(57)【要約】本発明は、「カイバードラッグ」に、及びカイバードラッグの有効量を含有する薬剤組成物に、及び自家ワクチン活性を示す免疫調節薬としてのその医療的使用に向けられている。【特許請求の範囲】
【請求項１】
所望により薬剤学的に許容し得る塩と合わさった、単離された実質的に純粋な生物学的材料であって、次の特徴すなわち、
（ａ） 約０．３〜０．４０μｍの一定の流体力学的半径を有し、約０．０５〜約０．０８％の低い多分散性指数を有し、
（ｂ） 食塩溶液中でモノマー単位の凝集体を有し、約６８〜７５個のモノマーを該凝集体中に含み、
（ｃ） 該凝集体が、約１３０，０００〜約１５０，０００ダルトンの数分子量を有し、
（ｄ） 該モノマーが約１，９００〜約２，０００ダルトンの分子量を有し、
（ｅ） 二糖アミン部分を含み、該糖は、それらのうち１つがグルコースであるという条件で、グルコース又はガラクトースであり、
（ｆ） ピロリン酸基を含まず、
（ｇ） 該２つの糖の間に１，６　β−結合を含み、
（ｈ） 該モノマーは、リン酸基を含まないか、又は該糖の１位若しくは４’位にリン酸を含んでよく、しかしながら該凝集体は、リン酸を全く担持しない糖部分を少なくとも８０重量％含有し、一リン酸を有する糖部分を最大でも２０重量％までしか含有せず、
（ｉ） ３−ヒドロキシテトラデカン酸とアミド結合を形成していてよいアミノ官能性を２及び２’位に含み、
（ｊ） ヒドロキシテトラデカン酸でエステル化されていてよいヒドロキシ官能性を３及び３’位に含み、
（ｋ） モノマーあたり偶数個の３’−ヒドロキシテトラデカン酸を含み、そして
（ｌ） ２５℃においてＦｉｇ ８ＡのＸ線回折パターンを有する
ものである材料。
【請求項２】
無毒の生物学的材料であって、
（ａ） 患者の感染部位におけるエンテロバクテリアシーから得られたエンドトキシン抽出物を集め、
（ｂ） コリシンを産生するがトリプトファンをインドールへと変換せず且つＭＵＧアッセイにおいて反応しない腸内細菌をスクリーニングして集め、
（ｃ） それらの選択された細菌を収穫し、
（ｄ） エンドトキシンを作ることのできないステップ（ｃ） の菌株を選択し、そして
（ｅ） ステップ（ｄ） の菌株を殺すこと
によって調製されるものである材料。
【請求項３】
請求項２の無毒の生物学的材料であって、ステップ（ｅ） が、ステップ（ｄ） の菌株を、該ステップにおける該タンパク質を変性させるに十分な温度に加熱することを含むものである材料。
【請求項４】
請求項２の無毒の生物学的材料であって、２３０ｎｍ及び５５０ｎｍに吸収を示す脂質材料をステップ（ｅ） の産物から更に抽出することによって調製されるものである材料。
【請求項５】
請求項４の無毒の生物学的材料であって、抽出が、該脂質材料をクロロホルム／メタノール又は溶液アセトニトリル／メタノール溶液で沈殿させ該産物を精製してこれを凍結乾燥することを含むものである、材料。
【請求項６】
請求項４の無毒の生物学的材料であって、抽出が、該脂質材料を水性食塩溶液中に入れ、クロマトグラフィーにより該粗製の脂質産物を精製し、約２３０および５５０ｎｍに紫外吸収を有する画分を集め、集められた画分を凍結乾燥し、目的の産物をクロロホルム／メタノール又はアセトニトリル／メタノールで沈殿させ、そして該沈殿された産物を精製することを含むものである、材料。
【請求項７】
請求項４の無毒の生物学的材料であって、約１９００ダルトンのモノマー分子量と、約１２０，０００ないし約１５０，０００ダルトンの食塩溶液中凝集体分子量を有するものである材料。
【請求項８】
水性溶液中にある請求項２の無毒の生物学的材料。
【請求項９】
該エンテロバクテリアシーが好気性のエンテロバクテリアシーである、請求項２の無毒の生物学的材料。
【請求項１０】
該エンテロバクテリアシーがＲ．形である、請求項２の無毒の生物学的材料。
【請求項１１】
該エンテロバクテリシーがＳ形である、請求項２の無毒の生物学的材料。
【請求項１２】
請求項１１の無毒の生物学的材料であって、該エンテロバクテリアシーが、バチルス、バクテロイデス、ブルセラ、カルノバクテリウム、カウロバクター、シトロバクター、クロストリジウム、コリネバクテリウム、エンテロバクター、大腸菌、ハロバクテリア、クレブシエラ、ラクトバチルス、ラクトコッカス、ロイコンストック、リステリア、ミクロコッカス、マイコバクテリウム、ナイセリア、パスツレラ、ペディオコッカス、プロピオニバクテリウム、プロテウス、シュードモナス、サルモネラ、サルジナ、シゲラ、セラチア、スタフィロコッカス、ストレプトコッカス、及びビブリオよりなる群より選ばれた菌株に属するものである、材料。
【請求項１３】
請求項１又は２の生物学的材料のコロイド結晶。
【請求項１４】
薬剤学的に許容し得る担体と合わさった請求項１又は２の生物学的材料の薬剤学的有効量を含んでなる薬剤組成物。
【請求項１５】
カルシウム塩、マグネシウム塩及び亜鉛塩を更に含んでなる、請求項１４の薬剤組成物。
【請求項１６】
該塩が、ＺｎＣｌ２、Ｚｎ−Ｄ−グルクロン酸、Ｚｎ−マグルミン（ｍａｇｌｕｍｉｎｅ）、Ｚｎ−Ｄ−クエン酸又はＺｎ−サリチル酸である、請求項１４の薬剤組成物。
【請求項１７】
リポソームの形態の請求項１４の薬剤組成物。
【請求項１８】
該組成物が凍結乾燥された形態である、請求項１４の薬剤組成物。
【請求項１９】
油滴エマルジョンの形態である、請求項１４の薬剤組成物。
【請求項２０】
ウイルス又は細菌感染に罹っている哺乳類における疾病に免疫療法を加える方法であって、請求項１又は２の産物の有効量を、これを必要とする哺乳類に投与することを含む方法。
【請求項２１】
請求項２の単離された産物。
【請求項２２】
次の特性すなわち、
（ａ） 腸内細菌であり、
（ｂ） コリシンを産生し、
（ｃ） エンドトキシンを産生せず、
（ｄ） ベロ毒素の産生を担う遺伝子を有さず、
（ｅ） ｃＡＭＰアデニル酸シクラーゼの活性化因子を含まず、
（ｆ） ｃＧＭＰＭグアニル酸シクラーゼの活性化因子を含まず、
（ｇ） 接着性分子を有さず、
（ｈ） ｅａｅ遺伝子配列を有さず、
（ｉ） インドール及びＭＵＧアッセイを受け、そして
（ｊ） ロッド状の外観を有する
という特性を有する単離された微生物。
【請求項２３】
請求項２１又は請求項２２の微生物の実質的に純粋な株。
【請求項２４】
請求項１の産物を中に含んだ単離された宿主細胞。
【請求項２５】
請求項２又は４の生物学的材料を中に含んだ単離された宿主細胞。
【請求項２６】
請求項１又は請求項４の実質的に純粋な産物。
【請求項２７】
請求項１又は２の生物学的材料を含んでなるワクチン。
【請求項２８】
細菌及びウイルス感染の治療を、そのような治療を必要とするヒトにおいて行う方法であって、請求項１又は２の生物学的材料の薬剤学的有効量をこれに投与することを含む方法。
【請求項２９】
式
【化１】
2004510746.tif 000023
の第１及び第２の化合物又はそれらの薬剤学的に許容し得る塩の混合物であって、該第１の化合物においてはＲ及びＲ１は共にＨであり、第２の化合物においては、Ｒ及びＲ１のうち一方はＨであり他方は
【化２】
2004510746.tif 000024
又はその薬剤学的に許容し得る塩であり、ここに、該第１の化合物の該第２の化合物に対する重量比が約６０：４０ないし約９０：１０である混合物。
【請求項３０】
該重量比が約８０：２０である、請求項２９の混合物。
【請求項３１】
＊で示したキラル中心がＲ配置である、請求項２９の混合物。
【請求項３２】
式
【化３】
2004510746.tif 000025
〔式中、Ｒ及びＲ１は共に
【化４】
2004510746.tif 000026
又はその薬剤学的な塩である。〕を有する第３の化合物が存在するものである、請求項２９の混合物。
【請求項３３】
式
【化５】
2004510746.tif 000027
の第１及び第２の化合物又はそれらの薬剤学的に許容し得る塩の混合物であって、該第１の化合物においてはＲ及びＲ１は共にＨであり、第２の化合物においては、Ｒ及びＲ１のうち一方はＨであり他方は
【化６】
2004510746.tif 000028
又はその薬剤学的に許容し得る塩であり、ここに、該第１の化合物の該第２の化合物に対する重量比が約６０：４０ないし約９０：１０である混合物。
【請求項３４】
該重量比が約８０：２０である、請求項３３の混合物。
【請求項３５】
＊で示したキラル中心がＲ配置である、請求項３３の混合物。
【請求項３６】
式
【化７】
2004510746.tif 000029
〔式中、Ｒ及びＲ１は共に
【化８】
2004510746.tif 000030
又はその薬剤学的な塩である。〕を有する第３の化合物が存在するものである、請求項３３の混合物。
【請求項３７】
式
【化９】
2004510746.tif 000031
の第１及び第２の化合物又はそれらの薬剤学的に許容し得る塩の混合物であって、該第１の化合物においてはＲ及びＲ１は共にＨであり、第２の化合物においては、Ｒ及びＲ１のうち一方はＨであり他方は
【化１０】
2004510746.tif 000032
又はその薬剤学的に許容し得る塩であり、ここに、該第１の化合物の該第２の化合物に対する重量比が約６０：４０ないし約９０：１０である混合物。
【請求項３８】
該重量比が約８０：２０である、請求項３７の混合物。
【請求項３９】
＊で示したキラル中心がＲ配置である、請求項３７の混合物。
【請求項４０】
式
【化１１】
2004510746.tif 000033
〔式中、Ｒ及びＲ１は共に
【化１２】
2004510746.tif 000034
又はその薬剤学的な塩である。〕を有する第３の化合物が存在するものである、請求項３７の混合物。
【請求項４１】
式
【化１３】
2004510746.tif 000035
の第１及び第２の化合物又はそれらの薬剤学的に許容し得る塩の混合物であって、該第１の化合物においてはＲ及びＲ１は共にＨであり、第２の化合物においては、Ｒ及びＲ１のうち一方はＨであり他方は
【化１４】
2004510746.tif 000036
又はその薬剤学的に許容し得る塩であり、ここに、該第１の化合物の該第２の化合物に対する重量比が約６０：４０ないし約９０：１０である混合物。
【請求項４２】
該重量比が約８０：２０である、請求項４１の混合物。
【請求項４３】
＊で示したキラル中心がＲ配置である、請求項４１の混合物。
【請求項４４】
式
【化１５】
2004510746.tif 000037
〔式中、Ｒ及びＲ１は共に
【化１６】
2004510746.tif 000038
又はその薬剤学的な塩である。〕を有する第３の化合物が存在するものである、請求項４１の混合物。
【請求項４５】
細菌又はウイルス起源の急性又は慢性感染に罹っている、細菌感染のある患者からカイバードラッグを調製する方法であって、
（ａ） 患者の感染部位におけるエンテロバクテリアシーから得られたエンドトキシン抽出物を集め、
（ｂ） コリシンを産生するがトリプトファンをインドールへと変換せず且つＭＵＧアッセイにおいて反応しない腸内細菌をスクリーニングして集め、
（ｃ） それらの選択された細菌を収穫し、
（ｄ） エンドトキシンを作ることのできないステップ（ｃ） の菌株を選択し、そして
（ｅ） ステップ（ｄ） の菌株を殺すこと
を含んでなる方法。
【請求項４６】
細菌の殺滅が、ステップ（ｄ）の菌株を、該ステップにおける該タンパク質を変性させるに十分な温度に加熱することを含む、請求項４５の方法。
【請求項４７】
カイバードラッグを調製するための方法であって、
（ａ） 患者の感染部位におけるエンテロバクテリアシーから得られたエンドトキシン抽出物を集め、
（ｂ） コリシンを産生するがトリプトファンをインドールへと変換せず且つＭＵＧアッセイにおいて反応しない腸内細菌をスクリーニングして集め、
（ｃ） それらの選択された細菌を収穫し、
（ｄ） エンドトキシンを作ることのできないステップ（ｃ） の菌株を選択し、
（ｅ） ステップ（ｄ） の菌株を殺し、そして
（ｆ） ２３０ｎｍ及び５５０ｎｍに吸収を示す脂質材料をステップ（ｅ） の産物から抽出すること
を含んでなる方法。
【請求項４８】
抽出が、該脂質材料をクロロホルム／メタノール又は溶液アセトニトリル／メタノール溶液で沈殿させその産物を凍結乾燥することを含むものである、請求項４７の方法。
【請求項４９】
該沈殿させた材料が凍結乾燥前に精製されるものである、請求項４８の方法。
【請求項５０】
請求項４６の方法であって、抽出が、該脂質材料を食塩溶液中に加え、クロマトグラフィーにより該脂質産物を精製し、約２３０ｎｍおよび５５０ｎｍに紫外吸収を有する画分を集め、集められた画分を凍結乾燥し、目的の産物をクロロホルム／メタノール又はアセトニトリル／メタノール溶液で沈殿させ、そして該沈殿された産物を精製することを含むものである、方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明は、非病原性細菌から単離された生物学的に活性な材料、これを含有する薬剤組成物、及び、レトロウイルスを含むウイルスと細菌によって引き起こされる、細菌性及びウイルス性の感染及び疾病を治療するための方法に関する。
【０００２】
発明の背景
ヒト及び動物の消化管は、効果的な粘膜障壁の存在によって全身循環に到達するのを阻止されている多数の病原性細菌を含んでいる。健常のヒト及び動物において、毒素及び少数の微生物が消化管の上皮よりなる内張りを絶え間なく破壊しているが、それにも拘らず、細菌の更なる移動は、消化管に関連したリンパ系組織によって、又は、白血球やそれらのサブグループのようなある種の特異的細胞、又は、存在する場合には、障害されたリンパ球によって、阻止されている。しかしながら、外傷、火傷、化学療法、炎症性疾患及び二次感染に対する多くの宿主応答は、微生物及びウイルス並びに毒素に対する腸組織及び大腸の透過性亢進を引き起こすことが示されている。腸の透過性のそのような変化は、細菌のトランスロケーション、すなわち、内因性の腸内細菌叢が腸内障壁を透過して無菌の組織を侵す過程から発生し得る。その結果、Ｔ細胞の免疫性が損なわれ、そしてエンドトキシンが形成されて放出されて、腸内腔の損傷及び、より重大なことには腸障壁の損傷を引き起こす。この活動は、腸内細菌とエンドトキシンがより深く宿主内へ侵入することを許し、それにより感染に対する宿主の応答を増強させ、長期に亘る又は命を脅かす疾病の原因となる。細菌のエンドトキシンの放出による腸透過性の亢進は、Ｔリンパ球及び腸細胞に対する有害な効果のみならず、より重要なことには、細胞−細胞伝達物質、例えば増殖因子及びインターフェロンを含むサイトカインに対して、有害な効果をもたらす。更には、腸の透過性の亢進は、患者の免疫系を損ない、患者に炎症を引き起こし、そして組織再造形を引き起こす。
【０００３】
トランスロケーションして上記の有害な効果を引き起こす腸に内在する細菌の一タイプが、エンテロバクテリアシー（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）である。それらは、ヒトを含む動物及び植物の寄生体及び病原体として広く分布しているグラム陰性の、通性嫌気性の細菌の一ファミリーである。例としては、腸内細菌である大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）及びプロテウス・ブルがリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ ｖｕｌｇａｒｉｓ）が挙げられる。これらの有害な効果を引き起こす他の細菌の一つはサルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）である。エンテロバクテリアシーは、哺乳類の糞、膿、痰、尿中、及び皮膚並びに哺乳類の、炎症性疾患の部位を含む感染部位特に細菌及びウイルスによって引き起こされたものの中に見出される。
【０００４】
細菌のトランスロケーションは、リンパ節、脾臓、肝臓、血液及び肺のような、種々の組織への微生物の移動を含む。これらの細菌のトランスロケーションは、有害な効果をもたらし得る。例えば、肺の末梢の気腔内におけるエンドトキシンの存在は、２４時間以内の好中球の集積と浮腫とをもたらす炎症性応答を誘発する。この応答は、サイトカインの産生を含む、上皮細胞、肺胞マクロファージ、及び内皮細胞に対するエンドトキシンの効果に帰せられる。これらのサイトカインは、その後、接着性分子のアップレギュレーション及び好中球の急性の遊走及び、後には、単核球の遊走を誘発する。
【０００５】
これらの有害な効果は、エンテロバクテリアシーによって産生されて細胞内に注入されるエンドトキシンによるものと信じられている。このエンドトキシンは、リピドＡであるか、又はこれを含む。グラム陰性細菌は、リピドＡを含んでいる。リピドＡは、全てのグラム陰性細菌の表面を被覆するリポ多糖の主たる要素である。このリポ多糖の一般構造は、次のとおりである。
【０００６】
（オリゴ糖反復単位）ｎ−コアのオリゴ糖−（ケトデオキシオクタン酸）３ーリピドＡ。
【０００７】
リピドＡは、長鎖脂肪酸が通常結合したグルコサミン骨格を含んだ、ジホスホロオリゴ糖である。より具体的には、それは、糖の環の１位及び４’位にリン酸残基を担持した（β、１ー６）結合したＤ−グルコサミン二糖の骨格よりなる。アミド化された又はエステル化された長鎖脂肪酸（一般に、Ｄ−３−ヒドロキシ及び／又はアシルオキシ脂肪酸）が、グルコサミン部分中の可能な部位の各々に存在する。
【０００８】
リピドＡ部分は、有害かつ致命的な効果の原因であるエンドトキシン部分である。更には、リピドＡの化学構造は、グラム陰性細菌の種々の属の間で最も一定なものである。
【０００９】
このリポ多糖は、共有結合したリピドＡを介してエンテロバクテリアシーの外膜の外表面に係留されており、エンテロバクテリアシーが宿主細胞に進入したときに遊離される。
【００１０】
その望ましくない毒性効果は、遊離のリピドＡの病理学的活性、例えば、エンドトキシンショックの誘発、発熱性、マクロファージ活性化、β−リンパ球分裂促進性、非特異的インターフェロン誘導、補体活性化及びヒト腫瘍の退行等の病態生理学的活性に関連している（例えば、Ｃ． Ｇａｌａｎｏｓ ｅｔ ａｌ．， Ｉｎｔ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． １４， ２８０−２８８， （１９７７）； Ｃ． Ｇａｌａｎｏｓ ｅｔ ａｌ．， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ３１， ２３０−２３３， （１９７２）； Ｃ． Ｇａｌａｎｏｓ， ｅｔ ａｌ．， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， ９， ２４５−２４９， （１９６９）； Ｗｅｉｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， １２１， ７２−８０， （１９７８）； Ｅ．Ｅ． Ｒｉｂｉ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｎａｔｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．， ５５， １２５３−１２５７ （１９８２）を参照のこと）。
【００１１】
しかしながら、エンドトキシンはまた、動物にとって有益な効果を有する部分、すなわちオリゴ糖反復領域（Ｏ−鎖）をも含んでいる。それは、このＯ−特異的な抗原がインビトロでの細菌の生存に必要でないにもかかわらず、細胞死及び食作用からの細胞の保護において、ある役割を演じている。
【００１２】
このリポ多糖はまた、宿主の免疫系がそれに対して抗体を産生するところの免疫性の強い構造（Ｏ−因子）をも担持している。従って、このＯ−特異鎖は、このリポ多糖のＯ−抗原性の原因である。Ｏ−因子はまた、特異的なサイトカイン及びインターフェロンを刺激することによる腫瘍の増殖の抑制、外来細菌の侵入阻害、動物の細胞及び／又は組織へのウイルスの接着の阻害、細胞性の免疫応答の免疫調節性伝達物質や特異的液性因子を介した侵入細菌に対する個々の防御機構の賦活、炎症の原因となる細胞刺激の抑制、細菌及びウイルスの浸潤の抑制、マクロファージ活性化及び補体（ＭＨＣ）活性化の促進、リンパ球分裂促進性の低減及びエンドトキシンのショックと発熱性の最小化のような、有益な効果を促進することも見出されている。加えて、この生物学的材料の持つ他の属性には、標的分子すなわちＩＣＡＭ−１又はラミナン（ｌａｍｉｎａｎ）様接着性分子の発現をインビボで阻害し、および特異的なサイトカイン及び／又はインターフェロン、接着性分子（ＩＣＡＭ）がウイルスに対する情報を、内皮細胞の発現の調節のアップレギュレーションを防止することによって再調節し、及び、大腸炎（Ｍ． Ｃｒｏｈｎ）及びカラゲルナン（ｃａｒａｇｅｌｌｎａｎ）誘発性の皮下又は腸外皮スペース内への好中球遊走を阻害する潜在能力が含まれる。
【００１３】
エンテロバクテリアシーによって産生されたエンドトキシンは、有益な及び有害な効果の両方を有する。有益な効果は、Ｏ−多糖部分に存し、これに対して内毒素の特徴は、全くリピドＡ部分に存する。しかしながら、無傷の細菌においては、リポ多糖及びリピドＡは、それぞれ、リン脂質及びタンパク質との複合体中にある。
【００１４】
このように、これらの細菌は、有益な及び有害な両方の効果を示す。これらの細菌は、特にエンテロバクテリアシー（例えば、大腸菌）は、免疫賦活効果を提供する化合物を産生するが、しかし同時に、有害且つ致死的な副作用をも提供する。従って、目的は、有害な効果を最小にし且つ有益な効果を最大にすることであった。
【００１５】
有害な化合物の無毒化とそれらの使用は、当該分野において記述されている。
【００１６】
米国特許第４，４３６，７２７号は、細胞壁骨格と組み合わせたとき、エンドトキシンと通常関連するものである有害な副作用なしに、癌性腫瘍の治療に治療上有効な組成物をもたらす、精製された無毒化エンドトキシンの製造を記載している。更には、そこに記載されている無毒化エンドトキシンは、微生物のバッチ培養から、メタノール／クロロホルム沈殿及びこれに続く、粗製のリピドＡ画分を得るための酸性加水分解の後に調製される。精製された無毒化エンドトキシンは、免疫療法を与えるために、細胞壁骨格と組み合わされた。
【００１７】
米国特許第４，９１２，０９４号は、グルコサミンの３位の還元性末端にエステル化されたβ−ヒドロキシミリスチンアシル基のみを除去する、厳格に制御されたアルカリ加水分解の下での、修飾されたリポ多糖、特に脱３−０−アシル化モノホスホリルリピドＡ及び３−Ｏ−アシル化ジホスホリルリピドＡの産生を開示している。この材料は、アレルゲン例えば花粉アレルゲン、黴アレルゲン、昆虫唾液アレルゲン、昆虫部分アレルゲン等に感受性の温血動物のＩ型過敏症に対して使用されつつある。
【００１８】
米国特許第５，７６２，９４３号は、モノホスホリルリピドＡ又は３−脱アシル化モノホスホリルリピドＡの投与による、イムノグロブリンＥ（ＩｇＥ）依存性のＩ型過敏症の治療のための方法及び組成物を記述している。その生物学的に活性な材料は、Ｉ型過敏症反応の防止のための脱感作療法の一部として又は予防ワクチンのＩ型として、投与することができる。
【００１９】
米国特許第５，８８８，５１９号は、免疫原性の物質としての、高度にカプセル化された高濃度リピドＡを開示している。この開示は、効果的な敗血症の受動的予防に対する又はその治療的処置を提供することを含む、グラム陰性細菌と反応する、高免疫ポリクローナル抗血清又はヒトモノクローナル抗体の形のヒト抗体を提供することを目的としている。
【００２０】
米国特許第５、７７６、４６８号は、３−Ｏ−脱アシル化モノホスホリルリピドＡの小さな粒子を含む新規のワクチン組成物を開示している。特に、それは、非常に低い投与量の抗原でも保護的免疫を誘導するために適用できるものである、１２０ｎｍより小さい特定の粒子サイズを如何にして調製するかを記載している。その明細書は、これらの化合物が初感染及び現在の感染に対して防護し、中和抗体による特異的な液性のまたエフェクター細胞に仲介された免疫応答の双方を、有利に賦活させることの証拠を提供している。更には、３−Ｏ−脱アシル化モノホスホリルリピドＡ分子よりなる小さな粒子、特に光子相関分光法（ｐｈｏｔｏｎ ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ）による測定で１２０ｎｍより小さいものを含むワクチン組成物が、肝炎感染（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、及びＥ型肝炎）並びにヘルペス（ＨＳＶ−１又はＨＳＶ−２）に対する防御を提供するのに有用であるということが主張されている。
【００２１】
しかしながら、上記の先行技術の何れも、細菌又はウイルスに由来する急性の又は慢性の感染に罹っている個々の患者からの生物学的に活性な微生物の単離であって、生存能力のある非複製性の細菌の形で特異的に活性な材料又はその類縁体を得ることができる単離を記載していない。
【００２２】
本発明者等は、一連の制御された単離ステップを通じて、毒性の副作用なしに免疫賦活作用を含む生物学的に活性な材料を単離した。より具体的には、エンドトキシン誘発性される腸内の細菌のトランスロケーションという毒性効果を最小にし又は完全に除去し、且つ、リピドＡ様材料の有益な効果を同時に促進する、生物学的材料を見出した。
【００２３】
本発明者は、この生物学的材料が、無毒でありしかも他の細菌の増殖を阻害する能力を維持していることを見出した。細菌は、他の細菌に対して致死的なタンパク質性化合物を産生することができること、同時に、それらのタンパク質性化合物（バクテリオシンと呼ばれる）を産生する細菌細胞は、その有害作用に対して免疫性があるということが知られている。すなわち、本発明者等は、この性質を維持ししかも無毒である生物学的材料を見出して単離した。
【００２４】
