(57)【要約】【課題】【解決手段】本発明は、抑制性および／または調節性ヒトＣＤ４+ＣＤ２５+Ｔ細胞、該細胞を増殖させる方法、ならびに該抑制性および／または調節性ヒトＣＤ４+ＣＤ２５+Ｔ細胞および該増殖させたＴ細胞の調節剤としての使用を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
抑制性および／または調節性ヒトＣＤ４+ＣＤ２５+Ｔ細胞。
【請求項２】
ヒト末梢血から好ましくは適切なモノクローナル抗体によって、および磁性分離または免疫吸着法を用いて単離しうる、請求項１に記載のＴ細胞。
【請求項３】
ＣＴＬＡ−４+であり、かつ調節特性を有する、請求項１または２に記載の細胞。
【請求項４】
Ｔ細胞刺激剤または抗原提示細胞を用いて細胞をｅｘ  ｖｉｖｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏで刺激することを含んでなる、請求項１〜３のいずれかに記載のＣＤ４+ＣＤ２５+Ｔ細胞を増殖させる方法。
【請求項５】
該Ｔ細胞刺激剤が
（ａ）スーパーアゴニスト性抗体を含む、抗ＣＤ３および／または抗ＣＤ２８リガンド／モノクローナル抗体、
（ｂ）  ＣＤ４+ＣＤ２５+Ｔ細胞表面上のＴ細胞受容体に対する、またはＴ細胞受容体成分に対するリガンド／抗体；または
（ｃ）調節Ｔ細胞の表面に発現されたＴ細胞受容体に結合するＭＨＣ−ペプチド複合体；または
（ｄ）ホルボールエステルおよびカルシウムイオノフォア；
を含む組成物である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
該抗原提示細胞が自己、非自己、人工抗原提示細胞、等から選択される、好ましくは該抗原提示細胞が樹状細胞である、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
該Ｔ細胞刺激剤および該抗原提示細胞がＩＬ−２および／またはＩＬ−５、ＩＬ−７および／またはＩＬ−９、ＩＦＮ−αおよび／またはＩＬ−１０と共に用いられる、請求項４〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
請求項４〜７のいずれかに記載の方法によって得られる、増殖させたヒトＣＤ４+ＣＤ２５+Ｔ細胞。
【請求項９】
好ましくはパラホルムアルデヒドでｅｘ  ｖｉｖｏ処理することによって得られる、固定されたＣＤ４+ＣＤ２５+細胞である、請求項８に記載の増殖させたヒトＣＤ４+ＣＤ２５+Ｔ細胞。
【請求項１０】
請求項１〜３、８または９のいずれかに記載のヒトＣＤ４+ＣＤ２５+Ｔ細胞を含む医薬組成物。
【請求項１１】
規制医薬品を調製するための、請求項１〜３、８または９のいずれかに記載のＣＤ４+ＣＤ２５+Ｔ細胞の使用。
【請求項１２】
ＣＤ４+ＣＤ２５+Ｔ細胞をヒトの血液または他の組織からｅｘ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで同定し、モニターしおよび／または除去する方法であって、
（ｉ）  Ｔ細胞上のＣＤ４、および／またはＣＤ２５、および／またはＣＴＬ−Ａ４（ＣＤ１５４）分子（ｅｎｔｉｔｉｅｓ）と特異的に結合する作用物質／リガンド、好ましくは抗ＣＤ４、および／または抗ＣＤ２５、および／または抗ＣＴＬ−Ａ４抗体を用いる；および／または
（ｉｉ）免疫吸着法を用いる；および／または
（ｉｉｉ）請求項４〜７に記載の刺激剤または抗原提示細胞を用いる；
ことを含む該方法。
【請求項１３】
調節性ＣＤ４+ＣＤ２５+Ｔ細胞をｉｎ  ｖｉｖｏで誘導する作用物質を調製するための、好ましくは患者の自己免疫疾患を治療するための作用物質を調製するための、請求項５〜７に記載のＴ細胞刺激剤または抗原提示細胞の使用。
【請求項１４】
請求項１〜３、８または９のいずれかに記載のＣＤ４+ＣＤ２５+Ｔ細胞の：
（ａ）他の増殖および／または機能的修飾性（抑制性／促進性）／アポトーシス性または抗アポトーシス性因子の同定を可能とするようなアッセイにおける
（ｂ）  ＣＤ４+ＣＤ２５+Ｔ細胞上の新規分子の同定を含む、ＣＤ４+ＣＤ２５+Ｔ細胞によって発現される分子を同定するため、または製薬的に活性とみなされる分子を提示しているかどうかを同定するため、または
（ｃ）調節性ＣＤ４+ＣＤ２５+Ｔ細胞の前駆体細胞または子孫を同定するため、
の使用。
【請求項１５】
養子免疫伝達療法のための作用物質、自己免疫疾患を含むがそれらだけに限定されない、免疫性が増大した疾患を治療するための作用物質、または移植片対宿主病、移植片拒絶、等の移植反応を阻止／治療する作用物質を調製するための、請求項１〜３に記載の富化されたＣＤ４+ＣＤ２５+Ｔ細胞、または請求項８に記載の増殖させたＴ細胞、または請求項９に記載の固定化されたＴ細胞の使用。
【請求項１６】
養子免疫伝達療法のための方法であって、強すぎる、および／または病原性の免疫反応を阻止または治療するため、または移植片対宿主病および移植片拒絶、等の移植反応を阻止／治療するために、請求項１〜３、８または９のいずれかに記載の富化／増殖させた自己または非自己の調節性ＣＤ４+ＣＤ２５+Ｔ細胞を患者に注射／注入することを含む、該養子免疫伝達療法の方法。
【請求項１７】
特定の所望の抗原特異的Ｔ細胞受容体を用いてＣＤ４+ＣＤ２５+Ｔ細胞を調製する方法であって、
（ｉ）  抗原提示細胞、好ましくは該抗原を提示する未成熟または成熟樹状細胞（ＤＣ）を用いて請求項１〜３のいずれかに記載のＣＤ４+ＣＤ２５+Ｔ細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで活性化し／刺激し／増殖させる；または、
（ｉｉ）  ＣＤ４+ＣＤ２５+調節Ｔ細胞（のサブセット）上に発現される特定のＴ細胞受容体に対するリガンド／抗体、またはＣＤ４+ＣＤ２５+Ｔ細胞（のサブセット）上の特定のＴ細胞受容体に結合するＭＨＣ−ペプチド複合体を用いる；
ことを含む該方法。
【請求項１８】
該抗原提示細胞が組織または任意の規定されたもしくは規定されない抗原をパルスされ／負荷され／供給され、ここで：
（ｉ）該規定された抗原が、好ましくは自己抗原（尋常性天疱瘡の場合にはデスモグレイン３；白斑の場合にはメランＡまたはチロシナーゼ；甲状腺炎の場合にはサイログロブリンを含むが、それらだけに限定されない）、外来抗原（Ｃ型肝炎のような病原体由来抗原を含む）、または同種異系抗原／移植抗原であり、かつ
（ｉｉ）該規定されない抗原が、好ましくは組織または細胞由来抗原（壊死性またはアポトーシス性細胞、または組織由来ＲＮＡ、または興味のある細胞と樹状細胞／抗原提示細胞とのハイブリッドの形態、規定されない抗原の樹状細胞もしくは他の抗原提示細胞へのデリバリーという他の形態を含むが、それらだけに限定されない）または病原体由来抗原である、
請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
特定の所望の抗原特異的Ｔ細胞受容体を有し、かつ請求項１７または１８の方法によって、または所望の抗原特異性を有するＴ細胞受容体を単離された又は増殖させたＴ細胞にｅｘ  ｖｉｖｏでトランスフェクションすることによって得られる、ＣＤ４+ＣＤ２５+  Ｔ細胞。
【請求項２０】
