(57)【要約】ヌクレオチド類似体、プライマーの5'末端にあるヘアピンループ、リボヌクレオチドまたは蛍光体もしくはクエンチャーから選択される少なくとも１つの修飾を含む等温性増幅の場合にプライマーを使用することによる核酸増幅反応のバックグラウンドシグナルを減少させる方法を開示する。より一般的な核酸増幅反応では、当該プライマーは、少なくとも２つの修飾を含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
等温性核酸増幅反応におけるバックグラウンドシグナルを抑制する方法であって、使用する少なくとも１つのプライマーが、
ヌクレオチド類似体
該プライマーの5'末端にあるヘアピンループ
リボヌクレオチド
蛍光体またはクエンチャー
の少なくとも１つを含む、当該方法。
【請求項２】
核酸増幅反応におけるバックグラウンドシグナルを抑制する方法であって、当該プライマーが、
ヌクレオチド類似体
該プライマーの5'末端にあるヘアピンループ
リボヌクレオチド
蛍光体またはクエンチャー
の少なくとも２つを含む、当該方法。
【請求項３】
ヌクレオチド類似体が、LNA、2'-O-メチルRNA、RNA、置換5'-ニトロインドールまたは非塩基性部位から選択される、請求項１または２の方法。
【請求項４】
ヌクレオチド類似体がプライマー3'末端から少なくとも6塩基に位置している、請求項１から３の方法。
【請求項５】
増幅反応が、ローリングサークル法である、請求項１から４の方法。
【請求項６】
使用するDNAポリメラーゼが、Bst DNA ポリメラーゼ、ThermoSequenaseTMII DNAポリメラーゼ、Phi29DNAポリメラーゼまたはSequenaseTMT7DNAポリメラーゼから選択される、請求項５の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明の分野
開示の発明は、アナライトの検出のためのアッセイの分野、および特に、核酸増幅および検出の分野に適用する。
【０００２】
本発明の背景
多くの方法が、核酸検出に基づく感受性の高い診断アッセイを可能にすることが知られる。多くは、核酸ターゲットまたはプローブ配列の指数的増幅を含む。それらには、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、リガーゼ連鎖反応(LCR)、自己持続配列複製(self-sustained sequence replication)(3SR)、核酸配列に基づく増幅(nucleic acid sequence based amplification)(NASBA)、鎖置換増幅(strand displacement amplification)(SDA)、およびローリングサークル増幅(RCA)が含まれる(Lizardi, et al (1998) Nature Genetics 19: 225-232, Lizardi, P.M., & Ward, D.C. (1997) Nature Genetics 16: 217-218, Fire, A., & Xu, S-Q (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92: 4641-4645, Liu, D., et al (1996) J. Am. Chem. Soc. 118: 1587-1594およびZhang et al (1998) Gene 211: 277-285 および WO97/19193)。それらはすべて高感度であり、検出の実用的限界は、約１０−１００の標的分子である。
【０００３】
あらゆる核酸に基づくアッセイの有用性は、特に、僅か数分子の標的しか存在しないときには、正確性および確実性によって決まる。当該プロセスは高度に特異的であることが重要である。非標的配列(untargeted sequences)の増幅および非標的(nontarget)を目的とする増幅は、アッセイの信頼性に非常に影響する。上記方法のそれぞれは、非特異的または偽性的バックグラウンドシグナルを発生させ、かつ増幅させ得る。
【０００４】
PCR反応のバックグラウンド増幅のソースは、しばしば標的配列と幾らかの相同性があるインプットDNA領域へのプライマーのハイブリダイゼーションである。プライマーの３'末端が、非標的領域に対し有意な相同性を有するならば、DNAポリメラーゼ連鎖反応で増幅し得る。幾つかの例では、結果として生ずる、偽性プライマー伸長産物を更に増幅し得る。バックグラウンドの更なる要因は、いわゆる「プライマー-ダイマー」人工産物を生ずる鎖内または鎖間のプライマーアニーリングに起因する。極端な場合、副反応が主流となり、標的配列の増幅を完全に阻害または遮蔽し得る。