本発明者等は、そのような生物学的材料を見出しそして単離した。彼らは、エンテロバクテリアシーの細菌のある単離菌株を利用することによって、ある化合物を単離してそこから、このクラスの細菌に帰す事のできる免疫賦活効果を利用し且つ同時に、エンドトキシンに誘発される腸内及び胃腸管内の細菌のトランスロケーションによる有害で致死的な副作用を実質的に除去する薬物を調整することができるということを見出した。更には、彼らは、この単離された材料が上で同定された特性を示すことを見出した。
【００２５】
例えば、彼らは、この単離された材料が、免疫賦活効果を示すことを見出した。それは、腫瘍の増殖を抑制しまた外来細菌の侵入及びウイルスの細胞への接着を阻害するために、適切なサイトカイン及びインターフェロンを賦活することができる。加えて、それは、ウイルス又は細菌に侵入されたときの動物の防御機構の賦活を促進する。この単離された材料はまた、炎症の原因となる細胞刺激を抑制し、細菌及びウイルスの浸潤を抑制し、マクロファージの活性化を促進し、リンパ球分裂促進性を減少させ、エンドトキシンのショック及び発熱性を最小限にする。加えて、これらの細菌株からの単離されたこの材料は、炎症の局所における白血球の動員及び保持に関係する過程に関与する可溶性及び細胞関連分子を調節する。
【００２６】
急性又は慢性の疾病に罹っている患者から彼らが最終的に単離したこの材料は、カイバードラッグ（Ｋｙｂｅｒｄｒｕｇ）と呼ばれる。
【００２７】
本発明の要約
こうして、本発明は、この単離された細菌性材料（以下、「カイバードラッグ」として知られる）、すなわちここに記述された生存能力のある非複製性の細菌から単離された材料に向けられている。
【００２８】
カイバードラッグと呼ばれるこの材料は、急性又は慢性の疾病に罹っている個々の患者から単離され、ある種の疾病、例えばウイルス又は細菌の感染を成功裏に治療するために投与量依存的な仕方で動物に成功裏に投与することができる。０．９％塩化ナトリウム溶液中において、それらはコロイド結晶を形成する。加えて、カイバードラッグのこれらコロイド結晶は、水性溶液中において低い多分散性を示し、０．６５μｍの狭いサイズ範囲を有し、そして面心又は体心立方の同相（ｂｉｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ）な相又は格子の形に配列されている。加熱すると、これらのコロイド結晶は融解して（Ｔｍ≒４７℃）六角形の薄板相を形成する。冷えると、この薄板相は、体心又は面心立方の格子に戻る。
【００２９】
加えて、１０μＭのカイバードラッグの水性懸濁液は、約１，９００〜２，１００ダルトンの重量平均分子量のモノマー単位のコロイド結晶としての凝集形態を圧倒的に（９９．９５％ｗ／ｗ）、そして痕跡量のみ（０．０５％ｗ／ｗ）のモノマー形を平衡状態として含むことが見出された。更には、カイバードラッグの凝集形は、ｐＨ７．８（２０℃）で非常にゆっくりとモノマー形へと解離し、これは、それぞれ、Ｃａ２＋の場合は１〜２５μＭの濃度範囲、Ｍｇ２＋の存在下では２０〜３０μＭの間で、Ｃａ２＋又はＭｇ２＋イオンの存在によってのみ影響を受ける。
【００３０】
より具体的には、以下に記載されるように、これらのカイバードラッグは、ヒトを含む哺乳類中に見出されるエンテロバクテリアシーの個々の非病原性菌株（例えば、大腸菌）から、注意深く且つ特定の選択方法を用いて単離される。哺乳類の選択された個々の細菌培養物から開始して、エンテロバクテリアシーは、感染性材料に冒された哺乳類、例えば、ヒトから得られ、糞、膿、痰、尿、皮膚及び感染部位に見出すことができる。その後、エンテロバクテリアシーは単離され、精製され、そしてエンテロトキシン、接着因子、及び他の望ましくない、他の証明された病原因子を含む有毒なエンテロヘモリシン（ｅｎｔｅｒｏｈｅｍｏｌｙｓｉｎｅｓ）等のような夾雑物が除去される。エンテロバクテリアシーは、産物のＤＮＡ増幅分析、例えばポリメラーゼ連鎖反応を含む特異的且つ生化学的な試験によって検証される。
【００３１】
そのようにして単離された細菌の菌株は、如何なるエンドトキシンも、また如何なる形のベロ毒素も溶血素（ｈｅｍｏｌｙｓｉｎｓ）も有しない。それは、ベロ毒素産生の原因となる遺伝子を有さず、ＡＭＰアデニル酸シクラーゼやｃ−ＧＭＰグアニル酸シクラーゼの活性化因子を有さない。加えて、それは、ＥＨＥＣ又はＥＰＥＣに特徴的なｅａｅ遺伝子配列を含まない。それは、上述したリピドＡ分子を、その有毒な形態では有さない。カイバードラッグを産生するこの細菌は、複製することができないが、しかし、他の生化学的活性な諸成分のうちに、特異的なリポ多糖様構造物を含み、それらはヒト及び動物における特異的免疫調節の原因となるものである。
【００３２】
本発明は、これらの非病原性の細菌、主としてエンテロバクテリアシーから単離された生物学的材料（カイバードラッグ）の製造及び治療応用に関する。本発明のカイバードラッグは、動物において特異的且つ個別に、感染性の及び慢性の疾病並びにアレルギー性反応の治療に有用である。より具体的には、カイバードラッグは、細菌及びウイルスの活性を阻害する。カイバードラッグは、免疫応答及び防御を増大させる。本発明のカイバードラッグは、喘息のようなアレルギー性の疾病を治療するのに有用であり、またＨＩＶウイルスを含む、ＤＮＡウイルス及びＲＮＡウイルスの双方に対して、またコートされている及びコートされていないウイルスに対して有効である。より具体的には、本発明に従って単離されたこの生物学的材料は、赤血球凝集素へのライノウイルスの接着を防止し、ｉｉ） ウイルスのノイラミニダーゼを阻害し、ｉｉｉ） 他の細菌及び真菌類の感染を阻害し、そしてｉｖ） レトロウイルスの逆転写酵素の転写速度を阻害する。
【００３３】
本発明はまた、カイバードラッグの有効量を投与することによる哺乳類の細菌及びウイルスの感染を治療する方法にも向けられている。カイバードラッグによって治療された患者がアレルギー又は喘息発作の強さ並びに発作頻度を含む症状の頻度において、減少を示すことが観察された。この効果はまた、本発明のカイバードラッグによる治療を受けている、リウマチ性疾病に罹っている患者においても観察された。
【００３４】
本発明のカイバードラッグは、こうして細菌及びウイルスの活性を阻害し、観察される臨床症状を減少させる。それは係留されたリピドＡの性質を有してはいるものの、遊離のリピドＡの致死的な効果を持たず、且つリポ多糖（ＬＰＳ）毒性がない。
【００３５】
本発明はまた、例えばウイルス及び細菌感染等のある種の疾病を成功裏に治療するために投与量依存的な仕方で哺乳類に投与するための、薬剤学的担体と合わせたカイバードラッグの有効量を含む薬剤組成物にも向けられている。本発明はまた、カイバードラッグを産生し且つ同時に上記した性質を示す単離されたエンテロバクテリアシーにも向けられている。最後に、本発明は、カイバードラッグを単離する方法に向けられている。
【００３６】
本発明の詳細な記述
上に示したように、本発明の一面は、カイバードラッグに、及び本発明による生存能力のないエンテロバクテリアシーからのその単離に向けられている。
【００３７】
本発明のカイバードラッグは、ヒト及び他の哺乳類の敵対的な制御システムと特に関係した諸々の細胞事象に働き、連絡をとり調節する。それらは、ワクチンのように働くが、しかしカイバードラッグはワクチンでもワクチン様物質でもない。
【００３８】
にも拘わらず、カイバードラッグは、細菌及びウイルス感染を阻害する。当該分野においてよく知られているように、細菌及びウイルスは、殆どの場合、哺乳類の生化学的プロセスを妨害する傷害的化学的遊離基の産生によりもたらされる慢性及び急性の事象並びに炎症の原因である。本発明のカイバードラッグは、細菌及びウイルスの増殖を阻害し、そうすることで、これら有毒な化学的遊離基を産生するそれらの能力を抑制する。カイバードラッグは、哺乳類を侵しうる他の微生物又はウイルスに対しては、溶解活性を有する。しかしながら、本発明者等は、本発明のカイバードラッグが、遺伝的決定基ではないことを見出した。拘束されることは望まないが、カイバードラッグは、感染性の微生物又はウイルスの弱力化したＤＮＡ（ＲＮＡ、遺伝子）を、それらにコードされたタンパク質ではなしに、直接に導入することによって、感染に対して防御するものと信じられる。更には、それら具体的なコードされたタンパク質及び酵素は、カイバードラッグによって阻害される。
【００３９】
カイバードラッグは大きな分子である。非弾性光及び静的散乱実験によるカイバードラッグの流体力学的性質の研究は、カイバードラッグが、殆ど球状の形で、流体力学的半径＜ＲＨ＞＝０．４５〜０．６５μｍを有し、これは非常に低濃度においてもイオン強度及び温度の変化に殆ど影響を受けないことを示した。この知見は、いくらか重要なものである、というのは、それは製造に際して一定の物理的尺度を与え、５５０ｎｍにおける透過吸収分光光度法により又は光散乱検出器を用いることにより、寸法又は質量の何れかの測定によるカイバードラッグの濃度の定量を許容するからである。これは、６．２μｍ台であり、そして、大腸菌の栄養及び増殖状態に依存して殆ど５０％というかなり大きな寸法変動を有するものである生存能力のある大腸菌の流体力学的半径とは対照的である。換言すれば、大腸菌は、カイバードラッグより１０倍以上大きい。更には、カイバードラッグの産生は、細菌の、産生での増殖速度及び栄養状態に依存しない、というのはその複製する特性が無くされているからである。この材料のマトリックス支援レーザーイオン化飛行時間形（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）質量分析及び液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣ−ＭＳ）は、約１，９００（ＭＺ＋Ｎａ）＋という分子量を与え、このことは、例えばオリゴペプチド等の如何なるタンパク質性成分、オリゴヌクレオチド又はヌクレオシド又はペプトグリカン（ｐｅｐｔｏｇｌｙｃａｎｓ）の誘導体又は、通常ムラミルジペプチド（Ｍｒ＝４５９）と呼ばれているＮ−アセチル−ムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミンを含むムラミルペプチドも存在しないことを示している。しかしながら、カイバードラッグは、１０μｇ／ｍＬという低濃度であっても、ＮａＣｌ又はＥＤＴＡ（０．９％ｗ／ｗ）の存在下に水溶液中で、濃度依存的な仕方で凝集し、６８〜８０という見かけの凝集数を有する１２０，０００〜１５０，０００ダルトンの分子量に等価である、＜ＲＨ＞＝０．４５〜０．６５という大きな流体力学的半径をもたらす。こうして、水溶液中では、それは分子量約１２０，０００〜約１５０，０００ダルトンを有する。
【００４０】
カイバードラッグは、タンパク質でなくまたタンパク質性材料を含んでもいない。更には、それは核酸でもない。従ってそれは、糖タンパク質でもリポタンパク質でもない。水溶液中においては、それは凝集したモノマー単位よりなる。モノマーは約１９００〜２０００ダルトンの分子量を有し、一方凝集体は約１２０，０００〜１５０，０００の分子量を有する。超音波処理又は他の解離方法にかけると凝集体はモノマーへと解離し、これは単離され、上に示したように、１９００〜２０００ダルトンの分子量を有する。
【００４１】
カイバードラッグは、リポ多糖である。モノマーは、アミノヘキソースを含んでいる。この糖環は、６〜１２個の炭素原子を、より好ましくは８〜１０個の炭素原子を含む。この糖環はフラノースである。カイバードラッグ中にガラクトースも存在することが見いだされてはいるが、カイバードラッグ中の糖は、主としてグルコースである。それは、特にマイコバクテリア（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ）例えばノカルジア（Ｎｏｃａｒｄｉａ）に対して、殺菌作用を有する。
【００４２】
カイバードラッグは、水性溶液中に単離される場合、凝集体を形成し、そして、拘束されることは望まないが、半径０．３μＭの粒子サイズあたり少なくとも６０〜８０個のモノマーよりなると信じられる。カイバードラッグは、一定の化学ポテンシャルにて、僅か１０〜１５％というかなり分散（δ）の小さい、０．６５μＭの一定の直径を有する。一定の（６．９という）ｐＨ及び温度におけるイオン強度０．１５３Ｍ ＮａＣｌでのカイバードラッグのサイズの変動（δ）は、イオン強度を０．３００Ｍ ＮａＣｌへと高めても有意には変動しない。しかしながら、非弾性光散乱実験による測定では、流体力学半径の縮小が認められる。０．３５０Ｍ ＮａＣｌ（２０℃）での約０．６５μＭから、０．３５０Ｍ ＮａＣｌ（２０℃）での約０．５７±０．０６μＭへの変化が見出されたが、これは塩濃度を最初の濃度に戻したとき可逆的である。更には、０．１５３Ｍ ＮａＣｌ（２０℃）未満では、カイバードラッグは、０．０１５Ｍ ＮａＣｌで約０．７０±０．０８μＭへと広がり、これもまた可逆的である。
【００４３】
カイバードラッグは、複数のコロイド結晶よりなる。拘束されることは望まないが、それら多数のコロイド結晶は、強い静電気力、その特異な化学構造からくる流体力学的相互作用、及び室温での溶液のイオン強度によって、安定化されまた分離されると信じられる。カイバードラッグは、面心立方（ｆｃｃ）結晶格子又は体心立方（ｂｃｃ）格子の何れかを有し、適切な条件においてそれらは相互変換できる。例えば、希薄な塩溶液例えば０．０７％ＮａＣｌ中に入れたとき、ｆｃｃの形の結晶格子は、ｂｃｃの形の結晶格子へと変換される。
【００４４】
本発明のカイバードラッグは、リピドＡの変性形、又は変性リピドＡ分子を含んだリポ多糖の凝集体である。リピドＡは、１位及び４’位にリン酸残基を担持し且つグルコサミン部分中の可能な各部位にアミド化又はエステル化された長鎖脂肪酸（一般にＤ−３−ヒドロキシ及び／又はアシルオキシ脂肪酸）を担持した、（βー１，６）−結合したＤ−グルコサミン二糖という骨格よりなる。
【００４５】
以下に記載される手順に従って収集されて単離されるこの変性されたリピドＡ分子は：
ｉ）還元性糖末端であって、該糖はヘキソースアミン、ここに主としてＮ−アシル化されたそれぞれＤ−グルコサミン又はＤ−ガラクトサミンであり；及び、約１，９００〜２，１００の分子量のモノマー単位あたりに２個の糖があるものである還元性糖末端と、
ｉｉ）エステル結合及び／又はペプチド結合であって、ヘキサミンのアミノ基と脂肪酸のカルボキシル基との縮合によって生ずると信じられるものである結合と、
ｉｉｉ）遊離の、エステル化されていないＲ−３−ヒドロキシ基を有する（Ｒ）−３−ヒドロキシテトラデカン酸なる脂肪酸と、
ｉｖ）エステル化された（Ｒ）−３−ヒドロキシテトラデカン酸脂肪酸残基であって、別の飽和脂肪酸で、ｎ＝１２又はｎ＝１４の鎖長の（Ｒ）−３−ヒドロキシテトラデカン酸のＲ−３−ヒドロキシルにおいてエステル化されているものであるエステル化された脂肪酸残基と、を含みそして
ｖ）リン酸基を含まないか又は、約１，９００ないし約２，１００ダルトンのモノマー分子量のカイバードラッグのモノマー単位あたり１個のリン酸基を含む。
【００４６】
これらの特徴的な化学的特徴点は、穏やかな酸性又はアルカリ性加水分解、及びこれに続くキラルな毛細管カラムを通したＧＣ−ＭＳ決定、適当なマトリックスの存在下でのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ、及び、０．０１％（ｖ ／ｖ）の水の存在下での無極性溶媒中での、それぞれアシル特異的加水分解酵素又はＮ−アシル−アミダーゼによる特異的な酵素的攻撃によって、得ることができる。絶対的Ｒ又はＳ配置もまた、キラルなＧＣ−ＭＳ法に加えて、ｎ＝１２及び／又はｎ＝１４の鎖長の３−ヒドロキシテトラデカン酸の単離された鏡像異性体の旋光度の測定によって、適当な位相シフト試薬の存在下でのＮＭＲスペクトル分析を含めて、それらの鏡像体を不斉合成によって得られたものと比較することによって、決定された。
【００４７】
本発明のカイバードラッグは、凝集体において大部分は１又は４’位の何れにもリン酸基を含まないリピドＡ分子である（以下、変性リピドＡとしても知られる。）。本発明のリピドＡのこの変性形は、しかしながら、最小限の量のリン酸基を含んでいる。変性リピドＡ分子（カイバードラッグ）は、非常に低いリン酸含量を有する。より具体的には、それは少なくとも８０％（ｗ／ｗ）の非リン酸化リピドＡ類縁体を含み、多くとも約２０％（ｗ／ｗ）までの一リン酸化リピドＡ類縁体しか含まない。一リン酸化変性リピドＡ分子の一例は、次の構造を有する。
【００４８】
【化１７】
2004510746.tif 000002
【００４９】
（式中、
Ｒ及びＲ’は、独立して水素又は
【００５０】
【化１８】
2004510746.tif 000003
である。）
【００５１】
しかしながら、凝集体の形をなしたときは、少なくとも８０％（ｗ／ｗ）の凝集体において、Ｒ及びＲ’は水素であり、そして多くとも凝集体中２０％（ｗ／ｗ）までにおいてＲ及びＲ’の一方が水素であり他方がリン酸である。しかしながら、もしあった場合には、Ｒ及びＲ’の双方がリン酸である最小限の量のモノマーが見出される。
【００５２】
凝集体中に存在する一リン酸化リピドの量は、以下に記載の手順に従ってカイバードラッグがそこから培養され最終的に単離されたところ疾病を含め、患者に応じて変動する。加えて、一リン酸化物は、単量体において糖の還元性末端に存在（これは１−０−ＰＯ３−である）しても、又は糖の非還元性末端に存在して（すなわち、４’−０−ＰＯ３−）、還元性末端を遊離且つ活性なまま残していてもよい。しかしながら、２糖の部分の１位及（還元性末端、糖Ｉ）及び４’位（非還元性末端、糖ＩＩ）における二リン酸化された形の僅かな部分もまた単離された。しかしながら、何れの末端においてもピロリン酸化された誘導体は見出されていない。
【００５３】
カイバードラッグ糖アミンは、大部分が、ピラノース環のＣ−２及びＣ−２’においてアミン部分（ＮＯＨ）による置換を有するグルコースアミンである。この分子は、しかしながら、アミンを含まない。というのは、それが脂肪酸とのアミド結合の一部を構成しているからであり、該脂肪酸は、合計１２個の炭素原子から統計３６個の炭素原子までに亘る、そしてより好ましくは、合計１４個の炭素原子から合計３０個の炭素原子までに亘る、偶数個の炭素原子を含んでおり、ここにカルボキシル基に対するβ炭素は、１０〜２０個の炭素原子、より好ましくは１２〜１８個の炭素原子よりなる脂肪酸によってエステル化されたヒドロキシル基によって置換されている。２及び２’位の置換基のサイズは、約２２〜３６個の炭素原の範囲にあることが最も好ましく、約２４〜３０個の炭素原子の範囲にあることが更に好ましい。該脂肪酸が、３−ヒドロキシ−テトラデカン酸であることが好ましい。しかしながら、存在する如何なるアミドも、当該分野において知られている化学反応に、例えば、ペプチドの加水分解及びこれに続く遊離のアミドと所望の脂肪酸との反応、によって化学的に変性されることができる。当然のことながら、反応条件において反応性である分子の基を保護するために、当該分野において知られている保護基を利用してよい。
【００５４】
リピドＡのＣ−１及びＣ−４’位に通常存在するリン酸基が存在しない場合、それらは、変性リピドＡ分子においては、ＯＨ基によって置き換えられている。環の３及び３’位のヒドロキシ基は、１２〜３６個の炭素原子を含んだ脂肪酸、より好ましくは１４〜３０個の炭素原子を含んだ脂肪酸でエステル化されていてよく、ここにカルボキシル基に関するβ炭素は、ヒドロキシ基で又は、１０〜２０個の炭素原子を含んだ、より好ましくは１２〜１８個の炭素原子を含んだ脂肪酸でエステル化されたヒドロキシル基で、置換されている。３又は３’位のβ炭素原子がヒドロキシル基で置換されている場合には、その３又は３’位の置換基のサイズは、独立して、１０〜２０個の炭素原子、より好ましくは１２〜１８個の炭素原子であることが一層好ましい。他方、β炭素が脂肪酸との間でエステル化されているヒドロキシル基を有する３又は３’位の置換基のサイズは、各々独立して、２２〜３６個の炭素原子、より好ましくは２４〜３０個の炭素原子を含む。脂肪酸は３−ＯＨ−テトラデカン酸であることが非常に好ましい。他の位置、すなわち４及び６’位は、ヒドロキシル基で置換されている。上に示した長さの脂肪酸は、単離されたカイバードラッグに見出された脂肪酸に、所望の脂肪酸及び当該分野で知られている適当な保護基を利用してエステル交換による等の当該分野で知られた化学的変換によって、置き換わってよいことに注意すべきである。
【００５５】
モノマーは、モノマーあたり偶数個の（エステル化された又はアミド結合で結合した）脂肪酸部分を含んでいることが見出された。すなわちモノマーは、２個、４個又は６個の脂肪酸部分を含んでよい。
【００５６】
上に説明したように、上記のリピドＡ分子は、生存能力のないエンテロバクテリアシーから単離される。従って、本発明は、生存能力のあるエンテロバクテリアシーに天然に存在する下記のリピドＡ分子の種々の変種を想定している。
【００５７】
加えて、カイバードラッグは、次の特性を有する：
（ａ） それらは、約０．０５〜約０．０８％という低い多分散性指数を有する約０．３〜０．４０μＭの実質的に一定の流体力学的半径を有する。
（ｂ） モノマーの分子量は、約１９００〜約２０００ダルトンである。
（ｃ） カイバードラッグについての凝集数は、約６８〜約７５で、温度に関して殆ど一定であり、イオン条件に僅かに依存性であるに過ぎない。
（ｄ） カイバードラッグは、約１３０，０００±９，０００ダルトンの数重量分子量、約１３５，０００±６，７００ダルトンの重量平均分子量及び約１３７，０００±１０，７００ダルトンの平均分子量を有する。
（ｅ） カイバードラッグは、モノマーあたり２個の糖を含み、１個のグルコサミン及び１個のガラクトサミンを含んでもよいが、大部分は２個のグルコサミンである。
（ｆ） それは無機リン酸を含み、これは、カイバードラッグのモノマーのグルコサミン分子の１つに結合していると信じられる。
（ｇ） カイバードラッグは、３−ヒドロキシテトラデカン酸を含むが、２−ヒドロキシ脂肪酸は含まない。
（ｈ） この３−ヒドロキシテトラデカン酸は、Ｒ−立体配置である。
（ｉ） カイバードラッグのモノマーあたり、おそらく偶数個例えば２、４又は６個の３−ヒドロキシテトラデカン酸が存在する。
（ｊ） 単離されたカイバードラッグは、コロイド結晶である。
（ｋ） 該コロイド結晶の形態は、液体様材料に似るが、約０．６μＭの直径の中空の球の形に配列されることができる。これらの流体力学的形態は、対イオン、ｐＨ及び温度のような種々の要因に依存して小さな浸透圧計として働く。カイバードラッグがその中に単離される溶液のｐＨは重大である、というのは、ｐＨ７．５以上のようなアルカリ性ｐＨにおいては、これらの凝集体は、１．１７×１０７ダルトン以上の分子量を有する巨大な凝集体へと成長し得るからである。この凝集は、ｐＨを６．５に低下させると、可逆的である。この巨大凝集体は、かなり柔軟であり、ヒンジを介して連結されてある種の管状の構造物を生み出しており、各管状の構造物は約１１０ｎｍ管の直径を有している。
（ｌ）食塩溶液例えば０．１５４Ｍ ＮａＣｌ中における、コロイド結晶としてのカイバードラッグの安定性は、２０〜３５℃での５５０〜６００ｎｍにおけるＵＶ／可視−分光光度法によって測定したところでは、約５〜１０ｎＭのＣａ２＋の存在によって増強される。
（ｍ）カイバードラッグ中の一リン酸化（２０％）形を、非リン酸化形に、塩、例えば第Ｉ族の塩、例えばナトリウム、カリウム、アンモニウム、並びにカルシウム及び／又はマグネシウム塩の形で、当量的な仕方で加えることができる。使用できる他の塩としてはまた、コリンの窒素含有塩、ホスホコリン、Ｌ−リシン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−ヒスチジン及びＬ−プロリンが挙げられる。加えて、以下の天然に存するイオウ含有化合物をこれらの塩の代わりとすることができる。
（ａ）Ｌ−システイン
（ｂ）Ｌ−メチオニン
（ｃ）Ｓ−（＋）−アデノシルメチオニン
（ｎ）カイバードラッグは、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）に、並びにＬ−ポリリシン又はＬ−ポリアルギニン（分子量９０００〜１０００）に非共有結合的に結合させることができる。
【００５８】
本発明により生存能力のないエンテロバクテリアシーから単離されたカイバードラッグすなわち変性リピドＡ分子は、実質的に純粋である。カイバードラッグは、少なくとも約７５％純度であることが好ましく、少なくとも約８０％純度であることがより好ましく、少なくとも約８５％純度であることがなお更好ましく、少なくとも９０％純度であることがもっとも好ましい。変性リピドＡ分子の幾らかはＬ型異性体のオリゴ糖よりなるコア炭水化物を有していてよいが、好ましい具体例は実質的にＤ型異性体のコア炭水化物を有する。存在する炭水化物の少なくとも約７５％がＤ型異性体の形であることが好ましく、炭水化物の少なくとも約８０％がＤ型異性体であることがより好ましく、存在する炭水化物の少なくとも約８５％以上がＤ型異性体であることが更に好ましく、そして存在する炭水化物の少なくとも約９０％が特に好ましく、そして、存在する炭水化物の少なくとも約９５％がＤ型異性体であることがなお更特に好ましく、そして、存在する炭水化物のすべてがＤ型異性体であることがもっとも好ましい。
【００５９】
