(57)【要約】本発明は試料中に場合により存在する二本鎖又は一本鎖ＤＮＡから出発してＤＮＡターゲットを増幅するための転写による増幅方法として、選択した制限部位でＤＮＡを開裂することが可能であり、前記ＤＮＡ鎖の規定３’末端を生成する１種以上の制限酵素と、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼにより認識されるプロモーターの配列を含む５’領域とＤＮＡ鎖の規定３’末端に相補的な３’領域をもつプロモータープライマーと、プロモータープライマーと逆極性であり、ターゲット配列の５’末端を含む第２のプライマーと、ターゲット配列が一本鎖ＤＮＡの場合には制限プライマーを加えた増幅緩衝液中で試料をインキュベートする段階と、こうして生成した反応混合物を制限酵素により消化させるために十分な時間適切な条件下に維持する段階と、制限酵素を失活させるため及び／又は二本鎖を一本鎖にするために十分な温度と時間で試料を熱処理する段階と、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性をもつ酵素と、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性をもつ酵素と、ＲＮアーゼＨ活性をもつ酵素と、ＲＮＡポリメラーゼ活性をもつ酵素を試料に加える段階と、こうして生成した反応混合物を増幅させるために十分な時間適切な条件下に維持する段階を含む方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中に場合により存在するＤＮＡから出発するターゲット核酸配列の転写による増幅方法であって、
−試料を、
選択した制限部位でＤＮＡを解裂することができ、前記ＤＮＡ鎖の規定３’末端を生成する１またはそれ以上の制限酵素、
ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼにより認識されるプロモーターの配列を含む５’領域およびＤＮＡ鎖の３’末端に相補的な３’領域を有するプロモータープライマー、
プロモータープライマーと逆極性であり、ターゲット配列の５’末端を含む第２のプライマー、および
ターゲット配列が一本鎖ＤＮＡの場合には制限プライマーと共に、
増幅緩衝液中にてインキュベートする段階、
−こうして生成した反応混合物を、制限酵素により消化させるために十分な時間適切な条件下に維持する段階、
−試料を、制限酵素を失活させるため及び／又は二本鎖を一本鎖にするために十分な温度と時間熱処理する段階、
−ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性をもつ酵素と、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性をもつ酵素と、ＲＮアーゼＨ活性をもつ酵素と、ＲＮＡポリメラーゼ活性をもつ酵素とを試料に加える段階、および
−こうして生成した反応混合物を、増幅させるために十分な時間適切な条件下に維持する段階を含む、前記方法。
【請求項２】
ＤＮＡが一本鎖であり、ターゲット一本鎖ＤＮＡの制限部位を含む領域に相補的な配列とＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼにより認識されるプロモーターの配列とを含むプロモーター兼制限プライマーを使用することにより、プロモータープライマーの機能と制限プライマーの機能を兼備する請求項１に記載の方法。
【請求項３】
熱処理前の初期インキュベーション混合物に適切なヌクレオシド三リン酸を加える請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性をもつ酵素とＤＮＡ依存性ＤＮＡ活性をもつ酵素の活性を兼備する逆転写酵素とを使用する請求項１又は２に記載の方法。
【請求項５】
ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性をもつ酵素と、ＤＮＡ依存性ＤＮＡ活性をもつ酵素と、ＲＮアーゼＨ活性をもつ酵素の３種の酵素に代用する固有ＲＮアーゼＨ活性をもつ逆転写酵素とを使用する請求項４に記載の方法。
【請求項６】
インキュベーション温度が３５℃〜約４５℃、好ましくは約３７〜４１℃である請求項１に記載の方法。
【請求項７】
加熱段階を９２℃〜９８℃、好ましくは約９５℃の温度で実施する請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はＤＮＡターゲットを増幅するための転写による増幅法に関する。
【背景技術】
【０００２】
分子生物学及び組換えＤＮＡ技術の分野では核酸増幅法が使用されている。これらの方法はＲＮＡとＤＮＡの両者を含めた多様な他の核酸配列が共存する環境に存在することが多い少量の特定核酸配列のコピー数を増すために使用される。特に、核酸増幅法は核酸の検出又は定量を容易にするために使用され、例えば感染症、遺伝病及び各種癌の診断に重要である。核酸増幅法は法医化学、考古学又は父子鑑定のように核酸が微量に存在している可能性のある試料を調査する他の分野でも利用されている。
【０００３】
作用メカニズムの異なる数種の核酸増幅法が知られている。核酸増幅法の１例は「ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）」として知られ、ヨーロッパ特許出願第ＥＰ２００３６２号及びＥＰ２０１１４８号に記載されている。
