(57)【要約】コマモナス（Ｃｏｍａｍｏｎａｓ）（以前はシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ））種ＮＣＩＭＢ ９８７２株由来のシクロペンタノン１，２−モノオキシゲナーゼ（ＣＰＭＯ）は、その細菌が増殖のために唯一の炭素源としてシクロペンタノールを用いることを可能にする、分解経路の第２段階を行う。本発明において、４．３ｋｂのＳｐｈＩ断片上でのＣＰＭＯをコードする遺伝子（ｃｐｎＢ）の位置、その配列の決定が報告されている。その遺伝子によりコードされる５５０アミノ酸のＣＰＭＯポリペプチド（分子量６２，１１１）は、アシネトバクター種（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．）ＮＣＩＭＢ ９８７１株のシクロヘキサノン１，２−モノオキシゲナーゼ（ＣＨＭＯ）の配列と、３６．５％の同一性を有することが見出された。６２ｋＤａのＣＰＭＯは、ＩＰＴＧ誘導性タンパク質として大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）において発現された。
2004504025.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離されたＤＮＡが、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、配列番号：８に表されるＤＮＡの相補体に特異的にハイブリダイズする能力を特徴とする、シクロペンタノンモノオキシゲナーゼ（ＣＰＭＯ）をコードする、単離されたＤＮＡまたはその酵素的に活性な部分。
【請求項２】
シクロペンタノンモノオキシゲナーゼ（ＣＰＭＯ）をコードし、かつ以下を含む、単離されたＤＮＡ：
（ａ）配列番号：８の核酸配列；
（ｂ）遺伝暗号の縮退（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）の範囲で該核酸配列に対応する配列；または
（ｃ）ストリンジェントな条件下で、（ａ）または（ｂ）由来の配列にハイブリダイズし、かつさらにシクロペンタノンモノオキシゲナーゼ（ＣＰＭＯ）をコードする配列。
【請求項３】
単離されたＤＮＡが配列番号：８を有する、シクロペンタノンモノオキシゲナーゼ（ＣＰＭＯ）をコードする、単離されたＤＮＡまたはその酵素的に活性な部分。
【請求項４】
配列番号：８に示される配列を特徴とするＤＮＡを含む、酵素的に活性なシクロペンタノンモノオキシゲナーゼ（ＣＰＭＯ）をコードする単離されたＤＮＡ発現ベクター、または該ＣＰＭＯをコードする、発現可能な形のその部分。
【請求項５】
単離されたＤＮＡがシクロペンタノンモノオキシゲナーゼをコードする、請求項１から３のいずれか一項記載の単離されたＤＮＡを含む、組換えベクター。
【請求項６】
単離されたＤＮＡが配列番号：８の核酸配列、または遺伝暗号の縮重（ｄｅｇｅｎｅｒａｃｙ）による、その機能的な等価物である核酸配列を有する、請求項５の組換えベクター。
【請求項７】
請求項１、２または３記載の組換えＤＮＡの、１つまたは複数のコピーを含む、組換えベクター。
【請求項８】
原核生物のベクターである、請求項４、５、６または７記載の組換えベクター。
【請求項９】
プラスミドである、請求項４、５、６または７記載の組換えベクター。
【請求項１０】
請求項１、２または３において定義されるＤＮＡを含む、生物学的に機能的なプラスミドまたはウイルスＤＮＡベクター。
【請求項１１】
請求項４から９のいずれか一項記載の組換えベクターを含む、宿主細胞。
【請求項１２】
配列番号：８に示される配列を特徴とするＤＮＡを含む、酵素的に活性なシクロペンタノンモノオキシゲナーゼ（ＣＰＭＯ）をコードする異種ＤＮＡ発現構築物、または該ＣＰＭＯをコードする、発現可能な形のその部分で形質転換された細胞。
【請求項１３】
原核細胞である、請求項１２において定義される細胞。
【請求項１４】
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）である、請求項１２において定義される細胞。
【請求項１５】
以下を含む、精製されたシクロペンタノンモノオキシゲナーゼ（ＣＰＭＯ）：
（ａ）配列番号：５に示されるアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号：８に示される核酸配列によりコードされる、アミノ酸配列；または
（ｃ）ストリンジェントな条件下で、上記の段階ｂ）の核酸配列に相補的な核酸配列にハイブリダイズする核酸配列によりコードされるアミノ酸配列であり、段階ｃ）においてコードされる該アミノ酸配列が、ａ）におけるアミノ酸配列と同じ活性を有する、アミノ酸配列。
【請求項１６】
天然に存在するものより優れた酵素活性を有する、組換えシクロペンタノンモノオキシゲナーゼ（ＣＰＭＯ）。
【請求項１７】
