(57)【要約】カルニチンが、家禽の健康改善および／または腹水症の予防もしくは軽減のため、家禽の卵にインオボ注射される。少量のカルニチンのインオボ注射は、多量のカルニチンを必要とする従来の飼料供給技術と類似する効果を示す。【特許請求の範囲】
【請求項１】
家禽の胚含有卵の卵内注射用の注射溶液を製造するためのカルニチン又はアルカノイル-カルニチンの使用。
【請求項２】
家禽の胚含有卵の卵内注射用の注射溶液を製造するためのカルニチン又はアルカノイル-カルニチンの使用であって、家禽の健康を改善するため及び／又は腹水症を予防もしくは軽減するための使用。
【請求項３】
家禽の健康を改善するため及び／又は家禽の腹水症を予防もしくは軽減するための方法であって、飼育者雌鳥が産卵した胚含有卵に効果的な量のカルニチン若しくはアルカノイル-カルニチン又はその塩を卵内注射で供給する工程を含む方法。
【請求項４】
請求項１〜３の何れか１項に記載の方法であって、注射される前記カルニチンがL-カルニチンまたはその塩であることを特徴とする方法。
【請求項５】
請求項１〜４の何れか１項に記載の方法であって、10〜400μgの量のカルニチン又はアルカノイル-カルニチン又はその塩が注射されることを特徴とする方法。
【請求項６】
請求項１〜５の何れか１項に記載の方法であって、前記卵がインキュベーションの10〜21日の間に注射されることを特徴とする方法。
【請求項７】
請求項１〜６の何れか１項に記載の方法であって、0.01〜1 mlの容量が注射されることを特徴とする方法。
【請求項８】
請求項１〜７の何れか１項に記載の方法であって、前記卵がカルニチン若しくはアルカノイル-カルニチン又はその塩の単回服用量で１回注射されることを特徴とする方法。
【請求項９】
請求項１〜８の何れか１項に記載の方法であって、前記カルニチン又はアルカノイル-カルニチンが、治療物質（therapeutic substances）、ワクチンおよびビタミンを含む群から選択される少なくとも１つの他の物資と混合されることを特徴とする方法。
【請求項１０】
効果的な量のカルニチンを家禽の卵に配送する方法であって、前記卵がカルニチンを含む液体を注射されることを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の説明】
【０００１】
本発明は、養鶏の一般的分野に関し、卵の孵化率（hatchability）を改善する及び／又は家禽の腹水症を予防する若しくは軽減するための方法に関する。
【０００２】
最近の数十年間で、腹水症（ascites）症候群は、多収穫ブロイラーを著しく脅かす存在となった。この病気は特に寒冷地および／または高地のブロイラー産業が直面しており；家禽の大量飼育から生じる疾患 または ダストおよび アンモニアによる肺障害によってもこの疾患に罹患しやすくなる。腹水症の発症時、鳥は最初に酸素の代謝要求の増大を心拍出量を増大することにより補償している。しかしながら、戻る血液の容量が、血液を循環させる心臓の能力を超えた場合に問題が発生する。結果として、心臓が肥大（enlarges）し、右心室が拡張（dilating）する。病的に進展した心臓の特性によって、ヘマトクリットの変化、肝挫傷（liver congestion）、大静脈圧の増加、および肝臓からの濾出による腹腔内の間質液（interstitial fluid）の蓄積が引き起こされる。
【０００３】
突然死症候群は、近年認識されており、類似の心臓変形（cardiac deformations）により発症する。これは、産業上増えた多大なる家禽のストックに特有に（endemic）発症する病気であり、そして腹水症と共通の生理学的原因を有する。
【０００４】
本願の出願者のWO 00/56330 および WO 00/56294は、ブロイラータイプの家禽の食餌に添加することにより、腹水症 および 突然死症候群が予防 および 軽減されることを教示している。しかしながら、不都合な点としてカルニチンは、毎日の規則的に給餌される飼料 化合物として高価である。また過剰摂取が生じる可能性がある。つまり鳥に摂取される飼料の正確な量は日ごとに変化するので最適な服用は困難である。
【０００５】
本発明の課題は、従来技術の不利益を回避し、別の方法を考案することである。この別の方法は、カルニチン投与により家禽の健康（well-being）の改善を可能とし、その上、かかる改善の達成に必要なカルニチンの量に関してより効率的な方法である。
