(57)【要約】創傷治癒は多くの糖尿病患者で損なわれており、彼らは慢性の下肢潰瘍および切断の危険性が高いことに悩まされている。創傷治癒能力の低い糖尿病患者は、正常な治癒能力者あるいは非糖尿病の対照と比較して、絶食時尿中硝酸塩濃度が有意に低いことが発見された。これは糖尿病のメディエーターとしての内因性の一酸化窒素活性の低下、すなわち創傷治癒障害であることを暗示する。尿またはその他の試料中の硝酸塩あるいは亜硝酸塩といった一酸化窒素関連産物レベルに基づいて糖尿病患者および一部の患者における慢性皮膚創傷治癒障害の特徴がある別の疾患または症状を有する患者の創傷治癒能力を推定する方法およびキットが提供される。創傷非治癒の糖尿病患者を処置し、糖尿病性潰瘍の処置をモニタリングする方法も提供される。
2004532389.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
静脈鬱滞潰瘍形成、または一部の患者における慢性皮膚創傷治癒障害を特徴とする疾患もしくは症状を有する被験者が創傷治癒者であるかまたは創傷非治癒者であるか判定する、以下の段階を含む方法：
一酸化窒素関連産物レベルが閾値を上回る場合に創傷治癒者であり、かつ一酸化窒素関連産物レベルがほぼ閾値と同レベルまたは下回る場合に創傷非治癒者である、創傷治癒者と創傷非治癒者を区別する該閾値と被験者の試料片中の一酸化窒素関連産物レベルを比較する段階。
【請求項２】
試料片中の一酸化窒素関連産物レベルを測定する段階をさらに含む、請求項1記載の方法。
【請求項３】
被験者の試料片を採取する段階をさらに含む、請求項2記載の方法。
【請求項４】
少なくとも6時間の絶食期間の後に試料片を採取する、請求項3記載の方法。
【請求項５】
絶食期間が6時間から10時間である、請求項4記載の方法
【請求項６】
絶食期間の直前の少なくとも6時間前に、摂取窒素化合物900mg／kg体重／日を下回る食事1回、および摂取窒素化合物9mg／kg体重／日を下回る食事を1回摂取する、請求項4記載の方法。
【請求項７】
食事を6時間から24時間継続して摂食させる、請求項6記載の方法。
【請求項８】
試料片が尿、血液および組織である、請求項1記載の方法。
【請求項９】
被験者がヒトである、請求項1記載の方法。
【請求項１０】
一酸化窒素関連物質が硝酸塩、硝酸塩誘導体、亜硝酸塩または亜硝酸塩誘導体である、請求項1記載の方法。
【請求項１１】
閾値が硝酸塩として15μモル濃度と50μモル濃度の間である、請求項10記載の方法。
【請求項１２】
閾値が硝酸塩として25μモル濃度と45μモル濃度の間である、請求項11記載の方法。
【請求項１３】
閾値が硝酸塩として20μモル濃度と40μモル濃度の間である、請求項12記載の方法。
【請求項１４】
閾値が硝酸塩として約35μモル濃度である、請求項13記載の方法。
【請求項１５】
試料片が血液であり、かつ閾値が硝酸塩として2μモル濃度と15μモル濃度の間である、請求項10記載の方法。
【請求項１６】
閾値が硝酸塩として3μモル濃度と17μモル濃度の間である、請求項15記載の方法。
【請求項１７】
閾値が硝酸塩として4μモル濃度と16μモル濃度の間である、請求項16記載の方法。
【請求項１８】
閾値が硝酸塩として約5μモル濃度である、請求項17記載の方法。
【請求項１９】
一酸化窒素関連産物が一酸化窒素、L−シトルリン、サクリックGMP、過酸化窒素、3-ニトロチロシンまたはL−ジメチルアルギニンである、請求項1記載の方法。
【請求項２０】
静脈鬱滞潰瘍形成、または一部の患者における慢性皮膚創傷治癒障害を特徴とする別の疾患もしくは症状を有する被験者を処置する、以下の段階を含む方法：
一酸化窒素関連産物レベルが創傷治癒患者の閾値を上回る場合に創傷治癒者であり、一酸化窒素関連産物レベルがほぼ閾値と同レベルまたは下回る場合に創傷非治癒者である、創傷治癒者と創傷非治癒者を区別する該閾値と被験者試料片中の一酸化窒素関連産物レベルを比較する段階、および
被験者が創傷治癒者か創傷非治癒者かによって被験者を処置する段階。
【請求項２１】
試料片中の一酸化窒素関連産物レベルを測定する段階をさらに含む、請求項20記載の方法。
【請求項２２】
被験者から試料片を採取する段階をさらに含む、請求項21記載の方法。
【請求項２３】
少なくとも6時間の絶食期間の後に試料片を採取する、請求項22記載の方法。
【請求項２４】
絶食期間が6時間から10時間である、請求項23記載の方法
【請求項２５】
絶食期間の直前の少なくとも6時間前に、摂取窒素化合物900mg／kg体重／日を下回る食事1回、および摂取窒素化合物9mg／kg体重／日を下回る食事を1回摂取する段階をさらに含む、請求項23記載の方法。
【請求項２６】
食事を6時間から24時間継続して摂食させる、請求項25記載の方法。
【請求項２７】
被験者が創傷非治癒者である場合、処置段階がL−アルギニンを治療上有効な用量で投与する段階、または高圧酸素処置を施す段階を含む、請求項20記載の方法。
【請求項２８】
被験者が創傷治癒者である場合、処置段階が血小板由来成長因子を治療上有効な用量での投与を含む、請求項20記載の方法。
【請求項２９】
一酸化窒素関連産物が硝酸塩、硝酸塩誘導体、亜硝酸塩、亜硝酸塩誘導体である請求項20記載の方法。
【請求項３０】
一酸化窒素関連産物が一酸化窒素、L−シトルリン、cGMP、ペルオキシ硝酸塩、3−ニトロチロシンまたはL−ジメチルアルギニンである、請求項20記載の方法。
【請求項３１】
静脈鬱滞潰瘍形成、または一部の患者における慢性皮膚創傷治癒障害を特徴とする別の疾患もしくは症状を有する創傷非治癒患者の創傷処置効果をモニタリングする、以下の段階を含む方法：
（a）患者の一酸化窒素が上昇するように設計された治療薬を投与する段階、
（b）処置効果を測定する手段として、患者由来の試料片中の一酸化窒素関連産物レベルを決定する段階、および
（c）一酸化窒素関連産物レベルが創傷治癒患者の閾値を上回る場合にその処置効果は創傷治癒を改善するのに十分であり、一酸化窒素関連産物レベルがほぼ閾値と同レベルまたは下回る場合にその処置効果は創傷治癒を改善するのに不十分である、創傷治癒者と創傷非治癒者を区別する閾値と被験者試料片中の一酸化窒素関連産物レベルを比較する段階。
【請求項３２】
一酸化窒素関連産物が硝酸塩、硝酸塩誘導体、亜硝酸塩、亜硝酸塩誘導体である請求項31記載の方法。
【請求項３３】
一酸化窒素関連産物が一酸化窒素、L−シトルリン、cGMP、ペルオキシ硝酸塩、3−ニトロチロシンまたはL−ジメチルアルギニンである、請求項31記載の方法。
【請求項３４】
患者から試料片を採取する段階をさらに含む、請求項31記載の方法。
【請求項３５】
少なくとも6時間の絶食期間の後に採取された試料片である、請求項34記載の方法。
【請求項３６】
治療剤を患者に投与する前に、以下の段階をさらに含む請求項31記載の方法：
