(57)【要約】本発明は、因子ＶＩＩと、アスパラギン連結グリコシル化の変更されたパターンを有する他の血液凝固因子とを含んでなる組成物に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数の因子ＶＩＩポリペプチドまたは因子ＶＩＩ関連ポリペプチドを含んでなる調製物であって、ポリペプチドがアスパラギン連結オリゴサッカライド鎖を含んでなり、かつオリゴサッカライド鎖の約９４〜９９％が少なくとも１つのシアル酸部分を含んでなる、調製物。
【請求項２】
複数の因子ＶＩＩポリペプチドまたは因子ＶＩＩ関連ポリペプチドを含んでなる調製物であって、ポリペプチドがアスパラギン連結オリゴサッカライド鎖を含んでなり、かつオリゴサッカライド鎖の約１〜７％が中性電荷を有する、調製物。
【請求項３】
複数の因子ＶＩＩポリペプチドまたは因子ＶＩＩ関連ポリペプチドを含んでなる調製物であって、ポリペプチドがアスパラギン連結オリゴサッカライド鎖を含んでなり、かつオリゴサッカライド鎖の約６〜１６％が少なくとも１つの末端ガラクトース残基を含んでなる、調製物。
【請求項４】
複数の因子ＶＩＩポリペプチドまたは因子ＶＩＩ関連ポリペプチドを含んでなる調製物であって、ポリペプチドがアスパラギン連結オリゴサッカライド鎖を含んでなり、かつオリゴサッカライド鎖の約６〜９％が少なくとも１つの末端Ｎ−アセチルガラクトサミン残基を含んでなる、調製物。
【請求項５】
複数の因子ＶＩＩポリペプチドまたは因子ＶＩＩ関連ポリペプチドを含んでなる調製物であって、ポリペプチドがアスパラギン連結オリゴサッカライド鎖を含んでなり、かつオリゴサッカライド鎖の約１１〜２３％が少なくとも１つの末端のガラクトース残基またはＮ−アセチルガラクトサミン残基を含んでなる、調製物。
【請求項６】
複数の因子ＶＩＩポリペプチドまたは因子ＶＩＩ関連ポリペプチドを含んでなる調製物であって、ポリペプチドがアスパラギン連結オリゴサッカライド鎖を含んでなり、かつオリゴサッカライド鎖の少なくとも約２％が触角状（ａｎｔｅｎｎａｒｙ）Ｎ−アセチルグルコサミン残基に対してα１→３連鎖した少なくとも１つのフコース部分を含んでなる、調製物。
【請求項７】
オリゴサッカライド鎖中のシアル酸残基がα２→３連鎖を介してガラクトースに連鎖されている、請求項１〜６のいずれかに記載の調製物。
【請求項８】
シアル酸残基がＮ−アセチルノイラミン酸 （Ｎｅｕ５Ａｃ） およびＮ−グリコリルノイラミン酸 （Ｎｅｕ５Ｇｃ） を含んでなる、請求項１〜７のいずれかに記載の調製物。
【請求項９】
オリゴサッカライドがコアＮ−アセチルグルコサミンに対してα１→６連鎖したフコースを含んでなる、請求項１〜８のいずれかに記載の調製物。
【請求項１０】
オリゴサッカライド鎖の約９５〜９８％が少なくとも１つのシアル酸残基を含有する、請求項１〜９のいずれかに記載の調製物。
【請求項１１】
オリゴサッカライド鎖の約９６〜９７％が少なくとも１つのシアル酸残基を含有する、請求項１〜１０のいずれかに記載の調製物。
【請求項１２】
オリゴサッカライド鎖の約２〜４％が中性電荷を有する、請求項１〜１１のいずれかに記載の調製物。
【請求項１３】
オリゴサッカライド鎖の約８〜１２％が少なくとも１つの末端ガラクトース残基を含有する、請求項１〜１２のいずれかに記載の調製物。
【請求項１４】
オリゴサッカライド鎖の約７〜８％が少なくとも１つの末端Ｎ−アセチルガラクトサミン残基を含有する、請求項１〜１３のいずれかに記載の調製物。
【請求項１５】
オリゴサッカライド鎖の約９６〜９７％が少なくとも１つの末端のガラクトース残基またはＮ−アセチルガラクトサミン残基を含有する、請求項１〜１４のいずれかに記載の調製物。
【請求項１６】
オリゴサッカライド鎖の少なくとも約５％が触角状（ａｎｔｅｎｎａｒｙ）Ｎ−アセチルグルコサミンに対してα１→３連鎖した少なくとも１つのフコース部分を含んでなる、請求項１〜１５のいずれかに記載の調製物。
【請求項１７】
オリゴサッカライド鎖の少なくとも約１０％が触角状（ａｎｔｅｎｎａｒｙ）Ｎ−アセチルグルコサミンに対してα１→３連鎖した少なくとも１つのフコース部分を含んでなる、請求項１〜１６のいずれかに記載の調製物。
【請求項１８】
オリゴサッカライド鎖の少なくとも約２０％が触角状（ａｎｔｅｎｎａｒｙ）Ｎ−アセチルグルコサミンに対してα１→３連鎖した少なくとも１つのフコース部分を含んでなる、請求項１〜１７のいずれかに記載の調製物。
【請求項１９】
オリゴサッカライド鎖の少なくとも約４０％が触角状（ａｎｔｅｎｎａｒｙ）Ｎ−アセチルグルコサミンに対してα１→３連鎖した少なくとも１つのフコース部分を含んでなる、請求項１〜１８のいずれかに記載の調製物。
【請求項２０】
ポリペプチドが野生型因子ＶＩＩのアミノ酸配列を有する、請求項１〜１９のいずれかに記載の調製物。
【請求項２１】
ポリペプチドが野生型因子ＶＩＩである、請求項１〜２０のいずれかに記載の調製物。
【請求項２２】
因子ＶＩＩポリペプチドがＳ５２Ａ−因子ＶＩＩ、６Ｓ６０Ａ−因子ＶＩＩ、残基２９０と２９１との間でタンパク質分解的に切断された因子ＶＩＩ、残基３１５と３１６との間でタンパク質分解的に切断された因子ＶＩＩ、および酸化された因子ＶＩＩから成る群から選択される、請求項１〜１９のいずれかに記載の調製物。
【請求項２３】
因子ＶＩＩ関連ポリペプチドがＲ１５２Ｅ−因子ＶＩＩ、Ｓ３４４Ａ−因子ＶＩＩ、ＦＦＲ−因子ＶＩＩ、およびＧｌａドメインを欠如する因子ＶＩＩａから成る群から選択される、請求項１〜１９のいずれかに記載の調製物。
【請求項２４】
複数の因子ＶＩＩポリペプチドまたは因子ＶＩＩ関連ポリペプチドを含んでなる調製物であって、ポリペプチドがアスパラギン連結オリゴサッカライド鎖を含んでなり、そして （ｉ） オリゴサッカライド鎖の約９４〜１００％が少なくとも１つのシアル酸部分を含んでなり、かつ （ｉｉ） オリゴサッカライド鎖の約６〜９％が少なくとも１つの末端Ｎ−アセチルガラクトサミン残基を含んでなる、調製物。
【請求項２５】
ポリペプチドが野生型因子ＶＩＩのアミノ酸配列を有する、請求項２４に記載の調製物。
【請求項２６】
複数の野生型因子ＶＩＩの配列を有する因子ＶＩＩａポリペプチドを含んでなる調製物であって、ポリペプチドがアスパラギン連結オリゴサッカライド鎖を含んでなり、かつオリゴサッカライド鎖の約９４〜９９％が少なくとも１つのシアル酸部分を含んでなる、調製物。
【請求項２７】
複数の野生型因子ＶＩＩの配列を有する因子ＶＩＩａポリペプチドを含んでなる調製物であって、ポリペプチドがアスパラギン連結オリゴサッカライド鎖を含んでなり、かつオリゴサッカライド鎖の少なくとも約２％が触角状（ａｎｔｅｎｎａｒｙ）Ｎ−アセチルグルコサミン残基に対してα１→３連鎖した少なくとも１つのフコース部分を含んでなる、調製物。
【請求項２８】
ポリペプチドが真菌、昆虫、および脊椎動物門の細胞から成る群から選択される宿主細胞において産生される、請求項１〜２７のいずれかに記載の調製物。
【請求項２９】
宿主細胞が哺乳動物細胞である、請求項２８に記載の調製物。
【請求項３０】
哺乳動物細胞がハムスターに由来する、請求項２９に記載の調製物。
【請求項３１】
ハムスター細胞がＣＨＯ細胞およびＢＨＫ細胞から成る群から選択される、請求項３０に記載の調製物。
【請求項３２】
哺乳動物細胞がヒトに由来する、請求項２９に記載の調製物。
【請求項３３】
ヒト細胞がＨＥＫ細胞である、請求項３２に記載の調製物。
【請求項３４】
調製物が参照調製物の生物学的利用能の少なくとも約１１０％である生物学的利用能を示し、参照調製物中のオリゴサッカライドの約９３％以下が少なくとも１つのシアル酸部分を含んでなる、請求項１〜３３のいずれかに記載の調製物。
【請求項３５】
調製物が参照調製物の生物学的利用能の少なくとも約１２０％である生物学的利用能を示す、請求項３４に記載の調製物。
【請求項３６】
調製物が参照調製物の生物学的利用能の少なくとも約１３０％である生物学的利用能を示す、請求項３５に記載の調製物。
【請求項３７】
調製物が参照調製物の生物学的利用能の少なくとも約１４０％である生物学的利用能を示す、請求項３６に記載の調製物。
【請求項３８】
因子ＶＩＩおよび因子ＶＩＩ関連ポリペプチドのグリコ型パターンを決定する方法において、
（ａ） 因子ＶＩＩまたは因子ＶＩＩ関連ポリペプチドを発現する細胞を第１組の前もって決定した培養条件下に培養し；
（ｂ） 培養物から因子ＶＩＩまたは因子ＶＩＩ関連ポリペプチドを回収して、ポリペプチドを含んでなる調製物を獲得し；そして
（ｃ） ポリペプチドに連鎖したオリゴサッカライドの構造を解析して調製物のグリコ型パターンを決定する；
ことを含んでなる方法。
【請求項３９】
（ｄ１） 工程 （ａ） の培養条件を変更して第２組の前もって決定した培養条件を達成し、そして
（ｅ１） 所望のグリコ型パターンが達成されるまで工程 （ｂ） 〜 （ｄ１） を反復する、
ことをさらに含んでなる、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
（ｄ２） 調製物を化学的または酵素的に処理してオリゴサッカライドの構造を変更し、そして
（ｅ２） 所望のグリコ型パターンが達成されるまで工程 （ｂ） 〜 （ｄ２） を反復する、
ことをさらに含んでなる、請求項３８に記載の方法。
【請求項４１】
Ｎ−連鎖グリコシル化の前もって決定したパターンを有する因子ＶＩＩポリペプチドまたは因子ＶＩＩ関連ポリペプチドを含んでなる調製物を調製する方法であって、ポリペプチド上に存在するアスパラギン連結オリゴサッカライドの少なくとも約９４％が少なくとも１つのシアル酸残基を含んでなる条件下に、ポリペプチドを発現する細胞を培養することを含んでなる、方法。
【請求項４２】
請求項１〜３７のいずれかに記載の調製物と、薬学上許容される担体またはアジュバントとを含んでなる医薬処方物。
【請求項４３】
出血を減少させ、そして／または血液凝固を増加させる条件下に、治療を必要とする患者に、因子ＶＩＩポリペプチドを含んでなる、請求項４２に記載の医薬処方物を投与することを含んでなる、因子ＶＩＩ応答性症候群を治療する方法。
【請求項４４】
症候群が血友病Ａ、血友病Ｂ、因子ＩＸ欠乏症、因子ＶＩＩ欠乏症、血小板減少症、フォン・ウィルブランド病、凝固因子インヒビターの存在、外科手術、外傷、および抗凝固治療から成る群から選択される、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
出血を減少させ、そして／または血液凝固を増加させる条件下に、治療を必要とする患者に、因子ＶＩＩポリペプチドを含んでなる、請求項４２に記載の医薬処方物を投与することを含んでなる、望ましくない出血を防止する方法。
【請求項４６】
凝固を抑制するために有効な条件下に、治療を必要とする患者に、因子ＶＩＩポリペプチドを含んでなる、請求項４２に記載の医薬処方物を投与することを含んでなる、望ましくない血液凝固を防止する方法。
【請求項４７】
凝固を抑制するために有効な条件下に、治療を必要とする患者に、因子ＶＩＩポリペプチドを含んでなる、請求項４２に記載の医薬処方物を投与することを含んでなる、組織因子仲介反応を防止する方法。
【請求項４８】
望ましくない血液凝固が血管形成、深静脈血栓症、肺塞栓症、発作、汎発生血管内凝固症候群 （ＤＩＣ） 、グラム陰性内毒素血症に関連する肺および腎臓におけるフィブリン沈着、および心筋梗塞から成る群から選択される症状に関連する、請求項４６に記載の方法。
【請求項４９】
組織因子仲介反応がＳＩＲＳ、ＡＲＤＳ、ＭＯＦ、ＨＵＳ、およびＴＴＰから成る群から選択される症状に関連する、請求項４７に記載の方法。
