(57)【要約】本発明は、低下したＣＡＲ 受容体活性を持つマウス、およびヒトＣＡＲ 受容体を発現させるマウスを提供する。これらのマウスは、ＣＡＲ 受容体活性を調節する化合物、ＣＡＲ 媒介毒性を持つと思われる化合物、および潜在的毒性が低下しているこれら化合物の類似体を同定するためのスクリーニング法に有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトＣＡＲ 受容体を発現させるトランスジェニックマウス。
【請求項２】
実質的に活性なネズミＣＡＲ 受容体を発現させない請求項１ のトランスジェニックマウス。
【請求項３】
ＣＡＲ 受容体活性を低下させる突然変異を含むマウス。
【請求項４】
トランスジェニックマウスである請求項３ のマウス。
【請求項５】
前記突然変異がＣＡＲ 受容体活性を実質的に排除する請求項３ のマウス。
【請求項６】
ある化合物がＣＡＲ 受容体を活性化するかどうかを決定するためのスクリーニング方法であって、
（ａ ）ヒトＣＡＲ 受容体を発現させるトランスジェニックマウスに化合物を投与する工程、および
（ｂ ）ＣＡＲ 標的遺伝子の誘導を測定する工程
を含み、前記化合物が前記ＣＡＲ 標的遺伝子の誘導を媒介する場合に、前記化合物は前記ＣＡＲ 受容体を活性化すると決定する方法。
【請求項７】
工程（ａ ）が、前記ヒトＣＡＲ 受容体を発現させる前記マウスにＣＡＲ 受容体インバースアゴニストを投与することをさらに含む、請求項６ の方法。
【請求項８】
前記ＣＡＲ 受容体インバースアゴニストがクロトリマゾールである請求項７ の方法。
【請求項９】
ある化合物がＣＡＲ 受容体を阻害するかどうかを決定するためのスクリーニング方法であって、
（ａ ）ヒトＣＡＲ 受容体を発現させるトランスジェニックマウスに前記化合物を投与する工程、および
（ｂ ）前記化合物の存在下および不在下でＣＡＲ 標的遺伝子の発現を測定する工程を含み、前記化合物が前記ＣＡＲ 標的遺伝子の発現を減少させる場合に、前記化合物は前記ＣＡＲ 受容体を阻害すると決定する方法。
【請求項１０】
工程（ａ ）が、前記ヒトＣＡＲ 受容体を発現させる前記マウスにＣＡＲ 受容体アゴニストを投与することをさらに含む、請求項９ の方法。
【請求項１１】
前記ＣＡＲ 受容体アゴニストが前記化合物の後に投与される請求項１０のスクリーニング方法。
【請求項１２】
ある化合物がＣＡＲ 受容体の活性を調節するかどうかを決定するためのスクリーニング方法であって、
（ａ ）ヒトＣＡＲ 受容体を発現させるトランスジェニックマウスに前記化合物を投与する工程、および
（ｂ ）前記化合物の投与によって媒介される生理学的効果を測定する工程
を含み、前記ヒト受容体を発現させる前記マウスにおける前記生理学的効果の大きさが、ＣＡＲ 受容体活性を低下させる突然変異を含むマウスにおける生理学的効果の大きさとは異なる場合に、前記化合物は前記ＣＡＲ 受容体の活性を調節すると決定する方法。
【請求項１３】
前記生理学的効果の前記測定が、前記化合物の投与によって媒介される毒性または活性の測定、または前記化合物の半減期の測定を含む、請求項１２の方法。
【請求項１４】
前記毒性または活性が前記化合物の代謝産物によって媒介される請求項１３の方法。
【請求項１５】
ある化合物の代謝がＣＡＲ 受容体の活性の調節によって制御されるかどうかを決定するためのスクリーニング方法であって、
（ａ ）ヒトＣＡＲ 受容体を発現させるトランスジェニックマウスに前記化合物を投与する工程、および
（ｂ ）前記化合物の代謝速度を測定する工程
を含み、前記ヒト受容体を発現させる前記マウスにおける前記代謝速度が、ＣＡＲ 受容体活性を低下させる突然変異を含むマウスにおける代謝速度より速い場合に、前記化合物の前記代謝は前記ＣＡＲ 受容体の活性の調節によって制御されると決定する方法。
【請求項１６】
前記代謝速度の前記測定が、前記化合物の投与によって媒介される毒性または活性の測定、前記化合物の半減期の測定、または肝酵素の血清レベルの測定を含む、請求項１５の方法。
【請求項１７】
第１ 化合物の代謝が第２ 化合物によって調節されるかどうかを決定するためのスクリーニング方法であって、
（ａ ）ヒトＣＡＲ 受容体を発現させるトランスジェニックマウスに、前記第２ 化合物の存在下および不在下で、前記第１ 化合物を投与する工程、および
（ｂ ）前記第２ 化合物の存在下および不在下で、前記第１ 化合物の投与によって媒介される生理学的効果を測定する工程
を含み、前記第２ 化合物が、前記第１ 化合物の前記投与によって媒介される前記生理学的効果の変化をもたらす場合に、前記第２ 化合物は前記第１ 化合物の代謝を調節すると決定する方法。
【請求項１８】
前記生理学的効果の前記測定が、前記第１ 化合物の投与によって媒介される毒性または活性の測定、または前記第１ 化合物の半減期の測定を含む、請求項１７の方法。
【請求項１９】
前記毒性または活性が前記第１ 化合物の代謝産物によって媒介される請求項１８の方法。
【請求項２０】
工程（ｂ ）が、前記第２ 化合物の存在下および不在下で前記第１ 化合物の半減期を測定することを含み、前記第２ 化合物が前記半減期を減少させる場合に、前記第２ 化合物は前記第１ 化合物の代謝を活性化すると決定するか、または前記第２ 化合物が前記半減期を増加させる場合に、前記第２ 化合物は前記第１ 化合物の代謝を阻害すると決定する、請求項１８の方法。
【請求項２１】
前記ヒトＣＡＲ 受容体を発現させる前記マウスが実質的に活性なネズミＣＡＲ 受容体を発現させない請求項６ 、９ 、１２、１５、または１７の方法。
【請求項２２】
ある化合物がＣＡＲ 受容体を活性化するかどうかを決定するためのスクリーニング方法であって、
（ａ ）ＣＡＲ 受容体活性を低下させる突然変異を含むマウスに化合物を投与する工程、および
（ｂ ）ＣＡＲ 標的遺伝子の誘導を測定する工程
を含み、前記突然変異を含む前記マウスにおける前記誘導が、野生型ＣＡＲ 受容体活性を持つマウスにおける誘導より小さい場合に、前記化合物は前記ＣＡＲ 受容体を活性化すると決定する方法。
【請求項２３】
工程（ａ ）が、前記突然変異を含む前記マウスにＣＡＲ 受容体インバースアゴニストを投与することをさらに含む、請求項２２の方法。
【請求項２４】
前記ＣＡＲ 受容体インバースアゴニストがアンドロスタノールである請求項２３の方法。
【請求項２５】
ある化合物がＣＡＲ 受容体を阻害するかどうかを決定するためのスクリーニング方法であって、
（ａ ）ＣＡＲ 受容体活性を低下させる突然変異を含むマウスに前記化合物を投与する工程、および
（ｂ ）前記化合物の存在下および不在下でＣＡＲ 標的遺伝子の発現を測定する工程を含み、前記化合物がもたらす前記発現の減少が、野生型ＣＡＲ 受容体活性を持つマウスにおける発現の減少より小さい場合に、前記化合物は前記ＣＡＲ 受容体を阻害すると決定する方法。
【請求項２６】
工程（ａ ）が、前記突然変異を含む前記マウスにＣＡＲ 受容体アゴニストを投与することをさらに含む、請求項２５の方法。
【請求項２７】
前記ＣＡＲ 受容体アゴニストがＴＣＰＯＢＯＰ であり、前記ＴＣＰＯＢＯＰ が前記化合物の後に投与される、請求項２６の方法。
【請求項２８】
ある化合物がＣＡＲ 受容体の活性を調節するかどうかを決定するためのスクリーニング方法であって、
（ａ ）ＣＡＲ 受容体活性を低下させる突然変異を含むマウスに前記化合物を投与する工程、および
（ｂ ）前記化合物の投与によって媒介される生理学的効果を測定する工程
を含み、前記突然変異を含む前記マウスにおける前記生理学的効果の大きさが、野生型ＣＡＲ 受容体活性を持つマウスにおける生理学的効果の大きさとは異なる場合に、前記化合物は前記ＣＡＲ 受容体の活性を調節すると決定する方法。
【請求項２９】
前記生理学的効果の前記測定が、前記化合物の投与によって媒介される毒性または活性の測定、または前記化合物の半減期の測定を含む、請求項２８の方法。
【請求項３０】
前記毒性または活性が前記化合物の代謝産物によって媒介される請求項２９の方法。
【請求項３１】
ある化合物の代謝がＣＡＲ 受容体の活性の調節によって制御されるかどうかを決定するためのスクリーニング方法であって、
（ａ ）ＣＡＲ 受容体活性を低下させる突然変異を含むマウスに前記化合物を投与する工程、および
（ｂ ）前記化合物の代謝速度を測定する工程
を含み、前記突然変異を含む前記マウスにおける前記代謝速度が野生型ＣＡＲ 受容体活性を持つマウスにおける代謝速度より遅い場合に、前記化合物の代謝は前記ＣＡＲ 受容体の活性の調節によって制御されると決定する方法。
【請求項３２】
前記代謝速度の前記測定が、前記化合物の投与によって媒介される毒性または活性の測定、前記化合物の半減期の測定、または肝酵素の血清レベルの測定を含む、請求項３１の方法。
【請求項３３】
第１ 化合物の代謝が第２ 化合物によって調節されるかどうかを決定するためのスクリーニング方法であって、
（ａ ）ＣＡＲ 受容体活性を低下させる突然変異を含むマウスに、前記第２ 化合物の存在下および不在下で、前記第１ 化合物を投与する工程、および
（ｂ ）前記第２ 化合物の存在下および不在下で、前記第１ 化合物の投与によって媒介される生理学的効果を測定する工程
を含み、前記突然変異を含む前記マウスにおいて、前記第２ 化合物によってもたらされる、前記第１ 化合物の前記投与によって媒介される前記生理学的効果の変化が、野生型ＣＡＲ 受容体活性を持つマウスにおける変化よりも小さい場合に、前記第２ 化合物は前記第１ 化合物の代謝を調節すると決定する方法。
【請求項３４】
前記生理学的効果の前記測定が、前記第１ 化合物の投与によって媒介される毒性または活性の測定、または前記第１ 化合物の半減期の測定を含む、請求項３３の方法。
【請求項３５】
前記毒性または活性が前記第１ 化合物の代謝産物によって媒介される請求項３４の方法。
【請求項３６】
工程（ｂ ）が、前記第２ 化合物の存在下および不在下で前記第１ 化合物の半減期を測定することを含み、前記突然変異を含む前記マウスにおいて前記第２ 化合物によってもたらされる前記半減期の減少が、野生型ＣＡＲ 受容体活性を持つマウスにおける半減期の減少よりも小さい場合に、前記第２ 化合物は前記第１ 化合物の代謝を活性化すると決定するか、または前記突然変異を持つ前記マウスにおいて前記第２ 化合物によってもたらされる前記半減期の増加が、野生型ＣＡＲ 受容体活性を持つマウスにおける半減期の増加よりも小さい場合に、前記第２ 化合物は前記第１ 化合物の代謝を阻害すると決定する、請求項３４の方法。
