(57)【要約】血管移植片の処置方法であって、活性化プロテインＣ（ＡＰＣ）を増大する少なくとも１つの作用物質をコードする有効量の少なくとも１つの核酸を導入し、細胞中で作用物質を発現し、そして血管を処置するのに十分なＡＰＣを増大することを包含する方法が開示される。初期および／または後期移植片不全を阻止するために工学処理される血管移植片も提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
血管移植片の処置方法であって、以下の：
ａ）移植片中の活性化プロテインＣ（ＡＰＣ）を増大する少なくとも１つの作用物質をコードする有効量の少なくとも１つの核酸を移植片の感受性細胞中に導入し、
ｂ）前記細胞中で作用物質を発現し、そして
ｃ）移植片を処置するのに十分なＡＰＣを増大する
ことを包含する方法。
【請求項２】
前記方法の少なくとも過程ａ）がｅｘ ｖｉｖｏで実施される請求項１記載の方法。
【請求項３】
宿主中に処理移植片を移植することをさらに包含する請求項１記載の方法。
【請求項４】
前記方法の過程ａ）の前に、移植片が宿主中に移植される請求項１記載の方法。
【請求項５】
ｉｎ ｖｉｖｏで血管移植片に関して実施される請求項１記載の方法。
【請求項６】
移植された血管移植片が標準プロテインＣ検定により確定した場合に初期または後期移植片不全を予防または治療するのに十分なＡＰＣを有する請求項３記載の方法。
【請求項７】
標準アテローム硬化静脈移植片モデルにより確定した場合に移植片が加速性アテローム硬化症における少なくとも約１０％減を示す請求項６記載の方法。
【請求項８】
処置移植片のプロテインＣレベルが標準プロテインＣ検出検定により確定した場合に対照血管より少なくとも約１オーダー高い大きさである請求項６または７記載の方法。
【請求項９】
処置血管移植片のプロテインＣレベル増大が少なくとも約１週間検出可能である請求項６または７記載の方法。
【請求項１０】
処置血管移植片のプロテインＣレベル増大が少なくとも約１週間検出可能である請求項８記載の方法。
【請求項１１】
初期移植片不全が血栓症により成し遂げられる請求項６記載の方法。
【請求項１２】
後期移植片不全が新内膜過形成により成し遂げられる請求項６記載の方法。
【請求項１３】
少なくとも１つの作用物質がヒトトロンボモジュリン（ＴＭ）、ヒト内皮プロテインＣ受容体（ＥＰＣＲ）、ヒトＩκＢ因子またはそれらの機能性断片である請求項１記載の方法。
【請求項１４】
核酸がカセット中に挿入される請求項１記載の方法。
【請求項１５】
カセットがプロモーターを包含する請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
カセットがベクター中に挿入される請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
ベクターがアデノウイルス、レトロウイルスまたはアデノ随伴ウイルスからの配列を含む請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
ベクターが複製欠陥アデノウイルスである請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
核酸が少なくとも１つの他の抗凝固分子をコードする請求項１記載の方法。
【請求項２０】
抗凝固分子がヒトトロンボモジュリンまたはその機能性断片である請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
宿主が炎症性または免疫学的刺激に対して感受性である請求項３記載の方法であって、その刺激を治療または予防するために治療的量の少なくとも１つの抗凝固、抗血栓または血栓崩壊薬を投与することをさらに包含する方法。
【請求項２２】
薬剤が前記方法の過程ａ）前または過程ｃ）後に投与される請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
抗凝固薬がクマジンである請求項２２記載の方法。
【請求項２４】
不全を阻止する血管移植片の工学処理方法であって、以下の：
ａ）移植片中の活性化プロテインＣ（ＡＰＣ）を増大する少なくとも１つの作用物質をコードする有効量の少なくとも１つの核酸を移植片の感受性細胞中に導入し、
ｂ）前記細胞中で作用物質を発現し、そして
ｃ）移植片不全を阻止するのに十分な移植片中のＡＰＣを増大する
ことを包含する方法。
【請求項２５】
請求項２４記載の方法により生成される工学処理血管移植片。
【請求項２６】
移植片が自系伏在静脈移植片（ＳＶＧ）または人工移植片である請求項２５記載の血管移植片。
【請求項２７】
移植片が動脈移植片である請求項２５記載の工学処理血管移植片。
【請求項２８】
請求項１または２４記載の方法を実施するためのキットであって、以下の：
ａ）活性化プロテインＣ（ＡＰＣ）を増大するための１つまたはそれ以上の作用物質
ｂ）ａ）作用物質の細胞発現、および２）血管中の増大ＡＰＣのうちの少なくとも１つを検出するための手段、ならびに
ｃ）キットを用いるための処方箋
を包含するキット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（関連出願に対する引照）
本出願は、米国特許仮出願第６０／２０６，１６２号（２０００年５月２２日提出）（この記載内容は、参照により本明細書中に含まれる）の利益を主張する。
【０００２】
【発明の属する技術分野】
本発明は全般に、血管の遺伝子操作に関する。特に本発明は、宿主における血管移植片の不全を予防または治療するための方法を提供する。このような不全を阻止する遺伝子工学処理血管移植片も提供される。
【０００３】
【従来の技術分野】
血管移植片の不全は大きな医学的問題である、という認識が増大しつつある。特に問題となっているのは、冠動脈および末梢動脈バイパス術のために用いられる伏在静脈移植片（ＳＶＧ）である。ＳＶＧ造作閉塞は、移植片開存性を危うくする血栓症、新内膜過形成および加速性アテローム硬化症と関連している。このような移植片を受け入れている患者は、アンギナ、心筋梗塞、反復性経皮的および外科的血管再生手法の必要性を、ならびに死をも含めたきわめて大きな医学的問題のために危険な状態である（一般的にはＭｏｔｗａｎｉ， Ｊ．Ｇ． Ｔｏｐｏｌ， Ｅ．Ｊ．（１９９８） ｉｎ Ｃａｒｄｉｏｌｏｇｙ ９７：９１６；およびＣａｍｅｒｏｎ， Ａ． ｅｔ ａｌ． （１９９６） ｉｎ Ｎ． Ｅｎｇｌ． Ｊ． Ｍｅｄ． ３３４：２１６参照）。
【０００４】
血管移植片の不全は２種類に、即ち早期と後期に分けられる、との一般的認識がある。早期移植片不全（移植後最初の２〜３ヶ月以内に起こる）は、典型的には閉塞性血栓症によるものである。後期移植片不全（移植後数ヶ月〜数年で起こる）は、新内膜過形成および加速性アテローム硬化症の発症によるものである。
【０００５】
トロンボモジュリン（ＴＭ）は、すべての血管の内皮細胞内層により多量に発現される重要な抗凝固分子であると報告されている。ＴＭは、循環抗凝固分子であるプロテインＣの活性化を媒介するその能力のために、血栓を低減または遮断すると報告されている。正常血管では、生成され得る少量のトロンビンが、内皮細胞上に発現されるＴＭと結合する。ＴＭとトロンビンとの結合は、それがもはやフィブリノーゲンをフィブリンに切断し得ないかまたは細胞関連トロンビン受容体を活性化し得ないよう、トロンビンの活性部位特異性を変換する。しかしながらＴＭに結合されたトロンビンは、プロテインＣを切断し得るので、したがって活性化プロテインＣ（ＡＰＣ）を生じる。ＡＰＣは強力な、抗凝固剤であり、これはいくつかの血液凝固因子を分解することによりトロンビン生成をさらに抑制する（例えばＪａｃｋｍａｎ， Ｒ．， ｅｔ ａｌ．， （１９８６） Ｐｒｏ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ ８３：８８３４および（１９８７） ８４：６４２５参照）。
【０００６】
ＴＭ発現のレベルおよびプロテインＣを活性化する能力が血管血栓耐性の重要な決定因子であることが当技術分野で示唆されている（例えばＭｉｔｃｈｅｌｌ ＣＡ ｅｔ ａｌ． （１９８６） Ｔｈｒｏｍｂ Ｈａｅｍｏｓｔ． （１９８６） ５６：１５１；およびＥｓｍｏｎ， ＣＴ （１９８９） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６４：４７４３参照）。血管内血栓は、局所トロンビン活性化の程度がＴＭ／ＡＰＣ経路の抗凝固作用を圧倒する場合に起こる。ＴＭまたはＡＰＣレベルおよび／または機能における遺伝性または後天性欠陥は、ヒトにおける病理学的血栓に関連していた（Ｅｓｍｏｎ ＣＴ （１９８９） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６４：４７４３およびそこに引用された参考文献参照）。
【０００７】
動脈の内皮内層の裸出は、冠動脈または末梢バルーン血管形成術中に起こる場合、局所トロンビン活性化増強の結果として閉塞性血栓形成をしばしば生じることが既知である。ＴＭ活性の損失とその後の内皮細胞裸出の結果として生じるＡＰＣ生成不能は、この局所トロンビン活性化を促し、血管血栓形成に関与する。
【０００８】
動脈循環に移植された静脈移植片の内皮は無傷のままであるが、しかし動脈のバルーン損傷中に起こるものと比較して、より潜行性および慢性形態の損傷をこうむると思われる。急性血栓は移植後１ヶ月以内にＳＶＧの８〜１２％までに起こるが、しかしこれに関与する内皮に対して生じる病理的過程についてはほとんど知られていない。特に、正常血管の血栓耐性に関与する分子の発現または機能における変化についてはほとんど分かっていない。
【０００９】
新生内膜は、多数の形態の血管損傷後に決まって発生する特異的血管層であると理解される。それは血管腔に向かって中間層からの平滑筋の増殖および移動により生成される。抑制されていない場合、新生内皮は血管の管腔を侵害して、血流の制限を生じる。血管移植片閉塞それ自体を引き起こすほかに、新生内皮は加速性アテローム硬化症の発症に関して熱心な基質である。
【００１０】
加速性アテローム硬化症は、後期静脈移植片不全の主因である。血管移植片に発生するアテローム硬化性プラークは、ネイティブ動脈において発生するプラークと同一様式で管腔侵害を起こしやすい。冠動脈ＳＶＧにおけるアテローム硬化性プラークの破裂は、アンギナ、心筋梗塞および死を引き起こし得る。末梢ＳＶＧにおけるプラークの破裂は、跛行および急性四肢虚血を引き起こし得る。両方の場合に、移植片開存性の復元を目指す外科的または経皮的手法はしばしば、患者に対する実質的危険を必然的に伴い、そして高頻度に不首尾に終わる。
【００１１】
血管移植片不全の防止はやりがいのある目標であるが、しかし一般に治療的取捨選択はほとんど存在しない（包括的再検討のためには、Ｍｏｔｗａｎｉ Ｊ． ａｎｄ Ｅ．Ｊ． Ｔｏｐｏｌ （１９９８） Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ ９７：９１６およびＯ．Ｎ． Ｎｗａｓｏｋｗａｆｏｒ （１９９５） Ａｎｎ Ｉｎｔｅｒｎ Ｍｅｄ １２３：５２８参照）。血栓が顕著な役割を有すると仮定して、抗血栓薬または抗血小板薬の全身投与を用いて血管移植片不全を防止するためのいくつかの試みがなされてきた。このような作用物質の使用はＳＶＧの残存をかろうじて改良し得るが、しかしそれらは患者を厄介な出血の危険のために危機にさらす、ということを証拠は示唆している。付随的全身性悪作用を伴わずに血管移植片のプロトロンビン表現型を積極的に変えるより限局形態の治療が非常に望ましい。
【００１２】
遺伝子療法は特に、血管系に対して薬理学的活性タンパク質の発現を標的化するための強力なツールとしてますます認識されている（例えばＳｃｈｕｌｉｃｋ ＡＨ， ｅｔ ａｌ． （１９９３） Ｃｉｒｃ． Ｒｅｓ． ７７：４７５；Ｎａｂｅｌ Ｅ．Ｇ ｅｔ ａｌ． （１９９０） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９： １２８５；およびＲａｆｉｅｌｄ， Ｌ． Ｅｔ ａｌ． ＷＯ　９２／０７５７３参照）。
【００１３】
Ｌｉｍ ｅｔ ａｌ． （１９９１） Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ ８３：２００７；Ｆｌｕｇｅｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．， （１９９２） Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ ８５：１１１０；Ｌｅｃｌｅｒｃ ｅｔ ａｌ． （１９９２） Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． ９０： ９３６；Ｃｈａｐｍａｎ ｅｔ ａｌ． Ｃｉｒｃ． Ｒｅｓ． ７１：２７；Ｒｉｅｓｓｅｎ ｅｔ ａｌ． （１９９３） Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． ４：７４９；Ｔａｋｅｓｈｉｔａ ｅｔ ａｌ． Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． （１９９４） ９３：６５２；Ｏｈｎｏ Ｔ ｅｔ ａｌ． （１９９４） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６５：７８１；ｖｏｎ ｄｅｒ Ｌｅｙｅｎ， Ｈ．Ｅ． ｅｔ ａｌ． ＰＮＡＳ （ＵＳＡ） （１９９５） ９２：１１３７も参照されたい。
【００１４】
動脈への特定遺伝子の発現を抑制するアンチセンス核酸の移入も報告されている（Ｔａｋｅｓｈｉｔａ， Ｓ． ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｉｎｖｅｓｔ． ７５：４８７；および米国特許第５，６５２，２２５号参照）。
【００１５】
ウイルス媒介性遺伝子移入は、ｉｎ ｖｉｖｏ血管損傷の部位で抗凝固分子を発現する好ましい一手段である。第一世代複製欠陥アデノウイルスベクターに関する結果は、強力なトロンビン阻害剤であるヒルジンの発現が、全身性抗凝固悪作用を伴わずに動脈損傷後のトロンビン誘導性新生内皮生成を低減し得ることを実証した（例えばＪ．Ｊ． Ｒａｄｅ ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２：２９３参照）。
【００１６】
同様にして、バルーン損傷動脈へのＴＭのアデノウイルス媒介性遺伝子移入は、血栓および新生内皮形成の両方を低減することを実証された（Ｊ．Ｍ． Ｗａｕｇｈ ｅｔ ａｌ． （１９９９） Ｃｉｒｃ Ｒｅｓ ８４：８４および（２０００） Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ １０２：３３２）。この場合、バルーン損傷は、内因性ＴＭの唯一の供給源である動脈内皮を裸出することが予測される。したがって、ヒルジンのアデノウイルス媒介性発現に関して示されたように（Ｒａｄｅ、上記）、ＴＭ発現の復元が局所血栓形成およびトロンビン誘導性新生内皮形成を低減する、ということは予期されない。
【００１７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は全般に、血管移植片不全を予防または治療するための療法に関する。一実施態様では、本発明は、局所的トロンビン活性化およびその後の閉塞性血栓を低減または排除することにより初期移植片不全を扱うための治療方法に関する。別の実施態様では、本発明は、移植片不全の主因である加速性アテローム硬化症の発症を低減または排除する療法を提供する。本発明は、ヒト患者における伏在静脈移植片（ＳＶＧ）および合成移植片不全の予防または治療における使用を含めた広範囲の有用な用途を有する。
【００１８】
【課題を解決するための手段】
本発明は、活性化プロテインＣ（ＡＰＣ）を生成する能力の復元が、局所トロンビン活性化、炎症および加速性アテローム硬化症の発症を防止することにより移植片開存性を改良し得るという発見に基づいている。特に、ＡＰＣ生成増大は、ＡＰＣを復元または強化するための少なくとも１つの作用物質、例えばトロンボモジュリン（ＴＭ）遺伝子のウイルス媒介性移入および発現により直接的に成し遂げられ得る、ということが判明した。あるいはＡＰＣ生成増大は、ＴＭ発現を調節する経路の遺伝子操作により、間接的に達成され得る。前記のように、血管移植片不全は、時間的に早期および後期方に分けられ得る。本発明により提供されるＡＰＣ生成増大は、両型の不全を取り扱う。このような不全を防止することにより、本発明は、血管移植片不全に関連した罹患率および死亡率を実質的に改善する。
【００１９】
本発明の特定の方法は、ＡＰＣ生成を復元または増強するために血管移植片を遺伝子工学処理するために用いられ得る。ＡＰＣ生成を復元するとは、対応する（未処理）対照移植片で見出される酵素のレベルまたはそれに近いレベルであるＡＰＣのレベルを確立することを意味する。ＡＰＣ生成は、ＡＰＣのレベルが対照移植片において見出されるものを越える場合に強化される。このような工学処理移植片は、早期および後期移植片不全に対する良好な耐性を提供すると考えられる。アデノウイルスベクターを用いて遺伝子工学処理されたウサギ静脈移植片（実施例４）、アデノ随伴ウイルスベクターを用いて遺伝子工学処理されたヒト潜伏静脈移植片（ＳＶＧ）（実施例７）および遺伝子工学処理内皮細胞を植え付けた合成移植片（実施例１４）についての実施例が以下で提供される。このような移植片およびそれらの操作方法は、冠動脈または末梢動脈バイパス移植片の不全を含めた広範囲の移植片疾患に罹患している患者のための新規の治療のための基礎を形成し得る。
