(57)【要約】本発明は、配列特異的ポリヌクレオチド類似体と、既知配列の核酸の機能の決定する方法を提供する。
2004504820.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリヌクレオチド類似体を含む硬骨魚目胚であって、該胚は、部分割を経る硬骨魚目種由来のものであり、該類似体が、上記胚において選択核酸からの発現を減弱するのに有効な量存在する、硬骨魚目胚。
【請求項２】
胚が、ゼブラフィッシュ胚、フグ胚、メダカ胚、およびトゲウオ胚からなる群より選択される、請求項１に記載の胚。
【請求項３】
胚が、ゼブラフィッシュ胚である、請求項２に記載の胚。
【請求項４】
選択核酸が、ｍＲＮＡである、請求項１に記載の胚。
【請求項５】
類似体が、ｍＲＮＡの５’非翻訳領域を含むｍＲＮＡの領域と相補的である、請求項４に記載の胚。
【請求項６】
類似体が、ｍＲＮＡのＡＵＧ開始コドンの部分または全部を含むｍＲＮＡの領域と相補的である、請求項４に記載の胚。
【請求項７】
類似体が、ｍＲＮＡのコード領域を含むｍＲＮＡの領域と相補的である、請求項４に記載の胚。
【請求項８】
類似体の長さが、９〜９０塩基である、請求項１に記載の胚。
【請求項９】
類似体の長さが、１５〜５０塩基である、請求項１に記載の胚。
【請求項１０】
類似体の長さが、２０〜３０塩基である、請求項１に記載の胚。
【請求項１１】
類似体が、モルホリノ修飾ポリヌクレオチドである、請求項１に記載の胚。
【請求項１２】
類似体が、３’−５’ホスホロアミデートである、請求項１に記載の胚。
【請求項１３】
類似体が、ペプチド核酸である、請求項１に記載の胚。
【請求項１４】
類似体が、２’Ｏ−メチル基を有するリボース成分を含むポリヌクレオチドである、請求項１に記載の胚。
【請求項１５】
類似体におけるヌクレオチドの少なくとも１５％が、選択核酸における対応ヌクレオチドと相補的ではない、請求項１に記載の胚。
【請求項１６】
類似体が、胚の核酸と相補的であり、該核酸が別の種において相同体またはオーソログを含むコード配列を有する、請求項１に記載の胚。
【請求項１７】
選択核酸からの発現の減弱が、発生の幼生期または孵化後期まで持続する、請求項１に記載の胚。
【請求項１８】
胚が、該ポリヌクレオチド類似体により発現が減弱するポリペプチドをコードする外来レスキューｍＲＮＡをさらに含み、その際、該レスキューｍＲＮＡが、上記類似体を含まない胚と同等のレベルで、上記ポリペプチドの発現に十分な量存在する、請求項１に記載の胚。
【請求項１９】
少なくとも１つの別のポリヌクレオチド類似体をさらに含む胚であって、該胚は、部分割を経る硬骨魚目種のものであり、前記ポリヌクレオチド類自体は同じ選択核酸の異なる領域と相補的であり、該類似体が、選択核酸からの発現を減弱するのに有効な量存在する、請求項１に記載の胚。
【請求項２０】
少なくとも１つの別のポリヌクレオチド類似体を含む胚であって、該胚は、部分割を経る硬骨魚目種のものであり、前記ポリペプチド類似体は異なる領域と相補的であり、該類似体が、異なる選択核酸からの発現を減弱するのに有効な量存在する、請求項１に記載の胚。
【請求項２１】
ポリヌクレオチド類似体を含む硬骨魚目胚を生産する方法であって、該硬骨魚目胚は、部分割を経る種のものであり、該類似体が、胚において選択核酸からの発現を減弱するのに有効な量存在し、この方法が、胚、または胚に発生する卵を、前記ポリヌクレオチド類似体と接触させることを含んでなる、方法。
【請求項２２】
接触段階が、胚、または胚に発生する卵に類似体をインジェクションするか、あるいは、前記類似体を胚、または胚を発生する卵の表面に添加することを含んでなる、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
胚または胚に発生する卵は、ゼブラフィッシュ胚もしくはゼブラフィッシュ胚に発生する卵、フグ胚もしくはフグ胚に発生する卵、メダカ胚もしくはメダカ胚に発生する卵、ならびにトゲウオ胚もしくはトゲウオ胚に発生する卵からなる群より選択される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
モルホリノ修飾ポリヌクレオチドと、硬骨魚目卵または胚内のｐＨと類似したｐＨを有するバッファーとを含んでなる組成物であって、該モルホリノ修飾ポリヌクレオチドが、選択核酸と相補的である、組成物。
【請求項２５】
バッファーが、上記硬骨魚目卵または胚と等張である、請求項２４に記載の組成物。
【請求項２６】
バッファーが、ダニウ（Ｄａｎｉｅａｕ）バッファーである、請求項２４に記載の組成物。
【請求項２７】
硬骨魚目卵または胚が、部分割を経る種のものである、請求項２４に記載の組成物。
【請求項２８】
硬骨魚目卵または胚が、ゼブラフィッシュ卵もしくは胚、フグ卵もしくは胚、メダカ卵もしくは胚、ならびにトゲウオ卵もしくは胚からなる群より選択される、請求項２４に記載の組成物。
【請求項２９】
硬骨魚目卵または胚が、ゼブラフィッシュ卵または胚である、請求項２４に記載の組成物。
【請求項３０】
さらに、レスキューｍＲＮＡを含み、該レスキューｍＲＮＡが、モルホリノ修飾類似体により発現が減弱するポリペプチドをコードする、請求項２４に記載の組成物。
【請求項３１】
さらに、少なくとも１つの別のポリヌクレオチド類似体を含み、該ポリヌクレオチド類似体が、選択核酸の様々な領域と相補的である、請求項２４に記載の組成物。
【請求項３２】
硬骨魚目胚または胚を発生する卵において選択核酸と関連する表現型を決定する方法であって、該胚または卵が、部分割を経る硬骨魚目種のものであり、
（ａ）硬骨魚目胚または胚を発生する卵を、選択核酸をターゲッティングするモルホリノ修飾ポリヌクレオチド類似体と接触させ、次に、
（ｂ）硬骨魚目胚もしくは卵、またはこの卵から発生する胚において、改変した表現型を検出するが、その際、改変表現型が、選択核酸の発現の減弱または機能の改変と関連する、ことを含んでなる方法。
【請求項３３】
選択核酸が母系または接合核酸である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
改変表現型が、受精から、器官形成期を通して、胚形成の完了まで認められる、請求項３２に記載の方法。
【請求項３５】
胚または胚を発生する卵を、レスキューｍＲＮＡと接触させることをさらに含む方法であって、その際、該レスキューｍＲＮＡは、類似体により発現が減弱するポリペプチドをコードし、かつ、該レスキューｍＲＮＡは、上記類似体を含まない硬骨魚目胚、または胚を発生する卵と同等のレベルで、ポリペプチドの発現に十分な量存在する。
【請求項３６】
硬骨魚目生物においてポリヌクレオチド類似体が媒介する表現型が、配列特異的であるかどうかを決定する方法であって、
ａ）第１の硬骨魚目胚または硬骨魚目卵を上記ポリヌクレオチド類似体と接触させ；
ｂ）段階（ａ）に続いて第１硬骨魚目胚もしくは卵、またはこの卵から発生する硬骨魚目胚の表現型を評価し；
ｃ）第２の硬骨魚目胚または硬骨魚目卵を、（ｉ）上記ポリヌクレオチド類似体および（ｉｉ）レスキューｍＲＮＡ分子と接触させ；
ｄ）段階（ｃ）に続いて第２硬骨魚目胚もしくは卵、またはこの卵から発生する硬骨魚目胚の表現型を評価し；そして
ｅ）（ｂ）と（ｄ）の結果を比較し、その際、（ｂ）で検出された表現型が、（ｂ）に存在しなければ、（ｂ）で検出された類似体は配列特異的であることを示す、
ことを含んでなる方法。
【請求項３７】
第１および第２ポリペプチドが遺伝的相互作用因子（ｇｅｎｅｔｉｃ ｉｎｔｅｒａｃｔｏｒｓ）であるかどうかを決定する方法であって、
ａ）第１の硬骨魚目胚または硬骨魚目卵を、第１ポリペプチドをコードする核酸をターゲッティングする第１のポリヌクレオチド類似体と接触させ、該硬骨魚目胚もしくは卵、またはこの卵から発生する硬骨魚目胚の表現型を評価し；
ｂ）第２の硬骨魚目胚またはこの胚を発生する卵を、第２ポリペプチドをコードする核酸をターゲッティングする第２のポリヌクレオチド類似体と接触させ、該硬骨魚目胚もしくは卵、またはこの卵から発生する硬骨魚目胚の表現型を評価し；
ｃ）第３の硬骨魚目胚またはこの胚を発生する卵を、前記第１および第２ポリヌクレオチド類似体と接触させ、該硬骨魚目胚もしくは卵、またはこの卵から発生する硬骨魚目胚の表現型を評価し；そして
ｄ）（ａ）、（ｂ）および（ｃ）の結果を比較し、その際、（ｃ）で認められる表現型が、（ａ）および（ｂ）で認められる個々の表現型の和とは異なっていれば、上記２つのポリペプチドは遺伝的相互作用因子である、
ことを含んでなる方法。
【請求項３８】
（ｃ）で認められる表現型が、（ａ）および（ｂ）で認められる個々の表現型の和と比べて、範囲が広いか、または狭い、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
各種モルホリノ修飾ポリヌクレオチドのコレクションを含むキットであって、各種モルホリノ修飾ポリヌクレオチドは、様々な核酸からの発現を減弱するのに有効であり、該様々な核酸は、共通の代謝過程に関与する、キット。
【請求項４０】
モルファントのコレクションであって、各モルファントは、様々な核酸からの発現を減弱するのに有効なモルホリノ修飾ポリヌクレオチドのコレクションから選択されたモルホリノ修飾ポリヌクレオチドによって作製され、該様々な核酸は、共通の代謝過程に関与する、コレクション。
【請求項４１】
分化組織の形成に欠陥がある硬骨魚目モルファント。
【請求項４２】
分化組織が、膵臓である、請求項４１に記載のモルファント。
【請求項４３】
分化組織が、血管系組織である、請求項４１に記載のモルファント。
【請求項４４】
分化組織が、血液である、請求項４１に記載のモルファント。
【請求項４５】
分化組織が、眼である、請求項４１に記載のモルファント。
【請求項４６】
分化組織が、中枢神経系である、請求項４１に記載のモルファント。
【請求項４７】
分化組織が、筋肉である、請求項４１に記載のモルファント。
【請求項４８】
分化組織が、背骨である、請求項４１に記載のモルファント。
【請求項４９】
分化組織が、頭部である、請求項４１に記載のモルファント。
【請求項５０】
分化組織が、肢である、請求項４１に記載のモルファント。
【請求項５１】
分化組織が、色素細胞である、請求項４１に記載のモルファント。
【請求項５２】
硬骨魚目モルファントのモルファント表現型が、疾病に特有の表現型に対応する、硬骨魚目モルファント。
【請求項５３】
疾病が、ポルフィリン症および単眼症から選択される、請求項５２に記載のモルファント。
【請求項５４】
疾病に関連する核酸を同定する方法であって、
ａ）疾病に特徴的な表現型に対応するモルファント表現型を有する硬骨魚目モルファントを作製し、
ｂ）前記硬骨魚目モルファントにおけるモリホリノ修飾ポリヌクレオチドの核酸標的を同定し、ここで前記モリホリノ修飾ポリヌクレオチドの核酸標的は、前記疾病に関連する核酸である、
ことを含んでなる方法。
【請求項５５】
モルファントに対する薬剤の効果を評価する方法であって、
ａ）モルファントを薬剤と接触させ、
ｂ）上記薬剤と接触後の前記モルファントの表現型を評価する、
ことを含んでなる方法。
【請求項５６】
モルファントの表現型が、薬剤との接触後も不変である、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
モルファントの表現型が、薬剤との接触後、それより弱い（ｌｅｓｓ ｓｅｖｅｒｅ）表現型に置換されている、請求項５５に記載の方法。
【請求項５８】
モルファントの表現型が、薬剤と接触させた後、バイオマーカーの活性の変化と相関している、請求項５５に記載の方法。
【請求項５９】
動物において、選択核酸からの発現を減弱する方法であって、該選択核酸の異なる領域と相補的な少なくとも２つのポリヌクレオチド類似体を該動物と接触させることを含んでなり、その際、前記少なくとも２つのポリヌクレオチド類似体は、それぞれを単独で用いた場合より、選択核酸からの発現を減弱するのに有効である、方法。
【請求項６０】
少なくとも２つのポリヌクレオチド類似体が、相乗的に作用して、選択核酸からの発現を減弱する、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
少なくとも２つのポリヌクレオチド類似体が、相乗係数３で、上記核酸からの発現を減弱する、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
少なくとも２つのポリヌクレオチド類似体が、相乗係数５で、上記核酸からの発現を減弱する、請求項６０に記載の方法。
【請求項６３】
少なくとも２つのポリヌクレオチド類似体が、相乗係数１０で、上記核酸からの発現を減弱する、請求項６０に記載の方法。
【請求項６４】
少なくとも２つのポリヌクレオチド類似体が、モルホリノ修飾ポリヌクレオチドである、請求項５９に記載の方法。
【請求項６５】
少なくとも２つの異なるモルホリノ修飾ポリヌクレオチドと、薬剤上許容される担体とを含んで成る組成物であって、該少なくとも２つの異なるモルホリノ修飾ポリヌクレオチドが、同じ選択核酸をターゲッティングする、組成物。
【請求項６６】
少なくとも２つの異なるモルホリノ修飾ポリヌクレオチドが、選択核酸の非オーバーラップ領域と相補的である、請求項６５に記載の組成物。
【請求項６７】
非オーバーラップ領域が、１，０００を超えるヌクレオチドにより隔てられている、請求項６６に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
関連出願に対するクロス・リフェランス
この出願は、２０００年７月３１日に提出された米国仮出願番号６０／２２１，７２２；２０００年１１月２２日に提出された米国仮出願番号６０／２５２，８６４；および２００１年４月１９日に提出された米国仮出願番号６０／２８４，９７４からの優先権を主張する。
【０００２】
連邦支援の研究に関する声明
本明細書に記載される研究の資金は、連邦政府により提供され、連邦政府は、本発明に所定の権利を有する。
【０００３】
（背景）
１．技術背景
本発明は、配列に基づく核酸の機能の決定に関与する方法および材料に関する。
【０００４】
２．背景情報
様々なゲノムプロジェクトによって、遺伝子配列を取得することができるようになったが、生物学的機能の原因をこれらの新しい遺伝子に求めるのがこれにまだまだ追いつかない状態である。このジレンマから、「機能的遺伝子学」の概念が生まれたが、これは、生物学的機能を、ゲノムレベルで遺伝子配列と適合させる試みとして定義することができる。進化において多くの生物学的過程が高度に保存されているため、高速の遺伝子ツールが開発されたモデル生物をモデル系として用いることにより、ヒト遺伝子を同定することができる。例えば、特定の生物学的役割を有する遺伝子を、まずモデル生物で同定した後、ゲノムデータベースを用いてヒト相同体を同定する。
【０００５】
脊椎動物生物学の研究に有用なモデル系は、ゼブラフィッシュ（Ｄａｎｉｏ ｒｅｒｉｏ）である。ゼブラフィッシュをモデル系として有用にするゼブラフィッシュ発生過程の特徴として、器官系の形成が速い、透明な胚、子宮外に形成される胚、多数の胚が入手可能であることなどが挙げられる。さらには、ゼブラフィッシュゲノムの配列決定は、２００２年末にまでには完了すると考えられる。配列情報に基づく機能の割当ては、このモデル脊椎動物における高速の標的ノックダウン技法の開発により、大幅に促進されるであろう。
【０００６】
近年、特定の遺伝子の発現を選択的に抑制する多数の戦略が開発されている。これらの方法は、二本鎖ＲＮＡを細胞に導入する、または、ＲＮアーゼＨによるｍＲＮＡ分解を引き起こす一本鎖アンチセンスＲＮＡの付加により、コグネイトｍＲＮＡの分解を誘発することからなる。これらの方法は、Ｄ． ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒおよび線虫（Ｃ． ｅｌｅｇａｎｓ）で用いられているが、毒性や、非特異的効果により、あるいは、遺伝子抑制の均一な分布を達成することが不可能なため、魚類では成功していない。
【０００７】
（概要）
本発明は、既知配列の核酸の機能を決定するための方法および材料を提供する。さらに具体的には、本発明は、硬骨魚目において選択された既知配列の核酸からの発現を特異的に減弱することによって、この選択核酸の機能、またはそれに関連する表現型を決定する方法および材料を提供する。本発明は、選択核酸からの発現を特異的に減弱するのに用いることができる配列特異的ポリヌクレオチド類似体、ならびに、配列特異的ポリヌクレオチド類似体を用いて、選択核酸からの発現を減弱する方法を提供する。選択された核酸の機能、またはそれに関連する表現型は、生物における配列特異的ポリヌクレオチド類似体の存在と関連する形態的またはその他の表現型改変を調べることにより、決定することができる。
【０００８】
本発明は、胚において選択核酸からの発現を減弱するのに有効な量のポリヌクレオチド類似体を含む硬骨魚目胚を提供する。胚は、部分割を経る硬骨魚目種由来のものである。このような胚として、例えば、ゼブラフィッシュ胚、フグ胚、メダカ胚、もしくはトゲウオ胚が挙げられる。
【０００９】
ポリヌクレオチド類似体を用いて、選択された核酸であるｍＲＮＡからの発現を減弱することができる。この類似体は、（１）ｍＲＮＡの５’非翻訳領域、（２）ｍＲＮＡの部分または全ＡＵＧ開始コドン、（３）ｍＲＮＡのコード領域、または（４）これらの様々な組合せを含むｍＲＮＡの領域に対して相補的である。類似体の長さは、例えば、９〜９０塩基、１５〜５０塩基、または２０〜３０塩基でよい。類似体は、モルホリノ（ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ）修飾ポリヌクレオチド、３’−５’−ホスホロアミデート、ペプチド核酸、または、２’Ｏ−メチル基を有するリボース部分を含むポリヌクレオチドでよい。類似体は、選択核酸の対応するヌクレオチドと比較して、少なくとも１５％非相補的ヌクレオチドを含むことができる。類似体は、別の種の相同体またはオーソログを有する胚の核酸と相補的であってもよい。このような類似体を用いて、幼生または孵化後の発生期を通じて、選択核酸からの発現を減弱することができる。
【００１０】
本発明はまた、ポリヌクレオチド類似体によって発現が減弱されるポリペプチドをコードする外来レスキュー（ｒｅｓｃｕｅ）ｍＲＮＡを含む胚を提供する。レスキューｍＲＮＡは、上記類似体を含まない胚と同等のレベルで、ポリペプチドの発現に十分な量存在している。
【００１１】
加えて、本発明は、同じ選択核酸の異なる領域と相補的である、少なくとも１つの別のポリヌクレオチド類似体を有する胚を提供する。両類似体は、選択核酸からの発現を減弱するのに有効な量存在する。
【００１２】
本発明はまた、第１のものとは異なる少なくとも１つの核酸と相補的である、少なくとも１つの別のポリヌクレオチド類似体を有する胚を提供する。すべての類似体は、異なる核酸の各々からの発現を減弱するのに有効な量存在する。
【００１３】
別の実施形態では、本発明は、ポリヌクレオチド類似体を含む硬骨魚目胚を生産する方法を提供する。この胚は、部分割を経る硬骨魚目胚でよい。上記類似体は、胚において選択核酸からの発現を減弱するのに有効な量存在する。この方法は、胚または胚を発生する卵を、ポリヌクレオチド類似体と接触させることを含んでなる。例えば、胚または胚を発生する卵を類似体に類似体をインジェクションするか、あるいは、類似体を胚または胚を発生する卵の表面に添加する。胚または胚を発生する卵は、ゼブラフィッシュ胚またはゼブラフィッシュ胚を発生する卵、フグ胚またはフグ胚を発生する卵、メダカ胚またはメダカ胚を発生する卵、もしくはトゲウオ胚またはトゲウオ胚を発生する卵でよい。
