(57)【要約】本発明は、脂質キナーゼの活性を調節する化合物をスクリーニングする方法に関する。本発明は、より好ましくは、脂質キナーゼ、特に膜脂質キナーゼ、より具体的にはスフィンゴシンキナーゼの活性を調節する化合物をスクリーニングするためにＳＰＡ技術に基づいている。本発明にはまた、該方法によって同定される化合物だけでなく、上記の方法を行うときに使用される組成物、製造物、キットなど、ならびにそれらの使用が含まれる。
2004509638.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
脂質キナーゼの活性を調節、阻害または活性化する化合物を選択または同定する方法であって、（ｉ）脂質キナーゼおよびその標識された脂質基質を候補化合物およびリン酸源の存在下で混合すること、（ｉｉ）リン酸化された脂質と結合するが、リン酸化されていない脂質とは本質的には結合しない担体材料に（ｉ）の反応混合物を曝露すること、および（ｉｉｉ）該担体に結合しているリン酸化された脂質の量を評価することを含む方法。
【請求項２】
担体材料が、ケイ酸イットリウム、酸化イットリウムまたはポリビニルトルエン（ＰＶＴ）から選択される成分を含む、請求項１記載の方法。
【請求項３】
担体が、（ポリ）アクリルアミド、アガロース、セファロースまたはポリスチレンを（さらに）含む、請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
担体がビーズまたはＳＰＡビーズである、請求項１〜３のいずれか１項記載の方法。
【請求項５】
担体がシンチラントを含有する、請求項１〜４のいずれか１項記載の方法。
【請求項６】
脂質基質が放射能標識されている、請求項１〜５のいずれか１項記載の方法。
【請求項７】
脂質基質がミセル内に存在する、請求項１〜６のいずれか１項記載の方法。
【請求項８】
脂質キナーゼが細胞抽出物または膜抽出物である、請求項１〜７のいずれか１項記載の方法。
【請求項９】
脂質キナーゼが組換え酵素である、請求項１〜８のいずれか１項記載の方法。
【請求項１０】
リン酸源がＡＴＰである、請求項１〜９のいずれか１項記載の方法。
【請求項１１】
（ｉ）における反応混合物が、
・０．０１〜１０μＭの非標識の脂質
・０．０１〜１０μＣｉの放射能標識された脂質
・０．１〜５％の界面活性剤（トリトンなど）または中性脂質（ホスファチジルセリンまたはカルジオリピンなど）または哺乳動物起源の血清タンパク質（ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）、ＨＳＡ（ヒト血清アルブミン）またはＦＢＳＡなど）あるいはそれらの混合物
・０．１μＭ〜１ｍＭのリン酸源（ＡＴＰなど）、および
・適切な希釈度で脂質キナーゼ（または脂質キナーゼを含む任意の組成物もしくは材料）を含む細胞調製物の所望する量の総タンパク質
を含む、請求項１〜１０のいずれか１項記載の方法。
【請求項１２】
（ｉ）における反応混合物が、
・０．０１〜１μＭの非標識の脂質
・０．０１〜０．５μＣｉの放射能標識された脂質
・０．１〜１％の界面活性剤（トリトンまたはノニデットなど）あるいはその混合物
・０．１μＭ〜５０μＭのリン酸源（ＡＴＰなど）、および
・適切な希釈度で脂質キナーゼ（または脂質キナーゼを含む任意の組成物もしくは材料）を含む細胞調製物の所望する量の総タンパク質
を含む、請求項１〜１１のいずれか１項記載の方法。
【請求項１３】
０〜３０％のグリセロールが反応混合物にさらに添加される、請求項１１または１２記載の方法。
【請求項１４】
１５％〜２５％、好ましくは約２０％のグリセロールが反応混合物に添加される、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
候補化合物の存在下および非存在下で担体に結合した脂質の量を比較すること、そして該量を調節する化合物を同定することを含む、請求項１〜１４のいずれか１項記載の方法。
【請求項１６】
数個の候補化合物が同時に試験される、請求項１〜１５のいずれか１項記載の方法。
【請求項１７】
工程（ｉ）がマイクロタイトレーションプレートにおいて行われる、請求項１〜１６のいずれか１項記載の方法。
【請求項１８】
脂質キナーゼが膜脂質キナーゼまたは細胞質脂質キナーゼまたは分泌型脂質キナーゼである、請求項１〜１７のいずれか１項記載の方法。
【請求項１９】
脂質キナーゼがスフィンゴシンキナーゼである、請求項１〜１８のいずれか１項記載の方法。
【請求項２０】
脂質基質がスフィンゴシンである、請求項１〜１９のいずれか１項記載の方法。
【請求項２１】
スフィンゴシンキナーゼの活性を調節、阻害または活性化する化合物を選択または同定する方法であって、（ｉ）該スフィンゴシンキナーゼおよび放射能標識されたスフィンゴシンを候補化合物およびリン酸源の存在下で混合すること、（ｉｉ）リン酸化されたスフィンゴシンと結合するが、リン酸化されていないスフィンゴシンとは本質的には結合しない担体材料に（ｉ）の反応混合物を曝露すること、および（ｉｉｉ）該担体に結合しているスフィンゴシン−１−Ｐの量を評価することを含む方法。
【請求項２２】
担体材料がケイ酸イットリウムＳＰＡビーズである、請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
担体材料が酸化イットリウムＳＰＡビーズである、請求項２１記載の方法。
【請求項２４】
脂質キナーゼの標識された脂質基質、および／またはリン酸化された脂質と結合するが、リン酸化されていない脂質とは本質的には結合しない担体材料および／または脂質キナーゼを含む、脂質キナーゼ調節因子をスクリーニングする際に使用するキット。
【請求項２５】
ヒトまたは動物の処置、診断または手術において使用される薬学的組成物を製造するための、請求項１〜２３のいずれか１項記載の方法によって取得、同定、選択または特徴付けすることができる化合物の使用。
【請求項２６】
ヒトまたは動物の処置、診断または手術において使用される薬学的組成物を製造するための、請求項１〜２３のいずれか１項記載の方法によって取得、同定、選択または特徴付けされた化合物の使用。
【請求項２７】
心臓血管疾患、糖尿病、発作、自己免疫疾患および炎症性疾患、アレルギー性疾患（皮膚炎など）、Ｔヘルパー−１関連疾患、慢性閉塞性肺疾患、喘息、ガンおよび神経変性障害などの様々な病理学的状態を処置または防止するための薬学的組成物を製造するための、請求項１〜２３のいずれか１項記載の方法によって取得、同定、選択または特徴付けされた化合物の使用。
【請求項２８】
心臓血管疾患、糖尿病、発作、自己免疫疾患および炎症性疾患、アレルギー性疾患（皮膚炎など）、Ｔヘルパー−１関連疾患、慢性閉塞性肺疾患、喘息、ガンおよび神経変性障害などの様々な病理学的状態を処置または防止するための薬学的組成物を製造するための、請求項１〜２３のいずれか１項記載の方法によって取得、同定、選択または特徴付けすることができる化合物の使用。
【請求項２９】
心臓血管疾患、糖尿病、発作、自己免疫疾患および炎症性疾患、アレルギー性疾患（皮膚炎など）、Ｔヘルパー−１関連疾患、慢性閉塞性肺疾患、喘息、ガンおよび神経変性障害などの様々な病理学的状態を処置または防止するための化合物を合成する際の、請求項１〜２３のいずれか１項記載の方法によって取得、同定、選択または特徴付けされた化合物の使用。
【請求項３０】