【０００４】
本発明は別種の核酸増幅法、即ち「転写による増幅法」に関する。これらの方法では、ＲＮＡポリメラーゼにより認識される機能プロモーターを含むＤＮＡ鋳型から多重ＲＮＡコピーが得られる。これらのＲＮＡコピーをターゲットとして使用すると、新たにＤＮＡ鋳型等が得られる。Ｇｉｎｇｅｒａｓら（ＷＯ８８／１０３１５）とＢｕｒｇら（ＷＯ８９／１０５０）がこのような方法を記載している。ＤａｖｅｙはＥＰ３２３８２２（ＮＡＳＢＡ法に関する）、ＧｉｎｇｅｒａｓらはＥＰ３７３９６０及びＫａｃｉａｎらはＥＰ４０８２９５に等温転写による増幅法を記載している。熱安定酵素を用いて転写による増幅反応を実施することもできる。転写による増幅は一般に４１℃前後の温度で実施される。熱安定酵素を使用すると、より高温で反応を行うことができる。このような熱安定法は東洋紡名義で出願されたＥＰ６８２１２１に記載されている。
【０００５】
ＥＰ３２３８２２、ＥＰ３７３９６０及びＥＰ４０８２９５に記載されているような方法は等温連続法である。これらの方法では増幅を行うためにＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性、ＲＮアーゼ（Ｈ）活性及びＲＮＡポリメラーゼ活性の４種の酵素活性が必要である。これらの活性のいくつかを１種の酵素で兼備できるので、通常は２、３種の酵素ですむ。ＡＭＶ（鳥類筋芽細胞腫ウイルス）又はＭＭＬＶ（モロニーマウス白血病ウイルス）逆転写酵素等の逆転写酵素はＲＮＡとＤＮＡの両者に依存性のＤＮＡポリメラーゼ活性に加え、固有ＲＮアーゼＨ活性ももつ。更に、転写による増幅反応の反応混合物に大腸菌ＲＮアーゼＨ等のＲＮアーゼを加えてもよい。
【０００６】
ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼはＲＮＡポリメラーゼにより認識されるプロモーターを含むＤＮＡ鋳型から多重ＲＮＡコピーを合成する。ＲＮＡポリメラーゼの例は大腸菌とバクテリオファージＴ７、Ｔ３及びＳＰ６に由来するポリメラーゼである。転写による増幅法で一般に使用されるＲＮＡポリメラーゼの１例はＴ７ポリメラーゼである。従って、この場合にＲＮＡの多重コピーを生産するために使用する鋳型に組込むプロモーターはＴ７プロモーターである。一般に、プロモーターを含む鋳型はターゲット配列を含む核酸から出発して作製すべきである。この核酸は増幅反応の原料として使用する出発材料に存在していてもよい。出発材料に存在する核酸は一般にずっと長い配列の一部としてターゲット配列を含む。ターゲット配列の３’及び５’末端の両方に付加核酸配列が存在していてもよい。増幅反応は出発材料からのこの核酸と、上記活性を提供する適切な酵素組合せと、少なくとも１種、通常は２種のオリゴヌクレオチドを混合することにより開始することができる。これらのオリゴヌクレオチドの少なくとも１種はＲＮＡポリメラーゼプロモーターの配列を含んでいる必要がある。転写による増幅反応は原料が一本鎖ＲＮＡである場合に特に有用であるが、一本鎖又は二本鎖ＤＮＡも原料として使用できる。ターゲット配列の３’末端と５’末端の両方に付加配列をもつ一本鎖ＲＮＡを含む試料で転写による増幅法を実施する場合、従来技術に記載されているような方法で簡便に使用されるオリゴヌクレオチド対は、
−ターゲット配列の３’末端にハイブリダイズすることが可能であり、その５’末端に結合したプロモーター（好ましくはＴ７プロモーター）の配列をもつ第１のオリゴヌクレオチド（一般に「プロモータープライマー」又は「フォワードプライマー」と言う）（このオリゴヌクレオチドのハイブリダイジング部分は原料として使用するターゲットＲＮＡと逆極性である）と、
−ターゲット配列の５’末端を含む第２のオリゴヌクレオチド（一般に「リバースプライマー」と言う）（このオリゴヌクレオチドはターゲットＲＮＡと同一極性である）から構成される。
【０００７】
このようなオリゴヌクレオチド対と適切な活性をもつ全酵素と十分な量の必要なリボヌクレオチド及びデオキシリボヌクレオチドを１つの反応混合物とし、適切な条件（即ち適切な緩衝液条件と適切な温度）に十分な時間維持すると、等温連続増幅反応が開始する。上記趣旨の多数の変形が従来技術に記載されている。転写による増幅反応はＲＮＡポリメラーゼ（例えばＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ）により認識されるプロモーター（例えばＴ７プロモーター）を含む鋳型から一本鎖ＲＮＡ転写産物を合成する。プロモーター配列を含むフォワードプライマーはターゲットＲＮＡに相補的なＤＮＡ鎖の合成を開始するプライマーとして機能する。
【０００８】
プライマーはＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性により伸長する。形成されたＲＮＡ−ｃＤＮＡハイブリッドはＲＮアーゼＨにより分解される。こうして特定リバースプライマーをｃＤＮＡにハイブリダイズさせることができる。このプライマーがＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼによりｃＤＮＡの５’末端まで伸長すると二本鎖プロモーター配列が形成され、こうしてフォワードプライマーの一部であったプロモーター配列が鋳型として使用される。この二本鎖プロモーターは更にＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼにより使用され、ターゲットＲＮＡに相補的な多数の新規ＲＮＡ分子を生じる。この開始期後、増幅は循環期に入る。