【０００６】
この課題は、以下の記載による及び本願の特許請求の範囲の請求項の記載による方法または使用により達成される。家禽の健康を改善する及び／又は家禽の腹水症を予防する若しくは軽減するための方法が提供される。該方法は、飼育者である雌鳥（breeder hen）が産卵した胚含有卵（embryonated eggs）に効果的な量の カルニチンを卵内注射の手段により供給する工程を含む方法である。
【０００７】
カルニチンをインキュベーションしている卵へ１回注射することにより、孵化時の体重を0.5 g程度増加させられることが見出された。最も驚くべきことには、この増加がその後にも持ち越されることである；カルニチン卵内注射の効果は、孵化後21 日および49 日に存在しており、同様に測定した全ての期間で体重が増加していた。飼料転換率（feed conversion ratio）も同様に改善されていることが見出された。
【０００８】
更に、孵化後の死亡率は、卵内注射により数値が減少した（非注射卵から孵化したコントロール動物と比べて）。前記効果が孵化後直後よりもより高い年齢で最も顕著であったことは、特に驚くべきことである。
【０００９】
死亡率は、最大年齢（highest age）に対して、およそ累積（cumulative）２０％に減少した。最終的に、低い酸素供給によって代謝的ストレスを制御した試験状態を採用することにより、ヘマトクリット および 腹水症スコアなどの腹水症に関連する生理学的 パラメータが卵内注射により改善されることが見出された。心筋症（cardiomyopathy）並びに異常な心臓特性（cardiac trait）および心臓損傷（cardiac lesions）の発生における共通原因を考慮すると、本発明は腹水症 および／または 突然死症候群の予防に又は軽減に適用可能と考えられるべきである。また、本明細書中の何れかの状態に関する記載は他の状態をも意味していると認定されるべきである。
【００１０】
本発明のより詳細な認識並びにその課題および利点は、当業者に以下の詳細な記載により明確となる。その記載中には、本発明の好適な態様のみが、本発明を実施するための最良の形態を説明することにより単純に記載される。本発明は、本発明の範囲内で様々に自明な点に関して修飾することが可能である。従って、記載は例示的なものであり、この記載により本発明が限定されることはない。
【００１１】
本発明において、腹水症スコアは、実験的なスコアであり０〜３は無症候から重度までの心筋変性（myocardial degeneration）を示しており、これは組織病理学変化に基づいている。右心室重量 および 腹水症心臓比率（ascites heart ratio；総心室重量に対する右心室重量の比率として定義される）などの心臓特性（cardiac traits）における病理学的変化も考慮される。
【００１２】
ゼロのスコアは最小の脂質蓄積（fat deposition）および筋細線維（myofiber）サイズ変異を示し、３のスコアは著しい心筋変性、高度に異常な心臓特性および動脈炎を示している。２のスコアは、前記の２つのスコアの中間である。腹水症スコアとは別に、ヘマトクリット値は、心臓機能を最も直接的に反映する。上昇した血液ヘマトクリット および 上昇した腹水症心臓比率は、腹水症（即ち、腹部の器官間の腔への漿液の蓄積）を生じる心臓の不調（malfunction）の症候である。
【００１３】
効果的な量のカルニチンの孵化前のインオボ単回注射が、心筋症（かかる心筋症は、孵化後の数週間後に最終的に発生する）の程度および／または発生を、若い動物の急速な成長の過程で十分に減少させることは最も驚くべきことである。特定の理論にとらわれることなく、この現象の考えられる解釈は、孵化している際のヒヨコ 体温に見出されると思われ、その体温は腹水症耐性およびその後の成長能力の重要なパラメータであると仮定されてきた。
【００１４】
本発明にしたがって適切な「家禽（poultry）」が、何種かの鳥に関して通常の広い意味で本発明に使用される。前記家禽には、ニワトリ、七面鳥、アヒル、ハト、ガチョウ、白鳥、ホロホロ鳥（guineas）、ハト、クジャク、ダチョウ、キジ（pheasants）、ウズラまたは雌飼育者（雌鳥）が存在する他の任意の家禽種が含まれるが、それらに限定されない。
【００１５】
本発明による卵は、好ましくは胚含有卵（embryonated eggs）である。即ち、適切にインキュベートすることにより子孫を生じる卵である。
