(57)【要約】非産生性のストレプトミセス属の放線菌系統において、ランチビオティックのシンナマイシンの産生能力をもたらす17 kbの核酸断片をストレプトミセス・シンナモニウス・シンナモニウス DSM 40005（Streptomyces cinnamoneus cinnamoneus DSM 40005）から単離し、その性質を調べた。また、非必須遺伝子が除かれた変異体、およびシンナマイシンの構造遺伝子のプロペプチド配列が改変されている変異体（例えば類似のB型ランチビオティックのプロペプチド配列に置換されているもの）を含む、この17 kbの断片の変異体も提供する。またベクター、宿主細胞、および本発明の核酸を用いるランチビオティックの産生法、ならびに変異体のライブラリーも提供する。
2004526456.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
cinAのorf、cinMのorf、および選択的にcinXのorfを含む発現カセット。
【請求項２】
cinAのorf、cinMの orf、および選択的にcinXのorfをともに含む、核酸のセット。
【請求項３】
cinAの読み枠（orf）、cinMのorf、cinTのorf、cinHのorf、およびcinYのorf、ならびに選択的にcinXのorfを含む、発現カセット。
【請求項４】
cinAのorf、cinMのorf、cinTのorf、cinHのorf、およびcinYのorf、ならびに選択的にcinXのorfをともに含む核酸のセット。
【請求項５】
単離された核酸のセットである、請求項4記載の核酸のセット。
【請求項６】
SARP結合部位、cinorf7のorf、cinRのorf、cinKのorf、およびcinR1のorfをさらに含む、請求項3〜5のいずれか一項記載のカセットまたはセット。
【請求項７】
SARP結合部位がcinorf7のorfの上流に位置する、請求項6記載のカセットまたはセット。
【請求項８】
cinorf7のorfが、cinA、cinM、cinX、cinT、cinH、およびcinYのorfとオペロンを形成する、請求項7記載のカセットまたはセット。
【請求項９】
cinorf3、cinorf4、smallorf、cinZ、cinorf8、cinorf9、cinorf10、cinorf11、cinorf12、cinorf13、およびcinorf14からなる群より選択される、1つまたは複数のorfをさらに含む、請求項3から8いずれか一項記載のカセットまたはセット。
【請求項１０】
1つまたは複数のorfが、cinorf4、smallorf、cinZ、cinorf8、cinorf9、cinorf10、cinorf11、およびcinorf12からなる群より選択される、1つまたは複数のorfを含む、請求項9記載のカセットまたはセット。
【請求項１１】
1つまたは複数のorfが、smallorf、cinZ、cinorf8、cinorf9、cinorf10、およびcinorf11からなる群より選択される1つまたは複数のorfを含む、請求項10記載のカセットまたはセット。
【請求項１２】
1つまたは複数のorfが、cinZおよび/またはcinorf8を含む、請求項11記載のカセットまたはセット。
【請求項１３】
任意の1つまたは複数のorf、または個々のorfがそれぞれ、図7〜27に記載されたorf（群）（cinorf3および/またはcinorf14については部分）の対応するアミノ酸配列に同一なアミノ酸配列、または変異体を有するポリペプチドをコードする核酸配列を有する、請求項3〜12のいずれか一項記載のカセットまたはセット。
【請求項１４】
変異体のアミノ酸配列が、orfの対応するアミノ酸配列と少なくとも80%のアミノ酸配列同一性を有する、請求項13記載のカセットまたはセット。
【請求項１５】
任意の1つまたは複数のorf、または個々のorfがそれぞれ、図4に記載されたorfの対応する核酸配列に同一な核酸配列、または変異体を有する、請求項3から14のいずれか一項記載のカセットまたはセット。
【請求項１６】
cinAのorfが、図11のポリペプチド配列をコードし、選択的に、デュラマイシンA、B、もしくはC、またはアンコベニンのプロペプチド配列中の、対応する位置に存在するアミノ酸と置換されたプロペプチド配列の、1個または複数のアミノ酸を共にコードする、請求項14または15記載のカセットまたはセット。
【請求項１７】
宿主細胞内におけるorfの転写および翻訳の誘導に適した調節配列をさらに含む、請求項3から16のいずれか一項記載のカセットまたはセット。
【請求項１８】
前記請求項のいずれか一項記載の、カセットまたはセットを含む、またはともに含む、ベクターまたはベクターのセット。
【請求項１９】
前記請求項のいずれか一項記載の、発現カセット、核酸のセット、ベクター、またはベクターのセットを含む、発現系。
【請求項２０】
細胞である、請求項19記載の発現系。
【請求項２１】
細胞が細菌である、請求項20記載の発現系。
【請求項２２】
細菌が放線菌である、請求項21記載の発現系。
【請求項２３】
放線菌がストレプトミセス属の放線菌である、請求項22記載の発現系。
【請求項２４】
ストレプトミセス科の放線菌がS. リビダンスである、請求項23記載の発現系。
【請求項２５】
請求項19〜24のいずれか一項記載の発現系を提供する段階、および該発現系を培養して対象の核酸を発現させる段階を含む方法。
【請求項２６】
発現産物がランチビオティックである、請求項25記載の方法。
【請求項２７】
発現産物を発現系から回収する段階をさらに含む、請求項25または26記載の方法。
【請求項２８】
発現産物を精製する段階をさらに含む、請求項25〜27のいずれか一項記載の方法。
【請求項２９】
請求項25〜28のいずれか一項記載の方法によって産生される発現産物。
【請求項３０】
以下の段階を含む、ランチビオティックを産生する宿主細胞のライブラリーを作製する方法：
請求項1〜18いずれか一項記載のさまざまな核酸、核酸のセット、ベクター、またはベクターのセットでそれぞれ形質転換された複数の宿主細胞を提供する段階；および選択的に、
ランチビオティック産生に関して細胞をスクリーニングする段階。
【請求項３１】
天然のシンナマイシン生合成クラスターと比較して、関心対象の変異、および/または有利な変異に関して、宿主細胞をスクリーニングする段階をさらに含む、請求項30記載の方法。
【請求項３２】
核酸、核酸のセット、ベクター、またはベクターのセットが、別のcinAのorfを含む点で異なる、請求項30または31記載の方法。
【請求項３３】
請求項30から32のいずれか一項記載の方法によって作製された、または作製可能な、ランチビオティック産生宿主細胞のライブラリー。
【請求項３４】
以下の段階を含む方法：
請求項33記載のランチビオティック産生宿主細胞のライブラリーを提供する段階；および
ランチビオティックの産生に適した条件下で宿主細胞を培養し、それによりランチビオティックのライブラリーを作製する段階。
【請求項３５】
産生されたランチビオティックを精製する、1つまたは複数の段階をさらに含む、請求項34記載の方法。
【請求項３６】
請求項34または35記載の方法によって作製された、または作製可能な、ランチビオティックのライブラリー。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ランチビオティック（lantibiotic）のシンナマイシン（cinnamycin）、およびその改変型を産生するための材料および方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ランチビオティックは、グラム陽性細菌が産生する抗生物質活性を有するペプチドである。ランチビオティックには、他の改変型残基、ペプチド鎖を架橋して多環構造を形成する、チオエーテルアミノ酸のランチオニンおよびメチルランチオニンなどが含まれる。ランチビオティックは、2つのクラス（A型とB型）に分類されているが、このような分類に問題がないわけではない。A型ランチビオティックは一般に、細菌および他の形質膜に孔の形成を可能とする両親媒性残基をもつ。A型ランチビオティックの例にはニシンおよびサブチリンがある。これとは対照的に、B型ランチビオティックは球状で、酵素機能を阻害する立体構造が明らかにされているペプチドである。B型ランチビオティックの例にはシンナマイシンおよびデュラマイシン（duramycin）がある。
【０００３】
シンナマイシンなどのB型ランチビオティックのもつ活性には、抗菌活性（抗生物質としての応用が考えられる）、アンジオテンシン交換酵素の阻害（血圧調節における応用が考えられる）、ホスホリパーゼA2の阻害を介する免疫調節（抗炎症薬としての応用が考えられる）、ならびにプロスタグランジンおよびロイコトリエンの生合成に対する干渉などが含まれる。
【０００４】
B型ランチビオティックは、それぞれの基質をブロックすることで酵素活性に干渉することで活性を発揮すると考えられている。例えばB型ランチビオティックは、ペプチドグリカンの生合成を阻害することが知られており、グリコシル転移が標的反応として同定されている。この反応の基質は、脂質に結合した細胞壁前駆体脂質IIである。これは抗生物質バンコマイシンの標的であるが、作用部位は異なり、また任意の現在の抗菌薬では対象とならない新しい標的結合部位の1つである。
【０００５】
抗菌活性は、特にバシラス（Bacillus）系統に関して、膜機能、ATP依存性プロトン転移、およびCa2+の取込み、ならびにATPアーゼに関して記載された作用とともに確認されている。また、ホスファチジルエタノールアミンを含む平面状の膜における明瞭な孔が形成されることについても報告されている。このような作用は、B型ランチビオティックとホスファチジルエタノールアミンとの特異的な結合に帰することができる。
【０００６】
ランチビオティックは、食品添加物およびプロピオニバクテリウム・アクネス（Propionibacterium acnes）、および問題となることの多い病原体（多くの一般的に使用されている抗生物質に対して耐性をもつか、または耐性を発現する、問題のある病原体、例えばメチシリン-耐性黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）（MRSA）、肺炎連鎖球菌（Streptococcus pneumoniae））に対する抗菌剤として効力および有用性をもつことが報告されている。
【０００７】
総説として、サール（Sahl）およびビーアマン（Bierbaum）、（1998）、Annu. Rev. Microbiol. 52：41-79；ジャック（Jack）およびサール（Sahl）、（1995）、TIBTECH 13：269-278；ガソン（Gasson）、（1995）、「Lantibiotics」第10章、バイニング（Vining）およびスチュタード（Stuttard）（編）、「Biotechnology Series：Genetics and Biochemistry of Antibiotic Production」、Biotechnological Series 28、283-306頁を参照されたい。
【０００８】
したがって、ランチビオティックの産生法、およびランチビオティックの変異体（天然型より改善している場合がある）の産生は非常に望ましい。
【０００９】
本発明者らは、ストレプトミセス・シンナモニウス・シンナモニウス DSM 40005（Streptomyces cinnamoneus cinnamoneus DSM 40005）に由来するB型ランチビオティックのシンナマイシンの生合成遺伝子クラスターをクローン化し、配列を決定し、また構造および調節に関する情報の詳細を明らかにした（いずれも最初の成功と考えられる）。このクラスターに由来する17 kbのDNAセグメントを含むプラスミド（pDWFT9）をシンナマイシン非産生系統のストレプトミセス・リビダンス（Streptomyces lividans）に導入し、シンナマイシン産生能力をもたらした。本発明者らはまた、シンナマイシンの産生能力をもたらすと考えられる最小セットの遺伝子群、および他の新しいランチビオティックを産生する可能性のある変異体である、シンナマイシン産生系統に由来する変異体系統を作る方法も提案する。
【００１０】
別のB型ランチビオティック（マーササイジン（mersacidin））の生合成に関連する遺伝子クラスターの存在が報告されているが、マーササイジンの生合成遺伝子クラスターと、本明細書で報告されている生合成遺伝子クラスターとの間の相同性は1つの遺伝子（本明細書ではcinMと呼ぶ遺伝子）だけにおけるものであり、また極めて低いレベルである。
【００１１】
したがって、この17 kbのセグメントは、S. リビダンス（S.lividans）にシンナマイシン産生能力をもたらすのに十分である。しかし本発明者らは、このセグメントに、上記機能に不可欠でない遺伝子が含まれることも提案する。シンナマイシンの構造遺伝子（文献に報告済み）であるcinAとは異なり、シンナマイシンの産生に必要な他の遺伝子配列でこれまで詳細が明らかにされた例はない。本明細書では、このような遺伝子群について提案を行う。また推定遺伝子cinR1は、シンナマイシン産生の正常な調節に関与すると本発明者らが考える、pDWFT9上の遺伝子群を同定する際に重要な役割を果たす。
【００１２】
推定遺伝子cinR1は、ストレプトマイセス（Streptomyces）抗生物質調節タンパク質（SARP）と呼ばれる、転写調節因子ファミリーの遺伝子である。本明細書は、SARPの制御を受けてランチビオティックが産生されることの最初の報告である（特にマーササイジン遺伝子クラスターはSARPによる調節を受けないようである）。このファミリーの調節因子は、特定のヌクレオチド部位においてDNAに結合する。このような部位は、（各モチーフの先頭の塩基から数えて）11塩基の倍数で反復される5塩基、6塩基、または7塩基の反復性の保存されたモチーフを特徴とする。シンナマイシンおよびデュラマイシンの生合成クラスターにおけるSARP結合部位のコンセンサス配列はTGAAAである（Nを任意の塩基とする11塩基のTGAAANNNNNN反復ユニットの一部を形成する）。最後のモチーフの後には通常、複数の11＋5または6塩基（例えば5、6、16、17、27、28、38、または39塩基）において-10 RNA-ポリメラーゼプロモーター部位が続く（コンセンサス配列はTAGTGT）。これは、保存されたモチーフを、らせんの一面と、反対側では-10プロモーター部位に対して位置させる作用をもつ。図4の配列（17 kbのセグメントを示す）をみると、このモデルにあう1か所の部位が、cinorf7と命名された読み枠の上流にある。この部位は、6塩基で隔てられた3個のペンタマーTGAAAと、これに続く推定-10プロモーター配列TAGTGTを含む。
【００１３】
この部位の下流には、1つのオペロンを形成していると考えられるcinorf7、cinA、cinM、cinX、cinT、cinH、およびcinYと命名された、同じ方向の7つの遺伝子群が存在する。この事実から、本発明者らは、これらがすべてシンナマイシンの産生または調節に関与すると提案する。
【００１４】
cinA遺伝子はシンナマイシンの構造遺伝子であると既に報告されている（Kaletta ら、（1991）、Eur.J.Biochem. 199（2）：411-415）。
【００１５】
cinM遺伝子は、既知タンパク質との相同性から、cinA遺伝子の翻訳産物を翻訳後に修飾して、成熟型シンナマイシンのランチオニン残基の導入に関与するタンパク質をコードすると考えられている。しかし、決定されていることが現在わかっている他の唯一のB型生合成遺伝子クラスターである、マーササイジン生合成遺伝子クラスターに含まれる同等の遺伝子（mrsM）との相同性のレベルは極めて弱い。本明細書に記載された実験は、cinMがシンナマイシンの産生に不可欠なことを示している。
【００１６】
cinT遺伝子およびcinH遺伝子は、プレシンナマイシンを細菌細胞から運び出す段階に関与するABC-カセットトランスポーターをコードすると提案されている。
【００１７】
cinX遺伝子およびcinY遺伝子は、プレシンナマイシンの成熟（すなわちリーダー配列の切断）、および/またはシンナマイシンの非ランチオニン修飾（すなわちリシン-アラニン環、およびヒドロキシ-アスパラギン酸残基）の導入に関与すると提案されている。具体的にはcinXは、酸素原子をアスパラギン酸残基に付加してベータ-ヒドロキシアスパラギン酸を形成して、シンナマイシンのプロペプチドの翻訳後修飾に関与すると提案されている。本明細書に記載された実験は、cinX遺伝子の機能的欠失が、シンナマイシン（分子量2039）と比較して、分子量が2023の産物を生じることを示している。興味深いことに、この産物も抗菌活性を示すので、cinXが、シンナマイシンの産生に必要な可能性がある一方で、ランチビオティックの1個または複数の活性を有する変異体の産生には不可欠ではない可能性があることがわかる。