本発明のカイバードラッグは、生存能力のないエンテロバクテリアシーから単離される。生存能力のないエンテロバクテリアシーがそこから得られるところの出発エンテロバクテリアシーは、一般には、哺乳類例えばヒトの糞、膿、痰、尿、皮膚又は、エンテロバクテリアシーに感染している部位に見出される。出発エンテロバクテリアシーは、上記部位に存在する親生物及び変異体を含む、如何なるエンテロバクテリアシーからも得ることができる。例として、次の属は、出発エンテロバクテリアシーとして利用してよいタイプの生物の実例である：サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、シゲラ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、ブルセラ（Ｂｒｕｃｅｌｌａ）、ボルデテラ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ）、シトロバクター（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、パスツレラ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ）、ナイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）、プロテウス（Ｐｒｏｔｅｕｓ）、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）、バクテロイデス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、カルノバクテリウム（Ｃａｒｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、カウロバクター（Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒ）、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、エンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、ハロバクテリア（Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉａ）、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ロイコノストック（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ）、リステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）、ミクロコッカス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ）、マイコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｇｔｅｒｉｕｍ）、ペディオコッカス（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ）、プロピオニバクテリウム（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、サルジナ（Ｓａｒｚｉｎａ）、セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）、スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）及びビブリオ（Ｖｉｂｒｉｏ）。次の種を使用してよい：Ｓ．ミネソタ（Ｓ． ｍｉｎｎｅｓｏｔａ）、ネズミチフス菌（Ｓ． ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、百日咳菌（Ｂ． ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）、ウシ流産菌（Ｂ． ａｂｏｒｔｕｓ）、Ｓ．エンテリティディス（Ｓ． ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ）、大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）、Ｓ．ティフィ（Ｓ． ｔｙｐｈｉ）、霊菌（Ｓ． ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）、チフス菌（Ｓ． ｔｉｐｈｏｓａ）、フレクスナー赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｆｌｅｘｎｉ）及びサルモネラ　アボルツス　エキ（Ｓ． ａｂｏｒｔｕｓ ｅｑｕｉ）その他、大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）及びシゲラは、利用される最も好ましいエンテロバクテリアシーである。
【００６０】
本発明のカイバードラッグを産生し、そこからカイバードラッグが単離されるところのエンテロバクテリアシーは、本方法によって単離される。これらの細菌は、他の細菌に対しては致死的であるタンパク質性の化合物を産生する。より具体的には、これらの細菌は、他の細菌、レトロウイルス及びコートされた又はコートされていないウイルスに対して敵対的活性を示すが自身に対しては示さない化合物を産生する。それらは、エンドトキシン媒介性の、腸を通る細菌トランスロケーションという有害な効果を有することなしに免疫賦活効果を含む抗原性を発揮するための、すべての抗原性成分を有する。更には、そして最も重要なことには、それらは複製（増殖）ができない。更には、この生存能力のないエンテロバクテリアシーは、自己複製に必要な遺伝的決定基を有さない。このエンテロバクテリアシーは、如何なるファージ様の溶菌活性をも欠いているが、一種のバクテリオシン様活性並びにある種の溶原性のあることを明らかにしていることから、カイバードラッグを産生するそれらの細菌は、広い意味で特異的であるという利点を有する。それらは、溶原性と併せてバクテリオシン様活性を有するからである。加えて、これらの細菌は、続くコリシン産生を誘導し、それらの対応する起源である大腸菌又はカイバードラッグがそこから得られたところのエンテロバクテリアシーからの感染に対して、免疫がある。
【００６１】
更には、カイバードラッグがそこから得られるところの生存能力のないエンテロバクテリアシーは、腸病原性の血清型（ＥＰＥＣ）のものであり、そのため、腸細胞（ｅｎｔｅｒｏｃｙｔｅ）の杯形成及び微絨毛の破壊をもたらす腸への限局された吸着が回避される。加えて、エンテロバクテリアシーはまた、腸毒素産生性大腸菌（ＥＴＥＣ）、腸侵襲性大腸菌（ＥＩＥＣ）及び腸管出血性大腸菌（ＥＨＥＣ）を欠いている。
【００６２】
出発エンテロバクテリアシーとして利用されるエンテロバクテリアシー並びに非複製性のエンテロバクテリアシーは、グラム陽性であってよい。しかしながら、該エンテロバクテリアシーはグラム陰性であることが好ましい。また、それらは、好気性エンテロバクテリアシーであることが好ましい。出発エンテロバクテリアシー及び生存能力のないエンテロバクテリアシーの双方が桿状であることが、なお一層好ましい。出発の及び生存能力のないエンテロバクテリアシーは、培養成功の指標として使用される蛍光団を発現する酵素β−Ｄ−グルクロニダーゼを含むことが、なお一層好ましい。
【００６３】
そこからカイバードラッグが単離されるところの生存能力のないエンテロバクテリアシーは、次の特性を有する：
（ａ）それは生存能力がない、すなわち増殖又は複製することができない。
（ｂ）それはヒドロキシクマリン−７−グルコシド（ウンベリフォルムー７−グルコシドとしても知られている）をウンベリフォルム、すなわち７−ヒドロキシ−２Ｈ−１−ベンゾ‐ピラン‐２−オン（ヒドロキシクマリンとしても知られている）へと変換する能力を有しない。ここに用いるとき、この反応は、ＭＵＧ反応として特定する。これは、当業者に知られた標準のアッセイによって測定できる。Ｍ． Ｍａｎｏｔｉ， ｅｔ ａｌ．によるＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗ， ５５（３）， ３３５−３４８ （１９９１）中の、”Ｆｌｕｏｒｏｇｅｎｉｃ ａｎｄ Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｃ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ ｕｓｅｄ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ”を参照のこと。その内容は参照によりここに導入される。
（ｃ）それは、当業者に知られている標準のアッセイによる測定によれば、トリプトファンをインドールへと変換する（以下、インドール反応という。）ことができない。
（ｄ）それは、殺菌作用を、特にマイコバクテリアに対して有する。ここに用いるとき、「マイコバクテリア」は、土壌、水及び種々の動物組織中に存在する好気性のグラム陽性細菌の属である。それらは、結核及び脂肪症（ｌｉｐｏｓｙ）の原因因子である。それらの一例は、ノカルジアである。
（ｅ）それは、コリシン因子、すなわち、エンテロバクテリアシーのある種の菌株によって産生される一群のタンパク質であって同じ科のある種の菌株に対し殺菌性であるコリシンの産生を生物に許容する細菌性プラスミドを、有する。
（ｆ）それは、溶血を引き起こす抗体であるヘモリシンを産生する能力を喪失している。
（ｇ）それはエンドトキシン、すなわち、グラム陰性細菌の細胞から、細胞の破壊時に遊離される毒性のリポ多糖を、産生できない。
（ｈ）それは、熱非感受性の形であろうと熱感受性の形であろうと、如何なる形のベロ毒素も産生できない。
（ｉ）それは、ｃ−ＡＭＰアデニレートシクラーゼ又はｃＧＭＰグアニレートシクラーゼを産生するための如何なる活性因子も有しない。
（ｊ）それは、ＩＣＡＭ Ｉ−ＩＩＩのような接着性分子を持たず、細胞壁へウイルスが接着するのを許さない。
（ｋ）それは、ＥＨＥＣ及びＥＰＥＣに特徴的なｅａｅ遺伝子配列を有しない。
（ｌ）それは、桿状である。
（ｍ）それらは、粗な（Ｒ）、平滑な（Ｓ）又はムコイド状の（ｍ）形態のクラスに属し、如何なるヘモリシン活性材料も欠いている。
【００６４】
これらの同定要素の幾つか又は全てを用いて、ここに記載されたようにして増殖させた他の細菌から、生存能力のないエンテロバクテリアシーを選択することができる。
【００６５】
本発明のカイバードラッグは、ヒトを含む哺乳類の感染部位からエンテロバクテリアシー菌株を単離し、エンドトキシンを含まない菌株を標準のアッセイで決定されるところにより選択し、これらの菌株を培養して増殖させ、選択された菌株を、存在するかもしれないバクテリオシンを変性させるに十分な温度及び時間で熱処理し、そこからカイバードラッグを抽出し、次いで得られた産物を凍結乾燥して精製するという、標準の微生物的技術を用いて調製することができる。凍結乾燥ステップを精製ステップに先行させてもその逆でもよいことに注意すべきである。
【００６６】
以下に記述するように、エンテロバクテリアシーは、適切な種を選択するために使用される以下に特定する種々のアッセイに付され、それらは、ヘモリシン陰性菌株であることを、例えばシトロバクター又はサルモネラがそれぞれ存在しないことを確認するために自動ＶＩＴＥＫシステムに導入される。もしそれらが存在する場合には、それらの菌株は、連続培養及び更なるＶＩＴＥＫによる分析を通じてその後に除去されなければならない。
【００６７】
これらの具体的な微生物学的アッセイは何れも、病原性微生物を起源とする病原性材料を排除するために適用されている。特に、インドール及びＭＵＧ反応を含むこれらの感受性の高いアッセイの組み合わせは、大腸菌及び他の無毒の細菌のみが選択され同定されていることを保障する。
【００６８】
選択ステップにおいて、正しい菌株が選択されつつあること、及び選択された細菌が病原性材料を有しないことを確認するために、種々のアッセイが実施される。それらのアッセイの幾つかは、エンドトキシンを産生する能力のあるエンテロバクテリアシー中に存在する２種の酵素の存在又は不存在について試験するものである。それらは、トリプトファンデスアミン及びβ−グルクロニダーゼである。β−グルクロニダーゼは、上記のＭＵＧ反応を触媒する。大腸菌のトリプトファナーゼ（トリプトファンセスアミナーゼ、ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎｓｅｓａｍｉｎａｓｅ）は、Ｌ−トリプトファンのインドール、ピルビン酸及びアンモニウムへの脱アミノ化を触媒する。これは、微生物がそれ自身の遺伝子によってＬ−トリプトファンを産生する能力を有する場合に可能であり、それは本件ではエンテロバクテリアシー、特に大腸菌の特徴である。加えて、この酵素活性が加わっていることは、この戸特定の遺伝子が同一直線状に並んでいることを示しており、エンテロバクテリアシー、特に大腸菌に存在しうる如何なる変異体も無視するものである。陽性試験結果を与えた菌株は維持され、それらの酵素を有しないものは廃棄される。
【００６９】
これらの酵素の存在は、当業者に知られている標準的アッセイによって判定される。
【００７０】
β−グルクロニダーゼについての標準的アッセイは、Ｇ． Ｄａｈｌｅｎ， ｅｔ ａｌ．， Ａｐｐ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．， ２６， ８６３−８６６ （１９７３）； Ｓ．Ｃ． Ｅｄｂｅｒｇ， ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．， ２４， ３０８−３７１ （１９８６）； Ｋａｓｐｅｒ， ｅｔ ａｌ．， Ａｐｐ． Ｅｎｖｉｒｏｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．， ５３， １０７３−１０７７ （１９８７）に記述されており、これら全ての内容を参照によりここに導入する。
【００７１】
トリプトファンデスアミナーゼが存在するか否かを判定するための如何なるアッセイも利用できる。これらは、当業者に知られている。例えば、これは、上記のインドール反応を用いて判定できる。正しい菌株の選択の確認のために使用される他のアッセイの一つは、上に言及したＭＵＧ反応アッセイであり、これにおいては、ヒドロキシクマリン−７−グルコシド（ウンベリフォルム−７−グルコシドとも呼ばれる）が、ウンベリフォルムに変換される。この手順は、Ｍ． Ｍａｎｏｆｉ， ｅｔ ａｌ．によるＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ， ５５（３）， ３３５−３４８ （１９９１）中の ”Ｆｌｕｏｒｏｇｅｎｉｃ ａｎｄ ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｃ ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ ｕｓｅｄ ｉｎ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ” に記載されており、その内容を参照によりここに導入する。
【００７２】
インドールアッセイもまた、正しい菌株が選択されたか否かを確認するために使用される。インドールアッセイにおいては、トリプトファンが記載の条件下にインドールへ変換される。
【００７３】
用いられる別の試験の一つは、コリシン測定である。コリシンは、エンテロバクテリアシーによって産生される一群のタンパク質であり、同じ科の他の菌株の細菌に対して殺菌的である。種々のステップで単離された腸内細菌は、ノカルジアその他のようなマイコバクテリアを含む種々の細菌に対して、殺菌作用を有する。従って、このアッセイで陽性の結果を示す菌株は、望ましい菌株であり、そ他方、陰性の効果を示すものは廃棄される。
【００７４】
エンテロバクテリアシーの正しい菌株を選択するために用いられる別のアッセイの一つは、接着因子及びエンテロトキシンの存在又は不存在を試験するものである。これらは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）アッセイを用いて検出できるが、これはＢ． Ｓｃｈｕｔｚ ｅｔ ａｌ．によりＬａｂ Ｍｅｄ．，１７， ４９６， １９９３に記述されており、その内容を参照によりここに導入する。それは、周知のスクリーニング手順であり、ヒトに存在する種々のトキシンタイプ及びサブタイプを考慮に入れている。より具体的には、エンドトキシン遺伝子、例えばＬＴＩ、ＳＴＩ、ＶＴＩ及びＶＴＩＩ等のＤＮＡ配列に相補的な、合成オリゴヌクレオチドプライマーが用意される。細菌からゲノムＤＮＡが単離される。もしもＤＮＡポリメラーゼがゲノムＤＮＡを変性させプライマーを延長するならば、該菌株がエンドトキシンを含んでいると結論される。それらの菌株は廃棄される。もしも全く反応がなければ、該菌株はエンドトキシンを作ることはできず、それは維持される。
【００７５】
収集され更に収穫されたエンテロバクテリアシーは、陰性テスト結果を与えるコリシン試験を除き、上記の全ての試験において陽性結果を与えるということに注意しなければならない。適切な菌株が選択されているか否かは、単一のアッセイでは判定できず、適切な結果を与える一層多くのアッセイで判定されるほど、適切な菌株が選択される可能性が大きいことに注意しなければならない。それにも拘らず、ここに記述した単離過程を続ける前に、上記アッセイのうち少なくとも２つにより所望の結果がえられることが好ましい。更には、各収穫ステップの後に、以下に説明するように、選択された菌株が他の望ましからざる細菌によって汚染されていないことを保証するため、少なくとも２つのアッセイを実施しなければならない。
【００７６】
カイバードラッグは、破壊的副作用を伴う特定の疾病、例えば咳及び風邪、リウマチ、骨関節炎、単純ヘルペス感染、ＨＩＶ感染又は一連のブドウ球菌感染その他に罹っているヒト個人から選択された腸内細菌株の単離の、標準的なしかし制御された微生物的技術を適用し、次いで微生物菌株を培養して同定し、続いて該菌株を培養し、所望のコロニーを、望ましくなく従って廃棄される汚染された菌株から識別することにより調製される。この一般的手順は、スキームＩに例示されて、付属書類として添付されている。
【００７７】
哺乳類宿主の感染部位からサンプルが標準的技術により収集され、そこにある細菌が、固形増殖培地等のような、細菌を増殖させて収穫するのに典型的に使用される栄養素を含んだ寒天上に播種される。典型的な栄養素には、アミノ酸及びサンプル炭水化物が含まれる。細菌は、約３７℃にて少なくと１２〜１８時間増殖させられ、次いでコロニーが単離される。コロニーの各々からの細菌サンプルは、コリシンの存在及びエンドトキシンの不存在について判定するために、上に記述したような種々のアッセイに付される。加えて、β−グルクロニダーゼ及びトリプトファンデスアミナーゼの存在又は不存在を判定するために、ＭＵＧ反応及びインドール反応等のようなアッセイが実施される。より具体的には、乳糖利用に耐え、陰性ＭＵＧ及び陰性インドール反応を有し、そしてトリプトファンデスアミナーゼ又はβ−グルクロニダーゼを有さず、そして、上記したような標準的アッセイで判定したとき陽性のコリシン試験を有するものであるコロニーが単離される。
【００７８】
選択された細菌は、ショ糖を含んだ、好ましくは９７ウェルのマイクロタイタープレート中で再培養される。それらは、コロニー形成に十分な時間効果的な収穫温度で、好ましくは３７℃にて１８〜２５時間で、収穫される。所望により、しかし好ましくは、新たな変異が起こっていないことを確認するために、菌株はアッセイされる。すなわち、単離された細菌が無毒のエンテロバクテリアシー菌株であることを確認するために当該分野で知られているアッセイが実施される。そのようなアッセイとしては、ＭＵＧアッセイ、トリプトファンデスアミナーゼアッセイ、ＰＣＲアッセイ及びコリシンアッセイその他のような、上記した標準的アッセイが含まれるが、これらに限定されない。もしコリシン試験を除く全ての試験が陰性結果を与え、且つもしコリシン試験が陽性であれば、これらの過程が続行される。他方、もしそれらが上記した何れかの試験（コリシンアッセイを除く）において陽性結果を与えるか、又は、コリシン試験において陰性結果を与えるならば、培養をやり直すか、又は、新たなサンプルを得て上記の手順が行われる。
【００７９】
菌株は、臨床上関連のある菌株の同定及び耐性の測定のために当業者に用いられている周知の自動的システムであるＶＩＴＥＫの使用による等のような、当該分野で知られている技術によって同定される。ＶＩＴＥＫは、重要なグラム陽性及びグラム陰性細菌並びに酵母を同定することができそして抗生物質感受性試験を行うものである、臨床微生物学において使用されている自動化されたアッセイシステムである。ＶＩＴＥＫの使用は、Ｃ．Ｃ． Ｐｉｅｒｓｏｎ ＆ Ｋ．Ｄ． ＭｃＣｌａｔｃｈｅｙ により Ｊ． Ｌｅｄｅｒｂｅｒｇ編 ”Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ”， Ｖｏｌ． １， ｐｐ． １７１−１７９ （１９９２）， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ中の、”Ａｕｔｏｍａｔｉｏｎ ｉｎ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ” に記載されており、その内容を参照により導入する。ＶＩＴＥＫ自動化システムは、商業的に入手でき、例えば、ミズリー州のＢｉｏＭｅｒｉｅｕｘ Ｖｉｔｅｋ Ｉｎｃ． によって販売されている。
【００８０】
選択された菌株は、次いで培養され、そして当該分野で知られた技術を用いて収穫される。それらは、例えば糖（例えばグルコース）及びイオウを含むアミノ酸（又はタンパク質）を含有し、増殖及び複製に効果的な温度にて十分な時間コロニー形成するよう増殖させた寒天上に収穫されることが好ましい。増殖に通常使用されている栄養素を含有したｅｎｄｏ−Ａｇａｒ又はＤｉａｇｏｎａｌ Ａｇａｒ樹脂上で、増殖に有効な条件下に、且つ増殖が観察されるに十分な時間、菌株を培養することがなおも一層好ましい。好ましい培地及び栄養素は、表Ｉに記載され、最も好ましくは表ＩＩに記載されており、付属書類として添付されている。栄養素は、タンパク質及び糖（例えばグルコース）及び塩及び所望により、ビタミンＢ、例えばビタミンＢ６、Ｂ１及びＢ１２その他及び水溶性ビタミン、及びシステイン、シスチン又はメチオニンのようなイオウ含有アミノ酸、酵母エキス及び水を含有することが好ましい。それらは、３７℃にて１８〜２４時間増殖させるのが好ましい。
【００８１】
ｅｎｄｏ−Ａｇａｒは、特にグラム陰性好気性エンテロバクテリアシーに、そして取り分け桿状の性質のものに、非常に選択的な樹脂であると考えられている。増殖させる好ましい菌株は、大腸菌又はシゲラのような、Ｂ−Ｄ−グルクロニダーゼを含んだ菌株である、というのは、この酵素は、指標として使用できる蛍光団ウンベリフェロンを発現するのに有用だからである。
【００８２】
少量または大量の適切な菌株を培養する別の一方法は、ｐＨ７．０及び約３０℃における酸素の追加的存在下での、細胞に結合したバクテリオシン（例えば大腸菌の場合コリシン）又は細胞内に結合した柱状材料を保存する、固形のＥｎｄｏ−Ａｇａｒ又はＤｉａｇｏｎａｌ Ａｇａｒの使用によるものである。
【００８３】
代わりとして、同定された菌株を、当該分野で知られている標準的技術を用いて増殖させる。例えば、それらは、当該分野において当業者によって利用されている通常の培地、例えば大腸菌を増殖させるためならブイヨンを用いて、滅菌条件下の生物反応器中において増殖させることができる。
【００８４】
選択された細菌は、有効な収穫温度で且つコロニー形成させるのに有効な量の時間に亘って、例えば３７℃にて約１２〜１８時間、生物反応器中でブイヨン培地上で培養されることが好ましい。生物反応器は、より効率的であり、細菌は、寒天上におけるよりも生物反応器中において一層速やかに増殖する。ブイヨン培地は、６．５〜７．５の範囲のｐＨを有することができる。前の収穫ステップにおけるように寒天培地を用いることができるが、ブイヨン培地がこの段階では好ましい、というのは適切な菌株の増殖が寒天培地上におけるより有意に速く、またエンテロバクテリアシーの適切な菌株の殆どは、すでに選択されているからである。
【００８５】
選択された菌株及び収穫されたコロニーは、次に、表Ｉの、より好ましくは表ＩＩの栄養素を含んだＤｉａｇｏｎａｌ Ａｇａｒ樹脂上で、これを収穫するために効果的な長さの時間に亘って、効果的な温度で培養される。菌株は、約３７±１．０℃で約１２〜１８時間インキュベートすることが好ましい。
【００８６】
好ましくは、細菌は、効果的な収穫条件の下で、細菌を増殖させるのに十分な時間に亘って、Ｄｉａｇｏｎａｌ Ａｇａｒ上で培養される。Ｄｉａｇｏｎａｌ Ａｇａｒ上で増殖させると、細菌の殻が形成される。通常、細菌は、Ｄｉａｇｏｎａｌ Ａｇａｒ（固形増殖培地）上で５〜１０℃にて貯蔵される。これらの細菌は、複製しないか、又は複製するとしても、このステップ以前よりも遅い速度で複製する。加えて、Ｃｏｌ＋大腸菌（すなわち、コリシンを含む大腸菌）による作用により、固形増殖培地上でのみ増殖する。
【００８７】
交差汚染のないことを保証するために、菌株が、仮に存在したとしても最少量の毒素しか含まないエンテロバクテリアシーであることを確認するために、当業者に知られている標準的技術を用いて該菌株をアッセイすることが好ましい。ここに用いるとき、「最少」の語の使用により、該菌株が病原体を含まないこと、又はもし毒素が存在するときは、それらが上述のＰＣＲアッセイによって検出されない量で存在することを意味する。従って、寒天上で培養された細菌を、毒素が存在するか否か判定するため試験することが好ましい。アッセイの結果が陰性であれば、次いでカイバードラッグを調製する過程を継続しなければならない。そうでなくて、もし陽性であれば、該菌株は廃棄されなければならない。
【００８８】