【００２０】
一般的に好ましい本発明の実施は、開存性を改善し、そして早期および後期型不全を阻止するために対象血管移植片中のＡＰＣレベルを増大することを包含する。その増大は、例えばその移植片内の一部位または多数部位で、移植片により多くのＡＰＣ酵素を提供することにより直接的であり得る。あるいは増大は、例えばより多くのＡＰＣを産生するよう細胞または組織経路を操作することにより、間接的であり得る。多数の実施態様において、本発明は、活性化を促す少なくとも１つの作用物質と移植片を接触させることにより、ＡＰＣへのプロテインＣ（ＰＣ）活性化を増大することを包含する。典型的には、しかし排他的でなく、ＡＰＣへのＰＣのその活性化は、局所的である。即ちそれは、対象血管移植片に実質的に制限される。移植片中により多くのＰＣ活性化を提供することにより、より多くの有益なＡＰＣ酵素が利用可能にされる。その酵素は、血管移植片に利用可能になった場合、早期および後期型の移植片不全を阻止するのに役立つと考えられる。
【００２１】
好ましい本発明の方法は、正常動脈で観察されるものの少なくとも５０％、好ましくは５０％〜１００％に移植片ＡＰＣ生成活性を復元し、あるいは一般に、「標準活性化プロテインＣ検定」または関連語句として本明細書中で言及されるものにより確定した場合に、正常動脈と比較して、少なくとも１２０％、さらに好ましくは少なくとも約２００％、３００％、５００％、１０００％、１０，０００％またはそれ以上、移植片ＡＰＣ生成活性を強化する。このような検定は一般に本技術分野で既知であり、以下で例示される。
【００２２】
本発明は特に、その中でＡＰＣを増大するために少なくとも１つの作用物質を、好ましくは１０未満のこのような作用物質を、さらに好ましくは約２〜５つの作用物質を対象血管移植片に投与することにより、早期および／または後期移植片不全を取り扱う方法を包含するが、一般的に約１または２つの作用物質が好ましい。１つより多いＡＰＣ作用物質が望ましい場合、それらの作用物質は、必要な場合に同時にまたは異なる時間に移植片に投与され得る。さらに、好ましい作用物質は、血管内皮の天然構成分から得られる。
【００２３】
一実施態様では、作用物質はトロンボモジュリン（ＴＭ）、好ましくは哺乳類ＴＭ、さらに好ましくは霊長類ＴＭ、もっとも好ましくはヒトＴＭまたはそれらの機能性断片である。例えば、そして理論に縛られずに考えると、より多くのＴＭを移植片に提供することにより、プロテインＣはＡＰＣ（強力な抗凝固剤）に活性化され、それにより局所的トロンビン生成を抑制する。トロンビン生成のこのような局所的および特にロバストな抑制は、対象血管移植片における血栓形成を低減するかまたは排除する。好ましい本発明の方法は、より多くの異種または同種ＴＭを移植片に補給することにより、ＴＭ活性を直接的に増大する。
【００２４】
ＡＰＣを増大するための作用物質の少なくとも１つがＴＭ（またはその機能性断片）である本発明の実施態様では、そのＴＭは、好ましくは「標準トロンボモジュリン検出」検定として本明細書中で言及されるものにより確定した場合に、正常動脈に見出されるレベルの５０％に、好ましくは５０％〜１００％に復元される。あるいはＴＭ（または機能性断片）は、標準トロンボモジュリン検出検定により確定した場合、正常動脈と比較して少なくとも約２５％、好ましくは約５０％〜約１００％、さらに好ましくは少なくとも約１５０％、２００％、３００％またはそれ以上、ＡＰＣを増大し得る。
【００２５】
別の実施態様では、本発明は、直接的に（より多くのＡＰＣ酵素を提供することにより）または間接的に（より多くのＡＰＣを生成するために細胞経路を操作することにより）、血管移植片中のＡＰＣを増大することを包含する後期移植片不全を取り扱うための方法を提供する。本発明により提供されるこのようなＡＰＣ増大は、加速性アテローム硬化症の発症を低減するかまたは排除すると考えられる。
【００２６】
このような特定の方法は、非処置（対照）移植片と比較して、アテローム硬化症の少なくとも約１０％低減を、好ましくは、「標準アテローム硬化ウサギ静脈移植片モデル」として本明細書中で言及されるものにより確定した場合に、約２０％〜約５０％低減を、さらに好ましくは少なくとも約８５％、９０％、９５％、９９％またはそれ以上の低減を提供するのに十分なＡＰＣのレベルを提供する（実施例１３（泡沫細胞が検査により計数され得るモデルの一例を開示する）参照）。
【００２７】
本発明の特定のＡＰＣ増強剤としては、ＴＭ（ならびにその機能性断片）ならびにＴＭと実質的に別々に、即ちトロンビン結合の有意の改善を伴わずにＡＰＣを増大するその他の作用物質が挙げられる。このような作用物質の例はいかに開示されており、その例としては、同定された内皮細胞プロテインＣ受容体（ＥＰＣＲ）が挙げられる。好ましくは受容体は哺乳類ＥＰＣＲ、さらに好ましくは霊長類ＥＰＣＲである。対象血管移植片内の望ましくないＴＭ下向き調節を低減または排除すると考えられる特定の転写因子も含まれる。
【００２８】
さらに特定の本発明の実施は、直接的または間接的にＡＰＣ酵素を強化するための静脈および動脈移植片の遺伝子修飾を包含する。例えば本発明の一実施態様では、本方法はＴＭ（またはその機能性断片）を、単独でまたはＡＰＣを増大するための少なくとも１つのその他の作用物質と組合せて、増強するために用いられ得る。このような方法は、良好な血管移植片開存性を危うくすると考えられる適応症、例えば血栓、新生内膜過形成および関連アテローム硬化症の重症度を予防し、治療しまたは提言するのに役立つよう意図される。
【００２９】
多数の本発明の用途のために好ましいのは、冠動脈および末梢バイパス術および関連手法のために用いられるＳＶＧ移植片である。
【００３０】
したがって、そして一局面において、本発明は、適切な（未処置）対照血管と比較した場合、移植片中のＡＰＣレベルを復元または強化することにより血管移植片不全を予防または治療するための療法を提供する。さらに特定の方法は、ＡＰＣを復元または強化するための少なくとも１つの作用物質をコードする治療的有効量の少なくとも１つの核酸を移植片の感受性細胞中に導入することを包含する。このようなＡＰＣ増大は、対象移植片が検出可能なＡＰＣまたはＰＣ活性化能力をほとんどまたはまったく有さない場合、ｄｅ ｎｏｖｏで提供され得る。しかしながらほとんどの場合、本発明は、より多くのＡＰＣを対象移植片に提供することにより、内因性ＡＰＣまたはＰＣを活性化する能力を増大する。一実施態様では、核酸はＴＭまたはその機能性断片をコードして、血管移植片、例えばＳＶＧ中のＡＰＣ酵素を復元または強化する。
【００３１】
典型的には、本方法に用いられる核酸は、ＡＰＣを復元または強化するために少なくとも１つの作用物質（通常はアミノ酸配列）をコードする。いくつかの実施態様では、核酸は別個のアミノ酸配列、例えば一次配列が一経路によりＡＰＣを復元または強化し、そして二次配列が異なる経路によりその酵素を復元または強化する。本発明のこの例の説明として、作用物質の１つはヒトＴＭまたはその機能性断片であり、一方、例えば作用物質は哺乳類ＰＣ受容体またはその機能性断片であり得る。好ましい例は、ヒトＥＰＣＲである。核酸は、好ましくは、移植片内のＡＰＣレベルを強化するために治療的有効レベルで、血管移植片の感受性細胞、例えば内皮細胞中に導入される。本発明の任意のＡＰＣ強化剤の投与は、意図された移植片結果を成し遂げるために必要な場合に同時にまたは異なるときに成し遂げられ得る。
【００３２】
本発明は、種々の重要な利点を提供する。
【００３３】
例えば好ましい本発明の実施は、血管移植片における血栓の形成を有意に低減または排除する特に強力な抗血栓作用を提供する。この特徴は、早期移植片不全を低減または排除するために特に有用である。さらに本発明により提供されるＡＰＣレベル強化は、加速性アテローム硬化症の発症による後期移植片不全からの危険に正の影響を与える。
【００３４】
さらに本発明は、望ましくはロバストでそして血管集中性であるＡＰＣ活性増大を提供する。好ましい実施は、ＡＰＣを局所的に増大し、それによりその酵素のより包括的な操作から生じ得る副作用（例えば望ましくない血液希薄化）を回避する対象血管の遺伝子操作を包含する。
【００３５】
前記のように、いくつかの本発明の実施態様は、レシピエント血管移植片中のＡＰＣを強化するための多経路を用いる。特定の本発明の方法は、ＴＭレベルを増強し、別個に、ＡＰＣを作製するためにより多くのＰＣ活性化を提供する。対照してみると、多数の従来の方法は、トロンボモジュリン発現を操作することにより、通常は一経路のみにより、より制限された（そして低有益性の）アプローチをとっていた。このような限定アプローチは、対象血管に不十分なＡＰＣ酵素を提供すると考えられる。一実施態様では、本発明は、１つより多い経路によりＡＰＣを強化することにより、例え血管移植片中のＴＭおよびＡＰＣのレベル強化を別個に提供することにより、この欠点を取り扱う。移植片中のＡＰＣ増大のためのこのおよびその他の本発明の戦略は、早期および後期移植片不全を取り扱う特にロバストな手段を提供することが判明している。
【００３６】
本発明は、その他の重要な利点を提供する。
【００３７】
例えば本発明の治療方法は柔軟性であり、そして意図された移植片使用に適合させるために容易に適応され得る。説明として、本方法の少なくとも一過程は、ｅｘ ｖｉｖｏで実施され得る。即ち、１つまたはそれ以上の方法過程は、本質的に保存移植片開存性が意図される哺乳類のほかに実行され得る。一般に本発明の実施例では、血管移植片はドナーまたは患者から除去される。次にこのような移植片は、ＡＰＣを増大するための少なくとも１つの作用物質をコードする治療的有効量の少なくとも１つの核酸を導入するために操作される。その後、操作移植片は、血管移植片を必要とする患者または別のレシピエントに移植される。
【００３８】
好ましくはレシピエント血管移植片に核酸を導入または投与する少なくともその過程は、ｅｘ ｖｉｖｏで実施されるが、しかし他の過程は、必要な場合、哺乳類意外で実施され得る。本発明の実施例では、本方法はしばしば、慣用的外科技法の１つまたは組合せを用いて哺乳類宿主中に操作血管移植片を移植する過程をさらに包含する。移植過程は、必要な場合、実施され、その例としては、核酸の導入前があげられるが、これに限定されない。この例では、核酸は慣用的遺伝子技法にしたがってｉｎ ｖｉｖｏで投与され得る。本発明の他の実施態様では、本方法過程のいくつかまたはすべては、血管に関してｉｎ ｖｉｖｏで実施される。
【００３９】
本発明の実施は、ＡＰＣ生成を強化すると考えられたかまたは考えられる広範囲の作用物質と相容れる。作用物質の実例としては、トロンボモジュリン（ＴＭ）ならびにその機能性断片が挙げられる。付加的作用物質、例えばその機能性断片を含めたＥＰＣＲは、プロテインＣをＴＭ−トロンビン複合体に「提示し」、したがって活性化過程をより効率的にさせることにより、ＡＰＣ生成を増大する（実施例８）。アプローチの組合せも意図される（実施例９）。
【００４０】
本発明は、哺乳類における移植片不全を阻止するために血管移植片を工学処理方法も提供する。移植片はＳＶＧであり得るが、これに限定されない。一実施態様では、当該方法は、以下の過程の少なくとも１つ、好ましくはすべてを包含する：
ａ）血管の細胞中のＡＰＣを増大する少なくとも１つの作用物質をコードする有効量の少なくとも１つの核酸を移植片の感受性細胞、例えば内皮細胞中に導入し、
ｂ）前記細胞中で作用物質を発現し、そして
ｃ）移植片不全を阻止するのに十分なレベルに移植片中のＡＰＣを増大する。
【００４１】
好ましくは工学処理移植片中のＡＰＣのレベルは、標準活性化プロテインＣ検定により確定した場合に、非処置（対照）血管と比較して、少なくとも２０％、好ましくは５０％〜１００％、さらに好ましくは少なくとも約２００％、３００％、５００％、１０００％、１０，０００％またはそれ以上、血管ＡＰＣを強化するのに十分である。
【００４２】
本発明のさらに好ましい血管移植片は、標準アテローム硬化ウサギ静脈移植片モデルとして言及されるものにより確定した場合に、非処置（対照）血管と比較して、加速性アテローム硬化症の発症の少なくとも約１０％低減を、好ましくは、約２０％〜約５０％低減を、さらに好ましくは少なくとも約８５％、９０％、９５％、９９％またはそれ以上の低減を提供するのに十分なＡＰＣのレベルを示す（下記および実施例１３参照）。
【００４３】
工学処理血管中のＡＰＣを増大するための作用物質の少なくとも１つがＴＭ（またはその機能性断片）である本発明の実施態様では、そのＴＭは、好ましくは、「標準トロンボモジュリン検出」検定により確定した場合に、非処置対照血管と比較して、少なくとも約２５％、好ましくは約５０％〜１００％、さらに好ましくは少なくとも約１５０％、２００％、３００％またはそれ以上である。
【００４４】
別の局面では、本発明は、本明細書中に記載した方法のうちの１つまたは組合せにより血管が作られる移植片として用いるのに適した工学処理血管移植片を提供する。このような血管の実例は、自系ＳＶＧまたは哺乳類、特にヒト患者における不全を阻止するために工学処理された動脈血管である。
【００４５】
本発明の血管移植片は、重要な利点を提供する。
【００４６】
例えばこのような移植片は、予定量のＡＰＣを産生するよう工学処理され得る。即ち移植片は、意図された移植片用途に合うよう作製され得る。さらに、ＡＰＣを強化するための作用物質の発現は、必要な場合、構成的または調節可能であり得る。したがって本発明は、移植片不全に影響を及ぼす既存のまたは疑わしい医学的条件に合うよう作製されるＡＰＣ量を移植片治療を必要とする哺乳類に提供し得る。このような条件の例としては、血管閉塞の家族性病歴、喫煙、高コレステロールレベル、ならびに抗凝固薬に対する過去のまたは進行中の曝露が挙げられる。これらの場合、本質的にロバストな抗トロンビン活性を有する移植片を作製するのが望ましい。対照してみると、これらの条件を有さない患者に関して意図される血管移植片は、低ＡＰＣを要する。したがって本発明は柔軟性であり、そして適切なレベルのＡＰＣ活性を提供する血管移植片を工学処理するよう適応され得る。
【００４７】
本発明によりさらに提供されるのは、本明細書中に開示された方法を実施するためのキットである。好ましくは、キットは少なくとも１つの以下の構成成分を包含する：ａ）ＡＰＣを増大するための少なくとも１つの作用物質。この場合、作用物質の少なくとも１つは、ＴＭまたはその機能性断片であり、そしてｂ）以下の：１）細胞中の作用物質の発現、および／または２）血管中のＡＰＣ酵素増大、のうちの少なくとも１つを検出するための手段。さらに特定検出手段は、プロテインＣ活性の定量のための手段を包含する。
【００４８】
本発明のその他の局面を以下に開示する。
【００４９】
【発明の実施の形態】
前記のように、本発明は、血管移植片不全を予防または治療するための方法に関する。特定の本発明の方法は、早期および／または後期型不全を低減または排除するための療法に関する。本発明の方法は一般に、活性化プロテインＣ（ＡＰＣ）酵素を強化し、それにより保存移植片開存性を促進するための少なくとも１つの作用物質を提供する。本発明は、ヒト患者における伏在静脈移植片（ＳＶＧ）または合成移植片不全の防止に用いることを含めた広範囲の有用な用途を有する。
【００５０】
「血管移植片」という語句は、静脈または動脈移植片を意味する。「移植片ｇｒａｆｔ」、「埋没物質ｉｍｐｌａｎｔ」または「移植組織ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ」という語は、レシピエントへの移植のためにドナーから得られる生物学的血管物質を指すために互換的に用いられる。動詞として用いる場合、「移植するｇｒａｆｔ」という語は、レシピエント中にこのような物質を入れるという動作を指すことを意味する。「血管移植片」という語句は、天然組換え操作内皮細胞を植えつけた人工移植片を含めた合成または半合成血管物質を包含することも意味する。このような人工移植片の例は、下記の実施例１４で提供される。多数の本発明の実施態様のための好ましい血管移植片は、本発明にしたがって操作された伏在静脈移植片（ＳＶＧ）である。
【００５１】
アテローム硬化症が多くの国々における死亡の主因であることは、広く認識されている。冠動脈および末梢動脈バイパス術は、通常は医薬でまたはバルーン血管形成で治療できないアテローム硬化症のための一治療である。手術中、足から取り出された伏在静脈は、閉塞された動脈をバイパスするための導管として用いられる。米国だけで、毎年１００万を上回る伏在静脈移植片が移植されている。残念ながら、ＳＶＧは、ネイティブ動脈移植片、例えば内胸動脈（ＩＭＧ）の場合より有意に高い高率で不首尾に終わることが報告されている。失敗は、閉塞性血餅の発生に関連する。残存するものはしばしば、加速性アテローム硬化症に感受性である。静脈移植片疾患のための治療選択は、一般に限定されている。血管形成がしばしば実施されるが、しかし長期利点は期待はずれであった。これらのそしてその他の欠点は、ＳＶＧの臨床効力を限定する。例えば術後最初の１ヶ月に、ＳＶＧの約８〜１２％が閉塞する。１および１０年閉塞率は、それぞれ約２０％および約６０％に近づくが、一方、ＩＭＡ移植片の１０年閉塞率は約１０％未満である。この不等性は、きわめて大きな臨床的意味を有する。即ちＩＭＡ移植片を受け入れた患者は、ＳＶＧのみを受けた患者より長く生存し、そしてアンギナ罹患率が有意に低い。
【００５２】
