(57)【要約】本発明は、β−ラクタマーゼ領域とＶｐｒ領域またはＶｐｘ領域とを含むキメラタンパク質に関する。前記キメラタンパク質はウイルスリポーター粒子に充填され、前記ウイルス粒子により認識される細胞に導入され、細胞内β−ラクタマーゼ活性を与えることができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
β−ラクタマーゼ領域である第１領域、及び前記第１領域のカルボキシ側にある、Ｖｐｒ領域またはＶｐｘ領域のいずれかである第２領域を含み、前記キメラタンパク質は侵入コンピテントレンチウイルス粒子中に充填され得、前記キメラタンパク質はβ−ラクタマーゼ活性を有することを特徴とするキメラタンパク質。
【請求項２】
前記侵入コンピテントレンチウイルス粒子がヒト免疫不全ウイルスであることを特徴とする請求の範囲第１項に記載のキメラタンパク質。
【請求項３】
前記キメラタンパク質が第１領域と第２領域の間にヒト免疫不全ウイルスプロテアーゼ認識部位を含まないことを特徴とする請求の範囲第２項に記載のキメラタンパク質。
【請求項４】
第１領域がＶｐｒ領域であることを特徴とする請求の範囲第３項に記載のキメラタンパク質。
【請求項５】
第１領域がＶｐｘ領域であることを特徴とする請求の範囲第３項に記載のキメラタンパク質。
【請求項６】
前記キメラタンパク質が配列番号２のアミノ酸配列からなることを特徴とする請求の範囲第３項に記載のキメラタンパク質。
【請求項７】
請求の範囲第１項〜第６項のいずれか１項に記載のキメラタンパク質を発現する核酸を含むことを特徴とする発現ベクター。
【請求項８】
請求の範囲第２項〜第６項のいずれか１項に記載のキメラタンパク質、１つ以上のウイルスエンベロープ糖タンパク質、脂質二分子層、ヒト免疫不全ウイルスマトリックスキャプシド、ヒト免疫不全ウイルスキャプシド、ヒト免疫不全ウイルスヌクレオキャプシド及びヒト免疫不全ウイルスＣ末端ｐ６ドメインを含むことを特徴とする侵入コンピテントウイルスリポーター粒子。
【請求項９】
前記１つ以上のエンベロープ糖タンパク質が水疱性口内炎ウイルスＧ糖タンパク質であることを特徴とする請求の範囲第８項に記載のウイルス粒子。
【請求項１０】
前記１つ以上のエンベロープ糖タンパク質がＨＩＶ  ｇｐ１２０及びＨＩＶ  ｇｐ４１であることを特徴とする請求の範囲第８項に記載のウイルス粒子。
【請求項１１】
前記粒子が複製インコンピテントであることを特徴とする請求の範囲第１０項に記載のウイルス粒子。
【請求項１２】
ＨＩＶ  ｇｐ１２０がＣＣＲ５向性であることを特徴とする請求の範囲第１０項に記載のウイルスリポーター粒子。
【請求項１３】
ＨＩＶ  ｇｐ１２０がヒト免疫不全ウイルスＢａｌ、ＪＲＦＬ、ＳＦ１６２またはＹＵ２由来であることを特徴とする請求の範囲第１２項に記載のウイルスリポーター粒子。
【請求項１４】
ＨＩＶ  ｇｐ１２０がＣＸＣＲ４向性であることを特徴とする請求の範囲第１０項に記載のウイルスリポーター粒子。
【請求項１５】
ＨＩＶ  ｇｐ１２０がヒト免疫不全ウイルスＮＬ４−３、Ｒ８またはＭＮ由来であることを特徴とする請求の範囲第１４項に記載のウイルスリポーター粒子。
【請求項１６】
前記１つ以上のエンベロープ糖タンパク質が初代ヒト免疫不全ウイルス単離物から得られるｇｐ１６０から生成されることを特徴とする請求の範囲第１０項に記載のウイルスリポーター粒子。
【請求項１７】
前記１つ以上のエンベロープ糖タンパク質がマウス白血病ウイルスエンベロープ糖タンパク質であることを特徴とする請求の範囲第８項に記載のウイルスリポーター粒子。
【請求項１８】
前記１つ以上のエンベロープ糖タンパク質がＨＣＶ  Ｅ１及びＥ２であることを特徴とする請求の範囲第８項に記載のウイルスリポーター粒子。
【請求項１９】
ヒト免疫不全ウイルスマトリックスキャプシド、ヒト免疫不全ウイルスキャプシド、ヒト免疫不全ウイルスヌクレオキャプシド及びヒト免疫不全ウイルスＣ末端ｐ６ドメインがすべてＨＩＶ  Ｒ８由来であることを特徴とする請求の範囲第８項に記載のウイルスリポーター粒子。
【請求項２０】
ａ）請求の範囲第１項〜第６項のいずれか１項に記載のキメラタンパク質と共に１つ以上のエンベロープ糖タンパク質を含む侵入コンピテントウイルスリポーター粒子を作成するのに必要な成分を含むキメラタンパク質を発現する１つ以上の核酸を用いて細胞を同時トランスフェクトするステップ、及び
ｂ）ステップａ）で同時トランスフェクトした細胞をウイルス生成条件下で増殖させて、前記ウイルス粒子を作成するステップ
を含む方法により作成され、前記キメラタンパク質はウイルスリポーター粒子により充填され、β−ラクタマーゼ活性を有することを特徴とする侵入コンピテントウイルスリポーター粒子。
【請求項２１】
１つ以上の発現ベクター上に１つ以上の核酸が存在することを特徴とする請求の範囲第２０項に記載のウイルスリポーター粒子。
【請求項２２】
前記成分がＨＩＶ  Ｒ８由来であることを特徴とする請求の範囲第２１項に記載のウイルスリポーター粒子。
【請求項２３】
前記方法が更にウイルス粒子を精製するステップを含むことを特徴とする請求の範囲第２１項に記載のウイルスリポーター粒子。
【請求項２４】
前記１つ以上のエンベロープ糖タンパク質が水泡性口内炎ウイルスＧ糖タンパク質であることを特徴とする請求の範囲第２１項に記載のウイルスリポーター粒子。
【請求項２５】
前記１つ以上のエンベロープ糖タンパク質がＨＩＶ  ｇｐ１２０及びＨＩＶ  ｇｐ４１であることを特徴とする請求の範囲第２１項に記載のウイルスリポーター粒子。
【請求項２６】
ＨＩＶ  ｇｐ１２０がＣＣＲ５向性であることを特徴とする請求の範囲第２５項に記載のウイルスリポーター粒子。
【請求項２７】
ＨＩＶ  ｇｐ１２０がヒト免疫不全ウイルスＢａｌ、ＪＲＦＬ、ＳＦ１６２またはＹＵ２由来であることを特徴とする請求の範囲第２６項に記載のウイルスリポーター粒子。
【請求項２８】
ＨＩＶ  ｇｐ１２０がＣＸＣＲ４向性であることを特徴とする請求の範囲第２５項に記載のウイルスリポーター粒子。
【請求項２９】
ＨＩＶ  ｇｐ１２０がヒト免疫不全ウイルスＮＬ４−３、Ｒ８またはＭＮ由来であることを特徴とする請求の範囲第２８項に記載のウイルスリポーター粒子。
【請求項３０】
前記１つ以上のエンベロープ糖タンパク質が初代ヒト免疫不全ウイルス単離物から得られるｇｐ１６０から生成されることを特徴とする請求の範囲第２１項に記載のウイルスリポーター粒子。
【請求項３１】
前記１つ以上のエンベロープ糖タンパク質がマウス白血病ウイルスエンベロープ糖タンパク質であることを特徴とする請求の範囲第２１項に記載のウイルスリポーター粒子。
【請求項３２】
前記１つ以上のエンベロープ糖タンパク質がＨＣＶ  Ｅ１及びＥ２であることを特徴とする請求の範囲第２１項に記載のウイルスリポーター粒子。
【請求項３３】
ａ）（ｉ）請求の範囲第１項〜第６項のいずれか１項に記載のキメラタンパク質を含む侵入コンピテントウイルスリポーター粒子、（ｉｉ）標的細胞及び（ｉｉｉ）前記化合物を該化合物の非存在下で前記ウイルス粒子が標的細胞に侵入し得る条件下で混合するステップ、及び
ｂ）ウイルス侵入を阻止する化合物の能力の尺度として宿主細胞におけるβ−ラクタマーゼ活性を測定するステップ
を含むことを特徴とする細胞へのウイルス侵入を阻止する化合物の能力を調べる方法。
【請求項３４】
前記標的細胞が初代ヒト細胞であることを特徴とする請求の範囲第３３項に記載の方法。
【請求項３５】
前記ウイルスリポーター粒子がＲ８プロウイルスであることを特徴とする請求の範囲第３３項に記載の方法。
【請求項３６】
ａ）請求の範囲第１項〜第６項のいずれか１項に記載のキメラタンパク質を含むウイルスリポーター粒子を作成し得る組換え細胞を前記化合物の存在下でウイルス生成条件下で増殖させるステップ、及び
ｂ）成熟ウイルス増殖を阻止する化合物の能力の指標として、ステップａ）における宿主細胞にβ−ラクタマーゼ活性を与え得る侵入コンピテントウイルスの増殖を測定するステップ
を含むことを特徴とする成熟ウイルス増殖を阻止する化合物の能力を調べる方法。
【請求項３７】
前記組換え細胞が、キメラタンパク質と１つ以上のエンベロープ糖タンパク質を含む侵入コンピテントウイルスリポーター粒子を作成するのに必要な成分を同時発現する発現ベクターを１つ以上含むことを特徴とする請求の範囲第３６項に記載の方法。
【請求項３８】
前記ウイルスリポーター粒子がＲ８プロウイルスであることを特徴とする請求の範囲第３７項に記載の方法。
【請求項３９】
前記１つ以上のエンベロープ糖タンパク質が水泡性口内炎ウイルスＧ糖タンパク質であることを特徴とする請求の範囲第３７項に記載の方法。
【請求項４０】
前記１つ以上のエンベロープ糖タンパク質がＨＩＶ  ｇｐ１２０及びＨＩＶ  ｇｐ４１であることを特徴とする請求の範囲第３７項に記載の方法。
【請求項４１】
前記１つ以上のエンベロープ糖タンパク質がＨＣＶ  Ｅ１及びＥ２であることを特徴とする請求の範囲第３７項に記載の方法。
【請求項４２】
前記１つ以上のウイルスエンベロープ糖タンパク質がマウス白血病ウイルスエンベロープ糖タンパク質であることを特徴とする請求の範囲第３７項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
【背景技術】
【０００２】
本明細書中に引用した文献は本発明に対する従来技術とは認められない。
【０００３】
レンチウイルスはレトロウイルス科に属するウイルス属である。レンチウイルスは、該レンチウイルスに感染する宿主に基づいて分類され得る。レンチウイルスには、ウシレンチウイルス類、ウマレンチウイルス類、ネコレンチウイルス類、ヒツジ／ヤギレンチウイルス類及び霊長類レンチウイルス類が含まれる。霊長類レンチウイルス類は更にヒト免疫不全ウイルス１（ＨＩＶ−１）、ヒト免疫不全ウイルス２（ＨＩＶ−２）及びサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）に分けられる（ウイルス分類学(Virus Taxonomy)，ｖａｎ  Ｒｅｇｅｎｍｏｒｔｅｌら編，カリフォルニア州サンジェゴに所在のＡｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（２０００年）発行）。
【０００４】
レンチウイルスゲノムは、３’及び５’長末端反復（ＬＴＲ）配列と隣接している構造遺伝子及び補助遺伝子を含む。ＬＴＲ配列はコード化ポリペプチドの発現及びプロセッシングのために重要な領域を含む（Ｆｉｅｌｄのウイルス学(Field's Virology)，Ｆｉｅｌｄら編，第３版，ペンシルバニア州フィラデルフィァに所在のＬｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ（１９９６年）発行）。
【０００５】
レンチウイルス構造遺伝子はｇａｇ、ｐｏｌ及びｅｎｖである。これらの遺伝子は異なる前駆体ポリタンパク質をコードする。Ｇａｇ前駆体（Ｐｒ５５ｇａｇ）はマトリックス、キャプシド、ヌクレオキャプシド及びｐ６に変換される。Ｐｏｌ前駆体はプロテアーゼ、逆転写酵素及びインテグラーゼに変換される。Ｅｎｖ前駆体は糖タンパク質を形成するように変換される。
