(57)【要約】本発明は、マトリプターゼまたはＭＴＳＰ１のセリンプロテアーゼ活性を阻害する、化合物を提供する。また、それらの化合物を含む薬学的組成物が、本発明によって提供される。マトリプターゼまたはＭＴＳＰ１の阻害によって改善される状態を処置するためにその化合物を使用する方法もまた、本発明によって提供される。マトリプターゼまたはＭＴＳＰ１の阻害によって改善される状態を処置するためにその薬学的組成物を使用する方法もまた、本発明によって提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の式：
【化１】
2004509085.tif 000025
の化合物、およびその薬学的に受容可能な塩であって、ここで、
（ａ）Ｘは、−Ｃ（＝Ｏ）−、−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−、−Ｓ（Ｏ）２−、Ｓ（Ｏ）２ＮＨ−、および直接結合からなる群より選択され；
（ｂ）Ｒ１は、以下の（１）〜（２１）：
（１）１個〜約１２個の炭素原子のアルキルであって、該アルキルは、非置換であるか、またはＹ１およびＹ２からなる群より選択される１個または２個の置換基で置換されている、アルキル；
（２）約３個〜約８個の炭素原子のシクロアルキルで置換されている１個〜約３個の炭素原子のアルキルであって、該シクロアルキルは、非置換であるか、またはＹ１、Ｙ２およびＹ３からなる群より選択される１個〜３個の置換基で置換されている、アルキル；
（３）３個〜約８個の炭素原子のシクロアルキルであって、該シクロアルキルは、非置換であるか、またはＹ１、Ｙ２およびＹ３からなる群より選択される１個〜３個の置換基で置換されている、シクロアルキル；および
（４）約６個〜１４個の炭素原子のアリールであって、該アリールは、非置換であるか、またはＹ１、Ｙ２およびＹ３からなる群より選択される１個〜３個の置換基で置換されている、アリール；
（５）約７個〜約１５個の炭素原子のアラルキルであって、該アラルキルは、アルキル鎖上で、非置換であるか、またはヒドロキシもしくはハロゲンで置換されており、かつ該アラルキルは、アリール環上で、非置換であるか、またはＹ１、Ｙ２およびＹ３からなる群より選択される１個〜３個の置換基で置換されている、アラルキル；および
（６）Ｘが−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−、−Ｓ（Ｏ）２−、−Ｓ（Ｏ）２ＮＨ−、または直接結合である場合に、水素；
（７）４個〜約１０個の環原子のヘテロシクロアルキルであって、該環原子は、炭素およびヘテロ原子から選択され、該ヘテロ原子は、酸素、窒素、およびＳ（Ｏ）ｉからなる群より選択され、ｉは０、１、または２であり、該ヘテロシクロアルキルは、非置換であるか、または該環上で、Ｙ１、Ｙ２およびＹ３からなる群より選択される１個〜３個の置換基でモノ置換、ジ置換、もしくはトリ置換されている、ヘテロシクロアルキル；
（８）４個〜約１０個の環原子のヘテロシクロであって、該環原子は、炭素およびヘテロ原子から選択され、該ヘテロ原子は、酸素、窒素、およびＳ（Ｏ）ｉからなる群より選択され、ｉは０、１、または２であり、該ヘテロシクロは、
【化２】
2004509085.tif 000026
を含み、
【化３】
2004509085.tif 000027
は、３個〜６個の環炭素原子を有する５員〜７員の複素環であり、Ｖは、−ＣＨ２−、−Ｏ−、−Ｓ（＝Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）２−、または−Ｓ−であり、該ヘテロシクロは、非置換であるか、または該環炭素上で、Ｙ１、Ｙ２およびＹ３からなる群より選択される１個〜３個の置換基でモノ置換、ジ置換、もしくはトリ置換されている、ヘテロシクロ；
（９）２個〜約６個の炭素原子のアルケニルであって、該アルケニルは、非置換であるか、または約３個〜約８個の炭素原子のシクロアルキルで置換されており、該シクロアルキルは、非置換であるか、または環上で、Ｙ１、Ｙ２およびＹ３からなる群より選択される１個〜３個の置換基でモノ置換、ジ置換、もしくはトリ置換されている、アルケニル；
（１０）約５個〜約１４個の環原子のヘテロアリールであって、該環原子は、炭素およびヘテロ原子から選択され、該ヘテロ原子は、酸素、窒素、および硫黄から選択され、そして該ヘテロアリールは、非置換であるか、またはＹ１、Ｙ２およびＹ３からなる群より選択される１個〜３個の置換基でモノ置換、ジ置換、もしくはトリ置換されている、ヘテロアリール；
（１１）約５個〜約１４個の環原子のヘテロアラルキルであって、該環原子は、炭素およびヘテロ原子から選択され、該ヘテロ原子は、酸素、窒素、および硫黄から選択され、そして該ヘテロアラルキルは、アルキル鎖上で、非置換であるか、またはヒドロキシもしくはハロゲンで置換されており、かつ該環上で、非置換であるか、またはＹ１、Ｙ２およびＹ３からなる群より選択される１個〜３個の置換基で該環上でモノ置換、ジ置換、もしくはトリ置換されている、ヘテロアラルキル；
（１２）約８個〜約１６個の炭素原子のアラルケニルであって、該アラルケニルは、非置換であるか、またはアリール環上で、Ｙ１、Ｙ２およびＹ３からなる群より選択される１個〜３個の置換基でモノ置換、ジ置換、もしくはトリ置換されている、アラルケニル；
（１３）約５個〜約１４個の環原子のヘテロアラルケニルであって、該環原子は、炭素およびヘテロ原子から選択され、該ヘテロ原子は、酸素、窒素、および硫黄から選択され、そして該ヘテロアラルケニルは、該環炭素上で、非置換であるか、またはＹ１、Ｙ２およびＹ３からなる群より選択される１個〜３個の置換基でモノ置換、ジ置換、もしくはトリ置換されている、ヘテロアラルケニル；
（１４）
【化４】
2004509085.tif 000028
（１５）
【化５】
2004509085.tif 000029
（１６）
【化６】
2004509085.tif 000030
（１７）
【化７】
2004509085.tif 000031
（１８）約９個〜約１５個の炭素原子の縮合炭素環式アルキル；
（１９）１個〜約１２個の炭素原子のジフルオロメチルまたはパーフルオロアルキル；
（２０）約６個〜約１４個の炭素原子のパーフルオロアリール；
（２１）約７個〜約１５個の炭素原子のパーフルオロアラルキル；
からなる群より選択され、
そしてここで、各Ｙ１、Ｙ２およびＹ３は、独立して選択され、かつ各Ｙ１、Ｙ２およびＹ３は、
（ｉ）ハロゲン、シアノ、ニトロ、テトラゾリル、グアニジノ、アミジノ、メチルグアニジノ、−ＣＦ３、−ＣＦ２ＣＦ３、−ＣＨ（ＣＦ３）２、−Ｃ（ＯＨ）（ＣＦ３）２、−ＯＣＦ３、−ＯＣＦ２Ｈ、−ＯＣＦ２ＣＦ３、−ＯＣ（Ｏ）ＮＨ２、−ＯＣ（Ｏ）ＮＨＺ１、−ＯＣ（Ｏ）ＮＺ１Ｚ２、−ＮＨＣ（Ｏ）Ｚ１、−ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨ２、−ＮＨＣ（Ｏ）ＮＺ１、−ＮＨＣ（Ｏ）ＮＺｌＺ２、−Ｃ（Ｏ）ＯＨ、−Ｃ（Ｏ）ＯＺ１、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ２、−Ｃ（Ｏ）ＮＨＺ１、−Ｃ（Ｏ）ＮＺ１Ｚ２、−Ｐ（Ｏ）３Ｈ２、−Ｐ（Ｏ）３（Ｚｌ）２、−Ｓ（Ｏ）３Ｈ、−Ｓ（Ｏ）ｍＺｌ、−Ｚｌ、−ＯＺｌ、−ＯＨ、−ＮＨ２、−ＮＨＺ１、−ＮＺ１Ｚ２、−Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ２、−Ｃ（＝ＮＯＨ）ＮＨ２、−Ｎ−モルホリノ、および−Ｓ（Ｏ）ｍ（ＣＦ２）ｑＣＦ３からなる群より選択され、ｍは０、１、または２であり、ｑは０〜５の整数であり、そしてＺ１およびＺ２は、１個〜約１２個の炭素原子のアルキル、約６個〜約１４個の炭素原子のアリール、約５個〜約１４個の環原子のヘテロアリール、約７個〜約１５個の炭素原子のアラルキル、および約５個〜約１４個の環原子のヘテロアラルキルからなる群より独立して選択される；かあるいは
（ｉｉ）Ｙ１およびＹ２は、−Ｏ［Ｃ（Ｚ３）（Ｚ４）］ｒＯ−または−Ｏ［Ｃ（Ｚ３）（Ｚ４）］ｒ＋１−であるように一緒に選択され、ｒは、１〜４の整数であり、そしてＺ３およびＺ４は、水素、１個〜約１２個の炭素原子のアルキル、約６個〜約１４個の炭素原子のアリール、約５個〜約１４個の環原子のヘテロアリール、約７個〜約１５個の炭素原子のアラルキル、および約５個〜約１４個の環原子のヘテロアラルキルからなる群より独立して選択され；
（ｃ）Ｒ２は、水素、または１個〜約１２個の炭素原子のアルキルであり；
（ｄ）ｎは、０、１、２、または３であり；
（ｅ）Ｒ３は、水素もしくはメチルであるか、またはＲ３、Ｒ４ａ、およびｑは、（ｇ）に示されるように一緒に選択され；
（ｆ）Ｒ４ａおよびＲ４ｂは、独立して水素、１個〜約３個の炭素原子の低級アルキルであり、かつｑは、０、１、もしくは２であるか、またはＲ３、Ｒ４ａ、およびｑは、（ｇ）に示されるように一緒に選択され；
（ｇ）ｑは、０であり、かつＲ３およびＲ４ａは、プロリル、ピペコリル、アゼチジン−２−カルボニル；４−ヒドロキシプロリル、３−ヒドロキシプロリル、４−アミノプロリル、４−（ＣＨ２ＮＨ２）−プロリル、３，４−メタノプロリル、および３，４−デヒドロプロリルからなる群より選択される基をＰ２にて与えるように、Ｓ配置になるように一緒に選択され；そして
（ｈ）Ｅは、０個〜２個の環ヘテロ原子を有しかつ該環原子の残りは炭素原子である、５員または６員の芳香環であり、該ヘテロ原子は、酸素、窒素、および硫黄からなる群より選択され、そして該芳香環は、Ｒ５およびＲ６で置換されており、Ｒ５およびＲ６は、水素、ヒドロキシ、ハロゲン、１個〜約６個の炭素原子のアルキル、１個〜約４個の炭素原子のアルコキシで置換された１個〜約４個の炭素原子のアルキル、１個〜約６個の炭素原子のアルコキシ、およびトリフルオロメチルからなる群より独立して選択され；
（ｉ）Ｔは、水素、ヒドロキシ、−ＣＨ２ＯＨ、１個〜約３個の炭素原子のアルキル、シアノ、−Ｃ（＝ＮＲ７）ＮＨＲ８、−ＮＨ−Ｃ（＝ＮＲ７）ＮＨＲ８、−ＮＨＲ９、または−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨＲ９であり、Ｒ７およびＲ８は、独立して、水素、ヒドロキシ、１個〜約３個の炭素原子のアルコキシ、３個〜約１６個の炭素原子のトリヒドロカルボシリル、１個〜約３個の炭素原子のアルキル、または−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ９であり、Ｒ９は、水素、１個〜約６個の炭素原子のアルキル、１個〜約６個の炭素原子のアルコキシ、または−（ＣＦ２）ｊＣＦ３であり、ｊは、０、１、２、または３であり、但し、Ｒ７およびＲ８は、両方ともにヒドロキシもしくは両方ともにアルコキシではない。
【請求項２】
請求項１に記載の化合物であって、ｑが０である、化合物。
【請求項３】
請求項２に記載の化合物であって、ｎが０または１である、化合物。
【請求項４】
請求項３に記載の化合物であって、Ｒ３が水素である、化合物。
【請求項５】
請求項４に記載の化合物であって、Ｒ４ａが水素またはメチルである、化合物。
【請求項６】
請求項５に記載の化合物であって、Ｒ２が水素またはメチルである、化合物。
【請求項７】
請求項６に記載の化合物であって、Ｘが、直接結合、−Ｓ（Ｏ）２−、−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−、または−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−である、化合物。
【請求項８】
請求項７に記載の化合物であって、Ｘが、直接結合である、化合物。
【請求項９】
請求項８に記載の化合物であって、Ｒ１が水素である、化合物。
【請求項１０】
請求項７に記載の化合物であって、Ｘが、−Ｓ（Ｏ）２−である、化合物。
【請求項１１】
請求項１０に記載の化合物であって、Ｒ１がアラルキルである、化合物。
【請求項１２】
請求項７に記載の化合物であって、Ｘが−Ｃ（＝Ｏ）−である、化合物。
【請求項１３】
請求項１２に記載の化合物であって、Ｒ１がアルキルである、化合物。
【請求項１４】
請求項７に記載の化合物であって、Ｅがフェニルである、化合物。
【請求項１５】
請求項１４に記載の化合物であって、Ｔが−Ｃ（＝ＮＲ７）ＮＨＲ８である、化合物。
【請求項１６】
請求項１５に記載の化合物であって、Ｒ７およびＲ８が水素である、化合物。
【請求項１７】
請求項３に記載の化合物であって、Ｒ３およびＲ４ａが、請求項１の（ｇ）に示されるように一緒に選択される、化合物。
【請求項１８】
請求項２に記載の化合物であって、Ｅがフェニルである、化合物。
【請求項１９】
請求項１８に記載の化合物であって、Ｘが直接結合であり、かつＲ１が水素である、化合物。
【請求項２０】
請求項１９に記載の化合物であって、Ｒ２が、水素、または１個〜約３個の炭素原子のアルキルである、化合物。
【請求項２１】
請求項１８に記載の化合物であって、Ｔが−Ｃ（＝ＮＲ７）ＮＨＲ８である、化合物。
【請求項２２】
請求項２１に記載の化合物であって、Ｒ７およびＲ８が水素である、化合物。
【請求項２３】
請求項１に記載の化合物であって、Ｅがフェニルである、化合物。
【請求項２４】
請求項２３に記載の化合物であって、Ｒ３およびＲ４ｂが水素であり、かつＲ４ａが水素もしくはメチルであるか、またはｑ、Ｒ３およびＲ４ａが、請求項１の（ｇ）におけるように一緒になる、化合物。
【請求項２５】
請求項１に記載の化合物であって、図５Ａおよび図５Ｂに示される化合物からなる群より選択される、化合物。
【請求項２６】
請求項１に記載の化合物であって、図５Ａおよび図５Ｂに示される化合物Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｆ、ＬおよびＭからなる群より選択される、化合物。
【請求項２７】
薬学的組成物であって、マトリプターゼまたはＭＴＳＰ１のセリンプロテアーゼ活性を阻害または減少させるために有効な量の、請求項１〜２６のいずれか１項に記載の化合物を含む、薬学的組成物。
【請求項２８】
哺乳動物における病理学的状態を処置する方法であって、該病理学的状態は、マトリプターゼまたはＭＴＳＰ１のセリンプロテアーゼ活性を阻害または減少させることにより改善され、該方法は、マトリプターゼまたはＭＴＳＰ１のセリンプロテアーゼ活性を阻害または減少させるために有効な量の、請求項１〜２６のいずれか１項に記載の化合物を、該哺乳動物に投与する工程を包含する、方法。
【請求項２９】
哺乳動物における病理学的状態を処置する方法であって、該病理学的状態は、マトリプターゼまたはＭＴＳＰ１のセリンプロテアーゼ活性を阻害または減少させることにより改善され、該方法は、マトリプターゼまたはＭＴＳＰ１のセリンプロテアーゼ活性を阻害または減少させるために有効な量の、請求項２７に記載の薬学的組成物を、該哺乳動物に投与する工程を包含する、方法。
【請求項３０】
マトリプターゼまたはＭＴＳＰ１のセリンプロテアーゼ活性を阻害または減少させることにより改善される状態を、処置が必要な哺乳動物において処置する方法であって、該方法は、マトリプターゼまたはＭＴＳＰ１のセリンプロテアーゼ活性を阻害する、治療上有効な量の化合物を、該哺乳動物に投与する工程を包含する、方法。
【請求項３１】
請求項３０に記載の方法であって、前記化合物が、１００ｎＭ以下のＩＣ５０を有する、方法。
【請求項３２】
請求項３０に記載の方法であって、前記化合物が、図１Ａ、１Ｂ、および１Ｃに示される化合物から選択される、方法。
【請求項３３】
マトリプターゼまたはＭＴＳＰ１のセリンプロテアーゼ活性を阻害または減少させることにより改善される状態を、処置が必要な哺乳動物において処置する方法であって、該方法は、マトリプターゼまたはＭＴＳＰ１のセリンプロテアーゼ活性を選択的に阻害する、治療上有効な量の化合物を、該哺乳動物に投与する工程を包含する、方法。
【請求項３４】
請求項３２に記載の方法であって、前記化合物が、１００ｎＭ以下のＩＣ５０を有する、方法。
【請求項３５】
図１Ａの番号６の化合物。
【請求項３６】
図１Ａの番号４の化合物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、腫瘍の進行および／または転移を減少する方法に関する。マトリプターゼおよびＭＴＳＰ１は、特定の癌細胞株において高レベルで発現されることが報告されている、セリンプロテアーゼである。
【０００２】
１つの局面に従って、本発明は、そのセリンプロテアーゼドメインに結合し、そしてマトリプターゼまたはＭＴＳＰ１のセリンプロテアーゼ活性の選択的インヒビターとして活性である化合物を提供する。これらのインヒビターを使用して、マトリプターゼまたはＭＴＳＰ１のセリンプロテアーゼ活性を阻害し得、それによって、その過剰発現の有害な効果を減少し得る。本発明の別の局面は、セリンプロテアーゼドメインに結合し、そしてマトリプターゼまたはＭＴＳＰ１のセリンプロテアーゼ活性を選択的に阻害する化合物の使用に関し；このような化合物は、癌性状態の予防および処置において使用され得、そして癌性腫瘍の増殖を減少し、そして転移を遅延させる。
【０００３】
（発明の背景および導入）
癌は、米国において、心臓疾患に次ぐ第２の死因であり（Ｂｏｒｉｎｇ，Ｃ．Ｃ．ら、１９９３、ＣＡ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｊ．Ｃｌｉｎ．４３：７）、米国人の３分の１が発症する。米国人の４人に１人が、癌で死亡する。癌は、増殖して腫瘍塊を形成する所定の正常組織由来の異常な（すなわち、新生物）細胞の数の増加、これらの新生物腫瘍細胞による隣接組織の浸潤、および血液またはリンパ系を介して局所的なリンパ節および異なる部位へ伝播する悪性細胞の生成によって、主に特徴付けられる。後者の悪性への進行は、転移と呼ばれる。
【０００４】
癌は、腫瘍細胞とそれらの環境（それらの近隣の正常な細胞を含む）との間の連絡の破断と考えられ得る。シグナル（増殖刺激性および増殖阻害性の両方）は、組織中の細胞間で慣用的に交換される。通常、細胞は、刺激シグナルの非存在下では分裂せず、同様に、阻害シグナルの存在下で分裂を中断する。癌性（すなわち新生物）状態において、細胞は、これらのシグナルを「打ち消す」能力、および正常細胞が増殖しない条件下で増殖する能力を獲得する。