特に、バイパス手術を受けたかまたは受ける患者における静脈移植片疾患を予防または治療することによりこれらの問題を取り扱うと、認識する必要がある（Ｍａｎｎ ｅｔ ａｌ． （１９９５） ＰＮＡＳ （ＵＳＡ） ９２：４５０２参照）。理論と結びつけずに考えると、移植自系静脈移植片の管腔表面に生成されるトロンビンは、血栓による急性移植片不全、ならびに新生内膜過形成とその後のアテローム硬化症による後期不全を媒介する。トロンビンおよび／またはトロンビン生成の持続性局所的抑制は、血栓を防止することにより、そして新生内膜過形成およびアテローム硬化症を阻止することにより、ヒト自系静脈移植片の長期開存性を改善し得る、とさらに考えられる。
【００５３】
多数のＳＶＧが移植片年齢に伴って失敗する理由も理解する必要がある。急性移植片閉塞（＜１ヶ月）は、血栓のためにほとんどいつもであることが報告されているが、一方、亜急性移植片不全（＜１年）は、付加的血栓を伴う新生内膜過形成に起因すると考えられる。後期移植片不全（＞１〜５年）は、新生内膜内に発症する加速性アテローム硬化により引き起こされると開示されている。いかなる理論とも結びつけずに考えると、トロンビンはＳＶＧ不全の３つの相のすべての病因に関連している。特に、移植片内皮に対する損傷は、移植中にそして動脈圧への突然の曝露に応答して起こり、そして応力を剪断する、と考えられる。損傷内皮は、組織プラスミノーゲン活性剤、一酸化窒素、プロスタサイクリン、プロテインＣ、ならびに組織因子の発生期発現を生成する能力低減のために、低血栓耐性である。移植片管腔表面で活性化されるトロンビンは、フィブリノーゲン切断に影響を及ぼし、そして血小板トロンビン受容体をタンパク質分解的に活性化し、さらにそれらの活性化、付着および凝集を刺激する、と考えられる。結果は、特に緩慢な血流の条件下で、血栓のために好ましい環境であると考えられる。
【００５４】
本発明は、例えばヒト自系静脈移植片、特にＳＶＧの長期開存性を改善する治療方法および工学処理血管を提供することにより、これらのおよびその他の問題を取り扱う。ＳＶＧに関しては、本発明の実施は、標準バイパス手術を代表し、そしてしばしば望ましくない血栓、新生内膜過形成およびアテローム硬化症を生じる血流妨害性閉塞を低減または排除し得る。
【００５５】
本発明の治療方法は一般に、細胞中で作用物質を発現する対象血管移植片の細胞中のＡＰＣを増大する少なくとも１つの作用物質をコードする有効量の少なくとも１つの核酸を導入し、そして血管を処置するのに十分なＡＰＣを増大することを包含する。「有効量」という語句または「治療的有効量」を含めた同様の語句は、標準活性化プロテインＣ検定により確定した場合に、非処置（対照）血管と比較して、少なくとも２０％、好ましくは約５０％〜約１００％、さらに好ましくは少なくとも約２００％、３００％、５００％、１０００％、１０，０００％またはそれ以上のＡＰＣを意味する。
【００５６】
好ましい本発明の実施は、このような治療を要する哺乳類、例えば齧歯類、例えばラット、マウス、ならびにブタ、ウサギおよび霊長類を包含する。好ましい霊長類としては、ヒト患者が挙げられる。さらに典型的な患者としては、血管移植片不全、特に多数のＳＶＧ移植試験に関連した早期および／または後期不全に罹患しているかまたは感受性である個体が挙げられる。血管のドナーと移植片のレシピエントとの免疫学的関係は、必要に応じて同種異系、自系、異種または合成であり得る。好ましい本発明の実施態様では、ドナーおよびレシピエントは遺伝的に同一であり、通常は同一個体（同系）である。この場合、血管移植片は同系である。
【００５７】
好ましい実施態様では、ＴＭは、ＡＰＣ酵素を増大するために用いられる作用物質の少なくとも１つである。成熟ＴＭは、血管血栓耐性に対する主因であると開示されている。当該タンパク質は、主として血管およびリンパ内皮細胞により、しかし滑膜細胞、白血球および血小板によっても産生される約５５７アミノ酸膜貫通タンパク質であると報告されている。ＴＭは、１：１複合体で活性化トロンビンを結合し（Ｋｄ＝２〜３ｎＭ）、そしてトロンビンがフィブリノーゲンまたはトロンビン受容体をもはや切断できないが、しかしプロテインＣを高親和性で活性化し得るよう、その活性部位特異性を変える（Ｋｍ＝０．５μＭ）、と報告されている（Ｃａｄｒｏｙ Ｙ．， ｅｔ ａｌ． （１９９７） Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ Ｔｈｒｏｍｂ Ｖａｓｃ Ｂｉｏｌ １７：５２０；Ｗｅｎ， Ｄ．， ｅｔ ａｌ．， （１９８７） Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２６：４３５０；Ｋｕｒｏｓａｗａ， Ｓ．， ｅｔ ａｌ．， （１９８８） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６３：５９９３；Ｚｕｓｈｉ， ｅｔ ａｌ．， （１９８９） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６４：１０３５１；およびＢｏｕｒｉｎ， Ｍ．Ｃ． ｅｔ ａｌ．， （１９８６） ＰＮＡＳ （ＵＳＡ） ８３： ５９２４参照）。
【００５８】
本発明とともに用いるのに適した広範な種々のＴＭ分子が開示されている（Ｍａｊｅｒｕｓ， ＰＷ． Ｅｔ ａｌ． Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． （１９８４） ２５９：１２２４６， １９８４；Ａｏｋｉ ｅｔ ａｌ． Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ Ｒｅｓ． （１９８５） ３７：３５３；および日本国特許公開第６０−１９９８１９号参照）。Ｍａｒｕｙａｍａ ｅｔ ａｌ． Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ（１９８５） ７５：９８７；Ｓｕｚｕｋｉ ｅｔ ａｌ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． （１９８８）１０４：６２８；ＷＯ ９６／０６９３３；米国特許第４，９１２，２０７号；第５，６９５，９６４号；Ｏｈｌｉｎ， Ａ−Ｋ （１９９７） Ｔｈｒｏｍｂ． Ｈａｅｍｏｓｔ ７８：３９６；およびＷｅｎ Ｄ． Ｅｔ ａｌ． （１９８７） Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２６：４３５０（例えばヒトＴＭｃＤＮＡを開示する）も参照されたい。
【００５９】
本発明の特定のＴＭ分子は、米国特許第４，９１２，２０７号（Ｍａｊｅｒｕｓ）（この記載内容は、参照により本明細書中に含まれる）に記載されているようなヒトトロンボモジュリン（ｈＴＭ）をコードするｃＤＮＡ配列である。特に、米国特許第４，９１２，２０７号（ｈＴＭのｃＤＮＡおよびアミノ酸配列を開示する）の図３を参照されたい。その配列は、約５７５アミノ酸を有するタンパク質をコードすると報告されている。さらに、好ましいのは米国特許第４，９１２，２０７号に開示されたｈＴＭｃＤＮＡ配列の機能性断片である。「機能性断片」という語句は、ＴＭコードｃＤＮＡ分子に関して用いられる場合、Ｍａｊｅｒｕｓ特許により開示された全長ｈＴＭ配列のトロンビン結合活性の少なくとも約８５％、好ましくは少なくとも約９５％の活性を有するアミノ配列をコードする核酸断片を意味する。ＴＭおよびトロンビン間の結合を検出するための免疫学的方法は当分野では既知であり、報告されている（Ｗａｕｇｈ， ＪＭ ｅｔ ａｌ． （１９９９） Ｃｉｒｃｕｌ． Ｒｅｓ． ８４：８４参照）。
【００６０】
ＷＯ　９６／０６９３３（これもｈＴＭ配列を開示する）も参照されたい。
【００６１】
さらに好ましいＴＭ機能性断片は、例えば標準核酸シーケンシング技法により確定した場合、約１６５０塩基対〜約１８００塩基対、好ましくは約１７００塩基対〜約１７５０塩基対のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）配列を有する。
【００６２】
本発明のさらに好ましいＴＭ分子としては、高緊縮性条件下で、米国特許第４，９１２，２０７号に開示された全長ｈＴＭ配列とハイブリダイズする核酸配列が挙げられる。「高緊縮性」という語句は、約４２℃で６ｘＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ、１００μｇ担体ＤＮＡおよび５０％ホルムアミドを用いる少なくとも１つのハイブリダイゼーション後洗浄過程を意味する。
【００６３】
その他の好ましいＴＭ分子としては、全長ｈＴＭとして米国特許第４，９１２，２０７号に開示されたアミノ酸配列の対立遺伝子変異体をコードする核酸配列が挙げられる。米国特許第４，９１２，２０７号により報告された全長配列に対して少なくとも１つのアミノ酸置換、欠失（連続または非連続的）または付加を有するアミノ酸配列をコードするＴＭ分子も意図される。好ましくは、このような置換、欠失および付加は、約１〜約５０アミノ酸、さらに好ましくは約１〜約１０アミノ酸を包含する。好ましいアミノ置換としては、保存的置換が挙げられる。したがって、フェニルアラニンで置換されるチロシンアミノ酸は保存的アミノ酸置換の一例であり、一方、アラニンで置き換えられるアルギニンは非保存的アミノ酸置換を表す。
【００６４】
本発明のさらに好ましいＴＭ分子は、１つまたはそれ以上の以下の検定により確定した場合、良好なＴＭおよびＡＰＣ活性を促進するアミノ酸配列をコードする。
【００６５】
適切なＴＭ分子を検出するための好ましい検定は、標準プロテインＣ検定または関連語句として本明細書中で呼ばれる以下の検定である。要するに、形質導入ウサギ静脈セグメントが分割され、そして管腔表面がウエルの底を形成するようウエルの底に入れる。次に形質導入血管は、約１０ｎｍのα−トロンビンおよび約１μＭのプロテインＣとともに約−ガラクトシダーゼインキュベートされる。上清をその後取り出して、活性化プロテインＣ（ＡＰＣ）の量を、色原性基質Ｓ−２３６６の変換を測定することにより確定する。プロテインＣ活性化の速度および程度は、必要な場合には、標準ＡＰＣ曲線を参照しながら標準マイクロプレート読取機を用いることにより定量され得る（この検定についてのさらなる情報に関しては、実施例３を参照）。
【００６６】
ＴＭ活性を検出するための別の好ましい検定は、以下の実施例１および２に記載されている標準ウサギ静脈移植片検定である。「標準ウサギ静脈移植片検定」または関連語句に対する本明細書中の参考文献は、それらの実施例に記載されたモデルに言及する。要するに、モデルの実施は、頚静脈のセグメントを切り取り、それを末端−側面方式で、同側頚動脈循環中に置くことを包含する。移植直前に、静脈移植片セグメントは、好ましくはＴＭをコードする少なくとも１つの適切なウイルスベクター（またはその機能性断片）をｅｘ ｖｉｖｏで形質導入される。ＴＭ発現は、所望により、適切な抗ＴＭ抗体を用いてＴＭイムノアッセイを実施することにより、検出され、定量される。ＴＭ発現は、例えば約１〜６ヶ月、好ましくは約２〜約６０日、さらに好ましくは約３日〜約５０日まで、必要に応じて検定でモニタリングされ得る（さらなる情報に関しては、以下の実施例１および２を参照）。
【００６７】
前記のように、静脈移植片の管腔表面からのＴＭの損失は、トロンビン生成およびその後のトロンビン媒介性移植片不全に有意に関与する、と考えられる。本発明は、ＴＭ損失を防止するかまたは置き換えて、それにより局所的トロンビン生成およびその後の移植片不全を低減するための有用な方法を提供する。ヒト伏在静脈移植片中のトロンボモジュリンの発現パターン、局所的血栓耐性に及ぼす影響、ならびに移植片血栓耐性および加速性アテローム硬化症の発症に及ぼすトロンボモジュリンのウイルスベクター媒介性発現の作用（以下の実施例参照）。
【００６８】
前記のように、本発明は柔軟性であり、そしてＡＰＣを増大するためのその他の作用物質と完全に相容れる。このような作用物質の実例は、その機能性断片を含めたヒト内皮細胞プロテインＣ受容体（ＥＰＣＲ）である。受容体は、プロテインＣを結合する２３５アミノ酸内皮細胞特異的膜貫通タンパク質であると報告されている。それは、プロテインＣを結合し（Ｋｄ＝３０ｎＭ）、そしてトロンビン／ＴＭ複合体にそれを提示し、したがってプロテインＣ活性化の速度を増大するためであると考えられる。ＥＰＣＲは、主として大型動脈および静脈の内皮により発現される。ＥＰＣＲ活性のｉｎ ｖｉｖｏ調節は、ＴＭに関する場合と同様に十分に定義されているわけではない。ＴＭと同様、ＥＰＣＲ遺伝子は、炎症性サイトカイン、例えばＴＮＦ−αへの曝露により下向き調節される。
【００６９】
好ましいＥＰＣＲ配列は、例えば米国特許第５，８５２，１７１号および第５，８０４，３９２号（これらの記載内容は、参照により本明細書中に含まれる）に開示された全長ヒトＥＰＣＲ配列である。
【００７０】
Ｆｕｋｋｕｄｏｍｅ ａｎｄ Ｅｓｍｏｎ， １９９４ Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ ２６９：２６４８６；Ｆｕｋｕｄｏｍｅ， ｅｔ ａｌ． １９９６， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７１：１７４９１；Ｒｅｇａｎ， ｅｔ ａｌ． １９９６， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７１：１７４９９；およびＥｓｍｏｎ ＣＴ （２０００） Ｔｈｒｏｍｂ Ｈａｅｍｏｓｔ ８３：６３９（さらに好ましいＥＰＣＲ配列を開示する）も参照されたい。
【００７１】
本発明の特定のＥＰＣＲ分子は、配列番号１として米国特許第５，８５２，１７１号に示されたようなヒトＥＰＣＲをコードするｃＤＮＡ配列である。そのｃＤＮＡ配列によりコードされるアミノ酸配列は、配列番号２として米国特許第５，８５２，１７１号に示されている。さらに越野は、米国特許第５，８５２，１７１号で配列番号１として示された核酸配列の機能性断片である。「機能性断片」という語句は、ＥＰＣＲコードＤＮＡ分子に関して用いられる場合、米国特許第５，８５２，１７１号で配列番号１として開示された全長ヒトＥＰＣＲｃＤＮＡ配列と比較した場合に、少なくとも約８５％、好ましくは少なくとも約９５％のプロテインＣ（ＰＣ）活性化を有するアミノ配列をコードする核酸断片を意味する。ＥＰＣＲによりＰＣ活性化を検出し、定量するための方法は、報告されている（Ｅｓｍｏｎ ＣＴ （２０００）、上記；Ｆｕｋｕｄｏｍｅ、上記参照）。
【００７２】
さらに好ましいＥＰＣＲ機能性断片は、標準核酸シーケンシング技法により確定した場合、約１２００〜約１４００塩基対、好ましくは約１２５０〜約１３５０塩基対のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）配列を有する。
【００７３】
本発明のさらに好ましいＥＰＣＲ分子としては、高緊縮性条件下で、米国特許第５，８５２，１７１号に配列番号１として開示された全長ｃＤＮＡ配列とハイブリダイズする核酸配列が挙げられる。
【００７４】
その他の好ましいＥＰＣＲ分子としては、全長ヒトＥＰＣＲ（配列番号２）として米国特許第５，８５２，１７１号に開示されたアミノ酸配列の対立遺伝子変異体をコードする核酸配列が挙げられる。米国特許第５，８５２，１７１号により報告された全長配列に対して少なくとも１つのアミノ酸置換、欠失（連続または非連続的）または付加を有するアミノ酸配列をコードするＥＰＣＲ分子も意図される。好ましくは、このような置換、欠失および付加は、約１〜約５０アミノ酸、さらに好ましくは約１〜約１０アミノ酸を包含する。好ましいアミノ置換としては、保存的置換が挙げられる。
【００７５】
本発明のさらに好ましいＥＰＣＲ分子は、標準プロテインＣ検定により確定した場合、ＰＣの良好な活性化を促進するアミノ酸配列をコードする。好ましくはこのような分子は、対照血管移植片と比較して、標準プロテインＣ検定においてプロテインＣ活性化の少なくとも約８０％増加を、好ましくは約９０％〜約１００％増加を提供するアミノ酸配列をコードする。
【００７６】
ＷＯ　００１０６０９、ＰＣＴ／ＵＳ９５／０９６３６、ＥＰ０９３７１０４および米国特許第５，８０４，３９２号、第６，２００，７５１号（さらに好ましいＥＰＣＲ配列を開示する）も参照されたい。
【００７７】
したがって例えば下記の標準検定を用いるルーチン試験は、対象血管移植片のＡＰＣを増大するための許容可能な作用物質のうちの１つまたは組合せを容易に同定し得る。
【００７８】
ＡＰＣを増大するためのさらに好ましい作用物質としては、ｉｎ ｖｉｖｏで免疫および炎症応答を調整することが既知のある種の細胞因子が挙げられる。炎症はＴＭの発現を低減することが知られているため、炎症経路の抑制は、保存化ＴＭ発現およびＡＰＣ生成を生じ得る。特に好ましいのは、直接または間接的に、転写因子ＮＦ−κＢの活性を低減するかまたは完全に遮断するために、相互作用する細胞因子である（Ｂｒｏｃｋｍａｎ ｅｔ ａｌ． （１９９５） Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． １５：２８０９参照）。ＮＦ−κＢは、炎症性サイトカインＴＮＦ−αへの曝露に応答してＴＭ下向き調節を防止し得る、ということがｉｎ ｖｉｔｒｏで実証された（実施例１２参照）。
【００７９】
さらに好ましい作用物質としては、「ＩκＢ」と呼ばれる抑制性タンパク質の一ファミリーの優性陰性突然変異体が挙げられる。ＩκＢはＮＦ−κＢと相互作用して、転写因子の活性を遮断する、と報告されている。下記の実施例１２に示したように、ＩκＢ因子を発現するアデノウイルスベクターを用いた培養細胞の形質導入は、ＴＮＦ−α刺激に応答して望ましくないＴＭ下向き調節を防止した（これも実施例１２参照）。