ＣＰＭＯがコマモナス種（Ｃｏｍａｍｏｎａｓ ｓｐ．）ＮＣＩＭＢ ９８７２から調製される、請求項１６記載の組換えシクロペンタノンモノオキシゲナーゼ（ＣＰＭＯ）。
【請求項１８】
配列番号：５に示される配列を有する、請求項１６記載の組換えシクロペンタノンモノオキシゲナーゼ（ＣＰＭＯ）。
【請求項１９】
天然のシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍａｎｓ）由来のＣＰＭＯのものより２倍優れた酵素活性を有する、請求項１６記載の組換えシクロペンタノンモノオキシゲナーゼ（ＣＰＭＯ）。
【請求項２０】
以下の段階を含む、唯一の炭素源としてシクロペンタノールまたはシクロペンタノンが存在する際に、インビトロで細胞を増殖させるための方法：
（ａ）請求項４、５、６、７、８または９に記載の発現構築物で、細胞を形質転換する段階；および
（ｂ）唯一の炭素源としてシクロペンタノールまたはシクロペンタノンを含む培地において、適する条件下で段階ａ）の細胞を増殖させる段階。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
技術分野
本発明は、シクロペンタノンモノオキシゲナーゼ（ＣＰＭＯ）をコードする単離されたＤＮＡ、またはその酵素的に活性な部分、ならびにその単離ＤＮＡを含む発現ベクターおよび形質転換細胞に関連する。
【０００２】
発明の背景
コマモナス（Ｃｏｍａｍｏｎａｓ）（以前はシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ））種ＮＣＩＭＢ ９８７２は、バイヤー−ビリガー（Ｂａｅｙｅｒ−Ｖｉｌｌｉｇｅｒ）モノオキシゲナーゼを産生することを特徴としてきた数少ない微生物の１つであった（ＢＶＭＯ； Ｇｒｉｆｆｉｎ， Ｍ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｊ． １２９：５９５〜６０３， １９７２； Ｇｒｉｆｆｉｎ， Ｍ．ら、Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ６３：１９９〜２０９， １９７６； および最近の概説として、Ｗｉｌｌｅｔｔｓ， Ａ．， Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ． １５：５５〜６２， １９９７）。ＢＶＭＯは、過酸−触媒されるケトンのエステルまたはラクトンへの酸化である典型的バイヤー−ビリガー有機化学反応を模倣するフラビンタンパク質である。高い収量および光学純度におけるラクトンの生産についての酵素代替物の使用は、化学的方法を生物学的代替法に置き換えるという方向への研究開発の最近の流れにおいて、魅力的な特徴である（Ｓｔｉｎｓｏｎ， Ｓ． Ｃ．， Ｃｈｅｍ． Ｅｎｇ． Ｎｅｗｓ， ８３〜１０４， １９９８）。現在まで、最高の特徴をもつＢＶＭＯ酵素は、アシネトバクター種（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．）ＮＣＩＭＢ ９８７１により産生されるシクロヘキサノンモノオキシゲナーゼ（ＣＨＭＯ）である（Ｓｔｅｗａｒｔ， Ｊ． Ｄ．， Ｃｕｒｒ． Ｏｒｇ． Ｃｈｅｍ． ２：１９５〜２１６， １９９８； Ｗｉｌｌｅｔｔｓ， Ａ．， Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ． １５：５５〜６２， １９９７）。これはまた、遺伝子がクローニングされかつ配列決定された唯一のＢＶＭＯである（Ｃｈｅｎら、Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １７０：７８１〜７８９， １９８８）。最近、この価値ある資源は、様々な不斉バイヤー−ビリガー酸化をもたらすための細胞全体的アプローチにおける「デザイナー酵母（ｄｅｓｉｇｎｅｒ ｙｅａｓｔ）」を設計するために用いられた（Ｓｔｅｗａｒｔ， Ｊ． Ｄ．ら、Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． １２０：３５４１〜３５４８， １９９８）。
【０００３】
唯一の炭素源としてシクロペンタノールまたはシクロペンタノンを含む培地において細胞を増殖させるために、増大した酵素活性を有する新しいＣＰＭＯが提供されることは、大いに望ましいと思われる。
【０００４】
発明の概要
本発明の一つの目的は、唯一の炭素源としてシクロペンタノールまたはシクロペンタノンを含む培地において細胞を増殖させるために、増大した酵素活性を有する新しいＣＰＭＯを提供することである。
【０００５】
本発明に従って、シクロペンタノンモノオキシゲナーゼ（ＣＰＭＯ）をコードする単離されたＤＮＡ、またはその酵素的に活性な部分が提供され、その単離されたＤＮＡは、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で配列番号：８において表されるＤＮＡの相補体に特異的にハイブリダイズする能力を特徴とする。
