(57)【要約】サイクリン依存性キナーゼの活性を調節および／または阻害するピラゾール−チアゾール化合物が記載されている。これらの化合物およびそれらを含有する医薬組成物は、好ましくない細胞増殖を調節および／または阻害するサイクリン依存性疾患を媒介することができる。本発明はまた、このような化合物を含有する医薬組成物の治療上または予防上の使用、並びにこのような化合物の有効量を投与することにより、癌および、糖尿病性網膜症、緑内障、リウマチ様関節炎、および乾癬のような好ましくない血管形成および／または細胞増殖に関連する他の疾患状態を治療する方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
式Ｉ：
【化１】
2004505983.tif 000020
式中：
Ｒ１は置換および非置換のアルキル、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキル、およびヘテロシクロアルキル基から選択される基であり；および
Ｒ２は置換および非置換のアルキル、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキル、およびヘテロシクロアルキル基から選択される基であり、ただしＲ１およびＲ２がともに非置換フェニルであってはいけない；
の化合物、または該化合物の薬剤学的に許容できる塩、多重結合体、プロドラッグ、もしくは薬理学的活性代謝物、または該代謝物の薬剤学的に許容できる塩。
【請求項２】
Ｒ１が置換または非置換のアリールまたはヘテロアリール基であり、Ｒ２が置換または非置換のアリールまたはヘテロアリール基である、請求項１に係る化合物、塩、多重結合体、プロドラッグまたは代謝物。
【請求項３】
Ｒ１が置換または非置換のフェニル基であり、Ｒ２がパラ位において置換されたフェニル基である、請求項１に係る化合物、塩、多重結合体、プロドラッグまたは代謝物。
【請求項４】
式：
【化２】
2004505983.tif 000021
からなる群から選択される構造を有する化合物、または該化合物の薬剤学的に許容できる塩、多重結合体、プロドラッグ、もしくは薬理学的活性代謝物、または該代謝物の薬剤学的に許容できる塩。
【請求項５】
式ＩＩ：
【化３】
2004505983.tif 000022
式中：
Ｒ２は置換または非置換のアルキル、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキル、またはヘテロシクロアルキル基であり；および
Ｒ３はそれぞれ独立して水素もしくはハロゲン、または置換もしくは非置換のアルキル、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキル、もしくはヘテロシクロアルキル基であり、ただしＲ２が非置換フェニルのとき、Ｒ３が全て水素であってはいけない；
の化合物、または該化合物の薬剤学的に許容できる塩、多重結合体、プロドラッグ、もしくは薬理学的活性代謝物、または該代謝物の薬剤学的に許容できる塩。
【請求項６】
式ＩＩａ：
【化４】
2004505983.tif 000023
式中：
Ｒ２は置換または非置換のアルキル、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキル、またはヘテロシクロアルキル基であり；および
Ｒ３およびＲ３’はそれぞれ独立して水素もしくはハロゲン、または置換もしくは非置換のアルキル、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキル、もしくはヘテロシクロアルキル基であり、ただしＲ２が非置換フェニルのとき、Ｒ３およびＲ３’がともに非置換フェニルであってはいけない；
の化合物、または該化合物の薬剤学的に許容できる塩、多重結合体、プロドラッグ、もしくは薬理学的活性代謝物、または該代謝物の薬剤学的に許容できる塩。
【請求項７】
（ａ）式Ｉ：
【化５】
2004505983.tif 000024
式中：
Ｒ１は置換および非置換のアルキル、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキル、およびヘテロシクロアルキル基から選択される基であり；および
Ｒ２は置換および非置換のアルキル、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキル、およびヘテロシクロアルキル基から選択される基である；
の化合物、該化合物の薬剤学的に許容できる塩、該化合物の多重結合体、該化合物のプロドラッグ、該化合物の薬理学的活性代謝物、および該代謝物の薬剤学的に許容できる塩からなる群から選択される、ＣＤＫ４またはＣＤＫ４／サイクリン複合体の阻害に有効な量の細胞周期調節剤；並びに
（ｂ）薬剤学的に許容できる担体
を含む医薬組成物。
【請求項８】
式Ｉ：
【化６】
2004505983.tif 000025
式中：
Ｒ１は置換および非置換のアルキル、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキル、およびヘテロシクロアルキル基から選択される基であり；および
Ｒ２は置換および非置換のアルキル、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキル、およびヘテロシクロアルキル基から選択される基である；
の化合物、該化合物の薬剤学的に許容できる塩、該化合物の多重結合体、該化合物のプロドラッグ、該化合物の薬理学的活性代謝物、および該代謝物の薬剤学的に許容できる塩からなる群から選択される細胞周期調節剤を、ＣＤＫ４またはＣＤＫ４／サイクリン複合体の阻害により媒介される疾患または障害の治療を要する患者に投与することを含む、ＣＤＫ４またはＣＤＫ４／サイクリン複合体の阻害により媒介される疾患または障害を治療する方法。
【請求項９】
（ａ）請求項１において定義される化合物、該化合物の薬剤学的に許容できる塩、多重結合体、プロドラッグ、もしくは薬理学的活性代謝物、または該代謝物の薬剤学的に許容できる塩、の治療有効量；および
（ｂ）そのための、薬剤学的に許容できる担体、希釈剤、媒体または賦形剤
を含む医薬組成物。
【請求項１０】
式Ｉ：
【化７】
2004505983.tif 000026
式中：
Ｒ１は置換および非置換のアルキル、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキル、およびヘテロシクロアルキル基から選択される基であり；および
Ｒ２は置換および非置換のアルキル、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキル、およびヘテロシクロアルキル基から選択される基である；
の化合物、または該化合物の薬剤学的に許容できる塩、多重結合体、プロドラッグ、もしくは薬理学的活性代謝物、または該代謝物の薬剤学的に許容できる塩の治療有効量を、プロテインキナーゼ活性により媒介される、哺乳動物における疾患状態の治療を要する哺乳動物に投与することを含む、プロテインキナーゼ活性により媒介される、哺乳動物における疾患状態を治療する方法。
【請求項１１】
前記疾患状態が、腫瘍増殖、細胞増殖、または血管形成に関連する、請求項１０に係る方法。
【請求項１２】
式Ｉ：
【化８】
2004505983.tif 000027
式中：
Ｒ１は置換および非置換のアルキル、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキル、およびヘテロシクロアルキル基から選択される基であり；および
Ｒ２は置換および非置換のアルキル、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキル、およびヘテロシクロアルキル基から選択される基である；
の化合物、または該化合物の薬剤学的に許容できる塩、多重結合体、プロドラッグ、もしくは薬理学的活性代謝物、または該代謝物の薬剤学的に許容できる塩の有効量とキナーゼ受容体を接触することを含む、プロテインキナーゼ受容体の活性を調節または阻害する方法。
【請求項１３】
（ａ）（１）式Ｉ：
【化９】
2004505983.tif 000028
式中：
Ｒ１は置換および非置換のアルキル、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキル、およびヘテロシクロアルキル基から選択される基であり；および
Ｒ２は置換および非置換のアルキル、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキル、およびヘテロシクロアルキル基から選択される基である；
の化合物；
（２）該化合物の薬剤学的に許容できる塩；
（３）該化合物の多重結合体；
（４）該化合物のプロドラッグ；
（５）該化合物の薬理学的活性代謝物；および
（６）該代謝物の薬剤学的に許容できる塩：
から選択される細胞周期調節剤の、ＣＤＫまたはＣＤＫ／サイクリン複合体を阻害するのに有効な量；および
（ｂ）薬剤学的に許容できる担体：
を含む医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
関連出願データ
この出願は、２０００年８月９日に出願された、Ｕ．Ｓ．仮特許出願第６０／２２３，９８９号に対し優先権を主張する。
【０００２】
発明の技術分野および産業上の利用可能性
本発明は、ＣＤＫ１、ＣＤＫ２、ＣＤＫ４、およびＣＤＫ６のようなサイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫｓ）の活性を媒介および／または阻害する、５−アミノ−３−置換−ピラゾロ［４，５−ｄ］チアゾール化合物、並びに、このような化合物を含有する医薬組成物に関する。本発明はまた、このような化合物および組成物の治療上または予防上の使用、並びに、このような化合物の有効量を投与することによる、癌およびその他の、好ましくない血管形成および／または細胞増殖に関連する疾患状態の治療方法にも関する。
【０００３】
発明の背景
統制されていない細胞増殖は、癌の証である。様々な刺激に応答した細胞増殖は、細胞が増殖し分裂する過程である細胞分裂サイクルの抑制解除によって現れる。腫瘍細胞は一般的に、細胞分裂サイクルを通じて進行を直接的または間接的に調節している遺伝子に損傷を与えている。
【０００４】
ＣＤＫは、Ｇ１（細胞分裂の新しい回のための、有糸分裂およびＤＮＡ複製の開始の間）における静止期からＳ（活発なＤＮＡ合成の期間）への進行、またはＧ２から、活発な有糸分裂および細胞分裂が起こるＭ期への進行のような、細胞周期の異なる段階間での移行の調節に重要な役割を担っている酵素クラスを構成する。例えば、Ｓｃｉｅｎｃｅ， ｖｏｌ． ２７４ （１９９６）， ｐｐ． １６４３−１６７７およびＡｎｎ． Ｒｅｖ． Ｃｅｌｌ Ｄｅｖ． Ｂｉｏｌ．， ｖｏｌ． １３ （１９９７）， ｐｐ． ２６１−２９１に編集された論文を参照。ＣＤＫ複合体は、調節サイクリンサブユニット（例えば、サイクリンＡ、Ｂ１、Ｂ２、Ｄ１、Ｄ２、Ｄ３、およびＥ）並びに触媒性キナーゼサブユニット（例えば、ｃｄｃ２（ＣＤＫ１）、ＣＤＫ２、ＣＤＫ４、ＣＤＫ５、およびＣＤＫ６）の会合を通して形成される。その名が示す通り、ＣＤＫは、その標的基質をリン酸化するためにサイクリンサブユニットに完全な依存性を示し、異なるキナーゼ／サイクリンペアが、細胞周期の特定部分を通して、進行を調節するために機能している。
【０００５】
Ｄサイクリンは、細胞外増殖シグナルに感受性であり、細胞周期のＧ１期の間に有糸分裂促進剤に応答して活性化される。ＣＤＫ４／サイクリンＤは、網膜芽細胞腫タンパク質（Ｒｂ）をリン酸化し、それにより不活性化することによって細胞周期の進行に重要な役割を果たしている。過少リン酸化Ｒｂは、転写調節因子のファミリーに結合するが、ＣＤＫ４／サイクリンＤによるＲｂの過剰リン酸化によって、これらの転写因子は、その産物がＳ期の進行に関与している遺伝子を活性化するために放出される。ＣＤＫ４／サイクリンＤによるＲｂのリン酸化および不活性化により、細胞はＧ１期の制限ポイントを通過でき、その結果細胞外の増殖または阻害シグナルに対する感受性が失われ、その細胞は細胞分裂へと引き渡される。Ｇ１の後期には、ＲｂはまたＣＤＫ２／サイクリンＥによってもリン酸化および不活性化を受け、最近の知見は、ＣＤＫ２／サイクリンＥはＲｂリン酸化とは独立な並列経路を通じてもＳ期への進行を調節できるということを示している（Ｌｕｋａｓ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｄｅｖ．， ｖｏｌ． １１ （１９９７）， ｐｐ． １４７９−１４９２を参照）。