【００８０】
ＩκＢ因子の「機能性断片」という用語は、Ｂｒｏｃｋｍａｎ ｅｔ ａｌ． （１９９５） Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． １５：２８０９により開示されたＩκＢ活性検定により確定した場合、全長ＩκＢの活性の少なくとも約９０％、好ましくは少なくとも約９５％を有する断片を意味する。
【００８１】
本発明の好ましい方法は、ＡＰＣを増大するための作用物質をコードする少なくとも１つの核酸が挿入された適切なベクターを用いる。特定の当該ベクターとしては、特異的ＲＮＡおよびＤＮＡウイルスベクターを含めたウイルスベクターが挙げられる。レトロウイルスベクターとしては、モロニーネズミ白血病ウイルスが挙げられる。ＤＮＡウイルスベクターが好ましい。これらのベクターとしては主に、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、ポックスベクター、例えばオルトポックスまたはアビポックスベクター、ヘルペスウイルスベクター、例えばＩ型単純ヘルペスベクター（ＨＳＶ）ベクターが挙げられる（Ａ．Ｉ． Ｇｅｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ， ６４：４８７ （１９９５）； Ｆ． Ｌｉｍ ｅｔ ａｌ．， ｉｎ ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ， Ｄ．Ｇｌｏｖｅｒ， Ｅｄ． （Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖ． Ｐｒｅｓｓ， Ｏｘｆｏｒｄ Ｅｎｇｌａｎｄ） （１９９５）； Ａ．Ｉ． Ｇｅｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ９０：７６０３ （１９９３）； Ａ．Ｉ． Ｇｅｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ：８７：１１４９ （１９９０）参照）。有用なアデノウイルスベクターに関連する開示に関しては、ＬｅＧａｌ ＬａＳａｌｌｅ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２５９：９８８ （１９９３）； Ｄａｖｉｄｓｏｎ， ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ． Ｇｅｎｅｔ．， ３：２１９ （１９９３）； およびＹａｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６９：２００４ （１９９５）を参照されたい。アデノウイルス関連ベクターについての情報に関しては、Ｋａｐｌｉｔｔ， Ｍ．Ｇ．， ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ． Ｇｅｎｅｔ．， ８：１４８ （１９９４）およびそこに引用された参考文献を参照されたい。
【００８２】
アデノウイルスベクターは、形質導入化標的細胞における相対的に短い（約１〜３週間）がしかし効率的で且つロバストな導入遺伝子発現を媒介する。レトロウイルスベクターは、理想的にはｅｘ ｖｉｖｏ遺伝子移入に適しているが、しかし、宿主ゲノム中へのウイルス組込みのために、長期（数ヶ月〜数年）導入遺伝子発現を媒介し得る。アデノ随伴ウイルスベクターは、宿主ゲノム中へのウイルス組込みのために、ｉｎ ｖｉｖｏでの効率的形質導入ならびに長期導入遺伝子発現（数ヶ月）のための能力という利点を有する。選択される特定のベクターは、標的細胞および処理される条件によっている。導入は、標準技法に、例えば感染、トランスフェクション、形質導入または形質転換により得る。遺伝子移入様式の例としては、例えば裸ＤＮＡ、Ｃａ３（ＰＯ４）２沈降、ＤＥＡＥデキストラン、電気穿孔、プロトプラスト融合、リポフェクション、細胞マイクロインジェクションおよびウイルスベクターが挙げられる。
【００８３】
このようなベクターにより発現されるアミノ酸配列はしばしば、非常に長い期間、例えば数日、２〜３週間までまたはそれ以上の間、存在する、と考えられる。この特徴は、血管移植片開存性を改善するために用いられる場合、多数の作用物質の有益な作用を有用に延長し得る。
【００８４】
アデノウイルス、即ち上気道疾患を引き起こし、潜在性霊長類感染においても存在するウイルスから得られるベクターは、一般的に既知であり、好ましくは本発明にしたがって用いられる。低周囲温度で細胞に付着する多数のアデノウイルスの能力が、移植設定における一利点であることは重要である。この利点は、対象血管の低温貯蔵中の遺伝子移入を促し得る。このようなウイルスは、プロテインＣ活性を増大するために所望の作用物質の発現を実行するための方法の１つまたは組合せにおいて操作され得る。好ましくは組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを用いて、同一物を発現する。このようなベクターにおいては、好ましいＴＭおよびＥＰＣＲ分子を含めた作用物質をコードする核酸は、１つまたはそれ以上の異なる構成性または調節可能プロモーターの制御下にある。
【００８５】
本発明とともに用いるための好ましいアデノウイルスベクター構築物としては、プロテインＣ活性を増大するための作用物質をコードする少なくとも１つの、好ましくは１つまたは２つの核酸配列を含む発現カセットが挙げられる。例えばベクターによりコードされる作用物質は、１つまたはそれ以上の構成性または調節可能プロモーターと操作可能的に関連するＴＭ　ＤＮＡであり得る。この実施例では、対象血管移植片は一般に、少なくとも１つのその他のベクターを用いて形質導入され、この場合、ベクターによりコードされる作用物質は、同一または異なるプロモーターと操作可能的に関連するＥＰＣＲ　ＤＮＡである。あるいはＥＰＣＲまたはＴＭ　ＤＮＡは、同一ベクター中に提供され得る。さらに好ましいアデノウイルスベクターは、典型的には、その下流にポリＡ配列を含む。
【００８６】
特定のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）およびそれに由来する適切なベクターの例は、米国特許第６，１５６，３０３号（この開示内容は、参照により本明細書中に含まれる）に報告されている。
【００８７】
例示的プロモーターとしては、既知のサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター／エンハンサーおよびラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ロングターミナルリピートプロモーターが挙げられる。用いるのに適したその他のプロモーターとしては、Ｕ１小核ＲＮＡプロモーターおよびＩＣＡＭ−２プロモーターが挙げられる（更なる情報に関しては実施例の項を参照）。
【００８８】
好ましいアデノウイルスベクターの発現カセットは、典型的には、Ｅ１を欠くウイルスの複製を可能にするために、トランスで、ウイルス機能、好ましくはＥ１遺伝子機能を提供適切な細胞株（例えば２９３）中の２つのプラスミド間の組換えにより、アデノウイルスゲノム中に導入され得る。
【００８９】
概して、本発明のベクターの調製は、本明細書中に開示された手法により、そして認識された組換えＤＮＡ技法により、例えばプラスミドＤＮＡの調製、制限酵素によるＤＮＡの切断、ＤＮＡの結繋、宿主の形質転換またはトランスフェクション、宿主の培養、ならびに所望のベクター構築物の単離および精製により成し遂げられ得る。このような手法は一般的に既知であり、例えばＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ （２ｎｄ ｅｄ． １９８９）；およびＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９８９（これらの記載内容は、参照により本明細書中に含まれる）に開示されている。
【００９０】
ｃｒｅ−ｌｏｘ組換え法によるアデノウイルスベクターの作製に関するさらに特定の開示は、Ｈａｒｄｙ， Ｓ． ｅｔ ａｌ． （１９９７） Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７１：１８４２に見出され得る。図７Ａ〜Ｂ（ｈＴＭまたはβ−ガラクトシダーゼをコードするアデノウイルスベクターの構築を図の形式で示す）も参照されたい。ベクター構築物の作製およびしように関するさらなる情報に関しては、Ｒａｄｅ， ＪＪ ｅｔ ａｌ． （１９９６）上記も参照されたい。
【００９１】
血液凝固カスケードに関する開示は、Ｒ． Ｈｏｆｆｍａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ： Ｂａｓｉｃ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ： Ｃｈｕｒｃｈｉｌｌ Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎ， Ｉｎｃ．， １９９１； Ｃ． Ｋｊｅｌｄｓｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ｏｆ Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｉｃ Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ， Ｃｈｉｃａｇｏ： Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐａｔｈｏｌｏｇｉｓｔｓ Ｐｒｅｓｓ， １９８９に見出され得る。カスケードにおけるＴＭおよびＥＰＣＲタンパク質の役割についての考察に関しては、Ｅｓｍｏｎ， Ｃ．Ｔ．， （２０００）上記、ならびにそこに引用された参考文献も参照されたい。
【００９２】
理論に縛られずに考えると、血管内皮細胞によるＴＭおよびＥＰＣＲの発現および活性における変化は、早期および後期ＳＶＧ不全の両方の病理生理学において顕著な役割を演じる。特に、静脈移植片「動脈化」は、ＴＭ発現の損失のために局所ＡＰＣ生成を低減する、と考えられる。冠動脈バイパス手術中に調製されるヒトＳＶＧセグメントに及ぼすＴＭ活性を、Ｃｏｏｋは調べた。普通は外科的手法中になされるようなＳＶＧ収穫およびヘパリン処理食塩水中での短期貯蔵の過程は、非操作静脈セグメントと比較して、プロテインＣ活性化の２８％減を生じた。さらに、動脈切断応力への曝露はＴＭ遺伝子発現を下向き調節する、と考えられる。動脈流条件下に９０分間、ヒト伏在静脈内皮細胞を置くと、定量的免疫組織染色により確定した場合、表面ＴＭ発現の４０％減が生じる、ということをＧｏｓｌｉｎｇは実証した。さらに、移植のすぐ後に、移植片に顕著な炎症が認められる、と考えられる。移植片管腔放出サイトカインに付着する炎症細胞は、ＴＭおよびＥＰＣＲ遺伝子の下向き調節のための刺激物質でもあり得る。炎症細胞は、多量の組織因子も発現し、したがって局所的前凝固性環境を生じる。プロテインＣ活性化の復元は、新生内膜過形成を制限し得る、ということも考えられる。バルーン損傷製ウサギ大腿動脈へのＴＭのアデノウイルス媒介性遺伝子移入は、内膜／中膜日を３８％低減する、ということをＷａｕｇｈは近年実証した（Ｎｗａｓｏｋｗａ Ｏｎ． Ａｎｎ Ｉｎｔ Ｍｅｄ． （１９９５） １２３：５２８； Ｃｈａｎｎｏｎ Ｋ．Ｍ． ｅｔ ａｌ． Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ Ｔｈｒｏｍｂ Ｖａｓｃ Ｂｉｏｌ． （１９９７） １７： １３１３； Ｃｏｏｋ ＪＭ ｅｔ ａｌ． （１９９１） Ｊ． Ｖａｓｃ． Ｓｕｒｇ． １４：１４７； およびＧｏｓｌｉｎｇ Ｍ． （１９９９） Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ ９９： １０４７参照）。
【００９３】
血管の新生内皮が、注意を引いている。それは、正常動脈の内膜と静止性中膜との両方と表現型的に異なり、そしてアテローム硬化症の発症に関してより熱心な基質である、ということを研究は明示した。新生内膜性ＳＶＧは付着分子を発現し、そして単球を循環するための化学誘引物質であるサイトカインを分泌する。酸化ＬＤＬのその後の取込を伴う単球の進入は泡沫細胞の形成を生じ、これは、１〜１５年を経た移植片の５０％以上で同定され得る。ネイティブ血管の場合と同様に、ＳＶＧ中に見出されるアテロームは、破裂して急性冠動脈症候群を引き起こす傾向がある。移植後５〜１０年目に切り出されたＳＶＧの４４％が、付加的血栓を伴う破裂プラークを含有した（Ｍａｎｎ， Ｍ． ｅｔ ａｌ． （１９９５） ＰＮＡＳ （ＵＳＡ） ９２：４５０２参照）。
【００９４】
本発明はこれらの問題を取り扱い、そして、動脈循環への静脈内皮細胞の移植がＴＭおよびＥＰＣＲ発現を変えて、プロテインＣを活性化する能力減少を生じる、という実験的証拠を提供する。プロテインＣ活性化減損は、局所組織因子発現強化と協力して、局所トロンビン生成を促し、これが、短期的には血栓のために、そして長期的にはトロンビン誘導性新生内皮過形成とその後の加速性アテローム硬化症のために、ＳＶＧ不全を促進する。ウイルス媒介性遺伝子移入によるＴＭおよびＥＰＣＲのうちの少なくとも１つ、好ましくはそれらの両方の損失防止は、血栓耐性を復元し、そしてＳＶＧ不全を防止するのに役立つ、と考えられる。
【００９５】
好ましい本発明の方法は、標準検定により確定した場合に、対照血管より少なくとも１オーダー高い大きさで、処置血管のプロテインＣ活性化を増大する。少なくとも約１〜２日、好ましくは少なくとも約１週間またはそれ以上の間、処置血管（移植片）のプロテインＣ活性化増大が検出可能であるのも好ましい。
【００９６】
本発明の一実施態様では、ＴＭおよびＥＰＣＲ作用物質の投与は、血管移植片不全を予防または治療するために好ましい。前記のように、ＴＭおよびＥＰＣＲは、普通は血管の内層上に見出される強力な抗凝固分子であると考えられる。これらのタンパク質は、血管を通って循環する血液を凝固させないことに役立つとも考えられる。以下の実施例で考察されるように、静脈内に通常見出されるＴＭの量は、それらがバイパス術に用いられる場合、劇的に低減される、ということが見出されている。ＴＭおよび／またはＥＰＣＲの量が低減され、それにより静脈移植片を不首尾にし易くする、ということも考えられる。血餅形成および加速性アテローム硬化は、これらの静脈移植片において促される。
【００９７】
本発明の開示は、ヒト静脈移植片疾患のウサギモデル（本明細書中では標準ウサギ静脈移植片検定と呼ばれる）においてＴＭおよびＥＰＣＲ発現の低減を実証することにより、前記の特定の問題を説明する。本発明の治療方法は、一局面において、遺伝子療法アプローチを用いて、ＴＭおよびＥＰＣＲのうちの少なくとも１つ、好ましくはそれらのタンパク質の両方の発現を増大することにより、当該問題を取り扱う。好ましい方法は、早期凝固および加速性アテローム硬化症の発症を防止することにより、当該タンパク質の活性を復元し、そして静脈移植片不全の重症度を防止または低減する。以下の実施例（例えば有効トロンビン抑制が血管損傷後の新生内膜過形成を低減することを示す）を参照されたい。
【００９８】
本発明は、以下の特定の対象を取り扱う。
【００９９】
第一に、本発明は、剖検組織ライブラリー中のヒト伏在静脈移植片によるＴＭ発現を開示する。免疫組織化学的方法を用いて、トロンボモジュリンタンパク質発現の程度および位置（即ち血管層および細胞型）、組織因子発現とのその関係、ならびに年齢との相関を確定する。第二に、本発明は、器官培養中におかれたヒト伏在静脈移植片により長期間のＴＭの発現を調べる。特に本発明は、ｉｎ ｓｉｔｕ凝固検定を用いて、トロンボモジュリン発現と組織因子発現との関係、新生内膜過形成の発生と管腔内膜の血栓耐性の発生を報告する。第三に、本発明は、ヒトトロンボモジュリンを発現する組換えアデノウイルスベクターを用いたヒト伏在静脈移植片の形質導入に関する報告を開示する。目的は、管腔血栓耐性およびトロンビン誘導性新生内膜過形成に及ぼす作用を確定することである。このｅｘ ｖｉｖｏモデルにおけるＴＭ過剰発現が中膜平滑筋細胞増殖、移動および／またはマトリックス分泌を調整し得るか否かを確定することもできる。
【０１００】
さらにその他の本発明の目的としては、自系静脈移植片疾患のウサギモデルにおけるＴＭおよびＥＰＣＲの発現パターン、局所的血栓耐性に及ぼす結果として生じる作用、ならびに早期および後期移植片不全に及ぼすプロテインＣ活性のウイルスベクター媒介性復元の作用を報告することが挙げられる。特に本開示は、１）コンピューター処理定量的免疫組織化学的分析を用いたＥＰＣＲタンパク質のｉｎ ｖｉｖｏ発現の定量、そして自系ウサギ静脈移植片における定量的ＲＴ−ＰＣＲを用いたＴＭおよびＥＰＣＲ遺伝子の発現パターンを確定すること；２）ウサギ静脈移植片における炎症の時間経過の確定、ならびにＴＭおよびＥＰＣＲ発現における変化との相関関係を確立すること；３）ｉｎ ｖｉｔｒｏでの形質導入内皮細胞によりプロテインＣ活性化を最適化するために種々のプロモーターの組合せで、それらの制御下でＴＭおよびＥＰＣＲの両方を発現する一連のアデノウイルスベクターの構築；ならびに４）ウサギ静脈移植片における血栓耐性の復元、炎症の程度および新生内皮過形成の発生に及ぼすＴＭおよびＥＰＣＲのアデノウイルスベクター媒介性発現の作用の確定を示す。
【０１０１】
