(57)【要約】細胞の炎症誘発性サイトカインの放出を阻害する方法が開示される。該方法には、コリン作動薬で細胞を処置することが含まれる。該方法は、炎症性サイトカインカスケードにより媒介される症状、例えばエンドトキシンショックの危険がある患者、またはそれを患っている患者に有益である。コリン作動薬の処置は、遠心性迷走神経線維または迷走神経全体を刺激することによって達成できる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳類細胞からの炎症誘発性サイトカインの放出を阻害する方法であって、前記細胞から放出される前記炎症誘発性サイトカインの量を減少させるのに十分な量のコリン作動薬で前記細胞を処置することを含み、前記細胞はマクロファージである方法。
【請求項２】
前記炎症誘発性サイトカインは、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、インターロイキン（ＩＬ）−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−１８およびＨＭＧ−１からなる群から選択される請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記炎症誘発性サイトカインはＴＮＦである請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記コリン作動薬は、アセチルコリン、ニコチン、ムスカリン、カルバコール、ガランタミン、アレコリン、セビメリン、およびレバミゾールからなる群から選択される請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記細胞は、炎症性サイトカインカスケードにより媒介される症状を患っているか、またはその危険がある患者内にある請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記症状は、虫垂炎、消化性潰瘍、胃潰瘍、十二指腸潰瘍、腹膜炎、膵炎、潰瘍性、偽膜性、急性および虚血性の大腸炎、憩室炎、喉頭蓋炎、アカラシア、胆管炎、胆嚢炎、肝炎、クローン病、腸炎、ホイップル病、喘息、アレルギー、アナフィラキシーショック、免疫複合体疾患、臓器の虚血、再灌流傷害、臓器の壊死、枯草熱、セプシス、敗血症、エンドトキシンショック、悪液質、異常高熱症、好酸球性肉芽腫、肉芽腫症、サルコイドーシス、敗血性流産、精巣上体炎、膣炎、前立腺炎、尿道炎、気管支炎、肺気腫、鼻炎、嚢胞性線維症、肺炎、肺塵症、肺胞炎、細気管支炎、咽頭炎、胸膜炎、副鼻腔炎、インフルエンザ、呼吸器合胞体ウィルス感染、ヘルペス感染、ＨＩＶ感染、Ｂ型肝炎ウィルス感染、Ｃ型肝炎ウィルス感染、播種性菌血症、デング熱、カンジダ症、マラリア、フィラリア症、アメーバ症、包虫嚢胞、火傷、皮膚炎、皮膚筋炎、日焼け、じんま疹、いぼ、膨疹、血管炎、脈管炎、心内膜炎、動脈炎、アテローム性動脈硬化症、血栓性静脈炎、心外膜炎、心筋炎、心筋虚血、結節性動脈周囲炎、リウマチ熱、アルツハイマー病、セリアック病、鬱血性心不全、成人呼吸窮迫症候群、髄膜炎、脳炎、多発性硬化症、脳梗塞、脳卒中、ギラン−バレー症候群、神経炎、神経痛、脊髄損傷、麻痺、ブドウ膜炎、関節炎疹、関節痛、骨髄炎、筋膜炎、パジェット病、痛風、歯周病、リウマチ様関節炎、滑膜炎、重症筋無力症、甲状腺炎、全身性エリテマトーデス、グッドパスチャー症候群、ベーチェット症候群、同種移植の拒絶反応、移植片対宿主病、Ｉ型糖尿病、強直性脊椎炎、バーガー病、Ｉ型糖尿病、強直性脊椎炎、バーガー病、ライター症候群、ならびにホジキン病からなる群から選択される請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記症状は、虫垂炎、消化性潰瘍、胃潰瘍、十二指腸潰瘍、腹膜炎、膵炎、潰瘍性、偽膜性、急性および虚血性の大腸炎、肝炎、クローン病、喘息、アレルギー、アナフィラキシーショック、臓器の虚血、再灌流傷害、臓器の壊死、枯草熱、セプシス、敗血症、エンドトキシンショック、悪液質、敗血性流産、播種性菌血症、火傷、アルツハイマー病、セリアック病、鬱血性心不全、成人呼吸窮迫症候群、脳梗塞、脳卒中、脊髄損傷、麻痺、同種移植の拒絶反応、ならびに移植片対宿主病からなる群から選択される請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記症状はエンドトキシンショックである請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記コリン作動薬による前記処置は、炎症性サイトカインカスケードを阻害するのに十分な遠心性迷走神経活性を刺激することによって達成される請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
前記遠心性迷走神経活性は電気的に刺激される請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
求心性迷走神経線維は刺激されない請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
神経節または節後ニューロンは刺激される請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
迷走神経によって支配される末梢の組織または臓器は直接刺激される請求項９に記載の方法。
【請求項１４】
患者の炎症性サイトカインカスケードを阻害する方法であって、前記炎症性サイトカインカスケードを阻害するのに十分な量のコリン作動薬で前記患者を処置することを含み、前記患者は前記炎症性サイトカインカスケードにより媒介される症状を患っているか、またはその危険がある方法。
【請求項１５】
前記コリン作動薬は、アセチルコリン、ニコチン、ムスカリン、カルバコール、ガランタミン、アレコリン、セビメリン、およびレバミゾールからなる群から選択される請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記症状は、虫垂炎、消化性潰瘍、胃潰瘍、十二指腸潰瘍、腹膜炎、膵炎、潰瘍性、偽膜性、急性および虚血性の大腸炎、憩室炎、喉頭蓋炎、アカラシア、胆管炎、胆嚢炎、肝炎、クローン病、腸炎、ホイップル病、喘息、アレルギー、アナフィラキシーショック、免疫複合体疾患、臓器の虚血、再灌流傷害、臓器の壊死、枯草熱、セプシス、敗血症、エンドトキシンショック、悪液質、異常高熱症、好酸球性肉芽腫、肉芽腫症、サルコイドーシス、敗血性流産、精巣上体炎、膣炎、前立腺炎、尿道炎、気管支炎、肺気腫、鼻炎、嚢胞性線維症、肺炎、肺塵症、肺胞炎、細気管支炎、咽頭炎、胸膜炎、副鼻腔炎、インフルエンザ、呼吸器合胞体ウィルス感染、ヘルペス感染、ＨＩＶ感染、Ｂ型肝炎ウィルス感染、Ｃ型肝炎ウィルス感染、播種性菌血症、デング熱、カンジダ症、マラリア、フィラリア症、アメーバ症、包虫嚢胞、火傷、皮膚炎、皮膚筋炎、日焼け、じんま疹、いぼ、膨疹、血管炎、脈管炎、心内膜炎、動脈炎、アテローム性動脈硬化症、血栓性静脈炎、心外膜炎、心筋炎、心筋虚血、結節性動脈周囲炎、リウマチ熱、アルツハイマー病、セリアック病、鬱血性心不全、成人呼吸窮迫症候群、髄膜炎、脳炎、多発性硬化症、脳梗塞、脳卒中、ギラン−バレー症候群、神経炎、神経痛、脊髄損傷、麻痺、ブドウ膜炎、関節炎疹、関節痛、骨髄炎、筋膜炎、パジェット病、痛風、歯周病、リウマチ様関節炎、滑膜炎、重症筋無力症、甲状腺炎、全身性エリテマトーデス、グッドパスチャー症候群、ベーチェット症候群、同種移植の拒絶反応、移植片対宿主病、Ｉ型糖尿病、強直性脊椎炎、バーガー病、Ｉ型糖尿病、強直性脊椎炎、バーガー病、ライター症候群、ならびにホジキン病からなる群から選択される請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記症状は、虫垂炎、消化性潰瘍、胃潰瘍、十二指腸潰瘍、腹膜炎、膵炎、潰瘍性、偽膜性、急性および虚血性の大腸炎、肝炎、クローン病、喘息、アレルギー、アナフィラキシーショック、臓器の虚血、再灌流傷害、臓器の壊死、枯草熱、セプシス、敗血症、エンドトキシンショック、悪液質、敗血性流産、播種性菌血症、火傷、アルツハイマー病、セリアック病、鬱血性心不全、成人呼吸窮迫症候群、脳梗塞、脳卒中、脊髄損傷、麻痺、同種移植の拒絶反応、ならびに移植片対宿主病からなる群から選択される請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記症状はエンドトキシンショックである請求項１８に記載の方法。
【請求項１９】
前記コリン作動薬による前記処置は、遠心性迷走神経活性を刺激することによって達成される請求項１４に記載の方法。
【請求項２０】
前記遠心性迷走神経活性は電気的に刺激される請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
求心性迷走神経線維は刺激されない請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
神経節または節後ニューロンは刺激される請求項１９に記載の方法。
【請求項２３】
迷走神経によって支配される末梢の組織または臓器は直接刺激される請求項１９に記載の方法。
【請求項２４】
炎症性サイトカインカスケードにより媒介される症状を患っているか、またはその危険がある患者を処置するための方法であって、前記炎症性サイトカインカスケードを阻害するのに十分な前記患者の遠心性迷走神経活性を刺激することを含む方法。
【請求項２５】
前記迷走神経活性は電気的に刺激される請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記症状は、虫垂炎、消化性潰瘍、胃潰瘍、十二指腸潰瘍、腹膜炎、膵炎、潰瘍性、偽膜性、急性および虚血性の大腸炎、憩室炎、喉頭蓋炎、アカラシア、胆管炎、胆嚢炎、肝炎、クローン病、腸炎、ホイップル病、喘息、アレルギー、アナフィラキシーショック、免疫複合体疾患、臓器の虚血、再灌流傷害、臓器の壊死、枯草熱、セプシス、敗血症、ショック、悪液質、異常高熱症、好酸球性肉芽腫、肉芽腫症、サルコイドーシス、敗血性流産、精巣上体炎、膣炎、前立腺炎、尿道炎、気管支炎、肺気腫、鼻炎、嚢胞性線維症、肺炎、肺塵症、肺胞炎、細気管支炎、咽頭炎、胸膜炎、副鼻腔炎、インフルエンザ、呼吸器合胞体ウィルス感染、ヘルペス感染、ＨＩＶ感染、Ｂ型肝炎ウィルス感染、Ｃ型肝炎ウィルス感染、播種性菌血症、デング熱、カンジダ症、マラリア、フィラリア症、アメーバ症、包虫嚢胞、火傷、皮膚炎、皮膚筋炎、日焼け、じんま疹、いぼ、膨疹、血管炎、脈管炎、心内膜炎、動脈炎、アテローム性動脈硬化症、血栓性静脈炎、心外膜炎、心筋炎、心筋虚血、結節性動脈周囲炎、リウマチ熱、アルツハイマー病、セリアック病、鬱血性心不全、成人呼吸窮迫症候群、髄膜炎、脳炎、多発性硬化症、脳梗塞、脳卒中、ギラン−バレー症候群、神経炎、神経痛、脊髄損傷、麻痺、ブドウ膜炎、関節炎疹、関節痛、骨髄炎、筋膜炎、パジェット病、痛風、歯周病、リウマチ様関節炎、滑膜炎、重症筋無力症、甲状腺炎、全身性エリテマトーデス、グッドパスチャー症候群、ベーチェット症候群、同種移植の拒絶反応、移植片対宿主病、Ｉ型糖尿病、強直性脊椎炎、バーガー病、Ｉ型糖尿病、強直性脊椎炎、バーガー病、ライター症候群、ならびにホジキン病からなる群から選択される請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
前記症状は、虫垂炎、消化性潰瘍、胃潰瘍、十二指腸潰瘍、腹膜炎、膵炎、潰瘍性、偽膜性、急性および虚血性の大腸炎、肝炎、クローン病、喘息、アレルギー、アナフィラキシーショック、臓器の虚血、再灌流傷害、臓器の壊死、枯草熱、セプシス、敗血症、エンドトキシンショック、悪液質、敗血性流産、播種性菌血症、火傷、アルツハイマー病、セリアック病、鬱血性心不全、成人呼吸窮迫症候群、脳梗塞、脳卒中、脊髄損傷、麻痺、同種移植の拒絶反応、ならびに移植片対宿主病からなる群から選択される請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記症状はエンドトキシンショックである請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
