(57)【要約】本発明は、胸腺間質リンホポイエチン（ｌｙｍｐｈｏｐｏｉｅｔｉｎ）レセプター（ＴＳＬＰＲ）ポリペプチドおよびこれをコードする核酸分子を提供する。本発明はまた、ＴＳＬＰＲポリペプチドを産生するための、選択的結合因子、ベクター、宿主細胞、および方法を提供する。本発明はさらに、ＴＳＬＰＲポリペプチドに関連する疾患、障害、および状態の、診断、処置、改善、および／または予防のための、薬学的組成物および方法を提供する。ＴＳＬＰＲポリペプチドをコードする核酸分子を含むトランスジェニック非ヒト動物がまた、本発明に含まれる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離された核酸分子であって、以下：
（ａ）配列番号４、配列番号７、配列番号１０、または配列番号１１のいずれかに示されるヌクレオチド配列；
（ｂ）配列番号５または配列番号８のいずれかに示されるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；
（ｃ）（ａ）または（ｂ）のいずれかの相補体に、中程度または高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列；および
（ｄ）（ａ）または（ｂ）のいずれかに相補的なヌクレオチド配列、
からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む、単離された核酸分子。
【請求項２】
単離された核酸分子であって、以下：
（ａ）配列番号５または配列番号８のいずれかに示されるポリペプチドに少なくとも約７０％同一であるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、ここで、該コードされたポリペプチドは、配列番号５または配列番号８のいずれかに示されるポリペプチドの活性を有する、ヌクレオチド配列；
（ｂ）配列番号４、配列番号７、配列番号１０、もしくは配列番号１１のいずれか、または（ａ）に示されるヌクレオチド配列の対立遺伝子改変体またはスプライス改変体をコードする、ヌクレオチド配列；
（ｃ）少なくとも約２５アミノ酸残基のポリペプチドフラグメントをコードする、配列番号４、配列番号７、配列番号１０、または配列番号１１のいずれか、（ａ）または（ｂ）のいずれかのヌクレオチド配列の領域であって、ここで、該ポリペプチドフラグメントは、配列番号５もしくは配列番号８のいずれかに示されるコードされたポリペプチドの活性を有するか、または抗原性である、領域；
（ｄ）少なくとも約１６ヌクレオチドのフラグメントを含む、配列番号４、配列番号７、配列番号１０、もしくは配列番号１１のいずれか、または（ａ）〜（ｃ）のいずれかのヌクレオチド配列の領域；
（ｅ）中程度または高度にストリンジェントな条件下で、（ａ）〜（ｄ）のいずれかの相補体にハイブリダイズする、ヌクレオチド配列；ならびに
（ｆ）（ａ）〜（ｄ）のいずれかに相補的なヌクレオチド配列、
からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む、単離された核酸分子。
【請求項３】
単離された核酸分子であって、以下；
（ａ）少なくとも１つの保存的アミノ酸置換を有する配列番号５または配列番号８のいずれかに示されるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、ここで、該コードされたポリペプチドは、配列番号５または配列番号８のいずれかに示されるポリペプチドの活性を有する、ヌクレオチド配列；
（ｂ）少なくとも１つのアミノ酸挿入を有する配列番号５または配列番号８のいずれかに示されるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、ここで、該コードされたポリペプチドは、配列番号５または配列番号８のいずれかに示されるポリペプチドの活性を有する、ヌクレオチド配列；
（ｃ）少なくとも１つのアミノ酸欠失を有する配列番号５または配列番号８のいずれかに示されるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、ここで、該コードされたポリペプチドは、配列番号５または配列番号８のいずれかに示されるポリペプチドの活性を有する、ヌクレオチド配列；
（ｄ）Ｃ末端短縮および／またはＮ末端短縮を有する配列番号５または配列番号８のいずれかに示されるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、ここで、該コードされたポリペプチドは、配列番号５または配列番号８のいずれかに示されるポリペプチドの活性を有する、ヌクレオチド配列；
（ｅ）アミノ酸置換、アミノ酸挿入、アミノ酸欠失、Ｃ末端短縮、およびＮ末端短縮からなる群より選択される少なくとも１つの改変を有する配列番号５または配列番号８のいずれかに示されるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、ここで、該コードされたポリペプチドは、配列番号５または配列番号８のいずれかに示されるポリペプチドの活性を有する、ヌクレオチド配列；
（ｆ）少なくとも約１６ヌクレオチドのフラグメントを含む（ａ）〜（ｅ）のいずれかのヌクレオチド配列；
（ｇ）中程度または高度にストリンジェントな条件下で、（ａ）〜（ｆ）のいずれかの相補体にハイブリダイズする、ヌクレオチド配列；ならびに
（ｈ）（ａ）〜（ｅ）のいずれかに相補的なヌクレオチド配列、
からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む、単離された核酸分子。
【請求項４】
請求項１、請求項２、または請求項３のいずれかに記載の核酸分子を含む、ベクター。
【請求項５】
請求項４に記載のベクターを含む、宿主細胞。
【請求項６】
真核生物細胞である、請求項５に記載の宿主細胞。
【請求項７】
原核生物細胞である、請求項５に記載の宿主細胞。
【請求項８】
ＴＳＬＰＲポリペプチドを産生するためのプロセスであって、該ポリペプチドを発現するために適切な条件下で請求項５に記載の宿主細胞を培養する工程、および必要に応じて、該培養物から該ポリペプチドを単離する工程を包含する、プロセス。
【請求項９】
請求項８に記載のプロセスによって産生される、ポリペプチド。
【請求項１０】
請求項８に記載のプロセスであって、ここで、前記核酸分子が、ＴＳＬＰＲポリペプチドをコードするＤＮＡに作動可能に連結された、ネイティブなＴＳＬＰＲポリペプチドに対するプロモーターＤＮＡ以外のプロモーターＤＮＡを含む、プロセス。
【請求項１１】
請求項２に記載の単離された核酸分子であって、ここで、同一性パーセントは、ＧＡＰ、ＢＬＡＳＴＮ、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴＸ、ＢｅｓｔＦｉｔ、およびＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムからなる群より選択されるコンピュータープログラムを用いて決定される、単離された核酸分子。
【請求項１２】
化合物がＴＳＬＰＲポリペプチド活性またはＴＳＬＰＲポリペプチド産生を阻害するか否かを決定するためのプロセスであって、請求項５、請求項６、または請求項７のいずれかに記載の細胞を該化合物に曝露する工程、および該細胞におけるＴＳＬＰＲポリペプチド活性またはＴＳＬＰＲポリペプチド産生を測定する工程を包含する、プロセス。
【請求項１３】
配列番号５または配列番号８のいずれかに示されるアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチド。
【請求項１４】
単離されたポリペプチドであって、以下：
（ａ）配列番号６または配列番号９のいずれかに示され、必要に応じて、アミノ末端メチオニンをさらに含む、アミノ酸配列；
（ｂ）配列番号５または配列番号８のいずれかのオルソログに対するアミノ酸配列；
（ｃ）配列番号５または配列番号８のいずれかのアミノ酸配列に少なくとも約７０％同一であるアミノ酸配列であって、ここで、該ポリペプチドは、配列番号５または配列番号８のいずれかに示されるポリペプチドの活性を有する、アミノ酸配列；
（ｄ）少なくとも約２５アミノ酸残基を含む配列番号５または配列番号８のいずれかに示されるアミノ酸配列のフラグメントであって、ここで、該フラグメントは、配列番号５もしくは配列番号８のいずれかに示されるポリペプチドの活性を有するか、または抗原性である、フラグメント；ならびに
（ｅ）配列番号５または配列番号８のいずれか、または（ａ）〜（ｃ）のいずれかに示されるアミノ酸配列の、対立遺伝子改変体またはスプライス改変体のアミノ酸配列、
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチド。
【請求項１５】
単離されたポリペプチドであって、以下：
（ａ）少なくとも１つの保存的アミノ酸置換を有する配列番号５または配列番号８のいずれかに示されるアミノ酸配列であって、ここで、該ポリペプチドは、配列番号５または配列番号８のいずれかに示されるポリペプチドの活性を有する、アミノ酸配列；
（ｂ）少なくとも１つのアミノ酸挿入を有する配列番号５または配列番号８のいずれかに示されるアミノ酸配列であって、ここで、該ポリペプチドは、配列番号５または配列番号８のいずれかに示されるポリペプチドの活性を有する、アミノ酸配列；
（ｃ）少なくとも１つのアミノ酸欠失を有する配列番号５または配列番号８のいずれかに示されるアミノ酸配列であって、ここで、該ポリペプチドは、配列番号５または配列番号８のいずれかに示されるポリペプチドの活性を有する、アミノ酸配列；
（ｄ）Ｃ末端短縮および／またはＮ末端短縮を有する配列番号５または配列番号８のいずれかに示されるアミノ酸配列であって、ここで、該ポリペプチドは、配列番号５または配列番号８のいずれかに示されるポリペプチドの活性を有する、アミノ酸配列；ならびに
（ｅ）アミノ酸置換、アミノ酸挿入、アミノ酸欠失、Ｃ末端短縮、およびＮ末端短縮からなる群より選択される少なくとも１つの改変を有する配列番号５または配列番号８のいずれかに示されるアミノ酸配列であって、ここで、該ポリペプチドは、配列番号５または配列番号８のいずれかに示されるポリペプチドの活性を有する、アミノ酸配列、
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチド。
【請求項１６】
請求項１、請求項２、または請求項３のいずれかに記載の核酸分子によってコードされる単離されたポリペプチドであって、ここで、該ポリペプチドは、配列番号５または配列番号８のいずれかに示されるポリペプチドの活性を有する、単離されたポリペプチド。
【請求項１７】
請求項１４に記載の単離されたポリペプチドであって、ここで、同一性パーセントは、ＧＡＰ、ＢＬＡＳＴＰ、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴＸ、ＢｅｓｔＦｉｔ、およびＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムからなる群より選択されるコンピュータープログラムを用いて決定される、単離されたポリペプチド。
【請求項１８】
請求項１３、請求項１４、または請求項１５のいずれかに記載のポリペプチドに特異的に結合する、選択的結合因子またはそのフラグメント。
【請求項１９】
配列番号５または配列番号８のいずれかに示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドまたはそのフラグメントに特異的に結合する、請求項１８に記載の選択的結合因子またはそのフラグメント。
【請求項２０】
抗体またはそのフラグメントである、請求項１８に記載の選択的結合因子。
【請求項２１】
ヒト化抗体である、請求項１８に記載の選択的結合因子。
【請求項２２】
ヒト抗体またはそのフラグメントである、請求項１８に記載の選択的結合因子。
【請求項２３】
ポリクローナル抗体またはそのフラグメントである、請求項１８に記載の選択的結合因子。
【請求項２４】
モノクローナル抗体またはそのフラグメントである、請求項１８に記載の選択的結合因子。
【請求項２５】
キメラ抗体またはそのフラグメントである、請求項１８に記載の選択的結合因子。
【請求項２６】
ＣＤＲ移植抗体またはそのフラグメントである、請求項１８に記載の選択的結合因子。
【請求項２７】
抗イディオタイプ抗体またはそのフラグメントである、請求項１８に記載の選択的結合因子。
【請求項２８】
可変領域フラグメントである、請求項１８に記載の選択的結合因子。
【請求項２９】
前記可変領域フラグメントが、ＦａｂフラグメントまたはＦａｂ’フラグメントである、請求項２８に記載の選択的結合因子。
【請求項３０】
配列番号５または配列番号８のいずれかのアミノ酸配列を有するポリペプチドに特異性を有する少なくとも１つの相補性決定領域を含む、選択的結合因子またはそのフラグメント。
【請求項３１】
検出可能標識に結合される、請求項１８に記載の選択的結合因子。
【請求項３２】
ＴＳＬＰＲポリペプチドの生物学的活性を拮抗する、請求項１８に記載の選択的結合因子。
【請求項３３】
ＴＳＬＰＲポリペプチド関連の疾患、状態、または障害を、処置、予防、または改善するための組成物であって、請求項１８に記載の選択的結合因子を含む、組成物。
【請求項３４】
配列番号５または配列番号８のいずれかのアミノ酸配列を含むポリペプチドで動物を免疫することによって産生される、選択的結合因子。
【請求項３５】
請求項１、請求項２、または請求項３のいずれかに記載のポリペプチドを結合し得る選択的結合因子を産生する、ハイブリドーマ。
【請求項３６】
請求項１８に記載の抗ＴＳＬＰＲ抗体またはフラグメントを用いて、ＴＳＬＰＲポリペプチドの量を検出または定量する方法。
【請求項３７】
請求項１３、請求項１４、または請求項１５のいずれかに記載のポリペプチド、および薬学的に受容可能な処方剤を含む、組成物。
【請求項３８】
前記薬学的に受容可能な処方剤が、キャリア、アジュバント、溶解剤、安定剤、または抗酸化剤である、請求項３７に記載の組成物。
【請求項３９】
前記ポリペプチドが、配列番号６または配列番号９のいずれかに示されるアミノ酸配列を含む、請求項３７に記載の組成物。
【請求項４０】
請求項１３、請求項１４、または請求項１５のいずれかに記載のポリペプチドの誘導体を含む、ポリペプチド。
【請求項４１】
水溶性ポリマーを用いて共有結合的に改変された、請求項４０に記載のポリペプチド。
【請求項４２】
請求項４１に記載のポリペプチドであって、ここで、前記水溶性ポリマーが、ポリエチレングリコール、モノメトキシポリエチレングリコール、デキストラン、セルロース、ポリ−（Ｎ−ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、プロピレングリコールホモポリマー、ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール、およびポリビニルアルコールからなる群より選択される、ポリペプチド。
【請求項４３】
請求項１、請求項２、または請求項３のいずれかに記載の核酸分子および薬学的に受容可能な処方剤を含む、組成物。
【請求項４４】
前記核酸分子が、ウイルスベクター中に含まれる、請求項４３に記載の組成物。
【請求項４５】
請求項１、請求項２、または請求項３のいずれかに記載の核酸分子を含む、ウイルスベクター。
【請求項４６】
異種アミノ酸配列に融合された、請求項１３、請求項１４、または請求項１５のいずれかに記載のポリペプチドを含む、融合ポリペプチド。
【請求項４７】
前記異種アミノ酸配列が、ＩｇＧ定常ドメインまたはそのフラグメントである、請求項４６に記載の融合ポリペプチド。
【請求項４８】
医学状態を、処置、予防、または改善するための組成物であって、請求項１３、請求項１４、もしくは請求項１５のいずれかに記載のポリペプチド、または請求項１、請求項２、もしくは請求項３のいずれかに記載の核酸によってコードされるポリペプチドを含む、組成物。
【請求項４９】
被験体における病的状態または病的状態に対する感受性を診断する方法であって、以下：
（ａ）サンプル中の、請求項１３、請求項１４、もしくは請求項１５のいずれかに記載のポリペプチド、または請求項１、請求項２、もしくは請求項３のいずれかに記載の核酸分子によってコードされるポリペプチドの、発現の存在または発現量を決定する工程；および
（ｂ）該ポリペプチドの発現の存在または発現量に基づいて、病的状態または病的状態に対する感受性を診断する工程、
を包含する、方法。
【請求項５０】
デバイスであって、以下：
（ａ）移植に適した膜；および
（ｂ）該膜内にカプセル化された細胞であって、該細胞は、請求項１３、請求項１４、もしくは請求項１５のいずれかに記載のタンパク質を分泌する、細胞；を備え、
該膜は、該タンパク質に対して透過性であり、そして該細胞に有害な物質に対して不透過性である、デバイス。
【請求項５１】
ＴＳＬＰＲポリペプチドに結合する化合物を同定する方法であって、以下：
（ａ）請求項１３、請求項１４、もしくは請求項１５のいずれかに記載のポリペプチドを、化合物と接触させる工程；および
（ｂ）該化合物に対する該ＴＳＬＰＲポリペプチドの結合の程度を決定する工程、
を包含する、方法。
【請求項５２】
前記化合物に結合した場合に、前記ポリペプチドの活性を決定する工程をさらに包含する、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
動物においてポリペプチドのレベルを調節する組成物であって、請求項１、請求項２、または請求項３のいずれかに記載の核酸分子を含む、組成物。
【請求項５４】
請求項１、請求項２、または請求項３のいずれかに記載の核酸分子を含む、トランスジェニック非ヒト哺乳動物。
【請求項５５】
化合物がＴＳＬＰＲポリペプチド活性またはＴＳＬＰＲポリペプチド産生を阻害するか否かを決定するためのプロセスであって、請求項５４に記載のトランスジェニック哺乳動物を該化合物に曝露する工程、および該哺乳動物におけるＴＳＬＰＲポリペプチド活性またはＴＳＬＰＲポリペプチド産生を測定する工程を包含する、プロセス。
【請求項５６】
固体支持体に結合する、請求項１、請求項２、または請求項３のいずれかに記載の核酸分子。
【請求項５７】
請求項１、請求項２、または請求項３のいずれかに記載の少なくとも１つの核酸分子を含む、核酸分子のアレイ。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本願は、２０００年６月２８日出願の米国仮特許出願第６０／２１４，８６６号からの優先権の利益を主張し、この仮出願の開示は、本明細書中で参考として明確に援用される。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、胸腺間質リンホポイエチン（Ｌｙｍｐｈｏｐｏｉｅｔｉｎ）レセプター（ＴＳＬＰＲ）ポリペプチドおよびこのポリペプチドをコードする核酸分子に関する。本発明はまた、ＴＳＬＰＲポリペプチドを産生するための、選択的結合因子、ベクター、宿主細胞および方法に関する。本発明はさらに、ＴＳＬＰＲポリペプチドと関連する疾患、障害、および状態の、診断、処置、改善、および／または予防のための薬学的組成物および方法に関する。
【０００３】
（発明の背景）
核酸分子の同定、クローニング、発現、および操作における技術進歩ならびにヒトゲノムの解読は、新規治療剤の発見を大きく加速した。現在、高速核酸配列決定技術は、前例のない速度で配列情報を作製し得、そしてコンピュータ分析と合わされて、ゲノムの一部および全体へと重複配列を集合すること、ならびにポリペプチドコード領域の同定を可能にする。既知アミノ酸配列のデータベース編集物に対する推定アミノ酸配列の比較は、以前に同定された配列および／または構造の目印に対して相同性の程度を決定することを可能にする。核酸分子のポリペプチドコード領域のクローニングおよび発現は、構造分析および機能分析のためのポリペプチド産物を提供する。核酸分子およびコードされるポリペプチドの操作は、治療剤としての使用に関して生成物に対して有利な特性を与え得る。
【０００４】
過去１０年間にわたるゲノム研究における有意な技術進歩にも関わらず、ヒトゲノムに基づく新規治療剤の開発に関する可能性は、未だほとんど実現されていない。潜在的に有利なポリペプチド治療剤をコードする多くの遺伝子またはこれらがコードするポリペプチド（これらは、治療分子に対して「標的」として働き得る）は、未だ同定されていない。従って、診断的な利点または治療的な利点を有する、新規ポリペプチドおよびこれらをコードする核酸分子を同定することが、本発明の目的である。
【０００５】
サイトカインは、増殖、分化、および生存を含む種々の細胞性応答を調節する。種々のクラスのサイトカインの中の１つが、Ｉ型サイトカインであり、これは、アップ−アップ−ダウン−ダウントポロジーを示す４つのαへリックス束の構造を形成する（Ｂａｚａｎ，１９９０，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ  １１：３５０−５４；ＬｅｏｎａｒｄおよびＯ’Ｓｈｅａ，１９９８，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６：２９３−３２２；Ｌｅｏｎａｒｄ，Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ７４１−７４（Ｐａｕｌ編，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｒａｖｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ  第４編、１９９９年））。Ｉ型サイトカインとしては、多数のインターロイキン（例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−９、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、およびＩＬ−１５）、ならびにＧＭ−ＣＳＦ、エリトロポイエチン、トロンボポイエチン（ｔｈｒｏｍｂｏｐｏｉｅｔｉｎ）のような血液学的に活性な他の分子、ならびに成長ホルモンおよびプロラクチンのような分子が挙げられる。Ｉ型サイトカインによるシグナル伝達は、Ｉ型サイトカインレセプタースーパーファミリーのホモ二量体、ヘテロ二量体、またはより高次の他のレセプターオリゴマーとの相互作用を含む。リガンド結合は、二量体化またはより高次のオリゴマー形成を誘導し、下流のシグナル伝達（Ｊａｋ−ＳＴＡＴ経路（Ｂａｚａｎ、前出；ＬｅｏｎａｒｄおよびＯ’Ｓｈｅａ、前出；Ｌｅｏｎａｒｄ、前出）に部分的に関与する）を生じる。
【０００６】
胸腺間質リンホポイエチン（ＴＳＬＰ）は、生物学的活性がＩＬ−７の生物学的活性と重複するサイトカインである。例えば、ＴＳＬＰおよびＩＬ−７は、転写因子Ｓｔａｔ５のチロシンリン酸化を誘導する（Ｉｓａｋｓｅｎら、１９９９、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６３：５９７１−７７）。ＴＳＬＰ活性は、胎仔肝臓の造血前駆細胞からのマウスＩｇＭ＋Ｂ細胞の発生を支持する胸腺間質細胞株の馴化培地中で元々同定された（Ｆｒｉｅｎｄら、１９９４  Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．２２：３２１−２８）。さらに、ＴＳＬＰは、長期の骨髄培養物中でＢ細胞リンパ球産生を促進し得、そして胸腺細胞および成熟Ｔ細胞の両方を同時刺激し得る（Ｆｒｉｅｎｄら、前出；Ｌｅｖｉｎら、１９９９，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６２：６７７−８３）。ＴＳＬＰはまた、Ｔ細胞レセプターγ座位を特異的に再配列するための外因性シグナルとして機能し得る（Ｃａｎｄｅｉａｓら、１９９７，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．５７：９−１４）。従って、ＴＳＬＰのためのサイトカインレセプターの単離および特徴付けは、ＴＳＬＰ関連疾患またはＴＳＬＰ関連状態の処置において有用な化合物（例えば、Ｂ細胞発生、Ｔ細胞発生、Ｔ細胞レセプター遺伝子再配列、またはＳｔａｔ５転写因子の調節に影響する化合物）の同定を可能にする。
【０００７】
（発明の要旨）
本発明は、新規ＴＳＬＰＲ核酸分子およびコードされるポリペプチドに関する。
【０００８】
本発明は、単離された核酸分子を提供し、この核酸分子は、以下：
（ａ）配列番号１、配列番号４、配列番号７、配列番号１０、または配列番号１１のいずれかに示される、ヌクレオチド配列；
（ｂ）配列番号２、配列番号５、または配列番号８のいずれかに示されるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；
（ｃ）（ｂ）または（ｃ）のいずれかの相補体に、中程度にストリンジェントな条件下または高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、ヌクレオチド配列；および
（ｄ）（ｂ）または（ｃ）のいずれかと相補的な、ヌクレオチド配列、
からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む。
【０００９】
本発明はまた、単離された核酸分子を提供し、この核酸分子は、
（ａ）配列番号２、配列番号５、または配列番号８のいずれかに示されるポリペプチドと少なくとも約７０％同一であるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、ここで、上記コードされたポリペプチドは、配列番号２、配列番号５、または配列番号８のいずれかに示されるポリペプチドの活性を有する、ヌクレオチド配列；
（ｂ）配列番号１、配列番号４、配列番号７、配列番号１０、もしくは配列番号１１のいずれかに示されるヌクレオチド配列の対立遺伝子改変体またはスプライス改変体、または（ａ）の対立遺伝子改変体またはスプライス改変体をコードする、ヌクレオチド配列；
（ｃ）少なくとも約２５アミノ酸残基のポリペプチドフラグメントをコードする、配列番号１、配列番号４、配列番号７、配列番号１０、もしくは配列番号１１のいずれかのヌクレオチド配列の領域、（ａ）のヌクレオチド配列の領域または（ｂ）のヌクレオチド配列の領域であって、ここで、上記ポリペプチドフラグメントは、配列番号２、配列番号５、もしくは配列番号８のいずれかに示されるコードされたポリペプチドの活性を有するか、または抗原性である、ヌクレオチド配列の領域；
（ｄ）少なくとも約１６ヌクレオチドのフラグメントを含む、配列番号１、配列番号４、配列番号７、配列番号１０、または配列番号１１のいずれかのヌクレオチド配列の領域、または（ａ）〜（ｃ）のいずれかのヌクレオチド配列の領域；
（ｅ）中程度にストリンジェントな条件下または高度にストリンジェントな条件下で、（ａ）〜（ｄ）のいずれかの相補体にハイブリダイズする、ヌクレオチド配列；ならびに
（ｆ）（ａ）〜（ｄ）のいずれかと相補的な、ヌクレオチド配列、
からなる群より選択される、ヌクレオチド配列を含む。
【００１０】
本発明はさらに、単離された核酸分子を提供し、この核酸分子は、
（ａ）少なくとも１つの保存的アミノ酸置換を有する、配列番号２、配列番号５、または配列番号８のいずれかに示されるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、ここで、上記コードされたポリペプチドは、配列番号２、配列番号５、または配列番号８のいずれかに示されるポリペプチドの活性を有する、ヌクレオチド配列；
（ｂ）少なくとも１つのアミノ酸挿入を有する、配列番号２、配列番号５、または配列番号８のいずれかに示されるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、ここで、上記コードされたポリペプチドは、配列番号２、配列番号５、配列番号８のいずれかに示されるポリペプチドの活性を有する、ヌクレオチド配列；
（ｃ）少なくとも１つのアミノ酸欠失を有する、配列番号２、配列番号５、または配列番号８のいずれかに示されるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、ここで、上記コードされたポリペプチドは、配列番号２、配列番号５、または配列番号８のいずれかに示されるポリペプチドの活性を有する、ヌクレオチド配列；
（ｄ）Ｃ末端短縮および／またはＮ末端短縮を有する、配列番号２、配列番号５、または配列番号８のいずれかに示されるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、ここで、上記コードされたポリペプチドは、配列番号２、配列番号５、または配列番号８のいずれかに示されるポリペプチドの活性を有する、ヌクレオチド配列；
（ｅ）アミノ酸置換、アミノ酸挿入、アミノ酸欠失、Ｃ末端短縮、およびＮ末端短縮からなる群より選択される少なくとも１つの改変を有する、配列番号２、配列番号５、または配列番号８のいずれかに示されるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、ここで、上記コードされたポリペプチドは、配列番号２、配列番号５、または配列番号８のいずれかに示されるポリペプチドの活性を有する、ヌクレオチド配列；
（ｆ）少なくとも約１６ヌクレオチドのフラグメントを含む、（ａ）〜（ｅ）のいずれかの、ヌクレオチド配列；
（ｇ）中程度にストリンジェントな条件下または高度にストリンジェントな条件下で、（ａ）〜（ｆ）のいずれかの相補体にハイブリダイズする、ヌクレオチド配列；ならびに
（ｈ）（ａ）〜（ｅ）のいずれかと相補的な、ヌクレオチド配列、
からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む。
【００１１】
本発明は、配列番号２、配列番号５、または配列番号８のいずれかに示されるアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチドを提供する。
【００１２】
本発明はまた、単離されたポリペプチドを提供し、このポリペプチドは、
（ａ）配列番号３、配列番号６、または配列番号９に示されるアミノ酸配列であって、必要に応じてさらにアミノ末端メチオニンを含む、アミノ酸配列；
（ｂ）配列番号２、配列番号５、または配列番号８のいずれかのオルソログについての、アミノ酸配列；
（ｃ）配列番号２、配列番号５、または配列番号８のいずれかのアミノ酸配列と少なくとも約７０％同一であるアミノ酸配列であって、ここで、上記ポリペプチドは、配列番号２、配列番号５、または配列番号８のいずれかに示されるポリペプチドの活性を有する、アミノ酸配列；
（ｄ）少なくとも約２５アミノ酸残基を含む、配列番号２、配列番号５、もしくは配列番号８のいずれかに示されるアミノ酸配列のフラグメントであって、ここで、上記フラグメントは、配列番号２、配列番号５、もしくは配列番号８のいずれかに示されるポリペプチドの活性を有するか、または抗原性である、フラグメント；ならびに
（ｅ）配列番号２、配列番号５、もしくは配列番号８のいずれかに示されるアミノ酸配列の対立遺伝子改変体またはスプライス改変体のアミノ酸配列、または（ａ）〜（ｃ）のいずれかの対立遺伝子改変体またはスプライス改変体のアミノ酸配列、
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。
【００１３】
本発明はさらに、単離されたポリペプチドを提供し、このポリペプチドは、
（ａ）少なくとも１つの保存的アミノ酸置換を有する、配列番号２、配列番号５、または配列番号８のいずれかに示されるアミノ酸配列であって、ここで、上記ポリペプチドは、配列番号２、配列番号５、または配列番号８のいずれかに示されるポリペプチドの活性を有する、アミノ酸配列；
（ｂ）少なくとも１つのアミノ酸挿入を有する、配列番号２、配列番号５、または配列番号８のいずれかに示されるアミノ酸配列であって、ここで、上記ポリペプチドは、配列番号２、配列番号５、または配列番号８のいずれかに示されるポリペプチドの活性を有する、アミノ酸配列；
（ｃ）少なくとも１つのアミノ酸欠失を有する、配列番号２、配列番号５、または配列番号８のいずれかに示されるアミノ酸配列であって、ここで、上記ポリペプチドは、配列番号２、配列番号５、または配列番号８のいずれかに示されるポリペプチドの活性を有する、アミノ酸配列；
（ｄ）Ｃ末端短縮および／またはＮ末端短縮を有する、配列番号２、配列番号５、または配列番号８のいずれかに示されるアミノ酸配列であって、ここで、上記ポリペプチドは、配列番号２、配列番号５、または配列番号８のいずれかに示されるポリペプチドの活性を有する、アミノ酸配列；ならびに
（ｅ）アミノ酸置換、アミノ酸挿入、アミノ酸欠失、Ｃ末端短縮、およびＮ末端短縮からなる群より選択される少なくとも１つの改変を有する、配列番号２、配列番号５、または配列番号８のいずれかに示されるアミノ酸配列であって、ここで、上記ポリペプチドは、配列番号２、配列番号５、または配列番号８のいずれかに示されるポリペプチドの活性を有する、アミノ酸配列、
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。
【００１４】
ＴＳＬＰＲアミノ酸配列を含む融合ポリペプチドもまた、提供される。
【００１５】
本発明はまた、本明細書中に示されるような単離された核酸分子を含む発現ベクター、本明細書中に示されるような組換え核酸分子を含む組換え宿主細胞、およびＴＳＬＰＲポリペプチドを産生する方法を提供し、この方法は、この宿主細胞を培養する工程、および必要に応じてそのように産生されたポリペプチドを単離する工程を包含する。
【００１６】
ＴＳＬＰＲポリペプチドをコードする核酸分子を含むトランスジェニック非ヒト動物もまた、本発明に含まれる。ＴＳＬＰＲ核酸分子は、ＴＳＬＰＲポリペプチドの発現およびＴＳＬＰＲポリペプチドの増加したレベル（これは、増加した循環レベルを含み得る）を可能にする様式で、動物中に導入される。あるいは、ＴＳＬＰＲ核酸分子は、内因性ＴＳＬＰＲポリペプチドの発現を阻害する（すなわち、ＴＳＬＰＲポリペプチド遺伝子ノックアウトを保有するトランスジェニック動物を作製する）様式で動物に導入される。このトランスジェニック非ヒト動物は、好ましくは哺乳動物であり、より好ましくはげっ歯類（例えば、ラットまたはマウス）である。
【００１７】
本発明のＴＳＬＰＲポリペプチドの誘導体もまた、提供される。
【００１８】
本発明のＴＳＬＰＲポリペプチドに特異的に結合し得る選択的結合因子（例えば、抗体およびペプチド）が、さらに提供される。このような抗体およびペプチドは、アゴニストであってもアンタゴニストであってもよい。
【００１９】
本発明のヌクレオチド、ポリペプチド、もしくは選択的結合因子と、１つ以上の薬学的に受容可能な処方剤とを含む、薬学的組成物もまた、本発明によって包含される。この薬学的組成物は、治療有効量の本発明のヌクレオチドまたはポリペプチドを提供するために使用される。本発明はまた、このポリペプチド、核酸分子、および選択的結合因子を使用する方法に関する。
【００２０】
本発明のＴＳＬＰＲポリペプチドおよびＴＳＬＰＲ核酸分子は、疾患および障害（本明細書中に列挙されるものを含む）を処置、予防、改善、および／または検出するために使用され得る。
【００２１】
本発明はまた、ＴＳＬＰＲポリペプチドに結合する試験分子を同定するために、試験分子をアッセイする方法を提供する。この方法は、ＴＳＬＰＲポリペプチドを試験分子と接触させて、このポリペプチドへのこの試験分子の結合の程度を決定する工程を包含する。この方法はさらに、このような試験分子が、ＴＳＬＰＲポリペプチドのアゴニストまたはアンタゴニストであるか否かを決定する工程を包含する。本発明はさらに、ＴＳＬＰＲポリペプチドの発現またはＴＳＬＰＲポリペプチドの活性に対する分子の影響を試験する方法を提供する。
【００２２】