上記のプロトコールからの逸脱又はｐＨ、温度の変更、又は増殖培地への栄養素、特に、（＋）−Ｓ−アデノシルメチオニンのようなイオウ含有アミノ酸又は水溶性ビタミンを含有する酵母エキスの追加は、カイバードラッグの量、選択の及び更には材料の精製の容易さに影響を及ぼす。当業者は、しかしながら、エンテロバクテリアシーの増殖のための適切な条件を容易に決定することができる。しかしながら、最も好ましい培地は、付属書類の表２に掲げたものである。これらがコリシン様材料（バクテリオシン）の産生を、特に選択された細菌をブイヨン中一定のｐＨ６．５で増殖させたとき、最大にするからである。更には、細胞内及び／又は細胞外バクテリオシン様材料の合成は、固形寒天を用いると誘導される。後者の場合には、細胞外の結合したタンパク質性材料は、ブイヨン中に遊離されるが、細胞内結合材料は、選択された微生物とともに残る。バクテリオシン様材料の産生は、選択された微生物を、マイトマイシンＣを含んだ培地に曝すか又は酸素の存在下に紫外光に曝すことにより、誘導される。本発明者等は、骨関節炎又は慢性間接リウマチに罹っている患者の糞より得られ、次いでＬ（＋）システイン又はＬ（−）メチオニンの存在下に、それぞれＯ２及びマイトマイシンＣの存在下に増殖される大腸菌株の約３０〜３５％が、コリシン陽性（Ｃｏｌ＋）であると見積もっている。
【００８９】
コリシン又は、バクテリオシンを含むコリシン様材料をコードする遺伝子は、接合や細胞対細胞接触のような方法で腸内細菌の科に属する他の類似の菌株に容易に伝達できるコプラスミド（ｃｏｐｌａｓｍｉｄ）上に殆ど専ら位置している。しかしながら、本件培養及び単離において、コリシン及びバクテリオシン様材料の活性は、腸内細菌の培養物の狭い範囲に対してのみ有効である。
【００９０】
培養した菌株は、バクテリオシン様物産生菌株を、それら自身の毒性代謝物から保護することができる。免疫の原因となるそれらタンパク質の最大発現は、該菌株を非誘導性機序を介して、例えば、マイトマイシンＣの不存在下に、但し、イオウ含有アミノ酸又は酵母エキス、水溶性ビタミン及び酸素の存在下に、増殖させたときに起こる。しかしながら、これらのタンパク質化合物の発現はまた、ごく少ない割合のバクテリオシン産生細胞のみがバクテリオシンを産生するときにも起こる。これらの条件下においては、実質的に全ての細胞が、遊離の免疫タンパク質を産生していることの証拠を示す。これらの阻害系の調節は、構成的であり、適切な免疫決定プラスミドの指令下にある。
【００９１】
この段階で選択された細菌は、如何なる複製機構も含まない。それらの特性は、付属書類の表ＩＩＩに纏められている。しかしながら、拘束されることは望まないものの、それらは依然として、損傷を受けたプラスミドを修復する酵素の連続的合成の阻止を担うＬＥＸ Ａタンパク質、及びコリシン又はコリシン様材料を、それぞれ含んでいると信じられる。本発明による細菌、特に酸素の存在下に及びイオウ含有アミノ酸を含んだＥｎｄｏ−Ａｇａｒの存在下でのｐＨ７．０で増殖する細菌の選択のため、ＤＮＡの修復プロセスもＤＮＡ生合成に特異的な酵素の合成も不可能であると信じられ、従って、複製過程が阻害される。それまで存在したＤＮＡ及びＲＮＡは、それぞれＤＮＡｓｅ及びＲＮＡｓｅの亢進した活性のため、分解する。
【００９２】
拘束されることは望まないが、例えば大腸菌等の増殖しつつある細胞中のオペロンの発現は、これら特定の細菌において、間違いを犯しやすいＤＮＡ修復を制御するＳＯＳ系によって調節されていると信じられる。ＳＯＳ制御は、ＬＥＸ Ａタンパク質及びＲＥＣタンパク質に、それぞれ関わっている。更には、ポア形成コリシン又はバクテリオシンのそれぞれ非常に有力な候補であるオペロンプロモータは、ＬＥＸ Ａタンパク質が結合して、損傷ＤＮＡを修復する酵素の合成を妨げているものである、２個の重なり合ったＳＯＳボックスよりなるＬＥＸオペレータ配列を含んでいる。更には、ＬＥＸ Ａタンパク質は、コリシン様材料及び溶菌タンパク質の生合成を妨害しているものと信じられる。ＤＮＡ傷害性の因子への又はＤＮＡ複製の阻害因子への暴露は、ＲＥＣ Ａタンパク質のそのプロテアーゼへの可逆的活性化の原因となる誘導されたシグナル（マイトマイシンＣ）の発生をもたらすものと信じられる。活性化されたＲＥＣ Ａがタンパク質は、次いで、ＬＥＸ Ａリプレッサを切断し、ＳＯＳ制御遺伝子の抑制解除をもたらし、続いてバクテリオシン様及び溶菌タンパク質の産生をもたらす。従って、溶菌タンパク質の過剰産生は、早期の細胞死をもたらし得るが、これは、構造的及び溶菌遺伝子とは反対の方向に配向しているように見える免疫遺伝子によって制御されているように思われ、ＳＯＳの制御下にはないように思われる。見たところ、ＳＯＳ系を含むこのレギュレータは、この場合グルコース培地、イオウ含有アミノ酸及び／又は酸素存在下の酵母エキスの存在によって影響を受け得る、というのは、コリシン産生が減少するからである。従って、レギュレータは、転写が起こるためにはプロモータ領域に結合する筈であり、これは上記の過程によって阻害される。こうして、入手できる栄養素は、代謝活性を制御するのを助ける。更には、本件方法の培養条件下においては、複製は阻害され、ＤＮＡ断片を担持する鋳型が入手できない。こうして、細胞は、見たところかなり萎縮しており、次のステップにおいて濯ぎに付されたとき、以前には係留されていた、外側にある流体力学半径約０．６μｍのサイズのリポオリゴ糖（カイバードラッグ）を遊離する。
【００９３】
選択された菌株は、次いで水性溶液、より好ましくは食塩溶液又はフェノールによって濯がれる。例えば、選択された菌株は、希薄な食塩溶液又はフェノール溶液で濯がれてよい。食塩溶液の濃度は、約２％（ｗ／ｗ）未満であり、より好ましくは１．５％（ｗ／ｗ）未満であり、更に好ましくは約１重量％未満である。食塩溶液の濃度は、約０．５％（ｗ／ｗ）ないし約１．５％（ｗ／ｗ）であり、より好ましくは約０．７％ないし約１．１重量％であり、更に好ましくは約０．９％食塩溶液である。
【００９４】
好ましい希薄フェノール溶液は、約０．０１％ないし約１％（ｗ／ｗ）、より好ましくは約０．１％ないし約０．５％（ｗ／ｗ）、そして最も好ましくは約０．２５％である。産物の穏やかな濯ぎは、予備調製されたカイバードラッグを形成する。
【００９５】
最終のステップは殺滅、すなわち、細菌を破壊することである。これは、緩和な条件下に、熱処理、放射線、細菌を極端なｐＨに付すこと、タンパク質分解その他によるような、当業者に知られている技術を用いて実施される。細菌を殺して存在するタンパク質を変性させるに十分な条件の下で、熱処理に「細菌」を付すことによって細菌を殺すことが好ましい。好ましくは、不活性化は、６０℃より高い温度、より好ましくは６５℃より高い温度であるがしかし１００℃未満、そして最も好ましくは７５℃で行われる。それらは好ましくは、食塩溶液（例えば、ＮａＣｌ）中で行われる。目的が達成されるよう、好ましくは、細菌はこの処理に約２時間に亘って付される。
【００９６】
細菌のこの開示された殺滅、例えば、固形のＥｎｄｏ−Ａｇａｒ又はＤｉａｇｏｎａｌ Ａｇａｒから、スキームＩにより等張ＮａＣｌ溶液でそれぞれ洗い出した後の最終的に製造されたカイバードラッグの、熱処理による殺滅は、カイバードラッグの収穫に際して細胞外に結合したバクテリオリシン様材料による汚染が起こらないことを保証する。細胞外に結合しているバクテリオシン様タンパク質は、約５５〜６０℃より高い温度で不安定であり、より高い温度での熱処理は、最終産物が、望んでいない内因性の有機材料を含まないことを保証する。これは、感度の高い紫外検出系を用いた非常に感度の高いＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）分析により、又は、エチジウムブロマイド又はフルオレッセインのような結合した蛍光指標の存在下に、それぞれ励起波長２９５ｎｍ及び発光波長３６７ｎｍで、分析することができる。この熱処理は、カイバードラッグを含んだ細菌の殻を与える。
【００９７】
Ｄｉａｇｏｎａｌ Ａｇａｒ上への細菌の負荷に依存して、生存能力のある細菌が単離される、といのは、それらはペトリ皿上で培養されるからである。しかしながら、ｉ）これら増殖した微生物は、選択過程のため、ＰＣＲ法で試験したところでは病原体でない。更には、もしもこの懸濁液が、上記したような且つスキームＩに従った、例えば７５℃までの加熱のような、細菌を殺す条件に付されるならば、複製は完全に失われ、カイバードラッグのみが後に残る。
【００９８】
更には、遊離されたカイバードラッグは、０．９％の塩の存在下に、ある種の動的なミセル形態をとることができ、これはｐＨ、温度及び対イオン、特にＣａ＋＋及びＭｇ＋＋に依存する。これらのコンフォメーション変化又は物理的形態変化は、光散乱技術によって観察したところによれば、カイバードラッグ分子の頭部の基における電荷相互作用（モノマー：ミセル平衡）によって駆動されている（コロイド結晶）。粗なものからから平滑なものまで、非常によく似た相互作用がカイバードラッグ分子間に起こっている。
【００９９】
拘束されることは望まないが、低食塩ＮａＣｌ溶液によってもたらされる低浸透圧が、殻からのカイバードラッグの分離を促進するものと信じられる。所望により、得られた産物が望みの材料を含有していること及び増幅されることのできる物質を含有しないことを確認するために、追加のＰＣＲ試験を行うことができる。例えば、核酸又はオリゴヌクレオチドは存在せず、すなわち、カイバードラッグを汚染していない。従って、不活性化ステップは、追加の安全確保ステップであるのみならず、Ｄｉａｇｏｎａｌ Ａｇａｒと共に、重要な製造ステップでもある。このことは、細菌の「殻」が、如何なる複製する材料も欠いていることを意味している。なぜなら、他の全ての夾雑物又は夾雑細菌が除去されているからである。加えて、複製機構が残っていてはならない。従って、リボソームでの生合成に関与するタンパク質の残滓も存在しない。
【０１００】
代わりとして、食塩溶液又はフェノールの代わりに、選択された菌株は、ＥＤＴＡナトリウム、０．００２５％（ｗ／ｗ）フェノール、０．００５〜０．０１５％（ｗ／ｗ）ＺｎＣｌ２で、又は、０．１〜０．００１％（ｗ／ｗ）ＺｎＣｌ２−Ｄ−グルコン酸の溶液で、濯がれてもよい。洗液は、外来の又は敵対的な細菌、ウイルス又は免疫調節効果に対する高められた応答に関連した全ての特異的な医薬的活性を含んでいる。細菌の殻の外表面を濯ぐことにより、リポ多糖が遊離されるが、しかしそれは食塩溶液のイオン強度と温度とに大きく影響される。低いイオン強度を有するｐＨ４．５〜７．０の食塩溶液による洗浄が、カイバードラッグの調製には必須である。食塩水の代わりに、「細菌」を、更にトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン・ＨＣｌ）で洗浄してもよい。しかしながら、低濃度のトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン・ＨＣｌ（例えば、１５〜５０ｍＭの範囲又はこれ未満）を利用しないことが好ましく、もし使うのであれば、少なくとも約１００ｍＭ（ｐＨ７．０）の濃度で存在することが好ましい。他のアミン類は、低い濃度であっても、濯ぎ剤として使用してよい。また、エンドトキシンが存在しないことを保証するために、ＰＣＲ反応性の材料の試験を所望により実施してよく、そしてもし結果が陽性であれば、菌株は廃棄されるが、もし陰性であれば、手順が続けられる。
【０１０１】
しかしながら、こうして得られたカイバードラッグは、細菌の殻から抽出されてよく、次いで、薬剤処方とするに先立って当該分野で知られた方法により精製されてよい。典型的な２つの方法が、スキーム２に概説されている。
【０１０２】
一つの方法では、カイバードラッグは、メタノール／クロロホルム又はメタノール／アセトニトリルで抽出される。この方法では、ＣＨＣｌ３／ＣＨ３ＯＨ又はＣＨ３ＣＮ／ＣＨ３ＯＨは、好ましくは約４：１〜１：４（ｖ／ｖ）の範囲の濃度で、そしてより好ましくは約１：１（ｖ／ｖ）で、使用される。カイバードラッグは、好ましくは攪拌しながらそれらの中に入れられ、細菌の殻からカイバードラッグを抽出するに十分な条件下に加熱還流される。カイバードラッグは、そこから沈殿し、そして収集される。粗製のカイバードラッグは、次いで、クロロホルム、メタノール、アセトン、酢酸、プロピオン酸その他のような溶媒を用いて、シリカ又はアルミナ又はメタクリル酸を吸収剤として用いた、又は、Ｓｅｐｈａｄｅｘカラム又はＤＥＡＥセルロースカラム又はＢｉｏＧｅｌを用いた分子排除クロマトグラフィーＨＰＬＣ等のような、クロマトグラフィーに付される。好ましい具体例においては、沈殿は、分離用ＨＰＬＣ中で室温にて精製され、吸着剤は、ＲＰ−１８、（メタクリレート）Ｓｅｐｈａｄｅｘ， Ｇ−１００， Ｇ−２００， Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ２Ｂ， ＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ， Ｇ−７５ 媒質その他である。好ましくは、例えば約５０〜１００μｍのメッシュサイズのメタクリレート等の球状のマトリックスを用いた較正されたＨＰＬＣカラム及び該ＨＰＬＣカラムに取り付けられた光散乱検出器が、標準によってＨＰＬＣカラムを較正した後に、カイバードラッグのサイズと質量とを確認するために使用される。これは、カイバードラッグのサイズ及び形状を連続的にモニターすることを許容し、そして最終産物が製造を通じて確認されることを許容する（工程管理）。
【０１０３】
ＨＰＬＣは紫外検出器に連結され、５５０ｎｍにて吸収のある材料が収集される。画分はプールされ、産物は凍結乾燥される。
【０１０４】
代わりとして、細菌の殻は、水性懸濁液を形成するよう、２０〜３０℃にて塩溶液中で連続攪拌に付される。塩は低いイオン強度で存在し、例えば０．５モル未満、そしてより好ましくは０．２モル未満であるが、しかし０．０５Ｍより高い。最も好ましくは、塩濃度は０．１５４Ｍである。好ましい塩は、ＫＣｌのような無機塩であり、特にＮａＣｌその他である。水性分散液は、細菌の殻から実質的に全てのカイバードラッグを除去するよう、効果的な条件下に十分な時間攪拌される。水性懸濁液は、次いで、例えば０．１ないし１０ｍｌ／分のような効果的な流速で、２０℃にて、６．５ないし７．５のｐＨを有する緩和な塩溶液（ＮａＣｌ）のような溶媒の存在下に２５℃にて、Ｓｅｐｈａｄｅｘカラム、好ましくはマトリックスとしてＳｅｐｈａｒｏｓｅ ２β又は６β又はＢｉｏＧｅｌを通される。２３０ｎｍ及び５５０ｎｍに吸収を有する材料が収集され、後者は、変性されたリピドＡの凝集体の紫外吸収であり、対して前者は、紫外におけるモノマー吸収である。活性の画分がプールされ、次いで凍結乾燥に付される。プールされた凍結乾燥済み画分は、６：１ないし１：１（ｖ／ｖ）、より好ましくはそれぞれ約５：１ないし約３：１（ｖ／ｖ）の範囲、そして最も好ましくは約４：１の比率のＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ又はＣＨ３ＣＮ／ＭｅＯＨにそれぞれ溶解され、そしてカイバードラッグを分離するに十分な時間に亘って加熱還流され、これは次いで、当該分野において知られている標準的方法を用いてクロマトグラフィーにより精製される。好ましくは、それは２５℃にてＤＥＡＥセルロースクロマトグラフィーカラムに通され、溶離液はアセトニトリルとメタノール又はＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ溶液であり、ここにアセトニトリル又はクロロホルムとメタノールとの比率は、約６：１ないし約１：１、より好ましくは約５：１ないし約３：１（ｖ／ｖ）、最も好ましくは約４：１（ｖ／ｖ）である。これに１リットル当たりで添加されるのは、０．００から０．７５Ｍ濃度までの酢酸塩又はプロピオン酸塩勾配である。
【０１０５】
そのリン酸含量は、リン酸イオン検出器を用いて定量される。リン酸検出器はカラムに接続してよい。いずれにせよ、溶離液がリン酸検出器を通過するときに、リン酸濃度が測定される。測定できる如何なるリン酸含量も含まないか又は最小限の量のリン酸しか含まない画分が収集される。各画分の紫外はまた、５５０及び２３０ｎｍで測定される。また、溶離液が紫外検出器を通るようにカラムに紫外検出器を取り付けることが好ましい。５５０ｎｍ及び／又は２３０ｎｍに紫外吸収を示す画分のみが収集されプールされる。
【０１０６】
カイバードラッグの、質量分布を含むサイズの変動、及び材料のモノマー状態であることの、すなわち温度に誘発され又は塩に誘発された凝集のないことの確認は、先に述べたＳｅｐｈａｒｏｓｅ ２Ｂ又は６Ｂを用いたゲルろ過クロマトグラフィーを通す何れかの方法を用いて、モニターできる。排除限界は１０×１０６Ｄａであり（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ２Ｂ）、包摂体積は１００，０００Ｄａより小さい分子に割り当てられる。蛍光色素の不存在下での２２０、２６５及び２８０ｎｍにおける溶出材料の同時測定は、カイバードラッグの純度及び均質な化学組成（それぞれ、ヌクレオチド及び核酸による、及び吸収のあるタンパク質による如何なる汚染もないこと）を記録するであろう。絶対スケールでの材料の実際の吸収は、適当なセルを備えた光散乱検出器を用いて屈折率の増分（ｄｎ／ｄｃ）Ｔ，ｐの変化を測定することにより、６６０ｎｍでモニターできる。得られた結果は、上記した静的光散乱実験、透過型電子顕微鏡及びＨＰＬＣにより導かれるものと整合する。カイバードラッグのサイズと濃度の測定と確認のための好ましい溶出系は、定組成勾配及びミクロスフェアカラム（Ｂｅｃｋｍａｎ， ＵＳＡ）であり、その中でカイバードラッグは、０．１０〜０．１９０ＭのＮａＣｌを含有する水性溶媒中に分散される。カイバードラッグサンプルの屈折率（ｄｎ／ｄｃ）μ、Ｔ（ここにμは化学ポテンシャルでありＴは絶対温度である）は、屈折率増分の較正後、参照により双方をここに導入するものであるＨ．Ｈ． Ｐａｒａｄｉｅｓ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｐｈｙｓ． Ｃｈｅｍ．， １００， ９８８１−９８９１， １９９６及びＨ．Ｈ． Ｐａｒａｄｉｅｓ， Ｊ． ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２５４， ７４９５−７５０５， １９７９に記載されたインターフェロメトリー法を適用して、約０．１６０±０．０００５ｍＬ／ｇと測定された。
【０１０７】
これら２つの技術の何れかに従うことにより、実質的に精製されたカイバードラッグが得られる。好ましくは、純度約７０％を超え、より好ましくは純度約８５％を超え、最も好ましくは少なくとも純度９０％である。
【０１０８】
ここに記載の手順の使用は、前述のようにこれらの病原因子を欠いた菌株のみの選択を許容する。当該分野において知られた手順に従った増幅方法の適用は、適切な菌株の単離を許容し、毒性のものからの適切な微生物株の分離を保証し、そして最終産物、すなわちカイバードラッグを提供し、これは如何なる致死的な又は病原的な因子をも欠いている。
【０１０９】
大量培養前に微生物を得るためのこの選択過程は、所望の材料を得るのに成功するのに必須の部分である、というのは、それは、更なる培養及び収穫に、それぞれ用いられるカイバードラッグの如何なる有毒な又は病原性の汚染も存しないことを明らかにしているからである。特に、病原的な外観の典型的な特徴を有するものからの該微生物の選択は、分析上の理由並びに産業規模での更なる処理のための病原性の細菌株、ウイルス又はバクテリオファージ様材料の除去（ＰＣＲ法）に関する安全性から、この過程を非常に特別且つ魅力的なものとしている。
【０１１０】
物理的−化学的分析及びカイバードラッグの安定性
この開示に従って得られたサンプルの分析は、塩の不存在下における及び塩溶液の存在下における、材料のサイズと形状とを推論するために拡散波分光光度法を含む静的及び非弾性光散乱実験によって行った。利用した技術は、Ｐａｒａｄｉｅｓ， Ｃｏｌｌｏｉｄｓ ＆ Ｓｕｒｆａｃｅｓ， ７４， ５７−６９， １９９３に記載されており、参照によりその内容をここに導入する。本発明者等は、カイバードラッグのサンプルが、一定の化学ポテンシャルにおいて、僅か１０〜１５％のみというかなり小さい分散（δ）の、０．６５μｍという一定の直径を有することを見出した。一定のｐＨ（６．９）及び温度における０．１５３Ｍ ＮａＣｌのイオン強度においてのカイバードラッグのサイズの分散（δ）は、イオン強度を０．３５０Ｍ ＮａＣｌに高めても有意な変動をしなかった。しかしながら、非弾性光散乱実験によって測定され且つ減衰スペクトルの自己相関関数から得られる流体力学的半径の萎縮が認められ、そこでは０．１５３Ｍ ＮａＣｌ（２０℃）における０．６５μｍという平均値から０．３５０Ｍ ＮａＣｌ（２０℃）における０．５７±０．０６μｍへの変化が見出され、これは、塩濃度を最初の濃度へと戻したとき可逆的である。更には、０．１５３Ｍ ＮａＣｌ（２０℃）未満では、カイバードラッグは、０．０１５Ｍ ＮａＣｌにおいて平均０．７０±０．０８μｍへと広がり、これもまた可逆的である。
【０１１１】
得られるカイバードラッグは、コロイド状の固体であり、結晶の形で存在する。
【０１１２】
本発明のカイバードラッグは安定である。
【０１１３】
拘束されることは望まないが、カイバードラッグのコロイド安定性は、あるサイズの粒子間での静電的及びリフシッツ−ファン・デア・ワールス電気力学的相互作用を考慮に入れたＤＬＶＯ理論（Ｅ．Ｊ． Ｖｅｒｗｅｙ， Ｊ． Ｔｈ． Ｏｖｅｒｂｅｅｋ： Ｔｈｅｏｒｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ Ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ Ｃｌｌｏｉｄｓ； Ｅｌｓｅｖｉｅｒ， Ａｍｓｔｅｒｄａｍ １９４８）によって理解できると信じられる。カイバードラッグ及び大腸菌のコロイド安定性は、それぞれ、電気泳動光散乱及び粒子電気泳動から測定したところではそれらの外表面は負電荷を担持しているが、エネルギー距離曲線の性質によって解釈される。例えば２個の球Ａ及びＢ（ＡはＢと等しくてもＢとは異なっていてもよい）に関し、カイバードラッグについて決定された平均値（０．６５μｍ）を考慮して、分離距離へのＡ−Ｂ相互作用の依存の様式が計算できる。驚くべきことに、カイバードラッグについては値はプラスであり、これに対し大腸菌での値は、如何なる距離においても何れもマイナスである。Ａ−Ｂ相互作用が静電的及びファン・デア・ワールス相互作用に対して優勢である場合、大腸菌（複製中の状態）は、速やかに凝集しなければならない（これが実際起こる）が、一方カイバードラッグは、実にその反発性のＡ−Ｂ相互作用のため、一定の化学ポテンシャル、例えばイオン強度及び一定の温度において、分散したままである。典型的な２層形の相互作用とは異なって、カイバードラッグについて認められたところによれば、Ａ−Ｂ相互作用のポテンシャルは、イオン濃度及びｐＨの変動に対しておおむね非感受性である、従って、それらの狭いサイズ分布及びイオン強度の小さな変化に対する非感受性が説明付けられる。カイバードラッグは、数週間という期間に亘って安定なままである。この状態は、０．２５％（ｇ／ｇ）のフェノールが存在するときも変わらない。カイバードラッグのコロイド安定性は、ある数密度のカイバードラッグについて、ＮＭＲ技術により水和の程度の、並びにｎｇ−天秤（水晶）を用いて実際の質量の変化を測定することによって、更に実証される。上記の手順に従って得られたサンプルについての測定値は、（１．５１±０．００９５）×１０−４ｇ／ｍＬという平均の質量密度、０．１５×１０−４ｇ／ｇ（ｇ水／ｇカイバードラッグ）という水和度を明らかにし、これは、０．１５３Ｍ ＮａＣｌの存在下における材料の全質量の約３０％である。非弾性光散乱実験（該方法及び設備は、Ｐａｒａｄｉｅｓ ｅｔ ａｌ．によりＪ． Ｐｈｙｓ． Ｃｈｅｍ． ９８， １１１４３−１１１６２， １９９４又は同書１００， ９８８１−９８９１， １９９６に開示されており、両者の内容を参照によりここに導入する）により得られる、自己相関関数から決定されるところによるこれらの条件下における並進拡散係数（ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ ｄｉｆｆｕｓｉｏｎ ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ）及びその分散は、表面ポテンシャル０．１７±０．０２Ｖを有する、Ｄ＝０．４３２μｍ２／ｓ、及び粒子密度＜η＞＝２．１８×１０１８ｍ−３という値を与えた。更には、μｍ粒子の弱い相互作用に由来するカイバードラッグのオパール色形成の観察は、１．７ｎｍの点対点解像度���有する透過型電子顕微鏡法（ＴＥＭ、２，０００ｋｅＶ）によっても記録できる（Ｆｉｇ．１）。コロイド安定性に関するこの知見は、観察されたカイバードラッグの「立体配置」が、多分散粒子の中間視的ファン・デア・ワールスエネルギーの最小化に対応していることを実証している。しかしながら、駆動力は分散引力のサイズ依存性である。加えて、驚くべきことに、注意すべき３つの重要な特徴がある。すなわち、中心に最大の粒子（約０．６〜０．６５μｍ）が配置され、極限の境界に最小の粒子が配置された状態の、「島」内における粒子サイズの半径方向分布が高度に観察される。第２に、最も近隣のもの同士の分離は、関与する特定のカイバードラッグのコアサイズからは独立である。最後に、大きな粒子は僅か約３％の全サイズ分布しか構成しないが、０．１５３Ｍ ＮａＣｌの存在下にそれらは核を成してこのオパール色のカイバードラッグの形成を駆動することができる。得られた結果は、静的光散乱測定結果と整合し、そのことは、約０．５６μｍの流体力学半径及び、高度に負電荷を帯び且つｐＨ依存性並びに塩依存性である厚い外殻を有する中空の球状粒子に近い形状を、明らかにしている。
【０１１４】
光散乱曲線は、０．１５４Ｍ ＮａＣｌ（２５℃）の存在下での低体積画分にてカイバードラッグのコロイド結晶から得ることができる。（Ｆｉｇ． ６を参照）。その結果は、同じ条件下に３７℃（これは、カイバードラッグの融点付近である（Ｆｉｇ． ７））にてカイバードラッグのコロイド結晶から得られた光散乱曲線と比較することができる。これらの結果は、同一の条件下に同じ材料について同時に実施された非弾性光散乱実験及び拡散波分光光度法から得られた結果と合わされて、この材料（カイバードラッグ）が、強い静電気力と流体力学的相互作用によって安定化され相互に分離されている多数のコロイド結晶より構成されている、という結論を支持している。この結論は、３７℃におけるＸ線回折パターン（Ｆｉｇ． ８Ｂ）に対して比較したときの２５℃におけるＸ線回折パターン（Ｆｉｇ． ８Ａ）によって、更に支持されている。