本明細書中に開示された方法は、宿主レシピエント中に移植される場合、唯一の治療プロトコールとして、即ち特に不全に対して血管を予防または治療するために用いられ得る。しかしながら一実施態様では、本発明は、標準抗凝固剤または抗血小板物質投与を増大するための付属療法として用いられ得る。このようなプロトコールは、血管移植片疾患を治療または予防するための治療量の少なくとも１つの抗凝固、抗血小板、抗血栓または血栓崩壊薬のルーチン投与を包含する。このような標準治療プロトコールの例としては、アスピリン、クロピドグレル、チクロピジン、ジピリダモール、クマジンの、それらの許容可能な誘導体を含めた治療的投与が挙げられるが、これらに限定されない（Ａ．Ｇ． Ｇｉｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ， ９ｔｈ Ｅｄ． ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ Ｉｎｃ． Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（種々の適切な薬剤を用いた認識済抗凝固プロトコールを開示する）参照）。
【０１０２】
本発明は、必要に応じて、特定の抗凝固剤または抗血小板物質プロトコールの前、最中または後に実施され得る。特に、選択される抗凝固、抗血小板、抗血栓または血栓崩壊薬またはその他の薬剤のうちの１つまたはそれ以上の投与が、本発明の方法の実施の前、最中または後に実行され得る。好ましい投与経路に関しては、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ （Ｍａｃｋ Ｐｕｂ． Ｃｏ．， Ｅａｓｔｏｎ， ＰＡ， １９８０）を参照されたい。一実施態様では、血管を治療するための方法は、核酸が少なくとも１つのその他のこのような薬剤、好ましくは抗凝固分子、さらに好ましくはヒルジンをコードするよう適応される。本発明の別の実施態様では、抗凝固薬、鎮痛薬、抗血栓薬、血栓崩壊薬またはその他の薬剤が、過程ａ）で、または本発明の過程ｃ）後に投与される。
【０１０３】
本発明の実際の好ましい血管移植片治療法は、認識されたパラメター、例えば選択される特定の作用物質（例えばＴＭ、ＥＰＣＲまたは両方）、用いられる特定の血管、および選択されるベクターと一致して変わる、と理解される。付加的パラメターとしては、適用および移植の方式、移植片の投与の特定部位、患者の体重、全身健康状態、性別等、治療される特定の適応症等、ならびにその他、例えば担当医師または獣医師を含めた当業者により認識されるような因子が挙げられる。投与の所定プロトコールのための最適投与速度は、慣用的投与量決定試験を用いて当業者により容易に確定され得る。
【０１０４】
「標準トロンボモジュリン検出検定」という語句は、例えば実施例２に記載された検定を意味する。要するに、移植片切片が調製され、ＴＭ染色のために適切な抗ＴＭポリクローナル抗体と接触される。ＴＭ発現が検出され、好ましくはデジタル閾値分析を用いて定量される。細胞損失に関して照査するために、フォンウィリブランド因子（ｖＷＦ）に関しても切片を染色する。抗体染色を実施するための方法は一般に、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．（上記）に記載されている。
【０１０５】
「標準アテローム硬化ウサギ静脈移植片モデル」という語句は、例えば実施例１３に記載されたモデルを意味する。一般的に当該モデルは、アテローム硬化症を発症しやすくされた特定のウサギにおいて実施例１に記載したウサギ静脈移植片モデルを実施することを包含する。移植片は、前記のように操作され、収穫される。脂質負荷マクロファージ（泡沫細胞）が検査により検出され、好ましくは計数される。典型的には、移植片中の有意の泡沫細胞の存在は（適切な対照移植片と比較した場合）、加速性アテローム硬化を示す。
【０１０６】
「人工移植片」という用語は、天然または組換え操作内皮細胞を植えつけられた合成または半合成血管物質を意味する。内皮細胞を収穫し、操作するための方法は記載されている（例えばＷＯ　９７／３００８３、ＷＯ　９３／１３８０７、Ｌｕｎｄｅｌｌ， Ａ． ｅｔ ａｌ． （１９９９） Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ １００：２０１８、ＪＪ． Ｒａｄｅ、上記、ＪＪ． Ｒａｄｅ （１９９９） Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ６：３８５参照）。このような移植片のさらに特定の例としては、合成繊維、例えばダクロン、テフロン、ゴア−テックス（それらの組合せを含む）から作られる（全部または一部）ものが挙げられる。本発明の好ましい人工移植片は、全部または一部分、ダクロン、テフロンまたはゴア−テックスから作られ、そして本明細書中に定義されたような少なくとも１つの作用物質を発現するために形質導入された植付け内皮細胞を包含する。好ましい作用物質としては、ヒトＴｍ、ヒトＥＰＣＲ（それらの機能性断片を含む）が挙げられる。
【０１０７】
以下の実施例は本発明の例示であって、本発明を限定するものではない。
【０１０８】
【実施例】
実施例１−標準ウサギ静脈移植片モデル
前記の十分に特性化されたウサギ静脈移植片モデルを、本実施例で説明する。本モデルを用いて、静脈移植片不全の病理、ならびに移植片血栓耐性、新生内皮過形成およびアテローム硬化症の発症に及ぼすウイルス媒介性遺伝子移入の作用を試験し得る。さらに、それは、関連ヒト病理を代表する。概して、本モデルは、末端−側面方式で、同側頚動脈循環中に頚静脈のセグメントを置くことにより作製される。移植直前に、静脈移植片セグメントは、本発明の少なくとも１つの適切なウイルスベクターを形質導入される。
【０１０９】
Ａ．外科的技法−　本モデルの実施は、体重２．５〜３．５ｋｇのパスツレラ属細菌無含有オスニュージーランドホワイトウサギを使用することを包含する。対照および実験群はすべて、術後死亡および移植片血栓症を説明するために統計学的有意＋１５％（われわれの実験室における損失率）を達成するのに必要な最小数に限定した。
【０１１０】
滅菌計器および技法を用いて、手術用スイートｓｕｉｔｅで本手法を実施した。耳静脈を介してキシラジン（７ｍｇ／ｋｇ）およびケタミン（３５ｍｇ／ｋｇ）を用いて麻酔を誘導し、次に気管内挿管後にハロタン（０．５〜１．０％）吸入麻酔薬で維持した。手術中、心拍数および心調律を計測的にモニタリングした。動物を準備し、滅菌布で包んで、正中頚部切開して、左頚動脈および頚静脈を露呈した。頚静脈の３ｃｍセグメントを単離し、遠位断端を結繋した。近位断端をカニューレ挿入し、洗浄して、次に適切な用量のウイルスを含有する２００：１のＭ−１９９培地またはＭ−１９９培地単独（対照）を充填した。１時間インキュベーション後、静脈セグメントをＭ−１９９培地で洗浄し、動物から取り出して、滅菌食塩水中に入れた。次に同側頚動脈を単離し、動物に３００Ｕの硫酸ヘパリンを静脈内投与した。次に、手術用顕微鏡の助けを借りて置かれた８−Ｏポリプロピレン縫合糸を用いて、静脈セグメントを分割頚動脈と末端−側面方式で吻合した（図１）。局部パペベリンを適用して痙攣を防止し、３−Ｏ皮下縫合糸および皮膚用ステープルで創傷を閉じた。動物を手術用スイートで抜管し、心臓手術動物実験室中で少なくとも２４時間、回復させた後、動物保持施設に戻した。
【０１１１】
術後鎮痛薬（ブプレノルフィン０．０１〜０．０５ｍｇ／ｋｇを１２時間ごとに皮下投与）を常套的に最初の２４時間、動物が痛がっているようであればさらにそれ以上の間、投与した。われわれの経験では、ウサギは手術後１時間以内に迅速に回復し、そして一般に有意の疼痛を伴わない。手術から迅速に（最初の２４時間以内）回復しない動物は、通常は全身性疾患状態（例えば肺炎からの）であり、安楽死させる。
【０１１２】
移植片収穫の時点で、ウサギを麻酔し、前記のように再挿管した。移植片を収穫後、過剰用量の塩化カリウムを用いて動物を安楽死させた。さらに、苦しんでいる任意の動物を、過剰用量のペントバルビタール（５０ｍｇ／ｋｇ）で安楽死させる。
【０１１３】
Ｂ−　結果　ウサギ頚静脈セグメントは、頚動脈循環中への移植後早くも１時間で、フィブリン沈着および血小板付着を伴う部分的内皮裸出を示す。移植後最初の２週間以内に、内皮再生が完了し、新生内皮が生成し始めた。ＳＭＣ増殖は移植後１週間でピークを示し、２〜４週間以内に実質的に低減し、そして１２週までにほぼ静止レベルに戻る。有意のＳＭＣ増殖が終止（４週間まで）後、マトリックス沈着は継続し、１２週間までの間、新生内皮質量を増大する。完全成熟時に、移植片壁厚はほぼ１０倍に増大し、そのほとんどが新生内皮過形成によるものである。
【０１１４】
Ｄａｖｉｅｓは、光学および電子顕微鏡を用いて、移植後数時間以内に内皮が伸びるようになり、そして収縮し始めるが、しかし内皮細胞損失それ自体はほとんど認められない、ということを実証した（Ｄａｖｉｅｓ， ＭＧ． （１９９３） Ｅｕｒ． Ｊ． Ｖａｓｃ． Ｓｕｒｇ． ７：１５６参照）。次の数日間、炎症細胞が管腔表面に付着し、浮腫性内皮下層中に移動するのが観察され得る。われわれはこれを、走査電子顕微鏡を用いて本実施例にしたがって調製した移植片においても認めた（図２Ａおよび２Ｂ）。１４日までに、内皮再生はほぼ完了する。Ｚｗｏｌａｋは、ＳＭＣ増殖の血管リモデリングへの関与を細心の注意を払って特性化した：移植後１週目のＳＭＣ増殖指数ピークは２〜４週間以内に実質的に低減し、そして１２週までにほぼ静止レベルに戻る。有意のＳＭＣ増殖が終止（４週間まで）後、マトリックス沈着は継続し、１２週間までの間、新生内皮質量を増大する。完全成熟時に、移植片壁厚はほぼ１０倍に増大し、そのほとんどが新生内皮過形成によるものである。動物に高コレステロール餌を供給する場合、新生内皮は、顕著な泡沫細胞浸潤を伴う初期アテローム硬化の変化を示す。
【０１１５】
図２Ａ〜Ｂは、以下のようにさらに特定的に説明される。本図面は、移植後１日目（図２Ａ）および７日目（図２Ｂ）に収穫したウサギ静脈移植片の管腔表面の走査電子顕微鏡写真を示す。７日目の、保存内皮細胞取込み、白血球付着ならびに血小板およびフィブリン沈着に留意されたい。
【０１１６】
実施例２−静脈移植片におけるトロンボモジュリン（ＴＭ）発現
実施例１に前記したのと同様に、ウサギ静脈移植片モデルを実施した。免疫組織化学分析を用いて、静脈移植片で、ＴＭ発現を確定した。図３は、正常ウサギ頚静脈（０日目移植片）と、移植後３および４２日目に収穫し、特異的抗ウサギＴＭポリクローナル抗体（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ Ｉｎｃ．）を用いてＴＭに関して染色した移植片の代表的切片を示す。ＴＭ発現は、移植のすぐ後にウサギ静脈移植片において劇的に減少し、そして４２日までに部分的回復を示すことが判明した。ＴＭ発現における変化をさらに完全に定量化するために、中間時間点で収穫されたウサギ静脈移植片をＴＭに関して染色し、デジタル閾値分析を用いて、ＴＭ発現の量を定量した。内皮細胞損失に関して照査するために、フォンウィリブランド因子（ｖＷＦ）に関して、ポリクローナル抗ヒトｖＷＦ抗体（Ｓｉｇｍａ）を用いて染色し、同様の様式で（図３）２８日間分析した。ＴＭ発現は、正常頚静脈（０日目移植片）と比較して、３日目移植片では９８％低下することが判明した。４２日目までに、ＴＭ発現は部分的に回復したが、しかし頚静脈および頚動脈対照と比較して、それぞれ５５％および４２％に過ぎなかった。静脈循環中に再移植した静脈移植片（ＶＶＧ）はＴＭ染色の低減を示さず、このことは、外科的手法それ自体はＴＭ発現に有意の作用を及ぼさなかったことを示唆する。ｖＷＦに関する染色は全時点で一貫しており、静脈および動脈対照に匹敵したが、このことは、ＴＭ発現の低減が内皮細胞損失のためでなかったことを示唆する。
【０１１７】
これらの結果は、動脈循環中への静脈移植片の移植がＴＭ発現を低減し、これが移植片血栓耐性現存を生じる、ということを示唆する。血栓耐性低減は、局所的トロンビン生成をうながし、これが、短期的には血栓のために、そして長期的にはアテローム硬化症の加速のために、ＳＶＧ不全を促進する。遺伝子移入技法によるＴＭ損失の防止は、血栓耐性を復元し、そしてＳＶＧ不全を防止する。
【０１１８】
図４Ａ〜Ｄは、ウサギ静脈移植片におけるネイティブウサギトロンボモジュリンおよびフォンウィリブランド因子タンパク質発現を示す。図３は、デジタル閾値分析を用いてこのような発現を定量する。データは、ｎ＝３〜６＋／−ＳＤ血管／時点の平均であり、任意の単位（ＡＵ）／管腔周囲長として表される。
【０１１９】
実施例３−プロテインＣを活性化するウサギ静脈移植片の能力と局所的トロンビン活性化との間の関係
無競争局所的トロンビン活性化は、初期静脈移植片不全の最も近い原因である。正常血管では、少量のトロンビンが継続的に生成される。内皮細胞上に大量に存在するＴＭは、トロンビンを結合し、そしてプロテインＣの活性化により前凝固剤から抗凝固剤分子にその活性部位特異性を変換する。活性化プロテインＣ（ＡＰＣ）は、その補助因子タンパク質Ｓとともに、凝固因子ＶａおよびＶＩＩＩａを分解し、それによりさらなるトロンビン生成を協力に抑制する。ＴＭ発現の損失は、プロテインＣを生成する移植片内皮の能力低減と、その後の局所的トロンビン生成の促進を生じると予測される。
【０１２０】
移植片血栓耐性に及ぼすＴＭ発現低減の結果を確定するために、プロテインＣを活性化する移植片内皮の能力ならびに移植片表面に結合されるトロンビン活性の量（局所的トロンビン活性化の測定値）の両方を、われわれは測定した。このｉｎ ｓｉｔｕ検定では、管腔表面が既知の表面積を有するウエルの底を形成するように、縦方向に分割された血管セグメントをアクリル鋳型に入れた。血管を１０ｎＭのα−トロンビンおよび１．０ＭのプロテインＣとともに２０分間インキュベートし、その後、余分量のヒルジンを付加した。上清を取り出して、生成された活性化プロテインＣ（ＡＰＣ）の量を、ＡＰＣ標準曲線と比較しながら、Ｋｉｎｅｔｉｃ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ （Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）で色原性基質Ｓ−２３６６（Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｘ）の変換を測定することにより確定した。予測どおり、ＡＰＣを生成する移植片の能力は、ＴＭタンパク質発現と平行した。７日までに、プロテインＣ活性化は、対照頚静脈と比較してほぼ９５％だけ低減され、４２日目までに不完全回復を示した（図５）。ＴＭタンパク質発現の場合と同様に、６週間でのＡＰＣ形成は、大動脈対照より依然として有意に低かった。
【０１２１】
同一アクリル鋳型を用いて、移植片表面の結合トロンビン活性を測定した。血管を、相対的トロンビン特異的色原性基質Ｓ−２２３８（Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｘ）とともに３７ＥＣで２０分間インキュベートした。次に移植片を余分量のヒルジンで洗浄し、Ｓ−２２３８とともに再びインキュベートした。ヒルジン処理の前および後の吸光度の差は、結合トロンビン活性への関与可能な基質の変換である。これは、トロンビン標準曲線との比較により定量される。結合トロンビン活性は、ＡＰＣを生成する移植片の能力と反比例することが判明した（図５）。トロンビン活性は、７日目にほぼ３０ｍＵ／ｃｍ２でピークであったが、しかし１４〜２８日間は依然として高かった。７日目の結合トロンビン活性の程度は、ウサギ大腿動脈に対する急性バルーン損傷後に見出されたものとほぼ同様であったが、しかし有意に長い持続期間を有した（Ｄｒｙｊｋｓｉ ｅｔ ａｌ． （１９８５） Ｔｈｒｏｍｂ Ｈａｅｍｏｓｔ， ５４：７７３およびＧｈｉｇｌｉｏｔｔｉ ｅｔ ａｌ．， （１９９８） Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ Ｔｈｒｏｍｂ Ｖａｓｃ １８：２５０）。
【０１２２】
図５は、移植後３〜４２日に外植されたウサギ静脈移植片におけるプロテインＣを活性化する能力の損失と結合トロンビン活性の量の増大との間の逆関係を示す。データは、ｎ＝３移植片／時点の平均±ＳＥＭである。
【０１２３】
実施例４−ＴＭのウイルスベクター媒介性遺伝子移入による局所的ｉｎ ｖｉｖｏトロンビン抑制
前記実施例は、ＴＭ発現の損失と局所トロンビン活性化強化との間の関連を実証する。ＴＭ損失を防止するかまたはＴＭ発現を復元する戦略は、ＡＰＣを生成し、そして局所的トロンビン活性化を低減するかまたはなくする移植片の能力を復元すると予測された。有効な場合、このような戦略は、初期静脈移植片不全の速度を有意に低減し得る。本実施例は、ウサギ静脈移植片によりＴＭ発現を復元するために第一世代アデノウイルスベクターを使用する。
【０１２４】
Ａ．ウサギ静脈移植片へのアデノウイルス媒介性遺伝子移入の最適化
静脈移植片への有効遺伝子移入を達成するためのアデノウイルスベクターの最適用量を決定するために、実験を実施した。上昇用量のＡｄＣＮＬａｃＺ、マーカー遺伝子を発現する第一世代アデノウイルスベクター、核標的化β−ガラクトシダーゼを用いて、実施例１に記載したように、ウサギ静脈移植片を形質導入させた。３日目に、移植片を収穫し、ＥＬＩＳＡを用いて血管抽出物中で∃−ガラクトシダーゼ抗原を確定し、そして総タンパク質に標準化した（図６Ａ）。結果は、ｎ＝４±ＳＥＭ血管／用量の平均である。∃−ガラクトシダーゼ発現は、３．７５ｘ１０１０プラーク形成単位（ｐｆｕ）／ｍｌの用量でプラトーに達した。これは、すべてのその後の試験に用いられる用量であった。導入遺伝子発現の持続時間を確定するために、移植片を指示時間に収穫し、血管抽出物をＥＬＩＳＡによるβ−ガラクトシダーゼ発現に関して検定した（図６Ｂ）。結果は、ｎ＝４±ＳＥＭ／時点の平均である。導入遺伝子発現は６日目にピークになり、９日までに急速に低下した。β−ガラクトシダーゼ抗原は、非形質導入血管中では検出されなかった。図６Ｃは、３．７５ｘ１０１０ｐｆｕ／ｍｌの用量でＡｄＣＮＬａｃＺを用いて形質導入し、３日目に収穫したウサギ静脈移植片の管腔表面の肉眼検査を示す。青色は、成功した遺伝子移入およびβ−ガラクトシダーゼ発現を意味する。矢印は動脈静脈吻合を示す。
