(57)【要約】Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）Ｅ２の糖蛋白質に結合でき、動物モデルにおいて生体内のＨＣＶ感染を中和できるヒト抗体を産生するハイブリドーマ細胞系と同様に当該細胞系が産生する抗体を開示する。同様に前記抗体のＨＣＶ感染の防止および治療にて種々の利用を開示する。抗ＨＣＶ　Ｅ２抗体の高力価を有するヒト提供者から得た末梢血リンパ球をＥｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒウイルスにより生体外で形質転換させ、次いでヘテロ骨髄腫細胞と融合してＨＣＶ　Ｅ２糖蛋白質に高い親和性および特異性を持つヒト抗体を分泌するハイブリドーマを生成させる。
2004504066.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）ＨＣＶエンベロープ糖蛋白質に結合でき、生体内でＨＣＶ感染を中和できるヒトモノクローナル抗体、
（ｂ）Ｅｕｒｏｐｅａｎ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｃｅｌｌ　Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＥＣＡＣＣ）に受け入れ番号０００５１７１４で寄託したハイブリドーマ細胞系が分泌するヒトモノクローナル抗体ＨＣＶ−ＡＢ　６８またはＨＣＶ−ＡＢ　６８の抗原結合特性を保持しているその断片、
（ｃ）そのアミノ酸配列が図４（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４）に記述されている重鎖可変領域およびそのアミノ酸配列が図４（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３）に記述されている軽鎖可変領域を少なくとも含むヒトモノクローナル抗体またはその断片、からなる群より選んだヒトモノクローナル抗体。
【請求項２】
２０００年５月１７日に、受け入れ番号０００５１７１４でＥＣＡＣＣに寄託した、ハイブリドーマ細胞系。
【請求項３】
請求項１記載の抗体に結合した、抗原。
【請求項４】
請求項１の抗体の治療上における効果量および医薬品で許容されている担体を含む、医薬品組成物。
【請求項５】
ＨＣＶ感染の治療および／または防止用の医薬品組成物を調製用する際の、請求項１の抗体の使用。
【請求項６】
ＨＣＶ感染の治療用医薬品組成物を調製する際の、請求項１の抗体の使用。
【請求項７】
追加活性成分として少なくとも一つの他の抗ウイルス薬剤、好ましくはインターフェロン、抗ＨＣモノクローナル抗体、抗ＨＣポリクローナル抗体、ＲＮＡポリメラーゼ阻害剤、プロテアーゼ阻害剤、ＩＲＥＳ阻害剤、ヘリカーゼ阻害剤、アンチセンス化合物およびリボチームからなる群より選択する前記薬剤と組み合わせた、請求項１の抗体を治療上における効果量を含む医薬品組成物。
【請求項８】
当該抗ウイルス薬剤が小分子である、請求項７記載の医薬品組成物。
【請求項９】
ＨＣＶ感染を治療する際の医薬品組成物を調製するための抗ウイルス薬剤、好ましくはインターフェロン、抗ＨＣモノクローナル抗体、抗ＨＣポリクロナール抗体、ＲＮＡポリメラーゼ阻害剤、プロテアーゼ阻害剤、ＩＲＥＳ阻害剤、ヘリカーゼ阻害剤、免疫調節剤、アンチセンス化合物およびリボチームからなる群より選択する前記薬剤との組み合わせにおける、請求項１の抗体の使用。
【請求項１０】
医薬品で許容されている担体とともに活性成分として請求項１のとおりの抗体を含む、ＨＣＶ感染の治療用の医薬品組成物。
【請求項１１】
追加活性成分として少なくとも一つの他の抗ウイルス薬剤、好ましくはインターフェロン、抗ＨＣモノクローナル抗体、抗ＨＣポリクロナール抗体、ＲＮＡポリメラーゼ阻害剤、プロテアーゼ阻害剤、ＩＲＥＳ阻害剤、ヘリカーゼ阻害剤、免疫調節剤、アンチセンス化合物およびリボチームからなる群より選択される前記薬剤と組合せた請求項１の抗体を治療上における効果量を含んでなる、ＨＣＶの治療用医薬品組成物。
【請求項１２】
当該抗ウイルス薬剤が小分子である、請求項１１記載の医薬品組成物。
【請求項１３】
請求項１記載の抗体を治療上における効果量を、それを必要とする個体に投与することを含む、ＨＣＶ感染を治療する方法。
【請求項１４】
集団においてＨＣＶ感染の発生を低減するために請求項１のヒトモノクローナル抗体を個体の集団へ投与することを含む、個体の集団におけるＨＣＶ感染の発生を低減するための方法。
【請求項１５】
請求項１１記載の医薬品組成物の治療上における効果量を、それを必要とする個体に投与することを含む、ＨＣＶ感染を治療する方法。
【請求項１６】
請求項１２記載の医薬品組成物の治療上における効果量を、それを必要とする個体に投与することを含む、ＨＣＶ感染を治療する方法。
【請求項１７】
図４に図示したアミノ酸配列を有するモノクローナル抗体ＨＣＶ−ＡＢ　６８の可変領域の軽鎖またはモノクローナル抗体ＨＣＶ−ＡＢ　６８のＨＣＶ結合特異性を維持しているその一部分、であるポリペプチド。
【請求項１８】
図４に図示したアミノ酸配列を有するモノクローナル抗体ＨＣＶ−ＡＢ　６８の可変領域の重鎖またはモノクローナル抗体ＨＣＶ−ＡＢ　６８のＨＣＶ結合特異性を維持しているその一部分、であるポリペプチド。
