(57)【要約】ウイルスタンパク質２（ＶＰ２）をコードするウイルス核酸において突然変異を有する分離弱毒化サーコウイルス。この弱毒化サーコウイルスは、動物、特に鳥への免疫性付与において使用するのに特に適している。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ウィルスタンパク質２（ＶＰ２）をコードするウイルス核酸に突然変異を有する、分離弱毒化サーコウイルス。
【請求項２】
請求項１に記載の分離弱毒化サーコウイルスであって、ニワトリ貧血ウィルス（ＣＡＶ）、ＴＴウィルス（ＴＴＶ）又はＶＰ２タンパク質を発現する他の類似のウィルスに由来又はそれから得たものである、前記サーコウイルス。
【請求項３】
請求項２に記載の分離弱毒化サーコウイルスであって、ニワトリ貧血ウィルス（ＣＡＶ）に由来又はそれから得たものである、前記サーコウイルス。
【請求項４】
前記突然変異が、ＶＰ２のサインモチーフをコードしている核酸の領域に存在している、請求項１〜３のいずれか１項に記載の分離弱毒化サーコウイルス。
【請求項５】
前記突然変異が、ウイルスＰＴＰａｓｅ活性、ＰＴＰａｓｅモチーフ、酸性アルファらせん領域又は塩基性ベータシート領域を変更させるものである、請求項４に記載の分離弱毒化サーコウイルス。
【請求項６】
前記突然変異が、ＣＡＶ  ＶＰ２における核酸残基８０〜１１０、１２８〜１４３、１５１〜１５８及び１６０〜１７０の領域に存在する、請求項３に記載の分離弱毒化サーコウイルス。
【請求項７】
ＣＡＶ  ＶＰ２内の突然変異誘発の前記標的部位が、８６、９５、９７、１０１、１０３及び１６９からなる群から選択されたものである、請求項６に記載の分離弱毒化サーコウイルス。
【請求項８】
前記突然変異が、ｍｕｔＣ８６Ｒ、ｍｕｔＣ９５Ｓ、ｍｕｔＣ９７Ｓ、ｍｕｔＲ１０１Ｇ、ｍｕｔＫ１０２Ｅ、ｍｕｔＨ１０３Ｙ、ｍｕｔＲ１２９Ｇ、ｍｕｔＱ１３１Ｐ、ｍｕｔＲ／Ｋ／Ｋ１５０／１５１／１５２Ｇ／Ａ／Ａ、ｍｕｔＤ／Ｅ１６１／１６２Ｇ／Ｇ、ｍｕｔＬ１６３Ｐ、ｍｕｔＤ１６９Ｇ、ｍｕｔＥ１８６Ｇ及びそれらの組み合わせから成る群から選択されたものである、請求項６に記載の分離弱毒化サーコウイルス。
【請求項９】
ｍｕｔＤ１６９Ｇを含む、請求項８に記載の分離弱毒化サーコウイルス。
【請求項１０】
配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５及び２７から成る群から選択された核酸配列から成る、請求項１〜９のいずれか１項に記載の分離弱毒化サーコウイルス。
【請求項１１】
ウィルスタンパク質２（ＶＰ２）をコードするウイルス核酸に突然変異を有する弱毒化サーコウイルスを、許容される担体又は希釈剤とともに含む、サーコウイルスワクチン組成物。
【請求項１２】
前記サーコウイルスが、ニワトリ貧血ウィルス（ＣＡＶ）、ＴＴウィルス（ＴＴＶ）又はＶＰ２タンパク質を発現する他の類似のウィルスに由来又はそれから得たものである、請求項１１に記載のサーコウイルスワクチン組成物。
【請求項１３】
前記サーコウイルスが、ニワトリ貧血ウィルス（ＣＡＶ）に由来又はそれから得たものである、請求項１２に記載のサーコウイルスワクチン組成物。
【請求項１４】
前記突然変異が、ＶＰ２のサインモチーフ（Ｓｉｇｎａｔｕｒｅ  ｍｏｔｉｆ）をコードしている核酸の領域に存在している、請求項１１〜１３のいずれか１項に記載のサーコウイルスワクチン組成物。
【請求項１５】
前記突然変異が、ウイルスＰＴＰａｓｅ活性、ＰＴＰａｓｅモチーフ、酸性アルファらせん領域又は塩基性ベータシート領域を変更させるものである、請求項１４に記載のサーコウイルスワクチン組成物。
【請求項１６】
前記突然変異が、ＣＡＶ  ＶＰ２における核酸残基８０〜１１０、１２８〜１４３、１５１〜１５８及び１６０〜１７０の領域に存在する、請求項１３に記載のサーコウイルスワクチン組成物。
【請求項１７】
ＣＡＶ  ＶＰ２内の突然変異誘発の標的部位が、８６、９５、９７、１０１、１０３及び１６９から成る群から選択されたものである、請求項１６に記載のサーコウイルスワクチン組成物。
【請求項１８】
前記突然変異が、ｍｕｔＣ８６Ｒ、ｍｕｔＣ９５Ｓ、ｍｕｔＣ９７Ｓ、ｍｕｔＲ１０１Ｇ、ｍｕｔＫ１０２Ｅ、ｍｕｔＨ１０３Ｙ、ｍｕｔＲ１２９Ｇ、ｍｕｔＱ１３１Ｐ、ｍｕｔＲ／Ｋ／Ｋ１５０／１５１／１５２Ｇ／Ａ／Ａ、ｍｕｔＤ／Ｅ１６１／１６２Ｇ／Ｇ、ｍｕｔＬ１６３Ｐ、ｍｕｔＤ１６９Ｇ、ｍｕｔＥ１８６Ｇ及びそれらの組み合わせから成る群から選択されたものである、請求項１６に記載のサーコウイルスワクチン組成物。
【請求項１９】
ｍｕｔＤ１６９Ｇを含む、請求項１８に記載のサーコウイルスワクチン組成物。
【請求項２０】
配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５及び２７から成る群から選択された核酸配列を含む、請求項１１〜１９のいずれか１項に記載のサーコウイルスワクチン組成物。
【請求項２１】
請求項１１〜２０のいずれか１項に記載のサーコウイルスワクチンの有効量を動物に投与することを含む、上記動物にサーコウイルス感染に対する免疫性を付与する方法。
【請求項２２】
前記動物が、鳥である、請求項２１に記載の免疫性を付与する方法。
【請求項２３】
前記鳥が、ニワトリである、請求項２２に記載の免疫性を付与する方法。
【請求項２４】
前記ワクチンを、非経口、筋肉内に、皮下に、経口、鼻腔内又は卵内経路で投与する、請求項２１〜２３のいずれか１項に記載の免疫性を付与する方法。
【請求項２５】
前記動物が鳥であり、前記ワクチンの投与経路が、粘膜投与、エアゾール投与又は飲料水経由である、請求項２４に記載の免疫性を付与する方法。
【請求項２６】
前記鳥が、ニワトリである、請求項２５に記載の免疫性を付与する方法。
【請求項２７】
前記ワクチンが、１ＴＣＩＤ50〜１億ＴＣＩＤ50の投与量範囲で投与される、請求項２１〜２６のいずれか１項に記載の免疫性を付与する方法。
【請求項２８】
前記ワクチンを、約１０００ＴＣＩＤ50の投与量範囲で投与する、請求項２７に記載の免疫性を付与する方法。
【請求項２９】
サーコウイルスゲノムに由来又はそれから得たものである分離核酸分子であって、突然変異をその中に有するウィルスタンパク質２（ＶＰ２）のコード領域の少なくとも一部分を含む、前記分離核酸分子。
【請求項３０】
前記サーコウイルスが、ニワトリ貧血ウィルス（ＣＡＶ）、ＴＴウィルス（ＴＴＶ）又はＶＰ２タンパク質を発現する他の類似のウィルスに由来又はそれから得たものである、請求項２９に記載の分離核酸分子。
【請求項３１】
前記サーコウイルスが、ニワトリ貧血ウィルス（ＣＡＶ）に由来又はそれから得たものである、請求項３０に記載の分離核酸分子。
【請求項３２】
前記突然変異が、ＶＰ２のサインモチーフをコードしている核酸の領域に存在している、請求項２９〜３１のいずれか１項に記載の分離核酸分子。
【請求項３３】
前記突然変異が、ウイルスＰＴＰａｓｅ活性、ＰＴＰａｓｅモチーフ、酸性アルファらせん領域又は塩基性ベータシート領域を変更させるものである、請求項３２に記載の分離核酸分子。
【請求項３４】
前記突然変異が、ＣＡＶ  ＶＰ２における核酸残基８０〜１１０、１２８〜１４３、１５１〜１５８及び１６０〜１７０の領域に存在する、請求項３１に記載の分離核酸分子。
【請求項３５】
ＣＡＶ  ＶＰ２内の突然変異誘発の標的部位が、８６、９５、９７、１０１、１０３及び１６９から成る群から選択されたものである、請求項３４に記載の分離核酸分子。
【請求項３６】
前記突然変異が、ｍｕｔＣ８６Ｒ、ｍｕｔＣ９５Ｓ、ｍｕｔＣ９７Ｓ、ｍｕｔＲ１０１Ｇ、ｍｕｔＫ１０２Ｅ、ｍｕｔＨ１０３Ｙ、ｍｕｔＲ１２９Ｇ、ｍｕｔＱ１３１Ｐ、ｍｕｔＲ／Ｋ／Ｋ１５０／１５１／１５２Ｇ／Ａ／Ａ、ｍｕｔＤ／Ｅ１６１／１６２Ｇ／Ｇ、ｍｕｔＬ１６３Ｐ、ｍｕｔＤ１６９Ｇ、ｍｕｔＥ１８６Ｇ及びそれらの組み合わせから成る群から選択されたものである、請求項３４に記載の分離核酸分子。
【請求項３７】
ｍｕｔＤ１６９Ｇを含む、請求項３６に記載の分離核酸分子。
【請求項３８】
配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５及び２７から成る群から選択された配列を含む、請求項２９〜３７のいずれか１項に記載の分離核酸分子。
【請求項３９】
請求項２９〜３８のいずれか１項に記載の分離核酸分子を、許容される担体又は希釈剤とともに含む、ワクチン組成物。
【請求項４０】
動物にサーコウイルス感染に対する免疫性を付与する方法であって、請求項３９に記載のワクチン組成物を動物に投与することを含む、前記方法。
【請求項４１】
前記サーコウイルス感染が、ＣＡＶ感染である、請求項４０に記載の免疫性を付与する方法。
【請求項４２】
前記動物が、鳥である、請求項４１に記載の免疫性を付与する方法。
【請求項４３】
前記鳥が、ニワトリである、請求項４２に記載の免疫性を付与する方法。
【請求項４４】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載の分離弱毒化サーコウイルスの使用であって、動物にサーコウイルス感染に対する免疫性を付与するためのワクチンの製造における前記使用。
【請求項４５】
請求項２９〜３８のいずれか１項に記載の分離核酸分子の使用であって、動物にサーコウイルス感染に対する免疫性を付与するためのワクチンの製造における前記使用。
【請求項４６】
サーコウイルスワクチンの製造方法であって、以下の工程：
（ａ）サーコウイルスゲノムに由来又はそれから得られた分離核酸分子を、有胚卵の卵黄嚢に接種する工程であって、前記核酸分子がその中に突然変異を有するウィルスタンパク質２（ＶＰ２）のコード領域の少なくとも一部分を含むものである、前記工程；
（ｂ）サーコウイルスを、前記分離核酸から複製する工程；及び、
（ｃ）前記卵から前記サーコウイルスを採取する工程、
を含む、前記方法。
【請求項４７】
前記分離核酸分子が、ニワトリ貧血ウィルス（ＣＡＶ）、ＴＴウィルス（ＴＴＶ）又はＶＰ２タンパク質を発現する他の類似のウィルスに由来又はそれから得たものである、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記分離核酸分子が、ニワトリ貧血ウィルス（ＣＡＶ）に由来又はそれから得たものである、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記突然変異が、ＶＰ２のサインモチーフをコードしている核酸の領域に存在している、請求項４６〜４８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５０】
前記突然変異が、ウイルスＰＴＰａｓｅ活性、ＰＴＰａｓｅモチーフ、酸性アルファらせん領域又は塩基性ベータシート領域を変更させるものである、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記突然変異が、ＣＡＶ  ＶＰ２における核酸残基８０〜１１０、１２８〜１４３、１５１〜１５８及び１６０〜１７０の領域に存在する、請求項４８に記載の方法。
【請求項５２】
ＣＡＶ  ＶＰ２内の突然変異誘発の標的部位が、８６、９５、９７、１０１、１０３及び１６９から成る群から選択されたものである、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記突然変異が、ｍｕｔＣ８６Ｒ、ｍｕｔＣ９５Ｓ、ｍｕｔＣ９７Ｓ、ｍｕｔＲ１０１Ｇ、ｍｕｔＫ１０２Ｅ、ｍｕｔＨ１０３Ｙ、ｍｕｔＲ１２９Ｇ、ｍｕｔＱ１３１Ｐ、ｍｕｔＲ／Ｋ／Ｋ１５０／１５１／１５２Ｇ／Ａ／Ａ、ｍｕｔＤ／Ｅ１６１／１６２Ｇ／Ｇ、ｍｕｔＬ１６３Ｐ、ｍｕｔＤ１６９Ｇ、ｍｕｔＥ１８６Ｇ及びそれらの組み合わせから成る群から選択されたものである、請求項５１に記載の方法。
【請求項５４】
ｍｕｔＤ１６９Ｇを含む、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５及び２７から成る群から選択された核酸配列を有する、請求項４６〜５４のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、弱毒化ウイルス、ウイルスワクチン組成物、特にニワトリ貧血ウィルスの形態の弱毒化サーコウイルスに関する。
【背景技術】
【０００２】
ニワトリ貧血ウィルス（ＣＡＶ）は、サーコウィルス科（Ｃｉｒｃｏｖｉｒｉｄａｅ）に属する。サーコウィルス科には、一本鎖のマイナス鎖環状ＤＮＡゲノムを所有していることにより特徴付けられる、多数の植物及び動物ウイルスが含まれる。ＣＡＶと以下の他の特徴付けられた動物サーコウイルス：オウム嘴羽病ウィルス（ＰＢＦＤＶ）、鳩サーコウイルス及び豚サーコウイルス（ＰＣＶ）１及び２、との間には、ゲノム配列及び構成において類似性はほんのわずかしかない。ＴＴウィルス（ＴＴＶ）が、最近ヒト宿主及び他の種において、一本鎖のマイナス鎖環状ＤＮＡウイルスの不均一なクラスターとして同定された。このウイルス群の配列解析により、ＣＡＶに対して最大の総相同性を有することが明らかとなり、ＴＴＶ、ＳＡＮＢＡＮ、ＹＯＮＢＡＮ、ＴＬＭＶ（ＴＴＶ様ミニウィルス）及びＣＡＶウィルスをパラサーコウィルス科（Ｐａｒａｃｉｒｃｏｖｉｒｉｄａｅ）として分類することが最近提案されたが、その系統発生は、いぜんとして活発に改訂されている。ＣＡＶに対する最高の配列相同性が、非コード領域中、及びＴＴＶのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ２）とＣＡＶのＶＰ２との間にみられる。ＣＡＶとＴＴＶとの間に高レベルの配列保存があることは、ＶＰ２がウイルス感染と病原性において極めて重要な役割を果たすことができることを示唆している。
【０００３】
ＣＡＶは、３つのタンパク質のみをコードしており、３つのフレームにＯＲＦが重複している。ＯＲＦ３は主要な４５〜５２ｋＤａキャプシドタンパク質ＶＰ１をコードしており、ＯＲＦ２は形質転換細胞株においてアポトーシス活性を示した１１〜１３ｋＤａ  ＶＰ３をコードしており、ＯＲＦ１は未知の機能を有する２８ｋＤａ非構造性タンパク質ＶＰ２をコードしている。ＶＰ２は、感染中にほとんど検出できないレベルで発現されるが、ウイルス感染及び細胞における複製には必須であることが判明した。このＶＰ２の低レベルの発現は、ウイルス複製及び感染に関与している非構造性調節タンパク質と一致している。
【０００４】
ＣＡＶ病原性は、免疫抑制及び汎血球減少が汎骨髄ろう及び胸腺細胞の欠乏から生じるという特徴がある。免疫抑制により、ＣＡＶに感染した幼鳥において、重感染及びワクチン接種不良に関連した罹患率及び死亡率の増加が生じる。ＣＡＶ感染は、胸腺及び脾臓の２つの別個のＴ細胞集団に対して直接細胞障害を生じる。胸腺感染には、未成熟リンパ芽球性前駆体が関与し、一方脾臓感染は、高度に活性化された成熟Ｔリンパ球によるものである。未感染免疫効果細胞にみられる免疫抑制の第二間接成分がある。マクロファージの減少並びにＡＰＣエフェクター機能及びＢ細胞抗原応答が、報告されている。感染細胞からのサイトカインプロファイルが限定されたものであることが、全身性間接免疫抑制の根拠を示唆している。感染鳥のリンパ球では、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、インターフェロンガンマ（ＩＦＮγ）、リンパ球刺激指数、ＩＬ−１、Ｔ細胞増殖因子活性及びＦｃ受容体レベルが減少している。ウイルスによるサイトカインプロファイルの変調及び間接免疫抑制についての分子的機序については、未知である。
【０００５】
ＣＡＶ  ＶＰ２配列と、Ｇｅｎｂａｎｋデータベースから入手できる配列とを予備比較したところ、多数の真核生物の受容体ＰＴＰａｓｅ（Ｒ−ＰＴＰａｓｅアルファ）に類似していることが示された。データベースサーチでは、ヒト胎盤Ｒ−ＰＴＰａｓｅアルファ前駆体、ラットＲ−ＰＴＰａｓｅアルファ前駆体、マウスＲ−ＰＴＰａｓｅアルファ前駆体及びニワトリＲ−ＰＴＰａｓｅアルファ前駆体がＣＡＶ  ＶＰ２配列と相同であることが確認された。可逆的タンパク質リン酸化は、代謝、遺伝子調節、細胞サイクル調節、細胞骨格構築及び細胞接着を含む、細胞プロセスの調節においては一般的である。ＰＴＰａｓｅ群は、非常に多種多様であり、真核生物受容体様膜貫通型タンパク質及び可溶性細胞質内タンパク質だけでなく、細菌ＰＴＰａｓｅ、例えば、病原性ＹｅｒｓｉｎｉａからのＹｏｐＨ  ＰＴＰase及びワクシニアウイルスにみられるウイルスＰＴＰａｓｅＶＨ１（ポックスウイルス科に属する）などがある。ワクシニアウイルス感染中、ＶＨ１タンパク質は、インターフェロンγ信号伝達をブロックし、それによりウイルス感染に対する免疫反応を回避する。感染におけるＶＨ１  ＰＴＰａｓｅの役割は、現在では特徴付けされた生体内機能を有する唯一のウイルスＰＴＰａｓｅであるけれども、ウイルスコードＰＴＰａｓｅが免疫回避及びウイルス持続性の機構に関与している可能性を浮き彫りにしている。
【０００６】
商業的養鶏業者は、臨床感染と亜臨床的感染の両方による経済的損失を減少させる、ニワトリ貧血ウィルス（ＣＡＶ）ワクチンを必要としている。ＣＡＶ感染に関連する成鳥における亜臨床的疾病をなくするは、感染による免疫抑制を克服する必要がある。ＣＡＶ感染は、ブロイラー群において、経済的に最も重要である。臨床感染と亜臨床的感染の両方とも、商業的なブロイラーの性能及び経済性に影響を及ぼす。臨床感染では、性能パラメータがより著しく減少するが、亜臨床的感染は、発生率がより高いため経済的損失度がより大きい。初年鶏、ブロイラー及び種鳥に好適なワクチンの必要性が高い。このようなワクチンは、産卵可能な時点で鳥に投与でき、したがって、胚への垂直感染の場合には安全でなければならない。
【０００７】
ＣＡＶワクチンの開発には、国際的な用途がある。ニワトリ貧血ウィルス（ＣＡＶ）は、血清学調査によると、世界中に分布しており、オーストラリアＳＰＦ群を除いて、ＳＰＦと商業的ニワトリ群の両方に固有のものである。ＣＡＶ分離株が特徴付けられ、且つそれらの完全なゲノム配列が公表されている国は、ドイツ、英国、米国、日本、オーストラリア及びオランダなどである。全ての分離株は、免疫蛍光における交差反応及びポリクローナル抗血清を用いた中和試験に基づいて単一の血清型に分類されている。ゲノム配列保存は、全てのＣＡＶ分離株の主要な特徴である。全ての実地分離株が、試験的感染において同等の病原性を示し、ＣＡＶに暴露した場合の罹患率及び疾病の重症度の変動は、相互作用、疫学的因子の範囲に起因している。ウイルスの用量が、実地でのＣＡＶ誘発疾病の重症度の主な決定要因である。いずれか一つの分離株から発現された弱毒化生ワクチンは、国際的に鶏の群において防御性があると思われる。
【０００８】
弱毒化ＣＡＶ菌株は、病原性が減少しながらも感染性でなければならない。臨床的疾病は、日齢１日で感染させた幼鳥について文献でもっともよく特徴付けされている。日齢１日で感染した幼鳥の臨床的疾病は、虚弱、意気消沈、発育阻害及び貧血により特徴付けられる。感染後７日までに、赤芽球細胞の破壊による過渡的であるが重度の過急性貧血、及び皮質リンパ球の欠乏による免疫不全が生ずる。感染後１４〜２１日では、重度の骨髄発育不全、胸腺及びリンパの萎縮並びに血小板の減少がある。一次凝固障害により、点状及び斑状出血が生じる。免疫抑制は、ＣＡＶ誘発疾病の顕著な特徴であり、且つ二次感染が一般的である。ＣＡＶに冒された鳥では、悪性浮腫、壊疽性皮膚炎、大腸菌症及び肺アスペルギルス症の発生率が増加する。回復期は、感染後１４〜３５日からである。回復中の顆粒球造血にさきだって、赤血球生成が生じる。感染後１６日では、循環未成熟赤血球、血小板及び顆粒球が高い割合となり、感染後２８日までに、ヘマトクリットが完全に回復する。２１日でのリンパ球遊走の第３の波により、胸腺は再集団化する。
【０００９】
ＣＡＶに冒された鳥は、重度の骨髄癆の貧血を生じる。ヘマトクリットは、２７％未満であり、典型的には９〜２３％である（通常、日齢７〜１４日の幼鳥では、３２〜３７．５％である）。チアノーゼが、非羽外皮において及び粘膜上で明らかにみられる。異質細胞減少及びリンパ球減少により、白血球減少が生じる。凝固時間の延長は、外皮、骨格筋、前胃の粘膜及びめったにはないが心膜で観察される点状及び斑状出血に関連している。
【００１０】
骨髄は、組織が、汎骨髄癆及び代償性の脂肪細胞の異常増殖により、黄色〜白色且つ水っぽく見える。これは、近位大腿骨髄腔において最も顕著である。
【００１１】
胸腺は、ひどく萎縮する。冒された胸腺は、定量化できる程度に重量が減少し、直径が２〜４ｍｍである。それらは、実質リンパ球集団の減少、細網細胞の異常増殖及び組織の充血のため、灰色ではなく赤褐色にみえる。
【００１２】
全ての組織のリンパ球濾胞成分の全身性欠乏がある。ファブリキウス嚢は、過渡的に中度に萎縮するが、膨潤しないか、浮腫状である。臨床的に冒された幼鳥では、嚢の萎縮は、軽度〜見えない程度のことがある。
【００１３】
肝臓、腎臓及び脾臓は、感染後１４日で、拡散性に脱色し、膨潤する。
【００１４】
