(57)【要約】本発明は、以下の相を含む、間期核上での蛍光プローブのインサイチューハイブリダイゼーションによって染色体不均衡を検出するシステムに関する；異なる二つの染色体上で蛍光プローブをインサイチューでハイブリダイズさせる段階；それぞれのプローブを異なる蛍光色素に曝露する段階；測定が、対照細胞集団において、および検出を行う細胞集団において行われる、このように曝露されたそれぞれのプローブにそれぞれ対応するシグナル強度を核の集合体上で測定する段階；比の計算が、参照比を提供するための前記対照細胞集団および検出を行う前記集団について行われる、プローブのそれぞれに対応するシグナル間の比を計算する段階；検出を行う集団に対応する蛍光比を参照比と比較する段階；および比較の結果を処理して、染色体間不均衡を検出する段階。
2004535807.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の相を含む、間期核に対する蛍光インサイチューハイブリダイゼーションによって染色体間不均衡を検出する方法：
−  異なる二つの染色体上で蛍光プローブをインサイチューでハイブリダイズさせる段階、
−  異なる蛍光色素によってそれぞれのプローブを可視化する段階、
−  測定が最初に対照細胞集団において行われ、次に、検出すべき細胞集団において行われる、一組の核においてこのように可視化されたそれぞれのプローブにそれぞれ対応するシグナル強度を測定する段階、
−  比の計算が最初に、参照比を提供するために対照細胞集団について行われ、次に検出すべき細胞集団について行われる、プローブにそれぞれ対応するシグナル間の比を計算する段階、
−  検出すべき細胞集団に対応するシグナル間の比を参照比と比較する段階、および
−  染色体間不均衡を検出するためにこの比較結果を処理する段階。
【請求項２】
各プローブにそれぞれ対応する二つのシグナルの測定が自動画像サイトメトリーによって行われることを特徴とする、請求項1記載の方法。
【請求項３】
二つのプローブがそれぞれ、異なる二つの蛍光色素によって可視化される（例えば緑色蛍光色素と赤色蛍光色素）ことを特徴とする、請求項1および2のいずれかに記載の方法。
【請求項４】
それぞれのプローブからの強度シグナルが、オペレーターによって定義されうる核の数、例えば数百個について測定されることを特徴とする、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
測定相が、所定の画像倍率で、分析可能な核の少なくとも既定数を得るために、定義された測定面において、所定の数の視野を獲得することからなる第一の段階を含むことを特徴とする、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
獲得段階が同様に、それぞれの視野に関して、複数の蛍光色素（例えば、対比染色のために青色、プローブを標識するために緑色と赤色）の波長に対応する複数の平面にそれぞれ対応するいくつかの画像を、連続的な光学フィルタリングによって獲得すること、獲得した画像を保存すること、および獲得した画像と保存した画像とを重ね合わせることを含むことを特徴とする、請求項5記載の方法。
【請求項７】
獲得段階が、対照細胞集団および検出すべき細胞集団と実質的に同一である獲得条件で行われることを特徴とする、請求項5および6のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
対照細胞集団および検出すべき細胞集団にそれぞれ対応する獲得が、同じ測定面に含まれる二つの視野において行われることを特徴とする、請求項7記載の方法。
【請求項９】
測定相がまた、核を検出して蛍光強度シグナルを定量する第二の段階も含むことを特徴とする、請求項5〜8のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
検出および定量段階が、測定面に含まれるそれぞれの視野において核のセグメント化を含むことを特徴とする、請求項9記載の方法。
【請求項１１】
核のセグメント化に、凝集物からの核の分離が含まれることを特徴とする、請求項10記載の方法。
【請求項１２】
核のセグメント化に、形態および大きさの基準による人工産物の消失が含まれることを特徴とする、請求項10および11のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
