(57)【要約】抑制性/不安定性配列を除去するまたは減少させるように変異させたHIV-1 gag/polおよびSIV gagまたはSIV env遺伝子を含む、核酸構築物を開示する。ウイルス粒子ならびにこれらの構築物および/またはウイルス粒子を含む宿主細胞もまた開示する。本発明の例示された構築物およびウイルス粒子は、HIV感染症を含む多数の疾患についての遺伝子治療において、またはHIV-1免疫療法および免疫予防のためのワクチンとして有用でありうる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
図1に示されるgag/pol遺伝子のコード配列を有するHIV-1 gag/pol遺伝子を含む、核酸構築物。
【請求項２】
図2に示されるpol遺伝子のコード配列を有するHIV-1 pol遺伝子を含む、核酸構築物。
【請求項３】
図3に示されるgag遺伝子のコード配列を有するSIV-1 gag遺伝子を含む、核酸構築物。
【請求項４】
HIV 5'LTRまたはSIV 5'LTR、パッケージングシグナル、図1に示される配列を含むgag/pol遺伝子、5'スプライス部位、3'スプライス部位、env遺伝子、tat遺伝子、機能的RNA輸送エレメント、および3' HIV LTRまたは3' SIV LTRを含む核酸構築物であって、機能的なGag、PolおよびEnvのビリオン構成要素を生成することができる核酸構築物。
【請求項５】
請求項1、2、3、または4記載の核酸構築物を含むベクター。
【請求項６】
請求項1、2、3、または4記載の核酸構築物を含む形質転換された宿主細胞。
【請求項７】
細胞が真核生物である、請求項6記載の形質転換された宿主細胞。
【請求項８】
細胞がヒト細胞である、請求項7記載の宿主細胞。
【請求項９】
細胞が原核生物である、請求項6記載の形質転換された宿主細胞。
【請求項１０】
細胞が大腸菌(E. coli)である、請求項9記載の宿主細胞。
【請求項１１】
請求項1、2、3、または4記載の核酸構築物および薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物。
【請求項１２】
請求項11記載の組成物を哺乳動物に投与する段階を含む、哺乳動物において抗体を誘導するための方法であって、核酸構築物が哺乳動物において抗体を誘導するために有効な量で存在している方法。
【請求項１３】
請求項11記載の組成物を哺乳動物に投与する段階を含む、哺乳動物において細胞障害性Tリンパ球を誘導するための方法であって、核酸構築物が哺乳動物において細胞障害性Tリンパ球を誘導するために有効な量で存在している方法。
【請求項１４】
薬学的に許容される担体を含み、かつさらにインビボで細胞においてHIV Rev制御タンパク質の非存在下でHIV GagおよびHIV Polタンパク質を生成する能力がある、請求項1記載の核酸構築物の治療的有効量を含む、HIV感染に対して哺乳動物に免疫を誘導するためのワクチン組成物。
【請求項１５】
薬学的に許容される担体を含み、かつさらにインビボで細胞においてHIV Rev制御タンパク質の非存在下でHIV Polタンパク質を生成する能力がある、請求項2記載の核酸構築物の治療的有効量を含む、HIV感染に対して哺乳動物に免疫を誘導するためのワクチン組成物。
【請求項１６】
哺乳動物がヒトである、請求項14記載のワクチン組成物。
【請求項１７】
哺乳動物がヒトである、請求項15記載のワクチン組成物。
【請求項１８】
請求項14記載のワクチン組成物の治療的有効量を哺乳動物に投与する段階を含む、哺乳動物においてHIV感染に対する免疫を誘導するための方法。
【請求項１９】
請求項15記載のワクチン組成物の治療的有効量を哺乳動物に投与する段階を含む、哺乳動物においてHIV感染に対する免疫を誘導するための方法。
【請求項２０】
哺乳動物がヒトである、請求項18記載の方法。
【請求項２１】
哺乳動物がヒトである、請求項19記載の方法。
【請求項２２】
以下を含むレンチウイルス発現系：
(a)図1に示されるヌクレオチド配列を有するHIV-1 gag/polを含む、パッケージングベクター；
(b)転移ベクター；および
(c)エンベロープをコードするベクター。
【請求項２３】
請求項22記載のレンチウイルス発現系を含む形質転換された宿主細胞。
【請求項２４】
細胞が真核生物である、請求項23記載の形質転換された宿主細胞。
【請求項２５】
細胞がヒト細胞である、請求項24記載の宿主細胞。
【請求項２６】
エンベロープタンパク質をコードする遺伝子の存在下において、図1に示されるHIV GagおよびHIV Polをコードするヌクレオチド配列を含むベクターから、宿主細胞においてHIV GagおよびHIV Polを発現させる段階を含むレンチウイルス粒子を作成するための工程。
【請求項２７】
以下を含む、Rev、Tat、および任意のウイルスRNA輸送エレメントの非存在下で機能する能力があるレンチウイルス発現系：
(a)抑制性/不安定性領域を除去するように変異させたHIV-1 gag/pol遺伝子を含む、パッケージングベクター；
(b)転移ベクター；および
(c)エンベロープをコードするベクター。
【請求項２８】
請求項27記載のレンチウイルス発現系を含む形質転換された宿主細胞。
【請求項２９】
細胞が真核生物である、請求項28記載の形質転換された宿主細胞。
【請求項３０】
細胞がヒト細胞である、請求項29記載の宿主細胞。
【請求項３１】
抑制性/不安定性領域を除去するように変異させたHIV-1 gag/pol遺伝子から、宿主細胞においてHIV GagおよびHIV Polを発現させる段階、ならびに発現がRev、Tatまたは任意のウイルスRNA輸送エレメントに依存していない、エンベロープコード遺伝子からエンベロープタンパク質を発現させる段階を含む、Rev、Tat、または任意のウイルスRNA輸送エレメントの非存在下でレンチウイルス粒子を作製するための工程。
【請求項３２】
図16に示されるenv遺伝子のコード配列を有するSIV-1 env遺伝子を含む、核酸構築物。
【請求項３３】
請求項32記載の核酸構築物を含むベクター。
【請求項３４】
請求項32記載の核酸構築物を含む形質転換された宿主細胞。
【請求項３５】
請求項32記載の核酸構築物および薬学的に許容される担体を含む、薬学的組成物。
【請求項３６】
HIV-1 gag/pol遺伝子が図1に示されるHIV-1 gag/pol遺伝子のコード配列を有する、請求項27記載のレンチウイルス発現系。
【請求項３７】
HIV-1 gag/pol遺伝子が図1に示されるHIV-1 gag/pol遺伝子のコード配列を有する、請求項31記載の工程。
【請求項３８】
パッケージングベクターが図9に示されるパッケージング構築物pCMVgag/polBNKanのDNA配列を有する、請求項27記載のレンチウイルス発現系。
【請求項３９】
転移ベクターが図10に示されるpmBCwCNluciまたは図11に示されるpmBCmCNluciのDNA配列を有する、請求項27記載のレンチウイルス発現系。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
I. 技術分野
本発明は、いずれのSIVまたはHIVの制御因子にも依存せずに発現することができる、変異したHIV-1 gag/polおよびSIV gag遺伝子配列を含む核酸に関する。本発明はまた、いずれのSIVまたはHIV制御因子にも依存せずに発現することができる、変異したSIV env遺伝子配列を含む核酸に関する。本発明の好ましい核酸は、感染性ウイルス粒子を生成することができる。
【０００２】
本発明はまた、変異したHIV-1 gag、HIV-1 pol、SIV gagおよび/またはSIV env遺伝子配列を含むベクター、ベクター系、および宿主細胞に関する。本発明はまた、これらの核酸および/またはベクターもしくはベクター系を含む宿主細胞に関する。本発明はまた、遺伝子治療における、またはワクチンとしての使用のためのこれらの核酸、ベクター、ベクター系および/または宿主細胞の使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
II. 背景
最近まで、遺伝子治療プロトコールは、しばしば、マウス白血病ウイルス(MLV)のようなレトロウイルス由来のベクターに頼ってきた。これらのベクターは、それらが形質導入する遺伝子は標的細胞のゲノムへ組み込まれるという、長期間発現のために望ましい性質であるため、有用である。しかしながら、これらのレトロウイルスベクターは、分裂細胞にのみ形質導入することができ、これは肝細胞、筋線維、造血幹細胞、および神経細胞のような非増殖性細胞におけるインビボでの遺伝子移入についてそれらの使用を制限する。
【０００４】
レンチウイルスは、分裂細胞および非分裂細胞の両方を感染させることができるレトロウイルスの型である。それらは動物モデルにおいて、様々な非分裂細胞(神経細胞およびマクロファージのような)での長期間の遺伝子発現(6ヶ月まで)を提供するのに極めて効果的であることが立証されている。例えば、Amadoら、Science 285:674-676(1999年7月)を参照されたい。最適な遺伝子移入系は非増殖性細胞のゲノムへ統合されうるHIV、または他のレンチウイルスに基づくベクターを含むであろうことが提唱された。レトロウイルスは標的細胞のゲノムに統合されるため、形質導入の繰り返しは必要ない。それゆえに、インビボでの遺伝子送達の能力があるアデノウイルスベクターと対照的に、注入されたウイルス抗原に対する体液性応答に関連する問題を回避することができる。例えば、Naldiniら、Science, 272:263-267(1996), p. 263を参照されたい。
【０００５】
HIVおよび他のレンチウイルスは、本質的な構造遺伝子(env、gagおよびpol)に加えて、制御遺伝子(tatおよびrev)およびアクセサリー遺伝子(vpr、vif、vpuおよびnef)を含む複合体ゲノムを有する。HIVは、ヒト細胞においてその遺伝子を効率的に感染および発現させるように進化してきた。かつ、その組み込み前複合体が標的細胞において、核の無傷の膜を通り抜けることができるため、マクロファージのような非分裂細胞を感染させることができる。この複合体は、ウイルスDNAに加えて、酵素インテグラーゼ、vpr遺伝子の産物、およびマトリックスと呼ばれるgag遺伝子によりコードされるタンパク質を含む。マトリックスタンパク質は、組み込み前複合体が核の中へと進み宿主DNAに接近することを可能にする。レンチウイルスは、真に静止状態の細胞(G0期における細胞)を効率的に形質導入することができない。しかしながら、マウスレトロウイルスベクターとは違って、分裂細胞を感染させることができることに加えて、HIV基盤ベクターは、造血幹細胞のような非分裂細胞において、ならびに神経細胞、網膜光受容体、筋肉および肝細胞のような終末分化した細胞において、治療遺伝子の効果的かつ持続性の形質導入および発現を達成することができる。例えば、Amadoら(1999年7月)およびKlimatchevaら、Frontiers in Bioscience 4:d481-496(1999年6月)、ならびにそれらに引用される参照文献を参照されたい。
【０００６】
レンチウイルスベクターは効率的な遺伝子送達媒体でありうるが、それらの起源による安全性の心配がある。それゆえに、この分野では、複製可能レンチウイルス(replication competent lentivirus)(RCL)の出現を防ぐために組み込まれた安全性の特徴をもつベクターおよび生成系の開発を研究してきた。例えば、たいていの実験室での適用では、レンチウイルスは一般的に、細胞系が3つの別々の構築物（パッケージング構築物、転移構築物、およびエンベロープコード構築物）でトランスフェクションされる、一過性系において作製される。パッケージング構築物は、ベクターのパッケージングに必要なエレメント(envを除いて)およびベクター粒子を生成するために必要とされる酵素を含む。転移構築物は、ベクターが標的細胞を感染させるため、および治療(またはレポーター)遺伝子の転移のために必要な遺伝的シス作用配列を含む。レンチウイルスenv遺伝子は一般的に、パッケージング構築物から除去され、その代わりとして、異なるウイルスのエンベロープ遺伝子が第三のベクター「envコードベクター」において供給されるが、レンチウイルスenv遺伝子は、ベクターがCD4+T細胞を感染させることを意図されることが望ましい場合に用いられうる。通常用いられるエンベロープ遺伝子は、幅広い種類の細胞を感染させることができ、その上、粒子に安定性を与え、かつベクターが高力価まで濃縮されることを可能にする、水疱性口内炎ウイルスのG糖タンパク質(VSV-G)をコードするものである(例えば、Naldiniら、Science 272:263-267(1996)およびAkkinaら、J. Virol. 70:2581(1996)を参照)。3つの別々の構築物の使用およびそれらの間の重複配列の欠如により、レンチウイルス(転移)ベクターの生成時における、組換えの可能性が最小化される。さらに、レンチウイルス(転移)ベクター自身によりウイルスタンパク質が発現されないため、それらは動物モデルにおいて、ベクターを発現する細胞に対する有効な免疫応答(アデノウイルスに基づくベクターに関する特定的な問題)を誘発しない。例えば、Amadoら、Science 285:674-676(1999年7月)およびそれに引用される参照文献を参照されたい。Naldiniら、Science 272:263-267(1996)も参照。
【０００７】
