(57)【要約】分子の蛍光強度を増加するための組成物および方法が提供される。特に、生体分子および低量子収量発蛍光団の内因性蛍光の増加に関する組成物および方法が記載される。生体分子の内因性蛍光は、金属粒子および生体分子を、生体分子の放射減衰速度を増加するのに十分な距離、離れて配置することによって増加する。核酸の同定のための方法もまた提供される。標識生体分子に使用される外因性プローブのような任意の発蛍光団の放射を増加するための組成物および方法もまた使用され得る。【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体分子を金属粒子と組み合わせて含む組成物であって、ここで、該金属粒子および該生体分子が、一定量の励起電磁放射に応答した該生体分子からの電磁放射の内因性放射を調整するのに十分な距離、離れて位置する、組成物。
【請求項２】
請求項１に記載の組成物であって、ここで、前記生体分子が核酸を含む、組成物。
【請求項３】
請求項１に記載の組成物であって、ここで、前記生体分子がプリンまたはピリミジンを含む、組成物。
【請求項４】
請求項１に記載の組成物であって、ここで、前記生体分子がヌクレオシドまたはヌクレオチドを含む、組成物。
【請求項５】
請求項１に記載の組成物であって、ここで、前記生体分子がオリゴヌクレオチドを含む、組成物。
【請求項６】
請求項１に記載の組成物であって、ここで、前記生体分子がタンパク質を含む、組成物。
【請求項７】
請求項１に記載の組成物であって、ここで、前記生体分子がアミノ酸を含む、組成物。
【請求項８】
請求項１に記載の組成物であって、ここで、前記生体分子が脂質を含む、組成物。
【請求項９】
請求項１に記載の組成物であって、ここで、前記生体分子が糖部分を含む、組成物。
【請求項１０】
請求項１に記載の組成物であって、ここで、前記金属粒子が、前記生体分子から約５０Å〜約２０００Åの距離にある、組成物。
【請求項１１】
請求項１に記載の組成物であって、ここで、前記金属粒子が、貴金属を含む、組成物。
【請求項１２】
請求項１１に記載の組成物であって、ここで、前記貴金属が、レニウム、ルテニウム、ロジウム、パラジウム、銀、オスミウム、イリジウム、白金、および金からなる群から選択される、組成物。
【請求項１３】
請求項１に記載の組成物であって、ここで、前記金属粒子が、サイズにおいて波長未満である、組成物。
【請求項１４】
請求項１に記載の組成物であって、ここで、前記生体分子が金属粒子に連結される、組成物。
【請求項１５】
生体分子の内因性蛍光を増加するための方法であって、該方法が、以下の工程：
金属粒子および該生体分子を、一定量の励起放射線に応答した該生体分子からの電磁放射を増加するのに十分な距離、離れて配置する工程、
を包含する、方法。
【請求項１６】
生体分子を検出するための方法であって、該方法が、以下の工程：
（ａ）金属粒子および生体分子を、該生体分子からの電磁放射を操作するのに十分な距離、離れて配置する工程；
（ｂ）該生体分子を一定量の励起放射線に暴露する工程；および
（ｃ）該生体分子からの該電磁放射を検出する工程、
を包含する、方法。
【請求項１７】
生体分子の蛍光強度を操作するための方法であって、該方法が、以下の工程：
（ａ）該生体分子を金属粒子に近接して配置することによって、該生体分子の放射減衰の速度を増加する工程；および
（ｂ）該生体分子を一定量の励起放射線に暴露する工程、
を包含する、方法。
【請求項１８】
サンプル中の核酸配列の存在を検出するための方法であって、該方法が、以下の工程：
（ａ）サンプルを提供する工程；
（ｂ）金属粒子に連結された核酸配列を添加する工程；
（ｃ）該サンプルを一定量の励起放射線に暴露する工程；
（ｄ）該蛍光を検出する工程；および
（ｅ）該蛍光の検出に基づいて、該核酸配列の存在を決定する工程、
を包含する、方法。
【請求項１９】
蛍光標識生体分子の蛍光強度を増加するための方法であって、該方法が、以下の工程：
（ａ）生体分子を、発蛍光団を用いて標識する工程；
（ｂ）一定量の励起放射線に応答して、該発蛍光団が放射を発するように、該標識生体分子を金属粒子の隣に配置する工程、
を包含する、方法。
【請求項２０】
蛍光標識生体分子上への蛍光エネルギー移動を増加するための方法であって、該方法が、以下の工程：
（ａ）生体分子を、ドナー発蛍光団およびアクセプター発蛍光団を用いて標識する工程；
（ｂ）一定量の励起放射線に応答して、該ドナー発蛍光団がエネルギーを該アクセプター発蛍光団に移動し、該アクセプター発蛍光団が電磁放射を発するように、該標識生体分子を金属粒子の隣に配置する工程、
を包含する、方法。
【請求項２１】
発蛍光団の蛍光強度を増加するための方法であって、該方法が、以下の工程：
（ａ）発蛍光団を金属粒子の隣に配置する工程；および
（ｂ）該発蛍光団を、複数の光子を用いて励起する工程、
を包含する、方法。
【請求項２２】
生体分子の蛍光強度を増加するための方法であって、該方法が、以下の工程：
（ａ）生体分子を、金属粒子の隣に配置する工程；および
（ｂ）該生体分子を複数の光子を用いて励起する工程、
を包含する、方法。
【請求項２３】
サンプルの電磁放射の領域を選択的に増強するための方法であって、該方法が、以下の工程：
（ａ）金属粒子を該サンプル中の目的の領域に方向付ける工程；および
（ｂ）該目的の領域中に一定量の励起放射線を提供する工程、
を包含する、方法。
【請求項２４】
サンプルの電磁放射の領域を選択的に増強するための方法であって、該方法が、以下の工程：
（ａ）金属粒子を該サンプル中の目的の領域に方向付ける工程；
（ｂ）該サンプルを発蛍光団と接触させる工程；
（ｃ）該サンプルを一定量の励起放射線に暴露する工程、
を包含する、方法。
【請求項２５】
蛍光標識生体分子上への蛍光エネルギー移動を増強するための方法であって、該方法が、以下の工程：
（ａ）第１生体分子を、ドナー発蛍光団を用いて標識する工程；
（ｂ）第２生体分子を、アクセプター発蛍光団を用いて標識する工程；
（ｃ）一定量の励起放射線に応答して、該ドナー発蛍光団が、エネルギーを該アクセプター発蛍光団に移動させて、該アクセプター発蛍光団の電磁放射の放射を増加するように、該標識生体分子を金属粒子に近接して配置する工程、
を包含する、方法。
【請求項２６】
マイクロアレイシステムであって、以下：
固体支持体であって、ここで、該固体支持体が金属粒子を用いてコーティングされる、固体支持体；および
マトリックスであって、標識されたプローブが生体分子にハイブリダイズする場合、該標識されたプローブの蛍光が、一定量の励起放射線に応答して増加するように、該支持体に結合した生体分子のアレイを有する、マトリクス、
を備える、マクロアレイシステム。
【請求項２７】
生体分子を金属表面とともに含む組成物であって、ここで、該金属表面および該生体分子が、一定量の励起電磁放射に応答して、該生体分子からの電磁放射の内因性放射を調整するために十分な距離、離れて配置される、組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本願は、２００１年２月１４日に出願された米国仮出願番号６０／２６８，３２６、表題「ＲＡＤＩＡＴＩＶＥ  ＤＥＣＡＹ  ＥＮＧＩＮＥＥＲＩＮＧ」に対して、優先権の利益を主張する。
【０００２】
（連邦に助成された研究に関する陳述）
ＮＩＨ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅによって交付された助成金番号ＲＲ−０８１１９の下で、米国政府は、一部、本発明を導く研究を支援した。従って、米国政府は、本発明に対して特定の権利を有し得る。
【０００３】
（発明の背景）
（１．発明の分野）
本発明は、分子の蛍光を増大させ、そして検出するための組成物および方法に関し、特に、生体分子の内因性の蛍光を増大させるための組成物および方法に関する。本発明はまた、生体分子の蛍光を増大および検出することによる、生体分子の検出のための方法および組成物に関する。
【０００４】
（２．関連技術の記載）
蛍光技術の使用は、特定の分子を検出する能力を大いに増強し、診断における迅速な進歩を導いた。例えば、蛍光検出は、蛍光技術を使用して得られる高感度に起因して、医療用試験およびＤＮＡ分析において広く使用される。少数の分子は、蛍光技術を使用して検出され得る。代表的には、外因性の発蛍光団を共有結合的または非共有結合的に付加して、元々蛍光性でないか、または以前には商業的に有用なレベルで蛍光ではない分子が検出されることを可能にする。生体分子（例えば、ＤＮＡ）は、元々、検出可能なレベルで蛍光性ではなく、外因性の発蛍光団がＤＮＡに付加されて、ゲル上のＤＮＡの検出（Ｂｅｎｓｏｎら（１９９３）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２１、５７２０−５７２６；Ｂｅｎｓｏｎら（１９９５）Ａｎａｎｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２３１、２４７−２５５）、ＤＮＡ配列決定（Ｓｍｉｔｈら（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ  ３２１、６７４−６７９；Ｐｒｏｂｅｒら（１９８７）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３８、３３６−３４３；Ｌｉら（１９９９）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．１０、２４１−２４５）、蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（Ｄｅｎｉｊｎら（１９９２）ＡＰＭＩＳ  １００、６６９−６８１；Ｗｉｅｇａｎｔら（２０００）Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．１０、８６１−８６５）および遺伝子発現のＤＮＡアレイの読み取り（Ｌｉｐｓｈｕｔｚら（１９９９）Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．補遺１、２０−２４；Ｆｅｒｅａら（１９９９）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．Ｄｅｖ．９、７１５−７２２）を容易にする。ＤＮＡは、２６０ｎｍ付近のＵＶ領域で吸収するので、外因性発蛍光団は、ＤＮＡと共に使用される。ＵＶ固体レーザーが利用可能になったので、短い吸収波長は、現在、あまり障害ではない。それにも関わらず、ＤＮＡからの内因性の蛍光は、１０−４〜１０−５の低量子収量に起因して、実用的な有用性はほとんどない（Ｖｉｇｎｙら（１９７４）Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍ．Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌ．２０、３４５−３４９；Ｍｏｒｇａｎら（１９８０）Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍ．Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌ．３１、１０１−１１３）。ＤＮＡ、ヌクレオチドおよび核酸塩基からの内因性の放射は非常に弱いので（Ｋｎｅｉｐｐら（１９９９）Ｃｕｒｒ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ７７、９１５−９２４；Ｎｉｅら（１９９７）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７５、１１０２−１１０６；Ｍｉｃｈａｅｌｓら（１９９９）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２１、９９３２−９９３９）、現在の計測器を使用しても、内因性の蛍光を観察するのは困難である（Ｇｅｒｓｔｅｎら（１９８５）Ｓｕｒｆａｃｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  １５８、１６５−１８９；Ｌａｋｏｗｉｃｚ（２００１）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２９８、１−２４）。
【０００５】
分子の存在を検出するために使用されるいくつかの蛍光技術としては、共鳴エネルギー移動（ＲＥＴ）、免疫蛍光アッセイおよび蛍光インサイチュハイブリダイゼーションが挙げられる。目的の分子の検出は、一般に、使用される発蛍光団の特性によって制限される。いくつかの場合、生体分子を外因性発蛍光団で標識することは、生体分子の生物学的活性を変更させ得、実験上のアーチファクトを生じる可能性がある。現在の蛍光技術に伴う問題は、一部、一般に使用される発蛍光団の低い蛍光強度に起因する。さらに、バックグラウンドの蛍光は、いくつかの発蛍光団によって必要とされる低波長励起放射線を使用する場合、または大量の発蛍光団が必要とされる場合、有意であり得る。
【０００６】
蛍光色素をマーカーとして使用するＤＮＡ配列決定技術は、可視の範囲に極大発光スペクトルを有し、ＤＮＡは、可視スペクトルでの照射に供され、そして可視スペクトル検出器および光源が使用される。一般的に、光電子増幅管が検出のために使用される。結果として、これらのＤＮＡ配列決定技術は、代表的に可視領域の光スペクトルで放射する蛍光マーカーを励起するために使用されるレーザーの高い費用から生じる高い費用、および生体分子によるバックグラウンドの干渉に起因するシグナルに対する高いノイズ比を含む、いくつかの欠点を有する。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
従って、生体分子の蛍光強度を増大するための組成物および方法についての必要性が存在する。
【０００８】
また、生体分子の内因性蛍光を増大するための組成物および方法についての必要性が存在する。
【０００９】
ある量の励起放射線に応答する生体分子の蛍光放射強度を操作するための組成物および方法についての、別の必要性が存在する。
【００１０】
生体分子の放射減衰速度を操作するための方法および組成物についての、なお別の必要性が存在する。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
（発明の簡単な要旨）
