(57)【要約】アポトーシスを誘発し、癌細胞の成長を抑制するのに、相乗的に効果的な量のＡｐｏ−２Ｌレセプターアゴニスト及びＣＰＴ−１１の使用方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
有効量のＣＰＴ−１１とＡｐｏ−２リガンドレセプターアゴニストに哺乳動物細胞をさらすことを含む、哺乳動物細胞においてアポトーシスを増強させる方法であって、前記哺乳動物細胞を、Ａｐｏ−２リガンドレセプターアゴニストにさらす前に、約６時間から約７２時間、ＣＰＴ−１１にさらす方法。
【請求項２】
前記哺乳動物細胞をＣＰＴ−１１にさらし、該細胞においてＤＲ４レセプターのアップレギュレーションを誘導する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記哺乳動物細胞をＣＰＴ−１１にさらし、該細胞においてＤＲ５レセプターのアップレギュレーションを誘導する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記哺乳動物細胞を、Ａｐｏ−２リガンドレセプターアゴニストにさらす前に、約２４又は４８時間、ＣＰＴ−１１にさらす、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記Ａｐｏ−２リガンドレセプターアゴニストがＡｐｏ２Ｌポリペプチドを含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記Ａｐｏ−２リガンドレセプターアゴニストが抗−ＤＲ４レセプター抗体を含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記抗−ＤＲ４レセプター抗体がモノクローナル抗体である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記抗−ＤＲ４レセプターモノクローナル抗体がキメラ抗体を含んでなる、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記抗−ＤＲ４レセプターモノクローナル抗体がヒト抗体を含んでなる、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記Ａｐｏ−２リガンドレセプターアゴニストが抗−ＤＲ５レセプター抗体を含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記抗−ＤＲ５レセプター抗体がモノクローナル抗体である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記抗−ＤＲ５レセプターモノクローナル抗体がキメラ抗体を含んでなる、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記抗−ＤＲ５レセプターモノクローナル抗体がヒト抗体を含んでなる、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記Ａｐｏ−２リガンドレセプターアゴニストが、一以上のＡｐｏ−２リガンドレセプターと交差反応する抗−Ａｐｏ−２リガンドレセプター抗体である、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
哺乳動物細胞を一又は複数の成長阻害剤にさらすことをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
哺乳動物細胞を放射線にさらすことをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
哺乳動物細胞が結腸直腸癌細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
有効量のＣＰＴ−１１及びＡｐｏ−２リガンドレセプターアゴニストに哺乳動物細胞をさらすことを含む、哺乳動物癌細胞におけるアポトーシスを増強する方法であって、（ａ）該哺乳動物癌細胞を、Ａｐｏ−２リガンドレセプターアゴニストにさらす前に、約６時間〜約７２時間、ＣＰＴ−１１にさらし、（ｂ）前記Ａｐｏ−２リガンドレセプターアゴニストが、配列番号：１のアミノ酸残基１１４−２８１を含んでなるＡｐｏ−２リガンドポリペプチド、抗−ＤＲ４レセプター抗体及び抗−ＤＲ５レセプター抗体からなる群から選択される方法。
【請求項１９】
前記哺乳動物癌細胞をＣＰＴ−１１にさらすことにより、該細胞においてＤＲ４レセプターのアップレギュレーションを誘導する、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記哺乳動物癌細胞をＣＰＴ−１１にさらすことにより、該細胞においてＤＲ５レセプターのアップレギュレーションを誘導する、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
前記抗−ＤＲ４レセプター抗体又は抗−ＤＲ５レセプター抗体が、キメラ、ヒト化又はヒト抗体である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２２】
前記哺乳動物癌細胞が結腸直腸癌細胞である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２３】
前記Ａｐｏ−２リガンドポリペプチドが配列番号：１のアミノ酸残基１１４−２８１からなる、請求項１８に記載の方法。
【請求項２４】
有効量のＣＰＴ−１１及びＡｐｏ−２リガンドレセプターアゴニストを、癌のある哺乳動物に投与することを含む哺乳動物の癌の治療方法であって、前記ＣＰＴ−１１を、Ａｐｏ−２リガンドレセプターアゴニストを投与するより約６時間〜７２時間前に投与する方法。
【請求項２５】
前記Ａｐｏ−２リガンドレセプターアゴニストがＡｐｏ２Ｌポリペプチドを含んでなる、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記Ａｐｏ−２リガンドレセプターアゴニストが抗−ＤＲ４レセプター抗体を含んでなる、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
前記Ａｐｏ−２リガンドレセプターアゴニストが抗−ＤＲ５レセプター抗体を含んでなる、請求項２４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の分野）
この発明は、一般に、哺乳動物細胞においてアポトーシスを誘発する方法に関する。特に、本発明は、哺乳動物細胞においてアポトーシスを相乗的に誘発するためのＡｐｏ−２レセプターアゴニストとＣＰＴ−１１の使用に関する。本発明によって考慮される種々のＡｐｏ−２Ｌレセプターアゴニストには、Ａｐｏ−２リガンド又はＴＲＡＩＬとして公知のリガンド、並びに一又は複数のＡｐｏ−２Ｌレセプターに対するアゴニスト抗体が含まれる。
【０００２】
（発明の背景）
様々な分子、例えば腫瘍壊死因子−α（「ＴＮＦ−α」）、腫瘍壊死因子−β（「ＴＮＦ−β」すなわち「リンホトキシン−α」）、リンホトキシン−β（「ＬＴ−β」）、ＣＤ３０リガンド、ＣＤ２７リガンド、ＣＤ４０リガンド、ＯＸ−４０リガンド、４−１ＢＢリガンド、Ａｐｏ−１リガンド（Ｆａｓリガンド又はＣＤ９５リガンドとも称される）、Ａｐｏ−２リガンド（ＴＲＡＩＬとも称される）、Ａｐｏ−３リガンド（ＴＷＥＡＫとも称される）、オステオプロテゲリン（ＯＰＧ）、ＡＰＲＩＬ、ＲＡＮＫリガンド（ＴＲＡＮＣＥとも称される）及びＴＡＬＬ−１（Ｂ１ｙＳ、ＢＡＦＦ又はＴＨＡＮＫとも称される）が、サイトカインの腫瘍壊死因子（「ＴＮＦ」）ファミリーのメンバーとして同定されている［例えば、Ｇｒｕｓｓ及びＤｏｗｅｒ， Ｂｌｏｏｄ， ８５：３３７８−３４０４（１９９５）；Ｐｉｔｔｉら， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２７１：１２６８７−１２６９０（１９９６）；Ｗｉｌｅｙら， Ｉｍｍｕｎｉｔｙ， ３：６７３−６８２（１９９５）；Ｂｒｏｗｎｉｎｇ等， Ｃｅｌｌ， ７２：８４７−８５６ （１９９３）；Ａｒｍｉｔａｇｅ等， Ｎａｔｕｒｅ， ３５７：８０−８２ （１９９２）、１９９７年１月１６日に公開された国際公開第９７／０１６３３号；１９９７年７月１７日に公開された国際公開第９７／２５４２８号；Ｍａｒｓｔｅｒｓら， Ｃｕｒｒ． Ｂｉｏｌ．， ８：５２５−５２８（１９９８）；Ｓｉｍｏｎｅｔら， Ｃｅｌｌ， ８９：３０９−３１９（１９９７）；Ｃｈｉｃｈｅｐｏｒｔｉｃｈｅら， Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２７２：３２４０１−３２４１０（１９９７）；Ｈａｈｎｅら， Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ．， １８８：１１８５−１１９０（１９９８）；１９９８年７月２日に公開された国際公開第９８／２８４２６号；１９９８年１０月２２日に公開された国際公開第９８／４６７５１号；１９９８年５月７日に公開された国際公開第９８／１８９２１号；Ｍｏｏｒｅら， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２８５：２６０−２６３（１９９９）；Ｓｈｕら， Ｊ． Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ Ｂｉｏｌ．， ６５：６８０（１９９９）；Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒら， Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ．， １８９：１７４７−１７５６（１９９９）；Ｍｕｋｈｏｐａｄｈｙａｙら， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２７４：１５９７８−１５９８１（１９９９）を参照のこと］。これらの分子のなかでも、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β、ＣＤ３０リガンド、４−１ＢＢリガンド、Ａｐｏ−１リガンド、Ａｐｏ−２リガンド（Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ）及びＡｐｏ−３リガンド（ＴＷＥＡＫ）は、アポトーシス性細胞死に関与していることが報告されている。ＴＮＦ−αとＴＮＦ−βの両方とも、感受性腫瘍細胞におけるアポトーシス性死を誘発することが報告されている［Ｓｃｈｍｉｄら， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．， ８３：１８８１（１９８６）；Ｄｅａｌｔｒｙら， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， １７：６８９（１９８７）］。
【０００３】
最近、ＴＮＦサイトカインファミリーのメンバーであると考えられる更なる分子が同定され、アポトーシスに関与することが報告されている。例えば、Ｐｉｔｔｉら， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２７１：１２６８７−１２６９０（１９９６）において、Ａｐｏ−２リガンドと呼ばれる分子が記載されている。１９９７年７月１７日公開の国際公開第９７／２５４２８号をまた参照されたい。全長ヒトＡｐｏ−２リガンドは様々な哺乳動物細胞においてアポトーシスを誘発する２８１のアミノ酸ポリペプチドであると報告されている。他の研究者はＴＲＡＩＬ［Ｗｉｌｅｙら， Ｉｍｍｕｎｉｔｙ， ３：６７３−６８２（１９９５）；１９９７年１月１６日公開の国際公開第９７／０１６３３号］及びＡＧＰ−１［１９９７年１２月１１日公開の国際公開第９７／４６６８６号］と呼ばれる関連したポリペプチドを開示している。
【０００４】
また、ＴＮＦファミリーの様々な分子が免疫システムの発達又は機能の役割を目的としている［Ｇｒｕｓｓら， Ｂｌｏｏｄ， ８５：３３７８（１９９５）］。Ｚｈｅｎｇ等は、ＴＮＦ−αがＣＤ８ポジティブＴ細胞の刺激後アポトーシスに関与していることを報告している［Ｚｈｅｎｇ等， Ｎａｔｕｒｅ， ３７７：３４８−３５１（１９９５）］。他の研究者は、ＣＤ３０リガンドが胸腺における自己反応性Ｔ細胞の欠失に関与していることを報告している［Ａｍａｋａｗａ等， プログラム細胞死に関するコールドスプリングハーバー研究所のシンポジウム、要約集、第１０巻、（１９９５）］。ＣＤ４０リガンドは、増殖、免疫グロブリン分泌、及び生存を含むＢ細胞の多くの機能を活性化する［Ｒｅｎｓｈａｗ等， Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ．，１８０：１８８９（１９９４）］。他の最近同定されたＴＮＦファミリーサイトカイン、ＴＡＬＬ−１（ＢｌｙＳ）は、ある条件下において、Ｂ細胞増殖及び免疫グロブリン分泌を誘発することが報告されている［Ｍｏｏｒｅ等， 上掲；Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ等， 上掲；Ｍａｃｋａｙ等， Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ．， １９０：１６９７（１９９９）］。
【０００５】
マウスのＦａｓ／Ａｐｏ−１レセプター又はリガンド遺伝子（それぞれｌｐｒ及びｇｌｄと呼称される）における変異が幾つかの自己免疫疾患に関連しており、Ａｐｏ−１リガンドが末梢の自己反応性リンパ球のクローン除去を調節する役割を担っていることを示している［Ｋｒａｍｍｅｒ等， Ｃｕｒｒ． Ｏｐ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．，６：２７９−２８９（１９９４）；Ｎａｇａｔａ等， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２６７：１４４９−１４５６（１９９５）］。また、Ａｐｏ−１リガンドは、ＣＤ４ポジティブＴリンパ球及びＢリンパ球においてポスト刺激性アポトーシスを誘発することが報告されており、それらの機能がもはや必要でなくなった際の活性化リンパ球の除去に関与している［Ｋｒａｍｍｅｒ等， 上掲；Ｎａｇａｔａ等， 上掲］。Ａｐｏ−１レセプターと特異的に結合するアゴニストのマウスモノクローナル抗体は、ＴＮＦ−αに匹敵するか類似する細胞死滅活性を示すことが報告されている［Ｙｏｎｅｈａｒａ等， Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ．， １６９：１７４７−１７５６（１９８９）］。
このようなＴＮＦファミリーのサイトカインが介在する種々の細胞反応誘導は、特異的な細胞レセプターに結合することにより開始されると考えられている。以前、約５５−ｋＤａ（ＴＮＦＲ１）と７５−ｋＤａ（ＴＮＦＲ２）の２つの異なるＴＮＦレセプターが同定されている［Ｈｏｈｍａｎ等， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２６４：１４９２７−１４９３４（１９８９）；Ｂｒｏｃｋｈａｕｓ等， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．， ８７：３１２７−３１３１（１９９０）；１９９１年３月２０日に公開された欧州特許第４１７５６３号；Ｌｏｅｔｓｃｈｅｒ等， Ｃｅｌｌ， ６１：３５１（１９９０）；Ｓｃｈａｌｌ等， Ｃｅｌｌ， ６１：３６１（１９９０）；Ｓｍｉｔｈ等， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２４８：１０１９−１０２３（１９９０）；Ｌｅｗｉｓ等， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．， ８８：２８３０−２８３４（１９９１）；Ｇｏｏｄｗｉｎ等， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ．， １１：３０２０−３０２６（１９９１）］。これらのＴＮＦＲは細胞外、膜貫通及び細胞内領域を含む細胞表面レセプターの典型的な構造を共有することが分かった。双方のレセプターの細胞外部分はまた可溶性ＴＮＦ結合タンパク質として天然に見出される［Ｎｏｐｈａｒ， Ｙ等， ＥＭＢＯ Ｊ．， ９：３２６９（１９９０）；及びＫｏｈｎｏ， Ｔ等， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ．， ８７：８３３１（１９９０）；Ｈａｌｅ等， Ｊ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． 増補１５Ｆ， １９９１， ｐ．１１３（Ｐ４２４）］。
【０００６】
１型又は２型のＴＮＦＲ（ＴＮＦＲ１及びＴＮＦＲ２）の細胞外部分は、ＮＨ２−末端から出発して、１から４とされる４つのシステインに富んだドメイン（ＣＲＤ）の反復アミノ酸配列パターンを含む［Ｓｃｈａｌｌ等， 上掲；Ｌｏｅｔｓｃｈｅｒ等， 上掲；Ｓｍｉｔｈ等， 上掲；Ｎｏｐｈａｒ等， 上掲；Ｋｏｈｎｏ等， 上掲；Ｂａｎｎｅｒ等， Ｃｅｌｌ， ７３：４３１−４３５（１９９３）］。ＣＲＤの類似の反復パターンが、ｐ７５神経成長因子レセプター（ＮＧＦＲ）［Ｊｏｈｎｓｏｎ等， Ｃｅｌｌ， ４７：５４５（１９８６）；Ｒａｄｅｋｅ等， Ｎａｔｕｒｅ， ３２５：５９３（１９８７）］、Ｂ細胞抗原ＣＤ４０［Ｓｔａｍｅｎｋｏｖｉｃ等， ＥＭＢＯ Ｊ．， ８：１４０３（１９８９）］、Ｔ細胞抗原ＯＸ４０［Ｍａｌｌｅｔ等， ＥＭＢＯ Ｊ．， ９：１０６３（１９９０）］及びＦａｓ抗原［Ｙｏｎｅｈａｒａ等， 上掲、及びＩｔｏｈ等， Ｃｅｌｌ， ６６：２３３−２４３（１９９１）］を含む幾つかの他の細胞表面タンパク質に存在している。また、ＣＲＤはショープ（Ｓｈｏｐｅ）及び粘液腫ポックスウィルスの可溶型ＴＮＦＲ（ｓＴＮＦＲ）様のＴ２タンパク質にも見出されている［Ｕｐｔｏｎ等， Ｖｉｒｏｌｏｇｙ， １６０：２０−２９（１９８７）；Ｓｍｉｔｈ等， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ．， １７６：３３５（１９９１）；Ｕｐｔｏｎ等， Ｖｉｒｏｌｏｇｙ， １８４：３７０（１９９１）］。これらの配列の最適なアラインメントは、システイン残基の位置が良好に保存されていることを示している。これらレセプターは、しばしば集合的に、ＴＮＦ／ＮＧＦレセプタースーパーファミリーのメンバーと称される。
リンホトキシン−αを除き、今日までに同定されているＴＮＦファミリーのリガンドは、ＩＩ型の膜貫通タンパク質であり、そのＣ末端は細胞外にある。これに対して、今日までに同定されているＴＮＦレセプター（ＴＮＦＲ）ファミリーのほとんどのレセプター類はＩ型の膜貫通タンパク質である。しかしながら、ＴＮＦリガンド及びレセプターファミリーの双方において、ファミリーメンバー間で同定された相同性は、主として細胞外ドメイン（「ＥＣＤ」）において見出されている。ＴＮＦ−α、Ａｐｏ−１リガンド及びＣＤ４０リガンドを含むＴＮＦファミリーサイトカインのいくつかは、細胞表面においてタンパク分解的に切断され；各場合に得られたタンパク質は、典型的には、可溶性サイトカインとして機能するホモ三量体分子を形成する。また、ＴＮＦレセプターファミリーのタンパク質は、通常、タンパク分解的に切断され、同族のサイトカインの阻害剤として機能し得る可溶性レセプターのＥＣＤを放出する。
【０００７】
より最近になって、ＴＮＦＲファミリーの他のメンバーが同定されている。Ｂｕｌｏｗ等によるＳｃｉｅｎｃｅ， ２７８：１３８−１４１（１９９７）において、研究者は膜活性剤及びＣＡＭＬ−インタラクターと称される原形質膜レセプター又は「ＴＡＣＩ」を記載している。ＴＡＣＩレセプターはＴＮＦＲファミリーのシステインリッチモチーフ特性を包含すると報告されている。インビトロアッセイにおいて、ＴＡＣＩ−特異性抗体を有するトランスフェクトされたＪｕｒｋａｔ細胞の表面上でのＴＡＣＩの架橋結合はＮＦ−ＫＢの活性化を引き起こす［また、１９９８年９月１８日公開の国際公開第９８／３９３６１号を参照］。
Ｌａａｂｉ等， ＥＭＢＯ Ｊ．， １１：３８９７−３９０４（１９９２）は、その発現がＢ細胞末端成熟と一致することが見出されている「ＢＣＭ」と呼ばれる新しい遺伝子の同定を報告した。ＢＣＭ通常ｃＤＮＡのオープンリーディングフレームは、単一膜貫通ドメインで１８４アミノ酸長ポリペプチドであると予測された。これらの研究者は後に、この遺伝子を「ＢＣＭＡ」と名付けた［Ｌａａｂｉ等， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， ２２：１１４７−１１５４（１９９４）］。ＢＣＭＡｍＲＮＡ発現は、Ｂリンパ球段階前を表すヒト悪性Ｂ細胞株の非存在であり、よってリンパ球の分化の段階に関わっていると考えられることが報告された［Ｇｒａｓ等， Ｉｎｔ． Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， ７：１０９３−１１０６（１９９５）］。Ｍａｄｒｙ等， Ｉｎｔ． Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， １０：１６９３−１７０２（１９９８）において、マウスＢＣＭＡｃＤＮＡのクローニングが記載された。マウスＢＣＭＡｃＤＮＡは、ヒトＢＣＭＡポリペプチドに対して６２％同一性を有する１８５アミノ酸長ポリペプチドをコードすることが報告された。マウス及びヒトＢＣＭＡタンパク質配列のアラインメントは、Ｎ末端領域で６システインの保存されたモチーフ、ＢＣＭＡタンパク質はＴＮＦＲスーパーファミリーに属するという予測を示した［Ｍａｄｒｙ等， 上掲］。
【０００８】
Ｍａｒｓｔｅｒｓ等、Ｃｕｒｒ． Ｂｉｏｌ．， ６：７５０（１９９６）において、研究者は、細胞外のシステインに富んだ反復についてＴＮＦＲファミリーに対して類似性を示し、細胞質死ドメイン配列を含む点でＴＮＦＲ１及びＣＤ９５に似ており、Ａｐｏ−３と称される、ヒトのポリペプチド天然配列の全長を開示している［Ｍａｒｓｔｅｒｓ等，Ｃｕｒｒ． Ｂｉｏｌ．， ６：１６６９（１９９６）もまた参照されたい］。他の研究者によれば、Ａｐｏ−３はＤＲ３、ｗｓｌ−１、ＴＲＡＭＰ及びＬＡＲＤとも称されている［Ｃｈｉｎｎａｉｙａｎ等， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２７４：９９０（１９９６）；Ｋｉｔｓｏｎ等， Ｎａｔｕｒｅ， ３８４：３７２（１９９６）；Ｂｏｄｍｅｒ等， Ｉｍｍｕｎｉｔｙ， ６：７９（１９９７）；Ｓｃｒｅａｔｏｎ等， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．， ９４：４６１５−４６１９（１９９７）］。
パン（Ｐａｎ）らは、「ＤＲ４」と称される他のＴＮＦレセプターファミリーのメンバーを開示している［Ｐａｎ等， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２７６：１１１−１１３（１９９７）；また、１９９８年７月３０日公開の国際公開第９８／３２８５６号参照］。ＤＲ４は、細胞自殺機構に関与できる細胞質死ドメインを含むことが報告された。パン等は、ＤＲ４がＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬとして知られているリガンドに対するレセプターであると考えられることをさらに開示している。
【０００９】
Ｓｈｅｒｉｄａｎ等， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２７７：８１８−８２１ （１９９７）及びパン等， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２７７：８１５−８１８ （１９９７）においては、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬに対するレセプターと思われる他の分子が開示されている［１９９８年１１月１９日公開の国際公開第９８／５１７９３号；１９９８年９月２４日公開の国際公開第９８／４１６２９号を参照のこと］。この分子は、ＤＲ５と称される（あるいは、Ａｐｏ−２；ＴＲＡＩＬ−Ｒ、ＴＲ６、Ｔａｎｇｏ−６３、ｈＡＰＯ８、ＴＲＩＣＫ２又はＫＩＬＬＥＲとも称される［Ｓｃｒｅａｔｏｎ等，Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．， ７：６９３−６９６（１９９７）；Ｗａｌｃｚａｋ等，ＥＭＢＯ Ｊ．， １６：５３８６−５３８７（１９９７）；Ｗｕ等，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ， １７：１４１−１４３（１９９７）；１９９８年８月２０日に公開の国際公開第９８／３５９８６号；１９９８年１０月１４日に公開の欧州特許第８７０，８２７号；１９９８年１０月２２日に公開の国際公開第９８／４６６４３号；１９９９年１月２１日に公開の国際公開第９９／０２６５３号；１９９９年２月２５日に公開の国際公開第９９／０９１６５号；１９９９年３月１１日に公開の国際公開第９９／１１７９１号］。ＤＲ４のように、ＤＲ５は細胞質死ドメインを含み、アポトーシスのシグナル伝達が可能であると報告されている。Ａｐｏ−２Ｌ／ＴＲＡＩＬ及びＤＲ５の間で形成された複合体の結晶構造は、Ｈｙｍｏｗｉｔｚら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ， ４：５６３−５７１（１９９９）に開示されている。
【００１０】
さらに他の死ドメインを含むレセプターであるＤＲ６が最近同定された［Ｐａｎ等， ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ， ４３１：３５１−３５６（１９９８）］。４つの推定の細胞外システインリッチドメイン及び細胞質死ドメインの他に、ＤＲ６は細胞質領域におけるプロリンに富む領域とオーバーラップするような予想されるロイシンジッパー配列を含むと考えられている。プロリンに富むモチーフはｓｒｃ相同性−３ドメインと結合する配列に類似しており、それは多くの細胞内シグナル伝達分子に見出されるものである。
最近同定されたレセプターのさらなるグループは、「デコイレセプター」と称され、シグナル伝達分子というよりはむしろ、阻害剤として機能すると考えられている。このグループには、ＤＣＲ１（ＴＲＩＤ，ＬＩＴ，又はＴＲＡＩＬ−Ｒ３とも称される）［Ｐａｎ等， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２７６：１１１−１１３（１９９７）；Ｓｈｅｒｉｄａｎ等， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２７７：８１８−８２１ （１９９７）；ＭｃＦａｒｌａｎｅ等， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２７２：２５４１７−２５４２０（１９９７）；Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ等， ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ， ４１６：３２９−３３４（１９９７）；Ｄｅｇｌｉ−Ｅｓｐｏｓｔｉ等， Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ．， １８６：１１６５−１１７０（１９９７）；及びＭｏｎｇｋｏｌｓａｐａｙａ等， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， １６０：３−６（１９９８）］及びＤＣＲ２（ＴＲＵＮＤＤ，又はＴＲＡＩＬ−Ｒ４とも称される）［Ｍａｒｓｔｅｒｓ等， Ｃｕｒｒ． Ｂｉｏｌ．， ７：１００３−１００６（１９９７）；Ｐａｎ等， ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ， ４２４：４１−４５（１９９８）；Ｄｅｇｌｉ−Ｅｓｐｏｓｔｉ等， Ｉｍｍｕｎｉｔｙ， ７：８１３−８２０（１９９７）］が含まれ、両者とも細胞表面分子であり、更にＯＰＧ［Ｓｉｍｏｎｅｔ等， 上掲；Ｅｍｅｒｙ等， 下記］及びＤＣＲ３［Ｐｉｔｔｉ等， Ｎａｔｕｒｅ， ３９６：６９９−７０３（１９９８）］も含まれ、これら両者は分泌性の可溶性タンパク質である。
【００１１】
最近になって、ＴＮＦＲファミリーの他の同定されているメンバーには、ＣＡＲ１、ＨＶＥＭ、ＧＩＴＲ、ＺＴＮＦＲ−５、ＮＴＲ−１、及びＴＮＦＬ１が含まれる［Ｂｒｏｊａｔｓｃｈ等， Ｃｅｌｌ， ８７：８４５−８５５ （１９９６）；Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙ等， Ｃｅｌｌ， ８７：４２７−４３６ （１９９６）；Ｍａｒｓｔｅｒｓ等， Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．， ２７２：１４０２９−１４０３２ （１９９７）；Ｎｏｃｅｎｔｉｎｉ等， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９４：６２１６−６２２１（１９９７）；Ｅｍｅｒｙ等， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２７３：１４３６３−１４３６７（１９９８）；１９９９年１月２８日公開の国際公開第９９／０４００１号；１９９９年２月１８日公開の国際公開第９９／０７７３８号；１９９９年７月８日公開の国際公開第９９／３３９８０号］。
Ｔｅｗａｒｉらにより最近概説されているように、ＴＮＦＲ１、ＴＮＦＲ２及びＣＤ４０は、転写因子、ＮＦ−ＫＢの活性化を通して、炎症誘発性及び同時刺激性サイトカイン、サイトカインレセプター、及び細胞接着分子の発現を変調する［Ｔｅｗａｒｉ等， Ｃｕｒｒ． Ｏｐ． Ｇｅｎｅｔ． Ｄｅｖｅｌｏｐ．， ６：３９−４４（１９９６）］。ＮＦ−ＫＢは、そのサブユニットが保存Ｒｅｌ領域を含有する二量体転写因子のファミリーの原型である［Ｖｅｒｍａ等， Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖｅｌｏｐ．， ９：２７２３−２７３５（１９９６）；Ｂａｌｄｗｉｎ， Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， １４：６４９−６８１（１９９６）］。その潜伏形態において、ＮＦ−ＫＢはＩＫＢ阻害剤ファミリーのメンバーと複合化しており；所定の刺激に反応してＩＫＢの不活性化の際に、放出されたＮＦ−ＫＢが、特異的ＤＮＡ配列と結合する核に転座して遺伝子転写を活性化する。前記したように、今日までに同定されたＴＮＦＲメンバーは細胞内死ドメイン領域を含むか、又は欠いている。例えばＴＮＦＲ２、ＣＤ４０、ＨＶＥＭ、及びＧＩＴＲのような、死のドメインを欠くいくつかのＴＮＦＲ分子は、ＮＦ−ＫＢ活性の調節の能力がある［例えばＬｏｔｚ等， Ｊ． Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ Ｂｉｏｌ．， ６０：１−７（１９９６）参照］。
サイトカインのＴＮＦファミリー及びそれらのレセプター類の概説については、Ａｓｈｋｅｎａｚｉ及びＤｉｘｉｔ， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２８１：１３０５−１３０８（１９９８）；Ｇｏｌｓｔｅｉｎ， Ｃｕｒｒ． Ｂｉｏｌ．， ７：７５０−７５３（１９９７）；Ｇｒｕｓｓ及びＤｏｗｅｒ， 上掲、及びＮａｇａｔａ， Ｃｅｌｌ， ８８：３５５−３６５（１９９７）を参照されたい。
