(57)【要約】本発明は、好熱性バシラス種由来の熱安定性プロテイナーゼ及び核酸試料の調製における該プロテイナーゼの使用に関する。本発明の酵素は、６５〜８０℃において安定且つ活性であるが、９０℃以上では即座に自己溶解又は変性する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｉ）少なくとも１つの非特異的な好熱性酵素を試験用核酸を含む試料に加える工程、及びｉｉ）該好熱性酵素の活性により、細胞の溶解、タンパク質の消化、細胞壁酵素の消化のうちの１つ又はそれ以上を行うのに必要な６５〜８０℃で好適な時間、前記試料をインキュベートする工程を有する、核酸試料の調製方法であって、前記好熱性酵素は６５〜８０℃で実質的に安定且つ活性であるが、前記試料が９０℃又はそれ以上でインキュベートされるときには直ちに自己溶解及び／又は変性することに特徴を有する、上記方法。
【請求項２】
前記好熱性酵素はプロテイナーゼである請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記好熱性酵素はバシラスsp. str. ＥＡ１由来である請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
前記好熱性酵素はバシラスsp. str. Ａｋ１由来である請求項１又は２記載の方法。
【請求項５】
細胞の溶解、タンパク質の消化、細胞壁酵素の消化のうちの１つ又はそれ以上を行うのに必要なインキュベーション温度が７５℃である請求項１〜４のいずれか１項記載の方法。
【請求項６】
試料を９４℃でインキュベートして、前記好熱性酵素の自己溶解及び／又は変性を行う請求項１〜５のいずれか１項記載の方法。
【請求項７】
ｉ）少なくとも１つの中温性酵素及び少なくとも１つの非特異的な好熱性酵素を試験用核酸を含む試料に加え、ｉｉ）該中温性酵素の活性により、細胞壁の除去を行うのに必要な４０℃以下で好適な時間、前記試料をインキュベートする、初期工程を有する請求項１〜６のいずれか１項記載の方法。
【請求項８】
中温性酵素がセルラーゼである請求項７記載の方法。
【請求項９】
細胞壁の除去を行うのに必要な初期インキュベーション温度が３７℃である請求項７のいずれか１項記載の方法。
【請求項１０】
方法を密閉管系で行うことを特徴とする請求項１〜９のいずれか１項記載の方法。
【請求項１１】
核酸試料の調製に用いられる好熱性酵素を同定する選択方法であって、ｉ）細胞の溶解、タンパク質の消化、細胞壁酵素の消化のうちの１つ又はそれ以上を行うのに必要な６５〜８０℃で実質的に安定且つ活性な好熱性酵素を単離する工程、及びｉｉ）９０℃又はそれ以上でインキュベートされると前記好熱性酵素が直ちに自己溶解及び／又は変性できることを確実化（ensure）する工程に特徴を有する、上記選択方法。
【請求項１２】
工程ｉ）の温度が７５℃である請求項１１記載の選択方法。
【請求項１３】
工程ｉｉ）の温度が９４℃である請求項１１記載の選択方法。
【請求項１４】
ｉ）４０℃以下で活性が低い好熱性酵素を単離する初期工程を有する請求項１１〜１３のいずれか１項記載の選択方法。
【請求項１５】
初期工程の温度が３７℃である請求項１４記載の選択方法。
【請求項１６】
核酸試料の調製に用いられる好熱性酵素であって、ｉ）４０℃以下で活性が低く、ｉｉ）６５〜８０℃で実質的に安定且つ活性であり、細胞の溶解、タンパク質の消化、細胞壁酵素の消化のうちの１つ又はそれ以上を生じさせ、ｉｉｉ）９０℃又はそれ以上でインキュベートすると直ちに自己溶解又は変性することに特徴を有する上記好熱性酵素。
【請求項１７】
前記酵素の温度−活性プロファイルが多工程反応又は多酵素反応において用いることができる請求項１６記載の好熱性酵素。
【請求項１８】
核酸抽出前に、植物及び菌組織及びバクテリアからの細胞壁、胞子並びに生物膜を弱めるか及び／又は除去するのに必要な４０℃以下の温度で活性な中温性酵素を含む請求項１７記載の多酵素混合物。
【請求項１９】
請求項１〜１０のいずれか１項記載の方法により調製される核酸試料を用いるポリメラーゼ連鎖反応。
【請求項２０】
請求項１〜１０のいずれか１項記載の方法に用いられるキットセットであって、単位体積の好熱性酵素を含み、単位体積の中温性酵素プレートを任意に含み、核酸試料の調製のための取扱説明書及び手段を含む、上記キットセット。
【請求項２１】
請求項１１〜１７のいずれか１項で同定される好熱性酵素を含む、核酸試料の調製用キットセット。
【請求項２２】
請求項１８記載の多酵素混合物、及び該混合物を使用するための取扱説明書及び手段を含む、核酸試料の調製用キットセット。
【請求項２３】
添付する実施例及び図面を参照して本願に実質的に記載され且つ添付する実施例及び図面に例示される核酸試料の調製方法。
【請求項２４】
添付する実施例及び図面を参照して本願に実質的に記載され且つ添付する実施例及び図面に例示される、核酸試料の調製用好熱性酵素を同定するための選択方法。
【請求項２５】
添付する実施例及び図面を参照して本願に実質的に記載され且つ添付する実施例及び図面に例示される好熱性酵素。
【請求項２６】
