(57)【要約】複合脊椎奇形（ＣＶＭ）病遺伝子の牛キャリアーを同定するための遺伝子マーカーを記載する。この遺伝子マーカーは、マイクロサテライトマーカーＢＭ４１２９、ＩＮＲＡＡ００３、ＢＭＳ２７９０、ＩＬＳＴＳ０２９、ＩＮＲＡ１２３、ＢＭ２２０、ＨＵＪ２４６、ＢＭＳ８６２、ＢＭＳ９３７、ＢＬ１０４８、ＢＭＳ２０９５、ＢＭＳ１２６６を含み、牛ＳＬＣ３５Ａ３遺伝子が牛染色体ＢＴＡ３上に位置する。牛ＳＬＣ３５Ａ３遺伝子の部位５５９でのＧ／Ｔ多形性を、牛におけるＣＶＭの原因性および診断性であると同定する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象牛における牛複合脊椎奇形（ＣＶＭ）を検出する方法であって、牛複合脊椎奇形（ＣＶＭ）に関連する遺伝子マーカーの存在を同定するものであり、下記：
ａ）牛遺伝子材料を準備すること、
ｂ）該遺伝子材料において、牛複合脊椎奇形病特性に連鎖する少なくとも１つの遺伝子マーカーの存在または不存在を検出すること、
を含む方法。
【請求項２】
少なくとも１つの遺伝子マーカーが、牛染色体ＢＴＡ３上に位置する、請求項１の方法。
【請求項３】
少なくとも１つの遺伝子マーカーが、多形性マイクロサテライトマーカーＢＭ４１２９とＢＭＳ１２６６に挟まれ、これらを含む領域中に位置する、請求項２の方法。
【請求項４】
少なくとも１つの遺伝子マーカーが、約５９.５ｃＭから約６７.９ｃＭの領域中に位置する、請求項３の方法。
【請求項５】
少なくとも１つの遺伝子マーカーが、多形性マイクロサテライトマーカーＩＮＲＡＡ００３とＢＭＳ９３７に挟まれ、これらを含む領域中に位置する、請求項４の方法。
【請求項６】
少なくとも１つの遺伝子マーカーが、多形性マイクロサテライトマーカーＩＮＲＡＡ００３とＩＬＳＴＳ０２９に挟まれ、これらを含む領域中に位置する、請求項５の方法。
【請求項７】
少なくとも１つの遺伝子マーカーが、マイクロサテライトマーカーＩＮＲＡＡ００３である、請求項２の方法。
【請求項８】
少なくとも１つの遺伝子マーカーが、マイクロサテライトマーカーＢＭＳ２７９０である、請求項２の方法。
【請求項９】
少なくとも１つの遺伝子マーカーが、マイクロサテライトマーカーＩＬＳＴＳ０２９である、請求項２の方法。
【請求項１０】
少なくとも１つの遺伝子マーカーが、マイクロサテライトマーカーＩＮＲＡ１２３である、請求項２の方法。
【請求項１１】
少なくとも１つの遺伝子マーカーが、マイクロサテライトマーカーＢＭ２２０である、請求項２の方法。
【請求項１２】
少なくとも１つの遺伝子マーカーが、マイクロサテライトマーカーＨＵＪ２４６である、請求項２の方法。
【請求項１３】
少なくとも１つの遺伝子マーカーが、マイクロサテライトマーカーＢＭＳ８６２である、請求項２の方法。
【請求項１４】
少なくとも１つの遺伝子マーカーが、マイクロサテライトマーカーＢＭＳ９３７である、請求項２の方法。
【請求項１５】
少なくとも１つの遺伝子マーカーが、牛複合脊椎奇形病を起こす遺伝子に連鎖している、請求項１の方法。
【請求項１６】
牛複合脊椎奇形病を起こす遺伝子が、牛ＳＬＣ３５Ａ３遺伝子である、請求項１５の方法。
【請求項１７】
牛ＳＬＣ３５Ａ３遺伝子が、配列番号１７に示されるアミノ酸配列を含む牛ＳＬＣ３５Ａ３タンパク質をコードする、請求項１６の方法。
【請求項１８】
牛ＳＬＣ３５Ａ３タンパク質が、配列番号１８のヌクレオチド配列を含むｃＤＮＡ配列によりコードされる、請求項１７の方法
【請求項１９】
遺伝子マーカーが、配列番号１８のヌクレオチド配列に等価の部位での単一ヌクレオチド多形性である、請求項１８の方法。
【請求項２０】
単一ヌクレオチド多形性が、Ｇ／Ｔ多形性である、請求項１９の方法。
【請求項２１】
Ｇ／Ｔ多形性の検出が、対立遺伝子特異的ＰＣＲ、ミニシークエンス、プライマー伸長法、ピロシークエンス、ＰＣＲ−ＲＦＬＦ、遺伝子特異的ローリングサイクル増幅法、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析に続くプライマー伸長法よりなる群から選ばれる技法により行われる、請求項２０の方法。
【請求項２２】
少なくとも１つの遺伝子マーカーが、牛複合脊椎奇形病を起こす遺伝子または疾患特性に、少なくとも５.０、少なくとも６.０、少なくとも７.０、少なくとも８.０、少なくとも９.０、少なくとも１０.０、少なくとも１１.０、少なくとも１２.０を含む少なくとも４.０などの少なくとも３.０のロッドスコアーで遺伝的に連鎖している、請求項２の方法。
【請求項２３】
少なくとも１つのマーカーが、遺伝子マーカーの組合せである、請求項１の方法。
【請求項２４】
マイクロサテライトマーカーＩＮＲＡＡ００３を増幅するためのプライマー対が、配列番号１および配列番号２である、請求項７の方法。
【請求項２５】
マイクロサテライトマーカーＢＭＳ２７９０を増幅するためのプライマー対が、配列番号３および配列番号４である、請求項８の方法。
【請求項２６】
マイクロサテライトマーカーＩＬＳＴＳ０２９を増幅するためのプライマー対が、配列番号５および配列番号６である、請求項９の方法。
【請求項２７】
マイクロサテライトマーカーＩＮＲＡ１２３を増幅するためのプライマー対が、配列番号７および配列番号８である、請求項１０の方法。
【請求項２８】
マイクロサテライトマーカーＢＭ２２０を増幅するためのプライマー対が、配列番号９および配列番号１０である、請求項１１の方法。
【請求項２９】
マイクロサテライトマーカーＨＵＪ２４６を増幅するためのプライマー対が、配列番号１１および配列番号１２である、請求項１２の方法。
【請求項３０】
マイクロサテライトマーカーＢＭＳ８６２を増幅するためのプライマー対が、配列番号１３および配列番号１４である、請求項１３の方法。
【請求項３１】
マイクロサテライトマーカーＢＭＳ９３７を増幅するためのプライマー対が、配列番号１５および配列番号１６である、請求項１４の方法。
【請求項３２】
牛複合脊椎奇形（ＣＶＭ）に関連する少なくとも１つの遺伝子マーカーの対象牛における存在を検出するために使用する診断キットであって、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８およびこれらの組合せよりなる群から選ばれる少なくとも１つのオリゴヌクレオチド配列を含むキット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は一般的に、牛に見られる遺伝性疾患、複合脊椎奇形（ＣＶＭ）に関する。具体的に、本発明は、ＣＶＭを有する可能性のある牛キャリアーの同定、および牛における複合脊椎奇形の原因となる遺伝子座およびその変異の同定のための分子マーカーに関する。
【０００２】
（発明の背景）
複合脊椎奇形（ＣＶＭ）は、ホルステイン−フリエシアン（ＨＦ）黒色および白色酪農牛に検出された先天性の脊椎異常である。この疾患は最近に報告された（Agerholm et al., 2000）。デンマークにおいて、今日（２０００年１０月１７日）までに診断されたすべての事例がかってのエリートＵＳホルステイン雄牛（Carlin-M Ivanhoe Bell）に遺伝子学的に関連している。現在のデータによると、ＣＶＭは、常染色体の劣性遺伝疾患として受け継がれるようである。
【０００３】
この疾患の特徴は、体重減少に関連する遠位関節の先天性両側性関節拘縮、および主に頚−胸接合部での柱の奇形である（Agerholm et al., 1994)。
【０００４】
外見上、主要な所見は下記のとおりである。多くの事例で頚部および／または胸部の柱が短いようである。手首関節の中程度の両側性収縮、および指骨−中骨関節（けずめげ）の重い収縮および回外運動が常に見られる。指骨−中骨関節の収縮および回内運動、および足根のわずかな伸長も共通の所見である。多くの場合、頚−胸接合部周辺の柱に異常がある。柱の他の領域に側弯が見られることがあり、病変が存在することがある。頚柱の検査および触診でしばしば異常が見られる。しかし、病変の程度は小さく、２または少数の頚骨に限られやすい。このような場合、柱はほとんど正常な長さである。従って、疑いのある事例で脊椎奇形を除外するのに、柱のＸ線検査が薦められる。脊髄は正常な大きさで明らかな収縮なしに椎管内にある。Ｘ線検査によって、脊椎の一部欠損、融合および奇形の脊椎、側弯、アンキローシス（anchylosis)からなる複合脊椎奇形が種々の程度で認められる。これは湾曲脊椎の除去後に最もよく現れる。いくつかの事例で心臓の奇形があり、高度の心室中隔欠損および右心室の異常な肥大である。大きい脈管の奇形も起こり得る。肺に胎児性拡張不全が存在する。出血液が胸郭にたいてい存在する。種々の他の奇形が認められているが、一定しておらず、また共通の所見でもない。筋緊張異常による病変がしばしば見られる。
【０００５】
流産胎児、早産子牛、満期での死産子牛のいずれでも奇形が認められる。大きい子牛での事例は報告されていない。一般に、体重が減少し、体重は満期出生子牛よりも早産子牛の方が低い。