【０００５】
RCAは、サンプル中の核酸、タンパク質および他の生体分子のような特定アナライトの増幅および検出に適用し得る。等温方法であるため、RCAでは、別法、例えばで使用するサーマルサイクリングの必要性がなく、ＰＣＲとは違って、標的分子は増幅されない。そのため、ポリメラーゼ誘導性変異の伝播は最小となる。
【０００６】
既に上記したように、ローリングサークル増幅のいくつかの異なる方式が発表されている。共通の要素は、標的分子にハイブリダイズする直鎖状前環状物(linear pre-circle)の化学的または酵素学的ライゲーションにより形成される、小さく、一本鎖の、環状DNAプローブからの増幅である(Baner J., et al (1998) Nucl. Acids Res. 26: 5073)。直鎖状核酸プローブのライゲーションは、サンプル中に存在する標的配列の量に対し、数的にに比例する環状プローブ分子を生成する。環状プローブのローリングサークル複製は、一本鎖プライマーおよび進行進行性鎖置換DNAポリメラーゼを介する等温法であって1時間当たり１０４倍の増幅を行う。当該反応動力学は、直線的であり、そのため、この方法は、直線的RCA[LRCA]と呼ばれている。
【０００７】
LRCAの伸張においては、更なるオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、一次一本鎖増幅産物を複製する。この技術は、過分枝カスケードまたは指数的RCA[ERCA](Lizardi(上述) and Thomas, et al (1999) Arch. Pathol. Lab. Med. 123: 1170)として、いくつか知られている。ここで、増幅は、１０９倍を超える速度での、分枝状二本鎖DNA産物合成を支配する幾何学的動力学で進行する。第一のプライマーがプローブバックボーンの相補領域にハイブリダイズする。鎖置換DNAポリメラーゼの存在下、一旦、環状化プローブの完全な循環が完成ずると、当該プライマーが伸張し、最終的に５'末端で置換する。連続的なポリメライゼーションおよび鎖置換により、元のプローブ環状物の、長い一本鎖のコンカテマー性DNAコピーが作成される。この一本鎖RCA産物は、第二プライマーのための結合部位を含む。第二プライマーは、第一鎖産物のタンデム反復物のそれぞれに結合する。これら多重プライミング事象が続くにつれて、それらは鎖置換を開始し、その後、第一増幅プライマーに対する更なる結合部位を提示する一本鎖DNA産物を生成する。広汎な過分枝構造が構築され、それは多くの複製分岐を含んでいる。自己増大鎖置換により、この複製複合体から二本鎖DNAフラグメントが放出される結果となる。これら置換DNA分子は、環単位長の数倍のサイズを示すフラグメントのネスト化集団として蓄積する。
【０００８】
RCAプローブまたは前環状物は、通常６０−１２０塩基の長さの直鎖状５'-リン酸化オリゴヌクレオチドからなる。プローブの５'および３'末端の配列は、その標的にハイブリダイズするとき、当該プローブ末端が並置するように、標的領域に相補的となる。熱安定性DNAリガーゼのストリンジェントな塩基ペアリング要件を組合せた二重ハイブリダイゼーション事象により、高度の標的特異性がもたらされる。RCA増幅プライマーに結合部位を提供する特異配列は標的特異的プローブアームの間に位置する。プローブは、標的核酸配列中に存在し得る２つの対立遺伝子を相互に識別できるように作成され得る。末端３'塩基は、多形性部位での２つの可能な対立遺伝子のそれぞれに相補的となるように変化する。プローブデザインおよびライゲーション条件を最適化して、標的領域のプレ増幅の必要のないゲノムDNAの複合体配列コンテクストにおいて直接、対立性を識別できるようにする。
【０００９】
特有のバックボーン配列により、各環状プローブを混合状態で特異的に増幅することが可能である。各プローブは、その特異的プライマー[LRCA]またはプライマー[ERCA]の対を用い増幅し得る。増幅されたプローブ配列は、蛍光標識、酵素連結検出システム、抗体介在標識検出、および放射活性標識の検出のような通常の方法により検出および定量し得る。蛍光検出によるアプローチは、AmplifluorTM技術 Nazarenko, et al (1997) Nucl. Acids Res. 25: 2516-2521を用いる。AmplifluorTM検出プライマーには、5'末端にヘアピンステム−ループがあり、ステムのベース付近がフルオロホアおよびクエンチャーで標識されている。