(57)【要約】本発明はその産物であるマロニルＣｏＡを通じた、脂肪酸酸化及び合成、グルコース代謝、並びに、エネルギーホメオスタシスの調節における、アセチルＣｏＡカルボキシラーゼの役割を強調する。アセチルＣｏＡカルボキシラーゼのアセチルＣｏＡカルボキシラーゼ２アイソフォームをコードする内因性ＡＣＣ２遺伝子における不活性化突然変異を有するトランスジェニックマウスを開示する。アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ２の不活性化は、骨格筋及び心臓におけるマロニルＣｏＡレベルの減少、無制限の脂肪酸酸化、及び、肝臓及び脂肪貯蔵細胞における減少された脂肪蓄積の表現型を示すマウスを生じさせるものとなる。その結果、マウスは、同じ制限食を与えた野生型マウスに比べ、多くの食物を消費するが、脂肪の蓄積が少なく、細身である。これらの結果はＡＣＣ２アセチルＣｏＡカルボキシラーゼの阻害が、体重コントロールの目的で脂肪酸化及び蓄積の調節に利用できることを示している。本発明は、筋肉、心臓、肝臓及びその他の組織の脂肪酸酸化の調節において、ＡＣＣ２によるマロニルＣｏＡ生産を調節するための有用な動物モデルを提供する。それらは、また、脂肪代謝及び体重コントロールのメカニズムの研究に用いられる潜在阻害剤を同定する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
個人においてアセチルＣｏＡカルボキシラーゼ２の活性を阻害するステップを含む前記個人に対する脂肪酸酸化及び体重の減少を促進する方法。
【請求項２】
前記活性が前記個人に対してアセチルＣｏＡカルボキシラーゼ２（ＡＣＣ２）の阻害剤を投与することにより阻害される、請求項１の方法。
【請求項３】
前記個人が病態生理学的状態である、請求項１の方法。
【請求項４】
前記病態生理学的状態が肥満及び糖尿病からなる群から選択される、請求項３の方法。
【請求項５】
個人に対してアセチルＣｏＡカルボキシラーゼ２（ＡＣＣ２）の阻害剤を投与するステップを含む、前記個人において血糖を減少させる方法。
【請求項６】
前記個人が糖尿病である、請求項５の方法。
【請求項７】
アセチルＣｏＡカルボキシラーゼのアセチルＣｏＡカルボキシラーゼ２アイソフォームをコードする内因性ＡＣＣ２遺伝子における突然変異を有するマウスであって、前記突然変異が前記遺伝子を不活性化して、機能的アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ２アイソフォームの発現を欠くものとしたトランスジェニックマウス。
【請求項８】
前記ＡＣＣ２遺伝子の１つ又はそれ以上のエクソンが欠損している、請求項７のマウス。
【請求項９】
前記エクソンが異種ＤＮＡ配列によって置換されたものである、請求項８のマウス。
【請求項１０】
前記異種ＤＮＡ配列がヒポキサンチンホスホリルリボシルトランスフェラーゼ発現カセットを含む、請求項９のマウス。
【請求項１１】
ＡＣＣ２のビオチン結合モチーフをコードするエクソンがヒポキサンチンホスホリルリボシルトランスフェラーゼ発現カセットで置換されたものである、請求項１０のマウス。
【請求項１２】
前記マウスが骨格筋及び心臓におけるマロニルＣｏＡ生産の代謝の減少を含む表現型を示す、請求項７のマウス。
【請求項１３】
さらに、無制限の脂肪酸化、並びに、肝臓及び脂肪貯蔵細胞における減少された脂肪蓄積の表現型を含む、請求項１２のマウス。
【請求項１４】
さらに、野生型マウスよりも多くのカロリーを消費するが、それにもかかわらず野生型マウスに比べ脂肪の蓄積が少ない表現型を含む、請求項１３のマウス。
【請求項１５】
野生型マウスに可能性のある阻害剤を投与する工程、及び
請求項１４のトランスジェニックマウスの表現型を示すマウスをスクリーニングする工程を含む、アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ２アイソフォーム活性に対する阻害剤のスクリーニング方法。
【請求項１６】
請求項１５の方法によって同定されたアセチルＣｏＡカルボキシラーゼ２阻害剤。
【請求項１７】
請求項１６のアセチルＣｏＡカルボキシラーゼ２阻害剤及び薬学的許容可能な担体を含む製薬組成物。
【請求項１８】
請求項７のトランスジェニックマウスから得られた組織からアセチルＣｏＡカルボキシラーゼ１タンパク質を精製する工程を含む、アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ２を含まないアセチルＣｏＡカルボキシラーゼ１タンパク質の精製された調製物を得る方法。
【請求項１９】
請求項７のトランスジェニックマウスにおいて抗体を発生させる工程を含む、アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ１及び他のマウスタンパク質とほとんど交差反応しない、アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ２に対するマウス抗体を得る方法。
【請求項２０】
請求項７のトランスジェニックマウスから派生した細胞系。
【請求項２１】
前記細胞系が筋肉細胞、心臓細胞、脂肪組織細胞及び肝臓細胞からなる群から選択された細胞から派生した細胞系である請求項２０の細胞系。
【請求項２２】
候補となる化合物を請求項２０の細胞系と野生型マウスから派生した細胞系とに投与する工程、及び、
ＡＣＣ２に特異的に作用する化合物が野生型細胞において細胞活性を変化させるが、請求項２０の細胞系には効果を及ぼさない、細胞活性の変化に関し、前記細胞系をモニタリングする工程を含む、
ＡＣＣ２のアゴニスト及びアンタゴニストをスクリーニングする方法。
【請求項２３】
モニタリングされた細胞活性がｍＲＮＡ発現、タンパク質発現、タンパク質分泌及び脂質代謝からなる群から選択されたものである、請求項２２の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（連邦財政援助説明）
本発明は、一部、連邦政府基金、Ｎ．Ｉ．Ｈ．  Ｇ．Ｍ．１９０９１号を使用してなされたものである。従って、連邦政府は本発明に関し、一定の権利を有するものである。
【０００２】
本発明は、一般的には、脂肪代謝及び体重コントロールの分野に関するものである。より詳しくは、本発明は、脂肪酸の蓄積及び酸化の調節におけるアセチルＣｏＡカルボキシラーゼのＡＣＣ２アイソフォームの役割に関するものである。
【背景技術】
【０００３】
ビオチン含有酵素であるアセチルＣｏＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣ）はアセチルＣｏＡにカルボキシル基を導入し、脂肪酸代謝の調節に中心的役割を果たす、中間代謝体であるマロニルＣｏＡを形成する反応に触媒作用を及ぼす。マロニルＣｏＡは、長鎖脂肪酸のミトコンドリア酸化に係る脂肪酸シャトル系の構成要素であるカルニチンパルミトイルトランスフェラーゼＩ（ＣＰＴＩ）の負の調節物として発見されてきたものである。この発見は２つの反対の経路、すなわち脂肪酸合成、及び、脂肪酸酸化の間の重要なリンクを提供するものである。したがって、ピルビン酸デヒドロゲナーゼの産物である、分担された中間体アセチルＣｏＡを経て、脂肪酸代謝と、炭水化物代謝とが相互関係がある可能性がある。従って、脂質の生合成組織（肝臓及び脂肪組織）及び脂質の非生合成組織（心臓及び筋肉）でのエネルギー代謝におけるマロニルＣｏＡの役割の研究に大きな力が注がれてきた。
【０００４】
