(57)【要約】正常な生物標本に比べた変化を決定するための、生物標本（１０４’）の解析方法は、生物標本の第１画像を、第１取得様式（ＤＬ）において生成する工程と、生物標本の第２画像を、第２取得様式（ＰＫ）において生成する工程とを含んでいる。第１画像は、第１所定パラメータに基づき分類される（Ｋ１）。第２画像は、第２所定パラメータに基づき分類される（Ｋ２）。第１画像は、第２画像とは独立して分類される。次に、分類結果（Ｅ１、Ｅ２）を基に、生物標本（１０４’）が、正常標本に比べた変化を有するかが決定される。
2004529360.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
正常な生物標本に比べた変化を決定するための生物標本（１０４’）の解析方法であって、
上記生物標本の第１画像を、第１取得様式（ＤＬ）において生成する工程と、
上記生物標本の第２画像を、第２取得様式（ＰＫ）において生成する工程と、
上記第１画像を、第１所定パラメータを基に分類する工程（Ｋ１）と、
上記第２画像を、第２所定パラメータを基に分類する工程（Ｋ２）と、
分類結果（Ｅ１、Ｅ２）に従い、上記生物標本（１０４’）が、上記第２画像と独立して分類されるかを決定する工程（１２２）とを含み、
上記第１取得様式と上記第２取得様式とは、透過光取得様式、蛍光取得様式、および位相コントラスト取得様式を含む取得様式群から選択され、かつ、上記第１取得様式と上記第２取得様式とは、異なる取得様式であり、
上記第１画像は、上記第２画像とは独立して分類される、解析方法。
【請求項２】
上記生物標本（１０４’）の第３画像を、第３取得様式（ＦＬ）において生成する工程と、
上記第３画像を、第３所定パラメータに基づいて分類する工程（Ｋ３）とをさらに含み、
上記第３画像は、上記第１画像および上記第２画像とは独立して分類される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
上記生物標本の変化が、良性か悪性かを決定するために、上記生物標本（１０４’）の変化を決定する際に、
上記生物標本（１０４’）の少なくとも１つの部分（１２８、１３０、１３２）を設定する工程（１２６）と、
上記生物標本の部分の第１サブ画像（ＤＬ）を、第４取得様式において生成する工程と、
上記生物標本の部分の第２サブ画像（ＰＫ）を、第５取得様式において生成する工程と、
上記第１サブ画像を、第４所定パラメータを基にして分類する工程（Ｋ）と、
上記第２サブ画像を、第５所定パラメータを基にして分類する工程（Ｋ）と、
分類結果（Ｅ）に応じて、上記生物標本の変化が良性または悪性かを決定する工程とをさらに含み、
上記部分は、実質的に、１つの要素、または、実質的に個別の要素群を備えており、
上記第１サブ画像は、上記第２サブ画像とは独立して分類される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
上記生物標本の部分の第３サブ画像（ＦＬ）を、第６取得様式において生成する工程と、
上記第３サブ画像を、第６所定パラメータを基にして分類する工程とをさらに含み、
上記第３サブ画像は、上記第１サブ画像および上記第２サブ画像とは独立して分類される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
上記生物標本は、複数の細胞を含み、
上記第１サブ画像、上記第２サブ画像、および上記第３サブ画像は、実質的に、１つの細胞または実質的に個別の細胞群を含む、請求項３または４に記載の方法。
【請求項６】
上記第１取得様式、上記第２取得様式、上記第３取得様式、上記第４取得様式、上記第５取得様式、および上記第６取得様式は、透過光、位相コントラスト、蛍光を含む群から選択され、
