(57)【要約】本発明は、バイオ発酵で使用するための生成物除去方法用のバイオプロセス工学溶液に関する。本発明は、バイオ発酵の少なくとも一部の間に、バイオ発酵容器から、ブロスのアリコートを抜き取り、バイオ触媒および水を除去し、水を溶離剤として使用して、抜き取ったブロスからバイオ発酵生成物をクロマトグラフィで分離し、ブロスの残りの成分をバイオ発酵容器に戻す方法を開示する。プロセスクロマトグラフィは、バイオ発酵のフィードバック阻害を防止して、標的分子の極めて選択的な分離を可能にする。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）  バイオ発酵の少なくとも一部の間に、標的分子を含有するバイオ発酵溶液の一部から、バイオ触媒の少なくとも大部分を除去する工程と、
ｂ）  工程ａ）で生成されるバイオ触媒を含まない溶液から水の一部を除去する工程と、
ｃ）  任意に、前記バイオ触媒を含まない溶液から標的分子以外の成分を工程ｂ）の前または後に除去する工程と、
ｄ）  １）ｂ）またはｃ）の工程のいずれかにより生成されるバイオ触媒を含まない溶液および
２）溶離剤
をクロマトグラフ媒体を介して給送する工程と、
ｅ）  前記クロマトグラフ媒体から放出されるバイオ触媒を含まない溶液の第１分画から標的分子を回収する工程と、
ｆ）  任意に、前記クロマトグラフ媒体から放出されるバイオ触媒を含まずかつ標的分子を含まない溶液の第２分画から非水性溶離剤を除去する工程と、
ｇ）  任意に、工程ｂ）でバイオ触媒を含まない溶液から除去された水を、バイオ発酵に戻すのに適した量で、バイオ触媒を含まずかつ標的分子を含まない溶液に工程ｅ）またはｆ）の後で加える工程と、
ｈ）  ｄ）、ｅ）、ｆ）、またはｇ）の工程のいずれかからの、前記バイオ触媒を含まずかつ標的分子を含まない溶液をバイオ発酵に戻す工程と
を含むことを特徴とするバイオ発酵システムで使用するための生成物除去方法。
【請求項２】
ａ）  バイオ発酵の少なくとも一部の間に、水より揮発性の標的分子を含有するバイオ発酵溶液の一部から、バイオ触媒の少なくとも大部分を除去する工程と、
ｂ）  任意に、工程ａ）で生成されるバイオ触媒を含まない溶液から標的分子以外の成分を工程ｃ）の前に除去する工程と、
ｃ）  １）工程ａ）またはｂ）のバイオ触媒を含まない溶液および
２）溶離剤
をクロマトグラフ媒体を介して給送する工程と、
ｄ）  前記クロマトグラフ媒体から放出されるバイオ触媒を含まない溶液の第１分画から標的分子を回収する工程と、
ｅ）  前記クロマトグラフ媒体から放出されるバイオ触媒を含まずかつ標的分子を含まない溶液の第２分画から水の一部を除去する工程と、
ｆ）  任意に、前記クロマトグラフ媒体から放出されるバイオ触媒を含まずかつ標的分子を含まない溶液の第２分画から非水性溶離剤を工程ｅ）の前または後に除去する工程と、
ｇ）  工程ｅ）、またはｆ）のいずれかからの、前記バイオ触媒を含まずかつ標的分子を含まない溶液をバイオ発酵に戻す工程と
を含むことを特徴とするバイオ発酵システムで使用するための生成物除去方法。
【請求項３】
前記溶離剤が、それぞれ、水除去工程ｂ）または工程ｅ）で発生する水を含むことを特徴とする請求項１または２に記載の生成物除去方法。
【請求項４】
前記溶離剤が、水と非水性溶離剤との混合物を含むことを特徴とする請求項３に記載の生成物除去方法。
【請求項５】
前記非水性溶離剤が短鎖アルコールまたはアセトンであることを特徴とする請求項４に記載の生成物除去方法。
【請求項６】
前期溶離剤が水であることを特徴とする請求項３に記載の生成物除去方法。
【請求項７】
工程（ａ）のバイオ触媒を含まない溶液から、水のおよそ５０〜８０％が除去されることを特徴とする請求項１に記載の生成物除去方法。
【請求項８】
工程（ｇ）で加える適量の水が、前記バイオ触媒を含まずかつ標的分子を含まない溶液の水濃度を、およそ工程（ｂ）前のバイオ触媒を含まない溶液の水濃度に戻すことを特徴とする請求項１に記載の生成物除去方法。
【請求項９】
工程（ｇ）で加える適量の水が、前記バイオ触媒を含まずかつ標的分子を含まない溶液の水濃度を、工程（ｂ）前のバイオ触媒を含まない溶液の水濃度未満に戻すことを特徴とする請求項１に記載の生成物除去方法。
【請求項１０】
工程（ｅ）のバイオ触媒を含まずかつ標的分子を含まない溶液から、水のおよそ５０〜８０％が除去されることを特徴とする請求項２に記載の生成物除去方法。
【請求項１１】
工程（ｇ）で加える適量の水が、前記バイオ触媒を含まずかつ標的分子を含まない溶液の水濃度を、およそ工程（ｃ）前のバイオ触媒を含まない溶液の水濃度に戻すことを特徴とする請求項２に記載の生成物除去方法。
【請求項１２】
工程（ｇ）で加える適量の水が、前記バイオ触媒を含まずかつ標的分子を含まない溶液の水濃度を、工程（ｃ）前のバイオ触媒を含まない溶液の水濃度未満に戻すことを特徴とする請求項２に記載の生成物除去方法。
【請求項１３】
前記標的分子が１，３−プロパンジオールであることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
ａ）  標的分子を含有するバイオ発酵溶液の一部から、バイオ触媒の少なくとも大部分を除去するためのバイオ触媒分離手段と、
ｂ）  ａ）のバイオ触媒分離手段によって生成されるバイオ触媒を含まない溶液から、水の一部を除去するための水除去手段と、
ｃ）  任意に、工程ｂ）の前または後に、ｂ）の水除去手段によって生成される前記バイオ触媒を含まない溶液から、標的分子以外の成分または水を除去するための除去手段と、
ｄ）  ｂ）の水除去手段または前記ｃ）の除去手段によって生成される前記バイオ触媒を含まない溶液および溶離剤を通過させるプロセスクロマトグラフ手段と、
ｅ）  ｄ）のプロセスクロマトグラフ手段から放出される第１分画から、標的分子を回収するための標的分子回収手段と、
ｆ）  任意に、ｄ）のプロセスクロマトグラフ手段によって放出される第２分画から非水性溶離剤を除去するための非水性溶離剤除去手段と、
ｇ）  ｂ）で発生した水を、バイオ発酵に戻すのに適した量で、ｅ）またはｆ）から生成される前記バイオ触媒を含まずかつ標的分子を含まない溶液に加えるための水添加手段と、
ｈ）  ｄ）、ｅ）、ｆ）、またはｇ）からの、前記バイオ触媒を含まずかつ標的分子を含まない溶液を、前記バイオ発酵にもどすための再循環手段と
を備えることを特徴とする標的分子のバイオ発酵の少なくとも一部の間での現場で（ｉｎ  ｓｉｔｕ）生成物を除去するためのシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バイオ発酵で使用するための生成物除去方法に関する。さらに詳細には、本発明は、バイオ発酵容器からブロスを抜き取り、そのブロスからバイオ発酵生成物をクロマトグラフィで分離し、ブロスの残りの成分をバイオ発酵容器に戻す方法である。
【背景技術】
【０００２】
バイオ発酵は、再生可能な資源のバイオ触媒的転換に重要な技術である。バイオ発酵により生成される微生物生成物としては、アミノ酸類、エタノール、および抗生物質などがある。少数の化学製品のバイオ発酵による製造および商業化が報告されている（非特許文献１および非特許文献２）。しかし、バイオ触媒的方法は、多くの場合、合成方法に比べて幾つかの周知の制限を受ける。これらの制限としては、１）比較的小さい範囲の生成物；２）低い収率、力価、および生産性；および３）水溶液から生成物を回収および精製する困難などがある。
【０００３】
バイオ触媒的方法の生産性は、幾つかの方式で、蓄積する生成物によって妨害される可能性がある。生化学レベルでは、蓄積する生成物によるフィードバック阻害は、阻害作用（可逆的であってもよい）か、または毒性作用（最終的に微生物を死滅させる、すなわちそのバイオ触媒的成分を不可逆的に不活化することができる）のいずれかのため、生産性を制限することがある。細胞生理学に関しては、蓄積する生成物が、成長速度に悪影響を及ぼす可能性がある。化学的作用および生理学的作用（蓄積する副生成物；ｐＨ変化）が、バイオ触媒の生産性を妨害する可能性もある。
【０００４】
バイオ触媒的方法の生成物は、１）バイオ触媒とのさらなる相互作用による分解、２）環境条件、３）システムからの非制御除去（すなわち、蒸発による）によって、システムから失われることもある。
【０００５】
代謝工学のみで、これらの制限の一部に対処することができるが、バイオ発酵の重要な価値を理解するためには、上流代謝工学（すなわち、生成物合成）と下流バイオプロセス工学（すなわち、生成物分離およびプロセス設計）とを統合することが重要である。
【０００６】