【０００５】
腫瘍細胞は、増殖するために多くの異なる異常な形質を獲得するはずである。この要件は、特定の十分に研究された腫瘍のゲノムが、いくつかの異なる独立して変更された遺伝子（活性化されたオンコジーンおよび不活性化された腫瘍サプレッサー遺伝子を含む）を保持するという事実を反映する。これらの遺伝的変化の各々は、これらの形質のいくつかを付与することを担うようであり、これらがまとまって、完全な新生物性表現型を示す（Ｌａｎｄ，Ｈ．ら、１９８３、Ｓｃｉｅｎｃｅ　２２２：７７１；Ｒｕｌｅｙ，Ｈ．Ｅ．、１９８３、Ｎａｔｕｒｅ　３０４：６０２；Ｈｕｎｔｅｒ，Ｔ．１９９１、Ｃｅｌｌ　６４：２４９）。
【０００６】
妨げられない細胞増殖に加えて、細胞は、腫瘍進行を生じるためのいくつかの形質を獲得するはずである。例えば、腫瘍進行の初期において、細胞は、宿主免疫系を回避するはずである。さらに、腫瘍塊が増加するにつれて、腫瘍は、栄養分を供給するため、そして代謝老廃物を除去するための、血管系を獲得するはずである。さらに、細胞は、隣接組織を浸潤する能力を獲得するはずであり、そして最終的には、細胞は、しばしば、別の部位に転移する能力を獲得する。
【０００７】
種々の生化学的因子が、異なる転移期と関連付けられている。コラーゲン、糖タンパク質（例えば、ラミニン）またはプロテオグリカンに対する細胞表面レセプターは、浸潤および転移における重要な工程である、腫瘍細胞の付着を促進する。次いで、付着は、分解酵素の放出を誘発し、これらの酵素は、組織障壁を介する腫瘍細胞の侵入を容易にする。一旦、腫瘍細胞が標的組織に侵入すると、特定の増殖因子が、さらなる増殖のために必要とされる。
【０００８】
癌細胞の主要な特徴の１つは、それらが周辺の正常な組織に浸潤しそして別の身体部位に転移する能力である。悪性腫瘍の転移性の性質は、処置の点で医師に大いなる挑戦を提示する。なぜなら、その腫瘍は、１つの領域にもはや局在化されないからである。
【０００９】
腫瘍浸潤（または進行）は、複雑な一連の事象であり、ここで、腫瘍細胞は、元の腫瘍から離れ、その周辺の正常組織を破壊し、そして血管内またはリンパ管内に移動して、異なる部位に運ばれる。正常組織障壁の破壊は、組織の基底膜および間質成分を構成する細胞外マトリクスのタンパク質を分解する、特定の酵素の生成によって達成される。
【００１０】
タンパク質分解活性の上昇は、新生物進行において示されている。新生物進行におけるタンパク質分解酵素（セリンプロテアーゼを含む）の役割は、研究中である。プロテアーゼが、細胞外マトリクスの分解および組織再構築に寄与することが提唱されており、従って、これらは、癌の浸潤および転移を補助し得る。
【００１１】
多くの細胞外プロテアーゼが報告されており、そしてこれらのプロテアーゼのいくつかの発現は、腫瘍進行と関連すると言われている（Ｍｉｇｎａｔｔｉ，Ｐ．およびＲｉｆｋｉｎ，Ｄ．Ｂ．、Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｒｅｖ．７３：１６１−１９５（１９９３））。
【００１２】
細胞外マトリクス分解酵素の１つのクラスが同定されており、マトリクスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）と呼ばれている。２つのマトリクスメタロプロテイナーゼが、腫瘍浸潤と関連付けられている。タイプＩＶコラーゲナーゼは、腫瘍細胞の転移能力と関連付けられている（Ｌｉｏｔｔａら、Ｎａｔｕｒｅ、２８４：６７−６８（Ｍａｒｃｈ、１９８０））。マトリクスメタロプロテイナーゼストロメライシンの産生が、転移能力を有する腫瘍細胞と関連することが報告されている（ＭｃＤｏｎｎｅｌｌおよびＭａｔｒｉｓｉａｎ、Ｓｍｎｒｓ．Ｃａｎｃｅｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　１：１０７−１１５（１９９０）；ＭｃＤｏｎｎｅｌｌおよびＭａｔｒｉｓｉａｎ、Ｃａｎｃｅｒ　ａｎｄ　Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ　Ｒｅｖｉｅｗｓ　９：３０９−３１９（１９９０））。
【００１３】
癌細胞が転移しそして組織を浸潤する能力は、基底膜の分解によって促進されることが報告されている。いくつかのプロテイナーゼ酵素は、腫瘍細胞の浸潤のプロセスを促進することが報告されている。１つの酵素ファミリーであるＭＭＰは、基底膜の分解を増強して、腫瘍性の細胞に組織を浸潤させるものとして、関連付けられている。ＭＭＰは、分子量および抗原性特性において異なることが報告されている。以前に、約７０ｋＤａおよび９２ｋＤａの分子量を有する２つの主要なメタロプロテイナーゼが研究されている。これらのＭＭＰの両方は、腫瘍細胞が転移する能力を増強することが報告されている。メタロプロテイナーゼの組織インヒビター（ＴＩＭＰ）として公知の、これらの酵素の２つの天然のインヒビターが同定されている。不活性化された切断されていないコラーゲナーゼは、一般に、ＴＩＭＰとの複合体として分泌される。この７２ｋＤａタンパク質および９２ｋＤａタンパク質の酵素活性は、分泌されたコラーゲナーゼ／ＴＩＭＰの比に依存することが報告されている。
【００１４】
マトリプターゼは、Ｔ−４７Ｄヒト乳癌細胞から単離およびクローニングされた、トリプシン様セリンプロテアーゼである。マトリプターゼは、Ｔ−４７Ｄ細胞馴化培地から単離された（Ｌｉｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４（２６）：１８２３１−１８２３６（１９９９））。ｃＤＮＡの分析の際に、このプロテアーゼが、６８３アミノ酸を有し、そして以下の３つの主な構造領域を含むことが決定された：カルボキシル末端領域に近いセリンプロテアーゼドメイン、４つの直列の低密度リポタンパク質レセプタードメイン、および２つの直列の相補的な小成分ＣｌｒおよびＣｌｓ。マトリプターゼは、広範囲の切断活性および２つの潜在的な調節モジュールを有する、モザイクタンパク質であることが報告された。細胞外マトリクスを分解するプロテアーゼの能力およびそのトリプシン様活性に起因して、「マトリプターゼ」と名付けられた（Ｌｉｎら、Ｊ．Ｂｉｏ．Ｃｈｅｍ．２７４：１８２３１−１８２３６（１９９９））。
【００１５】
マトリプターゼは、細胞表面に局在する、細胞外マトリクスの分解活性を有するプロテアーゼであると報告されている。乳癌細胞（またはＴ−４７Ｄ細胞馴化培地）から単離された場合、マトリプターゼは、主に非複合体化形態にあることが報告されている。マトリプターゼは、ヒト乳汁から単離された。ヒト乳汁から単離された場合、マトリプターゼは、２つの複合体化形態９５ｋＤａ（主な形態）および１１０ｋＤａのうちの１つにあることが報告され；非複合体化マトリプターゼは検出されなかった（Ｌｉｕら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４（２６）：１８２３７−１８２４２（１９９９））。マトリプターゼは、その活性状態にある場合、非複合体化プロテアーゼとして存在すると提唱されている。乳汁において、マトリプターゼは、肝細胞増殖因子インヒビター−１（ＨＡＩ−１）（トリプシン様セリンプロテアーゼに対する活性を有する、Ｋｕｎｔｚ型セリンプロテアーゼインヒビター）のフラグメントとの複合体で存在することが報告されている。
【００１６】
公開ＰＣＴ出願ＷＯ００／５３２３２「Ｍａｔｒｉｐｔａｓｅ，ａ　Ｓｅｒｉｎ　Ｐｒｏｔｅａｓｅ　ａｎｄ　Ｉｔｓ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」は、マトリプターゼを記載していると言われる。
【００１７】
エコチンおよびエコチンＭ８４Ｒ／Ｍ８５Ｒは、キモトリプシン折り畳みのセリンプロテアーゼの高分子インヒビターであることが報告されており、そして移植された管状前立腺の管の分枝、形態形成および分化を阻害することが報告されている。ＰＣ−３は、前立腺癌上皮細胞由来の細胞株である。エコチンおよびＭ８４Ｒ／Ｍ８５Ｒエコチンは、ＰＣ−３を移植したヌードマウスにおいて腫瘍のサイズおよび転移を減少することが見出された。癌細胞によって作製されるさらなるセリンプロテアーゼを同定するための研究が、ＰＣ−３細胞を使用して行われた。ＰＣＲ技術および縮重オリゴヌクレオチドプライマーを使用することによって、５つの独立したセリンプロテアーゼｃＤＮＡが、ＰＣ−３　ｍＲＮＡから単離されたことが報告されている。「ＭＴ−ＳＰ１」と称するセリンプロテアーゼがクローニングされ、そのｃＤＮＡが特徴付けられ、そしてモザイクの膜貫通プロテアーゼをコードすることが報告されている（Ｔａｋｅｕｃｈｉら、ＰＮＡＳ（ＵＳ）９６：１１０５４−１１０６１（１９９９））。
【００１８】
この報告されたマトリプターゼ配列は、ＭＴ−ＳＰ１のｃＤＮＡの翻訳化配列に含まれることが、その後報告された。このマトリプターゼｃＤＮＡは、部分ＭＴ−ＳＰ１　ｃＤＮＡであり、かつそのコードヌクレオチドのうち５１６を欠失することが、報告されている（Ｔａｋｅｕｃｈｉら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ　２７５：２６３３３−２６３４２（２０００））。報告されたマトリプターゼｃＤＮＡ配列は、可能性のある開始メチオニンをコードしたので、選択的スプライシングが、ＭＴ−ＳＰ１のＮ末端領域を欠くタンパク質を生じ得ることが提唱された。
【００１９】
マトリプターゼおよびＭＴ−ＳＰ１の両方は、トリプシン様プロテアーゼ活性を実証することが報告されている。ＭＴ−ＳＰ１は、細胞外プロテアーゼドメインを有するタイプＩＩ膜貫通タンパク質であることが報告されている。マトリプターゼに対する研究は、酵素分子の一部が細胞の表面上に局在化されることを報告した。
【００２０】
さらなる研究は、ＭＴ−ＳＰ１の基質特異性を調査した。これらの実験は、プロテアーゼ活性化レセプター２（ＰＡＲ２）および単鎖ウロキナーゼ型プラスミノゲンアクチベーター（ｓｃ−ｕＰＡ）が、ＭＴ−ＳＰ１の高分子基質であることを報告した。ＰＡＲ２は、炎症、細胞保護および／または細胞接着において機能することが報告されているが、ｓｃ−ｕＰａは、腫瘍細胞の浸潤および転移において機能することが報告されている。
【００２１】
公開ＰＣＴ出願ＷＯ０１／５７１９４「Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａａｄ　Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ　Ｅｎｃｏｄｉｎｇ　Ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ　Ｓｅｒｉｎｅ　Ｐｒｏｔｅａｓｅｓ，ｔｈｅ　Ｅｎｃｏｄｅｄ　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ａｎｄ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｂａｓｅｄ　Ｔｈｅｒｅｏｎ」は、特定の膜型セリンプロテアーゼ（「ＭＴＳＰ」）（ＭＴＳＰ１を含む）のプロテアーゼドメインを含むポリペプチドを記載すると言われる。
【００２２】
公開ＰＣＴ出願ＷＯ９９／４２１２０「ＴＡＤＧ−１５：Ａｎ　Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ　Ｓｅｒｉｎｅ　Ｐｒｏｔｅａｓｅ　Ｏｖｅｒ　ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ　ｉｎ　Ｂｒｅａｓｔ　ａｎｄ　Ｏｖａｒｉａｎ　Ｃａｒｃｅｎｏｍｅｓ」および米国特許第５，９７２，６１６号は、ＴＡＤＧ−１５タンパク質をコードするＤＮＡ配列およびこのようなＤＮＡ配列によってコードされる単離されたＴＡＤＧ−１５タンパク質を記載すると言われる。
【００２３】
マトリプターゼのインヒビターと言われている特定のビスベンズアミジン化合物が、Ｅｎｙｅｄｙ，Ｉ．Ｊ．ら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４４：１３４９−１３５５（２００１）によって報告されている。
【００２４】
（発明の要旨）
１つの局面において、本発明は、マトリプターゼまたはＭＴＳＰ１のセリンプロテアーゼドメインに結合し、そしてマトリプターゼまたはＭＴＳＰ１のセリンプロテアーゼ活性の選択的インヒビターである化合物、およびマトリプターゼまたはＭＴＳＰ１のセリンプロテアーゼ活性を阻害する際のそれらの使用に関する。
【００２５】
上記のように、ＭＴ−ＳＰ１について報告された配列は、報告されたマトリプターゼ配列を含む。本発明者らは、セリンプロテアーゼドメインをクローニングし、そしてマトリプターゼおよびＭＴＳＰ１が、共通のセリンプロテアーゼドメインを有することを決定した。マトリプターゼまたはＭＴＳＰ１のセリンプロテアーゼ活性の阻害は、癌性状態の予防および処置に有用であり、これは、腫瘍の進行および転移の遅延における活性を有することを含む。
【００２６】
マトリプターゼおよびＭＴＳＰ１の両方は、細胞外マトリクス（ＥＣＭ）の分解に関与するトリプシン様セリンプロテアーゼであることが報告されている。本発明者らのクローニング研究は、マトリプターゼおよびＭＴＳＰ１が共通のセリンプロテアーゼドメインを共有することを示す。細胞外マトリクス（基底膜および間質支質）の分解は、転移に重要な局面であり、そして転移性の癌細胞が構造上の障壁を介して移動するため、および組織を浸潤するために必要とされる。従って、細胞外マトリクスの破壊は、癌性状態の進行における主要な因子である。１つの局面において、本発明は、細胞外マトリクスの癌関連破壊を減少するための、マトリプターゼまたはＭＴＳＰ１のセリンプロテアーゼ活性の選択的阻害のための化合物およびそれらの使用に関する。
【００２７】
１つの局面に従って、本発明は、マトリプターゼまたはＭＴＳＰ１のセリンプロテアーゼ活性の選択的インヒビターである化合物を提供する。マトリプターゼまたはＭＴＳＰ１のセリンプロテアーゼ活性の阻害における活性を有する特定の化合物を、図１Ａ〜図１Ｃに示す。
【００２８】
本発明の別の局面に従って、以下の式（Ｉ）：
【００２９】
【化８】
2004509085.tif 000002
の新規化合物、およびその薬学的に受容可能な塩を提供し、ここで：
（ａ）Ｘは、−Ｃ（＝Ｏ）−、−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−、−Ｓ（Ｏ）２−、Ｓ（Ｏ）２ＮＨ−、および直接結合からなる群より選択され；
（ｂ）Ｒ１は、以下の（１）〜（２１）：
（１）１個〜約１２個の炭素原子のアルキルであって、該アルキルは、非置換であるか、またはＹ１およびＹ２からなる群より選択される１個または２個の置換基で置換されている、アルキル；
（２）約３個〜約８個の炭素原子のシクロアルキルで置換されている１個〜約３個の炭素原子のアルキルであって、該シクロアルキルは、非置換であるか、またはＹ１、Ｙ２およびＹ３からなる群より選択される１個〜３個の置換基で置換されている、アルキル；
（３）３個〜約８個の炭素原子のシクロアルキルであって、該シクロアルキルは、非置換であるか、またはＹ１、Ｙ２およびＹ３からなる群より選択される１個〜３個の置換基で置換されている、シクロアルキル；および
（４）約６個〜１４個の炭素原子のアリールであって、該アリールは、非置換であるか、またはＹ１、Ｙ２およびＹ３からなる群より選択される１個〜３個の置換基で置換されている、アリール；
（５）約７個〜約１５個の炭素原子のアラルキルであって、該アラルキルは、アルキル鎖上で、非置換であるか、またはヒドロキシもしくはハロゲンで置換されており、かつ該アラルキルは、アリール環上で、非置換であるか、またはＹ１、Ｙ２およびＹ３からなる群より選択される１個〜３個の置換基で置換されている、アラルキル；および
（６）Ｘが−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−、−Ｓ（Ｏ）２−、Ｓ（Ｏ）２ＮＨ−、または直接結合である場合に、水素；
（７）４個〜約１０個の環原子のヘテロシクロアルキルであって、該環原子は、炭素およびヘテロ原子から選択され、該へテロ原子は、酸素、窒素、およびＳ（Ｏ）ｉからなる群より選択され、ｉは０、１、または２であり、該ヘテロシクロアルキルは、非置換であるか、または該環上で、Ｙ１、Ｙ２およびＹ３からなる群より選択される１個〜３個の置換基でモノ置換、ジ置換、もしくはトリ置換されている、ヘテロシクロアルキル；
（８）４個〜約１０個の環原子のヘテロシクロであって、該環原子は、炭素およびヘテロ原子から選択され、該へテロ原子は、酸素、窒素、およびＳ（Ｏ）ｉからなる群より選択され、ｉは０、１、または２であり、該ヘテロシクロは、
【００３０】
【化９】
2004509085.tif 000003
を含み、
【００３１】
【化１０】
2004509085.tif 000004
は、３個〜６個の環原子を有する５員〜７員の複素環であり、Ｖは、−ＣＨ２−、−Ｏ−、−Ｓ（＝Ｏ）−、Ｓ（Ｏ）２−、または−Ｓ−であり、該ヘテロシクロは、非置換であるか、または該環炭素上で、Ｙ１、Ｙ２およびＹ３からなる群より選択される１個〜３個の置換基でモノ置換、ジ置換、もしくはトリ置換されている、ヘテロシクロ；
（９）２個〜約６個の炭素原子のアルケニルであって、該アルケニルは、非置換であるか、または約３個〜約８個の炭素原子のシクロアルキルで置換されており、該シクロアルキルは、非置換であるか、または環上で、Ｙ１、Ｙ２およびＹ３からなる群より選択される１個〜３個の置換基でモノ置換、ジ置換、もしくはトリ置換されている、アルケニル；
（１０）約５個〜約１４個の環原子のヘテロアリールであって、該環原子は、炭素およびヘテロ原子から選択され、該へテロ原子は、酸素、窒素、および硫黄から選択され、そして該ヘテロアリールは、非置換であるか、またはＹ１、Ｙ２およびＹ３からなる群より選択される１個〜３個の置換基でモノ置換、ジ置換、もしくはトリ置換されている、ヘテロアリール；