【請求項５０】
因子ＶＩＩ応答性症候群を治療する薬剤を製造するための請求項１〜３７のいずれかに記載の因子ＶＩＩポリペプチドまたは因子ＶＩＩ関連ポリペプチドを含んでなる調製物の使用。
【請求項５１】
症候群が血友病Ａ、血友病Ｂ、因子ＩＸ欠乏症、因子ＶＩＩ欠乏症、血小板減少症、フォン・ウィルブランド病、凝固因子インヒビターの存在、外科手術、外傷、および抗凝固治療から成る群から選択される、請求項５０に記載の使用。
【請求項５２】
望ましくない出血を防止する薬剤を製造するための請求項１〜３７のいずれかに記載の因子ＶＩＩポリペプチドまたは因子ＶＩＩ関連ポリペプチドを含んでなる調製物の使用。
【請求項５３】
望ましくない血液凝固を防止する薬剤を製造するための請求項１〜３７のいずれかに記載の因子ＶＩＩポリペプチドまたは因子ＶＩＩ関連ポリペプチドを含んでなる調製物の使用。
【請求項５４】
望ましくない血液凝固が血管形成、深静脈血栓症、肺塞栓症、発作、汎発生血管内凝固症候群 （ＤＩＣ） 、グラム陰性内毒素血症に関連する肺および腎臓におけるフィブリン沈着、および心筋梗塞から成る群から選択される症状に関連する、請求項５３に記載の使用。
【請求項５５】
組織因子仲介反応を防止する薬剤を製造するための請求項１〜３７のいずれかに記載の因子ＶＩＩポリペプチドまたは因子ＶＩＩ関連ポリペプチドを含んでなる調製物の使用。
【請求項５６】
組織因子仲介反応がＳＩＲＳ、ＡＲＤＳ、ＭＯＦ、ＨＵＳ、およびＴＴＰから成る群から選択される症状に関連する、請求項５５に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明は、因子ＶＩＩと、アスパラギン連結グリコシル化の変更されたパターンを有する他の血液凝固因子とを含んでなるに関する。
【０００２】
発明の背景
例えば、因子ＶＩＩ、因子ＶＩＩＩ、因子ＩＸ、因子Ｘ、およびプロテインＣを包含する、凝固カスケードに関係するタンパク質は、種々の病理学症状を治療する有用な治療剤であることが証明されている。したがって、薬学上許容され、かつ均一な前もって決定した臨床的効能を有する、それらのタンパク質を含んでなる処方物が必要とされている。
【０００３】
薬学的製品の源としてヒト血漿を使用することは多数の欠点を有するので、組換え系においてこれらのタンパク質を製造することが好ましい。しかしながら、凝固タンパク質は、例えば、アスパラギン連結 （Ｎ−連鎖） グリコシル化；Ｏ−連鎖グリコシル化；およびｇｌｕ残基のγ−カルボキシル化を包含する、種々の共翻訳および翻訳後修飾に暴露される。異種細胞をタンパク質の大規模生産用宿主細胞として使用するとき、これらの修飾は定性的または定量的に異なる。特に、異種細胞における生産はしばしば異なるアレイのグリコ型を生じ、これらのグリコ型は異なように共有結合したオリゴサッカライド構造を有する同一ポリペプチドである。
【０００４】
異なる系において、治療用タンパク質のオリゴサッカライド構造における変動は、なかでも、免疫原性およびｉｎ ｖｉｖｏクリアランスの変化に関係付けられた。こうして、凝固性調製物、特に組換えヒト因子ＶＩＩ、修飾された因子ＶＩＩ、または因子ＶＩＩ関連ポリペプチドを含んでなり、前もって決定したグリコ型パターンを含有する調製物を提供する組成物および方法がこの分野において要求されている。
【０００５】
発明の要約
本発明は、前もって決定したグリコ型パターンを示す因子ＶＩＩポリペプチドまたは因子ＶＩＩ関連ポリペプチドを含んでなる調製物に関する。本明細書において使用するとき、因子ＶＩＩまたは因子ＶＩＩ関連ポリペプチドは複数の因子ＶＩＩまたは因子ＶＩＩ関連ポリペプチドを意味し、変異型および化学的修飾された形態、ならびにタンパク質分解的に活性化された （例えば、因子ＶＩＩａ） 、それらが合成された細胞から分離された形態を包含する。グリコ型パターンは、因子ＶＩＩポリペプチドまたは因子ＶＩＩ関連ポリペプチド共有結合した、変化する構造を有するオリゴサッカライド鎖の調製物内の分布を言及する。
【０００６】
１つの面において、本発明は、複数の因子ＶＩＩポリペプチドまたは因子ＶＩＩ関連ポリペプチドを含んでなる調製物であって、ポリペプチドがアスパラギン連結オリゴサッカライド鎖を含んでなり、かつ下記の１または２以上が適用される調製物を提供する：（ｉ） オリゴサッカライド鎖の約９４〜１００％は少なくとも１つのシアル酸部分を含んでなる；（ｉｉ） オリゴサッカライド鎖の約０〜７％は中性電荷を有する；（ｉｉｉ） オリゴサッカライド鎖の約６％より小、例えば、約６〜１６％は少なくとも１つの末端ガラクトース残基を含んでなる；（ｉｖ） オリゴサッカライド鎖の約２５％より小、例えば、約６〜９％は少なくとも１つの末端Ｎ−アセチルガラクトサミン残基を含んでなる；または （ｖ） オリゴサッカライド鎖の約３０％より小、約１１〜２３％が少なくとも１つの末端のガラクトース残基またはＮ−アセチルガラクトサミン残基を含んでなる。
【０００７】
ある態様において、（ｉ） 〜 （ｖ） の１または２以上に加えて、オリゴサッカライド鎖中のすべてのシアル酸残基はα２→３連鎖を介してガラクトースに連鎖されている；シアル酸残基の少なくともいくつかはＮ−アセチルノイラミン酸 （Ｎｅｕ５Ａｃ） に加えてＮ−グリコリルノイラミン酸 （Ｎｅｕ５Ｇｃ） を含んでなる；および／またはオリゴサッカライド鎖はコアＮ−アセチルグルコサミンに対してα１→６連鎖したフコースを含んでなる。１つの態様において、本発明は、オリゴサッカライド鎖の約９４〜１００％が少なくとも１つのシアル酸部分を含んでなり、かつオリゴサッカライド鎖中のすべてのシアル酸残基がα２→３連鎖を介してガラクトースに連鎖されている、野生型因子ＶＩＩａを含んでなる調製物を包含する。
【０００８】
本発明の他の態様において、本発明は、オリゴサッカライド鎖の約９４〜１００％が少なくとも１つのシアル酸部分を含んでなり、かつシアル酸残基の少なくともいくつかがＮ−アセチルノイラミン酸である、野生型因子ＶＩＩａを含んでなる調製物を包含する。本発明のなお他の態様において、本発明は、オリゴサッカライド鎖の約９４〜１００％が少なくとも１つのシアル酸部分を含んでなり、かつシアル酸残基の少なくともいくつかがＮ−アセチルガラクトサミンである、野生型因子ＶＩＩａを含んでなる調製物を包含する。こうして、本発明の調製物は、ヒト血漿から単離され、グルコシダーゼ処理によりｅｘ ｖｉｖｏで修飾されていない野生型因子ＶＩＩまたは因子ＶＩＩａを含まない。
【０００９】
他の面において、本発明は、複数の因子ＶＩＩポリペプチドまたは因子ＶＩＩ関連ポリペプチドを含んでなる調製物であって、ポリペプチドがアスパラギン連結オリゴサッカライド鎖を含んでなり、かつオリゴサッカライド鎖の少なくとも約２％が触角状（ａｎｔｅｎｎａｒｙ）Ｎ−アセチルグルコサミン残基 （すなわち、Ｍａｎ残基に対してβ１→２、４、または６に連鎖されているＮ−アセチルグルコサミン残基） に対してα１→３連鎖した少なくとも１つのフコース部分を含有する、調製物を提供する。好ましくは、オリゴサッカライド鎖の少なくとも約５％、より好ましくは少なくとも約１０％または少なくとも２０％、最も好ましくは少なくとも約４０％は少なくとも１つのこのような触角状（ａｎｔｅｎｎａｒｙ）フコース残基を含有する。
【００１０】
本発明による調製物は、１または２以上の非修飾野生型因子ＶＩＩ；化学的および／または酵素的に修飾された野生型因子ＶＩＩ；および野生型因子ＶＩＩに関してアミノ酸配列中に１または２以上の変更を有する因子ＶＩＩ変異型を含んでなることができる。本発明の調製物は、内因的因子ＶＩＩ遺伝子から因子ＶＩＩを発現するヒト細胞に由来するか、あるいは組換え遺伝子から因子ＶＩＩまたは因子ＶＩＩ関連ポリペプチドを発現するようにプログラムされた細胞に由来することができる。
他の面において、本発明は、１または２以上の改良された機能的性質を示す因子ＶＩＩまたは因子ＶＩＩ関連ポリペプチドを含んでなる調製物を提供する。このような機能的性質は、安定性、生物学的利用能、および／または半減期の増加を包含するが、これらに限定されない。
【００１１】
他の面において、本発明は、下記の工程を含んでなる、因子ＶＩＩおよび因子ＶＩＩ関連ポリペプチドのグリコ型パターンを決定する方法を包含する：
（ａ） 因子ＶＩＩまたは因子ＶＩＩ関連ポリペプチドを発現する細胞を第１組の前もって決定した培養条件下に培養し、
（ｂ） 培養物から因子ＶＩＩまたは因子ＶＩＩ関連ポリペプチドを回収して、ポリペプチドを含んでなる調製物を獲得し、そして
（ｃ） ポリペプチドに連鎖したオリゴサッカライドの構造を解析して調製物のグリコ型パターンを決定する。
【００１２】
これらの方法は、工程 （ａ） の培養条件を変更して第２組の前もって決定した培養条件を達成し、所望のグリコ型パターンが達成されるまで工程を反復する、工程をさらに含むことができる。選択的に、これらの方法は、調製物を化学的または酵素的に処理してオリゴサッカライドの構造を変更し、そして所望のグリコ型パターンが達成されるまで工程を反復する、工程をさらに含むことができる。さらに、これらの方法は、前もって決定したグリコ型パターンを有する調製物を生物学的活性または他の機能 （例えば、薬学的プロファイルまたは安定性） の少なくとも１つの試験に付し、そして特定のグリコ型パターンを特定の生物学的活性または機能のプロファイルに相関させる、追加の工程を含むことができる。
【００１３】
他の面において、本発明は、Ｎ−連鎖グリコシル化の前もって決定したパターンを有する因子ＶＩＩポリペプチドまたは因子ＶＩＩ関連ポリペプチドを含んでなる調製物を調製する方法を提供する。ある態様において、これらの方法は、因子ＶＩＩポリペプチドまたは因子ＶＩＩ関連ポリペプチドに連鎖されたアスパラギン連結オリゴサッカライドの少なくとも約９４％が少なくとも１つ、２つ、３つ、または４つのシアル酸残基を含んでなる条件下に、ポリペプチドを発現する細胞を培養することによって実施される。
【００１４】
ある態様において、これらの方法は、オリゴサッカライド鎖の少なくとも約５％が触角状（ａｎｔｅｎｎａｒｙ）Ｎ−アセチルグルコサミン残基に対してα１→３連鎖した少なくとも１つのフコース部分を含んでなる条件下に、ポリペプチドを発現する細胞を培養することによって実施される。ある態様において、因子ＶＩＩポリペプチドまたは因子ＶＩＩ関連ポリペプチドを、それらの源に無関係に、酵素処理して所望のグリコ型パターンを達成する。
【００１５】
他の面において、本発明は、本発明の調製物を含んでなる医薬処方物、および因子ＶＩＩポリペプチドまたは因子ＶＩＩ関連ポリペプチドに対して応答性である症候群を予防および／または治療する方法を提供する。これらの方法は、血液凝固を増強または抑制する条件下に、治療を必要とする患者に医薬処方物を投与することを含んでなる。
【００１６】
１系列の態様において、血液凝固を増強しようとするとき、例えば、血友病Ａ、血友病Ｂ、因子ＩＸ欠乏症、因子ＶＩＩ欠乏症、血小板減少症、またはフォン・ウィルブランド病において；凝固因子インヒビターの存在；外科手術または抗凝固治療の前、間、または後に；または外傷後に、因子ＶＩＩ調製物を投与する。他の系列の態様において、血液凝固を減少させるために、例えば、血管形成を受けている患者、または深静脈血栓症、肺塞栓症、発作、汎発生血管内凝固症候群 （ＤＩＣ） 、グラム陰性内毒素血症に関連する肺および腎臓におけるフィブリン沈着、および心筋梗塞に罹った患者に、因子ＶＩＩ関連ポリペプチドの調製物 （すなわち、野生型因子ＶＩＩに関して生物学的活性が減少したまたは変更された調製物） を投与する。