本発明の１つの局面は、金属粒子と組み合わせた生体分子に関し、ここで、この金属粒子および生体分子は、ある量の励起電磁放射線に応答する生体分子からの電磁放射の内因性の放射を増強するに十分離れた距離で位置付けられる。例示的な生体分子としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：プリン、ピリミジン、核酸、オリゴヌクレオチド、ペプチド核酸、ＲＮＡ、ＤＮＡ、アミノ酸、タンパク質、ペプチド、ビタミン、脂質、炭水化物、ステロイドおよび抗体。例示的な金属としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：レニウム、ルテニウム、ロジウム、パラジウム、銀、銅、オスミウム、イリジウム、白金および金。本発明は、生体分子の蛍光強度が、生体分子と金属粒子との間の距離を変化させることによって操作され得るという驚くべき発見を記載する。本発明の範囲内に、生体分子の内因性蛍光および外因性プローブで標識された生体分子の蛍光を増加させることが含まれることは、当業者に明らかである。生体分子の外因性蛍光としては、生体分子に結合体化した発蛍光団の蛍光が挙げられるが、これに限定されない。このような外因性発蛍光団は、生体分子に共有結合または非共有結合により結合され得る。本発明の他の局面は、生体分子を検出するための新規の組成物および方法を記載する。生体分子の蛍光強度が増大する場合、ノイズに対するシグナルの比は増大するので、本発明は、バックグラウンドの蛍光に関連する問題を克服する。さらに、高価なレーザーは必要なく、それによってコストを減少させる。外因性発蛍光団は、生体分子の蛍光アッセイを、より迅速かつ安価にするために、必要とされなくてもよい。
【００１２】
本発明の別の局面は、生体分子の内因性の蛍光を増大させるための方法を提供し、この方法は、ある量の励起放射線に応答する、生体分子からの電磁放射を増大させるに十分離れた距離で、金属粒子および生体分子を位置付ける工程を包含する。本発明が、任意の開示された実施形態において、生体分子を金属粒子に近接して位置付けることか、または金属粒子を生体分子に近接して位置付けることを含むことが理解される。
【００１３】
本発明のなお別の局面は、生体分子を検出するための方法を提供し、この方法は、生体分子からの電磁放射を操作するに十分離れた距離で、金属粒子および生体分子を位置付ける工程、この生体分子をある量の励起放射線に曝露する工程、および生体分子からの電磁放射を検出する工程を包含する。
【００１４】
なお別の局面は、生体分子の蛍光強度を操作するための方法を提供し、この方法は、生体分子を金属粒子に近接して位置付けることによって、生体分子の放射減衰速度を増大させる工程、およびこの生体分子をある量の励起放射線に曝露する工程を包含する。放射減衰速度を増大させることによって、生体分子の蛍光強度は、増大され得る。
【００１５】
本発明の別の局面は、サンプル中の核酸配列の存在を検出するための方法を開示し、この方法は、サンプルを提供する工程、金属粒子に連結した核酸を添加する工程、サンプルをある量の励起放射線に曝露する工程、蛍光を検出する工程および蛍光検出に基づいて、核酸配列の存在を決定する工程を包含する。
【００１６】
なお別の局面は、蛍光標識された生体分子の蛍光強度を増大させるための方法を提供し、この方法は、生体分子を発蛍光団標識する工程、ある量の励起放射線に応答して、発蛍光団が放射を発するように、標識した生体分子を、金属粒子の隣に位置付ける工程、を包含する。
【００１７】
なお別の局面は、蛍光標識された生体分子上の共鳴エネルギー移動を増大させるための方法を提供し、この方法は、ドナー発蛍光団で第一の生体分子を標識する工程、アクセプター発蛍光団で第二の生体分子を標識する工程、ある量の励起放射線に応答して、ドナー発蛍光団がアクセプター発蛍光団へとエネルギーを移動させてアクセプター発蛍光団が電磁放射を発するように、第一の標識生体分子および第二の標識生体分子の両方を、金属粒子に近接して位置付ける工程、を包含する。
【００１８】
別の局面は、蛍光標識した生体分子上の共鳴エネルギー移動を増大させるための方法を提供し、この方法は、生体分子をドナー発蛍光団およびアクセプター発蛍光団で標識する工程、ある量の励起放射線に応答して、ドナー発蛍光団がアクセプター発蛍光団へとエネルギーを移動させてアクセプター発蛍光団が電磁放射を発するように、標識した生体分子を金属粒子に近接して位置付ける工程、を包含する。
【００１９】
本発明の別の局面は、発蛍光団の蛍光強度を増大させるための方法を提供し、この方法は、発蛍光団を金属粒子に近接して位置付ける工程、および複数の光子で発蛍光団を励起する工程（このプロセスは、多光子励起と呼ばれる）を包含する。
【００２０】
本発明の別の局面は、生体分子の蛍光強度を増大させるための方法を提供し、この方法は、金属粒子に近接して生体分子を位置付ける工程、および複数の光子でこの生体分子を励起する工程を包含する。
【００２１】
本発明のなお別の局面は、サンプルの電磁放射の領域を選択的に増強するための方法を提供し、この方法は、サンプル中の目的の領域に対して、金属粒子を向ける工程、およびサンプル中に、ある量の励起放射線を提供する工程を包含する。
【００２２】
本発明の別の局面は、サンプルの電磁放射の領域を選択的に増強するための方法を提供し、この方法は、サンプル中の目的の領域に対して、金属粒子を向ける工程、このサンプルを発蛍光団と接触させる工程、およびこのサンプルを、ある量の励起放射線に曝露する工程を包含する。
【００２３】
本発明をよりよく理解するために、本発明の他の目的およびさらなる目的と共に、添付の図面と組合わせて、以下の記載に対して参照がなされ、そして本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲において示される。
【００２４】
（発明の詳細な説明）
（略語）
ＡＯ  アクリジンオレンジ
ＢＦ  塩基性フクシン（Ｂａｓｉｃ  Ｆｕｃｓｉｎ）
ｂｐｙ  ２，２’−ビピリジン
ＣＴ  仔ウシ胸腺
ＤＡＰＩ  ４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール
ｄｐｐｚ  ジピリド［３，２−ａ：２’，３’−ｃ］フェナジン
ＤＭＦ  ジメチルホルムアミド
ＥｒＢ  エリトロシンＢ
ｐｈｅｎ  ９，１０−フェナントロリン
ｐｒｏｄａｎ  ６−プロピオニル−２−（ジメチルアミノ）ナフタレン
Ｐｙ２  ピリジン２
Ｒ６Ｇ  ローダミン６Ｇ
ＲｈＢ  ローダミンＢ
ＲＢ  ローズベンガル
ＲＥＴ  共鳴エネルギー移動
ＳＥＲＳ  表面増強ラマン散乱
ＳＩＦ  銀アイランドフィルム
ＳＲ１０１  スルホローダミン１０１
Ａ  アクセプター
Ｄ  ドナー
ＤＡＰＩ  ４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール
ＦＤ  周波数−ドメイン
ＰＩ  ヨウ化プロピジウム
ＲＥＴ  共鳴エネルギー移動
（定義）
用語「発蛍光団」は、その物質が異なる波長（励起波長）の放射線によって照射された場合に、特定の波長（発光波長）において光として電磁エネルギーを放射する任意の物質を意味する。外因性発蛍光団は、別の物質に結合する発蛍光団をいう。内因性発蛍光団は、発蛍光団自体である物質をいう。例示的な発蛍光団としては、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ  Ｃａｔａｌｏｇｕｅ（これは、本明細書中に参考として援用される）に列挙される発蛍光団が挙げられるが、これらに限定されない。代表的な発蛍光団としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）３５０、Ｄａｎｓｙｌ  Ｃｈｌｏｒｉｄｅ（ＤＮＳ−Ｃｌ）、５−（ヨードアセタミダ）フルオレセイン（５−（ｉｏｄｏａｃｅｔａｍｉｄａ）  フルオレセイン）（５−ＩＡＦ）；フルオレセイン５−イソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、テトラメチルローダミン５−（および６−）イソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）、６−アクリロイル−２−ジメチルアミノナフタレン（アクリロダン（ａｃｒｙｌｏｄａｎ））、７−ニトロベンゾ−２−オキサ−１，３，−ジアゾール−４−イルクロリド（ＮＢＤ−Ｃｌ）、臭化エチジウム、Ｌｕｃｉｆｅｒ  Ｙｅｌｌｏｗ、５−カルボキシローダミン６Ｇハイドロクロリド、ＬｉｓｓａｍｉｎｅローダミンＢスルホニルクロリド、Ｔｅｘａｓ  ＲｅｄＴＭスルホニルクロリド、ＢＯＤＩＰＹＴＭ、ナフタルアミンスルホン酸（１−アニリノナフタレン−８−スルホン酸（ＡＮＳ）および６−（ｐ−トルイジニル）ナフタレン−２−スルホン酸（ＴＮＳ）を含むが、これらに限定されない）、Ａｎｔｈｒｏｙｌ脂肪酸、ＤＰＨ、パリナン酸（Ｐａｒｉｎａｒｉｃ  ａｃｉｄ）、ＴＭＡ−ＤＰＨ、フルオレニル脂肪酸、フルオレセイン−ホスファチジルエタノールアミン、Ｔｅｘａｓ  ｒｅｄ−ホスファチジルエタノールアミン、ピレニル−ホスファチジルコリン、フルオレニル−ホスファチジルコリン、メロシアニン（Ｍｅｒｏｃｙａｎｉｎｅ）５４０、１−（３−スルホナトプロピル）−４−［β−［２［（ジ−ｎ−ブチルアミノ）−６ナフチル］ビニル］ピリジニウムベタイン（ナフチルスチリル）、３，３’ジプロピルチアジカルボシアニン（ｄｉｐｒｏｐｙｌｔｈｉａｄｉｃａｒｂｏｃｙａｎｉｎｅ）（ｄｉＳ−Ｃ３−（５））、４−（ｐ−ジペンチルアミノスチリル）−１−メチルピリジニウム（ｄｉ−５−ＡＳＰ）、Ｃｙ−３ヨードアセトアミド、Ｃｙ−５−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、Ｃｙ−７−イソチアシアネート、ローダミン８００、ＩＲ−１２５、チアゾールオレンジ、Ａｚｕｒｅ  Ｂ、Ｎｉｌｅ  Ｂｌｕｅ、Ａｌ  フタロシアニン、Ｏｘａｘｉｎｅ  １、４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）、Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２、ＴＯＴＯ、アクリジンオレンジ、エチジウムホモダイマー、Ｎ（エトキシカルボニルメチル）−６−メトキシキノリニウム（ＭＱＡＥ）、Ｆｕｒａ−２、カルシウムグリーン、カルボキシＳＮＡＲＦ−６、ＢＡＰＴＡ、クマリン、フィトフルオル（ｐｈｙｔｏｆｌｕｏｒ）、Ｃｏｒｏｎｅｎｅ、および金属−配位子錯体。代表的な内因性発蛍光団としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：芳香族環構造を有する有機化合物（ＮＡＤＨ、ＦＡＤ、チロシン、トリプトファン、プリン、ピリミジン、脂質、脂肪酸、核酸、ヌクレオチド、ヌクレオシド、アミノ酸、タンパク質、ペプチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ、糖、およびビタミンが挙げられるが、これらに限定されない）。さらなる適切な発蛍光団としては、酵素−補因子；ランタニド、緑色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、またはこれらの変異体および誘導体が挙げられる。
【００２５】
用語「生体分子」は、天然に存在する任意の炭素ベースの分子またはこのような分子の誘導体を意味する。生体分子は、活性形態であっても不活性形態であってもよい。「活性形態」は、生物学的機能を実行し得る形態の生体分子を意味する。「不活性形態」は、その生体分子が生物学的機能を実行し得る前に天然または合成のいずれかで処理されなければならない生体分子を意味する。例示的な生体分子としては、核酸、芳香族炭素環構造、ＮＡＤＨ、ＦＡＤ、アミノ酸、炭水化物、ステロイド、フラビン、タンパク質、ＤＮＡ、ＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、ペプチド核酸、脂肪酸、グルコースなどの糖群、ビタミン、補因子、プリン、ピリミジン、ホルミシン（ｆｏｒｍｙｃｉｎ）、脂質、フィトクロム、フィトフルオル（ｐｈｙｔｏｆｌｕｏｒ）、およびフィコビリプロプテイン（ｐｈｙｃｏｂｉｌｉｐｒｏｐｔｅｉｎ）が挙げられる。
【００２６】
用語「一定量の励起放射線」は、分子に放射を放出させるある一定量の放射線を意味する。
【００２７】
（例示的な実施形態）
本発明の１つの実施形態は、金属粒子と組み合わせた生体分子に関し、ここで、この金属粒子および生体分子は、一定量の励起電磁放射線に応答した生体分子からの電磁放射の内因性放出を調節する（好ましくは、増強する）に十分な距離離れて配置される。例示的な生体分子としては、プリン、ピリミジン、核酸、オリゴヌクレオチド、ペプチド核酸、ＲＮＡ、ＤＮＡ、アミノ酸、フラビン、タンパク質、ペプチド、ビタミン、脂質、抗体、および芳香族炭素環構造が挙げられるが、これらに限定されない。本発明の好ましい生体分子および発蛍光団は、約０．８未満、より好ましくは約０．５未満、そして最も好ましくは約０．２未満の量子収量を有する。例示的な金属としては、銅および貴金属（例えば、レニウム、ルテニウム、ロジウム、パラジウム、銀、オスミウム、イリジウム、白金、および金）が挙げられる。同様に、別の実施形態は、金属表面と組み合わせた生体分子を含む組成物を提供し、ここで、この金属表面および生体分子は、一定量の励起電磁放射線に応答した生体分子からの電磁放射の内因性放出を調節する（好ましくは、増強する）に十分な距離離れて配置される。さらに、金属表面が過ヨウ素酸金属表面であり得る別の実施形態を提供する。
【００２８】
本発明は、生体分子の蛍光強度が、生体分子と金属粒子との間の距離を変化させることによって操作され得るという驚くべき発見に基づく。実際に、生体分子の内因性蛍光は、その生体分子が金属粒子に近接して配置された場合、少なくとも約８０倍〜約１４０倍増加され得るということが発見されている。好ましくは、その金属粒子と生体分子とは、約５０Å〜約２０００Å、最も好ましくは約５０Å〜約２００Åの距離が離れている。別の実施形態において、金属粒子は、波長より小さい（ｓｕｂ−ｗａｖｅｌｅｎｇｔｈ）大きさであり、代表的に約５０Å〜約３００Åの範囲である。金属粒子は、長球状であっても、楕円状であっても、任意の他の外面的形態であってもよい。金属粒子は、コロイド中に懸濁され得るか、またはコロイド、合金、または１つより多くの金属と組み合わされ得る。金属粒子は、薄いフィルムとして表面上に配置され得るか、または表面に沈積されて小さいアイランド（ｉｓｌａｎｄ）を形成する。この表面は金属性であっても非金属性であってもよい。さらに、金属粒子は、ポリマー、ゲル、接着剤、酸化物、または生物学的材料でコーティングされ得る。例示的なコーティングとしては、表面または他の分子への金属粒子の結合を増加させる物質が挙げられる。１つの実施形態において、金属粒子は、非金属性分子および生体分子への結合を促進するように、その表面上で改変され得る。例示的な実施形態において、金属粒子（好ましくは、貴金属、最も好ましくは銀）は、表面上で化学的に還元される。化学還元は、公知の技術を用いて達成され得る。例示的な表面としては、ガラスまたは石英が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２９】