添付する実施例及び図面を参照して本願に実質的に記載され且つ添付する実施例及び図面に例示されるキットセット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、分子生物学の技術の改良手順に関する。特に、本手順は、全体の手順を簡略化するだけでなく、外来汚染を除去する手段を提供することにより、改良した分子生物学的な診断技術を促進するものと考えられる。
好ましくは、本発明の結果として除去される汚染として、タンパク質及びヌクレアーゼが含まれる。
【発明の背景】
【０００２】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、分子生物学において、急速に、広く用いられる技術の一つとなった。ＰＣＲは、源となる核酸が比較的その質が乏しいものであっても、少量の源となる材料から、（対象となる特異的な核酸配列の酵素的な増幅により）比較的多量のＤＮＡ分子のコピーを製造する、迅速で、高価ではなく、かつ単純な手段である。
標準的なＰＣＲには、試料の調製、試薬及びオリゴヌクレオチドプライマーのマスター混合、並びにその後の反応生成物の検出及び分析が含まれる。
【０００３】
テンプレート核酸調製のあるプロトコールがＰＣＲの目的に許容されるが、収率の減少及び／又は不所望の核酸による事故的な汚染を予防するために、核酸調製において、可能な限り少ない工程を用いることがしばしば最良である。
市販又は研究室における核酸に基づく診断手順は、しばしば、天然物からの核酸抽出物を必要とする。応用範囲は、法廷で用いるＤＮＡ照合（DNA-fingerprint）から、医療、農業及び環境のモニタリングに及ぶ。特に、初期試料の核酸濃度が非常に低いか及び／又は汚染が間違った結果をもたらす場合に、いかなる核酸抽出物も汚染されていないことが重要である。
【０００４】
出発材料の量がピコグラム以下で測定される法廷での分析又は証拠としての分析におけるケースにおいて特に重要である。試料の汚染は、試料管が雰囲気下で開けられるか又は施行者によって触れられた結果として単純に生じ得る。
試料が容易に汚染され得ることから、再現可能な核酸抽出技術が汚染から隔離されていること、及び該技術がそのような汚染を最小限にするプロトコールを要することが求められている。
【０００５】
標準的な核酸抽出技術は、抽出手順の全ての段階において、試料管を開けたり閉めたりする必要があることが問題である。よって、汚染などを最小限にする、単純で密閉管反応を可能とするプロトコールを開発するのがよい。
ＰＣＲ技術は、しばしば、長い精製手順を必要とする。これらの手順は、プロテイナーゼでの長時間インキュベーション、フェノール及びクロロホルム抽出、並びに最後にはエタノール性塩沈殿が含まれる。
【０００６】
ＰＣＲによる増幅のために、動物組織からの核酸を調製する方法が、多く記載されている。典型的な例が、Hunt, Parks及びLumley(1997) Food Chemistry 60巻: 437-442頁に記載されている。
【０００７】
動物組織試料（肉や骨など）からのＤＮＡ抽出方法は典型的に、次の工程を含む。即ち、１）ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を含むバッファに組織試料を再懸濁。
２）均質化。
３）酵素、プロテイナーゼＫでの１〜２時間のインキュベーション。
４）フェノールでの試料の溶媒抽出。
５）フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコールの混合物での溶媒抽出。
６）クロロホルムでの溶媒抽出。
７）３Ｍ酢酸ナトリウム及び３倍容量のエタノール中での最小でも１時間の沈殿。
８）ＤＮＡの遠心分離。
９）ペレットを２回エタノールで洗浄。
１０）空気乾燥及びバッファ中でのペレットの再懸濁。
【０００８】
簡単な方法は、血液からのＤＮＡの放出を利用する。最も一般的なのは、市販品シェレックス（Chelex、商標）を用いる。これらの方法は、この試薬の存在下、試料を単に煮沸することにより、適量（moderate yields）のＤＮＡをもたらすことができる。
しかしながら、ＰＣＲの阻害を除くために、法廷科学者は通常、血液細胞を前洗浄し且つ遠心分離し、赤血球を溶解しヘムを取り除く。これには、手順へのさらなる工程及び汚染の源を要し、分解するか又は環境的に汚される血液試料（典型的には罪の場面での試料）と共に収量のロスとなる。
【０００９】
出願人は、新規なプロテイナーゼを用いる核酸抽出がこの阻害を除去することを示す実験を行い、これにより、この工程の必要性を取り除き、且つ試料汚染の可能性が減少し且つ向上した収率を得られるに至った。
分子生物学に用いられる他の標準的な技術は、単純な、密閉管反応、例えば制限酵素及び熱不安定ではないホスホターゼの除去から利益を得て、試料を精製するためのフェノール／クロロホルム抽出、エタノール性塩析出及び洗浄工程に消費される時間を必要とすることもできる。
【００１０】