【００１７】
本発明によれば、因子ＶＩＩ関連ポリペプチドの調製物は、また、組織因子 （ＴＦ） 仲介経路を介する細胞内シグナリングを変更するために、例えば、減少させるために、症状、例えば、急性呼吸窮迫症候群 （ＡＲＤＳ ）、全身炎症応答症候群（ＳＩＲＳ）、溶血性尿毒症症候群 （ＨＵＳ）、多発性器官不全 （ＭＯＦ）、および血小板減少性紫斑病 （ＴＴＰ）を治療するために、因子ＶＩＩ関連ポリペプチドを投与することができる。
【００１８】
発明の詳細な説明
本発明者らは、前もって決定したグリコ型パターンを有する凝固タンパク質の調製物が改良された機能的性質を示すことを発見した。したがって、本発明は、これらのタンパク質調製物を提供する方法および組成物に関する。特に、本発明は、アスパラギン連結 （Ｎ−連鎖） オリゴサッカライドの特異的な前もって決定したパターンを有する因子ＶＩＩポリペプチドおよび残基因子ＶＩＩポリペプチドことを含んでなる調製物に関する。本発明の調製物は変更された性質を示す。このような性質は、改良された薬物速度論的性質および改良された臨床的効能を包含するが、これらに限定されない。本発明は、また、これらの調製物を含んでなる医薬処方物、ならびに医薬処方物を利用する治療法を包含する。
【００１９】
因子ＶＩＩポリペプチドおよび残基因子ＶＩＩポリペプチド
本発明は、ヒト因子ＶＩＩポリペプチド、例えば、米国特許第４，７８４，９５０号に開示されているアミノ酸配列を有するもの （野生型因子ＶＩＩ） を包含する。本明細書において使用するとき、「因子ＶＩＩ」または「因子ＶＩＩポリペプチド」は野生型因子ＶＩＩ、ならびに野生型因子ＶＩＩに関して実質的に同一のまたは改良された生物学的活性を示す因子ＶＩＩの変異型を包含する。用語「因子ＶＩＩ」は非切断 （チモーゲン） 形態の因子ＶＩＩポリペプチド、ならびにそれぞれの生物活性形態を生ずるようにタンパク質分解的にプロセシングされたもの （これは因子ＶＩＩａと表示することができる） を包含する。典型的には、因子ＶＩＩは残基１５２と１５３との間で切断されて因子ＶＩＩａを生ずる。
【００２０】
本明細書において使用するとき、「因子ＶＩＩ関連ポリペプチド」は、因子ＶＩＩａの生物学的活性が野生型因子ＶＩＩａの活性に関して実質的に変更または減少されている変異型を含む、ポリペプチドを包含する。これらのポリペプチドは、ポリペプチドの生物学的活性を変更または崩壊させる、特異的アミノ酸配列の変更が導入されている因子ＶＩＩまたは因子ＶＩＩａを包含するが、これらに限定されない。
【００２１】
血液凝固における因子ＶＩＩの生物学的活性は、（ｉ） 組織因子 （ＴＦ） に結合するその能力および （ｉｉ） 活性化された因子ＩＸまたはＸ （それぞれ、因子ＩＸａまたはＸａ） を産生する因子ＩＸまたは因子Ｘのタンパク質分解的切断を触媒するその能力に由来する。本発明の目的に対して、例えば、米国特許第５，９９７，８６４号に記載されているように、因子ＶＩＩａの生物学的活性は、因子ＶＩＩ欠乏血漿およびトロンボプラスチンを使用して血液凝固を促進する調製物の能力を測定することによって、定量することができる。このアッセイにおいて、生物学的活性は対照試料に関する凝固時間の減少として表され、１単位／ｍｌの因子ＶＩＩ活性を含有するプールしたヒト血清標準と比較することによって「因子ＶＩＩ単位」に変換される。
【００２２】
選択的に、因子ＶＩＩａの生物学的活性は、（ｉ） 脂質膜の中に埋め込まれたＴＦと因子Ｘとを含んでなる系中で因子Ｘａを産生する因子ＶＩＩａの能力を測定する （Ｐｅｒｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７２：１９９１９−１９９２４， １９９７）；（ｉｉ） 水性系中の因子Ｘの加水分解を測定する；（ｉｉｉ） 表面プラズモン共鳴をベースとする計装を使用してＴＦに対するその結合を測定する （Ｐｅｒｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｓ．　４１３：３５９−３６３， １９９７） ；（ｉｖ） 合成基質の加水分解を測定する （下記の実施例４参照）；および （ｖ） ＴＦ独立的ｉｎ ｖｉｔｒｏ系中のトロンビン発生を測定することによって定量することができる。
【００２３】
野生型因子ＶＩＩに関して実質的に同一のまたは改良された生物学的活性を有する因子ＶＩＩの変異型は、前述したように凝固アッセイ、タンパク質分解アッセイ、またはＴＦ結合アッセイの１または２以上において試験したとき、同一細胞型において産生された野生型因子ＶＩＩａの比活性の少なくとも約２５％、好ましくは少なくとも約５０％、より好ましくは少なくとも約７５％、最も好ましくは少なくとも約９０％を示す変異型を包含する。
【００２４】
野生型因子ＶＩＩａに関して実質的に減少した活性を有する因子ＶＩＩ変異型は、前述したように凝固アッセイ、タンパク質分解アッセイ、またはＴＦ結合アッセイの１または２以上において試験したとき、同一細胞型において産生された野生型因子ＶＩＩａの比活性の約２５％より少ない、好ましくは約１０％より少ない、より好ましくは約５％より少ない、最も好ましくは約１％より少ないを示す変異型を包含する。野生型因子ＶＩＩａに関して実質的に変更された活性を有する因子ＶＩＩ変異型は、ＴＦ独立的因子Ｘタンパク質分解活性を示す因子ＶＩＩ変異型およびＴＦに結合するが、因子Ｘを切断しない変異型を包含するが、これらに限定されない。
【００２５】
因子ＶＩＩの変異型は、野生型因子ＶＩＩと実質的に同一であるか、またはそれよりもすぐれた生物学的活性を示すか、あるいは野生型因子ＶＩＩに関して実質的に変更されたまたは減少した生物学的活性を示すかどうかにかかわらず、１または２以上のアミノ酸の挿入、欠失または置換により野生型因子ＶＩＩの配列と異なるアミノ酸配列を有するポリペプチドを包含するが、これらに限定されない。
【００２６】
野生型因子ＶＩＩと実質的に同一の生物学的活性を有する因子ＶＩＩ変異型の非限定的例は次の通りである：Ｓ５２Ａ−ＦＶＩＩａ、Ｓ６０Ａ−ＦＶＩＩａ （Ｌｉｎｏ ｅｔ ａｌ．， Ａｒｃｈ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． ３５２：１８２−１９２， １９９８）；米国特許第５，５８０，５６０号に開示されているような増加したタンパク質分解安定性を示すＦＶＩＩａ変異型；残基２９０と２９１との間または残基３１５と３１６との間でタンパク質分解的に切断された因子ＶＩＩａ （Ｍｏｌｌｅｒｕｐ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｂｉｏｅｎｇ． ４８：５０１−５０５， １９９５）；および因子ＶＩＩａの酸化された形態 （Ｋｏｍｆｅｌｔ ｅｔ ａｌ．， Ａｒｃｈ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． ３６３：４３−５４， １９９９）。
【００２７】
野生型因子ＶＩＩに関して実質的に減少したまたは変更された生物学的活性を有する因子ＶＩＩの非限定的例は次の通りである：Ｒ１５２Ｅ−ＦＶＩＩａ （Ｗｉｌｄｇｏｏｓｅ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２９：３４１３−３４２０，１９９０）、Ｓ３４４Ａ−ＦＶＩＩａ （Ｋａｚａｍａ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７０：６６−７２， １９９５ ）、ＦＦＲ−ＦＶＩＩ （Ｈｏｌｓｔ ｅｔ ａｌ．， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｖａｓｃ． Ｅｎｄｏｖａｓｃ． Ｓｕｒｇ． １５：５１５−５２０， １９９８ ）、およびＧｌａドメインを欠如する因子ＶＩＩａ （Ｎｉｃｏｌａｉｓｅｎ ｅｔ ａｌ．， ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｓ． ３１７：２４５−２４９， １９９３）。化学的修飾された因子ＶＩＩポリペプチドおよび配列変異型の非限定的例は、例えば、米国特許第５，９９７，８６４号に開示されている。
【００２８】
アスパラギン連結グリコシル化
本発明は、因子ＶＩＩグリコ型の特定のスペクトル、すなわち、アスパラギン連結 （Ｎ−連鎖） オリゴサッカライド鎖の前もって決定したパターンを有する因子ＶＩＩポリペプチドまたは因子ＶＩＩ関連ポリペプチドを含んでなる因子ＶＩＩポリペプチドまたは因子ＶＩＩ関連ポリペプチドの調製物を提供する。
【００２９】
本明細書において使用するとき、Ｎ−連鎖グリコシル化の「パターン」またはグリコ型の「パターン」、「分布」、または「スペクトル」は、因子ＶＩＩポリペプチドまたは因子ＶＩＩ関連ポリペプチドの所定集団内の特定のオリゴサッカライド構造の表示を言及する。このようなパターンの非限定的例は、（ｉ） 少なくとも１つのシアル酸残基を有する；（ｉｉ） シアル酸残基を欠如する （すなわち、電荷が中性である）；（ｉｉｉ） 少なくとも１つの末端ガラクトース残基を有する；（ｉｖ） 少なくとも１つのＮ−アセチルガラクトサミン残基を有する；（ｖ） 少なくとも１つの「アンキャプド」触角を有する、すなわち、少なくとも１つの末端ガラクトース残基またはＮ−アセチルガラクトサミン残基を有する；または （ｖｉ） 触角状（ａｎｔｅｎｎａｒｙ）Ｎ−アセチルグルコサミン残基に対してα１→３連鎖した少なくとも１つのフコースを有する、オリゴサッカライド鎖の相対的特性を包含する。
【００３０】
本明細書において使用するとき、オリゴサッカライド鎖は単一アスパラギン残基共有結合した全オリゴサッカライド構造を言及する。因子ＶＩＩは通常Ａｓｎ １４５およびＡｓｎ ３２２においてグリコシル化されている。ヒトにおいてその場で産生された因子ＶＩＩ上のＮ−連鎖オリゴサッカライドは、二成分、三成分、または四成分であることができ、各触角はＭａｎ残基に対する構造Ｎｅｕ５Ａｃ （α２→３またはα２→６） Ｇａｌ （β１→４） ＧｌｃＮＡｃ連鎖 （β１→２、４、または６） を有し、Ｍａｎ残基はＭａｎ （β１→４） ＧｌｃＮＡｃ （β１→４） ＧｌｃＮＡｃ−Ａｓｎに対して連鎖 （α１→３または６） されている。
【００３１】
（Ｎｅｕ５ＡｃはＮ−アセチルノイラミン酸 （シアル酸） を意味し、Ｇａｌはガラクトースを意味し、ＧｌｃＮＡｃはＮ−アセチルグルコサミンを意味し、そしてＭａｎはマンノースを意味する）。また、オリゴサッカライド鎖はＧｌｃＮＡｃに対してα１→６連鎖することができるフコース残基を含んでなることができる。因子ＶＩＩがヒトにおいてその場で産生されるとき、オリゴサッカライド鎖のいくつかはコアフコース残基を欠如する；鎖のすべては触角状（ａｎｔｅｎｎａｒｙ）フコース残基を欠如する；そして鎖のすべてはほとんど完全にシアリル化されている、すなわち、各触角の末端糖はα２→３またはα２→６連鎖を介してガラクトースに連鎖されたＮ−アセチルノイラミン酸である。
【００３２】
しかしながら、他の環境において産生されるとき、因子ＶＩＩは１または２以上のそれらの触角上に異なる末端構造を有するオリゴサッカライド鎖を含有することができる、例えば、シアル酸残基を欠如する；Ｎ−グリコリルノイラミン酸 （Ｎｅｕ５Ｇｃ） 残基を含有する；ガラクトースの代わりに末端Ｎ−アセチルガラクトサミン （ＧｌｃＮＡｃ） 残基を含有する；およびその他。例えば、仔ウシ血清の存在下に培養されたＢＨＫ細胞において産生されるとき、因子ＶＩＩ調製物は下記のオリゴサッカライドパターンを示す：
