(57)【要約】バイオフィルムの形成に及ぼす表面被覆剤等の物質の影響を試験し、迅速な応答時間で複数の物質又は抗菌剤を一度に試験することを可能とする装置及び方法を提供する。また、本発明は、複数のバイオフィルムを成長させる方法を提供するものである。前記方法は、複数のバイオフィルム付着部位を設ける工程、該バイオフィルム付着部位に、バイオフィルムの形成に関与する可能性のある表面をモデルとして形成する表面物質をさらに供給する工程、バイオフィルム付着部位に対して流動性の液体成長培地を流す工程、及び該液体成長培地の存在下に、バクテリアを培養する工程を含むことを特徴とする方法である。
2004505613.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数のバイオフィルム（生物膜）を成長させる方法であって、
（１）複数のバイオフィルム付着部位を設ける工程；
（２）該バイオフィルム付着部位に、バイオフィルムの形成に関与する可能性のある表面をモデルとして形成する表面物質を供給する工程；
（３）該バイオフィルム付着部位に対して、流動性の液体成長培地を流す工程；及び
（４）該バイオフィルム付着部位上で、該液体成長培地の存在下に、バクテリアを培養する工程
を含む、方法。
【請求項２】
前記バクテリアをバイオフィルムの形で培養する、請求項１の方法。
【請求項３】
前記バイオフィルム付着部位を被覆する、請求項１の方法。
【請求項４】
前記被覆剤をアルミニウム、ステンレス鋼、銀、銅、ヒドロキシアパタイト、シリコン、ラテックス、ウレタン、ＰＶＣ及びセラミックからなるグループ、鋼、金、チタニウム、ポリエチレン、並びにポリシリコーンから選択する、請求項３の方法。
【請求項５】
前記被覆剤がヒドロキシアパタイトであり、該ヒドロアパタイトを前記バイオフィルム付着部位に接着剤を用いて接着する、請求項３の方法。
【請求項６】
前記液体培養を攪拌することにより、前記バイオフィルム付着部位に対して流す、請求項２の方法。
【請求項７】
前記被覆剤が身体部分をモデルとして形成する、請求項４の方法。
【請求項８】
前記被覆剤が医療器具をモデルとして形成する、請求項４の方法。
【請求項９】
前記被覆剤が工業用部位をモデルとして形成する、請求項４の方法。
【請求項１０】
前記被覆剤が突起形状の前記バイオフィルム付着部位に配置する、請求項４の方法。
【請求項１１】
さらに前記バクテリアを殺生剤に曝す工程を含む、請求項１の方法。
【請求項１２】
表面物質が医療器具の一部である、請求項１の方法。
【請求項１３】
医療器具がバイオフィルム付着部位に取り付けたカテーテルである、請求項１２の方法。
【請求項１４】
医療器具がバイオフィルム付着部位に取り付けたステントである、請求項１２の方法。
【請求項１５】
旋回シェイカーにより液体成長培地を流動させる、請求項１の方法。
【請求項１６】
制御された環境下で、バイオフィルムの形成に及ぼす物質及び表面被覆剤の影響を試験する方法であって、
（１）複数のバイオフィルム付着部位を設ける工程；
（２）該バイオフィルム付着部位を、バイオフィルムの形成に関与する可能性のある表面のモデルとして作用する物質で被覆する工程；
（３）該バイオフィルム付着部位に対して、流動性の液体成長培地を流す工程；
（４）該液体成長培地を攪拌する工程；及び
（５）該バイオフィルム付着部位で、バクテリアを培養する工程
を含む、方法。
【請求項１７】
前記被覆剤をアルミニウム、ステンレス鋼、銀、銅、ヒドロキシアパタイト、シリコン、ラテックス、ウレタン、ＰＶＣ、及びセラミックからなるグループ、鋼、金、チタニウム、ポリエチレン、並びにポリシリコーンから選択する、請求項１６の方法。
【請求項１８】
前記被覆剤をバイオフィルム付着部位に接着剤を用いて接着する、請求項１７の方法。
【請求項１９】
前記被覆剤がカテーテルである、請求項１６の方法。
【請求項２０】
前記被覆剤が医療器具である、請求項１６の方法。
【請求項２１】
前記医療器具がステントである、請求項２０の方法。
【請求項２２】
制御された環境下で、バイオフィルムの形成に及ぼす物質及び表面被覆剤の影響を試験する装置であって、
（１）第一の面及び第二の面を有し、さらに該第一の面から延びた複数の突起部を含み、該突起部がバイオフィルム成長に関与する可能性のある表面をモデルとして形成するバイオフィルム成長用の物質を具える第一の主部；及び
（２）容器を画成する測面及び底面を有し、該第一の主部を受け入れるように構成され、該突起部を受け入れるようにされた複数の窪部を有し、該窪部は液体を入れるようにされた、第二の主部
を含む、装置。
【請求項２３】
前記物質がアルミニウム、ステンレス鋼、銀、銅、ヒドロキシアパタイト、シリコン、ラテックス、ウレタン、ＰＶＣ、及びセラミックからなるグループ、鋼、金、チタニウム、ポリエチレン、並びにポリシリコーンから選択された被覆剤を含む、請求項２２の装置。
【請求項２４】
前記物質がバイオフィルムの成長を促進する被覆剤である、請求項２２の装置。
【請求項２５】
前記物質がバイオフィルムの成長を抑制する被覆剤である、請求項２２の装置。
【請求項２６】
前記突起部の２つの突起部が前記物質を２つの突起部間に弓状となるように保持する、請求項２２の装置。
【請求項２７】
前記物質が第一及び第二の端部を有し、２つの突起部は該第一及び第二の端部が容器に入れた液体に浸漬されないように、２つの突起部を保持するようにされている、請求項２６の装置。
【請求項２８】
前記物質が突起部に取り付いたカテーテルである、請求項２２の装置。
【請求項２９】
前記物質が管状の横断面を有する、請求項２８の装置。
【請求項３０】