請求項１９に記載のＴ細胞を含む医薬組成物であって、好ましくは該医薬組成物が自己免疫疾患、移植片対宿主病および移植片拒絶を含むがそれらだけに限定されない、免疫性が増大した疾患を治療するのに適する、該医薬組成物。
【請求項２１】
抗ＣＤ２５および／または抗ＣＴＬ−Ａ４モノクローナル抗体等のリガンド／抗体、ＣＤ４+ＣＤ２５+Ｔ細胞（のサブセット）上のＴ細胞受容体と結合する抗体またはＭＨＣ−ペプチド複合体または他のリガンドを含むが、それらだけに限定されないＴ細胞上のＣＤ４、および／またはＣＤ２５および／またはＣＴＬ−Ａ４（ＣＤ１５４）分子（ｅｎｔｉｔｉｅｓ）と特異的に結合する作用物質の、例えば腫瘍免疫を高めるためのＣＤ４+ＣＤ２５+Ｔ細胞によるｉｎ  ｖｉｖｏ弱化調節を含む免疫応答を増強するためにＣＤ４+ＣＤ２５+Ｔ細胞をｉｎ  ｖｉｖｏで除去する又はその機能を損傷させる薬剤を調製するための使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抑制性および／または調節性ヒトＣＤ４+ＣＤ２５+Ｔ細胞、該細胞を増殖させる方法、ならびに該抑制性および／または調節性ヒトＣＤ４+ＣＤ２５+Ｔ細胞および対応する増殖させたＴ細胞の調節剤としての使用を提供する。
【背景技術】
【０００２】
免疫学的自己寛容は、自己免疫の阻止および免疫ホメオスタシスの維持にとって重大である。免疫系が自己と非自己を識別する能力は、中枢および末梢寛容の作用機構によって制御されている。中枢寛容は、発生の初期段階において胸腺中の自己反応性リンパ球の除去をもたらす（Ｒｏｃｈａ，Ｂ．およびｖｏｎ  Ｂｏｅｈｍｅｒ，Ｈ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５１：１２２５−１２２８（１９９１）；Ｋｉｓｉｅｌｏｗ，Ｐ．ら，Ｎａｔｕｒｅ  ３３３：７４２−７４６（１９８８））。Ｔ細胞アネルギーおよび非認識を含む、末梢寛容のいくつかの作用機構が記載されている（Ｒｏｃｈａ，Ｂ．およびｖｏｎ  Ｂｏｅｈｍｅｒ，  Ｈ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５１：１２２５−１２２８（１９９１）；Ｋｉｓｉｅｌｏｗ，  Ｐ．ら，Ｎａｔｕｒｅ  ３３３：７４２−７４６（１９８８）；Ｓｃｈｗａｒｔｚ，Ｒ．Ｈ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４８：１３４９−１３５６（１９９０）；Ｍｉｌｌｅｒ，Ｊ．Ｆ．Ａ．Ｐ．およびＨｅａｔｈ，Ｗ．Ｒ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．１３３：１３１−１５０（１９９３））。齧歯類を用いて１０年以上続けられた研究により、他の寛容作用機構から逃れた自己反応性Ｔ細胞の活性化およびエフェクター機能の両方を活性かつ優勢に阻止する「プロフェッショナルな」調節／抑制Ｔ細胞というユニークなＣＤ４+ＣＤ２５+集団が存在するという確かな証拠が提供された（Ｓａｋａｇｕｃｈｉ，Ｓ．ら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５５：１１５１−１１６４（１９９５）；Ｔａｋａｈａｓｈｉ，Ｔ．ら，Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０：１９６９−１９８０（１９９８）；Ｉｔｏｈ，Ｍ．ら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６２：５３１７−５３２６（１９９９））。これらの細胞の排除または不活性化は、重篤な自己免疫疾患をもたらし、また同種異系抗原およびさらには腫瘍に対する免疫応答を増大させることが見出された（Ｓａｋａｇｕｃｈｉ，Ｓ．ら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １５５：１１５１−１１６４（１９９５）；Ｉｔｏｈ，Ｍ．ら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６２：５３１７−５３２６（１９９９）；Ｓｈｉｍｉｚｕ，Ｊ．ら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６３：５２１１−５２１８（１９９９））。最近の研究では、ＣＤ４+ＣＤ２５+調節Ｔ細胞がかなり相同な集団を構成すること（Ｔｈｏｒｔｏｎ，Ａ．Ｍ．，Ｓｈｅｖａｃｈ，Ｅ．Ｍ．，  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４：１８３−１９０（２０００））、胸腺に由来すること（Ｉｔｏｈ，Ｍ．ら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６２：５３１７−５３２６（１９９９））、本来的にはＴＣＲによる刺激に対して非増殖性（すなわち、アネルギー性）であるが、抑制性となることおよびＣＤ４+またはＣＤ８+Ｔ細胞の増殖を抑制するためにはＴＣＲを介した活性化が必要であることを明らかにした。しかし、いったん活性化されると、それらの調節／抑制機能は完全に抗原非特異的であり、サイトカイン非依存的で、かつ細胞接触依存的であった（Ｔｈｏｒｔｏｎ，Ａ．Ｍ．，Ｓｈｅｖａｃｈ，Ｅ．Ｍ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １６４：１８３−１９０（２０００））。正確な抑制作用機構、特にＴ−Ｔ相互作用に関与する細胞表面および／または近傍の可溶性分子の抑制は、今後の特定を待たなければならない。新しいｉｎ  ｖｉｔｒｏのデータによれば、���Ｄ４+ＣＤ２５+Ｔ細胞がレスポンダーのＩＬ−２産生を抑制することによってレスポンダーの増殖を抑制することが示唆されている（Ｔｈｏｒｔｏｎ，Ａ．Ｍ．，Ｓｈｅｖａｃｈ，Ｅ．Ｍ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８８：２８７−２９６（１９９８））。最近のｉｎ  ｖｉｖｏ研究によれば、ＣＤ４+ＣＤ２５+Ｔ細胞の機能は、ＣＤ４+ＣＤ２５+Ｔ細胞上に構成的に発現されることが見出されたＣＴＬＡ−４／ＣＤ１５２分子を介したシグナル伝達に決定的に依存していることが示唆されている（Ｒｅａｄ，Ｓ．ら，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９２：２９５−３０２（２０００）；Ｓａｌｏｍｏｎ，Ｂ．ら，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １２：４３１−４４０（２０００）；  Ｔａｋａｈａｓｈｉ，Ｔ．Ｔ．ら，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９２：３０３−３１０（２０００））。
【０００３】
