(57)【要約】本発明は、乳汁の酸性タンパク質画分を含む骨の健康用組成物、かかる骨の健康用組成物を製造する方法、かかる骨の健康用組成物を含む処置方法、およびかかる骨の健康用組成物の医薬的使用に関する。本発明の一つの広い観点は、乳汁から、乳汁の成分から、乳清から、それらの加水分解物から、またはそれらの組合わせから、またはそれらの組合わせから誘導された酸性タンパク質画分を含む骨の健康用組成物であって、該組成物がカゼイノグリコマクロペプチド（ＣＧＭＰ）を含まない骨の健康用組成物を提供する。別の広い観点は、アニオン交換クロマトグラフィーを用いて、本発明の組成物を製造する方法を提供する。
2004510742.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
乳汁の酸性タンパク質画分、乳汁の酸性タンパク質画分の加水分解物またはそれらの組合わせを含む骨の健康用組成物であって、該組成物がカゼイノグリコマクロペプチド（ＣＧＭＰ）を含有しない骨の健康用組成物。
【請求項２】
乳汁の成分から誘導された酸性タンパク質画分、乳汁の成分から誘導された酸性タンパク質画分の加水分解物またはそれらの組合わせを含む骨の健康用組成物であって、該組成物がカゼイノグリコマクロペプチド（ＣＧＭＰ）を含有しない骨の健康用組成物。
【請求項３】
乳清の酸性タンパク質画分、乳清の酸性タンパク質画分の加水分解物またはそれらの組合わせを含む骨の健康用組成物であって、該組成物がカゼイノグリコマクロペプチド（ＣＧＭＰ）を含有しない骨の健康用組成物。
【請求項４】
酸性タンパク質画分が７０重量％またはそれ以上のタンパク質を含み、しかも該タンパク質の８０重量％またはそれ以上がオステオポンチンおよびプロテオースペプトンより成る、請求項１から３のいずれか一項に記載の骨の健康用組成物。
【請求項５】
酸性タンパク質画分が７０重量％またはそれ以上のタンパク質を含み、しかも該タンパク質の９０重量％またはそれ以上がオステオポンチンおよびプロテオースペプトンより成る、請求項１から３のいずれか一項に記載の骨の健康用組成物。
【請求項６】
画分中のタンパク質が、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより測定された場合、３，０００ないし６５，０００の分子量分布を有する、請求項１から５のいずれか一項に記載の骨の健康用組成物。
【請求項７】
プロテオースペプトンが、プラスミンの作用によりカゼインから生じたペプチドを含み、かつプロテオースペプトン５（ＰＰ５）、プロテオースペプトン８−スロー（ＰＰ８−スロー）、プロテオースペプトン８−ファスト（ＰＰ８−ファスト）並びに非カゼインプロテオースペプトン３（ＰＰ３）より成る群から選択されたタンパク質の一つまたはそれ以上を含む、請求項４または５に記載の骨の健康用組成物。
【請求項８】
画分のシアル酸含有率が、０．８％ないし６．５％の範囲にある、請求項１から７のいずれか一項に記載の骨の健康用組成物。
【請求項９】
画分のホスフェート含有率が、０．５％ないし３％の範囲にある、請求項１から８のいずれか一項に記載の骨の健康用組成物。
。
【請求項１０】
組成物が、アニオン交換クロマトグラフィーを用いて製造されている、請求項１から９のいずれか一項に記載の骨の健康用組成物。
【請求項１１】
組成物が、強アニオン交換クロマトグラフィーを用いて製造されている、請求項１から１０のいずれか一項に記載の骨の健康用組成物。
【請求項１２】
再結合式還元されたまたは新鮮な全乳、再結合式還元されたまたは新鮮な脱脂乳、復元式還元された全または脱脂粉乳、初乳、乳タンパク質濃厚物（ＭＰＣ）、乳タンパク質単離物（ＭＰＩ）、乳清タンパク質単離物（ＷＰＩ）、乳清タンパク質濃厚物（ＷＰＣ）、乳清、復元式還元された乳清粉末より成る群から選択されたいずれか一つまたはそれ以上の供給原料から誘導された、あるいはいずれかの乳加工流から誘導された、あるいはこれらの供給原料のいずれか一つまたはそれ以上の限外濾過および／または精密濾過により得られた透過物から誘導された、請求項１から１１のいずれか一項に記載の骨の健康用組成物。
【請求項１３】
乳酸乳清または鉱酸乳清から誘導された、請求項１から１２のいずれか一項に記載の骨の健康用組成物。
【請求項１４】
骨の健康用組成物を製造する方法であって、次の工程すなわち
（ａ）ＣＧＭＰを含有しない水溶液であって、再結合式還元されたまたは新鮮な全乳、再結合式還元されたまたは新鮮な脱脂乳、復元式還元された全または脱脂粉乳、初乳、乳タンパク質濃厚物（ＭＰＣ）、乳タンパク質単離物（ＭＰＩ）、乳清タンパク質単離物（ＷＰＩ）、乳清タンパク質濃厚物（ＷＰＣ）、乳清、復元式還元された乳清粉末より成る群から選択されたいずれか一つまたはそれ以上の供給原料から誘導され、あるいはいずれかの乳加工流から誘導され、あるいはこれらの供給原料のいずれか一つまたはそれ以上の限外濾過および／または精密濾過により得られた透過物から誘導される水溶液を用意し、
（ｂ）この水溶液を約ｐＨ３から約ｐＨ４．９のｐＨにてアニオン交換クロマトグラフィーに付し、
（ｃ）このアニオン交換媒質を洗浄し、
（ｄ）このアニオン交換媒質から乳清の酸性タンパク質画分を溶離する
工程を含む方法。
【請求項１５】
工程（ａ）において用意される水溶液が、乳酸乳清または鉱酸乳清である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
工程（ａ）において用意される水溶液が、乳酸乳清または鉱酸乳清から誘導される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
工程（ａ）において用意される水溶液が、乳清の酸性タンパク質画分の加水分解物を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
アニオン交換クロマトグラフィーが、強アニオン交換クロマトグラフィーである、請求項１４から１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
工程（ｂ）が、約ｐＨ４と約ｐＨ４．７の間にて行われる、請求項１４から１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
工程（ｂ）が、ｐＨ４．５にて行われる、請求項１４から１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
工程（ｃ）が、媒質を洗浄するために脱塩水の使用を含む、請求項１４から２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
工程（ｄ）が、ＮａＣｌもしくはＫＣｌまたはそれらの混合物を用いて行われる、請求項１４から２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
工程（ｄ）が、１Ｍ−ＮａＣｌを用いて行われる、請求項１４から２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
工程（ｄ）が、酸を用いて行われる、請求項１４から２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
工程（ｄ）が、異なるｐＨを有する２種またはそれ以上の溶離液を用いて行われる、請求項１４から２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
工程（ｄ）が、５．０と９．０の間のｐＨおよび１．０Ｍまでの塩濃度を有する溶離液を用いて行われる、請求項１４から２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
工程（ａ）の前に１つまたは複数の工程を更に含み、しかもこれらの１つまたは複数の工程は、熱処理、低温殺菌、遠心分離、限外濾過、精密濾過、逆浸透、電気透析またはイオン交換クロマトグラフィーより成る群から選択された一つまたはそれ以上の工程を含む、請求項１４から２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
請求項１４から２７のいずれか一項に記載の方法により製造された組成物。
【請求項２９】
生理学上容認され得る量のカルシウム、マグネシウム、ビタミンＣ、ビタミンＤ、ビタミンＥ、ビタミンＫ２および／または亜鉛を更に含む、請求項１から１３および２８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３０】
組成物が、ウシおよび他の乳源（ヤギもしくはヒツジまたは他の乳産生哺乳類を含めて）の一つまたは組合わせから誘導されている、請求項１から１３、２８および２９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３１】
