(57)【要約】結晶、結晶構造ＦｃγＲＩＩａ蛋白質、ＦｃγＲＩＩａ蛋白質の三次元座標並びにＦｃγＲＩＩａ構造から誘導される構造およびモデルを開示する。また、ＦｃεＲＩ蛋白質の結晶並びにＦｃγＲＩＩａ構造から誘導されるＦｃεＲＩ蛋白質モノマーおよびダイマーの三次元座標も開示する。また、ＦｃγＲＩＩＩｂ蛋白質の三次元座標およびＦｃγＲＩＩａ構造から誘導されるＦｃγＲＩＩＩｂのモデルも開示する。また、本発明はかかる結晶、結晶構造およびモデルを作成する方法を含む。薬物デザインおよび治療用組成物に基づく構造を含めた、かかる結晶、結晶構造およびモデルの使用も開示する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｆｃレセプター（ＦｃＲ）蛋白質のモデルであって、前記モデルが表１の原子座標に実質的に一致する三次元構造を表すモデル。
【請求項２】
前記構造が表１によって表された原子座標およびＢ値に実質的に一致する請求項１のモデル。
【請求項３】
前記構造がモノマーである請求項のモデル。
【請求項４】
前記構造がダイマーである請求項１のモデル。
【請求項５】
前記構造が表２、表３、表４および表５よりなる群から選択される表の原子座標に実質的に一致する請求項１のモデル。
【請求項６】
前記構造の少なくとも約５０％が前記構造の各ドメイン中の二次構造要素における主鎖原子について約１．５オングストローム未満の平均二乗平均平方根偏差（ＲＭＳＤ）を有する請求項１のモデル。
【請求項７】
前記構造と前記原子座標を含む構造との間に共通するアミノ酸側鎖の少なくとも約５０％が約１．５オングストローム未満の平均二乗平均平方根偏差（ＲＭＳＤ）を有する請求項１のモデル。
【請求項８】
前記ＦｃＲ蛋白質が、配列番号３、配列番号１０、配列番号１１および配列番号１２よりなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも約２５％で同一であるアミノ酸配列を含む請求項１記載のモデル。
【請求項９】
前記ＦｃＲ蛋白質が、配列番号３、配列番号１０、配列番号１１および配列番号１２よりなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも約４０％で同一であるアミノ酸配列を含む請求項１記載のモデル。
【請求項１０】
前記ＦｃＲ蛋白質が、配列番号３、配列番号１０、配列番号１１および配列番号１２よりなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも約６０％で同一であるアミノ酸配列を含む請求項１記載のモデル。
【請求項１１】
前記ＦｃＲ蛋白質が、配列番号３、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、前記アミノ酸配列のいずれかの突然変異体、および前記アミノ酸配列のいずれかの対立遺伝子変異体よりなる群から選択されるアミノ酸配列を含む請求項１記載のモデル。
【請求項１２】
前記ＦｃＲ蛋白質が、配列番号３、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３よりなる群から選択されるアミノ酸；配列番号３、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２または配列番号１３の突然変異体；および配列番号３、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２または配列番号１３の対立遺伝子変異体よりなる群から選択されるアミノ酸配列を含む請求項１記載のモデル。
【請求項１３】
前記ＦｃＲ蛋白質が、ＦｃγＲＩ蛋白質、ＦｃγＲＩＩａ蛋白質、ＦｃγＲＩＩｂ蛋白質、ＦｃγＲＩＩｃ蛋白質、ＦｃγＲＩＩＩ蛋白質、ＦｃεＲＩ蛋白質、ＦｃαＲＩ蛋白質および前記ＦｃＲ蛋白質のいずれかの構造相同体よりなる群から選択される請求項１記載のモデル。
【請求項１４】
前記ＦｃＲ蛋白質が、ＦｃγＲＩ蛋白質、ＦｃγＲＩＩａ蛋白質、ＦｃγＲＩＩｂ蛋白質、ＦｃγＲＩＩｃ蛋白質、ＦｃγＲＩＩＩ蛋白質、ＦｃεＲＩ蛋白質およびＦｃγＲＩ蛋白質よりなる群から選択される請求項１記載のモデル。
【請求項１５】
前記ＦｃＲ蛋白質がＦｃγＲＩＩａ蛋白質モノマー、ＦｃγＲＩＩａ蛋白質ダイマーおよび前記ＦｃγＲＩＩａ蛋白質の構造相同体よりなる群から選択される請求項１記載のモデル。
【請求項１６】
前記ＦｃＲ蛋白質がＦｃεＲＩ蛋白質ダイマー、ＦｃεＲＩ蛋白質モノマーおよび前記ＦｃεＲＩ蛋白質の構造相同体よりなる群から選択される請求項１記載モデル。
【請求項１７】
前記ＦｃＲ蛋白質がＦｃγＲＩ蛋白質ダイマー、ＦｃγＲＩ蛋白質モノマーおよび前記ＦｃγＲＩ蛋白質の構造類似体よりなる群から選択される請求項１記載のモデル。
【請求項１８】
前記ＦｃＲ蛋白質がＦｃγＲＩＩｂ蛋白質ダイマー、ＦｃγＲＩＩｂ蛋白質モノマーおよび前記ＦｃγＲＩＩｂ蛋白質の構造類似体よりなる群から選択される請求項１記載のモデル。
【請求項１９】
前記ＦｃＲ蛋白質がＦｃγＲＩＩｃ蛋白質ダイマー、ＦｃγＲＩＩｃ蛋白質モノマーおよび前記ＦｃγＲＩＩｃ蛋白質の構造類似体よりなる群から選択される請求項１記載のモデル。
【請求項２０】
前記ＦｃＲ蛋白質がＦｃγＲＩＩＩｂ蛋白質ダイマー、ＦｃγＲＩＩＩｂ蛋白質モノマーおよび前記ＦｃγＲＩＩＩｂ蛋白質の構造類似体よりなる群から選択される請求項１記載のモデル。
【請求項２１】
前記ＦｃＲ蛋白質がＦｃαＲＩ蛋白質ダイマー、ＦｃαＲＩ蛋白質モノマーおよび前記ＦｃαＲＩ蛋白質の構造類似体よりなる群から選択される請求項１記載のモデル。
【請求項２２】
前記原子座標が：
（ａ）結晶性形態のＦｃγＲＩＩａ蛋白質を提供することと；
（ｂ）前記結晶性ＦｃγＲＩＩａ蛋白質の電子密度マップを生成させることと；および、
（ｃ）前記電子密度マップを分析して前記原子座標を生じることとを具備する方法によって得られる請求項１記載のモデル。
【請求項２３】
前記結晶性ＦｃγＲＩＩａ蛋白質が、ＦｃγＲＩＩａ蛋白質と酢酸塩緩衝液および硫酸塩緩衝液よりなる群から選択される母液緩衝液と合わせ、および結晶形成を誘導して前記結晶性ＦｃγＲＩＩａ蛋白質を生じさせる方法によって生成される請求項２２記載のモデル。
【請求項２４】
前記酢酸塩緩衝液が約２００ｍＭの酢酸アンモニウム、約１００ｍＭのクエン酸ナトリウムおよび約３０％のＰＥＧ４０００を含み、前記緩衝液が約５．６のｐＨを有する請求項２３記載のモデル。
【請求項２５】
前記硫酸塩緩衝液が約０．１ＭのＨＥＰＥＳおよび約１．５Ｍの硫酸リチウムを含み、前記緩衝液が約７．５のｐＨを有する請求項２３記載のモデル。
【請求項２６】
電子密度マップを生じさせる前記工程がＸ線回折によって前記結晶性ＦｃγＲＩＩａ蛋白質を分析することを具備する請求項２２記載のモデル。
【請求項２７】
前記結晶性ＦｃγＲＩＩａ蛋白質が前記Ｘ線回折に先立ってジ−γ−ヨードビス｛エチレンジアミン｝ジ白金（ＩＩ）硝酸塩において誘導体化される請求項２２記載のモデル。
【請求項２８】
前記結晶性ＦｃγＲＩＩａ蛋白質が前記Ｘ線回折に先立って約５ｍＭのジ−γ−ヨードビス［エチレンジアミン］ジ白金（ＩＩ）硝酸塩において誘導体化される請求項２２記載のモデル。
【請求項２９】
前記モデルが前記三次元構造の三次元座標の組で符号化されたコンピュータリーダブル媒体によって生成されたコンピュータイメージである［ここで、グラフィックディスプレイソフトウェアプログラムを用い、前記三次元座標が、三次元イメージとして前記電子ファイルを表すことができるコンピュータ上で可視化できる電子ファイルを作成する］請求項１記載のモデル。
【請求項３０】
ａ．Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）蛋白質のモデルを提供することと［ここで、前記モデルは表１の原子座標に対して実質的に一致する三次元構造を表す］；
ｂ．前記モデルを用いて化合物を設計することと；および、
ｃ．前記化合物を化学的に合成することと
具備するコンピュータに援助された生物活性化合物の構造ベースの薬物デザイン方法。
【請求項３１】
前記方法が、さらに：
ｄ．前記合成された化合物の生物活性を評価することを具備する請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記三次元構造が表１にリストされた原子座標を含む請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
前記三次元構造がダイマーである請求項３０に記載の方法。
【請求項３４】
前記三次元構造が表２、表３、表４および表５よりなる群から選択される表にリストされた原子座標を含む請求項３０記載の方法。
【請求項３５】
表１にリストされた該原子座が、前記イメージの電子ファイルを生じさせためにグラフィックディスプレイソフトウェアプログラムを使用し、および三次元イメージとしての前記電子ファイルを表すことができるコンピュータにおいて前記電子ファイルを可視化するコンピュータにおいて分析されるときに生じるコンピュータイメージを、前記モデルが具備する請求項３０記載の方法。
【請求項３６】
設計の前記工程が、化合物の１以上のデーターベースをコンピュータスクリーニングすることを含み、ここにおいて、前記化合物の三次元構造が既知である請求項３０記載の方法。
【請求項３７】
さらに、前記スクリーニング工程によって同定された化合物をコンピュータによる前記モデルと相互作用させることを具備する請求項３６記載の方法。
【請求項３８】
前記設計の工程が指向性薬物デザインを具備する請求項３０記載の方法。
【請求項３９】
前記設計の工程がランダム薬物デザインを具備する請求項３０記載の方法。
【請求項４０】
前記設計の工程がグリッドベースの薬物デザインを具備する請求項３０記載の方法。
【請求項４１】
前記設計の工程が、前記ＦｃＲ蛋白質の前記三次元構造を模倣することを予測される化合物を選択することを具備する請求項３０記載の方法。
【請求項４２】
前記設計の工程が、前記ＦｃＲ蛋白質の前記三次元構造に結合することが予測される化合物を選択することを具備する請求項３０記載の方法。
【請求項４３】
前記生物活性が、前記ＦｃＲ蛋白質の免疫グロブリン蛋白質への結合を阻害すること、前記ＦｃＲ蛋白質に対して結合すること、前記ＦｃＲ蛋白質に結合することができる免疫グロブリンに対して結合すること、前記免疫グロブリン蛋白質の貪食作用を阻害すること、前記ＦｃＲ蛋白質の二量体化を阻害すること、前記ＦｃＲ蛋白質を介した細胞シグナル変換を刺激すること、および前記ＦｃＲ蛋白質を介したサイトカインの放出を刺激することとよりなる群から選択される請求項３０記載の方法。
【請求項４４】
前記ＦｃＲ蛋白質がＦｃγＲＩＩａであり、並びに前記生物活性が、ＦｃγＲＩＩａ蛋白質のＩｇＧへの結合を阻害すること、ＩｇＧの貪食作用を阻害すること、ＦｃγＲＩＩａ蛋白質の二量体化を阻害すること、ＦｃγＲＩＩａ蛋白質を介した細胞シグナル変換を刺激すること、ＩＬ−６およびＩＬ−１２よりなる群から選択されるサイトカインの放出を刺激することからなる群から選択される請求項３０記載の方法。
【請求項４５】
前記ＦｃＲ蛋白質がＦｃγＲＩＩＩｂであり、並びに前記生物活性が、ＦｃγＲＩＩＩｂ蛋白質のＩｇＧへの結合を阻害することと、ＩｇＧの貪食作用を阻害することと、ＦｃγＲＩＩＩｂ蛋白質の二量体化を阻害することと、ＦｃγＲＩＩＩｂ蛋白質を介した細胞シグナル変換を刺激することと、ＩＬ−６およびＩＬ−１２よりなる群から選択されるサイトカインの放出を刺激することとよりなる群から選択される請求項３０記載の方法。
【請求項４６】
前記ＦｃＲ蛋白質がＦｃεＲＩであり、更に前記生物活性がＦｃεＲＩ蛋白質のＩｇＥへの結合を阻害することと、ＩｇＥの貪食作用を阻害することと、ＦｃεＲＩ蛋白質の二量体化を阻害することと、ＦｃεＲＩ蛋白質を介した細胞シグナル変換を刺激することと、肥満細胞によるヒスタミンおよびセロトニンの放出を刺激することと、並びに肥満細胞によるヒスタミンおよびセロトニンの放出を阻害することとよりなる群から選択される請求項３０記載の方法。
【請求項４７】
Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）蛋白質のモデルを提供することと［ここで、前記モデルは、表１によって表される原子座標；表２によって表される原子座標；表３によって表される原子座標；表４によって表される原子座標；および表５によって表される原子座標よりなる群から選択される原子座標に対して実質的に一致する三次元構造を表す］；
ｂ．前記モデルを用いて化合物を設計することと；および、
ｃ．前記化合物を化学的に合成することと
を具備するコンピュータに援助された生物活性化合物の構造ベースの薬物デザイン方法。
【請求項４８】
ａ．ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩＩｂおよびＦｃεＲＩよりなる群から選択されるＦｃ受容体（ＦｃＲ）蛋白質の三次元構造のモデルを提供することと；
ｂ．前記モデルを用いて化合物を設計することと；および、
ｃ．前記化合物を化学的に合成することと
を具備するコンピュータに援助された生物活性化合物の構造ベースの薬物デザインの方法。
【請求項４９】
ＦｃＲ蛋白質の三次元構造の三次元コンピュータイメージ。
【請求項５０】
前記構造が、表１にリストされた三次元座標；表２にリストされた三次元座標；表３にリストされた三次元座標；表４にリストされた三次元座標；および表５にリストされた三次元座標よりなる群から選択される三次元座標に実質的に一致する請求項４９記載のイメージ。
【請求項５１】
前記イメージの電子ファイルを作成するためにグラフィックディスプレイソフトウェアプログラムを用い、且つ三次元イメージとして電子ファイルを表すことができるコンピュータ上で前記電子ファイルを可視化するコンピュータ上で前記三次元座標を含む三次元座標の組を分析するときに、前記コンピュータイメージが生じる請求項４９記載のイメージ。
【請求項５２】
前記三次元コンピュータイメージが図４、図６、図７、図８、図９、図１０、図１４、図１５および図１６よりなる群から選択される二次元イメージによって表される請求項４９記載のイメージ。
【請求項５３】
前記三次元コンピュータイメージを用いて治療化合物を設計する請求項４９記載のイメージ。
【請求項５４】
表１の原子座標に実質的に一致する三次元構造を有するＦｃＲ蛋白質の三次元座標の組で符号化されたコンピュータリーダブル媒体であって、グラフィックディスプレイソフトウェアプログラムを用いて、前記三次元座標が三次元イメージとして前記電子ファイルを表すことができるコンピュータ上で可視化することができる電子ファイルを作成するコンピュータリーダブル媒体。
【請求項５５】
表１に表された三次元座標、表２に表された三次元座標、表３に表された三次元座標、表４に表された三次元座標および表５に表された三次元座標よりなる群から選択される三次元座標の組で符号化されたコンピュータリーダブル媒体であって、グラフィックディスプレイソフトウェアプログラムを用いて、前記三次元座標が三次元イメージとして前記電子ファイルを表すことができるコンピュータ上で可視化することができる電子ファイルを作成するコンピュータリーダブル媒体。
【請求項５６】
ＦｃγＲＩ蛋白質、ＦｃγＲＩＩｂ蛋白質、ＦｃγＲＩＩｃ蛋白質、ＦｃγＲＩＩＩｂ蛋白質、ＦｃεＲＩ蛋白質およびＦｃαＲＩ蛋白質よりなる群から選択されるＦｃＲ蛋白質の三次元構造のモデルであって、
前記モデルが、
（ａ）ＦｃγＲＩＩａ蛋白質のアミノ酸配列および前記ＦｃＲ蛋白質のアミノ酸配列を提供することと；
（ｂ）前記ＦｃγＲＩＩａアミノ酸配列と前記ＦｃＲ蛋白質アミノ酸配列との間で共有された構造的に保存された領域を同定することと；および、
（ｃ）表１に表された原子座標に実質的に一致する前記ＦｃγＲＩＩａ蛋白質の三次元構造を用いて、前記ＦｃＲ蛋白質の前記構造的に保存された領域を三次元構造に割り当てることによって、前記ＦｃＲ蛋白質について原子座標を決定して、前記ＦｃＲ蛋白質アミノ酸配列の前記三次元構造のモデルを誘導することと
を具備する方法によって産生された三次元構造のモデル。
【請求項５７】
請求項５６に記載のモデルであって、前記ＦｃγＲＩ蛋白質アミノ配列が配列番号７を含み；前記ＦｃγＲＩＩｂ蛋白質アミノ酸配列が配列番号５を含み；前記ＦｃγＲＩＩｃ蛋白質アミノ酸配列が配列番号６を含み；前記ＦｃγＲＩＩＩｂ蛋白質アミノ酸配列が配列番号８を含み；前記ＦｃεＲＩ蛋白質アミノ酸配列が配列番号９を含み；および、前記ＦｃαＲＩ蛋白質アミノ酸配列が配列番号１３を含むモデル。
【請求項５８】
動物に投与すると、ＩｇＧ媒介組織障害を減少する治療用組成物であって、前記治療用組成物はＦｃγ受容体（ＦｃγＲ）蛋白質の活性を阻害する阻害性化合物を含み、前記阻害性化合物は：
（ａ）ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ、ＦｃγＲＩＩｃおよびＦｃγＲＩＩＩｂよりなる群から選択されるＦｃγＲ蛋白質の三次元構造を提供することと［ここで、前記ＦｃγＲ蛋白質の前記三次元構造は表１によって表された原子座標に実質的に一致する］；
（ｂ）前記ＦｃγＲ蛋白質の前記三次元構造を用いて、ＦｃγＲ蛋白質のＩｇＧへの結合を阻害する化合物、ＦｃγＲ蛋白質の三次元構造を実質的に模倣する化合物およびＦｃγＲ蛋白質を介した細胞信号変換を刺激する分子とのＦｃγＲ蛋白質の結合を阻害する化合物よりなる群から選択される化合物を設計することと；
（ｃ）前記化合物を化学的に合成することと；および
（ｄ）ＩｇＧ媒介組織障害を減少させる前記合成された化合物の能力を評価することと
を具備する方法によって同定される前記治療用組成物。
【請求項５９】
前記ＩｇＧ媒介組織障害がＩｇＧ媒介過敏症、炎症細胞のＩｇＧ媒介漸増および炎症モジュレーターのＩｇＧ媒介放出よりなる群から選択される生物学的応答に由来する請求項５８記載の組成物。
【請求項６０】
前記構造が表１に表される原子座標に実質的に一致する請求項５８記載の組成物。
【請求項６１】
前記化合物が無機化合物および有機化合物よりなる群から選択される請求項５８記載の組成物。
【請求項６２】
前記化合物がオリゴヌクレオチド、ペプチド、ペプチドミメティック化合物および小有機分子よりなる群から選択される請求項５８記載の組成物。
【請求項６３】
前記化合物が前記ＦｃγＲ蛋白質のアナログ、前記ＦｃγＲ蛋白質の基質アナログおよび前記ＦｃγＲ蛋白質のペプチドミメティック化合物よりなる群から選択される請求項５８記載の組成物。
【請求項６４】
前記組成物がさらに賦形剤、アジュバントおよび担体よりなる群から選択される成分を含む請求項５８記載の組成物。
【請求項６５】
動物に投与すると、ＩｇＧ媒介応答を増強する治療用組成物であって、前記治療用組成物は、Ｆｃγ受容体（ＦｃγＲ）蛋白質の活性を刺激する刺激性化合物を含み、前記刺激性化合物は：
（ａ）ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ、ＦｃγＲＩＩｃおよびＦｃγＲＩＩＩｄよりなる群から選択されるＦｃγＲ蛋白質の三次元構造を提供することと［ここで、前記ＦｃγＲ蛋白質の前記三次元構造は表１によって表される原子座標に実質的に一致する］；
（ｂ）前記ＦｃγＲ蛋白質の前記三次元構造を用いて、ＦｃγＲ蛋白質のＩｇＧへの結合を刺激する化合物、ＦｃγＲ蛋白質の三次元構造を実質的に模倣する化合物、およびＦｃγＲ蛋白質を介した細胞シグナル変換を刺激する分子とＦｃγＲ蛋白質との結合を刺激する化合物よりなる群から選択される化合物を設計することと；
（ｃ）前記化合物を化学的に合成することと；および
（ｄ）ＩｇＧ媒介応答を増強する前記合成された化合物の能力を評価することと
を具備する方法によって同定される治療用組成物。
【請求項６６】
動物に投与すると、ＩｇＥ媒介応答を減少させる治療用組成物であって、前記治療用組成物は、Ｆｃε受容体Ｉ（ＦｃεＲＩ）蛋白質の活性を阻害する阻害性化合物を含み、前記阻害性化合物は：
（ａ）ＦｃεＲＩ蛋白質の三次元構造を提供することと［ここで、前記ＦｃεＲＩ蛋白質の前記三次元構造は、表１によって表される原子座標、表２によって表される原子座標、表３によって表される原子座標、表４によって表される原子座標および表５によって表される原子座標よりなる群から選択される原子座標に実質的に一致する］；
（ｂ）前記ＦｃεＲＩ蛋白質の前記三次元構造を用いて、ＦｃεＲＩ蛋白質のＩｇＥへの結合を阻害する化合物、ＦｃεＲＩ蛋白質の三次元構造を実質的に模倣する化合物、およびＦｃεＲＩ蛋白質を介した細胞シグナル変換を刺激する分子とＦｃεＲＩ蛋白質との結合を阻害する化合物よりなる群から選択される化合物を設計することと；
（ｃ）前記化合物を化学的に合成することと；および
（ｄ）ＩｇＥ媒介応答を減少する前記合成された化合物の能力を評価すること
を具備する方法によって同定される治療用組成物。
【請求項６７】
前記ＩｇＥ媒介応答がＩｇＥ媒介過敏症、炎症細胞のＩｇＥ媒介漸増および炎症モジュレーターのＩｇＥ媒介放出からなる群から選択される生物学的応答に由来する請求項６６記載の組成物。
【請求項６８】
前記構造が表３に表される原子座標を含む請求項６６記載の組成物。
【請求項６９】
前記構造が表４に表される原子座標を含む請求項６６記載の組成物。
【請求項７０】
前記化合物が無機化合物および有機化合物よりなる群から選択される請求項６６記載の組成物。
【請求項７１】
前記化合物がオリゴヌクレオチド、ペプチド、ペプチドミメティック化合物および小有機分子よりなる群から選択される請求項６６記載の組成物。
【請求項７２】
前記化合物が前記ＦｃεＲ蛋白質のアナログ、前記ＦｃεＲＩ蛋白質の基質アナログおよび前記ＦｃεＲＩ蛋白質のペプチドミメティック化合物よりなる群から選択される請求項６６記載の組成物。
【請求項７３】
前記組成物がさらに賦形剤、アジュバントおよび担体よりなる群から選択される成分を含む請求項６６記載の組成物。
【請求項７４】
動物に投与すると、ＩｇＥ媒介応答を増強する治療用組成物であって、前記治療用組成物が、Ｆｃε受容体Ｉ（ＦｃεＲＩ）蛋白質の活性を刺激する刺激性化合物を含み、前記刺激性化合物は：
（ａ）ＦｃεＲＩ蛋白質の三次元構造を提供することと［ここで、前記ＦｃεＲＩ蛋白質の前記三次元構造は、表１によって表される原子座標、表２によって表される原子座標、表３によって表される原子座標、表４によって表される原子座標および表５によって表される原子座標よりなる群から選択される原子座標に実質的に一致する］；
（ｂ）前記ＦｃεＲＩ蛋白質の前記三次元構造を用いて、ＦｃεＲＩ蛋白質のＩｇＥへの結合を刺激する化合物、ＦｃεＲＩ蛋白質の三次元構造を実質的に模倣する化合物およびＦｃεＲ蛋白質を介した細胞シグナル変換を刺激する分子とＦｃεＲＩ蛋白質との結合を刺激する化合物よりなる群から選択される化合物を設計することと；
（ｃ）前記化合物を化学的に合成することと；および
（ｄ）ＩｇＥ媒介応答を増強する前記合成された化合物の能力を評価することと
を具備する方法によって同定される治療用組成物。
【請求項７５】
ＦｃＲ蛋白質の三次元構造を決定するための方法であって、前記方法が、
（ａ）ＦｃγＲＩ蛋白質、ＦｃγＲＩＩｂ蛋白質、ＦｃγＲＩＩｃ蛋白質、ＦｃγＲＩＩＩｂ蛋白質、ＦｃεＲＩ蛋白質およびＦｃαＲＩ蛋白質よりなる群から選択されるＦｃＲ蛋白質のアミノ酸配列を提供することと［ここで、前記ＦｃＲ蛋白質の三次元構造は公知ではない］；
（ｂ）折り畳み認識によって三次元立体配座における前記アミノ酸配列の折り畳みのパターンを分析することと；および
（ｃ）前記ＦｃＲ蛋白質アミノ酸配列の折り畳みの前記パターンを、ＦｃγＲＩＩａ蛋白質の三次元構造と比較し、前記ＦｃＲ蛋白質の三次元構造を決定することと［ここで、前記ＦｃγＲＩＩａ蛋白質の前記三次元構造は表１に表した原子座標に実質的に一致する］、
を具備する方法。
【請求項７６】
ＦｃＲ蛋白質の三次元構造を誘導するための方法であって、前記方法が、
（ａ）ＦｃγＲＩＩａ蛋白質のアミノ酸配列およびＦｃＲ蛋白質のアミノ配列を提供する工程と；
（ｂ）前記ＦｃγＲＩＩａアミノ酸配列と前記ＦｃＲ蛋白質のアミノ配列との間で共有された構造的に保存された領域を同定する工程と；
（ｃ）表１に表された原子座標に実質的に一致する原子座標に基づいてＦｃγＲＩＩａ蛋白質の三次元構造を用いて、前記ＦｃＲ蛋白質の前記構造的に保存された領域を三次元構造に対して割り当てることによって、前記標的構造について原子座標を決定し、前記ＦｃＲ蛋白質アミノ酸配列の三次元構造のモデルを誘導する工程と
を具備する方法。
【請求項７７】
さらに、回転異性体のライブラリーを用いて立体的に許容される位置を決定することによって前記ＦｃＲ蛋白質の側鎖につき原子座標を割り当てることを含む請求項７６記載の方法。
【請求項７８】
結晶化されたＦｃＲ蛋白質の三次元構造を誘導する方法であって、前記方法が、
（ａ）結晶化されたＦｃＲ蛋白質のパターソン関数と結晶性ＦｃγＲＩＩａ蛋白質のパターソン機能と比較して前記結晶化されたＦｃＲ蛋白質の電子密度マップを作成する工程と；および、
（ｂ）前記電子密度マップを分析して前記結晶化されたＦｃＲ蛋白質の前記三次元構造を生じさせる工程と
を具備する方法。
【請求項７９】
さらに、前記結晶化されたＦｃＲ蛋白質の前記三次元構造を電子的に刺激して前記結晶化されたＦｃＲ蛋白質の前記三次元構造のコンピュータイメージを誘導する工程を具備する請求項７８記載の方法。
【請求項８０】
さらに、前記結晶性ＦｃγＲＩＩａ蛋白質のパターソン関数上に前記結晶化されたＦｃＲ蛋白質の前記パターソン関数を回転させて、前記結晶化されたＦｃＲ蛋白質の結晶において前記結晶化されたＦｃＲ蛋白質の正しい配位を決定し、前記結晶化されたＦｃＲ蛋白質の初期相を同定する工程を具備する請求項７８記載の方法。
【請求項８１】
結晶性形態のＦｃγＲＩＩａ蛋白質を含む組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
（発明の分野）
本発明は、結晶性ＲｃγＲＩＩａ、結晶ＦｃεＲＩ、ＦｃαＲＩＩａ蛋白質の三次元座標、ＦｃγＲＩＩａの三次元構造、ＦｃＲ、特に、ＦｃγＲＩＩａの構造に由来するＦｃεＲＩおよびＲｃγＲＩＩＩｂの三次元構造を含むＦｃ受容体（ＦｃＲ）の三次元構造、そのモデル、並びにかかる構造およびモデルの使用に関する。
【０００２】
【従来の技術】
（発明の背景）
Ｒｃ受容体（ＦｃＲ）は、免疫グロブリン（Ｉｇ）のＦｃ部分に特異的な高度に関連している受容体のファミリーである。これらの受容体は通常の免疫性および感染に対する抵抗性において主要な役割を有し、細胞エフェクターアームを持つ体液性免疫系を提供する。受容体は免疫グロブリンクラスの各々について定義されており、それ自体、それらが結合するＩｇのクラスによって定義されている（すなわち、Ｆｃガンマ受容体（ＦｃγＲ）はガンマ免疫グロブリン（ＩｇＧ）に結合し、Ｆｃイプシロン受容体（ＦｃεＲ）はイプシロン免疫グロブリン（ＩｇＥ）に結合し、Ｆｃアルファ受容体（ＦｃαＲ）はアルファ免疫グロブリン（ＩｇＡ）に結合する）。ＦｃγＲ受容体の中に、３つのサブファミリーメンバーが定義されている；ＩｇＧに対する高い親和性受容体であるＦｃγＲＩ；凝集免疫複合体に強力に結合するＩｇＧに対する低親和性受容体であるＦｃγＲＩＩ；および免疫複合体に結合する低親和性受容体であるＦｃγＲＩＩＩ。これらの受容体は構造的には高度に関連しているが、異なる機能を示す。ＦｃγＲＩＩの構造および機能は、免疫複合体との相互作用と、疾患とのその関連とによって興味深い。
【０００３】
ＦｃγＲはほとんどの造血細胞で発現され、ＩｇＧの結合を介して免疫系および感染に対する宿主防御のホメオスタシスにおいて重要な役割を演じている。ＦｃγＲＩＩは、事実上、ＩｇＧ免疫複合体のみに結合し、例えば、単球、マクロファージ、好中球、好酸球、血小板およびＢリンパ球を含めた多様な種類の細胞で発現されるＩｇＧに対する低親和性受容体である。ＦｃγＲＩＩは、抗体依存性細胞媒介細胞毒性、免疫複合体のクリアランス、炎症メディエーターの放出および抗体生産の調節を含む、種々の免疫および炎症応答に関与する。ＩｇＧのＦｃγＲに対する結合は、ＦｃγＲによる調節に関連する疾患の徴候を導き得る。例えば、自己免疫性疾患血小板減少症紫斑は、血小板のＦｃγＲ依存性ＩｇＧ免疫複合体活性化またはＦｃγＲ＋貪食細胞によるそれらの破壊に由来する組織（血小板）損傷に関連する。加えて、ＩＩ型およびＩＩＩ型過敏症反応を含む種々の炎症性疾患は、ＩｇＧ免疫複合体に関係することが知られている（例えば、慢性関節リウマチ、全身性エリテマトーデス等）。ＩＩ型およびＩＩＩ型過敏症反応はＩｇＧによって媒介され、これは、補体の媒介または貪食細胞のエフェクターメカニズムのいずれかを活性化し、組織障害に導き得る。
【０００４】
ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃεＲＩ、または事実いずれかのＦｃＲの蛋白質構造の解明は、疾患の管理のための治療的および診断的試薬の処方において重要である。本発明の発見まで、免疫反応を調節するＦｃγＲＩＩａの構造およびその結果得られるメカニズムは知られていなかった。従って、ＦｃγＩＩａが一般的に多機能に機能しているにも拘わらず、疾患の治療または診断に有用な試薬の開発は、該受容体の構造的情報の欠如によって妨げられてきた。ＦｃγＲＩＩａの一次の核酸およびアミノ酸配列は従前に報告されている（Ｈｉｂｂｓら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，第８５巻，２２４０−２２４４，１９８８）。ヒトＦｃγＲＩＩａ（Ｈｕｌｅｔｔら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，第２３巻，４０−６４５頁，１９９３；Ｈｕｌｅｔｔら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，第６９巻，１５２８７−１５２９３；およびＨｕｌｅｔｔら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，第２７０巻，２１１８８−２１１９４，１９９５）、ヒトＦｃγＲＩＩＩｂ（Ｈｉｂｂｓら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，第１５２巻，４４６６，１９９４；およびＴａｍｍら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，第２７１巻，３６５９，１９９６）およびマウスＦｃγＲＩ（Ｈｕｌｅｔｔら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，第１４８巻，１８６３−１８６８頁，１９９１）の領域を同定する突然変異体誘発実験は、ＦｃγＲに対するＩｇＧ結合の重要な領域を定義してきた。しかしながら、一次配列（線状配列；ｌｉｎｅａｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ）に基づく情報は、該蛋白質の三次元構造およびその機能的ドメインを正確には予測できない。ヒューバーら（Ｈｕｂｅｒら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，第２３０巻，１０７７−１０８３頁，１９９３）は新生児ラットＦｃ受容体蛋白質（ＦｃＲｎ）の結晶形成を記載している。バーミスターら（Ｂｕｒｍｅｉｓｔｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ，第３７２巻，３３６−３４３頁，１９９４；およびＮａｔｕｒｅ，第３７２巻，３７９−３８３頁，１９９４）はＦｃＲｎ結晶の構造を記載している。しかしながら、ＦｃＲｎは主要な組織適合蛋白質複合体に密接に関連し、機能または構造による白血球ＦｃγＲファミリーには関連してはいない。かくして、ＦｃＲｎの蛋白質構造は本発明のＦｃＲ構造を予測するものではない。
【０００５】
ＦｃεＲは肥満細胞において発現され、ＩｇＥの結合を介して、該肥満細胞の脱顆粒に際して主として炎症メディエーター（例えば、ヒスタミンおよびセロトニン等）の放出による炎症免疫応答を作動させる。これらのメディエーターの放出は、多形核細胞の当該部位への流入を含む、局所的な血管透過性および局所組織における流体の増加の原因となる。かくして、ＩｇＥのＦｃεＲＩに対する結合は、腸からの流体の放出および増大した粘液分泌並びに気管支収縮を含む、アレルギー性炎症を含む疾患に典型的に関連する疾患の兆候に至り得る。従って、ＦｃεＲＩの蛋白質構造の解明は疾患の管理、特にアレルギー性炎症および他のＴｈ２ベースの免疫反応に関連する疾患の管理に対する治療的および診断的な処方において重要である。前記したＦｃγＲに関しては、ヒトＦｃεＲＩの一次核酸およびアミノ酸配列は従前に報告されている（Ｋｏｃｈａｎら，１９９８，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．，１６：３５８４）。しかしながら、本発明の発見まで、ＦｃεＲがそれによって免疫応答を調節する構造および得られたメカニズムは知られていない。かくして、ＦｃεＲＩの一般的作用の知識にも拘わらず、アレルギー性炎症に関連した疾患等の病気の治療または診断のために有用な試薬の開発は、その受容体の構造情報の欠如によって妨げられていた。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
従って、当該分野では、Ｆｃ受容体の三次元構造およびモデルを解明し、薬物デザイン等の治療戦略において、かかる構造およびモデルを用いることへの要望が存在する。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
（発明の概要）
本発明は、結晶性ＦｃγＲＩＩａおよび結晶性ＦｃεＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ蛋白質の三次元座標、ＦｃγＩＩａの三次元構造、ＦｃεＲＩおよびＦｃγＲＩＩＩｂを含めたＦｃγＲＩＩａの該構造に由来するＦｃ受容体（ＦｃＲ）の三次元構造およびモデル、並びにかかる構造およびモデルの使用に関する。かかる結晶を得ることは、予測されなかった結果である。蛋白質の構造を決定するために十分な品質の結晶を得ることが予測できないことであることは、蛋白質結晶学分野ではよく知られていることである。特に、ＦｃγＲＩＩａの三次元（３−Ｄ）構造を決定するのに十分な品質の結晶を得ることは、本出願明細書に開示されたＦｃγＩＩａの結晶化まで達成されていなかった。それ自体、ＦｃγＲＩＩａの三次元構造決定は、本発明の発見まで可能なことではなかった。加えて、本発明の発見までは、他のＦｃ受容体（ＦｃＲ）蛋白質の三次元構造およびモデルの導出は可能ではなかった。また、本発明者らは三次元構造を限定し、ＦｃεＲＩおよびＦｃγＲＩＩＩｂについての薬物デザインのための三次元モデルを提供する最初の者である。