ある条件では、蛍光体(fluor)およびクエンチャーは、有効な蛍光消光が生ずるように、十分に近接している。AmplifluorTMプライマーを第二ERCA増幅プライマーとして使用するとき、二本鎖DNA産物中に組み込まれる。DNAポリメラーゼは、AmplifluorTMプライマーを複製するときには、ステム−ループ構造の相補体をアンフォールドし、合成するので、、配列は直鎖状となり、フルオロホアとクエンチャーが物理的に離され、蛍光発生産物が生成する。種々のフルオロホアでそれぞれ標識された幾つかのAmplifluorTMプライマーの使用により、単一RCA反応における多重検出が容易となる。
【００１０】
RCA反応に影響する１つの問題は、環非依存または標的非依存DNA合成である。デュアルプライマーRCA反応中のある型の環非依存アーティファクトは、過剰の非ライゲーションプローブを除去するように設計したストラテジーにより減少すると報告されている。例えば、WO00/36141では、Hafner et alは、RCAバックグラウンドは、直鎖状プローブ分子を利用する増幅副反応から生じ得ることを示唆している。
【００１１】
我々は、特定条件下、アーティファクトRCA産物が、環状化プローブおよび／または標的DNAの非存在下で高レベルで蓄積し得ることを観察した。本明細書で解説したように、非特異的増幅は単一プライマーからより生じ得るが、当該問題は、多分２つのプライマーを含むERCA反応で生じるように思われる。アーティファクトの生成し易さは、４種またはそれより多い種類のRCAプライマーを用いる複合アッセイで有意に増大する。クローニングおよび配列決定すると、環非依存増幅産物は、主として頭-尾(head to tail)プライマー反復物の多量体であることが判る。プライマー配列に加えて、各反復単位はまた、標的またはプローブの何れにも由来せず、分子生物学的酵素の商品に通常付随する細菌性DNA汚染物から生ずると考えられる１５塩基までの１またはそれより多い配列セグメントを含むことがある。
【００１２】
多くの、非分離に基づく検出ストラテジーは、これらの産物を陽性結果として誤ってスコアする。そのため、DNA合成は、妥当な環状化プローブ分子の非存在下では起こらないことが、同種性アッセイシステムにとっては特に重要である。
【００１３】
従来技術は、種々の修飾をプライマーに含めることにより、増幅およびハイブリダイゼーション反応における非特異的事象を減少させる幾つかの試みを示している。例えば、EP866071、WO01/25478、WO98/13527参照。これらの方法は、水素結合を阻害することによりTmを低下させるか(EP866071およびWO98/13527)または高親和性類似体を使用することによってTmを維持しながらプライマーを短くすることによるか(WO01/25478)、何れかにより、プライマー−標的相互作用の特異性増加を介する効果を生ずる。EP866071では、修飾は、最大効果のためポリメラーゼフットプリント内の、プライマー3'末端の4-6塩基内で生じる。対照的に、本発明では、プライミング効率に逆作用しないように、この領域を修飾することを明示して避けている。
【００１４】
Stump et al (Nucleic Acids Res. 27, 4642-4648 (1999))は、サーモサイクルDNA配列決定反応におけるアーティファクトを除くため、RNA類似体または非塩基性部位で修飾したプライマーを使用している。その著者は、伸張開始後にDNAポリメラーゼはその後の反応サイクルで修飾プライマーを複製し得ないため、そのプライマーは指数的増幅反応に使用できないと説明している。Stump et alはこの設計のプライマーでは指数的増幅はできなかったが、我々は、プライマー複製は指数的RCAに絶対必要条件ではなく、非複製性プライマーを使用すると等温性RCA反応においてアーティファクト増幅を有効に阻止し得ることを示す。
【００１５】
本発明の要約
本発明は、核酸に基づく増幅ストラテジーの感度を改善し、それによって、プライマー多量体から生ずる非特異的バックグラウンドシグナルを減少または除去する。これは、DNA合成に有効な鋳型としての役割をするプライマーの能力を阻止または減少させることにより行う。
【００１６】
本発明は、プライマーに基づくアーティファクトを生ずる分子相互作用を阻害または阻止するように修飾された領域を有する核酸プローブまたはプライマーを提供する。本発明のひとつの特徴では、当該修飾は、アッセイ温度で安定ヘアピンループ構造を形成するパリンドローム形態をとっている。更なる特徴は、色素(これに限らない)のような化学成分の共有結合による付加である。更なる修飾は、プライマー内へのヌクレオシド類似体の包含が含まれる。