【００１２】
（発明の概要）
出願人は、Ａｐｏ−２リガンド又は他のＡｐｏ−２ＬレセプターアゴニストとＣＰＴ−１１が、哺乳動物細胞、特に哺乳動物癌細胞においてアポトーシスの誘発に相乗的に作用することができることを見出した。
本発明は、哺乳動物細胞においてアポトーシスを誘発するのためのＡｐｏ−２リガンド及びＣＰＴ−１１の様々な使用方法を提供する。例えば、本発明は、哺乳動物細胞、例えば癌細胞を、ＣＰＴ−１１及び一又は複数のＡｐｏ−２リガンドレセプターアゴニストにさらすことを含んでなるアポトーシスを誘発する方法を提供し、ＣＰＴ−１１はＡｐｏ−２リガンドレセプターアゴニストの前に投与されて、細胞を前処理する。
細胞は、細胞培地中又は哺乳動物、例えば細胞のアポトーシスの誘発が所望される症状又は癌に罹っている哺乳動物中にあってもよい。従って、本発明はここで開示されるように、Ａｐｏ−２リガンド及びＣＰＴ−１１の有効量を投与することを含んでなる癌を罹っている哺乳動物を治療する方法を含む。
【００１３】
場合によっては、本方法はＡｐｏ−２リガンドのアポトーシス活性に似たアゴニストの抗−Ａｐｏ−２リガンドレセプター抗体を使用しうる。よって、本発明は哺乳動物細胞のアポトーシスを誘発するためのＡｐｏ−２リガンドレセプターアゴニスト抗体及びＣＰＴ−１１の様々な使用方法を提供する。好ましい実施態様では、アゴニスト抗体は、ＤＲ４又はＤＲ５レセプターに対するモノクローナル抗体を含むであろう。
また任意の実施態様では、哺乳動物癌細胞を、有効量のＣＰＴ−１１及びＡｐｏ−２リガンドレセプターアゴニストにさらすことを含む、哺乳動物癌細胞のアポトーシスを高める方法を提供することにあり、ここで、該哺乳動物癌細胞を、該Ａｐｏ−２リガンドレセプターアゴニストにさらす前に、約６〜７２時間ＣＰＴ−１１にさらす。本方法は、有効量のＣＰＴ−１１に前記哺乳動物癌細胞を暴露させることを含み、前記細胞においてＤＲ４レセプター又はＤＲ５レセプターのアップレギュレーションを誘導する。場合によっては、哺乳動物癌細胞を、前記Ａｐｏ−２リガンドレセプターアゴニストにさらす前に、約２４〜４８時間ＣＰＴ−１１にさらす。Ａｐｏ−２リガンドレセプターアゴニストは、Ａｐｏ２Ｌポリペプチド又は抗−ＤＲ４レセプター抗体又は抗−ＤＲ５レセプター抗体を含んでいてもよい。
【００１４】
さらに、任意の実施態様では、有効量のＣＰＴ−１１及びＡｐｏ−２リガンドレセプターアゴニストを癌を患っている哺乳動物に投与することを含んでなる、哺乳動物の癌を治療する方法を提供し、ここで該ＣＰＴ−１１は、Ａｐｏ−２リガンドレセプターアゴニストを投与する前の約６〜７２時間に投与される。場合によっては、Ａｐｏ−２リガンドレセプターアゴニストは、Ａｐｏ２Ｌポリペプチド、抗−ＤＲ４レセプター抗体又は抗−ＤＲ５レセプター抗体を含む。
本発明はまた、Ａｐｏ−２リガンド又はＡｐｏ−２Ｌレセプターアゴニスト抗体及び／又はＣＰＴ−１１を含んでなる組成物を提供する。場合によっては、本発明の組成物は、製薬的に許容可能な担体又は希釈剤を含みうる。好ましくは、該組成物は、哺乳動物細胞のアポトーシスを相乗的に誘発する効果的な量のＡｐｏ−２リガンド又はアゴニスト抗体及び／又はＣＲＴ−１１を含みうる。
本発明はまた、Ａｐｏ−２リガンド又はＡｐｏ−２Ｌレセプターアゴニスト抗体及び／又はＣＰＴ−１１を含む製造品又はキットを提供する。
【００１５】
（発明の詳細な説明）
Ｉ．定義
「アポトーシス」及び「アポトーシス活性」という用語は広義に使用され、典型的には、細胞質の凝集、原形質膜の微絨毛の喪失、核の分節化、染色体ＤＮＡの分解又はミトコンドリア機能の喪失を含む一又は複数の特徴的な細胞変化を伴う、哺乳動物における細胞死の規則的又はコントロールされた形態を称す。この活性は、当該技術で公知の技術、例えば細胞生死判別アッセイ、ＦＡＣＳ分析又はＤＮＡ電気泳動法、そしてより詳細にはアネキシンＶの結合、ＤＮＡの断片化、ＰＡＲＰ切断、細胞収縮、小胞体の拡大、細胞断片化、及び／又は膜ベジクル（アポトーシス体と呼ばれる）の生成により、決定し測定することができる。これらの技術及びアッセイは、当該分野において、例えば国際公開第９７／２５４２８号及び国際公開第９７／０１６３３号に記載されている。場合によっては、アポトーシス活性は実施例に記載されているアッセイを使用して測定することもできる。
ここで使用される場合、「相乗」又は「相乗効果」又は「相乗的に」という用語は、組み合わせた効果がその個々の効果の合計よりもより大きいような２又はそれ以上の薬剤の相互作用を称する。
【００１６】
「Ａｐｏ−２リガンド」、「Ａｐｏ−２Ｌ」又は「ＴＲＡＩＬ」という用語は、Ｐｉｔｔｉ等， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２７１：１２６８７−１２６９０ （１９９６）の図１Ａに示されたアミノ酸配列のアミノ酸残基９５−２８１、１１４−２８１、残基９１−２８１、残基９２−２８１、残基４１−２８１、残基１５−２８１、又は残基１−２８１（ここでは、配列リストで配列番号：１として提供されている）、並びに上記配列の生物活性な（例えばアポトーシス活性）断片、欠失、挿入又は置換変異体を含むポリペプチドを称する。一実施態様において、ポリペプチド配列は、配列番号：１の残基１１４−２８１を含む。場合によっては、ポリペプチド配列は、配列番号：１の少なくとも残基９１−２８１又は残基９２−２８１を有する。他の好適な実施態様では、生物活性な断片又は変異体は、上記配列の何れかと少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性、そして更により好ましくは少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％のアミノ酸配列同一性を有する。本定義は、（Ｐｉｔｔｉ等， 上掲に提供される配列（配列番号：１）の番号を用いて）位置２０３、２１８又は２６９で少なくとも１のアミノ酸がアラニン残基によって置換されて、Ｐｉｔｔｉ等， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２７１：１２６８７−１２６９０（１９９６）の図１Ａのアミノ酸９１−２８１を含んでなるＡｐｏ−２リガンドの置換変異体を包含する。本定義は、例えばヒト組織型又は他の供給源のようなＡｐｏ−２リガンド供給源から単離されるか、組み換え又は合成法により調製されたＡｐｏ−２リガンドを包含する。Ａｐｏ−２リガンドという用語はまた上掲の国際公開第９７／２５４２８号及び上掲の国際公開第９７／０１６３３号に記載されたポリペプチドを称する。Ａｐｏ−２リガンドポリペプチドはポリエチレングリコールのような一又は複数のポリマー分子に結合しうるものと考えられる。
【００１７】
「ＣＰＴ−１１」という用語は一般的な意味で使用され、トポイソメラーゼＩ阻害剤クラスの化学療法又は化学療法剤を称する。ここで使用される「ＣＰＴ−１１」という用語は、化学名（４Ｓ）−４、１１−ジエチル−４−ヒドロキシ−９−［（４−ピペリジノ−ピペリジノ）カルボニルオキシル］−１Ｈ−ピラノ［３’，４’：６，７］インドリジノ［１，２−ｂ］キノリン−３，１４（４Ｈ，１２Ｈ）ジオン塩酸塩三水和物、及び名称イリノテカン、カンプトセシン、トポテカン、又はＣａｍｐｔｏｓａｒ（登録商標）（商品名）、同様にその水溶性誘導体又はこのような薬剤の製薬的に許容可能な塩を有する化学療法剤を含む。イリノテカン塩酸塩は、実験式Ｃ３３Ｈ３８Ｎ４Ｏ６＊ＨＣＩ＊３Ｈ２Ｏ及び分子量約６７７．１９を有する。このような化学名及び化学式は、当業者によく知られている。Ｃａｍｐｔｏｓａｒ（商品名）は、Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＆ Ｕｐｊｏｈｎより商業的に入手可能で、ＦＤＡにより米国での販売が許可されている。該分子を表示するＣａｍｐｔｏｓａｒ（商品名）の製品挿入物は、５−ＦＵに基づく治療に続いて、病気が再発又は進行した転移性直腸結腸癌を有するヒト患者の治療に使用することができる。ＣＰＴ−１１は、ポリエチレングリコール等の一又は複数のポリマー分子に結合可能であると考えられている。
【００１８】
ここで同定されているＡｐｏ−２Ｌポリペプチド配列に対する「パーセント（％）アミノ酸配列同一性」は、配列を整列させ、最大のパーセント配列同一性を得るために必要ならば間隙を導入し、如何なる保存的置換も配列同一性の一部と考えないとした、Ａｐｏ−２Ｌ配列のアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセントとして定義される。パーセント核酸配列同一性を決定する目的のためのアラインメントは、当業者の知る範囲にある種々の方法、例えばＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮ、ＡＬＩＧＮ−２又はＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウエアのような公に入手可能なコンピュータソフトウエアを使用することにより達成可能である。当業者であれば、比較される配列の全長に対して最大のアラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、アラインメントを測定するための適切なパラメータを決定することができる。場合によっては、％アミノ酸配列同一性値は、配列比較コンピュータプログラムＡＬＩＧＮ−２を用いて得られる。ＡＬＩＧＮ−２配列比較コンピュータプログラムはジェネンテク社によって作成され、ソースコードは米国著作権庁， Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｄ．Ｃ．， ２０５５９に使用者用書類とともに提出され、米国著作権登録番号ＴＸＵ５１００８７の下で登録されている。ＡＬＩＧＮ−２プログラムはジェネンテク社、Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ， Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａを通して公的に入手可能である。ＡＬＩＧＮ−２プログラムは、ＵＮＩＸオペレーティングシステム、好ましくはデジタルＵＮＩＸ Ｖ４．０Ｄでの使用のためにコンパイルされる。全ての配列比較パラメータは、ＡＬＩＧＮ−２プログラムによって設定され変動しない。しかしながら、％アミノ酸配列同一性は、配列比較プログラムＮＣＢＩ−ＢＬＡＳＴ２（Ａｌｔｓｃｈｕｌ等， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２５：３３８９−３４０２ （１９９７））を用いて決定してもよい。ＮＣＢＩ−ＢＬＡＳＴ２配列比較プログラムは、ｈｔｔｐ：／／ｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖからダウンロードできる。ＮＣＢＩ−ＢＬＡＳＴ２は幾つかの検索パラメータを使用し、それら検索パラメータの全てはデフォルト値に設定され、例えば、ｕｎｍａｓｋ＝可、鎖＝全て、予測される発生＝１０、最小低複合長＝１５／５、マルチパスｅ−値＝０．０１、マルチパスの定数＝２５、最終ギャップアラインメントのドロップオフ＝２５、及びスコアリングマトリクス＝ＢＬＯＳＵＭ６２を含む。
【００１９】
「アゴニストの抗−Ａｐｏ−２リガンドレセプター抗体」に関して使用される「抗体」という用語は広義に使用され、特に無傷のモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、少なくとも２つの無傷の抗体から形成される多重特異性抗体（例えば二重特異性抗体）、及びそれらが一又は複数のＡｐｏ−２リガンドと結合し、及び／又は一又は複数のＡｐｏ−２リガンドレセプターを発現している哺乳動物細胞のアポトーシスシグナル伝達経路を活性化させるか、又はＡｐｏ−２リガンドのアポトーシス活性を模倣する（例えば、それに匹敵するもしくは少なくとも等しい）か、又はＡｐｏ−２よりも大きなアポトーシス活性を有する限り抗体断片をカバーする。
【００２０】
「Ａｐｏ−２リガンドレセプター」は、当該分野において「ＤＲ４」及び「ＤＲ５」と称されるレセプターを含む。Ｐａｎ等は、「ＤＲ４」と称される他のＴＮＦレセプターファミリーのメンバーを開示している［Ｐａｎ等， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２７６：１１１−１１３（１９９７）；また１９９８年７月３０日公開の国際公開第９８／３２８５６号を参照］。ＤＲ４レセプターは、細胞自殺機構に関わることが可能な細胞質死ドメインを含むことが報告されている。Ｐａｎ等は、ＤＲ４がＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬとして知られるリガンドのレセプターであると考えられると開示している。全長ＤＲ４レセプターのアミノ酸配列は、ここでは配列番号：２として提供されている。Ｓｈｅｒｉｄａｎ等， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２７７：８１８−８２１ （１９９７）及びＰａｎ等， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２７７：８１５−８１８ （１９９７）においては、Ａｐｏ−２Ｌ／ＴＲＡＩＬの他のレセプターが記載されている。［１９９８年１１月１９日発行の国際公開第９８／５１７９３号；１９９８年９月２４日発行の国際公開第９８／４１６２９号を参照のこと］。このレセプターはＤＲ５とも呼ばれる。（該レセプターはまた、Ａｐｏ−２；ＴＲＡＩＬ−Ｒ、ＴＲ６、Ｔａｎｇｏ−６３、ｈＡＰＯ８、ＴＲＩＣＫ２又はＫＩＬＬＥＲとも呼ばれる；Ｓｃｒｅａｔｏｎ等，Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．， ７：６９３−６９６（１９９７）；Ｗａｌｃｚａｋ等，ＥＭＢＯ Ｊ．， １６：５３８６−５３８７（１９９７）；Ｗｕ等，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ， １７：１４１−１４３（１９９７）；１９９８年８月２０日に公開の国際公開第９８／３５９８６号（米国特許第６，０７２，０４７号に対応）；１９９８年１０月１４日に公開の欧州特許第８７０，８２７号；１９９８年１０月２２日に公開の国際公開第９８／４６６４３号；１９９９年１月２１日に公開の国際公開第９９／０２６５３号；１９９９年２月２５日に公開の国際公開第９９／０９１６５号；１９９９年３月１１日に公開の国際公開第９９／１１７９１号］。ＤＲ４のように、ＤＲ５は細胞質死ドメインを含み、アポトーシスのシグナル伝達が可能であると報告されている。国際公開第９８／３５９８６号（米国特許第６，０７２，０４７号に対応）の全長ＤＲ５レセプター配列は、４４０のアミノ酸のポリペプチドであることが報告されており、そのアミノ酸配列は配列番号：３で提供されている。国際公開第９８／５１７９３号の全長ＤＲ５レセプター配列は、４４１のアミノ酸のポリペプチドであることが報告されており、そのアミノ酸配列は配列番号：４で提供されている。前記されるように、Ａｐｏ−２Ｌに対する他のレセプターはＤｃＲ１、ＤｃＲ２、及びＯＰＧを含む［Ｓｈｅｒｉｄａｎ等、上掲；Ｍａｒｓｔｅｒｓ等、上掲；及びＳｉｍｏｎｅｔ等、上掲を参照のこと］。ここで使用される場合の「Ａｐｏ−２Ｌレセプター」という用語は天然配列レセプター及びレセプター変異体を含む。これらの用語は、ヒトを含む様々な動物で発現されるＡｐｏ−２Ｌレセプターを含む。Ａｐｏ−２Ｌレセプターは、様々なヒト組織系統で自然に発生して内因的に発現されても、あるいは組換え又は合成方法によって発現されてもよい。「天然配列Ａｐｏ−２Ｌレセプ��ー」は、自然から誘導したＡｐｏ−２Ｌレセプターと同じアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。よって、天然配列Ａｐｏ−２Ｌレセプターは、任意の動物から自然に発生したＡｐｏ−２Ｌレセプターのアミノ酸配列を有することができる。このような天然配列Ａｐｏ−２Ｌレセプターは、自然から単離することができ、あるいは組換え又は合成法によって作成することもできる。「天然配列Ａｐｏ−２Ｌレセプター」なる用語は、特にレセプターの自然に発生する切断又は分泌形態（例えば、細胞外ドメイン配列を含む可溶化形態など）、自然に発生する変異形態（例えば選択的にスプライシングされた形態）及び自然に発生する対立遺伝子変異体を含む。レセプター変異体は天然配列Ａｐｏ−２Ｌレセプターの断片又は欠失突然変異を含みうる。
【００２１】
ここで使用される「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を称する、すなわち、集団に含まれる個々の抗体が、少量存在しうる自然に生じる可能な突然変異を除いて同一である。モノクローナル抗体は高度に特異的であり、一つの抗原部位に指向する。さらに、異なる決定基（エピトープ）に対する異なる抗体を典型的に含む従来の（ポリクローナル）抗体調製物とは反対に、各モノクローナル抗体は抗原の単一の決定基に指向する。それらの特性に加えて、モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ培地で合成され、他の免疫グロブリンで汚染されていないという点で有利である。「モノクローナル」との修飾は、実質的に均一な抗体集団から得られたという抗体の特徴を示し、抗体を何か特定の方法で生産しなければならないと解釈されるものではない。例えば、本発明に従って使用されるモノクローナル抗体は、最初にＫｏｈｌｅｒ等， Ｎａｔｕｒｅ， ２５６：４９５ （１９７５）に記載されたハイブリドーマ法によって作ることができ、あるいは組換えＤＮＡ法によって作ることができる（例えば米国特許第４，８１６，５６７号参照）。「モノクローナル抗体」は、また、Ｃｌａｃｋｓｏｎ等， Ｎａｔｕｒｅ， ３５２：６２４−６２８（１９９１）及びＭａｒｋｓ等， Ｊ． Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．， ２２２：５８１−５９７（１９９１）に記載された技術を用いてファージ抗体ライブラリから単離することができる。
ここで、モノクローナル抗体は特に、「キメラ」抗体（免疫グロブリン）を含み、それは、重鎖又は軽鎖の一部が特定の種から誘導された又は特定の抗体クラス又はサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一又は相同であるが、鎖の残りの部分は他の種から誘導された又は他の抗体クラス又はサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一又は相同である抗体、並びにそれらが所望の生物学的活性を示す限りにおいてそれらの抗体の断片である（米国特許第４，８１６，５６７号；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ等， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８１：６８５１−６８５５ （１９８４））。
【００２２】
非ヒト（例えばマウス）抗体の「ヒト化」形とは、キメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖、あるいはそれらの断片（例えばＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２あるいは抗体の他の抗原結合サブ配列）であって、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含むものである。大部分において、ヒト化抗体はレシピエントの相補性決定領域（ＣＤＲ）の残基が、マウス、ラット又はウサギのような所望の特異性、親和性及び能力を有する非ヒト（ドナー抗体）のＣＤＲの残基によって置換されたヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。ある場合には、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク領域（ＦＲ）残基は、対応する非ヒト残基によって置換されている。更に、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にも、移入されたＣＤＲもしくはフレームワーク配列にも見出されない残基を含んでもよい。これらの修飾は抗体の特性を更に洗練し、最適化するために行われる。一般に、ヒト化抗体は、全てあるいはほとんど全てのＣＤＲ領域が非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、全てあるいはほとんど全てのＦＲ領域がヒト免疫グロブリン配列のものである、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含む。ヒト化抗体は、最適には免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）、典型的にはヒトの免疫グロブリンの定常領域の少なくとも一部を含んでなる。更なる詳細については、Ｊｏｎｅｓ等， Ｎａｔｕｒｅ， ３２１：５２２−５２５（１９８６）；Ｒｅｉｃｈｍａｎｎ等， Ｎａｔｕｒｅ， ３３２：３２３−３２９（１９８８）；及びＰｒｅｓｔａ， Ｃｕｒｒ． Ｏｐ． Ｓｔｒｕｃｔ． Ｂｉｏｌ．， ２：５９３−５９６（１９９２）参照。ヒト化抗体はＰＲＩＭＡＴＩＺＥＤＴＭを含み、抗体の抗原結合領域が、関心ある抗原でマカク属サルに免疫性を与えることで生成される抗体から得られる。
【００２３】
抗体は、典型的には、特定の抗原に結合特異性を示すタンパク質又はポリペプチドである。天然抗体は、通常はヘテロ四量体糖タンパク質であり、２つの同一な軽（Ｌ）鎖と２つの同一な重（Ｈ）鎖とからなる。典型的には、各軽鎖は共有ジスルフィド結合によって重鎖に結合しているが、ジスルフィド結合の数は異なる免疫グロブリンアイソタイプの重鎖の間で変化する。また各重鎖及び軽鎖は、規則的に離間した鎖間ジスルフィド架橋を有する。各重鎖は、一端に多数の定常ドメインに続く可変ドメイン（ＶＨ）を持つ。各軽鎖は、一端に可変ドメイン（ＶＬ）を、他端に定常ドメインを有し；軽鎖の定常ドメインは重鎖の第１の定常ドメインと整列し、軽鎖の可変ドメインは重鎖の可変ドメインと整列している。特定のアミノ酸残基が軽鎖と重鎖の可変ドメイン間の界面を形成すると考えられている［Ｃｈｏｔｈｉａ等， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， １８６：６５１−６６３ （１９８５）；Ｎｏｖｏｔｎｙ及びＨａｂｅｒ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ． ８２：４５９２−４５９６ （１９８５）］。任意の脊髄動物種からの抗体の軽鎖は、それらの定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ及びラムダと呼ばれる２つの明確に区別される型に割り当てることができる。それらの重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に応じて、免疫グロブリンは異なるクラスに割り当てられる。免疫グロブリンには５つの大きなクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭがあり、そのうちの幾つかは、サブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ−１、ＩｇＧ−２、ＩｇＧ−３、及びＩｇＧ−４；ＩｇＡ−１及びＩｇＡ−２に更に分けることができる。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインは、各々、アルファ、デルタ、イプシロン、ガンマ、及びミューと呼ばれる。
【００２４】
「抗体断片」は無傷の抗体の一部、一般的には無傷の抗体の抗原結合性又は可変領域を含む。抗体断片の例は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２及びＦｖ断片、ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｉｅｓ）、一本鎖抗体分子、及び抗体断片から形成された多重特異性抗体を含む。
ここで「可変」という用語は、抗体間で配列が異なり各特定の抗体のその抗原に対する結合性及び特異性の使用される可変ドメインの或る一部を記述するのに用いられる。しかしながら、可変性は抗体の可変ドメインを通して常に均一に分布しているわけではない。典型的には、軽鎖と重鎖の両方の可変ドメインにおいて相補性決定領域（ＣＤＲ）又は高頻度可変領域と呼ばれる３つのセグメントに集中している。可変ドメインのより高度に保存される部分はフレームワーク（ＦＲ）と呼ばれる。天然重鎖及び軽鎖の可変ドメインは各々４つのＦＲ領域を含み、これは大きくβ−シート配置をとり、３つのＣＤＲに結合してループ状結合を形成するが、β−シート構造の一部を形成する場合もある。各鎖のＣＤＲは、ＦＲ領域の直近に保持され、他の鎖からのＣＤＲとともに抗体の抗原結合部位の形成に寄与する［Ｋａｂａｔ， Ｅ．Ａ．等， Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ， Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ， Ｂｅｔｈｅｓｄａ， ＭＤ （１９８７）参照］。定常ドメインは抗体の抗原への結合には直接含まれないが、抗体依存的細胞毒性における抗体の寄与といった様々なエフェクター機能を示す。
ここで、モノクローナル抗体は、起源の種又は免疫グロブリンクラス又はサブクラスの命名にかかわらず、キメラ、定常ドメインを有する抗−Ａｐｏ−２Ｌレセプター抗体の可変（高頻度可変を含む）ドメインをスプライシングすることによって生産されるハイブリッド及び組換え抗体（例えば「ヒト化」抗体）、又は重鎖を有する軽鎖、又は他の種からの鎖を有するある種からの鎖、又は異種タンパク質との融合体、並びにそれが所望の生物的活性を有する限り抗体断片（例えばＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２及びＦｖ）を特に含む。例えば、米国特許第４，８１６，５６７号、及びＭａｇｅ等， Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ， ｐｐ．７９−９７（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ， Ｉｎｃ．：ニューヨーク， １９８７）を参照。
【００２５】
「ヒト抗体」は、ヒトによって生産される抗体のアミノ酸配列に一致するアミノ酸配列を有するもの、及び／又はここにおいて開示されたヒト抗体を製造するいずれかの技術を使用して製造されたものである。ヒト抗体この定義は、特に非ヒト抗原結合残基を含んでなるヒト化抗体を除く。ヒト抗体は、この分野で知られている種々の技術を使用することによって生産することが可能である。一実施態様では、ヒト抗体は、ヒト抗体を発現するファージライブラリーから選択される（Ｖａｕｇｈａｎ等， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １４：３０９−３１４ （１９９６）：Ｓｈｅｅｔｓら． ＰＮＡＳ， （ＵＳＡ）９５：６１５７−６１６２（１９９８）；Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ及びＷｉｎｔｅｒ， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， ２２７：３８１ （１９９１）；Ｍａｒｋｓ等， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， ２２２：５８１ （１９９１））。また、ヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン座位をトランスジェニック動物、例えば内在性免疫グロブリン遺伝子が部分的又は完全に不活性化されたマウスに導入することにより産生することができる。この試みでは、遺伝子再構成、構築及び抗体レパートリーを含む、あらゆる点でヒトに見られるものと密接に類似しているヒト抗体の産生が観察される。このアプローチ法は、例えば米国特許第５，５４５，８０７号；第５，５４５，８０６号；第５，５６９，８２５号；第５，６２５，１２６号；第５，６３３，４２５号；第５，６６１，０１６号、及び次の科学文献：Ｍａｒｋｓ等， Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：７７９−７８３ （１９９２）；Ｌｏｎｂｅｒｇ等， Ｎａｔｕｒｅ ３６８：８５６−８５９ （１９９４）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ等， Ｎａｔｕｒｅ ３６８：８１２−１３ （１９９４）；Ｆｉｓｈｗｉｌｄ等， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １４：８４５−５１ （１９９６）；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １４：８２６ （１９９６）；Ｌｏｎｂｅｒｇ及びＨｕｓｚａｒ， Ｉｎｔｅｒｎ． Ｒｅｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １３：６５−９３ （１９９５）。あるいは、ヒト抗体は、標的抗原に対する抗体を生産するヒトＢリンパ球の固定化によって調製されてもよい（そのようなＢリンパ球は、個々から回収されてもよいし、インビトロで免疫化してもよい）。例えば、Ｃｏｌｅ等， Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ， Ａｌａｎ Ｒ． Ｌｉｓｓ． ｐ．７７（１９８５）及びＢｏｅｒｎｅｒ等， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， １４７（１）：８６−９５（１９９１）；及び米国特許第５，７５０，３７３号を参照のこと。
【００２６】
「Ｆｃ領域」という用語は、無傷の抗体のパパイン消化で生じ得る免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を定義するために使用される。Ｆｃ領域は、天然配列Ｆｃ領域又は変異体Ｆｃ領域である。免疫グロブリン重鎖のＦｃ領域の境界は変化するかも知れないが、ヒトＩｇＧ重鎖のＦｃ領域は、通常、Ｃｙｓ２２６の位置のアミノ酸残基、又は約位置Ｐｒｏ２３０からＦｃ領域のカルボキシル末端まで伸展すると定義される（ここにおいては、Ｋａｂａｔら，上掲の番号方式を使用）。免疫グロブリンのＦｃ領域は、一般的に、二つの定常ドメイン、ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインを含み、場合によってはＣＨ４ドメインを含む。
ここで「Ｆｃ領域鎖」とは、Ｆｃ領域の二つのポリペプチド鎖のうちの一つを意味する。