【請求項１９】
（ａ）Ｅｕｒｏｐｅａｎ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｃｅｌｌ　Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＥＣＡＣＣ）に受け入れ番号０００５１７１４で寄託したハイブリドーマ細胞系が分泌するモノクローナル抗体ＨＣＶ−ＡＢ　６８の鎖をコードしているポリヌクレオチド、
（ｂ）（ａ）で定義した鎖の断片、前記抗体の他鎖または前記抗体の前記他鎖の断片と組み合わせると抗体全体の抗原結合特性を実質的に保持することができる前記断片をコードしているポリヌクレオチド、からなる群より選んだ前記ポリヌクレオチドで、モノクローナル抗体ＨＣＶ−ＡＢ　６８の結合特異性を有する抗体の鎖をコードしている、ポリヌクレオチド。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明の分野
本発明は、Ｃ型肝炎ウイルスエンベロープ糖蛋白質に結合できるヒト抗体を産生するハイブリドーマ細胞系、当該細胞系により産生される抗体およびそれの種々な使用に関する。
【０００２】
本発明の背景
Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）感染は主なる世界的な保健上の問題である。世界中で約１億７０００万人がＨＣＶに感染し、慢性的感染患者は肝硬変および肝細胞ガンを発生する高い危険性を抱えている（Ｃｏｈｅｎ　１９９９　Ｓｃｉｅｎｃｅ　２８５：２６〜３０）。
【０００３】
インターフェロンα単独またはリバビリンとの併用がＨＣＶの治療に用いられ、それぞれ２０％と４０％の間の患者で効果を示す。
【０００４】
ＨＣＶは包膜のあるウイルスで、その遺伝情報は９．５キロ塩基プラス鎖ＲＮＡゲノムにコードされている。３４１塩基対の高度に保存された非コード領域は当ウイルスゲノムの５’末端に局在し、約３，０１０個のアミノ酸のポリ蛋白質をコードしている長いオープンリーディングフレームが続いている。二つの推定上のエンベロープ糖蛋白質、Ｅ１（ｇｐ３５）およびＥ２（ｇｐ７２）は５または６個および１１個のＮ結合グリコシル化部位でそれぞれ同定されている。高レベルの遺伝的可変性はエンベロープ遺伝子と関連している。これはＨＶＲ１およびＨＶＲ２と名付けた超可変領域である当該Ｅ２遺伝子の５’−末端において強度に強調されていることが説明されている（Ｋａｔｏ他、１９９２　Ｂｉｏｃｈ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１８９：１１９〜１２７）。
【０００５】
哺乳類細胞で発現したＨＣＶ　Ｅ１〜Ｅ２蛋白質を用いた研究では、感染した個人がＨＣＶ　Ｅ２へ抗体反応を有することを示した（Ｈａｒａｄａ他、１９９４　Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７６：１２２３〜１２３１）。最近の研究ではＨＣＶ感染患者からの血清中に中和抗体が存在することを示している（Ｒｏｓａ他、１９９６　ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）９３：１７５９〜１７６３；Ｚｉｂｅｒｔ他、１９９５　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　２０８：６５３〜６６１；Ｚｉｂｅｒｔ他、１９９７　Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１：４１２３〜４１２７）。
【０００６】
研究者はウイルスが生体外では生育しないので、ウイルス中和につき洞察するのに代用検定法を採用した（Ｈｏｕｇｈｔｏｎ．Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ　Ｃ　ウイルス、Ｉｎ　Ｆｉｅｌｄｓ　ＢＮ，Ｋｎｉｐｅ　ＤＭ，Ｈｏｗｌｅｙ　ＰＭ（編者）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ページ１０３５〜１０５８）。一つの代用検定法、結合中和（ＮＯＢ）検定法では与えられた抗体または血清がＨＣＶ　Ｅ２蛋白質とヒトＴ細胞系の会合を防止する能力を評価する（Ｒｏｓａ他、１９９６　ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）９３：１７５９〜１７６３）。
【０００７】
Ｈａｂｅｒｓｅｔｚｅｒ他、１９９８　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　２４９：３２〜４１は、生体外でＨＣＶ　Ｅ２とヒト細胞の相互作用を阻害できるヒトモノクローナル抗体を記述している。
【０００８】
Ｂｕｒｉｏｎｉ他、１９９８　Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ　２８：８１０〜８１４は、生体外でＨＣＶとヒト細胞の相互作用を同様に阻害できるＨＣＶ　Ｅ２蛋白質に対するヒト組換えＦａｂｓを報告している。
【０００９】
