(57)【要約】真核細胞におけるテロメア選択的延長（ＡＬＴ）活性を測定するためのアッセイ法を提供する。ＡＬＴ活性に影響を及ぼす化合物を同定するためのアッセイ法も提供する。また、核酸構築物および核酸構築物を含む宿主細胞も提供する。2004504862.tif 000005
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１のＤＮＡタグ配列を相同組換えによってテロメアに組み込むことが可能な核酸構築物であって、（ｉ）タグ配列の３’側に位置する第１のＤＮＡ配列、および（ｉｉ）第１のＤＮＡタグ配列の５’側に位置する第２のＤＮＡ配列と結合した第１のＤＮＡタグ配列を含み、第１および第２のＤＮＡ配列がそれぞれヒトテロメアＤＮＡと相同な多重反復配列を含み、第１のＤＮＡタグ配列が第１のマーカーを含む、構築物。
【請求項２】
第１のマーカーが第１の真核生物選択マーカーである、請求項１記載の核酸構築物。
【請求項３】
多重反復配列が（ＴＴＡＧＧＧ）ｎである、請求項１または請求項２記載の核酸構築物。
【請求項４】
第１のＤＮＡタグ配列が第１の原核生物選択マーカー、および選択的には細菌複製起点をさらに含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の核酸構築物。
【請求項５】
第１の原核生物選択マーカーが第１のマーカーの５’側に位置し、構築物が第１の原核生物選択マーカーの３’側に位置する第１のエンドヌクレアーゼ認識部位を含む、請求項４記載の核酸構築物。
【請求項６】
第２のＤＮＡタグ配列を染色体内部のサブテロメア位置に組み込むことが可能な核酸構築物であって、（ｉ）第２のＤＮＡタグ配列の３’側に位置する、ヒトテロメアＤＮＡと相同な多重反復配列を含む第１のＤＮＡ配列、および選択的には（ｉｉ）第２のＤＮＡタグ配列の５’側に位置する第３のＤＮＡ配列と結合した第２のＤＮＡタグ配列を含み、第２のＤＮＡタグ配列の５’側のいかなるＤＮＡ配列もヒトテロメアＤＮＡと相同な核酸配列を含まず、第２のＤＮＡタグ配列が第２のマーカーを含む、構築物。
【請求項７】
第２のマーカーが第２の真核生物選択マーカーである、請求項６記載の核酸構築物。
【請求項８】
多重反復配列が（ＴＴＡＧＧＧ）ｎである、請求項６または請求項７記載の核酸構築物。
【請求項９】
第２のＤＮＡタグ配列が細菌複製起点および第２の原核生物選択マーカーをさらに含む、請求項６〜８のいずれか一項に記載の核酸構築物。
【請求項１０】
第２の原核生物選択マーカーが第２のマーカーの３’側に位置し、構築物が第２の原核生物選択マーカーの５’側に位置する第２のエンドヌクレアーゼ認識部位を含む、請求項９記載の核酸構築物。
【請求項１１】
テロメア多重反復配列が第３の固有のエンドヌクレアーゼ認識部位を含む、請求項１０記載の核酸構築物。
【請求項１２】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の核酸構築物を含む宿主細胞。
【請求項１３】
請求項６〜１１のいずれか一項に記載の核酸構築物を含む宿主細胞。
【請求項１４】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の核酸構築物、および請求項６〜１１のいずれか一項に記載の核酸構築物を含む宿主細胞。
【請求項１５】
１つまたは複数のテロメアに組み込まれた１つまたは複数の第１のＤＮＡタグ配列を含む宿主細胞。
【請求項１６】
１つまたは複数の染色体のサブテロメア位置に組み込まれた１つまたは複数の第２のＤＮＡタグ配列を含む宿主細胞。
【請求項１７】
１つまたは複数のテロメアに組み込まれた１つまたは複数の第１のＤＮＡタグ配列、および１つまたは複数の染色体のサブテロメア位置に組み込まれた１つまたは複数の第２のＤＮＡタグ配列を含む宿主細胞。
【請求項１８】
テロメア選択的延長（ＡＬＴ）活性を有する、請求項１２〜１７のいずれか一項に記載の宿主細胞。
【請求項１９】
真核細胞におけるＡＬＴに関するアッセイ法であって、
（ａ）第１のＤＮＡタグ配列を含む請求項１〜５のいずれか一項に記載の核酸構築物を細胞に導入する段階；
（ｂ）１つまたは複数のテロメアに第１のＤＮＡタグ配列が組み込まれた細胞を選択する段階；
（ｃ）（ｂ）による細胞に分裂を行わせる段階；および
（ｄ）別のテロメアにおける第１のＤＮＡタグ配列の存在を判定する段階、
を含む方法。
【請求項２０】
第１のＤＮＡタグ配列が第１の真核生物選択マーカーを含み、段階（ｂ）が、第１の選択マーカーを含む細胞に選択的増殖上の利点を与える条件下で、細胞をインキュベートすることを含む、請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
細胞がヒトもしくは動物由来の腫瘍細胞または不死化細胞系の細胞である、請求項１９または請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
段階（ｄ）が、第１のＤＮＡタグ配列に対して特異的なプローブを用いる蛍光インサイチューハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）を含む、請求項１９〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
段階（ｄ）が、第１のＤＮＡタグ配列に対して特異的なプローブを用いる、細胞由来のゲノムＤＮＡに対するサザンブロット法、または第１のＤＮＡタグ配列に対して特異的なプライマーーを用いるＰＣＲ増幅を含む、請求項１９〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
段階（ａ）が、第２のＤＮＡタグ配列を含む請求項６〜１１のいずれか一項に記載の核酸構築物を細胞に導入することをさらに含み、段階（ｂ）が、１つまたは複数のテロメアに第２のＤＮＡタグ配列が組み込まれた細胞を選択することをさらに含み、段階（ｄ）が、別のテロメアにおける第２のＤＮＡタグ配列の存在を検出することをさらに含む、請求項１９〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
第２のＤＮＡタグ配列が第２の真核生物選択マーカーを含み、および段階（ｂ）が、第２の選択マーカーを含む細胞に対して選択的な増殖上の利点を与える条件下で細胞をインキュベートすることを含む、請求項２４記載の方法。
【請求項２６】
細胞におけるＡＬＴ活性に対する影響に関して化合物をスクリーニングするためのアッセイ法であって、
（ａ）ＡＬＴ活性を有し、マーカーを含む第１のＤＮＡタグ配列を含む細胞であって、第１のＤＮＡタグ配列が細胞の１つまたは複数のテロメアに組み込まれている細胞を提供する段階；
（ｂ）細胞を被験化合物と接触させる段階；
（ｃ）細胞に分裂を行わせる段階；および
（ｄ）細胞の子孫において、別のテロメアにおける第１のＤＮＡタグ配列のテロメア取り込みの割合または発生率に、非処理細胞と比べて任意の変化があるか否かを判定する段階、
を含む方法。
【請求項２７】
細胞におけるＡＬＴ活性に対する影響に関して化合物をスクリーニングするためのアッセイ法であって、
（ａ）ＡＬＴ活性を有し、（ｉ）細胞の第１の染色体のテロメアに組み込まれた、第１のマーカーを含む第１のＤＮＡタグ配列；および（ｉｉ）該細胞の第２の染色体のサブテロメア位置に組み込まれた、第２のマーカーを含む第２のＤＮＡタグ配列、を含む細胞を提供する段階；
（ｂ）細胞を被験化合物と接触させる段階；
（ｃ）細胞に分裂を行わせる段階；ならびに
（ｄ）細胞の子孫において、第２のＤＮＡタグ配列を含むテロメア内に第１のＤＮＡタグ配列がコピーされる割合または発生率に、非処理細胞と比べて任意の変化があるか否かを判定する段階、
を含む方法。
【請求項２８】
ＡＬＴ活性を有する細胞が、第３のマーカーを含む第３のＤＮＡタグ配列が中間部位に組み込まれた染色体を含む、請求項２７記載の方法。
【請求項２９】
段階（ｄ）が、第１のＤＮＡ配列タグおよび第２のＤＮＡ配列タグの両方を含む染色体の存在をＰＣＲ増幅によって判定することを含む、請求項２７または請求項２８記載の方法。
【請求項３０】
第１のＤＮＡタグ配列が請求項５に規定されたものであり、第２のＤＮＡタグ配列が請求項１０に規定されたものであって、段階（ｄ）が、
（ｉ）細胞から核酸を回収する段階；
（ｉｉ）回収した核酸を、第１および第２のＤＮＡタグ配列の両方における第１および第２のエンドヌクレアーゼ認識部位を切断する、１つまたは複数のエンドヌクレアーゼと接触させる段階；
（ｉｉｉ）段階（ｉｉ）による核酸を、核酸の分子内連結を触媒する酵素と接触させる段階；
（ｉｖ）段階（ｉｉｉ）による核酸を１つまたは複数の細菌細胞に導入する段階；ならびに
（ｖ）第１の原核生物選択マーカーおよび第２の原核生物選択マーカーを含む細菌細胞を選択する段階を含む、
請求項２７記載の方法。
【請求項３１】
ＡＬＴ活性を有する細胞が、第３の原核生物選択マーカーを含み、エンドヌクレアーゼ認識部位に隣接する、中間部位に組み込まれた第３のＤＮＡタグ配列を有する染色体を含み、段階（ｉｉ）が、回収した核酸を、第３のＤＮＡタグ配列に隣接するエンドヌクレアーゼ認識部位を切断する１つまたは複数のエンドヌクレアーゼと接触させることをさらに含み、段階（ｖ）が、第３の原核生物選択マーカーを含む細菌細胞を選択することをさらに含む、請求項３０記載の方法。
【請求項３２】
サブテロメア位置に組み込まれた第２のＤＮＡ配列タグの５’側に位置するテロメア配列が第３の固有のエンドヌクレアーゼ認識部位を含む、段階（ｂ）の前に、テロメア配列中の第３の固有のエンドヌクレアーゼ認識部位を切断する第３のエンドヌクレアーゼを細胞に導入する段階をさらに含む、請求項３０または請求項３１記載の方法。
【請求項３３】
抗癌化合物を同定するための、請求項２６〜３２のいずれか一項に記載の方法の使用。
【請求項３４】
遺伝子産物が真核細胞におけるＡＬＴ活性に影響を及ぼすか否かを判定するためのアッセイ法であって、
（ａ）ＡＬＴ活性を有し、細胞の１つまたは複数のテロメアに組み込まれた、マーカーを含む第１のＤＮＡタグ配列を含む細胞を提供する段階；
（ｂ）該細胞における遺伝子産物のレベルを変化させる段階；
（ｃ）細胞に分裂を行わせる段階；および
（ｄ）細胞の子孫において、別のテロメアでの第１のＤＮＡタグ配列へのテロメア取り込み割合または発生率に、対照細胞と比べて任意の変化があるか否かを判定する段階、
を含む方法。
【請求項３５】
遺伝子産物が真核細胞におけるＡＬＴ活性に影響を及ぼすか否かを判定するためのアッセイ法であって、
（ａ）ＡＬＴ活性を有し、（ｉ）細胞の第１の染色体のテロメア内に組み込まれた、第１のマーカーを含む第１のＤＮＡタグ配列；および（ｉｉ）該細胞の第２の染色体のサブテロメア位置に組み込まれた、第２のマーカーを含む第２のＤＮＡタグ配列、を含む細胞を提供する段階；
（ｂ）該細胞における遺伝子産物のレベルを変化させる段階；
（ｃ）細胞に分裂を行わせる段階；ならびに
（ｄ）細胞の子孫における別のテロメアでの第１のＤＮＡタグ配列のテロメア取り込みの割合または発生率に任意の変化があるか否かを判定する段階、
を含む方法。
【請求項３６】
ＡＬＴ活性を有する細胞が、中間部位に組み込まれた第３のマーカーを含む第３のＤＮＡタグ配列を含む染色体を含む、請求項３５記載の方法。
【請求項３７】
段階（ｄ）が、第１のＤＮＡ配列タグおよび第２のＤＮＡ配列タグの両方を含む染色体の存在をＰＣＲ増幅によって判定することを含む、請求項３５または請求項３６記載の方法。
【請求項３８】
第１のＤＮＡタグ配列が請求項５に規定されたものであり、第２のＤＮＡタグ配列が請求項１０に規定されたものであって、段階（ｄ）が、
（ｉ）細胞から核酸を回収する段階；
（ｉｉ）回収した核酸を、第１および第２のＤＮＡタグ配列の両方における第１および第２のエンドヌクレアーゼ認識部位を切断する、１つまたは複数のエンドヌクレアーゼと接触させる段階；
（ｉｉｉ）段階（ｉｉ）による核酸を、核酸の分子内連結を触媒する酵素と接触させる段階；
（ｉｖ）段階（ｉｉｉ）による核酸を１つまたは複数の細菌細胞に導入する段階；ならびに
（ｖ）第１の原核生物選択マーカーおよび第２の原核生物選択マーカーを含む細菌細胞を選択する段階を含む、
請求項３５記載の方法。
【請求項３９】
ＡＬＴ活性を有する細胞が、第３の原核生物選択マーカーを含む、エンドヌクレアーゼ認識部位に隣接する、中間部位に組み込まれた第３のＤＮＡタグ配列を含む染色体を含み、段階（ｉｉ）が、回収した核酸を、第３のＤＮＡタグ配列に隣接するエンドヌクレアーゼ認識部位を切断する１つまたは複数のエンドヌクレアーゼと接触させることをさらに含み、段階（ｖ）が、第３の原核生物選択マーカーを含む細菌細胞を選択することをさらに含む、請求項３８記載の方法。
【請求項４０】
サブテロメア位置に組み込まれた第２のＤＮＡ配列タグの５’側に位置するテロメア配列が第３の固有のエンドヌクレアーゼ認識部位を含む、段階（ｂ）の前に、テロメア配列中の第３の固有のエンドヌクレアーゼ認識部位を切断する第３のエンドヌクレアーゼを細胞に導入する段階をさらに含む、請求項３８または請求項３９記載の方法。
【請求項４１】
遺伝子産物のレベルが、細胞における遺伝子産物の発現を指示しうる核酸を細胞に導入すること、および遺伝子産物の発現を引き起こす条件下で細胞をインキュベートすることによって変化する、請求項３４〜４０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４２】