ヒトＩｇＧＦｃ領域の「ＣＨ２ドメイン」（「Ｃγ２」ドメインとも呼ばれる）は通常アミノ酸残基で約位置２３１からアミノ酸残基で約位置３４０まで伸展する。ＣＨ２ドメインは、他のドメインと密接には対をなさないという点で独特である。むしろ、２つのＮ−結合分岐炭水化物鎖が未変性の天然ＩｇＧ分子の２つのＣＨ２ドメインの間に介在されている。炭水化物はドメイン−ドメイン対形成に対する代替物を提供し、ＣＨ２ドメインを安定化させるのに役立つと推測されてきた。Ｂｕｒｔｏｎ， Ｍｏｌｅｃ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２２：１６１−２０６ （１９８５）。ここにおけるＣＨ２ドメインは、天然配列ＣＨ２ドメイン又は変異体ＣＨ２ドメインであってもよい。
「ＣＨ３ドメイン」は、残基Ｃ末端からＦｃ領域のＣＨ２ドメインへの伸長を含む（すなわち、ＩｇＧのアミノ酸残基で約位置３４１からアミノ酸残基で約位置４４７）。ここにおけるＣＨ３領域は、天然配列ＣＨ３ドメイン又は変異体ＣＨ３ドメインでもよい（例えば、その一つの鎖の導入された「突出部（ｐｒｏｔｒｏｂｅｒａｎｃｅ）」を伴うＣＨ３ドメイン、及びその他の鎖の相当する導入された「空洞」；米国特許第５，８２１，３３３号を参照のこと）。
【００２７】
「ヒンジ領域」は、ヒトＩｇＧ１の約Ｇｌｕ２１６、又は約Ｃｙｓ２２６から約Ｐｒｏ２３０の伸展として一般に定義されている（Ｂｕｒｔｏｎ， Ｍｏｌｅｃ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２２：１６１−２０６ （１９８５））。他のＩｇＧアイソタイプのヒンジ領域は、重鎖間Ｓ−Ｓ結合を形成する最初と最後のシステイン残基を同じ位置に配することにより、ＩｇＧ１と整列させられうる。ここにおけるヒンジ領域は、天然配列ヒンジ領域又は変異体ヒンジ領域であってもよい。変異体ヒンジ領域の二つのポリペプチド鎖は、一般的に、ポリペプチド鎖当たり少なくとも一つのシステイン残基を保持し、変異体ヒンジ領域の二つのポリペプチド鎖は、二つの鎖の間でジスフィルド結合を形成できる。ここにおける好ましいヒンジ領域は、天然配列ヒトヒンジ領域で、例えば天然配列ヒトＩｇＧ１ヒンジ領域である。
「機能的Ｆｃ領域」は、天然配列Ｆｃ領域の少なくとも一つの「エフェクター機能」を有する。模範的な「エフェクター機能」は、Ｃ１ｑ結合を含む；補体依存性細胞障害性（ＣＤＣ）；Ｆｃレセプター結合；抗体依存性細胞媒介障害活性（ＡＤＣＣ）；ファゴサイトーシス；細胞表層レセプターの下方制御（例えば、Ｂ細胞レセプター；ＢＣＲ）等。このようなエフェクター機能は、一般的に、結合ドメインと結合するＦｃ領域を必要とし（例えば、抗体可変ドメイン）、そのような抗体エフェクター機能を評価するための分野で知られた種々のアッセイを使用して評価できる。
「天然配列Ｆｃ領域」は、天然に見出されるＦｃ領域のアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を含む。「変異体Ｆｃ領域」は、少なくとも一つのアミノ酸修飾によって天然配列Ｆｃ領域のアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を含む。好ましくは、変異体Ｆｃ領域は、天然配列Ｆｃ領域又は親ポリペプチドのＦｃ領域と比較し、少なくとも一つの一アミノ酸置換を有する、例えば、天然配列Ｆｃ領域又は親ポリペプチドのＦｃ領域において、約１から約１０アミノ酸置換、及び好ましくは約１から約５アミノ酸置換である。ここにおける変異体Ｆｃ領域は、好ましくは、天然配列Ｆｃ領域及び／又は親ポリペプチドのＦｃ領域と少なくとも約８０％配列同一性、最も好ましくは少なくとも約９０％配列同一性、さらに好ましくは少なくとも約９５％配列同一性を有する。
【００２８】
「Ｆｃレセプター」又は「ＦｃＲ」という用語は、抗体のＦｃ領域に結合するレセプターを記述するために使用される。好適なＦｃＲは、天然配列ヒトＦｃＲである。さらに好適なＦｃＲは、ＩｇＧ抗体（ガンマレセプター）に結合し、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ及びＦｃγＲＩＩＩサブクラスのレセプターを含むものであり、これらのレセプターの対立遺伝子変異体及び選択的スプライシング型を含む。ＦｃγＲＩＩレセプターは、ＦｃγＲＩＩＡ（「活性化レセプター」）及びＦｃγＲＩＩＢ（「阻害レセプター」）を含み、それらは、主としてその細胞質ドメインにおいて異なる類似のアミノ酸配列を有する。活性化レセプターＦｃγＲＩＩＡは、その細胞質ドメインに、免疫レセプターチロシン−ベース活性化モチーフ（ＩＴＩＭ）を有する。阻害レセプターＦｃγＲＩＩＢは、その細胞質ドメインに、免疫レセプターチロシン−ベース活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を有する（Ｄａｅｒｏｎ， Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， １５：２０３−２３４（１９９７）に概説されている）。ＦｃＲｓはＲａｖｅｔｃｈ及びＫｉｎｅｔ， Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ ９：４５７−９２ （１９９１）；Ｃａｐｅｌ等， Ｉｍｍｕｎｏｍｅｔｈｏｄｓ ４：２５−３４ （１９９４）；及びｄｅ Ｈａａｓ等， Ｊ． Ｌａｂ． Ｃｌｉｎ． Ｍｅｄ． １２６：３３０−４１ （１９９５）において概説されている。将来同定されるものも含む他のＦｃＲｓが、ここにおける「ＦｃＲ」なる用語によって包含される。この用語は胎児への母性ＩｇＧｓの移動の原因である新生児レセプター、ＦｃＲｎもまた含む（Ｇｕｙｅｒ等， Ｊ． Ｉｍｍｕｍｏｌ． １１７：５８７ （１９７６）及びＫｉｍ等， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２４：２４９ （１９９４））。
「親和性成熟」抗体とは、変化を有しない親抗体と比較し、抗原に対する抗体の親和性に改良を生じせしめる、抗体の一又は複数のＣＤＲにおける一又は複数の変化を伴うものである。好ましい親和性成熟抗体は、標的抗原に対してナノモル又はピコモルの親和性を有する。親和性成熟抗体は、当該分野において知られる手順によって生産される。Ｍａｒｋｓら． Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， １０：７７９−７８３（１９９２）は、ＶＨ及びＶＬドメイン混合による親和性成熟について記載している。ＣＤＲ及び／又はフレームワーク残基のランダム突然変異誘発は、Ｂａｒｂａｓ等， Ｐｒｏｃ Ｎａｔ Ａｃａｄ． Ｓｃｉ， ＵＳＡ ９１：３８０９−３８１３（１９９４）；Ｓｃｈｉｅｒ 等， Ｇｅｎｅ， １６９：１４７−１５５（１９９５）；Ｙｅｌｔｏｎ等， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， １５５：１９９４−２００４（１９９５）；Ｊａｃｋｓｏｎ等， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， １５４（７）：３３１０−９（１９９５）；及びＨａｗｋｉｎｓ等， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， ２２６：８８９−８９６（１９９２）に記載されている。
【００２９】
ここで用いられる場合の「アゴニスト」及び「アゴニスト性」という用語は、直接的又は間接的に、実質的にＡｐｏ−２リガンドに対するレセプターの生物学的活性又は活性化を含む、促進する又は向上させることのできる分子を称するか、又は記述する。場合によっては、「アゴニストＡｐｏ−２Ｌレセプター抗体」は、Ａｐｏ−２リガンドに類似する又は匹敵する活性を有する抗体である。好ましくは、アゴニストは哺乳動物細胞、好ましくは哺乳動物癌細胞のアポトーシスを含むことのできる分子である。さらに好ましくは、アゴニストはＡｐｏ−２Ｌレセプターに対する抗体であり、該抗体は実施例１に記載されるＡｐｏ−２Ｌポリペプチドよりも大きいか又は等しいアポトーシス活性を有する。場合によっては、このような分子のアゴニスト活性は、９Ｄ細胞あるいはＤＲ４又はＤＲ５のようなＡｐｏ−２Ｌに対するレセプターを発現する他の細胞のアポトーシスを検査するための実施例２に記載されたアッセイにおいて、Ｆｃ免疫グロブリン又は補体（以下に記載）を用いて、分子、単独又は架橋結合した形態でアッセイすることにより決定される。アゴニストは一又は複数のポリマー分子、例えばポリエチレングリコールに結合すると考えられる。
【００３０】
「単離された」とは、ここで開示された種々のタンパク質を記述するために使用するときは、その自然環境の成分から同定され分離され及び／又は回収されたタンパク質を意味する。その自然環境の汚染成分とは、タンパク質の診断又は治療への使用を典型的には妨害する物質であり、酵素、ホルモン、及び他のタンパク質様又は非タンパク質様溶質が含まれる。好ましい実施態様において、タンパク質は、（１）スピニングカップシークエネーターを使用することにより、Ｎ末端あるいは内部アミノ酸配列の少なくとも１５残基を得るのに充分なほど、あるいは、（２）クーマシーブルーあるいは好ましくは銀染色を用いた非還元あるいは還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥによる均一性が得られるように充分なほど精製される。タンパク質の自然環境の少なくとも１つの成分が存在しないため、単離されたタンパク質には、組換え細胞内のインサイツのタンパク質が含まれる。しかしながら、通常は、単離されたタンパク質は少なくとも１つの精製工程により調製される。
ここでの目的における「生物学的に活性な」又は「生物学的活性」とは、（ａ）インビボ及び／又はエキソビボで、少なくとも一種類の哺乳動物細胞（例えば癌細胞）又はウイルス感染した細胞においてアポトーシスを誘発又は刺激する能力を有する；（ｂ）抗体、例えば免疫原を産生する能力がある；又は（ｃ）天然又は天然発生Ａｐｏ−２リガンドポリペプチドの活性を保持していることを意味する。
【００３１】
ここで使用される場合の「成長阻害剤」とは、インビトロ及び／又はインビボにおいて細胞の成長を阻害する化合物又は組成物のことを称する。従って、成長阻害剤には、Ｓ期の細胞の割合を著しく減少させるようなものでありうる。成長阻害剤の例には、細胞周期の進行をブロックする薬剤（Ｓ期以外の時点において）、例えばＧ１停止及びＭ期停止を誘発する薬剤が含まれる。典型的なＭ期ブロッカーには、ビンカス（ビンクリスチン及びビンブラスチン）、タキソール（登録商標）、トポＩＩインヒビター、例えばドキソルビシン、エピルビシン、ダウノルビシン、エトポシド、及びブレオマイシンが含まれる。また、Ｇ１を停止させるこれらの薬剤、例えばＤＮＡアルキル化剤、例えばタモキシフェン、プレドニソン、ダカーバジン、メクロレタミン、シスプラチン、メトトレキセート、５−フルオロウラシル、及びａｒａ−ＣがＳ期停止に溢流する。更なる情報は、Ｍｕｒａｋａｍｉらにより「細胞周期の調節、オンコジーン、及び抗新生物薬」と題された、癌の分子的基礎、Ｍｅｎｄｅｌｓｏｈｎ及びＩｓｒａｅｌ編、第１章（ＷＢ Ｓａｕｎｄｅｒｓ；Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ， １９９５）、特に１３頁に見出すことができる。
【００３２】
この出願で使用される「プロドラッグ」という用語は、親薬物に比べて、癌細胞に対する細胞毒性が低く、より活性な親形態に、酵素的に活性化又は転換され得る製薬的に活性な物質の先駆体又は誘導体形態を称する。例えば、Ｗｉｌｍａｎ， 「Ｐｒｏｄｒｕｇｓ ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ」， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ， １４， ｐｐ．３７５−３８２， ６１５ｔｈ Ｍｅｅｔｉｎｇ Ｂｅｌｆａｓｔ（１９８６）及びＳｔｅｌｌａ等，「Ｐｒｏｄｒｕｇｓ：Ａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ ｔｏ Ｔａｒｇｅｔｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ」， Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ， Ｂｏｒｃｈａｒｄｔ等，（編）， ｐｐ．２４７−２６７， Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ（１９８５）を参照。 限定するものではないが、本発明のプロドラッグには、ホスファート含有プロドラッグ、チオホスファート含有プロドラッグ、スルファート含有プロドラッグ、ペプチド含有プロドラッグ、Ｄ−アミノ酸変性プロドラッグ、グリコシル化プロドラッグ、βラクタム含有プロドラッグ、任意に置換されたフェノキシアセトアミド含有プロドラッグ又は任意に置換されたフェニルアセトアミド含有プロドラッグ、より活性のある細胞毒のない薬剤に転換可能な５−フルオロシトシン及び他の５−フルオロウリジンプロドラッグが含まれる。限定するものではないが、本発明で使用されるプロドラッグ形態に誘導体化可能な細胞障害剤の例には、下記の化学療法剤が含まれる。
ここで用いられる「細胞障害剤」という用語は、細胞の機能を阻害し又は妨害し、及び／又は細胞の破壊を引き起こす物質のことをいう。この用語は放射活性アイソトープ（例えばＡｔ２１１，Ｉ１３１，Ｉ１２５，Ｙ９０，Ｒｅ１８６，Ｒｅ１８８，Ｓｍ１５３，Ｂｉ２１２，Ｐ３２，及びＬｕの放射性アイソトープ）、化学療法剤、及び断片及び／又はその変異体を含む細菌性、真菌性、植物又は動物起源の酵素的に活性な毒素又は小分子毒素等の毒素を含むことが意図されている。
【００３３】
「化学療法剤」は、癌のような症状の治療に有用な化学的化合物である。化学療法剤の例には、チオテパ及びシクロホスファミド（ＣＹＴＯＸＡＮ（登録商標））のようなアルキル化剤；ブスルファン、インプロスルファン及びピポスルファンのようなスルホン酸アルキル類、；ベンゾドーパ（ｂｅｎｚｏｄｏｐａ）、カルボコン、メツレドーパ（ｍｅｔｕｒｅｄｏｐａ）、及びウレドーパ（ｕｒｅｄｏｐａ）のようなアジリジン類；アルトレートアミン（ａｌｔｒｅｔａｍｉｎｅ）、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホラミド、トリエチレンチオホスホラミド（ｔｒｉｅｔｈｙｌｅｎｅｔｈｉｏｐｈｏｓｐｈａｏｒａｍｉｄｅ）及びトリメチローロメラミン（ｔｒｉｍｅｔｈｙｌｏｌｏｍｅｌａｍｉｎｅ）を含むエチレンイミン類及びメチラメラミン類；アセトゲニン（ａｃｅｔｏｇｅｎｉｎｓ）（特にブラタシン（ｂｕｌｌａｔａｃｉｎ）及びブラタシノン（ｂｕｌｌａｔａｃｉｎｏｎｅ））；カンプトセシン（合成類似体トポテカン（ｔｏｐｏｔｅｃａｎ）を含む）；ブリオスタチン；カリスタチン（ｃａｌｌｙｓｔａｔｉｎ）；ＣＣ−１０６５（そのアドゼレシン（ａｄｏｚｅｌｅｓｉｎ）、カルゼレシン（ｃａｒｚｅｌｅｓｉｎ）及びバイゼレシン（ｂｉｚｅｌｅｓｉｎ）合成類似体を含む）；クリプトフィシン（ｃｒｙｐｔｏｐｈｙｃｉｎ）（特にクリプトフィシン１及びクリプトフィシン８）；ドラスタチン（ｄｏｌａｓｔａｔｉｎ ）；デュカロマイシン（ｄｕｏｃａｒｍｙｃｉｎ ）（合成類似体、ＫＷ−２１８９及びＣＢＩ−ＴＭＩを含む）； エレトロビン（ｅｌｅｕｔｈｅｒｏｂｉｎ）；パンクラチスタチン（ｐａｎｃｒａｔｉｓｔａｔｉｎ ）；サルコデイチン（ｓａｒｃｏｄｉｃｔｙｉｎ）；スポンジスタチン（ｓｐｏｎｇｉｓｔａｔｉｎ ）；クロランブシル、クロロナファジン（ｃｈｌｏｒｎａｐｈａｚｉｎｅ）、チョロホスファミド（ｃｈｏｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシドヒドロクロリド、メルファラン、ノベンビチン（ｎｏｖｅｍｂｉｃｈｉｎ）、フェネステリン（ｐｈｅｎｅｓｔｅｒｉｎｅ）、プレドニムスチン（ｐｒｅｄｎｉｍｕｓｔｉｎｅ）、トロフォスファミド（ｔｒｏｆｏｓｆａｍｉｄｅ）、ウラシルマスタードなどのナイトロジェンマスタード；ニトロスレアス（ｎｉｔｒｏｓｕｒｅａｓ）、例えばカルムスチン（ｃａｒｍｕｓｔｉｎｅ）、クロロゾトシン（ｃｈｌｏｒｏｚｏｔｏｃｉｎ）、フォテムスチン（ｆｏｔｅｍｕｓｔｉｎｅ）、ロムスチン（ｌｏｍｕｓｔｉｎｅ）、ニムスチン、ラニムスチン；エネジイン（ｅｎｅｄｉｙｎｅ） 抗生物質等の抗生物質（例えば、カリケアマイシン（ｃａｌｉｃｈｅａｍｉｃｉｎ）、特にカリケアマイシンγ１Ｉ及びカリケアマイシンθＩ１、例えば、Ａｇｎｅｗ　Ｃｈｅｍ Ｉｎｔｌ． Ｅｄ． Ｅｎｇｌ．， ３３：１８３−１８６（１９９４）を参照のこと；ダイネミシンＡ（ｄｙｎｅｍｉｃｉｎＡ）を含むダイネミシン（ｄｙｎｅｍｉｃｉｎ）；エスペラマイシン（ｅｓｐｅｒａｍｉｃｉｎ）； 同様にネオカルチノスタチン発光団及び関連色素蛋白エネジイン（ｅｎｅｄｉｙｎｅ） 抗生物質発光団）、アクラシノマイシン（ａｃｌａｃｉｎｏｍｙｓｉ��ｓ）、アクチノマイシン、オースラマイシン（ａｕｔｈｒａｍｙｃｉｎ）、アザセリン、ブレオマイシン（ｂｌｅｏｍｙｃｉｎｓ）、カクチノマイシン（ｃａｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ）、カラビシン（ｃａｒａｂｉｃｉｎ）、カリミノマイシン（ｃａｒｍｉｎｏｍｙｃｉｎ）、カルジノフィリン（ｃａｒｚｉｎｏｐｈｉｌｉｎ）、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトロビシン（ｄｅｔｏｒｕｂｉｃｉｎ）、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン、ドキソルビシン（モルフォリノ−ドキソルビシン、シアノモルフォリノ−ドキソルビシン、２−ピロリノ−ドキソルビシン及びデオキシドキソルビシンを含む）、エピルビシン、エソルビシン（ｅｓｏｒｕｂｉｃｉｎ）、イダルビシン、マセロマイシン（ｍａｒｃｅｌｌｏｍｙｃｉｎ）、マイトマイシン（ｍｉｔｏｍｙｃｉｎｓ）、マイコフェノール酸（ｍｙｃｏｐｈｅｎｏｌｉｃ ａｃｉｄ）、ノガラマイシン（ｎｏｇａｌａｍｙｃｉｎ）、オリボマイシン（ｏｌｉｖｏｍｙｃｉｎｓ）、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン（ｐｏｔｆｉｒｏｍｙｃｉｎ）、ピューロマイシン、クエラマイシン（ｑｕｅｌａｍｙｃｉｎ）、ロドルビシン（ｒｏｄｏｒｕｂｉｃｉｎ）、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン（ｔｕｂｅｒｃｉｄｉｎ）、ウベニメクス、ジノスタチン（ｚｉｎｏｓｔａｔｉｎ）、ゾルビシン（ｚｏｒｕｂｉｃｉｎ）；メトトレキセート及び５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）のような抗−代謝産物；デノプテリン（ｄｅｎｏｐｔｅｒｉｎ）、メトトレキセート、プテロプテリン（ｐｔｅｒｏｐｔｅｒｉｎ）、トリメトレキセート（ｔｒｉｍｅｔｒｅｘａｔｅ）のような葉酸類似体；フルダラビン（ｆｌｕｄａｒａｂｉｎｅ）、６−メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニンのようなプリン類似体；アンシタビン、アザシチジン（ａｚａｃｉｔｉｄｉｎｅ）、６−アザウリジン（ａｚａｕｒｉｄｉｎｅ）、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン（ｅｎｏｃｉｔａｂｉｎｅ）、フロキシウリジン（ｆｌｏｘｕｒｉｄｉｎｅ）、５−ＦＵのようなピリミジン類似体；カルステロン（ｃａｌｕｓｔｅｒｏｎｅ）、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトン（ｔｅｓｔｏｌａｃｔｏｎｅ）のようなアンドロゲン類；アミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタンのような抗副腎剤；フロリン酸（ｆｒｏｌｉｎｉｃ ａｃｉｄ）のような葉酸リプレニッシャー（ｒｅｐｌｅｎｉｓｈｅｒ）；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；アムサクリン（ａｍｓａｃｒｉｎｅ）；ベストラブシル（ｂｅｓｔｒａｂｕｃｉｌ）；ビサントレン（ｂｉｓａｎｔｒｅｎｅ）；エダトラキセート（ｅｄａｔｒａｘａｔｅ）；デフォファミン（ｄｅｆｏｆａｍｉｎｅ）；デメコルシン（ｄｅｍｅｃｏｌｃｉｎｅ）；ジアジコン（ｄｉａｚｉｑｕｏｎｅ）；エルフォルニチン（ｅｌｆｏｒｎｉｔｈｉｎｅ）；酢酸エリプチニウム（ｅｌｌｉｐｔｉｎｉｕｍ ａｃｅｔａｔｅ）；エポチロン（ｅｐｏｔｈｉｌｏｎｅ）；エトグルシド（ｅｔｏｇｌｕｃｉｄ）；硝酸ガリウム；ヒドロキシ尿素；レンチナン；ロニダミン（ｌｏｎｉｄａｍｉｎ��）；メイタンシン（ｍａｙｔａｎｓｉｎｅ）及びアンサマイトシン（ａｎｓａｍｉｔｏｃｉｎ ）のようなメイタンシノイド（ｍａｙｔａｎｓｉｎｏｉｄ）；ミトグアゾン（ｍｉｔｏｇｕａｚｏｎｅ）；ミトキサントロン；モピダモール（ｍｏｐｉｄａｍｏｌ）；ニトラクリン（ｎｉｔｒａｃｒｉｎｅ）；ペントスタチン；フェナメット（ｐｈｅｎａｍｅｔ）；ピラルビシン；ポドフィリン酸（ｐｏｄｏｐｈｙｌｌｉｎｉｃ ａｃｉｄ）；２−エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ（登録商標）；ラゾキサン（ｒａｚｏｘａｎｅ）；リゾキシン（ｒｈｉｚｏｘｉｎ）；シゾフィラン；スピロゲルマニウム（ｓｐｉｒｏｇｅｒｍａｎｉｕｍ）；テニュアゾン酸（ｔｅｎｕａｚｏｎｉｃ ａｃｉｄ）；トリアジコン（ｔｒｉａｚｉｑｕｏｎｅ）；２，２’，２’’−トリクロロトリエチルアミン；トリコテセン（ｔｒｉｃｈｏｔｈｅｃｅｎｅｓ）（特に、Ｔ−２トキシン、ベラキュリンＡ（ｖｅｒｒａｃｕｒｉｎ Ａ）、ロリデンＡ（ｒｏｒｉｄｉｎ Ａ）及びアングイデン（ａｎｇｕｉｄｉｎｅ））；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン（ｍａｎｎｏｍｕｓｔｉｎｅ）；ミトブロニトール；ミトラクトール（ｍｉｔｏｌａｃｔｏｌ）；ピポブロマン（ｐｉｐｏｂｒｏｍａｎ）；ガシトシン（ｇａｃｙｔｏｓｉｎｅ）；アラビノシド（「Ａｒａ−Ｃ」）；シクロホスファミド；チオテパ；タキソイド、例えばパクリタキセル（タキソール（登録商標）、Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ， Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ， ＮＪ）、及びドキセタキセル（タキソテア（登録商標）、Ｒｈｏｎｅ−Ｐｏｕｌｅｎｃ Ｒｏｒｅｒ， Ａｎｔｏｎｙ， Ｆｒａｎｃｅ）；クロランブシル；ゲンシタビン（ｇｅｍｃｉｔａｂｉｎｅ）；６−チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキセート；シスプラチン及びカルボプラチンのようなプラチナ類似体；ビンブラスチン；プラチナ；エトポシド（ＶＰ−１６）；イフォスファミド；マイトマイシンＣ；ミトキサントン；ビンクリスチン；ビノレルビン；ナベルビン（ｎａｖｅｌｂｉｎｅ）；ノバントロン（ｎｏｖａｎｔｒｏｎｅ）；テニポシド；ダウノマイシン；アミノプテリン；キセローダ（ｘｅｌｏｄａ）；イバンドロナート（ｉｂａｎｄｒｏｎａｔｅ）；ＣＰＴ−１１；トポイソメラーゼインヒビターＲＦＳ２０００；ジフルオロメチロールニチン（ＤＭＦＯ）；レチノイン酸；カペシタビン（ｃａｐｅｃｉｔａｂｉｎｅ）；並びに上述したものの製薬的に許容可能な塩類、酸類又は誘導体が含まれる。また、この定義には、腫瘍に対するホルモン作用を調節又は阻害するように働く抗ホルモン剤、例えばタモキシフェン、ラロキシフェン（ｒａｌｏｘｉｆｅｎｅ）、４（５）−イミダゾール類を阻害するアロマターゼ、４−ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン（ｔｒｉｏｘｉｆｅｎｅ）、ケオキシフェン（ｋｅｏｘｉｆｅｎｅ）、ＬＹ１１７０１８、オナプリストーン（ｏｎａｐｒｉｓｔｏｎｅ）、及びトレミフェン（Ｆａｒｅｓｔｏｎ）を含む抗エストロゲン；及び抗アンドロゲン、例えばフルタミド（ｆｌｕｔａｍｉｄｅ）、ニルタミド（ｎｉｌｕｔａｍｉｄｅ）、ビカルタミド、ロイプロリド、及びゴセレリン；並びに上記のものの製薬��に許容可能な塩類、酸類又は誘導体が含まれる。
【００３４】
「サイトカイン」という用語は、一つの細胞集団から放出されるタンパク質であって、他の細胞に対して細胞間メディエータとして作用するものの包括的な用語である。そのようなサイトカインの例は、リンフォカイン、モノカイン、及び伝統的なポリペプチドホルモンである。サイトカインには、成長ホルモン、例えばヒト成長ホルモン、Ｎ−メチオニルヒト成長ホルモン、及びウシ成長ホルモン；副甲状腺ホルモン；チロキシン；インスリン；プロインスリン；リラクシン；プロリラクシン；卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、副甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、及び黄体形成ホルモン（ＬＨ）のような糖タンパク質ホルモン；肝臓成長因子；繊維芽細胞成長因子；プロラクチン；胎盤ラクトゲン；腫瘍壊死因子−α及び−β；マレリアン（ｍｕｌｌｅｒｉａｎ）阻害物質；マウス性腺刺激ホルモン関連ペプチド；インヒビン；アクチビン；血管内皮成長因子；インテグリン；トロンボポエチン（ＴＰＯ）；ＮＧＦ−αのような神経成長因子；血小板成長因子；ＴＧＦ−α及びＴＧＦ−βのようなトランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ）；インスリン様成長因子Ｉ及びＩＩ；エリスロポイエチン（ＥＰＯ）；オステオインダクティブ因子；インターフェロン、例えばインターフェロンα、β、γコロニー刺激因子（ＣＳＦ）、例えばマクロファージ−ＣＳＦ（Ｍ−ＣＳＦ）；顆粒球−マクロファージ−ＣＳＦ（ＧＭ−ＣＳＦ）及び顆粒球−ＣＳＦ（Ｇ−ＣＳＦ）；ＩＬ−１、ＩＬ−１α、ＩＬ−２、ＩＬ−３、 ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、 ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２等のインターロイキン（ＩＬ）；ＴＮＦ−α又はＴＮＦ−βのような腫瘍壊死因子；及びＬＩＦ及びキットリガンド（ＫＬ）を含む他のポリペプチド因子が含まれる。ここで使用される場合は、サイトカインなる用語は天然源由来あるいは組換え細胞培養由来のタンパク質及び天然配列サイトカインの生物的に活性な等価物を含む。
【００３５】
ここで使用される場合の「前処理」又は「前処理する」なる用語は、哺乳動物細胞をＡｐｏ−２レセプターアゴニストにさらす前に、ＣＰＴ−１１（又は他の化学療法剤）に暴露させることを称する。哺乳動物細胞、特に癌細胞をＣＰＴ−１１で前処理すると、該癌細胞内又は細胞上でＤＲ４又はＤＲ５レセプター発現が高められるかアップレギュレーションされて、Ａｐｏ−２リガンドレセプターアゴニストに対して敏感になると考えられる。好ましくは、細胞の前処理に使用されるＣＰＴ−１１の量は、前記哺乳動物細胞内又は細胞上において、同じ条件下でＣＰＴ−１１にさらされなかった同様の哺乳動物細胞と比較して、約０．５〜約５倍、好ましくは約１〜約４倍、より好ましくは約２〜約４倍になるまで、ＤＲ４又はＤＲ５レセプター発現が高められるかアップレギュレーションされるのに十分な量とされる。
「処理」又は「治療」とは、双方とも、治癒的処理、及び予防的又は防護的処置を称する。
「有効量」という用語は、哺乳類の疾病や疾患の治療のために有効な薬剤の量に相当する。癌の場合は、治療的有効量の薬剤により、癌細胞の数を減少させ；腫瘍の大きさを小さくし；癌細胞の周辺器官への浸潤を阻害（すなわち、ある程度に遅く、好ましくは止める）し；腫瘍の転移を阻害（すなわち、ある程度に遅く、好ましくは止める）し；腫瘍の成長をある程度阻害し；及び／又は疾患に関連する一又は複数の症状をある程度和らげることが可能である。ある程度、薬剤は、成長を妨げ及び／又は現存の癌細胞を殺すことが可能で、細胞分裂停止性及び／又は細胞障害性である。癌治療に対しては、インビボにおける効力は、腫瘍の負荷又は体積の評価、例えば病状の進行時間（ＴＴＰ）の評価、及び／又は応答速度（ＲＲ）を決定することにより測定される。
【００３６】
処置又は治療を目的とした「哺乳動物」とは、ヒト、家畜及び農場飼育動物、及び動物園、スポーツ、又はペット動物、例えば犬、ウマ、ネコ、ウシなどを含む哺乳類に分類される任意の動物を称する。好ましくは、哺乳動物はヒトである。
「癌」、「癌性」又は「悪性」という用語は、典型的には調節されない細胞成長を特徴とする、哺乳動物における生理学的状態を称するか記述する。癌の例には、これらに限定されるものではないが、癌腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫、及び白血病が含まれる。このような癌のより特定の例には、大腸癌、結腸直腸癌、直腸癌、扁平上皮細胞癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、ホジキン及び非ホジキンリンパ腫、睾丸癌、骨髄腫、食道癌、胃腸癌、腎臓癌、膵臓癌、グリア芽細胞腫、子宮頸癌、卵巣癌、神経膠腫、肝臓癌、膀胱癌、肝細胞腫（ｈｅｐａｔｏｍａ）、乳癌、子宮体癌、唾液腺癌、腎臓癌、肝臓癌、前立腺癌、産卵口癌、甲状腺癌、肝癌（ｈｅｐａｔｉｃ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）及び様々な種類の頭部及び頸部の癌が含まれる。
【００３７】
ＩＩ．　方法と材料
Ａ．方法
一般に、哺乳動物細胞においてアポトーシスを誘発する本発明の方法は、有効量のＡｐｏ−２リガンドとＣＰＴ−１１又は有効量のＡｐｏ−２Ｌレセプターアゴニスト抗体とＣＰＴ−１１に細胞をさらすことを含んでなり、ここで、該細胞は該Ａｐｏ−２Ｌ又はＡｐｏ−２Ｌレセプターアゴニスト抗体に暴露される前にＣＰＴ−１１に暴露される。通常、用いられるＡｐｏ−２Ｌ（又はアゴニスト抗体）の量はアポトーシスを誘発するのに効果的な量である。また、通常用いられるＣＰＴ−１１の量は、前記細胞内又は細胞上におけるＤＲ４又はＤＲ５レセプターの発現を高めるのに有効な量とされる。これは、例えば、以下と実施例に記載する方法に従ってインビボ又はエキゾビボで達成することができる。Ａｐｏ−２リガンド又はアゴニスト抗体とＣＰＴ−１１で治療される典型的な症状又は疾患には良性又は悪性癌が含まれる。
【００３８】
１．アポトーシス機構のエレメント
殺傷活性の増加に相関したアポトーシス機構のあるエレメントをさらに理解することで、哺乳動物細胞のアポトーシスを誘導するための方法を容易に実行することができるようになる。これに関連して、実施例３に提供されたデータにより、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ＋ＣＰＴ−１１処理で増加した殺傷活性と相関したアポトーシス機構のエレメントが同定される。