【０１１５】
動的光散乱測定及び静的光散乱測定は、ＡＬＶ光散乱ゴニオメータ５０００（Ｌａｎｇｅｎ，ドイツ）によって測定された。このゴニオメータは、散乱角（Θ）１５°から２５０°までをカバーし、６３３ｎｍの光源としてＨｅ−Ｎｅレーザ（１０ｍＷ）が用いられた。この光源は、２つの針穴を通した後、垂直方向に偏光され、焦点は、セルの中心に置かれた。測定は、カイバードラッグの懸濁液が結晶様でありカイバードラッグの構造がｆｃｃすなわち面細密充填（ｆａｃｅ ｃｌｏｓｅｄ ｐａｃｋｅｄ）及び／又はｂｃｃである。更には、カイバードラッグの結晶格子は、ｆｃｃ亜相（ｓｕｂｐｈａｓｅ）からｂｃｃ相へと、ある条件下に変換できる。より具体的には、ｂｃｃ格子変換は、ｉ）塩濃度が約０．１Ｍより、一層好ましくは０．０７Ｍ ＮａＣｌより低下するとき、ｉｉ）懸濁液の温度が約５０℃より、一層好ましくは約３７℃より低下する（約２０〜２５℃）とき、ｉｉｉ）球の電荷密度が、立体配置変化のために高分子電解質の単位電荷（上を参照）より寧ろ低いとき、又はｉｖ）浸透圧が低く且つカイバードラッグを含有する懸濁液の調製から時間が経過し、又は塩の存在下の又はコロイド結晶の形成中にｐＨが変わらないカイバードラッグの調製の技術のときに、高いことが認められた。
【０１１６】
カイバードラッグは、生理学的及び／又は薬剤学的条件下には、自己会合しない。低いイオン強度（１ｍＭ ＮａＣｌ及びこれより下、例えば０．０５ｍＭ ＮａＣｌ）では、サイズ分布は、水和のため僅かに増加するが、カイバードラッグの当初の質量は、有意には変わらない。イオン強度の増加（２５０ｍＭ ＮａＣｌ）は、カイバードラッグの実際の、検出される質量を変えず、ＮＭＲ測定によって定量したとき１０〜１５％という水和を減少させるのみである。
【０１１７】
この挙動はまた、一定の温度での種々のイオン強度条件下におけるカイバードラッグ懸濁液の粘土の測定からも観察されたが、そのことは、希釈によって大きな変化のないことを確認するものであり、それにより、コンフォメーション変化なしでは大きな静電的相互作用が実際上ないということを支持している。このことは、相互作用がデバイ長に直接関係していないことを意味している。
【０１１８】
本発明により製造されるカイバードラッグは、有用な治療剤である。例えば、それらは、主としてライノウイルス及びインフルエンザウイルスによって引き起こされた咳き及び風邪及びカタル性の炎症、皮膚感染及び感染性皮膚病；皮膚真菌症、熱傷皮膚のような細菌に誘発された皮膚病変、膿疱を伴った炎症形に罹っている患者におけるニキビ、尋常性座瘡；中耳炎、微生物性二次感染性の湿疹、真菌症、細菌感染及びグラム陽性及び／又はグラム陰性細菌感染による皮膚の二次感染、副鼻腔炎、カンジダ感染、特に皮膚、爪及び粘膜カンジダ、皮膚及び粘膜の扁平上皮癌、急性及び慢性のリウマチ及び皮膚科の悪性増殖物を含む、種々の疾患を治療するのに有用である。それはまた、熱傷皮膚のようなウイルス感染及び細菌誘発病変を予防するのにも有用であり、発癌物質誘発性の肝細胞癌を抑制する。
【０１１９】
拘束されることを望まないが、特異的な隊列における細胞性及び液性免疫の初期の賦活における一連の種々の抗体を誘導するカイバードラッグの能力は、ヒト（哺乳類）を、外来の侵入物から護ることを可能且つ適用できるものにしていると信じられる。特にカイバードラッグは、抗原を産生する細胞を賦活する能力を有し、それらの侵入した敵対的微生物を除去し又は慢性の炎症を除去するために、特異的抗原を増加させることができる。すばやい選択は、特異的抗体を産生するよう賦活されたＢ細胞によってもたらされる。
【０１２０】
それはまた、喘息発作の副作用を減少させる。拘束されることは望まないが、それは、腫瘍なアレルギー因子、アトピーを阻害すると信じられる。カイバードラッグに独特の仕方で応答して、アトピー応答は、カイバードラッグと抗原との相互作用により減少する、例えば、それにより、組織への水及び免疫細胞の流入による膨潤、局所的血液−血管欠失及び平滑筋痙攣を、減少させる。
【０１２１】
本発明のカイバードラッグは、以下に示すように、サイトカイン及びインターフェロンの産生に影響を及ぼす。
【０１２２】
それは、抗細菌及び抗ウイルス活性を有する。
【０１２３】
カイバードラッグは、液性及び腸の免疫を付与する。
【０１２４】
カイバードラッグはまた、正規の且つ臨床的な免疫付与にも、他の注射可能なワクチン、例えばジフテリア、百日咳、破傷風等とも一緒に、組み込んでよい。
【０１２５】
カイバードラッグは、非複製性の薬剤である。それらは変異や毒力復帰変異並びに細菌感染の可能性がない。カイバードラッグに複製するウイルス及び／又は細菌が存在しないことは、免疫不全の又は免疫抑制された個人における使用を許容する。
【０１２６】
カイバードラッグは、その多価性の故に、抗ウイルス活性を有する。それらは、何ら有意な抗凝固活性なしに、単純ヘルペス、黄熱病及びポリオウイルスのウイルスの複製を阻害する。
【０１２７】
カイバードラッグは、肥満細胞を安定化させ、肥満細胞表面のＩｇＥ分子にアレルゲンが結合したときに肥満細胞がそれ自身の、ヒスタミンやロイコトリエンのような炎症伝達物質のような内部顆粒を分泌するのを防止する。従って、カイバードラッグは、慢性の炎症性リウマチ性疾患、特に慢性リウマチ性疾患、例えば骨関節炎、筋関節炎、初期慢性関節炎を治療するのに有用である。
【０１２８】
拘束されることは望まないが、特異的な隊列において細胞性及び液性免疫の初期賦活における一連の種々の抗体を誘導するカイバードラッグの能力は、ヒト（哺乳類）を外来の侵入物から護ることが可能且つ適用できるものとしていると信じられる。特に、カイバードラッグは、抗原を産生する細胞を賦活する能力を有し、それらの侵入した敵対的微生物を除去し又は慢性の炎症を除去するために、特異的抗原を増加させることができる。すばやい選択は、特異的抗体を産生するよう賦活されたＢ細胞によってもたらされる。
【０１２９】
カイバードラッグは、細菌又はウイルス感染及び慢性の並びにアレルギー性の反応を治療するのに有用である。カイバードラッグは、細菌及びウイルス活性を阻害する。それらは、喘息を含むアレルギー疾患を治療するのに、及びＤＮＡ又はＲＮＡウイルスによって引き起こされる疾病を治療するのに、有用である。拘束されることは望まないが、それらはレトロウイルスの逆転写酵素の転写速度を阻害すると信じられる。
【０１３０】
カイバードラッグは、哺乳類における細菌及びウイルス感染を治療するのに効果的である。カイバードラッグにより治療されら患者は、アレルギー又は喘息発作の強さ並びに、発作の頻度を含む、症状の頻度の減少を示す。その効果はまた、リウマチ性疾患に罹っている患者においても観察される。
【０１３１】
更には、それらの小さな粒子サイズ及び希釈された、例えば約０．０５ないし約１Ｍ ＮａＣｌ、より好ましくは約０．１ないし約０．５Ｍ ＮａＣｌ、そして最も好ましくは約０．１Ｍないし約０．２Ｍの範囲の濃度の食塩溶液中に分散されたコロイド結晶のために、カイバードラッグは、ウイルス及び細菌、例えばＢ型肝炎抗原に対するワクチンとして、使用することができる。更には、カイバードラッグは、アレルゲン例えば花粉アレルゲン、昆虫唾液アレルゲン、昆虫部分アレルゲン、食物アレルゲンその他に対する、Ｉ型過敏症に対するアジュバントとして使用することができる。
【０１３２】
本発明者等は、その生物学的活性及び薬物としてのその有効性が、５〜１０ｎＭという低いカルシウム濃度であってさえ、カルシウム塩と共に投与したとき増強されることを見出した。
【０１３３】
カイバードラッグは、治療的有効量で投与される。カイバードラッグは、非常に効果がある。すなわち、ごく微量を投与する必要があるだけである。
【０１３４】
本発明のカイバードラッグは、体重１ｋｇあたり１日約０．０１ｍｇないし約２ｍｇの範囲の量で投与されることが好ましい。この投与量計画は、最適な治療効果を提供するよう、医者によって調節されてよい。例えば、数回に分けた投与量を１日に投与してよく、又は治療状態の緊急性によって指示されるのに従って、投与量を比例的に減少させてもよい。明確な実際的利点は、本発明のカイバードラッグが、経口、静脈内、筋肉内又は皮下経路等、簡便な仕方で投与してよいことである。
【０１３５】
個々の患者から調製されたカイバードラッグを、何らのアレルギー反応もアナフィラキシーショック症状もなしに、それら個々の患者に投与することができる。
【０１３６】
更には、カイバードラッグは無毒である。拘束されることは望まないが、この無毒であることは、如何なるエンドトキシン活性もないこと並びにその有効性に由来するものと信じられる、なぜなら、少ない投与量のみが適用されるからである。
【０１３７】
本発明のカイバードラッグは、例えば不活性な希釈剤と共に又は同化できる可食の担体と共に、経口投与してよく、又は、硬質若しくは軟質のゼラチンカプセルに封入してもよく、又は錠剤へと圧縮してもよく、又は食事において直接食物に組み入れてもよい。経口での治療的投与のためには、カイバードラッグは、賦形剤と合わせて、消化性の錠剤、舌下錠、トローチ剤、カプセル剤、エリキシル剤、懸濁剤、シロップ剤、ウエファーその他の形で用いてよい。そのような組成物及び製剤は、好ましくは、重量で約０．１％乃至約９９％カイバードラッグを含有する。そのような治療的に有用な組成物中のカイバードラッグの量は、適切な投与量が得られるようなものである。本発明による好ましい組成物又は製剤は、経口投与量単位が、約５０ｍｇないし２０００ｍｇの活性化合物を含有するように調製される。
【０１３８】
錠剤、トローチ剤、丸剤、カプセル剤その他は、次のものを含有してよい。トラガカントゴム、アカシア、トウモロコシ澱粉又はゼラチンのような結合剤；リン酸二カルシウムのような賦形剤；トウモロコシ澱粉、馬鈴薯澱粉、アルギン酸その他のような崩壊剤；ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤；ショ糖、乳糖又はサッカリンのような甘味剤を加えてよく、又はペパーミント、ウィンター・グリーン油又はチェリー香料のような香料を加えてよい。投与量単位形態がカプセルである場合には、上のタイプの材料に加え、液状の担体を含んでよい。他の種々の材料が、コーティングとして、又は投与量単位の物理的形態を修飾するために存在してよい。例えば、錠剤、丸剤、又はカプセル剤は、シェラック、糖又は双方で被覆してよい。シロップ剤又はエリキシル剤は、カイバードラッグ、甘味剤としてのショ糖、保存剤としてのメチル及びプロピルパラベン、色素及びチェリー又はオレンジ香料のような香料を含有してよい。勿論、如何なる投与量単位形態を用意するために使用される如何なる材料も、薬剤学的に純粋であり、且つ、用いられる量で実質的に無毒であるべきである。加えて、カイバードラッグは、徐放性製剤及び処方に組み込んでもよい。例えば、カイバードラッグをイオン交換樹脂に結合させた徐放性投与量形態が考えられ、それは、樹脂の放出特性を修正するために、所望により拡散障壁コーティングによって被覆されていてよい。
【０１３９】
カイバードラッグはまた、非経口的に又は腹腔内に投与してもよい。分散物は、グリセロール、液状ポリエチレングリコール及びこれらの混合物中に及び油中に調製することができる。
【０１４０】
注射可能な使用のために適した薬剤形態は、無菌の水溶液（水に可溶な場合）又は、無菌注射溶液又は分散液の応急の調製のため分散体及び無菌粉末を包含する。全ての場合において、形態は無菌でなければならず且つ注射器の使用が容易である程度に液状でなければならない。それは製造及び貯蔵の条件下に安定でなければならず、且つ、細菌及び真菌のような微生物の汚染作用に対して保存されていなければならない。担体は、例えば水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、及び液状ポリエチレングリコールその他等）、それらの適当な混合物、及び植物油を含む溶媒又は分散媒であることができる。適切な液性は、例えば、レシチンのようなコーティングの使用により、分散の場合は必要な粒子サイズの維持により、そして界面活性剤の使用により、維持することができる。微生物の作用の防止は、種々の抗生物質及び抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールその他によって、もたらすことができる。多くの場合、等張化剤、例えば糖類及び塩化ナトリウムを含有することが好ましい。注射可能な組成物の長時間にわたる吸収は、組成物中における吸収遅延剤、例えばモノステアリン酸アルミニウム及びゼラチン等の使用によってもたらすことができる。
【０１４１】
無菌の注射可能な溶液は、必要量のカイバードラッグを、必要に応じ、上に挙げた他の種々の成分と共に適当な溶媒に導入し、続いてろ過滅菌することによって調製される。一般に、分散液は、種々の滅菌された活性成分を、基本の分散媒及び上に挙げたものからの必要な他の成分を含んだ無菌の媒質内に導入することによって、準備される。無菌の注射溶液を調製するための無菌の粉末の場合、好ましい調製方法は、真空乾燥及び凍結乾燥技術であり、これは、活性成分及び追加の望ましい成分の粉末を、それらの予めろ無菌ろ過された溶液から与える。
【０１４２】
ここに用いるとき、「薬剤学的に許容しうる担体」は、該活性成分の医薬活性を妨害せず且つ投与される患者に対して毒性でない媒質を意味する。例としては、あらゆる溶媒、分散媒、コーティング、抗生物質及び抗真菌剤、等張化剤及び吸収遅延剤、水中油又は油中水エマルジョン、水性組成物、リポソーム、ミクロビーズ、ミクロソーム（ｍｉｃｒｏｓｏｍｅ）、水酸化アルミニウム（水酸化アルミニウム塩）その他が挙げられる。薬剤学的に活性な物質のためのそのような媒質及び剤の使用は、当該分野において周知である。如何なる慣用の媒質も剤もが該活性成分と相容れない場合以外は、治療的組成物におけるその使用が考えられる。それらの組成物には、補助的な活性成分もまた組み込むことができる。
【０１４３】
投与の容易さと投与量の均一性のためには、投与量単位形態の非経口組成物を処方することが特に有利である。ここに用いる投与量単位形態とは、治療すべき哺乳類患者のために単位投与量として適した物理的に分離した単位をいう。すなわち、各々の単位は、必要な薬剤学的担体と連携して、望む治療効果を生み出すことの計算された所定量の活性材料を含有する。
【０１４４】
便利な且つ有効な投与のために、カイバードラッグは、有効な量で、上記のような投与量単位形態中において、適した薬剤学的に許容しうる担体と、混合してよい。単位投与量形態は、例えば、カイバードラッグを、約５０ｍｇないし約２０００ｍｇの範囲の量で含有することができる。補助的な活性成分を含有する組成物の場合には、投与量は、それらの成分の通常の投与量及び投与の仕方を参照して決定される。
【０１４５】
カイバードラッグは、当業者に知られた技術を用いて、エアロゾルスプレーの形で投与してよい。
【０１４６】
カイバードラッグは、０．２５％（ｗ／ｗ）のフェノールの存在下に皮下形態で、又は、１％ ＮａＣｌ中所望の濃度のカイバードラッグの懸濁液の形で、又は、１％ ＮａＣｌ溶液と等浸透圧を有する０．０５％（ｗ／ｗ）のＺｎＣｌ２の存在下に食塩水処方として、投与することが好ましい。別の一処方は、ＮａＣｌの生理学的濃度の存在下に０．０５〜０．５（ｗ／ｗ）Ｚｎ−Ｄ−グルコネート又はリン酸グルコン酸及び所望の濃度のカイバードラッグとを含む。
【０１４７】
これらの処方とは別に、別の一形態は、ＵＳＰ−ＦＮ、英国薬局方、米国一般名評議会（ＵＳＡＮ）及びドイツ薬局方による種々のカルボポール（Ｃａｒｂｏｐｏｌ（登録商標））ホモポリマー樹脂（例えばＣａｒｂｏｐｏｌ（登録商標）９８０ ＮＦを「ポリアクリル酸」と呼んでいる。）について名づけられた「カルボマー」中に入れたカイバードラッグよりなる。カルボポール樹脂、例えばポリマー性乳化剤としてのパーミュレン（Ｐｅｒｍｕｌｅｎ（登録商標））及びポリカルボフィルとしてのノベオン（Ｎｏｖｅｏｎ（登録商標））は、ポリアルキレンエーテル又はジビニルグリコールで架橋されたアクリル酸のポリマーである。この粉末材料は、直径平均約０．１５μｍの基本粒子サイズの凝集した材料（粉末）として供給されている。この凝集した粉末は、非弾性光散乱測定によって測定したときの直径が、平均２ないし７μｍであり、供給業者である米国４４１４１−３２４７オハイオ州クリーブランドのＢＦ． Ｇｏｏｄｒｉｃｈ Ｓｐｅｃｉａｌｔｙ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓの測定と一致する。
【０１４８】
生体接着（ｂｉｏａｄｈｅｓｉｏｎ）、特に粘膜接着（ｍｕｃｏａｄｈｅｓｉｏｎ）が、カイバードラッグの作用様式にとって望ましいことから、薬剤学的に不活性の材料は、胃粘膜を保護している高度に水和された粘性のアニオン性ヒドロゲル層である粘液と、相互作用しなければならない。カイバードラッグは、ポリアクリル酸ポリマー例えばカルボポール（登録商標）又はノベアン（登録商標）ＡＡ−１米局薬局方ポリカルボフィル樹脂及びパーミュレン（登録商標）ポリマー性乳化剤等の生体接着性材料中に分散され、それらはカプセル化されたカイバードラッグのために卓越した生体接着剤となる。ポリアクリル酸ポリマーは、それらの高分子量ポリマーの膨潤及び接着特性という利点のため、好ましく、そしてそれらは、カイバードラッグを包含するのに特に適している。更には、これらの樹脂の追加の大きな接着性表面は、カイバードラッグの大きな表面積に加えて、胃粘膜又は腸粘膜との最大接触に非常に適したものとする。
【０１４９】
好ましい処方は、カイバードラッグを、ノベオン（登録商標）ＡＡ−１米国薬局方又はカルボポール（登録商標）９４３Ｐのような、ポリアクリル酸系の材料との組み合わせで用いる。これらのポリマーは、製造時には、直径０．２μｍという平均の粒子サイズを有する凝集した粉末である。カルボポール（登録商標）樹脂並びにノベオン（登録商標）ポリカルボフィルは、アクリル酸の高分子量のポリマーであり、ポリアルケニルアルコールで化学的に架橋されていることから、それら架橋された材料は水に不溶であるが、しかし水又は食塩溶液中で膨潤することができる。
【０１５０】
好ましくは１．０〜１．７％（ｗ／ｗ）の及び好ましくは０．７〜０．８％（ｗ／ｗ）の固形分よりなるポリアクリル酸ゲルが使用され、脱イオン水中に分散され、そして、２５℃にてｐＨ４．５〜５．０に中和される。このポリアクリル酸ゲルに、所望量のカイバードラッグ材料が食塩溶液中に入れて添加されるが、これは好ましくは約１Ｍ未満の食塩溶液、より好ましくは約０．５未満の食塩溶液、そして尚もより好ましくは約０．２Ｍ未満の食塩溶液である。約０．１５４Ｍの食塩溶液中にカイバードラッグを溶解させるのが最も好ましい。代わりとして、カイバードラッグは、脱イオンされ、凍結乾燥され、そして最後に、もしカイバードラッグが溶液として投与されるのであれば、水又は他の任意の所望の溶液の存在下に連続攪拌下でアクリル系材料と共に分散され、そして滅菌される。如何なる方法も用いられても、カイバードラッグ溶液のｐＨは、約３．５ないし６．５、より好ましくは４ないし５の範囲であることが好ましく、そして最も好ましくは、ｐＨは４．５±０．２（２５℃）である。
【０１５１】
別の薬剤組成物の一つは、ヒドロゲル又は、ノベオン（登録商標）Ａ−２−ＵＳＰ、ノベオン（登録商標）ＡＡ−ＵＳＰポリマー又はカルボポール（登録商標）９３４ ＰＮＦのようなアクリル酸ポリマーと合わせたカイバードラッグの所望量を含んでなる。これらのポリマーは、６．５±０．５より大きなｐＨ環境、すなわち酸性ｐＨに曝されると、ゲルを形成する。膨潤するとき、特にポリカルボフィル（ノベオン（登録商標））のＣａ２＋塩が適用されるとき、カイバードラッグは、遊離される。
【０１５２】
カイバードラッグの所望量を含んだヒドロゲル処方は、その中でカイバードラッグが分散されているところの、多数のポリマー粒子よりなる離散したミクロゲルである。このヒドロゲルは水溶性ではないが、完全に水和すると、内部からの浸透圧が構造内に孔を形成して、カイバードラッグがゲル層を通って拡散することを許容する。
【０１５３】
カイバードラッグを含有する上記のヒドロゲル処方は、フォノフォレーシス（ｐｈｏｎｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）にも有用である。カイバードラッグはゲルの形態であり、皮膚の感染領域に直接に塗布される。１１〜１５ＭＨｚの周波数がそこに適用される。この作用は、高分子量の材料（カイバードラッグ）が皮膚を通って拡散するのを助ける。更には、この特殊な処方においては、ヒトの耳にとっての可聴領域のすぐ上の低周波数超音波が、皮膚細胞の間の脂肪領域中にあるカルボフィル中のカイバードラッグが浸透して内部へと動き始めることを可能にする。
【０１５４】
更には、アクリル酸のポリマーとの関係で以下に記述されるシステムは、当該分野で知られている技術を用いて、接着剤を裏に備えた錠剤にすることができる。この錠剤は、歯肉と唇との間に配置される。カイバードラッグを含んだ錠剤が溶解するにつて、錠剤は、口の粘膜を介してカイバードラッグを、血流へと直接に届ける。開示された処方に従ってカイバードラッグを含んだ錠剤は、直径１ｃｍ未満であることができる。この錠剤は、上記のカルボフィル透過促進口腔経粘膜システムを構成する。加えて、それらは、カルシウム塩の形でのアルギン酸塩又は高度にピルビン酸化したキサンタン等のような促進剤を含有してよい。
【０１５５】
カイバードラッグのための別の好ましい薬剤処方の一つは、カイバードラッグと、リジン、オルニチン、アルギニン及びメチオニンの鏡像体又はラセミ体との間の複合体を含む。固体及び液体の処方のための、特に非経口投与のための別の一具体例は、１−アミノ−１−デオキシ−Ｄ−グルシトール（グルカミン）又はリバミン（ｒｉｂａｍｉｎｅ）（これはガラクトースの立体異性体である）、Ｄ−グルコン酸又はそのδ−ラクトンと合わせたカイバードラッグよりなる。
【０１５６】
別の好ましい処方の一つは、カイバードラッグと合わせたグルコン酸のＣａ２＋、Ｍｇ２＋及びＺｎ２＋塩又はその対応するδ−ラクトンを含んでなる。Ｄ−グルコン酸のＺｎ２＋塩、Ｚｎ［ＯＯＣ−（ＣＨＯＨ）４−ＣＨ２ＯＨ］２又は対応するＣａ２＋若しくはＭｇ２＋塩は、非常に水溶性であり、カイバードラッグの存在下に４．７〜５．５（２０℃）のｐＨにて、それぞれ、［α］２０Ｄ−６．７（ｃ＝１）、［α］２０Ｄ−５．９（ｃ＝０．７５）及び［α］２０Ｄ−９．５（ｃ＝１）の旋光度を有する。カイバードラッグと金属グルコン酸化合物との間のこの複合体は、水溶液中にあるときは、澄んだ透明な溶液を形成し、例えば、１．０〜１０ｍｇという広い範囲のカイバードラッグ濃度へと処方することができる。加えて、これらの溶液は、Ｄ−グルコン酸複合体のみの場合についての７９ｍＮ／ｍに対して、１．０×１０−５ｇ／ｍＬのカイバードラッグの存在下に、約３２ｍＮ／ｍという非常に低い表面張力を有する。更には、該材料が凍結乾燥されると、水又は食塩水中で復元された粉末は、再び透明な溶液を与え、分析後、カイバードラッグの何らの劣化や生物学的活性の損失も、何れもないことが明らかになる。
【０１５７】
カイバードラッグの単純な処方は、約０．００１重量％ないし約０．１重量％の濃度での、そして最も好ましくは約０．０１％（ｗ／ｗ）のＺｎ２＋（例えば塩化物として）濃度での、０．００１重量％ないし０．１％（ｗ／ｗ）、及び最も好ましくは約０．００２％（ｗ／ｗ）Ｃａ２＋濃度での、又は０．０１％（ｗ／ｗ）ないし約０．１％（ｗ／ｗ）及び最も好ましくは約０．０４％（ｗ／ｗ）Ｍｇ２＋（好ましくは塩化物又は水酸化物として）の濃度での、Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋及びＺｎ２＋イオンへのこの材料の結合特性を利用する。これらの溶液はまた、１％（ｗ／ｗ）のＮａＣｌ溶液の存在下においても、全体溶液の浸透圧を変化させることなしに調製できる。これらの処方は、処方中にフェノールを含有しないという利点を有するが、０．２５％（ｗ／ｗ）フェノール含有の溶液と同じ安定性（例えば、保管寿命、貯蔵）及び抗微生物活性を、カイバードラッグを皮下投与したとき示す。
【０１５８】
リポソーム様処方の存在下でのカイバードラッグの放出
カイバードラッグはまた、カチオン脂質又はその誘導体、例えばジパルミチル若しくはジパルミトイルホスファチジルコリン、塩化若しくはラセミ体若しくは鏡像体乳酸ジパルミチル−ジメチルアンモニウム、並びに対応するＣ１８−ジーｎ−アルキルジメチルアンモニウム誘導体等と共に、薬剤組成物の形に処方することができる。より具体的には、それらは、カイバードラッグをリポソーム中に含んだエアロゾルとして適用することができる。こうして、カイバードラッグは、非侵襲的に肺に投与することができる。
【０１５９】
所望のカイバードラッグ濃度の存在下の、ＮａＣｌ溶液（例えば、オイルサム（ｏｉｌｓｕｍ））中に分散させた、生理学的ｐＨにおいて弱いカチオンとして働くことのできる両性イオン性脂質であるジパルミトイルホスファチジルコリン（例えば、１％ｗ／ｗ）、又はジパルミトイルホスファチジルコリン（好ましくは、１％（ｗ／ｗ）溶液として１：１）を、用いることができ、標準的な装置を用いて超音波処理（５０Ｗ、３５℃、１．５分）することにより、リポソーム様分散液が容易に調製される。マイクロエマルジョンは、同じカチオン性脂質材料を用いて調製することができる。加えて、１０％（ｗ／ｗ）の水の存在下、担体は、溶媒オリーブ油又はオレイルアルコール［（ｚ）−９−オクタデセンー１−オール］又はオレイン酸［（Ｚ）−９−オクタデセン酸］並びに対応するオレイン酸のナトリウム塩であってよい。また、好ましい製剤は、０．１５４Ｍ ＮａＣｌ中にジオレイルホスファチジルアミン（１：１ｗ／ｗ）を含む溶液中における、対イオンとしての乳酸又はＳ−鏡像体又はピルビン酸ジパルミチル−又はジパルミトイル−ジメチルアンモニウムよりなるリポソーム様処方である。カイバードラッグは、臭化エチジウムによるカイバードラッグ又は共有結合によりすなわちチオシアン酸フルオレッセイン又は塩化ダンシルで蛍光標識したカイバードラッグのスパイキングによって、これらの脂質中にカプセル封入される。
