(57)【要約】本発明は、患者の乳管から回収可能な液体を増加させる方法を提供する。その後、増加させた液体貯留量の一部を分析用に採取するか、またはインサイチューで分析することができる。乳管液は、通常、乳癌および前癌の同定に役立つ乳管上皮細胞および他のマーカーを含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者の乳管からの液体、細胞、および／または他の材料の乳管内回収の準備を行うための方法であって、
乳管から回収可能な液体を増加させる物質を患者に投与する段階
を含む方法。
【請求項２】
投与段階が、物質を乳管内に投与する段階、物質を全身投与する段階、および物質を局所投与する段階からなる群より選択される様式によって実施される、請求項1記載の方法。
【請求項３】
物質が乳管に対して乳管内に投与され、且つ該物質が食塩液、リン酸緩衝食塩液（PBS）、等張液、低張液、緩衝液、pHがヒト組織、血液または血清での範囲にある溶液、弱酸性pHの溶液、弱塩基性pHの溶液、および非吸収性で生体適合性のある溶液からなる群より選択される、請求項2記載の方法。
【請求項４】
物質が全身投与され、且つ該物質がホルモン、オキシトシン、プロラクチン、乳管分泌誘導因子、天然薬用植物または天然薬用植物からの抽出物、シリマリン、成長因子、ビタミン、タンパク質、筋弛緩薬、および有機低分子からなる群より選択される、請求項2記載の方法。
【請求項５】
物質が乳管に対して乳管内に投与され、且つ該物質がタンパク質、コロイド、糖、ポリマー、マンニトール、ソルビトール、グルコース、グリセロール、スクロース、ラフィノース、フルクトース、ラクツロース、塩化ナトリウム、ポリエチレングリコール（PEG）、マルトデキストリン、デキストラン（例えば、デキストラン70）、ヒドロキシエチルデンプン、液状ゼラチン、合成コロイド、抗体、結合タンパク質、アルブミン、ホルモン、乳管分泌誘導因子、天然薬用植物または天然薬用植物からの抽出物、シリマリン、界面活性剤、成長因子、オキシトシン、プロラクチン、有機低分子、筋弛緩薬、乳管口拡張薬、および乳管上皮からの液体分泌を増加させる物質からなる群より選択される、請求項2記載の方法。
【請求項６】
物質が乳管内に投与され、且つ該物質が非液体、ゲル、乳濁液、気体、または半固体からなる群より選択される状態にある、請求項2記載の方法。
【請求項７】
物質が乳管内に投与され、且つ該物質が乳管内投与前の温度が室温よりも低い、酸素を過飽和させた液体を含む炭酸化液体を含む、請求項2記載の方法。
【請求項８】
増加した乳管液の一部を乳管から採取する段階をさらに含む、請求項1記載の方法。
【請求項９】
採取段階が、装置を用いて乳管にアクセスする段階、および増加した乳管液の一部を装置内に回収する段階を含む、請求項8記載の方法。
【請求項１０】
回収可能な液体を増加させてその一部を採取した後に、乳管内の細胞、液体、または他の材料のうち1つまたは複数を分析する段階をさらに含む、請求項8記載の方法。
【請求項１１】
分析段階が、乳房の状態に関するマーカーを同定する段階を含む、請求項10記載の方法。
【請求項１２】
回収可能な乳管液を人為的に増加させた乳管から乳管液を採取する方法であって、乳管に装置を用いてアクセスし、乳管液の一部を装置内に回収する段階を含む方法。
【請求項１３】
回収した乳管液が複数の乳管上皮細胞を含む、請求項12記載の方法。
【請求項１４】
回収可能な細胞量を増加させるための方法であって、乳管に振動を与えることにより、乳管内での細胞の脱落を誘発する段階を含む方法。
【請求項１５】
乳管に振動を与えることにより、乳管内での細胞の脱落を誘発する段階を含む、乳管内の回収可能な細胞量を増加させる段階をさらに含む、請求項1または12記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、37CFR§1.78の下に、以下の仮出願のそれぞれの恩典を主張するものである：1998年12月28日に提出された第60／114,048号；1999年5月18日に提出された第60／134,613号；1999年7月12日に提出された第60／143,476号；1999年7月12日に提出された第60／143,359号；1999年12月14日に提出された第60／170,997号；および1999年12月27日に提出された第09／473,510号。これらの出願の開示内容はすべて参照として本明細書に組み入れられる。
【０００２】
発明の分野
本発明の分野は、乳管から回収可能な液体（retrievable fluid）を増加させる方法および組成物である。
【背景技術】
【０００３】
背景技術の説明
乳癌研究に取り組んできた医学界のかなりの人々は、数十年にわたり、乳管からの乳頭分泌液から採取した細胞の細胞学的分析によって、乳癌のリスクがある患者の同定につながる有益な情報が得られると考え、そのことを示してきた。実際に、Papanicolaouは自ら、乳頭分泌液中に含まれる細胞の分析による、乳癌に対する「Pap」塗沫標本のこのような可能性を生み出すことに貢献した。Papanicolaouら、「ヒト乳腺の剥離細胞診ならびに乳房の癌および他の疾患の診断におけるその意義（Exfoliative Cytology of the Human Mammary Gland and Its Value in the Diagnosis of Cancer and Other Diseases of the Breast）」、Cancer (1958) March/April 377-409を参照されたい。