限局性の皮膚出血性損傷が、翼において最も顕著であり、さらに、頭部、尻、胸部及び腹部の側面、大腿部、脚及び足にもみられる。損傷は、これを覆う皮膚の虚血性壊死のために漿液滑液性溢血をともなう大きな潰瘍にまで進行する。二次感染に関連して、膿状の滲出物が生じる。損傷は、商業的なブロイラー生育装置の環境において、剥離・離断障害を合併する傾向がある。
【００１５】
ＣＡＶ病原性についての実験モデルが、弱毒化の評価には必要とされる。このようなモデルは、実地の感染において観察される全範囲の病変を示す必要はないが、最も重度の病変を生じる条件下で弱毒化を示さなければならない。７日の胚に高用量のウイルスを卵黄嚢接種することが、可能な最も厳しいモデルである。このモデルは、産卵可能な時点の在来種鳥が、ＣＡＶに暴露し、ウイルスを垂直感染する実地の状況に最もよく近似する。垂直感染で感染した幼鳥は、罹患率（１００％）及び死亡率（１０〜７０％）が最も高く、且つ病変が最も重度である。卵黄嚢接種により７日で試験的に感染させた胚の病変を広範に検討した文献はいままでない。
【００１６】
ニワトリは、全齢で、ＣＡＶ感染しやすいが、日齢１４日を超えるニワトリでは、病気の発現に対して齢特異的抵抗性がある。胚と日齢１日の幼鳥は、罹病性が最高である。齢特異的抵抗性は、血清中和体液性応答を生じる鳥の能力の発達と関連しているかもしれない。ＩＢＤＶ等の相乗的鳥病原体で共感染すると、齢特異的抵抗性がなくなり、高齢の鳥で急性の重度の疾病が大発生する。
【００１７】
商業的種鳥群の大部分は、ＣＡＶに暴露され、且つ長期に継続する中和体液性免疫を有する。抗体は、抗体陽転の少なくとも２０週後まで存続する。種鳥群の血清学調査をおこなったところ、典型的には感染後の長期間で、鳥の９７．５〜１００％が血清反応陽性のままであることが明らかとなった。母抗体が、２週齢までのニワトリにおける臨床的疾病に対する防御において重要であり、３週齢まで存続する。母抗体の減衰は、直線的であり、半減期は約１週間である。低レベルの母抗体が、感染による臨床的疾病を防止するのに効果的である。免疫性の種鳥群からの孵化したての幼鳥の大部分は、母抗体の減少に続いて水平感染し、亜臨床的疾病を生じ、感染後８〜１２週で抗体陽転を生じる。暴露した群において、種鳥の約１０％が、暴露後のいずれかの時点で血清反応陰性である。少ない割合のニワトリが、垂直感染し、他の孵化したての幼鳥の水平感染源としての役割を果たす高力価のウイルスを排出する。免疫性の種鳥群の子孫において、１６〜２５％の鳥が亜臨床的に冒されると思われる。したがって、ワクチン接種は、固有ＣＡＶを有する群においてでさえ性能が向上し、且つ持続性の中和体液性免疫を向上させる。
【００１８】
本発明者らは、新規のタンパク質チロシンホスファターゼとしてのＶＰ２の機能の同定及び全機能に必要とされるその配列の領域の同定に基づいて、初年鶏、ブロイラー及び種鳥群の接種に好適なワクチンに使用することができる、生の弱毒化ＣＡＶ及びＣＡＶ  ＤＮＡを開発した。
【発明の開示】
【００１９】
本発明の第一の側面によれば、ウィルスタンパク質２（ＶＰ２）をコードするウイルス核酸に突然変異を有する、分離弱毒化サーコウイルスが提供される。
【００２０】
好ましくは、サーコウイルスは、ニワトリ貧血ウィルス（ＣＡＶ）、ＴＴウィルス（ＴＴＶ）又は他の類似のウイルスである。より好ましくは、サーコウイルスは、ニワトリ貧血ウィルス（ＣＡＶ）である。サーコウイルスは、ＣＡＶ、及び一本鎖のマイナス鎖環状ＤＮＡゲノムを有し、且つＣＡＶ  ＶＰ２タンパク質と機能的に同等の活性を有するタンパク質を発現する、他のウイルスを含むものとして定義される。
【００２１】
突然変異の部位は、ウイルスの機能を同時に調査した上で選択するのが最もよい。本発明者らは、ＣＡＶ  ＶＰ２は、感染性及び免疫原性を保持しながら、病原性を変更する可能性があることから、突然変異誘発による弱毒化のためのよい標的であることを見出した。本発明の一部分として、ＣＡＶ  ＶＰ２の生化学的機能をＰＴＰａｓｅとして正確に明らかとすることにより、合理的に弱毒化するプロセスが非常に容易となり、突然変異誘発方法の中心点がはっきりする。突然変異は、それらが生体外におけるＰＴＰａｓｅの触媒作用に及ぼす影響についての理解に基づいて、感染におけるＰＴＰａｓｅの役割を変更するように設計することができる。ＣＡＶ  ＶＰ２は、ウイルス感染及び複製において必須の非構造的役割を有する多機能性タンパク質であると思われる。タンパク質が非構造性であるので、突然変異が、免疫原性に必須であるエピトープを変更することはありそうには思えない。リンパ球がＣＡＶ感染の標的細胞であるので、十分なウイルス複製が抗原刺激のためになされるならば、病原性が免疫原性と逆相関関係にあるであろう。したがって、ウイルス感染の病原性及び免疫抑制的影響を減少する突然変異により、野生型ウイルスと比較してこのウイルスの免疫原性を高めることができる。
【００２２】
好ましい一つの形態によれば、突然変異が、ＶＰ２のサインモチーフ（Ｓｉｇｎａｔｕｒｅ  ｍｏｔｉｆ）におけるキー残基をコードしている核酸の領域に存在する。このような突然変異は、ウイルス感染中にＰＴＰａｓｅの役割を変更するはずである。より好ましくは、ＣＡＶ  ＶＰ２内の突然変異誘発の標的部位は、８６、９５、９７、１０１、１０３及び１６９である。残基８６は、通常Ｃであり、Sに突然変異させた（ｍｕｔＣ８６S）。他の例示突然変異は、ｍｕｔＣ９５Ｓ、ｍｕｔＣ９７Ｓ、ｍｕｔＲ１０１Ｇ及びｍｕｔＨ１０３Ｙであった。突然変異ｍｕｔＣ９５Ｓ及びｍｕｔＣ９７Ｓでは、ＰＴＰａｓｅ活性に必須であり、且つ触媒反応中に形成されるシステイニル−ホスフェート中間体の形成に関与している触媒システインであると予想される、システイン残基を除去する。突然変異ｍｕｔＲ１０１Ｇでは、ＰＴＰａｓｅ活性に必須であり且つホスホチロシン基質の触媒システイン残基への配位に関与していると予測される塩基性帯電残基を除去する。残基１０３及び８６は、予測されるサインモチーフのわきに位置し、且つＴＴウィルス及びＣＡＶウィルスに高度に保存される。
【００２３】
別の好ましい形態によれば、突然変異は、ＣＡＶ  ＶＰ２における残基１２８〜１４３からの両親媒性αヘリックス領域と残基１５１〜１５８からの両親媒性βシート領域の２つの予測領域をコードする核酸の領域に存在する。他の好適な領域には、ＣＡＶ  ＶＰ２における核酸残基８０〜１１０、１２８〜１４３、１５１〜１５８及び１６０〜１７０などがある。
【００２４】
好ましくは、ＣＡＶ構築物は、ｍｕｔＣ８６Ｒ、ｍｕｔＣ９５Ｓ、ｍｕｔＣ９７Ｓ、ｍｕｔＲ１０１Ｇ、ｍｕｔＨ１０３Ｙ、ｍｕｔＲ１２９Ｇ、ｍｕｔＱ１３１Ｐ、ｍｕｔＲ／Ｋ／Ｋ１５０／１５１／１５２Ｇ／Ａ／Ａ、ｍｕｔＤ／Ｅ１６１／１６２Ｇ／Ｇ、ｍｕｔＬ１６３Ｐ、ｍｕｔＤ１６９Ｇ、ｍｕＫ１０２Ｅ、ｍｕｔＥ１８６Ｇ及びそれらの組み合わせから選択される。
【００２５】
特にワクチンに好適な候補であることがわかったＣＡＶには、ｍｕｔＣ８６Ｒ、ｍｕｔＲ１０１Ｇ、ｍｕｔＫ１０２Ｄ、ｍｕｔＨ１０３Ｙ、ｍｕｔＲ１２９Ｇ、ｍｕｔＮ１３１Ｐ、ｍｕｔＲ／Ｋ／Ｋ１５０／１５１／１５２Ｇ／Ａ／Ａ、ｍｕｔＤ／Ｅ１６１／１６２Ｇ／Ｇ、ｍｕｔＬ１６３Ｐ、ｍｕｔＤ１６９Ｇ、ｍｕｔＫ１０２Ｅ及びｍｕｔＥ１８６Ｇなどがある。
【００２６】
好ましくは、ＣＡＶ構築物は、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５又は２７から選択されたものである。
【００２７】
ＴＴＶのゲノム構造はＣＡＶに類似しているので、ＣＡＶについて本発明者らにより得られる弱毒化情報は、ＴＴＶに適用できるであろう。このことは、ＴＬＭＶのＯＲＦ２はタンパク質チロシンホスファターゼ活性を有しているという、本発明者らによって明らかにされた事柄によりさらに支持された。したがって、ＣＡＶについて本発明者らによって得られた広範な情報から、ＴＴＶ又は他のサーコウイルスの対応する又は類似のＯＲＦ２コード領域に突然変異を導入することにより、弱毒化ＴＴＶ（又は他の類似のサーコウイルス）を形成できることが、期待できるであろう。
【００２８】
本発明の第二の側面によれば、本発明の第一の側面による弱毒化サーコウイルスを、許容される担体又は希釈剤とともに含む、サーコウイルスワクチン組成物が提供される。
【００２９】
好ましい一つの形態によれば、このウイルスはＣＡＶであり、動物が鳥、好ましくはニワトリである。
【００３０】
別の好ましい形態によれば、このウイルスはＴＴＶであり、動物が哺乳動物、好ましくはヒトである。
【００３１】
ワクチン組成物は、担体又は希釈剤及び本発明の弱毒化ウイルスの一種以上を含むように製剤できる。好適な薬学的に許容される担体は、ウイルスの投与を容易にするが、受容者に対して生理学的に不活性であり及び/又は有害でないものである。担体は、当業者により選択できる。好適な担体には、無菌生理食塩水、ラクトース、スクロース、リン酸カルシウム、ゼラチン、デキストリン、寒天、ペクチン、落花生油、オリーブ油、ごま油及び水などがある。さらに、担体又は希釈剤は、グリセロールモノステアレート又はグリセロールジステアレート等のウイルスの放出を遅くする材料を、単独又はワックスとともに含有してもよい。さらに、徐放性ポリマー製剤を使用するこができる。
【００３２】
場合により、ワクチン組成物は、さらに保存剤、化学安定剤、他の抗原タンパク質及び慣用の医薬成分を含有していてもよい。ウイルスとともにワクチン組成物に使用するのに好適な成分には、例えば、カザミノ酸、スクロース、ゼラチン、フェノールレッド、Ｎ−Ｚアミン、二リン酸一カリウム、ラクトース、ラクトアルブミン水解物及び粉ミルクなどがある。典型的には、安定剤、補助剤及び保存剤を、標的動物又はヒトにおける効力が最良である製剤となるように最適化する。好適な保存剤には、クロロブタノール、ソルビン酸カリウム、ソルビン酸、二酸化硫黄、没食子酸プロピル、パラベン類、エチルバニリン、グリセリン、フェノール及びパラクロロフェノールなどがある。
【００３３】
本発明のワクチン組成物は、最も好ましくは補助剤なしで製造する。必要に応じて、上記したワクチン成分の一種以上を、慣用の補助剤と混合するか、そこに吸着させてもよい。補助剤は、白血球を引きつけるか、免疫応答を高めるための非特異的刺激剤として使用する。このような補助剤には、とりわけ、鉱油、並びに水、水酸化アルミニウム、アムフィゲン（Ａｍｐｈｉｇｅｎ）、アブリジン（Ａｖｒｉｄｉｎｅ）、Ｌ１２１／スクアレン、Ｄ−ラクチド−ポリラクチド／グリコシド、プルロニックプリオイス、ムラミルジペプチド、ボルデテラ死菌、サポニン及びキル（Ｑｕｉｌ）Ａなどがある。
【００３４】
別法として、又は本発明のウイルスに加えて、免疫賦活剤等のウイルス感染の治療に有用な他の作用物質も、特にヒトにおいて、疾病の症状を軽減したり、なくすのに有用であると思われる。これらの作用物質を含有するワクチン又は治療用組成物の開発は、本発明の教示から当業者によりなされることができる。
【００３５】
本発明の第二の側面による方法によれば、動物又はヒトに、上記したワクチン組成物の有効量を投与することにより、サーコウイルス感染に対するワクチン接種をすることができる。有効量は、受容者において、サーコウイルス感染に対する防御を誘発することができるサーコウイルスワクチンの量として定義される。ワクチンは、いずれかの好適な経路で投与できる。このような組成物は、非経口投与、好ましくは筋肉内投与又は皮下投与することができる。しかしながら、他の好適な経路による投与、例えば、鼻腔内投与、経口投与、膣内投与、皮下投与若しくは皮内投与又は卵内投与をおこなうように製剤してもよい。
【００３６】
本発明のサーコウイルスの好適で効果的な量は、所望の免疫応答のレベルに基づいて、当業者により決定できる。このような組成物は、一度で投与してもよく、及び/又はブースターを投与してもよい。しかしながら、好適な投与量は、動物又はヒト被験者の年齢、性別、重量及び全体の健康に応じて、担当獣医又は主治医によって、調整できる。典型的にはワクチンの投与量範囲は、１ＴＣＩＤ50〜１億ＴＣＩＤ50のオーダーである。好ましくは、投与量は、約１０００ＴＣＩＤ50である。
【００３７】
同様に、本発明のワクチン組成物の好適な投与量は、当業者により容易に決定できる。この投与量は、処置される動物種、すなわち、その重量、齢及び全体の健康に応じて、調節できる。
【００３８】
本発明の第三の側面によれば、動物にサーコウイルス感染に対する免疫性を付与する方法であって、本発明の第二の側面によるワクチン組成物を動物に投与することを含む方法が提供される。
【００３９】
一つの好ましい形態によれば、このウイルスはＣＡＶであり、動物が鳥、好ましくはニワトリである。
【００４０】
別の好ましい形態によれば、ウイルスはＴＴＶであり、動物が哺乳動物、好ましくはヒトである。
【００４１】
ワクチンは、鼻腔内投与、経口投与、膣内投与、皮下投与若しくは皮内投与又は卵内投与を含むいずれかの好適な経路により投与することができる。
【００４２】
ニワトリ等の鳥の場合、好ましい投与経路は、粘膜投与、エアゾール投与又は飲料水経由である。
【００４３】
投与されたワクチン組成物は、サーコウイルス感染の臨床的症状を防止するのに使用してもよい。
【００４４】
また、投与されたワクチン組成物は、動物において、サーコウイルスに対する免疫応答を誘発するために使用してもよい。
【００４５】
本発明の第四の側面によれば、サーコウイルスゲノムに由来又はそれから得たものである分離核酸分子であって、突然変異を中に有するウィルスタンパク質２（ＶＰ２）のコード領域の少なくとも一部分を含む、分離核酸分子が提供される。
【００４６】
好ましくは、サーコウイルスは、ニワトリ貧血ウィルス（ＣＡＶ）、ＴＴウィルス（ＴＴＶ）又は他の類似のウイルスである。より好ましくは、サーコウイルスは、ニワトリ貧血ウィルス（ＣＡＶ）である。サーコウイルスは、ＣＡＶ、及び一本鎖のマイナス鎖環状ＤＮＡゲノムを有し且つＣＡＶ  ＶＰ２タンパク質と機能的に同等の活性を有するタンパク質を発現するいずれの他のウイルスも含まれるものとして定義される。
【００４７】
好ましくは、分離核酸分子は、ＶＰ２翻訳開始領域、ＰＴＰａｓｅモチーフ又は酸性アルファらせん領域若しくは塩基性ベータシート領域に突然変異を組み込んだ、完全サーコウイルスゲノムを含む。
【００４８】
好ましくは、分離核酸分子は、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５又は２７から選択されたものである。
【００４９】
本発明の第五の側面によれば、本発明の第四の側面による分離核酸分子を、許容される担体又は希釈剤とともに含む、サーコウイルスワクチン組成物が提供される。
【００５０】
一つの好ましい形態によれば、このウイルスはＣＡＶであり、動物は鳥、好ましくはニワトリである。
【００５１】
別の好ましい形態によれば、ウイルスはＴＴＶであり、動物は哺乳動物、好ましくはヒトである。
【００５２】
本発明の第六の側面によれば、動物にサーコウイルス感染に対する免疫性を付与する方法であって、本発明の第五の側面によるワクチン組成物を動物に投与することを含む、方法が提供される。
【００５３】
本発明の第七の側面によれば、サーコウイルスから得られたＰＴＰａｓｅ活性を有する分離ウィルスタンパク質２（ＶＰ２）が提供される。
【００５４】
好ましくは、サーコウイルスは、ニワトリ貧血ウィルス（ＣＡＶ）、ＴＴウィルス（ＴＴＶ）又は他の類似のウイルスである。より好ましくは、サーコウイルスは、ニワトリ貧血ウィルス（ＣＡＶ）である。サーコウイルスは、ＣＡＶ、及び一本鎖のマイナス鎖環状ＤＮＡゲノムを有し且つＣＡＶ  ＶＰ２タンパク質と機能的に同等の活性を有するタンパク質を発現する、他のウイルスも含まれるものとして定義される。
【００５５】
好ましくは、分離ＶＰ２を、変更されたＰＴＰａｓｅ活性を有するように変更する。
【００５６】
好ましくは、分離ＶＰ２分子は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６又は２８から選択されたアミノ酸配列を含む。
【００５７】
本発明の第八の側面によれば、本発明の第一の側面による弱毒化サーコウイルスの、動物にサーコウイルス感染に対する免疫性を付与するためのワクチンの製造における使用が提供される。
【００５８】
本発明の第九の側面によれば、本発明の第四の側面による分離核酸分子の、動物にサーコウイルス感染に対する免疫性を付与するためのワクチンの製造における使用が提供される。
【００５９】
本発明の第十の側面によれば、本発明の第二の側面によるサーコウイルスワクチンの製造方法であって、以下の工程：
（ａ）サーコウイルスゲノムに由来又はそれから得られた分離核酸分子を、有胚卵の卵黄嚢に接種する工程であって、上記核酸分子が中に突然変異を有するウィルスタンパク質２（ＶＰ２）のコード領域の少なくとも一部分を含むものである、前記工程；
（ｂ）サーコウイルスを、前記分離核酸から複製する工程；及び
（ｃ）前記卵から前記サーコウイルスを採取する工程、
を含む、前記方法が提供される。
【００６０】
好ましくは、サーコウイルスは、ニワトリ貧血ウィルス（ＣＡＶ）、ＴＴウィルス（ＴＴＶ）又は他の類似のウイルスである。より好ましくは、サーコウイルスは、ニワトリ貧血ウィルス（ＣＡＶ）である。サーコウイルスは、ＣＡＶ、及び一本鎖のマイナス鎖環状ＤＮＡゲノムを有し且つＣＡＶ  ＶＰ２タンパク質と機能的に同等の活性を有するタンパク質を発現する、いずれの他のウイルスをも含むものとして定義される。
【００６１】
好ましくは、分離核酸分子は、ＶＰ２翻訳開始領域、ＰＴＰａｓｅモチーフ又は酸性アルファらせん領域若しくは塩基性ベータシート領域に突然変異を組み込んだ、完全サーコウイルスゲノムを含む。
【００６２】
本明細書全体を通じて、特記のない限りは、用語「含む」とは、述べられた要素、整数若しくは工程、又は要素群、整数群若しくは工程群を含むが、他の要素、整数若しくは工程、又は要素群、整数群若しくは工程群を排除しないことを意味する。
【００６３】
本明細書に含まれている文書、行為、材料、装置、物品等の説明は、単に本発明を説明するためのものであり、これらの事柄のいずれか又は全てが従来技術ベースの一部分を形成するか、この出願の各請求項の優先日前にオーストラリアに存在していた、本発明に関連する分野における一般的な周知の知識であることを認めているとしてとるべきではない。
【００６４】
以下、本発明のより明確な理解のために、以下の添付図面及び実施例に関して本発明の好ましい実施態様を説明する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００６５】
実験手順
Ｉ．ＣＡＶワクチン
ＣＡＶゲノムの解析及び突然変異誘発部位の設計
後述する検討（実験手順−ＶP２）によりＰＴＰａｓｅ活性を確定し、サインモチーフにおける予測されたキー残基を、公知のＰＴＰａｓｅサインモチーフと比較することにより同定した。これらの残基に基づいて、ＣＡＶの感染性全ゲノムクローンにおける突然変異誘発方法を設計した。突然変異を、それらの生体外でのＰＴＰａｓｅ触媒作用への影響の理解に基づき、感染中のＰＴＰａｓｅの役割を修正するように設計できる。この方法の利用可能性を示すためのＣＡＶ  ＶＰ２内の突然変異誘発の標的部位は、８６、９５、９７、１０１及び１０３であった。残基８６は、通常Ｃであり、Sに突然変異させた（ｍｕｔＣ８６S）。他の例示突然変異は、ｍｕｔＣ９５Ｓ、ｍｕｔＣ９７Ｓ、ｍｕｔＲ１０１Ｇ及びｍｕｔＨ１０３Ｙであった。突然変異ｍｕｔＣ９５Ｓ及びｍｕｔＣ９７Ｓでは、ＰＴＰａｓｅ活性に必須であり且つ触媒反応中に形成されるシステイニル−ホスフェート中間体の形成に関与している触媒システインであると予想される、システイン残基を除去する。突然変異ｍｕｔＲ１０１Ｇでは、ＰＴＰａｓｅ活性に必須であり且つホスホチロシン基質の触媒システイン残基への配位に関与していると予測される塩基性帯電残基を除去する。残基１０３及び８６は、予測されるサインモチーフのわきに位置し、且つＴＴウィルス及びＣＡＶウィルスに高度に保存される。
【００６６】
ＶＰ２タンパク質の構造の予測を、ＡＮＧＩＳインターフェース（ＷｅｂＡＮＧＩＳ、Ａｕｓｔｒａｌｉａｎ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅ）から入手できるソフトウエアを用いておこなった。高度の二次構造の領域を、ＶＰ２のカルボキシル末端の方向に同定した。この領域のＣｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎプロットにより、αヘリックスからなる酸性領域の予測後、αヘリックスとβシートとからなる塩基性領域を予測し、その後αヘリックスの第二酸性領域を予測する。二次構造は、一連のプロリン残基によりさらに分割されている。残基１２８〜１４３からの両親媒性αヘリックス領域と残基１５１〜１５８からの両親媒性βシート領域の２つの予測領域がある（図１）。高度の二次構造が、機能性タンパク質ドメインと関連していることが、予測される。二次構造を予測することで、その領域の構造組織を破壊するように設計された突然変異を導入することにより、この領域の機能を変更することができる。予測された塩基性両親媒性αヘリックスの領域内の突然変異の効果を示すために、ｍｕｔＲ１２９Ｇ及びｍｕｔＲ／Ｋ／Ｋ１５０／１５１／１５２Ｇ／Ａ／Ａを、二次構造における極性塩基性帯電分布を中和するように構築した。また、ｍｕｔＱ１３１Ｐを、この領域のαヘリックスに導入してこのヘリックスを破壊した。同一の手法を用いて、ｍｕｔＬ１６３Ｐを導入することにより酸性αヘリックスの領域を破壊した。酸性αヘリックスの領域において、酸性帯電分布を中和するために、ｍｕｔＤ／Ｅ１６１／１６２Ｇ／Ｇ及びｍｕｔＤ１６９Ｇ構築物を作製した。ＣＡＶゲノムの突然変異核酸配列及びＶＰ２アミノ酸配列を、配列番号１〜２８に示す。