齧歯類においてはＣＤ４+ＣＤ２５+Ｔ細胞集団が、自然発生性自己免疫疾患の阻止に極めて重大である「プロフェッショナルな」調節／抑制Ｔ細胞のユニークな系統を構成することが何年も前から明らかであったが（Ｓａｋａｇｕｃｈｉ，Ｓ．ら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５５：１１５１−１１６４（１９９５））、類似の機能特性を示すＣＤ４+４Ｔ細胞がヒトにおいて本来的に存在するかどうかは今日でも知られていない。マウスを例えば抗ＣＤ２５および／または抗ＣＴＬＡ−Ａ４モノクローナル抗体（ｍＡｂ）で処理する等によって、マウス中のこれらの細胞をｉｎ  ｖｉｖｏで除去し、および／またはその機能を損傷すると、種々の自然発生性自己免疫疾患が誘導され、かつ腫瘍の拒絶が誘導される。この作用機構は、これらの細胞の除去／機能損傷により、自己反応性Ｔ細胞に対するそれらの負の制御が除去され、その結果これら自己反応性Ｔ細胞が活性化する、というものである。養子免疫伝達によってＣＤ４+ＣＤ２５+Ｔ細胞をこれらの動物に戻してやると、調節が回復され、また自己免疫／腫瘍拒絶が停止する。
【０００４】
上記のように、類似の機能特性を示すＣＤ４+Ｔ細胞がヒトにおいて本来的に存在するかどうかは今日まで全く知られていない。ＣＤ４+ＣＤ２５+Ｔ細胞ではないが、調節特性を有するヒトＴ細胞の調製は当技術分野で公知である。例えば、Ｊｏｎｕｌｅｉｔ，Ｈ．ら，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ  １９２：１２１３−１２２２（２０００）には、未成熟樹状細胞を用いた反復刺激により、ヒト未処置Ｔ細胞から調節Ｔ細胞が誘導されることが記載されている。この研究の殆どは、真に未処置のＴ細胞の最も豊富な供給源である臍帯血由来のＴ細胞を用いて実施された。ＣＤ４+ＣＤ２５+Ｔ細胞は初期の時点からヒト血液中に構成的に検出可能である、ということに注目すべきである。Ｊｏｎｕｌｅｉｔらの対象は本来的に存在する集団ではない。Ｄｅ  Ｊｏｎｇ，Ｐ．ら，Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：６３１−６３８（１９９４）は、未処置のＣＤ４+Ｔ細胞および記憶ＣＤ４+Ｔ細胞に対するＴＧＦ−β１の作用を記載している。一次活性化ＣＤ４５ＲＡ+ＣＤ４+Ｔ細胞に対する刺激作用とともに差動作用が示される。ＣＤ４５ＲＯ+ＣＤ４+Ｔ細胞または二次刺激化ＣＤ４５ＲＯ+細胞の増殖は抑制される。ＣＤ４５ＲＡ+Ｔ細胞の場合は、ＴＧＦ−βはＣＤ２５の蛍光の平均値の増大をもたらす。この文献に記載されている作用は、Ｔ細胞の増殖にのみ関連するものである。未処置のＴＧＦ−βで処理したＴ細胞の調節能は示されていない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
驚くべきことに、ＣＤ４+ＣＤ２５+、主としてＣＤ４５ＲＯ+Ｔ細胞（ＣＤ４+Ｔ細胞の平均６％）（以下、単に”ＣＤ４+ＣＤ２５+Ｔ細胞”という）はヒト血液中、特に成人の健康なボランティアの末梢血に存在する。過去において、この表現型を示すＴ細胞（すなわち、抑制性／調節性ＣＤ４+ＣＤ２５+Ｔ細胞）は数年前から知られていたが、従来の記憶細胞であると誤って解釈されていた（Ｋａｎｅｇａｎｅ，Ｈ．ら，Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３：１３４９−１３５６（１９９１）；Ｔａｋａ，Ｋ．ら，Ｉｍｍｕｎｏｌ．７２：１５−１９（１９９０）；Ｊａｃｋｓｏｎ，Ａ．Ｌ．ら，Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ．  ５４：１２６−１３３（１９９０））。以前の報告とは対照的に、ヒトＣＤ４+ＣＤ２５+Ｔ細胞は従来の記憶細胞ではなく、むしろそれら細胞の齧歯類対応物と同一の機能特性を示す調節細胞である。例えば、ＣＤ４+ＣＤ２５+Ｔ細胞のｉｎ  ｖｉｖｏ抑制活性に必須のＣＴＬＡ−４（ＣＤ１５２）は構成的に発現され、そして刺激後、強くアップレギュレーションされたままであった。ＣＤ４+ＣＤ２５+Ｔ細胞は、それらのＴＣＲを介した刺激に対して非増殖性であったが、アネルギー状態はＩＬ−２およびＩＬ−１５によって部分的にくつがえされた。同種であるが同系ではない成熟樹状細胞またはプレート結合抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８で刺激すると、ＣＤ４+ＣＤ２５+Ｔ細胞はＩＬ−１０を放出した。また、共培養実験においては、ＣＤ４+ＣＤ２５+Ｔ細胞はＣＤ４+およびＣＤ８+Ｔ細胞の活性化および増殖を抑制した。抑制はＩＬ−１０に依存しないこと、かつマウスにおけるように接触依存性であることが実証された。調節性ＣＤ４+ＣＤ２５+  Ｔ細胞の同定は、ヒトにおける寛容の研究のために、特に自己免疫、移植および癌に関連して重大な意味を有する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、以下のものを提供する：
（１）抑制性および／または調節性ヒトＣＤ４+ＣＤ２５+Ｔ細胞；
（２）Ｔ細胞刺激剤または抗原提示細胞を用いて細胞をｅｘ  ｖｉｖｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏで刺激することを含んでなる、上記（１）に記載のＣＤ４+ＣＤ２５+Ｔ細胞を増殖させる方法；
（３）上記（２）に記載の方法、好ましくは上記（２）に記載のｅｘ  ｖｉｖｏ法によって得られる、増殖させたヒトＣＤ４+ＣＤ２５+Ｔ細胞；
（４）上記（１）または（３）に記載のヒトＣＤ４+ＣＤ２５+Ｔ細胞を含む医薬組成物；
（５）規制医薬品を調製するための、上記（１）または（３）に記載のヒトＣＤ４+ＣＤ２５+Ｔ細胞の使用；
（６）ＣＤ４+ＣＤ２５+Ｔ細胞をヒトの血液または他の組織からｅｘ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで同定し、モニターし、および／または除去する方法であって、
（ｉ）  Ｔ細胞上のＣＤ４、および／またはＣＤ２５、および／またはＣＴＬ−Ａ４（ＣＤ１５４）分子（ｅｎｔｉｔｉｅｓ）と特異的に結合する作用物質／リガンド、好ましくは抗ＣＤ４、および／または抗ＣＤ２５、および／または抗ＣＴＬ−Ａ４抗体を用いる；および／または
（ｉｉ）免疫吸着法を用いる；および／または
（ｉｉｉ）上記（２）に記載の刺激剤または抗原提示細胞を用いる；
ことを含む該方法；
（７）調節性ＣＤ４+ＣＤ２５+Ｔ細胞をｉｎ  ｖｉｖｏで誘導する作用物質を調製するための、好ましくは患者の自己免疫疾患を治療するための作用物質を調製するための、上記（２）に記載のＴ細胞刺激剤または抗原提示細胞の使用；
（８）上記（１）または（３）に記載のＣＤ４+ＣＤ２５+Ｔ細胞の、
（ａ）他の増殖および／または機能的修飾（抑制する／促進する）／アポトーシス性または抗アポトーシス性因子の同定を可能とするようなアッセイにおける
（ｂ）  ＣＤ４+ＣＤ２５+Ｔ細胞上の新規分子の同定を含む、ＣＤ４+ＣＤ２５+Ｔ細胞によって発現される分子を同定するため、または製薬的に活性とみなされる分子を提示しているかどうかを同定するため、または
（ｃ）調節性ＣＤ４+ＣＤ２５+Ｔ細胞の前駆体細胞または子孫を同定するため、
の使用；
（９）養子免疫伝達療法のための作用物質、自己免疫疾患を含むがそれらだけに限定されない、免疫性が増大した疾患を治療するための作用物質、または移植片対宿主病および移植片拒絶、等の移植反応を阻止／治療する作用物質を調製するための、上記（１）に記載の富化されたＣＤ４+ＣＤ２５+Ｔ細胞、または上記（３）に記載の増殖させたＴ細胞、または請求項９に記載の固定化されたＴ細胞の使用；