同じく、Petrakis, 「乳頭吸引液の生理的、生化学的、および細胞学的様相（Physiological, biochemical and cytological aspects of nipple aspirate fluid）」、Breast Cancer Research and Treatment 1986; 8:7-19；Petrakis, 「乳頭吸引液を用いた良性乳房疾患および乳癌の疫学および自然史に関する研究（Studies on the epidemiology and natural history of benign breast disease and breast cancer using nipple aspirate fluid）」、Cancer Epidemiology、Biomarkes and Prevention (Jan/Feb 1993) 2:3-10；Petrakis, 「乳房疾患の疫学的研究における乳頭吸引液（Nipple Aspirate fluid in epidemiological studies of breast disease）」、Epidemiologic Reviews (1993) 15:188-195も参照されたい。さらに最近では、乳頭吸引液中のマーカーも検出されている。Sauterら、「乳頭吸引液：乳癌リスクの細胞マーカーを同定するための有望な非侵襲的方法（Nipple aspirate fluid: a promising non-invasive method to identify cellular markers of breast cancer risk）」、British Journal of Cancer 76(4):494-501 (1997)を参照されたい。乳頭ブロット法によって得られた液体におけるCEAの検出は、Imayamaら、(1996) Cancer 78:1229-1234に記載されている。
【０００４】
これまで数十年にわたって行われてきた乳管液の細胞学的分析および他の分析には、乳頭の吸引によって乳頭表面から採取した乳頭吸引液（NAF）を用いる。乳房の乳頭吸引により、女性集団における被験女性の約半数で液体が得られる。乳頭吸引によって回収された液体には通常、分析対象となる乳管上皮細胞がいくつか存在し、時には15個または20個の乳管上皮細胞が存在する。NAFによって乳管上皮細胞の集塊（約6個〜約10個またはそれ以上の細胞の群）が回収されることは稀である。NAFによって吸引されるのは乳管ネットワークの表面近くからのものと一般に考えられており、一度に採取されるのは通常、この液体のうち1cc程度以下である。NAFは乳頭表面から採取されるが、複数の乳管から液体が生じている可能性があり、このため任意の乳頭吸引液の中で一緒になってしまうという事実のために、アリコートを分泌した特定の乳管と確実に関連づけることはできない。NAF中に回収される細胞が非常に少ないために、回収した液体、材料および／または細胞数が分析を行うには不十分であることがしばしばである。
【０００５】
乳管液は、自発的な乳頭分泌状態に対して行われる手法である乳管造影（galactography）の際に回収されてきた。乳管造影は分泌の原因を特定する目的で行われる。乳管造影の手順では、シリンジによる調節下での吸引により、オープンルーメンニードルまたはカニューレ内に少量の乳管液を採取する。この液体および細胞の量は一般にNAFの収量とほぼ等しい。シリンジ調節下でのカニューレまたはルーメンによる吸引を自発分泌性でない乳管で行うと、乳管の虚脱が起こり、液体または細胞の収量が全くまたはほとんど得られない恐れがある。乳管造影手順の前または後には、乳管が液体で満たされているため（および、このため自発分泌性であるため）、少量の液体が回収可能であると推定される。乳管からの自発的分泌を呈していない潜在的な状態では一般に、乳管内液を回収する機会は得られない。
【０００６】
高リスク乳管の場合はNAFで液体が得られる傾向があるため、自発分泌性でない乳管を予備的な乳頭吸引によって高リスクと同定し、これらの乳管を乳管アクセス用ツールを用いて評価することができる。続いて、アクセスした乳管に生体適合性のある液体を注入し、それを乳管液および細胞ならびに他のマーカーと混合することができる。充満した乳管はその結果、乳管液、乳管上皮細胞、および／または乳管の状態に関する他のマーカーを含む、この液体の一部の吸引、回収または他の様式での採取に耐えうる。
【０００７】
乳房内の1つまたは複数の乳管における回収可能な液体を、これらの乳管の1つまたは複数への以後の乳管内アクセスに備えて増加させることは、乳房疾患、特に無症候性で潜在的な乳房疾患の分析にとって有利と考えられる。さらに、乳管内の液体の増加により、乳管内の脱落細胞および他のマーカーの捕捉および生成のための機会も得られる。
【発明の開示】
【０００８】
発明の概要
本発明は、充満性でも分泌性でもない乳管、すなわち液体または材料を自発的に分泌しない乳管であって、乳管内の充満または他の形式での投与、例えば全身投与もしくは局所投与を行って乳管内の回収可能な液体を増加させることができ、それにより、乳管虚脱の大きなリスクを伴うことなしに細胞学的分析または他の分析を行うのに十分な材料が回収される形式で、以後に1本または複数の乳管にアクセスし、人為的に充満させた乳管内に存在する材料（液体、細胞、および／または他のマーカー）の少なくとも一部を回収する機会が得られるような、乳管を対象とする。最初に充満または他の形式により乳管内の液体を増加させなければ、液体および／または他の材料を診断的に十分な収量として乳管内で回収することはほとんど不可能である。
【０００９】
本発明の1つの局面は、乳管から回収可能な液体を増加させる物質を患者に投与することにより、患者の乳管からの液体、細胞、および／または他の材料の乳管内回収の準備を行うための方法である。投与は、物質の乳管内に投与することによって、物質を全身投与することによって、または物質を局所投与することによって行うことができる。
【００１０】
本発明の1つの態様は、物質を乳管に対して乳管内に投与し、物質を食塩液、リン酸緩衝食塩液（PBS）、等張液、低張液、緩衝液、pHがヒト組織、血液または血清での範囲にある溶液、弱酸性のpHを有する溶液、弱塩基性のpHを有する溶液、および非吸収性で生体適合性のある溶液からなる群より選択しうるような場合を含む。
【００１１】