以下に詳細に論議するように、反応性の腫瘍細胞であって正常細胞ではないものをＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬで処理すると、ＤＲ５レセプターの一過性のアップレギュレーションを誘発することができる。同様に、ＣＰＴ−１１にさらすことで、ＤＲ５レセプター及び／又はＤＲ４レセプターがアップレギュレーションする結果となる。約２４時間にわたるＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ＋ＣＰＴ−１１の組合せ処理により、対照と比較してＤＲ４及びＤＲ５の発現が増強される結果となった。さらに、種々の細胞を２０−２２時間、ＣＰＴ−１１で前処理し、続いて２時間、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬで処理することで、ＤＲ５及びＤＲ４ ｍＲＮＡ、並びにカスパーゼ−３様切断／活性化、及びアポトーシスが最も高く誘発された。カスパーゼインヒビターＺ−ＶＡＤの添加により、ＤＲ５及びＤＲ４ ｍＲＮＡの発現レベルがさらに増強されることが見出された。
【００３９】
実施例３に提供されたデータは、ＣＰＴ−１１及びＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬが、ｐ５３依存性及びｐ５３独立性経路でそれぞれ別個にアポトーシスを誘発する証拠を提供するものである。特に、ＨＣＴ−１１６細胞をＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ単独で処理するとｐ５３発現を誘発しなかったが、ＣＰＴ−１１及びＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬとＣＰＴ−１１を組合せると、ｐ５３タンパク質が強く誘発される結果となった。さらに、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬはＤＲ５ ｍＲＮＡ発現の一過性のアップレギュレーションを媒介したが、ＣＰＴ−１１はＤＲ５及びＤＲ４ ｍＲＮＡ発現の双方を増加した。ＣＰＴ−１１は単独で、細胞周期停止に関与しているｐ２１タンパク質、ｐ５３誘発性、サイクリン依存性キナーゼインヒビターの実質的なアップレギュレーションを誘発した。ｐ２１のＣＰＴ−１１誘発性蓄積は、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬで同時処理（ｃｏ−ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）することにより、カスパーゼ依存的に妨げられた。さらに、Ｇ２−Ｍ期での蓄積よりはむしろ、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬで同時処理された細胞はアポトーシスを受ける。よって、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ及びＣＰＴ−１１の組合せ処理により、ｐ２１の分解、ＤＲ４及びＤＲ５のアップレギュレーションが誘導され、細胞周期停止及びおそらくＤＮＡ修復よりもむしろアポトーシス経路へ癌細胞を至らしめる。このことは、組合せ処理を用い、インビボで示された抗−腫瘍活性を増強させることと明確に一致しており（Ａｓｈｋｅｎａｚｉら， Ｊ． Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ． １０４：１５５−１６２（１９９９）；Ｇｌｉｎｉａｋら， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ． ５９：６１５３−６１５８（１９９９））、これらのデータは、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ及びＣＰＴ−１１処理が抗−腫瘍活性の増強を媒介する、潜在的メカニズムを提供するものである。
【００４０】
実施例３のデータは、アポトーシスを被ったＨＣＴ１１６細胞におけるＦＬＩＣＥ阻害タンパク質（ＦＬＩＰ）のタンパク質発現に何の変化もなかったことを示しており、この実験系におけるＦＬＩＰの実質的な抗−アポトーシス関与を除外するものであり、該データはメラノーマ腫瘍における研究と一致する（Ｇｒｉｆｆｉｔｈら， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ． １０：５５９−５６３（１９９８）；Ｌｅｖｅｒｋｕｓら， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， ６０：５５３−５５９（２０００）；Ｚｈａｎｇら， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， ５９：２７４７−２７５３（１９９９））。さらに、一般的なカスパーゼインヒビター、ＺＶＡＤの存在により、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ媒介性アポトーシス、ｐ２１の分解、及びＣＰＴ−１１により媒介されるＧ２−Ｍ相細胞停止の破壊が効果的にブロックされ、これはｐ２１がＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ媒介性アポトーシスにおいて制御的な役割を担っていることの証拠を提供するものである（また、Ｘｕら， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍ．， ２６９：１７９−１９０（２０００）を参照）。しかしながら、これらの条件でｐ２１の過剰発現を誘発すると、近位カスパーゼ活性が阻害されてアポトーシスが防止される。
ここでのデータは、異なる経路、それぞれＤＮＡダメージ及び死亡シグナル伝達レセプターを通してアポトーシスを媒介するＣＰＴ−１１及びＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬという２つの薬剤が、互いに共同して作用可能であるといった、新規のメカニズムを記載するものである。すなわち、ＣＰＴ−１１によるｐ２１誘発のＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ阻害により、Ｇ２／Ｍ細胞周期停止における細胞の蓄積が予め除外され、よってアポトーシスの増強が促進される。さらに、これらの薬剤の組合せによる死亡レセプターのアップレギュレーションは、観察され増強したアポトーシス活性にも寄与する。
【００４１】
２．Ａｐｏ−２Ｌレセプターアゴニストに誘発されるアポトーシスの調節
ここに開示したようにして、哺乳動物癌細胞におけるアポトーシスを調節及び増強することが可能であり、これは、細胞を、有効量のＣＰＴ−１１及びＡｐｏ−２Ｌレセプターアゴニストに、Ａｐｏ−２リガンドレセプターアゴニストの投与の前に、ＣＰＴ−１１を投与することによってさらした際に生じる。特に、実施例３及び図５に示すように、細胞を２０−２２時間、ＣＰＴ−１１で前処理し、続いて２時間、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬで処理することで、ＤＲ５及びＤＲ４ ｍＲＮＡ、並びにカスパーゼ−３様切断／活性化、及びアポトーシスが最も高く誘発された。よって本発明の重要な側面は、Ａｐｏ−２Ｌレセプターアゴニスト及び化学療法剤、例えばＣＰＴ−１１を使用し、哺乳動物細胞においてアポトーシスを誘発される改善された方法にあり、ここで、該方法は、Ａｐｏ−２Ｌレセプターアゴニストで処理する前に、化学療法剤で細胞を前処理することを含む。
【００４２】
Ａｐｏ−２Ｌレセプターアゴニストで処理する前に、哺乳動物細胞をＣＰＴ−１１等の化学療法剤で前処理する方法は、これらの薬剤の同時投与よりもいくつかの利点を有し得る。特に上述したように、これらの方法は、これらの薬剤の組合せ投与にとって最適な条件を同定することによって、処理様式を促進することができる。従って、アポトーシス反応を最適化する方法を同定することによって、医者は、より簡便で患者に親切な方式でこれらの薬剤を付与することができるであろう。特に、アポトーシス反応を最適化する方法を使用することで、医者は複数回の注射というよりはむしろ単一のボーラスでこれらの薬剤を投与し、またこれらの薬剤をより低濃度で投与し、又はこれらの薬剤をより短い期間で投与することができるようになる。
【００４３】
ＣＰＴ−１１に類似した生理学的効果を有する付加的な化学療法剤を、ここで開示した方法に使用することができる。特に、異なる抗癌遺伝毒性ストレス化学物質、例えばドキソルビシン、エトポシド、ＣＤＤＰ及びガンマ放射線処理にさらすことで、いくつかの腫瘍株化細胞におけるＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ死亡レセプターＤＲ５の選択的ｐ５３依存性アップレギュレーションがなされる結果となる（例えば、Ｋｉｍら， Ｃｌｉｎ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ６（２）：３３５−３４６（２０００）；Ｇｉｂｓｏｎら， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． ２０（１）：２０５−２１２（２０００）；Ｋｅａｎｅら， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５９（３）：７３４−７４１（１９９９）；Ｎａｇａｎｅら， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ６０（４）：８４７−８５３（２０００）；Ｗｕら， Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ． １７：１４１−３（１９９７）及びＷｕら， Ｏｎｃｏｇｅｎｅ． １８：６４１１−６４１８（１９９９）を参照）。ｐ５３独立性様式におけるＤＲ５のアップレギュレーションは、ＴＮＦ−αで腫瘍細胞を処理することにより（Ｓｈｅｉｋｈら， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５８：１５９３−１５９８（１９９８））、あるいは異なる神経膠腫株化細胞におけるいくつかの化学療法剤により（Ｎａｇａｎｅら， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ６０：８４７−８５３（２０００））示されている。さらに、ＤＲ５のアップレギュレーションは、カスパーゼ依存性Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ媒介性アポトーシスに対する反応性が増加することと、最も多くのケースで相関している（Ｃｈｉｎｎａｉｙａｎら， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．， ９７：１７５４−１７５９（２０００））。
【００４４】
ここで開示したように、一つは殺傷活性を増加させることに関連した細胞アポトーシス機構を調節する薬剤で細胞を前処理することにより、哺乳動物癌細胞におけるＡｐｏ−２Ｌレセプターアゴニスト媒介性アポトーシスを増強することができる。ここに開示する本発明の典型的な実施態様には、ＤＲ４のアップレギュレーション、ＤＲ５のアップレギュレーション及び／又はｐ５３タンパク質の誘発を含む、一又は複数の生理学的事象に効果を及ぼす薬剤で細胞を前処理することにより、Ａｐｏ−２Ｌレセプターアゴニスト媒介性アポトーシスに細胞を感作させるための方法が含まれる。好ましくは、薬剤は、ＣＰＴ−１１、ドキソルビシン、５−フルオロウラシル、インターフェロン（例えば、インターフェロンアルファ又はインターフェロンガンマ）、エトポシド、シスジアミンジクロロプラチナム（ＩＩ）（ＣＤＤＰ）、ＴＮＦ−α及びガンマインターフェロンからなる群から選択される。より好ましい実施態様では、薬剤はＣＰＴ−１１である。
【００４５】
本発明の一実施態様においては、有効量のＣＰＴ−１１及びＡｐｏ−２リガンドレセプターアゴニストに細胞を暴露させることを含む、哺乳動物癌細胞でアポトーシスを誘導する方法を提供するものであり、ここで細胞はＡｐｏ−２リガンドレセプターアゴニストの前にＣＰＴ−１１に暴露される。好ましくは、これらの方法において、所定量のＣＰＴ−１１の投与により、該細胞中又は細胞上でＤＲ４及び／又はＤＲ５がアップレギュレーションされる結果となる。ＤＲ４及び／又はＤＲ５のアップレギュレーション又は増強した発現度合いは、実施例に記載されている技術を含む、例えばＤＲ４又はＤＲ５ｍＲＮＡの発現を測定する公知の技術を使用し、ＣＰＴ−１１に曝さない対照細胞と比較することによってアッセイ及び測定される。このようなアッセイは、ＤＲ４又はＤＲ５の所望の又は最適なアップレギュレーションを誘発させ得る、前処理の最適時間を決定するために、ＣＰＴ−１１に細胞をさらした後の選択した時間点で実施する。インビトロアッセイ法を使用することで、本出願人は、ＣＰＴ−１１によるＤＲ５発現の誘発が、２時間の暴露又はインキュベート後に観察され、特にＤＲ５発現は、５０マイクログラム／ｍｌのＣＰＴ−１１に６時間細胞をさらした後にインビトロで誘発され得ることを見出した。任意に、Ａｐｏ−２レセプターアゴニストにさらす前に、約１時間〜約５日、好ましくは約２時間〜約２４、４８又は７２時間、より好ましくは約６時間〜２４時間又は４８時間、細胞をＣＰＴ−１１にさらす。該方法において、Ａｐｏ−２リガンドレセプターアゴニストは、典型的にはＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ又は抗−ＤＲ４レセプター抗体を含む。本発明のさらなる実施態様にはこれらの方法の変形例が含まれ、例えば、付加的な治療様式、例えば一又は複数の成長阻害剤又は放射線に癌細胞をさらすといった様式を使用する。該方法の好ましい実施態様では、癌細胞には、直腸結腸癌細胞が含まれる。
【００４６】
典型的には、ＣＰＴ−１１の有効量は、ＣＰＴ−１１に暴露された哺乳動物細胞内又は細胞上において、ＤＲ４又はＤＲ５、もしくはＤＲ４とＤＲ５の双方がアップレギュレーションされるのに十分な量である。さらに典型的には、有効量のＣＰＴ−１１はｐ５３タンパク質を誘発する。使用されるＣＰＴ−１１の典型的な用量は、Ｐｈｙｓｉｃｉａｎ’ｓ Ｄｅｓｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ（ＰＤＲ）に従った標準的な臨床量を含み、約１マイクログラム／ｍｌ〜約１００マイクログラム／ｍｌ、場合によっては約２マイクログラム／ｍｌ〜約５０マイクログラム／ｍｌの範囲が含まれ、臨床的使用用として、さらに好ましくは約０．０５ｍｇ／ｋｇ〜約２．５ｍｇ／ｋｇの範囲が含まれ、一方、Ａｐｏ−２リガンドの典型的な用量は０．１ｍｇ／ｋｇ〜約１２．０ｍｇ／ｋｇの範囲を含む。
【００４７】
Ｂ．　材料
本方法において使用することができるＡｐｏ−２Ｌには、上掲のＰｉｔｔｉ等、上掲の国際公開第９７／２５４２８号、及び上掲の国際公開第９７／０１６３号に記載されたＡｐｏ−２Ｌポリペプチド（ＴＲＡＩＬと称されるポリペプチド）を含む。全長ポリペプチド並びに細胞外ドメイン（ＥＣＤ）配列を含んでなるＡｐｏ−２Ｌの可溶型のような、Ａｐｏ−２Ｌの様々な形態を使用することができると考えられる。そのような可溶型ＥＣＤ配列の例には、ここで配列番号：１であり、Ｐｉｔｔｉ等， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２７１：１２６８７−１２６９０ （１９９６）の図１Ａに示されたＡｐｏ−２Ｌ配列のアミノ酸１１４−２８１、９５−２８１、９１−２８１又は９２−２８１を含んでなるポリペプチドが含まれる。アミノ酸９２−２８１を含んでなるポリペプチはＡｐｏ−２Ｌの天然に切断した型であると現在は信じられている。本出願人は、ＣＨＯ細胞においてヒトＡｐｏ−２Ｌを発現させ、９２−２８１ポリペプチドがＡｐｏ−２Ｌの発現型であることを見出した。国際公開第９７／２５４２８号に記載された共有結合的に修飾された型のようなＡｐｏ−２Ｌの修飾型が含まれる。特に、ポリエチレングリコールのような非タンパク性ポリマーに結合したＡｐｏ−２Ｌが本方法に使用されるものに含まれる。Ａｐｏ−２Ｌポリペプチドは国際公開第９７／２５４２８号に記載された方法の何れかにより調製することができる。
該方法で使用されうるアポトーシス活性を有するＡｐｏ−２リガンドの変異体は、例えばアラニンスキャン技術により同定されたものを含む。特に置換変異体は、位置２０３、２１８又は２６９でアミノ酸の少なくとも１種がアラニン残基で置換された、Ｐｉｔｔｉ等， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２７１：１２６８７−１２６９０（１９９６）の図１Ａのアミノ酸９１−２８１を含んでなる。場合によっては、Ａｐｏ−２リガンド変異体は１又は複数のこれら３つの異なった部位の置換を含みうる。
【００４８】
Ａｐｏ−２Ｌのアポトーシス活性を模倣する分子がまた現在開示した方法において使用しうると考えられる。そのような分子の例には、Ａｐｏ−２Ｌに少なくとも匹敵するか、もしくは同様な方法でアポトーシスを誘発しうるアゴニスト抗体が含まれる。特に、これらのアゴニスト抗体はＡｐｏ−２Ｌに対するレセプターの一又は複数に結合する抗体を含む。好ましくは、アゴニスト抗体は、ＤＲ４又はＤＲ５のような細胞質死ドメインを含むＡｐｏ−２Ｌレセプターに対する。さらに好ましくは、アゴニスト抗体は、レセプターの様なものに結合し、その結合は実施例２に記載されているように、例えばＦＡＣＳ分析又はＥＬＩＳＡを用いて決定することができる。ＤＲ５（又はＡｐｏ−２）と呼ばれるレセプターに対するアゴニスト抗体は、以下に記載するような融合技術を使用して調製されている。ＤＲ５又はＡｐｏ−２レセプターアゴニスト抗体の一つは３Ｆ１１．３９．７と呼ばれ、１９９８年１月１３日に寄託番号ＨＢ−１２４５６としてＡＴＣＣに寄託されている。他のＤＲ５レセプター抗体は３Ｈ３．１４．５を含み、ここで示されるようにＡＴＣＣに寄託された。Ａｐｏ−２Ｌレセプター抗体のアゴニスト活性は、アポトーシス活性の様々な検査方法を使用して測定することができ、さらに場合によっては、このような抗体のアポトーシス活性は、９Ｄ細胞又はＤＲ４又はＤＲ５のようなＡｐｏ−２Ｌレセプターを発現する他の細胞のアポトーシスを検査するための実施例２に記載されたアッセイにおいて、Ｆｃ免疫グロブリン又は補体（下記）を用いて、抗体、単独又は架橋結合した形態でアッセイすることにより決定される。
さらに、ＤＲ４と呼ばれる他のＡｐｏ−２Ｌレセプターに対するアゴニスト抗体もまた、調製される。ＤＲ４アゴニスト抗体の１つは、４Ｈ６．１７．８と称され、１９９８年１月１３日に寄託番号ＨＢ−１２４５５としてＡＴＣＣに寄託されている。またさらにアゴニストＤＲ４抗体は、以下に記載されるようにＡＴＣＣに寄託されている抗体４Ｅ７．２４．３、１Ｈ５．２５．９、４Ｇ７．１８．８、及び５Ｇ１１．１７．１を含む。Ａｐｏ−２Ｌレセプター抗体のアゴニスト活性は、アポトーシス活性の様々な検査方法を使用して測定することができ、さらに場合によっては、このような抗体のアポトーシス活性は、９Ｄ細胞又はＤＲ４又はＤＲ５のようなＡｐｏ−２Ｌレセプターを発現する他の細胞のアポトーシスを検査するための実施例２に記載されたアッセイにおいて、Ｆｃ免疫グロブリン又は補体（下記）を用いて、抗体、単独又は架橋結合した形態でアッセイすることにより決定される。
【００４９】
本発明において考察されているアゴニスト抗体には、１つのＡｐｏ−２Ｌレセプター又は１以上のＡｐｏ−２Ｌレセプターと結合する抗体が含まれる。１以上のＡｐｏ−２Ｌレセプターを結合する抗体は、以下の実施例のように例えばＥＬＩＳＡ又はＦＡＣＳにより決定される、２又はそれ以上のそれぞれ異なる抗体と結合「交差反応し」、それぞれ異なる抗体と結合する能力のある抗体として特徴づけられうる。場合によっては、２又はそれ以上の異なる抗原と「特異的に交差反応する」抗体は、第１の抗原と結合するもので、さらに第２の異なる抗原と結合し、約１０μｇ／ｍＬの抗体濃度で第２の抗原に対する抗体の結合能力は、（以下の実施例のように）捕獲ＥＬＩＳＡで決定されるように第１の抗原の結合能力の約５０％〜約１００％（好ましくは約７５％〜約１００％）である。例えば抗体は、ＤＲ５（「第１抗原」）と特異的に結合しても、更にＤＲ４のような他のＡｐｏ−２レセプター（「第２抗原」）と特異的に交差反応してもよく、ここで、約１０μｇ／ｍＬの抗体のＤＲ４との結合の範囲は、ここでの捕獲ＥＬＩＳＡにおいてＤＲ５に対する抗体の結合能力の約５０％〜約１００％である。様々なＡｐｏ−２Ｌレセプターとの抗体の交差反応は、国際特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９９／１３１９７の更なる詳細に記載される。
以下に記載されるように、このような抗体の例示的な形態としては、ポリクローナル、モノクローナル、ヒト化、二重特異性及びヘテロ抱合体抗体が含まれる。
【００５０】
１．ポリクローナル抗体
本発明の抗体はポリクローナル抗体を含んでよい。ポリクローナル抗体の調製方法は当業者に知られている。ポリクローナル抗体は、哺乳動物において、例えば免疫化剤、及び所望するのであればアジュバントを、一又は複数回注射することで発生させることができる。典型的には、免疫化剤及び／又はアジュバントを複数回皮下又は腹腔内注射することにより哺乳動物に注射する。免疫化剤は、ＤＲ４又はＤＲ５ポリペプチド（又はＤＲ４又はＤＲ５ＥＣＤ）又はその融合タンパク質を含みうる。免疫化剤を、免疫化される哺乳動物で免疫原性が知られたタンパク質に抱合させるのが有用である。そのような免疫原性タンパク質の例は、限定するものではないが、キーホール・リンペット（ｋｅｙｈｏｌｅ ｌｉｍｐｅｔ）ヘモシアニン、血清アルブミン、ウシサイログロブリン及び大豆トリプシンインヒビターが含まれる。使用され得るアジュバントの例には、フロイント完全アジュバント及びＭＰＬ−ＴＤＭアジュバント（モノホスホリル脂質Ａ、合成トレハロースジコリノミコラート）が含まれる。免疫化プロトコールは、過度の実験なく当業者により選択されるであろう。哺乳動物から採血し、血清を検定して抗体価を求める。望まれるならば、抗体価が増加又は平坦化するまで哺乳動物に追加免疫を施す。
【００５１】
２．モノクローナル抗体
本発明の抗体は、あるいは、モノクローナル抗体であってもよい。モノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎ， Ｎａｔｕｒｅ， ２５６：４９５ （１９７５）に記載されているようなハイブリドーマ法を使用することで調製することができる。ハイブリドーマ法では、マウス、ハムスター又は他の適切な宿主動物を典型的には免疫化剤により免疫化することで、免疫化剤に特異的に結合する抗体を産生するかあるいは産生可能なリンパ球を誘発する。あるいは、リンパ球をインビトロで免疫化することもできる。
免疫化剤は、典型的にはＤＲ４又はＤＲ５ポリペプチド又はその融合タンパク質、例えばＤＲ４又はＤＲ５ＥＣＤ−ＩｇＧ融合タンパク質を含む。
一般にヒト由来の細胞が望まれる場合には末梢血リンパ球（「ＰＢＬ」）が使用され、あるいは非ヒト哺乳動物源が望まれている場合は、脾臓細胞又はリンパ節細胞が使用される。次いで、ポリエチレングリコール等の適当な融合剤を用いてリンパ球を不死化株化細胞と融合させ、ハイブリドーマ細胞を形成する［Ｇｏｄｉｎｇ， Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， （１９８６） ｐｐ． ５９−１０３］。不死化株化細胞は、通常は、形質転換した哺乳動物細胞、特に齧歯動物、ウシ、及びヒト由来の骨髄腫細胞である。通常、ラット又はマウスの骨髄腫細胞株が使用される。ハイブリドーマ細胞は、好ましくは、未融合の不死化細胞の生存又は成長を阻害する一又は複数の物質を含有する適切な培地で培養される。例えば、親の細胞が、酵素のヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴ又はＨＰＲＴ）を欠いていると、ハイブリドーマの培地は、典型的には、ヒポキサチン、アミノプチリン及びチミジンを含み（「ＨＡＴ培地」）、この物質がＨＧＰＲＴ欠乏性細胞の増殖を阻止する。
【００５２】
好ましい不死化株化細胞は、効率的に融合し、選択された抗体生成細胞による安定した高レベルの抗体発現を支援し、ＨＡＴ培地のような培地に対して感受性である。より好ましい不死化株化細胞はマウス骨髄腫株であり、これはカリフォルニア州サンディエゴのＳａｌｋ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｃｅｌｌ Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ Ｃｅｎｔｅｒやバージニア州マナッサスのアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションより入手可能である。そのようなマウス骨髄腫細胞株の例は、以下の実施例２に記載されたＰ３Ｘ６３ＡｇＵ．１である。ヒトモノクローナル抗体産生ためのヒト骨髄腫及びマウス−ヒト異種骨髄腫株化細胞も記載されている［Ｋｏｚｂｏｒ， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， １３３：３００１ （１９８４）；Ｂｒｏｄｅｕｒ等， Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ， Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ， Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， （１９８７） ｐｐ． ５１−６３］。
ハイブリドーマ細胞が培養される培地は、次いでＡｐｏ−２Ｌレセプターに対するモノクローナル抗体の存在について検定することができる。好ましくは、ハイブリドーマ細胞によって産生されたモノクローナル抗体の結合特異性は免疫沈降又はラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）又は酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）等のインビトロ結合検定法によって測定する。このような技術及びアッセイは、当該分野において公知である。モノクローナル抗体の結合親和性は、例えばＭｕｎｓｏｎ及びＰｏｌｌａｒｄ， Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， １０７：２２０ （１９８０）によるスキャッチャード分析法によって測定することができる。
【００５３】
所望のハイブリドーマ細胞が同定された後、クローンを制限希釈工程を経てサブクローニングし、標準的な方法で増殖させることができる［Ｇｏｄｉｎｇ， 上掲］。この目的のための適当な培地には、例えば、ダルベッコの改変イーグル培地又はＲＰＭＩ−１６４０倍地が含まれる。あるいは、ハイブリドーマ細胞は哺乳動物においてインビボで腹水として成長させることもできる。
サブクローンによって分泌されるモノクローナル抗体は、例えばプロテインＡセファロース法、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー法、ゲル電気泳動法、透析法又はアフィニティークロマトグラフィー等の従来の免疫グロブリン精製方法によって培地又は腹水液から分離又は精製される。
また、モノクローナル抗体は、組換えＤＮＡ法、例えば米国特許第４，８１６，５６７号に記載された方法により作成することができる。本発明のモノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、従来の手順によって（例えば、マウス抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合可能なオリゴヌクレオチドプローブを使用して）、容易に単離し配列決定することができる。本発明のハイブリドーマ細胞はそのようなＤＮＡの好ましい供給源となる。ひとたび単離されたら、ＤＮＡは発現ベクター内に配することができ、これが宿主細胞、例えばサルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、あるいは免疫グロブリンタンパク質を生成しない骨髄腫細胞内にトランスフェクトされ、組換え宿主細胞内でモノクローナル抗体の合成をすることができる。また、ＤＮＡは、例えば相同マウス配列に換えてヒト重鎖及び軽鎖定常ドメインのコード配列を置換することにより［米国特許第４，８１６，５６７号；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ等， 上掲］、又は免疫グロブリンコード配列に非免疫グロブリンポリペプチドのコード配列の一部又は全部を共有結合することにより修飾することができる。このような非免疫グロブリンポリペプチドは、本発明の抗体の定常ドメインの代わりに置換するか、本発明の抗体の一つの抗原結合部位の可変ドメインの代わりに置換し、キメラ性二価抗体を産生することができる。場合によっては、キメラ抗体は、ここで開示される４Ｈ６．１７．８、３Ｆ１１．３９．７、４Ｅ７．２４．３、１Ｈ５．２５．９、４Ｇ７．１８．８、５Ｇ１１．１７．１、及び３Ｈ３．１４．５抗体から選択される抗Ａｐｏ−２Ｌレセプター抗体の少なくとも１つの可変又は高頻度可変ドメインを含んで構築されうる。
場合によっては、本発明のアゴニスト抗体は、ここに開示した４Ｈ６．１７．８、３Ｆ１１．３９．７、４Ｅ７．２４．３、１Ｈ５．２５．９、４Ｇ７．１８．８、５Ｇ１１．１７．１、及び３Ｈ３．１４．５抗体と同じエピトープに結合する。このことは、ここに記載するような種々のアッセイを実施することにより決定できる。例えば、モノクローナル抗体が、ここにおいて特別に言及したＤＲ４又はＤＲ５抗体と同じ特異性を有するか否かを決定するために、阻止アッセイ又はアポトーシス誘発アッセイにおいて、その活性を比較することができる。
【００５４】
本発明の抗体は、「架橋」抗体を含む。ここにおいて使用されている「架橋」という用語は、一（又は単）分子を形成するための、少なくとも二つのＩｇＧ分子が互いに結合することを称する。Ａｐｏ−２Ｌレセプター抗体は種々のリンカー分子を使用して架橋されてもよく、場合によっては、ＤＲ４抗体は、抗ＩｇＧ分子、補体、化学修飾又は分子工学を使用して架橋される。一度抗体が細胞表層膜へ結合すると、補体が抗体分子に対して比較的に高い親和性を有することは、当業者とっては高く評価されることである。従って、細胞表層膜へ結合している二又はそれ以上の抗体を連結するための架橋分子として、補体を使用してもよいと考えられる。種々のマウスＩｇアイソタイプの中で、ＩｇＭ、ＩｇＧ２ａ及びＩｇＧ２ｂは、補体を固定することが知られている。
本発明の抗体は、抗体の多価型と同様に、二量体抗体を任意に含むことができる。当業者は、当該分野で知られている技術及びここにおける抗Ａｐｏ−２Ｌレセプター抗体を使用して、そのような二量体又は多価型を組み立てることができる。
【００５５】
本発明の抗体は一価抗体を含み得る。一価抗体の調製方法は当該分野においてよく知られてる。例えば、一つの方法は免疫グロブリン軽鎖と修飾重鎖の組換え発現を含む。重鎖は一般的に、重鎖の架橋を防止するようにＦｃ領域の任意のポイントで切断される。あるいは、関連したシステイン残基を他のアミノ酸残基で置換するか欠失させて架橋を防止する。