【００３３】
−　オリゴサッカライド鎖の８７〜９３％は少なくとも１つのシアル酸残基を含有する；
−　７〜１３％は中性である （シアル酸を欠如する）；
−　９〜１６％は少なくとも１つの末端ガラクトース残基を含有する；
−　１９〜２９％は少なくとも１つの末端Ｎ−アセチルガラクトサミン残基を含有する；そして
−　３０〜３９％は少なくとも１つのアンキャプド触角を含有する、すなわち、少なくとも１つの末端ガラクトース残基またはＮ−アセチルガラクトサミン残基を含有する。
【００３４】
本発明者らは、以前に記載されたものと異なる特異的な前もって決定したオリゴサッカライドパターンを含有する因子ＶＩＩ調製物を調製した。本発明は、下記のグリコ型パターンの１または２以上を示す因子ＶＩＩポリペプチドまたは因子ＶＩＩ関連ポリペプチド対応する調製物を包含する。
【００３５】
（ｉ） オリゴサッカライド鎖の約９４〜１００％、例えば、約９４〜９９％、約９５〜９８％、または約９６〜９７％は少なくとも１つのシアル酸残基を含有する。異なる態様において、オリゴサッカライド鎖の少なくとも約９４％、９５％、９６％、または９７％は少なくとも１つのシアル酸残基を含有する；
（ｉｉ） オリゴサッカライド鎖の６％以下、例えば、約１．５〜６％または約２〜４％は中性である；
（ｉｉｉ） オリゴサッカライド鎖の約１６％以下、好ましくは約１０％以下、例えば、約６〜１０％または約８〜９％は少なくとも１つの末端ガラクトースを含有する；
【００３６】
（ｉｖ） オリゴサッカライド鎖の約２５％以下、好ましくは１０％、例えば、約６〜９％または約７〜８％は少なくとも１つの末端ＧｌｃＮＡｃ残基を含有する；
（ｖ） オリゴサッカライド鎖の約３０％以下、好ましくは約２５％以下、例えば、約１１〜２３％または約１２〜１８％は少なくとも１つのアンキャプド触角を含有する；そして
（ｖｉ） オリゴサッカライド鎖の少なくとも約２％、好ましくは少なくとも約５％、より好ましくは少なくとも約１０％または２０％、最も好ましくは少なくとも約４０％は触角状（ａｎｔｅｎｎａｒｙ）Ｎ−アセチルグルコサミン残基 （すなわち、Ｍａｎ残基に対してβ１→２、４、または６連鎖されたＮ−アセチルグルコサミン残基） にα１→３連鎖された少なくとも１つのフコースを含有する。
【００３７】
（ｉ） 〜 （ｖｉ）の各々は本発明に包含される独特なグリコ型パターンを表すことができる、すなわち、本発明による調製物は （ｉ） 〜 （ｖｉ） のただ１つにより記載することができることが理解されるであろう。選択的に、特定のグリコ型パターンに依存して、本発明に包含される調製物は（ｉ） 〜 （ｖｉ） の２以上により記載できることがことが理解されるであろう。
【００３８】
さらに、本発明に包含される調製物は、（ｉ） 〜 （ｖｉ） の１または２以上と他の構造的特徴の１または２以上との組み合わせにより記載することができる。例えば、本発明は、シアル酸残基 （Ｎｅｕ５ＡｃまたはＮｅｕ５Ｇｃ） がもっぱらα２→３の立体配置においてガラクトースに連鎖されている、因子ＶＩＩポリペプチドまたは因子ＶＩＩ関連ポリペプチドを含んでなる調製物を包含する。本発明は、また、コアＮ−アセチルグルコサミンにα１→６連鎖されたフコースおよび／または触角状（ａｎｔｅｎｎａｒｙ）Ｎ−アセチルグルコサミンにα１→３連鎖されたフコースを含有する、因子ＶＩＩポリペプチドまたは因子ＶＩＩ関連ポリペプチドを含んでなる調製物を包含する。
【００３９】
１系列の態様において、本発明の調製物は、オリゴサッカライド鎖の９９％より多くが少なくとも１つのシアル酸残基を含有し、かつ （ａ） シアル酸残基がもっぱらα２→３立体配置で連鎖されており、および／または （ｂ） コアＮ−アセチルグルコサミンに連鎖されたフコース残基が存在し、および／または検出可能な数の触角がＮ−アセチルガラクトサミンにおいて終止する、因子ＶＩＩまたは因子ＶＩＩ関連ポリペプチドを包含する。
【００４０】
１つの態様において、本発明は、オリゴサッカライド鎖の９９％より多くが少なくとも１つのシアル酸残基を含有し、かつシアル酸残基がもっぱらα２→３立体配置でガラクトースに連鎖されている、野生型因子ＶＩＩａを含んでなる調製物を包含する。他の態様において、本発明は、オリゴサッカライド鎖の９９％より多くが少なくとも１つのシアル酸残基を含有し、かつオリゴサッカライド鎖の少なくともいくつかがＮ−アセチルガラクトサミンを含んでなる、野生型因子ＶＩＩａを含んでなる調製物を包含する。本発明は、ヒト血漿から単離され、グルコシダーゼを使用するｅｘ ｖｉｖｏ処理により変性されていない、野生型因子ＶＩＩまたは野生型因子ＶＩＩａを包含しない。
【００４１】
１つの態様において、因子ＶＩＩａ調製物は１つの触角状（ａｎｔｅｎｎａｒｙ）Ｎ−アセチルグルコサミンにα１→３連鎖された単一のフコースを有するオリゴサッカライド鎖を含んでなる。他の態様において、因子ＶＩＩａ調製物は二触角状（ａｎｔｅｎｎａｒｙ）オリゴサッカライド （シアリルルイスＸ構造） の各触角状（ａｎｔｅｎｎａｒｙ）Ｎ−アセチルグルコサミンの各々にα１→３連鎖されたフコース残基を有するオリゴサッカライド鎖を含んでなる。他の態様において、因子ＶＩＩａ調製物は、（ｉ）コアＮ−アセチルグルコサミンに連鎖されたフコースおよび （ｉｉ） １つの触角状（ａｎｔｅｎｎａｒｙ）Ｎ−アセチルグルコサミンにα１→３連鎖された単一のフコースを有するオリゴサッカライド鎖を含んでなる。他の態様において、因子ＶＩＩａ調製物は、（ｉ） コアＮ−アセチルグルコサミンに連鎖されたフコースおよび （ｉｉ） 二触角状（ａｎｔｅｎｎａｒｙ）オリゴサッカライドの各触角状（ａｎｔｅｎｎａｒｙ）Ｎ−アセチルグルコサミンの各々にα１→３連鎖されたフコース残基を有するオリゴサッカライド鎖を含んでなる。
【００４２】
本発明を実施するとき、この分野において知られている方法を使用して、Ｎ−連鎖オリゴサッカライドのパターンを決定することができる。このような方法は下記のものを包含するが、これらに限定されない：高性能液体クロマトグラフィー （ＨＰＬＣ）；毛管電気泳動 （ＣＥ）；核磁気共鳴 （ＮＭＲ）；イオン化技術、例えば、高速電子衝撃法、エレクトロスプレー、またはマトリックス援用レーザー脱着　（ＭＡＬＤＩ） を使用する質量分析 （ＭＳ）；ガスクロマトグラフィー （ＧＣ）；およびアニオン交換 （ＡＩＥ）−ＨＰＬＣ、サイズ排除クロマトグラフィー （ＳＥＣ）、ＭＳと組み合わせたエキソグリコシダーゼを使用する処理。
【００４３】
例えば、下記の文献を参照のこと：Ｗｅｂｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ａｎａｌ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２２５：１３５ （１９９５）；Ｋｌａｕｓｅｎ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｃｈｒｏｍａｔｏｇ． ７１８：１９５ （１９９５）；Ｍｏｒｒｉｓ ｅｔ ａｌ．， Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ， ＭｏＥｗｅｎ ｅｔ ａｌ．， 編者， Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ， （１９９０）， ｐｐ． １３７−１６７；Ｃｏｎｂｏｙ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｌ． Ｍａｓｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２１：３９７， １９９２；Ｈｅｌｌｅｒｑｖｉｓｔ， Ｍｅｔｈ． Ｅｎｚｙｍｏｌ． １９３：５５４ （１９９０）；Ｓｕｔｔｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ３１８：３４ （１９９４）；Ｈａｒｖｅｙ ｅｔ ａｌ．， Ｏｒｇａｎｉｃ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ ２９：７５２ （１９９４）。
【００４４】
前述の方法 （または異なる構造を有するオリゴサッカライド鎖を分離する他の方法） を使用して因子ＶＩＩ由来オリゴサッカライド鎖を分離した後、分離された種は、例えば、グループ （ｉ） 〜 （ｖｉ） の１つに割り当てられる。試料中のオリゴサッカライド鎖の全含量に関するそのグループに割り当てられたオリゴサッカライドの合計として、（ｉ） 〜 （ｖｉ） の各々の相対的含量を計算する。
【００４５】
例えば、ＡＩＥ−ＨＰＬＣを使用して、１３またはそれより多いオリゴサッカライドピークをＢＨＫ細胞中で産生された組換え因子ＶＩＩ調製物から分離することができる。例えば、下記の文献を参照のこと：Ｋｌａｕｓｅｎ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ９：， １９９８。ピークのうちの５つ （Ｋｌａｕｓｅｎ ｅｔ ａｌ．において１〜５と表示される） はシアル酸を含有しないが、ピークのうちの８つ （６、７、および１０〜１５と表示される） はシアル酸を含有する。
【００４６】
所定の解析において、シアル酸を含有する鎖およびシアル酸を欠如する鎖の数および分布は、（ａ） 発現されるポリペプチド；（ｂ） 細胞型および培養条件；および （ｃ） 使用する解析法に依存し、そして生ずるパターンはそれに応じて変化することが理解されるであろう。
【００４７】
いずれの場合においても、いったんシアル酸を含有するオリゴサッカライド鎖がシアル酸を含有しないオリゴサッカライド鎖から分離されると、慣用のデータ解析プログラムを使用して各ピークの下の面積；全ピーク面積；および特定のピークにより表される全ピーク面積の百分率を計算する。この方法において、シアル酸を含有するピークの面積の合計／全ピーク面積×１００ ＝ 本発明による調製物についてのシアリル化値％ （すなわち、少なくとも１つのシアル酸残基を含有するオリゴサッカライド鎖の比率） である。同様な方法において、シアル酸を含有しないまたは少なくとも１つのまたはＮ−アセチルグルコサミンを含有する鎖の％を計算することができる。
【００４８】
Ｎ−連鎖オリゴサッカライドの前もって決定したパターンを有する因子ＶＩＩ調製物を調製する方法
因子ＶＩＩまたは因子ＶＩＩ関連ポリペプチドを発現する適当な宿主細胞を使用して、各々がＮ−連鎖オリゴサッカライドの前もって決定したパターンを有する、因子ＶＩＩ、因子ＶＩＩ変異型、または因子ＶＩＩ関連ポリペプチドの調製物を調製することができる。
【００４９】
宿主細胞：ある態様において、宿主細胞は内因的因子ＶＩＩ遺伝子を発現するヒト細胞である。これらの細胞において、内因的遺伝子は完全であるか、あるいはその場で修飾されているか、あるいは因子ＶＩＩ遺伝子の外側の配列をその場で修飾して内因的因子ＶＩＩ遺伝子の発現が変更されていることができる。内因的因子ＶＩＩ遺伝子を発現することができるヒト細胞を使用することができる。
【００５０】
他の態様において、組換え遺伝子からヒト因子ＶＩＩを発現するように、異種宿主細胞をプログラムする。宿主細胞は脊椎動物門、昆虫、または真菌の細胞であることができる。好ましくは、細胞は哺乳動物のＮ−連鎖グリコシル化；Ｏ−連鎖グリコシル化；およびγ−カルボキシル化の全スペクトルが可能である哺乳動物細胞である。例えば、米国特許第４，７８４，９５０号参照。
【００５１】