【請求項３７】
前記マウスがトランスジェニックマウスである請求項２２、２５、２８、３１、または３３の方法。
【請求項３８】
前記突然変異がＣＡＲ 受容体活性を実質的に排除する請求項２２、２５、２８、３１、または３３の方法。
【請求項３９】
前記化合物が薬物開発から除外される請求項６ 、１５、２２、または３１の方法。
【請求項４０】
前記第１ 化合物が前記第２ 化合物の代謝を活性化し、前記第１ 化合物または前記第２ 化合物が薬物開発から除外される、請求項１７または３３の方法。
【請求項４１】
前記ＣＡＲ 標的遺伝子がＣＹＰ２Ｂ１０ またはＣＹＰ２Ｂ６である請求項６ 、９ 、２２、または２５の方法。
【請求項４２】
前記ＣＡＲ 標的遺伝子がＣＹＰ３Ａ１１ またはＣＹＰ３Ａ４である請求項６ 、９ 、２２、または２５の方法。
【請求項４３】
前記化合物、前記第１ 化合物または前記第２ 化合物の少なくとも一つが、前記突然変異を含む前記マウスまたは前記ヒトＣＡＲ 受容体を発現させる前記マウスに全て同時に投与される少なくとも５ 化合物のライブラリーの１ 構成要素である、請求項６ 、９ 、１２、１５、１７、２２、２５、２８、３１、または３３の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（連邦政府の資金提供を受けた研究に関する陳述）
本発明は、ＮＩＨ 助成金ＮＩＤＤＫ ＲＯ１ ＤＫ４６５４６ として米国政府の資金提供を受けて行なわれた。したがって、米国政府は本発明に一定の権利を有する。
【０００２】
（発明の背景）
本発明は、概して、生体異物と総称される広範囲にわたる外来化合物のいずれかの代謝の調節物質を同定するためのスクリーニング方法に関する。
【０００３】
多様な基質を代謝することができる数多くのシトクロムＰ４５０（ＣＹＰ ）酵素は、生体異物化合物の潜在的に有害な効果に対する一次防御として役立つ。特定の生体異物に応答して起こる個々のＣＹＰ 遺伝子の発現の誘導は、この代謝機構の中心的要素である。これらの応答のうち最もよく特徴付けられているものの１ つは、「フェノバルビタール様」誘導物質と呼ばれる多様な薬剤群による特異的ＣＹＰ 遺伝子の誘導である。動物がフェノバルビタール（ＰＢ）をはじめとする化学的に多様な一連の化合物のいずれかにばく露すると、ＣＹＰ 酵素および生体異物代謝に関係する他のタンパク質の特定サブセットの発現が強力に活性化される。マウスの場合、これらのＰＢ様誘導物質は、ＣＹＰ２Ｂ１０ と他の数個の遺伝子の発現を増加させる。ＴＣＰＯＢＯＰ と呼ばれる農薬不純物１，４−ビス［２−（３，５−ジクロロピリジルオキシ）］ベンゼンは、この誘導物質群のなかでも最も強力な物質であると一般に考えられている。
【０００４】
治療薬、殺昆虫剤、多環式炭化水素、および一部の天然物質などといった生体異物は、多くの場合、ＣＹＰ 酵素によって触媒される酸化反応を経由して代謝される。これらの反応は生体異物に親水性基を付加して、身体がこれらの有害な物質または単に不溶な物質を除去できるようにする。例えば、多環式芳香族化合物の酸化は、極めて反応性の高い求電子性基であるエポキシドを生成する。通常、これらのエポキシドはヒドロキシル基に迅速に加水分解され、そのヒドロキシル基が他の基に結合して、排泄されるのに十分な水溶性を持つ化合物を生成する。残念なことに、この中間体エポキシドは細胞中に放出される場合もあり、高い反応性を持つ求電子物質であるために、ＤＮＡ 中の負に荷電した基と反応してＤＮＡ 配列を変化させることもありうる。人体において、ＣＹＰ 酵素によるコカインの代謝中に生成する反応性酸素種は、突然変異生成および染色体切断に関係づけられている。
【０００５】
ＣＹＰ が媒介する代謝は、例えば治療活性化合物の迅速な分解、その生体内半減期の減少など、他にも望ましくない効果をもたらす。あるいは、ＣＹＰ 酵素は、プロドラッグを望ましい速度よりも速く活性薬物に変換して、生体内の活性薬物濃度を毒性濃度にするかもしれない。さらに、治療活性化合物の投与または他の外来化合物へのばく露によるＣＹＰ 酵素の活性化は、第２ の治療活性化合物の代謝を促進して、その有効性を低下させるか、またはその毒性を増加させる可能性もある。
【０００６】
ＣＹＰ 酵素を活性化する化合物は潜在的に有害な効果を持つので、どの化合物がＣＹＰ による代謝を活性化し、よってヒトに投与された時に副作用を引き起こす可能性があるかを決定するために、改良された方法が必要である。そうすることにより、これらの化合物を薬物開発から除外するか、またはこれらの化合物を化学的に修飾して、ＣＹＰ 酵素を活性化する能力が低下した類縁化合物を生成させることができる。
【０００７】
（発明の概要）
本発明は、ＣＡＲ 受容体を活性化または阻害する化合物の同定を容易にするスクリーニングシステムおよび方法を提供する。そのようなＣＡＲ 受容体活性化化合物は、哺乳動物に単独でまたは他の化合物と組み合わせて投与すると、毒性を示す可能性があるので、候補薬物または薬物開発プログラムからは除外することが好ましい。また、ＣＡＲ 受容体を阻害する化合物は、ＣＡＲ が媒介する治療活性化合物の代謝を低下させ、よって副作用を潜在的に軽減し、その化合物の生体内での治療半減期を回復させるために、哺乳動物に投与することができる。そのような代謝活性の低下は、適切な前駆体化合物からの毒性産物の生成を減少させるためにも役立ちうる。
【０００８】
したがって、第１ の側面として、本発明は、ヒトＣＡＲ 受容体を発現させるトランスジェニックマウスを特徴とする。関連する一側面として、本発明は、ＣＡＲ 受容体活性を低下させる突然変異を持つマウスを特徴とする。
【０００９】
本発明の動物は、ある化合物がＣＡＲ 受容体の活性を調節するかどうかを決定するために使用することができる。さらに、ある化合物の代謝がＣＡＲ 受容体の活性の調節によって制御されるかどうかを決定する方法も提供する。
【００１０】
したがって本発明は、ある化合物がＣＡＲ 受容体を活性化するかどうかを決定するためのスクリーニグ方法も特徴とする。この方法では、ヒトＣＡＲ 受容体を発現させるトランスジェニックマウスに化合物を投与し、ＣＡＲ 標的遺伝子の誘導を測定する。化合物がＣＡＲ 標的遺伝子の誘導を媒介する場合、その化合物はＣＡＲ 受容体を活性化すると決定される。好ましい一態様では、ヒトＣＡＲ 受容体を発現させるマウスに、ＣＡＲ 受容体インバースアゴニストも投与される。このＣＡＲ 受容体インバースアゴニストは、好ましくは、クロトリマゾールである。
【００１１】
もう一つの側面として、本発明は、ある化合物がＣＡＲ 受容体を阻害するかどうかを決定するためのスクリーニング方法を特徴とする。この方法では、ヒトＣＡＲ 受容体を発現させるトランスジェニックマウスに化合物を投与し、化合物の存在下および不在下でＣＡＲ 標的遺伝子の発現を測定する。化合物がＣＡＲ 標的遺伝子の発現を減少させる場合、その化合物はＣＡＲ 受容体を阻害すると決定される。好ましい一態様では、ヒトＣＡＲ 受容体を発現させるマウスに、ＣＡＲ 受容体アゴニストも投与される。好ましくは、このＣＡＲ 受容体アゴニストはヒトＣＡＲ に特異的な機能的ＣＡＲ 受容体アゴニストであり、アゴニストは上記化合物がマウスに投与された後に投与される。
【００１２】
さらにもう一つの側面として、本発明は、ある化合物がＣＡＲ 受容体の活性を調節するかどうかを決定するためのスクリーニング方法を特徴とする。この方法では、ヒトＣＡＲ 受容体を発現させるトランスジェニックマウスに化合物を投与し、その化合物の投与によって媒介される生理学的効果を測定する。ヒト受容体を発現させるマウスにおける生理学的効果の大きさが、ＣＡＲ 受容体活性を低下させる突然変異を持つマウスにおける生理学的効果の大きさとは異なる場合、その化合物はＣＡＲ 受容体の活性を調節すると決定される。好ましい態様では、化合物の投与によって媒介される毒性または活性を測定するか、または化合物の半減期を測定することによって、生理学的効果がアッセイされる。他の好ましい態様では、毒性または活性が、化合物の代謝産物によって媒介される。ヒトＣＡＲ 受容体を発現させるマウスにおける生理学的効果の大きさと、低下したＣＡＲ 受容体活性を持つマウスにおける生理学的効果の大きさとの相違は、少なくとも２ 、５ 、１０、または２０倍であることが好ましい。他の好ましい態様では、低下したＣＡＲ 活性を持つマウスにおける生理学的効果の大きさが、ヒトＣＡＲ 受容体を発現させるマウスにおける効果の大きさよりも、少なくとも１０、２５、５０または７５％は小さいか、または大きい。
【００１３】
さらにもう一つの側面として、本発明は、ある化合物の代謝がＣＡＲ 受容体の活性の調節によって制御されるかどうかを決定するためのスクリーニング方法を特徴とする。この方法では、ヒトＣＡＲ 受容体を発現させるトランスジェニックマウスに化合物を投与し、その化合物の代謝速度を測定する。ヒト受容体を発現させるマウスにおける代謝速度が、低下したＣＡＲ 受容体活性を持つマウスにおける代謝速度より速い場合、その化合物の代謝はＣＡＲ 受容体の活性の調節によって制御されると決定される。ヒトＣＡＲ 受容体を発現させるマウスにおける代謝速度は、低下したＣＡＲ 受容体活性を持つマウスにおける代謝速度より、少なくとも２ 、５ 、１０または２０倍は速いことが好ましい。好ましい態様では、化合物の投与によって媒介される毒性または活性を測定すること、化合物の半減期を測定すること、または肝酵素の血清レベルを測定することによって、代謝速度が決定される。これらの測定は、化合物の投与後に、１ 、３ 、または５ 時点より多い時点で行なわれることが好ましい。
【００１４】
