(57)【要約】ステロイド生体異物受容体（ＳＸＲ）と名付けた新しい核受容体、すなわち核受容体大グループの新しい枝グループである特異性の広いセンシング受容体が発見された。ＳＸＲはＲＸＲと共にヘテロダイマーを形成し、治療用のステロイドや食事中のステロイドおよび脂質を含めた生物学的活性を有する何百種類もの天然型および合成型の物質に反応して、ステロイドにより誘導されるチトクロームＰ４５０遺伝子中に存在する反応因子と結合しその転写を誘導する。発明のＳＸＲ受容体は、何百種類もの受容体ではなく誘導する物質それぞれについて、誘導物質の全体的な量を監視し、調節された代謝経路における代謝酵素の産生の引き金を引く。ＳＸＲの作動薬および拮抗薬を患者に投与することにより、１種類以上の内因性ステロイドあるいは生体異物の代謝調節に応じてホメオスタシスを確立し、治療上の各種の目的を達成することが可能である。患者に対して治療用量を投与した場合に薬物相互作用を起こす可能性のあるステロイド剤を特定するためのアッセイを提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
受容体のポリペプチド、または機能を有するその断片であって、
レチノイドＸ受容体（ＲＸＲ）と共にヘテロダイマーを形成すること、
半分の部位のＡＧＴＴＣＡに基づく直接の、あるいは反転した反復反応因子モチーフに結合すること、
各種の天然型および合成型ステロイドホルモンに反応してステロイド誘導性Ｐ４５０遺伝子中に見られる反応因子を通じて転写を活性化すること、および
主に肝臓および腸において発現されること、
を特徴とする上記ポリペプチド。
【請求項２】
当該ポリペプチドがさらに９個のＣｙｓ残基を含む約６７個のアミノ酸から成るＤＮＡ結合領域を有するという特徴をもつ請求項１に記載のポリペプチドであって、当該ＤＮＡ結合領域はゼノパス（Ｘｅｎｏｐｕｓ）の安息香酸Ｘ受容体のＤＮＡ結合領域と約７３％のアミノ酸相同性をもつ上記ペプチド。
【請求項３】
当該ポリペプチドがさらに約１９８個のアミノ酸から成るリガンド結合領域を有するという特徴をもつ請求項２に記載のポリペプチドであって、当該リガンド結合部位はゼノパス（Ｘｅｎｏｐｕｓ）の安息香酸Ｘ受容体のリガンド結合領域と約５２％のアミノ酸相同性をもつ上記ペプチド。
【請求項４】
当該ポリペプチドが配列番号２に記載したアミノ酸配列とほぼ同一の配列を有する請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項５】
当該ポリペプチドが配列番号２に記載したアミノ酸配列と同一の配列を有する請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項６】
ＲＸＲおよびＳＸＲから成るヘテロダイマー複合体。
【請求項７】
請求項１に記載のポリペプチドをコードする分離核酸。
【請求項８】
当該核酸が配列番号２に記載したアミノ酸配列とほぼ同一の配列をコードする請求項７に記載の核酸。
【請求項９】
当該核酸が配列番号２に記載したアミノ酸配列と同一の配列をコードする請求項７に記載の核酸。
【請求項１０】
配列番号１に記載したヌクレオチド５８３番から１８８４番とほぼ同一の隣接したヌクレオチド配列をもつ画分を含む請求項７に記載の核酸。
【請求項１１】
配列番号１に記載したヌクレオチド５８３番〜１８８４番と同一の隣接したヌクレオチド配列をもつ画分を含む請求項７に記載の核酸。
【請求項１２】
配列番号１に記載したＤＮＡまたはその相補配列のうち１番〜２０６８番までから任意に選択した２０個以上の隣接塩基とほぼ同一の配列をもつ最低２０個の隣接塩基から構成される、ラベルした一本鎖核酸。
【請求項１３】
３２Ｐでラベルした請求項１２に記載の核酸。
【請求項１４】
配列番号１に記載したＤＮＡまたはその相補配列のうち５８３番〜１８８４番までから任意に選択した２０個以上の隣接塩基とほぼ同一の配列をもつ最低２０個の隣接塩基から構成される、請求項１２に記載の核酸。
【請求項１５】
（ｉ）機能的に結合した請求項７に記載の核酸
（ｉｉ）動物の培養細胞において当該核酸配列の転写および当該ポリペプチドの発現に作用する調節因子
からなる分離核酸構築物。
【請求項１６】
請求項１５に記載の核酸構築物によって形質転換される動物の培養細胞。
【請求項１７】
当該細胞がさらに
（ａ）当該細胞中で作用するプロモーター
（ｂ）ホルモン反応因子、および
（ｃ）リポーター蛋白質をコードするＤＮＡ
を含有するリポーターベクターによって形質転換される請求項１６に記載の細胞であって、当該リポーター蛋白質をコードするＤＮＡは、当該ＤＮＡの転写のために当該プロモーターに機能的に結合しており、
当該プロモーターは当該ホルモン反応因子の活性化のために当該ホルモン反応因子に機能的に結合している上記細胞。
【請求項１８】
請求項１に記載の受容体ポリペプチドに特異的に結合する抗体。
【請求項１９】
当該抗体がモノクローナル抗体である請求項１８に記載の抗体。
【請求項２０】
請求項１に記載の受容体ポリペプチドを作成するための方法であって、当該ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を発現させるために当該細胞中で作用する発現ベクターを含有する細胞を培養することからなる上記方法。
【請求項２１】
受容体ポリペプチドまたは機能を有するその断片を特定するための方法であって、当該ポリペプチドが
レチノイドＸ受容体（ＲＸＲ）と共にヘテロダイマーを形成すること、
半分の部位のＡＧＴＴＣＡに基づく直接の、あるいは反転した反復反応因子モチーフに結合すること、
各種の天然型および合成型ステロイドホルモンに反応してステロイド誘導性Ｐ４５０遺伝子中に見られる反応因子を通じて転写を活性化すること、および
主に肝臓および腸において発現されること、
を特徴とする方法であって、
緊縮性の高い条件下でＤＮＡ検体を請求項１４に記載のプローブとハイブリダイズさせ、当該プローブとハイブリダイズする配列を選択することからなる上記方法。
【請求項２２】
ＳＸＲに結合する物質を特定するために一連の物質をスクリーニングするための方法であって、当該方法が結合アッセイの中で請求項１に記載の受容体を使用することからなる上記方法。
【請求項２３】
ある物質が請求項１に記載の受容体ポリペプチドの転写促進作用を調節し得るかどうか判定するための方法であって、当該方法は当該受容体ポリペプチドおよびリポーターベクターを含有する細胞と当該物質とを接触させることによりリポーター蛋白質の有無を調べることからなり、
当該リポーターベクターは
（ａ）当該細胞中で作用するプロモーター
（ｂ）ホルモン反応因子、および
（ｃ）リポーター蛋白質をコードするＤＮＡ、
からなることを特徴とし、
当該リポーター蛋白質をコードするＤＮＡは、当該ＤＮＡの転写のために当該プロモーターに機能的に結合しており、
当該プロモーターは当該ホルモン反応因子の活性化のために当該ホルモン反応因子に機能的に結合していることを特徴とする上記方法。
【請求項２４】
ステロイドＸ受容体（ＳＸＲ）の作動薬であるが他のステロイド受容体を促進したり拮抗したりすることのない物質を特定するための方法であって、
第１のアッセイ系においてＳＸＲおよびリポーターベクターを含有する細胞を当該物質と接触させることによりリポーター蛋白質の有無を検出すること、
ただし、当該リポーターベクターは
（ａ）当該細胞中で作用するプロモーター
（ｂ）ＳＸＲ反応因子、および
（ｃ）リポーター蛋白質をコードするＤＮＡ
からなることを特徴とし、
当該リポーター蛋白質をコードするＤＮＡは、当該ＤＮＡの転写のために当該プロモーターに機能的に結合しており、
当該プロモーターは当該ＳＸＲ反応因子の活性化のために当該ＳＸＲ反応因子に機能的に結合しており、
第２のアッセイ系においてＳＸＲ以外のステロイドホルモン受容体およびリポーターベクターを含有する細胞を当該物質と接触させることによりリポーター蛋白質の有無を検出すること、
ただし、当該リポーターベクターは
（ａ）当該細胞中で作用するプロモーター
（ｂ）ＳＸＲ以外の当該受容体のための反応因子、および
（ｃ）リポーター蛋白質をコードするＤＮＡ
からなることを特徴とし、
当該リポーター蛋白質をコードするＤＮＡは、当該ＤＮＡの転写のために当該プロモーターに機能的に結合しており、
当該プロモーターはＳＸＲ以外の当該受容体のための反応因子の活性化のために当該反応因子に機能的に結合しており、
当該第１アッセイにおいてリポーターの産生を誘導するが当該第２アッセイにおいては誘導しない物質を、ステロイドＸ受容体（ＳＸＲ）の作動薬であるが他のステロイド受容体の作動薬でも拮抗薬でもない物質として特定すること、
からなる上記方法。
【請求項２５】
請求項１に記載の受容体ポリペプチドにより媒介される過程を調節するための方法であって、当該方法が少なくとも１種類の作動薬、拮抗薬あるいは当該ポリペプチドに対して作成した抗体の存在下で当該過程を実施することからなる上記方法。
【請求項２６】
ステロイド分解酵素の発現を誘導するための方法であって、ＳＸＲの活性化を含む上記方法。
【請求項２７】
ステロイドを必要としている被験者において１種類以上の生体異物性ステロイドおよび／または生体異物性物質の代謝を調節するための方法であって、ステロイドの調節物質の有効量と、ステロイドおよび生体異物受容体（ＳＸＲ）反応因子に機能的に関連している内因性遺伝子の転写を促進する生体異物受容体（ＳＸＲ）ポリペプチドとを被験者に投与することからなる上記方法。
【請求項２８】
調節物質が作動薬である請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
調節物質が拮抗薬である請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
遺伝子がチトクロームＰ４５０グループのうちの１つをコードする請求項２７に記載の方法。
【請求項３１】
ステロイドおよび／または生体異物性物質を植物性エストロゲンおよびカルシウムチャンネル拮抗薬から成るグループから選択する請求項２７に記載の方法。
【請求項３２】
疾患のために１種類以上の治療用ステロイドおよび／または生体異物性物質の投与を受けている被験者におけるステロイド中毒を防止するための方法であって、ＳＸＲ反応因子と機能的に関連する内因性遺伝子の転写を促進するために被験者の全身ステロイド量を生理学的に許容し得る値まで低下させるのに有効な量のＳＸＲポリペプチド作動薬を被験者に投与することからなる上記方法。
【請求項３３】
遺伝子がチトクロームＰ４５０グループのうちの１つをコードする請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
治療用の物質がステロイドである請求項３２に記載の方法。
【請求項３５】
疾患が結核である請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
治療用の物質がリファンピン、またはその活性誘導体あるいは類似体である請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
疾患が乳癌である請求項３４に記載の方法。
【請求項３８】
治療用の物質がタモキシフェン、ラロキシフェン、またはその誘導体あるいは類似体である請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
疾患が骨粗しょう症である請求項３４に記載の方法。
【請求項４０】
治療用の物質がビタミンＫである請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
治療用の物質がプロプラノロールである請求項４１に記載の方法。
【請求項４２】
治療用の物質がカルシウムチャンネル拮抗薬である請求項３２に記載の方法。
【請求項４３】
カルシウムチャンネル拮抗薬がニフェジピンである請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
治療用のステロイドまたは生体異物性物質を必要とする被験者からのそれらのクリアランスを遅くするための方法であって、ＳＸＲ反応因子に機能的に関連している内因性遺伝子の転写を促進するＳＸＲ受容体ポリペプチドの拮抗薬の有効量を被験者に投与することからなる上記方法。
【請求項４５】
被験物質またはその併用によってステロイドおよび生体異物の受容体（ＳＸＲ）ポリペプチドが活性化されるかどうか検討するためのスクリーニングアッセイ方法であって、
（ａ）適切な培地中で、ＳＸＲポリペプチドおよびリポーターベクターを含有する宿主細胞系と１種類以上の被験物質とを接触させること、
ただし、リポーターベクターは
１）細胞中で機能し得るプロモーター
２）ＳＸＲ反応因子、および
３）ＤＮＡの転写のためのプロモーターに機能的に結合したリポーター蛋白質をコードするＤＮＡ
からなることを特徴とし、
プロモーターはその活性化のためのＳＸＲ反応因子に機能的に結合しており、
（ｂ）リポーター蛋白質の有無について調べること、
からなり、
リポーター蛋白質が存在するということは被験物質がＳＸＲ受容体ポリペプチドを活性化することを意味し、リポーター蛋白質が存在しないということは被験物質がＳＸＲ受容体ポリペプチドを活性化しないことを意味することを特徴とする上記アッセイ方法。
【請求項４６】
アッセイ方法においてリポーター物質が発現されるということから、被験者に対して被験物質を治療用量で投与することにより被験者の体内で被験物質と他のステロイドおよび／または生態異物性物質との間の薬物相互作用が起こるということが３０％以上の可能性をもって示されることを特徴とする請求項４５に記載のアッセイ方法。
【請求項４７】
被験物質が治療用ステロイドの組み合わせであり、リポーター物質の発現レベルがこの組み合わせを被験者に対して同時投与した場合に予想される治療用物質間の薬物相互作用のレベルを表すものであることを特徴とする請求項４５に記載のアッセイ方法。
【請求項４８】
疾患の治療が必要な被験者において疾患を治療するための方法であって、被験者の体内で内因性ＳＸＲポリペプチドの転写を調節するステロイドおよび／または生体異物性物質の有効量を被験者に投与することからなる上記方法。
【請求項４９】
物質がＳＸＲポリペプチドの作動薬であり、内因性ステロイドの量がホメオスタシスの状態よりも高いのが疾患の特徴である請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
疾患がクッシング症候群、女性における男性化および多毛症、多嚢胞性卵巣症候群、２１−ヒドロキシラーゼ欠乏症、１１β−ヒドロキシラーゼ欠乏症、３β−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ欠乏症、１７−ヒドロキシラーゼ欠乏症、そして乳癌、結腸直腸癌および前立腺癌から成るグループから選択される請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
物質がＳＸＲポリペプチドの拮抗薬であり、内因性ステロイドの量がホメオスタシスの状態よりも低いのが疾患の特徴である請求項４８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（技術分野）
この発明は、細胞内受容体、それをコードする核酸、およびその利用法に関するものである。特に、この発明はステロイドおよび／または生体異物性物質の量の上昇に対する生理学的な反応を調節するための方法に関するものである。
【０００２】
（背景技術）
核の受容体は、リガンド依存性、および配列特異的な転写因子の大スーパーファミリーを構成している。このグループに属する因子は、標的遺伝子のプロモーターへの特異的な結合を通じて直接（Ｅｖａｎｓ、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０：８８９−８９５（１９８８年）参照）、あるいは他の転写因子との蛋白質−蛋白質相互作用を通じて間接的に（例えば、Ｊｏｎａｔら、Ｃｅｌｌ ６２：１１８９−１２０４（１９９０年）、Ｓｃｈｕｅｌｅら、Ｃｅｌｌ ６２：１２１７−１２２６（１９９０年）、およびＹａｎｇ−Ｙｅｎら、Ｃｅｌｌ ６２：１２０５−１２１５（１９９０年）を参照）、のどちらかによって転写に影響を及ぼす。核受容体のスーパーファミリー（本分野では「ステロイド／甲状腺ホルモン受容体スーパーファミリー」としても知られている）には、コルチゾル、アルドステロン、エストロゲン、プロゲステロン、テストステロン、ビタミンＤ３、甲状腺ホルモンおよびレチン酸を含む各種の疎水性リガンドの受容体、さらにリガンドが不明である「オーファン受容体」と名付けられたいくつかの受容体様分子が含まれる（上記Ｅｖａｎｓ、１９８８年、参照）。これらの受容体はすべて、祖先の１つの原型から分岐したことを示唆する共通の構造をもっている。