【００６７】
プライマーの設計
ＣＡＶのＣＡＵ２６９／７オーストラリア分離株を、全ての実験に用いた。導入した各突然変異について、ＣＡＶ  ＶＰ２配列の両鎖に相補の、対重複オリゴヌクレオチドを合成した。オリゴヌクレオチド対を、アミノ酸変化をコードするヌクレオチド置換を組み込むように設計した。ＣＡＶゲノムは、３つの異なる重複オープンリーディングフレームに３つの遺伝子をコードしている。突然変異誘発の標的であるＣＡＶ  ＶＰ２の領域は、それぞれ１つの塩基対及び２つの塩基対だけＶＰ２に対してフレームシフトしているＯＲＦ２及びＯＲＦ３と重複している。導入した突然変異のどれも、ＯＲＦ２及びＯＲＦ３によりコードされているアミノ酸配列を変化させない。表１に、ＣＡＶ  ＶＰ２への突然変異の導入に使用したプライマーの概要を示す。
【００６８】
【表１】
2004535194.tif 000002
【００６９】
重複延長ＰＣＲ突然変異誘発
突然変異を、重複延長ＰＣＲによりＣＡＶ  ＶＰ２配列に導入した。以下の方法は、特記のない限りは、全ての突然変異構築物の突然変異誘発に適用される。ＰＣＲ鋳型は、プラスミドベクターｐＧＥＸ−４Ｚ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）におけるＣＡＶ（ｐＣＡＵ２６９／７）の全ゲノムクローンであった。鋳型ＤＮＡを、５０マイクログラム／ｍＬのアンピシリン選択を有するＬｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ寒天（ＬＡ）上、３７℃で培養したｐＣＡＵ２６９／７クローンを有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ５αから調製した。プラスミドは、製造業者の説明書（Ｑｉａｇｅｎ社）にしたがって、Ｑｉａｇｅｎキットを用いて調製した。突然変異誘発ＰＣＲを、二段階でおこなった。第一段階は、マイナス鎖突然変異誘発プライマー対して上流のフランキングプライマーからの一つと、プラス鎖突然変異誘発プライマーに対して下流のフランキングプライマーからの一つの、２つのＰＣＲ反応の一組からなるものであった。第二段階においては、第一対の反応からの突然変異誘発ＰＣＲ産物は、フランキングプライマーを利用するオーバーソーＰＣＲ反応における鋳型として作用した。得られたＰＣＲ産物を、フランキング配列により結合させ、両鎖に、ＰＣＲの第一段階において鋳型に導入した突然変異を組み込んでいる。
【００７０】
上流フランキングプライマーＣＡＶ．１−５‘ＣＴＡＴＣＧＡＡＴＴＣＣＧＡＧＴＧＧＴＴＡＣＴＡＴ３’及び下流フランキングプライマーＣＡＶ．１０−５‘ＴＧＣＴＣＡＣＧＴＡＴＧＴＣＡＧＧＴＴＣ３’を、ｍｕｔＣ９５Ｓ及びｍｕｔＣ９７Ｓの構築用オーバーソーＰＣＲに使用した。第一段階において、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰの各々３００μＭ、２ｍＭ  ＭｇＳＯ4、各プライマー２００μＭ、１０×白金ＰｆｕＴａｑＤＮＡポリメラーゼ緩衝液１０μＬ、白金Ｐｆｕ  ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）２Ｕ及び鋳型ＤＮＡ１μＬを含有する、反応混合物１００μＬを調製した。ＰＣＲ反応は、９５℃で２分間インキュベーションし、それから９５℃で４０秒間、６０℃で６０秒間、その後６８℃で４０秒間のインキュベーションを３０サイクルおこない、最後に６８℃で５分間インキュベーションすることによりおこなった。第一段階の鋳型を、ＤｐｎＩ制限エンドヌクレアーゼ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）で消化することにより除去した。ＰＣＲ産物を、アガロース（１％）ゲル電気泳動により分析し、第一段階生成物に相当するバンドを切除し、製造業者の説明書にしたがって、ＱｉａｅｘＩＩ（Ｑｉａｇｅｎ社）ゲル抽出により精製した。オーバーソーＰＣＲについては、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰの各々３００μＭ、２ｍＭ  ＭｇＳＯ4、各プライマー２００μＭ、１０×ＨｉｆｉｄｅｌｉｔｙＴａｑＤＮＡポリメラーゼ緩衝液１０μＬ、ＨｉｆｉｄｅｌｉｔｙＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）２Ｕ及び鋳型ＤＮＡ１μＬを含有する、反応混合物１００μＬを調製した。ＰＣＲ反応は、９５℃で２分間インキュベーションし、それから９５℃で４０秒間、５７℃で９０秒間後６８℃で４０秒間のインキュベーションを１サイクル、それから９５℃で４０秒間、５７℃で６０秒間後６８℃で４０秒間を１５サイクルおこない、最後に６８℃で５分間インキュベーションすることによりおこなった。
【００７１】
ｍｕｔＣ８６Ｒ及びｍｕｔＨ１０３Ｙを除く全ての他の突然変異の突然変異誘発は、上流フランキングプライマーがプライマーＣＡＶ．２−５‘ＧＣＧＧＡＧＣＣＧＣＧＣＡＧＧＧＧＣＡＡ３’であり、下流フランキングプライマーがＣＡＶ．１０であった以外は、ｍｕｔＣ９５Ｓ及びｍｕｔＣ９７Ｓについて説明した方法によりおこなった。第二段階オーバーソーＰＣＲでは、反応を、９６℃で２分間インキュベーションした後、９６℃で４０秒間、５８℃で６０秒間後７２℃で６０秒間のインキュベーションを１５サイクルおこない、それから最後に７２℃で５分間インキュベーションすることによりおこなった。
【００７２】
ｍｕｔＣ８６Ｒ及びｍｕｔＨ１０３Ｙの突然変異誘発生成物のＰＣＲオーバーソーの試みにおいて、各種ＰＣＲ条件で試みたが、うまくいかなかった。したがって、ｍｕｔＣ８６Ｒ及びｍｕｔＨ１０３Ｙを、単一ＰＣＲ反応における完全円（ｆｕｌｌ−ｃｉｒｃｌｅ）オーバーラップ延長突然変異誘発により得た。反応混合物１００μＬを、上記と同様にして準備した。但し、このときに、関連突然変異誘発プライマーのみを用いた。ＰＣＲ反応を、９６℃で２分間インキュベーションした後、９６℃で４０秒間、５５℃で６０秒間後６８℃で５分間のインキュベーションを１サイクルおこない、それから９６℃で４０秒間、６０℃で６０秒間後６８℃で５分間のインキュベーションを４０サイクルおこない、それから最後に６８℃で５分間インキュベーションすることによりおこなった。ＤｐｎＩ制限エンドヌクレアーゼによる消化により、鋳型ＤＮＡを除去し、ＰＣＲ産物を、標準的なフェノール、フェノール−クロロホルム、フェノール−クロロホルム−イソアミル抽出及びエタノール沈殿により精製した。
【００７３】
突然変異構築物のクローニング
以下の方法を、特記のない限りは、全ての突然変異構築物のクローニングに適用した。突然変異配列を含むＰＣＲ産物を、プラスミドベクターｐＧＥＸ−４Ｚ、ｐＣＡＵ２６９／７におけるＣＡＶ感染性クローンにサブクローニングした。ＰＣＲ産物を、ＳｔｕＩ及びＢｓｍＩ制限エンドヌクレアーゼで消化し、アガロース（１％）ゲル電気泳動により分析した。３５７ｂｐのバンドを切除し、製造業者の説明書にしたがってＱｉａｅｘＩＩ（Ｑｉａｇｅｎ社）ゲル抽出により精製した。ｐＣＡＵ２６９／７を、ＳｔｕＩ及びＢｓｍＩ制限エンドヌクレアーゼにより同様に消化して、突然変異配列と置換すべき３５７ｂｐの領域を除去し、４６８７ｂｐのバンドを１％アガロースゲルから精製した。次に、ＰＣＲ産物を、標準的なプロトコールに準じて消化ＣＡＶ−ｐＧＥＸ−４Ｔ−２（Ｐｒｏｍｅｇａ社）バックボーンに連結した。大腸菌ＤＨ５αを、連結したプラスミドを用いたエレクトロポレーションにより形質転換し、アンピシリン５０μｇ／ｍＬ含有Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ寒天（ＬＡ）上、３７℃で培養した。プラスミドを、製造業者の説明書（Ｑｉａｇｅｎ社）にしたがって、Ｑｉａｇｅｎキットを用いて選択されたクローンから精製した。クローンを、順方向プライマーＣＡＶ．２及び逆プライマー  ＣＡＶ．１０を用いてＰＣＲによりインサートの存在についてスクリーニングした。クローンＤＮＡを、プライマーＣＡＶ．２及びＣＡＶ．１０を用いたＴａｑ  Ｄｙｅ  Ｄｅｏｘｙ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇキット（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社）を用いて配列決定した。
【００７４】
ｍｕｔＣ８６Ｒ及びｍｕｔＨ１０３Ｙの構築方法は、以下の点を変更した以外は、上記のようにおこなった。精製段階２のＰＣＲ産物を、製造業者の説明書にしたがってまずｐＧＥＭ−４Ｔ−２ベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ社）にクローニングした後、ＳｔｕＩ及びＢｓｍＩ制限エンドヌクレアーゼで消化し、上記のようにｐＣＡＵ２６９／７にサブクローニングした。ＤｐｎＩ制限エンドヌクレアーゼで消化した後のｍｕｔＣ８６Ｒ及びｍｕｔＨ１０３Ｙ  ＰＣＲ産物を、標準的なプロトコールにしたがって連結し、エレクトロポレーションにより大腸菌ＤＨ５αに形質転換し、アンピシリン５０μｇ／ｍＬを含有するＬｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ寒天（ＬＡ）上、３７℃で培養した。この突然変異配列を含むクローンを、次に上記のようにスクリーニングし、選択した。
【００７５】
突然変異したウイルスゲノムのＭSＢ１細胞へのトランスフェクション
対照クローンｐＣＡＵ２６９／７、対照ｐＥＧＦＰ−Ｃ２並びに構築物ｍｕｔＣ８６Ｒ、ｍｕｔＣ９５Ｓ、ｍｕｔＣ９７Ｓ、ｍｕｔＲ１０１Ｇ、ｍｕｔＨ１０３Ｙ、ｍｕｔＲ１２９Ｇ、ｍｕｔＮ１３１Ｐ、ｍｕｔＲ／Ｋ／Ｋ１５０／１５１／１５２Ｇ／Ａ／Ａ、ｍｕｔＤ／Ｅ１６１／１６２Ｇ／Ｇ、ｍｕｔＬ１６３Ｐ、ｍｕｔＤ１６９Ｇ及びｍｕｔＥ１８６Ｇを、細胞培養にトランスフェクションした。トランスフェクション用ＣＡＶ  ＤＮＡを、Ｑｉａｇｅｎプラスミド精製キットを用いて調製した。全ての構築物を、ＥｃｏＲＩ制限エンドヌクレアーゼで消化し、１％アガロースゲルにより電気泳動されたゲノムインサートを開放し、２２９８ｂｐバンドをゲルから切除し、製造業者の説明書にしたがってＱｉａｅｘＩＩゲルプラスミド精製キットを用いて精製した。精製したＣＡＶ  ＤＮＡを、無菌１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（２５℃でｐＨ８）に再懸濁した。ＣＭＶプロモータから下流のグリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を含むトランスフェクションされた対照ＤＮＡ  ｐＥＧＦＰ−Ｃ２を、未消化プラスミドとして調製した。
【００７６】
マレック病ウイルス形質転換リンパ球ＭＤＣＣ−ＭＳＢ１細胞株を、全ての実験に使用した。細胞を、２ｍＭグルタミン（Ｓｉｇｍａ社）、２ｍＭピルビン酸塩（Ｓｉｇｍａ社）、０．２％ＮａＨＣＯ3、５０μｇ／ｍＬアンピシリン（ＣＳＬ社）、５０μｇ／ｍＬゲンタマイシン（ＣＳＬ社）及び１０％ウシ胎児血清（Ｆｌｏｗ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）（５２℃で熱失活）（「ＲＦ１０」と称される完全培地）を追加したＲＰＭＩ１６４０培地（米国ミズーリ州セントルイスにあるＳｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ社）で、５％ＣＯ2中３７℃で培養した。培養を、細胞サイクルの段階を同調化するためにトランスフェクションの２４時間前に新鮮な培地に継代した。細胞を、ＦＣＳフリーＲＰＭＩで２回洗浄し、最終濃度１０7細胞／ｍＬで再懸濁し、７００μＬアリコットを、関連ＤＮＡ１０μｇとともに、各試料について、氷上に配置した微量遠心管に移した。トランスフェクションを、Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ装置（Ｂｉｏ  Ｒａｄ社）において、０．４ｃｍギャップエレクトロポレーションキュベット中、長時間低電圧パルスでのエレクトロインターナリゼーションによりおこなった。パルスは、４００Ｖ、９００μＦ、∞抵抗及び拡張キャパシタンスで排出した。細胞を、室温で５分間インキュベーションした後、予め温めた成長培地５ｍＬに再懸濁した。トランスフェクション効率を、４８時間後に、対照トランスフェクションにおけるＧＦＰ発現について陽性である細胞の割合（％）を求めることにより評価した。
【００７７】
突然変異ＣＡＶ構築物の複製能及び感染力の評価
感染及び細胞培養における複製についての突然変異ウィルスの能力を、突然変異ウイルス構築物でトランスフェクションしたＭＤＣＣ−ＭＳＢ１細胞から評価した。培養を、１／１０希釈で連続的に４８時間間隔で１０代の継代をおこなった。試料（４８時間ごと）を、ＶＰ３を発現する細胞の割合（％）により感染力について評価した。ＶＰ３発現は、免疫蛍光アッセイにより検出した。感染細胞を、二回洗浄し、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（ｐＨ７．４）２００μＬに再懸濁し、マルチウエルスライドに適用した。調製物を、全てのインキュベーションの合間に、０．１％ＢＳＡ及び０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳ緩衝液で洗浄した。細胞を、氷冷９０％メタノール中で５分間固定し、調製物を、加湿チャンバー中３７℃で、５％ＢＳＡ／ＰＢＳＴの溶液で１時間ブロッキングした。一次抗体は、０．１％ＢＳＡ／ＰＢＳＴで１／２００希釈した抗ＶＰ３マウスモノクローナル抗体（ＴｒｏｐＢｉｏ社）であり、これを加湿チャンバー中３７℃で１時間インキュベーションした。二次抗体は、０．１％ＢＳＡ／ＰＢＳＴで１／１００希釈したフルオレセインイソチオシアネート（Ｄａｋｏ社）に接合したヒツジ抗マウスモノクローナル抗体であり、これを１時間インキュベーションした。継代数に対する蛍光細胞の割合（％）を、対照ＭＳＢ１バックグランド蛍光に対して定量化した。
【００７８】
突然変異ウイルスの調製物を、ＣＡＶによる少なくとも５０％の感染を示したトランスフェクションされた培養の最も早い継代から作製した。培養を、３回凍結・解凍後、６０００ｇで１０分間遠心分離することにより清澄化した。次に、ＭＤＣＣ−ＭＳＢ１細胞を、ウイルス調製物で再感染させた。この方法によるウイルスの調製及び培養の再感染を、各々少なくとも３ウイルス継代について反復した。複製コンピテントウイルスが回収されたことが、免疫蛍光アッセイ（上記した）、感染ライゼートのＰＣＲ後のＣＡＶ特異的プローブを用いたサザンブロッティング及び感染ライゼートのウエスタンブロッティングにより明らかとなった。細胞ＤＮＡ調製物を、突然変異ＣＡＶで感染して４８時間後にＭＤＣＣ−ＭＳＢ１細胞から、Ｍｅｅｈａｎ，Ｂ．Ｍ．，Ｔｏｄｄ，Ｄ．，Ｃｒｅｅｌａｎ，Ｊ．Ｌ．，Ｅａｒｌｅ，Ｊ．Ａ．，Ｈｏｅｙ，Ｅ．Ｍ．及びＭｃＮｕｌｔｙ，Ｍ．Ｓ．（１９９２）、「ニワトリ貧血作用物質を感染させた細胞からのウイルスＤＮＡの特性付け：クローン化複製型の配列解析及びクローン化ゲノム断片のトランスフェクション能」、Ａｒｃｈ  Ｖｉｒｏｌ  １２４、第３０１〜３１９頁、の方法にしたがって、プロテイナーゼＫ及び硫酸ドデシルナトリウム（ＳＤＳ）溶菌並びにフェノール／クロロホルム抽出により精製した。次に、突然変異配列を、ＣＡＶ．２及びＣＡＶ．１０プライマーセット及び上記した対応のＰＣＲ反応条件を用いて増幅した。ＰＣＲ産物を、１％アガロースゲルで電気泳動し、毛管トランスファを用いてＨｙｂｏｎｄ−Ｎ（Ａｍｅｒｓｈａｍ社）ナイロンメンブランに移した（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．及びＭａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．（１９８９），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、（Ｃ．Ｎｏｌａｎ編）、ニューヨーク：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ社）。メンブランに移した後、メンブランを、６×ＳＳＣ緩衝液で１０分間すすぎ、透光器で紫外線を１０分間照射した。放射性同位体標識ＣＡＶ特異的プローブを、製造業者の説明書（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ社）にしたがって、市販のキットを用いたＤＮＡ合成のランダムヘキサマープライミングを用いて、ＣＡＶゲノムクローンＤＮＡから作製した。メンブランを、調製した放射性同位体標識プローブを添加した、５×ＳＳＣ、５×Ｄｅｎｈａｒｔ溶液、１００μｇ／ｍＬ変性サケ精子ＤＮＡ及び０．５％ＳＤＳからなるプレハイブリダイゼーション緩衝液に、浸漬した。このプローブを、ブロッティングしたＤＮＡに５０℃で一晩ハイブリダイズさせた。ブロットを、２×ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳにより６８℃で２０分間３回洗浄し、放射線用フィルムを、−７０℃で４時間ブロットにあてた。
【００７９】
ウエスタンブロットを、突然変異ＣＡＶで感染させた１０3ＭＤＣＣ−ＭＳＢ１細胞のライゼートについて作製した。タンパク質を、１２．５％硫酸ドデシルナトリウム（ＳＤＳ）ポリアクリルアミドゲル中で電気泳動し、クマシーブリリアントブルー（Ｌａｅｍｍｌｉ、英国（１９７０）、「Ｃｌｅａｖａｇｅ  ｏｆ  ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｄｕｒｉｎｇ  ｔｈｅ  ａｓｓｅｍｂｌｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｅａｄ  ｏｆ  ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ  Ｔ４（バクテリオファージＴ４のヘッド部のアセンブリ中の構造タンパク質の開裂）」、Ｎａｔｕｒｅ２２７，第６８０〜６８５頁）で染色した。タンパク質を、ポリビニルジフロリドメンブラン（ＰＶＤＦ：Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）上にエレクトロトランスファーした。ウエスタンブロットを、０．１％ＢＳＡ／ＰＢＳＴで１／２０００希釈したＣＡＶ  ＶＰ３（ＴｒｏｐＢｉｏ社）に対するマウスモノクローナル抗体で調査し、１時間インキュベーションした後、１／２０００希釈したヒツジ抗マウス二次抗体−ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）接合体で調査し、化学発光基質（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）で展開した。
【００８０】
突然変異ＣＡＶウイルスの生体外表現型の実証
突然変異ウィルスの成長特性及び細胞病原性を、調査した。ＣＡＶ突然変異ウイルスを、ｐＣＡＵ２６９／７から得たウイルスを対照として使用して、プレート滴定した。滴定は、５×１０5ＭＳＢ１細胞／ｍＬで、培養容積２００μＬにおいて、８×１２マルチウエルトレイ（Ｎｕｎｃ社）を用いておこなった。ウイルスストックの階段１０倍希釈液を、６連で調製し、最終希釈係数０．０５〜０．５×１０-10の範囲とした。４８時間間隔で、感染細胞を、４に対して１の希釈で新鮮な培地に連続的に継代した。各ウエルを、細胞病原性効果（ＣＰＥ）について採点した。ＣＰＥは、拡大した膨潤細胞、核空胞形成及びクロマチンアセンブリー、細胞フラグメンテーション並びに培地のアルカリ化により判断できる。培養を、ウエルの５０％でＣＰＥが観察された終点又は最低希釈における連続継代間で差が検出されなくなるまで連続継代した。ＣＰＥは、終点希釈の免疫蛍光アッセイにより確認した。力価は、Ｋａｒｂｅｒ法を用いて、５０％組織培養感染量（ＴＣＩＤ50／ｍＬ）として計算により求めた。典型的には、終点を確定するには、５〜７継代が必要であった。
【００８１】
