(57)【要約】ペプチジルアルギニンデイミナーゼ６をコードするヌクレオチド配列を提供する。前記遺伝子は生殖腺でのみ発現し、男性及び女性避妊のための標的として使用され得る。そのコード化タンパク質は酵素活性を有する低分子量モジュレーターをスクリーニングするために使用され得る。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ペプチジルアルギニンデイミナーゼ６をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド。
【請求項２】
哺乳動物起源、好ましくはヒト起源である請求の範囲第１項に記載のポリペプチド。
【請求項３】
配列番号１または配列番号３をコードする請求の範囲第２項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項４】
配列番号２のヌクレオチド６−２０５１または配列番号４のヌクレオチド２０−２０７７を含む請求の範囲第３項の範囲に記載のポリヌクレオチド。
【請求項５】
配列番号２のヌクレオチド６−２０５１または配列番号４のヌクレオチド２０−２０７７を含む請求の範囲第３項の範囲に記載のポリヌクレオチド。
【請求項６】
請求の範囲第１項〜第５項のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含む組換え発現ベクター。
【請求項７】
請求の範囲第１項〜第５項のいずれかに記載のポリヌクレオチドまたは請求の範囲第６項に記載の発現ベクターによりコードされるポリペプチド。
【請求項８】
請求の範囲第１項〜第５項のいずれかに記載のポリヌクレオチドまたは請求の範囲第６項に記載の発現ベクターをトランスフェクトした細胞。
【請求項９】
請求の範囲第７項に記載のポリペプチドを発現する安定なトランスフェクト細胞である請求の範囲第８項に記載の細胞。
【請求項１０】
請求の範囲第８項に記載の細胞をタンパク質が生産される条件で培養し、前記培養物からタンパク質を回収することを含む請求の範囲第７項に記載のポリペプチドの生産方法。
【請求項１１】
ペプチジルアルギニンデイミナーゼ６の酵素機能に影響を及ぼす化合物の同定方法であって、
ａ）前記ペプチジルアルギニンデイミナーゼ６をアルギニン含有基質と接触させるステップ、
ｂ）前記混合物を試験化合物と接触させるステップ、
ｃ）アルギニン−シトルリン変換を測定するステップ、及び
ｄ）前記変換と試験化合物の非存在下でのペプチジルアルギニンデイミナーゼ活性を比較するステップ
を含む前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ペプチジルアルギニンデイミナーゼ６をコードするポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドをトランスフェクトした細胞、前記細胞により産生されるタンパク質、前記タンパク質の生産方法及びそのモジュレーターに関する。
【背景技術】
【０００２】
ペプチジルアルギニンデイミナーゼ（ＰＡＤ）は、ペプチジルアルギニンをＣａ２＋依存的にシトルリンに変換させる翻訳後修飾酵素である。インビトロでの酵素脱イミノ化により、各種タンパク質の機能特性は変化し、その二次及び三次構造が改変する。
【０００３】
今まで、広い組織分布を示す５つのイソ型のＰＡＤが同定されている。マウスＰＡＤ１は表皮及び子宮で検出されている（Ａ．Ａ．Ｒｕｓ’ｄら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２５９：６６０−６６９（１９９０））。マウスＰＡＤ２は脳、下垂体、脊髄、唾液腺、膵臓、骨格筋、子宮、脾臓、胃及び胸腺のような各種組織において広く発現している（Ｈ．Ｔａｋａｈａｒａら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６４：１３３６１−１３３６８（１９８９））。マウスＰＡＤ３は表皮及び毛のうにおいて発現する（Ｈ．Ｔｅｒａｋａｗａら，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（Ｔｏｋｙｏ），１１０：６６１−６６６（１９９１））。ＰＡＤ４（ラット）は膵臓、脾臓、子宮、肝臓、肺、胃、腎臓、子宮、真皮、脳、心臓及び表皮において発現する遍在性酵素である（Ａ．Ｙａｍａｋｏｓｈｉら，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１３８６：２２７−２３２（１９９８））。ヒトＰＡＤ５ファミリーは骨髄白血球細胞株から新しいファミリーメンバーとして単離されたが、その組織分布はまだ調べられていない（Ｋ．Ｎａｋａｓｈｉｍａら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７４：２７７８６−２７７９２（１９９９））。
【０００４】
ＰＡＤの生理学的機能はあまり知られていない。脳では、ミエリン塩基性タンパク質が天然基質であり、よってＰＡＤは中枢神経系において重要な部分を果たす。更に、脱調節されると(disregulated)、ＰＡＤは多発性硬化症の病因となる（Ｆ．Ｇ．Ｍａｓｔｒｏｎａｒｄｉら，Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，９７：３４９−３５８（１９９６））。表皮中のＰＡＤは、上部角質層において湿分を保持するために間接的に重要であるフィラグリンの末端プロセッシングに関与すると見られる（Ｔ．Ｓｅｎｓｈｕら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，２２５：７１２−７１９（１９９６））。また、このＰＡＤの脱調節は関節リウマチの病因となり得る（Ｅ．Ｇｉｒｂａｌ−Ｎｅｕｈａｕｓｅｒ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６２：５８５−５９４（１９９９））。毛のうでは、トリコヒアリンの溶解性がＰＡＤにより影響されるようであり、この機能は測定されなければならない（Ｇ．Ｅ．Ｒｏｇｅｒｓ，Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．，１０８：７００−７０７（１９９７））。
【０００５】
今回、本発明者らはＰＡＤ６と称される新規なＰＡＤを知見した。転写物はマウス卵母細胞中に見られた。そのヒトホモログも本明細書中に記載されている。前記タンパク質は専ら卵母細胞／卵巣及び精巣において発現されることが知見された。
【０００６】