本願に記載する、いかなる特許及び特許出願を含む、全ての参考文献は、参照として本件に含まれる。いかなる参考文献も先行技術を構成するものと認めるものではない。参考文献の議論は、その著者が主張することを述べ、出願人は、引用される文書の正確性及び適切さに挑戦する権利を保持する。多くの先行技術の公開公報が本願に参照されているが、この引用は、これらの文献が、ニュージーランドにおいて、又は他のいかなる国においても、当該分野の一般常識の一部を形成する承認を構成するものではないことを、明確に理解されるべきである。
【００１１】
“有する（comprise）”の語は、変化する司法権のもとでは、排他的な意味又は非排他的な意味のいずれかであるとできることが認められる。本明細書の目的として、特記しない限り、“有する（comprise）”の語は、非排他的な意味を有すべきである。即ち、直接引用するリストアップした成分のみならず、他の限定しない成分又は要素をも含む意味であると取るべきである。この原理は、“有する（comprised）”又は“有する（comprising）”の語が、方法又はプロセスにおける１以上の工程と関連して用いられるときにも、用いることができる。
【００１２】
前述の課題に注意を向けること、又は有用な選択と共に公衆に少なくとも提供することが本発明の目的である。
本発明のさらなる面及び利益は、例示としてのみなされる以下の記述によって明確にされるであろう。
【発明の開示】
【００１３】
本発明のある面によると、核酸試料の調製方法が提供される。この方法は、ｉ）少なくとも１つの非特異的な好熱性（thermophilic）酵素を試験用核酸を含む試料に加える工程、及びｉｉ）該好熱性酵素の活性により、細胞の溶解、タンパク質の消化、細胞壁酵素の消化のうちの１つ又はそれ以上を行うのに必要な６５〜８０℃で好適な時間、前記試料をインキュベートする工程を有し、該好熱性酵素は６５〜８０℃で実質的に安定且つ活性であるが、試料が９０℃又はそれ以上でインキュベートされるときには即座に自己溶解及び／又は自己分解することに特徴を有する。
【００１４】
本明細書を通して参照を容易にするために、「核酸」の語は、本明細書においてＤＮＡをいう。しかしながら、これは、本発明の方法についての限定として扱うべきではなく、ＲＮＡ試料の調製にも用いることができる。
好ましい態様として、好熱性酵素はプロテイナーゼである。
本明細書を通して参照を容易にするために、好熱性酵素は、本明細書においてプロテイナーゼをいう。しかしながら、これは、他の酵素についての限定として扱うべきではなく、他の酵素も用いることができる。
【００１５】
プロテイナーゼの活性により、細胞の溶解、タンパク質の消化、細胞壁酵素の消化のうちの１つ又はそれ以上を行うのに必要な、好ましいインキュベーション温度は、７５℃である。
プロテイナーゼの自己溶解及び／又は変性を行うのに必要な、好ましいインキュベーション温度は、９４℃である。
しかしながら、これらの温度は、例示のためだけのものであり、いかなる場合においても限定する意味ではないことを認識されるべきである。
【００１６】
プロテイナーゼが、温度範囲において、酵素活性及び安定性の双方に関して異なる特性を有し、そのような酵素の変遷が当業者に知られていることが予想される。本発明のプロテイナーゼに対するそのような酵素特性が、最小限の実験で測定できることも予想される。
【００１７】
本発明の他の面によると、実質的に上述したように、核酸試料の調製方法が提供される。この方法は、ｉ）少なくとも１つの中温性（mesophilic）酵素及び少なくとも１つの非特異的な好熱性酵素を試験用核酸を含む試料に加え、ｉｉ）該中温性酵素の活性により、ある細胞壁の除去を行うのに必要な４０℃以下で好適な時間、前記試料をインキュベートする、初期工程を含む。
【００１８】
好ましい態様として、中温性酵素がセルラーゼ又は他の細胞壁崩壊酵素であるのがよい。
中温性酵素の活性により、ある細胞壁の除去を行うのに必要な、好適な初期のインキュベーション温度は、３７℃である。再度、これは、いかなる場合においても、限定として扱うべきではない。
【００１９】
中温性有機体及び適度に好熱性の酵素の双方由来のタンパク質分解酵素は、商業用酵素の市場に大きなシェアを持つ微生物プロテイナーゼと共に、経済的に大いに重要であるとみなされる。好熱性有機体由来の酵素の熱的安定性は、そのような酵素が潜在的な応用を有することを保証する。商業的な応用を有する細胞外プロテイナーゼを生産する好熱性微生物の多くは、異常な環境に対して本来的に高い安定性を有することから、本発明に対して焦点が当てられた。
【００２０】
しかしながら、好ましい態様において、プロテイナーゼ源として、中性プロテイナーゼであるバシラス（Bacillus）sp.株ＥＡ１、及びセリン・プロテイナーゼであるバシラスsp. str. Ａｋ１が挙げられる。
ＥＡ１プロテイナーゼは、南極大陸エレバス山(Mount Erebus, Antarctica) から単離される、バシラス16S ｒＲＮＡ  第５群（Ｂ．ステアロサーモフィラス(B. stearothermophilus)を含む）の１つのメンバーである。ＥＡ１のプロテイナーゼは、本発明の手順の使用に役立つ。
【００２１】