ＴＳＬＰＲポリペプチドの発現を調整する方法およびＴＳＬＰＲポリペプチドのレベルを調節する（すなわち、増加または減少させる）方法もまた、本発明によって包含される。１つの方法は、ＴＳＬＰＲポリペプチドをコードする核酸分子を動物に投与する工程を包含する。別の方法において、ＴＳＬＰＲポリペプチドの発現を調整または調節するエレメントを含む核酸分子が、投与され得る。これらの方法の例としては、本明細書中にさらに記載されるような、遺伝子治療、細胞治療、およびアンチセンス治療が挙げられる。
【００２３】
（発明の詳細な説明）
本明細書中で使用される節の表題は、組織的な目的のみのためであり、そして記載される主題を限定するようには解釈されるべきではない。本願において引用される全ての参考文献は、明確に本明細書中に参考として援用される。
【００２４】
（定義）
用語「ＴＳＬＰＲ遺伝子」または「ＴＳＬＰＲ核酸分子」また「ＴＳＬＰＲポリヌクレオチド」とは、配列番号１、配列番号４、配列番号７、配列番号１０、または配列番号１１のいずれかに示されるヌクレオチド配列、配列番号２、配列番号５、または配列番号８のいずれかに示されるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、および本明細書中で定義される核酸分子を含むかまたはこれらからなる、核酸分子をいう。
【００２５】
用語「ＴＳＬＰＲポリペプチド対立遺伝子改変体」とは、生物または生物の集団の染色体上の所定の遺伝子座を占める遺伝子の、天然に存在する可能ないくつかの代替形態のうちの１つをいう。
【００２６】
用語「ＴＳＬＰＲポリペプチドスプライス改変体」とは、配列番号２、配列番号５、または配列番号８のいずれかに示されるＴＳＬＰＲポリペプチドアミノ酸配列のＲＮＡ転写物中のイントロン配列の選択的プロセシングによって生成される、核酸分子（通常はＲＮＡ）をいう。
【００２７】
用語「単離された核酸分子」とは、（１）総核酸が供給源細胞から単離される場合に、ともに天然で見出されるタンパク質、脂質、糖質、または他の物質のうち少なくとも約５０パーセントから分離された、本発明の核酸分子、（２）「単離された核酸分子」が天然で連結しているポリヌクレオチドの全てまたは一部に連結していない、本発明の核酸分子、（３）天然では連結しないポリヌクレオチドに作動可能に連結されている、本発明の核酸分子、または（４）より大きなポリヌクレオチド配列の一部として天然には存在しない、本発明の核酸分子をいう。好ましくは、本発明の単離された核酸分子は、いかなる他の夾雑核酸分子、または天然の環境において見出される他の夾雑物（これらは、ポリペプチド産生における使用、または治療的使用、診断的使用、予防的使用、または研究的使用を妨げる）も実質的には含まない。
【００２８】
用語「核酸配列」または「核酸分子」は、ＤＮＡ配列またはＲＮＡ配列をいう。この用語は、ＤＮＡおよびＲＮＡの公知の塩基アナログのうちのいずれかから形成される分子を含み、この塩基アナログは、例えば、以下であるがこれらに限定されない：４−アセチルシトシン、８−ヒドロキシ−Ｎ６−メチルアデノシン、アジリジニル−シトシン、プソイドイソシトシン、５−（カルボキシヒドロキシルメチル）ウラシル、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、イノシン、Ｎ６−イソ−ペンテニルアデニン、１−メチルアデニン、１−メチルプソイドウラシル、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−メチルアデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノ−メチル−２−チオウラシル、β−Ｄ−マンノシルキューオシン（ｂｅｔａ−Ｄ−ｍａｎｎｏｓｙｌｑｕｅｏｓｉｎｅ）、５’−メトキシカルボニル−メチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸、オキシブトキソシン、プソイドウラシル、キューオシン（ｑｕｅｏｓｉｎｅ）、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、Ｎ−ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸、プソイドウラシル、キューオシン（ｑｕｅｏｓｉｎｅ）、２−チオシトシン、および２，６−ジアミノプリン。
【００２９】
用語「ベクター」は、宿主細胞にコード情報を移すために使用される任意の分子（例えば、核酸、プラスミド、またはウイルス）をいうために使用される。
【００３０】
用語「発現ベクター」は、宿主細胞の形質転換に適切であり、かつ挿入された異種核酸配列の発現を、指向および／または制御する核酸配列を含む、ベクターをいう。発現としては、転写、翻訳、およびＲＮＡスプライシング（イントロンが存在する場合）のようなプロセスが挙げられるが、これらに限定されない。
【００３１】
用語「作動可能に連結された（されている）」は、隣接配列の配置方法をいうために本明細書中に使用される。ここで、このように記載される隣接配列は、その通常の機能を実行するように構成されるかまたは集合される。従って、コード配列に作動可能に連結された隣接配列は、そのコード配列の複製、転写および／または翻訳をもたらすことができ得る。例えば、プロモーターがコード配列の転写を指向し得る場合、このコード配列は、このプロモーターに作動可能に連結されている。隣接配列は、それが正確に機能する限り、コード配列と連続している必要はない。従って、例えば、翻訳されないが転写される介在配列が、プロモーター配列とこのコード配列との間に存在し得、そして、このプロモーター配列はなお、このコード配列に「作動可能に連結されている」とみなされ得る。
【００３２】
用語「宿主細胞」は、核酸配列で形質転換されたかまたは形質転換され得、次いで目的の選択された遺伝子を発現し得る、細胞をいうために用いられる。この用語は、この選択された遺伝子が存在する限り、子孫が形態学または遺伝的構成においてもとの親と同一であってもなくても、この親細胞の子孫を含む。
【００３３】
用語「ＴＳＬＰＲポリペプチド」とは、配列番号２、配列番号５、または配列番号８のいずれかのアミノ酸配列を含むポリペプチドおよび関連ポリペプチドをいう。関連ポリペプチドとしては、以下が挙げられる：ＴＳＬＰＲポリペプチドフラグメント、ＴＳＬＰＲポリペプチドオルソログ、ＴＳＬＰＲポリペプチド改変体、およびＴＳＬＰＲポリペプチド誘導体であって、配列番号２、配列番号５、または配列番号８のいずれかに示されるポリペプチドの少なくとも１つの活性を有するもの。ＴＳＬＰＲポリペプチドは、本明細書中に定義されるように、成熟ポリペプチドであり得、そして調製方法によっては、アミノ末端メチオニン残基を有しても有さなくてもよい。
【００３４】
用語「ＴＳＬＰＲポリペプチドフラグメント」とは、配列番号２、配列番号５、または配列番号８のいずれかに示されるポリペプチドのアミノ末端（リーダー配列を有するかまたは有さない）の短縮および／またはカルボキシル末端の短縮を含むポリペプチドをいう。用語「ＴＳＬＰＲポリペプチドフラグメント」とはまた、ＴＳＬＰＲポリペプチドオルソログ、ＴＳＬＰＲポリペプチド誘導体、またはＴＳＬＰＲポリペプチド改変体のアミノ末端および／またはカルボキシル末端の短縮物をいうか、あるいはＴＳＬＰＲポリペプチド対立遺伝子改変体またはＴＳＬＰＲポリペプチドスプライス改変体によってコードされるポリペプチドのアミノ末端および／またはカルボキシル末端の短縮物をいう。ＴＳＬＰＲポリペプチドフラグメントは、選択的ＲＮＡスプライシングから生じ得るか、またはインビボプロテアーゼ活性から生じ得る。ＴＳＬＰＲポリペプチドの膜結合形態もまた、本発明によって意図される。好ましい実施形態において、短縮および／または欠失は、約１０アミノ酸、または約２０アミノ酸、または約５０アミノ酸、または約７５アミノ酸、または約１００アミノ酸、または１００アミノ酸より多いアミノ酸を含む。このように産生されたポリペプチドフラグメントは、約２５個連続するアミノ酸、または約５０アミノ酸、または約７５アミノ酸、または約１００アミノ酸、または約１５０アミノ酸、または約２００アミノ酸を含む。このようなＴＳＬＰＲポリペプチドフラグメントは、必要に応じて、アミノ末端メチオニン残基を含み得る。このようなフラグメントは、例えば、ＴＳＬＰＲポリペプチドに対する抗体を生成するために用いられ得ることが理解される。
【００３５】
用語「ＴＳＬＰＲポリペプチドオルソログ」とは、配列番号２、配列番号５、または配列番号８のいずれかに示されるＴＳＬＰＲポリペプチドアミノ酸配列に対応する、別の種由来のポリペプチドをいう。例えば、マウスおよびヒトのＴＳＬＰＲポリペプチドは、互いにオルソログであるとみなされる。
【００３６】
用語「ＴＳＬＰＲポリペプチド改変体」とは、配列番号２、配列番号５、または配列番号８のいずれかに示されるＴＳＬＰＲポリペプチドアミノ酸配列（リーダー配列を有するか、または有さない）に比べて、１つ以上のアミノ酸配列の置換、欠失（例えば、内部欠失および／もしくはＴＳＬＰＲポリペプチドフラグメント）、ならびに／または付加（例えば、内部付加および／もしくはＴＳＬＰＲ融合ポリペプチド）を有するアミノ酸配列を含む、ＴＳＬＰＲポリペプチドをいう。改変体は、天然に存在し得る（例えば、ＴＳＬＰＲポリペプチド対立遺伝子改変体、ＴＳＬＰＲポリペプチドオルソログ、およびＴＳＬＰＲスプライス改変体）か、または人工的に構築され得る。このようなＴＳＬＰＲ−ポリペプチド改変体は、配列番号１、配列番号４、配列番号７、配列番号１０、または配列番号１１のいずれかに示されるＤＮＡ配列からしかるべく変動するＤＮＡ配列を有する対応する核酸分子から調製され得る。好ましい実施形態において、この改変体は、１〜３個、または１〜５個、または１〜１０個、または１〜１５個、または１〜２０個、または１〜２５個、または１〜５０個、または１〜７５個、または１〜１００個、または１００個よりも多いアミノ酸の置換、挿入、付加および／もしくは欠失を有し、ここでその置換は、保存的であっても、または非保存的であってもよいし、あるいはその組み合わせであってもよい。
【００３７】
用語「ＴＳＬＰＲポリペプチド誘導体」とは、化学的に改変された、本明細書中に定義されるような、配列番号２、配列番号５、もしくは配列番号８のいずれかに示されるポリペプチド、ＴＳＬＰＲポリペプチドフラグメント、ＴＳＬＰＲポリペプチドオルソログ、またはＴＳＬＰＲポリペプチド改変体をいう。用語「ＴＳＬＰＲポリペプチド誘導体」とはまた、化学的に改変された、本明細書中に定義されるような、ＴＳＬＰＲポリペプチド対立遺伝子改変体またはＴＳＬＰＲポリペプチドスプライス改変体によってコードされるポリペプチドをいう。
【００３８】
用語「成熟ＴＳＬＰＲポリペプチド」とは、リーダー配列を欠くＴＳＬＰＲポリペプチドをいう。成熟ＴＳＬＰＲポリペプチドはまた、アミノ末端（リーダー配列を有するか、または有さない）および／またはカルボキシル末端のタンパク質分解性プロセシング、より大きい前駆体からのより小さいポリペプチドの切断、Ｎ結合型グリコシル化および／またはＯ結合型グリコシル化などのような、他の改変を含み得る。例示的な成熟ＴＳＬＰＲポリペプチドは、配列番号３、配列番号６、または配列番号９のいずれかのアミノ酸配列によって示される。
【００３９】
用語「ＴＳＬＰＲ融合ポリペプチド」とは、本明細書中に定義されるような、配列番号２、配列番号５、または配列番号８のいずれかに示されるポリペプチド、ＴＳＬＰＲポリペプチドフラグメント、ＴＳＬＰＲポリペプチドオルソログ、ＴＳＬＰＲポリペプチド改変体、またはＴＳＬＰＲポリペプチド誘導体の、アミノ末端またはカルボキシル末端での１つ以上のアミノ酸（例えば、異種タンパク質または異種ペプチド）の融合体をいう。用語「ＴＳＬＰＲ融合ポリペプチド」とはまた、本明細書中に定義されるような、ＴＳＬＰＲポリペプチド対立遺伝子改変体またはＴＳＬＰＲポリペプチドスプライス改変体によってコードされるポリペプチドのアミノ末端またはカルボキシル末端での、１つ以上のアミノ酸の融合体をいう。
【００４０】
用語「生物学的に活性なＴＳＬＰＲポリペプチド」とは、配列番号２、配列番号５、または配列番号８のいずれかのアミノ酸配列を含むポリペプチドの少なくとも１つの活性の特徴を有する、ＴＳＬＰＲポリペプチドをいう。さらに、ＴＳＬＰＲポリペプチドは、免疫原として活性であり得る；すなわち、このＴＳＬＰＲポリペプチドは、抗体が惹起され得る少なくとも１つのエピトープを含む。
【００４１】
用語「単離されたポリペプチド」とは、以下のような本発明のポリペプチドをいう：（１）供給源細胞から単離された場合に、共に天然に見出されるポリヌクレオチド、脂質、糖質、または他の材料の、少なくとも約５０％から分離されたポリペプチド、（２）その「単離されたポリペプチド」が天然において結合されているポリペプチドの全体または一部分に（共有結合性の相互作用または非共有結合性の相互作用によって）結合されていないポリペプチド、（３）天然において結合されないポリペプチドに（共有結合性の相互作用または非共有結合性の相互作用によって）作動可能に連結されているポリペプチド、あるいは（４）天然に存在しないポリペプチド。好ましくは、この単離されたポリペプチドは、その治療用途、診断用途、予防用途または研究用途を妨害する、その天然の環境において見出されるいかなる他の夾雑ポリペプチドまたは他の夾雑物をも実質的に含まない。
【００４２】
用語「同一性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）」は、当該分野で公知のように、２つ以上のポリペプチド分子、または２つ以上の核酸分子の配列の間にある、これらの配列を比較することによって決定される、関係をいう。当該分野では、「同一性」はまた、核酸分子またはポリペプチドの配列関連性の程度（場合によっては、２つ以上のヌクレオチド配列または２つ以上のアミノ酸配列のストリングの間の一致により決定され得る）を意味する。「同一性」は、特定の算術モデルまたはコンピュータープログラム（すなわち、アルゴリズム）によって位置付けられた、ギャップアライメント（もし存在するならば）を有する２つ以上の配列のうちの短い方の間の同一適合のパーセントを測定する。
【００４３】
用語「類似性（ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ）」は、関連する概念であるが、「同一性」とは対照的に、「類似性」とは、同一適合および保存的置換適合の両方を含む関連性の尺度をいう。２つのポリペプチド配列が、例えば、１０／２０の同一のアミノ酸を有し、そして残りが全て非保存的置換であるならば、同一性パーセントおよび類似性パーセントは、両方とも５０％である。同じ例で、保存的置換が存在するさらに５つの位置が存在するならば、同一性パーセントは、５０％のままであるが、類似性パーセントは７５％（１５／２０）である。従って、保存的置換が存在する場合、２つのポリペプチドの間の類似性パーセントは、これらの２つのポリペプチドの間の同一性パーセントよりも高い。
【００４４】
用語「天然に存在する」または「ネイティブ」は、核酸分子、ポリペプチド、宿主細胞などのような生物学的材料に関して使用される場合、天然に見出されかつ人工的に操作されていない材料をいう。同様に、「天然に存在しない」または「非ネイティブ」は、本明細書中において使用される場合、天然には見出されないか、または人工的に構造改変されたかもしくは合成された、材料をいう。
【００４５】
用語「有効量」および「治療的に有効な量」とは、各々、本明細書中に示されるＴＳＬＰＲポリペプチドの１つ以上の生物学的活性の観察可能なレベルを支持するために使用されるＴＳＬＰＲポリペプチドまたはＴＳＬＰＲ核酸分子の量をいう。
【００４６】
本明細書中に使用される場合、用語「薬学的に受容可能なキャリア」または「生理学的に受容可能なキャリア」とは、薬学的組成物としてのＴＳＬＰＲポリペプチド、ＴＳＬＰＲ核酸分子、またはＴＳＬＰＲ選択的結合因子の送達を、達成するかまたは増強するのに適切な、１つ以上の処方材料をいう。
【００４７】
用語「抗原」とは、選択的結合因子（例えば、抗体）により結合され得る分子または分子の一部であって、そしてさらに、その抗原のエピトープに結合し得る抗体を産生するために動物において用いられ得る、分子または分子の一部をいう。抗原は、１つ以上のエピトープを有し得る。
【００４８】
用語「選択的結合因子」とは、ＴＳＬＰＲポリペプチドに対して特異性を有する分子（単数または複数）をいう。本明細書中にて使用される場合、用語「特異的」および「特異性」とは、ヒトＴＳＬＰＲポリペプチドに結合するがヒト非ＴＳＬＰＲポリペプチドに結合しない、選択的結合因子の能力をいう。しかし、その選択的結合因子が、配列番号２、配列番号５、または配列番号８のいずれかに示されるようなポリペプチドのオルソログ（すなわち、その種間のバージョン（例えば、マウスＴＳＬＰＲポリペプチドおよびラットＴＳＬＰＲポリペプチド））もまた結合し得ることが、理解される。
【００４９】
用語「形質導入」は、１つの細菌から別のものへの（通常、ファージによる）遺伝子の移入をいうために使用される。「形質導入」はまた、レトロウイルスによる真核生物細胞の配列の捕捉および移入をいう。
【００５０】
用語「トランスフェクション」は、細胞による外来ＤＮＡまたは外因性ＤＮＡの取り込みをいうために使用される。そして、細胞は、その外因性ＤＮＡが細胞膜の内側に導入されている場合、「トランスフェクト」されている。多数のトランスフェクション技術が、当該分野で周知であり、そして、本明細書中に開示される。例えば、Ｇｒａｈａｍら、１９７３，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ５２：４５６；Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，１９８９）；Ｄａｖｉｓら、Ｂａｓｉｃ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，１９８６）；およびＣｈｕら、１９８１，Ｇｅｎｅ  １３：１９７を参照のこと。このような技術は、１つ以上の外因性ＤＮＡ部分を適切な宿主細胞に導入するために使用され得る。
【００５１】
用語「形質転換」は、本明細書中に使用される場合、細胞の遺伝特徴における変化をいい、そして細胞は、新しいＤＮＡを含むように改変されている場合、形質転換されている。例えば、細胞は、そのネイティブな状態から遺伝的に改変された場合、形質転換されている。トランスフェクションまたは形質導入に続いて、その形質転換ＤＮＡは、細胞の染色体へ物理的に組み込むことによってその細胞のＤＮＡと組み換わり得るか、複製されないエピソームエレメントとして一過性に維持され得るか、またはプラスミドとして独立して複製し得る。細胞は、そのＤＮＡが細胞の分裂と共に複製される場合、安定に形質転換されているとみなされる。
【００５２】
（核酸分子および／またはポリペプチドの関連性）
関連する核酸分子が、配列番号１、配列番号４、配列番号７、配列番号１０、または配列番号１１のいずれかの核酸分子の対立遺伝子改変体またはスプライス改変体を含み、そして上記のヌクレオチド配列のいずれかと相補的である配列を含むことが、理解される。関連する核酸分子はまた、配列番号２、配列番号５、または配列番号８のいずれかのポリペプチドと比較して、１つ以上のアミノ酸残基の置換、改変、付加、および／もしくは欠失を含むかまたはこれらから本質的になる、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。このような関連するＴＳＬＰＲポリペプチドは、例えば、１つ以上のＮ結合型グリコシル化部位もしくはＯ結合型グリコシル化部位の付加および／または欠失、あるいは１つ以上のシステイン残基の付加および／または欠失を含み得る。
【００５３】
関連する核酸分子はまた、配列番号２、配列番号５、または配列番号８のいずれかのＴＳＬＰＲポリペプチドの、少なくとも約２５個連続したアミノ酸、または約５０アミノ酸、または約７５アミノ酸、または約１００アミノ酸、または約１５０アミノ酸、または約２００アミノ酸、または約２００個より多いアミノ酸残基のポリペプチドをコードする、ＴＳＬＰＲ核酸分子のフラグメントを含む。
【００５４】
さらに、関連するＴＳＬＰＲ核酸分子としてはまた、本明細書中に定義されるような中程度にストリンジェントな条件または高度にストリンジェントな条件下で、配列番号１、配列番号４、配列番号７、配列番号１０、もしくは配列番号１１のいずれかのＴＳＬＰＲ核酸分子の完全な相補配列とか、または配列番号２、配列番号５、もしくは配列番号８のいずれかに示されるようなアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする分子の完全な相補配列とか、または本明細書中に定義されるような核酸フラグメントの完全な相補配列とか、または本明細書中に定義されるようなポリペプチドをコードする核酸フラグメントの完全な相補配列、とハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む分子が挙げられる。ハイブリダイゼーションプローブは、関連する配列に関して、ｃＤＮＡライブラリー、ゲノムライブラリー、または合成ＤＮＡライブラリーをスクリーニングするために、本明細書中に提供されるＴＳＬＰＲ配列を用いて調製され得る。既知の配列と有意な同一性を示すＴＳＬＰＲポリペプチドのＤＮＡ配列および／またはアミノ酸配列の領域は、本明細書中に記載されるような配列アラインメントアルゴリズムを用いて容易に決定され、そしてこれらの領域は、スクリーニングのためのプローブを設計するために使用され得る。
【００５５】
用語「高度にストリンジェントな条件」は、配列が高度に相補的であるＤＮＡ鎖のハイブリダイゼーションを可能にし、そして有意にミスマッチしているＤＮＡのハイブリダイゼーションを除外するように設計された、条件をいう。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは、主に、温度、イオン強度、およびホルムアミドのような変性剤の濃度によって、決定される。ハイブリダイゼーションおよび洗浄に関する「高度にストリンジェントな条件」の例は、６５〜６８℃での、０．０１５Ｍ  塩化ナトリウム、０．００１５Ｍ  クエン酸ナトリウムであるか、または４２℃での、０．０１５Ｍ  塩化ナトリウム、０．００１５Ｍ  クエン酸ナトリウム、および５０％  ホルムアミドである。Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ  ＆  Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８９）；Ａｎｄｅｒｓｏｎら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ、第４章（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  Ｌｉｍｉｔｅｄ）を参照のこと。
【００５６】
よりストリンジェントな条件（例えば、より高い温度、より低いイオン強度、より高いホルムアミド、または他の変性剤）もまた、使用し得る−しかし、ハイブリダイゼーションの速度は、影響される。他の薬剤が、非特異的なハイブリダイゼーションおよび／またはバックグラウンドのハイブリダイゼーションを減少させる目的で、ハイブリダイゼーション緩衝液および洗浄緩衝液に含まれ得る。例は、０．１％ウシ血清アルブミン、０．１％ポリビニル−ピロリドン、０．１％ピロリン酸ナトリウム、０．１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＮａＤｏｄＳＯ４（ＳＤＳ））、フィコール、デンハルト溶液、超音波処理されたサケ精子ＤＮＡ（または別の非相補的ＤＮＡ）、および硫酸デキストランであるが、他の適切な薬剤もまた、使用され得る。これらの添加物の濃度および型は、ハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーに実質的に影響を与えることなく変更され得る。ハイブリダイゼーション実験は、通常、ｐＨ６．８〜７．４で実施されるが；代表的なイオン強度条件において、ハイブリダイゼーションの速度は、ほとんどｐＨとは無関係である。Ａｎｄｅｒｓｏｎら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ、第４章（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  Ｌｉｍｉｔｅｄ）を参照のこと。
【００５７】
ＤＮＡ二重鎖の安定性に影響を与える因子としては、塩基の組成、長さ、および塩基対不一致の程度が挙げられる。ハイブリダイゼーション条件は、これらの変数を適応させ、そして異なる配列関連性のＤＮＡがハイブリッドを形成するのを可能にするように、当業者によって調整され得る。完全に一致したＤＮＡ二重鎖の融解温度は、以下の式によって概算され得る：
Ｔｍ（℃）＝８１．５＋１６．６（ｌｏｇ［Ｎａ＋］）＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）−６００／Ｎ−０．７２（％ホルムアミド）
ここで、Ｎは、形成される二重鎖の長さであり、［Ｎａ＋］は、ハイブリダイゼーション溶液または洗浄溶液中のナトリウムイオンのモル濃度であり、％Ｇ＋Ｃは、ハイブリッド中の（グアニン＋シトシン）塩基のパーセンテージである。不完全に一致したハイブリッドに関して、融解温度は、各１％の不一致に対して約１℃ずつ減少する。
【００５８】
用語「中程度にストリンジェントな条件」は、「高度にストリンジェントな条件」下で生じ得るＤＮＡ二重鎖よりもより大きい程度の塩基対不一致を有するＤＮＡ二重鎖が、形成し得る条件をいう。代表的な「中程度にストリンジェントな条件」の例は、５０〜６５℃での、０．０１５Ｍ  塩化ナトリウム、０．００１５Ｍ  クエン酸ナトリウムであるか、または３７〜５０℃での、０．０１５Ｍ  塩化ナトリウム、０．００１５Ｍ  クエン酸ナトリウム、および２０％ホルムアミドである。例として、０．０１５Ｍ  ナトリウムイオン中、５０℃の「中程度にストリンジェントな条件」は、約２１％の不一致を許容する。
【００５９】
「高度にストリンジェントな条件」と「中程度にストリンジェントな条件」との間に完全な区別は存在しないことが、当業者によって理解される。例えば、０．０１５Ｍ  ナトリウムイオン（ホルムアミドなし）において、完全に一致した長いＤＮＡの融解温度は、約７１℃である。６５℃（同じイオン強度）で洗浄する場合、これは、約６％不一致を許容する。より関連性の遠い配列を捕獲するために、当業者は、単に温度を低下させ得るか、またはイオン強度を上昇させ得る。
【００６０】
約２０ｎｔまでのオリゴヌクレオチドプローブについて、１Ｍ  ＮａＣｌ＊における融解温度の適切な概算値は、以下によって提供される：
Ｔｍ＝１つのＡ−Ｔ塩基につき２℃  ＋  １つのＧ−Ｃ塩基対につき４℃
＊６×クエン酸ナトリウム塩（ＳＳＣ）におけるナトリウムイオン濃度は、１Ｍである。Ｓｕｇｇｓら、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｕｓｉｎｇ  Ｐｕｒｉｆｉｅｄ  Ｇｅｎｅｓ  ６８３（ＢｒｏｗｎおよびＦｏｘ（編）１９８１）を参照のこと。
【００６１】
オリゴヌクレオチドに対する高いストリンジェンシーの洗浄条件は、通常、６×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳにおいて、このオリゴヌクレオチドのＴｍの０〜５℃下の温度である。
【００６２】
別の実施形態において、関連する核酸分子は、配列番号１；配列番号４；配列番号７；配列番号１０；または配列番号１１のいずれかに示されるようなヌクレオチド配列と少なくとも約７０パーセント同一であるヌクレオチド配列を含むかもしくはこれからなるか、あるいは配列番号２；配列番号５または配列番号８のいずれかに示されるポリペプチドと少なくとも約７０パーセント同一であるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むかもしくはこれから本質的になる。好ましい実施形態において、このヌクレオチド配列は、配列番号１；配列番号４；配列番号７；配列番号１０；または配列番号１１のいずれかに示されるヌクレオチド配列と、約７５パーセント、または約８０パーセント、または約８５パーセント、または約９０パーセント、または約９５パーセント、９６パーセント、９７パーセント、９８パーセントまたは９９パーセント同一であるか、あるいは、このヌクレオチド配列は、配列番号２；配列番号５または配列番号８のいずれかに示されるポリペプチド配列と、約７５パーセント、または約８０パーセント、または約８５パーセント、または約９０パーセント、または約９５パーセント、９６パーセント、９７パーセント、９８パーセントまたは９９パーセント同一であるポリペプチドをコードする。関連する核酸分子は、配列番号２；配列番号５；または配列番号８のいずれかに示されるポリペプチドの少なくとも１つの活性を有するポリペプチドをコードする。
【００６３】
核酸配列における差異は、配列番号２；配列番号５；または配列番号８のいずれかのアミノ酸配列に対するアミノ酸配列の保存的改変および／または非保存的改変を生じ得る。
【００６４】
配列番号２；配列番号５；または配列番号８のいずれかのアミノ酸配列に対する保存的改変（およびそれをコードするヌクレオチドに対する対応する改変）は、ＴＳＬＰＲポリペプチドに類似した機能的特徴および化学的特徴を有するポリペプチドを生成する。対照的に、ＴＳＬＰＲポリペプチドの機能的特徴および／または化学的特徴における実質的な改変は、配列番号２；配列番号５；または配列番号８のいずれかのアミノ酸配列における置換を選択することによって達成され得、これらの置換は、（ａ）置換領域における分子骨格の構造（例えば、シートコンフォメーションまたはらせんコンフォメーション）、（ｂ）標的部位における分子の電荷または疎水性、あるいは（ｃ）側鎖の大きさを、維持することに対するその影響において有意に異なる。
【００６５】
例えば、「保存的アミノ酸置換」は、その位置におけるアミノ酸残基の極性または電荷にほとんど影響がないかまたは全く影響がないような、ネイティブなアミノ酸残基の非ネイティブな残基による置換を含み得る。さらに、ポリペプチド中の任意のネイティブな残基はまた、「アラニンスキャニング変異誘発」に関して以前に記載されたように、アラニンで置換され得る。
【００６６】
保存的アミノ酸置換はまた、天然に存在しないアミノ酸残基を含み、これらの残基は、生物系における合成によるよりむしろ化学的ペプチド合成によって代表的に組み込まれる。これらは、ペプチド模倣物、およびアミノ酸部分の他の逆転形態または反転形態を含む。
【００６７】
天然に存在する残基は、共通の側鎖の特性に基づいてクラスに分けられ得る：
１）疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；
２）中性親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ；
３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；
４）塩基性：Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；
５）鎖の方向に影響を与える残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；および
６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ。
【００６８】
例えば、非保存的置換は、これらのクラスのうちの１つのメンバーを、別のクラス由来のメンバーへと交換することを含み得る。このように置換された残基は、非ヒトＴＳＬＰＲポリペプチドと相同であるヒトＴＳＬＰＲポリペプチドの領域、またはこの分子の非相同性領域に、導入され得る。
【００６９】
このような変更を作製する場合、アミノ酸のハイドロパシー指標が、考慮され得る。各アミノ酸は、その疎水性特徴および荷電特徴に基づいてハイドロパシー指標が割り当てられている。これらのハイドロパシー指標は、イソロイシン（＋４．５）；バリン（＋４．２）；ロイシン（＋３．８）；フェニルアラニン（＋２．８）；システイン／シスチン（＋２．５）；メチオニン（＋１．９）；アラニン（＋１．８）；グリシン（−０．４）；スレオニン（−０．７）；セリン（−０．８）；トリプトファン（−０．９）；チロシン（−１．３）；プロリン（−１．６）；ヒスチジン（−３．２）；グルタミン酸（−３．５）；グルタミン（−３．５）；アスパラギン酸（−３．５）；アスパラギン（−３．５）；リジン（−３．９）およびアルギニン（−４．５）である。
【００７０】
タンパク質に対して相互作用的な生物学的機能を付与することにおけるハイドロパシーアミノ酸指標の重要性は、当該分野において一般的に理解されている（Ｋｙｔｅら、１９８２，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５７：１０５−３１）。特定のアミノ酸が類似のハイドロパシー指標またはハイドロパシースコアを有する他のアミノ酸に代わって置換され得、そして依然として類似の生物学的活性を維持し得ることが、公知である。ハイドロパシー指標に基づいて変化を起こす際に、ハイドロパシー指標が±２以内であるアミノ酸の置換が好ましく、±１以内であるものが特に好ましく、そして±０．５以内であるものが、なおより特に好ましい。
【００７１】
類似のアミノ酸の置換が親水性に基づいて効果的になされ得る（特に、これによって作製された生物学的機能的に等価なタンパク質またはペプチドが、この場合においてと同様に、免疫学的実施形態における使用に関して考慮される場合）こともまた、当該分野において理解されている。その隣接するアミノ酸の親水性によって支配される、タンパク質の最も大きな局所的平均親水性は、その免疫原性および抗原性に、すなわち、そのタンパク質の生物学的特性に、相関する。
【００７２】
以下の親水性の値が、これらのアミノ酸残基に割り当てられている：アルギニン（＋３．０）；リジン（＋３．０）；アスパラギン酸（＋３．０±１）；グルタミン酸（＋３．０±１）；セリン（＋０．３）；アスパラギン（＋０．２）；グルタミン（＋０．２）；グリシン（０）；スレオニン（−０．４）；プロリン（−０．５±１）；アラニン（−０．５）；ヒスチジン（−０．５）；システイン（−１．０）；メチオニン（−１．３）；バリン（−１．５）；ロイシン（−１．８）；イソロイシン（−１．８）；チロシン（−２．３）；フェニルアラニン（−２．５）；およびトリプトファン（−３．４）。類似の親水性の値に基づいて変化を起こす際に、親水性値が±２以内であるアミノ酸の置換が好ましく、±１以内であるものが特に好ましく、そして±０．５以内であるものが、なおより特に好ましい。親水性に基づいて、一次アミノ酸配列から、エピトープを、同定もし得る。これらの領域はまた、「エピトープコア領域」とも呼ばれる。
【００７３】
所望のアミノ酸置換（保存的であれ非保存的であれ）は、当業者によって、そのような置換が所望される時点で決定され得る。例えば、アミノ酸置換を使用して、ＴＳＬＰＲポリペプチドの重要な残基を同定し得るし、または本明細書中に記載されるＴＳＬＰＲポリペプチドの親和性を増加もしくは減少させ得る。例示的なアミノ酸置換は、表Ｉに記載される。
【００７４】
（表Ｉ）
【００７５】
【表１】
2004519205.tif 000002