もう一つの側面として、本発明は、第１ 化合物の代謝が第２ 化合物によって調節されるかどうかを決定するためのスクリーニング方法を提供する。この方法では、ヒトＣＡＲ 受容体を発現させるトランスジェニックマウスに、第２ 化合物の存在下および不在下で第１ 化合物を投与する。第１ 化合物の投与によって媒介される生理学的効果を第２ 化合物の存在下または不在下で測定する。第２ 化合物が第１ 化合物の投与によって媒介される生理学的効果の変化をもたらす場合、その第２ 化合物は、第１ 化合物の代謝を調節すると決定される。好ましい態様では、第１ 化合物の投与によって媒介される毒性または活性を測定すること、または第１ 化合物の半減期を測定することによって、生理学的効果がアッセイされる。種々の好ましい態様では、毒性または活性が第１ 化合物の代謝産物によって媒介される。さらにもう一つの好ましい態様では、第２ 化合物の存在下および不在下で第１ 化合物の半減期を測定することによって、生理学的効果がアッセイされる。第２ 化合物が半減期を減少させる場合、その第２ 化合物は第１ 化合物の代謝を活性化すると決定され、第２ 化合物が半減期を増加させる場合、その第２ 化合物は第１ 化合物の代謝を阻害すると決定される。
【００１５】
ある化合物がＣＡＲ 受容体の活性または別の化合物の代謝を調節するかどうかを決定するための同様の方法を、ＣＡＲ 受容体活性を低下させる突然変異を持つマウスを使って行なうこともできる。例えば本発明は、ある化合物がＣＡＲ 受容体を活性化するかどうかを決定するためのスクリーニグ方法を特徴とする。この方法では、ＣＡＲ 受容体活性を低下させる突然変異を持つマウスに化合物を投与し、ＣＡＲ 標的遺伝子の誘導を測定する。低下したＣＡＲ 受容体活性を持つマウスにおける誘導が野生型ＣＡＲ 受容体活性を持つマウスにおける誘導より小さい場合、その化合物はＣＡＲ 受容体を活性化すると決定される。好ましい態様では、低下したＣＡＲ 受容体活性を持つマウスにＣＡＲ 受容体インバースアゴニストも投与される。インバースアゴニストはアンドロスタノールであることが好ましい。
【００１６】
もう一つの側面として、本発明は、ある化合物がＣＡＲ 受容体を阻害するかどうかを決定するためのスクリーニング方法を特徴とする。この方法では、ＣＡＲ 受容体活性を低下させる突然変異を持つマウスに化合物を投与し、その化合物の存在下および不在下でＣＡＲ 標的遺伝子の発現を測定する。低下したＣＡＲ 受容体活性を持つマウスにおける化合物によって達成される発現の減少が、野生型ＣＡＲ 受容体活性を持つマウスにおける発現の減少より小さい場合、その化合物はＣＡＲ 受容体を阻害すると決定される。好ましい一態様では、低下したＣＡＲ 受容体活性を持つマウスに、ＣＡＲ 受容体アゴニストも投与される。好ましくは、ＣＡＲ 受容体アゴニストはＴＣＰＯＢＯＰ であり、ＴＣＰＯＢＯＰ は化合物の後に投与される。
【００１７】
さらにもう一つの側面として、本発明は、ある化合物がＣＡＲ 受容体の活性を調節するかどうかを決定するためのスクリーニング方法を特徴とする。この方法では、ＣＡＲ 受容体活性を低下させる突然変異を持つマウスに化合物を投与し、その化合物の投与によって媒介される生理学的効果を測定する。低下したＣＡＲ 受容体活性を持つマウスにおける生理学的効果の大きさが、野生型ＣＡＲ 受容体活性を持つマウスにおける生理学的効果の大きさとは異なる場合、その化合物はＣＡＲ 受容体の活性を調節すると決定される。低下したＣＡＲ 受容体活性を持つマウスにおける生理学的効果の大きさと、野生型ＣＡＲ 受容体活性を持つマウスにおける生理学的効果の大きさとの相違は、少なくとも２ 、５ 、１０または２０倍であることが好ましい。他の好ましい態様では、低下したＣＡＲ 活性を持つマウスにおける生理学的効果の大きさが、野生型ＣＡＲ 受容体活性を持つマウスにおける効果の大きさよりも、少なくとも１０、２５、５０または７５％は小さいか、または大きい。さらに他の好ましい態様では、化合物の投与によって媒介される毒性または活性を測定すること、または化合物の半減期を測定することによって、生理学的効果がアッセイされる。もう一つの好ましい態様では、毒性または活性が、化合物の代謝産物によって媒介される。
【００１８】
さらにもう一つの側面として、本発明は、ある化合物の代謝がＣＡＲ 受容体の活性の調節によって制御されるかどうかを決定するためのスクリーニング方法を提供する。この方法では、ＣＡＲ 受容体活性を低下させる突然変異を持つマウスに化合物を投与し、その化合物の代謝速度を測定する。低下したＣＡＲ 受容体活性を持つマウスにおける代謝速度が野生型ＣＡＲ 受容体活性を持つマウスにおける代謝速度より遅い場合、その化合物の代謝は、ＣＡＲ 受容体の活性の調節によって制御されると決定される。低下したＣＡＲ 受容体活性を持つマウスにおける代謝速度は、野生型ＣＡＲ 受容体活性を持つマウスにおける代謝速度よりも、少なくも２ 、５ 、１０または２０倍は遅いことが好ましい。
【００１９】
好ましい態様では、化合物の投与によって媒介される毒性または活性を測定すること、化合物の半減期を測定すること、または肝酵素の血清レベルを測定することによって、代謝速度が決定される。これらの測定は、化合物の投与後に、１ 、３ または５ 時点より多い時点で行なわれることが好ましい。
【００２０】
さらにもう一つの側面として、本発明は、第１ 化合物の代謝が第２ 化合物によって調節されるかどうかを決定するためのスクリーニング方法を特徴とする。この方法では、ＣＡＲ 受容体活性を低下させる突然変異を持つマウスに、第２ 化合物の存在下および不在下で第１ 化合物を投与する。第１ 化合物の投与によって媒介される生理学的効果を第２ 化合物の存在下または不在下で測定する。低下したＣＡＲ 受容体活性を持つマウスにおいて、第２ 化合物によってもたらされる、第１ 化合物の投与によって媒介される生理学的効果の変化が、野生型ＣＡＲ 受容体活性を持つマウスにおける変化より小さい場合、その第２ 化合物は、第１ 化合物の代謝を調節すると決定される。好ましい態様では、第１ 化合物の投与によって媒介される毒性または活性を測定すること、または第１ 化合物の半減期を測定することによって、生理学的効果がアッセイされる。種々の好ましい態様では、毒性または活性が第１ 化合物の代謝産物によって媒介される。もう一つの好ましい態様では、第２ 化合物の存在下および不在下で第１ 化合物の半減期を測定することによって、生理学的効果がアッセイされる。低下したＣＡＲ 受容体活性を持つマウスにおいて第２ 化合物がもたらす半減期の減少が、野生型ＣＡＲ 受容体活性を持つマウスにおける半減期の減少よりも小さい場合、その第２ 化合物は第１ 化合物の代謝を活性化すると決定され、低下したＣＡＲ 受容体活性を持つマウスにおいて第２ 化合物がもたらす半減期の増加が、野生型ＣＡＲ 受容体活性を持つマウスにおける半減期の増加よりも小さい場合、その第２ 化合物は第１ 化合物の代謝を阻害すると決定される。
【００２１】
本発明の種々の側面の好ましい態様において、ＣＡＲ 受容体活性を低下させる突然変異を持つマウスは、トランスジェニック動物である。ＣＡＲ 受容体活性を低下させる突然変異は、ＣＡＲ 受容体活性を実質的に排除することが好ましい。さらに他の好ましい態様として、ＣＡＲ 受容体活性を低下させる突然変異を持つマウスと、野生型ＣＡＲ 受容体活性を持つマウスとは、ＣＡＲ 受容体遺伝子、プロモーターまたは制御配列中の突然変異を除いて、同じ遺伝子型を持つ。さらに他の好ましい態様では、野生型ＣＡＲ 受容体活性を持つマウスは、ヒトＣＡＲ 受容体を発現させるトランスジェニックマウスである。ヒトＣＡＲ 受容体を発現させるマウスは、実質的に活性なネズミＣＡＲ 受容体を発現させないか、またはいかなるネズミＣＡＲ 受容体も発現させないことが好ましい。
【００２２】
好ましいＣＡＲ 標的遺伝子は、ネズミＣＹＰ２Ｂ１０ （配列番号１１、アクセッション番号ＮＭ＿００９９９８）、およびヒトＣＹＰ２Ｂ６（配列番号１２、ＧｅｎＢａｎｋ アクセッション番号ＡＣ０２３１７２）を含む導入遺伝子である。他の好ましいＣＡＲ 標的遺伝子として、ネズミＣＹＰ３Ａ１１ （配列番号１３、アクセッション番号ＮＭ＿０７８１８ ）、およびヒトＣＹＰ３Ａ４（配列番号１４、アクセッション番号Ａ３４１０１）を含む導入遺伝子が挙げられる。他の考え得るＣＡＲ 標的遺伝子として、他のＣＹＰ 酵素または生体異物代謝に関与する他の酵素が挙げられるが、これらに限るわけではない。ＣＡＲ 標的遺伝子には、レポーター遺伝子、例えばヒト成長ホルモン、分泌型アルカリホスファターゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質、ＣＹＰ２Ｂ６、または他の任意のレポーター遺伝子に作動可能に連結されたＣＡＲ 応答性プロモーターを含めることもできる（例えばＡｕｓｕｂｅｌ ら「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，ニューヨーク，２０００ ）の第９ 章を参照されたい）。適切なプロモーターの例としては、天然ＣＹＰ プロモーター、例えば、先に記載されたフェノバルビタール応答配列（Ｈｏｎｋａｋｏｓｋｉら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１８：５６５２−５６５８，１９９８）を含むＣＹＰ２Ｂ１０ プロモーター（ＧｅｎＢａｎｋ アクセッション番号Ｕ４８７３２、Ｈｏｎｋａｋｏｓｋｉら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１，９７４６−９７５３，１９９６ ）、ＣＹＰ２Ｂ６プロモーター（ＧｅｎＢａｎｋ アクセッション番号ＡＣ０２３１７２）、ＣＹＰ３Ａ１１ プロモーター（Ｔｏｉｄｅ ら，Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．３３８（１）：４３−４９，１９９７ ）、ＣＹＰ３Ａ４プロモーター（アクセッション番号ＡＦ１８５５８９）など、またはＣＡＲ／ＲＸＲ ヘテロ二量体に対するＤＮＡ 結合部位が機能的な基礎プロモーターに作動可能に連結されている合成プロモーターコンストラクト（Ｔｚａｍｅｌｉ ら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２０：２９５１−２９５８，２０００）が挙げられる。
【００２３】
他の好ましい態様では、本発明のスクリーニング方法で試験される化合物の少なくとも１ つは、全て同時にマウスに投与される少なくて２ または５ 化合物ないし多ければ１０、２０、または５０以上の化合物のライブラリーの１ 構成要素である。化合物の好ましい投与経路には、経口、筋肉内、静脈内、非経口、動脈内、腹腔内、皮下、または他の任意の適切な経路が含まれる。ＣＡＲ 受容体を活性化する化合物、またはＣＡＲ 受容体の活性の調節によってその代謝が制御される化合物は、薬物開発から除外される。第１ 化合物が第２ 化合物の代謝を活性化する場合は、その第１ 化合物、第２ 化合物、または両化合物を、薬物開発から除外することが好ましい。低下したＣＡＲ 受容体活性を持つかヒトＣＡＲ 受容体を発現させる他の動物モデル、例えばラット、または他の齧歯類動物も、本発明の種々の側面のいずれにも、使用することができると考えられる。
