(57)【要約】ファイヤアントを殺すための組成物および方法を開示しており、それはバチルス  スリンジエンシスの新規株から精製された活性化Ｃｒｙ毒素を含んでいる、ここで、移入性ファイヤアントを殺すための水溶性、部分精製、活性化毒素が誘因剤と共に提供され、毒性化学薬品を必要としない、生分解性で、環境に安全な糖蛋白質が使用される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも配列ＩＤ番号：２の残基５８から６４４をコードしている配列を含む核酸分子。
【請求項２】
配列が配列ＩＤ番号：２をコードしている核酸分子。
【請求項３】
核酸分子がｃＤＮＡである、請求項１または２に記載の核酸分子。
【請求項４】
少なくとも配列ＩＤ番号：１のヌクレオチド１７４から１９３６を含む、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項５】
配列ＩＤ番号：１のヌクレオチド１７４から１９３６を含む、請求項２に記載の核酸分子。
【請求項６】
請求項１から５のいずれかに記載の核酸分子を含むベクター。
【請求項７】
請求項６のベクターを含む宿主細胞。
【請求項８】
配列ＩＤ番号：２の残基５８から６４４のアミノ酸配列を含む、精製されたＣｒｙ毒素蛋白質。
【請求項９】
アミノ酸配列が配列ＩＤ番号：２を含む、請求項８に記載のＣｒｙ毒素蛋白質。
【請求項１０】
株ＵＴＤ−００１の同定特性を有するバチルス  スリンジエンシスの生物学的に純粋な培養物、ここで該特性には少なくとも以下が含まれる：
ａ．約６７ｋＤへの蛋白分解的処理により活性化され、ファイヤアントに対する毒素活性を持ち、およびｐＨ５−７間で活性を持つ、７３ｋＤ野生型Ｃｒｙ毒素蛋白質；
ｂ．実質的に図２に示すＳＤＳ−ＰＡＧＥプロフィール；かつ
ｃ．実質的に図３に示す任意プライマーによるＰＣＲ生成物プロフィール。
【請求項１１】
株がＮＲＲＬ番号Ｂ−３０３５６である、請求項１０のバチルス  スリンジエンシスの生物学的に純粋な培養物。
【請求項１２】
バチルス  スリンジエンシス６７−ｋＤ  Ｃｒｙ毒素蛋白質をコードしているポリヌクレオチド配列を含む核酸分子、ここで該核酸分子は請求項１０または１１のバチルス  スリンジエンシス培養物から得られる。
【請求項１３】
請求項１２の組換えＤＮＡを含むベクター。
【請求項１４】
請求項１３のベクターを含む宿主生物体。
【請求項１５】
該生物体がファイヤアントにより食物生物体として摂取できる、請求項１４に記載の宿主生物体。
【請求項１６】
請求項１２のポリヌクレオチド配列によりコードされる、精製されたポリペプチド。
【請求項１７】
ソレノプシスファミリーのメンバーに対して活性である、実質的に精製されたＣｒｙ毒素、ここで該Ｃｒｙ毒素は請求項１０または１１のバチルス  スリンジエンシス培養物から得られるＤＮＡによりコードされている。
【請求項１８】
蛋白分解的消化により６７ｋＤ活性型へ減らされる約７３ｋＤの前毒素分子量を有することを特徴とするバチルス  スリンジエンシスＣｒｙ毒素を含む組成物、およびここで該活性型は摂取されるとファイヤアントに対して致死的である。
【請求項１９】
該組成物がさらに砂糖水を含む、請求項１８に記載の組成物。
【請求項２０】
Ｃｒｙ毒素がバチルス  スリンジエンシス株ＵＴＤ−００１または亜種テネブリオニス（ｔｅｎｅｂｒｉｏｎｉｓ）から得られる、請求項１８に記載の組成物。
【請求項２１】
Ｃｒｙ毒素がＣｒｙ３Ａ−様毒素を産生するバチルス  スリンジエンシスの株または亜種から得られる、請求項項１８に記載の組成物。
【請求項２２】
ファイヤアントに対して処方された餌であって、以下のものを含んでいる：
ａ．水溶性バチルス  スリンジエンシスＣｒｙ毒素、ここで該Ｃｒｙ毒素は実質的に精製され、６７ｋＤであり、およびファイヤアントに対する活性を持っている；かつ
ｂ．ファイヤアント食物源を含む誘引剤。
【請求項２３】
該Ｃｒｙ毒素が、０．８８ミクロン未満の粒子サイズの乾燥粉末形中で該誘引剤と組み合わせて結晶として提供される、請求項２２に記載の餌。
【請求項２４】
液体形の請求項２２に記載の餌。
【請求項２５】
Ｃｒｙ毒素がバチルス  スリンジエンシス株ＵＴＤ−００１または亜種テネブリオニスから得られる、請求項項２２に記載の餌。
【請求項２６】
該アリ集団に、請求項２２乃至２５のいずれかに記載の餌を投与することを含む、アリ集団を減少させる方法。
【請求項２７】
殺虫剤の製造法であって、以下の工程を含んでいる：
ａ．Ｃｒｙ毒素が産生される条件下、株ＵＴＤ−００１の同定特性を有するバチルス  スリンジエンシス細菌を増殖させる工程；ここで該特性には少なくとも：約６７ｋＤ断片への蛋白分解的処理により活性化され、ファイヤアントに対する毒素活性を持ち、およびｐＨ５−７の間で活性を持つ約７３ｋＤ野生型Ｃｒｙ毒素蛋白質；実質的に図２に示すＳＤＳ−ＰＡＧＥプロフィール；および実質的に図３に示す任意プライマーによるＰＣＲ生成物プロフィール、が含まれる；
ｂ．該増殖された微生物から該Ｃｒｙ毒素を精製する工程；
ｃ．アリに対して有効な殺虫剤内に該精製されたＣｒｙ毒素を調合する工程。
【請求項２８】
さらに該精製されたＣｒｙ毒素を前もって活性化する工程を含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
バチルス  スリンジエンシスがＮＲＲＬ番号Ｂ−３０３５６である、請求項２７または２８に記載の方法。
【請求項３０】
配列ＩＤ番号：２の残基５８から６４４の全体の長さにわたり少なくとも９９％相同的である蛋白質をコードするポリヌクレオチドを含む核酸配列。
【請求項３１】
ｃＤＮＡ分子から得られる、請求項３０に記載の核酸分子。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
関連出願
この特許請求のための出願は、１９９９年１０月２６日に出願された、同時係属中の米国特許仮出願第６０／１６１，４９５号からの優先権の利益を請求し、その全開示を参照として本明細書に援用する。
【０００２】
技術分野