当業者は、配列番号２；配列番号５；または配列番号８のいずれかに記載のポリペプチドの適切な改変体を、周知の技術を使用して、決定し得る。生物学的活性を破壊することなく変更され得る分子の適切な領域を同定するために、当業者は、活性に重要であるとは考えられない領域を標的化し得る。例えば、同種由来かまたは他種由来の、類似の活性を有する類似のポリペプチドが既知である場合には、当業者は、ＴＳＬＰＲポリペプチドのアミノ酸配列を、このような類似のポリペプチドと比較し得る。このような比較を用いて、類似のポリペプチド間で保存される分子の残基および部分を同定し得る。このような類似のポリペプチドに対して保存されていない、ＴＳＬＰＲ分子の領域における変化が、ＴＳＬＰＲポリペプチドの生物学的活性および／または構造に不利な影響を与える可能性はほとんどないことが、理解される。当業者はまた、比較的保存された領域においてさえ、活性を維持しながら、天然に存在する残基を化学的に類似するアミノ酸で置換し得ることを認識している（保存的アミノ酸残基置換）。従って、生物学的活性または構造のために重要であり得る領域でさえ、生物学的活性を破壊することなく、またはポリペプチド構造に不利な影響を与えることなく、保存的アミノ酸置換に供され得る。
【００７６】
さらに、当業者は、活性または構造のために重要である、類似のポリペプチドにおける残基を同定する、構造−機能研究を再調査し得る。このような比較を考慮して、類似のポリペプチドにおける活性または構造のために重要なアミノ酸残基に対応するＴＳＬＰＲポリペプチドにおける、アミノ酸残基の重要性を予測し得る。当業者は、ＴＳＬＰＲポリペプチドのこのような予測された重要なアミノ酸残基に代わる化学的に類似するアミノ酸での置換を、選択し得る。
【００７７】
当業者はまた、類似のポリペプチドにおける三次元構造、およびその構造に関連するアミノ酸配列を分析し得る。このような情報を考慮して、当業者は、その三次元構造に関してＴＳＬＰＲポリペプチドのアミノ酸残基のアライメントを予測し得る。当業者は、そのタンパク質の表面上に存在すると予測されるアミノ酸残基に対する急激な変化を起こさないように、選択し得る。なぜなら、このような残基は、他の分子との重要な相互作用に関与し得るからである。さらに、当業者は、各アミノ酸残基に単一のアミノ酸置換を含む、試験改変体を生成し得る。これらの改変体は、当業者に公知の活性アッセイを使用して、スクリーニングされ得る。このような改変体は、適切な改変体に関する情報を集めるために使用され得る。例えば、特定のアミノ酸残基に対する変化が、破壊された活性、望ましくなく減少した活性、または適切でない活性を生じたことを発見した場合には、このような変化を有する改変体は、回避される。換言すれば、このような慣用的な実験から集めた情報に基づいて、当業者は、さらなる置換が、単独でかまたは他の変異と組み合わせてかのいずれかで回避されるべきであるアミノ酸を、容易に決定し得る。
【００７８】
多数の科学刊行物が、二次構造の推定に充てられてきた。Ｍｏｕｌｔ，１９９６，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．７：４２２−２７；Ｃｈｏｕら、１９７４，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １３：２２２−４５；Ｃｈｏｕら、１９７４，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １１３：２１１−２２；Ｃｈｏｕら、１９７８，Ａｄｖ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．Ｒｅｌａｔ．Ａｒｅａｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４７：４５−４８；Ｃｈｏｕら、１９７８，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．４７：２５１−２７６；およびＣｈｏｕら、１９７９，Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．２６：３６７−８４を参照のこと。さらに、コンピュータープログラムが、二次構造の予測を補助するために現在利用可能である。二次構造を推測する１つの方法は、相同性モデリングに基づく。例えば、３０％よりも大きい配列同一性、または４０％よりも大きい配列類似性を有する、２つのポリペプチドまたはタンパク質は、しばしば、類似した構造トポロジーを有する。タンパク質構造データベース（ＰＤＢ）の近年の成長により、二次構造の推測可能性（ポリペプチド構造またはタンパク質構造内の潜在的な折り畳みの数を含む）の促進がもたらされた。Ｈｏｌｍら、１９９９、Ｎｕｃｌｅｉｃ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．２７：２４４−４７を参照のこと。所定のポリペプチドもしくはタンパク質において限定された数の折り畳みが存在すること、および一旦臨界数の構造が決定されると、構造予測が劇的により正確になること、が示唆されている（Ｂｒｅｎｎｅｒら、１９９７、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．７：３６９−７６）。
【００７９】
二次構造を推定するさらなる方法は、「スレッディング（ｔｈｒｅａｄｉｎｇ）」（Ｊｏｎｅｓ，１９９７，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．７：３７７−８７；Ｓｉｐｐｌら、１９９６，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ４：１５−１９）、「プロフィール分析」（Ｂｏｗｉｅら、１９９１，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５３：１６４−７０；Ｇｒｉｂｓｋｏｖら、１９９０，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８３：１４６−５９；Ｇｒｉｂｓｋｏｖら、１９８７，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８４：４３５５−５８）、および「進化学的連鎖」（Ｈｏｌｍら、前出、およびＢｒｅｎｎｅｒら、前出を参照のこと）を包含する。
【００８０】
好ましいＴＳＬＰＲポリペプチド改変体としては、グリコシル化部位の数および／または型が配列番号２；配列番号５；または配列番号８のいずれかに記載のアミノ酸配列と比較して変化している、グリコシル化改変体が挙げられる。１つの実施形態において、ＴＳＬＰＲポリペプチド改変体は、配列番号２；配列番号５；または配列番号８のいずれかに記載のアミノ酸配列より多いかまたはより少ない数のＮ結合グリコシル化部位を含む。Ｎ結合グリコシル化部位は、配列Ａｓｎ−Ｘ−ＳｅｒまたはＡｓｎ−Ｘ−Ｔｈｒによって特徴付けられ、ここで、Ｘと印されるアミノ酸残基は、プロリン以外の任意のアミノ酸残基であり得る。この配列を作製するためのアミノ酸残基の置換は、Ｎ結合型糖鎖の付加のための潜在的な新たな部位を提供する。あるいは、この配列を排除する置換は、存在するＮ結合型糖鎖を除去する。１つ以上のＮ結合グリコシル化部位（代表的には、天然に存在するグリコシル化部位）が排除され、そして１つ以上の新たなＮ結合部位が作製される、Ｎ結合型糖鎖の再配列もまた、提供される。さらなる好ましいＴＳＬＰＲ改変体としては、１つ以上のシステイン残基が、配列番号２；配列番号５；または配列番号８のいずれかに記載のアミノ酸配列と比較して欠失しているか、または別のアミノ酸（例えば、セリン）で置換されている、システイン改変体が挙げられる。システイン改変体は、ＴＳＬＰＲポリペプチドが、例えば不溶性の封入体の単離の後に、生物学的に活性な立体構造へとリフォールディングされなければならない場合に、有用である。システイン改変体は、一般に、ネイティブタンパク質より少ないシステイン残基を有し、そして代表的には偶数のシステイン残基を有し、対合していないシステインから生じる相互作用を最小にする。
【００８１】
他の実施形態において、関連する核酸分子は、少なくとも１つのアミノ酸挿入を有する、配列番号２；配列番号５；または配列番号８のいずれかに記載のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むかまたはこの配列からなり、そしてこのポリペプチドが配列番号２；配列番号５；または配列番号８のいずれかに記載のポリペプチドの活性を有するか、あるいはこの関連する核酸分子は、少なくとも１つのアミノ酸欠失を有する、配列番号２；配列番号５；または配列番号８のいずれかに記載のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むかまたはこの配列からなり、ここでこのポリペプチド配列番号２；配列番号５；または配列番号８のいずれかに記載のポリペプチドの活性を有する。関連する核酸分子はまた、配列番号２；配列番号５；または配列番号８のいずれかに記載のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むかまたはこの配列からなり、このポリペプチドがカルボキシル末端および／またはアミノ末端の短縮を有し、そしてさらにこのポリペプチドが、配列番号２；配列番号５；または配列番号８のいずれかに記載のポリペプチドの活性を有する。関連する核酸分子はまた、アミノ酸置換、アミノ酸挿入、アミノ酸欠失、カルボキシル末端短縮、およびアミノ末端短縮からなる群より選択される少なくとも１つの改変を含む、配列番号２；配列番号５；または配列番号８のいずれかに記載のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むかまたはこの配列からなり、そしてこのポリペプチドは配列番号２；配列番号５；または配列番号８のいずれかに記載のポリペプチドの活性を有する。
【００８２】
さらに、配列番号２；配列番号５；または配列番号８のいずれかのアミノ酸配列を含むポリペプチドあるいは他のＴＳＬＰＲポリペプチドは、同種ポリペプチドに融合されてホモダイマーを形成し得るか、あるいは異種ポリペプチドに融合されてヘテロダイマーを形成し得る。異種のペプチドおよびポリペプチドとしては、以下が挙げられるが、それらに限定されない：ＴＳＬＰＲ融合ポリペプチドの検出および／または単離を可能にするエピトープ；膜貫通レセプタータンパク質またはその部分（例えば、細胞外ドメインまたは膜貫通ドメインおよび細胞内ドメイン）；膜貫通レセプタータンパク質に結合する、リガンドまたはその部分；触媒的に活性である、酵素またはその部分；オリゴマー化を促進するポリペプチドまたはペプチド（例えば、ロイシンジッパードメイン）；安定性を増加させるポリペプチドまたはペプチド（例えば、免疫グロブリン定常領域）；ならびに配列番号２；配列番号５；または配列番号８のいずれかに記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドあるいは他のＴＳＬＰＲポリペプチドとは異なる治療活性を有する、ポリペプチド。
【００８３】
融合は、配列番号２；配列番号５；または配列番号８のいずれかに記載のアミノ酸配列を含むポリペプチド、あるいは他のＴＳＬＰＲポリペプチドの、アミノ末端またはカルボキシル末端のいずれかにおいて、なされ得る。融合は、リンカーもアダプター分子も用いずに直接的であっても、リンカーもしくはアダプター分子を介してもよい。リンカーまたはアダプター分子は、１つ以上のアミノ酸残基であり得、代表的に、約２０〜約５０アミノ酸残基であり得る。リンカーまたはアダプター分子はまた、融合した部分の分離を可能にするために、ＤＮＡ制限エンドヌクレアーゼまたはプロテアーゼについての切断部位を有して設計され得る。一旦構築されると、融合ポリペプチドは、本明細書中に記載の方法に従って誘導体化され得ることが、理解される。
【００８４】
本発明のさらなる実施形態において、配列番号２；配列番号５；または配列番号８のいずれかのアミノ酸配列を含むポリペプチド、あるいは他のＴＳＬＰＲポリペプチドは、ヒトＩｇＧのＦｃ領域の１つ以上のドメインに融合される。抗体は、以下の２つの機能的に独立した部分を含む；抗原を結合する「Ｆａｂ」として公知の可変ドメイン、ならびに補体活性化および食作用細胞による攻撃のようなエフェクター機能に関与する、「Ｆｃ」として公知の定常ドメイン。Ｆｃは、長い血清半減期を有し、一方でＦａｂは、短寿命である。Ｃａｐｏｎら、１９８９，Ｎａｔｕｒｅ  ３３７：５２５−３１。治療タンパク質と一緒に構築される場合には、Ｆｃドメインは、より長い半減期を提供し得るか、またはＦｃレセプター結合、プロテインＡ結合、補体結合のような機能、および恐らく、胎盤移入のような機能さえも、組み込み得る（同書）。表ＩＩは、当該分野において公知の特定のＦｃ融合物の使用を要約する。
【００８５】
（表ＩＩ）
【００８６】
【表２】
2004519205.tif 000003
一例において、ヒトＩｇＧのヒンジ領域、ＣＨ２領域、およびＣＨ３領域が、当業者に公知の方法を使用して、ＴＳＬＰＲポリペプチドのアミノ末端またはカルボキシル末端のいずれかにおいて、融合され得る。別の例において、ヒトＩｇＧのヒンジ領域、ＣＨ２領域、およびＣＨ３領域は、ＴＳＬＰＲポリペプチドフラグメント（例えば、ＴＳＬＰＲポリペプチドの推定細胞外部分）のアミノ末端またはカルボキシル末端のいずれかにおいて、融合され得る。
【００８７】
得られるＴＳＬＰＲ融合ポリペプチドは、プロテインＡアフィニティーカラムの使用によって、精製され得る。Ｆｃ領域に融合したペプチドおよびタンパク質は、融合していない対応物より実質的に長いインビボでの半減期を示すことが見出された。また、Ｆｃ領域への融合は、融合ポリペプチドの二量体化／多量体化を可能にする。このＦｃ領域は、天然に存在するＦｃ領域であってもよいし、または治療品質、循環時間、もしくは減少した凝集のような、特定の品質を改善するよう変更されてもよい。
【００８８】
関連する核酸分子およびポリペプチドの同一性および類似性は、公知の方法によって容易に計算され得る。このような方法としては、Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａ．Ｍ．Ｌｅｓｋ編、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ  １９８８）；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔｓ（Ｄ．Ｗ．Ｓｍｉｔｈ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  １９９３）；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａ（Ｐａｒｔ  １，Ａ．Ｍ．ＧｒｉｆｆｉｎおよびＨ．Ｇ．Ｇｒｉｆｆｉｎ編、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ  １９９４）；Ｇ．ｖｏｎ  Ｈｅｉｎｌｅ，Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  １９８７）；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ（Ｍ．ＧｒｉｂｓｋｏｖおよびＪ．Ｄｅｖｅｒｅｕｘ編、Ｍ．Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ  １９９１）；ならびにＣａｒｉｌｌｏら、１９８８，ＳＩＡＭ  Ｊ．Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈ．，４８：１０７３に記載されるものが挙げられるが、これらに限定されない。
【００８９】
同一性および／または類似性を決定するための好ましい方法は、試験される配列間での最大の適合を生じるように、設計される。同一性および類似性を決定するための方法は、公に利用可能なコンピュータプログラムにおいて記載されている。２つの配列間の同一性および類似性を決定するための好ましいコンピュータプログラム方法としては、ＧＣＧプログラムパッケージ（ＧＡＰ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘら、１９８４，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１２：３８７；Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、およびＦＡＳＴＡ（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、１９９０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−１０）を含む）が挙げられるが、これらに限定されない。ＢＬＡＳＴＸプログラムは、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）および他の供給源（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、ＢＬＡＳＴ  Ｍａｎｕａｌ（ＮＣＢ  ＮＬＭ  ＮＩＨ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ）；Ａｌｔｓｃｈｕｌら、１９９０、前出）から公に利用可能である。周知のＳｍｉｔｈ  Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムもまた、同一性を決定するために使用され得る。
【００９０】
２つのアミノ酸配列を整列させるための特定のアライメントスキームは、これら２つの配列の短い領域のみの適合を生じ得、そしてこの小さな整列領域は、その２つの全長配列間に有意な関連がない場合でさえも、非常に高い配列同一性を有し得る。従って、好ましい実施形態において、選択されたアライメント方法（ＧＡＰプログラム）は、本願ポリペプチドのうちの少なくとも５０個連続するアミノ酸にわたる整列を生じる。
【００９１】
例えば、コンピュータアルゴリズムＧＡＰ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を使用して、配列同一性の百分率が決定されるべき２つのポリペプチドが、それらのそれぞれのアミノ酸の最適な適合（このアルゴリズムによって決定される「適合した範囲」）のために、整列される。ギャップオープニングペナルティー（ｇａｐ  ｏｐｅｎｉｎｇ  ｐｅｎａｌｔｙ）（これは、平均対角の３倍として計算される：「平均対角」とは、使用される比較行列（ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｍａｔｒｉｘ）の対角の平均である；「対角」とは、特定の比較行列によって各々の完全なアミノ酸適合に対して割り当てられたスコアまたは数である）およびギャップエクステンションペナルティー（ｇａｐ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｐｅｎａｌｔｙ）（これは通常、キャップオープニングペナルティーの０．１倍である）、ならびにＰＡＭ  ２５０またはＢＬＯＳＵＭ  ６２のような比較行列が、このアルゴリズムと組み合わせて使用される。標準的な比較行列もまた、このアルゴリズムによって使用される（Ｄａｙｈｏｆｆら、５  Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ（補遺３  １９７８）（ＰＡＭ２５０比較行列）；Ｈｅｎｉｋｏｆｆら、１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８９：１０９１５−１９（ＢＬＯＳＵＭ  ６２比較行列）を参照のこと）。
【００９２】
ポリペプチド配列比較のための好ましいパラメータとしては、以下が挙げられる：
アルゴリズム：ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ，１９７０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３−５３；
比較行列：ＢＬＯＳＵＭ  ６２（Ｈｅｎｉｋｏｆｆら、前出）；
ギャップペナルティー：１２
ギャップ長ペナルティー（Ｇａｐ  Ｌｅｎｇｔｈ  Ｐｅｎａｌｔｙ）：４
類似性の閾値（Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ  ｏｆ  Ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ）：０
このＧＡＰプログラムは、上記パラメータを用いて有用である。上記パラメータは、ＧＡＰアルゴリズムを用いるポリペプチド比較のためのデフォルトパラメータ（末端ギャップに対してはペナルティーはない）である。
【００９３】
核酸分子配列比較のための好ましいパラメータとしては、以下が挙げられる：
アルゴリズム：ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ，前出；
比較行列：適合＝＋１０，非適合＝０
ギャップペナルティー：５０
ギャップ長ペナルティー：３
このＧＡＰプログラムはまた、上記パラメータを用いて有用である。上記パラメータは、核酸分子比較のためのデフォルトパラメータである。
【００９４】
Ｐｒｏｇｒａｍ  Ｍａｎｕａｌ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅ，Ｖｅｒｓｉｏｎ  ９，Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ，１９９７に記載されるものを含む、他の例示的なアルゴリズム、ギャップオープニングペナルティー、ギャップエクステンションペナルティー、比較行列、および類似性の閾値が使用され得る。なされるべき特定の選択は、当業者に明らかであり、そしてなされるべき特定の比較（例えば、ＤＮＡ対ＤＮＡ、タンパク質対タンパク質、タンパク質対ＤＮＡ）；ならびにさらに、その比較が所定の配列対の間（この場合には、ＧＡＰまたはＢｅｓｔＦｉｔが一般的に好ましい）であるか、１つの配列と大きな配列データベースとの間（この場合には、ＦＡＳＴＡまたはＢＬＡＳＴＡが好ましい）であるかに、依存する。
【００９５】
（核酸分子）
ＴＳＬＰＲポリペプチドのアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸分子は、種々の様式（化学合成、ｃＤＮＡもしくはゲノムのライブラリーのスクリーニング、発現ライブラリースクリーニング、および／またはｃＤＮＡのＰＣＲ増幅が挙げられるが、これらに限定されない）で容易に得られ得る。
【００９６】
本明細書中において使用される組換えＤＮＡ法は、一般に、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９）および／またはＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｇｒｅｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ  Ｉｎｃ．ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ  １９９４）に記載されている方法である。本発明は、本明細書中に記載されているような核酸分子、およびこのような分子を得るための方法を提供する。
【００９７】
ＴＳＬＰＲポリペプチドのアミノ酸配列をコードする遺伝子が１つの種から同定された場合には、この遺伝子の全てまたは一部を、オルソログ（ｏｒｔｈｏｌｏｇ）または同じ種由来の関連遺伝子を同定するためのプローブとして使用し得る。このプローブまたはプライマーを使用して、ＴＳＬＰＲポリペプチドを発現すると考えられる種々の組織供給源由来のｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングし得る。さらに、配列番号１；配列番号４；配列番号７；配列番号１０；または配列番号１１のいずれかに記載されるような配列を有する核酸分子の部分または全てを使用して、ゲノムライブラリーをスクリーニングし、ＴＳＬＰＲポリペプチドのアミノ酸配列をコードする遺伝子を同定および単離し得る。代表的に、中程度または高度のストリンジェンシーの条件が、スクリーニングのために使用されて、このスクリーニングから得られる偽陽性の数を最少にする。
【００９８】
ＴＳＬＰＲポリペプチドのアミノ酸配列をコードする核酸分子はまた、発現されたタンパク質の特性に基づく陽性クローンの検出を使用する発現クローニングによって、同定され得る。代表的に、核酸ライブラリーは、抗体または他の結合パートナー（例えば、レセプターまたはリガンド）を、宿主細胞表面において発現および提示されたクローンタンパク質に結合させることによって、スクリーニングされる。抗体または結合パートナーは、所望のクローンを発現する細胞を同定するために、検出可能な標識で改変される。
【００９９】
以下に記載される説明に従い実施される組換え発現技術に従って、これらのポリヌクレオチドを産生し得、そしてコードされたポリペプチドを発現させ得る。例えば、ＴＳＬＰＲポリペプチドのアミノ酸配列をコードする核酸配列を適切なベクターに挿入することによって、当業者は、多量の所望されるヌクレオチド配列を容易に生成し得る。次いで、これらの配列を使用して、検出プローブまたは増幅プライマーを生成し得る。あるいは、ＴＳＬＰＲポリペプチドのアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを、発現ベクターに挿入し得る。発現ベクターを適切な宿主に導入することによって、コードされたＴＳＬＰＲポリペプチドが、多量に生成され得る。
【０１００】
適切な核酸配列を得るための別の方法は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）である。この方法において、ｃＤＮＡは、酵素リバーストランスクリプターゼを使用して、ポリ（Ａ）＋ＲＮＡまたは全ＲＮＡから調製される。次いで、２つのプライマー（代表的には、ＴＳＬＰＲポリペプチドのアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡの２つの別個の領域に対して相補的である）が、ＴａｑポリメラーゼのようなポリメラーゼとともにこのｃＤＮＡに添加され、そしてこのポリメラーゼが、２つのプライマー間のｃＤＮＡ領域を増幅する。
【０１０１】
ＴＳＬＰＲポリペプチドのアミノ酸配列をコードする核酸分子を調製する別の手段は、Ｅｎｇｅｌｓら、１９８９，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔｌ．第２８版：７１６−３４によって記載されるような、当業者に周知の方法を使用する、化学合成である。これらの方法としては、とりわけ、核酸合成のためのホスホトリエステル、ホスホルアミダイト、およびＨ−ホスホネート方法が挙げられる。このような化学合成のために好ましい方法は、標準的なホスホルアミダイト化学を使用する、ポリマーにより支持される合成である。代表的に、ＴＳＬＰＲポリペプチドのアミノ酸配列をコードするＤＮＡは、数百ヌクレオチド長である。約１００ヌクレオチドより長い核酸は、これらの方法を使用して、いくつかのフラグメントとして合成され得る。次いで、これらのフラグメントが一緒に連結されて、ＴＳＬＰＲ遺伝子の全長ヌクレオチド配列を形成し得る。通常、このポリペプチドのアミノ末端をコードするＤＮＡフラグメントは、ＡＴＧ（これは、メチオニン残基をコードする）を有する。このメチオニンは、宿主細胞において産生されるポリペプチドがその細胞から分泌されるよう設計されているか否かに依存して、ＴＳＬＰＲポリペプチドの成熟形態に存在してもそうでなくてもよい。当業者に公知の他の方法が、同様に使用され得る。
【０１０２】
特定の実施形態において、核酸改変体は、所定の宿主細胞におけるＴＳＬＰＲポリペプチドの最適な発現のために変更されたコドンを含む。特定のコドン変更は、発現のために選択されるＴＳＬＰＲポリペプチドおよび宿主細胞に依存する。このような「コドン最適化」は、種々の方法によって（例えば、所定の宿主細胞において高度に発現される遺伝子において使用されるのに好ましいコドンを選択することによって）実施され得る。高度に発現された細菌遺伝子のコドン優先度（ｃｏｄｏｎ  ｐｒｅｆｅｒｅｎｃｅ）についての「Ｅｃｏ＿ｈｉｇｈ．Ｃｏｄ」のようなコドン頻度表を組み込んだコンピュータアルゴリズムが使用され得、そしてＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ９．０（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）によって提供される。他の有用なコドン頻度表としては、「Ｃｅｌｅｇａｎｓ＿ｈｉｇｈ．ｃｏｄ」、「Ｃｅｌｅｇａｎｓ＿ｌｏｗ．ｃｏｄ」、「Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ＿ｈｉｇｈ．ｃｏｄ」、「Ｈｕｍａｎ＿ｈｉｇｈ．ｃｏｄ」、「Ｍａｉｚｅ＿ｈｉｇｈ．ｃｏｄ」、および「Ｙｅａｓｔ＿ｈｉｇｈ．ｃｏｄ．」が挙げられる。
【０１０３】
いくつかの場合において、ＴＳＬＰＲポリペプチド改変体をコードする核酸分子を調製することが所望され得る。改変体をコードする核酸分子は、プライマーが所望の点変異を有する部位特異的変異誘発、ＰＣＲ増幅、または他の適切な方法を使用して生成され得る（変異誘発技術の説明に関しては、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出、およびＡｕｓｕｂｅｌら、前出を参照のこと）。Ｅｎｇｅｌｓら、前出によって記載される方法を使用する化学合成もまた、このような改変体を調製するために使用され得る。当業者に公知の他の方法が、同様に使用され得る。
【０１０４】
（ベクターおよび宿主細胞）
ＴＳＬＰＲポリペプチドのアミノ酸配列をコードする核酸分子を、標準的な連結技術を使用して適切な発現ベクターに挿入する。ベクターは、代表的に、使用される特定の宿主細胞において機能的であるように選択される（すなわち、ベクターは、遺伝子の増幅および／または遺伝子の発現が生じ得るように、宿主細胞機構と適合性である）。ＴＳＬＰＲポリペプチドのアミノ酸配列をコードする核酸分子は、原核生物宿主細胞、酵母宿主細胞、昆虫（バキュロウイルス系）宿主細胞および／または真核生物宿主細胞において増幅／発現され得る。宿主細胞の選択は、ＴＳＬＰＲポリペプチドが翻訳後修飾（例えば、グリコシル化および／またはホスホリル化）されるか否かに一部依存する。その場合、酵母宿主細胞、昆虫宿主細胞、または哺乳動物宿主細胞が好ましい。発現ベクターの総説について、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．，第１８５巻（Ｄ．Ｖ．Ｇｏｅｄｄｅｌ編，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  １９９０）を参照のこと。
【０１０５】
代表的に、任意の宿主細胞に使用される発現ベクターは、プラスミド維持のための配列ならびに外来性ヌクレオチド配列のクローニングおよび発現のための配列を含む。このような配列（集合的に、「隣接配列」という）は、特定の実施形態において、代表的に、以下のヌクレオチド配列の１つ以上を含む：プロモーター、１つ以上のエンハンサー配列、複製起点、転写終結配列、ドナーおよびアクセプタースプライス部位を含む完全なイントロン配列、ポリペプチド分泌のためのリーダー配列をコードする配列、リボソーム結合部位、ポリアデニル化配列、発現されるポリペプチドをコードする核酸を挿入するためのポリリンカー領域、ならびに選択可能マーカーエレメント。これらの配列のそれぞれが、以下に議論される。
【０１０６】
必要に応じて、ベクターは、「タグ」コード配列（すなわち、ＴＳＬＰＲポリペプチドコード配列の５’末端または３’末端に配置されるオリゴヌクレオチド分子）を含み得；このオリゴヌクレオチド配列は、ポリＨｉｓ（例えば、ヘキサＨｉｓ）、または別の「タグ」（例えば、ＦＬＡＧ、ＨＡ（赤血球凝集素インフルエンザウイルス）またはｍｙｃ（これに対して、市販の抗体が存在する）をコードする。このタグは、代表的には、ポリペプチドの発現の際にポリペプチドに融合され、宿主細胞からの、ＴＳＬＰＲポリペプチドのアフィニティー精製のための手段として役立ち得る。アフィニティー精製は、例えば、アフィニティーマトリクスとして、タグに対する抗体を使用するカラムクロマトグラフィーによって達成され得る。必要に応じて、タグは、引き続いて、切断のために特定のペプチダーゼを使用するような、種々の手段によって、精製されたＴＳＬＰＲポリペプチドから除去され得る。
【０１０７】
隣接配列は、同種（すなわち、宿主細胞と同じ種および／または株由来）であり得るか、異種（すなわち、宿主細胞種または株以外の種由来）であり得るか、ハイブリッド（すなわち、１つより多くの供給源由来の隣接配列の組み合わせ）であり得るか、または合成であり得るか、あるいは隣接配列は、ＴＳＬＰＲポリペプチド発現を調節するために通常機能するネイティブな配列であり得る。このように、隣接配列の供給源は、隣接配列が、この宿主細胞の機構において機能的であり、そしてこの宿主細胞の機構によって活性化され得る限り、任意の原核生物または真核生物、任意の脊椎生物または無脊椎生物、または任意の植物であり得る。
【０１０８】
本発明のベクターに有用な隣接配列は、当該分野において周知である任意のいくつかの方法によって得られ得る。代表的には、ＴＳＬＰＲ遺伝子の隣接配列以外の、本発明で有用な隣接配列は、マッピングおよび／または制限エンドヌクレアーゼ消化によって以前に同定されており、従って、適切な制限エンドヌクレアーゼを使用して、適切な組織供給源から単離され得る。いくつかの場合において、隣接配列の全長ヌクレオチド配列は公知であり得る。ここで、隣接配列は、核酸合成またはクローニングのために本明細書中で記載される方法を使用して合成され得る。
【０１０９】
隣接配列の全てまたは一部のみが既知である場合、これは、ＰＣＲを使用して、および／または適切なオリゴヌクレオチドおよび／または同種もしくは別の種由来の隣接配列フラグメントを用いてゲノムライブラリーをスクリーニングすることによって得られ得る。隣接配列が既知ではない場合、隣接配列を含むＤＮＡのフラグメントは、例えば、コード配列または別の遺伝子さえも含み得る大きなＤＮＡ片から単離され得る。単離は、適切なＤＮＡフラグメントを生成するための制限エンドヌクレアーゼ消化、続くアガロースゲル精製、Ｑｉａｇｅｎ（登録商標）カラムクロマトグラフィー（Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ、ＣＡ）、または当業者に公知の他の方法を使用する単離によって達成され得る。この目的を達成するための適切な酵素の選択は、当業者に容易に明らかである。
【０１１０】
複製起点は、代表的に、市販の原核生物発現ベクターの一部であり、この起点は、宿主細胞におけるベクターの増幅を補助する。特定のコピー数のベクターの増幅は、いくつかの場合において、ＴＳＬＰＲポリペプチドの最適な発現のために重要であり得る。選択されたベクターが複製起点部位を含まない場合、複製起点は、既知の配列に基づいて化学的に合成され得、そしてベクターに連結され得る。例えば、プラスミドｐＢＲ３２２（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）からの複製起点は、大部分のグラム陰性細菌に適切であり、そして種々の起源（例えば、ＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウイルス、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、またはＨＰＶもしくはＢＰＶのようなパピローマウイルス）は、哺乳動物細胞におけるベクターのクローニングのために有用である。一般的に、複製起点の成分は、哺乳動物発現ベクターには必要ない（例えば、ＳＶ４０起源は、それが初期プロモーターを含むという理由のみによって、しばしば使用されている）。
【０１１１】