別の実施形態において、生体分子および金属粒子は、生体分子の内因性蛍光に対して所望の効果を有するのに十分な長さの中間物を介して互いに結合され得る。この結合は共有結合的であっても非共有結合的であってもよい。さらに、金属および生体分子は、安定に連結され得るか、またはこれら２つが化学反応、酵素反応、または光反応の結果として分離され得るように連結され得る。例えば、金属粒子に連結された生体分子は、細胞、細胞オルガネラ、または他の区画内に内在化され得る。一旦内在化されると、連結した生体分子は、酵素反応または化学反応に供されて、金属粒子のその生体分子からの完全な分離を生じる。例示的な酵素反応としては、非特異的エステラーゼ反応が挙げられるが、これに限定されない。そして例示的な化学反応としては、加水分解、酸化、または置換が挙げられるが、これらに限定されない。一旦分離されると、この生体分子は検出不可能になり得るか、または検出しにくくなり得る。なぜなら、この内因性蛍光は、その金属粒子によってもはや増幅されないからである。生体分子の内因性蛍光がクエンチされることが所望される場合、生体分子および金属粒子は、約０〜５０Å未満の距離で離され得る。生体分子の内因性蛍光が増加される場合、生体分子および金属粒子は、約５０Å〜約２０００Å、より好ましくは約５０Å〜約２００Åの距離で離れて得る。従って、生体分子の蛍光強度は、金属粒子と生体分子とを隔てている距離を変化させることによって操作され得る。
【００３０】
本発明の範囲が、生体分子の外因性蛍光および生体分子の内因性蛍光を増加する工程を包含することが、当業者によって理解される。生体分子の外因性蛍光は、生体分子に結合した発蛍光団の蛍光が挙げられるがこれに限定されない。このように結合した発蛍光団が、生体分子に共有結合的にまたは非共有結合的に結合され得る。本発明の蛍光強度の増加または減少は、生体分子または発蛍光団が金属粒子の非存在下での生体分子または発蛍光団の内因性蛍光強度または外因性蛍光強度と比較して、金属粒子と組み合わされた場合の、内因性蛍光強度または外因性蛍光強度における増加または減少を意味する。
【００３１】
本発明の別の実施形態は、生体分子の内因性蛍光を増加するための方法を提供し、この方法は、生体分子および金属粒子を、一定量の励起放射線に応答した生体分子からの電磁放射を増加するのに十分な距離、離れて配置する工程、を包含する。本発明が、任意の開示された実施形態において、金属粒子に近接して生体分子を配置する工程または金属粒子を生体分子に近接して配置する工程を包含することが理解される。例示的な実施形態において、生体分子および金属粒子が、生体分子の内因性蛍光を増加するために、約５０Å〜約２０００Å、好ましくは、約５０Å〜約２００Åの距離で分離されるか、または内因性蛍光がクエンチされる場合、約５０Å未満の距離で分離される。他の実施形態において、金属粒子は、表面に固定され得、そして生体分子は、このような表面に近接して配置され得る。このような表面は、キュベットの一部を形成し得るか、またはキュベット内に配置され得る挿入物であり得る。
【００３２】
生体分子または金属粒子を所望の距離で配置することは、２つを物理的に連結させるリンカーを使用して達成され得る。リンカーは、１つの介在する原子または分子（好ましくは、少なくとも１つの炭素原子の炭素鎖）であり得る。他のリンカーとしては、少なくとも１つのアミノ酸が挙げられるがこれに限定されない。さらに、当該分野で公知の他の化学リンカーが使用され得る。リンカーは、蛍光に対する所望の効果に依存して、任意の長さ（好ましくは、約２００Åまで）であり得る。他の実施形態において、金属粒子は、電磁力、荷電場、重力または他の公知の方法を使用して生体分子に近接して配置され得る。１つの例において、金属粒子の位置、または連結された生体分子および金属粒子の位置を操作するために電圧が制御され得る。あるいは、生体分子は、電磁場、電流、電圧、または重力を使用して配置され得る。
【００３３】
本発明のなお別の実施形態は、生体分子を検出するための方法を提供し、この方法は、生体分子および金属粒子を、生体分子からの電磁放射を操作するのに十分離れた距離で配置する工程、生体分子を一定量の励起放射線に暴露する工程、および生体分子からの電磁放射を検出する工程を包含する。蛍光のモニタリング、検出および定量は、当該分野において公知である。例えば、Ｊｏｓｅｐｈ  Ｒ．Ｌａｋｏｗｉｃｚ．Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｉｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ，Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ  １９９９（これは、その全体が本明細書中において参考として援用される）を参照のこと。
【００３４】
簡単に述べると、蛍光は、デバイス（光源および検出器を有する分光蛍光計が挙げられるがこれに限定されない）を使用して検出され得る。光源としては、アーク燈およびレーザーが挙げられ得る。検出器は、光電子増倍管が挙げられ得る。さらに、特定の波長の光が分子を励起するため、または特定の波長で放射を検出するために使用され得るように、モノクロメーターを有するデバイスが有利である。発蛍光団を含むサンプルが分光蛍光計に配置され、そして一定量の励起放射線に暴露される場合、発蛍光団が、光電子増倍管によって検出される放射を発する。生体分子の蛍光強度は、金属粒子と生体分子との間の距離が、約５０Å〜約２０００Å、好ましくは、約５０Å〜約２００Åである場合、一定量の励起放射線に応答して増加し得る。あるいは、生体分子の蛍光強度は、生体分子と金属粒子との間の距離が約５０Å未満である場合、減少され得る。
【００３５】
なお別の実施形態は、生体分子の蛍光強度を操作するための方法を提供し、この方法は、生体分子を金属粒子に近接して配置することによって、生体分子の放射減衰速度を増加させる工程、およびこの生体分子に一定量の励起放射線に暴露する工程を包含する。放射減衰速度を増加することによって、生体分子の蛍光強度は、増加し得る。生体分子と金属粒子とを分離する距離を操作することによって、生体分子の放射減衰がまた操作され得ることが発見された。
【００３６】
本発明の別の実施形態は、サンプル中の核酸配列の存在を検出するための方法を開示し、この方法は、サンプルを提供する工程、金属粒子に連結された核酸配列を添加する工程、このサンプルを一定量の励起放射線に暴露する工程、蛍光を検出する工程、および蛍光の検出に基づいて、核酸配列の存在を決定する工程、を包含する。１つの実施形態において、金属粒子に連結された核酸配列は、一本鎖である。他の実施形態において、金属粒子に連結された核酸配列は、二本鎖である。好ましい実施形態において、金属粒子に連結された核酸配列は、２００塩基対長未満であり、より好ましくは、１００塩基対長未満であり、最も好ましくは５０塩基対長未満であり、さらにより好ましくは、約２０以下の核酸長である。核酸は、デオキシリボ核酸、リボ核酸、または化学的に改変された核酸（例えば、ペプチド核酸など）であり得る。
【００３７】
核酸のハイブリダイゼーションのための方法は、当該分野において公知である。例えば、ｂｉｏｃｈｅｍ．ｒｏｃｈｅ．ｃｏｍ／ｐｒｏｄ ｉｎｆ／ｍａｎｕａｌｓ／ｉｎｓｉｔｕ／ｉｎｓｉ ｔｏｃ．ｈｔｍにおけるＮｏｎｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ  Ｉｎ  Ｓｉｔｕ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｍａｎｕａｌ（これは、「その全体が参考として援用される）を参照のこと。歴史的に、ハイブリダイズされた核酸の検出は、核酸サンプルにハイブリダイズするための標識された核酸プローブを使用した。例えば、サザンブロット技術において、核酸サンプルは、サイズに基づいてアガロース中で分離され、そして膜に固着され、変性され、そしてハイブリダイゼーション条件下で標識された核酸プローブに暴露される。標識された核酸プローブが、ブロット上の核酸とハイブリッドを形成する場合、標識は、膜に結合する。サザンブロットに使用されるプローブは、放射能、蛍光色素、ジゴキシゲニン、西洋わさびペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼおよびアクリジニウムエステルを用いて標識されている。
【００３８】
本発明は、核酸の内因性蛍光を増加することによる、核酸配列の検出のための新規な方法を開示する。この増加は、核酸を金属（好ましくは、貴金属）に連結することによって達成される。本発明は、外因性プローブの使用を必要としない。むしろ、金属粒子に連結される核酸が金属粒子がサンプルに添加される場合、この配列は、サンプル中の相補的な核酸配列にハイブリダイズし得る。好ましい実施形態において、検出される核酸配列は、固体支持体に固着され得る。例示的な固体支持体としては、フィルム、膜、カラム、ニトロセルロース、プラスチック、石英、ガラス、または金属が挙げられる。サンプルは、一定量の励起放射線を用いて放射される。サンプル中でまたは例えば固体支持体上で検出される蛍光は、金属粒子に連結された核酸がサンプル中に存在する相補的な核酸配列にハイブリダイズしたことを示す。従って、このサンプルは、目的の核酸配列を含む。金属粒子に結合されない核酸は、核酸の量子収量が低すぎるので、蛍光放射に有意に寄与しない。本発明によって検出される核酸ハイブリダイゼーションがインサイチュで生じ得ることが理解される。さらに、核酸の検出が、発蛍光団を金属粒子に近接して配置することによって、核酸に結合される外因性発蛍光団の蛍光強度の増加に基づき得ることが理解される。核酸の内因性蛍光の増加は、ＤＮＡアレイまたは遺伝子チップにおいて有用であり得る。
【００３９】
別の実施形態において、本発明は、核酸を同定するための方法を提供し、この方法は、核酸を金属粒子に近接して配置する工程、核酸を照射する工程、核酸からの蛍光放射を検出する工程、および蛍光放射に基づいて核酸を同定する工程を包含する。核酸の内因性蛍光を使用する核酸の同定は、外因性プローブの必要性を排除する。１つの実施形態において、バックグラウンド蛍光は、問題ではない。なぜなら、内因性蛍光は、約８０倍増加し得、これによって、シグナルに対するノイズの比を減少させるからである。別の実施形態において、核酸は、サンプルの蛍光をモニタリングすることから得られる発光スペクトルに基づいて同定され得る。従って、サンプル中の核酸の配列は、核酸を連続的に除去すること、核酸を金属粒子に近接して配置すること、核酸を一定量の励起放射線で照射すること、放出された放射を検出すること、および放出された放射を核酸塩基と相関させることによって決定され得る。核酸配列（例えば、オリゴヌクレオチド）から単一の核酸を連続的に除去するための方法は、当該分野において公知であり、連続的消化、加水分解、および化学的切断が挙げられる。核酸は、核酸を含む流体サンプルのストリームを、金属粒子を含む表面近くで通過させることによって、金属粒子に近接して配置され得る。このような表面は、サンプルチャンバの一部を形成する金属の薄いフィルムまたはアイランド（ｉｓｌａｎｄ）であり得る。核酸の照射は、核酸を金属粒子に近接して配置するのと同時に時間を合わせられ得る。核酸は、１つ以上の波長で照射され得る。好ましい実施形態において、核酸は、３００ｎｍ未満、好ましくは、２８０ｎｍ〜約２９５ｎｍの波長で励起される。別の実施形態において、励起波長は、多光子励起のために５２０ｎｍ付近である。
【００４０】
本発明の方法および組成物が、ポリメラーゼ連鎖反応技術に使用され得ることを当業者は理解する。ポリメラーゼ連鎖反応技術は、当該分野において周知である。金属粒子（好ましくは、貴金属粒子）に結合される核酸は、ポリメラーゼ連鎖反応混合物に添加され得る。結合された核酸は、成長するオリゴヌクレオチド鎖に組み込まれ得、そして一定量の励起放射線に応答して、結合された核酸の蛍光が、検出可能になり、ポリメラーゼ連鎖反応生成物の検出が可能になる。
【００４１】
なお別の実施形態は、蛍光標識された生体分子の蛍光強度を増加するための方法を提供し、この方法は、生体分子を、発蛍光団を用いて標識化する工程、一定量の励起放射線に応答して、発蛍光団が放射（好ましくは、検出可能な量の放射）を発するように、標識生体分子を金属粒子の隣に配置する工程、を包含する。好ましい実施形態において、発蛍光団は、０．８未満、好ましくは、０．５未満、より好ましくは、０．２未満、そして最も好ましくは、０．１未満の量子収量を有する。この実施形態において、外因性発蛍光団の蛍光強度は、生体分子を検出するために使用され得る。
【００４２】
なお別の実施形態は、蛍光標識された生体分子についての蛍光エネルギー移動を増加するための方法を提供し、この方法は、第１生体分子を、ドナー発蛍光団を用いて標識する工程、第２生体分子を、アクセプター発蛍光団を用いて標識する工程、一定量の励起放射線に応答して、ドナー発蛍光団が、エネルギーをアクセプター発蛍光団に移動させて、アクセプター発蛍光団が電磁放射を発するように、標識生体分子を金属粒子に近接して配置する工程、を包含する。
【００４３】
別の実施形態は、蛍光標識された生体分子についての蛍光エネルギー移動を増加するための方法を提供し、この方法は、生体分子を、ドナー発蛍光団およびアクセプター発蛍光団を用いて標識する工程、一定量の励起放射線に応答して、ドナー発蛍光団がエネルギーをアクセプター発蛍光団に移動し、アクセプター発蛍光団が電磁放射を発するように、標識生体分子を金属粒子の隣に配置する工程、を包含する。
【００４４】
金属粒子に起因するエネルギー移動の増加は、イムノアッセイに使用され得る。従って、１つの実施形態において、本発明の組成物は、親和性反応（好ましくは、抗体−抗原反応またはタンパク質−炭水化物相互作用）を測定するために蛍光エネルギー移動を使用し得る。さらに、金属粒子でコーティングされるかまたは金属粒子を含むアッセイチャンバを使用して、１００Å以上離れた距離にわたる、ドナーとアクセプターの間でさえ効率またはＲＥＴを増加し得る。金属増強エネルギー移動はまた、ＤＮＡアレイまたは遺伝子チップを用いて有用である。別の実施形態において、本発明の組成物および方法は、ＤＮＡハイブリダイゼーションまたは二重らせんＤＮＡの量を測定するための蛍光エネルギー移動を利用し得る。現在、アレイは、標的ＤＮＡにハイブリダイズした２つの発蛍光団の量を測定することによって読まれる（Ｆｅｒｅａら、（１９９９）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｄｅｖ．，９，７１５−７２２；Ｌｉｐｓｈｕｔｚら、（１９９９）Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎ．Ｓｕｐｐｌ．１，２０−２４；Ｈａｃｉａら、（１９９８）Ｍｏｌｅｃ．Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ  ３，４８３−４９２）。たとえ、２つの色素がおそらく良好なドナー−アクセプター対であるとしても、エネルギー移動は、通常、生じない。金属表面上のＤＮＡアレイの使用は、長い距離で配置されたドナーとアクセプターとの間のＲＥＴに基づいた新しいタイプのＤＮＡアレイ分析を提供する。
【００４５】