【０００９】
実際に、試料中の一本鎖ＲＮＡから出発するイベントシーケンス全体は全成分を混合するとすぐに始まり、混合物は全酵素を活性にするのに適した温度となる。この方法の実施者はこれらの段階を行うために介入する必要がない。
【００１０】
上述のように、転写による増幅法は一本鎖ＲＮＡから出発する増幅に特に有用である。増幅しようとする核酸を含む出発材料は規定長のＲＮＡとしてターゲット核酸を含んでいなくてもよい。環状又は線状二本鎖ＤＮＡとしてしかターゲット配列を含まない出発材料で転写による増幅法を実施する場合には、ＤＮＡを一本鎖核酸にする必要がある。これは高温（１００℃まで）を加えて二本鎖ＤＮＡの鎖を分離することにより実施することができる。このとき、増幅プライマーとして使用する第１のオリゴヌクレオチドが一本鎖の一方にアニールする可能性がある。現状の転写による増幅法で使用されている酵素はこのような高温に耐えられないので、ＤＮＡ鎖を分離した後にしか加えることができない。オリゴヌクレオチドの一方が一本鎖ＤＮＡにアニールして伸長すると、再び二本鎖ＤＮＡが生成され、二本鎖ＤＮＡを別々の鎖に再び融解するために十分な高温を反応混合物に加えなければならない。再び酵素を失活させ、熱段階を行った後に新たに酵素を加えなければならない。漸く第２のオリゴヌクレオチドを加え、第１段階で伸長した第１のオリゴヌクレオチドから生成された鎖にアニールすることができる。オリゴヌクレオチドの一方はＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（上記参照）の５’プロモーター配列を含んでいるので、二本鎖機能プロモーターを含む二本鎖ＤＮＡ鋳型が得られ、この鋳型からＲＮＡ生産の第１段階を実施することができる。得られたＲＮＡ転写産物は増幅の循環期に入り、プロセスは更に等温になる。
【００１１】
上記から明らかなように、二本鎖ＤＮＡから転写による増幅法を開始するのは冗長な方法であると思われる。実施者は特定操作を数回実施する必要があり、試料を繰返し加熱冷却しなければならず、各加熱段階後に酵素を補充しなければならない。
【００１２】
二本鎖ＤＮＡを循環等温転写による増幅の原料として使用可能な一本鎖ＲＮＡに変換するのに上記のような冗長な手順を使用せずに二本鎖ＤＮＡから出発することができる転写による増幅法の開発に向けて既にいくつかの研究が進められている。
【００１３】
かなり単純な二本鎖ＤＮＡの転写による増幅法はＷＯ９９２５８６８に開示されている。
【００１４】
ＷＯ９９２５８６８に記載されている方法によると、（９０℃を上回る）熱処理段階を全く介さないか、あるいは好適態様では１段階の初期加熱段階しか介さずに転写による増幅プロトコールにより試料中の二本鎖ＤＮＡを直接増幅することができる。この方法では比較的短い二本鎖ＤＮＡが好ましいとされている。しかし、この方法は実際には一本鎖ＲＮＡを増幅する慣用の転写による増幅プロトコールと本質的に変わらない。
【００１５】
また、増幅の開始前に出発材料中の二本鎖ＤＮＡをＲＮＡに転写することも考えられる。このような付加段階は例えばプロモーター配列（ポリメラーゼ結合部位とも言う）が存在しなくても二本鎖ＤＮＡをＲＮＡに転写する酵素（例えば大腸菌ＲＮＡポリメラーゼ）を利用して実施することができる。転写による増幅法による二本鎖ＤＮＡの増幅を容易にするために付加段階を実施するこのような方法はＰＣＴ特許出願第ＷＯ９６０２６６８号に記載されている。この方法に記載されている付加段階は処理段階と処理時間を増すだけでなく、付加成分（即ち大腸菌ＲＮＡポリメラーゼ）も必要である。
【００１６】
二本鎖ＤＮＡの転写による増幅法に適した鋳型を作製する別の方法はＥＰ３９７２６９に記載されている。
【００１７】
この特許には、二本鎖ＤＮＡを制限酵素で前処理する方法が記載されている。制限酵素で処理後に１段階の熱分離段階だけで一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）を生成できる。この方法では一本鎖ＤＮＡの一方の厳密な３’末端に相補的な配列を含む３’部分と、ＲＮＡポリメラーゼ（例えばＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ）により認識されるプロモーター配列を含む５’末端をもつフォワードプライマー（プロモータープライマー）を使用する。プロモータープライマーを一本鎖ＤＮＡの３’末端にハイブリダイズさせると、二本鎖複合体が形成され、フォワードプライマーの５’プロモーター配列をＤＮＡ鎖の３’末端から開始する伸長反応の鋳型として利用することができる。従って、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼにより二本鎖プロモーターが形成され、得られる複合体をＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの鋳型として利用し、ＲＮＡの多重コピーを合成することができる。
【００１８】
ＷＯ９１０４３４０にも一本鎖ＤＮＡの転写による増幅反応を開始するための数種の方法が開示されている。ここでもプロモータープライマーの３’配列にハイブリダイズすることができるＤＮＡの適切な３’末端を生成するために制限酵素を使用している。
【００１９】