さらに、キャリアー雄牛の精子で種つけされた雌牛で流産の頻度が高いようである。その原因は現在のところ不明である。
【０００６】
現在、ＣＶＭ診断に用い得る唯一の手段は、上記したような、体重減少に関連する遠位関節の両側性関節拘縮、および主に頚−胸接合部での柱の奇形に基づく病理解剖学的診断である。しかし、手足の両側収縮が子牛の脊椎奇形での共通で一般的な所見である。従って、種々の診断上の問題が存在し、ＣＶＭと他の奇形を識別するのをしばしば難しくする。
【０００７】
この遺伝子欠損が世界的に広く用いられている雄牛 Carlin-M Ivanhoe Bell によって広がるのであろうことからして、現状の可能性ある種牛がこの欠損のキャリアーかどうかを試験するのは非常に大きい経済的重要性がある。
【０００８】
デンマーク牛全数における可能性ＣＶＭキャリアー動物の頻度を見積もるために、本発明者は、デンマーク国立の牛データベースから血統情報を抽出した。抽出時（２０００年１０月）で、９１９,９１６頭の純系雌牛および若い雌牛、１６９,８２１頭の純系雄牛および雄子牛が登録されていた。Bell は、雌牛および若い雌牛の血統で７０７,９１５回、雄牛の血統で１６１,０４３回見られた。下記の表１および２に、血統の各世代における Bell の発生数を示す。
【０００９】
表１  デンマークホルステイン雌牛および若い雌牛の血統における Bell の発生数
【表１】
2004519219.tif 000002
【００１０】
表２  デンマークホルステイン雄牛の血統における Bell の発生数
【表２】
2004519219.tif 000003
【００１１】
これらの数に血統におけるいくつかの二重および三重の Bell の発生が含まれるが、データーによると明らかに、デンマークホルステイン牛の多くはＣＶＭキャリアーの可能性がある。明らかに問題は大きい。
このように、ＣＶＭキャリアーの可能性がある種々の品種における牛の同定（例えば、臨床的症状の発現前に）ができる遺伝試験について大きい需要がある。
【００１２】
本発明以前には、単離も特徴解明もなされていない上記の複合脊椎奇形を起こす遺伝子にマイクロサテライト・マッピングは適用されていなかった。従って、本発明者の知り得る限りでは、下記に詳しく述べる本発明による診断方法は、以前に示唆も開示もなされていない。
【００１３】
本発明は、ＣＶＭについての疾患座のマッピングを含み、牛染色体ＢＴＡ３上に位置するマイクロサテライトマーカーに基づくＤＮＡ試験を提供する。Bell に由来する動物のキャリアー状態を明確にする試験の能力を下記の実施例で確認した。
【００１４】
（発明の要旨）
最も広い態様において、本発明は、牛複合脊椎奇形（ＣＶＭ）に関連する遺伝子マーカーを対象牛において検出する方法を提供する。この方法は、牛遺伝子材料を準備すること、および遺伝子材料において、牛複合脊椎奇形病の特性に連鎖している少なくとも１つの遺伝子マーカーの存在または不存在、あるいは牛複合脊椎奇形病の特性を起こす特異的なヌクレオチド多形性を検出することを含む。
【００１５】
さらなる態様において、本発明は、牛複合脊椎奇形（ＣＶＭ）に関連する少なくとも１つの遺伝子マーカーの対象牛における存在を検出するのに使用する診断キットに関する。このマーカーは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８およびこれらの組合せよりなる群から選ばれる少なくとも１つのオリゴヌクレオチド配列を含む。さらに、本発明は、牛ＣＶＭの原因的および診断的な牛ＳＬＣ３５Ａ３遺伝子におけるＧ／Ｔ多形性を検出するための診断キットを含む診断方法に関する。
【００１６】
（発明の詳細な開示）
本発明のひとつの主要な目的は、複合脊椎奇形（ＣＶＭ）を有する牛の同定を可能にすることである。これは、対象牛においてＣＶＭに関連する遺伝子マーカーの存在を検出する方法によりなし得る。具体的に、遺伝子マーカーは牛ＳＬＣ３５Ａ３遺伝子であり得、さらに具体的に、牛ＳＬＣ３５Ａ３遺伝子における特異的多形性である。
【００１７】
本明細書における用語「対象牛」は、いかなる血統の牛をも意味する。すなわち、この用語には、種々の雌牛または雄牛のすべての種類、雄性または雌性であろうとも、また成牛も新生牛も含まれる。この用語は特定の年齢を意味しない。対象牛のひとつの例は、ホルステイン−フリエシアン群の構成牛である。
【００１８】
用語「遺伝子マーカー」は、染色体上の牛遺伝子ＤＮＡに存在し、特異的オリゴヌクレオチドで同定可能な可変的ヌクレオチド配列（多形性）を意味する。このような可変的ヌクレオチド配列は、例えば、核酸増幅および多形性によるヌクレオチドの配列またはサイズの相違の観測により、識別可能である。有用な実施態様において、この遺伝子マーカーは、当業者に既知のいくつかの技法により同定できる。それには、マイクロサテライトまたは短タンデム反復配列（ＳＴＲ）の型決定、制限フラグメント長多形性（ＲＦＬＰ)、欠失または挿入部位の検出、ランダム増幅多形性ＤＮＡ（ＲＡＰＤ）、単一ヌクレオチド多形性（ＳＮＰ）の型決定があり、制限フラグメント長ポリメラーゼ鎖反応、対立遺伝子特異的オリゴマー・ハイブリダイゼーション、オリゴマー特異的連結反応アッセイ、ミニシークエンス、直接シークエンス、蛍光検出５'‐エキソヌクレアーゼ・アッセイ、ＰＮＡやＬＮＡプローブなどとのハイブリダイゼーションを含む方法による。なお、他の遺伝子マーカーおよび技法も本発明に合わせて適用し得ることを、理解できるであろう。
【００１９】
上記したように、「牛複合脊椎奇形」(ＣＶＭ）は、先天性の脊椎障害である。現在のところ、この疾患はホルステイン−フリエシアン（ＨＦ）黒色および白色酪農牛のみで検出されている。しかし、他の牛の種類でも起こり得ると考えられる。この疾患は、Agerholm et al., 2000 によって最近報告された。従って、本明細書においてＣＶＭおよび牛複合脊椎奇形病の特性は、上述の臨床症状をもたらす疾患として、および Agerholm et al., 2000 により報告かつ定義された疾患として理解できる。
【００２０】
本発明の方法は牛遺伝子材料の準備を含む。この材料は、いかなる通常の方法または手段により準備され得る牛ＤＮＡ材料を含む。牛ＤＮＡ材料は、例えば、血液（例えば、新鮮または凍結の）、組織サンプル（例えば、脾臓、口腔スミア）、小胞細胞を含有する毛髪サンプル、精液から抽出、単離、精製できる。
上記したように、本発明はさらに、牛複合脊椎奇形病の特性に関連する遺伝子マーカーの存在または不存在を遺伝子材料において検出する工程を含む。
【００２１】
遺伝子材料中に遺伝子マーカーが存在するかどうかを検出するために、当業者に既知の標準的方法を、例えば核酸増幅を使用して、適用できる。遺伝子マーカーが複合脊椎奇形病の特性に遺伝子的に関連しているかを決定するために、ロッドスコアーを適用できる。ロッドスコアーは、Ｚｍａｘともいわれ、遺伝子マーカー座と特異的遺伝子座とが特定の距離で連鎖している蓋然性（見込み比率の対数）を表す。ロッドスコアーは,例えば、ＬＩＮＫＡＧＥパッケイジのＭＬＩＮＫプログラム（Lathrop et al., 1985) などのコンピューター・プログラムを用いて計算できる。ロッドスコアーが３.０よりも大きいと、遺伝子マーカーと複合脊椎奇形病特性または遺伝子座との連鎖について有意の証拠と考える。
【００２２】
本発明の実施態様において、遺伝子マーカーは牛染色体ＢＴＡ３上に位置する。本発明方法で有用な遺伝子マーカーを含む牛染色体ＢＴＡ３の領域を図２に示す。
すなわち、多形性マイクロサテライトマーカーＢＭ４１２９とＢＭＳ１２６６により挟まれ、これらを含む領域中で牛染色体ＢＴＡ３上に位置する遺伝子マーカーは、本発明で有用である。ひとつの具体的な実施態様において、少なくとも１つの遺伝子マーカーが牛染色体ＢＴＡ３上で約５９.５ｃＭから約６７.９ｃＭの領域中に位置する。
【００２３】
さらに有用な実施態様において、少なくとも１つの遺伝子マーカーが、多形性マイクロサテライトマーカーＩＮＲＡＡ００３とＢＭＳ９３７により挟まれ、これらを含む領域中で牛染色体ＢＴＡ３上に位置する。
【００２４】
さらなる態様において、少なくとも１つの遺伝子マーカーが、多形性マイクロサテライトマーカーＩＮＲＡＡ００３とＩＬＳＴＳ０２９により挟まれ、これらを含む領域中で牛染色体ＢＴＡ３上に位置する。
【００２５】
別の適した実施態様において、少なくとも１つの遺伝子マーカーを、マイクロサテライトマーカーＢＭ４１２９、ＩＮＲＡＡ００３、ＢＭＳ２７９０、ＩＬＳＴＳ０２９、ＩＮＲＡ１２３、ＢＭ２２０、ＨＵＪ２４６、ＢＭＳ８６２、ＢＭＳ９３７、ＢＬ１０４８、ＢＭＳ２０９５、ＢＭＳ１２６６よりなる群から選ぶ。
【００２６】