【００２４】
「ＣＡＲ 受容体活性」とは、「ＣＡＲ 標的遺伝子」と呼ばれる遺伝子またはＣＡＲ 応答性プロモーターに作動可能に連結された導入遺伝子の、ＣＡＲ 媒介性の誘導を意味する。ＣＡＲ 標的遺伝子または導入遺伝子の誘導レベルは、コードされているｍＲＮＡまたはタンパク質のレベルを測定するための標準的アッセイを使って決定することができる（例えばＡｕｓｕｂｅｌ ら「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，ニューヨーク，２０００ ）を参照されたい）。もう一つの選択肢として、ＣＡＲ 標的遺伝子の酵素活性、例えばＣＹＰ２Ｂ１０ ＣＡＲ 標的遺伝子の７−ペントキシレゾルフィンＯ−デアルキラーゼ活性などを測定してもよい（Ｐｅｌｌｉｎｅｎら，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ２３：５１５−２３，１９９６）。ＣＡＲ 標的遺伝子の例としては、ＣＹＰ２Ｂ１０ 、ＣＹＰ２Ｂ６導入遺伝子、ＣＹＰ３Ａ１１ 、およびＣＹＰ３Ａ４導入遺伝子が挙げられ、ＣＡＲ 応答性プロモーターの例としては、ＣＹＰ２Ｂ１０ 、ＣＹＰ２Ｂ６、ＣＹＰ３Ａ１１ およびＣＹＰ３Ａ４プロモーター、およびＣＡＲ／ＲＸＲ ヘテロ二量体のＤＮＡ 結合部位に作動可能に連結されたプロモーターが挙げられる。もう一つの選択肢として、体重に対する肝重量の増加、アラニンアミノトランスフェラーゼなどの肝酵素の血清中への放出量の増加、または肝臓におけるＤＮＡ 合成の増加を、本明細書に記載するアッセイで決定することによって、ＣＡＲ 受容体活性の増加をアッセイすることもできる。ＴＣＰＯＢＯＰ を含む数多くの生体異物化合物に応答して起こるＣＡＲ 媒介性の誘導を測定することができる。
【００２５】
「突然変異」とは、当該核酸配列によってコードされるアミノ酸配列が天然の配列と比較して少なくとも１ つのアミノ酸改変を持つような核酸配列の改変を意味する。突然変異は、例えば挿入、欠失、フレームシフト突然変異、またはミスセンス突然変異などであってよいが、これらに限るわけではない。あるいは、突然変異は、ＣＡＲ 受容体プロモーター、転写制御配列の配列または翻訳制御配列を、ＣＡＲ ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現量が減少するように変化させてもよい。突然変異は、コードされているＣＡＲ 受容体の活性を、天然ＣＡＲ 受容体の活性と比較して少なくとも２５、３５、５０、７０、８０、９０、９５、９９または１００ ％低下させることが好ましい。もう一つの好ましい態様として、ＣＡＲ 受容体に突然変異を持つマウスに投与された生体異物に応答して起こるＣＡＲ 標的遺伝子の誘導のレベルは、ＣＡＲ ｍＲＮＡまたはタンパク質を発現させないＣＡＲ ヌルマウスにおける対応する誘導のレベルの１０、５ または２ 倍未満である。
【００２６】
「トランスジェニック」とは、細胞中に技術的手段によって挿入され、かつその細胞から発生する生物のゲノムの一部となるＤＮＡ 配列を含む、任意の細胞または生物を意味する。本明細書にいうトランスジェニック生物は、概してトランスジェニック非ヒト哺乳動物であり、好ましくはマウスなどの齧歯類動物である。
【００２７】
「ＣＡＲ 受容体活性を実質的に排除する」とは、ＣＡＲ 受容体活性を天然ＣＡＲ 受容体の活性と比較して２５、３５、５０、７０、８０、９０、９５、９９または１００ ％低下させることを意味する。もう一つの好ましい態様では、残存ＣＡＲ 受容体活性レベルが、ＣＡＲ ｍＲＮＡまたはタンパク質を発現させないＣＡＲ ヌルマウスにおける対応するＣＡＲ 受容体活性レベルの１０、５ または２ 倍を越えない。
【００２８】
「実質的に活性なネズミＣＡＲ 受容体」とは、正常ネズミ宿主においてＧｅｎＢａｎｋ アクセッション番号２２６７５７５ がコードする天然ネズミＣＡＲ 受容体（Ｃｈｏｉら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：２３５６５−２３５７１，１９９７ ）（配列番号１ ）のＣＡＲ 受容体活性の少なくとも３０、６０、８０、９０、９５または１００ ％を持つことを意味する。
【００２９】
「ヒトＣＡＲ 受容体」とは、ＧｅｎＢａｎｋ アクセッション番号４５８５４１によってコードされる天然ヒトＣＡＲ 受容体のアミノ酸配列（Ｂａｅｓら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏ．１４：１５４４−１５５１，１９９４ ）（配列番号２ ）と少なくとも７５、８０、９０、９５、９９または１００ ％同一なアミノ酸配列を持ち、かつ同一条件でのアッセイで、天然ヒトＣＡＲ 受容体のＣＡＲ 受容体活性の少なくとも５０、７５、８０、９０、９５または１００ ％を持つタンパク質を意味する。発現されるヒトＣＡＲ 受容体は、天然ヒトＣＡＲ 受容体の対応する領域と少なくとも７５、８０、９０、９５、９９または１００ ％同一なアミノ酸配列を持ち、かつ天然ヒトＣＡＲ 受容体のＣＡＲ 受容体活性の少なくとも６０、８０、９０、９５または１００ ％を持つ断片であってもよいと考えられる。さらに、ヒトＣＡＲ 受容体はクロトリマゾールによって阻害される。クロトリマゾールはヒトＣＡＲ のインバースアゴニストであるが、ネズミＣＡＲ のインバースアゴニストではない（Ｍｏｏｒｅ ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：１５１２２−１５１２７，２０００ ）。
【００３０】
「ＣＡＲ 受容体の活性化」とは、ＣＡＲ 標的遺伝子またはＣＡＲ 応答性プロモーターに作動可能に連結された導入遺伝子のＣＡＲ 媒介性誘導率の増加を意味する。マウスにおけるＣＡＲ 標的遺伝子または導入遺伝子の誘導の増加は、本明細書に記載するアッセイを用いて測定した場合に、コードされているｍＲＮＡまたはタンパク質のレベル、ＣＡＲ 標的遺伝子の酵素活性、相対的肝重量、アラニンアミノトランスフェラーゼなどの肝酵素の血清中への放出量、または肝臓におけるＤＮＡ 合成の２ 、５ 、１０または２０倍の増加をもたらすことが好ましい。もう一つの好ましい態様では、野生型ＣＡＲ 受容体活性を持つマウスにおける誘導の増加は、ＣＡＲ 受容体活性を低下させる突然変異を持つマウスにおける誘導の増加よりも、２ 、５ 、１０または２０倍大きい。
【００３１】
好ましい一態様では、ＣＡＲ 受容体の候補活性化物質およびＣＡＲ 受容体インバースアゴニストを、ＣＡＲ 受容体活性を低下させる突然変異を持つマウスまたはヒトＣＡＲ 受容体を発現させるマウスに投与する。ＣＡＲ 標的遺伝子の誘導レベルを、候補活性化物質の存在下および不在下で測定して、その候補活性化物質がＣＡＲ 標的遺伝子の誘導レベルの上昇をもたらすかどうかを決定する。ＣＡＲ 受容体インバースアゴニストの投与は、ＣＡＲ 標的遺伝子の初期誘導レベルを低下させ、よって候補活性化物質が媒介する誘導の増加を検出しやすくするだろう。
【００３２】
「ＣＡＲ 受容体を阻害する」とは、ＣＡＲ 標的遺伝子またはＣＡＲ 標的遺伝子のプロモーターに作動可能に連結された導入遺伝子の誘導率を低下させることを意味する。マウスにおけるＣＡＲ 標的遺伝子または導入遺伝子の誘導の減少は、本明細書に記載するアッセイを用いて決定した場合に、コードされているｍＲＮＡ、タンパク質、酵素活性、相対的肝重量、肝酵素の血清中への放出、または肝臓におけるＤＮＡ 合成のレベルを２ 、５ 、１０または２０倍減少させることが好ましい。もう一つの好ましい態様では、野生型ＣＡＲ 受容体活性を持つマウスにおける誘導率の低下は、ＣＡＲ 受容体活性を低下させる突然変異を持つマウスにおける誘導率の低下よりも、２ 、５ 、１０または２０倍大きい。
【００３３】
好ましい一態様では、ＣＡＲ 受容体の候補阻害物質およびＣＡＲ 受容体アゴニストを、ＣＡＲ 受容体活性を低下させる突然変異を持つマウスまたはヒトＣＡＲ 受容体を発現させるマウスに投与する。ＣＡＲ 標的遺伝子の誘導レベルを、候補阻害物質の存在下および不在下で測定して、その候補阻害物質がＣＡＲ 標的遺伝子の誘導レベルの低下をもたらすかどうかを決定する。ＣＡＲ 受容体アゴニストの投与は、ＣＡＲ 標的遺伝子の初期誘導レベルを上昇させ、よって候補阻害物質が媒介する誘導の減少を検出しやすくするだろう。
【００３４】
「野生型ＣＡＲ 受容体活性を持つ」とは、天然のネズミまたはヒトＣＡＲ 受容体の活性と実質的に同じ活性を持つことを意味する。ここで使用する「実質的に同じ」とは、天然ＣＡＲ 受容体の活性の少なくとも８０、９０、９５、９９または１００ ％を意味する。ＣＡＲ 標的遺伝子またはＣＡＲ 応答性プロモーターに作動可能に連結された導入遺伝子を誘導するというＣＡＲ 受容体の能力は、コードされているｍＲＮＡ、タンパク質もしくは酵素活性に関するアッセイ、または相対的肝重量、血清中に放出された肝酵素、またはＤＮＡ 合成に関するアッセイを使って、ごく普通に測定することができる。
【００３５】
「代謝を調節する」とは、化合物のＣＹＰ 触媒反応、例えば化合物の酸化反応などの速度を上昇または低下させることを意味する。例えば、化合物の代謝速度は、酸化生成物の生成速度または酸化中間体から生成する後続の生成物の生成速度として測定することができる。あるいは、代謝速度は、初期化合物の半減期もしくは消失速度として、または初期化合物もしくは初期化合物からＣＹＰ 依存的に生成する代謝産物の毒性もしくは活性の変化として表してもよい。例えば、第１ 化合物の半減期、毒性または活性が第２ 化合物の存在下で増加または減少する場合、その第２ 化合物は第１ 化合物の代謝を調節するという。第１ 化合物または第１ 化合物の代謝産物の半減期、毒性、または活性の変化は、第２ 化合物の不在下での対応する半減期、毒性または活性の少なくとも２５、５０、１００ 、２００ 、５００ または１０００％であることが好ましい。もう一つの好ましい態様では、野生型ＣＡＲ 受容体活性を持つマウスにおける半減期、毒性または活性の変化が、ＣＡＲ 受容体活性を低下させる突然変異を持つマウスにおける半減期、毒性または活性の変化よりも、少なくとも２ 、５ 、１０または２０倍大きい。種々の好ましい態様では、本明細書に記載するアッセイのいずれかによる測定で、第２ 化合物は、第１ 化合物または第１ 化合物の代謝産物の半減期、活性または毒性の大きさを少なくとも２ 、５ 、１０または２０倍変化させる。