【０００８】
従って、本発明の１つの目的は、高分解能にて、好ましくは約１．８オングストロームまで、ＦｃγＲＩＩａの三次元構造の測定を得るのに十分な品質の結晶を提供することである。また、本発明は、結晶性ＦｃγＲＩＩａを製造する方法を含む。
【０００９】
本発明のさらにもう１つの方法は、好ましくは高分解能でＦｃεＲＩの三次元構造の決定を行うのに十分な品質のＦｃεＲＩ蛋白質の結晶を提供することにある。また、本発明は、結晶性ＦｃεＲＩを製造する方法を含む。
【００１０】
ＦｃγＲＩＩａおよびＦｃεＲＩの結晶の値は、単にかかる結晶を得ることができるのを超えて拡大される。ＦｃγＲＩＩａ結晶構造に関して得られた知識は、例えば、従来未知のＦｃγＲＩＩａ蛋白質の第三次構造を限定するために、従来未知のＦｃεＲＩ蛋白質の三次元構造および従来未知のＦｃγＲＩＩＩｂ蛋白質の三次元構造についての原子座標をモデル化し誘導するために本発明によって用いられており、加えて、これを用いて、例えば、ＦｃγＲ蛋白質ファミリーおよびＦｃαＲＩ蛋白質の他のメンバーについて等の、実質的に関連する一次アミノ酸配列を有する他のＦｃＲ蛋白質の従来未知の第三次構造をモデル化することが可能である。蛋白質のＦｃγＲファミリーには３つのメンバー、即ち、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩおよびＦｃγＲＩＩＩが存在し、その全ては免疫調節分子として作用し、且つその全てがＩｇＧに対して結合する。受容体のＦｃγＲファミリーの核酸およびアミノ酸配列の比較は、該受容体が高度に相同であることを示す。加えて、受容体のＦｃγＲファミリーの各メンバーは分子がＩｇスーパーファミリーに属し、これはよく確立された判定基準に基づく帰属である（Ｈｕｌｅｔｔら，１９９４，前掲）。さらに、ＦｃγＲＩＩ、ＦｃγＲＩＩＩ、ＦｃεＲＩおよびＦｃαＲＩは各々Ｉｇ様ドメインを含み、これは、これらの受容体の間の類似性を示す。ＦｃγＩは３つのＩｇ様ドメインを含む。しかしながら、ＦｃγＲＩの第１および第２のドメインは、ＦｃγＲＩＩ、ＦｃγＲＩＩＩ、ＦｃεＩおよびＦｃαＲＩのＩｇ様ドメインに対して実質的に相同である。Ｘ−線解析技術に依存せず、かくして、該蛋白質の結晶化を要しない第三次構造決定の現在の方法（例えば、コンピュータモデリングおよび核磁気共鳴技術）は、ＦｃγＲＩＩａ蛋白質の三次元構造から外挿された、他のＦｃγＲ蛋白質、ＦｃεＲＩおよびＦｃαＲＩ蛋白質のモデルの誘導および改善を可能とする。かくして、ＦｃγＲＩＩａ蛋白質の三次元構造の知識が、これらの蛋白質の全ての構造への調査のための出発点を提供している。
【００１１】
従って、本発明の第２の目的は、ＦｃγＲＩＩａ蛋白質の構造、並びにの該ＦｃγＲファミリーの他のメンバーの蛋白質、ＦｃεＲＩおよびＦｃαＲＩ蛋白質のモデル、原子座標および誘導された三次元構造に関する情報を提供することにある。
【００１２】
ＦｃγＲＩＩａの三次元構造および他のＦｃＲのモデルの知識は、ヒトを含む動物において免疫機能および炎症を調節する化合物を設計し、且つ生産するための手段（即ち、構造ベースの薬物デザイン）を提供する。例えば、種々のコンピュータプログラムおよびモデルを用い、Ｆｃ受容体蛋白質に対する免疫グロブリンの結合をブロックするように化合物を設計することができる。
【００１３】
本発明のもう１つの実施形態は、ＦｃＲの三次元構造の三次元コンピュータイメージを提供することである。
【００１４】
本発明のもう１つの実施形態は、表１に表された三次元座標、表２に表された三次元座標、表３に表された三次元座標、表４に表された三次元座標、および表５に表された三次元座標よりなる群から選択される三次元座標の組で符号化されたコンピュータリーダブル媒体であって、ここで、グラフィックディスプレイソフトウェアプログラムを用い、該三次元座標は、三次元イメージとしてその電子ファイルを表すことができるコンピュータ上で可視化され得る電子ファイルを作成するコンピュータリーダブル媒体を提供することである。
【００１５】
従って、本発明の第３の目的は、ＦｃＲ蛋白質に結合すること、若しくはＦｃＲ蛋白質の作用を模倣すること、免疫グロブリン（Ｉｇ）に結合すること、若しくは免疫グロブリン（Ｉｇ）の作用を模倣すること、例えば、２つのＦｃＲ蛋白質の二量体化を妨げることによってＦｃＲ蛋白質を介しての細胞シグナル変換を破壊すること、または例えば２つのＦｃＲ蛋白質の二量体化を強化することによって細胞シグナル変換を増強したり若しくはＦｃＲに対して結合することなどによって、疾患を治療および診断するための試薬を設計するために、ＦｃγＲＩＩａなどのＦｃＲの三次元構造、並びにかかる構造を用いて誘導される構造、座標およびモデルを使用する方法を提供することである。
【００１６】
また、ＦｃＲの三次元構造の知識は、該蛋白質の構造と個々のアミノ酸の間の相互作用とを分析することによって利益をもたらす機能を変更した蛋白質を設計する手段を提供する。例えば、ＩｇまたはＩｇの免疫複合体に対する改良された結合を有する治療用蛋白質を設計して、細胞に対する免疫複合体結合を防止するための、またはＦｃＲのＩｇ若しくはその複合体に対する結合に際して細胞シグナル変換などの生物学的応答を増強するための治療用化合物として使用することが可能である。かくして、改良を含むように設計された組換え可溶性ＦｃＲは、該三次元構造の知識を基礎にして作成することが可能である。
【００１７】
従って、本発明の第４の目的は、改変された生物学的活性を有する組換え蛋白質を製作するためのＦｃＲの三次元構造の外挿を提供することである。
【００１８】
本発明の１つの実施形態はＦｃＲ蛋白質のモデルであり、ここで、該モデルはＦｃＲ蛋白質の三次元構造を表し、ここで、該構造は表１によって表された原子座標に実質的に一致する。本発明の他の実施形態は、表１によって表された原子座標に実質的に一致するＦｃγＲＩＩａ蛋白質の三次元構造；表２によって表された原子座標に実質的に一致するダイマーＦｃγＲＩＩａ蛋白質の三次元構造；表３によって表された原子座標に実質的に一致するモノマーＦｃεＲＩ蛋白質の三次元構造；表４によって表された原子座標に実質的に一致するダイマーＦｃεＲＩ蛋白質の三次元構造；表５によって表された原子座標に実質的に一致するダイマーＦｃγＲＩＩＩｂ蛋白質の三次元構造、およびかかる構造を表すモデルである。本発明のさらなる実施形態は、前記座標が表１で表されるＦｃγＲＩＩａ蛋白質の三次元座標の組；前記座標が表２で表されるダイマーＦｃγＲＩＩａ蛋白質の三次元座標の組；前記座標が表３で表されるＦｃεＲＩ蛋白質の三次元座標の組；前記座標が表４で表されるＦｃεＲＩ蛋白質の三次元座標の組；および前記座標が表５で表されるＦｃγＲＩＩＩｂの三次元座標の組に関する。また、本発明は、構造ベースの薬物デザインを含むかかる構造を使用する方法、並びに標的ＦｃＲ構造のモデルおよびイメージを誘導する方法を含む。
【００１９】
本発明のもう１つの実施形態は、結晶性形態のＦｃγＲＩＩａ蛋白質を含む組成物である。本発明のさらにもう１つの実施形態は、結晶性形態のＦｃεＲＩ蛋白質を含む組成物である。
【００２０】
本発明のさらにもう１つの実施形態は、ＦｃγＲＩＩａ蛋白質を酢酸塩緩衝液および硫酸塩緩衝液よりなる群から選択される母液緩衝液と合わせることと、結晶形成を誘導して前記ＦｃγＲＩＩａ結晶を形成することとを具備するＦｃγＲＩＩａの結晶の製造する方法である。
【００２１】
また、本発明は、ＦｃεＲＩ蛋白質を、酢酸塩緩衝液、カコジル酸緩衝液およびクエン酸ナトリウム緩衝液よりなる群から選択される母液緩衝液と合わせることと、結晶形成を誘導して前記ＦｃεＲＩ結晶を形成することとを具備するＦｃεＲＩの結晶の製造する方法を含む。
【００２２】
また、本発明は、動物に投与すると、ＩｇＧ媒介組織損傷を減少する治療用組成物であって、前記組成物はＦｃγＲＩＩａ蛋白質の活性を阻害する阻害性化合物を含有し、前記阻害性化合物が：（ａ）ＦｃγＩＩａ蛋白質の三次元構造を提供することと；（ｂ）前記三次元構造を用いて、ＦｃγＲＩＩａ蛋白質のＩｇＧに対する結合を阻害する化合物と、ＦｃγＲＩＩａ蛋白質の三次元構造を実質的に模倣する化合物と、およびＦｃγＲＩＩａ蛋白質を介して細胞シグナル変換を刺激する分子とＦｃγＲＩＩａ蛋白質との結合を阻害する化合物とよりなる群から選択される化合物を設計することと；（ｃ）前記化合物を化学的に合成することと；並びに、（ｄ）ＩｇＧ媒介組織損傷を減少する前記合成された化合物の能力を評価することとを具備する方法；によって同定される治療用組成物を含む。
【００２３】
本発明のもう１つの実施形態は、動物におけるＩｇＧ体液性免疫応答を刺激することができる治療用組成物である。本発明のさらにもう１つの実施形態は、動物に投与されて、オプシニゼーション（ｏｐｓｉｎｉｚａｔｉｏｎ）またはＦｃγＲ依存性エフェクター機能（例えば、抗体依存性ＦｃγＲ媒介細胞毒性、貪食作用または細胞メディエーターの放出等）により、これに限定されるものではないが癌または感染性疾患（例えば、ＨＩＶ、ヘルペス、細菌感染、酵母感染または寄生虫感染等の経口感染など）を含む特定の疾患を治療する、抗体の治療学的作用を改良する治療用組成物である。かかる治療用組成物はＩｇＧに対する増大された結合を有し、ＩｇＧのＦｃγＲに対する結合を促進し、ＦｃγＲのダイマー形成を促進しおよび／またはＦｃγＲを介したシグナル変換を増強する１以上の刺激性化合物を含む。また、体液性免疫応答を刺激するための方法が本発明に含まれる。該方法は本発明の治療用組成物を動物に投与する工程を含む。
【００２４】
また、本発明は、動物に投与すると、ＩｇＧ媒介組成損傷を減少させる治療用組成物であって、該治療用組成物がＦｃγＲＩＩＩｂ蛋白質の活性を阻害する阻害性化合物を含有し、該阻害性化合物が：（ａ）ＦｃγＲＩＩＩｂ蛋白質の三次元構造を提供することと；（ｂ）前記三次元構造を使用して、ＦｃγＲＩＩＩｂ蛋白質のＩｇＧに対する結合を阻害する化合物と、ＦｃγＲＩＩＩｂ蛋白質の三次元構造を実質的に模倣する化合物と、およびＦｃγＲＩＩＩｂ蛋白質を介する細胞シグナル変換を刺激する分子とＦｃγＲＩＩＩｂ蛋白質との結合を阻害する化合物とよりなる群から選択される化合物を設計することと；（ｃ）前記化合物を化学的に合成することと；並びに（ｄ）ＩｇＧ媒介組織損傷を減少させる前記合成された化合物の能力を評価することとを具備する方法によって同定される治療用組成物を含む。
【００２５】
本発明の１つの実施形態は、ＩｇＥ媒介応答を減少させることができる治療用組成物である。かかる治療用組成物はＩｇＥ媒介過敏症、炎症モジュレーターのＩｇＥ媒介放出またはＦｃεＲ蛋白質に関連する炎症細胞のＩｇＥ媒介漸増に関与する他の生物学的機能に由来するＩｇＥ媒介応答を減少させることができる。本発明のかかる治療用組成物は：（１）ＦｃεＲ蛋白質のＩｇＥ結合部位を干渉することによるＩｇＥ免疫複合体に対するＦｃεＲ蛋白質を有する細胞（例えば、肥満細胞）上でのＦｃεＲ蛋白質の結合を阻害（すなわち、防止、ブロック）することと；（２）ＩｇＥまたはＩｇＥ免疫複合体の沈殿を阻害することと（すなわち、２つのＩｇＥの間のＦｃ：Ｆｃ相互作用を防止すること）：（３）細胞表面受容体に対するＩｇＥの結合に干渉することによって免疫グロブリン媒介細胞シグナル変換を阻害することと；および（４）細胞シグナル誘導分子（すなわち、ＦｃεＲ蛋白質を介して細胞シグナル変換を誘導する分子）のＦｃεＲ蛋白質に対する結合を干渉することによってＦｃεＲ媒介細胞シグナル変換を阻害することができる。かかる治療用組成物はＩｇＥのＦｃεＲ蛋白質に対する、ＩｇＥのＩｇＥに対する、ＩｇＥの細胞表面受容体に対する、または細胞シグナル誘導分子のＦｃεＲ蛋白質に対する結合を阻害する１以上の阻害性化合物を含む。また、ＩｇＥ媒介炎症等のＩｇＥ媒介応答を減少させる方法が本発明に含まれる。
【００２６】
本発明のもう１つの実施形態は動物においてＩｇＥ液性免疫応答を刺激することができる治療用組成物である。本発明のさらにもう１つの実施形態は、動物に投与して、オプシナイゼーションまたはＦｃεＲ依存性エフェクター機能（例えば、貪食作用または細胞メディエーターの放出等）によって特定の疾患を治療する、抗体の治療作用を改良する治療用組成物である。かかる治療用組成物はＩｇＥに対する増大した結合を有し、ＩｇＥのＦｃεＲＩに対する結合を増強し、ＦｃεＲＩのダイマーの形成を増強し、および／または別にＦｃεＲＩを介してシグナル変換を増強する１以上の刺激性化合物を含む。また、体液性免疫応答を刺激する方法が本発明に含まれる。該方法は本発明の治療用組成物を動物に投与する工程を具備する。
【００２７】
【発明の実施の形態】
（発明の詳細な説明）
本発明はＦｃ受容体（ＦｃＲ）蛋白質の三次元構造、かかる三次元構造のモデル、かかる構造を用いる構造ベースの薬物デザインの方法、かかる方法によって同定された化合物および治療用組成物におけるかかる化合物の使用の発見に関する。さらに詳しくは、本発明はＦｃガンマ受容体ＩＩａ（ＦｃγＲＩＩａ）の新規結晶、Ｆｃイプシロン受容体Ｉ（ＦｃεＲＩ）の新規結晶、かかる結晶の製造方法、ＦｃγＲＩＩａ蛋白質の三次元座標、ＦｃγＲＩＩａ蛋白質の三次元構造、ＦｃεＲＩおよびＦｃγＲＩＩｂを含むＦｃγＲＩＩａ構造に由来するＦｃＲ構造およびモデル、並びに他のＦｃＲ構造を誘導するかかる構造およびモデルの使用、薬物デザイン戦略におけるかかる構造およびモデルの使用に関する。用語「ある」（「ａ」または「ａｎ」）の存在は１以上のその存在を言うことに注意されたい；例えば、化合物は１以上の化合物または少なくとも１つの化合物を言う。それ自体、用語「ある」（「ａ」または「ａｎ」）、「１以上」、および「少なくとも１つ」はここでは交換可能に用いることができる。また、用語「を含む」、「含めた」および「有する」は交換可能に用いることができることに注意すべきである。さらに、「よりなる群から選択される」化合物とは２以上の化合物の混合物（すなわち組合せ）を含めた後のリスト中の１以上の化合物を言う。本発明によると、単離されたまたは純粋な蛋白質はその天然環境から取り出された蛋白質である。それ自体、「単離された」および「生物学的に純粋な」とは、該蛋白質が精製された程度を必ずしも反映しない。本発明の単離された蛋白質はその天然源から得られ、組換えＤＮＡ技術を用いて製造することができるか、あるいは化学合成によって製造することができる。また、用語「三次」および「三次元」は交換可能に用いることができることに注意すべきである。また、「ＦｃＲ蛋白質」への言及は単に「ＦｃＲ」として言及することができ、かかる用語は完全なＦｃＲ蛋白質、ポリペプチドおよび／またはＦｃＲ蛋白質のモノマーまたはダイマーのごときＦｃＲ蛋白質の一部に言及するために用いることもできることに注意すべきである。特に言及がモノマーまたはダイマーに対してなされる場合、例えば、かかる用語は典型的にはＦｃＲ蛋白質名と組み合わせて用いられる。
【００２８】
ＦｃγＲＩＩａの結晶構造の製造は１９９８年２月６日に出願された米国仮出願番号６０／０７３，９７２に詳細に説明されている。米国仮出願番号６０／０７３，９７２の全体は参照することによりここに組み込まれる。
【００２９】
本発明の１つの実施形態はＦｃ受容体のモデルを含み、該モデルはＦｃ受容体（ＦｃＲ）蛋白質の三次元構造を表す。本発明のもう１つの実施形態はＦｃＲ蛋白質の三次元構造を含む。本発明に包含されるＦｃＲ蛋白質の三次元構造は表１ないし５のいずれか１つに表された原子座標に実質的に一致する。本発明によると、用語「実質的に一致する」の使用は、ＦｃＲ蛋白質の三次元立体配置を定義する原子座標を決定するための基礎として原子座標の特定の組を用いてＦｃＲ蛋白質の三次元構造が（すなわち、分子置換によって）モデル化または計算されることを可能にするように、原子座標（例えば、表１等によって表されるもの）の特定の組の特定の三次元立体配置の少なくとも一部に対して十分に空間的に同様であるＦｃＲ蛋白質の三次元構造の少なくとも一部を言う。本発明によると、第１のＦｃＲのダイマーの三次元構造は第２のＦｃＲのモノマーの三次元構造を表す原子座標を実質的に一致させることができ、その逆も可能である。第１の例において、最初のＦｃＲ蛋白質の構造の少なくとも一部（すなわち、最初のＦｃＲ蛋白質のダイマーのモノマー）は第２のＦｃＲモノマーの三次元立体配置を表す原子座標に実質的に一致する。第２の逆の場合において、最初のモノマーＦｃＲ蛋白質は第２のＦｃＲ蛋白質の少なくとも一部（すなわち、第２のＦｃＲ蛋白質ダイマーのモノマー）に実質的に一致する。同様に、最初のＦｃＲの所与の１部または鎖の三次元構造は第２のＦｃＲの三次元立体配置を表す原子座標の少なくとも一部に実質的に一致することができる。
【００３０】
さらに詳しくは、原子座標の所与の組に実質的に一致する構造は、かかる構造の少なくとも約５０％が各ドメインにおける二次構造要素中の主鎖原子（ｂａｃｋｂｏｎｅ ａｔｏｍｓ）につき約１．５オングストローム未満の、より好ましくは各ドメインにおける二次構造要素中の主鎖原子につき約１．３オングストローム未満、順次、より好ましくは、約１．０オングストローム未満、約０．７オングストローム未満、約０．５オングストローム未満、最も好ましくは各ドメインにおける二次構造要素中の主鎖原子につき約０．３オングストローム未満の平均二乗平均平方根偏差（ＲＭＳＤ）を有する構造である。より好ましい実施形態において、原子座標の所与の組に実質的に一致する構造は、かかる構造の少なくとも約７５％が列挙された平均二乗平均平方根偏差（ＲＭＳＤ）値を有し、より好ましくはかかる構造の少なくとも約９０％が列挙された平均二乗平均平方根偏差（ＲＭＳＤ）値を有し、最も好ましくはかかる構造の約１００％が列挙された平均二乗平均平方根偏差（ＲＭＳＤ）値を有する構造である。さらにより好ましい実施形態において、「実質的に一致する」の前記定義はアミノ酸側鎖の原子を含めるように拡大することができる。本明細書中で用いるごとく語句「共通のアミノ酸側鎖」とは原子座標の所与の組に実質的に一致する構造と、およびかかる原子座標によって実際に表される構造との双方に共通するアミノ酸側鎖を言う。好ましくは、原子座標の所与の組に実質的に一致する三次元構造は、共通アミノ酸側鎖の少なくとも約５０％が約１．５オングストローム未満、より好ましくは約１．３オングストローム未満、順次、より好ましくは、約１．０オングストローム未満、約０．７オングストローム未満、約０．５オングストローム未満、最も好ましくは約０．３未満の平均二乗平均平方根偏差（ＲＭＳＤ）を有する構造である。より好ましい実施形態において、原子座標の所与の組に実質的に一致する構造は、共通アミノ酸側鎖の少なくとも約７５％が列挙された平均二乗平均平方根偏差（ＲＭＳＤ）値を有し、より好ましくは共通アミノ酸側鎖の少なくとも９０％が列挙された平均二乗平均平方根偏差（ＲＭＳＤ）値を有し、最も好ましくは共通アミノ酸側鎖の約１００％が列挙された平均二乗平均平方根偏差（ＲＭＳＤ）値を有する構造である。
【００３１】
原子座標の特定の組に実質的に一致するＦｃＲ蛋白質の三次元構造は、例えば、以下のデーター：（１）ＦｃＲ蛋白質のアミノ酸配列と；（２）三次元立体配置を有する原子座標の特定の組によって表された蛋白質の関連部分（単数または複数）のアミノ酸配列と；および（３）特定の三次元立体配置の原子座標と、に由来する情報を使用して、モデラー［ＭＯＤＥＬＥＲ、Ｉｎｓｉｇｈｔ　ＩＩ　Ｈｏｍｏｌｏｇｙソフトウェアパッケージ（Ｉｎｓｉｇｈｔ　ＩＩ）（９７．０），ＭＳＩ，Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ）で実施されているごときＡ．ＳａｌｉおよびＴ．Ｌ．Ｂｌｕｎｄｅｌｌ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．，ｖｏｌ．２３４：７７９−８１５，１９９３］のような適切なモデリングコンピュータプログラムによってモデル化することができる。また、原子座標の特定の組に実質的に一致するＦｃＲ蛋白質の三次元構造も、後で詳細に記載する分子置換のごとき方法によって計算することができる。
【００３２】
もう１つのＦｃＲ蛋白質の三次元構造をモデル化し、または計算するのに使用されるＦｃＲ蛋白質の適切な三次元構造は表１に表される原子座標の該組を含む。表１に記載された三次元座標の組は標準的なプロテイン・データ・バンク・フォーマット（Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｄａｔａ　Ｂａｎｋ　ｆｏｒｍａｔ）で表される。本発明によると、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ、ＦｃγＲＩＩｃ、ＦｃγＲＩＩＩｂ、ＦｃεＲＩおよびＦｃαＲＩの群から選択されるＦｃＲ蛋白質は表１によって表される原子座標の組に実質的に一致する三次元構造を有する。本明細書で用いるごとく、三次元構造は最もありそうに、または顕著に、原子座標の組に対して適応（ｆｉｔ）するものでもある。本発明によると、最もありそうな（即ち、蓋然的な）または顕著な適応とは、特定のＦｃＲ蛋白質がその特定のＦｃＲ蛋白質に由来する原子座標の組とで有する適応性である。かかる原子座標は、例えば、ここに提供されるＦｃγＲＩＩａ構造につき決定される座標のような蛋白質の結晶構造から、またはＦｃεＲＩおよびＦｃγＲＩＩＩｂにつきここに決定されるような蛋白質の構造のモデルから誘導される。例えば、天然に生じたまたは組換えにより生産されたＦｃγＲＩＩａ蛋白質を含むモノマーＦｃγＲＩＩａ蛋白質の三次元構造は表１の原子座標に実質的に一致し、それは該原子座標との最も可能性が高く適応または顕著に適応する。本発明によって決定されたＦｃγＲＩＩａの三次元結晶構造は表１の原子座標を含む。また、その例として、ＦｃεＲＩ蛋白質の三次元構造は表１の原子座標に実質的に一致し、並びに、共に表３の原子座標に実質的に一致し、且つそれとの蓋然的な適応であり、本発明者らによって決定されたＦｃεＲＩモノマーのモデルの三次元構造は表３の原子座標を含む。この定義は同様に他のＦｃＲ蛋白質に適用することができる。
【００３３】
本発明によるＦｃＲ蛋白質の好ましい構造は表１に表された原子座標、並びにＢ値および／または熱パラメーターに実質的に一致する。表１にリストされたかかる値は当業者によって解釈される。ＦｃＲ蛋白質のより好ましい三次元構造は表１に表された三次元座標に実質的に一致する。ＦｃＲ蛋白質のさらにより好ましい三次元構造は表１に表された三次元座標との最も蓋然的適応である。実質的に一致するおよび蓋然的な適応を決定する方法は当業者の技量内のものであり、例のセクションに記載する。
【００３４】
表１によって表される原子座標に実質的に一致する三次元構造を有する好ましいＦｃＲ蛋白質は、ＤＮＡｓｉｓＴＭプログラム（Ｈｉｔａｃｈｉ　Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｓａｎ　Ｂｒｕｎｏ，ＣＡから入手可能）またはＭａｃＶｅｃｔｏｒＴＭプログラム（Ｅａｓｔｍａｎ　Ｋｏｄａｋ　Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ　Ｈａｖｅｎ，ＣＴから入手可能）またはＧＣγＴＭプログラム（「ＧＣγ」，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩから入手可能）のごとき配列アラインメントプログラムを例えば用いる場合にＦｃＲ配列の全長を横切って、ＦｃγＲＩＩａ蛋白質のアミノ酸配列、好ましくは配列番号３、配列番号１０、配列番号１１および／または配列番号１２を含めたアミノ酸配列に対して少なくとも約２５％、好ましくは少なくとも約３０％、より好ましくは少なくとも約４０％、より好ましくは少なくとも約５０％、より好ましくは少なくとも約６０％、より好ましくは少なくとも約７０％、より好ましくは少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約９０％で同一であるアミノ酸配列を有するＦｃＲ蛋白質を含み、かかるアラインメントは例えばかかるアラインメントプログラムを伴う標準的な省略値（ｄｅｆａｕｌｔ ｖａｌｕｅｓ）を用いて行われる。
【００３５】
本発明の１つの実施形態はＦｃγＲＩＩａ蛋白質の三次元構造を含む。ＦｃγＲＩＩａ蛋白質の適切な三次元構造は表１に表された原子座標に実質的に一致する。ＦｃγＲＩＩａの適切な三次元構造は表２−５によって表される原子座標に一致する。また、ＦｃγＲＩＩａ蛋白質の適切な三次元構造は表１に表される原子座標の組を含む。ＦｃγＲＩＩａ蛋白質の三次元座標の組は標準的なプロテイン・データ・バンク・フォーマットで表される。ＦｃγＲＩＩａ蛋白質の好ましい構造は表１（モノマーＦｃγＲＩＩａ）または表２（ダイマーＦｃγＲＩＩａ）に表された原子座標、並びにＢ値および／または熱パラメーターに実質的に一致する。表１にリストされたかかる値は当業者によって解釈される。ＦｃγＲＩＩａ蛋白質のより好ましい三次元構造は表１に表された三次元座標との蓋然的な適応を有する。
【００３６】
本発明の１つの実施形態はＦｃεＲＩ蛋白質の三次元構造を含む。ＦｃεＲＩ蛋白質の適切な三次元構造は表１、表２、表３、表４または表５に表される原子座標と実質的に一致する。ＦｃεＲＩ蛋白質のより適切な三次元構造は表３（モノマーＦｃεＲＩ）または表４（ダイマーＦｃεＲＩ）に表された原子座標の組に実質的に一致する。また、ＦｃεＲＩ蛋白質の適切な三次元構造は表３または４に表された原子座標の組を含む。ＦｃεＲＩ蛋白質の三次元座標の組は標準的なプロテイン・データ・バンク・フォーマットで表される。表１ないし５にリストされたかかる座標は当業者によって解釈される。ＦｃεＲＩ蛋白質のより好ましい三次元構造は表３または表４に表された三次元座標との蓋然的な適応を有する。本発明の１つの実施形態はＦｃεＲＩＩＩｂ蛋白質の三次元構造を含む。ＦｃεＲＩＩＩｂ蛋白質の適切な三次元構造は表１、表２、表３、表４または表５に表された原子座標に実質的に一致する。ＦｃεＲＩＩＩｂ蛋白質のなおさらにより適切な三次元構造は表５に表された原子座標の組に実質的に一致する。また、ＦｃεＲＩＩＩｂ蛋白質の適切な三次元構造は表５に表された原子座標の組を含む。ＦｃεＲＩＩＩｂ蛋白質の三次元座標の組は標準的なプロテイン・データ・バンク・フォーマットで表される。ＦｃγＲＩＩＩｂ蛋白質のより好ましい三次元構造は表５に表された三次元座標との最も適切な適応を有する。いずれかのＦｃＲ蛋白質の三次元構造は、ＦｃγＲＩＩａ結晶の分析から、およびＦｃγＲＩＩａ結晶に由来する他のＦｃＲ構造から得られた情報に基づいて当該分野で一般的に用いられている方法でモデル化することができる。後記の例のセクションは、ＦｃγＲＩＩａ結晶の製造、ＦｃεＲＩ結晶の製造、ＦｃγＲＩＩａ結晶に由来するＦｃγＲＩＩａ蛋白質のモノマーおよびダイマーの三次元構造、およびＦｃγＲＩＩａ結晶の分析から得られた情報に基づいて当該分野で一般的に知られた方法を用いるＦｃεＲＩ蛋白質のモノマーおよびダイマーの三次元構造のモデルを開示する。結晶性ＦｃγＲＩＩａのごとき結晶性ＦｃＲの三次元構造を用いてここに開示されたＦｃεＲＩのごときいずれかの他のＦｃＲの三次元構造を誘導することができることは本発明の実施形態である。その結果、ＦｃγＲＩＩａの結晶性構造から誘導されたＦｃＲ（例えば、ＦｃεＲＩ）の誘導された三次元構造を用いて、ＦｃＲγＩＩＩのごとき他のＦｃＲの三次元構造を誘導することができる。従って、結晶性ＦｃγＲＩＩａのここにおける新規な発見およびＦｃγＲＩＩａの三次元構造により、当業者は今やいずれかのＦｃＲの三次元構造を誘導しそれをモデル化することができる。いずれかのＦｃＲの構造の誘導は今やかかる他のＦｃＲについての結晶構造データーが存在しない場合であってさえも達成することができ、もう１つのＦｃＲの結晶構造が入手できる場合は、新しいＦｃＲの三次元構造のモデリングは、ＦｃγＲＩＩａ構造からすでに得られた知識を用いて仕上げることができる。他のＦｃＲのアミノ酸配列における差を考慮し、他のＦｃＲの蛋白質についての結晶構造データの不存在下で、他のＦｃＲ蛋白質の三次元構造をモデル化することができることが、本発明の利点である。事実、本出願の優先日に続いてのモノマーＦｃεＲＩの結晶化および該受容体のモデルの公表（Ｇａｒｍａｎら、１９９８年１２月２３日，Ｃｅｌｌ　９５：９５１−９６１）する最近の報告は、表３に表された原子座標を含む本発明者らによって決定されたモノマーＦｃεＲＩ蛋白質がガーマン（Ｇａｒｍａｎ）らよって報告された結晶性ＦｃεＲＩの三次元構造の総合したかなりの構造的特徴を有することが確認された。ガーマンらの結晶性ＦｃεＲＩ構造の原子座標は現在公には入手できないが、ガーマンらにおける構造表示および考察の概要は、結晶性ＦｃεＲＩの三次元構造が表３によって表される原子座標に実質的に一致すると予測されることを示す。さらに、本発明の新規な発見は、実質的にいずれものＦｃＲ、特にＦｃγＲおよびＦｃεＲＩの活性に影響する化合物の構造ベースの薬物デザインを可能とする。
【００３７】
結晶はＰｔ、Ｈｇ、ＡｕおよびＰｂの錯体または塩のごとき重原子化合物で誘導体化し、天然および誘導化結晶につきＸ線回折データーを測定する。天然結晶および誘導化結晶についての回折強度の差を用いて、ＭＩＲ（マルチプル同型置換）またはＳＩＲＡＳ（異常散乱を有するシングル同型置換）の方法によってこれらのデーターにつき相を決定することができる。これらのデーターのフーリエ変換により、蛋白質についての低分解能電子密度マップが得られる。この電子密度はイメージ増強技術によって修飾することができる。次いで、該蛋白質についての分子モデルを電子密度に位置する。この初期の（部分的）構造は、蛋白質の公知の幾何学的および化学的特性に一致する該モデルを同時に拘束しつつ、測定され且つ計算された該回折パターンの間の差異を最小化するための構造を記載するパラメーターを修飾することによってコンピュータプログラム（ＸＰＬＯＲ等）を用いて仕上げることができる。新しい相およびかくして新しい電子密度マップは蛋白質について計算され得る。このマップをガイドとして用い、構造の分子モデルを手動で改良することができる。この手法を反復して、表１中の原子座標の組としてＦｃγＲＩＩａについて、ここに表した蛋白質の構造を与える。
【００３８】
本発明の１つの実施形態はＦｃγＲＩＩａ蛋白質の三次元構造を含み、ここで、ＦｃγＲＩＩａの蛋白質の原子座標は：（ａ）結晶性形態のＦｃγＲＩＩａの蛋白質を提供することと；（ｂ）結晶性ＦｃγＲＩＩａタンパクの電子密度マップを作成することと；および、（ｃ）電子密度マップを分析して原子座標を生じさせることとを具備する方法によって得られる。
【００３９】
本発明によると、本発明のＦｃγＲＩＩａ蛋白質の三次元構造を用いて、もう１つのＦｃＲ蛋白質の三次元構造（すなわち、モデル化すべき構造）のモデルを誘導することができる。本明細書で用いる通り、蛋白質の「構造」とは該蛋白質を構成する成分と、および該成分の配置の様式を言う。本明細書で用いるごとく、用語「モデル」とは蛋白質、ポリペプチド、またはペプチドの三次元構造の有形媒体における表示を言う。例えば、モデルは、コンピュータスクリーン上で、紙片上（すなわち、二次元媒体上）で、および／または玉棒図形としての、電子ファイルにおける三次元構造の表示であってもよい。物理的三次元モデルは有形であり、限定されるものではないが、棒模型および空間実体模型を含む。語句「コンピュータスクリーン上でモデルをイメージする」とは、当業者に知られた適切なコンピュータハードウェアおよびソフトウェア技術を用いてコンピュータスクリーン上のモデルを表現し（または表し）、それを操作する能力を言う。かかる技術は、例えば、エバンス・アンド・スザーランド（Ｅｖａｎｓ　ａｎｄ　Ｓｕｔｈｅｒｌａｎｄ，Ｓａｌｔｌａｋｅ　ｃｉｔｙ，Ｕｔａｈ，およびＢｉｏｓｙｍ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を含めた種々の源から入手できる。語句「モデルの画像を提供する」とは、モデルの「ハードコピー」を生成させる能力を言う。ハードコピーは動画および静止画を共に含む。モデルのコンピュータスクリーンイメージおよび画像は空間実体模型表示、α炭素追跡、リボンダイアグラム（例えば、ヒトＦｃεＲＩ蛋白質の三次元構造の二次元リボンダイアグラムモデルである図１４参照されたい）および電子密度マップを含めた多数のフォーマットで可視化することができる。
【００４０】
本発明の方法を用いるモデルに対する適切な標的ＦｃＲ構造は、ＦｃγＲＩＩａ蛋白質に実質的に構造的に関連するＦｃＲ蛋白質のモノマー、ダイマーおよびマルチマーを含めたいずれのＦｃＲ蛋白質、ポリペプチドまたはペプチドを含む。ＦｃμＲＩＩａ蛋白質に実質的に構造的に関連する好ましい標的ＦｃＲ構造は、ＤＮＡｓｉｓＴＭプログラム（Ｈｉｔａｃｈｉ　Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｓａｎ　Ｂｒｕｎｏ，ＣＡから入手可能）またはＭａｃＶｅｃｔｏｒＴＭプログラム（Ｅａｓｔｍａｎ　ｋｏｄａｋ　Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ　Ｈａｖｅｎ，ＣＴから入手可能）またはＧＣγＴＭプログラム（「ＧＣγ」，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩから入手可能）等の配列アラインメントプログラムを例えば用いる場合に、標的ＦｃＲ構造配列の全長を横切って、ＦｃγＲＩＩａ蛋白質のアミノ酸配列、好ましくは配列番号３、配列番号１０、配列番号１１，配列番号１２、配列番号１４および／または１５を含めたアミノ酸配列に対して少なくとも約２５％、好ましくは少なくとも約３０％、より好ましくは少なくとも約３６％、より好ましくは少なくとも約４０％、より好ましくは少なくとも約５０％、より好ましくは少なくとも約６０％、より好ましくは少なくとも約７０％、より好ましくは少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約９０％で同一であるアミノ酸配列を有する標的ＦｃＲ構造を含み、かかるアラインメントは、例えば、かかるアラインメントプログラムを伴う標準的な省略値を用いて行われる。モデルに対するより好ましい標的ＦｃＲ構造は、該アミノ酸配列をアラインメントするのにここに開示したＤＮＡアラインメントプログラムを用いた場合、該アミノ酸配列のいずれかのドメイン１またはドメイン２についてのアミノ酸配列等の配列の好ましい領域を比較すると、配列番号３、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２または配列番号１３のアミノ酸配列に対して、少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約６０％、より好ましくは少なくとも約７０％、より好ましくは少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約９０％、より好ましくは少なくとも約９５％で同一であるアミノ酸配列を含む蛋白質を含む。モデルに対するより好ましい標的ＦｃＲ構造は、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ、ＦｃγＲＩＩｃ、ＦｃγＲＩＩＩｂ、ＦｃεＲＩまたはＦｃαＲＩ蛋白質を含む構造、より好ましくはアミノ酸配列番号３、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２または配列番号１３を含む構造、より好ましくはアミノ酸配列番号３、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２または配列番号１３よりなる構造を含む。