バシラスＡｋ１は、細胞外セリン・プロテイナーゼを産生する好熱性バクテリアである。Ａｋ１プロテイナーゼは、熱安定性のサブチリシン（sabtilisin）である。Ａｋ１プロテイナーゼは、大腸菌（Escherichia coli）クローンＰＢ５５１７からの均質物へ精製される。バシラス株Ａｋ１は、バシラス株ＥＡ１と関連するが、B. サーモグルコシダシカス（B. thermoglucosidacus）とより密接に類似する。この有機体は、ＥＡ１の汚染物質として、オークランド（Auckland）で単離された。
【００２２】
本発明のプロテイナーゼに求められるものは、１）６５〜８０℃の範囲において実質的に安定且つ活性であること、２）９５℃で又はそれ以上で、即座に自己溶解及び／又は変性できること、及び任意に３）４０℃以下で低活性であるような温度−活性特性を有すること（付随する中温性酵素、例えばセルラーゼは、分解されない）である。
【００２３】
本発明は、これらの特徴を有するプロテイナーゼを同定する選択方法にも向けられている。
Ａｋ１プロテイナーゼは、元来調査して、高温でのＤＮＡ洗浄にその有用性が測定された。しかしながら、市販Ｒｔ４１Ａプロテイナーゼで得られるように、広い基質特異性が有効なタンパク質除去に求められるとみなされた。Ａｋ１プロテイナーゼが限定された基質特異性を有することが分かったので、その応用はさらに探索されていない（Toogoodら、Biochem. J. (2000) 350, 321-328）。
【００２４】
Ｒｔ４１Ａプロテイナーゼは、市販品プレタック（PreTaq、商標）として知られている熱安定性のアルカリ性プロテイナーゼであり、ＰＣＲによる増幅前にＤＮＡ及びｍＲＮＡの調製に用いられる。プレタック（PreTaq、商標）−サーマスsp. str. Ｒｔ４１Ａ（Thermus sp. str. Rt41A）は、Ｃａ２＋依存性セリン・プロテイナーゼである。Ｒｔ４１Ａは、ニュージーランドでのみ発見された、サーマス種の属内の分類される種である。
【００２５】
標準的なＤＮＡ抽出プロトコールは、試料をプロテイナーゼＫと共にインキュベートし、細胞から放出される有害な（deleterious）酵素であって試料ＤＮＡを分解することができる酵素が活性となる温度で細胞の溶解を生じさせることを含む。
【００２６】
好熱性プロテイナーゼを用いることにより、これらの有害な（deleterious）酵素が不活性であり、そのためにＤＮＡを保存できる温度で、ＤＮＡ抽出及び細胞溶解を行うことができる。
【００２７】
プレタック（PreTaq、商標）は、プロテイナーゼＫの熱安定性代替品として市販入手可能であり、分解せずにＤＮＡを洗浄することができる。
しかしながら、プレタック（商標）の温度−活性特性は、活性であり続け、高温で即座に除去できないので理想的ではなく、そのためそれ自身汚染物質となる。ＥＡ１プロテイナーゼ及びＡｋ１プロテイナーゼは、高温で容易に除去できる、熱安定性のＣａ２＋依存性プロテイナーゼ代替品として出願人によって同定された。
【００２８】
好ましい態様として、熱安定性プロテイナーゼを試料管に加える。その後、この試料管をインキュベートして、温度シフトを与える。温度シフト後、タンパク質分解が生じる。
この作業は、６５〜８０℃で行われる。この温度において、これらの酵素が非常に活性だからである。この温度で、細胞を洗浄し、プロテイナーゼはいかなる汚染タンパク質をも分解する。特に、これらは、ＤＮＡ−分解ヌクレアーゼが不活性である温度で、該ヌクレアーゼを即座に除去し、これにより試料のＤＮＡ分解を最小限に抑える。
【００２９】
本発明は、２種の好熱性プロテイナーゼのうち１種を用いて簡易な密閉管反応内の物質群からＤＮＡを抽出する改良プロトコールの開発に関する。
簡易な、密閉管系の開発は、先行技術を超える多くの利益を有する。現在のＤＮＡ抽出作業は、長く、フェノールなどの毒性を有する化学薬品を多く使用することを要し；管を開閉する多くの工程により、汚染が即座に生じ得る。
【００３０】
本発明の密閉管系により、ＤＮＡ抽出を実質的に汚染なしで、且つ高収率で行うことができ、診断技術の広範囲において、長い精製工程を用いることなく、使用することができる。
本発明の作業は、異なる温度で異なる活性を有するプロテイナーゼ及び／又はプロテイナーゼ／細胞壁分解酵素カクテルに依存する。新しい反応剤を加えるために管を開ける必要なく、可変温度をサイクルすることによって、異なる酵素の活性は、その役割を果たすことができる。
【００３１】
新しい作業は、初期段階で試料を加えるためだけに管を開け、次いで試験のためにそれを開けることを要する、核酸の精製に関する。よって、この作業は、速く、上記に用いられるプロトコールのように、汚染物質を導入させない傾向にある。
したがって、本方法は、ＰＣＲなどの分子生物学の診断技術の標準を改良することに関し、試料管の開閉の結果として生じる試料の汚染を最小限に抑えることに関する。
【００３２】
ＰＣＲを基礎とした応用として、試料を９０℃又はそれ以上に加熱してプロテイナーゼを除去することができ、これにより、迅速な自動触媒反応（自己消化又は変性）をもたらす。反応バッファも、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）で最も一般的に用いられるものと類似する。これらの２つの要因が、現在のプロトコールのフェノール／クロロホルム抽出及びエタノール性塩沈殿工程の必要性を除去し、これによりＤＮＡの収率における著しい改善をもたらすと共に汚染のリスク又は毒性ある化学薬品への暴露を減少させる。