求心性迷走神経は刺激されない請求項２４に記載の方法。
【請求項３０】
神経節または節後ニューロンは刺激される請求項２４に記載の方法。
【請求項３１】
迷走神経によって支配される末梢の組織または臓器は直接刺激される請求項２４に記載の方法。
【請求項３２】
患者のエンドトキシンに対する全身的な炎症応答を減弱するための方法であって、炎症性サイトカインカスケードを阻害するのに十分な、前記患者の遠心性迷走神経活性を刺激することを含む方法。
【請求項３３】
化合物がコリン作動薬であるかどうかを決定するための方法であって、前記化合物が哺乳類細胞からの炎症誘発性サイトカインの放出を阻害するかどうかを決定することを含む方法。
【請求項３４】
前記細胞はマクロファージである請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記炎症誘発性サイトカインはＴＮＦである請求項３３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
［発明の背景］
（１）発明の分野
本発明は、包括的に、炎症を低減する方法に関する。より詳細には、本発明は、炎症誘発性サイトカインまたは炎症性サイトカインカスケードによって生じる炎症を低減するための方法に関する。
【０００２】
（２）関連技術の説明
脊椎動物は、炎症誘発性経路と抗炎症性経路の活性の均衡を保つことによって、感染または傷害の間、内部恒常性を達成する。しかしながら、多くの病状では、この内部恒常性は不均衡になる。例えば、全てのグラム陰性細菌によって産生されるエンドトキシン（リポ多糖類、ＬＰＳ）はマクロファージを活性化して、致死的な可能性のあるサイトカインを放出する（４４、１０、４７、３１）。
【０００３】
炎症および他の有害な症状（エンドトキシンに曝されることで生じる敗血性ショックなど）は、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ、ＴＮＦαまたはカケクチンとしても知られる）、インターロイキン（ＩＬ）−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１８、インターフェロンγ、血小板活性化因子（ＰＡＦ）、マクロファージ遊走阻害性因子（ＭＩＦ）、および他の化合物のような炎症誘発性サイトカインによってしばしば誘発される（４２）。特定の他の化合物、例えば高移動度群タンパク質１（ＨＭＧ−１）はセプシスなどの種々の間に誘発され、これも炎症誘発性サイトカインとしての機能を果たすことができる（５７）。これらの炎症誘発性サイトカインはいくつかの異なる細胞タイプによって産生され、免疫細胞（例えば、単球、マクロファージおよび好中球）が最も重要であるが、線維芽細胞、骨芽細胞、平滑筋細胞、上皮細胞、およびニューロンなどの非免疫細胞によっても産生される（５６）。炎症誘発性サイトカインは、炎症性サイトカインカスケード中に放出されることによって、種々の障害、特にセプシスの一因となる。
【０００４】
炎症性サイトカインカスケードは、炎症およびアポトーシスを含む（３２）、多数の障害の有害な特徴の一因となる。局在的および全身的な反応の両方を特徴とする障害が含まれ、これには、胃腸管および関連組織に関する疾患（虫垂炎、消化性潰瘍、胃潰瘍、十二指腸潰瘍、腹膜炎、膵炎、潰瘍性、偽膜性、急性および虚血性の大腸炎、憩室炎、喉頭蓋炎、アカラシア、胆管炎、セリアック病、胆嚢炎、肝炎、クローン病、腸炎、ならびにホイップル病など）と、全身的または局在的な炎症性疾患および症状（喘息、アレルギー、アナフィラキシーショック、免疫複合体疾患、臓器の虚血、再灌流傷害、臓器の壊死、枯草熱、セプシス、敗血症、エンドトキシンショック、悪液質、異常高熱症、好酸球性肉芽腫、肉芽腫症、およびサルコイドーシスなど）と、泌尿生殖器系および関連組織に関する疾患（敗血性流産、精巣上体炎、膣炎、前立腺炎、および尿道炎など）と、呼吸器系および関連組織に関する疾患（気管支炎、肺気腫、鼻炎、嚢胞性線維症、成人呼吸窮迫症候群、肺炎、肺塵症、肺胞炎、細気管支炎、咽頭炎、胸膜炎、および副鼻腔炎など）と、種々のウィルス（インフルエンザ、呼吸器合胞体ウィルス、ＨＩＶ、Ｂ型肝炎ウィルス、Ｃ型肝炎ウィルスおよびヘルペスなど）、細菌（播種性菌血症、デング熱など）、真菌類（カンジダ症など）、ならびに原生動物および多細胞の寄生虫（マラリア、フィラリア症、アメーバ症、および包虫嚢胞など）による感染から生じる疾患と、皮膚科疾患および皮膚の症状（火傷、皮膚炎、皮膚筋炎、日焼け、じんま疹、いぼ、および膨疹など）と、心血管系および関連組織に関する疾患（血管炎、脈管炎、心内膜炎、動脈炎、アテローム性動脈硬化症、血栓性静脈炎、心外膜炎、心筋炎、心筋虚血、鬱血性心不全、結節性動脈周囲炎、およびリウマチ熱など）と、中枢または末梢神経系および関連組織に関する疾患（アルツハイマー病、髄膜炎、脳炎、多発性硬化症、脳梗塞、脳卒中、ギラン−バレー症候群、神経炎、神経痛、脊髄損傷、麻痺、およびブドウ膜炎など）と、骨、関節、筋肉および結合組織の疾患（種々の関節炎疹および関節痛、骨髄炎、筋膜炎、パジェット病、痛風、歯周病、リウマチ様関節炎、ならびに滑膜炎など）と、その他の自己免疫性および炎症性の障害（重症筋無力症、甲状腺炎、全身性エリテマトーデス、グッドパスチャー症候群、ベーチェット症候群、同種移植の拒絶反応、移植片対宿主病、Ｉ型糖尿病、強直性脊椎炎、バーガー病、Ｉ型糖尿病、強直性脊椎炎、バーガー病、およびライター症候群など）と、種々の癌、腫瘍および増殖性の障害（ホジキン病など）とがあるが、これらに限定はされず、いずれの場合も、初期疾患のいずれかに対する炎症性または免疫性の宿主応答である（１３、５５、３０、２０、３３、２５、１８、２７、４８、２４、７、９、４、３、１２、８、１９、１５、２３、２２、４９、３４）。
【０００５】
哺乳類は、炎症性サイトカインカスケードによって引き起こされる炎症に対して、中枢神経系の調節によってある程度応答する。この応答は、エンドトキシンへの炎症応答中の全身的な液性応答メカニズムに関して詳細に特徴付けられている（２、５４、２１、２８）。１組の応答では、エンドトキシンまたはサイトカインによって求心性迷走神経線維が活性化され、グルココルチコイドホルモン放出を通して液性抗炎症応答の放出を刺激する（５１、４１、３９）。これまでの研究によって、全身的なエンドトキシン血症およびサイトカイン血症に対する副腎皮質刺激ホルモンおよび発熱の応答を調節する求心性のループにおける重要要素として、迷走神経のシグナル伝達が果たす役割が解明された（１４、１１、５２、３５）。しかしながら、炎症を調節できる遠心性神経経路の役割については比較的ほとんど知られていない。
【０００６】
遠心性迷走神経のシグナル伝達は、ニコチン性アセチルコリン受容体の応答を介した胸腺からのリンパ球の放出を容易にすることに関与している（１）。また、臨床研究によって、ニコチン投与が炎症性腸疾患のいくつかのケースの処置では有効であり（１７、３６）、炎症性腸疾患を有する喫煙者の結腸粘膜において炎症誘発性サイトカインレベルが大幅に低下される（４０）ことも示されている。しかしながら、これらの発見はどれも、コリン作動薬が炎症性サイトカインカスケード、特にマクロファージにより媒介されるカスケードを阻害できることを示唆しないであろう。また、これらのカスケードの阻害において遠心性迷走神経刺激が有効であることは文献中にも示唆されていない。
【０００７】
［発明の概要］
したがって、本発明者は、コリン作動薬が、生体外または生体内で、哺乳類細胞からの炎症誘発性サイトカイン（ｐｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｃｙｔｏｋｉｎｅ）の放出を阻害できることの発見に成功した。この阻害効果は、多くの病状を媒介する炎症性サイトカインカスケードを阻害するために有用である。さらに、生体内でのコリン作動薬処置は、遠心性迷走神経を刺激することによって局在的または全身的な炎症性サイトカインカスケードを阻害するために達成可能である。
【０００８】
したがって、本発明の一実施形態は、哺乳類細胞からの炎症誘発性サイトカインの放出を阻害する方法に関する。該方法は、上記細胞から放出される炎症誘発性サイトカインの量を減少させるのに十分な量のコリン作動薬で上記細胞を処置することを含む。好適な実施形態では、上記細胞はマクロファージである。好ましくは、炎症誘発性サイトカインは、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、インターロイキン（ＩＬ）−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−１８およびＨＭＧ−１であり、最も好ましくは、ＴＮＦである。好適な実施形態では、コリン作動薬は、アセチルコリン、ニコチン、ムスカリン、カルバコール、ガランタミン、アレコリン、セビメリン、およびレバミゾールである。他の好適な実施形態では、上記細胞は、炎症性サイトカインカスケードにより媒介される症状を患っているか、またはその危険がある患者内にあり、好ましくは、虫垂炎、消化性潰瘍、胃潰瘍、十二指腸潰瘍、腹膜炎、膵炎、潰瘍性、偽膜性、急性および虚血性の大腸炎、憩室炎、喉頭蓋炎、アカラシア、胆管炎、胆嚢炎、肝炎、クローン病、腸炎、ホイップル病、喘息、アレルギー、アナフィラキシーショック、免疫複合体疾患、臓器の虚血、再灌流傷害、臓器の壊死、枯草熱、セプシス、敗血症、エンドトキシンショック、悪液質、異常高熱症、好酸球性肉芽腫、肉芽腫症、サルコイドーシス、敗血性流産、精巣上体炎、膣炎、前立腺炎、尿道炎、気管支炎、肺気腫、鼻炎、嚢胞性線維症、肺炎、肺塵症、肺胞炎、細気管支炎、咽頭炎、胸膜炎、副鼻腔炎、インフルエンザ、呼吸器合胞体ウィルス感染、ヘルペス感染、ＨＩＶ感染、Ｂ型肝炎ウィルス感染、Ｃ型肝炎ウィルス感染、播種性菌血症、デング熱、カンジダ症、マラリア、フィラリア症、アメーバ症、包虫嚢胞、火傷、皮膚炎、皮膚筋炎、日焼け、じんま疹、いぼ、膨疹、血管炎、脈管炎、心内膜炎、動脈炎、アテローム性動脈硬化症、血栓性静脈炎、心外膜炎、心筋炎、心筋虚血、結節性動脈周囲炎、リウマチ熱、アルツハイマー病、セリアック病、鬱血性心不全、成人呼吸窮迫症候群、髄膜炎、脳炎、多発性硬化症、脳梗塞、脳卒中、ギラン−バレー症候群、神経炎、神経痛、脊髄損傷、麻痺、ブドウ膜炎、関節炎疹、関節痛、骨髄炎、筋膜炎、パジェット病、痛風、歯周病、リウマチ様関節炎、滑膜炎、重症筋無力症、甲状腺炎、全身性エリテマトーデス、グッドパスチャー症候群、ベーチェット症候群、同種移植の拒絶反応、移植片対宿主病、Ｉ型糖尿病、強直性脊椎炎、バーガー病、Ｉ型糖尿病、強直性脊椎炎、バーガー病、ライター症候群、ならびにホジキン病である。より好適な実施形態では、上記症状は、虫垂炎、消化性潰瘍、胃潰瘍、十二指腸潰瘍、腹膜炎、膵炎、潰瘍性、偽膜性、急性および虚血性の大腸炎、肝炎、クローン病、喘息、アレルギー、アナフィラキシーショック、臓器の虚血、再灌流傷害、臓器の壊死、枯草熱、セプシス、敗血症、エンドトキシンショック、悪液質、敗血性流産、播種性菌血症、火傷、アルツハイマー病、セリアック病、鬱血性心不全、成人呼吸窮迫症候群、脳梗塞、脳卒中、脊髄損傷、麻痺、同種移植の拒絶反応、ならびに移植片対宿主病である。最も好適な実施形態では、上記症状はエンドトキシンショックである。いくつかの実施形態では���上記コリン作動薬による処置は、炎症性サイトカインカスケードを阻害するのに十分な遠心性迷走神経活性を刺激することによって達成される。好ましくは、遠心性迷走神経活性は電気的に刺激されることができる。遠心性迷走神経活性は、求心性迷走神経線維を刺激することなく刺激されることができる。神経節または節後ニューロンは刺激されることができる。さらに、迷走神経によって支配される末梢の組織または臓器は直接刺激されることができる。
【０００９】