オステオポンチン、骨シアロタンパク質、プロテオースペプトン３、プロテオースペプトン５、プロテオースペプトン８、それらから得られたシアル酸化およびリン酸化タンパク質およびペプチド、並びにアルファ−ｓ１−カゼインホスホペプチドより成る群から選択された一つまたはそれ以上の組成物を含む、請求項１から１３および２８から３０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３２】
有益な骨健康性質を示す、請求項１から１３および２８から３１のいずれか一項に記載の組成物またはその画分。
【請求項３３】
請求項１から１３および２８から３２のいずれか一項に記載の組成物を含む食餌サプリメント。
【請求項３４】
請求項１から１３および２８から３２のいずれか一項に記載の組成物を含む食料添加物。
【請求項３５】
請求項１から１３および２８から３２のいずれか一項に記載の組成物を含む飲料添加物。
【請求項３６】
請求項１から１３および２８から３２のいずれか一項に記載の組成物を含む栄養薬剤。
【請求項３７】
請求項１から１３および２８から３２のいずれか一項に記載の組成物を含む製薬。
【請求項３８】
骨の健康を維持または改善する方法であって、請求項１から１３および２８から３２のいずれか一項に記載の組成物を患者に投与することを含む方法。
【請求項３９】
正味の骨損失を処置または防止する方法であって、請求項１から１３および２８から３２のいずれか一項に記載の組成物を患者に投与することを含む方法。
【請求項４０】
請求項１から１３および２８から３２のいずれか一項に記載の組成物の、骨の健康を維持または改善するための処方物の製造における使用。
【請求項４１】
請求項１から１３および２８から３２のいずれか一項に記載の組成物の、正味の骨損失を処置または防止するための処方物の製造における使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明は、乳汁の酸性タンパク質画分から誘導された骨の健康用組成物、特に乳清の酸性タンパク質画分から誘導された骨の健康用組成物、かかる骨の健康用組成物を製造する方法、かかる骨の健康用組成物を含む処置方法、およびかかる骨の健康用組成物の医薬的使用に関する。
【０００２】
発明の背景
骨の生理学および病気
最も広がっておりかつ犠牲の大きい骨の病気の一つは、骨の漸進的な疎化および弱化により特徴づけられる骨粗しょう症である。この劣化が未処置のまま進行する場合、骨は、非常にわずかな外傷でもって破壊または骨折しそうである。
【０００３】
骨損失の過程は３０代の中ごろないし後半にて徐々に始まるけれども、それは非常に遅いので、被っている者がそれに気付くようになる前に多くの年数がかかり得る。一般に、女性は、男性より骨粗しょう症を発現する危険性が大きい。これは、閉経後、女性はエストロゲンの産生の減少に因り、骨格からの骨の速い損失を経験する故である。
【０００４】
ヒトは約４０まで、破骨細胞および骨芽細胞によりそれぞれ骨を破壊（吸収）および蓄積（再生）する過程は、ほぼ完全に結合されたシステムであって、一方の段階が他方の段階を刺激する。骨は、骨の細胞（骨細胞）が散在した細胞外タンパク質マトリックス（たいてい膠原原線維）を含み、しかもこの上に、カルシウム塩および他の無機質（ナトリウム、マグネシウムおよびフッ化物を含めて）から成る無機質成分がある。破骨細胞は特定部位にて骨を吸収し、そして次いでプログラム細胞死を受ける。骨芽細胞は、タンパク質マトリックス（類骨）を置換しそしてその再無機質化を仲介する。再無機質化中、骨芽細胞は石灰化物質内に包埋され、そして骨細胞すなわち骨の構造を維持するのを助ける細胞になる。破骨細胞および骨芽細胞により仲介される骨代謝回転は一生を通して行われ、そして「リモデリング」として知られている。エストロゲン欠乏は破骨細胞のプログラム細胞死すなわちアポプトシスを遅延させ、かくして正味の骨損失に通じると信じられる。
【０００５】
ヒトは年を取るにつれて、リモデリングシステムが壊れ、そして２つの過程（吸収および再生）は同調化しなくなる。これについての理由は、明らかでない。ある個体は、骨の非常に高い代謝回転速度を有する。ある個体は非常に漸進的代謝回転を有するが、しかし骨の破壊が究極的に蓄積をしのぐ。骨を再生するおよび吸収するパターンはしばしば患者ごとに変動する故、専門家は多数の異なる因子がこの問題の原因であると信じている。細胞成長に影響を及ぼすところの、エストロゲン、副甲状腺ホルモン、ビタミンＤおよび血液因子のような重要ホルモンがこの過程に関与する。これらの因子のいずれの因子のレベル変化も、骨粗しょう症の発現に役割を果たし得る。
【０００６】
閉経後の女性は、しばしば、天然エストロゲンレベルの減少を補償するために、ホルモン置換療法（ＨＲＴ）を受ける。ＨＲＴは、通常、患者が骨粗しょう症性骨折に通じ得る骨損失の臨界限度に非常に近くなる前には処方されない。
【０００７】
カルシウムは骨の必須成分であるので、食餌にてまたはサプリメントにてのどちらかにて十分なカルシウム摂取をすることが必要であると信じられる。ビタミンＤなしではカルシウムは骨中に取り込まれ得ず、それ故十分なビタミンＤ摂取も必要とされる。
乳汁および乳タンパク質
良好なタンパク質源であるのみならず、ウシの乳汁（「牛乳」）は、しばしば、カルシウムおよびビタミンＤの主要な食餌的源である。乳タンパク質、および骨の病気に対するそれらの効果が、多量の研究の焦点であってきた。乳汁中に存在するタンパク質は、免疫グロブリン、成長因子、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、アルファ−ラクトアルブミン、ベータ−ラクトグロブリンおよび多数のカゼイン（それらはすべて、リンタンパク質である）を包含する。これらのタンパク質は、カゼインは例外として、乳清中にも存在する。乳汁は、様々な細胞分裂誘起タンパク質および骨リモデリングに直接的に関与し得るタンパク質を含有すると知られている。
【０００８】
カゼイノグリコマクロペプチド（ＣＧＭＰ）は、チーズ製造過程のレンネット仲介カゼイン凝固工程（キモシンの作用を通じて）中カッパ−カゼインから放出されるペプチドであり、またスイートホエーまたはチーズ乳清として知られている乳清画分中に存在する。ＣＧＭＰは、時には、単にＧＭＰ（グリコマクロペプチド）と称される。チーズ乳清タンパク質は、１５％ないし２０％のＣＧＭＰから成る。ＣＧＭＰは、ＷＯ００／４９８８５に開示されているように、乳汁の骨の健康増進成分の一つとして考慮されてきた（下記に論考される）。
【０００９】
乳酸乳清は、乳酸菌での発酵によりあるいはカゼイン塩またはカテージおよびリコッタチーズの製造中乳酸の直接添加により製造される。鉱酸乳清は、カゼイン塩の製造中鉱酸の添加により製造される。乳酸乳清および鉱酸乳清は、ＣＧＭＰを含有しない。これらの２つの方法の基本原理は、キモシンの作用を用いて沈殿を引き起こすこととは反対に、ｐＨを約４．６に下げてカゼインを沈殿させることである。
【００１０】
それ故、キモシンに暴露されなかったいかなる乳製品も、ＣＧＭＰを含有しない。
【００１１】
成長因子（ＩＧＦ−インスリン様成長因子、ＴＧＦ−形質転換成長因子、等）、免疫グロブリン、ＢＳＡおよびいくつかのベータ−ラクトグロブリンは、乳汁または乳清からカチオン交換クロマトグラフィーにより回収される。いくつかの成長因子は、中性タンパク質として回収される。ＣＧＭＰは、アニオン交換により回収され得る酸性タンパク質画分である。
【００１２】
オステオポンチン（ＯＰＮ）は、あらゆる体液（乳汁を含めて）中におよび無機質化組織の細胞外マトリックス中に存在する高度にリン酸化およびグリコシル化されたタンパク質である。骨中のより豊富にある非コラーゲンタンパク質の一つであるＯＰＮは、無機質化組織において細胞−マトリックスおよびマトリックス−マトリックス界面に局在し、しかしてそこにおいて破骨細胞作用の結果として沈着される。ＯＰＮは、暴露骨表面を保護しまたは後続の細胞−マトリックス相互作用のためにそれをプライム化し得る。ＯＰＮがオプソニンとして作用して、マクロファージの接着および微粒状無機質化組織屑の食作用を容易する、ということが提案された。ＯＰＮはトランスグルタミナーゼにより架橋され得、またそれはＩ型コラーゲン、フィブロネクチンおよびオステオカルシンを含めて様々な細胞外分子に結合し得る。これは、物理的強度を細胞外マトリックスに付加することが期待され得る。ＯＰＮは、骨マトリックスへの骨細胞の接着を促進するように思える。ＯＰＮは脊椎動物の血清中に比較的高濃度にて存在し、そしてかくしてまた哺乳類の乳汁中に排出される（Ｄｅｎｈａｒｄｔ， Ｄ．Ｔ．およびＮｏｄａ， Ｍ．，オステオポンチンの表現および機能：骨リモデリングにおける役割，Ｊ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．増補版３０／３１：９２〜１０２（１９９８））。