【０００６】
Ｇａｇ前駆体及びそのタンパク質分解産物はレンチウイルスビリオンの主要な構造成分である。細胞膜にＧａｇタンパク質が蓄積すると、細胞表面から出芽する未熟ビリオンが集まるようになる。新生ビリオンの内側では、Ｐｒ５５ｇａｇはプロテアーゼによりマトリックスキャプシド、ヌクレオキャプシド及びＣ末端ｐ６ドメインに分解される。Ｇａｐプロセッシングにより内部ビリオン構造が認識される（Ｗｅｉｇｅｒｓら，Ｊ．Ｖｉｒｉｏｌｏｇｙ，７２：２８４６−２８５４（１９９８））。
【０００７】
Ｐｒ５５ｇａｇは補助タンパク質Ｖｐｘ及びＶｐｒのビリオン取込みを助け、ＨＩＶ−１  Ｃ末端ｐ６ドメインはＶｐｒのビリオン取込みを助ける（Ｌａｖａｌｌｅｅら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６８：１９２６−１９３４（１９９４）；Ｐａｘｔｏｎら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６７：７２２９−７２３７（１９９３）；Ｌｕら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６７：６５４２−６５５０（１９９３））。また、ＨＩＶ−２  Ｇａｐポリタンパク質前駆体のＣ末端領域はＨＩＶ−２  Ｖｐｘの取込みを助ける（Ｗｕら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６８：６１６１−６１６９（１９９４））。
【０００８】
Ｖｐｘ及びＶｐｒはキメラタンパク質の成分として使用されてきた（Ｗｕら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６９：３３８９−３３９８（１９９５）；Ｗｕら，ＥＭＢＯ  Ｊｏｕｒｎａｌ，１６：５１１３−５１２２（１９９７）；Ｃｏｈｅｎら，米国特許第５，８６１，１６１号明細書；Ｓａｔｏら，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．，３９：１０１５−１０１９（１９９５）；Ｋｏｂｉｎｇｅｒら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７２：５４４１−５４４８（１９９８）；Ｙａｏら，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ，６：１５９０−１５９９（１９９９）；Ｌｉｕら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７１：７７０４−７７１０（１９９７）；Ｓｔａｕｂｅｒら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，２５８：６９５−７０２（１９９９））。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、β−ラクタマーゼ領域とＶｐｒ領域またはＶｐｘ領域のいずれかとを含むキメラタンパク質に関する。前記キメラタンパク質はウイルスリポーター粒子に充填され、ウイルス粒子により認識される細胞に導入され、細胞内β−ラクタマーゼ活性を与え得る。
【００１０】
Ｖｐｒ／Ｖｐｘ領域のβ−ラクタマーゼ領域への方向づけ及び両領域間のＨＩＶプロテアーゼ部位の存在が細胞内β−ラクタマーゼ活性の発現に影響を与えることが知見された。好ましい構築物はβ−ラクタマーゼ領域のカルボキシにＶｐｒ／Ｖｐｘ領域を含んでいた。更に、β−ラクタマーゼ領域からＶｐｒ領域の細胞内分解により生ずるＨＩＶプロテアーゼ部位により、β−ラクタマーゼ活性が低下した。より好ましい構築物ではＶｐｒ／Ｖｐｘ領域とβ−ラクタマーゼ領域の間にＨＩＶプロテアーゼ部位を欠いている。
【００１１】
本明細書に記載のウイルスリポーター粒子はレンチウイルスビリオン、好ましくはＨＩＶビリオンを主成分とする。前記ビリオンはβ−ラクタマーゼ−Ｖｐｒ／Ｖｐｘキメラタンパク質の挿入及び侵入コンピテントビリオンの作成に必要なウイルス成分を含む。
【００１２】
“侵入コンピテントビリオン”は、キメラタンパク質を細胞に侵入し得るように標的細胞と相互作用するβ−ラクタマーゼ−Ｖｐｒ／Ｖｐｘキメラタンパク質を含むビリオンである。侵入は、標的細胞上に存在する１つ以上の受容体を認識するビリオンエンベロープ糖タンパク質の１つ以上により媒介される。
【００１３】
ウイルスリポーター粒子は、ＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２のような特定レンチウイルス由来のエンベロープ糖タンパク質を含めたビリオン成分を含み得る。或いは、ウイルスリポーター粒子は、レンチウイルス遺伝子以外のウイルス由来のエンベロープ糖タンパク質で偽タイプされ得る。
【００１４】
従って、本発明の第１の態様は、β−ラクタマーゼ領域とＶｐｒまたはＶｐｘ領域とを含むキメラタンパク質に関する。前記のＶｐｒまたはＶｐｘ領域はβ−ラクタマーゼ領域のカルボキシ側にある。キメラタンパク質は侵入コンピテントレンチウイルス粒子中に充填され得、β−ラクタマーゼ活性を有する。
【００１５】
Ｖｐｒ／Ｖｐｘ領域は、天然に存在するレンチウイルス粒子のようなウイルスリポーター粒子、好ましくはＨＩＶ粒子にキメラタンパク質を指向させ得る。ＨＩＶのようなレンチウイルス粒子に充填され得る能力には、偽タイプしたＨＩＶ粒子のような他の粒子に充填され得る能力も含まれる。
【００１６】
本発明の別の態様は、キメラβ−ラクタマーゼ−Ｖｐｒ／Ｖｐｘタンパク質を発現する核酸を含む発現ベクターに関する。タンパク質を“発現する”とは、細胞内でタンパク質の機能的発現を与える調節要素の存在を意味する。
【００１７】
タンパク質の機能的発現に必要な調節要素は当業界で公知である。前記要素には、プロモーター及びリボソーム結合部位が含まれる。存在し得る別の要素には、オペレーター、エンハンサー及びポリアデニル化領域が含まれる。
【００１８】
本発明の別の態様は、キメラβ−ラクタマーゼ−Ｖｐｒ／Ｖｐｘタンパク質を含む侵入コンピテントウイルスリポーター粒子に関する。前記粒子は、（ａ）１つ以上のウイルスエンベロープ糖タンパク質、（ｂ）脂質二分子層、（ｃ）ＨＩＶマトリックスキャプシド、（ｄ）ＨＩＶキャプシド、（ｅ）ＨＩＶヌクレオキャプシド及び（ｆ）ＨＩＶ  Ｃ末端ｐ６ドメインをも含む。
【００１９】
本発明の別の態様は、
ａ）β−ラクタマーゼ−Ｖｐｒ／Ｖｐｘキメラタンパク質と共に１つ以上のエンベロープ糖タンパク質を含む侵入コンピテントウイルスリポーター粒子を作成するのに必要な成分を発現する１つ以上の核酸を細胞に同時トランスフェクトするステップ、及び
ｂ）ステップａ）で同時トランスフェクトした細胞をウイルス生成条件下で増殖させて、前記ウイルス粒子を作成するステップ
を含む方法により作成される侵入コンピテントウイルスリポーター粒子に関する。前記のβ−ラクタマーゼ−Ｖｐｒ／Ｖｐｘキメラタンパク質はウイルスリポーター粒子により充填され、β−ラクタマーゼ活性を有する。
【００２０】
本発明の別の態様は、細胞へのウイルス侵入を阻止する化合物の能力を調べる方法に関する。この方法は、
ａ）（ｉ）β−ラクタマーゼ活性を有するβ−ラクタマーゼ−Ｖｐｒ／Ｖｐｘタンパク質キメラタンパク質を含む侵入コンピテントウイルスリポーター粒子、（ｉｉ）標的細胞及び（ｉｉｉ）前記化合物を該化合物の非存在下で前記ウイルス粒子が標的細胞に侵入し得る条件下で混合するステップ、及び
ｂ）ウイルス侵入を阻止する化合物の能力の尺度として宿主細胞においてβ−ラクタマーゼ活性を測定するステップ
を含む。
【００２１】
本発明の別の態様は、化合物の成熟ウイルス増殖を阻止する能力の測定方法に関する。この方法は、
ａ）β−ラクタマーゼ−Ｖｐｒ／Ｖｐｘタンパク質キメラタンパク質を含むウイルス粒子を作成し得る組換え細胞を前記化合物の存在下でウイルス生成条件下で増殖させるステップ、及び
ｂ）成熟ウイルス増殖を阻止する化合物の能力の指標として、細胞に対してβ−ラクタマーゼ活性を与え得る侵入コンピテントウイルスの増殖を測定するステップ
を含む。ウイルス生成条件はビリオンの作成に適合する条件である。
【００２２】
本発明の他の特徴及び作用効果は、複数の実施例を含めた本明細書中の記載から明らかである。本明細書の実施例は本発明を実施する際に有用な化合物及び方法を示すものであり、これらの実施例は本発明を限定するものではない。本明細書の記載に基づいて。当業者は本発明を実施するために有用な他の成分及び方法を特定、使用することができる。
【００２３】
（発明の詳細説明）
キメラβ−ラクタマーゼ−Ｖｐｒ／Ｖｐｘタンパク質は、侵入コンピテントビリオンの作成及び前記ビリオンの細胞感染能力を調べるアッセイのための有用なリポーターを提供する。前記アッセイは、基本的研究の道具として、抗ウイルス化合物を得るための道具として及び抗ウイルス化合物を評価するための道具としての使用を含めた各種用途に使用される。基本研究用途は更にウイルスの構築及びウイルスと細胞の相互作用を含む。
【００２４】
抗ウイルス化合物を入手、評価することは治療上有意義である。ビリオンの形成または前記ビリオンの細胞感染能力を阻止する化合物は抗ウイルス治療上有用であり得る。前記治療はウイルス感染を受けている患者に対して施されても、または予防処置であってもよい。病気を患っている患者を治療すると、その病気の進行を止めたり、遅らせられる。予防処置により、病気の発症及び重篤化が抑えられる。
【００２５】
キメラβ−ラクタマーゼ−Ｖｐｒ／Ｖｐｘタンパク質
キメラβ−ラクタマーゼ−Ｖｐｒ／Ｖｐｘは２つの成分、すなわち（１）検出可能な酵素活性を与えるβ−ラクタマーゼ領域及び（２）タンパク質をビリオンに標的するＶｐｒまたはＶｐｘ領域を有する。β−ラクタマーゼ−Ｖｐｒ／Ｖｐｘタンパク質は、宿主侵入の際に検出可能な細胞内β−ラクタマーゼ活性を生ずるのに十分な数ビリオンに組込むために適正なサイズを有する。
【００２６】
Ｖｐｒ／Ｖｐｘ領域及びβ−ラクタマーゼ領域は直接相互に結合されても、またはポリペプチドリンカーにより結合されてもよい。好ましい方向はβ−ラクタマーゼ領域のカルボキ側にＶｐｒ／Ｖｐｘ領域を有する。
【００２７】
任意に存在するポリペプチドリンカーの大きさ及び配列は、ビリオン内に充填される特定のβ−ラクタマーゼ−Ｖｐｒ／Ｖｐｘタンパク質の能力に実質的な影響を与えず、細胞内β−ラクタマーゼ活性を有するように選択されなければならない。それぞれの実施態様では、リンカーは約２〜約５０個のアミノ酸、約２〜約２０個のアミノ酸、約２〜約１０個のアミノ酸、約２個のアミノ酸である。リンカーがＨＩＶプロテアーゼ認識配列を含まないことが好ましい。
【００２８】
Ｖｐｒ／Ｖｐｘ領域
キメラβ−ラクタマーゼ−Ｖｐｒ／Ｖｐｘタンパク質はビリオン充填のために十分なＶｐｒまたはＶｐｘ領域を含む。好ましい実施態様では、ＨＩＶ由来のＶｐｒ領域が存在する。
【００２９】