現場での（ｉｎ  ｓｉｔｕ）生成物除去（ＩＳＰＲ）方法論は、バイオ発酵における標的分子（バイオ発酵生成物か、または他の特定の副生成物のいずれか）が、バイオ発酵工程の少なくとも一部の間に合成されるとき、それらを除去する一群の技法である（非特許文献３および非特許文献４で再検討）。異なる揮発性、溶解性、サイズ、密度、電荷、または特定の要素（またはこれらの方法の組み合わせ）に基づくものを含む、様々な分離原理をＩＳＰＲに使用することができるため、ＩＳＰＲ技法は、広い利用可能性を有する。アンバーライト（Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ）ＸＡＤ樹脂、連続沈殿、反応性溶媒抽出に続く同時抽出および逆抽出、および抽出用中空繊維膜反応器に基づくバイオ触媒的方法に、多数のＩＳＰＲ技法が統合されてきた（非特許文献５）。
【０００７】
バイオ発酵においてＩＳＰＲの使用を成功させるための主要な課題は、いかにして、分離技術を、生産性を高める費用および時間効果的方法で大規模工業プロセスに応用するかである。バイオ発酵回収および精製システムの生産性に著しく影響を及ぼす１つの生物工学因子は、プロセス作動モードである。連続分離方法を利用することは、一般に、純バッチ方法より費用および時間効果的であることを、当業者は知っている。
【０００８】
米国特許公報（特許文献１）には、ＩＳＰＲ技法を費用効果的および時間効果的に使用する課題が例示されている。この特許は、バイオ発酵による４−ヒドロキシ安息香酸（ＰＨＢ）の全生産量を増加するためのＩＳＰＲ方法を説明している。遺伝子操作された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞は、バイオ発酵中にＰＨＢを産生する。バイオ発酵の少なくとも一部については、バイオ発酵ブロスは、上向き方向で、イオン交換ビーズ床を通過する。次いで、ＰＨＢが激減したバイオ発酵培地は、バイオ発酵槽に戻る。この方法は、１０分毎に、ビーズを通して全培養体積を循環させ、培地を交換する必要はない。イオン交換ビーズが飽和したとき、バイオ発酵を停止し、水／エタノール混合物の状態の、酸性エタノールまたは塩化ナトリウムで、樹脂からＰＨＢを抽出した。
【０００９】
米国特許公報（特許文献１）は、培地をバイオ発酵槽に再循環させる、バイオ発酵生成物のＩＳＰＲ分離について開示しているが、本方法の効果は、拡大床吸着を利用することにより、制限される。拡大床吸着は連続的な方法ではないが、代わりに「負荷および溶離」という方策を必要とし、生成物を多段階プロセスで単離するための工程所要時間の増加を意味する。従って、この方法は、大規模商業的用途には、費用効率または時間効率が高くない。たとえば、吸着剤ビーズは、溶離前に水ですすぐ必要があり、また各再使用の前にリン酸緩衝液で再条件付けも必要とする可能性がある。米国特許公報（特許文献１）は、バイオ発酵槽の半分のサイズにほぼ等しい拡大床吸着装置を開示している。工業的に実行する際には、これは、商業投資を著しく増加させるであろう。さらに、大規模商業的用途では、樹脂および溶離剤の非能率的な使用は、経費を著しく増加させるであろう。具体的には、回収される生成物の量に比べて、生成物を溶離するためのエタノールの量が多く、また、拡大床を再生する間に、エタノールが徐々に蒸発する可能性がある。溶離剤も、高価な添加物であるトリフルオロ酢酸１モル当量を必要とする。さらに、高呼吸速度を有する微生物によるバイオ発酵は、拡大床内の溶存酸素量が長時間にわたって少なくなると考えられるため、拡大床吸着を生成物分離に使用することはできない。このことは、微生物の生存にひどく不利であろう。拡大床吸着の使用に固有の制限に加えて、米国特許公報（特許文献１）は、イオン交換方法が一般に有効な、中性荷電生成物を分離する方法について記載していない。
【００１０】
プロセス規模または規模生産規模（分析規模または分離規模に対して）で、有効でありかつ費用効率および時間効率が高い１つのＩＳＰＲ分離技術は、擬似移動床（ＳＭＢ）クロマトグラフィである。この技法は、向流クロマトグラフィまたは擬似向流クロマトグラフィを利用して分離する、連続的クロマトグラフ法である（非特許文献６）。これは、溶媒節約型、高効率技術として広く認められている（米国特許公報（特許文献２）、コラム１１）。ＳＭＢクロマトグラフィの操作原理は、米国特許公報（特許文献３）に記載されている。ＳＭＢクロマトグラフィの使用は、今では、生産規模用途のための確立された技法である。他のプロセスクロマトグラフ法としては、クロスフロークロマトグラフィおよび放射型クロマトグラフィなどがあるが、これらに限定されるものではない。しかし、現在実行されている通り、プロセスクロマトグラフ法は、バイオ発酵生成物を選択的に分離したり、他の培地成分をバイオ発酵槽に再循環させることができない。これは、クロマトグラフィによる分離を推進するのに必要な溶離剤の一部がバイオ発酵槽内に蓄積し、その能力を低下させるためである。バイオ発酵の継続時間を延長して生産性を高めることはできるが、大規模製造の場合、絶え間ない培地交換により製造コストが高くなる。このことは、バイオ発酵培地が高価な補因子およびその他のバイオ触媒の成長に必要な成分を含有するとき、特に当てはまる。
【００１１】
【特許文献１】
米国特許第６，１１４，１５７号明細書
【特許文献２】
米国特許第４，８５１，５７３号明細書
【特許文献３】
米国特許第２，９８５，５８９号明細書
【特許文献４】
米国特許第５，６８６，２７６号明細書
【特許文献５】
国際公開第０１／１２８３３Ａ３号パンフレット
【非特許文献１】
Ｗ．ＣｒｕｅｇｅｒおよびＡ．Ｃｒｕｅｇｅｒ著、バイオテクノロジー（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）：工業微生物学テキスト（Ａ  Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ）、マサチューセッツ州サンダーランド、Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ出版：１２４〜１７４頁（１９９０年）
【非特許文献２】
Ｂ．ＡｔｋｉｎｓｏｎおよびＦ．Ｍａｖｉｔｕｎａ著、生化学工学およびバイオテクノロジーハンドブック（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ）、２版；ニューヨーク、Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ出版：２４３−３６４頁（１９９１年）
【非特許文献３】
Ｃｈａｕｈａｎら著、ケムテック（ＣｈｅｍＴｅｃｈ）２７：２６−３０（１９９７年）
【非特許文献４】
Ｆｒｅｅｍａｎら著、バイオテクノロジー（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）１１：１００７−１０１２（１９９３年）
【非特許文献５】
Ｌｙｅら著、バイオテクノロジーにおける傾向（Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）１７：３９５−４０２（１９９９年）
【非特許文献６】
ＬｅＶａｎ，Ｍ．Ｄ．著、ペリーの化学エンジニアハンドブック（Ｐｅｒｒｙ'ｓ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｓ'  Ｈａｎｄｂｏｏｋ）、７版；Ｐｅｒｒｙ，Ｒ．Ｈ．，Ｄ．Ｗ．Ｇｒｅｅｎ，およびＪ．Ｏ．Ｍａｌｏｎｅｙ編；ニューヨークＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ出版、１６−６０頁（１９９７年）
【非特許文献７】
核酸リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）１３：３０２１−３０３０（１９８５）
【非特許文献８】
バイオケミカル・ジャーナル（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ）２１９（Ｎｏ．２）：３４５−３７３（１９８４）
【非特許文献９】
Ｒｏｓｓｉｔｅｒら、「Ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ  Ｐｒｏｃｅｓｓ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ：Ｃｈｉｒａｌ  ＆  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃ  ｗｉｔｈ  ＣＳＥＰ（商標）ａｎｄ  ＩＳＥＰ（商標）；Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ．Ｐｒｅｐ  ９７  Ｍｅｅｔｉｎｇ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．；ｐ  １２（１９９７）
【非特許文献１０】