【０００６】
ＣＤＫ４／サイクリンＤおよびＣＤＫ２／サイクリンＥの働きによって達成されるＧ１からＳ期への進行は、負および正の両方の増殖調節機構の多様性に従属している。有糸分裂促進剤のような増殖刺激は、サイクリンＤ１の合成の増加およびそれによる機能性ＣＤＫ４の増加を引き起こす。これに対し、ＤＮＡ損傷、または内因性阻害タンパク質の誘導による負の増殖刺激、に応答して、細胞増殖は負の調節を受けうる。これらの、自然発生的なタンパク質阻害因子としては、ｐ２１ＷＡＦ１／ＣＩＰ１、ｐ２７ＫＩＰ１、およびｐ１６ＩＮＫ４ファミリーを含み、最後のものは専らＣＤＫ４を阻害する（Ｈａｒｐｅｒ， Ｃａｎｃｅｒ Ｓｕｒｖ．， ｖｏｌ． ２９ （１９９７）， ｐｐ． ９１−１０７を参照）。この制御系における異常、特にＣＤＫ４およびＣＤＫ２の機能に影響する異常は、家族性黒色腫、食道癌、膵臓癌のような悪性腫瘍に特徴的な、高度に増殖性の状態への細胞の進行に関与している（例えば、Ｈａｌｌ ａｎｄ Ｐｅｔｅｒｓ， Ａｄｖ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．， ｖｏｌ． ６８ （１９９６）， ｐｐ． ６７−１０８およびＫａｍｂ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ｖｏｌ． ２６４ （１９９４）， ｐｐ． ４３６ ４４０を参照）。サイクリンＤ１の過剰発現は、食道癌、乳癌、および扁平上皮細胞癌に関係している（例えば、Ｄｅｌ Ｓａｌ ｅｔ ａｌ．， Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖ． Ｏｎｃｏｇｅｎｅｓｉｓ， ｖｏｌ． ７１ （１９９６）， ｐｐ． １２７−１４２を参照）。家族性黒色腫、神経膠腫、白血病、肉腫、並びに膵臓癌、非肺小細胞癌、頭部および頸部癌においては、ｐ１６ファミリーのＣＤＫ４特異的阻害因子をエンコードしている遺伝子は頻繁に欠失および変異を有している（Ｎｏｂｏｒｉ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ， ｖｏｌ． ３６８ （１９９４）， ｐｐ． ７５３−７５６を参照）。
【０００７】
サイクリンＥの増幅および／または過剰発現はまた、広範な固形癌において観察されており、上昇したサイクリンＥレベルは悪い予後と相関がある。加えて、乳癌、大腸癌、および前立腺癌においては、ＣＤＫ２／サイクリンＥの基質および阻害因子の双方として機能している、ＣＤＫ阻害因子ｐ２７の細胞レベルが異常に低く、ｐ２７の発現レベルは疾患の段階と逆相関している（Ｌｏｄａ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ， ｖｏｌ． ３ （１９９７）， ｐｐ． ２３１−２３４を参照）。最近、Ｓｈｅｒｒ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．， ｖｏｌ． １３ （１９９９）， ｐｐ． １５０１−１５１２において検討されたように、ＣＤＫ４／サイクリンＤがｐ２７を阻害しているかもしれないという証拠がある。ｐ２１タンパク質はまた、ｐ５３癌抑制シグナルをＣＤＫに伝達しているようであり、このことから、ヒトの全ての癌のおよそ半数において、ｐ５３の変異は間接的にＣＤＫ活性の抑制を解除する結果となっているのかもしれない。
【０００８】
ＣＤＫ、並びに特にＣＤＫ４およびＣＤＫ２の阻害剤は、抗増殖治療剤として有用である。ある種の生体分子がこの目的のために提案されている。例えば、Ｘｉｏｎｇらに対する米国特許第５，６２１，０８２号は、ＣＤＫ６の阻害因子をエンコードする核酸を開示しており、国際公開ＷＯ９９／０６５４０号は同様に、ＣＤＫの阻害剤を開示している。ペプチド性およびペプチド類似性阻害剤はまた、欧州特許公報第０６６６２７０　Ａ２号； Ｂａｎｄａｒａ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．， ｖｏｌ． １５ （１９９７）， ｐｐ． ８９６−９０１；およびＣｈｅｎ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ｖｏｌ． ９６ （１９９９）， ｐｐ． ４３２５−４３２９に記載されている。ペプチドアプタマーはＣｏｈｅｎ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ｖｏｌ． ９５ （１９９８）， ｐｐ． １４２７２−１４２７７において同定され、種々の小分子が、最近ＣＤＫの阻害剤として同定されている（最近のレビューとして、Ｗｅｂｓｔｅｒ， Ｅｘｐ． Ｏｐｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． Ｄｒｕｇｓ， ｖｏｌ． ７ （１９９８）， ｐｐ． ８６５−８８７およびＳｔｏｖｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． ｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃ． ａｎｄ Ｄｅｖｅｌ．， ｖｏｌ． ２ （１９９９）， ｐｐ． ２７４−２８５を参照）。
【０００９】
フラボン、フラボピリドールは、他のキナーゼ以上にＣＤＫの阻害に対して適度な選択性を示すが、ＣＤＫ４、ＣＤＫ２、およびＣＤＫ１を０．１−０．３μＭのＩＣ５０で同等に阻害する。フラボピリドールは現在、腫瘍化学療法として臨床試験中である（Ｓｅｄｌａｃｅｋ ｅｔ ａｌ．， Ｉｎｔ． Ｊ． Ｏｎｃｏｌ．， ｖｏｌ． ９ （１９９６）， ｐｐ． １１４３−１１６８）。フラボピリドールの類似体は、他の刊行物、例えば、Ｍａｎｓｕｒｉらに対する米国特許第５，７３３，９２０号（国際公開ＷＯ９７／１６４４７号も参照）並びに、国際公開ＷＯ９７／４２９４９号およびＷＯ９８／１７６６２号の対象である。Ｓｃｈｏｗ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｏｒｇ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． Ｌｅｔｔ．， ｖｏｌ． ７ （１９９７）， ｐｐ． ２６９７−２７０２； Ｇｒａｎｔ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ａｍｅｒ． Ａｓｓｏｃ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，． ｖｏｌ． ３９ （１９９８）， Ａｂｓｔ． １２０７； Ｌｅｇｒａｖｅｎｄ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｏｒｇ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． Ｌｅｔｔ．， ｖｏｌ． ８ （１９９８）， ｐｐ． ７９３−７９８； Ｇｒａｙ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ｖｏｌ． ２８１ （１９９８）， ｐｐ． ５３３−５３８； Ｃｈａｎｇ， ｅｔ ａｌ．， Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ＆ Ｂｉｏｌｏｇｙ， ｖｏｌ． ６ （１９９９）， ｐｐ． ３６１−３７５；並びに、国際公開ＷＯ９９／０２１６２号、ＷＯ９９／４３６７５号，およびＷＯ９９／４３６７６号においては、プリンを基礎とする誘導体を用いたＣＤＫの阻害の結果が記載されている。
【００１０】
さらに、以下の刊行物は、サイクリン依存性キナーゼおよび増殖因子媒介性キナーゼを阻害するある種のピリミジンを開示している：国際公開ＷＯ９８／３３７９８号；Ｒｕｅｔｚ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ａｍｅｒ． Ａｓｓｏｃ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，． ｖｏｌ． ３９ （１９９８）， Ａｂｓｔ． ３７９６；およびＭｅｙｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ａｍｅｒ． Ａｓｓｏｃ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．， ｖｏｌ． ３９ （１９９８）， Ａｂｓｔ． ３７９４。Ｇ１における細胞を阻害するある種のベンゼンスルホンアミドがＯｗａ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ．， ｖｏｌ． ４２ （１９９９）， ｐｐ． ３７８９−３７９９に記載されている。オキシインドールＣＤＫ阻害剤がＬｕｚｚｉｏ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ａｍｅｒ． Ａｓｓｏｃ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． （１９９９）， Ａｂｓｔ． ４１０２、および国際公開ＷＯ９９／１５５００号に記載されている。パウロンもまた、Ｓｃｈｕｌｔｚ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． （１９９９） ｐｐ． ２９０９−２９１９によって記載されている。インデノピラゾールは、国際公開ＷＯ９９／１７７６９号におよびＳｅｉｔｚ ｅｔ ａｌ， ２１８ｔｈ ＡＣＳ Ｎａｔｌ． Ｍｔｇ． （Ａｕｇ． ２２−２６， １９９９， Ｎｅｗ Ｏｒｌｅａｎｓ）， Ａｂｓｔ． ＭＥＤＩ ３１６により記載されている。アミノチアゾールは、国際公開ＷＯ９９／２４４１６号およびＷＯ９９／２１８４５号に記載されている。イソチアゾール誘導体は、ＷＩＰＯ公開ＷＯ９９／６２８０号に記載されている。プロテインキナーゼのピラゾール阻害剤は、ＷＩＰＯ公開ＷＯ９６／１４８４３号に記載されている。ピラゾール−４−オン類似体は、ＷＩＰＯ公開ＷＯ９９／５４３０８号に記載されている。プロテインチロシンキナーゼｐ５６１ｃｋの阻害剤としての５−アミノピラゾールがＷＩＰＯ公開ＷＯ９７／４００１９号に記載されている。
【００１１】
ピラゾール−チアゾール環系のいくつかの例は、当該分野においては知られている。例えば、Ｓｉｎｇｈらは、以下に実施例１として示される、３−アルキル−５−アルキルアミノタウロマーである、フェニル−（３−フェニル−２，６，−ジヒドロ−ピラゾロ［３，４−ｄ］チアゾール−５−イリデン）−アミンを記載している（Ｓｉｎｇｈ， Ｒ．Ｖ．Ｋ． ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｉｎｄ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ．， ｖｏｌ． ６８， ｐｐ． １６７−１６８ （１９９１）およびＳｉｎｇｈ， Ｒ．Ｖ．Ｋ．， Ｊ． Ｉｎｓｔ． Ｃｈｅｍ． （Ｉｎｄｉａ）， ｖｏｌ． ６４， ｐｐ． ５５−５８ （１９９２）を参照）。５−アクリルアミノ置換体は、Ｅｉｌｉｎｇｓｆｅｌｄ， Ｈ．らによって、ドイツ国特許公報ＤＥ２４２９１９５号（１９７４年６月１８日）に記載されている。３，３ａ−ジヒドロ−ピラゾロ［４，５ｄ］−チアゾールは、Ｉｓｍａｉｌらによって記載されており（Ｃｈｅｍ． Ｐａｐｅｒｓ， ｖｏｌ． ５１， ｐｐ． ４３−４７ （１９９７））、以下に実施例２として示される。
【００１２】
【化１０】