【００４１】
また、モデルに対する好ましい標的ＦｃＲ構造は、限定されるものではないが、置換、欠失または付加された１以上のアミノ酸残基を有するＦｃ受容体のごときＦｃ受容体蛋白質の誘導体（ここではＦｃ受容体突然変異体と言う）、またはＦｃ受容体をコードする核酸分子の天然対立遺伝子変異体によってコードされる蛋白質を含む。モデルに対する好ましいＦｃ受容体蛋白質はＦｃγＲＩＩａγＴｍ（すなわち、膜貫通ドメインが欠失したことによるＦｃγＲＩＩａ蛋白質）、およびＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ、ＦｃγＲＩＩｃ、ＦｃγＲＩＩＩｂ、ＦｃεＲＩ、ＦｃαＲＩ蛋白質をコードする核酸分子の突然変異体または天然対立遺伝子変異体を含む。モデルに対するより好ましいＦｃ受容体蛋白質は配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２若しくは配列番号１３を含むアミノ酸配列を有するＦｃ受容体蛋白質、または配列番号３、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２または配列番号１３の突然変異体若しくは天然対立遺伝子変異体を含む。本発明によると、ＦｃγＲＩＩｂのアミノ酸配列は、ここでは配列番号５として表され、ＦｃγＲＩＩｃについてのアミノ酸配列は配列番号６として表され、ＦｃγＲＩについてのアミノ酸配列は配列番号７として表され、ＦｃγＲＩＩＩについてのアミノ酸配列はここではアミノ酸配列番号８として表され、ＦｃεＲＩについてのアミノ酸配列はここでは配列番号９として表され、且つ図１３に記載され、ＦｃαＲＩについてのアミノ酸配列はここでは配列番号１３として表される。前記した公知のＦｃＲの全てについてのヌクレオチドおよびアミノ酸配列は公知であり、公に入手できることに注意されたい。モデルに対する好ましい対立遺伝子変異体は、限定されるものではないが、ここでは配列番号１０として表される、配列番号３の残基２７でのグルタミンと、配列番号３の残基１３１でのアルギニンを有した；ここでは配列番号１１として表される、配列番号３の残基２７のトリプトファンと配列番号３の残基１３１のヒスチジンと有した；ここでは配列番号１２として表される、配列番号３の残基２７でのトリプトファンおよび配列番号３の残基１３１でのアルギニンを有するＦｃγＲＩＩａ対立遺伝子変異体を含む。
【００４２】
本明細書で用いるごとく、「天然対立遺伝子変異体」とは、相同染色体上の対応する遺伝子座を占める遺伝子の代替の形態を言う。対立遺伝子変異体は、典型的には、それらが比較される遺伝子によってコードされる蛋白質のものと同様の活性を有する蛋白質をコードする。また、対立遺伝子変異体は当該遺伝子の５’または３’非翻訳領域（例えば、調節制御領域）に改変を含む。対立遺伝子変異体は当業者によく知られ、動物の所与の種においてＦｃ受容体をコードする遺伝子の所与の群内に見い出されることが予期されるであろう。
【００４３】
本明細書で用いるごとく、「Ｆｃ受容体をコードする核酸分子の変異体」とは、ヌクレオチドの挿入、欠失および／または置換によって修飾された核酸分子を言う。好ましくは、Ｆｃ受容体核酸分子の突然変異体は、Ｆｃ受容体核酸分子の突然変異体によってコードされた蛋白質（すなわち、Ｆｃ受容体蛋白質突然変異体）が、非突然変異Ｆｃ受容体蛋白質に対する液性または細胞性免疫応答によって標的化できる１以上のエピトープを有するように修飾を含む。より好ましくは、突然変異体Ｆｃ受容体蛋白質をコードする核酸分子が、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で非突然変異Ｆｃ受容体核酸分子をコードする核酸配列とで安定なハイブリッドを形成することができる。なおより好ましくは突然変異体Ｆｃ受容体蛋白質をコードする核酸分子はストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、配列番号３、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２または配列番号１３を含むアミノ酸配列をコードする核酸配列と安定なハイブリッドを形成することができる。
【００４４】
本明細書で用いるごとく、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、核酸分子を用いて相似する核酸分子を同定する標準的なハイブリダイゼーション条件を言う。かかる標準的な条件は、例えば、サンブルックら（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ　ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｓ　Ｐｒｅｓｓ　１９８９）によって開示されている。サンブルックら（前掲）の文献は、参照することにより、その全体をここに組み込む（特に、頁９．３１−９．６２、１１．７および１１．４５−１１．６１を参照されたい）。加えて、ヌクレオチドのミスマッチの程度を変動することを可能とするハイブリダイゼーションを達成するための適切なハイブリダイゼーションおよび洗浄条件を計算するための式は、例えば、メインコスら（Ｍｅｉｎｋｏｔｈら，１９８４，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１３８，２６７−２８４；前掲）に開示され、参照することにより、ここにその全体が組み込まれる。
【００４５】
より詳しくは、ここに言及するストリンジェントなハイブリダイゼーション条件とは、ハイブリダイゼーション反応でプローブとして使用されるべき核酸分子と少なくとも約７０％、より好ましくは少なくとも約７５％、特に少なくとも約８０％の核酸配列同一性を有する核酸分子の単離を可能とする条件をいう。かかる条件は、ＤＮＡ：ＲＮＡまたはＤＮＡ：ＤＮＡハイブリッドが形成されるかに応じて変化するであろう。ＤＮＡ：ＤＮＡハイブリッドについての計算された融解温度は、ＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドについてよりも１０℃低い。特別の実施形態において、ＤＮＡ：ＤＮＡハイブリッドについてのストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、約２０℃と約３５℃との間、より好ましくは約２８℃と約４０℃との間、さらにより好ましくは約３５℃と約４５℃との間の温度での、０．１×ＳＳＣ（０．１５７Ｍ　Ｎａ＋）のイオン強度でのハイブリダイゼーションを含む。特に実施形態においては、ＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドについてのストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、約３０℃と約４５℃との間、より好ましくは約３８℃と約５０℃との間、さらにより好ましくは約４５℃と約５５℃との間の温度で、０．１×ＳＳＣ（０．１５７Ｍ　Ｎａ＋）のイオン強度でのハイブリダイゼーションを含む。これらの値は、約１００ヌクレオチドよりも大きい分子についての融解温度の計算、０％ホルムアミドおよび約５０％のＧ＋Ｃ含有量に基づくものである。あるいは、Ｔｍはサンブルックら（前掲，頁１１．５５ないし１１．５７に記載されているごとく経験的に計算することができる。
【００４６】
本発明のモデルはＦｃγＲＩＩａ等の１つのＦｃＲ蛋白質の公知の三次元構造ともう１つの標的ＦｃＲ構造との間の保存された構造的特徴を用いて誘導することができる。かかる構造的特徴は、限定されるものではないが、免疫グロブリンのスーパーファミリーのメンバーに高度に保存されているアミノ酸配列、保存されたジスルフィド結合、およびβ−ストランドまたはβ−シートを含む。例えば、図５、１１および１２は種々のＦｃ受容体蛋白質の一次アミノ酸配列をβ−ストランドとの関係を説明する。好ましくは、本発明のモデルは、ＦｃγＲＩＩａ蛋白質の三次元構造の主鎖で出発することによって誘導される。次いで、個々の残基を、ＦｃγＲＩＩａ蛋白質のアミノ酸配列とは異なる残基での標的ＦｃＲ構造のアミノ酸配列に従って置き換える。残基の置き換えは主鎖の三次構造を乱さないように注意する。標的ＦｃＲ構造をモデル化するための手法は一般に当該分野で知られているが、本発明はＦｃγＲＩＩａ蛋白質の最初の三次元構造およびＦｃγＲ受容体のファミリーのメンバー、ＦｃεＲＩおよびＦｃεＲＩＩＩｂに実質的に関連する蛋白質の最初の三次元構造を提供する。かくして、本発明はＦｃεＲＩ受容体およびＦｃαＲＩ受容体の、ＦｃγＲ受容体のファミリーのメンバーの正確で、従って有用なモデルを作成するための必須の情報を提供する。前記したごとく、一旦、第２のＦｃＲの三次元構造が、ここに開示されたＦｃγＲＩＩａ等の最初のＦｃＲの決定された三次元構造から誘導されたならば、該第２のＦｃＲ三次元構造を用いて、もう１つのＦｃＲの三次元構造を誘導（すなわち、モデル化し、または計算）することができる。
【００４７】
本発明によると、例えば、サリ（Ｓａｌｉ、Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｏｐｉｎｉｏｎ　ｉｎ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．６，頁４３７−４５１，１９９５）によって一般的に記載された技術を用いて構造をモデル化することができ、アルゴリズムは、Ｈｏｍｏｌｏｇｙ９５．０（Ｂｉｏｓｙｍ／ＭＳＩ，Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ，ＣＡから入手可能な，プログラム・Ｉｎｓｉｇｈｔ　ＩＩにおいて）等のプログラムパッケージで実施することができる。Ｈｏｍｏｌｏｇｙ９５．０の使用は、モデル化すべき標的構造のアミノ酸配列を持つ公知の三次元構造を有する公知の構造のアミノ酸配列のアラインメントが必要である。該アラインメントは、精度を改良するための他の関連配列を含めた対様式のアラインメントまたはマルチプル配列アラインメントであってもよい（例えば、Ｒｏｓｔ，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，ｖｏｌ．２６６，頁５２５−５３９，１９９６によって一般的に記載されている方法を用いる）。構造的に保存された領域は、関連する構造的特徴を比較することによって、または公知の構造と当該標的構造との間の配列相同性の程度を調査することによって同定される。当該標的構造についての正確な座標は、公知の構造を用いて公知の構造から割り当てられる。当該標的構造の他の領域についての座標は、ブルックヘイベン・ナショナル・ラボラトリー（ＢｒｏｏｋＨａｖｅｎ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｕｐｔｏｎ，ＮＹ）によって維持されるプロテイン・データ・バンクに見いだされるような公知の構造から得られた断片から生成することができる。当該標的構造の側鎖の配座は、立体的配置に関して許容されるものを参照し、且つ回転異性体のライブラリーおよびそれらの発生頻度を用いて割り当てることができる（ＰｏｎｄｅｒおよびＲｉｃｈａｒｄｓ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，ｖｏｌ．１９３，頁７７５−７９１，１９８７に一般的に記載されている）。
【００４８】
当該標的構造の得られたモデルは、分子力学（例えば、Ｂｉｏｓｙｍ／ＭＳＩから入手可能なプログラムＤｉｓｃｏｖｅｒに具現化されている）によって改良されて、当該モデルが化学的且つ立体配置的に合理的であるように保証される。
【００４９】
従って、本発明の１つの実施形態は標的ＦｃＲの三次元構造のモデルを誘導する方法であり、該方法は：（ａ）ＦｃγＲＩＩａ蛋白質のアミノ酸配列および標的ＦｃＲ構造のアミノ酸配列を提供することと；（ｂ）ＦＣγＲＩＩａアミノ酸配列と当該標的ＦｃＲ構造アミノ酸配列との間に共有された構造的に保存された領域を同定することと；（ｃ）表１に表された原子座標に実質的に一致する原子座標に基づいたＦｃγＲＩＩａ蛋白質の三次元構造を用いて当該標的ＦｃＲ構造の前記構造的に保存された領域を三次元構造に対して割り当てることにより、当該標的ＦｃＲ構造について原子座標を決定し、当該標的構造アミノ酸配列の三次元構造のモデルを誘導する工程を具備する。本発明のモデルは、本明細書において先に記載してきた。好ましくは、該モデルはコンピュータモデルを含む。該方法は、さらに、構造的帰属を電子的に刺激し、当該標的構造アミノ酸配列の三次元構造のコンピュータモデルを誘導する工程を具備する。モデル化するための適切な標的構造は、ここに開示したＦｃ受容体の蛋白質、ポリペプチドおよびペプチドを含み、前記Ｆｃ受容体のモノマーおよびダイマーを含む。モデル化するための好ましいアミノ酸配列をここに開示する。
【００５０】
本発明のもう１つの実施形態は、それにつき結晶が製造された標的ＦｃＲ構造（ここでは「結晶化標的構造」と言う）の三次元構造のコンピュータモデルを誘導するための方法である。かかるモデルを生成させるための適切な方法は、分子置換を具備する方法を含む。分子置換の方法は一般に、当業者に知られており（一般に、Ｂｒｕｎｇｅｒ，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｎ．，Ｖｏｌ．２７６，頁５５８−５８０，１９９７，ＮａｖａｚａおよびＳａｌｕｂｊｉａｎ，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍ．，Ｖｏｌ．２７６，頁５８４−５９４，１９９７，ＴｏｎｇおよびＲｏｓｓｍａｎｎ，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍ．，Ｖｏｌ．２７６，頁５９４−６１１，１９９７；およびＢｅｎｔｌｅｙ，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍ．，Ｖｏｌ．２７６，頁６１１−６１９，１９９７に記載されており、その各々は参照することにより、その全体がここに組み込まれる）、例えばＸｐｌｏｒを含めたソフトウェアプログラムで行われる。本発明によると、Ｘ線回折データーは結晶化標的構造の結晶から収集される。Ｘ線回折データーを変換してパターソン関数を計算する。当該結晶化標的構造のパターソン関数を既知の構造（ここではサーチ構造と言う）から計算されたパターソン関数と比較する。当該結晶化標的構造のパターソン関数を当該サーチ構造パターソン関数上で回転させて、当該結晶における結晶化標的構造の正しい配向を決定する。次いで、翻訳関数を計算し、当該結晶軸に関する当該標的構造の配向を決定する。一旦、当該結晶化標的構造が単位格子で正しく位置付けられれば、当該実験データについての初期相を計算することができる。これらの相は、それから構造の差異が観察される電子密度マップの計算されることと、および当該構造の改良とが必要である。好ましくは、当該サーチ分子の構造的特徴（例えば、アミノ酸配列、保存されたジスルフィド結合、およびβ−ストランドまたはβ−シート）を、結晶化標的構造に関連づける。好ましくは、本発明による分子置換の方法で有用な結晶化標的ＦｃＲ構造は、ここに開示したＤＮＡアラインメントプログラムを用いて、当該２つのアミノ酸配列を比較した場合に、該サーチ構造（例えば、ＦｃγＲＩＩａ）のアミノ酸配列に対して少なくとも約２５％、より好ましくは少なくとも約３０％、より好ましくは少なくとも約４０％、より好ましくは少なくとも約５０％、より好ましくは少なくとも約６０％、より好ましくは少なくとも約７０％、より好ましくは少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約９０％で同一であるアミノ酸配列を有する。本発明の好ましいサーチ構造は、配列番号３、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１４または配列番号１５を含むアミノ酸配列を含むＦｃγＲＩＩａ蛋白質を含む。本発明のより好ましいサーチ構造は、表１にリストした原子座標に実質的に一致する三次元構造を有するＦｃγＲＩＩａ蛋白質を含む。好ましくは、結晶性ＦｃγＲＩＩａ蛋白質のパターソン関数は、本発明のＦｃγＲＩＩａ結晶のＸ線回折に由来する。本発明の分子置換戦略で使用する好ましい標的ＦｃＲ構造は、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩｂ、ＦｃγＲＩＩｃ、ＦｃγＲＩＩＩ、ＦｃεＲＩおよび／またはＦｃαＲＩを含み、最も好ましくはＦｃεＲＩおよび��ｃγＲＩＩＩｂである。
【００５１】
本発明の好ましい実施形態は、結晶化標的ＦｃＲ構造（すなわち、結晶化ＦｃＲ蛋白質）の三次元構造を誘導する方法を含み、該方法は：（ａ）結晶化標的ＦｃＲ構造のパターソン関数を、結晶性ＦｃγＲＩＩａ蛋白質のパターソン関数と比較し、前記結晶化標的ＦｃＲ構造の電子密度マップを作成することと；および、（ｂ）該電子密度マップを分析し、該結晶化標的ＦｃＲ構造の三次元構造を形成することとの工程を含む。
【００５２】
本発明のもう１つの実施形態は、標的構造の三次元構造を決定する方法であり、ここで、当該標的ＦｃＲ構造の三次元構造は未知である。かかる方法は、当該標的構造の三次元構造のみをベースとするＦｃγＲＩＩａ蛋白質の三次元構造に関連する構造を同定するのに有用である。従って、本発明の方法は、ＦｃγＲＩＩａ蛋白質との高いアミノ酸同一性を有してはいないが、三次元構造類似性は有する構造を同定することを可能にする。標的ＦｃＲ構造の三次元構造を決定するための好ましい方法は：（ａ）標的構造のアミノ酸配列を提供することと［ここで、当該標的構造の三次元構造は未知である］；（ｂ）折り畳み認識によって三次元立体配座におけるアミノ酸配列の折り畳みのパターンを分析することと；および、（ｃ）当該標的構造アミノ酸配列の折り畳みのパターンをＦｃγＲＩＩａ蛋白質の三次元構造と比較し、当該標的構造の三次元構造を決定することと［ここで、ＦｃγＲＩＩａ蛋白質の三次元構造は表１に表した原子座標に実質的に一致する］を具備する。折り畳み認識の好ましい方法は一般に、ジョーンズにより記載される方法を含む（Ｊｏｈｎｓ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ　Ｓｔｒｕｃ．Ｂｉｏｌ．，ｖｏｌ．７，頁３７７−３８７，１９９７）。かかる折り畳みは、標的構造の疎水性および／または親水性特性に基づいて分析することが可能である。
【００５３】
本発明の１つの実施形態は、ＦｃＲ蛋白質の三次元構造の三次元コンピュータイメージを含む。その三次元コンピュータイメージを形成するための適切な構造をここに開示する。好ましくは、コンピュータイメージは、表１にリストされた三次元座標に実質的に一致する構造に対して作られる。本発明のコンピュータイメージは、これにより限定されるものではないが、ＭＯＬＳＣＲＩＰＴ２．０（Ａｖａｔｅｒ　Ｓｏｆｔｗａｒｅ　ＡＢ，Ｈｅｌｅｎｅｂｏｒｇｓｇａｔａｎ　２１Ｃ，ＳＥ−１１７３１　Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ，スウェーデン）、グラフィック・ディスプレイ・プログラム（Ｊｏｈｎｓら、Ａｃｔａ　Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｔｈｙ、ｖｏｌ．Ａ４７，頁１１０、１９９１）またはグラフィック・ディスプレイ・プログラム・ＧＲＡＳＰを含めたいずれの適切なソフトウェアプログラムを用いて、製作することが可能である。本発明のイメージを作成するために有用な適切なコンピュータハードウェアは当業者に知られている。好ましいコンピュータハードウェアは、シリコン・グラフィック・ワークステーション（Ｓｉｌｉｃｏｎ　Ｇｒａｐｈｉｃｓ　Ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎ）を含む。
【００５４】
本発明のもう１つの実施形態は、表１に表された三次元座標、表２に表された三次元座標、表３に表された三次元座標、表４に表された三次元座標、表５に表された三次元座標よりなる群から選択された三次元座標の組で符号化されたコンピュータリーダブル媒体に関し、ここで、グラフィック・ディスプレイ・ソフトウェア・プログラムを用い、当該三次元座標は三次元イメージとしてその電子ファイルを表すことができるコンピュータ上で可視化することができる電子ファイルを製作する。好ましくは、当該三次元構造は、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃεＲＩおよびＦｃγＲＩＩＩｂよりなる群から選択されるＦｃＲ蛋白質である。
【００５５】
本発明のさらにもう１つの実施形態は表１に表された三次元座標に実質的に一致する三次元構造の三次元座標の組で符号化されたコンピュータリーダブル媒体に関し、ここで、グラフィック・ディスプレイ・ソフトウェア・プログラムを使用して、当該三次元座標の組は、三次元イメージとしてその電子ファイルを表すことができるコンピュータ上で可視化することができる電子ファイルを製作することができる。好ましくは、当該三次元構造は、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ、ＦｃγＲＩＩｃ、ＦｃγＲＩＩＩ、ＦｃεＲＩおよびＦｃαＲＩよりなる群から選択されるＦｃＲ蛋白質のものである。
【００５６】
本発明のもう１つの実施形態は図４、図６、図７、図８、図９、図１０、図１４、図１５または図１６に示されたものを含めたＦｃＲの二次元イメージに関する。これらの図面のほとんどは、ＭＯＬＳＣＲＩＰＴ２．０（Ａｖａｔｅｒ　Ｓｏｆｔｗａｒｅ　ＡＢ，Ｈｅｌｅｎｅｂｏｒｇｓｇａｔａｎ　２１Ｃ，ＳＥ−１１７３１　Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ，スウェーデン）により描かれた。
【００５７】
本発明の１つの実施形態は、表１に表された三次元座標を含む三次元座標の組を、グラフィックディスプレイソフトウェアプログラムを用いてコンピュータ上で分析して、前記イメージの電子ファイルを作成し、三次元イメージとして電子ファイルを表すことができるコンピュータ上で前記電子ファイルを可視化するときに製作されるＦｃＲタンパクのイメージを含む。適切なグラフィックソフトウェアディスプレイプログラムはＭＯＬＳＣＲＩＰＴ２．０、ＯおよびＧＲＡＳＰを含む。かかるイメージを可視化するための適切なコンピュータはシリコン・グラフィック・ワークステーション（Ｓｉｌｉｃｏｎ　Ｇｒａｐｈｉｃｓ　Ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎ）を含む。イメージに対する適切な構造およびモデルはここに開示される。好ましい三次元構造および／またはモデルは、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ、ＦｃγＲＩＩｃ、ＦｃγＲＩＩＩ、ＦｃεＲＩおよびＦｃαＲＩよりなる群から選択されるＦｃＲ蛋白質である。
【００５８】
また、本発明はＦｃγＲＩ蛋白質、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ蛋白質、ＦｃγＲＩＩｃ蛋白質、ＦｃγＲＩＩＩｂ蛋白質、ＦｃεＲＩ蛋白質、およびＦｃαＲＩ蛋白質を含めた標的構造の三次元構造の三次元モデルを含み、かかる三次元モデルは（ａ）ＦｃγＲＩＩａ蛋白質のアミノ酸配列および標的ＦｃＲ構造のアミノ酸配列を提供することと；（ｂ）ＦｃγＲＩＩａアミノ酸配列と該標的ＦｃＲアミノ酸配列との間で共有された構造的に保存された領域を同定することと；（ｃ）表１に表された原子座標に実質的に一致する原子座標に基づいてＦｃγＲＩＩａ蛋白質の三次元構造を用いて該標的ＦｃＲ構造の構造的に保存された領域を三次元構造に帰属させて、該標的ＦｃＲ構造アミノ酸配列の三次元構造のモデルを誘導することによってＦｃＲ蛋白質につき原子座標を決定することとを具備する方法によって製作される。好ましくは、該モデルはコンピュータモデルを含む。好ましくは、該方法はさらに標的ＦｃＲ構造アミノ酸配列の三次元構造のコンピュータモデルを誘導するために構造的帰属を電子的にシミュレートする工程を含む。ＦｃγＲＩ蛋白質、ＦｃγＲＩＩｂ蛋白質、ＦｃγＲＩＩｃ蛋白質、ＦｃγＲＩＩＩｂ蛋白質、およびＦｃεＲＩ蛋白質の好ましいアミノ酸配列はここに開示される。
【００５９】
本発明の１つの実施形態は、ＦｃγＲＩＩａ蛋白質を母液と合わせることと、および結晶形成を誘導してＦｃγＲＩＩａ結晶を生じさせることとを具備するＦｃγＲＩＩａの結晶の生産方法を含む。本発明のもう１つの実施形態は、ＦｃεＲＩ蛋白質を母液と合わせることと、および結晶形成を誘導してＦｃεＲＩ結晶を生じさせることとを具備するＦｃεＲＩの結晶の生産方法を含む。ＦｃγＲＩＩａおよびＦｃεＲＩの結晶の生産をここに具体的に記載したが、かかるプロセスはここに記載したごとく当業者によって適合されて、その三次元構造も本発明に含まれるような他のＦｃ受容体（ＦｃＲ）、特にＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩｂ、ＦｃγＲＩＩｃ、ＦｃγＲＩＩＩｂおよびＦｃαＲＩの結晶が得られることが理解されるべきである。
【００６０】
好ましくは、ＦｃγＲＩの結晶は、母液中で、約１ｍｇ／ｍｌないし約２０ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは約２ｍｇ／ｍｌないし約１５ｍｇ／ｍｌ、さらにより好ましくは約３ｍｇ／ｍｌないし約６ｍｇ／ｍｌの範囲のＦｃγＲＩＩａ蛋白質としてＦｃγＲＩＩａ蛋白質を含有する溶液を用いて形成される。好ましくは、結晶は３μｌ液滴当たり約１μｇないし約３０μｇ、より好ましくは約５μｇないし約２５μｇ、より好ましくは約４．５μｇないし約９μｇのＦｃγＲＩＩａ蛋白質を含有する液滴を用いて形成される。
【００６１】
本発明の適切な母液は酢酸塩緩衝液を含む。本発明の好ましい酢酸塩緩衝液は酢酸アンモニウムを含む。結晶化に先立っての緩衝液中の酢酸アンモニウムの濃度は約１００ｍＭないし約５００ｍＭ酢酸アンモニウムの範囲とすることができる。好ましくは、該緩衝液中の酢酸アンモニウムの濃度は約１５０ｍＭないし約３００ｍＭ酢酸アンモニウムの範囲である。より好ましくは、緩衝液中の酢酸アンモニウムの濃度は２００ｍＭ酢酸アンモニウムである。適切な酢酸塩緩衝液は好ましくは、約５ないし約７のｐＨ、より好ましくは約５．５ないし約６．５、より好ましくは約５．６のｐＨを有する緩衝液を含む。好ましくは、本発明の酢酸塩緩衝液のｐＨはクエン酸ナトリウムを用いて調節される。適切な酢酸塩緩衝液は約０．０１Ｍクエン酸ナトリウム、より好ましくは０．０５Ｍクエン酸ナトリウム、より好ましくは０．１Ｍクエン酸ナトリウムを含有する。適切な酢酸塩緩衝液は、いずれかのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含有し、ＰＥＧ４０００がより好ましい。本発明の酢酸塩緩衝液中の適切なＰＥＧ４０００濃度は、約２０％、好ましくは約２５％、より好ましくは約３０％ＰＥＧ４０００を含む。
【００６２】
本発明のもう１つの適切な母液は硫酸塩緩衝液を含む。本発明の好ましい硫酸塩は硫酸リチウムを含む。結晶化に先立っての緩衝液中の硫酸リチウムの濃度は約１００ｍＭないし約２．５Ｍ硫酸リチウムの範囲とすることができる。好ましくは、緩衝液中の硫酸リチウムの濃度は約５００ｍＭないし約２Ｍ硫酸リチウムの範囲である。より好ましくは、緩衝液中の硫酸リチウムの濃度は約１．５Ｍ硫酸リチウムである。適切な硫酸塩緩衝液は約５ないし約９、より好ましくは約６ないし約８、より好ましくは約７．５のｐＨを有する緩衝液を含む。好ましくは、本発明の硫酸塩緩衝液にｐＨはＨＥＰＥＳを用いて制御される。適切な硫酸塩緩衝液は約０．０１Ｍ　ＨＥＰＥＳ、より好ましくは０．０５Ｍ　ＨＥＰＥＳ、より好ましくは０．１Ｍ　ＨＥＰＥＳの濃度のＨＥＰＥＳを含有する。
【００６３】
限定されるものではないが、蒸気拡散、液体拡散、バッチ結晶化、一定温度および温度誘導またはその組合せを含めたいくつかの方法によってＦｃγＲＩＩａ蛋白質の超飽和溶液を誘導して結晶化させることができる。好ましくは、ＦｃγＲＩＩａ蛋白質の過飽和溶液を誘導して、蒸気拡散（すなわち、ハンギングドロップ方法）によって結晶化することができる。蒸気拡散方法において、ＦｃγＲＩＩａ蛋白質を本発明の母液と組合わせて、ＦｃγＲＩＩａ蛋白質溶液として、ＦｃγＲＩＩａ蛋白質溶液を過飽和して、一定温度でＦｃγＲＩＩａ結晶を形成させるる。蒸気拡散は、好ましくは、約１５℃ないし約３０℃、より好ましくは約２０℃ないし約２５℃の範囲で、より好ましくは約２２℃の一定した温度の制御された温度下で行う。
【００６４】
好ましい実施形態において、本発明は、（ａ）酢酸塩緩衝液中のＦｃγＲＩＩａ蛋白質の約３ｍｇ／ｍｌの溶液を調製して過飽調製物を形成することと［ここで、該緩衝液は約２００ｍＭ酢酸アンモニウム、約１００ｍＭクエン酸ナトリウムおよび約３０％ＰＥＧを含み、約ｐＨ５．８のｐＨを有する］；（ｂ）過飽和調製物の約３μｌ液滴をカバーグラス上に滴下し、約１ｍｌの酢酸塩緩衝液を含有するウェル上に倒立することと；および、（ｃ）ＦｃγＲＩＩａ結晶が形成されるまでインキュベートすることとの工程を具備するＦｃγＲＩＩａの結晶を産生じる方法を含む。
【００６５】
もう１つの好ましい実施形態において、本発明は：（ａ）硫酸塩緩衝液中のＦＣγＲＩＩａ蛋白質の約３ｍｇ／ｍｌ溶液を調製して過飽和調製物を形成することと［ここで、該緩衝液は約０．１５Ｍ　ＨＥＰＥＳおよび約１．５Ｍ硫酸リチウムを含み、約ｐＨ７．５のｐＨを有する］：（ｂ）過飽和調製物の約３μｌ液滴をカバーグラス上に滴下し、約１ｍｌの硫酸塩溶液を含有するウェル上にこれを倒立することと；および、（ｃ）ＦｃγＲＩＩａの結晶が形成されるまでインキュベートすることとの工程を具備するＦｃγＲＩＩａの結晶を製造する方法を含む。
【００６６】
簡単に前記で考察したごとく、本発明のもう１つの実施形態はＦｃεＲＩ結晶の製造方法およびそれにより製造されたＦｃεＲＩ結晶である。好ましくは、ＦｃεＲＩの結晶は、母液中のＦｃεＲＩ蛋白質を約１ｍｇ／ｍｌないし約２０ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは約２ｍｇ／ｍｌないし約１５ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは約３ｍｇ／ｍｌないし約６ｍｇ／ｍｌの範囲のＦｃεＲＩ蛋白質を含有する溶液を用いて形成され、母液中で３／ｍｌないし約６ｍｇ／ｍｌの範囲のＦｃεＲＩ蛋白質を含有する溶液を用いて形成されることがより好ましい。好ましくは、結晶は、３μｌ液滴当たり約１μｇないし約３０μｇ、より好ましくは約５μｇないし約２５μｇ、より好ましくは約４．５μｇないし約９μｇのＦｃεＲＩ蛋白質を含有する液滴を用いて形成される。
【００６７】
本発明の適切な母液は酢酸塩緩衝液を含む。本発明の好ましい酢酸塩緩衝液は酢酸カルシウムを含む。結晶化に先立っての緩衝液中の酢酸カルシウムの濃度は約１００ｍＭないし約５００ｍＭ酢酸カルシウムの範囲とすることができる。好ましくは、緩衝液中の酢酸カルシウムの濃度は約１５０ｍＭないし約３００ｍＭ酢酸カルシウムの範囲である。より好ましくは、緩衝液中の酢酸カルシウムの濃度は２００ｍＭ酢酸カルシウムである。適切な酢酸塩緩衝液は、好ましくは、約５．５ないし約７．５、より好ましくは約６．０ないし約７．０、より好ましくは約６．５のｐＨを有する緩衝液を含む。好ましくは、本発明の酢酸塩緩衝液のｐＨはカコジル酸ナトリウムを用いて調節される。適切な酢酸塩緩衝液は約０．０１Ｍカコジル酸ナトリウム、より好ましくは０．０５Ｍカコジル酸ナトリウム、より好ましくは０．１Ｍカコジル酸ナトリウムの濃度でカコジル酸ナトリウムを含有する。適切な酢酸塩緩衝液はいずれかのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含有し、ＰＥＧ８０００がより好ましい。本発明の酢酸塩緩衝液中の適切なＰＥＧ８０００濃度は約１０％ｗ／ｖ、好ましくは約１５％、より好ましくは約２０％Ｗ／ｖ濃度のＰＥＧ８０００を含む。
【００６８】