一価抗体の調製にはインビトロ法がまた適している。抗体の消化による、その断片、特にＦａｂ断片の調製は、当該分野において知られている慣用的技術を使用して達成できる。例えば、消化はパパインの使用により行うことができる。パパイン消化の例は、９４／１２／２２に公開された国際公開第９４／２９３４８号、及び米国特許第４，３４２，５６６号に記載されている。抗体のパパイン消化は、典型的には、Ｆａｂ断片と呼ばれ、各々が単一の抗原結合部位を有する２つの同一の抗原結合断片と、残りのＦｃ断片を生成する。ペプシン処理により、２つの抗原結合部位を有し、抗原の架橋が尚も可能なＦ（ａｂ’）２断片が得られる。
また、抗体の消化により生産されたＦａｂ断片は、軽鎖の定常ドメインと重鎖の第１定常ドメイン（ＣＨ１）を含む。Ｆａｂ’断片は、抗体のヒンジ領域から一又は複数のシステインを含む重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端に幾つかの残基が付加されているということで、Ｆａｂ断片とは異なっている。Ｆａｂ’−ＳＨとは、定常ドメインのシステイン残基が遊離のチオール基を担持しているＦａｂ’に対するここでの命名である。Ｆ（ａｂ’）２抗体断片は、本来は、それらの間にヒンジシステインを有するＦａｂ’断片の対として生産された。抗体断片の他の化学的結合もまた知られている。
また、Ｉｌｉａｄｅｓ等， ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ， ４０９：４３７−４４１ （１９９７）に記載されているように、一本鎖Ｆｖ断片も産生されうる。このような一本鎖断片の種々のリンカーを用いた結合は、Ｋｏｒｔｔ等， Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， １０：４２３−４３３ （１９９７）に記載されている。
【００５６】
上記に記載の抗体に加えて、キメラ又はハイブリッド抗体が、架橋剤を含む合成タンパク質化学における周知の方法を用いてインビトロで調製されうると考えられる。例えば、免疫毒素はジスルフィド交換反応を用いて、又はチオエーテル結合の形成により作成することができる。この目的に好適な試薬の例には、イミノチオレート及びメチル−４−メルカプトブチルイミデートが含まれる。
本発明のＡｐｏ−２Ｌレセプター抗体は、さらにヒト化抗体又はヒト抗体を含む。非ヒト（例えばマウス）抗体のヒト化型とは、キメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖あるいはその断片（例えばＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２あるいは抗体の他の抗原結合性サブ配列）であって、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含むものである。ヒト化抗体はレシピエントの相補性決定領域（ＣＤＲ）の残基が、マウス、ラット又はウサギのような所望の特異性、親和性及び能力を有する非ヒト種（ドナー抗体）のＣＤＲの残基によって置換されたヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）を含む。ある場合には、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク残基は、対応する非ヒト残基によって置換されている。また、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にも、移入されたＣＤＲもしくはフレームワーク配列にも見出されない残基を含んでいてもよい。一般に、ヒト化抗体は、全てあるいはほとんど全てのＣＤＲ領域が非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、全てあるいはほとんど全てのＦＲ領域がヒト免疫グロブリン共通配列のものである、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含む。ヒト化抗体は、最適には免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）、典型的にはヒトの免疫グロブリンの定常領域の少なくとも一部を含んでなる［Ｊｏｎｅｓ等， Ｎａｔｕｒｅ， ３２１：５２２−５２５ （１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ 等， Ｎａｔｕｒｅ， ３３２：３２３−３２９ （１９８８）；及びＰｒｅｓｔａ， Ｃｕｒｒ． Ｏｐ Ｓｔｒｕｃｔ． Ｂｉｏｌ．， ２：５９３−５９６ （１９９２）］。
【００５７】
非ヒト抗体をヒト化する方法はこの分野で良く知られている。一般的に、ヒト化抗体には非ヒト由来の一又は複数のアミノ酸残基が導入されている。これら非ヒトアミノ酸残基は、しばしば、典型的には「移入」可変ドメインから得られる「移入」残基と称される。ヒト化は基本的にウィンター（Ｗｉｎｔｅｒ）及び共同研究者の方法［Ｊｏｎｅｓ等， Ｎａｔｕｒｅ， ３２１：５２２−５２５ （１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ等， Ｎａｔｕｒｅ， ３３２：３２３−３２７ （１９８８）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ等， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２３９：１５３４−１５３６ （１９８８）］に従って、齧歯動物のＣＤＲ又はＣＤＲ配列でヒト抗体の対応する配列を置換することにより実施される。よって、このような「ヒト化」抗体は、無傷のヒト可変ドメインより実質的に少ない分が非ヒト種由来の対応する配列で置換されたキメラ抗体である（米国特許第４，８１６，５６７号）。実際には、ヒト化抗体は典型的には幾つかのＣＤＲ残基及び場合によっては幾つかのＦＲ残基が齧歯類抗体の類似部位からの残基によって置換されたヒト抗体である。そのような移入残基又は移入可変ドメイン（又はＣＤＲ）の元になるものは、ここで開示される寄託された抗Ａｐｏ−２Ｌレセプター抗体４Ｈ６．１７．８、３Ｆ１１．３９．７、４Ｅ７．２４．３、１Ｈ５．２５．９、４Ｇ７．１８．８、５Ｇ１１．１７．１、及び３Ｈ３．１４．５を含む。
抗原性の軽減のためには、ヒト化抗体を作成するために使用するヒトの可変ドメイン、軽鎖及び重鎖両方の選択が非常に重要である。「ベストフィット法」に従うと、齧歯動物抗体の可変ドメインの配列を既知のヒト可変ドメイン配列のライブラリ全体に対してスクリーニングする。齧歯動物のものと最も近いヒトの配列を次にヒト化抗体のヒトフレームワーク（ＦＲ）として受け入れる［Ｓｉｍｓ等， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， １５１：２２９６−２３０８ （１９９３）；Ｃｈｏｔｈｉａ及びＬｅｓｋ， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， １９６：９０１−９１７ （１９８７）］。他の方法では、軽鎖又は重鎖の特定のサブグループのヒト抗体全てのコンセンサス配列から誘導される特定のフレームワークを使用する。同じフレームワークを幾つかの異なるヒト化抗体に使用できる［Ｃａｒｔｅｒ等， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８９：４２８５−４２８９ （１９９２）；Ｐｒｅｓｔａ等， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， １５１：２６２３−２６３２ （１９９３）］。
【００５８】
さらに、抗体は、抗原に対する高親和性や他の好ましい生物学的性質を保持してヒト化することが重要である。この目標を達成するべく、好ましい方法では、親及びヒト化配列の三次元モデルを使用して、親配列及び様々な概念的ヒト化産物の分析工程を経てヒト化抗体を調製する。三次元免疫グロブリンモデルは一般的に入手可能であり、当業者にはよく知られている。選択された候補免疫グロブリン配列の推測三次元立体配座構造を図解し、表示するコンピュータプログラムは入手可能である。これら表示を見ることで、候補免疫グロブリン配列の機能における残基の役割の分析、すなわち候補免疫グログリンの抗原と結合する能力に影響を及ぼす残基の分析が可能となる。このようにして、例えば標的抗原に対する親和性を高めるといった、望ましい抗体特徴が得られるように、ＦＲ残基を共通及び移入配列から選択し、組み合わせることができる。一般的に、ＣＤＲ残基は、直接かつ最も実質的に抗原結合性に影響を及ぼしている［１９９４年、３月３日に公開された国際公開第９４／０４６７９号を参照］。
【００５９】
ヒトモノクローナル抗体は、ヒトＢリンパ球を融合パートナーとして使用する、Ｋｏｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎによって最初に記載されたハイブリドーマ法を適応することによって作製することができる。関心ある抗体を生産するヒトＢリンパ球は、例えば、インフォームド・コンセントを得た後に、ヒト個人から単離される。例えば、個人は、全身性紅斑性狼瘡（Ｓｈｏｅｎｆｅｌｄら，Ｊ．Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ．， ７０：２０５（１９８２））、免疫媒介血小板新生紫斑病（ＩＴＰ）（Ｎｕｇｅｎｔら，Ｂｌｏｏｄ， ７０（１）：１６−２２（１９８７））、又は癌のようなある疾患とともに生じる自己抗原に対する抗体を生産している。或いは、又は付加的に、リンパ球はインビトロで免疫化される。例えば、単離されたヒト末梢血リンパ球をｌｙｓｏｍｏｔｒｏｐｈｉｃ ａｇｅｎｔ（例えばＬ−ロイシン−Ｏ−メチルエステル、Ｌ−グルタミン酸ジメチルエステル又はＬ−ロイシル−Ｌ−ロイシン−Ｏ−メチル エステル）（米国特許第５，５６７，６１０号、Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ等，）へ暴露させる；及び／又はインビトロでＴ細胞欠損ヒト末梢血リンパ球を８−メルカプトグアノシン及びサイトカインのようなアジュバントで処理（米国特許第５，２２９，２７５号、Ｇｏｒｏｆｆ等．）してもよい。
被検者より回収されたかインビトロで免疫化されたＢリンパ球は、次には通常、ヒトモノクローナル抗体を生成するために不死化される。限定されるものではないが、Ｂリンパ球を不死化する技術は、（ａ）ヒトＢリンパ球とヒト、マウスミエローマ又はマウス−ヒトヘテロミエローマ細胞との融合；（ｂ）ウイルスによる形質転換（例えば、エプスタイン・バーウイルス；例えば、Ｎｕｇｅｎｔら，上掲を参照のこと）；（ｃ）リンパ芽球腫細胞株との融合；又は（ｄ）リンパ腫細胞との融合、を含む。
【００６０】
リンパ球を、ポリエチレングリコールのような適当な融合剤を用いて骨髄腫細胞と融合させ、ハイブリドーマ細胞を形成する（Ｇｏｄｉｎｇ， Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ， ｐｐ．５９０−１０３（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， １９８６））。このようにして調製されたハイブリドーマ細胞を、融合していない親の骨髄腫細胞の成長又は生存を阻害する一又は複数の物質を好ましくは含む適当な培地に蒔き、成長させる。例えば、親の骨髄腫細胞が酵素ヒポキサンチングアニジンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴ又はＨＰＲＴ）を欠失するならば、ハイブリドーマのための培地は、典型的には、ＨＧＰＲＴ欠失細胞の成長を妨げる物質であるヒポキサンチン、アミノプテリン及びチミジンを含有するであろう（ＨＡＴ培地）。適切なヒトミエローマ及びマウス−ヒトヘテロミエローマ細胞株が記載されている（Ｋｏｚｂｏｒ， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， １３３：３００１ （１９８４）；Ｂｒｏｄｅｕｒ等， Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ， ｐｐ． ５１−６３ （Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ， Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９８７））。ハイブリドーマ細胞が生育している培地を、抗原に対するモノクローナル抗体の産生について検定する。好ましくは、ハイブリドーマ細胞により産生されるモノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈降又はインビトロ結合検定、例えばラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）又は酵素結合免疫吸着検定（ＥＬＩＳＡ）によって測定する。
所望の特異性、親和性、及び／又は活性の抗体を産生するハイブリドーマ細胞が同定された後、クローンを限界希釈法によりサブクローニングし、標準的な方法により成長させることができる（Ｇｏｄｉｎｇ， Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ， ｐｐ．５９−１０３（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， １９８６））。この目的に対して好適な培地は、例えば、Ｄ−ＭＥＭ又はＲＰＭＩ−１６４０培地を包含する。サブクローンにより分泌されたモノクローナル抗体は、例えばプロテインＡ−クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、又はアフィニティークロマトグラフィーのような常套的な免疫グロブリン精製法により、培地、腹水、又は血清から好適に分離される。
【００６１】
また、ヒト抗体は、ヒト抗体を生産することのできるマウスのような非ヒト宿主を使用して生成してもよい。上記のように、免疫化することで、内在性免疫グロブリンが生成されない状態でもヒト抗体の完全リパートリを生成することができるトランスジェニックマウスを利用することが可能である。例えば、キメラ及び生殖系列変異マウスにおいて抗体重鎖結合領域（ＪＨ）遺伝子をホモ接合的に欠失させると内在性抗体生産の完全な阻害が生じることが記述されている。このような生殖系列変異マウスにヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子配列を移すと、抗原投与時にヒト抗体の生成が生じる。例えば、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ等， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ９０：２５５１（１９９３）；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ等， Ｎａｔｕｒｅ， ３６２：２５５−２５８ （１９９３）；Ｂｒｕｇｇｅｒｍａｎｎ等， Ｙｅａｒ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏ．， ７：３３ （１９９３）；米国特許第５，５９１，６６９号；米国特許第５，５８９，３６９号；及び米国特許第５，５４５，８０７号を参照のこと。また、ヒト抗体は、ＳＣＩＤ−ｈｕマウス（Ｄｕｃｈｏｓａｌら，Ｎａｔｕｒｅ ３５５：２５８−２６２（１９９２））を使用して作製してもよい。
その他の実施態様では、ヒト抗体は、ヒト抗体ファージディスプレイライブラリより選択してもよい。抗体又はその断片のライブラリの調製は当該分野で良く知られており、宿主細胞へ導入可能な形質転換ベクターのファミリーの構築のためには、いずれの既知の方法を使用してもよい。ファージ中の抗体軽鎖及び重鎖（Ｈｕｓｅら，Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２４６：１２７５（１９８９））、又はファージ或いはファージミド中の融合タンパク質のライブラリは、既知の方法によって調製が可能である。例えば、Ｖａｕｇｈａｎ等， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １４：３０９ −３１４（１９９６）；Ｂａｒｂａｓら，Ｐｒｏｃ． Ｎａｌｔ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．， ＵＳＡ， ８８：７９７８−７９８２（１９９１）；Ｍａｒｋｓ等， Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．， ２２２：５８１−５９７（１９９１）；Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ及びＷｉｎｔｅｒ， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， ２２７：３８１−３８８ （１９９２）；Ｂａｒｂａｓら，Ｐｒｏｃ． Ｎａｌｔ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．， ＵＳＡ， ８９：４４５７−４４６１（１９９２）；Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ等， ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ， １３：３２４５−３２６０（１９９４）；ｄｅ Ｋｒｕｉｆら，Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， ２４８：９７−１０５（１９９５）；国際公開第９８／０５３４４号；国際公開第９８／１５８３３号；国際公開第９７／４７３１４；国際公開第９７／４４４９１号；国際公開第９７／３５１９６号；国際公開第９５／３４６４８号；米国特許第５，７１２，０８９号；米国特許第５，７０２，８９２号；米国特許第５，４２７，９０８号；米国特許第５，４０３，４８４号；米国特許第５，４３２，０１８号；米国特許第５，２７０，１７０号；国際公開第９２／０６１７６号；国際公開第９９／０６５８７号；米国特許第５，５１４，５４８号；国際公開第９７／０８３２０号；及び米国特許第５，７０２，８９２号を参照のこと。関心ある抗原は、標的抗原と結合するファージ抗体を選択するための分野において既知の方法を使用し、ファージライブラリに対して選別される。
【００６２】
ここに記載のＡｐｏ−２Ｌレセプター抗体は、場合によっては一又は複数の所望する生物活性又は特性を有する。そのような抗体は、限定されないが、キメラ、ヒト化、ヒト、及び親和性成熟抗体を包含してもよい。記載されているように、抗体は、これらの所望する活性又は特性を達成するための種々の技術を使用して構築又は設計される。一実施態様では、Ａｐｏ−２Ｌレセプター抗体は、少なくとも１０５Ｍ−１、好ましくは１０６Ｍ−１から１０７Ｍ−１の範囲、さらに好ましくは少なくとも１０８Ｍ−１から１０１２Ｍ−１の範囲、及びよりさらに好ましくは少なくとも１０９Ｍ−１から１０１２Ｍ−１の範囲のＤＲ４又はＤＲ５レセプター結合親和性を有する。抗体の結合親和性は、スキャッチャード分析法（Ｍｕｎｓｏｎら、上掲を参照のこと）を包含する当該分野において既知の技術に従った抗体の試験による過度の実験なしに測定することができる。例えば、実施例２に記載のように、ＤＲ４−ＩｇＧレセプター構成物への結合親和性のために、ＤＲ４抗体をアッセイすることができる。
【００６３】
その他の実施態様では、本発明のＡｐｏ−２Ｌレセプター抗体は、Ａｐｏ−２Ｌが結合するＤＲ４又はＤＲ５上の同じエピトープと結合するか、又はＡｐｏ−２Ｌが結合するＤＲ４又はＤＲ５上のエピトープと一致又は重複するＤＲ４又はＤＲ５上のエピトープと結合する。また、Ａｐｏ−２リガンドがＤＲ４又はＤＲ５へ結合することを妨げる立体構造を作り出すように、抗体は相互作用する。本発明の抗体のエピトープ結合特性は、当該分野において既知の技術を用いて決定されてもよい。例えば、抗体は、競争阻害アッセイのような、ＤＲ４又はＤＲ５へのＡｐｏ−２Ｌの結合をブロック又は阻害する抗体の能力を測定するためのインビトロアッセイにおいて試験されてもよい。場合によっては、例えばＤＲ４−ＩｇＧ構成物（実施例２に記載のような）又は細胞発現ＤＲ４へＡｐｏ−２Ｌポリペプチド（実施例１に記載のような）の結合を阻害するＤＲ４抗体の能力を測定するために、抗体は競争阻害アッセイにおいて試験されてもよい。場合によっては、抗体は、少なくとも５０％、好ましくは少なくとも７５％、及びなおさらに好ましくは少なくとも９０％、レセプターへのＡｐｏ−２Ｌの結合を遮断又は阻害することができ、これは一例として、Ａｐｏ−２リガンド（ＴＲＡＩＬ）の可溶型及びＤＲ４ ＥＣＤ−ＩｇＧ（実施例２に記載のような）を使用するインビトロ競争阻害アッセイにおいて測定されてもよい。
好ましい実施態様では、抗体は、Ａｐｏ−２リガンド（ＴＲＡＩＬ）に匹敵する、又はこれに類する活性を有するアゴニスト抗体を含む。好ましくは、そのようなアゴニストＤＲ４又はＤＲ５抗体は、少なくとも一種類の癌又は腫瘍細胞株或いは原発腫瘍においてアポトーシスを誘導する。アゴニストＤＲ４又はＤＲ５抗体のアポトーシス活性は、既知のインビトロ又はインビボアッセイを使用して測定してもよい。そのようなインビトロ又はインビボアッセイの例は、下記の実施例部分に詳細に記載されている。インビトロでは、アポトーシス活性は、アネキシンＶ結合（ＡｎｎｅｘｉｎＶ ｂｉｎｄｉｎｇ）のような既知の技術を使用して測定することが可能である。インビボでは、アポトーシス活性は、例えば、腫瘍の負担又は容積の減少を測定することで決定してもよい。
【００６４】
３．二重特異性抗体
二重特異性抗体は、少なくとも２つの異なる抗原に対して結合特異性を有するモノクローナル抗体、好ましくはヒトもしくはヒト化抗体である。本ケースにおいて、結合特異性の一方はＡｐｏ−２Ｌレセプターに対してであり、他方は任意の他の抗原、好ましくは細胞表面タンパク質又はレセプター又はレセプターサブユニットに対してである。
二重特異性抗体を生成する方法は当該技術分野において周知である。伝統的には、二重特異性抗体の組換え生成方法は、二つの重鎖が異なる特異性を持つ二つの免疫グロブリン重鎖／軽鎖対の同時発現に基づく［Ｍｉｌｓｔｅｉｎ及びＣｕｅｌｌｏ， Ｎａｔｕｒｅ， ３０５：５３７−５３９ （１９８３）］。免疫グロブリンの重鎖と軽鎖を無作為に取り揃えたため、これらハイブリドーマ（クアドローマ）は１０種の異なる抗体分子の潜在的混合物を作成でき、その内一種のみが正しい二重特異性構造を有する。正しい分子の精製は、アフィニティークロマトグラフィー工程によって通常達成される。同様の手順が１９９３年５月１３日公開の国際公開第９３／０８８２９号、及びＴｒａｕｎｅｃｋｅｒ等， ＥＭＢＯ Ｊ．，１０：３６５５−３６５９ （１９９１）に開示されている。
所望の結合特異性（抗体−抗原結合部位）を有する抗体可変ドメインを免疫グロブリン定常ドメイン配列に融合することができる。融合は、好ましくは少なくともヒンジ部、ＣＨ２及びＣＨ３領域の一部を含む免疫グロブリン重鎖定常ドメインとのものである。少なくとも一つの融合には軽鎖結合に必要な部位を含む第一の重鎖定常領域（ＣＨ１）が存在することが望ましい。免疫グロブリン重鎖融合をコードするＤＮＡ、及び望むのであれば免疫グロブリン軽鎖を、別々の発現ベクターに挿入し、適当な宿主生物に同時形質移入する。二重特異性抗体を生成するための更なる詳細については、例えばＳｕｒｅｓｈ等， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ， １２１：２１０（１９８６）を参照されたい。
【００６５】
４．ヘテロ抱合体抗体
ヘテロ抱合抗体もまた本発明の範囲に入る。ヘテロ抱合抗体は、２つの共有的に結合した抗体からなる。このような抗体は、例えば、免疫系細胞を不要な細胞に対して標的化させるため［米国特許第４，６７６，９８０号］及びＨＩＶ感染の治療のために［国際公開第９１／００３６０号；国際公開号９２／２００３７３号；欧州特許第０３０８９号］提案された。本抗体は、架橋剤に関連したものを含む合成タンパク質化学における既知の方法を使用してインビトロで調製することができると考えられる。例えば、ジスルフィド交換反応を使用するか又はチオエーテル結合を形成することにより免疫毒素を作成することができる。この目的に対して好適な試薬の例には、イミノチオレート及びメチル−４−メルカプトブチリミデート、及び例えば米国特許第４，６７６，９８０号に開示されているものが含まれる。
【００６６】
５．トリアボディ（ｔｒｉａｂｏｄｉｅｓ）
トリアボディも本発明の範囲内である。このような抗体は、例えば上掲のＩｌｉａｄｅｓ等及び上掲のＫｏｒｔｔ等に記載されている。
【００６７】
６．他の修飾
Ａｐｏ−２Ｌレセプター抗体の他の修飾はここにおいて考慮されている。また、本発明の抗体は、プロドラッグ（例えばペプチジル化学療法剤、国際公開第８１／０１１４５号を参照）を活性な抗癌剤に転化させるプロドラッグ活性化酵素、又は細胞障害剤（毒素分子等）に抗体をコンジュゲートさせることにより修飾することができる。例えば国際公開第８８／０７３７８及び米国特許第４，９７５，２７８号を参照されたい。また、この技術は、「抗体依存性酵素媒介性プロドラッグ治療法」（ＡＤＥＰＴ）と呼ばれている。
ＡＤＥＰＴに有用な免疫コンジュゲートの酵素成分には、より活性な細胞毒形態に転化するように、プロドラッグに作用し得る任意の酵素が含まれる。限定するものではないが、この発明の方法に有用な酵素には、ホスファート含有プロドラッグを遊離の薬剤に転化するのに有用なアルカリ性ホスファターゼ；スルファート含有プロドラッグを遊離の薬剤に転化するのに有用なアリールスルファターゼ；非毒性５−フルオロシトシンを抗癌剤５−フルオロウラシルに転化するのに有用なシトシンデアミナーゼ；プロテアーゼ、例えばセラチアプロテアーゼ、サーモリシン、サブチリシン、カルボキシペプチダーゼ及びカテプシン（例えば、カテプシンＢ及びＬ）で、ペプチド含有プロドラッグを遊離の薬剤に転化するのに有用なもの；カスパーゼ、例えばカスパーゼ−３；Ｄ−アミノ酸置換基を含有するプロドラッグの転化に有用なＤ−アラニルカルボキシペプチダーゼ；炭水化物切断酵素、例えばグリコシル化プロドラッグを遊離の薬剤に転化するのに有用なノイラミニダーゼ及びβガラクトシダーゼ；βラクタムで誘導体化された薬剤を遊離の薬剤に転化させるのに有用なβ−ラクタマーゼ；及びペニシリンアミダーゼ、例えばそれぞれフェノキシアセチル又はフェニルアセチル基で、それらのアミン性窒素において誘導体化された薬剤を遊離の薬剤に転化するのに有用なペニシリンＶアミダーゼ又はペニシリンＧアミダーゼが含まれる。あるいは、当該技術において「アブザイム」としてもまた公知の酵素活性を有する抗体を、遊離の活性薬剤に本発明のプロドラッグを転化させるために使用することもできる（例えば、Ｍａｓｓｅｙ， Ｎａｔｕｒｅ ３２８：４５７−４５８（１９８７）を参照）。抗体−アブザイムコンジュゲートは、ここで記載されているようにして、腫瘍細胞個体群にアブザイムを送達するために調製することができる。
【００６８】
この酵素は、当該分野においてよく知られている技術、例えばヘテロ二官能性架橋試薬を使用することにより、抗体に共有的に結合させることができる。あるいは、本発明の抗体の少なくとも抗原結合領域を本発明の酵素の少なくとも機能的に活性な部位に結合せしめてなる融合タンパク質を、当該技術においてよく知られている組換えＤＮＡ技術を使用して作成することができる（Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ等， Ｎａｔｕｒｅ ３１２：６０４−６０８［１９８４］）。
さらなる抗体の修飾が考察されている。例えば、抗体は種々の非タンパク質様ポリマー、例えばポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリオキシアルキレン類、又はポリエチレングリコールとポリプロピレングリコールのコポリマーに結合してもよい。また抗体は、例えばコアセルベーション技術又は界面重合により調製されたマイクロカプセル（例えば、それぞれヒドロキシメチルセルロース又はゼラチン−マイクロカプセル及びポリ−（メチルメタクリレート）マイクロカプセル）にコロイド状薬物送達系（例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフィア、マイクロエマルション、ナノ粒子及びナノカプセル）又はマクロエマルションに捕捉することができる。このような技術はＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， １６ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ， Ａ． Ｏｓｌｏ編（１９８０）に開示されている。抗体の血清半減期を増大させるために、米国特許第５，７３９，２７７号に記載されているように抗体（特に抗体断片）へサルベージレセプター結合エピトープを組み込んでもよい。ここで使用される「サルベージレセプター結合エピトープ」という用語は、ＩｇＧ分子のインビボでの血清半減期を増加させる原因となるＩｇＧ分子（例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４）のＦｃ領域のエピトープを称する。
【００６９】
７．組み換え体方法
本発明はまたここに開示した抗体をコードしている単離された核酸、該核酸を含むベクター及び宿主細胞、及び抗体の生産に対する組換え技術を提供する。
抗体の組換え生産のために、それをコードする核酸が単離され、さらなるクローニング（ＤＮＡの増幅）又は発現のために、複製可能なベクター内に挿入される。抗体をコードするＤＮＡは直ぐに単離され、従来の手法（例えば、抗体をコードする遺伝子に特異的に結合可能なオリゴヌクレオチドを使用するもの）を用いて配列決定される。多くのベクターが入手可能である。ベクター成分としては、一般に、これらに制限されるものではないが、次のものの一又は複数が含まれる：シグナル配列、複製開始点、一又は複数のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーター、及び転写終結配列である。
ここにおける方法は、抗Ａｐｏ−２Ｌレセプター抗体軽鎖又は重鎖（又は両軽鎖及び重鎖の両方）をコードするＤＮＡ配列を含んでなるベクターを提供する、宿主細胞をベクターでトランスフェクト又は形質転換する、及び組み換え体抗Ａｐｏ−２Ｌレセプター抗体産物を産生するのに十分な条件下で宿主細胞を培養する段階を含む、キメラ又は組み換え体抗Ａｐｏ−２Ｌレセプター抗体の生産のための方法を包含する。
【００７０】
（ｉ）シグナル配列成分