【００１４】
別の実施形態では、本発明はまた、選択核酸と相補的なモルホリノ修飾ポリヌクレオチドと、硬骨魚目卵または胚内の生理学的ｐＨと類似したｐＨを有するバッファーとを含む組成物を提供する。バッファーは、硬骨魚目卵または胚と等張でよい。バッファーは、ダニウ（Ｄａｎｉｅａｕ）バッファーでよい。硬骨魚目卵または胚は、部分割を経る種のものでよい。硬骨魚目卵または胚は、ゼブラフィッシュ卵または胚、フグ卵または胚、メダカ卵または胚、もしくはトゲウオ卵または胚でよい。加えて、上記組成物は、発現がモルホリノ修飾類似体により減弱されるポリペプチドをコードするレスキューｍＲＮＡを含んでいることもできる。上記組成物はまた、選択核酸の様々な領域と相補的である、少なくとも１つの別のポリヌクレオチド類似体を含んでいてもよい。
【００１５】
別の実施形態では、本発明は、硬骨魚目胚または胚を発生する卵において選択核酸と関連する表現型を決定する方法を提供する。胚または卵は、部分割を経る硬骨魚目種由来のものである。上記方法は、硬骨魚目胚または胚を発生する卵を、選択核酸をターゲッティングするモルホリノ修飾ポリヌクレオチド類似体と接触させ、次に、硬骨魚目胚または卵、もしくはこの卵から発生する胚において、改変した表現型を検出することを含んでなる。改変した表現型は、上記選択核酸の減弱した発現または改変した機能に関連するものである。選択核酸は、母系または接合核酸でよく、また改変した表現型は、受精から、器官形成期を通して、胚形成の完了まで認めることができる。
【００１６】
本発明はまた、硬骨魚目胚または胚を発生する卵において、選択核酸と関連する表現型を決定する方法を提供する。胚または卵は、部分割を経る硬骨魚目種のものである。この方法は、硬骨魚目胚または胚を発生する卵を、モルホリノ修飾ポリヌクレオチドおよびレスキューｍＲＮＡと接触させ、次に、硬骨魚目胚もしくは卵、またはこの卵から発生する胚において、改変した表現型を検出することを含んでなる。モルホリノ修飾ポリヌクレオチドは、核酸からの発現を減弱するのに有効な量存在する。レスキューｍＲＮＡは、上記類似体により発現が減弱されるポリペプチドをコードし、類似体を含まない硬骨魚目胚、または胚を発生する卵と同等のレベルで、ポリペプチドの発現に十分な量存在する。
【００１７】
別の実施形態では、本発明は、硬骨魚目生物におけるポリヌクレオチド類似体が媒介する表現型が、配列特異的であるかどうかを決定する方法を提供する。この方法では、第１の硬骨魚目胚または硬骨魚目卵をポリヌクレオチド類似体と接触させた後、第１硬骨魚目胚もしくは卵、またはこの卵から発生する硬骨魚目胚の表現型を評価する。第２の硬骨魚目胚または硬骨魚目卵を、（ｉ）ポリヌクレオチド類似体および（ｉｉ）レスキューｍＲＮＡ分子と接触させた後、第２硬骨魚目胚もしくは卵、またはこの卵から発生する硬骨魚目胚の表現型を評価する。次に、第１胚または卵の表現型を第２胚または卵の表現型と比較する。第１胚または卵の表現型が、第２胚または卵の表現型に存在しなければ、この類似体は配列特異的である。
【００１８】
別の実施形態では、本発明は、第１および第２ポリペプチドが遺伝的相互作用因子（ｇｅｎｅｔｉｃ ｉｎｔｅｒａｃｔｏｒｓ）であるかどうかを決定する方法を提供する。本発明は、第１の硬骨魚目胚または硬骨魚目卵を、第１ポリペプチドをコードする核酸をターゲッティングする第１のポリヌクレオチド類似体と接触させ、次に、得られた硬骨魚目胚もしくは卵、またはこの卵から発生する硬骨魚目胚の表現型を評価することを含んでなる。この方法はまた、第２の硬骨魚目胚またはこの胚を発生する卵を、第２ポリペプチドをコードする核酸をターゲッティングする第２のポリヌクレオチド類似体と接触させ、次に、得られた硬骨魚目胚もしくは卵、またはこの卵から発生する硬骨魚目胚の表現型を評価することも含む。この方法はさらに、第３の硬骨魚目胚またはこの胚を発生する卵を、第１および第２ポリヌクレオチド類似体と接触させ、次に、得られた硬骨魚目胚もしくは卵、またはこの卵から発生する硬骨魚目胚の表現型を評価することも含む。得られた第１、第２および第３硬骨魚目胚もしくは卵、またはこの卵から発生する硬骨魚目胚の表現型を比較する。第３胚または卵に認められる表現型が、第１および第２胚または卵に認められる個々の表現型の和とは異なる場合に、２つのポリペプチドは遺伝的相互作用因子である。両ポリヌクレオチド類似体を用いて認められた表現型は、両類似体の一方を用いて認められた個々の表現型の和と比べて、範囲が広いか、または狭い可能性がある。
【００１９】
別の実施形態では、本発明は、異なるモルホリノ修飾ポリヌクレオチドのコレクションを含むキットを提供する。異なるモルホリノ修飾ポリヌクレオチドは、共通の代謝過程に関与する様々な核酸からの発現を減弱するのに有効である。
【００２０】
別の実施形態では、本発明は、モルファント（ｍｏｒｐｈａｎｔ）のコレクションを提供し、各モルファントは、共通の代謝過程に関与する様々な核酸からの発現を減弱するのに有効なモルホリノ修飾ポリヌクレオチドのコレクションから選択された別のモルホリノ修飾ポリヌクレオチドにより産生される。
【００２１】
別の実施形態では、本発明は、分化組織の形成に欠陥がある硬骨魚目モルファントを提供する。分化組織としては、膵臓、血管系組織、血液、眼、中枢神経系、筋肉、背骨、頭部、肢、または色素細胞が挙げられる。
【００２２】
別の実施形態では、本発明は、疾病に特有の表現型を有する硬骨魚目モルファントを提供する。疾病としては、例えば、ポルフィリン症または単眼症がある。
【００２３】
別の実施形態では、本発明は、疾病に関連する核酸を同定する方法を提供する。この方法は、疾病に特有の表現型に対応するモルファント表現型を有する硬骨魚目モルファントを作製し、この硬骨魚目モルファントにおけるモリホリノ修飾ポリヌクレオチドの核酸標的を同定することを含んでなる。モリホリノ修飾ポリヌクレオチドの核酸標的は、疾病に関連する核酸である。
【００２４】
別の実施形態では、本発明は、モルファントに対する薬剤の効果を評価する方法を提供する。この方法は、モルファントを薬剤と接触させた後、該モルファントの表現型を評価することを含んでなる。モルファントの表現型は、薬剤との接触後も不変であるか、または、薬剤との接触後、それより弱い（ｌｅｓｓ ｓｅｖｅｒｅ）表現型に置換されている可能性がある。薬剤と接触させたモルファントの表現型は、バイオマーカーの活性の変化と相関していると考えられる。
【００２５】
別の実施形態では、本発明は、動物において、選択核酸からの発現を減弱する方法を提供する。この方法は、少なくとも２つのポリヌクレオチド類似体を動物に投与することを含んでなる。これらの類似体は、選択核酸の異なる領域と相補的である。ポリヌクレオチド類似体は、相乗的に作用して、選択された核酸からの発現を減弱することができる。このような発現は、３、５または１０の相乗係数で減弱することができる。上記ポリヌクレオチド類似体は、モルホリノ修飾ポリヌクレオチドでよい。
【００２６】
別の実施形態では、本発明は、少なくとも２つの異なるモルホリノ修飾ポリヌクレオチドと、薬学上許容される担体とを含んでなる組成物を提供する。モルホリノ修飾ポリヌクレオチドは、同じ選択核酸をターゲッティングすることができ、かつ、選択された核酸の非オーバーラップ領域と相補的であってよい。非オーバーラップ領域は、１，０００を超えるヌクレオチドで隔てられていてもよい。
【００２７】
別途記載のない限り、本明細書で用いる技術および科学用語はすべて、本発明が関連する技術分野の当業者により一般に理解されているものと同じ意味を有するものとする。本明細書に記載したものに類似した、または同等の方法および材料を本発明の実施または試験で用いることができるが、好適な方法および材料について以下に説明する。本明細書に記載した出版物、特許出願、特許、およびその他の参照文献はすべて、参照としてその全文を本明細書に組み込む。抵触の場合には、定義を含む本明細書が調整（ｃｏｎｔｒｏｌ）する。加えて、本明細書に記載する材料、方法、および例は、説明のためにすぎず、制限を意図するものではない。
【００２８】
本発明のその他の特徴および利点は、以下の詳細な説明、ならびに、請求の範囲から明らかになるであろう。
【００２９】
（詳細な説明）
本発明は、既知配列の核酸の機能を決定する方法および材料を提供する。さらに具体的には、本発明は、硬骨魚目において選択核酸からの発現を特異的に減弱することにより、既知配列の選択核酸の機能、または選択核酸に関連する表現型を決定する方法および材料を提供する。本発明は、選択核酸からの発現を特異的に減弱するのに用いることができる配列特異的ポリヌクレオチド類似体と、これら配列特異的ポリヌクレオチド類似体を用いて、選択核酸からの発現を減弱する方法とを提供する。例えば、本発明は、モルホリノ修飾ポリヌクレオチドと、これらモルホリノ修飾ポリヌクレオチドを用いて、配列がわかっている選択核酸の発現を減弱する方法とを提供する。発現の減弱は、生産される特定のＲＮＡまたはポリペプチドのレベル、ならびに、形態的またはその他の表現型の変化に反映される。選択核酸の機能、または選択核酸に関連する表現型は、生物における配列特異的ポリヌクレオチド類似体の存在と関連する形態的またはその他の表現型改変を調べることにより、決定することができる。
【００３０】
１．ポリヌクレオチドおよびポリヌクレオチド類似体
ポリヌクレオチドは、ヌクレオチドと呼ばれる単量体サブユニットから構成される線状ポリマーである。ヌクレオチドは、次の３つの成分：リン酸基、有機塩基、およびリン酸機と有機塩基とを連結する５炭糖からなる。ポリヌクレオチドのヌクレオチドサブユニットは、リン酸ジエステル結合により連結されている、すなわち、１ヌクレオチドの５炭糖が、隣接ヌクレオチドのリン酸とのエステル結合を形成する。こうして得られた糖−リン酸は、ポリヌクレオチドのバックボーンを形成するのに対し、有機塩基は、ポリヌクレオチドの配列を決定して、第２のポリヌクレオチドとの相互作用を可能にする。１ポリヌクレオチドの塩基の配列が、第２ポリヌクレオチドの塩基の配列と相補的であるとき、２つのポリヌクレオチドはアニーリングし、水素結合と疎水的相互作用によって共に保持される二重らせんを形成することができる。１ポリヌクレオチドの塩基が、水素結合により、ワトソン−クリック型塩基対の法則に従って、第２ポリヌクレオチドの塩基と対合することができれば、２つのポリヌクレオチドは相補的配列を有すると言える（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ ＢｉｏｌｏｇｙのＤＮＡ、Ｄａｒｎｅｌｌら（１９９０）Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｂｏｏｋｓ、第２版、６８−７４ページ参照）。２つのポリヌクレオチド間の相互作用の強度は、相補性の度合いによって決定される。例えば、２つのポリヌクレオチド間の相互作用の強度は、塩基配列が１００％相補的であれば、最大となる。４％、８％、１６％、２５％または２５％以上のミスマッチ塩基と共に、２つのポリヌクレオチド間に形成された二重らせんは、順に強度が弱くなり、順に低い温度で分離する。本明細書で用いる用語「ポリヌクレオチド」とは、少なくとも３つのヌクレオチドを有するＤＮＡまたはＲＮＡポリマーを意味する。
【００３１】
ポリヌクレオチド類似体は、化学的に修飾されたポリヌクレオチドである。典型的には、ポリヌクレオチド類似体は、選択核酸との塩基対合が維持されるように、ポリヌクレオチドの５炭糖−リン酸バックボーンの全部または部分を別の官能基で置換することによって、形成される。本明細書で用いる用語「選択（された）核酸」とは、ポリヌクレオチド類似体と相補的な領域を有するＤＮＡまたはＲＮＡを意味する。ポリヌクレオチド類似体がアニーリングし、生理学的条件下で、選択核酸と安定した二重らせんを形成する限り、ポリヌクレオチド類似体と相補的な選択核酸の領域は、全ポリヌクレオチド類似体配列と、１００％以下相補的であり得る。例えば、２５ヌクレオチドのポリヌクレオチド配列は、ポリヌクレオチド全体に分布する３つもの非相補的塩基を有していても、選択核酸とアニーリングすることができる。
【００３２】
ポリヌクレオチド類似体の例として、下記のものが挙げられる：塩基が、ポリビニルバックボーンにより連結されている類似体（Ｐｉｔｈａら（１９７０）Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ ２０４：３９およびＰｉｔｈａら（１９７０）Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ ９： ９６５）；塩基が、擬ペプチド２−アミノエチル−グリシン基により形成されたアミド結合によって連結されているペプチド核酸（ＰＮＡ）；ヌクレオシドサブユニット（すなわち、塩基と糖）が、メチルリン酸基によって連結されている類似体（Ｍｉｌｌｅｒら（１９７９）Ｂｉｏｃｈｅｍ １８： ５１３４；Ｍｉｌｌｅｒら（１９８０）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２５５： ６９５９）；ヌクレオシドサブユニットを連結するリン酸残基が、ホスホロアミデート基で置換されている類似体（Ｆｒｏｅｈｌｅｒら（１９８８）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ １５６： ４８３１）；ホスホロチオエート化ＤＮＡ、すなわち、２’ Ｏ−メチル基を有する糖成分を含む類似体（Ｃｏｏｋ（１９９８）第２章：Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｉｎ Ｔｈｅ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ． Ｓｐｒｉｎｇｅｒ、ニューヨーク、５１−１０１ページ）；およびモルホリノ修飾類似体、すなわち、塩基が、モルホリノ−ホスホロアミデートバックボーンによって連結されている類似体（米国特許第５，１４２，０４７号および第５，１８５，４４４号）。ポリヌクレオチド類似体は、市販のものを入手することができ、市販の単量体サブユニットを用いて作製しても、また公知の方法を用いて合成してもよい（ＢｒａａｓｃｈおよびＣｏｒｅｙ（２００１）Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ、１−７ページ）。
【００３３】
有用なポリヌクレオチド類似体は、配列特異的な様式で、選択細胞核酸と二重らせんを形成することができ、（２）イオン濃度に比較的不感受性で、細胞の鎖分離機構に対する耐性が比較的高い二重らせんを形成し、（３）ヌクレアーゼ感受性が低く、しかも（４）細胞毒性および非特異的効果が低いものである。有用なポリヌクレオチド類似体は、典型的には特異的で、生物のほとんどまたは全ての細胞にわたって均一に分布することができ、多数または全ての細胞タイプで機能的であり、様々な核酸からの発現を減弱するのに効率的であり、かつ、非特異的効果がほとんどまたは全くない。さらに、使用方法は、簡単に実施することができ、しかも再現性がある。
【００３４】
典型的には、有用なポリヌクレオチド類似体は一本鎖で、８〜１１２塩基以上の様々な長さのものでよい。ポリヌクレオチド類似体の長さは、１２〜７２塩基でよい。例えば、ポリヌクレオチド類似体の長さは、１５〜４５塩基でよい。理想的には、ポリヌクレオチド類似体の長さは、１８〜３０塩基である。
【００３５】
有用なポリヌクレオチド類似体の１つは、センスまたはアンチセンス核酸と相補的である。センス核酸と相補的である場合に、ポリヌクレオチド類似体はアンチセンスであると言える。アンチセンス核酸と相補的である場合には、ポリヌクレオチド類似体は、センスであると言える。核酸は、ＲＮＡ（例えば、前駆ｍＲＮＡもしくはｍＲＮＡ）またはＤＮＡのいずれでもよい。例えば、有用なポリヌクレオチド類似体は、前駆ｍＲＮＡまたはｍＲＮＡ分子にアンチセンスであるか、あるいは、ｍＲＮＡが転写されるＤＮＡ分子にセンスであるかのいずれでもよい。
【００３６】
有用なポリヌクレオチド類似体の１つは、核酸の非コード領域と相補的である。非コード領域は、例えば、ＤＮＡ分子における転写開始点の上流領域または転写終結点の下流領域である。また、非コード領域は、前駆ｍＲＮＡまたはｍＲＮＡ分子における転写開始コドンの上流領域または終結コドンの下流領域であってもよい。非コード領域はまた、前駆ｍＲＮＡ内のイントロン配列でもよい（ＥｋｋｅｒおよびＬａｒｓｏｎ（２００１）Ｇｅｎｅｓｉｓ ３０：８９〜９３参照）。さらに、有用なポリヌクレオチド類似体は、前駆ｍＲＮＡ分子またはｍＲＮＡ分子のコード領域、あるいは、アンチセンスＤＮＡ鎖上のコード領域に対応する領域に相補的である。本明細書で用いる用語「コード配列」とは、細胞機能を有するＲＮＡ分子またはポリペプチドをコードするＤＮＡまたはＲＮＡの領域を意味する。また、有用なポリヌクレオチド類似体の１つは、選択核酸のコードおよび非コード領域の両方に相補的である。選択核酸のコードおよび非コード領域の両方に相補的であるポリヌクレオチド類似体は、例えば、開始コドンに至るまでの５’非翻訳領域の部分と、開始コドンと、選択ｍＲＮＡの開始コドンのすぐ後のコード配列とを含んでなる領域と相補的な類似体である。選択核酸のコードおよび非コード領域の両方に相補的であるポリヌクレオチド類似体にはまた、選択された前駆ｍＲＮＡのイントロン／エキソン結合部と相補的なものも含まれる（ＥｋｋｅｒおよびＬａｒｓｏｎ（２００１）Ｇｅｎｅｓｉｓ ３０：８９〜９３参照）。
【００３７】
２．発現の減弱
ポリヌクレオチド類似体を用いて、既知配列の選択核酸からの発現を減弱することができる。本明細書で、核酸からの発現に関して用いる「減弱」または「減弱する」という用語は、ＲＮＡレベル、タンパク質レベルおよび表現型の変化を評価することによって、検出できる量の発現の減少、または発現を減少させることを意味する。例えば、減弱とは、５％、１０％、２５％、５０％、７５％、または７５％を上回る発現減少を意味し得る。発現の減弱はまた、核酸からの発現の９５％を上回る減弱が達成されるような、発現の完全な阻害も含む。
【００３８】