（１１）約５個〜約１４個の環原子のヘテロアラルキルであって、該環原子は、炭素およびヘテロ原子から選択され、該へテロ原子は、酸素、窒素、および硫黄から選択され、そして該ヘテロアラルキルは、アルキル鎖上で、非置換であるか、またはヒドロキシもしくはハロゲンで置換されており、かつ該環上で非置換であるか、または該環上でＹ１、Ｙ２およびＹ３からなる群より選択される１個〜３個の置換基でモノ置換、ジ置換、もしくはトリ置換されている、ヘテロアラルキル；
（１２）約８個〜約１６個の炭素原子のアラルケニルであって、該アラルケニルは、非置換であるか、またはアリール環上で、Ｙ１、Ｙ２およびＹ３からなる群より選択される１個〜３個の置換基でモノ置換、ジ置換、もしくはトリ置換されている、アラルケニル；
（１３）約５個〜約１４個の炭素原子のヘテロアラルケニルであって、該環原子は、炭素およびヘテロ原子から選択され、該へテロ原子は、酸素、窒素、および硫黄から選択され、そして該ヘテロアラルケニルは、該環炭素上で、非置換であるか、またはＹ１、Ｙ２およびＹ３からなる群より選択される１個〜３個の置換基でモノ置換、ジ置換、もしくはトリ置換されている、ヘテロアラルケニル；
（１４）
【００３２】
【化１１】
2004509085.tif 000005
（１５）
【００３３】
【化１２】
2004509085.tif 000006
（１６）
【００３４】
【化１３】
2004509085.tif 000007
（１７）
【００３５】
【化１４】
2004509085.tif 000008
（１８）約９個〜約１５個の炭素原子の縮合炭素環式アルキル；
（１９）１個〜約１２個の炭素原子のジフルオロメチルまたはパーフルオロアルキル；
（２０）約６個〜約１４個の炭素原子のパーフルオロアリール；および
（２１）約７個〜約１５個の炭素原子のパーフルオロアラルキル；
からなる群より選択され、
そしてここで、各Ｙ１、Ｙ２およびＹ３は、独立して選択され、かつ各Ｙ１、Ｙ２およびＹ３は、
（ｉ）ハロゲン、シアノ、ニトロ、テトラゾリル、グアニジノ、アミジノ、メチルグアニジノ、−ＣＦ３、−ＣＦ２ＣＦ３、−ＣＨ（ＣＦ３）２、−Ｃ（ＯＨ）（ＣＦ３）２、−ＯＣＦ３、−ＯＣＦ２Ｈ、−ＯＣＦ２ＣＦ３、−ＯＣ（Ｏ）ＮＨ２、−ＯＣ（Ｏ）ＮＨＺ１、−ＯＣ（Ｏ）ＮＺ１Ｚ２、−ＮＨＣ（Ｏ）Ｚ１、−ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨ２、−ＮＨＣ（Ｏ）ＮＺ１、−ＮＨＣ（Ｏ）ＮＺｌＺ２、−Ｃ（Ｏ）ＯＨ、−Ｃ（Ｏ）ＯＺ１、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ２、−Ｃ（Ｏ）ＮＨＺ１、−Ｃ（Ｏ）ＮＺ１Ｚ２、−Ｐ（Ｏ）３Ｈ２、−Ｐ（Ｏ）３（Ｚｌ）２、−Ｓ（Ｏ）３Ｈ、−Ｓ（Ｏ）ｍＺｌ、−Ｚｌ、−ＯＺｌ、−ＯＨ、−ＮＨ２、−ＮＨＺ１、−ＮＺ１Ｚ２、−Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ２、−Ｃ（＝ＮＯＨ）ＮＨ２、−Ｎ−モルホリノ、および−Ｓ（Ｏ）ｍ（ＣＦ２）ｑＣＦ３からなる群より選択され、ｍは０、１、または２であり、ｑは０〜５の整数であり、そしてＺ１およびＺ２は、１個〜約１２個の炭素原子のアルキル、約６個〜約１４個の炭素原子のアリール、約５個〜約１４個の環原子のヘテロアリール、約７個〜約１５個の炭素原子のアラルキル、および約５個〜約１４個の環原子のヘテロアラルキルからなる群より独立して選択されるか、あるいは
（ｉｉ）Ｙ１およびＹ２は、−Ｏ［Ｃ（Ｚ３）（Ｚ４）］ｒＯ−または−Ｏ［Ｃ（Ｚ３）（Ｚ４）］ｒ＋１−であるように一緒に選択され、ｒは、１〜４の整数であり、そしてＺ３およびＺ４は、水素、１個〜約１２個の炭素原子のアルキル、約６個〜約１４個の炭素原子のアリール、約５個〜約１４個の環原子のヘテロアリール、約７個〜約１５個の炭素原子のアラルキル、および約５個〜約１４個の環原子のヘテロアラルキルからなる群より独立して選択され；
（ｃ）Ｒ２は、水素、または１個〜約１２個の炭素原子のアルキルであり；
（ｄ）ｎは、０、１、２、または３であり；
（ｅ）Ｒ３は、水素もしくはメチルであるか、またはＲ３、Ｒ４ａ、およびｑは、（ｇ）に示されるように一緒に選択され；
（ｆ）Ｒ４ａおよびＲ４ｂは、独立して水素、１個〜３個の炭素原子の低級アルキルであり、かつｑは、０、１、もしくは２であるか、またはＲ３、Ｒ４ａ、およびｑは、（ｇ）に示されるように一緒に選択され；
（ｇ）ｑは、０であり、かつＲ３およびＲ４ａは、プロリル、ピペコリル、アゼチジン−２−カルボニル；４−ヒドロキシプロリル、３−ヒドロキシプロリル、４−アミノプロリル、４−（ＣＨ２ＮＨ２）−プロリル、３，４−メタノプロリル、および３，４−デヒドロプロリルからなる群より選択される基をＰ２にて与えるように、Ｓ配置になるように一緒に選択され；そして
（ｈ）Ｅは、０個〜２個の環へテロ原子を有しかつ該環原子の残りは炭素原子である、５員または６員の芳香環であり、該へテロ原子は、酸素、窒素、および硫黄からなる群より選択され、そして該芳香環は、Ｒ５およびＲ６で置換されており、Ｒ５およびＲ６は、水素、ヒドロキシ、ハロゲン、１個〜約６個の炭素原子のアルキル、１個〜約４個の炭素原子のアルコキシで置換された１個〜約４個の炭素原子のアルキル、１個〜約６個の炭素原子のアルコキシ、およびトリフルオロメチルからなる群より独立して選択され；
（ｉ）Ｔは、水素、ヒドロキシ、−ＣＨ２ＯＨ、１個〜約３個の炭素原子のアルキル、シアノ、−Ｃ（＝ＮＲ７）ＮＨＲ８、−ＮＨ−Ｃ（＝ＮＲ７）ＮＨＲ８、−ＮＨＲ９、または−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨＲ９であり、Ｒ７およびＲ８は、独立して、水素、ヒドロキシ、１個〜約３個の炭素原子のアルコキシ、３個〜約１６個の炭素原子のトリヒドロカルボシリル、１個〜約３個の炭素原子のアルキル、または−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ９であり、Ｒ９は、水素、１個〜約６個の炭素原子のアルキル、１個〜約６個の炭素原子のアルコキシ、または−（ＣＦ２）ｊＣＦ３であり、ｊは、０、１、２、または３であり、但し、Ｒ７およびＲ８は、両方ともにヒドロキシもしくは両方ともにアルコキシではない。これらの化合物は、マトリプターゼまたはＭＴＳＰ１のセリンプロテアーゼ活性の選択的インヒビターとしての活性を有する。
【００３６】
また、本発明の１つの局面に従って、マトリプターゼまたはＭＴＳＰ１のセリンプロテアーゼ活性を阻害または減少するのに有効な量の式Ｉの化合物を含む、薬学的組成物を提供する。
【００３７】
本発明の別の局面に従って、哺乳動物における病理学的状態を処置する方法が提供され、該病理学的状態は、マトリプターゼまたはＭＴＳＰ１のセリンプロテアーゼ活性を減少または阻害することによって改善され、該方法は、マトリプターゼまたはＭＴＳＰ１のセリンプロテアーゼ活性を減少または阻害するのに有効な量の式Ｉの化合物を該哺乳動物に投与する工程を包含する。
【００３８】
哺乳動物における病理学的状態を処置する方法がまた提供され、該病理学的状態は、マトリプターゼまたはＭＴＳＰ１のセリンプロテアーゼ活性を減少または阻害することによって改善され、該方法は、マトリプターゼまたはＭＴＳＰ１のセリンプロテアーゼ活性を減少または阻害するのに有効な式の化合物を含む薬学的組成物を該哺乳動物に投与する工程を包含する。
【００３９】
本発明はまた、腫瘍進行を遅延させるための、転移性癌細胞を有することが疑われる哺乳動物の領域への、マトリプターゼまたはＭＴＳＰ１のセリンプロテアーゼ活性の選択的インヒビターの投与に関する。また、マトリプターゼまたはＭＴＳＰ１のセリンプロテアーゼ活性の選択的インヒビターおよび薬学的に受容可能なキャリアを含む、薬学的組成物が提供される。
【００４０】
（定義）
「マトリプターゼ」とは、腫瘍および癌の転移のような、癌性状態の発達において活性なトリプシン様セリンプロテアーゼである。マトリプターゼは、細胞表面に局在することが報告されている、マトリックス分解プロテアーゼである。マトリプターゼは、６８３個のアミノ酸を有し、そして３つの主要な構造領域（カルボキシル末端領域の近くのセリンプロテアーゼドメイン、直列に並んでいる４つの低密度リポタンパク質レセプタードメイン、および直列に並んでいる２つの相補副成分Ｃ１ｒおよびＣ１ｓ）を含むと報告されている。
【００４１】
膜型（ｍｅｍｂｒａｎｅ−ｔｙｐｅ）セリンプロテアーゼ１（「ＭＴ−ＳＰ１」または「ＭＴＳＰ１」）とは、ＰＣ−３細胞株から最初にクローニングされたセリンプロテアーゼをいう。ＭＴ−ＳＰ１は、細胞外プロテアーゼドメインを有するＩＩ型膜貫通タンパク質であると報告されている。マトリプターゼについて報告されたアミノ酸配列は、ＭＴ−ＳＰ１のｃＤＮＡについての翻訳された配列内に含まれると報告された。ＭＴ−ＳＰ１のｃＤＮＡは、マトリプターゼに関して上に記載した３つの主要な構造領域をコードする領域に加えて、シグナル／アンカードメインを形成するさらなる５１６個のヌクレオチドを有すると報告されている。
【００４２】
「癌性状態」とは、患者が進行性のヒト癌（例えば、白血病、リンパ腫、ヒト黒色腫、乳癌、胃腸癌（例えば、食道癌、胃癌、結腸癌、腸癌、結腸直腸癌、および直腸癌）、前立腺癌、膀胱癌、精巣癌、卵巣癌、子宮癌、頸部癌、脳癌、肺癌、気管支癌、喉頭癌、咽頭癌、膵臓癌、甲状腺癌、骨癌、および種々の型の皮膚癌）を有する状態である。
【００４３】
「転移」とは、体内の最初の位置から新たな位置への、癌の広がりである。
【００４４】
本発明に従って、そして本明細書中で使用される場合、以下の用語は、他のように明示的に言及しない限り、以下の意味を有すると定義される：
用語「アルケニル」とは、少なくとも１つの二重結合を有する、不飽和脂肪族基をいう。
【００４５】
用語「アルキル」とは、直鎖、分枝鎖、および環式（多環式を含む）の基を含む、飽和脂肪族基をいう。
【００４６】
用語「アルコキシ」および「アルコキシル」とは、Ｒがアルキル基である、式Ｒ−Ｏ−を有する基をいう。
【００４７】
用語「アルコキシカルボニル」とは、Ｒがアルキル基である、−Ｃ（Ｏ）ＯＲをいう。
【００４８】
用語「アラルケニル」とは、アリール基で置換されたアルケニル基をいう。好ましくは、アルケニル基は、２〜約６個の炭素原子を有する。
【００４９】
用語「アラルキル」とは、アリール基で置換されたアルキル基をいう。適切なアラルキル基としては、ベンジル、フェネチルなどが挙げられ、これらの全ては、必要に応じて置換され得る。好ましくは、アルキル基は、１〜約６個の炭素原子を有する。
【００５０】
用語「アリール」とは、共役π電子系を有する少なくとも１つの環を有する芳香族基をいい、そして炭素環式アリール基、複素環式アリール基、およびビアリール基を含み、これらの全ては、必要に応じて置換され得る。
【００５１】
用語「アリールオキシ」とは、Ｒがアリール基である、式Ｒ−Ｏ−を有する基をいう。
【００５２】
用語「アラルコキシ」とは、Ｒがアラルキル基である、式Ｒ−Ｏ−を有する基をいう。
【００５３】
用語「アミノ酸」とは、その構造でＤおよびＬの立体異性体形態が可能である場合にはＤ立体異性体およびＬ立体異性体の、天然アミノ酸と非天然アミノ酸との両方、ならびにそれらのアナログをいう。天然アミノ酸としては、アラニン（Ａｌａ）、アルギニン（Ａｒｇ）、アスパラギン（Ａｓｎ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ）、システイン（Ｃｙｓ）、グルタミン（Ｇｌｎ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）、グリシン（Ｇｌｙ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ）、イソロイシン（Ｉｌｅ）、ロイシン（Ｌｅｕ）、リジン（Ｌｙｓ）、メチオニン（Ｍｅｔ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、プロリン（Ｐｒｏ）、セリン（Ｓｅｒ），スレオニン（Ｔｈｒ）、トリプトファン（Ｔｒｐ）、チロシン（Ｔｙｒ）およびバリン（Ｖａｌ）が挙げられる。非天然アミノ酸としては、アゼチジンカルボン酸、２−アミノアジピン酸、３−アミノアジピン酸、β−アラニン、アミノプロピオン酸、２−アミノ酪酸、４−アミノ酪酸、６−アミノカプロン酸、２−アミノヘプタン酸、２−アミノイソ酪酸、３−アミノイソ酪酸、２−アミノピメリン酸、２，４−ジアミノイソ酪酸、デスモシン（ｄｅｍｏｓｉｎｅ）、２，２’−ジアミノピメリン酸、２，３−ジアミノプロピオン酸、Ｎ−エチルグリシン、Ｎ−エチルアスパラギン、ヒドロキシリジン、アロヒドロキシリジン、３−ヒドロキシプロリン、４−ヒドロキシプロリン、イソデスモシン、アロイソロイシン、Ｎ−メチルグリシン、Ｎ−メチルイソロイシン、Ｎ−メチルバリン、ノルバリン、ノルロイシン、オルニチンおよびピペコリン酸が挙げられるが、これらに限定されない。アミノ酸アナログとしては、Ｎ末端アミノ基または側鎖基が、可逆的もしくは非可逆的に化学的にブロックされたか、または改変された、天然または非天然のアミノ酸が挙げられ、例えば、メチオニンスルホキシド、メチオニンスルホン、Ｓ−（カルボキシメチル）システイン、Ｓ−（カルボキシメチル）システインスルホキシドおよびＳ−（カルボキシメチル）システインスルホンである。
【００５４】
用語「アミノ酸アナログ」とは、Ｃ末端カルボキシ基、Ｎ末端アミノ基、または側鎖の官能基のいずれかが、別の官能基へと化学的に改変された、アミノ酸をいう。例えば、アスパラギン酸−（β−メチルエステル）は、アスパラギン酸のアミノ酸アナログである；Ｎ−エチルグリシンは、グリシンのアミノ酸アナログである；またはアラニンカルボキサミドは、アラニンのアミノ酸アナログである。
【００５５】
用語「アミノ酸残基」とは、以下の構造（１）または（２）を有する基をいう：（１）−Ｃ（Ｏ）−Ｒ−ＮＨ−であって、ここでＲは、代表的に、−ＣＨ（Ｒ’）−であり、ここでＲ’は、Ｈまたは炭素含有置換基である；または（２）
【００５６】
【化１５】
2004509085.tif 000009
ここでｐは、１、２または３であり、それぞれアゼチジンカルボン酸残基、プロリン残基またはピペコリン酸残基を表す。
【００５７】
「ビアリール」とは、本明細書中で定義されるような炭素環式アリールまたは複素環式アリールによって、フェニル環の結合点に対してオルト、メタ、またはパラが置換された、フェニルをいう。
【００５８】
「ブライン」とは、塩化ナトリウムの飽和水溶液をいう。
【００５９】
「炭素環式アリール」とは、芳香族環上の環原子が炭素原子である、芳香族基をいう。炭素環式アリール基としては、単環式炭素環式アリール基およびナフチル基が挙げられ、これらの全ては、必要に応じて置換され得る。適切な炭素環式アリール基としては、フェニルおよびナフチルが挙げられる。適切な置換炭素環式アリール基としては、１つまたは２つの置換基によって置換されたインデンおよびフェニルが挙げられ、このような置換基は、有利には、低級アルキル、ヒドロキシ、低級アルコキシ、低級アルコキシカルボニル、ハロゲン、トリフルオロメチル、ジフルオロメチル、ニトロ、およびシアノである。置換ナフチルとは、本明細書中上記で式（Ｉ）に関して定義されたような、Ｙ１、Ｙ２および／またはＹ３によって置換された、ナフチル（より好ましくは、１−ナフチルまたは２−ナフチル）をいう。
【００６０】
「シクロアルケニル」とは、環式アルケニル基をいう。適切なシクロアルケニル基としては、例えば、シクロペンテニルおよびシクロヘキセニルが挙げられる。
【００６１】
「シクロアルキル」とは、少なくとも１つの環を有する環式アルキル基をいい、そして多環式基（縮合環の環式アルキル基を含む）を含む。適切なシクロアルキル基としては、例えば、シクロヘキシル、シクロプロピル、シクロペンチル、およびシクロヘプチルが挙げられる。
【００６２】
「シクロヘキシルメチル」とは、ＣＨ２に結合したシクロヘキシル基をいう。
【００６３】
「縮合炭素環式」とは、芳香族環と非芳香族環との両方を有する、縮合した多環式の炭素環式環をいう。適切な縮合炭素環式環としては、フルオレニル、テトラリンなどが挙げられる。
【００６４】
「縮合炭素環式アルキル」とは、縮合した炭素環式環部分（好ましくは、縮合した多環式炭素環式環であり、芳香族環と非芳香族環との両方が挙げられる）で置換されたアルキル基をいう。適切な縮合炭素環式アルキル基としては、フルオレニルメチルなどが挙げられる。
【００６５】
用語「ハロゲン」とは、フッ素、塩素、臭素およびヨウ素をいう。
【００６６】
「ヘテロアラルケニル」とは、ヘテロアリールで置換されたアルケニル基をいい、そして「Ｈａｎｄｂｏｏｋ　ｏｆ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ａｎｄ　Ｐｈｙｓｉｃｓ」、第４９版、１９６８、Ｒ．Ｃ．Ｗｅａｓｔ編；Ｔｈｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｒｕｂｂｅｒ　Ｃｏ．，Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，ＯＨに記載される複素環式系が挙げられる。特に、第Ｃ節、Ｒｕｌｅｓ　ｆｏｒ　Ｎａｍｉｎｇ　Ｏｒｇａｎｉｃ　Ｃｏｍｐｏｕｄｓ，Ｂ．Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ　Ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｉｃ　Ｓｙｓｔｅｍｓを参照のこと。好ましくは、このアルケニル基は、２〜約６個の炭素原子を有する。
【００６７】