本発明の抗Ａｐｏ−２Ｌレセプター抗体は直接的に組換え手法によって生産されるだけではなく、好ましくはシグナル配列あるいは成熟タンパク質あるいはポリペプチドのＮ末端に特異的切断部位を有する他のポリペプチドである異種性ポリペプチドとの融合ペプチドとしても産生される。好ましく選択された異種シグナル配列は宿主細胞によって認識され加工される（すなわち、シグナルペプチダーゼによって切断される）ものである。天然抗体シグナル配列を認識せずプロセシングしない原核生物宿主細胞に対しては、シグナル配列は、例えばアルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、ｌｐｐあるいは熱安定なエンテロトキシンＩＩリーダーの群から選択される原核生物シグナル配列により置換される。酵母の分泌に関しては、天然シグナル配列は、酵母インベルターゼリーダー、α因子リーダー（酵母菌属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）及びクルイベロマイシス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）α因子リーダーを含む）、又は酸ホスフォターゼリーダー、白体（Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ）グルコアミラーゼリーダー、又は国際公開第９０／１３６４６号に記載されているシグナルにより置換されうる。哺乳動物細胞の発現においては、哺乳動物のシグナル配列並びにウイルス分泌リーダー、例えば単純ヘルペスｇＤシグナルが利用できる。このような前駆体領域のＤＮＡは、抗体をコードするＤＮＡにリーディングフレームが結合される。
【００７１】
（ｉｉ）複製開始点成分
発現及びクローニングベクターは共に一又は複数の選択された宿主細胞においてベクターの複製を可能にする核酸配列を含む。一般に、この配列はクローニングベクターにおいて、宿主染色体ＤＮＡとは独立にベクターが複製することを可能にするものであり、複製開始点又は自律的複製配列を含む。そのような配列は様々な細菌、酵母及びウイルスに対してよく知られている。プラスミドｐＢＲ３２２に由来する複製開始点は大部分のグラム陰性細菌に好適であり、２μプラスミド開始点は酵母に適しており、様々なウイルス開始点（ＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウイルス、ＶＳＶ又はＢＰＶ）は哺乳動物細胞におけるクローニングベクターに有用である。一般には、哺乳動物の発現ベクターには複製開始点成分は不要である（ＳＶ４０開始点が典型的には初期プロモーターを有しているため用いられる）。
【００７２】
（ｉｉｉ）選択遺伝子成分
発現及びクローニングベクターは、選択可能マーカーとも称される選択遺伝子を含む。典型的な選択遺伝子は、（ａ）アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキセートあるいはテトラサイクリンのような抗生物質あるいは他の毒素に耐性を与え、（ｂ）栄養要求性欠陥を補い、又は（ｃ）例えばバシラス菌に対する遺伝子コードＤ−アラニンラセマーゼのような、複合培地から得られない重要な栄養素を供給する、タンパク質をコードする。
選択技術の一例においては、宿主細胞の成長を抑止する薬物が用いられる。異種性遺伝子で首尾よく形質転換したこれらの細胞は、抗薬物性を付与し、選択療法を生存するタンパク質を生産する。このような優性選択の例としては、薬物ネオマイシン、ミコフェノール酸又はハイグロマイシンが使用される。
哺乳動物細胞に適切な選択可能なマーカーの他の例は、抗体核酸を捕捉することのできる細胞成分を同定することのできるもの、例えばＤＨＦＲ、チミジンキナーゼ、メタロチオネインＩ及びＩＩ、好ましくは、霊長類メタロチオネイン遺伝子、アデノシンデアミナーゼ、オルニチンデカルボキシラーゼ等である。
例えば、ＤＨＦＲ選択遺伝子によって形質転換された細胞は、先ず、ＤＨＦＲの競合的アンタゴニストであるメトトリキセート（Ｍｔｘ）を含む培地において形質転換物の全てを培養することで同定される。野生型ＤＨＦＲを用いた場合の好適な宿主細胞は、ＤＨＦＲ活性に欠陥のあるチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）株化細胞である。
あるいは、抗Ａｐｏ−２Ｌレセプター抗体をコードするＤＮＡ配列、野生型ＤＨＦＲタンパク質、及びアミノグリコシド３’−ホスホトランスフェラーゼ（ＡＰＨ）のような他の選択可能マーカーで形質転換あるいは同時形質転換した宿主細胞（特に、内在性ＤＨＦＲを含む野生型宿主）は、カナマイシン、ネオマイシンあるいはＧ４１８のようなアミノグリコシド抗生物質のような選択可能マーカーの選択剤を含む培地における細胞増殖により選択することができる。米国特許第４，９６５，１９９号を参照。
【００７３】
酵母中での使用に好適な選択遺伝子は酵母プラスミドＹＲｐ７に存在するｔｒｐ１遺伝子である（Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂ等， Ｎａｔｕｒｅ， ２８２：３９（１９７９））。ｔｒｐ１遺伝子は、例えば、ＡＴＣＣ第４４０７６号あるいはＰＥＰ４−１のようなトリプトファン内で成長する能力に欠ける酵母の突然変異株に対する選択マーカーを提供する。Ｊｏｎｅｓ， Ｇｅｎｅｔｉｃｓ， ８５：１２ （１９７７）。酵母宿主細胞ゲノムにｔｒｐ１破壊が存在することは、トリプトファンの不存在下における成長による形質転換を検出するための有効な環境を提供する。同様に、Ｌｅｕ２欠陥酵母株（ＡＴＣＣ ２０，６２２あるいは ３８，６２６）は、Ｌｅｕ２遺伝子を有する既知のプラスミドによって補完される。
さらに、１．６μｍの円形プラスミドｐＫＤ１由来のベクターは、クルイヴェロマイシス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）酵母の形質転換に用いることができる。あるいは、組換え子ウシのキモシンの大量生産のための発現系がＫ．ラクティス（ｌａｃｔｉｓ）に対して報告されている。Ｖａｎ ｄｅｎ Ｂｅｒｇ， Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， ８：１３５ （１９９０）。クルイヴェロマイシスの工業的な菌株からの、組換えによる成熟したヒト血清アルブミンを分泌する安定した複数コピー発現ベクターも開示されている。Ｆｌｅｅｒ 等， Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，９：９６８−９７５ （１９９１）。
【００７４】
（ｉｖ）プロモーター成分
通常、発現及びクローニングベクターは、宿主生体により認識され、抗体核酸に作用可能に結合するプロモーターを含む。原核生物宿主での使用に好適なプロモーターは、ｐｈｏＡプロモーター、βラクタマーゼ及びラクトースプロモーター系、アルカリホスファターゼ、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系、及びハイブリッドプロモーター、例えばｔａｃプロモーターを含む。しかし、他の既知の細菌プロモーターも好適である。細菌系で使用するプロモータもまた抗Ａｐｏ−２Ｌレセプター抗体をコードするＤＮＡと作用可能に結合したシャイン・ダルガーノ（Ｓ．Ｄ．）配列を有する。
真核生物に対してもプロモーター配列が知られている。事実上、全ての真核生物の遺伝子は、転写開始部位からおよそ２５ないし３０塩基上流に位置するＡＴ富化領域を有する。多数の遺伝子の転写開始位置から７０ないし８０塩基上流に見出される他の配列は、Ｎが任意のヌクレオチドであるＣＮＣＡＡＴ領域である。大部分の真核生物遺伝子の３’末端には、コード配列の３’末端へのポリＡ尾部の付加に対するシグナルであるＡＡＴＡＡＡ配列がある。これらの配列は全て真核生物の発現ベクターに適切に挿入される。
【００７５】
酵母宿主と共に用いて好適なプロモーター配列の例としては、３−ホスホグリセラートキナーゼ又は他の糖分解酵素、例えばエノラーゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース−６−リン酸イソメラーゼ、３−ホスホグリセレートムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオセリン酸イソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ、及びグルコキナーゼが含まれる。
他の酵母プロモーターとしては、成長条件によって転写が制御される付加的利点を有する誘発的プロモーターであり、アルコールデヒドロゲナーゼ２、イソチトクロムＣ、酸ホスファターゼ、窒素代謝と関連する分解性酵素、メタロチオネイン、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、及びマルトース及びガラクトースの利用を支配する酵素のプロモーター領域がある。酵母の発現に好適に用いられるベクターとプロモータは欧州特許第７３６５７号に更に記載されている。また酵母エンハンサーも酵母プロモーターと共に好適に用いられる。
【００７６】
哺乳動物の宿主細胞におけるベクターからの抗Ａｐｏ−２Ｌレセプター抗体転写は、例えば、ポリオーマウィルス、伝染性上皮腫ウィルス、アデノウィルス（例えばアデノウィルス２）、ウシ乳頭腫ウィルス、トリ肉腫ウィルス、サイトメガロウィルス、レトロウィルス、Ｂ型肝炎ウィルス及び最も好ましくはサルウィルス４０（ＳＶ４０）のようなウィルスのゲノムから得られるプロモーター、異種性哺乳動物プロモーター、例えばアクチンプロモーター又は免疫グロブリンプロモーター、ヒートショックプロモーターによって、提供されるこのようなプロモーターが宿主細胞系に適合し得る限り、調節される。
ＳＶ４０ウィルスの初期及び後期プロモーターは、ＳＶ４０ウイルスの複製起点をさらに含むＳＶ４０制限断片として簡便に得られる。ヒトサイトメガロウィルスの最初期プロモーターは、ＨｉｎｄＩＩＩＥ制限断片として簡便に得られる。ベクターとしてウシ乳頭腫ウィルスを用いて哺乳動物宿主でＤＮＡを発現する系が、米国特許第４，４１９，４４６号に開示されている。この系の変更例は米国特許第４，６０１，９７８号に開示されている。また、単純ヘルペスウイルス由来のチミジンキナーゼプロモーターの調節下でのマウス細胞におけるヒトβインターフェロンｃＤＮＡの発現について、Ｒｅｙｅｓ等， Ｎａｔｕｒｅ， ２９７：５９８−６０１（１９８２）を参照されたい。あるいは、ラウス肉腫ウィルス長末端反復をプロモーターとして使用することができる。
【００７７】
（ｖ）エンハンサーエレメント成分
より高等の真核生物による本発明の抗Ａｐｏ−２Ｌレセプター抗体をコードしているＤＮＡの転写は、ベクター中にエンハンサー配列を挿入することによって増強され得る。哺乳動物の遺伝子由来の多くのエンハンサー配列が現在知られている（グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α−フェトプロテイン及びインスリン）。しかしながら、典型的には、真核細胞ウィルス由来のエンハンサーが用いられるであろう。例としては、複製開始点の後期側のＳＶ４０エンハンサー（１００−２７０塩基対）、サイトメガロウィルス初期プロモーターエンハンサー、複製開始点の後期側のポリオーマエンハンサー及びアデノウィルスエンハンサーが含まれる。真核生物のプロモーターの活性化のための増強要素については、Ｙａｎｉｖ， Ｎａｔｕｒｅ， ２９７：１７−１８ （１９８２）もまた参照のこと。エンハンサーは、抗体コード配列の５’又は３’位でベクター中にスプライシングされ得るが、好ましくはプロモーターから５’位に位置している。
【００７８】
（ｖｉ）転写終結成分
真核生物宿主細胞（酵母、真菌、昆虫、植物、動物、ヒト、又は他の多細胞生物由来の有核細胞）に用いられる発現ベクターは、また転写の終結及びｍＲＮＡの安定化に必要な配列を含む。このような配列は、真核生物又はウィルスのＤＮＡ又はｃＤＮＡの５’、時には３’の非翻訳領域から一般に取得できる。これらの領域は、多価抗体をコードしているｍＲＮＡの非翻訳部分にポリアデニル化断片として転写されるヌクレオチドセグメントを含む。一つの有用な転写終結成分はウシ成長ホルモンポリアデニル化領域である。国際公開第９４／１１０２６号とそこに開示した発現ベクターを参照されたい。
【００７９】
（ｖｉｉ）宿主細胞の選択及び形質転換
ここに記載のベクターにＤＮＡをクローニングあるいは発現するために適切な宿主細胞は、上述の原核生物、酵母、又は高等真核生物細胞である。この目的にとって適切な原核生物は、真正細菌、例えばグラム陰性又はグラム陽性生物体、例えばエシェリチアのような腸内菌科、例えば大腸菌、エンテロバクター、エルウィニア（Ｅｒｗｉｎｉａ）、クレブシエラ、プロテウス、サルモネラ、例えばネズミチフス菌、セラチア属、例えばセラチア・マルセスキャンス及び赤痢菌属、並びに桿菌、例えば枯草菌及びＢ．リチェフォルミス（ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）（例えば、１９８９年４月１２日に公開された ＤＤ ２６６，７１０に開示されたバシリ・リチェニフォルミス４１Ｐ）、シュードモナス属、例えば緑膿菌及びストレプトマイセス属を含む。一つの好適な大腸菌クローニング宿主は大腸菌２９４（ＡＴＣＣ３１４４６）であるが、他の大腸菌Ｂ、大腸菌Ｘ１７７６（ＡＴＣＣ３１５３７）及び大腸菌Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ２７３２５）のような株も好適である。これらの例は限定するものではなく例示的なものである。
原核生物に加えて、糸状菌又は酵母菌のような真核微生物は、Ａｐｏ−２Ｌレセプター抗体をコードするベクターのための適切なクローニング又は発現宿主である。サッカロミセス・セレヴィシア、又は一般的なパン酵母は下等真核生物宿主微生物のなかで最も一般的に用いられる。しかしながら、多数の他の属、種及び菌株も、一般的に入手可能でここで使用でき、例えば、シゾサッカロマイセスポンベ；クルイベロマイセス宿主、例えばＫ．ラクティス、Ｋ．フラギリス（ＡＴＣＣ１２４２４）、Ｋ．ブルガリカス（ＡＴＣＣ１６０４５）、Ｋ．ウィッケラミイ（ＡＴＣＣ２４１７８）、Ｋ．ワルチイ（ＡＴＣＣ５６５００）、Ｋ．ドロソフィラルム（ＡＴＣＣ３６９０６）、Ｋ．サーモトレランス、及びＫ．マルキシアナス；ヤローウィア（欧州特許第４０２，２２６号）；ピチア・パストリス（欧州特許第１８３，０７０号）；カンジダ；トリコデルマ・リーシア（欧州特許第２４４，２３４号）；アカパンカビ；シュワニオマイセス、例えばシュワニオマイセス・オクシデンタリス；及び糸状真菌、例えばパンカビ属、アオカビ属、トリポクラジウム、及びコウジカビ属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）宿主、例えば偽巣性コウジ菌（Ａ． ｎｉｄｕｌａｎｓ）及びクロカビ（Ａ． ｎｉｇｅｒ）が使用できる。
【００８０】
グリコシル化抗体の発現に適切な宿主細胞は、多細胞生物から誘導される。無脊椎動物細胞の例には、植物及び昆虫細胞が含まれる。多数のバキュロウィルス株及び変異体及び対応する許容可能な昆虫宿主細胞、例えばスポドプテラ・フルギペルダ（毛虫）、アエデス・アエジプティ（蚊）、アエデス・アルボピクトゥス（蚊）、ドゥロソフィラ・メラノガスター（ショウジョウバエ）、及びボンビクス・モリが同定されている。トランスフェクションのための種々のウィルス株、例えば、オートグラファ・カリフォルニカＮＰＶのＬ−１変異体とボンビクス・モリ ＮＰＶのＢｍ−５株が公に利用でき、このようなウィルスは本発明においてここに記載したウィルスとして使用でき、特にスポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）細胞のトランスフェクションに使用できる。
綿花、コーン、ジャガイモ、大豆、ペチュニア、トマト、及びタバコのような植物細胞培養を宿主として利用することができる。
しかしながら、脊椎動物細胞におけるものが最も興味深く、培養（組織培養）中での脊椎動物細胞の増殖は常套的な手順になった。有用な哺乳動物宿主株化細胞の例は、ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株 （ＣＯＳ−７， ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５１）；ヒト胚腎臓株［２９３又は懸濁培養での成長のためにサブクローン化された２９３細胞、Ｇｒａｈａｍほか， Ｊ． Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ．， ３６：５９ （１９７７）］；ハムスター乳児腎細胞（ＢＨＫ， ＡＴＣＣ ＣＣＬ １０）；チャイニーズハムスター卵巣細胞／−ＤＨＦＲ（ＣＨＯ， Ｕｒｌａｕｂ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ７７：４２１６ （１９８０））；マウスのセルトリ細胞［ＴＭ４， Ｍａｔｈｅｒ， Ｂｉｏｌ． Ｒｅｐｒｏｄ．， ２３：２４３−２５１ （１９８０）］；サルの腎細胞 （ＣＶＩ ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７０）；アフリカミドリザルの腎細胞（ＶＥＲＯ−７６， ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１５８７）；ヒト子宮頸癌細胞 （ＨＥＬＡ， ＡＴＣＣ ＣＣＬ ２）；イヌ腎細胞 （ＭＤＣＫ， ＡＴＣＣ ＣＣＬ ３４）； バッファローラット肝細胞 （ＢＲＬ ３Ａ， ＡＴＣＣ ＣＲＬ １４４２）；ヒト肺細胞 （Ｗ１３８， ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７５）；ヒト肝細胞 （Ｈｅｐ Ｇ２， ＨＢ ８０６５）；マウス乳房腫瘍（ＭＭＴ ０６０５６２， ＡＴＴＣ ＣＣＬ５１）；ＴＲＩ細胞［Ｍｏｔｈｅｒほか， Ａｎｎａｌｓ Ｎ．Ｙ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．， ３８３：４４−６８ （１９８２）］；ＭＲＣ５細胞；ＦＳ４細胞；ヒト肝癌株（ＨｅｐＧ２）；及びミエローマ又はリンパ腫細胞（例えば、Ｙ０， Ｊ５５８Ｌ， Ｐ３及びＮＳ０細胞）（米国特許第５，８０７，７１５号を参照のこと）である。
宿主細胞は、抗体生成のための上述した発現又はクローニングベクターで形質転換し、プロモーターを誘導し、形質転換体を選択し、又は所望の配列をコードしている遺伝子を増幅するために適当に修飾された常套的栄養培地で培養する。
【００８１】
（ｖｉｉｉ）宿主細胞の培養
本発明の抗体を生成するために用いられる宿主細胞は種々の培地において培養することができる。市販培地、例えばハム（Ｈａｍ）のＦ１０（シグマ）、最小必須培地（（ＭＥＭ），シグマ）、ＲＰＭＩ−１６４０（シグマ）及びダルベッコの改良イーグル培地（（ＤＭＥＭ），シグマ）が宿主細胞の培養に好適である。また、Ｈａｍ等， Ｍｅｔｈ． Ｅｎｚ． ５８：４４ （１９７９）， Ｂａｒｎｅｓ等， Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． １０２：２５５ （１９８０）， 米国特許第４，７６７，７０４号；同４，６５７，８６６号；同４，９２７，７６２号；同４，５６０，６５５号；又は同５，１２２，４６９号；国際公開第９０／０３４３０；国際公開第８７／００１９５；又は米国特許再発行第３０，９８５号に記載された任意の培地も宿主細胞に対する培地として使用できる。これらの培地はいずれも、ホルモン及び／又は他の成長因子（例えばインスリン、トランスフェリン、又は表皮成長因子）、塩類（例えば、塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム及びリン酸塩）、バッファー（例えばＨＥＰＥＳ）、ヌクレオチド（例えばアデノシン及びチミジン）、抗生物質（例えば、ゲンタマイシン（商品名）薬）、微量元素（最終濃度がマイクロモル範囲で通常存在する無機化合物として定義される）及びグルコース又は同等のエネルギー源を必要に応じて補充することができる。任意の他の必要な補充物質もまた当業者に知られている適当な濃度で含むことができる。培養条件、例えば温度、ｐＨ等々は、発現のために選ばれた宿主細胞について以前から用いられているものであり、当業者には明らかであろう。
【００８２】
（ｉｘ）精製
組換え技術を使用する場合、抗体は細胞内、細胞膜周辺腔内に生成されるか、又は培地に直接分泌され得る。抗体が細胞内に生成される場合、第１段階として、粒状屑、宿主細胞又は溶菌断片を、例えば遠心分離又は限外濾過にかけて取り除く。Ｃａｒｔｅｒ等， Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：１６３−１６７（１９９２）は、大腸菌の細胞膜周辺腔に分泌されるタンパク質を単離するための手順について記載している。簡単に述べると、細胞ペーストを酢酸ナトリウム（ｐＨ３．５）、ＥＤＴＡ、及びフェニルメチルスルホニルフロリド（ＰＭＳＦ）の存在下で、３０分以上かけて解凍する。細胞屑は遠心分離により除去することができる。抗体が培地へ分泌されている場合、そのような発現系からの上清は、一般的には第１に市販のタンパク質濃縮フィルター、例えばＡｍｉｃｏｎ又はＭｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｐｅｌｌｉｃｏｎの限外濾過ユニットを用いて濃縮する。ＰＭＳＦなどのプロテアーゼ阻害剤を上記の任意の工程に含めてタンパク質分解を阻害してもよく、抗生物質を含めて外来性の汚染物の成長を防止してもよい。
【００８３】
細胞から調製した抗体組成物は、例えば、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、及びアフィニティクロマトグラフィを用いて精製でき、アフィニティクロマトグラフィが好ましい精製技術である。アフィニティリガンドとしてのプロテインＡの適合性は、抗体に存在する任意の免疫グロブリンＦｃ領域の種及びアイソタイプに依存する。プロテインＡは、ヒトγ１、γ２、又はγ４重鎖に基づく抗体の精製に用いることができる（Ｌｉｎｄｍａｒｋ等， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈ． ６２：１−１３ （１９８３））。プロテインＧは、全てのマウスアイソタイプ及びヒトγ３に推奨されている（Ｇｕｓｓ等， ＥＭＢＯ Ｊ． ５：１５６７１５７５ （１９８６））。アフィニティリガンドが結合されるマトリクスはアガロースであることが最も多いが、他のマトリクスも使用可能である。孔制御ガラスやポリ（スチレンジビニル）ベンゼン等の機械的に安定なマトリクスは、アガロースで達成できるものより早い流速及び短い処理時間を可能にする。抗体がＣＨ３ドメインを含む場合、Ｂａｋｅｒｂｏｎｄ ＡＢＸ（商品名）樹脂（Ｊ．Ｔ． Ｂａｋｅｒ， Ｐｈｉｌｌｉｐｓｂｕｒｇ， ＮＪ）が精製に有用である。イオン交換カラムでの分画、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、シリカ上のクロマトグラフィー、アニオン又はカチオン交換樹脂（例えばポリアスパラギン酸カラム）上でのヘパリンＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商品名）クロマトグラフィー、クロマトフォーカシング、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、及び硫酸アンモニウム沈殿などの他の技術も、回収される抗体に応じて利用可能である。
【００８４】
Ｃ．製剤
Ａｐｏ−２リガンド又はＡｐｏ−２Ｌレセプターアゴニスト抗体とＣＰＴ−１１は好ましくは担体で投与される。分子は、単一の担体で投与することができ、あるいは別個の担体に含めることができる。適した担体とその製剤は、Ｏｓｌｏらにより編集されたＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， １６ｔｈ ｅｄ．．， １９８０， Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．に記載されている。典型的には、適当量の製薬的に許容可能な塩が製剤を等張にするために担体中に使用される。担体の例には、生理食塩水、リンゲル液及びブドウ糖液が含まれる。溶液のｐＨは好ましくは約５から約８、より好ましくは約７．４から約７．８である。例えば投与経路及び投与される薬剤の濃度に応じてある種の担体がより好ましいことは当業者には明らかであろう。担体は凍結乾燥された製剤又は水性溶液の形態をとりうる。
許容できる担体、賦形剤又は安定剤は、好ましくは、用いる投与量及び濃度では細胞及び／又はレシピエントに対して無毒性であり、リン酸、クエン酸及び他の有機酸等の緩衝液；アスコルビン酸及びメチオニンを含む抗酸化剤；防腐剤（例えば、オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンズアルコニウム；塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチル又はベンジルアルコール；アルキルパラベン類、例えばメチル又はプロピルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；及びｍ−クレゾール）；低分子量（残基数１０個未満）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン又は免疫グロブリン等のタンパク質；ポリビニルピロリドン等の親水性重合体；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、又はリシン等のアミノ酸；グルコース、マンノース又はデキストリン等の単糖類、二糖類及び他の炭水化物；ＥＤＴＡ等のキレート剤；スクロース、マンニトール、トレハロース又はソルビトール等の糖類、ナトリウム等の塩形成対イオン；及び／又はＴＷＥＥＮＴＭ、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳＴＭ又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の非イオン性界面活性剤を含む。
【００８５】
また、製剤は、治療される特定の効能に必要な一以上の活性化合物、好ましくは互いに悪影響を及ぼさない相補的活性を有するものを含有し得る。あるいは、又は加えて、組成物は、細胞障害剤、サイトカイン又は成長阻害剤を含有してもよい。このような分子は、好適には、意図した目的に有効な量で組合せて存在する。
またＡｐｏ−２Ｌ又はアゴニスト抗体とＣＰＴ−１１は、例えばコアセルベーション法又は界面重合により調製されたマイクロカプセル、例えばそれぞれヒドロキシメチルセルロース又はゼラチン−マイクロカプセル及びポリ−（メチルメタクリレート）マイクロカプセルに、コロイド状薬物送達系（例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフィア、マイクロエマルション、ナノ粒子及びナノカプセル）又はマクロエマルションに捕捉することができる。このような技術はＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， １６ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｏｓｌｏ，Ａ．編（１９８０）に開示されている。
インビボ投与に使用される製剤は滅菌されていなくてはならない。これは、滅菌濾過膜を通す濾過により容易に達成される。
徐放性調製物を調製してもよい。徐放性調製物の適切な例には、抗体を含む固体疎水性重合体の半透性マトリックスが含まれ、このマトリックスはフィルム又はマイクロカプセル等の成形品の形態である。徐放性マトリックスの例には、ポリエステル、ヒドロゲル（例えばポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）、又はポリ（ビニルアルコール））、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号）、Ｌ−グルタミン酸とγ−エチル−Ｌ−グルタマートのコポリマー、非分解性エチレン−酢酸ビニル、分解性の乳酸−グリコール酸コポリマー、例えばＬＵＰＲＯＮ ＤＥＰＯＴＴＭ（乳酸−グリコール酸コポリマー及び酢酸ロイプロリドからなる注入可能なミクロスフィア）、及びポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸が含まれる。エチレン−酢酸ビニルや乳酸−グリコール酸等のポリマーは１００日以上分子を放出できるが、特定のヒドロゲルはより短い時間タンパク質を放出する。
【００８６】
Ｄ．投与方法
Ａｐｏ−２Ｌ又はＡｐｏ−２Ｌレセプターアゴニスト抗体とＣＰＴ−１１は、公知の方法、例えばボーラスとしてもしくは一定時間にわたる連続注入による静脈内投与、筋肉内、腹腔内、脳脊髄内、皮下、関節内、滑液包内、くも膜下腔内、経口、局所的、又は吸入経路により投与することができる。場合によっては、投与は、様々な市販の装置を使用するミニポンプ流入によって実施することもできる。
Ａｐｏ−２リガンド又はアゴニスト抗体とＣＰＴ−１１の投与の有効な用量は経験的に決定することができ、そのような決定を行うことは当業者の技量の範囲にある。単独に使用されるＡｐｏ−２リガンドの効果的な用量又は量は一日当り約１μｇ／ｋｇから約１００ｍｇ／ｋｇ体重あるいはそれ以上までの範囲であると現在は考えられる。単独に使用されるＣＰＴ−１１の効果的な用量又は量は約１ｍｇ／ｍ２から約１５０ｍｇ／ｍ２の範囲である。用量の種間スケーリングは、例えば、Ｍｏｒｄｅｎｔｉ等， Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔ． Ｒｅｓ．， ８：１３５１（１９９１）に開示されているような当該分野で知られている方法で実施することができる。当業者であれば、投与されなければならないＡｐｏ−２リガンド又はアゴニスト抗体とＣＰＴ−１１の用量は、例えばＡｐｏ−２リガンド又はアゴニスト抗体とＣＰＴ−１１を受ける哺乳動物、投与経路、及び哺乳動物に投与されている他の薬物又は治療法に応じて変化することを理解するであろう。
細胞の型及び／又は病気の重症度に応じて、例えば一又は複数の別個の投与又は連続注入の何れであれ、約１μｇ／ｋｇないし１５ｍｇ／ｋｇ（例えば０．１−２０ｍｇ／ｋｇ）のアゴニスト抗体が、投与の最初の候補用量である。上述した要因に応じて、典型的な一日の投与量は約１μｇ／ｋｇから１００ｍｇ／ｋｇあるいはそれ以上の範囲である。数日間又はそれ以上の繰り返し投与の場合、状態によっては、病気の徴候の望ましい抑制が生じるまで処置を維持する。しかしながら、他の投薬計画も有効であろう。
【００８７】
ＣＰＴ−１１で細胞を前処理すると、選択された集団の細胞中でのアポトーシスを誘発するのに必要なＡｐｏ−２Ｌレセプターアゴニストの量が低減すると考えられている。例えば、ＣＰＴ−１１で細胞を前処理すると、少なくとも２５％、好ましくは少なくとも５０％まで、哺乳動物細胞におけるアポトーシスの誘発（等しい量又は程度）に必要なＡｐｏ−２Ｌレセプターアゴニストの量が低減する。
一又は複数のＡｐｏ−２Ｌレセプターアゴニストが本方法において使用されると考えられている。例えば、当業者であれば、Ａｐｏ−２リガンド、ＤＲ４アゴニスト抗体、ＤＲ５アゴニスト抗体、又はそれらの組合せを使用するであろう。場合によっては、Ａｐｏ−２Ｌレセプターアゴニスト抗体は、ＤＲ４及びＤＲ５の双方に結合する交差反応抗体を含むであろう。
【００８８】