本発明は、新規バチルス  スリンジエンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）（“ＢＴ”）毒素および製剤を使用する、ホルミシデ（アリ）科中の膜翅類害虫の集団を制御するための方法および組成物に関している。特に、本発明はファイヤアント（ｆｉｒｅ  ａｎｔ）を殺すのに有効なＢＴ毒素を使用する、ソレノプシス（Ｓｏｌｅｎｏｐｓｉｓ）科の種々のファイヤアント集団を制御するのに効果的な方法、およびそのような毒素を産生するＢＴの新規株に関している。
【０００３】
背景技術
例として、ファイヤアント致死性薬剤としてのバチルス  スリンジエンシス毒素の使用に関連してその背景が記載されているが、本発明の範囲を制限しているものではない。移入性ファイヤアント、ソレノプシス  インビクタ（Ｓｏｌｅｎｏｐｓｉｓ  ｉｎｖｉｃｔａ）、は１９３０年代あたりに南アメリカからＭｏｂｉｌｅ、Ａｌａｂａｍａに到達した持ち込み種である。移入性ファイヤアントは米国南部中に急速に拡がり、温和な気候および適合した湿気および食物がある北アメリカ領域へ拡がり続けている。
【０００４】
移入性ファイヤアントは農業的および医学的に重要な害虫であり、家畜、野生生物およびヒトに有害である。ファイヤアントは特に地表に居住する種およびすべての種の若い動物を脅かしている。移入性ファイヤアントはいくつかの原住種の衰退に関係していると考えられている。天然環境でその数を調節する捕食者、病原体および寄生生物が存在しないため、移入性ファイヤアントの増殖は大規模には抑えられていない。ファイヤアントは典型的にはヒトにおいて痛みを伴った刺創を起こし、アレルギー体質の個体ではより重症な反応が起こる。高密度のファイヤアントは道、牧草地および電気および機械設備の損傷を招く。多女王コロニーの最近の出現は、ファイヤアント集団の制御をさらに困難にしている。使用者および消費者に対して安全な、ファイヤアント集団を制御するための有効な化合物および方法が緊急に必要とされている。
【０００５】
ファイヤアント制御する過去の試みでは、高度に毒性のあるクロル化炭化水素、ヘプタクロル、ジエルドリンおよびミレックスを使用してきた。ＥＰＡはたとえすべてに対して比較的有効な化合物でも、高度に毒性のあるものの使用を、例外的応用を除いて禁止した。最も普通に使用されている現在の制御方法は、化学薬品ヒドラメチルノン、アベルメクチンおよび合成昆虫成長制御剤フェノキシカルブを含んでいる。これらの化合物は定期的に再使用されなければならず、および猛烈なファイヤアント横行にはっきりと影響を与えることおよびさらなる拡大を制御することができなかった。不妊昆虫の放出および天敵導入の分野で制御法の研究が現在実施されているが、それらの両方とも不確かな結果を持つ、可能性があるだけの解決法である。
【０００６】
バチルス  スリンジエンシス（“ＢＴ”）はたくさんのグラム陽性、胞子形成菌株の属および種であり、それはある種の条件下、昆虫致死性蛋白質毒素からなる副胞子結晶を形成する（Ｂｕｌｌａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，８：１４７−２０４，（１９８０）；Ｈｏｆｔｅ  ａｎｄ  Ｗｈｉｔｅｌｙ，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｒｅｖ（１９８９）５３：２４２，（１９８９）。毒素それ自身は、Ｈｏｆｔｅ（前記文献）に記載されているようにｃｒｙ遺伝子の糖蛋白質産物である（“Ｃｒｙ”は蛋白質を示すために使用され；“ｃｒｙ”は遺伝子を示すために使用される）。種々のＣｒｙ蛋白質の効果は独特のレセプターへの結合により仲介されるので、与えられたＢＴ毒素の種特異性は典型的には、Ｈｏｆｔｅ（前記文献）により提案されている本来の分類により例示されているように全く限定的である：ＣｒｙＩ（鱗翅類特異的）；ＣｒｙＩＩ（鱗翅類および双翅類特異的）；ＣｒｙＩＩＩ（鞘翅類特異的）；ＣｒｙＩＶ（双翅類特異的）。ＢＴ毒素は、昆虫中腸上皮細胞の刷子縁で機能し、ある種の昆虫へは非常に致死的であるが、毒素結合レセプターを欠く他の生物体に対しては無毒である（Ｇｉｌｌ，Ｓ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｅｎｔｏｍｏｌ（１９９２）３７：６１５）。
【０００７】
この３０年にわたるＢＴ毒素に対する強い興味の結果、１００以上の異なったＢＴ結晶蛋白質遺伝子が単離され、鱗翅類、双翅類、鞘翅類、膜翅類、同翅類、直翅類およびハジラミ類の昆虫種の制御および線虫、ダニおよび原虫に対する生物殺虫剤が開発されてきた（Ｓｃｈｎｅｐｆ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．（１９９８）６２（３）：７７５）。ＢＴ毒素は種々の形で、非化学殺虫剤における世界の販売の９０％を現在占めている。
【０００８】
米国特許証番号第５２６００５８、５２６８２９７、５５９６０７１および５８２４７９２号は、種々のＢＴ株の細菌細胞を含んでいる毒素を使用するファローアント（ｐｈａｒｏａｈ  ａｎｔｓ）（モノモリウム  ファラオニス（Ｍｏｎｏｍｏｒｉｕｍ  ｐｈａｒａｏｎｉｓ））を制御するための方法および組成物を開示している。これらの毒素はすべての膜翅類およびすべてのアリに対して有効であると断言されているが、ファローアント以外の試験は実施されていない。さらに、本発明の前毒素はそれに記載されているものよりも大きかった（１２０−１４０ｋＤ）。
【０００９】
発明の概要
本発明以前は、ファイヤアントの制御に有効であることが知られているＢＴ毒素、またはこの指示に商業的に利用できるＢＴ毒素は報告されていない。必要とされているのはファイヤアント集団の制御に有効であり、しかも非昆虫生物体には無毒である生物致死性組成物である。そのような殺虫剤は、農業、家畜、環境および生物医学的領域を含む広範囲の応用性を持っているであろう。このため、ファイヤアントを殺すのに有効なＢＴ毒素が特に望まれている。
【００１０】
ファイヤアントは雑食性であるが、その食物の大部分はファイヤアントが刺したおよび殺した無脊椎動物である。彼らはまた死んだ動物および植物組織、種、発育しているおよび熟した果実も餌とし、甘い汁および樹液の流出に引き寄せられる。かれらはその食物源中の糖、ある種のアミノ酸、溶液中のイオン、および不飽和脂肪酸を含んでいるいくつかの油に誘引される。
【００１１】