「ヘテロアラルキル」とは、ピコリルのような、ヘテロアリールで置換されたアルキル基をいい、そして「Ｈａｎｄｂｏｏｋ　ｏｆ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ａｎｄ　Ｐｈｙｓｉｃｓ」、第４９版、１９６８、Ｒ．Ｃ．Ｗｅａｓｔ編；Ｔｈｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｒｕｂｂｅｒ　Ｃｏ．，Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，ＯＨに記載される複素環式系が挙げられる。特に、第Ｃ節、Ｒｕｌｅｓ　ｆｏｒ　Ｎａｍｉｎｇ　Ｏｒｇａｎｉｃ　Ｃｏｍｐｏｕｄｓ，Ｂ．Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ　Ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｉｃ　Ｓｙｓｔｅｍｓを参照のこと。好ましくは、このアルキル基は、１〜約６個の炭素原子を有する。
【００６８】
「ヘテロアリール」とは、１〜１４個の炭素原子を有し、そして環原子の残りはヘテロ原子である、芳香族基をいい、そして「Ｈａｎｄｂｏｏｋ　ｏｆ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ａｎｄ　Ｐｈｙｓｉｃｓ」、第４９版、１９６８、Ｒ．Ｃ．Ｗｅａｓｔ編；Ｔｈｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｒｕｂｂｅｒ　Ｃｏ．，Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，ＯＨに記載される複素環式系が挙げられる。特に、第Ｃ節、Ｒｕｌｅｓ　ｆｏｒ　Ｎａｍｉｎｇ　Ｏｒｇａｎｉｃ　Ｃｏｍｐｏｕｄｓ，Ｂ．Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ　Ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｉｃ　Ｓｙｓｔｅｍｓを参照のこと。適切なヘテロ原子としては、酸素、窒素、およびＳ（Ｏ）ｉが挙げられ、ここでｉは、０、１、または２であり、そして適切な複素環式アリールとしては、フラニル、チエニル、ピリジル、ピロリル、ピリミジル、ピラジニル、イミダゾリルなどが挙げられる。
【００６９】
「ヘテロシクロ」とは、炭素原子、窒素原子、酸素原子、および／または硫黄原子から構成される、還元された複素環式環系をいい、そして「Ｈａｎｄｂｏｏｋ　ｏｆ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ａｎｄ　Ｐｈｙｓｉｃｓ」、第４９版、１９６８、Ｒ．Ｃ．Ｗｅａｓｔ編；Ｔｈｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｒｕｂｂｅｒ　Ｃｏ．，Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，ＯＨに記載される複素環式系が挙げられる。特に、第Ｃ節、Ｒｕｌｅｓ　ｆｏｒ　Ｎａｍｉｎｇ　Ｏｒｇａｎｉｃ　Ｃｏｍｐｏｕｄｓ，Ｂ．Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ　Ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｉｃ　Ｓｙｓｔｅｍｓを参照のこと。
【００７０】
「ヘテロシクロアルキル」とは、ヘテロシクロ基で置換されたアルキル基をいい、そして「Ｈａｎｄｂｏｏｋ　ｏｆ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ａｎｄ　Ｐｈｙｓｉｃｓ」、第４９版、１９６８、Ｒ．Ｃ．Ｗｅａｓｔ編；Ｔｈｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｒｕｂｂｅｒ　Ｃｏ．，Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，ＯＨに記載される複素環式系が挙げられる。特に、第Ｃ節、Ｒｕｌｅｓ　ｆｏｒ　Ｎａｍｉｎｇ　Ｏｒｇａｎｉｃ　Ｃｏｍｐｏｕｄｓ，Ｂ．Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ　Ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｉｃ　Ｓｙｓｔｅｍｓを参照のこと。好ましくは、このアルキル基は、約１〜約６個の炭素原子を有する。
【００７１】
本明細書中で有機ラジカルまたは有機基に関連して言及される、用語「低級」とは、１個以上５個以下の炭素原子、好ましくは４個以下の炭素原子、そして有利には１つまたは２つの炭素原子を含むような、ラジカルまたは基を定義する。このようなラジカルまたは基は、直鎖であっても分枝鎖であってもよい。
【００７２】
「パーフルオロアルキル」とは、全ての水素がフッ素で置き換えられたアルキル基をいう。
【００７３】
「パーフルオロアリール」とは、全ての水素がフッ素で置き換えられたアリール基をいう。
【００７４】
「パーフルオロアリールアルキル」とは、アリール部分の全ての水素がフッ素で置き換えられた、アラルキル基をいう。
【００７５】
「薬学的に受容可能な塩」とは、本発明の化合物と、有機塩または無機塩との組み合わせから誘導される、本発明の化合物の塩をいう。実際には、塩形態の使用は、塩基形態の使用に実質的に等しい。本発明の化合物は、遊離塩基の形態と塩形態との両方において有用であり、両方の形態が、本発明の範囲内であると考えられる。
「ＡｃＮ」、ＣＨ３ＣＮまたは「ＭｅＣＮ」は、アセトニトリルを表す。
「ＡＩＢＮ」は、２，２’−アゾビスイソブチロニトリルを表す。
「Ｂｎ」は、ベンジルを表す。
「Ｂｏｃ」は、ｔ−ブトキシカルボニルを表す。
「Ｂｏｃ２Ｏ」は、無水Ｂｏｃ（ジ−ｔｅｒｔ−ブチルカーボネート）を表す。
「ＢＯＣ−ＯＮ」は、２−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルオキシアミノ）−２−フェニルアセトニトリルを表す。
「ＢｚｌＳＯ２」は、ベンジルスルホニルを表す。
「Ｃｂｚ」または「ＣＢｚ」は、ベンジルオキシカルボニルを表す。
「ＣＮＮＨ２」または「Ｈ２ＮＣＮ」は、シアナミドを表す。
「ＣｓＣＯ３」は、炭酸セシウムを表す。
「ＤＣＡ」は、ジクロロ酢酸を表す。
「ＤＣＣ」は、Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミドを表す。
「ＤＣＭ」または「ＣＨ２Ｃｌ２」は、ジクロロメタンを表す。
「ＤＩＥＡ」は、ジイソプロピルエチルアミンを表す。
「ＤＭＦ」は、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミドを表す。
「ＤＭＳＯ」は、ジメチルスルホキシドを表す。
「ＤＭＡＰ」は、４−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノピリジンを表す。
「ＥＤＣ」は、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩を表す。
「Ｅｔ３Ｎ」または「ＴＥＡ」は、トリエチルアミンを表す。
「ＥｔＯＡｃ」は、酢酸エチルを表す。
「ＥｔＯＨ」は、エタノールを表す。
「ＨＡＴＵ」は、Ｏ−（７−アザベンゾトリアゾール−１−イル−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェートを表す。
「ＨＢＴＵ」は、２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェートを表す。
「ＨＣｌ」は、塩酸を表す。
「ＨＯＡｃ」は、酢酸を表す。
「ＨＯＡｔ」または「ＨＯＡＴ」は、１−ヒドロキシ−７−アザベンゾトリアゾールを表す。
「ＨＯＢｔ」は、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール一水和物を表す。
「ｉ−ＢｕＯＣＯＣｌ」は、イソブチルクロロホルメートを表す。
「ＨＰＬＣ」は、高速液体クロマトグラフィーを表す。
「ＫＨＭＤＳ」は、カリウムヘキサメチルジシラジド（カリウムビス（トリメチルシリル）アミドともまた称される）を表す。
「ＬｉＡｌＨ４」は、水素化アルミニウムリチウムを表す。
「ＬｉＡｌＨ２（ＯＥｔ）２」は、水素化アルミニウムリチウムジエトキシドを表す。
「Ｍｅ」は、メチルを表す。
「ＭｅＯＨ」は、メタノールを表す。
「ＮＭＭ」は、Ｎ−メチルモルホリンを表す。
「ＮＢＳ」は、Ｎ−ブロモスクシンイミドを表す。
「ＰｈＢ（ＯＨ）２」は、フェニルホウ酸を表す。
「Ｐｈ３Ｐ」または「ＰＰｈ３」は、トリフェニルホスフィンを表す。
「ＰｙＢＯＰ」は、ベンゾトリアゾリルオキシ−トリス−ピロリジノ−ホスホニウムヘキサフルオロホスフェートを表す。
「ＲＰ−ＨＰＬＣ」は、逆相高速液体クロマトグラフィーを表す。
「Ｓｗｅｒｎ　Ｏｘ」は、「Ｓｗｅｒｎ酸化」と呼ばれる反応工程を表す。実施例６を参照のこと。
「ＴＦＡ」は、トリフルオロ酢酸を表す。
「ＴＨＦ」は、テトラヒドロフランを表す。
「ＴＬＣ」は、薄層クロマトグラフィーを表す。
【００７６】
（発明の詳細な説明）
（１．好ましい化合物）
本発明の方法に従う使用のための適切な化合物は、マトリプターゼまたはＭＴＳＰ１のセリンプロテアーゼ活性を阻害するが細胞恒常性のために重要な他のセリンプロテアーゼの活性は有意には阻害しないことにおける、その効力および選択性について選択される。
【００７７】
本発明に従う使用のための好ましい化合物は、マトリプターゼまたはＭＴＳＰ１のセリンプロテアーゼ活性を選択的に阻害するが、循環するセリンプロテアーゼ（特に、凝固カスケードのセリンプロテアーゼ（特に、トロンビンおよび第Ｘａ因子））を実質的には阻害しない、化合物である。
【００７８】
１つの局面において、好ましいのは、マトリプターゼまたはＭＴＳＰ１のセリンプロテアーゼ活性を選択的に阻害するが、第Ｘａ因子またはトロンビンの活性を感知できるほどには阻害しない、化合物である。より好ましくは、そのような化合物は、第Ｘａ因子およびトロンビンの両方を、感知できるほどには阻害しない。これらの化合物は、第Ｘａ因子またはトロンビンのいずれかについて、マトリプターゼまたはＭＴＳＰ１のセリンプロテアーゼ活性を阻害することについてのＩＣ５０よりも少なくとも２倍、より好ましくは５倍大きいＩＣ５０を有することによって、特徴付けられる。好ましくは、この化合物は、第Ｘａ因子またはトロンビンの各々について、マトリプターゼまたはＭＴＳＰ１のセリンプロテアーゼ活性を阻害することについてのＩＣ５０よりも少なくとも２倍、より好ましくは５倍以上であるＩＣ５０を有する。より好ましいのは、第Ｘａ因子およびトロンビンの各々について、マトリプターゼまたはＭＴＳＰ１のセリンプロテアーゼ活性についてのＩＣ５０よりも１桁（１０倍）大きいＩＣ５０を有する、化合物である。より好ましいのは、プラスミンもまた感知できるほどには阻害せず、かつプラスミンについて、マトリプターゼまたはＭＴＳＰ１のセリンプロテアーゼ活性についてのＩＣ５０の少なくとも２倍、より好ましくは５倍であるＩＣ５０を有することによって特徴付けられる、化合物である。これらの化合物は、マトリプターゼまたはＭＴＳＰ１のセリンプロテアーゼ活性を選択的に阻害するが、第Ｘａ因子、トロンビン、および／もしくはプラスミンを（多少阻害するにしても）弱くしか阻害しない、インビトロ診断剤、またはマトリプターゼまたはＭＴＳＰ１のセリンプロテアーゼ活性の過剰発現および／もしくは過剰活性により特徴付けられる病理学的障害の処置のための薬剤のいずれかとして、有用であると考えられる。
【００７９】
本発明の別の局面に従って、好ましい化合物としては、非共有結合作用様式によって、マトリプターゼまたはＭＴＳＰ１のセリンプロテアーゼ活性を阻害する化合物が、挙げられる。
【００８０】
本発明の１つの局面に従って、マトリプターゼまたはＭＴＳＰ１のセリンプロテアーゼ活性のインヒビターである化合物としては、図１Ａ〜１Ｃに示される化合物が、挙げられる。
【００８１】
別の局面に従って、式（Ｉ）：
【００８２】
【化１６】
2004509085.tif 000010
の化合物、およびその薬学的に受容可能な塩が提供され、ここで、
（ａ）Ｘは、−Ｃ（＝Ｏ）−、−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−、−Ｓ（Ｏ）２−、Ｓ（Ｏ）２ＮＨ−、および直接結合からなる群より選択され；
（ｂ）Ｒ１は、以下の（１）〜（２１）：
（１）１個〜約１２個の炭素原子のアルキルであって、そのアルキルは、非置換であるか、またはＹ１およびＹ２からなる群より選択される１個または２個の置換基で置換されている、アルキル；
（２）約３個〜約８個の炭素原子のシクロアルキルで置換されている１個〜約３個の炭素原子のアルキルであって、そのシクロアルキルは、非置換であるか、またはＹ１、Ｙ２およびＹ３からなる群より選択される１個〜３個の置換基で置換されている、アルキル；
（３）３個〜約８個の炭素原子のシクロアルキルであって、そのシクロアルキルは、非置換であるか、またはＹ１、Ｙ２およびＹ３からなる群より選択される１個〜３個の置換基で置換されている、シクロアルキル；および
（４）約６個〜１４個の炭素原子のアリールであって、そのアリールは、非置換であるか、またはＹ１、Ｙ２およびＹ３からなる群より選択される１個〜３個の置換基で置換されている、アリール；
（５）約７個〜約１５個の炭素原子のアラルキルであって、そのアラルキルは、アルキル鎖上で、非置換であるか、またはヒドロキシもしくはハロゲンで置換されており、かつそのアラルキルは、アリール環上で、非置換であるか、またはＹ１、Ｙ２およびＹ３からなる群より選択される１個〜３個の置換基で置換されている、アラルキル；および
（６）Ｘが−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−、−Ｓ（Ｏ）２−、Ｓ（Ｏ）２ＮＨ−、または直接結合である場合に、水素；
（７）４個〜約１０個の環原子のヘテロシクロアルキルであって、その環原子は、炭素およびヘテロ原子から選択され、そのヘテロ原子は、酸素、窒素、およびＳ（Ｏ）ｉからなる群より選択され、ｉは０、１、または２であり、そのヘテロシクロアルキルは、非置換であるか、またはその環上で、Ｙ１、Ｙ２およびＹ３からなる群より選択される１個〜３個の置換基でモノ置換、ジ置換、もしくはトリ置換されている、ヘテロシクロアルキル；
（８）４個〜約１０個の環原子のヘテロシクロであって、その環原子は、炭素およびヘテロ原子から選択され、そのヘテロ原子は、酸素、窒素、およびＳ（Ｏ）ｉからなる群より選択され、ｉは０、１、または２であり、そのヘテロシクロは、
【００８３】
【化１７】
2004509085.tif 000011
を含み、
【００８４】
【化１８】
2004509085.tif 000012
は、３個〜６個の環原子を有する５員〜７員の複素環であり、Ｖは、−ＣＨ２−、−Ｏ−、−Ｓ（＝Ｏ）−、Ｓ（Ｏ）２−、または−Ｓ−であり、そのヘテロシクロは、非置換であるか、またはその環炭素上で、Ｙ１、Ｙ２およびＹ３からなる群より選択される１個〜３個の置換基でモノ置換、ジ置換、もしくはトリ置換されている、ヘテロシクロ；
（９）２個〜約６個の炭素原子のアルケニルであって、そのアルケニルは、非置換であるか、または約３個〜約８個の炭素原子のシクロアルキルで置換されており、そのシクロアルキルは、非置換であるか、または環上で、Ｙ１、Ｙ２およびＹ３からなる群より選択される１個〜３個の置換基でモノ置換、ジ置換、もしくはトリ置換されている、アルケニル；
（１０）約５個〜約１４個の環原子のヘテロアリールであって、その環原子は、炭素およびヘテロ原子から選択され、そのヘテロ原子は、酸素、窒素、および硫黄から選択され、そしてそのヘテロアリールは、非置換であるか、またはＹ１、Ｙ２およびＹ３からなる群より選択される１個〜３個の置換基でモノ置換、ジ置換、もしくはトリ置換されている、ヘテロアリール；
（１１）約５個〜約１４個の環原子のヘテロアラルキルであって、その環原子は、炭素およびヘテロ原子から選択され、そのヘテロ原子は、酸素、窒素、および硫黄から選択され、そしてそのヘテロアラルキルは、アルキル鎖上で、非置換であるか、またはヒドロキシもしくはハロゲンで置換されており、かつその環上で、非置換であるか、またはその環上で、Ｙ１、Ｙ２およびＹ３からなる群より選択される１個〜３個の置換基でモノ置換、ジ置換、もしくはトリ置換されている、ヘテロアラルキル；
（１２）約８個〜約１６個の炭素原子のアラルケニルであって、そのアラルケニルは、非置換であるか、またはアリール環上で、Ｙ１、Ｙ２およびＹ３からなる群より選択される１個〜３個の置換基でモノ置換、ジ置換、もしくはトリ置換されている、アラルケニル；
（１３）約５個〜約１４個の環原子のヘテロアラルケニルであって、その環原子は、炭素およびヘテロ原子から選択され、そのヘテロ原子は、酸素、窒素、および硫黄から選択され、そしてそのヘテロアラルケニルは、その環上で、非置換であるか、またはＹ１、Ｙ２およびＹ３からなる群より選択される１個〜３個の置換基でモノ置換、ジ置換、もしくはトリ置換されている、ヘテロアラルケニル；
（１４）
【００８５】
【化１９】
2004509085.tif 000013
（１５）
【００８６】
【化２０】
2004509085.tif 000014
（１６）
【００８７】
【化２１】
2004509085.tif 000015
（１７）
【００８８】
【化２２】
2004509085.tif 000016
（１８）約９個〜約１５個の炭素原子の縮合炭素環式アルキル；
（１９）１個〜約１２個の炭素原子のジフルオロメチルまたはパーフルオロアルキル；
（２０）約６個〜約１４個の炭素原子のパーフルオロアリール；
（２１）約７個〜約１５個の炭素原子のパーフルオロアラルキル；
からなる群より選択され、
そしてここで、各Ｙ１、Ｙ２およびＹ３は、独立して選択され、かつ各Ｙ１、Ｙ２およびＹ３は、