好ましくは哺乳動物細胞は下記のものを包含する：ＣＨＯ （例えば、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ６１）、ＣＯＳ−１ （ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５０）、ベイビーハムスター腎 （ＢＨＫ）、およびＨＥＫ ２９３ （ＡＴＣＣ ＣＲＬ １５７３；Ｇｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｇｅｎ． Ｖｉｒｏｌ． ３６：５９−７２， １９７７） 細胞系統。好ましいＢＨＫ細胞系統はｔｋ− ｔｓ １３ ＢＨＫ細胞系統 （ＷａｅｃｈｔｅｒおよびＢａｓｅｒｇａ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７９：１１０６−１１１０， １９８２）、（以後においてＢＨＫ ５７０細胞と呼ぶ） である。ＢＨＫ ５７０細胞系統は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション （Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ） （米国マリイランド州２０８５２、ロックビレパークローンドライブ１２３０１） からＡＴＣＣ受け入れ番号ＣＲＬ １０３１４で入手可能である。また、ｔｋ− ｔｓ １３ ＢＨＫ細胞系統はＡＴＣＣから受け入れ番号ＣＲＬ １６３２で入手可能である。
【００５２】
さらに、多数の他の細胞系統を使用することができ、下記のものを包含する：Ｒａｔ Ｈｅｐ Ｉ （ラットヘパトーム；ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６００）、Ｒａｔ Ｈｅｐ ＩＩ （ラットヘパトーム；ＡＴＣＣ ＣＲＬ １５４８）、ＴＣＭＫ （ＡＴＣＣ ＣＣＬ １３９）、ヒト肺 （ＡＴＣＣ ＨＢ ８０６５）、ＮＣＴＣ １４６９ （ＡＴＣＣ ＣＣＬ ９．１）；ＤＵＫＸ細胞 （ＣＨＯ細胞系統） （ＵｒｌａｕｂおよびＣｈａｓｉｎ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７７：４２１６−４２２０， １９８０） （ＤＵＫＸ細胞をまたＤＸＢ１１細胞と呼ぶ）、およびＤＧ４４ （ＣＨＯ細胞系統） （Ｃｅｌｌ， ３３：４０５， １９８３およびＳｏｍａｔｉｃ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １２：５５５， １９８６）。また、３Ｔ３細胞、Ｎａｍａｌｗａ細胞、骨髄腫細胞および骨髄腫細胞と他の細胞との融合物は有用である。
【００５３】
特定の好ましい態様において、宿主細胞は血清の非存在下に増殖するように適合され、因子ＶＩＩを発現するようにプログラムされたＢＨＫ ２１細胞である。ある態様において、細胞は、それらが由来された細胞型と品質的または定量的に異なるスペクトルのグリコシル化酵素 （例えば、グリコシルトランスフェラーゼおよび／またはグルコシダーゼ） を発現する突然変異または組換え体細胞であることができる。また、他の異種ペプチドまたはタンパク質、例えば、因子ＶＩＩのトランケートされた形態を発現するようにプログラムすることができる。１つの態様において、宿主細胞は問題の因子ＶＩＩポリペプチド （すなわち、因子ＶＩＩまたは因子ＶＩＩ関連ポリペプチド） および他の異種ペプチドまたはポリペプチド、例えば、因子ＶＩＩフラグメントの修飾性酵素の両方を共発現するようにプログラムされたＣＨＯ細胞である。
【００５４】
方法：本発明は、（ｉ） 〜 （ｖｉ） として前述したグリコ型パターンの任意のものを含んでなる調製物を調製する方法および、それ以上の態様において、因子ＶＩＩおよび因子ＶＩＩ関連ポリペプチドのグリコ型分布を最適化する方法を包含する。これらの方法は下記の工程を含んでなる：
（ａ） 因子ＶＩＩまたは因子ＶＩＩ関連ポリペプチドを発現する細胞を第１組の前もって決定した培養条件下に培養し、
（ｂ） 培養物から因子ＶＩＩまたは因子ＶＩＩ関連ポリペプチドを回収して、ポリペプチドを含んでなる調製物を獲得し、そして
（ｃ） ポリペプチドに連鎖したオリゴサッカライドの構造を解析して調製物のグリコ型パターンを決定する。
【００５５】
これらの方法は下記の工程をさらに含んでなる：
（ｄ１） 工程 （ａ） の培養条件を変更して第２組の前もって決定した培養条件を達成し、そして
（ｅ１） 所望のグリコ型パターンが達成されるまで工程 （ｂ） 〜 （ｄ１） を反復する。
選択的に、それらの方法は下記の工程をさらに含んでなる：
（ｄ２） 調製物を化学的または酵素的に処理してオリゴサッカライドの構造を変更し、そして
（ｅ２） 所望のグリコ型パターンが達成されるまで工程 （ｂ） 〜 （ｄ２） を反復する。
【００５６】
これらの方法は下記の工程をさらに含んでなる：前もって決定したグリコ型パターンを有する調製物を生物学的活性 （例えば、凝固、因子Ｘタンパク質分解、またはＴＦ結合を包含する） または他の機能 （例えば、薬物速度論的プロファイルまたは安定性） の少なくとも１つについて試験し、そして特定のグリコ型パターンを特定の生物学的活性または機能のプロファイルに相関させる。
【００５７】
工程 （ｄ１） において変更できる培養条件の変動は下記のものを包含するが、これらに限定されない：細胞の起源、例えば、本来使用されたものと異なる種に由来する細胞；または１または２以上のグリコシルトランスフェラーゼまたはグルコシダーゼまたはグリコシル化装置の他の成分を有する突然変異体または組換え細胞 （下記の文献を参照のこと：Ｇｒａｂｅｎｈｏｒｓｔ ｅｔ ａｌ．， Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｊ． １６：８１， １９９９；Ｂｒａｇｏｎｚｉ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ １４７４：２７３， ２０００；Ｗｅｉｋｅｒｔ， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １７：１１１６， １９９９）；ポリペプチドの発現レベル；代謝条件、例えば、グルコースまたはグルタミン濃度；血清のの非存在または存在；ビタミンＫの濃度；タンパク質加水分解物、ホルモン、微量金属、塩類ならびにプロセスのパラメーター、例えば、温度、溶解酸素レベルおよびｐＨ。
【００５８】
調製物のオリゴサッカライドパターンを変更するために使用できる酵素処理は下記のものを包含するが、これらに限定されない：順次にかつ特定の末端構造を有するオリゴサッカライド鎖の分布の所望変更を達成する条件下に、シアリダーゼ （ニューロアミダーゼ）、ガラクトシダーゼ、フコシダーゼ、ガラクトシルトランスフェラーゼ、フコシルトランスフェラーゼ、および／またはシアリルトランスフェラーゼの１または２以上を使用する処理。グリコシルトランスフェラーゼはＣａｌｂｉｏｃｈｅｍ （カリフォルニア州ラジョラ） から商業的に入手可能であり、そしてグルコシダーゼはＧｌｙｋｏ， Ｉｎｃ． （カリフォルニア州ノバト） から商業的に入手可能である。
【００５９】
１系列の態様において、因子ＶＩＩまたは関係ポリペプチドを発現する宿主細胞を特異的培養条件に対して暴露し、ここで宿主細胞は （ｉ） 〜 （ｖｉ） のいずれかとして前述したオリゴサッカライド構造の所望のパターンを有するグリコシル化因子ＶＩＩポリペプチドを分泌する。このような条件は、血清の非存在または完全な非存在下の還元を包含するが、これらに限定されない。好ましくは、宿主細胞を血清の非存在下に増殖するように適合させ、増殖期および調製期の両方において血清の非存在下に培養する。
【００６０】
このような手順は、例えば、下記の文献に記載されている：Ｓｃｈａｒｆｅｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．， Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ ｔｏｗａｒｄｓ ｔｈｅ ２１ｓｔ Ｃｅｎｔｕｒｙ， Ｅ． Ｃ． ｅｔ ａｌ． （編者）、Ｋｌｕｗｅｒ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ， ｐｐ． ６１９−６２３， １９９５ （ＢＨＫおよびＣＨＯ細胞）；Ｃｒｕｚ， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｔｅｃｈ． １１：１１７−１２０， １９９７ （昆虫細胞）；Ｋｅｅｎ， Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌ． １７：２０３−２１１， １９９５ （骨髄腫細胞）；Ｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １４：９７２−９７８， １９９３ （ヒト腎臓２９３細胞）。他の好ましい態様において、細胞に添加される増殖培地は動物組織または動物細胞培養物から単離されたタンパク質または他の成分を含有しない。
【００６１】
例えば、下記の実施例１参照。典型的には、慣用成分に加えて、因子ＶＩＩの産生に適当な培地は、因子ＶＩＩ中のグルタミン残基γ−カルボキシル化に必要なビタミンＫを０．１〜５０ ｍｇ／ｌの濃度で含有する。
他の系列の態様において、本発明のグリコ型は因子ＶＩＩまたは因子ＶＩＩ関連ポリペプチドの調製物をその中に含有されるＮ−連鎖オリゴサッカライドの酵素的および／または化学的修飾に付す。
【００６２】
因子ＶＩＩ調製物
本明細書において使用するとき、「因子ＶＩＩ調製物」は、それらが産生された細胞から分離された、複数の因子ＶＩＩポリペプチド、因子ＶＩＩａポリペプチド、または因子ＶＩＩ関連ポリペプチドを意味し、変異型および化学的に修飾された形態を包含する。
この分野において知られている方法により、ポリペプチドを由来細胞から分離することができる。このような方法は、付着細胞培養物からの所望産物を含有する細胞培地の収集；付着細胞を除去する遠心または濾過；およびその他を包含するが、これらに限定されない。
【００６３】
必要に応じて、因子ＶＩＩ調製物をさらに精製することができる。精製はこの分野において知られている方法により達成することができる。このような方法は下記のものを包含するが、これらに限定されない：アフィニティークロマトグラフィー、例えば、抗因子ＶＩＩ抗体カラム上のアフィニティークロマトグラフィー （例えば、下記文献を参照のこと、Ｗａｋａｂａｙａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６１：１１０９７， １９８６；およびＴｈｉｎ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２７：７７８５， １９８８）；疎水性相互作用クロマトグラフィー；イオン交換クロマトグラフィー；サイズ排除クロマトグラフィー；電気泳動手法 （例えば、調製用等電点電気泳動 （ＩＥＦ）、分別溶解度 （例えば、硫酸アンモニウム沈降法）、または抽出およびその他。
【００６４】
一般に、下記の文献を参照のこと：Ｓｃｏｐｅｓ， Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ， Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９８２；およびＰｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ， Ｊ．−Ｃ． ＪａｎｓｏｎおよびＬａｒｓ Ｒｙｄｅｎ， 編者， ＶＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９８９。精製後、調製物は好ましくは約１０重量％より少ない、より好ましくは約５重量％より少ない、最も好ましくは約１重量％より少ない量の宿主細胞に由来する非因子ＶＩＩタンパク質を含有する。
