(57)【要約】本発明は、所望の細胞型に対してアデノウイルス粒子を特異的に標的するために有用である標的化分子に関する。これらの標的化分子は、可溶性のアデノウイルスレセプタードメインと、三量体形成ドメインと、標的化リガンドドメインとを含む。このような標的化分子をコードするポリヌクレオチド、このようなポリヌクレオチドを含む発現ベクター、および細胞に対してアデノウイルス粒子を標的するための方法、ならびに細胞に対して選択的に異種遺伝子を送達する方法が、さらに提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
可溶性アデノウイルスレセプタードメインと、三量体形成ドメインと、標的化リガンドドメインとを含む、標的化分子。
【請求項２】
前記可溶性アデノウイルスレセプタードメインがｓＣＡＲである、請求項１に記載の標的化分子。
【請求項３】
前記三量体形成ドメインが、ロイシンジッパー分子に由来する、請求項１に記載の標的化分子。
【請求項４】
前記三量体形成ドメインが、酵母ＧＣＮ４ロイシンジッパー分子のイソロイシン改変体である、請求項１に記載の標的化分子。
【請求項５】
前記三量体形成ドメインが、可溶性アデノウイルスレセプタードメインと融合されている、請求項１に記載の標的化分子。
【請求項６】
前記三量体形成ドメインが、可溶性アデノウイルスレセプタードメインのカルボキシル末端に融合されている、請求項５に記載の標的化分子。
【請求項７】
請求項１に記載の標的化分子であって、前記可溶性アデノウイルスレセプタードメインのカルボキシル末端と前記三量体形成ドメインとの間に配置されているリンカーエレメントをさらに含む、標的化分子。
【請求項８】
前記リンカーエレメントが、交互になっているグリシン残基およびセリン残基からなる、請求項７に記載の標的化分子。
【請求項９】
前記標的化リガンドドメインが、サイクリックＲＧＤである、請求項１に記載の標的化分子。
【請求項１０】
前記標的化リガンドドメインが、アポＥタンパク質由来の少なくとも１５アミノ酸を含む、請求項１に記載の標的化分子。
【請求項１１】
前記標的化リガンドドメインが、アポＥタンパク質由来のアミノ酸１４１〜１５５の２つのタンデムコピーを含む、請求項１０に記載の標的化分子。
【請求項１２】
前記標的化リガンドドメインが、可溶性アデノウイルスレセプタードメインのカルボキシル末端に結合されている、請求項１に記載の標的化分子。
【請求項１３】
請求項１に記載の標的化分子であって、前記三量体形成ドメインのカルボキシル末端と前記標的化リガンドドメインとの間に配置されているリンカーエレメントをさらに含む、標的化分子。
【請求項１４】
前記可溶性アデノウイルスレセプタードメインがｓＣＡＲであり、そして前記三量体形成ドメインが、ロイシンジッパー分子由来である、請求項１に記載の標的化分子。
【請求項１５】
請求項１に記載の標的化分子を含む、三量体の標的化分子。
【請求項１６】
アデノウイルス粒子と、請求項１に記載の標的化分子とを含む、複合体。
【請求項１７】
前記可溶性アデノウイルスレセプタードメインが、ｓＣＡＲである、請求項１６に記載の複合体。
【請求項１８】
前記三量体形成ドメインが、ロイシンジッパー分子由来である、請求項１６に記載の複合体。
【請求項１９】
請求項１６に記載の複合体であって、前記可溶性アデノウイルスレセプタードメインのカルボキシル末端と前記三量体形成ドメインとの間に配置されているリンカーエレメントをさらに含む、複合体。
【請求項２０】
前記可溶性アデノウイルスレセプタードメインがｓＣＡＲであり、そして前記三量体形成ドメインが、ロイシンジッパー分子由来である、請求項１６に記載の複合体。
【請求項２１】
前記アデノウイルス粒子が、異種遺伝子をさらに含む、請求項１６に記載の複合体。
【請求項２２】
前記アデノウイルス粒子が、腫瘍崩壊性アデノウイルス粒子である、請求項１６に記載の複合体。
【請求項２３】
請求項１に記載の標的化分子をコードする、ポリヌクレオチド。
【請求項２４】
請求項２３に記載のポリヌクレオチドを含む、発現ベクター。
【請求項２５】
細胞表面分子を発現する細胞に対してアデノウイルス粒子を標的化する方法であって、以下の工程：（ａ）アデノウイルス粒子と、請求項１に記載の標的化分子とを接触させて、該アデノウイルス粒子および該標的化分子を含む複合体を形成する工程、ならびに（ｂ）該細胞と該複合体とを接触させる工程、を包含する、前記方法。
【請求項２６】
前記アデノウイルス粒子が、腫瘍崩壊性アデノウイルス粒子である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
細胞表面分子を発現する細胞に対して、異種遺伝子を選択的に送達する方法であって、以下の工程：
（ａ）該異種遺伝子を含むアデノウイルス粒子と、請求項１に記載の標的化分子とを接触させて、該細胞表面分子を標的するために適切な複合体を形成する工程、および（ｂ）該細胞と該複合体とを接触させる工程、を包含する、前記方法。
【請求項２８】
細胞表面分子を発現する特定の細胞或いは組織に対するアデノウイルス粒子の細胞進入を媒介するために適切な該細胞表面分子、又は、特定の細胞または組織に対してアデノウイルス粒子を標的化するために適切なリガンドのいずれか又は両方を同定するための方法であって、以下の工程：
１）細胞表面分子についてのリガンド分子と、可溶性アデノウイルスレセプター分子および三量体形成ドメインとを組み合わせて、標的化分子を形成する工程、２）マーカー遺伝子を含むアデノウイルス粒子と、該標的化分子とを接触させて、複合体を形成する工程、３）該細胞表面分子を発現する細胞または組織と該複合体とを接触させる工程、ならびに４）該マーカー遺伝子によって報告された場合、該細胞または組織を効率的に形質導入し得る複合体を選択する工程、
を包含する、前記方法。
【請求項２９】
前記標的化リガンドドメインが、単鎖抗体（ｓｃＦＶ）を含む、請求項１に記載の標的化分子。
【請求項３０】
医薬としての使用のための、請求項１６〜２２のいずれかに記載の複合体。
【請求項３１】
ヒトを含む哺乳動物における疾患の処置のための医薬の調製のための請求項１６〜２２のいずれかに記載の複合体の使用。
【請求項３２】
前記疾患が癌である、請求項３１に記載の使用。
【請求項３３】
前記癌が、前立腺の腺癌である、請求項３２に記載の使用。
【請求項３４】
アデノウイルス遺伝子治療を用いた疾患の処置のための方法であって、該方法は、請求項１５に記載の三量体の標的化分子とアデノウイルス遺伝子治療ベクターとを接触させて複合体を形成する工程、および治療上有効な量の該複合体を、その必要な患者に投与する工程、を包含する、前記方法。
【請求項３５】
前記疾患が癌である、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記癌が前立腺の腺癌である、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記遺伝子治療の副作用が軽減される、請求項３４に記載の方法。
【請求項３８】
アデノウイルスの肝毒性の副作用が軽減される、請求項３７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（技術分野）
本発明は該して、分子生物学および遺伝子治療の分野に関する。より詳細には、本発明は、アデノウイルス粒子の細胞特異的標的化の目的のための標的化分子（ターゲティング分子）の生成に関する。
【０００２】
（背景技術）
アデノウイルスは、約３６キロベース対の長さの、直鎖状の二本鎖ＤＮＡ分子のゲノムを有するＤＮＡウイルスである。このウイルスゲノムの各々の末端は、ウイルス複製に必須である、逆方向末端反復（ＩＴＲ）として公知の短い配列を有する。アデノウイルスの十分に特徴付けられた分子遺伝学によって、アデノウイルスは、遺伝子導入のための有利なベクターとなっている。アデノウイルスは、細胞レセプターへの結合によって、真核生物細胞に対してこのような遺伝子を送達する。
【０００３】
アデノウイルスのファイバータンパク質が、このような吸着を担っている。このファイバータンパク質は、以下の３つのドメインからなる：テールドメイン、ロッド様シャフト部分、およびレポーター結合領域を含む球状の頭部部分。このファイバースパイクは、ホモ三量体であり、そして１ビリオンあたり１２のスパイクが存在する。ヒトアデノウイルスは、種々の種由来の広範な培養細胞株および初代組織に対して結合し、そして感染し得る。
【０００４】
アデノウイルスの指向性は、特定の細胞表面分子に対する吸着によって決定される。サブグループＢにおける血清型を除き、多くのアデノウイルスの血清型は、コクサッキーアデノウイルスレセプター（ｃｏｘｓａｃｋｉｅ−ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）（ＣＡＲ）と呼ばれる細胞表面分子に結合する。ヒトＣＡＲは、３６５アミノ酸の膜貫通タンパク質（４６ｋＤａ）であり、これは、短いリーダーと、２２２アミノ酸の細胞外ドメインと、膜貫通らせん状ドメイン（ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｓｐａｎｎｉｎｇ  ｈｅｌｉｃａｌ  ｄｏｍａｉｎ）と、１０７アミノ酸の細胞内ドメイン（ＤＮＡ配列：配列番号１；タンパク質配列：配列番号２、実施例１４を参照のこと）とを有する。細胞外領域は、２つの免疫グロブリン（Ｉｇ）に関連した構造ドメインを含む。ＣＡＲは、インビボで広範に発現されており、これによって、全身投与されたアデノウイルスベクターの広範囲の組織分布が説明される。サブグループＢに属するアデノウイルス血清型３（Ａｄ３）は、異なる（まだ未同定である）レセプターに結合することが示されている。
【０００５】
しかし、所望の標的が特定の組織型または細胞型である場合、アデノウイルスが広範な細胞型に感染する能力は、不都合である。非標的細胞の形質導入は、効率的でないことに加えて、望ましくない効果を有し得る。首尾よいベクター標的化ストラテジーは、適切な部位に対して全体のベクター用量を指向することによって、これらの問題を克服し得る。これによって、ベクターの安全性プロフィールが改善され得、そしてより少ないベクター用量を用いることが可能になり得、これによって、毒性が低くかつ免疫原性が低くなる。さらに、アデノウイルスベクター標的化によって、アデノウイルス感染に対して抵抗性である細胞型（例えば、造血系の細胞または腫瘍細胞など）の形質導入が可能になり得る。従って、アデノウイルス粒子の標的化によって、アデノウイルスベクター媒介性遺伝子治療の臨床的有用性が拡大され得る。
【０００６】
（発明の開示）
本発明は、アデノウイルス粒子を所望の細胞型に対して特異的に標的化するために有用である新規な標的化分子を提供する。これらの標的化分子は、可溶性アデノウイルスレセプタードメインと、三量体形成ドメインと、標的化リガンドドメインとを含む。この三量体形成ドメインは、標的化分子の三量体バージョンの形成を容易にする。この三量体バージョンは、アデノウイルス粒子と安定な複合体を形成し得、そして単量体バージョンと比べて、標的細胞を形質導入する能力の増強を示す。
【０００７】
本発明の標的化分子は、アデノウイルスベクターの天然の指向性を取り除き、そして同時に、アデノウイルスベクターを選り抜きの標的に対して指向しなおさせる。さらに、ここに記載したストラテジーを用いたアデノウイルスベクターの標的化では、改変されたアデノウイルスベクターによる時間浪費的な生成を必要としない。対照的に、本発明の標的化分子と組み合わせて使用されるアデノウイルスベクターは、通常のプロトコールおよび標準的な細胞株を用いて、より高力価に調製され、かつ増殖され得る。従って、ここに記載した標的化分子は、細胞特異的標的化の目的のための効率的、迅速、かつ容易な手段を提供する。
【０００８】
従って、本発明は、細胞表面分子を発現する細胞に対してアデノウイルス粒子を標的する方法を提供する。この方法は、このアデノウイルス粒子を本発明の標的化分子と接触させて、このアデノウイルス粒子およびこの標的化分子を含む複合体を形成する工程、ならびにこの細胞をこの複合体と接触させる工程、を包含する。
【０００９】
遺伝子治療を達成するためのストラテジーという状況では、本発明は、細胞表面分子を発現する細胞に対して異種遺伝子を選択的に送達する方法をさらに提供する。この方法は、以下の工程：１）この異種遺伝子を含むアデノウイルス粒子と、本発明の標的化分子とを接触させて、このアデノウイルス粒子およびこの標的化分子を含む複合体を形成する工程、ならびに２）この細胞とこの複合体とを接触させる工程、を包含する。
【００１０】
本発明の標的化ストラテジーの柔軟性によってまた、本発明のアデノウイルス粒子を用いた標的化に適切である細胞表面分子の迅速な同定も可能になる。従って、本発明は、特定の細胞もしくは組織に対するアデノウイルス粒子の細胞進入を媒介するために適切な細胞表面分子、または特定の細胞もしくは組織に対してアデノウイルス粒子を標的するために適切なリガンドのうちのいずれか、または両方を同定するための方法を提供する。この方法は、以下の工程：１）細胞表面分子についてのリガンド分子と、可溶性アデノウイルスレセプター分子および三量体形成ドメインとを組み合わせて、標的化分子を形成する工程、２）マーカー遺伝子を含むアデノウイルス粒子と、この標的化分子とを接触させて、複合体を形成する工程、３）この細胞表面分子を発現する細胞または組織とこの複合体とを接触させる工程、ならびに４）このマーカー遺伝子によって報告された場合、この細胞または組織を効率的に形質導入し得る複合体を選択する工程、
を包含する。
【００１１】
本発明の他の態様、特徴、および利点、ならびにさらなる態様、特徴、および利点は、本発明の現在好ましい実施形態の以下の説明から明白になる。
【００１２】
（発明を実施するための最良の形態）
本発明は、ＣＡＲの細胞外ドメイン（ｓＣＡＲ）のような可溶性アデノウイルスレセプタードメインを使用する、標的化ストラテジーを提供する。標的化リガンドドメインは、可溶性アデノウイルスレセプタードメインに付加され、次いでこの接合体がアデノウイルス粒子に付加される。この接合体は、アデノウイルス粒子のファイバーノブに結合して、複合体を形成し、それによって異なる細胞表面分子に対してこのベクターを指向し直させる。驚くべきことに、可溶性アデノウイルスレセプタードメインの三量体形成によって、アデノウイルス粒子に対するこのような標的化分子の結合が有意に増強することが見出される。さらに、驚くべきことに、標的化分子と複合体化したアデノウイルス粒子（三量体形成ドメインおよび標的化リガンドドメインを含む）は、三量体形成ドメインなしの標的化分子と比べて、インビトロおよびインビボで細胞をより効率的に形質導入することが見出される。このアデノウイルス粒子の再標的化のアプローチは、遺伝子改変されたアデノウイルスベクターの時間浪費的な生成を必要としない。アデノウイルス粒子は、正常なプロトコールおよび標準的な細胞株を用いて、より高力価に調製され、かつ増殖され得る。標的化リガンドドメインに融合した可溶性アデノウイルスレセプタードメイン（例えば、ｓＣＡＲ）の付加によって、このベクターの正常な指向性が取り除かれ、そして同時にこのベクターは選り抜きの標的に対して指向し直される。
【００１３】
従って、本発明は、可溶性アデノウイルスレセプタードメインと、三量体形成ドメインと、標的化リガンドドメインとを含む標的化分子を提供する。
【００１４】