（１０）養子免疫伝達療法の方法であて、強すぎる、および／または病原性の免疫反応を阻止または治療するため、または移植片対宿主病および移植片拒絶、等の移植反応を阻止／治療するために、上記（１）または（３）に記載の富化／増殖させた自己または非自己の調節性ＣＤ４+ＣＤ２５+Ｔ細胞を患者に注射／注入することを含む、該養子免疫伝達療法の方法；
（１１）特定の所望の抗原特異的Ｔ細胞受容体を用いてＣＤ４+ＣＤ２５+Ｔ細胞を調製する方法であって、
（ｉ）  抗原提示細胞、好ましくは該抗原を提示する未成熟または成熟樹状細胞（ＤＣ）を用いて上記（１）に記載のＣＤ４+ＣＤ２５+Ｔ細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで活性化し／刺激し／増殖させる；または、
（ｉｉ）  ＣＤ４+ＣＤ２５+調節Ｔ細胞（のサブセット）上に発現される特定のＴ細胞受容体に対するリガンド／抗体、またはＣＤ４+ＣＤ２５+Ｔ細胞（のサブセット）上の特定のＴ細胞受容体に結合するＭＨＣ−ペプチド複合体を用いる；
ことを含む該方法；
（１２）上記（１１）に記載の方法によって、または所望の抗原特異性を有するＴ細胞受容体を単離された又は増殖させたＴ細胞にｅｘ  ｖｉｖｏでトランスフェクションすることによって得られるＣＤ４+ＣＤ２５+Ｔ細胞；
（１３）上記（１２）に記載のＴ細胞を含む医薬組成物であって、好ましくは該医薬組成物が自己免疫疾患、移植片対宿主病および移植片拒絶を含むがそれらだけに限定されない、免疫性が増大した疾患を治療するのに適する、該医薬組成物；および
（１４）抗ＣＤ２５および／または抗ＣＴＬ−Ａ４モノクローナル抗体等のリガンド／抗体、ＣＤ４+ＣＤ２５+Ｔ細胞（のサブセット）上のＴ細胞受容体と結合する抗体またはＭＨＣ−ペプチド複合体または他のリガンドを含むが、それらだけに限定されないＴ細胞上のＣＤ４および／またはＣＤ２５および／またはＣＴＬ−Ａ４（ＣＤ１５４）分子（ｅｎｔｉｔｉｅｓ）と特異的に結合する作用物質の、例えば腫瘍免疫を高めるためのＣＤ４+ＣＤ２５+Ｔ細胞によるｉｎ  ｖｉｖｏ弱化調節を含む免疫応答を増強するためにＣＤ４+ＣＤ２５+Ｔ細胞をｉｎ  ｖｉｖｏで除去する又はその機能を損傷させる薬剤を調製するための使用。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
本発明の実施形態（１）から（１４）を以下に詳細に説明する：
（Ａ）ヒトＣＤ４+ＣＤ２５+Ｔ細胞の表現型的特定により、ヒトの血液または他の組織からこれらの細胞をｅｘ  ｖｉｖｏ（以下、時々「ｉｎ  ｖｉｔｒｏ」という）またはｉｎ  ｖｉｖｏで同定し、モニターし（例えば、ＦＡＣＳによって）、単離および除去することが可能となる。この単離または除去は、ヒトの血液または他の組織を適切な作用物質とｅｘ  ｖｉｖｏで接触させることによって達成しうる。適切な作用物質とは、特に抗ＣＤ４、抗ＣＤ２５、抗ＣＴＬ−Ａ４（ＣＤ１５４）抗体等である。
【０００８】
（Ｂ）ＣＤ４+ＣＤ２５+Ｔ細胞は、適切なＴ細胞刺激剤または抗原提示細胞（以下、「ＡＰＣ」と略す）で処理することによって該細胞を刺激することにより、ｅｘ  ｖｉｖｏで増殖させることができる。上記（２）および（６）に記載の方法に適した適切なＴ細胞刺激剤としては、以下のものを含む組成物が挙げられる；
（ａ）スーパーアゴニスト性抗体を含む、抗ＣＤ３および／または抗ＣＤ２８リガンド／モノクローナル抗体（ｍＡｂ）、
（ｂ）  ＣＤ４+ＣＤ２５+Ｔ細胞表面上のＴ細胞受容体に対する、またはＴ細胞受容体成分に対するリガンド／抗体；または
（ｃ）調節Ｔ細胞の表面に発現されたＴ細胞受容体に結合するＭＨＣ−ペプチド複合体；または
（ｄ）  ＰＭＡ（および他のホルボールエステル）＋イオノマイシン（または他のカルシウムイオノフォア）。
【０００９】
本発明に用いる「リガンド」または「リガンド類」という用語は、特定の分子（ポリヌクレオチド、および細胞受容体、ＣＤ２５、ＣＴＬ−Ａ４、等のポリペプチドを含む）のに結合可能なあらゆる種類の化合物に関する。好ましいリガンドは、モノクローナル抗体またはそのフラグメントである。「リガンド」および「抗体」という用語は、本出願明細書を通して相互交換可能に用いられる。
【００１０】
適切なＡＰＣとしては、自己または非自己または人工の抗原提示細胞（例えば、樹状細胞（樹状細胞の調整については、例えば、ＷＯ９３／２０１８５、ＷＯ９７／２９１８２およびＥＰ−Ａ−０  ９２２  ７５８参照）等）が含まれる。該Ｔ細胞刺激剤および抗原提示細胞は、ＩＬ−２またはＩＬ−１５またはそれらの組み合わせと共に用いることができる。ＩＬ−２／ＩＬ−１５の代わりに、いくつかのサイトカイン受容体に共通したγ鎖を用いる他のサイトカイン（ＩＬ−７およびＩＬ−９を含むが、これらだけに限定されない）も使用可能である。さらに、他の調節細胞の生成を促進することが知られているＩＦＮαおよびＩＬ−１０（Ｇｒｏｕｘ，Ｈ．ら，Ｎａｔｕｒｅ  ３８９：７３７−７４２（１９９７）；  Ｒｏｎｃａｒｏｌｏ，Ｍ．Ｇ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９３：Ｆ５−Ｆ９（２００１））もまたこれらの細胞の生成／増殖を促進する。最後に、ポリクローナルなまたはオリゴクローナルな（例えば、スーパー抗原による）Ｔ細胞刺激のための他の方法もまた適用可能である（スーパーアゴニスト性抗体を含む抗ＣＤ３および／または抗ＣＤ２８リガンド／抗原；ＰＭＡ＋イオノマイシン；等）。これらの刺激剤または抗原提示細胞は、当業者にとって周知の量で増殖に使用することができる。
【００１１】
（Ｃ）ＣＤ４+ＣＤ２５+Ｔ細胞の同定は、例えば、自己免疫疾患と対抗するために調節Ｔ細胞を誘導するため、ＣＤ４+ＣＤ２５+Ｔ細胞をｉｎ  ｖｉｖｏでモニターし、増殖させる（例えば、ＩＬ−２＋ＩＬ−１５、ＩＬ−１０＋ＩＦＮα等の上記Ｔ細胞刺激剤を樹状細胞／抗原提示細胞と共に又は単独で患者に投与することによって）ことも可能とする。
【００１２】
（Ｄ）上記（１）または（３）に記載のＣＤ４+ＣＤ２５+Ｔ細胞または増殖させたＣＤ４+ＣＤ２５+Ｔ細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで（例えば、ＣＤ４+ＣＤ２５+Ｔ細胞を刺激する、または除去する、またはその機能を妨げるために）用いることができる他の増殖および／または機能的修飾（抑制性／促進性）／（アポトーシス性または抗アポトーシス性）因子を同定しうるアッセイに用いることができる。これらのＴ細胞は、ＣＤ４+ＣＤ２５+Ｔ細胞によって発現される分子を、ｍＡｂ生成、プロテオミクス、ＤＮＡチップ分析、差引きハイブリダイゼーション等の方法による同定にも適する。（特に、（ａ）「新規な」、すなわち、これまで知られていない分子の同定、または（ｂ）これらの分子が、ＣＤ４+ＣＤ２５+Ｔ細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏで「スイッチオン」または「スイッチオフ」するための新規な刺激性、抑制性またはアポトーシス誘導性薬剤を開発するにあたって、適切な医薬標的構造であるかどうかの同定。）また、これらのＴ細胞は、調節性ＣＤ４+ＣＤ２５+Ｔ細胞の前駆体細胞または子孫を同定するためにも適している。
【００１３】