本明細書で、遺伝子の発現、または核酸からの発現に関して用いる「発現」という用語は、ＤＮＡ分子からの機能的ＲＮＡ分子の生産、ならびに、ｍＲＮＡ分子からの機能的ポリペプチドの生産を意味する。選択核酸からの発現は、当技術分野では公知の標準的方法を用いて、検査することができる。例えば、ＲＭＡレベルは、適切な核酸ハイブリダイゼーションプローブを用いて、ノーザンハイブリダイゼーションおよびｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションにより決定することができ、また、ポリペプチドレベルは、抗体染色およびウエスタンハイブリダイゼーションにより決定することができる。選択核酸の発現の減弱に影響を受ける器官、分化組織、およびその他の細胞構造の発生は、各種方法を用いて評価することができる。例えば、血管系は、ＦＩＴＣ−デキストランインジェクションで視覚化することができ；軟骨は、アルシアンブルー（Ａｌｃｉａｎ Ｂｌｕｅ）染色を用いて視覚化することができ；筋肉は、蛍光−ファロイジン染色を用いて視覚化することができる。あるいは、組織特異的遺伝子の発現を用いて、器官、分化組織、および特定の細胞構造の発生を評価することができる。例えば、Ｒａｇ−１のような胸腺特異的マーカーの発現を用いて、胸腺の発生を評価することができ； Ｆｓｐｏｎｊｉｎやｉｓｌｅｔ−１のような膵臓特異的マーカーの発現を用いて、膵臓の発生を評価することができる（標準的方法については、下記を参照：Ｈ． Ｗ． Ｄｅｔｒｉｃｈ ＩＩＩ， Ｍ． Ｗｅｓｔｅｒｆｉｅｌｄ、およびＬ． Ｉ． Ｚｏｎ， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ第５９巻：Ｔｈｅ Ｚｅｂｒａｆｉｓｈ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ． Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ）。
【００３９】
核酸からの発現は、（１）ＲＮＡ転写に必要ないずれかのプロセス、（２）ＲＮＡプロセシング、（３）核膜を横切るＲＮＡ輸送、（４）ＲＮＡ翻訳に必要ないずれかのプロセス、または（５）ＲＮＡ分解を妨害することにより、減弱することができる。
【００４０】
ＤＮＡ分子のような核酸からの発現は、機能的ＲＮＡ分子の形成に必要なプロセス、または細胞質へのＲＮＡの輸送を妨害することにより、減弱することができる。機能的ＲＮＡ分子の形成に必要なプロセスとしては、例えば、ＲＮＡポリメラーゼとプロモーター領域の結合、転写アクチベーターとその認識配列の結合、ならびに、転写が挙げられる。ＤＮＡにアニーリングして、機能的ＲＮＡ分子の形成に必要なプロセスを妨害するポリヌクレオチド類似体は、一般に（必ずというわけではないが）、ｍＲＮＡが転写されるアンチセンスＤＮＡ鎖と相補的な配列を有する。このようなポリヌクレオチド類似体を「アンチジーン（ａｎｔｉｇｅｎｅ）」分子と呼ぶ。
【００４１】
ＲＮＡ分子のような核酸からの発現は、機能的ＲＮＡ分子の形成に必要ないずれかのプロセス、または機能的ポリペプチドへのｍＲＮＡ分子の適正な翻訳を妨害することにより、減弱することができる。ＲＮＡ分子からの発現は、例えば、ＲＮＡプロセシング、リボソームとｍＲＮＡのリボソーム結合部位との結合の妨害、翻訳開始の妨害、翻訳プロセスの妨害、または翻訳の適正な終結の妨害により、減弱することができる（ＥｋｋｅｒおよびＬａｒｓｏｎ（２００１）Ｇｅｎｅｓｉｓ ３０：８９−９３ならびにＮａｓｅｖｉｃｉｕｓおよびＥｋｋｅｒ（２００１）Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ ｉｎ Ｍｏｌ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ ３：２２４）。ｍＲＮＡ分子の領域にアニーリングして、翻訳を妨害するポリヌクレオチド類似体は、ｍＲＮＡ分子の領域と相補的な配列を有し、アンチセンス分子と呼ばれる。アンチセンス分子は、例えば、結合し、４０ｓリボソームサブユニットによりｍＲＮＡのスキャニングを立体的に阻害することができる。アンチセンス分子はまた、同種ｍＲＮＡを分解する細胞ヌクレアーゼ系を誘導することにより、発現を減弱することができる。ＲＮアーゼＨ依存性機構では、形成される二本鎖ｍＲＮＡ／アンチセンスＲＮＡは、ＲＮアーゼＨにより分解される。
【００４２】
選択核酸からの発現の減弱は、１種のポリヌクレオチド類似体を用いて達成することができる。選択核酸からの発現の減弱はまた、同じ選択核酸の異なる領域と相補的な２種以上のポリヌクレオチド類似体を用いて達成することができる。２種以上のポリヌクレオチド類似体を用いて選択核酸からの発現を減弱する場合には、ポリヌクレオチド類似体は、選択核酸の非重複領域または重複領域と相補的であってよい。非重複の場合には、ポリヌクレオチド類似体は、０、１、２、５、１０、２５、５０、１００、５００、１，０００、または１，０００を超えるヌクレオチド離れた選択核酸の領域と相補的でよい。
【００４３】
２種以上のポリヌクレオチド類似体を用いて選択核酸からの発現を減弱する場合には、２種以上のポリヌクレオチド類似体は、生物の表現型に加法的または相乗的効果をもたらすことができる。選択生物へのポリヌクレオチド類似体の導入によって得られる表現型を、本明細書では、ポリヌクレオチド類似体が媒介する表現型と呼ぶ。２種以上の類似体の効果は、例えば、類似体が媒介する表現型の浸透度に基づいて、加法的または相乗的であると表現することができる。２種以上の類似体の効果が、加法的または相乗的のいずれであるかを決定するのに用いる浸透度は、使用する各ポリヌクレオチド類似体の１Ｘ用量について測定される度数である。本明細書において使用する浸透度とは、特定の類似体と接触させたとき、特定の表現型を呈示する生物の百分率である。例えば、１００の生物を類似体１と接触させて、これらのうち８０が表現型１を呈示したとすると、浸透度は８０％である。類似体の１Ｘ用量は、５０％より低い浸透度を達成するのに必要などんな量でもよい。類似体の１Ｘ用量を決定するには、関心のある類似体の各々について、用量応答曲線を作製する。用量応答曲線から、最小限の有毒作用で、５０％より低い浸透度を達成する類似体の量を１Ｘ用量として用いることができる。２種の類似体をそれぞれ１Ｘ用量ずつ用いて得られた浸透度が、個々の１Ｘ用量での類似体の浸透度の和と等しい場合には、２種の類似体は加法的効果を有すると考えられる。例えば、浸透度が、（１）１Ｘ用量の類似体１で１０％、（２）１Ｘ用量の類似体２で２０％であり、（３）一緒に用いたとき、１Ｘ用量の類似体１と１Ｘ用量の類似体２で３０％であれば、これら２種の類似体は加法的効果を有すると考えられる。これに対し、２種の類似体をそれぞれ１Ｘ用量ずつ用いて得られた浸透度が、個々の１Ｘ用量での類似体の浸透度の和より大きい場合には、２種の類似体は相乗的効果を有すると考えられる。例えば、浸透度が、（１）１Ｘ用量の類似体１で１０％、（２）１Ｘ用量の類似体２で２０％であり、（３）一緒に用いたとき、１Ｘ用量の類似体１と１Ｘ用量の類似体２で９０％であれば、これら２種の類似体は相乗的効果を有すると考えられる。
【００４４】
また２種以上の類似体の効果は、制限するものではないが、使用する類似体の各々が媒介する「個々の表現型の和」と比較した、複数の類似体が媒介する表現型の強度（ｓｅｖｅｒｉｔｙ）に基づいて、加法的または相乗的であると表現することができる。「個々の表現型の和」である表現型は、各類似体の加法的効果によって得られるものである。２種以上の類似体が媒介する表現型が、「個々の表現型の和」より強い（ｓｅｖｅｒｅ）場合には、これら類似体は、相乗的効果を有すると考えられる。例えば、（１）類似体１に接触させた生物の１００％が、血管形成に１０％減弱を呈示し、（２）類似体２に接触させた生物の１００％が、血管形成に２０％減弱を呈示し、（３）類似体１および類似体２に接触させた生物の１００％が、血管形成に９０％減弱を呈示した場合には、２種の類似体は相乗的効果を有すると考えられる。この例では、血管形成の減弱の百分率は、ポリヌクレオチド類似体が媒介する表現型の強度である。これに対し、２種の類似体が媒介する表現型が、「個々の表現型の和」より強くない場合には、これら類似体は、生物の表現型に対して加法的効果を有すると考えられる。例えば、（１）類似体１に接触させた生物の１００％が、血管形成に１０％減弱を呈示し、（２）類似体２に接触させた生物の１００％が、血管形成に２０％減弱を呈示し、（３）類似体１および類似体２に接触させた生物の１００％が、血管形成に３０％減弱を呈示した場合には、２種の類似体は相乗的効果を有すると考えられる。
【００４５】
場合によっては、類似体がターゲティングする核酸からの発現の減弱の程度によって表現型強度を測定することもできる。発現の減弱量を標準的方法により定量化した後、比較して、２種以上の類似体が発現の減弱に対して加法的または相乗的効果のいずれを有するかを決定することができる。
【００４６】
２種の類似体の相乗作用の有用な測度は、相乗係数である。本明細書で用いる用語「相乗係数」とは、２種以上の類似体で観測された表現型の浸透度、または強度を、期待される加法的浸透度または「個々の表現型の和」でそれぞれ割ったものとして定義される。双方の類似体を用いて（各々１Ｘ用量で）得られた実際の浸透度と、加法的効果から期待される浸透度を比較することにより、相乗係数を決定することができる。例えば、浸透度が、（１）１Ｘ用量の類似体１で１０％、（２）１Ｘ用量の類似体２で２０％、（３）一緒に用いたとき、１Ｘ用量の類似体１と１Ｘ用量の類似体２で９０％である場合には、相乗係数は３（９０％／３０％）である。相乗係数はまた、２種以上の類似体を用いる場合、観測された表現型の強度を「個々の表現型の和」と比較することにより、決定することもできる。例えば、（１）類似体１に接触させた生物の１００％に、血管形成の１０％減弱が認められ、（２）類似体２に接触させた生物の１００％に、血管形成の２０％減弱が認められ、（３）類似体１および類似体２に一緒に接触させた生物の１００％に、血管形成の９０％減弱が認められた場合には、相乗係数はまた３（９０％／３０％）である。相乗係数は、２種以上のポリヌクレオチド類似体について決定することができる。例えば、相乗係数は、２、３、または３種より多い類似体について決定することができる。相乗係数は、０より大きい任意の値でありうる。例えば、相乗係数は、０．２、０．４、０．８、１．５、２、４、６、８、１０、１５、２０、または２０より大きくあってよい。特定の類似体群の相乗係数が１より大きい値、例えば、１．２、１．５、１．８、２．１、５、１０、２０、または２０より大きいとき、相乗的効果が示される。相乗係数１は、加法的効果を示す。０〜１の相乗係数は、干渉効果を示す。
【００４７】
またポリヌクレオチド類似体を用いて、生物における２種以上の異なる選択核酸からの発現を減弱することもできる。例えば、複数の選択核酸と相補的な配列を有する複数（すなわち、少なくとも２種）のポリヌクレオチド類似体を用いて、選択核酸からの発現を減弱することができる。２種以上のポリヌクレオチド類似体を用いて、２種以上の核酸からの発現を減弱すると、様々な核酸の発現減弱により、２つのクラスの表現型が生じうる。第１のクラスが、用いた類似体各々が媒介する「個々の表現型の和」を表すのに対し、第２のクラスは、第１クラスに入らない表現型から構成される。「個々の表現型の和」である表現型は、各類似体の加法的効果から得られたものである。複数のポリヌクレオチド類似体の加法的効果は、１つの選択核酸をターゲティングする複数のポリヌクレオチド類似体について表現されるものである。また２種以上の類似体と接触させた生物も、各類似体が媒介する個々の表現型が別個に、その生物に存在する場合には、「個々の表現型の和」である表現型を有するものとして表現される。あるいは、２種以上の類似体に接触させた生物が、「個々の表現型の和」とはみなされない表現型を呈示する場合がある。これらの生物は、「個々の表現型の和」である表現型より程度が大きい、もしくは小さい、または、それとは明らかに異なる表現型を呈示する。典型的には、「個々の表現型の和」ではない表現型は、複数の類似体の相乗的または干渉効果を呈示する。
【００４８】
「他の表現型の和」を呈示するもの、または「個々の表現型の和」である表現型とは明らかに異なるものを加法的、相乗的、干渉とみなすためには、ポリヌクレオチド類似体が媒介する表現型が、配列特異的でなければならない、すなわち、表現型が、選択核酸からの発現の配列特異的減弱から得られるものでならなければならない。
【００４９】
３．発現の配列特異的減弱の測定
表現型が、選択核酸からの発現の減弱に主としてまたは排他的に関連する、またはその結果生じたものであれば、ポリヌクレオチド類似体が媒介する表現型は「配列特異的」であると言える。ポリヌクレオチド類似体が媒介する表現型が配列特異的であるか否かを決定するためには、同じ核酸をターゲティングする非関連配列の第２のポリヌクレオチド類似体を用いることができる。あるいは、同じ核酸をターゲティングしない対照ポリヌクレオチド類似体または選択核酸からの発現減弱を補うレスキュー（ｒｅｓｃｕｅ）ｍＲＮＡを用いることもできる。
【００５０】
第１のポリヌクレオチド類似体が媒介する表現型が配列特異的であることを明らかにするために、また同じ選択核酸をターゲティングする第２のポリヌクレオチド類似体をモデル生物に導入する。第２のポリヌクレオチド類似体が媒介する表現型が、第１のポリヌクレオチド類似体が媒介する表現型と同じであれば、いずれのポリヌクレオチド類似体が媒介する表現型も配列特異的であることを示している。
【００５１】
あるいは、また対照ポリヌクレオチド類似体を用いて、第１のポリヌクレオチド類似体が媒介する表現型が配列特異的であることを確認することもできる。対照ポリヌクレオチド類似体は、第１のポリヌクレオチド類似体と配列がいくらか類似している。しかし、対照ポリヌクレオチド類似体は、第１のポリヌクレオチド類似体とは塩基数が違っているため、対照ポリヌクレオチド類似体が十分に相補的ではなく、従って、第１のポリヌクレオチド類似体がターゲティングする選択核酸とアニーリングしないだろう。従って、対照ポリヌクレオチド類似体が媒介する表現型は全く認められない。対照ポリヌクレオチド類似体を用いたとき、第１のポリヌクレオチド類似体が媒介する表現型が認められない場合には、第１のポリヌクレオチド類似体が媒介する表現型が配列特異的であることを示している。対照ポリヌクレオチド類似体が媒介する表現型が認められる場合には、第１のポリヌクレオチド類似体が媒介する表現型が、配列特異的であると決定することはできない。
【００５２】
さらに、ポリヌクレオチド類似体により発現を減弱するポリペプチドをコードするレスキューｍＲＮＡを用いて、ポリヌクレオチド類似体が媒介する表現型が配列特異的であることを示すこともできる。ポリヌクレオチド類似体が媒介する表現型を呈示する生物に、レスキューｍＲＮＡを導入する。ポリヌクレオチド類似体が媒介する表現型ではなく、野生型表現型が回復すれば、ポリヌクレオチド類似体が媒介する表現型が配列特異的であることを示している。レスキューｍＲＮＡにより、または非関連配列の第２モルホリノを用いたターゲティングにより配列特異的であることが確認された、モルホリノ修飾ポリヌクレオチド類似体が媒介する表現型は、モルファント表現型と呼ばれる。本明細書で用いる用語「モルファント」とは、モルホリノ修飾ポリヌクレオチド類似体が媒介する配列特異的表現型を呈示する生物を意味する。
【００５３】
４．ポリヌクレオチド類似体の適用
ポリヌクレオチド類似体を用いて、既知配列の選択核酸のコード配列の機能、またはそれに関連する表現型を決定することができる。核酸は、母系または接合体核酸のいずれでもよく、いずれかの生物学的プロセス、例えば、胚形成および発生、遺伝子発現、遺伝子発現の調節、特定の分化組織の形成、細胞シグナリング、ならびに、（１）胚形成および発生、（２）遺伝子発現およびその調節、（３）分化組織の形成、および（４）細胞シグナリングに必要な代謝プロセスに関与するものでよい。関心のある核酸はまた、疾病状態と関連するものである。疾病状態と関連する核酸は、発現の減弱により、疾病状態を引き起こす、または疾病状態を改善するものでありうる。疾病状態は、ポリペプチド、核酸、脂質、任意の細胞内もしくは細胞外分子または化合物、ならびに、細胞分子のリン酸化および非リン酸化形態のようなバイオマーカーのレベルの任意の変化、例えば、増加または減少によって起こり得る。疾病状態は、例えば、核酸の過剰発現、または核酸の突然変異した形態の発現、従って、異常活性を有する産物の形成によって起こると考えられる。
【００５４】
既知配列の選択核酸のコード配列の機能、またはそれに関連する表現型を決定するために、選択核酸の配列と相補的な配列を有するポリヌクレオチド類似体を合成する。選択核酸の配列と相補的な配列を有するように設計されたポリヌクレオチド類似体は、選択核酸を「ターゲティング」すると言える。ポリヌクレオチド類似体を生物に導入する場合には、選択核酸からの発現および関連表現型へのポリヌクレオチド類似体の効果を調べる。
【００５５】
ポリヌクレオチド類似体を用いる機能的研究に有用な生物は、選択核酸を発現する細胞において、ポリヌクレオチド類似体が均一に分布し、かつ、選択核酸からの発現を阻害することができるような生物である。生物は、受精卵または非受精卵、培養中の細胞、胚、または幼生もしくは成体動物でよい。動物としては、例えば、魚、カエル、マウス、モルモット、ヒツジ、チンパンジー、またはヒトが挙げられうる。ポリヌクレオチド類似体を用いる機能的研究には、部分割を経る硬骨魚目卵および胚などの脊椎生物を用いることができる。卵割とは、受精卵が多細胞の胚に変わる際、高速に連続して起こる一連の有糸分裂を意味する。多細胞胚は、割球を呼ばれるより小さな有核細胞からなる。部分割では、卵の一部のみが割球に再分割され、卵全体が割球に再分割される全割を経る生物とは対照的である。部分割から発生する割球は、卵の残る非分割細胞質と連続している（Ｂａｌｉｎｓｋｙら（１９８１）Ｃｌｅａｖａｇｅ， Ａｎ Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｅｍｂｒｙｏｌｏｇｙ， 第５版、ＣＢＳ Ｃｏｌｌｅｇｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ， １３５−１５２ページを参照）。部分割を経て、従って、ポリヌクレオチド類似体を用いる核酸の機能的研究に有用なモデル生物である脊椎生物の例としては、ゼブラフィッシュ、メダカ、フグ、およびトゲウオの卵および胚が挙げられる。
【００５６】
ポリヌクレオチド類似体を用いて、既知配列であるが、機能は未知の任意の核酸の機能、またはそれに関連する表現型を決定することができる。この核酸は、モデル生物に存在するものでも、または存在しないものでもよい。既知配列であるが、機能は未知の任意の核酸の機能、またはそれに関連する表現型を決定するために、モデル生物に存在する相同体、オーソログ、またはパラログの配列を用いる。相同体とは、ヌクレオチドまたはアミノ酸配列の比較によって同定することができる類似ドメインまたは構造を有するポリペプチドをコードする核酸を意味する。相同体はまた、類似した活性を有するものでもよい。オーソログは、異なる種に由来する相同体であるのに対し、パラログは、異なる発現パターン、従って、異なる生物学的役割を有する一生物内の相同体を意味する。相同体、オーソログ、またはパラログの既知配列から、該相同体、オーソログ、またはパラログをターゲティングするポリヌクレオチド類似体を作製する。上記相同体、オーソログ、またはパラログをターゲティングするポリヌクレオチド類似体をモデル生物に導入し、相同体、パラログ、またはオーソログの発現の減弱に関連する表現型について、生物を評価する。認められた表現型から、相同体、パラログ、またはオーソログの機能を決定し、次に、生物の特定の生物学的態様における、新しく発見した核酸の機能またはその関与を推定することができる。
【００５７】