さらに突起部に対して流れを形成する手段を含む、請求項２２の装置。
【請求項３１】
流れ形成手段が旋回シェーカーを含む、請求項３０の装置。
【請求項３２】
さらに液体成長培地を含む液体を前記窪部に含む、請求項２２の装置。
【請求項３３】
前記突起部が前記第一の主部から選択的に取り外し可能となっている、請求項２２の装置。
【請求項３４】
前記第一主部、前記容器及び前記部材がプラスティックで作成される、請求項２２の装置。
【請求項３５】
前記物質が少なくとも１つの突起部に配置されたステントを含む、請求項２２の装置。
【請求項３６】
物質又は表面被覆剤上に、バイオフィルムが形成されたかどうかを試験する方法であって、
（１）　バイオフィルムの形成についての被試験物質で試験装置中の複数の突起部を少なくとも部分的に被覆する工程；
（２）液体成長培地及びバイオフィルム形成有機体の入った、少なくとも１つのウェルを含む第一の容器に、突起部を入れる工程；及び
（３）突起部を第一の容器より取り出し、第二培地の入った第二の容器に入れる工程
を含む、方法。
【請求項３７】
被試験物質がヒドロキシアパタイトである、請求項３６の方法。
【請求項３８】
被試験物質が医療器具である、請求項３６の方法。
【請求項３９】
医療器具がカテーテルである、請求項３８の方法。
【請求項４０】
被試験物質がさらに被覆剤を含む、請求項３６の方法。
【請求項４１】
被覆剤がバイオフィルム抑制被覆剤である、請求項４０の方法。
【請求項４２】
被覆剤をアルミニウム、ステンレス鋼、銀、銅、ヒドロキシアパタイト、シリコン、ラテックス、ウレタン、ＰＶＣ、及びセラミックからなるグループ、鋼、金、チタニウム、ポリエチレン、並びにポリシリコーンから選択する、請求項３６の方法。
【請求項４３】
前記物質が少なくとも２つの突起部間に配置され、それによって、第一及び第二の端部が液体成長培地に接触しない、請求項３６の方法。
【請求項４４】
液体成長培地がさらに細菌を含む、請求項３６の方法。
【請求項４５】
第二培地が緩衝液である、請求項３６の方法。
【請求項４６】
第二培地が成長培地である、請求項３６の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の属する技術分野）
本発明は、バイオフィルムの形成に関し、さらに詳細には、種々の表面上でバイオフィルムを形成する装置、及びバイオフィルムの形成に及ぼす抗菌剤の影響を試験する方法を提供するものである。
【０００２】
（従来の技術）
近年、細菌増殖特性の広範囲にわたる研究より、細菌が何等かの表面に付着し複合体層を形成することが分かってきた。前記細菌の複合形体は、バイオフィルム、もしくは付着細菌として知られている。バイオフィルムは、人体及び動物の体、食品加工、医療施設、並びにその他の多くの産工業を含むさまざまな領域において、問題を引き起こす可能性がある。
【０００３】
現在、バイオフィルム形態での細菌は、プランクトン状態の細菌よりも、抗菌剤に強い耐性を有することは周知である。しかしながら、従来の抗菌剤試験は、プランクトン状態の細菌を使用して行われている。従って、細菌抑制効果を示す抗菌剤濃度が過小評価されている結果、誤った抗菌剤や誤った量の抗菌剤が細菌処理に用いられる可能性がある。
【０００４】
バイオフィルムの形成を観察する装置の一例として、Ｃａｎａｄｉａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ （１９８１） 第２７巻、９１０−９２７頁に、ロビンス（Ｒｏｂｉｎｓ）装置と呼ばれる装置の使用についてＭｃＣｏｙ等の記載がある。前記装置は、チューブを含み、そのチューブを通してリサイクル回路の水を流すことが可能である。前記チューブは、チューブ壁面内に複数の孔（ｐｏｒｔ）を有し、各孔は取り外し可能な鋲（ｓｔｕｄ）を具えている。前記鋲は、生物に付着し易い表面を有し、かつチューブに対して固定され孔に留まることが可能となっているため、チューブの内部表面の一部は、かかる表面により形成される。前記各鋲を所望時間経過後に孔から取り外し、その表面を分析し細菌の増殖を調べることができる。あるいは、鋲とは別に、表面を採取して調べることができる。細菌数は、例えば細菌のＡＴＰを検出したり、あるいはさらに細菌を培養することで得られる生成物を分析する等の物理的手段又は化学的手段を用いて測定できる。
【０００５】
Ｓｃｈａｐｉｒａ等による米国特許第５３４９８７４号には、他のバイオフィルム成長用の装置に関する記載がある。管路内に取外し可能な複数の鋲を配置することにより、該管路内であるいは第一の管路と平行な第二の管路内で細菌増殖を測定する。鋲を取外し、鋲上でのバイオフィルムの形成を分析することができる。取外し可能な複数の鋲を単一のチューブ中で使用する前記装置は、むしろ長い処理時間が必要であり、数種類の異なる抗菌剤の試験を行う場合、迅速な応答性が得られない。
【０００６】
さらに、他の装置がＳｉｍｐｌｅ Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ Ｍｅａｓｕｒｉｎｇ ｔｈｅ Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ Ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｔｏ Ｋｉｌｌ Ａｄｈｅｒｅｎｔ Ｂａｃｔｅｒｉａ， Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ， １９９２；３８， ２８６−２９０ にＭｉｙａｋｅ等により記載されているが、該装置では９６ウェルを備えたプラスティック製の細胞培養プレートの底部に付着した黄色ブドウ球菌細胞を、希釈した一連の抗生物質溶液で処理し２４時間培養した後、増殖状態から細胞の存続可能性を判断している。前記の方法は、付着細菌のコロニー形成が一様ではなく、プランクトン状態の細菌が沈殿するという欠点を有する。