Ｂｒｏｃｋ，Ｔ．Ｄ．著；バイオテクノロジー（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）：工業微生物学テキスト（Ａ  Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ）、２版；マサチューセッツ州サンダーランド、Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ出版：（１９８９年）
【非特許文献１１】
Ｄｅｓｈｐａｎｄｅ著、Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３６：２２７（１９９２）
【非特許文献１２】
Ｂａｉｌｅｙ，Ｊ．Ｅ．およびＯｌｌｉｓ，Ｄ．Ｆ．著，生化学工業基礎（Ｂｉｏｃｈａｍｉｃａｌ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｓ）、２版；ニューヨーク、ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ出版（１９８６年）
【非特許文献１３】
Ｂａｉｌｅｙ，Ｊ．Ｅ．ａｎｄ    Ｏｌｌｉｓ，Ｄ．Ｆ．，Ｂｉｏｃｈａｍｉｃａｌ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｓ，２版；３８３−３８４頁  および  ６２０−６２２頁；ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ：Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８６）
【非特許文献１４】
一般細菌学のための方法のマニュアル（Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）；Ｐｈｉｌｌｉｐｐ  Ｇｅｒｈａｒｄｔ，Ｒ．Ｇ．Ｅ．Ｍｕｒｒａｙ，Ｒａｌｐｈ  Ｎ．Ｃｏｓｔｉｌｏｗ，Ｅｕｇｅｎｅ  Ｗ．Ｎｅｓｔｅｒ，Ｗｉｌｌｉｓ  Ａ．Ｗｏｏｄ，Ｎｏｅｌ  Ｒ．ＫｒｉｅｇおよびＧ．Ｂｒｉｇｇｓ  Ｐｈｉｌｌｉｐｓ編、ワシントンＤ．Ｃ．アメリカ微生物学会（１９９４年）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
従って、解決すべき問題は、新鮮な培地を加えずに、バイオ発酵反応中に生成した妨害標的分子またはバイオ発酵槽内に蓄積する溶離剤を選択的に除去するバイオプロセス工学方法が欠如していることである。理想的には、バイオプロセス工学法は、１）バイオプロセスの毒性またはフィードバック阻害を引き起こす標的分子を除去し、２）ＩＳＰＲのため、バイオ発酵槽から抜き取られる培地の補充を軽減し、３）バイオ発酵槽内の溶離剤蓄積を防止するであろう。このような技法は、バイオプロセス性能を大幅に改良し、バイオ触媒の全生産速度高めるであろう。結果として、より高い資本生産性および潜在的により高い反応収率が達成されるであろう。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本明細書に記載の発明は、ａ）（バイオ発酵の少なくとも一部の間に）標的分子を含有するバイオ発酵溶液の一部から、バイオ触媒の少なくとも大半を除去する工程と、ｂ）工程ａ）で生成されるバイオ触媒を含まない溶液から、水の一部を除去する工程と；ｃ）任意に、バイオ触媒を含まない溶液から、標的分子以外の成分を工程ｂ）の前または後に、除去する工程と；ｄ）１）工程ｂ）またはｃ）のいずれかで生成されるバイオ触媒を含まない溶液および２）溶離剤をクロマトグラフ媒体を介して給送する工程と；ｅ）クロマトグラフ媒体から放出されるバイオ触媒を含まない溶液の第１分画から、標的分子を回収する工程と；ｆ）任意に、クロマトグラフ媒体から放出されるバイオ触媒を含まずかつ標的分子を含まない溶液の第２分画から、非水性溶離剤を除去する工程と；ｇ）任意に、工程ｂ）でバイオ触媒を含まない溶液から除去される水を、バイオ発酵に戻すのに適した量で、バイオ触媒を含まずかつ標的分子を含まない溶液に工程ｅ）またはｆ）の後で加える工程と；ｈ）工程ｄ）、ｅ）、ｆ）、またはｇ）のいずれかからの、バイオ触媒を含まずかつ標的分子を含まない溶液を、バイオ発酵に戻す工程とを含むバイオ発酵システムで使用するための生成物除去方法である。
【００１４】
本発明の代替実施形態は、水除去工程で使用される温度で、標的分子が水より高い蒸気圧蒸気圧を有するとき、生成物を除去する。この代替実施形態は、プロセスクロマトグラフに到達する前に、標的分子が優先的に蒸発するのを防止する。
【００１５】
本方法で使用される溶離剤は、バイオ発酵から除去される水であってもよく、非水性溶離剤と混合された水であってもよい。非水性溶離剤は、短鎖アルコールまたはアセトンである。本方法でバイオ触媒を含まない溶液から除去される水は、好ましくは５０〜８０％である。本発明は、バイオ発酵から標的分子を選択的に除去する。本発明の１つの実施形態は、１，３−プロパンジオールを選択的に除去する。
【００１６】
さらに、本発明の実施形態は、本明細書に記載されているようなバイオ発酵から、現場で（ｉｎ  ｓｉｔｕ）標的分子を除去するためのシステムである。本システムは、ａ）標的分子を含有するバイオ発酵溶液の一部から、バイオ触媒の少なくとも大部分を除去するためのバイオ触媒分離手段と；ｂ）ａ）のバイオ触媒分離手段によって生成されるバイオ触媒を含まない溶液から、水の一部を除去するための水除去手段と；ｃ）任意に、工程ｂ）の前または後に、ｂ）の水除去手段によって生成されるバイオ触媒を含まない溶液から、標的分子以外の成分または水を除去する除去手段と；ｄ）ｂ）の水除去手段またはｃ）の除去手段によって生成される濃縮されたバイオ触媒を含まない溶液および溶離剤を通過させるプロセスクロマトグラフ手段と；ｅ）ｄ）のクロマトグラフ手段から放出される第１分画から、標的分子の大部分を除去するための標的分子回収手段と；ｆ）任意に、ｄ）のクロマトグラフ手段から放出される第２分画から、非水性溶離剤を除去するための非水性溶離剤除去手段と；ｇ）ｂ）により発生する水を、バイオ発酵に戻すのに適した量で、ｅ）またはｆ）から生成されるバイオ触媒を含まずかつ標的分子を含まない溶液に加えるための水添加手段と；ｈ）ｄ）、ｅ）、ｆ）、またはｇ）からの、バイオ触媒を含まずかつ標的分子を含まない溶液を、バイオ発酵に戻すための培地再循環手段とを備える。水除去工程で使用される温度で、標的分子が、水より高い蒸気圧を有するとき、生成物を除去するために、本システムを一部変更してもよい。
【００１７】
（生物学的寄託、および配列リストの簡単な説明）
出願人は、ブダペスト条約の条項に従って、以下の生物学的寄託を行った：
【００１８】
【表１】
2004524852.tif 000002
【００１９】
本明細書で使用される「ＡＴＣＣ」は、合衆国２０１１０−１１０９  バージニア州マナッサス、ユニバーシティ・ブールバード１０８０１に位置するアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション国際寄託機関（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｄｅｐｏｓｉｔｏｒｙ）を指す。「ＡＴＣＣ番号」は、ＡＴＣＣに寄託した際の培養への寄託番号である。
【００２０】
列挙した寄託物は、表示された国際寄託機関で少なくとも３０年間維持され、それを開示する特許の付与に際して、一般人が利用できるようになる。寄託物の可用性は、政府の措置により付与された特許権の逸脱に際して、主題の発明を実行するための実施許諾を与えるものではない。
【００２１】
出願人は、特許出願におけるヌクレオチドおよびアミノ酸配列の標準的表現に関する規則（Ｒｕｌｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｓｔａｎｄａｒｄ  Ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ａｎｄ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｉｎ  Ｐａｔｅｎｔ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ）ＯＪ  ＥＰＯに対する補遺２に発表された、ＥＰＯの議長決定（Ｄｅｃｉｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｐｒｅｓｉｄｅｎｔ）に対する付属文書ＩおよびＩＩ、１９９２年１２））、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．１．８２１−１．８２５および付録ＡおよびＢ（ヌクレオチドおよび／またはアミノ酸配列を含む出願開示に関する要件（Ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ  ｆｏｒ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｄｉｓｃｌｏｓｕｒｅｓ  Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ／ｏｒ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ））、世界知的所有機関（Ｗｏｒｌｄ  Ｉｎｔｅｌｌｅｃｔｕａｌ  Ｐｒｏｐｅｒｔｙ  Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ（ＷＩＰＯ））基準ＳＴ．２５（１９９８）、およびＥＰＯおよびＰＣＴの配列リスト要件（規則５．２および４９．５（ａ−ｂｉｓ）、および実施細則のセクション２０８および付録Ｃ）に従って、１つの配列を提供した。この配列記述（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎｓ）は、（非特許文献７）および（非特許文献８）（これらを、参照により本明細書に援用する）に記載のＩＵＰＡＣ−ＩＹＵＢ基準に従って定義された、ヌクレオチド配列文字に関する一文字コードおよびアミノ酸に関する三文字コードを含む。