【００６５】
因子ＶＩＩおよび因子ＶＩＩ関連ポリペプチドは、因子ＶＩＩａまたはトリプシン様特異性を有する他のプロテアーゼ、例えば、因子ＩＸａ、カリクレイン、因子Ｘａ、およびトロンビンを使用する、タンパク質分解的活性化により活性化することができる。例えば、下記の文献を参照のこと：Ｏｓｔｅｒｕｄ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍ． １１：２８５３ （１９７２）；Ｔｈｏｍａｓ， 米国特許第４，４５６，５９１号；およびＨｅｄｎｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． ７１：１８３６ （１９８３）。選択的に、因子ＶＩＩは、それをイオン交換クロマトグラフィーカラム、例えば、Ｍｏｎｏ−ＱＴＭ （Ｐｈａｒｍａｃｉａ） またはその他に通過させることによって活性化することができる。次いで、後述するように、生ずる活性化された因子ＶＩＩを処方し、投与することができる。
【００６６】
因子ＶＩＩ調製物の機能的性質
本発明による前もって決定したオリゴサッカライドパターンを有する因子ＶＩＩポリペプチドおよび因子ＶＩＩ関連ポリペプチドの調製物は、参照調製物に関して機能的性質を示す。改良された性質は下記のものを包含するが、これらに限定されない：ａ） 物理的性質、例えば、貯蔵安定性；ｂ） 薬物速度論的性質、例えば、生物学的利用能および半減期；およびｃ） ヒトにおける免疫原性。
【００６７】
参照調製物は、アスパラギン連結グリコシル化の異なるパターンを示す以外、それが調製されている本発明による調製物の中に含有されるポリペプチドと同一であるポリペプチド （例えば、野生型因子ＶＩＩまたは特定の変異型または化学的に変更された形態） を意味する。例えば、参照調製物は典型的には下記のグリコ型パターンの１または２以上を含んでなる：（ｉ） オリゴサッカライド鎖の約９３より小 （例えば、約９２％より小または約９０％より小） は少なくとも１つのシアル酸残基を含有する；（ｉｉ） オリゴサッカライド鎖の少なくとも約６％ （例えば、少なくとも約７．５％または少なくとも約１０％） はシアル酸を欠如する （すなわち、中性である）；
【００６８】
（ｉｉｉ） オリゴサッカライド鎖の少なくとも約１０％ （例えば、少なくとも１２．５％または少なくとも約１５％） は少なくとも１つの末端ガラクトース残基を含有する；（ｉｖ） オリゴサッカライド鎖の少なくとも約１５％ （例えば、少なくとも約２０％または少なくとも約２５％） は少なくとも１つの末端Ｎ−アセチルガラクトサミン残基を含有する；（ｖ） オリゴサッカライド鎖の少なくとも約２５％ （例えば、少なくとも約３０％または少なくとも約３５％） は少なくとも１つのアンキャプド触角を含有する （すなわち、少なくとも１つの末端ガラクトース残基またはＮ−アセチルガラクトサミン残基を含有する）；または （ｖｉ） 本質的に検出不可能レベルの （例えば、約０．２％より少ない） 触角状（ａｎｔｅｎｎａｒｙ）フコース残基。
【００６９】
因子ＶＩＩ調製物の貯蔵安定性は、（ａ） ２５ ℃において乾燥粉末として貯蔵したとき、調製物の生物学的活性の２０％が崩壊するために要求される時間および／または （ｂ） 調製物中の因子ＶＩＩａ凝集物の比率が２倍となるために要求される時間を測定することによって評価することができる。
【００７０】
ある態様において、本発明の調製物は、それと参照調製物とを２５ ℃において乾燥粉末として貯蔵したとき、参照調製物において同一現象に要求される時間に関して生物学的活性が２０％崩壊するために要求される時間が少なくとも約３０％、好ましくは少なくとも約６０％、より好ましくは少なくとも約１００％増加することを示す。生物学的活性の測定は、凝固アッセイ、タンパク質分解アッセイ、ＴＦ結合アッセイ、またはＴＦ独立的トロンビン発生アッセイを使用して実施することができる。
【００７１】
ある態様において、本発明の調製物は、それと参照調製物とを２５ ℃において乾燥粉末として貯蔵したとき、参照調製物に関して凝集物が２倍になるために要求される時間が少なくとも約３０％、好ましくは少なくとも約６０％、より好ましくは少なくとも約１００％増加することを示す。凝集物の含量は、次のようにしてＰｒｏｔｅｉｎ Ｐａｋ ３００ ＳＷカラム （７．５×３００ ｍｍ） （Ｗａｔｅｒｓ、８００１３） 上のゲル透過ＨＰＬＣにより測定される。このカラムを溶離液Ａ （０．２ Ｍ硫酸アンモニウム、５％イソプロパノール、ｐＨをリン酸で２．５に調節し、次いでｐＨをトリエチルアミンで７．０に調節する） と平衡化し、次いで２５ μｇの試料をカラムに適用する。溶離を溶離液Ａで０．５ ｍｌ／分の流速で実施し、２１５ ｎｍにおける吸収を測定することによって検出を達成する。凝集物含量を因子ＶＩＩ凝集物のピーク面積／因子ＶＩＩのピークの全面積として計算する。
【００７２】
「生物学的利用能」は、投与後、前もって決定した時間において血漿中で検出することができる因子ＶＩＩまたは因子ＶＩＩ関係調製物の投与量の比率を意味する。典型的には、生物学的利用能は、試験動物において、約２５〜２５０ μｇ／ｋｇの調製物を投与し、投与後、前もって決定した時間において血漿試料を採り、そして凝固アッセイ （またはバイオアッセイ）、イムノアッセイ、または同等のアッセイの１または２以上を使用して因子ＶＩＩまたは因子ＶＩＩ関連ポリペプチドの含量を測定することによって決定される。データは典型的には［因子ＶＩＩ］／時間としてグラフで表示され、そして生物学的利用能は曲線の下の面積として表される （ＡＵＣ）。試験調製物の相対的生物学的利用能は、試験調製物のＡＵＣと参照調製物のそれとの間の比を意味する。
【００７３】
ある態様において、本発明の調製物は、参照調製物の生物学的利用能の少なくとも約１１０％、好ましくは少なくとも約１２０％、より好ましくは少なくとも約１３０％、最も好ましくは少なくとも約１４０％の相対的生物学的利用能を示す。生物学的利用能は、任意の哺乳動物種、好ましくはイヌにおいて測定することができ、そしてＡＵＣの計算に使用する前もって決定した時間は１０分〜８時間の異なる増分を包含することができる。
【００７４】
「半減期」は、因子ＶＩＩポリペプチドまたは因子ＶＩＩ関連ポリペプチドの血漿濃度を特定の値からその値の半分に減少させるために要求される時間を意味する。半減期は生物学的利用能についてと同一の手法を使用して測定することができる。ある態様において、本発明の調製物は、参照調製物の半減期に関して、少なくとも約０．２５時間、好ましくは少なくとも約０．５時間、より好ましくは少なくとも約１時間、最も好ましくは少なくとも約２時間の半減期の増加を示す。
【００７５】
「免疫原性」は、ヒトに投与したとき、体液性、細胞性、または両方であるかどうかにかかわらず、有害な免疫応答を誘発する調製物の能力を意味する。因子ＶＩＩポリペプチドおよび因子ＶＩＩ関連ポリペプチドがヒトにおいて検出可能な免疫応答を誘発することは知られていない。それにもかかわらず、任意のヒトの下位集団において、特定の投与したタンパク質に対して感受性を示す個体が存在することがある。免疫原性は、この分野において知られている慣用法を使用して、感受性個体において抗因子ＶＩＩ抗体および／または因子ＶＩＩ応答性Ｔ細胞の存在を定量することによって測定することができる。ある態様において、本発明の調製物は、参照調製物のその個体についての免疫原性に関して、少なくとも約１０％、好ましくは少なくとも約２５％、より好ましくは少なくとも約４０％、最も好ましくは少なくとも約５０％の感受性個体における免疫原性の減少を示す。
【００７６】
医薬組成物および使用法
本発明の調製物は、因子ＶＩＩ応答性症候群、例えば、出血性障害を治療するために使用することができる。このような症候群は、凝固因子欠乏症 （例えば、血友病ＡおよびＢまたは凝固因子ＸＩまたはＶＩＩの欠乏症）；血小板減少症尾残基フォン・ウィルブランド病；または凝固因子のインヒビター、またはいずれかの原因からの過剰の出血性により引き起こされる症候群を包含するが、これらに限定されない。また、調製物は、外科手術または他の外傷に関連する患者に、または抗凝固治療を受けている患者に投与することができる。
【００７７】
野生型因子ＶＩＩに関して実質的に減少した生物学的活性を有する、本発明による因子ＶＩＩ関連ポリペプチドを含んでなる調製物は、例えば、血管形成、または再狭窄において起こるような血管の血栓症または閉塞の危険を増加することがある他の外科的手法を受けている患者において、抗凝固剤として使用することができる。抗凝固剤を処方される他の医学的適用は下記のものを包含するが、これらに限定されない：深静脈血栓症、肺塞栓症、発作、汎発生血管内凝固症候群 （ＤＩＣ） 、グラム陰性内毒素血症に関連する肺および腎臓におけるフィブリン沈着、心筋梗塞；急性呼吸窮迫症候群 （ＡＲＤＳ ）、全身炎症応答症候群（ＳＩＲＳ）、溶血性尿毒症症候群 （ＨＵＳ）、ＭＯＦおよびＴＴＰ。
【００７８】
本発明による因子ＶＩＩおよび因子ＶＩＩ関連ポリペプチドを含んでなる医薬組成物は、予防的および／または療法的治療のための非経口的投与に主とし意図される。好ましくは、医薬組成物は、非経口的に、すなわち、静脈内、皮下、または筋肉内に投与される。それらは連続的または間欠的注入により投与することができる。
【００７９】
医薬組成物または処方物は、生理学上許容される担体、好ましくは水性担体または希釈剤と組み合わせた、好ましくはその中に溶解した、本発明による調製物を含んでなる。種々の水性担体、例えば、水、緩衝化水、０．４％の生理食塩水、０．３％のグリシンおよびその他を使用することができる。本発明の調製物は、また、損傷部位への送達またはターゲッティングのためにリポソーム調製物に処方することができる。リポソーム調製物は、例えば、米国特許第４，８３７，０２８号、米国特許第４，５０１，７２８号、および米国特許第４，９７５，２８２号に一般的に記載されている。組成物は慣用のよく知られている滅菌技術により滅菌することができる。生ずる水溶液を使用するために包装するか、あるいは無菌的条件下に濾過し、凍結乾燥であることができ、凍結乾燥調製物は無菌の水溶液と組み合わせた後、投与することができる。
【００８０】
組成物は薬学上許容される助剤またはアジュバントを含有することができる。このような助剤またはアジュバントは、ｐＨ調節剤および緩衝剤および／または張度調節剤、例えば、酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、およびその他を包含するが、これらに限定されない。
これらの処方物中の因子ＶＩＩまたは因子ＶＩＩ関連ポリペプチドの濃度は、広く変化させることができ、すなわち、約０．５重量％から、通常少なくとも約１重量％から１５または２０重量％程度に多くあることができ、そして選択した特定の投与モードに従い、流体体積、粘度、およびその他により主として選択されるであろう。
【００８１】