原核生物においては、アセチルＣｏＡカルボキシラーゼは、ビオチンカルボキシルキャリヤータンパク質、ビオチンカルボキシラーゼ、及びトランスカルボキシラーゼの３つの異なったタンパク質から構成されている。しかしながら、真核生物においては、これらの活性は単一の遺伝子でコードされた単一の多機能タンパク質に含まれている。
【０００５】
ヒトを含む動物においては、２つの独立した遺伝子によりコードされ、異なった組織分布を示すＡＣＣ１（Ｍr〜２６５，０００）およびＡＣＣ２（Ｍr〜２８０，０００）という、主要な細胞で発現するアセチルＣｏＡカルボキシラーゼの２つのアイソフォームが存在する。ＡＣＣ１およびＡＣＣ２の両方とも、脂肪酸生成における“Ｃ2ユニット”の供与体であり、長鎖脂肪酸のミトコンドリア酸化に係るカルニチンパルミトイルＣｏＡシャトル系の調節物であるマロニルＣｏＡを生産する。従って、アセチルＣｏＡカルボキシラーゼは脂肪酸合成及び脂肪酸酸化をリンクさせ、カルボキシラーゼの基質であるアセチルＣｏＡはピルビン酸デヒドロゲナーゼの産物であるため、それらをグルコース利用とエネルギー生産と関連づける。ＡＣＣ１は肝臓や脂肪組織のような脂質の生合成組織で高度に発現し、ＡＣＣ２が心臓や骨格筋で優位な発現を行うという発見を合わせ、この観察は脂質の生合成におけるエネルギー代謝及び脂肪酸酸化組織の比較研究の新たな展望を開いた。
【０００６】
制限食、特に脂肪の無いものは、ＡＣＣを増加させ、それらの活性を増加させる。飢餓又は糖尿病はＡｃｃ遺伝子の発現を抑制し、酵素の活性を減少させる。以前の研究では、ＡＣＣ１及びＡＣＣ２間の特異的な差異を伴ったカルボキシラーゼの全体としての活性について述べられている。動物カルボキシラーゼの研究においては、これらの酵素は転写及び翻訳レベルの長期の制御、及び、クエン酸又はパルミトイルＣｏＡで誘導された標的セリン残基のリン酸化／脱リン酸及びアロステリック修飾による短期の制御下に置かれている。
【０００７】
いくつかのキナーゼは両方のカルボキシラーゼをリン酸化し、それらの活性を低下させることが発見されてきた。食物グルコースに対する反応として、インシュリンはカルボキシラーゼの脱リン酸を通じて、それらを活性化する。飢餓及び／ストレスは、リン酸化を通じてカルボキシラーゼを不活性化させるレベルにグリコーゲン及びエピネフリンを増加させるように導いた。運動させたラットを使った実験では、激しい運動の作用として、骨格筋のマロニルＣｏＡ及びＡＣＣ活性を減少させ、それにより、脂肪酸酸化に有利に働くことが示された。これらの変化はＡＭＰキナーゼ活性の増加と関連している。ＡＭＰ活性化タンパク質キナーゼ（ＡＭＰＫ）は、ＡＴＰを減少させる運動及び細胞性ストレスにより活性化されるカスケードにおいてタンパク質キナーゼ（ＡＭＰキナーゼ）によるアロステリック調節及びリン酸化を含むメカニズムを通じて、低レベルのＡＴＰと同時に発生する高レベルＡＭＰによって活性化される。これらのメカニズムを通じて、代謝の燃料が少なく、ＡＴＰが必要な場合には、両方のＡＣＣ活性はリン酸化によって失われ、結果的に脂肪酸酸化の増加及び脂肪酸生成用のＡＴＰ消費の減少によってＡＴＰ合成の増加を導く低マロニルＣｏＡレベルを導く。
【０００８】
最近、ヒトＡＣＣ１及びＡＣＣ２のｃＤＮＡ由来のアミノ酸配列が８０％の相同性を有し、両者の最も重要な差異はＡＣＣ２のＮ末端配列であるという報告があった。ＡＣＣ２Ｎ末端の最初の２１８アミノ酸は、このアイソフォームで見出される１３７アミノ酸残基のうち１１４残基をその一部に含むユニークなペプチドを示している。ユニークなＡＣＣ２Ｎ末端ペプチドに対して発生させたポリクローナル抗体はヒト、ラット及びマウスの組織に由来するＡＣＣ２タンパク質に特異的に反応する。これらの発見はＡＣＣ１及びＡＣＣ２の細胞下の存在を確定することを可能とし、後にＡＣＣ２はミトコンドリアと関連し、及び、ＡＣＣ２の疎水性Ｎ末端はミトコンドリアにＡＣＣ２を向わせるのに重要な役割を果たすことが示された。それに対して、ＡＣＣ１は細胞質ゾルに存在する。
【０００９】
これらの発見及びＡＣＣ１及びＡＣＣ２の組織分布の差異は、ＡＣＣ２が脂肪酸酸化の調節に関与し、ＡＣＣ１が主に脂質生合成組織における脂肪酸生成に関与することが示唆されるが、ＡＣＣ１及びＡＣＣ２遺伝子の産物が異なった役割を有するという明らかな証拠は示されていない。
【００１０】
２つのＡＣＣアイソフォーム間の差異はここで記載されたＡｃｃ２ノックアウトマウスが生産される前は予測することはできなかった。さらに、ＡＣＣ１及びＡＣＣ２の産物であるマロニルＣｏＡは、肝臓、及び、恐らく混合されない２つの分離されたプールにおけるその他の組織に存在し、組織の生理的学的及び代謝において異なった役割を果たすと考えられる。ＡＣＣ１の産物のマロニルＣｏＡは「Ｃ２炭素」の供与体として脂肪酸生成に関与する。一方、ＡＣＣ２の産物のマロニルＣｏＡはカルニチンパルミトイルＣｏＡシャトル系の調節に関与し、それゆえ脂肪酸酸化に関与する。Ａｃｃ２マウスによって得られた結果に基づくＡＣＣ１及びＡＣＣ２の産物の役割におけるこの機能的差異はこの研究以前には予測することができなかった。
【００１１】
さらに、本研究はＡＣＣ２がその産物であるマロニルＣｏＡを通じて、肥満の調節に対する重要な標的になる可能性があることを示した。ＡＣＣ２の阻害はマロニルＣｏＡの生産を減少させ、継続的な脂肪酸酸化及びエネルギー生産を導く。この脂肪酸の継続した酸化は、新鮮な生成された脂肪酸及びトリグリセロール、並びに、体脂肪の減少を導く脂肪及び他の脂肪組織における蓄積された体脂肪の消費によって達成される。
【００１２】
従来の技術は脂肪酸代謝経路におけるＡＣＣ１及びＡＣＣ２の異なった役割の理解が不十分であった。従来の技術は、また脂肪酸代謝における、ＡＣＣ１により生産されたマロニルＣｏＡとＡＣＣ２によって生産されたマロニルＣｏＡの異なった役割の特定が不十分であった。従来の技術は、また、ＡＣＣを欠いたトランジェニックノックアウトマウスの生産、及び、これらのトランスジェニックマウスの使用方法について欠いていた。本発明はこの技術分野の長年の必要性と要望を満たすものである。
【発明の開示】
【発明の概要】
【００１３】
アセチルＣｏＡカルボキシラーゼＡＣＣ１及びＡＣＣ２によって生産されたマロニルＣｏＡ（Ｍａ−ＣｏＡ）は脂肪酸（ＦＡ）代謝の調節において鍵となる代謝物である。Ａｃｃ１-/-突然変異マウスは、恐らく生体膜に不可欠な脂肪酸の合成のための「Ｃ2ユニット」の欠如のために、胚致死性である。Ａｃｃ２-/-突然変異マウスは正常に繁殖し、正常な生命期間を有するものであった。通常の制限食を与えられたＡｃｃ２-/-マウスは野生型マウスと同様に肝臓に脂肪を蓄積することなく、一晩の絶食の結果ケトン体生産が５倍に増加し、高い脂肪酸酸化を示す結果となった。Ａｃｃ２-/-とＡｃｃ２+/+マウスの肝臓におけるＡＣＣ１及び脂肪酸合成酵素活性、並びに、マロニルＣｏＡ含有量は同じであり、脂肪酸合成は混乱したものではなく、また、ミトコンドリア脂肪酸シャトル系の阻害させるマロニルＣｏＡは存在せず、よって脂肪酸酸化は比較的高かった。この結果はこの発見の以前は予測されておらず、脂肪酸代謝の調節におけるＡＣＣ１によって生産されたマロニルＣｏＡに対するＡＣＣ２によって生産されたそれの役割の相違は非常に重要である。
【００１４】
