(57)【要約】ヒストン化合物により、血小板凝集を防止しかつ心臓血管の疾患を治療するための組成物及び方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
効果的な量のヒストン化合物と薬学的に受け入れられる媒介物を患者に投与することを含んで成る患者中の血小板凝集防止方法。
【請求項２】
ヒストン化合物が、Ｈ１、Ｈ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３又はＨ４を含んで成る請求項１の方法。
【請求項３】
Ｈ１ヒストンがヒストンサブタイプＨ１．０、Ｈ１．１、Ｈ１．２、Ｈ１．３、Ｈ１．４又はＨ１．５である請求項２の方法。
【請求項４】
ヒストン化合物が、遺伝子組換えにより生産される請求項１の方法。
【請求項５】
ヒストン化合物がヒトヒストンである請求項１の方法。
【請求項６】
ヒストン化合物が予防的に投与される請求項１の方法。
【請求項７】
効果的な量のヒストン化合物を患者に投与することを含んで成る血栓症の事象に関連する患者中の心臓血管の障害を治療する方法。
【請求項８】
ヒストン化合物と薬学的に受け入れられる媒介物を含んで成る血小板凝集防止用組成物。
【請求項９】
ヒストン化合物が、Ｈ１、Ｈ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３又はＨ４を含んで成る請求項８の組成物。
【請求項１０】
Ｈ１ヒストンがヒストンサブタイプＨ１．０、Ｈ１．１、Ｈ１．２、Ｈ１．３、Ｈ１．４又はＨ１．５である請求項９の組成物。
【請求項１１】
ヒストン化合物が、遺伝子組換えにより生産される請求項８の組成物。
【請求項１２】
ヒストン化合物で被覆され、患者の身体内に挿入されるデバイスを含んで成る埋め込み可能なデバイス。
【発明の詳細な説明】
発明の背景
抗血小板及び抗血栓症の治療方式の進展にかかわらず、心臓血管の疾患はアメリカ合衆国では依然として主要な死亡原因である。臨床的に使用される抗血小板及び抗血栓症の薬剤は、ヘパリン、アスピリン、インテグリリン及び抗ＧＰ  ＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体（ｃ７Ｅ３  Ｆａｂ、アブシキシマブ又はＲｅｏＰｒｏ）を含む。体内の管が損傷したサイトで発生するα−トロンビンは一般に、ヒト血小板７−膜透過型トロンビン受容体、蛋白質分解酵素活性受容体１（ＰＡＲ−１）からのＮ−末端ペプチドの加水分解を触媒すると考えられ、これは血栓形成に導かれる分子反応のカスケードを開始する。
細胞のトロンビン受容体の初期の研究は、血小板中に２以上の種が存在することを示した（Ｎ．Ｊ．グレコ及びＧ．Ａ．ジャミーソン、１９９１、ＰＳＥＢＭ １９８：７９２−７９９；Ｊ．Ｔ．ハルモン及びＧ．Ａ．ジャミーソン、１９９６、Ｊ．Ｂｉｏ．Ｃｈｅｍ． ２６１： １５９２８−１５９３３）。クローン化されシーケンス化された第１の細胞のトロンビン受容体はＰＡＲ−１であった（Ｔ−Ｋ．Ｈ．ブーら、１９９１、Ｃｅｌｌ ６４：１０５７−１０６８）。ヒト血小板はＰＡＲ−１及び第２のマイナーな受容体ＰＡＲ−４の活性化に応答し（Ｍ．Ｌ．カーンら、１９９８、Ｎａｔｕｒｅ ３９４：６９０−６９４）、最近クローン化されたＰＡＲ−３はヒト血小板には存在しないか、痕跡量が存在するかのいずれかである（Ｈ．イシハラ、１９９７、Ｎａｔｕｒｅ ３８６：５０２−５０６）。マウスの血小板は、ＰＡＲ−１を巻き込まずに、主にＰＡＲ−３を通してかつ補助的にＰＡＲ−４を通してα−トロンビンに応答する（Ｔ−Ｋ．Ｈ．ブーら、１９９１、Ｃｅｌｌ  ６４：１０５７−１０６８）。他の血小板膜蛋白ＧＰ  Ｉｂも少なくとも部分的にトロンビン受容体として機能する（Ｎ．Ｊ．グレコ及びＧ．Ａ．ジャミーソン、１９９１、ＰＳＥＢＭ １９８：７９２−７９９；Ｊ．Ｔ．ハルモン及びＧ．Ａ．ジャミーソン、１９９６、Ｊ．Ｂｉｏ．Ｃｈｅｍ． ２６１： １５９２８−１５９３３、Ｋ．Ｊ．クレメトソン、１９９５、Ｔｈｒｏｍｂ． Ｈａｅｍｏｓｔ． ７４： １１１−１１６及びＮ．Ｊ．グレコら、１９９６、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３５：９１５）。
３種類の血小板トロンビン受容体（ＰＡＲ−１、ＰＡＲ−４及びＧＰ  Ｉｂ）を意味するものの生理的な機能は、未だ明確には特徴付けられていない。α−トロンビンが誘発する血小板凝集におけるＰＡＲ−１の機能的な役割が試験管内で示された（Ｔ−Ｋ．Ｈ．ブーら、１９９１、Ｃｅｌｌ ６４：１０５７−１０６８）。ヒト血小板は、ＰＡＲ−４の活性化を通して、α−トロンビンの自己分解生成物であるγ−トロンビンに応答することが示された。しかし、抗血栓症及び抗血栓症治療とＧＰ  Ｉｂ及び／又はＰＡＲ−４受容体との相互関係は記載されていない。