さらなる治療法を本方法において使用することも考えられる。一又は複数の他の治療法には、これらに限定されるものではないが、他の化学療法（又は化学療法剤）及び／又は放射線療法、免疫アジュバント、成長阻害因子、サイトカイン、及び他の非Ｈｅｒ−２抗体をベースとした治療法が含まれる。例としては、インターロイキン（例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−６）、白血病抑制因子、インターフェロン、ＴＧＦ−β、エリスロポイエチン、トロンボポイエチン、及び抗ＶＥＧＦ抗体が含まれる。哺乳動物においてアポトーシスを誘発することが知られている他の薬剤もまた使用することができ、それら薬剤には、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β（リンホトキシン−α）、ＣＤ３０リガンド、４−１ＢＢリガンド、及びＡｐｏ−１リガンドが含まれる。
本発明により考えられる化学療法には、当該分野で知られ、商業的に入手可能な化学物質又は薬物、例えばアドリアマイシン、ドキソルビシン、５−フルオロウラシル、シトシンアラビノシド（「Ａｒａ−Ｃ」）、シクロホスファミド、ロイコボリン、チオテパ、ブスルファン、サイトキシン、タキソール、トキソテレ（Ｔｏｘｏｔｅｒｅ）、メトトレキサート、シスプラチン、メルファラン、ビンブラスチン、ブレオマイシン、エトポシド、イフォスファミド、マイトマイシンＣ、マイトキサントロン、ビンクレイスチン、ビノレルビン、カルボプラチン、テニポシド、ダウノマイシン、カルミノマイシン、アミノプテリン、ダクチノマイシン、マイトマイシン、エスペラマイシン（米国特許第４，６７５，１８７号参照）、メルファラン及び他の関連ナイトロジェン・マスタードが含まれる。また含まれるものは、タモキシフェン及びオナプリストーンのような腫瘍のホルモン作用を調節又は阻害するように作用する薬剤である。
【００８９】
このような化学療法の調製と用量スケジュールは、製造者の指示書に従って使用されるか、有能な実務者により経験的に決定されて使用される。このような化学療法の調製と用量スケジュールは、Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ Ｓｅｒｖｉｃｅ Ｅｄ．， Ｍ．Ｃ． Ｐｅｒｒｙ， Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ， Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ， ＭＤ （１９９２）にも記載されている。化学療法剤は、Ａｐｏ−２Ｌ又はアゴニスト抗体及び／又はＣＰＴ−１１の投与の前でも後でもよく、またはそれと同時に与えてもよい。
化学療法は、好ましくは、上述したもののような担体で投与される。化学療法の投与方法は、Ａｐｏ−２リガンド又はアゴニスト抗体又はＣＰＴ−１１に対して使用するものと同じものとでき、あるいは異なった方法で投与することもできる。
【００９０】
放射線療法は、当該分野で一般的に使用され、当業者に知られているプロトコルに従って施すことができる。このような療法には、セシウム、イリジウム、ヨウ素又はコバルト照射が含まれる。放射線療法は、体全体の照射でも、体の中又は上の特定の部位又は組織に局所的に向けられるものでもよい。典型的には、放射線療法は、約１週から約２週の期間にわたって、パルスで施される。しかしながら、放射線療法をより長い時間、施してもよい。場合によっては、放射線療法は、単一用量又は複数の連続用量として施されうる。
Ａｐｏ−２リガンド又はアゴニスト抗体とＣＰＴ−１１の投与に続いて、インビトロの治療細胞を分析することができる。インビボ治療があった場合、治療された哺乳動物は熟練した実務者によく知られた様々な方法でモニターすることができる。例えば、身体的に、バイオプシーにより、あるいは標準的なＸ線画像法により腫瘍を観察することができる。
【００９１】
ＩＩＩ．　製造品
本発明の他の実施態様では、前述した疾患の治療に有用な物質を含有する製造品が提供される。製造品は容器及びラベルを含んでなる。適切な容器には、例えばボトル、バイアル、シリンジ、及び試験管が含まれる。容器はガラス又はプラスチックのような様々な材料で形成することができる。容器は病状の治療に有効な組成物を収容しており、滅菌したアクセスポートを有している（例えば、容器は皮下注射針により貫通可能なストッパーを具備する静脈溶液用のバック又はバイアルであってよい）。組成物中の活性剤はＡｐｏ−２リガンド又はアゴニスト抗体とＣＰＴ−１１である。容器上の又は容器に伴うラベルには、組成物が、選択された病状の治療に使用されることが示されている。製造品は、製薬的に許容可能なバッファー、例えばリン酸緩衝生理食塩水、リンガル液及びブドウ糖液を収容する第２の容器をさらに具備する。さらに、他のバッファー、希釈剤、フィルター、針、シリンジ、及び使用指示書を含むパッケージ挿入物を含む、市販及び使用者の観点から望ましい他の材料をさらに含んでいてもよい。
【００９２】
以下の実施例は例示するためにのみ提供されるものであって、限定するものではない。本明細書で引用した全ての文献を、出典明示によりここに取り込む。
実施例１
この実施例は、インビボのＡｐｏ−２リガンド及びＣＰＴ−１１による腫瘍成長の相乗的抑制について例証するものである。
大腸癌細胞株ＣＯＬＯ２０５（ＮＣＩから入手可能）が育成され、サプライヤー法によって維持された。簡単に述べると、ＣＯＬＯ２０５細胞が１０％胎児ウシ血清と２．０ｍＭＬ−グルタミンを含有する高グルコースＤＭＥＭ／Ｆ１２（５０：５０）培地で培養された。アミノ酸１１４−２８１（配列番号：１）を含んでなるＡｐｏ−２リガンドが大腸菌で調製された。ヒトＡｐｏ−２Ｌの細胞外タンパク質（アミノ酸１１４−２８１；上掲のＰｉｔｔｉ等参照）は、加えられた開始メチオニンコドンを有するｐＳ１３４６発現プラスミド（Ｓｃｈｏｌｔｉｓｓｅｋ等， Ｇｅｎｅ， ６２：５５−６４（１９８８））中にサブクローン化され、１０Ｌ又は１００Ｌの発酵器でｔｒｐプロモーターのコントロールの下、大腸菌株Ｗ３１１０中に発現された。組換えヒト可溶性Ａｐｏ−２Ｌを含有する細胞ペーストが、０．１Ｍ　トリス／０．２Ｍ　ＮａＣＬ／５０ｍＭ　ＥＤＴＡを含有する緩衝液、ｐＨ８．０で抽出された。抽出物は、４０％硝酸アンモニウムにより沈殿させた。ヒドロキシアパタイト及びＮｉ−ＮＴＡアガロースカラムでの２つの連続したクロマトグラフィー分離段階により、精製度＞９８％均一性を達成した。（しかし、それはポリヒスチジンタグが欠け、組換え可溶性１１４−２８１アミノ酸Ａｐｏ−２Ｌ断片が内因性のヒスチジン残基を通じてＮｉ−ＮＴＡカラムに結合したと考えられる）。純度は、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）−ポリアクリルアミドゲル電気泳動及び硝酸銀又はカーマシーブルー染色により、アミノ酸配列分析、及び高速液体クロマトグラフィ−（ＨＰＬＣ）によるサイズ除外にて決定される。ＣＰＴ−１１（Ｃａｍｐｔｏｓａｒ（登録商標））はＰｈａｒｍａｃｉａ＆Ｕｐｊｏｈｎから入手した。
【００９３】
胸腺欠損ヌードマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）に５００万のＣＯＬＯ２０５大腸癌細胞を皮下注射し、腫瘍を約１２０ｍｍ３まで成長させた。腫瘍を持つマウスは、１グループにつき９匹の４グループ中にランダム化され、ビヒクル（２０ｍＭトリス、８％トレハロース、０．０１Ｔｗｅｅｎ−２０、ｐＨ７．５）、Ａｐｏ−２Ｌ（０−４及び７−１１日目に３０ｍｇ／ｋｇ／日）、又はＣＰＴ−１１（０、４及び８日目に８０ｍｇ／ｋｇ／日）、又はＡｐｏ−２Ｌ（０−４及び７−１１日目に３０ｍｇ／ｋｇ／日）＋ＣＰＴ−１１（０、４及び８日目に８０ｍｇ／ｋｇ／日）の何れかで治療した。腫瘍の用量は、３４日までの表示された日に測定された。
図１に示されるように、Ａｐｏ−２Ｌ（白抜き三角）又はＣＰＴ−１１（白抜き四角）は、それぞれ、治療期間の腫瘍成長を抑制したが、それぞれのグループの９動物全てで数日後、腫瘍成長が再開した。これに対して、Ａｐｏ−２ＬとＣＰＴ−１１の組み合わせ（塗りつぶされた三角）では、かなりの腫瘍減縮が起り、その結果、組み合わせ治療グループの９のうち８の動物で完全に腫瘍が消失した。
この実験の結果は、Ａｐｏ−２ＬリガンドとＣＰＴ−１１治療がインビボの癌細胞の成長を相乗的に抑制することを示している。
【００９４】
実施例２
この実施例はインビボのＤＲ４レセプターアゴニスト抗体、４Ｈ６．１７．８（「４Ｈ６」）及びＣＰＴ−１１による腫瘍成長の相乗的抑制について例示するものである。
アゴニスト抗体が、次のようにして調製された。可溶性のＤＲ４ＥＣＤイムノアドヘシン作成物を調製した。成熟ＤＲ４ ＥＣＤ配列（Ｐａｎらにより示されたアミノ酸１−２１８、上掲）を、ｐＣＭＶ−１Ｆｌａｇベクター（Ｋｏｄａｋ）のＦｌａｇシグナル配列の下流にクローニングし、既に記載されているようにして［Ａｒｕｆｆｏ等，Ｃｅｌｌ， ６１：１３０３−１３１３（１９９０）］ヒト免疫グロブリンＧ１重鎖のＣＨ１、ヒンジ及びＦｃ領域に融合した。イムノアドヘシンは、ヒト２９３細胞に一過性形質移入して発現させ、Ａｓｈｋｅｎａｚｉ等， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．， ８８：１０５３５−１０５３９（１９９１）により記載されたプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーにより細胞上清から精製した。
０．５μｇ／５０μｌのＤＲ４ＥＣＤイムノアドヘシンタンパク質（上記）（Ｒｉｂｉ Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｃ．， Ｈａｍｉｌｔｏｎ， ＭＴから購入したＭＰＬ−ＴＤＭアジュバントで希釈）を、各々の後足の裏の柔らかい部分に、３−４日間隔で１１回注射することで、Ｂａｌｂ／ｃマウス（チャールズリヴァー研究所から得たもの）を免疫化した。
最終の追加免疫から３日後に、膝窩リンパ節をマウスから取り出し、単細胞懸濁液を、１％のペニシリン−ストレプトマイシンが補われたＤＭＥＭ培地（Ｂｉｏｗｈｉｔａｋｋｅｒ Ｃｏｒｐ．から得たもの）中で調製した。次いで、リンパ節細胞を３５％のポリエチレングリコールを使用してマウス骨髄腫細胞Ｐ３Ｘ６３ＡｇＵ．１（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １５９７）と融合させ、９６−ウェル培養プレートで培養した。融合の結果得られたハイブリドーマをＨＡＴ培地において選択した。融合から１０日後に、ハイブリドーマ培養の上清をＥＬＩＳＡでスクリーニングし、ＤＲ４ＥＣＤイムノアドヘシンタンパク質（上記）に結合するモノクローナル抗体の存在を試験した。
【００９５】
ＥＬＩＳＡでは、各々のウェルに、ＰＢＳ中に２μｇ／ｍｌのヤギ抗ヒトＩｇＧＦｃ（Ｃａｐｐｅｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから購入）が入ったものを５０μｌ添加して、９６−ウェルマイクロタイタープレート（Ｍａｘｉｓｏｒｐ； Ｎｕｎｃ， Ｋａｍｓｔｒｕｐ， Ｄｅｎｍａｒｋ）をコートし、４℃で一晩インキュベートした。次いでプレートを洗浄用バッファー（０．０５％のトゥイーン２０を含有するＰＢＳ）で３回洗浄した。次いで、マイクロタイタープレートのウェルを、ＰＢＳに２．０％のウシ血清アルブミンが入ったもの２００μｌでブロックし、室温で１時間インキュベートした。次いで、プレートを洗浄用バッファーで再度３回洗浄した。
洗浄工程後、アッセイ用バッファー中の０．４μｇ／ｍｌのＤＲ４ＥＣＤイムノアドヘシンタンパク質５０μｌを各ウェルに添加した。プレートを振盪装置上で、室温で１時間インキュベートし、続いて洗浄用バッファーで３回洗浄した。
洗浄工程に続いて、１００μｌのハイブリドーマ上清又はプロテインＧ−セファロースカラム精製抗体（１０μｇ／ｍｌ）を指定ウェルに添加した。１００μｌのＰ３Ｘ６３ＡｇＵ．１骨髄腫細胞条件培地を他の指定ウェルに対照として添加した。プレートを振盪装置上で、室温で１時間インキュベートし、続いて洗浄用バッファーで３回洗浄した。
【００９６】
次に、アッセイ用バッファー（０．５％のウシ血清アルブミン、０．０５％のトゥイーン２０がＰＢＳ中に入ったもの）で、１：１０００に希釈されたＨＲＰ−抱合ヤギ抗マウスＩｇＧ Ｆｃ（Ｃａｐｐｅｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから購入）の５０μｌを各々のウェルに添加し、プレートを振盪装置上で、室温で１時間インキュベートした。プレートを洗浄用バッファーで３回洗浄し、次いで各々のウェルに５０μｌの基質（ＴＭＢマイクロウェルペルオキシダーゼ基質；Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ ＆ Ｐｅｒｒｙ， Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ， ＭＤ）を添加し、室温で１０分間インキュベートした。５０μｌのＴＭＢ１−成分終止溶液（ジエチルグリコール；Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ ＆ Ｐｅｒｒｙ）を各々のウェルに添加して反応を終了させ、４５０ｎｍでの吸光度を自動マイクロタイタープレート読取装置で読み取った。
最初にＥＬＩＳＡでスクリーニングしたハイブリドーマ上清は、ＣＤ４−ＩｇＧではなくＤＲ４−ＩｇＧに結合するそれらの能力について考慮した。ＥＬＩＳＡで陽性とされた上清は、９Ｄ細胞（ＤＲ４を発現するヒトＢリンパ細胞系；Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ， Ｉｎｃ．）及びＦＩＴＣ抱合ヤギ抗マウスＩｇＧを用いたＦＡＣＳ分析でさらに分析した。この分析のために、セルソーター用バッファー（１％のＦＣＳ及び０．０２％のＮａＮ３を含むＰＢＳ）中の細胞懸濁物（４ｘ１０６細胞／ｍｌ）の２５μｌを、Ｕ字底のミクロタイターウェルに添加し、１００μｌ培養上清又はセルソーター用バッファー中の精製抗体（１０μｇ／ｍｌ）と混合し、氷上で３０分間インキュベートした。次いで、細胞を洗浄し、１００μｌのＦＩＴＣ抱合ヤギ抗マウスＩｇＧとともに４℃で３０分間インキュベートした。次いで、細胞を２回洗浄し、１５０μｌのセルソーター用バッファーに再懸濁し、ＦＡＣＳｃａｎ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ， Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ， ＣＡ）によって分析した。
【００９７】
９Ｄ細胞のＦＡＣＳ染色は、抗体、４Ｅ７．２４．３及び４Ｈ６．１７．８が、９Ｄが細胞上のＤＲ４レセプターを認識したことを明らかにした。ハイブリドーマ上清及び精製抗体を、ＤＲ４に媒介された９Ｄ細胞のアポトーシスを誘発する能力について試験した。９Ｄ細胞（５ｘ１０５細胞／０．５ｍｌ）を５μｇのＤＲ４ｍＡｂｓ（４Ｅ７．２４．３又は４Ｈ６．１７．８）又はＩｇＧ対照抗体とともに２００μｌ完全ＲＰＭＩ培地中、４℃で１５分間インキュベートした。次いで、細胞を、１０μｇのヤギ抗マウスＩｇＧＦｃ抗体（ＩＣＮ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）を共なう又は共なわない、３００μｌの完全ＲＰＭＩ中、３７℃で５分間インキュベートした。この時点で、細胞を７％のＣＯ２存在下、３７℃で一晩インキュベートした。次いで細胞を回収し、ＰＢＳで１回洗浄した。細胞のアポトーシスを、製造者の推奨（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）に従ってホスファチジルセリンに結合するＦＩＴＣ−アネキシンＶの染色によって決定した。細胞をＰＢＳ中で洗浄し、２００μｌの結合バッファー中に再懸濁させた。１０μｌのアネキシン−Ｖ−ＦＩＴＣ（１μｇ／ｍｌ）及び１０μｌのヨウ化プロピジウムを細胞に添加した。暗中で１５分間インキュベートした後、９Ｄ細胞をＦＡＣＳで分析した。
どちらのＤＲ４抗体も（ヤギ抗マウスＩｇＧＦｃ無しで）対照抗体に比較して９Ｄ細胞のアポトーシスを誘発した。しかし、両方のＤＲ４抗体のアゴニスト活性は、ヤギ抗マウスＩｇＧＦｃ存在下でのＤＲ４レセプター交差結合によって高められた。両方のＤＲ４抗体によるこの高められたアポトーシスは、９Ｄ細胞におけるＡｐｏ−２Ｌのアポトーシス活性に匹敵した。
【００９８】
４Ｈ６．１７．８モノクローナル抗体＋ＣＰＴ−１１の効果（図２に示される他の治療グループと比較して）を試験したインビボ研究は、抗体治療グループにおいて抗ＤＲ４抗体４Ｈ６（５ｍｇ／ｋｇ；上述のようにして調製）が研究期間に毎週２回のマウスへのｉ．ｐ．注射により投与されたこと以外は、原則的に前記実施例１に記載されたようにして実施された。Ａｐｏ−２Ｌ治療グループにおいては、６０ｍｇ／ｋｇ／日で０−４日目にｉ．ｐ．注射によりＡｐｏ−２Ｌを投与した。ＣＰＴ−１１おいては、８０ｍｇ／ｋｇで０、４及び８日目にｉ．ｖ．注射によりＣＰＴ−１１を投与した。
結果は図２に示される。それぞれの薬剤単独では、腫瘍の進行をかなり遅らせた。Ａｐｏ−２Ｌ又は抗ＤＲ４モノクローナル抗体とＣＰＴ−１１の組み合わせでは、単一薬剤での治療と比較して腫瘍進行がより大きく遅れ、腫瘍退行を引き起こした。抗ＤＲ４モノクローナル抗体は、Ａｐｏ−２Ｌ単独薬剤として、及びＣＰＴ−１１との組み合わせの両方よりも効果的であった。有効（当初の５０％よりも多く減少した腫瘍の容量）は、抗ＤＲ４抗体＋ＣＰＴ−１１で治療した１０のマウス全てにおいて引き起こされたが、Ａｐｏ−２Ｌ＋ＣＰＴ−１１での治療では１０のうち６のマウスのみであった。これらの結果から、Ａｐｏ−２Ｌレセプターアゴニストは、ＣＰＴ−１１と協同して、それぞれ単一薬剤での効果の加法合計を超越して、腫瘍進行の相乗的に抑制することを示す。
【００９９】
実施例３
この実施例はＣＰＴ−１１とＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬの生理学的効果を記載し、Ａｐｏ２ｌ／ＴＲＡＩＬにさらす前にＣＰＴ−１１で細胞を前処理することで、ＤＲ５及びＤＲ４ｍＲＮＡ、並びにカスパーゼ（ｃａｓｐａｓｅ）−３−様切断／活性化、及びアポトーシスが最も誘発されることを示すものである。
ここで使用される略語には：Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ、Ａｐｏ２リガンド／腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘発性リガンド（実施例１及び２に記載されたようにして調製）；ＤＲ、死亡レセプター；ＤｃＲ、デコイレセプター；ＦＡＤＤ、死亡ドメインを有するＦａｓ−結合性タンパク質；ＣＰＴ、カンプトテシン；ＣＰＴ−１１、イリノテカン；ＨＵＶＥＣ、ヒト臍静脈内皮細胞；ＴＮＦ、腫瘍壊死因子；ＦＬＩＰ、ｆｌｉｃｅ−抑制タンパク質；ＣＤＤＰ、シスジアミンジクロロプラチナム（ＩＩ）；ＣＤＫ、サイクリン依存性キナーゼが含まれる。
細胞培養のために、ヒト腫瘍大腸癌株化細胞ＨＣＴ１１６をアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ｍａｎａｓｓａｓ， ＶＡ）から得た。細胞を、１０％の胎児ウシ血清、１ｍＭのグルタミン、１００単位／ｍｌのペニシリン及び１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを含有するＲＰＭＩ１６４０培地で培養した。薬剤処理する前に、１５０ｃｍのプレートで２４時間、細胞を継代培養した。ヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）をセル・システム（Ｃｅｌｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ）（＃２Ｖ０−Ｃ７５；Ｋｉｒｋｌａｎｄ， ＷＡ）から得て、ＣＳ−ＣＴＭ完全培地（＃４Ｚ０−５００， セル・システム）においてインキュベートした。
【０１００】
細胞生存度を測定するために、ＡｌａｍａｒＢｌｕｅＴＭアッセイを使用した。９６ウェル組織培養プレートにおいて、ＨＣＴ１１６大腸癌細胞（〜１００００細胞／ウェル）を１０％ＦＢＳのＲＰＭＩ１６４０培地にて一晩インキュベートした。翌日培地を取り除き、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ単独（１μｇ／ｍＬ）、ＣＰＴ−１１（５０μｇ／ｍＬ）又はＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ＋ＣＰＴ１１を含有する血清フリーの培地で、細胞を２４時間インキュベートした。２４時間のインキュベート時間の最後の６時間に、ＡｌａｍａｒＢｌｕｅＴＭをウェルに添加した。励起５３０ｎｍ及び発光５９０ｎｍにて、９６ウェル蛍光光度プレート読取機（ＣｙｔｏＦｌｏｕｒ ｍｕｌｔｉ−ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ ｒｅａｄｅｒ ｓｅｒｉｅｓ ４０００， ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ；Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ， ＭＡ）を使用して、蛍光を読み取った。さらに、分子プローブであるＬｉｖｅ／Ｄｅａｄ（登録商標）生存度／細胞障害性キット（Ｅｕｇｅｎｅ， ＯＲ）を使用し、生存又は死亡した細胞の存在を評価した。これらのアッセイにおいては、フルオレセイン（カルセイン）とローダミン（エチジウムホモダイマー−１）フィルターを具備するＡｘｉｏｖｅｒｔ２５（Ｚｅｉｓｓ；Ｔｈｏｒｎｗｏｏｄ， ＮＹ）蛍光顕微鏡下で培養物を観察する１５分前に、カルセイン（Ｃａｌｃｅｉｎ）−Ａｍ（４μＭ）とエチジウムホモダイマー−１（２μＭ）を添加して細胞を処理した。
【０１０１】
また、クリスタルバイオレットアッセイも使用した。９６ウェル組織培養プレートにおいて、ＨＣＴ１１６大腸癌細胞（約２００００細胞／ウェル）を１０％胎児ウシ血清（ＦＢＳ）のＲＰＭＩ１６４０培地にて一晩インキュベートした。翌日培地を取り除き、上述した種々の薬剤を含有する新鮮な培地で、細胞を２４又は４８時間インキュベートした。各処理の終わりに培地を取り除き、０．５％のクリスタルバイオレット溶液を各ウェルに１００μｌ添加し、水で洗浄する前に１０分間、室温でインキュベートした。ウェルを乾燥させた後、０．５ＮのＨＣｌを含有するエタノールを各ウェルに１００μｌ添加した。ついで、プレートを９６ウェルプレート読取機（Ｓｐｅｃｔｒａ Ｍａｘ ３４０ｐｃ， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ， Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ， ＣＡ）を使用し、５４０ｎｍで読み取った。
【０１０２】
カスパーゼ活性をカスパーゼ−３アッセイキット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ；Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ， ＣＡ）により測定した。該アッセイを製造者の指示書に従い行った。ＨＣＴ１１６細胞を、１０％のＦＣＳ、１ｍＭのグルタミン、１００単位／ｍｌのペニシリン及び１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを含有するＲＰＭＩ培地で培養し、図の説明文に記載しているような種々の処理を施した。処理後、細胞を収集し、冷ＰＢＳで１回洗浄し、アッセイ時間まで−２０℃で凍結した。細胞ペレットを解凍し、キットにて提供される細胞溶解バッファーにより１０分間、氷上で溶解させた。溶菌液を、反応バッファー中にて３７℃で１時間、蛍光発生的カスパーゼ基質（Ｚ−ＤＥＶＤ−ＡＦＥ， １００μＭ）と共にインキュベートした。サンプルを、４００／３０ｎｍの励起フィルター及び５０８／２０ｎｍの発光フィルターを具備するＣｙｔｏＦｌｕｏｒ ｍｕｌｔｉ−ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ ｒｅａｄｅｒ（ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）にて分析した。相対蛍光レベルを各サンプルのタンパク質濃度に対して規準化した。
【０１０３】
全ＲＮＡを、製造者の指示書に従い、ＲＮＡ Ｓｔａｔ−６０ＴＭ溶液（Ｔｅｌ−Ｔｅｓｔ， Ｉｎｃ （Ｆｒｉｅｎｄｓｗｅｅｄ， ＴＸ）を使用して単離した。Ｑｕａｎｔｉｇｅｎｅ ｂＤＮＡＴＭシグナル増幅キット（Ｃｈｉｒｏｎ ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ；Ｅａｓｔ Ｗａｌｐｏｌｅ， ＭＡ）を使用し、ｍＲＮＡレベルを評価した。ＧＡＰＤＨプローブ対の配列は製造者の推奨に従って。ＤＲ４プローブ対は、核酸残基９−５８２の領域に配列させた。５捕獲プローブ、１６標識プローブ及び８ブロックプローブが存在した。ＤＲ５プローブ対を核酸残基１３−５９１の領域に配列した。ＤＲ５に対する５捕獲プローブ、１７レベルプローブ及び５ブロックプローブが存在する。組換えＤｃＲ１、ＤｃＲ２、ＤＲ４及びＤＲ５構築物を使用し、インビトロ転写からのＲＮＡを使用し、プローブの特異性をテストした。ＤＲ４及びＤＲ５プローブ対の両方ともそれら自身のＲＮＡ転写に対して高い特異性があった。各プローブ対からのシグナルは、テストされた濃度では直線状であった。約２μｇの全ＲＮＡ／ウェルを使用して、製造者の指示書に従いｂＤＮＡアッセイを行った。
【０１０４】
ウエスタンブロット法のために、１０％のグリセロール、１％のトリトン−ｘ１００、１５０ｍＭのＮａＣｌ及びプロテアーゼインヒビターを含有する２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．４中で細胞を溶解した。（１ｍＭのＰＭＳＦ、１０μｇ／ｍｌのアプロチニン、１０μｇ／ｍｌのロイペプチン、シグマ）。ウェル当たり全タンパク質の５０μｇのアリコットを、ＮｕＰＡＧＥ ＭＥＳ ＳＤＳラニングバッファー（Ｎｏｖｅｘ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ）を有するＮｕＰＡＧＥ ４−１２％ビス−トリスゲル中で分離した。ゲルを、ＮｕＰＡＧＥトランスファーバッファーと共に、セミドライトランスファー装置（Ｂｉｏ−ｄａｄ；Ｈｅｒｃｕｌｅｓ， ＣＡ）により、０．２μＭの純粋ニトロセルロース膜（Ｂｉｏ７−Ｒａｄ）にトランスファーさせた。５％のノンファットドライミルクを含有するＰＢＳで膜をブロックし、興味あるタンパク質の第１抗体、続いて西洋ワサビペルオキシダーゼ結合第２抗体（Ａｍｅｒｓｈａｍ；Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ， Ｇｅｒｍａｎｙ）と共にインキュベートした。増強された化学発光系により免疫反応バンドを可視化した（Ａｍｅｒｓｈａｍ；Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ， Ｇｅｒｍａｎｙ）。この研究で使用した抗体は：抗−カスパーゼ−３（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ， ＃２０００２１；Ｌａ Ｊｏｌｌａ， ＣＡ）、抗−ｐ５３及び抗−ｐ２１（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ， ＃ＯＰ４３及び＃ＯＰ６４；Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ， ＭＡ）、及び抗−ＦＬＩＰ（＃３４３００２， Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ）である。抗体は、製造者に推奨される濃度で使用した。
【０１０５】
細胞周期分析をＦＡＣＳ分析を介して行った。ＨＣＴ１１６及びＨＵＶＥＣ細胞をインキュベートし、図の説明文に記載したようにして処理した。処理後、培地中に浮遊する細胞とプレートで生存している細胞の両方を収集した。周期テストプラスＤＮＡＴＭ試薬キット（Ｂｅｃｋｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ；Ｓａｎ Ｊｏｓｅ， ＣＡ）を使用し、製造者の指示書に従って細胞を染色した。染色した細胞をＦＡＣＳソーター（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）において分析した。ｓｕｂ−Ｇ１ ＤＮＡ内容物を含有するアポトーシス細胞のパーセンテージをＣｅｌｌＱｕｅｓｔプログラムを使用して定量した。細胞周期における各相で生存している細胞のパーセンテージをＭｏｄＦｉｔ’ ＬＴプログラムを使用して定量した。
【０１０６】
図５は、インビトロにおけるＨＣＴ１１６細胞のＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ媒介性アポトーシスのＣＰＴ−１１感作が時間依存していることを示すアポトーシスの時間特性を提供するものである。腫瘍細胞をカルセイン−ＡＭとエチジウムホモダイマー−１（それぞれ、緑及び赤の蛍光）で染色し、続いてＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ又はＣＰＴ−１１を単独で、又は組み合わせて、これと共にインキュべートした。これらの条件下では、緑の蛍光は生存している細胞を表し；赤い染色は死亡している細胞を示す。処理２時間後、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ及びＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ＋ＣＰＴ−１１の組み合わせにより、細胞収縮及び単層からの細胞剥離を含む、アポトーシスに特徴的な細胞変化が誘発された。しかしながら、この時点においては、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬとＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ＋ＣＰＴ−１１との間の細胞殺傷性において、あまり差はなかった。これに対し、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ＋ＣＰＴ−１１の組み合わせにより、エチジウムホモダイマーの取り込みに示されるように、２４時間までの細胞死が明確に増加し、全細胞密度がはっきりと減少する結果となった。ＣＰＴ−１１単独でインキュベートしても、２時間後に何の形態的変化も見られなかった。しかしながら、処理２４時間後には、いくつかの死亡した細胞がはっきりと存在していた。細胞生存度の定量的分析の結果（図４）は、形態学的蛍光データと一致した。処理２４時間後、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ＋ＣＰＴ−１１の組み合わせにより、Ａｐｏ２Ｌ単独のものと比較して、２６％アポトーシスが増加する結果となった。
【０１０７】