【０００６】
また、本発明に従って、シクロペンタノンモノオキシゲナーゼ（ＣＰＭＯ）をコードし、かつ以下を含む、単離されたＤＮＡが提供される：
（１）配列番号：８の核酸配列；
（２）遺伝暗号の縮退の範囲における該核酸配列に対応する配列；または
（３）ストリンジェントな条件下で（１）または（２）由来の配列にハイブリダイズし、かつなおシクロペンタノンモノオキシゲナーゼ（ＣＰＭＯ）をコードする配列。
【０００７】
さらに本発明に従って、シクロペンタノンモノオキシゲナーゼ（ＣＰＭＯ）をコードする単離されたＤＮＡ、またはその酵素的に活性な部分が提供され、該単離されたＤＮＡは配列番号：８を有する。
【０００８】
本発明は、さらにまた、配列番号：８に示される配列を特徴とするＤＮＡを含む酵素的に活性なシクロペンタノンモノオキシゲナーゼ（ＣＰＭＯ）をコードする単離されたＤＮＡ発現ベクター、または部分が該ＣＰＭＯをコードする、発現可能な形でのその部分を提供する。
【０００９】
本発明に従って、上記のような単離されたＤＮＡを含む組換えベクターもまた提供され、単離されたＤＮＡはシクロペンタノンモノオキシゲナーゼをコードする。
【００１０】
本発明の好ましい態様において、単離されたＤＮＡは、配列番号：８の核酸配列または、遺伝暗号の縮重による、その機能的等価物である核酸配列を有する。
【００１１】
または本発明に従って、上記の組換えＤＮＡの１つまたは複数のコピーを含む組換えベクターが提供される。
【００１２】
組換えベクターは原核生物のベクターであってもよい。組換えベクターはまた、プラスミドであってもよい。
【００１３】
それゆえ、本発明に従って、上記のようなＤＮＡを含む、生物学的に機能的なプラスミドまたはウイルスＤＮＡベクターもまた提供される。
【００１４】
本発明はまた、上記の組換えベクターを含む宿主細胞も提供する。
【００１５】
従って、配列番号：８に示される配列を特徴とするＤＮＡを含む酵素的に活性なシクロペンタノンモノオキシゲナーゼ（ＣＰＭＯ）をコードする異種ＤＮＡ発現構築物、または部分が該ＣＰＭＯをコードする、発現可能な形でのその部分で形質転換された細胞もまた提供される。
【００１６】
細胞は原核生物の細胞であってもよく、またはそれは大腸菌であってもよい。
【００１７】
さらに本発明に従って、以下を有する精製されたシクロペンタノンモノオキシゲナーゼ（ＣＰＭＯ）もまた提供される：
ａ）配列番号：５に示されるアミノ酸配列；
ｂ）配列番号：８に示される核酸配列によりコードされるアミノ酸配列；または
ｃ）ストリンジェントな条件下で上記の段階ｂ）の核酸配列に相補的な核酸配列にハイブリダイズする核酸配列によりコードされるアミノ酸配列であり、段階ｃ）においてコードされる該アミノ酸配列はａ）におけるアミノ酸配列と同じ活性を有する。
【００１８】
本発明はまた、天然のシュードモナス由来のものより優れた、およびより好ましくは、２倍優れた酵素活性を有する組換えシクロペンタノンモノオキシゲナーゼ（ＣＰＭＯ）も提供する。
【００１９】
組換えシクロペンタノンモノオキシゲナーゼ（ＣＰＭＯ）は、コマモナス種ＮＣＩＭＢ ９８７２から調製されてもよい。組換えシクロペンタノンモノオキシゲナーゼ（ＣＰＭＯ）は、好ましくは、配列番号：５に示される配列を有する。
【００２０】
唯一の炭素源としてシクロペンタノールまたはシクロペンタノンの存在下においてインビトロで細胞を増殖させるための方法であるが、該方法は以下の段階含む：
ａ）上記の発現構築物で細胞を形質転換する段階；および
ｂ）唯一の炭素源としてシクロペンタノールまたはシクロペンタノンを含む培地において適する条件下で段階ａ）の細胞を増殖させる段階。
【００２１】
この遺伝子の可能性を高めるため、コマモナス（シュードモナス）種ＮＣＩＭＢ ９８７２由来のシクロペンタノンモノオキシゲナーゼ（ＣＰＭＯ）をコードする遺伝子（ｃｐｎＢ）のクローニング、そのＤＮＡおよび周囲の配列の決定ならびに大腸菌におけるＣＰＭＯ活性およびタンパク質の発現を本発明に従い、本明細書に報告する。
【００２２】
好ましい態様の詳細な説明
コマモナス種ＮＣＩＭＢ ９８７２ ＣＰＭＯをコードする遺伝子のクローニング