バイオチップ、遺伝子チップ、またはマイクロアレイを作製するための方法および手順が、当該分野において公知である。例えば、米国特許第６，１７４，６８３号は、「バイオチップ」に関する方法および組成物、ならびに「バイオチップ」の形成を開示し、そしてこれは、本明細書中においてその全体が援用される。核酸プローブは、マイクロアレイ表面に固着される。本発明において、マイクロアレイ表面は、金属表面（好ましくは、貴金属、最も好ましくは、銀表面）である。表面は、上記のように、金属アイランドでコーティングされ得る。一般的に、全ＲＮＡは、遺伝子発現のパターンを決定するために、サンプルから調製される。これらのサンプルは、種々の細胞株、腫瘍サンプル、正常対疾患、コントロールまたは薬物処置などであり得る。大部分に場合において、最小で約１μｇのポリＡ＋ＲＮＡまたは約５μｇの全ＲＮＡが必要である。しかし、０．２μｇのように少ない「高品質」ポリＡ＋ＲＮＡが使用され得る。一般的規則として、１×１０６個の組織培養細胞は、１０〜１５μｇの全ＲＮＡを生じるはずである。
【００４６】
逆転写酵素を使用して、ＲＮＡは、ｃＤＮＡに変換される。この時点で、ｃＤＮＡは、蛍光タグ化ｄＮＴＰの取り込みによって直接標識され得る。より一般的に、ｃＤＮＡは、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを組み込むオリゴ−ｄＴプライマーを使用して調製される。次いで、ｃＤＮＡを、次の工程に使用して、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼを使用して、蛍光タグ化コピーＲＮＡを作製する。一般的に、少なくとも約５μｇの標識ｃＲＮＡまたはｃＤＮＡが、各マイクロアレイにハイブリダイズするために必要である。しかし、プローブは、再使用され得る。例えば、１つの標識化プローブは、引き続いて使用されて、５つの別のアレイにハイブリダイズし得る。
【００４７】
その蛍光標識プローブは、マイクロアレイにハイブリダイズされ、ほとんど同様に、放射性プローブが、従来のドットブロットにハイブリダイズされる。その標識プローブの蛍光は、そのプローブが相補配列にハイブリダイズした場合の一定量の励起放射線に応じて増加する。なぜなら、その蛍光は、金属マイクロアレイ表面付近に、好ましくは、その金属表面から約５０Å〜約２０００Å、より好ましくはその金属表面から約５０Å〜約２００Åに位置するからである。別の実施形態において、そのプローブは、ドナー発蛍光団およびアクセプター発蛍光団を用いて標識され得る。その標識プローブがマイクロアレイ表面上のその相補体にハイブリダイズする場合、そのプローブは、金属マイクロアレイ表面近く、好ましくは、その金属表面から約５０Å〜約２０００Å、より好ましくはその金属表面から約５０Å〜約２００Åに位置する。この位置において、ドナー分子からアクセプター分子への蛍光エネルギー移動は、その標識プローブの検出を可能にする一定量の励起放射線に応じて増加する。そのマイクロアレイ上の標識プローブの検出は、そのプローブが相補配列にハイブリダイズしていることを示し、このことは、対応する遺伝子の発現をさらに示す。なお別の実施形態において、金属コートマイクロアレイ表面上に固定された核酸配列が、ドナー分子またはアクセプター分子で標識され得、そしてその核酸プローブは、その核酸プローブがマイクロアレイ表面上の標識核酸配列とハイブリダイズした場合に、そのドナー分子からアクセプター分子への蛍光エネルギー移動が一定量の励起放射線に応じて増加されるように、それぞれアクセプター分子またはドナー分子で標識され得る。
【００４８】
洗浄後、そのマイクロアレイは、蛍光スキャナー：代表的平台型スキャナーと共焦点顕微鏡との間の交差（ｃｒｏｓｓ）を使用して分析される。そのデータは、そのマイクロアレイ上の蛍光スポットの画像である。その画像は、そのスポットを同定し各スポットの蛍光強度を算出するソフトウェアを使用して、分析され得る。２つの異なるプローブを用いて得た強度を比較すること（例えば、コントロール対薬物処理）によって、アレイにおける各遺伝子の発現がどのように変化するかを測定し得る。
【００４９】
他の実施形態において、タンパク質が、金属表面（好ましくは、貴金属表面、最も好ましくは、銀コート表面）上に整列され得る。一般的に、表面上にタンパク質を整列するために、ＧＭＳ  ４１７  Ａｒｒａｙｅｒ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ，Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，ＣＡ）または他の適切なデバイスが、使用され得る。この整列機（ａｒｒａｙｅｒ）は、９６ウェルプレートまたは３８４ウェルプレーとのうちの４つのウェルから約１μｌのサンプルを採集し、そして一連の顕微鏡スライドガラス上に規定された位置に、各サンプル約１μｌを配置する。この整列機（ａｒｒａｙｅｒ）は、ピンおよび環システムを使用し得：サンプルが、約１μｌを各々保持する小さい環の中に集められ、その後、固体ピン（１５０μｍ直径）が、その環を通して反復して穴を開けて、スライド上にそのタンパク質を配置する。ナノ液滴の蒸発を予防するために、４０％グリセロールが、そのタンパク質サンプル中に含まれる。ナノリットル単位の４０％グリセロール液滴は、大気に一晩曝された場合でされ、水和したままである。
【００５０】
タンパク質の機能を研究するために、タンパク質がフォールディングしたコンフォメーションを保存する様式で、そのタンパク質を固定することが必要である。さらに、その後の工程で表面への他のタンパク質の非特異的結合を最小にすることが、好ましい。これらの目的を達成するために、化学誘導したスライドが使用され得る。ほとんどの適用について、アルデヒド含有シラン試薬で処理したスライドが、使用される。これらのスライドはまた、商標名ＳｕｐｅｒＡｌｄｅｈｙｄｅ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓの下でＴｅｌｅＣｈｅｍ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌから購入され得る。このアルデヒドは、そのタンパク質の一級アミンと容易に反応して、シッフ塩基結合を形成する。代表的なタンパク質は、その表面上に多くのリジンを提示し、そしてそのアミノ末端に一般的により反応性が高いα−アミンを提示するので、それらのタンパク質は、種々の方向でそのスライドに付着し得、それにより、溶液中で、そのタンパク質の種々の側面と他のタンパク質または低分子が相互作用することが可能となる。これらのスライドへのそのタンパク質の付着後、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）含有緩衝液中にそのスライドを浸漬することによって、未反応アルデヒドがクエンチングされ、そして非特異的結合が最小にされる。
【００５１】
ほとんどの適用のために適切であるが、アルデヒドスライドは、ペプチドまたは非常に小さいタンパク質がプリントされた場合には、使用され得ない。これは、おそらく、ＢＳＡが、目的の分子を覆い隠すからである。このような適用のために、まず、ＢＳＡ分子層をガラススライドの表面に付着し、その後、そのＢＳＡをＮ，Ｎ’−ジスクシンイミジルカルボネートで活性化することにより製造される、ＢＳＡ−ＮＨＳスライドが、使用される。ＢＳＡ上にある活性化されたリジン残基、アスパラギン酸残基、およびグルタミン酸残基は、そのタンパク質上の表面アミンと容易に反応して、共有尿素結合またはアミド結合を形成する。その後、そのスライドは、グリシンでクエンチングされる。
【００５２】
アルデヒドスライドは、ＴｅｌｅＣｈｅｍ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（Ｃｕｐｅｒｔｉｎｏ，ＣＡ）から購入され得る。ＢＳＡ−ＮＨＳスライド（ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）の固定層の表面上に活性化アミノ基およびカルボキシル基を提示する）は、以下のよう製造され得る。１０．２４ｇのＮ，Ｎ’−ジスクシンイミジルカルボネート（１００ｍＭ）および６．９６ｍｌのＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（１００ｍＭ）を、４００ｍｌの無水Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中に溶解した。３０  ＣＭＴ−ＧＡＰスライド（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ，Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ）（その表面上にアミノ基を提示する）を、室温で３時間この溶液中に浸漬した。このスライドを、９５％エタノールで２回リンスし、その後、４００ｍｌの１％ＢＳＡ（ｗ／ｖ）含有リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）（ｐＨ７．５）中に室温で１２時間浸漬する。このスライドを、ｄｄＨ２Ｏで２回リンスし、９５％エタノールで２回リンスし、そして２００ｇで１分間遠心分離して、過剰な溶媒を除去する。その後、このスライドを、１００ｍＭのＮ，Ｎ’−ジスクシンイミジルカルボネートと１００ｍＭのＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミンとを含む、４００ｍｌのＤＭＦ中に室温で３時間浸漬する。このスライドを、９５％エタノールで４回リンスし、そして上記のように遠心分離して、ＢＳＡ−ＮＨＳスライドを得る。このスライドを、室温にて真空下でデシケーター中に２ヶ月間まで、認知可能に活性を損失することなく保存する。
【００５３】
タンパク質を、他のように示されない限り、濃度１００μｇ／ｍｌにて、４０％グリセロール、６０％ＰＢＳ（ｐＨ７．５）中に溶解する。そのタンパク質を、ＧＭＳ  ４１７  Ａｒｒａｙｅｒ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ，Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，ＣＡ）を使用して、アルデヒドスライド上にスポットする。室温にて加湿チャンバ中で３時間インキュベートした後、そのスライドを反転させ、そして１％ＢＳＡ（ｗ／ｖ）含有ＰＢＳ（ｐＨ７．５）溶液中に落とす。１分後、そのスライドの右側を上にし、そして室温で１時間穏やかに攪拌しながらこのＢＳＡ溶液中に浸漬する。ＰＢＳ中にて短くリンスした後、そのスライドは、すぐにさらに処理できる状態である。
【００５４】
目的のタンパク質が、発蛍光団で標識され得、そしてアレイにハイブリダイズされ得る。この発蛍光団の蛍光は、標識タンパク質が金属表面付近（好ましくは、その金属表面から約５０Å〜約２０００Å、より好ましくはその金属表面から約５０Å〜約２００Å）にある場合に、一定量の励起放射線に応じて増加する。別の実施形態において、目的のタンパク質プローブは、そのタンパク質プローブがマイクロアレイ上のタンパク質に結合した場合に、それらのタンパク質プローブが金属表面付近に位置し、ドナー分子からアクセプター分子への蛍光エネルギー移動が増加されるように、アクセプター発蛍光団およびドナー発蛍光団で標識され得る。なお別の実施形態において、金属コートマイクロアレイ表面に固定されたタンパク質が、ドナー分子またはアクセプター分子で標識され得、そしてタンパク質プローブが、そのタンパク質プローブがマイクロアレイ表面上の標識タンパク質とハイブリダイズした場合に、ドナー分子からアクセプター分子への蛍光エネルギー移動が一定量の励起放射線に応じて増加されるように、ドナー分子またはアクセプター分子で標識され得る。
【００５５】
従って、本発明の別の実施形態は、固体支持体と、その支持体に付着した所望の長さの生体分子（好ましくは核酸またはアミノ酸）のアレイを有するマトリックスとを、標識プローブがその生体分子配列にハイブリダイズした場合に（好ましくは、その標識が、金属粒子から約５０Å〜約２０００Å、より好ましくは金属粒子から約５０Å〜約２００Åに位置するように）その標識プローブの蛍光が一定量の励起放射線に応じて増加されるように含む、マイクロアレイシステムを提供し、ここで、その固体支持体は、金属粒子（好ましくは貴金属粒子、最も好ましくは銀粒子）でコートされている。用語「プローブ」は、タンパク質、核酸、アミノ酸、オリゴヌクレオチド、ペプチド核酸、またはマイクロアレイの金属コート表面に付着したマトリックスの分子とハイブリダイズするか、結合するか、または相補的である、他の分子を包含する。
【００５６】
ＲＥＴに基づく光採集アセンブリの効率（Ａｄｒｏｎｏｖら（２０００）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２２，１１７５−１１８５；Ｓｗａｌｌｅｎら（１９９９）Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ４８５−４８６：５８５−５９７）は、増加され得るか、または細胞中のドナーとアクセプターとの間（Ｇｏｎｚａｌｅｚら（１９９５）Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．６９，１２７２−１２８０（Ｎｇら（１９９９）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８３，２０８５−２０８９）であるが金属粒子に近いＲＥＴの程度が、増加され得る。金属が豊富なＲＥＴの現象は、金属粒子へのドナー−アクセプター対の近さを使用する独特の機会を提供して、移動の速度を改変する。このような効果は独特である。なぜなら、溶液組成ではなく、金属粒子または金属表面が、そのプローブのスペクトル特性を改変するために使用され得るからである。
【００５７】
本発明の別の実施形態は、発蛍光団の蛍光強度を増加するための方法を提供し、この方法は、金属粒子に近接して発蛍光団を位置付ける工程；および複数の光子によりその発蛍光団を励起する工程（多光子励起と一般的に呼ばれる）を包含する。代表的には、その発蛍光団は、最長単一光子吸収極大の約２倍の波長を有する短いピコ秒またはフェムト秒レーザーパルスを用いて励起される。多光子励起装置および多光子励起方法は、当該分野で公知であり、そして例えば、Ｊｏｓｅｐｈ  Ｒ．Ｌａｋｏｗｉｃｚにより編集されたＴｏｐｉｃｓ  ｉｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ，Ｖｏｌｕｍｅ  ５，Ｎｏｎｌｉｎｅａｒ  ａｎｄ  Ｔｗｏ−Ｐｈｏｔｏｎ−Ｉｎｄｕｃｅｄ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ，Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９７（本明細書中にその全体が参考として援用される）にて見出され得る。一般的に、多光子励起は、代表的には、強集束レーザー光源（例えば、約１００フェムト秒長、繰返し数８０ＭＨｚ付近、７００〜９００ｎｍの範囲の波長のパルスを提供する、モードロック（ｍｏｄｅ−ｌｏｃｋｅｄ）チタンサファイアレーザー）を用いて実施される。多光子励起はまた、ピコ秒色素レーザーを用いても達成され得る。