Ｖｐｒは通常ＨＩＶ−１を含めた霊長類レンチウイルス中に存在しており、ウイルス粒子中にトランスで取込まれる。β−ラクタマーゼ−Ｖｐｒ／Ｖｐｘキメラタンパク質中に存在するＶｐｒ領域は、レンチウイルスビリオン、好ましくはＨＩＶ−１ビリオンにより充填され得るようにＧａｇポリタンパク質前駆体と相互作用し得る。ＨＩＶビリオンによる充填能力には他の種類のビリオンによる充填能力が含まれる。
【００３０】
好適なＶｐｒ領域には、天然に存在するＶｐｒ領域及びＧａｇポリタンパク質前駆体と相互作用し得るその機能誘導体が含まれる。天然に存在するＶｐｒ領域の各種改変のＧａｇポリタンパク質前駆体との相互作用能力への影響及びビリオンによる充填能力は当業界で公知である（例えば、Ｐａｘｔｏｎら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６７：６５４２−６５５０（１９９３）；Ｙａｏら，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ，６：１５９０−１５９９（１９９６）；Ｓａｔｏら，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，３９：１０１５−１０１９（１９９５）；Ｃｏｈｅｎら，米国特許第５，８６１，１６１号明細書参照）。存在するＶｐｒ領域がＮ末端α−らせん領域を含むことが好ましい。
【００３１】
ＶｐｘはＨＩＶ−２中に存在する。Ｖｐｘのビリオンにより充填される能力に対する各種Ｖｐｘアミノ酸または領域の重要性は当業界で公知である（例えば、Ｓａｔｏら，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，３９：１０１５−１０１９（１９９５）；Ｃｏｈｅｎら，米国特許第５，８６１，１６１号明細書参照）。存在するＶｐｘ領域がＮ末端α−らせん領域を含むことが好ましい。
【００３２】
β−ラクタマーゼ
β−ラクタマーゼ領域は検出可能な細胞内β−ラクタマーゼ活性を与える。このβ−ラクタマーゼ活性はセファロスポリン中に存在するβ−ラクタム環の切断を触媒する。
【００３３】
β−ラクタマーゼ領域は、例えば当業界で公知のβ−ラクタマーゼ及びその機能誘導体からもたらされ得る。Ａｍｂｌｅｒ，Ｐｈｉｌ．Ｔｒａｎｓ  Ｒ．Ｓｏｃ．Ｌｏｎｄ．，Ｓｅｒ．Ｂ．２８９：３２１−３３１（１９８０）のような文献には天然に存在するβ−ラクタマーゼが例示されている。
【００３４】
機能誘導体
機能誘導体は天然に存在する配列を改変することにより製造され得る。一般的な改変の例には、１つ以上のアミノ酸またはアミノ酸領域の置換、欠失及び付加が含まれる。機能誘導体は、天然に存在する配列をコードする核酸配列を修飾し、その修飾核酸を発現させることにより製造され得る。タンパク質を製造及び精製するための組換え技術は当業界で公知である（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ，「分子生物学の現在のプロトコル(Current Protocols in Molecular Biology)」，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ，１９８７−１９９８；Ｓａｍｂｒｏｏｋら，「分子クローニング，実験マニュアル(Molecular Cloning, A Laboratory Manual)」，第２版，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９年）発行参照）
改変タンパク質を設計する１つの方法はアミノ酸Ｒ基を考慮することである。アミノ酸Ｒ基はアミノ酸の諸特性、例えば物理的サイズ、電荷及び疎水性に影響を及ぼす。アミノ酸は以下のように複数のグループに分類され得る：中性で疎水性（アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、トリプトファン、フェニルアラニン及びメチオニン）；中性で極性（グリシン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン、アスパラギン及びグルタミン）；塩基性（リシン、アルギニン及びヒスチジン）；及び酸性（アスパラギン酸及びグルタミン酸）。
【００３５】
通常、アミノ酸を置換するときには類似の特性を有するアミノ酸を交換することが好ましい。特定グループ内でアミノ酸を置換する、例えばロイシンをバリン、リシンをアルギニン、グルタミンをアスパラギンで置換することはポリペプチド機能を変化させない良好な候補である。
【００３６】
別のアミノ酸基の範囲外も変化させ得る。好ましくは、前記変化はポリペプチド中の置換させるアミノ酸の位置を考慮してなされ得る。例えば、アルギニンは長い脂肪族側鎖を有しているので、ポリペプチドの内部の非極性アミノ酸をグルタメートよりもより自由に置換し得る（Ａｕｓｕｂｅｌ，「分子生物学の現在のプロトコル(Current Protocols in Molecular Biology)」，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ，１９８７−１９９８，別冊３３，付録１Ｃ）。
【００３７】
誘導体は細胞内活性を高めるようにも製造され得る。そのような誘導体の例はＴＥＭ−１  β−ラクタマーゼの誘導体である（Ｋａｄｏｎａｇａら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５９：２１４９−２１５４（１９８４））。ＴＥＭ−１  β−ラクタマーゼはシグナル配列が欠失している大腸菌β−ラクタマーゼの誘導体である。シグナル配列が欠失すると細胞質蓄積が増加する。
【００３８】
ポリペプチド製造
β−ラクタマーゼ−Ｖｐｒ／Ｖｐｘキメラタンパク質は該タンパク質をコードする核酸を用いて組換え法により製造され得る。キメラタンパク質をコードする核酸は宿主ゲノムに挿入しても発現ベクターの一部であってもよい。
【００３９】
好ましくは、発現ベクターはβ−ラクタマーゼ−Ｖｐｒ／Ｖｐｘキメラタンパク質を製造するために使用される。発現ベクターはポリペプチドをコードする核酸と共に適切な転写及びプロセッシングのための調節要素を含む。発現ベクターが宿主細胞における自己複製のための複製源、選択マーカー、限定数の有用な制限酵素部位及び高コピー数のポテンシャルをも含むことが好ましい。発現ベクターの例はクローニングベクター、修飾クローニングベクター、特別に設計したプラスミド及びウイルスである。
【００４０】
特定のアミノ酸配列から遺伝子コードの公知の縮重を用いて、多種多様のコード化核酸配列を入手することができる。遺伝子コードの縮重は、殆どすべてのアミノ酸がヌクレオチドトリプレット、すなわちコドンのいろいろな組合せによりコードされるために生ずる。特定コドンの特定アミノ酸への翻訳は当業界で公知である（例えば、Ｌｅｗｉｎ，ＧＥＮＥＳ  ＩＶ，ｐ．１１９，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９９０年）発行参照）。アミノ酸は以下のようにコドンによりコードされる：
Ａ＝Ａｌａ＝アラニン：コドン  ＧＣＡ，ＧＣＣ，ＧＣＧ，ＧＣＵ；
Ｃ＝Ｃｙｓ＝システイン：コドン  ＵＧＣ，ＵＧＵ；
Ｄ＝Ａｓｐ＝アスパラギン酸：コドン  ＧＡＣ，ＧＡＵ；
Ｅ＝Ｇｌｕ＝グルタミン酸：コドン  ＧＡＡ，ＧＡＧ；
Ｆ＝Ｐｈｅ＝フェニルアラニン：コドン  ＵＵＣ，ＵＵＵ；
Ｇ＝Ｇｌｙ＝グリシン：コドン  ＧＧＡ，ＧＧＣ，ＧＧＧ，ＧＧＵ；
Ｈ＝Ｈｉｓ＝ヒスチジン：コドン  ＣＡＣ，ＣＡＵ；
Ｉ＝Ｉｌｅ＝イソロイシン：コドン  ＡＵＡ，ＡＵＣ，ＡＵＵ；
Ｋ＝Ｌｙｓ＝リシン：コドン  ＡＡＡ，ＡＡＧ；
Ｌ＝Ｌｅｕ＝ロイシン：コドン  ＵＵＡ，ＵＵＧ，ＣＵＡ，ＣＵＣ，ＣＵＧ，ＣＵＵ；
Ｍ＝Ｍｅｔ＝メチオニン：コドン  ＡＵＧ；
Ｎ＝Ａｓｎ＝アスパラギン：コドン  ＡＡＣ，ＡＡＵ；
Ｐ＝Ｐｒｏ＝プロリン：コドン  ＣＣＡ，ＣＣＣ，ＣＣＧ，ＣＣＵ；
Ｑ＝Ｇｌｎ＝グルタミン：コドン  ＣＡＡ，ＣＡＧ；
Ｒ＝Ａｒｇ＝アルギニン：コドン  ＡＧＡ，ＡＧＧ，ＣＧＡ，ＣＧＣ，ＣＧＧ，ＣＧＵ；
Ｓ＝Ｓｅｒ＝セリン：コドン  ＡＧＣ，ＡＧＵ，ＵＣＡ，ＵＣＣ，ＵＣＧ，ＵＣＵ；
Ｔ＝Ｔｈｒ＝スレオニン：コドン  ＡＣＡ，ＡＣＣ，ＡＣＧ，ＡＣＵ；
Ｖ＝Ｖａｌ＝バリン：コドン  ＧＵＡ，ＧＵＣ，ＧＵＧ，ＧＵＵ；
Ｗ＝Ｔｒｐ＝トリプトファン：コドン  ＵＣＧ；及び
Ｙ＝Ｔｙｒ＝チロシン：コドン  ＵＡＣ，ＵＡＵ。
【００４１】
ウイルスリポーター粒子
リポーター粒子は標的細胞を認識し、β−ラクタマーゼ−Ｖｐｒ／Ｖｐｘキメラタンパク質を細胞に送達し得る。標的細胞は粒子糖タンパク質により認識される。リポーター粒子は、存在する他のウイルス成分と元々関連する糖タンパク質を用いて作成され得る。リポーター粒子はまた、存在する他のウイルス成分と元々関連しない糖タンパク質を含むように偽タイプされ得る。
【００４２】
宿主細胞でのウイルス粒子の作成はＧａｇポリタンパク質により媒介される。生じた粒子は細胞膜でのウイルス出芽により生じ、糖タンパク質を取込んだ脂質二重膜を含む。取込まれた糖タンパク質によりウイルス粒子の宿主特異性が決まる。
【００４３】
好ましくは、リポーター粒子はβ−ラクタマーゼ−Ｖｐｒ／Ｖｐｘキメラタンパク質、１つ以上のウイルスエンベロープ糖タンパク質、脂質二重層、ＨＩＶマトリックスキャプシド、ＨＩＶキャプシド、ＨＩＶヌクレオキャプシド及びＨＩＶ  Ｃ末端ｐ６ドメインを含むＨＩＶ粒子である。ウイルス粒子の細胞特異性に影響を及ぼすいろいろなタイプのウイルスエンベロープタンパク質が存在し得る。
【００４４】
ウイルス粒子中に存在するＨＩＶ成分は、天然に存在する成分またはその機能誘導体を指す。機能誘導体は天然に存在する配列をベースとし、ウイルス粒子の形成にもウイルス粒子の細胞感染能力に実質的に影響を及ぼさない１つ以上の改変を含む。β−ラクタマーゼ−Ｖｐｒ／Ｖｐｘキメラタンパク質の充填及び細胞感染または侵入に関する誘導体の能力は下記実施例に記載されているような方法を用いて評価され得る。
【００４５】
ＨＩＶウイルス成分の配列変更は当業界で公知である。各種配列変更はＨＩＶウイルス成分として及び機能誘導体を製造するための出発点として機能し得る別の配列の例を与える。
【００４６】
存在し得るウイルスエンベロープ糖タンパク質には、別のレンチウイルス由来のもの及び他のタイプのウイルス由来のものが含まれる。好ましいレンチウイルス糖タンパク質はＨＩＶ  ｇｐ１２０及びＨＩＶ  ｇｐ４１である。ＨＩＶエンベロープ糖タンパク質は、単球由来マクロファージ、Ｔリンパ球細胞及び特定の形質転換細胞株の初代培養物のような各種細胞タイプを標的する。別の実施態様では、ＨＩＶ  ｇｐ１２０はＣＣＲ５向性であり、その例にはＨＩＶ  Ｂａｌ、ＪＲＦＬ、ＳＦ１６２及びＹＵ２由来のＨＩＶ  ｇｐ１２０が含まれる。ＨＩＶ  ｇｐ１２０はＣＸＣＲ４向性であり、その例にはＨＩＶ  ＮＬ４−３、Ｒ８及びＭＮ由来のＨＩＶ  ｇｐ１２０が含まれる。
【００４７】