本発明は、患者の炎症性サイトカインカスケードを阻害する方法にも関する。該方法は、炎症性サイトカインカスケードを阻害するのに十分な量のコリン作動薬で患者を処置することを含み、該患者は炎症性サイトカインカスケードにより媒介される症状を患っているか、またはその危険がある。コリン作動薬は、好ましくは、アセチルコリン、ニコチン、ムスカリン、カルバコール、ガランタミン、アレコリン、セビメリン、およびレバミゾールであり、上記症状は、好ましくは、虫垂炎、消化性潰瘍、胃潰瘍、十二指腸潰瘍、腹膜炎、膵炎、潰瘍性、偽膜性、急性および虚血性の大腸炎、憩室炎、喉頭蓋炎、アカラシア、胆管炎、胆嚢炎、肝炎、クローン病、腸炎、ホイップル病、喘息、アレルギー、アナフィラキシーショック、免疫複合体疾患、臓器の虚血、再灌流傷害、臓器の壊死、枯草熱、セプシス、敗血症、エンドトキシンショック、悪液質、異常高熱症、好酸球性肉芽腫、肉芽腫症、サルコイドーシス、敗血性流産、精巣上体炎、膣炎、前立腺炎、尿道炎、気管支炎、肺気腫、鼻炎、嚢胞性線維症、肺炎、肺塵症、肺胞炎、細気管支炎、咽頭炎、胸膜炎、副鼻腔炎、インフルエンザ、呼吸器合胞体ウィルス感染、ヘルペス感染、ＨＩＶ感染、Ｂ型肝炎ウィルス感染、Ｃ型肝炎ウィルス感染、播種性菌血症、デング熱、カンジダ症、マラリア、フィラリア症、アメーバ症、包虫嚢胞、火傷、皮膚炎、皮膚筋炎、日焼け、じんま疹、いぼ、膨疹、血管炎、脈管炎、心内膜炎、動脈炎、アテローム性動脈硬化症、血栓性静脈炎、心外膜炎、心筋炎、心筋虚血、結節性動脈周囲炎、リウマチ熱、アルツハイマー病、セリアック病、鬱血性心不全、成人呼吸窮迫症候群、髄膜炎、脳炎、多発性硬化症、脳梗塞、脳卒中、ギラン−バレー症候群、神経炎、神経痛、脊髄損傷、麻痺、ブドウ膜炎、関節炎疹、関節痛、骨髄炎、筋膜炎、パジェット病、痛風、歯周病、リウマチ様関節炎、滑膜炎、重症筋無力症、甲状腺炎、全身性エリテマトーデス、グッドパスチャー症候群、ベーチェット症候群、同種移植の拒絶反応、移植片対宿主病、Ｉ型糖尿病、強直性脊椎炎、バーガー病、Ｉ型糖尿病、強直性脊椎炎、バーガー病、ライター症候群、ならびにホジキン病である。より好ましい実施形態では、上記症状は、虫垂炎、消化性潰瘍、胃潰瘍、十二指腸潰瘍、腹膜炎、膵炎、潰瘍性、偽膜性、急性および虚血性の大腸炎、肝炎、クローン病、喘息、アレルギー、アナフィラキシーショック、臓器の虚血、再灌流傷害、臓器の壊死、枯草熱、セプシス、敗血症、エンドトキシンショック、悪液質、敗血性流産、播種性菌血症、火傷、アルツハイマー病、セリアック病、鬱血性心不全、成人呼吸窮迫症候群、脳梗塞、脳卒中、脊髄損傷、麻痺、同種移植の拒絶反応、ならびに移植片対宿主病である。最も好適な実施形態では、上記症状は、エンドトキシンショックである。コリン作動薬による処置は、遠心性迷走神経活性を刺激することによって達成されることができ、好ましくは、電気的に刺激されることができる。
【００１０】
さらなる実施形態では、本発明は、炎症性サイトカインカスケードにより媒介される症状を患っているか、またはその危険がある患者を処置するための方法に関する。該方法は、炎症性サイトカインカスケードを阻害するのに十分な上記患者の遠心性迷走神経活性を刺激することを含む。好適な刺激方法および好適な症状は、前に記載した方法によるものである。
【００１１】
さらに他の実施形態では、本発明は、患者のエンドトキシンに対する全身的な炎症応答を減弱するための方法に関する。該方法は、炎症性サイトカインカスケードを阻害するのに十分な上記患者の遠心性迷走神経活性を刺激する
【００１２】
本発明はさらに、化合物がコリン作動薬であるかどうかを決定するための方法に関する。該方法は、上記化合物が哺乳類細胞からの炎症誘発性サイトカインの放出を阻害するかどうかを決定することを含む。好適な実施形態では、上記細胞はマクロファージであり、炎症誘発性サイトカインはＴＮＦである。
【００１３】
［発明の詳細な説明］
本発明の実施には、他に指示されない限りは、当該技術の技能の範囲内で十分な、細胞培養、分子生物学、微生物学、細胞生物学、および免疫学の従来の技法が使用されるであろう。このような技法は文献に十分に説明されている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋらの「分子クローニング：実験室マニュアル」（１９８９年、Ｇｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）、Ａｕｓｕｂｅｌらの「分子生物学におけるショートプロトコル」（１９９５年、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ）、酵素学における方法（数巻）、細胞生物学における方法（数巻）、および分子生物学における方法（数巻）を参照のこと。
【００１４】
本発明は、コリン作動薬による炎症誘発性サイトカイン産生細胞の処置がその細胞からの炎症誘発性サイトカインの放出を減弱させ、炎症性サイトカインカスケード（５−６）で媒介される障害の処置においてこの減弱プロセスを利用できるという発見に基づく。さらに、遠心性迷走神経線維の刺激は、エンドトキシンショックで生じるような全身的な炎症性サイトカインカスケード（５）や、あるいは局在的な炎症性サイトカインカスケード（６）を停止させるのに十分なアセチルコリンを放出することが発見されている。また遠心性迷走神経刺激は、遠心性迷走神経線維が支配する組織および臓器における局在的な炎症性サイトカインカスケードを阻害することもできる。
【００１５】
したがって、本発明のいくつかの実施形態では、本発明は、哺乳類細胞からの炎症誘発性サイトカインの放出を阻害する方法に関する。この方法は、細胞から放出される炎症誘発性サイトカインの量を減少させるのに十分な量のコリン作動薬で細胞を処置することを含む。
【００１６】
本明細書中で使用されるように、サイトカインは、哺乳類細胞によって自然に産生され、マイクロ〜ピコモルの濃度において液性調節因子として生体内で作用する可溶性タンパク質またはペプチドである。サイトカインは、正常な状態または病的な状態の下で、個々の細胞および組織の機能的活性を調節できる。炎症誘発性サイトカインは、炎症に関連する以下の生理反応：血管拡張、充血、関連の浮腫を伴う血管の透過性増大、顆粒球および単核食細胞の蓄積、またはフィブリンの沈着、のうちのいずれでも引き起こすことができるサイトカインである。いくつかの場合には、炎症誘発性サイトカインは、ＴＮＦが心筋細胞のアポトーシスを刺激することが示された（３２、４５）慢性心不全のように、アポトーシスを引き起こすこともできる。炎症誘発性サイトカインの非限定的な例としては、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、インターロイキン（ＩＬ）−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１８、インターフェロンγ、ＨＭＧ−１、血小板活性化因子（ＰＡＦ）、およびマクロファージ遊走阻害性因子（ＭＩＦ）などがある。本発明の好ましい実施形態では、コリン作動薬処置によって阻害される炎症誘発性サイトカインは、ＴＮＦ、ＩＬ−１、ＩＬ−６またはＩＬ−１８である。なぜなら、これらのサイトカインは、マクロファージによって産生され、例えばエンドトキシンショック、喘息、リウマチ様関節炎、炎症性胆汁疾患、心不全、および同種移植の拒絶反応などの多くの重要な障害の有害な症状を媒介するからである。ほとんどの好ましい実施形態では、炎症誘発性サイトカインはＴＮＦである。
【００１７】
炎症誘発性サイトカインは、炎症のメディエータではないＩＬ−４、ＩＬ−１０およびＩＬ−１３などの抗炎症性サイトカインとは区別されるべきである。好ましい実施形態では、抗炎症性サイトカインの放出はコリン作動薬によって阻害されない。
【００１８】
多くの場合、炎症誘発性サイトカインは、哺乳類における少なくとも１つの炎症誘発性サイトカインの生体内放出としてここに定義される炎症性サイトカインカスケード内に産生され、サイトカインの放出は哺乳類の生理状態に影響を及ぼす。したがって、炎症誘発性サイトカイン放出が有害な生理状態を引き起こす本発明の実施形態において、炎症性サイトカインカスケードは阻害される。
【００１９】
炎症誘発性サイトカインを産生する哺乳類細胞はどれも、本発明の実施のために有用である。非限定的な例としては、単球、マクロファージ、好中球、上皮細胞、骨芽細胞、線維芽細胞、平滑筋細胞およびニューロンなどがある。好ましい実施形態では、細胞はマクロファージである。
【００２０】
本明細書中で使用されるように、コリン作動薬は、コリン作動性受容体活性を発現する細胞に結合する化合物である。当業者は、いくつかのよく知られた方法のいずれかによって、任意の特定の化合物がコリン作動薬であるかどうかを決定することができる。
【００２１】
炎症誘発性サイトカインまたは炎症性サイトカインカスケードの放出におけるコリン作動薬の効果、あるいは炎症性サイトカインカスケードにおける迷走神経刺激の効果に言及する場合、「阻害する」または「減少させる」という用語の使用は、少なくとも、炎症誘発性サイトカイン放出の小さいが測定可能な減少を包含する。好ましい実施形態では、炎症誘発性サイトカインの放出は、無処置のコントロールよりも少なくとも２０％阻害される。より好ましい実施形態では、阻害は少なくとも５０％であり、さらにより好ましい実施形態では、阻害は少なくとも７０％であり、最も好ましい実施形態では、阻害は少なくとも８０％である。炎症誘発性サイトカイン放出のこのような減少は、生体内の実施形態において炎症性サイトカインカスケードの有害な効果を低減することができる。
【００２２】
現在知られている、または後で発見されるコリン作動薬はどれも、哺乳類細胞からの炎症誘発性サイトカインの放出を阻害することが期待されるであろう。好ましい実施形態において、コリン作動薬は、有用な濃度では、ほかに細胞に有毒なところはない。より好ましい実施形態では、コリン作動薬は生体内で治療的に使用されているか、あるいは哺乳類細胞によって自然に産生される。非限定的な例としては、アセチルコリン、ニコチン、ムスカリン、カルバコール、ガランタミン、アレコリン、セビメリン、およびレバミゾ−ルが挙げられる。最も好ましい生体外の実施形態では、コリン作動薬はアセチルコリン、ニコチンまたはムスカリンである。生体内の実施形態では、アセチルコリンは好ましくない。というのは、この化合物は、組織中でアセチルコリンエステラーゼが広範囲にわたって発生するために、非常に急速に不活性化されることが予想されるからである。
【００２３】
本発明は、例えば、マクロファージ生物学における炎症性サイトカイン放出の効果の研究や、コリン作動薬活性についての化合物の試験のような、培養中の細胞の研究に有用である。しかしながら、生体内の適用は、多くの好ましい実施形態を構成する。これらの実施形態では、細胞は、炎症性サイトカインカスケードにより媒介される症状を患っているか、またはその危険がある患者内にある。ここで使用される場合、患者はどの哺乳類でもよい。しかしながら、好ましい実施形態では、患者はヒトである。
【００２４】
炎症性サイトカインカスケードにより媒介されるどんな症状の処置も、本発明の範囲内にある。好ましい実施形態では、症状は、マクロファージからの炎症誘発性サイトカインの放出によって炎症性サイトカインカスケードがもたらされるものである。症状は、敗血性ショックのように、炎症性サイトカインカスケードが全身反応を引き起こすものでもよい。あるいは、症状は、リウマチ様関節炎でのように、局在的な炎症性サイトカインカスケードにより媒介されてもよい。本発明を用いて有効に処置できる症状の非限定的な例には、本明細書の背景部分に列挙された症状が含まれる。好ましくは、症状は、虫垂炎、消化性潰瘍、胃潰瘍、十二指腸潰瘍、腹膜炎、膵炎、潰瘍性、偽膜性、急性または虚血性の大腸炎、憩室炎、喉頭蓋炎、アカラシア、胆管炎、胆嚢炎、肝炎、クローン病、腸炎、ホイップル病、喘息、アレルギー、アナフィラキシーショック、免疫複合体疾患、臓器の虚血、再灌流傷害、臓器の壊死、枯草熱、セプシス、敗血症、エンドトキシンショック、悪液質、異常高熱症、好酸球性肉芽腫、肉芽腫症、サルコイドーシス、敗血性流産、精巣上体炎、膣炎、前立腺炎、尿道炎、気管支炎、肺気腫、鼻炎、嚢胞性線維症、肺炎、肺塵症、肺胞炎、細気管支炎、咽頭炎、胸膜炎、副鼻腔炎、インフルエンザ、呼吸器合胞体ウィルス、ヘルペス、播種性菌血症、デング熱、カンジダ症、マラリア、フィラリア症、アメーバ症、包虫嚢胞、火傷、皮膚炎、皮膚筋炎、日焼け、じんま疹、いぼ、膨疹、血管炎、脈管炎、心内膜炎、動脈炎、アテローム性動脈硬化症、血栓性静脈炎、心外膜炎、心筋炎、心筋虚血、結節性動脈周囲炎、リウマチ熱、アルツハイマー病、セリアック病、鬱血性心不全、成人呼吸窮迫症候群、髄膜炎、脳炎、多発性硬化症、脳梗塞、脳卒中、ギラン−バレー症候群、神経炎、神経痛、脊髄損傷、麻痺、ブドウ膜炎、関節炎疹、関節痛、骨髄炎、筋膜炎、パジェット病、痛風、歯周病、リウマチ様関節炎、滑膜炎、重症筋無力症、甲状腺炎、全身性エリテマトーデス、グッドパスチャー症候群、ベーチェット症候群、同種移植の拒絶反応、移植片対宿主病、Ｉ型糖尿病、強直性脊椎炎、バーガー病、Ｉ型糖尿病、強直性脊椎炎、バーガー病、ライター症候群、もしくはホジキン病である。より好ましい実施形態では、症状は、虫垂炎、消化性潰瘍、胃潰瘍、十二指腸潰瘍、腹膜炎、膵炎、潰瘍性、偽膜性、急性または虚血性の大腸炎、肝炎、クローン病、喘息、アレルギー、アナフィラキシーショック、臓器の虚血、再灌流傷害、臓器の壊死、枯草熱、セプシス、敗血症、エンドトキシンショック、悪液質、敗血性流産、播種性菌血症、火傷、アルツハイマー病、セリアック病、鬱血性心不全、成人呼吸窮迫症候群、脳梗塞、脳卒中、脊髄損傷、麻痺、同種移植の拒絶反応、もしくは移植片対宿主病である。最も好ましい実施形態では、症状はエンドトキシンショックである。