一酸化窒素関連産物レベルが創傷治癒患者の閾値を上回る場合に創傷治癒者であり、あるいは一酸化窒素関連産物レベルがほぼ閾値と同レベルまたは下回る場合に創傷非治癒者である、創傷治癒者と創傷非治癒者を区別する該閾値と患者の試料片中の一酸化窒素関連産物レベルを比較することによって患者を非創傷治癒者であると同定する段階。
【請求項３７】
以下の段階をさらに含む、請求項31記載の方法：
（d）試料片中の一酸化窒素関連産物レベルに従って処置を調整する段階であって、そのレベルが閾値と同じか下回るレベルである場合に、治療薬の投与を増加する、またはそのレベルが閾値を上回る場合に、治療薬の投与量を増加しない、段階。
【請求項３８】
一酸化窒素関連産物が治療薬投与の後に閾値レベルと同等または下回る場合、さらに以下の段階を含む方法：
（e）（a）から（d）までの段階を患者由来試料片中の一酸化窒素関連産物レベルが閾値を上回るまで繰り返す段階を含む方法。
【請求項３９】
治療薬がL−アルギニンまたは高圧酸素である、請求項31記載の方法。
【請求項４０】
ある被験者について、静脈鬱滞潰瘍形成、または一部の患者における慢性皮膚創傷治癒障害を特徴とする別の疾患もしくは症状を有する被験者が創傷治癒者であるかまたは創傷非治癒者であるかを判定するキットであって、
被験者由来の試料片における一酸化窒素関連産物のレベルを決定するための1つまたは複数の試薬、および１つまたは複数の該試薬を用いて、該レベルが閾値を上回る場合、被験者が創傷治癒者である、または該レベルが閾値とほぼ同等かもしくは下回る場合、被験者が創傷非治癒者であると判定する使用説明書を含む、キット。
【請求項４１】
試料片が尿、血液および組織である、請求項40記載のキット。
【請求項４２】
一酸化窒素関連産物が硝酸塩、硝酸塩誘導体、亜硝酸塩および亜硝酸塩誘導体である、請求項40記載のキット
【請求項４３】
一酸化窒素関連産物が一酸化窒素、L−シトルリン、cGMP、ペルオキシ硝酸塩、3−ニトロチロシンおよびL−ジメチルアルギニンである、請求項40記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は2000年5月1日出願の米国特許出願第09/516,584の、一部継続出願であり、1999年5月19日出願の米国仮出願第60/125,284の恩典を主張する。それぞれの出願は全体を参照として本明細書に組み入れられる。
【０００２】
本発明は創傷治癒の領域に関連する。特に創傷治癒者と創傷非治癒者における一酸化窒素レベルのアッセイ法に関連する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
糖尿病は、米国で、概算1500万の人々に影響を及ぼす。糖尿病人口の内に、明らかな罹患率および治療費用と関連する慢性の非治癒の脚の潰瘍（LEU）を示す個人がある。慢性の非治癒のLEUは、毎年、50，000の糖尿病実験（GE  Reiber、EJ  Boyko、DG  Smith、「Diabetes in America」で、国立衛生研究所公報番号95−1468、Bethesda,Md編、2, 1995, pp409−428）を越える約85％の脚の切断（LEA）を進行する。これは、この国（米国）でLEAを受けている全ての個人の半分以上を表す。糖尿病の入院治療のわずか6％が、LEUに関連しているのに対して、1992年における糖尿病の脚の合併症についての総政府払戻しは、手足の切断およびリハビリのための費用を含まずに15億を越えた。LEAについての医療の病理学上の危険因子としては、糖尿病性神経傷害、脚の虚血、および慢性の非治癒の糖尿病性脚潰瘍が挙げられる。
【０００４】
LEUを示す糖尿病における根元的な問題は、ほとんど理解されていない創傷治癒を損なう。大半の糖尿病は、「正常な」創傷治癒を示す一方で、慢性LEUを示すものは、しばしば、減少した創傷炎症、回帰的創傷感染、減少した皮膚の血管灌流、乏しい創傷コラーゲン沈着、および瘢痕成熟を示す。血小板由来の成長因子（PDGF）欠失は、慢性の糖尿病性潰瘍に関連し、治癒が損なわれることに寄与する（HD  Beer、MT  Longaker、S  Werner、J  Invest  Dermatol  109巻、132頁（1997年））。Regranex（登録商標）を用いた治験は、評価されたわずか半分またはそれ未満の患者で、慢性の脚の潰瘍の治癒を改善する上での効力を示した（DL  Steed、J.Vasc  Surg、21、71（1995））。
【０００５】
創傷炎症、組織修復、および微細血管恒常性における一酸化窒素（NO）の役割における最近の研究は、我々に、創傷治癒の一次制御因子としてNOを考えさせた（D  Bruch−Gerharz、T  Ruzicka、V  Kolb−Bachofen、J  Invest  Dermatol. 110巻、1頁（1998年）；MR  Schafferら、Surgery  121巻、513頁（1997年））。上皮由来のNOの全身性欠失が、全ての糖尿病で観察され（A  Vevesら、Diabetes、47巻、457頁（1998年）；M  Huszkaら、Thrombosis  Res、86（2）巻、173頁（1997年）；SB  Williams、JA  Cusco、MA  Roddy、MT  Hohnston、MA  Creager、J. Am. Col. Cardiol. 27（3）、567 (1996））、それによりNOが、慢性の非治癒LEUの病理学における基本的役割を果すことを示唆する。結局、糖尿病における創傷治癒能力とNO産生を関連させる必要がある。このような相関関係は、それらのNOの生成に基づいた糖尿病の創傷治癒能力を推定する方法の開発を可能にし、そして適切な治療を選択するための根拠として働きうる有用な医療指標を提供する。
【発明の開示】
【０００６】
本発明の課題は静脈鬱滞潰瘍形成、または一部の患者における慢性皮膚創傷治癒障害を特徴とする別の疾患もしくは症状を有する被験者が創傷治癒者であるかまたは創傷非治癒者であるかを判定する方法を提供することである。その方法は以下の段階を含む：（a）被験者から試料片を採取する段階、（b）試料片中の一酸化窒素関連産物レベルを測定する段階、（c）創傷治癒者と創傷非治癒者を区別する該閾値と被験者試料片中の一酸化窒素関連産物レベルを比較段階。一酸化窒素関連産物レベルが創傷治癒患者の閾値を上回る場合に創傷治癒者であり、もし一酸化窒素関連産物レベルが閾値とほぼ同レベルまたは下回る場合は創傷非治癒者である。
【０００７】
また本発明の目的は、静脈鬱滞潰瘍形成、または一部の患者における慢性皮膚創傷治癒障害を特徴とする別の疾患もしくは症状を有する被験者を処置する方法を提供する方法を提供することである。その方法は次の段階を含む：（a）被験者から試料片を採取する段階、（b）試料片中の一酸化窒素関連産物レベルを測定する段階、（c）創傷治癒者と創傷非治癒者を区別する閾値と被験者試料片中の一酸化窒素関連産物レベルを比較する段階、および（d）被験者が創傷治癒者か創傷非治癒者かに従って被験者を処置する段階。
