(57)【要約】本発明は、ＣＤ１５４可動性を調節することができ且つ血栓症過程を安定化させて炎症応答に関与する細胞の活性化を減じるのに有用な化合物に関係する。本発明は又、かかる化合物を同定するために有用な方法にも関係する。本発明は又、輸血のための血小板の、炎症を治療し又は予防するためのメタロプロテイナーゼインヒビターでの処理にも関係する。本発明は又、かかる生物学的過程に関係する傷害及び疾患を治療するための組成物及び方法をも包含する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者における血栓症を治療する方法であって、可溶性ＣＤ１５４(ｓＣＤ１５４)の血小板からの放出を阻止するのに有効な量でのＣＤ１５４インヒビターの投与を含む当該方法。
【請求項２】
可溶性ＣＤ１５４の血小板からの放出が、少なくとも９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％及び１０％よりなる群から選択する％量により阻止される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記のＣＤ１５４インヒビターが、メタロプロテイナーゼインヒビターである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
メタロプロテイナーゼインヒビターを、HONHCOCH2CH(CH2CH(CH3)2-CO-NaI-Ala-NHCH2CH2NH2(ＴＡＰＩ−１)、メタロプロテイナーゼ２の組織インヒビター(ＴＩＭＰ−２)、ドキシサイクリン、ガラルディン、及びＳＢ−３ＣＴ(ＭＭＰ２／ＭＭＰ９インヒビターＶＩ)よりなる群から選択する、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
患者を、更に、血小板凝集をブロックし又は血栓溶解を増進させる少なくとも一種類の更なる薬剤で治療する、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記の血小板凝集をブロックする少なくとも一種類の更なる薬剤が、血小板糖タンパク質ＧＰ IIb-IIIaアンタゴニストである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記のＧＰ IIb-IIIaアンタゴニストが、エプチフィバチドである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
患者における炎症性疾患の予防又は治療のための方法であって、ＣＤ１５４インヒビターを可溶性ＣＤ１５４の血小板からの放出を阻害するのに有効な量で投与することを含む当該方法。
【請求項９】
患者が、血小板輸血のレシピエントである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記のレシピエントに、ＣＤ１５４インヒビターで処理された血小板を、可溶性ＣＤ１５４の血小板からの放出を阻止するのに有効な量で投与し、それにより、前記の血小板輸血に関連した炎症を治療し又は予防することを更に含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
輸血後に血小板を、可溶性ＣＤ１５４の血小板からの放出を阻止するのに有効な量で、ＣＤ１５４で処理することにより血小板の生存力を増進させることを更に含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
血小板を、前記のＣＤ１５４インヒビターで、イン・ビボ又はエキソ・ビボ処理した後に前記のレシピエントに投与する、請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
血小板を、前記のレシピエントへの投与の後に、前記のＣＤ１５４インヒビターで、イン・ビボ処理する、請求項９に記載の方法。
【請求項１４】
可溶性ＣＤ１５４の血小板からの放出を、少なくとも９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％及び１０％よりなる群から選択する％量により阻止する、請求項８に記載の方法。
【請求項１５】
前記のＣＤ１５４インヒビターが、メタロプロテイナーゼインヒビターである、請求項９に記載の方法。
【請求項１６】
前記のメタロプロテイナーゼインヒビターを、HONHCOCH2CH(CH2CH(CH3)2-CO-NaI-Ala-NHCH2CH2NH2(ＴＡＰＩ−１)、メタロプロテイナーゼ２の組織インヒビター(ＴＩＭＰ−２)、ドキシサイクリン、ガラルディン、及びＳＢ−３ＣＴ(ＭＭＰ２／ＭＭＰ９インヒビターＶＩ)よりなる群から選択する、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
患者を、更に、血小板凝集をブロックし又は血栓溶解を増進させる少なくとも一種類の更なる薬剤で治療する、請求項８に記載の方法。
【請求項１８】
前記の血小板凝集をブロックする少なくとも一種類の更なる薬剤が、血小板糖タンパク質ＧＰ IIb-IIIaアンタゴニストである、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記のＧＰ IIb-IIIaアンタゴニストが、エプチフィバチドである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
メタロプロテイナーゼインヒビターの有効な投与量の迅速な開始を含む治療プロフィル投与及び着実な放出を可能にする放出用配合物及びこれらの任意の組合せとして、ＣＤ１５４インヒビターを前記のレシピエントに、血小板輸血の前、血小板輸血と同時、血小板輸血の後よりなる群から選択する仕方で投与する、請求項９に記載の方法。
【請求項２１】
メタロプロテイナーゼインヒビター投与の治療プロフィルが、有効投与量の迅速な開始を着実な放出を可能にする放出用配合物と共に含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
メタロプロテイナーゼインヒビターの有効な投与量の迅速な開始を含む治療プロフィル投与及び着実な放出を可能にする放出用配合物及びこれらの任意の組合せとして、メタロプロテイナーゼインヒビターを、前記の患者に、血小板輸血の前、血小板輸血と同時、血小板輸血の後よりなる群から選択する仕方で投与する、請求項１３に記載の方法。
【請求項２３】
メタロプロテイナーゼインヒビター投与の治療プロフィルが、有効な投与量の迅速な開始を、着実な放出を可能にする放出用配合物と組み合わせて含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
メタロプロテイナーゼインヒビターがHONHCOCH2CH(CH2CH(CH3)2-CO-NaI-Ala-NHCH2CH2NH2(ＴＡＰＩ−１)又はメタロプロテイナーゼ２の組織インヒビター(ＴＩＭＰ−２)である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
可溶性ＣＤ１５４の血小板試料からの放出を阻止する方法であって、血小板を容器内で有効量のＣＤ１５４インヒビターとインキュベートすることを含む当該方法。
【請求項２６】
前記のＣＤ１５４インヒビターが、メタロプロテイナーゼインヒビターである、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
メタロプロテイナーゼインヒビターを、HONHCOCH2CH(CH2CH(CH3)2-CO-NaI-Ala-NHCH2CH2NH2(ＴＡＰＩ−１)、メタロプロテイナーゼ２の組織インヒビター、ドキシサイクリン、ガラルディン、及びＳＢ−３ＣＴ(ＭＭＰ２／ＭＭＰ９インヒビターＶＩ)よりなる群から選択する、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
ＣＤ１５４インヒビターを、容器に加えてから、血小板を加える、請求項２５に記載の方法。
【請求項２９】
血小板を容器に加えてから、ＣＤ１５４インヒビターを加える、請求項２５に記載の方法。
【請求項３０】
血小板を容器内で有効量のＣＤ１５４インヒビターとインキュベートするのが、該血小板の貯蔵中である、請求項２５に記載の方法。
【請求項３１】
血小板を、貯蔵後、血小板輸血のレシピエントへの投与前に、有効量のＣＤ１５４インヒビターで処理する、請求項２５に記載の方法。
【請求項３２】
血小板試料を、更に、血小板凝集をブロックし又は血栓溶解を増進させる少なくとも一種類の更なる薬剤で処理する、請求項２５に記載の方法。
【請求項３３】
前記の血小板凝集をブロックする少なくとも一種類の更なる薬剤が、血小板糖タンパク質ＧＰ IIb-IIIaアンタゴニストである、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記のＧＰ IIb-IIIaアンタゴニストが、エプチフィバチドである、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
ＣＤ１５４インヒビターを含む容器。
【請求項３６】
血液採集バッグである、請求項３５に記載の容器。
【請求項３７】
血小板貯蔵用容器である、請求項３５に記載の容器。
【請求項３８】
前記のＣＤ１５４インヒビターが、メタロプロテイナーゼインヒビターである、請求項３５に記載の容器。
【請求項３９】
血液採集バッグである、請求項３５に記載の容器。
【請求項４０】
血小板貯蔵用容器である、請求項３５に記載の容器。
【請求項４１】
前記のメタロプロテイナーゼインヒビターを、HONHCOCH2CH(CH2CH(CH3)2-CO-NaI-Ala-NHCH2CH2NH2(ＴＡＰＩ−１)、メタロプロテイナーゼ２の組織インヒビター、ドキシサイクリン、ガラルディン、及びＳＢ−３ＣＴ(ＭＭＰ２／ＭＭＰ９インヒビターＶＩ)よりなる群から選択する、請求項３８に記載の容器。
【請求項４２】
容器が、更に、血小板凝集をブロックし又は血栓溶解を増進させる少なくとも一種類の薬剤を含む、請求項３５に記載の容器。
【請求項４３】
前記の血小板凝集をブロックする少なくとも一種類の更なる薬剤が、血小板糖タンパク質ＧＰ IIb-IIIaアンタゴニストである、請求項４２に記載の容器。
【請求項４４】
前記のＧＰ IIb-IIIaアンタゴニストが、エプチフィバチドである、請求項４３に記載の容器。
【請求項４５】
血小板凝集をブロックし又は血栓溶解を増進させる少なくとも一種類の薬剤を含む容器。
【請求項４６】
血液採集バッグである、請求項４５に記載の容器。
【請求項４７】
血小板貯蔵用容器である、請求項４５に記載の容器。
【請求項４８】
前記の血小板凝集をブロックする少なくとも一種類の薬剤が、血小板糖タンパク質ＧＰ IIb-IIIaアンタゴニストである、請求項４５に記載の容器。
【請求項４９】
前記のＧＰ IIb-IIIaアンタゴニストが、エプチフィバチドである、請求項４８に記載の容器。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＣＤ１５４の可動化を特異的に調節することができ且つ、血栓過程の安定化及び炎症応答に関与する細胞の活性化の減少に有用である化合物に関係する。本発明は又、ＣＤ１５４の放出の調節に適した化合物の同定に有用な方法にも関係する。この発明は又、炎症を治療し又は防止し且つ血小板の生存能力を増大させるための、輸血のための血小板のメタロプロテイナーゼインヒビターによる処理にも関係する。本発明は又、かかる生物学的過程に関係する負傷及び病気を治療するための組成物及び方法をも包含する。
【背景技術】
【０００２】
血小板の凝集、活性化並びに内皮細胞及び細胞外マトリクスタンパク質への接着は、アテローム性動脈硬化症及び動脈性心臓血管病の発生における重大な事象である。血小板の活性化は、ｐ４２ミトゲン活性化されたプロテインキナーゼ(ＭＡＰＫ)及びｐ３８ＭＡＰＫ経路とその後の血小板細胞骨格並びに血小板表面レセプター例えばＰ−セレクチン(ＣＤ６２Ｐ)及びＣＤ１５４の発現及び活性化における主要な変化を含む細胞内シグナリングカスケードの刺激により開始される。
【０００３】
動脈壁在血栓症及びプラーク内血栓症は、主として、血小板凝集物により構成され、病変の発生と身体的に関係している。血小板リッチな動脈血栓症に存在する活性化された血小板は、血管内皮細胞、平滑筋細胞及び他のアテローム内細胞に、ＣＤ１５４／ＣＤ４０相互作用により直接結合する。この結合は、アテローム性動脈硬化病変の発生を開始又は促進する潜在能力を有する炎症反応を誘導する(炎症性サイトカインの放出並びに接着レセプター及び組織因子の内皮細胞における表面発現により検出)。この経路は又、Ｔ細胞に誘導された単球及び内皮細胞の凝血促進活性にも重要である。可溶性ＣＤ１５４の投与がある種の患者において免疫応答を増大させることができるかどうかを研究するためにデザインされたヒトの臨床試験が現在進行中であると考えられている。
【０００４】
血小板は、出血部位、アテローム性動脈硬化及び血管形成術後再狭窄病変内、及び虚血再灌流障害領域において白血球と一緒に局在する。この血小板と白血球の相互作用は、止血／血栓応答と炎症応答との間の生物学的結合を説明する。炎症と血栓症が、血管病の過程において以前に認められていたよりも一層からみ合っているということが示唆されてきた。
【０００５】
血管内皮は、３つの止血の古典的な相互作用する成分である血管、血小板並びに血漿の凝固及び繊維素溶解系に影響を及ぼす。加えて、血管内皮は、炎症及び組織修復において重要な役割を演じる。内皮の振舞いの２つの主要なモデルは、区別することができ、抗血栓症状態として及び血栓前状態として最もよく規定することができる。典型的な生理的条件下で、内皮は、血管拡張(ＮＯ、ＰＧＩ２、アデノシン、過分極化因子の生成)を媒介し、血小板の付着及び活性化(アデノシン、ＮＯ及びＰＧＩ２の産生、ＡＤＰの除去)を阻止し、トロンビン形成をブロックし(組織因子経路インヒビター、トロンボモジュリンによるプロテインＣの活性化、抗トロンビンＩＩＩの活性化)そしてフィブリン沈着を軽減する(ｔ−及びｓｃｕプラスミノーゲンアクチベーター産生)。炎症性白血球の付着及び移行は、例えばＮＯ及びＩＬ−１０によって減衰し、酸素遊離基は、効率的に取り除かれる(尿酸塩、ＮＯ、グルタチオン、ＳＯＤ；例えば、Becker, BF等、Z. Kardiol 2000; 89(3):160-167を参照されたい)。
【０００６】
内皮が、物理的に破壊され又は虚血後再潅流、急性及び慢性炎症、アテローム性動脈硬化症、糖尿病及び慢性の動脈性高血圧症により機能的に撹乱された場合には、対抗作用が付属する。この前血栓、前炎症状態は、血管収縮、血小板及び白血球の活性化及び付着(フォンウィルブランド因子、血小板活性化因子、Ｐ−セレクチン、ＩＣＡＭ−１、ＩＬ−８、ＭＣＰ−１、ＴＮＦαなどの外面化、発現及びアップレギュレーション)、トロンビン形成の促進、血管壁における凝固及びフィブリン付着(組織因子、ＰＡＩ−１、ホスファチジルセリンなどの発現)により特徴付けられ、血小板−白血球凝固においては、血小板の内皮、単球及びＢ細胞ＣＤ１５４への付着による更なる炎症性相互作用によって特徴付けられる。
【０００７】
アテローム性動脈硬化症の進行における内皮の炎症の役割が示されており(Libby, P.等、Atherosclerosis and Coronary Artery Disease, Fuster V等、編、Lippincot-Raven, フィラデルフィア、585-594(1996)；R.Ross, New Eng.J.Med.; 340:115-126(1999))、これは、病変の進行の原因である炎症性因子の理解及び炎症応答を調節する因子の同定に向けられた努力へと導いた。