転写終結配列は、代表的にポリペプチドコード領域の３’ 末端に配置され、そして転写を終結させるのに役立つ。通常、原核生物細胞における転写終結配列は、Ｇ−Ｃリッチフラグメントと、それに続くポリ−Ｔ配列である。この配列はライブラリーから容易にクローン化されるか、またはベクターの一部として市販すらされているが、これはまた、本明細書中に記載された核酸合成のための方法を使用して容易に合成され得る。
【０１１２】
選択マーカー遺伝子エレメントは、選択培養培地において増殖される宿主細胞の生存および増殖に必要なタンパク質をコードする。代表的な選択マーカー遺伝子は、（ａ）原核生物宿主細胞に対して、抗生物質または他の毒素（例えば、アンピシリン、テトラサイクリン、またはカナマイシン）に対する耐性を与えるか；（ｂ）細胞の栄養要求性の欠損を補うか；あるいは、（ｃ）複合培地から入手可能でない重要な栄養素を供給する、タンパク質をコードする。好ましい選択マーカーは、カナマイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、およびテトラサイクリン耐性遺伝子である。ネオマイシン耐性遺伝子もまた、原核生物宿主細胞および真核生物宿主細胞における選択のために使用され得る。
【０１１３】
他の選択遺伝子は、発現される遺伝子を増幅するために使用され得る。増幅は、増殖に重要なタンパク質の産生のために大いに要求されている遺伝子が、組換え細胞の継続世代の染色体内でタンデムに反復されるプロセスである。哺乳動物細胞に対する適切な選択マーカーの例としては、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）およびチミジンキナーゼが挙げられる。哺乳動物細胞の形質転換体は、選択圧下に置かれ、ここで、形質転換体のみが、ベクターに存在する選択遺伝子によって生存するように独自に適応される。選択圧を、培地中の選択因子の濃度を連続的に変化させ、それによって選択遺伝子とＴＳＬＰＲポリペプチドをコードするＤＮＡとの両方の増幅を導く条件下で、形質転換された細胞を培養することによって課される。結果として、増加した量のＴＳＬＰＲポリペプチドが、増幅されたＤＮＡから合成される。
【０１１４】
リボソーム結合部位は、通常ｍＲＮＡの翻訳開始に必要とされ、そしてＳｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ配列（原核生物）またはＫｏｚａｋ配列（真核生物）により特徴付けられる。このエレメントは代表的に、プロモーターに対して３’に位置し、そして発現されるＴＳＬＰＲポリペプチドのコード配列に対して５’に位置する。Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ配列は、変化するが代表的にはポリプリンである（すなわち、高いＡ−Ｇ含量を有する）。多くのＳｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ配列が同定されており、これらのそれぞれは、本明細書中に示される方法および原核生物ベクターにおいて使用される方法を使用して、容易に合成され得る。
【０１１５】
リーダー配列またはシグナル配列は、ＴＳＬＰＲポリペプチドを宿主細胞から外に出すことを指向するために使用され得る。代表的に、シグナル配列をコードするヌクレオチド配列は、ＴＳＬＰＲ核酸分子のコード領域に配置されるか、またはＴＳＬＰＲポリペプチドコード領域の５’末端に直接配置される。多くのシグナル配列が同定されており、そして選択された宿主細胞において機能的であるこれらのいずれかが、ＴＳＬＰＲ核酸分子との結合において使用され得る。従って、シグナル配列は、ＴＳＬＰＲ核酸分子に対して相同（天然に存在する）または異種であり得る。さらに、シグナル配列は、本明細書中に記載の方法を使用して化学的に合成され得る。ほとんどの場合、シグナルペプチドの存在を介する宿主細胞からのＴＳＬＰＲポリペプチドの分泌は、分泌ＴＳＬＰＲポリペプチドからのシグナルペプチドの除去を生じる。シグナル配列は、ベクターの構成要素であってもよいし、またはこれはベクターに挿入されるＴＳＬＰＲ核酸分子の一部であってもよい。
【０１１６】
本発明の範囲内には、ＴＳＬＰＲポリペプチドコード領域に連結されたネイティブなＴＳＬＰＲポリペプチドシグナル配列をコードするヌクレオチド配列、またはＴＳＬＰＲポリヌクレオチドコード領域に連結された異種シグナル配列をコードするヌクレオチド配列のいずれかの使用が含まれる。選択された異種シグナル配列は、宿主細胞により認識されそしてプロセシングされる（すなわち、シグナルペプチダーゼにより切断される）シグナル配列であるべきである。ネイティブなＴＳＬＰＲポリペプチドシグナル配列を認識せず、プロセシングしない原核生物宿主細胞について、シグナル配列は、例えば、アルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、または熱安定エンテロトキシンＩＩのリーダーの群から選択される原核生物シグナル配列により置換され得る。酵母分泌のために、ネイティブなＴＳＬＰＲポリペプチドシグナル配列は、酵母インベルターゼ、α因子、または酸性ホスファターゼのリーダーにより置換され得る。哺乳動物細胞発現について、ネイティブなシグナル配列は十分であるが、他の哺乳動物シグナル配列が適切であり得る。
【０１１７】
グリコシル化が真核生物宿主細胞発現系において所望されるようないくつかの場合、種々のプレ配列を操作してグリコシル化または収率を改良し得る。例えば、特定のシグナルペプチドのペプチダーゼ切断部位を変更し得るかまたはプロ配列を付加し得、これはまた、グリコシル化に影響を与え得る。最終タンパク質産物は、（成熟タンパク質の最初のアミノ酸に対して）−１位に、発現に付随して１以上のさらなるアミノ酸を有し得、これは、完全に取り除かれていなくてもよい。例えば、最終タンパク質産物は、アミノ末端に結合されたペプチダーゼ切断部位において見出される１または２つのアミノ酸を有し得る。あるいは、いくつかの酵素切断部位の使用は、その酵素が成熟ポリペプチド内のこのような領域で切断する場合、所望のＴＳＬＰＲポリペプチドの、わずかに短縮された形態を生じ得る。
【０１１８】
多くの場合、核酸分子の転写は、ベクター中の１以上のイントロンの存在により増加する；これは、ポリペプチドが真核生物宿主細胞（特に、哺乳動物宿主細胞）において産生される場合に特にあてはまる。使用されるイントロンは、ＴＳＬＰＲ遺伝子（特に、使用される遺伝子が全長ゲノム配列またはそのフラグメントである場合）内に天然に存在し得る。イントロンが、遺伝子（ほとんどのｃＤＮＡに関して）内に天然に存在しない場合、このイントロンは、別の供給源から得られ得る。隣接配列およびＴＳＬＰＲ遺伝子に関するイントロンの位置は、イントロンは有効であるように転写されなければならないので、一般に重要である。従って、ＴＳＬＰＲ  ｃＤＮＡ分子が転写されるべき場合、イントロンについての好ましい位置は、転写開始部位に対して３’であり、かつポリＡ転写終結配列に対して５’である。好ましくは、イントロンは、ｃＤＮＡの一方の側または他方の側（すなわち、５’または３’）に位置し、その結果、イントロンは、そのコード配列を中断しない。イントロンが挿入される宿主細胞と適合するならば、任意の供給源（ウイルス、原核生物および真核生物（植物または動物）の生物体が挙げられる）由来の任意のイントロンを使用して、本発明を実施し得る。また、本明細書中には、合成イントロンが含まれる。必要に応じて、１より多くのイントロンをベクターにおいて使用し得る。
【０１１９】
本発明の発現ベクターおよびクローニングベクターは、代表的には、宿主生物体により認識され、そしてＴＳＬＰＲポリペプチドをコードする分子に作動可能に連結されているプロモーターを含む。プロモーターは、構造遺伝子の転写を制御する、構造遺伝子（一般的には、約１００〜１０００ｂｐ以内）の開始コドンに対して上流（すなわち、５’）に位置する、非翻訳配列である。プロモーターは従来、２つのクラス（誘導性プロモーターおよび構成性プロモーター）のうちの一方に分類される。誘導性プロモーターは、培養条件下でいくらかの変化（例えば、栄養素の存在もしくは非存在または温度の変化）に応答して、これらの制御下のＤＮＡからの増加したレベルの転写を開始する。他方、構成性プロモーターは、連続的な遺伝子産物の産生を開始する；すなわち、遺伝子発現をほとんど制御しないかまたは制御しない。種々の潜在的な宿主細胞により認識される大量のプロモーターが周知である。適したプロモーターは、制限酵素消化により供給源ＤＮＡからプロモーターを取り除き、そしてベクターへ所望のプロモーター配列を挿入することにより、ＴＳＬＰＲポリペプチドをコードするＤＮＡに作動可能に連結される。ネイティブなＴＳＬＰＲプロモーター配列は、ＴＳＬＰＲ核酸分子の増幅および／または発現を指向するために使用され得る。しかし、異種プロモーターがネイティブプロモーターと比較して、発現タンパク質のより多い転写およびより高収率を可能にする場合、および使用のために選択された宿主細胞系と適合する場合、異種プロモーターが好ましい。
【０１２０】
原核生物宿主を用いる使用に適切なプロモーターとしては、以下が挙げられる：β−ラクタマーゼおよびラクトースプロモーター系；アルカリホスファターゼ、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系；およびｔａｃプロモーターのようなハイブリッドプロモーター。他の公知の細菌性プロモーターもまた適切である。これらの配列は、公開されており、それにより、当業者が、任意の有益な制限部位を供給する必要がある場合に、リンカーまたはアダプターを使用して所望のＤＮＡ配列にそれらを連結することを可能にする。
【０１２１】
酵母宿主を用いる使用に適切なプロモーターもまた、当該分野で周知である。酵母エンハンサーは、酵母プロモーターと共に有利に使用される。哺乳動物宿主細胞との使用に適切なプロモーターは、周知であり、そして以下：ポリオーマウイルス、鶏痘ウイルス、アデノウイルス（例えば、アデノウイルス２）、ウシパピローマウイルス、鳥類肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、そして最も好ましくはシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）のようなウイルスのゲノムから得られるプロモーターが挙げられるが、これらに制限されない。他の適切な哺乳動物プロモーターとしては、異種哺乳動物プロモーター（例えば、熱ショックプロモーターおよびアクチンプロモーター）が挙げられる。
【０１２２】
ＴＳＬＰＲ遺伝子発現を制御する際の目的のプロモーターであり得るさらなるプロモーターとしては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：ＳＶ４０初期プロモーター領域（ＢｅｒｎｏｉｓｔおよびＣｈａｍｂｏｎ，１９８１，Ｎａｔｕｒｅ  ２９０：３０４−１０）；ＣＭＶプロモーター；ラウス肉腫ウイルスの３’長末端反復に含まれるプロモーター（Ｙａｍａｍｏｔｏら，１９８０，Ｃｅｌｌ  ２２：７８７−９７）；ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター（Ｗａｇｎｅｒら，１９８１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７８：１４４４−４５）、メタロチオネイン遺伝子の調節配列（Ｂｒｉｎｓｔｅｒら，１９８２，Ｎａｔｕｒｅ  ２９６：３９−４２）、β−ラクタマーゼプロモーターのような原核生物発現ベクター（Ｖｉｌｌａ−Ｋａｍａｒｏｆｆら，１９７８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，７５：３７２７−３１）；またはｔａｃプロモーター（ＤｅＢｏｅｒら，１９８３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８０：２１−２５）。以下の動物転写制御領域もまた目的のものであり、これらは、組織特異性を示し、そしてトランスジェニック動物において利用されている：膵臓腺房細胞において活性であるエラスターゼＩ遺伝子制御領域（Ｓｗｉｆｔら，１９８４，Ｃｅｌｌ  ３８：６３９−４６；Ｏｒｎｉｔｚら，１９８６，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．５０：３９９−４０９（１９８６）；ＭａｃＤｏｎａｌｄ，１９８７，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ７：４２５−５１５）；膵臓β細胞中で活性であるインスリン遺伝子制御領域（Ｈａｎａｈａｎ，１９８５，Ｎａｔｕｒｅ，３１５：１１５−２２）；リンパ系細胞中で活性である免疫グロブリン遺伝子制御領域（Ｇｒｏｓｓｃｈｅｄｌら，１９８４，Ｃｅｌｌ  ３８：６４７−５８；Ａｄａｍｅｓら，１９８５，Ｎａｔｕｒｅ  ３１８：５３３−３８；Ａｌｅｘａｎｄｅｒら，１９８７，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，７：１４３６−４４）；精巣細胞、乳房細胞、リンパ系細胞および肥満細胞において活性であるマウス乳腺癌ウイルス制御領域（Ｌｅｄｅｒら，１９８６，Ｃｅｌｌ  ４５：４８５−９５）；肝臓において活性であるアルブミン遺伝子制御領域（Ｐｉｎｋｅｒｔら，１９８７，Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌ．，１：２６８−７６）；肝臓において活性であるαフェトプロテイン遺伝子制御領域（Ｋｒｕｍｌａｕｆら，１９８５，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，５：１６３９−１６４８；Ｈａｍｍｅｒら，１９８７，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３５：５３−５８）；肝臓において活性であるα１−アンチトリプシン遺伝子制御領域（Ｋｅｌｓｅｙら，１９８７，Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌ．１：１６１−７１）；骨髄性細胞において活性であるβ−グロビン遺伝子制御領域（Ｍｏｇｒａｍら，１９８５，Ｎａｔｕｒｅ  ３１５：３３８−４０；Ｋｏｌｌｉａｓら，１９８６，Ｃｅｌｌ  ４６：８９−９４）；脳中の稀突起膠細胞において活性であるミエリン塩基性タンパク質遺伝子制御領域（Ｒｅａｄｈｅａｄら，１９８７，Ｃｅｌｌ  ４８：７０３−１２）；骨格筋において活性であるミオシン軽鎖−２遺伝子制御領域（Ｓａｎｉ，１９８５，Ｎａｔｕｒｅ，３１４：２８３−８６）；および視床下部において活性である性腺刺激放出ホルモン遺伝子制御領域（Ｍａｓｏｎら，１９８６，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３４：１３７２−７８）。
【０１２３】
エンハンサー配列は、高等真核生物による本発明のＴＳＬＰＲポリペプチドをコードするＤＮＡの転写を増加させるためにベクターへ挿入され得る。エンハンサーは、ＤＮＡのシス作用性エレメントであり、通常約１０〜３００ｂｐ長であり、これは、プロモーターに対して作用して転写を増加させる。エンハンサーは比較的、配向依存性でありそして位置依存性である。エンハンサーは、転写単位に対して５’側および３’側に見出されている。哺乳動物遺伝子（例えば、グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α−フェトプロテインおよびインスリン）から入手可能ないくつかのエンハンサー配列が公知である。しかし、代表的に、ウイルス由来のエンハンサーが使用される。ＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、ポリオーマエンハンサーおよびアデノウイルスエンハンサーは、真核生物プロモーターの活性化についての例示的な増強エレメントである。エンハンサーは、ＴＳＬＰＲ核酸分子に対して５’または３’の位置でベクターへスプライスされ得るが、エンハンサーは、代表的には、プロモーターから５’部位に配置される。
【０１２４】
本発明の発現ベクターは、市販のベクターのような出発ベクターから構築され得る。このようなベクターは、全ての所望の隣接配列を含んでも含まなくてもよい。本明細書中に記載の隣接配列のうちの１以上が、ベクター中にまだ存在しない場合、これらは、それぞれ入手され、そしてベクターへ連結され得る。それぞれの隣接配列を得るために使用される方法は、当業者に周知である。
【０１２５】
本発明を実施するために好ましいベクターは、細菌宿主細胞、昆虫宿主細胞および哺乳動物宿主細胞と適合するベクターである。このようなベクターとしては、特に、ｐＣＲＩＩ、ｐＣＲ３およびｐｃＤＮＡ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）、ｐＢＳＩＩ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）、ｐＥＴ１５（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、ｐＧＥＸ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）、ｐＥＧＦＰ−Ｎ２（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）、ｐＥＴＬ（ＢｌｕｅＢａｃＩＩ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＤＳＲ−α（ＰＣＴ公開番号ＷＯ９０／１４３６３）およびｐＦａｓｔＢａｃＤｕａｌ（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ，Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）が挙げられる。
【０１２６】
さらに適切なベクターとしては、コスミド、プラスミドまたは改変ウイルスが挙げられるがこれらに限定されない。しかし、このベクター系が選択された宿主細胞と適合しなければならないことが理解される。このようなベクターとしては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：例えば、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（登録商標）プラスミド誘導体（高コピー数ＣｏｌＥ１ベースのファージミド；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ  ＣＡ）、Ｔａｑ増幅されたＰＣＲ産物をクローニングするために設計されたＰＣＲクローニングプラスミド（例えば、ＴＯＰＯＴＭ  ＴＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（登録商標）Ｋｉｔ，ＰＣＲ２．１（登録商標）プラスミド誘導体、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のようなプラスミド、ならびに哺乳動物ベクター、酵母ベクターまたはウイルスベクター（例えば、バキュロウイルス発現系（ｐＢａｃＰＡＫプラスミド誘導体；Ｃｌｏｎｔｅｃｈ））。
【０１２７】
ベクターが構築され、そしてＴＳＬＰＲポリペプチドをコードする核酸分子がベクターの適切な部位に挿入された後、完成されたベクターは、増幅および／またはポリペプチド発現のために適切な宿主細胞へ挿入され得る。ＴＳＬＰＲポリペプチドについての発現ベクターの選択された宿主細胞への形質転換は、トランスフェクション、感染、塩化カルシウム、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、リポフェクチン、ＤＥＡＥ−デキストラン法、または他の公知の技術のような方法を含む周知の方法によって達成され得る。選択される方法は、部分的に、使用される型の宿主細胞の機能である。これらの方法および他の適切な方法は、当業者に周知であり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出に記載される。
【０１２８】
宿主細胞は、原核生物宿主細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）または真核生物宿主細胞（例えば、酵母細胞、昆虫細胞、または脊椎動物細胞）であり得る。適切な条件下で培養される場合、宿主細胞は、ＴＳＬＰＲポリペプチドを合成し、これはその後培養培地から収集され得るか（宿主細胞がＴＳＬＰＲポリペプチドを培地中に分泌する場合）、またはＴＳＬＰＲポリペプチドを産生する宿主細胞から直接収集される（ＴＳＬＰＲポリペプチドが分泌されない場合）。適切な宿主細胞の選択は、種々の要因（例えば、所望の発現レベル、活性にとって所望であるかまたは必要であるポリペプチド改変（例えば、グリコシル化またはリン酸化）および生物学的に活性な分子への折り畳みの簡便性）に依存する。
【０１２９】
多数の適切な宿主細胞が当該分野で公知であり、そして多くのものがＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ），Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡから入手可能である。例としては、哺乳動物細胞（例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）、ＣＨＯ  ＤＨＦＲ（−）細胞（Ｕｒｌａｕｂら、１９８０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９７：４２１６−２０）、ヒト胎児腎臓（ＨＥＫ）２９３細胞もしくは２９３Ｔ細胞または３Ｔ３細胞であり得る。適切な哺乳動物宿主細胞の選択ならびに形質転換、培養、増幅、スクリーニング、産物産生および精製のための方法は、当該分野で公知である。他の適切な哺乳動物細胞株は、サルＣＯＳ−１細胞株およびＣＯＳ−７細胞株ならびにＣＶ−１細胞株である。さらなる例示的な哺乳動物宿主細胞としては、形質転換された細胞株を含む、霊長類細胞株およびげっ歯類細胞株が挙げられる。正常な二倍体細胞、一次組織のインビトロ培養に由来する細胞株、ならびに一次外植片もまた適切である。候補細胞は、遺伝子型的に選択遺伝子が欠損していてもよいし、または優性に作用する選択遺伝子を含んでいてもよい。他の適切な哺乳動物細胞株としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：マウス神経芽細胞腫Ｎ２Ａ細胞、ＨｅＬａ細胞、マウスＬ−９２９細胞、Ｓｗｉｓｓ、Ｂａｌｂ−ｃもしくはＮＩＨマウスに由来する３Ｔ３株またはＢＨＫハムスター細胞株もしくはＨａＫハムスター細胞株。これらの細胞株の各々は、タンパク質発現の分野の当業者に公知であり、そしてタンパク質発現の分野の当業者にとって利用可能である。
【０１３０】
本発明に適切な宿主細胞として同様に有用であるのは、細菌細胞である。例えば、Ｅ．ｃｏｌｉの種々の株（例えば、ＨＢ１０１、ＤＨ５α、ＤＨ１０、およびＭＣ１０６１）が、バイオテクノロジーの分野において宿主細胞として周知である。Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐｐ．、他のＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｐ．、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐｐ．などの種々の株もまた、本方法において使用され得る。
【０１３１】
当業者に公知の酵母細胞の多くの株もまた、本発明のポリペプチドの発現のための宿主細胞として利用可能である。好ましい酵母細胞としては、例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅおよびＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓが挙げられる。
【０１３２】
さらに、所望される場合、昆虫細胞系が、本発明の方法において利用され得る。このような系は、例えば、Ｋｉｔｔｓら，１９９３，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１４：８１０〜１７；Ｌｕｃｋｌｏｗ，１９９３，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．４：５６４〜７２；およびＬｕｃｋｌｏｗら，１９９３，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６７：４５６６〜７９に記載される。好ましい昆虫細胞は、Ｓｆ−９およびＨｉ５（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）である。
【０１３３】
グリコシル化ＴＳＬＰＲポリペプチドを発現するためにトランスジェニック動物もまた使用し得る。例えば、トランスジェニック乳汁産生動物（例えば、ウシまたはヤギ）を使用し得、そしてその動物の乳汁中の本発明のグリコシル化ポリペプチドを入手し得る。ＴＳＬＰＲポリペプチドを産生するために植物もまた使用し得るが、一般に、植物中で生じるグリコシル化は、哺乳動物細胞にて産生されるものと異なり、そしてヒト治療用途に適切でないグリコシル化産生物を生じ得る。
【０１３４】
（ポリペプチド産生）
ＴＳＬＰＲポリペプチド発現ベクターを含む宿主細胞が、当業者に周知の標準培地を使用して培養され得る。この培地は、通常、その細胞の増殖および生存に必要な栄養素すべてを含む。Ｅ．ｃｏｌｉ細胞を培養するのに適切な培地は、例えば、Ｌｕｒｉａ  Ｂｒｏｔｈ（ＬＢ）および／またはＴｅｒｒｉｆｉｃ  Ｂｒｏｔｈ（ＴＢ）が挙げられる。真核生物細胞を培養するのに適切な培地は、Ｒｏｓｗｅｌｌ  Ｐａｒｋ  Ｍｅｍｏｒｉａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｍｅｄｉｕｍ  １６４０（ＲＰＭＩ  １６４０）、Ｍｉｎｉｍａｌ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＭＥＭ）、および／またはＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）であり、これらすべては、培養される特定の細胞株により必要とされる血清および／または増殖因子が補充され得る。昆虫培養に適切な培地は、必要な場合にはイーストレート（ｙｅａｓｔｏｌａｔｅ）、ラクトアルブミン加水分解産物および／またはウシ胎仔血清を補充した、グレース培地である。
【０１３５】
代表的には、トランスフェクトまたは形質転換された細胞の選択的増殖に有用な抗生物質または他の化合物が、この培地に補充物として添加される。使用される化合物は、宿主細胞が形質転換されたプラスミド上に存在する選択マーカーエレメントにより決定される。例えば、その選択マーカーエレメントがカナマイシン耐性である場合、培養培地に添加される化合物は、カナマイシンである。選択的増殖のための他の化合物としては、アンピシリン、テトラサイクリンおよびネオマイシンが挙げられる。
【０１３６】
宿主細胞により産生されるＴＳＬＰＲポリペプチドの量は、当該分野で公知の標準的方法を使用して評価され得る。このような方法としては、限定はしないが、ウェスタンブロット分析、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動、非変性ゲル電気泳動、高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）分離、免疫沈降、および／または活性アッセイ（例えば、ＤＮＡ結合ゲルシフトアッセイ）が挙げられる。
【０１３７】
ＴＳＬＰＲポリペプチドが宿主細胞から分泌されるように設計された場合、ポリペプチドの大部分は、細胞培養培地にて見出され得る。しかし、ＴＳＬＰＲポリペプチドが宿主細胞から分泌されない場合、ＴＳＬＰＲポリペプチドは細胞質および／または核（真核生物宿主細胞について）あるいは細胞質ゾル（グラム陰性細菌宿主細胞について）に存在する。
【０１３８】
宿主細胞細胞質および／または核（真核生物宿主細胞について）に位置するかまたは細胞質ゾル（細菌宿主細胞について）に位置するＴＳＬＰＲポリペプチドについて、細胞内物質（グラム陰性細菌について封入体を含む）が、当業者に公知の任意の標準的技術を使用して宿主細胞から抽出され得る。例えば、宿主細胞は、フレンチプレス、ホモジナイゼーション、および／または超音波処理、それに続く遠心分離によって、ペリプラズム／細胞質の中身を放出するように溶解され得る。
【０１３９】
ＴＳＬＰＲポリペプチドが細胞質ゾル内に封入体を形成した場合、この封入体は、しばしば、内部および／または外部細胞膜に結合され得、従って、主に、遠心分離後にペレット材料において見出される。次いで、ペレット材料は、ｐＨ極限値で処理され得るか、あるいはジチオトレイトールのような還元剤の存在下アルカリ性のｐＨで、またはトリスカルボキシエチルホスフィンの存在下酸性のｐＨで、界面活性剤、グアニジン、グアニジン誘導体、尿素、または尿素誘導体のようなカオトロピック剤で処理して、封入体を放出させ、分断させ、そして溶解させ得る。次いで、溶解されたＴＳＬＰＲポリペプチドは、ゲル電気泳動、免疫沈降などを使用して分析され得る。ＴＳＬＰＲポリペプチドを単離することが望ましい場合、単離は、本明細書中およびＭａｒｓｔｏｎら，１９９０，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．，１８２：２６４−７５に記載される方法のような標準的な方法を使用して達成され得る。
【０１４０】
いくつかの場合、ＴＳＬＰＲポリペプチドは、単離の際、生物学的に活性でなくても良い。「再折り畳みする」、つまり、ポリペプチドをその三次構造に変換し、ジスルフィド連結を生成するための種々の方法を使用して、生物学的活性を回複し得る。このような方法は、溶解されたポリペプチドをあるｐＨ（通常７より上）および特定の濃度のカオトロピック剤（ｃｈａｏｔｒｏｐｅ）の存在に曝露する工程を包含する。カオトロピック剤の選択は、封入体溶解に使用される選択肢に非常に類似するが、通常、カオトロピック剤は低い濃度で使用され、溶解に使用されるカオトロピック剤と必ずしも同一ではない。多くの場合、再折り畳み／酸化溶液はまた、還元剤、または特定の比の還元剤およびその酸化形態を含んで、特定の酸化還元電位を生成し、タンパク質のシステイン架橋の形成を生じるジスルフィドシャフリングを可能にする。通常使用される酸化還元対のいくつかとしては、システイン／シスタミン、グルタチオン（ＧＳＨ）／ジチオビスＧＳＨ、塩化銅（ＩＩ）、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）／ジチアンＤＴＴ、および２，２−メルカプトエタノール（ｂＭＥ）／ジチオ−ｂ（ＭＥ）が挙げられる。多くの場合において、共溶媒が使用され得るか、または再折り畳みの効率を増加するのに必要であり得、この目的のために使用されるより一般的な試薬としては、グリセロール、種々の分子量のポリエチレングリコール、アルギニンなどが挙げられる。
【０１４１】
封入体がＴＳＬＰＲポリペプチドの発現において有意な程度まで形成されない場合、ポリペプチドは、主に、細胞ホモジネートの遠心分離後に上清中に見出される。ポリペプチドは、さらに、本明細書中に記載されるような方法を使用して上清から単離され得る。
【０１４２】
溶液からのＴＳＬＰＲポリペプチドの精製は、種々の技術を使用して達成され得る。ポリペプチドが、ヘキサヒスチジン（ＴＳＬＰＲポリペプチド／ｈｅｘａＨｉｓ）のようなタグまたは他の小さなペプチド（例えば、ＦＬＡＧ（Ｅａｓｔｍａｎ  Ｋｏｄａｋ  Ｃｏ．，Ｎｅｗ  Ｈａｖｅｎ，ＣＴ）またはｍｙｃ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））をそのカルボキシ末端またはアミノ末端のいずれかにおいて含むように合成された場合、カラムマトリクスがタグについて高い親和性を有するアフィニティーカラムに溶液を通すことによって一工程で精製され得る。
【０１４３】
例えば、ポリヒスチジンは、ニッケルに対して大きな親和性および特異性を有して結合する。従って、ニッケルのアフィニティーカラム（例えば、Ｑｉａｇｅｎ（登録商標）ニッケルカラム）は、ＴＳＬＰＲポリペプチド／ｐｏｌｙＨｉｓの精製のために使用され得る。例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ§１０．１１．８（Ａｕｓｕｂｅｌら，ｅｄｓ．，Ｇｒｅｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ  Ｉｎｃ．ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ  １９９３）を参照のこと。
【０１４４】
さらに、ＴＳＬＰＲポリペプチドは、ＴＳＬＰＲポリペプチドを特異的に認識し得、そして結合し得るモノクローナル抗体の使用によって精製され得る。
【０１４５】
精製のための他の適切な手段としては、限定しないが、アフィニティークロマトグラフィー、免疫親和性クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、モレキュラーシーブクロマトグラフィー、ＨＰＬＣ、ゲル溶出が続く電気泳動（ネイティブゲル電気泳動を含む）、および分取用等電集束法（「Ｉｓｏｐｒｉｍｅ」ｍａｃｈｉｎｅ／ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，Ｈｏｅｆｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）が挙げられる。いくつかの場合において、２つ以上の精製技術が、増加した純度を達成するために組み合わせられ得る。
【０１４６】
ＴＳＬＰＲポリペプチドはまた、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄら，１９６３，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５：２１４９；Ｈｏｕｇｈｔｅｎら，１９８５，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２：５１３２；およびＳｔｅｗａｒｔ  ａｎｄ  Ｙｏｕｎｇ，Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．１９８４）に記載されるような当該分野で公知の技術を使用する、化学合成法（例えば、固相ペプチド合成）によって調製され得る。このようなポリペプチドは、アミノ末端にメチオニンを有するかまたは有さないで合成され得る。化学的に合成されたＴＳＬＰＲポリペプチドは、これら参考文献に記載される方法を使用して酸化され得、ジスルフィド架橋を形成し得る。化学的に合成されたＴＳＬＰＲポリペプチドは、組換え的に産生されるかまたは天然の供給源から精製される対応するＴＳＬＰＲポリペプチドに匹敵する生物学的活性を有すると期待され、従って、組換えまたは天然のＴＳＬＰＲポリペプチドと相互交換可能に使用され得る。
【０１４７】
ＴＳＬＰＲポリペプチドを得る別の手段は、ＴＳＬＰＲポリペプチドが天然に見出される供給源の組織および／または流体のような生物学的サンプルからの精製による。このような精製は、本明細書中に記載されるようなタンパク質精製のための方法を使用して行われ得る。精製の間、ＴＳＬＰＲポリペプチドの存在が、例えば、組換え的に産生されたＴＳＬＰＲポリペプチドまたはそのペプチドフラグメントに対して調製される抗体を使用してモニターされ得る。
【０１４８】