【００５８】
本発明の別の実施形態は、生体分子の多光子蛍光強度を増加するための方法を提供し、この方法は、金属粒子に近接して生体分子を位置付ける工程、および複数の光子を用いてその生体分子を励起させる工程を包含する。
【００５９】
本発明のなお別の実施形態は、サンプルの電磁放射の領域を選択的に増強するための方法を提供し、この方法は、そのサンプル中の目的の領域に金属粒子を指向させる工程、およびそのサンプル中に一定量の励起放射線を提供する工程を包含する。
【００６０】
本発明の別の実施形態は、サンプルの電磁放射の領域を選択的に増強するための方法を提供し、この方法は、そのサンプル中の目的の領域に金属粒子を指向させる工程、そのサンプルを発蛍光団と接触させる工程、そのサンプルを一定量の励起放射線に曝露させる工程を包含する。例示的金属は、貴金属である。この金属粒子は、電位、磁気、または重力を使用して、位置付けされ得る。
【００６１】
なお別の実施形態は、サンプルの電磁放射の領域を選択的に増強するための方法を提供し、この方法は、そのサンプル中の目的の領域に金属粒子を指向させる工程、その目的の領域中に一定量の励起放射線を提供する工程を包含する。サンプルは、容器中の生細胞、組織、器官、または流体サンプルであり得る。その金属粒子は、電磁界を使用して位置付けられ得るか、またはその金属粒子は、タンパク質、抗体、核酸などに連結され得る。金属粒子に連結された抗体は、その抗体により認識される分子にその金属を近接させるために使用され得る。従って、この抗体が特定の生体分子を認識する場合、その金属は、そのような生体分子の傍に位置付けられ得、その生体分子の蛍光強度が、一定量の励起放射線に応じて増加するようにされる。
【００６２】
別の実施形態は、サンプルの電磁放射の領域を選択的に増強するための方法を開示し、この方法は、そのサンプル中の目的の領域に金属粒子を指向させる工程、そのサンプルを発蛍光団と接触させる工程、および一定量の励起放射線にそのサンプルを曝露させる工程を包含する。好ましい実施形態において、その発蛍光団は、量子収量０．８未満、好ましくは０．５未満、より好ましくは０．２未満、そして最も好ましくは０．１未満を有する。低量子収量を有する発蛍光団は、それらが金属粒子と近接していない限り、検出可能に蛍光発光しない。従って、そのサンプルが一定量の励起放射線に曝露された場合、金属粒子と近接した発蛍光団のみが、検出可能であるに十分に蛍光発光する。
【００６３】
なお別の実施形態は、分析物の存在を検出するためのキットを開示し、そのキットは、その分析物に結合可能である抗体、ならびに中に配置された金属アイランドを有する少なくとも１つの石英表面を含み、その抗体は、量子収量約０．５未満、好ましくは約０．２未満、最も好ましくは約０．１未満を有する発蛍光団に連結される。例示的抗体は、タンパク質、ペプチド、および他の生体分子に関する。
【００６４】
別の実施形態は、分析物を検出するための方法を開示し、その方法は、第１抗体をドナーで標識する工程、第２抗体をアクセプターで標識する工程、サンプルをその第１抗体および第２抗体と接触させてその分析物との複合体を形成する工程、その分析物を金属粒子（好ましくは貴金属）から約５０Å〜約２０００Å、好ましくは金属表面から約５０Å〜約２００Åに位置付ける工程、一定量の励起放射線を提供する工程、およびドナーからアクセプターへのエネルギー移動の増加に基づいてその分析物を検出する工程を包含する。例示的ドナーは、アクセプターの吸収スペクトルと重複する波長を有する発蛍光団である。例示的アクセプターは、ドナーの発光スペクトルと重複する吸収スペクトルを有する。アクセプターは、蛍光性であり得る。例示的ドナー−アクセプター対としては、フルオレセイン−ローダミン、ＤＡＰＩ−ヨウ化プロピジウム、およびＣｙ３−Ｃｙ５が挙げられる。この抗体は、標準的技術を使用して標識され得る。１つの実施形態において、その複合体は、重力、電位、または他の公知の力を使用して位置付けされ得る。
【実施例】
【００６５】
（実施例１）
（金属ナノ粒子フィルムを作製するための手順）
金属粒子または金属粒子フィルムは、公知であり、そして公知の方法を使用して作製され得る。以下の実施例は銀を使用するが、任意の金属（好ましくは貴金属）が使用され得ることが、認識される。銀粒子を生成するために使用した化学物質（硝酸銀（９９＋％）、水酸化ナトリウム（ペレット、９７％）、水酸化アンモニウム（ＮＨ３含量２８〜３９％）、およびＤ−グルコース（９９．５％）を、商業的供給業者から購入し、さらに精製することはなく使用した。すべての手順を、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ濾過によりされに精製した蒸留水を使用して実施した。銀アイランドを、石英顕微鏡スライド上に形成させた。石英は、ＵＶ透過および少ない自己蛍光を提供した。銀粒子を配置するために使用した石英スライドを、Ｈ２ＳＯ４（９５〜９８％）とＨ２Ｏ２（３０％）との１０：１混合物中に一晩浸漬した後、配置した。これらを、使用前に水で洗浄し、風乾した。
【００６６】
銀堆積を、Ｔｅｆｌｏｎコート攪拌棒を備えた清浄な３０ｍｌビーカー中で実行した。硝酸銀溶液（２６ｍｌのＭｉｌｌｉｐｏｒｅ濾過水中０．２２ｇ）を迅速に攪拌するために、８滴の新鮮な５％ＮａＯＨ溶液を添加した。黒褐色の沈殿物がすぐに形成された。その後、１ｍｌ未満の水酸化アンモニウムを１滴ずつ添加して、その沈殿物を再溶解させた。ビーカーを氷浴中に配置することによって、この清浄な溶液を５℃まで冷却させ、次いで、その洗浄し乾燥した石英スライドを、この溶液中に浸漬した。５℃にて、新鮮なグルコース溶液（４ｍｌの水中０．３５ｇ）を添加した。この混合物を、その温度で２分間攪拌した。その後、そのビーカーを氷浴から取り出した。その混合物の温度を３０℃まで温めさせた。その混合物の色が黄緑色から黄色に変化し、そのスライドの色が緑色がかったとき、そのスライドを取り出し、そして水で洗浄し、そして室温で１分間、浴超音波処理した。水で数回リンスした後、そのスライドを、実験前の数時間水中に保存した。
【００６７】
発光スペクトルは、ＳＬＭ８０００分光蛍光計を使用して得られた。強度減衰は、以前に記載される機器を使用して、周波数ドメインにおいて測定した（Ｌａｋｏｗｉｃｚら、（１９８５）Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．２１，６１−７８；Ｌａｃｚｋｏら、（１９９０）Ｒｅｖ．Ｓｃｉ．Ｉｎｓｔｒｕｍ，６１，２３３１−２３３７）。ローダミン６Ｇ（Ｒ６Ｇ）およびローズベンガル（ＲＢ）について、励起は、約７８ＭＨｚ出力のモードロックアルゴンイオンレーザーからの５１４ｎｍであった。周波数ドメイン測定のために、発光は、５８０干渉フィルターを通って観測された。すべての定常状態および周波数ドメイン測定について、励起は、垂直に偏光され、そして発光は、散乱光を最小化するために、水平方向の偏光子を通して観測された。ＦＤ強度減衰データは、多重指数関数モデル（ｍｕｌｔｉ−ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ  ｍｏｄｅｌ）
【００６８】
【数１】
2004524528.tif 000002
で分析され、ここで、τｉは、振幅αｉでの寿命であり、そしてΣαｉ＝１．０であった。多重指数関数モデルにあてはめることは、以前に記載されている（Ｌａｋｏｗｉｃｚら、（１９９４）Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．４６，４６３−４７７）ように実施した。定常状態強度に対する各成分の寄与は、
【００６９】
【数２】
2004524528.tif 000003
によって与えられる。
【００７０】
図１Ａは、石英スライド上の銀アイランドの実験的な形状を示し、そして図１Ｂは、銀アイランドフィルムの吸収スペクトルを示す。このスペクトルは、粒子が、サイズにおいて波長未満であることを示す。小粒子限界において、このプラズモン共鳴に起因する吸収極大は、３８０ｎｍ付近であると期待される（Ｋｅｒｋｅｒ，Ｍ．（１９８５）Ｊ．Ｃｏｌｌｏｉｄ  Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ  Ｓｃｉ．１０５，２９７−３１４；Ｍｕｌｖａｎｅｙ，Ｐ．（１９９６）Ｌａｎｇｕｍｕｉｒ，１２．７８８−８００）。４００ｎｍを超える吸収極大は、１．５〜１．０近くの軸比を有する粒子の非対称な効果的な形状に起因し得（Ｋｅｒｋｅｒ，Ｍ．（１９８５）Ｊ．Ｃｏｌｌｏｉｄ  Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ  Ｓｃｉ．１０５，２９７−３１４）、そしてまた４０〜５０ｎｍ付近の球形寸法を有する銀粒子と一致する（Ｒｉｖａｓら、（２００１）Ｌａｎｇｍｕｉｒ  １７、５７４−５７７；Ｊｅｎｓｅｎら、（２０００）Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．Ｂ１０４，１０５４９−１０５５６；Ｓｉｎｇｅｒら、（１９９５）Ｊ．Ｏｐｔ．Ｓｏｃ．Ａｍ．Ｂ，１２，２２０−２２８）。粒子の形状およびサイズの分布は、ほぼ確実に不均一であるが、粒子がサイズにおいて波長未満であることは明らかである。
【００７１】
蛍光に対する銀アイランドの効果を決定するために、発蛍光団を含むサンプルを、２つのこのような銀アイランドプレートの間に配置した。２つの石英プレート間または２つの銀アイランドコーティングプレート間のローズベンガルの吸収スペクトル（図２Ａ〜２Ｃ）から、プレート間の距離は、約１〜１．５μｍである。
【００７２】
（実施例２）
（発光スペクトルおよび寿命に対する銀アイランドフィルムの効果）
最初の実験として、コーティングされていない石英プレート間（Ｑ）または銀アイランドフィルム（Ｓ）間のローダミンＢ（ＲｈＢ）およびローズベンガル（ＲＢ）の発光スペクトルを調べた。これらの２つの発蛍光団は、類似の吸収スペクトルおよび発光スペクトルであるが、ＲｈＢおよびＲＢについて、それぞれ、０．４８および０．０２の異なる量子収量であるので、選択された。ＲｈＢの場合、強度は、これらの銀アイランドの非存在下および存在下で類似する（図３Ａ）。銀アイランドに起因して、ＲｈＢ強度の小さな減少が存在し得るが、これは、短い距離の金属のクエンチング効果に起因し得る。
【００７３】
対照的な結果が、ローズベンガルについて得られた（図３Ｂ）。この場合、強度は、銀アイランドの存在下で約５倍増加した。ＲＢについて観測された増加した強度が、銀アイランド近くのＲＢの量子収量の過小評価を表すことを認識することが重要である。これは、ＲＢ分子のほんの小さな画分が、金属表面が効果を発揮する距離内にあるからである。増強された蛍光の領域は、溶液中に約２００Å〜約２０００Åに広がる。それ故、プレート間の液体容量のほんの約４％が、活性容量内にある。活性容量の低い割合は、アイランドの２００Å内のＲＢの量子収量が１２５倍増加することを示唆する。この増加は、０．０２の量子収量が正しく、金属粒子に起因して、増加した入射場を反映する場合に可能であるよりも大きい。それにもかかわらず、図３のＲＢのスペクトルは、銀アイランドの２００Å内の分子についての量子収量の実質的な増加を示す。
【００７４】
集中した電場の効果は、図３Ｂのローズベンガルの強度増加の優勢な原因ではない。放射は、銀アイランドの近くのＲｈＢ分子および銀アイランドからある距離にあるＲｈＢ分子の両方について生じる。電場の集中効果は、銀アイランドから離れたＲｈＢ分子由来の優勢な放射によってマスクされ得る。
【００７５】
増加した放射速度および集中した電場の効果は、寿命測定によって区別され得る。放射速度の増加は、寿命を減少する；一方、励起速度の増加は、寿命を変化しない。銀アイランドの非存在下および存在下のＲｈＢおよびローズベンガルの強度減衰を測定した（図４Ａ〜４Ｃおよび図５Ａ〜５Ｃ）。標準的なキュベットにおいて、ＲｈＢの強度減衰は、寿命τ＝１．５６ｎｓで、単一指数関数であることが見出された（図４Ａ）。銀アイランドの存在下で、強度減衰は、強度に不均一になる（図４Ｃ）。
【００７６】
このデータは、キュベットにおいて見出される寿命に匹敵する１．８１ｎｓの長い寿命を有する２つの減衰時間に一致し得る。銀アイランド間で、銀アイランドに近接するＲｈＢ分子に起因する０．１４ｎｓの短い寿命が見られた。この短い成分の部分的な定常状態は、約１０％である。コントロール測定は、この成分が散乱光に起因しなかったことを示した。測定はまた、銀アイランドなしで、石英プレート間でＲｈＢについて実行された。この場合において、減衰はまた、二重指数関数的であるが、アイランドの存在下よりも不均一ではなかった。それにもかかわらず、短い寿命成分が、銀アイランド間でＲｈＢについて見られたことが明らかである（図４Ｂ）。コントロール測定は、ＲｈＢなしで、石英スライド単独では有意な強度がなかったことを示した。この結果は、散乱光が、コーティングされていないスライド間でＲｈＢについて見られる短い成分起源ではないことを示唆する。
【００７７】
ローズベンガルについての周波数ドメイン（ＦＤ）強度が、図５Ａ〜５Ｃに示される。キュベットにおいて、単一指数関数の減衰は、τ＝９４ｐｓである。この減衰は、コーティングされていない石英プレート間で、ローズベンガルについて少し不均一になる。しかし、ローズベンガルの強度減衰は、銀アイランド間の場合、劇的に変化した。この場合において、優勢な寿命は、６ｐｓ成分になった。これは、銀アイランドに近接するローズベンガル分子に対応する。
【００７８】
ＲｈＢおよびローズベンガルの強度減衰に対する銀アイランドの効果は、周波数ドメインデータから再構築された時間分解減衰において見られ得る（図６Ａおよび６Ｂ）。両方の発蛍光団について、強度減衰は、キュベットにおいて観測される値と本質的に同一の長い減衰時間成分を示す。銀アイランドは、短い減衰時間の外観を生じる。ローズベンガルについての短い減衰時間のより大きな寄与は、バルク溶液におけるその低い量子収量から理解され得る。ＲｈＢは、その放射が１μｍの厚みのサンプル全体を通って分子から検出されるように、より高い量子収量を有する。ローズベンガルは、溶液中において低い量子収量を有し、その結果、観測される放射が銀アイランド付近のローズベンガル分子にほとんど起因する。ＲｈＢおよびローズベンガルからの結果は、予想と一致する。
【００７９】