上記第１所定パラメータ、上記第２所定パラメータ、上記第３所定パラメータ、上記第４所定パラメータ、上記第５所定パラメータ、および上記第６所定パラメータは、細胞寸法、形状、構造、色、基調、統計的特性、形態データ、および細胞の酸化的損傷データを含む群から選択される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
上記第１取得様式および上記第４取得様式は、上記透過光取得様式であり、
上記第２取得様式および上記第５取得様式は、上記位相コントラスト取得様式であり、
上記第３取得様式および上記第６取得様式は、上記蛍光取得様式であり、
上記取得様式のそれぞれでは、パラメータセットのそれぞれが、互いに独立に、分類のための所定パラメータ群から決定される、請求項６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（説明）
本発明は、生物標本の解析方法に関し、特に、癌を初期段階で検出して予防する際の、良性または悪性腫瘍変化を認識する組織標本の解析方法に関するものである。
【０００２】
毎年、世界中で６６０万人が癌で死亡する。産業化された諸国では、癌による死は、死の原因のうち二番目に多いものである。財政的かつ科学的に多大に尽力しているにも関わらず、今日に至っても、腫瘍病の治療を成功させる、決定的な進展を達成できていない。今日の観点から言えば、癌の発生とその死亡率を顕著に減少させることは、初期段階における癌を検出し、予測し、予防する点において、革新的な解決方法を得ることによってのみ可能である。
【０００３】
癌を初期段階で検知して予防する効果的な手法は、定期的なスクリーニング検査である。癌のスクリーニングにより、腫瘍細胞の存在（これはまだ良性腫瘍組織変化（いわゆる形成異常）であるが）を確かめられる。いくつかの場合、これらはさらに成長して悪性腫瘍となるが、ほとんどは再び元に戻るか、あるいは変化しないまま保たれる。現在適用可能な診断方法では、進行評価を安全に行うのは不可能である。
【０００４】
癌のスクリーニング検査の多くは、顕微鏡下における、組織標本の細胞学的解析および組織学的解析に基づいている。顕微鏡画像の解釈は、当業技術における最大限の能力と、数多くの機械的操作を必要とする。デジタル画像処理法およびパターン認識法は、時に、高度に複雑で時にまばらでもある適用画像の結果の分類において、優れた利点を提供する。なぜなら、それらは中立であり、観察者の主観的な感性に依存しないからである。しかしながら、現在のところ、グレイスケール画像を基にした自動細胞解析では、分類上要求される安全度が達成されていない。特に、気管支分泌標本の評価や、婦人学的な塗沫標本（頚部の塗布）による頚椎腫瘍のスクリーニング検査では、開発された自動化方法は、しかしながら、既存の腫瘍細胞を、極めて限定された感度または特異性において認識できるのみである。
【０００５】
パパニコロー塗抹（ＰＡＰ検査；塗抹標本における前癌細胞および悪性細胞を特定する細胞学的染色法）後の方法により、西洋諸国および日本において、頚部腫瘍の発生を約７０％減少することが可能になった。しかし、この検査は、不明瞭な結果を得る確率が５〜１０％あり、誤って非腫瘍とする結果が５〜５０％あるという、顕著な欠点を有する。それゆえ、ここ数年、ＰＡＰ試験に代わる、新しい方法がいくつか開発されてきた。
【０００６】
１つの方法は、薄層細胞の自動化調製技術を使用する。この技術では、少量の非常に目立つ細胞材料のみが存在することにより、形成異常細胞が顕著に、より良く同定される。この方法は、従来のＰＡＰ検査を置き換えるものとして、１９９６年にアメリカのＦＤＡ（食品医薬品局）により認可された。臨床試験の結果から、形成異常の発見を６５％改善すると言われている。
【０００７】
さらには、今日、大規模な細胞学的研究所において主に行われる、コンピュータ補助による画像解析法が知られている。標本を人間が顕微鏡下で診断するＰＡＰ検査に比べて、この方法では、細胞標本を客観的に診断できる。アメリカにおける臨床研究によれば、これらの自動化手法では、誤って非腫瘍とする結果を減少できる。上述した検査は、１９９８年以来、頚部癌の日常的な診断手法として、アメリカで認可されている。