【０１２５】
図７Ａ〜Ｂは、ＡＤＣＮＬａｃＺおよびＡＤＴｍｈ５の構築を示す模式図である。略語の説明に関しては、Ｈａｒｄｙ， Ｓ． ｅｔ ａｌ． （１９９７）（上記）を参照されたい。
【０１２６】
Ｂ．ウサギ静脈移植片へのトロンボモジュリンのアデノウイルス媒介性移入
ヒトＴＭ遺伝子をコードするｃＤＮＡをアメリカ培養細胞コレクション（ＡＴＣＣ）から入手し、シャトルベクター中でクローン化して、図７に示したように標準方法により第一世代アデノウイルスベクター（ＡｄＴＭｈ５）を生成した。ウサギ頚静脈内皮細胞の形質導入は、ＴＭ抗原の発現における、そしてプロテインＣを活性化する能力における用量依存性増大を生じる（図８Ａおよび８Ｂ）。前記のようにヒトＴＭに特異的なＥＬＩＳＡを用いた抗原（図８Ａ）およびプロテインＣ検定を用いた活性（図８Ｂ）により、ＴＭ発現を定量した。値は、ｎ＝３±ＳＥＭの平均である。
【０１２７】
これらのｉｎ ｖｉｔｒｏ実験後、形質導入ウサギ静脈移植片によりヒトＴＭのｉｎ ｖｉｖｏ発現を媒介するＡｄＴＭｈ５の能力を評価した。ウイルス無含有、３．７５ｘ１０１０ｐｆｕ／ｍｌのＡｄＴＭｈ５またはＡｄＮｕｌｌ−１、導入遺伝子を発現しないアデノウイルスベクターを用いて、ウサギ静脈移植片を形質導入した。ＡｄＴＭｈ５を用いたウサギ静脈移植片の形質導入は、ヒトＴＭ特異的モノクローナル抗体（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ）を用いた免疫組織化学的検出により査定した場合、３日目に移植片内皮および平滑筋細胞によるヒトＴＭタンパク質の有意の発現を生じた。ヒトＴＭに特異的なＥＬＩＳＡを用いて血管抽出物中でＴＭ発現を低両し、総タンパク質に対して標準化した（図９）。アデノウイルス媒介性ヒトＴＭ発現は７日目にピークに達し、１４日間に亘ってずっと実質的であった。意外にも、ＴＭ発現は、少量であるとはいえ、４２日までの間、検出可能であった。非形質導入およびＡｄＮｕｌｌ−１形質導入移植片は、任意の検出可能量のヒトＴＭをいかなる時点でも有さなかった。
【０１２８】
図９は、形質導入ウサギ静脈移植片によるヒトＴＭのアデノウイルス媒介性発現の大きさおよび継続期間を示す。値は、ｎ＝３動物±ＳＥＭの平均である。
【０１２９】
実施例５−トロンボモジュリン発現の復元はＡＰＣ生成を増大し、トロンビン活性化を低減する
実施例２および３は、ＴＭ発現の損失がＡＰＣを生成する静脈移植片の能力を低減するという概念およびその結果としての初期移植片不全を引き起こす局所トロンビン活性化の強化を例証する。実施例４は、アデノウイルス媒介性遺伝子移入が、形質導入静脈移植片によるＴＭ発現を有効に復元し得る方法を例証する。アデノウイルス媒介性ＴＭ発現が次にＡＰＣ生成能力の復元および局所トロンビン生成低減を生じるか否かを確定しようとわれわれは努めた。
【０１３０】
３．７５ｘ１０１０ｐｆｕ／ｍｌのＡｄＴＭｈ５またはＡｄＮｕｌｌ−１を用いてウサギ静脈移植片を形質導入させて、ＡＰＣを生成する能力を、移植後１〜４２日間に測定した（図１０）。ＡｄＴＭｈ５を用いた形質導入は、ＡＰＣを生成する移植片の能力の超生理学的復元を生じた。この作用は７日目にピークであったが、しかし移植後４２日後にも存在した。
【０１３１】
図１０を、より詳細に説明する。指示時間で収穫された形質導入ウサギ静脈移植片中のｉｎ ｓｉｔｕプロテインＣ活性化。データは、ｎ＝３移植片／時点の平均±ＳＥＭである。０日目は、非形質導入頚静脈である。正常大動脈セグメントに関する値は、比較のために示される。
【０１３２】
結合トロンビン活性を、ウイルス無含有、ビヒクル対照、ＡｄＴＭＨ５またはＡｄＮｕｌｌ−１を用いて同様の方式で形質導入された移植片において、ピーク活性化の時間である７日目に測定した（図１１）。ＡｄＴＭｈ５による形質導入は、正常ウサギ静脈において見出されるのと同様のレベルに、対照と比較して約８５％、結合トロンビン活性の量を低減した。これは、ＴＭ発現の復元が、ＡＰＣを生成する静脈移植片の能力を同様に復元し、したがって局所トロンビン活性化を抑制するという仮説を確証する。
【０１３３】
図１１を、以下でさらに詳細に説明する。形質導入および対照ウサギ静脈移植片を７日目に収穫し、結合トロンビン活性をｉｎ ｓｉｔｕで測定する。値は、ｎ＝５移植片／群の平均±ＳＥＭである。正常ウサギ下大静脈（ＩＶＣ）および大動脈に関する値が、比較のために示される。Ｕｎｔｘ‘ｄ＝非形質導入移植片。ビヒクル＝ウイルスを含有しないビヒクルでインキュベートした移植片。
【０１３４】
実施例６−ヒトＳＶＧにおけるトロンボモジュリン発現の変化
ヒト伏在静脈移植片（ＳＶＧ）の固定切片中のヒトトロンボモジュリンの発現を検出し、定量することができる。好ましい検体は、冠動脈バイパス術後、種々の時間（数時間〜数年）で息を引き取った患者からである。検体をホルマリン固定し、パラフィン包埋し、または凍結切片作製のためにＯＣＴで調製し得る。目的は、ウサギ静脈移植片中で観察されたヒトＳＶＧ中のＴＭの発現の変化を比較することである。ＴＭの損失および発現および静脈移植片不全の時機間の相関が次に成され得る。
【０１３５】
以下のプロトコールを用い得る。マウスモノクローナル抗ヒトＴＭ抗体を用いて、ヒトＴＭに関して組織切片を染色する（Ｄａｋｏ ＴＭ １００９ （Ｄａｋｏ， Ｃａｌｅｎｔｅｒｉａ， ＣＡ））。この抗体は、新鮮凍結またはパラフィン包埋切片中のＴＭを認識する。切片を、適切なビオチニル化二次抗体とともにインキュベートし、そしてホースラディッシュペルオキシダーゼ標識化ストレプタビジンとともにインキュベートする。アミノエチルカルバゾール（Ｄａｋｏ）によりペルオキシダーゼ活性（赤色反応産物）を明示する。細胞特異的抗体を用いて、細胞構成成分（即ち、ＳＭＣ、内皮およびマクロファージ）を同定する。ＳｉｇｍａＳｃａｎ４．０ソフトウエア（ＳＰＳＳ， Ｃｈｉｃａｇｏ ＩＬ）を用いてＰＣコンピューターに連結されたオリンパスＢＸ６０顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ Ａｍｅｒｉｃａ， Ｍｅｌｖｉｌｌｅ， ＮＹ）上に据え付けたＤＭＣデジタル顕微鏡カメラ（Ｐｏｌａｒｏｉｄ， Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ， ＭＡ）からなるコンピューター処理画像形成システムを用いて、ＴＭおよびＴＦ発現の両方を定量する。特に、適切な抗体で染色し、ヘマトキシリンで対比染色した切片をデジタル化し、当該領域（即ち内膜、新生内膜または中膜）を、カーソルを用いて強調表示し、バックグラウンド染色を排除する。選定領域における色強度を、色閾値分析を用いて定量する。４つの血管四分円の平均を各切片に関して算定し、各々少なくとも７５：ｍ離れた４つの血管切片の平均を確定し得る。この方法で、新生内膜および中膜トロンボモジュリンおよび組織因子発現を定量し得る。
【０１３６】
ＴＭの初期発現パターン、ならびにその後のプロテインＣを活性化する能力に及ぼす作用を、器官培養中に入れたヒトＳＶＧにより長期間検査し得る。余分のＳＶＧセグメントを冠動脈または末梢バイパス術の時点で入手し、器官培養中に入れる。器官培養中に入れたＳＶＧセグメントは、少なくとも１４日間、ずっと生存可能であり、そしてそれらの内皮細胞完全性を保持する。このモデルを用いて、静脈移植片新生内膜過形成の病理生物学を調べ、ならびに遺伝子移入実験をお実施した。ＴＭタンパク質発現、およびプロテインＣを活性化する能力の測定値を、前記と同様に測定する。
【０１３７】
特に、冠動脈バイパス術を受けている患者からＳＶＧセグメントを入手する。これらの余分のセグメントの「外科的調製」は移植セグメントの場合と同一であり、その例としては、外膜ストリッピング、側鎖結繋、温和手動膨張および３０〜１２０分間のヘパリン処理食塩水中貯蔵が挙げられる。セグメントを、２０ｎＭのＨＥＰＥＳで緩衝させた、そして２ｍＭのグルタミン、０．２２５ｍｇ／ｍｌの塩酸パパベリン（Ｓｉｇｍａ， Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ）および１ｘ抗生物質／抗真菌性溶液（Ｂｉｏｆｌｕｅｄｓ， Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ， ＭＤ）を含有する予熱ＲＰＭＩ培地中に収集する。セグメントを縦方向に開き、横方向に５〜１０ｍｍの長さで切断して、２ｍＭのグルタミン、１ｘ抗生物質／抗真菌性溶液および３０％熱不活性化ウシ胎仔血清（Ｓｉｇｍａ）を含有する予熱ＲＰＭＩ培地中で、管腔側面を上にして、３７℃で５％ＣＯ２下で培養する。
【０１３８】
実施例７−アデノ随伴ウイルス媒介性遺伝子移入を用いるヒトＳＶＧに対するトロンボモジュリンの長期発現
血管壁への生物活性タンパク質のアデノウイルス媒介性送達は、かなり効率的であることが判明した。しかしながら、いくつかの設定において、導入遺伝子発現、前炎症応答およびベクター免疫原性が一過性であるとすると、ヒト静脈移植片の長期遺伝子修飾を促進するためには臨床的適用可能性を最大にすることが有用である。アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、複製のためにヘルパーウイルス（アデノウイルスまたはヘルペスウイルス）を要する非病原性ヒトパルボウイルスである。いくつかの特徴は、組換えＡＡＶを遺伝子移入のための魅力的ベクターにする：１）ＡＡＡＶは標的細胞ゲノム中に安定的に組み込まれて、持続性導入遺伝子発現を促し、２）アデノウイルスと同様に、ＡＡＶベクターは非分裂中細胞を形質導入し得るし、３）ＡＡＶ粒子は高力価に精製され得るし、４）ＡＡＶプロウイルスの組込みは標的細胞表現型に及ぼす見掛けの不適当な作用を生じないし、５）ＡＡＶベクターは広範な組織向性を有し、そして６）ＡＡＶベクターは宿主免疫応答を起こすとは思われない。これらの理由のために、ＡＡＶベクターは一般にいくつかの遺伝子療法臨床試験に用いられている。
【０１３９】
ＡＡＶベクターは、ｉｎ ｖｉｖｏ血管遺伝子移入のために用いられてきた。Ｇｎａｔｅｎｋｏ等は、∃−ガラクトシダーゼを発現する組換えＡＡＶベクターの管腔内送達が、非損傷ラット頚動脈の内膜および中膜を通してほぼ１００％の感染を生じる、と報告した。感染を、ｉｎ ｓｉｔｕＰＣＲを用いて査定したが、感染は、導入遺伝子を発現するウイルスの能力を反映し得ない。定量的β−ガラクトシダーゼ発現は、対照と比較して２０倍に増大された。発現のこの大きさは、損傷ラット頚動脈中のβ−ガラクトシダーゼのアデノウイルスベクター媒介性発現に関して見出されたものと同様であり、この場合、典型的には３０％の中膜ＳＭＣが形質導入される。Ｒｏｌｌｉｎｇ等は、同様のＡＡＶウイルスを形質導入された損傷および非損傷ラット頚動脈が少なくとも２０〜３０日間、β−ガラクトシダーゼを発現することを見出した。長期導入遺伝子発現の可能性のために、ＡＡＶベクターは、ヒト自系ＳＶＧの遺伝子修飾のために適応可能であると思われる。特定のＡＡＶベクターの使用を、以下のＡ節で考察する。
【０１４０】
本実施例のＡＡＶベクターを用いて、大規模ウイルス調製およびヒトＳＶＧの感染を促し得る。特に、器官培養中のヒトＳＶＧを感染させるＡＡＶベクターの能力を確定し、そして導入遺伝子発現の動力学を確定し得る。これらの実験は、ウサギ静脈移植片モデルを用いて実施されているものの補足物として用い得る。さらに、ヒト臨床試験に用いられ得る形質導入プロトコールを開発し、最適化するよう努めることも可能である。
【０１４１】
Ａ．ベクター構築
ヒトトロンボモジュリン（ＴＭ）を発現する組換えＡＡＶベクター、ＡＡＶ２ｈＴＭは、β−ガラクトシダーゼを発現する対照ベクターであるＡＡＶ２β−ｇａｌに関して前記したのと同様に生成し得る（組換えベクター生成の詳細に関しては、Ｚａｂｎｅｒ ｅｔ ａｌ． （２０００） Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７４：３８５２およびＣｈｉｏｒｉｎｉ ｅｔ ａｌ． （１９９５） Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ １２：１５３１参照）。ｎＬａｃＺｃＤＮＡの切り出し後に、ＴＭｃＤＮＡをシャトルベクターｐＡＡＶＲｎＬａｃＺ中でクローン化する。このシャトルベクターは、２つのフランキングＡＡＶ逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列、ラウス肉腫ウイルス長末端反復プロモーターおよび下流サルウイルス−４０ポリアデニル化シグナルを含有する。ＡＡＶＩＴＲ配列は、ウイルス複製に必要なシス作用素子を要する。シャトルベクターおよびヘルパープラスミドｐＳＶ４０ｏｒｉＡＡＶを、電気穿孔を用いてＣＯＳ細胞中に同時トランスフェクションする。ｐＳＶ４０ＯｒｉＡＡＶは、ＡＡＶＲｅｐおよびＣａｐ遺伝子を含有して、それぞれ必要な複製および構造タンパク質をコードする。同時トランスフェクション後、ＣＯＳ細胞を野生型アデノウイルスに感染させて、７２時間後に収穫する。粗製ウイルス溶解物を加熱して、ヘルパーアデノウイルスを不活性化し、次に塩化セシウム遠心分離により精製する。精製ウイルスストックを、ドット−ブロットハイブリダイゼーション法により滴定して、野生型ＡＡＶおよびヘルパーウイルス汚染に関して試験する。この方法は、１０１１感染単位（ＩＵ）／ｍｌまでの力価を有するウイルスストックを生成した。
【０１４２】
Ｂ．伏在静脈移植片（ＳＶＧ）中への遺伝子移入
外科的調製ＳＶＧ移植片セグメントを広範に洗浄して、残留ヘパリンを除去し、次に分割して、前記の実施例１に記載したようにカニューレ挿入する。ヘパリンは、ウイルス細胞受容体に関して競合することにより、２型ＡＡＶ形質導入を抑制することが示された。前期のように１０９〜１０１１ＩＵ／ｍｌの範囲の用量でＡＡＶ、β−ガラクトシダーゼを用いて、セグメント（各群ｎ＝１０）を形質導入した。β−ガラクトシダーゼを発現する組換えＡＡＶベクターで感染させたヒト臍帯静脈内皮細胞は５〜７日間、有意の導入遺伝子発現を明示しないため、７日目にＥＬＩＳＡによりβ−ガラクトシダーゼに関してＳＶＧセグメントを査定する。一旦最適用量が確定されれば、セグメント（各群ｎ＝１０）を形質導入し、１４日間の期間（移植片が残存する場合にはそれ以上の期間）中種々の時点で収穫して、導入遺伝子発現の動力学を確定する．実験は、最適停滞時間およびビヒクルを確定するためにも実施する。
【０１４３】
ＡＡＶベクターはアデノウイルスベクターより有意に小さい（それぞれ２０ｎｍ対１００ｎｍ）ため、管腔送達後の組織分布は、アデノウイルスに関するものとはおそらくは異なる。無傷内皮が、アデノウイルスベクターの管腔内送達後の中膜平滑筋細胞の形質導入の難攻不落のバリアであることが、いくつかの種において報告されている。これは、非損傷動脈におけるＡＡＶベクターによる有意の中膜細胞系質導入を実証したＲｏｌｌｉｎｇおよびＧｎａｔｅｎｋｏの両者により報告されたものと対照を成している。静脈移植片の内皮が移植中に部分的に裸出されるため、有意の中膜ＳＭＣ−形質導入は一結果であると考えられる。デジタル画像形成分析を用いて、内皮細胞と比較して、中膜平滑筋および外膜細胞の形質導入効率を定量し得る。
【０１４４】
ＡＡＶ２β−ｇａｌを用いた予備実験後、ＡＡＶ２ｈＴＭを用いて形質導入したＳＶＧセグメント中で、ＴＭ発現を最適化する。ＡＡＶ対アデノウイルス媒介性ＴＭ発現の程度および持続時間を比較することが可能である。血栓耐性およびアテローム硬化症に及ぼすＡＡＶ２ｈＴＭ媒介性ＴＭ発現の作用は、実施例３および４に前記したのと同様に査定し得る。
【０１４５】
実施例８−ウサギ静脈移植片中のＥＰＣＲの発現
内皮細胞によるＴＭの発現は、血管血栓耐性の重要な決定因子の１つである。プロテインＣと結合する２３５アミノ酸内皮細胞特異的膜貫通タンパク質が近年発見され、内皮細胞プロテインＣ受容体（ＥＰＣＲ）と命名された。ＥＰＣＲはプロテインＣ（Ｋｄ＝３０ｎＭ）と結合し、それをトロンビン／ＴＭ複合体に「提示」し、したがってプロテインＣ活性化の速度を増大する。ＥＰＣＲは、主として大型動脈および静脈の内皮により発現される。ＥＰＣＲ活性のｉｎ ｖｉｖｏ調節は、ＴＭに関する場合と同様に十分に定義されているわけではない。ＴＭと同様、ＥＰＣＲ遺伝子は、炎症性サイトカイン、例えばＴＮＦ−αへの曝露により下向き調節される。剪断応力がどんな作用をＥＰＣＲ発現に及ぼすのかは不明である。
【０１４６】
培養中のヒト臍帯静脈内皮細胞は、〜７００，０００分子のＥＰＣＲ／細胞を発現するが、これに比して、ＴＭ／細胞は〜１００，０００分子である。遮断抗体によるＥＰＣＲと結合するプロテインＣの抑制は、プロテインＣ活性化を９倍以上低減する。さらにリン脂質小胞で実施した再構成試験は、一定ＴＭ濃度で、プロテインＣ活性化はＥＰＣＲ濃度に比例し、そして１４：１という高いＥＰＣＲ：ＴＭ比で飽和しないことを示す。これらのデータは、１）プロテインＣ活性化の病理学的変化を理解するために、ＴＭおよびＥＰＣＲ発現の両方の変化を理解しなければならず、そして２）ｉｎ ｖｉｖｏプロテインＣ活性化を最大にすることを目指す戦略はおそらくはＴＭおよびＥＰＣＲ発現の両方の増大を包含し得る、ということを示唆する。