核酸およびポリペプチドを産生するための多くのさらなる方法は、当該分野において公知であり、この方法は、ＴＳＬＰＲポリペプチドに対して特異性を有するポリペプチドを産生するために使用され得る。例えば、Ｒｏｂｅｒｔｓら，１９９７，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９４：１２２９７−３０３を参照のこと。これは、ｍＲＮＡとそのコードされるペプチドとの間の融合タンパク質の産生を記載する。Ｒｏｂｅｒｔｓ，１９９９，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ  ３：２６８−７３もまた参照のこと。さらに、米国特許第５，８２４，４６９号は、特定の生物学的機能を実行し得るオリゴヌクレオチドを得るための方法を記載する。この手順は、異種プールのオリゴヌクレオチドを生成する工程を包含し、それぞれが、５’無作為化配列、中心予備選択配列、および３’ランダム化配列を有する。得られる異種プールは、所望の生物学的活性を示さない細胞の集団に導入される。次いで、細胞の亜集団を、所定の生物学的機能を示すものについてスクリーニングする。その亜集団から、所望の生物学的機能を実行し得るオリゴヌクレオチドが単離される。
【０１４９】
米国特許第５，７６３，１９２号；同第５，８１４，４７６号；同第５，７２３，３２３号；および同第５，８１７，４８３号は、ペプチドまたはポリペプチドを産生するためのプロセスを記載する。これは、確率論的遺伝子またはそのフラグメントを産生し、次いで、確率論的遺伝子によってコードされた１以上のタンパク質を産生する宿主細胞にこれらの遺伝子を導入することによって達成される。次いで、この宿主細胞は、所望の活性を有するペプチドまたはポリペプチドを産生する、これらのクローンを同定するためにスクリーニングされる。
【０１５０】
ペプチドまたはポリペプチドを産生するための別の方法は、Ａｔｈｅｒｓｙｓ，Ｉｎｃ．によって出願されたＰＣＴ／ＵＳ９８／２００９４（ＷＯ９９／１５６５０）に記載されている。「Ｒａｎｄｏｍ  Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ」（ＲＡＧＥ−ＧＤ）として知られているこのプロセスは、インサイチュ組換え方法によって、内因性遺伝子の発現または遺伝子の過剰発現の活性化を含む。例えば、内因性遺伝子の発現は、非相同性組換えまたは異常な組換えによって、遺伝子の発現を活性化し得る標的細胞中に、調節配列を組み込むことによって、活性化または増加される。この標的ＤＮＡは、まず、放射線に供せられ、そして遺伝子プロモーターに挿入される。このプロモーターは、遺伝子の前方に最終的に配置され、遺伝子の転写を開始する。これは、所望のペプチドまたはポリペプチドの発現を生じる。
【０１５１】
これらの方法は、包括的なＴＳＬＰＲポリペプチド発現ライブラリーを作製するために使用され得、これは、続いて、種々のアッセイ（例えば、生化学的アッセイ、細胞アッセイおよび全生物アッセイ（例えば、植物、マウスなど））において、ハイスループット表現型スクリーニングのために使用され得ることが理解される。
【０１５２】
（合成）
本明細書中に記載される核酸およびポリペプチド分子は、組換えおよび他の手段によって産生され得ることは、当業者によって理解される。
【０１５３】
（選択的結合因子）
用語「選択的結合因子」は、１以上のＴＳＬＰＲポリペプチドに対して特異性を有する分子を言う。適切な選択的結合因子としては、抗体およびその誘導体、ポリペプチド、ならびに小分子が挙げられるが、これらに限定されない。適切な選択的結合因子は、当該分野で公知の方法を使用して調製され得る。本発明の例示的なＴＳＬＰＲポリペプチド選択的結合因子は、ＴＳＬＰＲポリペプチドの特定の部分を結合し得、これにより、ポリペプチドのＴＳＬＰＲポリペプチドレセプターへの結合を阻害する。
【０１５４】
ＴＳＬＰＲポリペプチドと結合する抗体および抗体フラグメントのような選択的結合因子は、本発明の範囲内である。この抗体は、単一特異的なポリクローナルを含むポリクローナル；モノクローナル（ＭＡｂ）；組換え；キメラ；ヒト化（例えば、相補性決定領域（ＣＤＲ）移植化）；ヒト；単鎖；および／または二特異的；ならびにフラグメント；改変体；またはそれらの誘導体であり得る。抗体フラグメントとしては、ＴＳＬＰＲポリペプチド上のエピトープに結合する抗体のこれらの一部を含む。このようなフラグメントの例としては、全長抗体の酵素学的切断によって産生されたＦａｂおよびＦ（ａｂ’）フラグメントが挙げられる。他の結合フラグメントとしては、組換えＤＮＡ技術（例えば、抗体可変領域をコードする核酸配列を含む、組換えプラスミドの発現）によって産生されたフラグメントが挙げられる。
【０１５５】
ＴＳＬＰＲポリペプチドに指向したポリクローナル抗体は、一般に、ＴＳＬＰＲポリペプチドおよびアジュバンドの複数回の皮下注射または腹腔内注射によって動物（例えば、ウサギまたはマウス）において産生される。ＴＳＬＰＲポリペプチドをキャリアタンパク質に結合させることは、有用であり得、このタンパク質は、キーホールリンペットヘモシアニン、血清、アルブミン、ウシサイログロブリン、またはダイズトリプシンインヒビターのように、免疫化される種において免疫原性である。また、ミョウバンのような凝集剤は、免疫応答を増強させるために使用される。免疫化後、この動物は採血され、そして血清を、抗ＴＳＬＰＲポリペプチド抗体タイターについてアッセイする。
【０１５６】
ＴＳＬＰＲポリペプチドに指向したモノクローナル抗体は、培地中の連続的細胞株によって抗体分子を産生するために提供される、任意の方法を使用して産生される。モノクローナル抗体を調製するために適切な方法の例は、Ｋｏｈｌｅｒら、１９７５、Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５−９７のハイブリドーマ法、およびヒトＢ細胞ハイブリドーマ法（Ｋｏｚｂｏｒ，１９８４，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３３：３００１；Ｂｒｏｄｅｕｒら，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ５１−６３（Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，１９８７））が挙げられる。ＴＳＬＰＲポリペプチドと反応する、モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞株がまた、本発明によって提供される。
【０１５７】
本発明のモノクローナル抗体は、治療剤として使用するために、改変され得る。１実施形態は、「キメラ」抗体であり、この重鎖（Ｈ）および／または軽鎖（Ｌ）の一部が、特定の種から誘導されるか、または特定の抗体のクラスもしくはサブクラスの属する抗体中の対応する配列と同一であるか、または相同性である一方で、この鎖の残りは、別の種から誘導されるか、または別の抗体のクラスもしくはサブクラスに属する抗体中の対応する配列と同一であるか、または相同性である。このような抗体のフラグメントが所望の生物学的活性を示す限り、これらの抗体のフラグメントも含まれる。米国特許第４，８１６，５６７号；Ｍｏｒｒｉｓｏｎら，１９８５，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８１：６８５１−５５を参照のこと。
【０１５８】
別の実施形態において、本発明のモノクローナル抗体は、「ヒト化」抗体である。非ヒト抗体をヒト化するための方法は、当該分野で周知である。米国特許第５，５８５，０８９号および５，６９３，７６２号を参照のこと。一般に、ヒト化した抗体は、非ヒトである供給源から導入された１以上のアミノ酸残基を有する。ヒト化は、例えば、当該分野（Ｊｏｎｅｓら，１９８６，Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２−２５；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら，１９９８、Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３−２７；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら，１９８８、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：１５３４−３６）で記載される方法を使用して、げっ歯類相補性決定領域の少なくとも一部をヒトの抗体の対応する領域と置換することによって、実施され得る。
【０１５９】
ＴＳＬＰＲポリペプチドと結合するヒト抗体がまた、本発明によって包含される。内因性の免疫グロブリンの産物の非存在下で、ヒト抗体のレパートリーを産生し得る、トランスジェニック動物（例えば、マウス）を使用して、このような抗体は、ＴＳＬＰＲポリペプチド抗原（すなわち、少なくとも６個の連続アミノ酸を有する）を用いて免疫化することによって産生され、必要に応じて、キャリアに結合される。例えば、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら，１９９３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９０：２５５１−５５；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら，１９９３，Ｎａｔｕｒｅ  ３６２：２５５−５８；Ｂｒｕｇｇｅｒｍａｎｎら，１９９３，Ｙｅａｒ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏ．７：３３を参照のこと。１つの方法において、このようなトランスジェニック動物は、本明細書中の重鎖および軽鎖免疫グロブリンをコードする内因性遺伝子座を無能にし、そしてヒトの重鎖および軽鎖タンパク質をコードする挿入遺伝子座をそのゲノムに挿入することによって産生される。次いで、部分的に改変された動物（この動物は、改変体の完全相補体未満を有する動物である）は、所望の免疫系の改変体の全てを有する動物を得るために交配される。免疫原が投与される場合、これらのトランスジェニック動物が、ヒト（例えば、マウスではない）アミノ酸配列（このアミノ酸配列は、これらの抗原に対して免疫特異性である可変領域を含む）を有する抗体を産生する。例えば、ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９６／０５９２８およびＰＣＴ／ＵＳ９３／０６９２６を参照のこと。さらなる方法は、米国特許第５，５４５，８０７、ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９１／２４５およびＰＣＴ／ＧＢ８９／０１２０７、ならびに欧州特許第５４６０７３Ｂ１および５４６０７３Ａ１に記載される。ヒト抗体はまた、宿主細胞中の組換えＤＮＡの発現または本明細書中に記載されるようなハイブリドーマ細胞中での発現によって産生され得る。
【０１６０】
代替の実施形態において、ヒト抗体はまた、ファージディスプレイライブラリから産生され得る（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら，１９９１，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７：３８１；Ｍａｒｋｓら，１９９１，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１）。これらのプロセスは、糸状のバクテリオファージの表面上の抗体レパートリーのディスプレイを介する免疫選択、および選択した抗原への結合によるファージの引き続く選択を模倣する。１つのこのような技術は、ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９８／１７３６４に記載されており、これには、このようなアプローチを使用して、ＭＰＬ−およびｍｓｋ−レセプターについて、高い親和性および機能的なアンタゴニスト抗体の単離が記載される。
【０１６１】
キメラ抗体、ＣＤＲ移植化抗体、およびヒト化抗体は、代表的に組換え方法によって産生される。抗体をコードする核酸は、宿主細胞中に導入され、そして本明細書中に記載される物質および手順を使用して発現される。好ましい実施形態において、この抗体は、哺乳動物宿主細胞（例えば、ＣＨＯ細胞）中で産生される。モノクローナル（例えば、ヒト）抗体は、本明細書中に記載されるように、宿主細胞中での組換えＤＮＡの発現またはハイブリドーマ細胞中での発現によって産生され得る。
【０１６２】
本発明の抗−ＴＳＬＰＲ抗体は、ＴＳＬＰＲポリペプチドの検出および定量のために、任意の公知のアッセイ方法（例えば、競合結合アッセイ、直接的および間接的サンドイッチアッセイ、および免疫沈降アッセイ）において使用され得る（Ｓｏｌａ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １４７−１５８（ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，１９８７））。この抗体は、使用されるアッセイ方法に適切である親和性でＴＳＬＰＲポリペプチドと結合する。
【０１６３】
診断適用のために、特定の実施形態において、抗ＴＳＬＰＲ抗体は、検出可能な部分で標識され得る。この検出可能な部分は、直接的または間接的のいずれかで、検出可能なシグナルを産生し得る任意の部分であり得る。例えば、検出可能な部分は、放射性同位体（例えば、３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓ、１２５Ｉ、９９Ｔｃ、１１１Ｉｎ、または６７Ｇａ）；蛍光化合物または化学的蛍光化合物（フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、もしくはルシフェリン）、または酵素（アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、もしくは西洋ワサビペルオキシダーゼ）であり得る（Ｂａｙｅｒら，１９９０，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．１８４：１３８−６３）。
【０１６４】
競合結合アッセイは、標識した標準（例えば、ＴＳＬＰＲポリペプチド、またはその免疫学的に反応性な部分）の能力に依存し、限定された量の抗ＴＳＬＰＲ抗体との結合に関して、試験サンプル検体（ＴＳＬＰＲペプチド）と競合する。試験サンプル中のＴＳＬＰＲポリペプチドの量は、抗体と結合する標準の量と反比例する。結合する標準の量を決定するのを容易にするために、この抗体は、競合前または後に、代表的に不溶化され、この抗体と結合する標準および検体は、結合しないままの標準および検体から好都合に分離され得る。
【０１６５】
サンドイッチアッセイは、２つの抗体の使用に代表的に関連し、各々は、検出および／または定量されるべきタンパク質の異なる免疫原性部分またはエピトープに結合し得る。サンドイッチアッセイにおいて、この試験サンプル検体は、固体支持体上に固定される第１抗体によって代表的に結合され、その後、第２抗体が、この検体に結合され、不溶性の３部の複合体を形成する。例えば、米国特許第４，３７６，１１０号を参照のこと。第２抗体自体は、検出可能な部分で標識されるか（直接的なサンドイッチアッセイ）、または検出可能な部分で標識される抗免疫グロブリン抗体を使用して測定され得る（間接的なサンドイッチアッセイ）。例えば、サンドイッチアセイの１つの型は、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）（この場合、検出可能な部分は、酵素である）である。
【０１６６】
抗ＴＳＬＰＲ抗体を含む、選択的結合因子はまた、インビボイメージングのために有用である。検出可能な部分で標識した抗体は、動物に、好ましくは、血流に投与され得、宿主中で標識した抗体の存在および位置がアッセイされる。この抗体は、核磁気共鳴、放射線学、または当該分野で公知の他の検出手段のいずれかによって、動物中で検出可能である任意の部分で標識され得る。
【０１６７】
抗体を含む、本発明の選択的結合因子は、治療剤として使用され得る。これらの治療剤は、一般に、アゴニストまたはアンタゴニストであり、これらは、少なくとも１つのＴＳＬＰＲポリペプチドの生物学的活性を、それぞれ増強または減少させるかのいずれかである。１実施形態中で、本発明のアンタゴニスト抗体は、ＴＳＬＰＲポリペプチドに特異的に結合し得、そしてインビボまたはインビトロでＴＳＬＰＲポリペプチドの機能活性を阻害または排除し得る抗体またはその結合フラグメントである。好ましい実施形態において、選択的結合因子（例えば、アンタゴニスト抗体）は、少なくとも約５０％、および好ましくは、少なくとも約８０％によって、ＴＳＬＰＲポリペプチドの機能活性を阻害する。別の実施形態において、選択的結合因子は、ＴＳＬＰＲポリペプチド結合パートナー（リガンドまたはレセプター）と相互作用し得る抗ＴＳＬＰＲポリペプチド抗体であり、これにより、インビトロまたはインビボにおいてＴＳＬＰＲポリペプチド活性を阻害または排除する。アゴニストおよびアンタゴニスト抗ＴＳＬＰＲポリペプチド抗体を含む、選択的結合因子は、当該分野で周知であるスクリーニングアッセイによって同定される。
【０１６８】
本発明はまた、ＴＳＬＰＲ選択的結合因子（例えば、抗体）を含むキットおよび生物学的サンプル中でＴＳＬＰＲポリペプチドレベルを検出するために有用である他の試薬に関する。このような試薬はまた、血清を遮断する検出可能な標識、ポジティブおよびネガティブコントロールサンプル、および検出試薬を含み得る。
【０１６９】
（マイクロアレイ）
ＤＮＡマイクロアレイ技術は、本発明に従って利用され得ることが理解される。ＤＮＡマイクロアレイは、固体支持体（例えば、ガラス）上に配置された核酸の小型高密度アレイである。このアレイ内の各細胞またはエレメントは、相補的核酸配列（例えば、ｍＲＮＡ）とハイブリダイゼーションするための標的として作用する、単一の核酸種の複数のコピーを含む。ＤＮＡマイクロアレイ技術を使用する発現プロフィールにおいて、ｍＲＮＡは、最初に細胞または組織から抽出され、次いで、蛍光標識されたｃＤＮＡに酵素学的に変換される。この材料は、マイクロアレイにハイブリダイズされ、そして未結合のｃＤＮＡは、洗浄により除去される。次いで、このアレイ上に示された個々の遺伝子の発現は、各々の標的核酸分子に特異的に結合される、標識されたｃＤＮＡの量を定量することによって可視化される。この方法において、数千の遺伝子の発現が、生物学的材料の単一サンプルから、ハイスループットの並行様式で定量され得る。
【０１７０】
このハイスループット発現プロフィールは、本発明のＴＳＬＰＲ分子に関連して広範の適用を有し、これには、以下が挙げられるが、これに限定されない：治療剤のための標的としてのＴＳＬＰＲ疾患関連遺伝子の同定および検証；関連するＴＳＬＰＲ分子およびそのインヒビターの分子毒性；臨床試験のための代替マーカーの集団および産生の階層化；およびハイスループットスクリーニングにおいて、選択化合物の同定を援助することによって、関連するＴＳＬＰＲポリペプチド小分子薬物発見を増強すること。
【０１７１】
（化学的誘導体）
ＴＳＬＰＲポリペプチドの化学的に改変された誘導体は、この開示が、本明細書中に記載された場合、当業者によって調製され得る。ＴＳＬＰＲポリペプチド誘導体は、このポリペプチドに天然で結合した分子の型または位置のいずれかで、異なる様式で改変される。誘導体は、１以上の天然で結合した化学基の欠失によって形成される分子を含み得る。配列番号２、配列番号５、もしくは配列番号８、または他のＴＳＬＰＲポリペプチドのいずれかのアミノ酸配列を含むポリペプチドは、１以上のポリマーの共有結合によって改変され得る。例えば、選択されたポリマーは、代表的に水溶性であり、その結果、結合するタンパク質は、水環境（例えば、生理学的な環境）下で沈殿しない。ポリマーの混合物が、適切なポリマーの範囲内に含まれる。好ましくは、目的産物の調製の治療学的使用のために、このポリマーは、薬学的に受容可能である。
【０１７２】
このポリマーの各々は、任意の分子量を有し得、そして分枝または非分枝であり得る。このポリマーの各々は、代表的に、約２ｋＤａと約１００ｋＤａとの間の平均分子量を有する（この用語「約（およそ）」は、水溶性ポリマーの調製の際に、上記の分子量より多い、いくらか少ない重量を有することを示す）。各ポリマーの平均分子量は、好ましくは、約５ｋＤａと約５０ｋＤａとの間、より好ましくは、約１２ｋＤａと約４０ｋＤａとの間、そして最も好ましくは、約２０ｋＤａと約３５Ｄａとの間である。
【０１７３】
適切な水溶性ポリマーまたはその混合物としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：Ｎ−連結炭水化物またはＯ−連結炭水化物、糖、リン酸、ポリエチレン、グリコール（ＰＥＧ）（これは、モノ−（Ｃ１−Ｃ１０）ポリエチレングリコール、アルコキシ−ポリエチレングリコール、またはアリールオキシ−ポリエチレングリコールを含む、タンパク質を誘導体化するために使用されたＰＥＧの形態を含む）、モノメトキシ−ポリエチレングリコール、デキストラン（例えば、低分子量（例えば、約６ｋＤのデキストラン））、セルロース、または他の炭水化物ベースのポリマー、ポリ−（Ｎ−ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、プロピレングリコールホモポリマー、ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール（例えば、グリセロール）、およびビニルアルコール。共有結合したＴＳＬＰＲポリペプチドマルチマーを調製するために使用され得る、二官能性架橋分子もまた、本発明に含まれる。
【０１７４】
一般に、化学的誘導体化は、活性化したポリマー分子とタンパク質を反応させるために使用される任意の適切な条件下で、実施され得る。ポリペプチドの化学的誘導体を調製するための方法は、一般に、以下の工程を包含する：（ａ）配列番号２、配列番号５、もしくは配列番号８、のいずれかのアミノ酸配列を含むポリペプチドまたは他のＴＳＬＰＲポリペプチドが、１以上のポリマー分子に結合する条件下で、活性化したポリマー分子（例えば、ポリマー分子の反応性エステル誘導体またはアルデヒド誘導体）とこのポリペプチドを反応させる工程、ならびに（ｂ）反応生成物を得る工程。最適の反応条件は、既知のパラメータおよび所望の結果に基づいて決定される。例えば、タンパク質に対するポリマー分子の比が大きくなるほど、結合したポリマー分子の割合も大きくなる。１実施形態において、ＴＳＬＰＲポリペプチド誘導体は、アミノ末端に単一ポリマー分子部分を有する。例えば、米国特許第５，２３４，７８４号を参照のこと。
【０１７５】
ポリペプチドのペグ化（ｐｅｇｙｌａｔｉｏｎ）は、当該分野で公知の任意のペグ化反応を使用して特異的に実施され得る。このような反応は、例えば、以下の参考文献に記載されている：Ｆｒａｎｃｉｓら，１９９２，Ｆｏｃｕｓ  ｏｎ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒｓ  ３：４−１０；欧州特許第０１５４３１６号および０４０１３８４号；ならびに米国特許第４，１７９，３３７号。例えば、ペグ化は、本明細書中に記載されるように、反応性ポリエチレングリコール分子（または、類似の反応性水溶性ポリマー）とのアシル化反応またはアルキル化反応を介して実施され得る。アシル化反応のために、選択されたポリマーは、単一の反応性エステル基を有する。還元的アルキル化について、選択されたポリマーは、単一の反応性アルデヒド基を有する。例えば、反応性アルデヒドは、ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒド（これは、水安定性である）であるか、またはそのモノＣ１−Ｃ１０アルコキシ誘導体もしくはアリールオキシ誘導体である（米国特許第５，２５２，７１４号を参照のこと）。
【０１７６】
別の実施形態において、ＴＳＬＰＲポリペプチドは、ビオチンに化学的に連結され得る。次いで、このビオチン／ＴＳＬＰＲポリペプチド分子は、アビジンに結合され得、その結果、４価のアビジン／ビオチン／ＴＳＬＰＲポリペプチド分子が得られる。ＴＳＬＰＲポリペプチドはまた、ジニトロフェノール（ＤＮＰ）またはトリニトロフェノール（ＴＮＰ）に共有結合され得、そして得られた結合体は、抗−ＤＮＰまたは抗−ＴＮＰ−ＩｇＭと共に沈殿し、１０価の十量体の結合体を形成する。
【０１７７】
一般に、本発明のＴＳＬＰＲポリペプチド誘導体の投与によって、緩和または調節され得る条件は、ＴＳＬＰＲポリペプチドについて本明細書中に記載されたものを含む。しかし、本明細書中に開示されるＴＳＬＰＲポリペプチド誘導体は、非誘導体化分子と比較した場合、さらなる活性、増強または減少した生物学的活性、または他の特性（例えば、増加または減少した半減期）を有し得る。
【０１７８】
（遺伝子操作した非ヒト動物）
マウス、ラット、または他のげっ歯類；ウサギ、ヤギ、ヒツジ、または他の家畜のような非ヒト動物が、さらに本発明の範囲内に含まれ、ここで、天然のＴＳＬＰＲポリペプチドをコードする遺伝子は破壊（すなわち「ノックアウト」）され、ＴＳＬＰＲポリペプチドの発現レベルは、有意に減少するか、または完全に破壊される。このような動物は、米国特許第５，５５７，０３２号に記載されるような技術および方法を使用して調製され得る。
【０１７９】
本発明は、マウス、ラット、または他のげっ歯類；ウサギ、ヤギ、ヒツジ、または他の家畜のような非ヒト動物をさらに含み、この動物のＴＳＬＰＲ遺伝子のネイティブの形態または非相同性ＴＳＬＰＲ遺伝子のいずれかが、動物によって過剰発現され、これによって、「トランスジェニック」動物を作製する。このようなトランスジェニック動物は、米国特許第５，４８９，７４３号およびＰＣＴ公開番号ＷＯ９４／２８１２２号に記載されるような周知の方法を使用して調製され得る。
【０１８０】
本発明は、非ヒト動物をさらに含み、ここで、本発明の１以上のＴＳＬＰＲポリペプチドのプロモーターは、（例えば、相同的な組換え方法を使用することによって）活性化されるか、または不活化され、１以上のネイティブのＴＳＬＰＲポリペプチドの発現のレベルを改変する。
【０１８１】
これらの非ヒト動物は、薬物候補物スクリーニングのために使用され得る。このようなスクリーニングにおいて、動物での薬物候補物の影響が測定され得る。例えば、薬物候補物は、ＴＳＬＰＲ遺伝子の発現を減少または増加させ得る。特定の実施形態において、産生されるＴＳＬＰＲポリペプチドの量は、この動物を薬物候補物に曝露した後に測定され得る。さらに、特定の実施形態において、動物での薬物候補物の実際の影響を検出し得る。例えば、特定の遺伝子の過剰発現により、疾患状態または病理学的状態を生じるか、または関連し得る。このような場合において、遺伝子の発現を減少させる薬物候補物の能力または病理学的状態を防止または阻害するための薬物候補物の能力を試験し得る。他の例において、ポリペプチドのフラグメントのような、特定の代謝産物の産生により、疾患状態または病理学的状態を生じ得るか、または関連し得る。このような場合において、このような代謝産物の産生を減少させるための薬物候補物の能力または病理学的状態を防止または阻害するための薬物候補物の能力を試験し得る。
【０１８２】
（ＴＳＬＰＲポリペプチド活性の他の調節因子についてのアッセイ）
いくつかの状態において、ＴＳＬＰＲポリペプチドの活性の調節因子である分子（すなわち、アゴニストまたはアンタゴニスト）を同定することが所望され得る。ＴＳＬＰＲポリペプチドを調節する天然または合成分子は、本明細書中に記載されるように、１以上のスクリーニングアッセイを使用して同定され得る。このような分子は、エキソビボ様式またはインビボ様式のいずれかで、注射、または経口送達、移植デバイスなどによって投与され得る。
【０１８３】
「試験分子」とは、ＴＳＬＰＲポリペプチドの活性を調節する（すなわち、増加または減少させる）ための能力について評価される分子を言う。最も一般的に、試験分子は、ＴＳＬＰＲポリペプチドと直接的に相互作用する。しかし、試験分子はまた、例えば、ＴＳＬＰＲ遺伝子発現に影響を与えることによって、またはＴＳＬＰＲポリペプチド結合パートナー（例えば、レセプターまたはリガンド）に結合することによって、ＴＳＬＰＲポリペプチド活性を直接的に調節し得る。１実施形態において、試験分子は、少なくとも約１０−６Ｍ、好ましくは、約１０−８Ｍ、より好ましくは、約１０−９Ｍ、そしてさらにより好ましくは約１０−１０Ｍの親和性定数（ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｃｏｎｓｔａｎｔ）でＴＳＬＰＲポリペプチドと結合する。
【０１８４】
ＴＳＬＰＲポリペプチドと相互作用する化合物を同定するための方法は、本発明によって包含される。特定の実施形態において、ＴＳＬＰＲポリペプチドは、試験分子とＴＳＬＰＲポリペプチドとの相互作用を可能にする条件下で、試験分子と共にインキュベートされ、そして相互作用の範囲が測定される。試験分子は、実質的に精製された形態または粗製の混合物でスクリーニングされ得る。
【０１８５】
特定の実施形態において、ＴＳＬＰＲポリペプチドアゴニストまたはＴＳＬＰＲポリペプチドアンタゴニストは、タンパク質、ペプチド、炭水化物、脂質、または低分子量の分子であり得、これは、ＴＳＬＰＲポリペプチドと相互作用して、その活性を調節する。ＴＳＬＰＲポリペプチドの発現を調節する分子は、ＴＳＬＰＲポリペプチドをコードする核酸と相補的であるか、またはＴＳＬＰＲポリペプチドの発現を指向または制御する核酸配列と相補的である核酸、および発現のアンチセンス調節因子として作用する核酸を含む。
【０１８６】
一旦、試験分子が、ＴＳＬＰＲポリペプチドと相互作用するとして同定されると、この分子は、ＴＳＬＰＲポリペプチド活性を増加または減少させる能力についてさらに評価され得る。試験分子とＴＳＬＰＲポリペプチドとの相互作用の測定は、以下を含むいくつかの様式で実施され得る：細胞ベースの結合アッセイ、膜結合アッセイ、液相アッセイ、および免疫アッセイ。一般に、試験分子は、特定の期間、ＴＳＬＰＲポリペプチドと共にインキュベートされ、そしてＴＳＬＰＲポリペプチド活性は、生物学的活性を測定するために１以上のアッセイによって決定される。
【０１８７】
試験分子とＴＳＬＰＲポリペプチドとの相互作用はまた、免疫アッセイにおいて、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体を使用して直接的にアッセイされ得る。あるいは、本明細書中に記載されるようなエピトープタグを含むＴＳＬＰＲポリペプチドの改変形態は、溶液および免疫アッセイ中で使用され得る。
【０１８８】
ＴＳＬＰＲポリペプチドが、結合パートナー（例えば、レセプターまたはリガンド）との相互作用を介して、生物学的活性を示す場合において、種々のインビトロアッセイが、対応する結合パートナー（選択的結合因子、レセプター、またはリガンド）へのＴＳＬＰＲポリペプチドの結合を測定するために使用され得る。これらのアッセイは、結合パートナーに対するＴＳＬＰＲポリペプチドの結合の速度および／または程度を増加または減少させるために、それらの能力について試験分子をスクリーニングするために使用され得る。１つのアッセイにおいて、ＴＳＬＰＲポリペプチドは、マイクロタイタープレートのウェル中で固定化される。次いで、放射標識したＴＳＬＰＲポリペプチド結合パートナー（例えば、ヨウ素化したＴＳＬＰＲポリペプチド結合パートナー）および試験化合物は、このウェルに、一時に一方を（いずれかの順序で）または同時に添加され得る。インキュベーション後に、このウェルを洗浄し、そしてシンチレーション計数器を使用して、放射活性を計数し、結合パートナーがＴＳＬＰＲポリペプチドに結合する範囲を決定し得る。代表的に、分子は、濃度範囲にわたって試験され、そして試験アッセイの１以上要素を欠く一連のコントロールウェルは、結果の評価の正確性のために使用され得る。この方法の代わりは、このタンパク質の「位置」を逆にする工程（すなわち、マイクロタイタープレートウェルに対してＴＳＬＰＲポリペプチド結合パートナーを固定化し、試験分子および放射標識したＴＳＬＰＲポリペプチドをインキュベートし、そしてＴＳＬＰＲポリペプチド結合の程度を決定する工程）を包含する。例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、第１８章（Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｇｒｅｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ  Ｉｎｃ．ならびにＷｉｌｅｙおよびＳｏｎｓ１９９５）を参照のこと。
【０１８９】
放射性標識に対する代替として、ＴＳＬＰＲポリペプチドまたはその結合パートナーは、ビオチンと結合体化され得、次いで、ビオチン化されたタンパク質の存在が、酵素（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）またはアルカリホスファターゼ（ＡＰ））（これらは、比色定量的に検出される）に結合したストレプトアビジンを使用して検出され得るか、またはストレプトアビジンの蛍光タグ化によって検出され得る。ＴＳＬＰＲポリペプチドまたはＴＳＬＰＲポリペプチド結合パートナー（これらは、ビオチンに結合されている）に対する抗体はまた、ＡＰまたはＨＲＰに連結した酵素連結ストレプトアビジンとの複合体のインキュベーションに続いて、検出の目的のために使用され得る。
【０１９０】
ＴＳＬＰＲポリペプチドまたはＴＳＬＰＲポリペプチド結合パートナーは、アガロースビーズ、アクリルビーズ、または他の型のこのような不活性な固体相基材への付着によって固定化され得る。基材−タンパク質複合体は、相補タンパク質および試験化合物を含む溶液内に配置され得る。インキュベーション後、これらのビーズは、遠心分離によって沈澱され得、そしてＴＳＬＰＲポリペプチドとその結合パートナーとの間の結合の量が、本明細書中に記載の方法を使用して評価され得る。あるいは、基材−タンパク質複合体は、カラムを通過する、試験分子および相補タンパク質を用いてカラム内に固定化され得る。ＴＳＬＰＲポリペプチドトとその結合パートナーとの間の複合体の形成が、次いで、本明細書中に記載の技術（例えば、放射性標識または抗体結合）のいずれかを使用して評価され得る。
【０１９１】
ＴＳＬＰＲポリペプチド結合タンパク質とＴＳＬＰＲポリペプチド結合パートナーとの間の複合体の形成を増加または減少させる試験分子を同定するために有用な別のインビトロアッセイは、表面プラズモン共鳴検出器システム（例えば、ＢＩＡｃｏｒｅアッセイシステム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ））である。このＢＩＡｃｏｒｅシステムは、製造業者によって特定されるように利用される。このアッセイは、本質的に、ＴＳＬＰＲポリペプチドまたはＴＳＬＰＲポリペプチド結合パートナーのいずれかの、デキストランでコートされたセンサーチップ（これは、検出器に存在する）への共有結合を含む。次いで、この試験化合物および他の相補タンパク質が、同時にかまたは連続的にかのいずれかで、センサーチップを含むチャンバーに注入され得る。結合する相補タンパク質の量は、センサーチップのデキストランコート側面に物理的に関係する分子の質量の変化に基づいて評価され得、この分子の質量の変化は、検出器システムによって測定される。
【０１９２】
いくつかの場合において、２つ以上の試験化合物を一緒に、ＴＳＬＰＲポリペプチドとＴＳＬＰＲポリペプチド結合パートナーとの間の複合体の形成を増加または減少させるそれらの能力について評価することが所望され得る。これらの場合において、本明細書中に記載のアッセイは、第一の試験化合物と同時にか、またはそれに続いてのいずれかで、このようなさらなる試験化合物を添加することによって容易に改変され得る。このアッセイにおける工程の残りは、本明細書中に記載される。