ＰＣＴ出願特許ＷＯ　２００００５２６６では、ＨＣＶ　Ｅ２のコンフォメーション依存性エピトープを特異的に識別し、Ｅ１／Ｅ２複合体を沈殿させることができるヒト抗体の可変領域の少なくとも一つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む抗体を開示している。
【００１０】
ＰＣＴ出願特許ＷＯ　９７４０１７６では、組合せ抗体ライブラリーを用いて得たＨＣＶ　Ｅ２に結合できる組換えヒト抗体Ｆａｂ部分を開示している。ＨＣＶ感染の治療に対するそのような抗体の適切さを示すのは依然として必要である。
【００１１】
そこで、生体内のＨＣＶ感染を中和でき、Ｅ２糖蛋白質に対して指向するヒトモノクローナル抗体（Ｍａｂｓ）を同定するのはかなり興味を引くことである。そのような抗体はＨＣＶ感染の治療に対する新しい代替物になるだろう。
【００１２】
Ｃａｒｄｏｓｏ他、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｖｉｒｏｌ．５５，２８〜３４（１９９８）では、Ｃ型肝炎ウイルスエンベロープ糖蛋白質に結合することができるヒトモノクローナル抗体の単離につき記述している。記述された抗体（４Ｆ７）の一つは更に特性化され配列決定されたが、これが本発明の主題である。
【００１３】
本発明の概要
本発明では、Ｃ型肝炎ウイルスエンベロープ糖蛋白質Ｅ２に結合することができ、動物モデルでは生体内でＨＣＶ感染を中和できるヒト抗体を分泌するハイブリドーマ細胞系を提供する。当発明では、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）は抗ＨＣＶ　Ｅ１／Ｅ２抗体を有するヒト個人から得た。ヒト提供者からのＰＢＭＣは全血提供またはロイコホレシス（ｌｅｕｋｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）のどちらかで得た。それから当該ヒトＰＢＭＣは細胞外でＥｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒウイルス（ＥＢＶ）により形質転換される（Ｓｉｍｏｎｅｉｔ他、１９９４　Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ　１３：９〜１３）。形質転換後、得られた抗ＨＣＶ産生リンパ芽球細胞を細胞外で好ましくはヘテロ骨髄腫のようなヒト−マウス融合パートナーと当分野で良く知られている方法で融合させる（例えば、Ｋｏｈｌｅｒ　＆　Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５〜４９７，１９７５）。生じたハイブリドーマ細胞系は生体外で適切な培地でインキュベートして望むモノクローナル抗体を上澄み液から回収するか、または当該ハイブリドーマ細胞系をマウスに腹腔内注射して悪性腹水またはそれらのマウスの血清から当該抗体を採取する。当該ハイブリドーマ細胞系の上澄み液につき抗体結合用の基質としてＨＣＶ　Ｅ１／Ｅ２を用い、抗ＨＣＶ　Ｅ１／Ｅ２抗体の存在を固相酵素免疫検定法（ＥＬＩＳＡ）または放射線免疫検定法（ＲＩＡ）のような当分野で知られている方法のいずれかにより選別する。こうして産生したヒトモノクローナル抗ＨＣＶ　Ｅ１／Ｅ２抗体を更にＨＣＶ感染の小動物モデルにおいて当該ウイルス中和またはウイルス量を低減させる能力につき試験をする。ウイルス中和またはウイルス量の低減は、例えば動物血清中のＨＣＶ　ＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ分析またはＨＣＶ陽性マウスの数により測定すればよい。
【００１４】
本発明の好ましい実施形態では、受け入れ番号０００５１７１４でＥｕｒｏｐｅａｎ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｃｅｌｌ　Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＥＣＡＣＣ，ＣＡＭＲ，Ｓａｌｉｓｂｕｒｙ，Ｗｉｌｔｓｈｉｒｅ，ＳＰ４　０ＪＧ，ＵＫ）に２０００年５月１７日に寄託したハイブリドーマ細胞系を提供する。本明細書では“ＨＣＶ−ＡＢ　６８”と称する上記のハイブリドーマ細胞系により分泌された抗ＨＣＶ　Ｅ２ヒトモノクローナル抗体と共に当該抗体の抗原結合特性を保持するその断片も同様に提供する。そのような断片、例えばＦａｂまたはＦ（ａｂ）２断片は、当技術分野では知られており詳しく説明されているように種々な酵素による抗体全体の消化により得ることができる。抗体の抗原結合特性は、ＲＩＡ、ＥＬＩＳＡまたはＦＡＣＳ（蛍光活性化セルソーター）分析などの標準検定法を用いて測定される。本発明の抗体はＢＩＡコア２０００装置（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ）で測定するとき、ＨＣＶ　Ｅ２に対し約１０−９および１０−１１Ｍの範囲という比較的高い親和性を持つ。
【００１５】
上記で定義した抗体で結合した抗原が同様に当該発明の態様を構成する。
【００１６】