ヒストンは、ＤＮＡのパッケージング、転写及び複製に関与する核蛋白である（Ｉ．アイセンベルク、１９７９、Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ４８：１５９−１９１）。これらは機能的な細胞膜の天然に存在する必須成分である（Ｋ．ワトソンら、１９９４、Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓ． ２２：１９９Ｓ； Ｋ．ワトソンら、１９９５、Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． ５０：２９９−３０９）。過去数年、ヒストンが細胞核の外で、そして細胞の外でさえも更に多くの機能を有することが見出されている。例えば細胞が悪性の形質変換を受けてガン細胞になると、該細胞の分子構造が乱されてその結果細胞膜中に高いパーセンテージでヒストン分子が生じる（Ｒ．クラスら、１９９６、Ａｍ． Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｏｎｃｏｌ． １９：５２２−５３１）。ヒストンは標準的な膜蛋白と、それらがそれらを脂質二重層システム中に挿入できる疎水性のコアと親水性のＣ−及びＮ−末端を有するという点で同質性を共有している。ヒストンのコア領域は、ヒストン・フォールド・モティーフと呼ばれるα−へリックスとβ−シートの円筒状シーケンスから成っている。このモティーフは蛋白質のオリゴマー化やチャンネル形成に使用される（アレンツら、１９９５、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９２： １１１７０−１１１７４）。
通常の配向性が変化すると、ヒストン分子は他のヒストン分子とともにより高オーダーの錯体を形成するポテンシャルを有するようになり、最終的には膜中に致命的になりかねないチャンネルを形成する。このようなチャンネル形成はフレンドの赤白血病及びジュルカトの腹水腫瘍細胞中に示されている（ガンベッルチら、１９９８、Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｊ． ３３１： ６２３−６３０）。ヒストンＨ１は、アニオン性のリン脂質を含む人工的な細胞膜に強固に結合することが示されている（Ａ．コイブら、１９９５、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３４： ８０１８−８０２７； Ｅ．Ｍ．ゴールドベルクら、１９９８、Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２５８： ７２２−７２８； Ｍ．スブラマニアンら、１９９８、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３７：１３９４−１４０２）。同様の結果が、システム的な紅斑性ループス、ヒストンＨ１を含む自己免疫性の疾患の患者でも報告されている（ペレイラら、１９９４、Ｃｌｉｎ． Ｅｘｐ． Ｉｍｍｕｎｏｌ ９７： １７５−１８０）。ガン細胞の膜中の決定的に重要ではない量のヒストン分子は、細胞外ヒストンＨ１添加によるオリゴマー化及び致命的なチャンネル形成を開始させることができる。従って細胞溶解は、細胞外から添加される遊離のヒストンＨ１の量により臨床的に制御できると考えられる。
ヒストン蛋白のファミリーは、コアヒストンＨ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３及びＨ４とリンカーヒストンＨ１を含む５種類から成っている。ヒストンＨ１は低い免疫原性と抗原性を有し、起こりそうのない出来事ではあるが、ヒストンＨ１が注入された患者中に中和抗体を生産する。ヒストンＨ１は血液脳関門を阻害するために使用でき、かつ脳転移の治療に使用されてきた（パトリッジら、１９８９、Ｊ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  Ｅｘｐ． Ｔｈｅｒ． ２５１： ８２１−８２６）。
Ｈ１のようなヒストンはγ−トロンビンにより誘発される血小板凝集を特異的に阻止する能力を有することが見出された。
発明の概要
本発明の目的は、効果的な量のヒストン化合物を投与することを含んで成る血小板凝集防止方法を提供することである。