こうして、静脈内注入のために典型的な医薬組成物は２５０ ｍｌの無菌のリンガー溶液および１０ ｍｇの調製物を含有するように構成することができる。非経口的に投与可能な組成物について実際的方法は既知であるか、あるいは当業者にとって明らかでありそして、例えば、下記の文献にいっそう詳しく記載されている：Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， 第１８版， Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ， ペンシルベニア州イーストン （１９９０）。
【００８２】
本発明の調製物を含有する組成物は、予防的および／または療法的治療のために投与することができる。療法的適用において、組成物は、前述したように、既に疾患を患う患者に、疾患およびその合併症を治療し、軽減し、または部分的に抑制するために十分な量で投与される。これを達成するために適切な量は、「治療的に有効な量」として定義される。各目的に有効な量は、疾患または外傷の重症度ならびに被検体の体重および一般的状態に依存するであろう。しかしながら、一般に、有効量は７０ ｋｇの被検体について約０．０５ ｍｇ〜約５００ ｍｇの調製物／日の範囲であり、約１．０ ｍｇ〜約２００ ｍｇの調製物／日はいっそう普通に使用されるであろう。日常的実験を使用して、値のマトリックスを構成し、マトリックス中の異なる点を試験することによって、適当な投与量を決定することができることが理解されるであろう。
【００８３】
例えば、局所的適用するための、本発明の調製物の局所的デリバリーは、例えば、噴霧、潅流、二重バルーンカテーテル、ステント、脈管の移植片またはステントの中への組込み、バルーンカテーテルの被覆に使用されるヒドロゲル、または他の十分に確立された方法により実施することができる。いずれの場合においても、医薬組成物は被検体を効果的に治療するために十分な量の調製物を提供すべきである。
【００８４】
本発明の医薬組成物は、他の生物学的活性剤、例えば、非因子ＶＩＩ関係凝固剤または抗凝固剤をさらに含むことができる。
下記の実施例は本発明の例示であるが、本発明を限定するものと解釈すべきでない。
【００８５】
実施例
実施例１．変更されたグリコ型パターンを示す因子ＶＩＩポリペプチドの調製および分析
変更されたグリコ型パターンを有する因子ＶＩＩ調製物を調製するために、下記の実験を実施した。
Ｉ．　調製：
因子ＶＩＩエンコーディングプラスミドで形質転換したＢＨＫ細胞系統を、血清の非存在下に懸濁培養で増殖するように適合させた。細胞を回転培養において順次に増殖させ、細胞の数が増加するにつれて、新しい培地の添加により体積を徐々に増加させた。
【００８６】
最後に、マクロ多孔質Ｃｙｔｏｐｏｒｅ １担体 （Ｐｈａｒｍａｃｉａ） を含有する１００リットルの調製バイオリアクターの中に６リットルの種子培養物を接種し、次いで懸濁細胞は担体の中に固定化されるようになった。３６ ℃、ｐＨ ６．７〜６．９および５０％のＤＯにおいて、培養を維持した。細胞数が増加するにつれて、新しい培地の添加により調製バイオリアクター中の体積を徐々に増加させた。細胞密度がほぼ２×１０６細胞／ｍｌに到達したとき、調製期を開始させ、培地の交換を２４時間毎に実施した：攪拌を停止し、細胞を含有する担体を沈降させ、次いで培養上清の８０％を収集し、新しい培地と置換した。収集した培養上清を濾過して非捕捉細胞および細胞破片を除去し、次いでそれ以上プロセシングするために移した。
調製期間の間に、細胞は３〜６×１０６細胞／ｍｌおよび２〜７ ｍｇの因子ＶＩＩ／リットルの力価に到達した。
【００８７】
ＩＩ．　組換え因子ＶＩＩのグリコ型パターンの解析：
下記の調製物のオリゴサッカライドパターンを比較した：（ａ） 部Ｉに記載したように調製された組換え因子ＶＩＩ調製物 （ｎ＝７）；および２つの参照調製物：（ｂ） 仔ウシ血清の存在下にＢＨＫ細胞中で産生された組換え因子ＶＩＩ調製物 （ｎ＝１０）；および （ｃ） ヒト血漿から精製された因子ＶＩＩ調製物。
【００８８】
化学的切断 （ヒドラジン分解、ＧｌｙｃｏＰｒｅｐ １０００ユニット、Ｏｘｆｏｒｄ ＧｌｙｃｏＳｃｉｅｎｃｅｓ）または酵素的切断 （Ｎ−グルコシダーゼ、例えば、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍから） により、Ｎ−連鎖オリゴサッカライドを解放させた。解放されたオリゴサッカライドを２−アミノベンズアミドで標識化した （シグナル標識化キット、Ｋ−４０４、Ｏｘｆｏｒｄ ＧｌｙｃｏＳｃｉｅｎｃｅｓ）。Ｇｕａｒｄカラム （４×５０ ｍｍ、Ｄｉｏｎｅｘ、Ｐ／Ｎ ４３０５４）とともにＣａｒｂｏＰａｃ ＰＡ１００カラム （４×２５０ ｍｍ、Ｄｉｏｎｅｘ、Ｐ／Ｎ ４３０５５） 上のアニオン交換ＨＰＬＣを使用して、標識化オリゴサッカライドを分析した。カラムを１５０ ｍＭの水酸化ナトリウムと平衡化し、０〜１５０ ｍＭの酢酸ナトリウムの勾配、１５ ｍＭの水酸化ナトリウムで溶離した。蛍光、３３０ ｎｍにおける励起および４２０ ｎｍにおける放射を使用して、オリゴサッカライドを検出した。
【００８９】
種々の因子ＶＩＩオリゴサッカライド構造の相対的含量 （Ｋｌａｕｓｅｎｅ ｅｔ ａｌ．， １９９８） を、アニオン交換ＨＰＬＣ分析において炭水化物ピークについての相対的ピーク面積として計算した。各オリゴサッカライドの構造要素に基づいて、それを下記の１つに割り当てた：（ｉ） 少なくとも１つのシアル酸を含有する鎖；（ｉｉ） シアル酸を欠如する （すなわち、中性である） 鎖；（ｉｉｉ） 少なくとも１つの末端ガラクトース残基を含有する鎖；（ｉｖ） 少なくとも１つの末端Ｎ−アセチルガラクトサミン残基を含有する鎖；および （ｖ） 少なくとも１つのアンキャプド触角 （すなわち、少なくとも１つの末端ガラクトース残基またはＮ−アセチルガラクトサミン残基） を含有する鎖。最後に、各グループに割り当てられたオリゴサッカライド鎖の相対的含量の合計を、全オリゴサッカライド鎖の百分率として計算した。この決定の標準偏差は０．０８％であると計算された （その日の変動）；０．７％ （日々の変動）；および０．５％ （１〜１００ μｇの間隔）。
得られたグリコ型パターンを下記表に記載する：
【００９０】
【表１】
2004510786.tif 000002
【００９１】
この実施例に従い （すなわち、血清の非存在下に） 調製した組換え因子ＶＩＩ調製物は、血清の存在下に調製された組換え因子ＶＩＩおよびヒト血漿から単離された自然因子ＶＩＩの両方のグリコ型パターンと異なるグリコ型パターンを示す。血清の非存在下に調製された組換え因子ＶＩＩのオリゴサッカライドは、血清の存在下に調製されたものよりも高い程度にシアリル化され、より少ない中性鎖およびガラクトースまたはＮ−アセチルガラクトサミンにおいて終止する、より少ない鎖を含有する。
【００９２】
ＩＩＩ．　生物学的利用能：
前述したように調製された２つの因子ＶＩＩ調製物 （ＩおよびＩＩ） を２つの参照因子ＶＩＩ調製物 （すなわち、血清の存在下に調製した） （ＡおよびＢ） と比較するために、下記の実験を実施した。
塩化ナトリウム （７．８７ ｍｇ／ｍｌ）、塩化カルシウム二水和物 （１．４８ ｍｇ／ｌ）、マンニトール （２．５ ｍｇ／ｍｌ） およびポリソルベート８０を含有するグリシルグリシン緩衝液 （ｐＨ ７．４） 中の被験調製物または参照調製物を２５ μｇ／ｋｇ （＝１００ μｇ／ラット） の投与量で、８匹のラットのグループに投与した。
【００９３】
最初の投与後、１０分および３０分に血液試料を抜出した。試料から血漿を獲得し、因子ＶＩＩをＥＬＩＳＡにより定量した。１０および３０分の試料に基づく因子ＶＩＩについての血漿濃度曲線下の投与量調節面積として、各試料の生物学的利用能を計算した （ＡＵＣ１０−３０／投与量）。相対的生物学的利用能を、平均ＡＵＣ１０−３０／投与量の被験および参照試料の比×１００として表す。相対的生物学的利用能についての信頼限界を、調製物間の差についての９０％信頼限界から計算した。
結果を下記表に要約する。（前述したように測定した、各調製物のシアリル化％を括弧中に示す）。
【００９４】
【表２】
2004510786.tif 000003
【００９５】
これらの結果が示すように、少なくとも１つのシアル酸残基を有するオリゴサッカライド鎖の比率における差が比較的小さい、例えば、９３％および９６または９７％であるが、生物学的利用能に対する衝撃は顕著であることがある （２０〜３０％の増加）。その上、シアリル化％の１０％の増加は生物学的利用能を４０〜５０％増加させる。
【００９６】
実施例２．変更されたグリコ型パターンを示す因子ＶＩＩ調製物の分析
因子ＶＩＩを５００リットルの培養物から収集した以外、上記実施例１に記載されているように因子ＶＩＩを調製した。グリコ型の分析を実施例１に記載されているように実施した。３つの独立の調製物 （Ａ、Ｂ、およびＣ） を分析し、参照調製物 （Ｄ） と比較した。
【００９７】
生物学的利用能を次のようにしてイヌモデルにおいて測定した：４つのグループに分割した１２ビーグル犬においてについて脚交叉研究として、実験を実施した。塩化ナトリウム （２．９２ ｍｇ／ｍｌ）、塩化カルシウム二水和物 （１．４７ ｍｇ／ｌ）、マンニトール （３０ ｍｇ／ｍｌ） およびポリソルベート８０を含有するグリシルグリシン緩衝液 （ｐＨ ５．５） 中の３つの被験調製物Ａ、Ｂ、およびＣおよび参照調製物Ｄを約９０ μｇ／ｋｇ （＝１００ μｇ／ラット） の投与量で、すべての動物に投与した。最初の投与後、１０、３０、および６０分および２、３、４、６および８時間に血液試料を抜出した。試料から血漿を獲得し、因子ＶＩＩをＥＬＩＳＡにより定量した。
【００９８】
各試料の生物学的利用能を因子ＶＩＩについての血漿濃度曲線の下の投与量調節面積として表す（ＡＵＣ／投与量）。相対的生物学的利用能を、平均ＡＵＣ／投与量の被験および参照試料の比×１００として表し、相対的生物学的利用能についての９０％信頼限界を計算した。
結果を下記表に要約する。上記実施例１に記載したように測定した、各調製物のシアリル化％を括弧中に示す。
【００９９】
【表３】
2004510786.tif 000004
【０１００】
これらの結果が示すように、少なくとも１つのシアル酸残基を有するオリゴサッカライド鎖の比率における小さい差は、因子ＶＩＩについての生物学的利用能に対して顕著な衝撃を有する。シアリル化％の１０％の増加は生物学的利用能を３０〜５０％増加させ、３つの被験調製物および参照調製物について密接〜直線的関係が存在する。
【０１０１】
実施例３．変更されたグリコ型パターンを示す因子ＶＩＩ調製物
変更されたグリコ型パターンを有する因子ＶＩＩ調製物を調製するために、下記の実験を実施した。
Ｉ．　細胞系統の構築および因子ＶＩＩの調製
ヒト因子ＶＩＩの発現用プラスミドベクターｐＬＮ１７４は記載された （ＰｅｒｓｓｏｎおよびＮｉｅｌｓｅｎ， １９９６， ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ． ３８５：２４１−２４３）。簡単に述べると、それはヒト因子ＶＩＩをコードするｃＤＮＡヌクレオチド配列を保持し、挿入されたｃＤＮＡの転写用マウスメタロチオネインプロモーターの制御下にポリペプチド、および選択可能なマーカーとして使用するためのＳＶ４０初期プロモーターの制御下にマウスジヒドロ葉酸レダクターゼｃＤＮＡを含む。
【０１０２】