最初のパッケージングプラスミドは、envを除いてはほとんどのHIV遺伝子を含んでいた。安全性を向上させる試みにおいて、その後のHIVベクターは、パッケージングプラスミドがすべてのアクセサリー遺伝子を欠いて作製された。この方法は、効率的なベクター作製を妨げず、可能性のあるRCLはヒトにおいてHIVの効率的な複製に必要なアクセサリー遺伝子を欠損しているため、系の安全性を有意に増加させる。これらのベクターはインビボにおいて成長が停止した細胞系および神経細胞を形質導入することができるが、それらは効率的にはマクロファージに形質導入しないことが報告されていた。アクセサリー遺伝子vprは、これらのHIVベクターを用いるこれらの細胞のHIV感染に必要であると考えられている。Zuffereyら、Nature Biotechnol. 15:871-875(1997)を参照されたい。対照的に、本明細書に後で考察されているように、本発明のHIV基盤レンチウイルスベクターは、ヒトマクロファージおよび試験される他の細胞を感染させることができるために、いずれのHIVアクセサリー遺伝子も必要としない。
【０００８】
肝細胞の効率的形質導入のためのvprまたはvifの必要性もまた、報告されている。例えば、Kafriら、Nature Genet. 17:314(1997)を参照されたい。これらの結果は、効率的なレンチウイルス媒介型遺伝子移入のためのアクセサリー遺伝子の必要性が標的として選択される細胞の型に依存していることを示し、レンチウイルスベクターの将来的適用は、必要とされる異なるアクセサリー遺伝子をもつベクター構築物を含みうることを示唆している。
【０００９】
Zuffereyら(1997)は、病原性遺伝子、env、vif、vpr、vpu、およびnefが除去されたHIVベクター系を記載している。この複合的に弱毒化されたベクターは、成長を停止した細胞および培養中の単球由来マクロファージを形質導入する能力を保存し、かつインビボでの成体の神経細胞へ遺伝子を効率的に送達することができた。Zuffereyら(1997)およびNaldiniら(1996)に記載されているパッケージングプラスミドは、GagおよびPolに加えて、RevおよびTatをコードしている。
【００１０】
制御遺伝子tatの非存在下でビリオンへパッケージされることになるように操作されたレンチウイルスベクターもまた記載されている。例えば、Kimら、J. Virol. 72:811-816(1998)およびMiyoshiら、J. Virol. 72:8150-8157(1998)を参照されたい。これらのベクターにおいて、tat遺伝子は、パッケージングプラスミドから除去された。Kimらは、連続的な5' LTRプロモーターが強い構成的なプロモーターに置換されさえすれば、tatは必要ではないと述べている。それはまた、HIV治療にとって他の利点をもつ。構成的HCMVプロモーターでのHIV-1 LTRの置換は、ベクター作製に影響を及ぼさないであろうことから、Tatトランスドミナント変異体のような、抗Tat分子または治療的薬剤としてのTat活性化応答エレメントデコイ（decoy）の使用を可能にする。(p. 814、2段落目を参照。)tat遺伝子の除去は、可能性のあるRCLに寄与しうると考えられる本質的病原性因子を排除する。Kimら(1998)は、tat、vif、vpr、vpuおよびnefを含まないベクター系を記載している。好ましいベクター系は、著者らは「RREと共に」と述べているが、この系において効率的なRNA操作に必要とされるrev遺伝子を含む。(p. 811、2段落目。)しかしながら、Kimらはまた、CTEを使用するRev非依存性構築物も構築した。rev/RRE構成要素は、Mason-Pfizerサルウイルス(MPMV)構成的輸送エレメント(constitutive transport element)(CTE)のような配列を用いることにより除去することができ、それによりすべてのアクセサリータンパク質を排除するが、これは力価において有意な低下を導くと、Kimらは述べている。
【００１１】
Srinivasakumarら、J. Virol. 71:5841-5848(1997)は、Rev依存性様式またはRev非依存性様式のどちらにおいても、高レベルのHIV-1構造タンパク質を構成的に発現させる安定的なHIV-1パッケージング系統の作製を記載している。これらの細胞系は、ハイグロマイシンB耐性遺伝子を発現させるHIV-1ベクターを用いることにより遺伝子移入を評価するために、およびベクター力価へのRev、Tat、およびNefの効果を研究するために用いられた。Rev非依存性細胞系は、MPMV CTEを含むgag-pol発現ベクターおよびenv発現ベクターを用いることにより作製された。この論文は特に、4つのプラスミド：HIV-1構造遺伝子発現のためにRev同時発現を必要とするCMV gagpol-RREおよびpCMVenv、ならびに必要としないpCMV gagpol-CTEおよびpCMVenv-CTEの構築を記載している。Rev含有細胞系およびRev非依存性パッケージング細胞系を作製するために、CMT3細胞は、リン酸カルシウムトランスフェクション法を用いて、Gag、Gag-Pol、およびEnvを発現させるベクターでトランスフェクションされた。
【００１２】
MPMV CTE(pTR167-CTE)およびRev非依存性様式でHIV構造タンパク質を発現させるパッケージング細胞系を含むHIVベクターを作製することにより、著者らはRev無しで完全に機能するHIVベクター系を得ることができた。この系から得られるベクターの力価は、Revを含む対応する系から得られるものと本質的に同じであった。著者らはこのような関係において、CTEがRev依存性構築物での一過性発現アッセイにおいて以前に観察されたものと類似して、完全にRev-RRE機能の代わりになっているように考えられると述べている。これは、HIV複製の数ラウンドが測定された状況と対照的である。それらの場合において、CTE含有ウイルスからの力価は常に、RevおよびRREを利用するウイルスと比較して、少なくとも1ログユニット低下していた。(Srinivasakumarら、p. 5847を参照。)
【００１３】
著者らは、Revの非存在下において働くHIVベクター系をもつことの利点は、Rev機能に対する細胞内免疫のための送達媒体としてそれを使用する可能性を開くと述べている。Rev M10またはRREデコイのような、HIV複製に顕著な阻害効果を生じるRev拮抗物質をコードする遺伝子は、HIVベクターへ導入され、普通にHIVによる感染が可能な細胞へと入ることができる。「抗Rev」遺伝子の発現は、HIV感染を減衰させることが予想されるものと考えられる。任意の残留するHIVの複製がベクターLTR(Tatによる)の活性化を導き、感染性ウイルス由来のタンパク質によりパッケージされるであろうベクター由来のRNAを作製する。このシナリオにおいて、野生型ウイルスは、以前に免疫化されていない細胞へのベクター粒子の伝播を可能にしうるヘルパーとして作用するものと考えられる。さらなるベクター伝播のため、この種のスキームは、伝統的なレトロウイルスベクターに基づくものより、インビボでのHIV感染の調節においてより効果的である可能性が高い。著者らは、目下、モデル系においてこの方法を試験しているところであると、述べている。(Srinivasakumarら、p. 5847を参照)
【００１４】
安全な系の探求におけるもう一つの開発は、いわゆる自己不活化(self-inactivating)(SIN)ベクターである。例えば、Yuら、Proc Natl Acad Sci USA 83:3194-3198(1986)、およびMiyoshiら、J. Virol. 72:8150(1998)を参照されたい。Yuらにおいて、レトロウイルス由来ベクターSINベクターは、哺乳動物細胞へ遺伝子全体の形質導入のために設計された。YuらのSINベクターは、エンハンサーおよびプロモーターの機能をコードする配列を含む、3'末端反復配列(long terminal repeat)(LTR)において299塩基対の欠失を含む。そのようなベクター由来のウイルスがNIH 3T3細胞を感染させるために使用された場合、その欠失は5' LTRへ転移され、結果として感染した細胞においてプロウイルスの転写を不活化した。SINベクターによる細胞へのハイブリッド遺伝子(ヒトメタロチオネイン促進c-fos)の導入は、再編成に関連せず、いくつかの場合においてカドミウムにより誘導される標準のmRNA転写の形成に至った。Miyoshiらにおいて記載されているベクターもまた、欠失3'(下流)LTRを含む。上流LTR内の配列は、ウイルスのゲノムが発現されるプロモーターとしての役割を果たす。下流LTRに導入された欠失は、逆転写の間に上流LTRへ転移される。この欠失は、LTRプロモーターを不活化し、ベクターRNAの生成を排除する。転移されうる遺伝子(例えば、レポーターまたは治療遺伝子)は、レンチウイルスベクターへ挿入されている外因性ウイルスまたは細胞のプロモーターから発現される。SINベクターの重要な安全性特徴は、LTRのプロモーター活性の不活化が宿主ゲノムへの(転移ベクターの)挿入性突然変異誘発の可能性を低下させることである。さらに、(転移)ベクターRNAの発現が排除されるため、標的細胞におけるRCL生成の可能性がなお一層最小化される。SINベクターは、哺乳動物細胞において遺伝子の制御された発現を研究するために設計された遺伝子移入実験において、特に有用である。組み込まれたプロウイルスの両方のLTRにおけるエンハンサーおよびプロモーター配列の欠如はまた、細胞の発癌遺伝子を活性化する可能性を最小にし、ヒト遺伝子治療に用いられうるより安全な代替物を提供しうる。安全性および特異性を高めうる他の改変は、一時的にまたは組織もしくは細胞特異性を伴ってのいずれかで、遺伝子発現を制御する特定の内部プロモーターの使用を含む。
【００１５】
ヒトの研究において安全性を向上させるための他の方策は、サル免疫不全ウイルス、ウシ免疫不全ウイルス、またはウマ伝染性貧血ウイルスのような非ヒトのレンチウイルスを使用することであると考えられる。これらのうち、ネコ免疫不全ウイルス由来のベクターは、非分裂ヒト細胞を効率的に形質導入するように操作された。例えば、Poeschlaら、Nature Med. 4:354-357(1998)および国際公開公報第99/15641号を参照されたい。さらに、Whiteら、J. Virol. 73:2832-2840(1999年4月)は、パッケージング構築物と転移構築物との間の組換えの可能性を低下させることにより安全性を向上させる試みにおいて、ヒトおよびサルの免疫不全ウイルスエレメントを用いるレンチウイルスベクターを記載した。
【００１６】
効率的なパッケージング系統の開発は、VSV-Gエンベロープの発現および多数のHIVタンパク質が細胞への毒性があるため、困難であることが判明した。最近、パッケージング遺伝子およびVSV-Gの発現、さらにベクターの生成を意のままに行うことができる産生系統が設計された。Kafriら、J. Virol. 73:576-584(1999)。毒性遺伝子の発現が止められた場合、細胞系は、ベクター生成拡大のために増量されうる。この細胞系は、RCLを発生させることなく、高力価のベクターを生成する。Donahueら、Blood 92(補遺1)、抄録4648.5(1998)により記載されているように、HIVベクターで形質導入された造血幹細胞は、アカゲザルへ移植され、少なくとも14ヶ月、経過観察された。その時は、この方法が安全であることが立証された。その研究におけるすべての動物は、循環しているHIVまたはベクターの形跡もなく、健康なままであった。Amadoら、Science 285:674-676(1999年7月)を参照されたい。
【００１７】
多くの遺伝子治療プロトコールは、造血幹細胞を用いて多数の遺伝した代謝障害、感染症、または悪性腫瘍疾患を矯正するために設計されてきた。この細胞は、自己再生する、ならびに血液系および免疫系のすべての成熟細胞へと分化する能力を有する。これらの系に影響を及ぼす多くの疾患は、幹細胞への治療遺伝子の安定的導入により治療されうる可能性がある。最近、レンチウイルスベクターが、多くの造血系統をもつSCIDマウス骨髄の安定的な長期間の再構成に寄与する、極めて初期のヒト幹細胞への効率的遺伝子移入を媒介することにより、エキソビボの幹細胞刺激(マウスのレトロウイルスベクターを使用する場合には必要である)の必要性を回避することが示された。例えば、Miyoshiら、Science 283:682(1999)を参照。同様に、レンチウイルスで形質導入された幹細胞での自家移植のアカゲザルモデルにおいて、多系統遺伝子発現が見出され、マウスのレトロウイルスでの形質導入のためには通常不十分である、最小限の幹細胞刺激の条件下での初期血液細胞前駆体の形質導入を示唆した。Donahueら、Blood 92(補遺1)、抄録4648.5(1998)、およびAmadoら、Science 285:674-676(1999年7月)を参照されたい。
【００１８】