（ｉ）ハロゲン、シアノ、ニトロ、テトラゾリル、グアニジノ、アミジノ、メチルグアニジノ、−ＣＦ３、−ＣＦ２ＣＦ３、−ＣＨ（ＣＦ３）２、−Ｃ（ＯＨ）（ＣＦ３）２、−ＯＣＦ３、−ＯＣＦ２Ｈ、−ＯＣＦ２ＣＦ３、−ＯＣ（Ｏ）ＮＨ２、−ＯＣ（Ｏ）ＮＨＺ１、−ＯＣ（Ｏ）ＮＺ１Ｚ２、−ＮＨＣ（Ｏ）Ｚ１、−ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨ２、−ＮＨＣ（Ｏ）ＮＺ１、−ＮＨＣ（Ｏ）ＮＺｌＺ２、−Ｃ（Ｏ）ＯＨ、−Ｃ（Ｏ）ＯＺ１、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ２、−Ｃ（Ｏ）ＮＨＺ１、−Ｃ（Ｏ）ＮＺ１Ｚ２、−Ｐ（Ｏ）３Ｈ２、−Ｐ（Ｏ）３（Ｚｌ）２、−Ｓ（Ｏ）３Ｈ、−Ｓ（Ｏ）ｍＺｌ、−Ｚｌ、−ＯＺｌ、−ＯＨ、−ＮＨ２、−ＮＨＺ１、−ＮＺ１Ｚ２、−Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ２、−Ｃ（＝ＮＯＨ）ＮＨ２、−Ｎ−モルホリノ、および−Ｓ（Ｏ）ｍ（ＣＦ２）ｑＣＦ３からなる群より選択され、ｍは０、１、または２であり、ｑは０〜５の整数であり、そしてＺ１およびＺ２は、１個〜約１２個の炭素原子のアルキル、約６個〜約１４個の炭素原子のアリール、約５個〜約１４個の環原子のヘテロアリール、約７個〜約１５個の炭素原子のアラルキル、および約５個〜約１４個の環原子のヘテロアラルキルからなる群より独立して選択される；あるいは
（ｉｉ）Ｙ１およびＹ２は、−Ｏ［Ｃ（Ｚ３）（Ｚ４）］ｒＯ−または−Ｏ［Ｃ（Ｚ３）（Ｚ４）］ｒ＋１−であるように一緒に選択され、ｒは、１〜４の整数であり、そしてＺ３およびＺ４は、水素、１個〜約１２個の炭素原子のアルキル、約６個〜約１４個の炭素原子のアリール、約５個〜約１４個の環原子のヘテロアリール、約７個〜約１５個の炭素原子のアラルキル、および約５個〜約１４個の環原子のヘテロアラルキルからなる群より独立して選択され；
（ｃ）Ｒ２は、水素、または１個〜約１２個の炭素原子のアルキルであり；
（ｄ）ｎは、０、１、２、または３であり；
（ｅ）Ｒ３は、水素もしくはメチルであるか、またはＲ３、Ｒ４ａ、およびｑは、（ｇ）に示されるように一緒に選択され；
（ｆ）Ｒ４ａおよびＲ４ｂは、独立して水素、１個〜３個の炭素原子の低級アルキルであり、かつｑは、０、１、もしくは２であるか、またはＲ３、Ｒ４ａ、およびｑは、（ｇ）に示されるように一緒に選択され；
（ｇ）ｑは、０であり、かつＲ３およびＲ４ａは、プロリル、ピペコリル、アゼチジン−２−カルボニル；４−ヒドロキシプロリル、３−ヒドロキシプロリル、４−アミノプロリル、４−（ＣＨ２ＮＨ２）−プロリル、３，４−メタノプロリル、および３，４−デヒドロプロリルからなる群より選択される基をＰ２にて与えるように、Ｓ配置になるように一緒に選択され；そして
（ｈ）Ｅは、０個〜２個の環ヘテロ原子を有しかつその環原子の残りは炭素原子である、５員または６員の芳香環であり、そのヘテロ原子は、酸素、窒素、および硫黄からなる群より選択され、そしてその芳香環は、Ｒ５およびＲ６で置換されており、Ｒ５およびＲ６は、水素、ヒドロキシ、ハロゲン、１個〜約６個の炭素原子のアルキル、１個〜約４個の炭素原子のアルコキシで置換された１個〜約４個の炭素原子のアルキル、１個〜約６個の炭素原子のアルコキシ、およびトリフルオロメチルからなる群より独立して選択され；
（ｉ）Ｔは、水素、ヒドロキシ、−ＣＨ２ＯＨ、１個〜約３個の炭素原子のアルキル、シアノ、−Ｃ（＝ＮＲ７）ＮＨＲ８、−ＮＨ−Ｃ（＝ＮＲ７）ＮＨＲ８、−ＮＨＲ９、または−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨＲ９であり、Ｒ７およびＲ８は、独立して、水素、ヒドロキシ、１個〜約３個の炭素原子のアルコキシ、３個〜約１６個の炭素原子のトリヒドロカルボシリル、１個〜約３個の炭素原子のアルキル、または−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ９であり、Ｒ９は、水素、１個〜約６個の炭素原子のアルキル、１個〜約６個の炭素原子のアルコキシ、または−（ＣＦ２）ｊＣＦ３であり、ｊは、０、１、２、または３であり、但し、Ｒ７およびＲ８は、両方ともにヒドロキシもしくは両方ともにアルコキシではない。これらの化合物は、マトリプターゼまたはＭＴＳＰ１のセリンプロテアーゼ活性を阻害することにおいて活性を有する。
【００８９】
本発明のこの局面に従って、置換基の例が、以下に示される。
【００９０】
例示的Ｘ基としては、直接結合、−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ−、および−Ｓ（Ｏ）２−が、挙げられる。
【００９１】
例示的Ｒ１基としては、本明細書上記に示される段落（ｂ）（１）〜（ｂ）（６）のＲ１基が、挙げられる。
【００９２】
例示的Ｒ２基としては、水素、および１個〜約３個の炭素原子の低級アルキルが、挙げられる。
【００９３】
例示的ｑの値としては、０および１が挙げられ、より好ましくは、ｑは０である。
【００９４】
例示的ｎの値としては、０および１が挙げられ、より好ましくは、ｎは１である。
【００９５】
例示的Ｒ３基としては、水素が挙げられるか、またはＲ３、Ｒ４ａおよびｑが、本明細書上記段落（ｇ）に示されるように一緒に選択される。
【００９６】
例示的Ｒ４ａおよびＲ４ｂ基としては、水素およびメチルが挙げられるか、またはｑ、Ｒ３およびＲ４ａが、本明細書上記段落（ｇ）に示されるように一緒に選択される。
【００９７】
例示的Ｅ基としては、フェニル、チオフェン、ピリジン、ピリミジン、ピラジン、ピリダジン、イミダゾール、チアゾール、オキサゾール、およびピラゾールのような、芳香環が、挙げられる。
【００９８】
例示的Ｔ基としては、水素、メチル、シアノ、アミジノ、グアニジノ、およびアミノが、挙げられる。本発明のこの局面の１つの実施形態に従って、好ましいＴ基としては、アミジノが挙げられる。
【００９９】
本発明のこの局面の１つの実施形態に従って、ｑが０である式Ｉの化合物が提供される。好ましくは、ｎは０または１である。好ましくは、Ｒ３は、水素またはメチルである。好ましくは、Ｒ２は、水素または１個〜約３個の炭素原子の低級アルキルであり；好ましい低級アルキル基としては、メチルが挙げられる。好ましくは、Ｘは、直接結合、−Ｓ（Ｏ）２−、−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−、または−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−である。Ｘが直接結合である場合、Ｒ１は、好ましくは水素である。Ｘが、−Ｓ（Ｏ）２−である場合、Ｒ１は、好ましくはアリールである。Ｘが−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−である場合、Ｒ１は、好ましくはアルキルである。Ｘが−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−である場合、Ｒ１は、好ましくはアルキルである。好ましいＥは、フェニルである。特に好ましいＴ基としては、−Ｃ（＝ＮＲ７）ＮＨＲ８が挙げられ、より好ましくは、Ｒ７およびＲ８は水素である。
【０１００】
本発明のこの局面の別の実施形態に従って、ｑ、Ｒ３およびＲ４ａが、本明細書上記段落（ｇ）に示されるように一緒に選択される、式Ｉの化合物が提供される。
【０１０１】
本発明のこの局面の別の実施形態に従って、ｑが０でありかつＥがフェニルである、式Ｉの化合物が提供される。好ましくは、Ｘは、直接結合であり、かつＲ１は、水素である。好ましくは、Ｒ２は、水素、または１個〜約３個の炭素原子のアルキルである。好ましくは、Ｔは、−Ｃ（＝ＮＲ７）ＮＨＲ８である。Ｒ７およびＲ８は、より好ましくは水素である。
【０１０２】
本発明のこの局面の別の実施形態に従って、Ｅがフェニルである式Ｉの化合物が提供される。好ましくは、Ｒ３およびＲ４ｂは、水素であり、かつＲ４ａが水素もしくメチルであるか、または、ｑ、Ｒ３およびＲ４ａが、本明細書上記段落（ｇ）に示されるように一緒に選択される。
【０１０３】
本発明のこの局面のさらなる実施形態に従って、図５Ａおよび５Ｂに示される化合物から選択される式Ｉの化合物が、提供される。特に好ましい化合物としては、化合物Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｆ、Ｌ、およびＭが、挙げられる。
【０１０４】
（２．好ましい化合物の調製）
マトリプターゼまたはＭＴＳＰ１のインヒビターとしての活性を有する本発明の特定の化合物は、米国特許第５，４９２，８９５号；同第５，５３４，４９８号，同第５，９５５，９７６号；同第５，６４６，１９５号；同第５，６５８，９３９号；同第５，６９６，２３１号；同第５，６８１，８４４号；同第５，７０３，２０８号；同第５，７１４，４９９号；同第５，７３１，４１３号；同第５，７３９，１１２号；同第５，７７０，６００号；同第５，７７５，９２７号；同第５，８８３，０７７号；同第５，８８６，１４６号；同第６，０３４，２１５号；同第６，０２５，４７２号；ＷＯ　００／０５２４５；およびＴａｍｕｒａら，Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ　＆　Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　Ｌｅｔｔｅｒｓ　９：２５７３−２５７８（１９９９）（これらの開示は、本明細書中で参考として援用される）に記載される合成方法および技術に従うことによって、簡便に調製され得る。
【０１０５】
図２Ａおよび２Ｂは、図１Ａの番号６の化合物の調製の合成スキームを示す。
【０１０６】
図４Ａおよび４Ｂは、本発明の特定の化合物の調製の合成のための反応スキームを示し、そして実施例３〜１３は、本発明の特定の化合物の調製を記載する。
【０１０７】
図４Ａ〜４Ｃに示されかつ実施例３〜１３に記載される反応スキームにおける種々の点で適切な試薬を置換することによって、式Ｉの化合物は、簡便に合成され得る。
【０１０８】
（３．好ましい化合物の選択）
本発明の１つの局面に従って、本発明の化合物は、マトリプターゼまたはＭＴＳＰ１のセリンプロテアーゼ活性を阻害する際のその効力および選択性について、選択される。実施例ＡおよびＢに記載されそして一般的に公知であるように、標的セリンプロテアーゼおよびその基質は、そのプロテアーゼとその基質との反応を可能にするアッセイ条件下で、混合される。このアッセイは、試験化合物の非存在下で、および漸増濃度のその試験化合物の存在下で、実施される。セリンプロテアーゼ活性の５０％が試験化合物により阻害されるその試験化合物の濃度が、その化合物のついてのＩＣ５０（阻害濃度）値またはＥＣ５０（有効濃度）値である。一連の試験化合物の中では、より低いＩＣ５０値またはＥＣ５０値を有する化合物が、より高いＩＣ５０値またはＥＣ５０値を有する化合物がよりも強力な、セリンプロテアーゼインヒビターであると考えられる。ＩＣ５０測定は、しばしばより単純なアッセイのために使用され、一方、ＥＣ５０測定は、しばしば、より複雑なアッセイ（例えば、細胞を使用するアッセイ）のために使用される。
【０１０９】
本発明のこの局面に従う好ましい化合物は、マトリプターゼ活性またはＭＴＳＰ１活性のセリンプロテアーゼ活性の阻害についてのインビトロアッセイにおいて測定した場合に、ＩＣ５０値１００ｎＭ以下を有する。特に好ましい化合物は、ＩＣ５０値３０ｎＭ未満を有する。
【０１１０】
試験化合物はまた、他のセリンプロテアーゼに関して、マトリプターゼまたはＭＴＳＰ１のセリンプロテアーゼ活性の阻害に関する選択性について評価される（実施例ＡおよびＢを参照のこと）。実施例に記載されるように、および一般的に知られているように、試験化合物は、セリンプロテアーゼおよび他の酵素のパネルに関する、その効力についてアッセイされ、そしてＩＣ５０値またはＥＣ５０値が、各アッセイ系において各試験化合物について決定される。標的酵素（例えば、マトリプターゼまたはＭＴＳＰ１のセリンプロテアーゼドメイン）について、より低いＩＣ５０値またはＥＣ５０値を示す化合物、および試験パネル（例えば、組織プラスミノーゲン活性化因子、トロンビン、第Ｘａ因子）について、より高いＩＣ５０値またはＥＣ５０値を示す化合物は、標的酵素に関して選択的であると考えられる。一般に、化合物は、標的酵素アッセイにおけるそのＩＣ５０値またはＥＣ５０値が、酵素の選択的パネルにおいて測定される、次の最も低いＩＣ５０値またはＥＣ５０値の、１／２未満、好ましくは１／５未満、そしてより好ましくは、１オーダー低い場合、選択的であると考えられる。
【０１１１】
（４．薬学的組成物）
別の局面では、本発明は、保存または投与のために調製された薬学的組成物を含み、この組成物は、薬学的に受容可能なキャリア中に本発明の化合物の治療有効量を含む。
【０１１２】
本発明の化合物の治療有効量は、投与の経路、処置される哺乳動物の種類、および検討中の特定の哺乳動物の身体的特徴に依存する。この量を決定するための、これらの因子およびそれらの関係は、医療分野の当業者に周知である。この量および投与の方法は、最適な効力を達成するように合わせられ得るが、体重、食物、併用する薬物のような因子、および医療分野の当業者が認識する他の因子に依存する。
【０１１３】
本発明の化合物の治療有効量は、所望の効果および治療指標に依存して広い範囲であり得る。代表的には、投薬量は、約０．０１ｍｇ／体重１ｋｇと１００ｍｇ／体重１ｋｇの間、好ましくは、約０．０１ｍｇ／体重１ｋｇと１０ｍｇ／体重１ｋｇの間である。
【０１１４】
治療用途の薬学的に受容可能なキャリアは、薬学分野において周知であり、そして例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，　Ｍａｃｋ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ｃｏ．（Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ編、１９８５）に記載される。例えば、生理学的ｐＨの滅菌生理食塩水およびリン酸緩衝化生理食塩水が用いられ得る。保存料、安定化剤、色素、および香料までもが、薬学的組成物中に提供され得る。例えば、安息香酸ナトリウム、ソルビン酸、およびｐ−ヒドロキシ安息香酸のエステルが、保存料として添加され得る。同書、１４４９頁。さらに、抗酸化剤および懸濁剤が用いられ得る。同書。
【０１１５】
本発明の薬学的組成物は、以下のように処方され、用いられ得る：経口投与のための、錠剤、カプセル、またはエリキシル剤として；直腸内投与のための、座剤として；注射での投与のための、滅菌溶液および懸濁液として；など。投薬および投与の方法は、最適な効力を達成するように合わせられ得るが、体重、食物、併用する薬物のような因子、および医療分野の当業者が認識する他の因子に依存する。
【０１１６】
投与が、非経口（例えば、毎日の静脈内投与）であるべきである場合、注射可能な薬学的組成物が、溶液または懸濁液のいずれかのような従来の形態で、注射前の液体中の溶液または懸濁液に適した固体形態で、またはエマルジョンとして、調製され得る。適切な賦形剤は、例えば、水、生理食塩水、デキストロース、マンニトール、ラクトース、レシチン、アルブミン、ナトリウムグルタメートなど、である。さらに、所望の場合、注射可能な薬学的組成物は、湿潤剤、ｐＨ緩衝化剤などのような、微量の非毒性補助物質を含み得る。所望の場合、吸収促進調製物（例えば、リポソーム）が、利用され得る。
【０１１７】
（５．有用性）
本発明の化合物は、マトリプターゼ阻害活性を有する。
【０１１８】
本発明の化合物は、マトリプターゼのインヒビターとして活性であり、マトリプターゼに特異的に結合する。より詳細には、マトリプターゼのセリンプロテアーゼドメインに結合し、その活性を阻害する化合物が好ましい。
【０１１９】
これらの化合物は、癌の状態がマトリプターゼの活性により悪化する場合に、この癌の状態の予防または処置に有用であると考えられている。
【０１２０】
本発明の化合物の別の用途は、癌の状態の進行および付随する細胞マトリクスの分解の進行を遅らせることである。
【０１２１】
本発明の化合物は、マトリプターゼまたはＭＴＳＰ１のセリンプロテアーゼ活性のインヒビターとして活性であり、マトリプターゼまたはＭＴＳＰ１のセリンプロテアーゼドメインに特異的に結合する。従って、固体／ゲル支持体に連結するのに適する部位を含むこれらの化合物を、アフィニティークロマトグラフィーのためにインビトロで用いて、サンプルからマトリプターゼを精製し得るか、または従来のアフィニティークロマトグラフィー手順を用いて、サンプルからマトリプターゼを引き離し得る。これらの化合物は、直接的にかまたは従来の方法を用いる適切なリンカー支持体を介してのいずれかでアフィニティークロマトグラフィーに、付着またはカップリングされる。例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｓｃｉｅｎｃｅ，　Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　Ｓｏｎｓ（Ｊ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎら編、１９９７）およびＰｒｏｔｅｉｎ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，　Ｈｕｍａｎａ　Ｐｒｅｓｓ（Ｓ．Ｄｏｏｎａｎ編、１９６６）およびその中の参考文献を参照のこと。
【０１２２】
マトリプターゼまたはＭＴＳＰ１セリンプロテアーゼ阻害活性を有する本発明の化合物は、サンプル中の、マトリプターゼ活性またはＭＴＳＰ１活性、および複合体化マトリプターゼまたは複合体化ＭＴＳＰ１と非複合体化マトリプターゼまたは非複合体化ＭＴＳＰ１との割合を測定するためのインビトロアッセイに有用である。これらのアッセイはまた、例えば、生検からの組織サンプル中のマトリプターゼまたはＭＴＳＰ１の活性レベルをモニターするため、あるいはマトリプターゼ活性またはＭＴＳＰ１活性の測定が助けとなる任意の臨床状態について、マトリプターゼ活性、および複合体化マトリプターゼと、非複合体化マトリプターゼとの割合をモニターするために用いられ得る。サンプル中のセリンプロテアーゼ活性を決定するアッセイは、（複合体化または非複合体化）マトリプターゼまたはＭＴＳＰ１の総量を決定し、複合体化マトリプターゼと非複合体化マトリプターゼとの割合を決定する、ＥＬＩＳＡと組み合わせて用いられ得る。