本発明のもう1つの態様は、物質を全身的に投与し、物質にホルモン、オキシトシン、プロラクチン、乳管分泌誘導因子、天然薬用植物または天然薬用植物からの抽出物、シリマリン、成長因子、ビタミン、タンパク質、筋弛緩薬、および有機低分子からなる群より選択される物質が含まれうるような場合を含む。
【００１２】
本発明のもう1つの態様は、物質を乳管に対して乳管内に投与し、物質をタンパク質、コロイド、糖、重合体、マンニトール、ソルビトール、グルコース、グリセロール、スクロース、ラフィノース、フルクトース、ラクツロース、塩化ナトリウム、ポリエチレングリコール（PEG）、マルトデキストリン、デキストラン（例えば、デキストラン70）、ヒトロキシエチルデンプン、液状ゼラチン、合成コロイド、抗体、結合タンパク質、アルブミン、ホルモン、乳管分泌誘導因子、天然薬用植物または天然薬用植物からの抽出物、シリマリン、界面活性剤、成長因子、オキシトシン、プロラクチン、有機低分子、筋弛緩薬、乳管口拡張薬、および乳管上皮からの液体分泌を増加させる物質からなる群より選択しうるような場合を含む。
【００１３】
乳管内に投与される物質は、非液体、ゲル、乳濁液、気体、および半固体からなる群より選択される状態にあってよい。乳管内に投与される物質には、乳管内投与前の温度が室温よりも低い、酸素を過飽和させた液体（superoxygenated fluid）を含む炭酸化液体が含まれうる。
【００１４】
本発明のもう1つの局面において、本方法はさらに、増加した乳管液の一部を乳管から採取する段階を含みうる。採取段階には、装置を用いて乳管にアクセスし、貯留部の乳管液の一部を装置内に回収することが含まれうる。採取を含む本方法はさらに、乳管内の回収可能な液体を増加させた後に、乳管内の細胞、液体、または他の材料のうち1つまたは複数を分析する段階を含みうる。分析段階には、乳房の状態に関するマーカーを同定することが含まれうる。
【００１５】
本発明のもう1つの局面は、回収可能な乳管液を人為的に増加させた乳管から乳管液を採取する方法であって、装置を用いて乳管にアクセスし、増加させた乳管液の一部を装置内に回収することを含む方法である。回収した乳管液は、乳房の状態を特定するためのマーカーを含みうる。マーカーは複数の乳管上皮細胞から構成されうる。
【００１６】
本発明のもう1つの局面は、回収可能な細胞量を増加させるための方法であって、乳管に振動を与えることにより、乳管内での細胞の脱落を誘発することを含む方法である。
【００１７】
発明の好ましい態様の詳細な説明
以下の好ましい態様および実施例は例示を目的として提供するものであり、制限的なものではない。
【００１８】
本発明は、患者の乳管からの液体、細胞、および／または他の材料の乳管内回収の準備を行うための方法を提供する。本発明は、患者の1つまたは複数の乳管内の回収可能な液体を増加させる物質を患者に投与する段階を含む。患者の乳管内の回収可能な液体がひとたび増加すれば、増加した液体の少なくとも一部をインサイチューで分析するか、または乳管から分析用に採取することができる。液体の貯留量の増加により、乳管から回収可能な細胞、マーカーまたは他の材料の数が最大限に多くなるという恩典が得られる。
【００１９】
自発分泌性でない乳管からの乳管液の乳管内回収の成功の可否は、乳管からの液体の乳管内回収を行った際に、少なくとも十分な液体（細胞、他のマーカー、および／または他の診断的に有用な材料）を回収できるまでは乳管が虚脱しないように、乳管内の回収可能な液体を増加させることにかかっている。十分な液体とは一般に、乳管および乳房の診断を適切に行える程度に十分な細胞および／または他のマーカーを含む液体の量と見なされ、これは一般に乳頭吸引によって回収しうる液体の容積よりも多いと考えられる。本発明は、乳管内の液体の容積または液体の貯留量を最初に人為的に増加させることによって、乳管および乳房の分析に十分な乳管液を採取しうるという発見である。乳管内の液体貯留量の増加により、細胞または他のマーカーのインサイチューでの分析または同定を行う機会も得られる。
【００２０】
患者に対する物質の投与は、物質を乳管内に投与する段階、物質を全身投与する段階、または物質を局所投与する段階を含む様式によって行うことができる。物質の乳管内への投与には、乳管アクセスツールを用いた乳管へのアクセス、および乳管内に十分な量の物質を通し入れることが含まれる。
【００２１】
乳管内に導入する洗浄液には、生体適合性のある任意の物質または溶液が含まれうる。すなわち、洗浄液には、例えば食塩液またはリン酸緩衝食塩液が含まれうる。食塩液は乳管内に短時間留まることができ、食塩液を乳管内に注入してすぐ後に、注入した食塩液の少なくとも一部を乳管から回収することができる。乳管から回収可能な液体を増加させることは食塩液を用いて実現可能であるが、食塩液は乳管内に注入された後に極めて急速に乳管壁または他の手段を介して滲出する。乳管内の回収可能な液体を増加させるために食塩液を用いうるのは、乳管内の食塩液が高い頻度で再補給され、乳管液を採取する手順を、乳管を食塩液で満たしてすぐ後または直後に行うという条件の下である。追加的または代替的に、洗浄液には、液体または物質が乳管壁を介してまたは他の様式によって乳管を離れて身体の他の部位に入り込む能力を低下させる、1つまたは複数の物質または溶液が含まれうる。したがって、洗浄液には非吸収性液体、等張液、浸透圧液、低張液、または高張液が含まれうる。処置の際に乳管から入手されるまたは入手可能な材料の量の向上、増加、および／または最適化を目的として、液体または物質を乳管に投与することができる。注入する洗浄液中に含まれうる物質または溶液には、例えば、タンパク質、コロイド、糖、重合体、マンニトール、ソルビトール、グルコース、グリセロール、スクロース、ラフィノース、フルクトース、ラクツロース、塩化ナトリウム、ポリエチレングリコール（PEG）、マルトデキストリン、デキストラン（例えば、デキストラン70）、ヒドロキシエチルデンプン、液状ゼラチン、アルブミン、合成コロイド、抗体もしくは抗体の一部、または結合タンパク質が含まれうる。