HIV感染において、HIVに対して設計されたレンチウイルスベクターのもう一つの利点は、ウイルスがベクターのパッケージングのためのすべての必要なエレメントを供給するため、感染した患者においてHIVにより動員される可能性である。これらの動員されるベクターがHIVエンベロープを含んでいるとすれば、それらはCD4+ T細胞へそれらの遺伝子(例えば、HIVに対する抵抗性を与えるためにカスタム設計された遺伝子)を効率的に転移することができ、それらをその後のHIV感染から保護することができるであろう。レンチウイルスベクターはまた、HIVに感染しているCD4+ T細胞においてのみそれらの遺伝子を効率的に発現させるように設計されうる(いわゆる、tat誘導性ベクター)。これらのベクターにおいて、tatおよびrevを含むすべてのHIV遺伝子が除去される；組み込み、発現、およびパッケージングに必要とされるシス作用配列は保持され、発現はHIV LTRの活性(Tatによるトランス活性化を必要とする)に依存している。この系において、ベクター発現がHIV感染に効率的に誘導されることが示された。なおさらに、HIVに対する抵抗性を与える遺伝子の非存在下において、許容的な細胞系におけるこのベクターの安定的組み込みは、結果として、HIV複製の抑制を生じた。HIV抑制の機構は完全には解明されていないが、予備的な結果は、このベクターが逆転写のレベルでHIVと競合することを示唆している。Anら、J. Virol.、印刷中、およびAmadoら、Science 285:674-676(1999)を参照。
【００１９】
静止状態の細胞の遺伝物質の改変が結果として疾患過程の予防または反転を生じる、多数の他の可能性のある医学的適用は探究され始めたところである。例えば、レンチウイルスベクターがラットおよびマウスの網膜へ、ベクターの直接的注入により安定的かつ長期間の遺伝子移入を媒介することができるという発見は、色素性網膜炎の治療のための遺伝子治療という概念に支持を与えた。この網膜の変性疾患は、光受容体細胞死を特徴とし、ゆっくりとした進行で失明に至る。桿体光受容体のcGMPホスホジエステラーゼβサブユニット(PDEβ)遺伝子における変異は、ヒトにおいておよびその疾患のrdマウスモデルにおいて、色素性網膜炎の常染色体劣性型へと導く。以前の研究では、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルス媒介型PDEP網膜下の遺伝子移入が、結果として、光受容体細胞死に遅延を生じることを示した。rdマウスモデルを用いて、最近の研究が、光受容体はマウスPDEβ遺伝子を含むレンチウイルスベクターを注入された目のうち、最大50％において救出されうることを実証した。アデノウイルスベクターで以前に得られた短期間の発現と対照的に、この研究でのPDEβ発現は、少なくとも24週間、持続した。この発見は、目下有効な治療を欠いている疾患において遺伝子治療の成功の可能性を指摘するものである。Takahashiら、J. Virol., 73:7812-7816(1999年9月)およびAmadoら、Science, 285:674-676(1999)を参照。
【００２０】
天然において、HIV-1のgag、pol、およびenvの発現は、ウイルスのRevタンパク質の存在に依存している。この依存は、少なくとも一部は、スプライスされていないおよび部分的にスプライスされたmRNA内に位置する、負に作用する配列(抑制性または不安定性エレメント[INS])の存在による。これらのmRNAにおけるRevのRev応答エレメント[RRE]との正の相互作用は、抑制性配列の負の効果を打ち消す。
【００２１】
上記の参照文献のいずれも、そこに記載されるgagおよび/またはpol遺伝子が、抑制性/不安定性が変異されてそれらの発現をRev非依存性にしたgagおよび/またはpol遺伝子に置換されうることを示していないか、または示唆していない。さらになお、本明細書に記載される特定のHIV-1 gag/polまたはSIV gagの変異型遺伝子の開示はない。
【００２２】
本発明のgag/polクローンは、「Method of Eliminating Inhibitory/Instability Regions from mRNA」と題する1992年3月27日に出願された米国特許出願第07/858,747号(米国特許第6,174,666号として発行された)に初めて記載されており、かつ後に、1993年3月29日にPCT出願PCT/US93/02908として出願された一部継続出願(「CIP」)、ならびに米国特許第5,972,596号および第5,965,726号に記載されているように、遺伝子から抑制性/不安定性領域を除去するための方法を用いて作製された。CIP出願の開示は、1993年10月14日の国際公開公報第93/20212号として公表された。(これらの特許および特許出願の開示は、参照として本明細書に完全に明確に組み入れられている。)方法はまた、Schwartzら、J. Virol. 66:7176-7182(1992)に記載された。
【００２３】
Schneiderら、J. Virol. 71:4892-4903(1997)は、gag、プロテアーゼおよびpol遺伝子内の追加のINSを同定し、特徴付け、かつそれらを同様の方法で変異させることにより、特許出願およびSchwartzらに記載されている研究を広げている。Schneiderらは、完全に変異させたHIV-1gag遺伝子、しかし部分的にのみ変異させたHIV-1pol遺伝子を含む、核酸構築物を開示している。
【００２４】
Schneiderらは、無傷のまたはほとんど無傷のp55gag領域を含む発現ベクターが、他の任意のHIVタンパク質の非存在下で哺乳動物細胞において未成熟なウイルス粒子の生成を可能にすることを実証している。プロテアーゼ領域における追加の変異の導入は、Gag/プロテアーゼの効率的な生成を可能にし、結果として、Pr55gag前駆体のプロセシング、およびレンチウイルス様円錐形コア構造をもつ成熟Gag粒子の生成を生じた。
【００２５】
Schneiderらは、Rev非依存性発現ベクターがこれらのRNAの効率的なRev-RRE依存性救出を支持することができない多くの細胞系において、Gagタンパク質の効率的な発現を可能にすることを開示している。Schneiderらはまた、gag/pol領域がenv領域より多く保存されており、HIVに対する効果的な免疫応答および感染からの保護のために重要である可能性があるため、gag/pol発現ベクターはHIV-1に対するワクチン法にとって重要である可能性があることを開示している。彼らはまた、HIVおよび他のレンチウイルスが静止状態の細胞を感染させることができるため、多くの細胞における効率的なHIV遺伝子発現が非分裂細胞またはゆっくりと分裂する細胞において、レンチウイルスベクターを用いる可能な遺伝子移入実験の対象ともなると述べている。
【００２６】
Pavlakisら、「Natl Conf Hum Retroviruses Relat Infect」(第二版) (1995), 91は、Rev非依存性Gag発現ベクターが、他の任意のHIVタンパク質の非存在下で、ヒト細胞およびマウス細胞においてウイルス粒子を生成できることと、pol領域における追加の変異がプロテアーゼの発現およびp55 gag前駆体のプロセシングを可能にすることを述べている。TatおよびRev非依存性Gag発現ベクターのマウス筋肉における直接的DNAの注入により、結果として、ELISAによるGag発現の検出、および抗gag抗体の応答が生じた。いくつかのRevおよびTat非依存性Gag発現カセットは、レトロウイルスベクターへ挿入され、HIV-1のドミナントネガティブな抑制剤であるGagまたはGag断片を発現させる細胞系が構築された。
【００２７】
Shiverら(1996)は、HIV-1 gag(p55 gag)またはenv(gp120またはgp160)をコードする変異した遺伝子のどちらかをコードする、変異したプラスミドDNAでのマウスおよび非ヒトの霊長類のDNAワクチン接種の結果を記載している。gagおよびenvワクチンのレシピエントの両方とも、抗原特異的な細胞障害性Tリンパ球およびヘルパーTリンパ球(CTL、Th)応答を示した。その結果より、DNAワクチンがマウスおよび非ヒト霊長類の両方において、リンパを通して広められる長命のT細胞応答を誘発したことが実証されたことが示された。
【発明の開示】
【００２８】
III. 発明の概要
本発明は、図1(配列番号：1)に示される変異したHIV-1 gag/pol遺伝子の核酸配列を含む核酸、ならびにこれらの核酸を含むベクターおよびベクター系に関する。
【００２９】
本発明はまた、図3に示される変異したSIV gag遺伝子の核酸配列を含む核酸、ならびにこれらの核酸を含むベクターおよびベクター系に関する。
【００３０】
本発明はまた、図17に示される変異したSIV env遺伝子を含む核酸、ならびにこれらの核酸を含むベクターおよびベクター系に関する。
【００３１】
本発明はまた、その核酸により生成される生成物、例えば、mRNA、タンパク質、および感染性ウイルス粒子に関する。
【００３２】
本発明はまた、これらの核酸および/またはそれらの発現産物を含む組成物に関する。
【００３３】
本発明はまた、これらの核酸、ベクター系またはウイルス粒子を含む宿主細胞に関する。
【００３４】
本発明はまた、mRNA、タンパク質、および/もしくは感染性ウイルス粒子を生成するための、ならびに/または抗体および/もしくは細胞障害性Tリンパ球もしくはヘルパーTリンパ球を誘導するための、これらの核酸、ベクター系、宿主細胞、発現産物、および/または組成物の使用に関する。
【００３５】
本発明はまた、好ましくはヒトにおいて、免疫療法および例えば、ワクチンとしての免疫予防における、または発現後の遺伝子治療における使用のための、これらの核酸構築物、ベクター、ベクター系および/または宿主細胞の使用に関する。本発明の核酸構築物は、レンチウイルスベクターもしくは他の発現ベクターに含まれうるかもしくは組み入れられうる、またはそれらはまた組織細胞へ直接的に注入されうり、結果として、コードされたタンパク質もしくはタンパク質断片の効率的な発現を生じうる。これらの構築物はまた、例えば、インサイチューの標的遺伝子との相同的組換えによる、インビボまたはインビトロでの遺伝子置換のために使用されうる。
【００３６】
V. 本発明を行うための様式
前記の概括的な記載および以下の詳細な記載のどちらも、例示的かつ説明のためのもののみであり、主張しているように、本発明を限定するものではないことは理解されるべきである。組み入れられて本明細書の一部を構成している添付の図面は、本発明の態様を図示し、かつ記載と共に、本発明の原理を説明する役目を果たしている。
【００３７】
本発明の一つの局面は、Rev非依存性様式においてHIV-1のGagおよび/またはPolをコードするベクターを含む。本明細書に記載されているそのようなベクターの例は、プラスミドpCMVgagpolBNkanであり、Rev非依存性様式においてHIV-1の完全なGagおよびPolをコードし、カナマイシン耐性を与える遺伝子も含む。このプラスミドは、TatおよびRev非依存性であり、gag/pol mRNAに存在する抑制性/不安定性配列を、その遺伝子によりコードされるタンパク質のアミノ酸配列を変えることなく除去することにより、作製された。
【００３８】
本発明のgag/polクローンは、抑制性/不安定性領域を除去されているHIVのgag/pol領域のDNA構築物である。構築物は、遺伝子治療での使用のためのレンチウイルスベクターの新しい型の構成要素として、またはワクチンとして有用であると期待される。
【００３９】
本発明のgag、polまたはgag/pol配列は、Revを含むHIVの他の任意の制御および構造タンパク質の非存在下で、ヒトおよび他の哺乳動物の細胞において高度に発現されうる。gag/pol配列がVSV Gタンパク質またはHIVエンベロープタンパク質のようなエンベロープタンパク質をコードする配列(例えば、同じベクターまたは別の発現ベクターにおける)と結合される場合、ヒト細胞へのトランスフェクション後に感染性ウイルスが生成される。HIV gag/pol遺伝子の存在下において、例えば、非HIVエンベロープタンパク質をコードする遺伝子が用いられる場合、生成されるウイルス粒子は、HIVタンパク質GagおよびPolのみを含むものと考えられる。
【００４０】
本発明のgag、polまたはgag/pol配列に基づくレンチウイルスベクターまたはベクター系は、本明細書に記載されているRev非依存性pCMVgagpolBNkan構築物により例示されているように、インビボ(例えば、高力価ベクターの非経口的接種)またはエキソビボ(例えば、インビトロでの患者の細胞の形質導入、続いて形質導入された細胞の患者への再注入)での遺伝子治療のために使用されうる。これらの工程は、種々の立証済みの遺伝子治療プロトコールにすでに使用されている。
【００４１】
本発明のHIV gag/polクローンおよびSIV gagクローンは、参照として本明細書に組み入れられている、米国特許第6,174,666号、ならびにまた関連した米国特許第5,972,596号および第5,965,726号に記載されているように、遺伝子から抑制性/不安定性領域を除去するための方法を用いて作製された。この方法は、正確な位置の同定またはINS機能の機構に関する知識を必要としない。一般的に、突然変異は、mRNAにコードされるアミノ酸配列が変化していないものであるが、変異した遺伝子によりコードされるタンパク質が変異していない遺伝子によりコードされるタンパク質と実質的に類似している、保存的および非保存的アミノ酸置換もまた構想される。変異した遺伝子は、合成でありうる(例えば、化学合成により合成される)、半合成でありうる(例えば、ゲノムDNA、cDNA、またはPCR増幅されたDNAおよび合成DNAの組み合わせ)、または組換え的に作製されうる。遺伝子はまた、選択的にイントロンを含まない場合もある。本発明の核酸はまた、望ましい機能(例えば、GagもしくはPolの抗原性、粒子形成(Gag)または酵素活性(Pol)について)を保持するこれらの遺伝子のRev非依存性断片を含みうるか、またはコードされたタンパク質が、ある特定の環境において好ましくない機能を失うように変異させたRev非依存性変異体も含みうる。後者の場合、例えば、逆転写または組み込みを防ぐために、逆転写酵素またはインテグラーゼの活性部位において変異をコードする(アミノ酸レベルで)ように改変されうる。gag遺伝子のRev非依存性断片は、参照として本明細書に組み入れられている、1992年3月27日に出願された米国特許出願第07/858,747号に、ならびにまた関連した米国特許第5,972,596号および第5,965,726号に記載されている。望ましい場合には、存在するならば、いずれのHIVアクセサリー遺伝子(例えば、vif)のATG開始コドンもまた変異させうる。