男性及び／または女性生殖体において特異的に発現する遺伝子は男性及び女性避妊のための新規な分子標的となり得る。精巣に関して、胚細胞において独自に発現する多数の遺伝子配列が公知である（Ａ．Ｐａｗｌａｋら，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，２６：１５１−１５８８（１９９５）；Ｄ．Ｊ．Ｗｏｌｇｅｍｕｔｈ及びＦ．Ｗａｔｒｉｎ，Ｍａｍｍ  Ｇｅｎｏｍｅ，１：２８３−８１７（１９９１））。対照的に、今までに卵母細胞で特異的に発現する遺伝子はわずかしか同定されていない。同定された生殖体特異的遺伝子配列の大部分は生殖体での特異的発現のために必須の機能を有していると考えられる。後者は、精巣及び卵母細胞特異的遺伝子を遺伝子不活化すると通常男性及び／または女性不妊が生じるが、他の臓器及び組織に別の病態を生じないことを示すノックアウト動物を用いた実験により確認された（Ｊ．Ｄｏｎｇ，Ｎａｔｕｒｅ，３８３：５３１−５３５（１９９６）；Ｆ．Ｎａｎｔｅｌら，Ｎａｔｕｒｅ，３８０：１５９−１６２（１９９６））。これらのデータは、配偶子発生中前記遺伝子が特異的で必須の役割を果たすことを裏付けるものである。これは、受精調節のための分子標的の選択基準としての組織特異性の重要性を強調している。
【０００７】
遺伝子が不妊において果たし得る各種役割を明らかにするためには、受精調節に関わる遺伝子を解明することがかなり必要であることは明らかである。男性及び女性受精の異なる段階（例えば、配偶子発生）に関わる遺伝子、並びにその活性及び発現調節をより深く知ることにより、不妊疾患がより深く洞察され得る。こうすれば、最後にはインビボまたはインビトロでの治療プロトコルで使用される活性モジュレーターが同定され得る。
【発明の開示】
【０００８】
本発明は上記遺伝子を提供する。より具体的には、本発明はペプチジルアルギニンデイミナーゼ６（ＰＡＤ６）をコードするポリヌクレオチド配列を提供する。前記ポリヌクレオチドは好ましくは哺乳動物起源、より好ましくはマウス起源、更に好ましくはヒト起源である。ＲＮＡは専ら生殖臓器において発現する。最も好ましいポリヌクレオチド配列は配列番号１または配列番号３をコードするものである。
【０００９】
本発明は配列番号２に示す全マウスｍＲＮＡ配列、より具体的には配列番号２のヌクレオチド配列６−２０５１に対応するオープンリーディングフレームをも含む。この配列は６８２アミノ酸（配列番号１）のタンパク質をコードする。更に、本発明は配列番号４に示す全ヒトｍＲＮＡ配列及び配列番号４のヌクレオチド配列２０−２０７７に対応するオープンリーディングフレームを含む。この配列は６８６アミノ酸（配列番号３）のタンパク質をコードする。コドンの可変性を適応するために、本発明は本明細書に記載の配列と同じアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列をも含む。本明細書に記載されている配列情報は、誤って同定された塩基を排除しなければならないほど狭く解釈すべきではない。本明細書に記載されている特定配列は幾つかの他の種または対立遺伝子変異体の完全遺伝子を単離するために簡単に使用され得る。前記配列は、例えばプローブを作成するために、または完全変異遺伝子を単離及び同定し得るＤＮＡ増幅反応においてプライマーとして使用される合成オリゴヌクレオチドを製造するためのソースとして使用され得る。特に、標準条件下で配列番号１４及び配列番号１５、鋳型として哺乳動物起源、好ましくはヒトまたはマウス起源のｃＤＮＡを用いるＰＣＲで作成したプローブとストリンジェントな洗浄条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドも本発明の一部である。前記プローブ（及び、その相補性配列）は、例えば配列番号４のヌクレオチド４６４−１０５２により同定される。
【００１０】
完全遺伝子配列は、好適な宿主細胞においてタンパク質を発現させるためのベクター分子を作成するために使用され得る。
【００１１】
従って、１態様で、本発明は新規ＰＡＤ６タンパク質をコードする単離ポリヌクレオチドを提供する。好ましくは、前記ＰＡＤ６はヒト起源のものであり、オルソログも本発明の一部を構成する。
【００１２】
本発明のＤＮＡはｃＤＮＡから入手可能である。組織は、好ましくは哺乳動物起源、より好ましくはヒト起源である。好ましくは、リボ核酸は卵母細胞または精巣から単離される。或いは、コード配列はゲノムＤＮＡであるかまたはＤＮＡ合成技術を用いて製造され得る。ポリヌクレオチドはＲＮＡの形態であってもよい。ポリヌクレオチドがＤＮＡの場合、一本鎖または二本鎖のいずれの形態も採り得る。一本鎖はコード鎖または非コード（アンチセンス）鎖であり得る。
【００１３】
本発明のＤＮＡは、十分な量及び実質的に純粋な形態で本発明の新規タンパク質をインビボまたはインビトロ発現させるのに非常に有用である。
【００１４】
更に、本発明は僅かな変更または多形部位を有するポリヌクレオチドに関する。僅かな変更を有するポリヌクレオチドは、天然の成熟タンパク質と同じ生物学的機能または活性を保持している変異ポリヌクレオチドをコードし得る。多形部位は診断目的で有用である。
【００１５】
別の態様で、本発明はａ）本発明のポリヌクレオチドまたはその相補体を好ましくは当該ポリヌクレオチドを高度に発現する組織から単離した（ゲノム）ＤＮＡ、ＲＮＡまたはｃＤＮＡである核酸に対してストリンジェントな条件でハイブリダイズするステップ、及びｂ）前記核酸を当業者に公知の方法により単離するステップを含むポリヌクレオチドの単離方法を提供する。前記組織は好ましくはヒト起源のものである。好ましくは、リボ核酸は卵母細胞、卵巣または精巣から単離される。好ましいハイブリダイゼーション条件は高ストリンジェントである。
【００１６】
本発明によれば、「ストリンジェント」は６５℃の温度において１×ＳＳＣ，０．１％  ＳＤＳの洗浄条件を意味する。高ストリンジェント条件は０．３×ＳＳＣ、より好ましくは０．１×ＳＳＣへのＳＳＣの減少を指す。好ましくは、２つの洗浄はそれぞれ１５〜３０分間ずつ２回逐次実施する。高ストリンジェント条件下で洗浄する必要があるならば、０．１×ＳＳＣで１５分間の洗浄を更に１回実施する。ハイブリダイゼーションは例えば６５℃において０．５Ｍ  リン酸緩衝（ｐＨ７．５）／７％  ＳＤＳ中で一晩実施し得る。
【００１７】
或いは、遺伝子の単離方法は本発明の核酸から誘導されるプライマーを用いる遺伝子増幅方法を含む。完全ｃＤＮＡは、例えばハイブリダイズすることにより得たクローンと例えばＲＡＣＥ  ｃＤＮＡクローンを組合せることによっても得られ得る。
【００１８】
機能ポリペプチドをコードするコード配列の一部、その対立変異体及び種変異体も本発明の一部である。場合により、遺伝子をある組織においてスプライシング変異体として発現させると、改変５’または３’ｍＲＮＡが生じ、または１つ以上のエクソン配列が挿入または排除される。前記配列及び該配列によりコードされるタンパク質はすべて同一または同様の機能を発揮すると予想され、これも本発明の一部を構成する。