【００１８】
cinorf8推定遺伝子産物は、CoA結合モチーフを含むと考えられており、またプロシンナマイシン配列のアスパラギン酸残基へのCoAの付加、または同アスパラギン酸残基からのCoAの除去によって、シンナマイシン中間体の修飾に関与すると考えられている。
【００１９】
cinorf7推定遺伝子産物は、シンナマイシン産生の調節に部分的に関与する別の菌対数感知ペプチドである可能性がある。本明細書に記載された実験は、この遺伝子が、シンナマイシンの産生に不可欠ではないことを示している。しかし、本明細書で使用されるシンナマイシン生合成断片に関しては、cinorf7はシンナマイシンの高レベルの発現に不可欠であると考えられる。この事実は、cinorf7が調節的役割を果たすという推定を支持する。
【００２０】
推定SARP遺伝子（cinR1）の調節には、cinorf7の産物と反応する可能性がある推定遺伝子cinKおよびcinRによる2成分系が介在すると考えられている。
【００２１】
このことから、17 kbのセグメント以外の少数の遺伝子を含むカセットも、S. リビダンス（S.lividans）などの非産生系統に、シンナマイシンの産生能力をもたらす可能性があると提案されている。
【００２２】
特に、cinA、cinM、cinX、cinT、cinH、cinY遺伝子を含むカセットも、非産生系統にシンナマイシン産生能力をもたらす可能性があると提案されている。
【００２３】
しかし上述したように、cinX遺伝子の機能的欠失は、シンナマイシンと若干異なるランチビオティックの産生能力をもたらす。したがって、このカセットの成分は任意の存在とみなすことができる。
【００２４】
このようなカセットは、、産生系統における作用と同様に、シンナマイシン産生を調節できない可能性があると考えられている。したがって好ましいカセットは、SARP結合部位、ならびにcinorf7、cinR、cinK、およびcinR1の各遺伝子も含む。
【００２５】
したがって本発明は、第1の局面では、cinAの読み枠（orf）、cinMのorf、選択的にcinXのorf、cinTのorf、cinHのorf、およびcinYのorfを含む発現カセットを提供する。
【００２６】
このような構築物は、上記モデルによって、ランチビオティックの発現を誘導すると推定される最小発現カセットである。
【００２７】
好ましくは、これらのorfは、1つの発現カセット上に提供されるが、orfが別個に（例えば望ましい宿主に同時に導入可能な2つのベクター上に）提供されることも対象となる。
【００２８】
したがって、この第1の局面では、本発明は、cinAのorf、cinMのorf、選択的にcinXのorf、cinTのorf、cinHのorf、およびcinYのorfを併せて含む核酸のセットも提供する。
【００２９】
好ましくは、このセットは、核酸の単離されたセットである。
【００３０】
好ましくは、このようなカセットまたはセットは、SARP結合部位、cinorf7のorf、cinRのorf、cinKのorf、およびcinR1のorfをさらに含む。これらは、産生系統におけるシンナマイシンの産生を調節して、高細胞密度における発現を可能とすると考えられている。SARP結合部位は、好ましくはcinorf7のorfの上流に位置し、好ましくはcinA、cinM、cinX、cinT、cinH、およびcinYのorfとオペロンを形成する。
【００３１】
好ましくは、このような発現カセットまたはセットは、産生系統におけるシンナマイシン産生に重要な役割を果たす可能性がある、以下の1つまたは複数のorfをさらに含む：cinorf3、cinorf4、smallorf、cinZ、cinorf8、cinorf9、cinorf10、cinorf11、cinorf12、cinorf13、およびcinorf14。
【００３２】
これらのうち、特にcinorf3、cinorf13、およびcinorf14は、シンナマイシン（または他のランチビオティック）の産生に不可欠ではないと考えられている。cinorf4およびcinorf12は、不要であるとも考えられている。
【００３３】
したがって、上記のorf（特にcinorf3、cinorf4、smallorf、cinZ、cinorf8、cinorf9、cinorf10、cinorf11、cinorf12、cinorf13、およびcinorf14）のうち、smallorf、cinZ、cinorf8、cinorf9、cinorf10、およびcinorf11の1個または複数（より好ましくはすべて）は、本発明の好ましい態様に含めることができる。これらのうち、好ましくはcinorf8および/またはcinorfZは特に好ましい。cinorf3、cinorf13、およびcinorf14の1個または複数（好ましくはすべて）は、好ましい態様では存在しないか、または機能的に欠失した状態にある場合がある。同様にcinorf4および/または（好ましくは「および」）cinorf12は、好ましい態様では存在しないか、または機能的に欠失した状態にある場合がある。
【００３４】
好ましくは、例えばcinAのorfは、図11に記載された天然のCinAのアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列、または変異体のアミノ酸配列（後述）を有するポリペプチドをコードする核酸配列を有する。
【００３５】
好ましくはcinAのorfは、図4に記載された17 kbのセグメントのcinAのorfの核酸配列と同一の核酸配列、または変異体（後述）の核酸配列を有する。図4のレジェンドに記載されているように、cinAのorfは1671番目の塩基から始まり1907番目の塩基で終わる。
【００３６】
先行する2つのパラグラフは、本明細書で言及された他のorfに（独立に）準用される。すべてのorfのアミノ酸配列を図7〜27に示し、また17 kbのセグメントの核酸配列を図4に示し、そのレジェンドで各orfの開始塩基と終了塩基を記載した。
【００３７】
cinAに関しては、好ましい変異体は、CinAのプロペプチド配列の1個または複数のアミノ酸が、他のB型ランチビオティック、特にデュラマイシンA、B、もしくはC、またはアンコベニン（ancovenin）などの類似のB型ランチビオティックのプロペプチドの配列に対応する位置のアミノ酸と置換されている、CinAの変異体をコードする。置換の組み合わせ（例えば1個または複数のアミノ酸が、他の1つのB型ランチビオティックのプロペプチド配列の対応する位置のアミノ酸（群）と置換されること、また1個または複数のアミノ酸が、第2の、またはさらに別のB型ランチビオティックのプロペプチド配列の対応する位置のアミノ酸（群）と置換されること）も対象とされる。
【００３８】
CinAのプロペプチド配列を以下に示す（デュラマイシンA、B、およびC、ならびにアンコベニンの残基は、シンナマイシンのプロペプチド配列とは異なる）。
2004526456.tif 000003
【００３９】
しかしcinAの変異体は（付加的または二者択一的に）、他の既知のB型ランチビオティックの対応するものに対して他の差を含む場合がある。また好ましい差は、プロペプチド配列内に存在し、好ましくはプロペプチド配列の2番目、3番目、7番目、10番目、12番目、および13番目の1か所または複数の位置（シンナマイシン、デュラマイシンA、B、およびC、ならびにアンコベニンで異なる部位）にある。
【００４０】
発現カセットまたはセットは通常、カセット内のorfの、宿主細胞における転写および翻訳の誘導に適した調節配列をさらに含む。しかし核酸のセットは例えば、このような調節配列を含むことなく提供される場合があるが、宿主細胞における発現の調節配列と関連する場合がある。
【００４１】
特に、cinR、cinK、cinR1、および/またはcinorf7のorf、および/またはSARP結合部位を欠く態様の場合、調節配列は、17 kbのセグメントに対して異種の場合がある（例えば、宿主細胞における発現の構成的プロモーター）。しかし、上記のorfおよびSARP結合部位を含む好ましい態様では、調節配列は17 kbのセグメント中に存在する配列と同一である場合があるほか、その変異体である場合がある。特に、このようなカセットまたはセットは、好ましくは以下を含む：cinorf7のorfの上流の調節配列（この配列はSARP結合部位を含む）、またはその変異体；cinKのorf（存在する場合）の上流の調節配列；およびcinR1のorf（存在する場合）の上流の調節配列。他のorfは、上記orfからのリードスルーによって転写される場合があるが、例えばリボソーム結合部位を含む別の調節配列を必要とする場合がある。このような調節配列は、17 kbのセグメント（または変異体）の内部配列に対応する場合がある。
【００４２】
cinorf7のorfの好ましい調節配列は、図4の1199〜1266位の塩基の一部または全体、またはその変異体を含む場合があり、また特に図4の1185〜1228位の塩基、またはその変異体を含む場合がある。後者の配列は、17 kbのセグメント中に存在するSARP結合部位およびリボソーム結合部位を含む。代替的な、または別の定義では、このような調節配列は、好ましくは本明細書で説明されたコンセンサス配列を含み、より好ましくは相互に実質的に同じ関係をもち、また本明細書に記載されたcinorf7のorfの開始点を含む。
【００４３】
cinKのorfの好ましい調節配列は、図4の13256〜12823位の塩基の相補物の一部または全体、またはその変異体を含む場合がある。
【００４４】
cinR1のorfの好ましい調節配列は、図4の15380〜15161位の塩基の相補物の一部または全体、またはその変異体を含む場合がある。
【００４５】
上述したように、他の調節配列が、本明細書に記載された核酸配列とともに使用される場合があることも対象となる。例えば、上述のSARP関連調節構造と考えられる構造（例えばSARP結合部位、cinorf7、cinR、cinK、およびcinR1の各遺伝子）を欠く核酸の発現カセットまたはセットは、構成的または誘導的のプロモーターの制御下にある遺伝子群を含む場合がある。このようなプロモーターの詳細については例えば、カイザー（Kieser）ら、（2000）、「Practical Streptomyces Genetics」、The John Innes Foundationを参照されたい。
【００４６】
本明細書に記載されたいくつかのorfは、翻訳段階で共役している（すなわち1つのorfの停止コドンが、同時に転写されるorfの開始コドンと重複している）と考えられている。リボソームが、このようなorfの両方を、第2のorf用の別のリボソーム結合部位を必要とすることなく化学量論的に翻訳可能であると考えられている。
【００４７】
予備的な結果（本明細書には含まれない）によれば、cinA、cinM、およびcinXの各遺伝子のみを含むカセットは、低レベルのシンナマイシン産生能力しかもたらすることができないことがわかっている。したがって、cinAのorf、cinMのorf、および選択的にcinXのorfのみを含む最小のカセットまたはセットが、ランチビオティックの産生能力をもたらすとみなすることもできる。このようなカセットまたはセットも、本発明のこの局面に含まれると考えられる。好ましい性質については既に述べた。
【００４８】
第2の局面では、本発明は、本発明の第1の局面の発現カセットを含むベクターを提供する。さらに、本発明の第1の局面の核酸のセットを含むベクターのセットを提供する。
【００４９】
細菌への導入用の核酸を含む適切なベクターは、付加的なプロモーター、ターミネーター断片、エンハンサーエレメント、マーカー遺伝子、および他のエレメントを適宜含む、適切な付加的な調節エレメントを必要であれば含むものを選択または構築することができる。ベクターは、プラスミド、ウイルス（例えば必要に応じてAphageまたはAphagemid）の場合がある。詳細については例えば、サンブルック（Sambrook）ら、（1989）、「Molecular Cloning、A Laboratory Manual」、第2版、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harborを参照されたい。例えば、核酸構築物の調製、変異導入、配列決定、細胞へのDNAの導入、および遺伝子発現、ならびにタンパク質の解析における核酸の操作に関する多くの既知の手法およびプロトコルについては、アウシュベル（Ausubel）ら、（1995）、「Current Protocols in Molecular Biology」、Wiley Interscience Publishersで詳しく説明されている。ストレプトミセス種を対象とした上記手法の使用法の多くの局面は、ホップウッド（Hopwood）ら、（1985）、「Genetic Manipulation of Streptomyces a Laboratory Manual」（Norwich：John Innes Foundation）、およびカイザー（Kieser）ら、（2000）で詳しく説明されている。サンブルック（Sambrook）ら、アウシュベル（Ausubel）ら、ホップウッド（Hopwood）ら、およびカイザー（Kieser）らの文献に記載された内容は、以上の目的および他のすべての目的で、すべて参照として本明細書に組み入れられる。
【００５０】
第3の局面では、本発明は、本発明の第1の局面の発現カセットまたは核酸のセットを含む発現系、および本発明の第2の局面のベクターまたはベクターのセットを含む発現系を提供する。
【００５１】
好ましくは、この発現系は、宿主細胞または細胞培養物であるが、無細胞発現系も対象となる。好ましくは宿主細胞または培養物は細菌であり、より好ましくは放線菌であり、さらに好ましくはストレプトミセス科の放線菌（例えばS.lividans、またはS.coelicolor A3（2）、特にS.lividans）である。
【００５２】
一般に（特にインビトロにおける導入用の）「形質転換」に制限されない発現カセット、核酸のセット、またはベクター（群）の宿主細胞への導入は、任意の利用可能な手法で行うことができる。細菌の細胞の場合、適切な手法には、塩化カルシウム形質転換法、ポリエチレングリコールを用いた形質転換法、エレクトロポレーション法、接合法、およびトランスフェクション法、またはバクテリオファージを用いる形質導入法などがある。
【００５３】
第4の局面では、本発明は、第3の局面の宿主細胞（または他の発現系）を提供する段階、および宿主細胞を培養して対象核酸を発現させる段階を含む、対象核酸を発現させる方法を提供する。
【００５４】
疑念が生じることを避けるために言えば、対象核酸は、宿主細胞を培養することで、シンナマイシンまたはその変異体（例えばCinX遺伝子産物によりアスパラギン酸残基が翻訳後にベータ-ヒドロキシアスパラギン酸に変換されていないデオキシシンナマイシン、またはcinXの有無を問わないcinAの変異体の発現の産物）の産生が導かれる、第1の局面の発現カセットまたは核酸のセットである。
【００５５】
好ましくは、対象核酸は、宿主細胞の培養物が高細胞密度に達した場合、より好ましくは、宿主細胞の培養が定常状態に至るか、または定常状態に近くなった場合にのみ実質的に発現される。定常状態にある細胞培養物、または定常状態に近い細胞培養物のOD650値は1〜20の範囲の場合がある。
【００５６】
既知の細胞培養法が当技術分野では知られており、例えばサンブルック（Sambrook）ら、（1989）、アウシュベル（Ausubel）ら、（1992）、および（特にストレプトミセス種に関しては）ホップウッド（Hopwood）ら、（1985）、およびカイザー（Kieser）ら、（2000）で説明されている。
【００５７】
発現系の発現産物は回収して精製することができる。これは従来の方法で行うことができる。方法については例えば、マクダニエル（McDaniel）ら、（1993）を参照されたい。
【００５８】
したがって第5の局面では、本発明は、本発明の第4の局面の方法で作られた発現産物を提供する。
【００５９】
第6の局面では、本発明は、cinorf3、cinorf4、smallorf、cinorf7、cinA、cinM、cinX、cinT、cinH、cinY、cinZ、cinorf8、cinorf9、cinR、cinK、cinorf10、cinorf11、cinR1、cinorf12、cinorf13、およびcinorf14の各orf、また選択的に1つの調節領域または複数の調節領域の1個または複数を本質的に含む核酸分子を提供する。複数の調節領域が存在する場合、orf（群）のプロモーター配列（群）を含む場合がある。2個またはそれ以上のorfが存在する場合、1つまたは複数のorfの調節領域は、orfとorfの間に存在する場合がある。