【００１６】
卵に供給されるカルニチンは、任意の種類のカルニチン または カルニチン 誘導体 または その塩であってもよく、無毒で且つ薬学的に許容されるものである。カルニチンは、化学的には3-ヒドロキシ-4-N-トリメチルアミノブチル酸、或いはβ-ヒドロキシ-γ- トリメチルアミノブチル酸として知られる。また、カルニチンは、脊椎動物の筋肉に存在する第4級アンモニウム化合物であり、その代謝機能は、ミトコンドリア膜を横切った脂肪酸の転移に関わる機能である。好ましくは、前記カルニチンはL-カルニチンであり、これは天然の生理学的な形態である。
【００１７】
適切な カルニチン 誘導体は、例えば、アセチルカルニチン または プロピオニルカルニチンなどの3-アルカノイル誘導体であってもよい。適切な塩は、例えば、L-カルニチンインナーソルト（inner salt）、L-カルニチン酒石酸塩、Lカルニチンフマル酸塩またはL-カルニチンクエン酸マグネシウム塩。しかしながら、本発明にしたがってカルニチンは、例えば、細かく粉砕したケイ酸塩または澱粉粒子などの適切な不活性又は可溶性の担体をコートされてもよい。
【００１８】
卵内注射に関して、本発明によるカルニチンは、例えば、生理学的 (0.7% w/w) 塩類溶液または滅菌水などの適切な溶媒に新たに懸濁又は溶解される。かかる溶媒 または 溶液は、カルニチン添加の前に滅菌されるか又はその後に滅菌される。滅菌は、周知の手段により実行できる。その手段は、例えば、高圧蒸気殺菌法または濾過（2μ-フィルターを介した）である。
【００１９】
卵内注射されるカルニチン量は、本発明による家禽の健康状態（health）の及び成長の特性において所望の利益を産するのに効果的な量である。好ましくは10〜400 μg、より好ましくは20〜200 μg、最も好ましくは50〜100 μgのカルニチン（遊離塩基の量に基づき）が、卵ごとに注射される。かかる注射は、１度または数回適用されてもよく；好ましくは、卵ごとに１注射が実施される。
【００２０】
注射される適切な容量は、0.01〜1 mlの範囲である。好ましくは、0.05〜0.5 mlの容量、最も好ましくは0.05〜0.2 mlの容量が注射される。
【００２１】
本発明によるインキュベートしている胚含有卵には、孵化前のインキュベーションの間の任意の時間に注射することができる。本発明によるインキュベーションは、飼育状態（breeding condition）下で前記卵を保存することを意味する。適切な飼育温度範囲は、当業者に周知であり；通常、３７℃の温度又はその付近の温度が好ましい。
【００２２】
本発明によると、卵を産卵の直後に飼育温度でインキュベートできる。本発明により、適切な湿度で及び適切な低温度で、産卵直後に且つインキュベーション開始前に卵を保存することも可能であり、そしてこのことは当業者に周知である。この様式で保存された卵は、少なくとも２週間保存でき、インキュベーション開始前の孵化率における減少はない。好ましくは、前記卵は、インキュベーションの10日から21日までに注射される。より好ましくは、前記卵は、インキュベーションの15〜20 日の間に注射される。
【００２３】
本発明による卵内注射のための機械装置は市販されており、卵をワクチンで接種する技術分野において周知である。１つの利用可能な器具は、Embrex Inc.（Conneticut/U. S. A.）により製造および販売されているINOVOJECT  TM卵注射システムである。前記注射システムは、１時間に50,000 卵に接種する及び転移することが可能である。針は、各注射の後に個別に消毒される。従って、注射は、高生産性で且つ単位あたり最低限のコストで実施することができる。
【００２４】
好ましくは、例えば、ワクチン、治療薬（therapeutics）またはビタミンなどの他の活性成分が、カルニチンと混合され、一体化注射ステップ（all-in-one injection step）で注射される。治療化合物のかかる注射適用は家禽飼育ビジネスにおいて日常的に行われているので、卵内注射によるカルニチンの適用により卵に注射する処理のための更なるコストは発生しない。
【００２５】
本発明の実施可能で好適な更なる態様において、上記で記載したような胚含有卵におけるカルニチン卵内注射は、孵化後のカルニチン添加食餌の通常飼料と便宜上（expediently）組み合わされる。このようにして、最大の利益が動物に提供される。