存在し得る非レンチウイルス由来のウイルスエンベロープ糖タンパク質には、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、両種性マウス白血病ウイルス（ＡＭＬＶ）及びＣ型肝炎（ＨＣＶ）由来のものが含まれる。ＶＳＶ糖タンパク質は、初代ニワトリ胚細胞、ＢＨＫ−２１細胞、Ｖｅｒｏ細胞、マウスＬ細胞及びチャイニーズハムスター卵巣細胞を含めた多数の細胞を標的する（Ｆｉｅｌｄのウイルス学(Field's Virology)，Ｆｉｅｌｄら編，第２版，ニューヨークに所在のＲａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ（１９９０年）発行）。ＡＭＬＶ糖タンパク質は、ＮＩＨ  ３Ｔ３細胞（マウス線維芽細胞）、Ａ４３１細胞（ヒトケラチノサイト）及びＨ９細胞（ヒトＴ細胞）のような細胞を標的する（Ｂａｃｈｒａｃｈら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７４：８４８０−８４８６（２０００））。ＨＣＶ  Ｅ１及びＥ２は、ＨｅｐＧ２、Ｈｕｈ７及びＦＬＣ４のような細胞を標的する（Ｔａｋｉｋａｗａら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７４：５０６６−５０７４（２０００））。
【００４８】
偽タイピングは、非レンチウイルス由来の完全糖タンパク質または糖タンパク質領域と共にレンチウイルス領域及び非レンチウイルス領域を含むキメラタンパク質を用いて実施され得る。例えば、ＨＩＶビリオンのＶＳＶエンベロープ糖タンパク質による偽タイピングは完全ＶＳＶエンベロープ糖タンパク質、または貫膜ＨＩＶエンベロープ糖タンパク質に融合した細胞外ＶＳＶエンベロープ糖タンパク質ドメインを含むキメラＶＳＶエンベロープ糖タンパク質を用いてなし得る。
【００４９】
ウイルスリポーター粒子の作成
ウイルスリポーター粒子は、β−ラクタマーゼ−Ｖｐｒ／Ｖｐｘキメラタンパク質をコードする核酸と共に侵入コンピテントビリオンの作成に必要なウイルス成分をコードする核酸を発現させることにより作成され得る。リポーター粒子は、１つ以上の追加レンチウイルスをコードする核酸のような追加成分、好ましくはＨＩＶ遺伝子をも含み得る。
【００５０】
存在する追加成分が機能性である必要はない。好ましい実施態様では、ウイルスリポーター粒子は侵入コンピテントであり、複製インコンピテントである。複製インコンピテントなウイルスリポーター粒子は、ウイルス複製に必要な１つ以上の遺伝子を除去または改変させるようないろいろな方法により作成され得る。複製インコンピテントなウイルスリポーター粒子は複製し得るウイルスリポーター粒子に比して安全である。
【００５１】
レンチウイルスベクターは遺伝子治療のためのベクターとして興味深い（例えば、Ｄｕｌｌら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７２：８４６３−８４７１（１９８８）；及びＮａｌｄｉｎｉら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７２：２６３−２６７（１９９６））。本明細書に記載されているガイドラインに基づいて、レンチウイルスベクターを構築するための技術はβ−ラクタマーゼ−Ｖｐｒ／Ｖｐｘキメラタンパク質を取込んだウイルスリポーター粒子を作成するように改変され得る。
【００５２】
ウイルスリポーター粒子が作成されるようにレンチウイルスの作成方法を改変する際には、β−ラクタマーゼ−Ｖｐｒ／Ｖｐｘキメラタンパク質の取込み及び所望のエンベロープタンパク質の使用を考慮する。β−ラクタマーゼ−Ｖｐｒ／Ｖｐｘキメラタンパク質の取込みはＧａｇ前駆体との相互作用によりトランスで生ずる。従って、β−ラクタマーゼ−Ｖｐｒ／Ｖｐｘキメラタンパク質をコードする核酸は他のウイルス成分をコードする核酸の一部である必要はない。
【００５３】
別のウイルス成分をコードする核酸は宿主ゲノムを改変したり発現ベクターを使用することにより細胞に導入され、発現される。宿主ゲノムの改変には核酸が発現するような核酸のゲノムへの導入が含まれる。１つ以上の発現ベクター上にウイルス成分をコードする核酸が存在することが好ましい。
【００５４】
ウイルスリポーター粒子は形質転換ヒト細胞において作成される。好適な細胞の例はＨＥＫ−２９３である。
【００５５】
β−ラクタマーゼアッセイ
細胞内β−ラクタマーゼ活性をβ−ラクタマーゼにより切断される蛍光発生基質を用いて測定することが好ましい。好ましい基質は、細胞内で膜を不透過性とし且つβ−ラクタマーゼにより切断されて検出可能なシグナルを発生させる膜透過性蛍光発生基質である。前記基質の例は、Ｚｌｏｋａｒｎｉｋら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７９：８４−８８（１９９８）及びＴｓｉｅｎらの米国特許第５，７４１，６５７号明細書に記載されている。
【００５６】
本発明の実施態様では、ＣＣＦ２−ＡＭまたはＣＣＦ４−ＡＭ（カリフォルニア州サンジェゴに所在のＡｕｒｏｒａ  Ｂｉｏｓｃｉｃｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．）のような細胞透過性蛍光発生基質を細胞に添加する。これらの基質は細胞膜を横断する輸送を容易にするエステル基を有する。細胞内で、エステル基が切断されて、基質膜は不透過性となる。〜４０５ｎｍの光で刺激すると、クマリンからフルオレセイン染料分子への共振エネルギー伝達のために無傷の基質は緑色蛍光（〜５３０ｎｍ）を発光する。β−ラクタマーゼにより基質を切断すると、蛍光発光はクマリンのみの青色（〜４６０ｎｍ）に変化する。細胞中に存在する基質の蛍光発光は、例えば蛍光顕微鏡によるかまたは蛍光光度計を適当な放出及び励起フィルターと併用することにより検出され得る。
【００５７】
侵入阻止及びウイルス形成アッセイ
β−ラクタマーゼ−Ｖｐｒ／Ｖｐｘキメラタンパク質は、ウイルスリポーター粒子の作成及び活性を調べるアッセイにおいて使用され得る。前記アッセイは、ＨＩＶ、ＨＣＶ、ＡＭＬＶ及びＶＳＶの阻害剤のようなウイルス阻害剤を同定するために使用され得る。抗ウイルス化合物はインビトロでもインビボでも使用可能である。
【００５８】
細胞へのウイルス侵入を阻止する化合物の能力は、β−ラクタマーゼ−Ｖｐｒ／Ｖｐｘキメラタンパク質を含む侵入コンピテントウイルスリポーター粒子、相容性標的細胞及び当該化合物を合わせることにより測定され得る。このアッセイは、ウイルス粒子を当該試験化合物の非存在下で宿主細胞に侵入させ得る条件下で実施する。本発明の実施態様では、標的細胞は初代ヒト細胞である。
【００５９】
図１は、ＨＩＶ−１リポーター粒子を用いるウイルス阻止アッセイの例を示す。化合物のウイルス侵入阻害能力はβ−ラクタマーゼ活性を観察することにより評価される。
【００６０】
侵入阻害アッセイは、各種ウイルス阻害剤を同定するために偽タイプしたウイルス粒子を用いて実施され得る。例えば、ＨＩＶ侵入阻害剤をアッセイするためにはｇｐ４１及びｇｐ１２０を含むウイルス粒子を使用し得、ＨＣＶ侵入阻害剤をアッセイするためにはＨＣＶ  Ｅ１及びＥ２偽タイプしたウイルス粒子を使用し得る。
【００６１】
成熟ウイルス増殖を阻害する化合物の能力は、試験化合物の存在下でウイルス生成条件下でβ−ラクタマーゼ−Ｖｐｒ／Ｖｐｘキメラタンパク質を含むウイルスリポーター粒子を作成し得る組換え細胞を増殖させることにより実施され得る。試験化合物のウイルス増殖の阻害能力は、β−ラクタマーゼを宿主細胞に与えるビリオンの作成を評価することにより測定される。所望により、成熟ウイルス阻害アッセイは標的細胞を特異的に修飾するために偽タイプしたウイルス粒子を用いて実施され得る。
【００６２】
本発明の諸特徴を更に説明するために、以下実施例を提示する。これらの実施例は本発明を実施するための有用な方法をも例示する。これらの実施例は本発明を限定するものではない。
【実施例１】
【００６３】
材料及び方法
本実施例は、ウイルスリポーター粒子を作成及び評価するために使用される幾つかの材料及び方法を例示する。
【００６４】
（プラスミドＤＮＡ）
プラスミドを一般的な組換え核酸技術を用いて構築、発酵及び精製した。
【００６５】
ｐＭＭ３１０（図２）は、バクテリアβ−ラクタマーゼ遺伝子（Ａｕｒｏｒａ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．製ＢｌａＭ）をＨＩＶ−１（菌株ＹＵ２；Ｌｉら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６６：６５８７（１９９２））のｖｐｒに融合した融合タンパク質をコードする。ＢｌａＭ−ｖｐｒ融合配列をベクターｐｃＤＮＡ３．１／ｚｅｏ（＋）（カリフォルニア州カールズバッドに所在のＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のＨｉｎｄＩＩＩ及びＸｈｏＩ部位にクローン化する。β−ラクタマーゼ−Ｖｐｒ構築物のヌクレオチド配列を配列番号１に示す。この構築物によりコードされるアミノ酸配列を配列番号２に示す。
【００６６】
ｐＭＭ３０４は、制限消化断片を除去することにより菌株ＹＵ２（Ｌｉら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６６：６５８７（１９９２））由来のＨＩＶプロウイルスＤＮＡを含む。プラスミドｐＹＵ２をＰａｃＩ（ｎｔ６１９０）及びＢｓａＢＩ（ｎｔ７５２１）で消化し、末端をＴ４  ＤＮＡポリメラーゼを用いて平滑とし、プラスミドをＴ４  ＤＮＡリガーゼ（Ｌｉら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６６：６５８７（１９９２））を用いて再び環状とした。得られたプラスミドは、エンベロープ糖タンパク質遺伝子が発現しないように遺伝子欠失を含んでいる。
【００６７】
ｐＭＭ３１２は、２．６ｋｂ制限消化断片を除去することによりｐＭＭ３０４から得たＨＩＶプロウイルスＤＮＡを含む。プラスミドｐＭＭ３０４をＢｓｔＥＩＩ（ｎｔ３０１１）及びＮｃｏＩ（ｎｔ５６６５）で消化し、末端を大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片を用いて平滑とし、プラスミドをＴ４  ＤＮＡリガーゼを用いて再び環状とした。得られたプロウイルスＤＮＡは逆転写酵素のインテグラーゼ、ｖｉｒ、ｖｐｒ及びエンベロープをコードする無傷の配列を欠く。
【００６８】
ｐＮＬ４−３は、限界野生型ＨＩＶプロウイルスである（Ａｄａｃｈｉら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，５９：２８４−２９１（１９８６）；Ｓａｌｍｉｎｅｎら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，２１６：８０−８６（１９９５），ＧＥＮＢＡＮＫ受託番号Ｕ２６９４２）。
【００６９】
ｐＲＬ５００は、インテグラーゼタンパク質が２アミノ酸配列変化を含むようにインテグラーゼコード配列中に突然変異を含むｐＮＬ４−３の誘導体である。前記変化とはｖａｌ  １５１→ｇｌｕ及びａｓｐ  １２５→ｇｌｎであり、ｐＲＬ５００から構築したウイルスが複製インコンピテントであるようにインテグラーゼ酵素欠損とする（ＬａＦｅｍｉｎａら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６６：７４１４−７４１９（１９９２））。