【００６０】
これらのorfについては既に説明した。
【００６１】
不完全な状態で本明細書に開示されているcinorf3およびcinorf14に関しては、本発明者らは、完全長のorfを既知の手法で容易に入手できると思われる。
【００６２】
第7の局面では、本発明は、発現系におけるランチビオティックの産生に関して、または産生を目的とした、第6の局面で説明された1個または複数の核酸分子の使用法を提供する。
【００６３】
第8の局面では、本発明は、cinorf3、cinorf4、smallorf、cinorf7、cinA、cinM、cinX、cinT、cinH、cinY、cinZ、cinorf8、cinorf9、cinR、cinK、cinorf10、cinorf11、cinR1、cinorf12、cinorf13、およびcinorf14のうち1つのorfがコード可能なポリペプチドを提供する。好ましくは、このようなポリペプチドは、天然の状態で結合した状態にある他のタンパク質から実質的に単離される。
【００６４】
これらのポリペプチドは好ましくは、図7〜27に示されたうちの1つのアミノ酸配列を有する。しかし、この局面では、これらのアミノ酸配列の変異体であるポリペプチドも提供する。
【００６５】
第9の局面では、本発明は、第6の局面の核酸を含むベクターを提供する。核酸が、orf（群）の1つのプロモーターまたは複数のプロモーターを欠く態様では、このようなベクターは好ましくは、orf（群）と使用可能な状態で結合したプロモーターを含む。
【００６６】
第10の局面では、本発明は、第6の局面の1個または複数の核酸を含む発現系、および第9の局面のベクターを含む発現系を提供する。
【００６７】
好ましくは、このような発現系は細胞である。任意の適切な細胞（例えば、標準的な大腸菌（E. coli）の過剰発現系）を使用することができる。これについては例えば、サンブルック（Sambrook）ら、（1989）、およびアウシュベル（Ausubel）ら、（1992）を参照されたい。しかし既に述べたように、細菌、放線菌、およびストレプトミセス科の放線菌の細胞が望ましい。
【００６８】
第11の局面では、本発明は、第10の局面の発現系でポリペプチドを産生する段階を含む、第8の局面のポリペプチドを産生する方法を提供する。
【００６９】
このようなポリペプチドは、発現系から従来の方法で精製することができる。
【００７０】
既に証明されているように（SahlおよびBierbaum、1998）、翻訳後のプロセシング、およびランチビオティックの修飾（例えばランチオニン残基および/またはメチルランチオニン残基の導入）に関与するタンパク質は、他のタンパク質（特に他のランチビオティック）を修飾するためにインビトロで使用することができる。これについては例えば、本明細書の導入部および参考文献に引用された総説を参照されたい。このような使用法は、上記の1個または複数のポリペプチド（特にCinM、CinX、および/またはCinY）を対象とすると提案されている。実際に、本明細書に記載された実験では、pDWFT9プラスミド上のcinA遺伝子を、シンナマイシンの構造遺伝子の代わりにデュラマイシンAまたはBのプロペプチド配列を有するポリペプチドコードするように改変した。これにより、抗菌活性のある産物が得られ、プロペプチド配列の変化にもかかわらず翻訳後修飾が生じていたことがわかる。
【００７１】
本発明者らは、本発明の材料および方法が、シンナマイシンの変異体を産生するように、および/または、シンナマイシンまたは変異体の産生に影響を及ぼすように改変されることも提案する。特に、17 kbのセグメントの1つまたは複数のorf、または調節配列の変異が、このような変化を導く可能性があることが対象となる。例えば、cinAのorfにおける非サイレント変異は、orfにコードされたアミノ酸配列に変化を生じる。そして、この変化は、天然のシンナマイシンと比較して1個または複数のさまざまな性質をもつシンナマイシンの変異体の形成を導く。このような改変は本明細書で説明されており、特に好ましい。同様に、cinAの一次転写物の翻訳後修飾に関与すると考えられるタンパク質をコードするorfの変異は、さまざまな翻訳後修飾を導く可能性がある。調節配列の変異は、シンナマイシン（または変異体）の産生の制御に差を生じる可能性がある。このような改変された材料および方法も、先行する局面の範囲に含まれる。
【００７２】
例えば、化学的変異導入法、アラニン-スキャニング変異導入法、オリゴヌクレオチドを用いた部位特異的変異導入法、誤りの多いPCR法などの利用可能な方法で、または変異誘発系統（例えば大腸菌（E. coli）のXL1-Red系統（Stratagene））で適切なプラスミドにより標的核酸を増やすことで変異を誘発することができる。この手順のプロトコルは、グリーナー（Greener）およびキャラハン（Callahan）、（1993）、Strategies 6、32-34で説明されている。変異誘発法を、特定のorfまたはorfのグループ（または調節配列（群））を対象に実施した後に、変異を生じていない配列を含む核酸、または対象核酸全体（例えば17 kbのセグメント）に再びクローン化して、変異導入を行うことができる。
【００７３】
特に、シンナマイシンの生合成クラスターに関する本発明の方法および材料は、他のランチビオティック産生系統に由来する材料とともに使用して、例えば他のランチビオティック（他のB型ランチビオティック、例えばデュラマイシンなど）の一次翻訳産物を本発明の翻訳後修飾酵素に曝露させること（またはこの逆）が可能である。これは、翻訳産物を用いてインビトロで実施することができるほか、例えば、別のランチビオティックの構造遺伝子を、シンナマイシンの生合成経路に関与する他の遺伝子群を有する宿主細胞に導入することでインビボで実施することができる。
【００７４】
別の局面では、本発明は、以下の段階を含む、ランチビオティック産生宿主細胞のライブラリーを作製する方法を提供する：
第1または第2の局面に記載された、さまざまな核酸、核酸のセット、ベクター、またはベクターのセットでそれぞれ形質転換された複数の宿主細胞を提供する段階。
【００７５】
好ましくは、少なくとも複数の核酸、核酸のセット、ベクター、またはベクターのセットは、cinAのプロペプチドコード領域が異なる。しかし他の変異を予期している。
【００７６】
この局面では、好ましくは、この局面の方法で作製されたり、または作製可能な、ランチビオティック産生宿主細胞のライブラリーも提供される。
【００７７】
このようなライブラリーは、望ましい性質を対象にスクリーニングを行うことができる。好ましくは、ランチビオティックの産生に関して（例えば枯草菌（B.subtilis）の増殖に及ぼす作用を決定することによって）スクリーニングを最初に行った後に、関心のもたれる変異、および/または有利な変異に関するスクリーニングを行う。このようなライブラリーは、例えば、ランチビオティックの産生を示す宿主細胞に（例えば初期スクリーニング段階に続いて）制限される場合がある。
【００７８】
別の局面では、本発明は、以下の段階を含む、ランチビオティックのライブラリーを作製する方法を提供する：
上記の局面のランチビオティック産生宿主細胞のライブラリーを提供する段階；および、
宿主細胞を、ランチビオティックの産生に適した条件で培養する段階。
【００７９】
この方法は、ランチビオティックを精製することで産生する、1つまたは複数の段階を含む場合がある。
【００８０】
この局面では、好ましくは、この局面の方法で作製される、または作製可能な、ランチビオティックのライブラリーも提供される。
【００８１】
本発明の別の局面は、上述したように産生される、または産生可能なランチビオティックを含む組成物、および薬学的に許容される担体または希釈物に関する。
【００８２】
本発明の別の局面は、ヒトまたは動物の体の治療法に使用するために、上述したように作製されるランチビオティック、または作製可能なランチビオティックに関する。
【００８３】
本発明の別の局面は、上述したように作製された、または作製可能な有効量のランチビオティックを細胞に接触させる段階を含む、インビトロまたはインビボにおける治療法に関する。
【００８４】
本明細書では、orf、遺伝子、コード領域、および核酸という表現は、本明細書に記載された特定の核酸配列を有するorf、遺伝子、コード領域、および核酸に制限されるとは解釈されない。むしろ、これらの配列の変異体を有する遺伝子、コード領域、および核酸も含まれる。これらの特定の配列を有する遺伝子、コード領域、および核酸は好ましい態様である。したがって例えば「cinA orf」という表現は、図4の1671〜1907位の残基に由来する配列を有するorfに制限されるとは解釈されず、変異体も含む。
【００８５】
同様に、本明細書におけるポリペプチドという表現は、本明細書に開示された特定のアミノ酸配列を有するポリペプチドに制限されるとは解釈されない。むしろ、これらの配列の変異体を有するポリペプチドも含まれる。このような特定の配列を有するポリペプチドは好ましい態様である。したがって例えば「CinAポリペプチド」という表現は、図11に示したアミノ酸配列を有するポリペプチドに制限されるとは解釈されず、変異体も含む。
【００８６】
本明細書におけるプロモーターという表現は、本明細書に開示された特定の内部領域の全体または一部の配列を有する核酸に制限されるとは解釈されない。また、このような内部配列の変異体を有するプロモーターも含まれ、また特定の内部配列（またはこの一部）は好ましい態様である。
【００８７】
いずれの場合でも、orf、遺伝子、核酸、ポリペプチド、またはプロモーターの好ましい態様が、特定の配列に対する表現で表される場合は、本発明は広い意味で、このような特定の配列の変異体を有する態様を含むことを意図する。それにもかかわらず、本明細書に開示された特定の配列は、好ましい態様である。
【００８８】
特定の核酸（標準核酸）に関して、本明細書で用いる「変異体」という表現は以下の内容を意味する：標準核酸の配列とは異なるが、その相補物であるか、または標準核酸、もしくはその相補物、または標準核酸、もしくはその相補物の断片に対して、核酸配列の有意な同一性を示す配列か、またはストリンジェントな条件でハイブリッドを形成する配列を有する任意の核酸；または、標準核酸または同核酸の断片にコードされたアミノ酸配列と、有意なアミノ酸配列の同一性を有するアミノ酸配列をコードする任意の核酸。「変異体」という表現は、遺伝コードの縮重に関してのみ相互に異なり、またこのために同一の推定アミノ酸配列をコードする核酸にも関する。
【００８９】
特定のポリペプチド（標準ポリペプチド）に関して本明細書で用いる「変異体」という表現は以下を意味する：標準ポリペプチド、または同ポリペプチドの断片のアミノ酸配列とは異なるが、有意なアミノ酸配列の同一性を示すアミノ酸配列を有する任意のポリペプチド。
【００９０】
本発明の変異体の核酸について以下に詳しく説明する。本発明の変異体の核酸を、変異体である配列に代えて、本明細書に記載された17 kbの核酸断片に導入し、また組換え型の断片を、適切な宿主細胞に、ランチビオティックの産生に適切な条件（例えば実施例に示す条件）で導入する場合、ランチビオティックの1個または複数の活性（特に抗生物質活性）を有する分子の産生が誘導される。好ましくは産生は、高細胞密度で進むように調節される。
【００９１】
特に明記しない限り、アミノ酸配列の有意な同一性は、好ましくは少なくとも80%、より好ましくは85%、90%、もしくは95%、さらにより好ましくは98%もしくは99%であり、および/または核酸配列の有意な同一性は、好ましくは少なくとも50%、より好ましくは60%、70%、80%、もしくは90%、さらにより好ましくは95%、98%、または99%である。
【００９２】
アミノ酸配列の有意な同一性は、好ましくは変異体ポリペプチド（または変異体ポリペプチドの一部）と、標準ポリペプチドの少なくとも10アミノ酸の断片、より好ましくは少なくとも20、30、または40アミノ酸の断片、さらにより好ましくは60、80、または100アミノ酸の断片、より好ましくは標準ポリペプチド全体との間について示される。
【００９３】
核酸配列の有意な同一性は、好ましくは変異体核酸（または変異体核酸の一部）と、標準核酸の少なくとも30塩基の断片、より好ましくは少なくとも60、60、または120残基の断片、さらにより好ましくは180、240、または300残基の断片、より好ましくは標準核酸全体との間について示される。
【００９４】
「アミノ酸配列の同一性パーセント（%）」は、比較対象配列を整列させてギャップを導入した後に、必要であれば、最大パーセントの配列同一性を達成して、保存的置換を配列同一性の一部とみなさないことで、比較対象となる配列中のアミノ酸残基と同一な、候補配列中のアミノ酸残基のパーセンテージと定義される。本明細書で使用する同一性パーセントの値は、アルチュール（Altschul）ら、（1996）；http：//blast.wustl/edu/blast/README.htmlから得たWU-BLAST-2によって得られる。WU-BLAST-2では、複数の探索パラメータ（大部分はデフォルト値に設定）を用いる。調整可能なパラメータは以下の値に設定される：オーバーラップスパン（overlap span）＝1、オーバーラップフラクション（overlap fraction）＝0.125、ワード閾値（word threshold；T）＝11。HSPSおよびHSPS2のパラメータは変動する値であり、特定の配列の組成、および対象配列を探索するための特定のデータベースの内容に応じてプログラムそのものによって決定される。しかし、この値は、感度を高める目的で調節することができる。アミノ酸配列の同一性パーセントの値は、マッチした同一残基の数を、整列させた領域における「長い方の」配列の総残基数で割り、これに100を乗じて算出される。「長い方」の配列とは、整列させた領域内において、大部分の実際に存在する残基を有する配列である（アライメントスコアを最大化させるためにWU-BLAST-2によって導入されたギャップは無視される）。
【００９５】
「核酸配列の同一性パーセント（％）」は、候補配列中における、比較対象の配列中のヌクレオチド残基と同一なヌクレオチド残基の占めるパーセンテージと定義される。本明細書で使用される同一であることを示す値は、デフォルトのパラメータ（オーバーラップスパン＝1、オーバーラップフラクション＝0.125）を設定したWU BLAST-2のBLASTNモジュールにより得た。
【００９６】
本明細書で使用されるプロモーターの変異体に関しては、核酸配列の同一性は好ましくは、少なくとも30残基、より好ましくは40残基または50残基、さらにより好ましくは60残基の配列に対して評価される。
【００９７】
本明細書で定義される「ストリンジェントな条件」、または「高ストリンジェンシー条件」は、以下のように定義することができる：（1）洗浄条件として低イオン強度および高温、例えば0.015 M塩化ナトリウム/0.0015 Mクエン酸ナトリウム/0.1%ドデシル硫酸ナトリウムと50℃の条件を用いる条件；（2）ハイブリダイゼーションにホルムアミドなどの変性剤を用いる条件（例えば50%（v/v）ホルムアミドに0.1%ウシ血清アルブミン/0.1% Ficoll/0.1%ポリビニルピロリドン/50 mMリン酸ナトリウム緩衝液を添加したもの（pH 6.5）に750 mM塩化ナトリウム、75 mMクエン酸ナトリウムを添加する（温度は42℃））；または（3）50%ホルムアミド、5×SSC（0.75 M NaCl、0.075 Mクエン酸ナトリウム）、50 mMリン酸ナトリウム（pH 6.8）、0.1%ピロリン酸ナトリウム、5×デンハルト液、超音波処理したサケ精子DNA（50 μg/ml）、0.1% SDS、および10%硫酸デキストランを使用し、洗浄を42℃で0.2×SSC（塩化ナトリウム/クエン酸ナトリウム）、および50%ホルムアミド（55℃）中で行った後に、EDTAを含む0.1×SSC（55℃）の高ストリンジェンシー条件で洗浄を行う条件。
【００９８】
対象核酸が、プロモーターまたは調節配列と「使用可能に結合した」状態にある場合、プロモーター/調節配列は、適切な発現系において翻訳の正しい読み枠で対象核酸の転写を誘導することができる。好ましくは、対象核酸が、プロモーター/調節配列に使用可能に結合されている場合は、対象核酸の転写物は、対象核酸にコードされたポリペプチドの適切な発現系で発現させるために、適切に位置するリボソーム結合部位を含む。これについては例えば、サンブルック（Sambrook）ら、（1989）、およびアウシュベル（Ausubel）ら、（1995）を参照されたい。