実施例に記載のように、少なくとも１つの遺伝子マーカーが、牛複合脊椎奇形病を起こす遺伝子と連鎖し得る。ひとつの実施態様において、少なくとも１つの遺伝子マーカーが、多形性マイクロサテライトマーカーＢＭ４１２９とＢＭＳ１２６６により挟まれ、これらを含む領域中で牛染色体ＢＴＡ３上に位置し、そしてＣＶＭ病特性すなわちＣＶＭ遺伝子座に少なくとも３.０のロッドスコアーで遺伝的に連鎖している。ロッドスコアーは、例えば少なくとも４.０など、少なくとも５.０、少なくとも６.０、少なくとも７.０、少なくとも８.０、少なくとも９.０、少なくとも１０.０、少なくとも１１.０、少なくとも１２.０などを含む。
【００２７】
上記の多形性マイクロサテライトマーカーの具体的な定義および座はＵＳＤＡ遺伝子マップ（Kappes et al., 1997）に見ることができる。
ＣＶＭに関連する遺伝子マーカーの対象牛における存在または不存在を検出するために、１を越える遺伝子マーカーを本発明において適用できることが分かるであろう。すなわち、少なくとも１つの遺伝子マーカーを、試験の精度を増し得る情報を示す２以上の遺伝子マーカーと組合せ得る。
【００２８】
従って、下記にさらに例示するように、ひとつの有用な実施態様において、２以上のマイクロサテライトマーカーＩＮＲＡＡ００３、ＢＭＳ２７９０、ＩＬＳＴＳ０２９、ＩＮＲＡ１２３、ＢＭ２２０、ＨＵＪ２４６、ＢＭＳ８６２、ＢＭＳ９３７を組合せて使用できる。
本発明に対応して、上記マイクロサテライトマーカーを増幅するためのプライマー対のヌクレオチド配列を下記の表４に記載する。
【００２９】
比較マップ（Solinas-Toldo et al., 1995）によると、牛染色体ＢＴＡ３の大部分がヒト染色体１（ＨＳＡ１）の一部分に相当する。本明細書中で示されるＣＶＭ座の遺伝子マップ作成は、ヒト遺伝子について利用できる情報を使用すること、および候補の遺伝子についての研究をヒト染色体１に存在の遺伝子に集約することを可能にする。これは、候補遺伝子の数を非常に限定し、ＣＶＭ原因遺伝子についての研究を容易にする。
【００３０】
本発明の遺伝子マーカーは、当業者に既知の種々の方法を用いてつくり得る。すなわち、本明細書中に示される知見でもって、上記の牛染色体ＢＴＡ３の多形性マイクロサテライトマーカーのヌクレオチド配列をＣＶＭ遺伝子座に遺伝子的に連鎖しているものとして同定し、本発明の方法での使用のために牛染色体ＢＴＡ３上の既知の配列または表示の位置から追加のマーカーをつくることができるのを理解されよう。
【００３１】
例えば、図２に表示されるマップを用いて、牛染色体ＢＴＡ３のＣＶＭ領域をミクロ切開し、フラグメントをベクター中にクローン化して、ＣＶＭ遺伝子座との連鎖について試験し得るＤＮＡセグメントを単離できる。あるいは、表４で準備されるヌクレオチド配列でもって、単離ＤＮＡセグメントをＣＶＭ領域から、核酸増幅（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応）により、または牛染色体ＢＴＡ３の関係領域のヌクレオチド・シークエンス（染色体ウオーキング）により得ることができる。
【００３２】
さらに、牛染色体ＢＴＡ３とヒト染色体１（ＨＳＡ１）との上記の相同性によると、ヒトのこの類似的領域に対してマップされたいかなる遺伝子または発現配列タッグも牛染色体ＢＴＡ３のＣＶＭ領域に対してマップし得る。このように、ヒト染色体ＨＳＡ１上にマップする遺伝子または保存配列を、通常の方法を用いて、ＣＶＭ遺伝子座との連鎖について分析し得る。
【００３３】
遺伝子型決定は、本明細書に記載の標準ＤＮＡ抽出法を用いて準備し得るゲノムＤＮＡの分析に基づく。ゲノムＤＮＡを単離し精製するとき、核酸増幅（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応）を用いて、ＣＶＭに関連の遺伝子マーカーの対象牛における存在を検出するための分析に使用すべき各遺伝子マーカーに対応するＤＮＡの領域を増幅できる。従って、この実施態様における使用のための診断キットは、分離のパッケイジに、下記よりなる群から選ばれる少なくとも１つのオリゴヌクレオチド配列を含む：配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８およびこれらの組合せ。
【００３４】
牛ＣＶＭの原因的および診断的な牛ＳＬＣ３５Ａ３遺伝子における変異の同定
多形性マイクロサテライトマーカーにより限定されるＣＶＭ遺伝子のゲノム位置決定を行い、ＣＶＭの究極遺伝子マーカーとして使用できる構造遺伝子および原因的変異の同定についての研究を行った。
【００３５】
マーカーＩＮＲＡ００３とＩＬＳＴＳ０２９との間の領域として明確にされるＣＶＭ領域に対する配列相同性を共有するヒトゲノムを同定した。マーカーＢＭＳ２７９０はこの間隔中に位置する（図１)。最初に、牛ＢＡＣライブラリー（ＲＰＣＩ-４２、P. de Jonge らにより構築され利用可能となった）からの５つの異なるクローンを同定した。各々がマーカーＩＮＲＡ００３、ＩＳＬＴＳ０２９、ＢＭＳ２７９０の１つを有する。これらのＢＡＣクローンから得られた配列情報を用いて、マーカー含有ＢＡＳに対する相同領域を含有するヒト染色体１上の単一領域を、公表の配列データーベースのＢＬＡＳＴＮプログラムで同定した。この領域は約６百万塩基対にまたがり、部位約１０７.４−１１３.５に位置する（図３)(ENSEMBL viewer, The Sanger Center)。
【００３６】
ＳＬＣ３５Ａ３ｃＤＮＡの単離および配列決定
homo sapiens(ホモサピエンス)とcanis familiaris（イヌ科）とのＳＬＣ３５Ａ３の相同性アラインメントに基づき、２オリゴ（ＳＬ１ＦおよびＳＬ８Ｒ）を、開始コドンを含む牛ＳＬＣ３５Ａ３のほぼすべてのｃＤＮＡの増幅のために設計した。野生型動物、ＣＶＭキャリアー、罹患動物からそれぞれ収集した心臓組織サンプルより単離のｃＤＮＡに対してＰＣＲを行った。遺伝子の３'末端の配列を得るために、取得されたＰＣＲフラグメントを配列決定し、新しいオリゴを設計した（ＳＬ５Ｆ)。ＳＬＣ３５Ａ３の３'末端を増幅するために、部分的な牛ＥＳＴの公表配列（ジーンバンク、ｄｂＥＳＴ）を用いて設計されたオリゴ（ｂＳＬＣＢＶＩＲ）と組合せてＳＬ５Ｆを使用した。牛ＳＬＣ３５Ａ３のｃＤＮＡ配列（配列番号１８）および翻訳ペプチド配列（配列番号１７）を図４に示す。牛ＳＬＣ３５Ａ３によりコードされるタンパク質は、３２６アミノ酸を含有し、サイトゾルからゴルジ管腔へのヌクレオチド糖の輸送に関与する既知のタンパク質のファミリーとの相同性を共有する。図５におけるアラインメントは、ヒト（Ishida et al., 1999）およびイヌ（Guillen et al., 1998）で前に記述されているＳＬＣ３５Ａ３タンパク質に対する相同性を示す。
【００３７】
ＳＬＣ３５Ａ３遺伝子における多形性の検出
牛ＳＬＣ３５Ａ３遺伝子における可能性ある多形性を検出するために、遺伝子のＰＣＲ増幅を、ＣＶＭキャリアーおよび罹患動物からそれぞれ収集した心臓組織サンプルより単離のｃＤＮＡを用いて行った。罹患動物から単離されたフラグメントの配列決定は、野生型動物が対応部位のヌクレオチドＧにホモ接合体であるのに比べて、罹患動物がヌクレオチド部位５５９のヌクレオチドＴにホモ接合体である点を除き、野生型と同一あることを示した（図４)。ＣＶＭ欠損のキャリアーである動物からのｃＤＮＡの配列決定によると、この動物は部位５５９のＴおよびＧの両方を有するヘテロ接合体であった。
部位５５９のＧからＴへの変換は、得られるペプチドの配列に影響し、部位１８０のバリンがフェニルアラニンに変わる（参照、図４)。
【００３８】
ＤＮＡ配列決定に基づくアッセイによるＳＬＣ３５Ａ３多形性の型決定
図６は、ゲノムＤＮＡから増幅されたＰＣＲフラグメントの配列決定から得られた結果を示す。これはＧ／Ｔ変異を含有する領域（ＳＬＣ３５Ａ３ｃＤＮＡの５４４から５７２、番号は図４を参照のこと)を含有する。右および左のパネルはそれぞれフォワードおよびリバースの配列決定を示す。上欄（-／-で表示）は、野生型についての結果を示し、フォワード配列決定を用いる多形性部位でのＧおよびリバース配列決定を用いる他の鎖上の類似部位でのＣを示す（アステリスクで表示)。下欄＋／＋は、罹患牛についての結果を示し、フォワード配列決定を用いる多形性部位でのＴおよびリバース配列決定を用いる他の鎖上の同様の部位でのＡを示す（アステリスクで表示)。ヘテロ接合（＋／−）は、中間欄にあり、予測されるように野生型と罹患シグナルの混合として示し、フォワード配列決定を用いるＴおよびＧシグナルおよび他の鎖上のＡおよびＣシグナルを有する。
【００３９】
ＣＶＭに罹患の牛はＴ対立遺伝子についてホモ接合体である
ＣＶＭに罹患の３９頭の牛についての遺伝子型決定を、ゲノムＤＮＡから増幅されたＰＣＲ産物の配列決定によって行った（参照、図６および実施例６)。これらのすべての動物はＴ対立遺伝子についてホモ接合体であった。これは最初の結果を確認した。