遺伝子産物をコードする核酸が細胞に対して異種性である、請求項４１記載の方法。
【請求項４３】
タグ標識テロメアを細胞に導入する方法であって、
（ａ）テロメアにタグ標識ＤＮＡ配列が組み込まれた染色体を含む請求項１５記載の宿主細胞をドナー細胞として提供する段階；および
（ｂ）テロメアにタグ標識ＤＮＡ配列が組み込まれた染色体を含むレシピエント細胞を形成させるために、染色体をレシピエント細胞に導入する段階、
を含む方法。
【請求項４４】
タグ標識テロメアを細胞に導入する方法であって、
（ａ）サブテロメア位置に組み込まれたタグ標識ＤＮＡ配列を有する染色体を含む請求項１６記載の宿主細胞を提供する段階；および
（ｂ）サブテロメア位置に組み込まれたタグ標識ＤＮＡ配列を有する染色体を含むレシピエント細胞を形成させるために、染色体をレシピエント細胞に導入する段階、
を含む方法。
【請求項４５】
染色体をマイクロセルを介した染色体導入によって導入する、請求項４３または４４記載の方法。
【請求項４６】
細胞内のテロメアの遠位部を除去する方法であって、
（ａ）請求項１０記載の核酸構築物を提供する段階；
（ｂ）細胞に核酸構築物をトランスフェクトする段階；
（ｃ）細胞の染色体のサブテロメア位置への核酸構築物の組込みが起こるように細胞をインキュベートする段階；および
（ｄ）第３のエンドヌクレアーゼ認識部位を切断するエンドヌクレアーゼを細胞に導入する段階、
を含む方法。
【請求項４７】
エンドヌクレアーゼがＨＯエンドヌクレアーゼである、請求項４６記載の方法。
【請求項４８】
真核細胞におけるＡＬＴ活性をアッセイするための方法における、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の核酸構築物の使用。
【請求項４９】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の核酸構築物を含む、および／または線状化された場合に含む、核酸ベクター。
【請求項５０】
請求項６〜１１のいずれか一項に記載の核酸構築物を含む、および／または線状化された場合に含む、核酸ベクター。
【請求項５１】
請求項４９記載の核酸ベクターを線状化することを含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の核酸構築物を作製する方法。
【請求項５２】
請求項５０記載の核酸ベクターを線状化することを含む、請求項６〜１１のいずれか一項に記載のベクターを作製する方法。
【請求項５３】
（ｉ）請求項４９記載の核酸ベクターおよび（ｉｉ）請求項５０記載の核酸ベクターを含むキット。
【請求項５４】
第３のマーカーを含む第３のＤＮＡタグ配列を有する核酸構築物を含む核酸ベクターをさらに含む、請求項５３記載のキット。
【請求項５５】
真核細胞におけるＡＬＴ活性をアッセイする方法における、請求項５３または請求項５４記載のキットの使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明は、構築物、およびテロメアの変化に関するアッセイ法におけるそれらの使用、ならびにテロメアの変化に及ぼす影響に関して作用物質をアッセイするための構築物および方法に関する。
【０００２】
発明の背景
テロメアは、真核生物の線状染色体の末端に位置する特殊化した構造物である。これらの構造物は非常に多様な真核生物の間で高度に保存されており、５’側から３’側の方向に染色体の末端に向かって伸びるＧリッチ鎖を有する単純な縦列反復配列からなる。テロメアは、末端を分解および他の染色体との末端間融合から防御することにより、染色体を安定化する役割を果たす。
【０００３】
線状染色体の複製の際に、従来のＤＮＡポリメラーゼは第二鎖合成のためのプライマーを必要とする。これは不連続的な岡崎フラグメントを生じる。ＲＮＡプライマーは分解されて内部ギャップは充填されるが、複製鎖の５’末端のギャップは充填されないため、複製が不完全となり、以後の複製のたびにテロメア長が徐々に短縮する。老化のテロメア仮説によれば、染色体末端からのテロメア配列のこの段階的な喪失は細胞の分裂時計としての役割を果たす。しかし、時計機構は複数存在する可能性がある。
【０００４】
単細胞生物および生殖系列細胞は、テロメラーゼとして知られる特殊化した逆転写酵素により、テロメア短縮の問題を克服した。これは最初にテトラヒメナ（Ｔｅｔｒａｈｙｍｅｎａ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）で同定された。テロメラーゼは、Ｇリッチ鎖の３’末端に反復配列を付加するテンプレートとなる、テロメアＤＮＡに対して相補的なＲＮＡモチーフを有するリボ核タンパク質複合体である。テロメラーゼはヒト生殖系列細胞には存在するが、ほとんどの体細胞にはテロメラーゼはほとんどまたは全く検出されない。
【０００５】
しかし、ほとんどの正常な体細胞では、染色体の末端にあるＤＮＡ（テロメア）は、細胞分裂が起こるたびに短縮する。これは細胞が分裂しうる回数を限定するとともに、細胞の癌化に対する主要な障壁として作用すると思われる。癌細胞はテロメア維持機構を作動させることによってこの障壁を克服する（ＣｏｌｇｉｎおよびＲｅｄｄｅｌ、１９９９に総説がある）。ほとんどの場合、この機構には、失われたテロメラーゼ活性の代わりとなる新たなテロメアＤＮＡを合成するテロメラーゼという酵素が関与しており、これまでに検討されたほとんどの不死化ヒト細胞系および腫瘍にはテロメラーゼ活性がある。しかし、テロメラーゼ活性が検出されない不死化細胞系および腫瘍も数多くある。テロメラーゼ陰性の不死化細胞系のテロメア制限断片（ＴＲＦ）長の分析では通常、非常に短いものから非常に長いものに及ぶ極めて多様な長さが認められる。テロメラーゼ活性の非存在下でのテロメア長の維持は、テロメアの選択的延長（ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ ｌｅｎｇｔｈｅｎｉｎｇ ｏｆ ｔｅｌｏｍｅｒｅ）（ＡＬＴ）と呼ばれる。これまでに検討された不死化細胞系はすべて、テロメラーゼまたはＡＬＴ機構のいずれかによってテロメア長を維持している。
【０００６】
ＡＬＴ細胞はそのテロメアを維持するために（部分的）組換えおよびコピースイッチング（ｃｏｐｙ ｓｗｉｔｃｈｉｎｇ）を用いるという証拠がある。テロメラーゼ遺伝子に欠損のある酵母細胞は組換えを用いる。テロメラーゼ ＲＮＡ遺伝子を欠失した出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）およびクリュイベロミセス・ラクティス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ）細胞はある期間にわたり老化を呈するが、それを経た後の生存細胞はＲＡＤ−５２依存的な組換え過程によってテロメアを維持する。この状況では、テロメアの一部は野生型テロメアよりも長い。
【０００７】
ＡＬＴ機構を利用するヒト細胞の特徴には以下が含まれる：
（ａ）テロメラーゼ活性が存在しない（Ｂｒｙａｎら、１９９５）；
（ｂ）同一細胞に極めて短いテロメアと異常に長いテロメアが存在する（Ｂｒｙａｎら、１９９５）；
（ｃ）ＰＭＬタンパク質、テロメアＤＮＡ、テロメア結合タンパク質および他のタンパク質を含む核構造（Ｙｅａｇｅｒら、１９９９）。
【０００８】
細胞内のテロメアはすべて、本質的には同じＤＮＡ配列（脊椎動物では、ＴＴＡＧＧＧヘキサヌクレオチド反復配列の何百ものコピー）を含む。このため、本発明者らは（Ｒｅｄｄｅｌら、１９９７；Ｒｅｄｄｅｌ、２０００）、ＡＬＴ細胞内では１つのテロメアが別のテロメア内のテロメア配列の合成のためのテンプレートとして作用し（図１）、折り返し（ｌｏｏｐｉｎｇ ｂａｃｋ）過程によって自らに対しても同じ作用が働くものと提唱した。
【０００９】
ほとんどの癌細胞はテロメラーゼを用いており、テロメラーゼ阻害剤を新たな形態の癌治療法として開発することには幅広い関心が寄せられている。しかし、ＡＬＴ機構の存在は、（ａ）テロメラーゼに既に依存していない癌に対してテロメラーゼ阻害剤が有効な治療薬である可能性は低いこと、および（ｂ）テロメラーゼ阻害剤による治療は、ＡＬＴが作動した耐性癌細胞の出現を引き起こす可能性があることを意味する。したがって、テロメアを標的とする有効な癌治療法には、テロメラーゼ阻害剤およびＡＬＴ阻害剤の両方が必要である可能性が極めて高い。ＡＬＴ阻害剤を見いだすには、ＡＬＴ活性に関するアッセイ法が存在する必要がある。
【００１０】
発明の概要
テロメアの箇所での組換えを研究する上での障害の１つは、そのＤＮＡ配列が同一なことである。この問題を克服するために、本発明者らは、タグ標識がなされたテロメア配列を有するプラスミドを用いるアプローチを採用した。この新たなアプローチは、プラスミドの組込みによって生じる切断された染色体に対して新たなテロメアを供給する目的でプラスミドを用いている他の報告とは異なる。これに対して、本発明は、染色体の切断（ｔｒｕｎｃａｔｉｏｎ）を引き起こさずに任意のテロメアを標的化することができるプラスミド構築物を提供する。
【００１１】
したがって、本発明は、一般的な局面において、細胞におけるテロメアの選択的延長（ＡＬＴ）に関するアッセイ法に用いるための遺伝子構築物を提供する。
【００１２】
第１の局面において、本発明は、第１のＤＮＡタグ配列を相同組換えによってテロメアに組み込むことが可能な核酸構築物であって、（ｉ）タグ配列の３’側に位置する第１のＤＮＡ配列、および（ｉｉ）タグ配列の５’側に位置する第２のＤＮＡ配列と結合したＤＮＡタグ配列を含み、前記第１および第２のＤＮＡ配列がそれぞれヒトテロメアＤＮＡと相同な多重反復配列（ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｒｅｐｅａｔｓ）を含み、タグ配列が第１のマーカーを含む、構築物を提供する。
【００１３】
第１のマーカーは第１の真核生物選択マーカーであることが好ましく、多重反復配列は（ＴＴＡＧＧＧ）ｎであることが好ましい。
【００１４】
さらにもう１つの態様において、タグ配列はさらに、第１の原核生物選択マーカー、および選択的には、細菌複製起点を含む。構築物は、第１の原核生物選択マーカーの３’側に位置する第１のエンドヌクレアーゼ認識部位を含むことが好ましい。
【００１５】
本発明の第１の局面は、相同組込みによりテロメアに組み込むことが可能なプラスミドであって、（ａ）それぞれの腕部が多重反復配列を含む、ヒトテロメアＤＮＡと相同なＤＮＡ配列の２つの腕部；（ｂ）真核細胞における発現用に設計されたマーカーを含む、２つの腕部に隣接したＤＮＡタグを含む、プラスミドも提供する。
【００１６】
タグは、ＡＬＴ活性を有する細胞の子孫にテロメア的（テロメアの内部または末端）に取り込まれる。
【００１７】
マーカーは選択マーカーであることが好ましい。
【００１８】
多重反復配列は（ＴＴＡＧＧＧ）ｎであることが好ましい。
【００１９】
タグはさらに、細菌複製起点および細菌選択マーカーを含むことが好ましい。
【００２０】
１つの好ましい形態において、プラスミドは図３に規定するＴｅｌである。
【００２１】
第２の局面において、本発明は、第２のＤＮＡタグ配列を染色体内部のサブテロメア位置に組み込むことが可能な核酸構築物であって、（ｉ）第２のＤＮＡタグ配列の３’側に位置する、ヒトテロメアＤＮＡと相同な多重反復配列を含む第１のＤＮＡ配列、および選択的には（ｉｉ）タグ配列の５’側に位置する第３のＤＮＡ配列と結合した第２のＤＮＡタグ配列を含み、第２のＤＮＡタグ配列の５’側のいかなるＤＮＡ配列もヒトテロメアＤＮＡと相同な核酸配列を含まず、第２のＤＮＡタグ配列が第２のマーカーを含むような構築物を提供する。
【００２２】
第２のマーカーは第２の真核生物選択マーカーであることが好ましい。多重反復配列は（ＴＴＡＧＧＧ）ｎであることが好ましい。
【００２３】
さらにもう１つの態様において、第２のＤＮＡタグ配列はさらに、第２の原核生物選択マーカー、および選択的には、細菌複製起点を含む。構築物は、第２の原核生物選択マーカーの５’側に位置する第２のエンドヌクレアーゼ認識部位を含むことが好ましい。また、多重反復配列は、第３の固有のエンドヌクレアーゼ認識部位を含むことが好ましい。
【００２４】
本発明の第２の局面は、サブテロメア位置に組み込むことが可能なプラスミドであって、（ａ）ヒトテロメアＤＮＡと相同でない核酸配列を有するＤＮＡの第１の腕部、および真核細胞における発現用に設計されたマーカー；ならびに（ｂ）ヒトテロメアＤＮＡと相同な配列および多重反復配列を有する、第１のＤＮＡの腕部の３’側に位置する第２のＤＮＡの腕部を含むプラスミドも提供する。
【００２５】
マーカーは選択マーカーであることが好ましい。
【００２６】
多重反復配列は（ＴＴＡＧＧＧ）ｎであることが好ましい。
【００２７】
タグはさらに、細菌複製起点および細菌選択マーカーを含むことが好ましい。
【００２８】
第３の局面において、本発明は、本発明の第１の局面および／または第２の局面による核酸構築物を含む宿主細胞を提供する。
【００２９】
１つもしくは複数のテロメアに組み込まれた１つもしくは複数の第１のＤＮＡタグ配列、および／または１つもしくは複数の染色体のサブテロメア位置に組み込まれた１つもしくは複数の第２のＤＮＡタグ配列を含む宿主細胞も提供する。
【００３０】