本発明の他の目的は、ヒストン化合物と薬学的に受け入れられる媒介物を含んで成る血小板凝集防止用組成物を提供することである。
本発明の他の目的は、ヒストン化合物と薬学的に受け入れられる媒介物を含んで成る効果的な量の組成物を投与することを含んで成る血栓症の事象に関連する心臓血管の障害を治療する方法を提供することである。
本発明の他の目的は、ヒストン化合物で被覆され、患者の身体内に挿入されるデバイスを含んで成る埋め込み可能なデバイスを提供することである。
発明の詳細な説明
臨床データは、抗血栓症薬を摂取している患者は依然として再発の被害を被り、従って血管中の血小板凝集を誘発する活性な他の経路があることを示している。試験管中で行われた試験は、γ−トロンビン経路が抗血小板又は抗血栓症治療を受けている患者中で依然として活性で、血栓症の応答の少なくとも部分的な原因であることを示している。ヒストン化合物を含んで成る組成物は、α−トロンビンにより仲介される血小板凝集と互いに邪魔することなく、γ−トロンビンにより誘発される血小板凝集を特異的にかつ効果的に阻止する能力を有することが見出された。
本発明は、血小板凝集の阻止用及び血栓症の事象に関連する心臓血管の障害の治療のための組成物及び方法に関する。本発明の組成物は、直接ヒトを含む動物に使用され、又は血管、心臓又は脳中に埋め込まれる医学用デバイス用のコーティングとして使用される、薬学的に受け入れられる媒介物中に含まれて投与される少なくとも１種のヒストン化合物から成る。前記ヒストン化合物は、Ｈ１、Ｈ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３又はＨ４ヒストンを含んで成っていても良い。好ましい態様では、ヒストン化合物はＨ１ヒストンを含んで成る。該ヒストンＨ１は、Ｈ１．０、Ｈ１．１、Ｈ１．２、Ｈ１．３、Ｈ１．４又はＨ１．５のようなヒストンサブタイプでも良い。好ましい態様では、ヒストンはヒトヒストンである。他の好ましい態様では、ヒストンは遺伝子組換えにより生産される。好ましい態様では、薬学的に受け入れられる媒介物が生理食塩水を含んで成る。本発明は、更に少なくとも１種のヒストンを含んで成る組成物の投与を含んで成る血小板凝集阻止用及び血栓症の事象に関連する心臓血管の障害の治療のための方法を提供する。
抗血栓症薬としてのヒストンＨ１を含んで成る組成物の役割を調べる研究が行われた。血小板凝集アッセイを、溶液中での大きな血小板凝集体として増加している光伝達を追跡する血小板凝集計を使用して行った。γ−トロンビンは補助因子の存在下で血小板凝集を迅速に誘発させた。（９．５μＭの貯蔵された溶液からの）ヒストンＨ１を含んで成る組成物を５μｌ添加したところ、観察時間内で血小板の凝集は大きく減少した。より大きい投与量である２５μｌの（９．５μＭの貯蔵された溶液からの）ヒストンＨ１を投与したところ、血小板凝集は無くなった。
γ−トロンビン自身に替えて、γ−トロンビン模倣薬であるＴＲＡＰ−４（トロンビン受容体アゴニストペプチド−４）を使用して付加的な実験を行った。ＴＲＡＰ−４は低いレベルの血小板凝集応答を生じさせた。しかしヒストンＨ１を含んで成る組成物を添加したところ、ＴＲＡＰ−４で誘発される血小板凝集のレベルが大きく減少した。γ−トロンビンで誘発される血小板凝集を抑制するためのヒストンＨ１を含んで成る組成物の効果は投与量に依存する。０．９５、４．７５及び９．５μＭの投与量のヒストンＨ１を試験管中の血小板細胞に添加したところ、凝集は抑制された。０．９５μＭのみのヒストンＨ１投与量の場合でも９５％を超える血小板凝集が抑制された。
ヒストンＨ１の相互作用の特異性を調べるための実験も行った。ヒストンＨ１をα−トロンビンで誘発された血小板凝集体に添加したが、α−トロンビンで誘発された血小板凝集体には特筆すべき効果は生じなかった。これらの結果は、ヒストンＨ１の相互作用はγ−トロンビンの経路に対して特異的であることを示している。
Ｈ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３及びＨ４のような他のヒストン化合物を研究したところ、これらのヒストン化合物はヒストンＨ１に類似した活性を有することを示している。更にヒストンＨ１、及びＨ１．０、Ｈ１．１、Ｈ１．２、Ｈ１．３、Ｈ１．４又はＨ１．５のようなヒストンＨ１サブタイプも両者とも血小板凝集を防止することに成功した。本発明の組成物は、溶液として摂取又は注射され、又は経口投与用のピルの形態として薬学的に受け入れられる媒介物中に配合されたヒストン化合物を含んで成る。