【００２５】
コリン作動薬の投与経路は、処置すべき症状によって決まる。例えば、敗血性ショックのような全身的障害の処置では静脈注射が好ましく、胃潰瘍のような胃腸障害を処置するためには経口投与が好ましいであろう。投与すべきコリン作動薬の投与経路および投薬量は、標準の用量−応答研究と共に、過度の実験をしなくても当業者によって決定されることができる。これらの決定を行なう際に考慮すべき関連の状況には、処置すべき症状（単数または複数）、投与すべき組成物の選択、個々の患者の年齢、体重、および応答、ならびに患者の症状の重症度が含まれる。したがって、その症状に応じて、経口、非経口、経鼻、経膣、経直腸、舌側、舌下、頬側、口腔内、および経皮によって、コリン作動薬を患者に投与することができる。
【００２６】
したがって、経口、舌側、舌下、頬側、および口腔内投与のために設計されるコリン作動薬組成物は、例えば不活性な希釈剤または食用のキャリアを用いて、当該技術でよく知られた手段によって過度の実験を行なうことなく作ることができる。この組成物はゼラチンカプセルに入れられても、あるいは錠剤に圧縮されてもよい。経口治療投与の目的では、本発明の薬剤組成物は賦形剤と混和されてもよく、錠剤、トローチ、カプセル、エリキシル剤、懸濁液、シロップ、オブラート、およびチューインガムなどの形で使用できる。
【００２７】
また、錠剤、丸剤、カプセル、およびトローチなどは、結合剤、レシピエント、崩壊剤、滑沢剤、甘味剤、および香料添加剤を含有することもできる。結合剤のいくつかの例には、微結晶性セルロース、トラガカントゴムまたはゼラチンがある。賦形剤の例としては、デンプンまたはラクトースがある。崩壊剤のいくつかの例には、アルギン酸およびコーンスターチなどがある。滑沢剤の例には、ステアリン酸マグネシウムまたはステアリン酸カリウムが含まれる。流動促進剤（ｇｌｉｄａｎｔ）の一例はコロイド状二酸化ケイ素である。甘味剤のいくつかの例は、スクロース、およびサッカリンなどである。香料添加剤の例には、ペパーミント、サリチル酸メチルおよびオレンジフレーバリングなどがある。これらの種々の組成物を調製する際に使用される材料は、薬学的に純粋であり、使用される量で無毒性でなければならない。
【００２８】
本発明のコリン作動薬組成物は、例えば、静脈注射、筋肉注射、髄腔内注射または皮下注射によって、非経口で容易に投与できる。非経口投与は、本発明のコリン作動薬組成物を溶液または懸濁液中へ混和することによって達成できる。このような溶液または懸濁液は、注射用水、食塩水、不揮発性油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の合成溶媒などの滅菌した希釈剤を含むこともできる。また、非経口配合物は、例えばベンジルアルコールまたはメチルパラベンなどの抗菌剤と、例えばアスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウムなどの酸化防止剤と、ＥＤＴＡなどのキレート剤と、を含むことができる。アセテート、シトレートまたはホスフェートなどの緩衝剤、および塩化ナトリウムまたはデキストローズなどの張度の調整剤を添加してもよい。非経口製剤は、ガラスまたはプラスチックで製造されたアンプル、使い捨て注射器または複数回投与バイアルに入れることができる。
【００２９】
経直腸投与には、薬剤組成物を直腸または大腸内に投与することが含まれる。これは、座薬または浣腸剤を用いて達成できる。座薬配合物は、当該技術で知られる方法によって容易に製造できる。例えば、グリセリンを約１２０℃に加熱し、コリン作動薬をグリセリンに溶解し、加熱グリセリンを混ぜ合わせた後、精製水を添加し、熱い混合物を座薬の流し込み型に注ぐことによって、座薬配合物を調製できる。
【００３０】
経皮投与には、コリン作動薬の皮膚を通した経皮吸収が含まれる。経皮配合物には、パッチ（良く知られたニコチンパッチなど）、軟膏、クリーム、ジェル、および膏薬などが含まれる。
【００３１】
本発明には、治療的に有効な量のコリン作動薬を哺乳類へ鼻から投与することが含まれる。本明細書で使用されるように、鼻からの投与、すなわち経鼻投与とは、コリン作動薬を患者の鼻孔または鼻腔の粘膜へ投与することを含む。本発明で使用される場合、コリン作動薬の経鼻投与のための薬剤組成物には、例えば、スプレー式点鼻薬、点鼻薬、懸濁液、ジェル、軟膏、クリームまたは粉末で投与される周知の方法で調製される治療的に有効な量の作動薬が含まれる。またコリン作動薬の投与は、鼻タンポンまたは鼻スポンジを用いて行なわれても良い。
【００３２】
本発明によると、遠心性迷走神経線維を刺激することによって、コリン作動薬をアセチルコリンの形で患者に投与できることも発見されている。よく知られているように、遠心性迷走神経線維は、刺激されるとアセチルコリンを分泌する。このような刺激は、咽頭、喉頭、食道、心臓、肺、胃、膵臓、脾臓、腎臓、副腎、小腸、大腸、結腸、および肝臓を含む遠心性迷走神経分枝が支配する組織または臓器における局在的な炎症性サイトカインカスケードだけでなく、全身的な炎症性サイトカインカスケードも阻害するのに有効であるように十分なアセチルコリンを放出する。
【００３３】
炎症性サイトカインカスケードの阻害における迷走神経刺激の効果は、アセチルコリン放出によって生じるものに制限される必要はない。また本発明の範囲は、迷走神経刺激による炎症性サイトカインカスケードの阻害に対して部分的または全体的な原因となる他の任意のメカニズムも包含する。非限定的な例には、セロトニン作動薬の放出または他の神経伝達物質の刺激が含まれる。
【００３４】
本明細書中で使用される場合、迷走神経はその最も広い意味で使用され、迷走神経へ接続される神経節または節後ニューロンだけでなく、主要な迷走神経から分岐するどんな神経も含まれる。迷走神経は、当該技術では、副交感神経系およびその分枝、並びにコリン作動性神経としても知られている。
【００３５】
遠心性迷走神経線維は、いずれの手段でも刺激することができる。非限定的な例には、針、超音波または振動などの機械的な手段、赤外、可視または紫外光などの任意の電磁放射線、熱、もしくは他のエネルギー源のいずれもが含まれる。好ましい実施形態では、迷走神経を、例えば、Ｃｙｂｅｒｏｎｉｃｓ ＮＣＰ（商標）などの市販の迷走神経刺激装置、あるいは電気プローブを用いて電気的に刺激する。迷走神経全体（すなわち、求心性および遠心性神経の両方）を刺激することによって、あるいは遠心性神経を単離して、それを直接刺激することによって、遠心性迷走神経を刺激することができる。後者の方法は、両タイプの線維が存在する神経領域において遠心性線維から求心性線維を分離することによって達成できる。あるいは、例えば、遠心性線維が支配している標的臓器に近接するような、求心性線維が全く存在しないところで遠心性線維を刺激する。また、例えば電気的に、標的臓器を直接刺激し、それによりその臓器を支配している遠心性線維を刺激することによって、遠心性線維を刺激することもできる。他の実施形態では、迷走神経の神経節または節後ニューロンを刺激することができる。また、迷走神経を切断して遠心端を刺激することもでき、これにより、遠心性迷走神経線維だけが刺激される（例えば、実施例２を参照）。
【００３６】
当業者は、過度の実験をしなくても、処置すべき任意の症状について、炎症性サイトカインカスケードを阻害するのに有用な刺激の量を決定できる。エンドトキシンで誘導されるような全身的な炎症性サイトカインカスケードを阻害するために、露出前に１０分間および露出後に１０分間の２ｍｓおよび１Ｈｚにおける１ないし５Ｖの定電圧刺激は、エンドトキシンショックによる被験者の死を防止するために、全身的な炎症性サイトカインカスケードを十分に阻害するであろう（実施例２および３参照）。
【００３７】
他の実施形態では、本発明は患者の炎症性サイトカインカスケードを阻害する方法に関する。該方法は、炎症性サイトカインカスケードを阻害するのに十分な量のコリン作動薬で患者を処置することを含む。好ましい実施形態では、患者は、炎症性サイトカインカスケードにより媒介される症状を患っているか、またはその危険がある。
【００３８】
これらの実施形態に有用なコリン作動薬は既に論考しており、アセチルコリン、ニコチン、ムスカリン、カルバコール、ガランタミン、アレコリン、セビメリン、およびレバミゾ−ルが含まれる。また既に論じられたように、遠心性迷走神経線維を刺激することによって、アセチルコリンを投与することができる。
【００３９】
更なる実施形態では、本発明は、炎症性サイトカインカスケードにより媒介される症状を患っているか、またはその危険がある患者を処置するための方法に関する。該方法は、炎症性サイトカインカスケードを阻害するのに十分な遠心性迷走神経活性を刺激することを含む。遠心性迷走神経線維を刺激するための方法は既に論考した。
【００４０】
また本発明は、化合物がコリン作動薬であるかどうかを決定するための方法に関する。該方法は、哺乳類細胞からの炎症誘発性サイトカインの放出を化合物が阻害するかどうかを決定することを含む。
【００４１】
この方法では、細胞は、炎症誘発性サイトカインを産生するために誘発され得るどんな細胞でもよい。好ましい実施形態では、細胞は、免疫細胞、例えばマクロファージ、単球または好中球である。最も好ましい実施形態では、細胞はマクロファージである。
【００４２】
阻害について測定すべき炎症誘発性サイトカインは、細胞から放出されるように誘発され得るどんな炎症誘発性サイトカインでもよい。好ましい実施形態では、サイトカインはＴＮＦである。サイトカイン産生の阻害の評価は、サイトカインの定量化（例えば、ＥＬＩＳＡによる）を含む既知の手段のいずれかによって、あるいは生物検定法（例えば、炎症誘発性サイトカイン活性が減少されるかどうかを決定する）によって可能である。
【００４３】
本発明の好ましい実施形態は、以下の実施例で説明される。本明細書中の特許請求の範囲内にある他の実施形態は、ここに開示される本発明の明細書または実施の考慮から当業者には明らかであろう。本明細書は実施例と共に、単に模範的なものと考慮されるように意図されており、本発明の範囲および精神は実施例に続く特許請求の範囲によって示されるものである。
【００４４】
［実施例１］
コリン作動薬はマクロファージからの炎症誘発性サイトカインの放出を阻害する。
１．　材料および方法