先行技術
先行技術における公表された特許の大部分は、塩基性タンパク質すなわちカチオン交換の使用により誘導されたものの骨成長活性に焦点を当ててきた。
【００１３】
ニュージーランド国特許明細書５０３６０８は、乳汁または加熱乳清からカチオン交換クロマトグラフィーにより、骨吸収防止剤を製造することについて教示する。シスタチン、またはシスタチンの酵素加水分解生成物が、骨吸収を抑制するのに有効であると開示されている。骨、骨・関節および歯周の病気は、シスタチンまたはその加水分解生成物が存在する飲料、食料製品または飼料を摂取することにより予防（または処置）され得る。
【００１４】
ニュージーランド国特許明細書２８２８９８は、乳汁、脱脂乳、チーズ乳清、復元式還元された乳清、ＷＰＣ、ＷＰＩ、粉乳、乳清粉末または初乳からカチオン交換クロマトグラフィーにより精製されるウシＩＧＦ−１様成長因子を開示する。これらの物質は、好ましくは、カチオン交換工程の前に加熱される。結合は、タンパク質対カチオン交換体の規定比率を用いて、４と４０度Ｃの間の温度にて行われる。この製剤の成長促進効果は、培養骨芽細胞様細胞（ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞）において示された。この組成物は、骨および関節の病気、特に骨粗しょう症を予防または処置するために有用であると主張されている。ヒトに成長期中に投与される場合、ピーク骨量は増加され得る。原料成分として、請求の範囲に記載された物質は、飲料、食料、薬および動物用食餌に組み込むために有用である。
【００１５】
欧州特許明細書ＥＰ０７８７４９９（日本国特許アブストラクト８０４５５６６に対応する）は、ウシの血漿および乳汁中に存在するキニノーゲンが骨形成を促進しそして骨吸収を阻止することを教示する。全キニノーゲン、キニノーゲンのフラグメント１．２、およびキニノーゲンの酵素分解生成物（分子量範囲０．１〜７０ｋＤａ（キロダルトン））はすべて、活性であると主張されている。この特許は、かかる生成物群について飲料、食料、薬および飼料における使用をカバーする。
【００１６】
ニュージーランド国特許明細書３１４２８６は、高移動性群（ＨＭＧ）タンパク質およびアンホテリシンのＮ末端配列、またはそれらの分解生成物を、骨成長促進剤および骨吸収阻止剤として開示する。活性である該分解生成物は、０．１〜２０ｋＤａの分子量を有する。請求の範囲に記載された製剤は、カルシウムが含まれている食料、飲料、薬または飼料の成分として用いられ得る。他の体液から回収されたＨＭＧタンパク質およびアンホテリシンもまた、同様に作用する。与えられた例において、乳汁のＨＭＧタンパク質はカチオン交換クロマトグラフィーにより単離され、そして引き続いてＳ−セファロースおよびモノＱ（Ｍｏｎｏ−Ｑ）カラムにて精製される。
【００１７】
ニュージーランド国特許明細書２４６２１１は、酸性化乳清をエタノールで沈殿させることにより得られかつ５〜２８ｋＤａの間の分子量を有するところの、乳清からの骨芽細胞成長／骨増強因子について教示する。この活性剤は、エタノールで沈殿された画分の水抽出物として回収される。その代わりに、該因子は、加熱乳清が３０ｋＤａ膜を通じて限外濾過される場合の透過物にて回収され得る。この製剤の等電点は、４と９の間にある。アニオン交換クロマトグラフィーは用いられない。
【００１８】
ニュージーランド国特許明細書３１４０９７は、骨芽細胞増殖効果、骨強化効果および骨吸収阻止効果を有するところの、７．５〜１１．０の間の等電点を持った２と２４ｋＤａの間の分子量の乳汁誘導タンパク質を開示する。この活性タンパク質はカチオン交換クロマトグラフィーにより回収され、そして０．１Ｍ〜１．０Ｍ塩で溶離される。かかる製剤を含有する食料、飲料、薬および飼料もまた、請求の範囲に記載されている。
【００１９】
ニュージーランド国特許明細書３０１３６２（日本国特許アブストラクトＪＰ２０７５０８に対応する）は、破骨細胞阻害タンパク質、それをエンコードするＤＮＡおよび該ＤＮＡの表現方法について教示する。該タンパク質は、還元条件下で６０ｋＤａそして非還元条件下で６０〜１２０ｋＤａである。該タンパク質は、カチオン交換によりまたはヘパリンカラムへの結合により精製され得る。該タンパク質の生物学的活性は、５６度Ｃにて１０分間加熱することにより減少される。
【００２０】
欧州特許明細書ＥＰ７０４２１８は、塩基性乳汁を基材としたタンパク質画分および乳汁を基材とした塩基性ペプチド画分の製造を開示する。これらは、乳汁または乳清のカチオン交換クロマトグラフィーにより誘導される。両方の生成物、およびそれらの加水分解物は、経口投与される場合、骨成長を促進しそして破骨細胞の吸収を抑制する。食料または飲料製品として提供され得る。記載された組成物は、骨粗しょう症のような様々な骨の病気を処置または予防するために有用であると主張されている。
【００２１】
ＰＣＴ特許明細書ＷＯ００／４９８８５は、骨または歯の疾患の予防または処置用の組成物であって、乳タンパク質加水分解物を含む組成物を開示する。好ましい具体的態様において、乳タンパク質加水分解物は、カゼインの加水分解物、特に、カゼイノグリコマクロペプチド（ＣＧＭＰ）、その擬似体、相同体またはフラグメント（骨吸収もしくは骨損失を阻止するまたはカルシウムの吸収、保持もしくは石灰化を援助するまたはそれらの組合わせをなすＣＧＭＰの能力を保持する生物学的利用可能な形態にて）である。該組成物は、スイートホエーから濃縮および弱アニオンクロマトグラフィーにより製造される。
【００２２】
Ｂａｙｌｅｓｓ等（牛乳からのオステオポンチンの単離および生物学的性質，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ９（３）：３０９〜３１４（１９９７））は、生脱脂乳中に存在するオステオポンチンを、４度Ｃにて一晩混合されたＤＥＡＥセファセル（ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｃｅｌ）を用いて（６．６の中性乳ｐＨにて）精製する方法を開示する。未結合画分は除去され、そして他の結合タンパク質は０．２５Ｍ−ＮａＣｌ洗浄液で除去された。オステオポンチン含有画分は、０．３Ｍの溶離により回収された。オステオポンチン含有画分は集められ、塩中で４Ｍにされ、そして次いでフェニルセファロースカラムにて疎水性相互作用クロマトグラフィーにより精製された（２回）。生脱脂乳からの単離は商業上受け入れられ得ず、そして富化生成物流でない高度に精製された試料に焦点が当てられる。
【００２３】
Ｔａｋａｄａ等による初期の研究（乳汁の乳清タンパク質は卵巣摘出ラットにおいて骨破壊力を高める，Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １７，１７０９〜１７２０（１９９７））は、骨強化成分が乳清中に存在することを示す。これらの活性成分は熱安定性であり、そして乳清の低分子量の３０〜７０％エタノール沈殿性部分中に存在する。乳清の分画はなされなかった。
【００２４】
Ｙｕｎ Ｓ．Ｓ．等（チーズ乳清タンパク質濃厚物からの細胞分裂誘起性グリコホスホペプチドの単離，Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，６０（３）：４２９〜４３３（１９９６））は、指標としてネズミ脾臓細胞における細胞分裂誘起活性を用いて、チーズ乳清タンパク質濃厚物（ＣＷＰＣ）の免疫学的機能を調査した。ＣＷＰＣのゲル濾過およびアニオン交換クロマトグラフィーにより単離された画分は、高い細胞分裂誘起活性を示した。この調査結果は、チーズ乳清が強い細胞分裂誘起活性を有するグリコホスホペプチド（ＧＰＰ）を含有することを示した。
【００２５】