【０００８】
更に本発明の目的は静脈鬱滞潰瘍形成、または一部の患者における慢性皮膚創傷治癒障害を特徴とする別の疾患もしくは症状を有する創傷非治癒患者の処置効果をモニタリングする方法を提供することである。その方法は次の段階を含む：（a）患者の一酸化窒素が上昇するように設計された治療薬を患者に投与する段階、（b）その被験者の試料片を採取する段階、および（c）処置効果の測定の手段として被験者の試料片中の一酸化窒素関連産物レベルを測定する段階。
【０００９】
本発明のさらに別の目的は、静脈鬱滞潰瘍形成、または一部の患者における慢性皮膚創傷治癒障害を特徴とする別の疾患もしくは症状を有する被験者が創傷治癒者であるか、創傷非治癒者であるかを判定するキットを提供することである。そのキットは試料片中の一酸化窒素関連産物レベルを測定する試薬、および被験者試料片を採取し、試薬を使用して、その結果と創傷治癒者と創傷非治癒者を判定する閾値を比較し、被験者が創傷治癒者か創傷非治癒者かを判定する使用説明書を含む。
【００１０】
本発明のこれらの目的および他の目的は以下の一つまたは複数の態様によって提供される。
【００１１】
発明の詳細な説明
本発明の方法およびキットは、制御条件下で患者から採取した試料片におけるNOの分解生成物の測定に基づいて、乏しい創傷治癒能力を示す糖尿病患者を検出、治療および監視するように設計される。本発明は、糖尿病患者が、NO合成許容力の持続的スペクトルを表し、かつそのスペクトルの下端の患者が、創傷治癒機能を損なったことと見なす。NOは、正常に、安定な生成物の硝酸塩および亜硝酸塩に代謝され、それらは患者から得られる尿、血漿、組織、創傷体液(wound fluid)または他の試料片で分析できる。試料片中の硝酸塩および亜硝酸塩のレベルは、患者におけるNO合成のレベルの指標となる。本発明者の所見は、糖尿病患者でのNOの閾値レベルより下で、正常な創傷修復は達成されず、慢性的な創傷非治癒力または潰瘍形成を生じることが示される。
【００１２】
NOは、血管拡張、神経伝達、および腸管ぜん動のような自律的機能についての重要な生理学的メディエーターである小さな疎水性の気体遊離ラジカルである。NOは、環状グアノシンモノホスフェート（cGMP）の細胞内の濃度を上昇させるその標的分子グアニル酸シクラーゼの活性化により、細胞のシグナル伝達を提供する（JS  Beckman、「Nitric  Oxide」，J. Lancaster，Jr.編（アカデミック・プレス、ニューヨーク）、第1章）。細胞のシグナル伝達は、チャンネルまたは細胞膜レセプターが介在せずに行われ、そして細胞の環境におけるNOの濃度に依存する。
【００１３】
NOの半減期は、生物組織中で約5秒である。それは、一酸化窒素シンターゼ（NOS）の3つのイソ型によって生成され、そしてそれは、L−アルギニンおよび酸素分子を、シトルリンおよびNOに代謝する。3つのイソ型の内の2つは、神経の細胞（nNOS）で、そして上皮細胞（eNOS）で記述される構築的酵素システム（cNOS）である（D  Bruch−Gerharz、T  Rusicka、V  Kolb−Bachofen、J  Invest  Dermatol．110、1（1998））。これらのイソ型と共に、細胞内のカルシウムの増加したレベルが、カルモジュリンを介して酵素を活性化する。カルシウム依存性cNOSシステムは、低い（ピコモル濃度）濃度のNOを生成する。第三のシステムは、カルシウム依存性である誘導性イソ型（iNOS）である。iNOSの発現は、炎症サイトカインまたは細菌のリポ多糖（LPS）のような組織特異的刺激によって誘導される。誘導性イソ型は、cNOSより非常に高い（ナノモル濃度）濃度でNOを放出し、そして強力な内毒素効果を示す。
【００１４】
cNOS酵素は、皮膚恒常性を制御および維持することに関与する（S  Moncada、A  Higgs、N  Eng  J  Med  329、2002（1993））。iNOS酵素は、特定の皮膚疾病にも関与する炎症および免疫応答に主に関連するようである。ヒト皮膚ケラチノサイトで、繊維芽および上皮細胞は、cNOSおよびiNOSイソ型の両方を保有する。創傷マクロファージおよびケラチノサイトは、iNOSイソ型を保有する。創傷治癒研究において、創傷およびマクロファージが主要な細胞源のように見られる後にWO合成が長期間（10日〜14日）起こることが示された（MR  Schaffer、U  Tantry、RA  van Wesep、A  Barbul．J  Surg  Res、71、25（1997））。組織修復のメディエーターとして、NOは、血管形成（A  Papapetropoulos、G  Garcia−Cardena、JAA  Madri、WC  Sissa．J  Clin  Invest、100（12）、3131（1997））および細胞の移動（E  Noiriら、Am．J．Physiol．279：C794（1996））を促進し、創傷コラーゲン沈着およびコラーゲン架橋を増加させ（MR  Schaffer、U  Tantry、SS  Gross、HL  Wasserburg、A  Barbul、J  Surg  Res、63、237（1996））、微細血管の恒常性を制御し（血管拡張）（D  Bruch−Gerharz、T  Ruzicka、V  Kolb−Bachofen、J  Invest  Dermatol．110、1、（1998））、血小板凝集を阻害し（JS  Beckman、「Nitric Oxide」で、J．Lancaster，Jr．編、（アカデミック・プレス、ニューヨーク）、第1章）、上皮白血球接着の形成を阻害し（AM  Lefer、DJ  Lefer、Cardiovascular  Res、32、743（1996））、上皮増殖およびアポトーシスを調節し（YH  Shen，XL  Wang，DE  Wilcken，FEBS  Lett，433（1−2）、125（1998））、任意の皮膚の皮弁の生育可能性を増大し（SC  Umら、Plast  Reconstr  Surg．101、785（1998）；GF  Pierceら、Proc  Natl  Acad  Sci  USA、86、2229（1989））、そして細胞の免疫調節および細菌の細胞毒性を増強する（JS  Beckman、「Nitric Oxide」で、J．Lancaster，Jr．編、（アカデミック・プレス、ニューヨーク）、第1章）ことが示された。
【００１５】