ＷＯ９１０４３４０には一本鎖ＤＮＡを切断する制限酵素を使用して一本鎖ＤＮＡの規定３’末端を生成する方法が開示されている。同一方法の別態様では、ターゲット一本鎖ＤＮＡにハイブリダイズする制限オリゴヌクレオチドと共に二本鎖ＤＮＡを切断する制限酵素を使用し、適切な３’末端を生成するために制限酵素により切断可能な二本鎖ＤＮＡフラグメントを生成している。この方法では、制限酵素が二本鎖複合体を切断した後に制限オリゴヌクレオチドの小フラグメントが残存する。しかし、ＷＯ９１０４３４０の開示によると、消化後の残存フラグメントが一本鎖ＤＮＡの３’末端にハイブリダイズしたままの状態を続けるには小さ過ぎてプロモーターオリゴヌクレオチドの場所を取れないように制限オリゴヌクレオチドを選択しているように思われる。一方、従来技術の方法で使用されているような制限酵素で前処理すると、高感度な転写アッセイとなるかもしれないが、多数の余分な処理段階及び処理時間が必要である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２０】
本発明は制限酵素消化を含む転写による増幅法にも関する。
【００２１】
本発明はＤＮＡを高感度で特異的に増幅（及びその後に検出）することができる転写による増幅法を提供する。本発明の方法では、従来技術の転写増幅法よりも効率的にＤＮＡを増幅及び検出することができる。従来技術の方法とは対照的に、制限酵素を使用しても増幅手順は煩瑣にならない。
【課題を解決するための手段】
【００２２】
本発明は、
−試料を、
選択した制限部位でＤＮＡを解裂することができ、前記ＤＮＡ鎖の規定３’末端を生成する１またはそれ以上の制限酵素、
ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼにより認識されるプロモーターの配列を含む５’領域およびＤＮＡ鎖の３’末端に相補的な３’領域を有するプロモータープライマー、
プロモータープライマーと逆極性であり、ターゲット配列の５’末端を含む第２のプライマー、および
ターゲット配列が一本鎖ＤＮＡの場合には制限プライマーと共に、
増幅緩衝液中にてインキュベートする段階、
−こうして生成した反応混合物を制限酵素により消化させるために十分な時間適切な条件下に維持する段階、
−試料を制限酵素を失活させるため及び／又は二本鎖を一本鎖にするために十分な温度と時間熱処理する段階、
−ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性をもつ酵素と、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性をもつ酵素と、ＲＮアーゼＨ活性をもつ酵素と、ＲＮＡポリメラーゼ活性をもつ酵素とを試料に加える段階、および
−こうして生成した反応混合物を増幅させるために十分な時間適切な条件下に維持する段階を含む、試料中に場合により存在するＤＮＡから出発するターゲット核酸配列の転写による増幅方法を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
（適切な増幅のために）必要な（適切な）ヌクレオシド三リン酸はインキュベーション段階中に１種以上の制限酵素と共に例えば前記増幅緩衝液の一部として予め存在していてもよい。他方、工程の後期に例えば熱処理後に酵素と共に加えてもよい。
【００２４】
転写による増幅法に使用する酵素と転写による増幅法の実施条件は当業者に公知であり、転写による増幅反応を最適化するために実施可能なすべての通常の改変も当業者に公知である。例えば、フォワードプライマーであるプロモータープライマーはプライマーの５’末端のプロモーター配列とプライマーの３’末端のハイブリダイジング配列の間にプリン領域を加えてもよい。
【００２５】
プライマーの配列は主に選択した制限部位の位置により決定される。フォワードプライマーの３’末端は制限部位のすぐ隣りのターゲット配列にアニールすべきである。プライマーは増幅反応で使用する条件下でハイブリダイズするために十分な長さである限り、任意長さとすることができる。一般に、プライマーのハイブリダイジング部分は約１０〜約３５ヌクレオチドから構成される。
【００２６】
本発明の方法で使用される制限プライマーは、ターゲットが一本鎖ＤＮＡの場合には、フォワードプライマーとのオーバーラップが最小となること、および制限酵素が実際にＤＮＡを効率的に切断するように制限部位の配列を組込むことが必要である。
【００２７】
制限酵素は選択部位（即ち酵素により認識される特定ヌクレオチド配列）で二本鎖ＤＮＡを切断することができる酵素である。本発明の方法に適した制限酵素を選択するにあたっては、ＤＮＡのすべての変異体に存在する制限部位（例えば、試料中のウイルスＤＮＡを検出するために増幅を行う場合には特定ウイルスのすべての遺伝子型に存在する制限部位）を選択するように注意すべきである。制限部位はプライマー間のＤＮＡ配列に存在すべきではない。
【００２８】
制限酵素を加えると、ＤＮＡのターゲット鎖の規定３’末端が生成され、その後、プロモータープライマーのハイブリダイジング部分に結合するために利用することができる。付加側面として、消化によりＤＮＡのこの部分の変性が改善されるのでプライマー結合が容易になる。
【００２９】