ＡＣＣ２の不在は、筋肉及び心臓において、それぞれ３０分の１及び１０分の１の低さにするものとなった。Ａｃｃ２-/-ヒラメ筋における脂肪酸酸化はＡｃｃ２+/+マウスのそれに比べ３０％高かった。インシュリンの添加はＡｃｃ２-/-ヒラメ筋の脂肪酸酸化に影響を与えなかったが、予想された通り、インシュリンの添加は野生型ヒラメ筋の脂肪酸酸化を突然変異体のそれに比べ５０％低下させた。これは、糖尿病でのインシュリン作用及び脂肪酸酸化の調節におけるＡＣＣ２の役割を最初に示したものであるので、非常に重要である。グルカゴンのアナローグであるイソプロテレノールは、Ａｃｃ２-/-マウスの筋肉における脂肪酸酸化にはほとんど影響を及ぼさないが、しかし、ヒラメ筋における脂肪酸酸化を５０％増加させた。再度、この結果はＡＣＣ２の脂肪酸酸化の調節における重要な役割、及び、肥満の調節における標的としてのその可能性を強調する。突然変異マウスの高い脂肪酸酸化は、野生型マウスに比べ脂肪組織の脂肪貯蔵を５０％減少させた。これらの結果は、ヒトを含む正常、糖尿病及び肥満動物における、脂肪酸代謝及びエネルギーホメオスタシスの理解と制御に有用なものである。
【００１５】
本発明の一つの実施態様は、個人における体重低下及び／又は脂肪酸化を促進する方法を提供する。この方法は個人に対するアセチルＣｏＡカルボキシラーゼ２（ＡＣＣ２）の阻害剤の投与を含むものである。同じ方法は、さらに、体重低下のために使用してもよい。
【００１６】
本発明のさらに別の実施態様においては、肥満及び糖尿病のような状態の個人に対するアセチルＣｏＡカルボキシラーゼ２（ＡＣＣ２）の阻害剤の投与を含む、肥満及び糖尿病のような状況を治療するための脂肪酸酸化を促進する方法が提供される。
【００１７】
本発明の別の実施態様は、本発明によるアセチルＣｏＡカルボキシラーゼ２（ＡＣＣ２）の阻害剤を投与することを含む血糖を減少させる方法が提供される。この方法は糖尿病の個人の治療に用いることができる。
【００１８】
本発明の別の実施態様においては、タンパク質を不活性化するアセチルＣｏＡカルボキシラーゼのＡＣＣ２アイソフォームをコードする内因性遺伝子における突然変異を有するトランスジェニックマウスが提供される。ＡＣＣ２遺伝子はＨＰＲＴ発現カセットのような異種ＤＮＡ配列で置換することで、遺伝子の一つもしくはそれ以上のエクソンを欠失することによって突然変異する。好ましい実施態様は、ＡＣＣ２のビオチン結合モチーフをコードするエクソンがＨＰＲＴ発現カセットで置換されるものである。この分野のものとしては予想外に、これらのマウスは骨格筋及び心臓のマロニルＣｏＡレベルの減少、制限の無い脂肪酸化、及び、肝臓及び脂肪貯蔵細胞における脂肪蓄積の減少からなる表現型を示す。トランスジェニックマウスは野生型マウスに比べ、多くの餌を消費したが、細いままであった。
【００１９】
本発明の別の実施態様においては、野生型マウスに阻害剤の可能性があるものを投与し、Ａｃｃ２-/-トランスジェニックマウスと同じ表現型を示すマウスをスクリーニングするステップを含むＡＣＣ２アイソフォームの阻害剤をスクリーニングする方法を提供する。
【００２０】
本発明の別の実施態様においては、上記の方法によって同定されたＡＣＣ２阻害剤が提供される。この阻害剤は、体重の低下の促進又は体重の維持のため脂肪酸酸化を増加させ、脂肪蓄積を阻害する目的で個人に対して投与される製薬組成物に取り込むことができる。
【００２１】
本発明はさらに、体重増が原因となったタイプI及びタイプII糖尿病に投与するインシュリンを補助することにより、ヒトを含む動物の糖尿病を治療する可能性を有する。さらに、増加した脂肪酸酸化は、解糖の増加、及び、インシュリンから独立した糖新生とグリコーゲン合成の減少と脂肪酸酸化の累積の減少により炭水化物代謝に影響を与える。よって、これは糖尿病患者の脂肪燃焼及び体重の減少の助けとなる。
【００２２】
本発明のさらなる実施態様においては、Ａｃｃ２-/-トランスジェニックマウスからＡＣＣ１を精製することにより、ＡＣＣ２アイソフォームが全く無い精製されたＡＣＣ１タンパク質の調製物を得る方法が記載されている。
【００２３】
本発明の別の実施態様においては、Ａｃｃ２-/-トランスジェニックマウスにおいて抗体を発生させることによりＡＣＣ２に対する改良された抗体を得る方法が提供される。
【００２４】
本発明のさらに別の実施態様においては、Ａｃｃ２-/-トランスジェニックマウスから派生した細胞系が提供される。筋肉、心臓、脂肪組織細胞、及び肝臓細胞から派生させた細胞系は、目的とするバイオアッセイ及び薬剤の研究に有用であると期待される。視床下部を含む脳細胞の細胞系は給餌行動及び食欲の調節、並びに、脂肪及び炭水化物代謝を含む神経ペプチドに効果的であろう。
【００２５】
本発明のさらに別の実施態様においては、ＡＣＣ２のアゴニスト及びアンタゴニストをスクリーニングする方法が提供される。この方法は、Ａｃｃ２-/-細胞系及び野生型マウスから派生させた細胞系に対して候補となる化合物を投与したあとに、細胞活性の交代を見つけるための実験を行うステップを含んでいる。ＡＣＣ２に特異的に作用する化合物は、野生型細胞では細胞活性、脂肪及び炭水化物代謝を変更させるが、Ａｃｃ２-/-細胞には何も影響を与えない。モニタリングすることができる細胞活性には、ｍＲＮＡ発現、タンパク質発現、タンパク質分泌、及び脂肪酸及び脂質及び炭水化物代謝にかかわる、触媒的活性タンパク質（酵素）が含まれる。
【００２６】
ＡＣＣ２のセリン１２０１の不在は、ＡＣＣ１及びＡＣＣ２調節の間に重要な差異を示し、ＡＣＣ１及びＡＣＣ２に対する区別される阻害剤（薬剤）を設計し、及び／又は発生させることにおいて、有効なものとすることができる。ＡＣＣ２の独特の疎水性アミノ末端を含む、本発明の別の、さらなる側面、特徴及び利点には、ＡＣＣ１及びＡＣＣ２に対する区別される阻害剤（薬剤）を設計し、及び／又は発生させることにおいて、有効なものとなる。さらに、抗ＡＣＣ１抗体に対するＡＣＣ２の区別される反応は、ＡＣＣ１及びＡＣＣ２に対する区別される阻害剤（薬剤）を設計し、及び／又は発生させることにおいて重要であろう。さらに、さらなる側面は、開示の目的のために示された、以下の発明の実施態様の記載によって明らかになる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２７】
本発明は個人に対してアセチルＣｏＡカルボキシラーゼ２（ＡＣＣ２）の阻害剤を投与することによって、個人における体重低下を促進する方法を示すものである。同じ方法は、さらに、脂肪減少のために使用することができる。
【００２８】
本発明は、肥満及び糖尿病のような状態の個人に対してアセチルＣｏＡカルボキシラーゼ２（ＡＣＣ２）を投与することにより、肥満及び糖尿病のような状態を治療するための脂肪酸酸化を促進する方法が提供される。
【００２９】
本発明は、個人に対してアセチルＣｏＡカルボキシラーゼ２（ＡＣＣ２）の阻害剤を投与することによってその個人の血糖値を低下させる方法が提供される。この方法は糖尿病の個人の治療に用いることができる。
【００３０】
本発明はまた、機能的ＡＣＣ２アイソフォームの発現を結果的に欠くこととなる、アセチルＣｏＡカルボキシラーゼのＡＣＣ２アイソフォームをコードする内因性ＡＣＣ２遺伝子における突然変異を有するトランスジェニックマウスが提供される。この遺伝子は、ＨＰＲＴ発現カセットのような異種ＤＮＡ配列で置換される、ＡＣＣ２遺伝子の一つもしくはそれ以上のエクソンを欠失することによって突然変異する。好ましくは、ＡＣＣ２のビオチン結合モチーフをコードするエクソンがＨＰＲＴ発現カセットで置換されるものである。得られたマウスは骨格筋及び心臓、その他の組織におけるマロニルＣｏＡレベルの減少、制限の無い脂肪酸化、及び、肝臓及び脂肪貯蔵細胞における脂肪蓄積の減少からなる表現型を示す。トランスジェニックマウスは野生型マウスに比べ、多くの餌を消費するが、より少ない脂肪しか蓄積しない。
【００３１】
本発明はまた、野生型マウスに阻害剤の可能性があるものを投与し、Ａｃｃ２-/-トランスジェニックマウスの表現型を示すマウスをスクリーニングするステップを含むＡＣＣ２アイソフォーム活性の阻害剤をスクリーニングする方法を示すものである。