Ｓｏｒｅｎｓｅｎ Ｅ．Ｓ．等（牛乳のプロテオースペプトン画分から単離された３種のタンパク質の精製および特性決定，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｄａｉｒｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，６０（２）：１８９〜１９７（１９９３））は、牛乳のプロテオースペプトンから３種の主要タンパク質を単離した。これらは、セファデックスＧ−７５ゲルクロマトグラフィー、Ｑ−セファロースイオン交換および尿素の存在下での追加的セファデックスＧ−７５ゲルクロマトグラフィーにより精製された。傾斜ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおける移動度から、これらのタンパク質は１７、２８および６０ｋＤａの分子質量を有すると分かった。１７ｋＤａタンパク質のＮ末端アミノ酸配列は、ラクダの乳清タンパク質と相同であると分かった。このタンパク質は、牛乳において以前には記載されていなかった。ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果から、２８ｋＤａタンパク質は、プロテオースペプトンの主要タンパク質であって、総量のおおよそ２５％を成すと判定された。そのＮ末端アミノ酸配列は、いかなる公知タンパク質配列に対しても相同性を示さなかったが、しかしアミノ酸組成は、２８ｋＤａタンパク質が牛乳のプロテオースペプトン画分からのＰＰ３成分またはその一部と同一であることを指摘した。６０ｋＤａタンパク質は、細胞接着を仲介するところのＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ配列を有する非常に高度にリン酸化されたタンパク質であるウシオステオポンチンであると分かった。
【００２６】
科学刊行物および特許文献は、乳汁（または乳清）の酸性画分が骨吸収防止剤の（潜在的）源を与えることを示していない。
【００２７】
発明の目的
それ故、本発明の種々の観点の目的は、乳汁の酸性タンパク質画分から、特に乳清の酸性タンパク質画分から誘導された骨の健康用組成物、かかる組成物を製造する方法、該組成物を含む処置方法、該組成物の医薬的使用を提供すること、および／または少なくとも公衆に有用な選択を与えることである。
【００２８】
発明の概要
本発明の一つの観点によれば、乳汁の酸性タンパク質画分、乳汁の酸性タンパク質画分の加水分解物またはそれらの組合わせを含む骨の健康用組成物であって、該組成物がカゼイノグリコマクロペプチド（ＣＧＭＰ）を含有しない骨の健康用組成物が提供される。
【００２９】
本発明の第２観点によれば、乳汁の成分から誘導された酸性タンパク質画分、乳汁の成分から誘導された酸性タンパク質画分の加水分解物またはそれらの組合わせを含む骨の健康用組成物であって、該組成物がカゼイノグリコマクロペプチド（ＣＧＭＰ）を含有しない骨の健康用組成物が提供される。
【００３０】
本発明の第３の観点によれば、乳清の酸性タンパク質画分、乳清の酸性タンパク質画分の加水分解物またはそれらの組合わせを含む骨の健康用組成物であって、該組成物がカゼイノグリコマクロペプチド（ＣＧＭＰ）を含有しない骨の健康用組成物が提供される。
【００３１】
好ましくは、本発明の組成物は、アニオン交換クロマトグラフィー一層好ましくは強アニオン交換クロマトグラフィーを用いて製造される。
【００３２】
好ましくは、本発明の組成物は、７０重量％またはそれ以上のタンパク質を含み、しかも該タンパク質の８０重量％またはそれ以上好ましくは９０重量％またはそれ以上がオステオポンチンおよびプロテオースペプトンより成る。好ましくは、プロテオースペプトンは、プラスミンの作用によりカゼインから生じたペプチドを含み、かつプロテオースペプトン５（ＰＰ５）、プロテオースペプトン８−スロー（ＰＰ８−スロー）、プロテオースペプトン８−ファスト（ＰＰ８−ファスト）並びに非カゼインプロテオースペプトン３（ＰＰ３）より成る群から選択されたタンパク質の一つまたはそれ以上を含む。
【００３３】
好ましくは、本発明の組成物中のタンパク質は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより測定された場合、３，０００ないし６５，０００の分子量分布を有する。
【００３４】
好ましくは、本発明の組成物のシアル酸含有率は、０．８％ないし６．５％の範囲にある。好ましくは、本発明の組成物のホスフェート含有率は、０．５％ないし３％の範囲にある。
【００３５】
好ましくは、本発明の組成物は、再結合式還元された（ｒｅｃｏｍｂｉｎｅｄ）または新鮮な全乳、再結合式還元されたまたは新鮮な脱脂乳、復元式還元された（ｒｅｃｏｎｓｔｉｔｕｔｅｄ）全または脱脂粉乳、初乳、乳タンパク質濃厚物（ＭＰＣ）、乳タンパク質単離物（ＭＰＩ）、乳清タンパク質単離物（ＷＰＩ）、乳清タンパク質濃厚物（ＷＰＣ）、乳清、復元式還元された乳清粉末より成る群から選択されたいずれか一つまたはそれ以上の供給原料から誘導され、あるいはいずれかの乳加工流から誘導され、あるいはこれらの供給原料のいずれか一つまたはそれ以上の限外濾過および／または精密濾過により得られた透過物から誘導される。好ましくは、供給原料は、ウシおよび他の乳源（たとえば、ヤギもしくはヒツジまたは他の乳産生哺乳類）の一つまたは組合わせから得られる。適当な加工流の例は、ＬａｃｔａｌｂｕｍｉｎＴＭまたはＴＭＰＴＭ（Ｔｏｔａｌ Ｍｉｌｋ Ｐｒｏｔｅｉｎ）単離物の製造中生成されるものを包含する。更に一層好ましくは、本発明の組成物は、乳酸乳清または鉱酸乳清から誘導される。乳清の商業的製造のために適した方法は、Ｊ Ｇ Ｚａｄｏｗ（編者）「Ｗｈｅｙ ａｎｄ Ｌａｃｔｏｓｅ Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ」（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ，ロンドンおよびニューヨーク，１９９２）並びにＴ ＳｉｅｎｋｉｅｗｉｃｚおよびＣ Ｒｉｅｄｅｌ（編者）「Ｗｈｅｙ ａｎｄ ｗｈｅｙ ｕｔｉｌｉｓａｔｉｏｎ」（Ｖｅｒｌａｇ，独国，１９９０）に記載されている。
【００３６】
好ましくは、本発明の組成物は、生理学上容認され得る量のカルシウム、マグネシウム、ビタミンＣ、ビタミンＤ、ビタミンＥ、ビタミンＫ２および／または亜鉛を更に含む。
【００３７】
本発明の第４観点によれば、骨の健康用組成物を製造する方法であって、次の工程すなわち
（ａ）ＣＧＭＰを含有しない水溶液であって、再結合式還元されたまたは新鮮な全乳、再結合式還元されたまたは新鮮な脱脂乳、復元式還元された全または脱脂粉乳、初乳、乳タンパク質濃厚物（ＭＰＣ）、乳タンパク質単離物（ＭＰＩ）、乳清タンパク質単離物（ＷＰＩ）、乳清タンパク質濃厚物（ＷＰＣ）、乳清、復元式還元された乳清粉末より成る群から選択されたいずれか一つまたはそれ以上の供給原料から誘導され、あるいはいずれかの乳加工流から誘導され、あるいはこれらの供給原料のいずれか一つまたはそれ以上の限外濾過および／または精密濾過により得られた透過物から誘導される水溶液を用意し、
（ｂ）この水溶液を約ｐＨ３から約ｐＨ４．９のｐＨにてアニオン交換クロマトグラフィーに付し、
（ｃ）このアニオン交換媒質を洗浄し、
（ｄ）このアニオン交換媒質から乳清の酸性タンパク質画分を溶離する
工程を含む方法が提供される。
【００３８】
好ましくは、供給原料は、ウシおよび他の乳源（たとえば、ヤギもしくはヒツジまたは他の乳産生哺乳類）の一つまたは組合わせから得られる。
【００３９】
好ましくは、工程（ａ）において用意される水溶液は、乳酸乳清または鉱酸乳清である。好ましくは、工程（ａ）において用意される水溶液は、乳酸乳清または鉱酸乳清から誘導される。好ましくは、工程（ａ）において用意される水溶液は、乳清の酸性タンパク質画分の加水分解物を含む。
【００４０】
好ましくは、アニオン交換クロマトグラフィーは、強アニオン交換クロマトグラフィーである。好ましくは、工程（ｂ）は、約ｐＨ４と約ｐＨ４．７の間にて更に一層好ましくはｐＨ４．５にて行われる。用いられ得るアニオン交換体の典型例は、Ｑ−セファロース、Ｑ−セファロース・ファストフロー（Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ， Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ）、Ｑ−セファロース・ビッグビーズ（Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ， Ｂｉｇ Ｂｅａｄｓ）、およびＱ−セファデックスのような、マクロ孔質の親水性アガロースを基材としたアニオン交換体である。その代わりに、セルロースを基材としたマクロ孔質のギブコセル（Ｇｉｂｃｏｃｅｌ）ＱＡアニオン交換体およびワットマン（Ｗｈａｔｍａｎ）ＱＡセルロースが用いられ得る。やはり用いられ得る他のアニオン交換体は、ポリスチレンを基材としたマクロペプ（Ｍａｃｒｏｐｅｐ）Ｑおよびジアニオン（Ｄｉａｉｏｎ）アニオン交換体を包含する。
【００４１】
好ましくは、工程（ｃ）は、媒質を洗浄するために脱塩水の使用を含む。
【００４２】
好ましくは、工程（ｄ）は、ＮａＣｌもしくはＫＣｌまたはそれらの混合物を用いて行われる。好ましくは、工程（ｄ）は、１Ｍ−ＮａＣｌを用いて行われる。好ましくは、工程（ｄ）は、酸を用いて行われる。好ましくは、工程（ｄ）は、異なるｐＨを有する２種またはそれ以上の溶離液を用いて行われる。好ましくは、工程（ｄ）は、５．０と９．０の間のｐＨおよび１．０Ｍまでの塩濃度を有する溶離液を用いて行われる。