【００７０】
Ｒ８（Ｇａｌｌａｙら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７０：１０２７−１０３２（１９９６）；テネシー州ナッシュビルに所在のＶａｎｄｅｒｂｉｌｔ大学のＣ．Ａｉｋｅｎ氏より入手）は、一部はｐＮＬ４−３配列に由来し、一部は別の限界野生型ＨＩＶ株のＨＸＢ２に由来するハイブリッドＨＩＶプロウイルスを含む（Ｒａｔｎｅｒら，ＡＩＤＳ  Ｒｅｓ．Ｈｕｍ．Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ，３：５７（１９８６））。
【００７１】
Ｒ８．Ｂａｌは、多くのエンベロープ遺伝子がＨＩＶ−１初代単離物ＢａＬの対応エンベロープ遺伝子で置換されているＲ８の誘導体である（Ｇａｌｌａｙら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７０：１０２７−１０３２（１９９６）；テネシー州ナッシュビルに所在のＶａｎｄｅｒｂｉｌｔ大学のＣ．Ａｉｋｅｎ氏から入手）。
【００７２】
Ｒ９  ＰＲ−Δｅｎｖ−は、プロテアーゼ（ＰＲ）遺伝子及びエンベロープ（ｅｎｖ）遺伝子が欠失されているＲ８の誘導体である。これらの欠失により、機能性ＰＲタンパク質及びｅｎｖタンパク質の発現が妨げられる（Ｗｙｍａら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７４：９３８１−９３８７（２０００）；テネシー州ナッシュビルに所在のＶａｎｄｅｒｂｉｌｔ大学のＣ．Ａｉｋｅｎ氏から入手）。
【００７３】
ｐＹＵ２は、ＨＩＶのＹＵ２単離物由来のＨＩＶプロウイルスである（Ｌｉら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６６：６５８７（１９９２）；ＧＥＮＢＡＢＪ受託番号Ｍ９３２５８；メリーランド州ベセズダに所在のＡＩＤＳ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｐｒｏｇｒａｍから入手）。
【００７４】
ｐＣＭＶ−ＶＳＶＧは、ＶＳＶ（バーミンガムに所在のアラバマ大学のＪ．Ｋａｐｐｅｓ氏から入手した）サイトメガロウイルス初期プロモーターの制御下でのＶＳＶ由来のエンベロープ糖タンパク質配列である（Ｗｕら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７３：２１２６−２１３５（１９９９）；Ｌｉｕら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７３：８８３１−８８３６（１９９９））。
【００７５】
ｐＳＶ−Ａ−ＭＬＶは、ＡＭＬＶエンベロープ糖タンパク質をコードする配列を含む（Ｌａｎｄａｕら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６５：１６２（１９９１）；メリーランド州ベセズダに所在のＡＩＤＳ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｐｒｏｇｒａｍから入手）。
【００７６】
ｐＭＭ３２６は、ユニークなＮｏｔＩ制限酵素部位がエンベロープ遺伝子の上流に挿入されているＲ８の誘導体である。この酵素により、他のＨＩＶ単離物からクローン化したｇｐ１６０遺伝子が挿入され得る。修飾プロウイルスＤＮＡヌクレオチド配列を配列番号３として示す。
【００７７】
プラスミドｐＲ８．１０２１、ｐＲ８．１０２２及びｐＲ８．１０３６は、それぞれ初代ＨＩＶ単離物１０２１、１０２２及び１０３６のエンベロープ糖タンパク質遺伝子がクローン化されているプラスミドｐＭＭ３２６の誘導体である。これらの誘導体は配列番号３の（内因性エンベロープ糖タンパク質をコードする）塩基３６１４〜９０１７の代わりにクローン化糖タンパク質遺伝子を含む。Ｒ８．１０２１、Ｒ８．１０２２及びＲ８．１０３６由来のエンベロープ糖タンパク質遺伝子のヌクレオチド配列をそれぞれ配列番号４、配列番号５及び配列番号６として示す。
【００７８】
（オリゴヌクレオチド）
合成オリゴヌクレオチドはテキサス州ミッドランドに所在のＭｉｄｌａｎｄ  Ｃｅｒｔｉｆｉｅｄ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｃｏｍｐａｎｙから供給された。
【００７９】
Ｏｌｉｇｏ  ＭＭ４３９（配列番号７：５’ＧＡＡＧＣＧＧＣＣＧＣＡＡＧＡＡＡＧＡＧＣＡＧＡＡＧ  ＡＣＡＧＴＧＧＣＡＡＴＧＡ−３’）は、ＰＣＲ産物のクローニングを助けるためにＮｏｔＩ配列（下線）及び幾つかの追加ヌクレオチドが５’末端に付加されている（Ｇａｏら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７０：６５１−１６６７（１９９６）に記載されている）ｅｎｖＢオリゴヌクレオチドを表す。
【００８０】
Ｏｌｉｇｏ  ＭＭ４４０（配列番号８：５’−ＧＴＡＧＣＣＣＴＴＣＣＡＧＴＣＣＣＣＣＣＴＴＴＴＣＴＴＴＴＡ−３’）は、１つのＧ残基が５’末端に付加されている（Ｇａｏら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７０：６５１−１６６７（１９９６）に記載されている）ｅｎｖＭオリゴヌクレオチドを表す。
【００８１】
（細胞）
下記する形質転換細胞及び初代細胞を当業者に周知の一般的方法により産生し、培養した。
【００８２】
２９３Ｔ細胞は、ＳＶ４０大型Ｔ抗原を発現するように遺伝子工学処理されたＨＥＫ２９３形質転換ヒト胚腎細胞の誘導体である。この細胞は、１０％  ウシ胎仔血清（ＦＢＳ；メリーランド州ゲーザーズバーグに所在のＬｉｆｅｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓまたはユタ州ローガンに所在のＨｙｃｌｏｎｅ）を補充したダルベッコ修飾イーグル培地（ＤＭＥＭ；Ｌｉｆｅｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，カタログ番号１１９６０−０４４）に維持した。トランスフェクション後のウイルス産生のために、細胞をフェノールレッドを省き、１０％  ウシ胎仔血清を補充したＤＭＥＭ（Ｌｉｆｅｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，カタログ番号２１０６３−０２９）において維持した。
【００８３】
ＳｕｐＴ１細胞は形質転換ヒトＴ細胞株である。ＳｕｐＴ１細胞は１０％  ＦＢＳを補充したＲＰＭＩ  １６４０（Ｌｉｆｅｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，カタログ番号１１８７５−０９３）において維持した。場合により、ヒトＣＣＲ５遺伝子を安定的に発現させるためにＳｕｐＴ１細胞の誘導体をトランスフェクトした。ＣＣＲ５発現ＳｕｐＴ１細胞は０．４μｇ／ｍｌのプロマイシン（カリフォルニア州パロアルトに所在のＣｌｏｎｔｅｃｈ）を含有するＲＰＭＩ  １６４０／１０％  ＦＢＳにおいて維持した。
【００８４】
当業者に公知の一般的方法（Ｆｉｃｏｌｌ／Ｈｙｐａｑｕｅ密度遠心）によりヒト血液から末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を単離し、ＲＰＭＩ  １６４０／１０％  ＦＢＳにおいて維持した。
【００８５】
ヒトＰＢＭＣからヒト単核誘導マクロファージを得た。プラスチック製フラスコにおいてＰＢＭＣを＞２０分間平板培養して単核細胞を付着させ、非付着細胞を洗浄により除去した。Ｖｅｒｓｅｎｓｅ（バージニア州Ｈｅｒｎｄｏｎに所在のＣｅｌｌｇｒｏ）を用いてプラスチックから単核細胞を剥離し、洗浄し、単核細胞／マクロファージ培地（ＤＭＥＭ，１０％  ＦＢＳ，１０％  ウマ血清，２０ｎｇ／ｍｌずつのＭ−ＣＳＦ及びＧＭ−ＣＳＦ（いずれもミネソタ州ミネアポリスに所在のＲ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓから入手））中に１０６細胞／ｍｌの濃度で再懸濁し、テフロンジャーにおいて３７℃／５％  ＣＯ２で７２時間培養した。次いで、培地を交換し、細胞を更に７２時間培養してからアッセイに使用した。
【００８６】
（アッセイ試薬）
Ｆｕｇｅｎｅ６は、Ｒｏｃｈｅ（カタログ番号１８１５０９１）から市販されている脂質トランスフェクション試薬である。ＯｐｔｉＭＥＭはＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（カタログ番号３１９８５−０７０）より供給された無血清培地である。これらの試薬は、細胞にプラスミドＤＮＡをトランスフェクトすることによりＨＩＶウイルス粒子を作成するために一緒に使用される。
【００８７】
リン酸カルシウム−ＤＮＡ沈殿により細胞にＤＮＡをトランスフェクトし得る試薬は、ウィスコンシン州マジソンに所在のＰｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ．（Ｐｒｏｆｅｃｔｉｏｎリン酸カルシウムキット，カタログ番号Ｅ１２００）から購入した。
【００８８】
ＣＣＦ２−ＡＭ及びＣＣＦ４−ＡＭは、酵素β−ラクタマーゼ用の細胞透過性蛍光基質であり、カリフォルニア州サンジェゴに所在のＡｕｒｏｒａ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．から市販されている。これらの試薬は、Ａｕｒｏｒａから供給されている２つの“細胞添加”溶液（溶液Ｂ及びＣ）と一緒に使用される。
【００８９】
Ｉｎｄｉｎａｖｉｒ（ニュージャージ州ローウェーに所在のＭｅｒｃｋ  ＆  Ｃｏ．，Ｉｎｃ．）は、ビリオンの成熟及び感染性をブロックするＨＩＶプロテアーゼ阻害剤である。
【００９０】
ＤＰ−１７８は、ＨＩＶ−１エンベロープ糖タンパク質のｇｐ４１領域から誘導される合成ペプチドである。ＤＰ−１７８はＨＩＶ−１エンベロープ糖タンパク質により推進されるＨＩＶ−１ビリオンの侵入を抑制する。ＤＰ−１７８のアミノ酸配列は、アセチル−ＹＴＳＬＩＨＳＬＩＥＥＳＱＮＱＱＥＫＮＥＱＥＬＬＥＬＤＫＷＡＳＬＷＮＷＦ−アミド（配列番号９）である（Ｗｉｌｄら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，９１：９７７０−９７７４（１９９４））。
【００９１】
ＩｇＧ  １ｂ１２は、特定のＨＩＶ菌株由来のＨＩＶ−１エンベロープ糖タンパク質ｇｐ１２０に対して反応性のヒト化免疫グロブリンである（Ｂｕｒｔｏｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６６：１０２４−１０２７（１９９４））。ＩｇＧ  １ｂ１２はＨＩＶ−１感染性をブロックし得る。
【００９２】
拡張高忠実(expand high-fidelity)ＰＣＲシステムは、Ｒｏｃｈｅ（カタログ番号１７３２６４１）製であった。