【００３２】
本発明はまた、上記の方法によって同定されたＡＣＣ２阻害剤を示すものである。この阻害剤は、体重の低下の促進又は体重の維持のため脂肪酸酸化を増加させ、脂肪蓄積を阻害する目的で個人に対して投与される製薬組成物に取り込むことができる。
【００３３】
本発明はまた、ＡＣＣ２アイソフォームが無い、ＡＣＣ１タンパク質を得る精製方法を提供する。これは、本発明のＡＣＣ２アイソフォームを欠いたＡｃｃ２-/-トランスジェニックマウスから得られた組織からＡＣＣ１を精製することにより達成される。
【００３４】
本発明はまた、Ａｃｃ２-/-トランスジェニックマウスにおいて抗体を発生させることによりＡＣＣ２に対する改良された抗体を調製する方法を提供する。野生型マウスと異なり、これらのマウスは免疫自己寛容の発生期間においてＡＣＣ２が存在しないことから、ＡＣＣ２に対する免疫寛容がほとんどない。その結果、ＡＣＣ２で免疫されたＡｃｃ２-/-トランスジェニックマウスから得られた抗体は、野生型マウスで発生させた同様の抗体に比べ、ＡＣＣ２の独特な抗原ドメインをより多く示すものである。
【００３５】
本発明はさらに、Ａｃｃ２-/-トランスジェニックマウスから派生した細胞系を示すものである。これらの細胞系はＡＣＣ１及びＡＣＣ２のバイオアッセイ、並びに、薬剤ターゲッティングの研究の目的において有用である。筋肉、心臓、脂肪組織、及び肝臓細胞から派生させた細胞系は、特にこれらの研究において有用である。
【００３６】
本発明には、また、ＡＣＣ２のアゴニスト及びアンタゴニストをスクリーニングする方法が含まれる。Ａｃｃ２-/-細胞系及び野生型細胞系に対して候補となる化合物が投与される。細胞はその後、ｍＲＮＡ発現、タンパク質発現、タンパク質分泌、タンパク質活性、及び、脂質代謝のような細胞活性が変化しないかをモニタリングする。ＡＣＣ２に特異的に作用する化合物は、野生型細胞では細胞活性を変更させるが、Ａｃｃ２-/-細胞には何も影響を与えない。
【００３７】
以下の実施例は本発明の様々な態様を示すために与えられたもので、いかなるやり方においても本発明を制限することを意味するものではない。
【実施例１】
【００３８】
Ａｃｃ２-/-トランスジェニックマウスの生産
マウスＡｃｃ２ゲノムクローンをＡｃｃ２  ｃＤＮＡプローブを用いて単離した。ヒト及びマウスＡＣＣ２遺伝子間の相同性に基づき（Abu-Elheiga, L., Almarza-Ortega, D. B., Baldini, A., and Wakil, S.J., Ｊ Biol Chem. 272, 10669−10677, 1997)、ヒトＡＣＣ２のｃＤＮＡ配列に基づく、ビオチン結合領域からの２つのオリゴヌクレオチドが設計された：フォワードプライマー（５´−ＣＴＧＡＡＴＧＡＴＧＧＧＧＧＧＣＴＣＣＴＧＣＴＣＴ−３´；ヌクレオチド２５５１−２５７５）（配列番号１）及びリバースプライマー（５´−ＴＴＣＡＧＣＣＧＧＧＴＧＧＡＣＴＴＴＡＧＣＡＡＧＧ−３´；ヌクレオチド２８９０−２９１３）（配列番号２）。これらのプライマーはクイッククローンマウス心臓ｃＤＮＡプール（クローンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ））テンプレートからｃＤＮＡを増幅するのに用いた。
【００３９】
得られたｃＤＮＡ断片は、シークエンスされ、１６ｋｂｐ  λゲノムクローンを単離するために、１２９／ＳｖＥｖマウスゲノムライブラリーをスクリーニングするのに用いた。異なる制限酵素により消化させることにより、制限酵素地図が確立され、正負の選択マーカーを含み、ビオチン結合モチーフＭｅｔ−Ｌｙｓ−Ｍｅｔを含むエクソンを欠いたジーンターゲッティングベクターが構築された（図１Ａ）。このベクターをＡＣＣ２遺伝子の一つの突然変異のコピー（突然変異対立遺伝子は、Ａｃｃtml LAEと名付けられた）を有するマウス１２９ＳｖＥｖ  ＥＳ細胞を発生させるのに用いた。
【００４０】
２つの独立したＥＳ細胞クローンはマウス胚盤胞に注入され、それはその後、偽妊娠メスの子宮角に移植された。産まれた子供の中から、８匹の高レベルキメラを確認し、それらをＣ５７ＢＬ／６Ｊメスと交雑させた。それぞれのメスはＥＳ細胞の生殖系列の遺伝を含んだ、数匹のアーグティな子供を産んだ。ゲノムＤＮＡのサザンブロット分析では、Ｆ１ヘテロ接合体において、内因性対立遺伝子及び分裂した対立遺伝子の両方が含まれていることが確認された。ヘテロ接合体マウスは近親交配され、それらの子孫は共通の遺伝子型を示した。図１Ａで示された５´及び３´プローブでハイブリダイズされたＤＮＡのサザンブロット分析では、野生型（＋／＋）、ヘテロ接合体（＋／−）、及び、ホモ接合体ヌル（−／−）動物から予測された信号が検出された（図１Ｂ）。３００以上のマウス尾の遺伝子タイピングによって、子孫の２４％がＡｃｃ２-/-であり、２２％がＡｃｃ２+/+であり、５４％がＡｃｃ２+/-であると決定され、これらの結果はメンデル遺伝を形成していた。Ａｃｃ２-/-突然変異体は生きていくことができ、正常に生殖するものであり、正常な一生を送れるように思われた。
【実施例２】
【００４１】
Ａｃｃ２-/-トランスジェニックマウスにおけるＡｃｃ２発現
野生型、ヘテロ接合体及びホモ接合体ヌル動物から切除された骨格筋組織の全ＲＮＡのノーザンブロット分析では、ホモ接合体ヌル動物では検出可能なＡｃｃ２  ｍＲＮＡは示さず、予測されたように、ヘテロ接合体の動物のＡｃｃ２  ｍＲＮＡのレベルは野生型のそれの半分であった（図１Ｃ）。ビオチン含有タンパク質を検出するために、アビジンペルオキシダーゼを使用した、Ａｃｃ２-/-突然変異マウスの心臓、骨格筋及び肝臓組織のウエスタンブロットでは、ＡＣＣ２タンパク質の発現は示さなかった（図１Ｄ）。野生型マウスの心臓及び骨格筋組織では、ＡＣＣ２タンパク質（２８０ｋＤａ）のレベルは、ＡＣＣ１タンパク質（２６５ｋＤａ）のレベルより高く、一方、肝臓組織ではＡＣＣ１タンパク質がより優勢であった。
【００４２】
Ａｃｃ２-/-突然変異マウスにおけるＡＣＣ２タンパク質の不在は、アフィニティー精製抗ＡＣＣ２特異的抗体を用いた共焦点免疫蛍光顕微鏡によって確認された（Abu-Elheiga, L., W.R. Brinkley, L. Zhong, S.S. Chirala, G. Woldegiorgis, and S. Wakil. Proc Natl Acad Sci USA., 97:1444-1449,2000）。野生型マウスの心臓、骨格筋及び肝臓ではＡＣＣ２抗原を豊富に発現するのに対し、Ａｃｃ２-/-突然変異マウスではこのタンパク質の発現はなかった。従って、全ての測定によれば、Ａｃｃ２-/-突然変異対立遺伝はヌル対立遺伝子である。
【実施例３】
【００４３】
Ａｃｃ２-/-トランスジェニックマウスのマロニルＣｏＡレベル
動物組織におけるマロニルＣｏＡのレベルはＡＣＣ１及びＡＣＣ２の両方の活性に起因するので、これらの組織におけるマロニルＣｏＡレベルに対するＡＣＣ２の不在の効果、及び、ＡＣＣ１が補うことで、結果として、これらの組織のマロニルＣｏＡレベルを上昇させることができるのかを決定した。野生型及びＡｃｃ２-/-突然変異マウスの肝臓組織を比較した結果、マロニルＣｏＡレベル及びＡＣＣ活性において有意な差は無く、肝臓におけるマロニルＣｏＡのほとんど全ては、ＡＣＣ１が寄与したものであることが示唆された（図２）。
【００４４】
一方、同じ２グループのマウスの組織を比較すると、Ａｃｃ２-/-突然変異マウスの骨格筋及び心臓のマロニルＣｏＡレベルは、野生型マウスに比べ、それぞれ約１／３０及び１／１０の低さであった。このことは、ＡＣＣ２が骨格筋及び心臓のマロニルＣｏＡの主要な寄与者であることを示唆する。