【００４３】
好ましい形態において、本発明の方法は、工程（ａ）の前に１つまたは複数の工程を更に含み、しかもこれらの１つまたは複数の工程は、熱処理、低温殺菌、脂肪を除去するための遠心分離、水溶液を濃縮するための限外濾過および／もしくは精密濾過、または製剤を脱イオンするための逆浸透、電気透析もしくはイオン交換クロマトグラフィーより成る群から選択された一つまたはそれ以上の工程を含む。
【００４４】
本発明の第４観点の方法により製造された組成物はまた、カルシウム、マグネシウム、ビタミンＣ、ビタミンＤ、ビタミンＥ、ビタミンＫ２および／または亜鉛を含み得る。
【００４５】
本発明の好ましい具体的態様において、本発明の骨の健康用組成物、および本発明の方法により製造されたものは、食餌サプリメント、食料もしくは飲料中に組み込まれまたは食餌サプリメント、食料添加物もしくは飲料添加物として与えられ得る。
【００４６】
本発明の更なる好ましい具体的態様は、本発明の骨の健康用組成物および本発明の方法により製造されたものを含むところの、食餌サプリメント、栄養薬剤、食料添加物または飲料添加物を含む。
【００４７】
本発明の更なる好ましい具体的態様は、本発明の骨の健康用組成物および本発明の方法により製造されたものを含むところの、乳汁、粉乳および粉乳を基材とした処方物を含有する無機質サプリメント、強化ジュース製品、シリアルまたは糖果バー並びにこれらを利用する製品、ＵＨＴおよび低温殺菌乳、ヨーグルト、発酵乳、並びに直接酸性化乳を含む。
【００４８】
本発明の高度に好ましい具体的態様において、本発明の骨の健康用組成物、および本発明の方法により製造された組成物は、オステオポンチン、骨シアロタンパク質、プロテオースペプトン３、プロテオースペプトン５、プロテオースペプトン８、それらから得られたシアル酸化（ｓｉａｌｙａｔｅｄ）およびリン酸化タンパク質およびペプチド、並びにアルファ−ｓ１−カゼインホスホペプチドより成る群から選択された一つまたはそれ以上の組成物を含む。
【００４９】
好ましくは、本発明の組成物、または本発明の方法により製造された組成物は、有益な骨健康性質を示すところの、該タンパク質画分内のいずれかのペプチドまたはペプチド画分を含む。
【００５０】
本発明の第５観点によれば、骨の健康を維持または改善する方法であって、本発明の組成物または本発明の方法により製造された組成物を患者に投与することを含む方法が提供される。
【００５１】
本発明の第６観点によれば、正味の骨損失を処置または防止する方法であって、本発明の組成物または本発明の方法により製造された組成物を患者に投与することを含む方法が提供される。
【００５２】
本発明の第７観点によれば、本発明の組成物または本発明の方法により製造された組成物の、骨の健康を維持または改善するための処方物の製造における使用が提供される。
【００５３】
本発明の第８観点によれば、本発明の組成物または本発明の方法により製造された組成物の、正味の骨損失を処置または防止するための処方物の製造における使用が提供される。
【００５４】
本発明はまた、広範には、本願の明細書において個々にまたは集合的に言及または指摘された構成部分、要素および特徴、並びにかかる構成部分、要素または特徴のいずれか二つまたはそれ以上のいずれかのまたはすべての組合わせに存すると言われ得、また特定の完全体が本明細書において挙げられそして本発明が関する技術において公知の等価物がある場合、かかる公知の等価物は、あたかも個々に記載されているかのように本明細書に組み込まれているとみなされる。
【００５５】
本発明は以上の記載に存しそしてまた諸構成を想定し、しかして諸構成について以下の記載は例を与える。
発明の詳細な記載
本発明者は、乳汁の、乳汁の成分のおよび特に乳清の酸性タンパク質画分が正味の骨損失を減少または防止し得ることを見出した。
【００５６】
表現「酸性タンパク質画分」は、４．９またはそれ以下の等電点を有するタンパク質を含む乳タンパク質の画分を意味するよう意図されている。
【００５７】
本発明の酸性タンパク質画分は、多数の小量酸性乳清タンパク質を含有することが示された。これらは、オステオポンチン、プロテオースペプトン３、プロテオースペプトン５（ＰＰ５）（β−カゼイン−５Ｐ（ｆ１−１０５）またはβ−カゼイン−５Ｐ（ｆ１−１０７）としても知られている）、プロテオースペプトン８−スロー（ＰＰ８−スロー）（β−カゼイン−１Ｐ（ｆ２９−１０５）またはβ−カゼイン−１Ｐ（ｆ２９−１０７）としても知られている）、シアル酸化およびリン酸化タンパク質、アルファ−ｓ１−カゼインホスホペプチド、並びにまたこれらのタンパク質から自然タンパク質分解により誘導されたペプチドの混合物を包含する。非常に少量のラクトシル化アルファ−およびベータ−ラクトグロブリン、ウシ血清アルブミン並びに免疫グロブリンもまた存在する。
【００５８】
酸性タンパク質画分は、天然に存在する乳プロテアーゼプラスミンの加水分解作用により生じたところの、これらのタンパク質から誘導されたペプチドを含有することが示された。乳酸乳清から回収された酸性タンパク質画分の特定の場合において、乳酸菌プロテアーゼの作用によりおよびプラスミンにより自然に生じたより広い範囲のペプチドがある。
【００５９】
骨に対する閉経の効果を模する動物モデル（卵巣摘出ラット−ＯＶＸラット）を用いて、本発明の酸性タンパク質画分が、究極的に骨粗しょう症のような病気に通じ得るところの閉経後に通常見られる骨吸収を阻止することが分かった。かくして、本発明の酸性タンパク質画分は、骨粗しょう症および変形性関節症のような病気を処置または予防する手段として有用である。
【００６０】
本発明の酸性タンパク質画分は、０．８％ないし６．５％の範囲の全シアル酸含有率および０．５と３％の間のホスフェート含有率を有する。
【００６１】
酸性タンパク質画分は、３，０００ダルトン（加水分解生成物）からおおよそ６５，０００ダルトン（プロテオースペプトン３集塊）の範囲にある広範囲の分子量を有するタンパク質およびペプチドを含有する。
【００６２】
本発明の酸性タンパク質画分の商業的回収用の可能な供給原料は、再結合式還元されたまたは新鮮な全乳、再結合式還元されたまたは新鮮な脱脂乳、復元式還元された全または脱脂粉乳、初乳、乳タンパク質濃厚物（ＭＰＣ）、乳タンパク質単離物（ＭＰＩ）、乳清タンパク質単離物（ＷＰＩ）、乳清タンパク質濃厚物（ＷＰＣ）、乳清、復元式還元された乳清粉末を包含し、あるいはいずれかの乳加工流から誘導され、あるいはこれらの供給原料のいずれか一つまたはそれ以上の限外濾過および／または精密濾過により得られた透過物から誘導される。可能な供給原料は、スイートホエーから誘導されたものを排除する。これらの可能な供給原料のいずれも、ウシおよび他の乳源（たとえば、ヤギもしくはヒツジまたは他の乳産生哺乳類）の一つまたはそれ以上から誘導され得る。その代わりに、可能な供給原料は、ＬａｃｔａｌｂｕｍｉｎＴＭまたはＴＭＰＴＭ（Ｔｏｔａｌ Ｍｉｌｋ Ｐｒｏｔｅｉｎ）単離物の製造中生成されるもののような、いずれかの乳加工流から誘導され得る。乳清の商業的製造のために適した方法は、Ｊ Ｇ Ｚａｄｏｗ（編者）「Ｗｈｅｙ ａｎｄ Ｌａｃｔｏｓｅ Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ」（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ，ロンドンおよびニューヨーク，１９９２）並びにＴ ＳｉｅｎｋｉｅｗｉｃｚおよびＣ Ｒｉｅｄｅｌ（編者）「Ｗｈｅｙ ａｎｄ ｗｈｅｙ ｕｔｉｌｉｓａｔｉｏｎ」（Ｖｅｒｌａｇ，独国，１９９０）に記載されている。
【００６３】
本発明の酸性タンパク質画分は、アニオン交換クロマトグラフィー好ましくは強アニオン交換クロマトグラフィーを用いて製造される。アニオン交換クロマトグラフィーは、好ましくは約ｐＨ３．０とｐＨ４．９の間一層好ましくは約ｐＨ４．０とｐＨ４．７の間更に一層好ましくはｐＨ４．５にて行われる。これらのｐＨ条件はアニオン交換クロマトグラフィーによる酸性タンパク質画分の回収のために最適であり、何故ならこの範囲において活性成分はカラムに結合されそして不所望タンパク質は未結合画分にてほとんど完全に排除されるからである。これらは、アルファ−ラクトアルブミン、ベータ−ラクトグロブリンおよびウシ血清アルブミン（測定活性について希釈剤としてのみ働く）のような大量乳清タンパク質を包含する。
【００６４】
工業的適用
本発明の組成物、および本発明の方法により製造された組成物は、食料または飲料中への組込みによる機能性飲食物の製造のために、並びに変形性関節症、骨粗しょう症および歯の疾患を含めて骨の欠陥（すべての年齢群）の処置、管理および／または予防のために用いられ得る。