ヒストン化合物による本発明ではその趣旨から、Ｈ１、Ｈ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３及びＨ４ヒストンに限定されないがこれらを含むほか、ヒストンサブタイプ、ヒストンフラグメント、遺伝子組換えにより生産されたヒストン、不完全なヒストン、従来のアミノ酸で置換されたヒストン、ヒストンの主要な及び／又は二次的な構造を変化させないヒストンへの修正（例えばグリコシル化、リン酸化、メチル化、ペギレーション）、Ｄ−アミノ酸を含むヒストン、及び他の物質に縮合又は結合されたヒストンに限定されないがこれらを含む。例えばＨ１ヒストンに関して有用なサブタイプはこれらに限定されないが、Ｈ１．０、Ｈ１．１、Ｈ１．２、Ｈ１．３、Ｈ１．４及びＨ１．５を含む。溶液中の組成物は、静脈注射、筋肉注射により、あるいは皮下や腹膜に注入され、あるいは直接眼や筋肉の染み込ませることができる。
血栓症の事象に関連する患者の心臓血管の障害は、前記患者に効果的な量のヒストン化合物を投与することにより治療できる。更にヒストン化合物を含んで成る本発明の組成物は、高いリスクで血栓症の症状が発見される患者に対して予防用として与えられる。例えば本発明の組成物は、ヘパリンのような標準的な治療の代わりに外科的処置の後に患者に投与できる。当業者は当分野の周知の技術に従って本発明の組成物を投与できる。更に当業者は本明細書に提示した実験データに基づいて投与されるべきヒストン化合物の効果的な量を通常通りに選択できる。細胞中の効果的な量から生体内に投与されるべき投与量を推定することは、当業者により通常通り行われる。
ヒストン化合物はステント又はバルブのような埋め込み可能なデバイスを被覆するためにも使用され、又はカテーテルのような短期又は長期で患者の体内に挿入されるデバイスの被覆に使用できる。本発明では、その趣旨から、埋め込み可能なデバイスは、短期又は長期にかかわらず任意の時間、血管や心臓内に位置させるデバイスを含む。被覆の調製のために、ヒストン化合物は生理的に受け入れられるマトリックス中に配合される。その趣旨から、本発明における生理的に受け入れられるマトリックスは、免疫システムに対して外来性とは認識されずかつ生物学的適合性を有する（炎症や、免疫原性又は炎症性の応答を生じさせない物質）ものである。
本発明を更に説明するために、次に限定を意図しない実施例を記載する。
実施例
実施例１：血栓症凝集アッセイ
既知の技術（Ｇ．ソスラウ及びＪ．ジレス、１９８２、Ｔｈｒｏｍｂｏｓ． Ｒｅｓ．２６： ４４３−４５５）に従って、血液を、静脈に開けた穴から１／１０容量の３．８％のクエン酸塩を含むプラスチック管中に導入し、血小板リッチなプラズマ（ＰＲＰ）を調製した。血液サンプルは薬物治療を受けていない健康な提供者から得た。洗浄した血小板を既知の方法（Ａ．Ｒ．バッシャーら、１９９５、Ｂｉｏｃｈｉｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ １２５０： ９７−１０９）で前記ＰＲＰから調製した。簡単にいうと、ＰＲＰを、３容量部の１００ｎＭのクエン酸塩緩衝液（ｐＨ６．０）に１から２容量部のヘペス・チロードの緩衝液（ｐＨ７．４）を加えたもので希釈して最終容量が５０ｍｌになるようにし、１ｍｇ／ｍｌのデクストロースと１ｍｇ／ｍｌのウシ血清アルブミンを加えたヘペス・チロードの緩衝液中に２×１０６／μｌから３×１０６／μｌ（１０Ｘ規定濃度）となるように再懸濁させた。
既知の方法（Ｇ．ソスラウら、１９８８、Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ． １５： ９０９−９１６）により、デゥアル・チャンネルのクロノログ・ルミ血小板凝集計（ペンシルベニア州ハーバタウンのクロノログ・コーポレーション製）を使用して血小板凝集を行った。４８０μｌの洗浄した血小板、つまり５０μｌの濃縮した血小板のサンプルを４３０μｌのヘペス・チロードの緩衝液中に加えて最終の血小板カウント数が２×１０５／μｌから３×１０５／μｌとなるようにしたものを使用して凝集を行った。作用薬と拮抗薬を種々の濃度で添加した。
【国際公開パンフレット】
2004519476.tif 000002
2004519476.tif 000003
2004519476.tif 000004
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2004519476.tif 000010
2004519476.tif 000011
2004519476.tif 000012
【国際調査報告】
2004519476.tif 000013
2004519476.tif 000014