【００９９】
核酸が「単離された」という表現は、ストレプトミセス・シンナモニウス・シンナモニウス DSM 40005（Streptomyces cinnamoneus cinnamoneus DSM 40005）中に通常は存在する他の核酸、特に本明細書で説明された17 kbのセグメントの外側の核酸の一部または全体から実質的または完全に単離されたことを意味する場合がある。しかし、通常であれば単離される核酸を伴う、例えばストレプトミセス・シンナモニウス・シンナモニウス DSM 40005（Streptomyces cinnamoneus cinnamoneus DSM 40005）の調節配列の用途は、このような核酸が「単離された」と理解されることを妨げられるとはみなされない。ポリペプチドが「単離された」と表現される場合、これは、ストレプトミセス・シンナモニウス・シンナモニウス DSM 40005（Streptomyces cinnamoneus cinnamoneus DSM 40005）によって通常発現されるポリペプチド、特に本明細書で説明された17 kbのセグメントの外側の核酸にコードされたポリペプチドの一部または全体から実質的または完全に単離されたことを意味する場合がある。
【０１００】
剤形
本発明のランチビオティックは、薬学的に許容される担体、アジュバント、賦形剤、希釈剤、充填剤、緩衝剤、保存剤、抗酸化剤、潤滑剤、安定剤、可溶化剤、界面活性剤（例えば湿潤剤）、マスキング剤、着色剤、香味料、および甘味料を含むがこれらに限定されない、当業者に周知の1種または複数の他の薬学的に許容される成分とともに製剤化することができる。剤形には、他の活性薬剤、例えば他の治療用または予防用の薬剤をさらに含めることができる。
【０１０１】
したがって本発明はさらに、上述のように薬学的組成物、および、上述の少なくとも1種類の活性化合物を、例えば担体、アジュバント、賦形剤などの当業者に周知の1個または複数の他の薬学的に許容される成分と混合する段階を含む、薬学的組成物を作製する方法を提供する。明瞭な単位（例えば錠剤など）として製剤化されている場合、個々の単位は所定量（用量）の活性化合物を含む。
【０１０２】
本明細書で用いる「薬学的に許容される」という表現は、適切な医学的判断の範囲に含まれ、過剰な毒性、刺激性、アレルギー反応、または他の問題もしくは合併症のない、問題のある被験者（例えばヒト）の組織に接触させる用途に適し、妥当な利益/リスク比が相応の化合物、成分、材料、組成物、剤形などに関する。個々の担体、アジュバント、賦形剤などは、剤形の他の成分に適合するという意味でも「許容される」状態でなければならない。
【０１０３】
適切な担体、アジュバント、賦形剤などは、標準的な薬学分野の書籍、例えば「Remington's Pharmaceutical Sciences」、第18版、Mack Publishing Company、Easton、Pa.、1990；および「Handbook of Pharmaceutical Excipients」、第2版、1994で説明されている。
【０１０４】
実施例1：ストレプトミセス・シンナモニウス・シンナモニウス DSM 40005（Streptomyces cinnamoneus cinnamoneus DSM 40005）のシンナマイシンクラスターのクローニング
材料
シンナマイシンの構造遺伝子（cinA）を有するプラスミドpCK51（Kaletta Cら、（1991）、Eur.J.Biochem 199（2）：411-415）は、同プラスミドの配列データとともに、Torsten Helge Stein博士（Institut fur Mikrobiologie、der Johann Wolgang Goethe-Universitat Frankfurt、Biozentrum Niederursel、Marie-Curie-Strabe 9、D-60439 Frankfurt/Main、Germany）から入手した。
【０１０５】
ストレプトミセス・シンナモニウス・シンナモニウス（Streptomyces cinnamoneus cinnamoneus）系統DSM 40646およびDSM 40005（デュラマイシンおよびシンナマイシンをそれぞれ産生する系統）は、German Collection of Microorgansims、DSMから入手した。
【０１０６】
ストレプトミセス・リビダンス 1326（Streptomyces lividans 1326）、および大腸菌（E. coli）DH5αは、一般的な実験用系統である。
【０１０７】
方法
シンナマイシン産生遺伝子のクローニング
約2.8 kbのNdeI（図28参照。切断部位2033CA↓TATG）/BamHI（図28参照。切断部位4844G↓GATCC）制限酵素切断断片は、pCK51から、キアゲン（Qiagen）社のゲル抽出キットを用いたアガロースゲル電気泳動で単離した。この制限酵素切断断片はcinAの下流に位置し、ランチオニン残基の産生に関与すると考えられるタンパク質をコードする推定lanM型遺伝子の5'部分を有する。次に、この制限酵素切断断片を用いて、サザン解析およびコロニーハイブリダイゼーションに使用する放射標識プローブ（Pharmacia Oligolabelling Kit）、プローブ-CK（図1参照）を作製した。
【０１０８】
ゲノムDNAをストレプトミセス・シンナモニウス・シンナモニウス 40646（Streptomyces cinnamoneus cinnamoneus 40646）から単離し、一連の制限エンドヌクレアーゼ（Asp718、BamHI、BglII、SacI、SalI、XhoI、およびPstI）で切断した後に、プローブ-CKを用いてサザン解析を行った。約5 kbのBglII制限酵素切断断片を得て、クローニング用に選択を行った。BglIIで切断したゲノムDNAと、長さが約5 kbの断片をアガロースゲル電気泳動で単離し、BamHIで切断しておいたpBluescriptII KS（Stratagene）に連結した。結果として得られた連結混合物で、大腸菌（E. coli）DH5αの形質転換を行い、約5 kbのBglII断片のミニライブラリーを作製した。サザン解析で検出されたBglII断片を有するクローンpDWCC1（図2参照）を、このライブラリーから、プローブ-CKを用いたコロニーハイブリダイゼーションで単離した。pDWCC1の配列決定の結果、単離されたBglII断片の長さが4943 bpで、その一端が、プローブ-CKに対応するlanM型遺伝子の3'端をコードすることが明らかになった。
【０１０９】
pDWCC1の配列情報を用いてlanM型遺伝子に対するプローブを設計し、ストレプトミセス・シンナモニウス・シンナモニウス DSM 40005（Streptomyces cinnamoneus cinnamoneus DSM 40005）のゲノムDNAのスクリーニングに使用した。DNA断片はTaqポリメラーゼを用いたポリメラーゼ連鎖反応（PCR）で調製した。使用したプライマーはBB3
2004526456.tif 000004
およびBB4
2004526456.tif 000005
であり、長さが294 bpの断片が得られた。このPCR断片を、放射標識プローブ、プローブ-BB（図3参照）の作製に使用し、また、サザン解析およびコロニーハイブリダイゼーションに使用した。
【０１１０】
ゲノムDNAを、ストレプトミセス・シンナモニウス・シンナモニウス DSM 40005（Streptomyces cinnamoneus cinnamoneus DSM 40005）から単離し、一連の制限エンドヌクレアーゼ（BamHI、BglII、SacI、SalI、XhoI、およびPstI）で切断した後に、プローブ-BBを用いてサザン解析を行った。約5 kbのBglII制限酵素切断断片を得て、クローニング用に選択を行った。ゲノムDNAをBglIIで切断し、約5 kbの断片をアガロースゲル電気泳動で単離し、BamHIで切断しておいたpBluescriptII KS（Stratagene）に連結した。この連結混合物で大腸菌（E. coli）DH5αの形質転換を行い、約5 kbのBglII断片のミニライブラリーを作製した。サザン解析で検出されたBglII断片を有するpDWFT1とpDWFT2の2つのクローン（配列は図4の3756〜8734位に対応）を同ライブラリーからプローブ-BBを用いたコロニーハイブリダイゼーションで単離した。次に、これらの2つのプラスミドが同じ挿入部分を反対方向に含むことが、pBluescriptII KSのリバースプライマー（Stratagene）を用いた配列決定によって明らかとなった。pDWFT1の配列決定の結果、単離されたBglII断片の長さが4979 bpで（図4および図5参照）、一端が、プローブ-BBに対応するlanM型遺伝子の3'部分をコードすることがわかった。pDWCC1およびpDWFT1を対象としたコンピュータによる配列データの解析の結果、2つのBglII断片が、両断片の全長に対して88.8%の同一性を有することがわかった。次に、プローブ-BBを用いたサザン解析で同様に検出された約5 kbのBamHI断片を同様の手順でクローン化してpDWFT4を得た（配列は図4の1〜4872位に対応）。pDWFT4の配列決定の結果、BamHI断片の長さが4872 bpであり（図4および図5参照）、lanM型遺伝子の5'側およびcinAを有することがわかった。pDWFT4のBamHI断片の配列データと、pCK51の配列データとの比較から、この2つの断片の同一性が両断片の全長に対して97.3%であることがわかった。
【０１１１】
pDWFT2のBglII断片の末端から、lanM型遺伝子の遠位の末端に至る約1.1 kbのPstI断片（lanM型遺伝子を含む）をアガロースゲル電気泳動で単離した（これは図4の7612〜8734位とpBluescriptII KSポリリンカー（図6参照）の短い領域に対応する）。次に、この断片を用いて、サザン解析およびコロニーハイブリダイゼーションに使用するための放射標識プローブ、プローブ-1.1（図6参照）を作製した。プローブ-1.1を用いて、ストレプトミセス・シンナモニウス・シンナモニウス DSM 40005（Streptomyces cinnamoneus cinnamoneus DSM 40005）のゲノムDNAに由来する約11 kbのAsp718断片をサザン解析で得た。次に、この断片を単離して、プローブ-1.1を用いて、pDWCC1に関して記載した手順と同様の手順でクローン化してpDWFT5を得た（配列は5423〜17083位に対応）。このプラスミドの配列決定の結果、長さが11661 bpで、pDWFT1と3312 bpの重複があることがわかった（図4および図5参照）。
【０１１２】
次に、pDWFT1、pDWFT4、およびpDWFT5に由来するクローン化断片を、まとめてクローン化して、さまざまな部分が、ストレプトミセス・シンナモニウス・シンナモニウス DSM 40005（Streptomyces cinnamoneus cinnamoneus DSM 40005）の染色体における場合と同じ順序および方向である1つのDNA、pDWFT9（図4および図5参照）を得た。これら3種類のプラスミドを対象に配列データの解析（Wisconsin GCGパッケージのバージョン10.1-Unixを使用：ギャップ生成ペナルティ（gap creation penalty）＝50；ギャップエクステンションペナルティ（gap extension penalty）＝3）を行った結果、これらはストレプトミセス・シンナモニウス・シンナモニウス DSM 40005（Streptomyces cinnamoneus cinnamoneus DSM 40005）のゲノムの、1つの17083 bpの領域をカバーすることがわかる。この配列データから、同領域内にAsp718切断部位（GGTACC）が2か所しかないことがわかった。これらの部位の1か所はpDWFT1にカバーされる領域内にあり、pDWFT5のAsp718断片の一端に対応し、もう1か所はpDWFT5でカバーされる領域の他の末端に対応する。pDWFT4またはpDWFT5のいずれとも重複していないpDWFT1の領域は、1つの562 bpのBamHI/Asp718断片に対応する。pDWFT4のBamHI断片をpDWFT1の562 bpのBamHI/Asp718断片と連結して、野生型の構造に対するクラスターの一端を再構築した。次にpDWFT5のAsp718断片を、これに連結して、野生型の構造に対するクラスター全体を再構築した。
【０１１３】
この過程の最初のステップとして、pDWFT1に由来する562 bpのBamHI（図4参照。切断部位4867G↓GATCC）/Asp718（図4参照。切断部位5423G↓GTACC）断片を、BamHI/Asp718で切断しておいたpBluescriptII KSにクローン化してpDWFT6を得た。クローン化された、pDWFT4由来の5 kbのBamHI断片（図4参照。切断部位1G↓GATCCおよび4867G↓GATCC）を次に、BamHIで切断しておいたpDWFT6にクローン化してpDWFT7を得た。pDWFT7中における断片の方向を、標準的手順（Sambrooke Jら、（1989）、「Molecular Cloning；A Laboratory Manual」、Cold Spring Harbor Laboratory Press、第1章および第6章）による制限酵素切断解析で調べ、天然の構造と同じであることを確認した。次に、このBamHI/Asp718断片を、pDWFT7から、1つのAsp718/XbaI断片（配列は1〜5428位＋pBluescriptII KSポリリンカーの短い領域に対応）上で切り出して、pOJ436（Bierman Mら、（1992）、Gene 116、43-49）にクローン化してpDWFT8を得た。pDWFT5に由来するAsp718断片（図4参照。切断部位は5423G↓GTACCおよび17078G↓GTACC）を、Asp718で切断しておいたpDWFT8にクローン化してpDWFT9を得た。断片の方向を、BglIIを用いた制限酵素切断解析で調べ、pDWFT1のBglII断片に対応する断片が再構築されたことを確認した。このプラスミドpDWFT9は、ストレプトミセス・シンナモニウス・シンナモニウス DSM 40005（Streptomyces cinnamoneus cinnamoneus DSM 40005）の染色体と、これに加えて、pOJ436にクローン化されたpBluescriptII KSのポリリンカーの小領域の配列に正確に対応する17083 bpのDNAで構成される。
【０１１４】
次に、ストレプトミセス・リビダンス 1326（Streptomyces lividans 1326）を対象に、pDWFT9で形質転換を行って検討系統を、また基礎となるベクターpOJ436で形質転換を行って対照系統を得た。pDWFT9を有する系統をS. リビダンス（S.lividans）DW9a-1-8と命名し、またpOJ436を有する系統をS. リビダンス（S.lividans）DW436-1-4と命名した。
【０１１５】
シンナマイシン産生のバイオアッセイ法
検討対象系統DW9a1-8およびDW436-1-4を、R2YE培地（「Practical Streptomyces Genetics」、（2000）、Kieser T.ら、The John Innes Foundation、p408）で5〜7日間かけて増殖させた。一晩培養した枯草菌（B.subtilis）を10 mlのLB培地に植菌し、ODが0.3〜0.4（600 nm）になるまで（5〜8時間）増殖させた。次に、この培養物の0.5 mlのアリコートを、5 mlの軟オキソイド（Oxoid ）栄養寒天（55℃）に植菌し、反転させて混合した後に、アッセイ法の対象となるプレート上に直ちに注いだ。このプレートを、枯草菌（B.subtilis）が均一に覆うまで傾けた。次に、このアッセイ法に使用するプレートを37℃で一晩増殖させた後に、枯草菌（B.subtilis）の増殖阻害について調べた。
【０１１６】
質量分析によるシンナマイシンの検出
ストレプトミセス・リビダンス（Streptomyces lividans）の系統をYEME培地またはTSB培地（「Practical Streptomyces：、前掲）のいずれかを用いて5〜7日間かけて増殖させた後に、遠心して細胞を除去した。次に、上清を等容量の酢酸エチルで2回抽出し、水性画分を各回で分取した。この水性画分を、水で平衡化したブタノールで2回抽出し、ブタノール画分を分取して両画分をプールした。次に、ブタノール画分を10倍容量または2倍容量の10%ギ酸のいずれかで抽出した後に、MALDI-TOF質量分析計を使用する解析に用いた。