本発明の更なる態様は、ＨＣＶ−ＡＢ　６８モノクローナル抗体の予防および治療上での種々の利用である。当該発明の本態様では、ＨＣＶ−ＡＢ　６８抗体を含む医薬品組成物は、ＨＣＶ　Ｅ２に結合できる抗体またはその断片の治療上で効果ある量を患者に投与して慢性Ｃ型肝炎患者の治療に用いることができる。治療的に効果ある量とは、ＨＣＶ感染の症状を軽減或いは個体中で循環するウイルス粒子の数を低減するのに効果ある量である。そのような医薬品組成物は、例えばＨＣＶ陽性母体に生まれた新生児の受動的免疫化および肝移植患者における可能性ある再発性ＨＣＶ感染を防止するための受動的免疫化にも同様に使用してもよい。当該発明の更なる態様は、当該発明の抗体の治療上で効果ある量を追加活性成分として少なくとも一つの抗ウイルス薬物と共に含む医薬品組成物である。そのような薬物には、これには限らないがインターフェロン類、抗ＨＣＶモノクローナル抗体、抗ＨＣＶポリクロナール抗体、ＲＮＡポリメラーゼ阻害剤、プロテアーゼ阻害剤、ＩＲＥＳ阻害剤、ヘリカーゼ阻害剤、免疫調節薬、アンチセンス化合物およびリボザイム類を含むことができる。
【００１７】
実例で供した以下の実施例で参照をここで行うが、これは本発明を限定するものではない。
【００１８】
（実施例）
材料および方法
ＥＢＶ形質転換および細胞融合
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）はＨＣＶ感染ヒト血液提供者から得た。当該提供者は第三世代ＥＬＩＳＡ（Ｏｒｔｈｏ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ　Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｇｅｒｍａｎｙ）および同じように補助的試験（ＲＩＢＡ，Ｏｒｔｈｏ　ｏｒＭａｔｒｉｘ，Ａｂｂｏｔｔ）でＨＣＶにつき陽性を示した。本提供者からのＰＢＭＣはＥｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒウイルス（ＥＢＶ）（Ｓｉｅｍｏｎｅｔ　Ｋ他，１９９４，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ　１３：９〜１３）にて形質転換した。当該形質転換で産生したリンパ芽球腫細胞の上澄み液を抗ＨＣＶ　Ｅ１／Ｅ２抗体産生用に選別した。当該選別はＨＣＶ遺伝子型１ａウイルス（Ｈ株）のエンベロープ蛋白質Ｅ１およびＥ２を用いてＥＬＩＳＡにより実施した。陽性クローンをヘテロ骨髄腫細胞系Ｋ６Ｈ６／Ｂ５（Ｃａｒｄｏｓｏ　ＭＳ他，１９９８，Ｊ　Ｍｅｄ　Ｖｉｒｏｌ　５５：２８〜３４）と融合させた。得られたハイブリドーマクローンは上記のように選別し、陽性クローンを限界希釈で３回クローン化し、最終的に抗体産生に展開させた。
【００１９】
ＩｇＧサブクラスの測定
ヒトＩｇＧサブクラスは、精製ヤギＦ（ａｂ）２抗−ヒトＩｇＧ（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）（０．２５μｇ／穴）またはＥ２（バキュロウイルス表現系で実験室にて産生）（０．１μｇ／穴）のいずれかで被覆したプレートを用いたサンドイッチＥＬＩＳＡで測定した。マウス抗ヒトＩｇＧサブクラス（ＩｇＧ１，ＩｇＧ２，ＩｇＧ３，ＩｇＧ４）（Ｓｉｇｍａ）を二次抗体として用い、検出試薬として精製ヤギ抗−マウスＩｇＧペルオキシダーゼ抱合体（Ｚｙｍｅｄ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いた。室温で１時間インキュベートおよび洗浄の後、基質溶液に二塩酸３，３’，５，５’−テトラメチル−ベンジジン（ＴＭＢ）（Ｓｉｇｍａ）を加えた。結果はＥＬＩＺＡリーダーを用い、４５０ｎｍで読み取りをした。
【００２０】
親和定数の測定
精製ＨＣＶ−ＡＢ　６８のＨＣＶ　Ｅ２に対する親和定数（ＫＤ）は、製造業者の指示書に従ってＢＩＡコア２０００装置（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ）により、製造業者が提供した解離速度を測定するＢＩＡ評価３．０ソフトウェアを用いて測定した。
【００２１】
二つの異なる供給源から得たＨＣＶ　Ｅ２蛋白質を用いた：１）Ｅ２　ＣＨＯは、市販で入手できる哺乳類ＣＨＯ細胞にて産生した組換えＨＣＶ遺伝子型１ｂ　Ｅ２蛋白質（Ａｕｓｔｒａｌ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ，ＣＡ；Ｃｏｏ他に基づく、１９９１　ＰＮＡＳ　８８：２４５１）である。これは３３１個のアミノ酸を含みウエスターンブロットにおいて約６０ｋＤのバンドとして電気泳動する切断型蛋白質である。そして２）Ｅ２　ＢＥＶＳは、表現ベクターとしてバキュロウイルスを用い昆虫細胞にて産生した組換えＨＣＶ遺伝子型１ｂ　Ｅ２蛋白質である。当該蛋白質は２７９のアミノ酸を含み、Ｅ２の３’疎水性末端で１５０のアミノ酸を欠いている（これらのアミノ酸は当該蛋白質に溶解性を与え、発現させるために削除されている）。
【００２２】
ウエスターンブロット分析
全ての蛋白質ゲルは既成の４〜１２％ＮｕＰａｇｅ　Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル（Ｎｏｖｅｘ，ＣＡ）を用いて実施した。蛋白質のニトロセルロースへの転移はＸｃｅｌｌ　ＩＩ　ミニセル（Ｎｏｖｅｘ，ＣＡ）を用い、製造業者の推奨に従って実施した。
【００２３】