【０００８】
上述したＰＡＰ検査の発達は、従来方法の質的な不利点を、少なくとも部分的に解消することに適している。しかし、それらは、ＰＡＰ検査それ自体と同様に、形成異常の進行を確実には診断できない。標本調製を改善したり、自動化解析したりしたとしても、明確に診断し、形成異常を確認するために、検査を追加して繰り返すことが必要である。上述した従来の画像解析法は、高度に複雑でまばらでもある画像結果の分類において、人間による細胞解析に比べて、２つの顕著な有利点を提供する。しかし、これらの技術では、分類上の必要な安全度を達成できない。これらの方法では、存在する腫瘍細胞および形成異常を、極めて限られた感度および特異性（７０％以下）で認識できるのみである。
【０００９】
１９９６年、頚部癌を予防するためのヒト乳頭腫ウイルスを確かめる、ＤＮＡ検査が導入された。一連の検査では、ヒト乳頭腫ウイルス（ＨＰＶ）感染と、頚部障害および癌の発達との間に密接な連関が示された。ＨＰＶは、すべての侵襲的頚部癌では約９９％、高度初期段階では９０％が存在することが示された。ＨＰＶの典型化は、小さく中位の形成異常を有する女性における追加の診断試験として、西洋諸国で認識された。頚部癌のＨＰＶ検査の問題は、誤って非腫瘍とする結果を、高確率で生じる点にある。全女性の８０％は、その生涯においてＨＰＶに感染するが、形成異常を示すのは２〜４％程度であり、これらの女性のうち、頚部癌の病気になるのは、ほんの１〜２％である。
【００１０】
さらに、嚢癌を認識する手法が、先行技術で知られている。これは、ＮＭＰ技術（核マトリックスタンパク質技術）を基礎としている。ＮＭＰは、被覆組織の核に存在し、嚢癌患者では顕著に減少している。このことは、特異的な抗体によって、尿中で確かめられる。臨床研究結果によると、ＮＭＰ技術は、従来のＰＡＰ検査に比べて、頚部形成異常および腫瘍を、顕著に高い感度で検知できる。
【００１１】
頚部癌予防の他の方法は、形成異常細胞および腫瘍細胞で過剰に発現される、特異的なタンパク質マーカーの同定である。この方法に関する臨床研究結果は知られていない。ＰＡＰ検査の発達と同様に、ＨＰＶの典型化およびタンパク質マーカーも、顕著に、頚部スクリーニング細胞学の質的向上に貢献するかもしれない。これらのインビトロ診断方法では、腫瘍において細胞の成長が進行したか、客観的にはわからない。それゆえ、検査を追加して繰り返すことや、持続し進行する病変において安全策のために行う手術を、避けることが出来ない。
【００１２】
ＥＰ０６４７８４４Ａには、相互的自動化細胞学のための方法が記述されている。この方法では、自動化システムおよびオペレーターが、平行して診断を行い、システム診断とオペレーター診断とは、最終段階で比較される。この方法は、オペレーターも診断を行う必要があるため不利である。米国特許５，７５５７，９５４および５，９７８，４９７には、生物標本を示す画像を自動的に区分する方法が、より詳しく記載されている。この方法では、それぞれの対象は、所定の特性を基に分類される。
【００１３】
ＤＥ１９７４７４１５Ａ１には、標本由来の診断上重要な材料を決定し、標本を通じた「経路」を決定することによる、生物標本の細胞学者による単純化解析方法が記載されている。これにより、関連する標本を、観察者は一瞥するだけでよい。
【００１４】
上述の出版物に加えて、細胞検査に関するデジタル画像処理システムもまた、従来技術、例えば、ＤＥ１９８３４７１８Ａ１、ＤＥ１９６１２４６５Ａ１、およびＤＥ１９５３８００４Ａ１に知られている。これらの特許は、一般的な画像検知および分類システムに言及しているが、あり得る良性または悪性変化に対する、生物標本検査の十分な分類安全度を保証しない。
【００１５】
上述の先行技術から開始して、本発明の目的は、安全にかつ素早く、正常標本に比べた良性または悪性変化を認識する、生物標本の安全な解析のための改善された自動化方法を提供することにある。