【０００７】
そこで、バイオフィルムの形成に及ぼす表面被覆剤等の物質の影響を試験する装置及び方法を提供することが望ましいであろう。さらには、迅速な応答時間で複数の物質又は抗菌剤を一度に試験することを可能とする装置及び方法を提供することが望ましいであろう。
【０００８】
（発明の概要）
第一に、本発明は、複数のバイオフィルムを成長させる方法を提供するものである。前記方法は、複数のバイオフィルム付着部位を設ける工程、該バイオフィルム付着部位に、バイオフィルムの形成に関与する可能性のある表面をモデルとして形成する表面物質をさらに供給する工程、バイオフィルム付着部位に対して流動性の液体成長培地を流す工程、及び該液体成長培地の存在下に、バクテリアを培養する工程を含むことを特徴とする方法である。
【０００９】
第二に、本発明は、制御された環境下でバイオフィルムの成長に及ぼす物質及び表面被覆剤の影響を試験する方法を提供するものである。前記方法は、複数のバイオフィルム付着部位を設ける工程、該バイオフィルム付着部位をバイオフィルム形成に関与する可能性のある表面のモデルとして作用する物質で被覆する工程、該バイオフィルム付着部位に対して流動性の液体成長培地を流す工程、該液体成長培地を攪拌する工程、及び該バイオフィルム付着部位でバクテリアを培養する工程を含むことを特徴とする方法である。
【００１０】
第三に、本発明は、バイオフィルムが形成されたかどうかを試験する装置を提供するものである。前記装置は、第一の面及び第二の面を有する第一の主部、容器を画成する測面及び底面を有し、該第一の主部を受け入れるように構成された第二の主部含む。前記第一の主部は、該第一の面から延びた突起部を含み、該突起部がバイオフィルム成長用の物質を受け入れる。前記容器は、さらに複数の窪部に液体を入れることができ、部材に液体を流すことができる。
【００１１】
第四に、本発明は、物質又は表面被覆剤上にバイオフィルムが形成されたかどうかを試験する方法である。前記方法は、バイオフィルム形成についての被試験物質で試験装置中の複数の突起部を少なくとも部分的に被覆する工程、液体成長培地及びバイオフィルム形成有機体の入った少なくとも１つのウェルを含む第一の容器に突起部を入れる工程、及び突起部を第一の容器より取り除き第二培地の入った第二の容器に入れる工程を含む方法である。
【００１２】
（発明の実施の形態）
本発明は、種々の物質上においてバイオフィルムが形成されているかどうかを試験する装置及び方法に関する。前記装置は蓋及び容器を含み、蓋はバイオフィルム形成試験用の種々の物質を収容する形状としてある。例えば、前記蓋は、種々の物質を被覆又は付着させるための、複数の突起部を有するものとすることができる。あるいは、生体適合性の高い接着剤又は他の付着方法を用いて蓋に物質を固着することもできる。前記容器は、液密状態で蓋を受けるようにされ、その内部に液体成長培地を保持するように形成されている。
【００１３】
物質を突起部に付着させ、液体成長培地を含む容器に懸下する。そして、該物質を放置し一定時間培養し、該物質上でバイオフィルムを形成させる。培養中、バイオフィルムの形成は物質に対して液体成長培地を流すことにより促進することができる。バイオフィルムの形成後、蓋を容器から取り外す。殺生剤を入れた第二の容器を用意し蓋を第二の容器に入れ、殺生剤の有効性について試験を行う。
【００１４】
図１は、本発明に係るバイオフィルム形成装置の蓋９０を示す。図１に示すように、蓋９０は第一の表面１１０、第二の表面１１１（図示せず）、側面部１２０及び第一平面部１１０から延びた複数の突起部１３０を有する平面部１００を含む。
【００１５】
蓋９０は、ステンレス鋼、チタニウム、ポリスチレン、ウレタン、又は低密度ポリエチレン（ＬＤＰＥ）等の生体適合性の高いいずれかの物質で構成することができる。側面部１２０は平面部１００より延び、図２に示すように容器１０５に収容されるようになっており、それによって蓋９０及び容器１０５の間で液密な組立装置９５を形成する。
【００１６】
また、図１は、蓋９０の底面斜視図を示す。複数の突起部１３０が、平面部１００の第一の表面１１０から延び、ほぼ円錐形状を有する。前記突起部１３０は、ほぼ円錐形状を有するものとして示されるが、他のいずれかの適当な形状、例えば中空円筒形状、中実円筒形状若しくは正方形状又はその他の類似の形状に形成することができる。突起部１３０は、多数の異なる幾何学的パターンに形成することができる。例えば、蓋９０は、各列が１０個の突起部より成る５列の突起部を有するように構成することができる。実施態様では、蓋９０は各列が少なくとも８個の突起部より成る少なくとも３列の突起部で構成することが好ましい。
【００１７】
突起部１３０は、好ましくは蓋９０の平面部１００と一体に形成する。もしくは、平面部１００の第一の表面１１０に、突起部１３０の端部を固着することにより形成することができる。さらに、平面部１００の第一の表面及び第二の表面を貫通して多数の孔（図示せず）を形成し、孔を通して突起部１３０を配置し、適切な生体適合性の高い接着剤、超音波溶接、又は他の生体適合性の高い処理方法により突起部１３０を平面部１００に取付けることにより、突起部１３０を形成してもよい。突起部は蓋９０の第一の表面１１０上に配置され、蓋９０を容器１０５に置いた時に突起部２つが各ウェルにそれぞれ入るようになっている。突起部は長さが約１ｃｍから３ｃｍで、幅は最大２ｍｍである。