検出および定量段階が、各プローブに対応する各色に関してそれぞれの核内で積分された蛍光シグナル強度の定量を含むことを特徴とする、請求項9〜12のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
検出および定量段階がまた、各視野において、核外のそれぞれの色に関するバックグラウンドレベルの計算も含むことを特徴とする、請求項13記載の方法。
【請求項１５】
検出および定量段階が同様に、ノイズ参照レベルとして最も一般的なバックグラウンドレベルの決定およびそれぞれの核内で定量された蛍光シグナル強度の参照レベルによる補正も含むことを特徴とする、請求項14記載の方法。
【請求項１６】
以下を含む、請求項1〜15のいずれか一項に記載の方法を用いて、間期核において蛍光インサイチューハイブリダイゼーションによって染色体不均衡を検出するシステム：
−  異なる二つの染色体上で蛍光インサイチューでハイブリダイゼーションを行う手段、
−  異なる蛍光色素によってそれぞれのプローブを可視化する手段、
−  最初に対照細胞集団における、次に、検出すべき細胞集団における一組の核について、このように可視化されたそれぞれのプローブにそれぞれ対応する強度シグナルを測定する手段、
−  最初に、参照比を提供するために対照細胞集団に関して、次に検出すべき細胞集団に関して、プローブにそれぞれ対応するシグナル間の比を計算する手段、
−  検出すべき細胞集団に対応するシグナル間の比を参照比と比較する手段、および
−  モザイクの場合においても、染色体間不均衡を検出する目的で、この比較の結果を処理する手段。
【請求項１７】
測定手段として画像サイトメトリー装置を含むことを特徴とする、請求項16記載の検出システム。
【請求項１８】
画像サイトメトリー装置が以下を含むことを特徴とする、請求項17記載の検出システム：
−  予め蛍光インサイチューハイブリダイゼーションを行う細胞集団に適用される多数の蛍光顕微鏡手段、
−  蛍光顕微鏡手段によって得られた画像を獲得する手段、
−  獲得画像を保存する手段、および
−  該獲得画像および保存画像を分析する手段。
【請求項１９】
所定の画像倍率で、少なくとも既定数の分析可能な核を得るために、定義された測定面において所定の数の視野を獲得するために、蛍光顕微鏡手段と画像獲得手段とが協調して作用することを特徴とする、請求項18記載の検出システム。
【請求項２０】
それぞれの視野に関して、複数の蛍光色素（例えば：対比染色のためにDAPI（青色）、プローブのためにFITC（緑色）およびテキサスレッド（商標）（赤色））の波長に対応する複数の平面にそれぞれ対応するいくつかの画像を獲得するために、蛍光顕微鏡手段と獲得手段とを協調作用させるフィルタリング手段を含むことを特徴とする、請求項19記載の検出システム。
【請求項２１】
同じ分析平面内で対照細胞集団に対応する画像と検出すべき細胞集団に対応する画像とを獲得するために、蛍光顕微鏡手段と獲得手段とが協調作用することを特徴とする、請求項18〜20のいずれか一項に記載の検出システム。
【請求項２２】
画像サイトメトリー装置がまた、核を検出して、多数の波長の蛍光シグナルを定量する手段も含むことを特徴とする、請求項17〜21のいずれか一項に記載の検出システム。
【請求項２３】
形態測定および密度測定分析に基づいて核をセグメント化して、測定面の全ての視野に関するマスクを作製するように、検出および定量手段が組織化されることを特徴とする、請求項22記載の検出システム。
【請求項２４】
検出および定量手段が、凝集物から核を分離するように組織化されることを特徴とする、請求項22または23記載の検出システム。
【請求項２５】
検出および定量手段が、大きさおよび形態の基準による人工産物を排除するように組織化されることを特徴とする、請求項22〜24のいずれか一項に記載の検出システム。
【請求項２６】
検出および定量手段が、それぞれの色に関してそれぞれの核内で積分された蛍光シグナル強度を定量するように組織化されることを特徴とする、請求項22〜25のいずれか一項に記載の検出システム。
【請求項２７】
検出および定量手段が、核外のそれぞれの色に関してバックグラウンドレベルを計算するように組織化されることを特徴とする、請求項22〜26のいずれか一項に記載の検出システム。
【請求項２８】
検出および定量手段が、バックグラウンド参照値として最も一般的なバックグラウンドレベルを決定して、それぞれの核内で定量された強度から前記参照値を差し引くように組織化されることを特徴とする、請求項22〜27のいずれか一項に記載の検出システム。