【００２２】
配列表の配列番号：１は、プラスミドｐＳＹＣＯ１０３のヌクレオチド配列である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
出願人は、記述の問題を解決した。本発明は、現場での（ｉｎ  ｓｉｔｕ）生成物除去、および残存するバイオ触媒を含まないブロスのバイオ発酵容器への再循環を使用して、バイオ発酵中に、標的分子の選択的プロセスクロマトグラフフィ除去を可能にする、バイオプロセス工学溶液を提供する。クロマトグラフィ溶離剤の少なくとも一部のソースとして本システムのブロスを使用し、培地を再循環させることにより、本発明は、バイオプロセス全体を簡約し、培地を補充する必要性を低減し、バイオ触媒に対するフィードバック阻害または毒性を低下させ、かつ／またはバイオ発酵容器内の溶離剤蓄積を防止する。
【００２４】
本発明は、工業用途または商業用途のためにバイオ発酵ブロスから標的分子を単離する経費を下げ、かつ妨害する標的分子を除去することによりバイオ発酵の生産性を向上させる。本発明は、比較的簡単な装置を利用し、比較的容易に整備することができる。本発明から利益を受けるユニットのサイズは、実験室規模のものから商業規模のものまで様々であってもよく、１時間に数ミリリットルという少量から、１時間に数千ガロンまでの流量範囲であってもよい。
【００２５】
出願人の発明は、フィードバック阻害または毒性のためにバイオ発酵を妨害する生成物を生成するか、あるいは生成物分解、環境条件、またはシステムからの非制御除去のために失われる、または生成物回収プロセスを簡約することが望ましい、バイオ触媒を使用したバイオ発酵の生産性を改良するのに有用である。
【００２６】
本出願では、特に明記されていない限り、以下の略語および定義が適用される。
【００２７】
「生成物除去方法」は、生成物を選択的に除去するために、バイオ発酵の少なくとも一部の間に、バイオ発酵システムの一部がバイオ発酵容器から抜き取られる方法を指す。次いで、生成物、すなわち標的分子が、ブロスから選択的に除去される。
【００２８】
「Ｉｎ  ｓｉｔｕ生成物除去」は、ＩＳＰＲと略される。本発明では、ＩＳＰＲは、生成物除去のために培地の一部が特異的に循環される別のプロセス・ループで、外的に（すなわち、バイオ発酵容器外で）実施される。あるいは、ＩＳＰＲは、バイオ発酵容器内で直接実施することも可能である。
【００２９】
「バイオ発酵システム」または「バイオ発酵」は、バイオ触媒を使用することにより、基質から生成物までの間の反応を触媒するシステムを指す。「バイオ触媒」は、基質と生成物との間の化学反応を開始したり、その速度を加減したりする。バイオ触媒は、微生物全体であってもよく、単離された酵素、またはこれらの任意の組み合わせであってもよい。本出願の場合、「微生物」は、昆虫、動物、または植物からの細胞も包含する。
【００３０】
「ブロス」または「培地」は、微生物を培養するための栄養を含有する溶液を指す。ブロスは、バイオ触媒、バイオ触媒により生成される標的分子、代謝中間体、および他の培地成分、たとえば塩類、ビタミン類、アミノ酸類、補因子、および抗生物質をさらに含有してもよい。
【００３１】
「標的分子」は、本明細書に記載の方法を使用してバイオ発酵から選択的に除去される、バイオ触媒的に生成される生成物を指す。これは、バイオ触媒により自然に生成される化合物であってもよく、あるいは、非生来遺伝子を、バイオ発酵における機能的発現用の微生物に遺伝子操作してもよい。これに関連して、「標的分子」は、フィードバック阻害を排除しかつ／またはバイオ触媒活性を最大化するために、バイオ発酵システムから選択的に除去することが望ましい、バイオ発酵の副生成物も指す。
【００３２】
「バイオ触媒を含まない溶液」は、バイオ触媒材料の少なくとも大部分が除去されている、バイオ発酵から除去されるブロスを指す。バイオ触媒を含まない溶液は、（膜を貫通するバイオ発酵ブロスの通過後に生成される）透過水であってもよく、上澄であってもよい。バイオ触媒を含まない溶液中の成分は、バイオ触媒によって生成される標的分子、代謝中間体、および他の培地成分、たとえば、塩類、ビタミン類、アミノ酸類、補因子、および抗生物質を含んでもよい。
【００３３】
「バイオ触媒を含まずかつ標的分子を含まない溶液」は、バイオ触媒および標的分子の両者の少なくとも大部分が除去されているバイオ発酵から除去されるブロスを指す。任意に、バイオ触媒を含まずかつ標的分子を含まない溶液中に残存する成分は、著しく低下した濃度の、標的分子、代謝中間体、および他の培地成分、たとえば塩類、ビタミン類、アミノ酸、補因子、および抗生物質を含んでもよい。
【００３４】
「クロマトグラフ媒体」は、溶離剤およびバイオ触媒を含まない溶液からなる、インプット・フィード流中の成分を分離するために、クロマトグラフィシステムの一部として使用される材料を指す。
【００３５】
「容積生産性」は、グラム／（リットル時間）の単位（ｇ／（Ｌ  ｈｒ）と略される）を用いて、時間当たりの所定の体積で示した、バイオ発酵槽内で生成される標的分子の量を指す。この大きさは、バイオ触媒の比活性およびバイオ触媒の濃度によって決定される。力価、実行時間、およびバイオ発酵槽の動作容積から算出される。
【００３６】
「力価」は、グラム／リットル（ｇ／Ｌと略される）という単位を用いた、標的分子濃度を指す。
【００３７】
バイオ触媒を含まない溶液から標的分子を効果的に分離するためのプロセスクロマトグラフに関して、本発明を以下に説明するが、本発明では、プロセス規模または生産規模（分析規模または分離規模に対して）で、様々なクロマトグラフィ分離方法論が有効である。本発明のこれらの代替実施形態としては、バイオ発酵ブロスから標的分子を選択的に分離するための擬似移動床（ＳＭＢ）クロマトグラフィ、クロスフロークロマトグラフィ、または放射型クロマトグラフィなどがあるが、これらに限定されるものではない。
【００３８】
好ましい実施形態では、また図１を参照して、クロスフロー濾過ユニット（２）、水除去ユニット（４）、およびプロセスクロマトグラフ（９）を含む、ブロス再循環ループを、バイオ発酵容器（１）にセットする。この設備は、バイオ発酵容器（１）からのブロスの除去、およびそのクロスフロー濾過ユニット（２）の通過を可能にする。バイオ触媒およびブロスの一部はバイオ発酵容器（１）に戻されるが、クロスフロー濾過ユニット（２）を通過することにより生成されるバイオ触媒を含まない溶液は、水除去ユニット（４）で濃縮される。次いで、濃縮されたバイオ触媒を含まない溶液（５）は、水除去ユニット（４）で発生する水溶離剤（６）を用いた、プロセスクロマトグラフ（９）を通過する。このクロマトグラフィ分離は、濃縮されたバイオ触媒を含まない溶液の残りから、標的分子の大部分（７）を単離する。バイオ触媒を含まずかつ標的分子を含まない溶液（８）を、バイオ発酵容器（１）に戻すことにより、循環させる。
【００３９】
上に開示した本発明の代替実施形態では、また図２を参照して、水除去工程（４）で使用される温度で、標的分子が、水より高い蒸気圧を有するとき、本発明は、生成物を除去するように一部変更される。クロスフロー濾過ユニット（２）、水除去ユニット（４）、およびプロセスクロマトグラフ（９）を含む、ブロス再循環ループを、バイオ発酵容器（１）にセットする。この設備は、バイオ発酵容器（１）からのブロスの除去、およびそのクロスフロー濾過ユニット（２）の通過を可能にする。バイオ触媒およびブロスの一部はバイオ発酵容器（１）に戻されるが、クロスフロー濾過ユニット（２）を通過することにより生成されるバイオ触媒を含まない溶液は、水除去ユニット（４）で発生する水溶離剤（６）と共に、直ちにプロセスクロマトグラフ（９）に給送される。クロマトグラフィ分離で、バイオ触媒を含まない溶液の残りから、標的分子の大部分（７）が単離される。次いで、バイオ触媒を含まずかつ標的分子を含まない溶液（８）は、バイオ発酵容器（１）に戻る前に、水除去ユニット（４）で濃縮される。