プレート滴定により得られたウイルスストックの力価を、標準としての親ウイルスストックに対する蛍光標示式細胞分取（ＦＡＣＳ）により確認した。１０0〜１０-4の１０倍希釈系列を、０．５ｍＬの容積のＲＰＭＩ中のウイルスストックから調製した。次に、ウイルス希釈液を、４×１０6ＭＳＢ１−ＭＤＣＣ細胞上に吸着させ、６ウエル培養トレイに入れた４ｍＬのＲＦ１０に再懸濁した。感染を４８時間おこなった後、細胞２ｍＬを、遠心分離（１５００ｇ、５分間）によりペレット化した。固定化、透過化及び非特異的表面反応のブロッキングにより、感染細胞を免疫蛍光染色のために調製した。全ての洗液は、容積５ｍＬのＰＢＳ中１％ＦＣＳ及び１ｍＭアジ化ナトリウム（ＮａＮ3）であった。緩衝段階の間の遠心分離工程を、１５００ｇ、５分間の条件でおこなった。ＰＢＳ中３％超純粋ホルムアルデヒド及び１ｍＭ  ＮａＮ3  １ｍＬ中で４℃で４５分間インキュベーションすることにより、細胞を固定した。次に、固定細胞を、０．１Ｍグリシン及び１ｍＭ  ＮａＮ3の５ｍＬで２回洗浄後、ＰＢＳ中０．１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００及び１ｍＭ  ＮａＮ3の０．５ｍＬに再懸濁することにより５秒間透過化した後、洗浄緩衝液４．５ｍＬに希釈し、続いて洗浄工程を２回おこなった。透過化後、細胞は、全ての工程で、氷上で扱った。非特異的反応を、ＰＢＳ中１０％ＦＣＳ及び１ｍＭ  ＮａＮ3中で４℃で１５分間インキュベーションすることによりブロックした後、洗浄工程を２回おこなった。一次抗体は、洗浄緩衝液に１／５０希釈した５０μｌの抗ＶＰ３マウスモノクローナル抗体（ＴｒｏｐＢｉｏ社）であり、細胞を、この中で４℃、４５分間の条件でインキュベーションした。二次抗体は、洗浄緩衝液にここでも１／５０希釈したＦＩＴＣ（Ｄａｋｏ社）に接合したヒツジ抗マウスモノクローナル抗体であり、細胞を、この中で４℃、４５分間の条件でインキュベーションした。免疫染色細胞を、ＰＢＳ中１％超純粋ホルムアルデヒド及び１ｍＭ  ＮａＮ3  ２００μｌ中で、最大１６時間保存した。
【００８２】
上記でプレート滴定した３つの場合のｐＣＡＵ２６９／７ウイルスストックを、各ＦＡＣＳ解析の標準として使用した。データの取得と解析は、Ｃｅｌｌｑｕｅｓｔソフトウエアを用いておこなった。細胞数測定器の設定を、表２に示す。
【００８３】
【表２】
2004535194.tif 000003
【００８４】
ゲートリンパ球集団を、依存可変蛍光強度のヒストグラムとして表示した。その結果、以下の２つの明瞭な正常に分布した細胞集団：バックグランド染色及び自動蛍光による低蛍光強度ピーク並びに二次特異的高蛍光強度ピーク、がみられた。マーカーを、ＣＡＶ  ＶＰ３に特異的な高強度を有する細胞染色を含み、且つネガティブコントロール未感染試料に細胞を０．０５％未満含有するように目視設定した。マーカー領域における細胞計数に対するウイルス希釈度の標準曲線を、ウイルスストックから作成した。曲線は、３つの別個の場合について独立して作成した。試験ウイルスストックの相対希釈度を、同時標準曲線からのＦＡＣＳ曲線の移動を計算することにより、確定した。
【００８５】
生体外細胞病変を、位相差顕微鏡法及び上記のＶＰ３に特異的なモノクローナル抗体で固定細胞を染色することにより、評価した。細胞を、Ｈｏｅｓｃｈｔ染色液で２分間対比染色した。また、免疫蛍光染色（ＩＦＡ）を、ＶＰ２のＣ末端領域に対するマウスポリクローナル抗血清（０．１％ＢＳＡ／ＰＢＳＴで１／１００希釈）及びＦＩＴＣ（Ｄａｋｏ社）に接合したヒツジ抗マウスポリクローナル二次抗体（ここでも０．１％ＢＳＡ／ＰＢＳＴで１／１００希釈）を用いておこなった。
【００８６】
有胚卵におけるチャレンジモデル
突然変異ＣＡＶの感染力と生体内表現型を評価するために、チャレンジモデルを、有胚卵に発生させた。このモデルを、最初にｐＣＡＵ２６９／７ＤＮＡ（クローンウイルス）のトランスフェクションから得たウイルスと、親ＣＡＶ株ＣＡＵ２６９／７ウィルス（親ウイルス）との間の等価性を検証するのに使用した。７日齢の胚の卵黄嚢に、親ウイルスｐＣＡＵ２６９／７の接種と擬似ＭＳＢ１接種材料の接種を、３つの別個の場合について反復した。次に、ウイルスｍｕｔＣ８６Ｒ、ｍｕｔＲ１０１Ｇ、ｍｕｔＨ１０３Ｙ、ｍｕｔＲ１２９Ｇ、ｍｕｔＮ１３１Ｐ、ｍｕｔＲ／Ｋ／Ｋ１５０／１５１／１５２Ｇ／Ａ／Ａ、ｍｕｔＤ／Ｅ１６１／１６２Ｇ／Ｇ、ｍｕｔＬ１６３Ｐ、ｍｕｔＤ１６９Ｇ及びｍｕｔＥ１８６Ｇを、クローンウイルス及び未感染ＭＳＢ１細胞対照接種材料と比較したモデルにおいて試験した。突然変異チャレンジ実験を、２つの別個の場合について反復した。
【００８７】
有胚卵の接種
接種用ウイルスストックを、Ｔｏｄｄ，Ｄ．，Ｍａｃｋｉｅ，Ｄ．Ｐ．，Ｍａｗｈｉｎｎｅｙ，Ｋ．Ａ．，Ｃｏｎｎｅｒ，Ｔ．Ｊ．，ＭｃＮｅｉｌｌｙ，Ｆ．及びＭｃＮｕｌｔｙ，Ｍ．Ｓ．（１９９０），「Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ａｎ  ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  ａｓｓａｙ  ｔｏ  ｄｅｔｅｃｔ  ｓｅｒｕｍ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｔｏ  ｃｈｉｃｋｅｎ  ａｎｅｍｉａ  ａｇｅｎｔ（ニワトリ貧血作用物質に対する血清抗体を検出するための、酵素結合免疫吸着検定法の開発）」、Ａｖｉａｎ  Ｄｉｓ  ３４，第３５９〜３６３頁から採用した方法により、ＭＤＣＣ−ＭＳＢ１感染培養４００ｍＬから調製した。すなわち、培養４００ｍＬを、氷浴中低周波数で超音波処理し、SＤSを、０．５％まで添加し、ライゼートを、３７℃で３０分間インキュベーションした。細胞残屑を、１００００ｇ、３０分間の条件でペレット化することにより除去した。次に、ウイルスを、８００００ｇ、１５℃、３時間の条件で超遠心分離することにより精製した。ウイルスペレットを、ＲＰＭＩ培地で洗浄し、再び８００００ｇ、３時間の条件でペレット化した。ウイルスストックを、上記の方法にしたがって滴定し、再懸濁して最終力価１０4.5ＴＣＩＤ50／ｍＬとした。
【００８８】
受精特定病原体未感染（ＳＰＦ）卵を、オーストラリアのＪａｍｅｓ  Ｒｄ（ＰＯ  Ｂｏｘ６４１）、Ｗｏｏｄｅｎｄ  ＶＩＣ  ３４４２にあるＳＰＡＦＡＳ  Ａｕｓｔｒａｌｉａ  Ｐｔｙ社から入手した。これらの卵を、容量が卵３００個で手動回転式のＭｕｌｔｉｐｌｏ  Ｂｒｏｏｄｅｒインキュベータでインキュベーションした。ウイルス接種材料０．５ｍＬ、すなわち、１０4ＴＣＩＤ50を、２４ゲージ注射針を用いて、７日齢有胚卵の卵黄嚢に接種した。
【００８９】
突然変異ウイルスの感染性及び生体内表現型の評価
骨髄並びに胸腺、脾臓及び嚢から分離した細胞において免疫蛍光によりウイルスタンパク質ＶＰ３を検出することにより、感染力を評価した。押しつぶし試料を、大腿髄腔から除去した骨髄から得た。細胞培養について上記の免疫蛍光アッセイを使用して、骨髄中のＣＡＶ  ＶＰ３を検出した。２１日目で、胚における、体重、リンパ器官重量及び肉眼的病変の損傷スコアにより、生体内表現型を評価した。重量は、胚全体並びに解剖した胸腺、脾臓及びファブリキウスの嚢について測定した。赤血球沈層容積（ＰＣＶ）を、卵黄静脈からの静脈穿刺又は心臓穿刺により得た血液を用いて測定した。肉眼的病変は、ＣＡＶ感染の標的器官についての損傷スコアの標準化システムを用いて評価した。
【００９０】
損傷スコア
ＣＡＶ感染と関連した損傷程度の一貫した分類が可能な、評点方式を確立した。胸腺、骨髄、脾臓及びファブリキウスの嚢内の損傷並びに出血の発生について、全て１〜４のスケールでスコアをつけた。これらから、累積損傷スコアを、総合的な病変の程度について得た。胸腺及び骨髄についてのスコアは、感染の主要な標的器官であるので二倍した。全ての場合において、スコア１は、病変がないことを示す。表３〜８に、肉眼的病変について使用したスコア方式の概要を示す。
【００９１】
【表３】
2004535194.tif 000004
【００９２】
【表４】
2004535194.tif 000005
【００９３】
【表５】
2004535194.tif 000006
【００９４】
【表６】
2004535194.tif 000007
【００９５】
【表７】
2004535194.tif 000008
【００９６】
【表８】
2004535194.tif 000009
【００９７】
結果
Ｉ．ＣＡＶワクチン
突然変異遺伝子型を有するＣＡＶの構築
ＰＣＲ突然変異誘発及び完全ゲノムＣＡＶクローンｐＣＡＵ２６９／７へのサブクローニングにより、構築物ｍｕｔＣ８６Ｒ、ｍｕｔＣ９５Ｓ、ｍｕｔＣ９７Ｓ、ｍｕｔＲ１０１Ｇ、ｍｕｔＨ１０３Ｙ、ｍｕｔＲ１２９Ｇ、ｍｕｔＱ１３１Ｐ、ｍｕｔＲ／Ｋ／Ｋ１５０／１５１／１５２Ｇ／Ａ／Ａ、ｍｕｔＤ／Ｅ１６１／１６２Ｇ／Ｇ、ｍｕｔＬ１６３Ｐ、ｍｕｔＤ１６９Ｇ及びｍｕｔＥ１８６Ｇを作製した。各構築物に突然変異が存在することは、最終構築物の配列決定を、突然変異部位の両方向に２度おこなうことにより確認した。突然変異遺伝子型を有するウイルスは、構築物を細胞培養にトランスフェクションすることから発生させた。トランスフェクション効率を、対照ｐＥＧＦＰプラスミドによるトランスフェクションの後にＧＦＰを発現する細胞の数により、評価した。トランスフェクション効率は、可変で、細胞の１〜４０％が、トランスフェクションの４８時間後のＧＦＰ発現について陽性であることが分かった。ｐＣＡＵ２６９／７トランスフェクションにより、ＩＦＡにより観察されるような、ＣＡＶ  ＶＰ３の過渡的発現の初期段階が生じた。過渡的発現は、必ずしも活発なウイルス複製を示さない。対照ＶＰ３発現について陽性である細胞数の指数的増加がＩＦＡにより明らかとなる前には、可変の多数の継代が必要であった。１／１０希釈により、連続継代をおこなった。したがって、ＣＡＶ  ＶＰ３について陽性である細胞数が指数的に増加すると、形質導入されたＤＮＡ構築物が単に維持されるのではなく、活発なウイルス複製及び感染を示した。アッセイした全てのＣＡＶ  ＶＰ２突然変異構築物は、ｐＣＡＵ２６９／７及び擬似対照と並行して評価したときに、感染性であり且つ生体外である程度複製できることが分かった（図２〜１２）。各構築物について、細胞の関連とは無関係に複製コンピテントウイルスが存在することが、形質導入された培養の溶菌及び清澄化後、培養の再感染をおこなうことにより確認された。このプロセスは、４継代にわたって連続的に反復した。ウイルスが存在することは、ウエスタンブロッティングによりＣＡＶ  ＶＰ３を検出することによるか、ＣＡＶ特異的プローブを用いたサザンブロッティング及びＤｐｎＩ制限エンドヌクレアーゼで消化した培養のＰＣＲにより残留形質導入ＤＮＡを除去することにより、確認した。突然変異遺伝子型は、ライゼートからのＰＣＲ産物を配列決定することにより、確認した。
【００９８】
複製コンピテントウイルスが、全ての突然変異構築物から生成されたが、ｍｕｔＣ９５Ｓウィルス及びｍｕｔＣ９７Ｓウィルスの最大対数ウイルス力価（ＴＣＩＤ50／ｍＬ）は、培養条件を最適化することを反復したにもかかわらず、それぞれ１．５及び１．７であった。これらのウイルス力価は、胚の接種には低過ぎると考えられたので、ｍｕｔＣ９５Ｓウィルス及びｍｕｔＣ９７Ｓウィルスについては、さらなる調査はおこなわなかった。感染培養の最終容積４００ｍＬで４代にわたって調製し、超遠心分離により濃縮し、同等の力価で再懸濁したときに、ｍｕｔＣ８６Ｒ、ｍｕｔＲ１０１Ｇ、ｍｕｔＨ１０３Ｙ、ｍｕｔＲ１２９Ｇ、ｍｕｔＮ１３１Ｐ、ｍｕｔＲ／Ｋ／Ｋ１５０／１５１／１５２Ｇ／Ａ／Ａ、ｍｕｔＤ／Ｅ１６１／１６２Ｇ／Ｇ、ｍｕｔＬ１６３Ｐ、ｍｕｔＤ１６９Ｇ及びｍｕｔＥ１８６Ｇ構築物については、対数ウイルス力価（ＴＣＩＤ50／ｍＬ）４．５が得られた（表９）。これらの力価は、胚の接種には十分であると考えられ、ストックの０．５ｍＬ、すなわち、１０4.2ＴＣＩＤ50を使用した。
【００９９】
【表９】
2004535194.tif 000010
【０１００】
有胚卵における感染モデル
一連の感染実験を、実施した。実験１及び実験２により、親ウイルスと、クローン構築物ｐＣＡＵ２６９／７（クローンウイルス）から生成したウイルスとの間に同等の感染性及び病原性があることが、確認された。親ウイルス処理群とクローンウイルス処理群の両方の全ての鳥には、重大なＣＡＶ病変として分類される、胸腺、骨髄、脾臓内の損傷及び出血がみられた。Ｍａｎｎ  Ｗｈｉｔｎｅｙ試験により測定したとき、これらの２つの群については、胸腺、骨髄、脾臓、出血及び累積損傷スコアには顕著な差はなかった。両方の群とも、クローン群についての骨髄スコアを除く全ての場合において、未感染群とは顕著な差があった。野生型ウイルス感染（親又はクローンウイルス）に関連した重度の病変は、以下のようにまとめることができる：軽度〜中程度の点状出血が、全ての幼鳥又は胚における筋膜及び皮下組織にみられた。脾臓は、大きさが５０〜８０％減少し、一般的に異常に色が薄いように思われ、且つ被膜下出血があった。全ての鳥において、全ての胸腺葉の大きさの減少は、重度と判定され、大部分において、急性細胞融解に一致する、葉への出血又は葉において被膜下、ゼラチン状、漿液血液状の滲出物の外観がみられた。骨髄含量の減少、及び骨髄の色の薄い脂肪性の外観又はひどい急性出血及び溶菌があった。少数の鳥において、ファブリキウス嚢で、サイズが減少し、きょう膜及び実質ひだがひどく潰れてみえた。
【０１０１】
実験３〜１２は、突然変異ウイルス及びクローンウイルスでの感染と未感染対照が含まれるものであった。突然変異ウイルス又は野生型ウイルスで感染させたもの及び未感染対照における体重並びに胚の胸腺、ファブリキウス嚢及び脾臓におけるリンパ球集団の大きさと比較して損傷スコア、体重、リンパ器官重量を統計的解析をした結果の概略を、表１０〜１７に示す。要約すると、損傷スコアは、突然変異ウイルスで感染させた胚では、野生型ウイルスで感染させた胚よりも、有意に小さく、ほとんどの場合において、損傷度が、リンパ器官のほとんどにおいて、有意に小さかった（表１０）。同様に、体重、胸腺／体重比及び脾臓／体重比において、並びにほとんどの場合において突然変異ウイルスで感染させた胚とクローン野生型ＣＡＵ２６９／７で感染させた胚との間の嚢／体重比において、有意な差がみられた（表１１）。
【０１０２】
【表１０】
2004535194.tif 000011
【０１０３】
【表１１】
2004535194.tif 000012
【０１０４】
リンパ球集団の試験
主要なリンパ器官におけるリンパ球集団に対するウイルス感染の影響を、評価した。胸腺、脾臓及び嚢を、胚から切除し、１％ＢＳＡと１ｍＭ  ＮａＮ3を含有する冷却された無菌性ＰＢＳ洗浄緩衝液に入れた。組織を、だいたい解離させ、５０ｍｍポアナイロンメッシュによりろ過した。フィルターに冷却したＰＢＳ洗浄緩衝液を流し、組織のホモジェネートを集め、十分に混合した。フィルター上の残留組織の重量を、最初のフィルター重量と比較した。抽出した細胞を、２０００ｇ、７分間の条件でペレット化し、ＰＢＳ洗浄緩衝液４ｍｌに再懸濁した。細胞懸濁液を、  Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社）勾配により、１０００ｇ、５分間の条件で遠心分離して精製し、集めた細胞を、ＰＢＳ洗浄緩衝液で２回洗浄した。３連コールターカウンター及び血球計の読み取りをおこなった。
【０１０５】
胸腺、脾臓及び嚢におけるリンパ球集団の大きさを調査（表１２）したところ、全ての突然変異型は、病原性の野生型ウイルスよりもリンパ球集団の減少が顕著に少なかった。
【０１０６】
リンパ球集団の蛍光標示的細胞分取（ＦＡＣＳ）
濃度を、ｍＡｂｓマウス抗ニワトリＴＣＲ１（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）、マウス抗ニワトリＴＣＲ２（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）、マウス抗ニワトリＴＣＲ３（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）、マウス抗ニワトリＣＤ４−ＦＩＴＣ接合体（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）、マウス抗ニワトリＣＤ８−ＦＩＴＣ接合体（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）及びマウス抗ニワトリＡｖＢｕ−１（英国のＣｏｍｐｔｏｎ  ＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓのＦｒｅｄ  Ｄａｖｉｄｓｏｎ博士から入手）について、最適化した。二羽のＷｈｉｔｅ  Ｌｅｇｈｏｒｎ  Ｃｈｉｃｋｅｎｓ（ＳＰＡＦＡＳ社）を、ＣＯ2チャンバーに入れることにより安楽死させ、脾臓、胸腺及び嚢を、解剖して取り出し、ＰＢＳに入れた。プール白血球を、上記のように精製した。ＦＡＣＳ分析に使用する抗体の最適濃度を決定するために、マウス抗ニワトリＴＣＲ１ｍＡｂを、１／１００、１／１０００及び１／５０００希釈で評価した。マウス抗ニワトリＴＣＲ２ｍＡｂを、１／５０、１／１００及び１／１０００希釈で評価した。ｍＡｂマウス抗ニワトリＴＣＲ３及びマウス抗ニワトリＡｖＢｕ−１を、１／２０、１／５０及び１／１００希釈で評価した。マウス抗ニワトリＣＤ４−ＦＩＴＣ接合体及びマウス抗ニワトリＣＤ８−ＦＩＴＣ接合体ｍＡｂｓを、１／２０、１／５０、１／１００、１／２００及び１／５００希釈で力価を測定した。最適希釈率を、ＦＡＣＳ分析によるバックグランド及びシグナル染色が最も明瞭であった最高抗体希釈率、また特異的染色のピーク強度に基づいて決定した。
【０１０７】
各胚の胸腺及び脾臓から分離したリンパ球集団について、二重染色プロトコールを用いて、ＴＣＲ１、ＴＣＲ２、ＴＣＲ３、ＣＤ４及びＣＤ８細胞表面マーカーについてのＦＡＣＳ分析において陽性である細胞の割合を求めた。各胚について、８回の染色処理を、１０6リンパ球の二連の試料について実施した。第一染色工程では、細胞を、マウス抗ニワトリＴＣＲ１ｍＡｂをＰＢＳ洗浄緩衝液で１／１０００希釈したもの、又はマウス抗ニワトリＴＣＲ２ｍＡｂを１／１００希釈したもの、又はマウス抗ニワトリＴＣＲ３ｍＡｂを１／１００希釈したもの、又は３つ全てのｍＡｂを組み合わせたものとともに、４℃、３０分間の条件でインキュベーションした。細胞を、洗浄した後、ウサギ抗マウス二次抗体−フィコエリトリン（ＰＥ）接合体（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ社）を１／１５００希釈したものとともに、４℃、３０分間の条件でインキュベーションし、その後ＰＢＳ中１０％正常マウス血清（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ社）とともに、４℃、３０分間の条件でインキュベーションすることによりブロックした。第三染色工程において、４回処理の各組を、マウス抗ニワトリＣＤ４−ＦＩＴＣ接合体を１／１００希釈したもの、又はマウス抗ニワトリＣＤ８−ＦＩＴＣ接合体を１／１００希釈したものとともに、４℃、３０分間の条件でインキュベーションした。
【０１０８】
選択した実験幼鳥の胸腺、脾臓及び嚢から得たリンパ球試料を、染色し、Ｂ細胞マーカートリＢｕ−１（ＡｖＢｕ−１）について分析した。リンパ球１０６個の試料を、ｍＡｂマウス抗ニワトリＡｖＢｕ−１を１／２００希釈したものとともに、続いてウサギ抗マウス二次抗体−ＰＥ接合体ｍＡｂを１／１５００希釈したものとともに、４℃、３０分間の条件でインキュベーションした。
【０１０９】
二重陽性細胞及び単一陽性細胞の割合を、細胞蛍光計を用いて分析して求めた。
【０１１０】
データを、Ｃｅｌｌｑｕｅｓｔソフトウェア（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社）を用いて解析した。１０Ｅ８細胞の試料集団を、密度プロットのグラフで表した。この際、ＦＩＴＣ染色の強度をＸ軸上に表し、ＰＥ染色の強度をＹ軸上に表した。対照細胞のプロットから得た象現を使用して、陽性染色集団及び陰性染色集団を描写した。総リンパ球プールの絶対サイズと割合を、リンパ球の小集団について計算で求めた。
【０１１１】
蛍光標示式細胞分取を用いて、胸腺、脾臓及び嚢における異なるリンパ球小集団を解析したところ、突然変異ウイルスにより、ＣＤ４＋ＴＣＲ−、ＣＤ４＋ＴＣＲ１＋、ＣＤ４＋ＴＣＲ２＋及び場合によってはＣＤ４＋ＴＣＲ３＋、胸腺細胞（表１３）の数の低下が有意に少なく、ＣＤ８＋ＴＣＲ−及び場合によってはＣＤ８＋ＴＣＲ１＋、ＣＤ８＋ＴＣＲ２＋及びＣＤ８＋ＴＣＲ３＋、胸腺細胞（表１４）の数の低下が有意に少なかった。一般的に、突然変異により、脾細胞のこれらの小集団における低下も少なくなった（表１５及び表１６）。ある場合には、さらに、突然変異により、野生型ウイルスよりも、Ｂリンパ球集団への影響が有意に小さくなった（表１７）。これらの知見から、ＶＰ２の突然変異により、ＣＡＶの免疫抑制効果が有意に減少することが証明される。
【０１１２】
【表１２】
2004535194.tif 000013
【０１１３】
【表１３】
2004535194.tif 000014
【０１１４】
【表１４】
2004535194.tif 000015
【０１１５】
【表１５】
2004535194.tif 000016