【００１６】
この目的は、請求項１に係る方法で解決される。
【００１７】
本発明は、正常な生物標本に比べた変化を決定する、生物標本の解析方法を提供する。この方法は、生物標本の第１画像を、第１取得様式において生成する工程と、生物標本の第２画像を、第２取得様式において生成する工程と、第１所定パラメータを使用して、第２画像とは独立して第１画像を分類する工程と、分類結果に基づいて、生物標本が、正常な生物標本に比べて変化を有するかを決定する工程とを含んでいる。本発明の好ましい実施形態では、細胞数測定方法が提供される。この方法により、明白に腫瘍細胞を同定し、腫瘍細胞における形成異常進行の徴候を示すことができる。
【００１８】
ここで、本発明は、まず、形態計測（測定により検知される）細胞画像情報が、腫瘍細胞、および腫瘍細胞に変化しつつある前癌性細胞で顕著に増加する、酸化的ＤＮＡ損傷の度合いに関する情報と併用されるという、進歩的な発想に基づいている。形態画像情報は、透過光顕微鏡手段によって取得される。個々の細胞におけるＤＮＡ損傷の度合いは、所定のＤＮＡ損傷に特異的に結合する抗体（８−オクソグアニン）の蛍光信号の測定によって、蛍光顕微鏡で決定される。
【００１９】
本発明の利点は、既存方法に比べて顕著に増加した画像情報が、新規の知識ベースの訓練可能な画像評価手法と併用される点であり、それゆえ、分類安全度および適用感度に関して、或る程度までは同等でない進行技術が開発される点である。
【００２０】
好ましい実施形態によると、本発明の方法は、塗沫標本（頚部塗沫）の解析に適用される。この標本の解析の進行につれて、これらの標本の最適化された表現（Aufbereitung）処理が行われる。この処理では、粘液が除去されて、搬送体またはスライド上に細胞が賽の目形状に置かれ、抗体を使用した高度に正確で反復可能な調整および処置が行われる。続いて、この実施形態では、高品質顕微鏡透過光写真、色コントラスト写真、および蛍光写真の捕獲が起こる。これらは、形成異常または疑腫瘍細胞を自動的に認識し、コンピュータ補助の画像評価システムによる顕微鏡画像写真において、それらを予測する。
【００２１】
この手続の利点は、スライド上の画像情報が、系統的に、デジタルに検知されて保管されるだけでなく、資格を有する医療スタッフによる主観的な熟達と見なす結果が、客観的なコンピュータ補助部材によって置き換えられる点にある。
【００２２】
本発明は、塗沫標本の検査に限定されるだけでなく、嚢癌、乳癌、肺癌、甲状腺癌などの他種の癌、悪性排泄物やその類似物の初期検出にも適用できる。
【００２３】
本発明のこれらの目的、他の目的、および特性は、添付図面に基づいた以下の記述により明白になるだろう。図１は、本発明に係る方法の第１実施例の概略的な図である。図２ＡおよびＢは、図１に基づいて記載された実施形態の、各工程のさらに詳細な図である。
【００２４】
本発明の好ましい実施形態を詳しく説明する前に、本発明の一般的事項を以下に再度説明する。
【００２５】
腫瘍細胞を認識する１つの可能性は、酸化的ＤＮＡ損傷を検知することにある。腫瘍細胞は、それに対応する正常な細胞に比べて、常時、より高い酸化的ＤＮＡ損傷を有している。このことは、胃腸管、肺、前立腺、脳、卵巣、乳房等の腫瘍、および正常な組織における、突然変異誘発性塩基損傷８−オクソグアニンおよび他の酸化的ＤＮＡ変化に関するOlinski et al. (1992) FEBS Lett. 309, 193-198；Jaruga et al. (1994) FEBS Lett. 341, 59-64；Musarrat et al. (1996) Eur. J. Cancer 32A, 1209-1214；Malins et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 2557-2563；Matsui et al. (2000) Caner Lett. 151, 87-95などの、一連の出版物において見られる。