ヒトのマクロファージ培養物を次のように調製した。Ｌｏｎｇ Ｉｓｌａｎｄ Ｂｌｏｏｄ Ｂａｎｋ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ（Ｍｅｌｖｉｌｌｅ， ＮＹ）への健康な個々のドナーの血液からバフィーコートを採取した。フィコール／ハイパック（Ｐｈａｒｍａｃｉａ， ＮＪ）による密度勾配遠心分離法によって初代血液単核細胞を単離し、１０％の熱不活化ヒト血清が補充されたＲＰＭＩ１６４０培地（Ｇｅｍｉｎｉ Ｂｉｏ−Ｐｒｏｄｕｃｔｓ， Ｉｎｃ．， Ｃａｌａｂａｓａｓ， ＣＡ）に懸濁させ（８×１０６細胞／ｍｌ）、フラスコ中に播種した（ＰＲＩＭＡＲＩＡ、Ｂｅｃｋｔｏｎ ａｎｄ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ Ｌａｂｗａｒｅ， Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ， ＮＪ）。３７℃で２時間インキュベーションした後、付着細胞を十分に洗浄し、１０ｍＭのＥＤＴＡで簡単に処理し、剥離し、ヒトマクロファージコロニー刺激因子（ＭＣＳＦ、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ、２ｎｇ／ｍｌ）が補充されたＲＰＭＩ培地（１０％ヒト血清）に再懸濁し（１０６細胞／ｍｌ）、２４ウェルの組織培養プレート上へ播種した（ＰＲＩＭＡＲＩＡ、Ｆａｌｃｏｎ）（１０６細胞／ウェル）。ＭＣＳＦの存在下で細胞を７日間分化させた。７日目に細胞を１×ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、ＧｉｂｃｏＢＲＬ， Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ， ＭＤ）で３回洗浄し、ＭＣＳＦが欠けている新しい培地を添加し、示されたように実験を実行した。
【００４５】
以下のようにＲＮＡ分解酵素保護分析法を実行した。製造業者の指示に従ってトリゾール（ＴＲＩｚｏｌ）試薬（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ， Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ， ＭＤ）を用いて全ＲＮＡを培養細胞から単離し、ＲＮＡサンプルの完全性を確認するために１．２％アガロース／１７％ホルムアルデヒドゲル上で電気泳動させた。ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ）から得られるキットを用いてＲＮＡ分解酵素保護分析法を実行した。Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを用いてアンチセンスＲＮＡプローブセット（ｈｃｋ−３）を［ａ−３２Ｐ］ＵＴＰ（Ｓｐ．Ａｃｔ．８００Ｃｉ／ｍｍｏｌ、Ａｍｅｒｓｈａｍ， Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ Ｈｅｉｇｈｔｓ， ＩＬ）で標識した。ＭＳＰ Ｉ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏ Ｌａｂｓ， Ｂｅｖｅｒｌｙ， ＭＡ）で消化されたｐＢＲ−３２２プラスミドＤＮＡを用いることによって分子量マーカーを調製し、クレノウ酵素（Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅ， Ｌａ Ｊｏｌｌａ， ＣＡ）と共に［ａ−３２Ｐ］ｄＣＴＰ（Ｓｐ．Ａｃｔ．８００Ｃｉ／ｍｍｏｌ、Ａｍｅｒｓｈａｍ， Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ Ｈｅｉｇｈｔｓ， ＩＬ）を用いて末端を標識した。
【００４６】
ＴＮＦ免疫組織化学は以下の通りに実行された。ヒトのマクロファージを上記のように分化させ、ガラスチャンバスライド（Ｎｕｎｃ， Ｎａｐｅｒｖｉｌｌｅ， ＩＬ）上で成育させた。ブロッキング溶液（ＰＢＳ中、１％のＢＳＡ、５％の正常ヤギ血清、０．３％のトリトンＸ−１００）中でスライドを室温で１時間インキュベートし、次に、０．３％のトリトンＸ−１００、０．１％のＢＳＡ、および３％の正常ヤギ血清を含有するＰＢＳ中に１：１００で希釈された一次マウス抗ヒトＴＮＦモノクローナル抗体（Ｇｅｎｚｙｍｅ， Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ， ＭＡ）と共に、４℃で２４時間インキュベートした。洗浄したセクションを二次ビオチン化抗マウスＩｇＧ（１：２００、Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｉｎｃ．， Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ， ＣＡ）で２時間インキュベートした。０．００３％の過酸化水素および０．０５％の３，３’−ジアミノベンジジンテトラヒドロクロライドを色素原として、反応生成物を視覚化した。一次抗体を存在させずに、ネガティブコントロールをインキュベートした（図示せず）。ＭｅｔａＭｏｒｔｈイメージングシステム（Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｃｏ．， Ｗｅｓｔ Ｃｈｅｓｔｅｒ， ＰＡ）を用いて、光学顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ　ＢＸ６０、 日本）でスライドを分析した。
【００４７】
２．結果
ヒト末梢血単核細胞をマクロファージコロニー刺激因子（ＭＣＳＦ、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ）の存在下でインキュベートすることによって、初代ヒトマクロファージ培養物を確立した。これらの細胞は、ＬＰＳに４時間曝された状態のマクロファージ培養物中のＴＮＦレベルにおけるコリン作動薬の効果を決定するための実験で使用された（図１）。これらの実験では、塩化アセチルコリン（ＡＣｈ、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ）を、アセチルコリンエステラーゼ阻害剤の臭化ピリドスチグミン（１ｍＭ、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ）の存在下、図示された濃度（四角）でヒトマクロファージ培養物へ添加した。ムスカリン（三角）およびニコチン（丸）（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ）を図示された濃度で添加した（図１）。５分後にＬＰＳを添加し（１００ｎｇ／ｍｌ）、ＴＮＦ酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）による次の分析のために、刺激の４時間後に条件上清を採取した。全ての実験条件を３回実行した。９つの別々のマクロファージ調製物からのデータは、平均±標準誤差、ｎ＝９として示される。
【００４８】
図１に示されるように、アセチルコリン、ニコチンおよびムスカリンは全て、投与量に依存してＴＮＦ放出を阻害した。ＬＰＳに２０時間曝された状態のマクロファージ培養培地において、アセチルコリンによるＴＮＦ放出の同等の阻害が観察され（図示せず）、ＴＮＦに対するアセチルコリンの阻害効果は、ＴＮＦ応答の開始を単に遅らせるだけではないことが示された。またＴＮＦの阻害は、化学的に別個のコリン作動薬であるカルバコールで処理されたマクロファージ培養物においても観察された（図示せず）。
【００４９】
ＲＮＡ分解酵素保護分析法でＴＮＦｍＲＮＡレベルを測定することによって、ＴＮＦ阻害の分子機構を調査した。これらの実験（図２）では、ＡＣｈ（１００μＭ）、ムスカリン（Ｍｕｓ、１００μＭ）、ニコチン（Ｎｉｃ、１００μＭ）または培地のみの存在下でマクロファージを５分間インキュベートした後、ＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍｌ）へ２時間曝した。ＡＣｈを臭化ピリドスチグミン（１ｍＭ）と共に添加した。コントロールウェルは培地のみで２時間インキュベートした。ｍＲＮＡのローディングについて制御するためにＧＡＰＤＨ遺伝子産物の発現を測定した。
【００５０】
アセチルコリン処置され、ＬＰＳ刺激されたマクロファージのＴＮＦｍＲＮＡレベルは、ＴＮＦタンパク質放出を阻害する濃度でアセチルコリンを添加した場合でも、媒体処置され、ＬＰＳ刺激されたマクロファージと比較して減少しなかった（図２）。これは、アセチルコリンが、転写後のメカニズムによってＴＮＦ放出を抑制することを示す。
【００５１】
アセチルコリンがマクロファージのＴＮＦ合成またはマクロファージのＴＮＦ放出のどちらを阻害するのかを決定するために、モノクローナル抗ＴＮＦ抗体を用いて、ヒトのマクロファージ培養物中の細胞関連ＴＮＦを標識した。これらの実験（図３）では、ＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍｌ）処置の５分前に、ＡＣｈ（１００μＭ）へ、Ａｃｈ単独または臭化ピリドスチグミン（１ｍＭ）の存在下で、細胞を曝した。２時間後に、細胞を緩衝１０％ホルマリン中に固定し、材料および方法に記載された一次マウス抗ｈＴＮＦモノクローナル抗体を用いて、免疫細胞化学分析を行なった。
【００５２】
これらの実験によって、アセチルコリンは、マクロファージ中のＬＰＳ刺激されたＴＮＦの免疫反応性の出現を大幅に減弱することが立証された（図３）。考え合わせると、これらの結果は、ヒトマクロファージＴＮＦ産生におけるアセチルコリンの阻害効果が、ＴＮＦタンパク質合成の転写後の抑制によって、あるいはおそらく細胞内ＴＮＦの分解速度の上昇によって発生することを示す（図３）。
【００５３】
これまでの研究によって、末梢血単核細胞は、ニコチン性およびムスカリン性のアセチルコリン受容体を発現することが示された（３７−３８、５３）。ＴＮＦ応答の調節に関与するマクロファージのコリン作動性受容体活性のタイプを薬理学的に定義するために、図１の結果をさらに解析した。ニコチンは投与量に依存してＴＮＦ放出を著しく阻害し、ＴＮＦ応答の５０％を阻害するニコチンの有効濃度（Ｅ．Ｃ．５０）は、８．３±７．１ｎＭ（ｎ＝９）であると評価された。ニコチンのこのＥ．Ｃ．５０は、アセチルコリン媒介のＴＮＦ阻害のＥ．Ｃ．５０（アセチルコリンＥ．Ｃ．５０＝２０．２±８．７ｎＭ、ｎ＝９）と較べても優っている。また、アセチルコリンまたはニコチンのいずれかと比べて有効性が非常に低いマクロファージＴＮＦ阻害剤であるが、ムスカリンもＴＮＦ放出を大きく阻害した（ムスカリンＥ．Ｃ．５０＝４２．４±１８．６ｍＭ、ｎ＝９、ニコチンまたはアセチルコリンに対してＰ＜０．０１）。
【００５４】
アセチルコリンが、主に、ニコチン性またはムスカリン性のどちらのアセチルコリン受容体の活性によってＴＮＦを阻害するのかを立証するために、アセチルコリンで同時処置されたＬＰＳ刺激マクロファージ培養物へ特定のムスカリン拮抗薬、アトロピンを添加した（図４）。また、ＴＮＦの阻害を媒介するニコチン性アセチルコリン受容体活性がブンガロトキシンに敏感であるか、またはブンガロトキシンに敏感でないかについても扱った（図４）。マクロファージ培養の条件およびＴＮＦアッセイは既に記載された通りである。アトロピン（縞模様のバー）（１ｍＭ、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ）またはα−コノトキシン（黒色のバー）（０．１，０．０１ｍＭ、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ， Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ， ＭＡ）を、アセチルコリン（１０μＭ）およびＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍｌ）より５分前に、マクロファージ培養物へ添加した。図示されたデータは、別々のドナーから調製された異なるマクロファージを用いた３つの別々の実験の平均±標準誤差である。
【００５５】