脂質キナーゼの活性を調節、阻害または活性化する分子を合成するための方法であって、（ｉ）脂質キナーゼおよびその標識された脂質基質を候補化合物およびリン酸源の存在下で混合すること、（ｉｉ）リン酸化された脂質と結合するが、リン酸化されていない脂質とは本質的には結合しない担体材料に（ｉ）の反応混合物を曝露すること、および（ｉｉｉ）該担体に結合しているリン酸化された脂質の量を評価すること、（ｉｖ）１０μＭ未満のＩＣ５０値を示すヒット化合物を選択すること、および（ｖ）工程（ｉｖ）で選択されたヒット化合物を該分子の合成において使用することを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、脂質キナーゼの活性を調節する化合物をスクリーニングする方法に関する。本発明は、より好ましくは、脂質キナーゼ（特に、膜脂質キナーゼ、細胞質脂質キナーゼ、分泌型脂質キナーゼ、より具体的にはスフィンゴシンキナーゼ）の活性を調節する化合物をスクリーニングするためにＳＰＡ技術に基づいている。本発明にはまた、該方法によって同定される化合物だけでなく、上記の方法を行うときに使用される組成物、製造物、キット、ならびにそれらの使用が含まれる。
【０００２】
（発明の背景）
脂質キナーゼは、細胞内で脂質のリン酸化を触媒する酵素である。これらの酵素ならびに生じるリン酸化された脂質および脂質由来の生物学的に活性な有機分子は、細胞の増殖、遊走、接着、分化、活性などを含む多くの異なる生理学的プロセスにおいて役割を果たしている。特定の脂質キナーゼ群には、膜脂質キナーゼ（すなわち、細胞膜に含まれる脂質または細胞膜と会合している脂質のリン酸化を触媒するキナーゼ）が含まれる。そのような酵素の例には、ホスフィノシチドキナーゼ（ＰＩ３キナーゼなど）、ジアシルグリセロールキナーゼ、およびスフィンゴシンキナーゼが含まれる。
【０００３】
スフィンゴシンキナーゼ（ＳＰＨＫ）は基質のスフィンゴシンをスフィンゴシン−１−リン酸（Ｓ１Ｐ）に変換する。Ｓ１Ｐは、細胞内において、そして細胞外培地に放出されたとき、その両方で様々な生理学的プロセスに関与している。具体的には、細胞内のＳ１Ｐの報告されている生理学的役割には、貯蔵体からのカルシウムの放出、サイクリン依存性キナーゼの活性化、Ｆｃ受容体によって開始されるカスケードにおける中間の重要なシグナル変換、ｆＭＬＰ誘導による酵素放出、ＴＮＦ−α誘導による（内皮細胞における）接着分子の発現、および心室筋細胞における興奮性の抑制が含まれる。さらに、細胞から放出されたとき、Ｓ１Ｐは、例えば、細胞増殖、走化性（マクロファージの引き寄せおよび活性化）、細胞骨格の変化（ストレスファイバーの形成および細胞形状の変化、そして分泌）、細胞付着（フィブロネクチンマトリックスの組立て）、ならびにパキシリンおよびｐ１２５−ＦＡＫの組立ておよびリン酸化の制御において共役する特異的なＧタンパク質（共役ＥＤＧ受容体）を介して関与している。さらに、ＰＤＧＦは、血小板において高レベルのスフィンゴシンキナーゼ活性およびＳ１Ｐ生成を誘導する。実際に、Ｓ１Ｐが、活性化された血小板から大量に放出される。このことは、傷害後の炎症におけるＳ１Ｐの潜在的に重要な役割を示していると考えられる。より具体的には、Ｓ１Ｐは初期のアテローム発生および線維症において重要な役割を果たしていると考えられる。さらに、スフィンゴシンキナーゼ活性は、高親和性のＩｇＧ受容体（ＦｃγＲＩ）によって開始されるマクロファージの場合と同様に、高親和性のＩｇＥ受容体（ＦｃεＲＩ）を介して活性化されるマスト細胞におけるカルシウムシグナルを調節する際に大きな役割を果たしており、これらの細胞の活性化は、これらに限定されないが、喘息および慢性関節リウマチなどのアレルギー性疾患および自己免疫疾患において非常に重要である。
【０００４】
したがって、脂質（特に、膜脂質、細胞質脂質または分泌型脂質、より具体的にはスフィンゴシン−１−リン酸）は、薬物または薬理学的に活性な化合物を開発するための興味深い標的である。特に、細胞内のＳ１Ｐのレベルを調節することができる化合物は、Ｓ１Ｐが関与するすべての疾患、例えば、アテローム性動脈硬化、血栓症および脂肪血症（ｄｙｓｌｉｐｉｄｅｍｉａ）を含む心臓血管疾患、Ｉ型糖尿病およびＩＩ型糖尿病を含む糖尿病（特にＩ型糖尿病）、発作、自己免疫疾患および炎症性疾患（多発性硬化症、乾癬、疣贅状表皮異形成および炎症性関節炎など）、アレルギー性疾患（皮膚炎など）、Ｔヘルパー−１関連疾患、慢性閉塞性肺疾患、喘息、ガンならびに神経変性障害などを処置するための、大きい可能性を有する化合物である。
【０００５】
したがって、そのような性質を有する化合物をスクリーニングするために好適なアッセイが利用できることは非常に注目される。これに関して、スフィンゴシンキナーゼ（ＳＰＨＫ）活性は、従来的には、３３Ｐまたは３２Ｐの取り込み、その後の脂質抽出、および３３Ｐスフィンゴシン−１−Ｐまたは３２Ｐスフィンゴシン−１−Ｐの薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）分離を使用して測定される（Ａ． Ｍｅｌｅｎｄｅｚら、２０００）。しかし、この試験は高感度ではあるが、ハイスループットスクリーニングには適しておらず、そしてハイスループット形式における脂質キナーゼ調節因子の効率的な同定を可能とするＴＬＣを使用するそのような試験または方法はこの分野では報告されていない。
【０００６】
（発明の要約）
本発明は、脂質キナーゼの活性を調節、阻害または活性化する化合物を確実かつ効率的にスクリーニングするための組成物および方法に関する。本発明による方法は、簡便で、確実で、高感度で、使いやすく、かつ経済的であり、そしてハイスループットでの化合物のスクリーニングを可能にする。特に、本発明は、薬物候補物または標的を同定するために、化合物のコンビナトリアルライブラリーを含む非常に多数の化合物を同時にスクリーニングするために使用することができる。したがって、この種の発明としては、薬学的に活性な製造物の選択、改善および／または開発のために、標的として脂質キナーゼ（特にＳＰＨＫ）を使用して活性な化合物をスクリーニングすることが初めて可能になる。
【０００７】
本発明の目的は、より詳細には、脂質キナーゼの活性を調節する化合物を選択または同定する方法にある。この方法は、（ｉ）脂質キナーゼおよびその標識された脂質基質を候補化合物およびリン酸源の存在下で混合すること（または接触させること）、（ｉｉ）（脂質キナーゼによってリン酸化された）リン酸化脂質と結合するが、リン酸化されていない脂質とは本質的には結合しない担体材料に（ｉ）の反応混合物をさらす（曝露する）こと、および（ｉｉｉ）担体に結合しているリン酸化された脂質の量を評価することを含む。
担体材料は、ポリマー、ゲル、ガラス、人工な成分または有機成分などの様々な成分から構成され得るか、またはそのような様々な成分を含むことができ、より詳細には、ケイ酸イットリウム、酸化イットリウムまたはポリビニルトルエン（ＰＶＴ）から選択される成分から構成され得るか、またはそのような成分を含むことができる。
担体は、（ポリ）アクリルアミド、アガロース、セファロースまたはポリスチレンをさらに含むことができ、あるいはさらに官能基化することができ、そしてビーズを含む様々な形態に形状化することができる。
【０００８】
好ましい態様によれば、本発明の方法では、シンチレーション近接技術（ＳＰＡ）が使用される。該態様において、担体材料は、リン酸化された（放射能）標識されている脂質基質が結合したときに励起され得るシンチラントをさらに含む。
本発明の典型的な態様において、脂質基質はミセル内に存在し、リン酸源はＡＴＰである。
脂質キナーゼは細胞抽出物または膜抽出物であるか、あるいは精製することができる。脂質キナーゼはまた組換え酵素であってもよい。