【請求項２９】
請求項1〜15のいずれか一項に記載の染色体間検出方法の、母親の血液中で循環する胎児細胞の核への適用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、間期核の蛍光インサイチューハイブリダイゼーション（FISH）によって染色体間不均衡を検出する方法に関する。本発明はまた、この方法を用いるシステムに関する。
【背景技術】
【０００２】
新生児において認められる最も再発性の構成的染色体不均衡は、第21染色体、第18染色体および第13染色体ならびに性染色体に関する。トリソミー21（ダウン症候群）は最も再発性の異常であり、子供1000人あたり約1.7人が罹患する（Stollら、1998）。
【０００３】
トリソミー21の症例数は、母親の年齢と共に、特に35歳以降増加し、高齢妊娠の場合には出生前検査が勧告される。現在、妊娠年齢の高齢化傾向がある。35歳を超えて出産する女性の割合は4年間で8％から19％に増加した（Stollら、1994）。この割合はさらに増加すると推定されうるが、現在のところフランスにおける出生数は年間750,000例であるため、トリソミー21試験の必要性はおそらく、年間150,000回の次数である。
【０００４】
1970年代以降、通常の細胞遺伝学を用いて羊水穿刺による出生前診断が一般的に行われており、それによって中期染色体上で核型を確立して、このように異常な染色体数を検出することが可能となっている。試料の採取から診断結果までの期間が比較的長いこと（2週間）が、この技術の一番の欠点である。さらに、使用可能な中期細胞を得ることは、症例の100％において確実ではなく（失敗率1％）、母親の細胞が存在することによって偽陽性が現れうる（Vermaら、1998）。
【０００５】
より最近、蛍光インサイチューハイブリダイゼーション（FISH）によって、細胞培養に訴える必要なく、間期細胞に対して直接作業を行うことができるようになった。この技術は、蛍光プローブを用いて染色体（例えば、米国特許第5,756,696号を参照されたい）または染色体領域を標識すること、およびシグナル、すなわち蛍光シグナルを放出する染色体を計数することからなる（Pierluigiら、1996；Steinbornら、1996；Weiら、1997；Eibenら、1999）。このように、全く短期間（数日）で結果を得ることが可能であり、分析は採取した少数の細胞（数百個）について行うことができるが、細胞培養はより多数の細胞（数万個およびそれ以上）を必要とする。
【０００６】
様々なタイプのプローブがこれらの研究に用いられている：セントロメア領域または第21染色体長腕領域を範囲に持つプローブ（コスミド、YACs）（Solovievら、1995、Van Opstadら、1995；Pierluigiら、1996；Steinbornら、1996）。これらのプローブによる第21染色体の部分的標識によって、コピー数を評価することができる。したがって、第21染色体に対応する三つのシグナルを有する細胞を検出するために、手動または自動シグナル計数を行う必要がある。
【０００７】
いくつかの研究から、胎児細胞のインサイチューハイブリダイゼーションが技術的に実現可能であることが示されている。しかし、FISH法と通常の細胞遺伝学による診断とのあいだを直接比較した結果を得る研究はほとんどない（Pierluigiら、1996；Steinbornら、1996；Weiら、1997；Eibenら、1999；Theinら、2000）。それらの研究の著者らは、二つのアプローチによって97〜100％一致すると述べているが、同様に、間期FISHによる結果を解釈する難しさも強調している。これらの問題は、蛍光シグナルを認識して計数するヒトオペレーターが必要であることに本質的に連結している。現在、オペレーターが異なれば、特に異常な数のシグナルを有する核の数の統計学的重要性とのあいだに明らかなばらつきがあることは、診断に関して問題を提起する。観察者間のばらつきは、「スポット」（すなわち、蛍光シグナルのスポット）を定義する場合の様々な基準、例えば、その大きさ、その強度、およびその構造に由来するが、スポットは核における垂直軸Zに従って、しばしば様々な巣状平面に存在するという事実のためでもある。
【０００８】