【００１９】
本発明はまたペプチジルアルギニンデイミナーゼ６（ＰＡＤ６）を提供する。好ましくは、前記タンパク質は哺乳動物アミノ酸配列、より好ましくはヒト配列を有する。配列番号１または３に記載されている配列が最も好ましい。ＰＡＤ６をコードするポリヌクレオチドからなるベクター分子を適当な宿主細胞に導入することにより発現は得られ得る。前記細胞を培養し、タンパク質は当業者に公知の方法を用いて単離され得る。
【００２０】
別の態様で、本発明はＰＡＤ６活性をコードし、機能特性を維持しつつ配列の変更を有するが本質的に同一の配列番号１または３配列またはその一部からなるポリペプチドである機能同等体を提供する。
【００２１】
配列で見られ得る変更は、全配列中のアミノ酸の違いによるかまたは前記配列中のアミノ酸の欠失、置換、挿入、反転または付加により示され得る。本質的に生物学的及び免疫学的活性を変化させないと予想されるアミノ酸置換は公知である。関連するアミノ酸間のアミノ酸置換または進化中に高頻度で起こった置換は特にＳｅｒ／Ａｌａ、Ｓｅｒ／Ｇｌｙ、Ａｓｐ／Ｇｌｙ、Ａｓｐ／Ａｓｎ、Ｉｌｅ／Ｖａｌ（Ｍ．Ｄ．Ｄａｙｈｏｆ，「タンパク質配列及び構造のアトラス(Atlas of protein sequence and structure)」，Ｖｏｌ．５，補遺３，ワシントン・ディー・シーに所在のＮａｔ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｒｅｓ．Ｆｏｕｎｄ．（１９７８年）発行参照）。この情報に基づいて、Ｌｉｐｍａｎ及びＰｅａｒｓｏｎは迅速且つ高感度のタンパク質比較（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２７：１４３５−１４４１（１９８５））及び相同ポリペプチド間の機能類似性を調べる方法を開発した。前記変異体をコードするポリヌクレオチドも本発明の一部であることは明白である。
【００２２】
従って、更なる態様で、本発明は配列番号１または配列番号３を含むポリペプチドのみならず、８０％、好ましくは９０％、より好ましくは９５％の類似性を有するポリペプチドも提供する。
【００２３】
本明細書中、「類似性」はＮＣＢＩ−ＢＬＡＳＴ  ２．０．１０［１９９９年８月２６日］（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓｔｅｐｈｅｎ  Ｆ．，Ｔｈｏｍａｓ  Ｌ．Ｍａｄｄｅｎ，Ａｌｅｊａｎｄｒｏ  Ａ．Ｓｃｈａｆｆｅｒ，Ｊｉｎｇｈｕｉ  Ｚｈａｎｇ，Ｚｈｅｎｇ  Ｚｈａｎｇ，Ｗｅｂｂ  Ｍｉｌｌｅｒ及びＤａｖｉｄ  Ｊ．Ｌｉｐｍａｎ，「Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴ及びＰＳＯ−ＢＬＡＳＴ：タンパク質データベース検索プログラムの新世代(a new generation of protein database search programs)」，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２５：３３８９−３４０２（１９９７））に定義されている。前記プログラムは、デフォルトセッティングを用いて配列アラインメントを検索するために使用される。アミノ酸アラインメントに関しては、ＢＬＯＳＵＭ６２マトリックスをデフォルトとして使用し、類似性はポジティブの数として表す。低組成複雑性のフィルタリングは含めない。
【００２４】
生物学的効果を付与し得る前記ポリペプチドの部分も含まれる。特にアルギニンをシトルリンに変換し得る部分は本発明の一部を構成する。前記タンパク質またはその機能部分は機能そのもの（例えば、可溶化形態）であってもよく、または公知の生物学的手法または化学合成により他のポリペプチド（例えば、安定性を高めたり精製を容易とするべく特異的サブ細胞コンパートメント）に結合させてキメラタンパク質を得てもよい。
【００２５】
前記変異ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが本発明に包含されることは明白である。
【００２６】
宿主細胞とクローニングベクターの広範囲の組合せが本発明のポリペプチドをコードする核酸配列をクローニングする際に通常使用され得る。
【００２７】
好適な発現ベクターの例は細菌または酵母プラスミド、広い宿主範囲のプラスミド、及びプラスミドとファージまたはウイルスＤＮＡの組合せから誘導されるベクターである。染色体ＤＮＡから誘導されるベクターも含まれる。更に、複製起源および／または優性選択マーカーを本発明のベクターに存在させてもよい。本発明のベクターは宿主細胞を形質転換させるのに適している。
【００２８】
本発明のタンパク質またはその一部を発現する際に使用されるベヒクルは更にタンパク質をコードする核酸に作動的に結合する調節配列を含む。前記調節配列は、通常プロモーター配列及び発現レベルを調節及び／または高める配列を含む。勿論、調節配列及び他の配列は使用する宿主細胞に依存して変え得る。
【００２９】
本発明のＤＮＡを含む組換え発現ベクター及び前記ＤＮＡまたは発現ベクターを一過的または安定的にトランスフェクトした細胞も本発明の一部を構成する。
【００３０】
本発明の好適な宿主細胞は細菌宿主細胞、酵母及び他の真菌、植物または動物宿主（例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞、サル細胞またはヒト細胞）である。よって、本発明のＤＮＡまたは発現ベクターを含む宿主細胞も本発明の範囲に包含される。工学処理した宿主細胞は一般的な栄養培地において培養し得、前記培地は適当な選択、増幅または転写の誘導のために改変され得る。温度、ｐＨ、栄養物等のような培養条件は当業者に公知である。
【００３１】
本発明のＤＮＡまたはベクターの作成、並びにそのＤＮＡまたはベクターを用いる宿主細胞の形質転換またはトランスフェクションの方法は一般的であり、当業界で公知である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，「分子クローニング：実験マニュアル(Molecular Cloning: A laboratory Manual)」，第２版，ニューヨーク州コールドスプリングハーバーに所在のＣｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８９年）発行を参照されたい。
【００３２】