【００１８】
図３及び図４は、物質３００が突起部１３０上で突起部１３０間に配置された、本発明に係る蓋９０を示す。そして、図３は、物質３００が突起部１３０間に配置された、蓋９０の側面部図を示す。物質３００は、例えば医療処理に使用されるカテーテル等のチューブとすることができる。カテーテル３００は、約３．５ｃｍの長さの小片に切断することにより用意することができる。カテーテルの一端を突起部１３０の一つに配置し、他の一端を隣接する突起部１３０に配置し、図３に示すように第一の突起部及び第二の突起部間に弓形を形成する。
【００１９】
図３及び図４に示すような配置は、バイオフィルム形成試験用の種々の物質３００を、試験管内（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）実験と類似した状態で試験することができるという利点を有する。さらにこのように物質３００を配置することにより、物質３００の切断端部３０１は容器１０５のウェル中に入れた液体成長培地との接触を避けることができる。カテーテルの切断端部は試験用の被覆剤で被覆されていないため、該切断端部を容器１０５中の液体成長培地にさらすことは好ましくないことが判明した。さらに、前記切断端部が液体成長培地に接触した場合には、液体成長培地がカテーテルの内部の非被覆表面に流入することも判明した。よって、結果として、広い非覆表面が液体成長培地に接触するので、被覆部分においてバイオフィルムが成長するかどうかを確認することは困難であることが分かる。従って、好ましい実施態様では、被試験物質の切断端部又は非被覆表面は、液体成長培地と接触しないように組立装置９５中に配置されている。
【００２０】
本発明に係る蓋９０は、種々の物質を同時に試験すること、又は液体成長培地を含む容器から取外すことを可能にする。その結果、処理中には最小限の取扱いのみ必要とされる。前記従来技術のいずれかの方法を使用する場合には、個々のピンの挿入及び取外しが必要なため、実験において各ピンの全体の露出時間を調整することは困難である。例えば、多数のピン上でバイオフィルムが形成されたかどうかを試験することが望まれるが、該試験には、各ピン（すなわち各データポイント）は別々に取り出して処理する必要がある。各ピンを別々に取出さなければならないと、他のピンよりも液体成長培地に長時間接触するピンが存在するため、一貫性のない結果を生むという欠点を有し、よって、前記方法により形成されたバイオフィルムは、ピン毎に一貫性のない結果を生じる。本発明に係る蓋９０は、全突起部及びバイオフィルム形成物質３００を取付けた蓋９０全体を容器１０５から取外すことにより、バイオフィルムの露出時間及び形成時間を慎重にモニーターして調整することを可能とする。よって、前記蓋を取り外すことにより、全突起部又は物質を同時に液体成長培地から取外することができ、全突起部は一度に容器から取外されるため、蓋９０は各突起部又は物質上でバイオフィルムの形成を均一的に促進する。均一なバイオフィルムを形成することは、試験の結果が均一で正確であることを確保するために重要である。さらに、本発明に係る装置及び方法は、多数のバイオフィルムを一度に形成することができるため、バイオフィルムの形成に高い処理機能を有する。
【００２１】
物質上でのバイオフィルム形成試験において、物質３００としては、試験することが望ましいいずれかの物質をも含む。例えば、アルミニウムの表面上でバイオフィルムの形成試験をすることが望まれれば、物質３００は突起部１３０上に配置されたアルミニウムチューブの小片を含む。物質３００は、摩擦力によりピン上に留めることができる。必要であれば、物質３００を突起部１３０に留めるために、生体適合性の高い接着剤や他の方法を使用することができる。
【００２２】
物質３００に関し、特定の物質について言及されているが、物質３００はこれにより限定されるものではない。物質３００は、バイオフィルムの成長を調べるために望ましいいかなる物質をも含む。物質３００は、アルミニウム、鋼、銅、ステンレス鋼、チタニウム、シリコン、ウレタン、又は他の類似物質を含む。図３に示すように、物質３００は、２以上の突起部１３０に配置され、蓋９０を容器１０５上に置いた時には、物質３００の一端は容器１０５のウェル１２５中の液体成長培地に接触しない。さらに物質３００は、突起部上に渡って配置されＵ型を形成するように示されているが、物質３００は図示されたものとは異なる態様で突起部に配置することができることも考えられる。また、物質３００は、バイオフィルム形成の試験をすることが望まれる少なくとも１つの被覆剤をさらに含むことも考えられる。例えば、物質３００は、前記の態様で形成し、バイオフィルムの形成を調べることが望ましい被覆剤で被覆されたカテーテルとすることができる。前記被覆剤は、アルミニウム、ステンレス鋼、銀、銅、ヒドロキシアパタイト、シリコン、ラテックス、ウレタン、ＰＶＣ、及びセラミック、鋼、チタニウム、ポリエチレン、及びポリシリコーンから構成することができる。前記の被覆剤は単なる例示に過ぎず、被覆剤はこれに限定されるものではないと考える。
【００２３】
図５及び図６は、本発明の他の実施態様である蓋５９０を示す。蓋５９０は、第一の表面５１０、第二の表面５１１（図示せず）及び側面部５２０を有する平面部５０５を含み、それらは蓋５９０を画成する。蓋５９０は、さらに複数のバイオフィルム形成物質５００から成る素子を有する。かかるバイオフィルム形成物質５００から成る素子は、アルミニウム、銅、ステンレス鋼、若しくはヒドロキシアパタイト等のような物質から構成される。前記の物質は単に例示に過ぎず、物質はこれに限られると考えるべきではない。
【００２４】