宿主細胞は、テロメア選択的延長（ＡＬＴ）活性を有することが好ましい。
【００３１】
本発明の第３の局面は、ＡＬＴ活性を有し、本発明の第１または第２の局面によるプラスミドを含み、１つまたは複数のテロメアにテロメアタグが組み込まれた細胞も提供する。
【００３２】
第４の局面において、本発明は、真核細胞におけるＡＬＴに関するアッセイ法であって、
（ａ）第１のＤＮＡタグ配列を含む本発明の第１の局面による核酸構築物を細胞に導入する段階；
（ｂ）１つまたは複数のテロメアに第１のＤＮＡタグ配列が組み込まれた細胞を選択する段階；
（ｃ）（ｂ）による細胞に分裂を行わせる段階；および
（ｄ）別のテロメアにおける第１のＤＮＡタグ配列の存在を判定する段階、
を含む方法を提供する。
【００３３】
好ましくは、ＤＮＡタグ配列は第１の真核生物選択マーカーを含み、段階（ｂ）は、第１の選択マーカーを含む細胞に対して選択的な増殖上の利点を与える条件下で細胞をインキュベートすることを含む。
【００３４】
１つの態様において、段階（ａ）は、第２のＤＮＡタグ配列を含む本発明の第２の局面による核酸構築物を細胞に導入することをさらに含み、段階（ｂ）は、１つまたは複数のテロメアに第２のＤＮＡタグ配列が組み込まれた細胞を選択することをさらに含み、段階（ｄ）は、別のテロメアにおける第２のＤＮＡタグ配列の存在を検出することをさらに含む。
【００３５】
好ましくは、第２のＤＮＡタグ配列は第２の真核生物選択マーカーを含み、段階（ｂ）は、第２の選択マーカーを含む細胞に対して選択的な増殖上の利点を与える条件下で細胞をインキュベートすることを含む。
【００３６】
本発明の第４の局面は、真核細胞におけるＡＬＴに関するインビトロアッセイ法であって、
（ａ）本発明の第１の局面によるプラスミドによって標的細胞を処理する段階；
（ｂ）１つまたは複数のテロメアにプラスミドが組み込まれた、処理した細胞を選択する段階；
（ｃ）（ｂ）による細胞に分裂を行わせる段階；および
（ｄ）プラスミド由来のタグの別のテロメアへの取り込みを検出する段階、
を含むアッセイ法も提供する。
【００３７】
選択段階（ｂ）は、選択マーカーの存在を検出することによって行える。
【００３８】
検出段階（ｄ）は、タグＤＮＡに対するプローブを用いる蛍光インサイチューハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）によるものであってよい。しかし、他の検出方法も適している可能性があることは理解されると考えられる。
【００３９】
第５の局面において、本発明は、細胞におけるＡＬＴ活性に対する影響に関して化合物をスクリーニングするためのアッセイ法であって、
（ａ）ＡＬＴ活性を有し、マーカーを含む第１のＤＮＡタグ配列を含む細胞であって、ＤＮＡタグ配列が１つまたは複数のテロメアに組み込まれている細胞を提供する段階；
（ｂ）細胞を被験化合物と接触させる段階；
（ｃ）細胞に分裂を行わせる段階；および
（ｄ）細胞の子孫において、別のテロメアにおける第１のＤＮＡタグ配列のテロメア取り込みの割合または発生率に、非処理細胞と比べて変化があるか否かを判定する段階、
を含む方法を提供する。
【００４０】
本発明の第５の局面は、細胞におけるＡＬＴ活性に対する影響に関して化合物をスクリーニングするためのアッセイ法であって、
（ａ）本発明の第３の局面による、ＡＬＴ活性を有する細胞を提供する段階；
（ｂ）細胞を被験化合物で処理する段階；
（ｃ）細胞に分裂を行わせる段階；および
（ｄ）細胞の子孫における別のテロメアでのプラスミド由来のタグのテロメア取り込みの割合または発生率の変化を、非処理細胞の子孫と比べて検出する段階、
を含むアッセイ法も提供する。
【００４１】
テロメアタグの取り込みの割合または発生率の低下は、化合物によってＡＬＴ活性が阻害されることを示す。タグの取り込みの割合または発生率の上昇は、化合物によってＡＬＴ活性が亢進することを示す。テロメアタグの取り込みの割合または発生率に変化がないことは、化合物によるＡＬＴ活性への影響がないことを示す。
【００４２】
第６の局面において、本発明は、細胞におけるＡＬＴ活性に対する影響に関して化合物をスクリーニングするためのアッセイ法であって、
（ａ）ＡＬＴ活性を有し、（ｉ）前記細胞の第１の染色体のテロメアに組み込まれた、第１のマーカーを含む第１のＤＮＡタグ配列；および（ｉｉ）前記細胞の第２の染色体のサブテロメア位置に組み込まれた、第２のマーカーを含む第２のＤＮＡタグ配列、を含む細胞を提供する段階；
（ｂ）細胞を被験化合物と接触させる段階；
（ｃ）細胞に分裂を行わせる段階；ならびに
（ｄ）細胞の子孫において、第２のＤＮＡタグ配列を含むテロメア内に第１のＤＮＡタグ配列がコピーされる割合または発生率に、非処理細胞と比べて変化があるか否かを判定する段階、
を含む方法を提供する。
【００４３】
ＡＬＴ活性を有する細胞は、第３のマーカーを含む中間部位に組み込まれた第３のＤＮＡタグ配列を染色体を含むことが好ましい。
【００４４】
１つの態様において、段階（ｄ）は、第１のＤＮＡ配列タグおよび第２のＤＮＡ配列タグの両方を含む染色体の存在をＰＣＲ増幅によって判定することを含む。
【００４５】
１つの好ましい態様において、第１のＤＮＡタグ配列は、第１の原核生物選択マーカー、および第１の原核生物選択マーカーの３’側に位置する第１のエンドヌクレアーゼ認識部位を含む；第２のＤＮＡタグ配列は、第２の原核生物選択マーカー、および第２の原核生物選択マーカーの５’側に位置する第２のエンドヌクレアーゼ認識部位を含む；ならびに、段階（ｄ）は、
（ｉ）細胞から核酸を回収すること；
（ｉｉ）回収した核酸を、第１および第２のＤＮＡタグ配列の両方における第１および第２のエンドヌクレアーゼ認識部位を切断する、１つまたは複数のエンドヌクレアーゼと接触させること；
（ｉｉｉ）段階（ｉｉ）による核酸を、核酸の分子内連結を触媒する酵素と接触させること；
（ｉｖ）段階（ｉｉｉ）による核酸を１つまたは複数の細菌細胞に導入すること；ならびに
（ｖ）第１の原核生物選択マーカーおよび第２の原核生物選択マーカーを含む細菌細胞を選択すること、を含む。
【００４６】
より好ましくは、ＡＬＴ活性を有する細胞は、第３の原核生物選択マーカーを含む、エンドヌクレアーゼ認識部位に隣接する、中間部位に組み込まれた第３のＤＮＡタグ配列を有する染色体を含み、段階（ｉｉ）は、回収した核酸を、第３のＤＮＡタグ配列に隣接するエンドヌクレアーゼ認識部位を切断する１つまたは複数のエンドヌクレアーゼと接触させることをさらに含み、段階（ｖ）は、第３の原核生物選択マーカーを含む細菌細胞を選択することをさらに含む。
【００４７】
好ましくは、サブテロメア位置に組み込まれた第２のＤＮＡ配列タグの３’側に位置するテロメア配列は第３の固有のエンドヌクレアーゼ認識部位を含み、本方法は段階（ｂ）の前に、前記テロメア配列中の第３の固有のエンドヌクレアーゼ認識部位を切断する第３のエンドヌクレアーゼを細胞に導入する段階をさらに含む。
【００４８】
本発明の第６の局面は、細胞におけるＡＬＴ活性に対する影響に関して化合物をスクリーニングするためのアッセイ法であって、
（ａ）第１の染色体がそのテロメア内部にタグを有し、第２の染色体がサブテロメア位置にタグを有する、検出マーカーによるタグ標識がなされた２つの染色体を有する細胞を提供する段階；
（ｂ）細胞を被験化合物で処理する段階；
（ｃ）細胞に分裂を行わせる段階；および
（ｄ）サブテロメアタグを含むテロメア内にテロメアタグがコピーされた頻度をアッセイする段階、
を含むアッセイ法も提供する。
【００４９】
細胞は、内部アッセイ対照として作用する、中間部位にタグ標識がなされた染色体を含むことが好ましい。
【００５０】
本発明の第５および第６の局面によるアッセイ法は、新たな抗癌化合物のスクリーニングに特に適している。
【００５１】
第７の局面において、本発明は、遺伝子産物が真核細胞におけるＡＬＴ活性に影響を及ぼすか否かを判定するためのアッセイ法であって、
（ａ）ＡＬＴ活性を有し、前記細胞の１つまたは複数のテロメアに組み込まれた、マーカーを含む第１のＤＮＡタグ配列を含む細胞を提供する段階；
（ｂ）前記細胞における遺伝子産物のレベルを変化させ段階；
（ｃ）細胞に分裂を行わせる段階；および
（ｄ）細胞の子孫において、第２のＤＮＡタグ配列を含むテロメア内に第１のＤＮＡタグ配列がコピーされる割合または発生率に対照細胞と比べて変化があるか否かを判定する段階、
を含む方法を提供する。
【００５２】
もう１つの態様において、本発明の第７の局面は、遺伝子産物が真核細胞におけるＡＬＴ活性に影響を及ぼすか否かを判定するためのアッセイ法であって、
（ａ）ＡＬＴ活性を有し、（ｉ）前記細胞の第１の染色体のテロメア内に組み込まれた、第１のマーカーを含む第１のＤＮＡタグ配列；および（ｉｉ）前記細胞の第２の染色体のサブテロメア位置に組み込まれた、第２のマーカーを含む第２のＤＮＡタグ配列、を含む細胞を提供する段階；
（ｂ）前記細胞における遺伝子産物のレベルを変化させる段階；
（ｃ）細胞に分裂を行わせる段階；ならびに
（ｄ）細胞の子孫における別のテロメアでの第１のＤＮＡタグ配列のテロメア取り込みの割合または発生率に変化があるか否かを判定する段階、
を含む方法を提供する。
【００５３】
１つの態様において、遺伝子産物のレベルは、前記細胞における遺伝子産物の発現を指示しうる核酸を細胞に導入すること、および遺伝子産物の発現を引き起こす条件下で細胞をインキュベートすることによって変化する。
【００５４】
ＡＬＴ活性を有する細胞は、第３のマーカーを含む第３のＤＮＡタグ配列が中間部位に組み込まれた染色体を含むことが好ましい。
【００５５】
１つの態様において、段階（ｄ）は、第１のＤＮＡ配列タグおよび第２のＤＮＡ配列タグの両方を含む染色体の存在をＰＣＲ増幅によって判定することを含む。
【００５６】
１つの好ましい態様において、第１のＤＮＡタグ配列は、第１のマーカーの５’側に位置する第１の原核生物選択マーカー、および第１の原核生物選択マーカーの３’側に位置する第１のエンドヌクレアーゼ認識部位を含む；第２のＤＮＡタグ配列は、第２のマーカーの３’側に位置する第２の原核生物選択マーカー、および第２の原核生物選択マーカーの５’側に位置する第２のエンドヌクレアーゼ認識部位を含む；ならびに、段階（ｄ）は、
（ｉ）核酸を細胞から回収すること；
（ｉｉ）回収した核酸を、第１および第２のＤＮＡタグ配列の両方における第１および第２のエンドヌクレアーゼ認識部位を切断する、１つまたは複数のエンドヌクレアーゼと接触させること；
（ｉｉｉ）段階（ｉｉ）による核酸を、核酸の分子内連結を触媒する酵素と接触させること；
（ｉｖ）段階（ｉｉｉ）による核酸を１つまたは複数の細菌細胞に導入すること；ならびに
（ｖ）第１の原核生物選択マーカーおよび第２の原核生物選択マーカーを含む細胞を選択すること、を含む。
【００５７】
好ましくは、ＡＬＴ活性を有する細胞は、第３の原核生物選択マーカーを含む、エンドヌクレアーゼ認識部位に隣接する、中間部位に組み込まれた第３のＤＮＡタグ配列を有する染色体を含み、段階（ｉｉ）は、回収した核酸を、第３のＤＮＡタグ配列に隣接するエンドヌクレアーゼ認識部位を切断する１つまたは複数のエンドヌクレアーゼと接触させることをさらに含む；段階（ｖ）は、第３の原核生物選択マーカーを含む細胞を選択することをさらに含む。
【００５８】
さらにもう１つの好ましい態様において、サブテロメア位置に組み込まれた第２のＤＮＡ配列タグの３’側に位置するテロメア配列は第３の固有のエンドヌクレアーゼ認識部位を含み、本方法は段階（ｂ）の前に、前記テロメア配列中の第３の固有のエンドヌクレアーゼ認識部位を切断する第３のエンドヌクレアーゼを細胞に導入する段階をさらに含む。
【００５９】
本発明の第７の局面において、遺伝子産物をコードする核酸は細胞に対して異種性であってもよい。
【００６０】
本発明の第７の局面は、遺伝子および／またはその発現産物が真核細胞におけるＡＬＴ活性に影響を及ぼすか否かをスクリーニングするためのアッセイ法であって、
（ａ）関心対象の遺伝子を発現しうる細胞であって、さらにＡＬＴ活性を有し、１つまたは複数のテロメアに組み込まれた本発明の第１の局面によるプラスミドを有する細胞を提供する段階；
（ｂ）細胞に遺伝子を発現させる段階；
（ｃ）細胞に分裂を行わせる段階；および
（ｄ）細胞の子孫における別のテロメアでのプラスミド由来のタグの取り込みの割合または発生率の変化を、遺伝子をコードする核酸分子を発現していない細胞と比べて検出する段階、
を含むアッセイ法にもある。
【００６１】
細胞は関心対象の遺伝子を自然に含有または発現するものでもよく、遺伝子を含有または発現するように既知の技術によって改変または操作を受けたものでもよい。
【００６２】
タグの取り込みの割合または発生率の低下は、遺伝子または遺伝子産物によってＡＬＴ活性が阻害されることを示す。タグの取り込みの割合または発生率の上昇は、遺伝子または遺伝子産物によってＡＬＴ活性が亢進することを示す。タグの取り込みの割合または発生率に変化がないことは、遺伝子または遺伝子産物によるＡＬＴ活性への影響がないことを示す。
【００６３】
第８の局面において、本発明は、タグ標識テロメアを細胞に導入する方法であって、
（ａ）テロメアにタグ標識ＤＮＡ配列が組み込まれた染色体を含む、本発明の第３の局面による宿主細胞を提供する段階；および
（ｂ）テロメアにタグ標識ＤＮＡ配列が組み込まれた染色体を含むレシピエント細胞を形成させるために、染色体をレシピエント細胞に導入する段階、