【００４２】
インビボでの細胞において、Rev制御タンパク質の非存在下でHIV GagおよびPolタンパク質を生成する能力があることに加えて、本発明のHIV gag/polおよびSIV gagクローンはまた、CTEまたはCTE様エレメント(ひとまとめにして本明細書ではRNA輸送エレメント(RTE)と呼ぶ)のような、任意の追加のシス作用輸送エレメントの非存在下で、HIV GagおよびPolタンパク質を生成する能力もある。SIV gagについての本発明の変異したベクターは、CTEを付加したものよりはるかに優れていることを実験は示している(Qiuら、J Virol. 73:9145-9152(1999)を参照)。
【００４３】
ヒト細胞へのトランスフェクション後にこれらのベクターによりコードされるタンパク質の発現は、RNAおよびタンパク質生成の両方のレベルでモニターされうる。RNAレベルは、当技術分野において公知の方法、例えば、ノーザンブロット法、S1マッピング法またはPCR法により定量される。タンパク質レベルもまた、当技術分野において公知の方法、例えば、ウェスタンブロット法またはELISAまたは蛍光検出方法により定量されうる。高速非放射性ELISAプロトコールは、gagタンパク質を検出するために使用されうる(DUPONTまたはCOULTER gag抗原捕捉アッセイ法)。
【００４４】
遺伝子治療での使用のための、および/またはワクチンとしての本発明のgag/pol遺伝子に基づくレンチウイルスベクターの少なくとも3つの型が構想される、すなわち、以下のものを有するレンチウイルスベクター：
a)複製のラウンドをもたない(すなわち、ゼロ複製系)
b)複製の1ラウンド
c)完全複製系。
【００４５】
複製のラウンドをもたない系について、gag/pol遺伝子、もしくは別々のgag遺伝子およびpol遺伝子、またはこれらの遺伝子の断片は、適当な転写ユニット、例えば、CMVプロモーターおよびBGHポリ(A)部位を用いて発現される。これは、ワクチンを目的とするgag/polユニット(もしくはgagもしくはpolまたはそれの断片)の発現を可能にすると考えられる。この発現は、もし適切な変異、例えば、ミスセンス変異が導入されるとすれば、いずれの機能しうるレトロウイルス酵素の生成もなく、達成されうる。ゼロ複製系において、ウイルス貯蔵物は、対象となる細胞または動物に投与されるだろう。例えば、パッケージングベクターPCMVgagpolBNKan、転移構築物pmBCwCNluciまたはpmBCmCNluci、およびエンベロープ含有ベクターpHCMV-Gを用いる例示的系でウイルス貯蔵物を作製かつ使用すれば、ゼロ複製系を得る。そのような系により生成されたウイルス粒子は細胞を感染させることができ、逆転写された転移構築物DNAは、核へと進むだろうが、ウイルスの構造タンパク質についてのコード領域が存在しないため、ウイルスの発現および複製はない(0ラウンド)。同じ3個のDNAでインビボの細胞をトランスフェクションすれば、それらは核へ進み、ウイルスタンパク質を発現させ、感染性ウイルス粒子を作製し、そして外へ出て、別の細胞を感染させる(1ラウンド)。3個のプラスミドのインビボでの送達は、結果として、低い方の発現になる可能性があるため、少なくとも2つの異なる態様が構想される。第一として、2つのプラスミドは、例えば、図5に示されるMV1およびpHCMV-Gのようなエンベロープ発現プラスミドが使用されうる。HIV、SIV、または他のレトロウイルス由来の機能しうるエンベロープをコードする他のプラスミドも使用されうる。その2つのプラスミドによるトランスフェクションは、新しい細胞へ感染させて組み込むことができる感染性ウイルスを生じる(1ラウンド)。感染した細胞は、gagpolを生成するが、envの非存在下ではウイルス伝播は不可能である。
【００４６】
複製の1ラウンドをもつ系について、少なくとも2つの追加の態様が構想される。第一の方法において、遺伝子、例えば、gag/pol遺伝子、envコード遺伝子および、好ましくは、レポータータンパク質または対象となる他のポリヌクレオチドもしくはタンパク質をコードする遺伝子の組み合わせがインビボで対象となる細胞へ送達される。例示的系について上記で考察されているように、同じ3個のDNAでインビボの細胞をトランスフェクションすれば、それらは、核へ進み、ウイルスタンパク質を発現させ、感染性ウイルス粒子を作製し、放出され、そして別の細胞を感染させる(1ラウンド)。
【００４７】
もう一つの態様において、3'LTRにおいて欠失を有し、かつ異種性プロモーター(例えば、CMVプロモーター、または誘導性プロモーター、または組織特異的プロモーター)が3'LTRプロモーターの代わりに使用される転移ベクターを用いることにより、同じ結果(すなわち、1ラウンドのみの複製)が得られうる。3'LTRにおける変異は、逆転写および組み込みについて不活性にさせる。これは、組み込まれたプロウイルスがそれの5'LTRおよびそれの3'LTRの両方を出発(転移)構築物の3'LTRから引き出すためである。(これはすべてのレトロウイルスのよく知られた性質であり、自己不活化ベクター(SIN)を作製するために用いられている。)入ってくるLTRプロモーターを不活化することを望みうるいくつかの理由があるが、その一つは、組み込まれたプロウイルスにおいて対象となる遺伝子の発現のために、異なる組織特異的または制御されるプロモーターを使用するためである。SINについて、インビトロで細胞へのトランスフェクションおよび感染性ウイルスの収集後に生成されたウイルス貯蔵物を使用する場合には、複製のラウンドはないだろうことを留意されたい。インビボでそのDNAで細胞をトランスフェクションする場合には、複製の1ラウンドがある。機能しうるgag、pol、またはenvがそのDNA混合物に含まれない場合には、全く感染はない(すなわち、感染性ウイルスは生成されない)。
【００４８】
完全に複製するRev非依存性系はまだ構築されていないが、Rev非依存性gag/polおよびenv配列を用いて機能しうる系が構築されうることが予想される。望ましい場合には、Revに代わり感染性ウイルスを与えうる、CTEエレメントのような余分の転写後制御エレメントが含まれる(例えば、Zolotukhinら、J. Virol. 68:944-7952(1994)を参照)。完全に複製する系は、LTR、パッケージングシグナル、gag/pol、スプライス部位、env、tat、1つもしくは複数のCTEまたはCTE様エレメント(最適の結果のために望ましい場合には)、およびLTRを含み、一体となっているべきである。tatは、この構築物、少なくとも非許容的細胞に必要とされるものと考えられる。そのような系は図5、(構築物MV2)に描かれている。この系において、対象となる細胞または動物(好ましくはヒト)がその後増殖するウイルス貯蔵物に感染すると考えられる。CTEまたはCTE様エレメント(RTE(RNA輸送エレメント)として構築物MV2に描かれる)は、それらが発現を向上させることが示されたこと、および多くのレトロウイルスが転写後制御エレメントの存在を必要とすることから、望ましい。CTEおよびCTE様エレメントのいくつかの型があり、これらのエレメントはRev-RRE経路とは異なる経路により働くように考えられる。例えば、Taberneroら、J. Virol. 71:95-101(1997)を参照されたい。CTEおよびHIV RRE/Revに取って代わることができる転写後制御エレメントの新しい型を記載している、1999年5月22日に出願され、1999年12月2日に国際公開公報第99/61596号として公表された(かつ参照として本明細書に組み入れられている)PavlakisおよびNappi、PCT/US99/11082もまた参照されたい。Pavlakis-NappiエレメントはCTEと同じ様式で働かず、かつ配列または構造上の相同性を全くもたない。
【００４９】
好ましい態様において、本発明のレンチウイルス系は、以下の3つの構成要素を含む：
1. ベクター粒子を生成するために必要とされる構造タンパク質(HIV envを除く)および酵素のような、ベクターパッケージングに必要なエレメントをコードする核酸配列を含むパッケージングベクターであり、そのパッケージングベクターは少なくとも本発明の変異したHIVまたはSIV gag/pol遺伝子を含む；
2. 標的細胞を感染させるためのベクターに、および対象となる治療的またはレポーターまたは他の遺伝子の転移に必要な遺伝的シス作用配列を含む転移ベクターであり、その転移ベクターはキャプシド形成シグナルおよび対象となる遺伝子または対象となる遺伝子を挿入するためのクローニング部位を含む；ならびに
3. 意図されるレシピエント細胞へウイルス粒子をターゲットするために必要なエレメントをコードする配列、好ましくは、水疱性口内炎ウイルスのG糖タンパク質(VSV-G)をコードする遺伝子、または両種指向性MuLVもしくはレンチウイルスenvを含むベクター。
【００５０】
パッケージングベクターにおいてHIV-1 LTRプロモーターの代わりにCMVプロモーターまたは他の強い高効率的プロモーターを用いて、gag、pol、またはgag/polの高発現が、他のいずれのウイルスタンパク質も全く存在しない条件下で達成されうる。HIV-1 LTRプロモーターの他のプロモーターとの交換は、構成的発現が望ましい場合、およびまた、HIV-1プロモーターが弱いマウス細胞のような他の哺乳動物細胞における発現のために、ベクターまたは他のベクターをパッケージングするのに有益である。本発明の配列を含むベクターは、HIV-1 Gag/Pol、HIV-1 Gag、HIV-1 Pol、およびSIV Gagタンパク質の、Rev非依存性生成のために使用されうる。ある特定の態様において、異種性プロモーターの存在はまた、転移ベクターおよびエンベロープをコードするベクターにおいて、そのようなベクターが使用される場合、望ましいと考えられる。
【００５１】
対象となる遺伝子は、達成されるよう求められる効果に従って選択される。遺伝子治療の目的として、治療するまたは予防することが望ましい状態に対して有効である遺伝子産物をコードする、少なくとも1つの治療遺伝子が存在する。代わりに、または追加として、検出可能産物をコードすることによりマーカーとして作用する遺伝子が存在しうる。治療遺伝子は、例えば、アンチセンスRNA、リボザイム、標的タンパク質のトランスドミナントネガティブな変異体、毒素、条件的毒素、抗体もしくはヘルパーT細胞もしくは細胞障害性T細胞を誘導する抗原、単鎖抗体または腫瘍抑制タンパク質をコードしうる。例えば、国際公開公報第98/17816号を参照されたい。
【００５２】
レンチウイルスベクターにおける使用としての対象となる遺伝子のよりいっそう広範囲なリストは、例えば、国際公開公報第99/04026号の10ページ、20行目〜12ページ、7行目に記載されている。Klimatchevaら(1999)の表2もまた、遺伝子治療に関する疾患および標的細胞のリスト、加えて別のものに使用される多数のレンチウイルスベクターを提供している。このリストは、遺伝性/代謝性欠損症、ウイルス感染症および癌を含む。アデノシンデアミナーゼ欠乏症、家族性高コレステロール血症、嚢胞性線維症、ムコ多糖症VII型、I型およびII型糖尿病、古典的フェニルケトン尿症ならびにゴーシェ病のような遺伝によって受け継がれた遺伝的欠陥は、関与する遺伝子が既知である単一遺伝子の欠損を構成しているため、レンチウイルスベクター媒介型遺伝子治療により克服することが可能であるものとして位置づけられている疾患である。ウイルス性疾患もまた、レンチウイルスの遺伝子送達としての適切な標的を構成しているものとして位置づけられている。特に、多数の遺伝子治療方法がHIV感染の治療のために提案されており、これらの方策のいくつかについては、第一相研究が、最近ヒトにおいて開始された。その論文は、予備的研究がHIV複製に対するアンチセンスRNA、リボザイムおよびトランスドミナントタンパク質の送達のために欠陥マウスオンコウイルスを扱ったと述べている。
【００５３】
任意のベクターにおいて、好ましくは転移ベクターにおいて、挿入される遺伝子は、例えば、ピコルナウイルスRNA由来の内部リボソーム侵入部位(IRES)を有しうるものと考えられる。IRESは、同じプロモーターから2つのタンパク質を発現させたい状況において使用される。例えば、対象となる1つのタンパク質およびマーカー遺伝子、例えば緑色蛍光タンパク質(GFP)、または例えば、国際公開公報第99/04026号の58ページに記載されているようなマーカー遺伝子および薬剤耐性遺伝子(例えば、ホタルルシフェラーゼ遺伝子およびネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子)。IRESを用いて、2つのタンパク質の発現が協調される。さらなる遺伝子もまた、別途のプロモーターの制御下において存在しうる。そのような遺伝子は、例えば、選択マーカー、または上記に挙げられた治療薬剤の中にありうるさらなる治療薬剤をコードしうる。この遺伝子の発現は構成的でありうる；選択マーカーの場合、これは、成功裡にトランスフェクションされたパッケージング細胞、または特に高力価のレトロウイルスベクター粒子を生成しているパッケージング細胞を選択するために有用でありうる。代わりになるべきものとして、または追加として、選択マーカーは、レンチウイルスベクターに成功裡に感染して、それ自身のゲノムへ組み込まれたプロウイルスを有する細胞を選択するために有用でありうる。