本発明のもう１つの適切な母液は、２−プロパノールおよびポリエチレングリコールと共にカコジル酸ナトリウムを含む緩衝液を含む。本発明の好ましいカコジル酸ナトリウム緩衝液は、結晶化に先立っての緩衝液中で約０．０１Ｍカコジル酸ナトリウム、より好ましくは０．０５Ｍカコジル酸ナトリウム、より好ましくは０．１Ｍカコジル酸ナトリウムの濃度のカコジル酸ナトリウムを含む。適切なカコジル酸ナトリウム緩衝液は、好ましくは、約５ないし約７、より好ましくは約５．５ないし約６．５、より好ましくは約５．５ないし約６．０のｐＨを有する緩衝液を含む。適切なカコジル酸ナトリウム緩衝液は約５％ｖ／ｖ、より好ましくは７％ｖ／ｖ、より好ましくは１０％ｖ／ｖの濃度の２−プロパノールを含有する。適切なカコジル酸ナトリウム緩衝液はいずれかのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含有し、ＰＥＧ４０００がより好ましい。本発明の酢酸塩緩衝液中の適切なＰＥＧ４０００濃度は、約１０％ｗ／ｖ、好ましくは約１５％、より好ましくは約２０％ｗ／ｖ　ＰＥＧ４０００を含む。
【００６９】
本発明のもう１つの適切な母液は、カコジル酸ナトリウムおよび２−プロパノールと一緒にクエン酸三ナトリウム二水和物を含むクエン酸ナトリウム緩衝液を含む。本発明の好ましいクエン酸ナトリウム緩衝液は、結晶化に先立っての緩衝液中にクエン酸三ナトリウム二水和物の濃度で、約０．０５Ｍクエン酸三ナトリウム二水和物、より好ましくは約０．１Ｍクエン酸三ナトリウム二水和物、より好ましくは０．２Ｍクエン酸三ナトリウム二水和物を含む。適切なクエン酸ナトリウム緩衝液は、好ましくは、約５．５ないし約７、より好ましくは約６．０ないし約７．０、より好ましくは約６．５のｐＨを含む。本発明の好ましいクエン酸ナトリウム緩衝液は、結晶化に先立っての緩衝液中にカコジル酸ナトリウムの濃度で、約０．０１Ｍカコジル酸ナトリウム、より好ましくは０．０５Ｍカコジル酸ナトリウム、より好ましくは０．１Ｍカコジル酸ナトリウムの含む。適切なクエン酸ナトリウム緩衝液は約１５％ｖ／ｖ、より好ましくは２０％ｖ／ｖ、より好ましくは３０％ｖ／ｖの濃度の２−プロパノールを含有する。
【００７０】
ＦｃεＲＩ蛋白質の過飽和溶液は、限定されるものではないが、蒸気拡散、液体拡散、バッチ結晶化、一定温度および温度誘導またはその組合せを含めたいくつかの方法によって誘導して結晶化させることができる。好ましくは、ＦｃεＲＩ蛋白質の過飽和溶液は蒸気拡散（すなわちハンギングドロップ方法）によって誘導化して結晶化させる。蒸気拡散方法においてＦｃεＲＩ蛋白質を、ＦｃεＲＩ蛋白質溶液を本発明の母液と組合せ、ＦｃεＲＩ蛋白質溶液とし、過飽和にして、一定温度でＦｃεＲＩ結晶を形成させる。蒸気拡散は、好ましくは、約１５℃ないし約３０℃、より好ましくは約２０℃ないし約２５℃、より好ましくは約２２℃の一定温度の範囲の制御された温度下で行われる。
【００７１】
好ましい実施形態において、本発明は：（ａ）酢酸塩緩衝液中のＦｃεＲＩ蛋白質の約３ｍｇ／ｍｌ溶液を調製して過飽和処方を形成することと［ここで、該緩衝液は約２００ｍＭ酢酸カルシウム、約１００ｍＭカコジル酸ナトリウムおよび約１８％ｗ／ｖ　ＰＥＧ８０００を含み、約ｐＨ６．５のｐＨを有する］；（ｂ）約３μｌ液滴の過飽和処方をカバーグラス上に滴下し、約１ｍｌの酢酸塩緩衝液を含有するウェル上にこれを倒立することと；および、（ｃ）ＦｃεＲＩの結晶が形成されるまでインキュベートすることとの工程を具備するＦｃεＲＩの結晶を製造する方法を含む。
【００７２】
もう１つの好ましい実施形態において、本発明は：（ａ）カコジル酸ナトリウム緩衝液中のＦｃεＲＩ蛋白質の約３ｍｇ／ｍｌ溶液を調製して過飽和処方を形成することと［ここで、該緩衝液は約１００ｍＭカコジル酸ナトリウム、約１０％ｖ／ｖの２−プロパノールおよび２０％ｖ／ｖＰＥＧ４０００を含み、約ｐＨ５．５−６．０のｐＨを有する］；（ｂ）約３μｌ液滴の過飽和処方をカバーグラス上に滴下し、約１ｍｌの硫酸塩緩衝液を含有するウェル上にこれを倒立させるすることと；および、（ｃ）ＦｃεＲＩの結晶が形成されるまでインキュベートすることとの工程を含むＦｃεＲＩの結晶を製造する方法を含む。
【００７３】
もう１つの好ましい実施形態において、本発明は：（ａ）クエン酸ナトリウム緩衝液中のＦｃεＲＩ蛋白質の約３ｍｇ／ｍｌ溶液を調製して過飽和処方を形成することと［ここで、該緩衝液は約２００ｍＭクエン酸三ナトリウム二水和物、約１００ｍＭカコジル酸ナトリウムおよび約３０％ｖ／ｖの２−プロパノールを含み、約ｐＨ６．５のｐＨを有する］；（ｂ）約３μｌ液滴の過飽和処方をカバーグラス上に滴下し、約１ｍｌの硫酸塩緩衝液を含有するウェル上にこれを倒立することと；および、（ｃ）ＦｃεＲＩの結晶が形成されるまでインキュベートすることとの工程を含むＦｃεＲＩの結晶を製造する方法を含む。
【００７４】
いずれの単離されたＦｃＲ蛋白質も本発明の方法で用いることができる。単離されたＦｃＲ蛋白質はその中性媒体から単離されても、あるいは組換えＤＮＡ技術（例えば、ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）増幅、クローニング）または化学合成を用いて製造されてもよい。組換えＦｃＲ蛋白質を製造するには、ＦｃＲ蛋白質をコードする分子を、宿主細胞に核酸分子を送達することができるいずれのベクターに挿入することもできる。本発明の組換えベクターに含ませるべき適当で好ましい核酸分子をここに開示する。本発明の好ましい核酸分子はヒトＦｃＲ蛋白質、より好ましくはヒトＦｃγＲＩＩａ蛋白質、ヒトＦｃεＲＩ蛋白質またはヒトＦｃγＲＩＩＩｂ蛋白質をコードする。本発明の核酸分子はＦｃＲ蛋白質のいずれかの一部、好ましくは全長ＦｃＲ蛋白質、より好ましくはＦｃＲ蛋白質の可溶性形態（すなわち、かかる蛋白質を生産する細胞によって分泌され得るＦｃＲ蛋白質の形態）をコードすることができる。組換えベクター、特に組換え分子に含ませるべきより好ましい核酸分子は、配列番号３、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２または配列番号１３によって表されるアミノ酸配列を有する蛋白質をコードする核酸分子を含む。組換え分子に含ませるべき好ましい核酸分子はｓＦｃγＲＩＩａおよびｓＦｃεＲＩを含み、その生産は例のセクションに記載する。
【００７５】
本発明の組換えベクターはＲＮＡまたはＤＮＡいずれか、原核生物または真核生物いずれかとすることができ、典型的にはウィルスまたはプラスミドである。好ましくは、ＦｃＲ蛋白質をコードする核酸分子を発現ベクターを含むベクターに挿入して組換え分子を形成させる。本明細書で用いるごとく、発現ベクターは宿主細胞を形質転換でき、特定の核酸分子の発現に影響することができるＤＮＡまたはＲＮＡベクターである。本発明の発現ベクターは細菌、菌類、内寄生性生物、昆虫、他の動物および植物細胞を含めた本発明の組換え細胞において機能する（すなわち、遺伝子発現を指令する）いずれかのベクターを含む。本発明の好ましい発現ベクターは昆虫細胞中での発現を指令する。本発明のより好ましい発現ベクターはｐＶＬ１３９２バクロウィルスシャトルプラスミドを含む。本発明の好ましい組換え分子はｐＶＬ−ｓＦｃγＲＩＩａ（ａ）、ｐＶＬ−ｓＦｃγＲＩＩａ（ｂ）およびｐＶＬ−ｓＦｃεＲＩを含む。
【００７６】
本発明の発現ベクターをいずれかの適切な宿主細胞に形質転換して組換え細胞を形成することができる。適切な宿主細胞は発現ベクターに挿入された核酸分子を発現することができるいずれの細胞も含む。例えば、原核細胞発現ベクターを細菌宿主細胞に形質転換することができる。本発明の好ましい宿主細胞は特に昆虫細胞においてバクロウィルスを発現することができる細胞を含み、Ｓｐｏｂｏｐｔｅｒａ　ｆｒｕｇｉｐｅｒｂａまたはＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ　ｎｉ細胞が好ましい。本発明の好ましい組換え細胞はｓ．ｆｒｕｇｉｔｅｒｂａ：ｐＶＬ−ｓＦｃγＲＩＩａ（ａ）／ｐＶＬ−ｓＦｃγＲＩＩａ（ｂ）細胞およびＳ．ｆｒｕｇｉｐｅｒｂａ：ｐＶＬ−ｓＦｃεＲＩを含み、その生産をここに記載する。
【００７７】
ＦｃＲ結晶を生産するのに有用なＦｃＲ蛋白質を単離する１つの方法は、かかるＦｃＲ蛋白質を発現する組換え細胞の細胞培養物から組換え蛋白質からの組換え蛋白質の回収を含む。１つの実施形態において、本発明の単離された組換えＦｃＲ蛋白質は、当該蛋白質を生産するのに効果的な条件下で該蛋白質を発現することができる細胞を培養し、該蛋白質を回収することによって生産される。培養するための好ましい細胞は本発明の組換え細胞である。効果的な培養条件は、限定されるものではないが、効果的な培地、バイオリアクター、温度、ｐＨおよび酸素条件並びに蛋白質生産を可能とする培養培地を含む。かかる培養条件は当業者の技量内のものである。適切な条件の例は例のセクションに含まれる。
【００７８】
好ましくは、本発明の組換え細胞はＦｃＲ蛋白質の分泌された形態を発現する。本発明のＦｃＲ蛋白質は、限定されるものではないが、アフィニティクロマトグラフィ、イオン交換クロマトグラフィ、濾過、電気泳動、疎水性相互作用クロマトグラフィ、ゲル濾過クロマトグラフィ、逆相クロマトグラフィ、クロマトフォーカシングおよび分別可溶化のごとき種々の標準的な蛋白質精製技術を用いて精製することができる。好ましくは、ＦｃＲ蛋白質が、ＦｃＲ蛋白質の三次元構造に関連した情報を得るのに有用な結晶の形成のために十分に精製される方法で精製される。好ましくは、ＦｃＲ蛋白質の組成物は約７０％、より好ましくは７５％、より好ましくは８０％、より好ましくは８５％およびより好ましくは９０％純度である。
【００７９】
１つの実施形態において、組換えＦｃＲ蛋白質は感染後約２０時間および約６０時間の間、好ましくは感染後約３０時間および約５０時間の間、より好ましくは感染後約４０時間に収穫された細胞培養上澄みから精製される。好ましくは、ＦｃγＲＩＩａ蛋白質は、：（ａ）Ｓ．ｆｒｕｇｉｐｅｒｂａ：ｐＶＬ−ｓＦｃγＲＩＩａ（ａ）／ｐＶＬ−ｓＦｃγＲＩＩａ（ｂ）細胞からの上澄みをイオン交換カラムに適用することと：（ｂ）イオン交換カラムから未結合蛋白質を収集し、該未結合蛋白質を免疫アフィニティクロマトグラフィカラムに適用することと；（ｃ）免疫アフィニティクロマトグラフィカラムに結合した蛋白質を溶出させ、溶出した蛋白質をゲル濾過カラムに適用することと：および、（ｄ）ゲル濾過カラムからの濾過された蛋白質を回収してＦｃγＲＩＩａ蛋白質を得ることとの工程を具備する方法によって上澄みから精製される。好ましくは、ＦｃεＲＩ蛋白質は：（ａ）Ｓ．ｆｒｕｇｉｐｅｒｂａ：ｐＶＬ−ｓＦｃεＲＩ細胞からの上清をイオン交換カラムに適用することと；（ｂ）イオン交換カラムからの未結合蛋白質を回収し、該蛋白質を免疫アフィニティクロマトグラフィカラムに適用することと；（ｃ）免疫アフィニティクロマトグラフィカラムに結合した蛋白質を溶出させ、溶出した蛋白質をゲル濾過カラムに適用することと；および、（ｄ）ゲル濾過カラムからの濾過された蛋白質を回収してＦｃεＲＩ蛋白質を得ることとの工程を具備する方法によって上澄みから精製される。
【００８０】
ヒトＦｃγＲ蛋白質と蛋白質のＦｃγＲファミリーの他のメンバーとの間で高度のアミノ酸配列相同性を考慮すると、本発明の精製の方法はＦｃγＲファミリーの各メンバーに適用することができる。加えて、当業者であれば、本発明の精製方法は一般に、免疫アフィニティクロマトグラフィ精製の工程のためにＩｇＧよりもむしろＩｇＥを用いる以外、ＦｃεＲＩ蛋白質のごとき、および精製工程のためにＩｇＧよりもむしろＩｇＡを用いる以外はＦｃαＲＩ蛋白質のごときいずれかのＦｃＲ蛋白質を精製するのに一般的に有用である。蛋白質のＦｃγＲファミリーのメンバー、ＦｃεＲ蛋白質およびＦｃαＲ蛋白質の単離された蛋白質は組換えＤＮＡ技術を得てもよく、あるいは限定されるものではないが、単球、マクロファージ、好中球、好酸球、血小板およびＤリンパ球（すなわち、Ｂ細胞）を含めた天然源から精製してもよい。単離されたＦｃγＲＩＩａおよびＦｃεＲＩ蛋白質の組換え生産の記載は、例のセクションに記載する。
【００８１】
本発明のもう１つの実施形態は結晶形態のＦｃＲ蛋白質（すなわち、ＦｃＲ結晶）を含む組成物を含む。本明細書で用いるごとく、用語「結晶性ＦｃＲ」および「ＦｃＲ結晶」は共に結晶化されたＦｃＲ蛋白質を言い、相互に交換的して用いてもよいことを意図する。好ましくは、結晶性ＦｃＲは、特に例６または例９に開示された方法に従って、ここに記載された結晶形成方法を用いて製造される。本発明のＦｃＲ結晶はいずれの結晶構造も含み、好ましくは斜方系結晶として沈殿する。本発明の適切な結晶性ＦｃＲはＦｃＲ蛋白質のモノマーまたはマルチマーを含む。好ましい結晶性ＦｃＲは非対称ユニット中に１つのＦｃＲ蛋白質を含む。より好ましい結晶性ＦｃＲはＦｃＲ蛋白質のダイマーを含む。
【００８２】
本発明の特別の実施形態は、結晶性形態のＦｃγＲＩＩａ蛋白質（すなわち、ＦｃγＲＩＩａ結晶）を含む組成物を含む。本明細書中で用いるごとく、用語「結晶性ＦｃγＲＩＩａ」および「ＦｃγＲＩＩａ結晶」は共に結晶化されたＦｃγＲＩＩａ蛋白質を言い、相互に交換して使用することを意図する。好ましくは、結晶ＦｃγＲＩＩａは、例６に開示された方法に特に従って、ここに記載された結晶形成方法を用いて生産される。本発明のＦｃγＲＩＩａ結晶はいずれの結晶構造をも含み得るが、好ましくは斜方系結晶として沈殿する。好ましくは、本発明の組成物は、寸法ａ＝７８．８０オングストローム、ｂ＝１００．５５オングストローム、ｃ＝２７．８５オングストロームの単位格子を形成するように空間群Ｐ２１２１２の結晶様式に配置されたＦｃγＲＩＩａ蛋白質分子を含む。本発明の好ましい結晶は約３．０オングストローム、好ましくは２．４オングストローム、より好ましくは約１．８オングストロームの分解能までのＦｃγＲＩＩａ蛋白質の原子座標の測定のためのＸ線回折データーを提供する。
【００８３】
本発明の適切な結晶性ＦｃγＲＩＩａは、ＦｃγＲＩＩａ蛋白質のモノマーまたはマルチマーを含む。好ましい結晶性ＦＣγＲＩＩａは非対称ユニット中に１つのＦｃγＲＩＩａ蛋白質を含む。より好ましい結晶性ＦｃγＲＩＩａは、ＦｃγＲＩＩａ蛋白質のダイマーを含む。
【００８４】
本発明のもう１つの特別の実施形態は、結晶性形態のＦｃεＲＩ蛋白質（すなわち、ＦｃεＲＩ結晶）を含む組成物を含む。本明細書で用いるごとく、用語「結晶性ＦｃεＲＩ」および「ＦｃεＲＩ結晶」は共に結晶化されたＦｃεＲＩ蛋白質を言い、相互交換的に用いることを意図する。好ましくは、結晶ＦｃεＲＩは特に例９に開示された方法に従って本明細書に記載された結晶形成方法を用いて生産される。本発明のＦｃεＲＩ結晶はいずれの結晶構造をも含むことができ、好ましくは斜方系結晶として沈殿する。本発明の適切な結晶性ＦｃεＲＩ結晶は、ＦｃεＲＩ蛋白質のモノマーまたはマルチマーを含む。好ましい結晶性ＦｃεＲＩは非対称ユニット中に１つのＦｃεＲＩ蛋白質を含む。より好ましい結晶性ＦｃεＲＩはＦｃεＲＩ蛋白質のダイマーを含む。
【００８５】
本発明によると、結晶性ＦｃＲを用いて、本発明の構造ベースの薬物デザインによって予測される様式のＦｃγＲＩＩａ蛋白質に対して結合する本発明の化合物の能力を測定することができる。好ましくは、ＦｃγＲＩＩａ結晶は本発明の化合物を含有する溶液に浸漬される。次いで、化合物の該結晶への結合は当該分野で標準的な方法によって測定される。
【００８６】
本発明の１つの実施形態は治療用組成物である。本発明の治療用組成物は１以上の治療化合物を含む。本発明の好ましい治療化合物は阻害性化合物および刺激性化合物を含む。
【００８７】
本発明の１つの実施形態はＩｇＧ媒介組織損傷を減少させることができる治療用組成物である。適切な治療用組成物はＩｇＧ媒介過敏症またはＦｃγＲ蛋白質を含む炎症細胞のＩｇＧ媒介漸増に関与する他の生物学的メカニズムに由来するＩｇＧ媒介損傷を減少させることができる。例えば、本発明の治療用組成物は、（１）ＦｃγＲ蛋白質のＩｇＧ結合部位に干渉することによって、ＦｃγＲ蛋白質を有する細胞（例えばＢ細胞、マクロファージ、好中球、好酸球または血小板細胞）上のＦｃγＲ蛋白質のＩｇＧ免疫複合体に対する結合を阻害すること（すなわち、防止、ブロックし）；（２）Ｆｃ蛋白質のＩｇＧへの結合して、ＩｇＧ分子の補体結合部位に干渉することによって、ＩｇＧ免疫複合体による補体結合を阻害することと；（３）ＩｇＧまたはＩｇＧ免疫複合体の沈殿を阻害すること（すなわち、２つのＩｇＧの間のＦｃ：Ｆｃ相互作用を妨ぐ）；（４）ＩｇＧの細胞表面受容体への結合に干渉することによって、免疫グロブリン媒介細胞シグナルを阻害すること；（５）細胞シグナル誘導分子（すなわち、ＦｃγＲ蛋白質を介して細胞シグナル変換を誘導する分子）のＦｃγＲ蛋白質に対する結合に干渉することによってＦｃγＲ媒介細胞シグナル変換を阻害すること；（６）病原体に結合したＩｇＧの、貪食細胞上のＦｃγＲ蛋白質に対する結合を阻害することによって病原体のオプシン化を阻害すること（例えば、フラビウイルスおよびデングウイルスのごときウイルス感染の抗体依存性増強（ＡＤＥ）を防止するために）；および（７）ＦｃγＲ蛋白質（例えば、麻疹ウイルスヌクレオキャプシド蛋白質）に対するウイルス原子の結合を阻害することができる。本明細書で用いるごとく、用語「免疫複合体」とは、可溶性抗原に抗体が結合する場合に形成される複合体を言う。本明細書で用いるごとく、用語「補体結合」とは、典型的にはＣ３ａおよびＣ５ａを含む複合体の集合、または切断されたＣ４の生成によって、炎症性細胞の漸増の結果となる抗原：抗体複合体による補体活性化を言う。本明細書で用いるごとく、用語「結合部位」とは、それにもう１つの分子が特異的に結合する分子（例えば、蛋白質）の領域を言う。かかる治療用組成物はＩｇＧのＦｃγＲ蛋白質への、ＩｇＧの補体への、ＩｇＧのＩｇＧへの、ＩｇＧの細胞表面受容体への、細胞シグナル誘導分子のＦｃγＲ蛋白質への、ＦｃγＲ蛋白質ウイルスへの結合を阻害する、あるいはオプシン化を阻害する１以上の阻害性化合物を含む。また、本発明にはＩｇＧ媒介組織損傷を減少させる方法が含まれる。該方法は本発明の治療用組成物を動物に投与する工程を具備する。
【００８８】
本発明のもう１つの実施形態は、動物においてＩｇＧ液性免疫応答を刺激することができる治療用組成物である。本発明のさらにもう１つの実施形態は、オプシン化またはＦｃγＲ−依存性エフェクター機能（例えば、抗体−依存性ＦｃγＲ媒介細胞毒性、貪食作用または細胞メディエーターの放出等）によって、しかしながらこれに限定されるものではないが、癌または感染病（例えば、ＨＩＶ、ヘルペス、細菌感染、酵母感染または寄生虫感染等の経口感染）を含めた特定の疾患を治療するために動物に投与される抗体の治療効果を改良する治療用組成物である。かかる治療用組成物は増大したＩｇＧへの結合を有し、ＩｇＧのＦｃγＲへの結合を増強し、ＦｃγＲのダイマー形成を促進し、および／またはＦｃγＲを介したシグナル変換を増強する１以上の刺激性化合物を含む。また、本発明には、液性免疫応答を刺激する方法が含まれる。該方法は、本発明の治療用組成物を動物に投与する工程を含む。
【００８９】
本発明の適切な阻害性化合物は、ＦｃγＲ蛋白質、好ましくはＦｃγＲＩＩａ蛋白質またはＦｃγＲＩＩＩｂ蛋白質と直接的に相互作用し、ＦｃγＲのＩｇＧ結合部位（ここでは基質アナログという）をブロックするか（例えば、アロステリック相互作用によって）、あるいはＩｇＧがＦｃγＲに結合できないように、ＦｃγＲ蛋白質の他の領域（例えば、ＦｃγＲダイマーのモノマー間のＩｇＧ結合割目の上方溝において、該ダイマーインターフェースで、各モノマー上のＤ１およびＤ２の間の割目またはヒンジ領域中において、および／またはＦｃγＲダイマーの該モノマーによって形成された下方溝中のＩｇＧ結合割目直下において等）を修飾することによって、それにより、ＩｇＧのＦｃγＲ蛋白質への結合を阻害する化合物である。ＦｃγＲ基質アナログとは、ＦｃγＲ蛋白質のＩｇＧ結合部位と相互作用（例えば、結合、会合、修飾）する化合物をいう。ＦｃγＲ基質アナログは、例えばＩｇＧのＦｃ部分を模倣するか、またはＦｃγＲのＩｇＧ結合部位に特異的に結合するがＩｇＧのＦｃ部分を模倣しない化合物を含むことができる。また、本発明の阻害性化合物は、ＩｇＧに結合するＦｃγＲＩＩａ蛋白質の少なくとも一部分を実質的に模倣する化合物（ここではペプチドミメティック化合物と言う）を含むことができる。本発明の他の適切な阻害性動物は、ＦｃγＲ蛋白質の、ＩｇＧ以外の細胞シグナル誘導分子への結合を阻害する化合物を含む。かかる細胞シグナル誘導分子の例は（すなわち、ＦｃγＲ蛋白質のダイマーを形成するための）もう１つのＦｃγＲまたは細胞表面アクセサリー分子、細胞内アクセサリー分子またはウイルス（例えば、麻疹ウイルスヌクレオキャプシド蛋白質）を含む。
【００９０】
本発明の１つの実施形態はＩｇＥ媒介応答を減少させることができる治療用組成物である。適切な治療用組成物はＩｇＥ媒介過敏症、炎症モジュレーターのＩｇＥ媒介放出またはＦｃεＲ蛋白質を含む炎症細胞のＩｇＥ媒介漸増に関与する他の生物学的メカニズムによって、ＩｇＥ媒介応答を減少させることができる。例えば、本発明の治療用組成物は（１）ＦｃεＲ蛋白質のＩｇＥ結合部位に干渉することによって、ＦｃεＲ蛋白質を有する細胞（例えば、肥満細胞）上のＦｃεＲ蛋白質のＩｇＥ免疫複合体への結合を阻害（すなわち、防止、ブロック）すること；（２）ＩｇＥまたはＩｇＥ免疫複合体の沈殿を阻害（すなわち、２つのＩｇＥの間のＦｃ：Ｆｃ相互作用を阻害）すること；（３）ＩｇＥの細胞表面受容体への結合に干渉することによって免疫グロブリン媒介細胞シグナル変換を阻害すること；および（４）細胞シグナル誘導分子（ＦｃεＲ蛋白質を介する細胞シグナル変換を誘導する分子）のＦｃεＲ蛋白質への結合に干渉することによってＦｃε媒介細胞シグナル変換を阻害することができる。かかる治療用組成物はＩｇＥのＦｃεＲ蛋白質への、ＩｇＥのＩｇＥへの、ＩｇＥの細胞表面受容体への、または細胞シグナル誘導分子のＦｃεＲ蛋白質への結合を阻害する１以上の阻害性化合物を含む。また、ＩｇＥ媒介炎症のごときＩｇＥ媒介応答を減少させる方法が本発明に含まれる。該方法は本発明の治療用組成物を動物に投与する工程を含む。
【００９１】
本発明のもう１つの実施形態は動物においてＩｇＥ液性免疫応答を刺激することができる治療用組成物である。本発明のさらにもう１つの実施形態はオプシン化またはＦｃεＲ−依存性エフェクター機能（例えば、貪食作用または細胞メディエーターの放出）によって特定の病気を治療するために動物に投与される抗体の治療効果を改良する治療用組成物である。かかる治療用組成物は増大したＩｇＥへの結合を有し、ＩｇＥのＦｃεＲＩへの結合を増強させ、ＦｃεＲＩのダイマー形成を増強しおよび／または他の手段でＦｃεＲＩを介したシグナル変換を増強する１以上の刺激性化合物を含む。また、液性免疫応答を刺激する方法が本発明に含まれる。該方法は本発明の治療用組成物を動物に投与する工程を含む。
【００９２】
本発明の適切な阻害性化合物は、ＦｃεＲ蛋白質と直接的に相互作用し、ＦｃεＲのＩｇＥ結合部位（ここでは基質アナログという）をブロックすることによって、あるいはＩｇＥがＦｃεＲに結合できないように（例えば、アロステリック相互作用によって）ＦｃεＲ蛋白質の他の領域を修飾することによって（ＦｃεＲダイマーの該モノマー間のＩｇＥ結合割目の上方溝において、該ダイマーインターフェースにおいて、各モノマー上のＤ１およびＤ２の間の割目またはヒンジ領域において、および／またはＦｃεＲダイマーの該モノマーによって形成された下方溝におけるＩｇＧ結合割目直下において等）、それにより、ＩｇＥのＦｃεＲ蛋白質への結合を阻害する化合物である。ＦｃεＲ基質アナログとは、Ｆｃε蛋白質のＩｇＥ結合部位と相互作用（例えば、結合、会合、修飾）する化合物をいう。ＦｃεＲ基質アナログは、例えばＩｇＥのＦｃ部分を模倣するか、あるいはＦｃεＲのＩｇＥ結合部位に特異的に結合するがＩｇＥのＦｃ部分を模倣しない化合物を含むことができる。また、本発明の阻害性化合物はＩｇＥに結合するＦｃεＲＩＩａ蛋白質の少なくとも一部分を実質的に模倣する化合物（ここではペプチドミメティック化合物と言う）を含むことができる。本発明の他の適切な阻害性動物は、ＦｃεＲ蛋白質の、ＩｇＥ以外の細胞シグナル誘導分子への結合を阻害する化合物を含む。かかる細胞シグナル誘導分子の例はもう１つのＦｃεＲ（すなわち、ＦｃεＲ蛋白質のダイマーを形成するための）、または細胞表面アクセサリー分子、細胞内アクセサリー分子またはウイルス（例えば、麻疹ウイルスヌクレオキャプシド蛋白質）を含む。
【００９３】
本発明の阻害性化合物は当業者によって知られた種々の手段によって同定することができる。例えば、阻害性化合物のＦｃＲ蛋白質への結合、またはそれとの他の相互作用は、例えば、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）若しくはラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）等の免疫アッセイ、またはバイアコアアッセイ（ｂｉａｃｏｒｅ ａｓｓａｙ）等の結合試験等を用いて、溶液中または細胞上のＦｃＲ蛋白質で測定することができる。細胞ベースのアッセイは例えば、サイトカイン（例えば、ＩＬ−４、ＩＬ−６またはＩＬ−１２）分泌アッセイ、または例えば蛋白質または脂質リン酸化、細胞シグナル誘導分子へのＦｃＲ結合に際してのメディエーター放出または細胞内Ｃａ＋＋動態化を測定する細胞内シグナル変換アッセイを含む。
【００９４】
本発明の適切な刺激性治療化合物はＩｇに結合する天然ＦｃＲ蛋白質（例えば、その天然環境から単離されたＦｃＲ蛋白質）の能力と比較した場合、改良されたＩｇへの結合を呈する化合物であり、また、ＩｇのそのＦｃＲへの結合を増強するか、あるいはＦｃＲを介するシグナル変換を増強する化合物を含む。本発明の刺激性化合物は：（１）例えば天然ＦｃＲ蛋白質よりも高いレベルでＩｇに結合するか、若しくはそれと他の相互作用すること；（２）ＩｇのそのＦｃＲへの結合を増強すること；（３）ＦｃＲへの、ＦｃＲに結合するＩｇへの、またはＦｃＲに結合したＩｇの組合せへの、いずれかへの結合によるＦｃＲのダイマー形成を増強すること；および／または（４）ＦｃＲを介するシグナル変換を増強することに対するそれらの能力によって同定される。例えば、天然ＦｃＲ蛋白質と比較した本発明の刺激性化合物に対するＩｇの改良された結合を測定する方法は、Ｉｇが刺激性化合物および天然ＦｃＲ蛋白質に結合する際の結合の安定性、親和性または動態学を測定する結合アッセイを含む。かかる方法は当業者によく知られており、ここでは例のセクションで開示する。また、本発明の刺激性化合物はＩｇまたはＦｃＲ蛋白質に結合する化合物を含むことができ、従って、ＦｃＲのＩｇ結合部位またはＦｃＲ蛋白質に結合するＩｇのＦｃ部分を修飾するアロステリック相互作用によりＦｃＲまたはＩｇの他の領域を修飾することによって、ＩｇのＦｃＲ蛋白質への結合の間またはその後のＩｇのＦｃＲ蛋白質への結合を増強するか、あるいは細胞シグナル変換を改良する。本発明のもう１つの刺激性化合物は、Ｉｇの不在において、例えば、ＦｃＲ媒介細胞シグナル変換を刺激する様式で、ＦｃＲ蛋白質に対して結合する化合物を含むことが可能である。
【００９５】
当業者であれば、ＦｃγＲ蛋白質およびＩｇＧ、並びにＦｃεＲＩおよびＩｇＥにつき前記したごとく、阻害性または刺激性化合物はいずれかのＦｃＲおよびそのＩｇリガンドの構造に基づいて開発することができることを理解するであろう。
【００９６】
本発明によると、本発明の適切な治療化合物は、ペプチドまたは他の有機分子、および無機分子を含む。適切な有機分子は小有機分子を含む。好ましくは、本発明の治療化合物は、かかる化合物を動物に投与した場合、動物に対して有害（例えば、毒性）ではない。ペプチドとは分子量が小さくて、加水分解に際して２個以上のアミノ酸を生じる化合物の種類を言う。ポリペプチドは２以上のペプチドよりなる。本明細書で用いるごとく、蛋白質は１以上のポリペプチドよりなる。設計すべき好ましい治療化合物は、直鎖または分岐鎖状の立体配置において、正常またはレトロインベルソペプチド（ｒｅｔｒｏｉｎｖｅｒｓｏ ｐｅｐｔｉｄｅｓ）として形成された「Ｌ」および／または「Ｄ」アミノ酸よりなるペプチド、ペプチドミメティック化合物、小有機分子、そのホモ−またはヘテロ−ポリマーを含む。
【００９７】
本発明の治療化合物は構造ベースの薬物デザインを用いて設計することができる。本発明の三次元構造の発見までは、ＦｃＲ蛋白質の構造に基づく治療化合物の構造ベースの開発のために情報は入手できなかった。かかる合理的な開発は、従来、入手可能な一次アミノ酸配列情報からは新たに実行できなった。構造ベースの薬物デザインとは、ペプチド、ポリペプチド、蛋白質の立体配座、またはペプチド若しくはポリペプチドと治療化合物との間の立体配座を予測するコンピュターシミュレーションの使用を言う。例えば、一般的には、治療化合物と効果的に相互作用する蛋白質には、治療化合物の三次元構造が、結合に際して所望の結果が得られるような様式等で、当該化合物を当該蛋白質に結合させることを可能にする適合性の配座を推測することが必要である。該蛋白質の三次元構造の知識により、当業者は、かかる適合性の配座を有する治療化合物を設計することができる。例えば、ＦｃγＲＩＩａ蛋白質のＩｇＧ結合部位の三次元構造の知識により、当業者は、ＦｃγＲＩＩａに結合する、安定な、かかる結合に際してＦｃγＲを有する細胞へのＩｇＧ結合のごとき生物学的応答、または細胞シグナル変換を阻害する治療化合物を設計することができる。加えて、例えば、ＦｃγＲＩＩａ蛋白質のＩｇＧ結合部位の三次元構造の知識により、当業者は、ＦｃγＲＩＩａ蛋白質の基質アナログを設計することができる。
【００９８】
構造ベースの薬物デザインで有用な適切な構造およびモデルを本明細書中に開示する。構造ベースの薬物デザインの方法で用いるべき好ましい構造は、ＦｃγＲＩＩａ蛋白質の構造、ＦｃεＲＩ蛋白質の構造、ＦｃγＲＩＩＩｂ蛋白質の構造、および標的ＦｃＲ構造のモデルを含む。構造ベースの薬物デザインの方法で用いるべき標的構造の好ましいモデルは、分子置換および折り畳み認識関連方法を含めた、本明細書中に開示したいずれのモデリング方法によって生成されたモデルをも含む。
【００９９】
本発明の１つの実施形態は：（ａ）ＦｃＲ蛋白質の三次元構造を含めた蛋白質の構造または本発明のモデルを提供することと；（ｂ）三次元構造またはモデルを用いて化合物を設計することと；および、当該化合物を化学的に合成することとを具備する生物活性化合物の構造ベース薬物デザインのコンピュータに援助された方法である。かかる方法は、加えて、（ｄ）合成された化合物の生物活性を評価する工程を具備する。本発明で用いるべき適切な三次元構造ＦｃＲ蛋白質およびモデルを本明細書中に開示する。本発明によると、設計する工程は、新しい化合物を製造するか、または既知の化合物（例えば、既知の化合物の三次元構造を含むコンピュータスクリーニングデーターベースにリストされた化合物等）のライブラリーのデーターベースをサーチすることを含む。また、設計は、ある構造的な特徴において置換モイエティ（ｍｏｉｅｔｉｅｓ）を有する化合物をシミュレートすることによって行うことができる。設計する工程は化合物の既知の機能に基づいて化合物を選択することを含むことも可能である。設計する好ましい工程は、化合物の１以上のデーターベースのコンピュータスクリーニングを含み、ここで該化合物の三次元構造は公知であってもよく、コンピュータによってＦｃＲ蛋白質の三次元構造と相互作用（例えば、ドッキング、整列、マッチング、接続）してもよい（例えば、ＨｕｍｂｌｅｔおよびＤｕｎｂａｒ，Ａｎｉｍａｌ　Ｒｅｐｏｒｔｓ　ｉｎ　Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ｖｏｌ．２８，頁２７５−２８３，１９９３，Ｍ．Ｖｅｎｕｔｉ編，Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ　によって記載されている）。適切な化合物を合成する方法は当業者に知られており、合成すべき化合物の構造に依存する。合成された化合物の生物活性を評価する方法は、該化合物の生物活性（例えば、阻害性または刺激性）に依存し、それは本明細書中に開示される。
【０１００】
構造ベースの薬物デザインの種々の他の方法は、マウリック（Ｍａｕｌｉｋら，１９９７，Ｍａｕｌｉｋ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ　ａｎｄ　Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．）により開示されており、参照することによりその全体をここに組み込む。マウリックらは、例えば、指向性デザイン［ここにおいて、使用者は適当に選択された断片の断片ライブラリーから新規分子を作成するプロセスを方向付ける］；ランダムデザイン［ここにおいて、使用者は、候補リガンドの適合性を評価するために、選択基準を適用しつつ、それと同時に断片およびそれらの組合せをランダムに突然変異させるために遺伝または他のアルゴリズムを使用する］；およびグリッドべースのアプローチ［ここにおいて、使用者は、三次元受容体構造と小断片プローブとの間の相互作用エネルギーを計算し、続いて好都合なプローブ部位と共に結合する］等の方法を開示する。
【０１０１】
好ましくは、ＦｃＲ蛋白質のＩｇ結合部位に結合する本発明の化合物は、ＦｃＲ蛋白質および／またはＩｇとの化学的および／または立体化学的相補性を有する化合物に由来することが知られている。かかる相補性は、化学基の形状または分布の何れかにおいて受容体の表面にマッチし、且つ、ＦｃＲ蛋白質に結合してＦｃＲ蛋白質へのＩｇ結合を促進または阻害し、あるいはＦｃＲ蛋白質への結合に際して細胞シグナル変換を誘導する化合物の特徴的である。より好ましくは、ＦｃＲ蛋白質のＩｇ結合部位に結合する化合物は、少なくとも約１０−６Ｍの親和性を持って、好ましくは少なくとも約１０−８の親和性を持って結合する。
【０１０２】
好ましくは、ＦｃＲ蛋白質の５つの部位は構造ベースの薬物デザインのための標的である。これらの部位はＦｃＲ蛋白質のＩｇ結合部位、２つのＦｃＲモノマー間の上方溝、２つのＦｃＲ蛋白質モノマー間の二量体化インターフェース、２つのＦｃＲモノマー間の下方溝、ＦｃＲ蛋白質のドメイン１および２の間のインターフェース、割目またはヒンジ領域、およびこれらの部位のいずれかの組合せ（例えば、Ｉｇ結合部位およびモノマー間の上方溝と同時に相互作用するもの）を含む。これらの部位の模式的表示を図１７に示し、「ａ」はＦｃＲ蛋白質のＩｇ結合部位を表し、「ｂ」は２つのＦｃＲモノマー間の上方溝を表し、「ｃ」は２つのＦｃＲモノマー間の二量体化インターフェースを表し、「ｄ」はＦｃＲ蛋白質のドメイン１および２間のインターフェース、割目またはヒンジ領域を表し、並びに「ｅ」は２つのＦｃＲモノマー間の下方溝を表す。以下の考察は、ＦｃＲの標的部位を用いる薬物デザインについての具体的詳細を提供し、その例として、ＦｃγＲＩＩａ構造上の好ましい標的部位に言及する。しかしながら、当業者であれば、ここに提供したＦｃεＲＩ構造およびＦｃγＲＩＩＩｂ構造の記載を用いて、構造ベースの薬物デザインのためにＦｃεＲＩ蛋白質モノマーおよびダイマー上の同様の標的部位を効果的に選択することができるのは理解されるべきである。加えて、当業者であれば、今や、ここに提供された情報に基づいて他のＦｃＲ蛋白質をモデル化することができるので、構造ベースの薬物デザインのために他のＦｃＲ蛋白質上の同様の標的部位を効果的に選択することができるであろう。