アデノウイルスレセプタードメインは、例えば、少なくとも１μＭ（Ｋｄ）の親和性で、そして好ましくは少なくとも１ｎＭ（Ｋｄ）の親和性で、アデノウイルスファイバータンパク質に結合し得る。このアデノウイルスレセプタードメインは、アデノウイルスファイバータンパク質の生理的な結合エピトープをマスクし、その結果、このドメインはもはや、その生理的な細胞レセプターとは相互作用し得ない。最近のデータは、ＣＡＲに対する結合を担うアデノウイルスファイバーノブ上の重要な領域を記載している。これらのデータは、この結合領域がアデノウイルスファイバーノブの側面に配置されていることを示している（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８６ｐ．１５６８；Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８６ｐ．１５７９）。本発明の意図に包含されるアデノウイルスレセプタードメインは、ヒトアデノウイルスまたは非ヒトアデノウイルスのいずれか１つの血清型のアデノウイルスファイバータンパク質を結合し得る。しかし、Ａｄ２アデノウイルスおよびＡｄ５アデノウイルスについてのレセプターが好ましい。
【００１５】
可溶性アデノウイルスレセプタードメインは、アデノウイルスファイバータンパク質に結合特異性を保持し、そして生理的な条件下で水溶液中に溶解し得る、アデノウイルスレセプター分子のフラグメントか、もしくは化学的に改変されたフラグメントか、または全部分でさえあり得る。好ましくは、この可溶性アデノウイルスレセプタードメインは、アデノウイルスレセプタードメインの単離された細胞外ドメインである。好ましい実施形態において、この可溶性アデノウイルスレセプタードメインは、ｓＣＡＲである。このＣＡＲのｃＤＮＡ配列は、当該分野において公知であり、そしてＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｙ０７５９３として公開されている。本発明の１実施形態において、ｓＣＡＲは、公開されたＣＡＲのｃＤＮＡ配列のうち、ＡＴＧコドンから第一のＩｇ様ドメイン（Ｄ１ドメインと名付けられた）を通って伸長する、少なくとも塩基対６０〜４８７を含む。本発明の好ましいｓＣＡＲ配列は、ＣＡＲ配列の塩基対５４〜７６７を含む。
【００１６】
標的化分子の三量体形成ドメインは、可溶性アデノウイルスレセプタードメインに関して異種である三量体形成ドメインであり得る。すなわち、この三量体形成ドメインは、可溶性アデノウイルスレセプタードメインに関してネイティブでないアミノ酸配列を含む。「ネイティブでないアミノ酸配列（ｎｏｎｎａｔｉｖｅ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）」とは、この可溶性アデノウイルスレセプタードメインにおいて見出されない任意のアミノ酸配列を包含し、そしてこのアミノ酸配列が、この可溶性アデノウイルスレセプタードメイン中に、例えば遺伝子発現のレベルで導入される。ネイティブでないアミノ酸配列としては、例えば、ロイシンジッパー分子（例えば、酵母ロイシンジッパー分子）由来のアミノ酸配列が挙げられる。１実施形態において、ネイティブでないアミノ酸配列は、酵母ロイシンジッパー分子の改変体であり、ここでは、特定の重要なロイシン残基が、イソロイシン残基に変異されている（例えば、Ｈａｒｂｕｒｙら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６２ｐｐ．１４０１〜１４０７（１９９３））。この三量体形成ドメインは、この可溶性アデノウイルスレセプタードメインに対して、直接または間接的に、三量体（特にホモ三量体）を形成する能力を付与する。間接的なホモ三量体形成は、例えば、この三量体形成ドメインと相互作用する、二価特異的な結合因子または多価特異的な結合因子（例えば、それらの抗体またはフラグメント）を介して達成され得る。
【００１７】
この三量体形成ドメインは、この可溶性アデノウイルスレセプタードメインのＣ末端の下流に配置され得る（図１、「ｓＣＡＲ−三量体」および「ｓＣＡＲ−三量体−アポＥ」）。この三量体形成ドメインはまた、この可溶性アデノウイルスレセプタードメインの配列中に導入されてもよい。この三量体形成ドメインが、この可溶性アデノウイルスレセプタードメインの配列中に導入される場合、この三量体形成ドメインは好ましくは、カルボキシル末端に導入される。
【００１８】
本発明の三量体形成ドメインは、詳細には、バクテリオファージＴ４フィブリチン（ｆｉｂｒｉｔｉｎ）分子（Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ５ｐ．７８９，１９９７）、ヒト肺サーファクタントＤタンパク質由来のネック領域ペプチド（Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７１  ｐ．１８９１２〜１８９１９，１９９６、およびＪ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６４  ｐ．５８６６〜５８７０，２０００）、酵母熱ショック転写因子（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３８  ｐ．３５５９〜３５６９，１９９９）、軟骨基質タンパク質の三量体形成ドメイン（ＪＭＢ  ２５６  ｐ．９０９〜９２３，１９９６）、非対称性アセチルコリンエステラーゼのコラーゲン様テール（Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ．３５０  ｐ．２８３〜２９０，２０００）、コラーゲンＩの三量体カルボキシルプロペプチド（Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  Ａｕｇｕｓｔ  ２，２０００）、ＴＮＦα三量体形成ドメイン（Ｍｉｃｒｏｓｅｃ  Ｒｅｓ  Ｔｅｃｈ  ５０ｐ．１８４〜１９５，Ａｕｇ  ２０００）、呼吸器合胞体ウイルスの融合タンパク質（Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７４  ｐ．５９１１〜５９２０，２０００）、およびプロコラーゲン（ＥＭＢＯ  Ｊ  １６  ｐ．６６９４〜６７０１，Ｎｏｖ  １９９７）から誘導され得る。特に好ましい実施形態において、三量体形成ドメインは、Ｈａｒｂｕｒｙら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６２  ｐｐ．１４０１〜１４０７（１９９３）（その全体が参考として本明細書に援用される）に記載されるような、酵母ＧＣＮ４タンパク質のイソロイシン改変体（配列番号３：ＧＣＮ４改変体ＤＮＡ配列：ＡＴＧ  ＡＡＡ  ＣＡＡ  ＡＴＴ  ＧＡＡ  ＧＡＣ  ＡＡＧ  ＡＴＴ  ＧＡＡ  ＧＡＡ  ＡＴＴ  ＣＴＡ  ＴＣＡ  ＡＡＡ  ＡＴＴ  ＴＡＴ  ＣＡＣ  ＡＴＴ  ＧＡＡ  ＡＡＣ  ＧＡＡ  ＡＴＴ  ＧＣＣ  ＡＧＡ  ＡＴＴ  ＡＡＡ  ＡＡＡ  ＣＴＡ  ＡＴＴ  ＧＧＣ  ＧＡＡ；配列番号４：ＧＣＮ４改変体アミノ酸配列：ＭＫＱＩＥＤＫＩＥＥＩＬＳＫＩＹＨＩＥＮＥＩＡＲＩＫＫＬＩＧＥ）である。
【００１９】
特定の条件において、適切な三量体形成ドメインを選択するための重要な基準は、第一にその「強度」であり、そして第二にその「サイズ（大きさ）」であることは当業者に容易に理解される。三量体形成ドメインの強度は、例えば、その結合反応速度論／解離反応速度論において測定可能である場合、規定された条件下で形成された三量体分子の安定性として定量され得る。三量体形成ドメインのサイズ（詳細には、三量体形成ドメインのアミノ酸の総数）は、特定の標的化分子の構築において選択の基準であり得る。なぜなら、この三量体形成ドメインは、その結合機能を破壊することなしに可溶性アデノウイルスレセプタードメイン内に組み込まれるのに十分なほど小さくなければならないからである。
【００２０】
なお別の好ましい実施形態において、この標的化分子は、アデノウイルスレセプタードメインのカルボキシル末端と三量体形成ドメインとの間に配置されているリンカーエレメントをさらに含む（図１を参照のこと）。このリンカーエレメントは、好ましくは、ペプチドリンカーであり得る。本明細書において用いられる場合、「ペプチドリンカー」という用語は、例えば、アデノウイルスレセプタードメインのカルボキシル末端と三量体形成ドメインとの間のスペーサーとして働く短いペプチド配列をいう。このような配列は望ましくは、タンパク質に組み込まれて、この三量体形成ドメインが、可溶性アデノウイルスレセプタードメインによって立体的に邪魔されないこと、そして相互作用してホモ三量体を効率的に形成し得ることを確実にする。リンカー配列は、任意の適切な長さ、好ましくは約３アミノ酸〜約３０アミノ酸の長さの配列であり得、そして任意のアミノ酸、例えば、グリシン残基およびセリン残基の混合物を含む。好ましくは、このリンカー配列は、可溶性アデノウイルスレセプタードメインの機能を妨げない。好ましい実施形態において、このリンカーエレメントは、交互のグリシン残基およびセリン残基からなる。
【００２１】
この標的化分子はまた、各々のドメインを非共有結合的に結合することによって、完全にまたは部分的に、会合されるかまたは組み合わせられ得る。
【００２２】
本発明の標的化分子の標的化リガンドドメインは、本発明の目的に適切な任意の細胞特異的吸着部分を含み得る。この標的化リガンドドメインは、例えば、生理的なリガンド、抗レセプター抗体、または細胞特異的ペプチドのいずれかからなる群より選択され得る。「生理的なリガンド（ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃ  ｌｉｇａｎｄ）」という用語は、細胞表面レセプターに対するリガンドをいう。生理的リガンドおよびそれに由来する細胞特異的ペプチドは、本発明の標的化分子の好ましいエレメントである。
【００２３】
標的化リガンドドメインは、細胞表面分子に選択的に結合する。標的化リガンドドメインは、それが、より大きい親和性でこの細胞表面分子の結合ドメインと相互作用するか、または、他の細胞表面分子の他の結合ドメインと比べて、その結合ドメインに対してより特異的である場合、この細胞表面分子に「選択的に結合する（ｓｅｌｅｃｔｉｖｅｌｙ  ｂｉｎｄｓ）」。「特異的である（ｉｓ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｆｏｒ）」という表現は、このタンパク質が相互作用する相互作用分子の数および型、ならびにこれらの反応の速度および程度に関して、ペプチドまたはタンパク質によって選択的に示される程度（例えば、抗体が組み合わされる抗原の数および型、ならびにこれらの反応の速度および程度に関して、抗体によって選択的に示される程度）をいう。本発明の状況において、「選択的に結合する（ｓｅｌｅｃｔｉｖｅｌｙ  ｂｉｎｄｓ）」という表現はまた、本発明の方法において有用であるために十分な結合を意味する。当該分野で公知のように、例えば、レセプターに対する有用な選択的結合は、結合親和性、およびレセプターの近位において達成可能なリガンドの濃度の両方に依存する。従って、任意の天然に存在する競合リガンドについて見出された結合親和性よりも低い結合親和性は、処理されるべき細胞または組織が、例えば、細胞表面レセプターへの結合について競合するのに十分な添加されたリガンドの濃度を許容する限り、有用であり得る。
【００２４】
本発明の意図に包含される「細胞表面分子」という表現は、本発明の標的化リガンドドメインに選択的に結合する、真核生物細胞の表面膜に提示された任意の分子を含む。「細胞表面分子」とは、標的化リガンドドメインが細胞に吸着するように相互作用し、それによってアデノウイルス粒子の細胞進入を促進し得る、細胞の表面上に存在する任意の部位（すなわち、単一の分子または複数の分子）を意味する。
【００２５】
標的化リガンドドメインは、細胞表面分子に特異的な天然に存在するリガンド分子のフラグメントか、もしくは化学的に改変されたフラグメントか、または全部分でさえあり得る。
【００２６】
本発明において有用な標的化リガンドとしては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）（例えば、ＴＮＦ−αおよびＴＮＦ−βなど）、リンホトキシン、Ｆａｓリガンド（Ｆａｓ抗原に結合する）を含む、ＴＮＦスーパーファミリーのリガンド；ＣＤ４０リガンド（Ｂリンパ球のＣＤ４０レセプターに結合する）；ＣＤ３０リガンド（ホジキンリンパ腫の新生細胞のＣＤ３０レセプターに結合する）；ＣＤ２７リガンド、ＮＧＦリガンド、およびＯＸ−４０リガンド；トランスフェリン（腫瘍細胞、活性化Ｔ細胞、および神経組織細胞上に配置されたトランスフェリンレセプターに結合する）；アポＥ（肝細胞のＬＤＬレセプターに結合する）；α−２−マクログロブリン（肝細胞のＬＲＰレセプターに結合する）；α−１酸性糖タンパク質（肝臓のアシアロ糖タンパク質レセプターに結合する）；マンノース含有ペプチド（マクロファージのマンノースレセプターに結合する）；シアリル−ルイス−Ｘ抗原含有ペプチド（活性化内皮細胞のＥＬＡＭ−１レセプターに結合する）；ＣＤ３４リガンド（造血前駆細胞のＣＤ３４レセプターに結合する）；ＩＣＡＭ−１（リンパ球のＬＦＡ−１（ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８）レセプターにか、またはマクロファージのＭａｃ−１（ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８）レセプターに結合する）；Ｍ−ＣＳＦ（脾臓および骨髄のマクロファージのｃ−ｆｍｓレセプターに結合する）；スポロゾイト周囲タンパク質（肝細胞のＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ（熱帯熱マラリア）レセプターに結合する）；ＶＬＡ−４（活性化内皮細胞のＶＣＡＭ−１レセプターに結合する）；ＬＦＡ−１（活性化内皮細胞のＩＣＡＭ−１レセプターに結合する）；ＮＧＦ（神経細胞のＮＧＦレセプターに結合する）；ＨＩＶ  ｇｐ１２０およびクラスＩＩのＭＨＣ抗原（ヘルパーＴ細胞のＣＤ４レセプターに結合する）；アポリポタンパク質Ｅ（アポＥ）（ＡｐｏＥ）分子のＬＤＬレセプター結合領域；コロニー刺激因子（すなわち、ＣＳＦ）（ＣＳＦレセプターに結合する）；ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩ（それぞれ、ＩＧＦ−１レセプター、およびＩＧＦ−ＩＩレセプターに結合する）のような、インスリン様増殖因子；インターロイキン１〜インターロイキン１８（それぞれ、インターロイキン１レセプター〜インターロイキン１８レセプターに結合する）；ならびに免疫グロブリンのＦｖ抗原結合ドメイン。
【００２７】
１つの好ましい実施形態において、標的化リガンドドメインは、ＦＧＦ−２（塩基性線維芽細胞成長因子−２としても公知）およびＥＧＦ（上皮細胞成長因子）から選択される。これらの標的化リガンドドメインは、標的腫瘍に対して有用である。
【００２８】
さらなる実施形態において、この標的化リガンドドメインは、単鎖抗体フラグメント（ｓｃＦｖ）標的化リガンドドメインである。詳細には、ｓｃＦｖは、腫瘍特異的マーカーであるｃｃ３９を認識し得る。従って、本発明のこの実施形態は、腫瘍を特異的に標的するためのさらなる手段を提供する。
【００２９】