【０１１７】
結果
シンナマイシン産生のバイオアッセイ法
表1に示した結果から、S. シンナモニウス・シンナモニウス DSM 40005（S. cinnamoneus cinnamoneus DSM 40005）が枯草菌（B.subtilis）の増殖を抑制すること、およびベクターpOJ436（pDWFT9に由来）を有するが推定シンナマイシンクラスターを有しないS. リビダンス（S.lividans）の系統は枯草菌（B.subtilis）の増殖阻害を何ら示さないことがわかる。S. シンナモニウス・シンナモニウス DSM 40005（S. cinnamoneus cinnamoneus DSM 40005）に由来する推定シンナマイシンクラスターをコードするプラスミドpDWFT9を有するS. リビダンス（S.lividans）の系統は、枯草菌（B.subtilis）の増殖を阻害する。S. シンナモニウス・シンナモニウス DSM 40005（S. cinnamoneus cinnamoneus DSM 40005）は枯草菌（B.subtilis）の増殖を阻害し、シンナマイシンの既知の活性は枯草菌（B.subtilis）系統の増殖阻害なので、以上の結果は、pDWFT9上に存在する推定シンナマイシンクラスターを有するS. リビダンス（S.lividans）の系統がシンナマイシンを産生することの証拠となる。
【０１１８】
質量分析によるシンナマイシンの検出
表2に示した結果から、分子量がシンナマイシン（プロペプチド配列データおよび構造データに基づく計算で2039.4）と同等の分子が、ストレプトミセス・シンナモニウス・シンナモニウス DSM 40005（Streptomyces cinnamoneus cinnamoneus DSM 40005）、およびS. リビダンス（S.lividans）DW9a-1（プラスミドpDWFT9上に推定シンナマイシンクラスターを有する系統）の液体培養物の上清中に存在していたことがわかる。この分子量の分子は、pDWFT9に由来するがシンナマイシンクラスターをもたないベクターpOJ436を有する放線菌（S.lividans DW436-4）の液体培養物の上清中には検出されなかった。これは、推定シンナマイシンクラスターを有するS. リビダンス（S.lividans）DW9a-1がシンナマイシンを産生していることの証拠となる。
【０１１９】
ストレプトミセス・シンナモニウス・シンナモニウス DSM 40005（Streptomyces cinnamoneus cinnamoneus DSM 40005）のシンナマイシンクラスターの配列の解析
プラスミドpDWFT9は、S. リビダンス（S.lividans）におけるシンナマイシンの発現に不可欠なストレプトミセス・シンナモニウス・シンナモニウス DSM 40005（Streptomyces cinnamoneus cinnamoneus DSM 40005）のシンナマイシンクラスター遺伝子を有する。このプラスミドの配列データを、レジェンドとともに図4に示す。また推定遺伝子、およびこれらの遺伝子の位置についても、同配列にコードされた他の重要な性質と併せて示す。これらの遺伝子の位置は、フレームプロットプログラム（デフォルト値を使用可）で決定し、複数の利用可能な開始コドンが存在する場合は、配列GGAGGが理想的な潜在的なリボソーム結合部位（シャインダルガノ配列）（「Practical Streptomyces Genetics」、（2000）、Kieser T.ら、The John Innes Foundation、p.386）を探索した。推定遺伝子の順序および相対方向を図5に示す。このフレームプロットプログラムはウェブ上で利用することができる（http：//watson.nih.go.jp/~jun/cgi-bin/frameplot.pl（Ishikawa,J.およびHotta,K.、FEMS Microbioi.Lett. 174：251-253、（1999））。この配列内には、真の遺伝子である可能性がある21の潜在的遺伝子群が存在する。これらについては以下に、まず最初に配列について個別に、また出現する順序に沿って説明する。NCBIが提供するデータベース探索プログラムBlast Pを用いて、本明細書に記載された潜在的遺伝子のタンパク質の翻訳結果と、公的データベースの翻訳結果との間の類似性を、ウェブページ上で利用可能なBlastのバージョンを用いて調べた。
【０１２０】
cinorf3（図7）
3'端が欠けている不完全な推定遺伝子。
【０１２１】
cinorf4（図8）
この推定遺伝子のタンパク質翻訳産物は、既知の機能をもつ任意の遺伝子産物と相同性をもたない。
【０１２２】
smallorf（図9）
このモチーフは、図1の1109番目の残基から始まり1198番目の残基で終わる。
【０１２３】
cinorf7（図10）
この推定遺伝子のタンパク質翻訳産物は、既知の機能をもつ任意の遺伝子産物と相同性をもたない。
【０１２４】
cinA（図11）
これはシンナマイシンの構造遺伝子である。このタンパク質翻訳産物は、公表cinA遺伝子の遺伝子産物（Kaletta Cら、（1991）、Eur.J.Biochem 199（2）：411-415）と100%の同一性をもつ。
【０１２５】
cinM（図12）
この推定遺伝子のタンパク質翻訳産物は、修飾酵素であると考えられている。
【０１２６】
cinX（図13）
この推定遺伝子のタンパク質翻訳産物は、既知の機能をもつ任意の遺伝子産物と相同性をもたない。
【０１２７】
cinT（図14）
この推定遺伝子のタンパク質翻訳産物は、推定cinH遺伝子の翻訳産物と翻訳段階で共役しているようである。
【０１２８】
cinH（図15）
この推定遺伝子のタンパク質翻訳産物は、推定cinT遺伝子の翻訳産物と翻訳段階で共役しているようである。
【０１２９】
cinY（図16）
この推定遺伝子のタンパク質翻訳産物は、既知の機能をもつ任意の遺伝子産物と相同性をもたない。
【０１３０】
cinZ（図17）
この推定遺伝子のタンパク質翻訳産物は、その全長が、大腸菌（E. coli）のPepQタンパク質（embl locus ECPEPQ、アクセッション番号X54687.1）のC末端の3分の1に対して40%の相同性をもつ。
【０１３１】
cinorf8（図18）
この推定遺伝子のタンパク質翻訳産物は、その完全長が、大腸菌（E. coli）由来のタンパク質（pir：locus D64837）に対して47%を上回る同一性を示す。
【０１３２】
cinorf9（図19）
この推定遺伝子のタンパク質翻訳産物は、既知の機能をもつ任意の遺伝子産物と相同性をもたない。
【０１３３】
cinR（図20）
この推定遺伝子のタンパク質翻訳産物は、その完全長が、ストレプトミセス・コエリカラー A3（2）（Streptomyces coelicolor A3（2））に由来する多くの推定応答調節因子と相同性をもつ。例えば、Blast P（NCBIのウェブサイトwww.ncbi.nlm.nih.govで利用可；ワード長（word size）＝3；マトリックス＝blosum 62；ギャップコスト（gap cost）；existence＝11、extension＝1）を使用した時のヒットは、推定CinRタンパク質の全長に対して48%の同一性を示した。これは、ストレプトミセス・コエリカラー （Streptomyces coelicolor）による抗生物質合成の包括的な負の調節に関連すると考えられているAbsA2タンパク質と相関する（Brian, P.、Riggle, P.J.、Santos, R.A.およびChampness, W.C.、J.Bacteriol. 178（11）、3221-3231、（1996））。この推定遺伝子は、推定cinK遺伝子と翻訳段階で共役していると考えられる。
【０１３４】
cinK（図21）
この推定遺伝子のタンパク質翻訳産物は、その全長が、ストレプトミセス・コエリカラー A3（2）（Streptomyces coelicolor A3（2））に由来する多くの推定ヒスチジンキナーゼとの間に相同性をもつ。例えば、Blast P（デフォルトのパラメータ）を使用した時のヒットは、推定CinKタンパク質の全長に対して34%の同一性を示した。これは、ストレプトミセス・コエリカラー （Streptomyces coelicolor）による抗生物質合成の包括的な負の調節に関連すると考えられているAbsA1タンパク質と相関する（Brian, P.、Riggle, P.J.、Santos, R.A.、およびChampness, W.C. J.Bacteriol. 178（11）、3221-3231、（1996））。この推定遺伝子は、推定cinR遺伝子と翻訳段階で共役していると考えられる。
【０１３５】
cinorf10（図22）
この推定遺伝子のタンパク質翻訳産物は、既知の機能をもつ任意の遺伝子産物と相同性をもたない。この推定遺伝子は、推定cinorf11遺伝子と翻訳段階で共役している可能性がある。
【０１３６】
cinorf11（図23）
この推定遺伝子のタンパク質翻訳産物は、既知の機能をもつ任意の遺伝子産物と相同性をもたない。この推定遺伝子は、推定cinorf10遺伝子と翻訳段階で共役している可能性がある。
【０１３７】
cinR1（図24）
この推定遺伝子のタンパク質翻訳産物は、その全長が、ストレプトミセス・グリセウス（Streptomyces griseus）に由来するAfsR-gタンパク質（Umeyama, T.、Lee, P.C.、Ueda, K.、およびHorinouchi, S.、Microbiology 145 （Pt 9）、2281-2292、（1999））のN末端領域と38%の同一性を示し、また、その全長が、ストレプトミセス・コエリカラー A3（2）（Streptomyces coelicolor A3（2））に由来するAfsR-gタンパク質（Horinouchi, S.、Kito, M.、Nishiyama, M.、Furuya, K.、Hong, S.K.、Miyake, K、およびBeppu, T. Gene 95（1）、49-56、（1990））のN末端領域と38%の同一性を示す。
【０１３８】
cinorf12（図25）
この推定遺伝子のタンパク質翻訳産物は、既知の機能をもつ任意の遺伝子産物と相同性をもたない。
【０１３９】
cinorf13（図26）
この推定遺伝子のタンパク質翻訳産物は、既知の機能をもつ任意の遺伝子産物と相同性をもたない。
【０１４０】
cinorf14（図27）
このorfは3'端が欠けており、完全な潜在的遺伝子ではない。この推定遺伝子のタンパク質翻訳産物は、既知の機能をもつ任意の遺伝子産物と相同性をもたない。
【０１４１】
実施例2：シンナマイシンの人工変異体を作製するためのプラスミドツールの構築
新しい制限酵素切断部位を、シンナマイシンの構造遺伝子cinAの内部および下流に導入することにより、シンナマイシン産生過程を可能とする置換可能なカセットを、変異体の産生に利用することが可能となった。
【０１４２】
cinA構造遺伝子は、ストレプトミセス・シンナモニウス・シンナモニウス DSM 40005（Streptomyces cinnamoneus cinnamoneus DSM 40005）の染色体に由来する4872 bpのBamHI断片をもつプラスミドpDWFT4上にコードされている。このBamHI断片内には、XhoI（図4参照。切断部位1728C↓TCGAG）およびNdeI（図4参照。切断部位2056CA↓TATG）の2か所の固有の制限酵素切断部位がある。XhoI切断部位は、cinAをコードするリーダーペプチド内に位置し、またNdeI切断部位はcinA遺伝子の下流に位置する。これらの2か所の部位が存在することで、天然配列に変化を導入して新しい制限酵素切断部位を作り出すオリゴヌクレオチドを用いたPCRで得られる類似の領域によって置換された簡便なカセットが形成される。新しい切断部位はcinAのプロペプチド領域のいずれかの側に位置するので、天然のプロペプチドをコードする領域が除去されること、また選択されたプロペプチドをコードする2本鎖オリゴヌクレオチドと置換されることが可能となる。
【０１４３】
導入された、これらの新しい制限酵素切断部位はStuI切断部位とSpeI切断部位である。これらの部位が選択された理由は、StuI切断部位またはSpeI切断部位が上述のプラスミドpDWFT9には存在しないためである。新しい切断部位が導入されたことで、変異体プロペプチド領域を、特定の位置において重複する2本鎖のオリゴヌクレオチドと置換することで、同プラスミド内における変異体プロペプチド領域のライブラリーを構築することが可能となる。制限酵素切断部位としてStuIが選択された理由は、コードされたCinAペプチドを変化させることなく導入することが可能なためである。pDWFT4のBamHI断片のA1838G置換によってStuI切断部位が導入され、GAAコドンがGAGコドン（いずれもグルタミン酸残基をコードする）に交換される。この部位は、プロペプチドの先頭のコドンから4コドン上流に位置し、プロペプチド領域全体の交換を可能とする。SpeI切断部位は、3か所の変化をcinAの停止コドンのすぐ下流に導入することで作られた。これらの変化は、pDWFT4のBamHI断片のG1908C、G1910A、およびC1912Tであった。しかし、これらの変化の導入によって、配列の自然変化も持ち込まれることになった（後述）。
【０１４４】
上記の計画は以下の手順で実施した。pDWFT4の4872 bpのBamHI断片を、XhoI、StuI、SpeI、またはNdeIの切断部位をもたないベクターにサブクローン化した。プラスミドpBluescriptII KSは、StuI切断部位もNdeI切断部位ももたないが、XhoI切断部位およびSpeI切断部位をもつ。pBluescriptII KS のXhoI切断部位およびSpeI切断部位は固有であり、プラスミドのポリリンカー領域内に位置し、XhoIで切断してクレノウ断片ポリメラーゼで末端を埋めた後に連結してつぶし、改変型プラスミドを単離してプラスミドpNOXが得られる。次に、この過程をpNOXのSpeIについて同様に行うことでpNOXSが得られる。次に、プラスミドpNOXSをBamHIで切断し、pDWFT4の4872 bpのBamHI断片をこれにクローン化してpDWFT17を得た。
【０１４５】
上述のStuI切断部位またはSpeI切断部位のいずれかを作る配列変化を導入するためのオリゴヌクレオチドプライマー対を以下のように作製した：
2004526456.tif 000006
pDWFT4のBamHI断片（図4の1880〜1901）と相同性をもつ。
2004526456.tif 000007
pDWFT4のBamHI断片（図4の1889〜1918）と相同性をもつ。
2004526456.tif 000008
pDWFT4のBamHI断片（図4の1831〜1862）と相同性をもつ。
2004526456.tif 000009
pDWFT4のBamHI断片（図4の1847〜1806）と相同性をもつ。
2004526456.tif 000010
pDWFT4のBamHI断片（図4の1687〜1707）と相同性をもつ。
2004526456.tif 000011
pDWFT4のBamHI断片（図4の2062〜2083）と相同性をもつ。
【０１４６】
pDWFT4をテンプレートとして用いてPCR断片を得ることで、StuI切断部位を最初に導入した。StuとNdeのプライマー対とPfuポリメラーゼを用いて、以下の反応条件で断片StuPCR1を得た：1×Pfuポリメラーゼ緩衝液（Promega）、100 pgのテンプレート DNA、200 μMのdNTPs、20 pmolの各プライマー、5% DMSOを含む50 μlの反応物：加熱サイクルは、94℃で3分間の変性過程に続き、94℃で35秒間の25サイクルの変性、55℃で1分間のアニーリング、および68℃で1分30秒間の伸長。最後の伸長過程は68℃で5分間で行った。次に、プライマー対Stu1およびXhoとTaqポリメラーゼを用いて、StuPCR1の場合と同様の条件（ただし1×Taq緩衝液を使用し、伸長段階は72℃で実施）で断片StuPCR2を得た。次に、これらの断片をアガロースゲル電気泳動で精製し、50 μlの水溶液として得た。次に、0.5 μlの各PCR断片を混合して、Pfuポリメラーゼおよびプライマー対XhoおよびNdeをPCRのテンプレートとして用いて、StuPCR1の場合と同様の条件（ただし加熱サイクルは10回のみ実施）で断片StuPCR3を得た。プラスミドpDWFT17をXhoIおよびNdeIで切断し、精製し、切り離された短い断片をアガロースゲル電気泳動で除去した。次に、PCR産物StuPCR3をXhoIおよびNdeIで切断し、XhoI/NdeIで切断しておいたpDWFT17に連結して新しいプラスミドpDWFT19を得た（制限酵素StuIによる切断で、上述の位置にStuI切断部位があることを確認した）。