本発明のタンパク質は、組換え細胞培養物から（「タンパク質精製のガイド(Guide to Protein purification)」，Ｍｕｒｒａｙ  Ｐ．Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ編，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１８２，カリフォルニア州サンジェゴに所在のＡｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．（１９９０年）発行に記載されている）一般的な生化学的精製方法を用いて回収、精製され得る。前記方法には、硫酸アンモニウム沈殿、抽出、クロマトグラフィー（例えば、疎水性相互作用クロマトグラフィー、カチオンまたはアニオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー及び高速液体クロマトグラフィー）が含まれる。所要により、タンパク質再フォールディングステップを加えてもよい。或いは、前記タンパク質はアフィニティー精製のために使用され得る（“タグ”）を含む融合タンパク質として発現、精製され得る。
【００３３】
本発明のタンパク質の活性の調節は、卵胞補充並びに卵母細胞及び／または卵胞の成長及び成熟をコントロールするためにインビボで使用される。前記プロセスをインビボで抑制することは月経を遅らせる（早める）ため及び／または避妊薬として使用され得る。加えて、タンパク質は例えば凍結卵巣組織からの卵胞のインビトロ成熟及び成長のために使用され得る。
【００３４】
本発明のＰＡＤ遺伝子産物は、新規物質またはそのアナログをインビボまたはインビトロで同定するために使用され得る。この目的で、例えばペプチジルアルギニンデイミナーゼアッセイ研究は本発明のＤＮＡまたは本発明のＤＮＡを含む発現ベクターをトランスフェクトし、本発明のＰＡＤ６遺伝子産物を発現する細胞を用いて実施され得る。或いは、ＰＡＤ６タンパク質それ自体またはその基質結合ドメインは機能基質またはアナログを同定するためのアッセイにおいて使用され得る。
【００３５】
遺伝子産物の生物学的活性を測定するためのインビトロまたはインビボアッセイで発現遺伝子産物のペプチジルアルギニンデイミナーゼ活性を測定する方法は公知である。例えば、Ｆ．Ｅ．Ｗ．Ｌａｍｅｎｓａ及びＭ．Ａ．Ｍｏｓｃａｒｅｌｌｏ，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．，６１：９８７−９９６（１９９３）を参照されたい。このアッセイでは、α−Ｎベンジル−Ｌ−アルギニンエチルエステル（ＢＡＥＥ）中のアルギニンをシトルリンに変換し、シトルリンは過塩素酸で精製後容易に測定され得る。
【００３６】
ＰＡＤ６の酵素活性を測定する別の方法ではタンパク質、例えば大豆トリプシン阻害剤（ＳＴＩ）の不活化を利用する（Ｈ．Ｔａｋａｈａｒａら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６０：８３７８−８３８３（１９８５））。ＳＴＩ中の必須アルギニンがシトルリンに変換されると、トリプシンのタンパク質分解活性はもはや阻害され得ない。これをＰＡＤ活性の測定のための２ステップアッセイの基礎として使用し得る。前記アッセイは２ステップからなる。第１反応では、ＰＡＤはＳＴＩ中のＮｏ．６３のアルギニンをＳＴＩを不活化するシトルリンに変換する。第２反応では、トリプシン及び蛍光基質を添加し、トリプン活性を測定する。
【００３７】
或いは、ＰＡＤ６活性は、例えばトリプルヘリックス形成中にアンチセンス核酸を使用することによりタンパク質の発現レベルをダウンレギュレートする（Ｃｏｏｎｅｙら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４１：４５６−４５９（１９８８））、ｍＲＮＡに結合させる、または小分子によりｍＲＮＡ安定性またはタンパク質相互作用を影響させることによっても調節され得る。これは受精の調節、すなわち避妊または不妊治療につながる。
【００３８】
よって、本発明は本発明のタンパク質の酵素機能に影響を及ぼす化合物の同定方法を提供する。この方法は、
ａ）ＰＡＤ６タンパク質をアルギニン含有基質と接触させるステップ、
ｂ）前記混合物を試験化合物と接触させるステップ、
ｃ）アルギニン−シトルリン変換を測定するステップ、及び
ｄ）前記変換と試験化合物の非存在下でのペプチジルアルギニンデイミナーゼ活性を比較するステップ
を含む。アルギニン−シトルリン変換は、例えばＨＰＬＣのような分析方法、ペプチドの改変タンパク質分解感受性、ペプチドの活性の変化または特異的抗体認識により容易に測定され得る。基質としてアルギニンを含むペプチドまたはタンパク質を使用し得、α−Ｎ−ベンゾイル−Ｌ−アルギニンエチルエステルのような合成化合物も使用し得る。しかしながら、アミノ基及びカルボキシル基は置換されなければならず、またはペプチド結合形態でなければならない。
【００３９】
或いは、本発明はＰＡＤ６  ｍＲＮＡ変異体の安定性またはＰＡＤ６発現レベルを調節する化合物の同定方法を提供する。
【００４０】
本発明は、ＰＡＤ６の活性に関連する生殖コントロールのための治療薬をスクリーニングするための迅速且つ経済的方法を提供する。本発明の方法は更に、より有効な治療薬を得るべく異なるペブチシセルアルギニンデイミナーゼを区別及び／または副作用を低減させる選択的治療薬の選択を提供する。前記方法は多数の有力な標的化合物を有効にスクリーニングするために使用するのに特に適している。
【００４１】
ペプチジルアルギニンデイミナーゼ６機能を調節する化合物は、本発明のＰＡＤを調節することにより治療に使用され得る。
【００４２】
本発明は、同定されたモジュレーター化合物を医薬的に許容され得る担体と混合することを含む医薬組成物の調製方法をも提供する。医薬的に許容され得る担体は当業者に公知であり、例えば滅菌食塩水、ラクトース、スクロース、リン酸カルシウム、ゼラチン、デキストリン、寒天、ペクチン、落花生油、オリーブ油、ゴマ油及び水が含まれる。
【００４３】
更に、医薬組成物は１つ以上の安定剤（例えば、ソルビトール、マンニトール、スターチ、スクロース、デキストリン及びグルコースを含めた炭水化物）、タンパク質（例えば、アルブミンまたはカゼイン）、緩衝剤（例えば、アルカリホスフェート）を含み得る。前記調製物及び静脈内混合物の製造方法は米国ペンシルバニア州イーストンに所在のＭａｃｋ  Ｐｕｂｌ．Ｃｏ．に所在のＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１６版，ｐ．１４６３−１４６７に記載されている。
【００４４】
よって、本発明のペプチジルアルギニンデイミナーゼを用いて同定されるモジュレーター化合物は医薬品の製造に使用される。医薬品は生殖障害をコントロールするために使用される。
【００４５】