を含む方法に関する。
【００６４】
もう１つの態様において、第８の局面は、タグ標識テロメアを細胞に導入する方法であって、
（ａ）サブテロメア位置にタグ標識ＤＮＡ配列が組み込まれた染色体を含む、本発明の第３の局面による宿主細胞を提供する段階；および
（ｂ）サブテロメア位置にタグ標識ＤＮＡ配列が組み込まれた染色体を含むレシピエント細胞を形成させるために、染色体をレシピエント細胞に導入する段階、
を含む方法に関する。
【００６５】
染色体は例えば、マイクロセルを介した染色体導入法によって導入しうる。
【００６６】
本発明の第８の局面は、タグ標識テロメアに細胞に導入する方法であって、
（ａ）本発明の第３の局面による細胞由来のプラスミドＤＮＡタグを含むヒト染色体を入手する段階；および
（ｂ）タグ標識染色体を有する細胞を形成させるために、染色体を細胞に導入する段階、
を含む方法にも関する。
【００６７】
染色体は、マイクロセルを介した染色体導入によって導入することが好ましい。しかし、細胞間の染色体導入に適した任意の手段が適すると考えられることは理解されると思われる。
【００６８】
染色体はテロメアまたはサブテロメアにタグ標識がなされたものでよい。作製された、サブテロメアにタグ標識がなされた染色体を有する細胞は、細胞がＡＬＴを有するか否かに関係なく、テロメア−テロメア組換えによるプラスミドの他のテロメアへの移動が生じないため、対照として有用である。
【００６９】
第９の局面において、本発明は、細胞内のテロメアの遠位部を除去する方法であって、
（ａ）テロメア多重反復配列の内部に第３の固有のエンドヌクレアーゼ認識部位を含む、本発明の第２の局面による核酸構築物を提供する段階；
（ｂ）細胞に核酸構築物をトランスフェクトする段階；
（ｃ）細胞の染色体のサブテロメア位置への核酸構築物の組込みが起こるように細胞をインキュベートする段階；および
（ｄ）第３のエンドヌクレアーゼ認識部位を切断するエンドヌクレアーゼを細胞に導入する段階、
を含む方法に関する。
【００７０】
本発明の第９の局面のもう１つの態様は、細胞内のテロメアの遠位部を除去する方法であって、
（ａ）エンドヌクレアーゼの認識部位をタグに隣接して挿入することにより、本発明の第１の局面によるプラスミドを改変する段階；
（ｂ）染色体内のサブテロメアのすぐ近傍にタグを有する改変細胞を形成させるために、細胞に線状改変プラスミドをトランスフェクトする段階；および
（ｃ）テロメアの遠位部が除去された細胞を形成させることを目的として、エンドヌクレアーゼ切断部位を含む染色体由来のテロメアを切断するために、エンドヌクレアーゼを有する細胞を処理する段階、
を含む方法を提供する。
【００７１】
エンドヌクレアーゼはＨＯエンドヌクレアーゼであることが好ましい。
【００７２】
第１０の局面において、本発明は、真核細胞におけるＡＬＴ活性に関するアッセイ法における、第１または第２の局面によるプラスミド／核酸構築物の使用に関する。
【００７３】
第１１の局面において、本発明は、本発明の第１または第２の局面による核酸構築物を含む、または線状化された場合に含む、核酸ベクターを提供する。ハニッシュ（Ｈａｎｉｓｈ）ら、１９９４に記載されたｐＳＸｎｅｏ−１．６Ｔ２ＡＧ３は、特別に除外することが好ましい。
【００７４】
第１２の局面において、本発明は、第１または本発明の第２の局面の核酸構築物を作製する方法であって、本発明の第１１の局面の核酸ベクターを線状化することを含む方法を提供する。ハニッシュ（Ｈａｎｉｓｈ）ら、１９９４に記載されたｐＳＸｎｅｏ−１．６Ｔ２ＡＧ３は、特別に除外することが好ましい。
【００７５】
第１３の局面において、本発明は、本発明の第１または第２の局面の核酸構築物を含む、および／または線状化された場合に含む、核酸ベクターを含むキットを提供する。本キットは、真核細胞におけるＡＬＴ活性に関するアッセイ法に用いうる。
【００７６】
本明細書の全体を通じて、文脈で別のものを要求しない限り、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という用語、または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」もしくは「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの変形物は、言及した要素または整数または要素もしくは整数の群を含むものの、他の要素または整数または要素もしくは整数の群を除外しないことを意味するものと理解される。
【００７７】
本明細書における先行技術の文献に関するいかなる説明も、それらの文献がオーストラリアにおける関連技術に関する共通の一般的な知識の一部をなすことを認めたものではない。
【００７８】
発明の詳細な説明
別に定義する場合を除き、本明細書で用いるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する当業者（例えば、細胞培養、分子遺伝学、核酸化学、ハイブリダイゼーション法および生化学）が一般に理解しているものと同じ意味を持つ。標準的な技術を、分子遺伝生化学の方法（概論については、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、「分子クローニング：実験マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」、第２版（１９８９）、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．、ならびにアウスユーベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）ら、「分子生物学における簡略プロトコール（Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）」（１９９９）、第４版、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、Ｉｎｃ．および完全版の「分子生物学における最新プロトコール（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）を参照されたい。これらは参照として本明細書に組み入れられる）および化学の方法に関しては用いる。
【００７９】
染色体およびその中に組み込まれた配列に関する５’および３’という言及は、以下の通りに解釈する必要がある。５’末端は動原体に近い方の末端である。３’末端はテロメア末端に近い方の末端である。
【００８０】
核酸構築物
本発明の核酸構築物は二本鎖ＤＮＡであることが一般的である。これらは、ヒトテロメア配列などのテロメア配列またはヒトテロメア配列と相同な配列の多重反復配列を含むため、真核染色体のテロメアまたはサブテロメアの位置に組み込まれる能力がある。一般に、テロメア多重反復配列は、核酸構築物を組み込ませようとする染色体と適合するように選択する。例えば、構築物をヒト染色体に組み込ませようとする場合に好ましいテロメア反復配列は、ヒトテロメア反復配列、すなわち動原体からテロメア末端に向かって５’側から３’側の向きに表記して（ＴＴＡＧＧＧ）ｎである。酵母細胞などの他の真核細胞では、他のタイプのテロメア反復配列が同定されている。
【００８１】
テロメア多重反復配列の数は、標的染色体と核酸構築物との間に相同組換えが起こる程度に十分に長い、標的染色体と相同な領域が得られるものである必要がある。例えば、多重反復配列は少なくとも５００塩基対、８００塩基対または１０００塩基対を含みうる。
【００８２】
核酸構築物は環状ＤＮＡ分子（例えば、プラスミド）でも線状ＤＮＡ分子でもよい。線状ＤＮＡ分子の方が組換え能力が高いため、核酸構築物は組込みの前には線状であることが好ましい。環状ＤＮＡ分子を例えば、以下に述べる制限エンドヌクレアーゼで切断することにより、真核細胞に導入する前に線状化してもよい。
【００８３】
本発明の核酸構築物は、さまざまな手段、一般にインサイチューハイブリダイゼーション、ポリメラーゼ連鎖反応および／またはサザンブロット法などのハイブリダイゼーションに基づく手順による検出を可能とするマーカーを含むＤＮＡタグ配列も含む。マーカーは、真核細胞における使用に適した抗生物質耐性遺伝子などの選択マーカーであることが典型的である。細胞を数世代にわたって増殖させる場合には、細胞を選択圧の下で増殖させると、タグ標識テロメアを有する細胞を細胞集団内で維持するのに役立つ。
【００８４】
本マーカーは、真核細胞における選択マーカーの発現を可能とするために必要な転写／翻訳制御配列を含むと考えられる。適した真核耐性遺伝子には、ネオマイシン、ピューロマイシンまたはハイグロマイシンに対する耐性をコードする遺伝子が含まれる。
【００８５】
本発明の第１の局面の核酸構築物は第１のＤＮＡタグ配列を含み、そのタグを真核染色体のテロメア内部に組み込むように設計される。このため、第１のＤＮＡタグ配列には、タグの３’側に位置する第１のＤＮＡ配列（組み込まれると染色体のテロメア末端に近い側に位置すると考えられる）、およびタグの５’側に位置する第２のＤＮＡ配列（組み込まれるとタグのもう一方の側、すなわち染色体の動原体に向かって位置すると考えられる）というテロメア反復配列の２つの腕部が隣接する。
【００８６】
本発明の第２の局面の核酸構築物は第２のＤＮＡタグ配列を含み、そのタグを真核染色体の内部のサブテロメア位置に組み込むように設計される。このことは、組み込まれた時点で第２のＤＮＡタグ配列と動原体との間にテロメア反復配列は本質的には存在しないはずであり、唯一のテロメア反復配列は第２のＤＮＡタグ配列の３’側に染色体の末端に向かって位置するはずであることを意味する。このため、第２のＤＮＡタグ配列は、タグの３’側に位置し、テロメア多重反復配列を含む第１のＤＮＡ配列（組み込まれた時点で染色体のテロメア末端の側に位置すると考えられる）、および選択的には、タグ配列の５’側のＤＮＡ配列がいずれもテロメア反復配列を含まないように、タグの５’側に位置する第３のＤＮＡ配列と結合させる。
【００８７】
本発明の第２の局面の核酸構築物は一般に、染色体に組み込まれた場合に切断を引き起こす。しかし、第３のＤＮＡ配列を、標的染色体のサブテロメア領域に存在する配列と相同な配列を含むように選択してもよい。これにより、切断が起こる確率が低くなると思われる。
【００８８】
第２のＤＮＡタグ配列は第２のマーカーを含む。一般に、第２のマーカーは、染色体のテロメアもしくはサブテロメア位置またはその両方にタグが組み込まれたか否かを判定するためにマーカーの検出（および／または適宜、マーカーの選択）を用いうるように、第１のマーカーと識別可能であると考えられる。例えば、第１のマーカーはネオマイシン耐性をコードする遺伝子などの第１の真核生物選択マーカーであってよく、第２のマーカーはハイグロマイシン耐性をコードする遺伝子などの第２の真核生物選択マーカーであってよい。
【００８９】
本発明の１つの態様において、ＤＮＡタグ配列は、真核生物選択マーカーのほかに、原核生物選択マーカー、および選択的には細菌複製起点を含む。これらにより、核酸構築物が原核細胞内で増殖することが可能となる。
【００９０】
本発明の１つの特定の態様において、第１および第２のＤＮＡ配列タグは、以下に述べるように、真核染色体が第１のタグおよび第２のタグの両方を含む場合に、ＤＮＡ配列タグの回収、染色体ＤＮＡからの分離および原核細胞における増殖が可能となるように、エンドヌクレアーゼ認識部位も含む。詳細には、第１のＤＮＡ配列タグは、第１のエンドヌクレアーゼ認識部位が第１の原核生物選択マーカー（テロメア内部に組み込まれる）の３’側に位置するように配置し、第２のＤＮＡ配列タグは、第２のエンドヌクレアーゼ認識部位が第２の原核生物選択マーカー（サブテロメア位置に組み込まれる）の５’側に位置するように配置する。
【００９１】
エンドヌクレアーゼ認識部位は、第２の原核生物選択マーカーのテロメア末端と５’末端との間に他の等価な部位が存在しないように選択する必要がある。これは、適当なエンドヌクレアーゼを用いて真核染色体ＤＮＡから両方の原核生物選択マーカーを含む領域を切り出す場合に、原核生物選択マーカーの内部または間での切断を防ぐためである。エンドヌクレアーゼが染色体の他の部分または他の染色体を切断するか否かはそれほど重要でない。しかし、存在する唯一の部位がＤＮＡタグ配列内部の望ましい位置にあるという意味で固有のエンドヌクレアーゼ認識部位を用いることは有益と思われる。
【００９２】
染色体ＤＮＡに組み込まれた場合に適切な構成の一例を図５に示しており、エンドヌクレアーゼ認識部位は「Ｒ」として表している。ＡＬＴ染色体の両方のＲ部位で切断が生じると、アンピシリン耐性遺伝子およびテトラサイクリン耐性遺伝子の両方、ならびに選択的には細菌複製起点を含む断片が得られると考えられる。
【００９３】
この２つのエンドヌクレアーゼ認識部位は同じでも異なってもよい。エンドヌクレアーゼ認識部位の例には、制限エンドヌクレアーゼの認識部位が含まれる。ＩＩ型制限エンドヌクレアーゼは、「レアカッター」、例えば少なくとも８個の規定されたヌクレオチドを含むコグネート認識部位を有するものであることが好ましい。
【００９４】