【０００３】
ステロイド類、レチン酸、甲状腺ホルモン、およびビタミンＤ３のような脂肪親和性ホルモンは、広い意味での動物の成長、発達、および成体臓器の生理をコントロールする。これらのホルモンの作用は、リガンド依存性および配列特異的な転写因子として機能する細胞内受容体の大スーパーファミリーにより媒介される。甲状腺ホルモン（ＴＲ）、ビタミンＤ３（ＶＤＲ）、オールトランスレチン酸（ＲＡＲ）、および脂肪酸とエイコサノイド（ＰＰＡＲ）の非ステロイド核受容体は、ＡＧＴＴＣＡ配列に関連する直接反復半分部位から構成される２つの部分に分かれたホルモン反応因子（ＨＲＥ）に結合する９−シスレチン酸受容体（ＲＸＲ）と共にヘテロダイマーを形成する（Ｍａｎｇｅｌｓｄｏｒｆ および Ｅｖａｎｓ、Ｃｅｌｌ ８３：８４１−８５０、１９９５年を参照）。これに対して、ステロイド受容体はホモダイマーとして機能し、３個のヌクレオチドによって区切られるパリンドローム標的配列に結合する（Ｂｅａｔｏら、Ｃｅｌｌ ８３：８５１−８５７、１９９５年）。既知の受容体に加えて、明白なＤＮＡおよびリガンド結合領域をもつが特定のリガンドをもたない、構造的に関連した「オーファン」核受容体の大グループがあることも報告されている（Ｍａｎｇｅｌｓｄｏｒｆら、Ｃｅｌｌ ８３：８３５−８３９、１９９５年；Ｅｎｍａｒｋ および Ｇｕｓｔａｆｓｓｏｎ、Ｍｏｌ． Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ． １０：１２９３（１９９６年）；およびＯ’Ｍａｌｌｅｙ および Ｃｏｎｎｅｅｌｙ、Ｍｏｌ． Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ． ６：１３５９（１９９２年）を参照）。それぞれが、別個の内分泌シグナル伝達経路を制御する可能性をもっている。
【０００４】
ホルモンの反応は、内分泌腺からリガンドが遊離され、それが血液中を循環し、特異的な核受容体を通じて作用することにより標的組織中での反応を調和的に制御する結果である、と一般に考えられている。ホルモン反応性は、刺激が不在となった状態で標的組織が平常状態に戻れるよう、リガンドを血中および体内からいかに迅速に排泄し得るかどうかによって決まる。このように、ホルモンのホメオスタシスが維持されるためには、生物学的活性を有するホルモン類の調和のとれた遊離と分解が必要である。ステロイドホルモン類とその多くの代謝産物は、主に肝臓における還元と酸化によって不活化される。副腎ステロイドとして何百種類もが特定されている（例えば、性ステロイド（アンドロゲン、エストロゲンおよびプロゲスチン）それぞれが数十種類ずつ、ビタミンＤ代謝産物が２５〜３５種類、そして脂肪酸、エイコサノイド、ヒドロキシ脂肪および生物学的活性を有する関連脂質がおそらく数百種類）ため、生理学的なホメオスタシスのためにはリガンドの効率の良い消失という問題が非常に重要である。莫大な数存在する内因性のホルモンだけでなく、摂取した植物および動物由来のステロイドや生物学的活性を有する生体異物性物質も分解される必要がある。
【０００５】
Ｓｅｌｙｅは、外因性のステロイドおよび薬理活性を有する物質は以後の有毒な生体異物性物質への曝露を防ぐことになる酵素の発現を調節することによって機能するのではないか、との概念を最初に導入した（Ｈ．Ｓｅｌｙｅ、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ． ６０：１−２８、１９７１年）。Ｓｅｌｙｅが「カタトキシックステロイド」と呼んだこれらの物質の代表的なものは、合成グルココルチコイド拮抗薬、プレグネノロン−１６−カルボニトリル（ＰＣＮ）である。ＰＣＮ、および各種の生体異物ステロイド類は、肝臓の小胞体の増殖とチトクロームＰ４５０遺伝子の発現とを誘発する（Ｂｕｒｇｅｒら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）８９：２１４５−２１４９、１９９２年；Ｇｏｎｚａｌｅｚら、Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ．６：２９６９−２９７６、１９８６年；およびＳｃｈｕｅｔｚ および Ｇｕｚｅｌｉａｎ、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２５９：２００７−２０１２、１９８４年）。ＰＣＮを投与することによって起こる１つの結果は、ジゴキシン−インドメタシン、バルビツレート、およびステロイドのような各種生体異物への以後の曝露に対する非特異的な「防御」が誘発されることである（上記Ｓｅｌｙｅ、１９７１年）。
【０００６】
さらに、このような各種の物質は、自身の解毒または分解を担うＰ４５０遺伝子を活性化し得ることが知られている（Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ−Ｓａｌｇｕｅｒｏ および Ｇｏｎｚａｌｅｚ、Ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｅｔｉｃｓ ５：Ｓ１２３−１２８、１９９５年；Ｄｅｎｉｓｏｎ および Ｗｈｉｔｌｏｃｋ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２７０：１８１７５−１８１７８、１９９５年；Ｏ．Ｈａｎｋｉｎｓｏｎ、Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． Ｔｏｘｉｃｏｌ． ３５：３０７−３４０、１９９５年； Ｒｅｎｄｉｃ ａｎｄ Ｄｉ Ｃａｒｌｏ、Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂ． Ｒｅｖ． ２９：４１３−５８０、１９９７年）。
【０００７】
これらのカタトキシックな物質はチトクロームＰ４５０およびその他の解毒酵素の発現を調節すると考えられるが、このような調節は古典的なステロイド受容体に依存しないことを示す２つの証拠が得られている。第１の証拠は、最も作用の強力な物質の多く（例えば、ＰＣＮ、スピロノラクトン、および酢酸シプロテロン）がステロイド受容体拮抗薬であることが示されている一方、他の物質（例えば、デキサメタゾン）はステロイド受容体作動薬である、という点である（上記Ｂｕｒｇｅｒ、１９９２年）。第２の証拠は、両側の副腎を摘出した後にも（そしておそらく副腎ステロイド不在下でも）非特異的な防御反応は残存するが、肝臓の部分摘出を行った後には残存しない、という点である（上記Ｓｅｌｙｅ、１９７１年）。
【０００８】
ＰＣＮがＰ４５０グループのモノオキシゲナーゼの中の密接に関連する２つの酵素であるＣＹＰ３Ａ１とＣＹＰ３Ａ２の発現を誘導することが確認されたことにより、ＰＣＮがそのカタトキシック作用を発揮する機序について解明することができる（例えば、Ｅｌｓｈｏｕｒｂａｇｙ および Ｇｕｚｅｌｉａｎ、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２５５：１２７９（１９８０年）；Ｈｅｕｍａｎら、Ｍｏｌ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． ２１：７５３（１９８２年）；Ｈａｒｄｗｉｃｋら、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２５８：１０１８２（１９８３年）；Ｓｃｈｅｕｔｚ ａｎｄ Ｇｕｚｅｌｉａｎ、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２５９：２００７（１９８４年）；Ｓｃｈｅｕｔｚら、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２５９：１９９９（１９８４年）；Ｇｏｎｚａｌｅｚら、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６０：７４３５（１９８５年）を参照）。ＣＹＰ３Ａ血液蛋白は幅広い基質特異性を示し、種々の生体異物（例えばシクロスポリン、ワーファリンおよびエリスロマイシン）や内因性のステロイド類（例えば、コルチゾル、プロゲステロン、テストステロンおよびＤＨＥＡ−硫酸塩。例としてＮｅｂｅｒｔ および Ｇｏｎｚａｌｅｚ、Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ５６：９４５（１９８７年）およびＪｕｃｈａｕ、Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ． ４７：２３８５（１９９０年）を参照）を水酸化する。クローニングしたＣＹＰ３Ａ１遺伝子プロモーターにおける以後の研究から、ＰＣＮ反応因子（ＣＹＰ３Ａ２遺伝子プロモーター中に高率で保存されている）が特定された（Ｍｉｙａｔａら、Ａｒｃｈｉｖｅｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ ３１８：７１（１９９５年）およびＱｕａｔｔｒｏｃｈｉら、Ｊ．Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７０：２８９１７（１９９５年）を参照）。この反応因子は核受容体の半分部位一致配列ＡＧＴＴＣＡの２つのコピーの直接反復を含有する。
【０００９】
ＰＣＮは、ＣＹＰ３Ａ遺伝子の発現を誘導するだけでなく、肝臓コレステロールのホメオスタシスに対して顕著な影響を及ぼすことも示されている。このような影響の中には、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素およびコレステロール７ａ−水酸化酵素の遺伝子発現のレベルを顕著に低下させる作用が含まれ、それに関連してステロールの生合成および胆汁酸も低下する。ＰＣＮはまた、コレステロールエステルの生成と胆汁中へのコレステロールの過剰分泌を促進することが報告されている。このように、ＰＣＮはコレステロールの生合成、貯蔵および分泌を含めたその代謝の重要な局面に影響を及ぼす。
【００１０】
カタトキシックステロイドによってオーファン核受容体が活性化されることから、既知のステロイド受容体を活性化しない物質によって生体異物代謝酵素が誘導される機序に関する仮説が得られる。これらの酵素は（薬理学的に）高い用量の生体異物および天然型のステロイドによって活性化されるため、このような「センサー」が特異性が広く、親和性の低い受容体となると推測される。このような受容体は、内因性のステロイド類および代謝産物だけでなくフィトステロイド、生体異物および薬理学的インデューサーのような外因性の物質によっても活性化される。事実、これらの物質の多くが、その解毒あるいは分解を担うＰ４５０遺伝子を活性化し得ることが知られている（例として、Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ−Ｓａｌｇｕｅｒｏ および Ｇｏｎｚａｌｅｚ、Ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｅｔｉｃｓ ５：Ｓ１２３（１９９５年）；Ｄｅｎｉｓｏｎ および Ｗｈｉｔｌｏｃｋ， Ｊｒ． Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７０：１８１７５（１９９５年）；Ｈａｎｋｉｎｓｏｎ、Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． Ｔｏｘｉｃｏｌ． ３５：３０７（１９９５年）；Ｒｅｎｄｉｃ および Ｄｉ Ｃａｒｌｏ、Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂ． Ｒｅｖ． ２９：４１３（１９９７年）を参照）。
【００１１】
正常な個体においてはステロイドのレベルが厳密に制御されており、内因性ステロイドの異化作用が上昇すると、下垂体がＡＣＴＨを遊離して増加させ、ステロイドの生合成を促進し血漿中ステロイド濃度を維持することによってそれを相殺する。異化作用の上昇は、ステロイド代謝産物の尿中排泄量の増加により反映される。事実、リファンピシンを投与することによって６β−ヒドロキシコルチゾル（Ｏｈｎｈａｕｓら、Ｅｕｒ． Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． ３６：３９−４６、１９８９年；およびＷａｔｋｉｎｓら、Ｊ． Ｃｌｉｎ， Ｉｎｖｅｓｔ．、８３：６８８−６９７、１９８９年）のような尿中代謝産物や、６β−ヒドロキシヒオコール酸および６α−ヒオデオキシコール酸（Ｗｉｅｔｈｏｌｔｚら、Ｊ． Ｈｅｐａｔｏｌ．、２４：７１３−７１８、１９９６年）のような胆汁酸中代謝産物が増加するが、多くの循環ステロイドの血漿中濃度は合成の増加によって若干上昇することが既に知られている（Ｌｏｎｎｉｎｇら、Ｊ． Ｓｔｅｒｏｉｄ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ３３：６３１−６３５、１９８９年；Ｂａｍｍｅｌら、Ｅｕｒ． Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．、４２：６４１−６４４、１９９２年； Ｅｄｗａｒｄｓら、Ｌａｎｃｅｔ ２：５４８−５５１、１９７４年）。
【００１２】
プレドニゾロン（ＭｃＡｌｌｉｓｔｅｒら、Ｂｒ． Ｍｅｄ． Ｊ． ２８６：９２３−９２５、１９８３年；Ｌｅｅら、Ｅｕｒ． Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｐｈａｒｍａｃｏ．、４５：２８７−２８９、１９９３年）あるいは１７α−エチニルエストラジオール（Ｆ．Ｐ．Ｇｕｅｎｇｅｒｉｃｈ、Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ．、４７：１９８１−１９８８、１９９０年）のような合成ステロイド剤をリファンピシンと同時に投与すると、尿中排泄が促進されるため、血漿中量が速やかに低下する。結核のためにリファンピシン療法を受けている患者の中には、尿中のステロイド量が増加するためクッシング症候群と誤診される者もいる（Ｋｙｒｉａｚｏｐｏｕｌｏｕ および Ｖａｇｅｎａｋｉｓ、Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ． Ｍｅｔａｂ．、７５：３１５−３１７、１９９２年；Ｚａｗａｗｉら、Ｉｒ． Ｊ． Ｍｅｄ． Ｓｃｉ．、１６５：３００−３０２、１９９６年； Ｔｅｒｚｏｌｏら、Ｈｏｒｍ． Ｍｅｔａｂ． Ｒｅｓ．、２７：１４８−１５０、１９９５年）。このような患者では、リファンピシンを中止することによってステロイドの産生量およびクリアランスが正常化した。アジソン病の患者は副腎ステロイドを合成する能力をほとんど持っておらず、リファンピシンを投与することによって内因生および投与したステロイド剤が急速に消失する。このような臨床状態に関する証拠から、ＣＹＰ３Ａ４を誘導することによりステロイドの異化作用が増加することが確認される（Ｋｙｒｉａｚｏｐｏｕｌｏｕら、Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ． Ｍｅｔａｂ． ５９：１２０４−１２０６、１９８４年；上記Ｅｄｗａｒｄｓ、１９７４年）。しかし、体内でステロイドの代謝が調節される機序に関しては、まだ不明である。
【００１３】