【０１１６】
【表１６】
2004535194.tif 000017
【０１１７】
【表１７】
2004535194.tif 000018
【０１１８】
ＩＩ．ＣＡＶ  ＶＰ２の翻訳開始シグナルの突然変異
ＶＰ２  ＡＴＧコドン付近に突然変異を含むＣＡＶゲノムの構築
全てのＣＡＶ  ＤＮＡ配列を、最初にプラスミドｐＣＡＵ２６９／７から得た。オーバーラップＰＣＲ延長を使用して、所望のヌクレオチド変化を含むＤＮＡ配列を生成した。ＣＡＶゲノムのＡｐａＩ／ＢｓｔＢＩ  ＤＮＡ断片を、合成オリゴヌクレオチド対（ＣＡＶ１／ＣＡＶ２０、ＣＡＶ１９／ＣＡＶ１１、ＣＡＶ１／ＣＡＶ２２、ＣＡＶ２１／ＣＡＶ１１）を用いて、ＰＣＲにより増幅した（表１８参照）。
【０１１９】
【表１８】
2004535194.tif 000019
【０１２０】
所望のヌクレオチド変化を含むオリゴヌクレオチド対ＣＡＶ１／ＣＡＶ２０、ＣＡＶ１９／ＣＡＶ１１、ＣＡＶ１／ＣＡＶ２２及びＣＡＶ２１／ＣＡＶ１１を、別個の第一ラウンドＰＣＲ増幅（２５サイクル）に使用して、それぞれ３４７ｂｐ、４９５ｂｐ、３４７ｂｐ及び４９５ｂｐの生成物を得た。生成物を、ゲル電気泳動により分析してサイズ及び量を確かめ、続いて２５ｎｇ／μＬに希釈してから、２つの第二ラウンドＰＣＲ増幅（２０サイクル）（オリゴヌクレオチド対ＣＡＶ１／ＣＡＶ１１のみを利用）のシーディング（ＣＡＶ１／ＣＡＶ２０生成物とＣＡＶ１９／ＣＡＶ１１生成物又はＣＡＶ１／ＣＡＶ２１生成物とＣＡＶ２２／ＣＡＶ１１生成物）に使用した。このオーバーラップ延長ＰＣＲから得た生成物は、ＶＰ２  ＡＴＧコドン付近に、所望のヌクレオチド変化（ｐＣＡＵ２８３−３の−３位のＴのＡによる置換、又はｐＣＡＵ２８３＋４の＋４位のＣのＧによる置換）が組み込まれていることを除いて、断片ＣＡＶ１／ＣＡＶ１１と同一であった。オーバーラップ延長生成物を、ＡｐａＩ／ＢｓｔＢＩで消化し、ＶＰ２  ＡＴＧコドンにまたがっている１５３ｂｐの断片を、分離し、同じ酵素で消化したプラスミドｐＣＡＵ２６９／７と別個にライゲーションした。得られた構築物を、ｐＣＡＵ２８３−３及びｐＣＡＵ２８３＋４と命名し、制限酵素消化及び配列決定により解析して新しく導入された配列を確認した。
【０１２１】
配列解析
ＤＮＡ配列を、ベクター特異的（Ｔ７及びＳＰ６）及びＣＡＶ配列特異的合成プライマー（ＣＡＶ１２、２、１０、３、９、４、７、５）の組み合わせを有するＢｉｇＤｙｅターミネーター配列決定ケミストリー（ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ社）を用いた、ジデオキシチェーンターミネーション法により決定した。
【０１２２】
ＤＮＡの調製及びトランスフェクション
ＴｒｉｔｏｎＸ−１００により精製したエンドトキシンフリープラスミドＤＮＡ１０μｇをＥｃｏＲＩで消化してＣＡＶゲノムインサートを放出することにより、トランスフェクション用ウイルスＤＮＡを調製した。制限生成物を、フェノール−クロロホルムで抽出し、エタノールで沈殿させ、１μｇ／μＬの濃度で再懸濁させた。アリコットを、アガロースゲル電気泳動により試験してインサートの放出と回収効率を確認した。
【０１２３】
ＭＳＢ１細胞を、３回洗浄し、温めたＲＰＭ１−１６４０に補充なしで再懸濁して、７００μＬ中  ４×１０6個の最終濃度とした。細胞を、間隙０．４ｃｍのキュベット（ＢｉｏＲａｄ社）中、４００Ｖ及び３７５μＦでエレクトロポレーションすることによりトランスフェクションに付した。パルス細胞を、室温（ＲＴ）で５分間インキュベーションした後、予め温めたＲＦ１０を３ｍＬ入れた６ウエル組織培養トレイに移し、５％ＣＯ2中、３７℃でインキュベーションした。対照ウエルにおけるトランスフェクション効率（ＣＭＶ−ＧＦＰ発現−ｐＥＧＦＰＣ２、Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ社）を、トランスフェクションの２４時間後に推定した。トランスフェクトされた細胞を、細胞変性効果（ｃｐｅ）について観察し、サンプリングして蛍光染色により、ＶＰ３の発現について測定した。
【０１２４】
間接免疫蛍光アッセイ
細胞を、リン酸緩衝生理食塩水で二回洗浄し、再懸濁し、１２ウエルスライドにより、約３０〜５０，０００細胞／ウエルで平板培養し、風乾し、氷冷却アセトン：メタノール（９０：１０）で固定した。スライドを、ＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０中５％ＢＳＡでブロックしてから、マウス由来ＣＡＶ  ＶＰ３特異的モノクローナル抗体ＪＣＵ／ＣＡＶ／１Ｃ１（ＪＣＵ  ＴｒｏｐＢｉｏ社、Ｔｏｗｎｓｖｉｌｌｅ，Ｑｕｅｅｎｓｌａｎｄ）と、加湿チャンバー中、３７℃で６０分間反応させ、そして同条件下でフルオロセインイソチオシアネート接合ウサギ抗マウス免疫グロブリンＧ抗体と反応させた。三回目の洗浄後、スライドにＶｅｃｔａＳｈｉｅｌｄを取り付けて、蛍光顕微鏡検査法により観察した。
【０１２５】
結果
ＶＰ２  ＡＴＧコドン付近に突然変異を有するＣＡＶゲノムの構築
プラスミドｐＣＡＵ２６９／７は、生存可能な感染性ＣＡＶ粒子の製造に使用できる。この研究では、本発明者らは、突然変異ＣＡＶ−ＤＮＡゲノムであるｐＣＡＵ２８３−３及びｐＣＡＵ２８３＋４が、効率的に複製するウイルスを製造することもできるかどうかを調べた。このために、ＭＤＣＣ−ＭＳＢ１細胞に、これらの変更ＣＡＶゲノムをｗｔＣＡＶ  ＤＮＡ（ｐＣＡＵ２６９／７）と並行してトランスフェクトした。
【０１２６】
突然変異ＣＡＶ対ｗｔＣＡＶの複製速度差の分析
突然変異ゲノムの複製コンピテンシーを証明するために、ＣＡＶタンパク質ＶＰ３の合成を、トランスフェクトされたＭＤＣＣ−ＭＳＢ１細胞で追跡した。トランスフェクションの４０時間後、トランスフェクトされた培養の試料を、ＶＰ３に対してｍＡＢ  ＪＣＵ／ＣＡＶ／１Ｃ１を用いた間接免疫蛍光により分析した。並行して、トランスフェクトされた培養試料を、新鮮な培地に継代（１：１０）した。
【０１２７】
トランスフェクトされたＣＡＶ突然変異では、トランスフェクションの４０時間後に、ＶＰ３を発現する細胞の割合（％）が、野生型（ｗｔ）ＣＡＶゲノムと同様であった。ＶＰ３発現細胞では、観察された細胞変性効果は、拡大した不格好な細胞の外観に特徴があり、他の報告されているＣＡＶ分離物と一致していた。これらの細胞の細胞変性はすべて、感染の９６時間内でみられた。
【０１２８】
蛍光顕微鏡検査法により測定したときに、ｗｔ又は突然変異ゲノムにおける細胞局在化又はＶＰ３染色の蛍光強度には、明白な差はなかった。トランスフェクション後のいくつかの時間点で、継代しトランスフェクトされた培養のさらなる試料を、生存可能な感染性ＣＡＶ粒子の製造について調べた。６日以内で、突然変異ゲノムｐＣＡＵ２８３−３又はｐＣＡＵ２８３＋４でトランスフェクトされたＭＤＣＣ−ＭＳＢ１培養中にＶＰ３陽性細胞をみることができなくなった。さらに、これらのゲノムでトランスフェクトされた培養から採取された培地は、新鮮なＭＤＣＣ−ＭＳＢ１細胞で継代したときには、細胞変性効果を生じなかった。
【０１２９】
これらの結果は、突然変異ＤＮＡが、ｗｔ  ｐＣＡＵ２６９／７に対してＭＤＣＣ−ＭＳＢ１細胞における細胞病原性を大幅に減少させ、且つトランスフェクション後に一時的にのみＣＡＶタンパク質を発現することを示唆している。このような突然変異ウイルスゲノムは、複製ウイルスを生成しないが、一時的にウイルスタンパク質を発現できるので、ニワトリのＤＮＡワクチン接種に使用できる。
【０１３０】
ＩＩＩ．ウィルスタンパク質２
免疫抑制サーコウイルスであるニワトリ貧血ウィルス（ＣＡＶ）のウィルスタンパク質２（ＶＰ２）は、ウイルス感染性と複製には必須であることが分かったが、その機能は、いまだはっきりとはつかめていない。ＣＡＶ  ＶＰ２アミノ酸配列は、多数の真核生物の受容体、タンパク質−チロシンホスファターゼαタンパク質だけでなく、ＳＡＮＢＡＮ群内のＴＴウィルスのクラスターに対しても、顕著な相同性がある。ＶＰ２をコードしているＯＲＦを、ＰＣＲにより増幅し、バクテリア発現ベクターｐＧＥＸ４Ｔ−２にクローニングした。ＶＰ２−ＧＳＴ融合タンパク質を、発現し、アフィニティークロマトグラフィーにより精製した。精製したＶＰ２−ＧＳＴを、一般化ペプチド基質ＥＮＤＹ（Ｐｉ）ＩＮＡＳＬを用いたタンパク質チロシンホスファターゼ（ＰＴＰａｓｅ）活性についてアッセイした（マラカイトグリーン比色法により遊離ホスフェートを検出）。ＶＰ２−ＧＳＴのタンパク質チロシンホスファターゼ活性は、Ｖmaxが１４２８０Ｕ／ｍｇ・分及びＫmが１６．９５μＭであった。最適活性は、ｐＨ６〜７で得られ、活性は、０．０１ｍＭオルトバナデートにより特異的に阻害された。独特のサインモチーフが、アミノ酸残基９４〜１０２によりコードされているＣＡＶ  ＶＰ２ＰＴＰ：ＩＣＮＣＧＱＦＲＫについて提案される。
【０１３１】
実験手順−ＶＰ２
配列解析
ＣＡＶ  ＶＰ２に対して相同性を有するタンパク質配列を、ＮＣＢＩインターフェースを介して  ＢＬＡＳＴＸソフトウェア（Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ）を用いてＧｅｎｂａｎｋデータベースをサーチすることにより、同定した。この方法により同定された配列を、次にＥｃｌｕｓｔａｌＷ（ＷｅｂＡＮＧＩＳ，Ａｕｓｔｒａｌｉａｎ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅ）を用いて、ＣＡＶ配列に整列させた。
【０１３２】
ＣＡＶウィルスタンパク質２及びＴＬＭＶ  ＯＲＦ２の分子クローニング
ＣＡＶのＣＡＵ２６９／７オーストラリア分離株を、全ての実験に使用した。ＣＡＶ  ＯＲＦ１（ＶＰ２）を、ＣＡＶゲノムの二本鎖複製形態からのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅した。細胞ＤＮＡ試料をＣＡＶ感染ＭＤＣＣ−ＭＳＢ１細胞から、感染して４８時間後に、Ｍｅｅｈａｎ，Ｂ．Ｍ．，Ｔｏｄｄ，Ｄ．，Ｃｒｅｅｌａｎ，Ｊ．Ｌ．，Ｅａｒｌｅ，Ｊ．Ａ．，Ｈｏｅｙ，Ｅ．Ｍ．及びＭｃＮｕｌｔｙ，Ｍ．Ｓ．（１９９２）、「ニワトリ貧血作用物質を感染させた細胞からのウイルスＤＮＡの特性付け：クローン化複製型の配列解析及びクローン化ゲノム断片のトランスフェクション能」、Ａｒｃｈ  Ｖｉｒｏｌ  １２４、第３０１〜３１９頁、の方法にしたがって、プロテイナーゼＫ及び硫酸ドデシルナトリウム（ＳＤＳ）溶菌及びフェノール／クロロホルム抽出により精製した。オリゴヌクレオチド順方向プライマーＣＡＶ．１−５’ＣＧＧＴＣＣＧＧＡＴＣＣＡＴＧＣＡＣＧＧＡＡＡＣＧＧＣＧＧＡＣＡＡＣ３’及び逆プライマーＣＡＶ．２−５’ＧＧＴＴＴＧＧＡＡＴＴＣＴＣＡＣＡＣＴＡＴＡＣＧＴＡＣＣＧＧＧＧＣ３’を合成して、それぞれ５’端内にＢａｍＨＩ及びＥｃｏＲＩ制限エンドヌクレアーゼ部位を組み込んだ。ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰの各々３００μＭ、２ｍＭ  ＭｇＣｌ2、各プライマー２００μＭ、１０×ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ緩衝液１０μＬ、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）２Ｕ及び鋳型ＤＮＡ２μＬを含有する、反応混合物１００μＬを調製した。ＰＣＲ反応は、９５℃で２分間インキュベーションし、それから９６℃で４０秒間、６０℃で４０秒間、その後７２℃で４０秒間のインキュベーションを４０サイクルおこない、最後に７２℃で５分間インキュベーションすることによりおこなった。ＰＣＲ産物を、アガロース（１％）ゲル電気泳動により分析し、６７７ｂｐのバンドを切除し、製造業者の説明書にしたがって、ＱｉａｅｘＩＩ（Ｑｉａｇｅｎ社）ゲル抽出キットにより精製し、ＢａｍＨＩ及びＥｃｏＲＩで消化し、適切に消化したｐＧＥＸ−４Ｔ−２（Ｐｒｏｍｅｇａ社）にライゲーションした。大腸菌株ＤＨ５αを、エレクトロポレーションにより、ライゲーションしたプラスミドで形質転換し、アンピシリン（５０μｇ／ｍＬ）を含有するＬｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ寒天（ＬＡ）上で３７℃の温度で培養した。クローンＤＮＡを、ＰＧＥＸ−４Ｔ−２に特異的な市販の配列決定プライマーを用いて、Ｔａｑ  Ｄｙｅ  Ｄｅｏｘｙ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇキット（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社）により、配列決定した。
【０１３３】
ＴＬＭＶ株ＣＢＤ２３１のプライマーＭ−１３６０〜Ｍ−１３６３（２５８ｂｐ〜８８６ｂｐ）から得た精製ネステッドＰＣＲ産物を、Ｓｈｕｎｊｉ  Ｍｉｓｈｉｒｏ（Ｔａｋａｈａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ，２０００）から、ご好意により入手した。ＴＬＭＶ  ＯＲＦ２を、Ｍ−１３６０〜Ｍ−１３６３鋳型からＰＣＲにより増幅した。オリゴヌクレオチド順方向プライマーＴＬＭＶ．１−５’ＴＴＧＧＡＴＣＣＡＴＧＡＧＣＡＧＣＴＴＴＣＴＡＡＣＡＣＣＡＴＣ３’及び逆プライマーＴＬＭＶ．２−５’ＧＧＣＧＡＡＴＴＣＴＴＡＣＣＣＡＴＣＧＴＣＴＴＣＴＴＣＧＡＡＡＴＣ３’を合成して、独自のＢａｍＨＩ及びＥｃｏＲＩ制限酵素部位を、それぞれの５’端内に組み込んだ。ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰの各々３００μＭ、２ｍＭ  ＭｇＣｌ2、各プライマー２００μＭ、１０×ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ緩衝液５μＬ、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）１Ｕ及び鋳型ＤＮＡ１μＬを含有する、反応混合物５０μＬを調製した。ＰＣＲ反応は、９６℃で２分間インキュベーションし、それから９６℃で４０秒間、５６℃で４０秒間、その後７２℃で４０秒間のインキュベーションを４０サイクルおこない、最後に７２℃で５分間インキュベーションすることによりおこなった。２９５ｂｐのＰＣＲ産物の精製、消化及びｐＧＥＭ−Ｔプラスミドベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ社）へのクローニングは、ＣＡＶウイルスタンパク質２について上記で説明したようにしておこなった。インサートを、次にｐＧＥＸ−４Ｔ−２プラスミドベクターにサブクローニングし、インサートの配列及びフレームを、配列決定により確認した。
【０１３４】
タンパク質の発現及び精製
ＣＡＶ  ＶＰ２を、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼとのＣ末端融合物として生成した。すなわち、ＣＡＶ  ＶＰ２ｐＧＥＸ−４Ｔ−２構築物を有する大腸菌ＤＨ５αの培養１Ｌを、アンピシリン（５０μｇ／ｍＬ）を含有するＬｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ培養液中で培養した。培養の吸光度が６００ｎｍで０．６に達したとき、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を最終濃度１ｍＭまで添加することにより、発現を誘発させ、この培養を、追加で１時間インキュベーションしてから、採取した。６０００ｇ、３０分間の条件で遠心分離することにより、バクテリアを回収し、ペレットを、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で２回洗浄した。細胞を、０．３Ｍ  ＥＤＴＡとリゾチーム２００ｍｇとフェニルメチルスルホニルフロリド（Ｓｉｇｍａ社）１００μｇ／ｍＬとを含有するＰＢＳ２５ｍＬに再懸濁し、低周波数で１０秒間超音波処理することにより溶解させた。ライゼートを、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００に可溶化し、４℃でさらに１０分間インキュベーションし、１００００ｇ、３０分間の条件で遠心分離することにより、細胞残屑を除去した。融合タンパク質を、製造業者のプロトコールに従ってグルタチオンセファロース樹脂（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を用いてアフィニティー精製した。溶出液を、１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、２．７ｍＭ  ＫＣｌ及び２５ｍＭ  ＴｒｉｓＨＣｌを含有する緩衝液（ＴＢＳ）（ｐＨ７．４）に対して、十分に透析した。
【０１３５】
ネガティブコントロールグルタチオン−S−トランスフェラーゼを、ＧＳＴ−ＶＰ２融合物を精製するのに用いたのと同様の方法にしたがって、ｐＧＥＸ−４Ｔ−２で形質転換した大腸菌ＤＨ５αから精製した。
【０１３６】
精製したタンパク質を、１２．５％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル中で電気泳動により分離し、クマシーブリリアントブルー（Ｌａｅｍｍｌｉ、英国（１９７０）、「Ｃｌｅａｖａｇｅ  ｏｆ  ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｄｕｒｉｎｇ  ｔｈｅ  ａｓｓｅｍｂｌｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｅａｄ  ｏｆ  ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ  Ｔ４（バクテリオファージＴ４のヘッド部のアセンブリ中の構造タンパク質の開裂）」、Ｎａｔｕｒｅ２２７，第６８０〜６８５頁）で染色した。タンパク質を、ポリビニルジフロリドメンブラン（ＰＶＤＦ：Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）上にエレクトロトランスファーした。ＧＳＴ−ＶＰ２及びＧＳＴのウエスタンブロットを、１／５００希釈したＧＳＴに対するウサギポリクローナル抗血清で調査した後、１／１０００希釈ブタ抗ウサギ二次抗体ＨＲＰ接合体（Ｄａｋｏ社）で調査し、製造業者の説明書にしたがってＳｉｇｍａＦａｓｔ３，３’−ジアミノベンジジン基質（ＤＡＢ、Ｓｉｇｍａ社）で展開した。第二ウエスタンブロットを、プール免疫ニワトリ血清で調査した後、１／５００希釈のウサギ抗ニワトリ−ＨＲＰ接合体で調査し、ＤＡＢ基質で展開した。タンパク質濃度を、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）（Ｓｉｇｍａ社）標準を用いたＢｒａｄｆｏｒｄＡｓｓａｙ（ＢｉｏＲａｄ社）により、定量化した。
【０１３７】
ＧＳＴ−ＶＰ２融合物を精製するのに使用したのと同様の方法にしたがって、ＴＬＭＶ  ＯＲＦ２ｐＧＥＸ  ４Ｔ−２クローンで形質転換した大腸菌ＤＨ５αから、ＴＬＭＶ  ＯＲＦ２を精製した。しかしながら、タンパク質発現は、３０分間しか誘発されなかった。
【０１３８】
ペプチド基質の合成