2004505983.tif 000002
【００１３】
上記の刊行物は、これらの化合物をサイクリンまたはＣＤＫの阻害剤としては記載していない。
【００１４】
したがって、しかしながら、容易に合成することができ、一または複数のＣＤＫまたはＣＤＫ／サイクリン複合体の強力な阻害剤である他の小分子化合物についてはまだ要求がある。ほとんどの細胞において、ＣＤＫ４は細胞分裂の一般的な活性化剤として機能することができ、ＣＤＫ４／サイクリンＤおよびＣＤＫ２／サイクリンＥの複合体は細胞周期の初期Ｇ１期を支配しているので、一または複数のタイプの腫瘍を治療するために、ＣＤＫ４および／またはＣＤＫ２の効果的および特異的な阻害剤が要求されている。
【００１５】
発明の要約
したがって、本発明の一つの目的は、ＣＤＫ２、ＣＤＫ４、および／またはＣＤＫ６のような一または複数のＣＤＫ、またはこれらのサイクリン複合体の活性を阻害する化合物および医薬組成物を得ることである。さらなる目的は、ＣＤＫ４もしくはＣＤＫ４／Ｄ−タイプサイクリン複合体および／またはＣＤＫ２もしくはＣＤＫ２／Ｅ−タイプサイクリン複合体の阻害を通じてのように好ましくは選択的に、ＣＤＫの阻害を通じての効果的な癌適応症の治療方法を提供することである。もう一つの目的は、癌細胞の増殖期への移行を阻害するのに効果的な化合物を含有する医薬組成物を達成することである。これらのおよび他の本発明の目的および利点は、詳細な記述を考慮して、並びに本発明の実施およびその様々な実施形態を通して明らかになるであろう。
【００１６】
一つの一般的な態様において、本発明は式Ｉ：
【００１７】
【化１１】
2004505983.tif 000003
【００１８】
式中：
Ｒ１は置換または非置換アルキル、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキル、またはヘテロシクロアルキル基であり；および
Ｒ２は置換または非置換アルキル、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキル、またはヘテロシクロアルキル基であり、ただし、Ｒ１およびＲ２の双方が非置換フェニルではない；
の化合物、または該化合物の薬剤学的に許容できる塩、多重結合体、プロドラッグ、もしくは薬理学的活性代謝物、または該代謝物の薬剤学的に許容できる塩、である細胞周期調節剤に関する。
【００１９】
他の一般的な態様において、本発明は式ＩＩ：
【００２０】
【化１２】
2004505983.tif 000004
【００２１】
式中：
Ｒ２は上で定義された通りであり；および
各Ｒ３は独立して水素もしくはハロゲン、または置換もしくは非置換アルキル、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキル、もしくはヘテロシクロアルキル基であり、ただし、Ｒ２が非置換フェニルのとき、Ｒ３は全て水素ではない；
の細胞周期調節剤、またはこれらの薬剤学的に許容される塩、多重結合体、プロドラッグ、もしくは薬理学的に活性な代謝物、または該代謝物の薬剤学的に許容される塩に関する。
【００２２】
他の一般的な態様において、本発明は式ＩＩａ：
【００２３】
【化１３】
2004505983.tif 000005
【００２４】
式中：
Ｒ２およびＲ３は上で定義された通りであり；および
Ｒ３’は水素、ハロゲン、または置換もしくは非置換アルキル、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキル、もしくはヘテロシクロアルキル基であり、ただし、Ｒ２が非置換フェニルのとき、Ｒ３およびＲ３’の双方は水素ではない；
の細胞周期調節剤、またはこれらの薬剤学的に許容される塩、多重結合体、プロドラッグ、もしくは薬理学的に活性な代謝物、または該代謝物の薬剤学的に許容される塩に関する。
【００２５】
他の一般的な態様において、本発明は、各々：
（ａ）下記式Ｉ：
【００２６】
【化１４】
2004505983.tif 000006
【００２７】
式中：
Ｒ１は置換または非置換アルキル、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキル、またはヘテロシクロアルキル基であり；および
Ｒ２は置換または非置換アルキル、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキル、またはヘテロシクロアルキル基である；
の化合物、または該化合物の薬剤学的に許容される塩、多重結合体、プロドラッグ、もしくは薬理学的に活性な代謝物、または該代謝物の薬剤学的に許容される塩から選択される細胞周期調節剤；および
（ｂ）薬剤学的に許容される担体
を含む医薬組成物に関する。
【００２８】
さらなる一般的な態様において、本発明は、そのような治療を必要とする患者に対し、本発明の細胞周期調節剤の有効量を投与することにより、ＣＤＫ４および／またはＣＤＫ２の阻害により媒介されるもののように、ＣＤＫの阻害により媒介される疾患または障害の治療方法を提供する。
【００２９】
本発明はさらに、そのような治療を必要とする患者に対し、本発明の細胞周期調節剤の有効量を投与することを含む、悪性腫瘍または癌その他の、好ましくない血管形成および／または細胞増殖に関連する疾患状態、並びに真菌感染を治療する方法を提供する。
【００３０】
本発明はまた、本発明の細胞周期調節剤を患者に投与することにより、ＣＤＫ複合体のキナーゼ活性を調節および／または阻害する方法を提供する。さらに、本発明は、癌並びに、糖尿病性網膜症、緑内障、リウマチ様関節炎、再狭窄、および乾癬のような好ましくない血管形成および／または細胞増殖に関連する他の疾患状態のような、キナーゼ活性により媒介される疾患の治療における本発明の医薬組成物の治療上の用途にも関する。
【００３１】
発明の詳細な説明および好ましい実施形態
本明細書で用いられる「細胞周期調節剤」の語は、本発明の化合物（例えば、式Ｉ、式ＩＩおよび式ＩＩａの）、さらに該化合物の薬剤学的に許容される塩、多重結合体、プロドラッグ、または薬理学的に活性な代謝物、並びに該代謝物の薬剤学的に許容される塩を示している。
【００３２】
本明細書で用いられる「アルキル」および「アルキル基」の語は、好ましくは１〜１４の炭素原子を有する、炭素および水素原子の、飽和または不飽和の直鎖または分枝状鎖を示している。典型的なアルキル基は、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、イソペンチル、ｔｅｒｔ−ペンチル、ヘキシル、イソヘキシルなどを含む。「低級アルキル：および「低級アルキル基」の語は、鎖中に１〜４の炭素原子を有するアルキルを示している。該アルキルは、一または複数の、以下で定義される置換基により置換されていても、また、非置換であってもよい。典型的な置換アルキル基は、フルオロメチル、ジフルオロメチル、トリフルオロメチル、２−フルオロエチル、３−フルオロプロピル、ヒドロキシメチル、２−ヒドロキシエチル、３−ヒドロキシプロピルなどを含む。適当なアルキル基が、Ｒ１および／またはＲ２および／またはＲ３および／またはＲ３’として用いられ得る。
【００３３】
本明細書で用いられる「シクロアルキル」および「シクロアルキル基」の語は、３〜１４の炭素原子を有する、飽和および不飽和の単環および多環の炭素環構造を示している　典型的なシクロアルキルは、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、ナフチルなどを含む。該シクロアルキルは、一または複数の、以下で定義される置換基により置換されていても、また、非置換であってもよく、一または複数の、それ自身が一または複数の置換基により置換されているまたは非置換のヘテロシクロアルキル基、アリール基、またはヘテロアリール基に連結していてもよい。
【００３４】
本明細書で用いられる「ヘテロシクロアルキル」および「ヘテロシクロアルキル基」の語は、３〜１８の環原子を有し、少なくとも一つの、好ましくは１〜５の、窒素、酸素、および硫黄から選択されるヘテロ原子を含む、飽和および不飽和の単環および多環の炭素環構造を示している。典型的なヘテロシクロアルキルは、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロピラニル、アゼチジニル、ピロリジニル、ピペリジニル、ピペラジニル、チアジニル、モルフォリニルなどを含む。該へテロシクロアルキルは、単環、二環、または三環であってもよく、一または複数の、以下で定義される置換基により置換されていても、また、非置換であってもよい。該ヘテロシクロアルキルはまた、一または複数の、それ自身が一または複数の置換基により置換されているまたは非置換のシクロアルキル基、アリール基、またはヘテロアリール基に連結していてもよい。
【００３５】
本明細書で用いられる「アリール」および「アリール基」の語は、６、１０、１４、または１８の炭素環原子を有する単環または多環の芳香族環構造を示している。該アリールは、一または複数の、以下で定義される置換基により置換されていても、また、非置換であってもよく、一または複数の、それ自身が一または複数の置換基により置換されているまたは非置換のシクロアルキル基、ヘテロシクロアルキル基、またはヘテロアリール基に連結していてもよい。
【００３６】
本明細書で用いられる「ヘテロアリール」および「ヘテロアリール基」の語は、４〜１８の環原子を有し、１〜５の、窒素、酸素、および硫黄から選択されるヘテロ原子を含む、単環または多環の、不飽和または芳香族環構造を示している。該ヘテロアリールは、一または複数の、以下で定義される適当な置換基により置換されていても、また、非置換であってもよく、一または複数の、それ自身が一または複数の適当な置換基により置換されているまたは非置換のシクロアルキル基、ヘテロシクロアルキル基、またはアリール基に連結していてもよい。
【００３７】
芳香族環構造の例としては、フェニル、ナフチル、１，２，３，４−テトラヒドロナフチル、フリル、チエニル、ピロリル、ピリジル、ピリジニル、ピラゾリル、イミダゾリル、ピラジニル、ピリダジニル、１，２，３−トリアジニル、１，２，４−オキサジアゾリル、１，３，４−オキサジアゾリル、１−Ｈ−テトラゾール−５−イル、インドリル、キノリニル、ベンゾチオフェニル（チアナフテニル）、フラニル、チオフェニル、イミダゾリル、オキサゾリル、イソキサゾリル、チアゾリル、トリアゾリル、テトラゾリル、イソキノリニル、アクリジニル、ピリミジニル、ベンズイミダゾリル、ベンゾフラニルなどを含む。
【００３８】
本発明という面においては、該アリール、ヘテロアリール、シクロアルキル、およびヘテロシクロアルキル基は、単環または多環と連結していてもまたは連結していなくてもよい。適当なアリール、ヘテロアリール、シクロアルキルまたはヘテロシクロアルキル基が、Ｒ１および／またはＲ２および／またはＲ３および／またはＲ３’として用いられ得る。
【００３９】
特定の基が置換されている場合、置換基は：ハロゲン（クロロ、ヨード、ブロモ、またはフルオロ）；Ｃ１−６−アルキル；Ｃ１−６−アルケニル；Ｃ１−６−アルキニル；ヒドロキシル；Ｃ１−６−アルコキシル；アミノ；ニトロ；チオール；チオエーテル；イミン；シアノ；アミド；ホスホネート；ホスフィン；カルボキシル；チオカルボニル；スルホニル；スルホンアミド；ケトン；アルデヒド；エステル；酸素（＝Ｏ）；ハロアルキル（例えば、トリフルオロメチル）；単環または連結もしくは非連結の多環のシクロアルキル（例えば、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、またはシクロヘキシル）、または、単環または連結もしくは非連結の多環のヘテロシクロアルキル（例えば、ピロリジニル、ピペリジニル、ピペラジニル、モルフォリニル、またはチアジニル）；単環または連結もしくは非連結の多環のアリールまたはヘテロアリール（例えば、フェニル、ナフチル、ピロリル、インドリル、フラニル、チオフェニル、イミダゾリル、オキサゾリル、イソキサゾリル、チアゾリル、トリアゾリル、テトラゾリル、ピラゾリル、ピリジニル、キノリニル、イソキノリニル、アクリジニル、ピラジニル、ピリダジニル、ピリミジニル、ベンズイミダゾリル、ベンゾチオフェニル、またはベンゾフラニル）；アミノ（１級、２級、または３級）；ニトロ；チオール；チオエーテル、Ｏ−（Ｃ１−６−アルキル）；Ｏ−アリール、アリール；アリール−（Ｃ１−６−アルキル）；ＣＯ２ＣＨ３；ＣＯＮＨ２；ＯＣＨ２ＣＯＮＨ２；ＮＨ２；ＳＯ２ＮＨ２；ＯＣＨＦ２；ＣＦ３；ＯＣＦ３；などから選択することができる。このような部分はまた、必要であれば、例えばＯＣＨ２−Ｏのような、連結環構造または架橋によって置換されていてもよい。これらの置換基は、必要であれば、上記で例示された置換基から選択される置換基によってさらに置換されていてもよい。Ｒ１および／またはＲ２および／またはＲ３および／またはＲ３’基は、置換されていなくても、または所望の置換基により置換されていてもよい。