したがって結果は、それ自体それぞれの研究所において試料の調製によって左右されるこれらの基準に従って有意に異なりうる。「カットオフ」、すなわちこの値以降、試料が異常であると見なされる「陽性閾値」を確立することによって、かなりの偏りが起こる（Ruangvutilertら、2000）。対照例においてシグナル3個を有する核の割合の範囲が、分析した核の10〜20％の範囲となりうるため、この値は確立することが難しい。分析すべき細胞数そのものが50〜200個となりうることから、この値は試験によって変化し、これがこの統計学的ばらつきの原因である。さらに、この試験の医学的解釈を行うためには、染色体数の異常を有する核（モザイク）の比率の値を信頼できるように知ることが重要であるかも知れない。
【発明の開示】
【０００９】
本発明の目的は、まさにそのデザインによって、ヒトオペレーターによる読みに関連する問題をなくし、これまでその分析に影響を及ぼしていた試料の調製におけるばらつきに関する問題の解決を提供する自動検出法を提供することである。
【００１０】
この目的は、以下の相を含む、間期核上での蛍光インサイチューハイブリダイゼーション（FISH）によって、コンピューター化システムを用いて染色体間不均衡を検出する方法によって得られる：
−  異なる二つの染色体上で蛍光プローブをインサイチューでハイブリダイズさせる段階、
−  異なる蛍光色素によってそれぞれのプローブを可視化する段階、
−  測定が最初に対照細胞集団において行われ、次に、検出すべき細胞集団において行われる、一組の核の上でこのように可視化されたそれぞれのプローブにそれぞれ対応する強度シグナルを測定する段階、
−  比の計算が最初に、参照比を提供するために対照細胞集団について行われ、次に検出すべき細胞集団について行われる、前記プローブにそれぞれ対応する前記シグナル間の比を計算する段階、
−  検出すべき細胞集団に対応するシグナル間の比を参照比と比較する段階、および
−  染色体間不均衡を検出するためにこの比較結果を処理する段階。
【００１１】
本発明の目的に関して、「インサイチューハイブリダイゼーション」という用語は、調べるものと相同な特異的配列のプローブによって、DNA（またはRNA）配列を配置するための技術を指すと意図される。これは、ヌクレオチド相補性（A/T、A/U、G/C）に基づく；これは、染色体、細胞、または組織調製物上で正確な物理化学的条件において行うことができる。インサイチューハイブリダイゼーションプロセスの結果は、プローブと標的のあいだのハイブリッドの形成である。インサイチューハイブリダイゼーションには、変性段階、標的上でプローブをインサイチューでハイブリダイズさせる実際の段階、およびハイブリッドまたはプローブを検出する段階が含まれる。蛍光インサイチューハイブリダイゼーションの場合、プローブは蛍光体によって標識し、ハイブリダイゼーションは、蛍光標識によって可視化する。この技術の最近の発達によって、それぞれが異なる蛍光体によって可視化されるいくつかのプローブを同じ調製物において同時に可視化することができる。
【００１２】
各プローブにそれぞれ対応する二つまたはそれ以上のシグナルの測定は、画像サイトメトリーによって都合よく行われる。例えば、二つのプローブを緑色蛍光色素と赤色蛍光色素によってそれぞれ可視化することができる。
【００１３】
このように、間期核でのFISHによる分析の長所を、シグナルの読みの長所と組み合わせた画像サイトメトリーによるアプローチが開発され、これは、オペレーターとは無関係であることから、迅速、正確、定量的、および客観的である。
【００１４】
このアプローチは、最初に、不均衡を示す染色体に関して染色体の染色または染色体領域の染色を用いること、次に、もう一つの染色体（常染色体または性染色体）の染色を用いることからなり、後者は、染色体の染色によって得られたハイブリダイゼーションシグナルが不均衡を示す染色体の染色によって得られたシグナルと比較できるように選択される。実際に、参考染色体と不均衡を示す染色体とは、可能な限り大きさが類似である。このように、例えば、第21染色体の染色によって得られたハイブリダイゼーションシグナルは、大きさが類似である第20染色体または第22染色体の染色によって得られたシグナルと同等であることから、本発明のアプローチは、最初に第21染色体に関する染色を行い、例えば次に参照として用いる第20染色体または第22染色体、第20染色体または第22染色体に関する染色または染色体領域の染色を用いることからなる。第13染色体の異数性（例えば、トリソミー13）に関しては、参照染色体は、好ましくは第14および15染色体から選択される。第18染色体の異数性（例えば、トリソミー18）に関しては、参照染色体は、好ましくは第17、19、および20染色体から選択される。X染色体の異数性に関しては、参照染色体は、例えば第6、7、8、9、10、11および12染色体から選択される。Y染色体の異数性の場合、参照染色体は、好ましくは第19、20、21、および22染色体から選択される。