アトロピンの添加は、１ｍＭもの濃度においてでさえ、アセチルコリン処置マクロファージ培養物中のＴＮＦ放出を元に戻すことができなかった（図４）。アセチルコリンはＴＮＦ放出を８０％阻害するが、これはアトロピンによって覆らなかったことに留意されたい。しかしながら、アセチルコリン処置されたＬＰＳ刺激マクロファージ培養物へのα−コノトキシンの添加は、投与量に依存してアセチルコリンの阻害効果を大きく反転させた（図４）。（ＡＣｈに対して＊＊Ｐ＜０．００５、ＡＣｈに対して＊Ｐ＜０．０５）。アトロピンもα−コノトキシンも媒体処置培養物のＴＮＦ産生を変化させなかった（図示せず）。考え合わせると、これらのデータは、ヒトマクロファージ培養物におけるＬＰＳ誘発ＴＮＦ応答に対するアセチルコリンの阻害効果が、主に、α−ブンガロトキシンに敏感なニコチン性アセチルコリン受容体によって媒介されるという証拠を提供する。哺乳類組織中のアセチルコリンのレベルはミリモルの範囲に到達できる（５０）が、そうであっても、ここで説明されるニコチン性およびムスカリン性のマクロファージアセチルコリン受容体活性はどちらも、生体内のマクロファージＴＮＦ合成の阻害に関与することが可能である。
【００５６】
特異性を評価するために、アセチルコリンで処置されたＬＰＳ刺激マクロファージ培養物において、他のマクロファージ誘発サイトカインの放出を測定した。これらの実験では、臭化ピリドスチグミン（１ｍＭ）およびＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍｌ）の存在下、図示された濃度のＡＣｈと共にヒトマクロファージ培養物を２０時間インキュベートした。市販のＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．， Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ， ＭＮ）を用いて、ＩＬ−１β（図５）、ＩＬ−６（図６）、およびＩＬ−１０（図８）レベルを培地中で測定した。特定のＥＬＩＳＡ（Ｍｅｄｉｃａｌ ＆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．， Ｎａｇｏｙａ， Ｊａｐａｎ）によって、ＩＬ−１８（図７）レベルを決定した。各サンプルを３回分析した。データは、４人の別々の健康なドナーから調製されたマクロファージを用いて４つの別々の実験から、平均±標準誤差で表わされる。これらの実験によって、アセチルコリンは他のＬＰＳ誘発性のサイトカイン（ＩＬ−１β、ＩＬ−６、およびＩＬ−１８、それぞれ図５、６、および７）の放出を投与量に依存して阻害するが、抗炎症性サイトカインＩＬ−１０（図８）の構成的な放出を妨げないことが立証された。したがって、アセチルコリンは、特に、ＬＰＳ刺激ヒトマクロファージ培養物による炎症誘発性サイトカインの放出を阻害する（図５〜７）が、抗炎症性サイトカインＩＬ−１０の放出を抑制しない（図８）。ＬＰＳおよびアセチルコリンで処置されたマクロファージ培養物のテトラゾリウム塩ＭＴＴ（臭化３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウム、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ）による染色およびトリパンブルー排除によって、特異的なＬＰＳ誘発性サイトカイン阻害は、細胞毒性によるものではないことが示された（図示せず）。
【００５７】
比色マイクロプレートアッセイ（Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ ｍＲＮＡ、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ， Ｉｎｃ．， Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ， ＭＮ）において、ビオチン標識捕獲オリゴヌクレオチドプローブで遺伝子特異性ｍＲＮＡレベルを測定することによって、ＩＬ−１βおよびＩＬ−６のアセチルコリン阻害の分子機構をさらに調査した。ＬＰＳによる２時間のヒトマクロファージ培養物の刺激は、媒体処置コントロールと較べて、ＩＬ−１βのｍＲＮＡレベルを大幅に増大させた（ＬＰＳ刺激ＩＬ−１βｍＲＮＡ＝１９７４±１７９アットモル／ｍｌに対して、媒体処置ＩＬ−１βｍＲＮＡ＝１２０±５４アットモル／ｍｌ、ｎ＝３、Ｐ＜０．０１）。ＩＬ−１βタンパク質放出を大きく阻害する濃度（１００ｎＭ）のアセチルコリンの添加は、マクロファージＩＬ−１βｍＲＮＡレベルを大幅には変化させなかった（アセチルコリン処置ＬＰＳ刺激ＩＬ−１βｍＲＮＡ＝２１２８±６５アットモル／ｍｌ、ｎ＝３）。同様に、マクロファージ中のＬＰＳ刺激ＩＬ−６ｍＲＮＡレベルは、ＩＬ−６タンパク質を大きく阻害するアセチルコリン濃度によって大幅には変化されなかった（アセチルコリン処置ＬＰＳ刺激ＩＬ−６ｍＲＮＡ＝１８７２±９１アットモル／ｍｌに対して、ＬＰＳ刺激ＩＬ−６ｍＲＮＡ＝１７１６±１５７アットモル／ｍｌ、ｎ＝３）。合わせると、これらの観察は、アセチルコリンがマクロファージ中のＴＮＦ、ＩＬ−１βおよびＩＬ−６のＬＰＳ刺激放出を転写後に阻害するという証拠を与える。
【００５８】
本発明の結果は、分化型のヒトマクロファージ培養物がアセチルコリンおよびニコチンに対して極めて敏感であることを示す。マクロファージへ分化されないヒトの末梢血単核細胞におけるコリン作動性受容体活性についてのこれまでの報告（５３、２９、４６）は、最大のコリン作動性応答がマイクロモル濃度のコリン作動薬を必要とすることを示唆した。本発明の独自の研究によって、分化型のヒトマクロファージにおいてサイトカイン合成を抑制するために著しく高濃度のアセチルコリンが必要とされることが立証される（ＴＮＦ阻害のためのアセチルコリンＥ．Ｃ．５０＝０．８±０．２ｍＭ、ｎ＝３）。薬理学的結果は、その時点で、マクロファージサイトカイン応答を調節できるα−ブンガロトキシン感受性ニコチン性アセチルコリン受容体活性を包含する。このタイプのコリン作動性受容体の活性は、末梢血単核細胞と較べてマクロファージがコリン作動薬に対して著しく敏感である点を除いて、末梢血単核細胞で既に記載された（５３）ものと同様である。当業者は、マクロファージがコリン作動薬に対してそれ程敏感であるとは必ずしも予想しなかったであろう。あるいは、単核細胞に関して既に知られていることを仮定すれば、感度が全くないとさえ予想したであろう。実際、本願発明者らの研究室における最近の証拠は、単球とは異なった、マクロファージにおけるニコチン性受容体サブユニットの発現パターンを明らかにした。したがって、当業者は、単球よりもマクロファージのコリン作動薬に対する感度が大きいことの根底には分子の違いがあることがわかるであろう。
【００５９】
［実施例２］
遠心性迷走神経線維の刺激によるエンドトキシンショックの阻害。
遠心性迷走神経活性の直接刺激がエンドトキシンに対する全身的な炎症応答を抑制するかどうかを決定するために、成体の雄ルイスラットに、両側性頸部迷走神経切除、あるいは迷走神経が単離されるが切断はされない同等の偽外科的処置を施した。致死量（１５ｍｇ／ｋｇ、点滴（ｉ．ｖ．））のＬＰＳ投与の１０分前、および１０分後に再度、分割された迷走神経の遠心端へ定電圧刺激を加えることによって、迷走神経切除されたラットの遠心性迷走神経活性を刺激した。これらの実験では、エンドトキシンショックの動物モデルを利用した。成体雄ルイスラット（２８０〜３００ｇ、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ， ＭＡ）を、１２時間の明／暗サイクルで、２２℃で収容した。全ての動物実験は、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｆ Ｎｏｒｔｈ Ｓｈｏｒｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ＨｏｓｐｉｔａｌまたはＮｅｗ Ｙｏｒｋ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｍｅｄｅｃｉｎｅにより承認されたプロトコルの下で、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓに従って実施した。ラットにウレタン（１ｇ／ｋｇ、腹腔内）で麻酔をかけ、気管、総頸動脈、および頸静脈をポリエチレンチュービング（Ｃｌａｙ Ａｄａｍｓ， Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ， ＮＪ）でカニューレ処置した。右側総頸動脈に挿入されたカテーテルを、平均動脈血圧（図９のＭＡＢＰ）を連続的に記録するために血圧トランスデューサおよび収集システム（ＭＰ１００、ＢＩＯＰＡＣ Ｓｙｓｔｅｍｓ， Ｉｎｃ．， Ｓａｎｔａ Ｂａｒｂａｒａ， ＣＡ）へ接続した。動物に、両側性頸部迷走神経切除（ＶＧＸ、ｎ＝７）を単独で、または電気刺激と共に（ＶＧＸ＋ＳＴＩＭ、ｎ＝７）、もしくは偽手術（ＳＨＡＭ、ｎ＝７）を施した。迷走神経切除された動物では、腹側の頸部中線切開に続いて、両迷走神経中枢が露出され、４−０絹縫合で結紮され、分割された。偽手術された動物では、両迷走神経中枢が露出され、周囲の組織から単離されたが、切断はされなかった。既に迷走神経切除が施された動物において、迷走神経の電気刺激を実施した。これらのグループでは、右側迷走神経中枢の遠心端は、収集システム（ＭＰ１００、ＢＩＯＰＡＣ Ｓｙｓｔｅｍｓ， Ｉｎｃ．， Ｓａｎｔａ Ｂａｒｂａｒａ， ＣＡ）により制御されるように刺激モジュール（ＳＴＭ１００Ａ、Ｈａｒｖａｒｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ， Ｉｎｃ．， Ｈｏｌｌｉｓｔｏｎ， ＭＳ）へ接続された両極性白金電極（Ｐｌａｓｔｉｃｓ Ｏｎｅ Ｉｎｃ．， Ｒｏａｎｏｋｅ， ＶＡ）を横切って配置された。定電圧刺激（５Ｖ、２ｍｓ、１Ｈｚ）を神経へ２０分間（ＬＰＳ投与の前に１０分間、後に１０分間）印加した。リポ多糖類（大腸菌０１１１：Ｂ４、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ、生理食塩水中、１０ｍｇ／ｍｌ）は３０分間、超音波処理して、致死量で投与した（１５ｍｇ／ｋｇ、点滴）。血液は、ＬＰＳ投与の１時間後に右の頸動脈から採取された。Ｌ９２９生物活性アッセイによって、血清ＴＮＦレベルを定量化した。肝臓のＴＮＦレベルを決定するために、動物を安楽死させ、速やかに肝��を摘出し、血液で洗浄し、均質化緩衝液（ＰＢＳ、０．０５％アジ化ナトリウム、０．５％トリトンＸ−１００およびプロテアーゼ阻害剤カクテル（１０ｍｌＰＢＳ中に２個の錠剤、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ， Ｇｅｒｍａｎｙ）を含む、ｐＨ７．２、４℃）中でポリトロン（Ｂｒｉｎｋｍａｎ， Ｗｅｓｔｂｕｒｙ， ＮＹ）によりホモジナイズし、次に１０分間、超音波処理した。ホモジネートを１２，０００ｇで１０分間遠心分離し、上澄みのＴＮＦレベルをＥＬＩＳＡ（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ， Ｃａｍａｒｉｌｌｏ， ＣＡ）により決定した。上清中のタンパク質濃度は、Ｂｉｏ−Ｒａｄのタンパク質アッセイ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂ．， Ｈｅｒｃｕｌｅｓ， ＣＡ）により測定し、サンプル中のタンパク質量によって肝臓のＴＮＦ含量を正規化した。ＬＰＳの１時間後に血液サンプルを採取し、ＴＮＦをＬ９２９アッセイにより測定した。＊−Ｐ＜０．０５、ＳＨＡＭ＋ＬＰＳに対して＊＊−Ｐ＜０．００５、ＶＧＸ＋ＬＰＳに対して＃−Ｐ＜０．０５。
【００６０】
図９に示されるように、結果は、遠心性迷走神経の電気刺激は、ピーク血清ＴＮＦレベルを著しく減弱させ、電気刺激無しの迷走神経切除は、偽手術したコントロールと比較して、ピーク血清ＴＮＦレベルを著しく増大させることを立証した（Ｐ＜０．０５）。
【００６１】
肝臓はエンドトキシン血症時のピーク血清ＴＮＦの主原因なので、次に、肝臓ホモジネートのＴＮＦレベルを測定した（２６、１６）。末梢迷走神経の電気刺激は、偽手術されたコントロールと比較して、肝臓のＴＮＦ合成を著しく減弱した（図１０）。この図では、ＳＨＡＭ＋ＬＰＳに対して＊−Ｐ＜０．０５、ＶＧＸ＋ＬＰＳに対して＃−Ｐ＜０．０５である。これらのデータは、遠心性迷走神経シグナル伝達を生体内ＴＮＦ産生の調節に直接関係させる。
【００６２】
迷走神経の電気刺激が、ＴＮＦ産生を阻害する液性抗炎症性ホルモンまたはサイトカインの放出を誘導することは、理論的に可能であった。これを決定するために、偽手術したコントロール中のコルチコステロンおよびＩＬ−１０レベルの測定を実行した（表１）。