糖尿病患者では、正常な創傷修復は、著しく損なわれる可能性がある。一般に、創傷治癒過程の間、NOは、組織酸素利用性、修復機構の炎症介在、並びに創傷マトリックス開発および再造形の増強を供する（図1）。NOについての主要な代謝経路は、硝酸塩および亜硝酸塩に対するものであり、組織、血漿および尿内で安定な代謝である（S  Moncada、A  Higgs、N  Eng  J  Med  329、2002（1993））。ヒトにおけるトレーサー研究は、おそらく50％の総体重硝酸塩／亜硝酸塩が、NO合成についての基質、L−アルギニンから起こることを示した（PM  Rhodes、AM  Leone、PL  Francis、AD  Struthers、S  Moncada、Biomed  Biophys  Res．Commun．209、590（1995）；L．Castilloら、Proc  Natl  Acad  Sci  USA  90、193（1993））。硝酸塩および亜硝酸塩が、生物学的に活性なNOの測定値でないが、適切な期間の絶食の後、そして都合により制御食（低硝酸塩／低アルギニン）の投与の後に患者から得た血漿および尿の試料が、NO活性の指数として硝酸塩および亜硝酸塩の使用を可能にする（C  Baylis、P  Vallance、Curr  Opin  Nephrol  Hypertens  7、59（1998））。
【００１６】
内因性の一酸化窒素の測定はまた一部の患者の慢性創傷非治癒を特徴とする別の疾患または症状を有する患者に適用することが可能である。そのような症状の一つは慢性静脈鬱滞潰瘍形成（VSU）である。慢性静脈不全症（CVI）および二次的VSCの患者の根本的な障害は弁不全症、拍出量障害および下腿三頭筋機能不全に由来する持続的な静脈の高圧状態である (E Criado, in Vascular Surgery編 RB Rutherford, 4th ed W.B. Sauders, Philadelphia, pp.1771-85(1995)) 。しかしながらCVI患者における静脈炎の進行は、白色細胞(white cell)の捕捉に関与する。その中において隔絶された活性化白血球は、影響を受けた体肢の微小循環の中で解離されたタンパク質分解酵素の供給源や活性酸素の供給源になる。これにより内皮障害、フィブリンカフの沈着、ならびに局所局部的な組織の虚血および壊死が起こる（PD Coleridge-Smthら、 Br Med J 296 :1726-7(1988);PJ Pappasら、 J Surg Res 59:553-9(1995)）。CVIは循環を通じて血小板の増加、白血球（例えば単球）の活性化、血液凝固に関与することが証明された（BD Peytonら、 J Vasc Surg 27:1109-16(1998)）。しかしながら静脈炎が進行している患者において活性化された血小板や白血球から放出された因子の存在は予測不能である（CC Powellら、V Vasc Surg 30:844-53(1999)）。
【００１７】
糖尿病性潰瘍の患者とVSU患者とは微小循環レベルで病理生理学的に類似している。そこにおいて利用可能な一酸化窒素レベルは創傷治癒に重要な因子である。これらの症状の両方において、および一部の患者の慢性創傷非治癒の特徴がある別の疾患または症状において、皮膚の微小循環は活性化された白血球が非常に集積していて、この白血球は活性化された血小板または内皮表面と一緒に集まって細胞障害および脂質酸化を引き起こす活性酸素種、タンパク質分解性の酵素を放出する。白血球、血小板の活性化による障害作用は代償性一酸化窒素が媒介する内皮統合性と微小静脈の恒常性の原因となるメカニズムによって改善されうる。（Peytonら、前記,Powellら、前記,S Schroder, ae al.,Am J Pathol 139:81-100(1991); Z Pecsvarady Zら、 Diabetes Care 17:57-63(1994); M Huszkaら、 Thrombosis Res 86:173-80(1997)）。しかし一酸化窒素は活性酸素種によって破壊されるので、傷を受けた組織に存在する高度に増加した白血球または血小板は代償性の一酸化窒素を介するメカニズムを制圧する傾向があり、事実上一酸化窒素に制限された治癒過程となる。創傷治癒の患者においては、白血球、血小板の活性化によって破壊された一酸化窒素を補うことができるが、これに対して創傷非治癒の患者では十分に補うことができない。
【００１８】
臨床における糖尿病研究においては、以下の実施例1および実施例2に記述したように、活性酸素種産生の増加は創傷が治癒している糖尿病患者の絶食時一酸化窒素の血清中レベルが有意に高レベルであり、このことは創傷非治癒の糖尿病患者では観察されていない。これらの観察は内皮が産生する代償性の実効一酸化窒素の増加を導く能力が創傷治癒性の糖尿病患者にあるという証拠である。このことは増加した活性化酸素種の非毒素性の代謝を促進し（RM Clancyら、J Clin Invest 90: 1116-21(1992) D Winkら、Proc Natl Acad Sci USA 90:9813-17(1993))、以前に議論された一酸化窒素によって仲介される創傷回復のメカニズムの構成的完全性(constitutive integrity)を維持する。
【００１９】
糖尿病性の潰瘍やVSU患者は創傷治癒障害による炎症細胞病理上の明らかな類似性を持っている。それゆえ両者は創傷治癒の不全は、内因性一酸化窒素の関係する修復メカニズムにおいて、類似した補償の不全に関係している。糖尿病性の炎症を伴う創傷治癒者および創傷非治癒者、VSU、あるいは炎症細胞の高いレベルの活性化に関連した患者の皮膚創傷の治りの悪さによって特徴付けられる病態は、ここに記載した一酸化窒素関連産物の分析によって同定することができる。例えば、一部の患者における慢性皮膚創傷治癒障害の特徴があるさらに2つの症状は、圧迫創傷（加圧潰瘍、褥創性潰瘍または床ずれともいう）および非治癒性の外科的創傷である。非治癒性の外科的創傷は例えば外科医によって指摘される任意の創傷である。また非治癒性の外科的創傷は切断面において手術後約7日以上を経過しても接着および瘢痕組織形成を欠如した皮膚切開によって形成される傷である。微小循環不全患者（たとえば、一酸化窒素の構成的産生の減少をもたらす内皮障害を持つ患者）では再発性の疾病期間に圧迫創傷を進行させやすい傾向がある（MR Bliss,J Tissue Viability 8,4-13(1998)）。非治癒性の外科的創傷は似たような原因が背景にある可能性があり、これは主として内皮障害が構成的な一酸化窒素の合成を抑制することによる、または他の種類の組織障害に関連する非治癒性の外科的創傷としては放射線治療によって引き起こされるものがある。放射線治療は内皮の機能不全と一酸化窒素合成の障害に関係し、血管閉塞や外科的創傷治癒の遅れが生じる（T. Sugiharaら、 Circulation 100,635-41(1999)）。
【００２０】