【００３３】
ＤＮＡの低温消化（例えば、ＤＮＡの制限酵素消化）を必要とする応用として、プロテイナーゼは、３７℃で非常に低い活性を有するので、除去する必要がない。したがって、これにより、プロテイナーゼＫを除去する強制的な洗浄が必要である、パルスフィールドゲル電気泳動のプラグの調製などの他の診断技術にとっては理想的となる。
【００３４】
該プロテイナーゼは、制限消化されるＤＮＡを、制限酵素を除去する長時間の精製プロトコールを用いずに、ＤＮＡ結合に用いることができる。３７℃でのインキュベーション後、試料管を６５〜８０℃に加熱して、プロテイナーゼによって制限酵素を除去できる。この温度は、ＤＮＡを変性させない。このインキュベーション後、室温又はそれ以下で行われる、低温結合反応のために試料を冷却する。
【００３５】
好熱性プロテイナーゼは、低温で非常に低活性であるので、除去する必要がない。
多工程又は多酵素反応が必要である場合、該プロテイナーゼを酵素混合物内に用いることができる。４０℃以下で低活性であるので、他の酵素反応を、プロテイナーゼの存在下で生じさせることができる。中温性酵素の混合物は、低温で活性であり、上述のプロテイナーゼのうちの１種を用いて、本発明の密閉管ＤＮＡ抽出作業を続ける前に、植物及び菌の組織及びバクテリアからの細胞壁、胞子及び生物膜を弱めるか及び／又は除去することができる。
【００３６】
本発明は、それ自身に、ＤＮＡ抽出のための１組のプロトコール及びキット配合物の開発を添えて、現在行われているＤＮＡ抽出計略で経験する課題、時間を浪費し、非効率で、且つ汚染させる傾向にある、という課題を克服する。
【００３７】
この一例として、広範囲にわたるワットマンＦＴＡ（Whatman FTA、商標）製品がある。これらの製品は、法廷でのＤＮＡ分析において比較的新しいツールであり、核酸を保護しトラップするためのタンパク質変性剤、キレート剤及びフリーラジカルトラップを含んでいる。法廷での応用として、ＦＴＡ（商標）カードは、血液のような参照試料の収集のために最も広く用いられている。試料中のＤＮＡがＦＴＡ（商標）基質に結合する一方、試料中の他の材料（ヘムのような阻害剤）は、一連の洗浄工程により除去される。
【００３８】
ＦＴＡ（商標）カードの第一の利点は、方法のすべての工程がロボットを用いる単一の管内で行われるので、自動化へのその従順性にある。しかしながら、カードはその意図する使用において有効であるが、薦められる洗浄工程は、時間を浪費し、多数回にわたり開管し、汚染のリスクを増加させる。
ＥＡ１プロテアーゼを用いることにより、前述のプロトコールは、洗浄工程を必要としないので、ＦＴＡ（商標）カード試料からのＤＮＡ抽出での有効性について該酵素を試験した。
【００３９】
ＥＡ１プロテアーゼを用いる抽出は、有効であり、推奨される作業よりも簡潔であることがわかった。また、ＤＮＡのカードへの結合量を標準化するようであり、続いて行われるＰＣＲ増幅へのテンプレートのより制御された資源を提供する。
この標準化の結果、製造者の作業を用いるプロフィールと比較すると、プロフィール間の変化が著しく減少する。ＥＡ１抽出プロセスの加熱工程は、カードに付着しない過剰のＤＮＡを除去するようであり、密接に結合する分子だけを残す。
【００４０】
この結果は、ＥＡ１系によって産生されるＤＮＡの収量の測定により支持される。ＥＡ１抽出は、製造者の方法を用いて得られる平均収量よりも、低い平均収量が得られるが、より重要なことには、変性物（variation）を減少させた収量を産生する。この効果の結果として、より合致したＳＴＲプロフィールが得られ、より少ないプロフィールが合致しないピーク高さのために排除される。
【００４１】
本発明は、特に、改良ＰＣＲ技術に用いられる、好ましい中温性酵素及び好熱性酵素の使用に関するが、本発明は、汚染物質を除去するためのＤＮＡの洗浄が特に有益である、広範囲なＤＮＡ診断技術、又は本発明が適用されて類似の有益な結果を達成することができる診断技術に応用を有することができると認識されるべきである。
したがって、本発明は、改良プロテイナーゼの開発に関し、分子生物学診断技術におけるそのような酵素の使用のための研究に関する。
【発明の態様の詳細な説明】
【００４２】
例示のみのための図を参照しつつ、試料から汚染タンパク質及び阻害剤を除去するポリメラーゼ連鎖反応のためのＤＮＡ試料の調製方法を提供し、現存の作業に代わるものを提供する。
図１は、標準プロトコールと本発明の改良プロトコールとにおける、工程の数、取られる時間及び汚染物質の導入などにおける差を例示する。
【００４３】
本発明の方法も、少なくとも１つの中温性酵素及び少なくとも１つの非特異性好熱性酵素を、試験用ＤＮＡを含む試料に添加すること及びＰＣＲによる増幅を含むのが好ましい。
その後、試料は、中温性酵素の活性により、いかなる細胞壁の除去を行う３７℃での好ましい時間、インキュベートされる。
【００４４】
その後、温度を、好熱性酵素の活性によって、細胞の溶解、タンパク質の消化、細胞壁酵素の消化のうちの１つ又はそれ以上を行うのに必要な７５℃へと上昇させる。ここで、該好熱性酵素はプロテイナーゼである。