【０００８】
ＣＤ４０は、Ｂリンパ球系統細胞を含む多くの血管細胞において見出される４５〜５０ｋＤの膜貫通糖タンパク質である(Hollenbough, D, J.Exp.Med.282:33(1995))。ＣＤ４０は、ＴＮＦレセプターファミリーのメンバーであり、神経成長因子、ＴＮＦ−α、Ｆａｓ及びＣＤ３０のレセプターと相同性を有する。ＣＤ４０は、Ｂ細胞の分化及び活性化において重要な役割を演じることが示されている。その免疫細胞における主たる役割は、それらの活性化を増強し、それ故、それらのサイトカイン及び免疫調節分子の産生を増強することである。最近、ＣＤ４０は、ヒトの繊維芽細胞においても検出された。その繊維芽細胞の出現光景は、それが構造細胞より遥かに多いということである(免疫系の細胞と密接に相互作用することができる)。幾つかの組織に由来する繊維芽細胞において、ＣＤ４０のそのリガンドとの遭遇は、前炎症分子例えばインターロイキン６(ＩＬ−６)及びＩＬ−８の分泌を生じた。
【０００９】
ＣＤ４０のリガンドは、ＣＤ１５４(ＣＤ４０リガンド、ＣＤ４０Ｌ及びｇｐ３９としても知られている)である。ＣＤ１５４は、ＴＮＦファミリーにおける膜タンパク質であり、強力な前炎症因子である(最初は、ＣＤ４+Ｔリンパ球において同定された)。ＣＤ１５４は、免疫グロブリンイソ型スイッチングの原因因子として同定された(Gordon, J, Eur.J.Immunol.17:1535(1987))。活性化Ｔ細胞で発現されるので、それは、II型膜タンパク質(Ｎ末端が細胞内で、Ｃ末端が細胞外にある)細胞である。ヒトのＣＤ１５４タンパク質は、２６１残基長であり、単一Ｎ結合炭水化物部分を有している。
【００１０】
以前の研究は、ＣＤ１５４がＴ細胞活性化の後に急速に放出され(Graf, D, Eur.J.Immunol.25:1749(1995))、Ｂ細胞増殖を誘導し(Pietravalle, F J.Biol.Chem,271:5965(1996))、血管細胞における炎症応答を誘導する(Schonbeck, 1997)ことのできる１８ｋＤａの加水分解産物を生成することを確立した。ＣＤ１５４遺伝子の突然変異は、稀な免疫不全状態、Ｘ連鎖過ＩｇＭ症候群(ＸＬＨＩＧＭ)と関係している。
【００１１】
ＣＤ１５４に対する抗体は、Ｔ細胞及び抗体媒介の免疫応答を多くの実験系において抑制することが示されている。これらは、移植片の拒絶の阻止及び自己免疫疾患のブロッキングを包含する(Durie, FH等、Science,261:1328(1993))。抗ＣＤ１５４抗体とＣＤ２８ブロッカー(即ち、ＣＴＬＡ−４Ｉｇ)の組み合わせた利用は、マウス及びアカゲザルの移植モデルの両者において、移植片の拒絶のブロックに効果的であることが示されている(Larsen, CP等、Nature,381:434(1996)；Kirk, AD, Proc.Natl.Acad.Sci.(USA), 94:8789(1997))。他の研究は、アカゲザル腎臓同種異系移植片における抗ＣＤ１５４抗体の単一薬剤としての利用が、この処理が顕著に効果的であることを示した(Kirk, AD等、Nature Medicine 5:686.(1999))ことを示した。臨床研究は、狼瘡その他の自己免疫疾患の治療のための抗ＣＤ１５４ヒト化抗体を用いて進行中であると考えられる。
【００１２】
ＣＤ１５４は又、アテローム性動脈硬化病変の進行の鍵となるメディエーターであることも知られている。このＣＤ１５４のアテローム性動脈硬化症における役割は、ＣＤ１５４抗体(Mach, F, Nature,394:200(1998))又はＣＤ１５４遺伝子ターゲティング(Lutgens,E, Nature Medicine,5:1313(1999))がａｐｏＥ−／−マウスにおけるアテローム性動脈硬化病変の発生を低減させることを示す研究により確立された。
【００１３】
Aukrust等(Circulation; 100(6):614-620(1999))は、ＣＤ１５４の可溶性形態が、急性冠状動脈血栓症候群(例えば、不安定狭心症)の患者又は血管形成術を受けている患者において生成されること及び可溶性ＣＤ１５４が末梢血液単球に対して炎症性であることを示した。これらの観察から、こうして生成された可溶性ＣＤ１５４は、急性冠状動脈症候群の引き金を引き且つ／又は広げるということが仮定された。
【００１４】
ＣＤ１５４は、今や、脈管構造内の血小板を含む多くの細胞に存在することが知られている(Mach, F.,Proc.Natl.Acad.Sci.(USA),94:1931(1997)；Banchereau, Ann Rev.Immunol.12:881(1994))。ＣＤ１５４は、未刺激の円盤状血小板の表面には発現されていないが、トロンビン誘導された凝集時には急速に血小板上で発現されるようになることを示したHenn等は、開拓者的研究において、ＣＤ１５４の血小板配置を確立した。
【００１５】
Phipps等(The Lancet, 357:2023-2024(2001))は、更に、血小板の可溶性ＣＤ４０リガンドが、熱応答の原因であること及びＣＤ４０リガンドの放出を最小限に維持するか又はＣＤ４０リガンドを輸血前に除去することが血小板輸血後の有害な事象を効果的に減らすことができるということをはっきりさせた。
【００１６】
Eliopoulos等(Molecular Cell Biology, 20(15):5503-5515(2000))は、癌細胞においてＣＤ１５４がＣＤ４０を介してアポトーシスを誘導することことを見出して、内因性の細胞傷害性サイトカインの産生及び細胞死のオートクリン又はパラクリン誘導に依存する前アポトーシス機構を同定した。
【００１７】
血小板のＣＤ１５４／ＣＤ４０相互作用によるアテローム性動脈硬化症及び他の急性冠状動脈症候群への寄与を減少させることのできる治療剤への要求がある。その上更に、ＣＤ１５４の前炎症的役割の故に、及びＣＤ１５４の活性及び効果を阻止することの潜在的な治療的結果を仮定すれば、この分子の、高親和性で特異性の高い阻害剤を有することは望ましいことであろう。
【００１８】
血小板凝集の阻止及び低減に向けられた治療剤は、公知である。例えば、メタロプロテイナーゼインヒビターの投与が、血小板凝集を減じ又はブロックすることができるということが示唆されている。ある別の血小板ブロッキング剤は、血小板凝集に関与する血小板糖タンパク質IIｂ-IIIaレセプターに向けられている。多くのランダムな臨床的試みが、これら３種類の親ＧＰIIb-IIIaのアンタゴニスト(アブシキシマブ、アグラスタット及びエプチフィバチド(INTEGRILIN(登録商標)；Millennium Pharmaceuticals, Inc.))が、経皮的介入及び不安定なアンギーナの環境における急性冠状動脈血栓症の発病率を減少させることを確立した(Topol, E., Circulation, 97,211(1998))。このクラスの薬物の一つの更なる予想外の利益は、それらが、ヘパリンの抗凝固活性をも増大させるということである。これらの薬物は、この利益を、おそらく、凝集した血小板上に見出されるプロトロンビナーゼの発現を制限し及び／又はプロトロンビンのＧＰIIb-IIIaへの結合を阻止するので達成するということが示唆されてきた。このクラスの薬物の他の予想外の利益は、それらが、おそらく、繊維素溶解により生成された前血栓環境により生成された血小板凝集を阻止するので、血栓溶解によって血餅の溶解を増大させるということである。
【００１９】
これらの薬剤は、ある患者にはこれらの環境において利益があるが、治療結果の改善へ向けた更なる進歩が成されなければならない。例えば、血管形成術は、患者に利益を与えることが示されてきたが、その手順には副作用及び合併症がない訳ではない。最近の血管病の患者からの臨床データは、炎症が高まった場合には、炎症の兆候を有しない患者におけるほどには結果がよくないことを示唆している。血栓症及び炎症を調節する方法を理解し、発見することは、長いこと必要と感じられてきたにもかかわらず、細胞相互作用の複雑さが、止血機能の調節のための完全に満足な、安全且つ効果的な製品及び方法の開発を面倒なものとしてきた。こうして、血管の炎症及び血栓症の予報可能な制御の履行を可能にし、それ故、望ましくない細胞機能により引き起こされる様々な病気の治療を可能にする製品及び方法への要求は存在し続けている。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００２０】
本発明は、ＣＤ１５４の可動化を特異的に調節することができ、血栓形成過程を安定化させて炎症応答に関与する細胞の活性化を減少させるのに有用な化合物に関係する。
【００２１】
脈管構造におけるＣＤ１５４の循環が血小板において見出されることが見出されている。本発明は、血小板ＣＤ１５４の炎症活性に必要な条件を理解するための努力から生じた。本発明の発明者は、ＣＤ１５４が実際に刺激された血小板の表面で発現されること及びその後の血小板凝集(フィブリノーゲンの血小板糖タンパク質ＧＰ IIb-IIIaへの結合を必要とする)がＣＤ１５４の開裂を引き起こし、その結果、内皮細胞における炎症応答を誘導することのできるタンパク質の可溶性の１８ｋＤａの断片(「ｓＣＤ１５４」)が出現することを発見した。ｓＣＤ１５４の組換え型が作成されて、それが前炎症性であることが示されている。
【００２２】
重要なことには、ＣＤ１５４は、炎症だけでなく、血栓症に関与することが発見され、ＣＤ１５４アンタゴニストは、望ましい抗血栓症剤である。ＣＤ１５４加水分解のインヒビターは、抗血栓症剤として望ましい。
【００２３】
この発明の一つの面は、血小板刺激に際してのＣＤ１５４の加水分解をブロックするメタロプロテイナーゼインヒビターに関係し、メタロプロテイナーゼインヒビターは、望ましい抗血栓症剤であり且つ抗炎症剤である。
【００２４】
この発明の他の面は、輸血のための血小板の、炎症を治療し又は予防するための及び輸血後の血小板の生存力を増大させるためのメタロプロテイナーゼインヒビターでの処理に関係している。
【００２５】
この発明の他の面は、炎症及び／又は血栓症の治療方法に関係しており、該方法は、ＣＤ１５４アンタゴニスト、ＣＤ１５４の加水分解を阻害する薬剤、又はメタロプロテイナーゼインヒビターの投与を含む。これらの方法は、適宜、血小板凝集をブロックし又は血栓溶解を増大させる更なる薬剤の投与を与える。これらの薬剤は、成形され若しくは植え込まれた物品による局所的送達を含む様々な手段によって送達することができ、又は経皮的パッチ、静脈投与若しくは経口投薬形態などによって全身に送達することができる。
【００２６】
それ故、この発明は、ＣＤ１５４の血小板からの可動化を調節する方法であって、血小板凝集インヒビターの投与を含む当該方法に関係する。この発明の他の面は、ＣＤ１５４の血小板からの可動化を調節する方法に関係し、該方法は、血小板凝集インヒビターの投与を含む。インテグリリン(登録商標)(エプチフィバチド；Millennium Pharmaceuticals, Inc.)及び他の血小板凝集を阻害するＧＰ IIb-IIIaアンタゴニストは、ｓＣＤ１５４タンパク質の開裂及び放出を、血小板が、強力な刺激物例えばトロンビン又はＴＲＡＰにより刺激された場合でさえも、ブロックすることが見出されている。
【００２７】
驚いたことには、これらの血小板凝集インヒビターは、適当に低い投与量で送達された場合に、可溶性ＣＤ１５４の可動化を促進して、前炎症及び／又は前血栓症効果へと導くということが見出された。本発明は、障害された免疫系を有する患者又は免疫系が所与のレベルの刺激に対して十分な応答を開始するのが遅い患者の治療方法であって、それらの患者に望ましい前炎症性効果を最適化するために選択した投与量での血小板凝集インヒビターの投与を含む当該治療方法を提供する。
【００２８】
本発明の他の面は、血小板の活性化、凝集又はＣＤ１５４の血小板からの可動化を部分的にブロックするだけの薬剤の低投与量が、血小板ＣＤ１５４の放出を増強するという発見である。血栓症の継続的進行を与える十分低い投薬量レベルの抗血栓症剤のイン・ビボ又はイン・ビトロ投与は、ＣＤ１５４の血小板からの可動化を増進させ、増大された炎症へと導くことが発見されている。患者において、増大した炎症は、ある程度悪化した患者の結果と相関している。本発明のある具体例において、例えば、血管又は炎症性疾患の治療に関係するものにおいて、本発明は、患者試料中のＣＤ１５４又はｓＣＤ１５４のレベルの測定を含む方法及びこれらの測定値の、抗血栓症剤の投与のための初期投薬計画を決定するための利用及び投与された抗血栓症剤又は抗炎症剤の十分な投薬量レベルの評価のための利用を提供する。本発明は又、癌、免疫系の病気及び血栓症又は炎症性疾患の、ＣＤ１５４の血小板からの可動化を調節する薬剤を利用する治療方法にも関係する。
【００２９】
本発明の他の面は、ＣＤ１５４の血小板からの放出を調節するのに適した化合物を同定するための分析方法の利用に関係している。適当な化合物が与えられ、それらは、公知の及び未知の、経口及び非経口投与用の、血小板糖タンパク質ＧＰ IIb-IIIaアンタゴニストを含み、該アンタゴニストは、血小板が強力なアゴニストに刺激された場合でさえも、可溶性前炎症メディエーターの放出を調節する予想外の能力を有している。本発明は又、血小板糖タンパク質IIb-IIIaクラスの薬物の新たな利用、即ち、急性冠状動脈血栓症により生じた炎症の程度を制限する薬物のための利用をも提供する。幾つかの面において、本発明は、治療用抗血栓症剤、血栓溶解剤又は他の薬剤の新規な配合物を提供し、これらは、それらの所望の血栓症阻止効果を最適化させる速度及びレベルで治療剤を放出する能力により特徴付けられる。他の面においては、所望の前炎症又は抗炎症効果を最適化する特徴的な薬物動力学的プロフィルを有する新規な治療剤が与えられる。
【００３０】
本発明のある面においては、血小板活性化及び／又は血小板凝集を減少させる様々な治療剤を抗炎症剤として利用する。本発明の方法における利用のために選択した特定の治療剤は、関連する臨床状況及び所望の治療プロフィルに基づいて選択される。例えば、アスピリンは、コラーゲンが血小板活性化を引き起こす薬剤である環境においてはＣＤ１５４の血小板からの放出をブロックするが、ＡＤＰが血小板アゴニストである環境ではＣＤ１５４の放出をブロックしないということが示されている。現在は、この差異は、トロンボキサンＡ2のブロックを含むアスピリンの作用機構に帰することができると考えられている。それ故、投与されたアスピリン自体は、病気がコラーゲン媒介の炎症過程を含む患者において異なる病因の血栓症を有する患者におけるよりも一層効果的な抗炎症剤でありうることはありうることである。これらの後者の患者が、もしアスピリンを所望するならば、他の治療剤と組み合わせたアスピリンの投与によって、一層の治療上の利益を得ることはありそうなことである。それ故、本発明は、患者のための治療養生法の選択方法であって、治療すべき患者の疾患に関与する炎症メディエーターを評価し、それらの炎症メディエーターに所望の様式で影響を与える抗血栓症及び／又は炎症剤を同定し、それらの薬剤の適当な投薬量レベルを決定して、少なくとも一種の追加の治療剤と一緒での抗血栓症剤の投与を含む治療養生法(該追加の治療剤は、抗炎症剤、血栓溶解剤、抗癌剤又は治療すべき病気に向けられた他の任意の治療剤であってよい)を計画するステップを含む当該選択方法に関係する。
【００３１】
この発明の幾つかの面において、治療剤は、それらの鋭く且つ／又は局所的に作用する種々の能力に基づいて選択される。他の面において、治療剤は、好適な間接的又は全身性の作用を最適化するように選択される。
【００３２】