【０１２３】
種々の動物モデルを用いて、本発明の化合物の、原発性腫瘍増殖を減少させる能力または転移の発生を減少させる能力を評価し得る。これらのモデルとしては、遺伝的に変化させた齧歯類動物（トランスジェニック動物）が挙げられ得、移植可能な腫瘍細胞は、齧歯類動物またはヒトに本来由来しており、そして同系の宿主または免疫不全宿主に移植されているか、あるいはこれらのモデルとしては、腫瘍増殖に必須であると考えられる血管の増殖（新脈管形成）を阻害する化合物の能力を評価するように設計された、特定のモデル（例えば、以下に記載のＣＡＭモデル）が挙げられ得る。他のモデルもまた利用され得る。
【０１２４】
適切な動物モデルを、関連のある診断基準の組に基づいて、本発明に記載される化合物のインビボ抗腫瘍活性を評価するために選択する。例えば、ある診断基準は、試験される特定の腫瘍によるマトリプターゼもしくはＭＴＳＰ１の発現、および／またはマトリプターゼｍＲＮＡもしくはＭＴＳＰ１　ｍＲＮＡの発現であり得る。この診断基準を満たす２つのヒト前立腺由来腫瘍は、ＬｎＣａｐおよびＰＣ−３細胞株である。別の診断基準は、腫瘍が、高レベルのマトリプターゼまたはＭＴＳＰ１を通常発現する組織に由来するということであり得る。ヒト結腸癌は、この診断基準を満たす。第３の診断基準は、腫瘍の増殖および／または進行が、マトリプターゼまたはＭＴＳＰ１の基質（例えば、ｓｃ−ｕ−ＰＡ）のプロセシングに依存するということであり得る。ヒト類表皮癌であるＨｅｐ−３は、この診断基準に適合する。別の診断基準は、腫瘍の増殖および／または進行が、マトリプターゼまたはＭＴＳＰ１の活性を必要とする、生物学的または病理学的なプロセスに依存することであり得る。別の診断基準は、特定の腫瘍が、周辺組織によるマトリプターゼまたはＭＴＳＰ１の発現を誘導するということであり得る。他の診断基準もまた、特定の動物モデルを選択するために用いられ得る。
【０１２５】
一旦、適切な腫瘍細胞が選択されると、試験されるべき化合物が、選択された腫瘍細胞を保有する動物に投与され、次いで、選択したモデルに特異的な、一定の期間の増殖の後、腫瘍のサイズおよび／または転移の広がりの測定が行われる。
【０１２６】
ＣＡＭモデル（ニワトリ胚絨毛尿膜モデル（Ｌ．Ｏｓｓｏｗｓｋｉ（Ｊ．Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ．１０７：２４３７−２４４５，１９８８）によって最初に記載された））は、化合物の抗腫瘍活性および抗新脈管形成活性を評価するための別の方法を提供する。
【０１２７】
種々の起源の腫瘍細胞は、１０日齢のＣＡＭ上に配置され得、そして一晩静置される。次いで、試験されるべき化合物は、Ｂｒｏｏｋｓら、（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　１２９：２５７−２６９，１９９９）に記載されるように静脈内注射され得る。腫瘍の増殖またはＣＡＭへの侵襲を阻害するこの化合物の能力は、化合物の投与の７日後に測定される。
【０１２８】
新脈管形成を阻害する化合物の能力を測定するためのモデルとして使用される場合、脈管形成因子（例えば、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、または脈管内皮（ｅｄｉｏｔｈｅｌｉａｌ）細胞増殖因子（ＶＥＧＦ））を含むフィルタディスクは、Ｂｒｏｏｋｓら、（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　１２９：２５７−２６９，１９９９）によって記載されるように、１０日齢のＣＡＭに配置される。一晩のインキュベーション後、試験されるべき化合物は、次いで、静脈内投与される。新脈管形成の量は、化合物の投与後４８時間での、血管の分枝形成の量を計数することによって測定される（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　１２９：２５７−２６９，１９９９）。
【０１２９】
本発明の化合物は、マトリプターゼまたはＭＴＳＰ１の減少したセリンプロテアーゼ活性によって改善される病的状態の処置のためにインビボで有用である。
【０１３０】
これらの化合物は、腫瘍および他の新生物における転移の減少または阻害、ならびに細胞外マトリックスの分解において有用であると考えられる。これらの化合物は、細胞外マトリックス（本明細書中上記の背景および発明の導入部において記載される細胞外マトリックスを含む）の病的分解によって特徴付けられる状態の処置における治療剤として有用である。
【０１３１】
本発明は、マトリプターゼまたはＭＴＳＰ１のセリンプロテアーゼ活性を阻害することによって弱毒化される状態を有すると疑われる哺乳動物において、状態を予防または処置するための方法を含み、この方法は、マトリプターゼまたはＭＴＳＰ１のセリンプロテアーゼ活性を選択的に阻害する化合物、あるいは本発明の薬学的組成物の治療有効量を、この哺乳動物に投与する工程を包含する。
【０１３２】
本発明の化合物は、通常は哺乳動物（好ましくは、ヒト）に、インビボで投与される。これらの化合物をインビボで用いる場合、これらの化合物は、種々の投薬形態を用いて、種々の様式（経口的、非経口的、静脈内、皮下、筋肉内、結腸、直腸、経鼻、または腹腔内を含む）で、哺乳動物に投与され得る。
【０１３３】
本発明の方法の実施において、本発明の化合物は、単独もしくは互いに組み合わせて、または他の治療剤もしくはインビボ診断剤と組み合わせて、投与される。
【０１３４】
医療分野の当業者に明らかなように、本発明の化合物の「治療有効量」は、年齢、体重および処置される哺乳動物の種、処置される疾患または病的状態の段階、使用される特定の化合物、投与の特定の様式および所望の効果、ならびに治療の適応症に依存して変化する。この量を決定するためのこれらの要因およびその関連性は、医療分野において周知であるので、治療的に有効な投薬量レベル、マトリプターゼまたはＭＴＳＰ１のセリンプロテアーゼ活性を阻害する所望の結果を達成するために必要な量の決定は、当業者の範囲内である。代表的に、本発明の化合物の投与は、低い投薬量レベルで開始されて、マトリプターゼまたはＭＴＳＰ１の活性の所望の程度までの阻害が達成されるまで投薬量レベルが増加され、これにより治療有効量が規定される。本発明の化合物についてのこのような投薬量は、約０．０１ｍｇ／ｋｇ体重と約１００ｍｇ／ｋｇ体重との間、好ましくは約０．０１と約１０ｍｇ／ｋｇ体重との間である。
【０１３５】
（６．マトリプターゼまたはＭＴＳＰ１のインヒビター活性を決定するためのｒＭＡＰの使用）
実施例１および２は、組換え方法を使用する、マトリプターゼまたはＭＴＳＰ１由来の組換えセリンプロテアーゼドメイン（「ｒＭＡＰ」）のクローニングおよび発現を記載する。実施例Ａは、マトリプターゼまたはＭＴＳＰ１のセリンプロテアーゼ活性の阻害における活性について化合物を試験するためのアミド分解アッセイにおける、ｒＭＡＰの使用を記載する。本発明に従う適切な組換えセリンプロテアーゼドメインとしては、配列番号２、またはセリンプロテアーゼ活性を有しかつ配列番号２に対して少なくとも約８０％の配列同一性を有するアミノ酸を含むペプチドが挙げられる。このような配列は、対立遺伝子改変体および単一のヌクレオチド多型を有するが、セリンプロテアーゼ活性を有するペプチドを生じる配列を含む。
【０１３６】
参照アミノ酸配列（例えば、配列番号２）に対するアミノ酸の配列同一性は、当業者に公知の技術によって決定され得る。配列同一性に関する決定を行う際に、比較されるべきペプチドが整列される。このような整列は、手動で、またはこのような用途のために開発された特定のアルゴリズム（これは、都合よく使用される）を使用して、なされ得る。次いで、類似した位置を占める残基の比較がなされ、そして同一の残基数がスコア付けされる。
【０１３７】
マトリプターゼまたはＭＴＳＰ１由来の組換えセリンプロテアーゼドメインを含むペプチドは、マトリプターゼまたはＭＴＳＰ１のセリンプロテアーゼ活性の阻害における活性について、化合物をスクリーニングする際に有用である。アミド分解アッセイにおける１つのこのようなペプチド（ｒＭＡＰ）の使用は、実施例Ａに記載される。
【０１３８】
理解を補助するために、本発明は、ここで、以下の実施例によってさらに示される。これらの実施例は、これらが本発明に関連するので、当然ながら本発明を具体的に限定するとは解釈されるべきではなく、そして現在公知であるかまたは後で開発された本発明の改変物は、当業者の範囲内であり、そしてこの変化は、本明細書中および上記の特許請求の範囲に記載されているので、本発明の範囲内であるとみなされる。
【０１３９】
（実施例）
（実施例１：マトリプターゼの単離およびクローニング）
（Ａ．細胞の細胞型および増殖）
ヒト前立腺腺癌細胞株であるＰＣ−３を、ＡＴＣＣより購入した（カタログ番号ＣＲＬ−１４３５；Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）。この細胞を、２ｍＭ　Ｌ−グルタミンおよび１０％　仔ウシ胎児血清を補填したＨａｍ’ｓ　Ｆ−１２Ｋ増殖培地（カタログ番号９０７７；Ｉｒｖｉｎｅ）中にて３７℃、５％ＣＯ２で培養した。その後の細胞操作全てを、製造業者の指示書に従って実施した。ＰＣ−３細胞を、約９０％コンフルエントまで増殖させ、次いで、１×リン酸緩衝化生理食塩水で簡単に洗浄した。
【０１４０】
（Ｂ．総ＲＮＡの単離、およびポリＡ＋ＲＮＡの精製および富化）
ＰＣ−３細胞を、Ｔｒｉｚｏｌ試薬（カタログ番号１５５９６；Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）中に溶解し、そして総ＲＮＡを、製造業者のプロトコルに従って単離した。総ＲＮＡの濃度を、２６０ｎｍで読んだ吸光度から見積もった。ポリＡ＋ＲＮＡを精製し、そしてオリゴ−ｄＴビーズ（カタログ番号７００６１；Ｏｌｉｇｏｔｅｘ　Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を使用して富化した。
【０１４１】
（Ｃ．逆転写およびポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ））
ＰＣ−３由来のポリＡ＋ＲＮＡを、ＰｒｏＳＴＡＲ　ｆｉｒｓｔ−ｓｔｒａｎｄ　ＲＴ−ＰＣＲキット（カタログ番号２００４２０；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ　Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）およびＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ　ＩＩ　ＲＮａｓｅ　Ｈ−逆転写酵素（カタログ番号１８０６４−０２２；Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用する逆転写によって、一本鎖ｃＤＮＡ（ｓｓｃＤＮＡ）に変換した。逆転写後、ＰＣ−３ｓｓｃＤＮＡのアリコート（４μＬ）を、各々２ｍＭのセンス変性オリゴヌクレオチドプライマーおよびアンチセンス変性オリゴヌクレオチドプライマーならびにＴａｑポリメラーゼ（カタログ番号２０１２０３；Ｑｉａｇｅｎ）を使用するＰＣＲに供した。総反応容量は、１００μＬであった。センスプライマーの配列は、
【０１４２】
【化２２Ａ】
2004509085.tif 000017
であり、そしてアンチセンスプライマーの配列は、
【０１４３】
【化２２Ｂ】
2004509085.tif 000018
であり、ここで、Ｒ＝Ａ、Ｇ；Ｖ＝Ｇ、Ａ、Ｃ；Ｗ＝Ａ，Ｔ；Ｓ＝Ｇ、Ｃ；Ｙ＝Ｃ、Ｔ；Ｈ＝Ａ、Ｔ、Ｃである。プライマー配列は、全ての（キモ）トリプシン様セリンプロテアーゼ中の高度に保存された２つの領域に対応し、そして約４００〜５００塩基対の範囲のＰＣＲ産物を増幅した。
【０１４４】
（Ｄ．クローンスクリーニングおよび配列決定）
ＰＣＲ産物を、２％アガロースゲルで分離し、そしてゲル抽出キット（カタログ番号２８７０６；ＱＩＡｑｕｉｃｋ　ｇｅｌ　ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　ｋｉｔ；Ｑｉａｇｅｎ）を使用して精製した。精製したＤＮＡフラグメントを、ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ（カタログ番号Ｋ４５００−０１；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）中に連結した。Ｅ．ｃｏｌｉ細胞に形質転換した後、プラスミドＤＮＡを、ＥｃｏＲＩ制限部位で消化することによって単離および分析した。挿入ＤＮＡを有するクローンをさらに、蛍光色素ベースのＤＮＡ配列決定法（カタログ番号４３０３１４９；ＡｍｐｌｉＴａｑ　ＤＮＡポリメラーゼを有するＢｉｇＤｙｅターミネーターサイクル配列決定キット；Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ，Ｌｉｎｃｏｌｎ，ＣＡ）を使用する配列決定によって特徴付けた。合計３１個クローンを、配列決定および分析した。ＧｅｎＢａｎｋ（ＮＣＢＩ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ）に寄託された、同一または密接に関連したｃＤＮＡを同定するために、全ての配列を、多重ヌクレオチド配列アラインメントアルゴリズム（ｂｌａｓｔｎ）（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｌａｓｔ）によって分析した。顕著な相同性を示さなかったものをさらに、タンパク質配列データベース（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ）に対するヌクレオチド配列（両鎖）の６フレームの概念上の翻訳産物を比較するｂｌａｓｔｘを使用して分析した。新規なセリンプロテアーゼをコードする同一のｃＤＮＡフラグメントの８クローンを、得た。この配列は、当時に寄託されていた配列のいずれとも１００％一致しなかった。この新規セリンプロテアーゼを、ＭＴＳＰ１を名付けた。見出されたもので最も近く一致したのは、膜型セリンプロテアーゼをコードするマウスエピチン（ｅｐｉｔｈｉｎ）ｍＲＮＡであり（８５％同一性；ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＦ０４２８２２）、そしてＭＴＳＰ１の部分配列を含むヒトＳＮＣ１９　ｍＲＮＡ（９８％同一性；ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＨＳＵ２０４，２８）であった。ＭＴＳＰ１が、Ｃｏｒｖａｓにてマトリプターゼ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＦ１１８２２４）に同一であることを引き続き見出した。マトリプターゼの配列は、ＭＴＳＰ１をコードするｃＤＮＡがクローニングおよび配列決定された後にその配列がＧｅｎＢａｎｋ上に現れた。
【０１４５】
（Ｅ．ＭＴＳＰ１の、ｃＤＮＡ末端の迅速な増幅（Ｒａｐｉｄ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｃＤＮＡ）（ＲＡＣＥ）および遺伝子特異的増幅）
ＭＴＳＰ１の完全なプロテアーゼドメインをコードするｃＤＮＡを得るために、ＲＡＣＥ反応および遺伝子特異的増幅反応の両方を実施した。転写物の存在が前立腺において検出されたので、ヒト前立腺Ｍａｒａｔｈｏｎ−Ｒｅａｄｙ　ｃＤＮＡ（カタログ番号＃７４１８−１；Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を使用して、ＭＴＳＰ１をコードするｃＤＮＡの一部を単離した。Ｍａｒａｔｈｏｎ−Ｒｅａｄｙ　ｃＤＮＡは、ｓｓｃＤＮＡの５’末端および３’末端の両方で、公知のハイブリダイゼーション配列を含むように調製され、従って、このＲＡＣＥ反応に特に適している。以下の遺伝子特異的プライマー
【０１４６】
【化２２Ｃ】
2004509085.tif 000019
を使用する３’−ＲＡＣＥ反応によって、ＭＴＳＰ１　ｃＤＮＡの３’領域を首尾よく得た。センスプライマーとしての
【０１４７】
【化２２Ｄ】
2004509085.tif 000020
および、アンチセンスプライマーとしての
【０１４８】
【化２２Ｅ】
2004509085.tif 000021
の２つのＭＴＳＰ−１特異的プライマーを使用する遺伝子特異的増幅反応によって、ＭＴＳＰ１プロテアーゼドメインの５’末端を得た。これら２つのプライマーの配列を、ヒトＳＮＣ１９　ｍＲＮＡ配列より得た。３’−ＲＡＣＥ反応および遺伝子特異的ＰＣＲの両方は、サイズが＞１ｋｂｐであるＤＮＡフラグメントを生成した。これらのフラグメントを、ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯにサブクローニングした。Ｅ．ｃｏｌｉ細胞への形質転換後、プラスミドＤＮＡを、ＥｃｏＲＩ制限酵素で消化することによって単離および分析した。挿入ＤＮＡを有するクローンを、サザンブロット分析（内部ｃＤＮＡフラグメントをプローブとして使用する）およびＤＮＡ配列分析によって特徴付けた。
【０１４９】
（Ｆ．ＭＴＳＰ１のプロテアーゼドメインの全長をコードするｃＤＮＡのＰＣＲ増幅）
ＭＴＳＰ１のプロテアーゼドメイン全体をコードするｃＤＮＡフラグメントを得るために、遺伝子特異的プライマーを用いる、末端から末端までの（ｅｎｄ−ｔｏ−ｅｎｄ）ＰＣＲ増幅を使用した。使用した２つのプライマーは、５’末端については、
【０１５０】
【化２３】
2004509085.tif 000022
であり、３’末端については、
【０１５１】
【化２４】
2004509085.tif 000023