（Ｅ）上記（１）または（３）に記載のＣＤ４+ＣＤ２５+Ｔ細胞または増殖させたＣＤ４+ＣＤ２５+Ｔ細胞は、養子免疫伝達療法に用いることができる。すなわち、あまりに強い、および／または病原性の免疫応答を阻止または治療するために、すなわち最も広い意味における自己免疫（エリテマトーデス、慢性間接リウマチ、多発硬化、尋常性天疱瘡、甲状腺炎、等の古典的自己免疫疾患、ならびに白斑、アトピー性皮膚炎、尋常性乾癬、等の病因に少なくとも何らかの自己免疫的側面を含むが、それらだけに限定されない）を治療するために、富化した／増殖させた自己または非自己の調節Ｔ細胞を患者に注射／注入するのである。また、これはＧＶＨＤ（移植片対宿主病）および移植片拒絶、等の移植反応を阻止／治療するためにも行われるものである。
【００１４】
（Ｆ）上記（１）または（３）に記載のＣＤ４+ＣＤ２５+Ｔ細胞または増殖させたＣＤ４+ＣＤ２５+Ｔ細胞［ならびに上記（２）に記載の増殖方法、上記（４）に記載の医薬組成物、および上記（５）および（７）から（９）に記載の使用］は、ＣＤ４+ＣＤ２５+Ｔ細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで活性化する／刺激する／増殖させるために、特定の所望の抗原特異的ＴＣＲ（Ｔ細胞受容体）を有するＣＤ４+ＣＤ２５+Ｔ細胞を生成し／増殖させるため、熟樹状細胞（ＤＣ）（または人工細胞を含む他の抗原提示細胞）と共に用いることができる。該樹状細胞または他の抗原提示細胞は、組織または（規定された、もしくは規定されていない）他の任意の抗原をパルスされ／負荷され／供給されるか、またはされない。規定された抗原の例としては、自己抗原（例えば、尋常性天疱瘡の場合にはデスモグレイン（ｄｅｓｍｏｇｌｅｉｎ）３；白斑の場合にはメランＡまたはチロシナーゼ；甲状腺炎の場合にはサイログロブリン）または外来抗原（例えば、Ｃ型肝炎のような病原体由来抗原を含む）、または同種異系抗原／移植抗原が含まれる。規定されていない抗原としては、組織または細胞由来抗原（例えば、壊死性またはアポトーシス性細胞、または組織由来ＲＮＡ、または興味のある細胞と樹状細胞／抗原提示細胞とのハイブリッド形態、または規定されない抗原の樹状細胞もしくは他の抗原提示細胞への送達という他の形態）または病原体由来抗原が含まれる。自己または非自己ＣＤ４+ＣＤ２５+Ｔ細胞および／または樹状細胞を用いうる。
【００１５】
（Ｇ）上記（１４）に記載のＴ細胞上のＣＤ４および／またはＣＤ２５および／またはＣＴＬ−Ａ４（ＣＤ１５４）分子（ｅｎｔｉｔｉｅｓ）と特異的に結合する作用物質は、免疫応答、例えば、ＣＤ４+ＣＤ２５+Ｔ細胞による、腫瘍免疫を高めるためのｉｎ  ｖｉｖｏ弱化調節を増大させるために、例えば、抗ＣＤ２５および／または抗ＣＴＬ−Ａ４ｍＡｂ（未改変の、またはトキシンとコンジュゲート化する等の改変されたｍＡｂ）によって、または免疫吸着法によって（血液をカラムに通し、そしてＣＤ４+ＣＤ２５+Ｔ細胞は該細胞の表面上に発現される分子に対する固相結合抗体、例えば、ＣＤ２５によって除去される）、ＣＤ４+ＣＤ２５+Ｔ細胞をｉｎ  ｖｉｖｏで除去するため、およびその除去をモニターするために用いることができる。
【００１６】
（Ｈ）本発明の別の好ましい実施形態においては、上記（３）に記載の増殖させた（すなわち、活性化された）ＣＤ４+ＣＤ２５+Ｔ細胞（ならびに上記（１）および（１２）に記載のＴ細胞）は固定することができる。そのような固定化Ｔ細胞は、（増殖させた）Ｔ細胞を適切な固定剤（パラホルムアルデヒドを含むが、それだけに限定されない）を用いてｅｘ  ｖｉｖｏ処理することによって得ることができる。好ましくは、固定化は細胞を０．５から５％（ｗ／ｗ）パラホルムアルデヒド水溶液、最も好ましくは約２％（ｗ／ｗ）パラホルムアルデヒド水溶液に１５分から３時間、最も好ましくは１時間懸濁し、その後適切な洗浄工程を実施することによって達成される。
【００１７】
（Ｉ）上記（５）に記載の薬剤、上記（９）および（１４）に記載の作用物質、または上記（１０）に記載の方法において使用されるＣＤ４+ＣＤ２５+Ｔ細胞は、自己または非自己調節Ｔ細胞であることができる。非自己調節Ｔ細胞の場合、該Ｔ細胞は上記（Ｈ）に記載するように固定化されることが好ましい。
【００１８】
（Ｊ）上記（４）および（１３）に記載の医薬組成物、上記（５）に記載の薬剤、上記（７）、（９）および（１４）に記載の作用物質、および上記（６）、（８）および（１０）に記載の方法に用いられるＴ細胞は、当業者に公知の薬学上／診断上適切な担体、溶剤、希釈剤および添加剤、等のさらなる成分を含んでもよい。これらの成分の濃度は、当業者によってそれぞれの目的に合わせて適切に選択される。
【００１９】
過去２〜３年の間に齧歯類における数個の調節細胞種（これらの相互関係はまだ最終的に明らかにされていない）がさらに報告されたことにより、サプレッサーまたは免疫調節Ｔ細胞という概念は再生した。いわゆるＴｒ１およびＴｈ３細胞は、直接的な細胞接触を必要とせずに、高レベルのＩＬ−１０およびＴＧＦ−βをそれぞれ分泌することによってバイスタンダー抑制を介在する（Ｇｒｏｕｘ，Ｈ．ら，Ｎａｔｕｒｅ  ３８９：７３７−７４２（１９９７）；  Ｆｕｋａｕｒａ，Ｈ．ら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９８：７０−７７（１９９６））。調節Ｔ細胞集団のうち、これまでに最もよく特定され、そして最も重要と思われる集団のうち、同定された集団はＣＤ４+ＣＤ２５+Ｔ細胞である。この細胞は齧歯類に本来的に存在し（リンパ器官におけるＣＤ４+細胞の約１０％に相当する）、ＣＤ２５（ＩＬ−２Ｒ−α）の構成発現によって特定され、そしてｉｎ  ｖｉｖｏにおける寛容の維持および自己免疫疾患の防止に決定的に重要であることが明らかである。驚くべきことに、ヒトにおける等価の特性を示す細胞集団は今日まで報告がない。ここに我々は、従来の記憶Ｔ細胞に相当すると考えられていたヒト血液中のＣＤ４+ＣＤ２５+Ｔ細胞が（Ｋａｎｅｇａｎｅ，Ｈ．ら，Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３：１３４９−１３５６（１９９１）；Ｔａｋａ，Ｋ．ら，Ｉｍｍｕｎｏｌ．７２：１５−１９（１９９０）；Ｊａｃｋｓｏｎ，Ａ．Ｌ．ら，Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ．５４：１２６−１３３（１９９０））、実は、齧歯類において長年にわたって知られ、かつ研究されてきた固有のＣＤ４+ＣＤ２５+調節Ｔ細胞のヒトにおける対応物であると思われることを示した。我々は、成人血液からかなりの量（ＣＤ４+細胞の平均６％）のＣＤ４+ＣＤ２５+Ｔ細胞を単離することができ、詳細な研究およびＣＤ４+ＣＤ２５-Ｔ細胞との比較を行うことができた。その結果、ヒトＣＤ４+ＣＤ２５+Ｔ細胞はマウスＣＤ４+ＣＤ２５+  免疫調節Ｔ細胞と重大な表現型および機能的特徴を共有することが判明した。最も興味深く、以前には同定されなかった表現型的特徴は、ＣＴＬＡ−４分子（ＣＤ１５２）がヒトＣＤ４+ＣＤ２５+Ｔ細胞によってすでに構成的に発現されており（細胞内では高レベルで、表面では低レベルで）、ＴＣＲを介した刺激後、さらにアップレギュレーションされ、そしてその後少なくとも１週間は表面で高レベルを維持したことであった（これは、刺激後、ｄｅ  ｎｏｖｏにおいてＣＴＬＡ−４を発現したが、その発現はごく一過性であったＣＤ４+ＣＤ２５-Ｔ細胞とはっきりとした対照をなす）（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｃ．Ｂ．，Ａｌｌｉｓｏｎ，Ｊ．Ｐ．，  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，７：４４５−４５０（１９９８）；Ｃｈａｍｂｅｒｓ，Ｃ．Ａ．ら，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．１５３：２７−４６（１９９６））。ＣＤ４+ＣＤ２５-によるＣＴＬＡ−４の発現パターンは、マウスＣＤ４+ＣＤ２５+調節Ｔ細胞との関係をすでに裏付けるものであった。なぜなら、後者の細胞はそのｉｎ  ｖｉｖｏ抑制活性に必須の分子としてＣＴＬＡ−４を構成的に発現するからである（Ｒｅａｄ，Ｓ．ら，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９２：２９５−３０２（２０００；Ｓａｌｏｍｏｎ，Ｂ．ら，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，１２：４３１−４４０（２０００））。マウス対応物と同様に、ヒトＣＤ４+ＣＤ２５+Ｔ細胞も、プレート結合抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８によってポリクローナルな活性化に対しても、その後の最も有効な本来的な免疫刺激細胞、すなわち成熟（同種異系）ＤＣを用いて刺激しても（反復してさえも）、刺激に際してほとんど増殖を示さなかった。これらの刺激を高用量のＩＬ−２  （５００  Ｕ／ｍｌ）と組み合わせた場合、マウスについて記載されているようにアネルギーが部分的にくつがえされた（Ｔｈｏｒｔｏｎ，Ａ．Ｍ．，Ｓｈｅｖａｃｈ，Ｅ．Ｍ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４：１８３−１９０  （２０００））。高用量のＩＬ−１５  （５０−１００  ｎｇ／ｍｌ）が匹敵する増殖を誘導したこと、およびＩＬ＝２およびＩＬ−５を組み合わせた場合の作用は低用量（それぞれ１０  Ｕ／ｍｌおよび１０  ｎｇ／ｍｌ）でも強力な相乗作用を有し、活発な増殖を誘導した、という新たな発見があった。ＣＤ４+ＣＤ２５+Ｔ細胞の増殖は、潜在的な治療の適用および更に詳細な研究（作用機構および分子的研究を含む）のためのこれらの細胞のクローニングに不可欠であるため、上記の発見が重要であることが判明するであろう。興味深いのは、中和性抗ＩＬ−１０  ｍＡｂが増殖を促進しなかったことで、これらの細胞によるＩＬ−１０放出が自己分泌様式においてアネルギーを引き起こしていないことが示された。共培養実験において、ＣＤ４+ＣＤ２５+Ｔ細胞は別の重要な特徴を示した。すなわち、これらの細胞は自身のＴＣＲを介して活性化された後にのみ、接触および用量依存的で、かつサイトカイン非依存的に、ＣＤ２５-ＣＤ４+または  ＣＤ８+Ｔ細胞の増殖を抑制した。我々のｅｘ  ｖｉｖｏ系では、この抑制が最近ＴＣＲトランスジェニックマウスを用いて示されたように（Ｔｈｏｒｔｏｎ，Ａ．Ｍ．，Ｓｈｅｖａｃｈ，Ｅ．Ｍ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４：１８３−１９０（２０００））、完全に抗原非特異的なものかどうか調べることはできなかった。しかし、これらの細胞を増殖させるための我々のＩＬ−２＋ＩＬ−１５アプローチを用いれば、個々の作用機構研究は可能であろう。
注目すべきことは、我々がヒト血液からｅｘ  ｖｉｖｏで単離したＣＤ４+ＣＤ２５+Ｔ細胞と実質的に同一の調節特性および表現型を有するＴ細胞が、未成熟ＤＣを用いてヒトの未処置Ｔ細胞を反復刺激することによってｉｎ  ｖｉｔｒｏで作製できると示した最近の報告である（Ｊｏｎｕｌｅｉｔ，Ｈ．ら，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９２：１２１３−１２２２（２０００））。マウスにおいては、ＣＤ４+ＣＤ２５+調節Ｔ細胞集団は胸腺でたえず作られているが（Ｉｔｏｈ，Ｍ．ら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６２：５３１７−５３２６（１９９９））、末梢における調節Ｔ細胞の維持には組織特異抗原およびＩＬ−２の存在が必要である（２５，２６）。２つの他の発見（Ｊｏｎｕｌｅｉｔ，Ｈ．ら，Ｊ．Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．１９２：１２１３−１２２２（２０００））に基づいて、アポトーシス性抗体の摂取を介して末梢組織をサンプリングした未成熟ＤＣ（Ｓｔｅｉｎｍａｎ，Ｒ．Ｍ．ら，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９１：４１１−４１６（２０００）：Ｒｏｎｃａｒｏｌｏ，Ｍ．Ｇ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９３：Ｆ５−Ｆ９（２００１））および最近の普遍的又は組織特異的な自己抗原が、胸腺調節Ｔ細胞の移動における生存およびおそらく増殖程度がわずかであることの原因であると確かに推測しがちである。Ｅｘ  ｖｉｖｏで単離されたＣＤ４+ＣＤ２５+調節Ｔ細胞の生存は未成熟ＤＣとの相互作用によって促進されうると思われる。また、最近報告された、未成熟ＤＣによる未処置Ｔ細胞からのＣＤ４+ＣＤ２５+Ｔ細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ「生成」は（Ｊｏｎｕｌｅｉｔ，Ｈ．ら，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９２：１２１３−１２２２（２０００））、むしろ最初の接種物中にあらかじめ存在しているＣＤ４+ＣＤ２５+が持続的に生存していることを表すものと思われる。同種異系の成熟ＤＣは調節の有効なインデューサーであったが、ｅｘ  ｖｉｖｏで単離されたヒトＣＤ４+ＣＤ２５+  Ｔ細胞と同遺伝子型成熟ＤＣとの相互作用は、それらの抑制特性を活性化するには不十分であることが見出されたことにもまた注目すべきである。この観察は、検証可能な仮説を再度示唆する。例えば、成熟同系ＤＣに対して未成熟な同系ＤＣはＣＤ４+ＣＤ２５+Ｔ細胞を活性化するか（それらが相互作用のための何らかの特異的リガンドを担持することを示唆する）、または上記ＤＣはアポトーシス体の摂取後にのみ、その活性化を行うか（自己抗原の提示が必要であることを示唆する）？さらに、ごくわずかのリコール抗原（例：インフルエンザタンパク質／ペプチド）を提示する成熟ＤＣは、ＣＤ４+ＣＤ２５-Ｔ細胞集団およびＣＤ４+ＣＤ２５+Ｔ細胞集団の両方でＴ細胞を刺激できるか（自己抗原の他に外来抗原の認識も炎症部位において調節の引き金をひきうることを示唆する）。
【００２０】