本発明は、過去において可能であったよりも一層正確に、特定の治療適応症に対する治療剤候補を作成することを可能にする。例えば、本発明のこれらの化合物及び方法は、血小板形成から可溶性血小板ＣＤ１５４の放出に至る経路中の多くの介入点に適応可能である。薬剤は、ＣＤ１５４にのみ直接影響することにより選択することができる(ＣＤ１５４の血小板表面からの開裂又は放出を阻止するものなど)。改変し、不活性化したＣＤ１５４構築物の遺伝子治療導入が、本発明において企図される。アンチセンス核酸構築物も又、意図され、文献中に公知である。
【００３３】
本発明は又、ＣＤ１５４調節活性を含む細胞機能を調節するために利用することのできる調節化合物を同定する複雑な問題に対する解決をも与える。細胞内のシグナル変換ネットワークの複雑さにもかかわらず、本発明は、ＣＤ１５４活性を調節し、ＣＤ１５４活性を特異的に調節することのできる化合物を同定する効率的な方法を提供する。
【００３４】
本発明は、動物によるＩｇＭ又はＩｇＥの産生を調節することのできる化合物を、動物によるＩｇＭ及びＩｇＥの産生を実質的に邪魔することなく同定する方法を提供するので、特に有利である。こうして、動物の免疫応答を無差別に抑制する伝統的な免疫抑制試薬と異なり、本発明の方法により同定された化合物は、動物が、外来の病原体に対する免疫応答をＩｇＧ及びＩｇＡ抗体を産生することにより開始するのを可能にする。従って、当業者は、本発明から生じる利益を直ちに認めるであろう(それらは、アレルギー及び自己免疫疾患の治療に有用であるが、動物の全体的免疫応答を破壊しない化合物の同定及び利用を含む)。
【００３５】
本発明の他の面は、細胞におけるＣＤ１５４調節活性を制御する化合物を同定する方法に関係し、該方法は、次を含む：(１)細胞を推定の調節化合物と接触させ(ここに、該細胞は、ＣＤ１５４を含む)；及び(２)推定の調節化合物のＣＤ１５４の活性を調節する能力を評価する。本発明の他の具体例は、細胞における活性のＣＤ１５４調節を制御する化合物を同定する方法であって、次を含む方法を含む：(１)細胞を推定の調節化合物と接触させ(細胞は、ＣＤ４０タンパク質を含む)；及び(２)推定の調節化合物のＣＤ１５４タンパク質の活性を調節する能力を評価する。特に、本発明のこれらの方法は、評価ステップの前に、細胞をＣＤ１５４で刺激するステップを含む。
【００３６】
免疫グロブリン重鎖のクラススイッチング、サイトカイン産生及び炎症細胞活性化よりなる群から選択した生物学的機能を調節する化合物の能力により同定された調節化合物も又、本発明に含まれる(この化合物は、細胞の原形質膜を透過することができて、ＣＤ１５４タンパク質の炎症活性を調節する能力を阻害することができる)。
【００３７】
本発明の他の面は、免疫グロブリン重鎖クラススイッチングを阻害する方法(ＣＤ１５４タンパク質の活性の阻害を含む)に関係する。本発明は又、ＣＤ１５４を有する細胞によるサイトカイン産生を阻害する方法であって、ＣＤ１５４タンパク質の活性を阻害することを含む当該方法をも含む。
【００３８】
本発明の更に別の面は、アレルギー応答を含む病気、及び自己免疫疾患よりなる群から選択する病気の動物を治療する方法を含み、該方法は、動物に、ＣＤ１５４調節活性を調節し又は制御する化合物を含む有効量の治療用組成物を投与することを含む。
【００３９】
本発明の他の面は、細胞における炎症のＣＤ１５４調節を制御する化合物を同定するためのキットを含み、該キットは、次を含む：(１)ＣＤ１５４タンパク質を含み又は発現する細胞；及び(２)ＣＤ１５４タンパク質の調節を検出する手段。
【００４０】
本発明の他の面、目的、特徴及び利点は、好適具体例を説明する以下の詳細な説明により、当業者には明らかとなろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４１】
本発明は、ＣＤ１５４の可動化を調節することができて血栓症過程の安定化及び炎症応答に関与する細胞の活性化の低減に有用な化合物に関係する。
【００４２】
本発明のある面は、通常血小板で発現されるＣＤ１５４活性の阻害により抗血栓症効果を有する方法及び組成物に向けられている。この阻害は、ここに記載のように、様々なステップにおける介入により達成されうる。
【００４３】
他の具体例において、ＣＤ１５４の放出を減少させるＣＤ１５４インヒビター又は薬剤例えばメタロプロテイナーゼインヒビターは、患者への輸血に使用する血小板の処理のための本発明において有用である。血小板は、血友病、他の血液疾患及び化学療法を含む様々な病気(これらに限らない)につき、患者の治療において利用される。輸血に用いられる血小板は、典型的には、末梢血液(アレルギーのドナー由来の血液又は患者の自家血液)から採取され、他の血液製剤から分離して約２２〜３７℃(好ましくは、約２４℃)に、最長で約５日間貯蔵する。貯蔵中、血小板を、使用前に凝固するのを阻止するために、頻繁に攪拌する。当分野では、血小板輸血の患者は、ときに、輸血と関係する炎症応答に苦しめられるということが注意されている。本発明者は、貯蔵中に、血小板は、有意の量の可溶性ＣＤ１５４を放出するということを発見した。前に述べたように、ＣＤ１５４は、血栓症及び炎症の両方に関与する。メタロプロテイナーゼインヒビターは、可溶性ＣＤ１５４の血小板からの放出を阻害する。それ故、血小板輸血患者における炎症を予防し及び／又は治療するために、又は輸血後の血小板の生存力を増大させるために、輸血に使われる血小板を処理するための組成物及び方法を提供することは、本発明の目的である。
【００４４】
血小板を、貯蔵中に、可溶性ＣＤ１５４の放出及び血栓の形成を阻止するために有効量のメタロプロテイナーゼインヒビターとインキュベートしてからレシピエントに投与するのは、好適具体例である。血小板を、有効量のメタロプロテイナーゼインヒビターで処理して可溶性ＣＤ１５４の血小板からの放出を阻止してからレシピエントに投与するのは、更なる好適具体例である。有効量のメタロプロテイナーゼインヒビターを、血小板輸血との関連において、血小板輸血のレシピエントへ直接投与するのは、尚更なる好適具体例である。該メタロプロテイナーゼインヒビターの該レシピエントへの投与は、該血小板の該レシピエントへの輸血の前、後、又は輸血と同時に行なうことができる。メタロプロテイナーゼインヒビターと血小板との同時投与の場合には、該メタロプロテイナーゼインヒビターの投与は、該血小板を含む組成物と同じ組成物であっても別個の組成物であってもよい。
【００４５】
メタロプロテイナーゼインヒビターの血小板輸血レシピエントへの直接的投与の場合には、炎症又は血栓形成を予防し又は治療するのに有効な量のメタロプロテイナーゼインヒビターの投与は、単一投与によるものであってもよいし、分割した投与量の複数回の投与であってもよい。更に、メタロプロテイナーゼインヒビターの患者への直接的投与は、有効投与量の迅速な開始及び着実な放出を与える放出配合物を有する治療プロフィルを含むことができる。血小板のメタロプロテイナーゼインヒビターでの処理はこれらの方法の何れか一つ又はこれらの任意の組合せを用いて達成することができるということが更に企図される。
【００４６】
患者への投与に適した任意のメタロプロテイナーゼインヒビターをこの方法において利用することができるということは理解される。好適なのは、ヒトへの使用を認可され又は示されたメタロプロテイナーゼインヒビターである。メタロプロテイナーゼインヒビターには、HONHCOCH2CH(CH2CH(CH3)2-CO-NaI-Ala-NHCH2CH2NH2(ＴＡＰＩ−１)、メタロプロテイナーゼ２の組織インヒビター(ＴＩＭＰ−２)、ドキシサイクリン、ガラルディン、及びＳＢ−３ＣＴ(ＭＭＰ２／ＭＭＰ９インヒビターＶＩ)などが含まれ、これらは、当業者には、周知である。最も好適なメタロプロテイナーゼインヒビターには、ガラルディン、ドキシサイクリン、ＴＡＰＩ−１又はＴＩＭＰ−２が含まれる。メタロプロテイナーゼインヒビターは、本発明の方法において、単独で用いることもできるし、互いに組み合わせて用いることもできる。
【００４７】
血小板のメタロプロテイナーゼインヒビターでの処理には、血小板凝集をブロックし又は血栓溶解を増大させる少なくとも一種類の更なる薬剤で患者を治療することが含まれうることが更に企図される。かかる血小板凝集をブロックする更なる薬剤の例は、血小板糖タンパク質ＧＰ IIb-IIIa アンタゴニスト例えばインテグリリン(登録商標)(エプチフィバチド；Millennium Pharmaceuticals, Inc.)である。
【００４８】
この発明のある好適具体例は、可溶性ＣＤ１５４の血小板からの開裂においてメタロプロテイナーゼが演じる我々が発見した役割の故に、血栓症及び／又は炎症の治療のためにメタロプロテイナーゼインヒビターを利用する。特に好適な具体例においては、メタロプロテイナーゼインヒビターを、炎症性疾患例えば関節炎、多発性硬化症、炎症性腸症候群、臓器又は組織移植、移植片対宿主媒介疾患、卒中、及びクローン病の予防及び治療のために投与する。特に好適なのは、ＴＡＰＩ、メタロプロテイナーゼインヒビター(ＣＤ１５４の加水分解を阻害する)のある種の生物学的機能を共有する薬剤である。本発明で用いられる他の望ましい治療剤は、血管病で発現が増大する酵素例えばゼラチナーゼＡ(マトリクスメタロプロテイナーゼ２、ＭＭＰ−２又はＩＶ型コラゲナーゼとしても知られている)のインヒビターである。所望の本発明の治療剤の候補には、細胞外マトリクスのリモデリング又は細胞外マトリクスのターンオーバーに関与する群から選択する他のタンパク質分解酵素例えばプラスミノーゲン系のセリンプロテイナーゼ及びマトリクスメタロプロテイナーゼ(ＭＭＰ)のインヒビターが含まれる。これらの望ましい効果を有する多くの薬剤は、文献に記載されており、例えば、制限はしないが、抗ゼラチナーゼＡ抗体、メタロプロテイナーゼ２の組換えヒト組織インヒビター(ＴＩＭＰ−２)、内因性ヒトセリンプロテイナーゼ又はマトリクスメタロプロテイナーゼの可溶性又は組換え型、及びメタロプロテイナーゼの選択的インヒビター例えばフェナントロリン及びＳＣ４４４６３が含まれる(例えば、Sawicki G.等、Nature, 386:616-619(1997)；Kazes等、Blood,96,9:3064-3069,(2000)参照)。本発明により企図される他の治療剤は、腫瘍壊死因子ファミリーのメンバーを細胞膜結合性前駆体から放出するメタロプロテイナーゼである(例えば、Black等、Nature, 385:729-733(1997)；Moss等、Nature, 385:733-736(1997)参照)。
【００４９】
改変又は不活性化した可溶性ＣＤ１５４も又、本発明において、血小板から放出されうるＣＤ１５４の活性型と競争するように、望ましく投与される。他の面においては、抗血栓症又は前血栓症活性の所望のプロフィル並びに抗ＣＤ１５４特性のために、抗ＣＤ１５４抗体が選択され、投与される。
【００５０】
卒中又は他の脳血管病の治療に関係する本発明の一具体例においては、、この治療剤候補は、一層大きい抗血栓症効果を有する抗血小板介入をも含む治療プロフィルと区別して、ＣＤ１５４放出の減少に向けられた活性を最適化するように選択される。
【００５１】
ＣＤ１５４のＣＤ４０との結合をＣＤ４０結合部位に作用することにより邪魔する薬剤例えば抗ＣＤ４０抗体なども又、本発明において企図される。ＣＤ４０の血栓効果を調節するための方法であって、ＣＤ４０アンタゴニストの単独での又は他の治療剤と組み合わせての投与を含む当該方法を提供する。
【００５２】
本発明の更に別の具体例においては、血小板活性化、又は血小板凝集、又は血小板によるＣＤ１５４の発現の一つだけを選択的にブロックする治療剤を選択する。本発明の一層特に好適な具体例においては、この治療剤候補は、血小板の活性化のための唯一つの特定の機構を選択的にブロックするように作成される。血小板の活性化による凝集から可溶性ＣＤ１５４の発現及び放出までの経路中に介入の正確な点を作ることは、慢性病治療に望ましいものではなく急性期治療のための異なる特徴の選択(及びその逆)を可能にする。本発明の多くの具体例について、望ましい治療プロフィルには、有効な投与量の迅速な開始及び着実な放出を与える放出配合物が含まれる。治療剤候補の選択投薬の目的は、有効な治療範囲を迅速に達成して、それを維持することである。本発明は、望ましい治療プロフィルのＣＤ１５４アンタゴニスト(単独又は他の治療剤と組み合わせる)の同定を含む治療方法を提供する。
【００５３】
本発明の他の具体例においては、ＣＤ１５４の炎症活性をブロックすることが知られている薬剤を、予想外の抗血栓症的利益のために利用する。抗ＣＤ１５４抗体は、この発明のこの面の好適具体例である。
【００５４】
この発明は、抗血栓症療法中に可溶性ＣＤ１５４の潜在的効果を減じる免疫抑制治療を含む治療コースにおける抗血栓症剤の投与方法を提供する。類似の免疫抑制は、ある種の抗癌及びここに記載の他の適応症において望ましい。
【００５５】
本発明の更なる具体例においては、抗血栓症剤を、血管の外科手術、傷害又は病気において投与して、血管への傷害又は介入の炎症性合併症を減じる。これらの薬剤は、冠状動脈バイパス手術などにおいて、炎症因子により媒介される合併症を減じるために、単独で投与しても、可溶性ＣＤ１５４の放出をブロックする他の治療剤と組み合わせて投与してもよい。
【００５６】
本発明は、ＣＤ１５４調節活性を調節する化合物を同定する方法及びかかる方法を用いて同定された生成物を提供する。ここで用いる場合、「シグナル変換経路」という語句は、少なくとも一の生化学反応をいうが、一層一般的には、一連の生化学反応をいう(これらは、細胞と刺激性化合物との相互作用から生じる)。刺激性化合物と細胞との相互作用は、「シグナル」を生じ、それは、シグナル変換経路により伝達されて、最終的にＣＤ１５４活性化を生じる。シグナル変換経路に対して阻害的な化合物(アンタゴニスト)も又、有用であり、本発明の方法により同定することができる。
【００５７】
本発明のシグナル変換経路は、様々なシグナル変換分子を含むことができ、該分子は、細胞の一部から他の部分へのシグナルの伝達において役割を演じている。ここで用いる場合、用語「分子」は、タンパク質、脂質、核酸又はイオンをいい、かかる用語は、しばしば、交換可能に用いられる。特に、シグナル変換分子は、シグナル変換経路に関与するタンパク質、脂質、核酸又はイオンをいう。本発明のシグナル変換分子には、例えば、細胞表面レセプター及び細胞内シグナル変換分子が含まれる。ここで用いる場合、語句「細胞表面レセプター」には、シグナル及びかかるシグナルの細胞の原形質膜を横切る伝達を受容することのできる分子及び分子複合体が含まれる。語句「細胞内シグナル変換分子」には、ここで用いる場合、細胞の原形質膜から細胞質を通り、幾つかの場合には細胞核に入るシグナルの伝達に関与する分子又は分子複合体が含まれる。語句「刺激性化合物」には、ここで用いる場合、細胞表面レセプターに結合してシグナル変換経路を開始することのできるリガンド並びに、細胞内からのシグナル変換経路を開始することのできる細胞内イニシエーター分子が含まれる。
【００５８】
本発明の方法は、更に、推定のＣＤ１５４イニシエーターの、細胞内の免疫グロブリン重鎖クラススイッチング；細胞によるサイトカイン産生；又は炎症細胞(即ち、炎症応答に関与する細胞)の活性化を阻害する能力を評価することを含むことができる。免疫グロブリン重鎖クラススイッチングの測定方法は、当業者に対するものである。例えば、サザーンブロットを、免疫グロブリン重鎖の種々のクラスをコードする遺伝子に特異的なＤＮＡプローブを利用して行って、種々のクラスをコードするＤＮＡの再配列を探ることができる。或は、処理した細胞により生成されたタンパク質についてのイムノアッセイを、免疫グロブリン重鎖の種々のクラスに特異的な抗体を利用して行なうことができる。サイトカイン産生を測定する方法は、当業者には周知である。例えば、サイトカインに応答することのできる細胞を用いる細胞応答性アッセイを利用して、推定の調節化合物によるサイトカイン産生の破壊を試験することができる。加えて、サイトカインに特異的な抗体を利用するイムノアッセイを利用して、推定の調節化合物によるサイトカイン産生の破壊を試験することができる。炎症細胞活性化の阻害を、炎症細胞の所望の生物学的機能を履行する能力を推定の調節タンパク質の存在下又は非存在下で試験することによって測定する方法は、当業者に公知である。