【０１６０】
カイバードラッグを含有するエアロゾルは、超音波ネブライザー、例えばモデル６４６（ＤｅＶｉｌｂｉｌｉｓｓ、ペンシルバニア州サマーセット）によって発生させることができ、これは、直径５μｍのエアロゾル小液滴を作り出す。
【０１６１】
別途に示さない限り、パーセントは重量による。
【０１６２】
更には、単数は複数を含み、逆も同じである。
【０１６３】
カイバードラッグの語は、細菌の殻から単離された材料のみならず、スキーム１に記載の単離ステップの完了後に得られる産物をも含む。ここに用いるとき、カイバードラッグの語は、モノマーの凝集体よりなる。モノマーというときは、モノマーの語又は変性されたリピドＡ分子は、互換的に用いられている。
【０１６４】
「哺乳類」の語は、この哺乳類のクラスの如何なる種も含み、そして制限なく、ネコ、イヌ、ウマ、ヤギ、ブタ及びヒトを含む。好ましい哺乳類はヒトである。
【０１６５】
以下の非制限的実施例が、本発明を更に説明する。
【０１６６】
〔実施例１〕
カイバードラッグの上流処理及び下流処理
患者から得られた非病原性の大腸菌が、表ＩＩＩによる選択基準に適合した後、表Ｉ及びＩＩに掲げた培地の一つで、ビュッヒリアクター（Ｂｕｃｈｉ Ｒｅａｃｔｏｒ）１．５リットル発酵槽（Ｂｕｃｈｉ Ｇｌａｓ Ｍｕｓｔａｒ， １９９１ Ｆａｂ．＃ １１１ ０１０，９３６，１３８５）中３７℃で１２〜１４時間増殖された。低速遠心（３７℃にて３，０００ｒｐｍ）で細胞が収穫され、脱イオン水で数回洗浄（３７℃）され、更なる処理のために５℃にて水中に沈降物として貯蔵されるか又は、凍結乾燥されてシリカゲル上で５℃にて貯蔵された。カイバードラッグは、ｉ）、１００倍過剰量の塩溶液（０．１５４Ｍ ＮａＣｌ）で若しくは０．０１％（ｗ／ｗ）ＺｎＣｌ２ーグルコン酸存在下に細胞を連続的に濯ぐことにより２０℃にて０．１５４Ｍ ＮａＣｌで、又はｉｉ）１１．５％（ｗ／ｗ）フェノール／クロロホルム抽出及びこれに続く８８．５％クロロホルム抽出及び、ＺｎＣｌ２又はＺｎＣｌ２−グルコン酸又はＺｎＣｌ２−グルコン酸リン酸のそれぞれ存在下又は不存在下で、６倍量のエーテル／アセトン（１：６ｖ／ｖ）の添加により、又はｉｉｉ）０．１５４Ｍ ＮａＣｌの存在下に０．０２５％（ｗ／ｗ）フェノールで濯ぐことにより、細胞から解離された。得られた沈殿は、収集されろ過され、続いて凍結乾燥され、そしてシリカゲル上で２０℃にて貯蔵された。収率は、１５０ｇの乾燥大腸菌細胞あたり、粗製の材料（カイバードラッグ）４．８ｇであった。
【０１６７】
５００ｇの粗製の材料を、５０ｍＬのアセトニトリルーメタノール（５：１、ｖ／ｖ）中に溶解させた。得られた僅かにオパール色の溶液を５０〜６０℃の範囲の温度で６０分間熱処理に付した。得られた産物を、次いで再び２０，０００ｒｍｐで２０℃にて遠心した（Ｂｅｃｋｍａｎ遠心機， Ｊ２−２１ローター）。澄んだ透明な溶液が得られた。この調製された材料を、２０℃にてＳｅｐｈａｒｏｓｅ ２Ｂ （Ｐｈａｒｍａｃｉａ）カラムクロマトグラフィー（１．５×１５０ｃｍ）に付した。このカラムは、上記のアセトニトリルーメタノール共溶媒（５：１ｖ／ｖ）を用いて予め平衡化させておいた。粗製カイバードラッグの負荷（通常５０ｍｇ）の後、異なった濃度のアセトニトリルーメタノール溶液（３：１、ｖ／ｖ）を用いてカラムを溶出させた。各１．５ｍＬの画分を収集し、標準的方法を適用してリン含量について分析し、そして活性な画分を収集し、プールし、続いて凍結乾燥した。約５０ｇのカイバードラッグが得られた。この材料を、プールされた画分を汚染する可能性のあるＬＰＳ様材料、リピドＡその他の細胞残滓による如何なる汚染をも避けるため、表ＩＩＩに概略を示した選択基準に付し、又はスキームＩによるスクリーニング処理に付した。
【０１６８】
Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ２Ｂカラムクロマトグラフィーにより得られた画分はまた、不活性化シリカゲルＨプレート（Ｍｅｒｃｋ， ダルムシュタット、ドイツ）薄層クロマトグラフィーによっても分析した。１．５ｍｇのカイバードラッグをプレート（５００μｍ×２０ｃｍ）に負荷した。溶媒系は、８０：１０：５：２（ｖ／ｖ）という比の３０℃のアセトニトリルーメタノールー水ー濃アンモニア水であった。カイバードラッグのバンドを、ヨード又はアルカリ性酒石酸銅溶液を噴霧することによって可視化した。代わりとして、濃アンモニア水に代えて０．００１Ｍ ＮａＯＨを上記の比率で、ニンヒドリンと組み合わせて使用（噴霧）してもよい。低濃度のカイバードラッグ（１００μｇスケール以下）のための他の精製ステップとしては、１００ ＲＰ−１８カラム（ＬｉＣｈｒｏｓｐｈｏｒ， Ｍｅｒｃｋ，ダルムシュタット、ドイツ）を用い、８０％（ｖ／ｖ）のアセトニトリル及び２０％（ｖ／ｖ）のメタノールから５％のメタノールを含有する９５％（ｖ／ｖ）のアセトニトリルまでの定組成勾配を適用した、高速液体クロマトグラフィー（スキームＩＩ）が挙げれられる。カラム上でのカイバードラッグの分離は、２２０ｎｍで、又は屈折率増分（ｄｎ／ｄｃ）μ、Ｔの変化の測定により、光散乱検出器技術により５５０ｎｍで日常的に、又はリン酸感受性電極を適用してリン酸含量の測定により、モニターした。最後の場合には、サンプルは、日常的に加水分解（１０μｇ／１ｍＬ）するか、又はリン酸感受性電極をカイバードラッグで直接に較正した後でなければならない。
【０１６９】
〔実施例２〕
１ｍｇの純粋なカイバードラッグを１０ｍＬのメタノール（２５℃）に溶解させ、そして０．１５４Ｍ ＮａＣｌ（２５℃）の水溶液で希釈して、カイバードラッグの濃度５００μｇ／ｍＬを１０．０μｇ／ｍＬとした。カイバードラッグの最終濃度は、乾燥重量の測定により、又は較正のための標準を用いて５５０ｎｍの散乱により、又はリン酸含量をＢａｒｔｌｅｔｔ， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２３４， ４６６−４７１ （１９５９）（この内容を参照によりここに導入する。）に従って定量することにより決定した。カイバードラッグのｍｇあたりのリン酸０．５２μｇは、０．４８μｇ／ｍｇのグルコサミン（カイバードラッグの典型的な一成分）に等価であり、カイバードラッグのモノマー形態につき、リン酸に対するグルコサミンの一定の比率１．０８±０．０４という結果を与えた。食塩溶液中におけるカイバードラッグの重量平均分子量は、８０，０００〜１２０，０００のオーダーであり、１，９００のモノマー分子量（［ｍ＋Ｎａ］＋）よりなる８０〜１２０個の粒子、という結果を与えている。こうして、全リン酸含量又はグルコサミンに対するリン酸の比率は、一定であり、変化がなく、従って、ｍＬあたりのカイバードラッグの総当量を反映している。カイバードラッグのモノマー分子量は、これらの調製物について、マトリックス支援レーザーイオン化飛行時間形（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）質量分析（マトリックス：３．５−ジヒドロキシー安息香酸又はシナピン酸）及び、ブタンの存在下にマトリックスとしてチオグリコール酸を用いた高速原子衝撃（ＦＡＢ）質量分析によって定量し、約１９００ダルトンであることが見出された。
【０１７０】
〔実施例３〕
スキーム１によるカイバードラッグの調製を行った。細胞の数は、プラーク試験カウントにより、容易に且つ確信を持って決定できる。というのは、細胞の数は、例えば０．１５４Ｍ ＮａＣｌによる正確な洗浄過程の間に遊離されるカイバードラッグの量に比例するからである。例えば、Ｄｉａｇｏｎａｌ Ａｇａｒあたり１０９個の細胞の集団は、徹底した洗浄の後、０．１５４Ｍ ＮａＣｌの存在下に０．５１４７５ｍｇ／ｍＬのカイバードラッグを、又は０．０２５％フェノールの存在下に０．５１０４ｍｇ／ｍＬのカイバードラッグを、それぞれ遊離する。カイバードラッグの最終濃度の定量は、実施例２に述べた標準により、又はｎｇ天秤を用いた絶対乾燥重量の測定により実施でき、又は実施例２に記載した標準的なリン酸定量によって管理できる。
【０１７１】
〔実施例４〕
カイバードラッグーリジン複合体
（ａ）種々のカイバードラッグ−リジン複合体を次のようにして調製した：
１．４６ｇ（０．０１モル）のＬ−（＋）−リジン又はＤ，Ｌ−リジンを２００ｍＬの脱イオン水に２５℃で溶解させ、それぞれ５００μｇ又は１０００μｇのカイバードラッグを、（Ｌ）リジン又はＤ，Ｌ−リジン溶液に個々に加えた。２時間の間、温度を４０℃へと高めた。各溶液の当初の濁りは、３０分後には消滅し、得られた透明な溶液を、如何なる粒子状物も除去するために、１Ｇ４ガラスフィルターを通してろ過した。これら種々の溶液を、引き続いて凍結乾燥した。収量：それぞれ、５００μｇのカイバードラッグについて１．９５ｇ、又は１０００μｇのカイバードラッグについて２．４２ｇ。得られた生成物は、０．１５４Ｍ ＮａＣｌ中の溶液中で澄明であり、無臭で無色であった。融点（分解下）ｍ．ｐ．＝１５６℃
【０１７２】
（ｂ）（ａ）の生成物を凍結乾燥した。凍結乾燥により生じた薄片を、乳鉢で小粒子へと粉砕した。ボールミル（遠心ボールミル　モデル Ｓ １０００）で３０分間かけて粉にすると、自由に流動する白色粉末が得られた。平均粒子サイズ（ＡＡＡＳ ７９及びＡＡＡＳ ８２）は、０．９％塩化ナトリウム溶液を用いてＣｏｕｌｔｅｒ Ｍｕｌｔｉｓｉｚｅｒ ＩＩの使用により、５．０〜６．０μｍと測定されたが、しかし粒子サイズは５０〜６０μｍへと増大できる。
【０１７３】
（ｃ）錠剤の調製
５００μｇを含有する錠剤を調製する。不活性な薬剤成分は、錠剤あたり４ｍｇの総重量中、１．０ｍｇのゼラチン、１．５ｍｇの架橋カルボキシメチルセルロースナトリウム、１ｍｇのステアリン酸マグネシウムよりなる。
【０１７４】
この量のゼラチンを４０℃の水に分散させ、低混合能力の下でミキサー中で予め混合したカイバードラッグ−リジン複合体を、やはり４０℃で加えた。得られた顆粒をドラムロール中で４０℃にて乾燥させ、次いで１．６ｍｍのポアサイズを有する篩機によって篩いにかけた。最終の乾燥顆粒を、最終重量４．０ｍｇを有する錠剤へと圧縮した。
【０１７５】
（ｄ）１０００μｇのカイバードラッグを活性成分として用いた以外は、（Ｃ）の手順を反復した。錠剤の総重量は４．５ｍｇであった。
【０１７６】
〔実施例５〕
カイバードラッグ−（−）−Ｎ−メチルグルコサミン複合体
２．０ｍｇのカイバードラッグ及び１．９８ｍｇ（０．０１モル）のＤ−（−）−Ｎ−メチルグルカミンを、５０ｍＬのイソプロパノール／水（５０／５０、ｖ／ｖ）に２０℃にて分散させた。溶液を５０℃に３０分間、澄んだ透明な溶液が得られるまで加熱した。２０℃での連続攪拌下に、５０ｍＬの水をこれに加えた。溶液は混濁した。加えて、微結晶沈殿が形成され、これを濾去し、もはや微結晶沈殿が発生しなくなるまで上清を濃縮した。微結晶沈殿を合わせ、真空中２０℃にてＰ４Ｏ１０上で乾燥させた。最終生成物を、シリカゲル上で２５℃にてオーブン中で、重量変化が観察されなくなるまで更に乾燥させた。収量３．５ｇ。実施例４に記載したのと同様の条件下の圧縮条件及び不活性成分を用いて、錠剤を形成した。
【０１７７】
〔実施例６〕
カイバードラッグ−ポリーＬ−リジン複合体
０．１５ｍｇのポリーＬ−リジン（２５．６ｋＤ）を、５００μｇのカイバードラッグの存在下に、２０℃にて５ｍＬの０．９％（ｗ／ｗ）ＮａＣｌ中に溶解させた。分散溶液を、透明な溶液が得られるまで３０分間超音波処理（１００Ｗ、Ｂｒａｎｓｏｎ Ｓｏｎｉｆｙｅｒ）した。得られた溶液を、０．９％（０．１５４Ｍ）から１．７Ｍ ＮａＣｌ（２５℃）までの直線勾配を適用しＳｅｐｈａｒｏｓｅ ２Ｂカラムクロマトグラフィー（１．０×１０ｃｍ）によって精製した。流速は、１０ｍＬ／時に維持し、光学活性な画分を２２０ｎｍにより及び／又は、Ａｂｂｅ リフラクトメーター（Ｚｅｉｓｓ）を用いた屈折率測定（５５０ｎｍ）によってモニターした。０．７５Ｍ ＮａＣｌの塩濃度での溶出ピークは、それぞれ化学分析及びリン酸測定によれば、カイバードラッグ−ポリーＬ−リジン複合体を含有していた。光学活性の画分をプールし、凍結乾燥し、そしてデシケーター中シリカゲル上で２０℃にて貯蔵した。収量：０．１〜０．１２ｍｇ乾燥重量。
【０１７８】
〔実施例７〕
ポリーＬ−リジンー２本鎖カチオン型脂質ーカイバードラッグ複合体。
０．１５ｍｇのポリーＬ−リジン（２５．６ｋＤ）を、２５℃の水５ｍＬ中において０．５ｍｇの水酸化ジステアリルジメチルアンモニウム（ＤＳＤＭＡＯＨ）と混合した。この澄んだ溶液に、０．１５４Ｍ ＮａＣｌの１．０ｍＬ中に分散させた５００μｇのカイバードラッグを加えた。得られた産物を３０℃に３０分間加熱した。混濁した溶液が得られた。この混濁溶液は、超音波処理（１００Ｗ， Ｂｒａｎｓｏｎ Ｓｏｎｉｆｙｅｒ）を５分間行うと透明化した。ミリポアフィルター（０．９μｍ）を通して溶液を濾過し、続いて凍結乾燥した。ＮａＣｌを含む凍結乾燥された材料を水（２ｍＬ）に溶かし、１００ｍＬの脱イオン水に対し２５℃で、数回の脱イオン水交換を行って透析した。透析バッグ中の溶液を凍結乾燥し、シリカゲル上２５℃にて貯蔵した。２０℃ないし３０℃において、この材料の分解は全く観察されなかった。収量：０．９２ｍｇのポリ−Ｌ−リジン−ＤＳＭＤＡ−カイバードラッグ複合体。
【０１７９】
〔実施例８〕
カチオン型カイバードラッグ−リポソーム複合体の調製
ジオレイルーホスファチジルコリンとジオレイル‐トリメチルアンモニウムプロパンの１０ｍｇ／ｍＬ混合物を、１：１（ｗ／ｗ）比で、クロロホルム／メタノール溶液（１：１ ｖ／ｖ）中に調製した。これを原液として使用した。この溶液に、０．１５４Ｍ ＮａＣｌに溶解させた５００又は１０００μｇのカイバードラッグを、２つの相の完全かつ徹底した混合を保証するために２５℃で連続攪拌しつつ、加えた。得られた溶液を有機相及び水相に分離した。有機相を脱イオン水で洗浄し、再度分離し、そして有機相をＣａＣｌ２上で乾燥させた。この溶液を体積が１００ｍＬになるまで原液で希釈し、次いで、この希釈されたカイバードラッグ溶液を引き続き、透明な希釈カイバードラッグ溶液が得られるよう超音波処理した。リポソーム中のカイバードラッグの濃度を、クロロホルム／ＭｅＯＨ（１：１、ｖ／ｖ）で１００ｍＬへと更に希釈し、小さなガラスビーカー中で窒素下に乾燥させ、続いて真空下に１２時間乾燥させた。１．０ｍＬの脱イオン水（ミリポアフィルター）の添加及び３７℃で４時間のインキュベーションの後、澄明化させるため小胞懸濁液を再び１０分間超音波処理した。所望濃度のカイバードラッグを含む１５ｍｇ／ｍＬの材料を含んだカチオン型リポソームの得られた溶液を、０．２μｍのヌクレオポアフィルターを通して濾過した。光学的測定のためには、適用した単一の単層小胞の濃度は、０．１ないし０．２５ｍｇ／ｍＬであった。例えば５００μｇのカイバードラッグサイズを含んだカチオン型リポソーム−カイバードラッグ複合体を、動的光散乱（ＡＬＶ ５０００、ランゲン、ドイツ）によって測定した。決定されたサイズ分布は、直径０．０２ないし０．１μｍの範囲に及び、０．０８５ｎｍ付近にピークを有した。［備考：水溶液中のカイバードラッグは、０．１５４Ｍ ＮａＣｌの存在下に０．６μｍ付近にサイズ分布を有し、又は有機溶媒（クロロホルム、メタノールその他又はこれらの混合物等のような）中では、サイズは、０．００２μｍと測定され、このことは、カイバードラッグは、カチオン型リポソーム−カイバードラッグ複合体において、サイズ及び形態に関し、水溶液中におけるカイバードラッグの高度に凝集した状態と比較したとき完全に異なって配向していることを示している。］　リポソーム製剤中における所望濃度のカイバードラッグの形のカプセル封入されたカイバードラッグを含んだ材料をは、−２０℃で、製剤の如何なる劣化もなしに貯蔵された。溶液は、如何なる環境中の遊離基や外部汚染物も存在しない状態で窒素下において２０℃で貯蔵したとき、２年間に亘って安定であった。
【０１８０】
〔実施例９〕
合成のカチオン型脂質を用いたカチオン型カイバードラッグーリポソーム複合体の調製
ジオレイルーホスファチジルコリンと水酸化ジステアリルジメチルアンモニウム（ＤＳＤＭＡＯＨ）又は水酸化ジヘキサデシルジメチルアンモニウム（ＤＨＤＭＡＭＯＨ）とを１：１（ｗ／ｗ）の比で、６０％クロロホルム／４０％ＭｅＯＨ（ｗ／ｗ）中に、又はクロロホルム若しくはシクロヘキサン中に、それぞれ２５〜３０℃にて混合した。０．１５４Ｍ ＮａＣｌ（１０ｍＬ）中に分散させた１０００μｇのカイバードラッグを、連続攪拌下に４０℃及び窒素気流中において２０ｍＬのジオレイルーホスファチジルコリン／（ＤＳＤＭＡＯＨ）又は（ＤＨＤＭＡＭＯＨ）に、２相が分離するまで、それぞれ加えた。この２相の分離は殆ど即時であった。水相は、無機材料のみを含有し、これに対して有機相は、カイバードラッグ−リポソーム複合体をを含有した。
【０１８１】
〔実施例１０〕
Ｌ−（＋）−リジン−ジパルミトイル−α−ホスファチジルプロパノールアミンリポソーム内へのカイバードラッグのカプセル封入
Ｌ−（＋）−リジンの、それぞれジパルミトイル−）−α−ホスファチジルプロパノールアミン又はジミリストイル−−）−α−ホスファチジルプロパノールアミンへの共有結合による結合は、０．５μモルのトリエチルアミンを含有する１ｍＬのクロロホルム／ＭｅＯＨ（１：１、ｖ／ｖ）中に溶解させた１，１−（ジメチルエトキシ）カルボニル−スクシンイミジル−Ｌ−（＋）−リジンを、１００μモルのジパルミトイル−）−α−ホスファチジルプロパノールアミンと反応させることによって達成した。反応は６０℃で６時間行った。反応混合物の薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）分析（シリカゲルＨ、溶媒クロロホルム／ＭｅＯＨ／水、６５：２５：５）は、定量的な変換を明らかにし、このことは、ＲＰ−１８カラムでのＨＰＬＣ分析によっても確認された。溶媒系及び残存する未反応材料例えば１，１−（ジメチルエトキシ）カルボニル−スクシンイミジル−（Ｌ）−（＋）−リジン等の除去の後、精製されたＢＯＣ−Ｌ−（＋）−リジン−ＢＯＣ−ジパルミトイル−）−α−ホスファチジルプロパノールアミンを、クロロホルム／トリフルオロ酢酸（３０：７０）５ｍＬで処理した。混合物を穏やかに３時間２０℃で攪拌し、溶媒を真空下に除去し、残渣をクロロフォルムに溶解した。脱保護された生成物をＴＬＣ、リン含量で分析した。Ｒｆ≒０．４１（ＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ／Ｈ２Ｏ：５０：４０：１０）。リジニル−ジパルミトイル−）−α−ホスファチジルプロパノールアミンを、カルボキシメチルセルロース（ＣＭ ５２， Ｗｈａｔｍａｎ）により、ＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ又は９５：５の比率のアセトニトリル／ＭｅＯＨを溶離液として用いて精製した。生成物は１５％ＭｅＯＨに溶出し、これを凍結乾燥し、−２０℃で窒素下に貯蔵し、その場合１年にわたって何ら材料の劣化は検出されなかった。
【０１８２】
１０００μｇのカイバードラッグを含有するこの材料のリポソームが、プローブ超音波処理により及び０．１５４Ｍ ＮａＣｌの存在下に、例えばｐＨ７．０〜７．４で１０ｍＭトリス塩酸（２０℃）を含む緩衝液中に分散させることにより、通常の方法で調製された。カイバードラッグの濃度に関するカプセル封入効率及び漏出の測定は、カイバードラッグを１％（ｗ／ｗ）トリトンＸ １００で抽出し、続いてリン含量又は、２，５−ヒジドロキシ安息香酸をマトリックスとしたマトリックス支援レーザーイオン化飛行時間形質量分析における特徴的ピーク分布を分析することにより、行った。カイバードラッグ負荷リポソームの安定性は、３つの異なった条件下で評価した。すなわち、上述の調製緩衝液中４℃にて種々の時間；カルシウム又はマグネシウムを含み又は含まない培養培地中（それぞれ、ＭＥＮ ５００又は ＭＥＮ ４００： Ｇｉｂｃｏ）５％（ｖ／ｖ）の胎仔牛血清の存在又は不存在下４℃で４時間インキュベートの後、及び。３７℃でのインキュベート後のヒト血漿中である。何れの条件についても、負荷されたリポソームは、インキュベーション後にトリトン Ｘ １００ 又はデスオキシコレートで処理され、カラムクロマトグラフィー（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ２Ｂ）又はＨＰＬＣにより、上述したようにして分画された。
【０１８３】
〔実施例１１〕
2004510746.tif 000004
【０１８４】
〔実施例１２〕
2004510746.tif 000005
カイバードラッグを活性成分として含んだこの半透明な、油気のないエアロゾ
ル製剤は、容易に分散する。それは、皮膚刺激及びアレルギーに関連した疼痛及び痒みに対して、効果的な症状緩和を提供するように設計されている。
【０１８５】
〔実施例１３〕
2004510746.tif 000006
【０１８６】
実施例１４〜１７において、ここに記載の手順に従って、カイバードラッグを単離した。これら４つの実施例の全てにおいて単離されたカイバードラッグについて実施した化学的分析は、厳格に制御された条件下でのアルカリ性及び酸性加水分解、一般的な化学的及び生物化学的な標準的手順による酵素的加水分解により行った。分析のための方法は、それぞれ、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ、マトリックス支援レーザー脱離イオン化質量分析及びイオンスプレー質量分析であった。使用したマトリックスは、ＤＨＰ（３，５−ジヒドロキシ安息香酸）及び２−シアノ−４−ヒドロキシ−桂皮酸であった。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦの質量スペクトルは、検出のための正及び不のイオン化モードで記録した。
【０１８７】
〔実施例１４〕
ここに記述の手順を用いて、中耳炎の症状に悩まされている患者の尿及び便から単離された大腸菌の培養物から、混合物が単離された。それは次いで、上記の化学的分析に付された。
【０１８８】
単離された産物は次の構造を有し、化合物１として同定された。
【０１８９】
【化１９】
2004510746.tif 000007
【０１９０】
〔式中、Ｒは水素又は
【０１９１】
【化２０】
2004510746.tif 000008
【０１９２】
又はそれらの塩を表す。〕
【０１９３】
この単離された材料は、約８０％（ｗ／ｗ）のリン酸化されていない糖脂質と約２０％（ｗ／ｗ）の一リン酸化糖脂質との混合物であり、無機のリン酸は、二糖類の他の末端において、１位又は４’位に位置している。糖脂質の少量の１，４−ジホスホリル化産物もまた単離された。
【０１９４】
〔実施例１５〕
ここに記載の手順を用いて、副鼻腔炎に罹っている患者の尿及び便から単離された大腸菌の培養物から、混合物が単離された。それは次いで、上記の化学的分析に付された。
【０１９５】
単離された産物は次の構造を有し、化合物２として同定された。
【０１９６】
【化２１】
2004510746.tif 000009
【０１９７】
〔式中、Ｒは水素又は
【０１９８】
【化２２】
2004510746.tif 000010
【０１９９】
又はそれらの塩を表す。〕
【０２００】
この単離された産物は、約８０％（ｗ／ｗ）のリン酸化されていない糖脂質と約２０％（ｗ／ｗ）の一リン酸化糖脂質との混合物であり、無機のリン酸は、二糖類の他の末端において、１位又は４’位に位置している。糖脂質の少量の１，４’−ジホスホリル化産物もまた単離された。
【０２０１】
〔実施例１６〕
ここに記述の手順を用いて、慢性リウマチ（骨関節炎）に罹っている患者の尿及び便から単離された大腸菌の培養物から、混合物が単離された。それは次いで、上記の化学的分析に付された。
【０２０２】
単離された産物は次の構造を有し、化合物３として同定された。
【０２０３】
【化２３】
2004510746.tif 000011
【０２０４】
〔式中、Ｒは水素又は
【０２０５】
【化２４】
2004510746.tif 000012
【０２０６】
又はそれらの塩を表す。〕
【０２０７】
この単離された産物は、約８０％（ｗ／ｗ）のリン酸化されていない糖脂質と約２０％（ｗ／ｗ）の一リン酸化糖脂質との混合物であり、無機のリン酸は、二糖類の他の末端において、１位又は４’位に位置している。糖脂質の少量の１，４’−ジホスホリル化産物もまた単離された。
【０２０８】
〔実施例１７〕
ここに記載の手順を用いて、気管支喘息に罹っている患者の尿及び便から単離された大腸菌の培養物から、混合物が単離された。それは次いで、上記の化学的分析に付された。
【０２０９】
単離された産物は次の構造を有し、化合物４として同定された。
【０２１０】
【化２５】
2004510746.tif 000013
【０２１１】
〔式中、Ｒは水素又は
【０２１２】
【化２６】
2004510746.tif 000014
【０２１３】
又はそれらの塩を表す。〕
【０２１４】
この単離された産物は、約８０％（ｗ／ｗ）のリン酸化されていない糖脂質と約２０％（ｗ／ｗ）の一リン酸化糖脂質との混合物であり、無機のリン酸は、二糖類の他の末端において、１位又は４’位に位置している。糖脂質の少量の１，４’−ジホスホリル化産物もまた単離された。
【０２１５】
上記のように、４種の産物が単離された。これらの産物は、変性された遊離リピドＡ分子である。この産物は、約８０％（ｗ／ｗ）のリン酸化されていない糖脂質と約２０％（ｗ／ｗ）の対応する一リン酸化糖脂質との混合物を含み、無機のリン酸は、二糖類の他の末端において、１位又は４’位に位置している。４つの例の全てにおいて、二糖類の糖成分は、Ｎ−アシル化されたグルコサミンである。ある程度まで、糖脂質の１、４’−ジホスホリル化された産物の少量も存在した。Ｃ−６位のヒドロキシル基は遊離であり、アシル化も、また他の成分例えばアミノ酸残基又は他の糖成分との結合もしていない。