Ｔ７プロモーター配列を含むプロモーターオリゴヌクレオチドはハイブリダイジング部分が制限部位のすぐ上流の鋳型と相互作用するように設計すべきである。ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性をもつ酵素（通常はＭＭＬＶ−ＲＴやＡＭＶ−ＲＴ等の逆転写酵素）は、プライマーを鋳型として使用して制限酵素消化により生成されたＤＮＡのターゲット鎖の３’末端を伸長させることができる。二本鎖Ｔ７プロモーター配列が形成され、アンプリコンＲＮＡの産生を開始することができる。
【００３０】
驚くべきことに、転写による増幅法に適するように改変した環境で制限酵素を効率的に使用できることが判明した。換言するならば、転写による増幅の原料として使用するＤＮＡを切断するために制限酵素を使用しても試料の処理が煩瑣になったり、増えたりしないことが判明した。制限酵素の使用は通常転写によるＤＮＡ増幅プロトコールの既存部分である段階に組込まれ、その一部を構成する。
【００３１】
すべての従来技術の方法は実際の転写による増幅に先立つ別個の前処理として、転写による増幅に用いるＤＮＡ鋳型の作製に制限酵素を使用すると記載している。従って、従来技術はＤＮＡ鋳型の作製に制限酵素を使用するので、制限酵素を別途失活させたり、ＤＮＡを別途精製するなど試料の処理が増す。従って、増幅手順全体、特に自動工程が煩瑣になり、汚染の危険が増す。
【００３２】
制限酵素と共に制限オリゴヌクレオチドを加えることは既にＷＯ９１０４３４０に開示されているが、どのようにすれば転写による増幅に制限酵素（及びオリゴヌクレオチド）の使用を効率的に組合せることができるかについては本発明以前には開示されていない。
【００３３】
どのようにすれば試料処理段階や試薬添加段階を増やさずに転写による増幅に制限酵素の使用を組合せることができるかについて従来技術には開示されていない。
【００３４】
本発明の方法は従来技術の転写によるＤＮＡ増幅法を複雑にせずにこの組合せを実現する。
【００３５】
本発明の方法は通常の転写による増幅法と殆ど変わらない。必要な付加段階は試料と制限酵素の「ビルトインインキュベーション」だけであり、即ち試料の実際の処理が慣用／従来技術の転写によるＤＮＡ増幅法と変わらないように制限酵素を使用する。
【００３６】
本発明の方法で使用する好適制限酵素は当然のことながら比較的安定しており、（比較的高濃度の塩を含有する）増幅緩衝液を含む反応混合物に加える条件下で高活性を維持する酵素である。
【００３７】
制限酵素の添加後、酵素を活性にするのに適した条件下で適切な時間にわたって試料をインキュベートする必要がある。使用する制限酵素の種類により当然異なるが、約３５〜約４５℃、より特定的には約３７〜４１℃の温度で比較的短時間、好ましくは約１０〜２０分間、より好ましくは約１５分間試料を制限酵素と共にインキュベートすればよい。実際に、従来の転写によるＤＮＡ増幅法に追加する段階はこれだけである。
【００３８】
本発明の方法は制限酵素と共にインキュベーション後に試料を加熱する段階を含む。この加熱中に制限酵素を失活させ、二本鎖ＤＮＡを（少なくとも部分的に）一本鎖にする。この加熱段階は転写による増幅法を実施するためのプロトコールの既存部分である。これらの方法はプライマー添加後に試料を熱処理し、プライマーアニーリングに最適な状況を作る（核酸を伸長させ、核酸の鎖又は内部ループを分離し、冷却中にプライマーを鋳型にハイブリダイズし易くする）。
【００３９】
酵素と共にインキュベーション後の加熱は低温で実施してもよいが、９０℃を上回る温度、好ましくは９５±３℃で短時間（約５分間）のインキュベーションにより実施することが好ましい。
【００４０】
その後、転写による増幅反応を生じるのに適した温度（通常は約４１℃）まで試料を冷却させればよい。
【００４１】
加熱により、全二本鎖ＤＮＡが一本鎖になる。プライマー、特にプロモーターオリゴヌクレオチドが試料の加熱前に既に存在している場合には、熱処理はプライマーがＤＮＡにアニールするのも助長できる。
【００４２】
従って、制限酵素処理後に試料からＤＮＡを増幅する必要がない。既に転写による増幅法の一部であった熱処理で酵素を失活させるだけである。本発明の方法では、制限酵素が実際の転写による増幅反応を妨げる危険をなくすためにはこれで十分であることが分かった。
【００４３】
熱処理後に転写による増幅に用いる付加増幅試薬を常法で加え、当業者に公知の常法で転写による増幅を実施することができる。
【００４４】
（当然のことながら熱安定性酵素を使用しないという条件で）熱処理中の酵素の劣化を防ぐためには熱処理後に増幅酵素を加えるだけでよい。
【００４５】
本発明の方法の主要な利点は、付加試薬（例えば制限酵素）を使用するとしても、付加（別の）反応段階又は活性が必要ないことである。
【００４６】
特に増幅反応では汚染の危険を絶対に避けなければならないが試料の付加処理は常に汚染の危険を増すので、試料の付加処理が不要であるという事実は特に重要である。更に、試料の付加処理段階が必要であると、方法の自動化も複雑になる。
【００４７】
本発明の方法は一本鎖ＤＮＡにも使用することができる。ＤＮＡが一本鎖の場合には、ターゲットＤＮＡの制限部位を含む領域に相補的な配列を含む制限オリゴヌクレオチド又は制限プライマーを制限酵素と共に加える。
【００４８】
制限オリゴヌクレオチド（制限プライマー）は一本鎖ＤＮＡにハイブリダイズし、制限酵素で切断することができる二本鎖複合体を形成する。更に別の試薬（制限オリゴヌクレオチド）を加えても実施者が実施する段階は増えない。制限オリゴヌクレオチドを制限酵素及び増幅に必要な他のオリゴヌクレオチドと共に加えるだけでよい。従って、試薬を別に加えるために増幅システムを開く必要がない。