治療のために投与するステロイド剤は、治療上の目的を達成する上で有益であるが、これらの物質は場合によってはそれを投与した被験者におけるステロイドおよび生体異物の全身レベルを生理学的に適正なレベル以上に上昇させることがある。言い換えると、ステロイドおよび／または生体異物が治療上必要とされる以上に体内に残留する可能性がある、ということである。また、被験者によっては、異なる病状を治療するためにステロイド剤と生体異物とを別々に同時投与される場合があるが、併用することによって薬物相互作用として知られる相加作用、あるいは相乗作用さえもが出現する。このような場合、ステロイド剤および生体異物が生理学的に不適正なレベルに到達しても、あるいは別々に投与した薬剤の相互作用のために通常なら治療上有益な量であるステロイドが危険性を有することになってしまっても、患者は気が付かない可能性がある。
【００１４】
したがって、本分野において、特にステロイド剤と生体異物を同時投与することによってホメオスタシスが崩壊したり薬物相互作用を引き起こしたりする場合には、このような物質の生理学的作用の媒介に関与する、特異性が広く親和性の低い受容体を特定し特徴解析する必要がある。
【００１５】
（発明の要約）
この発明に基づき、我々はステロイドおよび生体異物受容体（ＳＸＲ）と名付けた新しい種類のヒトオーファン核受容体の例を分離し、特徴解析を行った。ＳＸＲはほとんど、生体異物およびステロイドの異化が行われる主要部位である肝臓においてのみ発現されている。古典的なステロイド受容体とは異なり、ＳＸＲはＲＸＲとヘテロダイマーを形成し、半分部位に関連する直接反復配列ＡＧＴＴＣＡに結合する。ＳＸＲは、ＰＣＮのような拮抗薬や生体異物性薬剤、およびフィトエストロゲンのような生物学的活性を有する健康食品を含めた各種多数の天然型および合成型のステロイドホルモンに反応して、ステロイド誘導性Ｐ４５０遺伝子のいくつかにおいて見られる反応因子を通じて転写を促進する作用をもつ。ＳＸＲがこのように様々なステロイドおよび／または生体異物性物質に反応して異化酵素の発現を制御し得ることから、このようなステロイドおよび／または生体異物性物質に関する生理学的ホメオスタシスを達成するために代謝を直接制御する新しい機序が考えられる。すなわち、ホルモンの生理学的な作用を媒介する「ステロイドセンシング受容体」としての理想的な特性である。ＳＸＲは、１０年前に鉱質コルチコイド受容体が特定されて以来、最初の新しいクラスのステロイド受容体として報告されたものである。
【００１６】
この発明の個々の局面に基づき、上述のように特定された受容体をコードする核酸配列、それと同等のものを含有する構築物および細胞、そしてそれから産生されるプローブも提供される。さらに、発明の受容体の転写促進作用を調節する様々な基質も発見された。
【００１７】
生理学的なホメオスタシスを維持するために重要な必要条件は、各種の内因性ホルモンおよび生物学的活性を有する生体異物の除去と解毒である。解毒の多くはチトクロームＰ４５０酵素によって行われる。これらの酵素の多くは広い基質特異性をもち、ステロイドを含めた非常に多くの物質によって誘導される。食事からステロイドおよび脂質を摂取しても同じ酵素が誘導されるため、調和のとれた代謝経路に組み込まれる必要がある。何百もの受容体を持つ代わりに、それぞれの誘導物質のために１つの受容体しか持たない、特異性の幅が広く親和性の低い核受容体のグループは、全身のステロイドレベルを監視し、生体異物代謝酵素をコードする遺伝子の発現を誘発することが発見された。新しい核受容体大グループの１つであるＳＸＲは、核受容体の新しい大グループの１つである特異性が広く親和性の低い受容体を通じて、レベルの上昇したステロイドおよび／または生体異物を循環から除去するためのステロイドセンサー機序の一端を担っている。
【００１８】
（発明の詳細な説明）
この発明に基づき、ステロイド／甲状腺ホルモン受容体スーパーファミリーの一部である新しい種類の受容体が特定され、その代表的な受容体をＳＸＲ（あるいは「ステロイドＸ受容体」）と命名した。発明の受容体の特徴は次のとおりである：
レチノイドＸ受容体（ＲＸＲ）と共にヘテロダイマーを形成する、
半分部位ＡＧＴＴＣＡに基づく（直接あるいは反転した）反復反応因子モチーフに結合する、
各種の天然型および合成型ステロイドホルモンに反応し、ステロイド誘導性Ｐ４５０遺伝子中で見られる反応因子を通じて転写を促進する、そして
主に肝臓および腸で発現する。
【００１９】
発明の受容体は、約４６４個のアミノ酸から成る蛋白質（配列番号２を参照）を含有しており、ゼノパス（Ｘｅｎｏｐｕｓ）の安息香酸Ｘ受容体（ＢＸＲ）、ビタミンＤ３受容体（ＶＤＲ）および構造活性化受容体（ＣＡＲ）に相同性は低いがもっとも密接に関連している。また、発明の受容体の例（配列番号１および図１Ａを参照）をコードする２０６８ ｂｐのｃＤＮＡもここに提供する。
【００２０】
この発明に基づき、ステロイドおよび／または生体異物を必要とする被験者において、それら１種類以上の代謝を調節するための方法も提供され、ステロイドおよび生体異物受容体Ｘ（ＳＸＲ）反応因子と機能的に関連する内因性遺伝子の転写を促進するＳＸＲポリペプチドの調節物質の有効量を被験者に投与するというものである。
【００２１】
この発明の１つの具体的な局面として、病的状態の治療のために１種類以上のステロイド剤の投与を受けている被験者においてステロイド中毒を予防するための方法が提供される。この態様において、発明の方法はこのような患者に対して発明のＳＸＲポリペプチドの作動薬を有効量で１種類以上投与し、発明のＳＸＲ反応因子のうちの１つと機能的に関連する内因性遺伝子の転写を促進することにより、ステロイドおよび生体異物の全身レベルが生理学的に容認されるレベル以上に上昇するのを防止する、という手段から構成される。ステロイド中毒の原因となる可能性があるのは、食事による蓄積（例えばエストロゲンの）、過剰投与（例えば疾患の状態の誤診によって起こる）、あるいは治療のために投与した物質の間、もしくは１種類以上の内因性ステロイドと１種類以上の食事により摂取した、および／または治療のために投与した物質との間での薬物相互作用である。
【００２２】
一般に投与される治療薬の中で、ある種の個体において蓄積したり薬物相互作用を誘発したりしてステロイドおよび生体異物の全身レベルを生理学的に適正なレベル以上に上昇させる傾向があるのは、タモキシフェン、ラロジフェン（例えば乳癌の治療において）、ビタミンＫ（例えば骨粗しょう症の治療において）、およびニフェジピンのようなカルシウムチャンネル拮抗薬などである。
【００２３】
さらに別の局面として、この発明はヒトあるいはその他の哺乳類などの被験体からの治療用ステロイドあるいは生体異物のクリアランスを遅くするための方法も提供するもので、 ＳＸＲ反応因子と機能的に関連する内因性遺伝子の転写を促進するＳＸＲポリペプチドの拮抗薬を有効量で被験者に投与する、という手段から構成される。発明の方法のこの局面は、１種類以上の治療用ステロイドかつ／または生体異物のクリアランスがこれらの物質の間での薬物相互作用によって急速になりすぎるのをコントロールする上で有用である。
【００２４】
例えば、リファンピン（すなわちリファンピシン）、あるいはその活性誘導体もしくは類似体は、結核を治療するために広く使用されている。しかし、リファンピンは他の治療薬の肝クリアランスを促進する傾向にあり、例えば経口避妊薬（希望しない妊娠につながる）、ワーファリン（プロトロンビン時間の低下につながる）、シクロスポリンおよびプレドニゾン（臓器拒絶反応あるいは潜在する炎症状態の悪化につながる）、そしてベラパミルおよびジルチアゼム（用量を増量する必要性が生じる）に対して影響を及ぼす。治療用ステロイド、ビタミンＫによって骨粗しょう症を治療する場合にも、同様の状況が発生する。このような問題を解決するために、この発明に基づき、治療用ステロイドの被験者からのクリアランスを遅らせるために有効量のＳＸＲポリペプチド拮抗薬を患者に対して投与する。
【００２５】
さらに別の局面として、この発明は被験物質、あるいはその組み合わせが発明のＳＸＲポリペプチドを活性化し得るかどうか検討するためのスクリーニングアッセイも提供する。このアッセイは、適切な培地中のＳＸＲ受容体ポリペプチドを含有する宿主細胞株（望ましくはヒトまたはウサギの細胞株）と１種類以上の被験物質から構成され、宿主細胞株にはさらに、ＳＸＲの活性化のために発明のＳＸＲ反応因子に機能的に結合した、細胞株中で機能し得るプロモーターを含有するリポーターベクターと、ＤＮＡの転写のためのプロモーターに機能的に結合したリポーター蛋白質をコードするＤＮＡが含まれる。発明のアッセイはさらに、リポーター蛋白質が存在するかどうか決定する方法を含み、リポーターが存在するという結果が得られれば被験物質がＳＸＲポリペプチドを活性化することが示され（すなわち作動薬）、アッセイ中にリポーターが存在しないという結果が得られた場合には被験物質は発明のＳＸＲポリペプチドを活性化しないことが予想される（すなわち、作動薬ではない）。
【００２６】
上述のリポーターベクター中に含まれるＤＮＡの転写を促進する物質は、発明のＳＸＲ受容体の強力な作動薬であり、ここで使用する「ステロイドおよび／または生体異物」の範疇に属する、ということが明らかになった。
【００２７】
さらに、上記のアッセイにより上述のリポーターベクター中に含まれるＤＮＡの転写を促進することが確認された物質は、治療のための用量で被験者に投与した場合に薬物相互作用の影響を受ける可能性があることも明らかになった。より具体的には、このような物質の治療用量が他のステロイド剤および／または生体異物と共にここに記載するような薬物相互作用を起こす可能性は３０％以上、例えば約４５％から約９０％の可能性、あるいは約５０％から約７０％の可能性である。そのようなステロイド剤および／または生体異物は、内因的に産生されたもの、食事中から摂取したもの、あるいは特定の疾患状態の治療のために被験者に対して投与されたもののいずれかを問わない。このように、１つの特定の局面において、この発明のアッセイは、物質、特に治療用に使用する可能性のある物質を治療のための用量で被験者に投与した場合に不都合な薬物相互作用に関与する可能性が少なくとも３０％あるかどうかスクリーニングするための方法となる。このようなスクリーニングアッセイにより、その安全性について検討するためにｉｎ ｖｉｖｏで徹底的なスクリーニング試験を実施する必要のある候補薬剤を特定することができ、それによって薬剤開発のコスト全体が軽減され、候補薬剤が「薬物相互作用」のためにステロイドを健康上有害なレベルまで上昇させてしまったり治療用に投与した別の物質のクリアランスを早め過ぎてしまったりする作用を有することにより危険であることが判明するのを防ぐことができるので、あらゆる薬剤開発プログラムの補助的手段として有用である。
【００２８】
発明の方法は、ステロイド／甲状腺ホルモン受容体スーパーファミリーの一部として分類される新しい種類の受容体が発見されたことに基づくものである。発明の受容体は「ステロイドおよび生体異物受容体」（ＳＸＲ）と命名され、ゼノパス安息香酸‘Ｘ’受容体、ＢＸＲのヒトでの相同体である可能性があるとして特定された。ＳＸＲクラスに属する１つの受容体をコードするｃＤＮＡ（配列番号１）から、４３４個のアミノ酸から成る蛋白質（配列番号２）（図１Ａ）が予想され、ＢＸＲとの相同性はＤＮＡ結合領域（ＤＢＤ）で７３％、リガンド結合領域（ＬＢＤ）で４３％である（図１Ｂ）。ＳＸＲは、最近報告されたプレグナン‘Ｘ’受容体（Ｋｌｉｅｗｅｒら、Ｃｅｌｌ ９２：７３−８２、１９９８年）と最もよく類似している（ＤＮＡ結合領域（ＤＢＤ）での相同性は９５％、リガンド結合領域（ＬＢＤ）での相同性は７３％）。これより相同性は低いが、ＳＸＲはビタミンＤ３受容体およびオーファン受容体ＣＡＲにも類似している（Ｂａｅｓら、Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． １４：５４４−１５５１、１９９４年）（図１Ｂ）。これらの受容体以外には、ＳＸＲはサブグループ内の各受容体が互いに示す相同性を除いて、他の核受容体と相同性を示さない（図１Ｂ）。核受容体の中の真の相同体同士は、特にＤＢＤにおいて一般にかなりの相同性を示すものであることが知られている。
【００２９】
ＳＸＲにはさらに、９個のＣｙｓ残基を含む約６７個のアミノ酸から成るＤＮＡ結合領域（すなわち、アミノ酸残基４１番〜１０７番、配列番号２に記載）をもつという特徴があり、ＳＸＲのＤＮＡ結合領域はゼノパスの安息香酸Ｘ受容体のＤＮＡ結合領域と約７３％のアミノ酸相同性を有する。これとは別に、あるいはさらに、ＳＸＲには少なくとも約２９４個のアミノ酸から成るリガンド結合領域（すなわち、少なくともアミノ酸残基１４１番〜４３４番、配列番号２に記載）をもつという特徴があり、当該リガンド結合領域はゼノパスの安息香酸Ｘ受容体のリガンド結合領域と約４３％のアミノ酸相同性を有する（図１Ｂ）。
【００３０】
この発明に基づき、現時点で望ましいＳＸＲポリペプチドは、配列番号２に示すアミノ酸配列と本質的に同一の配列をもつポリペプチドである。ここで使用する「本質的に同一」という語は、ＤＮＡのヌクレオチド配列に関して使用する場合にも、ＲＮＡのリボヌクレオチド配列に関して使用する場合にも、あるいは蛋白質のアミノ酸配列に関して使用する場合にも、ここに開示する実際の配列との違いがわずかでかつ重大でない配列のことを意味する。本質的に同一である亜種は開示した配列と同等であると判断し、添付した請求項の範囲内であると考える。この点に関して、「わずかでかつ重大でない配列の違い」とは、ここで開示し、および／または請求したＤＮＡ、ＲＮＡ、あるいは蛋白質と本質的に同一の配列が、ここで開示し、および／または請求した配列と機能的に同等であることを意味する。機能的に同等な配列は、本質的に同一の様式で機能し、ここで開示し請求した核酸およびアミノ酸の組成と本質的に同一の組成を産生する。特に、機能的に同等なＤＮＡとは、ここで開示したのと同一の蛋白質、あるいは非極性の残基が別の非極性残基に置換されているとか荷電した残基が同様に荷電した残基に置換されているといった重大でないアミノ酸変異のある蛋白質をコードするものである。このような変化の中には、本分野の技術に熟達した者によって蛋白質の三次構造を大きく変化させていないと認識される変化も含まれる。
【００３１】
発明の方法に基づき、特に望ましいＳＸＲポリペプチドは、配列番号２に示したのと同一のアミノ酸を有するポリペプチドである。
【００３２】
したがって、ここでは「ＳＸＲ受容体」と「ＳＸＲポリペプチド」という語を互換性のある語として使用し、発明のＳＸＲポリペプチドの中の機能を有する断片も含めることを意図する。このような断片として、ＳＸＲのＤＮＡ結合および／またはリガンド結合特性を有するペプチドが含まれ、例えばそのＤＮＡ結合領域（例、配列番号２に示すアミノ酸残基７１番〜１０７番）、そのリガンド結合領域（例、配列番号２に示すアミノ酸残基１４１番〜４３４番）が挙げられる。
【００３３】
この発明の方法を実施する上で有用な調節物質には、ＳＸＲポリペプチドの作動薬および拮抗薬の両方が含まれる。調節物質が作動薬である場合、調節物質の特徴は治療のために投与したステロイド、内因性のステロイド、あるいは食事中に含まれるステロイド、もしくは食事中に含まれるある種の脂質の異化作用において活性を有する物質をコードする遺伝子の転写を促進するという点であり、その遺伝子の特徴はＳＸＲ反応因子と関連していて反応因子の活性化により遺伝子の転写が起こるという点である。一般に、この遺伝子は１種類以上のステロイドまたは食事中の脂質やフィトエストロゲンのような生体異物の代謝において有効な酵素をコードしており、ＳＸＲ反応因子をコードするヌクレオチド配列も含有する。例えば、３、４、あるいは５個のヌクレオチドによって隔てられたＡＧＧＴＣＡ半分部位（ＤＲ半分部位）の直接反復、または３、４、あるいは５個のヌクレオチドによって隔てられたＡＧＴＴＣＡ半分部位（βＤＲ半分部位）の直接反復のようなヌクレオチド１個だけが異なるその変種の配列をもつヌクレオチドである。また反応因子は、ヌクレオチド６個のスペーサーによって隔てられた半分部位ＡＧＧＴＣＡの逆反復、あるいは６個のヌクレオチドスペーサーによって隔てられたヌクレオチド１個だけが異なるその変種の逆反復を含有する場合もある。発明の方法の実施における使用に適した反応因子の例は、次の中から選択することができる：
ＤＲ−３，４，５＝ＡＧＧＴＣＡＮｎＡＧＧＴＣＡ、ただし、ｎは３、４、または５（配列番号１５、１６および１７）；
βＤＲ−３，４，５＝ＡＧＴＴＣＡＮｎＴＧＡＡＣＴ、ただし、ｎは３、４または５（配列番号２２）；そして
ＩＲ−６＝ＴＧＡＡＣＴＮｎＡＧＧＴＣＡ、ただし、ｎは６（配列番号２３）、など。