白血病細胞においても、増加した８−オクソグアニンが観察される（Senturker et al. (1997) FEBS Lett., 416, 286-290を参照）。この損傷が続くと、所定の突然変異パターンが、標的組織（例えば、腫瘍組織）の細胞性ＤＮＡに現れる。これらは、酸化的ＤＮＡ損傷の典型であり、例えば、Moriva (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 1122-1126；Reid et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 3904-3907；Du et al, (1994) Mol. Carcinog., 11, 170-175：Turker et at., (1999) Cancer Res., 59, 1837-1839に記載されている。
【００２６】
さらなる試験により、増加した８−オクソグアニンが、腫瘍のみならず、前癌性細胞においても観察されることが明らかになった（Musarrat et al. (1996) Eur. J. Cancer 32A, 1209-1214；Olinski et al. (1995) Free Radic. Boil. Med., 18, 807-813）。それゆえ、酸化的ＤＮＡ損傷は、すでに初期腫瘍段階で発生し、このことがガン細胞の成長を引き起こすらしい。動物を使用した実験により、この仮説が確かめられている。そのため、増加した８−オクソグアニンの形成および維持と、腫瘍の発達とには、Driscoll et al. (1995) Exp. Lung Res., 21, 941-956；Nehls et al. (1998) Environ. Health Perspect., 105 Suppl. 5, 1291-1296に示すように、若干関連がある。この観察に加えて、この試験は、以下に示す三つのさらなる重要な情報を提供する。
（ａ）腫瘍発達に先立つ、酸化的ＤＮＡ損傷の発生。
（ｂ）ＤＮＡの酸化的損傷は、癌が発達するまでの長期間、持続する必要がある。初期悪性段階（ＴＩＮ  ＩＩＩ）からの形成異常腫瘍の成長では、女性では平均１６歳が決定されている（Forsmo et at. (1997) Int J. Cancer, 71, 4-8）。
（ｃ）酸化的損傷は、分裂可能な細胞のＤＮＡで起こる必要がある。これらの細胞においてのみ、損傷は、ＤＮＡ複製の間に突然変異として娘細胞に伝わる。
【００２７】
それゆえ、酸化的ＤＮＡ損傷の度合いは、既存の腫瘍細胞の同定に、または形成異常が腫瘍に成長するかの予知に使用されるかもしれない。
【００２８】
さらに、本発明の方法には、標本の表現（Probenaufbereitung）が必要である。実施形態によると、これには免疫細胞化学的方法を使用する。免疫細胞化学的方法は、これまで、次の２つの理由によって、限られた診断方式においてのみ使用された。パラフィン埋め込み組織における免疫組織化学的試験に比べて、標準化された方法で免疫細胞化学を行うことは難しく、免疫染色された細胞標本の質は、著しく変化する。加えて、免疫組織化学的染色のためのさまざまな培養工程の後、細胞の形態は著しく妨げられる（beeintraechtigt）。本発明によれば、免疫細胞化学的染色の質が保証され、その再現は標準化されるため、取り扱う細胞の形態が良好な状態に保たれ、画像評価は信頼できる状態にあるような方法が適用される。免疫細胞化学と併用した変形型パパニコローまたはパッペンヘイム染色と同様に、取り出し直後の出来るだけ早い、標本の表現または細胞標本の最適化された固定によって、より良好でさらに標準化された結果を取得できる。これにより、最適化された標本の表現および細胞の染色を行えるため、従来の透過光顕微鏡的評価、および自動的評価の両者を、より信頼して実行できる。
【００２９】