【００９３】
Ｅｆｆｅｃｔｅｎｃｅは市販のトランスフェクション試薬（カリフォルニア州バレンシアに所在のＱｉａｇｅｎ  Ｉｎｃ．，カタログ番号３０１４２５）である。
【００９４】
ＴｒａｎｓＩＴは、市販のトランスフェクション試薬（ウイスコンシン州マジソンに所在のＰａｎｖｅｒａ  Ｃｏｒｐ．，カタログ番号ＭＩＲ２３００）である。
【００９５】
Ｌ−６９７６６１（ニュージャージ州ローウェーに所在のＭｅｒｃｋ  ＆  Ｃｏ．，Ｉｎｃ．）は、新しく感染させた細胞におけるＨＩＶ  ｃＤＮＡの合成を阻害する非ヌクレオチド逆転写酵素阻害剤である（Ｇｏｌｄｍａｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８（１５）：６８６３−６８６７（１９９１））。
【００９６】
（計器）
蛍光β−ラクタマーゼ基質ＣＣＦ２−ＡＭまたはＣＣＦ４−ＡＭを添加した細胞を、水銀蒸気ランプ及びＣｈｒｏｍａ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（バーモント州Ｂａｔｔｌｅｂｏｒｏに所在，カタログ番号４１０３１）のβ−ラクタマーゼフィルターセットを備えたオリンパスＩＸ７０倒立マイクロスコープを用いてエピフルオレッセンス顕微鏡により観察した。
【００９７】
ＣＣＦ２−ＡＭまたはＣＣＦ４−ＡＭを添加した細胞における青色及び緑色蛍光を、４１０±１２ｎｍ励起フィルター（Ｃｈｒｏｍａカタログ番号０２０−４１０−１２）、４６０±１０ｎｍ励起フィルター（Ｃｈｒｏｍａカタログ番号０２０−４６０−１０）及び５３０±１２ｎｍ励起フィルター（Ｃｈｒｏｍａカタログ番号０２０−５３０−１２）を備えたＰｏｌａｒＳｔａｒ蛍光光度計（ノースカロライナ州ダラムに所在のＢＭＧ）を用いて定量した。
【実施例２】
【００９８】
ＶＡＶ−Ｇで偽タイプしたＨＩＶビリオン
本実施例は、エンベロープ糖タンパク質ＶＳＶ−Ｇで偽タイプしたＨＩＶビリオンをベースとするウイルス粒子の作成及び使用を例示する。このリポーター粒子は酵素活性β−ラクタマーゼを標的細胞に送達できた。
【００９９】
（ＶＳＶ−Ｇ偽タイプしたリポーター粒子）
リン酸カルシウム法（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｐｒｏｆｅｃｔｉｏｎ  ＣａＰＯ４トランスフェクションキット）を用いて２９３Ｔ細胞にプラスミドＤＮＡのＰＭＭ３０４（機能エンベロープ遺伝子を欠くＨＩＶプロウイルスＤＮＡ）、ｐＭＭ３１０（β−ラクタマーゼ−ｖｐｒ融合）及びｐＣＭＶ−ＶＳＶＧを同時トランスフェクトすることにより、β−ラクタマーゼ−Ｖｐｒキメラタンパク質を担持し且つプロミスカスエンベロープ糖タンパク質ＶＳＶ−Ｇを有するＨＩＶビリオンを作成した。トランスフェクションのために、２９３Ｔ細胞の密集フラスコをトリプシン／ＥＤＴＡ溶液で処理して細胞を除去し、細胞の１／５０を６ウェルプレートの各ウェルに平板培養した。翌日、細胞に対して以下のようにＤＮＡミックスをトランスフェクトした：
ウェル１：ｐＭＭ３０４（０．５μｇ）＋ｐＭＭ３１０（１μｇ）＋ｐｃＤＮＡ３．１（０．５μｇ）、
ウェル２：ｐＭＭ３０４（０．５μｇ）＋ｐＭＭ３１０（１μｇ）＋ｐＣＭＶ−ＶＳＶＧ（０．５μｇ）、
ウェル３：ｐＭＭ３０４（０．５μｇ）＋ｐＭＭ３１０（１μｇ）＋ＨＸＢ２  ｇｐ１６０（０．２５μｇ）＋ｐＲＳＶ−ｒｅｖ（０．１μｇ）。
【０１００】
トランスフェクションのために、各ＤＮＡミックス（全部で〜２μｇ）をＨ２Ｏ（４４μｌ）で希釈し、次いでキットに添付されている２．５Ｍ  ＣａＣｌ２（６μｌ）を添加した。各溶液を激しく撹拌しながらキットに添付されているＨＥＰＥＳ緩衝食塩液（１５０μｌ）に滴下し、室温で３０分間インキュベートし、次いで２９３Ｔ細胞の１ウェルに滴下した。細胞を３７℃／５％  ＣＯ２でインキュベートした。３日後、培養上清を収集し、１Ｍ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．３）溶液を添加することにより２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳとした。９６ウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒカタログ番号３６０３）のウェルにおいて各上清（９０μｌ）をＳｕｐＴ１細胞（＝１０５細胞）（１０μｌ）と３７℃で５時間インキュベートした後、各ウェルに（Ａｕｒｏｒａ  Ｂｉｏｓｃｉｎｅｃｅの指示に従って調製，最終［ＣＣＦ２−ＡＭ］＝１μＭ）６Ｘ  ＣＣＦ２−ＡＭ添加溶液（２０μｌ）を添加することにより、上清を試験した。細胞を添加溶液と一晩インキュベートし、マイクロプレート−読み蛍光光度計を用いて蛍光発光を測定した。この実験の結果を表Ｉに示す。
【０１０１】
表Ｉには、ＣＣＦ２−ＡＭを添加前の各種上清とインキュベートした標的細胞における青色蛍光値が示されている。ＶＳＶ−Ｇ含有粒子とインキュベートした標的細胞は強い青い蛍光を示し、このことは細胞中にβ−ラクタマーゼが存在することを表す。一方、エンベロープ糖タンパク質を欠く粒子またはＨＸＢ２  ｇｐ１６０の存在下で作成した粒子とインキュベートした標的細胞はバックグラウンドレベルの青色蛍光しか示さなかった。
【０１０２】
【表１】
2004532012.tif 000002
【０１０３】
エピフルオレッセンスの観察から、ＶＳＶ−Ｇ含有粒子とインキュベートした細胞の多くは青色に見え、他の粒子とインキュベートした細胞は殆ど緑色に見えたことが確認された。これらの結果は、β−ラクタマーゼを標的細胞に移入させるにはエンベロープ糖タンパク質（例えば、ＶＳＶ−Ｇ）及びβ−ラクタマーゼ−ｖｐｒの両方を発現する細胞中でビリオンを作成しなければならないことを示す。エンベロープ糖タンパク質に関する要件は、β−ラクタマーゼの標的細胞への移入がＶＳＶ−Ｇ媒介粒子侵入の結果であることを示唆している。
【０１０４】
（複製欠失ＶＳＶ−Ｇリポーター粒子）
リン酸カルシウム法を用いて同時トランスフェクションすることにより、侵入コンピテントＶＳＶ−Ｇリポーター粒子を複製インコンピテントとした。簡単に説明すると、２９３Ｔ細胞の集密フラスコをトリプシン／ＥＤＴＡ溶液で処理して細胞を除去し、細胞の１／７を４つのＣｏｓｔａｒ組織培養皿（１０ｃｍ）の各々で平板培養した。翌日、細胞に対して以下のようにＤＮＡミックスをトランスフェクトした：
フラスコ１：ｐＭＭ３０４（１５μｇ）＋ｐＭＭ３１０（５μｇ）＋ｐＣＭＶ−ＶＳＶＧ（５μｇ）、
フラスコ２：ｐＭＭ３０４（１５μｇ）＋ｐＭＭ３１０（５μｇ）＋ＨＸＢ２  ｇｐ１６０プラスミド（５μｇ）、
フラスコ３：ｐＭＭ３１２（１５μｇ）＋ｐＭＭ３１０（５μｇ）＋ｐＣＭＶ−ＶＳＶＧ（５μｇ）、
フラスコ４：ｐＭＭ３１２（１５μｇ）＋ｐＭＭ３１０（５μｇ）＋ＨＸＢ２  ｇｐ１６０プラスミド（５μｇ）。
【０１０５】
各ＤＮＡミックス（２０μｇ）を水で４４０μｌに希釈し、次いでキットに添付されている２．５Ｍ  ＣａＣｌ２（６０μｌ）を添加した。
【０１０６】
ＣａＰＯ４沈殿を形成するために、上記溶液を激しく撹拌しながらキットに添付されているＨＥＰＥＳ緩衝食塩液（０．５ｍｌ）を滴下し、３０分間インキュベートした。各ＤＮＡ沈殿を２９３Ｔ細胞の１つの皿に滴下した。一晩インキュベートした後、細胞をリン酸緩衝食塩液で洗浄した後、新しい培地で更に２日間インキュベートした。
【０１０７】
培養上清を収集し、本質的に前項に記載されているように試験した。表ＩＩには、ｐＭＭ３０４またはｐＭＭ３１２をトランスフェクトした細胞由来の上清はいずれも、トランスフェクトした細胞がＶＳＶ−Ｇタンパク質を発現したときのみβ−ラクタマーゼを標的細胞に移入し得ることが示されている。ＨＸＢ２  ｇｐ１６０発現プラスミドをトランスフェクトしても、有意なレベルでβ−ラクタマーゼを標的細胞に移入させることができる上清を生じなかった。
【０１０８】
【表２】
2004532012.tif 000003
【０１０９】
（ＶＳＶ−Ｇ粒子の侵入の阻止）
ＶＳＶ−Ｇタンパク質によるウイルス侵入はＮＨ４Ｃｌのようなリソソーム作用剤に対して感受性である。β−ラクタマーゼが正統ＶＳＶ−Ｇ推進ウイルス侵入により標的細胞に移入されたことを確認するために、細胞を１０ｍＭ  ＮＨ４Ｃｌの存在または非存在下でＶＳＶ−Ｇエンベロープ粒子とインキュベートした。蛍光顕微鏡によると、ＮＨ４Ｃｌの存在下で粒子とインキュベートした培養物はＮＨ４Ｃｌの非存在下でインキュベートした培養物に比して有意に少数の青色細胞しか含んでいなかった。蛍光顕微鏡に基づく青色細胞の推定％を表ＩＩＩに示す。表ＩＩＩに示した結果から、β−ラクタマーゼの移入には機能的ウイルス侵入経路が必要であることが確認される。
【０１１０】
【表３】
2004532012.tif 000004
【実施例３】
【０１１１】
ＨＩＶエンベロープ糖タンパク質を含むＨＩＶリポーター粒子
β−ラクタマーゼ−ｖｐｒ発現プラスミドｐＭＭ３１０及びｐＮＬ４−３と称する野生型ＨＩＶプロウイルスＤＮＡを用いてウイルスリポーター粒子を作成した。実質的に実施例２に記載されているようにして２９３Ｔ細胞をリン酸カルシウム法によりトランスフェクトした。ただし、ｉ）１．５×１０６個の２９３Ｔ細胞を各１０ｃｍ皿で平板培養し、ｉｉ）ＣａＰＯ４沈殿形成のために、全部で２５μｇのＤＮＡ（ｐＭＭ３１０  ＤＮＡ／ｐＮＬ４−３  ＤＮＡの比は変更した）を２Ｍ  ＣａＣｌ２（６２μｌ）及びＨＥＰＥＳ緩衝食塩液（０．５ｍｌ）を全部で１ｍｌ用いてトランスフェクトした。
【０１１２】
上清を収集し、ＳｕｐＴ１標的細胞へのβ−ラクタマーゼの移入能力を実施例２に記載されているようにして試験した。標的細胞及び上清を３７℃で５時間インキュベート後、細胞にＣＣＦ２−ＡＭを添加し、室温で一晩インキュベートした。エピフルオレッセンス顕微鏡により、ｐＮＬ４−３／ｐＭＭ３１０上清は〜５−１０％の細胞（すなわち、青色蛍光細胞）にβ−ラクタマーゼを移入させ得たことを知見した。ｐＮＬ４−３／ｐＭＭ３１０の比を変化させても同様の結果が得られた。ＶＳＶ−Ｇ−偽タイプした粒子と対照的に、１０ｍＭ  ＮＨ４Ｃｌを添加してもβ−ラクタマーゼの移入は阻止されなかった。
【０１１３】
蛍光顕微鏡による青色細胞の推定％を表ＩＶに示す。表ＩＶに示した結果は、ＨＩＶリポーター粒子のｇｐ１２０／ｇｐ４１−推進膜融合を介するＨＩＶ標的細胞侵入の正常な経路による細胞への侵入能力を示している。
【０１１４】
【表４】
2004532012.tif 000005
【０１１５】
ＨＩＶリポーター粒子のｇｐ１２０／ｇｐ４１−推進融合による細胞への侵入能力及び侵入阻害アッセイにおけるＨＩＶリポーター粒子の使用を公知の糖タンパク質阻害剤を用いて確認した。ＮＬ４−３／ｐＭＭ３１０−作成ＨＩＶリポーター粒子を特定の阻害剤の存在または非存在下で標的細胞とインキュベートした。ＤＰ−１７８（ｇｐ４１阻害剤）及びＩｇＧ１ｂ１２（ｇｐ１２０阻害剤）のいずれもがＮＬ４−３推進ＨＩＶリポーター粒子によるβ−ラクタマーゼの標的細胞への移入を阻止したが、いずれの阻害剤もＶＳＶ−Ｇ含有ＨＩＶリポーター粒子によるβ−ラクタマーゼの標的細胞への移入を阻止しなかった。