【００４０】
Ｔ対立遺伝子は Bell に関係しない動物で見られない
ＣＶＭに罹患の牛は、野生的に用いられる雄牛ＢＥＬＬを含有する血統でのみ報告されているので、Ｔ対立遺伝子がＢＥＬＬに関係のない動物に存在するかどうかを検査した。デンマーク牛データベースを利用して、血統にＢＥＬＬのないホルステイン品種の４９６頭を同定しサンプルとした。これらの動物の遺伝子型の決定を、ゲノムＤＮＡから増幅されたＰＣＲ産物の配列決定により行った（参照、図６および実施例６)。これらの動物のいずれもＴ対立遺伝子を含有しておらず、この対立遺伝子がＢＥＬＬに密接に関係する動物系に専らみられることを示唆している。
【００４１】
配列決定により、１２の異なる品種の３２６以上の非関係（少なくとも最後の３世代について）動物についても遺伝子型を決定した。これらのすべての動物は野生型対立遺伝子（Ｇ対立遺伝子）にホモ接合体であり、一般的な牛群におけるＣＶＭ関係対立遺伝子（Ｔ対立遺伝子）の欠失も示した。
【００４２】
対立遺伝子特異的ＰＣＲアッセイ（ＡＳ−ＰＣＲ）によるＳＬＣ３５Ａ３多形性の型決定
Ｇ／Ｔ多形性の型を効率的に決めるために、Bioline からのＢＩＯＬＡＳＥ Diamond ＤＮＡポリメラーゼを用いる対立遺伝子特異的ＰＣＲアッセイを開発した。このポリメラーゼはプライマーの３'末端のテンプレートに対する完全な対合を要求し、この部位での誤対合では増幅が得られない（またはほとんどない)。この方法において、野生型、キャリアー、罹患動物を、対立遺伝子特異的ＰＣＲ産物の存在または不存在を同定することで、識別できる（図７)。図７の左部は、コード鎖の対立遺伝子特異的ＰＣＲ産物を示す。予想のように、野生型動物はＧ特異的プライマーでの増幅を示すが、Ｔ特異的プライマーでは示さない。キャリアーはＧとＴ両方の特異的プライマーの増幅を示し、一方、罹患動物はＴ特異的プライマーでの増幅のみを示す。右部は、非コード鎖の対立遺伝子特異的ＰＣＲ産物を示す。予想のように、パターンはコード鎖と同じである。野生型はホモ接合体Ｃ、キャリアーはヘテロ接合体Ｃ／Ａ、罹患動物はホモ接合体Ａである。
【００４３】
位置的候補遺伝子を用いた上記の結果から、牛遺伝子は、ＵＤＰ-Ｎ-アセチルグルコサミン・トランスポーターをコードするヒト遺伝子ＳＬＣ３５Ａ３に相同性であると同定した。この遺伝子内において、タンパク質のアミノ酸配列を変えるＧ／Ｔ多形性を同定した。解析したすべての罹患牛（３９）はＴ対立遺伝子（Ｔ／Ｔ）についてホモ接合体であり、既知のキャリアー（１０８）はすべて多形性（Ｇ／Ｔ）についてヘテロ接合体である。Bell に無関係であるとして選択されたホルステイン品種の５００頭以上についての解析では、Ｔ対立遺伝子を保有するいかなる罹患動物も同定できなかった。血統に Bell を有する１５００頭についての解析で、Ｔ対立遺伝子についてホモ接合体の非罹患動物を見出さなかった。さらに、１２の異なる品種から選択された３００頭以上の解析で、これらの動物のいずれにもＴ対立遺伝子を検出しなかった。これらを合わす本発明による知見によると、Ｔ対立遺伝子がＣＶＭキャリアー動物では単一コピーで、ＣＶＭ罹患動物では２コピーで存在する。従って、部位５５９（図４からの番号つけ）でのＴ対立遺伝子の検出はＣＶＭの診断となり、ＣＶＭ欠損キャリアーの検出に理想的である。
【００４４】
Ｇ／Ｔ多形性がＣＶＭの原因であると同定されるので、この多形性に密接に共役する遺伝子マーカーは牛集団におけるＣＶＭの診断となり得る。従って、本発明は、ＣＶＭに罹患しているか、またはＣＶＭのキャリアーである対象牛を、牛ＳＬＣ３５Ａ３遺伝子の部位５５９でのＧ／Ｔ多形性の存在を調べることで同定する方法を記述する。この方法は、例えば、上記のようにまたは実施例で詳記するように、牛ＳＬＣ３５Ａ３遺伝子に共役するいかなる遺伝子マーカー、例えば本明細書に記載のマイクロサテライトを分析して間接的に、あるいは牛ＳＬＣ３５Ａ３遺伝子の配列を分析して直接的になし得る。
【００４５】
従って、ＣＶＭ罹患対象牛またはＣＶＭキャリアーを同定し得るために、対象牛における牛ＣＶＭに関連する遺伝子マーカーの存在を検出および/または定量する方法が、本発明の範囲内にある。この方法は下記の工程を含む：
ａ）牛遺伝子材料を準備すること、
ｂ）該遺伝子材料において、牛複合脊椎奇形病特性に連鎖する少なくとも１つの遺伝子マーカーの存在または不存在を検出すること。
【００４６】
少なくとも１つの遺伝子マーカーが牛ＣＶＭ病を起こす遺伝子に連鎖している。この遺伝子は、本発明において牛ＳＬＣ３５Ａ３遺伝子と同定されるものであって、配列番号１７で示されるアミノ酸配列を含む牛ＳＬＣ３５Ａ３タンパク質をコードする。
【００４７】
さらに具体的に、本発明は、遺伝子マーカーが、配列番号１８のヌクレオチド５５９に等価の位置での単一ヌクレオチド多形性である牛ＣＶＭを検出するための方法に関する。この単一ヌクレオチド多形性はＧ／Ｔ多形性である。
【００４８】
本発明はさらに、対立遺伝子特異的ＰＣＲを用いる本多形性の遺伝子型を調べるための効率的なアッセイを記述する。これは、ＳＮＰの型を調べるいくつかの方法のひとつであって、他の方法も用い得る。それには、限定でないが、ミニシークエンス、プライマー伸長法、ピロシークエンス、ＰＣＲ−ＲＦＬＦ、遺伝子特異的ローリングサイクル増幅法、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析に続くプライマー伸長法、他の酵素的およびハイブリダイゼーションに基づく方法などがある。
【００４９】
ＣＶＭに類似の遺伝子型が遺伝子ルナミック・フリンジ（lunatic fringe）変異のマウスに存在することが報告されている（Evrad et al., 1998)。ＣＶＭ罹患の子牛と類似して、ルナミック・フリンジにおけるナル変異についてのホモ接合体マウスが、短い体軸、脊椎と肋骨の融合、不完全形成の脊椎を有する変化した体節の分割およびパターンを表している（Evrad et al., 1998)。ノッチ受容体の活性を調節して、フリンジは境界形成および体節パターン化の明確化に関与するようである（Klein and Arias, 1998; Moloney et al., 2000; Brueckner et al., 2000)。ノッチ調節活性はフリンジのＮ−アセチルグルコサミニル・トランスフェラーゼにより調節されるようである。ゴルジ中のフリンジがノッチのＥＧＦ様配列リピートに連結のＯ-連鎖フコース残基の伸長を開始する（Moloney et al., 2000; Brueckner et al., 2000)。
【００５０】
さらに、牛ＳＬＣ３５Ａ３遺伝子がヒトＳＬＣ３５Ａ３遺伝子に相同性であるので、本明細書で開示の情報でもって、ヒトの発生的欠損、特に体節の分割およびパターン化に関する欠損を調べると、原因的および診断的変異についてのヒトＳＬＣ３５Ａ３のコード配列を分析できる。
【００５１】
サイトゾルからゴルジ管腔へのＮ−アセチルグルコサミンの輸送に作用するゴルジ位置Ｎ−アセチルグルコサミニル・トランスポーター（ＳＬＣ３５Ａ３）における変異の効果が基質についてのタンパク質のフリンジのファミリーを奪うと考えられる。このことは、ノッチ活性を調節するフリンジの能力に影響を与え、それでもってＣＶＭのような分節欠損を起こすのであろ牛たがって、ＳＬＣ３５Ａ３での変異が、ＣＶＭの診断のほかに、この広範な遺伝子欠損を起こす変異でもあることは、非常に信頼できよう。
本発明を下記の実施例でさらに詳細に記載する。
【実施例１】
【００５２】
実施例
実施例１
複合脊椎奇形のゲノムマッピング(ＣＭＶ)
この実施例は、牛染色体 ＢＴＡ３に対するＣＭＶ遺伝子座の局在化を示す。さらに、この実施態様は、ＣＭＶ遺伝子座に連鎖したマーカーの同定、次いで、牛染色体ＢＴＡ３のＣＭＶ領域に関する特徴付与を説明するものである。
【００５３】
ＣＭＶに関与する座をマッピングするために、サンプルを育種研究に関係のある動物から得た。要約すると、雄牛Ｔ Ｂｕｒｍａの系統であり、雄牛ＫＯＬ Ｎｉｘｏｎ由来の精液で人工受精した約３００の乳牛および若い雌牛を、育種研究に選択した。１３頭の罹患子牛を、Agerholm et al., 2000に記載のような剖検を基に選択した。これら１３頭の子牛と両親、全２８頭の動物を最初のゲノムスキャンに用いた。子牛を、共通の祖先、純系雄牛のエリートＵＳホルスタイン(Carlin-M Ivanhoe Bell)に対する４世代に分けた。
【００５４】