Ｄａｕｍ，Ｇ．，Ｓｏｌｃａ，Ｆ．，Ｄｉｌｔｚ，Ｃ．Ｄ．，Ｚｈａｏ，Ｚ．，Ｃｏｏｌ，Ｄ．Ｅ．及びＦｉｓｃｈｅｒ，Ｅ．Ｈ．（１９９３）、「Ａ  ｇｅｎｅｒａｌ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  ｆｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅｓ（タンパク質チロシンホスファターゼ用の一般のペプチド基質）」、Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ２１１、第５０〜５４頁に記載されているチロシンホスファターゼのための、一般化タンパク質基質を、全ての酵素アッセイに使用した。ホスホペプチド配列は、Ｈ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ（ＰＯ3Ｈ2）−Ｉｌｅ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−ＯＨであった。すなわち、ノナペプチドを、Ｆｍｏｃ化学反応を用いて固相で手動でアセンブリした。ペプチド合成に使用する全ての化学物質は、分析グレードのものであった。フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）で保護したアミノ酸残基（オーストラリアのメルボルンにあるＡｕｓｐｅｐ社）を、合成に使用した。使用した残基は、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｌｅｕ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ａｌａ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｉｌｅ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｔｙｒ（ＭＤＳＰＥ）、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ及びＦｍｏｃ−Ｌ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−ＯＨであった。支持樹脂ＰＡＣ−ＰＥＧ−ＰＳ（Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社、容量０．１８ミリモル／ｇ）を、合成に使用した。アミノ酸を、等モル量のＯ−ベンゾトリアゾール−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−ウロニウム−ヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）（Ａｕｓｐｅｐ社）及び１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）（Ａｕｓｐｅｐ社）並びに二当量のジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）（Ａｕｓｐｅｐ社）とともにインキュベーションすることにより、活性化した。カップリング反応を６０分間実施した後、トリニトロベンゼンスルホン酸試験をおこなった。Ｆｍｏｃ基を、各カップリング反応後に、２．５％１，８−ジアザビシクロ−［５．４．０］ウンデセ−７−エン（ＤＢＵ）で洗浄することにより除去した。残基４〜９のカップリングについては、各サイクルを、２回反復した。側鎖の保護基を除去し、水中、８８％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、５％フェノール及び２％トリ−イソプロピルシラン（ウィスコンシン州ＭｉｌｗａｕｋｅにあるＡｌｄｒｉｃｈ社）で処理することにより、ペプチドを樹脂から開裂させた。粗製ペプチドを、冷ジエチルエーテルで沈殿させた後、ＶｙｄａｃＣ４半分取カラム（０．１％トリフルオロ酢酸；アセトニトリル２％／分勾配で溶出）を用いた逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）により精製した。ペプチドの同定は、質量分析によりおこなった。
【０１３９】
タンパク質チロシンホスファターゼアッセイ
全てのタンパク質チロシンホスファターゼ反応は、Ｔｏｎｋｓ，ＮＫ．，ｄｉｌｔｚ，ＣＤ．及びＦｉｓｃｈｅｒ，Ｅ．Ｈ（１９９１）、「Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ａｓｓａｙ  ｏｆ  ＣＤ４５：  ａｎ  ｉｎｔｅｇｒａｌ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（ＣＤ４５の精製及びアッセイ：膜一体タンパク質（ｉｎｔｅｇｒａｌ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ）−チロシンホスファターゼ）」、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ  ２０１、第４４２〜４５１頁の方法を適合させておこなった。以下の反応条件は、特記のない限りは全てのアッセイに適用される。５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（２５℃でｐＨ７）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、５０ｍＭ  ２−メルカプトエタノール及び１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡを含有するアッセイ緩衝液（ＡＢ）を、調製した。５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（２５℃でｐＨ７）及び０．０１％ｗ／ｖＢｒｉｊ３５（Ｓｉｇｍａ社）を含有する第二緩衝液（ＴＢ）を、調製した。全ての反応は、マイクロタイタープレートにおいて容積２００μｌで実施した。ホスホペプチド基質の１ｍＭ溶液を、ＡＢ緩衝液で作製した。基質１５ナノモルを、ＡＢ緩衝液とＴＢ緩衝液と（１：１）の１４の３連の反応混合物の各々に添加した。反応を、９μｇのＶＰ２−ＧＳＴ又はＧＳＴを添加することにより、開始した。反応は、振盪しながら、室温で、０分間、１分間、２分間、３分間、４分間、５分間又は１０分間インキュベーションすることによりおこない、マラカイトグリーン試薬を添加することにより停止させた。全てのアッセイは、少なくとも３回反復し、平均活性を、各時間点についてプロットした。活性を、２４ｋＤａＧＳＴ融合ｔａｇの質量への寄与のため、０．５２の倍率だけ調整し、酵素の１マイクログラム当たりの触媒基質のナノモルとして表した。
【０１４０】
可溶性リン酸塩のマラカイトグリーン検出
溶液への遊離リン酸塩の放出を、マラカイトグリーン比色法により検出した。すなわち、濃硫酸６０ｍＬを水３００ｍＬにゆっくりと添加した後、室温まで冷却し、それからマラカイトグリーン（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）０．４４ｇを添加することにより、マラカイトグリーン原液を調製した。使用直前に、比色試薬を、マラカイトグリーン原液１０ｍＬ、３％（ｗ／ｖ）（ＮＨ4）3ＭｏＯ3（Ｓｉｇｍａ社）及び０．１５％Ｔｗｅｅｎ２０（Ｓｉｇｍａ社）から調製した。
【０１４１】
比色試薬５０μＬを、マイクロタイタープレートにおける反応容積２００μＬに添加し、室温で２０分間平衡化させた。吸光度を６２０ｎｍで読み取り、リン酸塩放出を、リン酸塩標準曲線と対照して較正した。
【０１４２】
リン酸塩標準曲線を、リン酸塩値０ナノモル、２．５ナノモル、５ナノモル、７．５ナノモル、１０ナノモル、１５ナノモル、２０ナノモル、２５ナノモル、３０ナノモル、４０ナノモル及び４５ナノモルについて作成した。リン酸塩溶液を、ＡＢ緩衝液とＴＢ緩衝液の１：１比からなる緩衝液で調製し、２００μｌを、マイクロタイタープレートにおける３つのウエルの各々に添加した。各濃度について、比色試薬５０μｌを添加し、室温で２０分間平衡化させた。次に、吸光度を、６２０ｎｍで測定した。
【０１４３】
酵素反応速度及び阻害の検討
基質を、０ナノモル、２．５ナノモル、５ナノモル、７．５ナノモル、１０ナノモル、１５ナノモル、２０ナノモル、２５ナノモル、３０ナノモル及び４０ナノモルの３連の反応混合物に添加した。インキュベーション時間は１分間であり、全ての他の反応条件は上記したものと同様であった。各基質濃度について、活性を少なくとも６連で測定し、平均活性の標準誤差を各値について計算した。Ｖmax及びＫmの推定値を、二重逆数プロットから直線回帰解析により求め、標準誤差及びＰ値を、プロットからの定数１／Ｖmax及び係数Ｋm／Ｖmaxについて計算した。
【０１４４】
１ｍＭ  Ｎａ3ＶＯ3・１０Ｈ2Ｏ原液を、蒸留水で調製し、硫酸でｐＨ１０に調整した。いったん溶解したＮａ3ＶＯ3・１０Ｈ2Ｏ原液をＡＢ及びＴＢ緩衝液に１：１：１の比で添加し、ｐＨ７に調整した。阻害についての検討を、０．１ｍＭオルトバナジン酸ナトリウム、０．０１ｍＭオルトバナジン酸ナトリウム及び０．００１ｍＭオルトバナジン酸ナトリウムを用いておこなった。全ての他の反応条件は、上記したのと同様であった。アッセイは、基質１０ナノモル及びＣＡＶ  ＶＰ２−ＧＳＴ９μｇを用い、各阻害剤濃度について三連でおこなった。
【０１４５】
酵素のｐＨ最適条件
三連の反応を、ｐＨ４、ｐＨ５、ｐＨ６、ｐＨ７、ｐＨ８及びｐＨ９でおこなった。アッセイは、基質１０ナノモル及びＣＡＶ  ＶＰ２−ＧＳＴ９μｇを用い、他の全ての反応条件は上記したのと同様であった。マラカイトグリーン試薬を添加する前に、硫酸又は水酸化ナトリウムにより中和して、ｐＨを７とした。
【０１４６】
ＴＬＭＶ  ＶＰ２  ＧＳＴ融合アッセイ
ＴＬＭＶ−ＧＳＴタンパク質のアッセイを、ＣＡＶ  ＶＰ２について記載した反応条件にしたがっておこなった。反応は、４回反復した。
【０１４７】
結果−ＶＰ２
配列解析
ＣＡＶ  ＶＰ２に対して相同性を有するタンパク質配列について、データベースを検索したところ、ヒト、ラット、マウス及びニワトリ由来の多数の受容体タンパク質チロシンホスファターゼアルファ（Ｒ−ＰＴＰａｓｅ）タンパク質が同定された。ＣＡＶ  ＶＰ２は、全てのＲ−ＰＴＰａｓｅ相同物におけるＰループのわきに位置しているＷＰＤループに相同であった。ＷＰＤループは、ＰＴＰａｓｅ活性に関与している。Ｐループは、触媒部位及びサインモチーフを含んでいる。ＣＡＶ  ＶＰ２とＲ−ＰＴＰａｓｅ相同物との間の類似度は、３０〜３２％の範囲であった。Ｒ−ＰＴＰａｓｅ相同物とＣＡＶ  ＶＰ２アミノ酸配列を、図１３において整列して示す。
【０１４８】
第二クラスターの配列をＧｅｎｂａｎｋデータベースで同定したところ、ＣＡＶ  ＶＰ２に対して高度な相同性を有することがわかった。ＴＴウィルスのＳＡＮＢＡＮ群は、ＣＡＶ  ＶＰ２に対して顕著な相同性を有している。全てのＳＡＮＢＡＮウイルス配列において、相同領域は、推定ＯＲＦ１によりコードされているアミノ酸配列の残基５４〜８０から伸長している。ＰＴＰａｓｅ相同物についての場合とタンパク質の同じ領域が相同であったが、相同残基のパターンが異なっていた。ＣＡＶ  ＶＰ２とＳＡＮＢＡＮウイルス配列との間の相同度は、４８％であった。ＣＡＶ  ＶＰ２配列をＳＡＮＢＡＮウィルスと整列させて、図１４に示す。
【０１４９】
タンパク質の発現及び精製
ＣＡＶ  ＯＲＦ１を、ＣＡＶのＣＡＵ２６９／７オーストラリア分離株から増幅した。ＣＡＵ２６９／７分離株は、ＣＡＶの他に記載された分離株と同等の病原性及び感染力を有するものであった。ＰＣＲ産物を、ｐＧＥＸ  ４Ｔ−２ベクターにクローニングし、ＣＡＶ  ＶＰ２タンパク質を、バクテリア発現系においてグルタチオン−S−トランスフェラーゼを用いて組み換え融合タンパク質として製造した。タンパク質のサイズ及び同一性を、１２．５％ＳＤＳ  ＰＡＧＥ中での電気泳動後、クマシーブリリアントブルー染色及びウエスタンブロッティングをおこなうことにより、確認した（図１５〜１７）。ＣＡＶ  ＶＰ２−ＧＳＴ融合タンパク質に対応する分子量５８ｋＤａのバンドは、アフィニティー精製溶出液からＳＤＳ−ＰＡＧＥにより同定した。タンパク質バンドは、ＧＳＴｔａｇに対する抗血清、さらにはプール過免疫ニワトリ血清と特異的に反応した。透析したタンパク質は、ＴＢＳ緩衝液に容易に溶解し、ＰＴＰａｓｅアッセイに直接使用した。タンパク質濃度は、ＢＳＡ標準曲線を用いてＢｒａｄｆｏｒｄアッセイにより測定した。
【０１５０】
ペプチド基質の合成
ペプチド基質を、標準Ｆｍｏｃ化学反応を用いて、固体支持体上に合成した。ホスホチロシン残基の付加の後、続く全てのサイクルは、大きなホスフェート基によるカップリングに対する可能性のある立体障害に対応するために、二連でおこなった。純粋なホスホペプチドと一致する単一ピークが、ＲＰ−ＨＰＬＣ分析により得られ、式量を質量分析で求めたところ、１１１６．３であった。
【０１５１】
タンパク質チロシンホスファターゼアッセイ
６２０ｎｍでの吸光度をホスフェート濃度との関係で求めた標準曲線を、アッセイ条件ごとに作成した。マラカイトグリーン比色検出の感度は、２．５ナノモルホスフェートであり、ｌｏｇ［Ｐｉ］と６２０ｎｍでの吸光度との間の関係は、ホスフェート０〜４５ナノモルの範囲で直線的であった。ホスフェート濃度が４５ナノモルを超えると、ホスホモリブデートが沈殿し、それにより直線関係がなくなった。
【０１５２】
ＶＰ２−ＧＳＴ融合タンパク質がタンパク質チロシンホスファターゼ活性を有することが、はっきりと示された。対照ＧＳＴに対する、ＣＡＶ  ＶＰ２−ＧＳＴタンパク質によるホスフェート放出の経時変化を、図１８に示す。時間的経過に対してプロットして得た曲線の直線領域に基づいて、続く全ての反応において、Ｖ0は１分で測定した。ＶＰ２−ＧＳＴは、Ｍｉｃｈａｅｌｉｓ−Ｍｅｎｔｉｎ反応速度を示し、Ｖ0と［Ｓ］との間の関係は、１／［Ｖ0］＝（１．２９２）・１／［Ｓ］＋０．０６０であった。ＶＰ２−ＧＳＴ及びＧＳＴ対照タンパク質の活性のプロットを、図１９に示す。ＶＰ２−ＧＳＴについてのＬｉｎｅｗｅａｖｅｒ−Ｂｕｒｋ二重逆数プロットを、図２０に示す。Ｌｉｎｅｗｅａｖｅｒ−Ｂｕｒｋプロットから、１／Ｖmaxは、直線回帰により求めたところ、０．０６０（標準偏差＝０．０１３７、Ｐ＜０．０００１）であり、Ｋm／Ｖmaxは、１．２９２（標準偏差＝０．１０８５、Ｐ＜０．０００１）であった。これらの結果から、Ｖmaxは、１４２８０Ｕ／ｍｇ・分であり、Ｋmは、１６．９５μＭであると推定した。全てのアッセイは、ＶＰ２−ＧＳＴタンパク質の２種の異なる試料を用いて３回反復した。各基質濃度は、少なくとも４回反復した。
【０１５３】
反応ｐＨとオルトバナデート阻害のチロシンホスファターゼ活性に及ぼす影響
タンパク質チロシンホスファターゼ活性を、種々の反応ｐＨで測定した（表１９）。最適ＶＰ２−ＧＳＴ  ＰＴＰａｓｅ活性は、ｐＨ６〜ｐＨ７の範囲で得られた。
【０１５４】
ＶＰ２−ＧＳＴ  ＰＴＰａｓｅ活性に対するオルトバナジン酸ナトリウムの阻害効果を、表２０に示す。オルトバナデート濃度が０．００１ｍＭ、０．０１ｍＭ及び０．１ｍＭのときに、ＶＰ２−ＧＳＴによるＰＴＰａｓｅ活性が完全に阻害された。
【０１５５】
【表１９】
2004535194.tif 000020
【０１５６】
【表２０】
2004535194.tif 000021
【０１５７】
ＴＬＭＶ  ＯＲＦ２生成物のＰＴＰａｓｅ活性
ＰＴＰａｓｅ活性を、ＴＬＭＶ  ＯＲＦ２−ＧＳＴ融合タンパク質について、対照ＣＡＶ  ＶＰ２−ＧＳＴアッセイと比較して明らかにした。定常状態活性は、ＣＡＶ  ＶＰ２について示したものと同等であった（図２０）。
【０１５８】
ＩＩＩ．ＶＰ２
この検討の一つの目的は、ＣＡＶ  ＶＰ２が新規なウイルスＰＴＰａｓｅであるかどうかを調査することであった。この調査は、主にＣＡＶ  ＶＰ２と多数のＰＴＰａｓｅとの間に相同性があるとの知見と、ＶＰ２配列内のＰＴＰａｓｅサインモチーフの提案とからはじまった。ＰＴＰａｓｅは、ＰＴＰＡＳＥサインモチーフＣＸＸＸＸＸＲが最小であるということと、システイニル-ホスフェート酵素中間体を用いた脱リン酸化の触媒作用により特徴付けられる。タンパク質の周囲のドメインは、酵素活性の調節及び基質特異性に関与している。極めて低いレベルで発現するが感染性には必須である非構造タンパク質及びＣＡＶとＴＴウィルスとの間の高度に保存されたタンパク質としてのＶＰ２のプロファイルは、ＰＴＰａｓｅ等の必須調節タンパク質と一致している。
【０１５９】
これは、ＶＰ２についての機能を定義する最初の研究であり、ＶＰ２が新規なＰＴＰａｓｅであることが判明した。これらの酵素（ＰＴＰａｓｅ）は、リンタンパク基質におけるホスホチロシン残基からホスフェートを特異的に除去する能力によって、定義される。ＰＴＰａｓｅは、それらの特異的活性が種々の複合タンパク基質で異なることがわかった。これらのアッセイで使用される一般化ペプチド基質ＥＮＤＹ（Ｐｉ）ＩＮＡＳＬは、前述したとおりのものである。この基質は、広範囲のＰＴＰａｓｅに利用され、速度パラメータを比較できる。時間的経過と反応速度の検討結果から、ＣＡＶ  ＶＰ２がタンパク質チロシンホスファターゼ活性を有することが明らかである。ＰＴＰａｓｅ群について、多数の他の記述的な特徴が定義された。一つの群としてのこれらの酵素は、ＥＤＴＡによる活性の阻害に対する耐性があり、最適ｐＨは、ｐＨ５．５〜７の範囲内の中性ｐＨである。ＣＡＶ  ＶＰ２を用いて検討したところ、アッセイ緩衝液にＥＤＴＡを含有させることが、活性には必須であり、活性はｐＨ６〜７が最適であることがわかった。これらの結果は、全体としてこの群について記載されているものと一致している。
【０１６０】
ＰＴＰａｓｅは、触媒裂における活性システインで形成されたシステイニル-ホスフェート中間体を介してホスホチロシンからホスフェートを除去するのを触媒する。触媒作用の機構は、低濃度のオルトバナデートにより活性が阻害され、ＰＴＰａｓｅ群に独自のものである。この化合物オルトバナデートは、構造的にホスフェートと類似しており、そのためにシステイニル-ホスフェート中間体を競争的に阻害する。ＰＴＰａｓｅ群に属するものは、阻害に必要とされるオルトバナデート濃度が異なることがわかった。０．００１ｍＭという低いオルトバナデート濃度により、ＣＡＶ  ＶＰ２活性が最大に阻害された。
【０１６１】
記載のアッセイ条件下で、ＣＡＶ  ＶＰ２はＶmaxが１４２８０Ｕ／ｍｇ・分であり、Ｋmが１６．９５μＭであった。ＣＡＶ  ＶＰ２活性は、高分子量（Ｍｒ）ＰＴＰａｓｅに特徴的な活性と低分子量（Ｍｒ）ＰＴＰａｓｅに特徴的な活性との中間である。低ＭｒＰＴＰａｓｅは、特異的活性が高い傾向がある。この一例にはＰＴＰ１Ｂがあり、Ｖmaxが２００００Ｕ／ｍｇ・分である。高ＭｒＰＴＰは、一般的に特異的活性がもっと低いが、この活性は、基質特異性に依存する。例えば、ヒト脾臓からのＣＤ４５のＶmaxは、１０００Ｕ／ｍｇ・分である。
【０１６２】
一部のタンパク質チロシンホスファターゼ（ＰＴＰａｓｅ）の結晶構造と触媒機構を、詳細に検討した。高ＭｒＰＴＰａｓｅを検討した結果から、コンセンサスサインモチーフが、（Ｉ／Ｖ）ＨＣＸＡＧＸＧＲ（Ｓ／Ｔ）として定義された。システイン残基は、ホスフェートを結合するのに重要であり、アルギニンは、触媒裂においてホスホチロシンを配位させる。ＰＴＰａｓｅスーパーファミリーについての最小サインモチーフは、ＣＸＸＸＸＸＲとして定義された。この定義は、保存ＰＴＰａｓｅドメインに対する全体的な配列相同性を欠いているが、この最小サインモチーフを含む、低ＭｒＰＴＰのサブグループに基づくものである。また、低ＭｒＰＴＰは、広範なｐＨにわたる活性によっても特徴付けられる。ＣＡＶ  ＶＰ２における提案された触媒モチーフは、アミノ酸残基９４〜１０２によりコードされているＩＣＮＣＧＱＦＲＫである。提案されたＣＡＶ  ＶＰ２サインモチーフは、高ＭｒＰＴＰａｓｅにおいてみられる高度に保存されたコンセンサスモチーフとは異なる。しかしながら、ＣＡＶ  ＶＰ２は、低ＭｒＰＴＰについてはみられない拡大された領域にわたって、高ＭｒＰＴＰａｓｅに対して配列相同性がある。さらに、最適ｐＨ等の反応速度特性は、高ＭｒＰＴＰのサブグループに特徴的なものである。
【０１６３】
データベースによる相同性のサーチにより、提案されたサインモチーフを含む、約５３アミノ酸の拡大された領域にわたってＣＡＶ  ＶＰ２に対する同一性スコアが３０〜３２％である、多数の真核生物の受容体ＰＴＰａｓｅ（Ｒ−ＰＴＰase）が同定された。このＲ−ＰＴＰase群は、互いに顕著な相同性を有する。逆説的に言えば、ＣＡＶ  ＶＰ２と真核生物のＰＴＰａｓｅとの間の配列相同性は、真核生物のタンパク質の定義された触媒モチーフから上流の領域に対してのものである。真核生物のＰＴＰａｓｅのタンパク質ドメインは、構成においてモジュラーとなっていることが判明した。数多くのＰＴＰａｓｅにおいて、２つのタンデム保存触媒ドメインが同定され、そのうちの一つのみが機能性である。同一の機能の真核生物のモチーフのわきに位置している活性ＶＰ２の触媒の折りたたみとタンパク質の折りたたみとの間に顕著な相同性があることから、真核生物のタンパク質において、機能的重複性を示すことがある。ＰＴＰａｓｅ内の重複は、すでに理解されているようにドメイン全体として存在するだけでなく、タンパク質の折りたたみ内の二次構造のレベルでも存在することがある。
【０１６４】
ＣＡＶ  ＶＰ２と、ＴＴウィルスのＳＡＮＢＡＮサブグループとの間の同じ領域にわたって顕著な相同性があることも、注目に値する。ＴＴウィルスは、最近ヒト宿主から、一本鎖の、マイナス鎖の、環状のＤＮＡウイルスの不均一なクラスターとして同定された。このウイルス群の配列解析から、ＣＡＶに対する総相同性が最も大きいことが、明らかとなった。ＣＡＶに対する最高の配列相同性は、非コード領域、及びＴＴＶウィルスのＯＲＦ２とＣＡＶ  ＶＰ２との間にみられる。全てのＴＴＶウィルス、ＳＡＮＢＡＮウィルス、ＹＯＮＢＡＮウィルス及びＴＬＭＶウィルス（ＴＴＶ様ミニウィルス）は、ＣＡＶと共通して、ＯＲＦ２に配列ＷＸ7ＨＸ3ＣＸＣＸ5Ｈを有している。この相同配列は、予測されたＰＴＰａｓｅサインモチーフの５’端に相当する。しかしながら、ＳＡＮＢＡＮ分離株とＣＡＶ  ＶＰ２との間の相同性は、もっと広範であり、提案されたサインモチーフの配列全体を含む。最近、ＴＴＶウィルス、ＳＡＮＢＡＮウィルス、ＹＯＮＢＡＮウィルス、ＴＬＭＶウィルス及びＣＡＶウィルスをパラサーコウィルス科として分類することが提案された。ＴＴウィルスにおけるＯＲＦの現在の名称は、これらのウイルスが培養で成長しなかったり、特徴付けられるウイルスタンパク質発現プロファイルが得られなかったりしたために、配列解析のみに基づくものである。
【０１６５】