さらに、物質３００及び５００は、医療処理において患者に使用される、表面及び装置をモデルとして形成するために用いられる。例えば、ヒドロキシアパタイトは、患者の歯、ステンレス鋼は外科用メスやはさみのような医療器具をモデルとして形成するのに用いる。バイオフィルム形成物質は、生体適合性の高い接着剤やその他の処理方法により、突起部５３０（図示せず）に固着される。もしくは、蓋５９０は、バイオフィルム形成物質５００と共に製造工程中で一体化して形成される。他の実施態様においては、蓋５９０は突起部５３０を含まず、生体適合性の高い物質５００は蓋５９０の第一の表面５１０に、生体適合性の高い接着剤を用いて固着される。
【００２５】
バイオフィルム形成物質５００は、図５及び６に示すように、ほぼ管状とすることができる。もしくは、バイオフィルム形成物質５００は他の態様に形成し、蓋５９０を９６個のウェル付プレート又は他の異なる形状を有するウェルプレートと共に使用することもできる。前記のように、蓋５９０は、チタニウム、ステンレス鋼、又はポリスチレン及び低密度ポリエチレン（ＬＤＰＥ）のようなプラスティック等の生体適合性の高い物質から成る。
【００２６】
図７は、容器１０５を示す。容器１０５は第一の表面１１１、側面部１２２、及び複数のウェル１２５を有する。ウェル１２５は容器１０５中に配置され、蓋９０を容器１０５に置いた時、一対の突起部が各ウェル１２５にそれぞれ入るように配置してある。図８に示すように、容器１０５は、突起部１２３を有し、側面部１２２と突起部１２３の間に段差を有している。かかる突起部１２３は、図２に示すように、蓋９０／５９０の側面部１２０を受けるように構成されている。蓋９０／５９０を容器１０５に置いた時には、かかる蓋９０／５９０の側面部１２０と、容器１０５の突起部１２３との間は液密となる。このように液密とすることにより、容器１０５に入れた液体成長培地を汚染から防ぐ。容器１０５は１２個のウェルを有するものとして図示するが、他の個数のウェルを使用することも考えられる。容器１０５は、蓋９０の突起部の対の数に相当するウェルの数となるものを選択する。
【００２７】
容器１０５は、ステンレス鋼又はチタニウムのような生体適合性の高い物質から形成する。好ましくは、容器１０５は、ポリ塩化ビニル（ＰＶＣ）、ポリエチレン、低密度ポリエチレン（ＬＤＰＥ）、ポリスチレン、ウレタン、シリコン、デルリン、又は他の類似物質等の生体適合性の高いプラスティックから成る。さらに、容器１０５は、透明もしくは不透明とし、突起部１３０又は物質３００若しくは５００上におけるバイオフィルムの形成を、使用者が観察できるようにすることもできる。
【００２８】
図９−１２は、本発明に係るバイオフィルム形成装置の他の実施態様を示す。さらに詳細には、バイオフィルム検定装置の一部は蓋７００を含む。前記蓋７００は、蓋の第一の表面７１０より延びた突起部７３０及び側面部７２０を有する。前記突起部７３０は、バイオフィルムが付着することができるバイオフィルム付着部位を形成する。蓋７００は、生体適合性の高いプラスティック、又はポリスチレン、ポリ塩化ビニル、ポリエチレン、ステンレス鋼、チタニウム若しくは生体適合性の高い他の適当な物質等の金属より形成する。突起部７３０は、図９に示すように、少なくとも１列が１２突起部から成る８列に形成することができる。かかる構造で、蓋７００は図に示す一般的に入手可能な９６個のウェル付プレートと組み合わせて、バイオフィルム形成に必要な液密状態の容器を形成することができる。突起部７３０は特定の形状を有する蓋７００上に配列されるとして記載したが、前記方法等のように、蓋７００の第一の表面７１０上にいずれかの態様で配列することができると考えられる。
【００２９】
図１０は容器７０５を示す。容器７０５は、液体保持容器７２２を含み、かかる器７２２は成形隆起部７２６により複数の溝７２４に分割されている。また、前記溝７２４は突起部７３０が入るのに十分な幅を有する。突起部７３０の各列に対しては、少なくとも溝７２４一つとすべきである。前記及び図示したように、蓋７００及び容器７０５は、容器が蓋を受け入れることによってその間に液密シールを形成するように構成される。容器７０５は、好ましい実施態様では図１１に示すように蓋７００と共に用いられ検査用の組立装置を形成するが、蓋９０と共に用いられて、バイオフィルム形成用組立装置を形成することもできる。
【００３０】
突起部１３０／７３０はバイオフィルム成長物質でさらに被覆することにより、種々の物質上におけるバイオフィルムの形成試験を可能にする。例えば、かかるバイオフィルム形成試験は、アルミニウム又はそれに類似する金属上で行なうことが望ましいかもしれない。各突起部１３０／７３０は、アルミニウム箔で被覆することもできる。シート状の箔を入手し、箔を１インチの正方形に細かく切断し、環状の接種材料（直径約１．５ｃｍ）をかかる箔で包むことにより、一端が開口した円筒体を形成することによって該突起部を被覆することもできる。その後、一端開口の筒体を単一の突起部１３０／７３０に合わせ、そこに微量の接着剤を付け、突起部１３０／７３０に箔を保持する。突出した箔の端部は突起部１３０／７３０の先端に巻きつけ、余分な部分は切断する。前記処理は、所望の個数の突起部が被覆されるまで反復する。前記処理は単に例示にすぎず、突起部を被覆する方法はこれに限るものではなく他の方法を用いて突起部を被覆することもできる。例えば、突起部１３０／７３０は、噴射被覆法、蒸着法、浸漬法、又は他の類似方法により被覆することができる。
【００３１】