本研究において１６Ｓ ｒＤＮＡの配列決定によりコマモナスとして同定されるシュードモナス種ＮＣＩＭＢ ９８７２（以下９８７２株）は、ナショナルコレクションズオブインダストリアルアンドマリンバクテリア社（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ ａｎｄ Ｍａｒｉｎｅ Ｂａｃｔｅｒｉａ Ｌｔｄ）（ＮＣＩＭＢ、アバディーン、スコットランド）から購入され、２ ｍｌのシクロペンタノンを含む、ルリア−ベルターニ（Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ）（ＬＢ）培地（Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｊ．ら、「分子クローニング：実験マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ： ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ）」、第２版、コールドスプリングハーバーラボラトリープレス（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）、コールドスプリングハーバー、Ｎ． Ｙ．、１９８９）、または無機塩培地（ＭＳＭ）、ｐＨ ７．０において３０℃で増殖された。ＭＳＭの配合はリットルあたり：１．０ ｇのＮＨ４ＮＯ３、１．５ ｇのＫＨ２ＰＯ４、１．５ ｇのＮａ２ＨＰＯ４、０．２ ｇの ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．０１ ｇのＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、０．００５のＦｅＳＯ・７Ｈ２Ｏ、０．００２ ｇのＭｎＳＯ４・４Ｈ２Ｏおよび０．１ ｇの酵母エキスを含む。寒天はプレートに対して１．５％まで加えられた。９８７２株のゲノムＤＮＡはマルマー（Ｍａｒｍｕｒ）法（Ｍａｒｍｕｒ， Ｊ．， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ３：２０８〜２１８， １９６１）により調製された。最初に、ＢａｍＨＩで消化されたＤＮＡのサザンハイブリダイゼーションを、アシネトバクターＮＣＩＭＢ ９８７１ ＣＨＭＯ−含有遺伝子をプローブとして用いて行った。陽性の結果が得られなかった（ハイブリダイゼーション条件は６５℃で行なった）ので、ＣＰＭＯタンパク質をＮ末端アミノ酸配列を得るために精製した。シクロペンタノン−増殖細胞からのＣＰＭＯタンパク質の精製は、グリフィン（Ｇｒｉｆｆｉｎ）およびツルギル（Ｔｕｒｇｉｌｌ）に従った（Ｇｒｉｆｆｉｎ， Ｍ．ら、Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ６３：１９９〜２０９， １９７６）。自動化タンパク質シーケンサー（パーキン−エルマー（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）モデル４７７）を使用して、精製されたＣＰＭＯの４０残基のアミノ末端配列が得られた（図２）。この配列は、１１個のアミノ酸だけ長いが、同じ生物体由来の以前に報告されたものと完全に一致している（Ｗｉｌｌｅｔｔｓ， Ａ．， Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ． １５：５５〜６２， １９９７）。２つの変性したオリゴデオキシヌクレオチドプライマー（５’−ＡＣＩＡＣＩＡＴＧＡ ＣＩＡＣＮＡＴＧＡＣ−３’（配列番号：１）および５’−ＡＲＲＴＧＲＴＡＩＡＲＹＴＧＲＴＡ−３’（配列番号：２）、それぞれアミノ酸２〜８および３５〜４０に対応している）は、９８７２株から調製された全ＤＮＡからの１１６−ｂｐ生成物を増幅するために、合成された。ＰＣＲ増幅は、パーキンエルマー−モデル２４００サーマルサイクラー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ−Ｍｏｄｅｌ ２４００ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ）（商標）において行われ、増幅条件は、９４℃で１分間、５０℃で１分間および７２℃で���分間の３０サイクルであった。増幅産物はｐＸｃｍｋｎ１２ベクター（Ｃｈａ， Ｊ．ら、Ｇｅｎｅ １３６：３６９〜３７０， １９９３）に直接的にクローニングされ、大腸菌ＪＭ１０９に形質転換され、そしてその結果生じたプラスミドはｐＣＭＰ１０と名付けられた。増幅産物を遺伝子プローブとして使用する前に、そのヌクレオチド配列を確認した。ヌクレオチドの配列決定は、タックダイデオキシ（Ｔａｑ ＤｙｅＤｅｏｘｙ）ターミネーターサイクル配列決定キットおよびＡＢＩ プリズム３１０ジェネティックアナライザー（ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ３１０ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ）（パーキンエルマー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ））により決定された。プラスミド単離は、バーンボイム（Ｂｉｒｎｂｏｉｍ）およびドリー（Ｄｏｌｙ）の方法により行われた（Ｂｉｒｎｂｏｉｍ， Ｈ． Ｃ．およびＪ． Ｄｏｌｙ， ＤＮＡ． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ７：１５１３〜１５２３， １９７９）。