【００４０】
当業者は、水除去工程で使用される温度で、標的分子が水より高い蒸気圧を有する場合、標的分子がプロセスクロマトグラフに到達する前に、標的分子が優先的に蒸発するのを防止するためには、このプロセス修飾が必要なことを熟知している。同様に、水除去方法として逆浸透を使用し、かつ水除去工程で使用される温度で、バイオ発酵で生成される標的分子が、水より高い蒸気圧を有する場合、やはりこの代替実施形態が必要である。これにより、やはり、水除去工程（４）の前に標的分子を除去することが可能になる。基本的な発明に対する変更を想定することができる。これらの実施形態の多くを、以下で論ずる。
【００４１】
バイオ触媒を含まない溶液がバイオ発酵容器（１）から除去され、バイオ発酵容器（１）に循環させる前に、本発明のプロセス流れに進む速度は、バイオ発酵容器（１）内の標的分子濃度を、バイオ触媒のフィードバック阻害閾値または毒性閾値より低く維持するために重要である。この循環速度を維持するためのパラメーターを決定する方法は、当業者に周知である。
【００４２】
本発明の特定の態様を、以下に、さらに詳細に論ずる。
【００４３】
（バイオ発酵ブロスの分離）
ブロスをバイオ発酵容器（１）から除去するとき、固体（すなわち、バイオ触媒）の液体からの分離が最初に起こる。この分離によって、バイオ触媒を含まない溶液が得られ、バイオ触媒材料および上澄の一部が、バイオ発酵容器（１）に戻ることが可能になる。様々な固−液分離方法が利用でき、クロスフロー濾過、遠心分離、およびデッドエンド濾過などが含まれるが、これらに限定されるものではない。従来の濾過を使用することも可能であるが、バイオ発酵容器（１）内に生体適合性フィルターを設置することが助けとなる。
【００４４】
クロスフロー濾過ユニット（２）は、流入流れを、２つの流出流れに分ける。バイオ触媒を含まない溶液（すなわち透過水）は、流出流体の膜を通過する部分である。第２の流出流れは、バイオ触媒の細胞物質および膜に拒絶される上澄を含む。この第２の流出流れは、直ちにバイオ発酵容器（１）に戻される。
【００４５】
クロスフロー濾過に使用される個々の膜は、流入流れから除去される粒子のサイズに応じて異なる。典型的なサイズは、約０．２μｍ以下の細孔を有する、精密濾過および限外濾過に一般に使用されるものである。好適な好ましい膜としては、セルロース誘導体、ポリアミド、ポリスルホン、およびフッ化ポリビニリデン等がある。
【００４６】
クロスフロー濾過ユニットの動作を確実に成功させるためには、膜選択に加えて、温度、圧力および汚染物質付着物の複合作用を注意深く考慮しなければならない。所与のプロセス流れｐＨにおける化学的相溶性および膜安定性もやはり因子である。これらの条件は、当業者により、容易に最適化することができる。
【００４７】
（バイオ触媒を含まない溶液の濾過）
より選択的な膜またはより小さい細孔径を有する第２段階クロスフロー濾過ユニットによる生成物除去方法で、任意のさらなる濾過（３）を使用することができる。この任意の濾過は、タンパク質、タンパク質フラグメント、二価塩類、一価イオン、または有機物等他の成分を、バイオ触媒を含まない溶液から除去する。第２段階濾過ユニットを使用することにより、クロマトグラフの吸収剤の寿命が潜在的に増加する。
【００４８】
（温度）
分離が、インプット・フィードの温度によって影響を受けることは、熟練したクロマトグラフィ技術者に周知である。任意に、熱交換器を水除去ユニット加えることが可能である。この熱交換器を使用することにより、クロマトグラフィ分離も蒸発も、一貫した予測できる速度で起こるように、容易になる。
【００４９】
（水除去）
蒸留、逆浸透、蒸気再圧縮、または単純蒸発を使用して、バイオ触媒を含まない溶液から水（４）を除去することが可能である。好ましい実施形態では、水除去工程は、バイオ触媒を含まない溶液から、水のおよそ５０〜８０％を除去して、バイオ発酵容器（１）から除去された後、最初に生成されるものより顕著に濃縮されたバイオ触媒を含まない溶液を生じる。この濃縮されたバイオ触媒を含まない溶液は、標的分子を含有する。この溶液は、最終的にバイオ発酵容器（１）に戻される他の培地成分（たとえば、塩類、ビタミン類、アミノ酸、補因子、抗生物質、および代謝中間体）も含有する。バイオ発酵の副生成物として生じた微量の揮発物質は、それらの沸点が水の沸点に近いかまたはそれより低ければ、バイオ触媒を含まない溶液から除去することが可能である。
【００５０】
（クロマトグラフ媒体通過による標的分子分離）
本発明を使用することにより、実質的にあらゆるタイプの標的分子をバイオ発酵溶液からクロマトグラフィで分離することが可能であろう。本発明は、中性および帯電した標的分子、小分子から大きい分泌タンパク質まで、およびキラル分子の分子量を有する標的分子を分離するのに適合できる。バイオ触媒を含まない溶液を、プロセスクロマトグラフを通過させることにより、標的分子の極めて選択的な分離が行われる（９）。好適な標的分子は、バイオ処理した１，３−プロパンジオールである米国特許公報（特許文献４）。
【００５１】
全ての場合に、バイオ触媒を含まない溶液からの標的分子の分離は、クロマトグラフ媒体または吸着剤との間の分子相互作用のレベルに依存する。吸着剤としては、活性炭、ゼオライト、高分子中性樹脂、キトサンビーズ、イオン交換樹脂、および固定化錯形成材料などがあるが、これらに限定されるものではない。個々の吸着剤の選択は、当業者に周知の様々な因子によって異なる。このような因子としては、標的分子の電荷、標的分子のサイズ、吸着および脱着脱の速度、表面との化学的および物理的相互作用、吸収剤（たとえば、液中のイオンを塩と交換するゼオライト）の安定性、および吸着剤のバイオ毒性などがあるが、これらに限定されるものではない。さらに考慮すべきものとしては、個々のアプリケーションおよび標的分子、培地の安定性、クロマトグラフの方法、およびプロセスおよび装置の規模などがある。
【００５２】
標的分子が水より揮発性ではない好ましい実施形態では、第１分画（標的分子およびクロマトグラフィ溶離剤を含有する）は、クロマトグラフ媒体から放出される。標的分子分離は、クロマトグラフ媒体に対する標的分子の親和力に基づいて起こる。標的分子結合／錯形成の可逆性は、バイオ触媒を含まない溶液中の他の溶質と比較した、標的分子の示差泳動（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｍｉｇｒａｔｉｏｎ）によって達成される。これにより、吸着剤から容易に溶離することが可能になる。溶離条件は、吸着条件に使用されるものと同じ温度および圧力の範囲を含む。次いで、クロマトグラフから回収される標的分子−溶離剤混合物を、当該技術分野で周知の方法（たとえば、蒸留）で精製する。
【００５３】
あるいは、分離は、クロマトグラフ媒体に対する標的分子親和力なしに生じることもある。たとえば、吸着剤との相互作用を持たない一部の標的分子は、クロマトグラフから最初に放出されるが、バイオ触媒を含まない溶液中の他の成分は、吸着剤に対する親和力のため、より長い保持時間を有することもあり得る。溶離剤の混合物および希釈された、バイオ触媒を含まずかつ標的分子を含まない溶液は、クロマトグラフから第２分画として放出される。
【００５４】
（クロマトグラフィ溶離剤および「培地再循環」）
本発明の好ましい実施形態において、クロマトグラフに給送される溶離剤は、水除去ユニット（４）で発生する水である。水除去ユニットにより、バイオ触媒を含まない溶液の含水量がおよそ５０〜８０％減少するため、クロマトグラフに給送されるバイオ触媒を含まない溶液は、バイオ発酵容器（１）から除去されたときに最初に生成されるバイオ触媒を含まない溶液より、溶質が顕著に濃縮されている。この濃縮溶液に、水溶離剤を後で加えるとき、結果として生じる総体的含水量は、バイオ発酵容器（１）から除去されたときに最初に生成されるバイオ触媒を含まない溶液より多くない。
【００５５】
多くの利点は、水除去ユニット（４）から回収される水を、クロマトグラフィ溶離剤として使用することから得られる。この「培地再循環」技法は、他の方法では、バイオ発酵容器（１）から除去されるバイオ触媒を含まない溶液に、ＩＳＰＲのために追加の新しい培地の補充を課せられるであろう経費を直接削減する。これにより、ブロスの残りの成分、たとえば、塩類、ビタミン類、アミノ酸、補因子、抗生物質、および代謝中間体（精製標的分子がない）を、バイオ発酵容器（１）に戻すことが可能になる。
【００５６】
さらに、バイオ触媒を含まない溶液は先ず濃縮され、次いで水分補給されるため、培地再循環方法は、バイオ発酵容器（１）内の全体積を増加させない。これにより、バイオ発酵容器（１）内に蓄積し、発酵ブロス組成を実質的に変え、かつ／またはバイオ発酵容器（１）の能力を減少させる、溶離剤の問題がなくなる。
【００５７】