未変性ゲルにつき、各抗原の２００ｎｇを還元剤なしの未変性試料緩衝液と混合し、負荷する前に３７℃または１００℃にて５分間インキュベートした。還元ゲルでは、抗原の同じ量をβ−メルカプトエタノール（３６０ｍＭ）またはＤＴＴ（５０ｍＭ）を含有する未変性試料緩衝液と混合し、未変性ゲルに対するのと同一のやり方で処理した。
【００２４】
転移に次いで、ブロットをブロッキング用緩衝液（ＰＢＳ／Ｍｉｌｋ／０．０４％Ｔｗｅｅｎ−２０）中で一夜インキュベートし、その後０．５μｇ／ｍｌＨＣＶ−ＡＢ　６８と共に３時間インキュベートした。当該ブロットは阻止用緩衝液で３回洗浄した後、阻止用緩衝液で１：２０，０００に希釈したペルオキシダーゼ抱合ヤギ−抗ヒトＩｇＧと６０分間インキュベートした。ＰＢＳ／０．０４％Ｔｗｅｅｎ−２０で３×５分間洗浄した後、ブロットをＸ線フィルムに曝し、増強した化学ルミネッセンスを用いて現像した。
【００２５】
ＥＬＩＳＡ：
マイクロタイタープレート（Ｆ９６　Ｍａｘｉｓｏｒｐ　Ｎｕｎｃ−Ｉｍｍｕｎｏ　Ｐｌａｔｅ，Ｎｕｎｃ，Ｄｅｎｍａｒｋ）をＰＢＳ中２μｇ／ｍｌのＥ２−ＢＥＶＳ、５０μｌ／穴で被覆した。１μｇ／ｍｌから連続的に希釈した精製ＨＣＶ−ＡＢ　６８を穴に添加し、４℃で毎夜（Ｏ．Ｎ．）インキュベートした。１：２０，０００に希釈したヤギ抗−ヒトＩｇＧペルオキシダーゼ抱合体（Ｚｙｍｅｄ）を二次抗体として用いた。３７℃でのインキュベーションおよび洗浄後一時間で、基質溶液の二塩酸３，３’，５，５’−テトラメチル−ベンジジン（ＴＭＢ，Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を添加した。結果はＥＬＩＳＡリーダーを用いて波長４５０ｎｍにて読み取った。
【００２６】
ヒト感染血清から得たＨＣＶの免疫的沈殿
ＨＣＶ−ＡＢ　６８のＨＣＶ粒子との結合能を測定するのに、免疫磁気分離（ＩＭＳ）検定法が開発された。感染患者から得た血清中に存在するウイルスＨＣＶ粒子を特異な抗体で被覆した磁気ビーズで捕集する。非結合画分から結合画分を磁気的分離した後、これらの粒子は特異的ＲＴ−ＰＣＲ検定法で検出する。
【００２７】
２μｇのＨＣＶ−ＡＢ６８を蛋白質−Ａ磁気粒子（Ｄｙｎａｌ　Ａ．Ｓ．）上に製造業者の指示書どおりに被覆した。ＨＢＶに対して産生したモノクローナル抗体であるＨＢＶ−ＡＢ１７を陰性対照として供した。全ての反応は室温で実施した。抗体被覆ビーズは０．１ＭＮａ−Ｐ緩衝液ｐＨ＝８．１で３回洗浄し、１％ＢＳＡで３０分間阻止し、ＰＢＳ−０．１％ＢＳＡ中に再懸濁する前にＰＢＳ中で再び洗浄した。平行して、感染した個体から得た試験をした血清は、血清抗体を排除するために蛋白質−Ａセファロース（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）で前処理した。これは１０μｌの血清を１０μｌの蛋白質−Ａセファロースと攪拌しながら３０分間インキュベートし、次いで５０００ＲＰＭ遠心分離工程を行って達成された。当該抗体除去血清はその後、抗体被覆磁気ビーズと２時間攪拌しながらインキュベートした。０．１％ＢＳＡ含有ＰＢＳを用いて最終容量２００μｌとした。当該非結合画分から磁気的に分離した結合画分は、最終的に２００μｌＰＢＳに再懸濁する前に１ｍｌのＰＢＳで５回洗浄した。
【００２８】
結合および非結合画分中のウイルス量の評価はＲＴ−ＰＣＲ分析で実施した。ウイルスＲＮＡは製造業者の指示書に従ってＴｒｉ−Ｒｅａｇｅｎｔ　ＢＤ（Ｓｉｇｍａ）を用いて抽出した。ＲＴ反応（最終容量２０μｌ）は４μｌＲＴ緩衝液、１ｍＭ　ｄＮＴＰ’ｓ、１０ｍＭのＤＴＴ、１００Ｕ　ｍＭＬＶ−ＲＴ（Ｐｒｏｍｅｇａ），２．７Ｕ　ＡＭＴ−ＲＴ（Ｐｒｏｍｅｇａ）および２．５ｐＭ　ＨＣＶ抗−センスプライマーＡＴＧＲＴＧＣＴＣＧＧＴＣＴＡを含有した。反応条件は２０分毎に１℃上昇で、３７℃から４２℃までの傾斜を設定した。反応は９４℃で１０分間のインキュベーション工程で終息させた。ＲＴ反応の５μｌをＰＣＲ反応（最終容量５０μｌ）用の鋳型として用いた。ＰＣＲ反応には、５μｌＰＣＲ緩衝液、２．５ｍＭのＭｇＣｌ２、０．２ｍＭのｄＮＴＰ’ｓ、０．２５ＵのＴａｑポリメラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、０．２５ｐＭのセンスプライマーＣＡＣＴＣＣＡＣＣＡＴＲＧＡＴＣＡＣＴＣＣＣおよびアンチセンスプライマーＡＣＴＣＧＣＡＡＧＣＡＣＣＣＴＡＴＣＡＧＧが含有されていた。９４℃で１分間、５８℃で１分間、７２℃で１．５分間の３３回増殖サイクルに最終の７２℃での延長工程を加えて実施した。ＰＣＲ産生物を２％アガロースゲルで分離し、ＥａｇｌｅＥｙｅ　ＩＩ装置にてＥｔＢｒ染色した後に可視化し、定量した。
【００２９】
配列分析
ＲＮＡをＲＮＡｓｏｌ　Ｂ（ＴＥＬ−ＴＥＬ，Ｉｎｃ．）を用いて１０×１０６のハイブリドーマ細胞から単離した。ｃＤＮＡは、標準手順に従い５０μｌ反応容量中で逆転トランスクリプターゼ（ＲＴ）およびオリゴｄＴ（Ｐｒｏｍｅｇａ）により全ＲＮＡの１０μｇから調製した。ＰＣＲはＲＴ反応混合物の１μｌにつき以下の縮重プライマーと共に実施した：
【００３０】
５’リーダープライマー：
重鎖（ＶＨ）：
５’ＧＧＧＡＡＴＴＣＡＴＧＧＡＧＴＴＫＧＧＧＣＴＫＡＧＣＴＧＧＲＴＴＴＴＣ３’