【００２３】
図２において、Ｏｒｆ１は、ＮｔｒＣ−型の転写アクチベーターである可能性が最も高い（Ｍｏｒｅｔｔ， Ｅ．， Ｌ． Ｓｅｇｏｖｉａ， Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １７５：６０６７〜６０７４， １９９３）。ＯＲＦ１のアミノ酸配列（Ｃ末端の３９１個のアミノ酸）は、ＮＴＲＣ＿ＥＣＯＬＩ（大腸菌由来の窒素調節タンパク質ＮＲ（Ｉ）；Ｍｉｒａｎｄａら、「大腸菌Ｋ１２のｇｌｎＡＬＧオペロンの完全ヌクレオチド配列（Ｔｈｅ ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｔｈｅ ｇｌｎＡＬＧ ｏｐｅｒｏｎ ｏｆ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２）」、１５：２７５７〜２７７０， １９８７）、ＡＣＯＲ＿ＡＬＣＥＵ（ラルストニア・ユトロファ（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａ）由来のアセトイン異化反応調節タンパク質；Ｋｒｕｇｅｒ， Ｎ．ら、Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １７９：４３９１〜４４００， １９９２）のようなタンパク質の対応する領域に３８％〜４０％の同一性を示した。ＯＲＦ２のアミノ酸配列は、短鎖アルコールデヒドロゲナーゼファミリーの酵素に類似性を示しているが（Ｊｏｒｎｖａｌｌ， Ｈ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３４：６００３〜６０１３， １９９５）、推定上のマイコバクテリウム・ツベルキュロシス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）のオキシドレダクターゼＣＹ３９．１６Ｃ（スイスプロット（Ｓｗｉｓｓ Ｐｒｏｔ）ｓｐ：Ｑ１０８５５）およびＭ． ツベルキュロシスのｆａｄＧ３（ゲンバンクアクセッション番号Ｚ７４０２５）に最も相同性がある（４５％〜４６％の同一性）。シュードモナス種ＨＩ−２０１株についてｐＫＯＫ６．１由来のｌａｃＺ−Ｋｍｒカセット（Ｋｏｋｏｔｅｋ， Ｗ．ら、Ｇｅｎｅ ８４：４６７〜４７１， １９８９）は、ＮｓｉＩ部位でｃｐｎＢへ挿入された。
【００２４】
図２において、次の用語は以下のように定義される：ｔｆｄ、ファージｆｄの転写終結配列；Ｋｍｒ、カナマイシン耐性遺伝子；ｌａｃＺ、ｂ−ガラクトシダーゼをコードする遺伝子。遺伝子およびマーカーは矢印で示されている。
【００２５】
ＣＰＭＯ−含有遺伝子をクローニングするために、ｐＣＭＰ１０由来のＤＮＡ挿入断片を増幅し、メーカーの説明書（ベーリンガーマンハイムＧｍｂＨ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ ＧｍｂＨ））に従い、ジゴキシゲニン−１１−ＵＴＰシステムにより標識し、そして様々な制限酵素（ＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＫｐｎＩ、ＮｈｅＩ、ＰｓｔＩ、ＳａｌＩ、ＳｐｈＩおよびＸｂａＩ）で消化された９８７２株ゲノムＤＮＡのサザンハイブリダイゼーションを探索するために使用した。結果として、ハイブリダイズしている１つの約４．３ｋｂのＳｐｈＩ断片のバンドが得られた。ハイブリダイゼーションの条件は前記と同様にした。続いて、０．８％アガロースゲル上で分離されたＳｐｈＩ−切断された全ＤＮＡの精製された４．０ｋｂ〜４．５ｋｂのサイズの断片を、線状化および脱リン酸されている大腸菌プラスミドｐＵＣ１８へライゲーションした。４．３ｋｂ挿入断片を含むクローンは、プローブとしてＰＣＲ産物を使用するコロニーハイブリダイゼーションにより、スクリーニングされた；この組換えプラスミドはｐＣＭＰ２００と名付けられた。
【００２６】
ＣＰＭＯをコードする遺伝子（ｃｐｎＢ）および隣接領域のＤＮＡ配列
ＣＰＭＯをコードする遺伝子のヌクレオチドの配列決定は、ｐＣＭＰ１０においてクローニングされたＰＣＲ産物の配列から設計されたプライマーを使用することにより開始され、そして、その新しい配列から引き出されるオリゴヌクレオチドを使用してさらに拡張された。ＳｐｈＩ断片の両方のＤＮＡ鎖は配列決定されて、４２８１塩基対（ｂｐ）からなることが見出された。配列は、ＧＥＮＥＴＹＸ−Ｍａｃ（ソフトウェアデベロップメント社（Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．）、千葉、日本）およびＢＬＡＳＴプログラム（Ａｌｔｓｃｈｕｌ， Ｓ． Ｆ．ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２５：３３８９〜３４０２， １９９７）により分析された。結果として、同じ方向に配置された３つの読み取り枠（ＯＰＦ）が予測された（図２）。