培地再循環方法を使用して、バイオ発酵容器（１）から水を除去することも可能である。これは、水に溶解した基質を漸進的に加えながらバイオ発酵をフェッドバッチ様式で運転する場合、特に有利であり得る。バイオ発酵容器（１）内の総体的水収支は、その結果、維持される。
【００５８】
最後に、水除去ユニットから回収される水をクロマトグラフィ溶離剤として再使用することにより、システムの運転ユニット数が減少する。具体的には、水再使用により、バイオ発酵に入るのに適した滅菌水源を分離する必要がなくなる。水再使用により、溶離剤を環境に排出するのであれば必要になるであろう工業用水処理施設および精製施設の建設を逃れるため、運転コストがさらに低減する。
【００５９】
本発明の代替実施形態において、非水性溶離剤（短鎖アルコール類、エタノール、またはアセトン等）を（単独または水と組み合わせて）、クロマトグラフィに使用することが可能である。次いで、クロマトグラフ放出液から回収される標的分子−溶離剤混合物を、当該技術分野で周知の方法（たとえば、蒸留）で、精製する。溶離剤および希釈されたバイオ触媒を含まずかつ標的分子を含まない溶液の混合物を含有する、プロセスクロマトグラフ（９）から放出される第２分画を、様々な分離装置（フラッシュ蒸発または充填床吸収体等）を通過させて、非水性溶離剤を除去することが可能である。非水性溶離剤をクロマトグラフ媒体に再循環させることが可能であるが、濃縮したバイオ触媒を含まずかつ標的分子を含まない溶液に、任意に水分補給し、次いで「培地再循環」としてバイオ発酵容器（１）に戻すことが可能である。
【００６０】
（バイオ発酵）
本発明は、様々なバイオ発酵方法論、特に大規模工業プロセスに適したものに適合できる。本発明は、バッチ法、フェッドバッチ法、または連続法を使用して実行することができるが、フェッドバッチ様式で実行することが好ましい。
【００６１】
バッチ法と連続法について、プロセス経済性の差を算出および比較することができる。標準セットの条件を使用する場合、連続システムは、バッチ法と比較して、生産性／吸着剤に関してはおよそ７０倍能率的にすることができ、溶離剤消費は、ファクター８で減少させることができる。（表１、（非特許文献９）から抜粋）。
【００６２】
（バッチおよびフェッドバッチバイオ発酵）
古典的バッチバイオ発酵は、バイオ発酵の開始時にブロスの組成が設定され、かつバイオ発酵中に人工的変化を受けない閉鎖システムである。従って、バイオ発酵の開始時に、ブロスに所望の微生物または生物を接種し、このシステムにさらに加えることなく、バイオ発酵が進行する。しかし、一般に、「バッチ」バイオ発酵は、炭素源の追加に関して回分式であり、ｐＨおよび酸素濃度等の因子の調節は、しばしば企てられる。バッチシステムの場合、代謝物およびシステムのバイオマスは、バイオ発酵を停止するまで絶えず変化する。バッチ内では、培養細胞は、静的ラグ期から高成長対数増殖期まで、さらに最終的には、成長速度が減少するかまたは停止する定常期まで、穏やかになる。未処理であれば、定常期の細胞は、最終的には死滅する。生成物が増殖関連であるとき、対数増殖期の細胞が、一般に、最終生成物または中間性生物の産生の大部分を担う。
【００６３】
標準バッチシステムの変法が、フェッドバッチシステムである。本方法は、バイオ発酵のフェッドバッチ方法を使用することが好ましい。フェッドバッチバイオ発酵法は、バイオ発酵が進行するにつれて増量して、基質を追加すること以外は、典型的なバッチシステムを含む。フェッドバッチシステムは、異化生成物抑制が細胞の代謝を阻害する傾向があるとき、および限られた量の基質を培地中に有することが望ましい場合に有用である。フェッドバッチシステムにおける実際の基質濃度を測定することは困難であり、従って、測定可能な因子、たとえば、ｐＨ、溶存酸素、およびＣＯ2等の排ガスの分圧の変化に基づいて推定される。バッチおよびフェッドバッチバイオ発酵は一般的であり、当該技術分野で周知である（非特許文献１０または非特許文献１１）。
【００６４】
（連続バイオ発酵）
連続バイオ発酵システムでは、確定したバイオ発酵溶液をバイオリアクターに連続的に加え、プロセッシングのために等量のバイオ発酵溶液を同時に除去する。連続バイオ発酵は、一般に、培養を、細胞が主として対数期増殖にある一定の高密度に維持する。この方法論は、細胞増殖または最終生成物濃度に影響を及ぼす一因子または任意の数の因子を調節することが可能である。たとえば、１つの方法は、炭素源または窒素レベル等の制限的栄養物質を一定速度に維持し、かつ全ての他のパラメーターを適度にすることができる。他のシステムでは、増殖に影響する多数の因子は連続的に変えることができるが、培地濁度で測定される細胞濃度は一定に保たれる。連続システムは、定常状態増殖条件下で作動し、またバイオ発酵において細胞成長速度に反して抜き取られるバイオ発酵溶液による細胞損失を埋めることを目指す。連続バイオ発酵法のための栄養物質および成長因子を調節する方法ならびに生成物形成速度を最大化するための技法は、工業微生物学の技術分野で周知である（非特許文献１０）。
【００６５】
（バイオ触媒）
バイオ触媒は、微生物全体であってもよく、単離された酵素触媒触媒の形態であってもよい。透過化処理等の前処理なしで、微生物細胞全体をバイオ触媒として使用することができる。あるいは、当業者によく知られている方法（たとえば、トルエン、デタージェント、または凍結−解凍により処理）で細胞全体を透過化処理して、細胞内への、および細胞からの、材料の拡散速度を改良することが可能である。
【００６６】
プラスミドｐＳＹＣＯ１０３で形質転換した大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）菌株ＲＪ８ｎを、１，３−プロパンジオールの生物生産用のバイオ触媒として使用した。
【００６７】
ＲＪ８ｎは、（ａ）各遺伝子が、その遺伝子を不活化する突然変異を有し、かつ（ｉ）グリセロールキナーゼをコードする遺伝子である、ｇｌｐＫ、（ｉｉ）グリセロールデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子である、ｇｌｄＡ、および（ｉｉｉ）トリオースリン酸イソメラーゼをコードする遺伝子である、ｔｐｉＡ、からなる、３つの内在遺伝子１セットと、（ｂ）３−ヒドロキシプロピオンアルデヒドを１，３−プロパンジオールに転換するのに十分な非特異的触媒活性をコードする、少なくとも１つの内在遺伝子とを含む。プラスミドｐＳＹＣＯ１０３（配列表の配列番号：１）は、下記の７つの外因性遺伝子１セットを含む：（ｉ）グリセロールデヒドラターゼをコードする３遺伝子（Ｅ．Ｃ．４．２．１．３０）、（ｉｉ）デヒドラターゼ再活性化因子をコードする２遺伝子（特許文献５）（ｉｉｉ）グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼをコードする１遺伝子（ＥＣ  １．１．１．８）、および（ｉｖ）グリセロール−３−ホスファターゼをコードする１遺伝子（ＥＣ  ３．１．３．２１）。
【００６８】
上述の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）菌株に加えて、本発明で有用な微生物としては、細菌（たとえば、腸内細菌、大腸菌およびサルモネラ、たとえば、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、アシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、メチロバクター（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）、およびシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ））；シアノバクテリア（Ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉａ）（たとえば、ロドバクター（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ）およびシネコシスティス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ））；酵母（たとえば、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、チゴサッカロミセス（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、クルイヴェロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、ハンセヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、デバリオミアセス（Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ）、ムコール（Ｍｕｃｏｒ）、ピッチア（Ｐｉｃｈｉａ）、およびトルロプシス（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ））；糸状菌（たとえば、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）およびアルトロボトリス（Ａｒｔｈｒｏｂｏｔｒｙｓ））；および藻類などがあるが、これらに限定されるものではない。当業者は、本発明が、昆虫、植物、および動物からの細胞の培養にも適合し得ることも理解するであろう。