【０１０３】
Ｉｇ結合部位（図１７；「ａ」）を標的化して、ＦｃＲのＩｇへの結合に直接的に影響（すなわち、阻害または増強）させる。ＦｃγＲＩＩａ蛋白質のＩｇＧ結合部位は、例えば、限定されるものではないが、配列番号３の残基１５５、１５６、１５８−１６０、１１３−１１６、１２９、１３１、１３３および１３４を含み、また、前記した第２の部位の少なくとも一部（図１７；「ｂ」）、ＦｃγＲＩＩａ蛋白質の二量体化に際して形成される２つのＩｇＧ結合部位の間の溝を含む。ＩｇＧ結合に含まれる部位「ｂ」からの残基は、限定されるものではないが、配列番号３の残基１１７−１２１、１２５−１２９、１５０−１５４および１５７−１６１を含む。ＦｃγＲＩＩａ蛋白質のＩｇＧ結合部位を含む構造ベースの薬物デザインのための適切な標的部位は図７に示す。より具体的には、突然変異誘発研究はＩｇＧの結合において影響を有するいくつかの残基を同定しており、ここに開示する三次元構造はいずれの残基が表面に露出されたことを明瞭に同定している（すなわち、おそらくＩｇＧの結合に参画し、且つ、アロステリック効果をまさに有してはいない）。これらの残基は３つの空間群：（１）Ｐｈｅ１２９、Ｈｉｓ１３１、Ｌｙｓ１１３、Ｐｒｏ１１４、Ｌｅｕ１１５、Ｖａｌ１１６；（２）Ｐｒｏ１３４およびＡｓｐ１３３；および（３）Ｌｅｕ１５９およびＳｅｒ１６１に分類することができる。群（１）は結合表面「ａ」（図１７）を横切って溝「ｂ」（図１７）のリップから導かれる連続表面を形成し、ＩｇＧ結合の部位におけるデザインワークの最も好ましい標的を表す。群（２）はＬｅｕ１３２によって群（１）から分離されており、これは、該ＩｇＧの結合で現在未知の重要性のものであり、該表面露出残基の一部と十分になり得る。群（３）は他の２つの群から離れ、該ダイマー構造によってＩｇＧの結合に参画するために利用可能であるようには見えない残基を含む。
【０１０４】
また、ＦｃＲの２つのモノマー間の上方溝（図１７；「ｂ」）を標的化して、ＦｃＲのＩｇへの結合に直接的に影響させる（すなわち、阻害または増強する）。該上方溝は平坦な蛋白質表面を標的化するのとは対称的に、ビルトインすべき誘因的部位を提供する。ＦｃγＲＩＩａ蛋白質のダイマー構造は、Ｃ２またはシュードＣ２対称阻害剤をターゲティングすることを示唆する。ＦｃγＲＩＩａ蛋白質における標的に対する好ましい残基はＬｙｓ１１７、Ｈｉｓ１３１、Ｐｈｅ１２９、Ａｓｎ１５４、Ｓｅｒ１６１、Ｌｅｕ１５９、Ｔｈｒ１５２およびＰｈｅ１２１を含み、Ｐｈｅ１２９、Ｌｙｓ１１７およびＨｉｓ１３１が最も好ましい。１つの実施形態において、上方溝「ｂ」およびＩｇＧ結合表面「ａ」の両者と同時に相互作用する化合物を設定することができる。例えば、当該溝から流出し、前記したごとく「ａ」の結合表面に結合する調節化合物を設計することによって改良されたＩｇ調製化合物を得ることができる。加えて、「ｂ」に結合する調節化合物は、「ａ」結合表面とは現実には相互作用することなくＩｇＧの「ａ」への結合を立体的に障害し得る。
【０１０５】
受容体ダイマーインターフェース（図１７；「ｃ」）を標的化して、２つのＦｃＲ蛋白質の能力に直接的に影響し、ダイマーを形成し、それによりＦｃＲ蛋白質の一方または双方を介した細胞シグナル変換に影響する。理論に拘束されるつもりはないが、本発明者らは、ダイマー形成は細胞シグナル変換に影響するか、あるいはダイマーに関与するＦｃＲ蛋白質の一方または双方のＩｇ結合の立体配座に影響でき、それにより細胞シグナル変換に影響すると考える。加えて、ダイマーインターフェースは優れた標的部位を表し、これは、１つのモノマーは他のモノマーについてのリガンド情報を提供し、またその逆も成立するからである。２つのＦｃγＲＩＩａ蛋白質の間の二量体化インターフェースを含む構造ベースの薬物デザインのための適切な標的部位を図１０に示す。より具体的には、残基１１７−１３１および残基１５０−１６４はＦｃγＲＩＩａダイマーのインターフェース領域を成し、これらの配列またはそれらのミミックからのペプチドは結合性阻害剤である。ＦｃγＲＩＩａの結晶構造からの水素結合相互作用の試験は、インターフェース領域中のモノマー間の比較的少ない相互作用を示すが、顕著なクラスターは、ヘキサペプチドＰｈｅ１２１−Ｇｌｎ１２２−Ａｓｎ１２３−Ｇｌｙ１２４−Ｌｙｓ１２５−Ｓｅｒ１２６に亘る。加えて、Ｇｌｙ１２４−Ｓｅｒ５６１およびＳｅｒ１２６−Ｌｅｕ５５９を含むモノマー間に水素結合がある。また、Ｌｙｓ１２５側鎖によって、およびＰｈｅ１２１フェニル環によって成されるいくつかの疎水性接触がある。
【０１０６】
ドメイン１および２間のインターフェース（図１７；「ｄ」）を標的化して、ＦｃγＲＩＩａ蛋白質へのＩｇＧ結合に影響する。本発明者らは、ＦｃγＲＩＩａ蛋白質の三次元構造において、ドメイン１がドメイン２と密接な接触をなすことを発見した。特に、ドメイン１における配列番号３の残基１７−２０を含むループはドメインのループ近くに存在してＩｇＧ−結合部位の少なくとも一部を形成する。ＩｇＧとの相互作用はＤ１Ｄ２インターフェース近くで起こると考えられ、従って、この部位における変化はＩｇ結合に影響し得る。加えて、割目は残基１２−１４（ベース）、６−１０および７７−８０（Ｄ１フェース）および９３−９６および１０１（Ｄ２フェース）によって否定され、それ自体は阻害剤デザインのための優れた部位を表す。ＦｃγＲＩＩａ蛋白質のドメイン１およびドメイン２の間のインターフェースを含む構造ベースの薬物デザインのための適切な標的部位は図５に示す。
【０１０７】
また、ＦｃＲの２つのモノマー間の下方溝（図１７；「ｅ」）を標的化して、ＦｃＲのＩｇへの結合に直接的に影響させる（すなわち、阻害または増強する）。この部位に結合する化合物は阻害性であるのか、あるいはより可能性が高くはＦｃγＲへのＩｇＧ結合を増強するのかは、明瞭ではないが、上方溝「ｄ」には前記したごとくこの部位で同様のデザイン戦略を用いることができる。
【０１０８】
ＦｃγＲＩＩａモノマーおよびダイマーの残基および領域に関して具体的に前記した薬物デザイン戦略を、ここに開示したＦｃγＲＩＩＩｂおよびＦｃεＲＩ構造を含めた他のＦｃＲ構造に同様に適用することができる。当業者であれば、その多くがここに記載された当該分野で認識されたモデリングプログラムおよび薬物デザイン方法を用い、例えば、他のＦｃＲにおいてアミノ酸配列の差異およびより好都合な構造に従ってＦｃγＲＩＩａデザイン戦略を修飾して、他のＦｃＲ作用を調節する化合物を同様に設計することができる。加えて、当業者であれば、ＦｃγＲＩＩａ蛋白質のごとき１つのＦｃＲから誘導されたリード化合物構造を用い、ＦｃεＲＩのごときもう１つのＦｃＲ蛋白質中のアミノ酸残基の差異を考慮して、ＦｃγＲＩＩａリード化合物を修飾して、ＦｃεＲＩ蛋白質の調節のためのリード化合物構造を設計できるであろう。例えば、上方溝ファルマコフォア（ｐｈａｒｍａｃｏｐｈｏｒｅ）中のＨｉｓ１３１＞Ｔｙｒ１３１は、ＦｃγＲＩＩａリード化合物構造中の酸性部位を電子結合ケトン部位に変化させることによって収容することができるであろう。
【０１０９】
構造ベースの薬物デザインのこの方法において、候補化合物（すなわち、例えば、本発明のコンピュータスクリーニング方法で分析されるべき化合物）を標的部位中の各残基に整列させる必要はない。適切な候補化合物を標的部位について記載した残基のサブセットに整列させることができる。好ましくは、候補化合物は、標的部位と候補化合物との間の共有結合または非共有結合架橋の形成を促進する立体配座を含む。好ましくは、候補化合物は標的部位に隣接した表面に結合して、複合体中に相互作用のさらなる部位を提供する。アンタゴニスト（すなわち、結合部位またはインターフェースをブロックすることによってリガンドのＦｃＲ蛋白質への結合を阻害する化合物）を設計する場合、該アンタゴニストは、結合部位に対する十分な親和性を持って結合するか、またはリガンド（すなわち、標的部位に特異的に結合する分子）が標的領域に結合するのを実質的に妨ぐべきである。候補化合物と標的部位との間の相補性は全てのここに特定する残基にわたって拡大してリガンドの結合を阻害または促進する必要はないことは当業者によって認識されるところであろう。
【０１１０】
一般に、立体化学相補性を保有する化合物の設計は化合物および標的部位の間の「適応」を化学的にまたは幾何学的に最適化する技術によって達成することができる。かかる技術は、例えば、シェリダンおよびベンカタラガヴァン等（Ｓｈｅｒｉｄａｎ　ａｎｄ　Ｖｅｎｋａｔａｒａｇｈａｖａｎ，Ａｃｃ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．，Ｖｏｌ．２０，頁３２２，１９８７：Ｇｏｏｄｆｏｒｄ，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，ｖｏｌ．２７，頁５５７、１９８４；Ｂｅｄｄａｌｌ，Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｒｅｖｉｅｗｓ，ｖｏｌ．２７９，１９８５；Ｈｏｌ，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．，ｖｏｌ．２５，頁７６７，１９８６；およびＶｅｒｌｉｎｄｅ　ａｎｄ　Ｈｏｌ，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，ｖｏｌ．２，頁５７７，１９９４）に開示されたおり、それらは参照することにより、その全体がここに組み込まれる。
【０１１１】
構造ベースの薬物デザインのための本発明の１つの実施形態は、ＦｃＲ蛋白質の形状またはＦｃＲ蛋白質に関連する構造を補足する化合物を同定することを含む。かかる方法をここでは「幾何学的アプローチ」と言う。本発明の幾何学的アプローチにおいて、内部自由度（および分子立体配座空間における対応する局所最小）の数は、２つの剛性体の幾何学的（硬球）相互作用のみを考慮することによって減少し、ここで、１つの体（活性部位）は第２の体（リガンドのごとき相補的分子）のための結合部位を形成する「ポケット」または「溝」を含有する。
【０１１２】
幾何学的アプローチは、クンツら（Ｋｕｎｔｚら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，ｖｏｌ．１６１，頁２６９，１９８２）によって記載されており、その全体が参照することによりここに組み込まれる。化合物設計のためのアルゴリズムは、ソフトウェアプログラムＤＯＣＫ　Ｐａｃｋａｇｅ，Ｖｅｒｓｉｏｎ１．０（Ｒｅｇｅｎｔｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａから入手可能な）を用いて実行することができる。クンツ（Ｋｕｎｔｚ）のアルゴリズムに従い、結合部位またはインターフェースにおける構造（例えば、ＦｃγＲＩＩａ蛋白質）の表面上のキャビティーまたは溝の形状は異なる半径の一連の重複する球として定義される。次いで、結晶学データーの１以上の現存データーベース（例えば、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｌｅｎｓｆｉｅｌｄ　Ｒｏａｄ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ　ＣＢ２　１ＥＷ，英国によって維持されるＣａｍｂｒｉｄｇｅ　Ｓｔｒｕｃｔｕａｌ　Ｄａｔａｂａｓｅ　Ｓｙｓｔｅｍ）またはブルックヘイベン・ナショナル・ラボラトリー（Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）によって維持されたプロテイン・データ・バンク（Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｄａｔａ　Ｂａｎｋ）で、各規定された形状に近似する化合物についてサーチする。
【０１１３】
幾何学的アプローチによって同定された化合物を修飾して、水素結合、イオン相互作用またはファンデルワールス相互作用のごとき化学的相補性に関連する基準を満足させることができる。
【０１１４】
構造ベースの薬物デザインのための本発明のもう１つの実施形態は、結合部位またはインターフェース内およびその回りの試料位置での化学基（「プローブ」）と活性部位との相互作用を測定し、その結果、選択されたエネルギーレベルでの三次元輪郭表面を得ることができるエネルギー値のアレイを得ることを含む。この方法をここでは「化学プローブアプローチ」と言う。本発明の化合物の設計に対する化学プローブアプローチは、例えば、グッドフォード（Ｇｏｏｄｆｏｒｄ，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，ｖｏｌ．２８，頁８４９，１９８５によって記載されており、これは参照することにより、ここにその全体が組み込まれ、並びに、これは、例えば、ＧＲＩＤ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ　Ｌｔｄ．，Ｏｘｆｏｒｄ　ＯＸ２　９ＬＬ，英国から入手可能）を含めた適切なソフトウェアパッケージを用いて実行される。部位−相補的分子のための化学的要件は、例えば、異なる化学プローブ、例えば、水、メチル基、アミン窒素、カルボキシル酸素および／またはヒドロキシルで、ＦｃγＲＩＩａ蛋白質の活性部位をプロービングすることによって最初に同定することができる（表１に示される原子座標によって表される）。活性部位およびプローブの間の相互作用のための好ましい部位が決定される。推定相補的化合物はかかる部位の得られた三次元パターンを用いて生成させることができる。
【０１１５】
本発明の治療用組成物は本発明の１以上の治療化合物を含む。治療用組成物は、さらに、Ｉｇ媒介応答を減少させるかまたは液性免疫応答を増加させることができる他の化合物を含むことができる。例えば、組織損傷を減少させるのに有用な本発明の治療用組成物は、例えば、補体固定化、血管外遊出をブロックすること等により、炎症細胞の漸増をブロックし、ウイルス蛋白質のＦｃＲへの結合をブロックし、オプシン化をブロックし、または正常および受動抗体免疫性を増強する化合物も含むことができる。Ｉｇ媒介炎症を減少させるのに有用な本発明の治療用組成物は、炎症細胞の漸増をブロックしおよび／または炎症メディエーターの放出に至るシグナル変換経路をブロックする化合物を含むことができる。
【０１１６】
体液性応答を増大させるのに有用な本発明の治療用組成物は、限定されるものではないが、サイトカイン、ケモカイン、およびサイトカインおよびケモカインの生産を誘導する化合物［例えば、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、エリスロポエジン（ＥＰＯ）、インターロイキン２（ＩＬ−２）、インターロイキン３（ＩＬ−３）、インターロイキン４（ＩＬ−４）、インターロイキン５（ＩＬ−５）、インターロイキン６（ＩＬ−６）、インターロイキン７（ＩＬ−７）、インターロイキン８（ＩＬ−８）、インターロイキン１０（ＩＬ−１０）、インターロイキン１２（ＩＬ−１２）、インターフェロンガンマー、インターフェロンガンマー誘導因子Ｉ（ＩＧＩＦ）、トランスフォーミング成長因子ベータ、ＲＡＴＥＳ（活性化に際して調節される、発現されおそらくは分泌される正常Ｔ細胞）、マクロファージ炎症蛋白質（例えば、ＭＩＰ−１アルファおよびＭＩＰ−１ベータ）、細菌成分（例えば、エンドトキシン、特にスーパー抗原、エキソトキシンおよび細胞壁成分）；アルミニウムベースの塩；カルシウムベースの塩；シリカ；ポリヌクレオチド；トキソイド；血清蛋白質、ウイルスコート蛋白質；ブロックコポリマーアジュバント（例えば、Ｈｕｎｔｅｒ’ｓ　Ｔｉｔｅｒｍａｘ　ＴＭアジュバント（ＶａｘｃｅｌＴＭ，Ｉｎｃ．Ｎｏｒｃｒｏｓｓ，ＧＡ）、Ｒｉｂｉアジュバント（Ｒｉｂｉ　ＩｍｍｕｎｏＣｈｅｍ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｉｎｃ．，Ｈａｍｉｌｔｏｎ，ＭＴ）；およびサポニンおよびそれらの誘導体（例えば、Ｑｕｉｌ　Ａ（Ｓｕｐｅｒｆｏｓ　Ｂｉｏｓｅｃｔｏｒ　Ａ／Ｓ，デンマーク国）］を含めた抗原に対する抗体生産を増加させる化合物（例えば、アジュバント）を含むこともできる。
【０１１７】
ｘ
本発明の治療用組成物を用いて、所望の治療効果が得られるようにかかる組成物を動物に投与することによって動物における疾患を治療することができる。治療すべき好ましい動物は、哺乳動物、有袋類、爬虫類および鳥類であり、ヒト、愛玩動物、食用動物、動物園動物および他の経済的に重要な動物（例えば、レース用のウマ、並びにチンチラおよびミンク等の毛皮が高価な動物等）を含む。治療すべきより好ましい動物はヒト、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ヒツジ、ブタ、ニワトリ、ダチョウ、エミュ、シチメンチョウ、コアラおよびカンガルーを含む。保護すべき特に好ましい動物はヒト、イヌおよびネコである。
【０１１８】
本発明の好ましい治療用組成物は、賦形剤、アジュバントおよび／または担体を含む。適切な賦形剤は、治療すべき動物が許容できる化合物を含む。かかる賦形剤の例は、水、塩類溶液、リンガー液、デキストロース溶液、ハンクスの溶液、および他の生理学的平衡塩水溶液を含む。不揮発性油、ゴマ油、オレイン酸エチル、またはトリグリセリドのごとき非水ビヒクルを用いることもできる。他の有用な処方は、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、またはデキストランのごとき増粘剤を含有する懸濁液を含む。賦形剤は、等張性および化学的安定性を増強する物質のごとき少量の添加剤を含むこともできる。緩衝剤の例は、リン酸塩緩衝液、炭酸水素塩緩衝液およびトリス緩衝液を含み、他方、防腐剤の例は、チメロサール、ｏ−クレゾール、ホルマリンおよびベンジルアルコールを含む。標準的な処方は、液体注射剤、あるいは注射用の懸濁液または溶液として適切な液体中に取ることができる固体いずれかであり得る。かくして、非液体処方において、賦形剤は、投与に先立って、滅菌した水または塩類溶液等を添加することができ、テキストロース、ヒト血清アルブミン、防腐剤を含むことができる。
【０１１９】
本発明の１つの実施形態において、治療用組成物は担体を含むことができる。担体は治療された動物において治療用組成物の半減期を増加させる化合物を含む。適切な担体は、以下に限定されるものではないが、ポリマー制御放出ビヒクル、生分解性インプラント、リポソーム、細菌、ウイルス、他の細胞、油、エステルおよびグリコールを含む。
【０１２０】
本発明の治療用組成物を効果的に投与するための許容されるプロトコールは、個々の投与量サイズ、投与の回数、用量投与の頻度、および投与様式を含む。かかるプロトコールの決定は当業者によって達成することができる。投与の様式は、以下に限定されるものではないが、皮下、皮内、静脈内、鼻孔内、経口、経皮、眼内および筋肉内経路を含む。
【０１２１】
本発明のもう１つの実施形態は、改変されたＦｃＲ蛋白質を検出することができる、あるいは異常免疫性または炎症を有する患者から得られた細胞から単離された診断化合物である。ここに記載された構造ベースの薬物デザインの方法を用いて、ＦｃＲ蛋白質の三次元を用いてＦｃＲ蛋白質に結合する診断試薬を開発することができる。本発明の好ましい診断試薬は、Ｉｇに結合することができるＦｃＲ蛋白質のＩｇ結合部位に結合することができる分子、および炎症を持つ患者から得られた循環性ＦｃＲ蛋白質に結合することができる分子を含む。好ましい診断試薬は、免疫原性である分子であるか、あるいは放射性同位体、酵素、色素またはビオチンのごとき、検出可能な化合物に化学的に結合することができる分子である。
【０１２２】
好ましい実施形態において、本発明の治療化合物または診断化合物は、組換えＤＮＡ技術によって作成される蛋白質を含む。
【０１２３】
【表１】
2004510681.tif 000002
【表２】
2004510681.tif 000003
【表３】
2004510681.tif 000004
【表４】
2004510681.tif 000005
【表５】
2004510681.tif 000006
【表６】
2004510681.tif 000007
【表７】
2004510681.tif 000008
【表８】
2004510681.tif 000009
【表９】
2004510681.tif 000010
【表１０】
2004510681.tif 000011
【表１１】
2004510681.tif 000012
【表１２】
2004510681.tif 000013
【表１３】
2004510681.tif 000014
【表１４】
2004510681.tif 000015
【表１５】
2004510681.tif 000016
【表１６】
2004510681.tif 000017
【表１７】
2004510681.tif 000018
【表１８】
2004510681.tif 000019
【表１９】
2004510681.tif 000020
【表２０】
2004510681.tif 000021
【表２１】
2004510681.tif 000022
【表２２】
2004510681.tif 000023
【表２３】
2004510681.tif 000024
【表２４】
2004510681.tif 000025
【表２５】
2004510681.tif 000026
【表２６】
2004510681.tif 000027
【表２７】
2004510681.tif 000028
【表２８】
2004510681.tif 000029
【表２９】
2004510681.tif 000030
【表３０】
2004510681.tif 000031
【表３１】
2004510681.tif 000032
【表３２】
2004510681.tif 000033
【表３３】
2004510681.tif 000034
【表３４】
2004510681.tif 000035
【表３５】
2004510681.tif 000036
【表３６】
2004510681.tif 000037
【表３７】
2004510681.tif 000038
【表３８】
2004510681.tif 000039
【表３９】
2004510681.tif 000040
【表４０】
2004510681.tif 000041
【表４１】
2004510681.tif 000042
【表４２】
2004510681.tif 000043
【表４３】
2004510681.tif 000044
【表４４】
2004510681.tif 000045
【表４５】
2004510681.tif 000046
【表４６】
2004510681.tif 000047
【表４７】
2004510681.tif 000048
【表４８】
2004510681.tif 000049
【表４９】
2004510681.tif 000050
【表５０】
2004510681.tif 000051
【表５１】
2004510681.tif 000052
【表５２】
2004510681.tif 000053
【表５３】
2004510681.tif 000054
【表５４】
2004510681.tif 000055
【表５５】
2004510681.tif 000056
【表５６】
2004510681.tif 000057
【表５７】
2004510681.tif 000058
【表５８】
2004510681.tif 000059
【表５９】
2004510681.tif 000060
【表６０】
2004510681.tif 000061
【表６１】
2004510681.tif 000062
【表６２】
2004510681.tif 000063
【表６３】
2004510681.tif 000064
【表６４】
2004510681.tif 000065
【表６５】
2004510681.tif 000066
【表６６】
2004510681.tif 000067
【表６７】
2004510681.tif 000068
【表６８】
2004510681.tif 000069
【表６９】
2004510681.tif 000070
【表７０】
2004510681.tif 000071
【表７１】
2004510681.tif 000072
【表７２】
2004510681.tif 000073
【表７３】
2004510681.tif 000074
【表７４】
2004510681.tif 000075
【表７５】
2004510681.tif 000076
【表７６】
2004510681.tif 000077
【表７７】
2004510681.tif 000078
【表７８】
2004510681.tif 000079
【表７９】
2004510681.tif 000080
【表８０】
2004510681.tif 000081
【表８１】
2004510681.tif 000082
【表８２】
2004510681.tif 000083
【表８３】
2004510681.tif 000084
【表８４】
2004510681.tif 000085
【表８５】
2004510681.tif 000086
【表８６】
2004510681.tif 000087
【表８７】
2004510681.tif 000088
【表８８】
2004510681.tif 000089
【表８９】
2004510681.tif 000090
【表９０】
2004510681.tif 000091
【表９１】
2004510681.tif 000092
【表９２】
2004510681.tif 000093
【表９３】
2004510681.tif 000094
【表９４】
2004510681.tif 000095
【表９５】
2004510681.tif 000096
【表９６】
2004510681.tif 000097
【表９７】
2004510681.tif 000098
【表９８】
2004510681.tif 000099
【表９９】
2004510681.tif 000100
【表１００】
2004510681.tif 000101
【表１０１】
2004510681.tif 000102
【表１０２】
2004510681.tif 000103
【表１０３】
2004510681.tif 000104
【表１０４】
2004510681.tif 000105
【表１０５】
2004510681.tif 000106
【表１０６】
2004510681.tif 000107
【表１０７】
2004510681.tif 000108
【表１０８】
2004510681.tif 000109
【表１０９】
2004510681.tif 000110
【表１１０】
2004510681.tif 000111
【表１１１】
2004510681.tif 000112
【表１１２】
2004510681.tif 000113
【表１１３】
2004510681.tif 000114
【表１１４】
2004510681.tif 000115
【表１１５】
2004510681.tif 000116
【表１１６】
2004510681.tif 000117
【表１１７】
2004510681.tif 000118
【表１１８】
2004510681.tif 000119
【表１１９】
2004510681.tif 000120
【表１２０】
2004510681.tif 000121
【表１２１】
2004510681.tif 000122
【表１２２】
2004510681.tif 000123
【表１２３】
2004510681.tif 000124
【表１２４】
2004510681.tif 000125
【表１２５】
2004510681.tif 000126
【表１２６】
2004510681.tif 000127
【表１２７】
2004510681.tif 000128
【表１２８】
2004510681.tif 000129
【表１２９】
2004510681.tif 000130
【表１３０】
2004510681.tif 000131
【表１３１】
2004510681.tif 000132
【表１３２】
2004510681.tif 000133
【表１３３】
2004510681.tif 000134
【表１３４】
2004510681.tif 000135
【表１３５】
2004510681.tif 000136
【表１３６】
2004510681.tif 000137
【表１３７】
2004510681.tif 000138
【表１３８】
2004510681.tif 000139
【表１３９】
2004510681.tif 000140
【表１４０】
2004510681.tif 000141
【表１４１】
2004510681.tif 000142
【表１４２】
2004510681.tif 000143
【表１４３】
2004510681.tif 000144
【表１４４】
2004510681.tif 000145
【表１４５】
2004510681.tif 000146
【表１４６】
2004510681.tif 000147
【表１４７】
2004510681.tif 000148
【表１４８】
2004510681.tif 000149
【表１４９】
2004510681.tif 000150
【表１５０】
2004510681.tif 000151
【表１５１】
2004510681.tif 000152
【表１５２】
2004510681.tif 000153
【表１５３】
2004510681.tif 000154
【表１５４】
2004510681.tif 000155
【表１５５】
2004510681.tif 000156
【表１５６】
2004510681.tif 000157
【表１５７】
2004510681.tif 000158
【表１５８】
2004510681.tif 000159
【表１５９】
2004510681.tif 000160
【表１６０】
2004510681.tif 000161
【表１６１】
2004510681.tif 000162
【表１６２】
2004510681.tif 000163
【表１６３】
2004510681.tif 000164
【表１６４】
2004510681.tif 000165
【表１６５】
2004510681.tif 000166
【表１６６】
2004510681.tif 000167
【表１６７】
2004510681.tif 000168
【表１６８】
2004510681.tif 000169
【表１６９】
2004510681.tif 000170
【表１７０】
2004510681.tif 000171
【表１７１】
2004510681.tif 000172
【表１７２】
2004510681.tif 000173
【表１７３】
2004510681.tif 000174
【表１７４】
2004510681.tif 000175
【表１７５】
2004510681.tif 000176
【表１７６】
2004510681.tif 000177
【表１７７】
2004510681.tif 000178
【表１７８】
2004510681.tif 000179
【表１７９】
2004510681.tif 000180
【表１８０】
2004510681.tif 000181
【表１８１】
2004510681.tif 000182
【表１８２】
2004510681.tif 000183
【表１８３】
2004510681.tif 000184
【表１８４】
2004510681.tif 000185
【表１８５】
2004510681.tif 000186
【表１８６】
2004510681.tif 000187
【表１８７】
2004510681.tif 000188
【表１８８】
2004510681.tif 000189
【表１８９】
2004510681.tif 000190
【表１９０】
2004510681.tif 000191
【表１９１】
2004510681.tif 000192
【表１９２】
2004510681.tif 000193
【表１９３】
2004510681.tif 000194
【表１９４】
2004510681.tif 000195
【表１９５】
2004510681.tif 000196
【表１９６】
2004510681.tif 000197
【表１９７】
2004510681.tif 000198
【表１９８】
2004510681.tif 000199
【表１９９】
2004510681.tif 000200
【表２００】
2004510681.tif 000201
【表２０１】
2004510681.tif 000202
【表２０２】
2004510681.tif 000203
【表２０３】
2004510681.tif 000204
【表２０４】
2004510681.tif 000205
【表２０５】
2004510681.tif 000206
【表２０６】
2004510681.tif 000207
【表２０７】
2004510681.tif 000208
【表２０８】
2004510681.tif 000209
【表２０９】
2004510681.tif 000210
【表２１０】
2004510681.tif 000211
【表２１１】
2004510681.tif 000212
【表２１２】
2004510681.tif 000213
【表２１３】
2004510681.tif 000214
【表２１４】
2004510681.tif 000215
【表２１５】
2004510681.tif 000216
【表２１６】
2004510681.tif 000217
【表２１７】
2004510681.tif 000218
【表２１８】