ＣＰＭＯをコードする１６５０−ｂｐ ＯＲＦのヌクレオチド配列はＮｔｒＣ−型転写アクチベーターのＣ末端をコードする部分的ＯＲＦ１（１１７３−ｂｐ）（Ｍｉｒａｎｄａら、「大腸菌Ｋ１２のｇｌｎＡＬＧオペロンの完全ヌクレオチド配列（Ｔｈｅ ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｔｈｅ ｇｌｎＡＬＧ ｏｐｅｒｏｎ ｏｆ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２）」、１５：２７５７〜２７７０， １９８７）および短鎖デヒドロゲナーゼ／レダクターゼの相同体をコードする完全ＯＲＦ２（７５０−ｂｐ）（Ｊｏｒｎｖａｌｌ， Ｈ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３４：６００３〜６０１３， １９９５）により先行される。その２つの遺伝子間の領域は、それぞれ、２４４−ｂｐおよび３２−ｂｐである。ＣＰＭＯをコードする遺伝子を以下では、ｃｐｎＢ（ｃｙｃｌｏｐｅｎｔａｎｏｎｅおよびＢは分解経路の第２段階を意味する、図１参照）と呼ぶ。図５において、ＣＰＭＯをコードする遺伝子は、ヌクレオチド１８２２位で始まり、かつ停止コドンを含まない３４７１位で終わる。したがって、ｃｐｎＡの境界は３５０７〜４２５６である。ｃｐｎＢに先行する部分的読み取り枠は１〜１１７４である。
【００２７】
図１はグリフィン， Ｍ．（Ｇｒｉｆｆｉｎ， Ｍ．）ら（Ｇｒｉｆｆｉｎ， Ｍ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｊ． １２９：５９５〜６０３， １９７２）から改作されている。命名された遺伝子は：シクロペンタノールデヒドロゲナーゼをコードするｃｐｎＡ；シクロペンタノン１，２−モノオキシゲナーゼ（ＣＰＭＯ）をコードするｃｐｎＢである。５−バレロラクトン（５−ｖａｌｅｒｏｌａｃｔｏｎｅ）の別名は５−ペンタノリド（５−ｐｅｎｔａｎｏｌｉｄｅ）である。続いて起こる反応段階は、５−ヒドロキシ吉草酸、５−オキソ吉草酸、グルタレート（ｇｌｕｔａｒａｔｅ）および最終的にアセチルＣｏＡの形成である。
【００２８】
ＣＰＭＯ酵素のアミノ酸配列は５５０残基からなる（図３）。この配列は、アシネトバクター種ＮＣＩＭＢ９８７１株の５４３残基ＣＨＭＯに３６．５％の同一性および追加の１３．６％のアミノ酸類似性を示す。同程度に関連するタンパク質（５４９のアミノ酸；３７．３％の同一性および１２．４％の類似性）は、ロドコッカス・ロドクロウスの推定上のステロイドモノオキシゲナーゼ（ＳＴＭＯ）（Ｍｏｒｉｉ， Ｓ．ら、ゲンバンクアクセッション番号ＡＢ０１０４３９， １９８８）である。後者の酵素は、プロゲステロンの酸化を行って酢酸テストステロンを生成する。これらの３つの配列のＣＬＵＳＴＡＬアラインメントは２４．６％の位置的同一性を示した（図３）。
【００２９】
図３において、星印は一致するアミノ酸を示し、点は類似したアミノ酸を示し、およびダッシュはアラインメントを最大限にするために導入された空所を示す。エドマン分解により確認されたアミノ末端ペプチド配列は下線が引かれている。エッピンク（Ｅｐｐｉｎｋ）ら（Ｅｐｐｉｎｋら、Ｐｒｏｔ． Ｓｃｉ． ６：２４５４〜２４５８， １９９７）により記載されているコンセンサスＦＡＤフィンガープリント配列の位置は、示されているとおりである。第２のＦＡＤフィンガープリントとしてフラビンタンパク質ヒドロキシラーゼに見出される保存ＧＤモチーフもまた示されている。ｃｈｈｈｓｓＤＧｘｃＳｘｈＲの配列を有するフラビンタンパク質ヒドロキシラーゼのＤＧモチーフは見られない。小文字は特定の残基の型を同定している：ｈ、疎水性残基、ｓ、小型の残基、ｃ、荷電残基、およびｘ、任意の残基。ＤＧダブレットはＣＰＭＯおよびＳＴＭＯの配列において存在することを留意しておきたい。
【００３０】
ＣＰＭＯおよび関連タンパク質に存在する注目すべき配列モチーフは、フラビンタンパク質ヒドロキシラーゼにおいて見出されるものと類似したＦＡＤ−結合フィンガープリント（ＧＸＧＸＸＧ）である（Ｅｐｐｉｎｋら、Ｐｒｏｔ． Ｓｃｉ． ６：２４５４〜２４５８， １９９７）。フラビンタンパク質ヒドロキシラーゼ（例えば、フェノールヒドロキシラーゼ、その構造が今では知られている；Ｅｎｒｏｔｈ， Ｃ．ら、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ６：６０５〜６１７， １９９８）は、電子供与体としてＮＡＤ（Ｐ）Ｈを用いて基質への酸素分子の１つの原子の挿入を触媒するモノオキシゲナーゼである。これらのタンパク質は、ＦＡＤ結合についての２つのフィンガープリントモチーフ（フィンガープリント１：ＧＸＧＸＸＧ；フィンガープリント２：Ｇｌｙ−Ａｓｐ［ＧＤ］モチーフ）の間において、ＦＡＤ結合およびＮＡＤ（Ｐ）Ｈ結合の両方についての保存された「Ａｓｐ−Ｇｌｙ（ＤＧ）」モチーフを有する。ＣＰＭＯ、ＳＴＭＯおよびＣＨＭＯにおける配列モチーフは、反復ＧＸＧＸＸＧモチーフ（ＣＰＭＯの番号付けにおいてアミノ酸２４〜３３および１９３〜２０２）を有することにより、フラビンタンパク質ヒドロキシラーゼのそれらとは異なる。ＣＰＭＯおよび関連タンパク質における第２のＦＡＤフィンガープリントがＦＡＤおよびＮＡＤＰＨ結合という二重の役割を果たしている可能性については、このファミリーのタンパク質の代表的メンバーの構造決定を待つばかりである。２つのクラスのタンパク質に見られるモチーフにおいて、触媒作用における異なる機構が反映されていると仮定することは妥当である。