図１には、本発明に係る方法の第１実施形態が模式的に表現されている。左列のブロックに、個々の処理工程が示されている。左列に平行して、個々の工程が行われる、対応する項目または要素が、右列に示されている。
【００３０】
図示された実施形態によると、本発明に係る方法は、通常、最初のサブ工程Ｉと、二番目のサブ工程ＩＩとに分けられる。
【００３１】
サブ工程Ｉでは、最初に、標本アレイ１０２が工程１００で読み込まれる。標本アレイ１０２は、複数の単一標本１０４を備えている。工程１００に応じたアレイ１０２から、生物標本１０４’が選択される。個々の標本１０４’が選択された後、標本１０４’に対応した単一画像の解析が工程１０８で行われる。このことをさらに以下で説明する。
【００３２】
標本画像の解析結果から始めて、生物標本１０４’に腫瘍の疑いがあるか無いかが決定される。腫瘍の疑いがある場合、本方法は、図１に示す実施形態に係る、二番目のサブ工程ＩＩに進む。この工程では、まず、単一画像が工程１１０で区分化され、図１において１１２で例示するように（２つの個別細胞１１４と１１６に関するサブ画像を示す）、個々の細胞に関するサブ画像が形成される。矢印１１８で示すように、細胞（この例では細胞１１４）が選択され、この疑わしい細胞１１４の解析が、工程１２０で行われる。解析結果に従って、腫瘍の疑いがある細胞が、既存の腫瘍細胞、または良性あるいは悪性の形成異常であるかについて、言及されてもよい。
【００３３】
本発明に係る方法によると、生物標本の検知された画像を分類するため、数学的特性演算子（mathematische Merkmalsoperatoren）が、あらかじめ分類された参照データセットから反復して決定される。それぞれの支配的特性型を有する標本の分離は、演算子の付随セットの決定を可能にする。互いに直交する演算子が、興味ある特性型に明白に関連する場合、画像データセット内のそれらの区別が実現される。
【００３４】
これまでのところ知られている自動的細胞学手法および細胞数測定手法では、構造および形状の抽出に使用される演算子は、試みおよび過ち原則において決定されてきた。この手法は、極めて複雑で特異的なパターンが、変動する内容内で認識されねばならないという、最大の制限を有する。これとともに、認識標的との関連を決定するための参照無作為標本における演算子の多様性を試みることは、検索空間の寸法が巨大であるため、数年の計算を要することに繋がるという問題がある。細胞解析では、パターン認識作業は極めて複雑であり、その形式が非常に変異する。そのため、新たなアプローチが必要であり、それは、本発明により教授される。既存の演算子ライブラリからの、制限がある利用可能な計算力および実行可能な計算時間の境界状態下では、最適な分類結果に貢献する演算子が選択される。
【００３５】
図１を基にした実施形態によると、その選択は、サブ工程Ｉおよびサブ工程ＩＩで行われる。
【００３６】
サブ工程Ｉでは、演算子の選択が、全体的に、画像１０４’の段階で適用される。そのような画像１０４’により、細胞学者が、おそらく異なる倍率で、顕微鏡の目に関する部品（Okular）を通じて、全体として見る構成一式が理解される。正常な細胞標本から、倍率係数に依存して、そのような画像が１２〜５００個、保存される。透過光、位相コントラスト、蛍光、異なる細胞型（頚部、嚢、肺など）などの異なる様式の単一画像において、自動的なパラメータ選択が、互いに関係なく実行される。十分に安全にあらかじめ分類された画像無作為標本では、よい選択結果が得られる。
【００３７】
疑わしい細胞が存在するサブ工程ＩＩでは、対象の区分化および単一細胞レベルでのサブ解析が、最大解像度で引き続き起こる。ここで、細胞寸法、形状、構造特性が検知され、また、基調パラメータ選択の働きかけが行われる。さらに、形態的パラメータが決定される。
【００３８】