上記で示した結果から、ＴＬＭＶ  ＯＲＦ２は明らかに第二の新規なウイルスＰＴＰａｓｅとして同定される。ＴＬＭＶ  ＯＲＦ２がＰＴＰａｓｅ活性を示すことは、ＣＡＶウィルスとＴＴウィルスとの間には、感染及び複製について共通のウイルスストラテジーが適用されることを示している。この知見は、ＴＴＶとＣＡＶとの間のゲノム構成及び配列相同性においてみられる密接な類似性と一致している。
【０１６６】
タンパク質チロシンホスファターゼは、有糸分裂誘発、遺伝子転写、シグナル伝達、細胞間相互作用、細胞分化の調節において、及びリンパ球のサイトカイン応答において機能することが知られている。日齢２１日以下のニワトリのＴリンパ球及び血球芽細胞集団をＣＡＶ感染させると、重度の免疫抑制及び貧血を生じる。感染中のＶＰ  ＰＴＰａｓｅ活性は、感染したリンパ球集団においてウイルス誘発された調節変化を介して病原性メカニズムを示すことがある。調節タンパク質をコードするウイルスについての全ての以前の報告には、大きなゲノムサイズと広範なコード化能を有するウイルスが含まれている。これらのウイルスは、重要なウイルス構造タンパク質及び複製タンパク質の他に、細胞調節タンパク質を維持できることが、示唆された。これには、前述のワクシニアウイルスからのＶＨ１ＰＴＰaseが含まれる。したがって、この知見は、ＣＡＶが極めて小さなゲノムサイズ（２．３ｋｂ）を有し、且つオーバーラップリーディングフレームから発現したのは３種のウイルスタンパク質のみであった点で、普通ではない。したがって、ＣＡＶは、複製サイクルの完了について、宿主の機能に大きく依存しており、リンパ球細胞サイクルを調節する能力は、重要なウイルス機能であるかもしれない。本発明者らの知る限り、ＣＡＶ  ＶＰ２ＰＴＰaseは、第二に記載されるべきウイルスＰＴＰａｓｅでしかなく、且つこの種のウイルスについて記載される唯一のＰＴＰａｓｅである。
【０１６７】
ＩＶ．胚への一本鎖及び二本鎖ＣＡＶゲノムのＤＮＡ接種
序文
二本鎖ＤＮＡのＭＤＣＣ−ＭＳＢ１細胞へのトランスフェクションによるＣＡＶゲノムからの感染性ウイルスの生成に使用される標準的な方法が、Ｎｏｔｅｂｏｒｎ，Ｍ．Ｈ．，ｄｅＢｏｅｒ，Ｇ．Ｆ．，ｖａｎＲｏｏｚｅｌａａｒ，Ｄ．Ｊ．，Ｋａｒｒｅｍａｎ，Ｃ．，Ｋｒａｎｅｎｂｕｒｇ，Ｏ．，Ｖｏｓ，Ｊ．Ｇ．，Ｊｅｕｒｉｓｓｅｎ，Ｓ．Ｈ．，Ｈｏｅｂｅｎ，Ｒ．Ｃ．，Ｚａｎｔｅｍａ，Ａ．及びＫｏｃｈ，Ｇ．（１９９１）、「Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｌｏｎｅｄ  ｃｈｉｃｋｅｎ  ａｎｅｍｉａ  ｖｉｒｕｓ  ＤＮＡ  ｔｈａｔ  ｃｏｎｔａｉｎｓ  ａｌｌ  ｅｌｅｍｅｎｔｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｃｙｃｌｅ（感染複製サイクルのための全ての要素を含むクローンニワトリ貧血ウイルスＤＮＡの特徴付け）」、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ６５、第３１３１〜３１３９頁に記載されている。ゲノムからＣＡＶビリオンを生成するための別の方法については、研究されておらず、いずれかのウイルスの裸ゲノムの幼鳥卵黄嚢への接種については、発表された報告がない。裸ＤＮＡゲノムから卵内で感染性ウイルスを生成する能力があれば、ＭＤＣＣ−ＭＳＢ１細胞における中間トランスフェクション工程なしでワクチンを製造することができるであろう。この方法は、形質転換されたＭＤＣＣ−ＭＳＢ１細胞株が潜在マレック病ウイルスゲノムを含み、且つ細胞継代は、ワクチンウィルスの不注意による汚染が引き継がれる恐れがあるので、バイオセキュリティーを高めることができる可能性がある。
【０１６８】
ニワトリ貧血ウィルスは、サーコウィルス科に属する他のものと共通に、非包膜キャプシド内に包まれた環状、一本鎖、マイナス鎖ＤＮＡゲノムを有する。ウイルスの複製が二本鎖複製中間体を介して進行する、このウイルスの正常感染性サイクルを調べた。２．３ｋｂｐ、１．３ｋｂｐ及び０．８ｋｂｐの二本鎖複製形態及び開環及び閉環形態が、ＣＡＶで感染させたＭＤＣＣ−ＭＳＢ１細胞で同定された。二本鎖複製中間体、転写物及びキャプシドに包まれた一本鎖ゲノムが合成される順序は、わからない。感染性ウイルスは二本鎖形態のゲノム単独でトランスフェクションされたＭＤＣＣ−ＭＳＢ１細胞から容易に回収できることが示された。したがって、２３１９ｂｐクローンＣＡＶ  ＤＮＡ配列は、宿主細胞内に感染性ウイルスを生成するのに必要な全ての遺伝情報を含んでいる。一本鎖ＤＮＡゲノムのトランスフェクションから複製コンピテントウイルスを回収することについては、調査しなかった。ウイルスの複製を一本鎖ＤＮＡゲノムのトランスフェクションから進行させるためには、二本鎖複製形態を細胞質一本鎖ゲノムから合成することが必要であろう。
【０１６９】
この検討の目的は、ウイルスの複製が、異なるＣＡＶゲノム構築物によるＭＤＣＣ−ＭＳＢ１細胞のトランスフェクションから進行することができるかどうかを調査することであった。ウイルス複製が一本鎖又は二本鎖形態のゲノム、線状又は環状形態、及びプラス鎖又はマイナス鎖から進行する能力を、調査した。さらなる目的は、ウイルスの複製が、これらのＤＮＡ構築物を卵黄嚢に接種した後生体内で進行できるかどうかを調査すること、及び卵黄嚢に接種した後に感染性ウイルスを生成する際の種々のゲノム構築物の相対的効率を調査することであった。
【０１７０】
Ｍ１３．ｔ１３０バクテリオファージへのＣＡＶゲノムの二方向クローニング
プラス鎖及びマイナス鎖の一本鎖ＣＡＶゲノムを得るために、ゲノムを、ｐＧＥＸ−４ＺプラスミドベクターからＭ１３．ｔ１３０バクテリオファージにサブクローニングした。ｐＧＥＸ−４Ｚベクターにおける  ｐＣＡＵ２６９／７ゲノムクローンの構築については、Ｂｒｏｗｎ，Ｈ．Ｋ．，Ｂｒｏｗｎｉｎｇ，Ｇ．Ｆ．，Ｓｃｏｔｔ，Ｐ．Ｃ．及びＣｒａｂｂ，Ｂ．Ｓ．（２０００）、「Ｆｕｌｌ−ｌｅｎｇｔｈ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  ｃｌｏｎｅ  ｏｆ  ａ  ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ  Ａｕｓｔｒａｌｉａｎ  ｉｓｏｌａｔｅ  ｏｆ  ｃｈｉｃｋｅｎ  ａｎａｅｍｉａ  ｖｉｒｕｓ（ニワトリ貧血ウイルスの病原性オーストラリア分離株の全長感染性クローン）」、Ａｕｓｔ  Ｖｅｔ  Ｊ  ７８、第６３７〜６４０頁に記載されている。ＣＡＵ２６９／７ゲノムを、ｐＧＥＸ−４ＺプラスミドベクターからＭ１３．ｔ１３０バクテリオファージに二方向にサブクローニングした。Ｍ１３．ｔ１３０バクテリオファージベクター内のゲノムインサートの向きを、ＰｓｔＩ消化パターンを解析して求めた。インサートされたＣＡＶゲノムを含むＭ１３．ｔ１３０クローンをＰｓｔＩで消化したところ約８．９ｋｂｐと０．６ｋｂｐのバンドが確認され、プラス鎖の向きは５’→３’であった（「ＣＡＶ．Ｍ１３．ｐｏｓ」と命名した）。インサートされたＣＡＶゲノムを含むＭ１３．ｔ１３０クローンをＰｓｔＩで消化したところ約７．８ｋｂｐと１．８ｋｂｐのバンドが確認され、マイナス鎖の向きは５’→３’であった（「ＣＡＶ．Ｍ１３．ｎｅｇ」と命名した）。これらのクローンにおけるＣＡＶゲノム配列の向きを、さらにクローニング部位のわきに位置している配列にハイブリダイゼーションしたプライマーを用いて両方向の配列決定をすることにより、確認した。
【０１７１】
ＣＡＶゲノム構築物のＭＤＣＣ−ＭＳＢ１細胞へのトランスフェクション
種々のＣＡＶゲノム構築物をＭＤＣＣ−ＭＳＢ１にトランスフェクションした後のウイルス成長の効率を評価した。一本鎖形態のＣＡＶゲノム及び二本鎖形態のＣＡＶゲノムを、調製した。二本鎖ＣＡＶ  ＤＮＡは、ｐＣＡＵ２６９／７プラスミドの培養から調製した。ＥｃｏＲＩ消化によりｐＣＡＵ２６９／７クローンから放出されたＣＡＶゲノムからの正しいサイズのバンドを、１％ゲル電気泳動で精製し、ライゲーションにより環状化した。正しいサイズのバンドは、バクテリオファージクローンＣＡＶ．Ｍ１３．ｐｏｓ及びＣＡＶ．Ｍ１３．ｎｅｇの培養から調製した一本鎖ＣＡＶ ＤＮＡについて、１％ゲル電気泳動により精製した。試料に一本鎖ＤＮＡだけが存在することを、一本鎖ＤＮＡを特異的に消化するＭｕｎｇ  Ｂｅａｎヌクレアーゼにより全てのＤＮＡを消化することにより確認した。クローニング部位のわきに位置している配列にハイブリダイゼーションしたプライマーを一本鎖ＣＡＶ．Ｍ１３．ｐｏｓ試料及び一本鎖ＣＡＶ．Ｍ１３．ｎｅｇ調製物の両方にアニーリングした後、ＥｃｏＲＩで消化した。ＤＮＡを、ライゲーションにより環状化した後、分光法により定量化した。
【０１７２】
これらのＤＮＡ構築物によるトランスフェクション後のウイルスの再生を、一連の細胞培養継代について免疫蛍光法により評価し、無細胞ウィルスを、細胞ライゼートから調製した。ウイルスを、以下のゲノムＤＮＡ構築物によるトランスフェクション後に回収した：
（ｉ）ＣＡＶＭ１３．ｐｏｓクローンから調製した環状化プラス鎖の一本鎖ＣＡＶ  ＤＮＡ；
（ｉｉ）ＣＡＶＭ１３．ｐｏｓクローンから調製した線状プラス鎖の一本鎖ＣＡＶ  ＤＮＡ；
（ｉｉｉ）ＣＡＶＭ１３．ｎｅｇクローンから調製した環状化マイナス鎖の一本鎖ＣＡＶ  ＤＮＡ；
（ｉｖ）ＣＡＶＭ１３．ｎｅｇクローンから調製した線状マイナス鎖の一本鎖ＣＡＶ  ＤＮＡ；
（ｖ）ｐＣＡＵ２６９／７のＥｃｏＲＩ消化により得た二本鎖環状化ＣＡＶ  ＤＮＡ。
【０１７３】
対照プラスミドＤＮＡによるトランスフェクション後、ウイルスは回収されなかった。二本鎖ＤＮＡについてのトランスフェクション効率は、ｐＥＧＦＰプラスミドによるトランスフェクションの４８時間後に、蛍光細胞の割合により評価したところ、１０％であった。
【０１７４】
全ての一本鎖構築物によるトランスフェクションにより、二本鎖ＤＮＡ構築物によるトランスフェクションよりも、感染細胞の割合が著しく高かった。一本鎖ゲノムの全ての形態によるトランスフェクション後の第二培養継代により、ＭＤＣＣ−ＭＳＢ１細胞の少なくとも５０％が感染した。しかしながら、感染率５０％は、二本鎖ＣＡＶゲノムによるトランスフェクション後、第四継代までみられなかった。プラス鎖又はマイナス鎖の一本鎖ゲノム間でも、線状ゲノムと環状化ゲノムとの間でも、トランスフェクション後に感染した細胞の割合において差がなかった。
【０１７５】
胚へのＤＮＡ接種
種々のＣＡＶゲノム構築物の卵内接種後のウイルス成長の効率を、評価した。種々のＣＡＶゲノム構築物を、５つの日齢７日の胚の群（Ｅ７）の卵黄嚢に接種した。Ｅ１８幼鳥胚全体の清澄化ホモジェネートにおけるウイルスの力価を、ＭＤＣＣ−ＭＳＢ１細胞培養の接種により測定した（表２１）。以下のゲノムＤＮＡ構築物を接種したＥ１８胚をホモジナイズしたものから、ウィルスを回収した（表２１）：
（ｉ）ＣＡＶＭ１３．ｐｏｓクローンから調製した環状化プラス鎖の一本鎖ＣＡＶ  ＤＮＡ；
（ｉｉ）ＣＡＶＭ１３．ｐｏｓクローンから調製した線状プラス鎖の一本鎖ＣＡＶ  ＤＮＡ；
（ｉｉｉ）ＣＡＶＭ１３．ｎｅｇクローンから調製した環状化マイナス鎖の一本鎖ＣＡＶ  ＤＮＡ；
（ｉｖ）ＣＡＶＭ１３．ｎｅｇクローンから調製した線状マイナス鎖の一本鎖ＣＡＶ  ＤＮＡ；
（ｖ）ｐＣＡＵ２６９／７のＥｃｏＲＩ消化により得た二本鎖環状化ＣＡＶ  ＤＮＡ。
【０１７６】
ホモジナイズした対照プラスミドＤＮＡを接種したＥ１８胚からは、ウイルスは回収されなかった（表２１）。プラス鎖の環状化一本鎖ゲノムの接種からのウイルス成長の効率は極めて低く、ウイルスは５つの胚のうちの一つからしか回収されなかった（表２１）。ウイルス成長の最大の効率は、ビリオンに存在するゲノムの形態である環状化マイナス鎖の一本鎖ゲノムの接種からみられた。環状化マイナス鎖の一本鎖ゲノムについての平均力価は、二本鎖ゲノム接種についての平均力価よりも、０．００１レベルで有意に大きかった。
【０１７７】
この検討から得られた知見は、さらにプラスミドベクター内にまだ含まれるクローン突然変異ウイルスゲノムとともにインキュベーションしてから６日後の卵の卵黄嚢の接種により確認された。これら３つの突然変異ゲノムは、ｍｕｔＣ８６Ｒ、ｍｕｔＨ１０３Ｙ及びｍｕｔＱ１３１Ｐであった。インキュベーションの１６日目で、絨毛尿膜及び骨髄の塗抹標本を、胚から調製し、ＣＡＶ  ＶＰ３に対する免疫蛍光抗体により染色した。全ての接種卵において、ウイルス複製が、ＶＰ３に特異的な染色により確認できた。
【０１７８】
Ｖ．一本鎖ＣＡＶゲノム及び二本鎖ＣＡＶゲノムの胚へのＤＮＡ接種
この検討では、Ｅ６又はＥ７胚に裸ＤＮＡゲノムを接種した後、卵内でＣＡＶを成長させるための新しい方法が、開発された。これは、生体内のウイルス成長が、ＤＮＡの接種から進行することができることを、ＣＡＶについて明らかにする最初の検討であるとともに、鳥類ウイルス病原体について、卵黄嚢への裸ウイルスゲノムの接種に関する最初の記載である。
【０１７９】
この検討では、ＣＡＶの培養のための卵黄嚢へのＤＮＡ接種の有効性を明らかにした。ＣＡＶ  ＤＮＡの、胚の卵黄嚢へのデリバリー又は他の卵内ルートが、ワクチン化のルートとして使用できる。
【０１８０】
この方法は、無細胞系において、操作されたゲノムから感染性ウイルスを生成する能力があるため、バイオセキュリティーの面で顕著な進歩を示す。ＭＤＣＣ−ＭＳＢ１細胞への操作されたゲノムのトランスフェクションによるウイルスの培養により、潜在的なワクチン接種物が、細胞培養系の成分に露出され、バイオセキュリティーの危険を生むかも知れない。したがって、胚卵黄嚢に接種したＤＮＡゲノムからウイルスを生成する能力により、バイオセキュリティーを高めることにおいて重要である。ＭＤＣＣ−ＭＳＢ１細胞培養におけるＣＡＶの培養について典型的に得られた力価１０5〜１０6ＴＣＩＤ50は、限定的に低い。力価の増幅は、卵黄嚢接種をさらに繰り返すことによりおこなうことができるであろう。
【０１８１】
卵黄嚢接種の有効性は、一本鎖のマイナス鎖環状化ゲノムで最大であった（表２１）。高力価の感染性ウイルスが、一本鎖のマイナス鎖環状化ゲノムの接種により得られ、中程度の力価物が、二本鎖環状化ゲノムの卵黄嚢接種により得られた（表２１）。胚に一本鎖のマイナス鎖環状化ゲノムを接種することにより得られた力価は、二本鎖ゲノムについてよりも、３log高かった（表２１）。環状化ゲノム接種と線状のマイナス鎖ゲノム接種との間には、得られる力価に大きな差があった。マイナス鎖の線状ゲノム、プラス鎖の環状化ゲノム又はプラス鎖の線状ゲノムの接種から得られたウイルス力価は、低かった。異なる形態の一本鎖ＤＮＡ構築物の間に、ＭＤＣＣ−ＭＳＢ１細胞におけるトランスフェクションの有効性において差がないことから考えると、卵黄嚢接種後の有効性の差は、いったん細胞質内に入った後ではウイルスゲノムのプロセシングから上流の影響によるものと思われる。卵黄嚢に細胞外接種したＤＮＡ構築物は、分解せずに卵黄に生存し、宿主標的細胞に入ってウイルス複製を開始しなければならない。したがって、プラス鎖構築物とマイナス鎖構築物との間で観察される差は、卵黄嚢の接種後の構築物の安定性と、標的細胞への取り込み能によるものである可能性が最も高い。マイナス鎖の環状化鎖の折りたたみ形成と確認により、この差を確定することができる。
【０１８２】
感染性ウイルスを、ＭＤＣＣ−ＭＳＢ１細胞にトランスフェクションした後の一本鎖ゲノムから生成できる。プラス鎖とマイナス鎖との間、及び環状化構築物と線状構築物との間には差が見られなかった。これは、いったん細胞質に入ったプラス鎖又はマイナス鎖から、環状の二本鎖複製中間体を合成できることによる可能性が最も高い。一本鎖のマイナス鎖ゲノムのトランスフェクションにより、二本鎖ゲノムのトランスフェクションよりも、はやい継代でより高い感染率が得られた。
【０１８３】
ＭＤＣＣ−ＭＳＢ１細胞に二本鎖ＣＡＶゲノムをトランスフェクションする方法が、Ｎｏｔｅｂｏｒｎ，Ｍ．Ｈ．，ｄｅＢｏｅｒ，Ｇ．Ｆ．，ｖａｎＲｏｏｚｅｌａａｒ，Ｄ．Ｊ．，Ｊｅｕｒｉｓｓｅｎ，Ｓ．Ｈ．，Ｈｏｅｂｅｎ，Ｒ．Ｃ．，Ｚａｎｔｅｍａ，Ａ．及びＫｏｃｈ，Ｇ．（１９９１）、「Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｌｏｎｅｄ  ｃｈｉｃｋｅｎ  ａｎｅｍｉａ  ｖｉｒｕｓ  ＤＮＡ  ｔｈａｔ  ｃｏｎｔａｉｎｓ  ａｌｌ  ｅｌｅｍｅｎｔｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｃｙｃｌｅ（感染性複製のための全ての要素を含むクローンニワトリ貧血ウイルスＤＮＡの特徴付け）」、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ６５、第３１３１〜３１３９頁に記載されており、この手法は、数多くの発表された研究において繰り返し実施されている。この手法を用いて、ＤＮＡゲノムを、生体外で容易に操作でき、細胞培養におけるビリオンの生成前に、正確に変更を確認できる。一本鎖構築物のトランスフェクションにより、このプロセスの有効性を増加することができる。トランスフェクション効率を高めることができる方法は、潜伏期の延長又は低バーストサイズ等の変更された成長特性を有する突然変異株の培養には特に有益であろう。Ｍ１３バクテリオファージクローニング系におけるプライマー突然変異誘発には、一本鎖突然変異ゲノムの生成のための単一の突然変異誘発工程のみがおこなわれるので、より迅速且つより簡単な方法である。したがって、Ｍ１３バクテリオファージベクターは、ＣＡＶゲノムの操作のための、プラスミド増殖の好適な代替系である。
【０１８４】
さらに検討をおこなったところ、プラスミドベクターにクローニングしたゲノムも、有胚卵の卵黄嚢に接種できたことから、感染性ウイルスの生成方法として使用できることが、わかった。したがって、このプロセスを、突然変異ゲノムの回収及びワクチンの製造にも使用できる。また、ＣＡＶ突然変異体のクローンゲノムの卵への直接接種を、とりわけ突然変異ウイルスが幼鳥胚用に弱毒化されることができることを考えると、ワクチン接種方法として使用できることも、わかった。
【０１８５】
【表２１】
2004535194.tif 000022
【０１８６】
ＶＩ．生まれて一日の幼鳥における、選択された突然変異ＣＡＶウイルスの、弱毒化及び感染防御免疫の誘発についての評価
目的
生まれて一日の幼鳥における選択されたＣＡＶ突然変異体の安全性の評価及び生まれて一日の幼鳥にＣＡＶ突然変異体を接種することにより誘発される感染防御免疫の評価をおこなうこと。
【０１８７】
方法
６つの実験群でおこなった。
【０１８８】
【表２２】
2004535194.tif 000023
【０１８９】
各実験群は、鳥１０羽から構成し、各群を、別個の正圧ガラス繊維アイソレーターに入れた。各アイソレーターにおいて、全ての入口と出口の空気を高効率粒子エアフィルターによりろ過し、全ての食物及び水を、アイソレーターに入れる前に殺菌した。全ての幼鳥は、翼帯により個々に確認した。
【０１９０】
幼鳥の半分を、１４日目に安楽死させ、とりだして突然変異体の安全性の評価に使用した。残りの幼鳥は、さらに２１日間アイソレーターに入れたままにしておいた。
【０１９１】
鳥に、５０％組織培養感染量（１０4）のウイルスを含むＣＡＶ０．５ｍＬ、又は未感染ＭＳＢ１細胞のライゼート０．５ｍＬを、皮下接種した。
【０１９２】
１４日目に、各群の鳥５羽をハロタンに暴露することにより、安楽死させた。解剖時に、体重をはかり、全てのリンパ器官、骨髄、肝臓、脾臓及び皮膚（出血の確認のため）を、肉眼的な病変について調べた。胸腺鎖（ｔｈｙｍｉｃ  ｃｈａｉｎ）を、ばらばらにして、重さをはかった。
【０１９３】
２１日目で、各群の残りの鳥に、５０％組織培養感染量（１０4）のウイルスを含むＣＡＶ０．５ｍＬ、又は未感染ＭＳＢ１細胞のライゼート０．５ｍＬを、皮下接種した。
【０１９４】
３５日目に、残りの鳥を、ハロタンに暴露することにより、安楽死させた。解剖時に、体重をはかり、全てのリンパ器官、骨髄、肝臓、脾臓及び皮膚（出血の確認のため）を調査／写真撮影して、肉眼的な病変を調べた。胸腺鎖を、ばらばらにして、重さをはかった。
【０１９５】
結果と考察
１４日目においてウイルス感染させた鳥が、未感染鳥よりも体重が小さいことを示す確証はなく、３５日目での各群のいずれの間でも、体重差がなかった。
【０１９６】
１４日目で、突然変異ウイルス１０１及び１６１／１６２を感染させた鳥と、未感染鳥との間で、胸腺の重さ又は胸腺／体重比において差を示す確証はなかった。しかしながら、野生型病原性ウイルスを感染させた鳥の胸腺の重さ及び胸腺／体重比は、未感染鳥よりも有意に低かった。突然変異体１６９を感染させた鳥の胸腺の重さ及び胸腺／体重比は、未感染鳥又は野生型病原性ウイルスを感染させた鳥とは有意の差はなかった。
【０１９７】
【表２３】
2004535194.tif 000024
【０１９８】
これらの結果から、幼鳥胚について弱毒化された突然変異ウイルスは、生まれて1日の幼鳥についても弱毒化され、突然変異体１６９の弱毒化は、突然変異体１０１及び突然変異体１６１／１６２の弱毒化と比較して、多少中間レベルであることが明らかである。