γ−カルボキシル化認識配列をコードするプラスミドベクターを構築するために、そのポリペプチドを含む因子ＶＩＩをコードするｃＤＮＡを含有するクローニングベクター （ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＫＳ＋、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ） を使用した （ｐＬＮ１７１）。（Ｐｅｒｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， １９９７， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７２：１９９１９−１９９２４）。このクローニングベクター上の逆位ＰＣＲ仲介突然変異誘発により因子ＶＩＩのポリペプチド後に因子ＶＩＩをコードするｃＤＮＡの中に、停止コドンをコードするヌクレオチド配列を挿入した。ＮａＯＨを使用する処理および引き続く下記のプライマーとともにポリメラーゼＰｗｏ （Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ） およびＴａｑ （Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ） ポリメラーゼを使用するＰＣＲにより鋳型プラスミドを変性した：
ａ）　５’−ＡＧＣ ＧＴＴ ＴＴＡ ＧＣＧ ＣＣＧ ＧＣＧ ＣＣＧ ＧＴＧ ＣＡＧ ＧＡＣ−３’
ｂ）　５’−ＣＧＣ ＣＧＧ ＣＧＣ ＴＡＡ ＡＡＣ ＧＣＴ ＴＴＣ ＣＴＧ ＧＡＧ ＧＡＧ ＣＴＧ ＣＧＧ ＣＣ−３’
【０１０３】
生ずる混合物をＤｐｎＩで消化して残留鋳型ＤＮＡを消化し、大腸菌 （Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ） をＰＣＲ生成物で形質転換した。クローンを配列決定により突然変異の存在についてスクリーニングした。正しいクローンからのｃＤＮＡをＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントとして、発現プラスミドｐｃＤＮＡ３ （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ） に移した。生ずるプラスミドをｐＬＮ３２９と命名した。ＣＨＯ Ｋ１細胞 （ＡＴＣＣ ＣＣＬ ６１） を、Ｆｕｇｅｎｅ６法 （Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ） に従い、等しい量のｐＬＮ１７４およびｐＬＮ３２９でトランスフェクトした。メトトレキセートを１ μＭに添加し、Ｇ−４１８を０．４５ ｍｇ／ｍｌに添加することによって、トランスフェクタントを選択した。トランスフェクタントのプールを限界希釈法によりクローニングし、クローンからのＦＶＩＩの発現を測定した。
【０１０４】
高い生産性のクローンをさらにサブクローニングし、１０％ウシ胎児血清を含むダルベッコ変性イーグル培地中で２．４ ｐｇ／細胞／日の特異的ＦＶＩＩ発現を示すクローンＥ１１を選択した。商業的に入手可能な動物由来成分を含まないＣＨＯ培地 （ＪＲＨ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ） 中の無血清懸濁培養に対して、クローンを適合させた。
適合させた細胞を回転培養において順次に増殖させ、細胞の数が増加するにつれて、新しい培地の添加により体積を徐々に増加させた。２５日後、６リットルの回転培養物を５０リットルのバイオリアクターの中に接種した。細胞をバイオリアクター中で増殖させ、細胞の数が増加するにつれて、新しい培地の添加により体積を徐々に増加させた。
【０１０５】
最後に、マクロ多孔質Ｃｙｔｏｐｏｒｅ １担体 （Ｐｈａｒｍａｃｉａ） を含有する５００リットルの調製バイオリアクターの中に５０リットルの種子培養物を接種し、次いで懸濁細胞は担体の中に固定化されるようになった。３６ ℃、ｐＨ ７．０〜７．１および飽和の５０％の溶解酸素テンション （ＤＯＴ） において、培養を維持した。細胞数が増加するにつれて、新しい培地の添加により調製バイオリアクター中の体積を徐々に増加させた。
【０１０６】
細胞密度がほぼ１０〜１２×１０５細胞／ｍｌに到達したとき、調製期を開始させ、培地の交換を２４時間毎に実施した：攪拌を停止し、細胞を含有する担体を沈降させ、次いで培養上清の８０％を収集し、新しい培地と置換した。収集した培養上清を濾過して非捕捉細胞 （すなわち、担体の中に固定化されなかった細胞） および細胞破片を除去し、次いでそれ以上プロセシングするために移した。
調製期間の間に、細胞は２〜３×１０７細胞／ｍｌおよび８ ｍｇの因子ＶＩＩ／リットルの力価に到達した。
【０１０７】
ＩＩ．　グリコ型の分析：
Ａ．　 前述したように調製した因子ＶＩＩ調製物 （ａ） のオリゴサッカライドのパターンを、仔ウシ血清の存在下にＢＨＫ細胞中で調製した組換え因子ＶＩＩ調製物 （ｂ） およびヒト血漿から精製した因子ＶＩＩ調製物 （ｃ） のそれらと比較した。方法は実施例１に本質的に記載された通りであった。
【０１０８】
結果を下記表に要約する。オリゴサッカライドの割り当ては次の通りである：（ｉ） 少なくとも１つのシアル酸を含有する鎖；（ｉｉ） シアル酸を欠如する （すなわち、中性である） 鎖；（ｉｉｉ） 少なくとも１つの末端ガラクトース残基を含有する鎖；（ｉｖ） 少なくとも１つの末端Ｎ−アセチルガラクトサミン残基を含有する鎖；および （ｖ） 少なくとも１つのアンキャプド触角 （すなわち、少なくとも１つの末端ガラクトース残基またはＮ−アセチルガラクトサミン残基） を含有する鎖。
【０１０９】
【表４】
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【０１１０】
Ｂ．　 実施例１に記載したように調製した５つの独立の因子ＶＩＩ調製物 （ａ） のオリゴサッカライドのパターンを、仔ウシ血清の存在下にＢＨＫ細胞中で調製した組換え因子ＶＩＩ調製物 （ｂ） およびヒト血漿から精製した因子ＶＩＩ調製物 （ｃ）のそれらと比較した。実施例１に記載されている分析方法を使用した。
各オリゴサッカライドの構造的要素に基づいて、それを下記の１つに割り当てた：（ｉ） 少なくとも１つのシアル酸を含有する鎖；（ｉｉ） シアル酸を欠如する （すなわち、中性である） 鎖；（ｉｉｉ） 触角に連鎖された少なくとも１つのフコースを含有する鎖。最後に、各グループに割り当てられたオリゴサッカライド鎖の相対的含量の合計を、全オリゴサッカライド鎖の百分率として計算した。この決定の標準偏差は０．０８％であると計算された （その日の変動）；０．７％ （日々の変動）；および０．５％ （１〜１００ μｇの間隔）。
得られたグリコ型パターンを下記表に記載する：
【０１１１】
【表５】
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【０１１２】
実施例１に従い調製された組換え因子ＶＩＩ調製物 （すなわち、血清の非存在下にＣＨＯ細胞系統により産生された） は、血清の存在下に調製された組換え因子ＶＩＩおよびヒト血漿から単離された自然因子ＶＩＩの両方のグリコ型パターンと異なるグリコ型パターンを示す。血清の非存在下にＣＨＯ ２８２．４細胞系統により産生された組換え因子ＶＩＩのオリゴサッカライドは、参照調製物の両方に存在しない、触角に連鎖されたフコースを有する構造を含む。構造物の２つを精製し、前述したようにマトリックス援用レーザー脱着イオン化質量分析、連鎖特異的フコシダーゼ酵素を使用する処理、およびアニオン交換ＨＰＬＣにより特性決定した。２つの構造物は、シアリルルイス×構造、すなわち、シアリル化オリゴサッカライド中の触角状（ａｎｔｅｎｎａｒｙ）Ｎ−アセチルグルコサミンにα１→３連鎖したフコースを含有することが示された。
【０１１３】
ＩＩＩ．　生物学的利用能：
この実施例に記載されているように調製された５つの因子ＶＩＩ調製物を、（ａ） トロンビン発生および （ｂ） 組織因子 （ＴＦ） に対する結合について分析し、そして血清の存在下にＢＨＫ細胞中で産生された組換え因子ＶＩＩ （参照） と比較した。グリコ型パターン （シアル酸を含有するオリゴサッカライド鎖の％およびフコシル化触角を含有するオリゴサッカライド鎖の％） と２つ生物学的利用能との相関を、下記表に示す。
【０１１４】
【表６】
2004510786.tif 000007
【０１１５】
これらの結果が示すように、フコシル化触角を有する因子ＶＩＩ調製物はフコシル化触角を欠如する因子ＶＩＩ調製物よりも高いＴＦ依存的因子ＶＩＩ活性 （例えば、トロンビン発生により示されるのような） を示す。
【０１１６】
実施例４．ｉｎ ｖｉｔｒｏ加水分解アッセイ
下記の方法を使用して因子ＶＩＩａ生物学的活性をアッセイすることができる。このアッセイはマイクロタイタープレート中で実施する （ＭａｘｉＳｏｒｐ、デンマーク国ヌンク）。０．１ ＭのＮａＣｌ、５ ｍＭのＣａＣｌ２および１ ｍｇ／ｍｌのウシ血清アルブミンを含有する５０ ｍＭのＨｅｐｅｓ、ｐＨ ７．４中の因子ＶＩＩａ （１００ ｎＭの最終濃度） に、色素形成基質Ｄ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−ｐ−ニトロアニリド （Ｓ−２２８８、Ｃｈｒｏｍｇｅｎｉｘ、スウェーデン国） を１ ｍＭの最終濃度で添加する。４０５ ｎｍにおける吸収をＳｐｅｃｔｒａＭａｘＴＭ ３４０プレートリーダー （Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ、米国） により連続的に測定する。被験および参照因子ＶＩＩａの活性間の比を計算するために、２０分のインキュベーション間に発生した吸収を、酵素を含有しないブランクウェルにおける吸収を減じた後、使用する。
【０１１７】
実施例５．ｉｎ ｖｉｔｒｏタンパク質分解アッセイ
下記の方法を使用して因子ＶＩＩａ生物学的活性をアッセイすることができる。このアッセイはマイクロタイタープレート中で実施する （ＭａｘｉＳｏｒｐ、デンマーク国ヌンク）。０．１ ＭのＮａＣｌ、５ ｍＭのＣａＣｌ２および１ ｍｇ／ｍｌのウシ血清アルブミンを含有する１００ ｍｌの５０ ｍＭのＨｅｐｅｓ、ｐＨ ７．４中で因子ＶＩＩａ （１０ ｎＭ） および因子Ｘ （０．８ μＭ） を１５分間インキュベートする。次いで０．１ ＭのＮａＣｌ、２０ ｍｌのＥＤＴＡおよび１ ｍｇ／ｍｌのウシ血清アルブミンを含有する５０ ｍｌの５０ ｍＭのＨｅｐｅｓ、ｐＨ ７．４の添加により、因子Ｘの切断を停止する。
【０１１８】
色素形成基質Ｚ−Ｄ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ｐ−ニトロアニリド （Ｓ−２７６５、Ｃｈｒｏｍｇｅｎｉｘ、スウェーデン国） を０．５ ｍＭの最終濃度で添加して、因子Ｘａの発生量を測定する。４０５ ｎｍにおける吸収をＳｐｅｃｔｒａＭａｘＴＭ ３４０プレートリーダー （Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ、米国） により連続的に測定する。被験および参照因子ＶＩＩａのタンパク質分解活性間の比を計算するために、１０分のインキュベーション間に発生した吸収を、酵素を含有しないブランクウェルにおける吸収を減じた後、使用する。
【０１１９】
本明細書において言及したすべての特許、特許出願、および参考文献は、引用することによって本明細書の一部分とされる。
前述の説明に照らして見ると、本発明の多数の変形は当業者にとって明らかとなるであろう。このような明らかの変形は本発明の完全な意図する範囲内に入る。
【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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