【００２２】
乳管内の回収可能な液体を増加させること、および液体と混合された液体をその後に乳管から採取することを目的とする乳管内腔への液体の投与は、吸収性洗浄液の一部が乳管壁から乳房組織中に吸収されるという事実によって複雑なものとなる。このため、回収される液体は、それが乳管内に存在した乳管液を含むことを考慮しても、注入したものよりは少ない。乳管内の液量を増加または維持させうる物質を洗浄液中に投与することは本工程にとって極めて有益である。したがって、本発明は、乳管から液体を採取する工程における、非吸収性液体または実際には液体を自らに引き入れる液体、例えば、膠質浸透圧性（oncotic）または浸透圧性液体の投与を提供する。非吸収性液体を投与することには、注入して回収した液体の所定の容積における乳管液および細胞の回収量を観測または標準化する手法が実施者にもたらされるという利点もある。例えば、10mlの非吸収性液体を乳管に投与し、その液体のうち9.5mlを採取する。採取した液体中には上皮細胞塊が100個含まれると考えられる。この情報を記録して、同じ乳管に対するその後の処置と比較することが可能である。非吸収性液体を用いる利点は、注入した液体の大部分またはすべての回収によって乳管液の収量が増加すると考えられ、実施者が注入量と採取量を比較しながら追跡しうると考えられることである。非吸収性液体は、注入量が回収量と相関しうるようにプロセスを標準化する目的で用いることができる。この液体は乳管によって吸収されないため、注入した液体の全体または大部分を回収することが可能である。
【００２３】
物質は、乳管内腔にある回収可能または採取可能な液体の量を増加させうる物質であってよい。すなわち、物質は、非吸収性の物質もしくは液体、または膠質浸透圧剤および／もしくは浸透圧剤、またはこのうち2つもしくは3つすべての組み合わせでありうる。膠質浸透圧剤および浸透圧剤とは、自らの周囲に液体を保持させる、または自らに液体を引き入れる物質のことである。物質は可溶性であってよく、例えば、水、緩衝液、または食塩液を含む適した溶媒中に可溶性であってよい。溶媒は哺乳動物に対して生体適合性があることが好ましい。適した溶媒は、物質が効率的に溶解する上に、哺乳動物に対して毒性のないものであると考えられる。
【００２４】
物質は、例えばタンパク質、コロイド、糖、または重合体などを含む分子であってよい。物質は、マンニトール、ソルビトール、グルコース、グリセロール、スクロース、ラフィノース、フルクトース、ラクツロース、塩化ナトリウム、アルブミン、ポリエチレングリコール（PEG）、マルトデキストリン、デキストラン（例えば、デキストラン70）、ヒドロキシエチルデンプン、液状ゼラチン、または合成コロイドであってよい。マンニトール、ソルビトール、PEG、グリセロールなどを含む物質は、「メルクインデックス（THE MERCK INDEX）」、第12版、1996、Whitehouse Station, NJに記載されている。マルトデキストリン、デキストランなどは、Aldrich Chemical Co.（Milwaukee, WI）またはSigma Chemical Co.（St. Louis, MO）から入手可能である。適した膠質浸透圧剤の分子量は、入手しうる適した膠質浸透圧剤の分子量の範囲で最適となるように決定することができる。また、物質が浸透圧剤および／または膠質浸透圧剤の混合物であってもよい。膠質浸透圧剤および／または浸透圧剤には、任意の2つもしくはそれ以上の浸透圧剤および／または膠質浸透圧剤、例えば、マンニトール、ソルビトール、グルコース、グリセロール、スクロース、ラフィノース、フルクトース、ラクツロース、塩化ナトリウム、アルブミン、ポリエチレングリコール（PEG）、マルトデキストリン、デキストラン（例えば、デキストラン70）、ヒドロキシエチルデンプン、液状ゼラチン、抗体、または合成コロイドの組み合わせが含まれうる。
【００２５】
物質がタンパク質である場合には、タンパク質は結合タンパク質または抗体であってよい。結合タンパク質はアルブミンであってよい。抗体は、乳管内に認められるエピトープ、例えば上皮細胞表面マーカーまたは癌細胞マーカーなどと結合することができる。物質がタンパク質である場合、タンパク質の分子量はアルブミンに近いかそれ以上であり、そのため乳管内腔で膠質浸透圧剤として作用しうる。適した抗体は市販されている。物質は、乳房の乳管の内層を構成する細胞内に、またはそれを越えて自由に拡散することができない物質であってよい。物質が、乳管内の細胞内に吸収されない物質であってもよい。例えば、物質の分子量が、乳管内層、細胞、または内層を越えた間質空隙内への吸収または拡散が起こる可能性が低いと考えられる程度に十分に大きくてもよい。
【００２６】
物質が、乳管腔内の採取可能な液体を増加させうるか否か、または少なくとも維持しうるか否か（注入した液体の量と比較して）は、近傍の対照乳管に対する対照等張液の投与と比較して、乳管内の採取可能な液体が物質の投与後に増加するか否かを判定する日常的な検査によって決定することができる。同様に、物質の最適な量および濃度は、投与する物質の量または濃度などの変数を変化させて得られる採取可能な液体の量の比較によって決定しうる。検討しようとする非吸収性液体および／または膠質浸透圧および／または浸透圧剤を含む物質を、ヒト、ラット、ウサギ、ブタ、または他の適切な哺乳動物の乳管に対して送達した上で、乳管液を採取することが可能である。得られた液体が、近傍の乳管から（対照溶液、好ましくは被験溶液と同じ容積のものを注入した後に）採取された対照液体よりも多い場合には、その物質は本方法における使用に適している。実施者が注入した量の中から採取される液体の量を増加させたいと考えている場合には、被験物質を投与した乳管からの液体の収量は対照液体の収量の数倍とすることが可能である。目標が単に、注入した量に近い量の液体を採取することである場合には、成功するためのパラメーターは、一連のアリコートの液体の注入後に乳管から採取される液体の量が、注入液が食塩液などの吸収性液体であった場合に可能と考えられる注入量と近いことである。このような比較は、食塩液などを用いて乳管における対照注入および採取を行い、その後に、例えばPEGを含む液体などの非吸収性液体を用いて同じ乳管で処置を繰り返すことによって行うことができる。