【００４５】
飢餓の間、野生型及びＡｃｃ２-/-突然変異マウスの両方の肝臓組織でマロニルＣｏＡレベルは似たように減少し、このことはＡＣＣ１が食餌条件により影響を受けることを示唆している（図２）。飢餓Ａｃｃ２-/-突然変異マウスの心臓及び筋肉組織におけるマロニルＣｏＡレベルは非常に低く、このことはこれらの組織のＡＣＣ１もまた制限食により影響を受けることを示唆するものである（図２）。筋肉におけるマロニルＣｏＡは一次的にはＡＣＣ２により発生するので（Thampy, K.G., J Biol Chem., 264：17631-17634, 1989)、飢餓状態の野生型マウスの筋肉におけるマロニルＣｏＡレベルは、十分に餌を与えられたマウスの筋肉に比べ７０％減少しており、このことはこれらのマウスのＡＣＣ２活性は制限食によって調節されたことが示唆するものである。ＡＣＣ２活性は、ＡＣＣ２発現量の減少、又は、その活性のダウン調節、又は、その両方によって有意に減少させることができる。
【実施例４】
【００４６】
Ａｃｃ２-/-トランスジェニックマウスの脂肪酸蓄積
ＡＣＣ反応は脂肪酸合成における律速段階であり（Wakil, S.J., Stoops, J.K., and Joshi, V.C., Ann Rev Biochem., 52：523-579,1983）、及び、野生型及びＡｃｃ２-/-突然変異マウスの肝臓組織におけるマロニルＣｏＡレベルは同様なものであるので、脂肪酸合成もまた同様であると予測される。実際に、［14Ｃ］−アセチルＣｏＡの取り込みによって測定したパルミチン酸塩の合成は両グループで同様なものであった。しかしながら、野生型マウスの肝臓は、突然変異体の肝臓よりも明るい色をしており、それらにはより多くの脂肪が含まれることが示唆された（図３Ａ）。
【００４７】
この示唆を確認するために、肝臓組織を脂質検出のためのオイルレッドＯで染色を行い、それらの脂質及びトリグリセリド含有量を測定した。野生型の肝臓には、初期にはトリグリセリドである油滴が豊富であるが（図３Ｂ）、一方、Ａｃｃ２-/-肝臓はより少ない油滴しか含んでいなかった（図３Ｃ）。全脂質を抽出し、薄層クロマトグラフィーで分析した結果は、突然変異体の肝臓は、野生型肝臓に比べ、脂質含有量が２０％低く、脂質中のトリグリセイド含有量は８０％から９０％低かった。
【実施例５】
【００４８】
別個のプールのマロニルＣｏＡを調節するＡＣＣ１及びＡＣＣ２
野生型及びＡｃｃ２-/-突然変異体の肝臓抽出物のＡＣＣの活性及び脂肪酸合成酵素（ＦＡＳ）は同様であるので、肝臓の脂質含有量の差は、脂質合成酵素の抑制のためではなく、２次的なＡｃｃ２-/-肝臓での未制御のミトコンドリア脂肪酸酸化によるによるものでなければならない。また、マロニルＣｏＡはミトコンドリアカルニチンパルミトイルＣｏＡシャトル系の負の調節物であるので（McGarry, J.D., and N.F. Brown., Eur. J. Biochem., 244：1-14, 1997）、Ａｃｃ２-/-肝臓におけるその不在はミトコンドリア膜を通過する脂肪酸の移動、及び、それに続くβ酸化を増加させることが予測された。従って、これらの結果は、ＡＣＣ２により合成されたマロニルＣｏＡは脂肪酸酸化を制御することによって、肝臓の脂肪蓄積に影響を与えることを示唆するものである。両グループのマウスの肝臓において豊富なＡＣＣ１生産マロニルＣｏＡは見かけ上、脂肪酸のβ酸化を阻害しないから、ＡＣＣ１及びＡＣＣ２によって生産されたマロニルＣｏＡは、それぞれ細胞質ゾルとミトコンドリアという、細胞の２つの異なる区画に存在し、それぞれの区画において異なった機能を果たしていると結論付けることができる。ＡＣＣ１及びＡＣＣ２は両者ともラット肝臓の門脈周囲（ゾーン１）及び静脈周囲（ゾーン２）肝細胞の両方に存在するので、２つのプールのマロニルＣｏＡが肝臓のこれら分離された領域におけるＡＣＣ１及びＡＣＣ２の異なった発現により派生したものとは考えにくい。
【実施例６】
【００４９】
Ａｃｃ２-/-トランスジェニックマウスの肝臓におけるグリコーゲンの分析
肝臓及び筋肉にけるグルコースの貯蔵型であるグリコーゲンはヒトを含む動物のエネルギーホメオスタシスの重要な調節物である。この合成及び分解はグルコース代謝と密接に関連している。グリコーゲン代謝に係る酵素は、インシュリン、グルカゴン及びエピネフリンのようなホルモンによって高度に調節される。
【００５０】
ＡＣＣ２の欠如がグリコーゲンのレベルに影響を与えるかどうかを調査するために、野生型及びＡｃｃ２-/-突然変異マウスから切除された肝臓の凍結切片においてクリコーゲンに対する染色を行った（図３Ｄ及び３Ｅ）。栄養が行き渡っている状態では、野生型の肝臓にはグリコーゲンを豊富に含む（４１０±１０μｍｏｌ／ｇ湿組織）、一方、Ａｃｃ２-/-マウスの肝臓に含まれるグリコーゲンは２０％低い（３２５±１４μｍｏｌ／ｇ湿組織）。より多くのグリコーゲンが脂肪酸合成に利用され、それは引き続きＡｃｃ２-/-肝臓において酸化され、それによりグリコーゲンが枯渇するという考えが示唆される。２４時間の飢餓野生型マウスの肝臓では明らかにグリコーゲンが存在している（図３Ｄ）、一方、Ａｃｃ２-/-変異体の肝臓ではグリコーゲンは検出できなかった（図３Ｅ）。
【実施例７】
【００５１】
Ａｃｃ２-/-トランスジェニックマウスにおける血糖及び脂質の分析
次の段階においては、標準的制限食を与えた野生型及びＡｃｃ２-/-トランスジェニックマウスの血清におけるコレステロール、グルコース、トリグリセリド、遊離脂肪酸及びケトン体のレベルの分析を行った。コレステロールのレベルは両方のグループのマウスにおいて同様であり（９２．８±３．１及び９５．１±７．４ｍｇ／ｄｌ）、グルコースのレベルは突然変異体で２０％低かった（１７６．６±６．５対１３６．２±５．４ｍｇ／ｄｌ）。おそらく酸化の基質として、肝臓及び／又は脂肪から心臓及び肝臓へトリグリセリド及び脂肪酸を伝達するそれらの移動性のため、脂肪酸のレベルは突然変異体マウスでは低いにもかかわらず（１．３７±０．３１対０．８４±０．１２ｍＭ）、トリグリセリド（３５．１±２．５対４５．２±５．９ｍｇ／ｄｌ）は、突然変異体マウスでは３０％高かった。ケトン体（β−ヒドロキシ酪酸）の血清レベルは、野生型及び突然変異マウスの両方で、ほとんど検出できないほどであった。しかしながら一晩（１０から１２時間）の飢餓により、Ａｃｃ２-/-マウスのβ−ヒドロキシ酪酸の血中濃度を野生型の４倍に増加させ（２．５±０．６ｍＭ対０．７±０．０５ｍＭ、ｎ＝５）、突然変異マウスにおいて脂肪酸酸化の度合いが高いことと合致している。
【実施例８】
【００５２】
Ａｃｃ２-/-トランスジェニックマウスにおける脂肪酸酸化
ＡＣＣ２合成マロニルＣｏＡの脂肪酸酸化の調節物としての役割をより明確な証拠を得るため、ホルモン調節に対して応答性のタイプII筋肉組織である、マウスヒラメ筋において脂肪酸酸化を調査した（Vavvas, D., Apazidis, A., Saha, A.K., Gamble, J., Patel, A., Kemp, B.E., Witters, L.A., and Ruderman, W.B., J Biol Chem., 272：13255-13261 1997；Alam, N., and E.D. Saggerson. Biochem J., 334：233-41, 1998；Abu-Elheiga, L., Jayakumar, A., Baldini, A., Chirala, S.S., and Wakil, S.J. Proc Natl Acad Sci. USA 92, 4011-4015, 1995；Abu-Elheiga, L., Almarza-Ortega, D.B., Baldini, A., and Wakil, S.J. J Biol Chem. 272, 10669-10677, 1997； - Ha, J., J.K. Lee, K.-S. Kim, L.A. Witters, and K.-H. Him. Proc Natl Acad Sci USA. 93：11466-11470, 1996； Rasmussen, B. B. and Wolfe, R.R., Ann. Rev. Natr. 19：463, 1999； Bressler, R. and Wakil, S.J. J Biol Chem. 236：1643-1651, 1961)。