【００２６】
本発明の別の課題は、効果的な量の カルニチンを家禽の卵に配送する方法であって、前記卵がカルニチンを含む液体を注射されることを特徴とする方法である。
【００２７】
本発明は、以下の実施例において更に説明されるが、これら実施例に限定されない。
【実施例】
【００２８】
＜実施例１＞
［卵の卵内注射］
Cobb-500 系統のブロイラー ニワトリ（Siloam Springs, ArkansasのCobb Vantressから取得した）の新規に産卵した約 4000の胚含有卵を、体重の均一性に関して前選択した。この卵は生産サイクルの約35〜45週の飼育者雌鳥（breeder hens）に由来するものであった。前記卵をクリマタイズドインキュベーションチェインバー（climatised incubation chamber）内で３７℃で産卵後１８日目まで維持した。次に卵に100 μl滅菌生理学的塩類溶液または100 μl滅菌生理学的塩類溶液に含まれる150 μgカルニチンの何れかをインキュベーションの１８日目に注射した。次にインキュベーションを孵化まで実施した。カルニチンは市販のL-カルニチン（商用名： Carnifeed, Lonza Inc., 100 % L-カルニチン）であった。前記卵にEmbrex, Inc.の自動インオボジェクト（inovoject）システム（最大能力：50,000 卵／時間）で注射した。前記システムは、卵殻に小さな孔をあけ、そして次に治療用の産物を前記孔を介して胚に配送する針を下げる。針は各注射後に自動的に消毒され、そして100%の接種を提供する。
【００２９】
＜実施例２＞
［その後のブロイラーパフォーマンスにおける１８日目のカルニチン注射の効果］
実施例１で実施したカルニチン注射の効果を評価するため、鳥を実施例１に由来する鳥から無作為に選択し、そして70 日まで飼育した。前記鳥を、通常以下の（subnormal）酸素供給条件に制御した商業生産環境中(12の地面の檻/trt；50羽の鳥／檻)または代謝チャンバー中の何れかに配置して通常の飼料を与えた。後者は、病気にかかり易くした鳥（predispositioned birds）に腹水症状態を発生させるための認可された試験モデルである。約 2400のヒヨコを以下に記載されるように地面の檻（floor pen）群として配置した。300個体の鳥を無作為に選択し、そして代謝チャンバー内でインキュベートした。標準飼料を適用した（市販のブロイラー ニワトリに与えられる食餌と類似する）。栄養素の仕様を以下に示す。飼料を認可された混合手順にしたがって混合した（つまり治療食餌はカルニチンの存在の有無においてのみ異なっている）。
【００３０】
カルニチン注射は、死亡率の減少並びに体重および飼料転換（feed conversion）の改善に有益であることが証明された。データをSAS (SAS, 1985)の一般線形モデル（General Linear Model）の手順を用いて分析した。有意なF統計値がANOVAにより示された場合、処理の平均値を最少二乗分析分散（least square analysis variance）を用いて比較した。
【００３１】
与えられた食餌の栄養素仕様（近似値  approx. values）を表１に示す。
【表１】
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【００３２】
2.1  地面の檻における試験：
結果を以下に要約する。データは確率水準（probability level）がp ＜ 0. 10の場合のみ示される。一般的に、カルニチン効果は試験の間で一貫していた（常にp ＜ 0.05で統計的に有意であるわけではないが）。
【００３３】
2.1.1  体重:
体重 (BW, g表示)および体重増加(WG, g表示)の平均における主な効果を表２に示す。孵化後日数を、例えばBW21のように示し、これは孵化したヒヨコを測定前に２１日間成育させたことを示す。
【表２】
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【００３４】
注射せず＝無菌の塩類溶液  W/O  カルニチンのみを注射したコントロール群
孵化後70日期間の終了時に、100 ヒヨコ毎の開始重量は、注射した卵の場合32.54 kgであり、および非注射コントロール群の場合32.42 kgであった。従って、少量のカルニチンを正確な量で卵のインキュベーションの間に単回注射することにより、孵化した動物の更なる成長に大きな効果が得られる。