【００１７】
本発明はまた、非特異的バックグラウンド増幅を抑制する方法および試薬を提供する。
【００１８】
本発明の詳細な説明
本発明は、等温性核酸増幅反応においてバックグラウンドシグナルを抑制する方法であって、使用する少なくとも１つのプライマーが
ヌクレオチド類似体
該プライマーの5'末端にあるヘアピンループ
リボヌクレオチド
蛍光体またはクエンチャー
のうちの少なくとも１つを含む当該方法を提供する。
【００１９】
核酸増幅反応におけるバックグラウンドシグナルを抑制するための本発明の他の態様では、少なくとも１つのプライマー中に、
ヌクレオチド類似体
該プライマーの5'末端にあるヘアピンループ
リボヌクレオチド
蛍光体またはクエンチャー
のうちの少なくとも２つの存在が必要である。
【００２０】
非特異的増幅は、１つまたはそれより多いオリゴヌクレオチドプライマーを利用する核酸増幅スキームにおける問題である。非特異的増幅のメカニズムは、RCA反応において、適当な環状プローブ分子とは無関係で、直鎖状プローブおよび標的分子の非存在下でも生じるとされている。このタイプのアーティファクトのDNA合成は、大きさが50ベース対から20キロベースを超える範囲であり、真正の、環状仲介RCA反応の産物とはしばしば識別できない、特徴的ラダーを形成する産物の、主として二本鎖DNA分子のネスト化セットを生ずる。非特異的増幅物質のDNA配列分析により、その物質は、連続シリーズの自己増大鎖置換およびプライマー伸張事象に起因して生じ得ることが示唆される。単一プライマー、４つのデオキシヌクレオシドトリホスフェートおよびDNAポリメラーゼは、1−2時間の等温性反応において数マイクログラムの高分子量DNAの合成を持続させるのに十分である。プローブ分子または添加した標的分子は、生ずる非特異的増幅には必要ない。
【００２１】
確固たる、そして信頼性のある核酸増幅アッセイは、産物が特異的標的分子の非存在下では形成されないという原則に依存する。このため、既述のタイプの非特異的増幅を防止することが重要である。
【００２２】
本発明のある態様は、核酸増幅反応における非特異的産物の合成を抑制する方法を提供することである。これは、特異的標的産物の産生を減少させることなく、行われる。この方法において、そうすることによって、ノイズに対するシグナルの比、感度および信頼性が向上する。
【００２３】
特に、本発明は、非特異的増幅に起因するバックグラウンドDNA合成が、環状プローブ分子が存在しないとき阻害される、RCAの方法を提供する。本発明は、単一プライマー、デュアルプライマーおよびマルチプルプライマー増幅反応を含む全てのRCAモードに有用である。
【００２４】
ある実施態様では、非特異的増幅は、少なくとも１つのヌクレオチド類似体を含む１つまたはそれより多いオリゴヌクレオチドプライマーの使用より阻害される。LRCAおよびERCAでは、プライマーの相補体は、増幅反応の持続化ために必須ではない。それゆえ、プライマーをポリメラーゼ酵素のの不十分な鋳型とする類似体は、プライマー自己増幅を抑制するために用い得る。適当な類似体は、プライマー配列の任意の位置に位置し得るが、好ましくは3'末端に最も近い6つの位置が、プライミング効率に影響を与えないように、非修飾でなければならない。効率的であると判明したヌクレオチド類似体および関連修飾の例には、以下に限定されないが、ロックされた核酸塩基[LNA](Singh et al (1998) Chem. Commun. 455-456)、2'-O-メチルRNA塩基、置換5-ニトロインドール(WO97/28176)、非塩基性部位およびRNAが含まれる。単一または複数の部位が修飾され得る。ある場合には、ポリメラーゼ・リード・スルーを最小とするため、近接または連続の塩基を修飾することが望ましい。ヌクレオシド類似体を有する鋳型を複製する能力がポリメラーゼによって異なるため、修飾塩基の最適のタイプの位置および頻度を経験的に決定する必要がある。使用し得るポリメラーゼの例には、以下に限らないが、phi29DNAポリメラーゼ、ThermoSequenaseTMII、delta、Thermoanaerobacter thermohydrosulfuricus DNAポリメラーゼ、Bst DNA ポリメラーゼ、Phi29DNAポリメラーゼおよびSequenaseTMT7DNAポリメラーゼが含まれる。好ましくは、Bst DNAポリメラーゼまたはPhi29DNAポリメラーゼを使用する。