ゲノムスキャンを、全ての２９常染色体を網羅して、ＵＳＤＡ ゲノムマップ(Kappes et al., 1997)から選抜した一連のマイクロサテライトマーカーを用いて行った。マーカーを１０から２０ｃＭのペア−ワイズ距離によって選択した。低いマーカーの情報付与性を理由とする疑わしいエリアでは、新規マーカーを含めて型決定をした。合計１９４マーカーを使用した。ＰＣＲ反応を、ゲノムＤＮＡ１２ｎｇ、１×ＰＣＲ緩衝液、０.４Ｕ AmpliTaq Gold (Applied Biosystems)、各プライマーおよび２.０ｍＭ ＭｇＣｌ２の２０pmolを含有する５μlの容積で、ABI 877 PCR robot(Applied Biosystems)において２回行った。全てのマーカーを、同じタッチダウンＰＣＲ条件で行った:酵素を活性化のために９４℃で１２分間のインキュベーションを行い、３５サイクルを、９４℃で３０秒; Ｔａ、４５秒；７２℃で２０秒、７２℃で１０分間の最終伸長で終結する。最初の１０サイクルのＴａは、各サイクルに対して１℃、６７℃から５８℃に低くし、残りの２５サイクルのＴａを５８℃に固定した。ＰＣＲ産物をプールし、５〜９の異なるマーカーを、ABI 377 (Applied Biosystems)上の各レーンに流し、ゲルを付随のソフトウェアで分析した。対立遺伝子（アレイ）を、Genotyper programme(Version 2.1, Applied Biosystems)を用いて割り当てた。
【００５５】
３つのマーカーについて、２点ロッドスコアーを、LINKAGE package(Lathrop et al., 1985)のMLINKプログラムを用いて計算した。多重(multiple)同系交配ループと共に系統構造(図１)により、系統を１３の小さなファミリーに分け、各々対する１つは、父系(KOL Nixon) 、母系および母系祖先(T Burma)を含む各罹患子牛である。この疾患は、遺伝子型の完全な挿入によって劣性遺伝すると推定した。
【００５６】
有意な連鎖を全ての３つのマーカーについて見出した。最も高いロッドスコア(Ｚ)を、Ｚ＝１０.３５、θ＝０で、ＢＭＳ２７９０およびＩＬＳＴＳ０２９で観察した。さらに、近傍マーカーＩＮＲＡ００３も、ＣＭＶ座に有意に連鎖した（表３)。
【００５７】
表３
ＣＭＶ座および牛染色体３のマーカーの連鎖解析からの２点ロッドスコアー(Ｚ)および組換え画分(θ)
【表３】
2004519219.tif 000004
【００５８】
上記の結果は、ＣＭＶ座をＵＳＤＡゲノムマップ(Kappes et al., 1997)によるＢＴＡ３(図２)に対して位置づける。
【００５９】
● １１頭の子牛は、ＩＮＲＡ００３、ＢＭＳ２７９０、ＩＬＳＴＳ０２９、ＢＭＳ８６２およびＨＵＪ２４６によって明確にされるインターバルについてホモ接合体であり、一方、ＢＭＳ２７９０およびＩＬＳＴＳ０２９のみが、図１に示した全１３頭の子牛においてホモ接合体であった。これらのマーカーのハプロタイプを構築することが可能となり、殆ど同じようなＣＭＶハプロタイプであると推定した(図１)。ハプロタイプを１からＮの数字をつけたマーカーの対立遺伝子のサイズによって定義した。ここで、１は増幅マーカーの最も短い対立遺伝子を定義し、Ｎは最も長い対立遺伝子と定義する。ＢellにおけるＣＭＶ関連対立遺伝子の実際の長さは下記の通りである：
ＩＮＲＡ００３ (対立遺伝子番号３): １７６塩基対
ＢＭＳ２７９０ (対立遺伝子番号３): １１８塩基対
ＩＬＳＴＳ０２９ (対立遺伝子番号２): １６４塩基対
ＢＭＳ８６２ (対立遺伝子番号１): １３０塩基対
ＨＵＪ２４６ (対立遺伝子番号３): ２６２塩基対
【００６０】
対立遺伝子の実際の長さは、マーカーを増幅するために使用したプライマーに依存し、上記に示したフラグメント長は表４に記載のプライマーを使用することを基準とする。
【００６１】
さらに、遺伝子欠損に対するthe Danish surveillance programmeの一部としてサンプルを採取した１７頭の別の罹患子牛をこの実験に含む。全ての罹患動物は、共通の祖先として純系雄牛であるＢellを持つ。ＤＮＡを、標準的方法を用いて、血液サンプルまたは精液から抽出した。
【００６２】
１７頭の子牛およびその母牛を、８つのマーカー：ＩＮＲＡ００３、ＢＭＳ２７９０、ＩＬＳＴＳ０２９、ＢＭ２２０、ＩＮＲＡ１２３、ＢＭＳ８６２、ＢＭＳ９３７、ＨＵＪ２４６を用いて遺伝子型を決定した。これらは、ＢＴＡ３上の約５９.５ｃＭ〜６７.９ｃＭの領域にある。そして最初の育種研究と同じように別の１７頭の子牛のＣＭＶ遺伝子が共通の祖先雄牛Ｂellから生じると想定できるので、系統(ＩＢＤ)による同一性に関する類似領域を、全ての罹患子牛中に存在すると考えた。また、これは、次ぎの事象でもわかる。１７頭の子牛中の１７頭でＩＮＲＡ００３およびＢＭＳ２７９０で明確にされる染色体分節が同型ホモ接合体であり、育種研究由来の動物と同一対立遺伝子を共有している。１９頭の動物のうち２頭において、ヘテロ接合体は、ＢＭＳ２７９０およびＩＬＳＴＳ０２９間の１つの組換え事象によって説明されるＩＬＳＴＳ０２９およびＢＭＳ８６２座で観察された。即ち、組み合わせた遺伝子型決定の結果を基に、ＣＭＶ遺伝子欠損が、図２に示したようなマーカーＩＮＲＡ００３およびＩＬＳＴＳ０２９に挟まれ、そして「ＣＭＶ領域」と表示した６ｃＭ以下のインターバル中に位置する可能性が最も高いことを見出した。
【００６３】
用いた８つのマーカー：ＩＮＲＡ００３、ＢＭＳ２７９０、ＩＬＳＴＳ０２９、ＢＭ２２０、ＩＮＲＡ１２３、ＢＭＳ８６２、ＢＭＳ９３７およびＨＵＪ２４６についてのプライマーの配列を、下記表４に示す。
表４：
【表４】
2004519219.tif 000005
【実施例２】
【００６４】
実施例２
ＣＭＶキャリアーを同定するための診断試験:
ＣＭＶの牛キャリアーを決定するための診断試験を、Ｂellからの子孫が疾患関連ハプロタイプのキャリアーであるかどうかを決定することによって確立した。
【００６５】
この試験は、８つのマイクロサテライトマーカー：ＩＮＲＡ００３、ＢＭＳ２７９０、ＩＬＳＴＳ０２９、ＢＭ２２０、ＩＮＲＡ１２３、ＢＭＳ８６２、ＢＭＳ９３７およびＨＵＪ２４６を基にしており、Ｂellからの子孫動物における疾患特異的対立遺伝子またはハプロタイプの認識による(図１を参照) 。
【００６６】
このようにして、マーカー：ＩＮＲＡ００３、ＢＭＳ２７９０、ＩＬＳＴＳ０２９、ＢＭ２２０によって明確にされる領域にＢellからまたはＢellの子孫動物から疾患関連対立遺伝子が遺伝された場合に、この動物をキャリアーであると決定した。ＢellからまたはＢellの子孫動物からの疾患関連ハプロタイプが遺伝されていなかった場合、その動物をノンキャリアーであると決定した。Ｂellハプロタイプが組換えによって分かれた場合に、この動物を確定できないものと示した。４つの追加マーカーは、母系と父系の系統間を識別できないために試験マーカー中の情報量が低下する場合にのみ用いた。
【００６７】
連鎖ＤＮＡマーカーを基にした全ての診断用遺伝子試験のように、このＣＶＭ試験は、二重組換え事象 (遺伝子とフランキングマーカーとの原因遺伝子の各サイドで１つの事象)が検出できないという欠点がある。本ケースでは、この事象は、マーカーとＣＭＶ遺伝子との堅い連鎖のために非常に稀であるので、該試験の信頼性を９９％以上であると推定する。
【実施例３】
【００６８】
実施例３
組織解剖およびＲＮＡ単離およびｃＤＮＡ合成:
概算５gの心臓組織を、運搬３時間以内に死産子牛から切開し、直ぐに液体窒素で凍結し、-８０℃で貯蔵した。２５０ｍｇの組織をＲＮＡ単離のために使用した。ＲＮＡを、StrataGene社のRNA Isolation Kit (cat. 200345)を用いて単離した。
【００６９】
ｃＤＮＡを、２.５μgの全ＲＮＡ、１μｌのオリゴ(ｄＴ)１２-１８(５００μｇ/ｍｌ)、１μｌの１０ｍＭｄＮＴＰ混合物およびＨ２Ｏを混合することによって合成し、最終容積１２μｌを得た。得られた混合物を、６５℃で５分間加熱し、氷上で冷却して短時間攪拌した。４μｌの５×第一ストランド緩衝液、２μｌの０.１ＭＤＴＴおよび１μｌのＨ２Ｏの添加後に、内容物を混合し、４２℃で２分間インキュベートし、その後、１μｌ(２００Ｕ)のSuperscript II (GibcoBRL(登録商標) Lifetechnologies)を添加し、４２℃で１.５時間インキュベーションを継続した。この反応を、１５分間７０℃で不活性化した。ＲＮＡを除くために、ｃＤＮＡを３７℃で２０分間、１Ｕ ＲＮＡse Ｈ(Roche Molecular Biochemicals)と共にインキュベートした。
【実施例４】
【００７０】
実施例４
ＳＬＣ３５Ａ３の配列決定:
homo sapiensとcanis familiarisとの間の、ＳＬＣ３５Ａ３遺伝子の相同性アラインメントに基づいて、２つのオリゴ（Oligo）類(ＳＬ１ＦおよびＳＬ８Ｒ)を、開始コドンを含む牛ＳＬＣ３５Ａ３に対してほぼ完全なｃＤＮＡの増幅のために構築した。遺伝子の３'末端を得るために、得られるＰＣＲフラグメントを配列決定し、新規オリゴを構築した(ＳＬ５Ｆ)。 ＳＬＣ３５Ａ３の３'末端を増幅するために、ＳＬ５Ｆを、牛ＥＳＴの開示された配列に基づいて、オリゴ(ｂＳＬＣＢＶＩＲ)と組合わせて使用した。
【００７１】