【００６９】
酵素バイオ触媒をポリマーマトリクス（たとえば、アルギナート、カラギーナン、ポリビニルアルコール、またはポリアクリルアミドゲル（ＰＡＧ）粒子）中、あるいは可溶性または不溶性の支持体（たとえば、セライト）上に固定化して、バイオ触媒の回収および再使用を容易にすることができる。バイオ触媒をポリマーマトリクス中、あるいは可溶性または不溶性の支持体上に固定化する方法は、広く報告されており、当業者に周知である。
【００７０】
（培養条件）
微生物培養の維持および成長に適した材料および方法は、微生物学の技術者またはバイオ発酵科学技術者に周知である（非特許文献１２）。所望の機能的遺伝子発現に関する微生物の具体的な必要条件に応じて、適切な培地、ｐＨ、温度、および好気、微好気、または嫌気条件に関する要求事項に配慮しなければならない。
【００７１】
（培地および炭素基質）
大規模微生物増殖および機能的遺伝子発現は、広範囲の単純または複雑な炭水化物、有機酸およびアルコール類、および飽和炭化水素を使用することができる。本発明におけるバイオ発酵培地は、バイオ触媒の必要性に照らして、適当な炭素基質を含有しなければならない。適当な基質としては、単糖類（たとえば、グルコースおよびフルクトース）、二糖類（たとえば、ラクトースまたはスクロース）、オリゴ糖類および多糖類（たとえば、スターチまたはセルロースまたはこれらの混合物）、または再生可能なフィードストック（たとえば、乳清透過水、コーンスティープリカー、砂糖大根糖液、およびオオムギ麦芽）からの未精製混合物などがあるが、これらに限定されるものではない。炭素基質は、炭素１個の基質（たとえば、二酸化炭素、メタノール、またはメタン）であってもよい。
【００７２】
適切な炭素源に加えて、バイオ発酵培地は、適したミネラル類、塩類、補因子、緩衝剤、および当業者に周知の他の成分を含有しなければならない（非特許文献１３）。これらの補助物質は、バイオ触媒の成長に適さなければならず、またバイオ発酵生成物の生成に必要な酵素経路を促進しなければならない。本発明の場合、炭素源および上述の他の成分は、標的分子から分離してバイオ発酵容器に戻される。
【００７３】
最後に、工業的に有用な生成物を発現する機能的遺伝子は、特定の増殖条件（たとえば、窒素、リン、イオウ、酸素、炭素または小さい無機イオンを含む微量の微量栄養素の形態および量）によって制御、抑制、または抑制解除することが可能である。機能的遺伝子の制御は、培養に添加されるが一般に栄養源またはエネルギー源と考えられない特定の制御分子（たとえば、非代謝性誘導物質）の有無によって達成される可能性がある。成長速度も遺伝子発現における重要な成長因子であろう。
【００７４】
（実施例）
以下の実施例で、本発明をさらに明確にする。これらの実施例は、本発明の好ましい実施形態を示すが、例示の目的にすぎないことを理解すべきである。上記およびこれらの実施例から、当業者は、本発明の本質的な特徴を確認することができ、また本発明の精神および範囲から逸脱することなく、本発明の様々な変更および修飾を行い、本発明を様々な使用および条件に適合させることができる。
【００７５】
略語の意味は以下の通りである：「ｈ」は時間を意味し、「ｍｉｎ」は分を意味し、「ｓｅｃ」は秒を意味し、「ｄ」は日を意味し、「ｍｌ」はミリリットルを意味し、「ｌ」はリットルを意味し、「ｇ」はグラムを意味し、「ｋｇ」はキログラムを意味し、「ａｔｍ」は気圧を意味する。
【００７６】
（一般方法）
細菌培養の維持および増殖に適した材料および方法は、当該技術分野で周知である。以下の実施例で使用するのに適した技法は、（非特許文献１４）または（非特許文献１０）に記載の通りであってもよい。
【００７７】
実施例２は、マサチューセッツ州ケンブリッジの、アスペン・テクノロジー・インク（Ａｓｐｅｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．），Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡからのアスペンプラス（Ａｓｐｅｎｐｌｕｓ）（商標）ソフトウェア・リリース１０．１を使用した、定常状態プロセスコンピューターシミュレーションを示す。アスペンプラス（Ａｓｐｅｎｐｌｕｓ）（商標）は、プロセスクロマトグラフィ用の特別のユニット作用を具有しない。擬似移動床（ＳＭＢ）プロセスクロマトグラフは、逆流液−液抽出に通常使用されるＥＸＴＲＡＣＴブロックを使用してモデル化した。液相の１つとしてドデカンを使用して、固相をシミュレートした。例外が１つあるが、バッチクロマトグラフィ実験の結果に基づいて、表２に示す通りに液−液平衡定数を設定した。具体的には、水およびドデカンの液−液平衡定数を、それぞれ、任意の高値および定値に設定した。
【実施例１】
【００７８】
（比較例（培地再循環なし））
この実験は、培地再循環なしで容積生産性を比較するために実施した。
【００７９】
フェッドバッチバイオ発酵は、１，３−プロパンジオールを産生するための基質としてグルコースを使用して実施した。プラスミドｐＳＹＣＯ１０３で形質転換した大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）菌株ＲＪ８ｎを、バイオプロセスにおけるバイオ触媒として使用した。
【００８０】
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＲＪ８ｎ菌株（ＡＴＣＣＰＴＡ−４２１６）は、（ａ）各遺伝子が、その遺伝子を不活化する突然変異を有し、かつ（ｉ）グリセロールキナーゼをコードする遺伝子である、ｇｌｐＫ、（ｉｉ）グリセロールデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子である、ｇｌｄＡ、および（ｉｉｉ）トリオースリン酸イソメラーゼをコードする遺伝子である、ｔｐｉＡ、からなる、３つの内在遺伝子１セットと、（ｂ）３−ヒドロキシプロピオンアルデヒドを１，３−プロパンジオールに転換するのに十分な非特異的触媒活性をコードする、少なくとも１つの内在遺伝子とを含む。プラスミドｐＳＹＣＯ１０３（配列表の配列番号：１）は、下記の７つの外因性遺伝子１セットを含む：（ｉ）グリセロールデヒドラターゼをコードする３の遺伝子（Ｅ．Ｃ．４．２．１．３０）、（ｉｉ）デヒドラターゼ再活性化因子をコードする２遺伝子（特許文献５）（ｉｉｉ）グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼをコードする１遺伝子（ＥＣ  １．１．１．８）、および（ｉｖ）グリセロール−３−ホスファターゼをコードする１遺伝子（ＥＣ  ３．１．３．２１）。
【００８１】
当該技術分野で周知の成分および方法を使用して、１０リットル動作容積バイオ発酵槽を作製した。当該技術分野で周知の成分（たとえば、水、塩類、酵母抽出物）および方法を使用して、培地を調製した。当該技術分野で周知の方法を使用して、振盪フラスコ内で接種材料を調製した。
【００８２】
接種後、発酵を６８時間実施した。２時間毎にサンプルを分析し、１０ｇグルコース／リットルの照準点に基づいて、グルコース溶液給送速度を調節することにより、グルコース調節を遂行した。
【００８３】
発酵槽をいっぱいにしすぎるのを避けるに当たって、接種の４０時間後にブロス３．４４リットルをバイオ発酵槽から排出した。
【００８４】
発酵槽内の１，３−プロパンジオール力価を液体クロマトグラフィで測定し、その力価が、バイオ発酵槽内の液体中で生じたら生成されたであろう１，３−プロパンジオールの質量に、排出された液体体積を加算して算出することにより、バイオ発酵槽の容積生産性を算出した。
【００８５】
培地を高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）分析にかけることにより、１，３−プロパンジオールを直接同定することが可能である。本発明で好ましいのは、発酵培地をイオン減速分配クロマトグラフィ（ＩＭＰ）で分析する方法である。移動相として、０．０１Ｎ硫酸をアイソクラティック様式で使用した。実施例の全てで、３Ｇの濃度をＨＰＬＣで測定した。
【００８６】