【００２５】
更なる実施態様では、非特異的増幅は、二重鎖ステムおよびループ構造を形成するような方法で鎖内塩基対となることが可能な5'領域を有する１つまたはそれより多いオリゴヌクレオチドプライマーの使用により、阻害され得る。適当なプライマーは、４つの連続配列エレメントS1、S2、S3およびS4から構成される。S1はプライマーの5'末端にあり、S4はプライマーの3'末端にある。S1はS3の逆相補性である。S2はスペーサー領域である。S4は、環状プローブ分子の領域に相補的であるかまたは同一であるか何れかであり得る。好ましくはS1およびS3は、4-12塩基長の間にある。S2は、3塩基長、好ましくは5-20塩基長よりも大きい。S4は、増幅反応の温度と等しいTmとなるように算出された長さである。S1、S2およびS3の配列は、望ましい二次構造のΔGが適当な他の構造よりも少なくとも6kCal、より好ましくは少なくとも10kCal高くなるように選択される。本明細書に詳述されている要件に加えて、核酸増幅反応においてするプライマーの設計のために確立されているガイドラインが適用される。デュアルプライマーPCA反応におけるThermoSequenaseTMIIによる非特異的増幅は、プライマーの対の１つが既述のように5'ヘアピンを有するとき、阻害された。ヘアピンを欠く同一プライマーは、同一条件下で、多量の高分子量アーティファクトを合成した。更に、ThermoSequenaseIIは、単一プライマーが5'ヘアピンを有するとき、当該プライマーの存在下に、RCAによりバックグラウンドを増幅し得なかった。単一ヘアピンプライマーを使用するBst DNAポリメラーゼによる非特異的RCAは抑制されなかったが、フルホロホアおよび蛍光消光部分が同じヘアピンプライマーに結合するならば非特異的増幅は抑制されることがわかった。従って、本発明は、AmplifluorTMプライマー Nazarenko et al(上記)の構造を有するプライマーの使用により非特異的増幅を阻害する方法をも提供する。この点で有用であることが判ったフルホロホアには、以下に限らないが、6-FAM、フルオレセイン、Cy3およびTETが含まれる。使用され得るクエンチャーには、DABCYL、DABSYLおよびMethyl Redが含まれる。
【００２６】
また、更なる実施態様では、非特異的増幅は、ヌクレオチド類似体を有するAmplifluorTMプライマーを組み合わせた、ヌクレオチド類似体を有する直鎖状またはヘアピン状プライマーの使用により、デュアルおよびマルチプルプライマーERCAにおいて抑制され得る。
【００２７】
例示では参照RCAを引用したが、等温性条件で類似するDNAポリメラーゼおよびプライマーを利用するSDAおよびLAMP(Notomi, et al (2000) Nucl. Acids Res. 28: (12) e63)のような他の増幅スキームは、既述のタイプに類似のモードの非特異的増幅を示し得ることが理解されるであろう。そのため、本発明は、これらの技術にも等しく適用し得る。
【００２８】
本発明は、ポリメラーゼ酵素によるプライマー分子の複製が非特異的増幅を生じ得、それにより偽性の反応産物が生ずる、あらゆる核酸増幅法に適用され得ることが予期される。
【実施例】
【００２９】
実施例
実施例１．非特異的増幅
DNAポリメラーゼは、プライマーおよび４つの共通のデオキシヌクレオシドトリホスフェート(dATP、dCTP、dGTPおよびdTTP)を与えられるだけで、等温性条件下で二本鎖の高分子量DNAを合成し得る。
【００３０】
20mM Tris-HCl、pH8.8、0.1% v/v TritonX-10、10mM KCl、2mM MgSO4、400μM dNTP、8ユニットBst DNAポリメラーゼ[New England Biolabs]および1μMプライマーを含む20μl反応物を60℃90分間インキュベーションした。Ficoll/Orang-Gローディング色素を各反応物に加え、10μlを2%高分離アガロースゲル[Sigma A-4718]において、90mM Tris-ホウ酸/EDTA緩衝液pH8.3中で〜1.5時間、150ボルトで展開した。当該ゲルを、1:20,000の水溶性希釈のVistra Green[Amersham Pharmacia Biotech]で15分間、染色し、次いで488nm励起および530nm放射フィルターを用いるMolecular Dynamics FluorImager-595でスキャンした。
【００３１】