【００３４】
本分野の技術に熟達した者であれば、反復半分部位の間の３、４、５、または６個のヌクレオチドから成るヌクレオチドスペーサーを構成するために、どのような組み合わせのヌクレオチドを使用してもよいことが理解できる（すなわち、配列番号１５、１６、１７、２２または２３のＮｎ）。
【００３５】
このような反応因子は一般に、ＣＹＰ２Ａ１、ＣＹＰ２Ａ２、ＣＹＰ２Ｃ１、ＣＹＰ３Ａ１、ＣＹＰ３Ａ２、Ｐ４５０オキシドリダクターゼ、ウリジンジホスフェートグルクロノシルトランスフェラーゼ、あるいはグルクロノシルトランスフェラーゼのような異化酵素をコードする遺伝子中に見られ、この発明の方法を実施することによりこれらの遺伝子の転写を促進したり抑制したりすることが可能である。
【００３６】
このような異化酵素の転写を促進することのできる作動薬の代表的な例として、プロゲステロン、テストステロン、エストロゲンおよびコルチコステロンのような高親和性受容体をもつ分子や、高親和性受容体上でほとんど活性をもたないその還元型異化産物が挙げられる。ＳＸＲは、天然型ステロイドだけでなく、ＰＣＮおよびデキサメタゾンを含む合成ステロイドや、生体異物性薬剤、フィトステロイドなどによっても活性化される。現時点で望ましい作動薬として、コルチコステロン、リファンピシン、ニフェジピン、コルチコステロン、ＤＥＳ、エストラジオール、ジヒドロテストステロン、プレグネノロン、プロゲステロン、およびＰＣＮが挙げられ、知られている中で最も強力な活性化物質はコルチコステロンである。
【００３７】
調節物質がＳＸＲの拮抗薬である場合、調節物質は以下の１つ以上の様式で機能する：（１）ポリペプチドがＳＸＲ反応因子に結合するのを阻害する、（２）ポリペプチドとレチノイドＸ受容体とがヘテロダイマーを形成するのを阻害する、あるいは（３）リガンドがＳＸＲまたは発明のＳＸＲポリペプチドのリガンド結合領域に結合するのを阻害する。例えば、拮抗薬はレチノイドＸ受容体ＳＸＲまたは発明のＳＸＲポリペプチドの間のドッキング部位を阻害することによって、これらの分子間でヘテロダイマーが形成されるのを阻害する。これとは別に、拮抗薬はリガンドの活性部位（すなわち、リガンド結合領域に結合するリガンドの部位）に結合することによって、リガンドがＳＸＲまたは発明のＳＸＲポリペプチドのリガンド結合領域に結合するのを阻害する。これらの目標の１つ以上を達成し得る物質であればどんな種類であっても、発明の方法における拮抗薬として使用可能である。例えば、ＳＸＲまたはＲＸＲに結合しＳＸＲ：ＲＸＲヘテロダイマーの形成を阻害する抗体は、今回の発明の実施において拮抗薬として使用することができる。同様に、標的遺伝子の転写を促進することなくＳＸＲ受容体のリガンド結合領域を阻害しリガンドがリガンド結合領域に結合するのを阻害する抗体は、発明の方法において拮抗薬として機能すると考えられる。
【００３８】
本分野の技術に熟達した者であれば、この発明の方法において遺伝子転写の拮抗薬として作用する他のポリペプチドあるいはヌクレオチドについて理解することができ、また容易に案出することができるはずである。
【００３９】
この発明の別の態様に基づき、上述の受容体ポリペプチドとＲＸＲまたはその他のサイレントパートナーから構成されるヘテロダイマー複合体が提供される。
【００４０】
この発明のさらに別の態様に基づき、上述の受容体ポリペプチドをコードする分離核酸が提供される。ここで使用する「分離核酸」という語は、自然には発生しない形の核酸のことを意味する。ポリペプチドをコードする核酸を分離するための１つの方法は、本分野でよく知られた方法を用いて、天然型あるいは人工的に設計したＤＮＡプローブにより哺乳類ゲノムライブラリーの検索を行うことである。この目的のために特に有用なのは、ＳＸＲ遺伝子に由来するＤＮＡプローブである。ＳＸＲポリペプチドをコードするＤＮＡおよびｃＤＮＡ分子を利用して、ヒト、哺乳類（例えばマウス、ラット、ウサギ、ブタなど）もしくは他の動物種から相補的なゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡあるいはＲＮＡを得たり、以下に詳細を記載する方法を用いてｃＤＮＡあるいはゲノムライブラリーのスクリーニングにより関連するｃＤＮＡあるいはゲノムクローンを分離したりすることが可能である。核酸の例として、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、あるいはＳＸＲをコードするゲノムＤＮＡが挙げられる。
【００４１】
代表的なＤＮＡは、配列番号２に記載したのとほぼ同一のアミノ酸（例えば、配列番号１に記載したヌクレオチド５８３番〜１８８４番とほぼ同一の隣接ヌクレオチド配列）である。現時点で望ましいＤＮＡは、配列番号２に記載したのと同一のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ（例えば、配列番号１に記載したヌクレオチド５８３番〜１８８４番と同一の隣接ヌクレオチド）である。
【００４２】
ここで使用するほぼ同一のヌクレオチド配列とは少なくとも約９０％の相同性をもつ配列であり、ほぼ同一のアミノ酸配列とは通常９５％以上のアミノ酸相同性をもつ配列のことである。しかし、スプライス変種として生じる、あるいは保守的なアミノ酸置換（または変性コドンの置換）によって修飾された蛋白質（およびこのような蛋白質をコードするＤＮＡまたはｍＲＮＡ）で、相同性が上述のレベルに達しないものも、この発明の範囲内に含まれるとみなす。本分野の技術に熟達した者であれば容易に認識できるように、比較のための配列を整列させるための各種の方法が考案されている（例えば、Ｂｌｏｓｕｍ ６２ スコアリングマトリックス、Ｈｅｎｉｋｏｆｆ および Ｈｅｎｉｋｏｆｆ、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８９：１０９１５（１９９２年））。この目的のために便利に使用することのできるアルゴリズムは、各種入手可能である（例えば、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ および Ｗｕｎｓｃｈ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０年）を参照）。
【００４３】
この発明のさらに別の態様に基づき、動物の培養細胞において核酸の転写およびポリペプチドの発現を調節する制御因子に機能的に結合した上述の核酸を含有する核酸構築物が提供される。また、次のものから構成されるリポーターベクターを任意に含有する、このような構築物を含む細胞も提供される：
（ａ）当該細胞中で機能し得るプロモーター
（ｂ）ＳＸＲ反応因子、および
（ｃ）リポーター蛋白質をコードするＤＮＡ
ただし、リポーター蛋白質をコードするＤＮＡは、ＤＮＡの転写のためにプロモーターに機能的に結合している、および
プロモーターはＳＸＲ反応因子の活性化のためにＳＸＲ反応因子に機能的に結合している。
【００４４】
この発明のさらに別の態様に基づき、発明の受容体ポリペプチドを作成するための方法が提供される。その方法とは、当該ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を発現させるために、当該細胞中で機能する発現ベクターを含有する細胞を培養するというものである。
【００４５】
この発明のさらに別の態様に基づき、配列番号１に記載したＤＮＡ、またはその相補体の１番〜２０６８番までの塩基から選択したいずれか２０個以上の隣接塩基とほぼ同一の配列をもつ最低２０個の隣接塩基から構成されるラベルした一本鎖核酸を含むプローブが提供される。発明のプローブとして特に望ましいのは、配列番号１に記載したＤＮＡ、またはその相補体の５８３番〜１８８４番までの塩基から選択したいずれか２０個以上の隣接塩基とほぼ同一の配列をもつ最低２０個の隣接塩基から構成されるプローブである。
【００４６】
本分野の技術に熟達した者であれば、ここに記載するプローブは例えば放射性ラベル、酵素活性ラベル、蛍光ラベルなどのような各種のラベルによって標識し得ることが認識できる。これらのプローブをラベルするための方法として現時点で望ましいのは、３２Ｐによるラベルである。このようなプローブは、例えば１種類以上のステロイドかつ／または生体異物の存在に反応して関連遺伝子の転写を制御することを特徴とする受容体ポリペプチドを特定するために有用である。当該方法は、緊縮性の高い条件下で被験ＤＮＡをここに記載したプローブと共にハイブリッド形成させ（例えば、０．５ Ｍ ＮａＰＯ４、ｐＨ７．３、７％ラウリル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）および５％硫酸デキストラン中でプローブと被験ＤＮＡとを６５℃において１２〜２４時間接触させた後、６０℃において０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中で３０分間ずつ３回洗浄する（各洗浄の開始時に新しい緩衝液を使用））、その後当該プローブとハイブリッド形成する配列を選択する、というものである。
【００４７】
この発明の別の局面において、上述のプローブは、発明の受容体ポリペプチド、あるいは機能を有するその断片を特定するために利用することができる。当該方法は、緊縮性の高い条件下で被験ＤＮＡをここに記載したプローブと共にハイブリッド形成させ、その後当該プローブとハイブリッド形成する配列を選択する、というものである。
【００４８】
この発明のさらに別の局面において、上述のプローブは、特定の組織標本中のＳＸＲのｍＲＮＡの量を測定することにより、ステロイドおよびステロイド様物質への曝露に対する個体の組織感受性を評価するために利用することができる。ＳＸＲのｍＲＮＡ（または蛋白質）を多量に有する個体は、多くの食物中に含まれていたり、ステロイドの過剰産生および／またはステロイド分解能の低下の結果として起きたり、クッシング症候群、女性における男性化および多毛症、多嚢胞性卵巣症候群などの疾患において見られたりするように、多量のステロイドおよび生体異物の存在に対して感受性が高いと予想される。
【００４９】
この発明のさらに別の態様に基づき、上述の受容体ポリペプチドに特異的に結合する抗体が提供される。このような抗体は、モノクローナル抗体であることが望ましい。本分野の技術に熟達した者であれば、発明の受容体に関してここに提供する配列情報を得て、このような抗体を容易に作成することができるはずである。
【００５０】
このように、抗体産生のための抗原として発明の受容体蛋白質またはその一部を使用し、本分野の技術に熟達した者によく知られている標準的な手法を用いることによって、上述の抗体を作成することができる。抗ペプチド抗体と抗融合蛋白質抗体のどちらを使用してもよい（例えば、Ｂａｈｏｕｔｈら、Ｔｒｅｎｄｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｓｃｉ． １２：３３８−３４３（１９９１年）；「分子生物学における最新のプロトコール」（Ａｕｓｕｂｅｌら編）Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８９年）を参照）。イムノゲンとして（合成ペプチドあるいは組み換えにより産生した細菌由来融合蛋白質のどちらかとして）使用するために発明の受容体の一部を選択する際に考慮すべき要因は、抗原性、特定のサブタイプに対する独自性などである。
【００５１】
このような抗体を作成することができると、発明の受容体の分布および発現密度を監視するために免疫組織化学の手法を応用することが可能になる。このような抗体はまた、診断および治療上の応用分野でも利用することができる。
【００５２】
この発明のさらに別の態様に基づき、どの物質（例えば、作動薬および拮抗薬）が発明の受容体に結合し得るかどうか検討するため多数の物質を迅速にスクリーニングする上で有用な、ＳＸＲを用いた結合アッセイが提供される。その後、そのような物質が発明の受容体の作動薬として作用するのかあるいは拮抗薬として作用するのかさらに検討するため、最初に特定された物質を用いてより詳細なアッセイを実施することが可能である。
【００５３】
発明の結合アッセイは、新しいＳＸＲ様リガンドを特定するためにも利用することができる。被験標本（例えば、体液）を用いて発明の結合アッセイを行い、ＳＸＲまたはＳＸＲリガンドの有無を検出することも可能である。
【００５４】
発明の結合アッセイの別の応用例は、ＳＸＲの有無を検出するための被験標本（例えば、体液）のアッセイである。したがって、例えばステロイドの過剰産生または過少産生に起因すると考えられる症状を呈している患者からの組織ホモジネートをアッセイに供し、観察された症状がＳＸＲの存在に関連するものであるかどうか検討することが可能である。
【００５５】
この発明により意図される結合アッセイは、本分野の技術に熟達した者であれば容易に理解できるように、様々な方法で実施することができる。例えば、競合的結合アッセイ、ラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ、ＥＲＭＡなどを用いることが可能である。
【００５６】
この発明のさらに別の態様に基づき、ある物質が発明の受容体ポリペプチドの転写促進作用を調節し得るかどうか検討するための方法が提供される。当該方法とは、当該受容体ポリペプチドおよびリポーターベクターを含有する細胞と当該物質とを接触させることによりリポーター蛋白質の有無を検討するための方法である；
ただし、当該リポーターベクターは次のものから構成される：
（ａ）当該細胞中で機能し得るプロモーター
（ｂ）ホルモン反応因子、および
（ｃ）リポーター蛋白質をコードするＤＮＡ
ただし、リポーター蛋白質をコードする当該ＤＮＡは、当該ＤＮＡの転写のために当該プロモーターに機能的に結合している、そして
当該プロモーターは当該ホルモン反応因子の活性化のためにホルモン反応因子に機能的に結合している。
【００５７】
上述のアッセイ方法における使用に適したホルモン反応因子は、少なくとも２箇所の半分部位（それぞれがここで定義する配列ＲＧＢＮＮＭをもつ）の直接あるいは反転反復から構成される。それぞれの半分部位におけるＲＧＢＮＮＭは次のとおりである：
ＲはＡまたはＧから選択する；
ＢはＧ、Ｃ、またはＴから選択する；
それぞれのＮはＡ、Ｔ、Ｃ、またはＧから別個に選択する；そして
ＭはＡまたはＣから選択する；
ただし、当該ＲＧＢＮＮＭ配列のうち少なくとも４個のヌクレオチドは、配列ＡＧＴＴＣＡの対応部位のヌクレオチドと同一でなければならない。
【００５８】
本分野の技術に熟達した者であれば、半分部位の間のスペーシングは相当広い範囲で変動することが理解できる。一般的には約０から１５個までのヌクレオチドである。半分部位が直接反復として配置されている場合、半分部位が３、４または５個のヌクレオチドから成るスペーサーによって分離されるのが現時点では望ましい。本分野の技術に熟達した者であれば、３、４または５個のヌクレオチドの中のいかなる組み合わせであってもスペーサーとして使用可能であることが理解できる。現時点では、４個のヌクレオチドから成るスペーサーをもつ直接反復反応因子（例えば、配列番号６、７または１６）が望ましい。半分部位が反転反復として配置されている場合、半分部位が４、５または６個のヌクレオチドから成るスペーサーによって分離されるのが現時点では望ましい。本分野の技術に熟達した者であれば、４、５または６個のヌクレオチドの中のいかなる組み合わせであってもスペーサーとして使用可能であることが理解できる。
【００５９】
また、発明の受容体のリガンドがさらに存在する条件下で上述の検査方法を実施し、発明の受容体の拮抗薬を特定することが可能である。本分野の技術に熟達した者であれば、本分野においてよく知られた方法を用いて拮抗薬のスクリーニングを容易に実施することができるはずである。一般に、拮抗薬のスクリーニングは、一定量の作動薬を用いて実施し、拮抗薬と推定される物質の量を増量してゆく（すなわち競合アッセイ）。または、受容体を構造的に活性を有する状態にし（例えば、強力で構造的に活性を有する活性化物質を受容体に添加することによって）、その結果得られる構造的に活性を有する受容体を阻害する物質をスクリーニングすることによって、拮抗薬を特定することも可能である。
【００６０】