【００５４】
遺伝子治療を行う一つの方法は、患者から細胞を抽出し、抽出された細胞をレンチウイルスベクターに感染させ、そしてその細胞を患者へ再導入することである。選択マーカーは、細胞を患者へ再導入する前に、感染したもしくは形質導入された細胞について濃縮する、または感染したもしくは形質導入されたそれらの細胞のみについて積極的に選択するための手段を提供するために用いられうる。この工程は、治療の成功の可能性を増加させうる。選択マーカーは、例として、薬剤耐性遺伝子、代謝酵素遺伝子、または当技術分野において公知の他のいずれの選択マーカーでもありうる。典型的な選択遺伝子は、抗生物質および他の毒性物質、例えば、ヒスチジノール、ピューロマイシン、ハイグロマイシン、ネオマイシン、メトトレキサートに対する耐性を与えるタンパク質、ならびに細胞表面マーカーをコードする。
【００５５】
しかしながら、多くのレンチウイルスベクターの遺伝子治療適用にとって、マーカー遺伝子の発現についての選択は、可能または必然ではない場合がある。実際に、選択マーカーの発現は、インビトロでの研究には都合がよいのに、外来マーカータンパク質に対して向けられた細胞障害性Tリンパ球(CTL)の不適当な誘導のためにインビボで有害でありうるものと考えられる。また、インビボでの適用について、いずれの内部プロモーターも含まないベクターが好ましい可能性がある。内部プロモーターの存在は、例えば、パッケージング細胞系から得られる形質導入力価および組み込まれたベクターの安定性に影響を及ぼしうる。このように、1つまたは2つまたはそれ以上の治療遺伝子についてコードする、二シストロン性または多シストロン性でありうる単一転写ユニットベクターが、インビボでの使用のために設計された好ましいベクターでありうる。例えば、国際公開公報第98/17816号を参照されたい。
【００５６】
本発明における使用のために適した宿主細胞または産生細胞は、当技術分野においてよく知られている。多くのレンチウイルスはすでに、複製欠陥ゲノムおよびパッケージング構成要素へと分割された。分割されていないものについて、それを行うための技術は利用可能である。産生細胞は、Gag、PolおよびEnvタンパク質のようなベクターゲノムによりコードされないウイルス構成要素をコードする。gag、polおよびenv遺伝子は、一過性に産生細胞へ導入されうる、または細胞ゲノムへと安定的に組み込まれて、パッケージング細胞系を与えうる。レンチウイルスベクターゲノムは、その後、トランスフェクションまたは形質導入によりパッケージング細胞系へ導入されて、レンチウイルスベクター粒子を生成するために必要とされるすべてのDNA配列を有する安定な細胞系を作製する。もう一つの方法は、レンチウイルスベクター粒子を生成するために必要とされる異なるDNA配列、例えば、envコード構築物、gag-polコード構築物および転移構築物を一過性三重トランスフェクションにより同時に細胞へ導入することである。
【００５７】
Klimatchevaら(1999)、およびそこに引用された参照文献により同定された標的細胞は、嚢胞性線維症についての気管上皮細胞；色素性網膜炎についての網膜光受容体細胞；造血性疾患、鎌状赤血球貧血、β-地中海貧血症、リソソーム貯蔵疾患、ムコ多糖症、および重症複合免疫不全症候群についての赤血球、マクロファージおよびリンパ球のための前駆体；ゴーシェ病についての骨髄細胞およびマクロファージ；家族性高コレステロール血症についての肝細胞；HIV感染症についてのTリンパ球およびマクロファージ；パーキンソン病およびアルツハイマー病のような神経変性疾患についての脳組織、神経細胞およびグリア細胞；心血管疾患についての内皮細胞および心筋細胞；ならびに癌についての様々な組織(例えば、肝臓または脳)における癌細胞を含む。他の疾患についての標的細胞は、当業者にとって明らかであると考えられる。
【００５８】
本発明の核酸配列の少なくとも1つ、ベクター、ベクター系、または形質導入されたもしくはトランスフェクションされた宿主細胞および薬学的に許容される担体を含むワクチンならびに薬学的組成物もまた、本発明の一部である。
【００５９】
本明細書に用いられる場合、「形質導入」という用語は一般的に、感染による、例えばこの場合レンチウイルスベクターによる、宿主への遺伝物質の移入を指す。「トランスフェクション」という用語は、一般的に、細胞質膜を通過して遺伝物質のいくらかを細胞核へ送達する特定のトランスフェクション剤(例えば、リン酸カルシウム、DEAEデキストラン、脂質製剤、金粒子、および他の微粒子)の使用による、細胞への単離された遺伝物質の移入を指す。
【００６０】
本明細書に記載されているものと類似した系は、本明細書に記載されるHIVおよび/またはSIV遺伝子に加えて、レンチウイルスのエレメントを用いて作製されうる。
【００６１】
薬学的組成物
本発明の薬学的組成物は、本発明の核酸構築物の少なくとも1つ、ベクター、ベクター系、ウイルス粒子/ウイルス貯蔵物、または宿主細胞(すなわち、薬剤)の薬学的および/または治療的有効量を含む。本発明の一つの態様において、単位用量あたりの本発明の薬剤の有効量は、対象となる遺伝子の検出可能な発現を誘導するのに十分な量である。本発明のもう一つの態様において、単位用量あたりの薬剤の有効量は、治療されることになっている状態の有害作用(症状の重症度、持続期間、または範囲を含む)に対して防ぐ、治療するまたは保護するのに十分な量である。単位用量あたりの薬剤の有効量は、当技術分野においてよく知られているが、特に、接種される哺乳動物の種、哺乳動物の体重および選択された接種療法に依存する。予防または治療に最も適していると考えられる治療薬剤の用量はまた、投与の形、選択された特定の薬剤および治療を受けている特定の患者の生理学的特徴によっても異なるものである。用量は少なくとも1回投与される。その後の用量は指示されるとおりに投与されうる。
【００６２】
本発明の組成物を投与される個体の応答をモニターするために、mRNAまたはタンパク質の発現レベルが測定されうる。多くの例において、そのような固体から得られた血清または血漿における発現レベルを評価することで十分であると考えられる。もう一回の用量を投与するかまたは個体に投与される組成物の量を変えるかどうかについての決定は、少なくとも部分的には、発現レベルに基づきうる。
【００６３】
接種物に関係する場合の「単位用量」という用語は、各単位が必要とされる希釈剤に結合して所望の効果を生じるために計算された、活性物質(例えば、核酸、ウイルス貯蔵物または宿主細胞)の所定の量を含む、哺乳動物のための単位投薬量として適する、物理的に別々の単位を指す。細胞または動物へ投与されうるウイルス貯蔵物の力価は、適用および送達の型(例えば、インビボまたはエキソビボ)に依存するものである。ウイルス貯蔵物は、遠心分離のような方法を用いて濃縮されうる。エキソビボで投与されうる力価は、好ましくは、0.001感染単位/細胞〜1感染単位/細胞の範囲である。ウイルス貯蔵物を生成するもう一つの方法は、標的細胞と共にウイルスを発現する安定的な細胞系を共培養することである。この方法は、細胞をより長い時間に渡って感染させることができ、それらがベクターの多数のコピーに感染する可能性をもつため、伝統的なレトロウイルスベクターを使用する場合、より良好な結果を達成するために用いられた。
【００６４】
エキソビボで形質導入またはトランスフェクションされた核酸構築物、ベクター、ベクター系、ウイルス貯蔵物、または細胞のインビボでの投与について、用量は、高い方の用量が容認できない副作用の発生により制限される、用量段階的増大により決定されるべきである。予備の開始用量は、当技術分野において公知の方法により、動物モデルにおいてレンチウイルスベクターを使用する実験から推定されうる、または既知のレトロウイルスの(例えば、アデノウイルスの)用量との比較から外挿されうる。一般的に、最初は少ない投薬量を用い、必要ならば、その環境下での最適効果が達せられるまで少しずつ増加させる。例示的な投薬量は、108粒子〜約5×1015粒子の範囲内である。
【００６５】
接種物は典型的には、水性薬学的組成物を形成するように、食塩水、リン酸緩衝食塩水などの生理学的に許容される担体中の溶液として調製される。
【００６６】
本発明の薬剤は、一般的に、それらのための生理学的に許容される担体または媒体と共に投与される。生理学的に許容される担体は、投与に対して有害な肉体的反応を引き起こさないもの、および化合物の薬学的または治療的有効量を送達しうる活性を保持するのに十分な核酸を溶解できるものである。本発明の薬剤の薬学的または治療的有効量および投与の方法は、個々の患者、治療しようとしている徴候、および当業者にとって明らかな他の基準に基づき異なりうる。本発明の核酸の治療的有効量は、有意な副作用を引き起こすことなく治療しようとしている状態の有害作用の重症度、範囲もしくは持続期間を防ぐか、または弱めるのに十分なものである。特定の適用に有用な投与の経路は、当業者にとって明らかである。
【００６７】
本発明の薬剤の投与の経路は、限定されるものではないが、非経口の、患部への直接的注射を含む。投与の非経口経路は、限定されるものではないが、静脈内、筋肉内、腹膜内および皮下を含む。本発明の薬剤の投与の経路は、典型的には非経口であり、好ましくは、骨髄内、CSF筋肉内、皮下、皮内、眼内、頭蓋内、鼻腔内などである。例えば、処方および投与経路の例として、国際公開公報第99/04026号を参照されたい。
【００６８】
本発明は、限定されるものではないが、薬学的に許容される滅菌等張液を含む非経口経路に適した上記の薬剤の組成物を含む。そのような溶液は、限定されるものではないが、鼻、静脈内、筋肉内、腹膜内、皮下または関節もしくは他の領域への直接的注射のための、食塩水およびリン酸緩衝食塩水を含む。
【００６９】
本発明の薬剤をレシピエント哺乳動物、好ましくは霊長類、最も好ましくはヒトへ供給するにおいて、投与される用量は、哺乳動物の年齢、体重、身長、性別、一般的な医学的状態、以前の病歴などのような要素に依存して異なるものである。
【００７０】
本発明の薬学的組成物の投与は、「予防」または「治療」目的のどちらのためにでもありうる。予防的に供給される場合、組成物は、任意の症状に先立って供給される。組成物の予防的投与は、治療しようとしている状態の任意の続いて起こる有害作用(症状の重症度、持続期間、または範囲を含む)を防ぐかまたは改善する役割を果たす。治療的に供給される場合、組成物は、治療されることになっている状態の症状の始まりの時点に(またはすぐ後に)供給される。
【００７１】
すべての治療的、予防的および診断的使用のために、本発明の薬剤の1つまたは複数、加えて抗体および他の必要な試薬ならびに適切な装置および付属品が、すぐに利用可能でかつ容易に使用されるようにキットの形で提供されうる。
【００７２】
免疫アッセイが含まれる所において、そのようなキットは、標的分子に特異的な抗体のような受容体が結合することになる膜(例えば、ニトロセルロース)、ビーズ、球、試験管、棒などのような固体支持体を含みうる。そのようなキットはまた、標識抗体のような第二の受容体を含む。そのようなキットは、毒素を検出するためのサンドイッチアッセイのために使用されうる。競合的アッセイのためのキットもまた、構想される。
【００７３】
VI. 産業的適用
本発明の変異した遺伝子は、本来の宿主細胞もしくは生物体または異なる細胞もしくは生物体において発現しうる。変異した遺伝子は、当技術分野においてよく知られた方法により、プラスミド、コスミド、ファージ、ウイルスまたはミニ染色体のようなベクターへ導入されて、宿主細胞または生物体へ挿入されうる。一般的に、変異した遺伝子またはこれらの変異した遺伝子を含む構築物は、哺乳動物細胞(例えば、ヒト細胞(例えば、HeLa)、サル細胞(例えば、Cos)、ウサギ細胞(例えば、ウサギ網状赤血球)、ラット細胞、ハムスター細胞(例えば、CHOおよびベビーハムスター腎臓細胞)またはマウス細胞(例えば、L細胞))、植物細胞、酵母細胞、昆虫細胞または細菌細胞(例えば、大腸菌)を含む、任意の細胞、真核細胞または原核細胞のどちらにおいても利用されうる。これらの変異した遺伝子をクローニングおよび/または発現させるために利用されうるベクターは、変異した遺伝子が複製されるおよび/もしくは発現することが望ましい宿主細胞において、変異した遺伝子を複製するならびに/または発現させる能力があるベクターである。宿主細胞の様々な型について適切なベクターの例として、例えば、F. Ausubelら、「Current Protocols in Molecular Biology」、Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience(1992)、およびSambrookら、(1989)を参照されたい。そのような遺伝子についての本来のプロモーターは、その遺伝子が挿入される宿主と適合性のある強いプロモーターに取って代わられうる。これらのプロモーターは誘導性でありうる。これらの変異した遺伝子を含む宿主細胞は、酵素調製、薬剤、診断試薬、ワクチンおよび治療に有用な大量のタンパク質を発現させるために使用されうる。
【００７４】