働きアリは液体食物のみを消費し、巣に持ち帰られる物資のほとんど半分は液体の形である。採餌働きアリにより消費および保存される液体は栄養交換により他の働きアリに給餌される。働きアリがコロニーに到着したら、油は徐々に幼虫の世話をするアリに、および幼虫の世話をするアリから幼虫へ渡される。溶解性糖、加えていくつかの溶解性蛋白質およびアミノ酸の混合物は強力な誘引剤であり、働きアリ間の栄養交換を助長する。このことは溶液を希釈し、これらの栄養の幼虫への移動速度を減少させる。
【００１２】
０．８８ミクロンより大きな不溶性固形物はファイヤアント働きアリの咽頭中で液体からふるい分けられ、働きアリは摂取できない。固形物はペレットとして頬部に蓄積され、後で４５ミクロン程度の大きさの粒子を消費することができる第四虫齢段階幼虫へ給餌するために吐き出される。固形食物は成熟幼虫、および働きアリにより使用されないので、固形物は液体食物よりも迅速におよび直接的にこれらの幼虫へ野外から運ばれる。第四虫齢幼虫により処理された後、前の固形食物は栄養交換により女王および若い幼虫が利用できる。働きアリが毒をコロニーに持ち帰り、コロニー中に毒を分配することが望ましいので、ファイヤアントの好む食物、ならびに毒の物理的大きさへの考慮が処置様式の効率に影響するであろう。
【００１３】
本発明はホルミシデ科のメンバー、特に移入性ファイヤアント、ソレノプシス  インビクタ、および関連種に対して活性であるＢＴ蛋白質を提供する。一般に、本発明はファイヤアントおよび関連種の集団を減少させるのに有効であるＢＴ製剤を提供する。本発明はさらにファイヤアントおよび関連種に対して有効な毒素を産生する新規Ｂ．スリンジエンシスを提供する。毒素に暴露された、集団内の未成熟および／または成熟個体を殺すことにより、局所ファイヤアント集団内の（典型的には塚型共同生活体）アリの数を減少させる能力として有効性が定義される。暴露は直接的に餌処方中のまたは送り届けられた食物源中の主題毒素摂取の形をとるか、または栄養交換による。
【００１４】
本発明は株ＵＴＤ−００１（ＮＲＲＬ番号Ｂ−３０３５６）の同定特性を持っている単離されたＢＴ細菌細胞の生物学的に純粋な培養物を提供する。
別の態様において、本発明はさらにＵＴＤ−００１の同定特性を持ち、およびＢＴ  Ｃｒｙ毒素蛋白質をコード化している、ＢＴ株由来組換えＤＮＡを提供する。これらの特性には、約６７ｋＤ毒素への蛋白分解的加工により活性化され、ファイヤアントに対する毒性活性を持ち、ｐＨ５−７間で活性を持ち、実質的に図２に示したようなＳＤＳ−ＰＡＧＥプロフィールを持ち、および実質的に図３に示したような任意に開始されたＰＣＲ生成物プロフィールを持つ、約７３ｋＤ野生型Ｃｒｙ前毒素蛋白質が含まれる。
【００１５】
ＢＴ  Ｃｒｙ毒素をコード化しているＤＮＡは、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．第２版  １９８９）の標準クローニングマニュアルのような本分野では既知の方法により組換えＤＮＡとして単離およびクローン化される。ＵＴＤ−００１からｃｒｙ遺伝子がクローン化され、本発明の配列は以下のように同定された：
【００１６】
【表１】
2004535752.tif 000002
【００１７】
本発明はさらに、ファイヤアントに毒であるＢＴ  Ｃｒｙ前毒素または毒素をコード化している組換えＤＮＡのクローニングおよび発現のためのベクターを提供する。本分野では既知の方法に従って、種々の宿主生物体におけるＣｒｙ前毒素または毒素蛋白質の発現のためにベクターを必要に応じて適合させる。誘導により過渡的に、または構成的にコード化された蛋白質を発現するように遺伝子操作された新規宿主生物体を製造するための、これらの発現ベクターの使用を本発明は企図している。宿主生物体には、多量の毒素製造のために工場として単に使用される生物体が含まれ、毒素は続いて精製され、餌に処方される。もしくは、蛋白質を発現しおよびファイヤアントの食物源として働くように遺伝子操作された生物体が宿主生物体には含まれる。宿主生物体には、原核生物細胞および真核生物細胞および例えば、酵母、真菌、植物または動物のような生物体が含まれる。
【００１８】
本発明はさらに、膜翅類、ホルミシデ、および特にソレノプシスに対して活性である、精製されたＣｒｙ前毒素および毒素およびこれらの蛋白質の組成物を提供する。一つの態様において、本明細書に開示されているＣｒｙ前毒素はＳＤＳ−ＰＡＧＥにより約７３ｋＤの、および概念的に翻訳された蛋白質からの計算により７２．９ｋＤの分子量で特徴付けられる。前毒素はパパインにより残基５５（ＥＡ間）、およびトリプシンにより残基５７（ＬＤ間）で切断されると推定され、活性蛋白質を生じる。従って、前毒素は蛋白分解性消化により約６７ｋＤの毒素へ減少される。しかしながら、この切断部位には幾分融通性があり、活性毒素の大きさに小さな変異を生じることが予想される。本発明の新規Ｃｒｙ毒素はまた、ＢｔｔのＣｒｙ３Ａ毒素との密接な相同性に基づいてＣｒｙ３Ａ様−毒素とも記述される。
【００１９】
そのような一つの態様において、Ｃｒｙ毒素はソレノプシス  インビクタ、Ｓ．リクテリ（ｒｉｃｈｔｅｒｉ）、Ｓ．キシロニ（ｘｙｌｏｎｉ）、Ｓ．ゲミナータム（ｇｅｍｉｎａｔａｍ）（ａｋａ  アッタ（Ａｔｔａ）  ゲミナータ（ｇｅｍｉｎａｔａ）  ファブリシウス（Ｆａｂｒｉｃｉｕｓ）  またはＳ．ゲミナータ  マイル（Ｍａｙｒ）、Ｓ．ジャポニカ（ｊａｐｏｎｉｃａ）（ａｋａ  Ｓ．フガックス（ｆｕｇａｘ）  ｖａｒ．ジャポニカ）、Ｓ．セビッシマ（ｓａｅｖｉｓｓｉｍａ）、Ｓ．オルブロイデス（ｏｒｂｕｌｏｉｄｅｓ）、Ｓ．プンクタチセプス（ｐｕｎｃｔａｔｉｃｅｐｓ）、番号で同定される種々のソレノプシス種、および関連するファイヤアント種を含むアリ類に対して毒性を持っている。本発明はＵＴＤ−００１の同定特性を持っているＢＴ株により産生されるＣｒｙ毒素または前毒素を含んでいる組成物による、アリ集団を減少させるための方法を提供する。
【００２０】
本発明のさらに別の態様において、（ａ）Ｃｒｙ蛋白質が産生される条件下、株ＵＴＤ−００１の同定特性を持っているＢ．スリンジエンシスを増殖させ；（ｂ）Ｃｒｙ前毒素を精製し；および（ｃ）精製Ｃｒｙ前毒素をアリに対して有効な殺虫剤に処方することにより殺虫剤が製造される。Ｃｒｙ前毒素は餌内への処方に先立って蛋白分解的に前活性化されるか、または宿主生物体により毒素形で直接的に産生される。
【００２１】