【００４０】
式Ｉの化合物の一つの好ましい実施形態において、Ｒ１およびＲ２は、異なるアリール、ヘテロアリール、シクロアルキルおよびヘテロシクロアルキル基となるように選択される。
【００４１】
特に好ましいＲ１部分は、非置換および置換アリール基、より好ましくは、置換および非置換フェニル基である。さらにより好ましくは、Ｒ１は非置換フェニルまたは２，６−ジフルオロフェニルである。
【００４２】
特に好ましいＲ２部分は、非置換または置換フェニル基のような非置換および置換アリール基である。例えば、カルボキシル、アミド、ＳＯ２ＮＨ２、ヘテロアリールおよびヘテロ環基から選択される置換基により、パラ位において置換されているフェニル基が特に好ましく；フェニル基に対する他の典型的な置換基は、下記の例のものを含む。他の特に好ましいＲ２部分は、４−（１，４−ピペルジン−１−イル）−フェニル、４−スルホンアミドフェニル、および４−メトキシフェニルを含む。
【００４３】
特に好ましい式ＩＩの化合物は、下記に表される表Ａ中の式ＩＩａにより代表されるものである。
【００４４】
式ＩＩの好ましい実施形態において、少なくとも一つのＲ３はフッ素、塩素、臭素またはヨウ素のようなハロゲンであり、好ましくはオルト位においてである。より好ましくは、一つのＲ３部分は水素であり、他の２つのＲ３基、好ましくはオルト位において、は独立してフッ素および水素から選択される。
【００４５】
式Ｉ、ＩＩまたはＩＩａの化合物は、互変異性の現象を示すかもしれないが、式ではあり得る互変異性型の一つのみを特に記載している。したがって、記載された構造の互変異性型をもまた、式は表すことを意図されており、本発明はその互変異性型を包含するということは理解されるだろう。式Ｉの典型的な互変異性体は以下に記載されており、ここで水素は互いにピラゾール環の各々の窒素に属しており（すなわち、互変異性体１および４）、そしてチアゾール環上、または環外の置換基窒素上のいずれかに属している（すなわち、互変異性体１および３）。これらのどの互変異性体も様々な様式でキナーゼと水素結合することができる。
【００４６】
【化１５】
2004505983.tif 000007
【００４７】
本発明の化合物のいくつかは、単一の立体異性体（すなわち、他の立体異性体が実質的に存在しない）、ラセミ体、並びに／またはエナンチオマーおよび／もしくはジアステレオマーの混合物として存在することができる。このような単一の立体異性体、ラセミ体およびこれらの混合物は、すべて本発明の範囲内であると意図されている。好ましくは、光学活性な本発明の化合物は光学的に純粋な形で用いられる。
【００４８】
当業者によって一般に理解されるように、一つのキラル中心（すなわち、一つの不斉炭素原子）を有する光学的に純粋な化合物は、実質的に、二つの可能なエナンチオマーのうちの一つからなる（すなわち、エナンチオ的に純粋である）ものであり、二以上のキラル中心を有する光学的に純粋な化合物は、ジアステレオ的に純粋およびエナンチオ的に純粋の双方であるものである。好ましくは、本発明の化合物は、少なくとも９０％の光学純度の形、すなわち、単一の異性体を少なくとも９０％（８０％エナンチオマー過剰（「ｅ．ｅ．」）またはジアステレオマー過剰（「ｄ．ｅ．」））、より好ましくは少なくとも９５％（９０％ｅ．ｅ．またはｄ．ｅ．）、さらにより好ましくは少なくとも９７．５％（９５％ｅ．ｅ．またはｄ．ｅ．）、および最も好ましくは少なくとも９９％（９８％ｅ．ｅ．またはｄ．ｅ．）、含有する形で使用される。
【００４９】
さらに、式Ｉ、ＩＩまたはＩＩａは、同定された構造の溶媒和および非溶媒和型を含むことを意図されている。例えば、式Ｉ、ＩＩおよびＩＩａは、示された構造の化合物の水和および非水和型双方を含む。溶媒和の他の例は、イソプロパノール、エタノール、メタノール、ＤＭＳＯ、酢酸エチル、酢酸、またはエタノールアミンと結合した構造を含む。
本発明に係る医薬組成物は、式Ｉ、ＩＩまたはＩＩａの化合物、該化合物の薬剤学的に許容される塩、多重結合体、プロドラッグ、および薬理学的に活性な代謝物、並びに該代謝物の薬剤学的に許容される塩、から選択される活性成分を含む。このような化合物、塩、多重結合体、プロドラッグ、および代謝物は、ここでは時に一くくりにして「細胞周期調節剤」と称される。
【００５０】
本発明の細胞周期調節剤は、細胞周期のＧ０またはＧ１期において活性な、例えば、ＣＤＫ２、ＣＤＫ４、および／またはＣＤＫ６複合体のような、ＣＤＫ／サイクリン複合体のキナーゼ活性を阻害する。一つの好ましい実施形態において、本発明の細胞周期調節剤は、ＣＤＫ４またはＣＤＫ４／Ｄタイプサイクリン複合体に対し約５μＭ以下、より好ましくは約１μＭ以下、より好ましくは約５００ｎＭ以下、さらにより好ましくは約２００ｎＭ以下の阻害定数を有する。他の好ましい実施形態において、該細胞周期調節剤は、ＣＤＫ２またはＣＤＫ２／Ｅタイプサイクリン複合体に対し約５μＭ以下、より好ましくは約１μＭ以下、より好ましくは約５００ｎＭ以下、さらにより好ましくは約２００ｎＭ以下、さらにより好ましくは約１００ｎＭ以下の阻害定数を有する。
【００５１】
「薬剤学的に許容される塩」は、当該化合物の遊離酸および塩基の生物学的有効性を保持し、生物学的に、またはその他の点においても好ましい塩を意味することを意図されている。本発明の化合物は、充分に酸性、充分に塩基性、または双方の官能基を有していてもよく、よって多くの無機もしくは有機塩基、または無機および有機酸のいずれかと反応し、薬剤学的に許容できる塩を形成してもよい。典型的な薬剤学的に許容できる塩は、硫酸塩、ピロ硫酸塩、重硫酸塩、亜硫酸塩、重亜硫酸塩、リン酸塩、一水素リン酸塩、二水素リン酸塩、メタリン酸塩、ピロリン酸塩、塩化物、臭化物、ヨウ化物、酢酸塩、プロピオン酸塩、デカン酸塩、カプリル酸塩、アクリル酸塩、ギ酸塩、イソ酪酸塩、カプロン酸塩、へプタン酸塩、プロピオレート、シュウ酸塩、マロン酸塩、コハク酸塩、スベリン酸塩、セバシン酸塩、フマル酸塩、マレイン酸塩、ブチン−１，４−ジオエート、へキシン−１，６−ジオエート、安息香酸塩、クロロ安息香酸塩、メチル安息香酸塩、ジニトロ安息香酸塩、ヒドロキシ安息香酸塩、メトキシ安息香酸塩、フタル酸塩、スルホン酸塩、キシレンスルホン酸塩、フェニル酢酸塩、フェニルプロピオン酸塩、フェニル酪酸塩、クエン酸塩、乳酸塩、γ−ヒドロキシ酪酸塩、グリコール酸塩、酒石酸塩、メタン−スルホン酸塩、プロパンスルホン酸塩、ナフタレン−１−スルホン酸塩、ナフタレン−２−スルホン酸塩、およびマンデル酸塩を含む塩のような、本発明の化合物の、無機もしくは有機酸または無機塩基との反応により調製される塩を含む。
【００５２】
「多重結合体」の語は、式Ｉの化合物の活性型の多価または多重結合型を示す。このような「多重結合体」は、例えば担体部分により提供される骨格を用いて、複数の活性化合物のコピーをお互いに近接して連結または配置することにより合成することができる。受容体結合に関して最適な大きさの多重結合体に到達するために、様々な寸法の多重結合体（すなわち、様々な活性化合物のコピー数を有する）を試験することができる。受容体結合部分間の最適な間隔を有するこのような活性受容体結合化合物の多重結合型を提供することで、受容体結合を増強することができる（例えば、Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍ．， １９８４， ２３：４２５５を参照）。熟練者によれば、適当な担体部分またはリンカー単位を選択することにより、多重性および間隔を制御することができる。有用な部分には、本発明の活性化合物に関連する官能基と反応し得る官能基の多様性を有する分子支持体を含む。ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）またはＨＳＡ（ヒト血清アルブミン）のようなタンパク質、ペンタペプチド、デカペプチド、ペンタデカペプチドのようなペプチドなど、および、吸収性、輸送、および標的生物内での持続性における有利な効果により選択される非生物学的化合物を含む、高度に活性な多重結合体を構築するために、多様な担体部分を用いることができる。アミノ、スルフヒドリル、ヒドロキシル、およびアルキルアミノ基、のような担体部分上の官能基は、本発明の化合物に対する安定な結合、固定化化合物間の最適な間隔、および最適な生物学的特性が得られるように選択することができる。
【００５３】
「プロドラッグ」の語は、患者に投与される際には不活性であってもよいが、生理的条件下もしくは加溶媒分解によって特定の化合物またはそのような化合物の薬剤学的に許容される塩に変換される、特定の化合物の代謝前駆体、を示す。
【００５４】
「活性代謝物」の語は、特定の化合物またはその塩の体内での代謝により生成される薬理学的に活性な生成物を意味することを意図されている。
【００５５】
式Ｉ、ＩＩまたはＩＩａの化合物のプロドラッグおよび活性代謝物は、当該分野において知られている汎用技術を用いて同定することができる。例えば、Ｂｅｒｔｏｌｉｎｉ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ．， ４０， ２０１１−２０１６ （１９９７）；Ｓｈａｎ， ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｐｈａｒｍ． Ｓｃｉ．， ８６ （７）， ７６５−７６７；Ｂａｇｓｈａｗｅ， Ｄｒｕｇ Ｄｅｖ． Ｒｅｓ．， ３４， ２２０−２３０ （１９９５）；Ｂｏｄｏｒ， Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｄｒｕｇ Ｒｅｓ．， １３， ２２４−３３１ （１９８４）；Ｂｕｎｄｇａａｒｄ， Ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ Ｐｒｏｄｒｕｇｓ （Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｐｒｅｓｓ １９８５）；およびＬａｒｓｅｎ， Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｏｄｒｕｇｓ， Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ （Ｋｒｏｇｓｇａａｒｄ−Ｌａｒｓｅｎ ｅｔ ａｌ．， ｅｄｓ．， Ｈａｒｗｏｏｄ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ， １９９１）を参照。
【００５６】
本発明の化合物が塩基の場合、好ましい薬剤学的に許容される塩は、当該分野において利用可能な適当な方法、例えば、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸などの無機酸による、または酢酸、マレイン酸、コハク酸、マンデル酸、フマル酸、マロン酸、ピロビン酸、シュウ酸、グリコール酸、サリチル酸、グルクロン酸もしくはガラクツロン酸のようなピラノシド酸、クエン酸もしくは酒石酸のようなアルファヒドロキシ酸、アスパラギン酸もしくはグルタミン酸のようなアミノ酸、安息香酸もしくはケイ皮酸のような芳香族酸、ｐ−トルエンスルホン酸もしくはエタンスルホン酸のようなスルホン酸などの有機酸による当該遊離塩基の処置によって調製することができる。