2004510681.tif 000219
【表２１９】
2004510681.tif 000220
【表２２０】
2004510681.tif 000221
【表２２１】
2004510681.tif 000222
【表２２２】
2004510681.tif 000223
【表２２３】
2004510681.tif 000224
【表２２４】
2004510681.tif 000225
【表２２５】
2004510681.tif 000226
【表２２６】
2004510681.tif 000227
【表２２７】
2004510681.tif 000228
以下の例は説明の目的で提供したものであり、本発明の範囲を限定することを意図するものではない。
【０１２４】
［例］
例１
本例は、可溶性ＦｃγＲＩＩａ蛋白質を発現する組換えバクロウイルスの構築およびかかる蛋白質の生産を記載する。
【０１２５】
バクロウイルス多面的転写制御配列に作動可能に連結したヒトＦｃγＲＩＩ（ｓＦｃγＲＩＩａ）の可溶性形態をコードする核酸分子を含有する組換え分子ｐＦｃγＲＩＩａを以下のごとくに製造した。核酸分子ｓＦｃγＲＩＩａは、標準的なポリメラーゼ連鎖反応（以下、ＰＣＲと称す）法を用い、核酸配列５’−ＴＡＣ　ＧＡＡ　ＴＴＣ　ＣＴＡ　ＴＧＧ　ＡＧＡ　ＣＣＣ　ＡＡＡ　ＴＧＴ　ＣＴＣ−３’（配列番号１で示す）を有する約１００ｎｇのプライマーＮＲ１および核酸配列５’−ＣＡＴ　ＴＣＴ　ＡＧＡ　ＣＴＡ　ＴＴＧ　ＧＡＣ　ＡＧＴ　ＧＡＴ　ＧＧＴ　ＣＡＣ−３’（配列番号２で示す）を有するプライマーＦＩ２を用い、（Ｉｅｒｉｎｏら，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，ｖｏｌ．１７８，頁１６１７−１６２８，１９９３に記載された）約１０ナノグラム（ｎｇ）のＦｃγＲＩＩａＴＭｃＤＮＡからＰＣＲ増幅した。得られたＰＣＲ産物は５１０塩基対（ここではｓＦｃγＲＩＩａ（ａ）という）であり、配列番号３によってここでは表されるアミノ酸をコードする。例７に記載された質量分析実験で得られた結果に基づき、第２の蛋白質産物は本例のＰＣＲ産物を含む組換え分子の発現に際して存在する。このデータは、２つのＰＣＲ産物が本方法から産生されたことを示唆する。該第２のＰＣＲ産物は５１３塩基対であることが予測され（ここではｓＦｃγＲＩＩａ（ｂ）という）、配列番号１２によってここでは表されるアミノ酸配列をコードする。ＰＣＲ産物を制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩで消化し、およびｐＶＬ１３９２バクロウイルスシャトルプラスミド（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ，ＣＡから入手可能）のユニークなＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩ部位に連結させて、ここではｐＶＬ−ｓＦｃγＲＩＩａ（ａ）およびｐＶＬ−ｓＦｃγＲＩＩａ（ｂ）という組換え分子を得る。
【０１２６】
組換え分子ｐＶＬ−ｓＦｃγＲＩＩａ（ａ）およびｐＶＬ−ｓＦｃγＲＩＩａ（ｂ）を、バクロウイルス株ＡｃＭＮＰＶ（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎから入手可能）でスポドプテラ・フルギペルダ２１（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ　ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ　２１；Ｓｆ−２１）細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ　Ｃｏｒｐ．，Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）に共トランスフェクトしてＳ．ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ：ｐＶＬ−ｓＦｃγＲＩＩａ（ａ）／ｓＦｃγＲＩＩａ（ｂ）細胞を得た。β−ガラクトシダーゼのオクルージョン（ｏｃｃｌｕｓｉｏｎ）についてＸ−ガラクトシダーゼプレート上でスクリーニングすることによって、推定組換えウイルス単離体を選択した。無血清Ｓｆ９００−ＩＩ培地（Ｇｉｂｃｏ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋから入手可能）を用いて感染のために、選択された単離体をＳｆ−２１細胞の単層上で増殖させ、上清を感染後約４０時間で採取した。該上清中の、ここではＰｓＦｃγＲＩＩａと呼ぶ組換え蛋白質の存在を、標準的な方法を用い、（Ｉｅｒｉｎｏら，前掲に詳細に記載された）抗ＦｃγＲＩＩモノクローナル抗体８．２６および８．７を用いてＥＬＩＳＡによって測定した。例７に記載された結果に基づき、組換え蛋白質ＰｓＦｃγＲＩＩａは配列番号３および配列番号１２を有する２種類の蛋白質を含む。
【０１２７】
例２
本例は該蛋白質の結晶化のためにＰｓＦｃγＲＩＩａの精製を記載する。
【０１２８】
例１に前記したＳ．ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ：ｐＶＬ−ｓＦｃγＲＩＩａ（ａ）／ｓＦｃγＲＩＩａ（ｂ）細胞からの上清を採取し、次いで、約×２０００ｒｐｍで遠心して細胞夾雑物を除去した。Ｍｉｎｉｔａｎａ超遠心系（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡから入手可能）を用いて、遠心沈殿法からの上清を約５倍濃縮し、次いで、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ　ｐＨ８．５および５０ｍＭ　ＮａＣｌを含有する緩衝液に対して十分に透析した。透析された溶液をＱ−セファロース高速流動（ｆａｓｔ−ｆｌｏｗ）イオン交換カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｕｐｐｓａｌａ，スウェーデン、から入手可能）に適用した。該カラムを１０ｍＭ　トリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．５で洗浄し、次いで、０ないし約５００ｍＭ　ＮａＣｌの塩勾配を用いて該カラムから蛋白質を溶出させ、４時間にわたって該カラムに通した。ＰｓＦｃγＲＩＩａをほぼ１５０ｍＭ　ＮａＣｌで該カラムから溶離させた。部分的に精製された生成物を２０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．４および３０ｍＭ　ＮａＣｌを含有する緩衝液に対して透析した。該透析物を（Ｉｅｒｉｎｏら，前掲に詳細に記載された）ＨＡＧＧ免疫アフィニティクロマトグラフィに適用した。該カラムを２０ｍＭトリス−ＨＣｌ　ｐＨ７．４および３０ｍＭ　ＮａＣｌを含有する緩衝液で洗浄した。０．１Ｍ酢酸ナトリウムｐＨ４．０、および０．５Ｍ　ＮａＣｌを含有する緩衝液を用いてＰｓＦｃγＲＩＩａをカラムから溶離させた。溶出物を３ｍトリス　ｐＨ８．０を用いて中和し、ＰＢＳ（３．５ｍＭ　ＮａＨ２ＰＯ４・２Ｈ２Ｏ、１６ｍＭ　Ｎａ２ＨＰＯ４、１５０ｍＭ　ＮａＣｌ）に対して透析した。次いで、（Ｆｉｌｔｒｏｎ，Ｎｏｒｔｈｂｏｒｏｕｇｈ，ＭＡから入手可能な）マクロおよびナノセプ１０限外濾過濃縮デバイスを用いて該透析物をほぼ５０倍濃縮し、（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｕｐｐｓａｌａ．スウェーデン、から入手可能な）ＰＢＳ中で平衡化したＧ７５　セファデックスゲル濾過カラムに適用した。濾過されたＰｓＦｃγＲＩＩａを１ｍＭ　トリス−ＨＣｌ　ｐＨ７．４に対して透析し、マクロおよびナノセプ１０限外濾過濃縮デバイスを用いて約６ミリグラム／ミリリットル（ｍｇ／ｍｌ）蛋白質に濃縮した。ＰｓＦｃγＲＩＩａの純度は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって濃縮された蛋白質を解像し、該蛋白質をクロセインスカーレットで染色することによって評価した。得られたゲルの電子スキャンは図１に示され、ここで、レーンＡはイオン交換工程に先立ってＳ．ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ：ｐＶＬ−ｓＦｃγＲＩＩａ（ａ）／ｓＦｃγＲＩＩａ（ｂ）細胞培養から採取した上清を含有し、レーンＢはアフィニティカラムから溶離した蛋白質を含有し、レーンＣはゲル濾過クロマトグラフィ工程から単離された蛋白質を含有し、レーンＤは６ｍｇ／ｍｌに濃縮したＰｓＦｃγＲＩＩａの試料を含有し、これをさらに結晶化実験で使用した。分子量マーカーは図面の左側に示される。結果は、精製されたＰｓＦｃγＲＩＩａが約９０％純度であり、見掛けの分子量は２５，０００ダルトンであった。
【０１２９】
例３
本例は精製されたＰｓＦｃγＲＩＩａの二次元非平衡ｐＨゲル電気泳動分析を記載する。
【０１３０】
Ｓ．ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ：ｐＶＬ−ｓＦｃγＲＩＩａ（ａ）／ｓＦｃγＲＩＩａ（ｂ）からの上清を、抗ＦｃγＲＩＩモノクローナル抗体８．２６（ＩｇＧ２ｂ）のＦ（ａｂ’）断片（その製造はＪ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，ｖｏｌ．１５０，頁１−１０，１９９３に記載されている）を結合した約２０マイクロリットル（ｍｌ）の充填セファロース　４Ｂビーズと共に４℃で約１時間インキュベートした。次いで、該ビーズを、１０ｍＭトリス−Ｈｃｌ　ｐＨ７．４、２％ｗｔ／ｖｏｌウシ血清アルブミン（Ｃｏｍｍｏｎｗｅａｌｔｈ　Ｓｅｒｕｍ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｍｅｌｂｏｕｒｎｅ，Ａｕｓｔｒａｌｉａから入手可能な）、１ｍＭ　ＰＭＳＦ（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、０．１％　ｖｏｌ／ｖｏｌアプロチニン（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａ）を含有する緩衝液で洗浄し、次いで、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ，ｐＨ７．４で洗浄した。該ビーズを約５０ｍｌの等電点電気泳動変性緩衝液（９．５Ｍ尿素、４％アクリルアミド、２％ｗｔ／ｖｏｌ　ＮＰ−４０、２％全アンフォリンおよび５０ｍＭジチオスレイトール）に再懸濁し、約×１３，０００ｒｐｍにて約２分間回転し４％チューブゲルに付加し、約１０ｍｌの重層緩衝液（９Ｍ尿素、１％全アンフォリン）およびアノード緩衝液（０．０１Ｍリン酸）で重層し、約５５０ボルトで約５時間電気泳動に付した。次いで、該ゲルをガラスチューブから取り出し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ試料緩衝液（６２．５ｍＭ　トリス−ＨＣｌ、ｐＨ６．８、５０ｍＭジチオスレイトールおよび１０％グリセロール）中で室温にて約２時間平衡化させ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥのために１３％スラブゲルの頂部に付着させた。
【０１３１】
半乾燥トランスファー・セル（ｔｒａｎｓｆｅｒ ｃｅｌｌ）（Ｂｉｏｒａｄ，オーストラリア国）を用いて２０ｍＡ電流下にて電気泳動蛋白質を（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅから入手可能な）Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐ　ＰＶＤＦ膜に約３０分間で移した。５％ｗｔ／ｖｏｌ脱脂粉乳を含有するＰＢＳ緩衝液中で該膜を約１時間ブロックした。次いで、（５％ｗｔ／ｖｏｌ脱脂粉乳を含有するＰＢＳ中に１：１０，０００希釈した）ウサギ抗ＦｃγＲＩＩポリプローナル抗血清と共に該膜を一晩インキュベートし、次いで、緩衝液（１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０　１５０ｍＭ　ＮａＣｌ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０）で十分に洗浄した。組換えＦｃγＲＩＩ蛋白質での免疫化によって該ポリクローナル抗血清をウサギにおいて生起させた。該動物を約１ｍｇのＦｃγＲＩＩ蛋白質で免疫化した。最初の免疫化では、ＦｃγＲＩＩ蛋白質をフロイントの完全アジュバント中に乳化させた。フロイントの不完全アジュバント中に乳化させたＦｃγＲＩＩ蛋白質を用いて引き続いての免疫化を行った。次いで、（Ｄａｋｏ　Ｃｏｒｐ．デンアーク国より入手可能な）（１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１５０ｍＭ　ＮａＣｌおよび０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０に１：５０００に希釈した）ペルオキシダーゼ結合ブタ抗ウサギ抗血清と共に該膜を室温にて約１時間インキュベートした。増強された化学ルミネセンス系（Ａｍｅｒｓｈａｌ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、オーストラリア国から入手可能な）を用いる移した蛋白質の検出前に、該膜を洗浄した。
【０１３２】
得られたゲルの電子スキャンを図２Ａおよび２Ｂに示す。図２Ａは３４時間後にＳ．ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ：ｐＶＬ−ｓＦｃγＲＩＩａ（ａ）／ｓＦｃγＲＩＩａ（ｂ）細胞培養物から採取した上澄みから単離された蛋白質の泳動を示す。図２Ｂは、７３時間後にＳ．ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ：ｐＶＬ−ｓＦｃγＲＩＩａ（ａ）／ｓＦｃγＲＩＩａ（ｂ）細胞培養物から採取した上澄みから単離された蛋白質の泳動を示す。分子量マーカーを図面の左側に示す。結果は、精製されたＰＳＦｃγＲＩＩａが２５，０００ダルトンの見掛けの分子量と約ｐＨ６のｐＩを有することを示す。
【０１３３】
例４
本例はＰｓＦｃγＲＩＩａのＮ末端ペプチド配列を記載する。
【０１３４】
（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，ＣＡから入手可能な）最初の８個のアミノ酸の自動オンライン分析のためにＡｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ１３０分離系に連結したＡｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ４７０Ａガス層シーケネーターを用いる標準的な連続エドマン分解方法を用いての例２に記載された精製ＰｓＦｃγＲＩＩａのアミノ酸配列決定。Ｎ末端配列はＡｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ（配列番号４と示す）であると決定された。
【０１３５】
例５
本例はＰｓＦｃγＲＩＩａのモノマー免疫グロブリンへの結合を記載する。
【０１３６】
ＨＥＰＥＳ緩衝化食塩水（ＨＢＳ；１０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ［Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−２−エタンスルホン酸、ＣｏｍｍｏｎＷｅａｌｔｈ　Ｓｅｒｕｍ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｐａｒｋｖｉｌｌｅ，オーストラリア国、から入手可能］、ｐＨ７．４、１５０ｍＭ　ＮａＣｌ、３．４ｍＭ　ＥＤＴＡおよび０．００５％インターフェース活性剤、Ｐｈａｒｍａｃｉａから入手可能）中で、約２２℃のＢＩＡｃｏｒｅａ２０００バイオセンサー（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｕｐｐｓａｌａ，スウェーデン国から入手可能）を用いてＰｓＦｃγＲＩＩａとモノマー免疫グロブリンとの間の相互作用の分析を行った。製造業者の方法に従って（ＢＩＡｃｏｒｅから入手可能な）アミンカップリングキットを用い、モノマーヒト免疫グロブリンのサブクラスＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＥ（各々５０μｇ／ｍｌ）の約４０００ないし約６０００応答ユニット（ＲＵ）を、各ＣＭ５センサーチップ（ＢＩＡｃｏｒｅ，Ｕｐｐｓａｌａ，スウェーデン国から入手可能な）の別々のカルボキシメチル化デキルトラン表面に共有結合カップリングさせた。一連のＰｓＦｃγＲＩＩａ濃度（約０．００１ないし約１ｍｇ／ｍｌ蛋白質）を約２０μｌ／分にて約１分間、各センサーチップ表面に注射し、続いて約３分間、相を解離した。該蛋白質の投与に続き、５０ｍＭジエチルアミンｐＨ１１．５および１Ｍ　ＮａＣｌを含有する緩衝液を用いて免疫グロブリン表面を各チップ上で再生処理した。単一部位結合方程式［結合したＲＵ＝（Ｂ１ｍａｘ・Ｃ）／（ＫＤ１＋Ｃ）］；または２部位結合方程式［結合したＲＵ＝（（Ｂ１ｍａｘ・Ｃ）／（ＫＤ１＋Ｃ））＋（（Ｂ２ｍａｘ・Ｃ）／（ＫＤ２＋Ｃ））］（ここで、Ｂ１ｍａｘとは部位１での表面の最大結合容量をいい；Ｂ２ｍａｘとは部位２での表面の最大結合容量をいい；ＣとはＰｓＦｃγＲＩＩａの濃度を言う）の非線形曲線適合によって、およびスカッチャードプロットに対する線形曲線適合によって、ＰｓＦｃγＲＩＩａと免疫グロブリンとの間の相互作用についての平衡解離定数（ＫＤ）が得られた。ＩｇＥチャンネルから得られたデーター点を差し引いて屈折率の差を修正した。５０秒および６０秒の間のデーター点を平均して、各ＰｓＦｃγＲＩＩａ結合についての平衡時の結合したＰｓＦｃγＲＩＩａの量を得た。
【０１３７】
ＰｓＦｃγＲＩＩａと固定化免疫グロブリンとの間の相互作用の特性を決定するために、過剰のモノマーＩｇＧ（サンダグロブリン；Ｓａｎｄａｇｌｏｂｕｌｉｎ、Ｓａｎｄｏｚ，Ｂａｓｅｌ，スイス国から入手可能な）の存在によって、ＰｓＦｃγＲＩＩａとモノマー免疫グロブリンとの間の相互作用を阻害した。固定した最大用量の半分のＰｓＦｃγＲＩＩａ（５０μｇ／ｍｌ）を用い、ＩｇＧ１を被覆したセンサーチップ表面にＰｓＦｃγＲＩＩａを通す前に約２２℃にて約１時間、濃度を増やしながらモノマーＩｇＧ（０ないし２ｍｇ／ｍｌ　ＩｇＧ）をＰｓＦｃγＲＩＩａと混合した。
【０１３８】
結果は、ＩｇＧ３およびＩｇＧ１へのＰｓＦｃγＲＩＩａの結合は広い範囲の蛋白質濃度にわたって飽和可能であることを示した。蛋白質濃度当たりの最大応答ユニットを、蛋白質のモル濃度と、保証された曲線適合分析に対してプロットした。最良の適合曲線は、ＩｇＧ３と相互作用するＰｓＦｃγＲＩＩａの２つの領域があることを示唆した。該部位の５０％において、ＩｇＧ３に対する親和性は約２．７×１０６Ｍ−１であり、残りの５０％の部位においては、該親和性は約１．２×１０４Ｍ−１であった（図３Ａ）。ＰｓＦｃγＲＩＩａとＩｇＧ１との間の相互作用は、２つの領域においても生じたが、該相互作用は、ＩｇＧ３とは異なった。さらに、該リガンド結合部位の約９０％において、ＩｇＧ１についてのＰｓＦｃγＲＩＩａの親和性は約２．１×１０６Ｍ−１であり、残りの１０％の部位においては該親和性は約２．３×１０４Ｍ−１であった（図３Ｂ）。６倍モル過剰のＩｇＧはＩｇＧに対するＰｓＦｃγＲＩＩａの結合を完全に阻害したことから、該相互作用はＰｓＦｃγＲＩＩａに特異的であった。また、ＩｇＧ２結合の分析も行ったところ、約８×１０−５Ｍ−１のＫｄ値が得られた（図３Ｃ）。
【０１３９】
例６
本例はＰｓＦｃγＲＩＩａの結晶化とＸ線回折を記載する。
【０１４０】
Ａ．結晶性ＰｓＦｃγＲＩＩａの製造
一連の代替する緩衝液を用いて、ハンギングドロップ蒸気拡散によってＰｓＦｃγＲＩＩａの結晶を製造することを試みた。表６は用いた異なる母液の処方と得られた結果とをまとめたものである。
【０１４１】
【表２２８】
2004510681.tif 000229
【表２２９】
2004510681.tif 000230
ａ．リストした結果を達成するのに用いた沈殿剤の最終濃度
ｂ．条件９は単一液滴中に２つの結晶を生じた。
【０１４２】
ｃ．条件１６は液滴内の多数の核形成点から生じた破片のシャワーを生じた。
【０１４３】
ｄ．条件２５は以上な結晶を生じた。多数の結晶性プレートが一緒に接合してこの結晶を形成するように見える。この結晶のＸ線回折分析は成功しなかった。
【０１４４】
迅速なスクリーニング方法を用いた（ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ，１９８２，Ｉｎ：Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｃｒｙｓｔａｌｓ，１９８２，Ｐａｇｅ　９４−９７，Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　ａｎｄ　Ｓｏｎｓ　出版社；およびＪ．Ｃｒｙｓｔａｌ　Ｇｒｏｗｔｈ，ｖｏｌ．１２２，Ｐａｇｅ１６１−１６７，１９９２に一般的に記載されている）。略言すれば、２４ウェル培養プレートを用いハンギングドロップ蒸気拡散実験を行った。等用量の母液中の約３ｍｇ／ｍｌのＰｓＦｃγＲＩＩａを含有する液滴（約３μｌ）を、２４ウェル組織培養プレートウェルに倒立したシリコン処理カバーグラスから懸濁させた。約１ｍｌの母液に対して液滴を約２２℃で平衡化させた。温度を制御したインキュベーションを２０℃のチャンバー（Ｌｉｎｂｒｏ　Ｉｎｃから入手可能であり、ＩＣＮ　Ｉｎｃ，Ｃｏｓｔａ　Ｍｅｓａ　ＣＡによって提供された）内で行った。母液０．２Ｍ酢酸アンモニウム、０．１Ｍクエン酸塩ｐＨ５．６および３０％ＰＥＧ４０００を用い、２２℃で、ＰｓＦｃγＲＩＩａの純度および濃度に応じて約３ないし約９日間の間、または９カ月まで、成功したＰｓＦｃγＲＩＩａ結晶化を行い、斜方系結晶が生産された。
【０１４５】
また、１．５Ｍ硫酸リチウムを含む母液０．１Ｍ　ＨＥＰＥＳ　ｐＨ７．５を用い、ＰｓＦｃγＲＩＩａの純度および濃度に応じて約３ないし約９日間の間で、または９カ月まで、成功したＰｓＦｃγＲＩＩａ結晶化を２２℃で行い、結果として、規定された構造の一連の棒状破片が製造された。該棒状破片はＸ線回折によって分析した。
【０１４６】
Ｂ．結晶性ＰｓＦｃγＲＩＩａのＸ線回折および電子密度マップの測定
セクションＡで前記したごとく製造されたＰｓＦｃγＲＩＩａ結晶をレーヨンループに取り付け、２０％グリセロールを含有する母液中で−１６５℃まで低温冷却した。広い範囲の活性をサンプリングした１２の重い原子の化合物を、ＰｓＦｃγＲＩＩａに対する結合について試験した。ＰＩＰ（ジ−μ−ヨードビス［エチレンジアミン］ジ白金（ＩＩ）硝酸塩）は反応性であることが判明した。約５ｍＭ　ＰＩＰを含有する母液中に一晩浸漬することによって結晶を誘導した。約４０ＫＶおよび約５０ｍＭで作動するＭ１８ＸＨＦ回転アノード発生器（Ｓｉｅｍｅｎｓ，ドイツ）により、ＮｉフィルターＣｕＫγ照射を用いて、回折測定を行った。該発生器にはＦｒａｎｋｓミラー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，米国）、低温計（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，米国）およびＲＡＸＩＳ　ＩＩＣおよびＩＶイメージプレート検出器（Ｒｉｇａｋｕ，日本）を装備した。
【０１４７】
該結晶は空間群Ｐ２１２１２（ａ＝７８．８０オングストローム，ｂ＝１００．５５オングストローム，ｃ＝２７．８５オングストローム）に属し、０．０６５のＲ（ｍｅｒｇｅ）で約２．４オングストローム分解能に回折された。Ｒ（ｍｅｒｇｅ）＝全ての独立した反射にわたって合計したＳ（Ｉｉ−（ＩＳ））／Ｉｉ（ここで、Ｉ＝強度である）。天然および誘導体データは、約１゜の振動範囲で４５分間露出で収集した。回折強度はＤＥＮＺＯ（Ｏｔｗｉｎｏｗｓｋｉら，Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．２７６，頁３０７，１９９６）を用いて積分し、ＳＣＡＬＥＰＡＣＫ（Ｏｔｗｉｎｏｗｓｋｉら，前掲）で計った。単一の重原子結合部位は、ＰＲＯＴＥＩＮシステム（Ｓｔｅｉｇｅｍａｎ，Ｐｈ．Ｄ．Ｔｈｅｓｉｓ，Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｍｕｎｉｃｈ，１９７４）で計算した同形体および異常差パターソンマップ（ａｎｏｍａｌｏｕｓ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ　Ｐａｔｔｅｒｓｏｎ　ｍａｐｓ、Ｂｌｕｎｄｅｌｌら，Ｉｎ：Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ．，Ｈｏｒｅｃｋｅｒ，Ｂ．，Ｋａｐｌａｎ，Ｎ．Ｏ．，Ｍａｒｍｕｒ，Ｊ．，Ｓｃｈｅｒａｇｅ，Ｈ．Ａ編，Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ，１９７６）の調査によって位置決定した。重原子パラメーターを改良し、プログラムＳＨＡＲＰ（Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ　Ｈｅａｖｙ−Ａｔｏｍ　Ｒｅｆｉｎｅｍｅｎｔ　ａｎｄ　Ｐｈａｓｉｎｇ　、ｄｅ　Ｌａ　Ｆｏｒｔｅｌｌｅら，Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．２７６，頁４７２，１９９６）を用い、異常散乱を有するシングル同型置換の方法（Ｓｉｎｇｌｅ　Ｉｓｏｍｏｒｐｈｏｕｓ　Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ　ｗｉｔｈ　Ａｎｏｍａｌｏｕｓ　Ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ）で相を測定した。約１８ないし約２．７オングストローム分解能の範囲のマージデータ（ｍｅｒｇｅｄ ｄａｔａ）は、約０．１６２の同形体Ｒ因子、中心反射０．３０８および中心をはずれた反射０．２４７に対する良さの指数、並びに中心反射についての１．１２７および中心をはずれた反射についての１．０８１の整相力を有した（Ｂｌｕｎｄｅｌｌ，前掲）。プログラムのＣＣＰ４（Ｃｏｗｔａｎ，後出）スート中の密度修飾パッケージＤＭ（Ｃｏｗｔａｎ，Ｊｏｉｎｔ　ＣＣＣＰ４　ａｎｄ　ＥＳＦ−ＥＡＣＢＭ　Ｎｅｗｓｌｅｔｔｅｒ　ｏｎ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ，ｖｏｌ．３１，頁３４，１９９４）において溶媒フラットニング（Ｗａｎｇ，Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．１１５，頁９０，１９８５）およびヒストグラムマッピング（Ｚｈａｎｇら，Ａｃｔａ　Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ，ｖｏｌ．Ａ４６，頁３７７，１９９０）のプロトコールにて相を修飾した。グラフィックディスプレイプログラムＯ（Ｊｏｎｅｓら，Ａｃｔａ　Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ，ｖｏｌ．Ａ４７，頁１１０，１９９１）を用いて２Ｆ０−Ｆｃ電子密度マップを表示した。二次構造特徴はこの段階で同定できたが、該マップは、該ポリペプチドの十分な解釈および追跡が困難であった。電子密度の単純化された表示を得るために、プログラムＢＯＮＥＳ（Ｊ��ｎｅｓら，前掲）を用い、該マップの骨組みを作成した（Ｇｒｅｅｒ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，ｖｏｌ．８２，頁２７９，１９７４）。キラー阻害性受容体（Ｆａｎら，Ｎａｔｕｒｅ，ｖｏｌ．３８９，頁９６，１９９７）の座標を参照として用いて、該ポリペプチドを追跡し、部分的モデルを得た。引き続いてのマップを計算するために、密度修飾相およびモデルから計算した相をＦｒｅｅ−Ｓｉｍ法（Ｓｉｍ，Ａｃｔａ　Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ，ｖｏｌ．１３，頁５１１，１９６０）によって組み合わせた。
【０１４８】
ブルックヘイベン・ナショナル・ラボラトリー（Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｕｐｔｏｎ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ）のナショナル・シンクロトロン・ライト・ソース（Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｓｙｎｃｈｒｏｔｒｏｎ　Ｌｉｇｈｔ　Ｓｏｕｒｃｅ）のビームラインＸ４Ａで、構造改良についての更なるデータを回収した。約１．０５８オングストロームの波長での照射を用い、約１００秒の露出および約１゜の振動範囲としてデータをフジイメージプレートで回収した。回折イメージをＢＡＳ２０００スキャナー（Ｆｕｊｉ，日本）でデジタル化し、前記したごとくに加工して、約１０オングストロームおよび約１．７オングストローム分解能の間のデータについての０．０３８のＲ（ｍｅｒｇｅ）を得た。個々の温度因子、エネルギー最小化およびバルク溶媒校正での徐冷却誘導アニーリング改良を含めたプロトコールを用い、構造改良をＸＰＬＯＲシステム（Ｂｒｕｎｇｅｒら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，ｖｏｌ．２３５，頁４５８，１９８７）で行った。
【０１４９】
ＰｓＦｃγＲＩＩａの改良された構造は、３３の溶媒と共に、１ないし１７０の全てのアミノ酸残基を含有する。結晶学的残留Ｒ因子および自由Ｒ因子は、約７オングストロームないし約２．０オングストローム分解能のデータにつき、各々、約０．２５３および約０．３２６である（Ｂｒｕｎｇｅｒ，１９８７，前掲）。結合長の理想的性質から、平均二乗平均平方根偏差は角度につき約０．０１オングストロームおよび約１．４５゜であった（Ｂｒｕｎｇｅｒら，Ｎａｔｕｒｅ，ｖｏｌ．３５５，頁４７２，１９９２）。ＰｓＦｃγＲＩＩａについての原子座標の得られたデータ組を図４に示す。
【０１５０】
Ｃ．ＰｓＦｃγＲＩＩａ構造
表１にリストした原子座標を用い、ＰｓＦｃγＲＩＩａのダイマーの構造を誘導した。ＭＯＬＳＣＲＩＰＴ２．０プログラム（Ａｖａｔａｒ　Ｓｏｆｔｗａｒｅ　ＡＢ，Ｈｅｌｅｎｅｂｏｒｇｓｇａｔａｎ　２１Ｃ，ＳＥ−１１７３１　Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ，スウェーデンから入手可能）を用いて、該構造をコンピュータにより作成した。該結晶構造は２つの１７０個のアミノ酸モノマーを有するダイマー形態のＰｓＦｃγＲＩＩａを明らかにする。該２つのモノマーは構造学的に同一である。
【０１５１】
ＰｓＦｃγＲＩＩａ残基１ないし１７０の構造は、２つの免疫グロブリン不変領域２（Ｃ２）タイプ免疫グロブリンドメインよりなり、各ドメインは、ジスルフィド結合によって共に拘束された２つの逆平行β−シートよりなる。各ドメインの最初のストランド（Ａストランド）は、シートＩを形成する部分（ＡＢＥストランド）およびシートＩＩを形成する部分（Ａ’ＧＦＣＣ’ストランド）で中央で分断されている。この構造特徴は免疫グロブリン可変領域（Ｖ）タイプドメインにおいて、およびナチュラルキラー阻害性受容体（ＫＩＲ）において起こるが、他のＣ２ドメインでは生じない。ＰｓＦｃγＲＩＩａの２つの免疫グロブリン様ドメインは相互に非常に類似しており、Ｃａ位置におけるｒｍｓ差異は６８残基につき１．２８オングストロームである。主要な差異は分子のＮ末端でのループ（ＢＣ、Ｃ’ＥおよびＦＧループ）およびＣ’ストランド上の位置にある。これらのループのいくつかはＦｃの結合に関係付けられてきた。
【０１５２】
ＰｓＦｃγＲＩＩａ構造における２つのドメインの結合領域はかなり曲がっており、ドメインの主要軸の間の角度はほぼ５２゜である。この曲がりはＫＩＲについての６０゜を含む、他の免疫グロブリンスーパーファミリーメンバーよりも過酷である。該ドメインのインターフェースはドメイン１からのストランドＡ’並びにドメイン２からのＡ＆Ｂから構成され、ここで、各ドメインからのシートＩＩが該インターフェースを形成する。その非水素原子が他のドメインの４オングストローム内にある残基。また、水分子２０１、２１１、２１７−２２０、２２７および２３２はインターフェース領域にある。
【０１５３】
ある種の構造特徴は、該結晶中の２つのＰｓＦｃγＲＩＩａの分子の間のダイマー形成が好ましい相互作用であることを示す。該結晶の唯一のＰｓＦｃγＲＩＩａ分子（残基１ないし１７０）の構造は決定されているが、該結晶中のダイマーよりなる各ＰｓＦｃγＲＩＩａ分子は２倍結晶軸によって該結晶中の他のＰｓＦｃγＲＩＩａ分子に関係している。該変換：
（−１　０　０）（ｘ）（０．）
（０　−１　０）．（ｙ）＋（１００．５５）
（０　０　１）（ｚ）（０．）
を表１中に与えた座標に適用することによって、ダイマーが形成される（図４）、該インターフェースは各ＰｓＦｃγＲＩＩａ分子からのシートＩＩよりなる。ＦｃγＲＩＩａダイマーの座標は表２に表される。接触領域が重要であり（〜４００オングストローム）、このインターフェースはドメイン１−ドメイン２のインターフェースよりも疎水性特徴を有する。その非水素原子が他の分子または軸の水分子２０７の４オングストローム内にある残基は、１１９、１２１、１２４−１２６、１５０、１５２および１５８−１６１であり、残基１４８、１６３および１６４は密接なアプローチをなす。このタイプのドメイン相互作用は免疫グロブリンについては新規ではなく、これは、抗体のＶ領域は同じ様式で対をなすからである。しかしながら、このタイプの相互作用はＣ２ドメインでは観察されていなかった。この接触のサイズおよび特徴により、この従来では予見できなかった相互作用が生理学的な関連性を有することを示唆する。
【０１５４】