さらなる態様において、本発明は移入性ファイヤアントのＢＴ毒素レセプターを単離およびクローニングするための、およびファイヤアントにより強い効力を持つ遺伝子操作された毒素に対してそのようなレセプターを使用するための、およびファイヤアント集団への本発明の応用後に生じるであろう耐性を避けるための方法を提供する。
【００２２】
現在好適な例示的態様の詳細な説明
ここで本発明の好適な態様が示されている付随した図を参考にし、以下に本発明がより完全に説明されるであろう。しかしながら、本発明は多くの異なった形で具体化されるであろうので、以下に示された態様へ制限されると解釈してはならない；むしろ、これらの態様は、本開示が徹底的および完全であるように、および当業者へ本発明の範囲を十分に伝えるために提供される。
【００２３】
略語および定義
以下の略語および定義が本出願を通して使用される：ＢＴ−バチルス  スリンジエンシス（Ｂ．スリンジエンシス）；Ｂｔｔ−バチルス  スリンジエンシス亜種テネブリオニス（ｔｅｎｅｂｒｉｏｎｉｓ）；Ｃｒｙ毒素−副胞子結晶蛋白質から誘導された毒素；ｃｒｙ−Ｃｒｙ毒素をコード化している遺伝子；ＥＤＴＡ−エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム、二水和物；ｋＤ−キロダルトン；ＬＢ−ルリアブロス；ＬＤ５０−５０％死亡率を生じる致死濃度；ＰＭＳＦ−フェニルメタン  スルホニル  フルオリド；およびＳＤＳ−ＰＡＧＥ−ドデシル硫酸ナトリウム  ポリアクリルゲル電気泳動。
【００２４】
用語“ｘ％相同性”とは、Ｔ．Ａ．Ｔａｔｕｓｏｖａ  ＆  Ｔ．Ｌ．Ｍａｄｄｅｎ（１９９９），“Ｂｌａｓｔ  ２配列−蛋白質およびヌクレオチド配列を比較するための新しい手段”ＦＥＭＳ  ＭＩＣＲＯＢＩＯＬ  ＬＥＴＴ．１７４：２４７−２５０、により記載されているＢＬＡＳＴ相同性アラインメントにより、および以下のパラメーター：プログラム（ｂｌａｓｔｎ）または（ｂｌａｓｔｐ）、適切に；マトリックス（ＯＢＬＯＳＵＭ６２）、一致のためのリワード（１）；不一致のペナルティー（−２）；オープンギャップ（５）およびエクステンションギャップ（２）ペナルティー；ギャップｘ−ドロップオフ（５０）；エクスペクト（１０）；ワードサイズ（１１）；フィルター（オフ）を使用して決定されるような、二つの核酸または蛋白質の同一性の程度を示している。これらのパラメーターを使用するｗｅｂでの２配列アラインメントプログラムの例はｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｏｒｆ／ｂ１２．ｈｔｍｌ、に見ることができる。高ストリンジェンシーは６０℃の温度での０．２Ｘ  ＳＳＣの最終洗浄を含んでいるものとして定義される。
【００２５】
本発明は新規ＢＴ単離物および新規膜翅類−活性蛋白質をコード化している単離物からの遺伝子に関している。特に、本毒素はホルミシデ、特にソレノプシスに対して活性である。バチルス  スリンジエンシスＵＴＤ−００１として知られている新規ＢＴ単離物、ならびにこの単離物からの前毒素および毒素はファイヤアント、オオアリ、アルジェンチンアリおよびファラオーアントのような害虫を制御するために使用される。
【００２６】
単離ＵＴＤ−００１からのＢＴ毒素遺伝子はクローン化および配列決定されており、図６（配列ＩＤ番号：１および２）に示されている。コード領域はヌクレオチド１から終端（１９３６）までである。図７の蛋白質は６４４アミノ酸であり、アミノ酸１から５５または５７までの前領域およびアミノ酸５６または５８から終端までの活性領域を含んでいる。前毒素のｐＩは５．６７である。ｃｒｙ遺伝子はＢｔｔのｃｒｙ３Ａ遺伝子と９８％相同的であり、現時点では最も近い相関物であるようである。
【００２７】
本明細書に開示されている新規毒素はアリ、特にファイヤアントに対して活性である。本発明は当業者に、ソレノプシス−活性毒素、毒素を使用するための方法、および毒素をコード化している遺伝子を提供する。ソレノプシス−活性毒素をコード化している遺伝子または遺伝子断片はクローン化され、毒素をコード化している遺伝子断片は組換えＤＮＡベクターを通して適した宿主へ移される。
【００２８】
Ｃｒｙ毒素は一般的には広範囲の種特異性を持っているので、本発明のＣｒｙ毒素は他の膜翅類に対しても活性を持っているであろうことが予想される。種特異性研究がこの予想を確認するために実施されるであろう。
【００２９】
本発明のＣｒｙ毒素を含んでいるアリ食物源として使用するための組換え宿主には、広範囲の微生物または植物宿主が含まれる。毒素遺伝子の発現は、直接的または間接的に、害虫致死性毒素の産生を生じる。本発明のこの態様の重要な特色は、ファイヤアントは摂食の間に、結晶のような大きな粒子を濾過して除くので、ＢＴで標準的なように、宿主内で結晶を形成する必要がないことである。従って、宿主はファイヤアントが摂食過程間に排除する粒子サイズ（例えば、０．８８ミクロン）より大きな結晶を産生しなくてもよい。もちろんｃｒｙ遺伝子は、サイズ排除問題を回避する、活性で可溶性の６７ｋＤ毒素形を産生するように遺伝子操作してもよい。
【００３０】
適した微生物宿主（例えば、シュードモナス）を用い、微生物を害虫の正常位置へ適用してもよく、そこでそれらは増殖し、摂取される。その結果はファイヤアントの効果的な制御である。本発明に従ったバチルス  スリンジエンシス毒素産生のための宿主細胞の選択において考慮される因子には以下の点が挙げられる：遺伝子−宿主適合性、宿主形質転換の容易さ；発現系の利用可能性；発現の効率；宿主中での毒素の安定性；補助的遺伝子能力および宿主が標的昆虫の直接的食物源として機能するか、または単に毒素源として機能するかどうか。考えられる他の因子には以下のものが挙げられる：動物およびヒトに対する宿主の病原性；処方および取り扱い易さ；経済的な側面；貯蔵安定性など。微生物食物源宿主は、問題とする一つまたはそれ以上の農作物の“フィトスフェアー（ｐｈｙｔｏｓｐｈｅｒｅ）”（フィロプレイン（ｐｈｙｌｌｏｐｌａｎｅ）、フィロスフェアー（ｐｈｙｌｌｏｓｐｈｅｒｅ）、リゾスフェアー（ｒｈｉｚｏｓｐｈｅｒｅ）および／またはリゾプレイン（ｒｈｉｚｏｐｌａｎｅ））を占拠することが知られているものから選択される。一般に、生物体は遺伝子の安定な維持および発現を提供せねばならず、環境分解および不活性化から、毒素の改良された保護を与える。
【００３１】