本発明は糖尿病患者、静脈鬱滞潰瘍形成を罹患する患者、または一部の患者の慢性皮膚創傷治癒障害の特徴がある別の疾患もしくは症状にある患者が創傷治癒者であるか、創傷非治癒者であるかを判定する方法を提供する。「創傷治癒性の糖尿病」または「創傷治癒者」とは創傷治癒能力がほぼ正常者ならびに健常者と同等である患者である。「創傷非治癒性の糖尿病」または「創傷非治癒者」とは創傷治癒能力が正常者および健常者に劣る被験者であり、結果的にLEU、VSUまたは慢性的創傷もしくは腫瘍形成の危険性のある被験者を指す。例えば、ある臨床研究では創傷非治癒性の糖尿病患者では、Regranex(登録商標）による20週間の治療の後の不完全な治癒による1つまたは複数の糖尿病による足の壊疽の病歴のある患者であると考えられた（実施例1参照）。被験者は真性糖尿病のような糖尿病の症状を有していればヒトであっても動物であっても良い。糖尿病の症状を有するヒトまたは動物とは血漿グルコース濃度の調節に欠陥のあるヒトまたは動物であり、通常インシュリンの不十分な産生やインシュリンの生理的効果に対する抵抗性が原因である。例えば被験者は内科医によってI型またはII型いずれかの糖尿病と診断されたヒト患者でもよい。また被験者はまたCVIまたはVSUを有すると内科医によって診断されたヒト患者でもよい。
【００２１】
糖尿病患者が、創傷治癒の糖尿病患者であるか、または創傷非治癒の糖尿病患者であるかを決定する1つの方法は、被験者から試料片を採取する段階、試料片中の硝酸塩または亜硝酸塩のレベルのレベルを測定する段階、ならびに創傷治癒および創傷非治癒を判別する閾値を示す試料片での硝酸塩または亜硝酸塩のレベルを比較することを含む。亜硝酸塩および硝酸塩に加えて、NO合成または分解に関連した他の分子種（他の「NO関連生成物」）は、患者から得られる血液、尿、組織、または他の試料中で定量できる。例えば、NOまたはcGMPを生成する反応の産物であり、そしてグアニン酸シクラーゼのNO活性化の結果として産生されるL−シトルリンの血漿中濃度は、患者における全身性NO合成の反映として測定されうる（FL  KiechleおよびT  Malinski、Ann．Clin．Lab．Sci．26、501（1996））。同様に、NOSの別の産物であるL−ジメチルアルギニンは、ヒト血清でのHPLCによって検出され、そして非常に特異的指数の全身性NOS活性として使用されうる。（J  Meyerら、Anal．Biochem．247、11（1997））。NOは、ヒト血漿中のスーパーオキシド陰イオンと反応させることによって分解して、過酸化亜硝酸塩を生成でき、その結果、電子常磁性共鳴（EPR）分光法を用いて検出できるアスコルビルラジカルおよびアルブミン−チニルラジカルのような様々の遊離基(radical)を生じ得た。（J  Vasquez−Vivarら、Biochem．J．314、869（1996））。ペロキシ亜硝酸塩の別の生成物は、3-ニトロチロシンで、これは質量分光測定法（E  Schwedhelmら、Anal．Biochem．276、195（1999））、逆相HPLC（H Ohshimaら、Nitric  Oxide  3、132（1999））または抗ニトロチロシン抗体を使用したELISA法（JC ter Steegeら、Free  Radic. Biol. Med. 25、953（1998））と連動した気体クロマトグラフィーによってヒト血漿または他の体液中に検出できる。硝酸塩または亜硝酸塩と違い、これらの生成物のほとんどは、食物摂取による障害を受けにくい。さらに、NOのインサイチュー検出それ自身は、できる限りNO濃度を定量する生物センサーの援助を伴い、そして刺激に応じたNO濃度に変化する。例えば、NOについての天然のレセプターである可溶性グアニル酸シクラーゼのヘムドメインは、蛍光レポーター色素で標識でき、蛍光強度における変化は光学繊維を介して測定され、体内の任意の望ましい配置（例えば創傷部位で、またはその付近）で、NO濃度を示すように較正することができる（SL  Barkerら、Anal．Chem．71、2071（1999））。生体液のNOの迅速な分解が示された場合、NOの直接検出は、試料片の採取に続くいずれかの時よりむしろインサイチューで行われるべきである。
【００２２】
試料片は、硝酸塩、亜硝酸塩または他のNO関連生成物の濃度の測定を可能にするために十分な量で、被験者から得られる体液または組織の任意の試料であってよい。例えば、試料片は、尿、血液（血漿を含めた）、障害体液または組織の試料でありうる。試料片は、好ましくは、硝酸塩、亜硝酸塩または他の一酸化窒素関連生成物レベルを、安定な基準(baseline)のレベルを得るために、試料片は絶食の期間の後に、被験者から得られる。絶食の期間は、NO分解に関連しない硝酸塩または亜硝酸塩の食物および代謝源からの妨げを減少させる。絶食の期間中、全ての固形食および液体食の被験者の消費は、少なくとも50％、60％、70％、80％、90％または100％まで、被験者の平均消費から減少される。好ましくは、全ての固形食および液体食の被験者の消費は、少なくとも90％まで減少される。さらに好ましくは、全ての固形食および液体食の被験者の消費は、100％まで減少される。最も好ましくは、被験者は、絶食の期間中いかなる固形食または液体食を消費しない。被験者の水の消費は、一般に、絶食期間中制限されない；しかし、ある種の態様では、被験者は、絶食期間中水も全く消費しない。絶食の期間は、安定な基準に、パラメーターが測定されるべきものに達しさせるために十分な期間のものであるべきである。安定な基準は、測定されたパラメーター、例えば尿の硝酸塩が、一般に再現可能であり、そして繰返した測定の間の大きな変動、またはNO対処に関係ない食事、代謝または他の源からの不当な妨げのかからない状態である。好ましくは、絶食の期間は、少なくとも3時間、4時間、5時間、6時間、7時間、8時間、9時間、10時間、12時間、16時間、20時間または24時間である。さらに好ましくは、絶食の期間は、4時間〜12時間、または6時間〜10時間、または8時間〜10時間、または10時間〜12時間である。
【００２３】
ある種のこのような生成物が、食事によって影響を及ぼされがたいので、絶食についてのあらゆる要求は、NO関連生成物が定量されつつあることに依り；他方は、ただ簡便な絶食を必要とする可能性があると解される。例えば、血漿L−ジメチルアルギニン（J  Meyerら、Anal．Biochem．247、11（1997））は、食事によって影響されないのに対して、一夜の絶食が、試料片を採取する前に行われる場合、尿の硝酸塩／クレアチニン比は、食事によって影響されない（PS  Grabowskiら、Arthritis  Rheum．39、643（1996））。
【００２４】
ある種の態様では、絶食の期間は、その間に患者が、食事の硝酸塩および亜硝酸塩の源について十分に低い食事を投与して、NO代謝産物が、試料片で測定さるものはどれでも安定な基準の値に達する期間まで直ぐ前に置かれる。例えば、食事は、全ての植物性食品および硝酸塩または亜硝酸塩保存食が、排除されたものでありうる。また食事は、被験者の正常な食事と比較してL−アルギニンのレベルが減少してもよい。例えば、1つの食事は、900mg／kg体重／日未満の硝酸塩濃度、および9mg／kg体重／日未満の亜硝酸塩濃度を供する。