【００５３】
図４に示すように、Ａｃｃ２-/-マウスから単離させたヒラメ筋はＡｃｃ２+/+マウスからのものに比べ、［3Ｈ］パルミチン酸塩の酸化が３０％高かった。インシュリンはＡＣＣ１及びＡＣＣ２の両方を活性化し、それにより、それぞれ脂肪酸合成の誘導と脂肪酸酸化の阻害を行うことが分かる。野生型及びＡｃｃ２-/-マウスから単離させたヒラメ筋にインシュリンを添加したところ、Ａｃｃ２-/-突然変異マウス筋肉細胞においては、脂肪酸酸化に影響を与えなかった（図４）、しかし、野生型筋肉細胞ではパルミチン酸塩の酸化を４５％減少させた（図４）。これらの結果に基づけば、β酸化のインシュリンが仲介する阻害は、恐らくは脱リン酸によるＡＣＣ２の活性化によって起こるものと結論付けることができる（Lopaschuk, G. and Gamble, J Can J Physiol Parmacol. 72：1101-1109. 1994； Kudo, N., Bar, A.J., R.L., Desai, S., Lopaschuk, G.D. J Biol Chem. 270：17513-17520, 1995； Dyck, J.R., N. Kudo, A.J. Barr, S.P. Davies, D.G. Hardie, and G.D. Lopaschuk. Eur J Biochem. 262：184-190, 1999； Vavvas, D., Apazidis, A., Saha, A.K., Gamble, J., Patel, A., Kemp, B.E., Witters, L.A., and Ruderman, W.B. J Biol Chem. 272：13255-13261, 1997； Iverson, A.J., A. Bianchi, A.C. Nordlund, and L.A. Witters. Biochem J. 269：365-371, 1990； Kim, K.H., F. Lopez-Casillas, D.H. Bai, X. Luo, and M.E. Pape. Faseb J. 3：2250-2256, 1989； Thampy, K.G., and Wakil, S.J. J. Biol. Chem. 263, 6454-6458, 1988； Mabrouk, G.M., Helmy, I. M., Thampy, K.G., and Wakil, S.J. J. Biol. Chem. 265, 6330-6338, 1990； Mohamed, A.H., W.Y. Huang, W. Huang, K.V. Venkatachalam, and S.J. Wakil. J Biol Chem. 269：6859-6865. 1994； and, Hardie, D.G. Prog Lipid Res. 28：117-146, 1989)。
【００５４】
脂肪酸のミトコンドリア酸化の調節におけるＡＣＣ２の役割をグルカゴンのアナローグであって、インシュリンがもたらす効果とは反対の効果をもたらすイソプロテレノールを用いることによりさらに確認した。イソプロテノールを野生型ヒラメ筋に添加すると、パルミチン酸化を５０％増加させ（図４）、突然変異体筋肉細胞で見られるレベルと同様なレベル近くまで上昇させる。さらに、イソプロテレノールは野生型ヒラメ筋細胞においても脂肪酸酸化を増加させることは注目に値する（図４）。この添加による増加は、マロニルＣｏＡとは独立の要因によるものと思われる（Kim, K.H., F. Lopez-Casillas, D.H. Bai, X. Luo, and M.E. Pape. Faseb J. 3：2250-2256, 1989）。
【００５５】
要するに、これらの結果は、細胞質ゾルＡＣＣ１ではなく、ミトコンドリア関連ＡＣＣ２が、それぞれ脂肪酸酸化を減少及び増加させる結果となるインシュリン仲介活性及びイソプロテレノール（グルカゴン）仲介することを最初に確認したものである。両グループのマウスのヒラメ筋のミトコンドリアＣＰＴＩ活性は非常に近いので（データは示さず）、観察されたホルモンの効果は、ＡＣＣ２だけの効果によるものである。
【実施例９】
【００５６】
Ａｃｃ２-/-トランスジェニックマウスの給餌実験
未調節のこれまで維持されてきたやり方でＡｃｃ２-/-突然変異マウスでは脂肪酸のミトコンドリアβ酸化が起こるようである。このタイプの脂肪酸β酸化の役割及び餌消費及び体重増加に対する効果を調査するために、アド・リベラタムで計量した標準制限食を与えられた３つのグループのマウス（それぞれのグループは５匹の野生型マウス及び５匹のＡｃｃ２-/-突然変異マウスで構成されている）に対する給餌実験を行った（図５はそれぞれのグループをプロットで示したものである）。それぞれのグループの餌消費量（こぼれた量は考慮しない）を２７週にわたって週ごとに測定した。
【００５７】
平均して見ると、Ａｃｃ２-/-突然変異マウスは野生型マウスに比べ週当たり２０〜３０％多く餌を消費し（図５Ａ）、平衡状態の平均体重は野生型マウスでは２３ｇであるのに対し、Ａｃｃ２-/-突然変異マウスでは２１ｇであった（図５Ｂ）。Ａｃｃ２-/-突然変異マウスは給餌期全体を通じて細身で、野生型マウスに比べ体重は約１０％減であった（図５Ｂ）。さらに、Ａｃｃ２-/-突然変異マウスでは、脂肪組織に蓄積された脂肪はほとんど無かった（図５Ｃ及び図５Ｄ）。例えば、同腹子の野生型マウスの副精巣脂肪パッドの重さは１．４ｇであるのに対し、Ａｃｃ２-/-突然変異マウスの副精巣脂肪パッド組織の重さは０．７５ｇであった（図５Ｅ）。脂肪組織の大きさの減少は、結果として、血漿に放出されるレプチンの量を、野生型マウスでは５９±３ｎｇ／ｍｌであるものからＡｃｃ２-/-突然変異マウス３６±３ｎｇ／ｍｌに減少させた。従って、脂肪酸のミトコンドリアβ酸化は脂肪組織における脂肪貯蔵を調節する。
【実施例１０】
【００５８】
ＡＣＣ１-/-トランスジェニックマウスの生産
脂肪酸のデ・ノボ合成におけるＡＣＣ１の重要性を示すために、ＡＣＣ２で行ったのと同様にして、Ａｃｃ１ノックアウトマウスを以下と同様な戦略により作成した。ＡＣＣ２と同様に、ＡＣＣ１アイソフォームもまた、動物種間で高度に保存されている（Thampy, K.G. J Biol Chem. 264：17631-17634, 1989)。ヒトＡｃｃ１  ｃＤＮＡに基づくフォワードプライマー（５´−ＧＧＡＴＡＴＣＧＣＡＴＣＡＣＡＡＴＴＧＧＣ−３´）（配列番号３）及びビオチン結合部位を含むリバースプライマー（ＣＣＴＣＧＧＡＧＴＧＣＣＧＴＧＣＴＣＴＧＧＡＴＣ−３´）（配列番号４）が設計され、ヒトｃＤＮＡをテンプレートとして使用し３３５ｂｐ  ｃＤＮＡプローブを増幅するのに用いた。ＡＣＣ２で記載したように、ＰＣＲ断片で、１２９／ＳｖＥｖマウスゲノムライブラリーをスクリーニングし、１４ｋｂｐクローン（図６Ａ）を単離し、制限酵素でマッピングし、サザンブロット分析を行った（図６Ｂ）。正確な標的クローンがＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス胚盤胞に注入され、それはその後、偽妊娠メスの子宮角に移植された。その結果生まれたオスキメラを確認し、それらをＣ５７ＢＬ／６Ｊ相手と交雑させ、Ａｃｃ１異種接合の子孫を近親交配させた。