この発明の別の局面に基づき、ステロイドＸ受容体（ＳＸＲ）の作動薬であるが他のステロイド受容体に対しては作動薬としても拮抗薬としても作用しない物質を特定するための方法が提供される。当該方法は、次の段階から構成される；
第１のアッセイ系においてＳＸＲおよびリポーターベクターを含有する細胞と当該物質とを接触させることにより、リポーター蛋白質の有無を検出する；
ただし、当該リポーターベクターは次のものから構成される：
（ａ）当該細胞中で機能し得るプロモーター
（ｂ）ＳＸＲ反応因子、および
（ｃ）リポーター蛋白質をコードするＤＮＡ
ただし、リポーター蛋白質をコードする当該ＤＮＡは、当該ＤＮＡの転写のために当該プロモーターに機能的に結合している、そして
当該プロモーターは当該ＳＸＲ反応因子の活性化のためにＳＸＲ反応因子に機能的に結合している；
第２のアッセイ系においてＳＸＲ以外のステロイドホルモン受容体およびリポーターベクターを含有する細胞と当該物質とを接触させることにより、リポーター蛋白質の有無を検出する；
ただし、当該リポーターベクターは次のものから構成される：
（ａ）当該細胞中で機能し得るプロモーター
（ｂ）ＳＸＲ以外の当該受容体び反応因子、および
（ｃ）リポーター蛋白質をコードするＤＮＡ、
ただし、リポーター蛋白質をコードする当該ＤＮＡは、当該ＤＮＡの転写のために当該プロモーターに機能的に結合している、そして
当該プロモーターはＳＸＲ以外の当該受容体の反応因子の活性化のためにＳＸＲ以外の受容体の反応因子に機能的に結合している；そして
当該第１アッセイでリポーターの産生を誘導するが当該第２アッセイでは誘導しない物質を、ステロイドＸ受容体（ＳＸＲ）の作動薬であるが他のステロイド受容体の作動薬でも拮抗薬でもない物質として特定する。
【００６１】
このように、発明の方法は治療上有用な各種の物質を特定するために使用できる、ということが容易に理解できる。ここで特定された物質は、例えば次のような幅広い適用疾患の治療のために使用することが可能である：
ａ）クッシング症候群（副腎皮質機能亢進症）、コルチゾルレベルの上昇として発現し、肥満、疲労、高血圧、浮腫および骨粗しょう症を含めた様々な障害につながる；
ｂ）テストステロンの過剰産生に起因する女性の男性化および多毛症；
ｃ）多嚢胞性卵巣症候群に起因するアンドロゲン過剰、デヒドロエピアンドロステロンの循環量の劇的な上昇として発現する；
ｄ）特定のステロイドの蓄積につながる酵素欠損症、例えば：
１）１７−ヒドロキシ−プロゲステロンおよびアンドロゲンの合成量増加につながる２１−ヒドロキシラーゼ欠損症；
２）デオキシコルチゾルおよびデオキシコルチコステロンの蓄積と付随高血圧症につながる１１β−ヒドロキシラーゼ欠損症；
３）プレグネノロンおよびデヒドロエピアンドロステロンの蓄積を起こし男女共における両性併存につながる３β−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ欠損症；
４）１７−ヒドロキシラーゼ欠損症、コルチゾル合成を阻害するがコルチコステロンおよびデオキシコルチコステロンを蓄積させるため、高血圧および男女共における第二次性徴の発達異常につながる；
ｆ）食事中かつ／または環境中に存在し内分泌かく乱物質として作用する物質、例えば乳癌、結腸直腸癌および前立腺癌に関与する可能性のあるエストロゲン（Ａｄｌｅｒｃｒｅｕｔｚ および Ｍａｚｕｒ、Ａｎｎ． Ｍｅｄ．２９：９５−１２０（１９９７年））の作用を増強する；など。
【００６２】
ＳＸＲの特異的な作動薬であって他のステロイド受容体に対しては作動薬としても拮抗薬としても作用しない物質は、他のステロイド剤をそのカタトキシック特性のために使用し、このような治療薬の負の陰性作用（おそらく前述したステロイド受容体、例えばグルココルチコイド受容体が不適切に活性化されることに起因する）に耐えなければならない場合に、特に有用であろう。ＳＸＲの特異的な作動薬であって他のステロイド受容体に対しては作動薬としても拮抗薬としても作用しない物質は、他のステロイド剤をそのカタトキシック特性のために使用し、このような治療薬の負の陰性作用（おそらく前述したステロイド受容体、例えばグルココルチコイド受容体が不適切に活性化されることに起因する）に耐えなければならない場合に、特に有用であろう。
【００６３】
この発明のさらに別の態様に基づき、発明の受容体ポリペプチドにより媒介される過程を調節するための方法が提供される。当該方法とは、少なくとも１種類の作動薬、拮抗薬あるいは発明の受容体に対して作成した抗体の存在下で当該過程を実施する、というものである。
【００６４】
この発明のさらに別の態様に基づき、ステロイド分解酵素の発現を融合するための方法が提供される。当該方法とは、ＳＸＲを活性化するものである。ここでの発現のために意図されるステロイド分解酵素の代表例として、ステロイドヒドロキシラーゼなどが挙げられる。
【００６５】
この発明に基づき、薬理学的な量のステロイドによるある種の生体異物代謝酵素の誘導は、特異性の幅が広く親和性の低い核ホルモン受容体であるＳＸＲによって制御されることがさらに発見された。このような受容体を基盤とする系の１つの利点は、活性化物質のレベルが正常な内分泌機能を阻害するほど十分に高い場合にのみ生体異物代謝酵素の発現を誘導するという点である。また、様々な種類の活性化物質（そのうちのいくつかは誘導された酵素の基質となり得る）に対して反応性を有する受容体によってチトクロームＰ４５０類のように基質特異性の広い酵素の発現が誘導される、という点も生物学的に理にかなっている。
【００６６】
ＳＸＲの活性がリガンド依存性であるかどうか検討するために、トランスフェクションアッセイにおいて天然型および合成型の物質の混合物がＳＸＲを活性化する作用をもつかどうか試験した（例３参照）。デヒドロエピアンドロステロン（ＤＨＥＡ）およびプレグネノロンを含有する混合物が活性を有することが確認され、ＳＸＲが新しいステロイド受容体であることが示唆された。その反応特性について分析するため、既知のステロイド生合成経路の中間産物および主要産物を含めた各種のステロイドについて試験を実施した。驚くべきことに、これらの物質のほとんどは活性を示したが、その力価には明白な差があった（図２参照）。実際、試験に使用した７０種類以上のステロイドのほとんどが、高用量において何らかの活性を示した。完全長の受容体とＧＡＬ４−受容体リガンド結合領域キメラとがどちらも同様の活性を示したが、リポーター単独、あるいはリポーター＋ＧＡＬ４ ＤＮＡ結合領域を用いて行った実験においてはリポーター遺伝子の発現が活性化されなかったことから、活性化はＳＸＲのリガンド結合領域に依存していた。
【００６７】
試験に使用した多数のステロイドの中で、最も強力かつ有効な活性化物質はコルチコステロンである。エストラジオールおよびジヒドロテストステロンもまた顕著に有効な活性化物質であるが、アルドステロンおよび１，２５ジヒドロキシビタミンＤ３は、５０ ｍＭにおいてさえも活性を示さない。古典的なステロイド受容体のためのリガンドは受容体特異性に関してある程度の重複を示すが、このように多くの種類のステロイドによって活性化される各受容体の例は今までにない。ＳＸＲのリガンド特異性がこのように広いのは、非常に多くの種類の食品中脂肪酸によってマイクロモルのレベルで活性化されるＰＰＡＲαと類似している（例えば、Ｆｏｒｍａｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９４：４３１２（１９９７年）およびＧｏｔｔｌｉｃｈｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８９：４６５３（１９９２年）を参照）。
【００６８】
ＳＸＲに対して活性を示すステロイドが非常に多いことから、この新しいクラスの受容体は累積した、および個々のステロイド量を検知できることが示唆され、活性化物質を併用することによって個々の成分よりも活性が強くなると予想される。図３に示すように、それぞれ１０ ｍＭの濃度の１０種類のステロイドを含有する混合製剤（すなわち、ステロイドの総濃度は１００ ｍＭ）は、個別ではほとんどが不活性であった１０ ｍＭの濃度において個々の成分よりもはるかに強い活性を示した。これらの結果から、ＳＸＲは特異性が広く親和性の低いステロイド活性化受容体であることが確認される。
【００６９】
生理学的なホメオスタシスを維持するために重要な必要条件は、各種の内因性ホルモンおよび生物学的活性を有する生体異物の除去と解毒である。解毒の多くはチトクロームＰ４５０酵素によって行われる。これらの酵素の多くは広い基質特異性をもち、ステロイドを含めた非常に多くの物質によって誘導される。食事からステロイドおよび脂質を摂取しても同じ酵素が誘導されるため、調和のとれた代謝経路に組み込まれる必要がある。何百もの受容体を持つ代わりに、それぞれの誘導物質のために１つの受容体しか持たないここに記載した受容体のクラスがあることから、全身のステロイドレベルを監視し、生体異物代謝酵素をコードする遺伝子の発現を誘発する、特異性の幅が広く親和性の低い核受容体クラスの存在が示される。これらの結果から、核受容体の新しい大スーパーファミリーの１つである特異性が広く親和性の低い受容体を通じて、レベルの上昇したステロイド（またはステロイド様物質）を循環から除去するためのステロイドセンサー機序が存在することが示される。
【００７０】
実際、ＧＥＮＢＡＮＫデータベースを利用して推定上のＳＸＲ反応因子を含有する遺伝子を検索した結果、標的遺伝子の候補としていくつかのステロイドヒドロキシラーゼ、例えばＣＹＰ２Ａ１、ＣＹＰ２Ａ２、ＣＹＰ２Ｃ１、ＣＹＰ２Ｃ６、ＣＹＰ３Ａ１、ＣＹＰ３Ａ２、Ｐ４５０オキシドリダクターゼおよびＵＤＰグルクロノシルトランスフェラーゼが特定された。これらの配列の中の該当部分は次のとおりである：
ＤＲ−３
ｒＣＹＰ３Ａ１　　ｔａｇａｃ ＡＧＴＴＣＡ ｔｇａ ＡＧＴＴＣＡ ｔｃｔａｃ（配列番号３）
ｒＣＹＰ３Ａ２　　ｔａａｇｃ ＡＧＴＴＣＡ ｔａａ ＡＧＴＴＣＡ ｔｃｔａｃ（配列番号４）
ｒＵＧＴ１Ａ６　　ａｃｔｇｔ ＡＧＴＴＣＡ ｔａａ ＡＧＴＴＣＡ ｃａｔｇｇ（配列番号５）
ＤＲ−４
ｒｂＣＹＰ２Ｃ１　 ｃａａｔｃ ＡＧＴＴＣＡ ａｃａｇ ＧＧＴＴＣＡ ｃｃａａｔ（配列番号６）
ｒＰ４５０Ｒ　　 ｃａｃ ＡＧＧＴＧＡ ｇｃｔｇ ＡＧＧＣＣＡ ｇｃａｇｃ ＡＧＧＴＣＧ ａａａ（配列番号７）
ＤＲ−５
ｒＣＹＰ２Ａ１　　ｇｔｇｃａ ＧＧＴＴＣＡ ａｃｔｇｇ ＡＧＧＴＣＡ ａｃａｔｇ（配列番号８）
ｒＣＹＰ２Ａ２　　ｇｔｇｃｔ ＧＧＴＴＣＡ ａｃｔｇｇ ＡＧＧＴＣＡ ｇｔａｔｇ（配列番号９）
ｒＣＹＰ２Ｃ６　　ａｇｔｃｔ ＡＧＴＴＣＡ ｇｔｇｇｇ ＧＧＴＴＣＡ ｇｔｃｔｔ（配列番号１０）
ｈＣＹＰ２Ｅ１　　ｇａｇａｔ ＧＧＴＴＣＡ ａｇｇａａ ＧＧＧＴＣＡ ｔｔａａｃ（配列番号１１）
【００７１】
図４に示したデータから、ＳＸＲはこれらの遺伝子の中に存在するＤＲ−３、ＤＲ−４およびＤＲ−５因子を活性化し得ることが証明される。例３に記載した一連のトランスフェクション実験において、コルチコステロンはプレグネノロン、プロゲステロン、ＤＨＴ、エストラジオールおよびＰＣＮと共に、一貫してもっとも強力な活性化物質である。デキサメタゾン、コルチゾンおよびＤＨＥＡは中等度のグループであり、アルドステロンあるいはコルチゾルはどちらもほとんど反応を示さない（図４参照）。ＤＮＡ結合データと一致して、βＤＲ−３、βＤＲ−４およびβＤＲ−５因子により最大の活性が見られる。
【００７２】
このように、ＳＸＲ反応因子は、ステロイドヒドロキシラーゼ、Ｐ４５０オキシドリダクターゼ、およびグルクロノシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子中に存在する。これらの酵素は、内因性および生体異物性の物質を代謝することができ、薬理学的な量のステロイドによって活性化される受容体の正当な標的である。ＳＸＲは生体異物代謝酵素の主要発現部位である肝臓において高レベルで発現されていることから、ステロイドセンサー機序が適切な組織において機能していることが示唆される。また、腸においても顕著な発現が認められる。ステロイドあるいは生体異物の代謝におけるこの組織の役割に関してはあまり知られていないが、食事から摂取したステロイドの代謝、そしておそらくは内因性のステロイドの代謝も制御する上で、腸が役割を果たすのは間違いないであろう。以上を合わせて考慮すると、これらのデータから細胞内「ステロイドセンサー」として機能するＳＸＲのような親和性が低く特異性の広い核ホルモン受容体のクラスが存在することが強く示唆される。
【００７３】
ステロイドヒドロキシラーゼをコードする遺伝子の中でのＳＸＲ反応因子の見かけ上の位置から、還元された、あるいは水酸化されたコルチコステロン誘導体のようなステロイド異化作用の産物もまたＳＸＲを活性化することができるのかどうか、という疑問が生じる。図５から、コルチコステロンの還元型である５αおよび５βは共にＳＸＲ活性化物質として有効であるが、ＧＲ上では５αはわずかに活性を示し５βは完全に不活性であることが示される。５α還元型ステロイドのいくつかは活性を示すが（例えば、ジヒドロテストステロン）、５β還元型ステロイドの方は、ほとんどの物質が古典的なステロイド受容体を活性化することができない（Ｒｕｓｓｅｌｌ および Ｗｉｌｓｏｎ、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６３：２５（１９９４年）を参照）。したがって、５β還元型ステロイドによってＳＸＲが活性化されることから、これらの物質は遺伝子制御においてこれまでに特定されていない役割を有することが明らかになる。
【００７４】
６β−ヒドロキシコルチコステロンは、ＳＸＲに対して実質上不活性であり、ＧＲに対してはわずかな活性を示す（図５参照）。ＳＸＲを活性化することのできる反応因子を含有するＣＹＰ３Ａ遺伝子は、多くのステロイドの６位における水酸化を触媒する。したがって、６β−ヒドロキシコルチコステロンがＳＸＲを活性化する作用を持たないことから、６位水酸化はＳＸＲシグナル伝達経路における制御段階である可能性が示唆される。
【００７５】
このように、ここで提案した核受容体のＳＸＲクラスに属する受容体の役割を裏付ける証拠として、ＳＸＲはプロゲステロン、テストステロン、エストロゲンおよびコルチコステロンのように親和性の高い受容体を持つ分子と、親和性の高い受容体上でほとんどが不活性であるその還元型異化産物を含めた非常に様々なステロイドおよびその代謝産物によって活性化されることがここで証明された。ＳＸＲは、天然型ステロイドだけでなく、ＰＣＮやデキサメタゾンを含めた合成ステロイドによっても活性化される。これらのデータから、ＣＹＰ３Ａ遺伝子（ａ．ｋ．ａ．Ｐ４５０ＰＣＮ）がグルココルチコイド受容体の作動薬および拮抗薬の両方によって誘導されるという矛盾する事実の分子レベルでの説明が得られる。何故なら、ｃｙｐ３Ａ遺伝子は、ＰＣＮおよびグルココルチコイドの誘導を担うことが示されているプロモーター領域中にＳＸＲを活性化し得る反応因子を持っているからである（上記Ｂｕｒｇｅｒら、および上記Ｇｏｎｚａｌｅｚら、参照）。このような結果は、親和性の高い伝統的なステロイド受容体の制御によっては説明できないが、この挙動は新たに特徴解析されたステロイドＸ受容体に関して観察される特性と一致する。
【００７６】