【００１５】
好ましい態様に従って、インサイチューハイブリダイゼーションにおいて用いられるプローブは、染色体染色プローブである。「染色体染色プローブ」または「染色体染色」という用語は、ハイブリダイゼーション条件において多染色体ゲノムの既定の染色体を含む標的とハイブリダイズするために適しているプローブまたはプローブ組成物を指すと意図される。そのようなプローブ組成物とのそのようなハイブリダイゼーションを行う試料中に、そのような染色体のごく一部が存在すれば、この画分はハイブリダイズして同定される。実際に、2個または3個等の既定の染色体の同時標識および検出を行うために、染色されたプローブを第二、第三等の染色体と混合することができる。様々な染色プローブが現在市販されている（ギブコ-BRL（GIBCO-BRL）；オンコー（ONCOR）；ベーリンガー・マンハイム（BOEHRINGER-MANHEIM）等）。それらは、IRS-PCR増幅（例えば、国際公開公報第00/22164号を参照されたい）によって、染色体の縮重PCRプライマーを用いるDOT-PCR増幅によって、または染色体ソーティング、フローサイトメトリー、もしくは染色体の顕微解剖によって単離された染色体断片から調製される。または、本発明において用いられるプローブは、セントロメア領域（α-サテライトDNA）または染色体腕（テロメア配列、例えば、TTAGGn）の全てもしくは一部を範囲に含むプローブ、または一つもしくはそれ以上の染色体（通常のサテライトDNA 1、2、および3）に対して特異的な反復DNA配列に特異的なプローブである。
【００１６】
好ましい態様に従って、染色体染色プローブは、発光物質、色素等のような非同位元素部分によって標識される。この標識は、プローブを酵素、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジン、ジゴキシゲニン、ハプテン等によって標識することによって間接的に行うことができ、これらを発光物質または色素によって可視化する。発光物質は、励起エネルギー源に応じて、放射発光、化学発光、生物発光および光発光（蛍光および燐光を含む）として分類することができる。「蛍光」という用語は、一般的に例えば紫外光のようなエネルギー源によって励起された場合に光を発する物質（蛍光体のような）の特性を意味する。より好ましくは、プローブは蛍光体によって標識する。
【００１７】
本発明において、本発明者らは、任意の動物またはヒト間期細胞、特に羊水または母親の血液に由来する胎児細胞における染色体間不均衡を検出することを提案する。構成的または後天性（癌）の染色体不均衡の検出はまた、例えば、末梢血細胞、皮膚細胞、口腔内細胞、およびより一般的に診断試験を行うために容易に入手可能な任意の細胞タイプにおいて行うことができる。
【００１８】
本発明において、本発明者らは、分析される染色体のコピー数を検出する代わりに、以下のように染色体間不均衡を検出することを提案する：
−  第21染色体および第22染色体（例えば）に関するプローブのインサイチューハイブリダイゼーションの後に、それぞれのプローブが異なる蛍光色素（緑色または赤色）によって可視化される、
−  それぞれのプローブの強度が、システムによって認識させた後に、対照細胞集団においておよび試験集団において少なくとも数百個（例えば、500個）の核について測定される、コンピューター化画像サイトメトリーシステムを用いて、
−  それぞれのプローブからの二つの強度シグナル間の比の計算により、正常な参考例と比較することによって、少なくとも一つの過剰染色体（例えば、第21染色体）の存在を決定することができる。そうであれば染色体内不均衡は1より大きく、トリソミーの場合には1.5である。プローブのそれぞれからの二つの強度シグナル間の比の計算によっても、正常な参照例と比較することによって染色体モノソミーの有無を決定することができる。その場合、染色体間不均衡は0.5となると考えられる。
【００１９】
現行の検出法と比較した本発明に従う検出法の長所は、以下の通りである：