ウォーターズ（Ｗａｔｅｒｓ）７１５オートサンプラー、ウォーターズ（Ｗａｔｅｒｓ）温度調節モジュール（設定温度５０°Ｃ）、ウォーターズ（Ｗａｔｅｒｓ）４１０屈折率検出器、およびウォーターズ（Ｗａｔｅｒｓ）４８６ＵＶ検出器（波長＝２１０ｎｍ）に、１，３−プロパンジオール定量化用ショデックス（Ｓｈｏｄｅｘ）ＨＰＬＣカラム（ＳＨ１０１１ショ糖カラム、３００ｍｍ×８ｍｍ）を備え付けた。移動相は、０．５ｍｌ／分アイソクラティック流の０．００５モル濃度の硫酸であった。ピバリン酸を内部標準として使用した。以上の条件で、１，３−プロパンジオールは２５．９分に溶離した。
【００８７】
最大容積生産性は、接種の４１．８５時間後に確認された、１５．８５ｋｇ／ｍ3／ｙｒであった。容積生産性は、生成された１，３−プロパンジオールの量（力価にブロスの全体積（発酵槽内および排出されたものの両者）を掛けた積）を、生成されたブロスの全体積で割り、さらに、接種からの時間に１８時間を加えた時間（バッチ間のターンアラウンドを考慮に入れるため）で割ることによって算出した。接種の４１．８５時間後に、１，３−プロパンジオール力価は１０８．２５ｇ／リットルであり、バイオ発酵槽内のブロス体積は６．１６８リットルであった。
【００８８】
（残存成分のバイオ発酵容器へのリターンのシミュレーション）
無触媒ブロスをバイオ発酵槽から抜き取り、分離システムからバイオ発酵槽に戻ってくるであろう流れ（補給培地）の組成に近づけた流れを発酵槽に加えることにより、１，３−プロパンジオール生産用バイオ発酵槽の運転に及ぼす本発明の効果をシミュレートした。
【００８９】
バイオ発酵槽、培地、および接種材料は、上記比較例の場合と同様に調製した。
【００９０】
（補給培地調製）
１）酵母抽出物を除いたこと、２）その他の全ての非水性成分の濃度を５０％低下させたこと、および３）１５ｇ／リットルのグリセロールおよび１０ｇ／リットルのグルコースを加えたこと以外は、通常のバイオ発酵槽培地レシピおよび方法を使用して、補給培地を調製した。培地への滅菌後添加、たとえば、抗生物質も、通常のレシピの５０％濃度で加えた。
【００９１】
（発酵）
接種の２４時間後に開始し、１リットル／分の全細胞ブロスをバイオ発酵容器から抜き取り、クロスフロー濾過ユニットを通過させた。クロスフロー濾過ユニットは、ペリコン（Ｐｅｌｌｉｃｏｎ）ＰＬＣシリーズ再生セルロース膜（ミリポア・コーポレーション（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）カタログ番号＃Ｐ２Ｃ０１ＭＶ０１）を含むペリコン−２ミニホルダー（Ｐｅｌｌｉｃｏｎ−２  Ｍｉｎｉ  Ｈｏｌｄｅｒ（ミリポア・コーポレーション（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）カタログ番号ＸＸ４２ＰＭＩＮＩ））で構成されていた。この膜は、０．１ｍ2の面積および１０００キロダルトンの名目分子量限界を有する。２０ｍｌ／分のバイオ触媒を含まない溶液をクロスフロー濾過ユニットから抜き取り、細胞物質およびブロスの残りをバイオ発酵容器に戻した。
【００９２】
バイオ触媒を含まない流れの抜き取り開始と同時に、１８．５ｍｌ／分の補給培地をバイオ発酵槽に給送した。発酵槽をいっぱいにしすぎるのを防止するために、接種の３８．２８時間後にバイオ発酵槽から３．２リットルの全細胞ブロスを排出し、接種の４６．８１時間後に２．６５リットルを排出した。
【００９３】
５２．８時間に、発酵槽内の力価は７５．７ｇ／リットルであり、バイオ発酵槽内のブロスの体積は８．３リットルであった。接種の５２．８時間後、クロスフロー濾過ユニットから抜き取られたバイオ触媒を含まない流れ中に、１，３−プロパンジオール２０１８ｇが回収された。ブロスの全体積は、８．３＋３．２＋２．６５＝１４．１５リットルであった。従って、生成された１，３−プロパンジオールの全量は、７５．７＊１４．１５＋２０１８＝３０８９ｇであると考えられた。接種の５２．８時間後の容積生産性は、２７ｋｇ／リットル／ｙｒであった。バイオ発酵容器内の阻害する標的分子の濃度が低下したため、生成物形成速度が７０％上昇した。
【実施例２】
【００９４】
（培地再循環を用いたアスペンプラス（Ａｓｐｅｎｐｌｕｓ）（商標）コンピューターシミュレーション）
この実施例では、シミュレーションに存在する化合物の既知の物理的性質に基づいて、質量流量を予測するために、定常状態コンピューターシミュレーションを実施した。
【００９５】
細胞分離工程、水除去工程およびＳＭＢプロセスクロマトグラフをモデル化するために、アスペンプラス（Ａｓｐｅｎｐｌｕｓ）（商標）シミュレーションを構築した。バイオ発酵ブロス給送質量組成は、１，３−プロパンジオール（標的分子）９．６０６％、乾燥細胞４．７３％、グルコース０．４８％、グリセロール０．９６１％、酢酸０．０４８％、リン酸カリウム０．１６９％、およびバランス水を含むと推測された。バイオ発酵ブロスの細胞分離工程は、上澄液の５％をバイオ触媒を含まない溶液として除去し、細胞および上澄の残りをバイオ発酵容器に戻した。このバイオ触媒を含まない溶液を、約０．１９６ａｔｍで作動するプロセス−プロセス熱交換器に給送する。熱交換器を出る液体および蒸気を分離する。この液体は、プロセスクロマトグラフの主要フィードである。交換器を出る蒸気は大部分が水であり、約０．２５６２ａｔｍに圧縮されて、プロセス−プロセス熱交換器の反対側に給送され、ここで蒸気が凝縮される。この凝縮液は、ＳＭＢプロセスクロマトグラフ用溶離剤の主成分として使用される。溶離剤のバランスは、プロセスクロマトグラフを出る生成物流れから分離される水である。
【００９６】
プロセスクロマトグラフを、新鮮な吸着剤がプレート１に給送され、溶離剤がプレート５０に給送される理論段５０のＳＭＢとしてモデル化した。液体給送は、プレート１２上であり、標的分子流れは、プレート３７から抜き取られた。プレート３７から抜き取られる標的分子に富む流れの水を有機物と分離し、プロセス−プロセス熱交換器からの凝縮物と合併して、プロセスクロマトグラフ用溶離剤を構成した。プレート１でクロマトグラフを出る液体は、バイオ触媒を含まず、かつ標的−分子を含まない溶液である。これを細胞分離工程からの細胞および液体と合併し、次いで、培地再循環のため、バイオ発酵容器に戻す。選択された流れに関する結果を表３に示す。
【００９７】
【表２】
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【００９８】
【表３】
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【００９９】
(比較例)
（培地再循環を使用しないアスペンプラス（Ａｓｐｅｎｐｌｕｓ）（商標）コンピューターシミュレーション）
この実施例では、実施例２の通りに、定常状態コンピューターシミュレーションを実施したが、培地再循環はなかった。実施例２で、１，３−プロパンジオールがバイオ発酵容器から除去される正味の速度は０．４５５ｋｇ／秒である。バイオ発酵容器から、同じ正味の１，３−プロパンジオールを除去するが、新鮮な（非再循環）培地を加えることにより、バイオ触媒を含まない溶液中のブロス成分（１，３−プロパンジオール以外）が、同一速度で、バイオ発酵槽内に補給されるのをシミュレートするために、シミュレーションを構築した。
【０１００】
細胞分離工程をモデル化するために、アスペンプラス（Ａｓｐｅｎｐｌｕｓ）（商標）シミュレーションを構築した。バイオ発酵ブロス給送質量組成は、１，３−プロパンジオール（標的分子）９．６０６％、乾燥細胞４．７３％、グルコース０．４８％、グリセロール０．９６１％、酢酸０．０４８％、リン酸カリウム０．１６９％、およびバランス水を含有すると推測された。バイオ発酵ブロスの細胞分離工程は、４．５１２ｋｇ／秒の上澄液を、バイオ触媒を含まない溶液として除去し、細胞および上澄の残りをバイオ発酵容器に戻した。このバイオ触媒を含まない溶液流れは、０．４５５ｋｇ／秒の１，３−プロパンジオールおよび４．０５７ｋｇ／秒の、１，３−プロパンジオール以外のブロス成分を含有する。従って、バイオ発酵容器内の他のブロス成分の濃度を維持するためには、４．０５７ｋｇ／秒（または３５０，５２５ｋｇ／日）の速度で、新鮮な培地をバイオ発酵容器に加えることが必要であろう。
【図面の簡単な説明】
【０１０１】
【図１】標的分子回収およびバイオ触媒を含まずかつ標的分子を含まない溶液のバイオ発酵容器への再循環を可能にする要素の好ましい配置を示す工程流れ線図である。
【図２】水除去工程で使用される温度で、標的分子が水より高い蒸気圧を有するとき、生成物を除去するための代替実施形態における、本発明を示す工程流れ線図である。
【図１】
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【図２】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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