【００５９】
本発明での利用に適した細胞には、ＣＤ１５４タンパク質を有する任意の細胞が含まれる。かかる細胞には、ネイティブな生理学的コンテキストにおいてＣＤ１５４を発現する正常細胞又はトランスフォームされた細胞(即ち、異種核酸分子を有する細胞)が含まれうる(例えば、プレＢ細胞、Ｂリンパ球、癌細胞、繊維芽細胞、ランゲルハンス細胞、上皮細胞単球及び樹状細胞)。或は、本発明での利用のための細胞には、正常細胞の自然に生じた変異体、又は遺伝子工学的に処理した細胞(特定のリガンドに対する応答を増大させるなど、シグナル変換活性を変更したもの)が含まれうる。正常細胞のシグナル変換変異体は、当業者に公知の方法を用いて同定することができる。例えば、変異体を、リガンドへの応答における細胞によるカルシウム可動化のレベルに基づいて、蛍光活性化セルソーティング(ＦＡＣＳ)を用いて選択することができる。遺伝子工学処理した細胞には、例えば本発明のシグナル変換分子をコードする組換え分子でトランスフォームした本発明の組換え細胞(以下に詳述)が含まれうる。
【００６０】
本発明での利用のための細胞には、哺乳動物、無脊椎動物、植物、昆虫、カビ、酵母及び細菌細胞が含まれる。好適な細胞には、哺乳動物、両生類及び酵母の細胞が含まれる。好適な哺乳動物細胞には、霊長類、非ヒト霊長類、マウス及びラットが含まれるが、ヒトの細胞が最も好ましい。
【００６１】
一具体例において、本発明における利用に適した細胞は、細胞表面に機能的ＣＤ１５４を有する。機能的ＣＤ１５４は、完全長のＣＤ１５４又は細胞の原形質膜を横切ってシグナルを伝達することのできるＣＤ１５４の部分を含むことができる(抗ＣＤ１５４抗体又はＣＤ１５４と、免疫グロブリンの重鎖クラススイッチングを生じるように連結する際に)。好ましくは、本発明の細胞は、ヒト、マウス又はラットに由来するＣＤ１５４を発現する(ヒト由来のものが好ましい)。
【００６２】
他の具体例において、本発明における利用に適した細胞は、細胞質内を通過するシグナルを伝達してＣＤ１５４活性化を生じることのできる少なくとも一つの細胞内シグナル変換分子を有する。ここに記載の細胞内シグナル変換分子は、天然の遺伝子の発現により及び／又は細胞内にトランスフォームされた異種核酸分子の発現によって、細胞内で生成することができる。
【００６３】
ここで言及されるシグナル変換分子には、天然の完全長タンパク質が含まれるが、又はアミノ酸が欠失(例えば、タンパク質の切り詰められたバージョン)、挿入、逆転、置換及び／又は誘導体化(例えば、リン酸化、アセチル化、グリコシル化、カルボキシメチル化、ミリストイル化、プレニル化又はパルミトイル化)され、それで、改変されたタンパク質が、天然のタンパク質と実質的に同じ生物学的活性及び／又は機能を有する機能的に同等のタンパク質であってもよい。改変は、当分野で公知の技術によって達成することができ、該技術には、制限はしないが、タンパク質への直接的改変又はタンパク質をコードする遺伝子への改変が含まれる。このタンパク質をコードする遺伝子へのかかる改変には、例えば、ランダムな又は標的を定めた突然変異導入を達成するための古典的な又は組換えＤＮＡ技術の利用が含まれうる(例えば、Sambrook等、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Labs Press, 1989 (そのまま参考として本明細書中に援用する)を参照されたい)。
【００６４】
機能的に同等なタンパク質を、そのタンパク質の生物学的活性を測定するために確立されたアッセイを利用して選択することができる。例えば、機能的に同等な細胞表面レセプターは、対応する天然の細胞表面レセプタータンパク質が結合する特定のリガンドに結合する類似の能力を有する。更なる例として、機能的に同等の細胞内シグナル変換タンパク質は、対応する天然の細胞内シグナル変換タンパク質が結合して調節するように、他の細胞内分子の活性と結合してそれを調節する類似の能力を有する。
【００６５】
ある具体例において、本発明の細胞は、少なくとも一の異種核酸分子でトランスフォームされている。ここに記載の核酸分子は、ＤＮＡ、ＲＮＡ又はＤＮＡ若しくはＲＮＡのハイブリッド若しくは誘導体であってよい。ここで言及する核酸分子には、核酸分子の発現を制御する調節領域(例えば、転写又は翻訳制御領域)、完全長又は部分的なコード領域、及びこれらの組合せが含まれうる。核酸分子の任意の部分は、(１)その天然環境からその分子を単離する；(２)組換えＤＮＡ技術(例えば、ＰＣＲ増幅、クローニング)を利用する；又は(３)化学合成法を利用することによって生成することができるということは理解されるべきである。遺伝子は、その遺伝子によりコードされる細胞表面レセプターの産生を制御する調節領域などの天然の細胞表面レセプター遺伝子と関連するすべての核酸配列(転写、翻訳又は翻訳後制御領域など、但し、これらに限られない)並びにコード領域自体を含む。
【００６６】
核酸分子は、タンパク質をコードする天然の核酸分子の機能的同等物を含む。天然の核酸分子の機能的同等物には、天然のアレル変異体及び改変核酸分子が含まれるが、これらに限られない(これらにおいては、ヌクレオチドが、かかる改変が、本発明の分子をコードする核酸分子の能力を実質的に邪魔しないような仕方で、挿入、欠失、置換及び／又は逆転されている)。好適な機能的同等物には、Sambrook等(前出)に記載された条件に従って、ストリンジェントな条件下で、シグナル変換タンパク質をコードする核酸分子の少なくとも一部分にハイブリダイズすることのできる配列(即ち、少なくとも約７０％の同一性を有する配列)が含まれる。
【００６７】
任意特定の核酸分子に対して如何なる特定の改変がなされうるかを決定する手引きとして、当業者は、過度の実験を要しないで、当業者が本発明の実行可能な具体例を正しく認識することを可能にする幾つかの因子を考慮すべきである。例えば、かかる因子には、コードされるタンパク質の特定の機能的領域(リガンド結合部位、標的結合部位、キナーゼ触媒ドメインなどを含む)を維持するようになされた核酸分子の改変が含まれる。これらの様々な特徴についての機能試験(例えば、リガンド結合研究及びシグナル変換アッセイ例えばキナーゼアッセイ及び他のここに詳述したアッセイ及び当業者に公知のもの)は、核酸配列に対する如何なる改変が正しく認識されるか及び何れが正しく認識されないかを当業者が決定することを可能にする。
【００６８】
異種核酸分子(例えば、異種細胞表面レセプターをコードする核酸分子)の、本発明での利用に適した細胞へのトランスフォーメーションは、遺伝子を細胞に挿入する任意の方法により達成することができる。トランスフォーメーション技術には、トランスフェクション、レトロウイルス感染、エレクトロポレーション、リポフェクション、細菌トランスファー及びスフェロプラスト融合が含まれるが、これらに限られない。本発明での利用に適した細胞中にトランスフォームされた核酸分子は、染色体外ベクター上に維持されてもよいし、細胞のゲノム中に組み込まれてもよい。
【００６９】
本発明の核酸分子の細胞中での発現は、当業者に公知の技術を利用して達成することができる。簡単にいえば、この核酸分子を、該核酸分子が、遺伝子が宿主細胞にトランスフォームされた場合に、その遺伝子の構成的又は調節された発現を果たすように転写制御配列に機能的に結合されるような仕方で発現ベクターに挿入する。所望の発現ベクターの構築は、当業者に公知の方法によって達成することができて、発現は、真核又は原核生物の系においてなされうる。発現系は、転写制御配列、翻訳制御配列、複製起点及び他の調節配列を含む制御エレメント(宿主細胞に適合性であり、当業者に公知の方法を利用して核酸配列に機能的に結合されている)から構築することができる(例えば、Sambrook等、前出を参照されたい)。
【００７０】
一具体例において、本発明における利用に適した細胞を、ここに詳細に記載するように、ＣＤ１５４をコードする核酸分子でトランスフォームする。
細胞が、少なくとも一の型のシグナル変換分子をコードする核酸分子及び少なくとも一の型の細胞表面レセプターをコードする核酸分子の両者でトランスフォームされうることは、本発明の範囲内にある。
【００７１】
一具体例において、本発明の方法は、細胞を推定の調節化合物と接触させることを含む。本発明によって、推定の調節化合物には、ＣＤ１５４活性を調節することができると推測される化合物が含まれる。用語「活性」は、任意の程度のシグナル変換分子の活性化をいい、例えば、分子による触媒活性の獲得を生じる分子のコンホメーション変化；分子のリン酸化(それにより、分子による触媒活性の獲得又は喪失を生じる)；又は分子の細胞の一領域から他の領域への移動(それにより、分子が他の分子に結合できるようになる)による。用語「調節する」は、分子の活性及び／又は生物学的機能を制御する(例えば、かかる活性又は機能を増進させ又は減少させる)ことをいう。
【００７２】
ここで言及する推定の化合物には、例えば、合理的な薬物デザインの製品である化合物、天然物及び化合物(部分的に限定されたシグナル変換調節特性を有する)が含まれる。推定の化合物は、タンパク質ベースの化合物、炭水化物ベースの化合物、脂質ベースの化合物、核酸ベースの化合物、天然有機化合物、合成により誘導された有機化合物、抗イディオタイプ抗体及び／又は触媒抗体、又はこれらの断片であってよい。推定の調節化合物は、例えば、天然の又は合成の化合物のライブラリーから、特に、化学又はコンビナトリアルライブラリー(即ち、配列又はサイズが異なるが同じビルディングブロックを有する化合物のライブラリー；例えば、Rutter及びSantiの米国特許第５，０１０，１７５号及び５，２６６，６８４号を参照；これらを参考としてそのまま本明細書中に援用する)から又は合理的な薬物デザインにより得ることができる。
【００７３】
合理的な薬物デザインの手順において、シグナル変換分子などの化合物の３次元構造を、例えば核磁気共鳴(ＮＭＲ)又はＸ線結晶構造解析によって分析することができる。この３次元構造を、次いで、潜在的化合物(例えば、推定の調節化合物)の構造を例えばコンピューターモデリングによって予想するために利用することができる。予想された化合物の構造を、次いで、例えば化学合成、組換えＤＮＡ技術により又は天然起源(例えば、植物、動物、細菌及びカビ)からミメトープを単離することによって生成することができる。潜在的な調節化合物は、例えばＰＣＴ公開Ｎｏ.ＷＯ９１／１９８１３；ＷＯ９２／０２５３６及びＷＯ９３／０３１７２(これらを参考として、そのまま本明細書中に援用する)に記載のように、ＳＥＬＥＸ技術を利用して同定してもよい。
【００７４】
特に、天然の細胞内シグナル変換分子は、その構造及び機能の分析に基づいて改変して適当な調節化合物を形成することができる。例えば、ＣＤ１５４を調節することのできる化合物は、ＣＤ１５４のアミノ末端の選択した残基の数が同じ構造を有する化合物を包含することができる。かかる化合物は、ペプチド、ポリペプチド又は小さい有機分子を含むことができる。
【００７５】
推定の調節化合物は又、ＣＤ１５４を邪魔するようにデザインされた分子をも含むことができる。例えば、レセプターの細胞内シグナル変換タンパク質との結合を邪魔する変異型ＣＤ１５４を造ることができる。或は、ＣＤ１５４のＣＤ４０への結合を邪魔する変異型ＣＤ１５４を造ることができる。推定の調節化合物は、ＣＤ１５４のアゴニスト及びアンタゴニストを誘導することができる。かかるアゴニスト及びアンタゴニストは、天然のＣＤ４０に対するリガンドの構造に基づいて選択することができる。
【００７６】
本発明の細胞が推定の調節化合物と接触する(混合などにより)条件は、ＣＤ１５４活性を邪魔する他の調節化合物が本質的に存在しないならば細胞がＣＤ１５４活性を示すことのできる条件である。かかる条件を達成することは、当分野の技能の内にあり、細胞がＣＤ１５４活性を示すことができるように細胞を培養することのできる有効な培地が含まれる。例えば、哺乳動物細胞用には、有効な培地は、典型的には、１０％ウシ胎児血清を含むＲＰＭＩ１６４０培地を含む水性培地である。
【００７７】
本発明の細胞は、組織培養フラスコ、試験管、ミクロ滴定皿及びペトリプレートを含む様々な容器中で培養することができるが、これらに限られない。培養は、細胞に適した温度、ｐＨ及び二酸化炭素含有量で行なう。かかる培養条件も又、当業者の技能の内にある。例えば、ラモス細胞の培養は、３７℃で、５％ＣＯ2環境中で行なうことができる。
【００７８】
細胞を推定の調節化合物と有効な仕方で接触させる受け入れられるプロトコールは、接触する容器当たりの細胞数、細胞に投与される推定の調節化合物の濃度、推定の調節化合物の細胞とのインキュベーション時間、細胞に投与されたリガンド及び／又は細胞内イニシエーター分子の濃度、及びリガンド及び／又は細胞内イニシエーター分子の細胞とのインキュベーション時間を含む。かかるプロトコールの決定は、当業者によって、容器のサイズ、容器内の液体の容積、試験される細胞の種類及び試験する推定の調節化合物の化学組成(即ち、サイズ、電荷など)などの変数に基づいて達成されうる。
【００７９】
本発明の方法の一具体例において、適当な数の細胞を、９６ウェル組織培養皿に加える(培養培地中)。好ましい細胞数は、ＣＤ１５４活性の変化を本発明の検出方法(以下に詳述)を用いて検出することを可能にする細胞数を含む。一層好ましい細胞数は、９６ウェル組織培養皿のウェル当たり約１〜１×１０6細胞を含む。細胞を組織培養更に加えた後に、それらの細胞を３７℃で、５％ＣＯ2中で約０〜２４時間予備インキュベートすることができる。
【００８０】
培養培地中に懸濁された推定の調節化合物をこれらの細胞に、細胞内のＣＤ１５４タンパク質の活性を調節するのに十分な量で、その調節が本発明の検出方法を用いて検出できるように加える。推定の調節化合物の好適な量は、９６ウェルプレートのウェル当たり約１ｎＭ〜１０ｍＭの推定の調節化合物を含む。これらの細胞を適当な長さの時間にわたってインキュベートして、推定の調節化合物を細胞に入れてシグナル変換分子と相互作用させる。好適なインキュベーション時間は、約１分間〜４８時間である。
【００８１】
本発明の方法の他の具体例においては、本発明における利用に適した細胞を、本発明のＣＤ４０に結合することのできる刺激分子で刺激して、シグナル変換経路を開始して細胞応答を生じさせる。好ましくは、推定の調節化合物の細胞との接触の後に細胞を刺激分子で刺激する。適当な刺激分子には、例えば、ＣＤ１５４の細胞外ドメインに特異的に結合する抗体が含まれうる。好適な刺激分子には、抗ヒトＣＤ４０抗体Ｇ２８−５、可溶性ＣＤ１５４、膜結合性ＣＤ１５４(例えば、細胞の原形質膜に結合したＣＤ１５４又は合成の脂質ベースの基質例えばリポソーム又はミセルに組み込まれたＣＤ１５４)及びこれらの混合物が含まれるが、これらに限られない。細胞に加えるべき刺激分子の適当な量は、用いるリガンドの種類(例えば、単量体か又は多量体か；透過性など)及び細胞上のレセプターの豊富さなどの因子に依存する。好ましくは、約１．０ｎＭ〜１ｍＭのリガンドを細胞に加える。
【００８２】