あるいは、他の物質上においてバイオフィルムの生成試験を行うことが望ましい場合もある。前記物質は、ヒドロキシアパタイトである。突起部１３０／７３０は、最初に生体適合性の高い接着剤で被覆し、次にヒドロキシアパタイトの結晶が入った窪部に入れ、該接着剤を硬化させることによって、ヒドロキシアパタイトで被覆することができる。突起部１３０／７３０はヒドロキシアパタイトの結晶から外に出し、一定時間又は接着剤が乾くまで放置する。前記処理は、突起部が完全にヒドロキシアパタイトの結晶で被覆されるまで反復する。さらに、突起部１３０／７３０は、その上でバイオフィルム形成成長を調べることが望まれる、異なる物質によって類似する方法により被覆することができる。
【００３２】
一実施態様において、蓋７００の突起部７３０は、中空横断面領域を有するよう形成してもよい。中空横断面を有する突起部を形成する場合には、図１３に図示するように、かかる窪部の断面領域はプラスティック製シート層１３に覆うべきである。突起部７３０の窪部を覆うプラスティック層１３は、バイオフィルム形成試験用のプレートから突起部を除去した場合に検査用組立装置を汚染から守る。さらに、図１３に示すように、突起部１３０／７３０は物質３００／５００を有する。
【００３３】
図２、８、及び１１に示すように、容器１０５及び７０５は、バイオフィルム形成において主要な２つの機能を果す。第一に、かかる容器は、突起部１３０／７３０上でバイオフィルムを形成する、バイオフィルム形成有機物を含む液体成長培地の貯留器としての機能を有する。第二に、かかる容器は、突起部に対し剪断力を生じるという機能を有する。かかる剪断力により、突起部上において最適の条件で、バイオフィルムを形成することが可能である。バイオフィルム形成有機体は、例えば細菌、酵母菌、又は菌類（ｆｕｎｇｉ）とすることができる。菌類はさらに糸状菌とすることができる。容器中での剪断力は、揺動テーブルや旋回シェーカーによって付与する。該剪断力を付与するための装置は、組立装置にいずれの容器を用いるかにより選択する。容器１０５を使用する場合は、旋回シェーカーを使用することが好ましい。旋回シェーカーが好ましいのは、付与される動作により液体成長培地中において遠心力が発生するからである。かかる遠心力は、液体成長培地を突起部に対して一様に流すことによって、突起部又は蓋９０の突起部に配置した物質上に、バイオフィルムを一様に形成するため、必要とされる。適切な旋回シェーカーは、Ｎｅｗ Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｃｏ． Ｉｎｃ．より入手可能である。
【００３４】
もしくは、検査に容器７０５を用いる場合は、揺動テーブルを使用して必要な剪断力を付与することが好ましい。本実施態様で、揺動テーブルを使用することが好ましいのは、前後の動作により液体成長培地を一様に突起部に対して流すことによって、突起部上においてバイオフィルムを一様に形成するためである。本明細書に開示する検査用組立装置と共に使用できる適切な揺動テーブルとしては、Ｈｏｆｆｅｒから入手可能なｔｈｅ Ｒｅｄ Ｒｏｃｋｅｒがある。
【００３５】
各実施態様は好ましい実施の態様として記載したが、各組立装置においては、液体成長培地に流れを付与するいずれかの方法を使用することができると考える。旋回シェーカーを容器１０５と共に使用することが好ましいのは、旋回シェーカーは液体成長培地中に遠心力を付与し、液体成長培地を突起部及び／又は各ウェル中の物質の周囲に流すからである。仮に揺動テーブルを容器１０５と共に使用すれば、揺動動作により液体成長培地の一部がウェル中に配置した物質の非被覆部分に接触し、前述したように、被覆表面におけるバイオフィルムの形成を阻害する。さらに、ウェル１２５はほぼ円筒状であるため、液体に層流を与えるためには、遠心運動が用いるのに最も効果的な動作である。さらに、旋回シェーカーを本発明の他の例で使用することにより、複数の突起部及び／又はその突起部の物質に対して液体成長培地を流動させることができるが、揺動テーブルが使用された場合のように、突起部又は物質に渡ってバイオフィルムが一様に形成されない可能性がある。
【００３６】
バイオフィルムを一方向の液体の流れのみで生成することは可能であるが、液体を容器の一側部から流入させ他の側部から流出させるように容器を設計しなければならないので、装置の費用及び複雑性が増すことになる。それに対して、一定の動作並びに乱流が旋回及び揺動により与えられるが、容器（すなわち、ウェル、溝、窪部、又は他の類似する形状）の設計は容易であり、一様なバイオフィルムの形成に効果的であることが判明した。
【００３７】
本明細書に記載したように、突起部及び窪部は全て実質的に同形（許容範囲内の誤差で）として、バイオフィルム形成中に突起部に渡って剪断力を一様にすべきである。さらに、均一な窪部全てを互いに連結することにより、該窪部が同じ液体栄養素及び混合物を分かち合うことを確保する。また、溝部を容器の一側面から他の側面に延びるように形成することにより、個々の溝部又はウェルに液体成長培地を有する第一の容器１０５の個々のウェルに対して溝部は類似した作用をすると考えられる。全てのバイオフィルム形成部位に対して同じバイオフィルム形成培地を分かち合いかつ同じ構造である溝部又はウェルを用いることにより、形成された複数のバイオフィルムは細菌試薬の試験の目的では互いに均等であると考えられる。従って、異なる濃度の異なる抗菌剤を、突起部の位置的相違に関わらず比較することができる。よって、本明細書に記載した装置を使用することにより形成されたバイオフィルムは、一様であると考えられる。
【００３８】
（使用方法）