下記実施例により本発明を説明するが、これらの実施例は発明の範囲を限定するものと解釈されるべきでない。
【実施例１】
【００４６】
マウスｃＤＮＡクローンの作成：
卵母細胞ｃＤＮＡライブラリーの構築
全ＲＮＡを、インビトロでＦＦ−ＭＡＳ（５０μＭ）で１５時間処理した２１７２個の裸出卵母細胞からＲＮＡｚｏｌＢ（商標）ＲＮＡ単離プロトコール（Ｃａｍｐｒｏ  ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に従って単離した。約１００個の卵母細胞を含む凍結細胞ペレットにＲＮＡｚｏｌ  Ｂを直接添加した。ホモジネートを集め、クロロホルム（０．１容量）で抽出し、１５秒間振盪し、氷上で１０分間インキュベートした。４℃において１４，０００ｒｐｍで１５分間遠心後、水性相を集めた。等容量のイソプロパノールを添加した後４℃でｏ／ｎインキュベートすることにより全ＲＮＡを沈殿させた。ＲＮＡを４℃において１４，０００ｒｐｍで４５分間遠心後、ペレットを７０％エタノール（７０μｌ）で１回洗浄し、４℃において１４，０００ｒｐｍで３０分間遠心した。最後に風乾したペレットをＲＮａｓｅ非含有水（Ａｍｂｉｃｏｎ）（７．５μｌ）中に再懸濁させた。この手順を用いて単離したＲＮＡの総量をＲｉｂｏｇｒｅｅｎ（商標）ＲＮＡ定量キット（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）を用いて測定した。
【００４７】
ｃＤＮＡ分析のために、ＳＭＡＲＴ（商標）ＰＣＲライブラリー構築キット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を使用した。以下の修正を加えた。ＥｃｏＲＩ制限部位を有するオリゴｄＴ（１８）プライマー（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）をｍＲＮＡの３’末端にアニーリングし、ＥｃｏＲＩ制限部位で延長したＳＭＡＲＴ（商標）オリゴをｍＲＮＡの５’末端にアニーリングした。第１鎖ｃＤＮＡ合成反応は、５０ｍＭ  トリス（ｐＨ８．３）、７５ｍＭ  ＫＣｌ、６ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２ｍＭ  ＤＴＴ、１ｍＭ  ｄＮＴＰミックス及び２００単位のＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩＲＮａｓｅ  Ｈ逆転写酵素（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）を含有する反応緩衝液中で４２℃で１時間実施した。その後、第１鎖ｃＤＮＡをＰｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒサーモサイクラー（９６００）を用いてＰＣＲにより増幅させた。ＰＣＲは、１×Ｋｌｅｎ  Ｔａｑ  ＰＣＲ緩衝液（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、０．２ｍＭ  ｄＮＴＰミックス（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、０．２ｍＭ  ５’ＥｃｏＲＩ−ＳＭＡＲプライマー、０．２ｍＭ  ＮｔｏＩ−ＥｏＲＩ−ｄｔ（１８）プライマー（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）及び１×Ａｄｖａｎｔａｇｅ  Ｋｌｅｎ  Ｔａｑポリメラーゼミックス（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を含有する反応緩衝液（総量１００μｌ）中、９５℃×１分間変性後９５℃×１５秒間と６８℃×５分間のサイクルに２８回かけた。
【００４８】
Ｑｉａｑｕｉｃｋスピンカラム（ＱＩＡＧＥＮ）で精製後、ｃＤＮＡを３７℃においてＥｃｏＲＩ（Ｐｈａｒｍａｃｉ）で消化し、７０℃において１０分間熱不活化した。ｃＤＮＡを２本の連続Ｑｉａｑｕｉｃｋスピンカラムを用いて２回精製し、最後に１０ｍＭ  トリス−Ｃｌ（ｐＨ８．５）（５０μｌ）中に再懸濁させた。ＤＮＡ濃度を、Ｇｅｎｅｑｕａｎｔ分光光度計を用いて２６０ｎｍの吸光度を測定することにより調べた。
【００４９】
ｃＤＮＡのサイズ分画
ｃＤＮＡをアガロース電気泳動を用いてサイズ分画し、ＱｉａｅｘＩＩアガロースゲル抽出キット（Ａｉａｇｅｎ）を用いてゲルマトリックスから抽出した。ＤＮＡをＨ２Ｏ（２０μｌ）中に溶離し、Ｑｉａｑｕｉｃｋスピンカラム（Ｑｉａｇｅｎ）で精製し、Ｈ２Ｏ（５０μｌ）中に溶離させた。３Ｍ  酢酸ナトリウム（０．１容量）、グリコーゲン（１０μｇ）及び９６％（ｖ／ｖ）エタノール（２．５容量）を添加した後−２０℃において１時間インキュベートすることによりサンプルを沈殿させた。４℃において１４，０００ｒｐｍで２０分間遠心することによりサイズ分画したｃＤＮＡを集めた。ＤＮＡペレットを７０％エタノールで洗浄し、風乾し、その後ＭＱに溶解した。ＤＮＡ濃度をＰｉｃｏＧｒｅｅｎ（商標）ｄｓＤＮＡ定量キット（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）を用いて調べた。
【００５０】
ＥｃｏＲＩで消化後、卵母細胞ｃＤＮＡ（２００ｎｇ）を５０ｍＭ  トリスＨＣｌ（ｐＨ７．８）、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ  ジチオトレイトール、１ｍＭ  ＡＴＰ及び７５０単位／ｍｌ  Ｔ４リガーゼ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を含有する緩衝液中で予備消化／脱リン酸化したλＧＴ１１ファージアーム（５００ｎｇ）に結合した。反応物を１６℃においてｏ／ｎインキュベートした。最後に、完成結合反応物を製品インフォメーションシートに記載されているようにＭａｘ  Ｐｌａｘ（商標）パッケージングエクストラクト（Ｅｐｉｉｃｅｎｔｒｅ）に充填した。
【実施例２】
【００５１】
マウスＰＡＤ６の単離及び特性決定：
ファージクローンのＰＣＲ増幅
単一プラークを１０ｍＭ  トリスＨＣｌ（ｐＨ８．３）、１００ｍＭ  ＮａＣｌ及び１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２を含有するλファージ緩衝液（１００μｌ）中で少なくとも１時間インキュベートした。各溶出プラーク（２．５μｌ）をλＧｔ１１プライマー（配列番号５及び配列番号６）を用いてＰＣＲ増幅した。ＰＣＲ反応はＰＥ９４００（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒの９６００モード）において１サイクル（９４℃×５分間）、３０サイクル（５５℃×３０秒間，５５℃×３０秒間及び７２℃×３分間）、次いで１サイクル（７２℃×５分間）を実施した。ＰＣＲ産物をアガラースゲル電気泳動により分析し、サイズ、純度及び濃度に基づいて選択した。５００ｂｐ以上のバンド１本だけを配列決定のために選択した。