クリスタルバイオレットアッセイを行い、いくつかのＨＣＴ１１６細胞をＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ（１００ｎｇ／ｍ）とＣＰＴ−１１（５０マクログラム／ｍｌ）の組合せ処理に全体で２４時間さらし、続いて、培地の単独存在においてさらなる２４時間インキュベートした。連続処理された細胞グループにおいて、ＨＣＴ１１６細胞を、最初の２４時間ＣＰＴ−１１にさらし、ついで培地を変えて、さらなる２４時間、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ含有培地にさらした。これらの条件下では、連続処理された細胞における全細胞殺傷性は、組合せ処理で処理された細胞サンプルよりも約６％増強されていた（ｐ＜０．００１、ｔ−Ｔｅｓｔ）。さらに、連続及び組合せ処理を比較する相対生存活性は、５４％と同程度まで低減した。この効果は異なる濃度のＣＰＴ−１１及びＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬでも観察された（データは図示せず）。
【０１０８】
Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ誘発性アポトーシスはカスパーゼ−３活性に関与していることが以前に報告されている（例えば、Ｍｕｈｌｅｎｂｅｃｋら， Ｊ．Ｂ．Ｃ． ２７３：３３０９１−８（１９９８））ので、キャズパーゼ−３活性化のレベルをこれらの条件下で測定した。特に、経時的なカスパーゼ−３活性の評価を、上述したような蛍光定量的及びウエスタンブロット分析によりモニターした。カスパーゼ−３活性化のウエスタンブロット分析では、処理２時間後に、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬによりｐ２４，ｐ２０及びｐ１７形でカスパーゼ−３の切断がかなり誘発されたことが示された（図５）。カスパーゼ−３活性化は、蛍光定量的アッセイにより別途、確認された（図５）。興味深いことに、処理２時間後に、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ＋ＣＰＴ−１１の組合せにより同程度のカスパーゼ切断及び活性が誘発された。ＣＰＴ−１１単独では、カスパーゼ−３様活性は弱くはあるが確認可能で顕著であったが、切断はウエスタンブロットでは検出されなかった。２４時間後、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ＋ＣＰＴ−１１の組合せインキュベートにより、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ又はＣＰＴ−１１単独のものと比較して、カスパーゼ−３プロセシング及び活性化がはっきりと増加した。さらに、細胞をＣＰＴ−１１単独で一晩インキュベートし、続いてＣＰＴ−１１に加えてＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬと共に２時間処理する組合せ処理の変形により、最も高い程度でカスパーゼ−３切断及び活性化がなされる結果となった。特に、２０−２２時間ＣＰＴ−１１で、続いて２時間Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬで細胞を前処理することで、ＤＲ５及びＤＲ４ ｍＲＮＡ、並びにカスパーゼ−３様切断／活性化、及びアポトーシスが最も高く誘発された。以上のことから、これらの結果には、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ＋ＣＰＴ−１１の組合せ処理後にカスパーゼ−３活性化が増強され、腫瘍アポトーシスの増加に至ることが示されている。
【０１０９】
Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬレセプターＤＲ５及びＤＲ４の発現におけるＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ及びＣＰＴ−１１の効果を調査するために、ｂＤＮＡアッセイを使用した。ＨＣＴ１１６細胞を、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ又はＣＰＴ−１１を単独で、さらには組合せでの処理前及び処理後に分析した。Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬは、処理２時間後に、ＤＲ５ｍＲＮＡ発現において、対照と比較して２倍の一過性増加を誘発した（図６）。ＤＲ５発現におけるＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ誘発性変化は、処理２４時間後に、対照のレベルまで戻った。これに対して、ＣＰＴ−１１単独では、処理２４時間後に、ＤＲ４及びＤＲ５ｍＲＮＡの双方において２．５倍増加したが、２時間後では増加がない結果となった（図６）。２２時間ＣＰＴ−１１単独で処理し、続いて２時間Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ＋ＣＰＴ−１１で処理すると、ＤＲ５の発現が最も高くアップレギュレーションされる結果となった（３ないし４倍）。３０分間の全ての処理によっては、レセプター発現に何の変化も見られなかった。カスパーゼ−３の切断／活性化レベルの時間特性は、それぞれ２及び２４時間後にＤＲ５及び／又はＤＲ４のアップレギュレーションに続くものであった（図５）。これに対して、ＨＵＶＥＣ細胞におけるＤＲ５及びＤＲ４発現は、これらの処理のいずれによっても何の影響も受けなかった。これらの結果により、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬにより腫瘍細胞中でＤＲ５がアップレギュレーションされ、それ自身のアポトーシス活性が増強されることが示唆される。Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ＋ＣＰＴ−１１の組合せ処理により、ＤＲ５及びＤＲ４がさらにアップレギュレーションされることは、この観察を支持するものである。さらに、一般的なカスパーゼインヒビター、Ｚ−ＶＡＤの存在下で同様の実験を行い、生存している細胞よりはむしろ全細胞集団を、２４時間後に分析した。Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ＋ＣＰＴ−１１とＺ−ＶＡＤを組合せることで、Ｚ−ＶＡＤのないそれぞれの対照と比較して、さらに増加（ＤＲ５に対しては１．７対２．７倍、ＤＲ４に対しては１．９対３．０倍の増加）する結果となった（図７）。これらの結果は、これらの死亡レセプターのアップレギュレーションが細胞死の増加に寄与するという見解に一致した。
【０１１０】
Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ及びＣＰＴ−１１による、ＤＲ５アップレギュレーションにおけるｐ５３の関与を決定するために、ｐ５３タンパク質の発現レベルをウエスタンブロット分析により測定した。ＨＣＴ１１６腫瘍及び正常なＨＵＶＥＣ細胞をＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ又はＣＰＴ−１１を単独で、及び組合せで処理した後、アリコットを分析した。Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ媒介性アポトーシスがｐ５３に非依存的である（例えば、Ａｓｈｋｅｎａｚｉら， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ １１：２５５−２６０（１９９９）及びＲｉｅｇｅｒら， ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ ４２７：１２４−１２８（１９９８））ことを示した以前の報告と一致して、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬは、分析した任意の時間点においてｐ５３タンパク質レベルを増加させなかった（図８）。これに対して、以前に報告されたように（ＭｃＤｏｎａｌｄら， Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ ７８：７４５−５１（１９９８））、ＣＰＴ−１１と共にインキュベートすると、腫瘍及び正常細胞の双方において、処理２時間後と同様に早く、ｐ５３発現の強くて持続性のある誘発が生じる結果となった。少なくとも２４時間、ｐ５３のＣＰＴ−１１誘発は持続し、この誘発はＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬの添加による影響を受けなかった。
【０１１１】
アポトーシス対細胞停止におけるｐ２１の役割も調べた。ウエスタンブロットにより、ｐ２１及びｐ５３タンパク質レベルについて並行して、アリコットを分析した。以前に示したように、ＣＰＴ−１１単独では、双方の細胞型において強くｐ５３を誘発した（図８）。また、ＣＰＴ−１１は、腫瘍及び正常細胞の双方において、２４時間後に、ｐ２１タンパク質のかなりの誘発を媒介した（図９）。Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ単独ではｐ５３又はｐ２１の発現に影響はなかった。またＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ＋ＣＰＴ−１１による組合せ処理により、正常細胞における処理２４時間後に、ｐ５３及びｐ２１の強い発現が誘発された。驚くべきことに、ＨＣＴ１１６腫瘍細胞の組合せ処理におけるｐ２１タンパク質レベルは、ＣＰＴ−１１単独と類似した規模でのｐ５３発現の増加にかかわらず、基底レベルのままであった。これらのデータにより、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬは、ＣＰＴ−１１処理後のｐ５３における増加と関連して、ｐ２１の蓄積を抑制することの証拠を提供するものである。
【０１１２】
さらに、腫瘍アポトーシスのインビトロ実験モデルにおけるＦＬＩＰの関連可能性を研究した。ＨＣＴ１１６細胞を先に記載したようにして、２及び２４時間処理した。細胞溶解物を得、抗−ＦＬＩＰ抗体を使用するウエスタンブロット分析用に処理した。図１０には、ＦＬＩＰのタンパク質レベルは如何なる実験処理によっても影響を受けないことが示されている。（これは、ＦＬＩＰがこの大腸癌株化細胞を使用するアポトーシス調節の因子ではないことを示している）。
【０１１３】
処理された細胞の細胞周期特性、特に細胞周期停止の出現におけるｐ２１誘発と変化との間の正の相関性を測定するために、ＨＣＴ１１６細胞を、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ又はＣＰＴ−１１を単独で、さらに組合せで処理した２、６及び２４時間後に細胞周期分析にかけた。６時間後（図１１）、ＣＰＴ−１１単独では、細胞周期特性においてかなりのシフトが誘発され、結果としてＧｏ−Ｇ１細胞周期停止が生じた（７６％）。また、この変化は、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ＋ＣＰＴ−１１の組合せ処理においても、より少ない程度ではあるが（５５％）、認めることができ、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ単独では誘発されなかった（４３％ｖｓ．３０％対照）。２４時間までに、ＣＰＴ−１１処理により、Ｇ２−Ｍ期停止（４３％ｖｓ． １９％対照）の出現、及びＧｏ−Ｇ１期の明確な低減により特徴付けられる全く異なった結果を示した。より重要なことに、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ＋ＣＰＴ−１１の組合せは、処理２４時間後において、このＧ２−Ｍ停止の出現（１７％ｖｓ．１９％対照）を完全に妨げた。これらのデータは、ｐ２１のＣＰＴ−１１誘発におけるＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ媒介性抑制と一致した。
【０１１４】
同様の実験条件下で２４時間、正常細胞の細胞周期分析したところ、処理の間では何の差異も示されなかった。また、これらの細胞周期分析により、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ＋ＣＰＴ−１１の組合せ処理のアポトーシス活性の増加が確認された。対照細胞は１％であるのに対し、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ＋ＣＰＴ−１１（２４時間）は４２％アポトーシス、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ単独では１９％、ＣＰＴ−１１処理では９％という結果となった（図１１）。これらの結果は、細胞周期停止経路よりも、むしろＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ＋ＣＰＴ−１１の組合せ処理が、ｐ２１誘発を防止し、癌細胞をアポトーシスに向かわせることにより腫瘍抑制を媒介するといった概念をさらに支持するものである。ＣＰＴ−１１インキュベートによる、ｐ２１タンパク質レベルにおけるさらに詳細な時間特性の変化では、処理１８時間までの増加が処理４時間と同様に早く増加したことを示した。
【０１１５】
近年の研究では、カスパーゼ基質（例えば、Ｚｈａｎｇら， Ｏｎｃｏｇｅｎｅ １８：１１３１−１１３８（１９９９）；Ｌｅｖｋａｕら， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ １：５５３−５６３（１９９８）；Ｇｅｒｖａｉｓら， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２７３：１９２０７−１９２１２（１９９８）を参照）として、又はカスパーゼ活性化のインヒビター（例えば、Ｓｕｚｕｋｉら， Ｏｎｃｏｇｅｎｅ １７：９３１−９３９（１９９８）；Ｓｕｚｕｋｉら， Ｏｎｃｏｇｅｎｅ １８：１２３９−４４（１９９９）；Ｓｕｚｕｋｉら， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ＆ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ １９：３８４２−３８４７（１９９９）；Ｓｕｚｕｋｉら， Ｏｎｃｏｇｅｎｅ １９：１３４６−１３５３（２０００）を参照）として、アポトーシスプロセスにおけるｐ２１に対する反対の役割が示されている。ｐ２１のタンパク質レベルにおけるカスパーゼＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬの役割を決定するために、一般的なカスパーゼインヒビター、Ｚ−ＶＡＤが存在するが、先に記載したようにして、ＨＣＴ１１６細胞を処理した。カスパーゼ阻害により、Ｚ−ＶＡＤなしの同様の処理のものと比較して、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ＋ＣＰＴ−１１の組合せグループにおけるｐ２１が、細胞内レベルにおいて顕著に増加する結果となった（図１２）。大きな違いは、残存処理グループで観察されなかった。興味あることに、腫瘍細胞をＣＰＴ−１１で一晩プレインキュベートし、次いで分析前にＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬで２時間処理した場合、２４時間の規則的な組合せ処理において検出されたようにｐ２１レベルにおいて同様の減少があった。ｐ２１の分解は、これらの条件下で約１５Ｋｄに切断された断片が存在することで確認された。この実験により、カスパーゼ活性を阻害することで、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬで誘発されるｐ２１の他の強い分解が防止されることが示された。さらに、カスパーゼ活性化、ｐ２１レベル及び細胞周期停止の間の相関性を示すために、細胞周期分析を実施し、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬがカスパーゼインヒビター、Ｚ−ＶＡＤの存在下においてＣＰＴ−１１誘発性Ｇ２−Ｍ停止を妨げないことを示した（図１３）。
【０１１６】
Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬとＣＰＴ−１１の組合せ療法を検査するためにさらなる実験を行い、２つの異なる条件の組合せ治療を比較した。最初の条件（組合せ）において、腫瘍細胞を、インビトロで２４時間、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ及びＣＰＴ−１１にさらし、続いてさらなる２４時間、培地単独の存在下でインキュベートした。第２グループ（連続）においては、最初の２４時間ＣＰＴ−１１にさらし、ついで、さらなる２４時間、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬを単独で含有する培地に変えた。図１４Ａには、連続処理における全細胞殺傷性が、組合せグループよりも約６％増強されていた（ｐ＜０．００１、ｔ−Ｔｅｓｔ）。さらに、連続及び組合せ処理を比較する相対殺傷活性は、５４％と同程度まで増加した。この効果は異なる濃度のＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬでも見られた（図１４Ａ）。さらに、組合せ処理を超えた連続治療の増加したアポトーシス効果は、細胞が薬剤フリーの培地でさらに４日間インキュベートし、続いて２日間の薬剤暴露の場合、さらに６８％まで増強された（図１４Ｂ）。
また、ＣＰＴ−１１、ＳＮ３８の活性な代謝産物が代わりに用いられた場合、増大した腫瘍細胞死が組合わせ及び連続的処理において認められたが（図１５）、これは、腫瘍のアポトーシスの増大がＣＰＴ−１１化合物の代謝における変化を反映するものではないことを示している。
【０１１７】
材料の寄託
次の材料をアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション，１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ．， Ｍａｎａｓｓａｓ， Ｖｉｒｇｉｎｉａ， ＵＳＡ（ＡＴＣＣ）に寄託した：
材料　　　　　　　　　　ＡＴＣＣ寄託番号　 　　　　 寄託日
４Ｅ７．２４．３　　　　ＨＢ−１２４５４ 　　　 １９９８年１月１３日
４Ｈ６．１７．８　　　　ＨＢ−１２４５５　 　　 １９９８年１月１３日
１Ｈ５．２５．９　　　　ＨＢ−１２６９５　 　　 １９９９年４月　１日
４Ｇ７．１８．８　　　　ＰＴＡ−９９　　 　　　 １９９９年５月２１日
５Ｇ１１．１７．１　　　ＨＢ−１２６９４　 　　 １９９９年４月　１日
３Ｆ１１．３９．７　　　ＨＢ−１２４５６　　　　１９９８年１月１３日
３Ｈ３．１４．５　　　　ＨＢ−１２５３４　　　　１９９８年６月　２日
【０１１８】
この寄託は、特許手続き上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約及びその規則（ブダペスト条約）の規定に従って行われた。これは、寄託の日付から３０年間、寄託の生存可能な培養が維持されることを保証するものである。寄託物はブダペスト条約の条項に従い、またジェネンテク社とＡＴＣＣとの間の合意に従い、ＡＴＣＣから入手することができ、これは、どれが最初であろうとも、関連した米国特許の発行時又は任意の米国又は外国特許出願の公開時に、寄託培養物の後代を永久かつ非制限的に入手可能とすることを保証し、３５ＵＳＣ１２２条及びそれに従う特許庁長官規則（特に参照番号８８６ＯＧ６３８の３７ＣＦＲ第１．１４条を含む）に従って権利を有すると米国特許庁長官が決定した者に後代を入手可能とすることを保証するものである。
本出願の譲受人は、寄託した培養物が、適切な条件下で培養されていた場合に死亡もしくは損失又は破壊されたならば、材料は通知時に同一の他のもの即座に取り替えることに同意する。寄託物質の入手可能性は、特許法に従いあらゆる政府の権限下で認められた権利に違反して、本発明を実施するライセンスであるとみなされるものではない。
上記の文書による記載は、当業者に本発明を実施できるようにするために十分であると考えられる。本発明は、ここに呈された実施例によりその範囲が限定されるものではない。実際、ここに示し記載したものに加えて、本発明を様々に改変することは、前記の記載から当業者にとっては明らかなものであり、添付の請求の範囲内に入るものである。
【図面の簡単な説明】
【図１】胸腺欠損ヌードマウスに皮下注射された、Ａｐｏ−２Ｌ（白抜き三角）、ＣＰＴ−１１（白抜き四角）、Ａｐｏ−２Ｌ＋ＣＰＴ−１１（塗りつぶした三角）、又はビヒクル単独（白抜き丸）のヒト大腸癌細胞の成長に対する効果を示す。
【図２】胸腺欠損ヌードマウスに皮下注射された、Ａｐｏ−２Ｌ（６０ｍｇ／ｋｇ）（白抜き四角）、ＣＰＴ−１１（８０ｍｇ／ｋｇ）（塗りつぶした三角）、Ａｐｏ−２Ｌ（「Ａｐｏ２Ｌ．０」）＋ＣＰＴ−１１（塗りつぶした四角）、抗−ＤＲ４ ｍＡｂ ４Ｈ６（白抜き三角）、抗−ＤＲ４ ｍＡｂ＋ＣＰＴ−１１（塗りつぶした三角）又はビヒクル単独（塗りつぶした丸）のヒト大腸癌細胞の成長に対する効果を示す。
【図３】図３Ａ−３Ｈは、死亡した又は生存している腫瘍細胞の蛍光特性を示す。ＨＣＴ１１６培養体を、それぞれ２及び２４時間、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ、ＣＰＴ−１１及びＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ＋ＣＰＴ−１１で処理した。次に、蛍光染料を使用して室温で３０分間インキュベートし、細胞を蛍光顕微鏡で検査した。カルセイン−ポジティブ細胞（緑の標識）は生存している細胞を示すのに対し、エチジウムホモダイマー−１でポジティブ染色（赤の標識）されたものは、死亡しているか、かなりの損傷がある細胞を表し、これを図３Ｅ、３Ｆ及び３Ｇに示した。
【図４】ＣＰＴ−１１がインビトロでＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ媒介性アポトーシスを増強させることを示す。ＨＣＴ１１６培養体を、ＣＰＴ−１１（５０μｇ／ｍｌ）、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ（１μｇ／ｍｌ）、及びＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ＋ＣＰＴ−１１と共に２４時間インキュベートした。生存している細胞の数をａｌａｍａｒＢｌｕｅアッセイ（平均＋ＳＤ、ｎ＝２）により測定した。サンプル中で生存している細胞のパーセンテージを対照処理に対して規準化した。
【図５】図５Ａ−５Ｄは、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ誘発性カスパーゼ−３活性のＣＰＴ−１１感作がどのように時間依存しているかを示す。ＨＣＴ１１６細胞を、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ（１μｇ／ｍｌ）、ＣＰＴ−１１（５０μｇ／ｍｌ）、及びＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ＋ＣＰＴ−１１で、２及び２４時間処理した。細胞溶解物の等量のアリコットを、ウエスタンブロット分析によるプロ−カスパーゼ−３プロセシング（５Ａ及び５Ｂ）、及び蛍光定量的アッセイによるカスパーゼ−３活性（５Ｃ及び５Ｄ）で評価した。
【図６】図６Ａ−６Ｂは、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ及びＣＰＴ−１１単独で、又は組合せでの処理後の、ＤＲ５（６Ａ）及びＤＲ４（６Ｂ）遺伝子発現におけるＨＣＴ１１６の変化を示す。ＤＲ５及びＤＲ４ ｍＲＮＡレベルを、それぞれ２、６及び２４時間、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ（１μｇ／ｍｌ）、ＣＰＴ−１１（５０μｇ／ｍｌ）、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ＋ＣＰＴ−１とインキュベートした後、ｂＤＮＡアッセイにより測定した。相対値はＧＡＰＤＨ対する比率として算出され、未処理の対照培養に対して規準化した。
【図７】図７Ａ−７Ｂは、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ及びＣＰＴ−１１単独で、又は組合せでの処理後の、ＨＣＴ１１６細胞におけるＤＲ５（７Ａ）及びＤＲ４（７Ｂ）誘発を、Ｚ−ＶＡＤがブロックしないことを示す。ＤＲ５及びＤＲ４ ｍＲＮＡレベルを、それぞれ２、６及び２４時間、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ（１μｇ／ｍｌ）、ＣＰＴ−１１（５０μｇ／ｍｌ）、及びＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ＋ＣＰＴ−１１とインキュベートした後、ｂＤＮＡアッセイにより測定した。相対値はＧＡＰＤＨに対する比率として算出され、未処理の対照培養体に対して規準化した。
【図８】ＣＰＴ−１１（Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ処理なし）により、ＨＣＴ１１６及びＨＵＶＥＣ細胞におけるｐ５３タンパク質レベルが増加するといった結果を示す。ｐ５３タンパク質レベルは、２及び２４時間処理されたＨＣＴ１１６及びＨＵＶＥＣ細胞培養体におけるウエスタンブロット分析により特徴付けられた。
【図９】Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ処理により、ｐ２１タンパク質レベルのＣＰＴ−１１媒介性誘発が、腫瘍細胞では抑制されて、ＨＵＶＥＣ細胞では抑制されないことを示す。ヒトＨＣＴ１１６大腸腫瘍及び正常なＨＵＶＥＣ細胞を、２及び２４時間、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ（１μｇ／ｍｌ）、ＣＰＴ−１１（５０μｇ／ｍｌ）、及びＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ＋ＣＰＴ−１で処理した。細胞溶解物の等量のアリコット（５０μｇ／レーン）を、ウエスタンブロット分析によるｐ２１タンパク質発現についてテストした。
【図１０】カスパーゼ−８インヒビター、ＦＬＩＰタンパク質レベルが処理後に変化しないことを示す。ヒトＨＣＴ１１６大腸腫瘍細胞を、２及び２４時間、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ（１μｇ／ｍｌ）、ＣＰＴ−１１（５０μｇ／ｍｌ）、及びＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ＋ＣＰＴ−１１（１μｇ／ｍｌ）で処理した。処理後、細胞培養体をフローサイトメトリー細胞周期分析にかけた。
【図１１】Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬによりＣＰＴ−１１誘発性のＧ２／Ｍ細胞周期停止が抑制されることを示す。ＨＣＴ１１６腫瘍細胞を、２、６及び２４時間、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ（１μｇ／ｍｌ）、ＣＰＴ−１１（５０μｇ／ｍｌ）、及びＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ＋ＣＰＴ−１１で処理した。処理後、細胞培養体をフローサイトメトリー細胞周期分析にかけた。
【図１２】カスパーゼインヒビター、Ｚ−ＶＡＤ（Ｉ）がｐ５３及びｐ２１のレベルにおいて異なる効果を有することを示す。細胞培養体を、２４時間、２０μＭのＺ−ＶＡＤで、又はこれを用いないで処理した。細胞溶解物を、ｐ５３及びｐ２１のタンパク質レベルのためのウエスタンブロット分析にかけた。
【図１３】カスパーゼインヒビターＺＶＡＤの存在下でＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ処理をすると、ＣＰＴ−１１誘発性Ｇ２−Ｍ停止の防止に失敗することを示す。２０μＭのＺ−ＶＡＤの存在下で、ＨＣＴ１１６腫瘍細胞を２４時間、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ（１μｇ／ｍｌ）、ＣＰＴ−１１（５０μｇ／ｍｌ）、及びＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ＋ＣＰＴ−１１で処理した。処理後、細胞培養体をフローサイトメトリー細胞周期分析にかけた。
【図１４】図１４Ａ−１４Ｂは、連続処理により、腫瘍細胞における全細胞殺傷性が増強されることを示す。Ａ．組合せグループにおいて、ＨＣＴ１１６細胞を、ＣＰＴ−１１（１０マイクログラム／ｍｌ）及び異なる濃度のＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ（図に示す）に２４時間さらし、さらなる２４時間、培地単独の存在下でインキュベートした。連続グループにおいては、細胞を、最初の２４時間ＣＰＴ−１１にさらし、ついで、さらなる２４時間、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ含有培地に変えた。細胞生存性を実施例に記載したようなクリスタルバイオレットアッセイにより測定した（平均±ＳＤ、ｎ＝４）。Ｂ．ＨＣＴ１１６細胞（組合せ）を、ＣＰＴ−１１（１０マイクログラム／ｍｌ）及び異なる濃度のＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬに、全部で２４時間さらし、さらなる１２０時間、培地単独の存在下でインキュベートした。連続グループにおいては、細胞を、最初の２４時間ＣＰＴ−１１にさらし、ついで、さらなる２４時間、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ含有培地に変え、薬剤フリーの培地で９６時間インキュベートし、上述した様にして細胞生存性をテストした。
【図１５】組合せ及び連続処理にＣＰＴ−１１の代わりにＳＮ−３８で置き換えると、同様に増強された腫瘍細胞殺傷性となる結果を示す。組合せグループにおいて、ＨＣＴ１１６細胞を、ＳＮ−３８（０．０５マイクログラム／ｍｌ）及び２つの濃度のＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ（図に示す）に、全体で２４時間さらし、さらなる２４時間、培地単独の存在下でインキュベートした。連続グループにおいては、細胞を、最初の２４時間ＳＮ−３８にさらし、ついで、さらなる２４時間、培地のみを含有するＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬに変えた。細胞生存性を実施例に記載したようなクリスタルバイオレットアッセイにより測定した（平均±ＳＤ、ｎ＝４）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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