【００４９】
本発明の１好適態様では、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼにより認識されるプロモーターの配列も含むオリゴヌクレオチドに制限オリゴヌクレオチドの機能を組込むことができる（プロモーター兼制限プライマー）。このように、制限部位を含む領域に相補的な配列を組込んだプロモータープライマーと第２のプライマーであるリバースプライマーの２種のオリゴヌクレオチドしか増幅に必要としない。この好適（プロモーター兼制限）プライマーの制限部位を含む配列は、
−消化後のプライマーの残存部分が加熱段階中にターゲットから変性するように、
−ターゲットのハイブリダイジング配列の残存部分が新規プロモーター兼制限プライマーを結合させるに十分な長さであるように、および
−制限酵素の活性に必要な場合には制限部位の周囲の付加ヌクレオチドをハイブリダイゼーションに加えるように、配置することが好ましい。
【００５０】
従って、プロモーター兼制限プライマーの一部は制限オリゴヌクレオチドとして機能し、ターゲットＤＮＡにアニールし、制限酵素により認識される制限部位を含む二本鎖ＤＮＡとなる。その後、制限酵素は前記二本鎖ＤＮＡを切断し、ＤＮＡの規定３’末端を提供する。
【００５１】
転写による増幅反応における慣用プロモータープライマーにおいて既に一般的なように、ターゲットＤＮＡの量に対して少なくとも１０００倍のこのプロモーター兼制限プライマーが存在すべきである。
【００５２】
本発明の方法はＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）からＤＮＡを増幅及び検出するのに特に有用であることが判明したが、本発明の方法は任意種のＤＮＡ、試料中の検出すべきウイルスＤＮＡ、更にはゲノムＤＮＡでも使用できる。
【００５３】
以下、実施例により本発明を更に説明する。
【００５４】
（実施例１）
ＨＢＶ  ＤＮＡの増幅
ＨＢＶ  ＤＮＡのＳ−ｇｅｎの保存領域（ＥｃｏＲＩ部位を基準にｎｔ２４４〜２８５）では２つの保存制限部位（ＸｂａＩとＢｓｓＳＩ）がコードされている。Ｓ領域のこの部分は負極性の一本鎖ＤＮＡであり得るので、制限部位配列を含む領域に相補的なオリゴヌクレオチド（「制限プライマー」（ＲＰ））を加え、存在する全ゲノムＤＮＡに二本鎖制限部位を生成した。ＮｕｃｌｉＳｅｎｓ  Ｅｘｔｒａｃｔｏｒ（Ｏｒｇａｎｏｎ  Ｔｅｋｎｉｋａ）を使用して３×１０８ｇｅｑ／ｍｌのＨＢＶ遺伝子型Ａを感染させた血漿の連続希釈液からＨＢＶ  ＤＮＡを単離した。ＲＮＡ単離について記載されているような標準手順（Ｏｐｅｒａｔｏｒ  Ｍａｎｕａｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｏｒ，４１００１−９，ｒｅｖ  Ａ，１９９９）に従い、抽出液５０μｌを得た。アッセイ当たり５μｌの抽出液を使用する。ＮＡＳＢＡ緩衝液（４０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．５，１２ｍＭ  ＭｇＣｌ２，７０ｍＭ  ＫＣｌ，１５％ｖ／ｖＤＭＳＯ，５ｍＭ  ＤＴＴ，１ｍＭ各ｄＮＴＰ，２ｍＭ  ＡＴＰ，２ｍＭ  ＣＴＰ，２ｍＭ  ＵＴＰ，１．５ｍＭ  ＧＴＰ，０．５ｍＭ  ＩＴＰ，０．２μＭフォワードプライマー（ＸｂａＩにはＳ−ｐ３．８、ＢｓｓＳＩにはＳ−ｐ３．１０、表１），０．２μＭリバースプライマー（Ｓ−ｐ４．５、表１），０．１μＭ分子ビーコンプローブ（Ｓ−ＷＴ２、表１），０．１７μＭ制限プライマー（ＲＰ−３、表１））に制限酵素ＢｓｓＳＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ，米国）０．２単位又は制限酵素ＸｂａＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ，米国）３．０単位を加えて制限酵素消化を実施した。１５分間４１℃でインキュベーション後に制限酵素を熱失活させ、ＤＮＡ鋳型を９５℃で５分間変性させた。３分間で４１℃まで冷却する間にプライマーのハイブリダイゼーションが生じた。次に、ＮＡＳＢＡ酵素（ＢＳＡ２．１μｇ、ＲＮアーゼＨ０．０８単位、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ３２単位及びＡＭＶ逆転写酵素６．４単位）を加え、軽くタッピングして短時間遠心分離することにより反応混合物を混合し、増幅とリアルタイム検出を開始した。反応混合物をＮｕｃｌｉＳｅｎｓ  ＥａｓｙＱ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｏｒｇａｎｏｎ  Ｔｅｋｎｉｋａ）で１分毎に蛍光モニターしながら１２０分間４１℃でインキュベートした。反応は４８５ｎｍで励起し、発光シグナルを５１８ｎｍで測定した。
【００５５】
（実施例１．１）
ＸｂａＩ消化を含むＨＢＶ  ＤＮＡの増幅