【０１９３】
インビトロアッセイ（例えば、本明細書中に記載されるもの）は、ＴＳＬＰＲポリペプチドとＴＳＬＰＲポリペプチド結合パートナーとの間の複合体の形成に対する効果について、多数の化合物をスクリーニングするために、有利に使用され得る。これらのアッセイは、ファージディスプレイ、合成ペプチド、および化学合成ライブラリーにおいて生成された化合物をスクリーニングするために、自動化され得る。
【０１９４】
ＴＳＬＰＲポリペプチドとＴＳＬＰＲポリペプチド結合パートナーとの間の複合体の形成を増加または減少する化合物はまた、ＴＳＬＰＲポリペプチドまたはＴＳＬＰＲポリペプチド結合パートナーのいずれかを発現する細胞および細胞株を使用して、細胞培養物においてスクリーニングされ得る。細胞および細胞株は、任意の哺乳動物から得られ得るが、好ましくは、ヒト、または他の霊長類、イヌ類またはげっ歯類の供給源由来である。ＴＳＬＰＲポリペプチドの、ＴＳＬＰＲポリペプチド結合パートナーを発現する細胞への、その表面での結合は、試験分子の存在または非存在下で評価され、そして結合の程度が、例えば、ＴＳＬＰＲポリペプチド結合パートナーに対するビオチン化抗体を使用するフローサイトメトリーによって決定され得る。細胞培養アッセイは、本明細書中に記載されるタンパク質結合アッセイにおいて、陽性であるとスコア付けされる化合物をさらに特徴付けするために有利に使用され得る。
【０１９５】
細胞培養物はまた、薬物候補の影響をスクリーニングするために使用され得る。例えば、薬物候補は、ＴＳＬＰＲ遺伝子の発現を減少または増加させ得る。特定の実施形態において、生成されるＴＳＬＰＲポリペプチドまたはＴＳＬＰＲポリペプチドフラグメントの量は、細胞培養物の薬物候補への曝露の後に測定され得る。特定の実施形態において、細胞培養物への薬物候補の実質的な影響が検出され得る。例えば、特定の遺伝子の過剰発現は、細胞培養物への特定の影響を有し得る。このような場合に、遺伝子の発現を増加または減少させる薬物候補の能力、または細胞培養物に対する特定の影響を予防または阻害するその能力が試験され得る。他の例において、特定の代謝産物（例えば、ポリペプチドのフラグメントなど）の生成が、疾患または病的状態を生じ得るか、またはそれらと関連し得る。このような場合、細胞培養物におけるこのような代謝産物の生成を減少する薬物候補の能力が試験され得る。
【０１９６】
（内部移行タンパク質）
ｔａｔタンパク質配列（ＨＩＶ由来）が、タンパク質を細胞内に内部移行させるために、使用され得る。例えば、Ｆａｌｗｅｌｌら、１９９４、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９１：６６４−６８を参照のこと。例えば、ＨＩＶ  ｔａｔタンパク質の１１アミノ酸の配列（Ｙ−Ｇ−Ｒ−Ｋ−Ｋ−Ｒ−Ｒ−Ｑ−Ｒ−Ｒ−Ｒ；配列番号１３）（「タンパク質形質導入ドメイン」、またはＴＡＴ  ＰＤＴと称される）は、細胞の細胞質膜および核膜を横切る送達を媒介するとして記載されている。Ｓｃｈｗａｒｚｅら，１９９９，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８５：１５６９−７２；およびＮａｇａｈａｒａら，１９９８，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．４：１４４９−５２を参照のこと。これらの手順において、ＦＩＴＣ構築物（ＦＩＴＣ標識Ｇ−Ｇ−Ｇ−Ｇ−Ｙ−Ｇ−Ｒ−Ｋ−Ｋ−Ｒ−Ｒ−Ｑ−Ｒ−Ｒ−Ｒ；配列番号１４）（これは、腹腔内投与に続いて組織を貫通する）が調製され、そしてこのような構築物の細胞への結合が、蛍光細胞分析分離（ＦＡＣＳ）分析によって検出される。ｔａｔ−β−ｇａｌ融合タンパク質で処理された細胞は、β−ｇａｌ活性を示す。注入に続いて、このような構築物の発現が、多くの組織（肝臓、腎臓、肺、心臓および脳組織を含む）において検出され得る。このような構築物は、細胞に入るためにある程度の変性を受け、そしてそれ自体、細胞内への移入後、再折り畳みを必要とし得ると考えられる。
【０１９７】
従って、ｔａｔタンパク質配列は、所望のポリペプチドを細胞に内部移入させるために使用され得ることが理解される。例えば、ｔａｔタンパク質配列を使用して、ＴＳＬＰＲアンタゴニスト（例えば、抗ＴＳＬＰＲ選択的結合因子、低分子、可溶性レセプター、またはアンチセンスオリゴヌクレオチド）は、ＴＳＬＰＲ分子の活性を阻害するために、細胞内投与され得る。本明細書中で使用される場合、用語「ＴＳＬＰＲ分子」は、本明細書中に規定されるような、ＴＳＬＰＲ核酸分子およびＴＳＬＰＲポリペプチドの両方をいう。所望の場合、ＴＳＬＰＲタンパク質自体はまた、これらの手順を使用して、細胞に内部投与され得る。Ｓｔｒａｕｓ，１９９９，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８５：１４６６−６７をまた参照のこと。
【０１９８】
（ＴＳＬＰＲポリペプチドを使用する細胞供給源の同定）
本発明の特定の実施形態に従って、ＴＳＬＰＲポリペプチドと関連する特定の細胞型の供給源を決定することを可能することが有用であり得る。例えば、適切な治療を選択する際の補助として疾患または病的状態の起源を決定することが有用であり得る。特定に実施形態において、ＴＳＬＰＲポリペプチドをコードする核酸は、プローブとして使用されて、このようなプローブを用いて細胞の核酸をスクリーニングすることによって、本明細書中に記載の細胞を同定し得る。他の実施形態において、抗ＴＳＬＰＲポリペプチド抗体を使用して、細胞におけるＴＳＬＰＲポリペプチドの存在について試験し得、従って、このような細胞が本明細書中に記載される型の細胞か否かを決定し得る。
【０１９９】
（ＴＳＬＰＲポリペプチド組成物および投与）
治療組成物は、本発明の範囲内である。このようなＴＳＬＰＲポリペプチド薬学的組成物は、治療有効量のＴＳＬＰＲポリペプチドまたはＴＳＬＰＲ核酸分子を、投与の様式と適合するように選択された薬学的にまたは生理学的に受容可能な処方薬剤との混合物中に、含み得る。薬学的組成物は、治療有効量の１以上のＴＳＬＰＲポリペプチド選択的結合因子を、投与の様式と適合するように選択された薬学的にまたは生理学的に受容可能な処方薬剤との混合物中に、含み得る。
【０２００】
受容可能な処方物材料は、好ましくは、使用される投薬量および濃度で、レシピエントに対して非毒性である。
【０２０１】
薬学的組成物は、例えば、ｐＨ、浸透圧重量オスモル濃度、粘度、清澄性、色、等張性、におい、無菌性、安定性、溶解または放出の速度、吸着、または組成物の浸透を改変、維持または保存するための処方物材料を含み得る。適切な処方物材料としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：アミノ酸（例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン、またはリジン）、抗菌剤、抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸、亜硫酸ナトリウム、または亜硫酸水素ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ  ｈｙｄｒｏｇｅｎ−ｓｕｌｆｉｔｅ））、緩衝液（例えば、ホウ酸塩、炭酸水素塩、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、クエン酸塩、リン酸塩、または他の有機酸）、バルキング剤（例えば、マンニトールまたはグリシン）、キレート化剤（エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ））、複合体化剤（例えば、カフェイン、ポリビニルピロリドン、β−シクロデキストリン、またはヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン）、フィラー、単糖類、二糖類、および他の炭水化物（例えば、グルコース、マンノースまたはデキストリン）、タンパク質（例えば、血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリン）、着色剤、味付け剤および希釈剤、乳化剤、親水性ポリマー（例えば、ポリビニルピロリドン）、低分子量ポリペプチド、塩形成対イオン（例えば、ナトリウム）、保存剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、安息香酸、サリチル酸、チメロサール、フェネチルアルコール、メチルパラベン、プロピルパラベン、クロルヘキシジン、ソルビン酸、または過酸化水素）、溶媒（例えば、グリセリン、プロピレングリコール、またはポリエチレングリコール）、糖アルコール（例えば、マンニトールまたはソルビトール）、懸濁剤、表面活性剤または湿潤剤（例えば、プルオニック（ｐｌｕｒｏｎｉｃ）；ＰＥＧ；ソルビタンエステル；ポリソルビベート（例えば、ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ  ２０またはｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ  ８０）；トリトン；トロメタミン；レシチン；コレステロールまたはチロキサポール（ｔｙｌｏｘａｐａｌ））、安定性増強剤（例えば、スクロースまたはソルビトール）、張度増強剤（例えば、ハロゲン化アルカリ金属（好ましくは塩化ナトリウムまたは塩化カリウム）、またはマンニトール、ソルビトール）、送達ビヒクル、希釈剤、賦形剤および／または薬学的なアジュバント。Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（第１８版，Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ編，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ  １９９０を参照のこと）。
【０２０２】
最適な薬学的組成物は、当業者によって、例えば、意図される投与経路、送達形式、および所望の投薬量に依存して決定される。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，前出を参照のこと。このような組成物は、ＴＳＬＰＲ分子の、物理的な状態、安定性、インビボ放出の速度、およびインビボクリアランスの速度に影響し得る。
【０２０３】
薬学的組成物における主要なビヒクルまたはキャリアは、本来水性または非水性のいずれかであり得る。例えば、注入のための適切なビヒクルまたはキャリアは、水、生理学的な生理食塩水溶液、または人工脳脊髄液であり、おそらく非経口投与のための組成物において他の一般的な材料で補充されている。中性の緩衝化生理食塩水または血清アルブミンと混合された生理食塩水は、さらなる例示的なビヒクルである。他の例示的な薬学的組成物は、約ｐＨ７．０−８．５のＴｒｉｓ緩衝液または約ｐＨ４．０−５．５の酢酸塩緩衝液を含み、これはさらに、ソルビトールまたは適切な置換物を含み得る。本発明の１つの実施形態において、ＴＳＬＰＲポリペプチド組成物は、所望の程度の純度を有する選択された組成物を、任意の処方薬剤（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，前出）と混合することによって、凍結乾燥ケークまたは水溶液の形態で、保存のために調製され得る。さらに、ＴＳＬＰＲポリペプチド産物は、スクロースのような適切な賦形剤を使用して凍結乾燥物として処方され得る。
【０２０４】
このＴＳＬＰＲポリペプチドの薬学的組成物は、非経口送達のために選択され得る。あるいは、これらの組成物は、吸入または消化管を介する送達（例えば、経口的に）のために、選択され得る。このような薬学的に受容可能な組成物の調製は、当該分野の技術内にある。
【０２０５】
処方成分が、投与の部位に受容可能な濃度で存在する。例えば、緩衝液は、生理学的ｐＨまたは多少より低いｐＨ（典型的に、約５〜約８のｐＨ範囲内）にこの組成物を維持するために使用される。
【０２０６】
非経口投与が意図される場合、本発明における使用のための治療組成物は、薬学的に受容可能なビヒクルに所望のＴＳＬＰＲ分子を含み、発熱物質を含まない非経口的に受容可能な水溶液の形態であり得る。非経口注入のために特に適切なビヒクルは、滅菌蒸留水であり、ここで、ＴＳＬＰＲ分子が、滅菌で、等張溶液として処方され、適切に保存される。なお別の調製物は、所望の分子と、粒子（例えば、注入可能なミクロスフィア、生体腐食（ｂｉｏ−ｅｒｏｄｉｂｌｅ）薬剤、ポリマー化合物（ポリ乳酸またはポリグリコール酸）、ビーズまたはリポソーム）との処方物に関係し得、これは、産物の制御されたまたは持続された放出を提供し、この産物は、次いで蓄積注射を介して送達され得る。ヒアルロン酸がまた、使用され得、そしてこれは、循環において、維持された持続時間を促進する効果を有し得る。所望の分子の導入のための他の適切な手段は、移植可能な薬物送達デバイスを含む。
【０２０７】
１つの実施形態において、薬学的組成物は、吸入のために処方され得る。例えば、ＴＳＬＰＲポリペプチドは、吸入のための乾燥粉末として処方され得る。ＴＳＬＰＲポリペプチドまたは核酸分子の吸入溶液はまた、エアロゾル送達のための噴霧体と共に処方され得る。なお別の実施形態において、溶液は、噴霧され得る。肺投与が、ＰＣＴ公開番号ＷＯ９４／２００６９にさらに記載され、これは化学的に改変されたタンパク質の肺送達を記載する。
【０２０８】
特定の処方物が、経口投与され得ることがまた企図される。本発明の１つの実施形態において、このよう様式で投与されるＴＳＬＰＲポリペプチドが、固体投薬形態（例えば、錠剤またはカプセル）の調合において慣用的に使用されるキャリアを伴うか、または伴わずに処方され得る。例えば、カプセルは、バイオアベイラビリティーが最大化され、そして前全身分解が最小化される場合、胃腸管内での点で処方物の活性部分を放出するように設計され得る。さらなる薬剤が、ＴＳＬＰＲポリペプチドの吸収を容易にするために含まれ得る。希釈剤、味付け剤、低融点ワックス、植物油、潤滑剤、懸濁剤、錠剤崩壊剤、およびバインダーがまた、使用され得る。
【０２０９】
別の薬学的組成物は、錠剤の製造に適切な非毒性賦形剤との混合物中に、有効量のＴＳＬＰＲポリペプチドを含み得る。錠剤を滅菌水または別の適切なビヒクルに溶解することによって、溶液が、単位用量形態で調製され得る。適切な賦形剤は以下を含むが、これらに限定されない：不活性な希釈剤（炭酸カルシウム、炭酸ナトリウムまたは炭酸水素ナトリウム、ラクトース、あるいはリン酸カルシウム）；または結合剤（例えば、デンプン、ゼラチンまたはアラビアゴム）；あるいは潤滑剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸またはタルク）。
【０２１０】
さらなるＴＳＬＰＲポリペプチドの薬学的組成物は、当業者に明らかであり、持続または制御送達処方物中にＴＳＬＰＲポリペプチドを含む処方物を含む。種々の他の持続または制御送達手段（例えば、リポソームキャリア、生体腐微粒子あるいは多孔性ビーズおよび蓄積注射）を処方するための技術はまた、当業者に公知である。例えば、ＰＣＴ／ＵＳ９３／００８２９（これは、薬学的組成物の送達のための多孔性ポリマー性微粒子の制御放出を記載する）を参照のこと。
【０２１１】
徐放性調製物のさらなる例としては、成形された物品の形態（例えば、フィルム、またはマイクロカプセル）の半透過性ポリマーマトリックスを含む。徐放性マトリックスとしては、ポリエステル、ヒドロゲル、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号および欧州特許第０５８４８１号）、Ｌ−グルタミン酸とγエチル−Ｌ−グルタメートとのコポリマー（Ｓｉｄｍａｎら，１９８３，Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ  ２２：５４７−５６）、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）（Ｌａｎｇｅｒら，１９８１，Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．１５：１６７−２７７およびＬａｎｇｅｒ，１９８２，Ｃｈｅｍ．Ｔｅｃｈ．１２：９８−１０５）、エチレンビニルアセテート（Ｌａｎｇｅｒら，前出）またはポリ−Ｄ（−）−３−ヒドロキシ酪酸（欧州特許第１３３９８８号）。徐放性組成物はまた、リポソームを含み得、これは、当該分野で公知のいくつかの方法のいずれかによって調製され得る。例えば、Ｅｐｐｓｔｅｉｎら，１９８５，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２：３６８８−９２；および欧州特許第０３６６７６号、同第０８８０４６号、および同第１４３９４９号を参照のこと。
【０２１２】
インビボ投与のために使用されるＴＳＬＰＲの薬学的組成物は、代表的に滅菌でなければならない。このことは、滅菌濾過膜を介する濾過によって達成され得る。組成物が、凍結乾燥される場合、この方法を使用する滅菌は、凍結乾燥および再構成の前に、またはそれに続いてのいずれかで実施され得る。非経口投与のための組成物は、凍結乾燥された形態または溶液で保存され得る。さらに、非経口組成物は、一般に、滅菌アクセスポートを有する容器（例えば、静脈内溶液バッグまたは皮下注射針によって貫通可能なストッパーを有するバイアル）内に配置される。
【０２１３】
一旦、薬学的組成物が処方されると、それは、滅菌バイアル中に溶液、懸濁液、ゲル、エマルジョン、固体、または脱水和粉末もしくは凍結乾燥粉末として保存され得る。このような処方物は、すぐに使用できる形態または投与の前に再構成を必要とする形態（例えば、凍結乾燥された形態）のいずれかで保存され得る。
【０２１４】
特定の実施形態において、本発明は、単一用量投与単位を生成するためのキットに関する。このキットは、各々、乾燥タンパク質を有する第一の容器および水性処方物を有する第二の容器の両方を含み得る。また、本発明の範囲内には、単一および多チャンバーの予め充填されたシリンジ（例えば、液体シリンジおよび分散シリンジ（ｌｙｏｓｙｒｉｎｇｅ））を含むキットが含まれる。
【０２１５】
治療的に使用されるＴＳＬＰＲの薬学的組成物の有効量は、例えば、治療の内容および目的に依存する。当業者は、処置のための適切な投薬レベルが、従って、送達される分子、ＴＳＬＰＲ分子が使用されている指標、投与の経路、および患者のサイズ（体重、体表面、または器官の大きさ）および状態（年齢および一般的な健康）に、部分的に依存して変化することを理解する。従って、臨床医は、最適な治療効果を得るために、投薬量を力価決定し（ｔｉｔｅｒ）、投与経路を改変し得る。代表的な投薬量は、上記の因子に依存して、約０．１μｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ以上までの範囲であり得る。他の実施形態において、投薬量は、０．１μｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇまで；または１μｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇまで；または５μｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇまでの範囲であり得る。
【０２１６】
投薬の頻度は、使用される処方物中でのＴＳＬＰＲ分子の薬物動態学のパラメーターに依存する。典型的に、臨床医は、所望の効果を達成する投薬量に達するまで組成物を投与する。従って、組成物は、経時的な単一用量として、２以上の用量（これは、同量の所望の分子を含んでも、含まなくてもよい）として、あるいは移植デバイスまたはカテーテルを介する連続的な注入として、投与され得る。適切な投薬量のさらなる改良は、当業者によって慣用的になされ、そしてそれらによって慣用的に実施される課題の範囲内である。適切な投薬量は、適切な用量−応答データの使用を介して確認され得る。
【０２１７】
薬学的組成物の投与の経路は、以下のような公知の方法と一致する：例えば、経口的に；静脈内、腹腔内、脳内（実質内の）、脳室内、筋肉内、眼内、動脈内、門脈内、または病巣内の経路による注入を介して；徐放性系によって；または移植デバイスによって。所望される場合、これらの組成物は、ボーラス注射によって投与され得るか、または注入によって連続的に投与され得るか、または移植デバイスによって投与され得る。
【０２１８】
あるいはまたはさらに、この組成物は、その上に所望の分子が吸収されるかまたはカプセル化される膜、スポンジ、または他の適切な材料の移植を介して局所的に投与され得る。移植デバイスが使用される場合、このデバイスは、任意の適切な組織または器官に移植され得、そして所望の分子の送達は、拡散、時限放出ボーラスまたは連続的な投与を介し得る。
【０２１９】
いくつかの場合において、エキソビボ様式において、ＴＳＬＰＲポリペプチドの薬学的組成物を使用することが所望され得る。このような例において、患者から取り出された細胞、組織、または器官は、これらの細胞、組織、または器官が引き続いて患者に移植して戻された後にＴＳＬＰＲポリペプチド薬学的組成物に曝露される。
【０２２０】
他の場合において、ＴＳＬＰＲポリペプチドは、本明細書中に記載されるような方法を使用して、遺伝的に操作されて、ＴＳＬＰＲポリペプチドを発現および分泌する特定の細胞を移植することによって送達され得る。このような細胞は、動物細胞またはヒト細胞であり得、そして自己、異種、または外因性の細胞であり得る。必要に応じて、これらの細胞は、不死化され得る。免疫学的応答の機会を減少するために、これらの細胞は、周囲の組織の浸潤を回避するために、カプセル化され得る。カプセル化材料は、典型的に、生体適合性の半浸透性ポリマー性包囲物または膜であり、これらは、タンパク質産物の放出を可能にするが、患者の免疫系または周囲の組織からの他の有害な因子による細胞の破壊を防止する。
【０２２１】
本明細書中において議論されるように、単離された細胞集団（例えば、幹細胞、リンパ球、赤血球、軟骨細胞、ニューロンなど）を１つ以上のＴＳＬＰＲポリペプチドで処理することが、望ましくあり得る。このことは、細胞膜に対して透過性の形態である場合には、単離された細胞をこのポリペプチドに直接曝露することによって達成され得る。
【０２２２】
本発明のさらなる実施形態は、治療ポリペプチドのインビトロ産生と、遺伝子治療または細胞治療による治療ポリペプチドの産生および送達との両方のための、細胞および方法（例えば、相同組換えおよび／または他の組換え産生方法）に関する。相同組換えおよび他の組換えの方法を使用して、通常は転写に対してサイレントなＴＳＬＰＲ遺伝子または過少発現される遺伝子を含む細胞を改変し得、これによって、治療有効量のＴＳＬＰＲポリペプチドを発現する細胞を産生し得る。
【０２２３】
相同組換えは、もともとは、遺伝子を標的化して転写活性な遺伝子における変異を誘導するか、または修正するために開発された技術である。Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉ，１９８９，Ｐｒｏｇ．ｉｎ  Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．＆  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３６：３０１。基本的な技術が、特定の変異を哺乳動物ゲノムの特定の領域に導入するため（Ｔｈｏｍａｓら、１９８６，Ｃｅｌｌ  ４４：４１９−２８；ＴｈｏｍａｓおよびＣａｐｅｃｃｈｉ，１９８７，Ｃｅｌｌ  ５１：５０３−１２；Ｄｏｅｔｓｃｈｍａｎら、１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８５：８５８３−８７）、または欠損遺伝子における特定の変異を修正するため（Ｄｏｅｔｓｃｈｍａｎら、１９８７，Ｎａｔｕｒｅ  ３３０：５７６−７８）の方法として、開発された。例示的な相同組換え技術は、米国特許第５，２７２，０７１号；欧州特許第９１９３０５１号および同第５０５５００号；ＰＣＴ／ＵＳ９０／０７６４２、ならびにＰＣＴ公開番号ＷＯ  ９１／０９９５５）に記載されている。
【０２２４】
相同組換えによって、ゲノムに挿入されるべきＤＮＡ配列は、それを標的ＤＮＡに付着させることによって、目的の遺伝子の特定の領域に指向され得る。この標的ＤＮＡは、ゲノムＤＮＡの領域に相補的（相同）であるヌクレオチド配列である。ゲノムの特定の領域に対して相補的な標的ＤＮＡの小さな断片は、ＤＮＡ複製プロセスの間に、親鎖と接触される。これは、細胞に挿入されてハイブリダイズしたＤＮＡの一般的な特性であり、従って、共有される相同領域を介して、内因性ＤＮＡの他の断片と組み換わる。この相補鎖が、変異または異なる配列またはさらなるヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドに付着される場合には、これはまた、この組換えの結果として新たに合成された鎖に組み込まれる。プルーフリーディング機能の結果として、ＤＮＡの新たな配列がテンプレートとして働くことが可能である。従って、移入されたＤＮＡは、ゲノムに組み込まれる。
【０２２５】
ＴＳＬＰＲポリペプチドと相互作用し得るかまたはその発現を制御し得るＤＮＡの領域（例えば、隣接配列）が、標的ＤＮＡのこれらの断片に付着する。例えば、プロモーター／エンハンサーエレメント、サプレッサ、または外因性転写調節エレメントが、意図される宿主細胞のゲノムにおいて、所望のＴＳＬＰＲポリペプチドをコードするＤＮＡの近位に、このＤＮＡの転写に影響を与えるに十分な配向で、挿入される。制御エレメントは、この宿主細胞ゲノムに存在するＤＮＡの部分を制御する。従って、所望のＴＳＬＰＲポリペプチドの発現は、ＴＳＬＰＲ遺伝子自体をコードするＤＮＡのトランスフェクションによってではなく、むしろ、ＴＳＬＰＲ遺伝子の転写のための認識可能なシグナルを有する内因性遺伝子配列を提供するＤＮＡ調節セグメントと結合した標的ＤＮＡ（目的の内因性遺伝子と相同の領域を含む）の使用によって、達成され得る。
【０２２６】
例示的な方法において、細胞における所望の標的遺伝子（すなわち、所望の内因性細胞遺伝子）の発現は、予め選択された部位における細胞ゲノムへの相同組換えを介して、少なくとも調節配列、エキソン、およびスプライスドナー部位を含むＤＮＡの導入によって、変更される。これらの構成成分は、新たな転写ユニットの産生を実際に生じるような様式で、染色体（ゲノム）ＤＮＡに導入される（ここで、このＤＮＡ構築物に存在する調節配列、エキソン、およびスプライスドナー部位は、この内因性遺伝子に作動可能に連結する）。染色体ＤＮＡへのこれらの構成成分の導入の結果として、所望の内因性遺伝子の発現が変化する。
【０２２７】
変化された遺伝子発現は、本明細書中で記載されるように、通常は得られたままの細胞においてサイレントな（発現されていない）遺伝子の活性化（または発現させる）、ならびに得られたままの細胞において生理学的に有意なレベルでは発現されない遺伝子の発現の増加を包含する。この実施形態はさらに、調節または誘導のパターンを変化させる工程を包含し、その結果、これは、得られたままの細胞において生じる調節または誘導のパターンとは異なり、そして得られたままの細胞において発現される遺伝子の発現を低減（除去を含む）させる。
【０２２８】
細胞の内在性ＴＳＬＰＲ遺伝子からのＴＳＬＰＲポリペプチドの産生を増加するかまたはこれを引き起こすために相同定組換えが使用され得る１つの方法は、最初に、相同性組換えを使用して、部位特異的組換え系由来の組換え配列（例えば、Ｃｒｅ／ｌｏｘＰ、ＦＬＰ／ＦＲＴ）（Ｓａｕｅｒ，１９９４，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，５：５２１−２７；Ｓａｕｅｒ，１９９３，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，２２５：８９０−９００）を、細胞の内在性ゲノムＴＳＬＰＲポリペプチドコード領域の上流（すなわち、５’）に配置する工程を包含する。ゲノムＴＳＬＰＲポリペプチドコード領域のすぐ上流に配置された部位に対して相同性の組換え部位を含むプラスミドは、適切なリコンビナーゼ酵素と共に、改変された細胞株に導入される。このリコンビナーゼによって、プラスミドは、このプラスミドの組換え部位を介して、この細胞株のゲノムＴＳＬＰＲポリペプチドコード領域のすぐ上流に位置する組換え部位に組込まれ得る（ＢａｕｂｏｎｉｓおよびＳａｕｅｒ、１９９３，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２１：２０２５−２９；Ｏ’Ｇａｒｍａｎら、１９９１，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５１：１３５１−５５）。転写を増加させることが知られている任意の隣接配列（例えば、エンハンサー／プロモーター、イントロン、翻訳エンハンサー）は、このプラスミド中に適切に配置される場合、細胞の内在性ＴＳＬＰＲ遺伝子からの新たな（ｄｅ  ｎｏｖｏ）または増加したＴＳＬＰＲポリペプチド産生を生じる新たなまたは改変された転写単位を作製するような様式で一体化する。
【０２２９】
部位特異的組換え配列が細胞の内在性ゲノムＴＳＬＰＲポリペプチドコード領域のすぐ上流に配置された細胞株を使用するさらなる方法は、細胞株のゲノムの他の位置に第２の組換え部位を導入するために相同性組換えを使用することである。適切なリコンビナーゼ酵素は、次いで、二組換え部位細胞株に導入され、組換え現象（欠失、転化、および転移）を生じ（Ｓａｕｅｒ，１９９４，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，５：５２１−２７；Ｓａｕｅｒ，１９９３，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，２２５：８９０−９００）、これは、細胞の内在性ＴＳＬＰＲ遺伝子からの新規なまたは増加したＴＳＬＰＲポリペプチド産生を生じる新しいかまたは改変された転写ユニットを作製する。
【０２３０】
細胞の内在性ＴＳＬＰＲ遺伝子からのＴＳＬＰＲポリペプチドの発現を増加するため、または引き起こすためのさらなるアプローチは、細胞の内在性ＴＳＬＰＲ遺伝子からの新たなまたは増加したＴＳＬＰＲポリペプチドの産生を生じる様式で、遺伝子（例えば、転写因子）の発現を増加するかまたは引き起こし、そして／または遺伝子（例えば、転写リプレッサ）の発現を減少する工程を包含する。この方法は、天然に存在しないポリペプチド（例えば、転写因子ドメインに融合した部位特異的ＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチド）を、細胞の内在性ＴＳＬＰＲ遺伝子からの新たなまたは増加したＴＳＬＰＲポリペプチドの産生が起こるように、細胞に導入する工程を包含する。
【０２３１】
本発明はさらに、標的遺伝子の発現を変化させる方法において有用なＤＮＡ構築物に関する。特定の実施形態において、代表的なＤＮＡ構築物は、以下を含む：（ａ）１つ以上の標的配列、（ｂ）調節配列、（ｃ）エキソン、および（ｄ）不対スプライスドナー部位。ＤＮＡ構築物中の標的配列は、エレメント（ａ）〜（ｄ）の細胞中の標的遺伝子への組込みを指向し、その結果、これらのエレメント（ｂ）〜（ｄ）は、内在性標的遺伝子の配列に作動可能に連結される。別の実施形態において、ＤＮＡ構築物は、以下を含む：（ａ）１つ以上の標的配列、（ｂ）調節配列、（ｃ）エキソン、（ｄ）スプライスドナー部位、（ｅ）イントロン、および（ｆ）スプライスアクセプター部位。ここで、標的配列は、エレメント（ａ）〜（ｆ）の組込みを指向し、その結果、これらのエレメント（ｂ）〜（ｆ）は、内在性遺伝子に作動可能に連結される。標的配列は、相同性組換えが生じる細胞染色体ＤＮＡの予め選択された部位に対して相同性である。この構築物において、エキソンは、一般的に、調節配列の３’であり、そしてスプライスドナー部位は、このエキソンの３’である。
【０２３２】
特定の遺伝子の配列（例えば、本明細書中で記載されるＴＳＬＰＲポリペプチドの核酸配列）が公知である場合、遺伝子の選択された領域に対して相補的なＤＮＡの部分は、合成されるか、またはそうでなければ、例えば、目的の領域に結合している特定の認識部位におけるネイティブのＤＮＡの適切な制限等によって得られ得る。この部分は、細胞に挿入された際に、標的配列として働き、そしてそのゲノム内の相同性領域にハイブリダイズする。このハイブリダイゼーションが、ＤＮＡ複製の間に生じる場合、このＤＮＡの部分、およびそれに結合した任意のさらなる配列は、Ｏｋａｚａｋｉフラグメントとして作用し、そしてＤＮＡの新たに合成された娘鎖に組み込まれる。従って、本発明は、ＴＳＬＰＲポリペプチドをコードするヌクレオチドを含み、このヌクレオチドは、標的配列として使用され得る。
【０２３３】
ＴＳＬＰＲポリペプチド細胞療法（例えば、ＴＳＬＰＲポリペプチドを産生する細胞の移植）もまた企図される。この実施形態は、生物学的に活性な形態のＴＳＬＰＲポリペプチドを合成および分泌し得る細胞を移植する工程を包含する。このようなＴＳＬＰＲポリペプチド産生細胞は、ＴＳＬＰＲポリペプチドの天然のプロデューサーである細胞であり得るか、または組換え細胞であって、そのＴＳＬＰＲポリペプチドを産生する能力が、所望のＴＳＬＰＲポリペプチドをコードする遺伝子またはＴＳＬＰＲポリペプチドの発現を増大する遺伝子で形質転換することによって増大された、組換え細胞であり得る。このような改変は、遺伝子を送達し、その発現および分泌を促進するために適切なベクターによって達成され得る。ＴＳＬＰＲポリペプチドを投与されている患者における潜在的な免疫学的反応を最小化するために、外来のポリペプチドの投与を伴い得る場合、ＴＳＬＰＲポリペプチドを産生する天然の細胞が、ヒト起源であり、そしてヒトＴＳＬＰＲポリペプチドを産生することが好ましい。同様に、ＴＳＬＰＲポリペプチドを産生する組換え細胞が、ヒトＴＳＬＰＲポリペプチドをコードする遺伝子を含む発現ベクターで形質転換されることが好ましい。
【０２３４】
移植細胞は、周辺組織の浸潤を回避するようにカプセル化され得る。ヒトまたは非ヒト動物細胞は、生体適合性の半透性ポリマー封入物または膜（これは、ＴＳＬＰＲポリペプチドの放出を可能にするが、患者の免疫系または周辺組織からの他の有害な因子による細胞の崩壊を防止する）の形態で患者に移植され得る。あるいは、ＴＳＬＰＲポリペプチドをエキソビボで産生するように形質転換された患者自身の細胞が、このようなカプセル化を伴わずに、患者に直接移植され得る。
【０２３５】
生存細胞をカプセル化するための技術は当該分野で公知であり、そしてカプセル化された細胞の調製および患者へのそれらの移植は、慣用的に達成され得る。例えば、Ｂａｅｔｇｅら（ＰＣＴ公開ＷＯ９５／０５４５２およびＰＣＴ／ＵＳ９４／０９２９９）は、生物学的に活性な分子の効率的な送達のために遺伝子操作された細胞を含む膜カプセルを記載する。このカプセルは、生体適合性であり、そして容易に回収可能（ｒｅｔｒｉｅｖａｂｌｅ）である。このカプセルは、哺乳動物宿主に移植された際に、インビボでダウンレギュレーションに供されないプロモーターに作動可能に連結された生物学的に活性な分子をコードするＤＮＡ配列を含む組換えＤＮＡ分子でトランスフェクトされた細胞をカプセル化する。このデバイスは、レシピエント内の特定の部位への生存細胞由来の分子の送達を提供する。さらに、米国特許第４，８９２，５３８号；同第５，０１１，４７２号；および同第５，１０６，６２７号を参照のこと。生存細胞をカプセル化するための系は、ＰＣＴ公開ＷＯ９１／１０４２５（Ａｅｂｉｓｃｈｅｒら）に記載される。ＰＣＴ公開ＷＯ９１／１０４７０（Ａｅｂｉｓｃｈｅｒら）；Ｗｉｎｎら、１９９１，Ｅｘｐｅｒ．Ｎｅｕｒｏｌ．１１３：３２２−２９；Ａｅｂｉｓｃｈｅｒら、１９９１，Ｅｘｐｅｒ．Ｎｅｕｒｏｌ．１１１：２６９−７５；およびＴｒｅｓｃｏら、１９９２，ＡＳＡＩＯ  ３８：１７−２３もまた参照のこと。