また、ポリヌクレオチド類似体を用いて、２種の核酸が、遺伝的相互作用因子（ｉｎｔｅｒａｃｔｏｒ）であるか、または遺伝的相互作用因子をコードするか否かを決定することができる。本明細書で用いる用語「遺伝的相互作用因子」とは、共通の代謝プロセスで機能する核酸またはポリペプチドを意味する。本明細書で用いる用語「代謝プロセス」とは、（１）胚形成および発生、（２）遺伝子発現およびその調節、（３）分化組織の形成、（４）細胞シグナリング、ならびに（５）その他の任意の細胞および生理学的プロセスに関与する代謝プロセスの特定セットを意味する。遺伝的相互作用因子としては、例えば、ＤＮＡもしくはＲＮＡのような核酸、または核酸によりコードされるポリペプチドが挙げられうる。遺伝的相互作用因子は、直接または間接的に相互作用することができる。
【００５８】
２種の異なる核酸が、遺伝的相互作用因子であるか、または遺伝的相互作用因子をコードするか否かを決定するために、２種の核酸をターゲティングするポリヌクレオチド類似体を用いて、核酸からの発現を減弱することができる。双方のポリヌクレオチド類似体が媒介する配列特異的表現型を、ポリヌクレオチド類似体の各々が媒介する配列特異的表現型と比較する。２種の異なる核酸が遺伝的相互作用因子である場合には、双方の類似体が媒介する表現型は、上記類似体の各々が媒介する「個々の表現型の和」とは異なると期待される。すなわち、ターゲティングされた核酸が、遺伝的相互作用因子である２種のポリペプチドをコードする場合には、生物において双方の核酸からの発現の減弱によって、個々の核酸が媒介する表現型に対する相乗的効果、または「個々の表現型の和」とは明らかに異なる表現型のいずれかが起こるだろう。これに対し、双方の核酸からの発現の減弱によって、「個々の表現型の和」である表現型が得られる場合には、ターゲティングされた核酸は、遺伝的相互作用因子ではない２種のポリペプチドをコードする。
【００５９】
同様に、またポリヌクレオチド類似体を用いて、疾病研究のためのモデル生物を作製することができる。モデル生物が相同的またはオーソロガス核酸を有する場合には、ポリヌクレオチド類似体を用いて、ヒトなどの高等生物における特定の核酸の機能の喪失または減弱に関連する疾病状態を、モデル生物に発生させることができる。例えば、モデル生物において相同体またはオーソログをターゲティングするポリヌクレオチド類似体を作製し、これをモデル生物に導入する。相同体またはオーソログの発現減弱により、疾病状態を呈示するモルファント生物が得られる。疾病状態を呈示するモルファントを用いて、疾病状態を治療するまたは疾病状態の重篤度を軽減するのに有用な化合物をスクリーニングすることができる。疾病状態を治療するまたは疾病状態の重篤度を軽減するのに有用な化合物をスクリーニングするために、疾病状態を呈示するモルファントを候補化合物と接触させた後、疾病状態が軽減しているか否かを決定するために評価することができる。
【００６０】
また、ポリヌクレオチド類似体を用いて、疾病状態と関連することがわかっていない核酸を同定することができる。疾病状態と関連することがわかっていない核酸を同定するために、様々なポリヌクレオチド類似体を野生型生物に導入し、任意の特定の疾病状態を呈示するモルファントをさらなる分析用に選択する。例えば、ポリヌクレオチド類似体のコレクションを用いて、モルファントのコレクションを作製することができる。特定の疾病状態を呈示するモルファントを用いて、薬剤標的を同定すると共に、疾病状態の新規治療法を開発することができる。潜在的薬剤は、例えば、発現の減弱により、疾病状態を引き起こした核酸として同定される。特定の疾病状態を呈示するモルファントを用いて、既述した特定の疾病状態の新規治療法をスクリーニングすることができる。
【００６１】
過剰な活性により、疾病状態を引き起こす核酸を同定するために、この疾病状態を呈示する生物にポリヌクレオチド類似体を導入する。ポリヌクレオチド類似体によって疾病状態が軽減した生物をさらに試験することにより、発現が減弱した核酸を同定する。これらの核酸は、特定の疾病の新規治療法の開発の有用な標的として同定される。
【００６２】
ポリヌクレオチド類似体はまた、疾病状態に対する治療として治療的に用いることができる。例えば、ポリヌクレオチド類似体を用いて、特定の核酸の過剰発現または病原（ｃｕｌｐｒｉｔ）核酸の発現に関連する疾病状態を治療することができる。例えば、同じ病原核酸をターゲティングし、かつ、疾病表現型を軽減するのに相乗的効果を有する複数のポリヌクレオチド類似体は、類似体の使用量がより少なくすることができるため、１種の類似体を用いた治療に伴なう毒性を回避するのに有用でありうる。
【００６３】
５．モルホリノ修飾ポリヌクレオチド類似体／ゼブラフィッシュ系
既知配列の選択核酸に関連する機能または表現型を決定するのに有用な系の例は、モルホリノ修飾ポリヌクレオチド類似体／ゼブラフィッシュ系である。
【００６４】
モルホリノ（モルホリノ修飾ポリヌクレオチド類似体）は、既知の内因性酵素分解活性を一切被らない。モルホリノは、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよび組織培養の双方で、ｍＲＮＡと結合し、その翻訳を阻止することがわかっている（Ｓｕｍｍｅｒｔｏｎ（１９９０）Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ １４８９：１４１−１５８；ＳｕｍｍｅｒｔｏｎおよびＷｅｌｌｅｒ（１９９７）Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖ ７：１８７−１９５）。この手法により、モルホリノターゲティングは、ポリヌクレオチド設計について高度な推定が可能になり、非特異的効果が有意に減弱する。これとは対照的に、伝統的なアンチセンスポリヌクレオチド手法は、ＲＮアーゼＨに基づくｍＲＮＡの分解を作用機構として利用する。しかし、ＲＮアーゼＨ媒介ストラテジーの試みは、わずかにしか成功していない（Ｂａｒａｂｉｎｏら（１９９７）Ｍｅｃｈ Ｄｅｖ ６３：１３３−１４３）。さらに、魚では、一本鎖ポリヌクレオチドは、有毒である傾向にあるか、あるいは、生物の全細胞にわたる均一な分布を達成する能力がない。
【００６５】
以下の節では、ゼブラフィッシュにおけるモルホリノの使用を説明する例により、これらの化合物が、（１）配列特異的であり、かつ（２）ターゲティング遺伝子「ノックダウン」物質として、Ｆ０ゼブラフィッシュ胚における少なくとも発生の最初の５０時間は、全細胞において極めて有効であることを明らかにする。このゼブラフィッシュ胚発生期間は、脊椎動物の分割および器官形成の基本的プロセスを含む。このツールは、労力を要し、時間がかかり、しかも高価なＦ３脊椎動物遺伝子試験を必要とせずに、配列特異的遺伝子ターゲティング研究を追跡する機会を提供する。従って、モルホリノは、脊椎動物の機能的ゲノミックス応用のための高処理量Ｆ０脊椎動物アッセイ系を提供する。
【００６６】
モルホリノに基づく遺伝子ターゲティングの使用は、優れたゼブラフィッシュ発生学と併せて、脊椎動物生物学者の遺伝子レパートリーに新規のツールを提供し、同様に保存されている発生プロセスの遺伝子機能の研究に極めて有用である。
【００６７】
６．投与方法
ポリヌクレオチド類似体は、一本鎖ｍＲＮＡをモデル生物に導入するのに用いられている方法によって、モデル生物に導入することができる（ＨｙａｔｔおよびＥｋｋｅｒ（１９９９）Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ ｂｉｏｌｏｇｙ ５９：１１７−１２６を参照）。送達方法の例としては、（１）マイクロインジェクションと、（２）モデル生物をポリヌクレオチド類似体に単純に暴露することが挙げられる。ポリヌクレオチド類似体は、水または好適なバッファー中で送達することができる。好適なバッファーは、ポリヌクレオチド類似体を溶解させることができ、かつ、ポリヌクレオチド類似体を送達しようとするモデル生物に対して非毒性のバッファーである。非毒性バッファーは、ポリヌクレオチド類似体を送達しようとする生物と等張であるか、またはその生理学的ｐＨと類似したｐＨを有するものでよい。生物と等張であるバッファーは、生物と同じ浸透性を有するものである。例えば、ダニウ（Ｄａｎｉｅａｕ）溶液は、モデル生物のゼブラフィッシュと等張である。生物の生理学的ｐＨと類似したｐＨは、生物のｐＨより２．５ｐＨ単位前後する範囲にあるものでよい。例えば、ゼブラフィッシュへの送達用に調製するポリヌクレオチド溶液のｐＨは、５、５．４、５．７、６、６．２、６．６、７、７．４、７．８、８、８．６またはこれらの間にあるあらゆる値でよい。
【００６８】
異なるポリヌクレオチド類似体を混合物としてモデル生物に導入することも可能である。あるいは、複数回の暴露またはインジェクションにより、異なるポリヌクレオチド類似体を順次導入することもできる。
【００６９】
７．組成物とキット
本発明は、好適なバッファー中における個々のポリヌクレオチド類似体の組成物を提供する。本発明はまた、薬学上許容される担体中における少なくとも２種のポリヌクレオチド類似体からなる組成物を提供する。
【００７０】
組成物は、投与経路に応じて、錠剤、カプセル、粉末、溶液、懸濁液、またはエマルジョンの形態であることができる。組成物は、無菌の薬学上許容される担体または賦形剤を含んでいてよい。一般的な薬学上許容される担体または賦形剤は、水性または非水性のいずれでもよい。水性担体としては、限定するものではないが、水、アルコール、生理食塩水、および緩衝溶液が挙げられる。非水性担体の例としては、限定するものではないが、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油、および注入可能な有機エステルが挙げられる。また、防腐剤、香味料、糖類、ならびに、抗菌剤、抗酸化剤、キレート剤、不活性ガスなどのその他の添加剤を存在させてもよい。
【００７１】
インジェクションによる投与の場合には、好適な非毒性バッファー、すなわち、選択した生物とｐＨが類似している、等張である、またはｐＨが類似し、かつ等張であるバッファーを用いて、溶液を調製することができる。
【００７２】
経口投与の場合には、以下に挙げる薬学上許容される賦形剤を用いて、通常の手段により、錠剤またはカプセルを調製することができる：結合剤（例えばプレゼラチン化したトウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドンまたはヒドロキシプロピルメチルセルロース）；充填剤（例えば、ラクトース、微晶質セルロースまたはリン酸水素カルシウム）；滑沢剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルクまたはシリカ）；崩壊剤（例えば、ジャガイモデンプンまたはナトリウムデンプングリコレート）；または湿潤剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウム）など。錠剤は、当技術分野で公知の方法によりコーティングすることができる。また、経口投与用の製剤は、ポリヌクレオチド類似体の制御放出を達成するように製剤化することもできる。本発明のポリヌクレオチド類似体のｉｎ ｖｉｖｏでの放出を制御するための賦形剤の例としては、生体適合性で、生体分解性のラクチドポリマー、ラクチド／グリコリドコポリマー、またはポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンコポリマーが挙げられる。
【００７３】
鼻投与の場合には、製剤は、液体溶液、ゲル、または乾燥製品の形態でよい。吸入用製剤は、例えば、ポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル、グリココレートおよびデオキシコレートを含む水溶液でよく、所望であれば、ラクトースのような賦形剤を含んでいてもよい。噴霧化水性懸濁液または水溶液に担体または賦形剤を含有させて、ｐＨおよび／または張性を調節することができる。点鼻剤を油性溶液の形態で投与することができる。
【００７４】
非経口投与の場合には、標準的方法を用いて、水性生理学的バッファー溶液中の液体溶液または懸濁液を所望のように調製することができる。製剤は、一般的な賦形剤ならびに頬側投与にはグリココレートを含有させることができる。好適な非経口送達系としては、エチレン−酢酸ビニルコポリマー粒子、浸透ポンプ、移植可能な注入系、およびリポソームが挙げられる。
【００７５】
本発明はまた、様々なポリヌクレオチド類似体、例えば、モルホリノ修飾ポリヌクレオチドのコレクションを含んでなるキットを提供する。ポリヌクレオチド類似体のコレクションは、生物の全ゲノムの核酸に指向する類似体でよい。ポリヌクレオチド類似体のコレクションはまた、例えば、疾病状態、核酸発現の調節、または一般的代謝、発生、もしくはシグナリング経路などの一般の生物学的プロセスに関与する核酸に指向することができる。
【００７６】
さらに本発明は、様々なポリヌクレオチド類似体のコレクションを用いて作製することができるモルファントのコレクションを提供する。モルファントは、ポルフィリン症（ｐｒｏｐｈｙｒｉａ）または単眼症などのヒト疾病モデルとなり得る。モルファントはまた、分化組織、例えば、血管系、血液、器官、または繊維芽細胞、ニューロン、および上皮細胞のような専門化した細胞タイプに欠陥があるものでもよい。
【００７７】
以下の実施例で、本発明をさらに説明するが、これらの実施例は、特許請求の範囲に記載されている本発明の範囲を何ら制限するものではない。
【００７８】
実施例
実施例１−ゼブラフィッシュ飼育と卵回収
標準的なゼブラフィッシュ飼育プロトコルは、Ｗｅｓｔｅｒｆｉｅｌｄ（１９９５）Ｔｈｅ Ｚｅｂｒａｆｉｓｈ Ｂｏｏｋ：Ａ Ｇｕｉｄｅ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｕｓｅ ｏｆ Ｚｅｂｒａｆｉｓｈ（Ｂｒａｃｈｙｄａｎｉｏ ｒｅｒｉｏ）第３版、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｏｒｅｇｏｎ Ｐｒｅｓｓに記載されている。
【００７９】
ゼブラフィッシュは、２８℃の６．５ガロン（２６リットル）および２０ガロン（７６リットル）のプラスチック製タンク中で飼育した。６．５ガロンのタンクには、２５匹、２０ガロンのタンクには７０匹の魚を入れた。タンクの水は、１５〜４０ｍＬ／分の速度で、炭素ろ過およびＵＶ殺菌した水道水（システムウォーター（ｓｙｓｔｅｍ ｗａｔｅｒ））で常時取り替えた。あるいは、タンクの底からデブリを吸い上げることにより、タンクの水を毎日取り替えた。塩素を放出するための開放（加熱）タンク中に１日以上置いた水道水が適していた。しかし、脱イオン化または蒸留水に、市販の海塩（水１リットル当たり６０ｍｇの「インスタントオーシャン（Ｉｎｓｔａｎｔ Ｏｃｅａｎ）」塩、Ｗｅｓｔｅｒｆｉｅｌｄ（１９９５）Ｔｈｅ Ｚｅｂｒａｆｉｓｈ Ｂｏｏｋ：Ａ Ｇｕｉｄｅ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｕｓｅ ｏｆ Ｚｅｂｒａｆｉｓｈ（Ｂｒａｃｈｙｄａｎｉｏ ｒｅｒｉｏ）第３版、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｏｒｅｇｏｎ Ｐｒｅｓｓを参照）を添加することにより、さらに一貫した条件を得た。１０時間暗所および１４時間明所という１日のサイクルをゼブラフィッシュ飼育設備で維持した。
【００８０】
魚には、毎日２回ブラインシュリンプを給餌した。このエビを用意するため、１００ｍＬのブラインシュリンプ卵を１８Ｌの塩水（１８Ｌの水当たり４００ｍＬの「インスタントオーシャン」塩）に添加し、活発に通気した。２８℃で２日後、エビを細かいネットでろ過し、システムウォーターで洗浄し、システムウォーター中に懸濁させ、魚に給餌した。あるいは、「テトラ（Ｔｅｔｒａ）」商標の乾燥フレーク餌を魚に給餌してもよい。
【００８１】
毎朝日の出後にゼブラフィッシュの産卵を誘発した。卵を回収するため、「偽底容器」系を用いた（Ｗｅｓｔｅｒｆｉｅｌｄ（１９９５）Ｔｈｅ Ｚｅｂｒａｆｉｓｈ Ｂｏｏｋ：Ａ Ｇｕｉｄｅ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｕｓｅ ｏｆ Ｚｅｂｒａｆｉｓｈ（Ｂｒａｃｈｙｄａｎｉｏ ｒｅｒｉｏ）第３版、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｏｒｅｇｏｎ Ｐｒｅｓｓを参照）。この系は、約１．５Ｌの２つの容器から構成され、１つは他方より若干小さかった。小さい方の容器の底をゼブラフィッシュ卵の直径より大きい穴を有するステンレス鋼メッシュに取り換えた。次いで、小さい方の容器を大きい方の容器内に配置し、該装置をシステムウォーターで充填した。小さい方の容器の内側に８匹までのゼブラフィッシュを入れた。魚が産卵したら、卵はメッシュを通過して、大きい方の容器に落下する。従って、魚は卵に到達できないし、これを食べることもできない。産卵には約１０〜１５分を見込み、その後、魚の入った小さい方の容器を別の大きい方の容器に移した。卵の直径より小さい穴を有するメッシュを用いて、卵をろ過することで回収した。毎週１回、魚を用いて最適な胚生産を行った。
【００８２】
実施例２−ゼブラフィッシュおよびアフリカツメガエルの系統
ゼブラフィッシュＥ系統トランスジェニック系統は、Ｅ系統遺伝子座に、ｐＴ−ＥＦ１α−ＧＦＰ−ｐＡトランスポソンの単一コピーを含んでいた（ＮａｓｅｖｉｃｉｕｓおよびＥｋｋｅｒ（２０００）Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ２６：２１６−２２０）。ホモ接合Ｅ系統成体の異系交配からヘテロ接合Ｅ系統胚を取得したが、これは、Ｓ． Ｃ． Ｅｋｋｅｒ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｍｉｎｎｅｓｏｔａ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｈｏｏｌ， Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ， ＭＮ）から入手することもできる。
【００８３】
実施例３−ポリヌクレオチド類似体
Ｇｅｎｅ−Ｔｏｏｌｓ、ＬＬＣ（Ｃｏｒｖａｌｌｉｓ， ＯＲ）から、モルホリノホスホロジアミデートアンチセンスオリゴヌクレオチド（モルホリノすなわちＭＯ）を購入した。ＭＯ配列は、同社が推奨するパラメーターに基づいて設計した。ＭＯは長さが２１〜２５塩基であり、推定される内部ヘアピンは一切なく、約５０％のＧ／Ｃおよび５０％のＡ／Ｔ残基から構成されていた。４つの連続するＧヌクレオチドを有する配列は排除した。ＭＯはすべて、５’非翻訳領域（ＵＴＲ）、または開始メチオニンをコードする配列と隣接する領域、および開始メチオニンをコードする配列を含む領域と結合するように設計した。
【００８４】
ＦＩＴＣ標識１４−ｍｅｒペプチド核酸（ＰＮＡ）をＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから取得した。ローダミン標識２５−ｍｅｒ ＰＮＡは、Ｄ． Ｃｏｒｅｙ博士（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｔｅｘａｓ Ｓｏｕｔｈｗｅｓｔｅｒｎ）から寄贈された。２’−ＯメチルＲＮＡをＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｉｎｃ．から取得した。ホスホルアミデートはＡｎｎｏｖｉｓ， Ｉｎｃ．から入手した。