DNA産物のスペクトルは、プライマーおよびdNTP単独からBst DNAポリメラーゼにより得られた。当該結果では、反応物がプライマー#1および#2の両方を含むとき、おおよそ40bp周期のラダーパターンが見られた。反応物がプライマー#1またはプライマー#2のみを含むとき、複雑な一連のフラグメントが作成され、それは、１プライマー長らゲル中に侵入できない大きさの物質までの範囲に亘った。Bst DNAポリメラーゼおよびdNTPのみ(プライマーなし)の反応物では、高分子量産物は生じなかった。プライマー#1または#2およびdNTPを含むがポリメラーゼは含まない反応物もまた高分子量産物を生じなかった。
【００３２】
実施例２．LNAを含むプライマーによる非特異的増幅の抑制
RCA反応中において、異なるプライマーの数が増加するほど、非特異的増幅のリスクが増大する。各反応に２つの独特な、事前に形成された環状DNAプローブ分子が含まれる、二重鎖ERCA反応を実施した。２つの特有の特異的RCAプライマーは、各環状DNAに含まれる。それぞれの対のプライマーの一方は、AmplifluorTMプライマーであり、他方は、直鎖状DNAプライマーまたはDNA/LNAキメラプライマーであった。
【００３３】
ゲル精製、環状化プローブの両方を含む連続希釈物を、ERCAにより、2時間、65℃、20mM Tris-HCl pH8.8、0.1% v/v TritonX-100、10mM KCl、10mM (NH4)2SO4、2mM MgSO4、400μM dNTP、8ユニット Bst DNAポリメラーゼ、0.4μM FAM-dabcyl Amplifluorプライマー#3、0.3μM Cy3-dabcyl Amplifluorプライマー#4および0.4μM DNAプライマー#5および#6または0.4μM LNA/DNAキメラプライマー#7および#8の何れかを含む20μl反応物中で、増幅した。
【００３４】
ERCA後、トラッキング色素[50% w/v Ficoll F400、1% w/v Orange-G、50mM EDTA]2μlを添加し、当該サンプルを3%高分離アガロースゲル上で、90mM Tris-ホウ酸/EDTA緩衝液中で2 1/2時間、125ボルトで電気泳動した。当該ゲルをMolecular Dynamics FluorImager 595で488nmの励起波長を用い2度スキャンし、530nmおよび570nmの両波長の発光を記録した。2つのそれぞれの色のイメージを重ね合わせた。
【００３５】
次いで当該ゲルを、1:20,000の水溶性希釈のVistra Green中に浸して染色し、488nm励起および530nm発光フィルターを用い再スキャンし蛍光標識および非標識DNA産物の両方を視覚化した。
【００３６】
106、105、104、103、102、101、100または0の環を含む反応を、同一塩基配列のDNAプライマーまたはLNA/DNAキメラプライマーの何れかを用い行った。
【００３７】
105またはそれより多い環状プローブ分子が存在するとき、すべての反応が、予想された蛍光標識産物ラダーを与えた。104コピーおよびそれ未満の環状プローブにおいて、非特異的蛍光および非蛍光増幅産物が、DNAプライマーのみを有する反応物中で見られた。DNA/LNAプライマーの存在下増幅する反応物では非特異的蛍光または非蛍光ラダーは見られず、正しい蛍光産物のみが形成された。
【００３８】
実施例３．RNAを含むプライマーによる非特異的増幅の抑制
殆どのDNAポリメラーゼは、最小の検出が可能なレベルの逆転写活性を有する。RCA反応におけるプライマー複製に依存する非特異的増幅のモードは、RCAプライマーが全体としてまたは部分的にRNAを含むとき、有意に減少または除去され得る。
【００３９】
ライゲーション反応物30μlは、20mM Tris-HCl pH8.3、25mM KCl、10mM MgCl2、0.01% v/v TritonX-100、1.5mM NAD+、100nM オープンサークルプローブ、1ユニットTth DNAリガーゼおよび103、105または107分子のPCR増幅DNA標的分子を含むように調製した。反応物を95℃で3分間変性させ、次いで65℃で60分間インキュベーションし、4℃に冷却した。
【００４０】
各ライゲーション反応物の1/10を、200mM Tris-酢酸pH 8.5、1% v/v TritonX-100、100mM (NH4)2SO4、400μM dNTP、8ユニット Bst DNAポリメラーゼ、0.4μM FAM-dabcyl Amplifluorプライマー#3、0.3μM Cy3-dabcyl Amplifluorプライマー#4および0.4μM DNAプライマー#5および#6または0.4μM RNAプライマー#9および#10の何れかを含む20μl中でERCAした。反応物は90分間65℃でインキュベーションした。ゲル分析およびイメージングは実施例2のように行った。