【００３６】
半減期は、様々な時点でマウスから採取した試料中に存在する化合物の量を決定することによって測定することができ、化合物の量は、高速液体クロマトグラフィー、質量分析法、化合物特異抗体を用いるウェスタンブロット解析などの標準的方法、または他の任意の適切な方法を使って定量することができる。好ましい態様では、第１ 化合物または第１ 化合物の代謝産物の毒性または活性に必要な反応（例えば活性化された代謝産物とＤＮＡ 、ＲＮＡ 、またはタンパク質との反応）が、第２ 化合物の不在下での対応する速度の少なくとも２５、５０、１００ 、２００ 、５００ または１０００％である。第１ 化合物または第１ 化合物の代謝産物の毒性は、相対的肝重量、血清中に放出された肝酵素の量、またはマウスの肝臓におけるＤＮＡ 合成速度を決定することによって測定することもできる。また、ＣＡＲ 受容体の下流にあって生体異物代謝に関与する別の酵素によって触媒される反応の速度が上昇または低下する場合もあると考えられる。好ましい一態様では、第２ 化合物が、ＣＡＲ 受容体を活性化または阻害することによって第１ 化合物の代謝を調節する。
【００３７】
「化合物の活性」とは、化合物によって媒介される生物学的効果を意味する。考え得る化合物の活性の例としては、他の分子への結合、分子間の結合相互作用の調節、酵素の触媒速度の調節、生理的変化または行動変化の誘導、または化合物の他の任意の治療関連活性が挙げられる。
【００３８】
「生理学的効果」とは、上述のように、ある化合物によって媒介される毒性効果、活性、またはＣＡＲ 標的遺伝子の発現の調節を意味する。代謝を受けて、初期化合物とは異なる毒性または活性レベルを持つ代謝産物を生成する化合物の場合、化合物の生理学的効果は、化合物の半減期を決定することによって測定することもできる。
【００３９】
「プロモーター」とは、作動可能に連結された遺伝子の転写を指示するのに十分な最小配列を意味する。プロモーターは遺伝子の転写を調節する５’制御配列に作動可能に連結することもできる。
【００４０】
本発明により、数多くの利点が得られる。例えば本発明の方法を使用することにより、ある化合物の類似体であって、ＣＡＲ 受容体を活性化する能力が低下しているか、または検出不可能であるために、生体内での副作用が減少しているか、または半減期が長くなっていると予想されるものを、容易に同定することができる。さらに、ネズミおよびヒトＣＡＲ 受容体は多少異なる基質特異性を持つので、本発明の方法において、ヒトＣＡＲ 受容体を発現させるトランスジェニックマウスを使用することにより、ある化合物の、ヒトに投与した場合の半減期またはＣＡＲ 受容体毒性の調節を、より正確に予測することができる。さらにまた、本アッセイは容易かつ迅速に実行することができる。
【００４１】
本発明の他の特徴および利点は、特許請求の範囲および以下の詳細な説明から明らかになるだろう。
【００４２】
（詳細な説明）
本スクリーニング方法およびスクリーニングシステムは、核ホルモン受容体ＣＡＲ （ＮＲ１Ｉ４ ）遺伝子を欠くマウスが、古典的ＣＹＰ 基質ゾキサゾラミンの代謝の低下を示し、フェノバルビタールまたはより強力な誘導物質ＴＣＰＯＢＯＰ による処置時に、ＣＹＰ２Ｂ１０ 遺伝子の発現を活性化することまたは肝臓の肥大もしくは過形成応答を引き起こすことができないという発見に由来している。これに対し、野生型マウスでは強い活性化と毒性がみられた。さらに、どちらかの誘導物質の存在下でコカイン処置を施すと、野生型マウスでは急性肝毒性が生じたが、ＣＡＲ−／−「ノックアウト」マウスでは検出可能な毒性は生じなかった。したがって本発明は、ＣＡＲ 受容体活性が低下しているかまたはＣＡＲ 受容体活性を持たないマウスへの投与後対野生型マウスへの投与後のＣＡＲ 標的遺伝子の活性化、毒性、および化合物の半減期を比較するためのスクリーニング方法を提供する。これらの方法により、ＣＡＲ 受容体を活性化し、哺乳動物（例えばヒト）にとって潜在的に毒性である化合物、およびＣＡＲ 受容体を阻害し、哺乳動物に投与された医薬活性化合物の毒性またはＣＹＰ 媒介性代謝を低下させる化合物の同定が可能になる。
【００４３】
ＣＡＲ 受容体ノックアウトマウス
ＣＡＲ の機能的役割を評価するために、本発明者らは、ＤＮＡ 結合ドメインの一部を含むＣＡＲ 遺伝子のプロモーター近接セグメントがβ− ガラクトシダーゼのコーディング領域で置換されている２ つの独立したマウス株を作出した（図１Ａ）。予想どおり、これらのβ− ガラクトシダーゼ「ノックイン」動物は、ＣＡＲ ｍＲＮＡを発現させることができなかった（図１Ｃ）。このＣＡＲ 発現の喪失は顕性な表現型を何ももたらさず、ホモ接合性ＣＡＲ−／−動物は、予想されるメンデル比で生まれ、雄および雌−／− 動物はどちらも繁殖能を持っていた。
【００４４】
ＣＡＲ は主に肝臓で発現されると、先に報告されている。ＣＡＲ 発現パターンをより詳しく記述するために、ＣＡＲ＋／−ヘテロ接合体におけるβ− ガラクトシダーゼ発現を調べた。予想どおり、β− ガラクトシダーゼマーカーは肝臓で発現され、発現は門脈付近が最も高かった。β− ガラクトシダーゼ発現は小腸の上皮細胞にも見られた。
【００４５】
ＰＢ様誘導物質に対する応答におけるＣＡＲ の役割を調べるために、野生型動物およびＣＡＲ−／−動物をＰＢまたはＴＣＰＯＢＯＰ で処置した場合の効果を調べた。これら２ つの化合物のいずれかに応答して野生型雄または雌動物で起こるＣＹＰ２Ｂ１０ ｍＲＮＡ発現の強い誘導は、ノックアウト動物では完全に欠けていた（図２Ａ）。独立したＣＡＲ−／−株のどちらでも同様の結果が得られた。このＣＡＲ 要求性は、インサイチューハイブリダイゼーションを使って、小腸でも実証された。図２Ｂに示すように、ＰＢまたはＴＣＰＯＢＯＰ は、野生型動物のこの組織でもＣＹＰ２Ｂ１０ 発現を誘導したが、ＣＡＲ−／−動物ではＣＹＰ２Ｂ１０ 発現を誘導しなかった。特異的ハイブリダイゼーションの上皮細胞への限局は、先の結果と合致し、上述したＣＡＲ 発現パターンとも合致した。
【００４６】
ＣＹＰ２Ｂ１０ の誘導と同様に、ＰＢまたはＴＣＰＯＢＯＰ に応答して起こるネズミＣＹＰ３Ａ１１ ｍＲＮＡの実質的な誘導も、野生型マウスでは観察された（図５Ａ）。これに対し、対照ＣＡＲ−／−マウスで検出されるＣＹＰ３１１の誘導は、無視できるレベルだった（図５Ｂ）。
【００４７】
ＰＢ様誘導物質、特にＴＣＰＯＢＯＰ による急性処置は、総体重に対する肝重量の２ 倍までの増加を引き起こす。この肝腫大は、細胞肥大と有糸分裂の両方を反映していると考えられる。ＣＡＲ−／−マウスは、ＰＢまたはＴＣＰＯＢＯＰ による処置の３ 日後に、野生型マウスにみられる肝重量増加の徴候を示さなかった（図３Ａ）。野生型動物におけるＢｒｄＵの取込み量の増加によって明らかになったＤＮＡ 合成の生体異物誘導も、ＣＡＲ−／−動物では完全に欠けていた（図３Ｂ）。
【００４８】
これらの結果は、ＰＢ様誘導物質に対するこれらの応答にとって、ＣＡＲ が不可欠であることを証明している。この結論は、ＣＡＲ 発現の喪失が２ つの生体異物の代謝に及ぼす効果を調べることによって確認され、拡張された。１ つは古典的基質ゾキサゾラミンである。ＣＹＰ 酵素活性の増加が、ゾキサゾラミン誘発性麻痺の持続時間の減少に反映されるこの筋弛緩剤の代謝的不活性化の増加をもたらすことは、多くの研究によって証明されている。表１ および２ に示すように、野生型動物をＰＢまたはＴＣＰＯＢＯＰ で前処置すると、予想どおり、麻痺の持続時間が有意に減少した。無処置ＣＡＲ−／−マウスにおける麻痺の持続時間は、野生型マウスにおける持続時間より有意に長くて上述の結果と合致し、麻痺はＰＢまたはＴＣＰＯＢＯＰ での前処置による影響を受けなかった。例えば、野生型対照雌マウスでは麻痺が１２時間以上続いたが、生体異物前処置を受けた野生型雌マウスでは麻痺が起こらなかった。ＣＡＲ−／−雌マウスのうち、対照群、ＰＢ処置群またはＴＣＰＯＢＯＰ 処置群のそれぞれ２ 匹は死亡し、生残マウスにおける麻痺は１２時間以上続いた。
【００４９】
【表１】
2004510416.tif 000002
【表２】
2004510416.tif 000003
これらの実験では、マウスをＰＢまたはＴＣＰＯＢＯＰ で３ 日間前処置した後、ゾキサゾラミン（３００ｍｇ／ｋｇ）を単回腹腔内注射した。麻痺時間は、マウスが繰り返して起き直ることができた時の時間として記録した。
【００５０】
ＰＢ様誘導物質で処置すると、動物は、コカインを含む多くの化合物の肝毒性効果に対して敏感にもなる。図４ に示すように、ＰＢまたはＴＣＰＯＢＯＰ による処置は、コカイン投与に対する急性応答として、肝酵素アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ ）の血清レベルを有意に増加させた。この肝損傷の証拠はＣＡＲ−／−動物では観察されなかった。
【００５１】
これらの結果から、生体異物代謝のＰＢ様誘導物質に対する応答にはＣＡＲ が必要であり、したがってＣＡＲ は、生体内でＰＢ様誘導物質に対する応答を媒介する生体異物受容体として機能することが、明解に証明された。したがって、外来化合物に対する第１ 相代謝酵素の応答の一次決定因子として、先に記載されたペルオキシソーム増殖剤応答性受容体αおよびアリール炭化水素受容体に、ＣＡＲ を加えることができる。ＣＡＲ は、異なる生体異物群に対する応答を媒介することが最近明らかにされた、受容体スーパーファミリー内で最も近縁なＰＸＲ／ＳＸＲ と共に、これに加えられる。ＣＡＲ とＰＸＲ／ＳＸＲ のＤＮＡ 結合特異性および生体異物応答はどちらもある程度は重なっていると報告されているが、ＣＡＲ ノックアウト動物において後者の補償効果を示す証拠は何も観察されていない。したがって、特定の生体異物が、異なる受容体を活性化することによって、特定の代謝応答を誘導できることは、今では明らかである。
【００５２】