多数の微生物が広範囲の重要な農作物のフィロプレイン（植物の葉の表面）および／またはリゾスフェアー（植物の根を囲んでいる土壌）に存在することが知られており、ファイヤアントの食物源である。これらの微生物には細菌、藻類および真菌類が含まれる。特に興味が引かれるのは、細菌、例えば、シュードメナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｅｎａｓ）、エルウィニア（Ｅｒｗｉｎｉａ）、セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉ  ｅｌｌａ）、ザントモナス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）、ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、ロドソイドモナス（Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、メチロフィリウス（Ｍｅｔｈｙｌｏｐｈｉｌｉｕｓ）、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、アセトバクター（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、アルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）、アゾトバクター（Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ）、ロイコノストック（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ）およびアルカリゲネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）属；真菌、特に酵母、例えば、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、クリプトコッカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、クライベロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、スポロボロミセス（Ｓｐｏｒｏｂｏｌｏｍｙｃｅｓ）、ロドトルラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）およびオーレオバシジウム（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ）属のような微生物である。
【００３２】
ファイヤアントの食物源として使用されるべき他の生物体にはシュードモナス  シリンゲ（ｓｙｒｉｎｇａｅ）、Ｐ．フルオレセンス（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）、セラチア  マルセセンス（ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）、アセトバクター  キシリウム（ｘｙｌｉｎｕｍ）、アグロバクテリウム  ツメファシエンス（ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）、ロドソイドモナス  スフェロイデス（ｓｐｈｅｒｏｉｄｅｓ）、ザントモナス  カンペストリス（ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ）、リゾビウム  メリオチ（ｍｅｌｉｏｔｉ）、アルカリゲネス  ユートロフス（ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ）、アゾトバクター  ビンランジー（ｖｉｎｌａｎｄｉｉ）のようなフィトスフェアー細菌種；および、ロドトルラ  ルブラ（ｒｕｂｒａ）、Ｒ．グルチニス（ｇｌｕｔｉｎｉｓ）、Ｒ．マリナ（ｍａｒｉｎａ）、Ｒ．オーランチアカ（ａｕｒａｎｔｉａｃａ）、クリプトコッカス  アルビダス（ａｌｂｉｄｕｓ）、Ｃ．ジフルエンス（ｄｉｆｆｌｕｅｎｓ）、Ｃ．ローレンチ（ｌａｕｒｅｎｔｉｉ）、サッカロミセス  ロセイ（ｒｏｓｅｉ）、Ｓ．プレトリエンシス（ｐｒｅｔｏｒｉｅｎｓｉｓ）、Ｓ．セレビジエ（ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、スポロボロミセス  ロセウス（ｒｏｓｅｕｓ）、Ｓ．オドラス（ｏｄｏｒｕｓ）、クライベロミセス  ベロネ（ｖｅｒｏｎａｅ）、およびオーレオバシジウム  ポルランス（ｐｏｌｌｕｌａｎｓ）のようなフィトスフェアー酵母種が含まれる。特に興味が引かれるのは色素性微生物である。
【００３３】
本発明のＢＴ株は標準技術の培地および発酵技術を使用して培養されるが、標準技術内に含まれるある種の特別な条件が本明細書に開示されている。発酵サイクルが完了すると同時に、本分野でよく知られた技術により発酵ブロスからＢＴ胞子および副胞子結晶を最初に分離することにより細菌が採取される。回収されたＢＴ胞子および結晶は取り扱いを容易にするためおよび特定の標的害虫への適用のため、表面活性剤、分散剤、不活性担体およびその他の成分を添加することにより、濡らすことのできる粉末、液体濃縮液、顆粒または他の処方へ処方される。
【００３４】
本分野では一般的には知られていないが本明細書で特別に認識されることは、ファイヤアントは細菌胞子および結晶のような大きな物体を口腔から濾過して除き、消化系内へのこれらの大きな物体の進入を防止しているということである。従って、ファイヤアントが有効に毒を摂取するのを可能にするには、粒子サイズが０．８８ミクロンまたはそれ未満に制限されていることがファイヤアントのための固形餌製剤には重要であるが、他の膜翅類の昆虫には粒子サイズはあまり関係しない。もしくは、ＢＴ胞子および前毒素結晶は少なくとも部分的な精製により一部を液体に可溶化でき、または結晶サイズはすりつぶしまたは遺伝子修飾により減少でき、またはファイヤアント防御のサイズ排除機構を出し抜くため、可溶性の活性蛋白質として毒素を発現できる。
【００３５】