好ましい態様において、（ｉ）における反応混合物は、
・０．０１〜１０μＭの非標識の脂質、
・０．０１〜１０μＣｉの放射能標識された脂質、
・０．１〜５％の界面活性剤（トリトンなど）または中性脂質（ホスファチジルセリンまたはカルジオリピンなど）または哺乳動物起源の血清タンパク質（ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）、ＨＳＡ（ヒト血清アルブミン）またはＦＢＳＡなど）あるいはそれらの混合物、
・０．１μＭ〜１ｍＭのリン酸源（ＡＴＰなど）、および
・適切な希釈で脂質キナーゼ（または脂質キナーゼを含む任意の組成物もしくは材料）を含む細胞調製物の所望する量の総タンパク質
を含む。
【０００９】
これに関して、本発明のより具体的な側面は、脂質キナーゼの活性を調節、阻害または活性化する化合物を選択または同定する方法にある。この方法は、（ｉ）該脂質キナーゼおよびその標識された脂質基質を候補化合物およびリン酸源の存在下で混合すること、（ｉｉ）リン酸化された形態の脂質と結合するが、リン酸化されていない形態の脂質とは本質的には結合しないビーズであって、標識された脂質がビーズに結合したときに標識された脂質によって励起され得るシンチラントをさらに含むビーズに（ｉ）の反応混合物をさらすこと、および（ｉｉｉ）ビーズのシンチレーションを評価することによって化合物の活性を評価することを含む。
本発明は、脂質キナーゼの活性を調節、阻害または活性化する化合物の選択、同定、特徴付け、改善、比較などのために使用することができる。本発明は、より詳細には、膜脂質キナーゼ、細胞質脂質キナーゼまたは分泌型脂質キナーゼの調節因子、さらにより好ましくはスフィンゴシンキナーゼの調節因子をスクリーニングするために好適である。
【００１０】
本発明のさらなる目的は、上記に定義されるような標識された脂質および／または担体を含む、上記のスクリーニングアッセイで使用されるキットにある。
【００１１】
本発明のさらなる目的は、上記の方法を使用して選択または同定される化合物の薬学目的または治療目的または実験目的のための使用にある。
【００１２】
（発明の詳細な説明）
示されているように、本発明は、一般には、脂質キナーゼの調節因子についてスクリーニングする改善された方法にある。これらの方法では、標識された脂質基質、およびより好ましくは非標識のリン酸源が使用される。これらの方法は、脂質キナーゼの活性化因子ならびに阻害剤を、これらの酵素の調節因子として、すなわち、脂質キナーゼに特異的なリン酸化基質のレベルを増大または低下させる化合物としてスクリーニングするために使用することができる。好ましくは、阻害剤が選択される。すなわち、脂質キナーゼに特異的なリン酸化基質のレベルを典型的には少なくとも２０％低下させ、好ましくは少なくとも５０％低下させる化合物が選択される。
【００１３】
典型的な態様において、本発明の方法は、（ｉ）脂質キナーゼおよびその標識された脂質基質を候補化合物およびリン酸源の存在下で混合すること、（ｉｉ）（脂質キナーゼによってリン酸化された）リン酸化脂質と結合するが、リン酸化されていない脂質とは本質的には結合しない担体材料に（ｉ）の反応混合物をさらすこと、および（ｉｉｉ）担体に結合しているリン酸化された脂質の量を評価することを含む。
【００１４】
好ましい態様では、候補化合物の存在下で担体に結合している脂質の量が、候補化合物の非存在下で担体に結合している脂質の量と比較される。したがって、該量を調節する化合物が、脂質キナーゼの活性を調節する化合物である。
【００１５】
いくつかのアッセイ形式を、本発明の方法を実施するために使用することができるが、好ましいアッセイ形式は、シンチレーション近接アッセイ（ＳＰＡ）などのシンチレーションアッセイである。シンチレーション近接アッセイ（ＳＰＡ）技術は、ＰＰＯなどの有機シンチラントを含有するシンチラントビーズの使用を伴う。アッセイは通常、水性環境ではそのエネルギーが容易に消失する低エネルギー放射線を放射する、３Ｈ、１２５Ｉ、１４Ｃ、３５Ｓまたは３３Ｐなどの放射性同位体を使用して水性緩衝液中で行われる。例えば、３Ｈにより放射される電子は、６ｋｅＶの平均エネルギーを有するにすぎず、水中では非常に短い経路長（−１〜ｔｍ）を有する。これらの同位体の１つで標識された分子が、直接的に、またはビーズに以前に結合させられた別の分子との相互作用を介してビーズ表面に結合した場合、放射される放射線により、シンチラントが活性化され、光が発生する。発生する光の量は、ビーズに結合している標識された分子の量に比例しており、液体シンチレーション（ＬＳ）カウンターで簡便に測定することができる。標識された分子がビーズに結合していない場合、その放射エネルギーは、ビーズに到達する前に周りの水性溶媒によって吸収され、光が発生しない。したがって、結合したリガンドはシンチレーションシグナルをもたらすが、遊離状態のリガンドは非常に低いバックグラウンドをもたらし、したがって、従来の放射性リガンド結合アッセイの特徴である時間のかかる分離工程の必要性がなくなる。アッセイにおいて必要とされる操作は数回の簡単なピペット操作工程に減らされ、これにより、より良好な正確性および再現性ならびにより大きいスループットが得られる。
【００１６】
より好ましい態様において、本発明の方法は、放射能標識されたリン酸化脂質（例えば、スフィンゴシン−１−Ｐ）をＳＰＡビーズに結合させることを含む。結合は、他の結合手段も考えられ得るが、好ましくは、ケイ酸イットリウムビーズまたは酸化イットリウムビーズとの化学的または物理的な相互作用を介して行われる。より具体的には、結合は、リン酸化された基質のリン酸基と担体表面との相互作用（すなわち、共有結合的な結合とは異なる結合）による。アッセイ媒体または反応液は（組換え）脂質キナーゼ（例えば、ｈＳＰＨＫ）およびＡＴＰを含む。測定されるものは、標識されたリン酸されていない化脂質（例えば、スフィンゴシン）の標識されたリン酸化脂質（例えば、Ｓ１Ｐ）への脂質キナーゼの作用による変換を妨害または増大する候補化合物の能力である。例えば、候補リガンドがｈＳＰＨＫを阻害する場合には、スフィンゴシンの変換は行われず、バックグラウンドのノイズシグナルと実質的には異ならないシグナルが記録される。他方、ｈＳＰＨＫの阻害が起こらない場合には、スフィンゴシンのリン酸化が行われ、標識されたＳ１ＰとＳＰＡビーズとの相互作用から生じるシグナルが記録される。
【００１７】
本発明は、リン酸化された脂質と結合するが、その非リン酸化形態とは結合しないように担体材料を設計することができるという予想外の発見に由来する。本発明はまた、アッセイの効率および選択性を変化させることなく、細胞溶解物を室温で使用できることも明らかにする。本発明はさらに、３８４ウエルプレート形式を使用することができるので、ハイスループットが小容量で可能であること、そしてＤＭＳＯの存在により、アッセイの信頼性が変化しないことを明らかにする。
【００１８】
担体材料
次に、本発明は、特定の担体材料を使用して活性な化合物をスクリーニングする新規な方法を開示する。担体材料は、リン酸化された脂質などの酵素活性生成物と結合する能力を有するが、リン酸化されていない脂質などの基質と結合する能力を有していない。したがって、担体に結合した脂質の量は、反応媒体中の脂質キナーゼ活性に対して比例的に相関する。担体は、リン酸化された脂質とリン酸化されていない脂質との該識別を可能にする官能基（抗体または他の反応基など）を含み得るか、あるいは該生成物を識別する能力を有する物質から構成され得る（またはそのような物質を含み得る）。
【００１９】