軽鎖
2004504066.tif 000003
５’ＧＧＧＡＡＴＴＣＡＴＧＲＣＣＴＧＳＷＣＹＣＣＴＣＴＣＹＴＹＣＴＳＷＹＣ−３’
または
2004504066.tif 000004
５’ＧＧＧＡＡＴＴＣＡＴＧＧＡＣＡＴＧＲＲＲＤＹＣＣＨＶＧＹＫＣＡＳＣＴＴ−３’
当該３’プライマーはヒト定常領域に一致する：
ＶＨ５’−ＧＣＧＡＡＧＣＴＴＴＣＡＴＴＴＡＣＣＣＲＧＡＧＡＣＡＧＧＧＡＧＡＧ−３’
2004504066.tif 000005
2004504066.tif 000006
通常用いる一文字コードを当該プライマー配列に組み込んだ：
Ｒ＝ＡまたはＧ　Ｓ＝ＣまたはＧ　Ｗ＝ＡまたはＴ　Ｙ＝ＣまたはＴ
Ｄ＝ＡまたはＧまたはＴ　Ｈ＝ＡまたはＣまたはＴ　Ｖ＝ＡまたはＣまたはＧ　Ｋ＝ＧまたはＴ
当該全長重鎖および軽鎖のｃＤＮＡ（当該ＰＣＲ反応生成物）を哺乳類発現プラスミド中にクローン化した。重鎖および軽鎖ＤＮＡの多重独立組合せは組織培養細胞へ形質移入され、当該上澄み液は抗体特異活性検定法用に採取した。重鎖および軽鎖プラスミドの陽性組合せ、即ち抗体活性が生じる組合せを配列決定した。配列はＧｅｎｂａｎｋと比較し、Ｋａｂａｔ配列と配列比較させて分析した（Ｋａｂａｔ他，１９９１，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ　ｏｆ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｏｆ　ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ　ｉｎｔｅｒｅｓｔ（５ｔｈ　Ｅｄ．）Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐｔ．ｏｆ　Ｈｅａｌｔｈ　ｓｅｒｖｉｃｅｓ，Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ　ｏｆ　Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ）。
【００３１】
実施例１
抗ＨＣＶ抗体につき陽性のヒト提供者からの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を得て、上記したようにＥＢＶを用いて細胞外で形質転換させた。当該細胞はそれからヒトマウスヘテロ骨髄腫と融合させてハイブリドーマ細胞系を形成させた。ＨＣＶ−ＡＢ　６８と称する特異的ヒト抗ＨＣＶ　Ｅ１／Ｅ２抗体を分泌する安定なハイブリドーマクローンのひとつを更に特性化した。上記クローンが分泌した抗体はＩｇＧ１であることが判明した。Ｅ２　ＣＨＯに対するＨＣＶ−ＡＢ　６８の親和定数は１．４×１０−１１±０．３であり、Ｅ２　ＢＥＶＳに対しては１．７×１０−９±１であった。特異性はウエスターンブロット分析およびＥＬＩＳＡで試験を行った。ウエスターンブロットではＨＣＶ−ＡＢ　６８はバキュロウイルス発現系（ＢＥＶＳ）および哺乳類発現系（ＣＨＯ細胞）の双方で発現する、異なるＥ２作成物に結合した。図１は、ＨＣＶ−ＡＢ　６８が作成物第２、即ちＨＶＲ１領域なしのＥ２蛋白質を除くと全てのＥ２作成物に結合することを示している。当該抗体はβメルカプトエタノールまたはＤＴＴの存在下ではＥ２に結合しない。これらの結果はＨＣＶ−ＡＢ　６８がコンフォメーションエピトープを認識することを示唆する。更に当該抗体は作成物２（ＨＶＲ１を欠落）には結合しないが、作成物４（ＨＶＲ１，ＩＱＬＩの３’末端における４アミノ酸を除くＨＶＲ１を欠落）には結合する。これらのアミノ酸はＥ２上にある抗体の結合エピトープの一部を形成していると考えられる。表１はＥＬＩＳＡにてＥ２　ＢＥＶＳへのＨＣＶ−ＡＢ　６８の結合特性を示している。
【００３２】
表１：ＥＬＩＳＡによるＥ２へのＨＣＶ−ＡＢ　６８の結合
ＨＣＶ−ＡＢ　６８　　　　　　　　　ＯＤ　４５０ｎｍ
μｇ／ｍｌ
１　　　　　　　　　　　　　　　０．４３９
０．５　　　　　　　　　　　　　０．３６２
０．２５　　　　　　　　　　　　０．３０５
０．１２５　　　　　　　　　　　０．２６７
０．０６２５　　　　　　　　　　０．２０４
０．０３１２５　　　　　　　　　０．１７１
０．０１５６　　　　　　　　　　０．１２
０．００７８　　　　　　　　　　０．０６５
【００３３】
実施例２
当該ＨＣＶ−ＡＢ　６８抗体を、材料および方法の項で説明したような免疫磁気分離法（ＩＭＳ）によりＨＣＶ感染患者の血液から得たＨＣＶ粒子を捕集する際に用いた。二人の患者につき個々の実験を行ったが、各試験は３回行った。患者１のＨＣＶ遺伝型は１ｂであるが、患者２の遺伝子型は１ａ／１ｂである。各血清は１〜５×１０６のＨＣＶ力価を有する。図２は、ＨＣＶ−ＡＢ６８が結合した画分は対照のＨＢＶ−ＡＢ１７が結合した画分より顕著に多い。ＨＣＶ−ＡＢ　６８は当該ウイルス粒子の５０％より多くに結合できるが、対照のＨＢＶ−ＡＢ１７バックグランド結合は１〜５％である（図２Ｂ）。
【００３４】
実施例３