【０１４７】
ポリクローナルヤギ抗体ｇｔ２６２αｍＥＰＣＲおよびｇｔαｐｇｔＥＰＣＲを得た。これらの抗体は、マウスおよびヒトＥＰＣＲに対して向けられる。ヒトＥＰＣＲをコードするｃＤＮＡも提供された（Ｆｕｋｋｕｄｏｍｅ ａｎｄ Ｅｓｍｏｎ， １９９４ Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ ２６９：２６４８６参照）。これらの抗体の両方がＯＣＴ−凍結組織中のウサギＥＰＣＲを認識するということを実証する試験を実行した。標準手法を用いて、染色パラメターを最適化し、各抗体の特異性を特性かし、そしてＥＰＣＲエピトープが、ＴＭの場合と同様にホルマリン固定組織中で認識されるか否かを確定することが可能である。
【０１４８】
ＥＰＣＲタンパク質発現は、ＴＭと同様の方式で、移植後１〜４２日間に収穫されるウサギ静脈移植片（ｎ＝４血管／時点）で確定される。非操作対側性頚静脈（０日目時点）および頚動脈は、対照として役立つ。ＯＣＴ−凍結切片（または可能な場合には灌流ホルマリン固定切片）を、少なくとも７５μｍ離れて、４つの５μｍ厚薄片を得るよう、切断する。組織を抗ＥＰＣＲ抗体で染色し、適切なビオチニル化二次抗体とともにインキュベートし、その後ホースラディッシュペルオキシダーゼ標識化ストレプタビジンとともにインキュベートする。アミノエチルカルバゾール（Ｄａｋｏ）によりペルオキシダーゼ活性（赤色反応産物）を明示する。ＳｉｇｍａＳｃａｎ４．０ソフトウエア（ＳＰＳＳ， Ｃｈｉｃａｇｏ ＩＬ）を用いてＰＣコンピューターに連結されたオリンパスＢＸ６０顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ Ａｍｅｒｉｃａ， Ｍｅｌｖｉｌｌｅ， ＮＹ）上に据え付けたＤＭＣデジタル顕微鏡カメラ（Ｐｏｌａｒｏｉｄ， Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ， ＭＡ）からなるコンピューター処理画像形成システムを用いて、ＥＰＣＲタンパク質発現を定量する。内膜を遮蔽し、赤色範囲の色強度の程度を、色閾値分析を用いて定量する。閾値に達しているピクセルの数を任意単位（ＡＵ）として表し、管腔周囲（ｍｍ）に標準化する。ＥＰＣＲ発現低減が内皮細胞損失のためでないことを保証するために、隣接切片を、マウスモノクローナル抗ｖＷＦ抗体Ｆ８／Ｆ６（Ｄａｋｏ）を用いて同様の方式で染色し、同様に分析する。
【０１４９】
実施例９−ＴＭおよびＥＰＣＲを発現するアデノウイルスベクターの構築
ＴＭおよびＥＰＣＲの同時発現が、ＴＭ単独の発現よりもプロテインＣ活性化を最大にし得るか否かを確定する。これを成し遂げるために、まず、ＲＳＶプロモーター、ＳＶ−４０ポリアデニル化シグナルおよびＦＬＡＧエピトープをコードする配列（Ｄ−Ｙ−Ｋ−Ｄ−Ｄ−Ｄ−Ｄ−Ｋ）配列番号１に３’末端で融合される全長ヒトＥＰＣＲｃＤＮＡからなる発現カセットを構築する。ＦＬＡＧエピトープによるＥＰＣＲのタグ化はその活性を変更せず、そして間接的ＥＬＩＳＡ（ビオチニル化Ｍ−２モノクローナル抗体（Ｓｉｇｍａ）を利用する）による発現ＥＰＣＲタンパク質のより容易な認識および定量を可能にする。タグ化ヒトＥＰＣＲタンパク質を発現するアデノウイルスベクターＡｄＥＰＣＲ−Ｆを生成する。
【０１５０】
ＴＭを発現しない（ウエスタンブロット分析およびｉｎ ｓｉｔｕプロテインＣ活性化検定によって以前に確定されたように）ＣＯＳ細胞を、ウイルスの総用量が１００ビリオン／細胞の感染多重度（ＭＯＩ）で一定のままであるよう、種々の用量のＡｄＴＭｈ５およびＡｄＥＰＣＲ−Ｆを用いて同時形質導入する。ＴＭおよびＥＰＣＲタンパク質発現をＥＬＩＳＡにより３日目に測定し、プロテインＣ活性化は、培養中の細胞での使用に関して前記したｉｎ ｓｉｔｕ検定の変法により測定する。このようにして、ＴＭ対ＥＰＣＲタンパク質発現のどの相対比が所定総用量のウイルスに関して最大プロテインＣ活性化を生じるかを確定する。１００のＭＯＩでのウイルス単独を用いた形質導入により生じるプロテインＣのレベルとの比較を実施する。
【０１５１】
限定シリーズのベクターを生成して、プロテインＣ活性化が、強力なプロモーターの制御下で同一ベクター中でＴＭおよびＥＰＣＲの両方を発現することにより最適化され得るという概念を試験する。ポリオウイルス内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）素子を用いて、両タンパク質をコードする二シストロンｍＲＮＡの単一プロモーターからの転写を指図する。これは、両タンパク質の高レベル翻訳を可能にするが、一方、２つの別個のプロモーターが用いられる場合に起こり得るプロモーター妨害を回避する。ＩＲＥＳに対して５’に位置する遺伝子は３’に位置する遺伝子よりわずかに効率的に（２：１〜３：２の比）翻訳されるので、ＩＲＥＳ素子に対するＴＭおよびＥＰＣＲ遺伝子の相対的配置は、前記の実験の結果から確定する。発現カセットはすべて、ベクターに関するパッケージサイズ限度内である。試験されるプロモーターとしては、１）ＡｄＴＭｈ５に用いられるラウス肉腫ウイルスＬＴＲプロモーター（ＲＳＶ）、２）伝統的ヒトＣＭＶ極初期プロモーターより５〜３０倍強いことが示されているマウスＣＭＶ極初期プロモーター（ｍＣＭＶ）、３）マウスＵ１小核ＲＮＡプロモーター、および４）異種遺伝子の高レベル内皮細胞特異的転写を駆動することが示されているヒトＩＣＡＭ−２プロモーターが挙げられる。
【０１５２】
プロテインＣ活性化のｉｎ ｖｉｖｏでの復元に及ぼす併合ＴＭおよびＥＰＣＲ発現の作用を測定するために、ウサギ静脈移植片（ｎ＝８／群）を、ウイルス無含有、ＡｄＲＮｕｌｌ−１またはＴＭおよびＥＰＣＲを発現する最適化ベクターを用いて形質導入する。７日目に移植片を収穫し、ＡＰＣを生じる能力を、実施例３に記載したｉｎ ｓｉｔｕ検定を用いて確定する。
【０１５３】
実施例１０−静脈移植片炎症の時間経過
静脈移植片は、移植後に炎症性浸潤物を発生する、ということが認識されている。しかしながら特定の炎症媒介物質の一時的発現は、十分には特性化されていない。サイトカインへの曝露はＴＭおよびＥＰＣＲ遺伝子発現を下向き調節することが分かっているため、内皮細胞活性化および炎症の時間経過をＴＭおよびＥＰＣＲ発現と相関させることは重要である。このデータは、これらの変化を限定する戦略を用いた移植片不全の予防に対する支持も提供する。
【０１５４】
実施例８で収穫した移植片および対照血管のＯＣＴ−凍結切片を、炎症のいくつかのマーカーに関して染色し、デジタル免疫組織化学的分析に付すことが可能である。それぞれウサギＶＣＡＭ−１およびＩＣＡＭ−１を認識する、十分特性化されたモノクローナル抗体Ｒｂ１／９およびＲｂ２／３は、Ｍｙｒｏｎ Ｃｙｂｕｌｓｋｉ博士（トロント大学）から入手した。用いられるウサギエピトープを検出する市販の抗体としては、ウサギＰ−選択を認識するポリクローナルＡｂであるＢＢＡ３２（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）；マクロファージを認識するモノクローナルＡｂであるＲＡＭ１１（Ｄａｋｏ）；ＣＤ−４０を認識するモノクローナルＡｂであるＣＢＬ４８６（Ｃｙｍｂｕｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）；ＣＤ４０リガンドを認識するモノクローナルＡｂであるＭ１５８（Ｉｍｍｕｎｅｘ）；Ｔリンパ球を認識するモノクローナルＡｂであるＫＥＮ−５（Ｓｅｒｏｔｅｃ）；好中球ペルオキシダーゼを認識するポリクローナルＡｂであるＫ５０８９１Ｒ（Ｂｉｏｄｅｓｉｇｎ）；およびクラスＩＩ　ＭＨＣを認識するモノクローナルＡｂである２Ｃ４（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）が挙げられる。組織切片をヘマトキシリンで対比染色し、適切な一次およびビオチニル化二次抗体と、その後ホースラディッシュペルオキシダーゼ標識化ストレプタビジンとともにインキュベートした後、アミノエチルカルバゾールで展開する。
【０１５５】
内皮細胞ＩＣＡＭ−１、ＶＣＡＭ−１Ｉ、Ｐ−選択クラスＩＩＭＨＣおよびＣＤ−４０染色の定量を、ＴＭおよびＥＰＣＲタンパク質発現に関して前記したのと同様に、デジタル免疫組織化学的分析を用いて実施する。付着または浸潤好中球、マクロファージ、Ｔリンパ球およびＣＤ−４０Ｌ陽性細胞（血小板およびリンパ球）の数を、併合スペクトル特異的強度およびサイズ閾値分析を用いて各切片に関して確定し、要約して、各血管に関する平均を確定する。所定時点の全血管の平均間の差を、一方向ＡＮＯＶＡを用いて比較する。
【０１５６】
実施例１１−静脈移植片血栓および炎症に及ぼすＴＭおよびＥＰＣＲの両方のアデノウイルス媒介性移入の作用
本発明の目的は、血栓耐性復元が移植不全を防止し得るか否かを確定することである。初期移植片血栓に及ぼすプロテインＣ活性化のウイルス媒介性強化の作用を確定することも可能である。プロテインＣは強力な抗炎症作用を有し、そして炎症が移植片不全における主要な役割を演じるために、内皮細胞活性化および炎症応答のいくつかの媒介物質の発現に及ぼす作用を調べることも可能である。
【０１５７】
標準ウサギ静脈移植片モデルでは、有意の血小板およびフィブリン沈着が走査顕微鏡により管腔表面に観察されなかったという事実にもかかわらず、移植片の完全血栓性閉塞が５％未満の動物において起こる。したがってプロテインＣ活性化強化が初期移植片閉塞を防止し得るか否かの確定を可能にする付加的血栓性刺激を導入するために、当該モデルを修正することは実行可能である。
【０１５８】
したがってウサギ静脈移植片を外科的に露呈し、係蹄結繋を、移植片吻合の近位に、頚動脈を取り囲んで配置する。ＴｒａｎｓｏｎｉｃＴ１０６流動計に接続された血管周囲ドップラー流動プローブを用いて、係蹄狭窄により誘導される移植片血流速度の変化を測定する。ｎ＝５ウサギの予備群において、平均ピーク移植片血流速度の低減により測定した場合、どの程度の狭窄が、活性血小板および血栓沈着を示す６０分以内に胃の循環流量変動（ＣＦＶ）を生じるかを確定する（Ｗｉｌｌｅｒｓｏｎ Ｊ．Ｔ． ｅｔ ａｌ． （１９９１） ＰＮＡＳ （ＵＳＡ） ８８：１０６２４参照）。有意のＣＦＶは、結繋適用後の平均ピーク流速の＞５０％減と定義する。
【０１５９】
プロテインＣ活性化増大の作用を確定するために、ウサギ静脈移植片（ｎ＝８／群）を、無ウイルス、ＡｄＲＮｕｌｌ−１またはＴＭ／ＥＰＣＲを発現する最適化ベクターを用いて形質導入し得る。７日目に、動物を麻酔し、移植片を露呈した。係蹄による血流の予定拘束後、１時間以内の有意のＣＦＶの数を確定する。一方向ＡＮＯＶＡを用いて、群平均を比較する。測定期間終了時に、動物に１０００Ｕの静脈内硫酸ヘパリン（死後血栓を防止するため）を投与し、移植片を直ちに還流し、１０％ホルマリンで固定して、取り出した。移植片を前記のように４つの薄片に切断し、リンタングステン酸ヘマトキシリンで染色して、フィブリンを検出する。血栓による管腔閉塞（％）を、デジタル画像分析を用いて各移植片に関して測定する。各群に関する管腔閉塞の平均％を、一方向ＡＮＯＶＡを用いて比較する。
【０１６０】
プロテインＣが抗炎症特性を有する場合、内皮細胞活性化および移植片炎症に及ぼすＴＭ／ＥＰＣＲの過剰発現の作用を測定し得る。無ウイルス、ＡｄＲＮｕｌｌ−１またはＴＭ／ＥＰＣＲを発現する最適化ベクターを用いて形質導入した静脈移植片（ｎ＝５群）を、炎症性変化および内皮細胞活性化が最大になったとき（前記で確定）に収穫する。ＯＣＴ−凍結切片を染色し、ＩＣＡＭ−１、ＶＣＡＭ−１Ｉ、ＣＤ−４０およびクラスＩＩＭＨＣの発現、ならびにマクロファージ、好中球、Ｔ細胞およびＣＤ４０Ｌ陽性細胞の存在に関して、抗体および実施例１０に記載した方法を用いてデジタル画像分析する。各群に関する平均を、一方向ＡＮＯＶＡを用いて比較する。
【０１６１】
実施例１２−ＴＭ調節経路の操作によるＴＭ発現の増大
ＴＭ遺伝子の移入は、ＴＭタンパク質発現および静脈移植片に対する血栓耐性を復元するための一方法である。ＴＭ調節経路における分子の発現および／または活性の操作も、ＴＭタンパク質発現の復元をもたらし得る。例えば、内皮細胞のＴＮＦ−α刺激がＴＭ遺伝子発現の極めて大きな下向き調節を生じることが既知である。静脈移植片においてきわめて大きな炎症性応答が存在する場合（図２参照）、単球またはリンパ球を活性化することによるＴＮＦ−α同化が静脈移植片におけるＴＭ発現の損失にある役割を演じ得る、と考えるのは合理的である。ＴＮＦ−αがＴＭ調節を媒介するメカニズムは未知であるが、しかし、転写因子である各因子−κＢ（ＮＦ−κＢ）の活性化が顕著な役割を演じ得ると考えられる。
【０１６２】
転写因子である核因子−６Ｂ（ＮＦ−６Ｂ）は、免疫および炎症応答を媒介する多数の遺伝子の発現の重要な調節物質である。それは多数の種類の細胞中で、例えば血管内皮細胞、肺上皮細胞およびマクロファージ中で発現される。ＮＦ−６Ｂは、ほとんど２つのサブユニット、ｐ６５（ｒｅｌＡとも呼ばれる）およびｐ５０から成るヘテロ二量体である。非刺激細胞中では、それは細胞質中に、Ｉ６Ｂと呼ばれる抑制タンパク質の一ファミリーと複合されて存在する。Ｉ６Ｂは、ＮＦ−６Ｂ上に存在する核局在化シグナルを遮蔽し、それによりそれが核中に転位するのを防止する。広範な種々の刺激による細胞活性化後、１６Ｂ∀は特異的キナーゼによりリン酸化されて、ＮＦ−６Ｂからのその解離を生じ、そしてプロテオソームによる分解に関してそれをマーキングする。その放出後、ＮＦ−６Ｂは核に転位され、そこでそれは標的遺伝子のプロモーター領域で特定配列と結合して、それらの転写を強化する。
【０１６３】
ＦＬＡＧエピトープ−タグ化優性陰性Ｉ６Ｂα突然変異体（１６Ｂα−Ｓ３２Ａ／Ｓ３６Ａ）をコードするｃＤＮＡを得た（Ｂｒｏｃｋｍａｎ ｅｔ ａｌ． （１９９５） Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． １５：２８０９参照）。セリン残基３２および３６の突然変異は、Ｉ６Ｂαがリン酸化され、分解するのを防止する。構成的に活性なＩ６Ｂαは、細胞質中でＮＦ−６Ｂに結合したままであり、したがってそれが炎症性刺激に応答して核中に転位するのを防止する。いくつかの群は、同様の優性−陰性Ｉ６Ｂα突然変異体の過剰発現が、ＴＮＦ−∀によりｉｎ ｖｉｔｒｏ内皮細胞ＮＦ−６Ｂ活性化および炎症性分子の発現を防止し得る、ということを実証した。この突然変異化形態のＩ６Ｂαを発現する第一世代アデノウイルスベクターＡｄＩκＢＳ３２／３６Ａを首尾よく生成した。われわれの実験室での予備実験は、ＡｄＩκＢＳ３２／３６Ａによる内皮細胞の形質導入が、ＴＮＦ−αに応答してＮＦ−６Ｂ活性化を防止する、ということを確証した。
【０１６４】
トロンボモジュリン発現に及ぼすＮＦ−κＢ抑制の作用を査定するために、培養中のヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を、５０ｐｆｕ／細胞の感染多重度で、無ウイルス、ＡｄＮｕｌｌ−１またはＡｄＩκＢＳ３２／３６Ａを用いて形質導入した。感染の２日後に、細胞を非刺激のままにするかまたは５．７ｎＭのヒトＴＮＦα（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ， Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ， ＣＡ）で１８時間処置した。次に、定量的ウエスタンブロット分析により、細胞抽出物中でＴＭタンパク質発現を査定した（図１２）。ＮＦ−６Ｂ抑制はＴＮＦ−∀刺激に応答してＴＭ下向き調節を防止するだけでなく、意外にも、非刺激およびＴＮＦ−α刺激細胞の両方においてＴＭタンパク質発現の見かけの上向き調節を生じた。
【０１６５】
ＴＭ発現の下向き調節におけるＮＦ−□Ｂの関与は、初期静脈移植片不全を防止するためのＮＦ−κＢ阻害剤の使用のための論理的根拠を提供する。ウサギ静脈移植片炎症、ＴＭ発現、プロテインＣ活性化および局所的トロンビン活性化に及ぼすＡｄＩκＢＳ３２／３６Ａ形質導入の作用を調べる実験を、われわれは実施中である。
【０１６６】
実施例１３−アテローム硬化症の発症に及ぼすＴＭ発現の復元の作用
その強力な抗凝固作用のほかに、ＡＰＣは抗炎症特性を有することが示された（Ｅｓｍｏｎ ｅｔ ａｌ． （１９９１） Ｔｈｒｏｍｂ Ｈａｅｍｏｓｔ ６６： １６０およびＥｓｍｏｎ （１９９８） Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｓｔ ６：８４で再検討）。ＴＭ発現の損失とその後の局所的ＡＰＣ生成の損失は、おそらくは移植後の静脈移植片中に観察される炎症応答に関与する。炎症も、アテローム硬化症の発症の主要構成成分である（Ｒｏｓｓ （１９９９） Ａｍ Ｈｅａｒｔ Ｊ １３８： Ｓ４１９およびＬｉｂｂｙ （２０００） Ａｍ Ｊ Ｃａｒｄｉｏｌ ８６：３Ｊで再検討）。静脈移植片炎症低減は、後期静脈移植片不全の主因であるアテローム硬化症の発症を防止する、とわれわれは仮定する。
【０１６７】
実施例１に詳述したウサギ静脈移植片は、移植片アテローム硬化の発症に及ぼす高コレステロール血症の作用を試験するためにも適応し得る（Ｚｗｏｌａｋ ｅｔ ａｌ． （１９８９） Ａｒｔｅｒｌｏｓｃｌｅｒ ９：３７４）。０．２％コレステロールから成るアテローム発生餌をウサギに１ヶ月間与えた後、移植片移植は、術後２〜６ヶ月目に、泡沫細胞（脂質負荷マクロファージ）の顕著な浸潤を伴う旺盛に生育する新生内膜性肥厚を生じる。炎症およびアテローム硬化症の発症に及ぼすＴＭ発現の復元の作用を調べる。