コーティングされていない石英プレート間および銀アイランドフィルム間の多数のさらなる発蛍光団を、アーチファクトの寄与を考慮するために調べた。４つの発蛍光団（Ｅｒｂ、ＢＦ、［Ｒｕ（ｂｐｙ）３］２＋、および［Ｒｕ（ｐｈｅｎ）２ｄｐｐｚ］２＋）の発光スペクトルが、図７Ａ〜７Ｄに示される。全ての場合において、放射は、銀アイランド間の溶液についてより強力である。例えば、［Ｒｕ（ｂｐｙ）３］２＋および［Ｒｕ（ｐｈｅｎ）２ｄｐｐｚ］２＋は、それぞれ、０に近い量子収量を有する（Ｖａｎ  Ｈｏｕｔｅｎら、（１９７５）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．９７，３８４３−３８４４；Ｈａｒｒｉｍａｎ，Ａ．（１９７７）Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．７７７−７７８；Ｎａｉｒら（１９９７）Ｉｎｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．３６，９６２−９６５；Ｔｕｒｒｏら（１９９５）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１７，９０２６−９０３２）。より多くの増強は、［Ｒｕ（ｂｐｙ）３］２＋よりも［Ｒｕ（ｐｈｅｎ）２ｄｐｐｚ］２＋について見られた。
【００８０】
１０個の異なる発蛍光団溶液についての増強が図８に示される。全ての場合において、低いバルク相量子収量は、銀アイランドフィルム間でサンプルについてのより多きな増強を生じる。さらに、水−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）混合物中の［Ｒｕ（ｐｈｅｎ）２ｄｐｐｚ］２＋を調べた（図９）。この化合物は、水によってクエンチされ、そして最も大きな増強は、最もクエンチされた溶液について観測された（図９）。図７〜９の結果は、金属アイランドへの発蛍光団の近接が、量子収量の増加を生じたという主張の強力な支持を与える。これらの様々な発蛍光団が全て銀アイランドに結合するか、減少した量子収量とともに単調に増加した増強を生じる他の未知の効果を示すことはなさそうである。
【００８１】
（実施例３）
（銀アイランドの存在下でのスペクトルシフト）
図１０Ａおよび１０Ｂは、石英プレート（Ｑ）間および銀アイランド（Ｓ）間における、２つの溶媒感受性発蛍光団の発光スペクトルを示す。両方の場合において、放射の青色シフト（これは、アイランド近くの発蛍光団の減少した寿命と一致する）が観測された。金属の５０Å内の発蛍光団がクエンチングされるようであるので、図１０Ａおよび図１０Ｂに見られる青色シフトが銀アイランドに結合された発蛍光団に起因することがなさそうである。コーティングしていない石英が両方の発光スペクトルに存在するので、コーティングしていない石英表面への発蛍光団の結合もまた、なさそうである。
【００８２】
（実施例４）
（内因性のタンパク質蛍光に対する銀アイランドの効果）
タンパク質Ｅ．ｃｏｌｉ  β−ガラクトシダーゼおよびヒトグリコキシダーゼを、商業的供給業者から得た。これらのタンパク質を１０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）中に溶解させた。β−ガラクトシダーゼおよびヒトグリオキシラーゼの濃度は、それぞれ、０．０５ｍｇ／ｍｌおよび０．１５ｍｇ／ｍｌであった。内因性のタンパク質の蛍光の研究について、励起波長は、２９５ｎｍであった。銀アイランドの存在下および非存在下での２つのタンパク質の発光スペクトルを調べた（図１１Ａおよび１１Ｂ）。タンパク質βガラクトシダーゼおよびヒトグリオキシラーゼを、それらの中程度の量子収量および低い量子収量で選択した。β−ガラクトシダーゼは、Ｎ−アセチル−Ｌ−トリプトファミド（ＮＡＴＡ）の量子収量（これは、０．１３であることが報告される（Ｄｅｍｃｈｅｎｋｏ，Ａ．Ｐ．（１９８１）Ｕｌｔｒａｖｉｏｌｅｔ  Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ））にほぼ等しい量子収量を有する（Ｄ’Ａｕｒｉａら（２００１）Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，印刷中）。ヒトグリオキシラーゼの量子収量は、約１０分の１であり、従って、０．０１３付近であることが見出された。より高い量子収量のβ−ガラクトシダーゼについて、発光スペクトルに対する銀アイランドの有意な効果はなかった。より低い量子収量について、ヒトグリオキシラーゼは、青色シフトおよび放射強度の増加の両方を観測する。β−ガラクトシダーゼは、４量体タンパク質で、４８０，０００分子量であり、これは、各１２０，０００ダルトンのサブユニットにおいて２６個のトリプトファン残基を含む（Ｊａｃｏｂｓｏｎら、（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ  ３６９、７６１−７６６）。ヒトグリオキシラーゼは、６６，０００ダルトンのモノマーであり、これは、２つのトリプトファン残基を含む（Ｄ’Ａｕｒｉａ，Ｓ．，非公開な結果）。図１１Ｂにおけるスペクトルの変化は、グリオキシラーゼにおける高度にクエンチされるトリプトファン残基からの増加した放射に起因し、この残基は、溶媒から遮蔽される。β−ガラクトシダーゼにおけるスペクトルシフトおよび増加の非存在は、その多数のトリプトファン残基を考慮すると理解可能であり、そして有意な画分が高度にクエンチされないようである。従って、銀アイランドは、タンパク質においてクエンチされた芳香族アミノ酸残基からの増加した放射を生じ得る。
【００８３】
（実施例５）
（核酸塩基およびＤＮＡに対する銀アイランドの効果）
アデニン、チミンおよびウシ胸腺ＤＮＡを、商業的供給業者から得た。ポリＴおよびポリＣ（それぞれ、１５塩基長）を、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｍａｒｙｌａｎｄ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ  Ｓｃｈｏｏｌ  ｏｆ  ＭｅｄｃｉｎｅのＢｉｏｐｏｌｙｍｅｒ  Ｃｏｒｅ  ｆａｃｉｌｉｔｙから得た。塩基アデニンおよびチミンの発光スペクトルが、図１２Ａおよび１２Ｂに示され、これらは、銀アイランドの存在下での放射の増加を示す。一本鎖ヌクレオチドである、ポリＴおよびポリＣについて、類似の結果が得られた（図１３Ａおよび１３Ｂ）。ポリＣの長波長発光極大は、以前に報告された結果と一致する（Ｐｌｅｓｓｏｗら（２０００）Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．Ｂ１０４，３６９５−３７０４）。
【００８４】
ウシ胸腺ＤＮＡを、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ＝７）中に溶解させた。ＤＮＡ濃度は、塩基対として５ｍＭであった。発光スペクトルを、２８７ｎｍの励起を用いて、ＳＬＭ  ８０００分光蛍光計で測定した。周波数ドメイン寿命測定を、１０ＧＨｚ機器で得た（Ｌａｃｚｋｏら（１９９０）Ｒｅｖ．Ｓｃｉ．Ｉｎｓｔｒｕｍ．６１，２３３１−２３３７；Ｌａｋｏｗｉｃｚら（１９９４）Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．４６，４６３−４７７）。励起供給源を、２８７ｎｍで二倍の周波数（ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ−ｄｏｕｂｌｅｄ）であった約１００ｐｓパルスを提供するキャビティーダンプト（ｃａｖｉｔｙ−ｄｕｍｐｅｄ）ローダミン６Ｇ色素レーザーであった。強度減衰を、３４４ｎｍ干渉フィルターおよびＷＧ３３５ロングパスフィルターの組み合わせによって測定し、これらは、約３３０〜３５５ｎｍの透過を提供した。発光スペクトルおよび寿命を、垂直偏光励起および水平偏光放射を用いて測定した。この光学的構成は、スペクトルおよび寿命の有意なゆがみなしに、励起波長の散乱光を減少した。周波数ドメインデータは、多重指数関数モデルに一致した。ここで、減衰の強度が、上記式（１）によって与えられ、ここで、αｉが、各減衰時間τｉと関連する振幅因子である。αｉ値の合計は、単位量に正規化される（Σαｉ＝１．０）。
【００８５】
塊の厚みが４０Å近くに制限される場合、小波長限界に近い特徴的な表面プラズモン吸収スペクトルから分かり得るように、波長未満の寸法を有する、表面上の粒子が得られる（図１Ｂ）。ＤＮＡサンプルは、１〜１．５μｍ付近の分離を有する、２つのこのような銀アイランド間に配置される。プレート間のＤＮＡの吸収スペクトルは、ＤＮＡ吸収と銀アイランドの吸収のほぼ合計であり（図１４Ａおよび１４Ｂ）、これは、アイランドが、ＤＮＡの吸光率を有意に変化しなかったことを示唆する。
【００８６】
ＤＮＡの発光スペクトルを、薄い０．１ｍｍのキュベットにおいて、そして２つのアイランド（ｉｓｌａｎｄ）フィルムの間で調べた（図１５Ａおよび１５Ｂ）。２８７ｎｍでの励起により、おそらく部分的にアデニン残基およびグアニン残基の選択的な励起を生じた（Ｗｉｌｓｏｎら（１９８０）Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍ．＆Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌ．３１，３２３−３２７；Ｇｅｏｒｇｈｉｏｕら（１９９６）Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．７０，１９０９−１９２２）。驚いたことに、金属アイランドの付近では、発光は約８０倍強かった。この８０倍の増加が、粒子付近のＤＮＡにより示される増加をかなり過小評価しているということに注目することは重要である。増大の領域は、溶液中で約２００Å〜約２０００Åにまで及ぶと予測される。２つのアイランドのフィルム表面を考慮すると、ＤＮＡの約１／２５しか銀の付近にない。このことは、銀付近のＤＮＡの発光が、２０００倍増大されるということを示唆する。これは、適切なサイズおよび形状の楕円からの最適距離にある分子について予測される最大の増強に近い。増幅された場の効果は、最大１４０倍の増強を生じ得（Ｇｅｒｓｔｅｎら（１９８１）Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．７５，１１３９−１１５２）、アイランドフィルム付近のＤＮＡの量子収量における最少で１５倍の増加を示唆する。場の増強は最大ではないようである。ＤＮＡの実際の増加した量子収量は、約１５倍と約２０００倍未満との間である。
【００８７】
図１５Ｂにおいて見られる増加した強度の１つの説明は、無放射減衰（ｄｅｃａｙ）速度ｋｎｒの減少であり得、これが、より長い寿命を生じる。増加した発光の別の理由は、増幅された入射光場であり得る。この効果は、増加した強度を生じるが、寿命は変化されない。周波数−ドメイン強度減衰は、図１６Ａおよび１６Ｂに示される。これらの測定値を、より直感的な時間−ドメイン減衰を再構築するために使用する（図１７）。この減衰は、金属アイランドの非存在下または存在下において多重指数関数的（ｍｕｌｔｉ−ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ）である（表１）。強度減衰は、非常に非同次であるかまたは多重指数関数的であり、これらは、６０ｐｓ〜４．５６ｎｓの減衰時間範囲から見られ得る。ＤＮＡの個々の寿命は、その弱い内因性の蛍光に起因して不確実であるが、平均寿命
【００８８】
【数３】
2004524528.tif 000004
は確実である。このような広範な寿命は、他の公開された報告と一致する（Ｂａｌｌｉｎｉら（１９８３）Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．１８，６１−６５；Ｇｅｏｒｇｈｉｏｕら（１９８５）Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍ．＆Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌ．４１，２０９−２１２；Ｐｌｅｓｓｏｗら（２０００）Ｊ  Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．Ｂ  １０４，３６９５−３７０４）。これらの実験からの重要な結論は、ＤＮＡの平均寿命
【００８９】
【数４】
2004524528.tif 000005
が、本発明者らが強度の８０倍の増加を観察した条件と同じ条件下で減少したということである（図１５Ｂ）。このように減少した寿命は、ｋｎｒの減少または励起速度の増加では説明できない。しかし、減少した寿命は、放射減衰速度の増加により説明され得る。Γｍが、金属粒子の存在に起因する放射減衰の速度を表すようにする。この新しい速度は、金属（ｍ）の存在下の量子を
【００９０】
【数５】
2004524528.tif 000006
に変化させ、これは、金属の存在下より大きい。金属の存在下での寿命（τｍ）は、
【００９１】
【数６】
2004524528.tif 000007
に減少する。金属の非存在下での量子収量および寿命は、Γｍ＝０．０を用いて等式１および２により与えられる。従って、金属によるＤＮＡの放射減衰速度における増加は、銀アイランドの存在下における増加した強度および減少した寿命の両方を説明し得る。強度の８０倍の増加と寿命の３倍の減少とに一致する等式はない。多数の可能な理由があり、これらには、強度測定および寿命測定による、サンプル間の異なる空間的平均化が含まれる。それにもかかわらず、固有のＤＮＡ寿命は、強度が増加するにつれて減少し、放射減衰の増加を実証している。
（表１：５０ｍＭ  ＴＲＩＳ（ｐＨ７．０、２０℃における仔ウシ胸腺ＤＮＡの蛍光強度減衰パラメータ）
【００９２】
【表１】
2004524528.tif 000008
（実施例６）
（共鳴エネルギー移動に対する銀アイランドの影響）
共鳴エネルギー移動（ＲＥＴ）は、生化学研究および生物医学研究において広く使用されるＭｏｒｒｉｓｏｎら（１９９３）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３２，３０９５−３１０４；Ｊｕら（１９９６）．Ｎａｔ．Ｍｅｄ，２９２，２４６−２４９）。ＲＥＴは、適切なスペクトル特性を有する蛍光団がフェルスター距離Ｒ０内に入る場合はいつでも起こる。フェルスター距離は、２０〜４０Åの範囲であり、まれに５０Åより大きい。均一溶液に溶解された場合にローダミン６Ｇ（Ｒ６Ｇ）とスルホローダミン１０１（ＳＲ１０１）との間のＲＥＴに対する銀アイランドフィルムの効果を調べた。ドナーの発光に対して正規化した、この混合物の発光スペクトルを図１８に示す。銀アイランドは、５９０ｎｍ付近のアクセプターの発光の増加を生じる。この増加は緩やかに現れ得るが、アクセプターが０．２ｍＭの濃度で存在してこのアクセプターの有意な直接の励起を生じる蛍光団の混合物では重要である。
【００９３】
さらに、二重らせん仔ウシ胸腺ＤＮＡに結合された場合のＤＡＰＩからアクリジンオレンジ（ＡＯ）へのＲＥＴを調べた（図１９）。この場合、ドナーおよびアクセプターのバルク濃度は低い。なぜなら、これらは、ＤＮＡによって近接して保持されているからである。５２０ｎｍ付近のアクセプター発光の劇的な増加が存在し、これは、エネルギー移動の程度における金属により増強された増加に起因すると考えられる。
【００９４】