別の好ましい実施形態において、標的化リガンドドメインは、ポリリジンである。ポリリジンは、硫酸ヘパランプロテオグリカンに結合し、そして腫瘍への局所送達に有用である。すなわち、標的化リガンドドメインとしてのポリリジンの選択によって、このベクターが腫瘍塊に局所的に注射される場合、腫瘍塊全体にわたって腫瘍細胞の感染が増強される。
【００３０】
本発明の特定の実施形態において、標的化リガンドドメインは、アミノ酸配列ＣＤＣＲＧＤＣＦＣ（配列番号５）を有するサイクリックＲＧＤである。このｃＲＧＤリガンドは、ａｖβ３およびａｖβ５インテグリンに選択的に結合する。このようなインテグリンは、腫瘍血管に存在する、増殖中の内皮細胞上で豊富に見出される。ｃＲＧＤは、いくつかの腫瘍型（癌腫、肉腫、および黒色腫を含む）に存在することが示されている。公開されたデータによって、ｃＲＧＤは腫瘍の脈管構造だけでなく、特定の腫瘍細胞自体も標的することが示唆される。
【００３１】
別の好ましい実施形態において、この標的化リガンドドメインは、アポＥタンパク質由来の少なくとも１５アミノ酸を含む。より好ましいのは、標的化分子であって、ここでこの標的化リガンドドメインは、アポＥタンパク質由来のアミノ酸１４１〜１５５の２つのタンデムコピー（配列番号６：アポＥダイマーＤＮＡ配列：ＣＴＧ  ＣＧＣ  ＡＡＧ  ＣＴＧ  ＣＧＴ  ＡＡＧ  ＣＧＧ  ＣＴＣ  ＣＴＣ  ＣＧＣ  ＧＡＴ  ＧＣＣ  ＧＡＴ  ＧＡＣ  ＣＴＧ  ＣＴＧ  ＣＧＣ  ＡＡＧ  ＣＴＧ  ＣＧＴ  ＡＡＧ  ＣＧＧ  ＣＴＣ  ＣＴＣ  ＣＧＣ  ＧＡＴ  ＧＣＣ  ＧＡＴ  ＧＡＣ  ＣＴＧ；配列番号７：アポＥダイマーアミノ酸配列：ＬＲＫＬＲＫＲＬＬＲＤＡＤＤＬ  ＬＲＫＬＲＫＲＬＬＲＤＡＤＤＬ）を含む。このアポＥリガンドは、肝細胞上で見出されるＬＤＬ−レセプターファミリーのレセプターに結合し、従って、このリガンドは肝臓の遺伝子治療適用において有用であり得る。ＬＤＬレセプターを認識するアポリポタンパク質Ｅの領域の２つのタンデムコピーが用いられる。なぜなら、この構造は、このペプチドがその正常な状況から動かされる場合、結合活性のために適切な立体配置を生成するのに必要であることが示されているからである。
【００３２】
本発明のさらなる好ましい実施形態において、この標的化リガンドドメインは、可溶性アデノウイルスレセプタードメインのカルボキシル末端に対して、共有結合または非共有結合のいずれかによって接合される。好ましくは、この標的化分子はさらに、三量体形成ドメインのカルボキシル末端と標的化リガンドドメインとの間に局在されるリンカーエレメントを含む。好ましくは、可溶性アデノウイルスレセプタードメインと三量体形成ドメインとの間に挿入されたリンカーは、このような標的化分子をコードするＤＮＡ構築物における相同性を防ぐために、三量体形成ドメインと標的化リガンドドメインとの間に挿入されたリンカーとはアミノ酸配列が異なる。このような相同性は、ＤＮＡレベルで、相同組み換えに起因する不安定性を生じ得るので、不利である。
【００３３】
本発明はまた、本発明の標的化分子を含む、三量体の標的化分子を提供する。この三量体の標的化分子は、単量体の標的化分子中に導入された三量体形成ドメインに起因して会合する。
【００３４】
本発明はさらに、アデノウイルス粒子および標的化分子を含む複合体を提供する。アデノウイルス粒子と標的化分子との「複合体（ｃｏｍｐｌｅｘ）」は、アデノウイルス粒子と標的化分子との間の、任意の相互作用（例えば、共有結合または非共有結合の相互作用）である。好ましくは、これは非共有結合的な相互作用である。アデノウイルス粒子と標的化分子とが接触されるとき、複合体形成が生じる。このような「接触（ｃｏｎｔａｃｔｉｎｇ）」は、当該分野で公知であり、かつ本明細書に記載の任意の手段によってなされ得る。この手段によって、アデノウイルスおよび標的化分子の相互の接触が達成され得る。例えば、アデノウイルス粒子と標的化分子との接触は、小容積の同じ溶液中にこれらのエレメントを混合することによってなされ得る。例えば、アデノウイルス粒子と標的化分子とは、適切な溶液中で３７℃で３０分間、会合させられ得る。必要に応じて、このアデノウイルス粒子と標的化分子とはさらに、例えば、当該分野で公知の化学的手段、もしくは他の手段によって共有結合され得るか、または好ましくは、非共有結合的な相互作用の手段（例えば、イオン結合、水素結合、ファンデルワールス力、および／または非極性相互作用）によって連結され得る。好ましくは、アデノウイルスと標的化分子との複合体は、細胞の接触の前に形成される。この期間は、アデノウイルスおよび標的化分子の複合体が使用可能な形態（例えば、凍結乾燥された形態）で、または−８０℃で凍結防止剤の存在下で安定に維持され得る、ほぼ最長の時間であり得る。
【００３５】
本発明はまた、本発明の標的化分子のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを提供する。また、このようなポリヌクレオチドの改変体であり、かつ標的化分子のアミノ酸配列の対応する機能的改変体をコードするポリヌクレオチドが提供される。機能的改変体は、１つ以上の置換、付加、欠失、短縮（トランケーション）（これが任意の組み合わせで存在し得る）で、アミノ酸配列において異なり得るが、レフェリー（審判）の標的化分子と同じ生物学的機能を保持する。
【００３６】
とりわけ好ましい改変体は、保存的アミノ酸置換基で参照ポリペプチドと変化している改変体である。従って、本発明はまた、標的化分子のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド、およびこのようなポリヌクレオチドの保存的に改変された改変体である任意のポリヌクレオチドを意図する。「保存的に改変された改変体（ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅｌｙ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｖａｒｉａｎｔ）」は、保存的アミノ酸置換を生じる核酸配列上のバリエーションである。「保存的アミノ酸置換」とは、同様の電荷密度、親水性／疎水性、サイズ（大きさ）、および／または立体構造である、代替的アミノ酸によって置換されたアミノ酸である。対照的に、「非保存的アミノ酸置換（ｎｏｎｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）」とは、異なる電荷密度、親水性／疎水性、サイズ（大きさ）、および／または立体構造である、代替的アミノ酸によって置換されたアミノ酸である。このような改変を作製する手段は当該分野で周知である。
【００３７】
以下のアミノ酸の非限定的な列挙は、保存的置換であるとみなされる：ａ）アラニン、セリン、およびトレオニン；ｂ）グルタミン酸およびアスパラギン酸；ｃ）アスパラギンおよびグルタミン；ｄ）アルギニンおよびリジン；ｅ）イソロイシン、ロイシン、メチオニンおよびバリン、；ならびにｆ）フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファン。
【００３８】
本出願の意図に包含される「生物学的機能（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ）」は、広義に理解されるべきである。この生物学的機能としては、本出願に開示された標的化分子のエレメント（このエレメントは、可溶性アデノウイルスレセプタードメイン、三量体形成ドメイン、および標的化リガンドドメインである）の特定の機能をが挙げられるがこれらに限定されない。従って、生物学的機能は、ポリペプチドがその生理的状況で（すなわち、生存している生物体または細胞の一部として）示す機能だけでなく、非生理的な環境（例えば、インビトロ）において実施し得る機能も含む。例えば、本出願の意図に包含される可溶性アデノウイルスレセプターの生物学的機能は、インビトロまたはインビボのいずれかで、本発明のアデノウイルス粒子のファイバータンパク質に結合する能力である。本出願の意図に包含される三量体形成ドメインの生物学的機能は、インビトロで本発明の標的化分子を三量体形成する能力、およびインビボでこの三量体状態を維持する能力である。本出願の意図に包含される標的化リガンドドメインの生物学的機能は、インビトロまたはインビボで、本出願において規定されるような対応する細胞表面分子に結合する能力である。必要な特性（例えば、特定のリガンドに対するタンパク質の結合特性）を評価するためのアッセイは、当該分野で周知である。
【００３９】
このような標的化分子を作製する手段、詳細には、ＤＮＡのレベルで、可溶性アデノウイルスレセプタードメインの配列中に、またはこの可溶性アデノウイルスレセプタードメインの３’末端に、三量体形成ドメインの配列を導入する手段は、当該分野で周知であり、そして本発明の実施例においてさらに記載されている。要するに、この方法は、野生型可溶性アデノウイルスレセプタードメインのタンパク質配列中にまたはそのタンパク質配列と入れ替えて、新しいペプチドモチーフを挿入するために、選択された可溶性アデノウイルスレセプタードメインをコードする配列中に、選択された三量体形成ドメインの配列を導入する工程を包含する。このような導入は、新しいペプチド結合モチーフの挿入、またはペプチドモチーフの創造を生じ得る。例えば、ここでこのモチーフを含むいくつかの配列は、既に、野生型の可溶性アデノウイルスレセプタードメインに存在する。この方法はまた、本発明に従って、可溶性アデノウイルスレセプタードメインの配列を、ネイティブでないアミノ酸配列と、置き換えるために実行され得る。一般に、これは、配列の操作を容易にするために、プラスミドまたはいくつかの他のベクター中に、可溶性アデノウイルスレセプタードメインをコードする核酸配列をクローニングすることによって達成され得る。次いで、さらなる配列が付加され得る特有の制限部位が、このプラスミドの配列（可溶性アデノウイルスレセプタードメインの配列を含む）中に同定されるかまたは挿入され得る。二本鎖の合成オリゴヌクレオチドは一般に、重複する合成の一本鎖のセンスオリゴヌクレオチドおよびアンチセンスオリゴヌクレオチドから作成され、その結果、この二本鎖オリゴヌクレオチドは、この標的配列に隣接する制限部位を組み込み、そして例えば、代わりのＤＮＡを組み込むために用いられ得る。このプラスミドまたは他のベクターは、制限酵素で切断され、そして適合性の付着末端を有するオリゴヌクレオチド配列は、野生型ＤＮＡを置き換えるために、プラスミドまたは他のベクター中に連結される。当業者に公知の他の手段（詳細にはＰＣＲ技術を用いる）がまた、可溶性アデノウイルスレセプタードメインコード配列中に三量体形成ドメインの配列を導入するために用いられ得る。
【００４０】
１つの好ましい実施形態において、可溶性アデノウイルスレセプタードメインをコードする配列の３‘末端に配置されるように、三量体形成ドメイン配列がクローニングされる。本発明によって提供されるクローニングアプローチのさらなる詳細は、以下の実施例に提供される。
【００４１】
本発明はさらに、標的化分子の核酸配列をコードするポリヌクレオチドを含むか、またはリガンド分子および可溶性アデノウイルスレセプター分子をコードする（必要に応じて、さらに配列中に三量体形成ドメインを含む）少なくとも２つのポリヌクレオチドを含む発現ベクターを提供する。適切な発現ベクターとは、適切な宿主細胞において増殖された場合、挿入されたＤＮＡ配列の発現のために必要な全ての遺伝子エレメントを含む任意のベクターである。多数の適切な発現ベクターが当業者に公知であり、そして市販されている。
【００４２】
本発明は、アデノウイルス粒子および標的化分子を含む複合体を提供する。「アデノウイルス粒子」という用語は、本発明のアデノウイルスベクターが、感染性粒子の生成のために適切な細胞または細胞株に形質導入されるときに形成される感染性ウイルス粒子を意味するとして広義に理解されるべきである。「アデノウイルスベクター」という用語は、組み換えアデノウイルスベクターを含む。組み換えアデノウイルスベクターは、種々の技術によって生成され得る。このような技術は、目的の所望の遺伝子を、細菌のプラスミド中に、アデノウイルス配列に隣接する部位で導入する工程を包含する。これらの配列は、遺伝子発現のための制御エレメントを提供し、そして適切な哺乳動物細胞株中に一緒に同時トランスフェクトされた場合、適合性のアデノウイルスゲノムとの組み換えのための部位として働く（Ｈｏｒｗｉｔｚ，Ｍ．Ｓ．，「Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓｅｓ」Ｆｉｅｌｄｓ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、第三版、Ｂ．Ｎ．Ｆｉｅｌｄｓ、Ｄ．Ｍ．Ｋｎｉｐｅ、Ｐ．Ｍ．Ｈｏｗｌｅｙら編、Ｌｉｐｐｉｎｏｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ：Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，Ｐａ．（ペンシルベニア州フィラデルフィア）（１９９６））。
【００４３】
使用されるアデノウイルスベクターは、１つの実施形態において、完全なアデノウイルスゲノムを本質的に含むアデノウイルスベクターであってもよい（Ｓｈｅｎｋら、Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，（１９８４）；１１１（３）：１〜３９）。あるいは、アデノウイルスプラスミドベクターは、アデノウイルスゲノムの少なくとも一部が欠失されている、改変されたアデノウイルスベクターであってもよい。
【００４４】
１実施形態において、このベクターは、以下を含む：アデノウイルス５’ＩＴＲ；アデノウイルス３’ＩＴＲ；アデノウイルスキャプシド形成シグナル；治療因子をコードする少なくとも１つのＤＮＡ配列；および治療因子をコードするＤＮＡ配列を制御するプロモーター。このベクターは、アデノウイルスＥ１およびＥ３のＤＮＡ配列の少なくとも大部分を含まないが、Ｅ２およびＥ４のＤＮＡ配列の全て、ならびにアデノウイルス主要後期プロモーターによって促進されたアデノウイルスタンパク質をコードするＤＮＡ配列を含まないわけではない。１実施形態において、このベクターはまた、Ｅ２およびＥ４のＤＮＡ配列からなる群より選択される少なくとも１つのＤＮＡ配列の少なくとも一部を含まない。別の実施形態において、このベクターは、アデノウイルスＥ１およびＥ３のＤＮＡ配列の少なくとも大部分を含まず、そしてＥ２およびＥ４のＤＮＡ配列の１つを含まず、そして他のＥ２およびＥ４のＤＮＡ配列の一部を含まない。
【００４５】
なお別の実施形態において、このアデノウイルスベクターは、Ｅ１およびＥ３のＤＮＡ配列の少なくとも大部分を含まず、Ｅ２およびＥ４のＤＮＡ配列からなる群より選択された少なくとも１つのＤＮＡ配列の少なくとも一部を含まず、そしてアデノウイルス主要後期プロモーターによってプロモートされたアデノウイルスタンパク質をコードするＤＮＡ配列を含まない。
【００４６】