【０２３６】
ＴＳＬＰＲポリペプチドのインビボおよびインビトロの遺伝子治療送達もまた想定される。遺伝子治療技術の一例は、構成的プロモーターまたは誘導的プロモーターに作動可能に連結され得る、ＴＳＬＰＲポリペプチドをコードするＴＳＬＰＲ遺伝子（ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡおよび／または合成ＤＮＡのいずれか）を使用して、「遺伝子治療ＤＮＡ構築物」を形成することである。このプロモーターは、内因性ＴＳＬＰＲ遺伝子に対して同種または異種であり得るが、ただし、これは、構築物が挿入される細胞または組織型において活性である。遺伝子治療ＤＮＡ構築物の他の成分は、必要に応じて、部位特異的組込みのために設計されるＤＮＡ分子（例えば、相同組換えのために有用な内因性配列）、組織特異的プロモーター、エンハンサーまたはサイレンサー、親細胞を超える選択的優性を提供し得るＤＮＡ分子、形質転換された細胞を同定するための標識として有用なＤＮＡ分子、ネガティブ選択系、細胞特異的結合因子（例えば、細胞標的化について）、細胞特異的内部移行因子、ベクターからの発現を増大する転写因子、およびベクターの産生を可能にする因子を含み得る。
【０２３７】
次いで、遺伝子治療ＤＮＡ構築物は、ウイルスベクターまたは非ウイルスベクターを使用して（エキソビボまたはインビボのいずれかで）細胞に導入され得る。遺伝子治療ＤＮＡ構築物を導入するための１つの方法は、本明細書中に記載されるようなウイルスベクターによる。特定のベクター（例えば、レトロウイルスベクター）は、ＤＮＡ構築物を細胞の染色体ＤＮＡに送達し、そしてこの遺伝子は、染色体ＤＮＡに組み込まれ得る。他のベクターは、エピソームとして機能し、そして遺伝子治療ＤＮＡ構築物は、細胞質に残る。
【０２３８】
さらに他の実施形態において、調節エレメントが、標的細胞におけるＴＳＬＰＲ遺伝子の制御された発現のために含められ得る。このようなエレメントは、適切なエフェクターに応答してオンになる（ｔｕｒｎ  ｏｎ）。このようにして、治療的ポリペプチドは、所望の場合に発現され得る。１つの従来の制御手段は、低分子結合ドメインおよび生物学的プロセスを開始し得るドメインを含むキメラタンパク質（例えば、ＤＮＡ結合タンパク質または転写活性化タンパク質）を二量化する低分子二量化剤またはラパログ（ｒａｐａｌｏｇ）の使用を包含する（ＰＣＴ公開ＷＯ９６／４１８６５、ＷＯ９７／３１８９８およびＷＯ９７／３１８９９を参照のこと）。タンパク質の二量化は、導入遺伝子の転写を開始するために使用され得る。
【０２３９】
代替の調節技術は、目的の遺伝子から発現されたタンパク質を、凝集体またはクラスターとして細胞の内側に貯蔵する方法を使用する。目的の遺伝子は、小胞体における凝集タンパク質の保持を生じる、条件的凝集ドメインを含む融合タンパク質として発現される。貯蔵されたタンパク質は安定であり、そして細胞の内側で不活性である。しかし、このタンパク質は、条件的凝集ドメインを除去する薬物（例えば、低分子リガンド）を投与することによって放出され得、それにより、凝集体またはクラスターを特異的に破壊し、その結果、このタンパク質は細胞から分泌され得る。Ａｒｉｄｏｒら、２０００，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８７：８１６−１７およびＲｉｖｅｒａら、２０００，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８７：８２６−３０を参照のこと。
【０２４０】
他の適切な制御手段または遺伝子スイッチとしては、本明細書中で記載される系が挙げられるが、これらに限定されない。ミフェプリストン（Ｍｉｆｅｐｒｉｓｔｏｎｅ）（ＲＵ４８６）は、プロゲステロンアンタゴニストとして使用される。改変されたプロゲステロンレセプターリガンド結合ドメインのプロゲステロンアンタゴニストへの結合は、２つの転写因子の二量体を形成することによって、転写を活性化し、次いで、これは核に至り、ＤＮＡに結合する。このリガンド結合ドメインは、天然のリガンドに結合するレセプターの能力を排除するように改変される。改変されたステロイドホルモンレセプター系はさらに、米国特許第５，３６４，７９１号、ならびにＰＣＴ公開ＷＯ９６／４０９１１およびＷＯ９７／１０３３７に記載される。
【０２４１】
さらに別の制御系は、エクジソンレセプター（細胞質レセプター）に結合し、そしてこれを活性化するエクジソン（ショウジョウバエステロイドホルモン）を使用する。次いで、このレセプターは核にトランスロケーションし、特定のＤＮＡ応答エレメント（エクジソン応答性遺伝子由来のプロモーター）に結合する。エクジソンレセプターは、トランス活性化ドメイン、ＤＮＡ結合ドメイン、およびリガンド結合ドメインを含み、転写を開始する。エクジソン系はさらに、米国特許第５，５１４，５７８号、およびＰＣＴ公開ＷＯ９７／３８１１７、ＷＯ９６／３７６０９、およびＷＯ９３／０３１６２に記載される。
【０２４２】
別の制御手段は、陽性テトラサイクリン制御可能トランス活性化因子を使用する。この系は、転写を活性化するポリペプチドに連結された変異ｔｅｔレプレッサタンパク質ＤＮＡ結合ドメイン（逆テトラサイクリン制御トランス活性化因子タンパク質を生じさせる変異ｔｅｔＲ−４アミノ酸の変化、すなわち、これは、テトラサイクリンの存在下でｔｅｔオペレーターに結合する）を含む。このような系は、米国特許第５，４６４，７５８号、同第５，６５０，２９８号、および同第５，６５４，１６８号に記載される。
【０２４３】
さらなる発現制御系および核酸構築物は、米国特許第５，７４１，６７９号および同第５，８３４，１８６号（Ｉｎｎｏｖｉｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．）に記載される。
【０２４４】
インビボ遺伝子治療は、ＴＳＬＰＲポリペプチドをコードする遺伝子を、ＴＳＬＰＲ核酸分子の局所的注射によって、または他の適切なウイルスもしくは非ウイルス性の送達ベクターによって、細胞に導入することにより達成され得る。Ｈｅｆｔｉ，１９９４，Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ２５：１４１８−３５。例えば、ＴＳＬＰＲポリペプチドをコードする核酸分子は、標的細胞への送達のためのアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターに含まれ得る（例えば、Ｊｏｈｎｓｏｎ，ＰＣＴ公開ＷＯ９５／３４６７０；ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９５／０７１７８を参照のこと）。組換えＡＡＶゲノムは、典型的に、機能的プロモーターおよびポリアデニル化配列に作動可能に連結した、ＴＳＬＰＲポリペプチドをコードするＤＮＡ配列に隣接するＡＡＶ逆末端反復を含む。
【０２４５】
代替の適切なウイルスベクターとしては、レトロウイルス、アデノウイルス、単純ヘルペスウイルス、レンチウイルス、肝炎ウイルス、パルボウイルス、パポバウイルス、ポックスウイルス、アルファウイルス、コロナウイルス、ラブドウイルス、パラミクソウイルス、およびパピローマウイルスのベクターが挙げられるが、これらに限定されない。米国特許第５，６７２，３４４号は、組換え神経栄養性ＨＳＶ−１ベクターを含むインビボウイルス媒介遺伝子移入系を記載する。米国特許第５，３９９，３４６号は、治療タンパク質をコードするＤＮＡセグメントを挿入するためにインビトロで処理されたヒト細胞の送達によって、治療タンパク質を患者に提供するためのプロセスの例を提供する。遺伝子治療技術の実施のためのさらなる方法および材料は、米国特許第５，６３１，２３６号（アデノウイルスベクターに関する）、同第５，６７２，５１０号（レトロウイルスベクターに関する）、同第５，６３５，３９９号（サイトカインを発現するレトロウイルスベクターに関する）に記載される。
【０２４６】
非ウイルス送達法としては、リポソーム媒介移入、裸のＤＮＡ送達（直接注射）、レセプター媒介移入（リガンド−ＤＮＡ複合体）、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈降、および微粒子銃（ｍｉｃｒｏｐａｒｔｉｃｌｅ  ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ）（例えば、遺伝子銃（ｇｅｎｅ  ｇｕｎ））が挙げられるが、これらに限定されない。遺伝子治療の材料および方法はまた、誘導的プロモーター、組織特異的エンハンサー−プロモーター、部位特異的組込みのために設計されたＤＮＡ配列、親細胞を超える選択的優性を提供し得るＤＮＡ配列、形質転換された細胞を同定するための標識、ネガティブな選択系および発現制御系（安全性の指標）、細胞特異的結合因子（細胞標的化のため）、細胞特異的インターナリゼーション因子、およびベクターによる発現を増大する転写因子ならびにベクターの製造方法を含み得る。遺伝子治療技術の実施のためのこのようなさらなる方法および材料は、米国特許第４，９７０，１５４号（エレクトロポレーション技術に関する）、同第５，６７９，５５９号（遺伝子送達のためのリポタンパク質含有系を記載する）、同第５，６７６，９５４号（リポソームキャリアに関する）、同第５，５９３，８７５号（リン酸カルシウムトランスフェクションのための方法を記載する）、および同第４，９４５，０５０号（生物学的に活性な粒子が一定の速度で細胞に噴霧され、それによりこの粒子がこの細胞の表面に浸透し、そしてこの細胞の内側に組み込まれるプロセスを記載する）、およびＰＣＴ公開ＷＯ９６／４０９５８（核リガンドに関する）に記載される。
【０２４７】
ＴＳＬＰＲ遺伝子治療または細胞治療は、同一または異なる細胞（単数または複数）における１つ以上のさらなるポリペプチドの送達をさらに含み得ることもまた企図される。このような細胞は、患者に別々に導入され得るか、またはこの細胞は、単一の移植可能デバイス（例えば、上記のカプセル化膜）に含められ得るか、あるいはこの細胞は、ウイルスベクターによって別々に改変され得る。
【０２４８】
遺伝子治療による細胞における内因性ＴＳＬＰＲポリペプチドの発現を増加する手段は、ＴＳＬＰＲポリペプチドプロモーターに１つ以上のエンハンサーエレメントを挿入することであり、ここでエンハンサーエレメントは、ＴＳＬＰＲ遺伝子の転写活性を増加させるように作用し得る。使用されるエンハンサーエレメントは、この遺伝子を活性化することを所望する組織に基づいて選択される（その組織においてプロモーター活性化を与えることが知られているエンハンサーエレメントが選択される）。例えば、ＴＳＬＰＲポリペプチドをコードする遺伝子がＴ細胞において「オンに変わる（ｔｕｒｎ  ｏｎ）」場合、ｌｃｋプロモーターエンハンサーエレメントが使用され得る。ここで、付加される転写エレメントの機能的部分は、標準的なクローニング技術を使用して、ＴＳＬＰＲポリペプチドプロモーターを含むＤＮＡのフラグメントに挿入され得る（そして必要に応じて、ベクターならびに／または５’および／もしくは３’隣接配列に挿入される）。「相同組換え構築物」として公知のこの構築物は、次いで、エキソビボまたはインビボのいずれかで、所望の細胞に導入され得る。
【０２４９】
遺伝子治療はまた、内因性プロモーターのヌクレオチド配列を改変することによって、ＴＳＬＰＲポリペプチド発現を減少させるために使用され得る。このような改変は、典型的に、相同組換え方法によって達成される。例えば、不活性化のために選択されたＴＳＬＰＲ遺伝子のプロモーターの全てまたは一部を含むＤＮＡ分子は、転写を調節するプロモーターの断片を除去および／または置換するように操作され得る。例えば、プロモーターの転写活性化因子のＴＡＴＡボックスおよび／または結合部位は、標準的な分子生物学的技術を使用して欠失され得；このような欠失は、プロモーター活性を阻害し得、それによって、対応するＴＳＬＰＲ遺伝子の転写を阻止し得る。プロモーターにおけるＴＡＴＡボックスまたは転写活性化因子結合部位の欠失は、ＴＳＬＰＲポリペプチドプロモーター（調節されるＴＳＬＰＲ遺伝子と同じかまたは関連の種由来）のすべてまたは関連の部分を含むＤＮＡ構築物を生成することによって達成され得、ここで、１つ以上のＴＡＴＡボックスおよび／または転写活性化因子結合部位のヌクレオチドは、１つ以上のヌクレオチドの置換、欠失、および／または挿入によって変異される。結果として、ＴＡＴＡボックスおよび／または活性化因子結合部位は、活性を減少するか、または完全に不活化される。この構築物（これはまた、典型的に、改変されたプロモーターセグメントに隣接したネイティブの（内因性）５’および３’ＤＮＡ配列に対応する少なくとも約５００塩基のＤＮＡを含む）は、直接または本明細書中に記載されるようなウイルスベクターを介してのいずれかで、適切な細胞に（エキソビボまたはインビボのいずれかで）導入され得る。典型的に、細胞のゲノムＤＮＡへのこの構築物の組込みは、相同組換えを介し、ここで、このプロモーター構築物の５’および３’ＤＮＡ配列は、内因性染色体ＤＮＡへのハイブリダイゼーションによって、改変プロモーター領域を組み込むのを補助するように作用し得る。
【０２５０】
（治療的用途）
ＴＳＬＰＲ核酸分子、ポリペプチド、ならびにそれらのアゴニストおよびアンタゴニストは、多数の疾患、障害または状態（ＴＳＬＰ関連の疾患、障害、または状態を含む）を処置、診断、回復または予防するために使用され得る。ＴＳＬＰ関連の疾患、障害、または状態は、Ｂ細胞の発生、Ｔ細胞の発生、Ｔ細胞レセプター遺伝子の再配列、またはＳｔａｔ５転写因子の調節に関与し得る。ＴＳＬＰの所望されないレベルによって引き起こされるかまたは媒介される疾患は、本発明の範囲内に含まれる。所望されないレベルとしては、ＴＳＬＰの過剰なレベル、およびＴＳＬＰの正常以下のレベルが挙げられる。
【０２５１】
ＴＳＬＰＲポリペプチドアゴニストおよびアンタゴニストは、ＴＳＬＰＲポリペプチド活性を調節し、ＴＳＬＰＲポリペプチドの成熟形態の少なくとも１つの活性を増加または減少する分子を含む。アゴニストまたはアンタゴニストは、ＴＳＬＰＲポリペプチドと相互作用し、それによりその活性を調節する補因子（例えば、タンパク質、ペプチド、炭水化物、脂質または低分子量分子）であり得る。潜在的なポリペプチドアゴニストまたはアンタゴニストは、タンパク質の細胞外ドメインの一部または全てを含むＴＳＬＰＲポリペプチドの可溶性または膜結合形態のいずれかと反応する抗体を含む。ＴＳＬＰＲポリペプチド発現を調節する分子は、典型的に、発現のアンチセンス制御因子として作用し得るＴＳＬＰＲポリペプチドをコードする核酸を含む。
【０２５２】
ＴＳＬＰＲの核酸分子、ポリペプチド、ならびにそのアゴニストまたはアンタゴニストは、処置される状態に適切であるように、１つ以上のサイトカイン、増殖因子、抗生物質、抗炎症剤および／または化学療法剤と組み合わせて（同時にかまたは引き続き）使用され得る。
【０２５３】
望ましくないレベルのＴＳＬＰＲポリペプチドによって引き起こされるかまたは媒介される他の疾患または障害は、本発明の範囲内に含まれる。望ましくないレベルとしては、過度のレベルのＴＳＬＰＲポリペプチド、および正常以下のレベルのＴＳＬＰＲポリペプチドが挙げられる。
【０２５４】
（ＴＳＬＰＲ核酸およびＴＳＬＰＲポリペプチドの使用）
本発明の核酸分子（それ自体は生物学的に活性なポリペプチドをコードしない核酸分子を含む）を使用して、ＴＳＬＰＲ遺伝子および関連遺伝子の染色体上の位置をマッピングし得る。マッピングは、当該分野で公知の技術（例えば、ＰＣＲ増幅およびインサイチュハイブリダイゼーション）により行われ得る。
【０２５５】
ＴＳＬＰＲ核酸分子（それ自体は生物学的に活性なポリペプチドをコードしない核酸分子を含む）は、哺乳動物組織または体液サンプル中のＴＳＬＰＲ核酸分子の存在について、定性的または定量的のいずれかで試験するための、診断アッセイにおけるハイブリダイゼーションプローブとして有用であり得る。
【０２５６】
他の方法はまた、１つ以上のＴＳＬＰＲポリペプチドの活性を阻害することが所望される場合に使用され得る。このような阻害は、発現制御配列（三重らせん形成）またはＴＳＬＰＲ  ｍＲＮＡに相補的でありかつ発現制御配列（三重らせん形成）またはＴＳＬＰＲ  ｍＲＮＡにハイブリダイズする核酸分子によりもたらされ得る。例えば、アンチセンスＤＮＡまたはＲＮＡ分子（これらは、ＴＳＬＰＲ遺伝子の少なくとも一部に相補的である配列を有する）は、細胞中に導入され得る。アンチセンスプローブは、本明細書中に開示されるＴＳＬＰＲ遺伝子の配列を使用して、利用可能な技術により設計され得る。代表的には、このようなアンチセンス分子の各々は、選択された各ＴＳＬＰＲ遺伝子の開始部位（５’末端）に相補的である。このアンチセンス分子が次いで、対応するＴＳＬＰＲ  ｍＲＮＡにハイブリダイズする場合、このｍＲＮＡの翻訳は、防止されるかまたは低減される。アンチセンスインヒビターは、細胞または生物におけるＴＳＬＰＲポリペプチドの減少または不在に関連する情報を提供する。
【０２５７】
あるいは、遺伝子治療を使用して、１つ以上のＴＳＬＰＲポリペプチドの優性ネガティブインヒビターを作製し得る。この状況において、各選択されたＴＳＬＰＲポリペプチドの変異体ポリペプチドをコードするＤＮＡは、調製され得、そして本明細書中に記載されるウイルスまたは非ウイルスの方法のいずれかを使用して患者の細胞中に導入され得る。このような変異体の各々は、代表的にはその生物学的役割において内因性ポリペプチドと競合するように設計される。
【０２５８】
さらに、ＴＳＬＰＲポリペプチド（生物学的に活性でも活性でなくても）は、免疫原として使用され得、すなわち、これらのポリペプチドは、それに対して抗体が誘発され得る少なくとも１つのエピトープを含有する。ＴＳＬＰＲポリペプチドに結合する選択的結合因子（本明細書中に記載されるように）は、インビボおよびインビトロでの診断目的のために使用され得、これらの目的としては、体液サンプルまたは細胞サンプル中のＴＳＬＰＲポリペプチドの存在を検出するための標識された形態での使用を含むが、これに限定されない。これらの抗体をまた使用して、本明細書中に列挙される疾患および障害を含む多数の疾患および障害を、予防、処置、または診断し得る。これらの抗体は、ＴＳＬＰＲポリペプチドの少なくとも１つの活性特徴を低減するかまたは遮断するように、ＴＳＬＰＲポリペプチドに結合し得るか、またはポリペプチドに結合してＴＳＬＰＲポリペプチドの少なくとも１つの活性特徴を増加し得る（ＴＳＬＰＲポリペプチドの薬物動態を増加させることによるものを含む）。
【０２５９】
本発明のマウスおよびヒトのＴＳＬＰＲ核酸はまた、対応する染色体ＴＳＬＰＲポリペプチド遺伝子を単離するために有用なツールである。例えば、ＴＳＬＰＲ配列を含むマウス染色体ＤＭＡは、ノックアウトマウスを構築し、それによりＴＳＬＰＲポリペプチドのインビボでの役割の試験を可能にするために用いられ得る。ヒトＴＳＬＰＲゲノムＤＮＡは、遺伝性組織変性疾患を同定するために用いられ得る。
【０２６０】
以下の実施例は、例示目的のみのために意図され、本発明の範囲をどちらにしても限定するとは解釈されるべきではない。
【０２６１】
（実施例１：マウスおよびヒトＴＳＬＰＲポリペプチド遺伝子のクローニング）
概して、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（前出）に記載されるような材料および方法を、マウスおよびヒトＴＳＬＰＲポリペプチドをコードする遺伝子をクローン化および分析するために使用した。
【０２６２】
マウスＴＳＬＰＲポリペプチドをコードする配列を、エリスロポエチンレセプターの細胞質ドメインに対応する配列を用いて、ＥＳＴデータベースのＢＬＡＳＴサーチにおいて同定した。いくつかの重複するマウスＥＳＴ（これは、新規なＩ型サイトカインレセプター分子をコードする）をＢＬＡＳＴサーチにおいて得た。これらの配列によりコードされるサイトカインレセプターの細胞質ドメインは、共通するサイトカインレセプターγ鎖（γｃ）、エリスロポエチンレセプター、およびＩＬ−９レセプターα鎖の細胞質ドメインに対して有意な類似性を共有することが見出された。
【０２６３】
この共通するサイトカインレセプターγ鎖は、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−７、ＩＬ−９、およびＩＬ−１５についてのレセプターの必須のサブユニットである（Ｎｏｇｕｃｈｉら、１９９３、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６２：１８７７−８０；Ｋｏｎｄｏら、１９９４、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６３：１４５３−５４；Ｋｏｎｄｏら、１９９３、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６２：１８７４−７７；Ｒｕｓｓｅｌｌら、１９９４、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６６：１０４２−４５；Ｔａｋｅｓｈｉｔａら、１９９２、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５７：３７９−８２；Ｒｕｓｓｅｌｌら、１９９３、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６２：１８８０−８３；Ｇｉｒｉら、１９９４、ＥＭＢＯ  Ｊ．１３：２８２２−３０；Ｋｉｍｕｒａら、１９９５、Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．７：１１５−２０）。ヒトにおけるγｃの変異は、Ｘ連鎖重症複合免疫不全を生じ得る（Ｎｏｇｕｃｈｉら、１９９３、Ｃｅｌｌ  ７３：１４７−５７；Ｌｅｏｎａｒｄら、１９９５、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．１４８：９７−１１４）。
【０２６４】
ＢＬＡＳＴ検索において同定されたいずれのＥＳＴ配列も、ＴＳＬＰＲポリペプチドのオープンリーディングフレーム全体を含んでいなかったので、マウス胚ライブラリーをスクリーニングして、全長ｃＤＮＡを得た。最も長いインサートを含むポジティブクローンを用いて、標準的方法によりプラスミドＤＮＡを調製した。このコロニー由来のｃＤＮＡインサートは、長さが２ｋｂであった。ＤＮＡ配列分析により、このクローンが、ＴＳＬＰＲポリペプチドのリーディングフレーム全体を含んでいることを確認した。
【０２６５】
マウスＴＳＬＰＲポリペプチドについての全長ｃＤＮＡの配列分析により、この遺伝子は、１１１０ｂｐのオープンリーディングフレーム（３７０アミノ酸のタンパク質をコードし、そのアミノ末端に長さ１７アミノ酸の潜在的なシグナルペプチドを有する）を含むことが示された（図１Ａ−１Ｂ；推定シグナルペプチドは下線により示される）。このオープンリーディングフレームは、２つの潜在的Ｎ結合型グリコシル化部位、および１つのチロシン残基を含む１０４アミノ酸の細胞質ドメインを有するＩ型膜貫通タンパク質をコードすることが見出された。
【０２６６】
対照的に、マウスγｃは、３６９アミノ酸を含み、２つのチロシン残基を含む８６アミノ酸の細胞質ドメインを有する（Ｋｕｍａｋｉら、１９９３、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１９３：３５６−６３；Ｃａｏら、１９９３、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：８４６４−６８；Ｋｏｂａｙａｓｈら、１９９３：Ｇｅｎｅ  １３０：３０３−０４）。図２は、マウスＴＳＬＰＲポリペプチド（上の配列）およびマウスγｃ（下の配列）のアミノ酸配列アライメントを例示する。マウスＴＳＬＰＲポリペプチドは、アミノ酸レベルで、γｃと２６％の配列同一性および４７％の配列類似性を共有することが見出された。マウスＴＳＬＰＲポリペプチドの配列は、システインのわずか１対が保存され、Ｗ−Ｓ−Ｘ−Ｗ−Ｓ（配列番号１５）モチーフが、Ｗ−Ｔ−Ａ−Ｖ−Ｔ（配列番号１６）モチーフにより置換されているという点で、Ｉ型サイトカインレセプターについて、いくらか代表的ではない。マウスＴＳＬＰＲポリペプチドの推定分子量は、３７ｋＤである。
【０２６７】
ヒトＴＳＬＰＲポリペプチドをコードする配列を、クエリー配列としてマウスＴＳＬＰＲ核酸配列を用いて、ｃＤＮＡ配列の私設データベース（Ａｍｇｅｎ，Ｔｈｏｕｓａｎｄ  Ｏａｋｓ，ＣＡ）のＢＬＡＳＴサーチにおいて同定した。ヒトｃＤＮＡ配列を含み、マウスＴＳＬＰＲ核酸配列と最も大きな相同性を共有する２つのクローンを、この検索において同定した：９６０４９２７（配列番号１０）および９５０８９９０（配列番号１１）。ヒトＴＳＬＰＲポリペプチドの全長ｃＤＮＡ（クローン９６０４９２７に含まれる）の配列分析により、ヒトＴＳＬＰＲ遺伝子が１１１３ｂｐのオープンリーディングフレーム（３７１アミノ酸のタンパク質をコードし、そのアミノ末端に長さ２２アミノ酸の潜在的シグナルペプチドを有する）を含むことが示された（図３Ａ−３Ｂ；推定シグナルペプチドは、下線により示される）。
【０２６８】
クローン９５０８９９０は、３７９アミノ酸のタンパク質をコードする１１３７ｂｐのオープンリーディングフレームを含む（図４Ａ−４Ｂ）。このクローンは、本質的には、全長ヒトＴＳＬＰＲポリペプチド配列および、ＦＬＡＧエピトープに対応するカルボキシ末端にさらなる８アミノ酸を含む。図５は、マウスＴＳＬＰＲポリペプチド（上の配列）とヒトＴＳＬＰＲポリペプチド（下の配列）とのアミノ酸配列アラインメントを示す。マウスおよびヒトＴＳＬＰＲ核酸およびアミノ酸配列の有用性は、ＴＳＬＰにより利用されるシグナル伝達経路の解明をさらに補助する。
【０２６９】
（実施例２：ＴＳＬＰＲポリペプチドの発現）
マウスＴＳＬＰＲのオープンリーディングフレームをコードするｃＤＮＡ構築物を、３５ＳメチオニンおよびＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離された産物の存在下で、インビトロで転写および翻訳した。図６Ａは、約４０ｋＤの単一の種が得られたゲルのオートラジオグラムを示す。
【０２７０】
図６Ｂは、マウスＴＳＬＰＲポリペプチドの細胞外ドメインに対して惹起されたウサギポリクローナル抗血清を用いた、増殖因子依存性プレＢ細胞株ＮＡＧ８／７におけるマウスＴＳＬＰＲポリペプチドの免疫沈降を示す。ウサギポリクローナル抗血清を、マウスＴＳＬＰＲポリペプチド−グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ融合タンパク質（これは、ｐＧＥＸ４Ｔ２発現ベクター（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）にクローニングされ、細菌において発現された）に対して生成した。代謝標識の前に、ＮＡＧ８／７細胞を、１０％ウシ胎仔血清、抗生物質およびＴＳＬＰを補充したＲＰＭＩ中で増殖させた。
【０２７１】
ＮＡＧ８／７細胞を、３５Ｓ−メチオニンおよびシステインで代謝標識し、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、およびプロテアーゼインヒビター中で溶解し、この溶解物をウサギポリクローナル抗血清（レーン２）または免疫前血清（レーン１）のいずれかとともに一晩インキュベートした。この免疫複合体をプロテインＧセファロースに捕捉し、溶解緩衝液で洗浄し、次いで、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離した。ポリクローナル抗血清は、プレＢ細胞株ＮＡＧ８／７における約５０ｋＤの広いバンドを特異的に免疫沈降した（図６Ｂ）。インビトロ翻訳により生成された産物と比較して、より大きなサイズの免疫沈降した産物は、細胞外ドメインにおけるＮ結合型糖質部分の付加と一致した。トランスフェクト２９３細胞およびいくつかの造血細胞株（すなわち、３２Ｄ、ＢａＦ３、およびＷＥＨＩ−３）のフローサイトメトリー分析により、マウスＴＳＬＰＲが細胞表面で発現されたことが確認された。
【０２７２】
（実施例３：ＴＳＬＰＲ  ｍＲＮＡの発現）
マウスＴＳＬＰＲの組織分布を、ノーザンブロット分析によって試験した。複数のマウス組織ノーザンブロット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）を、標準的な技術を用いて、３２Ｐ標識したＴＳＬＰＲ  ｃＤＮＡプローブでスクリーニングした。マウスＴＳＬＰＲ転写物を、試験した組織のほぼ全てにおいて検出した。最も高いレベルの発現は、肺、肝臓および精巣において検出された（図６Ｃ）。低下したレベルの発現は、心臓、脳、脾臓、および骨格菌において検出された。約２ｋｂおよび２．２ｋｂの２つの転写物をいくつかの組織で検出したのに対して、約２ｋｂの単一の転写物のみが他の組織において検出された。マウスＴＳＬＰＲ  ｍＲＮＡの広い組織分布は、γｃについて観察された発現の比較的制限されたリンパ−造血パターンとは異なる。
【０２７３】
ＴＳＬＰＲ  ｍＲＮＡの発現を、以下のようにインサイチュハイブリダイゼーションによって局在化し得る。正常胚および成体マウス組織のパネルを４％パラホルムアルデド中で固定し、パラフィンに包埋し、そして５μｍに切片化した。切片化した組織を、０．２Ｍ  ＨＣｌ中で透過化処理し、プロテイナーゼＫで消化し、そしてトリエタノールアミンおよび無水酢酸でアセチル化する。切片を、ハイブリダイゼーション溶液（３００ｍＭ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、１×デンハート溶液、０．２％  ＳＤＳ、１０ｍＭ  ＤＴＴ、０．２５ｍｇ／ｍｌ  ｔＲＮＡ、２５μｇ／ｍｌ  ポリＡ、２５μｇ／ｍｌ  ポリＣおよび５０％ホルムアミド）中で１時間６０℃でプレハイブリダイズし、次いで、１０％デキストランおよび２×１０４ｃｐｍ／μｌの３３Ｐ−標識アンチセンスリボプローブ（ヒトＴＳＬＰＲ遺伝子に相補的）を含有する同じ溶液中で６０℃で一晩ハイブリダイズする。標準的技術を用いて、ヒトＴＳＬＰＲ  ｃＤＮＡ配列を含有するクローンのインビトロ転写によって、このリボプローブを得る。
【０２７４】
ハイブリダイゼーション後、切片を、ハイブリダイゼーション溶液中でリンスし、ＲＮａｓｅＡで処理してハイブリダイズしていないプローブを消化し、次いで０．１×ＳＳＣ中で５５℃で３０分間洗浄する。次いで、切片をＮＴＢ−２エマルジョン（Ｋｏｄａｋ，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）に浸し、４℃に３週間曝し、発色させ、そしてヘマトキシリンおよびエオシンで対比染色する。組織形態学およびハイブリダイゼーションシグナルを、脳（矢状断面１つおよび冠状断面２つ）、胃腸管（食道、胃、十二指腸、空腸、回腸、近位結腸、および遠位結腸）、下垂体、肝臓、肺、心臓、脾臓、胸腺、リンパ節、腎臓、副腎、膀胱、膵臓、唾液腺、雄性および雌性生殖器（雌性の卵巣、卵管、および子宮；ならびに雄性の精巣、精巣上体、前立腺、精嚢および輸精管）、ＢＡＴおよびＷＡＴ（皮下、腎臓周囲）、骨（大腿）、皮膚、乳房、および骨格筋についての暗野かつ標準のイルミネーションによって同時に分析する。
【０２７５】
（実施例４：マウスＴＳＬＰＲポリペプチドの生物学的活性）
マウスＴＳＬＰＲポリペプチドとエリスロポエチンレセプターとの間の類似性により、マウスＴＳＬＰＲ（エリスロポエチンレセプター様である）がホモダイマー化により活性化され得ることが示唆された。このことを、ｃ−Ｋｉｔレセプターの細胞外ドメインおよび膜貫通ドメイン、ならびにマウスＴＳＬＰＲポリペプチドの細胞質ドメインに由来するキメラ構築物を用いて、増殖アッセイにおいて試験した。この構築物を生成するために、ｃ−Ｋｉｔの細胞外ドメインおよび膜貫通ドメイン、ならびにＴＳＬＰＲの細胞質ドメインをＰＣＲにより増幅し、標準的技術を用いてレトロウイルスベクターｐＭＸ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰに連結した。
【０２７６】
ＩＬ−２依存性ＣＴＬＬ２細胞を、ｃ−Ｋｉｔ／ＴＳＬＰＲとｃ−Ｋｉｔ／β、ｃ−Ｋｉｔ／βとｃ−Ｋｉｔ／γ、またはｃ−Ｋｉｔ／γ単独をコードする発現構築物で安定に形質転換した。ｃ−Ｋｉｔ／βとｃ−Ｋｉｔ／γの構築物は、Ｎｅｌｓｏｎら、１９９４、Ｎａｔｕｒｅ  ３６９：３３３−３６に記載されるとおりであった。トランスフェクション後、ＣＴＬＬ２細胞を、ＩＬ−２について除去し、４８ウェルディッシュに１０，０００細胞／ウェルで移し、ｃ−Ｋｉｔについてのリガンドである幹細胞因子（ＳＣＦ）の存在下および非存在下で増殖させた。細胞を、培養で増殖させて７日後に計数した。
【０２７７】
図７は、ＩＬ−２がＳＣＦにより置換された場合に、キメラｃ−Ｋｉｔ／ＴＳＬＰＲポリペプチドを安定に発現するＣＴＬＬ２細胞が増殖できなかったことを示し、このことは、マウスＴＳＬＰＲポリペプチドの細胞質ドメインの単純なホモダイマー化では、増殖シグナルを誘導するに不十分であることを示唆する。同様の結果が、キメラｃ−Ｋｉｔ／γｃポリペプチドを用いた増殖実験において得られた（Ｎｅｌｓｏｎら、前出）。さらに、ＣＴＬＬ２細胞をｃ−Ｋｉｔ／ＴＳＬＰＲおよびｃ−Ｋｉｔ／βで同時ドランスフェクトした場合、この細胞はなお増殖できなかった。しかし、ｃ−Ｋｉｔ／βおよびｃ−Ｋｉｔ／γで同時トランスフェクトしたＣＴＬＬ２細胞は、ＳＣＦとのインキュベーション後に増殖できた。このことは、ＩＬ−２Ｒβ鎖の細胞質ドメインが、増殖を開始するためにマウスＴＳＬＰＲポリペプチドの細胞質ドメインと協同せず、マウスＴＳＬＰＲポリペプチドが、シグナル伝達に関与する他のいくつかのレセプターとオリゴマー化し得ることを示唆した。
【０２７８】
マウスＴＳＬＰＲポリペプチドとγｃとの間の類似性により、マウスＴＳＬＰＲがＩＬ−２サイトカインサブファミリーのメンバーのいくつかに結合する能力を有し得ることが示唆された。このことを、１２５Ｉ標識したＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−７およびＩＬ−１５を用いたアフィニティー標識アッセイにおいて試験した。１２５Ｉ標識したサイトカインを添加する前に、２９３細胞を、γｃまたはマウスＴＳＬＰＲポリペプチドいずれかの存在下で、サイトカイン特異的サブユニットＩＬ−２Ｒβ、ＩＬ−４Ｒα、またはＩＬ−７Ｒαで再構成した。試験したリガンドはいずれも、たとえγｃがサイトカイン特異的サブユニットと同時発現した場合にリガンドが効率的に結合したとしても、マウスＴＳＬＰＲがサイトカイン特異的サブユニットと同時発現した場合に結合を示さなかった。このことは、マウスＴＳＬＰＲポリペプチドが新規なサイトカインを結合するか、または新規もしくは試験されていないサブユニットとともに公知のサイトカインを結合するかのいずれかであることを示唆した。
【０２７９】
胸腺間質のリンホポエチン（ｌｙｍｐｈｏｐｏｉｅｔｉｎ）（ＴＳＬＰ）は、その生物学的活性がＩＬ−７の生物学的活性と重なるサイトカインである。ＴＳＬＰ活性は、元来、胎児肝臓造血前駆細胞由来のマウスＩｇＭ＋  Ｂ細胞の発生を支持する胸腺間質細胞株の馴化培地中で同定された（Ｆｒｉｅｎｄら、１９９４、Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．２２：３２１−２８）。さらに、ＴＳＬＰは、長期骨髄培養物においてＢ細胞のリンパ球産生を促進し得、胸腺細胞および成熟Ｔ細胞の両方を同時刺激し得る（Ｆｒｉｅｎｄら、前出；Ｌｅｖｉｎら、１９９９、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６２：６７７−８３）。
【０２８０】