【００８５】
ポリヌクレオチド類似体の溶液を調製し、実施例４に記載のようにインジェクションした。
【００８６】
用いたポリヌクレオチド類似体の配列は次の通りであった。推定開始コドンと相補的な残基にはすべて下線を引いてある。
【００８７】
ＦＩＴＣ標識ＭＯ、ＦＩＴＣ標識３’−５’ ホスホロアミデート、およびＦＩＴＣ標識２’−ＯメチルＲＮＡ：５’−ＡＴＣ ＣＡＣ ＡＧＣ ＡＧＣ ＣＣＣ ＴＣＣ ＡＴＣ ＡＴＣ Ｃ−３’（配列番号１）
ＦＩＴＣ標識ＰＮＡ−１：５’− ＡＧＣ ＡＧＣ ＣＣＣ ＴＣＣ ＡＴ−３’（配列番号２）
ＦＩＴＣ標識ＰＮＡ−２：５’− ＴＣＴＣＴＣＴＣ−Ｏ−ｎＪＴＪＴＪＴＪＴ−３’（配列番号３）
陰性対照ＭＯ配列［非標識または３’末端にＦＩＴＣ標識］：
５’−ＣＣＴＣＴＴＡＣＣＴＣＡＧＴＴＡＣＡＡＴＴＴＡＴＡ−３’（配列番号４）
コーディン（ｃｈｏｒｄｉｎ）−ＭＯ［３’末端にＦＩＴＣ標識］およびコーディン−ＰＮＡ［ローダミン標識］：
５’−ＡＴＣＣＡＣＡＧＣＡＧＣＣＣＣＴＣＣＡＴＣＡＴＣＣ−３’（配列番号５）
ＧＦＰ−ＭＯ：５’−ＴＣＴＴＣＴＣＣＴＴＴＡＣＴＣＡＴＴＴＴＣＴＡＣＣ−３’（配列番号６）
ＧＦＰＤ４−ＭＯ：５’−ＴＣＴａＣＴＣｇＴＴＴＡＣＴＣＡＴＴａＴＣＴｔＣＣ−３’（配列番号７）
ｏｅｐ−ＭＯ：５’−ＧＣＣＡＡＴＡＡＡＣＴＣＣＡＡＡＡＣＡＡＣＴＣＧＡ −３’（配列番号８）
ｎｔｌ−ＭＯ：５’−ＧＡＣＴＴＧＡＧＧＣＡＧＧＣＡＴＡＴＴＴＣＣＧＡＴ−３’（配列番号９）
ｓｈｈ−ＭＯ＃１：５’−ＣＡＧＣＡＣＴＣＴＣＧＴＣＡＡＡＡＧＣＣＧＣＡＴＴ−３’（配列番号１０）
ｓｈｈ−ＭＯ＃２：５’−ＴＧＴＣＴＡＧＣＡＧＧＧＴＴＴＣＴＣＧＴＴＧＴＣＧ −３’（配列番号１１）
ｔｗｈｈ−ＭＯ：５’−ＴＴＣＣＡＴＧＡＣＧＴＴＴＧＡＡＴＴＡＴＣＴＣＴＴ−３’（配列番号１２）
ｎａｃｒｅ−ＭＯおよびｎａｃｒｅ−ＰＮＡ［ローダミン標識］：
５’−ＣＡＴＧＴＴＣＡＡＣＴＡＴＧＴＧＴＴＡＧＣＴＴＣＡ−３’（配列番号１３）
ｓｐａｒｓｅ−ＭＯ：５’−ＴＡＴＡＡＧＴＣＣＡＴＣＴＡＴＣＴＣＡＴＧＴＧＴＧ−３’（配列番号１４）
ｕｒｏｄ−ＭＯ：５’−ＧＡＡＴＧＡＡＡＣＴＧＴＣＣＴＴＡＴＣＣＡＴＣＡ−３’（配列番号１５）
ＶＥＧＦ−Ａ−１：５’−ＧＴＡＴＣＡＡＡＴＡＡＡＣＡＡＣＣＡＡＧＴＴＣＡＴ−３’（配列番号１６）
ＶＥＧＦ−Ａ−１Ｄ４［４塩基ミスマッチ］：
５’−ＧＴＡａＣＡＡｔＴＡＡＡＣＡＡＣＣＡｔＧＴＴｇＡＴ−３’（配列番号１７）
ＶＥＧＦ−Ａ−３：５’−ＴＡＡＧＡＡＡＧＣＧＡＡＧＣＴＧＣＴＧＧＧＴＡＴＧ−３’（配列番号１８）
ｚｔｓｇ１−ＭＯ：５’−ＣＴＧＡＴＧＡＴＧＡＴＧＡＴＧＡＡＧＡＣＣＣＣＡＴ−３’（配列番号１９）
ｚｆｚ２ＭＯ−ＡＴＧ：５’−ＣＡＣＡＣＡＣＡＣＴＴＣＣＡＣＴＣＧＣＣＴＧＣＡＴ−３’（配列番号２０）
ｚｆｚＭＯ−ＵＴＲ：５’−ＣＣＴＧＣＡＴＴＧＴＣＴＣＧＡＡＡＡＧＴＴＣＣＧＣ−３’（配列番号２１）
Ｆｌｉ−１−ＵＴＲ ＭＯ：５’−ＣＡＡＴＴＴＴＣＡＧＴＧＧＡＧＣＣＣＧＡＣＡＡＴＡ−３’（配列番号２２）
Ｆｌｉ−１−ＡＴＧ ＭＯ：５’−ＴＡＡＴＡＧＴＴＣＣＧＴＣＣＡＴＴＴＴＣＣＧＣＡＡ−３’（配列番号２３）
Ｆｌｉ−１．３ ＭＯ：５’−ＴＣＣＧＴＣＣＡＴＴＴＴＣＣＧＣＡＡＴＴＴＴＣＡＧ−３’（配列番号２４）
【００８８】
実施例４−ポリヌクレオチド類似体のインジェクション
類似体ＭＯ、２’Ｏ−メチルＲＮＡ、および３’−５’ホスホロアミデートを、濃度８ｍＭ（約６５ｍｇ／ｍｌ）で水に溶解させた。得られた原液を、水または１Ｘダニウ溶液（５８ｍＭ ＮａＣｌ、０．７ｍＭ ＫＣｌ、０．４ｍＭ ＭｇＳＯ４、０．６ｍＭ Ｃａ（ＮＯ３）２、５ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．６）中に０．０９〜３．０ｍｇ／ｍｌの作用濃度まで稀釈した。Ｅｋｋｅｒら（１９９５）Ｃｕｒｒ Ｂｉｏｌ ５：９４４−９５５に記載されているように、類似体溶液を卵黄にインジェクションした。ｍＲＮＡインジェクションに用いたものと同様の方法を用いて、類似体インジェクションを実施した。簡単に言えば、Ｗｅｓｔｅｒｆｉｅｌｄ（１９９５）Ｔｈｅ Ｚｅｂｒａｆｉｓｈ Ｂｏｏｋ：Ａ Ｇｕｉｄｅ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｕｓｅ ｏｆ Ｚｅｂｒａｆｉｓｈ（Ｂｒａｃｈｙｄａｎｉｏ ｒｅｒｉｏ）第３版、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｏｒｅｇｏｎ Ｐｒｅｓｓに記載されているように、ゼブラフィッシュ卵を回収し、アガロースプレート上に移した。低温の胚への類似体インジェクションは、非特異的効果および、インジェクションした胚の致死率を高めることがわかっていることから、ｍＲＮＡインジェクション用のアガロースプレートを低温に維持して、胚の発生を遅くし、一方類似体インジェクション用のプレートを約２０℃に予め保温しておいた。
【００８９】
類似体インジェクションに用いる針は、ｍＲＮＡインジェクションに用いるものと同じであった（ＨｙａｔｔおよびＥｋｋｅｒ（１９９９）Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ５９：１１７−１２６）。針はピペットで逆充填（ｂａｃｋ−ｆｉｌｌｅｄ）し、ローディングしたモルホリノ溶液をガラス毛細管にインジェクションすることにより較正した。次に、ピコインジェクター容量制御を１．５〜１５ｎＬに設定した。インジェクション量は、必要な用量に応じて異なったが、通常、１．５〜１８ｎｇの類似体をインジェクションした。絨毛膜を介して、類似体溶液をゼブラフィッシュ胚の卵黄にインジェクションした。インジェクションを受けた胚は、システムウォーターを含むペトリ皿に移し、２８℃で発生させた。
【００９０】
緩衝ダニウ−ＭＯ溶液のインジェクションは、水−ＭＯ溶液のインジェクションと比較して、インジェクションを受けた胚の致死率が低かった。しかし、緩衝ダニウまたは水溶液をインジェクションした胚の間では、観測された表現型の浸透度に違いは認められなかった。インジェクション量は、全ての類似体について、必要なインジェクション用量に応じ１．５ｎＬ〜１５ｎＬであった。１〜１６細胞期の野生型またはヘテロ接合Ｅ系統胚には、類似体を卵黄にインジェクションした。
【００９１】
２種の異なるＭＯを受けた胚には２回、各ＭＯには１回ずつインジェクションした。２種の異なるＭＯのインジェクションを含む実験では、単一のＭＯだけをインジェクションした胚を分析し、２種の異なるＭＯをインジェクションした胚と比較した。
【００９２】
各類似体について個別に有効用量を決定した。例えば、ＧＦＰ−ＭＯの場合、４．５ｎｇ以下の有効用量で、ＧＦＰタンパク質の減弱が検出され、≧９０％のＧＦＰ−ＭＯインジェクションを受けた胚は、標準的な形態学的基準を用いてアッセイしたところ、正常に発生した。ＧＦＰ−ＭＯの用量が高くなると、ＧＦＰタンパク質の平均減弱が大きくなったが、発生に対する検出可能な有害な効果をいくらか引き起こした。これらのより高い用量については、このＭＯではこれ以上追跡しなかった。明らかになったすべての場合で、分析に用いた用量により、２つのクラスの胚が得られ、これらは、形態学的基準を用いて評価すると、特定の表現型を呈示するものか、または正常なものであった。胚の小さな断片（典型的には、≦５％）が、マイクロインジェクション後の機械的損傷により異常に発生した。インジェクションした胚の形態を調べることにより、特定のＭＯの浸透度数および濃度を評価した。最小サイズ：２５を用いた。
【００９３】
ＰＮＡ（コーディンおよびｎａｃｒｅ２５−ｍｅｒ ＰＮＡ）を水中に稀釈して、濃度を０．２５ｍｇ／ｍｌ（これにより、最終ｐＨ＝５の溶液が得られる）とした。得られた溶液を５５℃で５分インキュベートし、氷上に置いた。モルホリノホスホロジアミデート（ＭＯ）、２’Ｏ−メチルＲＮＡ、およびその他のインジェクションについて記載したのと同様に、ＰＮＡ溶液をゼブラフィッシュ胚の卵黄にインジェクションした。ＭＯによる作業とは対照的に、ＰＮＡは、４細胞期以降にインジェクションすると、モザイク分布を呈示する。さらに、１胚当たり１．５ｎｇ以上の用量でＰＮＡをインジェクションすると、インジェクション部位にインジェクションしたＰＮＡの有意な画分の沈殿が認められた。
【００９４】
実施例５−ｍＲＮＡインジェクション
Ｅｋｋｅｒら（１９９５）Ｃｕｒｒ Ｂｉｏｌ ５：９４４−９５５に記載されているように、表示したＭＯを事前にインジェクションしたゼブラフィッシュ胚の卵黄に、合成ｍＲＮＡをインジェクションした。ＭＯインジェクションを受けた胚の同じプールからの同胞をこれら実験の内部対照として用いた。
【００９５】
アフリカツメガエルの場合には、０．３Ｘ ＭＭＲ、３．５％のフィコールを用いて、４細胞期で、ｍＲＮＡマイクロインジェクションを実施した。色素形成の差異を用いて、初期卵割期胚の背側−腹側極性を決定した（Ｃｈｏら（１９９１）Ｃｅｌｌ ６７：１１１−１２０）。
【００９６】
合成ｍＲＮＡは、合成ｍＲＮＡとＭＯ間にある任意の重複がＭＯターゲティングには不十分であるように設計された。用いたｏｅｐ ｍＲＮＡは、ｏｅｐ−ＭＯとの重複を全く含んでいなかった。用いたｔｗｈｈ ｍＲＮＡは、ｔｗｈｈ−ＭＯと６塩基の重複しか含まず、重複度は、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよび組織培養研究でのＭＯターゲティングには不十分であることがすでに明らかにされていた（Ｓｕｍｍｅｒｔｏｎ（１９９９）Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ １４８９：１４１−１５８およびＳｕｍｍｅｒｔｏｎら（１９９７）Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖ ７：１８７−１９５）。アフリカツメガエル由来のコーディンｍＲＮＡは、ゼブラフィッシュコーディン−ＭＯとの配列相同性を排除するために用いたのであるが、これは、以前の研究から、アフリカツメガエおよびとゼブラフィッシュコーディン遺伝子が、アフリカツメガエル胚に、同等の特定の活性をコードすることがわかっていたからである（Ｍｉｌｌｅｒ−Ｂｅｒｔｏｇｌｉｏら（１９９８）Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ ２１４：７２−８６）。
【００９７】
実施例６−ＦＩＴＣ−デキストランインジェクション、組織切片化および視覚化
Ｗｅｉｓｔｅｉｎら（１９９５）Ｎａｔ Ｍｅｄ １：１１４３−７に記載のように、微小血管造影を実施した。分子量が２，０００，０００ダルトンのフルオレセインイソチオシアネート−デキストラン（ＦＩＴＣ−デキストラン）（ＳＩＧＭＡ、カタログ番号ＦＤ−２０００Ｓ）をこれらの研究に用いた。デキストランを２ｍｇ／ｍｌの濃度で１Ｘダニウ溶液に溶解させた。約１０μｌの調製溶液を、麻酔した４８時間胚の静脈洞／主静脈にインジェクションした。
【００９８】
ＦＩＴＣ−デキストランをインジェクションした胚を一晩固定し、標準的手順を用いて、パラフィンに埋め込み、切片に切断した。次に、標準的プロトコルを用いて、切片の組織学的ヘマトキシリン−エオシン染色を実施した。
【００９９】
標準ＦＩＴＣフィルターセットを備えるＺＥＩＳＳ Ａｘｉｏｓｋｏｐ ２顕微鏡を用いて、ＦＩＴＩ−デキストランのインジェクションを受けた胚と、未処理の組織切片（すなわち、非染色切片）の双方を視覚化した。
【０１００】
実施例７−デジタル写真撮影
Ｎｉｋｏｎ ＣｏｏｌＰｉｘ ９９０（明視野）またはＫｏｄａｋ ＤＣＳ ４２０（ｉｎ ｓｉｔｕ）デジタルカメラを用いて、ＺＥＩＳＳ Ａｘｉｏｐｌａｎ ２顕微鏡で明視野およびｉｎ ｓｉｔｕ写真撮影を実施した。蛍光写真撮影には、ＺＥＩＳＳ ＡｘｉｏＣａｍまたはＮｉｋｏｎ ＣｏｏｌＰｉｘ ９９０デジタルカメラを用いた。
【０１０１】
実施例８： 蛍光分析
ＦＩＴＣ標識アンチセンスポリヌクレオチド類似体をインジェクションした胚を、Ｚｅｉｓｓ Ａｘｉｏｐｌａｎ２蛍光顕微鏡で、ＦＩＴＣフィルターを用いて分析した。Ｋｏｄａｋ ＤＣＳ４２０デジタルカメラを用いて画像を得た。
【０１０２】
ＭＩＣＲＯＩＭＡＧＥ Ｉ３０Ｂ Ｌｏｗ Ｌｉｇｈｔ Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｎｇ Ｃａｍｅｒａを用いて胚群の蛍光写真を撮影した後、それを最大解像度（６４０×４８０）設定で、ＤＣ３０＋アナログ・デジタル変換ビデオキャプチャーボード（Ｐｉｎｎａｃｌｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて取り込んだ。シグナル強度は、最大情報取り込みに対する準飽和レベルに設定した。準飽和レベルのシグナル強度は、非インジェクションＥ系統胚を用いて決定した。取り込みの忠実度は、アナログビデオショットおよびデジタルビデオショットを同時に画像化することにより確認した。得られた画像をＡｄｏｂｅ Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ ５．０にインポートし、定量分析に付した。各画像のバックグラウンドは、「色選択（Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ Ｃｏｌｏｒ）」アルゴリズムを用いて決定し、すべての画像で同じ設定にした。「ヒストグラム」アルゴリズムの「平均」値を用いて、グリーンチャネルシグナルを測定し；その他のチャネルを排除して、非特異的バックグラウンドを最小化した。すべての得点を、非インジェクションＥ系統（１００％）と野生型（０％）データ点から得た値に対して標準化した。
【０１０３】
実施例９： ウエスタン、ノーザン、およびｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション分析
ＧＦＰまたはＮＴＬタンパク質の検出のため、ＧＦＰ抗体（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）またはＮＴＬ抗体（Ｓ． Ｓｃｈｕｌｔｅ−Ｍｅｒｋｅｒからの寄贈）を用いて、標準的なウエスタン分析を実施した。インジェクションした胚のプールから単離したタンパク質を用いた。１サンプルにつき分析を行った。タンパク質の量は、５つの胚から得たタンパク質の量に相当するものであった。
【０１０４】
抗体染色には、Ｐ． ｔｅｎ Ｄｉｊｋｅからの寄贈品であるウサギ抗ホスホＭａｄ抗体を１／２０００希釈で用いた。アルカリホスファターゼ結合二次抗体（Ｐｒｏｍｅｇａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いて、染色を視覚化した。
【０１０５】
ＧＦＰ ｍＲＮＡの検出では、ノーザンブロットハイブリダイゼーションを標準的手順に従い実施した。ＧＦＰコード領域に対応するＰｓｔ Ｉ消化による７００塩基対断片をプローブとして用いた。分析した各サンプルは、３０個の胚のプールから単離した５μｇの全ＲＮＡからなる。２つの独立した分析を実施した。
【０１０６】
ホールマウントｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションには、Ｍａｓｏｎら（１９９４）Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ８：１４８９−１５０１およびＪｏｗｅｔｔ（１９９９）Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ５９：６３−８５を用いた。ハイブリダイゼーションは、６５℃で実施した。リボプローブの合成にはＴ７ポリメラーゼを用いた。ＥｃｏＲ ＩおよびＳｍａ Ｉでそれぞれ消化したプラスミドｚｆｆｌｉ−１およびｚｆｆｌｋ−１（Ｔｈｏｍｐｓｏｎら（１９９８）Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ １９７：２４８−６９）を用いて、ｆｌｉ−１およびｆｌｋ−１用のリボプローブを合成した。
【０１０７】
実施例１０： ゼブラフィッシュ初期胚におけるインジェクションされた修飾ポリヌクレオチド類似体の均一分布
ＦＩＴＣ標識類似体を用いて、修飾ポリヌクレオチド類似体の送達効率を決定した。１〜２細胞期の胚にＦＩＴＣ標識修飾ポリヌクレオチド類似体をインジェクションした。インジェクションした修飾ポリヌクレオチド類似体は、ＭＯ、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、２’−ＯメチルＲＮＡおよび３’−５’ホスホロアミデートを包含する。実施例７および８に記載したようにして、蛍光顕微鏡検査により、ＦＩＴＣ標識ポリヌクレオチド類似体の分布を調べた。インジェクションを受けた胚を、非インジェクション対照胚と比較した。その結果、８細胞期（インジェクションから１時間以内）という初期に、ポリヌクレオチド類似体が割球に完全に移行することが示された。中期胞胚期のサンプルから明らかなように、ポリヌクレオチド類似体は、割球全体に均一に分布したままであった。
【０１０８】
第２分布試験では、９０ｐｇのＦＩＴＣ標識対照−ＭＯまたはＦＩＴＣ標識コーディン−ＭＯを発生過程における１〜１６細胞期の野生型ゼブラフィッシュ胚にインジェクションした。２８時間の段階で、割球にＦＩＴＣ標識ＭＯの均一分布が達成された。９０ｐｇ量のコーディン−ＭＯをインジェクションすると、胚は正常に発生した。
【０１０９】
第３分布試験では、ＦＩＴＣ標識ＰＮＡ−２（Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を１〜１６細胞期ゼブラフィッシュ胚の卵黄中にマイクロインジェクションした。インジェクション量は６〜１５ｎｌであり、約５０〜２００ｎｇをインジェクションした。Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｓｙｓｔｅｍｓから入手したバッファーまたは０．５×ダニウバッファーを用いた。いずれのバッファーにも毒性は認められなかった。インジェクションを受けた胚の８５〜９０％が、発生の４８時間の時点で生存した（非毒性インジェクションについての通常生存率）。それより遅い時点の胚は分析しなかった。蛍光シグナルは、全組織において同等レベルで検出された。蛍光顕微鏡検査で調べたところ、分布は均一であった。しかし、シグナル濃度の高い独立した点が観察された（１胚につき１０未満、約１細胞直径ごと）。
【０１１０】
実施例１１： ＧＦＰ−ＭＯによるゼブラフィッシュ胚の全細胞におけるＧＦＰトランスジーン発現の特異的阻害