【００３１】
大腸菌におけるｃｐｎＢ遺伝子の発現
以下の配列の２つのプライマーはｃｐｎＢ遺伝子を増幅するために合成され、その結果として生じた１．７ｋｂのＤＮＡ断片はｐＳＤ８０プラスミドにクローニングされてｐＣＭＰ２０１を生じた。プラスミドｐＳＤ８０は、マルチクローニングサイト（ＭＣＳ）の上流にｔａｃプロモーター、ＭＣＳの下流にｕｎｃターミネーター配列、およびプラスミド上の他の場所にｌａｃＩｑを含む商業的に入手可能なｐＫＫ２２３−３ベクター（ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ））系の第三世代である（Ｓｍｉｔｈ， Ｓ． Ｐ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３５：８８０５−８８１４， １９９６）。プライマーは：
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であり、ｐＳＤ８０ベクターの適合性のある部位（ＳｍａＩおよびＰｓｔＩ）でのクローニングを容易にするため、それぞれ、組込みのＳｔｕＩおよびＰｓｔＩ制限部位（下線が引かれている）をもつ。ベント（Ｖｅｎｔ）ＤＮＡポリメラーゼ（ニューイングランドバイオラブズ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ）、ベヴァリー、ＭＡ）が使用され、増幅条件は、９４℃で１分間、５０℃で１分間、および７２℃で１分間の３０サイクルであった。増幅されたＤＮＡ断片はアガロースゲルから精製され、ＳｔｕＩおよびＰｓｔＩで消化された。その結果として生じた組換えプラスミドの１つをｐＣＭＰ２０１と名付けた。ＤＮＡの配列決定により、ＰＣＲ増幅の間にｃｐｎＢ遺伝子において突然変異は導入されなかったことが確証された。
【００３２】
図４は、０．１ ｍＭのイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）により誘導される大腸菌ＪＭ１０９（ｐＣＭＰ２０１）細胞から調製される粗タンパク質抽出物のクーマシーブルー染色ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルにおける６０ｋＤａのタンパク質の生成を示す。細胞は、０．４〜０．５の吸光度（Ａ６００ ｎｍ）で誘導され、誘導時間は４時間までであった。観察される分子量は、６２ｋＤａのＣＰＭＯの予測されるサイズと一致していた。ＩＰＴＧの非存在下において、このタンパク質のバンドは生成されなかった。また、ＣＰＭＯ酵素活性は、ＩＰＴＧの存在下において増殖されたそれらの細胞においてのみ観察された。ＣＰＭＯ活性は、１ μモルのシクロペンタノン、０．２ μモルのＮＡＤＰＨ、および大腸菌ＪＭ１０９（ｐＣＭＰ２０１）から調製される粗酵素抽出物を含む５０ ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ ７．８）において、３４０ ｎｍでの吸光度の減少を測定することにより、２５℃でアッセイした。これらの細胞は、１００ μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む１００ ｍｌのＬＢ培地において、２５℃で培養された。ＩＰＴＧ−誘導化細胞は、遠心分離により収集され、５０ ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ ７．２）で洗浄され、同じ緩衝液の１／２０の容量に再懸濁され、そしてブラウン−ソニファイヤー（Ｂｒａｕｎ−Ｓｏｎｉｆｉｅｒ）（商標）２５０装置で４回の２０秒バーストにより超音波処理された。１８，０００×ｇおよび４℃での３０分間の遠心分離後、上清は酵素活性の測定のために使用された。活性の１ユニット（Ｕ）は、１分間において１ μモルの基質を変換するために要求される酵素量として定義される。タンパク質濃度は、ブラッドフォード（Ｂｒａｄｆｏｒｄ）法（Ｂｒａｄｆｏｒｄ， Ｍ． Ｍ．， Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ７２：２４８〜２５４， １９７６）により測定された。結果として、ＣＰＭＯ酵素の比活性は０．２８ Ｕ／ｍｇであることが見出された。天然のシュードモナスにおけるＣＰＭＯの比活性は０．１１ Ｕ／ｍｇであると報告されていた（Ｇｒｉｆｆｉｎ， Ｍ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｊ． １２９：５９５〜６０３， １９７２）。