このようなアデノウイルスベクターは、５’末端で開始する、「重要な左末端エレメント（ｃｒｉｔｉｃａｌ  ｌｅｆｔ  ｅｎｄ  ｅｌｅｍｅｎｔｓ）」（これは、アデノウイルス５’ＩＴＲ、アデノウイルスキャプシド形成シグナル、およびＥ１ａエンハンサー配列を含む）；プロモーター（アデノウイルスプロモーターまたは外来のプロモーターであってもよい）；３つの部分からなるリーダー配列、マルチクローニング部位（本明細書において上記で記載されている）；ポリＡシグナル；ならびにアデノウイルスゲノムのセグメントに対応するＤＮＡセグメント；を含むシャトルプラスミドを、標準的な技術に従って、まず構築することによって、構築され得る。このようなＤＮＡセグメントは、改変されたかまたは変異したアデノウイルスを用いた相同組み換えのための基質として働き、そしてこのような配列は、例えば、アデノウイルス５のゲノムの塩基３３２９〜塩基６２４６でしかない、このゲノムのセグメントを包含し得る。このプラスミドはまた、選択マーカーおよび複製起点を含み得る。複製起点は、複製の細菌性起源であり得る。次いで、治療因子をコードする所望のＤＮＡ配列は、マルチクローニング部位に挿入され得る。次いで、相同組み換えは、改変されたアデノウイルスまたは変異したアデノウイルスを用いて達成される。ここでは、Ｅ１およびＥ３のアデノウイルスＤＮＡの配列の少なくとも大部分が欠失されている。このような相同組み換えは、ＣａＰＯ４沈殿による、シャトルプラスミドおよび改変されたアデノウイルスの、ヘルパー細胞株（例えば、２９３細胞）への同時トランスフェクションによって達成され得る。このような相同組み換えの際、ＮｏｔＩ部位と相同組み換えフラグメントの間のシャトルプラスミド由来のＤＮＡ配列、ならびに相同組み換えフラグメントと３’ＩＴＲとの間のＥ１およびＥ３を欠失したアデノウイルス由来のＤＮＡを含む組み換えアデノウイルスベクターが形成される。この相同組み換えフラグメントは好ましくは、アデノウイルス５のゲノムのヌクレオチド３３２９〜６２４６と重複している。
【００４７】
このような相同組み換えを通じて、アデノウイルス５’ＩＴＲ、アデノウイルスキャプシド形成シグナル；Ｅ１ａエンハンサー配列；プロモーター；三部分からなるリーダー配列；治療因子をコードする少なくとも１つのＤＮＡ配列；ポリＡシグナル；Ｅ１およびＥ３アデノウイルスＤＮＡ配列の少なくとも大部分を含まないアデノウイルスＤＮＡ；ならびにアデノウイルス３’ＩＴＲ；を含むアデノウイルスベクターが形成され得る。次いで、このベクターは、ウイルス複製のために、そして感染性ウイルス粒子を生成するために必須である、Ｅ１ａおよびＥ１ｂのＤＮＡ配列を含む、ヘルパー細胞株（例えば、２９３ヘルパー細胞株）にトランスフェクトされ得る。
【００４８】
このアデノウイルスベクターは、アデノウイルス粒子の生成のために適切な細胞株にトランスフェクトされる。トランスフェクションは、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿、マイクロインジェクションによって、またはタンパクリポソームを通じて、生じ得る。適切な細胞株の例としては、ＨｅＬａ細胞または２９３細胞（胚性腎臓上皮細胞）が挙げられるがこれらに限定されない。
【００４９】
別の実施形態において、このアデノウイルスベクターは、以下を含む：アデノウイルス５’ＩＴＲ；アデノウイルス３’ＩＴＲ；アデノウイルスキャプシド形成シグナル；治療因子をコードする少なくとも１つのＤＮＡ配列；および治療因子をコードするこの少なくとも１つのＤＮＡ配列を制御するプロモーター。このベクターは、アデノウイルスＥ１、Ｅ２、Ｅ３、およびＥ４のＤＮＡ配列を含まず、そしてこのベクターは、アデノウイルスの主要後期プロモーターによってプロモートされるアデノウイルスタンパク質をコードするＤＮＡ配列を含まない。
【００５０】
このようなベクターは、アデノウイルスゲノムから、標準的な技術によってアデノウイルス５’ＩＴＲ、アデノウイルス３’ＩＴＲ、およびアデノウイルスキャプシド形成シグナルを取り除くことによって構築され得る。このような成分、ならびにプロモーター（アデノウイルスプロモーターであっても、非アデノウイルスプロモーターであってもよい）三部分からなるリーダー配列、ポリＡシグナル、および選択マーカーは、適切なクローニングベクターを形成するために、標準的な技術によって、基礎のプラスミドまたは「スターター（ｓｔａｒｔｅｒ）」プラスミド（例えば、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＫＳ−（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）など）中に連結され得る。このクローニングベクターは、このクローニングベクター中への治療因子をコードするＤＮＡ配列の挿入を容易にするためにマルチクローニング部位を含み得る。一般に、このマルチクローニング部位は、「まれな（レアな）（ｒａｒｅ）」制限酵素部位；すなわち、１０，０００塩基対ごとに約１〜１００，０００塩基対ごとに約１の頻度で、真核生物遺伝子中に見出される部位を含む。従って、適切なベクターは、このマルチクローニング部位において適切な制限部位で、標準的な技術により、このクローニングベクターを切断することによって、次いで治療因子をコードするＤＮＡ配列をこのクローニングベクター中に連結することによって形成される。
【００５１】
このベクターは、必要なキャプシド形成材料を提供するへルパーアデノウイルスを用いて、感染性ウイルス粒子中にパッケージングされ得る。好ましくは、このヘルパーウイルスは、このヘルパーウイルス自体がキャプシド形成することがないように、不完全なキャプシド形成シグナルを有する。使用され得るキャプシド形成欠陥ヘルパーウイルスの例は、Ｇｒａｂｌｅら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，第６６巻、７２３〜７３１頁（１９９２）に記載されている。
【００５２】
本発明はまた、細胞表面分子を発現する細胞に対してアデノウイルス粒子を標的する方法を提供する。この方法は、このアデノウイルス粒子と標的化分子（可溶性アデノウイルスレセプタードメインと、三量体形成ドメインと、標的化リガンドドメインとを含む）とを接触させる工程、この細胞表面分子を標的するのに適切な複合体を獲得する工程、ならびにこの細胞をこの複合体と接触させる工程、を包含する。
【００５３】
本発明はさらに、細胞表面分子を発現する細胞に対してアデノウイルスベクターを選択的に送達する方法を提供する。この方法は、アデノウイルス粒子（このアデノウイルスベクターを含む）と、標的化分子（可溶性アデノウイルスレセプタードメインと、三量体形成ドメインと、標的化リガンドドメインとを含む）とを接触させる工程、この細胞表面分子を標的するのに適切な複合体を獲得する工程、ならびにこの細胞をこの複合体と接触させる工程、を包含する。
【００５４】
さらに、本発明の標的化分子は、細胞表面分子がアデノウイルス粒子の細胞進入を媒介し得るか否かを簡便に評価するために有用である。ｓＣＡＲを介してベクターを標的する１つの利点は、各々の新しい標的について改変されたベクターを生成するための必要性が、この方法によって回避されることである。対照的に、キャプシドタンパク質（例えば、ファイバーもしくはヘキソン、またはペントン）への標的化リガンドドメインの挿入に基づく標的化ストラテジーでは、試験されるべき各々のリガンドについて新しいアデノウイルスベクターの生成を必要とする。さらに、キャプシドタンパク質改変ストラテジーは、ＣＡＲ結合能力をノックアウトするためにファイバーノブ中に変異を生成することのような、ウイルスの正常な指向性を除去するための機構に依存する。しかし、ＣＡＲ結合の除去は、パッケージング細胞へのベクターの進入に有害に影響し得、ベクターの産生を可能にするためには、パッケージング細胞またはウイルスのいずれかのさらなる操作を要する。このｓＣＡＲ標的化ストラテジーは、ウイルスまたはパッケージング細胞の操作を必要としないので、ベクターは、標準的なパッケージング細胞上で正常な力価まで増殖され得る。さらに、このｓＣＡＲストラテジーは同時に、ベクターの正常な指向性を除去し、そしてこのベクターを新しい標的に指向し直させる。
【００５５】
従って、本発明は、細胞培養中において標的化リガンドドメインをスクリーニングするための簡便な方法を提供する。多数の可能性のあるリガンドを、ｓＣＡＲをコードする発現プラスミド中に挿入し得、そしてこの対応する融合タンパク質を、簡便に生成し得る。各々をマーカー遺伝子（例えば、ＧＦＰなど）をコードするアデノウイルスベクターと複合体化し得、そして特定の標的細胞の形質導入効率を迅速に評価し得る。一旦、最適のリガンドが同定されれば、それらのリガンドをまた、キャプシドタンパク質の露出したループ中へのリガンドの挿入のような、他のベクター標的化ストラテジーにおいて使用し得る。
【００５６】
本発明はまた、細胞表面分子であって、この細胞表面分子を発現する特定の細胞または組織に対するアデノウイルス粒子の進入を媒介するために適切なある細胞表面分子を同定する方法を提供する。この方法は、この細胞表面分子と相互作用する標的化リガンドドメインを含む標的化分子を生成する工程、マーカー遺伝子を含むアデノウイルス粒子と、この標的化分子とを接触させて、複合体を形成する工程、この細胞または組織とこの複合体とを接触させる工程、およびこのマーカー遺伝子によって報告された場合、この細胞または組織を効率的に形質導入している複合体を選択する工程、を包含する。この細胞または組織においてこのマーカー遺伝子の存在を評価すれば、効率的な形質導入を実証するために十分である。「マーカー遺伝子（ｍａｒｋｅｒ  ｇｅｎｅ）」は、これがアデノウイルス起源の一部または異種であろうとなかろうと、アデノウイルスベクターによって保有される任意の遺伝子であり得、そしてこのマーカー遺伝子は、例えば、細胞における遺伝子の発現を評価することによってモニターされ得る。遺伝子発現を評価するための多くの有用な方法は、当業者に公知である。
【００５７】
さらに、本発明はまた、細胞表面分子を発現する細胞に対して選択的に異種遺伝子を送達する方法を提供する。この方法は、アデノウイルス粒子（この異種遺伝子を含む）と、標的化分子（可溶性アデノウイルスレセプタードメインと、三量体形成ドメインと、標的化リガンドドメインとを含む）とを接触させる工程、この細胞表面分子を標的するのに適切な複合体を獲得する工程、ならびにこの細胞をこの複合体と接触させる工程、を包含する。
【００５８】
従って、本発明の複合体は、宿主に対してインビボで投与され得る。宿主は、哺乳動物宿主、霊長類宿主、およびヒト宿主を含む動物宿主であり得る。従って、本発明の複合体は、ヒトを含む哺乳動物における疾患の処置のための医薬として有用であり、かつ医薬の調製のために有用である。
【００５９】
本発明の複合体は、宿主に治療効果を提供するために効果的な量で投与され得る。１実施形態において、このベクターは、１プラーク形成単位〜約１０１４プラーク形成単位、好ましくは、約１０６プラーク形成単位〜約１０１３プラーク形成単位の量で投与され得る。宿主は、ヒト宿主であってもまたは非ヒト動物宿主であってもよい。好ましくは、この複合体粒子は、例えば、静脈内投与（例えば、門脈注射または末梢血管注射など）、筋肉内投与、腹腔内投与、または経鼻投与などによって全身に投与される。この複合体粒子は、患者への投与に適切な薬学的に受容可能なキャリアと組み合わせて投与され得る。このキャリアは、液体キャリア（例えば、食塩水）であっても、または固体キャリア（例えば、マイクロキャリアビーズなど）であってもよい。この複合体粒子は、宿主へのこのような複合体粒子のインビボ投与の際、所望の細胞または組織に直接移動する。次いで、この標的化ベクター粒子は所望の細胞または組織に感染する。所望の細胞または組織は、例えば、悪性細胞および癌組織であり得る。従って、標的されたベクター粒子は、例えば、癌のような疾患の処置のために有用である。例えば、１つの好ましい実施形態において、標的されたベクター粒子は、例えば、前立腺の腺癌のような前立腺癌を処置するために有用である。この粒子の再標的化に起因して、遺伝子治療の副作用は、このような処置方法において軽減され得る。詳細には、アデノウイルスの肝毒性の副作用は、複合体化されていないアデノウイルスベクターでなく、本発明の複合体が使用される場合に、減弱され得る。
【００６０】
感染性複合体粒子によって感染され得る細胞としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：初代有核血球（例えば、白血球、顆粒球、単球、マクロファージ、リンパ球（Ｔリンパ球およびＢリンパ球を含む）、全能性幹細胞、および腫瘍浸潤性リンパ球（ＴＩＬ細胞））のような初代細胞；骨髄細胞；内皮細胞（活性化内皮細胞を含む）；上皮細胞；ケラチノサイト；幹細胞；肝細胞（肝細胞前駆細胞を含む）；線維芽細胞；間葉細胞；中皮細胞；実質細胞；血管（脈管）平滑筋細胞；脳細胞および他の神経細胞；腸の腸細胞；腸の幹細胞；および筋芽細胞。感染され得る細胞としてはさらに、初代癌細胞および転移性癌細胞が挙げられ、これには、前立腺癌、膵臓癌、肺癌（小細胞肺癌および非小細胞肺癌の両方を含む）、結腸癌、および肝臓癌が挙げられるがこれらに限定されない。感染性ウイルス粒子で「標的化される」か、または感染されるか、または形質導入される細胞は、標的化分子が操作されているリガンドに依存する。
【００６１】
従って、本発明の複合体は、「標的可能（ｔａｒｇｅｔａｂｌｅ）」であり、すなわち、この複合体は宿主への投与の際、所望の標的または組織に結合して感染し、それによってこの所望の標的細胞または組織に、治療因子をコードするＤＮＡを選択的に送達する。粒子が標的される特定の標的細胞または組織は、この標的化分子が操作されているリガンドに依存する。なぜなら、標的化分子の標的化リガンドドメインは、所望の標的細胞によって提示された細胞表面分子に特異的であるからである。
【００６２】
従って、本発明はまた、アデノウイルスベクターの細胞進入を達成するために、細胞に対してアデノウイルスを標的化する方法を提供する。この方法は、細胞へのアデノウイルスの侵入が達成されるように、この細胞と、上記のような複合体とを接触させる工程を包含する。「標的化（する）（ｔａｒｇｅｔｉｎｇ）」または「選択的に送達する（ｄｅｌｉｖｅｒｉｎｇ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｅｌｙ）」とは、別の細胞へではなく、特定の細胞中に優先的に導入することを意味する。本発明に従って、細胞は任意の細胞であり、そして好ましくは真核生物細胞である。好ましくは、真核生物細胞は、多細胞種の細胞であり、そしてなおより好ましくは、哺乳動物、例えば、ヒトの細胞である。望ましくは、このような真核生物細胞は、アデノウイルスが、細胞への進入後、一定期間（すなわち、代表的には、いずれかから約２ヶ月まで、そして可能性としては約２ヶ月後さえ）存在し得る細胞である。新生ＲＮＡは、本明細書においてさらに記載しているように、アデノウイルスによって細胞中に運搬されたアデノウイルスゲノム（ネイティブでない遺伝子を含み得る）から転写される。
【００６３】
細胞は単一の実体として存在してもよいし、または細胞のより大きい集合体の一部であってもよい。このような「細胞のより大きい集合体（ｌａｒｇｅｒ  ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｅｌｌｓ）」とは、以下を含み得る：例えば、細胞培養物（混合されているかまたは純粋かのいずれか）、組織、例えば、上皮組織もしくは他の組織（例えば、新生物（両性または悪性）の組織）、器官（例えば、心臓、肺、肝臓、および他の器官）、器官系（例えば、循環系、呼吸器系、胃腸系、または他の器官系）、または生物体（例えば、鳥類、哺乳動物など）。１実施形態において、標的されている細胞は、循環系（例えば、心臓、血管、および血液を含むがこれらに限定されない）の細胞、呼吸器系（例えば、鼻、咽頭、喉頭、気管、気管支、細気管支、肺など）の細胞、または胃腸系（例えば、口、咽頭、食道、胃、腸、唾液腺、膵臓、肝臓、膀胱などを含む）の細胞である。好ましい実施形態において、新生物組織（すなわち、「腫瘍組織」）の細胞は、本発明の標的化分子／アデノウイルス粒子複合体で標的される。