ＩＬ−７はまた、これらの活性を有するが（Ｓｕｄａ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｂｌｏｏｄ  ７４：１９３６−４１；Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４２：３８７５−８３；Ｓｕｄｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７０：３３３−３８）、ＴＳＬＰは、ＩｇＭ＋未成熟Ｂ細胞段階までＢリンパ球産生を促進する一方で、ＩＬ−７は、主にＩｇＭ−プレＢ細胞の生成を促進するという点で独特である（Ｌｅｖｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，前出；Ｃａｎｄｅｉａｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ６：５０１−０８）。ＩＬ−７およびＴＳＬＰの重なる生物学的活性についての１つのあり得る説明は、ＴＳＬＰがＩＬ−７Ｒα鎖を含むレセプターを介してシグナル伝達することである（Ｌｅｖｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，前出）。しかし、抗体阻害実験により、ＴＳＬＰが、その効果を発揮するためにγｃを必要としないことが示された（Ｌｅｖｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，前出）。これらの結果は、ＴＳＬＰが、ＩＬ−７Ｒαの存在下でマウスＴＳＬＰＲポリペプチドを結合することを示唆した。
【０２８１】
ＩＬ−７Ｒαの存在下でのＴＳＬＰのＴＳＬＰＲポリペプチドへの結合を、アフィニティー標識アッセイにおいて試験した。マウスＩＬ−７Ｒα、マウスＴＳＬＰＲポリペプチド、マウスＩＬ−７ＲαおよびマウスＴＳＬＰＲポリペプチド、またはヒトＩＬ−７ＲαおよびマウスＴＳＬＰＲポリペプチドについての発現構築物でトランスフェクトした５×１０６の２９３細胞に、１−５ｎＭ  １２５Ｉ標識ＴＳＬＰを添加することにより、アフィニティー標識アッセイを行った。ＩＯＤＯ−ＧＥＮ（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）および２ｍＣｉ  １２５Ｉを１ｕｇのＴＳＬＰに添加することにより、ヨウ素化したＴＳＬＰを調製した。この方法により、約２００−３００μＣｉ／μｇの比活性を得た。アフィニティー標識の前に、リン酸カルシウム法（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ−５  Ｐｒｉｍｅ，Ｂｏｕｌｄｅｒ，ＣＯ）を用いて２９３細胞を一時的にトランスフェクトした。１２５Ｉ−ＴＳＬＰとともに２時間インキュベーションした後に、細胞を０．１ｍｇ／ｍｌのジスクシンイミジルスベレート（Ｐｉｅｒｃｅ）と架橋し、溶解緩衝液中で溶解し、この溶解物をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離した。
【０２８２】
図８Ａに示されるように、１２５Ｉ−ＴＳＬＰは、マウスＩＬ−７ＲαおよびマウスＴＳＬＰＲポリペプチドのヘテロダイマーに結合した（レーン４）。上のバンドは、架橋したマウスＩＬ−７Ｒαに対応し、下のバンドは、架橋したマウスＴＳＬＰＲポリペプチドに対応する。さらに、１２５Ｉ−ＴＳＬＰはまた、ヒトＩＬ−７ＲαおよびマウスＴＳＬＰＲポリペプチドのヘテロダイマーを結合した（レーン５）。マウスＩＬ−７Ｒα単独では、ＴＳＬＰ結合は観察されなかった（レーン２）。
【０２８３】
アフィニティー標識アッセイもまた、マウスＴＳＬＰＲポリペプチドのＦＬＡＧタグ化バージョンを用いて行った。ＦＬＡＧエピトープに対応する配列を含む３’プライマーを用いて、マウスＴＳＬＰＲ−ＦＬＡＧポリペプチドを、ＴＳＬＰＲポリペプチドのコード領域を含むフラグメントを増幅するＰＣＲによって得た。次いで、このＰＣＲ産物をｐＣＲ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にサブクローニングし、得られたクローンを、配列決定によって分析した。細胞溶解物を抗ＦＬＡＧモノクローナルＭ２抗体で免疫沈降したことを除いて、アフィニティー標識アッセイを本明細書中に記載のように行った。図８Ｂに示されるように、ＴＳＬＰＲ免疫沈降後に、架橋したＴＳＬＰＲバンドが観察され（レーン１）、これは、ＴＳＬＰがＴＳＬＰＲ単独に弱く結合することを示す。
【０２８４】
マウスＩＬ−７が、ＴＳＬＰＲポリペプチドおよびＩＬ−７Ｒαを発現する細胞において、ＴＳＬＰ結合について競合し得るか否かを試験するために、競合アッセイを行った。細胞溶解物を、漸増量の非標識マウスＩＬ−７が１２５Ｉ−ＴＳＬＰとともに添加されることを除いて、本明細書中に記載のように分析した。図８Ｃに示されるように、過剰なマウスＩＬ−７は、ＩＬ−７Ｒα／ＴＳＬＰＲポリペプチドへテロダイマーへのＴＳＬＰの結合を阻害した。アフィニティー標識アッセイは、ＴＳＬＰの結合に関して、ＩＬ−７ＲαおよびマウスＴＳＬＰＲポリペプチドの共同性を示した。これらのアッセイはまた、ＩＬ−７がＴＳＬＰの結合について競合することを確立し、このことは、インビボでこれらの２つのサイトカインの間での潜在的な競合について暗示する。
【０２８５】
マウスＩＬ−７ＲαおよびマウスＴＳＬＰＲポリペプチド、またはマウスＩＬ−７Ｒα単独でトランスフェクトした２９３細胞へのＴＳＬＰの結合を、置換結合アッセイ（ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ａｓｓａｙ）において分析した。２回洗浄した後に、１×１０６のトランスフェクト２９３細胞を、一定量の１２５Ｉ−標識ＴＳＬＰ（約２０，０００ｃｐｍ）および種々の量の非標識ＴＳＬＰ中でインキュベートした。３時間のインキュベーション後、処置した細胞をオリーブ油およびＮ−ブチルフタレート中で遠心分離することにより培地から分離した。細胞に結合した放射活性をγカウンターを用いて測定した。
【０２８６】
図９Ａに示されるように、１２５Ｉ−ＴＳＬＰの非特異的結合は、マウスＩＬ−７Ｒα単独（またはベクター単独）でトランスフェクトされた細胞で観察されたが、１２５Ｉ−ＴＳＬＰの特異的結合は、非標識ＴＳＬＰが、１２５Ｉ−ＴＳＬＰの結合について競合することを除いて、ＩＬ−７ＲαおよびＴＳＬＰＲポリペプチドの両方でトランスフェクトされた細胞で観察された。ＴＳＬＰＲポリペプチド単独でトランスフェクトされた細胞は、非常に低い結合を示した。スキャッチャード変換により結合データの分析を、ＬＩＧＡＮＤコンピュータープログラム（Ｍｕｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｒｏｄｂａｒｄ，１９８０，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０７：２２０−３９）を用いて行った。ＴＳＬＰＲポリペプチドおよびＩＬ−７Ｒαを発現する細胞へのＴＳＬＰの結合についてのＫｄは、約１３ｎＭであると決定された（図９Ｂ）。７回の独立した実験において、Ｋｄは、１．２〜４０ｎＭの範囲であることが見出された。ＴＳＬＰＲポリペプチド単独を発現する細胞についてのＴＳＬＰの結合活性が非常に低いことに起因して、これらの細胞についてのＫｄを決定することはできなかった。また、置換結合アッセイを、ＮＡＧ８／７細胞（これは、ＴＳＬＰに応答して、ＴＳＬＰレセプターを構成的に発現し、増殖する）を用いて行った（Ｆｒｉｅｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，前出；Ｌｅｖｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，前出）。これらの置換結合アッセイにおいて、５×１０６のＮＡＧ８／７細胞を、一定量の１２５Ｉ標識ＴＳＬＰ（約１８０，０００ｃｐｍ）および種々の量の標識ＴＳＬＰ中でインキュベートした。このアッセイの残りを本明細書中に記載のように行った。図９Ｃに示されるように、ＮＡＧ８／７細胞を用いて得た結合データのスキャッチャード変換により、細胞が、約２．２ｎＭのＫｄを有する単一のクラスのレセプターを発現した（トランスフェクトした２９３細胞を用いて得た結果と類似する結果）ことを示唆した。
【０２８７】
また、置換結合アッセイを行って、ＴＳＬＰＲポリペプチドおよびＩＬ−７Ｒαでトランスフェクトした２９３細胞においてＩＬ−７または非標識ＴＳＬＰによる１２５Ｉ標識ＴＳＬＰの置換を比較した。図９Ｄは、マウスＩＬ−７がＴＳＬＰＲポリペプチドに対する結合について競合することを示す。
【０２８８】
ＩＬ−７またはＴＳＬＰのいずれかでのＮＡＧ８／７細胞の処置が、ＳＴＡＴ５を活性化することが以前示された（Ｆｒｉｅｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，前出；Ｌｅｖｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，前出）。ＳＴＡＴ５活性化におけるＴＳＬＰＲポリペプチドのあり得る役割を、ＨｅｐＧ２細胞を用いてＣＡＴアッセイにおいて分析した。ＩＬ−７ＲαおよびＴＳＬＰＲ、またはＩＬ−７Ｒαおよびγｃについての発現構築物を、リン酸カルシウム法により、ｐＨＲＲＥ−ＣＡＴベクターとともにＨｅｐＧ２細胞に導入した。ｐＨＲＲＥ−ＣＡＴベクターは、２７ｂｐのサイトカイン誘導性造血素レセプター応答エレメントの８つのタンデムコピーおよびＳＴＡＴ５ｂを含む（Ｚｉｅｇｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２５：３９９−４０４）。トランスフェクトした細胞を一晩で回収し、その後、この細胞をトリプシン処理し、６ウェル培養ディッシュ中にプレートした。細胞を２４時間のインキュベーションの間にプレートに接着させ、次いで、この細胞を、１００ｎｇ／ｍｌのＩＬ−７またはＴＳＬＰいずれかを含む無血清培地中で、さらに２４時間インキュベートした。
【０２８９】
ＣＡＴ活性およびトランスフェクション効率について正規化した後の折りたたみ刺激を図１０に示す。ＩＬ−７Ｒα単独の存在下でのＴＳＬＰ刺激（レーン２）またはＩＬ−７ＲαおよびγｃでのＴＳＬＰ刺激（レーン７）後に、ＣＡＴ活性の増加は認められなかった。しかし、ＴＳＬＰＲポリペプチドが同時トランスフェクトされる場合、ＴＳＬＰ刺激後にＣＡＴ活性の劇的な増加が観察された（レーン５）。このことは、ＴＳＬＰＲポリペプチドの存在がＴＳＬＰシグナル伝達に必要であることを示す。γｃおよびＩＬ−７Ｒαでの同時トランスフェクションが、ＴＳＬＰ依存性レポーター活性においてなんら効果を有さない場合、この組み合わせは、ＩＬ−７依存性レポーター活性を効率的に媒介した（レーン９）。
【０２９０】
多くのサイトカインレセプター鎖が、１つを超えるサイトカインにより共有されている。最も知られた例は、ｇｐ１３０（ｇｐ１３０は、ＩＬ−６、ＩＬ−１１、シリア繊毛神経栄養因子、白血病阻害因子、オンコスタチンＭ、およびカルジオトロフィン−１により共有されている（Ｈｉｒａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｖ．８：２４１−５２；Ｔａｇａ  ａｎｄ  Ｋｉｓｈｉｍｏｔｏ，１９９７，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５：７９７−８１９））、βｃ（βｃは、ＩＬ−３、ＩＬ−５、およびＧＭ−ＣＳＦにより共有されている（Ｍｉｙａｊｉｍａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｌｅｕｋｅｍｉａ  １１：４１８−２２；Ｇｕｔｈｒｉｄｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  １６：３０１−１３；Ｂｕｒｄａｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｈｅｍａｔｏｌ．５：１７７−８０））、およびγｃ（γｃは、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−７、ＩＬ−９、およびＩＬ−１５により共有されている（Ｎｏｇｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６２：１８７７−８０；Ｋｏｎｄｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，前出；Ｋｏｎｄｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，ｓｕｐｒａ；Ｒｕｓｓｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，ｓｕｐｒａ；Ｔａｋｅｓｈｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．，ｓｕｐｒａ；Ｒｕｓｓｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，前出；Ｇｉｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，前出；Ｋｉｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，前出））である。１つを超えるサイトカインレセプターの成分として働くサイトカインレセプター鎖を列挙すると、ＩＬ−２Ｒβ（これは、ＩＬ−２レセプターおよびＩＬ−１５レセプター両方についての成分である）、およびＩＬ−４Ｒα（これは、ＩＬ−４レセプターおよびＩＬ−１３レセプター両方についての成分である）が挙げられる。サイトカインレセプターサブユニットＩＬ−７Ｒαは、本明細書中に示されたデータが、このサブユニットがＩＬ−７レセプターおよびＴＳＬＰ  レセプター両方の成分であることを示すので、この列挙に加えられ得る。
【０２９１】
Ｉ１７−／−マウスにおけるＴ細胞およびＢ細胞発生における欠損の観察（ｖｏｎ  Ｆｒｅｅｄｅｎ−Ｊｅｆｆｒｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８１：１５１９−２６）は、ＴＳＬＰがＩＬ−７の喪失について十分に補償できないことを示唆する。ＴＳＬＰシグナル伝達におけるＩＬ−７Ｒαの機能的共同の試験は、Ｉ１７ｒ−／−マウスおよびＩ１７−／−マウスにおけるＢ細胞の差異を説明するために役立ち得る（Ｃａｎｄｅｉａｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ６：５０１−０８；ｖｏｎ  Ｆｒｅｅｄｅｎ−Ｊｅｆｆｒｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，前出；Ｐｅｓｃｈｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８０：１９５５−６０；Ｈｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｊ．Ｉｍｍｕｒｚｏｌ．１５８：２５９２−９９）。ＴＳＬＰＲポリペプチドのさらなる特徴づけは、本発明を補助する。
【０２９２】
（実施例５：ＴＳＬＰＲポリペプチドの生成）
（Ａ．細菌におけるＴＳＬＰＲポリペプチドの発現）
ＰＣＲを用いて、ＴＳＬＰＲポリペプチドをコードするテンプレートＤＮＡ配列を増幅する。このＰＣＲには、この配列の５’および３’末端に対応するプライマーを用いる。増幅したＤＮＡ産物を改変して、発現ベクター内への挿入を可能にするために制限酵素部位を含むようにし得る。ＰＣＲ産物をゲル精製し、そして標準的組み換えＤＮＡ方法論を用いて発現ベクター中に挿入する。ｌｕｘプロモーターおよびカナマイシン耐性をコードする遺伝子を含むｐＡＭＧ２１（ＡＴＣＣ番号９８１１３）のような代表的ベクターを、挿入したＤＮＡの方向性クローニングのために、ＢａｍＨＩおよびＮｄｅＩを用いて消化する。連結した混合物を、エレクトロポレーションによってＥ．ｃｏｌｉ宿主株中に形質転換し、そして形質転換体をカナマイシン耐性について選択する。選択したコロニー由来のプラスミドＤＮＡを、単離し、そしてＤＮＡ配列決定に供してインサート（挿入物）の存在を確認する。
【０２９３】
形質転換した宿主細胞を、導入前に、３０μｇ／ｍＬカナマイシンを含有する２×ＹＴ培地中で３０℃でインキュベートする。最終濃度３０ｎｇ／ｍＬへのＮ−（３−オキソヘキサノイル）−ｄｌ−ホモセリンラクトンの添加、それに続く３０℃かまたは３７℃での６時間のインキュベーションによって、遺伝子発現を誘導する。ＴＳＬＰＲポリペプチドの発現を、培養物の遠心分離、細菌ペレットの再懸濁および溶解、ならびに、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動による宿主細胞タンパク質の分析によって評価する。
【０２９４】
ＴＳＬＰＲポリペプチドを含有する封入体を、以下の通り精製する。細菌細胞を遠心分離によってペレット化し、そして水中に再懸濁する。この細胞懸濁液を超音波処理によって溶解し、そして１９５，０００×ｇでの５〜１０分間の遠心分離によってペレット化する。この上清を廃棄し、そしてペレットを洗浄してホモジナイザーに移す。このペレットを、均一に懸濁されるまで、５ｍＬのＰｅｒｃｏｌｌ溶液（７５％液体Ｐｅｒｃｏｌｌおよび０．１５Ｍ  ＮａＣｌ）中にホモジナイズし、次いで希釈して２１，６００×ｇで３０分間遠心分離する。封入体を含む勾配画分を回収してプールする。単離した封入体をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析する。
【０２９５】
Ｅ．ｃｏｌｉが産生したＴＳＬＰＲポリペプチドに相当する、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル上の単一のバンドを、ゲルから切り出し、そしてＮ末端アミノ酸配列を、本質的にＭａｔｓｕｄａｉｒａら、１９８７，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：１０〜３５に記載のように決定する。
【０２９６】
（Ｂ．哺乳動物細胞におけるＴＳＬＰＲポリペプチドの発現）
ＰＣＲを用いて、ＴＳＬＰＲポリペプチドをコードするテンプレートＤＮＡ配列を増幅する。このＰＣＲには、この配列の５’および３’末端に対応するプライマーを用いる。増幅したＤＮＡ産物を改変して、発現ベクター内への挿入を可能にするために制限酵素部位を含むようにし得る。ＰＣＲ産物をゲル精製し、そして標準的組み換えＤＮＡ方法論を用いて発現ベクター中に挿入する。エプスタイン−バーウイルス複製起点を含む代表的な発現ベクターであるｐＣＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を、２９３−ＥＢＮＡ−１細胞におけるＴＳＬＰＲポリペプチドの発現のために用い得る。増幅およびゲル精製したＰＣＲ産物を、ｐＣＥＰ４ベクターに連結し、そしてリポフェクチンによって２９３−ＥＢＮＡ細胞中に導入する。トランスフェクトした細胞を、１００μｇ／ｍＬのハイグロマイシン中で選択し、そして得られた薬物耐性培養物をコンフルエンスになるまで増殖する。次いで、この細胞を無血清培地中で７２時間培養する。馴化培地を取り出し、ＴＳＬＰＲポリペプチド発現をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析する。
【０２９７】
ＴＳＬＰＲポリペプチド発現は、銀染色によって検出できる。あるいは、ＴＳＬＰＲポリペプチドを、ペプチドタグに対する抗体を用いてウエスタンブロット分析によって検出可能であり得る、エピトープタグ（例えば、ＩｇＧ定常ドメインまたはＦＬＡＧエピトープ）を有する融合タンパク質として生成する。
【０２９８】
ＴＳＬＰＲポリペプチドを、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルから切り出し得るか、またはＴＳＬＰＲ融合タンパク質を、エピトープタグに対するアフィニティークロマトグラフィーによって精製し、そして本明細書に記載のようなＮ末端アミノ酸配列分析に供する。
【０２９９】
（Ｃ．哺乳動物細胞におけるＴＳＬＰＲポリペプチドの発現および精製）
リポフェクチンまたはリン酸カルシウムプロトコールのいずれかを用いて、２９３  ＥＢＮＡ細胞またはＣＨＯ細胞中に、ＴＳＬＰＲポリペプチド発現構築物を導入する。
【０３００】
生成されるＴＳＬＰＲポリペプチドに対する機能的研究を行うため、ハイグロマイシン選択２９３  ＥＢＮＡクローニングのプールから大量の馴化培地を生成する。この細胞を５００ｃｍ  Ｎｕｎｃ  Ｔｒｉｐｌｅ  Ｆｌａｓｋｓ中で、８０％コンフルエンスになるまで培養し、その後、培地を回収する１週間前に無血清培地に切り換える。馴化培地を回収し、そして精製まで−２０℃に凍結する。
【０３０１】
馴化培地を下記のとおり、アフィニティークロマトグラフィーによって精製する。この培地を解凍し、次いで０．２μｍフィルターに通す。プロテインＧカラムをＰＢＳでｐＨ７．０に平衡化し、次いで濾過した培地をロードする。このカラムをＡ２８０の吸収がベースラインに達するまでＰＢＳで洗浄する。０．１Ｍ  Ｇｌｙｃｉｎｅ−ＨＣｌを用いてｐＨ２．７でＴＳＬＰＲポリペプチドを、カラムから溶出し、直ちに１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌを用いてｐＨ８．５で中和する。ＴＳＬＰＲポリペプチドを含有する画分をプールし、ＰＢＳ中で透析し、そして−７０℃で貯蔵した。
【０３０２】
ヒトＴＳＬＰＲポリペプチド−Ｆｃ融合ポリペプチドの第Ｘａ因子切断について、アフィニティークロマトグラフィー精製したタンパク質を、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＣａＣｌ２中でｐＨ８．０で透析する。制限プロテアーゼ第Ｘａ因子を、透析したタンパク質に１／１００（ｗ／ｗ）で添加し、そしてこのサンプルを室温で一晩消化する。
【０３０３】
（実施例６：抗ＴＳＬＰＲポリペプチド抗体の生成）
ＴＳＬＰＲポリペプチドに対する抗体を、生物学的合成または化学的合成によって生成した、精製タンパク質またはＴＳＬＰＲペプチドを用いて免疫することによって獲得し得る。抗体を生成するための適切な手順は、ＨｕｄｓｏｎおよびＢａｙ、Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（第二版、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｉｌｉｃａｔｉｏｎ）に記載の手順を含む。
【０３０４】
抗体生成のための１つの手順において、動物（代表的には、マウスまたはウサギ）に、ＴＳＬＰＲ抗原（例えば、ＴＳＬＰＲポリペプチド）を注射し、そして、ハイブリドーマ産生のため、ＥＬＩＳＡによって決定した十分な血清力価レベルを有する動物を、選択する。免疫した動物の脾臓を回収し、そして単一細胞懸濁液として調製し、これから脾臓細胞を回収する。脾臓細胞をマウスミエローマ細胞（例えば、Ｓｐ２／０−Ａｇ１４細胞）に融合し、ＤＭＥＭ（２００Ｕ／ｍＬペニシリン、２００μｇ／ｍＬ硫酸ストレプトマイシン、および４ｍＭグルタミン含有）中でまずインキュベートし、次いで、ＨＡＴ選択培地（ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジン）中でインキュベートする。選択後、組織培養上清を各融合ウェルから取り出し、そしてＥＬＩＳＡによって、抗ＴＳＬＰＲ抗体産生について試験する。
【０３０５】
抗ＴＳＬＰＲ抗体を得るため、別の手順をまた、使用し得る。この手順は例えば、ヒト抗体の生成のためのヒトＩｇ遺伝子座を保有するトランスジェニックマウスの免疫、および合成抗体ライブラリー（例えば、抗体可変ドメインの変異誘発によって生成されるライブラリーなど）のスクリーニングである。
【０３０６】
（実施例７：トランスジェニックマウスにおけるＴＳＬＰＲポリペプチドの発現）
ＴＳＬＰＲポリペプチドの生物学的活性を評価するため、肝臓特異的ＡｐｏＥプロモーターの制御下で、ＴＳＬＰＲポリペプチド／Ｆｃ融合タンパク質をコードする構築物を調製する。この構築物の送達により、ＴＳＬＰＲポリペプチドの機能に関して情報を与える、病理的変化を生じることが期待される。同様に、βアクチンプロモーターの制御下で、全長ＴＳＬＰＲポリペプチドを含む構築物を調製する。この構築物の送達により、遍在性発現を生じることが期待される。
【０３０７】
これらの構築物を生成するために、ＰＣＲを用いて、ＴＳＬＰＲポリペプチドをコードするテンプレートＤＮＡ配列を増幅する。このＰＣＲには、所望の配列の５’および３’末端に対応するプライマーを用いる。そしてこのプライマーは、発現ベクター内への増幅産物の挿入を可能にするために制限酵素部位を組み込む。増幅後、ＰＣＲ産物をゲル精製し、適切な制限酵素で消化し、そして標準的組み換えＤＮＡ技術を用いて発現ベクター中に連結する。例えば、増幅したＴＳＬＰＲポリペプチド配列を、Ｇｒａｈａｍら、１９９７、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１７：２７２〜７４およびＲａｙら，１９９１，Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．５：２２６５〜７３に記載のように、ヒトβアクチンプロモーターの制御下で発現ベクター中にクローニングし得る。
【０３０８】
連結（ライゲーション）後、反応混合物を用いて、Ｅ．ｃｏｌｉ宿主株をエレクトロポレーションによって形質転換し、そして形質転換体を、薬物耐性について選択する。選択したコロニー由来のプラスミドＤＮＡを単離して、ＤＮＡ配列決定に供し、適切なインサートが存在することおよび変異が存在しないことを確認する。ＴＳＬＰＲポリペプチド発現ベクターを、２回のＣｓＣｌ密度勾配遠心分離を通じて精製し、適切な制限酵素で切断し、そして、ＴＳＬＰＲポリペプチド導入遺伝子を含有する直鎖化フラグメントを、ゲル電気泳動によって精製する。精製したフラグメントを、５ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．４）および０．２ｍＭ  ＥＤＴＡ中で、２ｍｇ／ｍＬの濃度で、再懸濁する。
【０３０９】
ＢＤＦ１×ＢＤＦ１交配マウス由来の単一細胞胚に、記載（ＰＣＴ公開番号ＷＯ９７／２３６１４）のように注射する。胚を、ＣＯ２インキュベーター中で一晩培養し、そして１５〜２０の２細胞胚を偽妊娠ＣＤ１雌性マウスの卵管に移す。マイクロインジェクションした胚の移植から得た子孫を、以下のように、ゲノムＤＮＡサンプル中に組み込まれた導入遺伝子のＰＣＲ増幅によってスクリーニングする。耳切片を２０ｍＬの耳緩衝液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．５％  ＳＤＳ、および５００ｍｇ／ｍＬ  プロテイナーゼＫ）中で、５５℃で一晩消化する。次いで、このサンプルを２００ｍＬのＴＥで希釈し、そして２ｍＬの耳サンプルを、適切なプライマーを用いるＰＣＲ反応中で用いる。
【０３１０】
８週齢で、トランスジェニック創始動物およびコントロール動物を、剖検および病理分析のため、屠殺する。脾臓の一部を取り出し、そしてＴｏｔａｌ  ＲＮＡ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、脾臓から、総細胞ＲＮＡを単離し、そして導入遺伝子発現を、ＲＴ−ＰＣＲによって決定する。脾臓から回収したＲＮＡを、以下のように、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＴＭ  Ｐｒｅａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）を用いてｃＤＮＡに変換する。適切なプライマー（発現ベクター配列中に位置し、そしてＴＳＬＰＲポリペプチド導入遺伝子の３’側にある）を用いて、導入遺伝子転写物からｃＤＮＡ合成をプライムする。トランスジェニック創始動物およびコントロール由来の１０ｍｇの総脾臓ＲＮＡを、１ｍＭのプライマーとともに、１０分間７０℃でインキュベートし、そして氷上に置く。次いで、反応物に、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．３、５０ｍＭ  ＫＣｌ、２．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０ｍＭの各ｄＮＴＰ、０．１ｍＭ  ＤＴＴ、および２００ＵのＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩ逆転写酵素を補充する。４２℃で５０分間のインキュベーション後、７２℃で１５分間加熱することによって反応を停止し、２ＵのＲＮａｓｅ  Ｈを用いて２０分間３７℃で消化する。次いで、サンプルをＴＳＬＰＲポリペプチドに特異的なプライマーを用いるＰＣＲによって増幅する。
【０３１１】
Ｔｓｌｐ−／−またはＴｓｌｐｒ−／−マウスの表現型を決定することはまた、ＴＳＬＰの正確な役割を規定することを補助する。
【０３１２】
（実施例８：トランスジェニックマウスにおけるＴＳＬＰＲポリペプチドの生物学的活性）
安楽死の前に、トランスジェニック動物を計量し、イソフルラン（ｉｓｏｆｌｕｏｒａｎｅ）によって麻酔し、そして心臓穿刺によって採血する。サンプルを、血液学および血清化学分析に供する。Ｘ線撮影を、最終的な放血後に行う。肉眼での解剖の際に、主な内臓器官を、重量分析に供する。
【０３１３】
肉眼での解剖後、組織（すなわち、肝臓、脾臓、膵臓、胃、胃腸管全体、腎臓、生殖器官、皮膚および乳腺、骨、脳、心臓、肺、胸腺、気管、食道、甲状腺、副腎、膀胱、リンパ節および骨格筋）を取出し、そして１０％緩衝化Ｚｎ−ホルマリン中で組織学的検査のために固定する。固定後、組織をパラフィンブロック中で処理し、そして３ｍｍの切片を得る。全ての切片を、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色し、次いで組織学的分析に供する。
【０３１４】
トランスジェニックマウスおよびコントロールマウスの両方の脾臓、リンパ節およびパイアー斑を、以下の通りにＢ細胞特異的抗体およびＴ細胞特異的抗体についての免疫組織学的分析に供する。ホルマリンで固定したパラフィン包埋切片を脱パラフィン処理し、そして脱イオン水中で水和する。切片を３％過酸化水素でクエンチし、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｂｌｏｃｋ（Ｌｉｐｓｈａｗ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ）でブロックし、そしてラットモノクローナル抗マウスＢ２２０およびＣＤ３（Ｈａｒｌａｎ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）中でインキュベートする。抗体結合を、色素原（ｃｈｒｏｍａｇｅｎ）としてＤＡＢ（ＢｉｏＴｅｋ，Ｓａｎｔａ  Ｂａｒｂａｒａ，ＣＡ）を用いて、ビオチン化ウサギ抗ラット免疫グロブリンおよびペルオキシダーゼ結合体化ストレプトアビジン（ＢｉｏＧｅｎｅｘ，Ｓａｎ  Ｒａｍｏｎ，ＣＡ）によって検出する。切片を、ヘマトキシリンで対比染色する。
【０３１５】
剖検後、トランスジェニック動物およびコントロールの同腹仔由来の脾臓および胸腺のＭＬＮおよび切片を取出す。シリンジの平らな末端を用いて１００ｍｍナイロン性細胞ストレーナー（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）の底に対してこの組織を穏やかに粉砕することによって単細胞懸濁物を調製する。細胞を２回洗浄し、計数し、次いで各組織由来の約１×１０６細胞を、２０μＬ容量において０．５μｇ  ＣＤ１６／３２（ＦｃγＩＩＩ／ＩＩ）Ｆｃブロックで１０分間インキュベートする。次いで、サンプルを、ＦＩＴＣまたはＰＥに結合体化した、ＣＤ９０．２（Ｔｈｙ−１．２）、ＣＤ４５Ｒ（Ｂ２２０）、ＣＤ１１ｂ（Ｍａｃ−１）、Ｇｒ−１、ＣＤ４またはＣＤ８に対するモノクローナル抗体（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）の０．５μｇ抗体を有する、１００μＬ容量のＰＢＳ（Ｃａ＋およびＭｇ＋を欠く）、０．１％ウシ血清アルブミンおよび０．０１％アジ化ナトリウム中で２〜８℃で３０分間染色する。抗体結合後、細胞を洗浄し、次いでＦＡＣＳｃａｎ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）でのフローサイトメトリーによって分析する。
【０３１６】
本発明を好ましい実施形態に関して記載してきたが、バリエーションおよび改変が当業者に思い浮かぶことが理解される。それゆえ、添付の特許請求の範囲が、本願発明の範囲内に入る全てのこのような均等なバリエーションを包含することが意図される。
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１Ａ〜１Ｂは、マウスＴＳＬＰＲ遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号１）、およびマウスＴＳＬＰＲポリペプチドの推定アミノ酸配列（配列番号２）を示す。推定シグナルペプチド（下線部）および膜貫通ドメイン（二重下線部）を示す。
【図２】
図２は、マウスＴＳＬＰＲポリペプチド（上の配列；配列番号２）とマウス共通サイトカインレセプターγ鎖（γｃ）（下の配列；配列番号１２）とのアミノ酸配列アライメントを示す。同一の残基（囲み）、潜在的なＮ結合グリコシル化部位（＊）、ならびに推定シグナルペプチドおよび膜貫通ドメイン（下線部）を示す。
【図３】
図３Ａ〜３Ｂは、ヒトＴＳＬＰＲ遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号４）、およびヒトＴＳＬＰＲポリペプチドの推定アミノ酸配列（配列番号５）を示す。推定シグナルペプチド（下線部）および膜貫通ドメイン（二重下線部）を示す。
【図４】
図４〜４Ｂは、ヒトＴＳＬＰＲ／ＦＬＡＧのヌクレオチド配列（配列番号７）およびヒトＴＳＬＰＲ／ＦＬＡＧポリペプチドの推定アミノ酸配列（配列番号８）を示す。ＦＬＡＧペプチド（点線部）、推定シグナルペプチド（下線部）、および推定膜貫通ドメイン（二重下線部）を示す。
【図５】
図５は、マウスＴＳＬＰＲポリペプチド（上の配列；配列番号２）およびヒトＴＳＬＰＲポリペプチド（下の配列；配列番号５）のアミノ酸配列アライメントを示す。
【図６】
図６Ａ〜６Ｃは、（Ａ）マウスＴＳＬＰＲポリペプチドのインビトロ翻訳、（Ｂ）ＮＡＧ  ８／７細胞由来のマウスＴＳＬＰＲポリペプチドの免疫沈降、および（Ｃ）マウスＴＳＬＰＲ  ｍＲＮＡ発現のノーザンブロット分析を示す。
【図７】
図７は、ｃ−Ｋｉｔ／γｃ、ｃ−Ｋｉｔ／ＴＳＬＰＲおよびｃ−Ｋｉｔ／β、またはｃ−Ｋｉｔ／γｃおよびｃ−Ｋｉｔ／βについてのキメラ発現構築物でトランスフェクトした細胞を使用する増殖アッセイにおいて得られた結果を示す。
【図８】
図８Ａ〜８Ｃは、１２５Ｉ−ＴＳＬＰが、マウスＩＬ−７Ｒα、マウスＴＳＬＰＲ、マウスＩＬ−７ＲαおよびマウスＴＳＬＰＲ、またはヒトＩＬ−７ＲαおよびマウスＴＳＬＰＲについての発現構築物でトランスフェクトした２９３細胞に添加され、次いでＤＳＳと架橋する、親和性標識アッセイにおいて得られた結果を示す。
【図９】
図９Ａ〜９Ｄは、置換結合アッセイにおいて得られた結果を示す。
【図１０】
図１０は、ＨｅｐＧ２細胞が、ＩＬ−７ＲαおよびＴＳＬＰＲ、またはγｃおよびｐＨＲＲＥ−ＣＡＴについての発現構築物で同時トランスフェクトされる、ＣＡＴアッセイにおいて得られた結果を示す。
【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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