【００３５】
2.1.2  死亡率:
死亡率 (M)を％主作用平均（main effect mean in %）として示す。孵化後日数は、例えばM21-49と示される（即ち、孵化後21〜49日の期間の死んだ鳥のパーセンテージ）。
【表３】
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【００３６】
2.1.3  飼料転換率:
飼料転換率 (FCR、飼料のグラム／増加したグラム)に関する主作用平均を示す。孵化後日数は、例えばFCR 0-49と示される（即ち、ヒヨコが成育した孵化後0〜49日の期間におけるFCR）。更なるコントロールとして、卵内注射の効果が、同じ食餌（この食餌に200 ppmカルニチンを添加されたことを除き）を与えられた場合の効果と比較された。飼料転換は、カルニチン治療により改善された（摂食させた場合または注射した場合の何れにおいても）。カルニチン投与の双方の方法から得られた結果は、一貫性がある結果であった。
【表４】
2004526746.tif 000005
【００３７】
2.2  代謝チャンバー試験:
ヒヨコを気密チェインバー内で高地状態をシュミュレートする正常以下の酸素供給下で飼育した。飼料および飲料水を自由に摂取させた。チェインバー温度は、最初の５日は30℃に維持され、そしてその後は27.8℃に維持された。チェインバーを、鳥の死亡率について１日に２回チェックした。
【００３８】
圧縮した乾燥空気（７％相対湿度 (rH）、17％酸素）をチェインバー内のヒヨコにポリスチレンチュウブを介して供給した。ヒヨコ チェインバーに低rHの空気を供給することが必要であり、これは前記チェインバーを75%以下のrHに維持するためである。各々の鳥チェインバーから排出される空気中の酸素および二酸化炭素の濃度を、それぞれAmetekの酸素(精度  0.2%)および二酸化炭素(精度  0.3%)分析器を用いて15〜25分毎にモニターした。
【００３９】
様々なパラメータに関する主作用平均を示す。
【００４０】
孵化時の体重 および 体温に加えて（0日目； BWO, BTO）、ヒヨコの腹水症スコア (AS) および ヘマトクリット〔パック細胞容積(packed cell volume; HCT)〕を14日目に決定した。血液（２ｍｌ）を鳥から静脈穿刺で採取し、その後、彼等をCO2を用いて安楽死させ、そして剖検を実施した。
【００４１】
心臓全体を秤量し、そして次に腹水症心臓比率（ascites heart ratio）を決定するために解剖した。心臓切片を採取し、そして組織病理検査のための10％緩衝中性ホルマリン中で固定した。心臓解剖 および 組織病理学分析の結果を腹水症スコアに要約した。
【表５】
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【００４２】
1スケール（0〜3）は、それぞれ無症候、軽度、中等度、重度の腹水症病変を示している。
【００４３】
2パック細胞のパーセント。
【００４４】
カルニチン注射は、ヘマトクリット および 腹水症スコアを有意に減少させ、この結果は200 ppmのL-カルニチン（シリカ粒子にコートされた）を前記飼料を介して適用した非注射コントロールと一致する結果であった。
【００４５】
本発明は詳細に記載されたが、本発明は、例示の目的で本明細書中に記載された態様に限定されることはなく、本願の特許請求の範囲に記載される請求項の範囲によってのみ限定される。前記請求項には、その発明が具備する各要素に対して均等性がおよぶ範囲の全体が含まれる。
【国際公開パンフレット】
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2004526746.tif 000008
2004526746.tif 000009
2004526746.tif 000010
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2004526746.tif 000018
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【国際調査報告】
2004526746.tif 000020
2004526746.tif 000021
2004526746.tif 000022