ＣＤ１５４の可溶性形態を、公知の原核及び真核生物系において(好ましくは、哺乳動物細胞培養物中で)、組換えタンパク質として発現させることができ、培養上清又は細胞消化物から慣用の方法により精製することができる。可溶性ＣＤ４０分子の可能な直接的な治療用途から離れて、後者は、更に又、膜結合したＣＤ１５４の相互作用をブロックするので治療的潜在能力を有することがありそうな他の物質の同定のために使うこともできる。これは、例えば、無細胞レセプター結合アッセイ(ＥＰ−Ａ−０４８８１７０)において起こりうる(該アッセイにおいては、可溶性ＣＤ４０分子は、固相上に存在し、可溶性ＣＤ１５４の結合の後に、適当な標識手段又は抗体を結合させる)。この種のアッセイは、それらの自動化の可能性の故に、多数の物質を、ＣＤ１５４との相互作用について調べるための手段を提供する(レセプタースクリーニング)。
【００８３】
本発明の方法は、推定の調節化合物がＣＤ１５４活性化を調節することができるかどうかを決定することを含む。かかる方法は、実施例部に詳細に記載したアッセイを含む。本発明の方法は、毒性試験を実施して推定の調節化合物の毒性を決定するステップを更に含むことができる。
【００８４】
本発明の他の面は、細胞における炎症活性のＣＤ４０調節を調節することのできる化合物を同定するためのキットを含む。かかるキットは、次を含む：(１)ＣＤ１５４タンパク質を含む細胞；及び(２)ＣＤ１５４タンパク質の調節を検出する手段。かかるＣＤ１５４タンパク質の調節を検出するための手段は、当業者に公知の方法及び試薬を含み、例えばＣＤ１５４活性を例えば実施例２に記載の活性化アッセイを利用して検出することができる。ｐ３８ＭＡＰＫタンパク質の調節を検出する手段及び血小板活性化の指示も又、当業者に公知の方法及び試薬を含む。本発明のキットでの使用に適した細胞には、ここに詳述する細胞が含まれる。キットでの使用のための好適な細胞は、ヒトの細胞である。
【００８５】
本発明は又、推定の調節化合物が哺乳動物における生物学的応答を調節することができるかどうかに関する測定をも含む。かかる方法は、推定の調節化合物の動物への投与を必要とし、かかる化合物は、本発明のアッセイを利用して、細胞におけるＣＤ１５４活性を調節することが示される。かかる測定は、推定の調節化合物を動物に治療用組成物として投与することのできる条件を決定するのに有用である。従って、動物において化合物を試験するためにここに述べた条件を、本発明の治療用組成物を投与する際に利用することができるということは、本発明の範囲内にある。特に、推定の調節化合物は、その化合物が例えば動物における炎症応答、感染性因子に対する応答、自己免疫応答、代謝応答、心臓血管応答、アレルギー応答及び／又は異常細胞増殖応答を調節することができるかどうかを決定するために動物に投与することができる。推定の調節化合物を投与してその化合物の効力を試験するための許容しうるプロトコールには、個々の投与量サイズ、投与回数、投与頻度及び投与方法が含まれる。かかるプロトコールの決定は、当業者により達成されうる。適当な単一投与量は、適当な期間(例えば、数分から数週間)にわたって少なくとも一回投与した場合に、動物における生物学的応答を変えることのできる投与量である。好ましくは、投与量は、体重１キログラム当たり化合物約１ｎｇ(ｎｇ／ｋｇ)から体重１キログラム当たり化合物約１グラム(ｇ／ｋｇ)、一層好ましくは、約１００ｎｇ／ｋｇ〜約１００ミリグラム／キログラム(ｍｇ／ｋｇ)、尚一層好ましくは、体重１キログラム当たり化合物約１０マイクログラム〜約１０ｍｇ／ｋｇを含む。投与方法には、噴霧化、皮下、直腸、皮内、静脈、鼻腔、口腔、経皮及び筋肉経路が含まれるが、これらに限られない。
【００８６】
推定の調節化合物を、他の成分例えば製薬上許容しうる賦形剤及び／又はキャリアーと組み合わせてから、動物に投与することができる。かかる賦形剤の例には、水、塩溶液、リンゲル液、デキストロース溶液、ハンクス溶液及び他の生理的食塩水が含まれる。非水系ビヒクル例えば固定油、胡麻油、エチルオレエート、又はトリグリセリドも又、用いることができる。他の有用な配合物には、増粘剤例えばナトリウムカルボキシメチルセルロース、ソルビトール又はデキストランを含む懸濁液が含まれる。賦形剤は又、少量の添加剤例えば等張性及び化学的安定性を増強する物質を含むこともできる。緩衝剤の例には、リン酸塩緩衝剤、重炭酸塩緩衝剤及びトリス緩衝剤が含まれ、防腐剤の例には、チメロサール、ｍ−又はｏ−クレゾール、ホルマリン及びベンジルアルコールが含まれる。標準的配合物は、注射可能な液体であっても、注射用懸濁液又は溶液として適当な液体に溶解させることのできる固体であってもよい。キャリアーは、典型的には、治療される動物における化合物の半減期を増大させる化合物である。適当なキャリアーには、高分子の制御された放出用ビヒクル、生物分解性インプラント、リポソーム、細菌、ウイルス、油、エステル、及びグリコールが含まれるが、これらに限られない。好適な制御された放出用配合物は、本発明の組成物を動物にゆっくりと放出することができる。適当な制御された放出用ビヒクルには、生体適合性ポリマー、他のポリマーマトリクス、カプセル、マイクロカプセル、マイクロパーティクル、ボーラス製剤、浸透圧ポンプ、拡散デバイス、リポソーム、リポスフェア及び経皮的送達システムが含まれるが、これらに限られない。本発明の他の制御された放出用ビヒクルには、動物への投与に際して固体又はゲルをその場で形成する脂質が含まれる。好適な制御された放出用ビヒクルは、生物分解性である(即ち、生物浸食性)。
【００８７】
他の具体例において、本発明は、動物において毒性試験を行なって、推定の調節化合物の毒性を測定することを含む。推定の調節化合物の毒性試験は、例えば、推定の調節化合物が細胞レベルでシグナル変換例えば細胞の炎症応答の調節に対する効果を有することが測定された後に、動物において実施することができる。かかる毒性試験は、当業者の技能の内にあり、一般に、イン・ビボ又はイン・ビトロでの化合物の毒性を試験することを含む。推定の調節化合物の毒性をイン・ビボで試験する適当な方法は、推定の調節化合物の数匹の動物への科学的に制御された投与及びこの化合物の動物の生物学的機能の様々な面に対する効果(例えば、組織の損傷の出現、臓器の機能及び死)に注目する一定期間の観察を含むことができる。推定の調節化合物の毒性をイン・ビトロで試験するのに適した方法は、推定の調節化合物の細胞への科学的に制御された投与及びその後の細胞機能、細胞傷害性又は細胞死の測定を含むことができる。細胞機能は、広範なアッセイの何れか一つによって測定することができ、その幾つかはここに開示してあるが、当業者には明らかであろう(例えば、チロシンリン酸化、カルシウム流動化及びホスホイノシトールアッセイ)。細胞毒性を測定する方法は、当分野で周知であり、色素産生基質例えばテトラゾリウムベースのＭＴＴ又はスルホローダミンブルーを還元する能力の測定、ＡＴＰ−生物発光アッセイ及び多くの他の容易に利用可能なアッセイ(例えば、Bellamy, Drugs 44(5):690-708,1992参照、これらを参考としてそのまま本明細書中に援用する)の内で例えば蛍光グリーンタンパク質を利用する蛍光アッセイが含まれる。細胞死を測定する方法には、例えば、クーマシーブルー染色、アクリジンオレンジ染色、ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ(ＴＤＴ)アッセイ(ＤＮＡ断片化測定用)、ニュートラルレッド排除、及びフローサイトメーターにおける前方光散乱の変化の測定が含まれる。
【００８８】
本発明の方法により発現された実質的に純粋なタンパク質を、当業者に周知の免疫診断アッセイ法において利用することができる。該免疫診断アッセイ法には、放射免疫アッセイ(ＲＩＡ)、酵素免疫アッセイ(ＥＩＡ)及び酵素結合免疫吸着アッセイ(ＥＬＩＳＡ)が含まれる。本発明の実質的に純粋なタンパク質(可溶性)は、単独で投与してもよいし、本発明の他のタンパク質又はヒトを含む動物における免疫関連疾患の治療のためのリンホカイン及びモノカイン又は薬物を含む他の薬剤と組み合わせて投与してもよい。本発明の実質的に純粋なタンパク質による治療から利益を得ることのできる病気の例としては、免疫不全疾患、即時型過敏症、喘息、過敏性肺炎、免疫複合体病、脈管炎、全身性エリテマトーデス、リウマチ様関接炎、免疫病理学的腎臓傷害、急性及び慢性の炎症、溶血性貧血、血小板疾患、形質細胞及び他の細胞の新生物、アミロイドーシス、寄生虫病、多発性硬化症、ギラン−バレー症候群、急性及び亜急性の筋性麻痺、重症筋無力症、免疫内分泌障害、並びに組織及び臓器移植の拒絶を挙げることができる(これらすべては、Petersdorf等編、Harrison's Principles of Internal Medicine, 前出に記載されており、Weir編、前出；Boguslaski等編、前出；及びHolborow等編、前出も参照されたい)。
【００８９】
免疫療法に用いる場合、本発明のタンパク質は、未標識であっても、治療剤で標識してあってもよい。免疫療法のためにこの発明のタンパク質と結合させることのできる治療剤の例は、薬物、放射性同位体、レクチン及びトキシンである。
【００９０】
本発明のタンパク質の投与のための投与量範囲は、所望の免疫療法の効果を生じるだけ十分大きいが、有害な副作用例えば望ましくない交叉反応、アナフィラキシー反応などを引き起こすほどには大きくないものである。一般に、使用する投薬量は、年齢、状況、性別、及び患者の病気の程度によって変化する。禁忌(もしあるならば)、免疫寛容及び他の変数も又、適当な投薬量に影響を及ぼす。投与は、非経口であってよく、経時的な注射又は漸進的潅流によるものでよい。投与は又、静脈投与、腹腔内投与、筋肉内投与、皮下投与又は皮内投与であってもよい。
【００９１】
非経口投与のための製剤には、無菌の又は水性若しくは非水性溶液、懸濁液及び乳濁液が含まれる。非水性溶媒の例には、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油例えばオリーブ油、及び注射可能な有機エステル例えばエチルオレエートが含まれる。水性キャリアーには、水、アルコール溶液及び水溶液、乳濁液又は懸濁液(塩溶液及び緩衝媒質を含む)が含まれる。非経口投与用ビヒクルには、塩化ナトリウム溶液、リンゲルのデキストロース、デキストロース及び塩化ナトリウム、乳酸加リンゲル液又は固定油が含まれる。静脈内ビヒクルには、液体及び栄養補充液、電解質補充液例えばリンゲルのデキストロースに基づくものなどが含まれる。防腐剤及び他の添加剤例えば抗菌剤、抗酸化剤、キレート剤、不活性ガスなども又、存在してよい。かかる製剤並びにそれらの製造方法は、公知であり、例えば、Remington's Pharmaceutical Science, 第16版、前出に記載されている。
【００９２】
本発明のタンパク質は又、これらのタンパク質を単独で又は他のタンパク質若しくは他の薬剤と組み合わせて含む医薬又は医薬組成物として製造することもでき、該薬剤は、リンホカイン、モノカイン、及び薬物などであり、該医薬は、ヒトを含む動物の免疫関連適応症の治療に用いられる。
【００９３】
本発明のタンパク質は、単独で投与できるが、それらは、医薬組成物として投与するのが好ましい。本発明の組成物は、少なくとも一種類のタンパク質又はその製薬上許容しうる塩を、少なくとも一種類の許容しうるキャリアー及び適宜他の治療剤と共に含む。「許容しうる」とは、薬剤又はキャリアーが、組成物の他の成分と相容性であり且つ患者に対して有害でないことを意味する。組成物は、経口投与、直腸投与、鼻腔投与、局所投与(頬及び舌下を含む)、膣投与、又は非経口投与に適したものを含む。これらの組成物は、慣用的に、単位投薬形態で与えられて、製薬分野で周知の方法によって製造することができる。かかる方法は、活性成分を少なくとも一種の補助的成分を構成するキャリアーと合わせることを含む。一般に、組成物は、活性成分を液体キャリアー若しくは微粉末化固体キャリアー又は両者と一様に且つ完全に合わせて、そうして生成された生成物を所望であれば付形することにより調製される。
【００９４】
経口投与された本発明の医薬組成物は、それぞれ予め決めた量の活性成分を含むカプセル、カシェ剤、又は錠剤を含む任意の慣用の形態であってよい。粉末又は顆粒並びに水性又は非水性液体中の溶液又は懸濁液或は水中油液体乳濁液又は油中水液体乳濁液も又、可能である。活性成分は又、巨丸剤、舐剤又はペーストとして与えることもできる。
【００９５】
本発明の他の具体例は、免疫グロブリン重鎖クラススイッチング、サイトカイン産生又は炎症細胞活性化よりなる群から選択する細胞機能を調節する方法であって、ＣＤ１５４タンパク質の活性を調節することを含む当該方法を含む。かかるタンパク質の活性の調節は、ＣＤ１５４タンパク質を不活性複合体に封鎖し、ＣＤ１５４のリガンド結合活性を調節することにより、及びこれらの組み合わせによって達成することができる。
【００９６】
ＣＤ１５４タンパク質を不活性な複合体に封鎖するための適当な化合物には、ＣＤ１５４タンパク質がＣＤ４０と相互作用する部位を真似る化合物が含まれる。ＣＤ１５４の結合活性を調節するのに適した化合物には、ＣＤ１５４に対する細胞外リガンドのＣＤ４０アンタゴニストが含まれる。
【００９７】
ＣＤ１５４タンパク質をコードする内因性及び／又は異種核酸分子の発現を調節するのに適した方法には、当業者に公知の方法が含まれる。例えば、アンチセンス−、三重鎖形成−、リボザイム−及び／又はＲＮＡ薬物ベースの技術における使用に適したオリゴヌクレオチドを利用して、ＣＤ１５４タンパク質をコードする内因性核酸分子の発現を減じることができる。それ故、本発明は、かかる技術の少なくとも一つを利用することにより、ＣＤ１５４タンパク質の産生を邪魔するかかるオリゴヌクレオチド及び方法を含む。適当な発現ベクターは、トランスフォームされる細胞型に基づいて、当業者によって開発されうる。
【００９８】
本発明によれば、「ミメトープ」は、本発明の調節試薬の能力を真似ることのできる任意の化合物をいう。ミメトープは、分解されやすさを減じるように改変されたが、未だ調節活性を保持しているペプチドであってよい。ミメトープの他の例には、タンパク質ベースの化合物、炭水化物ベースの化合物、脂質ベースの化合物、核酸ベースの化合物、天然の有機化合物、合成により誘導された有機化合物、及び抗イディオタイプ抗体及び／又は触媒抗体、又は所望の調節活性を有するこれらの断片が含まれるが、これらに限られない。ミメトープは、例えば、天然の及び合成の化合物のライブラリーを、ここに開示したように、ＣＤ１５４の活性を変えることのできる化合物についてスクリーニングすることにより得ることができる。ミメトープは、例えば、合理的な薬物のデザインによっても得ることができる。合理的な薬物デザインの手順において、本発明の化合物の３次元構造を、例えば、核磁気共鳴(ＮＭＲ)又はＸ線結晶構造解析によって分析することができる。次いで、この３次元構造を利用して、例えば、コンピューターモデリングによって、潜在的なミメトープの構造を予想することができる。次いで、予想されたミメトープ構造を、例えば、化学合成により、組換えＤＮＡ技術により、又はミメトープを天然起源(例えば、植物、動物、細菌及びカビ)から単離することにより、生成することができる。
【００９９】
本発明の他の具体例は、動物に、免疫グロブリン重鎖クラススイッチング、サイトカイン産生又は炎症細胞活性化を含む生物学的機能を調節することのできる治療用組成物を投与することを含む。本発明の治療用組成物は、望ましくない免疫グロブリン及び／又はサイトカイン産生又は炎症細胞活性化を含む病気の予防又は治療に特に有用である。特に、治療用組成物は、アレルギー応答又は自己免疫応答を含む病気の予防又は治療に有用である。好ましくは、本発明の治療用組成物を利用して、アレルギー性過敏症、喘息、リウマチ様関節炎、全身性エリテマトーデス(ＳＬＥ)、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎及び急性気管支肺アスペルギルス症を含む病気(但し、これらに限られない)を予防し又は治療する。治療用組成物を、好ましくは、ＣＤ４０を有する細胞に投与し、一層好ましくは、プレＢ細胞、Ｂリンパ球、癌細胞、繊維芽細胞、ランゲルハンス細胞、上皮細胞、単球及び樹状細胞を含む細胞(但し、これらに限られない)に投与する。