完全または部分的精製後、本発明の害虫致死性毒素は、必要とされる液体または溶解液体の総量だけ、ある濃度で提供される。毒素の濃度は特定の処方の性質に依存して広範囲に変化するであろう。殺虫剤は約１％（重量／容量）の濃度でファイヤアントに利用できるが、誘引剤を含む乾燥形で提供されるならば、重量で１００％であってもよい。誘引剤はそれ自身さえも毒、または毒素が提供される吸い取り剤または粉末であってもよい。例えば、乾燥処方は殺虫剤重量が約１−９５％であろうし、一方、液体処方は一般に液体相中の固形物重量で約１−６０％であろう。処方は噴霧、散粉、散水、餌などにより、膜翅類害虫の環境、例えば、植物、土壌または水、に適用される。
【００３６】
実施例１  バチルス  スリンジエンシス株の単離
１グラムの土壌試料を１０ｍｌの０．２５Ｍ酢酸ナトリウムで緩衝化したＬＢ（ｐＨ６．８）と混合し、強くかき混ぜながら３０℃で一夜インキュベートした。試料の１．５ｍｌを採り、５０ｍｌのコニカルチューブ中で３分間、８０℃で熱ショックをかけた。１０、２０および１００μｌを採り、ＬＢ培地上で３０℃で一夜培養した。次の日、コロニーを選び取り、ＧＹＳプレート上に蒔き、３０℃で一夜インキュベートした。ＧＹＳ培地は以下のように調製した：
【００３７】
【表２】
2004535752.tif 000003
【００３８】
単離物は結晶封入体が生成されているかどうかを決定するために顕微鏡で検査した。封入体は以下のようにマラカイトグリーン／グラム  サフラニンで染色することにより可視化された：細胞をスライド上で乾燥させ、沸騰Ｈ２Ｏ上、マラカイトグリーン５％水溶液で１５分間染色した。スライドを洗浄し、５−６分間、グラム  サフラニン溶液（保存溶液は１００ｍｌ  ＥＴＯＨに溶解した２．５％サフラニン０（ＳＩＧＭＡ（登録商標））溶液である）で染色した。スライドを洗浄し、乾燥する。胞子は緑／青に着色し、一方、結晶および栄養細胞は赤に着色する。
【００３９】
結晶を生成すると思われる単離物に注目し、ＬＢ中、３０℃で一夜増殖させ、純粋培養物を得るために、ＧＹＳプレート上で再画線培養した。結晶および胞子生成単離物を同定するため、培養物をグラム  サフラニンで染色することにより再検査した。そのような培養物は７ｍｌの液体ＧＹＳで５日間増殖させ、結晶／胞子生成で再び染色し、遠心分離し、５０ｍｌのトリスＣｌ、ｐＨ７．５、１０ｍＭ  ＫＣｌ、および１０ｍＭ  ＥＤＴＡで３回洗浄した。ペレットを凍結乾燥し、後での使用のために秤量した。
【００４０】
実施例２  Ｃｒｙ毒素の製造
毒素を製造するため、１ｍｌの培養物をベンチトップ型微量遠心機中で１分間遠心分離し、２００μｌの蛋白質可溶化緩衝液に再懸濁して１０分間煮沸した。調製された試料は１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにのせ、電気泳動した。各々の試料の全蛋白質プロフィールはゲルをクーマシーブルーで染色することにより決定した。栄養および胞子形成細胞の両方をこの方法で分析し、例が図１に示されている。全蛋白質抽出物を調製するためにプロテアーゼ阻害剤が使用されなかったので、前毒素は完全に６７ｋＤ形に切断されていたことに注意されたい。切断が不完全である調製試料においては二重線が観察され、プロテアーゼ活性が完全に防止された調製試料においては単一の７３ｋＤバンドが観察された。
【００４１】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより決定されたような、問題とするＣｒｙ毒素蛋白質プロフィールを含んでいる単離物がバイオアッセイのために選択された。単離物はＧＹＳブロスを含んでいる１リットルのバッチ培養で増殖させた。培養物の胞子形成が完了後（マラカイトグリーン染色で決定された）、培養物を遠心分離し、数回のソニフィケーションおよび緩衝液交換を使用して副胞子結晶を洗浄した。洗浄した結晶は３０−８０％のショ糖密度勾配での遠心分離によりさらに精製した。精製結晶は炭酸ナトリウム緩衝液に溶解し、前毒素はパパインまたはトリプシンを使用して活性化毒素に変換した。活性化毒素はＨＰＬＣまたはＦＰＬＣにより精製された。
【００４２】
精製活性化毒素は前記のように昆虫食餌に種々の濃度で加えることにより昆虫バイオアッセイに使用する。この方法により、ＵＴＤ−００１と称されるファイヤアントに有効なＢＴの株が同定された。株ＵＴＤ−００１は前記のように、その全蛋白質バンド化パターンに従って特徴付けられた。蛋白質バンド化パターンは、図１に示されているように、対照種Ｂｔｔの蛋白質バンド化パターンと類似していたが、同一ではなかった。
【００４３】
Ｂｔｔはある種の甲虫に対して有効であることが知られており、Ｃｒｙ３Ａ毒素を含んでいる。Ｃｒｙ３Ａ毒素は約７３ｋＤの前毒素として発現され、６７ｋＤ毒素への蛋白分解切断により活性化される。当業者は、Ｂｔｔ毒素は図３に例示されたような、例えば、Ｃｒｙ３Ａ−様毒素、毒性特性を示すことを理解しなければならない。ＵＴＤ株のさらなる特徴付けはＢＴセリバー（ｓｅｒｉｖａｒ）および株を同定するための強力な方法である、任意のプライマーＰＣＲ（図２）により実施された、Ｂｒｏｕｓｓｅａｕ，Ｃ．，ｅｔ  ａｌ．，（１９９３）Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５９：１１４−１１９。再び、プロフィールは対照株Ｂｔｔと類似しているが同一ではなかった。特に、三つのバンド（矢印により示されている）がＢｔｔ株には存在するが、ＵＴＤ−００１株には存在しなかった。
【００４４】
実施例３  Ｃｒｙ蛋白質結晶の精製および活性化
ファイヤアント有効Ｂｔｔ株の１リットル培養物を、ほとんどの細胞が溶解するまで、改良ＧＹＳ培地中で４−６日増殖させた。溶解細胞を含んでいる培地は７５００ｒｐｍで２０分遠心分離する。上清を捨て、細胞ペレットを４０ｍｌの遠心管へ移した。細胞ペレットを１Ｍ  ＮａＣｌに再懸濁し（３０ｍｌ／管）、１５，０００ｒｐｍで２０分遠心分離する。続いて、蒸留水で２回洗浄する。細胞（２−４グラム）を２本の遠心管を用い、６８％ＲＥＮＯＧＲＡＦＩＮ（登録商標）７６（２０．４ｍｌのＲｅｎｏｇｒａｆｉｎ（登録商標）７６に３ｍｌの１００ｍＭ  ＥＤＴＡおよび６．６ｍｌの２％トリトンＸ−１００ｄＨ２Ｏ溶液を加える）（ＲＥＮＯＧＲＡＦＩＮ（登録商標）７６はＳＱＵＩＢＢ  ＤＩＡＧＮＯＳＴＩＣＳ（登録商標），Ｎｅｗ  Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ，ＮＪにより製造されたダイアトリゾエート  メグルミンおよびダイアトリゾエート  ナトリウムである）に再懸濁する。
【００４５】