同じＰＣＲ条件を、両方のプライマーの組に適用した。
【００７２】
ＰＣＲ反応を、１μｌの１０ｘＮＨ４反応緩衝液、０.５μｌの５０ｍＭ ＭｇＣｌ２、０.８μｌのｄＮＴＰ(各々２.５ ｍＭ)、５.６５μｌのＨ２Ｏ、１μｌのフォワードおよびリバースプライマー(各々５pmol)および０.０５μｌの５Ｕ／μｌのBIOTAQ DNA polymerase(Bioline)を含有する最終容積１０μｌで、Gene Amp（登録商標）PCR System 9700 (Applied Biosystems)において行った。
【００７３】
９５℃で２分間の初期熱活性化ステップに続いて、９５℃で３０秒間の変性、６２℃で３０秒間(０.５℃減少率)のアニーリング、そして７２℃で２０秒間の伸長を１０サイクル、さらに９５℃で３０秒間の変性ステップ、５７℃で３０秒間のアニーリングおよび７２℃で３０秒間の伸長ステップを含む３０サイクル、を含むタッチダウンＰＣＲ反応を行った。
【００７４】
下記プライマーを用いて、完全なＳＬＣ３５Ａ３ｃＤＮＡを増幅した:
ＳＬ１Ｆ：５'-ＧＧＡ ＧＧＣ ＡＡＡ ＴＧＡ ＡＧＡ ＴＡＡ ＡＡＣ-３' (配列番号１９)
ＳＬ８Ｒ：５'-ＣＴＡ ＴＧＣ ＴＴＴ ＡＧＴ ＧＧＧ ＡＴＴ３'- (配列番号２０)
ＳＬ５Ｆ：５'-ＧＡＧ ＴＴＧ ＣＴＴ ＴＴＧ ＴＡＣ ＡＧＴ ＧＧ-３' (配列番号２１)
ｂＳＬＣＢＶＩＲ：５'‐ＡＣＴ ＧＧＣ ＴＡＣ ＴＡＴ ＣＴＡ ＧＣＡ ＣＡＧ ＧＡ-３' (配列番号２２)
【００７５】
完全なｃＤＮＡ配列を、鋳型として精製ＰＣＲ産物を用いる４つの別々のサイクルシークエンス反応で、これらプライマーを用いて得た。このＰＣＲ産物を、SPIN-X（登録商標）を用いて、0.8% Seakem agarose gel(Corning Incorporated)から精製した。
【００７６】
サイクルシークエンス反応を、GeneAmp(登録商標)PCR System 9700 (Applied Biosystems) で実施し、９６℃で２分間の初期ステップ、続いて、９６℃で１０秒、 ５５℃で５秒および６０℃で４分間の９９サイクルを包含する。シークエンス産物を２倍容量のエタノールおよび１／１０容量の３Ｍ ＮａＡｃ(ｐＨ５.５)で沈殿させ、７０％エタノールで洗浄し、５μｌのローディグ緩衝液に再縣濁させ、ＡＢＩ３７７オートマティックシークエンサーを用いて、４％アクリルアミドシークエンスゲル上で流した。
【００７７】
牛ＳＬＣ３５Ａ３のｃＤＮＡ配列は図４(配列番号１８)で示した。
【実施例５】
【００７８】
実施例５
マイクロサテライトマーカーを含有するＢＡＣの同定および単離
フィルターハイブリダイゼーション:
フィルターを、ハイブリダイゼーション溶液(６ｘＳＳＣ(ＮａＣｌ(５２.６g)およびクエン酸ナトリウム(２６.４６g)／リットル)、５ｘＤenhardt［２gのＦicoll(type 400, Pharmacia)、５gのポリビニルピロリドン、５gの牛血清アルブミン(Fraction V, Sigma)、０.５％ ＳＤＳおよび５０μｇ／ｍｌ ＳＳ-ＤＮＡ］で６５℃で３時間、攪拌しながらプレハイブリダイズした。次いで、１００μｌの５'末端標識したオリゴヌクレオチドを、このフィルターと６５℃で１６時間インキュベーションした。末端標識のために、５pmolのオリゴヌクレオチドを、５μｌ(５０μＣｉ)のγ-32Ｐ-ＡＴＰ(特異的活性＞５０００Ｃｉ/mmole)、２μｌの１０×キナーゼ緩衝液、１１μｌのＨ2Ｏおよび１μｌ(１０Ｕ)のＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ(New England Bio-labs Inc.)とを合せて、この混合物を３７℃、１.５時間でインキュベートし、続いて５分間の沸騰加熱により酵素を不活性化した。標識したプローブを、標準的方法を用いてＮａＡｃ／エタノール沈殿させ、７０％エタノールの洗浄後、プローブを１００μｌのＨ２Ｏで再溶解した。ハイブリダイゼーションの後、このフィルターを洗浄溶液Ｉ(２ｘＳＳＣ、０.２％ ＳＤＳ)で１回洗浄し、６５℃で洗浄溶液ＩＩ(０.１ｘＳＳＣ、０.５％ ＳＤＳ)で２回洗浄し、Kodak BIOMAX(登録商標)MS film、２日、−８０℃に曝露した。
【００７９】
下記５'末端標識したオリゴヌクレオチドを使用して、ＩＬＳＴＳ０２９およびＩＮＲＡ００３陽性ＢＡＣクローンを同定した:
ＩＬＳＴＳ０２９ オリゴ：５'-ＣＡＣ ＡＣＣ ＧＣＴ ＧＴＡ ＣＡＧ ＧＡＡ ＡＡＡ ＧＴＧ ＴＧＣ ＣＡＡ ＣＣＣ ＴＧＧ ＴＣＴ ＡＡＡ ＴＣＣ ＡＡＡ ＡＴＣ ＣＡＴ ＴＡＴ ＣＴＴ ＣＣＡ ＡＧＴ ＡＣＡ Ｔ-３' (配列番号２３)
ＩＮＲＡ００３ オリゴ：５'-ＣＧＴ ＣＣＣ ＣＴＡ ＴＧＣ ＧＣＴ ＴＡＣ ＴＡＣ ＡＴＡ ＣＡＣ ＴＣＡ ＡＡＴ ＧＧＡ ＡＡＴ ＧＧＧ ＡＡＡ ＡＣＴ ＧＧＡ ＧＧＴ ＧＴＧ ＴＧＡ ＧＣＣ ＣＣＡ ＴＴＴ Ａ-３' (配列番号２４)
【００８０】
牛ＢＡＣライブラリィのＰＣＲスクリーニング:
ＢＡＣプールを、ＢＡＣライブラリィから調製し、ＰＣＲによってスクリーニングした。ＰＣＲ反応を、GeneAmp(登録商標)PCR System 9700 (Applied Biosystems)において、１μｌの１０ｘＮＨ４反応緩衝液、０.５μｌの５０ｍＭ ＭｇＣｌ２、０.８μｌのｄＮＴＰ(各々２.５ ｍＭ)、５.６５μｌのＨ２Ｏ、１μｌのフォワードおよびリバースプライマー(各々５pmol)および０.０５μｌの５Ｕ／μｌのBIOTAQ DNA polymerase(Bioline)を含有する最終容積１０μｌで行った。
【００８１】
下記プライマーを用いて、ＰＣＲによってＢＡＣクローンを含有するＢＭＳ２７９０を同定した:
【００８２】
ＢＭＳ２７９０ Ｆ: ５'-ＡＡＧ ＡＣＡ ＡＧＧ ＡＣＴ ＴＴＣ ＡＧＣ ＣＣ-３' (配列番号２５)
ＢＭＳ２７９０ Ｒ: ５'-ＡＡＡ ＧＡＧ ＴＣＧ ＧＡＣ ＡＴＴ ＡＣＴ ＧＡＧ Ｃ-３' (配列番号２６)
【００８３】
９５℃で２分間の初期熱活性化ステップに続いて、９５℃３０秒間の変性、７０℃、３０秒間(０.５℃減少率) のアニーリングおよび７２℃で２０秒間の伸長を１０サイクル、さらに９５℃で３０秒間の変性ステップ、５７℃で３０秒間のアニーリングおよび７２℃で３０秒間の伸長ステップを含む３０サイクル、タッチダウンＰＣＲ反応を行った。
【００８４】
ＢＡＣ ＤＮＡ単離および配列決定:
ＢＡＣ ＤＮＡを、Qiagens Large Construct Kitに従って調製し、約１μｇのＢＡＣ ＤＮＡを、サイクルシークエンスのための鋳型として使用し、BigDye（登録商標）Terminator cycle squencing Kit (PE Applied Biosystems)を用いて行った。このサイクルシークエンス反応を、１μlのBig Dye(登録商標) Terminator mix、１μｌのプライマー(５pmol)、１μｌの反応緩衝液および２μｌのＨ２Ｏを含有する６μｌの最終容積で行った。サイクルシークエンス反応は、GeneAmp(登録商標)PCR System 9700 (Applied Biosystems)で実施し、９６℃で２分間の初期ステップ、続いて、９６℃で１０秒、５５℃で５秒そして６０℃で４分間の１３０サイクルを包含する。シークエンス産物を、２倍容量のエタノールと１／１０倍容量の３ＭＮａＡｃ(ｐＨ ５.５)とで沈殿させ、７０％エタノールで洗浄し、２μｌのローディグ緩衝液に再縣濁させ、ＡＢＩ３７７オートマティックシークエンサーを用いて、４％アクリルアミドシークエンスゲル上に流した。
【００８５】
シークエンスプライマー:
Ｔ７：５'-ＴＴＡ ＴＡＣ ＧＡＣ ＴＣＡ ＣＴＡ ＴＡＧ ＧＧ-３' (配列番号２７)
ＳＰ６：５'-ＡＴＴ ＴＡＧ ＧＴＧ ＡＣＡ ＣＴＡ ＴＡＧ-３' (配列番号２８)
ＩＮＲＡ００３Ｆ:５'‐ＣＴＧ ＧＡＧ ＧＴＧ ＴＧＴ ＧＡＧ ＣＣＣ ＣＡＴ ＴＴＡ-３' (配列番号２９)
ＩＮＲＡ００３Ｒ:５'-ＣＴＡ ＡＧＡ ＧＴＣ ＧＡＡ ＧＧＴ ＧＴＧ ＡＣＴ ＡＧＧ-３' (配列番号３０)
【実施例６】
【００８６】
実施例６
配列決定によるＣＭＶの決定:
ＰＣＲ反応(２μlの精製鋳型/サンプルゲノムＤＮＡ、１０ｘＰＣＲ緩衝液（２μｌ）、２５ｍＭ ＭｇＣｌ２(２μｌ)、３.３ μｌの０.２ ｍＭの各ｄＮＴＰ(Ultrapure dNTP, 27-2033-01; Amersham Pharma-cia Biotech)、６pmolのプライマー (フォワード: ＣＢＦＥＸ１, ５'-ＧＧＣ ＣＣＴ ＣＡＧ ＡＴＴ ＣＴＣ-３' (配列番号３１); リバース: ＣＢＴＥＸＲ, ５'‐ＧＴＴ ＧＡＡ ＴＧＴ ＴＴＣ ＴＴＡ-３') (配列番号３２)、０.１６５ Ｕ Ｔａｑポリメラーゼ (Biotaq, M95801B; Bioline)、ｄＨ2Ｏ の添加で全容積)を、Primus HT (MWG Biotech AG)を用いて、９６ウェルプレートにおいて油不含で行った。サイクル条件: ９５℃で１２０秒、３５ｘ[９５℃６０秒、６０℃３０秒、７２℃１１０秒]。反応後の清浄化を、最終のサンプル溶出のためにｄＨ2Ｏ(５０μｌ)を用いて、製造者推奨の説明に従って、Sephadex G-50 Superfine (17-0041-01, Amersham Pharmacia Biotech)を用いてゲルろ過(Millipore Filtration System)を行った。フォワードおよびリバース反応を、ＰＣＲ産物(２μｌのＰＣＲ産物、８μｌのSequencing Mix、０.６μｌの６pmol プライマー(上記参照)、ｄＨ２Ｏ、２０μｌ添加; DYEnamic ET Dye Terminator Sequencing Kit (US81095)の生成に使用したものと同じプライマーで行った。熱サイクル(３０ｘ [９５℃２０秒、５５℃１５秒、６０℃７０秒])後、サンプルを、上記記載のように主にゲルろ過によって清浄にし、LPA long-read matrixと下記シークエンス条件：３ｋＶで９０秒の注入、９ｋＶで３５分間の実施時間を用いて、MegaBACE1000 (Amersham Pharmacia Biotech)で分析した。
【実施例７】
【００８７】
実施例７
対立遺伝子特異的ＰＣＲアッセイ:
プライマーをｃＤＮＡ配列から構築し、４つの対立遺伝子特異的プライマーを構築し、変異の位置に３'塩基を持たせた。
【００８８】
プライマー配列:
Ｔ_ｆｗｄ: ５'-ＣＡＧ ＴＧＧ ＣＣＣ ＴＣＡ ＧＡＴ ＴＣＴ ＣＡＡ ＧＡＧ ＣＴＴ ＡＡＴ ＴＣＴ ＡＡＧ ＧＡＡ ＣＴＴ ＴＣＡ ＧＣＴ ＧＧＣ ＴＣＡ ＣＡＡ ＴＴＴ ＧＴＡ ＧＧＴ ＣＴＣ ＡＴＧ ＧＣＡ Ｔ-３' (配列番号３３)
Ｇ_ｆｗｄ: ５'-ＣＡＣ ＡＡＴ ＴＴＧ ＴＡＧ ＧＴＣ ＴＣＡ ＴＧＧ ＣＡＧ-３' (配列番号３４)
Ａ_ｒｅｖ: ５'-ＧＣＣ ＡＣＴ ＧＧＡ ＡＡＡ ＡＣＡ ＴＧＣ ＴＧＴ ＧＡＧ ＡＡＡ‐３' (配列番号３５)
Ｃ_ｒｅｖ_ｌｉｎｋ*：5'-aat gct act act att agt aga att gat gcc acc ttt tca gct cgc gcc cca aat gaa aat ata gct aaa cag gtt att gac cat ttg cga aat gta tct aat ggt caa act ttt ttC TGG AAA AAC ATG CTG TGA GAA C -3' (配列番号３６)
Ｆｗｄ: ５'-ＧＧＣ ＣＣＴ ＣＡＧ ＡＴＴ ＣＴＣ ＡＡＧ ＡＧＣ-３' (配列番号３７)
Ｒｅｖ: ５'-ＣＧＡ ＴＧＡ ＡＡＡ ＡＧＧ ＡＡＣ ＣＡＡ ＡＡＧ ＧＧ-３' (配列番号３８)
【００８９】
Ｃ_ｒｅｖ_ｌｉｎｋプライマーは、Ｍ１３ ファージ(小文字で示す)由来のリンカー配列を含有する。このリンカーを添加し、ＰＣＲ反応中にＣ-およびＡ-プライマーが重複するために、比較的長いＰＣＲ産物を得た。変異の位置にある３'塩基を太字で示した。Ｃ-およびＧ-プライマーは、野生型対立遺伝子について特異的であり、一方でＴ-およびＡ-特異的プライマーは、変異に特異的である。
【００９０】
プライマー対:
Ｃ-およびＡ-特異的マルチプレックス：Ｆｗｄ＋Ａ_ｒｅｖ＋Ｃ_ｒｅｖ_ｌｉｎｋ(ローアーストランド)
Ｔ-特異的反応: Ｔ_ｆｗｄ＋Ｒｅｖ (アッパーストランド)
Ｇ-特異的反応： Ｇ_ｆｗｄ＋Ｒｅｖ(アッパーストランド)
【００９１】
ＡＳ-ＰＣＲ条件:
各ＰＣＲ反応を、２０-１００ｎｇのゲノムＤＮＡ、０.０２５ユニット/μｌのBIOLASE Diamond ＤＮＡポリメラーゼ、０.７５ ｍＭ ｄＮＴＰ、３ｍＭ ＭｇＣｌ2、１ｘＮＨ４緩衝液(Bioline)中０.２５pmol/μｌプライマー (０.１２５pmol/μLのマルチプレックスにおける２つのリバースプライマー)を含有する１０μｌの容積で実施した。ＰＣＲを、GeneAmp(登録商標)PCR System 9700 (PE Ap-plied Biosystems)において、下記条件:９５℃で４分間、９４℃で３０秒、３０秒間勾配８０％で６２℃(Ｔ-およびＧ-反応については５６℃)、７２℃で３０秒、続いて最終伸長７２℃で７分間の３５サイクルを行い、４℃で貯蔵した。ＰＣＲ産物を２％のアガロースゲルで、２００Ｖ、３０分間で電気泳動に供した。
【００９２】
２つの野生型、２つのキャリアーおよび２つの罹患動物に関する対立遺伝子特異的ＰＣＲ分析の結果を図７に示した。
【００９３】
（図面の簡単な説明）
図１は、牛複合脊椎奇形(ＣＭＶ)座および牛染色体３上で５つのマイクロサテライトマーカーのハプロタイプを位置付けるのに使用した系統を示す。最も多いＣＭＶハプロタイプは太字である。黒四角は罹患子牛を示す。父系と母系の間の二重線は同系交配ループを示す。Ｎは動物の数を示す。１３頭の異なる母系の遺伝子型は簡素化のために示していない。
【００９４】
図２は、牛染色体３の遺伝子マップを示す。側面の数は、染色体と共にセンチモルガン(centiMorgan)(ｃＭ)で与えられる遺伝子距離を示す。牛複合脊椎奇形(ＣＭＶ) 座の最も多い位置を示した。
【００９５】
図３は、U.S. Meat Animal Research Center (Kappes et al. 1997)によって説明されたように、牛染色体３上にの３つのマイクロサテライトマーカーＩＬＳＴＳ０２９、ＢＭＳ２７９０およびＩＮＲＡ００３(牛染色体３上の表示Contigマーカー上に示した)間のｃＭの相対距離を示す。これら３マーカーを含有するＢＡＣを、高密度レプリカフィルター(ILSTS029およびINRA003)とのハイブリダイゼーションによって、またはＲＰＣＩ-４２牛ＢＡＣライブラリィ(BMS2790)のＰＣＲスクリーニングによって単離した。同定したＢＡＣを黒棒で示し、プレート数／ウェル数によって注釈を付けた。これらのＢＡＣを、ＳＰ６およびＴ７プライマーを用いる末端配列決定に、またはマイクロサテライトから伸長するプライマーを用いる配列決定に供した。得られる配列を、Sanger CentreでのEnsemble Serverを用いて、ヒト染色体１に対してブラスター化した。ブラストサーチからの受け入れ番号をヒト染色体１の下に示し、ヒット間の相対的距離をＭＢに示した。領域中の選択遺伝子をボックス中に示した。
【００９６】
図４は、ＳＬＣ３５Ａ３遺伝子のｃＤＮＡ配列 (配列番号１８)、翻訳およびコードされたアミノ酸配列(配列番号１７) を示す。５５９位の多形性ヌクレオチドおよび罹患バリン-１８０を太字で示す。
【００９７】
図５は、乳牛ＬＣ３５Ａ３と、ヒト(ＡＢ０２１９８１) (Ishida et al. 1999)およびイヌ(AF057365)(Guillen et al. 1998)の配列の推論アミノ酸配列の比較を示す。点は、Bos Taurus sequenceとマッチする残基を示す。ダッシュは、アラインメントを適切にするために導入されているギャップを示す。
【００９８】
図６は、配列決定によってＣＭＶ状態の測定において５５９位でＧ/Ｔ多形性を示す領域(ＳＬＣ３５Ａ３のヌクレオチド５４４から５７２）（図４を参照)の配列決定から得た結果を示す。左および右パネルは、フォワードおよびリバース配列を各々示す。上欄(―／―)は、野生型動物の配列を示し、中欄は、キャリアー(ヘテロ接合体)の配列を示し、下欄は、罹患動物の配列を示す。
【００９９】
図７は、２つの野生型、２つのキャリアーおよび２つの罹患動物からの対立遺伝子特異的ＰＣＲ産物を示す図である。注：ＷＴ：野生型、Ｃ:キャリアー、Ｓ：罹患、neg：ネガティブコントロール、Ｍ：マーカー(サイズラダー)。矢印は、対立遺伝子特異的ＰＣＲ産物を示す：Ｃ：２２０ｂｐ、Ａ：９８ｂｐ、Ｔ：３４０bpおよびＧ:２８８bp。
【０１００】
引用文献
1. Agerholm JS, Bendixen, C., Andersen O., Arnbjerg, J. (2000) LK meddelelser October 2000.
2. Barendse W, Vaiman D, Kemp SJ, Sugimoto Y, Armitage SM, Williams JL, Sun HS, Eggen A, Agaba M, Aleyasin SA, Band M, Bishop MD, Buitkamp J, Byrne K, Collins F, Cooper L, Coppettiers W, Denys B, Drinkwater RD, Easterday K, Elduque C, Ennis S, Erhardt G, Li L, Lil L (1997) A medium-density genetic linkage map of the bovine genome. Mamm Genome 8, 21-28.