【００６４】
組み換えアデノウイルスが標的される細胞は、標的されない別の細胞とは、この標的されている細胞が、特定の細胞表面分子、または少なくとも非標的細胞よりも高密度の特定の細胞表面分子を提示するという点で異なる。この細胞表面分子は、タンパク質（改変されたタンパク質を含む）、炭水化物、糖タンパク質、プロテオグリカン、脂質、ムチン分子またはムコタンパク質などであり得る。可能性のある細胞表面分子の例としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：グリコサミノグリカンに見出されるヘパリンおよびコンドロイチン硫酸；ムチン、糖タンパク質、およびガングリオシドに見出されるシアル酸部分；主要組織適合性遺伝子複合体Ｉ糖タンパク質；マンノース、Ｎ−アセチル−ガラクトサミン、Ｎ−アセチル−グルコサミン、フコース、およびガラクトースを含む、膜糖タンパク質に見出される共通の炭水化物分子；糖タンパク質（例えば、ＩＣＡＭ−１、ＶＣＡＭ、Ｅ−セレクチン、Ｐ−セレクチン、Ｌ−セレクチン、およびインテグリン分子）；ならびに癌性細胞上に存在する腫瘍特異的抗原（例えば、ＭＵＣ−１腫瘍特異的エピトープ、およびｃｃ３９分子など）。癌性細胞上に存在する腫瘍特異的抗原の標的化は、本発明の１つの好ましい実施形態である。しかし、細胞に対してアデノウイルスを標的する本発明の方法は、細胞の相互作用（すなわち、所定の細胞表面結合部位との相互作用）のいずれの特定の機構にも限定されず、そしてそのように解釈されるべきではない。
【００６５】
標的化分子と複合体化され、そして所望のタンパク質または治療因子をコードする遺伝子を含むアデノウイルス粒子は、インビトロで所望の細胞株を感染するために使用され得、これによってこの感染した細胞はインビトロで所望のタンパク質または治療因子を生成する。この感染した細胞は、種々の疾患の処置（「エキソビボ遺伝子治療」）において有用であり得る。これらの疾患としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：アデノシン・デアミナーゼ欠損症、鎌形赤血球貧血、地中海貧血症（サラセミア）、血友病、糖尿病、α−抗トリプシン欠乏症、脳障害（例えば、アルツハイマー病、フェニルケトン尿症、および他の疾患（例えば、コレステロール代謝方法の変化および免疫系の欠損によって生じるような、成長障害および心疾患など））。本発明の標的化分子および複合体はまた、例えば、遺伝子治療の移植適用の状況における、そしてエキソビボ細胞治療（細胞療法）における、血管および器官の体外的な形質導入のために有用である。
【００６６】
特に好ましい実施形態において、腫瘍崩壊性（ｏｎｃｏｌｙｔｉｃ）アデノウイルス粒子は、本発明のアデノウイルス粒子として意図される。腫瘍崩壊性アデノウイルス粒子は、腫瘍細胞において選択的に複製し、そして細胞（アデノウイルス粒子がその中で複製する）を破壊するが、非腫瘍細胞では複製しないアデノウイルス粒子である。それらは、複製のために必要なアデノウイルスエレメントに加えて、異種遺伝子を含んでも含まなくてもよい。１実施形態において、腫瘍崩壊性アデノウイルス粒子は、アデノウイルスの複製に必須の遺伝子（例えば、Ｅ１ａ遺伝子またはＥ１ｂ遺伝子）中に変異を含む。このような変異は、例えば、この組織の細胞がｐ５３またはＲｂの経路において欠損を有する場合、腫瘍組織に特異的なアデノウイルス複製をもたらし得る。別の実施形態において、腫瘍崩壊性アデノウイルス粒子は、アデノウイルス粒子の複製に必須のアデノウイルス遺伝子を駆動する組織特異的転写調節配列を含み得、この配列が、腫瘍崩壊性アデノウイルス粒子の腫瘍組織特異的な複製を提供する。Ｈａｌｌｅｎｂｅｃｋらに対して、１９９９年１２月７日に発行された、米国特許第５，９９８，２０５号を参照のこと。
【００６７】
１つの態様において、本発明は、アデノウイルス粒子が異種遺伝子を含む複合体を提供する。「異種遺伝子」という用語は、対応する天然に存在する（すなわち、野生型）アデノウイルスにおいては見出されない任意の遺伝子を意味する。このネイティブでない遺伝子は、いずれの遺伝子であってもよく、そして望ましくは治療遺伝子またはレポーター遺伝子（これは好ましくは、アデノウイルス粒子に進入された細胞において発現され得る）のいずれかである。治療遺伝子は、ＲＮＡまたはタンパク質のレベルでその効果を発揮する遺伝子であり得る。例えば、治療遺伝子によってコードされるタンパク質は、遺伝性疾患の処置において使用され得る（例えば、嚢胞性線維症の処置における嚢胞性線維症膜貫通調節因子をコードするｃＤＮＡの使用）。さらに、この治療遺伝子によってコードされるタンパク質は、細胞死を引き起こすことにより治療効果を発揮し得る。例えば、タンパク質の発現自体が、ジフテリア毒素Ａの発現と同様に、細胞死を導き得るか、またはこのタンパク質の発現が、特定の薬物に対して細胞を選択的に感受性にさせ得る。例えば、単純ヘルペスのチミジンキナーゼ遺伝子の発現は、抗ウイルス化合物（例えば、アシクロビル、ガンシクロビル、およびＦＩＡＵ（１−（２−デオキシ−２−フルオロ−β−Ｄ−アラビノフラノシル）−５−ヨードウラシル））に対して細胞を感受性にする。あるいは、この治療遺伝子は、以下のレベルでその効果を発揮し得る：ＲＮＡのレベルで（例えば、アンチセンスメッセージまたはリボザイムをコードすることによって）、スプライシングもしくは３’プロセシング（例えば、ポリアデニル化）に影響するタンパク質のレベルで、または細胞内の別の遺伝子の発現のレベルに影響するタンパク質のレベルで（例えば、ｍＲＮＡの蓄積の速度の変更、ｍＲＮＡ輸送の変化、および／または転写後調節における変化を媒介することによって）。従って、「治療用遺伝子（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｇｅｎｅ）」という用語の使用は、これら、および当業者に公知のように、より通常には遺伝子治療と呼ばれるその他の任意の実施形態を包含することが意図される。「治療用因子」という用語は、一般的な意味で用いられ、そして処置因子、予防因子、および交換因子を包含する。
【００６８】
アデノウイルスベクター中に配置され得る治療因子をコードするＤＮＡ配列としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：ＴＮＦ−αのような腫瘍壊死因子をコードするＤＮＡ配列；インターフェロンα、インターフェロンβ、およびインターフェロンγのようなインターフェロンをコードする遺伝子；ＩＬ−１、ＩＬ−１β、およびインターロイキン２〜１８のようなインターロイキンをコードする遺伝子；ＧＭ−ＣＳＦをコードする遺伝子；アデノシンデアミナーゼ（すなわちＡＤＡ）をコードする遺伝子；リンパ球の増殖因子である、リンホカインのような、細胞増殖因子をコードする遺伝子；可溶性ＣＤ４をコードする遺伝子；第ＶＩＩＩ因子；第ＩＸ因子；Ｔ細胞レセプター；コレステロールの輸送および代謝に関与するＬＤＬレセプター、アポＥ、アポＣ、アポＡＩ，および他の遺伝子；α−１抗トリプシン遺伝子、オルニチントランスカルバミラーゼ遺伝子、ＣＦＴＲ遺伝子、インスリン遺伝子、陰性選択マーカー、または「自殺（ｓｕｉｃｉｄｅ）」遺伝子（例えば、ウイルスのチミジンキナーゼ遺伝子（例えば、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子、サイトメガロウイルスチミジンキナーゼ遺伝子、および水疱瘡ウイルスチミジンキナーゼ遺伝子））；抗体の抗原結合ドメインのＦｃレセプター、ならびにウイルス複製を阻害するアンチセンス配列。
【００６９】
本発明の好ましい実施形態において、治療因子をコードするＤＮＡ配列は、ＧＭ−ＣＳＦ、チキジンキナーゼ、Ｎｏｓ、ＦａｓＬ、またはｓＦａｓＲ（可溶性Ｆａｓレセプター）のいずれかから選択される。治療因子をコードするＤＮＡ配列はまた、アデノウイルスＥ１ａ遺伝子のような、アデノウイルスゲノムの一部である配列であり得る。一方では、Ｅ１ａは、アデノウイルス複製サイクルを駆動するのに役立ち、これが次に細胞溶解をもたらす。従って、Ｅ１ａは、例えば腫瘍組織に投与される場合、本発明の意図に包含される治療因子をコードするＤＮＡ配列であるとみなされ得る。さらにこのような遺伝子は、例えば、特定の因子および／または照射に対して感染した細胞を感作させることによって、さらなる治療的利点を提供し得る。
【００７０】
ヒト患者については、治療遺伝子は、ヒト起源の遺伝子であるが、高い相同性を示し、ヒトにおける機能に生物学的に同一または等価な機能を示す密接に関連した種の遺伝子を、この遺伝子がレシピエントにおいて有害な免疫反応を生じない場合、用いらてもよい。核酸配列または治療遺伝子の治療上活性な量とは、所望の結果を達成するために必要な投薬量で、かつある期間について有効な量である。この量は被験体の性別、年齢、体重などを含むがこれに限定されない種々の因子によって変化し得る。
【００７１】
少なくとも１つの治療因子をコードするＤＮＡ配列は、適切なプロモーターの制御下にある。使用され得る適切なプロモーターとしては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：アデノウイルスプロモーター（例えば、アデノウイルス主要後期プロモーター）；または異種プロモーター（例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター；ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター；誘導性プロモーター（例えば、ＭＭＴプロモーター、メタロチオネインプロモーター）；熱ショックプロモーター；アルブミンプロモーター；およびアポＡＩプロモーター。以下の腫瘍選択性プロモーターは本発明の好ましい実施形態である：Ｅ２Ｆ、オステオカルシン、Ｌ−プラスチン、ＣＥＡ、ＡＶＰ、ｃ−ｍｙｃ、テロメラーゼ、ｓｋｐ−２、ｐｓｍａ、サイクリンＡ、およびｃｄｃ２５プロモーター。特に好ましい実施形態において、本発明のプロモーターは、Ｅ２Ｆプロモーターである。本発明の実施形態において、Ｅ２ＦプロモーターはＥ１ａ遺伝子に作動可能に連結されている。しかし、本発明の範囲は特定の外来遺伝子またはプロモーターに限定されるべきではないということが理解されるべきである。
【００７２】
（実施例）
本発明はここで、以下の実施例に関して記載される；しかし、本発明の範囲は、それによって限定されるべきであるとは意図さていないことが理解されるべきである。
【００７３】
（実施例１：ＣＡＲをコードするヒトｃＤＮＡの単離）
ＣＡＲをコードするヒトｃＤＮＡは、ＲＴ−ＰＣＲによってクローニングされた。公開されたＣＡＲ  ｃＤＮＡ配列（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｙ０７５９３）を用いて、増幅のためのオリゴヌクレオチドプライマーを設計した。培養したＨｅＬａ細胞から、ＲＮＡｚｏｌ（Ｔｅｌ−Ｔｅｓｔ，Ｆｒｉｅｎｄｓｗｏｏｄ，ＴＸ）を用いて、総ＲＮＡを単離し、そしてＲＴ−ＰＣＲシステム（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を用いて１μｇを逆転写した。全長ＣＡＲ  ｃＤＮＡ（開始コドンＡＴＧで始まり、終止コドンＴＡＧで終わる）のコード配列全体を増幅するためにプライマーを設計した。クローニングの目的のために、センスプライマーは、ＢａｍＨＩ制限部位およびＫｏｚａｋコンセンサス配列（５’−ＧＴＡＧＧＡＴＣＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＣＧＣＴＣＣＴＧＣＴＧ−３’（配列番号８））を含んだ。アンチセンスプライマーは、ＥｃｏＲＩ制限部位（５’−ＧＣＧＣＧＡＡＴＴＣＣＴＡＴＡＣＴＡＴＡＧＡＣＣＣＡＴＣＣＴ−３’（配列番号９））を含んだ。予想サイズ１．１ｋｂの増幅産物を得て、ｐｃＤＮＡ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ；図５）中にクローニングして、プラスミドｐｃＤＮＡｈＣＡＲを生成した。クローニングされた挿入物のヌクレオチド配列を決定し、そして細胞内ドメイン中に２つの個々の塩基対の変化を同定した。第一の塩基対変化はサイレントであり、アミノ酸変化を生じなかった。第二の塩基対の変化は、セリンからアスパラギンへのアミノ酸変化を生じた。ＣＡＲの細胞外ドメインは、予期された配列のドメインであった。
【００７４】
（実施例２：ｓＣＡＲをコードする組み換えプラスミドの構築）
カルボキシル末端にヒスチジンタグを有するヒトｓＣＡＲを発現するプラスミドを生成するために、ＣＡＲの細胞外ドメインをコードする配列を、上記のＣＡＲ  ｃＤＮＡ全体を含むｐｃＤＮＡｈＣＡＲ構築物から、ＰＣＲによって増幅した。センスプライマーは、ＡＴＧ開始コドンの上流にＮｈｅＩ部位を含んでおり、そして配列５’−ＡＣＴＡＧＣＴＡＧＣＧＣＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＣＧＣＴＣ−３’（配列番号１０）から構成されていた。アンチセンスプライマーは、ＣＡＲの細胞外ドメインの末端、その直後のＸｈｏＩ部位（標的化リガンドドメインの挿入を可能にするため）、６−ｈｉｓタグ、ＴＡＧ終止コドン、およびＸｂａＩ制限部位をコードしており、そして配列５’−ＧＴＧＡＴＣＴＡＧＡＣＴＡＧＴＧＡＴＧＡＴＧＧＴＧＡＴＧＧＴＧＣＴＣＧＡＧＡＧＣＴＴＴＡＴＴＴＧＡＡＧＧＡＧＧＧ−３’（配列番号１１）から構成されていた。このＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動によって分析し、ＮｈｅＩおよびＸｂａＩで消化し、そして哺乳動物発現ベクターｐＣＩ−ｎｅｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ）のＮｈｅＩ部位およびＸｂａＩ部位に連結して、プラスミドｐＣＩ−ｎｅｏ−ｓＣＡＲａを生成した。
【００７５】
ｓＣＡＲの末端で標的化リガンドドメインの挿入を可能にするために、ｐＣＩ−ｎｅｏ−ｓＣＡＲａに対して以下の改変を行った。第一に、マルチクローニング領域中のＮｏｔＩ部位をＮｏｔＩによる制限消化によって破壊し、続いてＴ４ＤＮＡポリメラーゼによる平滑末端化および再連結をさせた。第二に、相補的なオリゴヌクレオチドの対を合成してアニーリングし、ＤＮＡ二重鎖を形成した。
このアニーリングしたオリゴヌクレオチドは、両端のＸｈｏＩ適合性オーバーハングおよびコードされたリンカードメイン（そのレセプターに対する標的化リガンドドメインのより良好な提示を提供するために）を、続いてＮｏｔＩ制限部位（リガンドの挿入のため）、ならびに第Ｘａ因子切断部位（ｈｉｓタグの除去を可能にするため）を含んでいた。このオリゴヌクレオチドの配列は、以下のとおりであった：５’−ＴＣＧＡＡＣＣＡＴＣＡＧＣＣＴＣＣＧＣＡＴＣＴＧＣＴＴＣＣＧＣＣＣＣＴＧＧＡＴＣＣＧＣＧＧＣＣＧＣＣＡＴＴＧＡＧＧＧＣＣＧＣＣ−３’（配列番号１２）、および５’−ＴＣＧＡＧＧＣＧＧＣＣＣＴＣＡＡＴＧＧＣＧＧＣＣＧＣＧＧＡＴＣＣＡＧＧＧＧＣＧＧＡＡＧＣＡＧＡＴＧＣＧＧＡＧＧＣＴＧＡＴＧＧＴ−３’（配列番号１３）。アニーリングしたオリゴヌクレオチドを、ｐＣＩ−ｎｅｏ−ｓＣＡＲａのＸｈｏＩ部位に連結して、プラスミドｐＣＩ−ｎｅｏ−ｓＣＡＲｂを生成した。