【０２１６】
１〜４の化合物の種々の立体異性体が、本発明の範囲の中にあることが想定されている。種々のキラル中心がアスタリスクで印されており、各キラルセンターは、Ｒ又はＳ立体配置であってよい。しかしながら、これら印されたキラル中心の全てがＲ立体配置であることが好ましい。
【０２１７】
リン酸化されていない化合物１〜４は、クロマトグラフィー、カラムクロマトグラフィーＨＰＬＣその他のような、当業者に知られた技術を用いて、リン酸化された化合物から分離することができる。一旦分離されると、リン酸化されていない化合物の一リン酸化された化合物に対する他の比も調製できる。化合物１〜４の重量比は、リン酸化されていない糖脂質の対応する一リン酸化化合物に対する比約９０：１０から約６０：４０の範囲にあることが好ましく、最も好ましくは比は８０：２０である。
【０２１８】
リン酸化されていない化合物１〜４並びにリン酸化された化合物１〜４は、薬剤学的に許容しうる塩としても存在してよい。例としては、薬剤学的に許容し得る金属塩、例えば、特に第１族及び第２族の塩、例えば、ナトリウム、カリウムカルシウム、マグネシウムその他である。
【０２１９】
凝集体中では、実施例１４〜１７で単離されたこれらの混合物は、ここで定義されたカイバードラッグを形成するであろう。
【０２２０】
実施例１４〜１７で単離された混合物は、ここに記載したカイバードラッグの有用性を示す。
【０２２１】
〔実施例１８〕
多施設研究での、咳、風邪又は副鼻腔炎及び感染性呼吸器系の患者７８名を、ここに記載した手順を用いて彼等から単離したカイバードラッグで治療した。医者の監督下、カイバードラッグを毎日４週間。彼等は皆、毎日の投与量１００μｇ／ｍＬを非経口的に、又は皮下で２００〜３００μｇ／ｍＬ又は１０００μｇ／ｍＬの何れかの同じ投与量計画に置かれた。
【０２２２】
投与量を高めることなしに、全患者が有意に且つ個々に回復した。加えて、８種の異なったサイトカインが分析され、治療期間中におけるそれらの変動が、治療の前、治療中及び治療の終りにモニターされた。加えて、これらのサイトカインは、上記感染の軽い症状を有しカイバードラッグによる治療を受けなかった患者においてもモニターされた。特に、観察されたサイトカイン濃度の変化は、カイバードラッグによる治療の前、最中及び後に定量された。Ｆｉｇ． ２ は、カイバードラッグによる治療を受けていない及び受けた患者におけるインターロイキン−１０βの濃度の相対的変化を示している。グラフにおいて、（○ー○）で示した線は、無治療の患者に対応するものであり、（●ー●）で示した線は、カイバードラッグによる４週間の治療を受けた患者に対応するものである。治療の前及び後における体積あたりのコロニー数は、ｍＬあたりコロニー１０５ないし１０６個と急速に増加し、且つ患者血清中のインターロイキン−１０の濃度が２５０ｐｇ／ｍＬから１，５００ｐｇ／ｍＬ以上へと上昇していることが明瞭に見られる。これは、カイバードラッグの刺激による、殆ど１００μｇ／ｍＬの強度（これは、ｍＬあたり１０５個の細胞に等価である）のインターロイキン−１０の指数関数的増加に一致しており、このことは、非常に高い治療指数及び刺激指数を示している。このことは、同一のアッセイ条件下におけるヒト血液標本を用いたインビトロ及びインビボの実験によっても確認された。
【０２２３】
ＩＬ−１β及びＩＬ−１０のバイオアッセイは、患者の血清を用いてエクスーインビトロ（ｅｘ−ｉｎ ｖｉｔｒｏ）試験として実施した。ＩＬ−１α及びβのバイオアッセイは、共に、これらのサイトカインがＥＬ４．６．１及びＬＢＲＭのようなＴ細胞株により、又は胸腺細胞（ＬＡＦアッセイ）の初代培養においてＩＬ−２産生を誘導する能力を利用する。典型的なアッセイ系の一つが、プロトコール１及び２に示されており、それぞれ付属書類としてここに添付されている。これらのアッセイ系は、Ｍ． Ｗａｄｈｗａ， Ｃ． Ｂｉｒｄ， Ｌ． Ｐａｇｅ， Ａ． Ｍｉｒｅ−Ｓｌｕｉｓ 及びＲ． Ｔｈｏｒｐｅにより ”Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ， Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ”， ２ｎｄ ｅｄ．， Ｆ．Ｒ． Ｂａｌｋｗｉｌｌ編、ＩＲＬ−Ｐｒｅｓｓ ａｔ Ｏｘｆｏｒｄ Ｐｒｅｓｓ， １９９５， ｐｐ． ３５８−３６１に発表されているプロトコールに非常に近いものである。ＩＬ−１０についてのプロトコールは、本質的にＭ． Ｗａｄｈｗａ等によって同書の３６８〜３６９頁に提示されているものと同じである。
【０２２４】
Ｆｉｇ． ３ は、自家ワクチンによる治療の前後における、カイバードラッグの数に関する同じコロニー集団内でのインターロイキン−１βの有意な減少を示す。線（○ー○）は、治療前のインターロイキンＢの濃度であり、線（●ー●）は、治療後のその濃度を表す。カイバードラッグによる治療を受けた患者の血清中において、インターロイキンー１βの相対的産生の有意な指数関数的減少が観察され、これはインターロイキンー１０の増加に対して不変である。これらの患者群に関して、この投与量計画内で、カイバードラッグによる治療の下での種々のサイトカインの生合成の相違又は調節が、Ｆｉｇ． ４ に示されており、治療前及び治療後のそれぞれの数及び絶対値における変化をも明らかにしている。Ｆｉｇ． ４ に記載された実験において、副鼻腔炎に罹っている２７５名の患者が、皮下で１００μｇにより治療された。治療前（●ー●）及び４週間にわたる治療後（−）におけるインターロイキンの変化が、グラフにより描かれている。明瞭に示されているように、インターロイキンの種々の濃度は、治療の前後で変化した。このことはまた、カイバードラッグの投与後のインターロイキン−１０の増加を測定することにより、ヒト血液サンプルにおけるインビトロ研究によっても確認された。すなわち、それはカイバードラッグ２．０ｍｇ／ｍＬにおいて１４より大なる高い刺激指数を示し、これは参照サンプルとしての通常のＬＰＳよりも低い強度である。これらの臨床例は、例えば咳及び風邪、気管支炎又は副鼻腔炎並びにリウマチなどの種々の疾病の治療におけるカイバードラッグの有用性を検証しており、そこでは感染経路において又は骨関節炎の増悪においてその阻害作用を働かせることにより、類似の要因がカイバードラッグによって調節されまたは刺激され、それに続いてそれらの疾病によって引き起こされていた症状が緩解されて、患者に歓迎される。
【０２２５】
例えば、骨関節炎に罹っている患者（Ｎ＝１４、平均年齢５５）が、皮下によるカイバードラッグの１００μｇの投与量を毎日（朝、朝食後）、４週間の期間に亘って受けたが、症状の緩解を、特に関節においてまた有意な疼痛緩解を報告した。結果として、非ステロイド抗炎症剤の有意な、例えば、イブプロフェン又はＳ−（＋）−ナプロキセンの場合通常５０〜６０％の量の低減が観察された。加えて、この形態のリウマチの増悪は、有意に減少し、これは、上で用いた試験による患者からの血液の臨床的試験により測定されたインターロイキン及びサイトカインと強く相関し得た。カイバードラッグで治療されたこれらの患者のエクス−インビボ試験は、通常、Ｆｉｇ． ３ に示したのと全く同一のパターンを明らかにした。
【０２２６】
カイバードラッグは、種々のサイトカイン、例えばプロテアーゼインヒビターのような酵素等の濃度の変化を引き起こす。インターロイキン濃度におけるこの同じ変化が、リウマチ性疾患又は骨折、打撲、慢性リウマチ疼痛、神経炎又は、連鎖球菌又はブドウ球菌によって引き起こされた感染性疾患の患者であってカイバードラッグにより治療されたものに見られてきた。
【０２２７】
拘束されることは望まないが、カイバードラッグは、プロテアーゼの刺激を介して細胞の形態変化特性及びそれらの凝集性に影響を及ぼすと信じられる。カイバードラッグの投与は、先に露出されアクセス不能であった膜のレクチン結合部位のタンパク質分解を誘導し、これは、プロテアーゼ阻害系の作用の逆過程であると信じられる。他方、プロテアーゼ阻害物質系は、正常細胞においてレクチンの凝集を誘発する。更には、それらは、形態変化した細胞の凝集と関連しており、細胞増殖の制御に対する外因性の植物レクチンの効果を模擬する。細胞にインビトロでカイバードラッグが投与されたとき、細胞は、凝集不能となり、且つ細胞分裂がかなり遅くなる。
【０２２８】
カイバードラッグの投与が、細胞の形態変化及びプロテアーゼ処理に伴なう細胞運動性の正常な抑制の喪失をもたらすことも観察されている。傷への繊維芽細胞の移動は、プラスミン依存性の過程であり、これはプロテアーゼ阻害物質により抑制される。カイバードラッグが投与されたとき、繊維芽細胞は、粒子を摂食する能力を有し、そしてＦｃ受容体を提示する。それらは、従って、免疫複合体活性化又はプロテアーゼ産生に感受性であるように見える。多形核白血球の走化性、エキソサイトーシス、食作用、及びスーパーオキサイドアニオン産生は、典型的にプロテアーゼ依存性の過程であり、従って、慢性リウマチに罹っている患者の実験室試験を含め、カイバードラッグの影響を研究できる。スーパーオキサイド、特にＨＯＯ−アニオン（Ｈ．Ｈ． Ｐａｒａｄｉｅｓ ｅｔ ａｌ．， Ａｐｏｔｈｅｋｅｒ−Ｚｅｉｔｕｇ， １２６， ４７７−４８３， １９８５； Ｈ．Ｈ． Ｐａｒａｄｉｅｓ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｅｕｒ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ．， ２５， １４３−１５６， １９９０； Ｈ．Ｈ． ｐａｒａｄｉｅｓ ＆ Ｋ．Ｅ． Ｓｃｈｕｌｔｅ， Ａｎｎ． Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．， Ｖｏｌ． ５２９， ２２１−２２８， １９９８）が、炎症性関節炎の病原の主たる要因の一つであり、植物の有糸分裂促進物質又は非ステロイド抗リウマチ薬に対するリウマチ様滑液リンパ球の応答低下の原因となっているということが前提とされた。スーパーオキサイドアニオン及びＨＯＯ−の効果に対して、Ｔ細胞はＢ細胞よりも感受性である。しかしながら、有効量のカイバードラッグが投与されたとき、ｉ）スーパーオキサイド及びＨＯＯ−アニオンは、無視し得る濃度にしか存在しない、ｉｉ）驚くべきことに、コンカナバリンＡ応答性リンパ球（抑制性細胞）は、コンカナバリンＡのみで処理したときはもはや感受性でない、ｉｉｉ）特に炎症性関節炎に罹っている患者においては滑液中に無視し得る量しか存在しないスーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）は、リンパ球機能に対するスーパーオキシドアニオンの抑制効果を阻害しないが、驚くべきことに、カイバードラッグによる治療中には、阻害する。
【０２２９】
更には、驚くべきことに、カイバードラッグが、インターフェロン及びインターロイキンの刺激により特異的に制御されているある種の自家エステラーゼ活性を有していることが見出された。すなわち、炎症過程において遊離されると、これらのインターフェロン及びインターロイキンは、エステラーゼ活性に加えて、カイバードラッグの表面活性的な様式のために、天然の及びインターフェロン刺激性のキラー細胞活性の双方を賦活する。
【０２３０】
カイバードラッグは、肥満細胞表面のＩｇＥ分子の凝集を阻害し、従って、ヒスタミン、セロトニン、ヘパリン、プロテアーゼの遊離を減少させ、更に例えばロイコトリエン及びプロスタグランジン等の遅反応遊離物質を阻害する。この機序により、カイバードラッグは、慢性的炎症の患者の血清中のＣ−反応性タンパク質を制御することができる。
【０２３１】
繊維芽細胞に対して有糸分裂促進的であり、慢性炎的症過程の特徴である循環中のプロテアーゼは、骨関節炎及び強皮症の患者において認められてきた。この効果は、カイバードラッグにより、特に骨関節炎の重症例において、制御される。拘束されることは望まないが、これは、その独特な分子のコンフォメーションに帰すことができると信じられる。カイバードラッグは、患者の血清中に存在する細胞毒性物質を不活性化させ、それにより内皮細胞が細胞毒性の内因性に産生された物質から攻撃されるのを防ぐ能力を有する物質であるとみなされてよい。拘束されることは望まないが、急性の免疫反応におけるカイバードラッグによるプロテアーゼの刺激のための可能な役割の一つは、皮膚へのチオールプロテイナーゼの注入に対する浸潤応答であり、プロテアーゼ誘発性の、走化性及びエキソサイトーシス並びにスーパーオキシド又はＨＯＯ−アニオン産生の増加であると信じられる。拘束されることは望まないが、浸潤応答は、カイバードラッグのサイズ、電荷及び形状の力学のためである一方、走化性の増大並びにプロテアーゼの酵素活性の増大もまた主としてカイバードラッグによるものと信じられる。炎症性の滑液は、軟骨を分解する能力のある、増大されたエステラーゼ活性を含み、これはカイバードラッグによる治療の下で、減少され又は除去される。金属タンパク質であるコラゲナーゼ及びプロテオグリカナーゼによる軟骨細胞誘発性の軟骨破壊は、酵素阻害のため、カイバードラッグにより「下流調節」される。
【０２３２】
拘束されることは望まないが、カイバードラッグは、抗体依存性の細胞媒介性の細胞毒性及びナチュラルキラー細胞活性を含む、低下した細胞障害性リンパ球活性によって内因性に、阻害的プロテアーゼ活性を調節するものと信じられる。更には、マクロファージ阻害因子活性を亢進することにけるプロテアーゼの阻害物質としてのカイバードラッグの作用は、マクロファージの表面接着、食作用及び腫瘍細胞毒性をも高める。更には、多形核白血球の走化性、食作用、脱顆粒、及びスーパーオキサイド又はＨＯＯ−産生は、驚くべきことに、カイバードラッグに感受性の過程である。従って、これらの遊離基によって引き起こされる疾患は、カイバードラッグによって治療できる。カイバードラッグはまた、槽のマクロファージ、末梢血単核球、多形核白血球、及び好塩基球によって産生される内因性の及び刺激に関係したスーパーオキサイド及びＨＯＯ−アニオンをも減少させる。カイバードラッグはまた、ウイルス性血液凝集素に対するカイバードラッグと細胞表面の唾液オリゴ糖との競合を測定するものである血液凝集素試験、及び、インフルエンザＡウイルスによる感染の前後でのＭＤＣＫ細胞（Ｍａｄｉｎ−Ｃａｒｂｙ イヌ腎臓）におけるプラーク減少を測定する感染性試験を適用してインビトロ研究によって測定されたように、それぞれ風邪及び鼻炎の患者のインビトロ及びインビボ研究で認められるように唾液タンパク質に関連した抗原性をも示す。インフルエンザＡウイルスプラーク試験アッセイは、Ｋ． Ｔｏｂｉｔａ， ｅｔ ａｌ．， Ｍｅｄ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｉｍｍｎｏｌ．， １９７５， １６２， ９−１４； Ｈａｙｄｅｎ， Ｆ．Ｇ．， Ｃｏｔｅ， Ｋ．Ｍ．， Ｄｏｕｇｌａｓ， Ｒ．Ｇ．， Ｊｒ．， Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ． Ａｇ． Ｃｈｅｍｏｔｈ．， １９８０， １７， ８６５−８７０に従って行った。具体的には、ＭＤＣＫ細胞にインフルエンザＡ／ＰＲ／８／３４（ＡＴＣＣ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ）を接種し、４μｇのトリプシンを含んだイーグル最小培地、ｐＨ７．３〜７．５で、ウェルあたり約５０個のプラークを与えるまで希釈した。ウイルスが吸着するよう、細胞を２５℃にて１時間放置し、その後、１％のアガロース、２μｇ／ｍＬのトリプシン、０．００１％のＤＥＡＥ−デキストラン（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）及び試験すべき量のカイバードラッグを含んだ、細胞増殖培地（ＤＣＣＭ−１， Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ、ドイツ）で覆った。３２℃で７２時間後、２．５％グルタルアルデヒドで固定し続いてカルボポールフクシンで染色することによりプラークを可視化した。カイバードラッグの不存在下でのプラーク形成の阻害パーセントは、各阻害的カイバードラッグ濃度について計算した。３本行ったこれらの実験からの平均の％阻害値は、５０％における阻害濃度を評価するのに用いた。具体的な対イオン例えば、それぞれＣａ２＋又はＭｇ２＋の存在に依存して、ＩＣ５０は、カイバードラッグ１０μｇ／ｍＬないし５０μｇ／ｍＬの範囲にあることが見出された。Ｇ．Ｎ． Ｒｏｇｅｒｓ， Ｔ． Ｐｒｉｔｃｈｅｔｔ， Ｊ．Ｌ． Ｌａｎｅ ａｎｄ Ｊ．Ｃ． Ｐａｕｌｓｏｎ， Ｖｉｒｏｌｏｇｙ， １９８３， １３１， ３９４−４０８に従って、血液凝集素阻害試験（標準の試験）を実施した。カイバードラッグについてのＩＣ５０値は、Ｚｎグルコン酸（０．００１％）の添加又は不存在に応じて、それぞれ、２．０μｇ／ｍＬないし０．２μｇ／ｍＬの範囲にあった。
【０２３３】
α−２マクログロブリンもまた、カイバードラッグによって調節される中心的なプロテアーゼ阻害物質である。α−２マクログロブリンは、α−１−アンチトリプシンプロテアーゼインヒビターのような他の阻害物質からのプロテアーゼの移転において担体タンパク質として機能し、例えば、抗トロンビンＩＩＩ中和からのプラスミンの保護、繊維芽細胞上のプラスミン感受性の表面結合フィブロネクチン分子の分解からの保護、及び／又は、軟骨のパパイン分解からの保護等（Ｄ．Ａ． Ｌｅｗｉｓ， ”Ｅｎｄｏｇｅｎｅｏｕｓ ａｎｔｉ−ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｐｒｏｔｅｉｎｓ”， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．， ２６， ６９３， １９７７）、他の一層特異的な阻害物質の活性に対して保護的機能を有する。α−２−マクログロブリンは、関節液からの免疫複合体の除去に重要な機序を有する。免疫過程の増強を伴うその後のマクロファージによるそのような複合体の除去は、マクロファージ活性化及びプラスミノーゲン遊離の作用によると信じられる。α−２−マクログロブリンのスペクトルは、α−１−アンチトリプシンプロテアーゼインヒビターのそれに幾分似ているが、トリプシンとの反応がカイバードラッグによってかなりの程度に、α−１−アンチトリプシンプロテアーゼインヒビターによるよりも遥かに迅速な仕方で刺激されること、ヘパリンによる影響を受けないが、しかしカイバードラッグによって強く影響を受けることは、驚くべきことである。これは、α−２−マクログロブリン−トロンビン複合体形成のヘパリンによる阻害と対照的である、というのは、カイバードラッグは、トロンビンには結合しないが、ヘパリンは結合するからである。α−２−マクログロブリンは、内皮表面に位置し、接着性細胞の活性を調節して炎症性応答を低下させることができる。カイバードラッグはα−２−マクログロブリンを刺激することから、炎症におけるカラゲニン、ヒスタミン、プロスタグランジンＥ２、セロトニン、及びブラジキニン誘導の阻害は、以前に測定された非常に感受性のパラメータと調和できる。遊離の及び複合体形成したα−２マクログロブリンのカイバードラッグとの相対的比率は、炎症性疾患を有する患者において観察されている生物学的効果を決定する。更には、リウマチ様関節炎を有する患者から誘導されたカイバードラッグによるα−２マクログロブリンの刺激は、ポリクローナルなＢ細胞活性化物質の活性を介して示された。健康な個人からのα−２−マクログロブリンは、この活性を示さないが、リウマチ様関節炎の患者は示す。従って、カイバードラッグはポリクローナルなＢ細胞活性化の原因となるということと、α−２−マクログロブリン−プロテイナーゼ複合体がマクロファージの活性化の原因となるということが調和する。
【０２３４】
更には、固有のα−２−マクログロブリン抗原性決定基はまた、カイバードラッグによって刺激されたとき、ヒト中における細菌の生存を減じるカイバードラッグの能力の原因である。カイバードラッグの支持のため、生物体の機構は重要な要素でなければならない、というのは、血中の阻害物質を凌駕するため過剰のプロテアーゼを産生しなければならないからである。「盲目の」腸の存在は、追加のα−２−マクログロブリン複合体を、それらが感染部位へ拡散して行くに応じて産生できる過剰のプロテアーゼの還流を必要とする。カイバードラッグの不存在下におけるそのような複合体の免疫抑制効果は、持続的な侵襲における一要素であり、炎症及び感染という連続的な出来事を、それぞれ提供する。
【０２３５】
更には、遊離のα−２−マクログロブリンの重要性は、循環中における及び腹腔内におけるα−２−マクログロブリンの飽和には、これらのカイバードラッグの投与により防止できるショック及び死が通常続く、という観察に反映している。更には、この特定の阻害物質の飽和の程度は、生命に関わる決定因子であるように思われる。従って、カイバードラッグの投与によって、微妙なバランスが導入される。従って、カイバードラッグが完全に複合体形成するにはα−２−マクログロブリンの１ｍｇあたり、僅か約１５μｇのトリプシンしか必要でない。カイバードラッグそれ自身並びにカイバードラッグとα−２マクログロブリンよりなる複合体は、胃及び腸粘膜の保護を含む、自己消化の防止における中心的役割を果たす。
【０２３６】
α−２−マクログロブリンの欠乏は、呼吸窮迫症候群、を含む消費性凝固障害を含む敗血症、限局性の腸炎、多発性骨髄腫の患者に、不当軽量児に、又はストレプトキナーゼ治療において、見出されている。更には、α−２マクログロブリンレベルはまた、インビボでプラスミンが産生されたときにも抑制されるが、血栓性の状態では抑制されない。肺におけるα−２−マクログロブリンの存在は、血清中に見出されるそれより通常２５％低いが、気腫の初発におけるα−２−マクログロブリンの保護効果の欠如を説明しており、これは今やカイバードラッグの投与によって回避することができる。呼吸窮迫症候群において観察される抑制されたレベル、及び、α−１−アンチトリプシン欠乏を有する患者が気腫を発症しないことは、α−２マクログロブリンの役割が、カイバードラッグの調節効果を含んで、重要性を欠くものでないことを示唆している。
【０２３７】
α−２−マクログロブリンの血清レベルは、リウマチ様関節炎患者において、たとえα−２−グロブリンレベルが上昇していたたとしても、殆ど正常であることが報告されている（Ｊ．Ｒ． Ｌａｄｄ ＆ Ｊ．Ｔ． Ｃａｓｓｉｄｙ， ”Ｓｅｒｕｍ ａｎｄ Ｓｙｎｏｖｉａｌ ｆｌｕｉｄ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ ｏｆ α−２−ｍａｃｒｏｂｌｏｂｕｌｉｎ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ ａｒｔｈｒｉｔｉｓ”， Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ．， １２， ３０９， １９６９）。加えて、リウマチ様関節炎又は変性関節炎の患者の滑液中のα−２−マクログロブリンの有意な割合が、コラゲナーゼやカテプシンのような滑液酵素の結合のために、機能的に不活性であることが見出され、これは、カイバードラッグの存在により逆転されることを示すことができる。
【０２３８】
カイバードラッグはまた、炎症性の関節炎をも抑制する。炎症性の関節炎においては、α−２マクログロブリンは、コラーゲンの３重螺旋を分解する滑液コラゲナーゼ、プロテオグリカンを分解するカテプシンＤ、及び双方を分解するカテプシンＡを阻害する。これらの分解過程は、リウマチ様関節炎の患者においてカイバードラッグの投与後に有意に阻害された。更には、遊離のプラスミンの存在下に起こる内皮表面の自己消化を制限するα−２マクログロブリンの役割及び調節は、カイバードラッグの存在下に、有意に減少され、コラーゲン血管疾患の病原における脈管構造に重要である。
【０２３９】
カイバードラッグによって調節される別の一要素は、抗トロンビンＩＩＩであり、これは、他の機能と共に、フィブリン溶解及び補体系を調節する多数の酵素のインヒビターであって、本発明の文脈において重要である。より直接的な免疫調節は、細胞分裂及び有糸分裂促進剤で誘発されたＴ細胞増殖の阻害の過程において、カイバードラッグと共に抗トロンビンＩＩＩについて観察されており、おそらくトロンビンの阻害を反映している。抗トロンビンＩＩＩは、カイバードラッグによって刺激されたとき、マクロファージ活性化因子及びその後応答においてマクロファージ遊走阻止因子の刺激を増強する。
【０２４０】
レトロウイルスに対するカイバードラッグの阻害効果