3. Brueckner, K., Perez, L., Clausen, H., & Cohen, S., (2000) Glycosyltransferase activity of Fringe modulates Notch-Delta interactions Nature 406, pp. 411-415.
4. Evrad, Y. A., Lun, Y., Aulehla, A,. Gan, L., & Johnson, R. L. (1998) Lunatic fringe is an essential mediator of somite segmentation and patterning. Nature 394, pp. 377-381.
5. Guillen, E., Abeijon, C., & Hirschberg, C. B. (1998) Mammalian Golgi apparatus UDP-N-acetylglucosamine transporter: Molecular cloning by phenotypic correction of a yeast mutant. Proc. Natl. Acad. Sci.USA. 95, pp. 7888-7892.
6. Ishida, N., Yoshioka, S., Chiba, Y., Takeuchi, M., & Kawakita, M. (1999) Molecular cloning and functional expression of the human golgi UDP-N-acetylglucosamine transporter. J. Biochem. 126, pp. 68-77.
7. Kappes SM, Keele JW, Stone RT, McGraw RA, Sonstegard TS, Smith TP, Lopez-Corrales NL, Beattie CW (1997) A second-generation linkage map of the bovine genome. Genome Res 7, 235-249.
8. Klein, T., & Arias, M. (1998) Interactions among Delta, Serrate and Fringe modulate Notch activity during drosophila wing development. Development 125, pp. 2951-2962.
9. Lathrop GM, Lalouel JM, Julier C, Ott J (1985) Multilocus linkage analysis in humans: detection of linkage and estimation of recombination. Am J Hum Genet 37, 482-498
10. Moloney, D.J., Panin, V. M., Johnston, S. H., Chen, J., Shao, L., Wilson, Y., Stanley, P., Irvine, K. D., Haltiwanger, R. S., & Vogt, T. F. (2000) Fringe is a glycosyltransfer-ase that modifies Notch. Nature 406, pp 369-375.
11. Solinas-Toldo S, Lengauer C, Fries R (1995) Comparative genome map of human and cattle Genomics 27, 489-496.
【図面の簡単な説明】
【０１０１】
【図１】図１は、牛複合脊椎奇形(ＣＭＶ)座および牛クロモソーム３上で５つのマイクロサテライトマーカーのハプロタイプを位置付けるのに使用した系統を示す。最も多いＣＭＶハプロタイプは太字である。
【図２】図２は、牛クロモソーム３の遺伝子マップを示す。側面の数は、クロモソームと共にセンチモルガン(centiMorgan)(ｃＭ)で与えられる遺伝子距離を示す。牛複合脊椎奇形(ＣＭＶ) 座の最も多い位置を示した。
【図３】図３は、U.S. Meat Animal Research Center (Kappes et al. 1997)によって説明されたように、牛クロモソーム３上にの３つのマイクロサテライトマーカーＩＬＳＴＳ０２９、ＢＭＳ２７９０およびＩＮＲＡ００３(牛クロモソーム３上のContigマーカーに示した直線で示した)間のｃＭの相対距離を示す。
【図４】図４は、ｃＤＮＡ配列およびＳＬＣ３５Ａ３遺伝子 (配列番号１８)の翻訳およびコードしたアミノ酸配列(配列番号１７) を示す。
【図５】図５は、乳牛ＬＣ３５Ａ３と、ヒト(ＡＢ０２１９８１) (Ishida et al. 1999)およびイヌ(AF057365)(Guillen et al. 1998)の配列の推論アミノ酸配列の比較を示す。
【図６】図６は、シーケンスによるＣＭＶ状態の決定において５５９位置でＧ/Ｔ多型性を示す領域(ＳＬＣ３５Ａ３のヌクレオチド５４４から５７２）（図４を参照)のシーケンスから得た結果を示す。
【図７】図７は、２つの野生型、２つのキャリアーおよび２つの罹患動物からのアレイ特異的ＰＣＲ産物を示す図である。
【図２】
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【図３】
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【図６】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【手続補正書】
【提出日】平成15年7月16日(2003.7.16)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象牛における牛複合脊椎奇形（ＣＶＭ）を検出する方法であって、多形性マイクロサテライトマーカーＢＭ４１２９およびＢＭＳ１２６６によって挟まれ、これらを包む領域中の牛染色体ＢＴＡ上に位置する、牛複合脊椎奇形（ＣＶＭ）に関連する少なくとも１つの遺伝子マーカーの存在を同定するものであり、下記：
ａ）牛遺伝子材料を準備すること、
ｂ）該遺伝子材料において、牛複合脊椎奇形病特性に連鎖する少なくとも１つの遺伝子マーカーの存在または不存在を検出すること、
を含む方法。
【請求項２】
少なくとも１つの遺伝子マーカーが、約５９.５ｃＭ〜約６７.９ｃＭの領域に位置する、請求項１の方法。
【請求項３】
少なくとも１つの遺伝子マーカーが、多形性マイクロサテライトマーカーＩＮＲＡＡ００３とＢＭＳ９３７に挟まれ、これらを含む領域中に位置する、請求項２の方法。
【請求項４】
少なくとも１つの遺伝子マーカーが、多形性マイクロサテライトマーカーＩＮＲＡＡ００３とＩＬＳＴＳ０２９に挟まれ、これらを含む領域中に位置する、請求項３の方法。
【請求項５】
少なくとも１つの遺伝子マーカーが、マイクロサテライトマーカーＩＮＲＡＡ００３である、請求項１の方法。
【請求項６】
少なくとも１つの遺伝子マーカーが、マイクロサテライトマーカーＢＭＳ２７９０である、請求項１の方法。
【請求項７】
少なくとも１つの遺伝子マーカーが、マイクロサテライトマーカーＩＬＳＴＳ０２９である、請求項１の方法。
【請求項８】
少なくとも１つの遺伝子マーカーが、マイクロサテライトマーカーＩＮＲＡ１２３である、請求項１の方法。
【請求項９】
少なくとも１つの遺伝子マーカーが、マイクロサテライトマーカーＢＭ２２０である、請求項１の方法。
【請求項１０】
少なくとも１つの遺伝子マーカーが、マイクロサテライトマーカーＨＵＪ２４６である、請求項１の方法。
【請求項１１】
少なくとも１つの遺伝子マーカーが、マイクロサテライトマーカーＢＭＳ８６２である、請求項１の方法。
【請求項１２】
少なくとも１つの遺伝子マーカーが、マイクロサテライトマーカーＢＭＳ９３７である、請求項１の方法。
【請求項１３】
少なくとも１つの遺伝子マーカーが、牛複合脊椎奇形病を起こす遺伝子に連鎖している、請求項１の方法。
【請求項１４】
牛複合脊椎奇形病を起こす遺伝子が、牛ＳＬＣ３５Ａ３遺伝子である、請求項１３の方法。
【請求項１５】
牛ＳＬＣ３５Ａ３遺伝子が、配列番号１７に示されるアミノ酸配列を含む牛ＳＬＣ３５Ａ３タンパク質をコードする、請求項１４の方法。
【請求項１６】
牛ＳＬＣ３５Ａ３タンパク質が、配列番号１８のヌクレオチド配列を含むｃＤＮＡ配列によりコードされる、請求項１５の方法
【請求項１７】
遺伝子マーカーが、配列番号１８のヌクレオチド５５９に等価の位置での単一ヌクレオチド多形性である、請求項１６の方法。
【請求項１８】
単一ヌクレオチド多形性が、Ｇ／Ｔ多形性である、請求項１７の方法。
【請求項１９】
Ｇ／Ｔ多形性の検出が、対立遺伝子特異的ＰＣＲ、ミニシークエンス、プライマー伸長法、ピロシークエンス、ＰＣＲ−ＲＦＬＦ、遺伝子特異的ローリングサイクル増幅法、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析に続くプライマー伸長法よりなる群から選ばれる技法により行われる、請求項１８の方法。
【請求項２０】
少なくとも１つの遺伝子マーカーが、牛複合脊椎奇形病を起こす遺伝子または疾患特性に、少なくとも５.０、少なくとも６.０、少なくとも７.０、少なくとも８.０、少なくとも９.０、少なくとも１０.０、少なくとも１１.０、少なくとも１２.０を含む少なくとも４.０などの少なくとも３.０のロッドスコアーで遺伝的に連鎖している、請求項１の方法。
【請求項２１】
少なくとも１つのマーカーが、遺伝子マーカーの組合せである、請求項１の方法。
【請求項２２】
マイクロサテライトマーカーＩＮＲＡＡ００３を増幅するためのプライマー対が、配列番号１および配列番号２である、請求項５の方法。
【請求項２３】
マイクロサテライトマーカーＢＭＳ２７９０を増幅するためのプライマー対が、配列番号３および配列番号４である、請求項６の方法。
【請求項２４】
マイクロサテライトマーカーＩＬＳＴＳ０２９を増幅するためのプライマー対が、配列番号５および配列番号６である、請求項７の方法。
【請求項２５】
マイクロサテライトマーカーＩＮＲＡ１２３を増幅するためのプライマー対が、配列番号７および配列番号８である、請求項８の方法。
【請求項２６】
マイクロサテライトマーカーＢＭ２２０を増幅するためのプライマー対が、配列番号９および配列番号１０である、請求項９の方法。
【請求項２７】
マイクロサテライトマーカーＨＵＪ２４６を増幅するためのプライマー対が、配列番号１１および配列番号１２である、請求項１０の方法。
【請求項２８】
マイクロサテライトマーカーＢＭＳ８６２を増幅するためのプライマー対が、配列番号１３および配列番号１４である、請求項１１の方法。
【請求項２９】
マイクロサテライトマーカーＢＭＳ９３７を増幅するためのプライマー対が、配列番号１５および配列番号１６である、請求項１２の方法。
【請求項３０】
牛複合脊椎奇形（ＣＶＭ）に関連する少なくとも１つの遺伝子マーカーの対象牛における存在を検出するために使用する診断キットであって、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８およびこれらの組合せよりなる群から選ばれる少なくとも１つのオリゴヌクレオチド配列を含むキット。
【国際調査報告】
2004519219.tif 000057
2004519219.tif 000058
2004519219.tif 000059