変異した遺伝子または変異した遺伝子を含む構築物はまた、インビボまたはインビトロの遺伝子治療のために使用されうる。例えば、本発明の変異した遺伝子は、インサイチューでmRNAを生成し、最終的に発現するタンパク質の量を増加させる。そのような遺伝子は、ウイルスの遺伝子および/または細胞の遺伝子を含む。そのような変異した遺伝子は、例えば、ワクチンおよび/または遺伝子治療の開発において有用であると期待される。
【００７５】
変異したgag、envおよびpol遺伝子をコードする構築物を用いることにより生成された構築物および/またはタンパク質は、例えば、AIDSおよびAIDS関連疾患についての診断試薬、ワクチンの作製および治療において用いられうる。HIV-1gag遺伝子における抑制性/不安定性エレメントは、宿主において、低いウイルス生成の状態の確立に関与しうる。HIV-1および残りのレンチウイルスは、免疫系により一掃されない慢性活性感染症を引き起こす。レンチウイルスゲノムからの抑制性/不安定性配列エレメントの完全な除去が、結果として構成的発現を生じる可能性がある。これは、ウイルスが潜伏感染を確立し、かつ免疫系監視から逃れるのを防ぎうると考えられる。抑制性配列エレメントを除去することによる全gag/pol遺伝子の発現を増加させることにおける成功は、いずれの負のエレメントも含有しないレンチウイルスを作製することができることを示唆している。そのようなレンチウイルスは、弱毒ワクチンに向けての新規な方法を提供するものと考えられる。
【００７６】
例えば、高レベルのGagを発現させるベクターは、ヒトにおける発現後、免疫療法および免疫予防に用いられうる。そのようなベクターは、レトロウイルスベクターを含み、また例えば、Wolffら、Science 247:1465-1468(1990)、Wolffら、Human Molecular Genetics 1(6):363-369(1992)、およびUlmerら、Science 259:1745-1749(1993)に記載される技術を用いて、結果としてgagの効率的発現を生じる、筋肉細胞または他の受容性細胞へのDNAの直接的注射も含む。さらにgag構築物は、ヒトへの導入後、HIV発現のトランスドミナントな抑制において用いられうると考えられる。この適用について、例えば、Tronoら、Cell 59:113-120(1989)に記載されているように、例えば、高レベルのp55gagもしくはp37gagを発現させる適切なベクターまたはDNA分子が、トランスドミナントgag変異体を生じるように改変されると考えられる。ベクターはヒトへ導入され、結果としてgagトランスドミナントな抑制の機構および生成されたgagタンパク質による免疫刺激の機構の結合による、HIV生成の抑制を生じるものと考えられる。加えて、本発明のgag構築物は、レンチウイルスgagタンパク質の発現に基づく新規なレトロウイルスベクターの作製に用いられうると考えられる。レンチウイルスは、非分裂細胞にターゲットしかつ効率的な感染を可能にしうる特有の特徴をもつ。類似した適用が高レベルのenvを発現させるベクターについて期待される。
【００７７】
SIVにおける類似した抑制性/不安定性エレメントの同定より、このウイルスはこれらの仮説を試験するのに都合の良いモデルであることが示されている。同様に改変されたSIVは、感染性HIVの発生へ導くであろう再編成事象の可能性をさらに最小化する試みにおいて、HIVの代わりに用いられうるものと考えられる。
【００７８】
以下の実施例は、本発明のある特定の態様を例証するが、決してその範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。ある特定の改変および変異は、前記の開示および以下の実施例の教示から当業者にとって明らかであり、これらは、本発明の意図および範囲に含まれるものとする。
【００７９】
実施例1
Rev非依存性HIV-1 Gag/Pol分子クローン
図1は、Rev非依存性HIV-1 gag/pol分子クローンのDNA配列を示す。示されるこのDNA配列は、HIV-1の完全なGagおよびPolをコードし、プロモーターへ機能的に連結される場合、Rev非依存性様式で発現することができる。Rev非依存性gag配列は、米国特許第6,174,666号、第5,972,596号および第5,965,726号に記載され、Rev非依存性pol配列は、それらの特許に記載される方法を用いて抑制性/不安定性配列を除去することにより作製された。伝える所によれば、ヒト細胞のためにコドンの利用を最適化することにより、Rev非依存性gag配列が作製された(例えば、国際公開公報第98/34640号を参照されたい)。
【００８０】
図2は、野生型およびpCMVgagpolBNkanにおける変異型pol領域の、配列のアラインメントを示す。図の位置#1は、プラスミドpCMVgagpolBNkanにおける2641位である。
【００８１】
gag、polおよびenv領域におけるINSの除去は、HIV-1のRev制御因子の非存在下において高レベルの標準HIV-1構造タンパク質の発現を可能にする。
【００８２】
実施例2
Rev非依存性SIV Gag分子クローン
図3は、Rev非依存性SIV gag分子クローン、SIVgagDXのDNA配列を示す。図4は、野生型(WT)配列および変異体(SIVgagDX)配列の比較を示す。野生型SIV配列は、サル(マカーク)免疫不全ウイルス分離239、クローンλsiv 239-1(GenBankアクセッション番号M33262)由来である。
【００８３】
実施例3
Rev非依存性SIV Env分子クローン
いずれのSIVまたはHIV制御因子にも依存せず発現する能力がある変異したレンチウイルスのenv遺伝子配列を含むベクターの例である、「envコード」ベクターCMVkan/R-R-SIVgp160CTEの模式図を図16に示し、DNA配列は図17に示す。「CMV」は、サイトメガロウイルスプロモーターを表す；「SRV-CTE」は、サルレトロウイルス1型の構成的輸送エレメント(CTE)を表す；「全停止」は、すべての3つの読み枠において翻訳停止を与える配列を表す；「BGHターミネーター」は、ウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナルを表す。表示されているSRV-CTEの代わりに他の転写後制御エレメントを使用してもよく、例えば、1999年12月2日に国際公開公報第99/61596号として公表された(および参照として本明細書に組み入れられている)、1999年5月22日に出願されたPavlakisおよびNappi、PCT/US99/11082により記載されているものである。
【００８４】
上ですでに言及されているように、ベクターがCD4+T細胞を感染させることが望ましい場合には、レンチウイルスのenv遺伝子をコードするそのようなベクターが使用されうる。また、上ですでに言及されているように、CTEエレメント(すなわち、ベクターCMVkan/R-R-SIVgp160CTEの場合におけるSRV-CTEエレメント)は、CTEおよびHIV RRE/Revに取って代わることができるPavlakis-Nappiエレメントのような、別の転写後制御エレメントに置換されうる。1999年12月2日に国際公開公報第99/61596号として公表された(および参照として本明細書に組み入れられている)、1999年5月22日に出願されたPavlakisおよびNappi、PCT/US99/11082を参照されたい。
【００８５】
実施例4
レンチウイルスのベクター系
図5は、使用されうるパッケージング構築物および3つの異なる転移ベクターを含む、本明細書に例示されるRev非依存性レンチウイルスのベクター系の予備的バージョンのいくつかの構成要素の概略図である。本明細書に例示されるレンチウイルス系において、パッケージング構築物はまた、カナマイシン耐性についての遺伝子を含む。本明細書に例示されるレンチウイルス系はまた、図5に示されているベクターpHCMV-Gを含む。
【００８６】
図5に示されるパッケージング構築物において、「CMV」はサイトメガロウイルスプロモーターを表し、「Gag」はビリオンコアの構成要素を生成するgag遺伝子を表し、「Pro」は「プロテアーゼ」を表し、「RT」は「逆転写酵素」を表し、「Int」は「インテグラーゼ」を表し、かつ「BGHポリ(A)」はウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナルを表す。プロテアーゼ、逆転写酵素およびインテグラーゼ遺伝子は、「pol」遺伝子を構成する。転移構築物1において、「LTR」はHIVプロモーターを含むHIV「末端反復配列」を表し、「mSD」はRNA転写物のスプライシングが起こらないように構築物に存在している「変異したスプライス供与部位」を表し；「Ψ」はキャプシド形成シグナルを表し；「wGA」はキャプシド形成に必要であると考えられる配列を含む野生型gag遺伝子の部分を表し；「X」はこの遺伝子の翻訳が起こらないように一部分のgag遺伝子配列のATGコドンが変異していることを示し；「CMV」はサイトメガロウイルスプロモーターを表し、かつルシフェラーゼがレポーター遺伝子として用いられる。ルシフェラーゼは、対象となるいずれの遺伝子とも交換されうる。もう一つのHIV LTRが転移構築物1の3'末端に存在している。転移構築物1、2、または3のような構築物におけるこのLTRの、プロモーター-エンハンサー欠失型HIV LTRとの置換は、組み込み後のLTRの不活化へと導く。転移構築物2は、転移構築物1と類似しており、その違いは、gag遺伝子の野生型部分の代わりにgag遺伝子の変異した部分が用いられていることである。転移構築物3(pm2BCwCNluci)は、5'スプライス部位に異なる変異をもち、かつ変異したgag遺伝子の部分の翻訳が起こるように無傷のATGコドンを有する。転移構築物3はまた、5'LTRプロモーターの代わりに5'CMVプロモーターを有する。この構築物はHIV Tatタンパク質の存在に依存しないで発現する。LTRプロモーターから発現した転移構築物は、Tatタンパク質に部分的に依存している。293細胞において有意な発現は、Tatの非存在下で達成されうる。例えば、Valentinら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 95:8886-8891(1988)を参照。
【００８７】
実施例5
パッケージング構築物pCMVgagpolBNkanの作製
図6は、パッケージング構築物pCMVgagpolBNKanの概略的地図を示す。ヌクレオチドの番号付けは、HXB2R配列(GenBankアクセッション番号K03455およびM38432)のものであり、+1が転写の開始点である。
【００８８】
HIV-1 gag/pol領域における配列は、すべてのINSを除去するために変異させた。Schneiderら、J Virol. 71:4892-4903(1997)および米国特許第6,174,666号、第5,972,596号および第5,965,726号に記載されている、polにおけるgagの最初からBsrGI部位までの断片、および断片KE[KpnI(3700)-EcoRI(4194)]は、以前に変異させた。
【００８９】
pCMVgagpolBNkanを作製するために、HIV-1 pol領域内の3つの断片を変異させた。それらは、断片BP[BsrGI(2207)-PflMI(3032)]、断片PK[PflMI(3032)-KpnI(3700)]および断片EN[EcoRI(4194)-NdeI(4668)]である。突然変異誘発は、Hoら、Gene 77:51-59(1989)により記載されている方法の改変版、およびDNAシャフリング(ZhaoおよびArnold、Nucl. Acid Res. 25(6)、1307-1308(1997))を用いて行われた。その3つの断片の完全配列にわたる16個のオリゴヌクレオチドが設計された。断片BPに対応した6個のオリゴ、断片PKに対応した6個、および断片ENに対応した4個(長さが130塩基から195塩基までの範囲であるオリゴヌクレオチド；20ヌクレオチドが重複している隣接オリゴ)。各断片は2段階で構築された：
1)PCR；反応は、50 μl最終容量において、各精製された大オリゴの10 pmol、各dNTPの0.2 mMおよび2.5 u pfu DNAポリメラーゼ酵素(Stratagene)を含有する標準pfu緩衝液で行われた。PCRプログラムは次のとおりであった：3分96℃、続いて、1分94℃、1分55℃、および1分 + 5秒/サイクル 72℃の50サイクル、72℃で7分で終了させた。PCR後、大オリゴヌクレオチドを構築された変異型断片から除去した。
2)第二段階は、各変異型断片の5'末端および3'末端に配置させた30 merプライマーで構築された産物を特異的に増幅することであった。構築されたPCR産物の1マイクロリットルが、50 μl最終容量における各プライマー50 pmol、1×pfu緩衝液、各dNTPの0.2 mMおよび2.5 u pfu DNAポリメラーゼでの25サイクルのPCR反応において鋳型として使用された。PCRプログラムは次のとおりであった：3分96℃；30秒94℃、30秒55℃、45秒72℃の10サイクル、続いて、別の30秒94℃、30秒55℃、45秒 + 20秒/サイクル 72℃の14サイクル、および最後に7分72℃。このプログラムは、正しいサイズの単一PCR産物を供給する。増幅されたBP、PKおよびEN断片は、PCR-script(商標)Amp SK(+)クローニングキット(Stratagene)を用いるPCR-script(商標)へ個々にクローニングされた。クローンは、ランダムに選択されかつ配列決定された。Schneiderらにより以前に変異させた断片KEと共に正しいBP、PKおよびEN断片は、p55AM1-R5(Schneiderら、J. Virol. 71:4892-4903(1997)において以前に記載された)のBsrGI部位とKpnI部位との間にライゲーションして、完全に変異したgag/polORFを作製した。完全に変異したgag/polを含む新しいプラスミドは、pLTRgagpolBNと名付けられた。BNは、BsrGIとNdeI間の断片の改変を表す。変異したgag/polは、その後、サイトメガロウイルスの主要な後期プロモーター(GenBankアクセッション番号X17403)およびカナマイシン耐性遺伝子を含むCMVkanベクターへとクローニングされ、結果としてpCMVgagpolBNkanを生じた。プラスミドバックボーンは、Vical社により提供され、かつHartikkaら、Hum Gene Ther. 7:1205-1217(1996)に記載されているpVR1332由来である。