【００５２】
ＤＮＡ配列分析
ＰＣＲによりインサート増幅後、マウス卵母細胞ｃＤＮＡライブラリーからの７５０クローンをＤＮＡ配列決定により分析した。配列分析はＢｉｇ  Ｄｙｅ  ＤＮＡ配列決定レディ反応プロトコル（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を用いて実施し、サンプルをＡＢＩ３７７自動ＤＮＡシーケンサー（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を用いて分析した。配列を自動化手順でＢＬＡＳＴＮまたはＴＢＬＡＳＴＮを用いてｇｂ１１１ｒｏｄ、ｇｅｎｐｅｐｔ、ＥＭｒｏｄＥＳＴｓ５９及びＥＭｈｕｍａｎＥＳＴｓ５９データーベースの幾つかのデーターベースに対してブラストし、公知の機能を有する遺伝子との相同性に基づいて注釈を付けた。
【００５３】
ＰＡＤ６の同定及び特性決定
得られた配列の１つはペプチジルアルギニンデイミナーゼＩＩＩと強い相同性を示す。相同性検索に基づいて、このクローン１Ｂ１１はＰＡＤ６と称される新規なペプチジルアルギニンデイミナーゼをコードすることが確認された。
【００５４】
マウスＰＡＤ６  ｃＤＮＡの５’末端はマウス卵巣ｃＤＮＡライブラリーから増幅させ得る。このライブラリーのｃＤＮＡをｐＳＯＲＴベクター（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）のＮｏｔＩ−ＳａｌＩ部位（５’−３’）に指向的にクローン化した。このベクターは、２つのＰＡＤ６特異的逆プライマーと共に、５’ＲＡＣＥ  ＰＣＲに使用されてきたＮｏｔＩ部位から５’にＭ１３前進及びＳＰ６プロモーター配列を含む。第１ＰＣＲをＭ１３Ｆプライマー（配列番号７）及び遺伝子特異的逆プライマー（配列番号８）を用いて実施した。このＰＣＲ産物を５０倍希釈し、この希釈物（１μｌ）をＳＰ６プライマー（配列番号９）及びネステッド遺伝子特異的逆プライマー（配列番号１０）を用いてネステッドＰＣＲにおける鋳型として使用した。ＰＣＲ反応は１×Ｋｌｅｎ  Ｔａｑ  ＰＣＲ緩衝液（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、０．２ｍＭ  ｄＮＴＰミックス（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）及び１×Ａｄｖａｎｔａｇｅ  Ｋｌｅｎ  Ｔａｑポリメラーゼミックス（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を含有する反応緩衝液（総量５０μｌ）中、９４℃×５分間の変性、３０サイクル（９４℃×３０秒間，５６℃×３０秒間及び７２℃×３分間）、最後に７２℃×５分間の延長を実施した。
【００５５】
ネステッドＰＣＲ産物中のバンドを製品の情報シートに従ってＴＡ  Ｔｏｐｏ  ＰＣＲ２．１ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローン化し、配列決定した。１８００ｂｐ５’ＲＡＣＥ断片はマウスＰＡＤ６クローンを完全に備えていることが分かった。完全長マウスｃＤＮＡの配列を配列番号２に示す。
【００５６】
得られたＤＮＡ配列情報に基づいて、遺伝子特異的ＰＣＲプライマー組を設計し、組織特異的発現プロファイルを確認するためのＲＴ−ＰＣＲ実験で使用した。得られたデータ（図１）により、マウスＰＡＤ６について卵母細胞／卵巣（及び精巣）特異的発現が確認された（配列番号８及び配列番号１３をプライマーとして使用した）。
【００５７】
ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）
生殖腺におけるＰＡＤ６の発現を更に研究するために、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）をマウス卵巣及び精巣の切片に対して実施した。
【００５８】
７日令及び成熟マウスの卵巣を室温において４％緩衝ホルマリン中に２４時間固定した。組織をパラフィンに包埋した。パラフィン切片（５μｍ）を切り、Ｓｕｐｅｒｆｒｏｓｔプラス顕微鏡スライド上に載せ、３７℃において一晩乾燥した。スライドを６０℃において２時間加熱した。
【００５９】
組織切片をキシレン中で脱蝋し、漸減濃度のエタノール中で再水和した。スライドを０．２Ｍ  ＨＣｌ中で振盪しながら２０分間洗浄し、ＤＥＰＥ（ジ−エチルピロカーボネート）処理Ｍｉｌｌｉ  Ｑで２回洗浄した。切片を３７℃において消化緩衝液（１００ｍＭ  トリス，５０ｍＭ  ＥＤＴＡ，ｐＨ８）中１μｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫを用いて３０分間処理した。室温（ＲＴ）においてＰＢＳ中予冷０．２％グリシンを用いて１０分間振盪することにより消化を停止させた。スライドを０．１Ｍ  トリエタノールアミン緩衝液中０．２５％無水酢酸を用いて５分間アセチル化し、ＤＥＰＥ処理Ｍｉｌｌｉ  Ｑで２回洗浄した。切片を、湿潤チャンバー中ハイブリダイゼーション温度において５２％ホルムアミド、２１ｍＭ  トリス、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．３３Ｍ  ＮａＣｌ、１０％  硫酸デキストラン、１×デンハート溶液、１００μｇ／ｍｌ  サケ精子ＤＮＡ、１００μｇ／ｍｌ  ｔＲＮＡ及び２５０μｇ／ｍｌ  酵母総ＲＮＡを含有するプレハイブリダイゼーションミックスを用いてプレハイブリダイズした。スライドをカバーガラスで覆った。２時間後、このカバーガラスを０．１ｍＭ  ＤＴＴ、０．１％  チオ硫酸ナトリウム、０．１％  ＳＤＳ及び２００ｎｇ／ｍｌ  ＤＩＧ標識ラベルを添加したプレハイブリダイゼーションミックスを含有するプローブハイブリダイゼーションミックス（１００μｌ）を有するカバーガラスと取り替えた。
【００６０】
ＤＩＧ標識ラベルは、ＤＩＧ−ｄＵＴＰ及びＤＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼ（ＳＰ６及びＴ７）を用い、線状ＤＮＡ鋳型からインビトロ転写により作成した。各ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター部位を遺伝子特異的配列に結合して、５’部位にＳＰ６プロモーター部位及び３’部位にＴ７プロモーターを含むＰＣＲ断片が生じた。通常、約２５０〜５００ヌクレオチドのプローブを配列番号２の５’末端に位置させた。インビトロ転写後、少量のプローブを１．５％アガロースゲル上で分析して、インビトロ転写が成功したことを確認した。プローブ濃度は、（対照ＤＩＧ−ＲＮＡ（１００ｎｇ／μｌ）を含む）一連の希釈物をＨｙｂｏｎｄ  Ｎ＋膜上にスポットし、抗−ＤＩＧアルカリホスファターゼＦａｂ’断片（抗ＤＩＧ−ＡＰ）及びＮＢＴ／ＢＣＩＰカラー基質インキュベーションにより推定した。