この機序は、ある化合物、例えばフェノバルビタールなどの存在が、他の薬物または外来化合物の代謝の増加をもたらす臨床的に重要な数多くの薬物− 薬物相互作用の説明になるかもしれない。特定の生体異物へのばく露の相違に基づく個体間の生体異物受容体の活性化レベルの相違は、特定シトクロムのレベルが個体間でかなり変動することの説明にもなるかもしれない。マウスＣＹＰ２Ｂ１０ の基礎レベルが極めて低いことと呼応して、ほとんどのヒトでは、ＣＡＲ 活性化のヒト標的であるＣＹＰ２Ｂ６のレベルは低いか、検出不可能である。しかし、一部の個体には、この酵素が最高１００ 倍高いレベルで存在する。ここに記載する結果から、この変動性は、高レベルのコカインにばく露された一部の個体に観察される比較的稀ではあるが臨床的に重要な肝毒性の根拠となりうることが示唆される。より一般的に述べると、広範囲にわたるＰＢ様誘導物質に応答して生じるＣＡＲ 活性の変動は、広範囲にわたる医薬および他の外来化合物の代謝に対して、有意な影響を持つかもしれない。本明細書に記載するＣＡＲ マウスは、生体内でＣＡＲ を活性化することができる化合物の同定を容易にすると共に、その効果を媒介する新たな特異的下流標的遺伝子の同定も可能にする。
【００５３】
上記の実験は以下のように行なった。
【００５４】
ターゲティングベクターの構築
ＣＡＲ 遺伝子座用のターゲティングベクターを構築するために、ベクターｐＰＤ４６．２１由来の核局在性β− ガラクトシダーゼ遺伝子を含むＸｂａＩ−ＥａｇＩ 断片を、ｐＧＫｎｅｏプラスミドのＸｂａＩおよびＥｃｏＲＩ 部位にサブクローニングした。ＡＢ１ ＥＳ細胞から得たＤＮＡ を使って、５’アームおよび３’アーム用のＣＡＲ ゲノム断片を増幅した。５’アームとして、３ｋｂ ＣＡＲ プロモーター断片をＡｐａＩおよびＸｂａＩ部位にクローニングした。３’アームとして、エキソン３ 〜９ をまたぐ５ｋｂ 断片をＳａｌＩおよびＮｏｔＩ部位にクローニングした。５’アーム用のプライマーは
５’−ｇｃｇｃｇｃｇｇｇｃｃｃｔｇｇｃａｔａｃａｔｔａａｃａｃａａａｃａｃａｔａｃａｔａｔ−３’（配列番号３ ）および５’−ｇｃｇｃｇｃｔｃｔａｇａａｇｇａｃｃｃａｇａｃｔｃｔｇｇａｃｃｃａｇｇｇｃａａａｇａ−３’（配列番号４ ）とした。３’アーム用のプライマーは５’−ｇｃｇｃｇｃｇｔｃｇａｃａｇｇｔｇａａｇｔｇｃｔｔｃｔｃｃｃｃａａｃａｇａａａｃａａ−３’（配列番号５ ）および５’−ｇｃｇｃｇｃｇｃｇｇｃｃｇｃｔｇｔｃｃｔｇｇｇａｇｃａｇｃｃｔｃｔｇｃａｇｃｃｇｃｔ−３’（配列番号６ ）とした。
【００５５】
ＣＡＲ 受容体ノックアウトマウスの作出
Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ （５００ μＦ 、２３０Ｖ）を使用し、０．９ｍｌ のＰＢＳ 中で、ＡＢ１ ＥＳ細胞（１０７ 個）に、２５μｇ のターゲティングコンストラクトを使ったエレクトロポレーションを行なった。次に、それらの細胞を、照射ＳＴＯ フィーダー細胞の単層を含む１ または２ 枚の１０ｃｍプレートに播種した。２４時間後に、それらを９ 日間のＧ４１８選択（３５０ μｇ／ｍｌ、Ｇｉｂｃｏ ）にかけた。ＨｉｎｄＩＩＩ 消化後に、耐性クローンを、図１Ａに示す３’プローブを使ったサザンブロット法によって解析した（図１Ｂ）。３’プローブ用のプライマーは５’−ｇｇａｃａａｃｃｔｃａｇｃｃｃａｃａｇｔｇａｔｇｃ−３’ （配列番号７ ）および５’−ｔｃｃｔｔｔｇｇｔｔａｃｃａｃｃｔｇａｃｔｃｔｇｃ−３’ （配列番号８ ）とした。２ つの陽性クローンを増殖させ、Ｃ５７ＢＬ／６ 胚盤胞に注入した。雄キメラを雌Ｃ５７ＢＬ／６ に戻し交配した。ヘテロ接合体をサザンブロット法によって決定し、交雑してホモ接合体を作出した。
【００５６】
動物の処置
各処置には８ 〜１０週齢のマウスを少なくとも３ 匹は使用した。マウスを、トウモロコシ油、ＰＢ（１００ｍｇ／ｋｇ、Ｓｉｇｍａ ）またはＴＣＢＯＰＯＰ （３ｍｇ／ｋｇ）の腹腔内注射により、表示した時間にわたって、前処置した。３ 日間のＰＢ処置の場合は、マウスにＰＢを毎日１ 回、計３ 回腹腔内注射した。
【００５７】
ゾキサゾラミン麻痺試験
トウモロコシ油、ＰＢまたはＴＣＰＯＢＯＰ で前処置したマウスに、ゾキサゾラミン（３００ｍｇ／ｋｇ、Ｓｉｇｍａ ）の単回腹腔内注射を、ＰＢの最後の投与の２４時間後に施した。マウスを仰向けに置き、麻痺時間は、動物が十分な意識を回復して繰り返し起き直るのに必要な時間と定義した（Ｌｉａｎｇ ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９３：１６７１−６，１９９６）。
【００５８】
コカイン処置およびＡＬＴ アッセイ
トウモロコシ油、ＰＢまたはＴＣＰＯＢＯＰ で前処置した雄マウスに、ＰＢの最後の投与の２４時間後に、コカイン塩酸塩（３０ｍｇ／ｋｇ ）を腹腔内注射した。コカイン処置の２４時間後にマウスを麻酔した。血清アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ ）活性を決定するために、眼から血液を採取した。
【００５９】
ＲＮＡ 解析
個々のマウス肝臓から得た２０μｇ の全ＲＮＡ をノーザンブロット解析にかけた（図１Ｃ）。マウスＣＡＲ ｃＤＮＡプローブを使って、ＣＡＲ ヌルマウスにＣＡＲ 転写物が存在しないことを明らかにした。ＣＹＰ２Ｂ１０ 用のプローブは、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ Ｏｎｅ−ｓｔｅｐ ＲＴ−ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ）を使用し、マウス肝臓全ＲＮＡ を使ったＲＴ−ＰＣＲによって調製した。ＰＣＲ プライマーは５’−ｃｃｇｃｃｔｃｔａｇａａｇｔｃａａｃａｔｔｇｇｔｔａｇａｃ−３’ （配列番号９ ）および５’−ｃｃｇｃｃｇｇａｔｃｃｃａｃａｃｔａａｇｃｃｔｃａｔａａｔ−３’ （配列番号１０）とした。インサイチューハイブリダイゼーションを行なうために、小腸組織を厚さ７ μｍ の横断切片に薄切した。スライドを［３５Ｓ］ 標識ＣＹＰ２Ｂ１０ アンチセンスプローブによるインサイチューハイブリダイゼーションにかけた。プローブを調製するために、ＣＹＰ２Ｂ１０ ＲＴ−ＰＣＲ産物をＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（登録商標）ＳＫ（−） ファージミド（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）のＸｂａＩおよびＢａｍＨＩ 部位にサブクローニングした。そのプラスミドをＸｂａＩで線状化した。Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを使って、［３５Ｓ］ 標識アンチセンスプローブを合成した。
【００６０】
ＰＢまたはＴＣＰＯＢＯＰ 処置後の肝細胞増殖の決定
トウモロコシ油、ＰＢまたはＴＣＰＯＢＯＰ で前処置したマウスに、ＢｒｄＵ／ＦｄＵ（２ｍｌ／１００ｇ、Ａｍｅｒｓｈａｍ）を単回腹腔内投与した。ＢｒｄＵ投与の２ 時間後にマウスを屠殺した。マウス抗ＢｒｄＵモノクローナル抗体（ＤＡＫＯ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）およびＶｅｃｔａｓｔａｉｎ ＡＢＣ Ｋｉｔ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．）を使って、標準的方法により、ＢｒｄＵ取込み量を決定した（図３Ｂ）。
【００６１】
ヒトＣＡＲ 受容体を発現させるマウスの作出
ヒトとマウスのＣＡＲ 遺伝子のリガンド結合ドメインはアミノ酸配列が多少異なり、これら２ つのタンパク質は一部の活性化物質に異なる応答をすることが知られている。具体的に述べると、ＴＣＰＯＢＯＰ はネズミＣＡＲ 受容体のアゴニストリガンドであるが、ヒトＣＡＲ 受容体のアゴニストリガンドではない（Ｔｚａｍｅｌｉ ら， 前掲）。同様にクロトリマゾールはヒトＣＡＲ 受容体のインバースアゴニストであるが、ネズミＣＡＲ 受容体のインバースアゴニストではない（Ｍｏｏｒｅ ら， 前掲）。そのため、機能的なヒトＣＡＲ 受容体を発現させるＣＡＲ−／−ノックアウトマウスも、薬物スクリーニングの有用なモデルになる。というのも、薬物または他の生体異物化合物に対するそれらの応答は、ネズミＣＡＲ 受容体ではなく、ヒトＣＡＲ 受容体に基づくはずだからである。そのような「ヒト化」ＣＡＲ マウスは、マウスでは顕性でないかもしれない潜在的に有害な効果を人体で示す化合物（例えば臨床開発中の化合物）の同定を可能にする。
【００６２】
ネズミＣＡＲ は持っていないがヒトＣＡＲ 受容体を発現させるヒト化ＣＡＲ マウスは、いくつかの標準的方法のいずれによっても作出することができる（例えばＡｕｓｕｂｅｌ ら（前掲）の第９ 章を参照されたい）。例えば、肝臓などの適切な組織で活性なプロモーターからヒトＣＡＲ 遺伝子を発現させる通常のトランスジェニック動物を作出することができる。そのようなプロモーターの例としては、アルブミン（Ｘｉｅ ら，Ｎａｔｕｒｅ ４０６：４３５−４３９，２０００）、トランスチレチン（Ｙｅら，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１９：８５７０−８５８０，１９９９）、またはＣＡＲ 自体の発現を指示するプロモーターが挙げられる。次に、このヒトＣＡＲ 導入遺伝子を、ホモ接合性ＣＡＲ−／−マウスに、通常の繁殖によって導入することができる（Ｐｉｅｒｓｏｎ ら，Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１４：１０７５−１０８５，２０００ ；Ｓｌｅｅら，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ． ９６：８０４０−８０４５，１９９９）。考え得るもう一つの方法として、ヒトＣＡＲ 導入遺伝子を、ホモ接合性ＣＡＲ−／−マウスから得た受精卵母細胞に注入して、所望のトランスジェニックマウスを直接作出してもよい。第３ の方法として、ホモ接合性ＣＡＲ−／−動物から胚性幹細胞を作製してもよい（Ａｕｓｕｂｅｌ ら（前掲）の第９ 章）。次に、通常の相同組換え技術を使って、不活性ネズミＣＡＲ 遺伝子を機能的なヒトＣＡＲ 受容体遺伝子で置き換えることができる（Ｆｉｅｒｉｎｇ ら，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．３０６：４２−６６，１９９９ ）。ＣＡＲ−／−動物はＧ４１８に対する耐性を付与するｎｅｏ 遺伝子を持つので、ヒトＣＡＲ 置換コンストラクト中にハイグロマイシンなどの適切な遺伝子をもう１ つ使って、不活性ネズミＣＡＲ 遺伝子がヒトＣＡＲ 遺伝子に置き換えられている細胞を選択することができるようにしてもよい。さらにもう一つの考え得る方法として、遺伝子治療法と、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、非ウイルスベクター、または他の任意の適切なベクターに含まれている、適切な組織中で活性なプロモーター、例えば上述のプロモーターとを使って、機能的なヒトＣＡＲ 受容体遺伝子を、ホモ接合性ＣＡＲ−／−マウスに導入してもよい（例えばＳａｒｋａｒら，Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１１：８８１−８９４，２０００；Ｇｏｄｄａｒｄ ら，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．４：１２３１−１２３６，１９９７ を参照されたい）。