【００５７】
本発明の化合物が酸の場合、好ましい薬剤学的に許容される塩は、どのような適当な方法、例えば、アミン（一級、二級もしくは三級）、アルカリ金属水酸化物またはアルカリ土類金属水酸化物などのような無機または有機塩基による当該遊離酸の処置によって調製することができる。適当な塩を説明する例としては、グリシンおよびアルギニンのようなアミノ酸、アンモニア、一級、二級、および三級アミン、並びにピペリジン、モルフォリンおよびピペラジンのような環状アミン、由来の有機塩、あるいは、ナトリウム、カルシウム、カリウム、マグネシウム、マンガン、鉄、銅、亜鉛、アルミニウムおよびリチウム由来の無機塩を含む。
【００５８】
固体である薬剤の場合、本発明の化合物および塩は、異なる結晶または多形として存在することができ、いずれも本発明の範囲内であることが意図されているということは当業者によって理解される。
【００５９】
本発明に係る細胞周期調節剤は、哺乳動物、好ましくはヒトにおいて、内因性組織の好ましくない増殖によって特徴づけられる増殖性疾患の治療のための薬剤として有用である。式Ｉ、ＩＩおよびＩＩａの化合物は、例えば、癌、乾癬、白血球の好ましくない増殖を含む免疫疾患、並びに、再狭窄および他の平滑筋疾患のような過剰な細胞増殖に関連する疾患を有する患者を治療するために用いられ得る。さらに、このような化合物は、分裂後組織および／または細胞の脱分化を防止するために用いられ得る。
【００６０】
本発明の医薬組成物または製剤は、薬剤学的に許容される担体、および有効量の、少なくとも一つの細胞周期調節剤を含む。治療または阻害効果を得るために投与される細胞周期調節剤の具体的な投与量は、例えば、投与される特定の薬剤、投与経路、治療される状態、および、治療される患者または宿主を含む、その場合の周囲の特定の状況に従って、本技術分野において知られている方法により決定することができる。単独または複数回で投与され得る、細胞周期調節剤の典型的な合計一日投与量は、約０．０１ｍｇ／ｋｇ体重から約５０ｍｇ／ｋｇ体重の投与量レベルを含む。
【００６１】
本発明の細胞周期調節剤は、経口、経直腸、経皮、皮下、静脈内、筋肉内、または鼻腔内のような様々な適当な経路のいずれによっても投与され得る。前記細胞周期調節剤は、投与前に、所望の経路に適当な組成物として配合されることが好ましい。
【００６２】
本発明に係る医薬組成物または製剤は、有効量の細胞周期調節剤および該薬剤のための希釈剤または賦形剤のような薬剤学的に許容できる担体を含む。前記担体が希釈剤として機能する場合、活性成分の媒介物、賦形剤、または媒体として働く固形、半固形、または液状の物質であってもよい。本発明に係る組成物は、活性成分を、担体と混合することにより、または担体で希釈することにより、または担体中に封入もしくはカプセル化し、カプセル剤、サッシェ剤、もしくは紙容器の形状にすることなどにより調製することができる。一または複数の細胞周期調節剤およびその他の活性成分の他に、典型的な成分としては、アヴィセル（微結晶性セルロース）、デンプン、乳糖、硫酸カルシウム二水和物、石膏、ショ糖、タルク、ゼラチン、寒天、ペクチン、アラビアゴム、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、ピーナッツ油、オリーブ油、モノステアリン酸グリセリン、トゥイーン８０（ポリソルベート８０）、１，３−ブタンジオール、カカオ脂、ミツロウ、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、モノステアリン酸ソルビタン、ポリソルベート６０、２−オクチルドデカノール、ベンジルアルコール、グリシン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、リン酸水素二ナトリウム、塩化ナトリウム、および水を含む。
【００６３】
前記組成物は、所望の投与形態に適当な多様な形状のいずれにも調製され得る。例えば、医薬組成物は、錠剤、丸剤、散剤、口内錠剤、サッシェ剤、カシェ剤、エリキシル剤、懸濁剤、乳剤、水剤、シロップ剤、エアロゾル剤（固体としてまたは溶媒中）、軟膏剤（例えば、細胞周期調節剤を１０質量％まで含有する）、ソフトゲルおよびハードゲルカプセル剤、坐剤、滅菌注射液、滅菌封入散剤などの形状に調製され得る。
【００６４】
同様に、前記担体または希釈剤は、モノステアリン酸グリセリンまたはジステアリン酸グリセリン単独またはロウ、エチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、メチルメタクリレートなどと共のような、本技術分野で知られている時間遅延または持効性物質を含んでいてもよい。
【００６５】
多様な薬剤学的形状が用いられ得る。したがって、固体の担体が用いられた場合には、調製は錠剤にするか、散剤もしくはペレットの形状でハードゼラチンカプセル中にまたはトローチもしくは口内錠剤の形状にされうる。固体の担体の量は様々であってよいが、一般的には約２５ｍｇから約１ｇであろう。液体の担体が用いられた場合には、製剤はシロップ剤、乳剤、ソフトゼラチンカプセル、アンプルもしくはバイアル中の滅菌注射液もしくは懸濁剤または非水懸濁液の形状が可能である。
【００６６】
安定に水溶性の投与形態を得るためには、薬剤の薬剤学的に許容できる塩が、０．３Ｍ−コハク酸またはクエン酸溶液のような有機または無機酸の水溶液に溶解される。溶解可能な塩の形態が利用できない場合には、前記薬剤は適当な共溶媒または共溶媒の組み合わせ中に溶解してもよい。適当な共溶媒の例としては、全容積の０〜６０％の範囲の濃度のアルコール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール３００、ポリソルベート８０、グリセリンなどを含む。典型的な実施形態において、式Ｉ、ＩＩまたはＩＩａの化合物は、ＤＭＳＯに溶解され、水で希釈される。前記組成物はまた、水または等張の食塩水もしくはデキストロース溶液のような適切な水性媒体中における活性成分の塩型の溶液の形状であってもよい。
【００６７】
本発明の組成物は、例えば、混合、溶解、顆粒化、糖衣化、研和、乳化、カプセル化、封入または凍結乾燥のような従来の技術を用いる、医薬組成物の調製のために一般的に知られている方法により製造することができる。医薬組成物は、賦形剤および、薬剤学的に用いられ得る製剤への活性成分の加工を促進する添加剤から選択され得る、一または複数の生理学的に許容できる担体を用いて、従来の方法により配合され得る。
【００６８】
特定の配合は、選択される投与経路に依存している。注射のためには、本発明の薬剤は水溶液、好ましくはハンクス液、リンゲル液、またはリン酸緩衝生理食塩水のような生理学的に適合した緩衝液中に配合され得る。経粘膜投与のためには、透過すべき障壁に適切であると本技術分野において知られているものから浸透剤が選択される。
【００６９】
経口投与のためには、本化合物は、活性化合物を、本技術分野において知られている薬剤学的に許容される担体と組み合わせることにより配合することができる。このような担体により、本発明の化合物は、治療される患者による経口摂取のために、錠剤、丸剤、糖衣錠、カプセル剤、液剤、ゲル、シロップ剤、スラリー、懸濁剤などとして配合されることができる。経口使用のための医薬製剤は、固体の添加剤を活性成分（薬剤）と混合して用い、必要であれば得られた混合物を粉砕し、必要であれば錠剤または糖衣錠の核を得るために適当な添加剤を加えた後に顆粒の混合物を加工することにより、得ることができる。適当な添加剤は：乳糖、ショ糖、マンニトール、またはソルビト−ルを含む糖のような増量剤；および、例えばトウモロコシデンプン、コムギデンプン、コメデンプン、バレイショデンプン、ゼラチン、ゴム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチル−セルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、またはポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）のようなセルロース製剤を含む。必要であれば、架橋ポリビニルピロリドン、寒天、もしくはアルギン酸またはアルギン酸ナトリウムのようなこれらの塩、のような崩壊剤を添加してもよい。
【００７０】
糖衣錠の核は適当な被覆とともに提供される。この目的のために、濃縮された糖溶液を用いることができ、必要であればアラビアゴム、ポリビニルピロリドン、カーボポールゲル、ポリエチレングリコール、および／または二酸化チタン、ラッカー溶液、並びに適当な有機溶媒または溶媒混合物を含有していてもよい。識別、または活性薬剤の異なる組み合わせを特徴づけるために、錠剤または糖衣錠の被覆に染料または顔料を添加してもよい。
【００７１】
経口的に投与され得る医薬製剤は、ゼラチンから作られる押し込みばめカプセル、並びに、ゼラチンおよびグリセロールもしくはソルビトールのような可塑剤から作られる軟封入カプセルを含む。前記押し込みばめカプセルは、活性成分を、乳糖のような増量剤、デンプンのような結合剤、および／またはタルクもしくはステアリン酸マグネシウムのような滑沢剤、並びに、必要であれば安定化剤と混合して含んでいてもよい。軟カプセルにおいては、活性薬剤は、脂肪油、流動パラフィン、または流動ポリエチレングリコールのような適当な液体に溶解または懸濁されてもよい。さらに、安定化剤が添加されてもよい。経口投与のための配合は全て、このような投与に適当な量においてなされるべきである。バッカル剤投与のためには、組成物は従来の方法により錠剤または口内錠剤の形状をとってもよい。
【００７２】
経鼻または吸入剤による投与のために、本発明に係る薬剤は、適当な噴射剤、例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素または他の適当な気体を用いて、加圧容器またはネブライザーからのエアロゾル噴霧による提示により簡便に送達することができる。加圧エアロゾルの場合に、投与単位量は、一定量を送達するためのバルブを提供することにより決定してもよい。吸入器または注入器などにおいて使用するゼラチンのカプセルおよびカートリッジは、化合物および、乳糖またはデンプンのような適当な粉末基剤の粉末混合物を含有して配合されてもよい。
【００７３】
前記化合物は、注射による、例えば単回注射または持続注入による非経口投与のために配合されてもよい。注射のための配合は、単位用量の形状で、例えば、アンプル中または複数用量容器中で、保存剤を添加して行ってもよい。前記組成物は、油性または水性媒体中で、懸濁剤、液剤または乳剤のような形状をとってもよく、懸濁化剤、安定化剤、および／または分散剤のような配合剤を含有してもよい。
【００７４】
非経口投与のための医薬製剤は、活性化合物の水溶性型での水性溶液を含む。さらに、活性薬剤の懸濁剤は、適切な油性注射懸濁剤として調製されてもよい。適当な親油性の溶媒または媒体は、ゴマ油、またはオレイン酸エチルもしくはトリグリセリドのような合成脂肪酸エステルのような脂肪油、あるいはリポソームを含む。水性注射懸濁剤は、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、またはデキストランのような、懸濁剤の粘度を増加させる物質を含んでもよい。必要であれば、前記懸濁剤はまた、高濃度溶液を調製するために、適当な懸濁剤または化合物の溶解度を増加させる薬剤をも含んでもよい。
【００７５】
眼に対する投与のためには、式Ｉ、ＩＩまたはＩＩａの化合物は、例えば前眼房、後眼房、硝子体、眼房水、硝子体液、角膜、虹彩／シラリー、水晶体、脈絡膜／網膜およびセレラを含む、眼の角膜および内部領域を該化合物が浸透できるのに十分な時間、該化合物の眼球表面への接触が維持されるような薬剤学的に許容できる点眼用媒体により送達される。薬剤学的に許容できる点眼用媒体は軟膏、植物油、または封入材料であってもよい。本発明の化合物はまた、硝子体および眼房水に直接注入されてもよい。
【００７６】