【００２７】
乳管内に注入する液体中の膠質浸透圧剤および／または浸透圧剤の適切な濃度および量は、溶液中の物質がどの濃度および量で、対照乳管から採取可能な液体と比べて、乳管から採取可能な液体の量が最大になるかを判定するための、哺乳動物の乳頭（例えば、ラット、ウサギ、ブタ、またはヒトの乳頭）へのカニューレ挿入またはカテーテル挿入を含む、日常的な実験によって決定しうる。乳管を有する多様な哺乳動物のすべてで、さまざまな膠質浸透圧剤および／または浸透圧剤、濃度、容積、および物質の混合物を検査するための実験を設計することができる。
【００２８】
このように、乳管液の貯留量を増加させる目的で乳管内に投与される物質には、例えば、タンパク質、コロイド、糖、ポリマー、マンニトール、ソルビトール、グルコース、グリセロール、スクロース、ラフィノース、フルクトース、ラクツロース、塩化ナトリウム、ポリエチレングリコール（PEG）、マルトデキストリン、デキストラン（例えば、デキストラン70）、ヒドロキシエチルデンプン、液状ゼラチン、合成コロイド、抗体、結合タンパク質、またはアルブミンが含まれうる。乳管内に投与される物質にはこのほか、例えば、食塩液、リン酸緩衝食塩液（PBS）、等張液、低張液、緩衝液、pHがヒト組織、血液または血清での範囲にある溶液、弱酸性pHの溶液、弱塩基性pHの溶液、および非吸収性で生体適合性のある溶液も含まれうる。適した膠質浸透圧剤の分子量は、入手しうる適した膠質浸透圧剤の分子量の範囲で最適となるように決定することができる。乳管内に投与される物質には、乳管がその液体貯留量を増加させるように患者に対して作用する分子が含まれうる。したがって、乳管内に投与される物質には、例えば、ホルモン、乳管分泌誘導因子、天然薬用植物または天然薬用植物の抽出物、例えばシリマリン、成長因子、オキシトシンまたはプロラクチン、有機低分子、筋弛緩薬、乳管口拡張薬、および乳管上皮からの液体分泌を増加させる物質が含まれうる。
【００２９】
液体はさらに、乳管からの液体もしくは細胞またはその両方の回収に役立つと思われる、または処置の際に有用な何らかの他の目的に役立つと思われる、他の物質を含みうる。例えば、液体が、乳管からの液体もしくは細胞またはその両方の回収に役立つと思われる、または処置の際に有用な何らかの他の目的に役立つと思われるこのような他の物質を含んでもよく、または液体をその前もしくは後に用いてもよい。このような他の物質は、例えば、乳管腔内の採取可能な液体を増加させうる膠質浸透圧剤および／もしくは浸透圧剤、またはより多くの細胞を洗い流すのに役立つ界面活性剤、またはより多くの細胞を乳管壁から乳管内腔へと脱離させるのに役立つ物質（例えば、トリプシン、コラゲナーゼ、またはEDTA）であってよい。物質は、膠質浸透圧剤および／または浸透圧剤またはその両方でありうる。膠質浸透圧剤および浸透圧剤とは、自らの周囲に液体を保持させる、または自らに液体を引き入れる物質のことである。物質は可溶性であってよく、例えば、水、緩衝液、または食塩液を含む適した溶媒中に可溶性であってよい。溶媒は哺乳動物に対して生体適合性があることが好ましい。適した溶媒は、物質が効率的に溶解する上に、哺乳動物に対して毒性のないものであると考えられる。物質は例えば、液体、気体、固体、または半固体であってもよい。物質の状態が投与後に変化してもよく、例えば、過冷却した気体を液化させて低温液体として乳管に投与し、それを乳管環境と接触した際に気化させることができる。食塩液を乳管に投与することもできるが、一定の期間を経た後には食塩液は乳管によって吸収されると思われる。自らに液体を引き入れる溶液中の分子、例えば膠質浸透圧剤または浸透圧剤は、乳管液の貯留量を増加させること、および／または乳管内の回収可能な液体を増加させることができる。回収可能な乳管液を増加させる1つまたは複数の物質には、例えば、非液体、ゲル、乳濁液、気体、または半固体などを含む状態にある物質も含まれうる。
【００３０】
液体は一般に、患者に対して生体適合性があって非毒性であると考えられる。液体はさらに、例えば気体、粒子、乳濁液、または他の液体などの添加物を含みうる。液体に対するこれらの添加物にはさまざまな目的が考えられるが、処置の際の主な目的は一般に、乳管からの液体および／または細胞材料、および／または分子種の回収を増加させることであると考えられる。このため、この種の気体には、乳壁に対して洗浄作用を及ぼして、乳管内の病変部などに位置する乳管上皮細胞が乳管アクセス手順の際に脱落して回収可能となるのを助長するものが考えられる。同様に、粒子性添加物は、乳管を通過する液体の流れの中の粒子に液体、細胞材料および／または分子種を付随させ、乳管アクセス手順の際に回収されるように助長するのに役立つと思われる。界面活性剤などの添加物、例えば、細胞および分子種を含む乳管内容物の採取用のミセルを形成する傾向のある物質を用いると、洗浄処置の際に細胞、分子種、および液体の収量がさらに増えると考えられる。気体は周囲空気または関連製造物であってよく、液体は乳管内への送達のために液体と混合された気体を含みうる。空気または他の気体の存在は、液体のみを用いて行う処置と比べて、細胞および液体の回収を増加させるのに役立つと思われる。空気は液体中に通気させて加えることもでき、他の標準的な手段によって液体混合物に導入することもできる。液体を乳管内に送達する際に空気を液体中に混合してもよく、これに例えば、注入ポートによって空気および液体の両方を流入ルーメン内に送達することが可能であり、この2つが混合されてアクセスした乳管にこの両方が送達される場合がある。
【００３１】