【００６１】
ハイブリダイゼーションは、湿潤チャンバーにおいて４２℃または５０℃において一晩（１６時間）実施した。次いで、スライドを振盪しながら２×ＳＳＣで１５分間洗浄し、振盪しながらハイブリダイゼーション温度において２×ＳＳＣ、１×ＳＳＣ及び０．１×ＳＳＣで１５分間洗浄した。切片を３７℃においてＲＮａｓｅ緩衝液（０．６Ｍ  ＮａＣｌ，２０ｍＭ  トリス，１０ｍＭ  ＥＤＴＡ）中リボヌクレアーゼＡ（２０μｇ／ｍｌ）により１時間消化した。予冷ＰＢＳで２回（室温で５分間振盪）及び緩衝液１（１００ｍＭ  マレイン酸，１５０ｍＭ  ＮａＣｌ）で１回洗浄後、切片をブロッキング溶液（緩衝液１中１ｇ／ｍｌのブロッキング剤）と３０分間インキュベートした。次いで、切片を室温においてブロッキング溶液で１：５００希釈した抗ＤＩＧ−ＡＰと１時間インキュベートした。緩衝液１（振盪しながら室温で１５分間）で２回洗浄後、スライドの組織の周囲を注意深く拭き取り、切片をＤＡＩＯ−ペンで囲んだ。切片をＮＢＴ／ＢＣＩＰ発色試薬で覆い、湿潤チャンバ中室温でインキュベートした。２時間後、切片を顕微鏡下で検査した。着色が全くもしくは少ししか見られなかったならば、インキュベーションを４℃で一晩、翌日は室温で続けた。最後に、スライドを水で濯ぎ、場合によりＭａｙｅｒのヘマトキシリン１：５で３秒間逆染色した。スライドをＫａｉｓｅｒｓグリセロールゼラチンに入れた。
【００６２】
図２に示すように、ＰＡＤ６は卵巣、特に卵母細胞において発現する。
【００６３】
ＰＡＤ６  ｍＲＮＡは、一次、二次及び胞状卵胞の卵母細胞において高い発現レベルを有し、始原卵胞由来の卵母細胞でも発現する。得られたデータに基づく限り、ＰＡＤ６  ｍＲＮＡの発現レベルは胞状卵胞の卵母細胞では低下している。このことは、ＰＡＤ６の機能が卵子発生の初期段階で必要とされる可能性が最も高いことが示唆される。ＲＴ−ＰＣＲデータはＰＡＤ６の精巣発現を示しているが、ＰＡＤ６  ｍＲＮＡのバックグラウンドレベルを越える発現はＩＳＨ分析により検出されなかった。このことは、精巣でのＰＡＤ６発現レベルは低いことが示唆される。
【実施例３】
【００６４】
ヒトＰＡＤ６の単離及び特性決定：
ＥＭ６３ｈｓＧｅｎｏ（ｎｅｗ）データベースに対する照会として完全長マウスＰＡＤ６  ｃＤＮＡを用いるＢＬＡＳＴ検索により、ＰＡＤ６のヒトホモログを同定した。この検索はヒトＰＡＤ６のコード配列のＣ末端領域しか同定しなかった。５’方向に配列を延長するために、プライマーを消化し、５’ＲＡＣＥ  ＰＣＲをＭａｒａｔｈｏｎ  Ｒｅａｄｙ（商標）ｃＤＮＡユーザーマニュアルを用いてヒト卵巣Ｍａｒａｔｈｏｎ  Ｒｅａｄｙ  ｃＤＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）に対して実施した。第１ＰＣＲを９４℃×３０秒間の変性、５サイクル（９４℃×５秒間及び７２℃×３分間）、５サイクル（９４℃×５秒間及び７０℃×３分間）及び２５サイクル（９４℃×５秒間及び６８℃×３分間）の条件で実施した。この第１ＰＣＲ産物の５０倍希釈物を同一ＰＣＲ条件下での第２ネステッドＰＣＲ反応における鋳型として使用した。≒６５０ｂｐの予想されるバンドをＴＡ  Ｔｏｐｏ  ＰＣＲ２．１ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローン化し、配列決定した。このクローンは（相同性により）ヒトＰＡＤ６のコード配列の最初の５’５００塩基対を含んでおり、ヒトＰＡＤ６のコード配列を完成させた。
【００６５】
完全長ヒトＰＡＤ６  ｃＤＮＡヒト卵巣ＲＮＡを増幅させるためにＰＣＲプライマーを選択した。ヒトＰＡＤ６  ｃＤＮＡを単離するために、Ｍａｒａｔｈｏｎ  Ｒｅａｄｙ卵巣ｃＤＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）に対してプライマー（配列番号１１及び配列番号１２）を使用した。ＰＣＲ条件は９４℃×５分間の変性、５サイクル（９４℃×３０秒間及び６８℃×３分間）、２８サイクル（９４℃×３０秒間，６２℃×３０秒間及び７２℃×３分間）及び最後に延長（７２℃×７分間）であった。
【００６６】
３つの独立したＰＣＲ反応の完全長増幅物をＰＣＲ２．１  Ｔｏｐｏベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローン化し、配列決定して、コンセンサスヌクレオチド配列を決定した。その配列を配列番号４に示す。
【００６７】
遺伝子特異的ＰＣＲプライマー組（配列番号１４及び配列番号１５）を消化し、ＲＴ−ＰＣＲ実験に使用して、ヒトＰＡＤ６の発現プロファイルを調べた。ヒト精巣、子宮、腎臓、精巣、肝臓、脳、心臓、肺及び脾臓由来のＲＮＡに対するＲＴ−ＰＣＲから、ＰＡＤ６が精巣でのみ発現することが分かった（図３）。
【００６８】
ヒト組織の多組織ノーザンブロット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）をヒトＰＡＤ６のＰＣＲ断片（約５９０ｂｐ；プライマー配列番号１４及び配列番号１５のＰＣＲ産物；配列番号４のヌクレオチド４６４−０５２から延長）とハイブリダイズした。プローブを製造業者の指示に従ってＲｅａｄｙ  ｔｏ  Ｇｏ標識ビーズ（ＡＰ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）及び［３２Ｐ］ｄＣＴＰを用いて３７℃で６０分間のインキュベーション時間で標識した。取り込まれなかったｄＮＴＰをＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ５０のスピンカラム上で１ｍｌ注射器を用いて除去した。
【００６９】
ブロットをＥｘｐｒｅｓｓ  ｈｙｂｍｉｘ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）中６５℃において少なくとも１時間プレハイブリダイズした。ハイブリダイゼーションのために、プレハイブリダイゼーション混合物に４〜８×１０７ｃｐｍの変性プローブを添加した。ブロットを６５℃で一晩ハイブリダイズし、室温において２×ＳＳＣ，０．１％  ＳＤＳで１回、６５℃において１×ＳＳＣ，０．１％  ＳＤＳで２回、６５℃において０．１×ＳＳＣ，０．１％  ＳＤＳで１回洗浄した。ハイブリダイズしたブロットをＳＴＯＲＭ  ８４０リン画像解析装置（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ）を用いて分析し、２００ミクロンで走査し、Ｋｏｄａｋ貯蔵リンスクリーンＧＰ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ）に３日間露出させた後０〜５０の範囲でプリントした。