本発明によると、顕微鏡的組織的結果の検査および評価における、細胞学者および細胞学補助者の長期間にわたる経験は、細胞の分類に使用される細胞画像および細胞パラメータを選択する際の、自動的パラメータ選択のより客観的なアプローチと関連する。理想的なパラメータを選択するための複雑で最適な探索を行う場合には、計算に数年の時間を必要とするため、既存の専門的知識は、統語論的および意味論的に、重み付け機能に関連する自動的選択に統合される。
【００３９】
ここで、以下の進展が実現される。パラメータ選択は、あらかじめ分類された巨大な無作為標本を基礎とした、いくつかの学習段階において実行される。最適化のための変形物は、新たに訓練され、構成ファイルに格納される。様々な構成データセットの確立により、異なる細胞学的パラメータ（頚部、嚢、肺等）は、分類システムで検査され、必要なアルゴリズムが適用されうる。これにより、そのような分類システムは、もはや、１つの適用に限定されず、多数の細胞学的および組織学的検査作業の取り扱いを可能とする。
【００４０】
図２では、図１を基にして記述された本発明の実施形態が、さらに詳しく記述されている。単一標本１０４’を複数有する標本アレイ１０２から、単一標本１０４’が解析に選択される。
【００４１】
この単一標本１０４’に関して、ブロックＤＬ、ＰＫ、ＦＬで示される３つのサブ画像が生成される。第１サブ画像は、第１取得様式手段によって生成される。この様式は、顕微鏡透過光取得様式（ＤＬ）である。第２サブ画像は、位相コントラスト取得様式（ＰＫ）で得られる。第３サブ画像は、蛍光取得様式（ＦＬ）で得られる。得られたサブ画像ＤＬ、ＰＫ、およびＦＬのそれぞれは、選択されたパラメータセットによって、互いに別々に分類される。このことは、ブロックＫ１、Ｋ２およびＫ３で示されている。個別のサブ画像の分類から、対応する分類結果が、それぞれのサブ画像の結果となる。このことは、ブロックＥ１、Ｅ２、およびＥ３で示されている。工程１１２では、標本１０４’において正常標本に比べた変化があるか、結果Ｅ１、Ｅ２、およびＥ３を基にして決定される。これが否定的結果であれば、本方法は工程１２４で停止する。標本の変化が、例えば腫瘍の疑いがあるものであれば、本方法は図２Ｂにおける工程１２６に進む。工程１２６では、上述した標本１０４’の区分化が起こり、標本は、実質的に１つの細胞または個別の細胞群を有する個別の標本領域に分けられる。このことは、図２Ｂにおける１２８，１３０，１３２で、模式的に示されている。
【００４２】
１２８〜１３２部のそれぞれ、または個別細胞群のそれぞれのサブ画像では、続いて、上述した三つの、透過光、位相コントラスト、および蛍光（ＤＬ、ＰＫ、ＦＬ）取得様式におけるサブ画像が生成される。このことは、図２Ｂで対応するブロックに示されている。図２のブロックＫに示されているように、次に、個々のサブ画像の分類が行われる。上述したように、対応する分類結果を得るため（ブロックＥを参照）、ここで個々のサブ画像の分類もまた、互いに独立して異なる取得様式で行われる。
【００４３】
サブ画像の個別部の分類結果を基にして、細胞または細胞群１３４、１３６、１３８の対応する診断が保管され、工程１４０において、生物標本全体の診断に使用される。
【００４４】
図２を基にして記述された、さらに詳しい実施形態は、図２Ａに示されるように、まず画像レベルの前分類を含む。標本１０４のそれぞれのため、検査では、透過光、位相コントラスト、および蛍光（ＤＬ、ＰＫ、ＦＬ）取得様式の手段によって取得される、３つの単一画像が生成される。最初の３つの画像は、画像レベルにおいて、すなわち、それぞれを全体として、互いに別れて分類される。ここで、拡張型の修正された自動基調解析方法が使用される。この方法の付加部分は、補足が基調方法によって統合され、特に細胞標本に必要である、といったものである。さらに、本熟達知識が統合される。本発明によると、これらの分類作業に必要かつ十分なパラメータの自動的な選択は、保存された約６００〜１，０００個の基調パラメータ（色、統計、基調、形状パラメータ）から行われる。必要なパラメータは、賢明な選択によって、代表的な画像無作為標本から決定される。他のパラメータのうち、選択されたパラメータの分離の質、意味、そして鮮明さは、分類において重要である。それぞれの取得様式（ＤＬ、ＰＫ、ＦＬ）では、自身のパラメータセットは、それぞれ、分類のために互いに独立して決定される。