【００６５】
本発明の組成物は、衰弱性骨疾患の開始を遅延または防止するために、栄養薬剤または食餌サプリメントとして日ベースで摂取される、ということが想定される。
【００６６】
例
例１　鉱酸乳清から誘導された酸性タンパク質画分
１０％固形分およびｐＨ４．５における鉱酸乳清タンパク質濃厚物（Ａｌａｃｅｎ ３４２−ニュージーランド国ウェリントンのＮＺＭＰから入手できる）の２０Ｌ溶液を、１１０ｍｌ／ｍｉｎの流速にてＱ−セファロースＢＢ（オーストラリア国のＡｍｒａｄ Ｐｈａｒｍａｃｉａ）の２Ｌカラムに通した。カラムを５Ｌの脱塩水で洗浄し、そして塩化ナトリウムの１．０Ｍ溶液（ｐＨ６．０）で溶離した。タンパク質の吸着および溶離は、２８０ｎｍにおける吸光度を測定することにより監視された。
【００６７】
カラムから溶離された酸性タンパク質画分を、Ａｍｉｃｏｎ ３Ｋ ＮＭＣＯ Ｓｐｉｒａｌ限外濾過装置（米国のＭｉｌｌｉｐｏｒｅから入手できる）を用いて、おおよそ６．２５倍に濃縮した。濃縮されたタンパク質保留物を水で透析し、そして次いで凍結乾燥した。
【００６８】
この乾燥生成物（５６ｇ回収された）は、７９％のタンパク質、０．５％未満のカルシウム、おおよそ１．０のリンおよび６．０％のシアル酸の含有率を有していた。溶離されたタンパク質画分のアミノ酸組成は、表１に示されている。
【００６９】
表１−鉱酸乳清からの酸性タンパク質画分のアミノ酸分析表
【表１】
2004510742.tif 000003
【００７０】
酸性タンパク質画分を、乳清タンパク質およびプロテオースペプトンについて、Ｅｌｇａｒ等（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ａ，８７８（２０００），ｐｐ１８３〜１９６）により記載された方法に従って逆相ＨＰＬＣにより分析した。分析用アニオン交換モノＱカラムＨＲ５／５（オーストラリア国のＡｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈから得られる）を、酸性タンパク質画分のタンパク質組成を決定するために用いた。これにより、オステオポンチン、アルファ−ｓ１−カゼインホスホペプチド、プロテオースペプトン３、プロテオースペプトン５およびベータ−ラクトグロブリンの存在が検出された。プロテオースペプトン８−スローはＰＰ５と共に共溶離し、従って明確なピークとして現れない。自然タンパク質分解によりこれらのタンパク質から誘導されたペプチドもまた、各成分についての幅広いピークおよび主ピークを取り囲む小さいピークの存在により示されるように検出された。
【００７１】
アニオン交換体から回収された凍結乾燥酸性画分をｐＨ８．０の２０ｍＭトリス／ＨＣｌ緩衝液中に溶解し、そしてモノＱカラムに充填した。分析的分離を、１Ｍ塩化ナトリウム（ｐＨ６．０）に対して三相線状傾斜を用いて展開した。タンパク質の吸着および溶離を、２１４ｎｍにおいて測定した。タンパク質ピーク同定を、我々自身の実験室において作製された標準物質を用いて分析した。標準物質は、ＰＰ５、ＰＰ３およびオステオポンチンについて作製された。各標準物質の同定はアミノ酸配列決定（Ｎ末端配列決定のような）により、そしてそれらの純度はＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＨＰＬＣ分析により確認された。他の成分を、図１に示されたＨＰＬＣ実験からの捕捉ピークのアミノ酸配列分析により同定した。
【００７２】
これらの分析の結果（図１）により、オステオポンチン、アルファ−ｓ１−カゼインフラグメント、シアル酸化および／またはリン酸化小量タンパク質、プロテオースペプトン５および３並びにこれらのタンパク質から誘導されたペプチドが、鉱酸乳清から回収された酸性タンパク質画分中に存在することが示された。
【００７３】
例２　乳酸乳清から誘導された酸性タンパク質画分
１０％固形分およびｐＨ４．５における乳酸乳清タンパク質濃厚物（Ａｌａｃｅｎ ３１２−ニュージーランド国ウェリントンのＮＺＭＰから入手できる）の２０Ｌ溶液を、１１０ｍｌ／ｍｉｎの流速にてＱ−セファロースＢＢの２Ｌカラムに通した。カラムを５Ｌの脱塩水で洗浄し、そして塩化ナトリウムの１．０Ｍ溶液（ｐＨ６．０）で溶離した。タンパク質の吸着および溶離は、２８０ｎｍにおける吸光度を測定することにより監視された。
【００７４】
カラムから溶離されたタンパク質を、Ａｍｉｃｏｎ ３Ｋ ＮＭＣＯ Ｓｐｉｒａｌ限外濾過装置（米国のＭｉｌｌｉｐｏｒｅから入手できる）を用いて、おおよそ６．２５倍に濃縮した。濃縮されたタンパク質保留物を水で透析し、そして次いで凍結乾燥した。
【００７５】
酸性タンパク質画分を、乳清タンパク質およびプロテオースペプトンについて、Ｅｌｇａｒ等（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ａ，８７８（２０００），ｐｐ１８３〜１９６）により記載された方法に従って逆相ＨＰＬＣにより分析した。分析用アニオン交換モノＱカラムＨＲ５／５（オーストラリア国のＡｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈから得られる）を用いて、オステオポンチン、アルファ−ｓ１−カゼインホスホペプチド、プロテオースペプトン３およびプロテオースペプトン５の存在を決定した。これらのタンパク質から誘導されたペプチドの存在もまた、例１において論考されたように認められた。
【００７６】
アニオン交換体から回収された凍結乾燥酸性タンパク質画分をｐＨ８．０の２０ｍＭトリス／ＨＣｌ緩衝液中に溶解し、そしてモノＱカラムに充填した。分析的分離を、１Ｍ塩化ナトリウム（ｐＨ６．０）に対して三相線状傾斜を用いて展開した。タンパク質の吸着および溶離を、２１４ｎｍにおいて測定した。タンパク質ピーク同定を、既知標準物質または捕捉ピークのＮ末端配列決定を用いて分析した。これらの分析の結果（図２）により、オステオポンチン、アルファ−ｓ１−カゼインフラグメント、シアル酸化および／またはリン酸化小量タンパク質、プロテオースペプトン５および３並びにこれらのタンパク質から誘導されたペプチドが、乳酸乳清から回収された酸性画分中に存在することが示された。図１との比較において、図２は、酸性タンパク質画分のタンパク質から誘導されたペプチドがより多数存在することを示している。
【００７７】
例３　効能の試験管内分析
例１からの生成物を、Ｌｏｗｅ等（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｏｎｅ ａｎｄ Ｍｉｎｅｒａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（米国），６（１２）：１２７７〜１２８３（１９９１））により記載された骨器官培養モデルにおいて試験した。図３は、酸性タンパク質画分が１０μｇ／ｍｌくらいの低い投与量にて、骨器官の培養からの細胞に対して吸収防止効果を有していたことを示している。対照と比較してより低いカルシウム放出およびより低いチミジン取込みの両方が、吸収防止効果を示す。
【００７８】
例４　効能の生体内分析
卵巣摘出（ＯＶＸ）ラットにおいてエストロゲン欠乏により誘発される骨損失を減少するべき例１からの酸性タンパク質画分の能力を、１６週間の期間にわたって調査した。卵巣摘出ラットモデルは、閉経後起こる骨損失を調査するために広く受け入れられているモデルである。
【００７９】
３０匹の６月齢の雌スプレーグ−ドーリーラットを、５．５ヶ月の齢における１０匹の見せかけ手術動物および２０匹のＯＶＸ動物として受け取った。見せかけ手術動物は麻酔を受けそして切開がなされるが、しかし卵巣は無傷のままにされる。ＯＶＸ動物において、卵巣は除去される。到着次第、動物を、３つのグループ（１グループ当たりｎ＝１０）に分けた。これらのグループは、表２に示されている。
表２−３つのラットグループについて用いられた処置
【表２】
2004510742.tif 000004
動物を靴箱型かごに別々に収容し、そして温度（２２℃±２℃）および光（１２時間の昼／夜サイクル）が制御される室において飼育した。動物は、脱イオン水を自由に入手できた。動物に、１５％カゼイン塩、５％セルロース、５％トウモロコシ油、０．５％カルシウム、６２％デンプン並びに必要に応じて添加されたビタミンおよび無機質から成るバランスのとれた半合成食餌を与えた。カゼインは、０．３％（ｗ／ｗ）の酸性乳清タンパク質画分（例１により製造された試料）を添加する場合調節された。見せかけ対照グループ（グループＡ）およびＯＶＸ対照グループ（グループＢ）は、酸性タンパク質画分が添加されていない基礎食餌を受け取った。グループＣ（ＯＶＸラット）は、０．３％（ｗ／ｗ）の例１からの酸性タンパク質画分を含有する食餌を受け取った。動物の毎日の摂取量を測定し、そしてＯＶＸグループにおける体重利得を防ぐために、見せかけグループの体重に従って摂取量を毎週調節した。実験は、毎月測定しながら４ヶ月間行われた。