あるいは、活性成分は、使用前に適当な媒体、例えば無発熱性物質滅菌水、と混合するために粉末状であってもよい。前記薬剤はまた、例えば、カカオ脂または他のグリセリドのような従来の坐薬基剤を含有する座薬または停留浣腸のような経直腸組成物に配合されてもよい。
【００７７】
上記の配合に加えて、前記薬剤はまた、デポー製剤として配合されてもよい。このような長時間作用配合剤は、埋め込み（例えば、皮下にもしくは筋肉内に）によりまたは筋肉内注射により投与されてもよい。したがって、例えば、前記化合物は適当な高分子もしくは疎水性の物質またはイオン交換樹脂と配合されてもよく、あるいは難溶性誘導体として、例えば難溶性塩として、配合されてもよい。
【００７８】
疎水性化合物のための典型的な医薬用担体は、ベンジルアルコール、非極性界面活性剤、水混和性有機高分子、および水相を含む共溶媒系である。該共溶媒系はＶＰＤ共溶媒系であってもよい。ＶＰＤは、無水エタノールでメスアップされた、３％ｗ／ｖベンジルアルコール、非極性界面活性剤であるポリソルベート８０の８％ｗ／ｖ、および６５％ｗ／ｖポリエチレングリコール３００の溶液である。ＶＰＤ共溶媒系（ＶＰＤ：５Ｗ）は、５％デキストロース水溶液で１：１に希釈されたＶＰＤを含む。この共溶媒系は疎水性化合物をよく溶解し、それ自身全身投与の際の毒性が低く；共溶媒系の割合は、その溶解性および毒性特性を損なわずに変化させてもよい。さらに、前記共溶媒構成成分の同一性は変化し得る：例えば、ポリソルベート８０の代わりに、他の低毒性非極性界面活性剤を用いてもよく；ポリエチレングリコールのフラクションサイズは変化してもよく；他の生物学的に適合する高分子、例えばポリビニルピロリドン、がポリエチレングリコールと置き換わってもよく；そして他の糖または多糖がデキストロースと置換されてもよい。
【００７９】
あるいは、疎水性医薬化合物のための他の送達システムが用いられてもよい。リポソームおよび乳剤が、疎水性薬物の送達媒体または担体の知られている例である。ジメチルスルホキシドのようなある種の有機溶媒もまた、通常高い毒性を示すが、用いられてもよい。さらに、前記化合物は、治療薬を含有する固体疎水性高分子の半透性マトリックスのような持続放出システムを用いて送達されてもよい。様々な持続放出物質が確立され、当業者により知られている。化学的性質によるが、持続放出カプセルは数週間から１００日以上にわたって化合物を放出することができる。治療薬の化学的性質および生物学的安定性により、タンパク質安定化のためのさらなる戦略が用いられてもよい。
【００８０】
前記医薬組成物はまた、適当な固相またはゲル相の担体または添加剤を含んでもよい。このような担体または添加剤の例は、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、糖、デンプン、セルロース誘導体、ゼラチン、およびポリエチレングリコールのような高分子を含む。
【００８１】
本発明の化合物のいくつかは、薬剤学的に妥当な対イオンとの塩として提供され得る。薬剤学的に妥当な塩は、塩酸、硫酸、酢酸、乳酸、酒石酸、リンゴ酸、コハク酸などを含む多くの酸と形成され得る。塩は、対応する遊離塩基型よりも、水性または他のプロトン性溶媒に溶解しやすい。
【００８２】
本発明に係る医薬組成物は、必要であれば、細胞周期調節剤に加えて一または複数の、前記細胞周期調節剤に適合し、治療されるべき適応症に適当な周知の抗増殖剤のような他の活性成分を含んでもよい。前記化合物は、抗血管形成剤として並びにＣＤＫの活性を調節および／または阻害するための薬剤として有用であり、したがって、プロテインキナーゼにより媒介される細胞増殖に関連する癌またはその他の疾患に対する治療が提供される。本発明の薬剤および組成物は、哺乳動物のＣＤＫ／サイクリン複合体、昆虫のＣＤＫ、またはカビのＣＤＫ複合体の阻害剤として有用である。このような薬剤および組成物はまた、増殖、分化、および／またはアポトーシスを制御するためにも有用である。ＣＤＫの阻害は、癌、炎症、心疾患状態、およびアルツハイマー病を治療するために有用であり得る。
【００８３】
本発明の薬剤の治療有効量は、プロテインキナーゼの調節または調整により媒介される疾患を治療するために用いられ得る。「有効量」は、このような治療の必要な哺乳動物に投与される際に、一または複数のプロテインキナーゼの活性により媒介される疾患の治療に効果を示すのに十分な薬剤の量、ということを意味すると意図されている。したがって、例えば、薬剤の治療有効量は、ＣＤＫの活性により媒介されている疾患状態が減少または軽減するように、一または複数のＣＤＫの活性を調節、調整、または阻害するのに十分な量である。
【００８４】
このような量に対応するであろう所定の薬剤の量は、特定の化合物、疾患の状態およびその重度、治療の必要のある哺乳動物の同一性（例えば、体重）、のような要素に依存して変化するだろうし、当業者によって普通に決定されるだろう。「治療」とは、少なくとも、ヒトのような哺乳動物において、一または複数のプロテインキナーゼの活性により少なくとも部分的には影響を受ける疾患状態の軽減を意味することを意図されており：特に、前記哺乳動物がある疾患状態に罹患しやすいと判明したがまだ罹患したとは診断されていない際に疾患状態が哺乳動物において発生するのを防止すること；疾患状態を調節および／もしくは阻害すること；並びに／または疾患状態を軽減することを含む。
【００８５】
本発明の薬剤は、容易に入手可能な出発物質を用いて、本技術分野において利用可能な技術を利用し、以下に記載した反応経路および合成計画を用いて調製され得る。本発明の典型的な化合物の調製は、以下の実施例において詳細に記載されているが、熟練者は、記載された化学反応は、本発明の他の多くのプロテインキナーゼ阻害剤の調製に容易に適合すると認識するだろう。例えば、例示されていない本発明に係る化合物の合成は、当業者にとっては明白な修飾、例えば、妨害する基を適切に保護すること、本技術分野で周知の他の適当な試薬に変更すること、または反応条件に通常の修飾を行うこと、によりうまく達成され得る。あるいは、ここに開示されているまたは本技術分野において周知の他の反応は、本発明の他の化合物を調製するための適応性を有していると認識されるだろう。
【００８６】
実施例
材料および方法
以下に記載された実施例において、特記しない限り、温度は全てセルシウス度で示され、特記しない限り、割合および百分率は全て重量である。試薬は、Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ ＣｏｍｐａｎｙまたはＬａｎｃａｓｔｅｒ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｌｔｄ．のような商業供給者から購入し、特記しない限り、さらなる精製をせずに用いた。テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）およびＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）はＡｌｄｒｉｃｈからＳｕｒｅ ｓｅａｌ ｂｏｔｔｌｅｓで購入し、受け取ったままで使用した。特記しない限り、溶媒は全て、当業者に周知の標準法を用いて精製した。
【００８７】
以下で表される反応は、一般的に、窒素、アルゴンの陽圧下でまたは乾燥管を用いて、室温で（特記しない限り）、無水溶媒中で行われ、反応フラスコには物質および試薬をシリンジを通して導入するためにゴム隔膜がはめられた。ガラス製品はオーブン乾燥および／または熱風乾燥した。分析用薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）は、Ａｎａｌｔｅｃｈ製ガラス支持シリカゲル６０Ｆ２５４プレート（０．２５ｍｍ）上で行われ、適切な溶媒比（ｖ／ｖ）で溶出され、適切な場所に表示された。反応はＴＬＣ、ＮＭＲ、またはＨＰＬＣによって分析され、出発物質の消費を判断して終了した。ＴＬＣプレートの可視化はＵＶランプ、ヨウ素、またはｐ−アニスアルデヒドスプレー試薬もしくはリンモリブデン酸試薬（Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ エタノール中２０質量％）を用いて行われ、熱で活性化した。
【００８８】
精密な試験は、特記しない限り、通常、反応溶媒または抽出溶媒を用いて反応容積を２倍にし、次いで抽出容積の２５容積％の指示された水溶液を用いて洗浄することにより行われた。生成物溶液は、濾過およびロータリーエバポレータによる減圧下での溶媒の蒸発の前に無水Ｎａ２ＳＯ４を用いて乾燥し、真空下での溶媒の除去を確認した。特記しない限り、Ｍｅｒｃｋ ＥＭフラッシュシリカゲル（４７〜６１μｍ）およびシリカゲル：粗製物を約２０：１から５０：１の比で用いて、フラッシュカラムクロマトグラフィー（Ｓｔｉｌｌ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｏｒｇ． Ｃｈｅｍ．， ４３， ２９２３ （１９７８））を行った。実施例において示された圧力または常圧において水素化分解を行った。
【００８９】
１Ｈ−ＮＭＲスペクトルは、３００ＭＨｚで作動するＢｒｕｋｅｒ装置を用いて記録され、１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルは、７５ＭＨｚで作動して記録された。ＮＭＲスペクトルは、クロロホルム（７．２５ｐｐｍおよび７７．００ｐｐｍ）もしくはＣＤ３ＯＤ（３．４および４．８ｐｐｍ並びに４９．３ｐｐｍ）、または適切な際には内部テトラメチルシラン（０．００ｐｐｍ）を参照標準として用い、ＣＤＣｌ３溶液（ｐｐｍで報告される）として得られた。必要であれば他のＮＭＲ溶媒を用いた。ピーク多重度が報告される際、以下の略語が用いられる：ｓ（一重線）、ｄ（二重線）、ｔ（三重線）、ｍ（多重線）、ｂｒ（広がり）、ｄｄ（二重の二重線）、ｄｔ（二重の三重線）。カップリング定数が与えられる際には、ヘルツ（Ｈｚ）で報告される。
【００９０】
赤外（ＩＲ）スぺクトルはＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ ＦＴ−ＩＲスペクトロメーターによって、ニート油として、ＫＢｒペレットとして、またはＣＤＣｌ３溶液として記録され、与えられる際には波数（ｃｍ−１）で報告される。質量スペクトルはＬＳＩＭＳまたは電子スプレーを用いて得られた。融点（ｍｐ）は全て訂正されていない。
【００９１】
実施例で用いた出発物質は商業的に入手可能または本技術分野において周知の技術を用いて一般的に調製し得る。
【００９２】
実施例Ａ（１）：５−（４−メトキシフェニルアミノ）−３−フェニル−１Ｈ−ピラゾロ［４，５−ｄ］チアゾール臭化水素酸塩。（化合物１）
【００９３】
【化１６】
2004505983.tif 000008
【００９４】
Ｌａｎｃａｓｔｅｒ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ， Ｌｔｄ．（「Ｌａｎｃａｓｔｅｒ」）から入手可能な５−アミノ−４−ブロモ−３−フェニル−ピラゾール、（２５０ｍｇ、１．０５ｍｍｏｌ）およびＬａｎｃａｓｔｅｒから入手可能な４−メトキシフェニルイソチオシアネート（１９１ｍｇ、１．１５ｍｍｏｌ）のジオキサン（１０ｍＬ）中の混合物を、１８時間加熱還流し、次いで室温まで冷却した。溶媒は減圧下で除去され、得られた固体を沸騰エタノールから再結晶し、ｍｐ２５９Ｃの黄色の固体を２５０ｍｇ（収率７４％）得た。１Ｈ ＮＭＲ （ＤＭＳＯ−ｄ６）：　０．２８ （１Ｈ， ｓ）， ７．６８ （２Ｈ， ｂｓ）， ７．６６ （２Ｈ， ｄ， Ｊ ＝ ２．４ Ｈｚ）， ７．５２ （２Ｈ， ｄｄ， Ｊ ＝ ７．９， ７．５ Ｈｚ）， ７．３７ （１Ｈ， ｄｄ， Ｊ ＝ ７．４， ７．３ Ｈｚ）， ６．９７ （２Ｈ， ｄ， Ｊ ＝ ９．１ Ｈｚ）， ３．７２ （３Ｈ， ｓ）。ＩＲ （ＫＢｒ）： ３２３５， ３１７６， １６０５， １５６６， １５１１， １４５０， １２３３ ｃｍ−１。ＨＲＦＡＢＭＳ：Ｃ１７Ｈ１５Ｎ４ＯＳに関する算出値（ＭＨ＋）： ３２３．０９６７。実測値： ３２３．０９６８。Ｃ１７Ｈ１４Ｎ４ＯＳ・ＨＢｒ・０．７ ＥｔＯＨに関する分析算出値： Ｃ， ５０．７４； Ｈ， ４．４４； Ｎ， １２．８６； Ｓ， ７．３６。実測値： Ｃ， ５０．６８； Ｈ， ４．６４； Ｎ， １２．６５； Ｓ， ７．２４。