さらなる構造的考慮がこの結論をサポートする。上述した結晶構造は、仮に、ＦｃγＲＩＩａ分子が、該受容体を含有する細胞膜に向けてＣ末端で方向付けられるのであれば、従って、該受容体の推定Ｆｃ結合領域は細胞から外れないが、１つの側では遠くに離れることが示唆される。従って、細胞膜における２つのＦｃγＲＩＩａ分子の間にダイマーを形成し、該２つの可能なＦｃ結合領域を相互に近づけ、且つ、ダイマー軸が細胞から離れるので、該細胞から離れる。この配向は、リガンド（すなわち、ＩｇＧ）との相互作用のために、可能なＦｃ結合部位を理想的に位置付け、該リガンド結合部位が２つの受容体分子からの領域からなるようにする。結合事象において２つの受容体分子を関係付けることは、細胞シグナル変換につき密接な関係を有し、何故ならば、細胞外ドメインの二量体化は２つの受容体の細胞質ドメインを一緒にして細胞シグナル変換応答を開始するためである。
【０１５５】
図４はＰＦｃγＲＩＩａのダイマーのグラフィック表示を示す。２つのＩｇ様ドメイン（ドメイン１および２）は、各ダイマーの各モノマーに示される。該蛋白質のアミノ（ＮＨ２）末端の最初のアミノ酸残基は残基番号０によって示される。該蛋白質のカルボキシル（ＣＯＯＨ）末端の最後のアミノ酸残基は残基１７０によって示される。ＮＨ２末端からＣＯＯＨ末端へのアミノ酸残基のナンバリングは可能な場合に示される。ある残基は明瞭性のために省略した。図５は、ＰＦｃγＲＩＩａのドメイン１およびドメイン２の各ベータシートよりなるアミノ酸残基を示す。ドメイン１において、ストランドＡは残基５−１０を含み、ストランドＡ’は残基１４−１７を含み、ストランドＢは残基２０−２８を含み、ストランドＣは残基３７−４１を含み、残基Ｃ’は残基４４−４６を含み、ストランドＥは残基５２−２８を含み、ストランドＦは残基６３−７０を含み、ストランドＦは残基６３−７０を含み、およびストランドＧは残基７８−８４を含む。ドメイン２において、ストランドＡは残基８７−９２を含み、ストランドＡ’は残基９５−９７を含み、ストランドＢは残基１０２−１１０を含み、ストランドＣは残基１１７−１２２を含み、ストランドＣ’は残基１２５−１３１を含み、ストランドＥは残基１３４−１３９を含み、ストランドＦは残基１４６−１５５を含み、ストランドＧは残基１５８−１６２を含み、およびストランドＧ’は残基１６３−１６９を含む。図６は立体で図４で示した該ポリペプチドの構造の立体図を示す。
【０１５６】
図４に示した三次元構造のグラフ表示を用いて、ＦｃγＲＩＩａのＩｇＧへの結合に関与するアミノ酸残基の位置を決定した。図７はＦｃγＲＩＩａのＩｇＧへの結合の喪失に関与する突然変異したアラニン残基の位置（黒色球によって示された）を示す。図７に示された残基はＦｃγＲＩＩａの組換え突然変異体を用いて同定し、ここで、残基はアラニンで置き換えられ、且つＦｃγＲＩＩａに対するＩｇＧの結合を分断または減少することが判明した（Ｈｕｌｅｔｔら，１９９４，前掲；Ｈｕｌｅｔｔら，１９９５，前掲）。図８は、ＩｇＧへの減少した結合を有するＦｃγＲＩＩａ蛋白質をコードする領域における突然変異を有する核酸分子の産生によって示されるごとく、ＦｃγＲＩＩａへのＩｇＧ結合に関与するアミノ酸の位置および側鎖を示すＩｇＧ結合領域の拡大図を示す。
【０１５７】
図９はＩｇＧ結合領域およびアミノ酸残基（これはアラニンに突然変異された場合にＩｇＧ結合を改良する）の拡大図を示す。
【０１５８】
図４に示される三次元構造のグラフ表示に示された２つのダイマーの間のインターフェースをさらに分析した。図１０は該ダイマーインターフェースに寄与する１つのＦｃγＲＩＩａモノマーの領域の拡大図を示す。図１０において、当該領域はｘにおいて約９０℃回転されており、ここでｘは頁に対して水平である。インターフェースに寄与するアミノ酸残基のγ炭素は黒色球として示され、配列番号３の残基ナンバーリングに従って番号が付される。
【０１５９】
例７
本例は電子スプレーイオン化質量分析によるＰｓＦｃγＲＩＩａ蛋白質のＮ末端配列の分析を記載する。
【０１６０】
ＰｓＦｃγＲＩＩａ蛋白質のＮ末端アミノ酸配列を決定するために、Ｎ結合グリコシル化質量分光分析の不均一性を以下のごとく行った。０．１％酢酸を含有する５０％ＣＨ３ＣＮの約２μｌないし約４μｌ中に、約１ないし約１００ピコモーラー（ｐｍｏｌ）のＰｓＦｃγＲＩＩａ蛋白質を合わせることによって種々の試料を調製した。ミクロイオンスプレーのイオン源を装備し、Ｑ１スキャンモードで作動するパーキン・エルマー・サイエックス（Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｅｍｅｒ　Ｓｃｉｅｘ）Ａｐｉ−３００三重四極質量分光計に、約０．２μｌ／分の流速で試料を注入した。単一に荷電したポリ（プロピレングリコール）イオンを用い、±０．０１％に等しい精度まで、３０００ｕ質量範囲にわたって８つの点で質量スケールを較正した。０．６ｕの一定のピーク幅（半分の高さにおけるピーク幅）で、質量スペクトル（典型的には３０−１００スキャン）を、質量ランドｎ／ｚ２００ｕないし３０００ｕにわたって記録し、ＰＥ−サイエックス・バイオマルチビュー（ＰＥ−Ｓｃｉｅｘ　Ｂｉｏｍｕｌｔｉｖｉｅｗ）ソフトウェアを用いて単一平均化、手動質量測定および変換によって加工した。結果は、異なるＮ末端配列を有する蛋白質の主要な２種類が精製されたＰｓＦｃγＲＩＩａ蛋白質の溶液中に存在することを示した。１種類は、配列番号４を含むＮ末端配列を有し、且つ他種類は該蛋白質の５’末端にでの更なるＡｌａを持つＮ末端配列を有した（例えば、Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−）。
【０１６１】
例８
本例はモノマーおよびダイマー両形態のＦｃε受容体Ｉ（ＦｃεＲＩ）の三次元構造のモデリングを記載する。
【０１６２】
ヒトＦｃイプシロン受容体タイプＩ（ＦｃεＲＩ）およびヒトＦｃガンマ受容体タイプＩＩａ（ＦｃγＲＩＩａ）の細胞外領域は約３８％（１７２残基につき）の配列同一性を示す。このモデリングワークで用いる最終配列アラインメントを図１３に示す。ヒトＦｃγＲＩＩａのＸ線結晶学構造は本発明者らによって決定された（表１）。表１中のＦｃγＲＩＩａ三次元座標は、Ｈｉｓ１０８のイミダール環の配向および１ラウンドの改良によって、ヒトＦｃεＲＩの三次元モデルを構築するための鋳型として用いたものとは異なる。
【０１６３】
ＦｃεＲＩで行った二次構造予測により図１３に与えられたアラインメントの有効性が確認され、βストランドのパターンがＦｃεＲＩおよびＦｃγＲＩＩａの双方で同一であることを示した。用いた二次構造予測方法はＰＨＤ（Ｂ．Ｒｏｓｔら，ＣＡＢＩＯＳ，ｖｏｌ．１０，２６６−２７５（１９９４））およびＰＲＥＤＡＴＯＲ（Ｄ．ＦｒｉｓｈｍａｎおよびＰ．Ａｒｇｏｓ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，ｖｏｌ．２７，３２７−３３５（１９９７））であった。
【０１６４】
インサイトＩＩ・ホモロジー・ソフトウェア・パッケージ（ＩｎｓｉｇｈｔＩＩ　Ｈｏｍｏｌｏｇｙ　Ｓｏｆｔｗａｒｅ　Ｐａｃｋａｇｅ、Ｉｎｓｉｇｈｔ　ＩＩ（９７．０），ＭＳＩ，Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ）を実行して、モデラー（ＭＯＤＥＬＥＲ、Ａ．ＳａｌｉおよびＴ．Ｌ．、Ｂｌｕｎｄｅｌｌ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，ｖｏｌ．２３４，７７９−８１５（１９９３））を用いて、多数の異なる初期配列アラインメントおよびＦｃγＲＩＩａの２つの構造鋳型を使用してＦｃεＲＩの三次元モデルを得た。構造鋳型のうちの１つはＦｃγＲＩＩａの三次元座標であり、ここで、代替側鎖立体配座を有した残基（残基番号１０、２１、３３、５７、６０、６１、６５および８９）については、「Ａ」で標識した立体配座を選択し、他方、他の鋳型においては「Ｂ」で標識した立体配座を選択した。各モデラー実行において、ＦｃεＲＩの５つの構造モデルが生じた。以下のパラメーター値またはオプションを用いた：１の「ｌｉｂｒａｒｙ　ｓｃｈｄｕｌｅ」、３００の「ｍａｘ　ｖａｒ　ｉｔｅｒａｔｉｏｎｓ」、「ｒｅｆｉｎｅｌ」の「ｍｄ　ｌｅｖｅｌ」、３の「ｒｅｐｅａｔ　ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ」、および１ｅ６の「ｍａｘ　ｍｏｌｐｄｆ」。これらの実行からの最良のモデルは図１３に与えた配列アラインメントを有し、ＦｃγＲＩＩａの構造鋳型を用い、ここで、残基１０、２１、３３、５７、６０、６１、６５および８９は「Ａ」立体配座において側鎖を有した。「最良」モデルを判断する基準はモデラー目的関数の最小値（または−１．０×ｌｎ（分子確率密度関数＝Ｍｐｄｆ））、モデルに対する「ｗｅｌｌ−ｂｅｈａｖｅｄ」ＰＲＯＳＡＩＩ（Ｍ．Ｓｉｐｐｌ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，ｖｏｌ．１７，３５５−３６２（１９９３））残基エネルギープロット（例えば、該配列を通じて負の残基エネルギースコア）、および「ｗｅｌｌ−ｂｅｈａｖｅｄ」ＰＲＯＦＩＬＥＳ−３Ｄ（Ｊ．Ｕ．Ｂｏｗｉｅら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，ｖｏｌ．２５３，１６４−１７０（１９９１））局所３Ｄ−１Ｄ適合性スコアプロット（例えば、配列を通じて正のプロットスコア）を含んだ。
【０１６５】
次に、前記で選択した配列アラインメントおよび鋳型を用い、および前記でリストしたパラメーター値およびオプションを用い、モデラーを用いてＦｃεＲＩの２０の異なる構造モデルを得た。次いで、最小の−ｌｎ（Ｍｐｄｆ）値（すなわち９５７．２）を持つモデルを鋳型として選択して、モデラーの実行の次のサイクルにおいてＦｃεＲＩ配列の構造モデルを得た。４つのかかるサイクルの最後に、ＦｃεＲＩ構造の「最良の」三次元モデルは６４３．２の−ｌｎ（Ｍｐｄｆ）値を有した。これをＦｃεＲＩモノマーの最終構造モデルとして選択し、対応する重（非水素）原子デカルト座標を表３に示す。該構造の「ワーム（ｗｏｒｍ）」表示を図１４に示す。この構造はプログラムＰＲＯＳＡＩＩ、ＰＲＯＦＩＬＥＳ−３Ｄ、およびＰＲＯＣＨＥＣＫ（Ｒ．Ｍ．Ｌａｓｋｏｗｓｋｉら，Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｃｒｙｓｔ．ｖｏｌ．２６，２８３−２９１（１９９３））で有効化された。
【０１６６】
最後に、ＦｃγＲＩＩａモノマーからダイマーを生じる同一座標変換をＦｃεＲＩモノマーの前記モノマーの上記モデルに適用した。インサイトＩＩ・ホモロジー（ＩｎｓｉｇｈｔＩＩ　Ｈｏｍｏｌｏｇｙ）モジュール（ＭＳＩ，Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ）のオート・ロータマー（Ａｕｔｏ　Ｒｏｔａｍｅｒ）オプションでＧｌｕ１６１およびＴｙｒ１５０残基につき代替回転異性体を選択し、ついで、水素原子を該ダイマーモデルに水素原子を加え、およびエネルギーを最小化して全ての重原子を固定して保持する（該主鎖原子のみが固定して維持される場合はＴｙｒ１５０およびＧｌｕ１６１は除く）ことにより、得られたダイマーのインターフェースを最適化した。ＣＦＦ９１の力の場および１．０×ｒの距離依存性誘電率でエネルギーの最小化のために、プログラムディスカバー（Ｄｉｓｃｏｖｅｒ）ｖ．２．９８（ＭＳＩ，Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ）を使用し、且つ最大エネルギー勾配が０．１０ｋｃａｌ／オングストローム未満となるまで共役勾配方法で最小化を行った。ＦｃεＲＩダイマーの得られたモデルのデカルト座標を表４に表し、該ダイマーモデルの「ワーム（ｗｏｒｍ）」表示は図１５に示す。該ＦｃεＲＩダイマーのこのモデルは形状相補性、または０．６４のモノマー−モノマーインターフェースでのＳｃ値（Ｍ．Ｃ．ＬａｗｒｅｎｃｅおよびＰ．Ｍ．Ｃｏｌｍａｎ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，ｖｏｌ．２３４，９４６−９５０（１９９３）を参照されたい）、および静電的相補性値、［十分に溶媒和化した場合には、スピアマンの階数相関係数（Ａ．Ｊ．ＭｃＣｏｙ，Ｖ．Ｃ．Ｅｐａ，およびＰ．Ｍ．Ｃｏｌｍａｎ，Ｊ　Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，ｖｏｌ．２６８，５７０−５８４（１９９７）参照されたい）を使用する］、または０．０８のモノマー−モノマーインターフェースにおけるＥＣＳＦＳを有する。これらを、ＦｃγＲＩＩａダイマーにつき、各々、０．８０および０．３２に匹敵する。ＦｃγＲＩＩａダイマーと比較したＦｃεＲＩダイマーについてのこれらの減少した相補性値は、ここにおける形成（ｂｕｉｌｔ）として、ＦｃεＲＩダイマーの形成がＦｃγＲＩＩａの場合におけるよりもエネルギー的に不都合であることを示す。しかしながら、我々は、ＦｃεＲＩのβまたはγ鎖との該相互作用が考慮されてなかったことを注記する。図１６はＦｃεＲＩダイマーモデルの分子表面表示を示す。
【０１６７】
ここで、ＦｃγＲＩＩａの結晶学的座標につき記載したのと同様に、表３における該座標によって表されるＦｃεＲＩモノマー、または表４における該座標によって表されるＦｃεＲＩダイマーの三次元構造のモデルを薬物デザインの基礎として用いることができる。
【０１６８】
例９
以下の例はＦｃε受容体Ｉ（ＦｃεＲＩ）の結晶化を示す。
【０１６９】
バクロウイルス多面的転写制御配列に作動可能に連結したヒトＦｃεＲＩの可溶性形態（ｓＦｃεＲＩ）をコードする核酸分子を含有する組換え分子ｐＦｃεＲＩを例１−３においてｐＦｃγＲＩＩａ分子につき記載したごとくに生産した。即ち、Ｐｒｏを通常はコードする位置１７３の翻訳終止コドンを、図１３に表わした配列に記載した第２のドメインのＣ−末端での配列Ｉｌｅ、Ｌｙｓ、Ａｌａ、Ｐｒｏに入れることによって、該組換え可溶性ＦｃεＲＩを得た。可溶性ＦｃεＲＩは、ギブコ（ＧＩＢＣＯ）によって供給されたバクロウイルス発現系「Ｂａｃ　ｔｏ　Ｂａｃ」で発現させた。ＳＦ２１またはＳｆ９細胞の感染は製造業者によって記載されているごとくに行った。即ち、該組換えＦｃεＲＩＩａ分子をｐＶＬ１３９２バクロウイルスシャトルプラスミド（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）に連結して、ここではｐＶＬ−ｓＦｃεＲＩと称する組換え分子を作成した。引き続いて、組換え分子ｐＶＬ−ｓＦｃεＲＩを、バクロウイルス株ＡｃＭＮＰＷ（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎから入手可能な）でスポドプテラ・フルギペルダ２１細胞（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ　ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ２１　ｃｅｌｌ；Ｓｆ−２１、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ　Ｃｏｒｐ．，Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ，ＣＡから入手可能な）に共トランスフェクトしてＳ．フルギペルダ：ｐＶＬ−ｓＦｃεＲＩ細胞（Ｓ．ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ：ｐＶＬ−ｓＦｃεＲＩ　ｃｅｌｌ）を作成した。感染後６５−７０時間に、上澄みを収穫し、例５においてＦｃγＲＩＩａにつき記載したプロセスと同様に、抗ＦｃεＲＩ抗体（３Ｂ４）モノクローナル抗体−セファロース　４Ｂアフィニティカラム上のアフィニティクロマトグラフィによって可溶性受容体を精製した。該カラムを１０ｍＭトリスｐＨ７．５で洗浄し、０．１Ｍ酢酸ナトリウム、０．５Ｍ塩化ナトリウム、ｐＨ４．０で溶離した。その精製した蛋白質を濃縮し、ＦｃγＲＩＩａにつき記載したごとくに結晶化トライアルで用いた（例６）。結晶を以下のごとくにいくつかの条件下で生成した：
（ａ）０．２Ｍ酢酸カルシウム；０．１Ｍカコジル酸ナトリウム、ｐＨ６．５；１８％ｗ／ｖポリエチレングリコール（ＰＥＧ）８０００；
（ｂ）０．１Ｍカコジル酸ナトリウム、ｐＨ６．０またはｐＨ５．５；１０％ｖ／ｖ　２−プロパノール；２０％ｗ／ｖ　ＰＥＧ４０００；
（ｃ）０．２Ｍクエン酸三ナトリウム二水和物；０．１Ｍカコジル酸ナトリウムｐＨ６．５；３０％ｖ／ｖ　２−プロパノール。
【０１７０】
本明細書中で記載したごとく、これらの実験によって得られたＦｃεＲＩ結晶の構造は、Ｘ線回折分析および／または分子置換およびモデリング戦略で用いることができる。
【０１７１】
例１０
本例はモノマー形態のＦｃγ受容体ＩＩＩ（ＦｃγＲＩＩＩｂ）の三次元構造のモデリングを記載する。
【０１７２】
ヒトＦｃガンマ受容体タイプＩＩＩ（ＦｃγＲＩＩＩｂ）およびヒトＦｃガンマ受容体タイプＩＩａ（ＦｃγＲＩＩａ）の細胞外領域は約５３％（１７４残基につき）の配列同一性を示す。このモデリングワークで用いた最終配列アラインメントを図１８に示す。ヒトＦｃγＲＩＩａのＸ線結晶学的構造は、例１−７に記載したごとく本発明者らによって測定された（表１）。表１中のＦｃγＲＩＩａの三次元座標は、Ｈｉｓ１０８のイミダゾール環の配向および１ラウンドの改良によって、ヒトＦｃγＲＩＩＩｂの三次元モデルを形成するために鋳型として用いたものとは異なる。
【０１７３】
ＦｃγＲＩＩａの多数の異なる初期配列アラインメントおよび２つの構造鋳型を用い、インサイトＩＩ・ホモロジー（ＩｎｓｉｇｈｔＩＩ　Ｈｏｍｏｌｏｇｙ）ソフトウェアパッケージ（Ｉｎｓｉｇｈｔ　ＩＩ（９７．０），ＭＳＩ，Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ）で実施したモデラー（ＭＯＤＥＬＥＲ、Ａ．ＳａｌｉおよびＴ．Ｌ．Ｂｌｕｎｄｅｌｌ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，ｖｏｌ．２３４，７７９−８１５（１９９３））を用いてＦｃγＲＩＩＩｂの三次元モデルを作成した。用いた構造鋳型はＦｃγＲＩＩａの三次元座標であり、ここで、代替側鎖立体配座（残基番号１０、２１、３３、５７、６０、６１、６５および８９）を有した残基については、「Ａ」で標識した立体配座を選択した。各モデラーの実行において、ＦｃγＲＩＩＩｂの５つの構造モデルが生成された。以下のパラメーター値またはオプションを用いた：１の「ｌｉｂｒａｒｙ　ｓｃｈｅｄｕｌｅ」、３００の「ｍａｘ　ｖａｒ　ｉｔｅｒａｔｉｏｎｓ」、「ｒｅｆｉｎｅｌ」の「ｍｄ　ｌｅｖｅｌ」、３の「ｒｅｐｅａｔ　ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ」、および１ｅ６の「ｍａｘ　ｍｏｌｐｄｆ」。これらの実行からの最良のモデルは図１８に与えた配列アラインメントを有し、ＦｃγＲＩＩａの構造鋳型を用い、ここで、残基１０、２１、３３、５７、６０、６１、６５および８９は「Ａ」立体配座における側鎖を有した。「最良」モデルを判断する基準は該モデラー目的関数の最小値（または−１．０×ｌｎ（分子確率密度関数＝Ｍｐｄｆ））、モデルに対する「ｗｅｌｌ−ｂｅｈａｖｅｄ」ＰＲＯＳＡＩＩ（Ｍ．Ｓｉｐｐｌ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，ｖｏｌ．１７，３５５−３６２（１９９３））残基エネルギープロット（例えば、配列を通じて負の残基エネルギースコア）、および「ｗｅｌｌ−ｂｅｈａｖｅｄ」ＰＲＯＦＩＬＥＳ−３Ｄ（Ｊ．Ｕ．Ｂｏｗｉｅら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，ｖｏｌ．２５３，１６４−１７０（１９９１））局所３Ｄ−１Ｄ適合性スコアプロット（例えば、配列を通じて正のプロットスコア）を含んだ。
【０１７４】
次に、前記で選択した配列アラインメントおよび鋳型を用い、および前記でリストしたパラメーター値およびオプションを用い、モデラーを用いてＦｃγＲＩＩＩｂの２０の異なる構造モデルを得た。次いで、最小の−ｌｎ（Ｍｐｄｆ）値（すなわち９３３．３）を持つモデルをＦｃγＲＩＩＩｂモノマーの最終構造モデルとして選択し、対応する重（非水素）原子デカルト座標を表５に表す。この構造はプログラムＰＲＯＳＡＩＩ、ＰＲＯＦＩＬＥＳ−３Ｄ、およびＰＲＯＣＨＥＣＫ（Ｒ．Ｍ．Ｌａｓｋｏｗｓｋｉら，Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｃｒｙｓｔ．ｖｏｌ．２６，２８３−２９１（１９９３））で有効化された。
【０１７５】
ここでは、ＦｃγＲＩＩａの結晶学的座標につき記載したものと同様にして、表５における座標によって表されたＦｃγＲＩＩＩｂモノマーの三次元構造のモデルを薬物デザインのための基礎として用いることができる。
【０１７６】
本発明の種々の実施形態を詳細に記載してきたが、それらの実施形態の修飾および適合は当業者によりなされることは明白である。しかしながら、かかる修飾および適合は請求の範囲に記載した本発明の範囲内にあることははっきりと理解されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は精製プロセスの間のＰｓＦｃγＲＩＩａ蛋白質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析のスキャンイメージである。
【図２】
図２は精製したＰｓＦｃγＲＩＩａ蛋白質の二次元ＮＥＰＨＧＥ分析のスキャンイメージである。
【図３】
図３はヒト免疫グロブリンＧの異なるアイソタイプに結合する精製ＰｓＦｃγＲＩＩａ蛋白質のラングミュアプロットを示す。
【図４】
図４はＰＦｃγＲＩＩａのダイマーのグラフを示す。
【図５】
図５はＦｃγＲＩＩａドメイン１および２におけるベーターシートの位置を示し、ＦｃγＲＩＩの同形体のアミノ酸配列を比較する。
【図６】
図６は図４に示したＦｃγＲＩＩａ構造の立体図を示す。
【図７】
図７はＦｃγＲＩＩａのＩｇＧへの結合に関与するアミノ酸の位置を示す。
【図８】
図８は関係するアミノ酸の位置および側鎖を示すＩｇＧ結合領域の拡大図を示す。
【図９】
図９はアラニンに突然変異した場合にＦｃγＲＩＩａに対するＩｇＧ結合が改良するアミノ酸を示すＩｇＧ結合領域の拡大図を示す。
【図１０】
図１０はダイマーインターフェースに寄与する１つのＦｃγＲＩＩａモノマーの領域の拡大図を示す。
【図１１】
図１１はＦｃγＲＩＩａ蛋白質のアミノ酸配列とＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩＩｂおよびＦｃεＲＩ蛋白質のアミノ酸配列との比較を示す。
【図１２】
図１２はＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩＩｂおよびＦｃεＲＩ蛋白質によって共有される構造特徴の比較を示す。
【図１３】
図１３はＦｃγＲＩＩＩａおよびＦｃεＲＩのアミノ酸配列の配列アラインメントを示す。
【図１４】
図１４はＦｃεＲＩモノマーの構造のワーム表示を示すスキャンイメージである。
【図１５】
図１５はＦｃεＲＩダイマーの構造のワーム表示を示すスキャンイメージである。
【図１６】
図１６はＦｃεＲＩダイマーモデルの分子表面表示を示すスキャンイメージである。
【図１７】
図１７は薬物デザインのためのＦｃＲ構造における標的部位の模式図である。
【図１８】
図１８はＦｃγＲＩＩａおよびＦｃγＲＩＩＩｂのアミノ酸配列の配列アラインメントを示す。
【図１】
2004510681.tif 000231
【図２】
2004510681.tif 000232
【図３】
2004510681.tif 000233
【図４】
2004510681.tif 000234
【図５】
2004510681.tif 000235
【図６】
2004510681.tif 000236
【図７】
2004510681.tif 000237
【図８】
2004510681.tif 000238
【図９】
2004510681.tif 000239
【図１０】
2004510681.tif 000240
【図１１】
2004510681.tif 000241
【図１２】
2004510681.tif 000242
【図１３】
2004510681.tif 000243
【図１４】
2004510681.tif 000244
【図１５】
2004510681.tif 000245
【図１６】
2004510681.tif 000246
【図１７】
2004510681.tif 000247
【図１８】
2004510681.tif 000248
【国際公開パンフレット】
2004510681.tif 000249
2004510681.tif 000250
2004510681.tif 000251
2004510681.tif 000252
2004510681.tif 000253
2004510681.tif 000254
2004510681.tif 000255
2004510681.tif 000256
2004510681.tif 000257
2004510681.tif 000258
2004510681.tif 000259
2004510681.tif 000260
2004510681.tif 000261
2004510681.tif 000262
2004510681.tif 000263
2004510681.tif 000264
2004510681.tif 000265
2004510681.tif 000266
2004510681.tif 000267
2004510681.tif 000268
2004510681.tif 000269
2004510681.tif 000270
2004510681.tif 000271
2004510681.tif 000272
2004510681.tif 000273
2004510681.tif 000274
2004510681.tif 000275
2004510681.tif 000276
2004510681.tif 000277
2004510681.tif 000278
2004510681.tif 000279
2004510681.tif 000280
2004510681.tif 000281
2004510681.tif 000282
2004510681.tif 000283
2004510681.tif 000284
2004510681.tif 000285
2004510681.tif 000286
2004510681.tif 000287
2004510681.tif 000288
2004510681.tif 000289
2004510681.tif 000290
2004510681.tif 000291
2004510681.tif 000292
2004510681.tif 000293
2004510681.tif 000294
2004510681.tif 000295
2004510681.tif 000296
2004510681.tif 000297
2004510681.tif 000298
2004510681.tif 000299
2004510681.tif 000300
2004510681.tif 000301
2004510681.tif 000302
2004510681.tif 000303
2004510681.tif 000304
2004510681.tif 000305
2004510681.tif 000306
2004510681.tif 000307
2004510681.tif 000308
2004510681.tif 000309
2004510681.tif 000310
2004510681.tif 000311
2004510681.tif 000312
2004510681.tif 000313
2004510681.tif 000314
2004510681.tif 000315
2004510681.tif 000316
2004510681.tif 000317
2004510681.tif 000318
2004510681.tif 000319
2004510681.tif 000320
2004510681.tif 000321
2004510681.tif 000322
2004510681.tif 000323
2004510681.tif 000324
2004510681.tif 000325
2004510681.tif 000326
2004510681.tif 000327
2004510681.tif 000328
2004510681.tif 000329
2004510681.tif 000330
2004510681.tif 000331
2004510681.tif 000332
2004510681.tif 000333
2004510681.tif 000334
2004510681.tif 000335
2004510681.tif 000336
2004510681.tif 000337
2004510681.tif 000338
2004510681.tif 000339
2004510681.tif 000340
2004510681.tif 000341
2004510681.tif 000342
2004510681.tif 000343
2004510681.tif 000344
2004510681.tif 000345
2004510681.tif 000346
2004510681.tif 000347
2004510681.tif 000348
2004510681.tif 000349
2004510681.tif 000350
2004510681.tif 000351
2004510681.tif 000352
2004510681.tif 000353
2004510681.tif 000354
2004510681.tif 000355
2004510681.tif 000356
2004510681.tif 000357
2004510681.tif 000358
2004510681.tif 000359
2004510681.tif 000360
2004510681.tif 000361
2004510681.tif 000362
2004510681.tif 000363
2004510681.tif 000364
2004510681.tif 000365
2004510681.tif 000366
2004510681.tif 000367
2004510681.tif 000368
2004510681.tif 000369
2004510681.tif 000370
2004510681.tif 000371
2004510681.tif 000372
2004510681.tif 000373
2004510681.tif 000374
2004510681.tif 000375
2004510681.tif 000376
2004510681.tif 000377
2004510681.tif 000378
2004510681.tif 000379
2004510681.tif 000380
2004510681.tif 000381
2004510681.tif 000382
2004510681.tif 000383
2004510681.tif 000384
2004510681.tif 000385
2004510681.tif 000386
2004510681.tif 000387
2004510681.tif 000388
2004510681.tif 000389
2004510681.tif 000390
2004510681.tif 000391
2004510681.tif 000392
2004510681.tif 000393
2004510681.tif 000394
2004510681.tif 000395
2004510681.tif 000396
2004510681.tif 000397
2004510681.tif 000398
2004510681.tif 000399
2004510681.tif 000400
2004510681.tif 000401
2004510681.tif 000402
2004510681.tif 000403
2004510681.tif 000404
2004510681.tif 000405
2004510681.tif 000406
2004510681.tif 000407
2004510681.tif 000408
2004510681.tif 000409
2004510681.tif 000410
2004510681.tif 000411
2004510681.tif 000412
2004510681.tif 000413
2004510681.tif 000414
2004510681.tif 000415
2004510681.tif 000416
2004510681.tif 000417
2004510681.tif 000418
2004510681.tif 000419
2004510681.tif 000420
2004510681.tif 000421
2004510681.tif 000422
2004510681.tif 000423
2004510681.tif 000424
2004510681.tif 000425
2004510681.tif 000426
2004510681.tif 000427
2004510681.tif 000428
2004510681.tif 000429
2004510681.tif 000430
2004510681.tif 000431
2004510681.tif 000432
2004510681.tif 000433
2004510681.tif 000434
2004510681.tif 000435
2004510681.tif 000436
2004510681.tif 000437
2004510681.tif 000438
2004510681.tif 000439
2004510681.tif 000440
2004510681.tif 000441