【００８０】
骨無機質密度（ＢＭＤ）の測定について、ラットは、麻酔下で４週間ごとにスキャンされた。ラットを体重測定し、そして適切な投与量レベルすなわち０．０５ｍｌ／１００ｇ体重でもって麻酔した。麻酔薬は０．２ｍｌアセプロマジン（ＡＣＰ）＋０．５ｍｌケタミン＋０．１キシラジン＋０．２ｍｌ無菌Ｈ２Ｏの混合物であり、そして２５Ｇ×５／８″の針および１ｍｌの注射器を用いて腹腔内注射により投与された。ラットは注射後おおよそ５ないし１０分して適当な麻酔レベルを獲得し、そして２時間麻酔状態下のままであった。
【００８１】
ペンシルビームユニットを用いるＨｏｌｏｇｉｃ ＱＤＲ４０００骨密度計（米国のＢｅｄｆｏｒｄ）を用いて、骨無機質測定を行った。精度を保証するために、毎日の品質管理（ＱＣ）スキャンを行った。これは、変動係数を満たすために必要とされた。０．０１２７インチ（３．２３×１０−２ｃｍ）の点解像および０．０２５４インチ（６．４５×１０−２ｃｍ）の線間隔を有する０．０６インチ（０．１５２４ｃｍ）直径コリメーターを用いて、部位の高解像スキャンを遂行した。ラットは、均一な１．５インチ（３．８１ｃｍ）厚のアクリル台上に置かれた。各ラットは、脊椎並びに左および右大腿骨の３部位の高解像スキャンを受けた。ラットは、脊椎と大腿骨の間をおよび大腿骨と脛骨の間を直角にして、仰向けに置かれた。
【００８２】
図４は、画分の１６週間の給餌後の右大腿骨および脊椎のＢＭＤを示す。両方の場合において、対照ＯＶＸグループ（グループＢ）のＢＭＤは見せかけグループＡのそれより統計的に有意に低い（統計的に有意な結果は＊で印されている）のに対して、酸性乳清タンパク質画分が与えられたグループ（グループＣ）のＢＭＤは見せかけグループから有意には相違しなかった（ｐ＜０．０５）。
【００８３】
この実験は、対照食餌が与えられたＯＶＸラット（グループＢ）が見せかけ対照ラット（グループＡ）と比較して有意量の骨を失ったのに対して、驚くべきことに酸性タンパク質画分が与えられたラット（グループＣ）は見せかけラットと比較して有意量の骨を失わなかったことを示した。これにより、本発明の酸性タンパク質画分がエストロゲン欠乏に因り起こる骨損失を減少または防止し得ることが示された。
【００８４】
以上の記載は本発明のいくつかの好ましい具体的態様を記載し、またいくつかの可能な改変を指摘するが、しかし本発明の範囲から逸脱することなく他の改変がなされ得ることが当業者により理解される。
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は、例１において鉱酸乳清から誘導された酸性乳清タンパク質画分のＨＰＬＣ（モノＱ）分析を示す。
【図２】
図２は、例２において乳酸乳清から誘導された酸性乳清タンパク質画分のＨＰＬＣ（モノＱ）分析を示す。
【図３】
図３は、例３からの培養におけるマウス頭蓋冠（頭蓋の円蓋）細胞に対する酸性乳清タンパク質画分の吸収防止効果を示す。
【図４】
図４は、例４からの生体内給餌実験においてラットの種々のグループの大腿骨および脊椎の骨無機質密度を比較する。
【図１】
2004510742.tif 000005
【図２】
2004510742.tif 000006
【図３】
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【図４】
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【国際公開パンフレット】
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【手続補正書】
【提出日】平成14年6月26日(2002.6.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
正味の骨損失を減少するために適した骨の健康用組成物であってしかも乳汁の酸性タンパク質画分、乳汁の酸性タンパク質画分の加水分解物またはそれらの組合わせを含む骨の健康用組成物であって、該組成物がカゼイノグリコマクロペプチド（ＣＧＭＰ）を含有しない骨の健康用組成物。
【請求項２】
正味の骨損失を減少するために適した骨の健康用組成物であってしかも乳汁の成分から誘導された酸性タンパク質画分、乳汁の成分から誘導された酸性タンパク質画分の加水分解物またはそれらの組合わせを含む骨の健康用組成物であって、該組成物がカゼイノグリコマクロペプチド（ＣＧＭＰ）を含有しない骨の健康用組成物。
【請求項３】
正味の骨損失を減少するために適した骨の健康用組成物であってしかも乳清の酸性タンパク質画分、乳清の酸性タンパク質画分の加水分解物またはそれらの組合わせを含む骨の健康用組成物であって、該組成物がカゼイノグリコマクロペプチド（ＣＧＭＰ）を含有しない骨の健康用組成物。
【請求項４】
酸性タンパク質画分が７０重量％またはそれ以上のタンパク質を含み、しかも該タンパク質の８０重量％またはそれ以上がオステオポンチンおよびプロテオースペプトンより成る、請求項１から３のいずれか一項に記載の骨の健康用組成物。
【請求項５】
酸性タンパク質画分が７０重量％またはそれ以上のタンパク質を含み、しかも該タンパク質の９０重量％またはそれ以上がオステオポンチンおよびプロテオースペプトンより成る、請求項１から３のいずれか一項に記載の骨の健康用組成物。
【請求項６】
画分中のタンパク質が、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより測定された場合、３，０００ないし６５，０００の分子量分布を有する、請求項１から５のいずれか一項に記載の骨の健康用組成物。
【請求項７】
プロテオースペプトンが、プラスミンの作用によりカゼインから生じたペプチドを含み、かつプロテオースペプトン５（ＰＰ５）、プロテオースペプトン８−スロー（ＰＰ８−スロー）、プロテオースペプトン８−ファスト（ＰＰ８−ファスト）並びに非カゼインプロテオースペプトン３（ＰＰ３）より成る群から選択されたタンパク質の一つまたはそれ以上を含む、請求項４または５に記載の骨の健康用組成物。
【請求項８】
画分のシアル酸含有率が、０．８％ないし６．５％の範囲にある、請求項１から７のいずれか一項に記載の骨の健康用組成物。
【請求項９】
画分のホスフェート含有率が、０．５％ないし３％の範囲にある、請求項１から８のいずれか一項に記載の骨の健康用組成物。
。
【請求項１０】
組成物が、アニオン交換クロマトグラフィーを用いて製造されている、請求項１から９のいずれか一項に記載の骨の健康用組成物。
【請求項１１】
組成物が、強アニオン交換クロマトグラフィーを用いて製造されている、請求項１から１０のいずれか一項に記載の骨の健康用組成物。
【請求項１２】
再結合式還元されたまたは新鮮な全乳、再結合式還元されたまたは新鮮な脱脂乳、復元式還元された全または脱脂粉乳、初乳、乳タンパク質濃厚物（ＭＰＣ）、乳タンパク質単離物（ＭＰＩ）、乳清タンパク質単離物（ＷＰＩ）、乳清タンパク質濃厚物（ＷＰＣ）、乳清、復元式還元された乳清粉末より成る群から選択されたいずれか一つまたはそれ以上の供給原料から誘導された、あるいはいずれかの乳加工流から誘導された、あるいはこれらの供給原料のいずれか一つまたはそれ以上の限外濾過および／または精密濾過により得られた透過物から誘導された、請求項１から１１のいずれか一項に記載の骨の健康用組成物。
【請求項１３】
乳酸乳清または鉱酸乳清から誘導された、請求項１から１２のいずれか一項に記載の骨の健康用組成物。
【請求項１４】
骨の健康用組成物を製造する方法であって、次の工程すなわち
（ａ）ＣＧＭＰを含有しない水溶液であって、再結合式還元されたまたは新鮮な全乳、再結合式還元されたまたは新鮮な脱脂乳、復元式還元された全または脱脂粉乳、初乳、乳タンパク質濃厚物（ＭＰＣ）、乳タンパク質単離物（ＭＰＩ）、乳清タンパク質単離物（ＷＰＩ）、乳清タンパク質濃厚物（ＷＰＣ）、乳清、復元式還元された乳清粉末より成る群から選択されたいずれか一つまたはそれ以上の供給原料から誘導され、あるいはいずれかの乳加工流から誘導され、あるいはこれらの供給原料のいずれか一つまたはそれ以上の限外濾過および／または精密濾過により得られた透過物から誘導される水溶液を用意し、
（ｂ）この水溶液を約ｐＨ３から約ｐＨ４．９のｐＨにてアニオン交換クロマトグラフィーに付し、
（ｃ）このアニオン交換媒質を洗浄し、
（ｄ）このアニオン交換媒質から乳清の酸性タンパク質画分を溶離する
工程を含む方法。
【請求項１５】
工程（ａ）において用意される水溶液が、乳酸乳清または鉱酸乳清である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