例えば、ＪＡ−２０またはＳｏｒｖａｌｌ  ＳＳ−３４ローター中、１５，０００ｒｐｍで２時間の遠心分離により細胞破片をペレット化する。結晶を含んでいる上清をピペットで採取し、別の遠心管に加えた。上清は１．２−ｐｍ濾紙を使用して濾過し、３−５ｍＭになるまでのＥＤＴＡ、および０．１ｍｇ／ｍｌのＰＭＳＦを加えた後、１２，０００から１４，０００の分子量カットオフを持つ透析膜を使用し、蒸留水に対して３６時間透析する。透析した物質は次に７，５００ｒｐｍで１５分遠心分離し、結晶を含んでいる上清は４℃にて湿気のある状態で保存した。
【００４６】
前毒素結晶は、３．３Ｍ  ＮａＢｒ、ｐＨ７．０、および１ｍＭ  ＰＭＳＦを含んでいる５０ｍＭリン酸緩衝液に可溶化する。不溶性パパインビーズ（ＳＩＧＭＡ（登録商標））を使用説明書に従って活性化し、可溶化結晶毒素に加えて切断を達成する。切断はＮａ−ｐ−トスリル−Ｌ−リジン  クロロメチルケトン（ＴＬＣＫ）のｐＨ１０．０  Ｎａ２ＣＯ３溶液を１．２５ｍｇ／ｍｌおよび０．２容量まで加えることにより停止される。切断された毒素は、１ｍＭ  ＥＤＴＡを含んでいる５０ｍＭ  Ｎａ２ＣＯ３、ｐＨ１０．０で平衡化されたＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−７５（ＡＭＥＲＳＨＡＭ  ＰＨＡＲＭＡＣＩＡ  ＢＩＯＴＥＣＨ，ＩＮＣ．（登録商標），ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を通すことにより精製する。
【００４７】
実施例４  ＢＴ毒素の精製および活性化の別法
バチルス  スリンジエンシス毒素はＣｒｙ毒素を発現している組換え細胞から単離できる。例えば、ｃｒｙ遺伝子を含んでいる大腸菌が製造される。５００ｍｌ培養物を〜０．８のＯ．Ｄ．６００まで増殖させる。ここで組換え遺伝子はｌａｃプロモーターの影響下でクローン化され、発現は０．１ｍＭイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）による３７℃で一夜の処理により誘導される。
【００４８】
例えば、ＪＡ−４ローター中、５，０００ｒｐｍで１０分の遠心分離により細胞をペレット化する。細胞ペレットは２５ｍｌのＴＥＳ緩衝液（５０ｍＭトリス、ｐＨ８．０；５０ｍＭ  ＥＤＴＡ；１５％ショ糖）に再懸濁する。細胞はリゾチーム（０．５ｍｇ／ｍｌ最終濃度）およびＰＭＳＦ（０．１ｍＭ最終濃度）と室温で３０分間、続いて氷上で３ｘ１分超音波処理することにより溶解させる。
上清および表面の破片を破棄し、細胞を２０ｍｌのＴＴＮ緩衝液（２０ｍＭトリス、ｐＨ８．０；２％トリトンＸ−１００；０．５Ｍ  ＮａＣｌ）に懸濁する。ペレットはスパーテルで、続いてガラスダウンスで懸濁し、次に１２，０００ｒｐｍで１５分間ペレット化する。この洗浄過程を４回繰り返す。ペレットは次に２０ｍｌ  ＰＢＳ：アセトン（５：１）で前記のように２回洗浄し、続いてＰＢＳ（リットル当たり：８ｇｍ  ＮａＣｌ；０．２ｇｍ  ＫＣｌ；１．４４ｇｍ  Ｎａ２ＨＰＯ４；０．２４ｇｍ  ＫＨ２ＰＯ４）単独で洗浄する。最後に、ペレットを２０ｍｌのＮａ２ＣＯ３緩衝液（５０ｍＭ  Ｎａ２ＣＯ３、ｐＨ１０．０；５ｍＭ  ＤＴＴ）に再懸濁すると４℃で保存でき、または前毒素を可溶化させるために３７℃で４時間振とうする。生じた乳濁液は不溶性物質を除去するためにペレット化し、必要に応じ追加の炭酸ナトリウムを加えてもよい。
【００４９】
前毒素調製試料はミニ−ゲルで分析でき、主たる７３ｋＤ前毒素に加え、いくつかのより小さい（細菌性）蛋白質を示さなければならない。蛋白質はパパイン処理に先立って、使用説明書に従ってＢＣＡ蛋白質試薬（ＰＩＥＲＣＥ（登録商標））を使用して定量できる。前毒素は４℃で保存される。凍結は前毒素の劣化を生じる。
【００５０】
前毒素の活性化は代わりにトリプシンを使用して実施できる。ＴＰＣＫ（ＳＩＧＭＡ（登録商標））トリプシンを１：２０のトリプシン：前毒素比で加え、混合物は室温で１５分間振とうする。反応混合物を氷上に置き、一部をミニ−ゲル上で完全消化を検査する。もし、消化が完全であれば、氷上でＰＭＳＦを１００μＭまで加える。
【００５１】
切断混合物は、１００ｍＭ  ＮａＣｌを含んでいる２０ｍＭトリス、ｐＨ９．５、に対して一夜透析する。最後の透析に先立って、活性化毒素の濃度は沈殿を避けるため２ｍｇ／ｍｌを超えてはならない。透析試料は０．２μｍフィルターを通して濾過し、ＦＰＬＣによるさらなる精製を行う。下記のような１００−１０００ｍＭ  ＮａＣｌ濃度勾配を使用し、ＦＰＬＣでの１８％Ｂ分画を集める。
【００５２】
実施例５  ＦＰＬＣによるＣｒｙ毒素の精製
ＦＰＬＣは以下の詳細を含んでいる標準法に従って実施される。
【００５３】
【表３】
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【００５４】
2004535752.tif 000005
【００５５】
実施例６  ファイヤアント死亡率
本明細書に記載している発明は、移入性ファイヤアントの集団を殺すことに有効なＢＴの同定を標的にしていた。ＢＴ毒素特性と共に毒素がその毒性効果を発揮する腸環境の特性に関して考慮が払われた。いくつかのＢＴ株は中性ｐＨおよびそれ以下（ｐＨ５−７）で作用する毒素を産生する。異なった昆虫の腸環境は異なったｐＨにより特徴付けられる。特に、ファイヤアントの腸はわずかに酸性である。ファイヤアントに対して有効であるＢＴ毒素はファイヤアント腸環境で生き残らなければならない。
【００５６】
図３は種々のＢＴ毒素濃縮物で処理された移入性ファイヤアント集団の死亡率を示している。簡単には、方法は以下のようである。働きアリの別々のコロニーが各々の濃縮物を試験するために使用された。すべての試験において、種々の濃縮物はショ糖の１０％蒸留水溶液と合併された。試験に先立って、働きアリコロニーは５日間食物なしで保たれた。各々の繰り返しで２０の働きアリが１４日間３０ｍｌのコップに入れられた。毒素製剤は最初の２４時間のみカップ中へ置かれ、その後それらは除かれ、ショ糖の１０％蒸留水溶液で置き換えられた。日１、２、３、６、８、１０および１４にパーセント死亡率が記録された。対照はショ糖の１０％蒸留水溶液のみである。
【００５７】
