質含有量をアミノ酸分析により決定する。
平均分子量を屈折率およびＭＡＬＬＳ検出と組み合わせたゲル濾過により決定する。
エンドトキシン含有を、澱粉に対して確認された分析の Ｌｉｍｂｕｌｕｓ アメーバ様細胞比濁法（Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ｏｆ Ｃａｐｅ Ｃｏｄ Ｉｎｔ Ｉｎｃ）を用いて決定する。
【００７０】
実施例２
本発明に係る洗浄に供した澱粉顆粒から澱粉懸濁液を調製する。この懸濁液を５０℃に前処理した塩酸と混合することにより調製する。所望の平均分子量が得られるまでインキュベーションを５０℃で行う。次いでこの懸濁液を例えば室温に冷却して中和するか、または最初に中和して冷却する。顆粒を例えば普通またはバスケット遠心分離器で遠心分離することにより、またはフィルター上で繰り返しすすぐことにより洗浄する。
【００７１】
各澱粉および選択されたインキュベーション条件について、インキュベーション混合物のサンプルを所定の時間に分析することにより、所望の分子量に達する時間を決定することができる。可能な異なる工程条件を示すために下記の非限定的実施例を挙げる。これらの条件から、当業者は簡単な実験により適切に適合させることができる。
【００７２】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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