【００７６】
ｓＣＡＲのカルボキシル末端で標的化リガンドドメインをコードする発現プラスミドを構築するために、相補的なオリゴヌクレオチドの対を合成し、そしてアニーリングして、所望の標的化リガンドドメインをコードするＤＮＡ二重鎖を形成した。このＤＮＡ二重鎖は、両方の末端にＮｏｔＩ適合性オーバーハングを含むように設計し、これによって、このフラグメントは、ｐＣＩ−ｎｅｏ−ｓＣＡＲｂのＮｏｔＩ部位に挿入することができた。２つの異なる標的化リガンドドメインをｓＣＡＲの末端に融合させた。１つのリガンドは、アミノ酸配列ＣＤＣＲＧＤＣＦＣからなり、そしてサイクリックＲＧＤ（ｃＲＧＤ）と名付けられる。ｃＲＧＤを生成するように合成されたオリゴヌクレオチドは以下のとおりであった；５’−ＧＧＣＣＴＧＣＧＡＴＴＧＣＣＧＴＧＧＴＧＡＴＴＧＣＴＴＴＴＧＣＧＣ−３’（配列番号１４）および５’−ＧＧＣＣＧＣＧＣＡＡＡＡＧＣＡＡＴＣＡＣＣＡＣＧＧＣＡＡＴＣＧＣＡ−３’（配列番号１５）。得られたプラスミドをｐＣＩ−ｎｅｏ−ｓＣＡＲ−ｃＲＧＤと命名した。第二の標的化リガンドドメインは、ＬＤＬ−レセプターファミリーのレセプターに結合する、アポリポタンパク質Ｅ（アポＥ）由来のアミノ酸１４１〜１５５の２つのタンデムコピーからなる。アポＥ標的化リガンドドメインを生成するために合成されたオリゴヌクレオチドは以下のとおりであった：５’ＧＧＣＣＣＴＧＣＧＣＡＡＧＣＴＧＣＧＴＡＡＧＣＧＧＣＴＣＣＴＣＣＧＣＧＡＴＧＣＣＧＡＴＧＡＣＣＴＧＧＣ−３’（配列番号１６）、および５’−ＧＧＣＣＧＣＣＡＧＧＴＣＡＴＣＧＧＣＡＴＣＧＣＧＧＡＧＧＡＧＣＣＧＣＴＴＡＣＧＣＡＧＣＴＴＧＣＧＣＡＧ−３’（配列番号１７）。得られたプラスミドをｐＣＩ−ｎｅｏ−ｓＣＡＲ−ａｐｏＥと命名した。ｐＣＩ−ｎｅｏ−ｓＣＡＲ−ｃＲＧＤ、およびｐＣＩ−ｎｅｏ−ｓＣＡＲ−ａｐｏＥによってコードされた構造の図式を図１に示す。
【００７７】
三量体形成したｓＣＡＲをコードするプラスミドを以下のとおり構築した。第一に、相補的なオリゴヌクレオチドの対を合成してアニーリングし、ＤＮＡ二重鎖を形成した。この二重鎖は、各々の末端にＸｈｏＩ適合性オーバーハングを含んでおり、そしてまたグリシン／セリンリンカーエレメント、続いてＮｏｔＩ部位、その後第Ｘａ因子切断部位をコードした。この二重鎖を、上記の、ｐＣＩｎｅｏｓＣＡＲａのＸｈｏＩ部位に連結し、プラスミドｐＣＩｎｅｏｓＣＡＲＮｏｔを生成した。このオリゴヌクレオチドを、５’ＸｈｏＩ部位が破壊されるが、３’部位がインタクトなままであるように、設計した。この相補的なオリゴヌクレオチドの配列は以下のとおりであった：５’ＴＣＧ  ＡＡＧ  ＧＡＧ  ＧＡＧ  ＧＡＧ  ＧＡＡ  ＧＴＧ  ＧＡＧ  ＧＡＧ  ＧＡＧ  ＧＡＡ  ＧＴＧ  ＧＡＧ  ＧＡＧ  ＧＡＧ  ＧＡＡ  ＧＴＧ  ＧＡＴ  ＣＣＧ  ＣＧＧ  ＣＣＧ  ＣＣＡ  ＴＴＧ  ＡＧＧ  ＧＣＣ  ＧＣＣ  ３’（配列番号１８）、および５’ＴＣＧ  ＡＧＧ  ＣＧＧ  ＣＣＣ  ＴＣＡ  ＡＴＧ  ＧＣＧ  ＧＣＣ  ＧＣＧ  ＧＡＴ  ＣＣＡ  ＣＴＴ  ＣＣＴ  ＣＣＴ  ＣＣＴ  ＣＣＡ  ＣＴＴ  ＣＣＴ  ＣＣＴ  ＣＣＴ  ＣＣＡ  ＣＴＴ  ＣＣＴ  ＣＣＴ  ＣＣＴ  ＣＣＴ  ３’（配列番号１９）。
【００７８】
相補的なオリゴヌクレオチドの第二の対を合成し、そしてアニーリングして、酵母ＧＣＮ４ロイシンジッパー分子のイソロイシン改変体由来の三量体形成ドメインをコードするＤＮＡ二重鎖を形成した。この二重鎖は、両端にＮｏｔＩ適合性オーバーハングを含んだ。このオリゴヌクレオチドを、５’ＮｏｔＩ部位が破壊されるが、３’部位がインタクトなままであるように、設計した。このオリゴヌクレオチドの配列は以下のとおりであった：５’ＧＧＣＣ  ＡＴＧ  ＡＡＡ  ＣＡＡ  ＡＴＴ  ＧＡＡ  ＧＡＣ  ＡＡＧ  ＡＴＴ  ＧＡＡ  ＧＡＡ  ＡＴＴ  ＣＴＡ  ＴＣＡ  ＡＡＡ  ＡＴＴ  ＴＡＴ  ＣＡＣ  ＡＴＴ  ＧＡＡ  ＡＡＣ  ＧＡＡ  ＡＴＴ  ＧＣＣ  ＡＧＡ  ＡＴＴ  ＡＡＡ  ＡＡＡ  ＣＴＡ  ＡＴＴ  ＧＧＣ  ＧＡＡ  ＧＣ  ３’（配列番号２０）、および５’ＧＧＣＣＧＣ  ＴＴＣ  ＧＣＣ  ＡＡＴ  ＴＡＧ  ＴＴＴ  ＴＴＴ  ＡＡＴ  ＴＣＴ  ＧＧＣ  ＡＡＴ  ＴＴＣ  ＧＴＴ  ＴＴＣ  ＡＡＴ  ＧＴＧ  ＡＴＡ  ＡＡＴ  ＴＴＴ  ＴＧＡ  ＴＡＧ  ＡＡＴ  ＴＴＣ  ＴＴＣ  ＡＡＴ  ＣＴＴ  ＧＴＣ  ＴＴＣ  ＡＡＴ  ＴＴＧ  ＴＴＴ  ＣＡＴ  ３’（配列番号２１）。この二重鎖をｐＣＩｎｅｏｓＣＡＲＮｏｔのＮｏｔＩ部位に連結して、プラスミドｐＧＳｔｒｉＣＡＲａを生成した。次に、ｐＧＳｔｒｉＣＡＲａをＮｏｔＩおよびＸｈｏＩの両方で消化して、その末端をＭｕｎｇ  Ｂｅａｎ  Ｎｕｃｌｅａｓｅ（マングビーン（リョクトウ）ヌクレアーゼ）を用いて平滑末端化して連結し、プラスミドｐＧＳｔｒｉＣＡＲｂを生成した。このプラスミドは、ｓＣＡＲ、その後にグリシン／セリンリンカー、イソロイシン改変体ＧＣＮ４三量体形成ドメイン、およびＨｉｓタグをコードしている。アポＥ標的化リガンドドメインを含むｓＣＡＲの三量体形成されたバージョンをコードするプラスミドは、以下のように構築された。第一に、相補的なオリゴヌクレオチドの対を合成してアニーリングして、アポリポタンパク質Ｅ由来のアミノ酸１４１〜１５５の２つのタンデムコピーからなるアポＥ標的化リガンドドメインをコードするＤＮＡ二重鎖を形成した。この二重鎖は、５’末端付近にＮｏｔＩ部位、および３’末端付近にＸｈｏＩ部位を含んでいた。このオリゴヌクレオチドの配列は以下のとおりであった：５’ＧＣＧＧＣＣ  ＧＣＧ  ＣＴＧ  ＣＧＣ  ＡＡＧ  ＣＴＧ  ＣＧＴ  ＡＡＧ  ＣＧＧ  ＣＴＣ  ＣＴＣ  ＣＧＣ  ＧＡＴ  ＧＣＣ  ＧＡＴ  ＧＡＣ  ＣＴＧ  ＣＴＧ  ＣＧＣ  ＡＡＧ  ＣＴＧ  ＣＧＴ  ＡＡＧ  ＣＧＧ  ＣＴＣ  ＣＴＣ  ＣＧＣ  ＧＡＴ  ＧＣＣ  ＧＡＴ  ＧＡＣ  ＣＴＧ  ＣＴＣ  ＧＡＧ  ＣＡＣ  ＣＡＴ  ３’（配列番号２２）、および５’ＡＴＧ  ＧＴＧ  ＣＴＣ  ＧＡＧ  ＣＡＧ  ＧＴＣ  ＡＴＣ  ＧＧＣ  ＡＴＣ  ＧＣＧ  ＧＡＧ  ＧＡＧ  ＣＣＧ  ＣＴＴ  ＡＣＧ  ＣＡＧ  ＣＴＴ  ＧＣＧ  ＣＡＧ  ＣＡＧ  ＧＴＣ  ＡＴＣ  ＧＧＣ  ＡＴＣ  ＧＣＧ  ＧＡＧ  ＧＡＧ  ＣＣＧ  ＣＴＴ  ＡＣＧ  ＣＡＧ  ＣＴＴ  ＧＣＧ  ＣＡＧ  ＣＧＣ  ＧＧＣ  ＣＧＣ  ３’（配列番号２３）。この二重鎖をＮｏｔＩおよびＸｈｏＩの両方を用いて消化して、ＮｏｔＩおよびＸｈｏＩの両方を用いて消化されているｐＧＳｔｒｉＣＡＲａ中に連結して、ｐＧＳｔｒｉＣＡＲａａｐｏＥを生成した。次に、以下のように、標的化リガンドドメインの上流にリンカーエレメ��トを挿入した。相補的なオリゴヌクレオチドの対を合成してアニーリングし、各々の末端付近のＮｏｔＩ部位で、セリン／アラニンリンカーをコードするＤＮＡ二重鎖を生成した。このオリゴヌクレオチドの配列は以下のとおりであった：５’ＧＧＣＣ  ＣＣＡ  ＴＣＡ  ＧＣＣ  ＴＣＣ  ＧＣＡ  ＴＣＴ  ＧＣＴ  ＴＣＣ  ＧＣＣ  ＣＣＴ  ＧＧＡ  ＴＣＣ  ＧＣ  ３’（配列番号２４）、および５’ＧＧＣＣ  ＧＣ  ＧＧＡ  ＴＣＣ  ＡＧＧ  ＧＧＣ  ＧＧＡ  ＡＧＣ  ＡＧＡ  ＴＧＣ  ＧＧＡ  ＧＧＣ  ＴＧＡ  ＴＧＧ  ＧＧＣ  ＣＧＣ  ３’（配列番号２５）。この二重鎖をＮｏｔＩで消化して、ｐＧＳｔｒｉＣＡＲａａｐｏＥのＮｏｔＩ部位に連結して、ｐＧＳｔｒｉＣＡＲａｐｏＥを生成した。
【００７９】
（実施例３：標的化リガンドドメインに接合されたｓＣＡＲの産生および精製）
標的化リガンドドメインに接合されたｓＣＡＲタンパク質を生成するために、融合タンパク質をコードする発現プラスミド（ｐＣＩ−ｎｅｏ−ｓＣＡＲ−ｃＲＧＤ、ｐＣＩ−ｎｅｏ−ｓＣＡＲ−ａｐｏＥ、ｐＧＳｔｒｉＣＡＲｂ、またはｐＧＳｔｒｉＣＡＲａｐｏＥのいずれか）を、エレクトロポレーションによってＣＯＳ−７細胞中に導入した。エレクトロポレーションの前に、この細胞を、１×１０７細胞／ｍｌの最終濃度で、ＲＰＭＩ（２０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、ＨＥＰＥＳ）中に再懸濁した。細胞の５００μｌのアリコートを４ｍｍのエレクトロポレーションキュベット中に入れて、２５μｇのプラスミドＤＮＡをこの細胞に添加した。Ｒ３、２１００μＦ、および２６４ボルトの設定でＢＴＸ装置を用いてエレクトロポレーションを実施した。
【００８０】
エレクトロポレーション後、種々の時点で、この培地を細胞から取り出して、新鮮培地と交換した。この培地をＰＢＳに対して透析して、グルタミンおよびＮｉ−ＮＴＡ樹脂（Ｑｉａｇｅｎ）に対するＨｉｓ−ｔａｇ結合を妨げ得るいずれかの他の成分を除去した。Ｎｉ−ＮＴＡ樹脂をこの培地に添加して、４℃で２時間混合した。タンパク質が結合した樹脂を遠心分離によってペレット化し、そして５０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、６０ｍＭ  イミダゾール（ｐＨ８．０）を用いて数回洗浄した。５０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、４００ｍＭ  イミダゾール（ｐＨ８．０）を用いて樹脂から融合タンパク質を溶出させた。イミダゾールの除去、緩衝液交換、および精製タンパク質の濃縮は、Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ  Ｐｌｕｓ−２０コンセントレータ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて実施した。精製したタンパク質を、１×ＰＢＳ（１０％グリセロール）中で−７０℃で保存した。
【００８１】
（実施例４：アポＥ標的化リガンドドメインに対して融合した三量体形成されたｓＣＡＲの産生および精製）
アポＥ標的化リガンドドメインと融合した三量体形成したｓＣＡＲタンパク質を生成するため、この融合タンパク質をコードする発現プラスミドであるｐＧＳｔｒｉＣＡＲａｐｏＥを、エレクトロポレーションによってＣＯＳ−７細胞中に導入した。エレクトロポレーションの翌日、この培地を細胞から取り除き、新鮮培地と交換した。その翌日、この細胞をＰＢＳで洗浄し、ついで２ｍｌのＲＩＰＡ緩衝液（５ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．０、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、１％デオキシコール酸塩、１％ＮＰ−４００）および１ｍＭ  ＰＭＳＦ（フェニルメチルスルホニルフルオライド）を添加して溶解させた。この細胞を２１ゲージの注射針を通過させることによって分けた。この細胞溶解物を氷上で３０分間インキュベートさせた。この溶解物を２０分間１０，０００ｒｐｍで遠心分離して、細胞細片を取り除いた。この上清を清浄な試験管に移し、そしてＮｉ−ＮＴＡ樹脂を添加した（１０ｃｍプレートあたり１５０μｌ）。この試験管を４℃で１時間振とうさせた。５分間、３５００ｒｐｍの遠心分離によって、ｓＣＡＲ融合タンパク質と結合した樹脂を収集した。上清を取り出して、この樹脂を清浄な試験管に移し、そして８００μｌの洗浄緩衝液（Ｗａｓｈ  ｂｕｆｆｅｒ）（５０ｍＭ  ＮａＰＯ４、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、４０ｍＭイミダゾール、１０％グリセロール）を用いて２回洗浄した。この樹脂を６０ｍＭ  イミダゾールを含有する洗浄緩衝液で３回、そして８０ｍＭ  イミダゾールを含有する洗浄緩衝液を用いて４回洗浄した。１００〜４００μｌの溶出緩衝液（Ｅｌｕｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ）（５０ｍＭ  ＮａＰＯ４、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、４００ｍＭ  イミダゾール、１０％グリセロール）を用いて、樹脂からｓＣＡＲ融合タンパク質を溶出した。
【００８２】
（実施例５：ｓＣＡＲのウエスタン分析）
発現プラスミドｐＣＩｎｅｏｓＣＡＲ（カルボキシル末端でＨｉｓ−タグを有するＣＡＲの細胞外ドメインをコードする）を、ＣＯＳ−７中にエレクトロポレーションした。エレクトロポレーションの前に、２０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）および１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）を含有するＲＰＭＩ培地中に１ミリリットルあたり１×１０７細胞の濃度で細胞を再懸濁した。細胞の５００μｌのアリコートを４ｍｍのエレクトロポレーションキュベットに入れ、そして２５μｇのプラスミドＤＮＡをこの細胞に添加した。Ｒ３、２１００μＦ、および２６４ボルトの設定でＢＴＸ装置を用いてエレクトロポレーションを実施した。エレクトロポレーション後、１日目、２日目、３日目、４日目、および７日目に培地のサンプルを収集し、そして抗−Ｈｉｓ−Ｔａｇ抗体を用いるウエスタンブロットによってｓＣＡＲの存在を実証した。この結果によって、ｓＣＡＲタンパク質は、少なくとも７日間の間、ＣＯＳ−７細胞から連続的に分泌されることが示された。プローブとしてｓＣＡＲに対するウサギ抗血清由来の精製したＩｇＧを用いる第２のウエスタン分析によって、タンパク質の同一性を確認した。
【００８３】
（実施例６：３５Ｓ標識したＡｄ５ファイバーの生成および細胞結合アッセイ）
ｓＣＡＲが細胞に対する放射線標識したファイバーの結合をブロックする能力を試験することによって、ｓＣＡＲがアデノウイルスファイバータンパク質に結合する能力を評価した。Ｔ７と合わせた転写／翻訳網状赤血球溶解物システム（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて、インビトロでＡｄ５ファイバータンパク質を生成し、そして放射線標識した。ファイバーをコードするプラスミドＤＮＡの１μｇのアリコートを、総容積５０μｌ中に４０μＣｉのＬ−３５Ｓ−メチオニンを含むシステムの成分とともに、３０℃で２０時間インキュベートした。標識したタンパク質混合物の１μｌのアリコートを、未変性ＳＤＳ−４〜１５％  ＰＡＧＥおよび蛍光光度分析によって分析した。この結果は、有意なレベルの３５Ｓ標識した三量体形成したファイバータンパク質を示した。この３５Ｓ標識したファイバーを種々の量のｓＣＡＲタンパク質と混合し、次いで６ウェルのシャーレ中のＨｅｐＧ２細胞単層またはＨＤＦ細胞単層のいずれかに、１ウェルあたり１×１０６個の細胞密度で付与した。３５Ｓ標識した細胞に結合したタンパク質をＳＤＳ−（４〜１５％）ＰＡＧＥおよび蛍光光度分析によって分析した。この結果によって、細胞に対するファイバーの結合は、ｓＣＡＲタンパク質の漸増する量の添加でブロックされることが示された。
【００８４】
（実施例７：アデノウイルス媒介性の標的細胞形質導入）