仔ウシ胸腺ＤＮＡは、商業的供給源から得られ、そして１塩基対あたり１３，３００Ｍ−１ｃｍ−１を使用して、５０ｍＭｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７）に溶解して２ｍＭの塩基対の濃度にした。ＤＡＰＩおよびヨウ化プロピジウム（ＰＩ）を、購入した。エネルギー移動測定については、ＤＡＰＩおよびＰＩの濃度は、それぞれ１．５×１０−５Ｍおよび１．５×１０−４Ｍであった。これらの濃度は、ＤＡＰＩ１分子あたり１３３塩基対、およびＰＩ１分子あたり１３塩基対という結果になった。
【００９５】
発光スペクトルを、ＳＬＭ８０００分光蛍光計を使用して３６０ｎｍの励起を用いて得た。強度減衰を、以前に記載された計測を使用する周波数−ドメインにおいて測定した（Ｌａｃｚｋｏら（１９９０）Ｒｅｖ．Ｓｃｉ．Ｉｎｓｔｒｕｍ．６１，２３３１−２３３７；Ｌａｋｏｗｉｃｚら（１９９４）Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ  ４６，４６３−４７７）。３６０ｎｍの励起波長を、１０ｐｓ以下のパルス幅を用いる３．８０ＭＨｚキャビティダンピングしたＰｙｒｉｄｉｎｅ  ２色素レーザーの周波数倍加出力から得た。
周波数−ドメイン測定について、発光を４６０ｎｍ干渉フィルターを通して観察した。定常状態測定および周波数−ドメイン測定について、励起を垂直偏光し、そして発光を、水平に配向した偏光子を通して散乱光を最小にするように観察した。ＦＤ強度減衰を、上記の等式（１）（ここでτｉは、αｉの振幅を有する寿命であり、そしてΣαｉ＝１．０である）を使用して多重指数関数モデルの点から分析した。多重指数関数モデルに対するフィッティングを、依然に記載されたように実行した（Ｌａｋｏｗｉｃｚら（１９９４）Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．４６，４６３−４７７）。定常状態強度に対する各成分の寄与は、上記の等式（２）により与えられる。
【００９６】
平均減衰時間は、
【００９７】
【数７】
2004524528.tif 000009
により与えられる。
【００９８】
振幅重みつき寿命は、
【００９９】
【数８】
2004524528.tif 000010
により与えられる。塩基対長３．４Åおよびｒｍｉｎ＝１２Åは、固定パラメータであった。
【０１００】
銀粒子を、上記のように石英スライド上への銀の化学的還元により得た。堆積銀の全体的な厚さが４０Å付近に維持される場合、銀粒子は、準波長（ｓｕｂ−ｗａｖｅｌｅｎｇｔｈ）次元を有し、そして表面プラズモン吸収の特徴を示す（図１）。２つのこのような銀アイランドフィルム間の色素の吸収スペクトルの研究から、サンプル厚さは、１〜１．５μｍ付近であることが見出された。
【０１０１】
共鳴エネルギー移動に対する銀アイランドの効果を試験するために、ドナーとしてＤＡＰＩおよび／またはアクセプターとしてＰＩで標識された二重らせん仔ウシ胸腺ＤＮＡを使用した。キュベット中のＤＡＰＩ−ＤＮＡならびにＤＡＰＩおよびＰＩの両方で標識されたＤＮＡの発光スペクトルを、図２０に示す。４６０ｎｍ付近のＤＡＰＩドナー強度における減少から見られ得るとおり、エネルギー移動の程度は、約２０％である。ＰＩアクセプターは、６１０ｎｍに見られる発光に対してわずかに寄与するのみである。約２０％のエネルギー移動の程度は、このＤ−Ａ対についての３５．７ÅのＲ０値と一致する（Ｍｕｒａｔａら（２０００）Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｓ（Ｂｉｏｓｐｅｃｔｒｏｓｃ．）５７，３０６−３１５）。ＤＮＡらせんにおいて１３塩基対あたり１つのアクセプター標識の程度、および塩基対あたり３．４Åということに基づいて、アクセプター分子は平均４５Åはなれて存在する。
【０１０２】
次に、ＤＡＰＩドナーのみかまたはＰＩアクセプターのみで標識されたＤＮＡに対する銀アイランドフィルムの効果を調べた（図２１）。ＤＡＰＩ−ＤＮＡの場合、強度は、石英プレート間または銀アイランドフィルム間に置かれた場合、実質的に変化しない。ＰＩ−ＤＮＡの場合には、ＰＩ強度において約２倍の増加がある。ＰＩ−ＤＮＡに対する銀アイランドフィルムのより大きな効果は、ＤＡＰＩ−ＤＮＡの量子収量０．５３と比較して、０．１５近くというそのより低い量子収量と一致する（Ｍｕｒａｔａら（２０００）Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ  （Ｂｉｏｓｐｅｃｔｒｏｓｃ．）５７，３０６−３１５）。
【０１０３】
ドナーおよびアクセプターで標識されたＤＮＡの発光スペクトルを図２２に示す。ＰＩアクセプター発光における顕著な増加は、２つの銀のない石英プレート間と比較した場合に、２つの銀アイランドフィルム間のＤＮＡサンプルについて見出された。この銀アイランドフィルムは、アクセプターのみのＤＮＡ（ＰＩ−ＤＮＡ）に対しては穏やかな効果しか有していなかった。これらの結果は、銀アイランドに対する近さに起因するＤＡＰＩからＰＩへのＲＥＴの効率の増加を示す。
【０１０４】
ＤＡＰＩからＰＩへのエネルギー移動の増加は、ＤＡＰＩ減衰時間の減少を生じると期待される。ＤＡＰＩの周波数−ドメイン強度減衰を図２３に示す。各パネルにおける点線は、ＰＩアクセプターの非存在下でのＤＡＰＩ減衰を示す。全ての場合において、平均ＤＡＰＩ寿命は、ＰＩの存在下で減少した（表２）。平均ＤＡＰＩ減衰時間（アクセプターなしで
【０１０５】
【数９】
2004524528.tif 000011
＝２．９３ｎｓ）は、銀アイランドの存在下でτ＝２．３９ｎｓへと約２０％減少したが、定常状態の強度は、実質的に変化しなかった（図２１）。この結果は、銀アイランドに起因する放射減衰の速度の増加を示唆する。コントロール測定は、全てのこれらの測定において散乱光が存在しないことを示した。
（表２）
アクセプターおよび銀アイランドの存在下および非存在下におけるＤＡＰＩドナー強度減衰の多重指数関数分析
【０１０６】
【表２】
2004524528.tif 000012
ＤＡＰＩドナー減衰を、ドナーおよびアクセプターで標識されたＤＮＡが０．５ｍｍのキュベット中にある場合に、プレーンな石英プレート間および銀アイランドフィルム間で調べた（表２）。平均ＤＡＰＩ寿命は、キュベットから銀のない石英プレートに及ぶまで変化されなかった（それぞれ、
【０１０７】
【数１０】
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＝２．１６および２．２６ｎｓ）。
【０１０８】
【数１１】
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＝１．６７ｎｓへのＤＡＰＩ減衰時間の劇的な減少は、銀アイランドフィルム間のＤＡＰＩ−ＤＮＡについて見出された（図２３Ａ  Ｃ）。この寿命の減少は、発光スペクトルにおいて見られる増加したＲＥＴに帰因する（図２２）。
【０１０９】
見かけ上のフェルスター距離の点について周波数−ドメインドナー減衰を分析した。これは、ドナーの減衰を分析することにより達成される。アクセプター濃度は、１塩基対あたり０．０７５のアクセプターで一定に保持され、そしてＲ０値は、データに対する適合度を得るように変化させられる（図２４Ａ〜Ｃ）。Ｒ０＝３７．４Åという値は、Ｄ−Ａ対について計算された値（Ｒ０＝３５．７Ａ）に近い。Ｒ０の見かけの値は、石英プレート間で３３．５Åに減少した。重要なことに、Ｒ０の見かけの値は、銀アイランドフィルム間のサンプルについて７５．６Åへと２倍増加した。これは、見かけのＲ０値である。この適合（ｆｉｔ）を調べることにより（図２４Ｃ）、周波数−ドメイン強度減衰が、単一のＲ０値に適合し得ないことがわかった。この適合の欠如は、Ｄ−Ａ対の少なくとも２つの集団の存在を示唆し、銀アイランドに近い方の対が、より大きなＲ０値を示す。
【０１１０】
見かけのＲ０値における２倍の増加が、ＲＥＴに対する銀アイランドの効果の最小限の推定値を表すということを認識することは重要である。銀アイランド付近の活性空間は、溶液中で約２００Å〜約２０００Åにまで及ぶ。１μＭのサンプル厚さを仮定すると、サンプルの約１／２５しかこの活性な値内にない。このことは、ＲＥＴに対する実際の効果が、Ｒ０における２倍の増加よりも大きいということを示唆する。
【０１１１】
（実施例７：多光子励起による金属粒子付近の蛍光の局部的な増強）
ＲｈＢ、エオシンナトリウム塩、ローズベンガル、およびクマリン１５２を、業者から入手した。実験サンプルのジオメトリを図２５に示す。ＲｈＢ、エオシン、およびローズベンガルの二光子励起を、８５２ｎｍ出力のＴｓｕｎａｍｉ  ｍｏｄｅ−ｌｏｃｋｅｄ  Ｔｉ：Ｓａｐｐｈｉｒｅレーザー、８０ＭＨｚの繰り返し周期（ｒｅｐｅｔｉｔｉｏｎ  ｒａｔｅ）、９０ｆｓのパルス、約０．５Ｗの平均電力で達成した。Ｃ１５２およびＡＮＳについて、多光子励起波長は、ほぼ８００ｎｍであった。この励起を、１５ｃｍ半径の凹面鏡を用いてサンプルに集束させた。この溶液を、２つの高質石英プレート（λ／４平坦度）の間に配置した。これらのプレートの半分を被覆せず、半分を上記のように銀アイランド（ｓｉｌｖｅｒ  ｉｓｌａｎｄ）で被覆した。吸収の測定値から、プレート間のサンプルの厚みは約１μｍであった。このサンドイッチサンプルを、ｘ−ｙポジショナー上に設置した。レーザーの集束点は、長さ約４ｍｍおよび直径３０μｍであった。レーザーが銀アイランドを有する領域または銀アイランドを有さない領域を照射するように、ｘ−ｙポジショナーを用いてサンプルを移動させた。この位置変更を、実験のジオメトリにおけるいかなる変化も伴わずに達成した。散乱した励起を、発光スペクトルについては、熱フィルターおよびＢＧ−３８ガラスフィルターの組み合わせを用い、時間分解測定についてはＢＧ−３８および５８０ｎｍ干渉フィルターを用いて消去した。
【０１１２】
強度の減衰を、以前に記載された器具を用いて周波数領域で測定した（Ｌａｋｏｗｉｃｚら（１９８５）Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．２１、６１−７８；Ｌａｃｚｋｏら（１９９０）Ｒｅｖ．Ｓｃｉ．Ｉｎｓｔｒｕｍ．６１、２３３１−２３３７）。周波数領域の測定のために、発光を、５８０干渉フィルターを通して観察した。全ての定常状態および周波数領域の測定について、散乱光を最小限に抑えるために、励起を垂直に偏光し、発光を水平方向に配向された偏光子を通して観察した。ＦＤ強度の減衰を、上記等式（１）（τｉは振幅αｉを有する寿命であり、Σαｉ＝１．０である）を用いた多重指数関数モデル（ｍｕｌｔｉ−ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ  ｍｏｄｅｌ）の形式で分析した。以前に記載されたようにして、多重指数関数モデルに適合させた（Ｌａｋｏｗｉｃｚら（１９９４）Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．４６、４６３−４７７）。定常状態の強度への各成分の寄与は、上記等式（２）により与えられる。平均減衰時間は、上記等式（５）により与えられる。
【０１１３】
８５２ｎｍでの二光子励起よる銀アイランドフィルムの間のＲｈＢの発光スペクトルを試験した（図２６Ａ）。金属粒子の間のＲｈＢについての発光強度（図２６Ａにて───で示される）は、被覆されていない石英プレートの間のＲｈＢ（図２６Ａにて−−−で示される）に対して約４倍増大した。サンプルを、集束した８５２ｎｍの光に最初に曝した場合、照射領域から白色光を視覚的に検出した。この「スパーク」は１秒未満で減衰したが、一部の白色光はバックグラウンドで残存した。この白色光はまた、ＲｈＢを有さない銀アイランド単独でも見られた（図２６Ａにて・・・・で示される）。近距離場顕微鏡法における照射した金属プローブのこのような白色の連続発光は、以前に報告されている（Ｓａｎｃｈｅｚら（１９９９）Ｐｈｙｓ．Ｒｅｖ．Ｌｅｔｔｓ．８２、４０１４−４０１７）。重要なことに、ＲｈＢのシグナルは、最初の発光の過渡状態後に安定なままであった。また、４９０ｎｍの一光子励起を用いてＲｈＢを試験した(図２６下）。この場合、被覆されていない石英プレートと比較して、銀アイランドの効果はほとんどなかった。
【０１１４】
コントロール実験として、銀アイランドの存在下で二光子励起によりＲｈＢを試験したが、アイランドがＲｈＢと接触せずに外表面にくるようにプレートを回転させた（図２７）。この場合、銀で被覆したプレートと銀で被覆していないプレートとの間の差は、見出されなかった。白色の連続発光は、この銀アイランドからもなお観察された。この結果は、図２６で見られるＲｈＢの増強された発光が、ＲｈＢの二光子励起に起因し、次にＲｈＢを励起する金属粒子による第２高調波発生に起因しないことを実証した。
【０１１５】
図２６の結果は、本発明者らの層状サンプル（図１を参照のこと）の性質を考慮することにより、理解され得る。発蛍光団は、１μの厚みのサンプルにおいて均一に分配される。金属アイランド（ｍｅｔａｌ  ｉｓｌａｎｄ）により影響を受ける領域は、溶液中で約２５０Å広がると考えられる。２つの銀アイランド表面が存在することを思い起し、本発明者らは、この溶液の約５％のみが活性領域に含まれると評価した。実際は、このパーセンテージさえも、高すぎる可能性がある。なぜならば、金属表面の５０Å以内の発蛍光団は、代表的に、消光されるからである。サンプルの５％が金属により影響を受けると仮定すると、ＲｈＢの４倍の増強（図２６上）は、金属粒子に起因して、二光子励起の８０倍の増強を示唆する。金属粒子付近の発蛍光団の小画分は、一光子によっては有意な効果が存在しないことを説明する（図２６下）。なぜならば、発光の大部分は、銀アイランドから離れたＲｈＢ分子から生じるからである。
【０１１６】
一光子励起および二光子励起により、被覆された石英プレートと被覆されていない石英プレートとの間のＲｈＢの周波数領域の強度の減衰を試験した。図２９Ａの励起波長は８５２ｎｍであり、観察波長は５８０ｎｍであった。一光子励起について、平均寿命は、被覆されたプレートと被覆されていないプレートとの間で本質的に変化しなかった（図２８Ａ〜Ｂ）。この結果は、ＲｈＢの一光子の個々の発光のほとんどが、バルクサンプルから生じたことを示す図２６Ｂと一致する。対照的な結果を、二光子励起によるＲｈＢの強度の減衰について見出した（図２９Ａ〜Ｂ）。この場合、平均寿命は、銀アイランドフィルムにより劇的に短縮される。８５２ｎｍの励起により減少したＲｈＢの寿命は、金属粒子付近のＲｈＢ分子の局部的な二光子励起の結果である。減少したＲｈＢ寿命はまた、この励起が金属アイランドによる第２高調波発生に起因しないことを実証した。この高調波による励起から生じるＲｈＢの寿命は、バルク溶液において見出されるＲｈＢの寿命と同じである。
【０１１７】