非必須偏在性ＧＦＰトランスジーンを用いて、ゼブラフィッシュにおける全身的遺伝子ノックダウン戦略としてのアンチセンスＭＯの利用可能性を試験した。ＧＦＰ−標的化ＭＯ（ＧＦＰ−ＭＯ）をゼブラフィッシュＥ系統胚にインジェクションした。蛍光およびウエスタンブロットアッセイを用いて、ＧＦＰトランスジーン発現を調べた。（１）非インジェクションＥ系統胚、（２）４．５ｎｇの対照−ＭＯをインジェクションしたＥ系統胚、（３）４．５ｎｇのＧＦＰ−ＭＯをインジェクションしたＥ系統胚、および（４）野生型胚、のＧＦＰ蛍光を、ＦＩＴＣ照射により比較した。非インジェクションＥ系統胚のＧＦＰ蛍光は偏在性であった。同様に、４．５ｎｇの対照−ＭＯまたは４塩基ミスマッチＧＦＰ−ＭＯ（ＧＦＰＤ４−ＭＯ）をインジェクションしたＥ系統胚のＧＦＰ蛍光は野生型に近かった。対照的に、ＧＦＰトランスジーンは、４．５ｎｇのＧＦＰ−ＭＯをインジェクションしたゼブラフィッシュＥ系統胚の全細胞で阻害された。ＧＦＰ−ＭＯをインジェクションした胚におけるＧＦＰシグナルの特異的喪失が９つの別個の実験で認められた。各々の実験では、少なくとも３０の胚をアッセイした。目視できるＧＦＰ蛍光の欠如は、ＧＦＰタンパク質発現のほぼ完全な喪失が達成されたことを意味する。さらに、ＧＦＰ発現のＧＦＰ−ＭＯ阻害は、用量依存的であった。図１は、ＧＦＰ発現の配列特異的および用量依存的阻害を示す、ＧＦＰ蛍光阻害グラフである。対照−ＭＯをインジェクションした胚と、ＧＦＰ−ＭＯをインジェクションした胚におけるＧＦＰ活性を比較した。図示する各データ点について、１５個の胚をアッセイした。蛍光活性データをウエスタンブロットにより確認した。これらのデータから、２８時間ゼブラフィッシュ胚の全細胞で、ＭＯにより、遺伝子発現の特異的阻害が達成されたことがわかった。
【０１１１】
実施例１２： コーディン−ＭＯによるコーディン発現の阻害
コーディンアンチセンスＭＯ（コーディン−ＭＯ）をゼブラフィッシュ胚にインジェクションしたところ、２８時間胚および３日胚に、用量に応じた、高度に特異的な一連の表現型が認められた。様々な量のコーディン−ＭＯをインジェクションした胚を野生型胚と比較した。特定量のコーディン−ＭＯをインジェクションした胚の数は次の通りである：１６９個の胚に０．０９ｎｇのＭＯをインジェクションし；９７個の胚に０．９ｎｇのＭＯをインジェクションし；３９９個の胚に１．５ｎｇのＭＯをインジェクションし；４２３個の胚に４．５ｎｇのＭＯをインジェクションし；２２４個の胚に９ｎｇのＭＯをインジェクションした。図２は、インジェクションするコーディン−ＭＯの用量を増加させていくことにより、強弱２つのコーディン−ＭＯ表現型が達成されたことを示すグラフである。低用量では、弱いコーディン−ＭＯ表現型、すなわち、減弱したコーディン機能喪失型表現型の等価物が認められた。弱いコーディン−ＭＯ表現型を示す胚は、部分的に拡張した血島、Ｕ字型体節、および複数のひだがある異常な尾びれを有していた。より高用量では、コーディン−ＭＯをインジェクションした胚は、コーディンヌル突然変異胚の表現型模写（Ｆｉｓｈｅｒら（１９９７）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １２４：１３０１−１３１１；Ｈａｍｍｅｒｓｃｈｍｉｄｔら（１９９６）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １２３：９５−１０２）、すなわち、強いコーディン−ＭＯ表現型を示した。この強いコーディン−ＭＯ表現型は、高用量インジェクションの場合に高い頻度で認められ（≧７５％、４．５ｎｇＭＯのインジェクション時、ｎ＝４２３）、異常なＵ字型体節、過度に拡張した血島、異常な尾ひれ、および短縮した頭部から構成されるものであった。ｏｔｘ−２に対するｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションに付した被包胚の約８０％が、短縮頭部に対応するｏｔｘ−２の減弱を示した。ｇａｔａ−２に対するｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションに付した被包胚の約６５％が、ｇａｔａ−２発現ドメインが大幅に拡張して、前方にずれたことを示したが、これは、中胚葉の腹側化を意味する（ｇａｔａ−２は、インジェクションした胚；ｎ＝３０の１００％で拡張した）。インジェクションを受けた胚と、受けていない胚とを比較したところ、ｇａｔａ−２発現の縞の後部融合が明らかになった。これらの結果から、様々な用量のコーディン−ＭＯを用いることにより、コーディン遺伝子の欠損に関する一連の対立遺伝子の等価物を得られることが明らかとなった。
【０１１２】
コーディン ｍＲＮＡに対するホールマウントｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを実施した。インジェクション胚および非インジェクション胚の比較から、コーディン ｍＲＮＡレベルが類似していることが明らかとなった。従って、コーディン−ＭＯによるコーディン機能の阻害は、通常のコーディン ｍＲＮＡのＲＮアーゼＨ媒介アンチセンス標的化分解によって媒介されなかった。コーディン−ＭＯによる遺伝子ターゲッティングの特異性を確認するために、合成アフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ）コーディン ｍＲＮＡを胚にインジェクションすることにより、コーディン−ＭＯの効果を反転できるかどうかを調べた。４２３個の胚に４．５ｎｇのコーディン−ＭＯをインジェクションしたところ、７６％が強いコーディン表現型を示した。これに対し、３０個の胚に４．５ｎｇのコーディン−ＭＯと３００ｐｇのアフリカツメガエルコーディン ｍＲＮＡとをインジェクションしたところ、１０％が強いコーディン表現型を示した。図３は、コーディン−ＭＯ表現型が、アフリカツメガエルコーディン ｍＲＮＡのインジェクションにより部分的に救済されたことを示すグラフであり、これにより、コーディン−ＭＯターゲッティングの特異性が明らかとなっている。
【０１１３】
実施例１３： コーディン−ＰＮＡによるコーディン発現の阻害
２５塩基コーディン−ＰＮＡ（ｃｈｄ−ＰＮＡ）およびｎａｃｒｅ−ＰＮＡを実施例４に記載したのと同様にゼブラフィッシュ胚にインジェクションした。インジェクションした胚を野生型胚と比較した。これより生じた表現は２８時間胚に認められた。
【０１１４】
所定量のコーディン ＰＮＡをインジェクションした胚の数は次の通りであった：４１個の胚に０．２５ｎｇのｃｈｄ−ＰＮＡをインジェクションし；１３０個の胚に０．５ｎｇのｃｈｄ−ＰＮＡをインジェクションし；９８個の胚に１ｎｇのｃｈｄ−ＰＮＡをインジェクションし；７７個の胚に１．５ｎｇのｃｈｄ−ＰＮＡをインジェクションした。所定量のｎａｃｒｅ−ＰＮＡをインジェクションした胚の数は次の通りであった：３８個の胚に０．２５ｎｇのｎａｃｒｅ−ＰＮＡをインジェクションし；７１個の胚に０．５ｎｇのｎａｃｒｅ−ＰＮＡをインジェクションし；７８個の胚に１ｎｇのｎａｃｒｅ−ＰＮＡをインジェクションし；７５個の胚に１．５ｎｇのｎａｃｒｅ−ＰＮＡをインジェクションした。
【０１１５】
ｃｈｄ−ＭＯインジェクションにおいて認められる弱い表現型に相当する弱い腹側化（ｖｅｎｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ）が、０．２５ｎｇのｃｈｄ−ＰＮＡをインジェクションした胚の１３％に認められた。非特異的効果がインジェクションした胚の６％に認められ、致死率は２２％であった。０．５ｎｇのｃｈｄ−ＰＮＡをインジェクションした胚では、３１％の致死率が認められた。インジェクションを受けた胚の約３８％が、弱い腹側化表現型を示したのに対し、２％がヌルコーディン突然変異表現型と類似する強い腹側化表現型を示した。インジェクションを受けた胚の４３％に非特異的効果が認められた。１ｎｇおよび１．５ｎｇのｃｈｄ−ＰＮＡのインジェクションによる致死率は、それぞれ７４％および７６％であった。インジェクション表現型は分析しなかった。
【０１１６】
被包期の胚をｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションに付して、形態学的結果を確認した。これらの分析から、ｃｈｄ−ＰＮＡをインジェクションした胚の２８％が、ｇａｔａ−２発現を拡張したが、これは、中胚葉腹側化の顕著な特徴である。ｏｔｘ−２のｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションにより、０．５ｎｇのｃｈｄ−ＰＮＡをインジェクションしたゼブラフィッシュ胚の５０％と、１ｎｇおよび１．５ｎｇのｃｈｄ−ＰＮＡをインジェクションしたゼブラフィッシュ胚の７０％で、ｏｔｘ−２発現が減弱したことがわかった。ｏｔｘ−２発現の減弱は、ｃｈｄ−ＰＮＡによる胚腹側化を意味する。
【０１１７】
ｎａｃｒｅ−ＰＮＡインジェクションによる致死率は、低から中程度であった。０．２５ｎｇ、０．５ｎｇ、１ｎｇおよび１．５ｎｇのｎａｃｒｅ−ＰＮＡをインジェクションすることにより、致死率は、それぞれ、１２％、２４％、３６％および３５％となった。非特異的異常率は、０．２５ｎｇおよび０．５ｎｇのインジェクションに対する３％から、１．５ｎｇのｎａｃｒｅ−ＰＮＡのインジェクションに対する１２％までの範囲で示された。ｎａｃｒｅ−ＰＮＡをインジェクションした胚に、腹側化表現型は全く認められなかった。さらに、ゼブラフィッシュ２日胚の分析により、ｎａｃｒｅ−ＰＮＡのインジェクションは、ｎａｃｒｅ遺伝子活性にまったく影響を与えないことが明らかとなった。インジェクションした胚のｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション分析から、ｎａｃｒｅ−ＰＮＡのインジェクションは、ｇａｔａ−２またはｏｔｘ−２発現を改変しないことが明らかになった。これらの結果から、腹側化表現型が、コーディン ＰＮＡに特異的であることがわかる。
【０１１８】
実施例１４： ｏｅｐ−ＭＯによる母系遺伝子発現の阻害
ｏｎｅ−ｅｙｅｄ ｐｉｎｈｅａｄ遺伝子（ｏｅｐ）（Ｚｈａｎｇら（１９９８）Ｃｅｌｌ ９２：２４１−２５１）を選択し、ＭＯによる母系遺伝子活性阻害について試験する。胚のｏｅｐ機能は、母系遺伝子寄与および接合子遺伝子寄与の両方によるものであり、両者は、特定の基準（Ｇｒｉｔｓｍａｎら（１９９９）Ｃｅｌｌ ９７：１２１−１３２）に基づいて区別することができる。ｏｅｐ機能を欠損した胚は、ｎｏｄａｌ経路を介したシグナリングに欠陥がある。胚に９ｎｇのｏｅｐ−ＭＯをインジェクションしたところ、接合子ｏｅｐ機能の喪失と結びついた表現型が認められた。接合子ｏｅｐ突然変異体に典型的な単眼症および腹側彎曲が、胚（ｎ＝２９１）の３０±５％に認められた。胚（ｎ＝２９１）の１３±５％に、母系−接合子ｏｅｐ突然変異体に典型的な重症の単眼症、体幹における体節の欠如、奇形尾体節、および短縮脊索が認められた。尾芽胚を、ｐａｘ−２およびａｘｉａｌに対するｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションに付した。野生型胚と比較して、インジェクションした胚（２４の胚を分析した）の４５％に前脊索中胚葉の短縮が認められた。
【０１１９】
ゼブラフィッシュｏｅｐ 合成ｍＲＮＡのインジェクションにより、ｏｅｐ−ＭＯ表現型が救済された。９ｎｇのｏｅｐ−ＭＯをインジェクションすると、胚（ｎ＝２９１）の４３％がｏｅｐ表現型を示したが、９ｎｇのｏｅｐ−ＭＯと５０ｐｇのｏｅｐ ｍＲＮＡをインジェクションした場合には、分析した３３個の胚のいずれもｏｅｐ表現型を示さなかった。図４は、ｏｅｐ ｍＲＮＡのインジェクションに応答したｏｅｐ表現型の頻度における用量依存的減弱を示すグラフである。この結果から、認められたｏｅｐ表現型がｏｅｐ機能の特異的阻害によるものであったことがわかる。
【０１２０】
これより高濃度のｏｅｐ−ＭＯをインジェクションすると、接合子ｏｅｐ機能および母系ｏｅｐ機能の両方を喪失した表現型の表現型模写が示される。このように、ＭＯは、接合子遺伝子ターゲッティングと比較して低いレベルではあるが、母系遺伝子機能をターゲッティングすることができる。
【０１２１】
実施例１５： 遺伝的相互作用因子を同定するためのモルホリノの使用
ｎｏ ｔａｉｌ（ｎｔｌ）遺伝子（Ｓｃｈｕｌｔｅ−Ｍｅｒｋｅｒら（１９９４）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １２０：１００９−１０１５）にターゲッティングしたＭＯを用いて、ｎｔｌの遺伝的相互作用因子を同定した。胚（ｎ＝１１８）に９ｎｇのｎｔｌ−ＭＯをインジェクションした。分子的および表現型上の基準を用いて評価したところ、インジェクションした胚の９８％は、ヌル突然変異により生じたもの（Ｈａｌｐｅｒｎら（１９９７）Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ １８７：１５４−１７０）と区別がつかなかった。正常頭部、異常体節、および極めて短縮した尾が顕著であった。ｎｔｌ−ＭＯをｎｔｌ突然変異胚（ｎ＝７２）にインジェクションしても、ｎｔｌ突然変異体胚にｎｔｌ−ＭＯのインジェクションによる新たな欠陥は認められなかった。ｎｔｌ−ＭＯをインジェクションした野生型胚では、ＮＴＬタンパク質が特異的かつ定量的に減少した。
【０１２２】
体節の中胚葉マーカーであるｍｙｏｄの活性化は、ｏｅｐ経路およびｎｔｌ経路両方からの入力を必要とする（Ｓｃｈｉｅｒら（１９９７）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １２４：３２７−３４２）。胚に９ｎｇのｎｔｌ−ＭＯと９ｎｇのｏｅｐ−ＭＯを共インジェクションすると、高度に短縮した頭部、短縮した尾と、極めて短縮した体節および脊索が認められた。１０〜１２体節期胚をｍｙｏｄに対するｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションに付すと、ｎｔｌまたはｏｅｐ機能のいずれかが低下した胚は、改変されているが強いｍｙｏｄの発現を示したのに対し、両機能が低下した胚は、わずか２、３個の細胞でしかｍｙｏｄを発現しなかった。例えば、ｎｔｌ−ＭＯをインジェクションした胚（ｎ＝２５）の９２％が、向軸側中胚葉短縮および後部体節融合を示し、ｏｅｐ−ＭＯをインジェクションした胚（ｎ＝２２）の４１％が、向軸側中胚葉の融合を示した。ｎｔｌ−ＭＯおよびｏｅｐ−ＭＯを共インジェクションした胚（ｎ＝２４）では、５２％には向軸側中胚葉を示さず、かつ極めて短縮した体節中胚葉を示した。
【０１２３】
１０〜１２体節期胚におけるｓｈｈのホールマウントｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションにより、ｎｔｌ−ＭＯをインジェクションした胚（ｎ＝２５）の８０％が、ｓｈｈ発現の弱い拡張を示すのに対し、ｏｅｐ−ＭＯをインジェクションした胚（ｎ＝２２）の５０％が、ｓｈｈ発現の強度の拡張を示すことが示された。ｎｔｌ−ＭＯおよびｏｅｐ−ＭＯを共インジェクションした胚（ｎ＝３１）の５２％が、ｓｈｈ発現の著しい減弱を示した。図５は、ｎｔｌ−ＭＯ、ｏｅｐ−ＭＯ、または両ＭＯをインジェクションした胚に認められたｎｔｌ表現型、ｏｅｐ表現型、ならびに、ｎｔｌおよびｏｅｐ表現型の頻度を比較しているグラフである。このように、これらのＭＯは、ｉｎ ｖｉｖｏでの遺伝的相互作用の試験に有効なツールである。
【０１２４】
実施例１６： 体形成（ｓｏｍａｔｏｇｅｎｅｓｉｓ）および器官形成を通じた遺伝子発現の阻害
後期作用性遺伝子を用いて、モルホリノ効果の持続性を測定した。１１２個の胚に９ｎｇのｎａｃｒｅ−ＭＯをインジェクションした。インジェクションした胚の９８％が、発生の最初の５０時間の間、身体色素沈着の特徴的かつほぼ完全な喪失という、ｎａｃｒｅ突然変異体で認められたものと区別できない表現型を示した（Ｌｉｓｔｅｒら（１９９９）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １２６：３７５７−３７６７）。それより後の時点で、色素沈着が様々な速度で回復した。１５９個の胚に９ｎｇのｓｐａｒｓｅ−ＭＯをインジェクションした。ｓｐａｒｓｅ−ＭＯのインジェクションにより、既知のゼブラフィッシュ色素突然変異ｓｐａｒｓｅが重複した（Ｐａｒｉｃｈｙら（１９９９）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １２６：３４２５−３４３６）。ゼブラフィッシュ６５時間および１０日胚を調べると、９５％が、色素性細胞（メラノサイト）数の減少を示した。これらの胚では、背側メラノサイトが顕著に減少した。従って、ＭＯに基づく遺伝子ターゲッティングは、発生の最初の２日間、さらに潜在的には最初の１０日間の間、完全浸透することがわかった。さらに、ＭＯに基づく遺伝子ターゲッティングは、ゼブラフィッシュ胚における脊椎動物の重要な過程である体形成および器官形成を通じて完全浸透した。
【０１２５】
実施例１７： モルホリノに基づくヒト疾患に対するモデル系の開発
肝造血性ポルフィリン症（ＨＥＰ）は、ウロポルフィリノーゲン・デカルボキシラーゼ（ｕｒｏｄ）酵素の欠損による血液生合成の欠陥によって起こる（Ｋａｐｐａｓら（１９９５）「遺伝性疾患の代謝的基礎（Ｔｈｅ Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｉｎｈｅｒｉｔｅｄ Ｄｉｓｅａｓｅｓ）」 ２１０３−２１５９ページ）。この症候群の徴候としては、蛍光感受性および光感受性赤血球が挙げられる。１１８個の胚にｕｒｏｄ−ＭＯをインジェクションし、次いでローダミンフィルターセットを用いて試験した。対照−ＭＯをインジェクションした胚をｕｒｏｄ−ＭＯをインジェクションした胚と比較した。低形質対立遺伝子（ｈｙｐｏｍｏｒｐｈｉｃ）ｕｒｏｄ突然変異に認められたのと同様に、インジェクションした胚のすべてが、蛍光感受性および光感受性赤血球の両方を示した（Ｗａｎｇら（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ ２０：２３９−２４３）。インジェクションした胚における強い自己蛍光は、循環血液細胞中の光感受性ポルフィリンの蓄積を示した。ｕｒｏｄ−ＭＯをインジェクションした胚における血液細胞の光感受性は、胚を光に暴露すると明らかであった。光への暴露により、ｕｒｏｄ−ＭＯをインジェクションした胚において赤血球の全てが枯渇した。ｕｒｏｄ−ＭＯをインジェクションした胚の表現型の完全浸透は、ＭＯに基づくヒト疾患の動物モデルが作製されたことを証明している。
【０１２６】
全前脳症（ＨＰＥ）は、ヒト胚（１：２５０）および生産児（１：１６，０００）に高頻度で発生する（Ｗａｌｌｉｓら（１９９９）Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ Ｍｅｔａｂ ６８：１２６−１３８）。重症の場合、表現型は単眼症である。ソニックヘッジホッグ（ｓｏｎｉｃ ｈｅｄｇｅｈｏｇ； ｓｈｈ）遺伝子が、ヒトにおける上記疾患の発生に重要な役割を果すと考えられている（Ｂｅｌｌｏｎｉら（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ １４：３５３−３５６；Ｒｏｅｓｓｌｅｒら（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ １４：３５７−３６０）。しかし、ゼブラフィッシュｓｈｈ突然変異は、前正中線シグナリング欠陥を全く引き起こさない（Ｓｃｈａｕｅｒｔｅら（１９９８）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １２５：２９８３−２９９３）。前中線に発現した第２のｓｈｈオーソログである、ティギーウィンクルヘッジホッグ（ｔｉｇｇｙ−ｗｉｎｋｌｅ ｈｅｄｇｅｈｏｇ； ｔｗｈｈ）（Ｅｋｋｅｒら（１９９５）Ｃｕｒｒ Ｂｉｏｌ ５：９４４−９５５）により、高度に保存された脊椎動物の発生過程におけるこの表現型の欠如を説明することができる。ＭＯを用いて、ｓｈｈおよびｔｗｈｈ遺伝子の両方をターゲッティングすることにより、重複性について試験し、ＨＰＥの遺伝モデルとしてのゼブラフィッシュを作製した。