【００２５】
試料片での硝酸塩または亜硝酸塩のレベルは、適切な感受性および再現性を供する当技術分野において知られる任意の方法によって定量されうる。例えば、グリース反応は、生体液試料における硝酸塩および亜硝酸塩の高感度な測定を提供する硝酸塩についての分光光度アッセイ法である（M  Marzinzigら、Nitric  Oxide  1、177（1997））。グリース反応または別の亜硝酸塩アッセイ法は、硝酸塩から亜硝酸塩への還元を伴う、および伴わないの両方で行われる場合、それにより硝酸塩値は、還元試料について得られた亜硝酸塩値と、非還元試料との間の差異として得ることができる。蛍光生成物が、例えば亜硝酸塩を2，3−ジアミノナフタレンと反応させることによって得られる場合、グリースアッセイ法は、いっそう高感度になりうる（TP  Miskoら、Anal．Biochem．214、11（1993））。最初に亜硝酸塩および硝酸塩（RS  BramanおよびSA  Hendrix、Anal．Chem．61、2715（1989））または任意のNO関連化合物（M  Sonodaら、Anal．Biochem．247、417（1997））を検出用のNOに、特定の化学ルミネッセンス試薬を用いて還元する非常に高感度なアッセイ法も利用可能である。種々のプロトコールは、イオンクロマトグラフィー（例えば、SA  Everettら、J．Chromatogr．706、437（1995）；JM  Monaghanら、J．Chromatogr．770、143（1997））、高速液体クロマトグラフィー（例えば、M  Kelmら、Cardiovasc．Res．41、765（1999））およびキャピラリー電気泳動（MA  Friedbergら、J．Chromatogr．781、491（1997））によって生体液中の亜硝酸塩および硝酸塩濃度を検出および定量することについても記述されている。
【００２６】
硝酸塩、亜硝酸塩、または他のNO関連生成物の「レベル」は、通常、試料片中の、または試料片の体液部分中の硝酸塩または亜硝酸塩の濃度（リットル当たりモル、リットル当たりマイクロモル、または他の適切な単位）に該当する。しかし、測定の他の単位は、硝酸塩または亜硝酸塩のレベルを表すためにも使用されうる。例えば、特に、その量が、検討中の試料片の一定量（例えば、グラム、キログラム、ミリリットル、リットル、または他の適切な単位）まで戻って引用される場合、絶対量（マイクログラム、ミリグラム、ナノモル、モル、または他の適切な単位での）が、使用できる。多数の市販で入手可能なキットが使用できる。そのようなキットの1つは、実施例2に記述されている。
【００２７】
試料片は、定量法によって必要とされる場合、または結果を改善するために、または調査者の便宜のために、硝酸塩または亜硝酸塩の測定の前に加工されうる。例えば、加工は、試料を遠心分離する段階、濾過する段階、または均質化する段階を伴う。試料が、全血である場合、血液を、遠心分離して、細胞を除去し、硝酸塩または亜硝酸塩アッセイ法を、血漿画分または血清画分で実施できる。試料が組織である場合、組織は硝酸塩または亜硝酸塩の測定の前に当技術分野において知られた任意の方法によって分散または均質化されうる。遠心分離または別の方法によって細胞および他の残骸を除去すること、および試料の体液部分のみ、または試料の細胞外の体液画分を使用して、硝酸塩または亜硝酸塩のレベルを測定することがより好ましいかもしれない。試料は、後の測定のために、例えば尿または血漿試料を凍結することによって、保存することもできる。適切な場合、添加剤は、試料片に導入されて、硝酸塩または亜硝酸塩アッセイ法での使用のためにその特徴を保存または改善しうる。
【００２８】
硝酸塩、亜硝酸塩、または他のNO関連生成物の閾値は、上に記述される検出の方法を使用しながら、正常および乏しい創傷治癒能力を示す糖尿病の患者を比較することによって決定されうる。例えば、好ましくは低硝酸塩食の投与に続いて、および絶食期間の後に、創傷非治癒の糖尿病患者の群の尿中硝酸塩レベルを、創傷治癒の糖尿病患者または正常な患者の群と比較することによって、2つの群の硝酸塩レベルは、実施例2でのとおり比較されうる。閾値は、得られたデータから選択されうる。例えば、閾値は、創傷非治癒群の尿の硝酸塩レベルの平均よりわずかに高い値として選択されうる；閾値は、試験された創傷非治癒糖尿病患者の少なくとも70％、80％、90％、95％、98％、または99％の尿中硝酸塩レベルが、その閾値に入るか、または下になるように選択されるべきである。ヒト患者については、尿中の硝酸塩についての閾値は、15マイクロモル濃度と50マイクロモル濃度の間である。好ましくは、ヒトの尿中の硝酸塩の閾値は、20マイクロモル濃度と45マイクロモル濃度の間であるか、または25マイクロモル濃度と40マイクロモル濃度の間である。さらに好ましくは、ヒトの尿中の硝酸塩についての閾値は、20マイクロモル濃度、25マイクロモル濃度、28マイクロモル濃度、30マイクロモル濃度、32マイクロモル濃度、35マイクロモル濃度、37マイクロモル濃度または40マイクロモル濃度である。ヒト患者については、血漿中の硝酸塩についての閾値は、2マイクロモル濃度および20マイクロモル濃度の間である。好ましくは、ヒト血漿中の硝酸塩についての閾値は、3マイクロモル濃度および17マイクロモル濃度の間であるか、または4マイクロモル濃度および16マイクロモル濃度の間である。さらに好ましくは、ヒト血漿中の硝酸塩についての閾値は、2マイクロモル濃度、4マイクロモル濃度、6マイクロモル濃度、8マイクロモル濃度、10マイクロモル濃度、12マイクロモル濃度、14マイクロモル濃度、16マイクロモル濃度、18マイクロモル濃度、または20マイクロモル濃度である。規定の種類の試料片（例えばヒトの尿または血漿）を用いて使用するための硝酸塩、亜硝酸塩または他のNO関連生成物の閾値を選択する場合、注目すべきは標準化の異なるアッセイ法または方法の使用によって、ここで提供される数値範囲から数値範囲が移行しうることである。
【００２９】