【０１１６】
侵入コンピテントＨＩＶリポーター粒子の形成はプロテアーゼ阻害剤により阻止された。２９３Ｔ細胞（各１０ｃｍ皿）にそれぞれ１０μｇのｐＮＬ４−３及びｐＭＭ３１０を実施例２に記載のリン酸カルシウム法を用いてトランスフェクトして、ｐＮＬ４−３推進ＨＩＶリポーター粒子を作成した。１つのトランスフェクションでは、ＨＩＶプロテアーゼ阻害剤のｉｎｄｉｎａｖｉｒを１μＭの濃度で培地に連続的に添加した。上清を収集し、侵入コンピテントＨＩＶリポーター粒子について実施例２に記載されているように試験した。
【０１１７】
エピフルオレッセンス顕微鏡で観察されるように、阻害剤の非存在下で作成したＨＩＶビリオンの上清はβ−ラクタマーゼを標的細胞の〜１０−２０％に移入させた。しかしながら、前記ＨＩＶリポーター粒子をｉｎｄｉｎａｖｉｒの存在下で作成したときにはβ−ラクタマーゼの標的細胞への移入は効率的でなかった（〜１％）。
【０１１８】
蛍光顕微鏡による青色細胞の推定％を表Ｖに示す。表Ｖに示した結果は、成熟ＨＩＶビリオンのみが標的細胞への侵入に対してコンピテントであることを示しており、更にβ−ラクタマーゼの標的細胞への移入は真正ウイルス侵入経路により媒介されることを示している。
【０１１９】
【表５】
2004532012.tif 000006
【実施例４】
【０１２０】
別のプロウイルスクローンを用いるＨＩＶリポーター粒子の作成
本実施例では、別のＨＩＶプロウイルスクローンを用いるＨＩＶリポーター粒子の構築を例示する。ＨＩＶリポーター粒子はＹＵ２株及びＲ８株から作成した。
【０１２１】
２９３Ｔ細胞（１０ｃｍ皿）にｐＹＵ２ｐまたはｐＮＬ４−３（１０μｇ）及びｐＭＭ３１０（１０μｇ）を実施例２に記載のリン酸カルシウム法を用いてトランスフェクトすることにより、ＹＵ２株由来のリポーター粒子を作成した。トランスフェクトした細胞由来の培養上清を収集し、実施例２に記載されているように侵入コンピテントＨＩＶリポーター粒子について試験した。ただし、標的細胞は、ＹＵ２ビリオン粒子による侵入に必要なＣＣＲ５タンパク質を安定的に発現するＳｕｐＴ１細胞であった。ＣＣＦ２添加細胞をエピフルオレッセンス顕微鏡で観察すると、ＮＬ４−３推進ＨＩＶリポーター粒子を含む上清はβ−ラクタマーゼを標的細胞の〜１０−２０％に移入させた。ＹＵ２推進ＨＩＶリポーター粒子を含む上清もβ−ラクタマーゼを標的細胞に移入させたが、小数の標的細胞は青色に見えた。
【０１２２】
２９３Ｔ細胞（１０ｃｍ皿）にＲ８（１０μｇ）及びｐＭＭ３１０（１０μｇ）を実施例２に記載のリン酸カルシウム法を用いてトランスフェクトすることにより、Ｒ８株由来のリポーター粒子を作成した。トランスフェクトした細胞由来の培養上清を収集し、標的細胞としてＣＣＲ５発現ＳｕｐＴ１細胞を用いて上記したように侵入コンピテントＨＩＶリポーター粒子について試験した。
【０１２３】
ＣＣＦ２添加細胞をエピフルオレッセンス顕微鏡で観察すると、Ｒ８推進ＨＩＶリポーター粒子を含む上清はβ−ラクタマーゼを標的細胞の〜７０−８０％に移入させた。蛍光顕微鏡による青色細胞の推定％を表ＶＩに示す。
【０１２４】
【表６】
2004532012.tif 000007
【０１２５】
Ｒ８プロウイルス由来のＨＩＶリポーター粒子は常に、試験した他のプロウイルスＤＮＡ由来のＨＩＶリポーターに比してより効果的にβ−ラクタマーゼを標的細胞に移入させた。
【実施例５】
【０１２６】
別のＶｐｒ及びβ−ラクタマーゼ構築物
β−ラクタマーゼとＶｐｒを融合した数種の構築物を構築し、ＨＩＶタンパク質と同時発現させたときのＨＩＶリポーター粒子の作成能力について試験した。試験した変数には、融合方向（すなわち、Ｖｐｒ−β−ラクタマーゼまたはβ−ラクタマーゼ−Ｖｐｒ）の変化、β−ラクタマーゼとＶｐｒの間の合成ＨＩＶプロテアーゼ切断部位の存在または不在、及びプロモーターの選択を含めた。試験した４つの代表的に構築物は、
ｐＭＭ３０７：ｖｐｒ−ＢｌａＭ  ｗ／ＳＶ４０プロモーター、
ｐＭＭ３０８：ＢｌａＭ−ｖｐｒ  ｗ／ＳＶ４０プロモーター、
ｐＭＭ３１０：ＢｌａＭ−ｖｐｒ  ｗ／ＣＭＶプロモーター、
ｐＭＭ３１１：ＢｌａＭ−ＰＲ−ｖｐｒ  ｗ／ＣＭＶプロモーター
であった。
【０１２７】
２９３細胞（１０ｃｍ皿）に各試験プラスミド（１０μｇ）及びプロウイルスＤＮＡ  ＮＬ４−３／ｐＲＬ５００（１０μｇ）を実施例２に記載されているリン酸カルシウム法を用いて同時トランスフェクトすることにより、４つの構築物を同時に試験した。細胞上清を生成し、標的細胞としてＳｕｐＴ１／ＣＣＲ５細胞を用いて侵入コンピテンスについて試験した。
【０１２８】
ＣＣＦ２添加細胞をエピフルオレッセンス顕微鏡で観察すると、ｐＲＬ５００及びｐＭＭ３１０を同時トランスフェクトして作成したＨＩＶリポーター粒子を含む上清がβ−ラクタマーゼを標的細胞の〜２５％に移入させたことが分かった。対照的に、ｐＲＬ５００及び他のＶｐｒ−β−ラクタマーゼ融合構築物を同時トランスフェクトした細胞から生成した上清はβ−ラクタマーゼを少数の標的細胞にしか移入させなかった。蛍光顕微鏡による青色細胞の推定％を表ＶＩＩに示す。データーを総合的に勘案すると、プロテアーゼ部位を欠くβ−ラクタマーゼ−Ｖｐｒ構築物のより強力なプロモーター（例えば、ＣＭＶ）から発現させることにより、ＨＩＶプロモーター粒子の効率的な作成が助長されることが分かる。
【０１２９】
【表７】
2004532012.tif 000008
【実施例６】
【０１３０】
侵入コンピテントリポーター粒子はウイルスライフサイクルの後期ステップを完成するためにコンピテントである必要はない
侵入コンピテントリポーター粒子は、ＨＩＶライフサイクルのポスト侵入ステップ（例えば、逆転写、組込み）を完成するためにコンピテントである必要はない。従って、有用なウイルスリポーター粒子はポスト侵入活性に関わる遺伝子を欠くかまたはその遺伝子を改変させて作成され得る。
【０１３１】
２９３Ｔ細胞をそれぞれ１０μｇのＮＬ４−３プロウイルスプラスミド及びプラスミドｐＭＭ３１０を実施例２に記載されているように同時トランスフェクトすることにより、ＨＩＶリポーター粒子を作成した。次いで、１μＭの逆転写酵素阻害剤Ｌ−６９７６６１の存在または非存在下ではあるが実施例４に記載されているようにして培養上清をβ−ラクタマーゼのＳｕｐＴ１／ＣＣＲ５標的細胞への移入能力について試験した。この濃度で、Ｌ−６９７６６１は細胞中での全長ＨＩＶ  ｃＤＮＡの合成を完全に阻止した。
【０１３２】
エピフルオレッセンス顕微鏡で観察すると、ウイルス侵入アッセイにおいて１μＭのＬ−６９７６６１を存在させても、ＨＩＶリポーター粒子のβ−ラクタマーゼの標的細胞への移入能力に影響はなかった。各種条件下での青色細胞の推定％を表ＶＩＩＩに示す。
【０１３３】
【表８】
2004532012.tif 000009
【０１３４】
ＨＩＶプロウイルスプラスミド（ｐＲＬ５００）はｐＮＬ４−３  ＨＩＶ分子クローンに由来し、組込みステップを完成することができない成熟ＨＩＶをコードする。トランスフェクトすると、このプロウイルスプラスミドは組込みに対してインコンピテントであり、組織培養において伝播性感染を確立することができないウイルス粒子を生ずる（ＬａＦｅｍｉｎａら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６６：７４１４−７４１９（１９９２））。
【０１３５】
２９３Ｔ細胞にｐＭＭ３１０と共にｐＲＬ５００またはｐＮＬ４−３を実施例２に記載されているリン酸カルシウム法により同時トランスフェクトすることにより、ＨＩＶリポーター粒子を作成した。培養上清を収集し、ＳｕｐＴ１／ＣＣＲ５標的細胞を用いて侵入コンピテンスについて試験した。エピフルオレッセンス顕微鏡で観察すると、野生型ｐＮＬ４−３６９及び組込み欠陥成熟ｐＲＬ５００のいずれによってもＨＩＶリポーター粒子は同様の効率（各例で〜１０−２０％の青色細胞）でβ−ラクタマーゼを標的細胞に移入させた。
【実施例７】
【０１３６】
侵入阻害アッセイにおけるリポーター粒子の使用
ＨＩＶ侵入阻害剤の効力を同定、測定するために本発明を使用することができる。本実施例では、Ｒ８  ＨＩＶプロウイルスから作成したＨＩＶリポーター粒子及びＲ８．ＢａＬプロウイルスから作成したＨＩＶリポーター粒子の２つのＨＩＶリポーター粒子を試験にかけた。
【０１３７】
２９３Ｔ細胞にプロウイルスプラスミド（１０μｇ）及びｐＭＭ３１０（１０μｇ）を実施例２に記載のリン酸カルシウム法を用いて同時トランスフェクトすることにより、ＨＩＶリポーター粒子を作成した。標的細胞をＨＩＶリポーター粒子とインキュベートするときに異なる濃度の阻害剤を存在させる以外は実施例４に記載されているようにして上清をＳｕｐＴ１／ＣＣＲ５標的細胞を用いて試験した。
【０１３８】
ＨＩＶリポーター粒子及び標的細胞の培養物中のペプチドＤＰ−１７８の濃度を増加させると、蛍光光度計で測定した青色蛍光の大きさが用量依存的に減少した（図３）。同時にエピフルオレッセンス顕微鏡で測定したところ、漸増量の阻害剤を存在させると青色細胞の数が用量依存的に減少することが分かった。これらの結果は、ｇｐ１２０／ｇｐ４１推進ビリオン侵入のＤＰ−１７８阻害と一致している。３パラメーターロジスティック式への非線形曲線のあてはめによりデーターを分析したところ、Ｒ８及びＲ８．ＢａＬ  ＨＩＶリポーター粒子調製物のＩＣ５０（シグナルの５０％を抑制するのに必要な阻害剤の濃度）はそれぞれ９１ｎＭ及び２６ｎＭであったことが分かった。
【０１３９】
ＨＩＶリポーター粒子及び標的細胞の培養物中のヒト抗体ＩｇＧ  １ｂ１２の濃度を増加させると、蛍光光度計で測定した青色蛍光の大きさが用量依存的に減少した（図４）。同時にエピフルオレッセンス顕微鏡で測定したところ、漸増量の阻害剤を存在させると青色細胞の数が用量依存的に減少することが分かった。これらの結果は、ｇｐ１２０／ｇｐ４１推進ビリオン侵入のＩｇＧ  １ｂ１２阻止と一致している。Ｒ８及びＲ８．ＢａＬ  ＨＩＶリポーター粒子調製物のＩＣ５０（シグナルの５０％を抑制するのに必要な阻害剤の濃度）はそれぞれ１．２μｇ／ｍｌ及び２．４μｇ／ｍｌであったことが分かった。
【実施例８】
【０１４０】
ＡＭＬＶ糖タンパク質での偽タイピング
他のウイルス由来のエンベロープウイルス糖タンパク質が機能的にＨＩＶリポーター粒子に取り込まれ得るかを調べるために、２９３Ｔ細胞に
１．Ｒ９  ＰＲ−Δｅｎｖ−（１０μｇ）＋ｐＭＭ３１０（１０μｇ）、
２．Ｒ９  ＰＲ−Δｅｎｖ−（１０μｇ）＋ｐＭＭ３１０（１０μｇ）＋ｐＣＭＶ−ＶＳＶＧ（５μｇ）、
３．Ｒ９  ＰＲ−Δｅｎｖ−（１０μｇ）＋ｐＭＭ３１０（１０μｇ）＋ｐＳＶ−ＡＭＬＶ（５μｇ）
を同時トランスフェクトした。ＨＩＶリポーター粒子は実施例２に記載されているように収集した。
【０１４１】
ＨＩＶリポーター粒子含有上清の連続２倍希釈物を、ＳｕｐＴ１／ＣＣＲ５細胞と３７℃で５時間インキュベートすることにより侵入について試験し、その後細胞に実施例４に記載されているようにＣＣＦ２−ＡＭを添加した。図５に示すように、エンベロープ糖タンパク質を欠くＨＩＶリポーター粒子はβ−ラクタマーゼを標的細胞に移入させなかった。