要約すれば、健常なヒト成人の末梢血中に、かなり大きい集団（約６％）のＣＤ４+ＣＤ２５-Ｔ細胞が存在することが示された。以前に考えられていたのとは対照的に、これらの細胞は従来の記憶Ｔ細胞ではなく、齧歯類において多年にわたって研究されてきたＣＤ４+ＣＤ２５-「プロフェッショナル」抑制／調節Ｔ細胞のユニークな集団と同等な調節Ｔ細胞である。ヒトＣＤ４+ＣＤ２５+調節Ｔ細胞の同定および特定は、種々の病態におけるそれらのモニタリングを可能とし、そして自己免疫、移植片拒絶、および癌を理解し、治療するうえで重大な意味がある。
【００２１】
本発明を以下の図および実施例によってさらに詳しく説明するが、これらは本発明を限定するものではない。
【００２２】
図
図１：ＣＤ４+ＣＤ２５+Ｔ細胞は、ＣＤ４+ＣＤ２５-Ｔ細胞に対して明確な表現型的相違を示す。陰性ＭＡＣＳソーティングによってＰＢＭＣからＣＤ４+Ｔ細胞を単離し、高度に精製された未処置ＣＤ４+Ｔ細胞を得た。これらの細胞を抗ＣＤ２５磁性ビーズで標識し、ソーティングした。
（Ａ）：ソーティングにより実質的に純粋なＣＤ２５+Ｔ細胞が得られた。２０回の独立した、標準化された実験の代表的な結果を示す。
（Ｂ）：ＣＤ４+ＣＤ２５+、ＣＤ４+ＣＤ２５-および活性化ＣＤ４+ＣＤ２５-Ｔ細胞の表現型を「材料および方法」の項に記載するように分析した。さらに、固定化抗ＣＤ３＋可溶性抗ＣＤ２８を用いてＣＤ４+ＣＤ２５-Ｔ細胞を活性化した。活性化後、細胞を抗ＣＤ２５磁性ビーズで標識し、ソーティングした。５つの独立した実験で、結果は類似していた。
（Ｃ）：抗ＣＴＬＡ−４抗体を用いてＣＤ４+ＣＤ２５+およびＣＤ４+ＣＤ２５-Ｔ細胞を３７℃で２時間染色した。染色はｅｘ  ｖｉｖｏで、そして固定化抗ＣＤ３＋可溶性抗ＣＤ２８を用いた活性化の後の異なる時点で実施した。４つの独立した実験の代表的結果を示す。
【００２３】
図２：ＣＤ４+ＣＤ２５+Ｔ細胞は、同種異系刺激およびポリクローナルな刺激の両方に対して非増殖性／アネルギー性である。これはＩＬ−２および／またはＩＬ−１５の添加によって部分的にくつがえされるが、中和性抗ＩＬ−１０抗体によってはくつがえされない。
（Ａ）：ＣＤ４+ＣＤ２５+およびＣＤ４+ＣＤ２５-Ｔ細胞を図１に示すＭＡＣＳソーティングによって成人血液から単離した。Ｔ細胞１ｘ１０5個／９６ウエルを異なる数の成熟同種異系ＤＣで刺激した。Ｔ細胞の増殖（３つの培養物）を［3Ｈ］Ｔｄｒ取り込みによって測定した。６つの独立した実験において結果は類似していた。
（Ｂ）：全ＣＤ４+、ＣＤ４+ＣＤ２５+およびＣＤ４+ＣＤ２５-Ｔ細胞を上記（Ａ）に記載するように処理した。３つの培養物における増殖を［3Ｈ］Ｔｄｒ取り込みによって測定した（５つの独立した実験の代表的結果）。
（Ｃ）：ＭＡＣＳソーティングを行ったＣＤ４+ＣＤ２５+およびＣＤ４+ＣＤ２５-Ｔ細胞をプライミングし、同一ドナー由来の成熟同種異系ＤＣで毎週再刺激した（ＤＣ：Ｔ細胞比は１：２０）。増殖（Ｔ細胞１ｘ１０5個／９６ウエル）を［3Ｈ］Ｔｄｒ取り込みによって測定した。３つの独立した実験において類似の結果が得られた。
（Ｄ）：固定化抗ＣＤ３（１０μｇ／ｍｌ）および可溶性抗ＣＤ２８（１０μｇ／ｍｌ）を用いて（上のパネル）、または成熟同種異系ＤＣを用いて上記（Ａ）に記載するように（下のパネル）、ＣＤ４+ＣＤ２５+およびＣＤ４+ＣＤ２５-Ｔ細胞を刺激した。５００Ｕ／ｍｌのＩＬ−２、１００ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１５、１０Ｕ／ｍｌのＩＬ−２＋１ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１５の混合物、または１０μｇ／ｍｌの抗ＩＬ−１０を培養開始時に添加した。培養開始の５日後に［3Ｈ］Ｔｄｒ取り込みを測定した。３つの独立した実験のうち１つを示す。ポリクローナルなまたは同種異系Ｔ細胞刺激物の不存在下でのＩＬ−２および／またはＩＬ−５の添加は、ＣＤ２５+またはＣＤ２５-Ｔ細胞サブセットにおいて著しい増殖を誘導しなかった（データはここに示していない）。
【００２４】
図３：ＴＣＲによって刺激された場合、ＣＤ４+ＣＤ２５+Ｔ細胞はＣＤ４+およびＣＤ８+Ｔ細胞の活性化を細胞接触および用量依存的に抑制する。
（Ａ，Ｂ）：ＭＡＣＳソーティングを行った全ＣＤ４+（Ａ）およびＣＤ８+（Ｂ）Ｔ細胞（１ｘ１０5個／９６ウエル）を図に示した比でＣＤ４+ＣＤ２５+Ｔ細胞に添加し、そしてＤＣ対ＣＤ４+またはＣＤ８+Ｔ細胞の比を１：２０として同種異系ＤＣで刺激した。５日後に［3Ｈ］Ｔｄｒ取り込みによって増殖を測定した。５つの独立した実験のうち１つを示す。
（Ｃ）：同一ドナー（ドナーＩ）からＤＣおよびＣＤ４+ＣＤ２５+Ｔ細胞を生成させ／単離した。さらに、別のドナー（ドナーＩＩ）から全ＣＤ４+Ｔ細胞およびＣＤ４+ＣＤ２５+Ｔ細胞を単離した。全ＣＤ４+Ｔ細胞１０5個／９６ウエルをＤＣ細胞５ｘ１０3個／ウエルと共に培養した（すなわち、ＤＣ：Ｔ比＝１：２０；結果はＤＣ：Ｔ比が１：１００の場合（データはここに示していない）に匹敵した）。次に、ドナーＩおよびドナーＩＩ由来のＣＤ４+ＣＤ２５+  Ｔ細胞をそれぞれ添加した。培養開始から５日後に［3Ｈ］Ｔｄｒ取り込みによって増殖を測定した。３つの独立した実験の代表的な結果を示す。
（Ｄ）：全ＣＤ４+Ｔ細胞またはＣＤ４+ＣＤ２５+Ｔ細胞（Ｔ細胞１０5個／９６ウエル）を５ｘ１０3個の同種異系成熟ＤＣで刺激した（ＤＣ：Ｔ比  ＝  １：２０）（上の２つのパネル）。さらに、全ＣＤ４+Ｔ細胞を１：１の比でＣＤ４+ＣＤ２５+Ｔ細胞と共に共培養し（Ｔ細胞１０5個／９６ウエルのそれぞれ）、そして１０μｇ／ｍｌの抗ＩＬ−１０、２μｇ／ｍｌのＴＧＦ−β、５００Ｕ／ｍｌのＩＬ−２、５０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１５、または１０Ｕ／ｍｌのＩＬ−２と１ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１５との混合物の存在下または不存在下で、ＤＣ：Ｔ比を１：２０として同種異系ＤＣを用いて再度刺激した。平行して行ったＴｒａｎｓｗｅｌｌアプローチでは、同種異系ＤＣを用いてＴｒａｎｓｗｅｌｌチェンバー内でＣＤ４+ＣＤ２５+Ｔ細胞を刺激し（ＤＣ／Ｔ細胞比は１：２０）、そして全ＣＤ４+Ｔ細胞レスポンダーを同種異系ＤＣと共にＤＣ：Ｔ比＝１：２０で再度ウエルに入れた。培養開始から５日後に［3Ｈ］Ｔｄｒ取り込みによって増殖を測定した。４つの代表的実験のうち１つを示す。
【００２５】
図４：ＣＤ４+ＣＤ２５+およびＣＤ４+ＣＤ２５-Ｔ細胞の異なるサイトカインプロフィール。
（Ａ）：ＭＡＣＳソーティングを行ったＣＤ４+ＣＤ２５+およびＣＤ４+ＣＤ２５-Ｔ細胞をＰＭＡ（２０ｎｇ／ｍｌ）およびＡ２３１８７Ｃａ2+イオノフォア（５００μｇ／ｍｌ）で６時間刺激した。最後の５時間の間、モネンシン（Ｍｏｎｅｎｓｉｎ）（２μＭ）を添加した。ＣＤ３表面発現の染色を実施した。細胞を洗浄し、固定し、透過性とし、そして細胞内サイトカインの検出のためＦＩＴＣ−またはＰＥ−結合特定抗体を用いて染色した。類似の結果が得られた５つの独立した実験のうち１つを示す。結果は、Ｔ細胞をプレート結合抗ＣＤ３＋可溶性抗ＣＤ２８ＡＢで刺激した場合（データはここに示していない）と同じであった。
（Ｂ）：ＣＤ４+ＣＤ２５+およびＣＤ４+ＣＤ２５-Ｔ細胞をプレート結合抗ＣＤ３＋可溶性抗ＣＤ２８で活性化した。培養開始４８時間後に、ＲＮａｓｅプロテクションアッセイによりＲＮＡ発現の分析を実施した。