代表的には、ｓＣＡＲタンパク質をＡｖ３ＧＦＰ（ＲＳＶがプロモートした緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）ｃＤＮＡを含むＥ１、Ｅ２ａ、Ｅ３欠失したアデノウイルスベクター）の２×１０９個の粒子とともに、ＰＢＳ中で総容積５０μｌ中で室温で３０分間、インキュベートした。インキュベーション後、この複合体を適切な組織培養培地（２％ＦＢＳ含有）を用いて１ｍｌに希釈し、次いで１×１０６個の細胞（ヒト二倍体線維芽細胞（ＨＤＦ）またはＨｅｐＧ２細胞のいずれか）を含有する６ウェルプレートに添加した。この細胞をｓＣＡＲアデノウイルスベクター複合体の添加の前に１×ＰＢＳで洗浄した。この細胞を３７℃で２時間、この複合体とともにインキュベートし、次いで培地を変更し、そしてこの細胞をさらに２４時間〜４８時間３７℃でインキュベートした。Ｎｉｋｏｎ蛍光顕微鏡のもとで緑色の蛍光について細胞を観察した。ある場合には、結合の特異性を実証するため、１ｍｌあたり１０μｇの競合するＡｄ５ファイバータンパク質、またはヒトＬＤＬレセプターに対する抗体、または過剰なｃＲＧＤペプチドのいずれかを用いて、ｓＣＡＲ−アデノウイルスベクター複合体の添加の前に、３７℃で３０分間この細胞をプレブロック（予備ブロック）した。この結果によって、三量体形成したｓＣＡＲタンパク質は、標的化リガンドドメインなしに、ＨｅｐＧ２細胞の形質導入を効率的にブロックすることが示された。単量体のｓＣＡＲタンパク質はまた、ＨｅｐＧ２細胞の形質導入をブロックしたが、同じ程度のブロックを達成するためには、さらにかなり大量の単量体ｓＣＡＲタンパク質が必要であった。
【００８５】
（実施例８：複合体の形成および精製）
ｓＣＡＲｃＲＧＤタンパク質を有するＡｖ３ＧＦＰベクターの複合体を、ファイバーモノマーに対して５５０倍モル過剰のｓＣＡＲを用いて形成した。精製したベクター（２００μｌ中、４×１０１１粒子のＡｖ３ＧＦＰ）を、１１５μｌの部分的に精製したｓＣＡＲｃＲＧＤタンパク質（４００μｇ）とともに、室温で３０分間混合した。次いで、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｖｔｉ６５．２ローター中で、一晩、６０，０００ｒｐｍで、１．３３ｇ／ｍｌ  ＣｓＣｌ中で、この反応混合物を遠心分離した。このウイルス複合体のバンドを単離し、そして１０％グリセロール、２００ｍＭ  Ｔｒｉｓ、５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳを含有する緩衝液（リン酸でｐＨ８．０に調節した）中に透析した。２６０ｎｍの吸光度を測定することによって粒子濃度を決定した。
【００８６】
（実施例９：ｓＣＡＲ−ｃＲＧＤを用いたヒト二倍体線維芽細胞に対するアデノウイルスの標的化）
標的化リガンドドメインに接合されたｓＣＡＲがベクターの指向性を変更する能力を評価した。まず、ｐＣＩｎｅｏ−ＣＡＲ−ｃＲＧＤを、エレクトロポレーションによって、ＣＯＳ−７細胞にトランスフェクトした。エレクトロポレーション後、２日、４日、および６日後に培地を収集し、そしてｓＣＡＲ−ｃＲＧＤタンパク質を、Ｎｉ−ＮＴＡ樹脂に対する結合によって単離し、そして部分的に精製した。このタンパク質を緑色蛍光タンパク質をコードするアデノウイルスベクター（Ａｖ３ＧＦＰ）と混合し、そしてこの複合体をヒト二倍体線維芽細胞（ＨＤＦ）の単層に加えた。通常は、ＨＤＦは、アデノウイルスによって十分に形質導入されない。なぜなら、この細胞は、その表面上でＣＡＲをほとんど発現しないか、または全く発現しないからである。改変されていないＡｖ３ＧＦＰを、高い感染効率（ＭＯＩ）でＨＤＦに添加した場合、細胞の１％未満がＧＦＰを発現した。しかし、ｓＣＡＲ−ｃＲＧＤをＡｖ３ＧＦＰに付加した場合、ＨＤＦの形質導入は、効率的であった。なぜなら、この細胞は、ｃＲＧＤによって認識されるインテグリンを発現するからである。
【００８７】
（実施例１０：ｓＣＡＲ−アポＥを用いたＨｅｐＧ２に対するアデノウイルスの標的化）
アポＥリガンドによって認識されるレセプターは、肝細胞（肝細胞癌に由来するＨｅｐＧ２細胞を含む）の表面上において高レベルで発現される。未改変のＡｖ３ＧＦＰは、高い効率でＨｅｐＧ２細胞を形質導入した。なぜなら、肝細胞は、その表面上でＣＡＲを発現するからである。しかし、細胞表面上のＣＡＲに対する結合について、ベクターキャプシド上のファイバーと精製されたファイバーとの間の競合に起因して、高レベルの精製アデノウイルスファイバータンパク質の存在下では、形質導入はブロックされた。ｓＣＡＲ−アポＥと複合体化したＡｖ３ＧＦＰを用いたＨｅｐＧ２細胞の形質導入は、精製されたファイバータンパク質によってブロックされなかった。このことは、ベクターが、アポＥリガンドを介して細胞に結合されていることを示した。
【００８８】
アポＥリガンドは、ＬＤＬレセプターを介して細胞との相互作用を媒介しているというさらなる証拠が、ＬＤＬレセプターに対する抗体を用いる競合実験によって得られた。ｓＣＡＲ−アポＥと複合体化したＡｖ３ＧＦＰによるＨｅｐＧ２細胞の形質導入は、抗ヒトＬＤＬレセプター抗体によってブロックされた。対照的に、この抗体は、未改変のＡｖ３ＧＦＰによる形質導入に対してどのような影響も有さなかった。
【００８９】
（実施例１１：可溶性ＣＡＲアデノウイルス複合体の安定性）
Ａｖ３ＧＦＰアデノウイルスベクターに対して結合したｓＣＡＲの安定性を評価するために、塩化セシウム中の遠心分離によるバンド形成、続いてヒト血清中の凍結、融解およびインキュベーション（室温で６０分間）に抵抗する能力を測定した。実施例８に記載のように、ｓＣＡＲ−ｃＲＧＤとのＡｖ３ＧＦＰの複合体を生成し、そしてＣｓＣｌでバンド形成した。ＣｓＣｌでバンド形成した複合体の活性を、新鮮に形成した複合体（５０μｌの反応混合物を含有するＰＢＳ中で、４×１０９粒子のＡｖ３ＧＦＰと、１７．５μｇのｓＣＡＲ−ｃＲＧＤタンパク質（ファイバーモノマーに対して２４００倍モル過剰のｓＣＡＲ）との室温で３０分間の混合によって調製した）の活性と比較した。
【００９０】
ヒト二倍体線維芽細胞（ＨＤＦ）を、６ウェルのシャーレ中で、１ウェルあたり、５×１０５個の細胞で培養した。１ウェルあたり４×１０９粒子のＣｓＣｌでバンド形成した複合体を含有するＤＭＥＭ培地（２％ＦＢＳ含有）中で細胞を３７℃で形質導入した。コントロール細胞を１ウェルあたり４×１０９粒子の精製Ａｖ３ＧＦＰベクター単独、または新鮮形成したＡｖ３ＧＦＰ／ｓＣＡＲｃＲＧＤ複合体を用いて形質導入した。感染培地を２時間後に取り除き、１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭと交換した。２４時間後に細胞をＧＦＰ発現についてモニターした。
【００９１】
ＣｓＣｌでバンド形成したＡｖ３ＧＦＰ／ｓＣＡＲｃＲＧＤ複合体を、透析緩衝液中で凍結して、−８０℃で貯蔵した。６ウェルシャーレ中で１ウェルあたり１×１０６細胞に、ＨＤＦ細胞を培養した。解凍した複合体（１１μｌに４×１０９個の粒子）を、８９μｌのＰＢＳと混合して、直ちに細胞上に置くか、または室温でＰＢＳ中で６０分間インキュベートした。同様に、４×１０９個の粒子の解凍した複合体（１１μｌ）を８９μｌの正常マウス血清と混合し、そして３０分間または６０分間室温でインキュベートした。正常マウス血清中でのプレインキュベーション（予備インキュベーション）を行うかまたは行わずに、１ウェルあたり４×１０９個の粒子の解凍したＣｓＣｌでバンド形成した複合体を用いて、ＨＤＦ細胞を形質導入した。精製したＡｖ３ＧＦＰベクター単独、または新鮮に形成したＡｖ３ＧＦＰ／ｓＣＡＲｃＲＧＤ複合体を１ウェルあたり４×１０９個の粒子用いて、２％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地中で、２時間３７℃で、コントロール細胞を形質導入した。感染培地を取り除いて、１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭと交換した。２４時間後、ＧＦＰ発現について細胞をモニターした。
【００９２】
図２に示すように、未改変のＡｖ３ＧＦＰは、ＨＤＦを効率的に形質導入しなかった。このことは、ＨＤＦがその表面上でＣＡＲを発現しないので、予期されたことであった。しかし、ｓＣＡＲｃＲＧＤと複合体化したＡｖ３ＧＦＰは、細胞を効率的に形質導入した。さらに、この結果によって、Ａｖ３ＧＦＰ／ｓＣＡＲｃＲＧＤ複合体が、ＣｓＣｌでのバンド形成、凍結、および融解、ならびに血清への曝露を通じて安定であることが示された。
【００９３】
（実施例１２：ｓＣＡＲの三量体形成は、その機能を有意に増強する）
３５Ｓ標識したＡｄ５ファイバータンパク質を、精製したｓＣＡＲタンパク質と混合し、そして未変性アクリルアミドゲル上での電気泳動に供した。乾燥したゲルのオートラジオグラフィーによって、３５Ｓファイバーが、ｓＣＡＲの三量体型に対して主に結合されることが実証された。ｓＣＡＲの単量体型または二量体方に対応する位置でバンドは可視ではなかった。しかし、未変性ゲルのクマーシー染色によって、ｓＣＡＲの大部分が単量体型であることが示された。これらの観察によって、ｓＣＡＲの三量体は、単量体または二量体のいずれかよりもファイバーに対して有意に高い親和性を有することが示唆され、ただしｓＣＡＲの三量体は、まれであることも示唆された。
【００９４】
ｓＣＡＲの三量体の量を増大するため、ＧＣＮ４三量体形成ドメインをコードする配列を、ＣＡＲの細胞外ドメインをコードする配列の３’末端でｓＣＡＲ発現プラスミド中に挿入した。三量体形成ドメインが、ｓＣＡＲ三量体の形成を促進するようにお互いに対してアクセス可能である可能性を増大するため、交互のグリシン残基およびセリン残基からなるリンカーをｓＣＡＲの末端と三量体形成ドメインとの間に挿入した。得られた発現プラスミドをエレクトロポレーションによってＣＯＳ細胞中に導入し、そしてｓＣＡＲタンパク質を上記のように単離および精製した。
【００９５】
三量体形成ドメインを含有するｓＣＡＲが、アデノウイルスベクターＡｖ３ＧＦＰによるＨｅｐＧ２細胞の形質導入をブロックする能力を、三量体形成ドメインなしのｓＣＡＲの能力と比較した。６ウェルシャーレ中に、１ウェルあたり５×１０５細胞の密度でＨｅｐ２細胞を播種した。翌日、Ａｖ３ＧＦＰを両方の型のｓＣＡＲ（三量体形成ドメインを含むか、または欠失するかのいずれかである）の種々の量で処理した。未処理Ａｖ３ＧＦＰ，三量体形成ドメインなしのｓＣＡＲで処理したＡｖ３ＧＦＰ、または三量体形成ドメインを含有するｓＣＡＲで処理したＡｖ３ＧＦＰのいずれかを用いて、Ｈｅｐ２細胞を、形質導入した。１細胞あたり３５００ベクター粒子のＭＯＩで細胞を形質導入した。形質導入の２４時間後、細胞を収集し、そしてＧＦＰ発現をＦＡＣＳ分析によって測定した。
【００９６】
結果（表１）は、三量体形成したｓＣＡＲが、Ａｖ３ＧＦＰによるＨｅｐＧ２細胞の形質導入をブロックする能力の有意な増強を示した。実験Ａは、ＧＦＰ陽性（Ｐｏｓｉｔｉｖｅ） 細胞とＧＦＰ陰性細胞との間の分離を確立するために用いた、偽（モック）形質導入した細胞についての結果を示す。未改変のＡｖ３ＧＦＰで形質導入した細胞は、９８％陽性であった（実験Ｂ）。三量体形成ドメインなしのｓＣＡＲが、細胞の形質導入をブロックし得る程度は、実験ＣおよびＤに示される；１０μｇのｓＣＡＲは、形質導入を７９％陽性細胞まで減じ、そして２０μｇのｓＣＡＲは、形質導入を６９％陽性細胞まで減じた。三量体形成したｓＣＡＲが形質導入をブロックする能力の増強は、実験Ｅ〜Ｇに実証される。この実験では、形質導入されていない細胞へ向かうピークの有意なシフトが観察される。
【００９７】
【表１】
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【００９８】
表１．ＨｅｐＧ２細胞を、１細胞あたり３５００粒子のＭＯＩでＡｖ３ＧＦＰで形質導入した。形質導入の２４時間後、細胞を収集して、ＧＦＰ発現についてＦＡＣＳによって分析した。（Ａ）偽（モック）形質転換した細胞。（Ｂ）Ａｖ３ＧＦＰ単独で形質導入した細胞。（Ｃ）１０μｇの単量体（ｍｏｎｏｍｅｒｉｃ）ｓＣＡＲの存在下においてＡｖ３ＧＦＰで形質導入した細胞。（Ｄ）２０μｇの単量体ｓＣＡＲの存在下においてＡｖ３ＧＦＰで形質導入した細胞。（Ｅ）５μｇの三量体 （ｔｒｉｍｅｒｉｃ）のｓＣＡＲの存在下においてＡｖ３ＧＦＰで形質導入した細胞。（Ｆ）１０μｇの三量体のｓＣＡＲの存在下においてＡｖ３ＧＦＰで形質導入した細胞。（Ｇ）２０μｇの三量体のｓＣＡＲの存在下においてＡｖ３ＧＦＰで形質導入した細胞。
【００９９】
さらに、標的化リガンドドメインを含むｓＣＡＲの三量体形成したバージョンは、同じ標的化リガンドドメインを含むｓＣＡＲの単量体バージョンに比べて、ヒト二倍体線維芽細胞（ＨＤＦ）を形質導入する能力の増強を実証した。アデノウイルスベクターＡｖ３ＧＦＰを、アポＥリガンドを含む三量体形成したｓＣＡＲか、またはアポＥリガンドを含む単量体ｓＣＡＲのいずれかの種々の量と混合した。アデノウイルスベクターおよびｓＣＡＲ融合タンパク質を、ＨＤＦ（その前日に１ウェルあたり５×１０５個の細胞密度で６ウェルシャーレのウェル中に播種している）に対する複合体の添加の前に３７℃で３０分間会合させた。各々の場合、１細胞あたり５０００ベクターの粒子のＭＯＩを用いた。形質導入の翌日、細胞を収集して、ＧＦＰ発現について、蛍光標示式細胞分取器（ＦＡＣＳ）によって分析した。この結果を図３に示す。ＨＤＦは、その表面にＣＡＲをほとんど発現しないか、または全く発現せず、従って、未改変のアデノウイルスベクターによっては十分に形質導入されない。ｓＣＡＲ融合タンパク質の添加のないＡｖ３ＧＦＰは、８．３％ＧＦＰ陽性細胞を生じた。図３に示すように、アポＥ標的化リガンドドメインと融合したｓＣＡＲは、ＨＤＦの効率的な形質導入を生じた。顕著にも、ＨＤＦの形質導入を可能にするために必要な量は、単量体バージョンに比べて、ｓＣＡＲアポＥの三量体形成したバージョンでは、かなり少ない量である。これらの結果によって、ｓＣＡＲの三量体形成がその機能を有意に増強するという知見が支持される。
【０１００】
（実施例１３：ｓＣＡＲを用いるインビボにおけるアデノウイルスベクターの指向性の変更）
本実施例は、インビボにおいてアデノウイルスベクターを標的化するためのｓＣＡＲの有用性を実証する。標的化の必要性は、末梢血管投与後のベクターの広範な組織分布によって実証される。げっ歯類、イヌ、および非ヒト霊長類における前臨床研究によって、アデノウイルスベクターが、全身投与後に、試験されたほとんどの器官および組織を形質導入することが実証されている。マウスにおいては、最高レベルの形質導入が肝臓でみられたが、ほとんどの他の組織は有意なレベルのベクターを示す。本実施例は、標的化リガンドドメインなしの三量体形成されたｓＣＡＲが、肝臓の形質導入を効率的にブロックし得ることを示す。対照的に、ｓＣＡＲの単量体型は、肝臓の形質導入を効率的にブロックしない。
【０１０１】
βガラクトシダーゼをコードするアデノウイルスであるＡｖ３ｎＢｇを、１マウスあたり５×１０１０粒子の用量での尾静脈注射によって、Ｃ５７ＢＬ／６雄性マウスに投与した。５匹のマウスの集団に、未改変のアデノウイルスベクター、または単量体ｓＣＡＲもしくは三量体ｓＣＡＲのいずれかと複合体化したベクターのいずれかを投与した。注射前にベクターにｓＣＡＲを投与した場合は、３μｇまたは１５μｇのいずれかのｓＣＡＲタンパク質を、アデノウイルスベクターと室温で３０分間混合した。
【０１０２】