であった。５’プライマーは、ＭＴＳＰ１プロテアーゼドメインの最初（ＶＶＧＧＴＤＡＤＥ）（配列番号（ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．）１０）をコードする配列（下線を付した）を含んだ。３’プライマーは、ＭＴＳＰ１の終止コドン（下線を付した）を含んだ。約８００ｂｐのフラグメントを増幅し、精製し、そしてＰｉｃｈｉａ　ｐａｓｔｏｒｉｓ発現ベクターのｐＰＩＣ９Ｋにサブクローニングし、ｐＰＩＣ９Ｋ−ＭＴＳＰ１を得た。
【０１５２】
（Ｇ．正常組織、癌細胞および癌組織におけるＭＴＳＰ１の遺伝子発現プロファイル）
ＭＴＳＰ１の組織分布および遺伝子発現レベルに関する情報を得るために、ｐＰＩＣ９Ｋ−ＭＴＳＰ１由来のＤＮＡ挿入物を使用して、７６個の異なるヒト組織由来のＲＮＡを含むブロット（カタログ番号７７７５−１；ヒト多重組織発現（ＭＴＥ）アレイ；ＣＬＯＮＴＥＣＨ、Ｐａｌｏ　Ａｌｔｏ，ＣＡ）をプローブした。結腸（上行、横行および下行）、直腸、気管、食道および十二指腸において、顕著な発現を観察した。空腸、回腸、回盲部（ｉｌｏｃｅｃｕｍ）、胃、前立腺、脳下垂体、虫垂、腎臓、肺、胎盤、膵臓、甲状腺、唾液腺、乳腺、胎児腎臓および胎児肺において、中程度の発現レベルを観察した。脾臓、胸腺、末梢血白血球、リンパ節、骨髄、膀胱、子宮、肝臓、副腎、胎児心臓、胎児肝臓、胎児脾臓および胎児胸腺において、低い発現レベルを観察した。結腸直腸の腺癌細胞株（ＳＷ４８０）、バーキットリンパ腫細胞株（Ｄａｕｄｉ）および白血病細胞株（ＨＬ−６０）においてもまた、顕著な量のＭＴＳＰ１転写物を検出した。無胸腺症ヌードマウスでのいくつかのヒト原発性腫瘍異種移植片におけるＭＴＳＰ１転写物のＲＴ−ＰＣＲを、遺伝子特異的プライマーを使用して実施した。結腸腺癌（ＣＸ−１）および膵臓腺癌（ＧＩ−１０３）において、高レベルのＭＴＳＰ１転写物を検出した。別の結腸腺癌（ＧＩ−１１２）、卵巣腺癌（ＧＩ−１０２）、肺癌（ＬＸ−１）および乳癌（ＧＩ−１０１）において、中程度のレベルを観察した。別の肺癌（ＧＩ−１１７）は、低レベルのＭＴＳＰ１転写物を発現した。ＰＣ−３細胞株およびＬＮＣａＰ細胞株におけるＭＴＳＰ１転写物の存在を検出するために、同様のＲＴ−ＰＣＲを実施した。両方の細胞株は、顕著な量のＭＴＳＰ１転写物を発現した。
【０１５３】
（Ｈ．配列分析）
誘導したＤＮＡおよびタンパク質の配列全てを、ＭａｃＶｅｃｔｏｒ（バージョン６．５；Ｏｘｆｏｒｄ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｌｔｄ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を使用して分析した。ＭＴＳＰ１のプロテアーゼドメインをコードするｃＤＮＡは、２４１アミノ酸タンパク質配列（ｒＭＡＰ）に翻訳される７２６塩基対からなる。図３Ａ〜３Ｃを参照のこと。
【０１５４】
（実施例２：マトリプターゼまたはＭＴＳＰ１の組換えセリンプロテアーゼドメインｒＭＡＰの生成）
（Ａ．発酵）
数ミリグラム量のｒＡＭＰの生成を、ＳＭＤ１１６８／ｐＰＩＣ９Ｋ：ＭＴＳＰ１　Ｓａｃ　ＳＣ１クローンを使用して、３．３Ｌ容量のバイオリアクターを備えたＢｉｏＦｌｏ　３０００　ｆｅｒｍｅｎｔｏｒ（Ｎｅｗ　Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＮＪ）での醗酵によって実施した。ＺＡ００１複合培地（１０ｇ／Ｌ酵母抽出物、２０ｇ／Ｌペプトン、４０ｇ／Ｌグリセロール、５ｇ／Ｌ硫酸アンモニウム、０．２ｇ／Ｌ硫酸カルシウム２水和物、２ｇ／Ｌ硫酸マグネシウム７水和物、２ｇ／Ｌ硫酸カリウム、２５ｇ／Ｌヘキサメタリン酸（ｐｏｓｐｈａｔｅ）ナトリウム、４．３５ｍｌ／Ｌ　ＰＴＭ１）を、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ形質転換体の一晩培養物１００ｍｌをもちいて接種した。この培養物を、ｆｅｄ−ｂａｔｃｈ　ｐｈａｓｅによって５０％グリセロールで補充し、そして０．０２５％で制御したメタノールを用いて１８〜２４時間誘導した。
【０１５５】
（Ｂ．マトリプターゼまたはＭＴＳＰ１の組換えセリンプロテアーゼドメイン（ｒＭＡＰ）の精製）
ｒＭＡＰを、培養培地中に分泌した。よって、精製の第一工程は、５０００ｇで３０分間の遠心分離による細胞および細胞片の除去を含んだ。得られた上清をデカントし、１０Ｎ　ＮａＯＨでｐＨ８．０に調整し、そしてＳａｒｔｏＢｒａｎ　３００　０．４５＋０．２μＭカプセルを通して濾過した。この上清を、１０ｋＤａ限外濾過カートリッジ（ＡＧ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ　ＵＦＰ−１０−Ｃ−５Ａフィルターを備えたＮＣ　ＳＲＴ　ＵＦシステム）を使用する限外濾過によって１Ｌまで濃縮し、そしてこの緩衝液を、５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、５０ｍＭ　ＮａＣｌ、０．０５％　ｔｗｅｅｎ−８０（ｐＨ８．０）（緩衝液Ａ）へとクロスフロー濾過によって置換した。濾過ユニットを、この濃縮と組合わせた１Ｌの緩衝液Ａで一度リンスした。
【０１５６】
濃縮したｒＭＡＰ含有溶液を、緩衝液Ａで平衡化した１５０ｍｌ　ベンズアミジンカラムに流速８ｍｌ／分で通過させた。このカラムを、カラム容量の３倍の５０ｍＭ　ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１．０Ｍ　ＮａＣｌ、０．０５％　ｔｗｅｅｎ−８０（ｐＨ８．０）（緩衝液Ｂ）で洗浄し、カラム容量の３倍の５０ｍＭ　ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１．０Ｍ　Ｌ−アルギニン、０．０５％　ｔｗｅｅｎ−８０（ｐＨ８．０）（緩衝液Ｃ）で溶出した。ｒＭＡＰを含有する画分を、活性アッセイにより同定し、プールした。このプールした物質を、ＪｕｍｂｏＳｅｐ濃縮器（Ｐａｌｌ　Ｇｅｌｍａｎ）および１０ｋＤａカットオフ膜を使用して１０ｍｌにまで濃縮した。一旦１０ｍｌにまで濃縮したら、この緩衝液を、５０ｍＭ　Ｎａ２ＨＰＯ４、１２５ｍＭ　ＮａＣｌ（ｐＨ５．５）（緩衝液Ｄ）に交換し、そして容量を５〜１０ｍｌに調整した。保持物質（ｒｅｔｅｎｔａｔｅ）を除き、この濃縮器を、濃縮物に加えた緩衝液Ｄで洗浄した。総サンプル量を、１５ｍｌに調整した。
【０１５７】
部分精製したｒＭＡＰを、１５ｍｌの緩衝液Ｄで予め平衡化した５ｍｌのＱ−ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　Ｆａｓｔ　Ｆｌｏｗ　ＨｉＴｒａｐカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ）に通した。通過画分（ｆｌｏｗ　ｔｈｒｏｕｇｈ）を回収した。このＨｉＴｒａｐカラムを、さらに１０ｍｌの緩衝液Ｄで洗浄した。両方の通過画分をプールし、そしてタンパク質濃度を、（２．０１２ｍｇ／ＯＤ２８０の吸光係数を使用して）ＯＤ２８０の測定により測定した。次いで、精製したｒＭＡＰを、０．１μｌのエンドグリコシダーゼＨ（ＰｒｏＺｙｍｅ、５Ｕ／ｍｌ）／ｍｇタンパク質の添加によって脱グリコシル化し、穏やかに攪拌して４℃で一晩インキュベートした。
【０１５８】
この脱グリコシル化したプールの伝導率を、Ｎａｎｏｐｕｒｅ水を用いて２．０〜３．０ｍＳ／ｃｍに調整し、ｐＨを６．５に調整した（最終容量２００〜３００ｍＬ）。次いで、７ｍＬのＳｏｕｒｃｅ　１５Ｑアニオン交換カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ）を使用するＰｈａｒｍａｃｉａ　Ａｋｔａ　Ｅｘｐｌｏｒｅｒ　ｓｙｓｔｅｍに直接ロードすることによるアニオン交換クロマトグラフィーによって、ｒＭＡＰをさらに精製した。０〜０．３３Ｍ　ＮａＣｌ勾配を用いる５０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ（ｐＨ６．５）を含む緩衝液を、１０カラム容量にわたって流速６ｍｌ／分で、このタンパク質を溶出した。タンパク質を含有する画分をプールし、最終濃度１０ｍＭまでベンズアミジンを添加した。タンパク質純度を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって調べ、ＯＤ２８０の測定および２．０１２ｍｇ／ＯＤ２８０の理論的吸光係数の使用により、タンパク質濃度を測定した。
【０１５９】
（実施例３：（Ｒ）−２−ｔｅｒｔ−ブチル−（Ｓ）−４−（３−シアノ−ベンジル）−３−ホルミル−オキサゾリジン−４−カルボン酸ベンジルエステル（２）の調製）
テフロン（登録商標）で被覆した電磁攪拌バーおよびゴムの隔壁を含む、オーブンで乾燥した１Ｌの丸底フラスコに、ＴＨＦ（２２５ｍＬ）を入れ、そして−７８℃まで冷却した。反応混合物を、ＫＨＭＤＳ（トルエン中、０．５Ｍを７５．５ｍＬ、３７．８ｍｍｏｌ、１．１当量）で処理し、そして２０分間攪拌し；次いで、ＴＨＦ（５０ｍＬ）中に溶解した（Ｒ）−２−ｔｅｒｔ−ブチル−３−ホルミル−オキサゾリジン−（Ｓ）−４−カルボン酸ベンジルエステル（Ｓｅｅｂａｃｈら、Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ　ｖ７０、（１９８７）、１１９４−１２１６）（１０ｇ、３４．３ｍｍｏｌ）を、３０分間の時間に亘り、シリンジおよびシリンジポンプにより添加した。一旦添加を終了すると、反応混合物を−７８℃で２時間攪拌し、そしてＴＨＦ（５０ｍＬ）中に溶解したα−ブロモ−ｍ−トルニトリル（８．７５ｇ、４４．６ｍｍｏｌ、１．３当量）を用い、カニューレを介して、５分間の時間処理した。反応混合物を−７８℃で２時間攪拌し、そして次に１０時間の時間に亘って周囲温度まで暖めた（ドライアイス／イソプロパノール浴を融解させた）。反応混合物を、激しく攪拌した、氷／ＮＨ４Ｃｌ（飽和）混合物（１００ｍＬ）中に注ぎ、そして２０分間攪拌した。二相性混合物を、分離漏斗に移し、そして相分離した。水相を酢酸エチル（３×７５ｍｌ）で再抽出し、そして合わせた有機相を、０．５Ｎ　ＨＣｌ（１００ｍＬ）、Ｈ２Ｏ（５０ｍＬ）、ＮａＨＣＯ３（飽和）（５０ｍＬ）、Ｈ２Ｏ（５０ｍＬ）、鹹水（１００ｍＬ）で洗浄し、乾燥し（ＭｇＳＯ４）、濾過し、そして濃縮して淡黄色の油を得た。粗製物質を、３０％酢酸エチル／ヘキサンとともに粉砕し、濾過し、そして濃縮して黄色の油を得、これを、フラッシュクロマトグラフィーにより精製し（ＳｉＯ２、溶出には４０％酢酸エチル／ヘキサン）、白色の結晶固体として表題の化合物を得た（１０．３ｇ、７４％）。
（式Ｉのその他の化合物を得るために、その他の適切な求電子試薬（すなわち、α−ブロモ−ｐ−トルニトリル）が、このステップで置き換えられ得る。）
（実施例４：（Ｓ）−アミノ−２−（３−シアノ−ベンジル）−３−ヒドロキシ−プロピオン酸ベンジルエステル（３）の調製）
還流濃縮器およびテフロン（登録商標）被覆された電磁攪拌バーを備えた１Ｌ丸底フラスコに、化合物２（３０ｇ、７３．８ｍｍｏｌ）およびＭｅＯＨ（１Ｌ）を入れた。６Ｎ　ＨＣｌ（４５ｍＬ）を添加し、そして僅かに濁った反応混合物を、４８時間の間、攪拌しながら加熱して穏やかに還流した。反応混合物を周囲温度まで冷却し、そして濃縮して乾燥し、白い無色の固体を得、これを、Ｈ２Ｏ（３００ｍＬ）に溶解し、そしてＣＨ２Ｃｌ２（５０ｍＬ）で抽出した。水相を濃縮し、白い無色の固体として表題の化合物を得た（２２．７ｇ、８９％）。
【０１６０】
（実施例５：（Ｓ）−シアノ−ベンジル）−３−ヒドロキシ−２−メトキシカルボニルアミノ−プロピオン酸（４）の調製）
テフロン（登録商標）で被覆した磁性の攪拌バーおよびゴムの隔壁を含む、２５０ｍＬの丸底フラスコに、化合物（３）（１０ｇ、２８．８ｍｍｏｌ）およびＣＨ２Ｃｌ２（２５０ｍＬ）を入れた。メチルクロロホルメート（３．５４ｇ、３７．５ｍｍｏｌ、１．３当量）を反応混合物に添加し、そしてこの混合物を、４８時間攪拌した。Ｈ２Ｏ（１００ｍＬ）を添加し、そしてこの混合物を２０分間攪拌した。二相性混合物を分離漏斗に移し、そして相分離した。水相を、ＣＨ２Ｃｌ２（３×５０ｍＬ）で再抽出し、そして合わせた有機相を、Ｈ２Ｏ（５０ｍＬ）、鹹水（５０ｍＬ）で洗浄し、乾燥し（ＭｇＳＯ４）、濾過し、そして濃縮して僅かに黄色のオイルを得た。この粗製物質を、フラッシュクロマトグラフィーにより精製し（ＳｉＯ２、溶出には４０％酢酸エチル／ヘキサン）、無色のオイルとして表題の化合物を得た（９．１７ｇ、８６％）。
（他の適切なキャッピング基（アシルクロライド、イソシアナート、スルホニルクロライド）を、式Ｉのその他の化合物を得るために、この工程で、クロロホルネートに置き換え得る。）
（実施例６：（Ｒ）−４−（３−シアノ−ベンジル）−４−メトキシカルボニルアミノ−ｐｅｎｔ−（Ｅ）−エン二酸−１−ｔｅｒｔ−ブチルエステル（５）の調製）
テフロン（登録商標）で被覆した電磁攪拌バーおよびゴムの隔壁を含む、オーブンで乾燥した５００ｍＬの丸底フラスコに、ＣＨ２Ｃｌ２（２００ｍＬ）を入れ、そして−７８℃まで冷却した。オキサリルクロライド（４．１ｇ、３３ｍｍｏｌ、１．５当量）を反応混合物に添加し、そして−７８℃で１０分間攪拌した。ＤＭＳＯ（３．４ｇ、４３ｍｍｏｌ、２当量）を滴下により１５分間の時間に亘り添加し、そして−７８℃でさらに１５分間攪拌した。ＣＨ２Ｃｌ２（５０ｍＬ）中に溶解した化合物４（８ｇ、２２ｍｍｏｌ）をシリンジおよびシリンジポンプを用いて、３０分間の時間に亘り滴下により添加した。一旦添加が終了したならば、反応混合物を−７８℃で３０分間攪拌し、そして次にトリエチルアミン（１０ｇ、１０９ｍｍｏｌ、５当量）で処理した。反応混合物を、周囲温度まで温め、そしてさらに２０分間攪拌した。水（５０ｍＬ）を添加し、そしてて２０分間激しく攪拌した。この二相性混合物を、分離漏斗に移し、そして相分離した。水相を、酢酸エチル（３×５０ｍＬ）で再抽出した。合わせた有機相を、０．５Ｎ　ＨＣｌ（１００ｍＬ）、Ｈ２Ｏ（１００ｍＬ）、ＮａＨＣＯ３（飽和）（１００ｍＬ）、鹹水（１００ｍＬ）で洗浄し、乾燥し（ＭｇＳＯ４）、そして丸底フラスコに濾過した。濾液を、（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−メチレン）トリフェニルホスホラン（１２．３ｇ、３３ｍｍｏｌ、１．５当量）で処理し、そして周囲温度で１８時間攪拌した。この反応混合物を濃縮し、そして粗製物質を最小量のＣＨ２Ｃｌ２（約２５ｍＬ）中に溶解し、そしてフラッシュクロマトグラフィーにより精製し（ＳｉＯ２、溶出にはＣＨ２Ｃｌ２、４０％酢酸エチル／ヘキサン）、無色の固体として表題の化合物を得た（７．４ｇ、７３％）。
【０１６１】
（実施例７：（Ｒ）−２−（３−シアノ−ベンジル）−２−メトキシカルボニルアミノ−グルタル酸−５−ｔｅｒｔ−ブチルエステルメトキシカルボニルアミノ−ペンタン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル（６）の調製）
Ｐｄ−ＢａＳＯ４（２３１ｍｇ、５１重量％）およびＭｅＯＨ（２５ｍＬ）の懸濁液を含む丸底フラスコに、化合物５（４５５ｍｇ、０．９８ｍｍｏｌ）を添加した。この不均一混合物を脱気し、そしてフラスコを、７２時間攪拌する前に、数回、Ｈ２で逆充填した（１気圧のＨ２、バルーン）。Ｐｄ触媒を濾し取り、そしてＭｅＯＨで数回すすいだ。濾液を濃縮し、無色の固体として表題の化合物を得た（４０５ｍｇ、８９％）。
【０１６２】
（実施例８：４−（ベンジルオキシカルボニルメチル−カルバモイル）−（Ｒ）−５−（３−シアノ−フェニル）−４−メトキシカルボニルアミノ−ペンタン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル（７）の調製）
テフロン（登録商標）で被覆した磁性の攪拌バーおよびゴムの隔壁を含む丸底フラスコに、化合物６（３８７ｍｇ、１．０３ｍｍｏｌ）、ＥＤＣ（２９６ｍｇ、１．５４ｍｍｏｌ、１．５当量）、ＨＯＢｔ（１７３ｍｇ、１．１３ｍｍｏｌ、１．１当量）、Ｈ−Ｇｌｙ（ＯＢｚｌ）・ＨＣｌ（２７０ｍｇ、１．３４ｍｍｏｌ、１．３当量）、およびアセトニトリル（１０ｍＬ）を入れた。この反応混合物を、ＤＩＥＡ（０．４７７ｍＬ、２．６７ｍｍｏｌ、２．６当量）で処理し、そして１８時間攪拌した。アセトニトリルを真空下で除去し、そして粗製物質を、酢酸エチルおよびＨ２Ｏの混合物で処理し、そして分離漏斗に移した。相分離し、そして水相を酢酸エチル（３×１０ｍＬ）で再抽出した。合わせた有機相を、０．５Ｎ　ＨＣｌ（１０ｍＬ）、Ｈ２Ｏ（１０ｍＬ）、ＮａＨＣＯ３（飽和）（１０ｍＬ）、ブライン（１０ｍＬ）で洗浄し、乾燥し（ＭｇＳＯ４）、濾過および濃縮し、無色の濃厚なオイルとして表題の産物を得た（５２７ｍｇ、９８％）。
（式Ｉのその他の化合物を得るためにこのステップにおいて、その他の適切なアミノ酸（すなわち、β−アラニン（ＯＢｚｌ）、プロリン（ＯＢｚｌ））が置換され得る）。
【０１６３】
（実施例９：４−（カルボキシメチル−カルバモイル）−５−（３−シアノ−フェニル）−（Ｒ）−４−メトキシカルボニルアミノ−ペンタン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル（８）の調製）
Ｐｄ−ＢａＳＯ４（４７ｍｇ）およびＭｅＯＨ（１０ｍＬ）の懸濁液を含む丸底フラスコに、化合物７（５２７ｍｇ、１．０１ｍｍｏｌ）を添加した。反応フラスコを脱気し、３０分間攪拌する前に、数回、Ｈ２で逆充填した（１気圧、バルーン）（反応の次にＴＬＣを行った）。Ｐｄ触媒を濾し取り、そしてＭｅＯＨで数回すすいだ。濾液を濃縮し、無色の固体である表題の化合物を得た（３８３ｍｇ、８８％）。
【０１６４】
（実施例１０：（Ｒ）−５−（３−シアノ−フェニル）−４−（｛［２−エトキシ−１−（Ｎ−ニトロカルバミミドイル）−ピペリジン−（Ｓ）−３−イルカルバモイル］−メチル｝カルバモイル−４−メトキシカルボニルアミノ−ペンタン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル（９）の調製）