【０１２７】
胚には、それぞれ（１）１８ｎｇのｔｗｈｈ−ＭＯと９ｎｇの対照−ＭＯをインジェクションし；（２）１８ｎｇのｓｈｈ−ＭＯと９ｎｇの対照−ＭＯをインジェクションし；（３）ｓｈｈ−ＭＯおよびｔｗｈｈ−ＭＯをそれぞれ１３．５ｎｇずつ共インジェクションし；または（４）ｓｈｈ−ＭＯおよびｔｗｈｈ−ＭＯをそれぞれ１３．５ｎｇずつと、１００ｎｇのｔｗｈｈ ｍＲＮＡとをインジェクションした。３日または１０体節期胚を分析した。図６は、対照−ＭＯとｔｗｈｈ−ＭＯ、対照−ＭＯとｓｈｈ−ＭＯ、またはｔｗｈｈ−ＭＯおよびｓｈｈ−ＭＯの両方をインジェクションした胚における単眼症、Ｕ字型体節、および短縮ひれの頻度を比較しているグラフである。
【０１２８】
ｓｈｈ−ＭＯをインジェクションした胚は、ｓｈｈ突然変異に特有の表現型を示した（Ｓｃｈａｕｅｒｔｅら（１９９８）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １２５：２９８３−２９９３）。これらの胚は、Ｕ字型体節を示し、水平筋節中隔が欠如し、胸びれが短縮していた。ｔｗｈｈ−ＭＯをインジェクションした胚は、対照と区別できない表現型を示した。これらの胚は、野生型胚と比較して、正常頭部、Ｖ字型体節、および正常筋節中隔を有していた。しかし、ｔｗｈｈ−ＭＯとｓｈｈ−ＭＯ両方をインジェクションすると、体幹の体節パターン形成における相乗作用的欠陥、すなわち前脳における新しい表現型、部分的単眼症、筋節中隔の欠如、およびヘッジホッグ標的遺伝子ｐａｔｃｈｅｄ（ｐｔｃ）の転写喪失を示す胚が生じた（Ｃｏｎｃｏｒｄｅｔら（１９９６）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １２２：２８３５−２８４６）。
【０１２９】
ｓｈｈ欠損胚（ｎ＝５２）に９ｎｇのｔｗｈｈ−ＭＯをインジェクションすると、部分的単眼症の１００％浸透度が達成された。対照的に、ｔｗｈｈ−ＭＯは、同胞胚に単眼症を一切引き起こすことがなかった（０％、ｎ＝１２０）（Ｓ． ＢｉｎｇｈａｍおよびＡ． Ｃｈａｎｄｒａｓｅｋｈａｒ、印刷中）。このことは、ゼブラフィッシュ胚が、前中線パターン形成において同様の役割を有する２つの機能的に重複した哺乳動物ｓｈｈ遺伝子のオーソログを含むことを示唆している。
【０１３０】
ｍｙｏｄに対するホールマウントｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションにより、１０体節期胚を試験した。その結果、ｓｈｈ−ＭＯをインジェクションした胚は、野生型胚と比較すると、向軸側および壁側中胚葉の弱い短縮を示すことがわかった。ｓｈｈ−ＭＯおよびｔｗｈｈ−ＭＯを共インジェクションした胚は、向軸側中胚葉の極端な短縮を示した。ゼブラフィッシュｔｗｈｈ ｍＲＮＡのインジェクションにより、この短縮は逆転し、向軸側中胚葉は若干拡張した。
【０１３１】
これらの結果から、ゼブラフィッシュがＨＰＥの有効なモデルであることが示される。加えて、これらの実験により、脊椎動物の胚形成および胚性疾患を理解する上での単一および複数遺伝子ノックダウンの両方についてモルホリノの有用性が明らかにされた。
【０１３２】
実施例１８： ソニックヘッジホッグＭＯ相乗効果
実施例４に記載したように、２種のオーバーラップしていないｓｈｈ−ＭＯ：ｓｈｈ−ＭＯ＃１およびｓｈｈ−ＭＯ＃２を胚にインジェクションした。ｓｈｈ−ＭＯ＃１およびｓｈｈ−ＭＯ＃２の配列は実施例３に記載する。胚を、発生の３日目に、ソニックヘッジホッグ機能の喪失により起こった表現型の変化について分析した（Ｓｃｈａｕｅｒｔｅら（１９９８）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １２５：２９８３−２９９３）。最も弱い対立遺伝子ｔｑ２５２と同じ強さの効果を体節で示した胚は、正の表現型を示すものとして得点付けした。図７は、１種または２種のｓｈｈ−ＭＯをインジェクションしたとき、ソニックヘッジホッグ機能喪失型に結びついた表現型を示した胚の頻度を比較する。示した結果は、３つの独立した実験から得たものである。各データ点について２０個以上の胚を得点付けした。図７Ａに示すように、モルホリノインジェクションにより得られたソニックヘッジホッグ機能喪失型表現型を有する胚の数は、単一のｓｈｈ−ＭＯを胚にインジェクションしたときより、２種のｓｈｈ−ＭＯを胚にインジェクションしたときの方が多かった。１種または２種のｓｈｈ−ＭＯのインジェクションにより起こったソニックヘッジホッグ機能喪失型表現型を有する胚の数の比較から、その増加は、加法的増加より大きいこと、すなわち、２種のｓｈｈ−ＭＯのインジェクションは、ソニックヘッジホッグ機能喪失型表現型を示す胚の数に相乗効果を及ぼすことが明らかとなった。さらに、２種のｓｈｈ−ＭＯを半用量ずつインジェクションする方が、各ＭＯを単独で全量用いるよりも、ｓｈｈ遺伝子発現のノックダウン能力においてはるかに強力である（図７Ｂ参照）。
【０１３３】
実施例１９： モルホリノによる遺伝子不活性化の効率
既知遺伝子に対するモルホリノを作製して、成功率の推定値を決定した。標的遺伝子として、ｓｈｈ、コーディン、ｎｏ ｔａｉｌ、ｏｎｅ−ｅｙｅｄ−ｐｉｎｈｅａｄ（ｏｅｐ）、ｓｐａｒｓｅ、ｎａｃｒｅ、ｕｒｏｄ、ｂｏｚｏｚｏｋ／ｄｈａｒｍａ、ＥＦ１ａ−ＧＦＰトランスジーン、ｐａｘ２．１、ｂｍｐｌ、ｂｍｐ２ｂ、ｂｍｐ７、ａｌｋ８、ｓｍａｄ５、ｗｎｔ５、およびｗｎｔ１１が挙げられる（Ｅｋｋｅｒ（２０００）Ｙｅａｓｔ １７：３０２−３０６参照）。ｐａｘ２．１を除くすべての標的遺伝子が、試験した第１ＭＯによる明らかに特異的な遺伝子不活性化を示した。すなわち、既知遺伝子の１６／１７すなわち＞９４％が成功裡に不活性化された。この遺伝子不活性化の成功率は、ＭＯミスターゲッティングまたはその他の非特異的作用により低下する可能性がある。例えば、ＭＯが、第２の遺伝子を阻害して、複合表現型を示す胚を発生させることがありうる。極端な例は、ｂｏｚｏｚｏｋ／ｄｈａｒｍａ ＭＯにより示され、この場合、第２の効果（ＣＮＳ変性）が、ｂｏｚｏｚｏｋ機能喪失型表現型に追加される（Ｎａｓｅｖｉｃｉｕｓら（２０００）Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ２６：２１６−２２０）。これらの第２の非特異的作用によって、胚構造の喪失または胚の早期死が起これば、試験中の遺伝子の機能は得点化できない。この遺伝子ミスターゲッティング率（２／１７）の分だけＭＯ遺伝子不活性化の成功率（１６／１７）が低下すれば、ＭＯスクリーニング効率の推定値が低くなり、初期ＭＯスクリーニング率は８２％（１４／１７）となる。これらの「取り逃した」遺伝子のかなりの割合は、非関連配列について第２のＭＯを用いることにより回収することができる。「取り逃した」遺伝子の残る１８％についての同様の成功率を約８０％と仮定すると、さらに１４％の遺伝子を第２のＭＯによりターゲッティングすることができ、これにより、２つの標的ＭＯを用いてスクリーニングされる遺伝子の合計推定成功率は＞９５％となる。
【０１３４】
特定の遺伝子座におけるリーダー配列について特に多型性が高い場合には、ｉｎ ｖｉｖｏでのＭＯターゲッティングの高い特異性のせいで、選択遺伝子はすべての胚で不活性化されないかもしれない。ｏｎｅ−ｅｙｅｄ−ｐｉｎｈｅａｄ遺伝子座は、この現象が考えられる例である（実施例１４を参照）。ある野生型株では、胚の約５０％しかこのＭＯに応答せず、別の株ではまったく応答しない。それ以外の非直接的な系統の相違も、ＭＯの有効性を低減し得る。例えば、遺伝的バックグラウンドの違いが、第２のモジュレーター遺伝子座に存在する遺伝因子のせいで、所与のＭＯ効果の浸透度を改変することがある。共通の「野生型」および他の非同質遺伝子の研究室系統を配列決定計画において特性決定および包含することが、ゼブラフィッシュにおいてＭＯ技法を最大限に活用するために提唱される。
【０１３５】
多数の遺伝子スクリーニングと同様に、ＭＯも、脊椎動物に特に関係する課題である、機能重複性の制限を被る。さらに、ゼブラフィッシュゲノムは、哺乳動物に存在する遺伝子の３０％と推定される遺伝子に対する不完全な複製物のさらなるセットを含んでいる（Ｐｏｓｔｌｅｔｈｗａｉｔら（１９９９）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ６０：１４９−１６３；およびＯａｔｅｓら（１９９９）Ｄｅｖ Ｄｙｎ ２１５：３５２−３７０）。この部分的ゲノム重複は、場合によっては、ヒトでは１つである遺伝子に対し、ゼブラフィッシュにおいては２個のオーソログを生じさせる。一例として、ソニックヘッジホッグ遺伝子座がある（実施例１７）。しかし、推定オーソログの比較発現プロフィールからは、これら遺伝子の発現パターンの一部の重複のみが示される。実際に、２個のオーソログで、ゼブラフィッシュにおいて同一の発現パターンを持っているものはない（Ｇａｔｅｓら（１９９９）Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ ９：３３４−３４７）。しかし、ＭＯの使用は、関連配列の遺伝子の同時ターゲッティングによる、重複性の迅速試験に非常に適している（実施例１７を参照）。このように、多重遺伝子ターゲッティング戦略は、このモルフィノ技法を用いて実施可能であり、推定最低成功率は（０．８２×０．８２）＝６７％である。この戦略に適した遺伝子に対して、モルホリノは、ｉｎ ｖｉｖｏで重複機能を有する分子を同定および試験するのに、極めて有効であろう。
【０１３６】
実施例２０： ３６時間目のＶＥＧＦ−Ａ−１モルホリノインジェクションの形態学的効果
血管上皮成長因子（ＶＥＧＦ）遺伝子ファミリーのメンバーによるシグナリングは、胚形成、創傷の治癒の際の血管系の形成、ならびに、腫瘍誘導性血管系の成長に関与する（Ｃａｒｍｅｌｉｅｔら（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ ３８０：４３５−９；Ｃａｒｍｅｌｉｅｔら（１９９７）Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ ２７３：Ｈ２０９１−１０４；およびＦｅｒｒａｒａ（１９９９）Ｊ Ｍｏｌ Ｍｅｄ ７７：５２７−４３）。ＶＥＧＦ−Ａを用いたマウスでの先駆的研究から、発生におけるＶＥＧＦ−Ａシグナリングに対するマウス胚の極度な用量応答性が明らかにされている。単一コピーのＶＥＧＦ−Ａ遺伝子の欠損は、一日当たり９．５％のハプロインサフィシエントな（ｈａｐｌｏｉｎｓｕｆｆｉｃｉｅｎｔ）致死を誘発する（Ｆｅｒｒａｒａら（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ ３８０：４３９−４２）；Ｃａｒｍｅｌｉｅｔら（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ ３８０：４３５−９）。後期発生におけるＶＥＧＦ−Ａ必要性という、遺伝学的研究に対するこの生物学的ハードルが、条件付きノックアウト戦略（Ｇｅｒｂｅｒら（１９９９）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １２６：１１４９−５９；Ｈａｉｇｈら（２０００）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １２７：１４４５−５３）または優性ネガティブタンパク質（Ｇｅｒｂｅｒら（１９９９）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １２６：１１４９−５９）を用いた一連の実験に結びついた。この問題に取り組むさらに最近の手法では、妊娠マウスにアンチセンスオリゴヌクレオチドを静脈内注射して、マウス胚形成におけるＶＥＧＦ−Ａ機能の機能喪失型条件を実現した（Ｄｒｉｖｅｒら（１９９９）Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １７：１１８４−７）。
【０１３７】
ゼブラフィッシュ胚は、体外発生するため、初期発生期では、機能している循環系に対する必要性はごく限られている。例えば、ポルフィリン症により赤血球が循環しない胚も発生の最初の３日間は生存する（Ｒａｎｓｏｍら（１９９６）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １２３：３１１−９）が、この期間には、魚胚の卵割および器官形成の全体が含まれる。心臓血管形成における複数の突然変異が、最初の大規模な化学的突然変異誘発スクリーニングで単離された（Ｓｔａｉｎｉｅｒら（１９９６）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １２３：２８５−９２；Ｃｈｅｎら（１９９２）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １２３：２９３−３０２；Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎら（１９９５）Ｎａｔ Ｍｅｄ １：１１４３−７）。これらのことから、ゼブラフィッシュは、この不可欠な脊椎動物過程に必要な血管新生因子の生物学的役割を迅速に評価するのに有用となり得る。
【０１３８】
ゼブラフィッシュＶＥＧＦ−Ａは、胚形成において、前神経系、将来の心臓領域に隣接する中胚葉、および発生中の内胚葉に隣接する体節中胚葉にて発現される（Ｌｉａｎｇら（１９９８）Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ １３９７：１４−２０）。ＶＥＧＦ−Ａに対するＭＯを作製して、胚発生の際の該遺伝子の必要性を分析した。ＭＯは、ゼブラフィッシュ発生の最初の２日間の間、遺伝子不活性化に有効であることが証明されている（実施例１６参照）。
【０１３９】
９ｎｇのＶＥＧＦ−Ａ−１−ＭＯを胚にインジェクションした。得られたＶＥＧＦ−Ａモルファント胚は、発生の最初の一日間は明らかな異常表現型も示さずに発生した。胚発生の２日目に、ＶＥＧＦ−Ａモルファント表現型では、心膜が肥大し、循環する赤血球が認められず、神経管および身体サイズがやや短縮し、機能している血管系がほとんどまたは全く存在しなかった。胚の一部では、腹側尾に赤血球の蓄積が認められた。表１に、表示した量のＭＯをインジェクションした際の血管系の欠損、心膜水腫、前大動脈における血液貯留、および尾内の血液貯留を示す胚の頻度をまとめて示す。
【０１４０】
各ＭＯ用量につき４回の実験を実施した。各ＭＯ用量で実施した全実験の平均頻度を示す。標準誤差は、平均頻度と個々の実験の頻度との差の平均である。
【０１４１】
【表１】
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【０１４２】
実施例２１： ＶＥＧＦ−Ａ−１モルファントにおける血管系欠損の微小血管造影による視覚化
２つの個別蛍光アッセイを用いて、血管機能を評価した。第１のアッセイでは、９ｎｇのｕｒｏｄ−ＭＯを用いて、ウロポリフィリノーゲン・デカルボキシラーゼ遺伝子（ｕｒｏｄ；Ｗａｎｇら（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ ２０：２３９−２４３）の不活性化により、蛍光標識ＲＢＣを作製した。９ｎｇのｕｒｏｄ−ＭＯをインジェクションした３６時間胚では、蛍光標識ＲＢＣにより、軸方向血管系、頭部血管系、卵黄嚢、および心臓を造影した。９ｎｇのＶＥＧＦ−Ａ−１−ＭＯをインジェクションした胚では、ＰＢＣは前大動脈だけに局在化した。
【０１４３】
第２のアッセイでは、ＦＩＴＣ−デキストランのインジェクションにより血管系を直接分析した。麻酔を施した４８時間胚の静脈洞／主静脈にＦＩＴＣ−デキストランをインジェクションすると、卵黄嚢、心臓、頭部、軸方向および分節間血管を含むゼブラフィッシュ胚の血管系全体の標識が達成される（Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎら（１９９５）Ｎａｔ Ｍｅｄ １：１１４３−７）。
【０１４４】
ＶＥＧＦ−Ａ−１−ＭＯのインジェクションにより、これらの構造が、ＶＥＧＦ−Ａシグナリングに対してそれぞれ別様に感受性を有することがわかった。さらに、ＶＥＧＦ−Ａ−１−ＭＯの量を変えてインジェクションすると、３つの表現型クラスが認められた。最も強い表現型クラス、すなわち、高用量のＶＥＧＦ−Ａ−１−ＭＯをインジェクションした際には、検出可能な唯一の血管系が、心臓と卵黄において認められた。頭部、軸方向および分節間血管は認めることができなかった。これらの胚では、血管系は、まったく形成できないか、あるいは、心臓との機能的連結を含んでいないかのいずれかであった。これらの可能性を区別するために、最も強く影響を受けた胚に対して、組織学的分析を実施した。インジェクションした胚には、背側大動脈および軸方向静脈のいずれも認めることはできなかった。
【０１４５】
頻度は高いが、これより弱い表現型クラスの胚も観察された。これらの胚は、中程度のＶＥＧＦ−Ａ−１−ＭＯインジェクション効果を示すと言える。これらの胚では、インジェクションしたＦＩＴＣ−デキストランが、卵黄嚢、心臓および頭部血管だけを強調表示した。軸方向または分節間血管系は認められなかった。
【０１４６】
最も弱い表現型に分類されたものには、分節間血管系は短縮しているが、正常な心臓、卵黄、頭部、および軸方向血管を示す胚が含まれる。分節間血管系が全くまたはほとんどもたないが、正常な卵黄嚢、心臓、頭部血管系、および軸方向血管を示す胚は、弱いＶＥＧＦ−Ａ−１−ＭＯ効果を示すと言う。
【０１４７】
これらの表現型クラスの浸透度は、用量依存的であった（表１参照）。これは、マウス胚におけるＶＥＧＦ−Ａ機能の強い用量依存性と一致している（Ｆｅｒｒａｒａら（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ ３８０：４３９−４２；Ｃａｒｍｅｌｉｅｔら（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ ３８０：４３５−９）。ヘテロ接合マウスＶＥＧＦ−Ａ突然変異体は、組織学的分析により検出された短縮された背側大動脈を示した。組織特異的ｌａｃＺ発現により、さらに少ない分節間血管系が認められた。ホモ接合マウスＶＥＧＦ−Ａ突然変異体における組織学的分析により、背側大動脈の欠如が明らかにされたが（Ｃａｒｍｅｌｉｅｔら（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ ３８０：４３５−９）、これは、最も強いゼブラフィッシュＶＥＧＦ−Ａモルファントクラスが、ほぼ完全な機能喪失型表現型を示すことを示している。マウスＶＥＧＦ−Ａ突然変異体はまた、未発生の筋芽細胞を有する心臓を示すが（Ｆｅｒｒａｒａら（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ ３８０：４３９−４２；Ｈａｉｇｈら（２０００）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １２７：１４４５−５３）、ゼブラフィッシュＶＥＧＦ−Ａモルファントにおける心臓は、恐らく心臓圧の増加による心房および心室がやや拡張しているとはいえ本質的には正常な外観をしていた。