ＬＣ５０は最終的には決定されていないが、確かでない品質の六ヶ月経過した毒素からの予備的結果は、ＬＣ５０は７０ｎｇ／ｍｌほどの低さであろうことを示している。新規Ｃｒｙ毒素の種特異性を決定するための研究も計画された。特に、毒素効力がミツバチおよびスズメバチでアッセイされるであろう。
【００５８】
実施例７  ＵＴＤ−００１からのｃｒｙ遺伝子のクローニング
株ＵＴＤ−００１のｃｒｙ遺伝子は、対照株Ｂｔｔにより示されたものと類似のサイズおよび制限パターンのプラスミド上に含まれている（示されてはいない）。それ故、本遺伝子はＢｔｔ遺伝子と非常に類似しているであろうことが予想される。従って、プライマーｃｒｙ３Ａ−Ｆおよびｃｒｙ３Ａ−Ｒ（Ｂｔｔ  ｃｒｙ遺伝子から誘導された）が、ＴＡＱ作製Ａオーバーハングを持っているＵＴＤ−００１の１．８−ｋｂ断片を増幅するために使用された。断片は低融解アガロースゲルから切り出され、Ｔオーバーハングを持つ線状化ｐＣＲ２．１内へ連結され，ｐＣＲＲＹ３プラスミドが生成された（図５参照−ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ（登録商標）によるＴＡクローニング法）。
【００５９】
遺伝子は配列決定され、図７の概念的に翻訳された前毒素アミノ酸配列と一緒に、図６に示されている。コード領域はヌクレオチド５６または５８から終端まで広がっている。推定蛋白分解部位は矢印で示されており、毒素配列はボールド体で示されている。前毒素の計算された分子量は７２．９ｋＤであり、および毒素は約６７ｋＤであり、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより決定されたサイズとよく一致している。
【００６０】
遺伝子は、対照として使用されたＢｔｔ株のｃｒｙ３Ａ遺伝子と最大の相同性（９８％）を示している。特に、アミノ酸配列（配列ＩＤ番号：２）が前記定義で記載されている検索パラメーターによるＢＬＡＳＴＰにより検索され、かなりの甲虫類特異的、７３−７４ｋＤＣｒｙ前毒素への相同性が観察された。最も密接な相同性はＢ．スリンジエンシス変種テネブリオニス（ｔｅｎｅｂｒｉｏｎｉｓ）からのＣｒｙ３Ａ（Ａ）毒素（Ａｃｃ．番号Ｐ０７１３０）に対してであり、変異するＢｔｔ単離物と６３２／６４４（９８％）から５７２／５８４（９７％）までの範囲の相同性を持っていた。次に近い相同性はＢ．スリンジエンシス亜種クルスタキ（ｋｕｒｓｔａｋｉ）（Ａｃｃ．番号Ｑ４５７４４）で４７９／６５２（７３％）のアミノ酸同一性、および４３９／６５０（６７％）の同一性を持つＣｒｙ３Ｂ（Ｂ）毒素（Ａｃｃ．番号Ｑ０６１１７）であった。同様に、ヌクレオチド配列はＢｔｔのＣｒｙ３Ａ（Ａ）配列と１９０２／１９３６（９８％）ヌクレオチド相同性を示した。
【００６１】
新規ｃｒｙ毒素は驚くほどＢｔｔ毒素（甲虫類に対してのみ有効であることが知られている毒素）と密接に関連しているので、Ｂｔｔ毒素もまたファイヤアントに対する有効性が試験された。Ｂｔｔ毒素はファイヤアントに対して有効であるけれども、本明細書記載した株よりも低い効力を持つことを予備的結果は示している。従って、従来のＢｔｔ毒素の新規使用が予期せずに発見された。大きな固形物は消費されないというファイヤアントの普通でない食餌要求性のため、このファイヤアント活性は従来知られていなかったのであろう。
【００６２】
ここで引用したすべての文献は本明細書において参考文献として組み入れられる。本発明は例示の態様を参考にして説明されてきたが、この記述が制限的意味で解釈されるのは意図されていない。種々の変形および例示的態様の組み合わせ、ならびに本発明のその他の態様が、記述を参考にすることにより当業者には明らかになるであろう。それ故、付随する特許請求の範囲はそのような変形または態様を包含していることが意図されている。
【図面の簡単な説明】
本発明の方法および装置のより完全な理解は、発明の詳細な説明を付随する図と共に参考にすることにより得られるであろう、ここで：
【図１】図１はＵＴＤ−００１および対照種バチルス  スリンジエンシス株亜種テネブリオニス（Ｂｔｔ）から単離された細胞質蛋白質のクーマシーブルー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルである。左のパネルは栄養細胞からの蛋白質であり、一方、右のパネルは胞子形成細胞からである。ＵＴＤ−００１染色はＢｔｔのＣｒｙ３Ａ蛋白質とほとんど同一のサイズ（約６８ｋＤ）のＣｒｙ毒素を持っていることを、パターンは明瞭に示している。分子量サイズマーカー（ｋＤ）もまた示されている；
【図２】図２はＵＴＤ−００１および対照種Ｂｔｔの任意に開始されたＰＣＲ生成物のエチジウムブロミド染色アガロースゲルである。任意のプライマーはＡＣＧＣＧＣＣＣＴであった。矢印はＢｔｔ株に存在し、ＵＴＤ−００１株には存在しないバンドを示している。サイズマーカーＭ（１００ｂｐラダー）が右側に示されている；
【図３】図３はファイヤアント毒素アッセイを示しており、ここで精製パパイン処理毒素が、精製毒素、粗胞子＆結晶毒素、および対照と比較されている；
【図４】図４Ａおよび図４Ｂは活性化毒素（４Ａ）および粗胞子および結晶毒素（４Ｂ）のＳＤＳ−ＰＡＧＥプロフィールである。４Ｂに７３ｋＤ前毒素および６７ｋＤ毒素の両方が観察される。分子量サイズマーカー（ｋＤ）もまた示されている；
【図５】図５はｐＣＣＲＹ３プラスミドを製造するための、ＴＡクローニングベクターｐＣＲ２．１（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ（登録商標））内への、ＵＴＤ−００１の１．８ｋｂ  ＰＣＲ生成物からのＣｒｙ毒素遺伝子のクローニングを例示している。使用されたプライマーはフォワード：ＡＴＧＡＡＴＣＣＧＡＡＣＡＡＴＣＧＡＡＧおよびリバース：ＴＴＡＡＴＴＣＡＣＴＧＧＡＡＴＡＡＡＴＴＣであった；
【図６】図６はＵＴＤ−００１のＣｒｙ前毒素のヌクレオチド配列（配列ＩＤ番号：１）であり；および
【図７】図７はＵＴＤ−００１のＣｒｙ前毒素のアミノ酸配列（配列ＩＤ番号：２）である。活性毒素部分はボールド体である。矢印は前毒素の推定切断部位を示している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004535752.tif 000048
【国際調査報告】
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