【００３３】
図４において、レーン１にはＩＰＴＧ−誘導化大腸菌の抽出物を載せ、レーン２にはＩＰＴＧの非存在下での大腸菌の抽出物を載せた。Ｍはキロダルトンで示される分子量マーカーを意味する。矢印は所望の６０ｋＤａタンパク質の生成を指す。
【００３４】
ｃｐｎＢ遺伝子の不活性化
シュードモナス種ＨＩ−２０１株は、可動化可能なｐＫＯＫ６．１ベクター由来のｌａｃＺ−Ｋｍｒカセットを用いたｃｐｎＢ遺伝子の染色体性不活性化により構築された（Ｋｏｋｏｔｅｋ， Ｗ．ら、Ｇｅｎｅ ８４：４６７〜４７１， １９８９）。ｐＫＯＫ６．１において、ｌａｃＺ遺伝子はプロモーターがなく、Ｋｍｒに加えてアンピシリン耐性（Ａｐｒ）である。ｌａｃＺ−ＫｍｒカセットはＰｓｔＩ−断片として切除され、そしてｐＣＭＰ２００においてｃｐｎＢ遺伝子間のＮｓｉＩ部位へ挿入されて、ｐＣＭＰ２０２を生じた。このプラスミドの９８７２細胞へのエレクトロポレーションはジーンパルサー（Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ）（商標）（バイオラッド（ＢｉｏＲａｄｓ））において行われ、エレクトロポレーションのパラメーターは２．５ ｋＶ、２５ ｕＦおよび２００オームであった。細胞を最初に１ ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液で洗浄し、１０％グリセロールを含む１ ｍＭ ＨＥＰＥＳに再懸濁した。ＫｍｒコロニーはＫｍ（２５０ μｇ／ｍｌ）を含むＬＢプレート上で選択された。二重交差変異体について選択するため、Ａｐ（３００ μｇ／ｍｌ）を含むＬＢプレート上での２番目のスクリーニングが行われた。ｃｐｎＢの不活性化（図２）はＰＣＲ法により確認された。その結果生じた変異体ＨＩ−２０１は、唯一の炭素およびエネルギー源としてシクロペンタノールまたはシクロペンタノンで増殖することができないことが見出された。この結果より、ｃｐｎＢはシクロペンタノールの分解について不可欠であることが示され、かつ９８７２株においてｃｐｎＢ遺伝子のたった１つのコピーのみがあることが明らかになった。
【００３５】
フラビンタンパク質として予想されたとおり、ＣＰＭＯのアミノ酸配列は、フラビンタンパク質ヒドロキシラーゼにおいて見出されるものと類似したＦＡＤフィンガープリントのモチーフを含む。
【００３６】
ヌクレオチド配列アクセッション番号
４，２８１−ｂｐのＳｐｈＩ断片のＤＮＡ配列は、ＤＤＢＪへ提出され、アクセッション番号ＡＢ０２２１０２を与えられた。このデータの公開は本発明者らの許可を待つばかりである。
【００３７】
本発明はその特定の態様に関して記載されているが、さらなる改変が可能であり、本出願は、一般的に本発明の原理に従い、かつ本発明が属する技術分野内での公知または通例の実施の範囲内になる、ならびに上に示されている本質的な特徴に当てはめられ、および添付された特許請求の範囲の中でありうるような本開示からの離脱を含む、本発明のいずれの変形、使用または適応も包含するものであることは、理解されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【図１】シュードモナス種ＮＣＩＭＢ ９８７２によるシクロペンタノールの分解の最初の２段階を示す。
【図２】シクロペンタノンモノオキシゲナーゼコード遺伝子（ｃｐｎＢ）および付加的読み取り枠を含むＳｐｈＩ断片におけるコマモナス種ＮＣＩＭＢ ９８７２の遺伝子の構成を示す。
【図３】コマモナス種ＮＣＩＭＢ ９８７２のＣＰＭＯのアミノ酸配列の、アシネトバクター種ＮＣＩＭＢ ９８７１由来のＣＨＭＯおよびロドコッカス・ロドクロウス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ）由来のステロイドモノオキシゲナーゼ（ＳＴＭＯ）のそれとのアラインメントを示す。
【図４】大腸菌（ｐＣＭＰ２０１）からの粗抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。
【図５】ｃｐｎＢと名付けられたＣＰＭＯをコードする遺伝子を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図５Ｅ】
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【図５Ｆ】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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