【０１４８】
実施例２２： ＶＥＧＦ−Ａ ＭＯ特異性の確認
２つのＶＥＧＦ−Ａ−ＭＯ（１つは、ＶＥＧＦ−Ａ−１−ＭＯとオーバーラップしない配列を有するもの、もう１つは、４塩基ミスマッチを含むもの）を用いて、ターゲッティングの特異性を確認した（表２を参照）。各ＭＯ用量につき、４回のＶＥＧＦ−Ａ−Ｄ４−ＭＯインジェクション実験と、２回のＶＥＧＦ−Ａ−３−ＭＯインジェクション実験を実施した。表２に、各ＭＯ用量で実施した実験全体において観察された平均頻度をまとめて示す。標準誤差は、平均頻度と、個々の実験の頻度との差の平均である。
【０１４９】
ＶＥＧＦ−Ａ−Ｄ４、すなわち、ミスマッチＭＯを胚にインジェクションすることにより、認められたＶＥＧＦ−Ａ−１−ＭＯの効果の配列特異的性質が明らかにされた（表２を参照）。外来性ＶＥＧＦ−Ａ遺伝子に対するターゲッティングの特異性について独立に試験するために、完全に別個の配列（ＶＥＧＦ−Ａ−３）である第２のＶＥＧＦ−Ａ−１−ＭＯを用いた。この非常に強力なＭＯは、ＶＥＧＦ−Ａ−１−ＭＯと同じ表現型効果を発生に対して及ぼした。それらの効果には、血管機能の用量依存的減弱、心膜水腫、および尾内の血液貯留が含まれる（表２を参照）。効率の差は、ＭＯの様々な二次構造、または標的ｍＲＮＡ領域によると考えられる。あるいは、この効果は、ＶＥＧＦ−Ａ−１（２８％Ｇ／Ｃ）と比較して、ＶＥＧＦ−Ａ−３の推定融解温度が高い（４８％Ｇ／Ｃ）ために起こることも考えられる。従って、ＶＥＧＦ−Ａ−１−ＭＯのインジェクションに関連する表現型は、ＶＥＧＦ−Ａ転写物の翻訳のＭＯによる特異的阻害によって生じたものである。
【０１５０】
ゼブラフィッシュを用いた化学的突然変異誘発スクリーニングでは、突然変異により心臓血管欠損を引き起こす多数の遺伝子が認められた（Ｓｔａｉｎｉｅｒら（１９９６）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １２３：２８５−９２；Ｃｈｅｎら（１９９６）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １２３：２９３−３０２）。これらの突然変異と関連する表現型のどれも、ＶＥＧＦ−Ａモルファント表現型と非常に似ているわけではないが、それらの突然変異胚は、重複する表現型を有していた。複数の遺伝子座における突然変異は、胚において心臓水腫を起こし、また、スコッチテープ（ｓｃｏｔｃｈ ｔａｐｅ）（ｓｃｏ）突然変異では、内皮の組織崩壊により腹側尾びれ内に同様の血液貯留が認められた（Ｃｈｅｎら（１９９６）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １２３：２９３−３０２）。循環の改変を引き起こす複数の突然変異が認められた（Ｓｔａｉｎｉｅｒら（１９９６）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １２３：２８５−９２；Ｃｈｅｎら（１９９６）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １２３：２９３−３０２）。これらの突然変異には、ｇｒｉｄｌｏｃｋ、すなわち、動脈形成だけに必要なｂＨＬＨタンパク質をコードする遺伝子が含まれる（Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎら（１９９５）Ｎａｔ Ｍｅｄ １：１１４３−７；Ｓｔａｉｎｉｅｒら（１９９６）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １２３：２８５−９２；Ｚｈｏｎｇら（２０００）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８７：１８２０−４）。これら遺伝子のＶＥＧＦシグナリングにおける役割の解明には、残る遺伝子座の分子遺伝学的特性解析が待たれる。
【０１５１】
【表２】
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【０１５２】
実施例２３： ２６時間野生型およびＶＥＧＦ−Ａ−１モルホリノインジェクションゼブラフィッシュ胚におけるｆｌｉ−１およびｆｌｋ−１の比較発現
ＶＥＧＦ−Ａモルファント胚において、２つの内胚葉血管マーカー、ｆｌｉ−１およびｆｌｋ−１の発現を分析した。転写因子ｆｌｉ−１は、血管細胞の運命の特殊化の極初期マーカーである（Ｔｈｏｍｐｓｏｎら（１９９８）Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ １９７：２４８−６９；Ｂｒｏｗｎら（２０００）Ｍｅｃｈ Ｄｅｖ ９２：２３７−５２）。野生型の２６時間胚では、形成中の背側大動脈および軸方向静脈、ならびに、低次体節中の分節間血管系において、ｆｌｉ−１が発現された。完全な血管発生を果たせなかった胚では、ｆｌｉ−１の血管発現パターンの一部のみが改変された。ｆｌｉ−１の検出可能な分節間発現は認められなかった。これはＶＥＧＦシグナリングに対する強い分節間血管内胚葉の感受性と一致していた（表１）。これらの細胞は、適正に特殊化されなかったか、または分節間血管の形成の際に移動できなかったかのいずれかである。分節間血管における内皮マーカーｆｌｉ−１の発現のＶＥＧＦ−Ａシグナリングに対する明白な応答性は、血管発生の際のＶＥＧＦの二重の役割を示している。第１に、ＶＥＧＦ−Ａは、適正な軸方向血管形成に必要であるが、初期軸方向血管パターン形成には必要ない。第２に、ＶＥＧＦ−Ａは、分節間血管細胞の特殊化または移動、さらに恐らく、後の血管形成に必要である。
【０１５３】
同様の結果が、チロシンキナーゼＶＥＧＦ受容体ｆｌｋ−１の発現の分析により得られた。ｆｌｋ−１転写物の分布は、野生型胚の体幹および尾におけるｆｌｉ−１のそれと非常に類似していた。９ｎｇのＶＥＧＦ−Ａ−１のインジェクションにより作製したＶＥＧＦ−Ａモルファント胚では、軸方向発現ではなく、分節間発現が喪失していた。ｆｌｋ−１遺伝子発現の有意な減弱が、ＶＥＧＦ−Ａ活性を示さないマウス胚で認められた（Ｃａｒｍｅｌｉｅｔら（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ ３８０：４３５−９）。これほど極端ではないが、ｆｌｋ−１発現細胞の欠如が、部分的かつ条件付きＶＥＧＦ−Ａノックアウトを有するマウスに認められた（Ｈａｉｇｈら（２０００）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １２７：１４４５−５３）。
【０１５４】
１８ｎｇのＶＥＧＦ−Ａ−１−ＭＯをインジェクションしたゼブラフィッシュ胚は、ｆｌｉ−１およびｆｌｋ−１の両方について分節間領域で発現の同様な特異的喪失を示した。ｆｌｋ−１発現のＶＥＧＦシグナリングの必要性の欠如は、ＶＥＧＦシグナリングのパラ分泌様式の以前の観察と一致する（Ｆｅｒｒａｒａ， １９９９に概要）。しかし、ＶＥＧＦ受容体ｆｌｋ−１の発現は、分節間血管新生の際には、ＶＥＧＦ依存的である。この後者の観察は、分節間血管の血管形成の際に機能する自己調節ループの可能性を示唆している。魚から哺乳動物までのＶＥＧＦの高度の保存は、これが脊椎動物の基本的な生物学的経路であることを意味する。
【０１５５】
これらの実験から、軸方向および分節間血管構造の規格化に対するＶＥＧＦ−Ａの必要性の間に根本的な相違があることが明らかである。より具体的には、ＶＥＧＦ−Ａは、軸方向血管系パターン形成の初期確立に必要ではないが、分節間血管系の発生はすべて、ＶＥＧＦ−Ａシグナリングに依存している。ＶＥＧＦ−Ａモルファント胚における軸方向および分節間血管の不在は、ＶＥＧＦ−Ａが、血管形成におけるｆｌｋ−１およびｆｌｉ−１発現の確立を超える役割を果すことを示している。
【０１５６】
実施例２４： ＶＥＧＦ−ＭＯ相乗効果
実施例４に記載したように、胚に２種のＶＥＧＦ−ＭＯ（ＶＥＧＦ−Ａ−１−ＭＯおよびＶＥＧＦ−Ａ−３−ＭＯ）をインジェクションした。ＶＥＧＦ−Ａ−１−ＭＯおよびＶＥＧＦ−Ａ−３−ＭＯの配列は実施例３に記載している。実施例２１に記載したように、微小血管造影を用いて、発生２日目の胚を分析した。分節間血管系に欠陥を示した胚だけを弱いＶＥＧＦ−ＭＯ表現型を示すものとして得点付けし、分節間および軸方向血管系の両方に欠陥を示した胚は、強いＶＥＧＦ−ＭＯ表現型を示すものとして得点付けした。図８に表示した結果から、モルホリノインジェクションによる弱いまたは強いＶＥＧＦ−ＭＯ表現型を有する胚の数は、胚に単一のＶＥＧＦ−ＭＯをインジェクションしたときより、２種のＶＥＧＦ−ＭＯをインジェクションしたときの方が多いことが示される。１種または２種のＶＥＧＦ−ＭＯのインジェクションによる弱いまたは強いＶＥＧＦ−ＭＯ表現型を有する胚の数の比較から、増加が加法的増加より大きいこと、すなわち、２種のＭＯのインジェクションが、弱いまたは強いＶＥＧＦ−ＭＯ表現型を示す胚の数に相乗効果をもたらすことが示される。
【０１５７】
実施例２５： ゼブラフィッシュｆｒｉｚｚｌｅｄ−２ターゲッティング分析
実施例４に記載したように、２種のｚｆｚ２−ＭＯ（ｚｆｚ２−ＭＯ−ＡＴＧおよびｚｆｚ２−ＭＯ−ＵＴＲ）をインジェクションした。ｚｆｚ２−ＭＯ−ＡＴＧおよびｚｆｚ２−ＭＯ−ＵＴＲの配列は実施例３に記載している。図９は、２種のｚｆｚ２−ＭＯの一方または両方のｚｆｚ２−ＭＯのいずれかのインジェクションにより影響を受けた胚の百分率を示す棒グラフである。ｚｆｚ２に関連する発生異常は、波形脊索と、胚発生の際の後部集中体節が正常より広いことである。１種のｚｆｚ２−ＭＯまたは２種のｚｆｚ２−ＭＯのいずれかをインジェクションした胚を、形態学的に視覚化できるこれらの欠陥について調べた。両ｚｆｚ２−ＭＯは、個別に胚にインジェクションすると、類似した波形脊索と体節欠陥を引き起こすことができた。両ｚｆｚ２−ＭＯを同じ胚にインジェクションすると、脊索および体節形成における欠陥は相乗的であった。
【０１５８】
さらに、Ｆｓｐｏｎｄｉｎおよびｉｓｌｅｔ−１のような膵臓特異的マーカーを用いて、ゼブラフィッシュ膵臓の発生を調べた。Ｆｓｐｏｎｄｉｎおよびｉｓｌｅｔ−１はゼブラフィッシュ膵臓における細胞の一部で発現されるため、Ｆｓｐｏｎｄｉｎまたはｉｓｌｅｔ−１の発現の不在は、膵臓発生に欠陥があることを示す。Ｆｓｐｏｎｄｉｎおよびｉｓｌｅｔ−１発現を調べたところ、モルホリノインジェクションを受けた胚において、発現の減弱または発現の完全な欠如が認められた。
【０１５９】
実施例２６： コーディン阻害活性を高めるための脊椎動物のＴｓｇ機能
脊椎動物におけるｔｓｇの機能を調べるために、ゼブラフィッシュにおけるｚｔｓｇ１遺伝子の機能をｚｔｓｇ１−ＭＯを用いて分析した。ｚｔｓｇ１が初期ゼブラフィッシュ胚に偏在的に発現するのに対し、ｚｔｓｇ２は、後期段階にしか発現しないことから、ｚｔｓｇ１遺伝子は、初期胚ショウジョウバエｔｓｇに対する妥当な同等物である。
【０１６０】
ＭＯを用いて、内在性ｚｔｓｇ１の機能を減弱した。血管系を視覚化するため、９ｎｇのＵｒｏＤ−ＭＯを胚にインジェクションした。下記のマーカーについて、表示した発生段階でｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを実施した：ＭｙｏＤ（８体節期）、Ｋｒｏｘ２０（８体節）、ＧＡＴＡ２（２２体節）およびＢＭＰ−４（３体節期）。１２ｎｇのｚｔｓｇ１モルホリノ（ｚｔｓｇ−ＭＯ）のインジェクションにより、インジェクションを受けた胚の５０％が、拡張したＢＭＰシグナリングを特徴とする表現型を有するゼブラフィッシュを生じた（Ｈａｍｍｅｒｓｃｈｍｉｄｔら（１９９６）Ｄｅｖｅｌｏｐ １２３：９５−１０２；Ｍｉｌｌｅｒ−Ｂｅｒｔｏｇｌｉｏら（１９９９）Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ ２１４：７２−８６）。胚は、腹びれ領域の拡張を示したが、これは、異所性血島、すなわち、腹側中胚葉由来の組織に相当した。インジェクションした胚はまた、２２体節期でＧＡＴＡ２の拡張（４８％、ｎ＝２１）、８体節期に沿軸中胚葉の喪失（マーカーＭｙｏＤで視覚化）（３８％、ｎ＝３３）、ならびに、８体節期に前外胚葉組織の軽度の短縮（Ｋｒｏｘ−２０に対する染色により検出）（４９％、ｎ＝３９）も示した。これらの胚では、ＢＭＰ４の尾部発現も３体節期に拡張しており（４８％、ｎ＝２５）、前外胚葉マーカーｏｔｘ−２が減弱していた。処理胚は、ｄｉｎｏおよびｍｅｒｃｅｄｅｓ突然変異体と同様に、卵黄拡大に対して腹側のアポトーシス細胞の拡張を示した（Ｈａｍｍｅｒｓｃｈｍｉｄｔら（１９９６）Ｄｅｖｅｌｏｐ １２３：９５−１０２；Ｆｉｓｈｅｒら（１９９７）Ｄｅｖｅｌｏｐ １２４：１３０１−１１）。全体として、この表現型は、ｏｇｏｎ／ｍｅｒｃｅｄｅｓ突然変異体（Ｈａｍｍｅｒｓｃｈｍｉｄｔら（１９９６）Ｄｅｖｅｌｏｐ １２３：９５−１０２；Ｍｉｌｌｅｒ−Ｂｅｒｔｏｇｌｉｏら（１９９９）Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ ２１４：７２−８６）および中程度のコーディン機能喪失型突然変異体の表現型と非常に類似しており、中程度の腹側化表現型を示す（Ｎａｓｅｖｉｃｉｕｓら（２０００）Ｎａｔ Ｇｅｎ ２６：２１６−２２０；Ｈａｍｍｅｒｓｃｈｍｉｄｓら（１９９６）Ｄｅｖｅｌｏｐ １２３：９５−１０２）。
【０１６１】
ｚｔｓｇ１ ｍＲＮＡのインジェクションにより、ＢＭＰシグナリングの減弱に特徴的な表現型が生じた（Ｍｕｌｌｉｎｓら（１９９６）Ｄｅｖｅｌｏｐ １２３：８１−９３；Ｋｉｓｈｉｍｏｔｏら（１９９７）Ｄｅｖｅｌｏｐ １２４：４４５７−６６；Ｄｉｃｋら（２０００）Ｄｅｖｅｌｏｐ １２７：３４３−５４）。７５ｐｇのｚｔｓｇ１ ｍＲＮＡのインジェクションにより、生存した動物の５６％（インジェクションを受けた１６４匹のうち、１０８匹が生存）では、軸方向の長さが短縮し、腹びれが欠損した。これは、ｓｎａｉｌｈｏｕｓｅ突然変異（ＢＭＰ−７相同体）およびｐｉｇｇｙｔａｉｌ突然変異に観察される背側化突然変異胚のＣ３−Ｃ４クラスの表現型模写である（Ｍｕｌｌｉｎｓら（１９９６）Ｄｅｖｅｌｏｐ １２３：８１−９３；Ｄｉｃｋら（２０００）Ｄｅｖｅｌｏｐ １２７：３４３−５４）。分子分析により、８体節期で、ＭｙｏＤ（５０％、ｎ＝８）およびＫｒｏｘ２０（７０％、ｎ＝１０）の類似した拡張が明らかになった。さらに、ｚｔｓｇ１ ｍＲＮＡの背側化作用により、ｚｔｓｇ１−ＭＯの腹側化作用が部分的に反転した（９ｎｇのｔｓｇ１−ＭＯにより、４７±２％の腹側化胚（ｎ＝３７６）が、９ｎｇのｚｔｓｇ１−ＭＯ＋３０ｐｇのｚｔｓｇ１ ｍＲＮＡにより、１９±８％の腹側化胚（ｎ＝２７０）が、生じた）が、これは、ｚｔｓｇ１の欠損がその表現型の原因であったことを示している。従って、ｚｔｓｇ１の欠損が、腹側化表現型を有する胚を生じたのに対し、ｚｔｓｇ１の異所性発現は、背側化胚表現型を発生させた。
【０１６２】
実施例２７： コーディン遺伝子の不完全阻害的欠損によるｚｔｓｇ１機能喪失型表現型の増強
ショウジョウバエのデータは、Ｔｓｇの役割の１つが、Ｓｏｇ／コーディンと関連したＢＭＰシグナリングの阻害を増強することであるのを示唆している。脊椎動物についても同じことが言えるかどうかを判断するために、コーディン−ＭＯおよびｚｔｓｇ１−ＭＯを不完全阻害レベルで野生型胚にインジェクションし、異所性血島発生に対する効果を得点化した。胚には、ｚｔｓｇ１−ＭＯ、コーディン−ＭＯ、またはｚｔｓｇ１−ＭＯおよびコーディン−ＭＯの両方、を低用量でインジェクションし、得られた胚を血島拡張に関して調べた。図１０に表す結果は、ｚｔｓｇ１−ＭＯおよびコーディン−ＭＯが血島拡張を相乗的に増強することを示している。Ｔｓｇおよびコーディンの両方に対するＭＯの不完全阻害レベルの共インジェクションにより、腹側化表現型の浸透度が相乗的に高まる。従って、両遺伝子産物は、協働してＢＭＰシグナリングを阻害していた。Ｔｓｇおよびコーディンが、協働してＢＭＰシグナリングを阻害するという知見は、ショウジョウバエおよびアフリカツメガエルで実施された生化学実験の結果により確認された（Ｒｏｓｓら（２００１）Ｎａｔｕｒｅ ４１０：４７９−８３）。
【０１６３】
その他の実施形態
本発明を詳細な説明と関連付けて記載してきたが、以上の説明は、例証を目的としており、本発明の範囲を制限するものではないことは理解されるべきである。本発明の範囲は、本願の請求の範囲によって定められる。その他の態様、利点および変更は、本願の請求の範囲に含まれるものとする。
【図面の簡単な説明】
【図１】ＧＦＰ発現の配列特異的および用量依存的阻害を示すＧＦＰ蛍光阻害グラフである。
【図２】インジェクションしたコーディンＭＯの用量を増加しながら、２つの弱いおよび強いコーディンＭＯ表現型を達成したことを示すグラフである。
【図３】アフリカツメガエルコーディンｍＲＮＡインジェクションにより、コーディンＭＯ表現型が部分的にレスキューされたことを示し、これによってコーディンＭＯターゲッティングの特異性を明らかにする棒グラフである。
【図４】ｏｅｐ ｍＲＮＡインジェクションに応答するｏｅｐ表現型の頻度の用量依存的減弱を示す棒グラフである。
【図５】ｎｔｌ−ＭＯ、ｏｅｐ−ＭＯまたは両方のＭＯをインジェクションした胚に認められたｎｔｌ、ｏｅｐ、ならびに、ｎｔｌおよびｏｅｐ表現型の頻度を比較する棒グラフである。
【図６】対照ＭＯおよびｔｗｈｈ−ＭＯ、対照ＭＯおよびｓｈｈ−ＭＯ、またはｔｗｈｈ−およびｓｈｈ−ＭＯの両方をインジェクションした胚における単眼症、ｕ字型体節、および短縮ひれの頻度を比較する棒グラフである。
【図７Ａ】２つのｓｈｈ−ＭＯ間の相乗効果を示す棒グラフである。
【図７Ｂ】２つのｓｈｈ−ＭＯ間の相乗効果を示す棒グラフである。
【図８】２つのＶＥＧＦ−ＭＯ間の相乗効果を示す棒グラフである。
【図９】２つのｚｆｚ−ＭＯ間の相乗効果を示す棒グラフである。
【図１０】血島拡張に対するｚｔｓｇ１−ＭＯとコーディンＭＯの相乗効果を示す棒グラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【国際公開パンフレット】
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2004504820.tif 000086
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004504820.tif 000087
2004504820.tif 000088
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004504820.tif 000089
2004504820.tif 000090
【国際調査報告】
2004504820.tif 000091
2004504820.tif 000092
2004504820.tif 000093
2004504820.tif 000094
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