【００４１】
DNAプライマーを含むERCA反応物には、107PCR標的分子をプローブライゲーションおよび環状化に使用するとき、予期された蛍光増幅産物が見られた。蛍光シグナルは105または103標的分子では見られなかった。更に、DNAプライマーによる全ての反応物では、実質的な量の非特異的、非蛍光性物質を生じた。
【００４２】
DNAプライマーのRNAバージョンを含む反応物は、非特異的または非蛍光性産物を与えなかった。RNAプライマーは、107および105標的コピーの両方中で特異的蛍光産物ラダーのみ与えた。標的を加えず、DNAリガーゼを加えず、またはリガーゼ反応を生じさせていない対照ERCA反応物は、予想されたとおり陰性であった。
【００４３】
RNAプライマーは、非特異的バックグラウンド増幅を抑制したが、環状プローブ分子のローリングサークル増幅を阻害しなかった。
【００４４】
実施例４．5'末端ヘアピンループを有するプライマーによる非特異的増幅の抑制
プライマーの一つがが5'末端ヘアピンループを有し、当該反応がThermoSequenaseTMII DNAポリメラーゼを用い行われるならば、デュアルプライマー反応中にプライマー複製を含む非特異的増幅は抑制され得ることがわかった。
【００４５】
反応物30μlを、30μM 各RCAプライマー、250mM Tris-酢酸pH 8.0、17.5mM 酢酸マグネシウム、125mM グルタミン酸カリウム、5% v/v グリセロール、8mM dNTPおよび20ユニット ThermoSequenaseTMIIを含むように調製した。反応物は、95℃で3時間変性させ、次いで68℃で60分間インキュベーションした。増幅産物を実施例1に記載したとおりゲルで分析した。反応物は、2つのプライマー#11および#12、#11および#13、#1および#2、#14および#15、#1および#16、または#14および#17を含む。
【００４６】
直鎖状プライマーの対を用いる反応は、非特異的増幅反応物の50塩基対ラダーを生ずる。5'ヘアピン構造を加えた同一プライミング配列の１つで直鎖状プライマーの対の一方のメンバーを置換することにより、非特異的増幅が阻止された。
【００４７】
実施例５．置換5ニトロインドール塩基類似体を含むプライマーによる非特異的増幅の抑制
5-アミノ-ペンタン酸{4-[1-(4-ヒドロキシ-5ヒドロキシメチルテトラヒドロフラン-2-イル)-5-ニトロ-1H-インドール-3-イル]-ブチル}-アミド、3位にC6スペーサーアームを有する5-ニトロインドール塩基類似体は、WO97/28176に記載の方法でホスホールアミダイトとして合成した。DNAポリメラーゼは、単一鎖DNA鋳型中にこの塩基類似体が存在するとき、該塩基類似体を読み過ごすことができないことが示された。置換5-ニトロインドールを含むDNAプライマーを調製し、その非特異的増幅を抑制する能力が示された。
【００４８】
実験は、実施例１で概説した方法により行った。単一の非修飾プライマーを含む反応物は、アーティファクト産物の特徴的なラダーを生じた。3'末端から単一置換5-ニトロインドール６塩基で内部修飾したプライマー(直鎖状または5'ヘアピンを有する)の存在下では、非特異的増幅は観察されなかった。
【００４９】
実施例６．Amplifluorプライマーによる非特異的増幅の抑制
ヒト嚢胞性線維症遺伝子の推定ヌクレオチド(ATP)-結合フォールドに相当する領域を、Kerem, B-S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87: 8447に記載のプライマー11i-5および11i-3(配列#18および#19)を用いPCR増幅した。
【００５０】
20μlのライゲーション反応物のシリーズを、109-105コピーのホモ接合性の通常またはホモ接合性G542X変異のPCRフラグメント、10nM G542Xオープンサークルプローブ(配列#20)、20mM Tris-HCl pH8.3、25mM KCl、10mM MgCl2、0.01% v/v TritonX-100、1.5mM NAD+および1ユニットTth DNAリガーゼを含むように作成した。95℃で3分間の熱変性後、ライゲーションミックスを65℃で60分間インキュベーションした。
【００５１】