本発明の別の態様は糖尿病被験者、静脈鬱滞潰瘍形成を罹患する被験者、または一部の患者における慢性皮膚創傷治癒障害を特徴とする別の疾患もしくは症状を有する被験者の処置方法である。この態様を実現するために、上記の方法、または別の方法によって、被験者が創傷治癒者か創傷非治癒者かということを最初に同定する。本発明によって創傷非治癒者と同定されたとき、患者は一酸化窒素活性が減弱しているので、患者は一酸化窒素産生を増加するように設計された何らかの治療によって処置することができる。そのような治療法には、これらに限定されるものではないが、規定食にL−アルギニン含有量を増やすことによるL-アルギニンの投与、薬学的に許容されるL−アルギニンを含む規定食補助剤の経口投与、またはL−アルギニンを含む薬学的に許容される調合の非経口投与もしくは静脈内投与を含む。投薬量は公知のプロトコールの中で患者の一酸化窒素を産生を増加させるようにデザインされた方法から選択可能である。一酸化窒素産生を増加させる更なる治療は高圧酸素療法である。以下に示す被験者の一酸化窒素レベルを増加させる治療の効果をモニタリングする方法と被験者の一酸化窒素産生を増加させるように設計された治療の管理を任意選択によって組み合わせることができる。被験者が創傷治癒者であるということが判明したとき、好ましい処置は一酸化窒素産生を増加させるように設計された治療薬を含まない。たとえばPDGF（Regranex(登録商標）または他のPDGF製剤）の投与が創傷治癒者の創傷治癒を促進するのに効果的な可能性がある。
【００３０】
本発明は、特定の糖尿病患者について不利でありうる療法を避けるためにも使用されうる。創傷治癒を促進する上で一酸化窒素の合成またはそれの効率における任意の負の治療的影響が、本発明を使用することによって最小限におさえることができる。例えば、グルココルチコイド薬剤は、それらの抗炎症効果のためにLEUを示す糖尿病患者に投与されることがある。しかし、グルココルチコイドは、iNOSの発現を選択的に阻害することが知られており（MW  Radomski、RM  Palmer、S  Moncada、Proc  Natl  Acad  Sci  USA  87、10043（1990）、かつ創傷体液中の亜硝酸塩／硝酸塩の量をが減少されることが示された（AE  Ulland、JD  Shearer、MD  Caldwell、J  Surg  Res  70、84（1997））。そのNO合成許容量は、創傷治癒の糖尿病患者と比較して減少されることが予測される創傷非治癒の糖尿病患者として同定された患者については、その患者においてさらにNOレベルを抑制するであろうステロイドの使用は、望ましくない。したがって、本発明の1つの態様により、創傷非治癒の糖尿病患者と同定された患者は、患者におけるNOレベルを減少すると疑われるグルココルチコイドまたは他の薬剤で処置されない。
【００３１】
異なる態様では、本発明は、創傷非治癒の患者（例えば静脈鬱滞潰瘍形成の患者、または一部の患者の慢性皮膚創傷治癒障害の特徴がある別の疾患もしくは症状を有する患者）の処置効果をモニタリングする方法として使用されうる。この態様では、患者は、患者における一酸化窒素レベルを上昇させるように設計された治療剤の投与を含む治療を受けている。このような治療剤の例としては、記述のL−アルギニンおよび高圧酸素処置が挙げられる。治療剤の投与に続いて、上記のとおり、患者から試料片中の硝酸塩または亜硝酸塩を検出する方法によってその処置効果について、患者をモニタリングする。試料片中の硝酸塩、亜硝酸塩、または他のNO関連生成物レベルが、患者が創傷治癒者または創傷非治癒者であるかを決定する閾値にあるか、またはより下である場合、治療剤の効果は、創傷治癒を促進するのには不十分である。その場合には、処置は、例えば、治療剤の用量または効力を増加すること、または治療剤にさらす期間を長くすることによって、順次調節されうる。関連した態様では、患者をモニタリングする方法が繰返され、そして治療剤の用量もしくは効力をさらに増加する期間、または治療剤にさらす期間は、さらに延ばされる。好ましくは、この態様では、治療剤の用量を監視および増加する方法は、患者から得られる試料片における硝酸塩または亜硝酸塩レベルが、閾値の上である限り増加される。それなら、患者の創傷が、治癒されるまで、必要とされる限り最も有効な用量で療法を維持することが望みうる。
【００３２】
さらに別の態様は、ある被験者（例えば静脈鬱滞潰瘍形成を伴うか、または一部の患者における慢性皮膚創傷治癒障害を特徴とする別の疾患または症状を有する被験者）が創傷治癒者であるか創傷非治癒者であるかを判定するキットである。このキットは被験者か得た試料片中の硝酸塩または亜硝酸塩のレベルを測定する、1つまたは複数の試薬類からなるものである。試薬または試薬類は試料片中の硝酸塩または亜硝酸塩を測定する当該技術における公知の方法に要求されるものである。このキットは上述したように、創傷治癒者であるか創傷非治癒者であるかを、ある患者（例えば静脈鬱滞潰瘍形成の患者）を対象に、試薬類を用いて測定を実行するための使用説明書一式を含む。使用説明書一式は適切な書式ならばどんな形（例えば、印刷された紙、ディスク上の電子フォーマット、CD−ROM，ウェブサイト上の引例、または印刷された出版物）でも情報を提供し、これによって適切な試料片の採取、試料片の処理、試料片中の硝酸塩、亜硝酸塩もしくはその他の一酸化窒素関連産物を測定するための試薬および試薬類の使用、得られた結果の解釈、すなわち被験者が創傷治癒者か創傷非治癒者かを使用者に判定できるように閾値と諸結果を比較する解釈を使用者に提供する。
【００３３】
上記の開示は、全般的に、本発明を説明する。さらに完全な理解は、以下の特定の実施例を参照することによって得ることができ、それは、例示のみの目的のために本明細書に供され、本発明の範囲を限定することは意図されない。
【００３４】
実施例1
創傷治癒および創傷非治癒の糖尿病患者から得られる試料片収集
創傷非治癒の糖尿病患者が、損傷を受けたNO活性を示すという仮説を探究するために、血漿および尿のNO代謝産物である硝酸塩および亜硝酸塩の以下の研究を、Regranex（登録商標）を用いた糖尿病性潰瘍創傷治癒の研究に続いて行った。結果は、慢性の非治癒LEU糖尿病患者の集団が、明らかに減少した尿中硝酸塩分泌によって特徴づけられる。
【００３５】
臨床研究については、10名の1つまたは複数の糖尿病性の脚部潰瘍の病歴で表す健康な、糖尿病患者が選択された。全ての患者は、先に、綿密な臨床的観察下でRegranex（登録商標）を用いた局所の潰瘍治療を受けた。この群の半分（n＝5）は、観察の20週目まで、潰瘍の完全な治癒を受けた経験がある（治癒した糖尿病／HD）。この群の残りの半分（n＝5）は、観察の20週目まで、完全な治癒を受けた経験がなかった（治癒しなかった糖尿病／UHD）。完全なRegranex（登録商標）治療に続いて、10名の糖尿病被験者（HDおよびUHD）および10名の健康な非糖尿病の対照（C）は、尿および血漿中硝酸塩／亜硝酸塩分析に掛けられた。この分析の前に、活発な悪性疾病、リューマチ性またはコラーゲンの血管疾病、慢性腎不全、炎症性腸疾患、アルコール／薬剤乱用、蜂巣炎、骨髄炎および血管再生手術を示す患者を排除するために、全ての患者を、医療上の病歴、身体検査、および基準の血液学、血清および尿の化学で篩いに掛けた。伸展性の理由のため、乏しい糖尿病対照を示すことが決定された患者を、不適任と判断された。さらに、放射線療法、全身性コルチコステロイド、および免疫抑制または化学療法剤を受けているものは、不適任と判断された。インフォームドコンセンサスは、研究の全ての参加者から得た。