ＨＣＶ−ＡＢ　６８の可変領域をコードしている遺伝子を単離し、全てを配列決定してサブグループおよび相補性決定領域（ＣＤＲｓ）を測定した。Ｇｅｎｅｂａｎｋ配列およびＫａｂａｔ蛋白質配列との配列比較により測定すると、当該抗体は全ヒトＩｇ遺伝子配列を有していた。図３は、ＨＣＶ−ＡＢ　６８の可変領域の重鎖および軽鎖をコードしているｃＤＮＡのヌクレオチド配列を示している（それぞれ配列同定番号１および２）。図４は相当するアミノ酸配列を示す（それぞれ配列同定番号４および３）。当該配列データはＨＣＶ−ＡＢ　６８の可変領域はサブグループＶＨ３ＪＨ４ＶＫ１ＪＫ１からなることを示した。
【００３５】
実施例４
ＨＣＶ−ＡＢ　６８の生物活性を以下のＨＣＶ−Ｔｒｉｍｅｒａ動物モデルを用いて特性化した：マウスはヒト肝臓片の安定した移植ができるように処置を受けた。当該処置には徹底的放射線照射、それに次ぐＳＣＩＤ（重症複合免疫不全症）マウス骨髄の移植が含まれる。ヒト肝臓片のウイルス感染はＨＣＶ陽性ヒト血清を用い、生体外で実施した（米国特許５，８４９，９８７）。当該動物モデルは、当該抗体の種々な使用可能性を表す二つの異なる方法で用いた：治療および感染の防止。
【００３６】
１．治療−当該様式は慢性ＨＣＶ感染を治療するのに抗体を使用する性能を示す。確立したウイルス血症のＴｒｉｍｅｒａマウスにＨＣＶ−ＡＢ　６８または無関係のＨＢＶ−ＡＢ　１７の２種を腹腔内注射で投与した；一匹当たり全４０μｇ　ｍＡｂを、二日連続して与えた（２０μｇ／マウス／日）。処置完了後１日目に採取したマウス血清中のＨＣＶ−ＲＮＡを定量した。図５は、ＨＣＶ−ＡＢ　６８が陽性マウスのパーセント（８５％から４２％へ）および平均ウイルス量（３．１×１０４から１．０×１０４ＨＣＶ　ＲＮＡコピー／ｍｌへ）の双方を減少させることができた。当該無関係ヒトモノクローナル抗体、ＨＢＶ−ＡＢ　１７は当該平均ウイルス量または陽性マウスのパーセントを減少させる能力を全然示さなかった。図６はＨＣＶ−ＡＢ　６８のウイルス量およびＨＣＶ−陽性マウスのパーセントを低減する効果に用量依存性があることを示した。処置後１日目で測定した場合、５μｇ／マウスの全用量はウイルス量を４．２×１０４から１．６×１０４ＨＣＶ　ＲＮＡコピー／マウス血清ｍｌへ、ＨＣＶ−ＲＮＡ陽性マウスのパーセントを７１％から４３％へ低減させた。最大用量（６０μｇ／マウス）は最高の効果を示し、ウイルス量が対数の指数１より大きな低減（４．２×１０４から３．１×１０３コピー／ｍｌ）およびＨＣＶ−陽性マウスのパーセントは７１％から１４％への低減を示した。処置中止後６日目、当該ウイルス量および当該ＨＣＶ−陽性マウスのパーセントは、３用量全てにおいて非処理対照群で見られるレベルよりは顕著に低いレベルではあるが少し戻っていた。この時点で、当該異なる群の平均ウイルス量についても用量反応が依然見られた。
【００３７】
２．感染の防止−本様式では肝臓感染を防止するのに抗体を用いた能力を示す。１０６ＨＣＶ−ＲＮＡコピー／ｍｌを含有するヒト血清の試料０．５ｍｌを２００μｇのＨＣＶ−ＡＢ　６８または非関連性ヒト抗−ＨＢｓＡｇモノクローナル抗体であるＨＢＶ−ＡＢ　１７と共に前インキュベートし（室温で３時間）、その後に生体外にて正常ヒト肝臓片の感染に用いた。感染に引き続き、当該肝臓断片をマウスに移植し、１１または１５日後に血清中のＨＣＶ−ＲＮＡを定量した。図７はＨＣＶによる肝臓感染の防止におけるＨＣＶ−ＡＢ　６８の効果につき、平均ウイルス量およびＨＣＶ−ＲＮＡ陽性マウスのパーセントの両方で示す。ＨＣＶ−ＡＢ　６８はこれらのマウスのパーセントを７５％から４１％に低減した。これはまた平均ウイルス量を２．２×１０４から５．０×１０３ＨＣＶ−ＲＮＡコピー／マウス血清ｍｌに低減した。当該非関連性ヒトモノクローナル抗体、ＨＢＶ−ＡＢ　１７の同量（２００μｇ）では当該陽性マウスのパーセントを低減しないだけでなく当該ウイルス量も低減せず、非処置対照群と同様な結果を与えた（図７）。異なる実験では、移植後１５日目で試料採取した血清で測定するとき、ＨＣＶ−ＡＢ　６８はＨＣＶ陽性マウスのパーセントを７６％から４１％に低減し（ｐ＝０．０５、ｎ＝１７）、当該平均ウイルス量を６．０×１０４から１．１×１０４ＨＣＶ−ＲＮＡコピー／ｍｌに低減した（ｐ＝０．００３）．対照的に、ウエスターンブロット分析（図８Ｂ）で示すと生体外ではＥ２に結合することができる他の抗ＨＣＶヒトモノクローナル抗体４Ｅ５は、ＨＣＶ感染マウスのパーセントおよびＨＣＶ−Ｔｒｉｍｅｒａ動物モデルの平均ウイルス量を低減することができなかった。
【００３８】
実施例５
２種の異なる有望な抗ウイルス薬物の組合せの治療上での効果をＨＣＶ−Ｔｒｉｍｅｒａモデルで試験を行った。当該試験にはマウスの４群が含まれていた．一つの群は抗ウイルス薬Ｉ７０（Ｂｉｏｃｈｅｍ　Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓから入手したもので、ＨＣＶ翻訳を阻害する小さな分子）で処置した。第二群はＨＣＶ−ＡＢ　６８で処置した。第三群は両方の組合せで処置した。四群目は対照として供し、ＤｕｌｂｅｃｃｏのＰＢＳのみを投与した。Ｉ７０処置群では、各マウスは１ｍｇの薬物を肝移植後１０〜１３日に投与した（０．２５ｍｇ／マウス／日を腹腔内投与（ｉ．ｐ．））。ＨＣＶ−ＡＢ　６８処置群においては、各マウスに肝臓移植後の１２〜１３日目に４０μｇの抗体を投与した（２０μｇ／マウス／日腹腔内投与）。組合せ群では、各マウスに上記処置の組合せを投与した。マウス血清中のウイルス量およびＨＣＶ−陽性マウスのパーセントは１４日目（処置後１日目）に測定した。図９は薬物の組合せ使用が治療上有利であることを示している。処置後１日目において、Ｉ７０での処置はＨＣＶ平均ウイルス量を４．７２×１０４から１．４６×１０４に、ＨＣＶ−陽性マウスのパーセントを９３％から５０％に低減したが、ＨＣＶ−ＡＢ　６８での処置はＨＣＶ平均ウイルス量を１．７４×１０４に、ＨＣＶ−陽性マウスパーセントを５０％に低減させた。当該組合せ処置はウイルス量を５．８３×１０３、ＨＣＶ感染動物を２８％まで低減した。