【００９０】
例えば、インビボで例として、DNA注射の場合において、良好な発現を提供するために異なるプラスミドバックボーンが使用されうることは理解される。
【００９１】
実施例6
転移ベクターpmBCwCNluciおよびpmBCmCNluciの構築
BssHII(257)とClaI(376)間のHIV-1配列BCは、主要なスプライス供与部位およびキャプシド形成シグナルを含む。6個のオリゴ(33塩基〜46塩基)は、スプライス供与部位およびgagのAUG開始コドンに変異を導入するように設計された。BC断片は、pCMVgagpolBNの構築物に関する項に記載されているように構築、増幅かつ配列決定された。
【００９２】
変異型BC断片およびClaI(376)とNsi(793)間の野生型gagの断片をp55RRE(Schneiderら、J. Virol. 71:4892-4903(1997))のBssHII部位とNsi部位の間に置き、pmBCwCNを作製した。並行して、p55BM1-10SD+由来の変異型gagのClaI(376)部位とNsiI部位間の断片を用いてpmBCmCNを作製した。(p55BM1-10SD+は、Schneiderら(1997)に記載されているp55BM1-10に類似しているが、さらにgag上流に無傷のスプライス供与およびキャプシド形成部位を含む。)pmBCwCNおよびpmBCmCNにおける、gagの3'部分およびRREを含むNsiIとXhoI間の領域は、pHR'-CMVluci(D. Tronoからのベクター)由来のCMVプロモーターおよびルシフェラーゼ遺伝子を含むClaI-XhoI断片により置換され、pmBCwCNluciおよびpmBCmCNluci(図5において転移構築物1および転移構築物2として示され、それぞれ、図7および図8において模式的に描かれている)が作製された。これらのプラスミドの配列は、それぞれ、図10および図11に示されている。これらのプラスミドの異なるバージョンもまた、キャプシド形成部位、第一スプライス供与部位、およびイニシエーターgagAUGの領域における変化をもって、標準的方法により作製された。例えば、転移構築物pm2BCwCNluci(図5において転移構築物3として示されている)は、5'スプライス部位領域に異なる変異をもち、かつ無傷のATGを有する。転移構築物1および2(mBCwCN frag)、転移構築物3(m2BCwCN frag)、HXB2ならびにNL43のBssHII-ClaI領域における配列の比較は、図12に示されている。
【００９３】
実施例7
ウイルス粒子の調製
レンチウイルス粒子は、3つのプラスミド：pCMVgagpolBNkan、pmBCwCNluciまたはpmBCmCNluci(転移ベクター)、およびpHCMV-G(Yeeら、Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 91:9564-9568(1994)エンベロープVSV-G(水疱性口内炎ウイルスの糖タンパク質)をコードするプラスミド)の組み合わせを用いて、293ヒト腎臓細胞の一過性共トランスフェクションにより生成された。
【００９４】
トランスフェクションの前日、293細胞を60 mmのプレート上に106細胞/プレートの密度で蒔いた。プラスミドDNAは、以下の割合でCa-リン酸沈殿法によりトランスフェクションさせた：3 μg パッケージング構築物、6 μg 転移構築物および100 ng VSV-Gコード構築物、pHCMV-G。[LTRプロモーターは、Tatの非存在下で、効率が中程度に減少して293細胞に発現しうることに留意されたい。転移構築物は、CMV(例えば、図5における転移構築物3を参照)またはmRNA開始部位がLTR R領域の最初にあるような様式における他のプロモーターによる、LTRプロモーターの交換後に完全にTat非依存性でありうる。] ウイルス粒子の調製のための本実験において、Tat発現プラスミドの500 ngがトランスフェクションに含まれた。
【００９５】
トランスフェクションの翌日、細胞を洗浄し、上清を収集する前に、さらに48時間、DMEM培地に維持した。いずれの浮遊細胞も除去するために上清を1,200 rpmで7分間、回転させた。pCMVgagpolBNkanは、細胞から効率的に放出される高レベルのGagタンパク質を生成し(図13)、また、完全HIV-1の発現において見出されるものと類似した逆転写酵素のレベルにより判断される、高レベルの機能しうるPolを生成する(図14)。
【００９６】
293トランスフェクションされた細胞からの上清は、いくつかのヒト細胞系(293、ジャーカット(Jurkat)、U937)および非分裂ヒト初代マクロファージを形質導入するために使用された。
【００９７】
実施例8
細胞形質導入
形質導入は、レトロウイルスベクターを含む上清の1 ml〜2 mlと共に標的細胞を37℃で3時間〜4時間、インキュベートすることにより行われた。上清に存在するレトロウイルスベクターの量は、p24含有量(ELISAにより測定される)により規準化された。p24 gagタンパク質の等量を細胞の感染に使用した。このようにして、異なる調製の生成における差異を最小化した。
【００９８】
形質導入のために使用されるマクロファージは、プラスチックへの付着により健康な供与者の末梢血から単離された。細胞をRPMI + 20％ ウシ胎児血清(FCS) + 10％ ヒト血清(HS)において培養した。1週間後、非付着細胞をPBSで洗い落とし、マクロファージをヒト血清の非存在下で、さらに1週間〜2週間、培養し続けた。形質導入前に、細胞をPBSで2回〜4回、洗浄した。
【００９９】
形質導入の48時間(初代マクロファージについては7日間)後、細胞を収集し、形質導入効率は、培養物からの細胞抽出物におけるルシフェラーゼ活性を測定することにより測定された。293、ジャーカット、U937および初代マクロファージにおける形質導入実験の結果は図15A〜図15Dに示されている。これらの結果は、Rev非依存性gag-HIV-1基盤レトロウイルスベクターが(A)293細胞、(B)ヒトリンパ球様細胞、(C)ヒト骨髄細胞(U937)、ならびに(D)初代ヒトマクロファージのような、非分裂細胞において高形質導入効率を示すことを実証している。
【０１００】
実施例9
免疫予防または免疫療法における本発明の核酸の使用
出生後の遺伝子治療において、身体から標的細胞を取り出し、それらを新しい遺伝情報をもつウイルスベクターに感染させ、その後、それらを身体へ再移植するような間接的手段により；またはDNAの製剤をリポソーム内にカプセル化する；ウイルスエンベロープ受容体タンパク質を含むタンパクリポソーム内にDNAを包括する；DNAをリン酸カルシウム共沈殿させる；およびDNAをポリリシン-糖タンパク質担体複合体へカップリングさせるような直接的手段により、組織へ導入させた。さらに、リン酸カルシウム共沈澱物の形成があるまたはない場合の直接的肝臓内注射後のクローニングされたウイルスDNA配列のインビボでの感染力もまた記載されていた。安定性を増強するエレメントを含むmRNA配列はまた、陽イオン脂質小胞の使用で、アフリカツメガエル(Xenopus laevis)胚において効率的に翻訳されることが示された。例えば、J. A. Wolffら、Science 247:1465-1468(1990)、およびそこに引用された参照文献を参照されたい。
【０１０１】
最近、純粋なRNAまたはDNAの骨格筋への直接的注射が、結果として、筋肉細胞内での遺伝子の有意な発現を生じることも示された。J. A. Wolffら、Science 247:1465-1468(1990)。粒子加速による(N. -S. Yangら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:9568-9572(1990); S. R. Williamsら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:2726-2730(1991))またはウイルス形質導入によるような他の手段により、RNAまたはDNAを筋肉細胞へ導入されるように強いることもまた、DNAまたはRNAが安定的に維持されかつ発現することを可能にする。Wolffらに報告された実験において、RNAベクターまたはDNAベクターは、マウス骨格筋細胞、特に四頭筋の細胞において、レポーター遺伝子を発現させるために用いられた。タンパク質発現は容易に検出され、これらの効果のために特別の送達系を必要としなかった。注射液の組成および容量ならびに注入の方法が、記載されるプロトコールから改変された場合にもポリヌクレオチド発現が得られた。例えば、レポーター酵素活性は、低浸透圧、等浸透圧、および高浸透圧のショ糖溶液、Opti-MEM、または2 mM CaCl2を含むショ糖溶液の10 μl〜100 μlで観察され、また10μl〜100μlの注入が1分以内でなくポンプで20分を超えて行われた場合にも観察されることが報告された。
【０１０２】
レポーター遺伝子によりコードされるタンパク質由来の酵素活性はまた、RNAベクターまたはDNAベクターで注入された腹筋においても検出され、他の筋肉がポリヌクレオチドを取り上げかつ発現させることができることを示している。RNAベクターおよびDNAベクターで注入された他の組織(肝臓、脾臓、皮膚、肺、脳および血液)においても低量のレポーター酵素が検出された。筋内注射されたプラスミドDNAはまた、非ヒト霊長類の筋肉において安定的に発現することが実証された。S. Jiaoら、Hum. Gene Therapy 3:21-33(1992)。
【０１０３】
インサイチューでのヒト筋肉への遺伝子の直接的移入には、いくつかの潜在的な臨床的適用がありうることが提案された。筋肉は、筋肉が関与するものに加えて、筋肉が主としては関与しない疾患状態を改変すると考えられる導入遺伝子の異種性発現のために適した組織である可能性がある。例えば筋肉組織は、免疫できる、血液中に分泌されうる、または循環する毒性代謝物を一掃できるタンパク質の、異種性発現のために用いられうる。繰り返して接触されうるRNAおよび組織の使用は、通常の薬学的治療のようにしばしば投与される可逆型の遺伝子移入にとって有用であるものと考えられる。J. A. Wolffら、Science 247:1465-1468(1990)、およびS. Jiaoら、Hum. Gene Therapy 3:21-33(1992)を参照。
【０１０４】
J. A. Wolffら、前記により、抗原をコードする遺伝子の細胞内発現がワクチン開発に代わる方法を提供する可能性があることが提案された。この仮説は、BALB/cマウスの四頭筋へ注射されたインフルエンザA核タンパク質をコードするプラスミドDNAが、ウイルスの肺力価（lung titer）の減少、体重減少の抑制、および生存率の増加により測定されるように、結果としてインフルエンザA核タンパク質特異的細胞障害性Tリンパ球(CTL)を生成し、かつインフルエンザAウイルスの異種性系統によるその後の攻撃からの保護をもたらしたという最近の報告により裏付けられた。J. B. Ulmerら、Science 259:1745-1749(1993)。
【０１０５】
それゆえに、ウイルス抗原をコードするRNAベクターまたはDNAベクターの直接的注入は、自己複製剤またはアジュバントの必要なしに免疫系への提示のためのウイルス抗原を産生し、結果として、抗原特異的CTLの発生およびウイルスの同一源または異種性の系統によるその後の攻撃からの保護を生じる、抗原の内因的発現のために用いられうる。
【０１０６】
マウスおよびヒトの両方におけるCTLは、保存された内部ウイルスタンパク質由来のエピトープを認識する能力があり、ウイルスに対する免疫応答において重要であると考えられる。保存されたウイルスタンパク質由来のエピトープの認識により、CTLは交雑系統保護を提供しうる。保存されたウイルス抗原に特異的なCTLは、一般的に系統特異的である抗体と対照的に、ウイルスの異なる系統に応答できる。
【０１０７】
このように、ウイルス抗原をコードするRNAまたはDNAの直接的注入は、直接的なペプチド送達またはウイルスベクターのいくつかの制限を含まないという利点を有する。J. A. Ulmerら、前記、およびその中の考察および参照文献を参照されたい。さらになお、DNAの注入後の発現したタンパク質に対する高力価の抗体の生成は、これが、保存されたまたは保存されていない抗原に向けて標的化される抗体に基づくワクチンを、保存された抗原に向けて標的化されるCTLワクチンと別々にまたは組み合わせてのいずれかで生成する、容易かつ効果的な手段でありうることを示している。これらはまた、組み合わせワクチンの生成のために、伝統的なペプチドワクチンと共に用いられうる。さらになお、タンパク質発現はDNA注入後維持されるため、B細胞およびT細胞の記憶の持続を増強することができ、それにより長持ちする体液性および細胞性免疫を生じる。例えば、Shriverら(1996)は、Rev非依存性HIV gagベクターおよびHIV gagベクターを含む、ワクチン組成物で処理されたマウスおよび非ヒト霊長類における、長持ちするT細胞応答を記載し、Helら、J. Immunol., 167:7180-7181(2001)は、参照として本明細書に明確に組み入れられているが、Rev非依存性発現SIV gagベクターおよびSIV envベクター、ならびにナイーブのマカークザルとDNA-SIVおよびNYVAC-SIV初回抗原刺激/追加免疫療法により感染したマカークザルの両方における、SIV特異的CD4+およびCD8+T細胞応答のそれらの増強を記載している。