ERCA30μl反応物は、2μlライゲーション混合物、20ユニットThermoSequenaseTMII、250mM Tris-酢酸 pH8.0、17.5mM 酢酸マグネシウム、125mM グルタミン酸カリウム、5% v/v グリセロール、8mM dNTPs、30μM プライマーおよび30μM プライマー#2または30μM AmplifluorTMプライマー#21の何れかを含む。サンプルを95℃で3分間加熱し、次いで、68℃で60分間インキュベーションした。ゲル分析およびイメージングは実施例２に記載のとおりであった。
【００５２】
オープンサークルプローブを、マッチしたまたはミスマッチしたPCR標的DNAの何れかの存在下、ライゲーションした。マッチしたというのは、オープンサークルプローブが標的と正確に相補しライゲーションが生ずることを意味する。ミスマッチというのは、ライゲーションおよび増幅が殆ど生じないか全く生じないことを示す。標的DNAはライゲーションあたり109、107および105コピーで存在した。環状化プローブを、ERCAにより、ThermoSequenaseTMIIを用い、68℃で60分間、増幅した。反応物は、１つの直鎖状および１つのAmplifluorTMプライマーの両方または２つの直鎖状RCAプライマーを含む。直鎖状プライマーの場合、109未満の標的コピーのマッチしたプローブ／標的組合せによる増幅であって、全てのミスマッチ反応物中における、実質的非特異的増幅が存在した。直鎖状プライマーによるAmplifluorTMプライマーへの置換により、完全にバックグラウンド増幅が阻害され、特異的産物のラダーのみが生じた。AmplifluorTM反応産物は、プライマー長の増加により大きくなり、未決定の二次構造によりネイティブアガロースゲル上でかすんでいた。
【００５３】
７．Amplifluorプライマーおよび類似体-修飾5'ヘアピンプライマーの組合せによる非特異的増幅の抑制
5'ヘアピン構造は、ThermoSequenaseTMIIによる単一プライマーの非特異的増幅の阻止に十分であるが、Bst DNAポリメラーゼには有効ではなかった。しかし、5'ヘアピンに加えて、プライミング領域が、酵素による読みを阻止する1つまたは塩基修飾を含むとき、Bst DNAポリメラーゼは単一プライマーを増幅できない。有効であると判明した修飾は、非塩基性部位および置換5-ニトロインドールを含んでいた。塩基修飾のない各Amplifluorプライマーはまた、Bstポリメラーゼによる増幅に抵抗(refractory)する。
【００５４】
２つまたはそれより多いプライマーを組合せると、非特異的増幅は、(１)両方のプライマーがヘアピンおよび修飾塩基を有する場合、または(２)第一のプライマーがヘアピンおよび修飾塩基を有し、第二のプライマーがAmplifluorプライマーである場合、または(３)両方のプライマーがAmplifluorプライマーである場合のみ、阻止され得る。
【００５５】
プライマー#14は、非修飾直鎖状プライマーであり、プライマー#22は、3'末端由来の非塩基性部位6塩基を有する以外同じ配列を有し、そしてプライマー#23は5'末端ヘアピンの付加以外#22に類似した。プライマー#25はAmplifluorプライマーであった。増幅反応およびゲル分析は実施例１に記載のとおりであった。
【００５６】
プライマー#14および#25
プライマー#22および#25
プライマー#23および#25
プライマー#24および#25
プライマー#16および#25
プライマーなし、Bst DNAポリメラーゼおよびdNTPのみ
プライマー#16および#17、直鎖状プライマーのみ
プライマーおよびdNTPのみ、Bst DNAポリメラーゼなし
を利用する別々の反応を行った。２つの陰性対照は別として、１つの反応のみが、如何なる非特異的増幅産物も生成しなかった。この反応物は、非塩基性部位を有する-6位が修飾された１つのヘアピンプライマーおよび１つのFAM-dabcyl Amplifluorプライマーを含んでいた。
【００５７】
鎖置換DNAポリメラーゼを含むデュアルプライマーERCA反応物中の非特異的プライマー対増幅は、各プライマーが、プライミング領域中に塩基類似体を付加した5'-末端ヘアピンを有するかAmplifluorプライマーであるか、何れかの場合に減少し得る。
【００５８】
【化１】
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【００５９】
【化２】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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