【００６３】
ヒトＣＡＲ 受容体を発現させるマウスを作出するための導入遺伝子コンストラクト
ヒトＣＡＲ 受容体を発現させるマウスを作出するために取りうる方法の一つとして、図６ に示す導入遺伝子コンストラクトを使用した。このトランスジェニックコンストラクトは、肝臓特異的アルブミンプロモーターに作動可能に連結されたヒトＣＡＲ 受容体のコーディング配列を含んでいる。さらに、ヒトＣＡＲ 受容体の発現を増進するために、大量に発現される遺伝子ウサギβ− グロビンに由来する領域を、プロモーターとＣＡＲ 受容体コーディング配列との間に加えた。ウシ成長ホルモン由来のポリアデニル化（ポリＡ ）配列もヒトＣＡＲ 受容体コーディング配列の下流に加えた。このウシ成長ホルモン配列は、ｍＲＮＡ転写物の転写の終結および安定性を確実にする強いポリＡ 配列である。さらに、異種ポリＡ 配列を使用することにより、ヒトＣＡＲ の内因性ポリＡ 配列に相当するゲノム配列を単離する必要がなくなる。
【００６４】
トランスジェニックヒトＣＡＲ コンストラクトを、先に記載されたいくつかのプラスミドから作製した。出発ベクターを作製するために、ウサギβ− グロビン遺伝子のエキソン２ の一部、イントロン２ 、およびエキソン３ からなるＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩ ６４０ 塩基対断片［Ｅｎｔｒｅｚアクセッション番号Ｖ００８７８のヌクレオチド約５５１ 〜１１９０、先に記載されたベクターｐＫＣＲ（Ｎｉｋａｉｄｏ ら，Ｎａｔｕｒｅ ３１１：６３１−６３５，１９８４）に由来］を、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ プラスミド（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）の対応する部位に挿入して、ベクターＫＣＲ−ＫＳを作製した。ウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナル由来の３５０ 塩基対の平滑末端ＸｂａＩ−ＸｈｏＩ 断片［「ｂＧＨｐＡ 」、Ｅｎｔｒｅｚアクセッション番号ＡＦ３３５４１９のヌクレオチド１６７１−１８６７ を含む］をＰＧＫＮｅｏプラスミド（Ｍｏｒｔｅｎｓｅｎ ら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１２（５）：２３９１−５，１９９２）から取り出し、ＫＣＲ−ＫＳベクターのＥｃｏＲＶ 部位に挿入して、ＫｂｐＡベクターを作製した。
【００６５】
ＫｂｐＡベクターへのヒトＣＡＲ ｃＤＮＡインサートのクローニングを容易にするために、本発明者らは、制限部位ＡｖｒＩＩ 、ＳｔｕＩ、ＢｇｌＩＩ 、ＥｃｏＲＶ およびＥｃｏＲＩ からなるアニールしたオリゴヌクレオチドを、元のＥｃｏＲＩ 部位の下流、ｂＧＨｐＡ 部位の上流に導入して、ＫｂｐＡ１ｂベクターを作製した。次に、ＸｂａＩ−ＮｏｔＩ （ギャップ充填（ｇａｐ−ｆｉｌｌｅｄ））ヒトＣＡＲ ｃＤＮＡ（「ｈＣＡＲ」、１．２ キロ塩基、ＧｅｎＢａｎｋ アクセッション番号４５８５４１）を、ＫｂｐＡ１ｂベクターのＡｖｒＩＩ−ＥｃｏＲＶ 部位にサブクローニングして、ＫｂｐＡ１ｂ−ｈＣＡＲ コンストラクトを得た。次に、ＫＣＲ 、ｈＣＡＲ ｃＤＮＡ およびｂＧＨｐＡ からなる２．５ｋｂ のＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩ 断片を、改変ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ３’ｓｋ ベクターの対応する部位に連結して、ベクターＫｂｐＡ１ｂ−ｈＣＡＲ３’ｓｋ を得た。このステップに使用した改変ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ３’ｓｋ ベクターでは、元のｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ ベクターの３’末端のＣｌａＩ−Ａｃｃ６５Ｉ 領域が、ＡｓｃＩ、ＳｗａＩおよびＰａｃＩ切断部位などのユニークな８ 塩基対クラスターに置き換えられている。最後に、ＮｏｔＩおよびＢａｍＨＩ で消化されたアルブミンプロモーターを含む２．３ｋｂ 断片（Ｒｏｎａｌｄ Ｅｖａｎｓから入手したもの、Ｘｉｅ ら， 前掲）を、ＫｂｐＡ１ｂ−ｈＣＡＲ３’ｓｋ ベクターのＮｏｔＩおよびＢａｍＨＩ 部位にクローニングして、Ａｌｂ−ｈＣＡＲトランスジェニックコンストラクトを得た。このプラスミドはアンピシリン耐性遺伝子とＣｏｌＥ１ 複製起点とを含んでいる。
【００６６】
Ａｌｂ−ｈＣＡＲトランスジェニックコンストラクトを用いたヒト化ＣＡＲ マウスの作出および特徴づけ
ヒト化ＣＡＲ マウスを作出するために、Ｃ５７ＢＬ／６ 雄と交配したＣ５７ＢＬ／６ ドナー雌マウスから収集した受精単細胞胚をＭ２培地中に集め、上述の線状化Ａｌｂ−ｈＣＡＲトランスジェニックコンストラクトを顕微注入した。その結果得られたマウスを下記のように試験して、それらがヒトＣＡＲ を発現させるかどうかを決定した。所望であれば、ヒト化ＣＡＲ マウスを上述のＣＡＲ−／−ノックアウトマウスと交配することによって、ヒトＣＡＲ を発現させるがマウスＣＡＲ は欠いているマウスを作出することができる。あるいは、ヒト化ＣＡＲ マウスから得たＥＳ細胞または胚を上述のように遺伝子改変して、内因性マウスＣＡＲ 遺伝子を破壊することもできる。
【００６７】
マウスにおけるトランスジェニックコンストラクトの組込みと保持を、標準的なサザンブロット解析によって確認した。この解析を行なうために、ゲノムＤＮＡ をＢａｍＨＩ およびＡｓｐ７１８で消化した後、ヒトＣＡＲ リガンド結合ドメイン（ＬＢＤ ）をコードするＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩ 制限酵素消化配列を含む１ｋｂ 断片でプローブした。ヒトＬＢＤ 領域はネズミＣＡＲ に対する相同性が最も低い領域なので、このＬＢＤ をプローブとして使用した。予想される約１．７ｋｂ のバンドは、マウスがヒトＣＡＲ コーディング配列を持つトランスジェニックマウスであることを示す（図７Ａおよび７Ｃ、＊は、トランスジェニックマウスに由来するＤＮＡ を含むと同定されたレーンを表す）。この解析に基づいて、９ 匹のトランスジェニックファウンダーマウスが同定された。
【００６８】
これらのトランスジェニックマウスがヒトＣＡＲ をコードするＤＮＡ を含んでいることをさらに確認するために、ＰＣＲ 解析を行なった。プライマーｈＣＡＲ−ｈｉｎｇｅ５’（５’−ＣＣＧＧＡＡＴＴＣＡＧＧＡＡＡＧＡＣＡＴＧＡＴＡＣＴＧＴＣＧＧＣＡＧＡＡＧＣＣ−３’ 、配列番号１５）およびｈＣＡＲ３’（５’−ｃｇｃｇｇａｔｃｃＧＧＣＣＧＣＴＧＣＡＧＧＣＧＣＡＧＡＡＣＴＧＧＴＡＧＧＴＡＴＧＧ−３’ 、配列番号１６）を使って、ヒトＣＡＲ ｃＤＮＡ配列を特異的に増幅し、１０００塩基対のＰＣＲ 産物を生成させた（図７Ｂ）。陽性対照として、プライマーＳＣＢＦ（５’−ＧＡＴ ＧＴＧ ＣＴＣ ＣＡＧ ＧＣＴ ＡＡＡ ＧＴＴ−３’ 、配列番号１７）およびＳＣＢＲ（５’−ＡＧＡ ＡＡＣ ＧＧＡ ＡＴＧ ＴＴＧ ＴＧＧ ＡＧＴ−３’ 、配列番号１８）を使って、内因性マウスβ− アクチンを増幅することにより、６００ 塩基対のＰＣＲ 産物を生成させた。この解析により、９ 匹のファウンダーマウスはヒトＣＡＲ ＤＮＡ を持つことが確認された。
【００６９】
９ つのマウス株のうち４ 株はノーザンブロット解析でも試験することにより、それらが予想されるサイズ（約１．５ｋｂ ）のヒトＣＡＲ ｍＲＮＡ転写物を発現させるかどうかを決定した。この解析を行なうために、細胞ｍＲＮＡを、サザンブロット解析に使用したものと同じＬＢＤ 領域に対するプローブでプローブした。マウス株の一つが予想されるサイズのヒトＣＡＲ ｍＲＮＡ転写物を発現させた（図８ ）。予想どおり、肝臓特異的アルブミンプロモーターの制御下にあるヒトＣＡＲ ｍＲＮＡは、このトランスジェニック株の肝臓で特異的に発現した。他の３ 株は予想されるサイズより大きいｍＲＮＡ転写物を発現させるようであった。予想より大きいこれらのｍＲＮＡ転写物は、導入遺伝子の再配列または不適切にスプライスされた構造を示すのかも知れない。４ 株全てを少なくとも以下の器官におけるヒトＣＡＲ 発現について解析した：肝臓、脾臓、小腸、および膵臓。
【００７０】
ＣＡＲ 受容体活性のアッセイ
本明細書に記載するホモ接合性ＣＡＲ−／−動物は、ＣＹＰ２Ｂ１０ 、ＣＹＰ３Ａ１１ または他のＣＡＲ 標的遺伝子の発現を野生型動物では誘導するがＣＡＲ−／−動物では誘導しない薬物または他の生体異物化合物の同定を可能にするので、薬物代謝アッセイに役立つ。ＣＹＰ２Ｂ１０ またはＣＹＰ３Ａ１１ 誘導の検出は、ＣＹＰ２Ｂ１０ またはＣＹＰ３Ａ１１ タンパク質レベルのアッセイ（例えばウェスタンブロット解析によるアッセイ）、ｍＲＮＡレベルのアッセイ（例えばノーザンブロット解析によるアッセイ）、または酵素活性のアッセイ（例えばＰｅｌｌｉｎｅｎら，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ２３：５１５−２３，１９９６などに記載されているように７−ペントキシレゾルフィンＯ−デアルキラーゼ酵素活性を測定することによるアッセイ）を含むいくつかのアッセイのいずれで行なってもよい。あるいは、総体重に対する肝重量の増加または肝臓におけるＤＮＡ 合成の増加を本明細書に記載するように測定してもよい。他のＣＡＲ 標的遺伝子の同様のアッセイも使用することができる。