ある種の態様においては、本発明の第２の局面の核酸構築物の多重反復配列中に第３のエンドヌクレアーゼ認識部位を含めることが望ましいと思われる。一般に、第３のエンドヌクレアーゼ認識部位は、第１および第２のエンドヌクレアーゼ認識部位を認識するエンドヌクレアーゼによっては切断されない。エンドヌクレアーゼ認識部位配列は細胞のゲノムに対して固的であるように、すなわち宿主細胞のゲノム中の別の箇所には存在しないように選択することが好ましい。第３のエンドヌクレアーゼ認識部位を切断するヌクレアーゼの好ましい一例はＨＯエンドヌクレアーゼである。
【００９５】
核酸ベクター
本発明の核酸構築物は、組換え核酸ベクターに組み入れることができる。ベクターを、適合性のある宿主細胞内で核酸を複製するために用いてもよい。適した宿主細胞には、大腸菌などの細菌、酵母、哺乳動物細胞系および他の真核細胞系が含まれる。一般に、ベクターは原核生物宿主内で複製しうるプラスミドベクターである。
【００９６】
本発明の核酸構築物を線状形態で用いるが、それが環状プラスミド中に存在する場合には、標的真核細胞に導入する前にエンドヌクレアーゼでプラスミドＤＮＡを線状化することが一般に望ましい。ある種の状況では、必要とされる最終的な構成は、プラスミドを線状化した後に初めて実現される。例えば、本発明の第１の局面による核酸構築物は、第１のＤＮＡタグ配列に隣接したテロメア反復配列を含む。しかし、このような構築物を、反復配列の両方のセットがタグ配列の同じ側に存在するプラスミド構築物から、多重反復配列の内部でプラスミドを切断することによって入手することもできる。すると、その結果得られる線状核酸構築物は正しい構成をとる。
【００９７】
したがって、本発明の核酸ベクターは、以上に定義した本発明の核酸構築物を含んでもよく、または適切な処理を加えた場合、例えば制限酵素による完全消化によって線状化した場合に、本発明の核酸構築物を生じうるものでもよい。
【００９８】
宿主細胞
適した宿主細胞は、酵母細胞もしくは哺乳動物細胞などの真核細胞でもよく、または細菌細胞などの原核細胞でもよい。本発明の核酸構築物を１つまたは複数の染色体に組み込まれた状態で含む真核細胞はＡＬＴ活性に関するアッセイ法に用いることが一般的であり、一方、原核細胞は構築物を後に用いる目的で増殖させるため、または１つの局面においては、真核細胞におけるＡＬＴ活性の測定の結果を定量化するために用いられる。
【００９９】
真核宿主細胞はＡＬＴ活性を有することが好ましい。ヒト細胞も好ましい。
【０１００】
宿主細胞には、哺乳動物細胞系、および癌が疑われる細胞などのように、ヒトまたは動物から採取した細胞が含まれる。
【０１０１】
本発明の核酸構築物は、当技術分野で知られた適した手段を用いて宿主細胞に導入しうる。真核細胞の場合には、適した技術には、陽イオン性試薬（例えばリン酸カルシウムおよびＤＥＡＥ−デキストラン）、およびリポフェクタント（ｌｉｐｏｆｅｃｔａｎｔ）（例えばリポフェクタム（ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍ）（商標）およびトランスフェクタム（ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｍ）（商標））を含むトランスフェクション用試薬を用いるトランスフェクションが含まれる。核酸構築物をトランスフェクション用試薬と混合して組成物とすることが一般的である。
【０１０２】
トランスフェクションの後には、本発明の核酸構築物を含まない細胞の増殖を選択的に阻害する、抗生物質などの薬剤の存在下で真核細胞を増殖させることが一般的である。これにより、細胞のみが抗生物質の存在下で増殖しうるのは本発明の核酸構築物を含む細胞のみであることから、うまくトランスフェクションが行われた細胞を選択することが可能となる。細胞に本発明の第２の局面による核酸構築物をトランスフェクトする場合には、第２のＤＮＡタグ配列がサブテロメア位置に組み込まれたことを確認するために、ＦＩＳＨまたはサザンブロット法などの技術によって第２のＤＮＡタグ配列の位置を確かめることが望ましい。
【０１０３】
トランスフェクションおよび選択の結果として、１つまたは複数の染色体に組み込まれた状態で第１のＤＮＡタグ配列および／または第２のＤＮＡタグ配列を含む真核宿主細胞を入手することができる。第１のタグはテロメア位置に組み込まれ、第２のタグはサブテロメア位置に組み込まれる（例えば、図４、５および６を参照）。いくつかの態様では、２つの第１のＤＮＡタグ配列がテロメアに組み込まれた染色体を含む宿主細胞を作製することが望ましいと思われる。これらの場合には、２つの第１のＤＮＡタグ配列は異なるマーカー配列を有する必要がある。
【０１０４】
１つの態様において、本発明の宿主細胞は、第１のタグを含む染色体、第２のタグを含む染色体および第３のタグを含む染色体を含み、第３のタグは染色体の中間位置に組み込まれている。第３のタグを含む染色体は、第１または第２のタグに対するものと同じ染色体でもよく、異なる染色体でもよい。好ましくは、第３のタグは第１および第２の真核／原核生物マーカーとはいずれも異なる第３の真核生物選択マーカー、原核生物選択マーカーを含み、第３の原核生物選択マーカーには、第３の原核生物選択マーカーを染色体ＤＮＡから回収して原核宿主細胞にクローニングすることを可能とする固有のエンドヌクレアーゼ認識部位が隣接している（図５）。第３のタグ配列は、以下に述べるある種の構成のＡＬＴ活性アッセイ法において対照として用いうる。
【０１０５】
タグ配列の存在は、例えば、ゲノムＤＮＡのインサイチューハイブリダイゼーションまたはＰＣＲ／サザンブロット法を用いて、タグ配列中にマーカーが存在することを検出することによって確認しうる。
【０１０６】
本発明の真核宿主細胞を、例えば以下に述べるように、ＡＬＴ活性に関するアッセイ法に用いることもできる。
【０１０７】
また、他の宿主細胞にタグ標識テロメアを導入するためにそれらを用いてもよい。本工程は一般に、標準的な方法を用いて、タグ標識テロメアを含む染色体を本発明のドナー宿主細胞からレシピエント細胞に導入することを含む。レシピエント細胞はテロメラーゼ活性を有することが好ましい。
【０１０８】
適した技術の一例は、個々の染色体または染色体の小規模な群が膜によって囲まれるような様式でドナー細胞を断片化し、続いてそれを「レシピエント」細胞系と融合させる、ミクロセルを介した染色体導入である。ヒトドナー宿主細胞およびマウスレシピエント細胞の場合、結果として生じる、マウス染色体に加えて１つまたは少数のヒト染色体を含むハイブリッド核は、進行性かつランダムにヒト染色体を失う。ＤＮＡタグ配列を含む染色体を保持している細胞は、真核生物の抗生物質耐性遺伝子などの選択マーカー配列に基づいて選択可能である。これらのレシピエント細胞をそれ自体で用いてもよく、またはそれらを、タグ標識を行った染色体を別のレシピエント細胞にさらに導入するための供給源として用いてもよい。例えば、マウス／ヒトハイブリッド細胞に存在するヒト染色体を、ミクロセルを介した染色体導入などの技術を用いて、ヒト細胞に導入することができる。マウス染色体のみを含むレシピエント細胞を除外するために、タグ標識を行ったヒト染色体に存在するマーカーの選択を利用してもよい。
【０１０９】
本発明の宿主細胞は、例えば、ＡＬＴリプレッサー遺伝子の候補の試験を行うため、候補遺伝子をＡＬＴの活性化に関して試験するため、および、ＡＬＴ阻害剤として作用する能力に関して化合物をスクリーニングするために用いることができる。適したアッセイ法については以下に述べる。
【０１１０】
ＡＬＴアッセイ法
本発明は、ヒト細胞を含む哺乳動物細胞などの真核細胞におけるテロメア選択的延長（ＡＬＴ）活性に関するアッセイ法を提供する。本アッセイ法の根本原理は、テロメア内部に組み込まれる本発明の第１の局面の核酸構築物を一般に用いる相同組換えにより、細胞の１つまたは複数のテロメアにマーカー配列を導入することである。続いて、核酸構築物が組み込まれた細胞に分裂を行わせる。細胞にＡＬＴ活性が存在すればテロメア間テンプレート現象（ｔｅｍｐｌａｔｉｎｇ）が起こって、マーカー配列が相同組換えによってタグ標識染色体から別の染色体にコピーされる可能性がある。この種の現象は、細胞におけるマーカー配列の存在、選択的にはその量を検出することによって計測可能である。マーカーは、さまざまな手段、一般にはインサイチューハイブリダイゼーション、ポリメラーゼ連鎖反応および／またはサザンブロット法などのハイブリダイゼーションに基づく手順によって検出しうる。さまざまな構成を用いることができ、そのさまざまなものを以下にさらに詳細に説明する。
【０１１１】
ＡＬＴアッセイ法＃１
真核生物選択マーカー遺伝子を含む（図２Ａ）非テロメアプラスミドＤＮＡ配列（「タグ」と称する）の両側に、テロメアＤＮＡ配列（すなわち、ヒトテロメアに認められるＴＴＡＧＧＧヘキサヌクレオチドの反復配列などのテロメア多重反復配列を含むＤＮＡ）の２つの腕部を含む本発明の第１の局面の核酸構築物を、例えばトランスフェクションによって細胞に導入する。本構築物は一般に、適したプラスミドの線状化によって作製される（このようなプラスミドの構築の一例は、以下の実施例の材料および方法の項に記載されている）。本構築物は、相同組換えを介してテロメアＤＮＡに組み込まれるように設計されている。
【０１１２】
構築物が組み込まれた細胞のコロニーを、選択マーカーを用いて選択する。続いて、コロニーを、１つまたは複数のテロメアに構築物が組み込まれたものを判定するために検討する。検討方法には、ＤＮＡタグ配列に対するプローブを用いる蛍光インサイチューハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）が含まれる。１つまたは複数のテロメア組込み体を含むコロニーをさらに培養し、別のテロメアにもタグが新たに存在しているか否かを判定するために再びＦＩＳＨによって検討する（図４、図面Ａ）。これがテロメラーゼ陽性細胞よりも高い頻度で起こっている場合には、その細胞にはＡＬＴ活性がある。例えば、テロメラーゼ陽性細胞の別のテロメアに認められるタグが実質的に皆無であれば、被験細胞に別のタグが存在すればＡＬＴ活性の指標になると考えられる。しかし、テロメラーゼ陽性細胞に別のタグが低レベルで存在する場合には、被験細胞をＡＬＴ陽性と判断するためには、その内部に背景レベルを上回る別のタグが存在する必要がある。
【０１１３】
対照として、細胞に対して、テロメアの直前に組み込まれるように設計された本発明の第２の局面による第２の核酸構築物をトランスフェクトしてもよい。この構築物は非テロメアＤＮＡタグ配列の３’側にテロメアＤＮＡを有する（図２Ｂ）。本構築物はランダムに組み込まれるため、染色体の損傷、遠位染色体配列の喪失、さらには新たなテロメアの播種（ｓｅｅｄｉｎｇ）を招く。最終的な結果として、ＤＮＡタグ配列が新たなテロメアの直前（動原体側）に生じる。ＡＬＴ活性を有する細胞の場合には、タグの近位側（動原体側）に相同組換えが可能なテロメア反復ＤＮＡが存在しないため、タグは本来の位置のみに保たれ、他のテロメアにはコピーされない（図４、図面Ｂ）。この第２の構築物の内部のマーカーは、第１の構築物に存在するものとは異なるマーカーであることが一般的である。
【０１１４】
ＡＬＴアッセイ法＃２
ＡＬＴアッセイ法＃１の記載のようにして得られる、テロメア内部に第１のＤＮＡタグ配列を含むヒト染色体を、マイクロセルを介した染色体導入の技術により、Ａ９などのテロメラーゼ陽性マウス細胞系に導入する。ヒト染色体は、ヒトまたはマウスのゲノム配列に対して特異的なプローブを用いることにより、マウス染色体と識別可能である。ヒト細胞系におけるＡＬＴ活性をアッセイするためには、同じくマイクロセルを介した染色体導入により、テロメアにタグ標識がなされた染色体をＡ９細胞からヒト細胞に移行させる。Ａ９細胞によって付与されたもの以外の染色体のテロメア内でタグを検出することができれば、その細胞系はＡＬＴ活性を有する。
【０１１５】
対照として、サブテロメア位置に第２のＤＮＡタグ配列を有するヒト染色体を含むＡ９細胞を染色体ドナーとして用いる。細胞系がＡＬＴ活性を有するか否かに関係なく、この第２のタグのテロメア−テロメア組換えによる他のテロメアへの移動は起こらない。
【０１１６】
ＡＬＴアッセイ法＃３
本アッセイ法の原理は、単一の細胞内の２つの染色体（１つはテロメア内部、もう１つはサブテロメア位置）をタグ標識し、テロメアタグがサブテロメアタグを含むテロメア内にコピーされる頻度をＡＬＴ活性の指標として役立てるというものである（図４および６）。選択的には、内部アッセイ対照として役立てるために、染色体の中間部位にタグ標識を行ってもよい。
【０１１７】
２つのタグは、それらが同じ染色体に存在する場合にのみゲノムＤＮＡのＰＣＲによって断片が増幅されるように、すなわち、第１のＤＮＡ配列タグおよび第２のＤＮＡ配列タグが同じ染色体に存在するとＰＣＲ産物の検出が可能となるように設計してもよい。その結果、適したプライマーを用いた子孫細胞からのゲノムＤＮＡのＰＣＲによって、ＡＬＴ活性が検出されるようになる。
【０１１８】
本アッセイ法の特定の態様において、第１のタグおよび第２のタグが同じ染色体に存在するか否かに関する測定は、真核細胞からゲノムＤＮＡを抽出し、特定のエンドヌクレアーゼを用いてゲノムＤＮＡを消化して、消化したＤＮＡを原核生物宿主にクローニングした上で、それに対して特定のマーカーに関する選択を行うことによって行われる。本態様において、第１および第２のＤＮＡタグ配列は異なる原核生物選択マーカーも含む。さらに、両方のタグを含む真核染色体を１つまたは複数の適切なエンドヌクレアーゼで消化すると両方の原核生物マーカーを含む断片が生成されるように、第１および第２のＤＮＡタグ配列の内部には制限エンドヌクレアーゼ認識部位が存在する。核酸構築物およびタグ標識がなされた染色体に必要な構成は、核酸構築物に関する上記の項で詳細に説明している。