乳管液の貯留量を増加させるために、物質を患者に全身投与することが可能である。例えば、全身投与される物質には、経口的、非経口的、皮下、筋肉内、静脈内、坐薬、または身体によって全身的な受容がなされる他の投与手段が含まれるが、1つまたは複数の物質が乳管液の貯留量の増加を促進することによって乳管に影響を及ぼしてもよい。物質は例えば、ホルモン、例えばオキシトシンもしくはプロラクチン、乳管分泌誘導因子、天然薬用植物または天然薬用植物からの抽出物、例えばシリマリン、成長因子、界面活性剤、ビタミン、タンパク質、筋弛緩薬、または有機低分子でありうる。
【００３２】
乳管内の液体貯留量の増加を促すため、または乳管へのアクセスおよびその内部の液体、材料または細胞の回収を容易にするために、局所投与される物質を乳頭表面および乳管口と接触させて配置することもできる。
【００３３】
液体貯留量を増加させた後に、増加した液体貯留量の一部を採取することができる。または代替的に、貯留量が増加した乳管内の材料、液体、マーカー、または細胞をインサイチューで分析または同定することもできる。採取した材料の分析または材料のインサイチューでの分析は、乳房の状態に関するマーカーを同定することを含む。乳管内の回収可能な液体を人為的に増加させた乳管からの乳管液の採取は、装置を用いて乳管にアクセスし、貯留部の乳管液の一部を装置内に回収することが含まれうる。回収した液体は、乳房の状態を特定するためのマーカーを含みうる。マーカーには複数の乳管上皮細胞が含まれうる。本発明の方法は、細胞の脱落を誘導する振動または他の運動または動きを乳管に加えることによって乳管内の細胞脱落を誘導することにより、乳管内の回収可能な細胞量を増加させることを含みうる。乳管内の回収可能な細胞量を増加させることには、乳管に対して界面活性剤を乳管内に投与することも含まれうる。界面活性剤は、乳管液中の細胞の量を増加させ、それによって分析に用いうる細胞集団を増大させるように作用しうる。
【００３４】
採取した細胞には乳管上皮細胞が含まれうる；採取した乳管液には分子および細胞材料が含まれうる。乳管内の乳管上皮細胞ならびに／または分子および細胞材料の分析は、採取したこれらの材料の分析のために利用しうる方法を用いて進めることができる；採取した細胞ならびに液体および液体成分の分析は、例えば、本明細書の記載または示唆の通りに行うことができる。乳管細胞を含む液体を、診断目的で分析することができる。診断することが望ましい乳管における状態には、癌または前癌状態が含まれる。前癌状態には非定型性乳管過形成（ADH）または低悪性度非浸潤性乳管癌（LG-DCIS）が含まれる。診断用物質に、例えば、線維性、嚢胞性、または授乳に関連した疾患を含む他の乳房関連疾患を同定する能力があってもよい。診断用物質は乳管液と混合することができる（乳管アクセス手順中または液体を採取した後のいずれかにおいて）。
【００３５】
例えば、乳管の細胞の任意のものを、細胞成分の形態学的異常、例えば、核、細胞質、ゴルジ装置、または他の細胞部分の形態学的異常に関して分析することができる。細胞を、凝集するか否か（例えば、細胞塊として）に関して、または乳管上皮細胞と乳管液中に回収された他の細胞種（例えば、マクロファージ、リンパ球、泡沫細胞、および乳管液の他に考えられる成分）との比較を行うことにより、分析することもできる。乳管上皮細胞は例えば、細胞内または細胞表面のタンパク質マーカー、核酸マーカー、生化学マーカーを含む、乳管上皮細胞の分子含量または形態に関して、または新生物の証拠に関して分析することができる。細胞含有物の分析は、一般的には細胞における前癌状態または癌状態の進行を捉える、形態学的に立証されるものと類似した病期分類を立証するのに有用と思われる。
【００３６】
さらに、乳管から採取した液体には、生体液の成分、例えば、乳管液中に通常認められるもの、例えば水、細胞、細胞マーカー、分子マーカー、核酸、タンパク質、細胞片、塩、または有機分子が含まれうる。これらの成分を、実施者が液体を入手する目的に応じた任意の適切な方法によって分析することができる。
【００３７】
マーカーを同定するための標準的なアッセイ手順を用いることができる。採取した試料は、乳管内に癌性または前癌性の乳管上皮細胞が存在することを示すと思われる可溶性因子または他の成分の存在に関して分析することができる。乳管から回収した上皮細胞は、癌性または前癌性の細胞の存在を知らせると考えられるタンパク質マーカー、核酸マーカー、染色体異常、または他の特徴的な変化に関して分析することができる。さらに、乳管内に認められる他の細胞を、例えば、正常な乳管液と比較したこれらの細胞の増加もしくは減少に関して、またはこれらの細胞自体の質に関して分析することもできる。このようにして、乳管の状態を、例えば、可溶性タンパク質含有量、もしくは同じく乳管上皮細胞の分泌産物であるものを含む他の乳管液成分の存在に関して、または乳管上皮細胞自体、例えば細胞の形態、タンパク質マーカー、核酸マーカー、および生化学マーカーに関して分析することが可能である。
【００３８】
乳管または乳頭吸引物から回収した細胞に対して実施しうる細胞学的アッセイ法には、例えば、Kingら、J Nat'l Cancer Inst (1983) 71: 1115-21、Wrenschら (1992) Am. J. Epidem. 135: 130-141、Papanicolaouら (1958) Cancer, 11: 377-409、ならびにGoodson WHおよびKing EB, 「第4章：乳頭の分泌物および分泌（Chapter 4: Discharges and Secretions of the Nipple）」、「乳房：良性および悪性の乳房疾患の総合的管理（Breast: Comprehensive Management of Benign and Malignant Breast Diseases）」(1998) 第2版、第2巻、BlandおよびKirby編、W.B. Saunders Co, Philadelphia, PA、pp.51-74に記載されたアッセイ法が含まれうる。