ＰＣＮおよび他のステロイドによって誘導可能であることが知られているＰ４５０がＳＸＲの標的となり得るかどうかについて検討するため、さらなる試験を実施した。ヒトにおいてステロイドにより誘導される主なＰ４５０は、ＣＹＰ３Ａ４遺伝子である（Ｍｏｌｏｗａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）８３：５３１１−５３１５、１９８６年、Ｂｅａｕｎｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ（ＵＳＡ）８３：８０６４−８０６８、１９８６年）。ラットおよびマウスのＣＹＰ３Ａ遺伝子のすべてに、ＳＸＲが活性化し得るＤＲ−３反応因子が含まれる（図４）のに対して、ヒトおよびウサギのプロモーターは子のような因子を含まない。ステロイドおよび生体異物によるＣＹＰ３Ａ４の誘導能は、一時トランスフェクションアッセイにおいて機能を有する１９個の塩基対から成る因子に局在している（Ｂａｒｗｉｃｋら、Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． ５０：１０−１６、１９９６年）。この因子は、ＩＲ−６モチーフ（ＴＧＡＡＣＴｃａａａｇｇＡＧＧＴＣＡ）（配列番号２４）を含有する。ヒトのＣＹＰ３Ａ５およびＣＹＰ３Ａ７、そしてウサギのＣＹＰ３Ａ６遺伝子中で、同様の因子が特定されている（図６Ｂ）（上記Ｂａｒｗｉｃｋ、１９９６年）。ＳＸＲが０〜６個のヌクレオチドのスペーシングをもつ一連の反転反復因子に結合する能力について検討するために試験を実施した結果、ＩＲ−６反応因子のみが有意な結合を示した。直接反復の場合と同様、これらの結果から結合はＲＸＲ：ＳＸＲヘテロダイマーの形成に依存していたことが示される。また、競合結合実験から、ＳＸＲ：ＲＸＲヘテロダイマーのβＤＲ−４およびＣＹＰ３Ａ４ ＩＲ−６の反応因子に対する見かけ上の親和性にはほとんど差がないことも実証された。親プロモーターの既知の誘導能に一致して、ＳＸＲはＣＹＰ３Ａ４を含有するリポーター構築物を活性化するがＣＹＰ３Ａ５あるいはＣＹＰ３Ａ７のモチーフは活性化しないことが示された。
【００７７】
ＣＹＰ３Ａ４を誘導することが知られている物質もまた、発明のＳＸＲを活性化することが示された。試験に使用した物質は、リファンピシンおよびニフェジピンのような薬剤；タモキシフェン、スピロノラクトンおよびＰＣＮのようなステロイド拮抗薬；デキサメタゾン、ジエチルスチルベストロール、エストラジオール、ジヒドロテストステロン、コルチコステロンおよびコルチゾンのような天然型および合成型のステロイド；およびクメストロール、イクオールおよびゲニステインのようなフィトエストロゲンであった。これらの物質のうち、リファンピシン、ニフェジピン、コルチコステロン、エストラジオール、ＤＥＳ、およびクメストロールが最も強力な活性化物質であった（図７Ａ）。マウスの受容体ＰＸＲは、これらの誘導物質に対してあまり反応しなかったが、ＳＸＲの弱い活性化物質であるＰＣＮによって選択的に活性化された（図７Ｂ）。ＰＸＲは、プレグナン類（デキサメタゾン（ＤＥＸ）およびプレグネノロンのような２１炭素ステロイド）によって選択的に活性化されることが報告されている（上記Ｋｌｉｅｗｅｒ、１９９８年）が、我々の試験の結果からはＰＸＲはテストステロンのような１９炭素アンドロスタンによってもエストラジオールのような１８炭素エストランによっても同様に活性化されることが示された（図７Ｂ）。プロゲステロン、プレグネノロンおよびジヒドロ酢酸（ＤＨＥＡ）を含む他の天然型ステロイドによっても同様の結果が得られた。
【００７８】
高濃度のステロイドによってＳＸＲおよびＰＸＲが活性化されることがすべてのステロイド受容体の一般的な特性ではないことを実証するために、同一グループの物質によるヒトエストロゲン受容体（ＥＲ）の活性化について検討した。試験に使用した内因性ステロイドの中で、ＥＲを活性化したのはＤＨＴとエストラジオールだけであった。合成ＥＲ作動薬、ＤＥＳ、およびクメストロールを含むフィトエストロゲン類（図７Ｃ）もまた、ヒトエストロゲン受容体を活性化した。
【００７９】
発明のＳＸＲ反応因子は、ステロイドヒドロキシラーゼをコードする遺伝子の中に局在しているため、還元型あるいは水酸化型のコルチコステロン誘導体など、ステロイドの異化産物がＳＸＲを活性化し得るかどうか試験した。これらの試験の結果は図７Ｄに示すとおりで、コルチコステロンの５αおよび５βの還元型はどちらも有効なＳＸＲ活性化物質である；しかし、ＧＲに対しては５αはわずかに活性を示し、５βは完全に不活性である。いくつかの５α還元型ステロイドは活性を有するが（例えばジヒドロテストステロン）、５β還元型のステロイドは古典的なステロイド受容体を活性化することができない（Ｒｕｓｓｅｌｌ および Ｗｉｌｓｏｎ、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ． ６３：２５−６１、１９９４年）。このように、５β還元型ステロイドによるＳＸＲの活性化は、これまでに発見されていないこれらの物質のための調節経路を反映している可能性がある。また、６β−ヒドロキシコルチコステロンがＳＸＲに対してほとんど活性を示さないことから（図６Ｄ）、ＣＹＰ３Ａ４が触媒する水酸化はステロイド代謝における決定的な制御段階である可能性が示唆される。
【００８０】
このような結果から、薬理学的なレベルのステロイド、薬物、および生体異物によるある種の生体異物代謝酵素の誘導は、多数の特異的な受容体ではなく特異性の広いセンサーによって制御されている、ということが示される。ＳＸＲは、各種のステロイドおよびその代謝産物によって活性化される核受容体大グループの新しい一員である。発明のＳＸＲのように、特異性の広い１つのセンサーによって直接制御されるということは、生物学的にみて無駄のないことである。何故ならば、これらの物質の解毒および異化作用の多くはＣＹＰ３Ａグループの一員であるチトクロームＰ４５０によって媒介されるが、この酵素はステロイドを含めた広範囲の物質を代謝し、またそれによって誘導されるからである。
【００８１】
上述の研究に基づき、標的遺伝子、ＳＸＲ、およびその活性化物質の間でいくつかの関連が発見され、ＳＸＲがステロイドおよび生体異物の累積量調節を担う感受性の広いセンサーとしての役割を果たすことが裏付けられた。第１に、ＳＸＲはステロイドおよび生体異物を異化する組織中、特にステロイドおよび生体異物代謝酵素の主要発現部位である肝臓や腸において発現されている。ステロイド代謝における腸の組織の役割についてはあまり知られていないが、腸は食事から摂取した物質、および経口投与した物質の初回通過効果による代謝において重要な役割を果たすことが知られている（Ｈｏｌｔｂｅｃｋｅｒら、Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂ．Ｄｉｓｐｏｓ． ２４：１１２１−１１２３、１９９６年；およびＫｏｌａｒｓら、Ｌａｎｃｅｔ ３３８：１４８８−１４９０、１９９１年）。例えば、ＣＹＰ３Ａ４は腸細胞中に多量に発現されている（Ｋｏｌａｒｓら、Ｊ．Ｃｌｉｎ，Ｉｎｖｅｓｔ．９０：１８７１−１８７８、１９９２年）。このように、ＳＸＲはステロイドおよび生体異物の異化作用に関して非常に重要な２種類の組織中で多量に発現されている。第２に、発明のＳＸＲによって、ＳＸＲを発現する組織中で発現している異化酵素が誘導される。ＳＸＲ反応因子は、十分な特徴解析が行われているＣＹＰ３Ａ４プロモーター中だけでなく、Ｐ４５０オキシドリダクターゼ、ＣＹＰ２Ａ、ＣＹＰ２Ｃ、ＣＹＰ２Ｅおよびグルクロノシルトランスフェラーゼのプロモーター中でも発見された。これらの酵素はすべて、ステロイドおよび生体異物の異化に関与することがよく知られている（Ｆ．Ｊ．Ｇｏｎｚａｌｅｚ、Ｔｒｅｎｄｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｃｉ． １３：３４６−３５２、１９９２年）。第３に、薬物（リファンピシンおよびニフェジピンなど）、ステロイド受容体作動薬および拮抗薬（エストロゲンおよびタモキシフェンなど）；食事中に含まれる生物学的活性を有する物質（フィトエストロゲンなど）など、異化酵素を誘導することで知られる物質が発明のＳＸＲを活性化する。特に、ＣＹＰ３Ａ４は、申請者がＳＸＲ活性化物質であるとして特定したほぼすべての物質によって誘導されることが知られている（Ｒｅｎｄｉｃ および Ｄｉ Ｃａｒｌｏ、１９９７年）。最後に、還元型ステロイドのように異化の初期の段階における産物がＳＸＲを活性化し、それらの完全な不活化および消失を保証している。以上を合わせて判断すると、このような関連があることから、ステロイドおよび生体異物のホメオスタシスを調節するために機能する特異性の広いセンサーとしてのＳＸＲの役割が裏付けられる。
【００８２】
ＳＸＲが活性化されるということから、ＣＹＰ３Ａ遺伝子（ａ．ｋ．ａ．Ｐ４５０ＰＣＮ）がグルココルチコイド受容体の作動薬および拮抗薬の両方によって誘導されるという矛盾する事実、および異なる種においてオルトロガスな酵素がそれぞれ異なる反応を示すという事実の分子レベルでの説明が提供される。誘導可能なＣＹＰ３Ａ遺伝子は、 ＰＣＮおよびグルココルチコイドの誘導を担うことが示されているプロモーター領域中に反応因子を持っている（上記Ｂａｒｗｉｃｋ、１９９６年；上記Ｂｕｒｇｅｒ、１９９２年；上記Ｇｏｎｚａｌｅｚ、１９８６年；上記Ｓｃｈｕｅｔｚ および Ｇｕｚｅｌｉａｎ、１９８４年；上記Ｋｌｉｅｗｅｒ、１９９８年）。出願人は、これらの反応因子が発明のＳＸＲによって活性化されることを発見した（図６Ａおよび６Ｃ）。異なる種に由来するＣＹＰ３Ａ２遺伝子、そして特にグルココルチコイド反応性プロモーター因子は、ステロイドおよび生体異物の異化作用において共通の役割をもっているにもかかわらず、その誘導物質の薬理学的特性は顕著に異なっている（上記Ｂａｒｗｉｃｋ、１９９６年）。例えば、ＰＣＮはラットのＣＹＰ３Ａ２およびＣＹＰ３Ａ３の強力な誘導物質であるが、ヒトのＣＹＰ３Ａ４およびウサギのＣＹＰ３Ａ６に対しては弱い誘導物質でしかない。一方、リファンピシンはこのような酵素をコードするヒトおよびウサギの遺伝子の強力な誘導物質であるが、ラットの遺伝子に対しては作用しない（上記Ｂａｒｗｉｃｋ、１９９６年）。
【００８３】
しかし、ラットあるいはウサギからの一次培養肝細胞中に一時トランスフェクションを行うことによりこのような遺伝子からの反応因子の試験を行うと、反応性は宿主のタイプの反応性に変化する。例えば、ラットのＣＹＰ３Ａ２およびＣＹＰ３Ａ３プロモーターからのグルココルチコイド反応因子は、ＤＥＸによりラットおよびウサギの両肝細胞において誘導されたが、ＰＣＮによって誘導されたのはラットの肝細胞においてのみであり、リファンピシンによって誘導されたのはウサギの肝細胞においてのみであった（上記Ｂａｒｗｉｃｋ、１９９６年）。同様に、ヒトＣＹＰ３Ａ４プロモーターからのグルココルチコイド反応因子は、ＤＥＸによりラットおよびウサギの両肝細胞において誘導されたが、ＰＣＮによって誘導されたのはラットの肝細胞においてのみであり、リファンピシンによって誘導されたのはウサギの肝細胞においてのみであった（上記Ｂａｒｗｉｃｋ、１９９６年）。ラットの細胞における活性化特性は、ＰＸＲの誘導物質に対する反応性に相応している（図６Ｃ）；一方、ウサギの細胞における反応性はＳＸＲの反応性に相応する。ウサギの３Ａ６プロモーターにはげっ歯類のＤＲ−３因子が欠如しているが、ヒトのＩＲ−６因子が存在する（上記Ｂａｒｗｉｃｋ、１９９６年）ため、ウサギの肝臓はＰＸＲよりもＳＸＲに密接に関連した受容体をもつであろうことが推測される。このように、ＳＸＲとＰＸＲの活性化の薬理学的特性により、チトクロームＰ４５０３Ａグループの中のラット、ウサギおよびヒトの酵素の誘導性が異なることが説明される。この発見から、ウサギの肝細胞はげっ歯類の肝細胞よりもヒトの肝細胞に近い挙動を示すこと、そしてヒトにおける薬物相互作用の試験を行うためにはげっ歯類よりもウサギの方が適していると思われることが示唆される。
【００８４】
マウスの組織中で、ステロイド生体異物受容体と呼ばれる核受容体スーパーファミリーの新しい枝グループに属する１つの受容体が発見された。緊縮性の低い条件下でマウス肝臓のｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングした結果、３９種類のｃＤＮＡが特定され、これらすべてがＰＸＲをコードしていた。げっ歯類とヒトとの受容体を比較した場合、オルトロガスな核受容体は一般に、リガンド結合領域のアミノ酸の相同性が９０％以上である（例えば、ＲＡＲα−９８％ヒト／マウス（ｈ／ｍ）、ＰＰＡＲγ−９８％ｈ／ｍ、ＧＲ−９５％ｈ／ｍ、ＴＲβ−９８％ｈ／ラット、ＥＲα−８９％ｈ／ｍ）。このように、ＰＸＲとＳＸＲは、ステロイドおよび生体異物核受容体グループのαとβのサブタイプであるのかもしれない。この結論は、ここに記載する例で示すように、受容体の明白に異なる薬理学的特性によって裏付けられる。マウスおよびヒトの肝臓のｃＤＮＡをさらにスクリーニングしたが、他のグループに属する受容体は特定できなかった。ＰＸＲとＳＸＲが非常に異なるオルトロガス遺伝子を代表しているのかもしれない。もしこれが真実であれば、差異は、げっ歯類と霊長類との食餌における差への受容体の適応、および受容体が食餌に由来する該当物質に反応する必要性を反映していると考えられる。
【００８５】
発明の受容体を得るために、ここに記載する例１で示したように、完全長のＳＸＲ ｃＤＮＡ（配列番号１）をプローブとして各種ヒト組織について市販のノーザンブロットを行った。結果から、ＳＸＲのｍＲＮＡはヒト肝臓において多量に発現されており、ヒト腸においてはそれよりもやや少ない量で発現されていることが示された。ノーザンブロットを２４時間以上曝露させても、他の組織における発現は認められなかった。３５００ ｎｔから９０００ ｎｔ以上のものまで、数多くのｍＲＮＡが検出された。得られた４種類のｃＤＮＡの配列を比較した結果、蛋白質のコードと５’未翻訳配列は共通であったが、３’末端は４種類すべて異なっていた。このような配列の差は、別経路によるポリアデニル化に起因するものと考えられる。
【００８６】
ＳＸＲがＲＸＲと共にヘテロダイマーを形成し得るかどうか検討するため、そしてここに記載する例４で示すようにＳＸＲのＤＮＡ結合の選択性および特異性について分析するために、電気泳動移動シフトアッセイを実施した。ＲＸＲと共にヘテロダイマーを形成する受容体は一般に、ＡＧＧＴＣＡの直接反復あるいは密接に関連する配列に結合する（上記Ｍａｎｇｅｌｓｄｏｒｆ および Ｅｖａｎｓ、１９９５年）。半分部位の間のスペーシングが０個〜１５個のヌクレオチドである種々の反応因子に対して、ＳＸＲを単独で、およびＲＸＲと共に試験した。古典的なステロイド反応因子上では、結合は見られなかった。これに対して、ＤＲ−４モチーフに選択的な強い結合が認められ、ＤＲ−３およびＤＲ−５に対してはわずかな結合、そして他のスペーシングの場合には結合は認められなかった。変種であるＡＧＴＴＣＡ（βＤＲ）の半分部位を使用した場合、βＤＲ−４およびβＤＲ−５上で強い結合が見られ、βＤＲ−３に対する結合は顕著であったが若干弱かった。これらの結果から、ＳＸＲは、古典的なステロイド受容体のようにホモダイマーとしてではなく、ＲＸＲとのヘテロダイマーとしてＤＮＡに結合することが実証される（上記Ｂｅａｔｏ、１９９５年）。
【００８７】
ＳＸＲの活性がリガンドに依存するのかどうか検討するために、トランスフェクションに基づくアッセイにおいて天然型および合成型の物質の混合物がＳＸＲを活性化し得るかどうかの試験を実施した。ＤＨＥＡおよびプレグネノロンを含有する混合物が活性を示したことから、ＳＸＲは新しいステロイド受容体であることが示唆される。受容体の反応特性についてさらに詳細に特徴解析するために、既知のステロイド生合成経路の中間代謝産物および主要代謝産物を含めた様々な種類のステロイドについて、発明のＳＸＲを活性化し得るかどうか試験した。図２に示す結果から明らかなように、これらの物質のほとんどは活性を有していたが、力価には明白な差があった。試験に使用した７０種類以上のステロイドのうち、ほとんどが高用量において何らかの活性を示した。また、完全長の受容体とＧＡＬ４受容体リガンド結合領域キメラとはどちらも同様の活性を示すことも発見された；しかしリポーター単独、あるいはリポーターとＧＡＬ４のＤＮＡ結合領域とで行った実験においては、リポーター遺伝子発現の活性化は認められなかった（図２）。これらの結果から、活性化はＳＸＲのリガンド結合領域に依存することが示される。
【００８８】
試験に使用した各種ステロイドの中で、最も強力かつ有効な活性化物質はコルチコステロンであった（図２）。エストラジオールおよびジヒドロテストステロンもまた顕著に有効な活性化物質であったが、アルドステロンおよび１，２５ジヒドロキシビタミンＤ３は、５０ μＭの濃度においてさえも不活性であった（図２）。古典的なステロイド受容体のためのリガンドは受容体特異性に関してある程度の重複を示すが、このように多くの種類のステロイドによって活性化される核受容体の例は今までにない。ＳＸＲのリガンド特異性がこのように広いのは、非常に多くの種類の食品中脂肪酸によってマイクロモルのレベルで活性化されるＰＰＡＲαと類似している（Ｆｏｒｍａｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９４：４３１２−４３１７、１９９７年；Ｇｏｔｔｌｉｃｈｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８９：４６５３−４６５７、１９９２年；Ｋｌｉｅｗｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）９４：４３１８−４３２３、１９９７年）。