本発明は、バイオフィルムの形成に及ぼす物質及び表面被覆剤の影響を試験する装置及び方法を提供するものである。前記発明は、培養器中でバイオフィルムを植え付けた蓋９０／５９０を、図２、７及び８に示したような容器１０５中に配置することにより、完成される。前記のように、容器１０５は、突起部１３０及びその上に配置する物質３００／５００を入れるための複数のウェル１２５を含む。抗生物質又は殺生剤を含む液体成長培地は、容器１０５のウェル１２５中に配置するが、前記のように、各突起部又は物質３００／５００上に形成されたバイオフィルムは均一と考えられるため、異なる細菌試薬を異なるウェル１２５に配置するべきである。このように実験を行なうと一貫性のある結果が得られる。それにより、各ウェル中の各突起部又は物質上におけるバイオフィルムの形成状態は非常に類似しているため、異なるウェル中の突起部又は物質に対する抗菌剤処理の全体的な信頼性を得ることに寄与する。
【００３９】
さらに、前記処理には、ウェル又分流手段を何ら含まない第二の容器の使用が必要である。このような単純な容器は、汚染を防ぎ、また突起部を低い形態に覆うことが必要であるため、標準ＥＬＩＳＡプレートリーダーを使用することが可能となる。各試験において従来の最小抑制濃度（ＭＩＣ）及び最小バイオフィルム形成阻止濃度（ＭＢＥＣ）を付与するために、２枚の９６個のウェル付プレートが必要となろう。
【００４０】
（実施例）
抗生物質又は殺生剤の感度試験に対し十分量のバイオフィルムを調べるために、各有機体についてのバイオフィルム形成に関するグラフが必要である。
【００４１】
本実施態様において使用する接種材料は、直接コロニー懸濁法により、１８から２４時間かけて作製された。緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）コロニーをトリプシン大豆寒天培地上で成長させ、唾液連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｌｖａｒｕｓ）コロニーを血液寒天培地上で摂氏３７℃において成長させた。唾液連鎖球菌コロニーを３ｍｌの単純塩培養液に懸濁し、緑膿菌コロニーをトリプシン大豆培養液（ＢＤＨ）にマクファーランド標準（ＭａｃＦａｒｌａｎｄ Ｓｔａｎｄａｒｄ）である濁度１．０となるように懸濁した。その後、各懸濁液の１ｍｌを２９ｍｌの対応する培養液に希釈し、生存する緑膿菌数をトリプシン大豆寒天培地上で測定し、生存する唾液連鎖球菌数を血液寒天培地上で測定した。前記により得られる接種材料は、緑膿菌については１０５、唾液連鎖球菌については１０２であった。その後、図１１に示すような装置中の容器に、全唾液連鎖球菌を含むウシ胎仔血清（Ｆｅｔａｌ Ｃａｌｆ Ｓｅｒｕｍ）溶液６００ｍｌと共に、２５ｍｌの希釈懸濁液を添加した。旋回テーブルを用いて必要な層流を液体に与えることにより、バイオフィルムを３５℃及び湿度９５度で形成した。
【００４２】
（唾液連鎖球菌の最小バイオフィルム形成阻止濃度及び最小抑制濃度）
上記のように、バイオフィルムの形成を開始後１〜８時間と再度１２時間で、個々の個所で約４個の突起部１３０／７３０を壊して蓋から取り外した。突起部を０．９％の生理的食塩水で洗浄し、各々の突起部を０．９％生理的食塩水２００μｌを含む容器中の別々のウェルに分けて入れ、５分間超音波分解処理により形成されたバイオフィルムを破壊した。緑膿菌のバイオフィルムに関してはトリプシン大豆寒天培地上で、唾液連鎖球菌バイオフィルムに関しては血液寒天培地上で、生存する菌数を連続希釈法により測定した。
【００４３】
殺生剤を上記の接種材料を作製する際に同時に準備した。本明細書に述べる試験において用いた殺生剤は、Ｓａｌｖｏｎ（Ｚｅｎｅｃａ）、Ｋａｔｈａｎ（Ｒｏｈｍ ａｎｄ Ｈａａｓ）、ＲＸ７８１６（Ｂｅｎｚ）を含むものである。各殺生剤は、プランクトン状態試験、対照表面試験、及びアルミニウム表面試験全てについて、それぞれ１．０％、１０ｐｐｍ、１００ｐｐｍ、及び１０００ｐｐｍの作用溶液として０．９％の生理食塩水中で準備した。各殺生剤は試験の２時間前に準備した。前記のように準備した各溶液から、０．９％の生理的食塩水により連続希釈法を９６個のウェル付プレートの２列目から１１列目まで２回繰り返し行った。１列は殺菌対照例とし、他の１列は形成対照例とした。表面に成長したバイオフィルム上の殺生剤の試験を行う際に、殺生剤の貯蔵溶液を使用した。
【００４４】
バイオフィルムが被試験物質又は被覆突起部上に形成された後、バイオフィルムのうちの１つ（すなわち、突起部１つ、又は物質の１部）を、０．９％の生理的食塩水で少なくとも２分間洗浄処理を行った後、前記のように準備した試験プレートに移した。試験プレートを平らな蓋で覆い、３５℃で約２時間培養した。培養後、試験プレートから蓋を取り除き、突起部又は物質を０．９％の生理的食塩水で１回につき少なくとも２分間２回洗浄した。
【００４５】
後に残っている突起部又は物質を含む蓋をその後、緑膿菌バイオフィルムに関しては各ウェルに単純塩培養液２００μｌを含む第二プレートに入れ、唾液連鎖球菌バイオフィルムに関しては各ウェル内にミューラー・ヒントン培養液（ＢＤＨ）を含む第二プレートに入れた。その後、前記のようにバイオフィルムを破壊し、生存菌数を測定した。
【００４６】
本明細書に記載する装置は、さらに抗菌物質又は表面被覆剤が及ぼす影響を調べるために使用することもできる。すなわち、蓋は前記のように準備することができるが、但し突起部又は突起部上に置いた物質にはさらに抗菌性被覆剤を含ませることもできる。突起部及び／又は物質は、細菌及び液体成長培地を含む容器に入れ、前記のように培養し、規定時間放置し、バイオフィルム形成に関与する可能性のある表面を曝すシュミレートをする。突起部及び／又は物質をその後第一の容器より取り出し、緩衝液を含む第二の容器に入れる。細菌が抗菌剤の試験中物質又は突起部に接触し保たれている現在使用されている試験と比べて、抗菌性被覆剤は細菌の増殖効果に時間を要するため、前記試験方法は、より感度の高い試験となり、複数の被覆剤間の殺菌効果の相違を明らかにする。