【０１１９】
その断片を原核宿主細胞にサブクローニングすると、宿主細胞は両方の選択マーカーを有すると考えられ、それによって選択することができる。断片が細菌複製起点も含む場合には、それらを単に連結し（断片の末端間に適合性がある場合）、標準的な形質転換の手順を用いて原核細胞に導入した上で、選択培地上で増殖させることができる。または別の方法として、断片を原核ベクター中にクローニングした後に原核宿主細胞に導入してもよい。選択培地上で増殖するコロニーの数は、二重にタグ標識がなされた染色体を含む真核細胞の程度に関する指標となる。
【０１２０】
対照として、第３の原核生物選択マーカーを含み、同様の様式でマーカーを染色体ＤＮＡから回収して原核宿主にサブクローニングすることを可能とするエンドヌクレアーゼ認識部位に隣接した第３のタグを真核細胞に導入する。
【０１２１】
本アッセイ法の具体的な一例は以下の通りである：
（ｉ）サブテロメアタグ（タグ２）はｎｅｏＲ遺伝子およびβ−ラクタマーゼアンピシリン耐性遺伝子を含む；制限酵素で線状化すると、プラスミドＤＮＡの残りに対して遠位側に（ＴＴＡＧＧＧ）ｎ配列が存在する。選択的には、ＨＯエンドヌクレアーゼ（ヒトゲノム内部のいかなる部位も通常は切断しない）の認識部位を（ＴＴＡＧＧＧ）ｎ配列内部に挿入することにより、この構築物を改変する。ＡＬＴ細胞に線状化プラスミドをトランスフェクトした後に、ｎｅｏＲプローブを用いるＦＩＳＨによってＧ４１８耐性コロニーをスクリーニングする。単一のサブテロメアタグを含むと思われるコロニーを、タグが確かにサブテロメアのすぐ近傍に位置することを確認するために、サザンブロット法およびＤＮＡ配列決定によってさらに分析する。このような１つのクローンを以下の通りにさらに改変した。
【０１２２】
（ｉｉ）テロメアタグ（タグ１）はハイグロマイシン耐性（真核生物選択マーカー）およびテトラサイクリン耐性（原核生物マーカー）を含む；線状化すると、タグ配列の残りの部分（すなわち、非ＴＴＡＧＧＧ配列）に隣接して（ＴＴＡＧＧＧ）ｎ配列が存在する。このプラスミドを、（ｉ）の記載の通りに作製した細胞にトランスフェクトする。ハイグロマイシン耐性コロニーを、テロメアタグ（すなわち、テロメア位置にあるタグ１）のみを含むと思われるものを同定するためにＦＩＳＨによってスクリーニングし、これらに対してさらに確認のための分子的分析を行う。続いて１つのクローンを以下の通りに改変する。
【０１２３】
（ｉｉｉ）ピューロマイシン耐性遺伝子（真核生物選択マーカー）およびクロラムフェニコール耐性（原核生物マーカー）を含むもののテロメア配列は全く含まない構築物を細胞にトランスフェクトすることによって中間タグ（タグ３）を挿入し、続いてピューロマイシン耐性に関する選択を行う。ＨＯエンドヌクレアーゼ部位は特定されているが、Ｓｃｅｌなどに対する部位などの他の類似の部位も代わりになると考えられる。また、３つのタグを別の順序で細胞に導入することもできる。
【０１２４】
本プラスミドのそのほかの特徴は以下の通りである。第１に、ＡＬＴ活性によってタグ２がタグ１と細胞内で並置されることにより、２種の原核生物耐性マーカーを備えたプラスミドが回収可能となるように、プラスミドは制限部位Ｒの１つのコピー（タグ１および２）または２つのコピー（タグ３）を含む（図５）。同じ手順により、タグ３が内部アッセイ対照として回収されると考えられる。
【０１２５】
第２に、ＡＬＴ活性によってタグ２がタグ１と細胞内で並置されることによってＰＣＲ産物が検出可能となるように、それらはＰＣＲ増幅のために適した配列を含んでもよい。ＰＣＲ反応により、組み込まれたタグ３からの産物を内部アッセイ対照として検出することもできる。上記の通り、このシステムは原核生物マーカーを必要とせずに用いうる。
【０１２６】
（ｉｉ）の記載の通りにテロメアタグが細胞に挿入された時点から、それは他のテロメアにコピーされると考えられ、これにはサブテロメアタグを含むものも含まれうる。サブテロメアにタグ標識がなされた染色体がテロメア配列の内部に第３の固有のエンドヌクレアーゼ認識部位も含む場合は、アッセイ法を行う直前に、ＨＯエンドヌクレアーゼなどの組換えエンドヌクレアーゼで細胞を処理することにより、サブテロメアタグを有する染色体からテロメアタグを切り出すことが好ましい。組換えエンドヌクレアーゼを、高い効率でそれを核に貫通させうると考えられるヒト免疫不全ウイルスＴＡＴタンパク質由来のタンパク質形質導入ドメインを含むように改変してもよい（他のヌクレアーゼを用いてもよい；他のタンパク質形質導入ドメインを用いてもよい；または、タンパク質形質導入法の代わりに、誘導性プロモーターの制御下でエンドヌクレアーゼを発現させてもよい）。
【０１２７】
この後の時点で、テロメアタグのこの染色体へのコピーを、ゲノムＤＮＡの抽出、表記の制限酵素による消化（図５）、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼによる再連結、コンピテント大腸菌の形質転換、およびアンピシリン＋テトラサイクリンまたはクロラムフェニコールのみを含む寒天培地へのプレーティングを行うことによって測定しうると考えられる。ａｍｐ／ｔｅｔ平板培地上のコロニーの数は、両方の原核生物マーカーを有するプラスミドを回収しうる程度に十分にサブテロメアタグに近接してテロメアタグが導入された組換え現象の数と比例すると考えられる。クロラムフェニコール耐性コロニーは中間タグの回収によるものであり、これらのコロニーは、実施するすべてのアッセイ法においてアッセイ効率の内部対照になると考えられる。または、タグ１および２の並置を検出するためにＰＣＲを用いてもよい。
【０１２８】
ＡＬＴアッセイ法＃３の変法では、異なるマーカー配列を有する２つのテロメアタグ（すなわち、第１のＤＮＡタグ配列）を同一染色体に導入する。この２つのタグの別の染色体へのコピーは、上のＡＬＴアッセイ法＃３に記載したものと同じ技術、すなわち２つの異なる第１のタグが同じ染色体にある場合にのみＰＣＲ断片が生成されるプライマーを用いたＰＣＲを用いて、またはゲノムＤＮＡを回収して原核生物宿主にサブクローニングすることにより、検出することができる。
【０１２９】
ＡＬＴアッセイ法の用途
本発明によるＡＬＴ活性のアッセイ法は、例えば以下の目的に用いることができる。
ａ）不死化細胞がＡＬＴテロメア維持機構を用いているか否かの決定；
ｂ）遺伝子および／またはその発現産物がＡＬＴ活性を上昇または低下させるか否かの決定；
ｃ）化合物がＡＬＴ活性を阻害しうるか否かの決定（すなわち、抗癌薬などのＡＬＴ阻害剤に関するスクリーニング）。
【０１３０】
ＡＬＴ活性に影響を及ぼす化合物／遺伝子産物に関するアッセイ法
腫瘍細胞などの細胞におけるＡＬＴ活性を測定することに加えて、本発明の核酸構築物および宿主細胞を、ＡＬＴ活性に対する影響に関して化合物および遺伝子産物をスクリーニングするために用いることもできる。
【０１３１】
本質的には、これらのアッセイ法は、ＡＬＴ活性の測定を被験化合物または遺伝子産物の存在下および非存在下で行うことを除き、上記のものと同様の様式で行われる。
【０１３２】
１つまたは複数のテロメアに組み込まれた少なくとも第１のＤＮＡタグ配列を含む宿主細胞を用意する。続いて、細胞の１つの試料（対照）を培養し、第１のＤＮＡタグの他の染色体へのコピーの割合および／または程度を上記の通りに測定する。細胞のもう１つの試料も培養するが、これは候補化合物の存在下で行う。同じく、第１のＤＮＡタグの他の染色体へのコピーの割合および／または程度を測定する。続いて、化合物の存在下における結果を対照と比較する。上昇が得られれば化合物はＡＬＴ活性を亢進させると判断され、低下が得られれば化合物はＡＬＴ活性の阻害剤と判断される。
【０１３３】
１つの好ましい態様において、宿主細胞は、サブテロメア位置に組み込まれた少なくとも第２のＤＮＡタグ配列を含む。一般的には、第１のＤＮＡタグが第２のＤＮＡタグを含む染色体にコピーされるか否かによってＡＬＴ活性を測定する。これはＡＬＴアッセイ法＃３に記載した技術、すなわち並置されたタグに関するＰＣＲを用いて、または上記の通りにゲノムＤＮＡを抽出し、消化した上で原核生物ベクターにサブクローニングすることによって行える。
【０１３４】
候補化合物には、トポイソメラーゼ阻害剤、またはＡＬＴに関与する遺伝子の発現を低下させる改変オリゴヌクレオチドなどの化合物が含まれ、抗体作製物（例えば、モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体、一本鎖抗体、キメラ抗体ならびにＣＤＲグラフト抗体）も含まれうる。さらに、コンビナトリアルライブラリー、ペプチドおよびペプチド模倣物、規定された化学的実体、オリゴヌクレオチド、ならびに天然物ライブラリーを、ＡＬＴ活性の修飾物質としての作用に関してスクリーニングしてもよい。候補物質を例えば、反応毎に例えば１０種の物質のバッチとして初期スクリーニングに用い、阻害が認められたバッチの物質を個別に検査することもできる。
【０１３５】
候補化合物は一般に最終濃度が１〜１０００ｎｍｏｌ／ｍｌ、より好ましくは１〜１００ｎｍｏｌ／ｍｌとなるように添加する。抗体の場合には、用いる最終濃度は一般に１００〜５００μｇ／ｍｌ、より好ましくは２００〜３００μｇ／ｍｌである。
【０１３６】
上記のスクリーニング法を、ＡＬＴ活性に対する影響に関して遺伝子産物をスクリーニングするために用いてもよい。宿主細胞における遺伝子産物のレベルを変化させ（これは一般に、細胞内に存在する遺伝子産物の分子の実際の数ではなく、機能的な遺伝子産物のレベルを意味する）、ＡＬＴ活性に対する影響を判定する。例えば、遺伝子産物のレベルは、細胞における遺伝子産物の発現を指示しうる核酸を細胞に導入し、遺伝子産物の発現がもたらされる条件下で細胞をインキュベートすることによってと比較してしうる。核酸配列（ＤＮＡでもＲＮＡでもよい）は、トランスフェクションまたは直接注入などの標準的な技術を用いて宿主細胞に導入しうる。核酸配列は対照細胞および被験細胞の両方に存在してもよく、被験細胞のみに存在してもよい。核酸配列が対照細胞に存在する場合には、被験細胞における遺伝子産物の発現を誘導することができるように、コード配列を誘導性プロモーターと結合させるとよい。
【０１３７】
核酸配列は細胞に対して異種性でもよい。「細胞に対して異種性である」という用語は、配列が正常な細胞ゲノムの部分ではないことを意味する。
【０１３８】
しかし、遺伝子産物のレベルを他の技術を用いて変化させてもよい。例えば、遺伝子産物（タンパク質など）を細胞内に直接注入してもよい。または、内因性遺伝子産物（例えば、アンチセンス構築物、干渉性ＲＮＡ、ドミナントネガティブ構築物、リボザイムまたは抗体）の発現レベルに影響を与える化合物／核酸を細胞に導入してもよい。
【０１３９】
関心対象の核酸配列は、例えば、特定の既知の配列でもよく、または配列ライブラリーから入手した未知の配列でもよい。このため、例えば、本発明のアッセイ法は、ＡＬＴ活性に対する影響に関して既知の遺伝子産物を試験するため、またはＡＬＴ活性に影響を及ぼす遺伝子産物に関して配列ライブラリーをスクリーニングするために用いうる。
【０１４０】
ＡＬＴ阻害剤の用途
ＡＬＴ阻害剤、例えば本発明のアッセイ法によって同定されたものなどは（テロメラーゼ阻害剤との併用で）、外科手術では治癒しない任意の癌の短期的および／もしくは長期的治療、または外科手術後に再発のリスクがある場合に用いうる可能性がある（すべての癌のうち５０％以上がこのカテゴリーに属する可能性がある）。また、ハイリスク個体における癌の予防のために配合型テロメア維持阻害剤を用いうる可能性もある。
【０１４１】
不死化細胞でテロメアの維持を阻害するとテロメア短縮が起こり、その後に増殖が停止する。これには集団倍加回数を要するため（この数はテロメア初期長に比例し、これは癌によってさまざまである）、テロメア維持阻害剤が腫瘍の減量（すなわち、初期治療）を目的として用いられる可能性は低く、他の形態の治療の後に残った少数の細胞からの腫瘍の再増殖を予防するため（すなわち、アジュバント療法）に用いられる可能性の方が高い。
【０１４２】
正常細胞はテロメア長維持機構に依存しないと思われる。このため、テロメア維持に対する阻害剤の正常細胞に対する毒性は極めてわずかであると考えられる。このため、これらは癌の再発予防を目的とする長期的治療に適すると思われ、さらに場合によっては、癌のリスクが高い個体の癌予防にも適すると思われる。
【０１４３】
本発明がさらによく理解されるように、以下に実施例および図面を参照しながら本発明を説明するが、これは例示に過ぎず、限定的ではない。
【０１４４】
実施例
材料および方法
Ｔｅｌプラスミドの構築