【０１００】
様々な治療用組成物を利用して、本発明の調節方法を実施することができる。かかる治療用組成物には、ここに詳細に記載された化合物、特に、本発明の方法を利用して同定された化合物が含まれる。本発明の治療用組成物は、治療される動物が許容しうる賦形剤中に配合することができる。かかる賦形剤の例には、上で詳述したものが含まれる。細胞における重鎖クラススイッチングを調節するために、本発明の治療用組成物を、イン・ビボ(即ち、動物体内)又はエキソ・ビボ(即ち、動物の体外、例えば、組織培養)で有効な仕方で投与し、それで、この組成物は、重鎖クラススイッチングを調節することができる。
【０１０１】
有効な投与プロトコール(即ち、有効な仕方での治療用組成物の投与)は、病気の予防又は治療を生じる適当な投与量パラメーター及び方法を含む。有効な投与量パラメーター及び投与方法は、特定の病気について、その分野での標準的方法を用いて決定することができる。かかる方法は、例えば、生存率、副作用(即ち、毒性)及び病気の進行度又は緩解の測定を含む。例えば、本発明の治療用組成物の投与量パラメーター及び投与方法の有効性を、応答速度を評価することにより測定することができる。かかる応答速度は、患者の集団中の、治療を受けて部分的又は完全な緩解で応答する患者のパーセントをいう。
【０１０２】
本発明によれば、適当な単一投与量サイズは、適当な期間にわたって少なくとも一回投与した場合に、動物の病気を予防又は治療できる投与量である。投与量は、治療される病気に依って変化しうる。例えば、過敏症の治療において、適当な単一投与量は、過敏症を引き起こす免疫原の性質に依存しうる。
【０１０３】
動物に投与される投与量の数は、病気の程度及び個々の患者の治療に対する応答に依存するということは、当業者には明らかとなろう。例えば、アレルギー応答の場合、免疫原性の化合物は、一層免疫原性の低い化合物よりも一層多くの投与量を必要としうる。従って、適当な投与量の数並びに投与の間の時間は、病気を治療するのに必要な任意の数を含むということは、本発明の範囲内にある。
【０１０４】
治療用組成物は、イン・ビボ又はエキソ・ビボで又は全身に、直接細胞に投与することができる。全身投与の好適な方法には、静脈注射、噴霧、経口投与及び経皮的(局所的)送達が含まれる。静脈注射は、当分野での標準的方法を用いて行なうことができる。噴霧送達も又、当分野で標準的な方法を用いて実施することができる(例えば、Stribling等、Proc.Natl.Acad.Sci.(USA), 189:11277-11281,(1992)参照、参考として本明細書中にそのまま援用する)。経口送達は、本発明の治療用組成物を、動物の消化管内での消化酵素による分解に耐えることのできるキャリアーと複合体化することにより実施することができる。かかるキャリアーの例には、プラスチックカプセル又は錠剤(当分野で公知のものなど)が含まれる。局所送達は、本発明の治療用組成物を、皮膚を通過できる親油性試薬(例えば、ＤＭＳＯ)と混合することにより実施することができる。
【０１０５】
本発明の他の具体例は、血小板の輸血を受ける患者における炎症を予防し又は治療するために、血小板を、ｓＣＤ１５４放出を調節し又は阻止する薬剤例えばメタロプロテイナーゼインヒビターで処理する方法を含む。血小板を、貯蔵中から輸血後期間に至る様々なステージで、ＣＤ１５４インヒビターで処理することができる。血小板の処理は又、様々なステージの任意の組合せにおいて行なうこともできる。
【０１０６】
ここで用いる場合、ＣＤ４０Ｌ又はｓＣＤ４０Ｌは、ＣＤ１５４又はｓＣＤ１５４Ｌと交換可能である。ここで用いる場合、「ＣＤ１５４インヒビター」は、ＣＤ１５４又はｓＣＤ１５４のイン・ビボ、エキソ・ビボ又はイン・ビトロでの産生、分泌、放出、結合、取込み又は生物学的活性を阻害し又は減じる任意の化合物を含む。ＣＤ１５４インヒビターは又、ＣＤ１５４又はｓＣＤ１５４の分解、崩壊又は破壊を実施し、増進し、促進し、又は加速する薬剤であってもよい。好ましくは、ＣＤ１５４インヒビターは、ＣＤ１５４又はｓＣＤ１５４の産生、分泌、放出、結合、取込み又は生物学的活性を、少なくとも約１０％又は２０％阻害し又は減じ、一層好ましくは、少なくとも約３０％又は４０％阻害し又は減じ、尚一層好ましくは、少なくとも約５０％又は６０％阻害し又は減じ、更に一層好ましくは、少なくとも約７０％又は８０％阻害し又は減じ、最も好ましくは少なくとも約９０％阻害し又は減じる。
【０１０７】
ここで用いる場合、「メタロプロテイナーゼインヒビター」には、血小板刺激に際してのＣＤ１５４の加水分解に関与する酵素を阻害し、メタロプロテイナーゼ活性を阻害し、又はメタロプロテイナーゼ依存性の機構によるＣＤ１５４の開裂を阻害する任意の化合物が含まれる。メタロプロテイナーゼインヒビターの例には、Peptides International(ケンタッキー、Louisville在)より市販されているＣＤ１５４の加水分解をブロックする化合物ＴＡＰＩ(HONHCOCH2CH(CH2CH(CH3)2-CO-NaI-Ala-NHCH2CH2NH2))；Calbiochem(カリフォルニア、La Jolla在)より市販されているガラルディン、Ｎ−[(２Ｒ)−２−(ヒドロキシアミドカルボニルメチル)−４−メチルペンタノイル]−Ｌ−トリプトファンメチルアミド)；ドキシサイクリン、−６−デオキシ−５−ヒドロキシテトラサイクリン；及びＳＢ−３ＣＴ(ＭＭＰ−２／ＭＭＰ−９インヒビターＶＩ)(すべてCalbiochemから市販されている)が含まれる。他の組織から精製することができ又は組換えタンパク質として生成できる巨大分子メタロプロテイナーゼには、Calbiochemから市販されているＴＩＭＰ(tissue inhibitors of metalloproteases)例えばＴＩＭＰ−１、ＴＩＭＰ−２、ＴＩＭＰ−３又はＴＩＭＰ−４が含まれる。当業者は、容易に、用語「メタロプロテイナーゼインヒビター」は、ＴＡＰＩの生物学的特性を共有してＣＤ１５４の加水分解をブロックする任意の化合物を包含することを理解するであろう。メタロプロテイナーゼインヒビターの更なる例には、(３Ｓ)−(−)−[２−(４−メトキシベンゼンスルホニル)−１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン−３−ヒドロキサメート]、Ｎ−イソブチル−Ｎ−(４−メトキシフェニルスルホニル)−グリシルヒドロキサム酸、Ｎ−ヒドロキシ−１−(４−メトキシフェニル)スルホニル−４−ベンジルオキシカルボニルピペラジン−２−カルボキサミド、Ｎ−ヒドロキシ−１−(４−メトキシフェニル)スルホニル−４−(４−ビフェニルカルボニル)ピペラジン−２−カルボキサミド、Ｎ−ヒドロキシ−１，３−ジ−(４−メトキシベンゼンスルホニル)−５，５−ジメチル−[１，３]−ピペラジン−２−カルボキサミド、Ｎ−[(２Ｒ)−２−(ヒドロキサミドカルボニルメチル)−４−メチルペンタノイル]−Ｌ−トリプトファンメチルアミド、Ｎ−[[(４，５−ジヒドロ−５−チオキソ−１，３，４−チアジアゾール−２−イル)アミノ]カルボニル]−Ｌ−フェニルアラニンメチルエステル、Ｎ−[[(４，５−ジヒドロ−５−チオキソ−１，３，４−チアジアゾール−２−イル)アミノ]カルボニル]−Ｌ−フェニルアラニン、(２Ｒ)−[(４−ビフェニリルスルホニル)アミノ]−Ｎ−ヒドロキシ−３−フェニルプロピオンアミド、(３Ｒ)−(＋)−[２−(４−メトキシベンゼンスルホニル)−１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン−３−ヒドロキサメート]、α−[[[(４，５−ジヒドロ−５−チオキソ−１，３，４−チアジアゾール−２−イル)アミノ]カルボニル]アミノ]−Ｎ−(シクロヘキシルメチル)−(Ｓ)−ベンゼンプロパンアミド、α−[[[４，５−ジヒドロ−５−チオキソ−１，３，４−チアジアゾール−２−イル]アミノ]カルボニル]アミノ]−((２−ピリジル)ピペラジニル)−(Ｓ)−ベンゼンプロパンアミド、α−６−デオキシ−５−ヒドロキシテトラサイクリン、７−アザ−２−フェニルベンズイソチゾール−��−オン、７−ジメチルアミノ−６−デメチル−６−デオキシテトラサイクリン、ＨＣｌ、(２Ｒ)−２−[(４−ビフェニリルスルホニル)アミノ]−３−フェニルプロピオン酸、Ｎ−ｔ−ブトキシカルボニル−Ｌ−ロイシル−Ｌ−トリプトファンメチルアミド、Ｎ−[(２Ｒ)−２−(カルボキシメチル)−４−メチルペンタノイル]−Ｌ−トリプトファン−(Ｓ)−メチル−ベンジルアミド、クロルヘキシジン、ジヒドロクロリド、１，６−ビス[Ｎ−(ｐ−クロロフェニル)−Ｎ5−ビグアニド]ヘキサン、２ＨＣｌ、ＣＨＸ、ＣＬ−８２１９８、ＸＧ０７６、ビブラマイシン、ＨＣｌ、(±)−(３Ｒ，５Ｓ，６Ｅ)−７−[３−(４−フルオロフェニル)−１−イソプロピルインドール−２−イル]−３，５−ジヒドロキシ−６−ヘプテノエート、ドキシサイクリン、塩酸塩、フルバスタチン、ＦＮ−４３９、ＧＭ１４８９、ＧＭ６００１、ＭＭＰインヒビターＩ、ＭＭＰインヒビターII、ＭＭＰインヒビターIII、ＭＭＰインヒビターIV、ＭＭＰインヒビターセットＩ、ＭＭＰ−２インヒビターＩ、ＭＭＰ−２／ＭＭＰ−３インヒビターＩ、ＭＭＰ−２／ＭＭＰ−３インヒビターII、ＭＭＰ−２／ＭＭＰ−３インヒビターIII、ＭＭＰ−２／ＭＭＰ−３インヒビターIV、ＭＭＰ−３インヒビターＩ、ＭＭＰ−３インヒビターII、ＭＭＰ−３インヒビターIII、ＭＭＰ−３インヒビターIV、ＭＭＰ−３インヒビターＶ、ＭＭＰ−３インヒビターVI、ＭＭＰ−８インヒビターＩ、ＭＭＰ−９／ＭＭＰ−１３インヒビターＩ、ＭＭＰ−９／ＭＭＰ−１３インヒビターII、ＮＮＧＨ、ＯＡ−Ｈｙ、シス−９−オクタデカノイル−Ｎ−ヒドロキシアミド、オレオリル−Ｎ−ヒドロキシルアミド、Ａｃ−ＲＣＧＶＰＤ−ＮＨ2、ＳＢ−３ＣＴ、ストロメリシン−１インヒビター、ビブラマイシンＨＣｌ、ＸＧ０７６、ＣＬ−８２１９８及びＨＯＮＨ−ＣＯＣＨ2ＣＨ2−ＦＡ−ＮＨ2が含まれる。好適なメタロプロテイナーゼインヒビターには、ＴＡＰＩ−１、ガラルディン、ドキシサイクリン又はＳＢ−３ＣＴ(ＭＭＰ−２／ＭＭＰ−９インヒビターVI、一層好ましくは、ＴＡＰＩ−１又はガラルディンが含まれる。最も好ましくは、本発明の方法で用いるメタロプロテイナーゼインヒビターは、患者におけるイン・ビボでの利用に適したもの例えばガラルディンである。巨大分子メタロプロテイナーゼについて、好適なインヒビターには、ＴＩＭＰが含まれ、一層好ましくは、ＴＩＭＰ−１、ＴＩＭＰ−２、ＴＩＭＰ−３又はＴＩＭＰ−４が含まれ、最も好ましくは、ＴＩＭＰ−２が含まれる。
【０１０８】
ここで用いる場合、「容器」は、全血液、巨核球、血小板、ＣＤ１５４インヒビター又はメタロプロテイナーゼインヒビターを、レシピエント又はドナーの体外で、任意の期間保存することのできる任意の容器を意味する。これは、次を含む：細胞培養皿及び／又はフラスコ；注射器；血液採集用及び／又は分離用バッグ、管、針及び／又は器具；血小板貯蔵用バッグ、試験管及び管類。この容器の列記は、単に説明のためのものであり、本発明の実施において利用することのできる容器の種類についての制限ではない。
【０１０９】
血小板を、貯蔵中にメタロプロテイナーゼインヒビターの存在下でインキュベートする場合には、メタロプロテイナーゼインヒビターを貯蔵容器に加え(容器をメタロプロテイナーゼインヒビターでコートすることにより、但し、制限はしない)、その後血小板を加えてもよいし、メタロプロテイナーゼインヒビターの容器内への無菌注射によってもよい。或は、メタロプロテイナーゼインヒビターを、既に血小板を集めて入れてある貯蔵容器に、貯蔵手順の開始前に又は該期間中何時でも加えることができる。メタロプロテイナーゼインヒビターとインキュベートした血小板を、次いで、当分野で既に慣用となっているものと同じ仕方で貯蔵することができる。好ましくは、メタロプロテイナーゼインヒビターは、貯蔵容器内に、約０．５ｎｇ／ｍｌ〜１０ｍｇ／ｍｌの濃度の血小板と共に存在する。一層好ましくは、メタロプロテイナーゼインヒビターは、貯蔵容器内に、約５ｎｇ／ｍｌ〜１ｍｇ／ｍｌの濃度の血小板と共に存在する。最も好ましくは、メタロプロテイナーゼインヒビターは、貯蔵容器内に、約５０ｎｇ／ｍｌ〜０５ｍｇ／ｍｌの濃度の血小板と共に存在する。
【０１１０】
血小板をメタロプロテイナーゼインヒビターで処理し(但し、輸血のレシピエントへの投与前に)、その後貯蔵する場合には、メタロプロテイナーゼインヒビターは、血小板を貯蔵した容器に直接加えることもできるし、血小板が貯蔵手順と患者への輸血の中間にある任意の容器に直接加えることもできる(現実の輸血用容器まで)。好ましくは、メタロプロテイナーゼインヒビターを、約０．５ｎｇ／ｍｌ〜１０ｍｇ／ｍｌの濃度での貯蔵の後に血小板に加える。一層好ましくは、メタロプロテイナーゼインヒビターを、約５ｎｇ／ｍｌ〜１ｍｇ／ｍｌの濃度での貯蔵の後に血小板に加える。最も好ましくは、メタロプロテイナーゼインヒビターを、約５０ｎｇ／ｍｌ〜０．５ｍｇ／ｍｌの濃度での貯蔵の後に血小板に加える。
【０１１１】
メタロプロテイナーゼインヒビターを直接患者に投与する場合であって、該患者が血小板輸血を受けている場合には、メタロプロテイナーゼインヒビターを、血小板の前に、血小板と同時に、又は血小板輸血後に患者に投与してよい。加えて、メタロプロテイナーゼインヒビターを患者に、血小板と同じ部位に又は異なる部位に、局所的に又は全身に、或はこれらの因子の任意の組合せにて投与することができる。メタロプロテイナーゼインヒビターを該患者に血小板の投与と同時に投与する場合には、メタロプロテイナーゼインヒビターを、血小板と同じ組成物の部分として及び／又は製薬上許容しうるキャリアーを有する別の組成物として投与することができる。
【０１１２】
メタロプロテイナーゼインヒビターを、血小板輸血のレシピエントに、様々な方法で投与することができる。かかる投与方法には、例えば、静脈、皮下、筋肉又は皮内経路による注射が含まれる。メタロプロテイナーゼインヒビターは又、付形化若しくは移植式製品を用いて又は経皮パッチによって投与することもできる。他の送達方法は、例えばメタロプロテイナーゼインヒビターの口鼻又は腸投与を包含することができる。メタロプロテイナーゼインヒビターの好適な投与方法は、迅速な有効投与量の開始及び着実な放出を可能にする放出用配合物を有する治療プロフィルを含むことができる。この列記は、例示的で非網羅的なものであり、メタロプロテイナーゼインヒビターを血小板輸血のレシピエントに投与する方法に関して、本発明に対する制限と考えるべきではない。
【０１１３】
メタロプロテイナーゼインヒビターを血小板輸血レシピエントに直接投与する場合には、その送達投薬量は、体重１ｋｇ当たり、メタロプロテイナーゼインヒビター約１ｎｇ〜約５００ｍｇの範囲にあるべきである。好ましくは、この送達投薬量は、体重１ｋｇ当たり、メタロプロテイナーゼインヒビター約１００ｎｇ〜１００ｍｇの範囲にあるべきである。一層好ましくは、この送達投薬量は、体重１ｋｇ当たり、メタロプロテイナーゼインヒビター約１０μｇ〜５０ｍｇの範囲にあるべきである。
【０１１４】
最も好ましくは、この送達投薬量は、体重１ｋｇ当たり、メタロプロテイナーゼインヒビター約１００μｇ〜２０ｍｇの範囲にあるべきである。
【０１１５】
以下の実施例を、説明の目的のために与えるが、本発明の範囲を制限することを意図するものではない。
【実施例】