ベクター送達の３日後、動物を屠殺して、組織（肝臓、肺、心臓、腎臓、および脾臓を含む）を収集した。約２〜３ｍｍの厚みの各組織のスライスを、１０％の中性緩衝化ホルマリン中に入れた。固定後、これらのサンプルをパラフィン中に包埋し、切片化し、そしてβ−ガラクトシダーゼ発現について免疫組織化学によって分析した。組織の他の片をエッペンドルフチューブ中に入れて、ドライアイス上で凍結させた。これらの組織サンプルを用いてサザン分析のためのＤＮＡを単離して、ベクター含量を決定し、そしてまた化学発光アッセイ（Ｔｒｏｐｉｘ，Ｉｎｃ．）を用いてβガラクトシダーゼ発現を分析した。標準的な手順を用いて、組織からＤＮＡを単離した。要するに、組織を細切れにして、１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）およびプロテイナーゼＫ（２５０μｇ／ｍｌ）中で３７℃で一晩消化する。この後にフェノール−クロロホルム抽出、Ｒｎａｓｅ処理、２回目のフェノールクロロホルム抽出、クロロホルム−イソアミル  アルコール抽出、エタノール沈殿、および水への再懸濁を行う。１０μｇの各ＤＮＡサンプルを、ＨｉｄＩＩＩで消化し、そしてサザン分析に供した。このプローブは、βガラクトシダーゼｃＤＮＡの放射線標識したＤＮＡフラグメントであった。
【０１０３】
この結果は、未改変Ａｖ３ｎＢｇの送達後の肝臓におけるβガラクトシダーゼの発現を示した。さらに、サザン分析によって、この肝臓が有意なレベルのベクターを含むことが示された。注射前に単量体ｓＣＡＲと混合されたＡｖ３ｎＢｇは、未改変のベクターと、肝臓において同じレベルのβガラクトシダーゼ発現、および肝臓において同じベクター含量を生じた。しかし、三量体形成されたｓＣＡＲと複合体化されたＡｖ３ｎＢｇは、肝臓において有意に低下したβガラクトシダーゼ発現、および肝臓において低下したレベルのベクターを示した。このことは、三量体形成されたｓＣＡＲが形質導入を効率的にブロックすることを実証する。
肝臓におけるβガラクトシダーゼの発現を、組織切片の免疫組織化学染色で評価した。未改変Ａｖ３ｎＢｇを投与されたマウスにおいて、約１０〜１５％の肝細胞が、βガラクトシダーゼを発現した。単量体ｓＣＡＲは、導入遺伝子を発現する肝細胞のパーセンテージに対して影響を有さなかった；対照的に、三量体ｓＣＡＲは肝臓形質導入を効率的にブロックし、その結果、βガラクトシダーゼ発現について陽性であったのは肝細胞の１％未満であった。
【０１０４】
βガラクトシダーゼ発現についての第二のアッセイによって、免疫組織化学染色の結果を確認した。Ｇａｌａｔｏ−Ｌｉｇｈｔ  Ｐｌｕｓ  β−ガラクトシダーゼレポーター遺伝子アッセイシステム（Ｔｒｏｐｉｘ，Ｉｎｃ）を用いて、肝臓サンプルにおけるβガラクトシダーゼ発現を測定した。この結果を図４に示す。１群のマウスには、いずれのアデノウイルスベクターも投与しなかった。２群のマウスにはＡｖ３ｎＢｇのみを投与した。３群のマウスには、３μｇのｓＣＡＲ三量体と複合体化したＡｖ３ｎＢｇを投与した。４群のマウスには、１５μｇのｓＣＡＲ三量体と複合体化したＡｖ３ｎＢｇを投与した。５群のマウスには、３μｇのｓＣＡＲ単量体と複合体化したＡｖ３ｎＢｇを投与した。６群のマウスには、１５μｇのｓＣＡＲ単量体と複合体化したＡｖ３ｎＢｇを投与した。この結果は、ｓＣＡＲ三量体が、アデノウイルスベクターによる肝臓形質導入を効率的にブロックすることを示した。しかし、ｓＣＡＲの単量体バージョンは、肝臓形質導入を効率的にブロックしなかった。これらの結果は、ｓＣＡＲの三量体形成が、効率的な機能を達成するために必要であるという結果を支持する。
【０１０５】
（実施例１４：ヒトＣＡＲ配列）
配列番号１：ヒトＣＡＲ  ＤＮＡ配列（ＣＤＳ＝６０−１１５７）：
【０１０６】
【化１】
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【０１０７】
配列番号２：ヒトＣＡＲアミノ酸配列：
【０１０８】
【化２】
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【０１０９】
（実施例１５：ｓＣＡＲｔ−ｃＲＧＤと複合体化した腫瘍崩壊性アデノウイルスＡｒ６ｐＡＯｓｃＥ３Ｆの有効性：腫瘍保有マウスにおける三量体ｓＣＡＲ標的化分子のインビボ分析）
（方法：）
アデノウイルスベクター。Ａｒ６ｐＡＯｓｃＥ３Ｆは、Ｅ１発現および引き続くウイルス複製を駆動するためのオステオカルシンプロモーターを含む、腫瘍崩壊性アデノウイルスベクターである。このベクターの調製は、標準的な塩化セシウム勾配精製方法を用いて調製した。
【０１１０】
三量体のｓＣＡＲ標的化分子の生成。これらの研究において用いた三量体のｓＣＡＲｔ−ｃＲＧＤ標的化分子を生成するために、ｓＣＡＲｔ−ｃＲＧＤ発現プラスミドを、エレクトロポレーションによってＣＯＳ−７細胞中に導入した。実施例３および４に以前に記載したように、Ｎｉ−ＮＴＡ樹脂（Ｑｉａｇｅｎ）を利用して、細胞溶解物からこのタンパク質を精製した。
【０１１１】
細胞。ヒト前立腺腺癌株ＰＣ３（ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ−１４５５）を、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（アメリカンタイプカルチャーコレクション）（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）（バージニア州、マナサス）から入手した。ＰＣ３細胞を１０％ウシ胎仔血清を含有するＲＰＭＩ１６４０培地中で培養した。
【０１１２】
ヌードマウスにおける皮下腫瘍異種移植片モデル。雌性の胸腺欠損、非近交系ｎｕ／ｎｕマウス（Ｈａｒｌｅｎ  Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙ）（６〜７週齢）の右脇腹に３×１０６個のＰＣ３細胞を、皮下に移植した。Ｍａｔｒｉｇｅｌ（マトリゲル）（Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）を、１：１の比で細胞に添加して、腫瘍形成を増強した。マイクロキャリパー（微小ノギス）を用いて週に２回、腫瘍測定値を記録した（２つの次元で）。Ｌｅｎｇｔｈ（長さ）×Ｗｉｄｔｈ（幅）２×Π／６という式を用いて、腫瘍容積を算出した。９０〜２００ｍｍ３の腫瘍容積を有する動物の研究集団を選択して、群に均一に分配し（１群あたりｎ＝１５、平均腫瘍容積１１０ｍｍ３）、そして表２に記載のように、ウイルス単独とともに、または三量体のｓＣＡＲ標的化分子と複合体化したウイルスとともに静脈注射した。陰性コントロール群には、同じ容積のＨＢＳＳを投与した。三量体のｓＣＡＲ標的化分子を１：１０モル比で混合して、注射の前に室温で３０分間、相互作用させた。
【０１１３】
【表２】
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【０１１４】
研究の１日目、３日目、および７日目に、肝毒性の評価のために１群について５匹の動物から血液を収集した。この研究の期間中、１週あたり２回、腫瘍測定を実行した。
【０１１５】
研究の１日目、３日目、および７日目に、１群について５匹のマウスから、後眼窩洞からの採血によって血液を収集した。血清を収集して、臨床化学分析のためにＡｎｉＬｙｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）に供した。分析したパラメーターは、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）およびアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）であった。ＡＬＴおよびＡＳＴの両方の血清レベルの上昇は、肝細胞の傷害の指標である。
【０１１６】
（結果：）
ＰＣ３細胞は、ヌードマウスへの皮下注射の約１０日後に９０〜２００ｍｍ３の腫瘍を形成した。ウイルス単独または三量体のｓＣＡＲ標的化分子と複合体化したウイルスの、１キログラムあたり１×１０１３粒子の用量での、単回静脈内注射を投与した。このウイルス用量では、病的状態はなかった。
【０１１７】
血液サンプルを研究の１日目、３日目、７日目にマウスから収集し、そしてＡＬＴおよびＡＳＴの血清レベルを測定した（図７）。ＨＢＳＳおよびＡｒ６ｐＡＯｓｃＥ３Ｆ／ｓＣＡＲｔ−ｃＲＧＤの群は、３つの時点全てで、低レベルの酵素を示した。しかし、Ａｒ６ｐＡＯｓｃＥ３Ｆで処理した群は、他の群に比べて、ＡＬＴおよびＡＳＴの血清レベルの上昇を示した。従って、三量体のｓＣＡＲｔ−ｃＲＧＤ標的化分子を用いて、腫瘍崩壊性アデノウイルスを全身に送達した場合、アデノウイルス媒介性肝毒性は、減弱された。これは、実施例１２および１３に以前に示されたように肝臓が形質導入されることを可能にするウイルスが少ないことの結果である。
【０１１８】
本研究の最終的な目標は、三量体ｓＣＡＲｔ標的化分子を用いた腫瘍崩壊性アデノウイルスの腫瘍への全身送達が有効性の改善をもたらすことを実証することであった。この目標に取り組むために、Ａｒ６ｐＡＯｓｃＥ３Ｆ腫瘍崩壊性アデノウイルスベクターを、単独でか、またはｓＣＡＲｔ−ｃＲＧＤ標的化分子と複合体化して静脈内に送達した。本研究の期間中、１週あたり２回、腫瘍容積を決定した。図８は、各処理群についての経時的な平均腫瘍容積を示す。ＨＢＳＳおよびウイルス単独群についての平均腫瘍容積は、開始腫瘍容積である約１２０ｍｍ３から研究の１８日目には、平均腫瘍容積がそれぞれ３５９．８ｍｍ３および３３５．４ｍｍ３まで経時的に増大した。Ａｒ６ｐＡＯｓｃＥ３Ｆ腫瘍崩壊性アデノウイルスを、ｓＣＡＲｔ−ｃＲＧＤ標的化分子を用いて全身に送達した場合、腫瘍のサイズは急速には増大せず、研究の１８日目には有意に小さい腫瘍容積を生じた（ｐ＝０．０２８）。
【０１１９】
まとめると、これらのインビボの結果によって、このアデノウイルスベクターが、三量体のｓＣＡＲ標的化分子を用いて特定の部位に全身的に送達され得ることが実証される。ｓＣＡＲ−ｔｃＲＧＤ標的化分子を用いた腫瘍崩壊性アデノウイルスの送達によって、肝毒性の減少および有効性の改善（腫瘍容積の減少によって示される）によって示されるように、肝臓形質導入の減少が生じた。
【０１２０】
本明細書中に言及される全ての特許、刊行物（公開された特許出願を含む）、およびデータベース登録番号の開示は、このような個々の特許、刊行物、およびデータベース番号が、その全体が参考として援用されるように詳細にかつ個々に示されるかのように、同じ程度までその全体が参考として本明細書において詳細に援用されている。
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は、可溶性ＣＡＲ構築物の略図を示す。上側の図式は、コクサッキー−アデノウイルスレセプター（ｃｏｘｓａｃｋｉｅ−ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）（ＣＡＲ）を示しており、このＣＡＲの図式には、リーダー配列（ＬＳ）と、細胞外ドメインと、膜貫通ドメイン（ＴＭ）と、細胞内ドメイン（ＩＤ）とを含む。２番目の図式は、ｓＣＡＲ−ｃＲＧＤを示しており、このｓＣＡＲ−ｃＲＧＤは、ｃＲＧＤリガンドに連結されたＣＡＲの細胞外ドメイン（ｓＣＡＲ）を含む。このタンパク質の精製を容易にするために、Ｈｉｓ−タグがカルボキシル末端に含まれている。３番目の図式は、ｓＣＡＲ−ａｐｏＥを示しており、このｓＣＡＲ−ａｐｏＥは、アポリポタンパク質Ｅ（アポＥ）リガンドが、ｃＲＧＤリガンドと入れ替わった以外は、ｓＣＡＲ−ｃＲＧＤと同様である。４番目の図式は、ｓＣＡＲ−三量体を示しており、このｓＣＡＲ−三量体は、ＣＡＲの細胞外ドメイン（ｓＣＡＲ）のカルボキシル末端に連結された三量体形成ドメインを含む。５番目の図式は、ｓＣＡＲ−三量体−アポＥを示しており、このｓＣＡＲ−三量体−アポＥは、標的化リガンドドメインとして、さらにアポＥを含む。
【図２】
図２は、アデノウイルスベクター−ｓＣＡＲ複合体が安定であることを示す。ＨＤＦを、未改変Ａｖ３ＧＦＰ（上の左側）、またはｓＣＡＲ−ｃＲＧＤと複合体化したＡｖ３ＧＦＰ（上の右側）のいずれかを用いて形質導入した。Ａｖ３ＧＦＰ−ｓＣＡＲ−ｃＲＧＤ複合体を、ＨＤＦの形質導入の前に、ＣｓＣｌ勾配遠心分離に供し、その後、凍結融解に供した（下の左側）。ＣｓＣｌのバンド形成および凍結／融解に加えて、この複合体をＨＤＦの形質導入の前に６０分間、血清に曝露した（下の右側）。形質導入した細胞のＧＦＰ蛍光によって、この複合体が試験された条件下で安定であることが示される。
【図３】
図３は、標的化リガンドドメインを含むｓＣＡＲの三量体化されたバージョンが、同じ標的化リガンドドメインを含むｓＣＡＲの単量体バージョンと比べて、ヒト二倍体線維芽細胞（ＨＤＦ）を形質導入する能力の増強を実証することを示す。Ａｖ３ＧＦＰは、ｓＣＡＲ融合タンパク質の付加なしに、８．３％のＧＦＰ陽性細胞を生じる。アポＥ標的化リガンドドメインと融合したｓＣＡＲは、ＨＤＦの効率的な形質導入を生じる。
【図４】
図４は、ｓＣＡＲ三量体が、アデノウイルスベクターによる肝臓形質導入を効率的にブロックすることを示す。ｓＣＡＲの単量体バージョンは、肝臓形質導入を効率的にブロックしない。１群のマウスには、どのアデノウイルスベクターも投与しなかった。２群のマウスには、Ａｖ３ｎＢｇのみを投与した。３群のマウスには３ｍｇのｓＣＡＲ三量体と複合体化したＡｖ３ｎＢｇを投与した。４群のマウスには、１５μｇのｓＣＡＲ三量体と複合体化したＡｖ３ｎＢｇを投与した。５群のマウスには、３μｇのｓＣＡＲ単量体と複合体化したＡｖ３ｎＢｇを投与した。６群のマウスには、１５μｇのｓＣＡＲ単量体と複合体化したＡｖ３ｎＢｇを投与した。
【図５】
図５は、ｐｃＤＮＡ３．１のプラスミドマップを示す。
【図６】
図６は、ｐＣｌｎｅｏのプラスミドマップを示す。
【図７】
図７は、三量体のｓＣＡＲｔ−ｃＲＧＤ標的化分子を用いた腫瘍崩壊性ベクターの全身送達が、腫瘍を保有するマウスにおいて肝臓毒性を減弱することを示す。ヌードマウスにおけるＰＣ３細胞異種移植を、Ａｒ６ｐＡＯｓｃＥ３Ｆ単独（ＯＶ）、もしくは三量体のｓＣＡＲｔ−ｃＲＧＤ標的化分子と複合体化したＡｒ６ｐＡＯｓｃＥ３ｆ（ＯＶ＋ｓＣＡＲｔ−ｃＲＧＤ）（１キログラムあたり１×１０１３粒子）、またはＨＢＳＳ緩衝液単独の単回静脈内投与で処理した。注射後、２４時間、７２時間、または１週間で１群あたり５匹のマウスから血液を収集し、そして血清を単離して、ＡＳＴおよびＡＬＴの血清化学に供した。平均ＡＳＴ（Ａ）±標準偏差、または平均ＡＬＴ（Ｂ）±標準偏差を、各時点について示している。
【図８】
図８は、三量体のｓＣＡＲｔ−ｃＲＧＤ標的化分子を用いた腫瘍崩壊性アデノウイルスベクターの全身送達が効力（有効性）を改善することを示す。ヌードマウスにおけるＰＣ３細胞異種移植片を、Ａｒ６ｐＡＯｓｃＥ３Ｆ単独（ＯＶ）、もしくは三量体のｓＣＡＲｔ−ｃＲＧＤ標的化分子と複合体化したＡｒ６ｐＡＯｓｃＥ３ｆ（ＯＶ＋ｓＣＡＲｔ−ｃＲＧＤ）（１キログラムあたり１×１０１３粒子）、またはＨＢＳＳ緩衝液単独のいずれかの単回静脈内投与で処理した。腫瘍容積を１週に２回測定した。結果を、経時的に、平均腫瘍容積（ｍｍ３）±平均値の標準誤差（１群あたりｎ＝１５）として示している。＊（ｐ＝０．０２８）は、テューキー（Ｔｕｋｅｙ’ｓ Ｔｅｓｔ）検定を用いた一元分散分析によって決定した、ＨＢＳＳ処理群またはウイルス単独での処理群と比較した統計的に有意な差異である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004535755.tif 000089
【国際調査報告】
2004535755.tif 000090
2004535755.tif 000091
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