【０１４２】
ＶＳＶ−ＧまたはＡＭＬＶエンベロープ糖タンパク質を有するＨＩＶリポーター粒子はβ−ラクタマーゼを標的細胞にＨＩＶリポーター粒子用量依存的に移入させた。蛍光分析及び顕微鏡分析により、ＶＳＶ−Ｇタンパク質はＡＭＬＶタンパク質に比してより多数の細胞に侵入されることが裏付けられた。しかしながら、ＡＭＬＶによりＨＩＶリポーター粒子が幾つかの標的細胞に侵入されたという知見から、異なるウイルス由来のエンベロープ糖タンパク質がＨＩＶリポーター粒子に取り込まれたときに機能し得ることを示す立証が得られる。
【実施例９】
【０１４３】
初代（臨床）ＨＩＶ単離物由来のエンベロープ糖タンパク質のリポーター粒子への取込み
初代ＨＩＶ単離物由来のｇｐ１６０遺伝子を用いて糖タンパク質を含むＨＩＶリポーター粒子を作成した。ＨＩＶ  Ｒ８ゲノムを用いてリポーター粒子を構築した。
【０１４４】
Ｒ８ゲノムは、多くの場合初代ＨＩＶ−１ゲノム中に存在するゲノムの３’末端に向かって存在する数個のユニーク制限部位（すなわち、ＢａｍＨＩ、ＣｅｌＩＩ及びＸｈｏＩ）を含んでいる。初代ＨＩＶ−１単離物由来のｇｐ１６０遺伝子をＲ８ゲノムに挿入させるために、ｇｐ１６０の翻訳開始部位のちょうど５’のエンドヌクレアーゼＮｏｔ１のユニーク認識部位を挿入することによりＲ８プロウイルスＤＮＡを改変した（プラスミドｐＭＭ３２６）。
【０１４５】
製造業者（Ｒｏｃｈｅ）に従ってＥｘｐａｎｄ  Ｈｉｇｈ−ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＰＣＲシステムを用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を実施することにより、初代ｇｐ１６０遺伝子を増幅させた。ＰＣＲ増幅のためのオリゴヌクレオチドは下流プライマーｐＭＭ４４０及び上流プライマーＭＭ４３９であって、ＮｏｔＩ部位を含んでいる。ＤＮＡ鋳型は初代ＨＩＶ単離物１０２１、１０２２及び１０３６を感染させたＰＢＭＣから単離したゲノムＤＮＡから構成した。増幅条件は、本質的にＧａｏら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７０：１６５１−１６６７（１９９６）に記載されているとおりであった。増幅産物をＮｏｔＩとＣｅｌＩＩまたはＸｈｏＩを用いて消化し、同じ酵素を用いて消化したｐＭＭ３２６に連結させた。生じたプラスミドをＲ８．１０２１、Ｒ８．１０２２及びＲ８．１０３６と呼ぶ。
【０１４６】
２９３Ｔ細胞にｐＭＭ３１０と共にＨＩＶプロウイルスプラスミドＲ８、Ｒ８．ＢａＬ、Ｒ８．１０２１、Ｒ８．１０２２及びＲ８．１０３６を実施例２に記載のリン酸カルシウム法を用いて同時トランスフェクトすることにより、ＨＩＶリポーター粒子を作成した。実施例２に記載されているように上清を収集し、特定の阻害剤ＤＰ−１７８の存在または非存在下で上清をＳｕｐＴ１／ＣＣＲ５標的細胞（１０５／１０μｌ）とインキュベートすることにより侵入について試験した。標的細胞を上清と３７℃で５時間インキュベートした後ＣＣＦ２−ＡＭ（１μＭ）を室温で一晩添加した。
【０１４７】
エピフルオレッセンス顕微鏡によると、プラスミドＲ８、Ｒ８．ＢａＬ、Ｒ８．１０２１及びＲ８．１０３６はβ−ラクタマーゼをＳｕｐＴ１／ＣＣＲ５細胞に効率的に移入させることが知見された。蛍光分析の結果を表ＩＸに示す。
【０１４８】
【表９】
2004532012.tif 000010
【０１４９】
ＤＰ−１７８ペプチド（１μＭ）を添加すると、Ｒ８．１０３６以外のすべてのＨＩＶリポーター粒子による侵入が効率的に阻止された。この単離物の侵入は他の阻害剤（データー示さず）により効率的に阻止された。要約すると、これらの結果は、初代ＨＩＶ−１単離物によりコードされるｇｐ１６０ｓの侵入コンピテンス機能の分析が簡便になることを示している。
【実施例１０】
【０１５０】
初代ヒト細胞の標的細胞としての使用
本セクションに示す結果から、ＨＩＶ侵入を評価するためにＨＩＶリポーター粒子を非クローン化初代ヒト細胞と併用し得ることを示す。ＨＩＶリポーター粒子はβ−ラクタマーゼをヒト単球由来マクロファージ及び初代末梢血単核細胞に移入させた。
【０１５１】
ＰＢＭＣは標準方法を用いて献血から単離した。単球は標準方法を用いるプラスチック付着によりＰＢＭＣから入手し、テフロンジャーにおいて単球／マクロファージ培地で培養して、マクロファージに分化させた。マクロファージを１０％  ＰＢＳを添加したフェノールレッドを含まないＤＭＥＭ中に１０７細胞／ｍｌで再懸濁させた。細胞（１０μｌ＝１０５細胞）をＲ８または８．ＢａＬ  ＨＩＶリポーター粒子上清（９０μｌ）と一緒に３７℃で４時間インキュベートし、その後ＣＣＦ２−ＡＭ（１μＭ）を室温で一晩添加した。
【０１５２】
光顕微鏡によると、培養物は大きくて平らな接着細胞及び小さくて丸い非接着細胞の両方を含んでいた。エピルピネッセンス顕微鏡で観察すると、Ｒ８及び８．ＢａＬ由来のＨＩＶリポーター粒子はβ−ラクタマーゼを培養物中の細胞に移入し得たことが認められ、初代細胞がＨＩＶリポーター粒子により侵入され得ることを示す。
【０１５３】
更に、Ｒ８由来のＨＩＶリポーター粒子はβ−ラクタマーゼを小さくて丸い細胞に優先的に移入し、一方８．ＢａＬ由来のＨＩＶリポーター粒子はβ−ラクタマーゼを大きい接着細胞に優先的に移入させたことが明らかであった。これらの所見は、Ｒ８エンベロープはウイルスをＴ細胞に侵入させる傾向（Ｔ向性）にあり、ＢａＬエンべロープはウイルスをマクロファージに侵入させる傾向（Ｍ向性）にあるという既報の報告と一致している。
【０１５４】
別の実験では、ＰＢＭＣを４人のドナーの血液から単離した。静脈穿刺により血液をＥＤＴＡ含有Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒチューブに集め、ＰＢＭＣは標準法により調製した。ＰＢＭＣをフェノールレッド非含有のＤＭＥＭ／１０％  ＦＢＳに１０７／ｍｌで再懸濁した。細胞（１０μｌ＝１０５細胞）をＤＰ−１７８（１μＭ）の存在または非存在下でＲ８または８．ＢａＬ  ＨＩＶリポーター粒子上清（９０μｌ）と一緒に３７℃で４時間インキュベートした。このインキュベート後、ＣＣＦ４−ＡＭ（１μＭ）を室温で一晩添加した。
【０１５５】
細胞をエピルミネッセンス顕微鏡により観察すると、Ｒ８及び８．ＢａＬ由来のＨＩＶリポーター粒子はβ−ラクタマーゼを４人のドナー由来のＰＢＭＣに移入させたことが認められた。阻害剤の非存在下では、各ドナーからの細胞の〜２０−２５％は各タイプのＨＩＶリポーター粒子と一緒にインキュベートした後青色に見えた。β−ラクタマーゼのＰＢＭＣへの移入を阻止する能力は該移入がｇｐ１２０／ｇｐ４１により媒介されることを示す。
【実施例１１】
【０１５６】
別のトランスフェクション方法
ＨＩＶリポーター粒子はリン酸カルシウム沈降以外の方法により細胞をトランスフェクトすることにより作成し得る。ＨＩＶリポーター粒子を作成するためのトランスフェクション条件を最適にするために、市販されている各種トランスフェクションキットを試験した。いずれの場合も、２９３Ｔ細胞（１０ｃｍ皿に前日に接種した１．５×１０６細胞）に製造業者の推奨に従ってＲ８  ＤＮＡ（５μｇ）及びｐＭＭ３１０または非関連ＤＮＡ（５μｇ）をトランスフェクトした。
【０１５７】
リン酸カルシウム、Ｆｕｇｅｎｅ６（６０μｌ）、Ｅｆｆｅｃｔｅｎｅ（エンハンサー１６μｌ）またはＴｒａｎｓＩＴ（トランスフェクション剤５０μｌ）を用いてトランスフェクションを一晩実施した。翌日、培地を除去し、細胞をＰＢＳ（１０ｍｌ）で１回洗浄し、細胞にフェノールレッド非含有のＤＭＥＭ／１０％  ＦＢＳ（８ｍｌ）を再供給し、４８時間インキュベートした。上清を実施例２に記載したように収集した後、９６ウェルプレートにおいて上清の連続２倍希釈物（９０μｌ／ウェル）を実施例４に記載したようにＳｕｐＴ１／ＣＣＲ５細胞（１０μｌ＝１０５細胞／ウェル）と３７℃でインキュベートすることにより侵入アッセイで試験した。
【０１５８】
インキュベート後、細胞にＣＣＦ２−ＡＭを室温で一晩添加した後、蛍光をＢＭＧ  ＰｏｌａｒＳｔａｒ蛍光光度計を用いて測定した。図６に示す結果から、いずれのトランスフェクション方法によっても侵入−コンピテントＨＩＶリポーター粒子を生じさせたことが分かる。
【０１５９】
他の実施態様も上記した請求の範囲の範囲内である。幾つかの実施態様を例示乃至説明してきたが、本発明の趣旨及び範囲を逸脱しない範囲で各種変更をなし得る。
【図面の簡単な説明】
【０１６０】
【図１】ＨＩＶベースのウイルスリポーター粒子アッセイの細胞に対してβ−ラクタマーゼ活性を与える能力を示す。
【図２】ＨＩＶ補助タンパク質Ｖｐｒに融合したバクテリアβ−ラクタマーゼ酵素からなる融合タンパク質をコードするプラスミドｐＭＭ３１０を示す。
【図３】特定のＨＩＶ侵入阻害剤ＤＰ−１７８によりβ−ラクタマーゼの標的細胞へのＨＩＶリポーター粒子媒介移入が阻止されることを示す。ＨＩＶリポーター粒子を異なる濃度のペプチド阻害剤ＤＰ−１７８の存在下で標的細胞と３７℃で５時間インキュベートした後、蛍光β−ラクタマーゼ基質ＣＣＦ２−ＡＭを添加した。グラフはＤＰ−１７８濃度（ｘ軸）に対する青色蛍光発光（ｙ軸）を示す。Ｒ８  ＨＩＶプロウイルスから作成したＨＩＶリポーター粒子及びＲ８．ＢａＬプロウイルスから作成したＨＩＶリポーター粒子の２つの異なるＨＩＶリポーター粒子を試験にかけた。
【図４】特定のＨＩＶ侵入阻害剤ＩｇＧ  １ｂ１２によりβ−ラクタマーゼの標的細胞へのＨＩＶリポーター粒子媒介移入が阻止されることを示す。ＨＩＶリポーター粒子を異なる濃度の抗体ＩｇＧ  １ｂ１２の存在下で標的細胞と３７℃で５時間インキュベートした後、蛍光β−ラクタマーゼ基質ＣＣＦ２−ＡＭを添加した。グラフはＩｇＧ  １ｂ１２濃度（ｘ軸）に対する青色蛍光発光（ｙ軸）を示す。Ｒ８  ＨＩＶプロウイルスから作成したＨＩＶリポーター粒子及びＲ８．ＢａＬプロウイルスから作成したＨＩＶリポーター粒子の２つの異なるＨＩＶリポーター粒子を試験にかけた。
【図５】入力ＨＩＶリポーター粒子に対するＣＣＦ２−ＡＭ−添加ＳｕｐＴ１細胞からの青色蛍光発光（ｙ軸）のグラフである。ＣＣＦ２−ＡＭの添加前に、細胞をエンベロープ糖タンパク質、水疱性口内炎ウイルスＧエンベロープ糖タンパク質または両種性マウス白血球ウイルスエンベロープ糖タンパク質を持たないＨＩＶリポーター粒子の希釈物とインキュベートした。
【図６】入力ＨＩＶリポーター粒子に対するＣＣＦ２−ＡＭ−添加ＳｕｐＴ１細胞からの青色蛍光発光（ｙ軸）のグラフである。ＣＣＦ２−ＡＭの添加前に、細胞を各種試薬、すなわちＣａＰＯ４、Ｆｕｇｅｎｅ６、ＥｆｆｅｃｔｅｎｃｅまたはＴｒａｎｓＩＴをトランスフェクトした２９３Ｔ細胞から作成したＨＩＶリポーター粒子の希釈物とインキュベートした。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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