蛍光の多くの用途において、発蛍光団の光安定性は最大の関心事である。このことは、光消滅（ｐｈｏｔｏｄｅｓｔｒｕｃｔｉｏｎ）前に約１，０００の光子が、ローダミンのような高安定性の発蛍光団から観察され得ると評価された場合の単一分子の検出に特にあてはまる（Ａｍｂｒｏｓｅら（１９９９）Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．９９、２９２９−２９５６）。光化学は励起状態で生じるので、蛍光寿命の減少は、光安定性を増大させると考えられる。一光子励起および二光子励起を用いて、被覆された石英スライドと被覆されていない石英スライドとの間のローダミンＢの光安定性を試験した（図３０Ａ〜Ｂ）。一光子励起について、光安定性は、銀アイランドの存在または非存在により影響を受けなかった（図３０Ｂ）。二光子励起について、銀アイランドの存在下での光安定性は増強された（図３０Ａ）。これらの結果は、銀アイランド間のローダミンＢについて観察されたより短い寿命および二光子励起が銀アイランドフィルム付近で優先的に生じるという主張と一致する。
【０１１８】
実験を進める上で、バルク溶液中で０．４８の量子収量（Ｑ＝０．４８）を示すローダミンＢを使用した。結果として、多くの発光が、銀アイランドにより影響を受けない領域中で、バルク溶液から生じた。銀アイランド付近で生じる多光子励起は、付近の発蛍光団の量子収量を増大する。図３１Ａは、エオシン（Ｑ＝０．２４）の発光スペクトルを示し、図３１Ｂは、石英プレート間および銀アイランドフィルム間のローズベンガル（Ｑ＝０．０２）の発光スペクトルを示す。励起波長は８５２ｎｍであった。これらのスペクトルにおける、銀アイランドフィルムから生じる白色光の連続帯は、全体的なシグナルが低いことからより明らかである。重要なことに、銀アイランド間の発蛍光団から実質的な発光が生じる条件下で、二光子励起によって、エオシンまたはローズベンガルから発光が本質的に生じない。この結果は、金属粒子付近の選択的かつ局部的な二光子励起を示唆していた。
【０１１９】
選択的な励起の概念を、生化学的に関連する発蛍光団（例えば、クマリン１５２およびＡＮＳ）を用いてさらに追跡した（図３２Ａ〜Ｂ）。この場合、銀アイランドフィルム間のこれらの発蛍光団について、二光子により誘導される発光の顕著な増強が観察された。水中での非常に低い量子収量（Ｑ＜０．０１）を有するＡＮＳの場合、被覆されていないスライド間のＡＮＳについて本質的にシグナルが見られず、キュベット中のバルク溶液から観察されたシグナルでさえ、銀粒子の存在下で二光子により誘導された発光と比較して有意でなかった。図３１Ａ〜Ｂおよび図３２Ａ〜Ｂに示される結果は、銀粒子付近の多光子励起が、金属粒子付近の領域での高度に局在化された励起を引き起こし得る一般的な現象であることを示唆する。
【０１２０】
図３３は、金属コロイド上の発蛍光団が、どのようにして、遊離発蛍光団の存在下で多光子励起により選択的に検出され得るかを示す図である。金属粒子の約５０Å〜約２０００Å、好ましくは、約５０Å〜約２００Å内の発蛍光団のみが、一定量の励起放射に曝された場合に蛍光が増大する。遊離発蛍光団は、検出可能なレベルで蛍光を発しない。
【０１２１】
図３４は、金属コロイドによる細胞内自己蛍光の局部的な多光子励起の図である。１つの実施形態において、金属粒子（好ましくは、貴金属）が、所望の標的に結合する抗体に取り付けられる。抗体が所望の標的に結合した場合、金属粒子は、標的付近の、励起量の蛍光（好ましくは、多光子励起）に応答して標的の蛍光を増大するのに十分な距離（代表的には、約５０Å〜約２０００Å、好ましくは、約５０Å〜約２００Å）に位置する。抗体は、抗体を産生し得る任意の宿主動物由来であり得る。宿主動物の例として、哺乳動物、好ましくは、ウサギ、ヤギ、ウマ、およびヒトが挙げられる。抗体はまた、外因的な発蛍光団と結合体化され得る。
【０１２２】
（実施例８）
（アッセイ）
図３５は、免疫アッセイの概略図を示す。捕捉抗体は、金属粒子付近の表面に共有結合される。分析物（Ａｎ）が存在すると、非蛍光発色団で標識された二次抗体と表面結合する。非蛍光発光団発蛍光団または弱蛍光発光団発蛍光団の例として、ローズベンガル、エオシン、マラカイトグリーン、および光学顕微鏡法において色素または染料として使用される有機分子が挙げられるがこれらに限定されない。光学顕微鏡法において色素または染料として使用される適切な有機分子は、当該分野で周知であり、アシッドフクシン、アルシアンブルー、アリザリンレッド、コンゴーレッド、クリスタルバイオレット、エオシン、エバンスブルー、ライトグリーンＳＦ、ルキソールファストブルー、メチルグリーン、ニュートラルレッド、ニグロシン、オイルレッドｏ、オレンジｇ、ピクリン酸、ピロニンｙ、サフラニンｏ、シリウスレッド、スーダンブラックｂ、およびトルイジンブルーｏが挙げられるがこれらに限定されない。抗原への結合の際に、以前は非蛍光性の種が、増大した放射率に起因して一定量の励起放射線に応じて発光する。金属部位からより離れた未結合種は蛍光を発しないので、この蛍光シグナルと干渉しない。非蛍光種は、金属粒子に近接する場合にのみ発光する「分子ビーコン」となる。抗体を産生し得る任意の宿主由来の抗体または抗体フラグメントが使用され得ることが理解される。宿主の例として、哺乳動物（例えば、霊長類、ヤギ、ウマ、ウサギ、およびげっ歯類）が挙げられる。さらに、組換え抗体またはキメラ抗体もまた、使用され得る。このアッセイは、生物学的流体（唾液、尿、粘液、血液、血漿、およびリンパ液が挙げられるがこれらに限定されない）中の分析物の存在を検出するのに使用され得る。分析物の例として、ステロイド、低分子、タンパク質、ペプチド、細菌、および真菌が挙げられる。
【０１２３】
図３６は、電気電位を用いて蛍光のオンオフをゲート制御する本発明のアッセイを示す。発蛍光団は、金属粒子で被覆された表面に取り付けられた可撓性ポリマー鎖の末端に配置される。１つの実施形態において、この鎖および発蛍光団全体は負に荷電している。電圧または金属が正の場合、発蛍光団は、消光ゾーンに存在する。電圧が負の場合、発蛍光団は、増強ゾーンに置き換わる。あるいは、発蛍光団は、より短い範囲で金属の消光ゾーンを出入する。従って、発光は、電圧によりゲート制御される。電気電位は、公知の技術を用いて生成され得る。適切な電気電位源として、電気を生成し得るデバイス（バッテリー、燃料電池、および変圧器が挙げられるがこれらに限定されない）が挙げられる。別の実施形態において、電気電位を用いてアレイセンサにアクセスする方法は、ＤＮＡまたはタンパク質を表面上に所望のバターンで連結するための公知の方法を用いて提供される。例えば、生体分子は、接着剤、ポリマー、リジン、またはビオチン−アビジンを用いて表面に連結され得る。
【０１２４】
本発明の別の実施形態は、免疫アッセイを開示する。このアッセイにおいて、第１の抗体はドナー分子で標識され、そして第２の抗体はアクセプター分子で標識される（図３７）。標識された抗体は、各々の抗原に結合し、複合体を形成する。この複合体が、金属粒子の近くにある場合、ドナーからアクセプターへの共鳴エネルギー移動は増強され、アクセプターからの発光が検出可能となる。この複合体は、電気電位または他の誘引力を用いて銀アイランド表面付近に位置し得る。金属により誘導される移動速度の増大は、より長い距離の移動を導き、抗原は、移動効率の増大により検出可能である。
【０１２５】
図３８は、本発明の別の実施形態である、表面プラズモン励起用装置を示す。銀を含まないコントロール表面について（図３８Ｂ）、発光は、蛍光の臨界角で増大している。励起がプラズモン共鳴角にある場合、発光は、発光波長のプラズモン角で急激に分散される。この目的のための代表的な金属表面は、連続的な半透明の銀被覆である。この被覆はさらに、金属コロイドまたは粒子の結合により修飾され得、増強された、指向性の発光を提供する。
【０１２６】
本発明の意図または添付の特許請求の範囲から逸脱することなく、本発明に対して種々の改変がなされ得る。
【図面の簡単な説明】
【０１２７】
【図１】図１Ａおよび１Ｂは、それぞれ、石英表面上の銀金属アイランドおよびその吸収スペクトルを示す。
【図２】図２Ａ〜Ｃは、それぞれ、キュベット中、石英プレート間、および銀アイランドを有する石英スライド間におけるローズベンガルの吸収スペクトルである。
【図３】図３Ａおよび３Ｂは、銀アイランドフィルム間のローダミンＢおよびローズベンガルの発光スペクトルである。
【図４】図４Ａ〜４Ｃは、種々の条件下でのローダミンＢの、周波数−ドメイン強度減衰を示すグラフである。
【図５】図５Ａ〜５Ｃは、種々の条件下でのローズベンガルの、周波数−ドメイン強度減衰を示すグラフである。
【図６】図６Ａ〜６Ｂは、ローダミンＢおよびローズベンガルの、再構築時間−ドメイン強度減衰である。
【図７】図７Ａ〜７Ｄは、銀アイランドフィルム間（Ｓ）およびコーティングしていない石英プレート間（Ｑ）の、Ｅｒｂ、ＢＦ、［Ｒｕ（ｂｐｙ）３］２＋、および［Ｒｕ（ｐｈｅｎ）２ｄｐｐｚ］２＋の発光スペクトルである。
【図８】図８は、銀アイランドフィルム間に配置された場合に異なる量子収量を有する発蛍光団の発光の増強の、グラフでの描写である。
【図９】図９は、ＤＭＦ溶液および水中における、石英プレート間での蛍光強度（ＩＱ）に対して比較した、銀アイランドフィルム間の［Ｒｕ（ｐｈｅｎ）２ｄｐｐｚ］２＋の蛍光強度（ＩＳ）の、グラフでの描写である。［Ｒｕ｛ｐｈｅｎ｝２ｄｐｐｚ］２＋は、水の存在下で蛍光強度が減少する（挿入図）。図９は、銀アイランド粒子が、ＤＭＦよりも多くの水を含む溶液中で、［Ｒｕ（ｐｈｅｎ）２ｄｐｐｚ］２＋に対してより大きい増強（ＩＳ／ＩＱ）を有することを示す。従って、銀アイランドフィルムは、強いかまたはクエンチされていない発蛍光団に対してよりも弱いかまたはクエンチされた発蛍光団に対して、蛍光強度のより大きい増強を有する。
【図１０】図１０Ａおよび１０Ｂは、銀アイランドフィルム間（Ｓ）およびコーティングしていない石英プレート間（Ｑ）の、溶媒感受性発蛍光団の発光スペクトルである。
【図１１】図１１Ａおよび１１Ｂは、銀アイランドフィルム間（Ｓ）およびコーティングしていない石英プレート間（Ｑ）の、β−ガラクトシダーゼおよびヒトグリオキサラーゼの発光スペクトルである。
【図１２】図１２Ａおよび１２Ｂは、銀アイランドフィルム間（Ｓ）およびコーティングしていない石英プレート間（Ｑ）の、核酸塩基の発光スペクトルである。
【図１３】図１３Ａおよび１３Ｂは、銀アイランドフィルム間（Ｓ）およびコーティングしていない石英プレート間（Ｑ）の、一本鎖核酸の発光スペクトルである。
【図１４】図１４Ａおよび１４Ｂは、キュベット中（１４Ａ）および銀アイランドフィルム間またはコーティングしていない石英プレート間（１４Ｂ）の、仔ウシ胸腺ＤＮＡの吸収スペクトルである。
【図１５】図１５Ａおよび１５Ｂは、キュベット中（１５Ａ）および銀アイランドフィルム間またはコーティングしていない石英プレート間（１５Ｂ）の、ＤＮＡの発光スペクトルである。
【図１６】図１６Ａおよび１６Ｂは、キュベット中（１６Ａ）および銀アイランドフィルム間（１６Ｂ）の、仔ウシ胸腺ＤＮＡの周波数−ドメイン強度減衰である。
【図１７】図１７は、銀アイランドフィルム間およびキュベット中の、仔ウシ胸腺ＤＮＡの時間依存性の強度減衰である。
【図１８】図１８は、コーティングしていない石英プレート間および銀アイランドフィルム間の、Ｒ６Ｇ（ドナーとして）およびＳＲ１０１（アクセプターとして）の発光スペクトルである。
【図１９】図１９は、銀アイランドフィルム間およびコーティングしていない石英プレート間の、ＤＡＰＩおよびアクリジンオレンジで標識したＤＮＡの発光スペクトルである。
【図２０】図２０は、コーティングしていない石英プレート間の、ＤＡＰＩ単独；ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）単独；またはＤＡＰＩおよびＰＩの両方で標識したＤＮＡの発光スペクトルである。
【図２１】図２１は、銀アイランドフィルム間およびコーティングしていない石英プレート間の、ＤＡＰＩ標識ＤＮＡおよびＰＩ標識ＤＮＡの発光スペクトルである。
【図２２】図２２は、銀アイランドフィルム間およびコーティングしていない石英プレート間の、ＤＡＰＩおよびＰＩの両方で標識したＤＮＡの発光スペクトルである。
【図２３】図２３Ａ〜２３Ｃは、キュベット中（２３Ａ）、コーティングしていない石英プレート間（２３Ｂ）、および銀アイランド間（２３Ｃ）における、ＤＡＰＩおよびＰＩの両方で標識した仔ウシ胸腺ＤＮＡについての、ＤＡＰＩドナー減衰の周波数−ドメイン強度減衰である。ＤＡＰＩ単独の周波数−ドメイン強度減衰もまた示す。
【図２４】図２４Ａ〜２４Ｃは、キュベット中（２４Ａ）、コーティングしていない石英プレート間（２４Ｂ）、および銀アイランド間（２４Ｃ）における、ＤＡＰＩおよびＰＩの両方で標識した仔ウシ胸腺ＤＮＡの、ＤＡＰＩの周波数−ドメイン強度減衰である。
【図２５】図２５は、銀アイランドフィルム間の発蛍光団を検出するための例示的な外面的形態である。
【図２６】図２６Ａおよび２６Ｂは、一光子励起および二光子励起を用いた、銀アイランドフィルムとコーティングしていない石英プレートとの間のローダミンＢの発光スペクトルである。
【図２７】図２７は、コーティングしていない石英プレート間および石英プレートの外表面上に銀アイランドを有する石英プレート間での、二光子励起を用いたローダミンＢの発光スペクトルである。
【図２８】図２８Ａおよび２８Ｂは、コーティングしていない石英プレート（２８Ａ）および銀アイランドフィルム間（２８Ｂ）での、一光子励起を用いたローダミンＢの周波数−ローダミン強度減衰である。
【図２９】図２９Ａおよび２９Ｂは、コーティングしていない石英プレート（２９Ａ）および銀アイランドフィルム間（２９Ｂ）での、二光子励起を用いたローダミンＢの周波数−ローダミン強度減衰である。
【図３０】図３０Ａおよび３０Ｂは、コーティングしていない石英プレート間（Ｑ）および銀アイランドフィルム間（Ｓ）での、ローダミンＢの光安定性を示すグラフである。
【図３１】図３１Ａおよび３１Ｂは、二光子励起を用いた、コーティングしていない石英プレート間（Ｑ）および銀アイランドフィルム間（Ｓ）でのエオシン（３１Ａ）およびローズベンガル（３１Ｂ）の発光スペクトルである。
【図３２】図３２Ａおよび３２Ｂは、コーティングしていない石英プレート間（Ｑ）および銀アイランドフィルム間（Ｓ）でのクマリン（３２Ａ）の発光スペクトル、ならびにキュベット中（Ｃ）、コーティングしていない石英プレート間（Ｑ）および銀アイランドフィルム間（Ｓ）でのＡＮＳ（３２Ｂ）の発光スペクトルである。
【図３３】図３３は、遊離発蛍光団の存在下での、金属コロイド上の発蛍光団の選択的多光子励起を示す。
【図３４】図３４は、金属コロイドによる細胞内自己蛍光の局所的な多光子励起を示す。
【図３５】図３５は、銀アイランドでコーティングされた表面と結合させたサンドイッチイムノアッセイの、例示的な実施形態である。
【図３６】図３６Ａ〜３６Ｃは、電圧活性化蛍光アッセイの例示的な実施形態である。
【図３７】図３７Ａ〜３７Ｃは、ドナーおよびアクセプター標識抗体を用いたエネルギー移動イムノアッセイの例示的な実施形態である。
【図３８】図３８Ａは、表面プラズモン励起のための例示的な装置である。そして図３８Ｂは、ローダミン６Ｇからの蛍光の角分布のグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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