これに関して、担体は、少なくとも一部が、ケイ酸塩、ポリビニルトルエン（ＰＶＴ）、（ポリ）アクリルアミド、アガロース、セファロース、ポリスチレンなどから構成され得る。担体材料の具体的な例には、ＷＧＡ、ストレプトアビジン、ポリリシンなどのリガンドで場合によりコーティングされたＰＶＴまたはケイ酸塩物質が挙げられる。より好ましい物質は、酸化イットリウムもしくはケイ酸イットリウム（ＹｔＳｉ）（これらは場合によりコーティングもしくは官能化される）、またはＰＶＴを含む。
【００２０】
より好ましい態様において、担体はシンチラント（すなわち、有機シンチラント）を含有する。シンチラントは、好ましくは、水に不溶性であり、標識された脂質が担体に結合したときに、より高いエネルギー状態に励起され得る。シンチラントは、好適な装置（例えば、シンチレーションカウンター）を使用して検出される十分な光エネルギーをもたらさなければならない。シンチラントの典型的な例には、ジフェニルオキサゾール（ＰＰＯ）がある。このシンチラントは、β線を放出する放射性同位体によって効率的に励起される。
【００２１】
本発明において使用される好適な担体材料は市販品の中に見出すことができ、例えば、Ａｍｅｒｓｈａｍ製品のＷＧＡコーティングＰＶＴビーズ（ＲＰＮＱ０００１）、ＰＥＩ処理ＷＧＡ　ＰＶＴビーズ（ＲＰＮＱ０００３）、ストレプトアビジンコーティングＰＶＴビーズ（ＲＰＮＱ０００７）、ポリリシンコーティングケイ酸イットリウムビーズ（ＲＰＮＱ００１０）、ＷＧＡコーティングケイ酸イットリウムビーズ（ＲＰＮＱ００１１）、ストレプトアビジンコーティングケイ酸イットリウムビーズ（ＲＰＮＱ００１２）およびＲＮＡ結合ケイ酸イットリウムＳＰＡビーズ（ＲＰＮＱ００１３）またはＲＮＡ結合酸化イットリウムＳＰＡビーズ（ＲＰＮＱ０２８０）などがある。
【００２２】
リン酸化された脂質とリン酸化されていない脂質とを識別する担体材料の能力は、実施例に記載されるような従来の結合実験を使用して測定（または確認）することができる。典型的には、担体材料は、リン酸化された標識脂質およびリン酸化されていない標識脂質で別々にコーティングすることができる。結合（または結合の非存在）を、担体に付着している標識の量を評価することによって確認することができる。リン酸化された脂質との結合の差が十分に大きい限り、リン酸されていない化脂質の残留する結合は許容され得ることを理解しなければならない。
【００２３】
具体的な例において、担体材料は、セリウムがドープされたケイ酸イットリウム（ｙ２ＳｉＯ５：Ｃｅ）を含む。担体は、全体が上記の物質から構成され得るか、または（ポリ）アクリルアミド、アガロースもしくはポリスチレンなどのさらなる成分を含むことができる。本発明において使用される担体材料の具体的な例には、ＲＮＡ結合ケイ酸イットリウムＳＰＡビーズ（ＲＰＮＱ０６２５またはＲＰＮＱ００１３、Ａｍｅｒｓｈａｍ）がある。別の具体的な例には、酸化イットリウムＳＰＡビーズ（ＲＰＮＱ０２８０、Ａｍｅｒｓｈａｍ）がある。
【００２４】
一般に、０．０５〜５ｍｇの担体材料が各アッセイについて使用される。担体材料の正確な量は、担体材料、試薬量などに依存して当業者によって調節され得ることを理解しなければならない。さらに、この段階では、アッセイ性能を改善するためにＺｎイオンを反応混合物または緩衝剤に添加することが可能である。担体材料の好ましい量は、特に３８４ウエルプレートではウエルあたり約０．５ｍｇである。例えば、好ましい態様において、担体材料は酸化イットリウムビーズである。
【００２５】
標識された脂質
上記に示されるように、本発明では、標識された脂質が上記に記載される条件のもとで用いられ、そのリン酸化された形態が検出される。標識された脂質の使用は、標識されたリン酸源（ＡＴＰなど）とは対照的に、リン酸源と担体材料との間における何らかの直接的な相互作用による非特異的なシグナルが避けられるので好都合である。
【００２６】
標識された脂質は、好ましくは放射能標識されている。放射能標識は、３Ｈ、１２５Ｉ、１４Ｃ、３５Ｓ、３３Ｐまたは３２Ｐを含む様々な放射性同位体を使用して行うことができる。好ましくは、放射性同位体は、水性環境においてそのエネルギーが容易に消失する低エネルギー放射線を放出しなければならない。実際、結合していない標識された基質は、担体材料に含有されるシンチラントを本質的には活性化しないことが必要である。同位体の性質は、シンチラントのタイプに依存してもまた選択され得る。例えば、ＰＰＯがシンチラントとして使用される場合、同位体は、好ましくは例えば３Ｈなど、β線を放射しなければならない。
【００２７】
アッセイのために使用される標識された脂質の量は当業者によって調節され得る。典型的な実験では、０．０１〜１０μＭ、好ましくは０．０２〜１μＭの基質が、０．０１〜０．５μＣｉの［３Ｈ］スフィンゴシンを含む各アッセイについて使用される。反応混合物に添加されるタンパク質の量は、その活性に依存し、当業者によって調節され得る。好ましくは、この量は、反応時間内の基質の消費が３０％未満であるようにしなければならない。
【００２８】
さらに、具体的な変形において、脂質はミセル内に取り込まれる。実際、本発明は、基質脂質がミセル内に存在するときに効率的なスクリーニング条件が得られることを明らかにする。そのような目的のために、界面活性剤、中性脂質または血清タンパク質（またはそれらの任意の混合物）を、典型的には約０．１〜約５％の範囲内で、より好ましくは約０．２〜約３％の範囲内で反応混合物に加えることができる。より詳細には、界面活性剤はトリトンまたはノニデットが可能であり、中性脂質はホスファチジルセリンまたはカルジオリピンが可能であり、血清タンパク質は哺乳動物起源であり、例えば、ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）、ＨＡＳ（ヒト血清アルブミン）またはＦＢＳＡなどである。
【００２９】
より好ましい態様において、トリトンまたはノニデットなどの界面活性剤が、約０．１〜約５％の範囲内で、より好ましくは約０．１％〜約３％の範囲内で、最も好ましくは０．１〜１％の範囲内で添加される。
【００３０】
したがって、具体的な変形において、工程（ｉ）における反応混合物は、放射能標識された脂質および非放射能的に標識された脂質（放射能標識されたスフィンゴシンなど）、リン酸源、界面活性剤（トリトンなど）または中性脂質、および脂質キナーゼを含む細胞抽出物（または脂質キナーゼを含む任意の組成物もしくは材料）を含む。反応混合物は、様々な試薬の接触を可能するが、それらの生物学的活性を変化させない任意の溶媒、緩衝剤、生理食塩液、水溶液などを含むことができる。
【００３１】
他の具体的な変形において、工程（ｉ）における反応混合物は、放射能標識された脂質（放射能標識されたスフィンゴシンなど）、非放射能的に標識された脂質、リン酸源、界面活性剤（トリトンなど）または中性脂質、および脂質キナーゼ（または脂質キナーゼを含む任意の組成物もしくは材料）を含む。反応混合物は、様々な試薬の接触を可能するが、それらの生物学的活性を変化させない任意の溶媒、緩衝剤、生理食塩液、水溶液などを含むことができる。
【００３２】
より好ましくは、工程（ｉ）における反応混合物は、放射能標識された脂質（放射能標識されたスフィンゴシンなど）、非放射能的に標識された脂質、リン酸源、界面活性剤（トリトンなど）、脂質キナーゼを含有する細胞抽出物または調製物を含む。
【００３３】
さらに、ミセルの形成を容易にするために、反応混合物はさらに超音波処理することができるが、これは、アッセイを行うためには必要ではない。
【００３４】