【０１０８】
1. HIV-1に対する免疫予防または免疫療法のためのベクター
変異したgag、polまたはgag/pol配列は、CMVもしくはRSVのような強い構成的プロモーター、またはHIV-1のような誘導性プロモーターを用いる発現ベクターに挿入される。
【０１０９】
ベクターは、ヒト組織への直接的DNAの注射；培養中の初代ヒト細胞(エキソビボ)へのDNAのエレクトロポレーションもしくはトランスフェクション、望ましい性質についての細胞の選択およびそのような細胞の身体への再導入(この選択は、適切に前もって選ばれたゲノム領域への入ってくるDNAの、成功した相同的組換えについてでありうる)；gag遺伝子を含む感染性粒子の生成、エキソビボでの細胞の感染およびそのような細胞の身体への再導入；またはインビボでのその粒子による直接的感染のようないくつかの技術の一つを用いて、薬学的に許容される担体中において動物またはヒトへ導入される。
【０１１０】
実質的なレベルのタンパク質が生成され、免疫系の効率的な刺激がもたらされる。
【０１１１】
本発明のもう一つの態様において、記載される構築物は、ウイルス粒子形成に関与することができない、変異したGagタンパク質を発現させるように改変される。そのようなGagタンパク質は、野生型Gagタンパク質と同じ程度まで免疫系を刺激するが、HIV-1生成の増加に寄与する能力がないことが予測される。この改変は、結果として、免疫療法および免疫予防のためのより安全なベクターを生じる。
【０１１２】
実施例10
トランスドミナントな(TD)-TD-Gag-TD RevまたはTd Gag-Pro-TD Rev遺伝子を用いるHIV-1発現の抑制
DNAの直接的注入またはレトロウイルス以外のベクターの使用は、細胞においてトランスドミナントなGag(TDgag)の高レベルを恒常的に可能にする。加えて、B. K. Felberら、Science 239:184-187(1988)によりとられた方法は、レトロウイルスベクターによるヒト細胞の感染を妨げない、HIV-1 TDgagをコードするレトロウイルスベクター、例えば、マウス由来レトロウイルスベクターの作製を可能にする。Felberら、前記の方法において、プロモーターおよびポリAシグナルの一部を含むHIV-1 LTRの断片は、マウスレトロウイルスベクター内に有害な作用無しに組み入れられ、転写的にサイレントなままでありうることが示された。Tatタンパク質の存在は、HIV-1 LTRからの転写を刺激し、結果としてHIV-1 LTRに連結された遺伝子の高レベルな発現をもたらした。
【０１１３】
ハイブリッドTDgag-TDRevまたはTDgag-pro-TDRev遺伝子の作製およびヒト細胞における発現ベクターの導入は、HIV-1発現を抑制する2つのタンパク質の、効率的生成を可能にする。同じベクター内での2つのTDタンパク質の組み込みは、ウイルス複製へのそれぞれの効果を増幅することが予測される。B. K. Felberら、前記、に記載されるものと類似した状況でのHIV-1プロモーターの使用は、感染した細胞において、高レベルのGagおよびRev発現を可能にする。感染の非存在下において、発現は実質的により低い。または、他の強いプロモーターの使用は、そのようなタンパク質の構成的発現を可能にする。感染性ウイルスの生成に関与することができない、それどころか、そのような生成に拮抗する、高度に免疫原性のgagの生成のために、この方法は大いに有益でありうる。これは、AIDSに対する効率的な免疫予防または免疫療法の方法として用いられうる。
【０１１４】
トランスドミナントな変異体の例は、Tronoら、Cell 59:112-120(1989)に記載されている。
【０１１５】
1. トランスドミナントなGag変異体タンパク質をコードする構築物の作製
例えば、Tronoら、前記、に記載されているような、トランスドミナントな変異体として働くことができるGag変異体タンパク質は、高い恒常的レベルでトランスドミナントなGagタンパク質を生成するようにベクターp37M1-10Dまたはp55M1-13P0を改変することにより産生される。
【０１１６】
トランスドミナントなGagタンパク質は、免疫系を刺激し、かつ感染性ウイルスの生成を抑制するが、感染性ウイルスの生成に寄与しない。
【０１１７】
この方法の追加された安全性により、この方法はヒトへの適用としてより許容できるものになっている。
【０１１８】
VII. 参照文献
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【０１１９】
抑制性/不安定性配列を含むmRNAをコードするいずれの遺伝子も、本発明の例示された方法またはそれらの機能的に等価であるものに従って改変されうることを、当業者は認識している。
【０１２０】
遺伝子工学、ウイルス学、免疫学、医学の分野、および関連分野における当業者にとって明らかである、本発明を行うための上記の様式の改変は、特許請求の範囲内であるものとする。
【０１２１】
本出願を通して上に引用されたあらゆる参照文献は、参照として本明細書により完全に組み入れられている。
【図面の簡単な説明】
【０１２２】
【図１】変異したHIV-1 gag/pol分子クローンのDNA配列(配列番号：1)。gagpolターミネーターは、配列番号：1の4305位〜4307位に位置している。
【図２】野生型およびpCMVgagpolBNkanにおける変異したpol領域の配列の比較。図における位置#1は、プラスミドpCMVgagpolBNkanにおける2641位である。比較は、1872位のgagイニシエーターATGから始まっている。
【図３】変異したSIV gag分子クローンのDNA配列(SIVgagDX)。
【図４】SIVgagDXにおける変異したSIV gag DNA配列の、サル(マカーク)免疫不全ウイルス単離239、クローンλsiv 239-1(GenBankアクセッション番号M33262)由来の野生型SIV配列との比較。
【図５】レンチウイルス系の見本版のいくつかの構成要素の模式図。BGHポリ(A)：ウシ成長ホルモンポリ(A)シグナル；MSD：変異したスプライス供与部位；Ψ：キャプシド形成シグナル；SD、スプライス供与部位；SA、スプライス受容部位；「X」はこの遺伝子の翻訳が起こらないように一部分のgag遺伝子配列のATGコドンが変異していることを示している。
【図６】パッケージング構築物pCMVgagpolBNkanの模式図。
【図７】転移構築物1：pmBCwCNluciの模式図。矢印により示されているように、パッケージングシグナル、CMVプロモーターおよびルシフェラーゼ遺伝子についてのコード領域は、プロモーターおよびポリアデニル化シグナルを供給している5' HIV-1 LTRおよび3' HIV-1 LTRに隣接している。3つの連続する矢印は、それぞれ、LTRのU5領域、R領域、およびU3領域を示す。LTRの転写される部分は黒で示されている。いくつかの制限エンドヌクレアーゼ切断部位もまた示されている。
【図８】転移構築物2：pmBCmCNluciの模式図。記号は上の通りである。
【図９】パッケージング構築物pCMVgagpolBNkanのDNA配列。
【図１０】転移構築物1：pmBCwCNluciのDNA配列。
【図１１】転移構築物2：pmBCmCNluciのDNA配列。
【図１２】野生型HIV-1分子クローンHXB2およびNL4-3、ならびに転移構築物における領域BssHII(711)〜ClaI(830)のヌクレオチド配列。Gagタンパク質についての翻訳イニシエーターシグナル(ATG)は下線が引かれている。pmBCwCNluciおよびpmBCmCNluci(転移構築物1および転移構築物2)は、配列mBCwCNを含む。転移構築物3は、配列m2BCwCNを含む。配列mBCwCNと比較して、m2BCwCNは、5'スプライス部位領域に異なる変異をもち、かつ無傷のGag ATGを有する。
【図１３】pCMVgagpolBNkan(図ではpCMVBNKanと名付けられている)での一過性トランスフェクションにより細胞から放出される、gagタンパク質のレベルを示す棒グラフ。
【図１４】Rev非依存性gag-pol HIV-1ベクターpCMVgagpolBNkan(図ではpCMVBNKanと名付けられている)由来の逆転写酵素活性を示す棒グラフ。
【図１５】pCMVgagpolBNkan Rev非依存性gag-HIV-1基盤レトロウイルスベクターで形質導入された細胞において検出される、p24 Gagタンパク質のナノグラムあたりのルシフェラーゼ量を示す棒グラフ。結果は、pCMVgagpolBNkan Rev非依存性gag-HIV-1基盤レトロウイルスベクターが、(A)293細胞、(B)ヒトリンパ球様細胞、(C)ヒト骨髄細胞(U937)、ならびに（D）初代ヒトマクロファージのような非分裂細胞において、高形質導入効率を見せることを示している。
【図１６】SIVエンベロープをコードするベクターCMVkan/R-R-SIVgp160CTEの模式図。
【図１７】変異型SIV env遺伝子を含むSIVエンベロープをコードするベクターCMVkan/R-R-SIVgp160CTEのDNA配列。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図１−３】
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【図１−４】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図２−３】
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【図２−４】
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【図２−５】
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【図２−６】
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【図３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図４−３】
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【図４−４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図９−３】
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【図９−４】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【図１０−３】
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【図１０−４】
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【図１０−５】
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【図１１−１】
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【図１１−２】
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【図１１−３】
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【図１１−４】
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【図１１−５】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１５Ｃ】
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【図１５Ｄ】
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【図１６】
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【図１７−１】
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【図１７−２】
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【図１７−３】
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【図１７−４】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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2004535190.tif 000179