制限酵素ＸｂａＩで処理する場合としない場合とでＮＡＳＢＡアッセイを実施した。ＨＢＶ  ＤＮＡのアンプリコン領域を含むＰＣＲフラグメント１０９コピーの消化によりＮＡＳＢＡ条件下でＸｂａＩの最適濃度を測定した処、３単位であることが分かった。Ｓ−ｐ３．８をフォワードプライマーとして使用すると、ＡＭＶ  ＲＴにより鋳型として使用され、ＸｂａＩ消化後に鋳型ＤＮＡを伸長することができる。消化しない場合に得られる感度は３×１０６ｇｅｑ／ｍｌであるが、消化後の感度は３×１０３ｇｅｑ／ｍｌであり、感度は１０００倍に増加する（図２）。更に、消化しない場合には陽性までの時間（ＴＴＰ）は約１６分間であるが、ＸｂａＩ消化後には約６分間となり、ＴＴＰは約１０分間短くなる（図２）。どちらも増幅反応の改善を表す。
【００５６】
（実施例１．２）
ＢｓｓＳＩ消化を含むＨＢＶ  ＤＮＡの増幅
上記と同一ＨＢＶ  ＤＮＡ抽出液と同等の反応条件を使用して制限酵素ＢｓｓＳＩで処理する場合としない場合とでＮＡＳＢＡ反応を実施した。ＨＢＶ  ＤＮＡのアンプリコン領域を含むＰＣＲフラグメント１０９コピーの消化によりＮＡＳＢＡ条件下でＢｓｓＳＩの最適濃度を測定した処、０．２単位であることが分かった。Ｓ−ｐ３．１０をフォワードプライマーとして使用すると、ＡＭＶ  ＲＴにより鋳型として使用され、ＢｓｓＳＩ消化後に鋳型ＤＮＡを伸長することができる。この場合も制限酵素ＢｓｓＳＩ処理の結果として顕著な試験改善が得られた（図３）。消化しない場合に得られる感度は３×１０７ｇｅｑ／ｍｌに過ぎないが、消化後の感度は３×１０４ｇｅｑ／ｍｌであり、この場合も感度は１０００倍に増加する（図３）。更に、消化しない場合には陽性までの時間（ＴＴＰ）は約２１分間であるが、ＢｓｓＳＩ消化後には約１１分間となり、ＴＴＰは約１０分間短くなる（図３）。以上の結果から明らかなように、ＮＡＳＢＡ反応前にＨＢＶ  ＤＮＡを制限酵素で消化するとＨＢＶ  ＤＮＡの増幅と検出を著しく改善できる。
【００５７】
（実施例１．３）
ＸｂａＩ消化を含むＨＢＶ  ＤＮＡの増幅−２
アッセイ結果の改善が消化自体によるのかあるいは選択したプライマーと制限酵素の組合せによるのかを試験するために、プライマーＳ−ｐ３．８の代わりにＳ−ｐ３．１０を使用してＸｂａＩ消化を含むアッセイを繰返した。ＡＭＶ  ＲＴはＸｂａＩ消化後にターゲット配列を伸長するためにＳ−ｐ３．１０を鋳型として使用することができない。図４から明らかなように、Ｓ−ｐ３．１０と組合せてＸｂａＩ消化後に感度は僅かしか増加せず（１０倍）、ＴＴＰ短縮も少ない（２１分から１６分への約５分間）。これは、ＸｂａＩとプライマーＳ−ｐ３．８及びＢｓｓＳＩとプライマーＳ−ｐ３．１０で得られる結果の改善がＮＡＳＢＡの開始中の鋳型の伸長によるものであることを示している。
【００５８】
（実施例１．４）
ＢｓｓＳＩ消化を含むＨＢＶ  ＤＮＡの増幅−２
アッセイ結果の改善が確かにターゲットの伸長によるものであるかを試験するために、プライマーＳ−ｐ３．１０の代わりにＳ−ｐ３．８を使用してＢｓｓＳＩ消化を含むアッセイを繰返した。ＡＭＶ  ＲＴはＢｓｓＳＩ消化後にターゲット配列を伸長するためにＳ−ｐ３．８を鋳型として使用することができる。しかし、プライマーとターゲット配列のハイブリダイゼーションには加わるヌクレオチドは通常は約２０であるが、ＢｓｓＳＩ消化後には１７ヌクレオチドしかない。この差にも拘わらず、ＢｓｓＳＩ消化後にやはり明白な試験改善が得られた（図５）。プライマーＳ−ｐ３．８とＳ−ｐ４．５、制限プライマーＲＴ−３及び分子ビーコンＳ−ＷＴ２を使用するＮＡＳＢＡではＸｂａＩとＢｓｓＳＩの両者で二重消化を実施することができ、単独消化ＮＡＳＢＡアッセイに比較して増幅効率は低下しない。
【００５９】
（実施例１．５）
ＡｖｒＩＩ消化を含むＨＢＶ  ＤＮＡの増幅
制限部位（ＡｖｒＩＩ）はＨＢＶ  ＤＮＡのＳ−ｇｅｎの別の保存領域（ＥｃｏＲＩ部位を基準にｎｔ１７７〜１９２）でコードされる。フォワードプライマーＳ−ｐ３．５、リバースプライマーＳ−ｐ４．４、分子ビーコンＳ−ＷＴ４及び制限プライマーＲＰ−１（表１）をＮＡＳＢＡで使用した。ＡＭＶ  ＲＴはＳ−ｐ３．５を鋳型として使用してＡｖｒＩＩ消化後にＨＢＶ  ＤＮＡのターゲット鎖を伸長することができる。上記と同一の反応条件を使用した。１反応当たり２単位のＡｖｒＩＩを使用して上記と同一ＨＢＶ  ＤＮＡ抽出液で制限酵素ＡｖｒＩＩで処理する場合と処理しない場合とでＮＡＳＢＡ反応を実施した。消化しない場合に得られる感度は＞１０８ｇｅｑ／ｍｌであるが、消化後の感度は１×１０５ｇｅｑ／ｍｌであり、消化の結果として感度は＞１０３倍増加した（図６）。この場合もこれらの結果はＮＡＳＢＡ反応に加える制限酵素でＨＢＶ  ＤＮＡを消化するとＨＢＶ  ＤＮＡの増幅を著しく改善できることを立証している。
（実施例１．６）
ＭｓｐＩ消化を含むＵ１ａ  ＤＮＡの増幅
フォワードプライマーＵ１ａ−ｐ１、リバースプライマーＵ１ａ−ｐ２及び分子ビーコンＵ１ａ−ＭＢ（表２）を含むＵ１ａ  ＤＮＡに適したＮＡＳＢＡ反応を設計する。ＮＡＳＢＡ緩衝液（４０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．５，１２ｍＭ  ＭｇＣｌ２，７０ｍＭ  ＫＣｌ，１５％ｖ／ｖＤＭＳＯ，５ｍＭ  ＤＴＴ，１ｍＭ各ｄＮＴＰ，２ｍＭ  ＡＴＰ，２ｍＭ  ＣＴＰ，２ｍＭ  ＵＴＰ，２ｍＭ  ＧＴＰ，０．２μＭフォワードプライマー，０．２μＭリバースプライマー及び０．０５μＭ分子ビーコンプローブ）中で制限酵素ＭｓｐＩを加えた場合と加えない場合とでＮＡＳＢＡを実施した。制限酵素消化を含むＮＡＳＢＡにはＭｓｐＩ  １．５単位を加えた。３７℃で２５分間インキュベーション後にＤＮＡ鋳型を９５℃で３分間変性させた。３分間で４１℃まで冷却する間にプライマーのハイブリダイゼーションが生じた。