脂質キナーゼ
脂質キナーゼは様々な条件のもとで使用することができる。実際、精製された酵素、または酵素を含む任意の溶液もしくは懸濁物もしくは組成物、例えば、活性な酵素を含む細胞分画物、細胞溶解物もしくは任意の細胞調製物などを使用することが可能である。実際、本発明は、アッセイで使用するために酵素を精製および単離することを必要としないこと、そして細胞溶解物が、効率および特異性の両方の点で顕著な結果をもたらすことを明らかにする。本発明の好ましい態様では、脂質キナーゼは精製されないで使用される。
【００３５】
特定の態様において、本発明の方法では、（組換え）哺乳動物細胞、細菌細胞または昆虫細胞に由来する（から得られる）脂質キナーゼを含む調製物、より好ましくは、細胞溶解物もしくは細胞分画物、またはそれらに由来する予備精製溶液もしくは濃縮溶液が使用される。
【００３６】
酵素は様々な起源であり、例えば、ヒトまたは動物に由来し得、ヒトが好ましい。酵素は、天然に存在する酵素であってもよく、または該酵素を天然に産生する生物学的サンプル（組織培養物、細胞培養物など）から単離もしくは調製することができ、または前記酵素をコードする組換え核酸を含有する細胞から調製される組換え酵素であってもよい。
【００３７】
これに関して、特定の態様において、脂質キナーゼは、酵素の合成を可能にする条件のもとで培養された哺乳動物細胞、好ましくはヒト細胞の培養物から得られる。
【００３８】
酵素がスフィンゴシンキナーゼである場合、スフィンゴシンキナーゼは、原核生物細胞から、そして同様に真核生物細胞（哺乳動物細胞、好ましくはヒト細胞）、例えば、繊維芽細胞、血小板、単球、マクロファージ、マスト細胞、Ｔ細胞などから調製することができる。さらに、細胞は、特に、増殖因子（例えば、ＰＤＧＦ、ＥＧＦ、ＦＧＦなど）のリガンドの存在下で、そして免疫−受容体（例えば、ＴＣＲ、ＦｃεＲＩおよびＦｃγＲＩ）の活性化によって、より大きい酵素活性を生じさせるために刺激することができる。細胞は、任意の適切な培地で培養され、その後、脂質キナーゼ含有材料（細胞抽出物、分画物など）を調製するために処理され得る。典型的には、細胞は、脂質キナーゼ含有材料を作製するために物理的処理および／または化学的処理に供される。典型的な実験では、細胞は、好ましくはトリプシン、解凍／凍結サイクル、超音波などを単独または様々な組合せで使用して、酵素的溶解および／または化学的溶解および／または物理的溶解に供される。細胞抽出物（または分画物）は集められ、そしてさらに濃縮され、適切な緩衝液に懸濁され、そして精製および調整などが行われ得る。
【００３９】
スフィンゴシンキナーゼはまた、該酵素をコードする核酸を含有するトランスフェクションされた細胞から得ることができる。これに関して、ヒトのスフィンゴシンキナーゼをコードする核酸配列が、Ｍｅｌｅｎｄｅｚら、ＧＥＮＥ、２５１、１９〜２４に記載されている。この配列は、組換え酵素を産生させるために様々なプロモーターを含有する様々なプラスミドおよび／またはベクターを使用して細胞にトランスフェクションすることができる。そのような細胞の溶解物（またはそれらに由来する他の調製物）を本発明のスクリーニングアッセイにおいて使用することができる。
【００４０】
好ましい態様において、スフィンゴシンキナーゼは原核生物細胞から得られるが、好ましくはＳｆ９またはＳｆ２１などの昆虫細胞から得られる。細胞は、該酵素をコードする核酸配列を含むベクターでトランスフェクションまたは感染させられる。これに関して、バキュロウイルスが好ましいベクターであり、酵素の製造は、「Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｖｅｃｔｏｒｓ」（Ｄａｖｉｓ Ｒ． Ｏ’ＲＥＩＬＬＹ、Ｌｉｏｓ Ｋ． ＭＩＬＬＥＲ、Ｖｅｒｎｅ Ａ． ＬＵＣＫＯＷ）（これは参照として本明細書中に組み入れられる）に従って行われる。しかし、当業者によって知られているバキュロウイルスによるタンパク質製造に対するアッセイもまたすべて、本発明に関連して使用することができる。
【００４１】
典型的には、使用されるキナーゼ調製物は、０．１〜４０μｇの総タンパク質、より好ましくは０．１〜５μｇの総タンパク質、さらにより好ましくは約１μｇの総タンパク質を含む細胞溶解物または細胞分画物（または細胞から得られる他の材料）である。キナーゼ調製物はまた、（トランスフェクションされた）細胞の全抽出物を含むことができる。正確な量は当業者によって調節され得る。一般に、本発明のスクリーニングにおいて必要とされるキナーゼの量は、基質の１／３未満がアッセイのインキュベーション期間中に使用されるキナーゼの量である。好ましくは、この量は、反応時間内において基質の１０％未満の消費をもたらさなければならない。
【００４２】
または、精製された（組換え）酵素を使用することができる。
【００４３】
アッセイは、プレート、チューブ、フラスコなどを含む任意の適切な担体または器具で行うことができる。一般に、接触は、多数のアッセイが同時に行うことができるマルチウエルプレートで行われる。典型的な担体には、マイクロタイタープレートが挙げられ、特に９６ウエルマイクロタイタープレート形式または３８４ウエルマイクロタイタープレート形式およびより大きいスループットのマイクロタイタープレート形式があり、これらは操作が容易であり、そして通常の励起で照射することが容易である。他の形式もまた使用することができ、これには、より大きいマイクロタイタープレートまたはナノテクノジーが含まれる。
【００４４】
担体および試験化合物に依存して、様々な量の試薬をアッセイで使用することができる。典型的には、下記の量が、ウエルあたり２５０μｌの最終的な最大容量で分配され得る：
・０．０１〜１０μＭの非標識の脂質、
・０．０１〜１０μＣｉの放射能標識された脂質、
・０．１〜５％の界面活性剤（トリトンなど）または中性脂質（ホスファチジルセリンまたはカルジオリピンなど）または哺乳動物起源の血清タンパク質（ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）、ＨＳＡ（ヒト血清アルブミン）またはＦＢＳＡなど）あるいはそれらの混合物、
・０．１μＭ〜１ｍＭのリン酸源（ＡＴＰなど）、および
・適切な希釈で脂質キナーゼ（または脂質キナーゼを含む任意の組成物もしくは材料）を含む細胞調製物の所望する量の総タンパク質。
【００４５】
好ましい態様において、試薬は、３０μｌ〜１００μｌの間で含まれる最終的な容量において下記の量範囲にある：
・０．０１〜１μＭの非標識の脂質、
・０．０１〜０．５μＣｉの放射能標識された脂質、
・０．１〜０．５％の界面活性剤（トリトンなど）または中性脂質（ホスファチジルセリンまたはカルジオリピンなど）または哺乳動物起源の血清タンパク質（ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）、ＨＳＡ（ヒト血清アルブミン）またはＦＢＳＡなど）あるいはそれらの混合物、
・０．１〜５０μＭのリン酸源（ＡＴＰなど）、
・適切な希釈で脂質キナーゼ（または脂質キナーゼを含む任意の組成物もしくは材料）を含む細胞調製物の所望する量の総タンパク質。
【００４６】
さらなる好ましい態様において、０〜３０％のグリセロールが反応混合物に添加される。好ましくは、１５％〜２５％のグリセロールが反応混合物に添加され、最も好ましくは２０％が反応混合物に添加される。
【００４７】