テフロン（登録商標）で被覆した磁性の攪拌バーおよびゴムの隔壁を含む丸底フラスコに、化合物８（３６７ｍｇ、０．８４７ｍｍｏｌ）、ＥＤＣ（３２５ｍｇ、１．６９ｍｍｏｌ、２当量）、ＨＯＢｔ（１９４ｍｇ、１．２７ｍｍｏｌ、１．５当量）、ＨＣｌ・Ｈ２Ｎ−Ａｒｇ（ＮＯ２）−ＥｔＡｍｉｎａｌ（４５３ｍｇ、１．６９ｍｍｏｌ、２当量）、およびアセトニトリル（１５ｍＬ）を入れた。この反応混合物を、ＤＩＥＡ（０．７６７ｍＬ、４．４０ｍｍｏｌ、５．２当量）で処理し、そして１８時間攪拌し、そして濃縮した。酢酸エチル（１０ｍＬ）およびＨ２Ｏ（１０ｍＬ）を添加した。この二相の混合物を分離漏斗に移し、相分離した。水相を酢酸エチル（３×１０ｍＬ）で再抽出し、そして合わせた有機相を、０．５Ｎ　ＨＣｌ（１０ｍＬ）、Ｈ２Ｏ（１０ｍＬ）、ＮａＨＣＯ３（飽和）（１０ｍＬ）、ブライン（１０ｍＬ）で洗浄し、乾燥し（ＭｇＳＯ４）、濾過および濃縮し、淡黄色の固体として表題の産物を得た（５０２ｍｇ、９２％）。
【０１６５】
（実施例１１：（Ｒ）−４−（｛［２−エトキシ−１−（Ｎ−ニトロカルバミミドイル）−ピペリジン−（Ｓ）−３−イルカルバモイル］−メチル｝カルバモイル）−５−［３−（Ｎ−ヒドロキシカルバモイル）−フェニル］−４−カルボニルアミノ−ペンタン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル（１０）の調製）
テフロン（登録商標）で被覆した磁性の攪拌バーおよびゴムの隔壁を含む丸底フラスコに、化合物９（４８３ｍｇ、０．７４７ｍｍｏｌ）、ＨＣｌ・Ｈ２ＮＯＨ（５１９ｍｇ、７．４７ｍｍｏｌ）およびＭｅＯＨ（２０ｍＬ）を入れた。この均一な反応混合物を、Ｎ−メチルモルホリン（１．６５ｍＬ、１４．９ｍｍｏｌ）で処理し、そして４８時間攪拌した。この反応混合物を濃縮し、黄色の固体を得、これを、Ｈ２Ｏ／アセトニトリル（１０ｍＬ／５ｍＬ）に溶解し、そして調製ＨＰＬＣ（Ｃ１８、アセトニトリル／Ｈ２Ｏ（０．１％ＴＦＡ勾配で溶出））により精製し、凍結乾燥後、白色の綿毛状固体として表題の産物を得た（３６３ｍｇ、５３％）。
【０１６６】
（実施例１２：（Ｒ）−４−｛［１−カルバミミドイル−２−エトキシ−ピペリジ−（Ｓ）−３−イルカルバモイル）−メチル］−カルバモイル｝−５−（３−ジアミノメチル−フェニル−４−メトキシカルボニルアミノ−ペンタン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル（１１））
１０％Ｐｄ−Ｃ（１１ｍｇ、２０重量％）およびＥｔＯＨ／ＡｃＯＨ／Ｈ２Ｏ（１０：２：１）（１０ｍＬ）の溶液の懸濁物を含む高圧反応容器に、化合物１０（５５ｍｇ、８．１×１０−５ｍｏｌ）を添加した。反応容器を脱気し、４８時間攪拌する前に、数回、Ｈ２（５０ｐｓｉ）で逆充填した（反応の次に質量分析法を行った）。Ｐｄ触媒を濾し取り、そしてＭｅＯＨで数回すすいだ。濾液を濃縮し、無色の固体を得（４５ｍｇ、８９％）、これを、調製ＨＰＬＣ（Ｃ１８、アセトニトリル／Ｈ２Ｏ（０．１％ＴＦＡ勾配で溶出））により精製し、凍結乾燥後、白色の綿毛状固体として表題の化合物を得た（２１ｍｇ）。
【０１６７】
（実施例１３：（Ｒ）−５−（３−ジアミノメチル−フェニル）−４−｛［１−ホルミル−（Ｓ）−４−グアニジノ−ブチルカルバモイル−メチル］−カルバモイル｝−４−メトキシカルボニルアミノ−ペンタン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル（１２）の調製）
丸底フラスコに、化合物１１（１２．５ｍｇ、０．０１５ｍｍｏｌ）および６Ｎ　ＨＣｌ（０．４ｍＬ）を入れた。この反応混合物を、０．５時間攪拌し（ＨＰＬＣによりモニターした）、Ｈ２Ｏ（５ｍＬ）で希釈し、そして調製クロマトグラフィー（逆相Ｃ１８、アセトニトリル／Ｈ２Ｏ（０．１％ＴＦＡ））により精製し、凍結乾燥後、白色の綿毛状固体として表題の化合物を得た（８．４ｍｇ）。
【０１６８】
（実施例Ａ：　マトリプターゼまたはＭＴＳＰ１のセリンプロテアーゼ活性の阻害を決定するためのアミド分解性（ａｍｉｄｏｌｙｔｉｃ）アッセイ）
ＭＡＰによるアミド分解性活性のインヒビター誘導性阻害を、ＩＣ５０値によって測定されるように決定することによって、ｒＭＡＰ触媒活性のインヒビターとして作用する本発明の化合物の能力を評価した。
【０１６９】
アッセイ緩衝液は、ＨＢＳＡ（１０ｍＭ　Ｈｅｐｅｓ、１５０ｍＭ塩化ナトリウム（ｐＨ７．４）、０．１％　ウシ血清アルブミン）であった。他で示さない限り、全ての試薬を、Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ．（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）より得た。
【０１７０】
以下の２つのＩＣ５０アッセイを実施した：（ａ）３０分間または６０分間のいずれでのアッセイ（試験化合物と酵素との３０分間または６０分間のプレインキュベーション）；および（ｂ）０分間でのアッセイ（試験化合物と酵素とのプレインキュベーションなし）。３０分間または６０分間のいずれかでのＩＣ５０アッセイについて、以下の試薬を、Ｃｏｒｎｉｎｇマイクロタイタープレートの適切なウェル中で合わせた：５０μｌのＨＢＳＡ、５０μｌの試験化合物（ＨＢＳＡ中で希釈した（広い濃度範囲をカバーする）またはＨＢＳＡ単独（阻害のない速度測定のために））、緩衝液で希釈した５０μｌのｒＭＡＰ（Ｃｏｒｖａｓ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）。これは、活性部位濾過によって決定される場合、２５０ｐＭの最終酵素濃度を生じる。周囲温度での３０分間または６０分間のいずれかでのインキュベーションに続いて、各ウェルに５０μｌの基質Ｓ−２７６５（Ｎ−α−ベンジルオキシカルボニル−Ｄ−アルギニル−Ｌ−グリシル−Ｌ−アルギニン−ｐ−ニトロアニリンジヒドロクロリド；ＤｉａＰｈａｒｍａ　Ｇｒｏｕｐ，Ｉｎｃ．；Ｆｒａｎｋｌｉｎ，ＯＨ）の添加によって、アッセイを開始した。これは、２００μｌの最終アッセイ容量および１００μＭの最終基質濃度（Ｋｍの約４倍）を生じる。アッセイ混合物の添加前、Ｓ−２７６５を、脱イオン水中で再構成し、ＨＢＳＡ中で希釈した。０分でのＩＣ５０アッセイについて、同一の試薬を合わせた：５０μｌのＨＢＳＡ、５０μｌの試験化合物（ＨＢＳＡ中で希釈した（同一の濃度範囲をカバーする）またはＨＢＳＡ単独（阻害のない速度測定のために））、および５０μｌの基質Ｓ−２７６５。このアッセイを、５０μｌのｒＭＡＰの添加により開始した。全ての成分の最終濃度は、両方のＩＣ５０アッセイ（３０分間または６０分間、および０分間）において同一であった。
【０１７１】
発色性基質加水分解の最初の速度を、Ｔｈｅｒｍｏ　Ｍａｘ（登録商標）Ｋｉｎｅｔｉｃ　Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ　Ｒｅａｄｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用する５分間にわたる４０５ｎｍでの吸光度の変化によって、両方のアッセイにおいて測定した。ここで、添加された５％未満の基質が利用された。加水分解の最初の速度において５０％減少を生じた添加したインヒビターの濃度を、これら２つのアッセイ（３０分間または６０分間、および０分間）の各々におけるそれぞれのＩＣ５０値として規定した。
【０１７２】
本発明の特定の化合物の結果を、表Ｉに報告する。
【０１７３】
（Ｂ．特異性決定のためのインビトロ酵素アッセイ）
実施例Ａに記載したように、マトリプターゼ活性を５０％阻害する試験化合物の濃度（ＩＣ５０）を決定し、そして、以下のセリンプロテアーゼの全てまたはいくつかについて測定したＩＣ５０値とマトリプターゼに対するＩＣ５０値とを比較することによって、マトリプターゼ活性の選択的インヒビターとして作用する化合物の能力を評価した：トロンビン、組換え組織プラスミノゲン活性化因子（ｒｔ−ＰＡ）、プラスミン、活性化プロテインＣ、キモトリプシン、第Ｘａ因子およびトリプシン。
【０１７４】
全てのアッセイに使用した緩衝液は、ＨＢＳＡ（１０ｍＭ　Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、０．１％　ウシ血清アルブミン）であった。
【０１７５】
５０μｌのＨＢＳＡ、特定の濃度の５０μｌの試験化合物（ＨＢＳＡ中で希釈した（広い濃度範囲をカバーする）またはＨＢＳＡ単独（Ｖ０Ｃ（（阻害のない速度測定）のために））、およびＨＢＳＡ中で希釈した５０μｌの酵素を、Ｃｏｒｎｉｎｇマイクロタイタープレートの適切なウェル中と合わせることによって、ＩＣ５０決定のためのアッセイを実施した。周囲温度での３０分間のインキュベーションに続いて、以下に特定した濃度での基質５０μｌを、ウェルに添加し、２００μｌの最終容量を得た。発色性基質加水分解の最初の速度を、Ｔｈｅｒｍｏ　Ｍａｘ（登録商標）Ｋｉｎｅｔｉｃ　Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ　Ｒｅａｄｅｒを使用する５分間にわたる４０５ｎｍでの吸光度の変化によって、両方のアッセイにおいて測定した。ここで、添加した５％未満の基質が利用された。加水分解の最初の速度において５０％減少を生じた添加したインヒビターの濃度を、ＩＣ５０値として規定した。
【０１７６】
（トロンビン（ｆＩＩａ）アッセイ）
発色性基質であるＰｅｆａｃｈｒｏｍｅ　ｔ−ＰＡ（ＣＨ３ＳＯ２−Ｄ−ヘキサヒドロチロシン−グリシル−Ｌ−アルギニン−ｐ−ニトロアニリン、Ｐｅｎｔａｐｈａｒｍ　Ｌｔｄ．より入手）を使用して、酵素活性を測定した。この基質を、使用前に脱イオン水中で再構成した。精製したヒトα−トロンビンを、Ｅｎｚｙｍｅ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．より得た。全てのアッセイについて使用した緩衝液は、ＨＢＳＡ（１０ｍＭ　Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、０．１％　ウシ血清アルブミン）であった。
【０１７７】
ＩＣ５０値測定を行った。ここでは、ＨＢＳＡ（５０μｌ）、α−トロンビン（５０μｌ）（最終濃度０．５ｎＭ）およびインヒビター（５０μｌ）（広い濃度範囲をカバーする））を、適切なウェル中で合わせ、そして室温で３０分間インキュベーションした後、基質Ｐｅｆａｃｈｒｏｍｅ　ｔ−ＰＡ（５０μｌ）（最終基質濃度２５０μＭ、Ｋｍの約５倍）を添加した。Ｐｅｆａｃｈｒｏｍｅ　ｔ−ＰＡ加水分解の最初の速度を、Ｔｈｅｒｍｏ　Ｍａｘ（登録商標）Ｋｉｎｅｔｉｃ　Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ　Ｒｅａｄｅｒを使用する５分間にわたる４０５ｎｍでの吸光度の変化によって測定した。ここで、添加した５％未満の基質が利用された。加水分解の最初の速度において５０％減少を生じた添加したインヒビターの濃度を、ＩＣ５０値として規定した。
【０１７８】
（第Ｘａ因子）
発色性の基質Ｓ−２７６５（Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−Ｄ−アルギニン−Ｌ−グリシン−Ｌ−アルギニン−ｐ−ニトロアニリン）（ＤｉａＰｈａｒｍａ　Ｇｒｏｕｐ（Ｆｒａｎｋｌｉｎ，ＯＨ）より得た）を使用して、第Ｘａ因子触媒活性を測定した。全ての基質を、使用前に脱イオン水中で再構成した。Ｓ−２７６５の最終濃度は２５０ｎＭ（Ｋｍの約５倍）であった。精製したヒト第Ｘ因子をＥｎｚｙｍｅ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｓｏｕｔｈ　Ｂｅｎｄ，ＩＮ）より得、そして第Ｘａ因子（ＦＸａ）を、記載［Ｂｏｃｋ，Ｐ．Ｅ．，Ｃｒａｉｇ，Ｐ．Ａ．，Ｏｌｓｏｎ，Ｓ．Ｔ．，ａｎｄ　Ｓｉｎｇｈ，Ｐ．Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．２７３：３７５−３８８（１９８９）］されるように活性化し、そしてそこから調製した。この酵素を、ＨＢＳＡ中に希釈した後、最終濃度０．２５ｎＭでアッセイした。
【０１７９】
（組換え組織プラスミノゲン活性化因子（ｒｔ−ＰＡ）アッセイ）
基質Ｐｅｆａｃｈｒｏｍｅ　ｔ−ＰＡ（ＣＨ３ＳＯ２−Ｄ−ヘキサヒドロチロシン−グリシル−Ｌ−アルギニン−ｐ−ニトロアニリン、Ｐｅｎｔａｐｈａｒｍ　Ｌｔｄ．から入手）を使用して、ｒｔ−ＰＡ触媒活性を測定した。この基質を、脱イオン水中で構成した後、ＨＢＳＡ中に希釈して、最終濃度５００μＭ（Ｋｍの約３倍）でアッセイした。ヒトｒｔ−ＰＡ（Ａｃｔｉｖａｓｅ（登録商標））を、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ　Ｉｎｃ．より得た。この酵素を脱イオン水中で再構成し、そしてＨＢＳＡ中に希釈した後、最終濃度１．０ｎＭでアッセイした。
【０１８０】
（プラスミンアッセイ）
ＤｉａＰｈａｒｍａ　ｇｒｏｕｐより得た発色性の基質であるＳ−２３６６（Ｌ−ピログルタミル−Ｌ−プロピル−Ｌ−アルギニン−ｐ−ニトロアニリンヒドロクロリド）を使用して、プラスミン触媒活性を測定した。この基質を、脱イオン水中で構成した後、ＨＢＳＡ中に希釈して、最終濃度３００μＭ（Ｋｍの約２．５倍）でアッセイした。精製したヒトプラスミンを、Ｅｎｚｙｍｅ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．より得た。この酵素をＨＢＳＡ中に希釈した後、最終濃度１．０ｎＭでアッセイした。
【０１８１】
（活性化プロテインＣ（ａＰＣ）アッセイ）
Ｐｅｎｔａｐｈａｒｍ　Ｌｔｄ．より得た発色性の基質であるＰｅｆａｃｈｒｏｍｅ　ＰＣ（Δ−カルボベンジルオキシ−Ｄ−リジン−Ｌ−プロリル−Ｌ−アルギニン−ｐ−ニトロアニリンジヒドロクロリド）を使用して、ａＰＣ触媒活性を測定した。この基質を、脱イオン水中で構成した後、ＨＢＳＡ中に希釈して、最終濃度４００μＭ（Ｋｍの約３倍）でアッセイした。精製したヒトａＰＣを、Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｉｃ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．より得た。この酵素をＨＢＳＡ中に希釈した後、そして最終濃度１．０ｎＭでアッセイした。
【０１８２】
（キモトリプシンアッセイ）
ＤｉａＰｈａｒｍａ　ｇｒｏｕｐより得た発色性の基質であるＳ−２５８６（メトキシ−スクシニル−Ｌ−アルギニン−Ｌ−プロリル−Ｌ−チロシル−ｐ−ニトロアニリド）を使用して、キモトリプシン触媒活性を測定した。この基質を、脱イオン水中で作製した後、ＨＢＳＡ中に希釈して、最終濃度１００μＭ（Ｋｍの約９倍）でアッセイした。精製した（３Ｘ−結晶化した；ＣＤＩ）ウシ脾臓α−キモトリプシンを、Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｒｐ．より得た。この酵素を脱イオン水中で再構成し、そしてＨＢＳＡ中に希釈した後、最終濃度０．５ｎＭでアッセイした。
【０１８３】
（トリプシンアッセイ）
ＤｉａＰｈａｒｍａ　ｇｒｏｕｐより得た発色性の基質であるＳ−２２２２（ベンゾイル−Ｌ−イソロイシン−Ｌ−グルタミン酸−［γ−メチルエステル］−Ｌ−アルギニン−ｐ−ニトロアニリド）を使用して、トリプシン触媒活性を測定した。この基質を、脱イオン水中で作製した後、ＨＢＳＡ中に希釈して、最終濃度２５０μＭ（Ｋｍの約４倍）でアッセイした。精製した（３Ｘ−結晶化した；ＴＲＬ３）ウシ脾臓トリプシンを、Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｒｐ．より得た。この酵素を脱イオン水中で再構成し、そしてＨＢＳＡ中に希釈した後、最終濃度０．５ｎＭでアッセイした。
【０１８４】
表Ｉは、図５Ａおよび５Ｂに示した特定の化合物について、上記に列挙した特定の酵素に対して測定したＩＣ５０値を列挙し、そして他のセリンプロテアーゼと比較してマトリプターゼ阻害について高度な特異性を例証する。
【０１８５】
【表１】
2004509085.tif 000024
Ａ＝１００ｎＭ未満
Ｂ＝１００〜２５０ｎＭ
Ｃ＝２５０〜５００ｎＭ
Ｄ＝５００〜２５００ｎＭ
Ｅ＝２５００ｎＭより高い
Ｆ＝不活性
ＮＴ＝試験しなかった。
【図面の簡単な説明】
【図１Ａ】
図１Ａ〜１Ｃは、マトリプターゼの特定の好ましい選択的インヒビターを表す。
【図１Ｂ】
図１Ａ〜１Ｃは、マトリプターゼの特定の好ましい選択的インヒビターを表す。
【図１Ｃ】
図１Ａ〜１Ｃは、マトリプターゼの特定の好ましい選択的インヒビターを表す。
【図２Ａ】
図２Ａおよび２Ｂは、図１Ａの化合物６の合成のための反応スキームを表す。
【図２Ｂ】
図２Ａおよび２Ｂは、図１Ａの化合物６の合成のための反応スキームを表す。
【図３】
図３Ａ〜３Ｃは、実施例１に記載されるように、ヒト腺癌細胞株ＰＣ−３からクローニングされた、組換えマトリプターゼまたは組換えＭＴＳＰ１（ｒＭＡＰ）のセリンプロテアーゼドメイン全体をコードするｃＤＮＡフラグメントについての、核酸配列（配列番号１）および対応するアミノ酸配列（配列番号２）を表す。
【図４Ａ】
図４Ａおよび４Ｂは、本発明の化合物の合成のための反応スキームを表す。この反応スキームは、実施例３〜１３にさらに記載されている。
【図４Ｂ】
図４Ａおよび４Ｂは、本発明の化合物の合成のための反応スキームを表す。この反応スキームは、実施例３〜１３にさらに記載されている。
【図５Ａ】
図５Ａおよび５Ｂは、マトリプターゼまたはＭＴＳＰ１のセリンプロテアーゼ活性の特定のインヒビターを表す。
【図５Ｂ】
図５Ａおよび５Ｂは、マトリプターゼまたはＭＴＳＰ１のセリンプロテアーゼ活性の特定のインヒビターを表す。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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2004509085.tif 000124
2004509085.tif 000125
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