例えば、GoodsonおよびKingに記載された通り（p.60）、非定型性過形成は細胞異常を有し、クロマチンの粗雑度が高く、細胞群とともに単細胞が多い傾向があるものとして存在する。非浸潤癌に関して、Papanicolaouらは、細胞異常、例えば乳管細胞を含む乳頭分泌物からの液体の細胞診によって診断される核異常を記載している。異常細胞の細胞診を、Sartoriusら(1977) J. Natl Cancer Inst 59: 1073-1080およびKingら(1983) JNCI 71 (6) 1115-1121に記載された通りに行うこともできる。非定型性および非浸潤癌は、Pageら(1998) Mod Pathol 11 (2) : 120-8に記載された通り、病理学的に広く特徴が知られている。乳管液は、液体の一部をスライドグラスに載せ、標準的な細胞学的染色を施して光学顕微鏡を用いる細胞学的手法によって分析可能である。Mouriquand J (1993) S Karger Pub, 「触知不能な乳房病変の診断: 超音波制御による細針吸引：細胞学的評価の診断および予後判定に対する意義（Diagnosis of Non-Palpable Breast Lesions: Ultrasonographically Controlled Fine-Needle Aspiration: Diagnostic and Prognostic Implications of Cytology）」(ISBN 3805557477)；Kline TSおよびIK、Pub Igaku-Shoin Medical「乳房：臨床的吸引生検ガイド（Breast: Guides to Clinical Aspiration Biopsy）」(LSBN 0896401596；Masood, American Society of Clinical Pathology: Nov. 199S, 「乳房の細胞病理学（Cytopathology of the Breast）」ISBN 0891893806；ならびにFeldman PS, American Society of Clinical Pathology, Nov. 1984, 「細針吸引細胞診およびその臨床応用：乳房および肺（Fine Needle Aspiration Cytology and Its Clinical Applications: Breast and Lung）」ISBN 0891891846を含む刊行された方法を用いて、個々の細胞および細胞塊における非定型的増殖パターンに関して細胞を検討することができる。
【００３９】
細胞学的分析を考察し、乳管液に由来する乳管上皮細胞の分析を指導している他の参考文献には、Silvermanら（「FNA生検によって乳房の非定型性過形成、非浸潤癌および浸潤癌を区別することは可能か：細胞形態学的基準および診断の限界（Can FNA biopsy separate atypical hyperplasia, carcinoma in situ, and invasive carcinoma of the breast?:  Cytomorphologic criteria and limitations in diagnosis）」）Diagnostic Cytopathology 9 (6) : 713-28, 1993；Masoodら（「乳房の非定型性過形成と非浸潤癌の免疫組織学的鑑別（Immunohistochemical differentiation of atypical hyperplasia vs. carcinoma in situ of the breast）」）Cancer Detection & Prevention. 16 (4) : 225-35, 1992；Masoodら（「マンモグラフィーガイド下細針吸引における増殖性および非増殖性乳房疾患の細胞学的鑑別 (Cytologic differentiation between proliferative and nonproliferative breast disease in mammographically guided fine-needle aspirates）」）Diagnostic Cytopathology. 7 (6) : 581-90, 1991；Masood S.（「潜在性乳房病変および吸引生検：新たな挑戦 (Occult breast lesions and aspiration biopsy: a new challenge）」）Diagnostic Cytopathology. 9 (6) : 613-4, 1993；Masood S.（「乳癌における予後判定因子：細胞標本の使用（Prognostic factors in Breast Cancer: use of cytologic preparations）」）Diagnostic Cytopathology. 13 (5) : 388-95, 1995；NovakおよびMasood（「乳房病変の細針吸引生検における核溝：これに意義はあるか（Nuclear grooves in fine-needle aspiration biopsies of breast lesions: do they have any significance?）」）Diagnostic Cytopathology. 18 (5) : 333-7, 1998；Sidawyら（「細針吸引による増殖性乳房疾患の分類における観察者間変動: パパニコロー細胞病理学会の研究結果（Interobserver variability in the classification of proliferative breast lesions by fine-needle aspiration: results of the Papanicolaou Society of Cytopathology Study）」）Diagnostic Cytopathology. 18 (2) : 150-65, 1998；Masoodら（「細胞学における自動化：パパニコロー細胞病理学会の新技術作業部会による調査（Automation in cytology: a survey conducted by the New Technology Task Force, Papanicolaou Society of Cytopathology）」）Diagnostic Cytopathology. 18 (1) : 47-55, 1998；ならびにFrykbergおよびMasood Copeland EM 3d、Bland KI.（「乳房の非浸潤性乳管癌（Ductal carcinoma in situ of the breast）」）Surgery, Gynecology & Obstetrics 177 (4) : 425-40, 1993が含まれる。