工程（ａ）において用意される水溶液が、乳酸乳清または鉱酸乳清から誘導される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
工程（ａ）において用意される水溶液が、乳清の酸性タンパク質画分の加水分解物を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
アニオン交換クロマトグラフィーが、強アニオン交換クロマトグラフィーである、請求項１４から１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
工程（ｂ）が、約ｐＨ４と約ｐＨ４．７の間にて行われる、請求項１４から１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
工程（ｂ）が、ｐＨ４．５にて行われる、請求項１４から１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
工程（ｃ）が、媒質を洗浄するために脱塩水の使用を含む、請求項１４から２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
工程（ｄ）が、ＮａＣｌもしくはＫＣｌまたはそれらの混合物を用いて行われる、請求項１４から２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
工程（ｄ）が、１Ｍ−ＮａＣｌを用いて行われる、請求項１４から２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
工程（ｄ）が、酸を用いて行われる、請求項１４から２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
工程（ｄ）が、異なるｐＨを有する２種またはそれ以上の溶離液を用いて行われる、請求項１４から２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
工程（ｄ）が、５．０と９．０の間のｐＨおよび１．０Ｍまでの塩濃度を有する溶離液を用いて行われる、請求項１４から２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
工程（ａ）の前に１つまたは複数の工程を更に含み、しかもこれらの１つまたは複数の工程は、熱処理、低温殺菌、遠心分離、限外濾過、精密濾過、逆浸透、電気透析またはイオン交換クロマトグラフィーより成る群から選択された一つまたはそれ以上の工程を含む、請求項１４から２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
請求項１４から２７のいずれか一項に記載の方法により製造された組成物。
【請求項２９】
生理学上容認され得る量のカルシウム、マグネシウム、ビタミンＣ、ビタミンＤ、ビタミンＥ、ビタミンＫ２および／または亜鉛を更に含む、請求項１から１３および２８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３０】
組成物が、ウシおよび他の乳源（ヤギもしくはヒツジまたは他の乳産生哺乳類を含めて）の一つまたは組合わせから誘導されている、請求項１から１３、２８および２９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３１】
オステオポンチン、骨シアロタンパク質、プロテオースペプトン３、プロテオースペプトン５、プロテオースペプトン８、それらから得られたシアル酸化およびリン酸化タンパク質およびペプチド、並びにアルファ−ｓ１−カゼインホスホペプチドより成る群から選択された一つまたはそれ以上の組成物を含む、請求項１から１３および２８から３０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３２】
有益な骨健康性質を示す、請求項１から１３および２８から３１のいずれか一項に記載の組成物またはその画分。
【請求項３３】
請求項１から１３および２８から３２のいずれか一項に記載の組成物を含む食餌サプリメント。
【請求項３４】
請求項１から１３および２８から３２のいずれか一項に記載の組成物を含む食料添加物。
【請求項３５】
請求項１から１３および２８から３２のいずれか一項に記載の組成物を含む飲料添加物。
【請求項３６】
請求項１から１３および２８から３２のいずれか一項に記載の組成物を含む栄養薬剤。
【請求項３７】
請求項１から１３および２８から３２のいずれか一項に記載の組成物を含む製薬。
【請求項３８】
骨吸収を抑制する方法であって、請求項１から１３および２８から３２のいずれか一項に記載の組成物を患者に投与することを含む方法。
【請求項３９】
正味の骨損失を処置または防止する方法であって、請求項１から１３および２８から３２のいずれか一項に記載の組成物を患者に投与することを含む方法。
【請求項４０】
請求項１から１３および２８から３２のいずれか一項に記載の組成物の、骨吸収を抑制するための処方物の製造における使用。
【請求項４１】
請求項１から１３および２８から３２のいずれか一項に記載の組成物の、正味の骨損失を処置または防止するための処方物の製造における使用。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２７】
発明の目的
それ故、本発明の種々の観点の目的は、乳汁の酸性タンパク質画分から、特に乳清の酸性タンパク質画分から誘導された骨の健康用組成物、かかる組成物を製造する方法、該組成物を含む処置方法、該組成物の医薬的使用を提供すること、および／または少なくとも公衆に有用な選択を与えることである。


【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２８】
発明の要約
本発明の一つの観点によれば、正味の骨損失を減少するために適した骨の健康用組成物であってしかも乳汁の酸性タンパク質画分、乳汁の酸性タンパク質画分の加水分解物またはそれらの組合わせを含む骨の健康用組成物であって、該組成物がカゼイノグリコマクロペプチド（ＣＧＭＰ）を含有しない骨の健康用組成物が提供される。


【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２９】
本発明の第２観点によれば、正味の骨損失を減少するために適した骨の健康用組成物であってしかも乳汁の成分から誘導された酸性タンパク質画分、乳汁の成分から誘導された酸性タンパク質画分の加水分解物またはそれらの組合わせを含む骨の健康用組成物であって、該組成物がカゼイノグリコマクロペプチド（ＣＧＭＰ）を含有しない骨の健康用組成物が提供される。


【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３０】
本発明の第３の観点によれば、正味の骨損失を減少するために適した骨の健康用組成物であってしかも乳清の酸性タンパク質画分、乳清の酸性タンパク質画分の加水分解物またはそれらの組合わせを含む骨の健康用組成物であって、該組成物がカゼイノグリコマクロペプチド（ＣＧＭＰ）を含有しない骨の健康用組成物が提供される。


【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３１】
好ましくは、本発明の組成物は、アニオン交換クロマトグラフィー一層好ましくは強アニオン交換クロマトグラフィーを用いて製造される。


【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３２】
好ましくは、本発明の組成物は、７０重量％またはそれ以上のタンパク質を含み、しかも該タンパク質の８０重量％またはそれ以上好ましくは９０重量％またはそれ以上がオステオポンチンおよびプロテオースペプトンより成る。好ましくは、プロテオースペプトンは、プラスミンの作用によりカゼインから生じたペプチドを含み、かつプロテオースペプトン５（ＰＰ５）、プロテオースペプトン８−スロー（ＰＰ８−スロー）、プロテオースペプトン８−ファスト（ＰＰ８−ファスト）並びに非カゼインプロテオースペプトン３（ＰＰ３）より成る群から選択されたタンパク質の一つまたはそれ以上を含む。


【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３３】
好ましくは、本発明の組成物中のタンパク質は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより測定された場合、３，０００ないし６５，０００の分子量分布を有する。




【国際調査報告】
2004510742.tif 000040
2004510742.tif 000041