温度を９４℃へとさらに上昇させることにより、好熱性プロテイナーゼの自己消化及び／又は変性を生じさせる。
【００４５】
密閉した管を３７−７５−９５℃とサイクルさせることにより、まず、いかなる細胞壁又は保護層も分解し、次いで、中温性酵素が分解され、最後に好熱性プロテイナーゼが分解又は変性される。
作業は、異なる温度で異なる活性を有するプロテイナーゼ又はプロテイナーゼ／細胞壁分解酵素カクテルに依存する。可変の温度でサイクルさせることにより、管を開けて新たに試薬を添加する必要なく、異なる酵素活性を利用することができる。
したがって、作業は迅速であり、以前に用いられたプロトコールのように汚染物質が導入される傾向が生じない。
【００４６】
好ましい方法は、７５℃で実質的に安定且つ活性であるが、試料を９４℃でインキュベートされると即座に自己溶解するか及び／又は変性する好熱性プロテイナーゼによって特徴づけられる。
本発明に用いるのに選択される好熱性プロテイナーゼとして、中性プロテイナーゼであるバシラスsp. str. ＥＡ１(Bacillus sp. str. EA1)、及びセリンプロテイナーゼであるバシラスsp. str. Ａｋ１(Bacillus sp. str. Ak1)を含むバシラスsp.由来のプロテイナーゼが挙げられる。
【００４７】
動物組織で用いられる標準的な手順において、まず、氷冷した試薬を添加しＤＮＡ分解を最小限にする。その後、細胞が溶解しタンパク質が変性し、これらが好熱性プロテイナーゼによって消化される７５℃に、試料管をシフトする。内因性ヌクレアーゼにより、この段階で生じるＤＮＡ分解を最小限にする。その後、好熱性プロテイナーゼが自己消化及び／又は変性する９４℃に、管をシフトする。
【００４８】
本発明の一態様により修飾した作業を図２に示す。ここでは、次のように、代りの酵素が細胞壁を分解するのに必要である（植物及び菌の抽出に関して特に有用である）。
ａ）管を３７℃にシフトし、細胞壁を中温性酵素で除去する。好熱性プロテイナーゼは、この温度では不活性であるので、細胞壁酵素を分解しない。
ｂ）その後、試料管を、細胞が溶解し、タンパク質及び細胞壁酵素が好熱性プロテイナーゼによって消化される７５℃に移す。
ｃ）その後、管を、プロテイナーゼが自己消化する９４℃に移す。
【００４９】
したがって、本発明の方法は、ＰＣＲのような標準的な分子生物学診断技術を改良することに関し、試料管の開閉の結果として生じる試料の汚染を最小限にすることに関する。
新規な作業は、初期段階で試料を加えるために管を開けるだけで、次に開けるのはＰＣＲのときだけで、核酸を精製することに関する。
記載する２つのプロテイナーゼ（ＥＡ１及びＡｋ１）は共に、キレート剤によって不安定にされ、共に本来的に安定ではないため、以前に用いられる好熱性酵素と比較して、処理の最終段階で容易に除去できる。
【００５０】
本発明は、溶解工程を、これらの酵素が不活性である７５℃で行うため、細胞溶解の際の細胞酵素による核酸試料の不所望な分解も避けられる。これは、低温でプロテイナーゼＫを用い、核酸分解を回避できない現在の方法よりも著しい改良である。
双方の酵素は、高温で活性であるように、注意して選択されるが、作業の最終段階で効果が弱められ、酵素をより確実に除去することができる。これらの酵素を除去することは本質であるか又はそれらはＰＣＲ反応を実行する酵素を潜在的に攻撃することができる。好ましいプロテイナーゼは、上述したように、バシラス由来の、Ａｋ１及びＥＡ１である。
【００５１】
本発明は、核酸をベースとした応用、特にＤＮＡ試料の調製における迅速で簡潔な方法における、広範囲な好熱性プロテイナーゼの使用の可能性を例示する。
本発明の面を実施例のみによって記述したが、添付の特許請求の範囲に規定される範囲から離れることなく、修飾及び追加ができることは認識されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【００５２】
本発明のさらなる面は、、例示のためだけになされ、かつ添付する図面を参照してなされる次の説明から明らかとなるであろう。
【図１】図１は、標準プロトコールと本発明のある好ましい態様によるプロテイナーゼを用いる新しいプロトコールを用いるＤＮＡ抽出を含む工程の比較である。
【図２】図２は、本発明のある好ましい態様による新しいＤＮＡ抽出プロトコールを用いる、異なる温度で生じる作用を図で表したものである。
【図１】
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【図２】
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【国際公開パンフレット】
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【手続補正書】