【００４０】
本発明は、乳房の乳管から回収可能な液体の量を増加させるためのキットであって、乳管内投与用の物質、物質を患者に対して乳管内に送達するための医用ツール、および使用説明書を含むキットを含む。物質は、乳管内の回収可能な乳管液および材料を増加させうる物質である。医用ツールは、このような物質の乳管内送達をもたらす任意のツールであってよい。説明書は、物質の投与方法、液体を採取するまでに待つ時間の長さ、液体の採取方法、および採取した液体の分析方法または分析のための調製方法を含む、投与のためのプロトコールを指示することができる。
【００４１】
実施例
ウサギ肝臓内へのマンニトール溶液の導入は乳管液の採取量の増加をもたらす
これらの実験の目的は、マンニトールを含む溶液の導入が生きたウサギの乳管からの液体分泌に及ぼす影響を検討することであった。Kraelik Farm, CAから入手した体重4.1kgの雌性ニュージーランドウサギ#3242を用いた。ケタミン200mgおよびザイラジン40mgの注射によってウサギに麻酔を施した。2時間後に、麻酔を深いレベルに保つためにケタミン100mgおよびキシラジン20mgによる2回目の注射を行った。ウサギの胸部および腹部の剃毛を行い、乳房および乳頭を露出させた。
【００４２】
青色のシングルルーメンカテーテル（外径0.23"、内径0.017；先端の外径0.011"〜0.012"）を各乳頭の乳管内に挿入した。3つの乳頭を検討し、乳頭1つにつき2本の乳管にカテーテルを用いてアクセスした。乳頭はA、BおよびCと指定した。
【００４３】
乳頭Aの1本の乳管に、単一のカテーテルを用いて12.5％D-マンニトール水溶液（Sigma Chemicals, St. Louis, MOから購入、カタログ番号M-9546 ロット6710402：C6H14O6 FW 182.2）0.20mlを注入した。乳頭Aの対照乳管にはリン酸緩衝食塩液（PBS）0.20mlを注入した。微量遠心管を各カテーテルの末端に装着し、流出する液体を採取した。10分後に、12.5％D-マンニトール水溶液0.2mlを第1の乳管に、第2の乳管にはリン酸緩衝食塩液0.20mlを注入し、各乳管に注入した総容積を0.40mlとした。
【００４４】
乳頭Bの1本の乳管には、12.5％D-マンニトール水溶液0.5mlを単一のカテーテルを用いて注入した。乳頭Bの対照乳管にはリン酸緩衝食塩液（PBS）0.50mlを注入した。微量遠心管を各カテーテルの末端に装着し、流出する液体を採取した。
【００４５】
乳頭Cの1本の乳管には12.5％D-マンニトール水溶液0.7mlを単一のカテーテルを用いて注入した。乳頭Cの対照乳管にはリン酸緩衝食塩液（PBS）0.70mlを注入した。微量遠心管を各カテーテルの末端に装着し、流出する液体を採取した。
【００４６】
約1時間後に、マンニトールを含む液体またはPBSをカテーテルを介して乳管内に注入し、微量遠心管を液体が回収されたか否かに関して検査した。その結果を以下の表1にまとめた。
【００４７】
【表１】
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【００４８】
写真を撮影するために、液体を含む各微量遠心管にダビッドソン緑色色素（1μl）を添加した。過飽和KClの静脈内注射によってウサギを屠殺した。各採取物にPBS（1.5μl）を添加した。細胞に対して、メガファンネル（megafunnel）およびサイトスピン-3（cytospin-3）装置（Shandon, Inc. Pittsburgh, PA）を用いて、Shandonコートスライド上で1500／分の遠心処理を15分間行った。95％エタノール中に10分間置いて細胞を固定した。細胞を、採取した液体のヘマトキシリン・エオジン（HE）法による細胞診を用いて染色した。細胞分析の結果を表2に示した。
【００４９】
【表２】
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【００５０】
この実験からの観察所見によれば、マンニトール溶液を注入した3本の乳管中3本とも液体を採取できた；PBS溶液を注入した3本の乳管中のうち1本で液体を採取でき、液体が採取された乳管における容積は約50％少なかった。各々の乳管から採取した液体から細胞が検出された。細胞の形態は、マンニトールおよびPBSを注入した乳管のいずれにおいても類似していた。
【００５１】
本明細書で言及したすべての刊行物および特許出願は、それぞれの個々の刊行物が参照として組み込まれるように明確かつ個別に示されている場合と同程度に、参照として本明細書に組み入れられる。上記の本発明は、理解しやすいように図面および実施例を用いてある程度詳細に記載されているが、当業者には、本発明の開示に鑑みて、その精神または添付した特許請求の範囲を逸脱することなくある種の変更および改変が可能であることは容易に理解されると思われる。
【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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