−  FISH法を用いる事実により、本発明に従う検出法は、細胞培養に関連した全ての短所を回避することができ、少数の細胞（細胞500個〜数千個）を有する試料に関しても統計学的に有意であって制限的でない多くの細胞について、結果をより迅速（数日間で）に得ることができる。
−  分析はコンピューター化システムによって自動的に行われることから、ヒトオペレーターによる読み取りおよび解釈に関連した問題、特に間期核の認識に関する問題はこの方法によって全て消失し、各プローブとのハイブリダイゼーションに関連した総蛍光強度の測定によって、現在提唱されている蛍光シグナルの認識および計数（Tkachukら、1991における「スポット計数」）を用いる場合より、分析はかなり単純となり、はるかにより強くなる。
【００２０】
その上、小さいプローブを用いるほうが、計数にとってよりよい解像度を有するシグナルを生じる場合でも、前記シグナルは、バックグラウンドノイズによって容易に混同され、したがってシグナル対ノイズ比は低くなり、まして羊水は、かなりのバックグラウンドノイズ源である多数のタンパク質を含むことから、シグナル対ノイズ比はなお低くなる。染色体染色を用いる本発明者らのアプローチは、得られたシグナルの大きさのために、小さいシグナルの計数（特にセントロメアプローブの計数）を用いる方法より高いシグナル対ノイズ比を提供する。
【００２１】
バックグラウンドノイズを評価して差し引くことによって、羊水試料の特徴のために難しい条件においてもトリソミー細胞を検出することができる。
【００２２】
さらに、試料調製のばらつきに関する問題は、分析に影響を及ぼさない。二つのシグナルが同じように影響を受けるために、実験条件において起こりうる変化は、蛍光比を変化させないと考えられる。より多数の核を迅速に分析できるという事実により、より良好な統計学的精度でより良好な信頼性によって細胞集団内の二つの集団の存在を検出することが可能である。これによって、母親の細胞の混入例またはモザイク例（胎児の細胞画分のみが異常を示す症例）を区別することが可能となる。
【００２３】
−  最後に、第21同位染色体またはt転座（21；21）を含む特定の症例（Stollら、1998）は、再構成染色体の特性によらず、より良好な信頼性で検出される。染色体の染色を用いると、大きさおよび強度が倍加するスポットを示す。取り付けたカメラによる測定はシグナルの大きさを考慮すればなおもより正確である。このアプローチは第13染色体および第18染色体ならびに性染色体に関する他の病態にも適用することができるが、染色体数の不均衡が存在する他の病態（モノソミー、トリソミー、クアドリソミー等、ポリソミー）にも適用することができる。注意しなければならないのは、蛍光インサイチューハイブリダイゼーションFISH法は、仏国特許出願第2783253号で公表されている特許出願において開示されている異なる方法において、間期核の染色体内不均衡を検出するために、より正確には、染色体腕の全てまたは一部の遺伝子材料の喪失または獲得（欠失、挿入、増幅、複製等）を検出するために既に用いられていることである。本発明の検出法において、異なる二つの蛍光色素によって標識され、染色体の長腕および単腕に対してそれぞれ特異的である二つのプローブをこの同じ染色体上でハイブリダイズさせる。
【００２４】
本発明に従う方法の特に都合のよい態様において、測定する段階は、所定の画像倍率に関して、分析可能な核の少なくとも既定数（数百または数千）を得るために、定義された測定面において、所定の数の視野を獲得することからなる第一の段階を含む。
【００２５】
獲得段階はまた、連続的な狭い帯域光学フィルタリングによって、それぞれの観察視野に関して、複数の蛍光色素（例えば：青色の蛍光を有する4,6-ジアミジノ-2-フェニルインドール（DAPI）、緑色の蛍光を有するフルオレセインイソチオシアネート（FITC）、および赤色の蛍光を有するテキサスレッド（Texas Red）（商標））の波長に対応する複数の平面にそれぞれ対応するいくつかの画像を捕獲すること、これらの獲得した画像を保存して、獲得した画像と保存された画像とを重ねることを含む。
【００２６】
本発明のもう一つの局面に従って、以下を含む、本発明に従う方法を用いて、間期核の蛍光インサイチューハイブリダイゼーションによって、染色体領域の不均衡を検出するシステムを提案する：
−  異なる二つの染色体上で蛍光インサイチューハイブリダイゼーションを行う手段、
−  異なる蛍光色素によってそれぞれのプローブを可視化する手段、
−  最初に対照細胞集団における、および次に検出すべき細胞集団における一組の核において、このように可視化されたそれぞれのプローブに対してそれぞれ対応する強度シグナルを測定する装置、