カイバードラッグについて観察された別の予期せぬ効果の一つは、ＡＩＤＳ患者の血液からのヒト免疫不全ウイルス１型及び２型（ＨＩＶ１及び２）に感染させたリンパン球培養における、阻害作用であり、これは、ウイルス産生（負荷）及び感染性についてのアッセイ系によって判定された。感染の経路は、ｉ）ビリオン関連タンパク質アッセイ例えばｐ２４抗原捕捉の定量的により直接的に、又は、逆転写酵素（ＲＴ）及びｇｐ１２０糖タンパク質により間接的に、ＨＩＶ粒子の数によって、ｉｉ）ＴＣＩＤ５０（組織培養感染投与量、半値）測定及び合胞体形成（ＳＣＦ）アッセイにより粒子の感染性によって、モニターした。ｐ２４抗原捕捉アッセイ、ＲＴアッセイ並びにｇｐ１２０タンパク質アッセイを使用することの利点は、粒子に関連したタンパク質の変化を、それらの濃度対カイバードラッグの濃度を含めて、定量的に評価するための感度及び定量可能性に関係している。ＲＴアッセイは、ｐ２４抗原捕捉アッセイより感度が低いことが知られているが、しかしｇｐ１２０アッセイと同等の感度であることが見出された。アッセイ系は、科学文献、特に ”ＨＩＶ， Ｖｏｌｓ． １＆２， Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ， Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ”， Ｊ． Ｋａｒｎ編， ＰＡＳ−Ｓｅｒｉｅｓ， ＩＲＣ−Ｐｒｅｓｓ， Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，１９９５に記載され、及びＺｉｍｍｅｒｍａｎｎ と Ｐａｒａｄｉｅｓ （１９７７）によってドイツ特許ＤＥ ＃１９６ ３２ ８２３．３に記載のものであり、技術状態とみなされる。加えて、Ｒ． Ｐａｕｖｅｌｓ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ， ２０， ３０９， １９８８によって導入されたＭＴＴの適用によって改良した抗ＨＩＶアッセイ系も使用した。ヒトＴリンパ球ウイルス１型を含んだヒトＴ４陽性細胞株であるＭＴ−４細胞を、ＨＩＶ−１ＨＴＬＶ−ＩＩＩＢで感染の多重度０．０１で感染させ、そしてＨＩＶ−１感染及び偽感染ＭＴ−４細胞を、種々の量のカイバードラッグ（μｇ／ｍＬ）の存在下に３７℃で４日間、ＣＯ２インキュベータ中でインキュベートした。ＨＩＶ−１感染及び偽感染ＭＴ−４細胞双方の生存可能性を、３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウム（ＭＴＴ）の減少を介して分光光度法によりアッセイした。抗ＨＩＶ活性はＩＣ５０として表され、これはＭＴ−４細胞のＨＩＶ感染の５０％阻害のために必要な濃度を表す。細胞毒性濃度ＣＣ５０は、ＭＴ−４細胞に対する試験材料の５０％毒性濃度によって決定された。これらの感染リンパ球に基づいて改良されたＲＴアッセイ系を用いた。更には、カイバードラッグが抗凝固活性を欠くことを示すために、ウシ血漿を用いて、Ｋ． Ｈａｔａｎａｋａ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ．， ３０， ８１０， １９８７に記載の改良された手順により、２５単位／ｍｇの抗凝固活性を有するデキストラン硫酸を参照標準として用いて、この活性を評価した。
【０２４１】
ＨＩＶのエンベロープの糖タンパク質であるｇｐ１２０は、６個のα螺旋よりなる明確な二次構造を有し、６個のα螺旋のうち４個、すなわちα１、α４、α５及びα６は、Ｃ１、Ｃ４及びＣ５領域において保存されており、他の２個の螺旋すなわちα２及びα３は、Ｖ２領域及び偽保存Ｃ３領域に見出される（Ｊ−Ｆ． Ｈａｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｔｅｉｎｓ， ２５， １， １９９６； Ｌ． Ｒａｔｎｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３１３， ２７７， １９８５）。プロテアーゼ阻害及び経口又は非経口でカイバードラッグの投与を受けた患者における賦活効果に関してカイバードラッグについて得られた結果に照らし、拘束されることは望まないが、カイバードラッグは、ウイルス複製の間のＨＩＶ特異的プロテアーゼ酵素の活性を遮断すると信じられる。プロテアーゼは、ウイルスの遺伝材料から形成されるウイルスタンパク質を、より短い鎖へと切断する。これは、宿主細胞中で新たなウイルス粒子を成功裏に組み立てるために必須である。従って、プロテアーゼ阻害剤は、ＨＩＶ粒子を、その複製サイクルにおいて、一旦宿主細胞内に入たとき遺伝材料のウイルス複製を阻害するものである逆転写酵素阻害薬より、遅い段階で攻撃する。
【０２４２】
拘束されることは望まないが、カイバードラッグは、Ｋｍ値５００μｇ及びｋａｃｔ＝２０分−１を有する非競合的阻害物質であり、Ｋｍ値に対して如何なる有意な影響も及ぼさずに減少させると信じられる。しかしながら、ＲＴアッセイにおいて適用するよりも遥かに低い濃度でカイバードラッグで処置したとき、ＨＩＶ粒子の数の有意な減少及びｇｐ１２０及びｇｐ２４の濃度の減少がそれぞれ観察された。これらの濃度は、しかしながら、ｐＨによって変動し、ｐＨ６．５（３７℃）において１００μｇ、ｐＨ７．８（３７℃）において２０μｇという値を明らかにした。
【０２４３】
カイバードラッグによりＭＴ−４細胞に対するウイルス感染を５０％阻害するに有効な濃度であるＥＣ５０値を得るために、ＭＴ−４細胞株及びＨＩＶＨＴＬＶ−ＩＩＩＢ株を用いて、カイバードラッグの抗ＨＩＶ活性をＭＴＴ法によってアッセイした。ＨＩＶ感染患者に投与される低分子量の薬物とは対照的なカイバードラッグの流体力学的に大きなサイズにも拘わらず、カイバードラッグの全調製物は、０．１５４Ｍ ＮａＣｌ中での細胞培養物に投与したとき、０．４ないし０．６μｇ／ｍＬの範囲のＥＣ５０値によって表される抗ＨＩＶ活性を示した。ｐＨ変化や異なったイオン強度は、ＥＣ５０値を有意に変化させなかった。更には、ＣＣ５０値によって得られるものとしてのカイバードラッグの細胞毒性は、８００μｇ／ｍＬより大きく、この量より上である１０００μｇ／ｍＬより上においてＣＣ５０値に変化は見られなかった。本発明者等はまた、ヘパリンを参照として又はデキストラン硫酸を標準参照として用いて、米国薬局方に従って、活性化部分トロンボプラスチン時間によって、この濃度範囲のカイバードラッグの抗凝固活性の依存性につき評価した。それらは、適用したカイバードラッグの全ての濃度において抗凝固活性がないことを結論付け、これはやはり抗ＨＩＶ活性を有する硫酸化多糖類について報告されているのとは非常に異なっている（Ｆｉｇ． ５）。
【０２４４】
上記の好ましい具体化物は、例であり、本発明の範囲と精神とを説明するために提示されている。ここに記載された具体化物及び例は、他の具体化物及び例を当業者にとって明らかなものとするであろう。これら他の具体化物及び例は、本発明の意図の範囲内にある。従って、本発明は、添付の請求の範囲によってのみ制限されるべきものである。
【０２４５】
プロトコール１．ＣＴＬＬ細胞株を用いたＩＬ−２のバイオアッセイ
装置及び試薬
・ＣＴＬＬ細胞培養物
・ＲＰＭＩ １６４０培地
・１０％ＦＣＳ含有ＲＰＭＩ １６４０培地
・遠心機（ＭＳＥベンチトップ）
・トリパンブルー
・ＩＬ−２標準
・試験サンプル
・９６ウェル ミクロタイタープレート
・３７℃、５％ＣＯ２、加湿インキュベーター
・［３Ｈ］チミジン（２５Ｃｉ／ｍＭｏｌ、５ ｍＣｌ／５ ｍｌｓ）
・フィルターマット
・液体シンチレーションカウンターシステム
【０２４６】
方法
１．ＣＴＬＬ細胞（培養３日後）を、ＲＰＭＩ１６４０で細胞を２５０ｇ１０分間遠心することにより、３回洗浄。
２．例えばトリパンブルー色素排除ａによって細胞の生存能力を判定し、細胞を１０％ＦＳＣを含有するＲＰＭＩ１６４０培地に最終濃度１×１０５個／ｍｌになるよう再懸濁させる。
３．９６ウェルマイクロタイタープレート中において、ＩＬ−２標準を３本ずつ滴定する。４０ ＩＵ／ｍｌのＩＬ−２で滴定を開始し、次いで、０．０１９ ＩＵ／ｍｌのＩＬ−２まで、連続的な２倍希釈を行う。サンプルの希釈物を各３本ずつ用意する。陰性対照、すなわち培地のみのものを用意する。各ウェルは、５０μｌを含むべきである。
４．５０μｌの細胞懸濁液を各ウェルに加え、プレートを１８時間３７℃にて加湿したＣＯ２インキュベータ中でインキュベートする。
５．０．５μＣｉのトリチウム化チミジンを各ウェルに加え、プレートをインキュベータに約４時間戻す。
６．各ウェルの内容物をフィルターマット上に収穫し、液体シンチレーションカウントにより放射能を測定する。
７．ｃ．ｐ．ｍ．対ＩＬ−２濃度の標準曲線をプロットする。未知サンプル中の放射能の定量のために、結果を標準曲線と比較する。
ａ細胞は８０％超の生存能力であるべきである。
【０２４７】
プロトコール２．　ＥＬ４／ＮＯＢ−１細胞株ｂを用いたＩＬ−１ａのバイオアッセイ
装置及び試薬
・ＥＬ４／ＮＯＢ−１細胞培養物
・５％ＦＣＳを含んだＲＰＭＩ１６４０培地
・ＩＬ−１標準
・試験サンプル
・及びプロトコール１の装置及び試薬
【０２４８】
方法
１．ＥＬ４／ＮＯＢ−１細胞（培養２〜３日後）を、ＲＰＭＩ１６４０培地で細胞を２５０ｇ１０分間遠心することにより２回洗浄し、プロトコール１のステップ（２）のようにして生存能力を判定。
２．５％ＦＣＳを含んだＲＰＭＩ１６４０培地に最終濃度５×１０５個／ｍｌとなるように細胞を再懸濁。
３．ＩＬ−１標準の滴定を、９６ウェルマイクロタイタープレート中で３本ずつ分布させる。標準の滴定を１００ｐｇ／ｍｌのＩＬ−１（１０ ＩＵ／ｍｌ）から開始し、連続的な２倍希釈を０．０９ｐｇ／ｍｌのＩＬ−１（０．００９ ＩＵ／ｍｌ）になるまで行う。ＩＬ−１活性の測定のためにサンプルの適当な希釈（２倍又は１０倍連続希釈）を３本ずつ行う。陰性対照は培養培地である。各ウェルは、この段階で１００μｌの液量を含むべきである。
４．１００μｌの洗浄済み細胞懸濁液を各ウェルに加え、プレートを２４時間、３７℃にて加湿されたＣＯ２インキュベータ中でインキュベートする。
５．各ウェルから５０μｌの上清を除去し、存在するＩＬ−２を、ＣＴＬＬ−２バイオアッセイＣを用いて定量する（プロトコール１を参照）。上清中のＩＬ−２の量は、元のサンプル中のＩＬ−１の量に比例するであろう。ＥＬ４／ＮＯＢ−１細胞からの上清は、除去し、ＩＬ−２を便利にアッセイできるまで冷凍貯蔵することができる。
ａＩＬ−１ｎ及びβは、このアッセイで等しい感度を有する。
ｂＥＬ４／ＮＯＢ−１細胞株はまた、マウスのＴＮＦαに対しても応答する。
ｃＮＯＢ−１バイオアッセイはＣＴＬＬ−２バイオアッセイを第２段階で使用することから、もしＩＬ−１活性を試験しているサンプル中に存在すれば、ＩＬ−２及びｍＩＬ−４が干渉し得る。これは、サンプルを、ＥＬ４／ＮＯＢ−１細胞株と４〜５時間予備インキュベートし、続いて細胞をステップ４及び５に先立って徹底洗浄することによって、克服することができる。
【０２４９】
【表１】
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【０２５０】
【表２】
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【０２５１】
【表３】
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【０２５２】
【表４】
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【０２５３】
【表５】
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【０２５４】
Ｆ．　Ｅに掲げたのと同じ培地、但し１００μｇのマイトマイシンＣを加え、ｐＨ６．５、３７℃
Ｇ．　Ｆに掲げたのと同じ培地、但し１００μｇのマイトマイシンＣに加え、０．１５０ｇＬ−（−）−メチオニンを添加、但しＳ−（−）−アデノシルメチオニン・Ｈ２ＰＯ４は不含、ｐＨ６．５、３７℃
【０２５５】
【表６】
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【０２５６】
【表７】
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【０２５７】
【表８】
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【図面の簡単な説明】
【Ｆｉｇ１（ａ）】及び
【Ｆｉｇ１（ｂ）】カイバードラッグの透過型電子顕微鏡写真である。
【Ｆｉｇ２】カイバードラッグ（１００μｇ）により治療を受けていない又は受けている静脈洞炎の患者の血清中のインターロイキン１０β濃度（ｐｇ／ｍＬ）の相対的変化を比較するグラフ表示である。
【Ｆｉｇ３】カイバードラッグにより治療を受けていない又は受けている静脈洞炎の患者の種々のインターロイキンの調節を比較したグラフ表示である。
【Ｆｉｇ４】４週間の期間の治療の前後における、静脈洞炎の多数の患者（２７５）でのカイバードラッグ（１００μｇ、皮下）によって賦活された種々のインターロイキンの調節のグラフ表示である。
【Ｆｉｇ５（ａ）】カイバードラッグの存在下おけるインビトロでのＨＩＶ活性の阻害をグラフで描いている。
【Ｆｉｇ５（ｂ）】２つの異なったイオン強度におけるカイバードラッグの濃度の関数として、抗凝固活性をグラフで描いている。
【Ｆｉｇ６】約６３０ｎｍの可視光を用いた２５℃における散乱波ベクトルＱの関数としての、本発明により単離されたカイバードラッグのコロイド微結晶の回折パターンである。ｙ軸は、ａ．ｕ．単位（任意単位）で表してある。
【Ｆｉｇ７】約６３０ｎｍの可視光を用いた３７℃における散乱波ベクトルＱの関数としての、カイバードラッグのコロイド微結晶の回折パターンである。ｙ軸は、ａ．ｕ．単位（任意単位）で表してある。
【Ｆｉｇ８Ａ】２５℃における、コロイド微結晶のＸ線回折パターンである
【Ｆｉｇ８Ｂ】３７℃における、コロイド微結晶のＸ線回折パターンである
【図１（ａ）】
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【図１（ｂ）】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５（ａ）】
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【図５（ｂ）】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【国際公開パンフレット】
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【手続補正書】
【提出日】平成15年1月13日(2003.1.13)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
所望により薬剤学的に許容し得る塩と合わさった、単離された実質的に純粋な生物学的材料であって、次の特徴すなわち、
（ａ） 約０．３〜０．４０μｍの一定の流体力学的半径を有し、約０．０５〜約０．０８％の低い多分散性指数を有し、
（ｂ） 食塩溶液中でモノマー単位の凝集体を有し、約６８〜７５個のモノマーを該凝集体中に含み、
（ｃ） 該凝集体が、約１３０，０００〜約１５０，０００ダルトンの数分子量を有し、
（ｄ） 該モノマーが約１，９００〜約２，０００ダルトンの分子量を有し、
（ｅ） 二糖アミン部分を含み、該糖は、それらのうち１つがグルコースであるという条件で、グルコース又はガラクトースであり、
（ｆ） ピロリン酸基を含まず、
（ｇ） 該２つの糖の間に１，６　β−結合を含み、
（ｈ） 該モノマーは、リン酸基を含まないか、又は該糖の１位若しくは４’位にリン酸を含んでよく、しかしながら該凝集体は、リン酸を全く担持しない糖部分を少なくとも８０重量％含有し、一リン酸を有する糖部分を最大でも２０重量％までしか含有せず、
（ｉ） ３−ヒドロキシテトラデカン酸とアミド結合を形成していてよいアミノ官能性を２及び２’位に含み、
（ｊ） ヒドロキシテトラデカン酸でエステル化されていてよいヒドロキシ官能性を３及び３’位に含み、
（ｋ） モノマーあたり偶数個の３’−ヒドロキシテトラデカン酸を含み、そして　（ｌ） ２５℃においてＦｉｇ ８ＡのＸ線回折パターンを有する
ものである材料。
【請求項２】
無毒の生物学的材料を製造するための方法であって、
（ａ） 患者の感染部位におけるエンテロバクテリアシーから得られたエンドトキシン抽出物を集め、
（ｂ） コリシンを産生するがトリプトファンをインドールへと変換せず且つＭＵＧアッセイにおいて反応しない腸内細菌をスクリーニングして集め、
（ｃ） それらの選択された細菌を収穫し、
（ｄ） エンドトキシンを作ることのできないステップ（ｃ） の菌株を選択し、そして
（ｅ） ステップ（ｄ） の菌株を殺すこと
を含むものである方法。
【請求項３】
請求項２の方法であって、ステップ（ｅ） が、ステップ（ｄ） の菌株を、該ステップにおける該タンパク質を変性させるに十分な温度に加熱することを含むものである方法。
【請求項４】
請求項２の方法であって、２３０ｎｍ及び５５０ｎｍに吸収を示す脂質材料をステップ（ｅ） の産物から更に抽出することを含むものである方法。
【請求項５】
請求項４の方法であって、抽出が、該脂質材料をクロロホルム／メタノール又は溶液アセトニトリル／メタノール溶液で沈殿させ該産物を精製してこれを凍結乾燥することを含むものである方法。
【請求項６】
請求項４の方法であって、抽出が、該脂質材料を水性食塩溶液中に入れ、クロマトグラフィーにより該粗製の脂質産物を精製し、約２３０および５５０ｎｍに紫外吸収を有する画分を集め、集められた画分を凍結乾燥し、目的の産物をクロロホルム／メタノール又はアセトニトリル／メタノールで沈殿させ、そして該沈殿された産物を精製することを含むものである方法。
【請求項７】
請求項４の方法であって、該無毒の生物学的材料が約１９００ダルトンのモノマー分子量と、約１２０，０００ないし約１５０，０００ダルトンの食塩溶液中凝集体分子量を有するものである方法。
【請求項８】
請求項２の方法であって、該無毒の生物学的材料を水性溶液中に入れることを含むものである方法。
【請求項９】
該エンテロバクテリアシーが好気性のエンテロバクテリアシーである、請求項２の方法。
【請求項１０】
該エンテロバクテリアシーがＲ．形である、請求項２の方法。
【請求項１１】
該エンテロバクテリシーがＳ形である、請求項２の方法。
【請求項１２】
請求項１１の方法であって、該エンテロバクテリアシーが、バチルス、バクテロイデス、ブルセラ、カルノバクテリウム、カウロバクター、シトロバクター、クロストリジウム、コリネバクテリウム、エンテロバクター、大腸菌、ハロバクテリア、クレブシエラ、ラクトバチルス、ラクトコッカス、ロイコンストック、リステリア、ミクロコッカス、マイコバクテリウム、ナイセリア、パスツレラ、ペディオコッカス、プロピオニバクテリウム、プロテウス、シュードモナス、サルモネラ、サルジナ、シゲラ、セラチア、スタフィロコッカス、ストレプトコッカス、及びビブリオよりなる群より選ばれた菌株に属するものである、方法。
【請求項１３】
請求項２に従って製造された請求項１の生物学的材料のコロイド結晶。
【請求項１４】
薬剤学的に許容し得る担体と合わさった請求項１の生物学的材料の薬剤学的有効量を含んでなる薬剤組成物。
【請求項１５】
カルシウム塩、マグネシウム塩及び亜鉛塩を更に含んでなる、請求項１４の薬剤組成物。
【請求項１６】
該塩が、ＺｎＣｌ２、Ｚｎ−Ｄ−グルクロン酸、Ｚｎ−マグルミン（ｍａｇｌｕｍｉｎｅ）、Ｚｎ−Ｄ−クエン酸又はＺｎ−サリチル酸である、請求項１４の薬剤組成物。
【請求項１７】
リポソームの形態の請求項１４の薬剤組成物。
【請求項１８】
該組成物が凍結乾燥された形態である、請求項１４の薬剤組成物。
【請求項１９】
油滴エマルジョンの形態である、請求項１４の薬剤組成物。
【請求項２０】
ウイルス又は細菌感染に罹っている哺乳類における疾病に免疫療法を加える方法であって、請求項１の産物の有効量を、これを必要とする哺乳類に投与することを含む方法。
【請求項２１】
次の特性すなわち、
（ａ） 腸内細菌であり、
（ｂ） コリシンを産生し、
（ｃ） エンドトキシンを産生せず、
（ｄ） ベロ毒素の産生を担う遺伝子を有さず、
（ｅ） ｃＡＭＰアデニル酸シクラーゼの活性化因子を含まず、
（ｆ） ｃＧＭＰＭグアニル酸シクラーゼの活性化因子を含まず、
（ｇ） 接着性分子を有さず、
（ｈ） ｅａｅ遺伝子配列を有さず、
（ｉ） インドール及びＭＵＧアッセイを受け、そして
（ｊ） ロッド状の外観を有する
という特性を有する単離された微生物。
【請求項２２】
請求項２１の微生物の実質的に純粋な株。
【請求項２３】
請求項１の産物を中に含んだ単離された宿主細胞。
【請求項２４】
請求項１の実質的に純粋な産物。
【請求項２５】
請求項１の生物学的材料を含んでなるワクチン。
【請求項２６】
細菌及びウイルス感染の治療を、そのような治療を必要とするヒトにおいて行う方法であって、請求項１の生物学的材料の薬剤学的有効量をこれに投与することを含む方法。
【請求項２７】
式
【化１】
2004510746.tif 000348
の第１及び第２の化合物又はそれらの薬剤学的に許容し得る塩の混合物であって、該第１の化合物においてはＲ及びＲ１は共にＨであり、第２の化合物においては、Ｒ及びＲ１のうち一方はＨであり他方は
【化２】
2004510746.tif 000349
又はその薬剤学的に許容し得る塩であり、ここに、該第１の化合物の該第２の化合物に対する重量比が約６０：４０ないし約９０：１０である混合物。
【請求項２８】
該重量比が約８０：２０である、請求項２７の混合物。
【請求項２９】
＊で示したキラル中心がＲ配置である、請求項２７の混合物。
【請求項３０】
式
【化３】
2004510746.tif 000350
〔式中、Ｒ及びＲ１は共に
【化４】
2004510746.tif 000351
又はその薬剤学的な塩である。〕を有する第３の化合物が存在するものである、請求項２７の混合物。
【請求項３１】
式
【化５】
2004510746.tif 000352
の第１及び第２の化合物又はそれらの薬剤学的に許容し得る塩の混合物であって、該第１の化合物においてはＲ及びＲ１は共にＨであり、第２の化合物においては、Ｒ及びＲ１のうち一方はＨであり他方は
【化６】
2004510746.tif 000353
又はその薬剤学的に許容し得る塩であり、ここに、該第１の化合物の該第２の化合物に対する重量比が約６０：４０ないし約９０：１０である混合物。
【請求項３２】
該重量比が約８０：２０である、請求項３１の混合物。
【請求項３３】
＊で示したキラル中心がＲ配置である、請求項３１の混合物。
【請求項３４】
式
【化７】
2004510746.tif 000354
〔式中、Ｒ及びＲ１は共に
【化８】
2004510746.tif 000355
又はその薬剤学的な塩である。〕を有する第３の化合物が存在するものである、請求項３１の混合物。
【請求項３５】
式
【化９】
2004510746.tif 000356
の第１及び第２の化合物又はそれらの薬剤学的に許容し得る塩の混合物であって、該第１の化合物においてはＲ及びＲ１は共にＨであり、第２の化合物においては、Ｒ及びＲ１のうち一方はＨであり他方は
【化１０】
2004510746.tif 000357
又はその薬剤学的に許容し得る塩であり、ここに、該第１の化合物の該第２の化合物に対する重量比が約６０：４０ないし約９０：１０である混合物。
【請求項３６】
該重量比が約８０：２０である、請求項３５の混合物。
【請求項３７】
＊で示したキラル中心がＲ配置である、請求項３５の混合物。
【請求項３８】
式
【化１１】
2004510746.tif 000358
〔式中、Ｒ及びＲ１は共に
【化１２】
2004510746.tif 000359
又はその薬剤学的な塩である。〕を有する第３の化合物が存在するものである、請求項３５の混合物。
【請求項３９】
式
【化１３】
2004510746.tif 000360
の第１及び第２の化合物又はそれらの薬剤学的に許容し得る塩の混合物であって、該第１の化合物においてはＲ及びＲ１は共にＨであり、第２の化合物においては、Ｒ及びＲ１のうち一方はＨであり他方は
【化１４】
2004510746.tif 000361
又はその薬剤学的に許容し得る塩であり、ここに、該第１の化合物の該第２の化合物に対する重量比が約６０：４０ないし約９０：１０である混合物。
【請求項４０】
該重量比が約８０：２０である、請求項３９の混合物。
【請求項４１】
＊で示したキラル中心がＲ配置である、請求項３９の混合物。
【請求項４２】
式
【化１５】
2004510746.tif 000362
〔式中、Ｒ及びＲ１は共に
【化１６】
2004510746.tif 000363
又はその薬剤学的な塩である。〕を有する第３の化合物が存在するものである、請求項３９の混合物。
【請求項４３】
細菌又はウイルス起源の急性又は慢性感染に罹っている、細菌感染のある患者からカイバードラッグを調製する方法であって、
（ａ） 患者の感染部位におけるエンテロバクテリアシーから得られたエンドトキシン抽出物を集め、
（ｂ） コリシンを産生するがトリプトファンをインドールへと変換せず且つＭＵＧアッセイにおいて反応しない腸内細菌をスクリーニングして集め、
（ｃ） それらの選択された細菌を収穫し、
（ｄ） エンドトキシンを作ることのできないステップ（ｃ） の菌株を選択し、そして
（ｅ） ステップ（ｄ） の菌株を殺すこと
を含んでなる方法。
【請求項４４】
細菌の殺滅が、ステップ（ｄ）の菌株を、該ステップにおける該タンパク質を変性させるに十分な温度に加熱することを含む、請求項４３の方法。
【請求項４５】
カイバードラッグを調製するための方法であって、
（ａ） 患者の感染部位におけるエンテロバクテリアシーから得られたエンドトキシン抽出物を集め、
（ｂ） コリシンを産生するがトリプトファンをインドールへと変換せず且つＭＵＧアッセイにおいて反応しない腸内細菌をスクリーニングして集め、
（ｃ） それらの選択された細菌を収穫し、
（ｄ） エンドトキシンを作ることのできないステップ（ｃ） の菌株を選択し、
（ｅ） ステップ（ｄ） の菌株を殺し、そして
（ｆ） ２３０ｎｍ及び５５０ｎｍに吸収を示す脂質材料をステップ（ｅ） の産物から抽出すること
を含んでなる方法。
【請求項４６】
抽出が、該脂質材料をクロロホルム／メタノール又は溶液アセトニトリル／メタノール溶液で沈殿させその産物を凍結乾燥することを含むものである、請求項４５の方法。
【請求項４７】
該沈殿させた材料が凍結乾燥前に精製されるものである、請求項４６の方法。
【請求項４８】
請求項４７の方法であって、抽出が、該脂質材料を食塩溶液中に加え、クロマトグラフィーにより該脂質産物を精製し、約２３０ｎｍおよび５５０ｎｍに紫外吸収を有する画分を集め、集められた画分を凍結乾燥し、目的の産物をクロロホルム／メタノール又はアセトニトリル／メタノール溶液で沈殿させ、そして該沈殿された産物を精製することを含むものである、方法。
【国際調査報告】
2004510746.tif 000364
2004510746.tif 000365
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