【０１６８】
ウサギ（ｎ＝１０／群）に、手術前１週間に開始するアテローム発生餌（１％コレステロール）を与える。静脈移植片セグメントを、３．７５ｘ１０１０ｐｆｕ／ｍｌの用量で、無ウイルス、ＡｄＴＨ５またはＡｄＮｕｌｌ−１を用いて形質導入する。一群の動物を７日目に屠殺し、実施例１０に記載した炎症マーカーに関する免疫組織化学的染色を用いて、急性炎症の程度を査定する。動物の別の群を１２週目に屠殺し、移植片セグメントを収穫して、分割した。一セグメント半分を血管形態計測分析のためにホルマリン固定し、他の半分は凍結切片にして、組織中のウサギマクロファージを認識するが、循環または付着単球を認識しないモノクローナル抗体であるＲＡＭ−１１（Ｄａｋｏ）で染色する。泡沫細胞集合（アテローム硬化症のマーカー）の程度を、視覚的採点系を用いて低両氏、新生内膜塊と関連させる。手術時および屠殺時に血清を採取し、脂質レベル上昇を証明する。ＴＭ発現の復元は、静脈移植片炎症を低減し、アテローム硬化症の発症を防止する、とわれわれは予測する。
【０１６９】
実施例１４−植付人工器官移植片によるＴＭ発現増大
ダクロン、テフロンまたはゴア−テックスから構築された合成血管移植片はしばしば、大型血管、鼠径部下再血管形成手法を実施する外科医が用いる。冠動脈および小血管末梢動脈バイパス手法のための人工器官移植片のより広範な使用は、初期血栓のために、直径＜４ｍｍの移植片における不全の比率が非常に高いことにより排除される（Ｃｌｏｗｅｓ， Ａ．Ｗ． （１９９３） Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ Ｐａｔｈｏｌ ２：１７９Ｓ参照）。自系内皮細胞を用いる移植片の植付は、ｉｎ ｖｉｖｏでの移植片開存性をかろうじて改善することが示されている人工器官移植片の血栓原性を低減するための一方法である（Ｌ． Ｂｏｒｄｅｎａｖｅ ｅｔ ａｌ． （１９９９） Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｕｍ ６：２６７およびＰ． Ｚｉｌｌａ （１９９１） Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｃａｒｄｉｏｌ ６：８７７で再検討）。
【０１７０】
血栓を阻止するための植付内皮細胞の遺伝子修飾は、小直径人口器官移植片の性能をさらに改善することを支持した（Ｇ． Ｖａｓｓａｌｌｉ ｅｔ ａｌ （１９９７） Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ Ｒｅｓ ３５：４５９で再検討）。レトロウイルスベクターおよびおそらくはアデノ随伴ウイルスベクターは、抗凝固分子の長期発現を可能にする内皮細胞のｅｘ ｖｉｖｏ形質導入に理想的に適している。
【０１７１】
増大剪断応力に培養中の内皮細胞を曝露すると、ＴＭ遺伝子発現の下向き調節が引き起こされることが示されている（Ａ．Ｍ． Ｍａｌｅｋ ｅｔ ａｌ． （１９９４） Ｃｉｒｃ Ｒｅｓ ７４：８５２）。自系内皮細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏでの拡張は、これらの細胞を用いて人工器官血管移植片を植付る場合、ｉｎ ｖｉｖｏＴＭ発現およびＡＰＣ生成能力の減損を生じる、とわれわれは仮定する。さらに、ヒトＴＭを発現するレトロウイルスベクターによる内皮細胞の遺伝子修飾は、移植後の小直径人工器官移植片の血栓耐性および開存性を改善する、とわれわれは仮定する。
【０１７２】
内皮細胞を培養中で展開し、人工移植片上に植付け、そしてｅｘ ｖｉｖｏ灌流系を用いて動脈剪断応力を施す場合に、ＴＭ発現の変化を低減することにより、この最初の仮説を試験する。ＴＭ発現が植付内皮細胞中で減損されることが判明した場合、ヒトＴＭを発現するレトロウイルスを用いたこれらの細胞のｅｘ ｖｉｖｏ形質導入の作用を、われわれは測定する。
【０１７３】
高流量ポンプおよび種々の血管を収容し得る灌流小室からなるｅｘ ｖｉｖｏ灌流系を、われわれの実験室は近年獲得した。この系は、５％ＣＯ２を有し、３７℃に加温されるインキュベータに適合する。予備実験は、ポンプが１２５ｍｌ／分までの流量を送達し、これは、直径２ｍｍの人工器官移植片の場合、２５〜５０ｄｙｎｅ／ｃｍ２までの剪断応力を移植片管腔表面に生じ得ることを示す。ウサギ頚静脈および大動脈から収穫した内皮細胞の特性化一次培養をわれわれは確立した。標準条件下で、ＥＧＭ培地（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ）中で、細胞を増殖させる。
【０１７４】
ウサギＴＭ特異的プローブおよびプライマーを用いて、ＡＢＩ　Ｐｒｉｓｍ７７００配列検出器を用いた定量的実時間ＰＣＲにより、静止培養中の内皮細胞によるＴＭ遺伝子発現のベースライン発現を確定する。前に記載された方法（Ｖ． Ｓｈａｙａｎｉ ｅｔ ａｌ． （１９９４） Ｊ Ｓｕｒｇ Ｒｅｓ ５７：４９５）を用いて、内皮細胞を２ｍｍダクロン移植片セグメント（Ｍｅａｄｏｘ Ｍｅｄｉｃａｌｓ， Ｏａｋｌａｎｄ， ＮＪ）上に植えつけ、１〜７日間、低および高剪断応力下で灌流する。コラーゲン消化により内皮細胞を移植片から取り出して、ＲＮＡ抽出し、逆転写酵素を用いてｃＤＮＡを生成する。ＴＭ発現のレベルをリボソームＲＮＡに対して標準化する。
【０１７５】
内皮細胞ＴＭ遺伝子発現は、静止培養中での発現とその後の動脈剪断応力への曝露後に低減する、と予測される。ＴＭ発現を増大するために、無ウイルス、Ｇ１ＳｈＴＭ、ヒトＴＭを発現するレトロウイルスベクターまたは導入遺伝子を発現しない同一レトロウイルスベクターであるＧ１ＳＡＭＥＮ（Ｒ． Ｍｏｒｇａｎ博士（ＮＣＨＧＲ， ＮＩＨ）の御厚意により供給いただいた）を用いて、内皮細胞をｅｘ ｖｉｖｏで形質導入する。Ｇ−４１８（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中での適切な選択後、ヒトおよびウサギＴＭ遺伝子発現の量を、種特異的ＴＭプライマーおよびプローブを用いて、実時間ＰＣＲにより低了する。次に細胞を血管移植片上に植えつけ、１〜７日間、低および高剪断応力下で灌流する。内皮細胞を収穫し、総ＴＭ（ウサギ＋ヒト）遺伝子発現における任意の変化を、処置群間で比較する。
【０１７６】
ＴＭ遺伝子のレトロウイルス媒介性移入は、ＴＭ発現および活性の保存および増大が、人工器官血管移植片を植付けるために用いられる内皮細胞中で達成され得る効率的方法である、と予測される。これらの結果は、遺伝子修飾内皮細胞を用いた人工器官移植片の植え付けが移植片開存性をｉｎ ｖｉｔｒｏで改善し得るか否かを確定するための実験の開始を可能にする。
【０１７７】
ヒト静脈移植片疾患のウサギモデルからの証拠（実施例１）は、静脈内皮によるＴＭ発現が、動脈循環中への移植後に劇的に低減される（実施例２）ことを実証する。ＴＭ発現の損失は、ＡＰＣを生成する移植片の能力を低減し、その結果、局所的トロンビン活性化が強化される。この新規の知見は、ヒト静脈移植片が、移植後最初の２〜３ヶ月で閉塞性血栓を発症する高率を説明し得る。
【０１７８】
静脈移植片へのＴＭのウイルス媒介性移入が静脈移植片不全を防止する（実施例４および５）という概念は、以下の理由のために、この従来の研究からは固有に派生しない：１）ネイティブＴＭのｉｎ ｖｉｖｏ発現の長期低減は、従来実証されておらず、動脈循環中への静脈移植片の移植後にも予測されなかった。２）ＴＭ発現低減は、静脈移植片における局所的トロンビン生成強化に一時的に関連すると実証されていなかった。３）トロンビン活性強化は、初期静脈移植片血栓の一因として、従来実証されていない。４）ＴＭ発現の復元は、局所的トロンビン活性化を防止することが従来実証されていない。５）ＴＭ発現強化は、静脈移植片における加速性アテローム硬化症の発症を防止することが、従来実証されていない。
【０１７９】
以下の特定の参考文献を含めて本明細書中に開示された参考文献はすべて、その記載内容が参照により本明細書中に含まれる。以下の参考文献は参照により特定的に含まれる。
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６４．Ｋａｐｌｉｔｔ ＭＧ， ｅｔ ａｌ． （１９９４） Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｎｃｓ ８：１４８−１５４
６５．Ｐｏｄｓａｋｏｆｆ Ｇ．， ｅｔ ａｌ． （１９９４） Ｊ Ｖｉｒｏｌ ６８：５６５６−５６６６
６６．Ｂａｎｔｅｌ−Ｓｃｈａａｌ Ａ， Ｓｔｏｈｒ Ｍ （１９９２） Ｊ Ｖｉｒｏｌ ６６：７７３−７７８
６７．Ｇｎａｔｅｎｋｏ Ｄ， ｅｔ ａｌ． （１９９７） Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ ４５：８７−９８
６８．Ｒｏｌｌｉｎｇ Ｆ．， ｅｔ ａｌ． （１９９７） Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ４：７５７−７６１
６９．Ｃｈｉｏｒｉｒｎ ＪＣ， ｅｔ ａｌ． （１９９５） Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ６：１５３１−１５４１
７０．Ｆｌｏｔｔｅ ＩＸ， ｅｔ ａｌ． （１９９２） Ａｍ Ｊ Ｒｅｓｐｉｒ Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ７：３４９−３５６
７１．Ｓｕｍｍｅｒｆｏｒｄ Ｃ， Ｓａｒｎｕｌｓｋｉ ＲＪ （１９９８） Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７２：１４３８−１４４５ ｍ
７２．Ｒｏｍｅ ＪＪ， ｅｔ ａｌ． （１９９４） Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ５：１２４９−１２５８
７３．Ｓｃｈｕｌｉｃｋ ＡＨ， ｅｔ ａｌ． （１９９５） Ｃｉｒｃ Ｒｅｓ ７７：４７５−４８５〜Ｉ
７４．Ｌｙｎｃｈ Ｃ， ｅｔ ａｌ． （１９９７） Ｃｉｒｃ Ｒｅｓ ８０：４９７−５０５ １〜Ｉ
７５．Ｆｅｒｒａｒｉ ＦＫ， ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７０：３２２７−３２３４
７６．Ｆｉｓｈｅｒ ＫＪ， ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７０：５２０−５３２
７７．Ｅｓｍｏｎ ＣＴ （２０００） Ｔｈｒｏｍｂ Ｈａｅｍｏｓｔ ２０００；８３：６３９−６４３
７８．Ｘｕ Ｊ．， ｅｔ ａｌ． （１９９９） Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７４：６７０４−６７１０
７９．Ｗａｕｇｈ ＪＭ， ｅｔ ａｌ． （２０００） Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ １０２：３３２−３３７
８０．Ｄａｖｉｅｓ ＭＧ， ｅｔ ａｌ． （１９９３） Ｅｕｒ Ｊ Ｖａｓｃ Ｓｕｒｇ ７：１５６−１６５
８１．Ｃｈａｍｐｉｏｎ ＨＣ， ｅｔ ａｌ． （１９９９） Ｃｉｒｃ Ｒｅｓ ８４：１４２２−１４３２
８２．Ｆｕｋｕｄｏｍｅ Ｋ， Ｅｓｍｏｎ ＣＴ （１９９４） Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２６９：２６４８６−２６４９１
８３．Ｆｕｋｕｄｏｍｅ Ｋ， Ｅｓｍｏｎ ＣＴ （１９９５） Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７０：５５７１−５５７７
８４．Ｗａｎｇ Ｊ．， ｅｔ ａｌ． （１９９９） ＤＮＡ Ｒｅｓ ２６：５７−６２
８５．Ｋｕｒｏｓａｗａ Ｓ．， ｅｔ ａｌ． （１９８８） Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２６３：５９９３−５９９６
８６．Ｎｅｗｍａｎ ＫＤ， ｅｔ ａｌ． （１９９５） Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ ９６：２９５５−２９６５
８７．Ｗｅｎ Ｓ．， ｅｔ ａｌ． （２０００） Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ Ｔｈｒｏｍｂ Ｖａｓｃ Ｂｉｏｌ ２０： １４５２−１４５８
８８．Ｆｕｋｕｄｏｍｅ Ｋ， ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７１：１７４９１−１７４９８
８９．Ｍｏｒｇａｎ ＲＡ， ｅｔ ａｌ． （１９９２） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ ２０：１２９３−１２９９
９０．Ａｎｏｎｙｍｏｕｓ Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ （１９９７） Ｊ Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ ７８：１６５３−１６６１
９１．Ｂａｒｔｌｅｔｔ ＪＳ， ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９３：８８５２−８８５７
９２．Ｃｏｗａｎ ＰＪ， ｅｔ ａｌ． （１９９１） Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７３：１１７３７−１１７４４
９３．Ｗｉｌｌｅｒｓｏｎ ＪＴ， ｅｔ ａｌ． （１９９１） Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８８ １０６２４−１０６２８
【０１８０】
特定の実施態様を参照しながら本発明を説明してきたが、本発明の修正および変更は、特許請求の範囲に定義された本発明の範囲を逸脱しない限り、意図され得る。
【図面の簡単な説明】
【図１】
ウサギ静脈セグメントを示す図である。
【図２】
移植後１日目（図２Ａ）および７日目（図２Ｂ）に採取したウサギ静脈移植片の管腔表面を示す走査電子顕微鏡写真である。
【図３】
移植時間の一関数としての静脈移植片におけるＴＭタンパク質発現を示すグラフである。
【図４】
ウサギ頚静脈および頚動脈におけるトロンボモジュリン（ＴＭ）発現を示す写真である。３日目に、頚静脈移植片を収穫した（図４Ｂ）。頚動脈は、２８日目に収穫した（図４Ｄ）。内皮細胞損失に関して照査するために、フォンウィリブランド因子（ｖＷＦ）に関して切片を染色した（図４Ａおよび４Ｃ）。
【図５】
移植時間の一関数としての結合トロンビンおよびＡＰＣ生成のレベルを示すグラフである。
図５Ａ〜Ｆは移植後ウサギＴＭに関して染色したウサギ静脈移植片のデジタル画像である。３日目（図５Ｂ）および４２日目（図５Ｃ）にＴＭ（図５Ａ）で頚静脈を染色。３日目（図５Ｅ）および４２日目（図５Ｆ）にｖＷＦ（図５Ｄ）で頚静脈を染色。
【図６】
図６Ａおよび図６Ｂはウサギ静脈移植片へのアデノウイルス媒介性遺伝子移入の最適化を示すグラフである。グラフは、用量応答（図６Ａ）および発現継続期間（図６Ｂ）を示す。図６Ｃはβ−ガラクトシダーゼを発現する複製欠陥アデノウイルスを形質導入したウサギ静脈移植片の管腔表面の肉眼検査を示す写真である。
【図７】
トロンボモジュリン（ＴＭ）およびβ−ガラクトシダーゼコードアデノウイルスベクターの構築を示す模式図である。
【図８】
ヒトトロンボモジュリン（図８Ａ）およびプロテインＣ検定（図８Ｂ）に特異的なＥＬＩＳＡにより確定した場合の用量依存性アデノウイルス媒介性トロンボモジュリン発現を示すグラフである。ＡｄＴｍｈ５は、ヒトＴＭをコードするアデノウイルスベクターである。ＡｄＣＮＬａｃＺは同一アデノウイルスベクターであるが、但しそれはβ−ガラクトシダーゼをコードする。
【図９】
ウサギ頚静脈対内皮細胞におけるトロンボモジュリン（ＴＭ）発現の継続期間を示すグラフである。
【図１０】
指示時間に収穫したＡｄＴｍｈ５形質導入ウサギ静脈移植片におけるｉｎ ｓｉｔｕプロテインＣ活性化を示すグラフである。
【図１１】
移植時間の一関数としてのウサギ静脈移植片のアデノウイルス媒介性遺伝子移入後のヒトＴＭ発現を示す棒グラフである。Ｕｎｔｘ‘ｄ＝非形質導入化。ＩＶＣ＝正常ウサギ下大静脈。
【図１２】
トロンボモジュリン（ＴＭ）発現に及ぼすＮＦ−κＢ抑制の作用を示す棒グラフである。ＡｄＩκＢＳ３２／３６Ａ＝因子１６Ｂαの突然変異化形態をコードするアデノウイルスベクター。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2004503216.tif 000009
【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【国際公開パンフレット】
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2004503216.tif 000089
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004503216.tif 000090
【国際調査報告】
2004503216.tif 000091
2004503216.tif 000092
2004503216.tif 000093
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