【提出日】平成15年8月13日(2003.8.13)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｉ）少なくとも１つの好熱性プロテイナーゼを試験用核酸を含む試料に加える工程、及びｉｉ）該好熱性プロテイナーゼの活性により、細胞の溶解、タンパク質の消化、細胞壁酵素の消化のうちの１つ又はそれ以上を行うのに必要な６５〜８０℃で好適な時間、前記試料をインキュベートする工程を有する、密閉系での核酸試料の調製方法であって、前記好熱性プロテイナーゼは、６５〜８０℃で実質的に安定且つ活性であるが、前記試料を９０℃又はそれ以上でインキュベートするとき、さらに変性剤を添加する必要もなく、直ちに自己溶解及び／又は変性するプロテイナーゼの群から選ばれる特徴を有する工程により前記方法は特徴づけられる、上記方法。
【請求項２】
前記好熱性プロテイナーゼはバシラスsp. str. ＥＡ１由来である請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記好熱性プロテイナーゼはバシラスsp. str. Ａｋ１由来である請求項１記載の方法。
【請求項４】
細胞の溶解、タンパク質の消化、細胞壁酵素の消化のうちの１つ又はそれ以上を行うのに必要なインキュベーション温度が７５℃である請求項１〜３のいずれか１項記載の方法。
【請求項５】
試料を９４℃でインキュベートして前記好熱性プロテイナーゼの自己溶解及び／又は変性を行う請求項１〜４のいずれか１項記載の方法。
【請求項６】
ｉ）少なくとも１つの中温性酵素及び少なくとも１つの好熱性プロテイナーゼを試験用核酸を含む試料に加え、ｉｉ）該中温性酵素の活性により、細胞壁の除去を行うのに必要な４０℃以下で好適な時間、前記試料をインキュベートする、初期工程を有する請求項１〜５のいずれか１項記載の方法。
【請求項７】
中温性酵素がセルラーゼである請求項６記載の方法。
【請求項８】
細胞壁の除去を行うのに必要な初期インキュベーション温度が３７℃である請求項６又は７記載の方法。
【請求項９】
密閉系での核酸試料の調製に用いられる好熱性プロテイナーゼを同定する選択方法であって、ｉ）細胞の溶解、タンパク質の消化、細胞壁酵素の消化のうちの１つ又はそれ以上を行うのに必要な６５〜８０℃で実質的に安定且つ活性な好熱性プロテイナーゼを単離する工程、及びｉｉ）９０℃又はそれ以上でインキュベートされるとき、さらに変性剤を添加する必要もなく、前記好熱性プロテイナーゼが直ちに自己溶解及び／又は変性できるか否かを確認する工程に特徴を有する、上記選択方法。
【請求項１０】
工程ｉ）の温度が７５℃である請求項９記載の選択方法。
【請求項１１】
工程ｉｉ）の温度が９４℃である請求項９又は１０記載の選択方法。
【請求項１２】
ｉ）４０℃以下で活性が低い好熱性プロテイナーゼを単離する初期工程を有する請求項９〜１１のいずれか１項記載の選択方法。
【請求項１３】
密閉系での核酸試料の調製に用いられる好熱性プロテイナーゼであって、ｉ）４０℃以下で活性が低く、ｉｉ）６５〜８０℃で実質的に安定且つ活性であり、細胞の溶解、タンパク質の消化、細胞壁酵素の消化のうちの１つ又はそれ以上を生じさせ、ｉｉｉ）９０℃又はそれ以上でインキュベートすると、さらに変性剤を添加する必要もなく、直ちに自己溶解又は変性することに特徴を有する上記好熱性プロテイナーゼ。
【請求項１４】
前記プロテイナーゼの温度−活性プロフィールによって、該プロテイナーゼを多工程反応又は多酵素反応において用いることができる請求項１３記載の好熱性プロテイナーゼ。
【請求項１５】
核酸抽出前に植物及び菌組織及びバクテリアからの細胞壁、胞子並びに生物膜を弱めるか及び／又は除去するのに必要な４０℃以下の温度で活性な中温性酵素を含む請求項１４記載の多酵素混合物。
【請求項１６】
請求項１〜８のいずれか１項記載の方法により調製される核酸試料を用いるポリメラーゼ連鎖反応。
【請求項１７】
請求項１〜８のいずれか１項記載の方法に用いられるキットセットであって、単位体積の好熱性プロテイナーゼ、並びに密閉系での核酸試料の調製のための取扱説明書及び手段を含む、上記キットセット。
【請求項１８】
単位体積の中温性酵素を含む請求項１７記載のキットセット。
【請求項１９】
請求項９〜１４のいずれか１項で同定される好熱性プロテイナーゼを含む、密閉系での核酸試料の調製用キットセット。
【請求項２０】
請求項１５記載の多酵素混合物、並びに該混合物を使用するための取扱説明書及び手段を含む、密閉系での核酸試料の調製用キットセット。
【請求項２１】
添付する実施例及び図面を参照して本願に実質的に記載され且つ添付する実施例及び図面に例示される、密閉系での核酸試料の調製方法。
【請求項２２】
添付する実施例及び図面を参照して本願に実質的に記載され且つ添付する実施例及び図面に例示される、密閉系での核酸試料の調製用好熱性プロテイナーゼを同定するための選択方法。
【請求項２３】
添付する実施例及び図面を参照して本願に実質的に記載され且つ添付する実施例及び図面に例示される好熱性プロテイナーゼ。
【請求項２４】
添付する実施例及び図面を参照して本願に実質的に記載され且つ添付する実施例及び図面に例示されるキットセット。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１３】