【００９５】
実施例Ａ（２）：３−フェニル−５−（４−スルホンアミドフェニルアミノ）−１Ｈ−ピラゾロ［４，５−ｄ］チアゾール臭化水素酸塩。（化合物２）
【００９６】
【化１７】
2004505983.tif 000009
【００９７】
標題の化合物は、実施例Ａ（１）において用いたものと類似した方法により調製された。Ｌａｎｃａｓｔｅｒから入手可能な５−アミノ−４−ブロモ−３−フェニル−ピラゾールおよびＬａｎｃａｓｔｅｒから入手可能な４−イソチオシアナート−ベンゼンスルホンアミドにより、ｍｐ＞３００Ｃのクリーム色の非晶質固体が収率８９％で得られた。１Ｈ ＮＭＲ （ＤＭＳＯ−ｄ６）：　８．０９ （２Ｈ， ｄ， Ｊ ＝　８．９ Ｈｚ）， ７．９９ （２Ｈ， ｄ， Ｊ ＝　８．６ Ｈｚ）， ７．８５ （２Ｈ， ｄ， Ｊ ＝ ７．３ Ｈｚ）， ７．７０ （２Ｈ， ｄｄ， Ｊ ＝ ７．８， ７．５ Ｈｚ）， ７．５５ （１Ｈ， ｔ， Ｊ ＝ ７．４， ７．３ Ｈｚ）， ６．００ （２Ｈ， ｂｓ）。ＩＲ （ＫＢｒ）： ３２４３， ３１７４， ３０９５， ３０３５， ２９８６， ２８８６， ２７４８， １６１６， １５９６， １５０６， １４６７ ｃｍ−１。ＨＲＦＡＢＭＳ： に関する算出値Ｃ１６Ｈ１４Ｎ５Ｏ２Ｓ２に関する算出値（ＭＨ＋）： ３７２．０５８９。実測値： ３７２．０５９２。Ｃ１６Ｈ１３Ｎ５Ｏ２Ｓ２・ＨＢｒ・０．２ ＥｔＯＨに関する分析算出値： Ｃ， ４２．６８； Ｈ， ３．３２； Ｎ， １５．１７； Ｓ， １３．８９。実測値： Ｃ， ４２．６２； Ｈ， ３．１７； Ｎ， １５．１０； Ｓ， １３．５４。
【００９８】
実施例Ｂ（１）：５−［４−（４−メチル−ピペラジン−１−イル）−フェニルアミノ］−３−フェニル−１Ｈ−ピラゾロ［４，５−ｄ］チアゾール臭化水素酸塩。（化合物４）
【００９９】
【化１８】
2004505983.tif 000010
【０１００】
まず、式：
【０１０１】
【化１９】
2004505983.tif 000011
【０１０２】
の構造を有する、１−［４−（４−メチル−ピペラジン−１−イル）−フェニル］−３−（３−フェニル−ピラゾール−５−イル）−チオウレアを、以下のように調製した。Ｌａｎｃａｓｔｅｒから入手可能な５−アミノ−３−フェニル−ピラゾール（３６２ｍｇ、２．２７ｍｍｏｌ）および１−（４−イソチオシアナート−フェニル）−４−メチル−ピペラジン（Ｃｈｏｎｇらの国際公開ＷＯ９９／２１８４５号（１９９９）に従い、全体を参照することにより組み入れて調製した）；５００ｍｇ、２．２７ｍｍｏｌ）のジオキサン（１０ｍＬ）中の混合物を、４時間加熱還流し、次いで室温まで冷却した。得られた固体を濾過によって回収し、冷ジオキサンでリンスし、減圧下で乾燥して、８００ｍｇ（収率９０％）のクリーム色の固体を得、さらなる精製は行わずに用いた。１Ｈ ＮＭＲ （ＤＭＳＯ−ｄ６）：　１３．１０ （１Ｈ， ｂｓ）， １１．４８ （１Ｈ， ｂｓ）， １０．６８ （１Ｈ， ｂｓ）， ７．７２ （２Ｈ， ｄ， Ｊ ＝ ７．２ Ｈｚ）， ７．３７−７．５２ （５Ｈ， ｍ）， ６．９３ （２Ｈ， ｄ， Ｊ ＝ ９．０ Ｈｚ）， ６．３８ （１Ｈ， ｓ）， ３．１５ （４Ｈ， ｄｄ， Ｊ ＝ ５．０， ４．５ Ｈｚ）， ２．２４ （３Ｈ， ｓ）。
【０１０３】
標題の化合物は、Ｅｉｌｉｎｇｓｆｅｌｄ， Ｈ．のドイツ国特許公報第ＤＥ２４２９１９５号（１９７４年６月１８日）の方法に従い、ここで全体を参照することにより組み入れて調製した。１−［４−（４−メチル−ピペラジン−１−イル）−フェニル］−３−（３−フェニル−ピラゾール−５−イル）−チオウレア（２５０ｍｇ、０．６４ｍｍｏｌ）の氷酢酸（２ｍＬ）懸濁液に、１．５Ｍ臭素氷酢酸溶液（４６７μＬ、０．７０ｍｍｏｌ）を添加した。得られた混合液を８０Ｃで３時間加熱し、室温まで冷却して、水で希釈した。固体を濾過により回収し、水でリンスし、減圧下で乾燥してｍｐ２２０〜２２２Ｃの白色固体を６０ｍｇ（収率２４％）得た。１Ｈ ＮＭＲ （ＣＤ３ＯＤ）：　７．５７ （４Ｈ， ｂｄ， Ｊ ＝　８．７ Ｈｚ）， ７．３８ （２Ｈ， ｄｄ， Ｊ ＝ ８．０， ７．２ Ｈｚ）， ７．２８ （１Ｈ， ｄｄ， Ｊ ＝ ７．４， ７．２ Ｈｚ）， ６．９５ （２Ｈ， ｄ， Ｊ ＝ ９．０ Ｈｚ）， ３．２８ （４Ｈ， ｂｓ）， ２．８２ （３Ｈ， ｓ）。ＨＲＦＡＢＭＳ：Ｃ２１Ｈ２３Ｎ６Ｓに関する算出値（ＭＨ＋）： ３９１．１７０５。実測値： ３９１．１６９２。Ｃ２１Ｈ２２Ｎ６Ｓ・ＨＢｒ・１．５ Ｈ２Ｏに関する分析算出値： Ｃ， ５０．６０； Ｈ， ５．２６； Ｎ， １６．８６； Ｓ， ６．４６。実測値： Ｃ， ５０．６５； Ｈ， ５．０５； Ｎ， １６．９９； Ｓ， ６．６４。
【０１０４】
実施例Ｃ（１）：３−（２，６−ジフルオロフェニル）−５−（４−スルホンアミドフェニルアミノ）−１Ｈ−ピラゾロ［４，５−ｄ］チアゾール。（化合物３）
【０１０５】
【化２０】
2004505983.tif 000012
【０１０６】
まず、式：
【０１０７】
【化２１】
2004505983.tif 000013
【０１０８】
の構造を有する、３−（２，６−ジフルオロ−フェニル）−３−オキソ−プロピオニトリルを、以下のように調製した。ここで全体を参照することにより組み入れたＳｊｏｇｒｅｎ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． ｖｏｌ． ３４ （１９９１）， ｐｐ． ３２９５−３３０１の方法に従い、−７８Ｃのアセトニトリル（Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌより、２．１５ｍＬ、４１．２ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（５０ｍＬ）攪拌溶液に、２．５Ｍ　ｎ−ＢｕＬｉのヘキサン溶液（１２．４ｍＬ、３０．９ｍｍｏｌ）を５分かけて添加した。得られたスラリーは−７８Ｃで３０分間攪拌し、次いでＡｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌからの２，６−ジフルオロ−ベンゾイルクロライド（２．１７ｇ、１０．４ｍｍｏｌ）を５分かけて添加した。４５分後、反応混合液を飽和ＮＨ４Ｃｌ水溶液（２５ｍＬ）でクエンチし、１Ｎ ＨＣｌおよびＥｔＯＡｃ間に分配した。有機層を分離し、ブラインで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、濾過し、濃縮し、茶色の油を得て、これを溶出液として１０％ＭｅＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２を用いてカラムクロマトグラフィーにより精製し、１．８３ｇ（収率８２％）の茶色の油を得て、さらなる精製は行わずに用いた。１Ｈ ＮＭＲ （ＣＤＣｌ３）：　７．４０ （３Ｈ， ｓ）， ３．９２ （２Ｈ， ｓ）。ＩＲ： ２９１３， ２２６５， ２２１６， １７３２， １５６２， １４３２ ｃｍ−１。
【０１０９】
次いで、式：
【０１１０】
【化２２】
2004505983.tif 000014
【０１１１】
の構造を有する、５−アミノ−３−（２，６−ジフルオロ−フェニル）−ピラゾールを、以下のように調製した。粗製の３−（２，６−ジフルオロ−フェニル）−３−オキソ−プロピオニトリル（５００ｍｇ、２．７６ｍｍｏｌ）およびヒドラジン水化物（８０３μＬ、１６．６ｍｍｏｌ）の無水エタノール（５ｍＬ）中の混合物を１８時間加熱還流した。混合液を室温まで冷却し、溶媒を除去し、茶色のロウを得て、溶出液として５％ＭｅＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２を用いてカラムクロマトグラフィーにより精製し、３００ｍｇ（収率５６％）の茶色の半固体を得て、例によってさらなる精製は行わずに用いた。１Ｈ ＮＭＲ （ＣＤ３ＯＤ）：　７．３０−７．３９ （１Ｈ， ｍ）， ７．０８ （２Ｈ， ｄｄ， Ｊ ＝ ８．６， ８．５ Ｈｚ）， ５．９８ （１Ｈ， ｂｓ）。ＩＲ： ３３０６， １６２４， １５８６， １５１１ ｃｍ−１。ＦＡＢＭＳ （ＭＨ＋）： １９６。
【０１１２】
式：
【０１１３】
【化２３】
2004505983.tif 000015
【０１１４】
の構造を有する４−｛３−［３−（２，６−ジフルオロ−フェニル）−ピラゾール−５−イル］−チオウレイド｝−ベンゼンスルホンアミドを、実施例Ｂ（１）の１−［４−（４−メチル−ピペラジン−１−イル）−フェニル］−３−（３−フェニル−ピラゾール−５−イル）−チオウレアに類似した方法により５−アミノ−３−（２，６−ジフルオロ−フェニル）−ピラゾールおよび４−イソチオシアナート−ベンゼンスルホンアミドから調製し、収率６４％で黄色の粉末を得て、さらなる精製は行わずに用いた。１Ｈ ＮＭＲ （ＤＭＳＯ−ｄ６）：　１０．７８ （１Ｈ， ｓ）， ７．６８ （２Ｈ， ｄ， Ｊ ＝ ８．８ Ｈｚ）， ７．５９ （２Ｈ， ｄ， Ｊ ＝ ８．８ Ｈｚ）， ７．２８−７．３９ （１Ｈ， ｍ）， ７．１３ （２Ｈ， ｓ）， ７．０８ （２Ｈ， ｄｄ， Ｊ ＝　８．６， ８．５ Ｈｚ）， ６．２５ （１Ｈ， ｂｓ）。ＩＲ （ＫＢｒ）： ３３２１， ３２４３， ３０８６， ２９７７， ２８５９， １６５５， １５９８， １５６０， １５００， １１７４ ｃｍ−１。
【０１１５】
標題の化合物は、実施例Ｂ（１）に記載のものに類似の方法により４−｛３−［３−（２，６−ジフルオロ−フェニル）−ピラゾール−５−イル］−チオウレイド｝−ベンゼンスルホンアミドから調製し、粗生成物を得、これをエチレングリコールから再結晶してクリーム色の固体を収率２１％で得た。１Ｈ ＮＭＲ （ＤＭＳＯ−ｄ６）：　１３．１２ （１Ｈ， ｓ）， １０．８８ （１Ｈ， ｓ）， ７．９０ （２Ｈ， ｄ， Ｊ ＝ ８．０ Ｈｚ）， ７．８１ （２Ｈ， ｄ， Ｊ ＝　８．９ Ｈｚ）， ７．４８−７．５９ （１Ｈ， ｍ）， ７．２７−７．３８ （２Ｈ， ｍ）， ７．２４ （２Ｈ， ｓ）。ＩＲ （ＫＢｒ）： ３４４８， ３３１２， ３２３９， ３０５８， １６２８， １６０４， １５５１， １４９０， １１５４ ｃｍ−１。ＨＲＦＡＢＭＳ：Ｃ１６Ｈ１１Ｆ２Ｎ５Ｏ２Ｓ２Ｎａ に関する算出値（ＭＮａ＋）： ４３０．０２２０。実測値： ４３０．０２２９。Ｃ１６Ｈ１１Ｆ２Ｎ５Ｏ２Ｓ２・０．４ Ｈ２Ｏに関する分析算出値： Ｃ， ４６．３５； Ｈ， ２．８７； Ｎ， １６．８９； Ｓ， １５．４７。実測値： Ｃ， ４６．４４； Ｈ， ２．７４； Ｎ， １６．５７； Ｓ， １５．３４。
【０１１６】
実施例Ｃ（２）：３−（２，６−ジフルオロ−フェニル）−５−［（４−メチル−ピペラジン−１−イル）−フェニルアミノ］−１Ｈ−ピラゾロ［４，５ｄ］チアゾール。（化合物５）
【０１１７】
【化２４】
2004505983.tif 000016
【０１１８】
式：
【０１１９】
【化２５】
2004505983.tif 000017
【０１２０】
の構造を有する１−［３−（２，６−ジフルオロ−フェニル）−ピラゾール−５−イル］−３−［４−（４−メチル−ピペラジン−１−イル）−フェニル］−チオウレアを、実施例Ｂ（１）の１−［４−（４−メチル−ピペラジン−１−イル）−フェニル］−３−（３−フェニル−ピラゾール−５−イル）−チオウレアに類似した方法により、５−アミノ−３−（２，６−ジフルオロ−フェニル）−ピラゾール（実施例Ｃ（１）よりおよび１−（４−イソチオシアナート−フェニル）−４−メチル−ピペラジンから調製し、収率３１％で白色の固体を得て、さらなる精製は行わずに用いた。１Ｈ ＮＭＲ （ＤＭＳＯ−ｄ６）：　１２．８２ （１Ｈ， ｓ）， １１．１８ （１Ｈ， ｂｓ）， １０．５２ （１Ｈ， ｓ）， ７．３０−７．４２ （１Ｈ， ｍ）， ７．２６ （２Ｈ， ｄ， Ｊ ＝ ８．９ Ｈｚ）， ７．１０ （２Ｈ， ｄｄ， Ｊ ＝ ８．６， ８．５ Ｈｚ）， ６．８２ （２Ｈ， ｄ，　Ｊ ＝　９．０ Ｈｚ）， ６．２４ （１Ｈ， ｓ）， ３．２２ （４Ｈ， ｓ）， ２．４２ （４Ｈ， ｓ）， ２．５８ （３Ｈ， ｓ）。