−  参照比を提供するために最初に対照細胞集団について、および次に検出すべき細胞集団について、前記プローブにそれぞれ対応するシグナル間の比を計算する手段、
−  検出すべき細胞集団に対応するシグナル比を参照比と比較する手段、および
−  染色体間不均衡を検出する目的でこの比較結果を処理する手段。
【００２７】
画像サイトメトリー装置は以下を含むことが都合がよい：
−  蛍光インサイチューハイブリダイゼーションを行う細胞集団に予め適用される多数の蛍光顕微鏡手段、
−  蛍光顕微鏡手段によって生成された画像の組を獲得する手段、
−  獲得された画像を保存する手段、および
−  獲得された画像と保存された画像とを分析する手段。
【００２８】
蛍光顕微鏡手段および画像獲得手段は、所定の画像倍率に関して少なくとも既定数の分析可能な核を得るために、定義された測定面において、所定の数の視野を獲得するように協調作用する。
【００２９】
本発明に従う検出システムの好ましい構造において、システムはまた、それぞれの視野に関して複数の蛍光色素（例えば、DAPI、FITC（緑色）、テキサスレッド（赤））の波長に対応する複数の平面にそれぞれ対応するいくつかの画像を獲得するために、蛍光顕微鏡手段および獲得手段と協調して作用するフィルタリング手段を含む。
【００３０】
その上、蛍光顕微鏡手段および獲得手段は、同じ分析平面において、対照細胞集団に対応する画像と検出すべき細胞集団に対応する画像とを獲得するために協調して有利に作用しうる。
【００３１】
本発明の他の長所および特徴は、決して制限的でない態様および以下の添付の図面に関する詳細な説明を調べれば明らかとなると思われる。
【００３２】
検出および定量相の前に行われる最初の調製およびハイブリダイゼーション相を、特に図1を参考にして、本発明に従う検出法の実行例という意味において、まず説明する。
【００３３】
試料の調製
現在羊水に由来する試験試料は、これが培養物中の試料を含むかまたは直接分析されるスライドガラス上での通常の細胞遺伝学分析のために調製される。しかし、スライドガラスの自動分析を改善するために、スライドガラスへのスポットプレーティングに関しては、細胞を平坦にプレーティングするためにウェルの遠心分離を用いる（例えばサイトスピン（cytospin）（商標））ことが推奨される。これによって、自動読み取りのあいだに「焦点がぼやける」細胞数を減少させることができる。プレーティング部位を限定することによっても、画像の獲得時間が短縮される。
【００３４】
培養した羊水試料を、通常の出生前診断プロトコールに従って処理する。直接の液体分析の場合、ペプシンによる処置の後に、細胞凝集物解離培地による処置を行う。
【００３５】
プレーティングはまた、ウェルの遠心を用いて行う。対照スライドガラスは、同じプロトコールに従って正常な羊水または正常線維芽細胞から調製することができる。さらに、分析はまた、血液試料について行うことができる。母親の末梢血に由来する試料の場合、予め胎児細胞の検出を行う。
【００３６】
プローブの調製
インサイチューハイブリダイゼーションは、染色体を染色するための通常のプロトコール（Truongら、1998）に従って行うことができる。まず、スライドガラスを2SSC生理食塩液溶液において15分間インキュベートした後、PBS緩衝液によってすすぎ、0.01 N HCl中でペプシン処理（4 μg/ml、シグマ（Sigma））を10分間行う。消化を5分間のPBS浴によって停止させ、スライドガラスをカルノア固定液（エタノール／酢酸、3：1（v/v））において10分間固定して、空気乾燥させる。
【００３７】
プローブを、pH 7の70％ホルムアミド（フルカ（FLUKA））／2SSCにおいて70℃で10分間変性させる。標的DNA、すなわちスライドガラス上の核を、同じ条件で3分間変性させる。次に、スライドガラスを2SSCによってすすぎ、一連のアルコール浴において脱水する。プローブを37℃で一晩ハイブリダイズさせる。ハイブリダイゼーション後の洗浄は2SSC緩衝液において72℃で5分間行う。
【００３８】
ジゴキシゲニン標識またはビオチン標識プローブを用いる場合、プローブの検出は、異なる蛍光色素（緑色と赤色）にカップリングさせた抗体を用いて行う。
【００３９】
蛍光色素によって直接標識したプローブを用いる場合、スライドガラスはDAPI（1 μg/ml、モレキュラープローブス（Molecular Probes））によって染色して、p-フェニルジアミンに直接封入することができる。