プラスミドｐＳＸｎｅｏ−１．６−Ｔ２ＡＧ３（Ｈａｎｉｓｈら、１９９４）（図３）をＫｐｎＩ制限酵素で部分的に消化し、その産物を０．８％トリス−酢酸／ＥＤＴＡ（ＴＡＥ）アガロースゲル上で電気泳動にかけた。線状化された５．２ｋｂバンドをゲルから切り出し、ブレサ−クリーン（Ｂｒｅｓａ−ｃｌｅａｎ）（Ｂｒｅｓａ−Ｔｅｃ）を用いて精製した。末端を１単位のクレノウ酵素（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）および５０μＭのｄＮＴＰｓを用いて平滑化した後にフェノールで抽出した。線状化および平滑化を行ったプラスミドを、５単位のＴ４リガーゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を用いてそれ自体と再連結させた。いずれかのＫｐｎＩ制限部位はこの方法を用いて破壊しうると考えられる。部位２が破壊されるようにした（図３参照）。これにより、部位１の箇所でＫｐｎＩによって線状化されるプラスミドをターゲティングベクターとして用い、テロメアに組み込ませることが可能になった。再連結したプラスミドを電気穿孔によって細胞に導入し、コロニーに対してミニプレップ処理を行った。このプラスミドを再びＫｐｎＩで切断した。部位１が破壊されたならば、その結果生じる産物は１．６ｋｂ（テロメア反復配列からなる）および３．６ｋｂのプラスミドと考えられる。部位２が破壊されたならば、その結果生じる産物は０．８ｋｂ（テロメア反復配列の１回分）および４．４ｋｂのプラスミドと考えられる。２つのクローンからは、部位２が破壊されたことを示す産物が得られた。これらにマキシプレップ処理を行い（Ｑｉａｇｅｎ）、トランスフェクションに用いた。この改変プラスミドをＴｅｌと新たに命名した。
【０１４５】
細胞
ＧＭ８４７ＤＭは、米国ベイラー医科大学（Ｂａｙｌｏｒ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、Ｈｏｕｓｔｏｎ、Ｔｅｘａｓ）のペレイラ−スミス（Ｐｅｒｅｉｒａ−Ｓｍｉｔｈ）博士から入手した、ＳＶ４０不死化ヒト皮膚線維芽細胞である（「二重変異体」、ウアバインおよび６−チオグアニンに耐性のある普遍的ハイブリッド形成用細胞）。
【０１４６】
線維肉腫細胞系ＨＴ１０８０はアメリカンタイプカルチャーコレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）から入手した。
【０１４７】
マウス線維肉腫細胞系Ａ９もアメリカンタイプカルチャーコレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）から入手した。
【０１４８】
細胞培養
すべての細胞系および結果として得られたハイブリッド細胞は、約１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を加えたダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で維持した。トランスフェクションを行ったＧＭ８４７ＤＭ細胞およびＨＴ１０８０細胞は、それぞれ３００μｇ／ｍｌおよび７００μｇ／ｍｌ Ｇ４１８中で維持した。細胞培養物はルーチン的に７５ｃｍ２フラスコ内で維持し、トリプシン処理を行うことによって１：８または１：１６の比で継代した。
【０１４９】
トランスフェクション
１×１０６個の細胞をトランスフェクション１８時間前に１０ｃｍ培養皿にプレーティングした。トランスフェクションのためには、ＫｐｎＩ（Ｔｅｌ）またはＮｏｔＩ（Ｓｕｂｔｅｌの作製用）のいずれかを用いて１０μｇのＴｅｌを線状化し、総容積８ｍｌの無血清ＤＭＥ培地中にある細胞に対して１００μｌのリポフェクタミン（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ）を添加した。トランスフェクションから５時間後に細胞に２０％ＦＢＳを加えた。トランスフェクションから２日後に細胞のトリプシン処理を行い、１×１０５個の細胞を選択のために播種した。１８時間後にＧ４１８を適切な濃度で添加した。２週間を経て対照細胞が死滅した時点で、トランスフェクション後に生じた個々の増殖巣を、プラスチック製クローニングシリンダーを用いるトリプシン処理によって回収し、継代を行ってクローン細胞系を得た。
【０１５０】
テロメア長の分析
ＤＮＡ抽出キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いて細胞からゲノムＤＮＡを抽出した。２０μｇのＤＮＡをＨｉｎｆＩおよびＲｓａＩ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）で消化し、フェノール／クロロホルムで１回抽出した後に、エタノール沈殿を行い、トリス−ＥＤＴＡ中に再懸濁した。消化したＤＮＡを蛍光定量法によって定量化し、１．０μｇを０．８％アガロースゲル（ＴＡＥ緩衝液中）による２Ｖｃｍ−１、１７時間の電気泳動にかけた。ゲルを４０℃で４０分間にわたって乾燥させ、０．５Ｍ ＮａＯＨおよび１．５Ｍ ＮａＣｌ中で３０〜６０分かけて変性させた上で、１Ｍ トリス−Ｃｌ、ｐＨ ８．０および１．５Ｍ ＮａＣｌ中で３０〜６０分にわたって中和した。続いてこのゲルを、［γ−３２Ｐ］ｄＡＴＰで５’末端標識を行ったテロメアオリゴヌクレオチドプローブ［γ−３２Ｐ−（ＴＴＡＧＧＧ）３］とハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーションおよび洗浄は以前の記載の通りに行った（Ｃｏｕｎｔｅｒら、１９９２）。コダック（Ｋｏｄａｋ）ＸＡＲ５ Ｘ線フィルムに対して−８０℃で１２〜２４時間かけて、ゲルのオートラジオグラフを作成した。
【０１５１】
サザン分析
約２０μｇのゲノムＤＮＡをＸｂａＩで１６時間かけて消化した。消化したＤＮＡを蛍光定量法によって定量化し、３．０μｇを０．８％アガロースゲル（ＴＡＥ緩衝液中）による３０Ｖ、１６時間の電気泳動にかけた。ゲルを１０ｐｇ／ｍｌの臭化エチジウムで染色し、０．２５Ｍ ＨＣｌ中で脱プリン処理を行い、０．５Ｍ ＮａＯＨおよび１．５Ｍ ＮａＣｌ中で３０分間かけて変性させ、１Ｍ トリス−Ｃｌ、ｐＨ ８．０および１．５Ｍ ＮａＣｌ中で３０分間にわたって中和した後に毛管作用によってハイボンドＮ＋（Ｈｙｂｏｎｄ Ｎ＋）（Ａｍｅｒｓｈａｍ）膜（０．４Ｍ ＮａＯＨ中）に転写させた。この膜を、５倍デンハルト液（５０倍は、５ｇ Ｆｉｃｏｌｌ、５ｇポリビニルピロリドン、５ｇウシ血清アルブミン、Ｈ２Ｏで５０ｍｌにする）、６×ＳＳＣ（クエン酸ナトリウム、ＮａＣｌ）、０．５％ＳＤＳおよび５０ｐｇ／ｍｌ変性ニシン精子ＤＮＡからなる溶液中で、ギガ−プライムキット（Ｇｉｇａ−ｐｒｉｍｅ ｋｉｔ）（Ｂｒｅｓａｔｅｃ）を６５℃で１６時間用いてランダムプライミングを行った［γ−３２Ｐ］ｄＣＴＰ−ｐＳＸｎｅｏとハイブリダイズさせた。膜を６５℃の２×ＳＳＣ／０．５％ＳＤＳで１０分間×２回、６５℃の１×ＳＳＣ／０．５％ＳＤＳで１０分間×１回洗浄した後に、コダックＸＡＲ−５またはＭＳ Ｘ線フィルムに対して−８０℃で３日間かけてオートラジオグラフを作成した。
【０１５２】
ＤＮＡのＢａｌ−３１分析
ゲノムＤＮＡ（１００μｇ）を、６００ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭ トリス−ＨＣｌ、ｐＨ ８．０、１２ｍＭ ＣａＣｌ２、１２ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ ＥＤＴＡ（総容積１ｍｌ）中にて、エキソヌクレアーゼＢａ１−３１（１０単位；Ｇｅｎｅｓｅａｒｃｈ）とともに３０℃でインキュベートした。アリコート（１００μｌ）を０時間、０．２５時間、０．５時間、１時間および２時間の時点で採取し、反応を停止させるためにＥＤＴＡ（４０ｍＭ）を添加した。ＤＮＡのエタノール沈殿を行い、続いてＨｉｎｆＩ／ＲｓａＩまたはＳｃａＩで消化して、上記の通りにＴＲＦ分析またはサザン分析を行った。
【０１５３】
蛍光インサイチューハイブリダイゼーション
標準的な細胞遺伝学的方法により、指数的に増殖している線維芽細胞に関する中期染色体を得た。
【０１５４】
ビオチン−ニックトランスレーション混合物（Ｂｉｏｔｉｎ−Ｎｉｃｋ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ Ｍｉｘ）（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を製造者の指示に従って用いて、プラスミドｐＳＸｎｅｏをｂｉｏ−１６−ｄＵＴＰで標識した。
【０１５５】
染色体調製物には、ＲＮアーゼＡ処理（２００μｇ／ｍｌ ２×ＳＳＣ；Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を３７℃で６０分間にわたって行い、２×ＳＳＣ中ですすぎ洗いし、１０ｍＭ ＨＣｌ（ｐＨ ２． ０）で短時間平衡化した上でペプシン（０． ０１％／１０ｍＭ ＨＣｌ；Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）によって３７℃で１０分間消化し、続いてＰＢＳ（Ｍｇ２＋、Ｃａ２＋）で３回洗浄して、室温の１％ホルムアルデヒドによる後固定を行った。
【０１５６】
約３０ｎｇ／μｌのｐＳＸｎｅｏプローブを、個別に変性させた染色体調製物に対して、３７℃の加湿槽中で１６〜１８時間かけてハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーション後に短時間の洗浄を４２℃の５０％ホルムアミド／２×ＳＳＣおよび室温の２×ＳＳＣ中で２回行い、スライドガラスを室温の下でＢＳＡ（５％／４×ＳＳＣ／０．２％Ｔｗｅｅｎ２０、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）中で１０〜３０分かけてブロックした。
【０１５７】
フルオレセイン結合アビジンＤＣＳ（５μｇ／ｍｌ、４×ＳＳＣ／０．２％Ｔｗｅｅｎ２０；Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）またはオレゴングリーン５１９結合ニュートラライト（Ｏｒｅｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ ５１９−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ＮｅｕｔｒａＬｉｔｅ）アビジン（５μｇ／ｍｌ、４×ＳＳＣ／０．２％Ｔｗｅｅｎ２０；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）の後に、ビオチン化抗アビジン抗体（５μｇ／ｍｌ、４×ＳＳＣ／０．２％Ｔｗｅｅｎ２０；Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）ならびに蛍光色素結合アビジンの第２層および第３層を用いるを２回の増幅工程により、ハイブリダイズしたｐＳＸｎｅｏプローブの検出を行った。
【０１５８】
染色体の同定のために、染色体をヨウ化プロピジウム（ＰＴ、最終濃度１２０ｎｇ／ｍｌ；Ｓｉｇｍａ）およびジアミジノ−フェニル−インドール−ジヒドロクロライド （ＤＡＰＩ、最終濃度０．６μｇ／ｍｌ；Ｓｉｇｍａ）で対比染色し、ＵＴＶおよび青色励起光用に適したフィルターのセットを備えたライカ（Ｌｅｉｃａ）ＤＭＬＢ落射蛍光顕微鏡でスライドガラスを評価した。
【０１５９】
各クローンに対して５０〜１００件の中期像を分析し、それぞれの染色体の両方の姉妹染色分体上に二重シグナルが検出される場合には陽性と評価した。
【０１６０】
冷却ＣＣＤ（ＳＰＯＴ２、Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）カメラを用いてＦＩＴＣ画像、ＰＩ画像およびＤＡＰＩ画像を別々に取り込み、ＳＰＯＴ２ソフトウエアを用いて統合した上で、アドビフォトショップ・バージョン５．５（Ａｄｏｂｅ Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ Ｖｅｒｓｉｏｎ ５．５）ソフトウエアを用いてさらに画像処理を行った。
【０１６１】
ミクロセルを介した染色体導入
ＧＭ８４７／Ｔｅｌ−１をドナーとし、Ａ９をレシピエントとして用いるミクロセルを介した染色体導入を行ってＣＭＣ３ｃ２ハイブリッド細胞系を得た上で、次にＣＭＣ３ｃ２をドナーとし、ＧＭ８４７細胞をレシピエントとした。簡潔に述べると、ドナー細胞を２０ｎｇ／ｍｌコルセミド（Ｓｉｇｍａ）中で４８時間にわたって組織培養フラスコ内で増殖させ、１０μｇ／ｍｌサイトカラシンＢ（Ｓｉｇｍａ）で処理してから、ベックマン（Ｂｅｃｋｍａｎ）Ｊ２−２１遠心管に入れてペレット化した。続いてこのペレットを一連のヌクレオポア（Ｎｕｃｌｅｏｐｏｒｅ）（商標）フィルター（Ｗｈａｔｍａｎ）に通過させることによって分画し、その結果得られた濾過液をレシピエント細胞の上から重ねた。レシピエント細胞を５０％ポリエチレングリコール１３００−１６００（Ｓｉｇｍａ）で処理し、洗浄した上で回復するまで置いた。２４時間後にレシピエント細胞を１０ｃｍ培養皿にプレーティングし、Ｇ４１８耐性に関して選択した。コロニーを単離し、陽性のマイクロセルハイブリッド細胞を判定するためにＦＩＳＨによって分析した。
【０１６２】
結果
Ｔｅｌプラスミドの構築