【００３６】
全ての群から得た患者を、10時間の期間、絶食させた後、病院環境に至らせた。絶食中の尿および血漿試料は、患者の基準の硝酸塩および亜硝酸塩のレベルの指標を供する承認（1日目）により各患者から得た。さらに、化学パネル、CBC、および尿検査から構成される日常の実験室作業は、病院承認による全ての患者から得られた。患者は、時間活動のレベル、食物摂取、および他の環境因子が制御される24時間の病院設定に制限された。全ての患者は、バスルーム特権と休息取ることに制限され、そして24時間の入院の間同じ食事を消費した（2,581Kcal；1タンパク質24.2g；アルギニン5,779mg：表1参照）。全ての患者には、喫煙およびアルコール消費を慎むように要求した。通常、肥料から高い硝酸塩含有量を示す野菜、および硝酸塩および亜硝酸塩保存食は、研究食から除去され、下に表1で示された。基準の投薬を付随して投与され、そして血中グルコースの監視は、彼らの通常の家庭の日常当たり糖尿病の対照によって行われた。投薬および食事摂取並びに尿排出は、記録され、そして24時間の制限期間の間、研究チームによって評価された。制限の日の午後9時に、全ての患者は、さらに10時間の絶食期間を始めることが要求された。病院の設定から開放する前に、患者は、再度、絶食中の血漿および尿試料を提供した（2日目）。生命徴候が、制限期間じゅう毎日監視され、そして全ての患者は、開放する前に有害事象について評価された。得られた全ての血漿および尿試料は、実験室分析の準備で、−20℃で直ちに凍結された。
【００３７】
（表１）
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【００３８】
実施例2
創傷治癒および創傷非治癒の糖尿病患者における尿および血漿の硝酸塩および亜硝酸塩濃度の測定
尿および血液の試料片は、実施例1で記述されるとおり、創傷治癒および創傷非治癒の糖尿病被験者から得られた。
【００３９】
尿および血漿試料は、製造業者の指示によって、市販のキット（Cayman  Chemical、Ann  Arbor、MI）を用いて亜硝酸塩および硝酸塩のレベルについて蛍光測定法を用いて分析された。使用された方法は、Gilliamら（Anal．Biochem．212、359（1993））によって記述されるものである。血液を、ガラス管に採取し、遠心分離し、血漿を採取し、アッセイするまで凍結させた。試料を解凍させ、渦巻攪拌し、そして10kDaサイズの排除フィルター（Millipore、Bedford、MA）で濾過した。硝酸塩の測定のために、亜硝酸塩レダクターゼおよびNADPを添加し、そして2時間、室温でインキュベートさせた。インキュベーションに続いて、2,3−ジアミノナフタレン、続いてNaOHを添加し、そして蛍光を、365nmでの励起および405nmでの発光を使用した蛍光光度計で測定した。亜硝酸塩濃度は、硝酸塩還元段階が排除される以外は同じ方法を使用して測定された。尿を、濾過が排除される以外は同様の形態で加工した。全ての試料は、三重に分析された。患者の試料における濃度（リットル当たりマイクロモル）は、標準硝酸塩および亜硝酸塩溶液に対する比較によって測定された。Tukey−Kramer後試験（Ludbrook、Clin．Exp．Pharmacol．Physiol．18、379（1991））を用いた一方向のANOVAを、Windows98用のCraphPad  InStatソフトウェア）、バージョン4.10を使用して行った。P値＜0.05は、有為であると考えられた。
【００４０】
C群およびHD群についての一日目の絶食中の尿中硝酸塩レベル（マイクロモル／1±S.E.）（それぞれ、55.88±4.49および554.14±3.32）は、明らかな異なりはなかった（図2）。しかし、絶食中のUHD群の尿硝酸塩レベル（30.35±3.61）は、C群（p＜0.001）またはHD群（p＜0.01）より明らかに低かった。C群およびHD群についての2日目の絶食中の尿の硝酸塩レベルは、低かった（それぞれ、42.60±1.92および45.57±5.10）が、明らかな差異はなかった。同様に、UHD群絶食中の尿中硝酸塩レベル（22.74±3.13）は、一日目の値より低く、そしてC群（p＜0.05）またはHD群（p＜0.05）よりさらに明らかに低かった［表2］。C群（4.80±0.85）およびUHD群（4.05±0.37）についての1日目の絶食中の血漿中硝酸塩レベル（マイクロモル／1±S.E.）は、明らかに異なるものではなかった（図3）。しかし、HD群（11.71±2.08）は、UHD群より高かったが、しかしC群より明らかに高いのみであった（p＜0.05）。2日目の絶食中の血漿中硝酸塩レベルは、C群（2.92±0.37）およびUHD群（3.16±0.61）についてわずかに低かったが、しかしこれらが明らかに異なっていない前のとおりである。しかし、HD群（11.94±4.46）は、ここで、C群（p＜0.01）およびUHD群（p＜0.05）のいずれかのものより明らかに高かった。尿および血漿の硝酸塩レベルは、亜硝酸塩よりおよそ100倍大きく、そしてこの方法論によって任意に未検出性のものであった。これらの理由のため、尿および血漿中亜硝酸レベルは、報告されなかった。
【００４１】
（表２）絶食中の尿および血漿中硝酸塩値
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【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１】創傷修復制限における一酸化窒素（NO）の役割の全体的代表を表す。創傷NO指向性「細胞のシグナル伝達」は、修復の炎症介在、創傷酸素有用性、および創傷マトリックス改造および成熟を増強するようである。
【図２】研究の1日目および2日目での、対照（C）、治癒糖尿病患者（HD）、および未治癒糖尿病患者（UHD）についての絶食中の尿中硝酸塩レベル（リットル当たりマイクロモル）のグラフ表現である。結果は、各日での、C（Pc）およびHD（PHD）に比較した場合にP値で、平均±S.E.として表される。
【図３】研究の1日目および2日目での、対照（C）、治癒糖尿病患者（HD）、および未治癒糖尿病患者（UHD）についての絶食中の血漿中硝酸塩レベル（リットル当たりマイクロモル）のグラフ表現である。結果は、2日目についてHDとUHDを比較すること以外は、各日での、CおよびHDに比較した場合にP値で、平均±S.E.として表される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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