試薬および試験化合物の正確なそれぞれの量（または濃度）は、化合物のタイプ、脂質キナーゼのタイプ、インキュベーション期間の長さなどに依存して使用者によって調節され得ることを理解しなければならない。さらに、必要な場合には、酵素は、アッセイの性能を改善するためのさらなる薬剤の存在下で混合することができる。
【００４８】
さらに、ＡＴＰは好ましいリン酸源である。
【００４９】
工程ｉ）における混合は６時間まで続けることができるが、典型的には４時間未満である。実際、様々な試薬が、好ましくは、リン酸化を生じさせるために十分な時間にわたってインキュベーションされる。アッセイに依存するが、この期間は、通常、約３時間未満である。典型的な実験では、混合は約１時間以下にわたって行われるが、好ましくは約４５分間行われる。工程（ｉｉ）では、担体が約１０分間から数時間にわたって加えられる。反応混合物の総容量に依存して、後者は最初の５〜３０分間振とうされる。その後、混合物は１５分間〜２４時間の期間にわたって置かれる。担体がビーズであるとき、ビーズ溶液は０〜７０％のグリセロールを含むことができ、好ましくはグリセロールを２０％以上含むことができる。例えば、９６ウエルプレート形式アッセイでは、７０％のグリセロールが好ましくはビーズ溶液に加えられ、そして３８４ウエルプレートアッセイについては、２０％のグリセロールがビーズ溶液に加えられる。
【００５０】
担体に結合している脂質の量を、脂質キナーゼの活性の目安として、様々な方法によって評価することができる。一般には、従来の装置を使用してシンチレーション計数することによって評価される。ＳＰＡに由来する方法が使用される場合、カウント数が、何らかの分離工程を必要とすることなく、反応混合物において直接的に測定される。または、担体に結合している脂質を、クロマトグラフィー、免疫アッセイなどの他の従来技術を使用して検出または定量することができる。
【００５１】
試験（または候補）化合物
試験化合物は、単離された形態にある任意の生成物、または任意の他の物質（例えば、任意の他の生成物）との混合状態にある任意の生成物であり得る。化合物は、構造および／または組成に関して定義することができ、あるいは定義することができない。例えば、化合物には、単離された構造的に定義される生成物、構造が未知である単離された生成物、いくつかの知られている特徴付けられた生成物の混合物、または１つ以上の生成物を含む定義できない組成物を挙げることができる。そのような不明確な組成物の例には、例えば、組織サンプル、生物学的流体、細胞抽出物、植物調製物などが含まれる。試験化合物は、ポリペプチド（またはタンパク質もしくはペプチド）、核酸、脂質、多糖、化学的生成物、またはそれらの任意の混合物もしくは誘導体を含む任意の有機生成物または無機生成物であり得る。化合物は、化合物のライブラリーを含む天然起源、合成起源であり得る。
【００５２】
下記においてさらに議論されるように、本発明は、化合物のコンビナトリアルライブラリーなどの非常に多数の化合物をスクリーニングするために特に適合化される。実際、本発明は、複数の化合物を短時間で効率的かつ簡便なスクリーニングすることを可能にする組成物および方法を提供する。具体的には、本発明の方法は部分的に自動化することができ、それにより、化合物の多数の組合せを効率的かつ同時にスクリーニングすることを可能にする。
【００５３】
一般に、試験化合物の活性は不明であり、本発明の方法は、選択された性質を示す化合物（例えば、脂質キナーゼ調節因子）を同定するために使用される。しかし、特に、試験化合物の活性（または活性のタイプ）が知られているか、または予想される場合には、本発明の方法は、該試験化合物の誘導体をアッセイすることによって、該活性を（特異性、効力などに関して）さらに特徴付けるために、および／または該活性を最適化するために使用することができる。
【００５４】
本発明のさらなる目的は、上記に定義されるように取得、同定、選択または特徴付けされた化合物を、医薬品、薬物候補物、さらに最適化するためのリードなどとして製薬産業において使用することにある。これらの化合物は、例えば、ヒトの身体を処置するための組成物を製造するために、特に、心臓血管疾患、糖尿病、発作、自己免疫性疾患および炎症性疾患、アレルギー性疾患（皮膚炎など）、Ｔヘルパー−１関連疾患、慢性閉塞性肺疾患、喘息、ガンおよび神経変性障害などの様々な病理学的状態を処置するための組成物を製造するために使用することができる。
【００５５】
本発明はまた、上記に定義されるように取得、同定、選択または特徴付けされた化合物、ならびに本発明の方法によって取得、同定、選択または特徴付けすることができる化合物を含む薬学的組成物に関する。
【００５６】
本発明はまた、脂質キナーゼ調節因子をスクリーニングするときに使用されるキットを含む。このキットは、上記に定義されるような脂質キナーゼの標識された脂質基質および／または担体材料を含む。キットは、脂質キナーゼ自体、緩衝液などの、ＳＰＡ技術に対する試薬および／またはプロトコルをさらに含むことができる。
【００５７】
本発明のさらなる側面および利点が下記の実施例に開示される。下記の実施例は、本出願の範囲を限定するのではなく、本発明の例示と見なさなければならない。
【００５８】
材料＆方法
材料
すべての補充物を含む増殖培地はＬｉｆｅＴｅｃｈ（Ｐａｒｉｓ、フランス）から購入した。トランスフェクション試薬はＱＩＡＧＥＮ（Ｐａｒｉｓ、フランス）から得た。すべての脂質はＳｉｇｍａ（Ｐａｒｉｓ、フランス）から購入した。［３−３Ｈ］スフィンゴシン（１５ｍＣｉ／ｍｍｏｌ）はＡｍｅｒｓｈａｍ（Ｐａｒｉｓ、フランス）またはＮＥＮ（Ｂｏｓｔｏｎ、Ｍａ）から得られた。ケイ酸イットリウムＲＮＡ結合ビーズおよび酸化イットリウムＲＮＡ結合ビーズはＡｍｅｒｓｈａｍ（Ｐａｒｉｓ、フランス）から得る。
【００５９】
ＣＨＯ細胞および／またはＣＯＳ−７細胞におけるヒトスフィンゴシンキナーゼ（ｈｕＳＰＨＫ１）のトランスフェクション
ＣＨＯ細胞またはＣＯＳ−７細胞を、５％ＣＯ２雰囲気の空気中、３７℃で、Ｔ−１７５組織培養フラスコにおいて、９０％ＨａｍＦ１２培地、１０％ウシ胎児血清、ゲンタマイシンで培養した。ＣＨＯ細胞および／またはＣＯＳ−７細胞を、Ｑｉａｇｅｎ試薬Ｓｕｐｅｒｆｅｃｔを使用して、ベクターｐｃＤＮＡ３単独で、またはヒトスフィンゴシンキナーゼｃＤＮＡを含有するベクターで一過性トランスフェクションした。細胞を１７５ｃｍ２フラスコあたり５×１０６で播種した。２４時間後、細胞を、２０μｌのＳｕｐｅｒｆｅｃｔと混合された１０μｇのｃＤＮＡで６時間トランスフェクションし、洗浄し、そして完全Ｈａｍ培地で２日間培養した。その後、細胞をトリプシン処理し、１５００ｒｐｍで１０分間遠心分離して、アッセイ緩衝液に再懸濁した。細胞を３回の解凍／凍結サイクルに供し、そしてタンパク質濃度を、Ｂｒａｄｆａｏｒｄ技術（Ｂｉｏｒａｄキット）を使用して推定した。タンパク質濃度を１μｇ／μｌに調節して、小分けし、−２０℃で凍結保存した。
【００６０】
ＢＬ２１ＤＥ３細胞におけるスフィンゴシンキナーゼの産生
ＢＬ２１ＤＥ３／ＳＫ細胞の培養物を２５℃で５０μＭのＩＰＴＧとともに一晩インキュベーションした。細菌ペレットを緩衝液Ａに懸濁する。２ｍｇ／ｍｌのリゾチームを加えて、調製物を４℃で３０分間撹拌する。その後、Ｍｇｃｌ（１０ｍＭ）を加え、次いでＤＮＡアーゼ１（１０μｇ／ｍｌ）を加え、混合物を４℃で３０分間撹拌する。溶液を、４℃で１０秒間、約４回、超音波処理する。細胞の超音波処理物を４０００ｒｐｍにおいて４℃で１５分間遠心分離する。得られた上清を−２０℃で保存する。
アッセイ緩衝液：ＴｒｉｓＨｃｌ　２０ｍＭ、グリセロール　２０％、β−メルカプトエタノール　１ｍＭ、ＥＤＴＡ　１ｍＭ、オルトバナジン酸ナトリウム　１ｍＭ、デオキシピリドキシン　０．５ｍＭ、プロテアーゼ阻害剤完全カクテル（Ｒｏｃｈｅ、ｒｅｆ１６９７４９８）。