【００４０】
プローブからの蛍光シグナルを検出および定量する方法
本発明に従って染色体間不均衡を検出する系において用いられる画像サイトメトリー装置1は、図2を参照して、蛍光顕微鏡2、3、積分時間が40 ms〜10 msの範囲である冷却白黒CCDカメラ5、光源と顕微鏡3とのあいだに、選択的に顕微鏡3とCCDカメラ5のあいだに配置された、蛍光プローブの励起および放出光スペクトルを自動的に変化させる装置4（電動フィルター回転盤または電動フィルタータレット）、ならびに系統的サンプリングのために装置1によって自動的に制御されるX-およびY-電動試料スライド台13を含む獲得成分10と、特に画像獲得板を含むコンピューターからなる制御処理成分14とを含む。
【００４１】
蛍光の測定は、二段階に分けられる：
1）調べるスライドガラス上での分析領域の定義後の画像の獲得および保存。
2）画像の分析およびそれが由来するデータの処理。
【００４２】
第一段階は、分析可能な核500〜1000個を得るために、例えば倍率40倍の対物レンズによって、定義された表面積の限界内で、所定の数の視野を獲得することからなる。画像は、選択的干渉光学フィルターを用いてCCDカメラによって獲得する。それぞれの視野に関して、様々な蛍光色素（青、緑、赤）の波長に対応する三つの画像平面を保存して重ね合わせる（図2）。観察した視野の焦点がぼやけないように参照点を確立する。このように、検出を行うスライドガラス11および対照スライドガラス12を、同じ条件で分析する（特に、同じ積分時間および同じカメラの獲得）。
【００４３】
核の検出およびシグナルの定量を含む第二の段階において、図3を参照して以下を行う：
1）蛍光強度を測定する対比染色平面、例えばDAPI平面上での核のマスクを確立できるように、凝集物からの核の分離、ならびに同様に大きさおよび形態の基準による人工産物の排除を含む、それぞれの画像の分離と分析すべき核の検出。
2）シグナルの形状および位置に関する如何なる仮説もなく、用いたプローブのそれぞれから放出された蛍光に対応する、それぞれの核内部での各蛍光色素（赤および緑）に関する積分強度の定量。
3）それぞれの色および核の外側のそれぞれの視野に関するバックグラウンドレベルの定量；参考としての最も一般的なノイズレベルの決定。
4）プローブのそれぞれに関して核におけるバックグラウンドレベル（参考値）を差し引く。
5）それぞれの核に関してバックグラウンドレベルに関して補正した緑／赤強度比の計算。
6）例えばヒストグラムまたは「スキャッタープロット」（二つの色の強度値の二次元表示）の形でのデータの表示。
7）集団分析、すなわち点の集団を分析してこれらの点の集団の重力の中心を決定する方法によって選択した核の集団に関する蛍光比の値の平均値および標準偏差の自動的決定。
【００４４】
蛍光比は、同じようにおよび同じ条件でそれぞれの試料に関して計算する。このように、対照試料に関して標準化した場合に、患者からの試料の蛍光比が1.5である場合、トリソミー21が検出される。
【００４５】
当然、本発明は、まさに記述した例に限定されず、多くの変更をこれらの実施例に導入することができ、それらも本発明の意味に含まれる。本発明に従う検出法はこのように、他の染色体：X、Y、13、および18等の他の再発性の低い異常に拡大することができる。
【００４６】
検出システムは以下を特徴とする：
−  画像サイトメトリー装置はまた、核を検出して、多数の波長の蛍光シグナルを定量する手段を含む；
−  検出および定量手段は、形状、大きさ、蛍光密度に関する多数の基準、通常、形態測定および密度測定基準と呼ばれる基準に基づいて分析の基礎に基づいて核をセグメント化して、測定面の全ての場のマスクを形成するように組織化される。
【００４７】
参照文献
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【図面の簡単な説明】
【００４８】
【図１】本発明に従う染色体間不均衡を検出する方法の主な相を説明する。
【図２】本発明に従う検出システムの構造の略図を示す。
【図３】本発明に従う検出システムによって獲得された画像について行われた検出および定量操作を表すフローチャートである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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