【００６３】
これらの研究では、動物は、ＬＰＳの全身投与（１５ｍｇ／ｋｇ）の３０分前に、偽手術（ＳＨＡＭ）、迷走神経切除（ＶＧＸ）、または迷走神経切除を伴う電気刺激（ＶＧＸ＋ＳＴＩＭ）のいずれかが施された。ＬＰＳまたは媒体投与の１時間後に血液サンプルを採取した。血清コルチコステロンをラジオイムノアッセイ（ＩＣＮ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ， Ｃｏｓｔａ Ｍｅｓａ， ＣＡ）によって測定し、ＩＬ−１０をＥＬＩＳＡ（ＢｉｏＳｏｕｒｃｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ， Ｃａｍａｒｉｌｌｏ， ＣＡ）によって決定した。全てのアッセイを３回実行した。結果は表１に示され、エンドトキシン血症がコルチコステロンおよびＩＬ−１０レベルの増加に関連することを示す。これまでの研究と合致して、迷走神経切除はコルチコステロンレベルを著しく低下させた。なぜなら、１つには、次の視床下部−下垂体−副腎軸の活性化に必要とされる脳への求心性迷走神経信号をそれが排除するからである（１４、１１）。これはコルチコステロイド応答を減少させ、コルチコステロイドは通常ＴＮＦ産生を下方制御する（４１、３９）ので、おそらく迷走神経切除された動物の血清および肝臓で観察されるＴＮＦレベルの上昇の原因であった（図９および図１０）。末梢迷走神経の直接電気刺激は、コルチコステロイドまたはＩＬ−１０応答の上昇を刺激しなかった。したがって、迷走神経刺激後の血清および肝臓中の抑制されたＴＮＦ合成は、これらの液性抗炎症性メディエータの活性が原因ではないだろう。
【００６４】
【表１】
2004510695.tif 000002
【００６５】
図１１は、図９および図１０と同一の動物群における平均動脈血圧（ＭＡＢＰ）の測定結果を示す（方法に記載されたように）。丸は偽手術されたラット（ＳＨＡＭ）、三角は迷走神経切除されたラット（ＶＧＸ）、四角は迷走神経の電気刺激および迷走神経切除された動物（ＶＧＸ＋ＳＴＩＭ）である。時間＝０においてＬＰＳ（１５ｍｇ／ｋｇ、点滴）を注射した。全てのデータはＭＡＢＰの％（ＭＡＢＰ／ＭＡＢＰ（時間＝０における）ｘ１００％）、平均±標準誤差、ｎ＝７で表される。偽手術、迷走神経切除、および迷走神経切除を伴う電気刺激は、媒体処置されたコントロールのＭＡＢＰに著しい影響を与えなかった（図示せず）。
【００６６】
末梢迷走神経刺激は、致死量のエンドトキシンへ曝されたラットのＬＰＳ誘発性低血圧（ショック）の発生を大幅に減弱させた（図１１）。ＴＮＦは急性エンドトキシン誘発性ショックの原則的な初期メディエータなので、この観察は予想されなかった（４３、４４）。迷走神経切除は、単独（電気刺激なし）では、偽手術コントロールと較べて、ショック発生までの時間を著しく短縮した（平均動脈血圧の５０％降下までの迷走神経切除時間＝１５±２分に対して、平均動脈血圧の５０％降下までの偽手術時間３０±３分、Ｐ＜０．０５）。迷走神経切除単独に続くこの増幅されたショックの発生は、減少したコルチコステロイド応答および増大したＴＮＦ応答に相当する。
【００６７】
アセチルコリンは、血圧低下を引き起こす抵抗血管の一酸化窒素依存性弛緩を媒介する血管拡張剤である。したがって、遠心性迷走神経の刺激が逆説的な高血圧応答を媒介したかもしれないという可能性を排除することが望まれた。エンドトキシンの代わりに生理食塩水を与えたコントロールの迷走神経刺激に続いて高血圧は観察されず（図示せず）、迷走神経刺激によるエンドトキシンショックに対する保護が特異的であることが示された。考え合わせると、これらの観察は、遠心性迷走神経活性の刺激が致死的エンドトキシン血症の間の全身的なＴＮＦ産生およびショック発生を下方制御することを示す。
【００６８】
［実施例３］
無傷の迷走神経の刺激はエンドトキシンショックを減弱する。
遠心性迷走神経刺激による炎症性サイトカインカスケードの阻害が、無傷の迷走神経の刺激によって有効であるかどうかを決定するために実験を行なった。左側および右側迷走神経の刺激も比較された。
【００６９】
麻酔したラットの迷走神経を露出させ、血圧および心拍をモニターするために、左側総腸骨動脈をカニューレ処置した。エンドトキシン（大腸菌０１１１：Ｂ４、Ｓｉｇｍａ）を致死量（６０ｍｇ／ｋｇ）で投与した。処置された動物において、ＬＰＳ注射の１０分前に始まり、注射の１０分後まで継続して全部で２０分間、左側または右側のいずれかの無傷の迷走神経を定電圧（５Ｖまたは１Ｖ、２ｍｓ、１Ｈｚ）で刺激した。血圧および心拍は、Ｂｉｏ−Ｐａｃ Ｍ１００コンピュータ支援収集システムの使用によって測定した。図１２〜図１４はこれらの実験結果を示す。
【００７０】
図１２に示されるように、刺激されなかったラットおよび低量（１Ｖ）の迷走神経刺激で処置されたラットの両方において、ＬＰＳ注射後数分以内に血圧が下降し始めたが、高量（５Ｖ）の刺激で処置されたラットは、より安定な血圧を保持した。ＬＰＳ後３０分と４０分の間に、低量の電圧で処置された動物の血圧は安定化した。
【００７１】
図１３は実験動物の心拍を示す。ＬＰＳ注射後数分以内に、高量（５Ｖ）の迷走神経刺激で刺激されたラットの心拍は上昇し始めた。一方、刺激されなかったラットおよび低量（１Ｖ）電圧で刺激されたラットの両方の心拍は、ＬＰＳ後約６０分間、安定したままであった。１時間後、低量刺激で処置されたラットの心拍は上昇し始め、高量の迷走神経刺激を受けるラットに匹敵するレベルへ到達した。
【００７２】
図１４は、左側と右側の迷走神経刺激を比較する。エンドトキシン動物を左側または右側いずれかの迷走神経の１Ｖの刺激によって処置した。ＬＰＳ注射後数分以内に、３セット全ての動物（刺激なし、左側刺激、右側刺激）において血圧は下降し始めた。刺激された動物は両セットとも血圧を回復したが、左側迷走神経で刺激を受けた動物は、実験の期間中、より安定な血圧を保持した。しかしながら、左側と右側の迷走神経刺激の結果の違いは統計的に有意なものではなく、実用面での違いはないと予想されるであろう。
【００７３】
この実験セットは、無傷の迷走神経の刺激が炎症性サイトカインカスケードを有効に阻害でき、カスケードにより引き起こされる症状を十分に軽減することを確認する。
【００７４】
［実施例４］
ニコチンによるマクロファージからのＨｍｇ−１放出の阻害。
炎症誘発性サイトカインにおけるコリン作動薬の阻害効果がＨＭＧ−１に適用されるかどうかを決定するために実験を行なった。マウスのＲＡＷ２６４．７マクロファージ様細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ， Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ， ＭＤ， ＵＳＡ）を、１０％ウシ胎児血清および１％グルタミンが補充されたＤＭＥＭ下で培養して成育させた。細胞が７０〜８０％集密したら、培地を無血清のＯＰＴＩ−ＭＥＭＩ培地に取り替えた。次にニコチン（Ｓｉｇｍａ）を、０、０．１、１、１０または１００μＭで添加した。ニコチン添加の５分後、細胞をＬＰＳ（５００ｍｇ／ｍｌ）で処置した。培地を２０時間後に採取した。培地をＣｅｎｔｒｉｃｏｎ（商標）１０フィルタで濃縮し、次に、抗ＨＭＧ−１ポリクローナル抗血清（ＷＯ００／４７１０４）および標準方法を用いて、ウェスタンブロットで分析した。バイオラッドイメージングデンシトメータを用いて、バンド濃度を決定した。
【００７５】
結果は図１５に示される。ＨＭＧ−１バンドは、対応のニコチンおよびＬＰＳ濃度と共に上端沿いに示され、示されたバンドの濃度は下のグラフに図示される。図１５は、ニコチンが投与量に依存してＨＭＧ−１産生を阻害することを明白に示す。これにより、ＨＭＧ−１は、その産生がコリン作動薬により阻害され得るという点で、炎症誘発性サイトカインのように振る舞うことが実証される。
【００７６】
「コリン作動性抗炎症経路」と称されるここに説明される神経−免疫相互作用は、病原の侵入に対する全身的な応答を直接調節することができる。副交感神経系活性が循環ＴＮＦレベルおよびエンドトキシン血症へのショック応答に影響を及ぼすという観察は、広範囲に及ぶ意味を有する。というのは、それが、生物学的毒素の致死効果を抑制するために活性化され得る、これまでに認識されていない直接および急速な内因性メカニズムを示すからである。コリン作動性抗炎症性経路は、既に説明した液性抗炎症性経路と比較して、はるかに短い応答時間で作用するように位置づけられる。さらに、全身ストレスの間の副交感遠心性神経の活性化、または「逃走または闘争」応答は、致死的な可能性のある末梢免疫応答の大きさを抑制することによって、宿主へさらなる保護の利点を与える。
【００７７】
上記の点を考慮して、本発明のいくつかの利点が達成され、他の利点が獲得されることがわかるであろう。
本発明の範囲から逸脱することなく上記の方法および組成物には種々の変更が成され得るので、上記の説明に含まれ、添付図面に示される全ての事柄は実例として解釈され、限定的な意味ではないものと意図されるべきである。
【００７８】
参考文献
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５． Ｂｏｒｏｖｉｋｏｖａ， Ｌ．Ｖ．， ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ， ４０５： ４５８−６２， ２０００ａ．
６． Ｂｏｒｏｖｉｋｏｖａ， Ｌ．Ｖ．， ｅｔ ａｌ．， Ａｕｔｏｎ． Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．， ２０：１４１−４７， ２０００ｂ．
７． Ｂｕｍｇａｒｄｎｅｒ， Ｇ．Ｌ．， ａｎｄ Ｏｒｏｓｚ， Ｃ．Ｇ．， Ｓｅｍｉｎ． Ｌｉｖｅｒ Ｄｉｓ．， １９： １８９−２０４ １９９９．
８． Ｃａｒｔｅｒｏｎ， Ｎ．Ｌ．， Ｍｏｌ． Ｍｅｄ． Ｔｏｄａｙ， ６：３１５−２３， ２０００．
９． Ｄｉｂｂｓ， Ｚ．， ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ａｓｓｏｃ． Ａｍ， Ｐｈｙｓｉｃｉａｎｓ， １１１：４２３−２８， １９９９．
１０． Ｄｉｎａｒｅｌｌｏ， Ｃ．Ａ．， ＦＡＳＥＢ Ｊ．， ８： １３１４−２５， １９９４．
１１． Ｆｌｅｓｈｎｅｒ， Ｍ．， ｅｔ ａｌ， Ｊ． Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ， ８６：１３４−４１， １９９８．
１２． Ｆｏｘ， Ｄ．Ａ．， Ａｒｃｈ． Ｉｎｔｅｒｎ． Ｍｅｄ．， ２８ ４３７−４４４， ２０００．
１３． Ｇａｔｔｏｒｎｏ， Ｍ．， ｅｔ ａｌ， Ｊ． Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．， ２７：２２５１−２２５５， ２０００．
１４． Ｇａｙｋｅｍａ， Ｒ．Ｐ．， ｅｔ ａｌ．， Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ， １３６：４７１７−４７２０， １９９５．
１５． Ｇｒａｃｉｅ， Ｊ．Ａ．， ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ．， １０４：１３９３−１４０１， １９９９．
【００７９】
１６． Ｇｒｅｇｏｒｙ． Ｓ．Ｈ． ａｎｄ Ｗｉｎｇ， Ｅ．Ｊ．， Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ， １９：５０７−１０， １９９８．
１７． Ｇｕｓｌａｎｄｉ， Ｍ．， Ｂｒ． Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．， ４８：４８１−８４， １９９９．
１８． Ｈｉｒａｎｏ， Ｔ．， Ｊ． Ｓｕｒｇ． Ｒｅｓ．， ８１：２２４−２９ １９９９
１９． Ｈｏｍｍｅｓ． Ｄ．Ｗ． ａｎｄ ｖａｎ Ｄｅｖｅｎｔｅｒ， Ｓ．Ｊ．， Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． ｃｌｉｎ． Ｎｕｔｒ． Ｍｅｔａｂ． Ｃａｒｅ， ３：１９１−９５， ２０００．