【００５９】
３００匹以上の子孫のゲノムＤＮＡを５´及び３´プローブを使用したサザンブロットによる分析によっては、ホモ接合体Ａｃｃ１ヌル突然変異体の子孫は得られなかった。一腹の子の数は６又は７で平均を下回り、子孫の３５％は野生型で、６５％はヘテロ接合型であった。これらの結果は、Ａｃｃ１突然変異体は胚致死性であることを示すものである。
【００６０】
この胚致死性を特徴付けるためにヘテロ接合型の交配後時間計測し、得られた胚の遺伝子型を決定した。妊娠日Ｅ１２．５及びＥ１３．５では、生存していた胚の３５％が野生型で６５％がヘテロ接合型であり、この致死が早期に起こることが示された。妊娠日Ｅ９．５では、死亡した胚の遺骸が回収され、妊娠日Ｅ８．５では退化した胚が子宮角内部から回収された。
【００６１】
考察
肥満は、心臓発作、脳卒中及び糖尿病のような多様な疾患にかかりやすくなるという身体に影響を与える主要な健康的要因である。肥満は、食料摂取、脂肪酸及びトリグリセリド合成、脂肪酸酸化、並びに、エネルギー消費に対して応答する、脂肪組織において貯蔵された脂肪が評価の基準とされる。過剰な食料は、身体に必要とされる適時のエネルギーを供給するだけでなく、肝臓及び筋肉でグリコーゲンの合成及び貯蔵、並びに、脂肪組織における脂肪酸及びトリグリセリドの合成及び貯蔵を促進する。カロリー制限及び飢餓は、必要とされるところへグルコースを供給するグリコーゲン分解、並びに、酸化及びエネルギー生産に用いられる脂肪酸を供給する脂肪分解を促進する。インシュリン及びグルカゴンはこれらの過程を調節するホルモンである。マロニルＣｏＡは脂肪酸酸化における鍵中間体であり、また、近年、脂肪酸合成及び炭化水素代謝に影響を与えることになる、脂肪酸酸化を通じてエネルギーレベル（ＡＴＰ）を調節する第２のメッセンジャーとしての付加的な役割があると推定された。
【００６２】
上記の研究は脂肪酸酸化及びエネルギー代謝の調節におけるＡＣＣ２により生産されたマロニルＣｏＡの役割の完全に特徴付けるものである。ＡＣＣ１により生産されたマロニルＣｏＡは脂肪酸合成に要求されるＣ2ユニットの供与体である。ＡＣＣ１及びＡＣＣ２の基質であるアセチルＣｏＡはピルビン酸酸化の産物であり、従ってカルボキシラーゼの研究は、炭化水素代謝、脂肪酸合成及び脂肪酸酸化という３つの主要な代謝経路を相互に関連づけるものとなる。
【００６３】
通常はＡＣＣ１及びＡＣＣ２の混合物である動物のカルボキシラーゼの研究においては、これらの酵素は転写及び翻訳レベルにおける長期の制御下、並びに、標的セリン残基のリン酸化／脱リン酸、及び、クエン酸又はパルミトイルＣｏＡによるアロステリック修飾による短期の制御下に置かれる。いくつかのキナーゼは両方のカルボキシラーゼをリン酸化し、それらの活性を低下させることが発見されてきた。インシュリンはカルボキシラーゼの脱リン酸を通じて、それらを活性化する、一方、グリコーゲン及びエピネフリンはカルボキシラーゼのリン酸化を通じてそれらを不活性化させる。最も重要なキナーゼの一つであるＡＭＰ活性化タンパク質キナーゼ（ＡＭＰＫ）は、ＡＴＰを減少させる細胞性ストレスにより活性化されるカスケードにおいてタンパク質キナーゼ（ＡＭＰキナーゼ）によるアロステリック調節及びリン酸化に係るメカニズムを通じて、低レベルのＡＴＰと同時に発生する高レベルＡＭＰによって活性化される。これらのメカニズムを通じて、代謝の燃料が少なく、ＡＴＰが必要な場合には、両方のＡＣＣ活性はリン酸化によって失われ、脂肪酸酸化の増加及び脂肪酸生成用のＡＴＰ消費の減少によってＡＴＰ合成の増加を導く低マロニルＣｏＡレベルを導くことになる。
【００６４】
ＡＣＣ１は肝臓及び脂肪組織において高度に発現し、ＡＣＣ２は心臓及び筋肉で優勢であるという、ＡＣＣ１及びＡＣＣ２の異なる発現、並びに、ＡＣＣ１は細胞質ゾルに存在し、ＡＣＣ２はミトコンドリア膜に存在するという、それらの細胞内分布は、それらの機能が相互関係はあるが、異なっていることを示唆している。細胞質ゾルＡＣＣ１生産マロニルＣｏＡは、それはまた、脂肪酸合成のための細胞質ゾル酵素でも脂肪酸合成酵素に利用される。ミトコンドリアＡＣＣ２生産マロニルＣｏＡは長鎖脂肪酸をβ酸化およびエネルギー生産のためにミトコンドリアへの運搬を触媒する最初の酵素であるＣＰＴＩの活性の調製物として機能する。従って、ＡＣＣ２生産マロニルＣｏＡは脂肪酸合成及び炭化水素代謝に影響を与えることになる、脂肪酸酸化を通じてＡＴＰレベルを調節する第２のメッセンジャーである。
【００６５】
Ａｃｃ２突然変異マウスを使った本研究は、この結論を強力に支持するものである。突然変異体の肝臓におけるマロニルＣｏＡのレベルは野生型マウスの肝臓におけるものと同様であり、その合成は、この組織で優勢なカルボキシラーゼであるＡＣＣ１によるものであることを示している。野生型マウスの肝臓では、後にトリグリセリドに転換され、油滴として蓄積されることになる脂肪酸の合成に使用される（図３Ａ）。Ａｃｃ２-/-突然変異マウスにおける肝臓では、未制御のＣＰＴＩ活性が、結果的に肝臓ミトコンドリアによる脂肪酸の酸化、又は、非阻害ＣＰＴＩ活性及び増幅された脂肪酸酸化の結果として伴う、組織の増加した脂肪酸の要求量に打ち勝つために血液を通して心臓及び筋肉に送られることになる脂質（超低密度リポタンパク質）へ脂肪酸の転換をさせることになる。これらの結論は、Ａｃｃ２-/-突然変異マウスの心臓及び骨格筋組織にはマロニルＣｏＡはほとんど無いこと、Ａｃｃ２-/-突然変異マウスのヒラメ筋でより高い脂肪酸酸化値を取ること、及び、インシュリンとグルカゴンのアナローグであるイソプロテレノールとは独立した脂肪酸酸化が発生すること（図４）によって支持されるものである。
【００６６】
最後に、ミトコンドリアの第２のメッセンジャーであるマロニルＣｏＡを欠いたことを示すＡＣＣ２がノックアウトされたマウスは、脂肪酸酸化が増加し、脂質の蓄積が減少し、及び、肝臓におけるグリコーゲンの貯蔵が減少してはいるが、形態学上は正常で、期待された速度で成長し、正常に繁殖した（それらの寿命と加齢については後述する）。全ての代謝の変化は餌消費のパターン及び体重によって表され、標準的制限食を与えられたＡｃｃ２-/-突然変異マウスは、典型的には野生型マウスに比べ２０％以上の餌を消費したが、最終的な体重は１０％低かった。
【００６７】
飢餓マウスで起こったことと同様に、脂肪含有量及び脂肪組織の減少は血漿に放出されたレプチンを約３０％減少させた。これは、視床下部が、給餌行動を促進する食欲刺激ニューロペプチドＹを生産させる信号となる。これが、Ａｃｃ２-/-マウスが野生型マウスよりも多くの餌を消費したにもかかわらず、より少ない脂肪しか蓄積しないことへの最も合理的な説明と考えられる（図５Ａ〜５Ｅ）。マロニルＣｏＡは視床下部神経を通じた作用によって生理学的燃料の利用することを合図する役割を果たしていることが示唆されている。この示唆は、脂肪酸合成酵素阻害剤で処理されたマウスにおいて餌摂取を増加させる５−（テトラデクロキシ）−フラン酸（5-(tetradeculoxy)-2 furoic acid）によるＡＣＣの阻害に基づくものである。この可能性はＡｃｃ２-/-マウスにおいて除外できるものではないが、血漿におけるレプチンが低レベルであることが食欲を増加させる可能性がある。さらに、Ａｃｃ２-/-マウスは明白な神経学上の異常は有しておらず、外見上は正常である。