【００４７】
本明細書に記載する装置及び方法は、さらに機器及び物質をモデルとして形成するために使用される。例えば、手術過程で使用する新しいカテーテルを作製する際には、カテーテルの表面上でバイオフィルムが形成されているかどうかを試験することが望ましいかもしれない。さらに、表面被覆剤がカテーテルに及ぼす影響、及びカテーテルの表面被覆剤上でバイオフィルムが形成されているかどうかを調べることが望ましいかもしれない。例えば、滑らかな被覆剤で被覆されたカテーテルを作製し、患者に内部で使用する前に、該被覆剤がバイオフィルムの形成を促進するか否かを決定することが望ましいかもしれない。よって、カテーテルは、実際に患者の体内に使用されるものとして準備されるであろう。カテーテルの小片を作製し、図３及び４に示したような突起部上に配置することによって、カテーテル上のバイオフィルムの形成を試験することを可能とする。物質上でバイオフォルムの成長を試験することが望ましいいずれかの物質、例えば、排管、点滴管、注射器、注射針、ステント並びに他の類似する器具及び製品等を使用することができることを理解されよう。
【００４８】
本方法及び処理手段を図１及び２に示す装置に関して示したが、装置はこれに限るものではない。本明細書に記載する方法は、現在利用できる他の検査システムにおいても使用されるかもしれない。
【００４９】
液体成長培地の流れを反転させる方法は好ましいが、前記装置は液体に一方向の流れを与えるものとすることが可能であった。流れを反転させることは、各容器の一端から他の端まで液体を循環させることであるが、但し、この場合システムの複雑さを増し、かつ液体を汚染する可能性があるため、処理を非常に複雑にする。
【００５０】
本明細書に記載する方法及び装置は、これに限られるものではないことを理解すべきである。本明細書に記載する発明は、請求項に記載する範囲に包含することを意図する発明の本質から逸脱することなく、本発明に対して変更を加えることができるであろうことは、当業者は理解されよう。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明に係る蓋の等角図である。
【図２】本発明に係る蓋の側面図で、容器に蓋を配置して組立装置を形成していることを示す。
【図３】本発明に係る蓋の側面図で、突起部間にバイオフィルム形成物質を配置していることを示す。
【図４】本発明に係る蓋の底面図で、突起部間にバイオフィルム形成物質を配置していることを示す。
【図５】本発明の他の実施態様の底面図で、第一の表面に物質を付着していることを図示する。
【図６】図５の他の実施態様の側面図である。
【図７】本発明に係る容器の平面図である。
【図８】本発明に係る該容器の側面図である。
【図９】本発明による９６個のウェル付プレート又は溝を有する容器と共に使用する、蓋の底面図である。
【図１０】本発明にかかる方法及び装置と共に使用する、溝を有する容器の他の実施態様の平面図である。
【図１１】図１０の容器に組み付けた、本発明にかかる図１０の蓋の側断図である。
【図１２】本発明において使用する９６個のウェル付プレートの平面図である。
【図１３】その上にバイオフィルムが形成されるかどうかを試験するための物質を被覆した突起部の側面図である。
【国際公開パンフレット】
2004505613.tif 000003
2004505613.tif 000004
2004505613.tif 000005
2004505613.tif 000006
2004505613.tif 000007
2004505613.tif 000008
2004505613.tif 000009
2004505613.tif 000010
2004505613.tif 000011
2004505613.tif 000012
2004505613.tif 000013
2004505613.tif 000014
2004505613.tif 000015
2004505613.tif 000016
2004505613.tif 000017
2004505613.tif 000018
2004505613.tif 000019
2004505613.tif 000020
2004505613.tif 000021
2004505613.tif 000022
2004505613.tif 000023
2004505613.tif 000024
2004505613.tif 000025
2004505613.tif 000026
2004505613.tif 000027
2004505613.tif 000028
2004505613.tif 000029
2004505613.tif 000030
2004505613.tif 000031
2004505613.tif 000032
2004505613.tif 000033
2004505613.tif 000034
2004505613.tif 000035
2004505613.tif 000036
2004505613.tif 000037
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004505613.tif 000038
2004505613.tif 000039
【国際調査報告】
2004505613.tif 000040
2004505613.tif 000041
2004505613.tif 000042