【００８９】
ＧＥＮＢＡＮＫデータベースを利用して推定上のＳＸＲ反応因子を含有する遺伝子を検索した結果、標的遺伝子の候補としてステロイドヒドロキシラーゼＣＹＰ２Ａ１、ＣＹＰ２Ａ２、ＣＹＰ２Ｃ１、ＣＹＰ２Ｃ６、ＣＹＰ３Ａ１、ＣＹＰ３Ａ２、Ｐ４５０オキシドリダクターゼ、およびＵＤＰグルクロノシルトランスフェラーゼが特定された（図６Ａ）。この検索によって、これらの遺伝子中に存在するＤＲ−３、ＤＲ−４およびＤＲ−５因子が特定されたことから、このような物質が発明のＳＸＲを活性化することが示された。同様に、ステロイドおよび生体異物がＳＸＲ反応因子を活性化し得るかどうか検討するために実施した例４に記載のトランスフェクションアッセイからも、コルチコステロンやプレグネノロン、プロゲステロン、ジヒドロテストステロン（ＤＨＴ）、エストラジオール、およびＰＣＮは一貫して最強の活性化物質であることが示された。デキサメタゾン、コルチゾン、およびＤＨＥＡは中等度の強さの活性化物質であり、アルドステロンあるいはコルチゾルはどちらもほとんど反応を示さない（図４）。ＤＮＡ結合データに一致して、これらの活性化物質により誘導される活性が最大になるのは、βＤＲ−３、βＤＲ−４、およびβＤＲ−５反応因子を含有するステロイド誘導可能なＰ４５０遺伝子の場合であった（図４）。
【００９０】
発明のＳＸＲポリペプチド作動薬または拮抗薬に関して使用する「有効量」という語は、１種類以上のステロイドおよび／または生体異物の代謝を望ましいレベルに調節するために必要な量のことである。例えば、治療用の物質を投与することになった疾患を治療、治癒、あるいはその症状を軽減したり、ホメオスタシスを確立したりする上で有効な量という意味である。あるいは、疾患の治療のために１種類以上の治療用ステロイドおよび／または生体異物を投与した患者においてステロイド毒性を防止する目的で発明の作動薬を使用する場合には、「有効量」という語はステロイドおよび生体異物の全身量（例えば、治療中の患者のステロイド毒性の影響について調べるための血液検査によって測定される）を安全なレベルに調節するため、あるいは医師により判定されるステロイド毒性の症状を軽減するために必要な量のことを意味する。同様に、治療用のステロイドあるいは生体異物のクリアランスを遅くするために使用する発明のＳＸＲポリペプチド拮抗薬の量とは、特定の治療用物質の血中濃度を治療上有効なレベルまで上昇させ、それによって治療用のステロイドあるいは生体異物を投与することになった疾患を治療、またはその症状を軽減するために必要な量のことである。症状の重症度は個々の，患者によって大きく異なると思われ、それぞれの薬物や活性物質も独自の治療特性を持つことから、各患者に対する正確な投与方法、用いる用量および治療計画は医師の判断に委ねられることになる。
【００９１】
特定の治療目標を達成するために有効な量は、当然、投与を受ける病状の重症度、および患者の体重や全身状態に応じて変わってくる。「有効量」を決定する上で考慮すべき様々な一般要因は、本分野の技術に熟達した者によく知られており、例えばＧｉｌｍａｎら編、Ｇｏｏｄｍａｎ Ａｎｄ Ｇｉｌｍａｎ’ｓ：「治療法の薬理学的根拠」第８版、Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ、１９９０年；および「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎの薬剤学」第１７版、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、Ｐａ．、１９９０年がある。これらはいずれもここに参考文献として引用している。
【００９２】
発明のＳＸＲポリペプチド作動薬あるいは拮抗薬の製剤は、固体、溶液、乳濁液、分散剤、ミセル、リポソームなどの剤形で使用することができる。ただし、作成した製剤中は、経腸的あるいは非経口的に投与するのに適した有機もしくは無機の担体または賦形剤と混合して、この発明の実施において使用することを目的とした作動薬あるいは拮抗薬を１種類以上含むものとする。例えば、有効成分を、錠剤、丸剤、カプセル、座薬、溶液、乳濁液、懸濁液、および使用に適したその他のあらゆる剤形にするために、製剤学上容認される一般的な毒性のない担体と共に製剤化することができる。使用可能な担体として、グルコース、ラクトース、アカシアゴム、ゼラチン、マンニトール、スターチ糊、三ケイ酸マグネシウム、タルク、コーンスターチ、ケラチン、コロイド状シリカ、ポテトスターチ、尿素、中鎖トリグリセリド、デキストラン、およびその他製剤化のための使用に適した固体、半固体、あるいは液体状の担体が挙げられる。また、補助剤、安定化剤、増粘剤および着色剤、ならびに香料も使用可能である。製剤中には、有効成分（すなわち１種類以上のＳＸＲポリペプチド作動薬または拮抗薬）が、標的とする過程、病状あるいは疾患に対して望ましい作用を発揮するのに十分な量で含まれるものとする。
【００９３】
ここで意図する有効成分を含有する製剤は、例えば錠剤、トローチ、口内錠、水性または油性の懸濁液、分散粉末または顆粒、乳濁液、硬カプセルまたは軟カプセル、もしくはシロップまたはエリキシル剤として、経口投与に適した剤形にすることもできる。経口投与を目的とする製剤は、製剤製造の分野において知られているいかなる方法に従って作成してもよい。また、このような製剤には、製剤学上洗練された服用しやすい製剤とするために、甘味料（スクロース、ラクトース、あるいはサッカリンなど）、香味料（ペパーミント、冬緑油またはチェリー油など）、着色料および保存料などの中から１種類以上を選択して含めることができる。既知の方法により、製剤学的に容認される毒性のない賦形剤を混合して、有効成分を含有する錠剤も製造することが可能である。使用可能な賦形剤の例として、（１）炭酸カルシウム、ラクトース、リン酸カルシウム、リン酸ナトリウムなどのような不活性の希釈物質；（２）コーンスターチ、ポテトスターチ、アルギン酸などのような顆粒化剤および崩壊剤；（３）トラガントガム、コーンスターチ、ゼラチン、アカシアなどの結合剤；そして（４）ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、タルクなどの潤滑剤が挙げられる。錠剤はコーティングなしでも、また胃腸管での分解および吸収を遅らせ、それによって長時間にわたり作用を持続させるために既知の技術を用いてコーティングしてもよい。例えば、グリセリルモノステアリン酸またはグリセリルジステアリン酸のような徐放補助剤を使用することが可能である。また、放出をコントロールするための浸透圧性治療用錠剤を作成するために、アメリカ合衆国特許第４，２５６，１０８号；および第４，２６５，８７４号に記載の技術によってコーティングすることもできる。
【００９４】
場合によっては、経口投与用の製剤を、有効成分を例えば炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、カオリンなどのような不活性の固体希釈剤と共に混合した硬質ゼラチンカプセルの形で製剤化することも可能である。また、有効成分を水や例えばピーナツ油、液体パラフィン、あるいはオリーブ油のような油性媒体と共に混合した軟質ゼラチンカプセルの形で製剤化することも可能である。
【００９５】
また、製剤は滅菌した注射用溶液または懸濁液の形で製剤化することもできる。この懸濁液は、適切な分散剤あるいは湿潤剤と懸濁剤とを使用して既知の方法に基づき作成することができる。滅菌した注射用製剤はまた、例えば１，４−ブタンジオールのような非経口投与用として容認される無毒の希釈剤あるいは溶媒中の滅菌注射用溶液または懸濁液の形で作成することが可能である。滅菌した不揮発性油は、溶媒あるいは懸濁用媒体として便利に使用することができる。この目的のために、合成モノグリセリドまたはジグリセリド、脂肪酸（オレイン酸を含む）、ごま油、ココナツ油、ピーナツ油、綿実油のような天然型の野菜油、あるいはオレイン酸エチルのような合成脂肪酸などを含めたあらゆる銘柄の不揮発性油を使用することができる。必要に応じて、緩衝液、保存料、抗酸化剤などを添加しても良い。
【００９６】
この発明の実施における使用を目的とする製剤は、有効成分を経直腸投与するための座薬の形で投与することもできる。このような製剤は、カカオ油脂、ポリエチレングリコールの合成グリセリドエステル（常温で固体であるが直腸内で液化および／または溶解して有効成分を放出するもの）などのような刺激性のない適切な賦形剤を有効成分と混合することによって作成する。
【００９７】
次に、以下に示す例（これに限定されるわけではない）を引用して、この発明についてのさらに詳細な説明を記載する。
【００９８】
（例１）
（ｃＤＮＡの特定）
ＳＸＲは、緊縮性の低い条件下（０．５ ＭＮａ ＰＯ４ ｐＨ ７．０、７％ラウリル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、５％硫酸デキストラン中で６５℃において一晩ハイブリダイゼーションさせ、２倍の標準クエン酸生理食塩水溶液（０．０１５ Ｍクエン酸ナトリウムを含有する０．１５ Ｍ生理食塩水ｐＨ７）（ＳＳＣ）、０．１％ＳＤＳ中で３７℃において２０分間、３回洗浄する）で、ヒトゲノムライブラリー（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）をゼノパス ＢＸＲをコードする完全長ｃＤＮＡ（Ｂｌｕｍｂｅｒｇら、１９９８年ａ）と共にハイブリダイズさせることによって特定した。制限酵素マッピングおよびＳｏｕｔｈｅｒｎブロット分析から、９ｋｂのＥｃｏＲＩハイブリダイジング断片内に３個のエクソンが含まれていることが明らかになった。この断片をプローブとして使用して、緊縮性の高い条件下（上述のようにしてハイブリッド形成し、０．１倍ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中で５０℃において２０分間、２回洗浄する）で各種のヒト組織（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）のノーザンブロットを行い、肝臓においてハイブリダイゼーションを検出した。その後、同一条件を用いてヒト肝臓ｃＤＮＡライブラリー（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）の検索を行い、４種類の別個のクローンを特定した。これらのクローンのそれぞれについて、蛋白質コード領域内で両方の鎖の配列決定を行った。ＤＮＡ配列を収集し、Ｓｔａｄｅｎのプログラム（Ｒ．Ｓｔａｄｅｎ、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１４：２１７−２３１、１９８６年）、ウイスコンシン大学遺伝学コンピュータグループ（Ｄｅｖｅｒｅａｕｘら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １２：３８７−３９５、１９８４年）により比較した。データベースの検索は、国立バイオテクノロジー情報センターのＢＬＡＳＴネットワークサーバーを用いて行った（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ． ２１５：４０３−４１０、１９９０年）。ＰＸＲは、緊縮性の低い条件下（５倍ＳＳＣ、４３％ホルムアミド、５倍Ｄｅｎｈａｒｄｔｓ、０．１％ ＳＤＳ、０．１ ｍｇ／ｍｌ超音波処理変性サケ精子ＤＮＡ、３７℃）においてＳＸＲ蛋白質をコードする領域を用いてスクリーニングすることにより、マウス肝臓ｃＤＮＡライブラリー（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）から分離した。０．５倍ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中で５０℃において２０分間の洗浄を３回行った。
【００９９】
（例２）
（ＳＸＲがＲＸＲとヘテロダイマーを形成する能力）
ＳＸＲの蛋白質コード領域をＰＣＲにより増幅し、ＥｘｏＩＩＩ媒介連結非依存性クローニング（Ｌｉ ａｎｄ Ｅｖａｎｓ、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２５、４１６５−４１６６、１９９７年）を用いてベクターｐＣＤＧ１（上記Ｂｌｕｍｂｅｒｇ、１９９８年ａ）のＮｃｏＩおよびＢａｍＨＩ部位中にサブクローニングした。この過程の間に、推定上のイニシエーターＬｅｕをＫｏｚａｋの共通配列ＣＣＡＴＧＧによってＭｅｔに変換した。実際の反応因子およびコピーの数は次のとおりである：どの場合も、基本ベクターはｔｋ−ｌｕｃである（Ｈｏｌｌｅｎｂｅｒｇら、Ｎａｔｕｒｅ ３１８：６３５−６４１、１９８５年）：
ＤＲ−１、ｔｋ（ＡｐｏＡＩ）４（Ｌａｄｉａｓ および Ｋａｒａｔｈａｎａｓｉｓ、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５１：５６１−５６５、１９９１年）；
ＤＲ−２、ｔｋ（Ｈｏｘ−Ｂ１−ＲＡＲＥ）２（Ｏｇｕｒａ および Ｅｖａｎｓ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）９２：３８７−３９１、１９９５年）；
βＤＲ−３、ｔｋ（ＣＹＰ３Ａ２）３（Ｋｌｉｅｗｅｒら、Ｃｅｌｌ ９２：７３−８２、１９９８年）、
ＤＲ−４、ｔｋ（ＭＬＶ−ＴＲＥ）２（Ｕｍｅｓｏｎｏら、Ｃｅｌｌ ６５：１２５５−１２６６、１９９１年）；
βＤＲ−４、ｔｋ（ＬＸＲＥ）３（Ｗｉｌｌｙら、Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ． ９：１０３３−１０４５、１９９５年）；
βＤＲ−５、ｔｋ（βＲＡＲＥ）３（Ｓｕｃｏｖら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）８７：５３９２−５３９６、１９９０年）；
ＴＲＥｐ、ｔｋ（ＴＲＥｐ）２（上記Ｕｍｅｓｏｎｏら、１９９１年）。
ここで使用した直接反復０−１５（ＤＲ−０からＤＲ−１５まで）のオリゴヌクレオチドの配列は以下のとおりであった：
ＤＲ−０：ｃａｔａｇｔｃＡＧＧＴＣＡ ＡＧＧＴＣＡ ｇａｔｃａａｃ（配列番号１２）；
ＤＲ−１：ｃａｔａｇｔｃＡＧＧＴＣＡ ｔ ＡＧＧＴＣＡ ｇａｔｃａａｃ（配列番号１３）；
ＤＲ−２：ｃａｔａｇｔｃＡＧＧＴＣＡ ａｔ ＡＧＧＴＣＡ ｇａｔｃａａｃ（配列番号１４）；
ＤＲ−３：ｃａｔａｇｔｃＡＧＧＴＣＡ ｔａｔ ＡＧＧＴＣＡ ｇａｔｃａａｃ（配列番号１５）；
ＤＲ−４：ｃａｔａｇｔｃＡＧＧＴＣＡ ｔａｔａ ＡＧＧＴＣＡ ｇａｔｃａａｃ（配列番号１６）；
ＤＲ−５：ｃａｔａｇｔｃＡＧＧＴＣＡ ｔａｔａｔ ＡＧＧＴＣＡ ｇａｔｃａａｃ（配列番号１７）；
ＤＲ−６：ｃａｔａｇｔｃＡＧＧＴＣＡ ｔａｔａｔａ ＡＧＧＴＣＡ ａｇａｔｃａａｃ（配列番号１８）；
ＤＲ−７：ｃａｔａｇｔｃＡＧＧＴＣＡ ｔａｔａｔａｔ ＡＧＧＴＣＡ ｇａｔｃａａｃ（配列番号１９）；
ＤＲ−１０：ｃａｔａｇｔｃＡＧＧＴＣＡ ｔａｔａｔａｔａｔａ ＡＧＧＴＣＡ ｇａｔｃａａｃ（配列番号２０）；
ＤＲ−１５：ｃａｔａｇｔｃＡＧＧＴＣＡ ｔａｇｔａｇｔａｇｔａｇｔａｇ ＡＧＧＴＣＡ ｇａｔｃａａｃ（配列番号２１）。
ＧＡＬ４−ＳＸＲは、配列番号２の１０７〜４３４番をｐＣＭＸ−ＧＡＬ４中にサブクローニングすることによって構築した（上記Ｐｅｒｌｍａｎｎ、１９９３年）。
【０１００】
同様に、ＰＸＲ．１蛋白質コード領域をＰＣＲにより増幅してｐＣＤＧ１中のＮｃｏＩ−ＢａｍＨＩ切断部位にサブクローニングし、１０４〜４３１番のアミノ酸をＣＭＸ−ＧＡＬ４中にサブクローニングした。リポータープラスミドは、反応因子の３個のコピーを合成し、ｐＴＫ−ｌｕｃ中のＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩ切断部位にサブクローニングすることによって構築した（Ｈｏｌｌｅｎｂｅｒｇら、Ｃｅｌｌ ４９：３９−４６、１９８７年）。