2004510681.tif 000442
2004510681.tif 000443
2004510681.tif 000444
2004510681.tif 000445
2004510681.tif 000446
2004510681.tif 000447
2004510681.tif 000448
2004510681.tif 000449
2004510681.tif 000450
2004510681.tif 000451
2004510681.tif 000452
2004510681.tif 000453
2004510681.tif 000454
2004510681.tif 000455
2004510681.tif 000456
2004510681.tif 000457
2004510681.tif 000458
2004510681.tif 000459
2004510681.tif 000460
2004510681.tif 000461
2004510681.tif 000462
2004510681.tif 000463
2004510681.tif 000464
2004510681.tif 000465
2004510681.tif 000466
2004510681.tif 000467
2004510681.tif 000468
2004510681.tif 000469
2004510681.tif 000470
2004510681.tif 000471
2004510681.tif 000472
2004510681.tif 000473
2004510681.tif 000474
2004510681.tif 000475
2004510681.tif 000476
2004510681.tif 000477
2004510681.tif 000478
2004510681.tif 000479
2004510681.tif 000480
2004510681.tif 000481
2004510681.tif 000482
2004510681.tif 000483
2004510681.tif 000484
2004510681.tif 000485
2004510681.tif 000486
2004510681.tif 000487
2004510681.tif 000488
2004510681.tif 000489
2004510681.tif 000490
2004510681.tif 000491
2004510681.tif 000492
2004510681.tif 000493
2004510681.tif 000494
2004510681.tif 000495
2004510681.tif 000496
2004510681.tif 000497
2004510681.tif 000498
2004510681.tif 000499
2004510681.tif 000500
2004510681.tif 000501
2004510681.tif 000502
2004510681.tif 000503
2004510681.tif 000504
2004510681.tif 000505
2004510681.tif 000506
2004510681.tif 000507
2004510681.tif 000508
2004510681.tif 000509
2004510681.tif 000510
2004510681.tif 000511
2004510681.tif 000512
2004510681.tif 000513
2004510681.tif 000514
2004510681.tif 000515
2004510681.tif 000516
2004510681.tif 000517
2004510681.tif 000518
2004510681.tif 000519
2004510681.tif 000520
2004510681.tif 000521
2004510681.tif 000522
2004510681.tif 000523
2004510681.tif 000524
2004510681.tif 000525
2004510681.tif 000526
2004510681.tif 000527
2004510681.tif 000528
2004510681.tif 000529
2004510681.tif 000530
2004510681.tif 000531
2004510681.tif 000532
2004510681.tif 000533
2004510681.tif 000534
2004510681.tif 000535
2004510681.tif 000536
2004510681.tif 000537
2004510681.tif 000538
2004510681.tif 000539
2004510681.tif 000540
2004510681.tif 000541
2004510681.tif 000542
2004510681.tif 000543
2004510681.tif 000544
2004510681.tif 000545
2004510681.tif 000546
2004510681.tif 000547
2004510681.tif 000548
2004510681.tif 000549
2004510681.tif 000550
2004510681.tif 000551
2004510681.tif 000552
2004510681.tif 000553
2004510681.tif 000554
2004510681.tif 000555
2004510681.tif 000556
2004510681.tif 000557
2004510681.tif 000558
2004510681.tif 000559
2004510681.tif 000560
2004510681.tif 000561
2004510681.tif 000562
2004510681.tif 000563
2004510681.tif 000564
2004510681.tif 000565
2004510681.tif 000566
2004510681.tif 000567
2004510681.tif 000568
2004510681.tif 000569
2004510681.tif 000570
2004510681.tif 000571
2004510681.tif 000572
2004510681.tif 000573
【手続補正書】
【提出日】平成11年12月17日(1999.12.17)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｆｃレセプター（ＦｃＲ）蛋白質のモデルであって、前記モデルが表１の原子座標に実質的に一致する三次元構造を表すモデル。
【請求項２】
前記構造が表１によって表された原子座標およびＢ−値に実質的に一致する請求項１のモデル。
【請求項３】
前記構造がモノマーである請求項のモデル。
【請求項４】
前記構造がダイマーである請求項１のモデル。
【請求項５】
前記構造が表２、表３、表４および表５よりなる群から選択される表の原子座標に実質的に一致する請求項１のモデル。
【請求項６】
前記構造の少なくとも約５０％が前記構造の各ドメイン中の二次構造要素における主鎖原子について約１．５オングストローム未満の平均二乗平均平方根偏差（ＲＭＳＤ）を有する請求項１のモデル。
【請求項７】
前記構造と前記原子座標を含む構造との間に共通するアミノ酸側鎖の少なくとも約５０％が約１．５オングストローム未満の平均二乗平均平方根偏差（ＲＭＳＤ）を有する請求項１のモデル。
【請求項８】
前記ＦｃＲ蛋白質が、配列番号３、配列番号１０、配列番号１１および配列番号１２よりなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも約２５％で同一であるアミノ酸配列を含む請求項１記載のモデル。
【請求項９】
前記ＦｃＲ蛋白質が、配列番号３、配列番号１０、配列番号１１および配列番号１２よりなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも約４０％で同一であるアミノ酸配列を含む請求項１記載のモデル。
【請求項１０】
前記ＦｃＲ蛋白質が、配列番号３、配列番号１０、配列番号１１および配列番号１２よりなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも約６０％で同一であるアミノ酸配列を含む請求項１記載のモデル。
【請求項１１】
前記ＦｃＲ蛋白質が、配列番号３、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、前記アミノ酸配列のいずれかの突然変異体、および前記アミノ酸配列のいずれかの対立遺伝子変異体よりなる群から選択されるアミノ酸配列を含む請求項１記載のモデル。
【請求項１２】
前記ＦｃＲ蛋白質が、配列番号３、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３よりなる群から選択されるアミノ酸；配列番号３、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２または配列番号１３の突然変異体；および配列番号３、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２または配列番号１３の対立遺伝子変異体よりなる群から選択されるアミノ酸配列を含む請求項１記載のモデル。
【請求項１３】
前記ＦｃＲ蛋白質が、ＦｃγＲＩ蛋白質、ＦｃγＲＩＩａ蛋白質、ＦｃγＲＩＩｂ蛋白質、ＦｃγＲＩＩｃ蛋白質、ＦｃγＲＩＩＩ蛋白質、ＦｃεＲＩ蛋白質、ＦｃαＲＩ蛋白質および前記ＦｃＲ蛋白質のいずれかの構造相同体よりなる群から選択される請求項１記載のモデル。
【請求項１４】
前記ＦｃＲ蛋白質が、ＦｃγＲＩ蛋白質、ＦｃγＲＩＩａ蛋白質、ＦｃγＲＩＩｂ蛋白質、ＦｃγＲＩＩｃ蛋白質、ＦｃγＲＩＩＩ蛋白質、ＦｃεＲＩ蛋白質およびＦｃγＲＩ蛋白質よりなる群から選択される請求項１記載のモデル。
【請求項１５】
前記ＦｃＲ蛋白質がＦｃγＲＩＩａ蛋白質モノマー、ＦｃγＲＩＩａ蛋白質ダイマーおよび前記ＦｃγＲＩＩａ蛋白質の構造相同体よりなる群から選択される請求項１記載のモデル。
【請求項１６】
前記ＦｃＲ蛋白質がＦｃεＲＩ蛋白質ダイマー、ＦｃεＲＩ蛋白質モノマーおよび前記ＦｃεＲＩ蛋白質の構造相同体よりなる群から選択される請求項１記載モデル。
【請求項１７】
前記ＦｃＲ蛋白質がＦｃγＲＩ蛋白質ダイマー、ＦｃγＲＩ蛋白質モノマーおよび前記ＦｃγＲＩ蛋白質の構造類似体よりなる群から選択される請求項１記載のモデル。
【請求項１８】
前記ＦｃＲ蛋白質がＦｃγＲＩＩｂ蛋白質ダイマー、ＦｃγＲＩＩｂ蛋白質モノマーおよび前記ＦｃγＲＩＩｂ蛋白質の構造類似体よりなる群から選択される請求項１記載のモデル。
【請求項１９】
前記ＦｃＲ蛋白質がＦｃγＲＩＩｃ蛋白質ダイマー、ＦｃγＲＩＩｃ蛋白質モノマーおよび前記ＦｃγＲＩＩｃ蛋白質の構造類似体よりなる群から選択される請求項１記載のモデル。
【請求項２０】
前記ＦｃＲ蛋白質がＦｃγＲＩＩＩｂ蛋白質ダイマー、ＦｃγＲＩＩＩｂ蛋白質モノマーおよび前記ＦｃγＲＩＩＩｂ蛋白質の構造類似体よりなる群から選択される請求項１記載のモデル。
【請求項２１】
前記ＦｃＲ蛋白質がＦｃαＲＩ蛋白質ダイマー、ＦｃαＲＩ蛋白質モノマーおよび前記ＦｃαＲＩ蛋白質の構造類似体よりなる群から選択される請求項１記載のモデル。
【請求項２２】
前記原子座標が：
（ａ）結晶性形態のＦｃγＲＩＩａ蛋白質を提供することと；
（ｂ）前記結晶性ＦｃγＲＩＩａ蛋白質の電子密度マップを生成させることと；および、
（ｃ）前記電子密度マップを分析して前記原子座標を生じることとを具備する方法によって得られる請求項１記載のモデル。
【請求項２３】
前記結晶性ＦｃγＲＩＩａ蛋白質が、ＦｃγＲＩＩａ蛋白質と酢酸塩緩衝液および硫酸塩緩衝液よりなる群から選択される母液緩衝液と合わせ、および結晶形成を誘導して前記結晶性ＦｃγＲＩＩａ蛋白質を生じさせる方法によって生成される請求項２２記載のモデル。
【請求項２４】
前記酢酸塩緩衝液が約２００ｍＭの酢酸アンモニウム、約１００ｍＭのクエン酸ナトリウムおよび約３０％のＰＥＧ４０００を含み、前記緩衝液が約５．６のｐＨを有する請求項２３記載のモデル。
【請求項２５】
前記硫酸塩緩衝液が約０．１ＭのＨＥＰＥＳおよび約１．５Ｍの硫酸リチウムを含み、前記緩衝液が約７．５のｐＨを有する請求項２３記載のモデル。
【請求項２６】
電子密度マップを生じさせる前記工程がＸ線回折によって前記結晶性ＦｃγＲＩＩａ蛋白質を分析することを具備する請求項２２記載のモデル。
【請求項２７】
前記結晶性ＦｃγＲＩＩａ蛋白質が前記Ｘ線回折に先立ってジ−γ−ヨードビス｛エチレンジアミン｝ジ白金（ＩＩ）硝酸塩において誘導体化される請求項２２記載のモデル。
【請求項２８】
前記結晶性ＦｃγＲＩＩａ蛋白質が前記Ｘ線回折に先立って約５ｍＭのジ−γ−ヨードビス［エチレンジアミン］ジ白金（ＩＩ）硝酸塩において誘導体化される請求項２２記載のモデル。
【請求項２９】
前記モデルが前記三次元構造の三次元座標の組で符号化されたコンピュータリーダブル媒体によって生成されたコンピュータイメージである［ここで、グラフィックディスプレイソフトウェアプログラムを用い、前記三次元座標が、三次元イメージとして前記電子ファイルを表すことができるコンピュータ上で可視化できる電子ファイルを作成する］請求項１記載のモデル。
【請求項３０】
ａ．Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）蛋白質のモデルを提供することと［ここで、前記モデルは表１の原子座標に対して実質的に一致する三次元構造を表す］；
ｂ．前記モデルを用いて化合物を設計することと；および、
ｃ．前記化合物を化学的に合成することと
具備するコンピュータに援助された生物活性化合物の構造ベースの薬物デザイン方法。
【請求項３１】
前記方法が、さらに：
ｄ．前記合成された化合物の生物活性を評価することを具備する請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記三次元構造が表１にリストされた原子座標を含む請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
前記三次元構造がダイマーである請求項３０に記載の方法。
【請求項３４】
前記三次元構造が表２、表３、表４および表５よりなる群から選択される表にリストされた原子座標を含む請求項３０記載の方法。
【請求項３５】
表１にリストされた該原子座が、前記イメージの電子ファイルを生じさせためにグラフィックディスプレイソフトウェアプログラムを使用し、および三次元イメージとしての前記電子ファイルを表すことができるコンピュータにおいて前記電子ファイルを可視化するコンピュータにおいて分析されるときに生じるコンピュータイメージを、前記モデルが具備する請求項３０記載の方法。
【請求項３６】
設計の前記工程が、化合物の１以上のデーターベースをコンピュータスクリーニングすることを含み、ここにおいて、前記化合物の三次元構造が既知である請求項３０記載の方法。
【請求項３７】
さらに、前記スクリーニング工程によって同定された化合物をコンピュータによる前記モデルと相互作用させることを具備する請求項３６記載の方法。
【請求項３８】
前記設計の工程が指向性薬物デザインを具備する請求項３０記載の方法。
【請求項３９】
前記設計の工程がランダム薬物デザインを具備する請求項３０記載の方法。
【請求項４０】
前記設計の工程がグリッドベースの薬物デザインを具備する請求項３０記載の方法。
【請求項４１】
前記設計の工程が、前記ＦｃＲ蛋白質の前記三次元構造を模倣することを予測される化合物を選択することを具備する請求項３０記載の方法。
【請求項４２】
前記設計の工程が、前記ＦｃＲ蛋白質の前記三次元構造に結合することが予測される化合物を選択することを具備する請求項３０記載の方法。
【請求項４３】
前記生物活性が、前記ＦｃＲ蛋白質の免疫グロブリン蛋白質への結合を阻害すること、前記ＦｃＲ蛋白質に対して結合すること、前記ＦｃＲ蛋白質に結合することができる免疫グロブリンに対して結合すること、前記免疫グロブリン蛋白質のファゴサイトーシスを阻害すること、前記ＦｃＲ蛋白質の二量体化を阻害すること、前記ＦｃＲ蛋白質を介した細胞シグナル変換を刺激すること、および前記ＦｃＲ蛋白質を介したサイトカインの放出を刺激することとよりなる群から選択される請求項３０記載の方法。
【請求項４４】
前記ＦｃＲ蛋白質がＦｃγＲＩＩａであり、並びに前記生物活性が、ＦｃγＲＩＩａ蛋白質のＩｇＧへの結合を阻害すること、ＩｇＧのファゴサイトーシスを阻害すること、ＦｃγＲＩＩａ蛋白質の二量体化を阻害すること、ＦｃγＲＩＩａ蛋白質を介した細胞シグナル変換を刺激すること、ＩＬ−６およびＩＬ−１２よりなる群から選択されるサイトカインの放出を刺激することからなる群から選択される請求項３０記載の方法。
【請求項４５】
前記ＦｃＲ蛋白質がＦｃγＲＩＩＩｂであり、並びに前記生物活性が、ＦｃγＲＩＩＩｂ蛋白質のＩｇＧへの結合を阻害することと、ＩｇＧのファゴサイトーシスを阻害することと、ＦｃγＲＩＩＩｂ蛋白質の二量体化を阻害することと、ＦｃγＲＩＩＩｂ蛋白質を介した細胞シグナル変換を刺激することと、ＩＬ−６およびＩＬ−１２よりなる群から選択されるサイトカインの放出を刺激することとよりなる群から選択される請求項３０記載の方法。
【請求項４６】
前記ＦｃＲ蛋白質がＦｃεＲＩであり、更に前記生物活性がＦｃεＲＩ蛋白質のＩｇＥへの結合を阻害することと、ＩｇＥのファゴサイトーシスを阻害することと、ＦｃεＲＩ蛋白質の二量体化を阻害することと、ＦｃεＲＩ蛋白質を介した細胞シグナル変換を刺激することと、肥満細胞によるヒスタミンおよびセロトニンの放出を刺激することと、並びに肥満細胞によるヒスタミンおよびセロトニンの放出を阻害することとよりなる群から選択される請求項３０記載の方法。
【請求項４７】
Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）蛋白質のモデルを提供することと［ここで、前記モデルは、表１によって表される原子座標；表２によって表される原子座標；表３によって表される原子座標；表４によって表される原子座標；および表５によって表される原子座標よりなる群から選択される原子座標に対して実質的に一致する三次元構造を表す］；
ｂ．前記モデルを用いて化合物を設計することと；および、
ｃ．前記化合物を化学的に合成することと
を具備するコンピュータに援助された生物活性化合物の構造ベースの薬物デザイン方法。
【請求項４８】
ａ．ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩＩｂおよびＦｃεＲＩよりなる群から選択されるＦｃ受容体（ＦｃＲ）蛋白質の三次元構造のモデルを提供することと；
ｂ．前記モデルを用いて化合物を設計することと；および、
ｃ．前記化合物を化学的に合成することと
を具備するコンピュータに援助された生物活性化合物の構造ベースの薬物デザインの方法。
【請求項４９】
ＦｃＲ蛋白質の三次元構造の三次元コンピュータイメージ。
【請求項５０】
前記構造が、表１にリストされた三次元座標；表２にリストされた三次元座標；表３にリストされた三次元座標；表４にリストされた三次元座標；および表５にリストされた三次元座標よりなる群から選択される三次元座標に実質的に一致する請求項４９記載のイメージ。
【請求項５１】
前記イメージの電子ファイルを作成するためにグラフィックディスプレイソフトウェアプログラムを用い、且つ三次元イメージとして電子ファイルを表すことができるコンピュータ上で前記電子ファイルを可視化するコンピュータ上で前記三次元座標を含む三次元座標の組を分析するときに、前記コンピュータイメージが生じる請求項４９記載のイメージ。
【請求項５２】
前記三次元コンピュータイメージが図４、図６、図７、図８、図９、図１０、図１４、図１５および図１６よりなる群から選択される二次元イメージによって表される請求項４９記載のイメージ。
【請求項５３】
前記三次元コンピュータイメージを用いて治療化合物を設計する請求項４９記載のイメージ。
【請求項５４】
表１の原子座標に実質的に一致する三次元構造を有するＦｃＲ蛋白質の三次元座標の組で符号化されたコンピュータリーダブル媒体であって、グラフィックディスプレイソフトウェアプログラムを用いて、前記三次元座標が三次元イメージとして前記電子ファイルを表すことができるコンピュータ上で可視化することができる電子ファイルを作成するコンピュータリーダブル媒体。
【請求項５５】
表１に表された三次元座標、表２に表された三次元座標、表３に表された三次元座標、表４に表された三次元座標および表５に表された三次元座標よりなる群から選択される三次元座標の組で符号化されたコンピュータリーダブル媒体であって、グラフィックディスプレイソフトウェアプログラムを用いて、前記三次元座標が三次元イメージとして前記電子ファイルを表すことができるコンピュータ上で可視化することができる電子ファイルを作成するコンピュータリーダブル媒体。
【請求項５６】
ＦｃγＲＩ蛋白質、ＦｃγＲＩＩｂ蛋白質、ＦｃγＲＩＩｃ蛋白質、ＦｃγＲＩＩＩｂ蛋白質、ＦｃεＲＩ蛋白質およびＦｃαＲＩ蛋白質よりなる群から選択されるＦｃＲ蛋白質の三次元構造のモデルであって、
前記モデルが、
（ａ）ＦｃγＲＩＩａ蛋白質のアミノ酸配列および前記ＦｃＲ蛋白質のアミノ酸配列を提供することと；
（ｂ）前記ＦｃγＲＩＩａアミノ酸配列と前記ＦｃＲ蛋白質アミノ酸配列との間で共有された構造的に保存された領域を同定することと；および、
（ｃ）表１に表された原子座標に実質的に一致する前記ＦｃγＲＩＩａ蛋白質の三次元構造を用いて、前記ＦｃＲ蛋白質の前記構造的に保存された領域を三次元構造に割り当てることによって、前記ＦｃＲ蛋白質について原子座標を決定して、前記ＦｃＲ蛋白質アミノ酸配列の前記三次元構造のモデルを誘導することと
を具備する方法によって産生された三次元構造のモデル。
【請求項５７】
請求項５６に記載のモデルであって、前記ＦｃγＲＩ蛋白質アミノ配列が配列番号７を含み；前記ＦｃγＲＩＩｂ蛋白質アミノ酸配列が配列番号５を含み；前記ＦｃγＲＩＩｃ蛋白質アミノ酸配列が配列番号６を含み；前記ＦｃγＲＩＩＩｂ蛋白質アミノ酸配列が配列番号８を含み；前記ＦｃεＲＩ蛋白質アミノ酸配列が配列番号９を含み；および、前記ＦｃαＲＩ蛋白質アミノ酸配列が配列番号１３を含むモデル。
【請求項５８】
動物に投与すると、ＩｇＧ介在の組織障害を減少する治療用組成物であって、前記治療用組成物はＦｃγ受容体（ＦｃγＲ）蛋白質の活性を阻害する阻害性化合物を含み、前記阻害性化合物は：
（ａ）ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ、ＦｃγＲＩＩｃおよびＦｃγＲＩＩＩｂよりなる群から選択されるＦｃγＲ蛋白質の三次元構造を提供することと［ここで、前記ＦｃγＲ蛋白質の前記三次元構造は表１によって表された原子座標に実質的に一致する］；
（ｂ）前記ＦｃγＲ蛋白質の前記三次元構造を用いて、ＦｃγＲ蛋白質のＩｇＧへの結合を阻害する化合物、ＦｃγＲ蛋白質の三次元構造を実質的に模倣する化合物およびＦｃγＲ蛋白質を介した細胞信号変換を刺激する分子とのＦｃγＲ蛋白質の結合を阻害する化合物よりなる群から選択される化合物を設計することと；
（ｃ）前記化合物を化学的に合成することと；および
（ｄ）ＩｇＧ介在の組織障害を減少させる前記合成された化合物の能力を評価することと
を具備する方法によって同定される前記治療用組成物。
【請求項５９】
前記ＩｇＧ介在の組織障害がＩｇＧ介在の過敏症、炎症細胞のＩｇＧ介在の漸増および炎症モジュレーターのＩｇＧ介在の放出よりなる群から選択される生物学的応答に由来する請求項５８記載の組成物。
【請求項６０】
前記構造が表１に表される原子座標に実質的に一致する請求項５８記載の組成物。
【請求項６１】
前記化合物が無機化合物および有機化合物よりなる群から選択される請求項５８記載の組成物。
【請求項６２】
前記化合物がオリゴヌクレオチド、ペプチド、ペプチドミメティック化合物および小有機分子よりなる群から選択される請求項５８記載の組成物。
【請求項６３】
前記化合物が前記ＦｃγＲ蛋白質のアナログ、前記ＦｃγＲ蛋白質の基質アナログおよび前記ＦｃγＲ蛋白質のペプチドミメティック化合物よりなる群から選択される請求項５８記載の組成物。
【請求項６４】
前記組成物がさらに賦形剤、アジュバントおよび担体よりなる群から選択される成分を含む請求項５８記載の組成物。
【請求項６５】
動物に投与すると、ＩｇＧ介在の応答を増強する治療用組成物であって、前記治療用組成物は、Ｆｃγ受容体（ＦｃγＲ）蛋白質の活性を刺激する刺激性化合物を含み、前記刺激性化合物は：
（ａ）ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ、ＦｃγＲＩＩｃおよびＦｃγＲＩＩＩｄよりなる群から選択されるＦｃγＲ蛋白質の三次元構造を提供することと［ここで、前記ＦｃγＲ蛋白質の前記三次元構造は表１によって表される原子座標に実質的に一致する］；
（ｂ）前記ＦｃγＲ蛋白質の前記三次元構造を用いて、ＦｃγＲ蛋白質のＩｇＧへの結合を刺激する化合物、ＦｃγＲ蛋白質の三次元構造を実質的に模倣する化合物、およびＦｃγＲ蛋白質を介した細胞シグナル変換を刺激する分子とＦｃγＲ蛋白質との結合を刺激する化合物よりなる群から選択される化合物を設計することと；
（ｃ）前記化合物を化学的に合成することと；および
（ｄ）ＩｇＧ介在の応答を増強する前記合成された化合物の能力を評価することと
を具備する方法によって同定される治療用組成物。
【請求項６６】
動物に投与すると、ＩｇＥ介在の応答を減少させる治療用組成物であって、前記治療用組成物は、Ｆｃε受容体Ｉ（ＦｃεＲＩ）蛋白質の活性を阻害する阻害性化合物を含み、前記阻害性化合物は：
（ａ）ＦｃεＲＩ蛋白質の三次元構造を提供することと［ここで、前記ＦｃεＲＩ蛋白質の前記三次元構造は、表１によって表される原子座標、表２によって表される原子座標、表３によって表される原子座標、表４によって表される原子座標および表５によって表される原子座標よりなる群から選択される原子座標に実質的に一致する］；
（ｂ）前記ＦｃεＲＩ蛋白質の前記三次元構造を用いて、ＦｃεＲＩ蛋白質のＩｇＥへの結合を阻害する化合物、ＦｃεＲＩ蛋白質の三次元構造を実質的に模倣する化合物、およびＦｃεＲＩ蛋白質を介した細胞シグナル変換を刺激する分子とＦｃεＲＩ蛋白質との結合を阻害する化合物よりなる群から選択される化合物を設計することと；
（ｃ）前記化合物を化学的に合成することと；および
（ｄ）ＩｇＥ介在の応答を減少する前記合成された化合物の能力を評価すること
を具備する方法によって同定される治療用組成物。
【請求項６７】
前記ＩｇＥ介在の応答がＩｇＥ介在の過敏症、炎症細胞のＩｇＥ介在の漸増および炎症モジュレーターのＩｇＥ介在の放出からなる群から選択される生物学的応答に由来する請求項６６記載の組成物。
【請求項６８】
前記構造が表３に表される原子座標を含む請求項６６記載の組成物。
【請求項６９】
前記構造が表４に表される原子座標を含む請求項６６記載の組成物。
【請求項７０】
前記化合物が無機化合物および有機化合物よりなる群から選択される請求項６６記載の組成物。
【請求項７１】
前記化合物がオリゴヌクレオチド、ペプチド、ペプチドミメティック化合物および小有機分子よりなる群から選択される請求項６６記載の組成物。
【請求項７２】
前記化合物が前記ＦｃεＲ蛋白質のアナログ、前記ＦｃεＲＩ蛋白質の基質アナログおよび前記ＦｃεＲＩ蛋白質のペプチドミメティック化合物よりなる群から選択される請求項６６記載の組成物。
【請求項７３】
前記組成物がさらに賦形剤、アジュバントおよび担体よりなる群から選択される成分を含む請求項６６記載の組成物。
【請求項７４】
動物に投与すると、ＩｇＥ介在の応答を増強する治療用組成物であって、前記治療用組成物が、Ｆｃε受容体Ｉ（ＦｃεＲＩ）蛋白質の活性を刺激する刺激性化合物を含み、前記刺激性化合物は：
（ａ）ＦｃεＲＩ蛋白質の三次元構造を提供することと［ここで、前記ＦｃεＲＩ蛋白質の前記三次元構造は、表１によって表される原子座標、表２によって表される原子座標、表３によって表される原子座標、表４によって表される原子座標および表５によって表される原子座標よりなる群から選択される原子座標に実質的に一致する］；
（ｂ）前記ＦｃεＲＩ蛋白質の前記三次元構造を用いて、ＦｃεＲＩ蛋白質のＩｇＥへの結合を刺激する化合物、ＦｃεＲＩ蛋白質の三次元構造を実質的に模倣する化合物およびＦｃεＲ蛋白質を介した細胞シグナル変換を刺激する分子とＦｃεＲＩ蛋白質との結合を刺激する化合物よりなる群から選択される化合物を設計することと；
（ｃ）前記化合物を化学的に合成することと；および
（ｄ）ＩｇＥ介在の応答を増強する前記合成された化合物の能力を評価することと
を具備する方法によって同定される治療用組成物。
【請求項７５】
ＦｃＲ蛋白質の三次元構造を決定するための方法であって、前記方法が、
（ａ）ＦｃγＲＩ蛋白質、ＦｃγＲＩＩｂ蛋白質、ＦｃγＲＩＩｃ蛋白質、ＦｃγＲＩＩＩｂ蛋白質、ＦｃεＲＩ蛋白質およびＦｃαＲＩ蛋白質よりなる群から選択されるＦｃＲ蛋白質のアミノ酸配列を提供することと［ここで、前記ＦｃＲ蛋白質の三次元構造は公知ではない］；
（ｂ）折り畳み認識によって三次元立体配座における前記アミノ酸配列の折り畳みのパターンを分析することと；および
（ｃ）前記ＦｃＲ蛋白質アミノ酸配列の折り畳みの前記パターンを、ＦｃγＲＩＩａ蛋白質の三次元構造と比較し、前記ＦｃＲ蛋白質の三次元構造を決定することと［ここで、前記ＦｃγＲＩＩａ蛋白質の前記三次元構造は表１に表した原子座標に実質的に一致する］、
を具備する方法。
【請求項７６】
ＦｃＲ蛋白質の三次元構造を誘導するための方法であって、前記方法が、
（ａ）ＦｃγＲＩＩａ蛋白質のアミノ酸配列およびＦｃＲ蛋白質のアミノ配列を提供する工程と；
（ｂ）前記ＦｃγＲＩＩａアミノ酸配列と前記ＦｃＲ蛋白質のアミノ配列との間で共有された構造的に保存された領域を同定する工程と；
（ｃ）表１に表された原子座標に実質的に一致する原子座標に基づいてＦｃγＲＩＩａ蛋白質の三次元構造を用いて、前記ＦｃＲ蛋白質の前記構造的に保存された領域を三次元構造に対して割り当てることによって、前記標的構造について原子座標を決定し、前記ＦｃＲ蛋白質アミノ酸配列の三次元構造のモデルを誘導する工程と
を具備する方法。
【請求項７７】
さらに、回転異性体のライブラリーを用いて立体的に許容される位置を決定することによって前記ＦｃＲ蛋白質の側鎖につき原子座標を割り当てることを含む請求項７６記載の方法。
【請求項７８】
結晶化されたＦｃＲ蛋白質の三次元構造を誘導する方法であって、前記方法が、
（ａ）結晶化されたＦｃＲ蛋白質のパターソン関数と結晶性ＦｃγＲＩＩａ蛋白質のパターソン機能と比較して前記結晶化されたＦｃＲ蛋白質の電子密度マップを作成する工程と；および、
（ｂ）前記電子密度マップを分析して前記結晶化されたＦｃＲ蛋白質の前記三次元構造を生じさせる工程と
を具備する方法。
【請求項７９】
さらに、前記結晶化されたＦｃＲ蛋白質の前記三次元構造を電子的に刺激して前記結晶化されたＦｃＲ蛋白質の前記三次元構造のコンピュータイメージを誘導する工程を具備する請求項７８記載の方法。
【請求項８０】
さらに、前記結晶性ＦｃγＲＩＩａ蛋白質のパターソン関数上に前記結晶化されたＦｃＲ蛋白質の前記パターソン関数を回転させて、前記結晶化されたＦｃＲ蛋白質の結晶において前記結晶化されたＦｃＲ蛋白質の正しい配位を決定し、前記結晶化されたＦｃＲ蛋白質の初期相を同定する工程を具備する請求項７８記載の方法。
【請求項８１】
結晶性形態のＦｃγＲＩＩａ蛋白質を含む組成物。
【請求項８２】
分子または分子構造の三次元モデルを作成するコンピュータであって、前記分子または分子構造が表１、表２、表３、表４および表５よりなる群から選択された表に従うＦｃＲ蛋白質の原子座標により限定される三次元構造、または、前記分子若しくは分子構造の相同体の三次元構造を含み、ここで、前記相同体は、前記ＦｃＲ蛋白質の各ドメイン中の二次構造要素における主鎖原子について約１．５オングストローム未満の平均二乗平均平方根偏差（ＲＭＳＤ）を有し、前記コンピュータが；
（ａ）電子ファイルを作成するために、表１、表２、表３、表４および表５よりなる群から選択された表に従い、ＦｃＲタンパクの前記原子座標をコードするコンピュータリーダブル媒体と；
（ｂ）前記電子ファイルを加工するためのグラフィックディスプレイソフトウェアプログラムを記憶するためのワーキングメモリーと；
（ｃ）前記ワーキングメモリーおよび前記コンピュータリーダブル媒体に対して連結され、前記電子ファイルを前記三次元モデルとして表すことが可能なプロセッサーと；および
（ｄ）前記プロセッサーに連結された前記三次元モデルを可視化するためのディスプレイと
を具備するコンピュータ。
【請求項８３】
前記分子または分子構造がダイマーである請求項８２に記載のコンピュータ。
【請求項８４】
前記同相体の前記三次元構造の少なくとも約５０％が、前記ＦｃＲ蛋白質の各ドメイン中の二次構造要素における主鎖原子について約１．５オングストローム未満の平均二乗平均平方根偏差（ＲＭＳＤ）を有する請求項８２に記載のコンピュータ。
【請求項８５】
前記同相体の前記三次構造とＦｃＲ蛋白質の前記原子座標により限定さる前記三次構造との間に共通するアミノ酸側鎖の少なくとも約５０％が約１．５オングストローム未満の平均二乗平均平方根偏差（ＲＭＳＤ）を有する請求項８２に記載のコンピュータ。
【請求項８６】
前記ＦｃＲ蛋白質が、配列番号３、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３よりなる群から選択されるアミノ酸配置よりなる群から選択されるアミノ酸配置を含む請求項８２に記載のコンピュータ。
【請求項８７】
前記ＦｃＲ蛋白質が、ＦｃγＲＩ蛋白質、ＦｃγＲＩＩａ蛋白質、ＦｃγＲＩＩｂ蛋白質、ＦｃγＲＩＩｃ蛋白質、ＦｃγＲＩＩＩ蛋白質、ＦｃεＲＩ蛋白質、ＦｃαＲＩ蛋白質よりなる群から選択される請求項８２に記載のコンピュータ。
【国際調査報告】
2004510681.tif 000574
2004510681.tif 000575