【０１４７】
次に、pDWFT19をテンプレートとして用いてPCR断片を作ることでSpeI切断部位を導入した。プライマー対FTP25およびNdeとPfuポリメラーゼを用いてPCR断片SpePCR1を得た（条件はStuPCR1の場合と同じ）。次に、プライマー対Spe1およびXhoとPfuポリメラーゼを用いてPCR断片SpePCR2を得た（条件はStuPCR1の場合と同じ）。これらの断片をアガロースゲル電気泳動で精製し、ほぼ等モル量を混合した後に、Pfuポリメラーゼとプライマー対XhoおよびNdeを用いてPCRを行い、PCR断片SpePCR3を得た（条件はStuPCR3の場合と同じ）。次に、このPCR産物を用いて、pDWFT17のXhoI〜NdeI制限酵素切断部位間の領域を置換した。プラスミドpDWFT17をXhoIおよびNdeIで切断し、切り出される短い断片をアガロースゲル電気泳動で除いて精製した。PCR産物SpePCR3をXhoIおよびNdeIで切断し、XhoI/NdeIで切断しておいたpDWFT17に連結して新しいプラスミドpDWFT21を得た。このプラスミドは、上述のSpeIおよびStuIの制限酵素切断部位を両方もつことが配列決定で判明したが、この配列には、3 bpの挿入がSpeI切断部位の下流に導入されていることも判明している（図29参照）。
【０１４８】
StuI/SpeI切断部位に含まれるpDWFT21のcinAのプロペプチドのコード領域をテトラサイクリン耐性カセットと置換することにした。このカセットは長さが1 kbを上回るので、StuI/SpeI制限エンドヌクレアーゼによる同カセットの切り出し後に残されたpDWFT21の断片を容易に同定できると考えられている。
【０１４９】
この処理はTaqポリメラーゼを用いたPCRで行い、StuI切断部位が停止コドンのすぐ下流にあり、またSpeIが開始コドンの121 bp上流にある、pBR322由来のテトラサイクリン耐性遺伝子Tcのコピーを以下のプライマーを用いて得た：
2004526456.tif 000012
このようなPCR断片を得るために用いた反応条件は、StuPCR2の場合と同じとした。次に、これを用いて、pDWFT21のcinAのプロペプチド領域をコードするStuI/SpeI断片を置換することでpDWFT33を得た。この最後の構築物を用いて、シンナマイシン誘導体構築物を作製した。
【０１５０】
pDWFT21上のStuI/SpeI断片のcinAプロペプチドコード領域に変異がある長い2本鎖オリゴを作製し、導入された変化によって、シンナマイシンの代わりにデュラマイシンまたはデュラマイシンBを産生するシンナマイシンクラスターを得た。これらは、88 merの1本鎖オリゴヌクレオチド（それぞれデュラマイシンとデュラマイシンBのプロペプチド領域をコードするduranAとduranB）から構築した。具体的には、相補的な20 merの1本鎖オリゴヌクレオチド（endfill）とアニーリングさせた後に、StuPCR1の場合と同様の条件（ただし溶解、アニーリング、および伸長のサイクルは1回のみ）で、Pfuポリメラーゼで伸長させて88 merの2本鎖オリゴヌクレオチドを得た。オリゴヌクレオチドの配列を以下に示す：
2004526456.tif 000013
【０１５１】
これらの2本鎖オリゴヌクレオチドの精製を、キアゲン（Qiagen）ゲル抽出キットを用いて、50 μlの滅菌水を50 μlの反応混合物に添加した後に、これを100 mgのゲルスライスとみなして処理して行った。この2本鎖オリゴヌクレオチドを、キアゲンカラムから溶出して40 μlの水溶液として得た。次にStuIおよびSpeIで切断し、pDWFT33のStuI/SpeI Tc遺伝子断片との置換に使用し、2種類のプラスミドpDWFT40（duranB）およびpDWFT42（duranA）を得た。したがって、シンナマイシンの構造遺伝子cinAは、上述のデュラマイシンの構造遺伝子、または必要に応じてデュラマイシンBの構造遺伝子と置換された。次に、これらのプラスミドを用いて、pDWFT4の場合と同じ手順でpDWFT9のデュラマイシン相当物を再構成した。この過程で、デュラマイシンBの構造遺伝子をもつpDWFT52、およびデュラマイシンの構造遺伝子をもつpDWFT54を得た。次に、これらのプラスミドでS. リビダンス 1326（S.lividans 1326）の形質転換を行った。形質転換体を選択し、結果として得られた系統DW52およびDW54を対象に、シンナマイシンに関するバイオアッセイ法を行い、上述のようにMALDI-TOF解析用の培養物を増殖させた。
【０１５２】
結果
それぞれデュラマイシンBおよびデュラマイシンを産生すると推定される系統DW52およびDW54を対象に、枯草菌（B.subtillis）の増殖を阻害可能か否かをバイオアッセイ法で検討した。
【０１５３】
系統DW52およびDW54は、バイオアッセイ法で枯草菌（B.subtillis）の増殖を阻害するので、それぞれ抗生物質化合物を産生することがわかる。これは、cinAのプロペプチドのコード領域が変化しても、シンナマイシンクラスターによる抗生物質化合物の産生が可能なことを意味する（表3参照）。
【０１５４】
化合物がデュラマイシンB、およびデュラマイシンであることを調べるために、液体培養物の上清をMALDI-TOF質量分析で調べた。
【０１５５】
DW52またはDW54のいずれも、シンナマイシンの分子量を示す化合物を産生しなかったことから、個々のcinA遺伝子のプロペプチド領域の変化が、シンナマイシンクラスターによるシンナマイシンの産生を無効化したことがわかる。しかし、cinAのプロペプチド領域に導入された変化から推定されるように、DW52は、デュラマイシンBの推定分子量を示す化合物を産生可能であり、DW54は、デュラマイシンの推定分子量を示す化合物を産生可能であった。この結果は、本発明者らが、シンナマイシンの変異体を産生するシンナマイシンクラスターの作製に成功したことを意味する（表4参照）。
【０１５６】
実施例3：pDWFT9上でシンナマイシン産生クラスター上のいくつかの遺伝子が果たす役割の決定
cinorf7およびcinR1の上流の遺伝子を欠くプラスミドの作製
cinorf3、cinorf4、cinorf12、cinorf13、およびcinorf14が、シンナマイシンの産生に関与するか否かを判定するために、これらの遺伝子の全体または一部を欠く系統を作製した。この操作を容易に行うために、cinorf7の上流のBamHI側を除去してcinorf3、およびcinorf4の大部分が欠失したバージョンのpDWFT4を、またcinR1の上流のAsp718側を除去してcinorf13、cinorf14、およびcinorf12の大部分が欠失したpDWFT5のバージョンを作製することにした。これら2種類の改変型プラスミドは後に、同様の手順で再集合させることでpDWFT9（上述）を得ることができた。
【０１５７】
この過程の最初のステップではpDWFT4の変異体を作製した。PCR産物を以下の2本のプライマーを用いて得た：
2004526456.tif 000014
およびNDE（上述）。
【０１５８】
プライマーBAMの先頭の6個のヌクレオチドは、後にPCR断片をBamHIで切断されやすくするためのランダムなG＋Cである。続く6個のヌクレオチドは、導入された新しいBamHI切断部位であり、また残りのヌクレオチドは、961〜982位のシンナマイシンクラスターと相同である。BAMおよびNDEを用いて作製したPCR産物は長さが1123 bpで、テンプレートのpDWFT4とTaqポリメラーゼを用いて得られた（他の反応条件はStuPCR2の場合と同じ）。次にBamHIおよびXhoIで切断し、BamHI適合末端およびXhoI適合末端をもつ約770 bpの断片を得た。次に、この断片をアガロースゲル電気泳動で精製し、BamHIおよびXhoIで切断しておいたpBluescriptII KSにクローン化してpDWFT11を得た。pDWFT4のBamHI断片を、BamHIで切断しておいたpUC18にサブクローン化することで、BamHI断片内のXhoI切断部位をpUC18のXbaI切断部位に接近させてpDWFT14を得た。次に、プラスミドpDWFT11をXbaIおよびXhoIで切断して、クローン化されたPCR断片およびpUC18のポリリンカー領域の短い断片を切り離した。次に、この断片をアガロースゲル電気泳動で精製し、XbaIおよびXhoIで切断しておいたpDWFT14にクローン化してpDWFT15を得た。こうしてcinA遺伝子の天然の構造を再現し、図4の961〜4872位に存在する、pDWFT4の領域に対応する新しいBamHI断片を得た。続いて、このBamHI断片をpDWFT6にクローン化し、さらにpDWFT4からpDWFT8を得たのと同様にpOJ436にクローン化することでpDWFT25を得た。
【０１５９】
この過程の第2のステップでは、pDWFT5の変異体を作製した。PCR産物を以下の2本のプライマーを用いて得た：
2004526456.tif 000015
（プライマーKPNの先頭の6個のヌクレオチドは、後にPCR断片をAsp718で切断されやすくする意味のみをもつランダムなG＋Cである。続く6個のヌクレオチドは、導入された新しいAsp718切断部位であり、また残りのヌクレオチドは、15621〜15599位のシンナマイシンクラスターと相同である）。
2004526456.tif 000016
【０１６０】
これらのプライマーを用いて、PfuポリメラーゼとテンプレートのpDWFT5を用いてPCR断片を作製した（その他の反応条件はStuPCR1の場合と同じとした）。この長さが約1025 bpのPCR断片をBamHIおよびAsp718で切断し、長さが約956 bpの断片を得た後に、アガロースゲル電気泳動で精製し、BamHIおよびAsp718で切断しておいたpUC18にクローン化してpDWFT16を得た。約6.5 kbのBamHI断片を、S. シンナモニウス・シンナモニウス 40005（S. cinnamoneus cinnamoneus 40005）の染色体DNAから、pDWFT5のAsp718断片をクローン化した手順と同様の方法でクローン化し、染色体DNAをBamHIで切断して、BamHIで切断しておいたpBluescriptIIにクローン化する改変を行ってpDWFT3を得た。図4の8016〜14660位に対応する、pDWFT3に由来する6.5 kbのBamHIを、断片上のcinR1部分とpDWFT16が近接するように、BamHIで切断しておいたpDWFT16にクローン化してpDWFT24を得た。次に、このプラスミドをBglIIおよびEcoRIで切断し、（図4の8730〜15621位に対応する）約6.9 kbの断片を切り出してアガロースゲル電気泳動で精製し、BglIIおよびEcoRIで切断しておいたpDWFT5にクローン化し、約6.3 kbの断片をアガロースゲル電気泳動で精製してpDWFT27を得た。このプラスミドは、図4の5423〜15621位に対応するAsp718断片を含む。最後のステップでは、pDWFT27をAsp718で切断し、約10 kbの断片をアガロースゲル電気泳動で精製し、これを、Asp718断片上のcinX遺伝子部分が、pDWFT25上のcinM遺伝子部分に対応するように、Asp718で切断しておいたpDWFT25にクローン化してpDWFT28を得た。次に、このプラスミドでS. リビダンス 1326（S.lividans 1326）の形質転換を行った。pDWFT28上のDNAは、図4の961〜15621位の領域に対応する。形質転換体を選択し、結果として得られた系統DW28を対象に、シンナマイシンに関するバイオアッセイ法を行い、上述したようにMALDI-TOF解析用に培養物を増殖させた。
【０１６１】
pDWFT9上のシンナマイシンクラスターに由来する単一遺伝子欠失体の構築
1つの遺伝子が除去されて、開始コドンから終止コドンまでの読み枠が完全に失われ、またいずれかが完全に失われ、StuI制限酵素切断部位で置換されるか、またはpDWFT33に由来するテトラサイクリン耐性遺伝子Tcで置換されるような一連の構築物を作製した。これについては、これらの遺伝子群がシンナマイシンの産生に不可欠であるという仮説を検討することとした。
【０１６２】
cinorf7欠失体の構築
cinorf7欠失体の構築は、所望の遺伝子を、選択マーカーをもつ、PCRで作製した置換カセットと相同組換えで置換することで行った。この場合、置換カセットとして、pDWFT33に由来するテトラサイクリン耐性をもたらすTc遺伝子を使用した。置換対象遺伝子をもつプラスミドを用いて、プラスミドpIJ790（pIJ790はプラスミドpKD20（DatsenkoおよびWanner、2000）に由来する）を有するがラムダファージに由来するアラビノース誘導性組換え系をもつ、クロラムフェニコール耐性遺伝子（cat）をアンピシリン耐性遺伝子（bla）の代わりに有する大腸菌（E. coli）BW25113 pIJ790（JICより入手可）を形質転換する。PCR用プライマーは、3'端において所望の置換カセットと相同性をもち、また置換対象領域に隣接するDNAに相同な5'延長部分をもつように設計する。PCR産物を上記プライマーを用いて調製した後に、標的プラスミドとともに大腸菌（E. coli）BW25113 pIJ790の形質転換を行う。次に、細胞内で誘導されたリコンビナーゼが、この相同領域を利用して、PCRプライマーの5'延長部分に結合し、標的DNAに隣接する配列に移動し、標的DNAが置換カセットと置換される。次に形質転換体を、置換カセット上の選択マーカーが利用可能か否かを選択することができる。
【０１６３】
このオリゴヌクレオチドプライマーを使用することで、StuI制限酵素切断部位が、置換対象遺伝子の隣接領域に相同性のある領域と、Tc置換カセットと相同性のある領域との間に組み入れられる。そして続いて、StuI制限酵素で切断してTc置換カセットを除去して、cinorf7の代わりにStuI切断部位を配置することができる。
【０１６４】
以下のオリゴヌクレオチドプライマーを合成した：
2004526456.tif 000017
（このプライマーは、シンナマイシンクラスターの1228〜1266位と相同性をもつ）；および
2004526456.tif 000018
（このプライマーは、シンナマイシンクラスターの1665〜1627位と相同性をもつ）。
【０１６５】
PCRを、7Aおよび7BをプライマーとしてTaqポリメラーゼを用いて標識したPCR7、およびpDWFT33をテンプレートとして、StuPCR2の場合と同様の反応混合物を用いて、「94℃で3分間、94℃で35秒間の溶解を5サイクル、55℃で1分間のアニーリング、72℃で2分間の伸長、94℃で35秒間の溶解を20サイクル、60℃で1分間のアニーリング、72℃で2分間の伸長」の加熱サイクルで行った。次に、PCR産物をアガロースゲル電気泳動で精製した。プラスミドpDWFT7で大腸菌（E. coli）BW25113 pIJ790（JICより入手可）の形質転換を行った。大腸菌（E. coli）BW25113 pIJ790 pDWFT7を、クロラムフェニコール（25 μg/ml）、アプラマイシン、およびL-アラビノース（最終濃度＝10 mM）を添加した10 mlのSOB（Hanahan、1983）中で、OD600が約0.6になるまで30℃で増殖させた後に、10 mlの氷冷した10%グリセロールで2回洗浄して100 μlの10%グリセロール中に懸濁して、エレクトロポレーションに適した細胞を調製した。エレクトロポレーションで約100 ngの精製PCR7を細胞に導入した。エレクトロポレーションは、200 Ω、25 μF、および2.5 kVのパラメータに設定したBioRad GenePulser IIを用いて、0.2 cmの氷冷したエレクトロポレーション用チャンバー内で行った。電気ショックを加えた細胞を、1 mlのLB（Luria-Bertani培地；Sambrookら、1998）に添加し、30℃で1時間インキュベートした後に、LB寒天＋テトラサイクリン（10 μg/ml）上にプレーティングし、37℃で一晩インキュベートして、Tc遺伝子を含むPCR産物と標的遺伝子の置換が成功したコロニーを選択した。このようにして、cinorf7がStuIで挟まれたTc遺伝子で置換された、pDWFT7の変異体pDWFT73を選択した。次に、このプラスミドを用いて、pDWFT9の作製にpDWFT7の場合と同様の手順で、cinorf7がStuIで挟まれたTc遺伝子で置換された、pDWFT9の変異体を作製してpDWFT77を得た。次に、このプラスミドをStuIで切断し、生じた大きな断片をアガロースゲル電気泳動で精製して再び連結し、cinorf7がStuI切断部位で置換された、pDWFT9のバージョンpDWFT78を得た。次に、このプラスミドをS. リビダンス 1326（S.lividans 1326）に接合法で導入した。これは以下の手順で行った。プラスミドpDWFT78で大腸菌（E. coli）ET12567/pUZ8002の形質転換を行った。結果として得られた系統（ET12567/pUZ8002/pDWFT78）の1個のコロニーを、カナマイシン（25 μg/ml）、クロラムフェニコール（25 μg/ml）、およびアプラマイシン（50 μg/ml）を含む10 mlのLBに植菌して37℃で一晩増殖させた。一晩培養した培養物を、抗生物質による選択（上記参照）用の新鮮なLBで1：100に希釈し、OD600が約0.4〜0.6となるまで37℃で増殖させた。この細胞を、等容量のLBで2回洗浄して抗生物質を除去し、1 mlのLBに再懸濁した。