【０１１６】
実施例１．凝集に際してのｓＣＤ１５４の血小板からの放出：
血小板リッチな血漿(ＰＲＰ)をヒトのドナーから、１９ゲージのバタフライによりＰＰＡＣＫ抗凝血剤(８．６ｍｌの２．１ｍＭ ＰＰＡＣＫ(Calbiochem, カリフォルニア、La Jolla在)：終濃度０．３ｍＭ)中に血液を得ることによって調製した。血液のアリコートを１５ｍｌのポリプロピレンチューブに採って、９００ｒｐｍで２０分間遠心分離した(１６０×ｇ)。この血小板リッチな血漿(ＰＲＰ)を、注意して取り出し、新しいチューブにプールした。血小板の計数を行なって記録した。次いで、３７℃のＰＲＰのアリコートを、様々な量のＩＮＴＥＲＧＩＬＩＮ(登録商標)を含む１．５ｍｌ遠心分離用チューブに加えた。凝集を開始するために、２０μＭ ＡＤＰ又は５μＭ ＴＲＡＰ６を加えて、試料を旋回装置上で、３７℃で３０分間揺り動かした。これらのチューブを、氷上に置き、直ちに４℃で１０分間、１５，０００×ｇで遠心分離した。
【０１１７】
血小板の乏しい血漿(ＰＰＰ)の上清を新しいチューブに採り、これらの試料中のｓＣＤ１５４のレベルをＥＬＩＳＡにより測定した。血小板をＡＤＰ又はＴＲＡＰ６で凝集させた場合には、ｓＣＤ１５４放出に時間依存性の増大があった。この放出は、血小板をＩＮＴＥＧＲＩＬＩＮ(登録商標)と共にインキュベートしてからアゴニストを加えた場合には、投与量依存性の様式でブロックされた。
【０１１８】
実施例２．ヒトｒｓＣＤ１５４のクローニング及び発現：
ヒトｓＣＤ１５４のｃＤＮＡを、下記のＣＤ１５４用のフォワードプライマー
(CGAATTCCTCTTCCATGGAAAACAGCTTTGAAATG；SEQ ID NO:１)及びリバースプライマー(GACTCTTCGAAGCTAGGATCCTAGGGTTA；SEQ ID NO:２)を利用して、ジャーカット細胞から単離したポリＡ ＲＮＡを逆転写することにより調製した。ヒトｓＣＤ１５４(１０８a.a〜２６１a.a.)を発現するｃＤＮＡを、ｐＤＵＡＬベクター中のＥａｍ１１０４１制限部位にクローン化した。このクローンを配列決定して、所望の配列を有することを確認した。このｃＤＮＡは、人為的に挿入されたメチオニン開始部位を有して、ＣＭＶプロモーター下で１８ｋＤａのタンパク質として発現された。ｓＣＤ１５４のｃＤＮＡを、細菌株ＢＬ２３(ＤＥ３)−ＲＩＬ中にトランスフォームして、最大の発現を得た。生育及び最適発現のための条件を標準化した。ｒｓＣＤ１５４を、細菌ペレットを超音波処理により溶解させ、その溶解物を２回のイオン交換クロマトグラフィー及び１回のゲル濾過にかけることによって精製した。配列決定は、精製されたタンパク質が実際にｓＣＤ１５４であることを確認した。
【０１１９】
実施例３．細菌により発現されたヒトｒｓＣＤ１５４の生物学的機能：
本発明の研究における炎症は、培養内皮細胞における組織因子のアップレギュレーションによって測定した。内皮細胞は、血液に晒される最も豊富な細胞であり且つＣＤ１５４、ＣＤ１５４のリガンドを発現することが知られている(Yellin, MJ, J.Exp Med, 182: 1857(1995))ので、研究用に選択した細胞であった。組織因子は、このタンパク質はＣＤ１５４に応答してアップレギュレートされること(Slupsky, JR, Thromb.Haemost., 80:1008(1998))、アテローム性動脈硬化病変の発達のすべての発達ステージに局在していること(Wilcox, JN, Proc.Natl.Acad.Sci.(USA),86:2839(1989)；Annex, BH, Circulation, 91:619(1995))及び血栓症を開始することが知られているので、炎症のマーカーとして選択した。
【０１２０】
Clonetics Inc.から購入したヒトの臍静脈内皮細胞(ＨＵＶＥＣＳ)を、２０％ ＦＢＳ、５０μｇ／ｍｌ内皮有糸分裂誘起物質(Biomedical technologies Inc.)２ｍＭ グルタミン、１ｍＭ ピルビン酸ナトリウム、１×非必須アミノ酸、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン／ストレプトマイシン及び１００μｇ／ｍｌ ヘパリンを含むＭ１９９中で培養した。０．７５％ウシ皮膚ゼラチン(Sigma Chemicals)でコートした６ウェル皿又は９６ウェル組織培養プレート中で生育したＨＵＶＥＣＳ(３〜５回継代)を、種々の濃度(１００ｎｇ〜１０μｇ／ｍｌ)のｒｓＣＤ１５４を伴って又は伴わないで、ＴＲＡＰ−１(ｈＣＤ１５４に対するモノクローナル抗体、BD Pharmingen)又はＭＯＰＣ−２１(マウスＩｇＧ、Sigma)の存在下で、４時間、３７℃で、タイロード−Ｈｅｐｅｓ緩衝液(１２ｍＭ ＮａＨＣＯ３、１３８ｍＭ ＮａＣｌ、５．５ｍＭ グルコース、２．９ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、１ｍＭ ＣａＣｌ2、１ｍＭ ＭｇＣｌ2、ｐＨ７．４)中でインキュベートした。可溶性ＣＤ１５４加水分解生成物の放出は、３０分までリニアーであった。データにおいて(示してない)、ＴＲＡＰ凝集した血小板由来の血小板当たりの放出されたｓＣＤ１５４の量からなる測定値に加えて、測定値は、ＰＰＡＣＫ抗凝血処理した血漿中のＡＤＰ凝集した血小板由来の血小板当たりの放出されたｓＣＤ１５４の量からなった。糖タンパク質IIb-IIIaアンタゴニストＩＮＴＥＧＲＩＬＩＮ(登録商標)(エプチフィバチド；Millennium Pharmaceuticals, Inc.)による血小板凝集の阻止は、トロンビン又はＴＲＡＰ誘導されたＣＤ１５４の表面発現又はトロンボスポンジンの放出に影響を及ぼさなかったが、このＧＰ IIb-IIIaアンタゴニストは、ＡＤＰにより活性化された血小板及びＴＲＡＰにより活性化された血小板における可溶性ＣＤ１５４の放出を阻止した。
【０１２１】
上清を集めて、ＭＣＰ−１の濃度をＥＬＩＳＡにより測定した。組織因子の発現を、９６ウェルプレートにてＨＵＶＥＣＳを用いて実施する凝固アッセイによって測定した。凝集した血小板からの培地は、ヒトの臍静脈内皮細胞において組織因子の発現を誘導することが見出され、可溶性形態のＣＤ１５４は、この活性の幾らかの原因であることが見出された。ＩＣＡＭ−１及びＥ−セレクチンの発現を、ＦＡＣＳ分析(ＦＡＣＳｏｒｔ，Beckton Dickinson)とその後のそれらの皿からのＨＵＶＥＣＳの放出により測定した。ＨＵＶＥＣＳは、２μｇ/ｍｌ ｒｓＣＤ１５４に晒された場合、４時間後に３倍のＭＣＰ−１を分泌し、この増加は、抗ＣＤ１５４抗体によりブロックされたが、イソ型マッチの対照用抗体によってはブロックされなかった。凝固アッセイにより測定されたように、凝固時間の５０％の減少があり、これは、ＴＲＡＰ−１の存在下では逆転した。やはり、ＣＤ１５４の表面発現の変化が、ＦＡＣＳ分析により測定され、これは、２μｇ／ｍｌのｒｓＣＤ１５４によって２倍のＩＣＡＭ−１及びＥ−セレクチンの増大した発現があることを示した(これは、ＴＲＡＰ−１によりブロックされた)。
【０１２２】
この実施例においては、ＴＲＡＰ(血小板をＰＡＲ１トロンビンレセプターを介して刺激する強力な血小板アゴニスト)で洗浄した血小板の凝集中のＣＤ１５４破壊及び見かけ分子量の変化を測定した。前に記載されたように、ＣＤ１５４は、未刺激血小板においては、３３／３１ｋＤａのダブレットとして存在する。しかしながら、血小板凝集は、ＣＤ１５４の加水分解を誘導することが見出され、該加水分解は、未刺激血小板で見出される３３／３１ｋＤａのダブレットを可溶性の１８ｋＤａの生成物へと変換させる。この１８ｋＤａの加水分解断片を、遠心分離により凝集血小板を除去した後の上清において回収した。５μＭの血小板糖タンパク質IIb-IIIaアンタゴニスト(ＩＮＴＥＧＲＩＬＩＮ(登録商標))の含有による血小板凝集の阻止は、ＣＤ１５４の加水分解及び可溶性の１８ｋＤａの加水分解断片の出現を防止した。このＣＤ１５４放出の阻止は、ＴＲＡＰ誘導されたトロンボスポンジンの放出に影響することなく起きた(データは示さない)。類似のデータが、血小板をトロンビンで刺激したときに得られた。前に示されたように、血小板刺激は、顕著なＣＤ１５４の表面発現の増進を引き起こした。この増進は、ＩＮＴＥＧＲＩＬＩＮ(登録商標)の含有によっては影響されなかった。
【０１２３】
これらの結果は、細菌により発現されたｒｓＣＤ１５４が生物学的に活性であることを示している。この活性は、ＴＲＡＰ−１(以前に、ブロッキング抗体として示された)によりブロックされた。これらの実験の結果は、血小板凝集が、開裂した可溶性形態のＣＤ１５４を放出し、これは、血管内皮細胞において炎症性応答を生成することができることを示している。ＧＰ IIb-IIIaアンタゴニズムは、血小板が強力なアゴニストにより活性化される場合でさえも、可溶性ＣＤ１５４(強力な可溶性の前炎症メディエーター)の放出の阻害の予想外の利益を有した。
【０１２４】
実施例４．ヒト血清、ＥＤＴＡ血漿及びクエン酸化血漿中のｓＣＤ１５４の測定のためのＥＬＩＳＡ法の確認
ｓＣＤ１５４酵素結合免疫吸着アッセイ(ＥＬＩＳＡ)を、ヒトの血清、ＥＤＴＡ血漿及びクエン酸化血漿におけるｓＣＤ１５４の定量的検出に利用した。これらのｓＣＤ１５４試料を、ＥＬＩＳＡプレート中で、抗ｓＣＤ１５４モノクローナル抗体でコートされたウェルを用いてインキュベートして遊離のｓＣＤ１５４を捕捉し、ＨＲＰ結合体化モノクローナル抗ｓＣＤ１５４抗体を用いて、捕捉されたｓＣＤ１５４の存在を検出する。結合したＨＲＰ結合体の検出は、テトラメチルベンジジン(基質)とペルオキシドを加えて４５０ｎｍでの吸光度を測定することにより達成する。
【０１２５】
ヒトｓＣＤ１５４のＥＬＩＳＡでの定量の下限は、０．１５６ｎｇ／ｍｌである。血清方法は、アッセイ間の正確さ範囲８５．０〜９３．３％及びアッセイ間の精度７．７８〜１０．５％ ＱＣ試料のＲＳＤ公称値(１．００〜９．００ｎｇ／ｍｌ)を有する。ＥＤＴＡ血漿法は、アッセイ間の正確さ範囲９７．１〜１１５．０％及びアッセイ間精度７．３４〜１２．５％ＱＣ試料のＲＳＤ公称値を有する。クエン酸血漿法は、アッセイ間の正確さ範囲８６．３〜１０４．８％及びアッセイ間精度６．１５〜２１．４％ＱＣ試料のＲＳＤ公称値を有する。このアッセイは、０．１５６〜１０．０ｎｇ／ｍｌの分析範囲でリニアーである。
【０１２６】
このｓＣＤ１５４ＥＬＩＳＡ法は、糖タンパク質IIb-IIIa阻害治療を受けている患者でｓＣＤ１５４を研究するために適用されてきた。この方法は、３つのすべてのヒトマトリクスにおける臨床試料の分析において丈夫であることが分かっており、血小板凝集に対するこれらの糖タンパク質IIb-IIIaインヒビターの機能及び冠状動脈疾患におけるｓCD１５４の役割を研究する他の試みにおいて利用されよう。
【０１２７】
実施例５．ＣＤ１５４を欠くマウスにおける動脈血栓形成：
血栓形成におけるＣＤ１５４の役割を、野生型(ＷＴ)マウスを血栓症を減じてあるＣＤ１５４−／−マウスと比較するモデルを用いて研究した。このモデルにおいて、２０μｍを超える直径の血栓の形成に要する時間は、ＷＴマウスと比較してＣＤ１５４−／−において有意に増加していないが、驚くべきことに、閉塞に要する時間は、有意に増加することが見出された。閉塞時間は、ＣＤ１５４−／−マウスにおいて野生型におけるそれの約２倍であるということが認められた(他の如何なる治療効果も除く)。
【０１２８】
この実施例において、可溶性ＣＤ１５４の組換え型をＣＤ１５４−／−マウスに注入した。血栓形成を、下記のモデルを利用して評価した。
【０１２９】
研究を実施するために、マウス腸間膜の生体顕微鏡観察用の血栓症モデル(Denis等、PNAS, 95:9524-9, (1998))を利用した。ＦｅＣｌ3を用いて蛍光標識した血小板−傷害された小血管壁の相互作用(剪断速度約１３００ｓ-1)を分析した。初期の単一血小板−血管壁相互作用(血管傷害後３〜５分)、血栓(２０μＭを超える直径)の形成に要する時間、並びに血管の閉塞に要する時間を研究した。
【０１３０】
血液を、逆行静脈叢から穿刺により採取して、１０％終容積の酸−シトレート−デキストロース、３８ｍモル／Ｌ クエン酸、７５ｍモル／Ｌ クエン酸三ナトリウム及び１００ｍモル／Ｌ デキストロースを含む１ｍＬのポリプロピレンチューブ(Eppendorf； Marsh Biochemical Products, ニューヨーク、Rochester在)に集めた。血小板リッチな血漿を、２２０ｇ、７分間の遠心分離により得た。その血漿とバフィーコートを穏やかに、０．７ｍｌの洗浄用緩衝液(１２９ｍモル／Ｌ ＮａＣｌ；１３．６ｍモル／Ｌクエン酸三ナトリウム；１１．１ｍモル／Ｌデキストロース、１．６ｍモル／Ｌ ＫＨ2ＰＯ4、ｐＨ６．８)を含む新しいポリプロピレンチューブに、１μモル／Ｌプロスタグランジン(Sigma, ミズーリ、St.Louis在)の存在下で移して、１６０ｇで４分間遠心分離した。その上清を、３ｍｌの洗浄用緩衝液を含む２つのポリプロピレンチューブに移した。２０００ｇで１０分間の遠心分離の後に、ペレットを再懸濁用緩衝液(１３７ｍモル／Ｌ ＮａＣｌ；４ｍモル／Ｌ ＫＣｌ；０．５ｍモル／Ｌ ＭｇＣｌ2；０．５ｍモル／Ｌ リン酸ナトリウム；１１．１ｍモル／Ｌ デキストロース；０．１％ ウシ血清アルブミン；１０ｍモル／Ｌ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４)中に再懸濁させた。
【０１３１】
血小板を、カルセインＡＭ０．２５μｇ／ｍｌ(Molecular Probes, オレゴン、Eugene在)を用いて、１５分間、室温で蛍光標識した。蛍光血小板(５×１０9血小板／ｋｇ)を尾静脈から注入した。
【０１３２】
遺伝子型のマッチするマウス(４〜５週齢のＣ５７ＢＬ６Ｊ及びＣＤ１５４−／−)への蛍光血小板の注入直後に、動物を、２．５％ トリブロモエタノール(０．１５ｍＬ／１０ｇ)で麻酔した。腹壁を切開して腸間膜を露出させ、直径６０〜１００μｍの腸間膜動脈を研究した。剪断速度(１０００〜１３００ｓ-1)を、光学的ドップラー速度計を用いて、公知の方法(例えば、Blood, 2000年11月を参照)を利用して計算した。小動脈を、狭帯域フルオレセインイソチオシアネートフィルターセット(Chroma Technology, バーモント、Brattleboro在)及びSVHSビデオレコーダー(AG-6730; Panasonic, 日本国、Tokyo在)に接続したシリコン増強管カメラC2400(Hamamatsu, 日本国、Tokyo在)を有する100-W HBO蛍光ランプ光源(Opti Quip, ニューヨーク、Highland Mills在)を備えたツァイス(ドイツ国、Oberkochen在)Axiovert 135 倒立顕微鏡(対物レンズ３２×，０．４ＮＡ)を用いて可視化した。
【０１３３】
休止血管を２分間記録してから、フェリッククロリド(３０μｌの２５０ｍＭ溶液)を注ぎ、ビデオ記録を更に４０分間にわたって(又は、完全な閉塞が生じて１０秒より長く持続するまで)再開した。
【０１３４】
最初の２０μｍより大きい血栓の出現のための時間、血管の閉塞のための時間並びに塞栓を形成する３０μｍより大きい血栓の数を分析した。
【０１３５】
図１及び２は、ＣＤ１５４−／−マウスにおける３２００／ｓでの減少した平均血栓高さを示す潅流用チャンバーを用いて行なった実験結果を与える。これらの結果は、ＡＤＰ、コラーゲン又はトロンビンにより誘導される血小板凝集に如何なる差異をも示さない。トロンビン活性化血小板表面上のＰ−セレクチン再分布は、高剪断環境下で増大しつつある血栓上に付着している血小板の表面と同じである(潅流用チャンバー、共焦点顕微鏡観察)。データは、潅流用チャンバー内の透過性にした血栓においてＦＩＴＣ４Ｇ１０抗体を用いて観察して、比較的高い剪断速度下でコラーゲンに結合している血小板(ＷＴとＣＤ１５４−／−マウスの両方)における正常な(全体の)ホスホチロシンプロフィルを示している。