ＡＬＴの機構を調べるためにはターゲティングベクターが必要であった。ターゲティングベクターにＡＬＴ細胞のテロメアを標的とさせ、その後にそれが他のテロメアにコピーされた（これはテロメアの組換えが起こったことを示すと考えられる）か否かを調べるために、ＦＩＳＨを行う必要がある。ターゲティングベクターは、ネオマイシン耐性遺伝子の両端にテロメア反復配列が隣接したものを含む骨格からなる。図３に、部位１および２として示した２つのマルチクローニング部位を含むｐＳＸｎｅｏ−１．６Ｔ２ＡＧ３を示している。このベクターは、クローニング部位１によって隔てられて８００ｂｐのテロメア反復配列を２つ含む。いずれのクローニング部位も制限部位ＥｃｏＲＩ、ＳａｃＩおよびＫｐｎＩを含む。ｐＳＸｎｅｏ−１．６−Ｔ２ＡＧ３をターゲティングベクターとして用いるためには、骨格にテロメア配列が隣接したものが得られるように、それをクローニング部位１で線状化する必要がある。部位２にあるＫｐｎＩ制限部位を、上記の材料および方法の項に述べた通りに破壊してＴｅｌを作製した。続いて、このプラスミドをＫｐｎＩによって部位１のみで線状化し、ＡＬＴ細胞であるＧＭ８４７にトランスフェクトした。対照として、ＫｐｎＩで線状化したＴｅｌをＨＴ１０８０テロメラーゼ陽性細胞にもトランスフェクトした。さらにもう１つの対照として、ＴｅｌをＮｏｔＩで切断してＳｕｂｔｅｌを作製し、ＧＭ８４７およびＨＴ１０８０細胞にトランスフェクトした。このベクターはターゲティングベクターとしては作用しないものの、同じくテロメア近傍に組み込まれるはずである。組み込まれたＳｕｂｔｅｌプラスミドは、プラスミドの遠位にしかテロメア反復配列を含まないと考えられるため、他のテロメアにはコピーされないと考えられる。
【０１６３】
Ｇ４１８耐性コロニーを採取して増殖させた。各トランスフェクト体から以後の検討のために２つのクローンを選択した。Ｔｅｌトランスフェクト体からはＧＭ８４７／Ｔｅｌ−１、ＧＭ８４７／Ｔｅｌ−２、ＨＴ１０８０／Ｔｅｌ−１およびＨＴ１０８０／Ｔｅｌ−２、Ｓｕｂｔｅｌトランスフェクト体からはＧＭ８４７／Ｓｕｂｔｅｌ−１およびＧＭ８４７／Ｓｕｂｔｅｌ−２とした。ｐＳＸｎｅｏ（テロメア反復配列を欠く）をプローブとして用いるＦＩＳＨにより、これらのクローンを初期および後期の継代時点で分析した。
【０１６４】
蛍光インサイチューハイブリダイゼーション
プラスミドタグをＡＬＴ細胞のテロメア内部に配置することにより、テロメア間テンプレート現象をアッセイした（図６）。プラスミドＤＮＡタグがテロメア内部に位置していれば、タグの近位側（動原体側）で起こったテロメア間組換えにより、別のテロメアへのタグのコピーが生じるはずである（図６ａ）。これに対して、タグがテロメアＤＮＡのすぐ近位側にあれば、組換えはタグの遠位側でしか起こりえず、このためタグはコピーされないと考えられる（図６ｂ）。
【０１６５】
ＡＬＴ細胞（ＧＭ８４７）のテロメアに対してＴｅｌのターゲティングを行った（図６ａ）；テロメアの組込みを方法の項に記載した通りに評価した。Ｇ４１８で選択されたクローンＧＭ８４７／Ｔｅｌ−１およびＴｅｌ−２は、ＦＩＳＨにより検出したところ、集団倍加回数（ＰＤ）２３回の時点でそれぞれテロメアタグを３つおよび２つ含んでいた。ＰＤ６３までに細胞集団内のタグ標識テロメアの数はどちらのクローンも１０倍に増加した（図７および表１）；中期像当たりの検出可能なタグの最大数は５であった。これらのデータは、テロメア長がＡＬＴ細胞では動的であり、テロメア短縮に伴ってタグの一部が除去されるとともに、テロメア−テロメア組換えを介したテロメア延長により、それまでタグ標識がなされていなかったテロメアにもタグがコピーされることに合致する。
【０１６６】
テロメラーゼ陽性細胞系およびＡＬＴ細胞系のいずれにおいても染色体の切断および新たなテロメアの播種を引き起こすプラスミド（Ｓｕｂｔｅｌ；図６ｂ）を細胞にトランスフェクトすることにより、サブテロメアタグを得た。組換え／コピー切換えモデル（図６）によって予想される通り、ＧＭ８４７／Ｓｕｂｔｅｌクローンにおけるタグ標識テロメアの数はＰＤが増加しても大きくは変化しなかった。ＧＭ８４７／Ｓｕｂｔｅｌ−１では同じ２つのテロメアによるタグ標識がなされており、ＧＭ８４７／Ｓｕｂｔｅｌ−２では初期および後期のＰＤともに１つの染色体にタグ標識がなされていた（図７および表１）。一群のサブテロメアプローブを用いたいくつかのＧＭ８４７クローンのＦＩＳＨ分析ではサブテロメア転位現象は検出されず、このことから組換え現象が明確にテロメアにかかわることがさらに示された。この作用がＡＬＴに特異的か否かを検討するために、Ｔｅｌプラスミドをテロメラーゼ陽性線維肉腫ＨＴ１０８０細胞にトランスフェクトした。ＨＴ１０８０／Ｔｅｌ−１および／Ｔｅｌ２には、初期から後期のＰＤレベルにかけて、タグ標識テロメアの増加は認められなかった（図７および表１）。
【０１６７】
このＦＩＳＨデータは、組み込まれたプラスミドＤＮＡに対するサザン分析によって裏づけられた。すなわち、ＧＭ８４７／Ｔｅｌ−１およびＴｅｌ−２系には、初期から後期のＰＤレベルにかけてハイブリダイズするバンドの数の増加が認められた（図８）。これはクローンＧＭ８４７／Ｔｅｌ−２で最も顕著に認められ、ＰＤ６３細胞にはＰＤ２３には存在しないバンドが７本みられた。これに対して、ＧＭ８４７／Ｓｕｂｔｅｌ−１およびＳｕｂｔｅｌ−２系ならびにＨＴ１０８０／Ｔｅｌ−１およびＴｅｌ−２系が含むバンドははるかに少なく、バンドの数も変化しなかった（図８）。ＧＭ８４７／Ｔｅｌクローンに存在するバンドは、相対強度の点で初期から後期のＰＤにかけて異なっており、いくつかのテロメアからプラスミドタグが消失し、他のタグを含む細胞集団が集積したことが示唆された。
【０１６８】
単一のテロメアからのタグが他のテロメアにコピーされたことを明確に示すために、ＧＭ８４７／Ｔｅｌ−１細胞から得た単一のタグ標識染色体をミクロセルを介した染色体導入（ＭＭＣＴ）を用いてマウスＡ９細胞系に導入し、続いてＧ４１８選択を行って、ハイブリッド細胞系ＣＭＣ３ｃ２を得た（図９ａ）。プラスミドのコアとハイブリダイズする４本のバンドがサザン分析によって検出され、予想通りそれぞれの１つずつがＧＭ８４７／Ｔｅｌ−１細胞に存在するバンドと対応した（図８）。次に、タグ標識染色体をＭＭＣＴによってＣＭＣ３ｃ２からＧＭ８４７細胞に移行させた。ＰＤ２４の時点でタグはすでに複数のテロメアで検出された（図９ｂ）。
【０１６９】
これらのデータは、ＡＬＴ細胞ではテロメアＤＮＡが他のテロメアにコピーされることを初めて示したものである。この過程に関与するタンパク質を同定する必要があるが、それらは、テロメアの維持のみに関与するタンパク質ではなく、ＤＮＡの組換えおよび複製に関与するタンパク質である可能性が非常に高い。テロメア−テロメア間組換えは、テロメラーゼ陽性ＨＴ１０８０細胞系では検出されなかった。これは、ＨＴ１０８０細胞におけるテロメラーゼ阻害によってテロメア短縮および老化様状態が生じたことという所見と一致しており、これらの細胞がテロメラーゼ以外のテロメア維持機構を有していないことを示している。
【表１】ＧＭ８４７クローンおよびＨＴ１０８０クローンにおけるテロメアタグ標識染色体
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初期および後期のＰＤレベルは図７の説明に明記している。
【０１７０】
当業者は、幅広く説明してきた本発明の精神または範囲を逸脱することなく、具体的な態様に示されたように本発明に対してさまざまな変更および／または修正を加えうることを理解すると考えられる。したがって、本態様はすべての局面において例示的とみなされる必要があり、限定的とみなしてはならない。
【０１７１】
参照文献
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【図面の簡単な説明】
【図１】染色体間の組換えを介したテロメアの延長に関するモデル。
（ａ）極めて短くなった場合を含むさまざまな理由から、テロメアは細胞によって二本鎖切断（ＤＳＢ）と解釈されることがある。（ｂ）続いてＤＳＢ修復酵素が、短いテロメアの一本鎖３’末端のより長いテロメア鎖の間への侵入を媒介する。この段階はＲＡＤ５２に依存すると思われる。次にＤＮＡポリメラーゼが長い鎖をテンプレートとして用いて短い鎖を伸長させる。（ｃ）次に交差した鎖がヌクレアーゼによる切断を受け（→）、その後に連結されて組換えＤＮＡ分子が生じる（ｄ）。または、（ｂ）に示した構造が、新たに形成されたヘリックスの巻き戻しおよび巻き直しによって分解されて（ｃ）、非組換え分子が生じる（ｄ）。いずれの場合も、長いテロメアと短いテロメアの反復配列のねじれ型アニーリングにより、テロメアの正味の延長が生じる。（Ｒｅｄｄｅｌら、１９９７）による。
【図２】本発明によるＡＬＴアッセイ法＃１に用いたプラスミド。
（Ａ）相同組換えによってテロメアに組み込まれるように設計されたプラスミド。線状化されると、このプラスミドは、細菌複製起点、細菌選択マーカー、および真核細胞における発現用に設計した選択マーカー（斑状のバー；ネオマイシン耐性遺伝子を図示しているが、任意の適した真核生物マーカーを用いうる）を含む非ＴＴＡＧＧＧプラスミド「タグ」ＤＮＡ（白のバー）に隣接して、（ＴＴＡＧＧＧ）ｎ ＤＮＡ（黒のバー）の２つの腕部を有する。
（Ｂ）サブテロメア位置に組み込まれるように設計されたプラスミド。線状化されると、このプラスミドは、非ＴＴＡＧＧＧ性「タグ」ＤＮＡ（白のバー）の３’側に（ＴＴＡＧＧＧ）ｎ配列（黒のバー）を有する。
【図３】Ｔｅｌプラスミドの地図。ｐＳＸｎｅｏ−１．６Ｔ２ＡＧ３のＫｐｎＩ制限部位を部位２で破壊し、プラスミドをＫｐｎＩ（部位１）を用いて線状化できるようにした上で、ターゲティングベクターとして用いた。
【図４】本発明によるＡＬＴアッセイ法＃１。ＡＬＴには、相同組換えを介したテロメア延長および１つのテロメアの別のテロメアによるコピーが含まれる。細胞がＡＬＴ活性を有していれば、テロメア内部に配置されたＤＮＡ配列タグ（図面Ａ）が１つのテロメアから別のものへとコピーされると考えられるが、テロメアのすぐ近位側、すなわちサブテロメアに配置されたタグ（図面Ｂ）はコピーされないと考えられる。
【図５】本発明によるＡＬＴアッセイ法＃３。このアッセイ系では、２つまたは３つの染色体にプラスミドＤＮＡによるタグ標識を行い：タグ１は１つまたは複数のテロメアの内部にあり、タグ２はサブテロメアのすぐ近傍にあり、タグ３は中間部（任意の染色体の内部）に位置する（タグ３がタグ１または２と同じ染色体にあってもよい）。各タグは異なる原核生物マーカー―アンピシリン（ａｍｐ）、テトラサイクリン（ｔｅｔ）またはクロラムフェニコール（ＣＡＰ）耐性―および異なる真核生物マーカー―ネオマイシン（ｎｅｏ）、ハイグロマイシン（ｈｙｇｒｏ）またはピューロマイシン（ｐｕｒｏ）耐性を有する。ＡＬＴ活性があるとタグ１および２が同じテロメアに位置する可能性があり、この場合には、ゲノムＤＮＡを表記の制限部位（Ｒ）で切断した後に、再連結して環状化したＤＮＡによる細菌の形質転換を行うと、ａｍｐおよびｔｅｔの二重耐性がある細菌ならびにＧＡＰ耐性のあるもの（内部対照）が生じると考えられる。アッセイを開始する直前に、タグ１を含むテロメアをＨＯエンドヌクレアーゼで切断することにより、バックグラウンド値が低下すると考えられる。
【図６】テロメア間のＤＮＡコピーを検出するための戦略。ａ．組み込まれたテロメアターゲティングプラスミドＴｅｌの近位側でテロメア間組換えが起こると、プラスミドＤＮＡ「タグ」配列の別のテロメアへのコピーが生じると考えられる。ｂ．ＳｕｂｔｅｌプラスミドＤＮＡがテロメアＤＮＡのすぐ近位側に位置する場合には、テロメア間組換えが起こりうるのはプラスミドの遠位側のみでであり、タグは他の染色体にコピーされないと考えられる。
【図７】ＦＩＳＨによるテロメアでのプラスミドタグＤＮＡの検出。上図および中央図：テロメア用ターゲティングプラスミドＴｅｌをトランスフェクトしたＡＬＴ細胞系ＧＭ８４７のクローンであるＧＭ８４７／Ｔｅｌ−１（上）およびＧＭ８４７／Ｔｅｌ−２（中央）の中期の広がりの全体または一部。いずれのクローンもＰＤ２３（初期）およびＰＤ６３（後期）を示している。下図：ＧＭ８４７／Ｓｕｂｔｅｌ−１のＰＤ２４（初期）およびＰＤ６４（後期）；ＧＭ８４７／Ｓｕｂｔｅｌ−２のＰＤ２４（初期）およびＰＤ６４（後期）；ＨＴ１０８０／Ｔｅｌ−１のＰＤ２３（初期）およびＰＤ６３（後期）；ＨＴ１０８０／Ｔｅｌ−２のＰＤ２３（初期）およびＰＤ６３（後期）での中期の広がりの一部。タグ標識テロメアは表１に記載している。
【図８】ＧＭ８４７系およびＨＴ１０８０系のサザン分析。表記の集団倍加（ＰＤ）時点で細胞からゲノムＤＮＡを単離し、ＸｂａＩで消化して０．８％アガロースで電気泳動を行い、サザンブロット法を行った上で、ＴｅｌおよびＳｕｂｔｅｌのコアプラスミド配列を検出する放射標識α−３２Ｐ−ｐＳＸＮｅｏプローブとハイブリダイズさせた。ＣＭＣ３ｃ２は、ＧＭ８４７／Ｔｅｌ−１からマイクロセル化した単一のタグ標識ヒト染色体を含むマウスＡ９細胞系である。ＨｉｎｄＩＩＩで消化したλＤＮＡマーカーのサイズをｋｂ単位で示している。
【図９】Ａ．ＧＭ８４７／Ｔｅｌ−１由来のテロメアタグ標識ヒト染色体（矢印）を含むＣＭＣ３ｃ２マイクロセルハイブリッドドナーによる分裂中期像の一部。マウス染色体はビオチン化マウスＣｏｔ−１ ＤＮＡ（ＦＩＴＣ）とハイブリダイズさせている。Ｂ．ＣＭＣ３ｃ２から移行したタグ標識ドナー染色体（縦の矢印）、および新たにテロメアタグを獲得した染色体（横の矢印）を含むＧＭ８４７細胞による分裂中期像の一部。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
2004504862.tif 000070
2004504862.tif 000071