【００６１】
昆虫細胞におけるスフィンゴシンキナーゼの産生
Ｓｆ９細胞を、以前に記載された方法に従ってバキュロウイルスによって感染させる。感染６日後、細胞を溶解緩衝液で回収して、懸濁する。細胞溶液を１６０００ｇにおいて４℃で１５分間遠心分離する。上清を超音波処理し、次いで溶解緩衝液で完全にする。撹拌しながら４℃で２時間インキュベーションした後、溶液を１６０００ｇにおいて４℃で２０分間遠心分離する。得られた上清を−８０℃で保存する。
【００６２】
スフィンゴシンキナーゼ活性アッセイ
スフィンゴシンキナーゼ活性を、２つの形式のシンチレーション近接アッセイ（ＳＰＡ）を使用してアッセイした。
【００６３】
９６ウエルプレート形式でのスフィンゴシンキナーゼ活性アッセイ
ａ）アッセイ組成
このアッセイの総容量は１００μＬであり、これは、ＤＭＳＯに溶解された化合物またはＤＭＳＯ単独２μＬと、［３Ｈ］−スフィンゴシンとともにトリトンミセルを含むアッセイ緩衝液６０μＬと、ＳＫ緩衝液における酵素希釈物３８μＬとを含む。
【００６４】
アッセイの組成は下記の通りである：
適切な希釈度の酵素を、０．１２５μＣｉ／ウエルの［３Ｈ］−スフィンゴシン、１μＭのスフィンゴシン、３０μＭのＡＴＰおよび０．２５％のトリトン、１２個の異なる濃度でアッセイされる化合物、２０ｍＭのＴＲＩＳ、１ｍＭのβ−メルカプトエタノール、１ｍＭのＥＤＴＡ、０．５ｍＭの４−デオキシピリドキシン、４０ｍＭのβ−グリセロホスファート、１ｍＭのオルトバナジン酸塩、１０ｍＭのＭｇＣｌ２および２０％のグリセロールと混合する。
【００６５】
酵素をＳＫ緩衝液で希釈する。選ばれる希釈度は、１μＭのスフィンゴシンが約１０％消費される希釈度である。この希釈物は０℃で調製され、この温度でアッセイに添加される。
【００６６】
ｂ）アッセイプロトコル
アッセイは９６ウエルプレート（Ｉｓｏｐｌａｔｅ、白色マトリックスにおける透明ウエルを有するＷａｌｌａｃ）で行われる。各プレートには、１１個の１つづつの濃度で８個の化合物（Ｉ１〜Ｉ１１）、６個の総活性ウエル（ＴＡ）、およびＤＭＳＯのみを含有する２個の非特異的ウエル（ＮＳ）が含まれる。
【００６７】
下記の溶液が最初に調製される：
・ＳＫｘ１緩衝液：Ｔｒｉｓ　２０ｍＭ、ＭｇＣｌ２　１０ｍＭ、β−メルカプトエタノール　１ｍＭ、ＥＤＴＡ　１ｍＭ、４−デオキシピリドキシ　０．５ｍＭ、β−グリセロホスファート　４０ｍＭ、オルトバナジン酸ナトリウム　１ｍＭ、グリセロール　２０％、ｐＨ７．４
・ＳＰＡビーズ溶液：ＳＰＡビーズ　５ｍｇ／ｍｌ、ＺｎＣｌ２　４０ｍＭ、グリセロール　７０％
・ＤＭＳＯによる阻害剤希釈物：各阻害剤について、１１個の希釈物Ｉ１〜Ｉ１１がポリプロピレン製の母プレートで調製される。
・アッセイ緩衝液（１枚のプレートについて）：１９μＬのスフィンゴシン（０．５ｍＭ）、１２μｌの［３Ｈ］−スフィンゴシン（１７Ｃｉ／ｍｍｏｌ、１ｍＣｉ／ｍｌ）、２９μＬのＡＴＰ（１０ｍＭ）および２４μｌのトリトン１００Ｘとともにプロテアーゼ阻害剤カクテルを含有する５６７６μｌのＳＫ緩衝液。混合物を数分間超音波処理して、ミセルエマルションを形成させる。
【００６８】
その後、種々の構成成分がＩｓｏｐｌａｔｅに分配される：
・ＤＭＳＯ（２μＬ／ウエル）をＴＡウエルおよびＮＳウエルに加える。
・阻害剤希釈物をウエルに分配する（２μＬ／ウエル）。
・［３Ｈ］−スフィンゴシンとともにトリトンミセルを含有するアッセイ緩衝液（６０μｌ／ウエル）
・適切な希釈度の酵素（３８μＬ／ウエル）を、ＮＳウエルを除くすべてのウエルに加える。
・プレートを８００ｒｐｍで撹拌し、室温で４５分間インキュベーションする。
・１００μＬ／ウエルのＳＰＡビーズエマルション（これは０．５ｍｇ／ウエルのビーズに対応する）。プレートを透明なＴｏｐｓｅａｌ（Ｐａｃｋａｒｄ）で覆い、８００ｒｐｍで１時間撹拌し、Ｗａｌｌａｃ Ｔｒｉｌｕｘで計数する。
必要な場合には、このアッセイは室温で行うことができ、そして構成成分の分配を変化させることができる。
【００６９】
３８４ウエルプレート形式でのスフィンゴシンキナーゼ活性アッセイ
ａ）アッセイ組成
総容量は３０μＬであり、これは、２５％ＤＭＳＯに溶解された試験化合物または２５％ＤＭＳＯ単独の３μＬと、［３Ｈ］−スフィンゴシンとともにトリトンミセルを含むアッセイ緩衝液１４μＬと、ＳＫ緩衝液における酵素希釈物１３μＬとを含む。
【００７０】
アッセイの組成は下記の通りである：
適切な希釈度の酵素を、０．０４２μＣｉ／ウエルの［３Ｈ］−スフィンゴシン、１μＭのスフィンゴシン、３０μＭのＡＴＰおよび０．２５％のトリトン、２０μＭの試験化合物、２０ｍＭのＴＲＩＳ、１ｍＭのβ−メルカプトエタノール、１ｍＭのＥＤＴＡ、０．５ｍＭの４−デオキシピリドキシン、４０ｍＭのβ−グリセロホスファート、１ｍＭのオルトバナジン酸塩、１０ｍＭのＭｇＣｌ２および２０％のグリセロールと混合する。
【００７１】
酵素をＳＫ緩衝液で希釈する。選ばれる希釈度は、１μＭのスフィンゴシンおよび３０μＭのＡＴＰが約１０％消費される希釈度である。この希釈物は０℃で調製され、この温度でアッセイに添加される。
【００７２】
ｂ）アッセイプロトコル
アッセイは３８４ウエルプレート（白色マトリックスにおける白色の３８４ウエルプレート）で行われる。各プレートには、１１個または１２個の１つづつの濃度で２３個または３２個の化合物（Ｉ１〜Ｉ１１または１２）、８個の総活性ウエル（ＴＡ）、およびＤＭＳＯのみを含有する４個の非特異的ウエル（ＮＳ）が含まれる。
【００７３】
下記の溶液が最初に調製される：
・ＳＫｘ１緩衝液：Ｔｒｉｓ　２０ｍＭ、ＭｇＣｌ２　１０ｍＭ、β−メルカプトエタノール　１ｍＭ、ＥＤＴＡ　１ｍＭ、４−デオキシピリドキシ　０．５ｍＭ、β−グリセロホスファート　４０ｍＭ、オルトバナジン酸ナトリウム　１ｍＭ、グリセロール　２０％、ｐＨ７．４
・Ｌｅａｄｓｅｅｋｅｒビーズ溶液：ＳＰＡビーズ　１７ｍｇ／ｍｌ、Ｚｎｃｌ２　４０ｍＭ、グリセロール２０％
・ＤＭＳＯによる阻害剤希釈物。各阻害剤について、１１個の希釈物Ｉ１〜Ｉ１１がポリプロピレン製の元プレートで調製される。
・アッセイ緩衝液（１枚のプレートについて）：２３μＬのスフィンゴシン（０．５ｍＭ）、１６μｌの［３Ｈ］−スフィンゴシン（１７Ｃｉ／ｍｍｏｌ、１ｍＣｉ／ｍｌ）、３５μＬのＡＴＰ（１０ｍＭ）および２９μｌのトリトン１００Ｘとともにプロテアーゼ阻害剤カクテルを含有する５２７３μｌのＳＫ緩衝液。
反応混合物を数分間超音波処理して、ミセルエマルションを形成させる。
【００７４】
その後、種々の構成成分が（可能であれば室温で）白色マトリックスプレートに分配される：
・２５％ＤＭＳＯ（３μＬ／ウエル）をＴＡウエルおよびＮＳウエルに加える。
・２５％ＤＭＳＯでの阻害剤希釈物をウエルに分配する（３μＬ／ウエル）。
・［３Ｈ］−スフィンゴシンとともにトリトンミセルを含有するアッセイ緩衝液（１４μｌ／ウエル）
・適切な希釈度の酵素（１３μＬ／ウエル）を、ＮＳウエルを除くすべてのウエルに加える。
・プレートを室温で４５分間インキュベーションする。
・３０μＬ／ウエルのｌｅａｄｓｅｅｋｅｒビーズエマルション（これは０．５ｍｇ／ウエルのビーズに対応する）。
プレートを１時間〜２４時間置き、その後、Ｌｅａｄｓｅｅｋｅｒ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ ｂｉｏｔｅｃｈ）で計数する。
必要な場合には、構成成分の分配を変化させることができる。