【０１３６】
この実施例において、塩化鉄を注ぐと、血小板は、野生型(ＷＴ)とＣＤ１５４−／−マウスの両方で一時的に接着した。閉塞に達する時間は、ＣＤ１５４−／−マウスにおいてＷＴと比較して有意に増加するが、血栓の開始において差異はなく、これは、ｖＷｆ−ＧＰ Ibα相互作用が接着過程に関与し、その後の血小板−血小板相互作用はＣＤ１５４の欠如に影響されないことを示唆している。低い剪断応力の環境下では、血栓形成は、ＣＤ４０Ｌ−／−マウスにおいて正常であるが、流量は増すので、ＣＤ４０Ｌ−／−マウスにおいては欠如があるということは一層ありそうなことである。これは、正常な凝集は、低剪断応力環境の血小板凝集計で行われたので、観察された正常な凝集を説明する。
【０１３７】
興味深いことには、我々は、小動脈傷害の５〜１０分前に、単一投与量のヒトｒｓＣＤ１５４(２６μｇ／マウス)の注射の後に、ＣＤ１５４−／−マウスにおける正常な血栓症の過程を再構成することができた。我々は、可溶性ＣＤ１５４の注入が、ＣＤ１５４−／−マウスにおける血栓症欠損を排除することを見出した。
【０１３８】
ＣＤ１５４−／−マウスにおいて閉塞に達する時間の増加は、高剪断速度下で形成された血栓の増大した不安定性により説明され、ヒトｒｓＣＤ１５４の外からの添加は、血栓過程を安定化させ、現在、血小板への直接的結合により作用すると考えられている。
【０１３９】
実施例６．メタロプロテイナーゼインヒビターは、血小板凝集及びｓＣＤ１５４放出を阻害する：
洗浄した血小板を、(８５ｍＭ クエン酸ナトリウム、１１１ｍＭ デキストロース及び７１ｍＭクエン酸)を０．０５μｇ／ｍｌ ＰＧＩ２と共に含むＡＣＤの１／６容に汲み入れた血液から調製した。集めた血液を１６０×ｇで、２０分間、室温で遠心分離して(Beckman GP)、ＰＲＰ層を集めた。次いで、ＰＲＰを１１００×ｇで１０分間遠心分離して、血小板を沈降させた。血小板を、一回目の洗浄用に０．０５μｇ／ｍｌ ＰＧＩ２を含むＣＧＳ(１３ｍＭ クエン酸三ナトリウム、１２０ｍＭ ＮａＣｌ、３０ｍＭ デキストロース、ｐＨ７．０)に再懸濁させることにより２回洗った。血小板の最終懸濁液(３×１０8／ｍｌ)は、タイロードＨＥＰＥＳ中であった。
ａ．血小板凝集研究のために、５００μＬの洗浄した血小板を、クロノ−Ｌｏｇ血小板凝集計中で攪拌してから、１μＭ ＴＲＡＰ６を加えて凝集を開始した。その後の試料は、ＴＲＡＰ６；０．１〜１．０μｇ／ｍｌ ＴＩＭＰ−２(Calbiochem)又は５〜５０μＭＴＡＰＩ−１(Peptides International)の添加前に洗浄した血小板に加えられた様々なメタロプロテイナーゼインヒビターを含んだ。凝集は、５分間進行し、各血小板凝集計の自動記録の振幅をＡｇｇｒｏリンクしたソフトウェアによって計算した。
ｂ．ＣＤ１５４測定を、次のように行なった：洗浄した血小板を、様々な濃度のＴＩＭＰ−２及びＴＡＰＩ−１(上記参照)と共に、３０分間、旋回装置上で揺り動かしながら、３７℃でインキュベートした。血小板又は血小板凝集物を、４℃、１５，０００×ｇで、１０分間の遠心分離によって懸濁液から取り出し、残りの上清を集めた。ｓＣＤ１５４のレベルをＥＬＩＳＡにより測定した。
【０１４０】
これらの実験において、ＴＩＭＰ−２及びＴＡＰＩ−１は、準最適濃度のＴＲＡＰ６により誘導される血小板凝集を投与量依存様式で阻止した。ＴＩＭＰ−２及びＴＡＰＩ−１は、ｓＣＤ１５４のＴＲＡＰ６刺激された血小板からの放出を阻害した。
【０１４１】
実施例７．メタロプロテイナーゼインヒビターは、ｓＣＤ１５４の活性化血小板からの放出を阻止する：
洗浄した血小板を、(８５ｍＭ クエン酸ナトリウム、１１１ｍＭ デキストロース及び７１ｍＭクエン酸)を０．０５μｇ／ｍｌ ＰＧＩ２と共に含むＡＣＤの１／６容に汲み入れた血液から調製した。集めた血液を１６０×ｇで、２０分間、室温で遠心分離して(Beckman GP)、ＰＲＰ層を集めた。次いで、ＰＲＰを１１００×ｇで１０分間遠心分離して、血小板を沈降させた。血小板を、一回目の洗浄用に０．０５μｇ／ｍｌ ＰＧＩ２を含むＣＧＳ(１３ｍＭ クエン酸三ナトリウム、１２０ｍＭ ＮａＣｌ、３０ｍＭ デキストロース、ｐＨ７．０)に繰り返し懸濁させてペレット化することにより２回洗った。血小板の最終懸濁液(５×１０8／ｍｌ)は、タイロードＨＥＰＥＳ中であった。
【０１４２】
ｓＣＤ４０Ｌの活性化血小板からの放出を、次のように測定した：５００μＬの洗浄した血小板を、穏やかに、５μＭのＴＲＡＰと混合して、揺り動かさずに３０分間３７℃でインキュベートした。この条件化で、血小板は、活性化されるが、凝集しなかった。５〜５０μＭのメタロプロテイナーゼインヒビターＧＭ６００１(ガラルディン、Calbiochem)又はＴＡＰＩ−１(Peptide International)を洗った血小板に加えてから、ＴＲＡＰを加えた。血小板を、懸濁液から、４℃、１５，０００×ｇで、１０分間の遠心分離によって取り出して、残りの上清を集めた。ｓＣＤ１５４のレベルを、ＥＬＩＳＡにより測定した。
【０１４３】
これらの実験において、ＧＭ６００１及びＴＡＰＩ−１は、ｓＣＤ１５４のＴＲＡＰ刺激された血小板からの放出を、投与量依存様式で阻止した。図３は、５０μＭのＧＭ６００１(ＧＭ)及びＴＡＰＩ−１の両者が、ｓＣＤ４０ＬのＴＲＡＰ活性化されたが凝集してない血小板からの放出を阻止したことを示している。
【０１４４】
実施例８．メタロプロテイナーゼインヒビターは、血小板におけるＣＤ４０ＬのｓＣＤ４０Ｌへの開裂を阻止する：
洗浄した血小板を、(８５ｍＭ クエン酸ナトリウム、１１１ｍＭ デキストロース及び７１ｍＭクエン酸)を０．０５μｇ／ｍｌ ＰＧＩ２と共に含むＡＣＤの１／６容に汲み入れた血液から調製した。集めた血液を１６０×ｇで、２０分間、室温で遠心分離して(Beckman GP)、ＰＲＰ層を集めた。次いで、ＰＲＰを１１００×ｇで１０分間遠心分離して、血小板を沈降させた。血小板を、一回目の洗浄用に０．０５μｇ／ｍｌ ＰＧＩ２を含むＣＧＳ(１３ｍＭ クエン酸三ナトリウム、１２０ｍＭ ＮａＣｌ、３０ｍＭ デキストロース、ｐＨ７．０)に繰り返し懸濁させてペレット化することにより２回洗った。血小板の最終懸濁液(５×１０8／ｍｌ)は、タイロードＨＥＰＥＳ中であった。
【０１４５】
ＣＤ４０ＬのｓＣＤ４０Ｌへの開裂は、血小板溶解物中での種々の形態のＣＤ４０Ｌのイムノブロッティングにより示された。完全長ＣＤ４０Ｌ(３２ｋＤ)の開裂は、１８ｋＤの可溶性形態(ｓＣＤ４０Ｌ)を生じる。５００μｌの洗った血小板を穏やかにＴＲＡＰ(５μＭ)と混合して、血小板活性化を開始した。メタロプロテイナーゼインヒビターＧＭ６００１(５０μＭ、Calbiochem)又はＤＭＳＯを洗った血小板に加えて、３７℃で、揺り動かすか又は揺り動かさないで３０分間インキュベートした。血小板は、ＴＲＡＰの存在下で揺り動かした場合には、凝集したが、揺り動かさない場合には、活性化されたが凝集しなかった。血小板を、懸濁液から、４℃、１５，０００×ｇで、１０分間の遠心分離によって取り出して、残りの血小板ペレットをローディング緩衝液に溶解させた。これらのペレット溶解物中のタンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、ニトロセルロース膜上に移して、抗ＣＤ４０Ｌ抗体(ＭＫ１３Ａ４、Alexis)を用いてブロット分析した。
【０１４６】
図４は、これらの実験において、ＴＲＡＰが、ＣＤ４０ＬのｓＣＤ４０Ｌへの開裂を、活性化血小板の試料及び血小板凝集(ａｇｇ)の両方において誘導したことを示している。ＧＭ６００１(ＧＭ)は、完全長ＣＤ４０Ｌの１８ｋＤ可溶性形態への開裂を阻止した。同じ結果が、他のメタロプロテイナーゼインヒビターＴＡＰＩ−１(Peptide International, Inc.)を用いて得られた。別の例は、対照用の不活性化合物ＧＭ１０１２(Calbiochem)が開裂に影響しないことを示した。それ故、ＣＤ４０Ｌの加水分解は、血小板におけるメタロプロテイナーゼの機能に帰せられた。
【０１４７】
実施例９．保存された血小板のメタロプロテイナーゼインヒビターとのインキュベーション：
血小板を、患者の全末梢血液から得て又は、アフェレーシスにより同種異系のドナーから分離する。血小板を、抗凝固処理したドナー血清中に当分野で標準的な折り畳める容器中の全容積５０〜７０ｍＬにつき、一定の攪拌下で、２０〜２４℃で貯蔵する。９．７ｍｇのガラルディン(５００μモルの終濃度)を、容器の注入用ポートから無菌的に加える。血小板を、血清を含むメタロプロテイナーゼインヒビター中で、最長期間少なくとも６日間(血小板貯蔵のために推奨)インキュベートする。血小板を、輸血のために有用な仕方で調製して、患者に輸血する。
【０１４８】
メタロプロテイナーゼインヒビターのＣＤ４０Ｌ放出に対する効果をモニターするために、単一ドナーに由来する５０〜７０ｍｌの濃縮血小板を、２つの等しい部分に分割して、折り畳める２つの血小板バッグ中に貯蔵した。ＤＭＳＯに溶解させたメタロプロテイナーゼインヒビターガラルディンを一方のバッグに加え、対照用のＤＭＳＯを同じドナーに由来する血小板の他のバッグに加えた。２ｍｌの血小板を、その後５日間、毎日、各バッグから採取した。これらの血小板を、上清から、２０００ｒｐｍで１０分間の遠心分離により分離した。これらの上清を、１５，０００ｒｍｐで、１０分間、卓上小型遠心機で再び遠心分離して、血漿試料を得た。これらの血小板ペレットを、溶解用緩衝液に溶解させた。血漿試料及び血小板試料の両者におけるＣＤ４０Ｌのレベルを、ＥＬＩＳＡを用いて測定した。
【０１４９】
図５は、メタロプロテイナーゼインヒビターが、貯蔵した血小板濃縮物からのＣＤ４０Ｌの血漿中への放出を減じたことを示している。同時に、メタロプロテイナーゼインヒビターの存在下で、貯蔵中に血小板中に残っている一層高いＣＤ４０Ｌレベルがあった(図６)。
【０１５０】
実施例１０．貯蔵した血小板のメタロプロテイナーゼインヒビターでの処理：
標準的方法により貯蔵した患者由来の又は同種異系のドナー由来の血小板を、通常の方法で輸血のために調製する。輸血のための準備中に、約９．７〜１２ｍｇのガラルディンを５００μモルの終濃度まで無菌的に加える。メタロプロテイナーゼインヒビター処理した血小板を、通常の方法で患者に輸血する。
【０１５１】
実施例１１．血小板輸血レシピエントのメタロプロテイナーゼインヒビターでの処理：
標準的方法により貯蔵した患者由来の又は同種異系のドナー由来の血小板を、通常の方法で輸血のために調製する。輸血中、ガラルディンを無菌的に輸血用器具に注入用ポートから、患者の体重１ｋｇ当たり約１０ｍｇの終濃度で注入する。何人かの患者においては、患者の体重１ｋｇ当たり約１０ｍｇのガラルディンを、約１０〜１４日間にわたって、１日当たり少なくとも３回反復投与するのが望ましい。
【０１５２】
実施例１２．ＣＤ１５４の高剪断応力下での血小板凝集に対する効果：
ＣＤ１５４の高剪断応力条件下での血小板凝集に対する効果を評価した。組換えＣＤ１５４(ｒＣＤ１５４又はｒＣＤ４０Ｌ)を、フィブリノーゲン(Ｆｇ)と、血栓形成能力並びにＦｇと共同して血栓を形成する能力について比較した。対照もＣＤ１５４を含んだが、ＫＧＤ インテグリリン(登録商標)認識配列をＫＧＥ(ＣＤ１５４(ＫＧＥ)又はＣＤ４０(ＫＧＥ))に突然変異させた。簡単にいえば、１２７μｍの高さの流路を有するシリコーンガスケットを平らな潅流用チャンバー(Glycotech, メリーランド、Rockville在)とタンパク質でコートしたペトリ皿の間に記載されたように置いた(Andre, P.等、Nature Medicine, 8:247-252(2002))。ペトリ皿をｒＣＤ４０Ｌ、フィブリノーゲン(Ｆｇ)、ｒＣＤ４０Ｌ＋Ｆｇ、変異したＣＤ４０Ｌ(ＣＤ４０Ｌ(ＫＧＥ))、ＣＤ４０Ｌ(ＫＧＥ)＋Ｆｇでコートした。一具体例において、糖タンパク質IIb/IIIaアンタゴニストインテグリリン(登録商標)(２μＭ)を全血液とインキュベートしてからｒＣＤ４０Ｌでコートした表面上に潅流させた。ＦｇをｒＣＤ４０Ｌ又はＣＤ４０Ｌ(ＫＧＥ)でコートした場合には、各分子は、２５μｇ／ｃｍ2で付着された。これらのタンパク質のコーティングを、スプレー法を用いて実施したが、該方法においては、２５μｌの１ｍｇ／ｍｌのタンパク質溶液をプラスチック上に修正エアブラシでコートして、２５μｇ／ｃｍ2の濃度を生じた(Houdijk, WP等、J.Clin.Invest., 75:531-540(1985))。ヒトの末梢血液を、ＰＰＡＣＫで集めて(終濃度４０μモル／Ｌ)、４分間タンパク質でコートした表面を潅流した。剪断速度１５００〜１６００／ｓ、５００〜６００／ｓ及び１００〜２００／ｓが、それぞれ、約０．６、０．２５及び０．０７５ｍｌ／分の流量で生じた。血栓の付着の測定を、シンプルＰＣＩソフトウェアイメージ分析プログラム(Technical Instrument, カリフォルニア、Burlingame在)を利用して行なった。
【０１５３】
図７は、３つの異なる剪断速度についての実験ごとの平均血栓面積の未処理データを表している。図８は、グループごとの及び剪断速度ごとの平均血栓面積を表している。統計分析(スチューデントのｔ検定)及びグラフ化を、GraphPad PRISMプログラム(GraphPad Software, Inc.、 カリフォルニア、San Diego在)を用いて行なった。平均血栓面積は、ｒＣＤ４０Ｌ及びＦｇでコートした場合に、１００〜２００／ｓ及び５００〜６００／ｓの剪断速度で増加するが、この増加は、１５００〜１６００／ｓで消失する(おそらく、Ｆｇの塞栓のため)。しかしながら、１５００〜１６００／ｓの剪断速度では、ｒＣＤ４０Ｌ単独で、凝集過程をＦｇに対して有意に増進させる。ＣＤ４０Ｌ(ＫＧＥ)は、Ｆｇの存否によらず、凝集形成を誘導しない。ｒＣＤ４０Ｌへの血小板の結合は、インテグリリン(登録商標)により阻止される。図９は、ｒＣＤ４０Ｌでコートされた表面上の平均血栓面積を剪断速度に対して表しており、平均血栓面積の剪断依存性の有意の増加を示している。
【０１５４】
本発明は、上記の実施例を参照して詳細に記載しているが、この発明の精神から離れることなく様々な改変がなされうるということは理解される。すべてのこの出願中で引用した特許、特許出願及び刊行物は、そのまま、本明細書中に参考として援用する。
【図面の簡単な説明】
【０１５５】
【図１】潅流用チャンバーを用いて行なった実験結果を示す図であり、ＣＤ４０Ｌ−／−マウスにおける減少した平均血栓高さを示している(３２００／秒)。
【図２】ＡＤＰ、コラーゲン及びトロンビンにより誘導された血小板凝集(処理集団中)の比較を示す図である。
【図３】ｓＣＤ４０Ｌ放出の減少におけるメタロプロテイナーゼインヒビターの利用を示す図である。
【図４】メタロプロテイナーゼによるＣＤ４０Ｌ開裂を示す図である。
【図５】６日間の貯蔵後における血漿中のＣＤ４０Ｌ放出の比較を示す図である。
【図６】６日間の貯蔵後における血小板のＣＤ４０Ｌ放出の比較を示す図である。
【図７】３つの異なる剪断速度について、実験ごとの平均血栓面積の未処理データを示す図である。
【図８】グループごとの及び剪断速度ごとの平均血栓面積を示す図である。
【図９】ｒＣＤ４０Ｌでコートされた表面上の平均血栓面積を剪断速度に対して示した図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004535389.tif 000069
【国際調査報告】
2004535389.tif 000070
2004535389.tif 000071
2004535389.tif 000072