【０１０１】
レジン−活性炭で不要物を除去した１０％ウシ血清（ＣＢＳ）を含有するＤｕｌｂｅｃｃｏの改良イーグル培地中で、ＣＶ−１細胞を維持した。（Ｂｌｕｍｂｅｒｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）９３：４８７３−４８７８、１９９６年）の記載に従い、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｂｉｏｍｅｋ １０００ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎを利用して、９６穴プレートに入れたレジン−活性炭で不要物を除去した１０％ウシ胎児血清を含有するＤＭＥＭ中の５ （ｇ／ｍｌの濃度の１，２−ビス（オレオイルオキシ）−３−（トリメチルアンモニオ）プロパン（ＤＯＴＡＰ）試薬（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｈｅｉｍ）を使用し、リポソームによる一時トランスフェクションを実施した。翌日、脂質除去した１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含有するＤＭＥＭ中に被験リガンド添加した。１８〜２４時間インキュベートした後、細胞を溶解し、（上記Ｂｌｕｍｂｅｒｇ、１９９６年）の記載に従ってルシフェラーゼリポーター遺伝子アッセイおよびβ−ガラクトシダーゼトランスフェクション対照アッセイを実施した。リポーター遺伝子の発現をβ−ガラクトシダーゼトランスフェクション対照に対して正規化し、β−ガラクトシダーゼ活性の１分間当たりの吸光度単位当たり相対的光学単位、あるいは溶媒対照に対する誘導倍率として表した。各データ点はトリプリケート実験の平均値＋／−標準誤差を表し、独立した実験において反復した。
【０１０２】
（例３）
（細胞培養およびトランスフェクション試験）
ＳＸＲの活性がリガンド依存性であるかどうか検討するために、トランスフェクションアッセイにおいて天然型および合成型の物質の混合物がＳＸＲを活性化する作用をもつかどうか試験した。すなわち、ＳＸＲの蛋白質コード領域をＰＣＲにより増幅し、ベクターｐＣＤＧ１のＮｃｏＩおよびＢａｍＨＩ部位中にサブクローニングした（上記Ｂｌｕｍｂｅｒｇら、）。この過程の間に、推定上のイニシエーターＬｅｕをＫｏｚａｋの共通配列ＣＣＡＴＧＧによってＭｅｔに変換した。
【０１０３】
ＧＡＬ４−ＳＸＲは、ＳＸＲの１３４〜４４６番のアミノ酸残基をｐＣＭＸ−ＧＡＬ４中にサブクローニングすることによって構築した（上記Ｐｅｒｌｍａｎｎ、を参照）。レジン−活性炭で不要物を除去した１０％ウシ血清を含有するＤＭＥＭ中で、ＣＶ−１細胞を維持した。Ｂｌｕｍｂｅｒｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）９３：４８７３（１９９６年）の記載に従い、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｂｉｏｍｅｋ １０００ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎを利用して、９６穴プレートに入れたレジン−活性炭で不要物を除去した１０％ウシ胎児血清を含有するＤＭＥＭ中の５ｍｇ／ｍｌの濃度のＤＯＴＡＰ試薬（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｈｅｉｍ）を使用し、リポソームによる一時トランスフェクションを実施した。
【０１０４】
翌日、脂質除去した１０％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭ中に、リガンドを添加した。１８〜２４時間インキュベートした後、細胞を溶解し、上記Ｂｌｕｍｂｅｒｇ（１９９６年）の記載に従ってルシフェラーゼリポーター遺伝子アッセイおよびβ−ガラクトシダーゼトランスフェクション対照アッセイを実施した。リポーター遺伝子の発現をβ−ガラクトシダーゼトランスフェクション対照に対して正規化し、β−ガラクトシダーゼ活性の１分間当たりのＯ．Ｄ．当たり相対的光学単位、あるいは溶媒対照に対する誘導倍率として表した。各データ点（図２参照）はトリプリケート実験の平均値＋／−標準誤差を表し、独立した実験において反復した。
【０１０５】
（例４）
（ＤＮＡ結合分析）
ｉｎ ｖｉｔｒｏで転写され翻訳された蛋白質（ＴＮＴ、Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて、電気泳動移動シフトアッセイを実施した。蛋白質（各１ μｌ）を１０ ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８、１００ ｍＭ ＫＣｌ、６％グリセロール、０．０５％ＮＰ−４０、１ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ）、１００ ｎｇ／μｌポリｄＩ：ｄＣ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）中で室温において１００，０００ ｃｐｍのクレノーラベルしたプローブと共に２０分間インキュベートした後、０．５倍のＴＢＥ（４５ ｍＭ Ｔｒｉｓ塩基、４５ ｍＭホウ酸、１ｍＭエチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）中５％ポリアクリルアミドゲルを用いて室温で電気泳動した。競合結合のために、蛋白質と５倍あるいは５０倍過剰なモル数のラベルしていないオリゴヌクレオチドとを１０分間氷上でプレインキュベートした後、ラベルしたプローブを添加し、室温で２０分間インキュベートした。電気泳動は、上述の方法で行った。試験に使用したＩＲシリーズのオリゴヌクレオチドの配列は次のとおりであった：
ＩＲ−０、ａｇｃｔｔＡＧＧＴＣＡＴＧＡＣＣＴａ（配列番号２５）；
ＩＲ−１、 ａｇｃｔｔＡＧＧＴＣＡｇＴＧＡＣＣＴａ（配列番号２６）；
ＩＲ−２、ａｇｃｔｔＡＧＧＴＣＡｃｇＴＧＡＣＣＴａ（配列番号２７）；
ＩＲ−３、ａｇｃｔｔＡＧＧＴＣＡｃａｇＴＧＡＣＣＴａ（配列番号２８）；
ＩＲ−４、ａｇｃｔｔＡＧＧＴＣＡｃａｔｇＴＧＡＣＣＴａ（配列番号２９）；
ＩＲ−５、ａｇｃｔｔＡＧＧＴＣＡｃａｃｔｇＴＧＡＣＣＴａ（配列番号３０）；
ＩＲ−６、ａｇｃｔｔＴＧＡＡＣＴｃａａａｇｇＡＧＧＴＣＡ（配列番号３１）；および
ＩＲ−Ｍ、ａｇｃｔｔＡＣＧＴＣＡＴＧＡＣＧＴａ（配列番号３２）。
ＩＲ−Ｍヌクレオチド配列中には変異があるため、ヘテロダイマーの反応因子への結合が阻害された。
【０１０６】
試験に使用したＣＹＰ３Ａオリゴヌクレオチドの配列は次のとおりであった：
ＣＹＰ３Ａ４、ｔａｇａａｔａＴＧＡＡＣＴｃａａａｇｇＡＧＧＴＣＡｇｔｇａｇｔｇｇ（配列番号３１）；
ＣＹＰ３Ａ５、ｔａｇａａｔａＴＧＡＡＣＴｃａａａｇｇＡＧＧＴＡＡｇｃａａａｇｇｇ（配列番号３２）；および
ＣＹＰ３Ａ７、ｔａｇａａｔａＴＴＡＡＣＴｃａａｔｇｇＡＧＧＣＡｇｔｇａｇｔｇｇ（配列番号３３）。
【０１０７】
本分野の技術に熟達した者にとって、この発明の意図や範囲から逸脱することなくこの発明に様々な変更を加えることができ、添付の請求項の中で示した形態のみとして明細書の中で個々に開示した態様に加えてこの発明は種種の態様を包含することが明白に理解できるであろう。
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は、ＳＸＲが新しいオーファン各受容体であることを例証するものである。
【図１Ａ】
最長のＳＸＲ ｃＤＮＡクローン（配列番号１）とそれによってコードされる蛋白質（配列番号２のアミノ酸４１〜４３４番）である。ＤＮＡ結合領域（アミノ酸４１番〜１０７番）を太字で示してあり、推定上のイニシエーター、ロイシンを含む枠の中の上流終結コドンに星印を付けてある。このＬｅｕがイニシエーターとして機能し得ることは、ｉｎ ｖｉｔｒｏで転写され翻訳されたｃＤＮＡから産生された蛋白質をラベルしＳＤＳ−ＰＡＧＥを行うことによって証明した。修飾していないｃＤＮＡから得られた翻訳産物は、ロイシンをメチオニンに変更した場合に産生される産物と比較して、効率は落ちるものの、サイズの面ではほとんど区別のつかないものであった。
【図１Ｂ】
ＳＸＲと他のＲＸＲ（例えば、Ｘｅｎｏｐｕｓ安息香酸Ｘ受容体（ｘＢＸＲ）、ヒトビタミンＤ３受容体（ｈＶＤＲ）、ヒト活性受容体α（ｈＣＡＲα）、ラットｆａｍｅｓｏｉｄＸ受容体（ｒＦＸＲ）、ヒトペルオキシソーム増殖因子活性化受容体α（ｈＰＰＡＲα）、ヒト肝臓由来受容体Ｘ（ＬＸＲα）、ヒトレチン酸受容体α−１（ｈＲＡＲα−１）、ヒト甲状腺ホルモン受容体β（ｈＴＲβ）、ヒトレチノイドＸ受容体α（ＲＸＲα）およびヒトグルココルチコイド受容体α（ｈＧＲα））との比較の概略図である。正規の核受容体リガンド結合領域の境界の後に、リガンド結合領域の境界が続いている（Ｗｕｒｔｚら、Ｎａｔｕｒｅ Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ． ３：８７−９４、１９９６年）。ＲＸＲと他の受容体との間の相同性を、アミノ酸相同性百分率で表す（各クローンの上にアラビア数字で表示）。プログラムＧＡＰ（Ｄｅｖｅｒｅａｕｘら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １２：３８７−３９５、１９８４年）を利用して、配列中のアミノ酸残基を一列に並べた。ＤＮＡ＝ＤＮＡ結合領域、およびＬＩＧＡＮＤ＝リガンド結合領域。
【図２】
ＳＸＲが多くのステロイドによって活性化されることを示したものである。リポーター遺伝子ｔｋ（ＭＨ１００）４−ｌｕｃにより、ＧＡＬ４ ＤＮＡ結合領域とＳＸＲリガンド結合領域から構成されるキメラ受容体をＣＶ−１細胞中に同時にトランスフェクトした（Ｆｏｒｍａｎら、Ｃｅｌｌ ８１：５４１−５５０、１９９５年）。結果は５０ （Ｍのステロイドの場合の溶媒（ＤＭＳＯ）対照に対する誘導倍率として示し、トリプリケートでのアッセイから得られた平均値と標準誤差を表す。リポーター単独、あるいはリポーター＋ＧＡＬ４−ＤＢＤのどちらの場合も、これらの物質のいずれによっても活性化されなかった。カラム１＝溶媒；カラム２＝コルチコステロン；カラム３＝プレグネノロン；カラム４＝ジヒドロテストステロン（ＤＨＴ）；カラム５＝デヒドロエピアンドロステロン；カラム６＝プロゲステロン；カラム７＝デキサメタゾン；カラム７＝エストラジオール；カラム８＝コルチゾル；およびカラム９＝コルチゾン。
【図３】
ステロイド活性化物質が相加的に作用し得るかどうかを示すものである。すなわち、完全長のＳＸＲとリポーターｔｋ（ＬＸＲＥ）３−ｌｕｃを用いて、ステロイド活性化物質が相加的に作用し得るかどうか試験した（Ｗｉｌｌｙら、Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ． ９：１０３３（１９９５年）参照）。混合液中には、各ステロイド１０ ｍＭずつを添加し、ステロイドの総濃度が１００ ｍＭとなるようにした。混合液とその各成分について、１００、１０および１ｍＭの濃度で試験を行った；１００ ｍＭの混合液と１０ ｍＭステロイド成分による結果を図に示す。
【図４】
ＳＸＲの幅広い活性化物質特異性および反応因子特異性について示すものである。同時トランスフェクション実験において、完全長のＳＸＲが５０ ｍＭの各種ステロイドに反応して図３と同様の因子を活性化することができるかどうか検討した。ＤＲ−１、２と、ＴＲＥＰがごくわずかに活性化されただけであったため、結果はコルチコステロンとＰＣＮに関してのみ示す。示したデータは、トリプリケートアッセイから得られた溶媒対照＋／−標準誤差に対する平均誘導倍率として表す。
【図５】
さらに、ＳＸＲの幅広いリガンド特異性について示す。すなわち、４−５の二重結合が還元されてもコルチコステロンは不活化しないことが明らかである。コルチコステロンの６β水酸化型、非還元型、５αおよび５β還元型について、５０ ｍＭの濃度でｔｋ（ＭＨ１００）４−ｌｕｃ上のＧＡＬ−ＳＸＲおよびＭＴＶ−ｌｕｃ上のｈＧＲａを活性化し得るかどうか試験した。完全長ＳＸＲを使用して、同様の結果が得られた。
【図６】
図６Ａ−Ｃは、ＳＸＲが各種のステロイドおよび生体異物により誘導されるＰ４５０酵素中に見られる反応因子を活性化し得ることを示す一連の図である。
【図６Ａ】
誘導されるチトクロームＰ４５０酵素中に見られる反応因子をコードするヌクレオチドを比較した略図である。配列ＲＧＫＴＣＡの反復に関するデータベース検索を行った結果、肝臓でのステロイド水酸化に関与する酵素に関してある程度の対応性があることが示される。Ｐ４５０酵素については、標準的な命名法を用いている。Ｐ４５０Ｒは、ステロイドの水酸化のために必要な単一のＰ４５０オキシドリダクターゼである。ＵＧＴ１Ａ６は、グルクロン酸と水酸化されたステロイドとを抱合させるラットのウリジン二リン酸（ＵＤＰ）−グルクロノシルトランスフェラーゼである。
【図６Ｂ】
ヒトＣＹＰ３遺伝子中に見られる保存されたグルココルチコイド反応因子を比較した略図である。ここに示すヒトＣＹＰ３Ａ４の領域は、グルココルチコイドおよびリファンピシンが完全長のプロモーターを誘導するのに必要かつ十分な領域である。ＣＹＰ３Ａ５およびＣＹＰ３Ａ７の対応領域も示す（Ｂａｒｗｉｃｋら、Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． ５０：１０−１６、１９９６年）。
【図６Ｃ】
ＳＸＲが誘導可能な、そして誘導不能ではないＣＹＰ３プロモーター因子を通じて活性化し得ることを示す棒グラフである。ＳＸＲが各種誘導物質に反応してｔｋ−ＣＹＰ３−ｌｕｃ反応因子を活性化し得るかどうか、試験した。結果は物質が５０ （Ｍである場合を示し、トリプリケートによる測定の平均値を表す。
□＝リファンピシン；および■＝コルチコステロン
【図７】
図７Ａ−Ｃは、一連の物質が核受容体大グループの代表的な３種類の受容体であるヒトＳＸＲ（図５Ａ）；マウスＰＸＲ（図５Ｂ）；およびヒトエストロゲン受容体α（ｈＥＲα）を活性化する能力について示した棒グラフである。結果は、タモキシフェンの濃度が５ （Ｍであった以外は、試験に使用した物質の５０ （Ｍの濃度の場合を示す；デキサメタゾン（ＤＥＸ）の濃度は、図７Ａおよび７Ｂにおいて５０ （Ｍ、そして図７Ｃにおいては５ （Ｍであった。カラム１＝溶媒；カラム２＝リファンピシン；カラム３＝ニフェジピン；カラム４＝タモキシフェン；カラム５＝スピロノラクトン；カラム６＝ＰＣＮ；カラム７＝ＤＥＸ；カラム８＝コルチコステロン；カラム９＝コルチゾン；カラム１０＝ＤＨＴ；カラム１１＝エストラジオール；カラム１２＝ＤＥＳ；およびカラム１３＝クメストロール。
【図７Ｄ】
４−５の二重結合が還元されてもコルチコステロンはｈＳＸＲの作動薬として物質を不活化しないことを示す棒グラフである。コルチコステロンの６β水酸化型、非還元型、５αおよび５β還元型について、５０ ｍＭの濃度でｔｋ（ＭＨ１００）４−ｌｕｃ上のＧＡＬ−ＳＸＲ（５個のカラムの左側）およびＭＴＶ−ｌｕｃ上のｈＧＲα（５個のカラムの右側）を活性化し得るかどうか試験した。完全長ＳＸＲを使用して、同様の結果が得られた。各カラムとも：カラム１＝溶媒；カラム２＝コルチコステロン；カラム３＝５α−テトラヒドロコルチコステロン；カラム４＝５β−テトラヒドロコルチコステロン；およびカラム５＝６β−ＯＨ−コルチコステロン。
【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ｃ】
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【図７】
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【図７Ｄ】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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