【００７０】
図４に、推定長さが約３ｋＢの単一バンドが卵巣中にのみ認められ得る。精巣にはシグナルが検出され得なかった。これは、多分精巣でのＰＡＤ６発現レベルがノーザンブロットで検出するには非常に低かったためであろう。ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション分析はこれらの結果を裏付けている。ＰＡＤ６発現はヒト及びマウス卵巣のあらゆる種類の卵胞で検出され、これに関してマウスのｉｎ  ｓｉｔｕデータに類似している。ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションにより、精巣で発現は検出されなかった（データ示さず）。
【実施例４】
【００７１】
ヒトＰＡＤ６の発現及びＰＡＤ６活性の測定：
クローニング
完全長ヒトＰＡＤ６をＲａｐｉｄ  ＤＮＡ結合キット（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）を用いて細菌発現ベクターｐＧＥＸ４Ｔ１（ＡＰ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）にクローン化した。組換え構築物（ｐＧＥＸｈＰＡＤ６）を制限酵素消化により特性決定した。
【００７２】
ｐＧＥＸｈＰＡＤ６で形質転換した大腸菌ＢＬ−２１細胞を２５℃において２×ＹＴ培地で６５０ｎｍでの細胞密度１．０まで増殖させた。０．１ｍＭ  イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシドを添加した後、培養物を２５℃において更に５時間増殖させた。細胞を遠心し、２０ｍＭ  トリスＨＣｌ（ｐＨ７．６）及び１ｍＭ  ＥＤＴＡを含有する初期培地（０．１容量）に再懸濁し、氷上で音波処理して溶解した。処理物を４℃において１５，０００×ｇで３０分間遠心し（Ｓｏｒｖａｌｌ，ＳＳ３４ローター）、上清にＰＢＳ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，初期培養物２５０ｍｌの同等物に対して１ｍｌ）中１Ｍ  ＮａＣｌ、０．１％  トリトンＸ−１００及び５０％  グルタチオン−セファロース４Ｂビーズを添加し、ゆっくり撹拌しながら４℃で６０分間インキュベートした。次いで、ビーズを室温においてゆっくり撹拌しながら５分間２０ｍＭ  トリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．１％  トリトンＸ−１００及び０．１Ｍ  ＮａＣｌを含有する緩衝液（１０ベッド容量）を用いて３回洗浄した。組換え体ｈＰＡＤ６−ｇｓｔ融合タンパク質を、ゆっくり撹拌しながら４℃において３０分間５０ｍＭ  トリス−Ｃｌ（ｐＨ８．０）、０．１Ｍ  ＮａＣｌ及び０．１％  トリトンＸ−１００中１０〜１００ｍＭ  還元グルタチオンを用いて複数ステップでビーズから溶離させた。酵素活性の測定のために、溶離物を−２０℃において１０％グリセロールと共に貯蔵した。タンパク質の純度はＳＤＳ  ＰＡＧＥ分析に基づいて９０％と推定された。
【００７３】
ＰＡＤ６酵素活性の測定
ＰＡＤの活性を、基質としての大豆トリプシン阻害剤（ＳＴＩ）中でのシトルリンの形成により調べた。元のＳＴＩとは対照的に、シトルリン化ＳＴＩはトリプシン活性を阻害できなかった。従って、蛍光トリプシン基質を用いて検出されるトリプシンの高活性はＰＡＤ活性を表す。
【００７４】
ＰＡＤ活性のために、反応混合物は１００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ４．５）、５ｍＭ  ＣａＣｌ２、２ｍＭ  ＤＴＴ、０．１７μｇ  ＳＴＩ及び精製酵素溶液［家兎筋から誘導される、ＧＳＴ−ＰＡＤ６または市販のＰＡＤ（Ｓｉｇｍａ）］のアリコートから構成され、最終容量は２０μｌとした。アッセイ混合物を３７℃において３０分間インキュベート後、蛍光基質Ｎα−ベンゾイル−Ｌ−アルギニン−７−アミド−４−メチルクマリン［１００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）中４００μＭ，５０ｍＭ  ＥＤＴＡ］（１０μｌ）及びトリプシン溶液［１００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）中０．２５μｇ］（１０μｌ）を順次添加した。蛍光測定（励起３６０ｎｍ，発光４６０ｎｍ）をＶｉｃｔｏｒ  Ｖにおいて室温で始め、１時間継続した。
【００７５】
ＰＡＤ６活性は図５に示され得るように検出され得た。
【図面の簡単な説明】
【００７６】
【図１】上図は各種マウス組織におけるマウスＰＡＤ６発現のＲＴ−ＰＣＲ分析（３０サイクル）を示し、下図はＲＴの非存在下及び存在下でのＧＡＰＤＨコントロールを示す。
【図２】若年（７日令）及び成熟マウスの卵巣に対するプローブとしてクローン１Ｂ１１を用いるＩＳＨ（ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション）分析を示す。Ｓ＝二次卵胞、Ａ＝胞状卵胞。
【図３】上図は各種ヒト組織におけるヒトＰＡＤ６発現のＲＴ−ＰＣＲ分析（３０サイクル）を示し、下図はＲＴの非存在下及び存在下でのＧＡＰＤＨコントロールを示す、
【図４】ｈＰＡＤ６プローブを用いてハイブリダイズしたヒト複組織ノーザンブロット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）。
【図５】ＰＡＤ活性を調べるための蛍光測定の結果を示す。ＳＴＩ（０．１７μｇ）を非存在下（黒四角）、或いはそれぞれ０．５μｇのＧＳＴ−ＰＡＤ６（黒三角）、１．０μｇのＧＳＴ−ＰＡＤ６（白三角）または０．１μｇの家兎筋ＰＡＤ（白四角；Ｓｉｇｍａカタログ番号Ｐ１５８４）の存在下で予備インキュベートした。その後、Ｎα−ベンゾイル−Ｌ−アルギニン−７−アミド−４−メチルクマリン（１００μＭ；Ｓｉｇｍａカタログ番号Ｂ７２６０）及びトリプシン（０．２５μｇ）を添加し、蛍光を測定した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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