２０． Ｈｓｕ， Ｈ，Ｙ．， ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｐｅｄｉａｔｒ． Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．， ２９：５４０−４５， １９９９．
２１． Ｈｕ． Ｘ．Ｘ．， ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ．， ３１：３５−４２， １９９１．
２２． Ｊａｎｄｅｒ， Ｓ． ａｎｄ Ｓｔｏｌｌ， Ｇ．， Ｊ． Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ．， １１４：２５３−５８， ２００１．
２３． Ｋａｎａｉ． Ｔ． ｅｔ ａｌ．， Ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ， ６３ Ｓｕｐｐｌ． １：３７−４２， ２００１．
２４． Ｋａｔａｇｉｒｉ， Ｍ．， ｅｔ ａｌ Ｊ． Ｃｌｎ． Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．， ２５ Ｓｕｐｐｌ． １：Ｓ２１１−１４ １９９７．
２５． Ｋｉｍｍｉｎｇｓ． Ａ．Ｎ．， ｅｔ ａｌ．， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｓｕｒｇ．， １６６：７００−０５， ２０００．
２６． Ｋｕｍｉｎｓ， Ｎ．Ｈ．， ｅｔ ａｌ．， ＳＨＯＣＫ， ５：３８５−８８， １９９６．
２７． Ｌｅｅ， Ｈ．Ｇ．， ｅｔ ａｌ．， Ｃｌｉｎ． Ｅｘｐ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， １００：１３９−４４， １９９５．
２８． Ｌｉｐｔｏｎ， Ｊ．Ｍ， ａｎｄ Ｇａｔａｎｉａ， Ａ．， Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｔｏｄａｙ， １８：１４０−４５， １９９７．
２９． Ｍａｄｒｅｔｓｍａ， Ｇ．Ｓ．， ｅｔ ａｌ．， Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ， ３５：４７−５１， １９９６．
３０． ＭｃＧｕｉｎｎｅｓｓ． Ｐ．Ｈ．， ｅｔ ａｌ．， Ｇｕｔ， ４６：２６０−６９， ２０００．
【００８０】
３１． Ｎａｔｈａｎ． Ｃ．Ｆ．， Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ．， ７９：３１９−２６， １９８７．
３２． Ｐｕｌｋｋｉ， Ｋ．Ｊ．， Ａｎｎ． Ｍｅｄ， ２９：３３９−４３， １９９７．
３３． Ｐｒｙｓｔｏｗｓｋｙ， Ｊ．Ｂ， ａｎｄ Ｒｅｇｅ， Ｒ．Ｖ．， Ｊ． Ｓｕｒｇ． Ｒｅｓ．， ７１；１２３−２６ １９９７．
３４． Ｒａｙｎｅｒ． Ｓ．Ａ． ｅｔ ａｌ．， Ｃｌｉｎ． Ｅｘｐ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， １２２：ｌ０９−１６， ２０００．
３５． Ｒｏｍａｎｏｖｓｋｙ， Ａ．Ａ．， ｅｔ ａｌ．， Ａｍ． Ｊ． Ｐｈｙｓｉｏｌ．， ２７３ ：Ｒ４０７−１３， １９９７．
３６． Ｓａｎｄｂｏｍ． Ｗ．Ｊ．， ｅｔ ａｌ．， Ａｎｎ． Ｉｎｔｅｒｎ． Ｍｅｄ， １２６：３６４−７１， １９９７．
３７． Ｓａｔｏ， Ｅ．， ｅｔ ａｌ．， Ａｍ． Ｊ． Ｐｈｙｓｉｏｌ．， ２７４：Ｌ９７０−７９， １９９８．
３８． Ｓａｔｏ， Ｋ．Ｚ．， ｅｔ ａｌ． Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． Ｌｅｔｔ．， ２６６：１７−２０， １９９９．
３９． Ｓｃｈｅｉｎｍａｎ， Ｒ．１．， ｅｔ ａｌ， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２７０：２８３−８６， １９９５．
４０． Ｓｈｅｒ， Ｍ．Ｅ．， ｅｔ ａｌ．， Ｉｎｆｌａｍｍ． Ｂｏｗｅｌ Ｄｉｓ．， ５：７３−７８， １９９９．
４１． Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇ， Ｅ．Ｍ．， Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ．， １００：２６４１−４７， １９９７．
４２． Ｔｈｏｍｐｓｏｎ． Ａ．， Ｅｄ． Ｔｈｅ Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｈａｎｄｂｏｏｋ，３ｒｄ ｅｄ．， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， １９９８．
４３． Ｔｒａｃｅｙ． Ｋ．Ｊ． ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ， ３３０：６６２−６４， １９８７．
４４． Ｔｒａｃｅｙ． Ｋ．Ｊ． ｅｔ ａｌ， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２３４：４７０−７４， １９８６．
４５． Ｔｓｕｔｓｕｉ， Ｈ．， ｅｔ ａｌ．， Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｒｅｖ．， １７４：１９２−２０９， ２０００．
【００８１】
４６． ｖａｎ Ｄｉｊｋ． Ａ．Ｐ．， ｅｔ ａｌ．， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ．， ２８：６６４−７１， １９９８．
４７． Ｗａｎｇ． Ｈ．， ｅｔ ａｌ， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２８５：２４８−５１， １９９９．
４８． Ｗａｓｅｒｍａｎ， Ｓ．， ｅｔ ａｌ， Ｃａｎ． Ｒｅｓｐｉｒ． Ｊ．， ７：２２９−３７， ２０００．
４９． Ｗａｔａｎａｂｅ， Ｈ． ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｒｅｃｏｎｓｔｒ． Ｍｉｃｒｏｓｕｒｇ．， １３：１９３−９７， １９９７．
５０． Ｗａｔｈｅｙ． Ｊ．Ｃ．， ｅｔ ａｌ， Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｊ．， ２７：１４５−６４， １９７９．
５１． Ｗａｔｋｉｎｓ， Ｌ．Ｒ． ａｎｄ Ｍａｉｅｒ， Ｓ．Ｆ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ．， ９６：７７１０−１３， １９９９．
５２． Ｗａｔｋｉｎｓ Ｌ．Ｒ．， ｅｔ ａｌ，， Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． Ｌｅｔｔ． １８３：２７−３１， １９９５．
５３． Ｗｈａｌｅｙ． Ｋ．， ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ， ２９３：５８０−８３， １９８１．
５４． Ｗｏｉｃｉｅｃｈｏｗｓｋｙ， Ｃ．， ｅｔ ａｌ，， Ｎａｔ． Ｍｅｄ．， ４： ８０８−１３， １９９８．
５５． Ｙｅｈ， Ｓ．Ｓ．， ａｎｄ Ｓｃｈｕｓｔｅｒ Ｍ． Ｗ．， Ａｍ． Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｎｕｔｒ．， ７０， １８３−９７， １９９９．
５６． Ｚｈａｎｇ ａｎｄ Ｔｒａｃｅｙ， ｉｎ Ｔｈｅ Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｈａｎｄｂｏｏｋ． ３ｒｄ ｅｄ．， Ｅｄ． Ｔｈｏｍｐｓｏｎ， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， ５１５−４７， １９９８．
５７． ＰＣＴ ｐａｔｅｎｔ ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ ＷＯ ００／４７１０４．
５８． Ｓａｍｂｒｏｏｋ， ｅｔ ａｌ． ， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， １９８９．
【００８２】
本明細書に引用された全ての参考文献は、参照によってここに援用される。本明細書中での参考文献の論考は単に著者らによる主張を概説するためのものであり、どの文献も先行技術を構成するという承認は成されていない。本出願者らは、引用文献が正確および適切であるかを検討する権利を留保する。
【図面の簡単な説明】
【図１】コリン作動薬が投与量に依存してヒトのマクロファージ培養物からのＴＮＦ放出を阻害することを示す実験結果を概説するグラフである。アセチルコリン（ＡＣｈ）、ムスカリン、またはニコチンを、示された濃度でヒトのマクロファージ培養物へ添加した後、４時間、ＬＰＳを添加した。次にＴＮＦ濃度を決定した。
【図２】アセチルコリン（ＡＣｈ）、ニコチン（Ｎｉｃ）、またはムスカリン（Ｍｕｓ）で処置された、もしくはコリン作動薬で処置されないＬＰＳ刺激ヒトマクロファージからのＴＮＦまたはＧＡＤＰＨ ｍＲＮＡのオートラジオグラフを示し、これは、コリン作動薬がマクロファージ中のＬＰＳ刺激ＴＮＦ ｍＲＮＡレベルを減少させないことを実証する。
【図３】ＴＮＦ抗体で染色されたヒトマクロファージの顕微鏡写真を示し、細胞中に存在するＴＮＦに対するＬＰＳおよび／またはアセチルコリン（ＡＣｈ）処置の効果を実証する。
【図４】アトロピン（ＡＴＲ）ではなくα−コノトキシン（α−ＣＴＸ）がヒトマクロファージにおけるアセチルコリン（ＡＣｈ）媒介のＴＮＦ阻害の阻害効果を反転させることを示す実験結果を概説するグラフである。
【図５】アセチルコリンが用量に依存してヒトマクロファージからのＩＬ−１β放出を阻害することを示す実験結果を概説するグラフである。
【図６】アセチルコリンが用量に依存してヒトマクロファージからのＩＬ−６放出を阻害することを示す実験結果を概説するグラフである。
【図７】アセチルコリンが用量に依存してヒトマクロファージからのＩＬ−１８放出を阻害することを示す実験結果を概説するグラフである。
【図８】アセチルコリンがヒトマクロファージからのＩＬ−１０放出を阻害しないことを示す実験結果を概説するグラフである。
【図９】ＬＰＳにより誘導されたエンドトキシン血症の間、迷走神経切除（ＶＧＸ）後の迷走神経刺激（ＳＴＩＭ）がＴＮＦの循環レベルの低下を引き起こすことを示す実験結果を概説するグラフである。
【図１０】ＬＰＳにより誘導されたエンドトキシン血症の間、迷走神経切除（ＶＧＸ）後の迷走神経刺激（ＳＴＩＭ）が肝臓中のＴＮＦレベルの低下を引き起こすことを示す実験結果を概説するグラフである。
【図１１】致死量のエンドトキシンへ曝されたラットにおいて、平均動脈血圧（ＭＡＢＰ）で測定されるように、迷走神経切除（ＶＧＸ）後の迷走神経刺激（ＳＴＩＭ）が低血圧（ショック）の発生を減弱することを示す実験結果を概説するグラフである。
【図１２】致死量のエンドトキシンへ曝されたラットにおいて、１Ｖおよび５Ｖにおける無傷の迷走神経刺激がショックの発生を減弱することを示す実験結果を概説するグラフである。
【図１３】致死量のエンドトキシンへ曝されたラットにおいて、１Ｖおよび５Ｖにおける無傷の迷走神経刺激が心拍数の増加を生じることを示す実験結果を概説するグラフである。
【図１４】致死量のエンドトキシンへ曝されたラットにおいて、１Ｖにおける無傷の左側迷走神経刺激が、無傷の右側迷走神経刺激よりも効果的に血圧を安定化することを示す実験結果を概説するグラフである。
【図１５】ＲＡＷ２６４．７マクロファージ様細胞へのニコチン添加が、細胞によるＨＭＧ−１産生を阻害することを示す実験結果のウェスタンブロットおよびグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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