【０１６６】
個々の接合時には、約108個のストレプトミセス属の放線菌の胞子を500 μlの2×YTブロスに添加し、50℃で10分間の熱ショックを加え、冷却するまで待機した後に、500 μlのET12567/pUZ8002/pDWFT78細胞と混合し、軽く遠心して上清の大部分を捨てた。ペレットを、残る液体で再懸濁し、SFM寒天＋10 mM MgCl2（Kieserら、2000）にプレーティングし、30℃で16〜20時間インキュベートした。
【０１６７】
0.5 mgのナリジクス酸（大腸菌（E. coli）を死滅させることでストレプトミセス属の放線菌細胞を選択する）、および1 mgのアプラマイシンを含む1 mlの水をプレートに加え、30℃で3〜6日間インキュベートした。接合完了体（exoconjugant）を、SFM＋ナリジクス酸（50 μg/ml）およびアプラマイシン（50 μg/ml）上にストリークした。このようにして作製した系統C78を対象に、シンナマイシン産生に関するバイオアッセイ法を上述した手順で行い、SFM＋アプラマイシン（50 μg/ml）培地上で増殖させて胞子を調製し、MALDI-TOFアッセイ法用の液体培養物を調製した。この液体培養物は上述の手順で調製した（ただし培養後の培地を有機溶媒で抽出するのではなく、10%ギ酸中に1/10に希釈して、MALDI-TOF質量分析計に直接使用した）。
【０１６８】
cinA欠失体の構築
cinA欠失体の構築は、各PCR産物のうち、プライマー配列の1つがcinA遺伝子に直接隣接するDNA領域と相同性をもつ重複性PCR産物を作製することで行った。このようなプライマーは相互にかなりの重複部分ももつので、後のPCRプライマーが相互にアニーリングして伸長することが可能であり、結果として得られた産物を、隣接するPCR用プライマーで増幅することができる。
【０１６９】
以下のオリゴヌクレオチドプライマーを合成した：
2004526456.tif 000019
（このプライマーは、シンナマイシンクラスターの811〜832位と相同性をもつ）；
2004526456.tif 000020
（このプライマーは、シンナマイシンクラスターの1670〜1650位および1919〜1908位と相同性をもつ）；
2004526456.tif 000021
（このプライマーは、シンナマイシンクラスターの1659〜1650位および1908〜1925位と相同性をもつ）；および
2004526456.tif 000022
（このプライマーは、シンナマイシンクラスターの2795〜2774位と相同性をもつ）。
【０１７０】
PfuポリメラーゼおよびテンプレートpDWFT4を用いて、プライマー対FTP35およびLAを用いて、StuPCR1の場合と同様の反応条件でPCRを行ってPCR産物CINAPCR1を得たほか、RAおよびFTP28を用いて同等の反応条件でPCR産物CINAPCR2を得た。これらのPCR産物をアガロースゲル電気泳動で精製した後に、プライマー対FTP35およびFTP28を用いてPCRを行い、StuPCR3の作製時と同様の手順でPCR産物CINAPCR3を得た。次に、この産物をアガロースゲル電気泳動で精製し、SalIおよびPstIで切断し、SalIおよびPstIで切断しておいたpUC18にクローン化し、アガロースゲル電気泳動で精製してpDWFT35を得た。プラスミドpDWFT14r（pDWFT14fの場合と同様の手順で作製；ただし約5 kbのBamHI断片の方向は反対）をAsp718およびSalIで切断し、約900 bpの断片をアガロースゲル電気泳動で精製し、Asp718およびSalIで切断しておいたpDWFT35にクローン化し、アガロースゲル電気泳動で精製してpDWFT55を得た。次に、プラスミドpDWFT4をPstIおよびXbaIで切断し、約2.5 kbの断片をアガロースゲル電気泳動で精製し、PstIおよびXbaIで切断しておいたpDWFT55にクローン化し、アガロースゲル電気泳動で精製してpDWFT56を得た。結果として得られたプラスミドpDWFT56は、cinA遺伝子を欠く点を除いてはpDWFT4と類似のプラスミドである。次に、このプラスミドを用いて、pDWFT9に類似しているがcinAを欠くシンナマイシンクラスターを、pDWFT9の作製に用いた経路と同様の経路で再構築してpDWFT69を得た。次に、このプラスミドを、cinorf7欠失体の構築について説明した接合法でS. リビダンス 1326（S.lividans 1326）に導入した。結果として得られた系統C69を対象に、シンナマイシンに関してバイオアッセイ法を行い、cinorf7欠失体の構築に際して説明したように、MALDI-TOF解析用の培養物を増殖させた。
【０１７１】
cinM欠失体の構築
cinM欠失体の構築は、各PCR産物のうち、プライマー配列の1つがcimM遺伝子に直接隣接するDNA領域と相同性をもつ重複性PCR産物を作製することで行った。このようなプライマーは相互にかなりの重複部分ももつので、後のPCRプライマーが相互にアニーリングして伸長することが可能であり、結果として得られた産物を、隣接するPCR用プライマーで増幅することができる。
以下のオリゴヌクレオチドプライマーを合成した：
XHO（上記参照）；
2004526456.tif 000023
（このプライマーは、シンナマイシンクラスターの5337〜5326位および2058〜2037位と相同性をもつ）；
2004526456.tif 000024
（このプライマーは、シンナマイシンクラスターの2047〜2058位と5326〜5343位と相同性をもつ）；および
2004526456.tif 000025
（このプライマーは、シンナマイシンクラスターの5449〜5429位と相同性をもつ）。
【０１７２】
PfuポリメラーゼおよびテンプレートのpDWFT9を用いて、プライマー対XHOおよびLMを用いて、StuPCR1の場合と同様の反応条件でPCR産物を調製して、PCR産物CINMPCR1を得た。同様の反応条件で、RMおよびFTPMRを用いて、PCR産物CINAPCR2を得た。これらのPCR産物をアガロースゲル電気泳動で精製した後に、プライマー対XHOおよびFTPMRを用いてPCRを行い、StuPCR3の作製時と同様の手順でPCR産物CINAPCR3を得た。次に、この産物をアガロースゲル電気泳動で精製し、XhoIおよびAsp718で切断し、XhoIおよびAsp718で切断しておいたpDWFT7に由来する約4.7 kbの断片にクローン化し、アガロースゲル電気泳動で精製してpDWFT43を得た。プラスミドpDWFT43は、cinM遺伝子を欠く点を除いてはpDWFT7と類似のプラスミドである。次に、このプラスミドを用いて、pDWFT9に類似しているがcinMを欠くシンナマイシンクラスターを、pDWFT9の作製に用いた経路と同様の経路で再構築してpDWFT68を得た。次に、このプラスミドを、cinorf7欠失体の構築について説明した接合法でS. リビダンス 1326（S.lividans 1326）に導入した。結果として得られた系統C68を対象に、シンナマイシンに関してバイオアッセイ法を行い、cinorf7欠失体の構築に際して説明したように、MALDI-TOF解析用の培養物を増殖させた。
【０１７３】
cinX欠失体の構築
cinX欠失体の構築は、cinorf7の場合と同様の手順で行い、cinXの代わりにStuI切断部位を配置した。
【０１７４】
以下のプライマーを使用した：
2004526456.tif 000026
（このプライマーは、シンナマイシンクラスターの5301〜5339位と相同性をもつ）；および
2004526456.tif 000027
（このプライマーは、シンナマイシンクラスターの6356〜6318位と相同性をもつ）。
【０１７５】
プライマーとしてXAおよびXBを用いて、cinorf7の場合と同様の手順でPCR産物PCRXを調製した。プラスミドpDWFT5をAsp718で切断し、約11.5 kbの断片をアガロースゲル電気泳動で精製し、Asp718で切断しておいたpDWFT7にクローン化し、アガロースゲル電気泳動で精製して、シンナマイシンクラスターの元の方向を再現してpDWFT74を得た。プラスミドpDWFT74で、大腸菌（E. coli）BW25113 pIJ790の形質転換を行った。次にBW25113 pIJ790 pDWFT74系統を用いて、エレクトロポレーションに適した状態の細胞を調製し、cinorf7の場合と同様の手順で、PCRXでエレクトロポレーションによる形質転換を行った。このようにして、cinXが、StuIに挟まれたTc遺伝子と置換された、pDWFT74の変異体pDWFT79を選択した。次に、このプラスミドを用いて、XbaIおよびAsp718で切断して、XbaIおよびAsp718で切断しておいたpOJ436にクローン化することで、cinXがStuIに挟まれたTc遺伝子と置換された、pDWFT9の変異体pDWFT82を選択した。次に、このプラスミドをStuIで切断し、生じた大きな断片をアガロースゲル電気泳動で精製して再び連結し、cinXがStuI切断部位で置換されたpDWFT9のバージョンpDWFT90を得た。次に、このプラスミドをS. リビダンス 1326（S.lividans 1326）に、cinorf7欠失体の構築について記載された手順で、接合法で導入した。結果として得られたC90株系統を対象に、シンナマイシンに関してバイオアッセイ法を行い、cinorf7欠失体の構築に際して説明したように、MALDI-TOF解析用の培養物を増殖させた。
【０１７６】
cinR欠失体の構築
cinR欠失体の構築は、cinorf7の場合と同様の手順で行い、cinRの代わりにStuI切断部位を配置した。
【０１７７】
以下のプライマーを使用した：
2004526456.tif 000028
（このプライマーは、シンナマイシンクラスターの11798〜11760位と相同性をもつ）；および
2004526456.tif 000029
（このプライマーは、シンナマイシンクラスターの11072〜11110位と相同性をもつ）。
【０１７８】
プライマーとしてRAおよびRBを用いて、cinorf7の場合と同様の手順でPCR産物PCRRを調製した。プラスミドpDWFT5で大腸菌（E. coli）BW25113 pIJ790の形質転換を行った。次に、BW25113 pIJ790 pDWFT5系統を用いて、エレクトロポレーションに適した状態の細胞を調製し、cinorf7の場合と同様の手順で、PCRRでエレクトロポレーションによる形質転換を行った。このようにして、cinRが、StuIに挟まれたTc遺伝子と置換された、pDWFT5の変異体pDWFT80を選択した。次に、このプラスミドを用いて、pDWFT5を用いてpDWFT9を作製した同様の手順で、cinRが、StuIに挟まれたTc遺伝子と置換された、pDWFT9の変異体pDWFT85を得た。次に、このプラスミドをStuIで切断し、生じた大きな断片をアガロースゲル電気泳動で精製して再び連結し、cinRがStuI切断部位で置換された、pDWFT9のバージョンpDWFT88を得た。次に、このプラスミドを、cinorf7欠失体の構築について説明した接合法でS. リビダンス 1326（S.lividans 1326）に導入した。結果として得られた系統C88を対象に、シンナマイシンに関してバイオアッセイ法を行い、cinorf7欠失体の構築に際して説明したように、MALDI-TOF解析用の培養物を増殖させた。
【０１７９】
cinR1欠失体の構築
cinR1欠失体の構築は、cinorf7の置換の場合と同様の手順で、cinR1をTc置換カセットと置換して行った。
【０１８０】
以下のプライマーを使用した：
2004526456.tif 000030
（このプライマーは、シンナマイシンクラスターの15199〜15161位と相同性をもつ）；および
2004526456.tif 000031
（このプライマーは、シンナマイシンクラスターの14336〜14374位と相同性をもつ）。
【０１８１】
プライマーとしてSARPAおよびSARPBを用いて、cinorf7の調製と同様の手順でPCR産物PCRSARPを調製した。プラスミドpDWFT5で、大腸菌（E. coli）BW25113 pIJ790の形質転換を行った。次に、系統BW25113 pIJ790 pDWFT5を用いて、エレクトロポレーションに適した状態の細胞を調製し、cinorf7の場合と同様の手順で、PCRSARPでエレクトロポレーションによる形質転換を行った。このようにして、cinR1が、StuIに挟まれたTc遺伝子と置換された、pDWFT5の変異体pDWFT81を選択した。次に、このプラスミドを用いて、pDWFT5を用いてpDWFT9を作製した同様の手順で、cinR1が、StuIに挟まれたTc遺伝子と置換された、pDWFT9の変異体pDWFT89を得た。次に、このプラスミドを、cinorf7欠失体の構築について説明した接合法でS. リビダンス 1326（S.lividans 1326）に導入した。結果として得られた系統C89を対象に、シンナマイシンに関してバイオアッセイ法を行い、cinorf7欠失体の構築に際して説明したように、MALDI-TOF解析用の培養物を増殖させた。
【０１８２】
結果
上述のシンナマイシンクラスターの全欠失体構築物をバイオアッセイ法で調べて、抗生物質化合物の産生能力を保持しているかどうかを判定した（表5参照）。
【０１８３】
系統DW28（領域cinAおよびcinR1の上流の欠失体）、ならびにC90（cinXの欠失体）は、抗生物質化合物を産生していたが、系統C78（cinorf7の欠失体）、C69（cinAの欠失体）、C68（cinMの欠失体）、C88（cinRの欠失体）、およびC89（cinR1の欠失体）では産生は認められなかった。以上の結果は、C78、C69、C68、C88、およびC89（それぞれ遺伝子cinorf7、cinA、cinM、cinR、およびcinR1に対応する）でシンナマイシンクラスターから失われた領域が、バイオアッセイ法における枯草菌（B.subtillis）の増殖の阻害に不可欠なことを意味する。しかし、DW28（cinorf3、cinorf13、およびcinorf14の全体、ならびにcinorf4およびcinorf12の大部分を含む）、ならびにC90（cinXの欠失体）でシンナマイシンクラスターから失われた領域は、バイオアッセイ法における枯草菌（B.subtillis）の増殖の阻害に不可欠ではない。これらの系統に由来する上清をMALDI-TOF質量分析で調査して、シンナマイシンの分子量を示す化合物が、同系統で未だ作られているかどうかを判定した（表6参照）。
【０１８４】
表6に示したMALDI-TOF質量分析データから、DW28およびC78は未だシンナマイシン（MW＝2039）を産生するが、C69、C68、およびC90は産生しないことがわかる。この結果は、cinA、cinM、およびcinXがシンナマイシン産生に不可欠なことを意味する。しかし、表6に示した系統のなかで、シンナマイシンを産生する3つの系統では、分子量が2023ダルトン（シンナマイシンより16ダルトン軽い）のピークも認められる。このピークは、シンナマイシンを産生できない3つの系統のうち、C69（cinAの欠失体）、およびC68（cinMの欠失体）の2つの系統では認められないが、C90（cinXの欠失体）には存在する。
【０１８５】
考察
後述する結果はいずれも、S. リビダンス 1326（S.lividans 1326）のシンナマイシンクラスターの遺伝子の機能に関する。
【０１８６】
本発明者らは、cinAプロペプチドのコード領域のいずれかの側に固有の制限酵素切断部位を導入することにより、シンナマイシンの構造遺伝子をコードするcinAの領域を、シンナマイシンの変異体をコードする領域と置換可能であることを明らかにした。これに関して本発明者らは、シンナマイシンクラスターを操作して、シンナマイシンの代わりにデュラマイシンおよびデュラマイシンBを産生可能であることを示す証拠を得ている。本明細書に記載された方法で、シンナマイシンの多種多様な新しい変異体の産生することができる。