次に、ＮＡＳＢＡ酵素（３７５ｍＭソルビトール中ＲＮアーゼＨ０．０８単位、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ３２単位及びＡＭＶ逆転写酵素６．４単位にＢＳＡ２．１μｇを添加）を加え、軽くタッピングして短時間遠心分離することにより反応混合物を混合し、増幅とリアルタイム検出を開始した。反応混合物を４５秒毎に蛍光モニターしながら９０分間４１℃でインキュベートした。反応は４８５ｎｍで励起し、発光シグナルを５３０ｎｍでフルオロメーター（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で測定した。ＭｓｐＩで消化しない場合には１０倍の希釈液も検出できなかったが、ＭｓｐＩで消化すると１０３倍希釈液を検出でき、感度は少なくとも１００倍に増加したことになる（図７）。この結果、フォワードプライマーがＡＭＶ  ＲＴの鋳型として直接機能できるようにＵ１ａ  ＤＮＡを制限酵素で消化すると、Ｕ１ａ  ＤＮＡの増幅と、従ってその検出を著しく改善できることが判明した。更に、ＭｓｐＩ消化をＮＡＳＢＡ反応に加えることができる。
【００６０】
【表１】
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【００６１】
【表２】
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【図面の簡単な説明】
【００６２】
【図１】制限酵素消化を含むＤＮＡ  ＮＡＳＢＡの概念図。制限酵素（矢印）はＮＡＳＢＡの開始期のみ活性である。消化後、フォワードプライマーを鋳型にハイブリダイズさせる。ＡＭＶ  ＲＴはＴ７プロモーター配列（濃灰色）を鋳型として含むフォワードプライマーを使用してＤＮＡのターゲット鎖の３’末端（黒）を伸長する。Ｔ７  ＤｄＲｐは二本鎖Ｔ７プロモーター配列を認識し、ＲＮＡアンプリコン（薄灰色）産生が開始する。ＲＮＡアンプリコン配列はターゲットＤＮＡ鎖に相補的である。循環期にＲＮＡアンプリコンが増幅され、分子ビーコン技術により検出される。循環期にはＲＮアーゼＨとリバースプライマーしか必要としない。
【図２】フォワードプライマーＳ−ｐ３．８と組合せてＸｂａＩで消化した場合としない場合のＨＢＶ  ＤＮＡのＮＡＳＢＡ。ＸｂａＩで消化後にＳ−ｐ３．８はターゲットＤＮＡの伸長用鋳型として使用することができる。プライマーＳ−ｐ４．５をリバースプライマーとして使用し、分子ビーコンＳ−ＷＴ２をプローブとして使用する。鋳型なしの試料（ＮＴ）を陰性対照として使用する。
【図３】フォワードプライマーＳ−ｐ３．１０と組合せてＢｓｓＳＩで消化した場合としない場合のＨＢＶ  ＤＮＡのＮＡＳＢＡ。ＢｓｓＳＩで消化後にＳ−ｐ３．１０はターゲットＤＮＡの伸長用鋳型として使用することができる。プライマーＳ−ｐ４．５をリバースプライマーとして使用し、分子ビーコンＳ−ＷＴ２をプローブとして使用する。鋳型なしの試料（ＮＴ）を陰性対照として使用する。
【図４】フォワードプライマーＳ−ｐ３．１０と組合せてＸｂａＩで消化した場合としない場合のＨＢＶ  ＤＮＡのＮＡＳＢＡ。ＸｂａＩで消化後にＳ−ｐ３．１０はターゲットＤＮＡの伸長用鋳型として使用することができない。プライマーＳ−ｐ４．５をリバースプライマーとして使用し、分子ビーコンＳ−ＷＴ２をプローブとして使用する。鋳型なしの試料（ＮＴ）を陰性対照として使用する。
【図５】フォワードプライマーＳ−ｐ３．８と組合せてＢｓｓＳＩで消化した場合としない場合のＨＢＶ  ＤＮＡのＮＡＳＢＡ。ＢｓｓＳＩで消化後にＳ−ｐ３．８はターゲットＤＮＡの伸長用鋳型として使用することができる。プライマーＳ−ｐ４．５をリバースプライマーとして使用し、分子ビーコンＳ−ＷＴ２をプローブとして使用する。鋳型なしの試料（ＮＴ）を陰性対照として使用する。
【図６】フォワードプライマーＳ−ｐ３．５と組合せてＡｖｒＩＩで消化した場合としない場合のＨＢＶ  ＤＮＡのＮＡＳＢＡ。ＡｖｒＩＩで消化後にＳ−ｐ３．５はターゲットＤＮＡの伸長用鋳型として使用することができる。プライマーＳ−ｐ４．４をリバースプライマーとして使用し、分子ビーコンＳ−ＷＴ４をプローブとして使用する。鋳型なしの試料（ＮＴ）を陰性対照として使用する。
【図７】フォワードプライマーＵ１ａ−ｐ１と組合せてＭｓｐＩで消化した場合としない場合のＤＮＡのＮＡＳＢＡ。ＭｓｐＩで消化後にＵ１ａ−ｐ１はターゲットＤＮＡの伸長用鋳型として使用することができる。プライマーＵ１ａ−ｐ２をリバースプライマーとして使用し、分子ビーコンＵ１ａ−ＭＢをプローブとして使用する。鋳型なしの試料（ＮＴ）を陰性対照として使用する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際公開パンフレット】
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2004528028.tif 000012
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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2004528028.tif 000044
2004528028.tif 000045
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