【００４５】
続いて、工程１２２では、いくつかの取得様式からの前分類結果が、相互に関係する。３つの取得様式の独立した分類結果であるＫ１、Ｋ２、およびＫ３は、互いに関連し、生物標本１０４’が正常か、あるいは腫瘍の疑いがあるかを決定する。決定境界の関連して適合した選択によって、約７５％の標本は、この種の前分類による高度の安全度のもと、腫瘍の疑いが無いことになる。腫瘍の疑いがあるとされた全ての標本は、図２Ｂに示す次に続く工程において、細胞段階におけるさらなる分類段階へと進む。
【００４６】
図２Ｂにおいて、工程１２６では、まず、細胞の区分化が行われる。腫瘍の疑いがある全ての画像標本を、より詳しく検査して精密な分類に供するために、まず、それぞれの細胞はこれらの画像標本から区分される。細胞の区分化は、再び、３つの画像抽出ＤＬ、ＰＫ、およびＦＬの全てにおいて、互いに別々に行われる。この区分化の結果により、最小構成要素として、画像領域（理想的には個々の細胞それぞれ）が形成される。標本の前段階における適当な調製によって、ほんの少数の細胞集合体、すなわち細胞の重なりが見られることが保証される。
【００４７】
続いて、区分化された細胞が分類される。まず、個々の細胞のそれぞれは、上述した、ここでも使用される自動的知識ベースのパラメータ選択方法によって、別々に分類される。細胞段階では、色のみならず、基調、および統計的パラメータも使用される。しかし、さらに、区分化された細胞の形状パラメータも考慮される。ここで、保管された６００〜１，０００個の記述可能な細胞パラメータからの賢明な選択手段によって、それらもまた選択される。異なる取得様式で現れる細胞型も、高い安全度で互いに区別されうる。
【００４８】
続いて、分類結果と決定とが融合される。細胞段階の分類は、最初に、画像様式のそれぞれに対して別々に行われる。次に、異なる診断に到達するために、３つの視点で区分化された細胞が互いに登録される必要があり、かつ、分類結果は処理される必要がある。
【００４９】
上述した実施形態では、異なる取得様式におけるサブ画像は、第１の主要工程において単純な区分化によって事前に生成されたサブ画像、または標本の対応する区分化を原因として、区分化された細胞のために得られてもよい。そして、第２の部分において、画像の更新された生成が行われる。
【００５０】
さらに、本発明の方法が好ましい実施形態に限定されるものではないことは、理解されるべきである。本発明に係る方法は、むしろ、正常組織に比べて変化しているかを決定するための生物標本の解析を容易にする。標本の分類から始めて、結局、これが望ましいのであれば、さまざまなさらなる解析が可能である。いくつかの適用では、標本における変化が、正常組織または正常標本に比べて起こることを決定することは、十分であるかもしれない。
【００５１】
再び、他の適用、例えば半自動的解析方法では、さらなる探究のための、対応する疑わしい変化を材料において有するこれらの単一標本のみ有する全体の標本から、細胞学者が供給される。細胞学者は次に、最終診断を行う。
【００５２】
第３の可能性は完全な自動化であり、図面に基づいて上述されている。
【図面の簡単な説明】
【００５３】
【図１】本発明に係る方法の第１実施例の概略的な図である。
【図２Ａ】図１に基づいて記載された実施形態の、各工程のさらに詳細な図である。
【図２Ｂ】図１に基づいて記載された実施形態の、各工程のさらに詳細な図である。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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