本発明のある面によると、密閉系での核酸試料の調製方法が提供される。この方法は、ｉ）少なくとも１つの好熱性（thermophilic）プロテイナーゼを試験用核酸を含む試料に加える工程、及びｉｉ）該好熱性プロテイナーゼの活性により、細胞の溶解、タンパク質の消化、細胞壁酵素の消化のうちの１つ又はそれ以上を行うのに必要な６５〜８０℃で好適な時間、前記試料をインキュベートする工程を有し、該好熱性プロテイナーゼは、６５〜８０℃で実質的に安定且つ活性であるが、前記試料が９０℃又はそれ以上でインキュベートされるとき、さらに変性剤を添加する必要もなく、直ちに自己溶解及び／又は変性するプロテイナーゼの群から選ばれる特徴を有する工程により前記方法は特徴づけられる。


【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１４】
本明細書を通して参照を容易にするために、「核酸」の語は、本明細書においてＤＮＡをいう。しかしながら、これは、本発明の方法についての限定として扱うべきではなく、ＲＮＡ試料の調製にも用いることができる。
本発明の好ましい態様において、好熱性プロテイナーゼが用いられるが、考えられるところではプロテイナーゼ以外の好熱性酵素も用いることができると予想される。
本明細書を通して参照を容易にするために、好熱性酵素は、本明細書においてプロテイナーゼをいう。しかしながら、これは、他の酵素についての限定として扱うべきではなく、他の酵素も用いることができる。


【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２１】
バシラスＡｋ１は、細胞外セリン・プロテイナーゼを産生する好熱性バクテリアである。Ａｋ１プロテイナーゼは、熱安定性のサブチリシン（sabtilisin）である。Ａｋ１プロテイナーゼは、大腸菌（Escherichia coli）クローンＰＢ５５１７からの均質物へ精製される。バシラス株Ａｋ１は、バシラス株ＥＡ１と関連するが、B. サーモグルコシダシカス（B. thermoglucosidacus）とより密接に類似する。この有機体は、ＥＡ１の汚染物質として、オークランド（Auckland）で単離された。
Ａｋ１及びＥＡ１の精製、特徴及び遺伝子配列は、以前に刊行されており、読者は次の参考文献を参照する。
・トーグッド（Toogood HS）ら、Ａｋ１プロテアーゼ、基質結合裂け目のジスルフィド結合を有する熱安定性サブチリシンの精製及び特徴（Purification and characterization of Ak1 protease, a thermostable subtilisin with a disulphide bond in the substrate-binding cleft.）、Biochemical Journal. 2000. 350(Pt 1); 321-8。
・サウル（Sail DJ）ら、バシラスsp.株ＥＡ１由来の高熱安定性、中性プロテイナーゼをコードする遺伝子の配列：大腸菌での発現及び特徴（Sequence of the gene encoding a highly thermostable neutral proteinase from Bacillus sp. strain EA1: expression in Escherichia coli and characterisation.）、Biochimica et Biophysica Acta. 1996. 1308(J): 74-80。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２７】
プレタック（PreTaq、商標）は、プロテイナーゼＫの熱安定性代替品として市販入手可能であり、分解せずにＤＮＡを洗浄することができる。
しかしながら、プレタック（商標）の温度−活性特性は、活性であり続け、高温で即座に除去できないので理想的ではなく、そのためそれ自身汚染物質となる。ＥＡ１プロテイナーゼ及びＡｋ１プロテイナーゼは、高温で容易に除去できる、熱安定性のＣａ２＋依存性プロテイナーゼ代替品として出願人によって同定された。
本発明において、Ｃａ２＋濃度が最適化されることが予見される。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５０】
本発明は、溶解工程を、これらの酵素が不活性である７５℃で行うため、細胞溶解の際の細胞酵素による核酸試料の不所望な分解も避けられる。これは、低温でプロテイナーゼＫを用い、核酸分解を回避できない現在の方法よりも著しい改良である。
双方の酵素は、高温で活性であるように、注意して選択されるが、作業の最終段階で効果が弱められ、酵素活性をより確実に停止させることができる。これらの酵素を不活性化することは本質であるか又はそれらはＰＣＲ反応を実行する酵素を潜在的に攻撃することができる。好ましいプロテイナーゼは、上述したように、バシラス由来の、Ａｋ１及びＥＡ１である。




【国際調査報告】
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2004524861.tif 000027
2004524861.tif 000028
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