【００７１】
さらにまた、内因性ネズミＣＡＲ 標的遺伝子が関わるアッセイに代わる方法として、野生型マウス、ＣＡＲ−／−マウス、ヒト化ＣＡＲ マウス、ＣＡＲ と近縁関係にある受容体（ＳＸＲ 、ＰＸＲ または他の名称で知られているもの（Ｋｌｉｅｗｅｒ ら，Ｃｅｌｌ ９２：７３−８２，１９９８ ；Ｂｌｕｍｂｅｒｇら，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１２：３１９５−３２０５，１９９８））をコードする遺伝子を欠くマウス、または他の任意の適切な株に、任意の標準的技術（例えば上述の技術）を使って挿入された適切なレポーター導入遺伝子を測定するアッセイを行なってもよい。これらのレポーター導入遺伝子は、容易に測定できるレポーター遺伝子に作動可能に連結されたＣＡＲ 応答性プロモーターからなる。適切なプロモーターの例としては、先に記載されたフェノバルビタール応答性エレメントを含んでいるＣＹＰ２Ｂ１０ プロモーター（Ｈｏｎｋａｋｏｓｋｉら， 前掲）、ＣＹＰ２Ｂ６プロモーター、ＣＹＰ３Ａ１１ プロモーター、ＣＹＰ３Ａ４プロモーターなどの天然ＣＹＰ プロモーター、またはＣＡＲ／ＲＸＲ ヘテロ二量体のＤＮＡ 結合部位が機能的な基礎プロモーターに連結されている合成プロモーターコンストラクト（Ｔｚａｍｅｌｉ ら， 前掲）が挙げられる。適切なレポーター遺伝子の例としては、ヒト成長ホルモン、分泌型アルカリホスファターゼ、ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、ＣＹＰ２Ｂ６、ＣＹＰ３Ａ１１ 、および他の任意のレポーター遺伝子が挙げられる（例えばＡｕｓｕｂｅｌ ら（前掲）の第９ 章を参照されたい）。ＣＡＲ 標的遺伝子のアッセイは標準的手順を含み（例えばＡｕｓｕｂｅｌ ら（前掲）の第９ 章を参照されたい）、マウスから採取された適切な試料、例えば肝臓または血清試料などに基づいて行なうことができる。もう一つの選択肢として、肝細胞または他の適切な細胞タイプを動物から収集して増殖させ、それらの細胞に化合物を投与して、その化合物がＣＡＲ 標的遺伝子またはレポーター導入遺伝子の発現を変化させるかどうかを決定することもできる。
【００７２】
候補化合物は、ヒトＣＡＲ をコードするトランスジェニックコンストラクトを一過性にまたは安定にトランスフェクトした細胞を用いる細胞アッセイで、ヒトＣＡＲ を活性化または阻害する能力について試験することもできる。例えば、アルブミンプロモーターの制御下にあるヒトＣＡＲ をコードする図６ のＡｌｂ−ｈＣＡＲトランスジェニックコンストラクトを使って、ヒト肝癌由来ＨｅｐＧ２ 細胞株を一過性にトランスフェクトした。ＨｅｐＧ２ 細胞株は、ＣＡＲ 応答性プロモーターの制御下にあるルシフェラーゼレポーター遺伝子を含むｂｅｔａＲＡＲＥｌｕｃｉｆｅｒａｓｅと呼ばれる先に記載されたレポーターコンストラクトを有するプラスミドを含んでいる（Ｆｏｒｍａｎら，Ｎａｔｕｒｅ ３９５（６７０２）：６１２−５，１９９８）。図９ に示すように、Ａｌｂ−ｈＣＡＲ導入遺伝子コンストラクトを細胞にトランスフェクトすると、ルシフェラーゼレポーター遺伝子の発現レベルが、ヒトＣＡＲ コーディング配列を欠く対応する対照コンストラクトをトランスフェクトした細胞より５．２ 倍高くなった。この結果は、このトランスジェニックコンストラクトが、ＣＡＲ 応答性プロモーターに作動可能に連結されたレポーター遺伝子の発現を活性化できる機能的ヒトＣＡＲ をコードすることを示している。Ａｌｂ−ｈＣＡＲコンストラクトをトランスフェクトした細胞は、ヒトＣＡＲ の活性化物質としてルシフェラーゼレポーター遺伝子の発現を増加させる候補化合物を同定するため、およびヒトＣＡＲ の阻害物質としてルシフェラーゼレポーター遺伝子の発現を減少させる候補化合物を同定するために、使用することができる。
【００７３】
他の態様
種々の用法および条件に対して本発明を採用するために、本明細書に記載した発明に改変および変更を加えうることは、上記の説明から明らかだろう。そのような態様も本願特許請求の範囲に包含される。
【００７４】
本明細書で言及した刊行物は、個々の刊行物または特許出願について参照により本明細書に組み込まれることを個別に明示した場合と同様に、いずれも参照により本明細書に組み込まれるものとする。
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１Ａ　マウスＣＡＲ 遺伝子の標的破壊の概略図である。四角い枠はエキソンを表す。エキソン２ および３ （斜線付きの枠）はＤＮＡ 結合ドメインを含んでいる。相同組換えにより、β−ｇａｌおよびｎｅｏ 耐性遺伝子によるエキソン１ および２ の置換が起こった。ＡｐａＩ（Ａ ）、ＨｉｎｄＩＩＩ （Ｈ３）、ＮｏｔＩ（Ｎ ）、ＳａｌＩ（Ｓ ）およびＸｂａＩ（Ｘ ）について制限酵素部位を示す。
図１Ｂ　サザンブロット法による遺伝子型解析を示すゲルの写真である。尾試料から得たゲノムＤＮＡ をＨｉｎｄＩＩＩ で消化し、３’プローブとハイブリダイズさせた。野生型および突然変異型対立遺伝子から、それぞれ１０Ｋｂおよび１５Ｋｂのバンドが生成した。
図１Ｃ　ノーザンブロット解析を示すゲルの写真である。プローブとしてネズミＣＡＲ ｃＤＮＡを使用して、野生型およびＣＡＲ＋／−または−／− 動物の肝臓で発現されるＣＡＲ ｍＲＮＡのレベルを決定した。
【図２】
図２Ａ　肝試料におけるＣＡＲ によるＣＹＰ２Ｂ１０ 遺伝子の生体異物活性化を示す代表的ノーザンブロットの写真である。マウス（８ 〜１０週齢、各処置につき３ 匹）をトウモロコシ油（ＣＯ）で６ または２４時間、ＰＢで２４時間、またはＴＣＰＯＢＯＰ で６ 時間処置した。
図２Ｂ　ＰＢまたはＴＣＰＯＢＯＰ で３ 日間処置したマウスから採取した小腸片のインサイチューハイブリダイゼーションを示す一連の写真である。インサイチューハイブリダイゼーションは［３５Ｓ］標識アンチセンスＣＹＰ２Ｂ１０ リボプローブを使って行なった。ＣＡＲ−／−動物における１ 細胞あたりの粒子数は、生体異物処置の有無によって有意に相違しない。無処置の野生型マウスにおける１ 細胞あたりの粒子数はＣＡＲ 受容体ノックアウトマウスより約２ 倍高く、生体異物処置した野生型マウスにおける１ 細胞あたりの粒子数は無処置の野生型マウスより約２ 倍高い。
【図３】
図３Ａ　ＰＢまたはＴＣＰＯＢＯＰ による肝臓肥大および肝細胞増殖を示す棒グラフである。マウス（８ 〜１０週齢）をＰＢまたはＴＣＰＯＢＯＰ で３ 日間処置した後、肝重量と体重の両方を測定した。データを総体重に対する肝重量のパーセンテージとして表す。
図３Ｂ　肝臓組織を収集する前にＢｒｄＵで２ 時間処置したＰＢ処置マウス、ＴＣＰＯＢＯＰ 処置マウスまたは対照マウスを表す一組の写真である。代表的顕微鏡写真により、ＰＢまたはＴＣＰＯＢＯＰ 処置した野生型動物にのみ、ＢｒｄＵ陽性肝細胞が存在することがわかる。
【図４】
血清アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ ）活性として測定したコカイン媒介性肝細胞毒性に対するＰＢまたはＴＣＰＯＢＯＰ の効果を示す棒グラフである。雄マウスをＰＢまたはＴＣＰＯＢＯＰ で３ 日間処置した。最後の投与の２４時間後に、動物にコカインを単回注射した。コカイン処置の２０時間後に血液を採取して、血清ＡＬＴ 活性を決定した。
【図５】
図５ＡおよびＢ　肝試料におけるネズミＣＡＲ によるネズミＣＹＰ３Ａ１１ 遺伝子の生体異物活性化を示す代表的ノーザンブロットの写真である。マウス（８ 〜１０週齢、各処置につき３ 匹）をトウモロコシ油（ＣＯ）で６ または２４時間、ＰＢで２４時間、またはＴＣＰＯＢＯＰ で６ 時間処置した。
【図６】
ヒトＣＡＲ を発現させるマウスを作出するために使用した導入遺伝子コンストラクトの概略図である。このトランスジェニックコンストラクトは、ヒトＣＡＲ のｃＤＮＡ配列に作動可能に連結された肝臓特異的アルブミンプロモーターを含んでいる。ヒトＣＡＲ 転写物の発現および安定性を増大させるために、大量に発現する遺伝子ウサギβ− グロビン由来の領域と、ウシ成長ホルモン由来のポリアデニル化（ポリＡ ）配列も、このコンストラクトに付加した。
【図７】
図７ＡおよびＣ　ヒトＣＡＲ 導入遺伝子コンストラクトを使って作出したマウスから得たゲノムＤＮＡ の代表的サザンブロットの写真である。ヒトＣＡＲ プローブに結合したＤＮＡ を含むレーンをアステリスクで示す。
図７Ｂ　ヒトＣＡＲ 導入遺伝子コンストラクトを使って作出したマウスから得たゲノムＤＮＡ のＰＣＲ 増幅を示す代表的ゲルである。ヒトＣＡＲ に特異的なプライマーを使ったＰＣＲ 産物の生成により、図７Ａおよび７Ｃにおけるサザンブロット解析の結果が確認された。これらの解析に基づいて、９ 匹のマウスが、ヒトＣＡＲ をコードするＤＮＡ を保有するトランスジェニックマウスであると同定された。
【図８】
ヒト化ＣＡＲ マウス株の一つ（６２１０株）におけるヒトＣＡＲ ｍＲＮＡ転写物の発現を表すノーザンブロットである。予想どおり、ヒトＣＡＲ ｍＲＮＡは肝臓で特異的に発現された。
【図９】
図６に示すヒトＣＡＲ トランスジェニックコンストラクトを一過性にトランスフェクトしたＨｅｐＧ２ 細胞におけるＣＡＲ レポーター遺伝子の誘導体を表す棒グラフである。これらの結果は、このトランスジェニックコンストラクトが、ＣＡＲ 応答性プロモーターに作動可能に連結されたレポーター遺伝子の発現を活性化することができる機能的ヒトＣＡＲ をコードすることを示している。これらのトランスフェクト細胞は、候補化合物がヒトＣＡＲ を活性化または阻害するかどうかを決定するために行なわれる候補化合物のスクリーニングに使用することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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