【０１２１】
標題の化合物は、実施例Ｂ（１）に記載のものに類似の方法により１−［３−（２，６−ジフルオロ−フェニル）−ピラゾール−５−イル］−３−［４−（４−メチル−ピペラジン−１−イル）−フェニル］−チオウレアから調製し、粗生成物を得、これを溶出液として５％ＭｅＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２を用いてカラムクロマトグラフィーにより粗生成物を精製し、ｍｐ２０８−２１０Ｃの薄黄色の固体を収率２９％で得た。１Ｈ ＮＭＲ （ＣＤ３ＯＤ）：　７．９１ （１Ｈ， ｓ）， ７．５８ （２Ｈ， ｄ， Ｊ ＝ ９．０ Ｈｚ）， ７．４０−７．５２ （１Ｈ， ｍ）， ７．１７ （２Ｈ， ｄｄ， Ｊ ＝ ８．４， ７．８ Ｈｚ）， ７．０２ （２Ｈ， ｄ， Ｊ ＝ ９．０ Ｈｚ）， ３．２１ （４Ｈ， ｄｄ， Ｊ ＝ ５．３， ４．６ Ｈｚ）， ２．６７ （４Ｈ， ｄｄ， Ｊ ＝ ５．１， ４．８ Ｈｚ）， ２．３８ （３Ｈ， ｓ）。ＨＲＦＡＢＭＳ：Ｃ２１Ｈ２１Ｆ２Ｎ６Ｓに関する算出値（ＭＨ＋）： ４２７．１５１６。実測値： ４２７．１５０５。Ｃ２１Ｈ２０Ｆ２Ｎ６Ｓ・０．２ ＭｅＯＨ・０．ＣＨＣｌ３に関する分析算出値： Ｃ， ５６．２７； Ｈ， ４．６３； Ｎ， １８．４０； Ｓ， ７．０２。実測値： Ｃ， ５６．４２； Ｈ， ４．７７； Ｎ， １８．２１； Ｓ， ６．８４。
【０１２２】
上記記載の典型的な化合物は、以下のようにその活性を調べることができる。増殖因子により誘導される細胞増殖を阻害するプロテインキナーゼ阻害剤の活性は、自身の受容体自己リン酸化阻害活性と直接相関している。前記化合物のプロテインキナーゼ阻害活性を測定するために、以下の実験条件が用いられた。
【０１２３】
生化学的および生物学的評価
サイクリン依存性キナーゼ活性は、［３２Ｐ］ＡＴＰまたは［３３Ｐ］ＡＴＰ由来の放射性リン酸の、タンパク質基質への酵素触媒性、時間依存的な取り込みを定量することにより測定した。特記しない限り、分析は、反応ごとに１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（Ｎ−［２−ヒドロキシエチル］ピペラジン−Ｎ’−［２−エタンスルホン酸］）（ｐＨ ７．４）、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、２５μＭアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、１ｍｇ／ｍＬ卵白アルブミン、５μｇ／ｍＬロイペプチン、１ｍＭジチオスレイトール、１０ｍＭグリセロリン酸、０．１ｍＭバナジン酸ナトリウム、１ｍＭフッ化ナトリウム、２．５ｍＭエチレングリコール−ビス（β−アミノエチルエーテル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸（ＥＧＴＡ）、２％（ｖ／ｖ）ジメチルスルホキシド、および０．０３−０．４μＣｉ［３２／３３Ｐ］ＡＴＰの存在下で５０μＬの総容量の９６ウェルプレートで行った。反応は酵素を用いて開始させ、３０℃でインキュベートし、２０分後にエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を２５０ｍＭになるよう添加することにより停止させた。次いでリン酸化基質をニトロセルロースまたはホスホセルロース膜に９６ウェル濾過マニホールドを用いて捕捉し、０．８５％リン酸を用いて繰り返し洗浄することにより未取り込み放射能を除去した。放射能は、ホスホリメージャー（ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｍａｇｅｒ）に乾燥膜をさらすことにより定量した。
【０１２４】
異なる阻害剤化合物濃度の存在下で酵素活性を測定し、酵素非存在下で測定したバックグラウンド放射能を減じることにより、見かけのＫｉ値を測定した。
【０１２５】
ＣＤＫ４／サイクリンＤ網膜芽細胞腫キナーゼ活性の阻害
ヒトＣＤＫ４およびサイクリンＤ３の複合体、またはヒトＣＤＫ４および遺伝的に切断された（１−２６４）サイクリンＤ３の複合体を、慣用の生化学的クロマトグラフィー技術を用いて、対応するバキュロウイルス発現ベクター（例えば、Ｍｅｉｊｅｒ ａｎｄ Ｋｉｍ， ”Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｏｆ Ｃｙｃｌｉｎ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｋｉｎａｓｅｓ，” Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ，． ｖｏｌ． ２８３ （１９９７）， ｐｐ． １１３−１２８を参照。）を共感染させた昆虫細胞から精製した。前記酵素複合体（５または５０ｎＭ）は、基質として０．３−０．５μｇの精製組換え網膜芽細胞腫タンパク質断片（Ｒｂ）を用いて分析した。操作されたＲｂ断片（天然の網膜芽細胞腫タンパク質の残基３８６−９２８；６２．３ｋＤａ）は、天然の１０６−ｋＤａタンパク質に見られるリン酸化部位の大部分、および精製を容易にするための６つのヒスチジン残基のタグを含む。リン酸化Ｒｂ基質は、微細濾過によりニトロセルロース膜上に捕捉し、上記のようにホスホリメージャーを用いて定量した。強固に結合した阻害剤の測定のため、前記酵素複合体濃度を５ｎＭに低下させ、分析時間を６０分間に延長し、その間生成物の生成の時間依存性が直線状であった。
【０１２６】
ＣＤＫ２／サイクリンＡ網膜芽細胞腫キナーゼ活性の阻害
ＣＤＫ２は公表されている方法（Ｒｏｓｅｎｂｌａｔｔ ｅｔ ａｌ．， ”Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｒｙｓｔａｌｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｃｙｃｌｉｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｋｉｎａｓｅ ２，” Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， ｖｏｌ． ２３０， １９９３， ｐｐ． １３１７−１３１９）を用いて、バキュロウイルス発現ベクターを感染させた昆虫細胞から精製した。サイクリンＡは、全長組換えサイクリンＡを発現している大腸菌細胞から精製し、切断されたサイクリンＡ構成体を制限タンパク質分解により作製し、過去に記載されたように（Ｊｅｆｆｒｅｙ ｅｔ ａｌ．， ”Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ＣＤＫ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｒｅｖｅａｌｅｄ ｂｙ ｔｈｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ａ ｃｙｃｌｉｎ Ａ−ＣＤＫ２ ｃｏｍｐｌｅｘ，” Ｎａｔｕｒｅ， ｖｏｌ． ３７６ （２７ Ｊｕｌｙ １９９５）， ｐｐ． ３１３−３２０）精製した。ＣＤＫ２およびタンパク質分解されたサイクリンＡの複合体を調製し、ゲル濾過により精製した。本分析の基質はＣＤＫ４分析に用いたのと同じＲｂ基質断片であり、ＣＤＫ２は１５０ｎＭまたは１０ｎＭで存在したことを除いては、ＣＤＫ２／サイクリンＡおよびＣＤＫ４／サイクリンＤ３分析の方法論は本質的には同じである。Ｋｉ値は上記のように測定した。
【０１２７】
上記の具体例を含む化合物について行われた分析の結果は、以下に表Ａで示している。特定の見出しで特記されない限り、用いた単位および分析は、表の該当する欄において示されている通りである。
【０１２８】
【化２６】
2004505983.tif 000018
【０１２９】
【表１】
2004505983.tif 000019
【０１３０】
細胞増殖の阻害：細胞毒性の評価
細胞増殖の阻害は、３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−［２Ｈ］−ジフェニルテトラゾリウムブロマイド（ＭＴＴ）をホルマザンに還元する生細胞の能力に基づく、テトラゾリウム塩分析（Ｍｏｓｓｍａｎ， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ， ｖｏｌ． ６５ （１９８３）， ｐｐ． ５５−５８）を用いて測定した。次いで、水不溶性の紫色のホルマザン生成物を分光学的に検出した。ＨＣＴ１１６細胞株は９６ウェルプレートで増殖させた。細胞はマッコイの５Ａ培地中で、１３５μｌ／ウェルの容積の適切な培地中で平板培養した。阻害剤化合物を添加する前に、プレートを４時間インキュベートした。０．５％（ｖ／ｖ）ジメチルスルホキシド（１５μＬ／ウェル）中に、異なる濃度の阻害剤化合物を添加し、細胞を３７Ｃ（５％ＣＯ２）で４〜６日間（細胞の種類による）インキュベートした。インキュベーションの最後に、ＭＴＴを最終濃度０．２ｍｇ／ｍＬで添加し、細胞をさらに４時間３７℃でインキュベートした。プレートを遠心分離し培地を除去した後、ホルマザン（ジメチルスルホキシドに溶解）の吸光度を５４０ｎｍで測定した。５０％の増殖の阻害を生じる阻害剤化合物濃度を、阻害百分率に対する阻害剤濃度の片対数プロットの直線部分から決定した。結果は全て、０．５％（ｖ／ｖ）ジメチルスルホキシドのみを処置したコントロール細胞と比較した。
【０１３１】
上記実施例は、式Ｉ、ＩＩおよびＩＩａに係る化合物、および様々なＣＤＫ／サイクリン複合体に対するそれらの活性レベルを決定するために容易に行うことができる分析を例示している。選択した標的に対する所望の活性レベルを有する阻害剤を選択するために、このような分析または本技術分野において周知の他の適切な分析を用いることができるということは明らかだろう。
【０１３２】
上記の典型的な化合物は、以下の一般例に係る医薬組成物に配合され得る。
【０１３３】
非経口組成物の例
注射による投与に適切な非経口医薬組成物を調製するためには、１００ｍｇの、式Ｉ、ＩＩ、またはＩＩａの化合物の水溶性塩をＤＭＳＯに溶解させ、次いで０．９％の滅菌生理食塩水１０ｍＬと混合する。該混合物を注射による投与に適当な服用単位の形状にする。
【０１３４】
経口組成物の例
経口送達のための医薬組成物を調製するためには、１００ｍｇの式Ｉ、ＩＩ、またはＩＩａの化合物を７５０ｍｇの乳糖と混合する。該混合物を、ハードゼラチンカプセルのような経口投与に適当な経口服用単位にする。
【０１３５】
本発明は、具体例および好ましい実施形態を参照することにより例示されている。本発明は、前述の記載により制限されず、添付の請求の範囲およびそれと同等のものにより定義されるということを意図されているということは理解されるべきである。
【国際公開パンフレット】
2004505983.tif 000029
2004505983.tif 000030
2004505983.tif 000031
2004505983.tif 000032
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2004505983.tif 000079
2004505983.tif 000080
2004505983.tif 000081
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004505983.tif 000082
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004505983.tif 000083
【国際調査報告】
2004505983.tif 000084
2004505983.tif 000085
2004505983.tif 000086
2004505983.tif 000087
2004505983.tif 000088
2004505983.tif 000089