【００７５】
アッセイの定量：
各アッセイの定量には、下記の式を使用して阻害率が計算されるソフトウエア（エクセル９７など）で生データを変換することが必要である：
阻害％＝１００×（１−（阻害された活性ｃｐｍ−ＮＳｃｐｍ）／（ＴＡｃｐｍ−ＮＳｃｐｍ））
阻害％は、その後、モデル「Ｈｉｌｌ傾きを有するシグモイダル曲線、ｙ＝１００＊Ｘ∧ｎ／（Ｋ∧ｎ＋Ｘ∧ｎ）」を使用して近似される。Ｋは所望のＩＣ５０である。
【００７６】
（実施例）
実施例１：スクリーニングアッセイの組立て
スフィンゴシンキナーゼ（ＳＰＨＫ）活性は、従来的には、３３Ｐまたは３２Ｐの取込み、その後の脂質抽出、および３３Ｐスフィンゴシン−１−Ｐまたは３２Ｐスフィンゴシン−１−Ｐの薄層クロマトグラフィー分離を使用して測定されている（Ａ． Ｍｅｌｅｎｄｅｚら、２０００）。この試験は非常に高感度であるが、ハイスループットのスクリーニングには適していない。今回、特定の担体材料（「ＲＮＡ結合ＳＰＡビーズ」など）が、リン酸化されていない脂質ではなく、リン酸化された脂質と特異的に結合する能力を有することが本発明者らによって発見された。これらの担体の性質の利点を利用して、２段階アッセイが組み立てられた（図１を参照のこと）。第１段階のスフィンゴシンの酵素的リン酸化は、上記に記載される試験に基づいている。酵素は、ＡＴＰと、トリトンミセルに取り込まれた［３Ｈ］スフィンゴシンとともに１時間インキュベーションされる。第２段階において、ビーズがウエルに添加され、混合物が１５分間撹拌され、リン酸化されたトリチウム化スフィンゴシンがビーズに結合させられる。ＳＰＡの原理に従って、（リン酸化されたトリチウム化スフィンゴシンを介して）ビーズに結合しているトリチウムのβ放射により、ビーズはシンチレーションが誘導され、これに対して、リン酸化されていないスフィンゴシンのトリチウムは十分に接近しておらず、シンチレーションを誘導しない。ビーズは１時間静置され、そしてプレートがシンチレーションカウンターで読み取られる。
【００７７】
実施例２：スクリーニングアッセイの特異性の実証
試験の特異性を、トランスフェクションされた細胞と比較して低い内因性のスフィンゴシンキナーゼ活性を示すＣＨＯ細胞またはＣＯＳ７細胞などの非トランスフェクション細胞を使用して、以前の記載（Ａ． Ｍｅｌｅｎｄｅｚら、２０００）のように評価した（図２）。図２は、ＡＴＰが存在しない場合、活性が妨げられること、そして既に記載されたＳＰＨＫ阻害剤のＮ−Ｎ−ジメチルスフィンゴシンが、以前の結果とよく一致するＩＣ５０で酵素活性を阻止したことを示している。これらのデータは、このアッセイで検出される活性がＳＰＨＫ活性に対応することを強く示唆した。
【００７８】
実施例３：３７℃および室温でのスクリーニングアッセイの効率の比較
シグナル対ノイズ比が、最適化された条件を使用して大きく増大した。アッセイが行われる温度はこれらの条件の１つである。
ロボット操作時における３７℃でのインキュベーションを避けるために、酵素の室温および３７℃での活性を比較した。図３に示されるように、１時間のインキュベーション時間で、両方のインキュベーション温度における活性は等しいことが見出された。
【００７９】
実施例４：ＡＴＰ量およびスフィンゴシン量の決定
アッセイ条件の最適化にはまた、ＡＴＰ濃度、スフィンゴシン濃度および酵素濃度の適切な量を決定することが必要である。
ＳＰＨＫのＡＴＰポケットは他のキナーゼのポケットとの大きい相同性を示していない（Ａ． Ｍｅｌｅｎｄｅｚ、私信）ので、ＡＴＰ結合ポケットの遮断剤はこれらのキナーゼの特異的な阻害剤であり得る。その場合、特異的な阻害剤を選び出すことができることは重要であると考えられる。スフィンゴシンキナーゼの阻害剤を高感度で検出するために、基質濃度、すなわち、スフィンゴシンならびにＡＴＰの濃度は、好ましくは、それらのそれぞれのＫＭよりも低くしなければならない。スフィンゴシンのＫＭは５μＭであり（Ａ． Ｍｅｌｅｎｄｅｚら、２０００）、ＡＴＰのＫＭは約３０μＭである（図４Ｂ）。ＡＴＰの好ましい濃度は１０μＭに設定され、スフィンゴシンの濃度は１μＭに設定された。さらに、図４Ａは、２μｇの細胞抽出物で最大の酵素活性（Ｖｍａｘ）に達することを示した。したがって、酵素量はウエルあたり１μｇの細胞抽出物に設定されている。
【００８０】
実施例５：トリトン量の比較
シグナルを改善するために、スフィンゴシンが取り込まれているトリトンミセルの量もまた調べた。図５Ａでは、トリトンＸ−１００のいくつかの量（％）によるスフィンゴシンキナーゼの活性が比較される。本実施例では、最大のスフィンゴシンキナーゼ活性はトリトンが０．２５％〜１．０％の間であり、最適な活性はトリトンが１％においてであることを示している。
【００８１】
実施例６：様々な濃度のＤＭＳＯを用いたスフィンゴシン活性の比較
主なライブラリーの化合物はＤＭＳＯに溶解される。したがって、様々な量のこの溶媒が存在するもとでアッセイを評価することは重要である。図５Ｂでは、ＤＭＳＯの様々な量（％）によるスフィンゴシンキナーゼの活性が比較される。本実施例では、ＤＭＳＯはシグナルを２０％低下させるが、１０％までのＤＭＳＯはＳｐｈＫ活性を妨害しなかったことを明らかにしている。このことは、この溶媒は試験の性能を損なわないことを示している。
【００８２】
実施例７：リンパ球（ｊｕｒｋａｔ細胞）でのスフィンゴシンキナーゼ活性
本実施例は、ＣＨＯまたはＣＯＳ−７のような他の細胞タイプ、より具体的にはリンパ球におけるスフィンゴシンキナーゼ活性の発現を明らかにする。図７によれば、スフィンゴシンキナーゼ活性が、Ｊｕｒｋａｔ細胞抽出物におけるいくつかのタンパク質（酵素）量に従って記録されている。
【００８３】
まとめると、前記の実施例により、スフィンゴシンキナーゼのＳＰＡ試験が、トリチウム化スフィンゴシンおよびＲＮＡ結合ビーズを使用して組み立てられた。この試験は、９６ウエル形式および３８４ウエル形式の両方で影響を非常に受けにくく、そして使用されるＡＴＰおよびスフィンゴシンの両方の濃度が低いため、ＡＴＰおよびスフィンゴシンの結合ポケットの両方の阻害剤を非常に優れた感度で選び出すために化合物のライブラリーを迅速にスクリーニングすることが可能になる。この試験は、精製された酵素を必要とせず、しかしその代わり、一過性のトランスフェクション細胞の粗抽出物を使用して行われる。これは、スフィンゴシンキナーゼについてこれまでに記載された、３３Ｐまたは３２Ｐを含有しない最初のアッセイである。他の脂質キナーゼも、この技術を使用してスクリーニングすることができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は、ＳＰＡに基づくアッセイの概略図である。
【図２】
図２は、キナーゼ活性の特異性を示す。
【図３】
図３は、ＳｐｈＫ活性に対するインキュベーション温度の影響を示す。
【図４Ａ】
図４Ａは、スフィンゴシンキナーゼ活性プロフィル（トリトン＝０．２５％）に対する［３Ｈ］スフィンゴシン酵素の影響を示す。
【図４Ｂ】
図４Ｂは、シグナルに対するＡＴＰ濃度の影響を示す。
【図５Ａ】
図５Ａは、ＳｐｈＫ活性に対するトリトンの影響を示す。
【図５Ｂ】
図５Ｂは、ＳｐｈＫ活性に対するＤＭＳＯの影響を示す。
【図６】
図６は、ＳＰＡビーズ定量最適化を示す。
【図７】
図７は、Ｊｕｒｋａｔ細胞（リンパ球）におけるＳｐｈＫ活性を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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