【００３９】
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は、電気泳動の前に種々な条件で処理した数種のＥ２蛋白質へのＨＣＶ−ＡＢ　６８の結合を示すウエスターンブロットの写真である。枠（ａ）および（ｂ）は未変条件において調製したＥ２試料を表示している。枠（ｃ）および（ｄ）はβ−メルカプトエタノール（β−ＭＥ）で処理したＥ２試料を表示している。枠（ｅ）および（ｆ）はＤＴＴで処理したＥ２試料を表示している。枠（ａ）（ｃ）（ｅ）はゲルに負荷する前に３７℃で５分間インキュベートしたＥ２試料を表示しており、枠（ｂ）（ｄ）（ｆ）はゲルに負荷する前に１００℃で加熱したものである。個々のレーンは異なるＥ２作成物から、または異なる発現系を用いて発現した蛋白質を含んでいる：
１　Ｅ２　ＢＥＶＳ．昆虫細胞中で産生した組換えＥ２蛋白質。
２　ＨＶＲ１なしのＥ２　ＢＥＶＳ（超可変領域１）．５’末端において３３個のアミノ酸を欠失している組換えＥ２蛋白質。
３　Ｅ２　ＭＣＳ　ＢＥＶＳ．ＨＣＶの６種遺伝子型全てから得た最も普遍的配列を表す組換えＥ２蛋白質。
４　ＨＶＲ１なしのＥ２　ＭＣＳ　ＢＥＶＳ．４個のアミノ酸を除きＨＶＲ１の大部分を欠失している３にあるような組換えＥ２蛋白質。
５　Ｅ２　ＣＨＯ．ＣＨＯ細胞で産生した組換えＥ２蛋白質。
【図２】
図２は、ＨＣＶ−ＡＢ　６８によりＨＣＶ−感染血清からＨＣＶ粒子の免疫磁気分離（ＩＭＳ）および対照抗体（ＨＣＶ−ＡＢ１７）を表している。図２ＡはＨＣＶ粒子を表現するＰＣＲ産生物を示しているアガロースゲルの写真である。図２ＢはＰＣＲで検出されたウイルスの全量のうち、結合＋非結合中の結合ウイルスのパーセントを図示している。
【図３】
図３は、ＨＣＶ−ＡＢ　６８の可変領域の軽鎖および重鎖の核酸配列を表している。当該遺伝子のＦＷ（骨格）およびＣＤＲｓ（相補性決定領域）は目印をつけてある。
【図４】
図４は、ＨＣＶ−ＡＢ　６８の可変領域の軽鎖（ＶＬ）および重鎖（ＶＨ）のアミノ酸配列を表している。当該遺伝子のＦＷｓおよびＣＤＲｓは目印をつけてある。
【図５】
図５は、非処置群、ＨＣＶ−ＡＢ　６８処置群およびＨＢＶ−ＡＢ　１７で処置した対照群において移植後１２日目における当該平均ウイルス量およびＨＣＶ感染動物のパーセント（括弧内の数）を図示したものである（処置様式において）。
【図６】
図６は、非処置群および異なる用量のＨＣＶ−ＡＢ　６８で処置した群において、移植後１６および２１日目における、当該平均ウイルス量および血清中でＨＣＶ　ＲＴ−ＰＣＲシグナル陽性のＨＣＶ−Ｔｒｉｍｅｒａマウスのパーセント（括弧内の数）を図示したものである。
【図７】
図７は、非処置群、ＨＣＶ−ＡＢ　６８処置群およびＨＢＶ−ＡＢ　１７で処置した対照群につき移植後１１日目の平均ウイルス量および血清中に陽性ＨＣＶ　ＲＴ−ＰＣＲシグナルを伴うＨＣＶ−Ｔｒｉｍｅｒａマウスのパーセント（括弧内の数字）を図示したものである（感染様式の阻害において）。
【図８Ａ】
図８Ａは、異なるＥ２作成物から或いは異なる発現系を用いて発現した数種のＥ２蛋白質に抗ＨＣＶ抗体４Ｅ５の結合を示しているウエスターンブロットの写真である。レーン番号は図１に説明したものに相当する。
【図８Ｂ】
図８Ｂは、非処置群、ＨＣＶ−ＡＢ　６８処置群および４Ｅ５で処置した群において移植後１５日目の平均ウイルス量および血清に陽性ＨＣＶ　ＲＴ−ＰＣＲシグナルを伴うＨＣＶ−Ｔｒｉｍｅｒａマウスのパーセント（括弧内の数字）を図示したものである（感染様式の阻害において）。
【図９】
図９は、非処置群、Ｉ７０で処置した群、ＨＣＶ−ＡＢ　６８で処置した群およびＩ７０およびＨＣＶ−ＡＢ　６８で処置した群における移植後１４日目の平均ウイルス量および血清中に陽性ＨＣＶ　ＲＴ−ＰＣＲシグナルを伴うＨＣＶ−Ｔｒｉｍｅｒａマウスのパーセント（括弧内の数字）を図示したものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ｂ】
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【図９】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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2004504066.tif 000048
【国際調査報告】
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2004504066.tif 000050
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