【０１９９】
防御実験
突然変異ウイルス１６９でワクチン接種した後２１日で野生型病原性ＣＡＶをチャレンジ投与した鳥と、感染させなかった鳥と、日齢１日で野生型病原性ＣＡＶを接種した後、２１日で野生型病原性ＣＡＶをチャレンジ投与した鳥の間では、３５日目において胸腺の重さ又は胸腺／体重比の差を示す確証はなかった。しかしながら、日齢１日でＣＡＶに暴露させなかったが、次に日齢２１日で野生型病原性ウイルスに感染させた鳥の胸腺の重さ及び胸腺／体重比は、これらの群よりも有意に低かった。突然変異体１０１又は突然変異体１６１／１６２でワクチン接種した後、野生型病原性ウイルスをチャレンジ接種した鳥は、防御レベルは中間であった。
【０２００】
【表２４】
2004535194.tif 000025
【０２０１】
これらの結果から、突然変異ウイルスでワクチン接種することにより、ＣＡＶ感染の作用からニワトリを防御することができることが明らかである。
【０２０２】
このように、突然変異ＣＡＶウイルスは、弱毒化されただけでなく、日齢１日のニワトリにおいて感染防御免疫を誘発することもできた。
【０２０３】
考察
Ｉ．ＣＡＶワクチン
本発明者らは、初年鶏、ブロイラー及び種鳥群に接種するのに好適な弱毒化生ＣＡＶ及びＤＮＡワクチンを開発した。このプロセスは、以下の工程を含む多数の工程を伴う：
−ウイルスの分析及び成長のための生体外細胞培養系を確立する工程；
−突然変異誘発及びウイルスの機能の調査に適当な部位についてウイルスを分析する工程；
−全ゲノムクローンについてＰＣＲを利用して特定部位の突然変異誘発をする工程；
−突然変異ウイルスを細胞培養系にトランスフェクションし、感染率、細胞病原性効果及びウイルス機能の特異的変化について評価する工程；
−SＰＦ幼鳥胚を用いたチャレンジモデルにおいて、潜在的なワクチン候補として突然変異ウイルスを試験する工程；及び
−チャレンジモデルにおいて、突然変異ウイルスの表現型及び生体内感染率を評価する工程。
【０２０４】
幼鳥胚における病原性試験の結果から、構造のキー領域及び確認された機能におけるＶＰ２の突然変異を使用して、弱毒化ウイルスとして又はＤＮＡワクチンとしてのワクチン接種に好適である、弱毒化ウイルスを生成できることが、明白となった。ｍｕｔ１６３を除く全ての突然変異体は、総損傷スコアにより測定したところ、有意に弱毒化されたことがわかった。しかしながら、ｍｕｔ１６３は、胸腺及び脾臓損傷スコアで測定したところ、有意に弱毒化されたことがわかった。
【０２０５】
弱毒化に対する影響は、ＶＰ２のＰＴＰａｓｅ機能に直接関与していると思われる残基の突然変異が最も大きかったが、ＶＰ２のカルボキシル末端の酸性領域及び塩基性領域を突然変異させることによっても、多少の弱毒化がなされたことは、注目に値する。
【０２０６】
さらに、ＶＰ２遺伝子の翻訳開始点でのＫｏｚａｃの配列を、より多くのＶＰ２が産生されるように突然変異すると、もはや生産的複製のできない構築物が得られた。このような構築物は、弱毒化生ワクチンの開発の観点からは有用ではないが、ＤＮＡワクチンとして使用できる。
【０２０７】
これらの検討から、ＶＰ２は、強力な免疫調節効果を有することも明らかとなった。したがって、突然変異体ＶＰ２は、免疫系に対して大きな変化を生じさせることなく使用できる。
【０２０８】
ＩＩ．ＣＡＶ  ＶＰ２の翻訳開始シグナルの突然変異
これらの検討から、ＣＡＶにおけるＶＰ２及び他のサーコウイルスにおけるその相同体についての遺伝子の突然変異を、生ワクチン又はＤＮＡワクチンとして使用するための弱毒化株の生成、及びＤＮＡワクチンとして使用できる非複製ゲノムクローンの生成に一般的に適用できることが、明らかとなった。
【０２０９】
さらに、本発明者らは、ＣＡＶ感染中の免疫調節においてＶＰ２が果たす役割を、明確に示した。ＶＰ２及びその相同体を使用して、免疫系の機能に影響を及ぼすことができることが、わかった。
【０２１０】
ＶＰ２／ＶＰ３の一時的発現が免疫応答を引き出すのに十分であるとおもわれるので、複製不全突然変異体であるｐＣＡＵ２８３−３及びｐＣＡＵ２８３＋４を、ニワトリにおいてＤＮＡワクチンとして使用できる可能性も考えられる。
【０２１１】
まとめ
本発明者らは、定方向突然変異誘発は、第一にＣＡＶのゲノムはサイズが小さいので操作をほどこすことができ、第二にウイルス粒子がゲノム単独のトランスフェクションにより容易に生成できることから、弱毒化ウイルス株の製造に使用できることを見出した。定方向突然変異は、細胞及びウイルスのない系におけるゲノムに導入でき、ウイルスの産生の前に正確に特徴付けできる。したがって、この方法は、非常に効率的であり、且つ最適なバイオセキュリティーを用いる。弱毒化生ワクチンの利用に対する制約は、生体外でウイルスが成長する力価が低いことと、特異的病原体のない（SＰＦ）有胚卵でウイルスの産生をおこなう必要があるため、少し不便であることである。ＤＮＡワクチンの開発により、培養生産のバイオセキュリティーの危険や低ウイルス力価の制限がなくなり、且つ卵内接種に有効であると思われる。弱毒化生ワクチンの別の手法は、不活化ワクチン、又は継代により弱毒化した生ワクチンである。幼鳥に共発現ＶＰ１及びＶＰ２をを接種することにより、チャレンジに対して防御できる血清中和抗体応答が起こる。しかしながら、弱毒化生ワクチンは、典型的には体液性免疫と細胞性免疫の両方を誘発するため、免疫原性についてより大きな能力を有している。継代により弱毒化された菌株は、低レベルの病原性を維持するので、ワクチン候補として次善である。さらに、継代した弱毒化菌株は、幼鳥における継代で迅速に病原性の形態に戻る。したがって、ＤＮＡワクチンとしての使用又は弱毒化生菌株の誘導化のために、組み換えゲノムについての部位特異的突然変異誘発を使用することには、顕著な利点がある。ワクチンプログラムデザインには、有胚卵へのＤＮＡワクチンの投与及びより高齢の鳥への弱毒化生ワクチンの投与を含めることができる。
【０２１２】
ＣＡＶゲノムの構成上の特徴は、感染率と免疫原性を保持するとともに、突然変異誘発による弱毒化の可能性を制限もするし、高めたりもする。ＣＡＶは、そのコーディング能力の面で極めて経済的である。ゲノムは、２．３ｋｂしかなく、３つの重複ＯＲＦをコードし、突然変異誘発可能な選択を制限する。一つのＯＲＦにおける突然変異は、重複するＯＲＦを破壊しないように設計しなければならない。全ての３つのウイルスタンパク質の機能は、ウイルス感染率に極めて重要であり、したがって、導入された突然変異は、タンパク質機能を確実に保持しなければならない。弱毒化の安定性は、多因子性の手法により高めることができる。病原性への復帰は、単点突然変異に依存して低い頻度で生じるものと思われる。ＣＡＶは、重複リーディングフレームを含むコード領域にわたって、全ての特徴付けされた分離株において極端な配列保存性がある。このことは、実地の状況において、ウイルスにより許容されるべき自然突然変異の容量は、ポリメラーゼ酵素系の誤差率と関連する自然発生突然変異の予想率よりも十分に下に保たれることを示唆している。このことは、重複フレームにおける有害であるかも知れない同時変化によって一つのフレーム中のコドン変化に課せられる制限による可能性が最も高い。このことは、継代弱毒化法は、弱毒化が極めて遅く、目標とする突然変異誘発により達成することのできる最適な弱毒化を生じることができないことも示唆している。自然発生突然変異は、重複しているリーディングフレームがコドンのゆらぎを示すコドンにおいて、測定可能な頻度でのみ許容される。したがって、部位特異的突然変異誘発は、低頻度で発生する突然変異の確率に依存しないことから、最適であり、重複しているＯＲＦのコドンのゆらぎが最小である部位は、設計を慎重におこなうことにより容易に突然変異させることができる。重複するフレームを維持する生体外の部位特異的突然変異誘発により導入された突然変異は、重複フレームにおけるコドン保存の必要性があるため、復帰の頻度が減少する。弱毒化には、部位特異的突然変異誘発を用いて慎重に構築された突然変異の合理的に設計された方法が必要である。
【０２１３】
当業者には、広く説明した本発明の精神又は範囲から逸脱することなく、特異的な実施態様に示す本発明に対して、非常に数多くの変更及び／又は修正が可能であることが、理解されるであろう。したがって、本実施態様は、あらゆる点で、説明のためのものであり、発明を限定するものではない。
【図面の簡単な説明】
【０２１４】
【図１】ＶＰ２の残基１２８〜１４３からの両親媒性αヘリックス領域と残基１５１〜１５８からの両親媒性βシート領域の２つの予測領域のＣｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎプロットを示す。
【図２】ＭＳＢ１細胞へのｍｕｔＣ８６Ｒのトランスフェクションを示す。
【図３】ＭＳＢ１細胞へのｍｕｔＣ９５Ｓのトランスフェクションを示す。
【図４】ＭＳＢ１細胞へのｍｕｔＣ９７Sのトランスフェクションを示す。
【図５】ＭＳＢ１細胞へのｍｕｔＲ１０１Ｇのトランスフェクションを示す。
【図６】ＭＳＢ１細胞へのｍｕｔＨ１０３Ｙのトランスフェクションを示す。
【図７】ＭＳＢ１細胞へのｍｕｔＲ１２９Ｇのトランスフェクションを示す。
【図８】ＭＳＢ１細胞へのｍｕｔＱ１３１Ｐのトランスフェクションを示す。
【図９】ＭＳＢ１細胞へのｍｕｔＲ／Ｋ／Ｋ１５０／１５１／１５２Ｇ／Ａ／Ａのトランスフェクションを示す。
【図１０】ＭＳＢ１細胞へのｍｕｔＤ／Ｅ１６１／１６２Ｇ／Ｇのトランスフェクションを示す。
【図１１】ＭＳＢ１細胞へのｍｕｔＬ１６３Ｐのトランスフェクションを示す。
【図１２】ＭＳＢ１細胞へのｍｕｔＤ１６９Ｇのトランスフェクションを示す。
【図１３】ＥＣＬＵＳＴＡＬＷソフトウェア（ＷｅｂＡＮＧＩＳ）を用いてＣＡＶ  ＶＰ２アミノ酸配列に整列させ、且つＳｅｑｖｕソフトウェア（Ｇａｒｖｉｎ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）を用いて図で示したＲ−ＰＴＰａｓｅ相同体を示したものであり、列１：ニワトリタンパク質チロシンホスファターゼアルファ（Ｚ３２７４９）、残基３０２〜３０６、相同性スコア３０％。列２：ヒトＲ−ＰＴＰａｓｅアルファ（ＰＰ１８４３３）、残基３０１〜３５３、相同性スコア３２％。列３：ラットＲ−ＰＴＰａｓｅアルファ（Ｑ０３３４８）、残基２９５〜３４７、相同性スコア３２％。列４：マウスＲ−ＰＴＰａｓｅアルファ（Ｐ１８０５２）、残基３２８〜３８０、相同性スコア３２％。列５：ヒトＲ−ＰＴＰａｓｅアルファ（１７０１１３００Ａ）。列６：ヒト胎盤タンパク質チロシンホスファターゼ（ＣＡＡ３８０６５）、残基２９２〜３４５、相同性スコア３２％。列７：ＣＡＶ  ＶＰ２である。
【図１４】ＥＣＬＵＳＴＡＬＷソフトウェア（ＷｅｂＡＮＧＩＳ）を用いてＣＡＶ  ＶＰ２アミノ酸配列とＳＡＮＢＡＮ  ＴＴＶ配列を整列させ、且つＳｅｑｖｕソフトウェア（Ｇａｒｖｉｎ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）を用いて図で示したものであり、ＴＴウィルスについてのＧｅｎｂａｎｋ受入番号を示してある。
【図１５】１２．５％ポリアクリルアミドゲルによるグルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）融合タンパク質の電気泳動及びクマシーブルー染色での視覚化を示したものであり、レーン１、広範囲分子量標準（Ｂｉｏｒａｄ）；レーン２、２．６μｇＣＡＶ  ＶＰ２−ＧＳＴ融合；レーン３、３．０μｇＧＳＴである。
【図１６】ＶＰ２のＣＯＯＨ末端領域に対するマウスポリクローナル抗血清を用いて調査したウエスタンブロットを示したものであり、レーン１、広範囲分子量標準（Ｂｉｏｒａｄ）；レーン２、３．０μｇＧＳＴ；レーン３、２．６μｇＣＡＶ  ＶＰ２−ＧＳＴ融合である。
【図１７】ＧＳＴに対するウサギポリクローナル抗血清を用いて調査したウエスタンブロットを示したものであり、レーン１、分子量標準；レーン２、３．０μｇＧＳＴ；レーン３、２．６μｇニワトリ貧血ウィルスＶＰ２−ＧＳＴ融合である。
【図１８】ＶＰ２−ＧＳＴ又はＧＳＴ対照試料により触媒されたＥＮＤＹ（Ｐｉ）ＩＮＡＳＬからのホスフェート放出の経時的変化を検討した結果を示したものであり、反応は、基質１５ナノモルを用いておこない、活性［Ｖ］の測定の単位は、各時点で放出されたホスフェートのナノモルである。
【図１９】ＰＴＰａｓｅアッセイにおけるＶＰ２−ＧＳＴタンパク質とＧＳＴ対照タンパク質のＰＴＰａｓｅ活性を示したものであり、反応は、基質１０ナノモルを用い、１分間おこない、初期活性［Ｖ0］の測定単位は、各基質濃度で放出されたホスフェートのナノモルであり、試験した各基質濃度についての平均の標準誤差は、０．１０１未満であった。
【図２０】ＴＬＭＶ  ＶＰ２  ＰＴＰａｓｅ活性を、ＣＡＶ  ＶＰ２活性と比較して示す。
【図１】
2004535194.tif 000026
【図２】
2004535194.tif 000027
【図３】
2004535194.tif 000028
【図４】
2004535194.tif 000029
【図５】
2004535194.tif 000030
【図６】
2004535194.tif 000031
【図７】
2004535194.tif 000032
【図８】
2004535194.tif 000033
【図９】
2004535194.tif 000034
【図１０】
2004535194.tif 000035
【図１１】
2004535194.tif 000036
【図１２】
2004535194.tif 000037
【図１３】
2004535194.tif 000038
【図１４】
2004535194.tif 000039
【図１５】
2004535194.tif 000040
【図１６】
2004535194.tif 000041
【図１７】
2004535194.tif 000042
【図１８】
2004535194.tif 000043
【図１９】
2004535194.tif 000044
【図２０】
2004535194.tif 000045
【国際公開パンフレット】
2004535194.tif 000046
2004535194.tif 000047
2004535194.tif 000048
2004535194.tif 000049
2004535194.tif 000050
2004535194.tif 000051
2004535194.tif 000052
2004535194.tif 000053
2004535194.tif 000054
2004535194.tif 000055
2004535194.tif 000056
2004535194.tif 000057
2004535194.tif 000058
2004535194.tif 000059
2004535194.tif 000060
2004535194.tif 000061
2004535194.tif 000062
2004535194.tif 000063
2004535194.tif 000064
2004535194.tif 000065
2004535194.tif 000066
2004535194.tif 000067
2004535194.tif 000068
2004535194.tif 000069
2004535194.tif 000070
2004535194.tif 000071
2004535194.tif 000072
2004535194.tif 000073
2004535194.tif 000074
2004535194.tif 000075
2004535194.tif 000076
2004535194.tif 000077
2004535194.tif 000078
2004535194.tif 000079
2004535194.tif 000080
2004535194.tif 000081
2004535194.tif 000082
2004535194.tif 000083
2004535194.tif 000084
2004535194.tif 000085
2004535194.tif 000086
2004535194.tif 000087
2004535194.tif 000088
2004535194.tif 000089
2004535194.tif 000090
2004535194.tif 000091
2004535194.tif 000092
2004535194.tif 000093
2004535194.tif 000094
2004535194.tif 000095
2004535194.tif 000096
2004535194.tif 000097
2004535194.tif 000098
2004535194.tif 000099
2004535194.tif 000100
2004535194.tif 000101
2004535194.tif 000102
2004535194.tif 000103
2004535194.tif 000104
2004535194.tif 000105
2004535194.tif 000106
2004535194.tif 000107
2004535194.tif 000108
2004535194.tif 000109
2004535194.tif 000110
2004535194.tif 000111
2004535194.tif 000112
2004535194.tif 000113
2004535194.tif 000114
2004535194.tif 000115
2004535194.tif 000116
2004535194.tif 000117
2004535194.tif 000118
2004535194.tif 000119
2004535194.tif 000120
2004535194.tif 000121
2004535194.tif 000122
2004535194.tif 000123
2004535194.tif 000124
2004535194.tif 000125
2004535194.tif 000126
2004535194.tif 000127
2004535194.tif 000128
2004535194.tif 000129
2004535194.tif 000130
2004535194.tif 000131
2004535194.tif 000132
2004535194.tif 000133
2004535194.tif 000134
2004535194.tif 000135
2004535194.tif 000136
2004535194.tif 000137
2004535194.tif 000138
2004535194.tif 000139
2004535194.tif 000140
2004535194.tif 000141
2004535194.tif 000142
2004535194.tif 000143
2004535194.tif 000144
2004535194.tif 000145
2004535194.tif 000146
2004535194.tif 000147
2004535194.tif 000148
2004535194.tif 000149
2004535194.tif 000150
2004535194.tif 000151
2004535194.tif 000152
2004535194.tif 000153
2004535194.tif 000154
2004535194.tif 000155
2004535194.tif 000156
2004535194.tif 000157
2004535194.tif 000158
2004535194.tif 000159
2004535194.tif 000160
2004535194.tif 000161
2004535194.tif 000162
2004535194.tif 000163
2004535194.tif 000164
2004535194.tif 000165
2004535194.tif 000166
2004535194.tif 000167
2004535194.tif 000168
2004535194.tif 000169
2004535194.tif 000170
2004535194.tif 000171
2004535194.tif 000172
2004535194.tif 000173
2004535194.tif 000174
2004535194.tif 000175
2004535194.tif 000176
2004535194.tif 000177
2004535194.tif 000178
2004535194.tif 000179
2004535194.tif 000180
2004535194.tif 000181
【国際調査報告】
2004535194.tif 000182
2004535194.tif 000183
2004535194.tif 000184
2004535194.tif 000185