【０１８７】
系統DW28については、本発明者らは、図4に示すシンナマイシンクラスターの1〜961位および15621〜17083位がS. リビダンス 1326（S.lividans 1326）におけるシンナマイシンの産生に不可欠ではないことも示した。この結果は、cinorf3、cinorf13、およびcinorf14が、シンナマイシンの産生に不可欠でないことを意味する。またcinorf4が不可欠でないことも示唆している。というのは、そのプロモーター領域も欠く切断型として存在するだけだからである。またcinorf12の産物が、シンナマイシン産生に不可欠でない可能性があることも示唆されている。
【０１８８】
バイオアッセイ法および質量分析による解析の両方により、系統C69およびC68については、遺伝子cinAおよびcinMの両方が、シンナマイシンの産生に不可欠なことがわかる。本発明者らが既に示したように遺伝子cinAはシンナマイシンの構造遺伝子であり、これを操作することで、シンナマイシンの天然の変異体を産生するシンナマイシンクラスターを作製することができる。遺伝子cinMは、シンナマイシンのランチオニン残基の産生に関与する可能性があるLanM型タンパク質をコードすると考えられる。
【０１８９】
系統C78はバイオアッセイ法で阻害ゾーンを生じないが、質量分析による解析の結果によればシンナマイシンを産生する。この結果は、同系統がMALDI-TOF質量分析計で十分検出される量のシンナマイシンを産生するが、枯草菌（B.subtilis）の増殖を十分阻害するシンナマイシンを産生しないことを示唆している。この結果は、cinorf7がシンナマイシン産生には不可欠ではないが、シンナマイシン産生を大きく促進することを意味する。
【０１９０】
系統C90はバイオアッセイ法で阻害ゾーンを生じるが、シンナマイシンの分子量を示す化合物を産生しない。しかし、表6に示す他のシンナマイシン産生系統と同様に、シンナマイシンより16ダルトン軽い化合物を産生する。シンナマイシンプロペプチドの翻訳後修飾のなかには、アスパラギン酸残基へ酸素原子の付加によるベータ-ヒドロキシアスパラギン酸の形成がある。本明細書に示した結果は、酸素原子を付加する過程が効率的ではないこと、また本発明者らがデオキシシンナマイシンと呼ぶことを提案するシンナマイシン前駆体の一部が分泌されてから、修飾されること、そしてこれが、MALDI-TOF質量分析で検出される分子量2023のピークとなって現れることを示唆している。C90が、デオキシシンナマイシンに対応する分子量のピークのみを生じることは、cinXの産物が、プロペプチドのアスパラギン酸残基へ酸素原子を付加してシンナマイシンの形成に関与する酵素であることを示唆する。これは、cinXをシンナマイシンクラスターから除去することで、またこの段階を、シンナマイシンの変異体の産生に関する上述の方法と組み合わせることによって、変異体とデオキシ変異体の両方を産生することが可能なことを意味すると考えられる。また、系統におけるcinXのコピー数を増やすことによっても、細胞内のcinX産物の量を増やすことで、シンナマイシンクラスターを有するS. リビダンス（S.lividans）系統によって産生されるデオキシシンナマイシン（またはデオキシ-変異体）の量を減少させることが可能かもしれない。
【０１９１】
系統C88およびC89を対象としたバイオアッセイ法で得られた結果から、遺伝子cinRおよびcinR1が、S. リビダンス（S.lividans）系統を対象としたバイオアッセイ法で検出されるために十分なシンナマイシンの産生に少なくとも必要であることが示唆される。
【０１９２】
（表１）プラスミドpDWFT9またはベクターpOJ436のいずれかを有するS. リビダンス（S.lividans）の系統が枯草菌（B.subtilis）の増殖に及ぼす作用
2004526456.tif 000032
【０１９３】
（表２）シンナマイシンと同等の分子量をもつ化合物のMALDI-TOF質量分析による検出
2004526456.tif 000033
【０１９４】
（表３）シンナマイシンの変異体をコードするクラスターをもつプラスミドを有するS. リビダンス（S.lividans）の系統が枯草菌（B.subtilis）の増殖に及ぼす作用
2004526456.tif 000034
【０１９５】
（表４）シンナマイシンおよびシンナマイシン誘導体のMALDI-TOF質量分析による検出
2004526456.tif 000035
【０１９６】
（表５）DNAのさまざまな部分が欠失したpDWFT9の変異体を有するS. リビダンス（S.lividans）の系統が枯草菌（B.subtilis）の増殖に及ぼす作用
2004526456.tif 000036
【０１９７】
（表６）DNAのさまざまな部分が欠失したpDWFT9の変異体を有するS. リビダンス（S.lividans）の系統を対象としたMALDI-TOF質量分析によるシンナマイシンの検出
2004526456.tif 000037
注：系統C9はpDWFT9を有するので系統DW9a-1に似ているが、形質転換ではなく接合法で作製された。
【図面の簡単な説明】
【０１９８】
本発明の実験の基礎について、添付図表を参照して、例示する目的のみで以下に詳しく説明する：。
【図１】プローブCKのDNA配列。この図を始め本明細書では、塩基Nは、A、C、G、またはT（RNAの場合はU）を意味する。
【図２】pDWCC1のDNA配列。プライマーBB3およびBB4は太字で表示した。
【図３】プローブBBのDNA配列。
【図４】プラスミドpDWFT9上に存在する、ストレプトミセス・シンナモニウス・シンナモニウス 40005（Streptomyces cinnamoneus cinnamoneus 40005）のシンナマイシンクラスターの配列。SARP結合部位と考えられる部位を太字で示し、-10プロモーター部位と考えられる部位を太斜体字で示す。配列内の読み枠は以下の通りである（括弧内の数字は、先頭と末尾の塩基対を意味する）：cinorf3＝相補物（346..1）（注：これは不完全なorfなので配列の末端は停止コドンではない）；cinorf4＝454..1026；smallorf＝1109..1198；cinorf7＝1267..1626；cinA＝1671..1907；cinM＝2059..5325；cinX＝5340..6317；cinT＝6543..7472；cinH＝7469..8341；cinY＝8444..9466；cinZ＝相補物（10171..9545）；cinorf8＝10246..10665；cinorf9＝10758..11078；cinR＝相補物（11761..11111）；cinK＝相補物（12822..11758）；cinorf10＝13257..13754；cinorf11＝13754..14944；cinR1＝相補物（15160..14375）；cinorf12＝15381..15872；cinorf13＝15912..16496；cinorf14＝16549..17083（注：これは不完全なorfのため、配列の末端は停止コドンではない）。
【図５】ストレプトミセス・シンナモニウス・シンナモニウス 40005（Streptomyces cinnamoneus cinnamoneus 40005）のシンナマイシンクラスターの推定遺伝子群の順序および方向。pDWFT9を得るためにpOJ436に挿入されたストレプトミセス・シンナモニウス・シンナモニウス 40005（Streptomyces cinnamoneus cinnamoneus 40005）のDNAの全体も併せて示す。この図で大文字で示した推定遺伝子には、本文中では「cin」が接頭辞として付けられており、数字に接頭辞cinorfがつく。クローニング過程で使用される酵素で切断される制限酵素切断部位を、図4に示した配列中の関連する認識部位の先頭の塩基対の位置とともに示した。これは略図であって実寸を反映していない。
【図６】プローブ1.1のDNA配列。
【図７】cinorf3にコードされた推定アミノ酸配列。これは不完全なorfである。MWを併せて示す。
【図８−２６】個々のorf（図5の左側のcinorf4から図5の右側のcinorf13）にコードされた推定アミノ酸配列。MWを併せて示す。
【図２７】cinorf14にコードされた推定アミノ酸配列。これは不完全なorfである。MWを併せて示す。
【図２８】pCK51のDNA配列。
【図２９】pDWFT33のテトラサイクリン耐性カセットのDNA配列。
【図１−１】
2004526456.tif 000038
【図１−２】
2004526456.tif 000039
【図２−１】
2004526456.tif 000040
【図２−２】
2004526456.tif 000041
【図２−３】
2004526456.tif 000042
【図２−４】
2004526456.tif 000043
【図３】
2004526456.tif 000044
【図４−１】
2004526456.tif 000045
【図４−２】
2004526456.tif 000046
【図４−３】
2004526456.tif 000047
【図４−４】
2004526456.tif 000048
【図４−５】
2004526456.tif 000049
【図５】
2004526456.tif 000050
【図６】
2004526456.tif 000051
【図７】
2004526456.tif 000052
【図８】
2004526456.tif 000053
【図９】
2004526456.tif 000054
【図１０】
2004526456.tif 000055
【図１１】
2004526456.tif 000056
【図１２】
2004526456.tif 000057
【図１３】
2004526456.tif 000058
【図１４】
2004526456.tif 000059
【図１５】
2004526456.tif 000060
【図１６】
2004526456.tif 000061
【図１７】
2004526456.tif 000062
【図１８】
2004526456.tif 000063
【図１９】
2004526456.tif 000064
【図２０】
2004526456.tif 000065
【図２１】
2004526456.tif 000066
【図２２】
2004526456.tif 000067
【図２３】
2004526456.tif 000068
【図２４】
2004526456.tif 000069
【図２５】
2004526456.tif 000070
【図２６】
2004526456.tif 000071
【図２７】
2004526456.tif 000072
【図２８−１】
2004526456.tif 000073
【図２８−２】
2004526456.tif 000074
【図２８−３】
2004526456.tif 000075
【図２８−４】
2004526456.tif 000076
【図２９】
2004526456.tif 000077
【国際公開パンフレット】
2004526456.tif 000078
2004526456.tif 000079
2004526456.tif 000080
2004526456.tif 000081
2004526456.tif 000082
2004526456.tif 000083
2004526456.tif 000084
2004526456.tif 000085
2004526456.tif 000086
2004526456.tif 000087
2004526456.tif 000088
2004526456.tif 000089
2004526456.tif 000090
2004526456.tif 000091
2004526456.tif 000092
2004526456.tif 000093
2004526456.tif 000094
2004526456.tif 000095
2004526456.tif 000096
2004526456.tif 000097
2004526456.tif 000098
2004526456.tif 000099
2004526456.tif 000100
2004526456.tif 000101
2004526456.tif 000102
2004526456.tif 000103
2004526456.tif 000104
2004526456.tif 000105
2004526456.tif 000106
2004526456.tif 000107
2004526456.tif 000108
2004526456.tif 000109
2004526456.tif 000110
2004526456.tif 000111
2004526456.tif 000112
2004526456.tif 000113
2004526456.tif 000114
2004526456.tif 000115
2004526456.tif 000116
2004526456.tif 000117
2004526456.tif 000118
2004526456.tif 000119
2004526456.tif 000120
2004526456.tif 000121
2004526456.tif 000122
2004526456.tif 000123
2004526456.tif 000124
2004526456.tif 000125
2004526456.tif 000126
2004526456.tif 000127
2004526456.tif 000128
2004526456.tif 000129
2004526456.tif 000130
2004526456.tif 000131
2004526456.tif 000132
2004526456.tif 000133
2004526456.tif 000134
2004526456.tif 000135
2004526456.tif 000136
2004526456.tif 000137
2004526456.tif 000138
2004526456.tif 000139
2004526456.tif 000140
2004526456.tif 000141
2004526456.tif 000142
2004526456.tif 000143
2004526456.tif 000144
2004526456.tif 000145
2004526456.tif 000146
2004526456.tif 000147
2004526456.tif 000148
2004526456.tif 000149
2004526456.tif 000150
2004526456.tif 000151
2004526456.tif 000152
2004526456.tif 000153
2004526456.tif 000154
2004526456.tif 000155
2004526456.tif 000156
2004526456.tif 000157
2004526456.tif 000158
2004526456.tif 000159
2004526456.tif 000160
2004526456.tif 000161
2004526456.tif 000162
2004526456.tif 000163
2004526456.tif 000164
2004526456.tif 000165
2004526456.tif 000166
2004526456.tif 000167
2004526456.tif 000168
2004526456.tif 000169
2004526456.tif 000170
2004526456.tif 000171
2004526456.tif 000172
2004526456.tif 000173
2004526456.tif 000174
2004526456.tif 000175
2004526456.tif 000176
2004526456.tif 000177
2004526456.tif 000178
2004526456.tif 000179
2004526456.tif 000180
2004526456.tif 000181
2004526456.tif 000182
2004526456.tif 000183
【国際調査報告】
2004526456.tif 000184
2004526456.tif 000185
2004526456.tif 000186
2004526456.tif 000187
2004526456.tif 000188