【００６８】
高レベルの脂肪酸酸化を維持することは、結果的に脂肪の蓄積及び貯蔵を減少させ、ヒトが運動を行ったのと同じ生理学的状態になる。ＡＣＣ２の薬理学的阻害により、個人に対して通常のカロリー摂取を維持したまま、体重を減少させることが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００６９】
上記記載の側面、特徴及び利点は、これから明らかになる他のものを含め、達成し、詳細に理解できるように、上記発明について、添付の図面に示されたある実施態様を参照することにより、より詳細に記載している。これらの図面は明細書の一部を形成する。しかしながら、添付の図面は本発明の好ましい実施態様を記載したものであり、したがって発明の範囲を制限するものでないことを特記する。
【００７０】
【図１Ａ】Ａｃｃ２遺伝子座の標的突然変異に使用された戦略を示すものである。マウスゲノムクローンで確認される２つのエクソン（斜線四角）のうち、ビオチン結合モチーフ（Ｍｅｔ−Ｌｙｓ−Ｍｅｔ）を含むエクソンはヒポキサンチンホスホリルリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）発現カセットによって置換され、標的化構築体を発生させた。サザンブロット分析によって標的の結果を確認するために使用された３´及び５´プローブが示されている。
【図１Ｂ】マウス尾部から抽出されたゲノムＤＮＡのサザンブロット分析を示すものである。ＢｇｌＩで消化されたＤＮＡは５´プローブで調査された。Ｂａｍ  Ｈ２及びＫｐｎ１で消化されたＤＮＡは３´プローブで調査された。野生型（＋／＋）、ヘテロ接合体（＋／−）及びＡｃｃ２ｎヌル（−／−）マウスは、予想された断片の大きさを与えた。
【図１Ｃ】野生型（＋／＋）、ヘテロ接合体（＋／−）及びＡｃｃ２ヌル（−／−）マウスの骨格筋から調製された全ＲＮＡの、ゲノムライブラリーのスクリーニングに用いられる32Ｐ標識３６２ｂｐ  ｃＤＮＡ断片をプローブとしたノーザンブロットを示すものである。プローブは、Ａｃｃ２+/-及びＡｃｃ２+/+ＲＮＡでは、１０ｋｂｐ  ＲＮＡバンドを検出するが、Ａｃｃ２-/-ＲＮＡでは検出できなかった。同じフィルター（ストリッピング後）のβアクチンｃＤＮＡプローブによるハイブリダイゼーションにより、等量のＲＮＡがゲルに載せられたことが確認された。
【図１Ｄ】Ａｃｃ２ヌルマウスにおけるＡＣＣ２タンパク質が存在しないことの確証を示すものである。マウスの肝臓、骨格筋及び心臓からの抽出物（それぞれ５０μｇ）は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（６％）により分離された。タンパク質はニトロセルロースフィルター上に移され、アビジンペルオキシダーゼをプローブとしてビオチン含有タンパク質を検出した。２つのカルボキシラーゼ−２８０ｋＤａのＡＣＣ２及び２６５ｋＤａのＡＣＣ１−の存在する場所が示された。
【図２】野生型（黒塗り棒）、及び、Ａｃｃ２-/-突然変異（白抜き棒）マウスの組織におけるマロニルＣｏＡの相対的な量を示すものである。示されたマウス組織からの酸可溶性抽出物におけるマロニルＣｏＡは、還元ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰＨ）及び高度に精製されたニワトリ脂肪酸合成酵素の存在下で、パルミチン酸塩への［3Ｈ］アセチルＣｏＡ取り込みによって測定された。合成された［3Ｈ］パルミチン酸は鉱油エーテルで抽出され、放射能が測定された。マウスは通常の餌を食べさせるか、あるいは、殺す４８時間前から絶食させた。データは、３匹の動物の平均±標準偏差である。
【図３】図３Ａ〜３Ｅは標準的な食餌療法を行った３２週齢のオスマウスの肝臓の組織学的分析結果を示している。図３Ａは、２４時間の飢餓状態に置かれた野生型（左）及びＡｃｃ２-/-突然変異マウス（右）の肝臓を示す。野生型及び突然変異の肝臓の凍結切片は油滴を検出するためにオイルレッドＯで染色され、マイヤー・ヘマトキシリンで対比染色された。野生型マウスの肝臓切片は赤く染色された油滴が豊富であるのに対し（図３Ｂ）、Ａｃｃ２-/-突然変異体肝臓は赤く染色された油滴が劇的に減少している（図３Ｃ）。同じ肝臓から得られた凍結切片がグリコーゲンを染色するために過ヨウ素シッフ法で染色され、ヘマトキシリンで対比染色した。野生型肝臓には、グリコーゲン（ピンクに染色）及び未染色の脂質液胞が含まれるが（図３Ｄ）、一方、突然変異体の肝臓には、グリコーゲンがほとんど無いか全く無く、また、脂質液胞もほとんど無い（図３Ｅ）。
【図４】頸部を脱臼させ殺したマウスを使用した実験の要約したものであり、それぞれのマウスからヒラメ筋−２つがそれぞれ後肢から出ている−を切除し、脂肪酸フリーの４％ウシ血清アルブミン、１０ｍＭグルコース、及び０．３ｍＭ［９，１０（ｎ）−3Ｈ］パルミチン酸（３ｍＣｉ／バイアル）［イブラヒミ（Ｉｂｒａｈｉｍｉ）、１９９９＃４２３］を含む１．５ｍｌのクレブス・ヘンゼライトバッファーに浸された。示されたように、インシュリン（１０ｎＭ）又はイソプロテレノール（３ｍＭ）が加えらた場合、バイアルは湿性Ｏ2／ＣＯ2（９５／５％）雰囲気下で３０分インキュベートされた。インキュベートの終了時、［3Ｈ］2Ｏが標識された基質から分離され、計測された。
【図５】図５Ａ〜５Ｅは、Ａｃｃ２-/-、及び、野生型マウスの餌摂取量、成長（体重）、及び、脂肪組織を示すものである。２グループのメスマウス（１及び２；それぞれ、３週齢及び６週齢）及び１グループの５週齢オス−それぞれのグループは５匹のＡｃｃ２-/-突然変異（Ｍ、黒塗り）及び５匹の野生型（Ｗ、白抜き）からなる−は、２７週間の標準的な制限食を与えられた。図５Ａにおいて、各週の餌摂取量を測定し、２７週期に渡りマウス当たりの累積摂取量で示した。それぞれのグループに属する各マウスの体重は週ごとに測定し、データを平均±標準偏差で図５Ｂに示した。図５Ｃは標準制限食を与えたオス同腹児の背部から見た図を示すものである。Ａｃｃ２-/-マウス（体重３３．６ｇ）の皮膚で観察された白色の脂肪は、野生型マウス（体重３４．２ｇ）のそれより少なかった。図５Ｄは、Ａｃｃ２-/-、及び、野生型マウス（＋／＋）の腹部から見た皮膚下の脂肪パッドを示すものである。図５Ｅは突然変異マウスから分離された副精巣脂肪パッド（０．７５ｇ）及び野生型マウス分離された副精巣脂肪パッド（１．４ｇ）を示すものである。バーは１ｃｍである。
【図６】図６Ａ及び６ＢはＡｃｃ１遺伝子座の標的突然変異を示すものである。図６Ａは標的突然変異を産出するための戦略を示すものである。ビオチン結合モチーフ（Ｍｅｔ−Ｌｙｓ−Ｍｅｔ）を含むエクソン（暗色四角）はＨＰＲＴ発現カセットによって置換され、標的化構築体を発生させた。サザンブロット分析に使用された３´及び５´プローブが示されている。図６Ｂは、マウス尾部から抽出されたゲノムＤＮＡのサザンブロット分析による遺伝子タイピングで観察された典型的なパターンを示すものである。ＤＮＡは重複の形で、ＳｈｐＩで消化された。ブロットは図６Ａで示された３´及び５´プローブで調査された。野生型（＋／＋）及びヘテロ接合（＋／−）の遺伝子型のみが存在することはホモ接合（−／−）マウスは生まれなかったことを示す。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図５Ｅ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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