（Ｃ）：上清中のサイトカインをＥＬＩＳＡによって測定した（５つの独立した実験のうち１つを示す）。
【００２６】
材料および方法
培養培地：１％熱不活化自己血漿、２０μｇ／ｍｌゲンタマイシン（Ｍｅｒｃｋ）および２  ｍＭグルタミン（Ｂｉｏ  Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ）を補充したＲＰＭＩ  １６４０（Ｂｉｏ  Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ）を樹状細胞（ＤＣ）の作製に用いた；１％熱不活化単一ドナーヒト血清、２０μｇ／ｍｌゲンタマイシン（Ｍｅｒｃｋ）および２ｍＭグルタミン（Ｂｉｏ  Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ）を補充したＸ−ＶＩＶＯ−２０  （Ｂｉｏ  Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ）をＴ細胞培養に用いた。
サイトカイン：この実験に用いた全てのサイトカインは組み換えヒトタンパク質であった。最終濃度は、ＧＭ−ＣＳＦ  １，０００Ｕ／ｍｌ（ＬｅｕｋｏｍａｘTM；Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、ＩＬ−４  ８００Ｕ／ｍｌ（Ｓａｎｄｏｚ）であった。ＩＬ−２（Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ；Ｃｈｉｒｏｎ  Ｃｏｒｐ．）およびＩＬ−１５（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ）は、指示した濃度で使用した。ＤＣを成熟させるため、我々はＩＬ−１β  ２ｎｇ／ｍｌ（Ｓｉｇｍａ）；  ＩＬ−６  １０００Ｕ／ｍｌ（Ｓａｎｄｏｚ）；ＴＮＦ−α  １０ｎｇ／ｍｌ（Ｂｅｎｄｅｒ，Ｖｉｅｎｎａ）およびＰＧＥ2  １μｇ／ｍｌ（Ｓｉｇｍａ）からなるカクテルを用いた。
抗体：免疫染色のため、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ１４、ＣＤ１９、ＣＤ２５、ＣＤ２８、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ５６、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ８６、ＣＤ９５、ＣＤ９５Ｌ、ＣＤ１２２、ＣＤ１５２、ＣＤ１５４、ＨＬＡ−ＤＲに対するＰＥ−およびＦＩＴＣ−結合抗体（Ａｂ）（すべてＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ製）、ならびにそれぞれのマウスおよびラットイソタイプ対照を用いた。細胞内サイトカイン染色に用いたＡｂは、ＦＩＴＣ−およびＰＥ−結合抗ＩＬ−２（ＭＱ１−１７Ｈ１２）、抗ＩＬ−４（８Ｄ４−８）、抗ＩＬ−１０（ＪＥＳ３−１９Ｆ１）および抗ＩＦＮ−γ（４Ｓ．Ｂ３）（すべてＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ製）であった。未結合抗ＩＬ−１０（ＪＥＳ３−１９Ｆ１）（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）および抗ＴＧＦ−β（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を中和実験に使用し、抗ＣＤ３（ＵＣＨＴ１）および抗ＣＤ２８（ＣＤ２８．２）をＴ細胞のポリクローナルな活性化に用いた。
サイトカインアッセイ：Ｘ−ＶＩＶＯ−２０＋１％血清中で、Ｔ細胞を同種異系ＤＣまたはプレート結合抗ＣＤ３（１０μｇ／ｍｌ）＋可溶性抗ＣＤ２８（１０μｇ／ｍｌ）で刺激した。ヒトＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＩＦＮ−γおよびＴＧＦ−β用の市販のＥＬＩＳＡキット（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を用いた上清の分析によって、異なる時点で、サイトカイン分析を実施した。細胞内サイトカイン産生を分析するため、Ｔ細胞をＰＭＡ  （２０ｎｇ／ｍｌ）およびＣａ2+イオノフォアＡ２３１８７（５００μｇ／ｍｌ）（ともにＳｉｇｍａ製）で６時間、またはプレート結合抗ＣＤ３および可溶性抗ＣＤ２８  Ａｂで６時間刺激した。培養の最後の５時間の間、モネンシン２μＭ（Ｓｉｇｍａ）を添加した。細胞を回収し、洗浄し、固定し、サポニンで透過性とし（Ｆｉｘ／ｐｅｒｍ溶液、ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）、そしてサイトカイン特異的Ａｂまたはイソタイプで染色した。サイトカインｍＲＮＡ分析のためには、Ｔ細胞をプレート結合抗ＣＤ３および可溶性抗ＣＤ２８  Ａｂで刺激した。ＲＮａｓｅプロテクションアッセイテンプレートセット（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）によって細胞を分析した。
細胞単離およびＤＣ作製：ＤＣは、軟膜または白血球採血物（両方ともＤｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅより入手。インフォームドコンセントが与えられた後に健常なドナーから得たもの）から文献に記載されているように作製した（１８、１９）。すなわち、フィコール密度勾配遠心分離によりＰＢＭＣを単離した。プラスチック接着によって単球を単離し、そしてＩＬ−４およびＧＭ−ＣＳＦを補充したＲＰＭＩ培地で培養した。６日目に成熟カクテル（ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＰＧＥ2およびＴＮＦα）を添加した。７日目に非接着性細胞を回収し、共刺激分子（ＣＤ８０、ＣＤ８６およびＣＤ８３）について９０％以上二重陽性である成熟ＤＣを構成した。
陰性ＣＤ４+Ｔ細胞単離セット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いてＰＢＭＣからＣＤ４+Ｔ細胞を単離した。ＣＤ２５マイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いて、純粋な未処置ＣＤ４+Ｔ細胞からＣＤ４+ＣＤ２５+Ｔ細胞を単離した。ＣＤ８+Ｔ細胞の単離は、陰性ＣＤ８+Ｔ細胞単離セット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いて実施した。ＦＡＣＳによって純度を評価した。
フローサイトメトリー分析：免疫蛍光染色のため、細胞を洗浄し、各抗体の最適希釈物を２０分間４℃で染色した。細胞を再度洗浄し、フローサイトメトリーで分析した（ＦＡＣＳ  ＳｃａｎTM  ＣＥＬＬＱｕｅｓｔTMソフトウエア：Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）。細胞表面ＣＤ１５２発現の分析のため、細胞を適切な抗体を２時間３７℃で染色した。
増殖アッセイ：異なるＣＤ４+サブタイプの増殖を評価するため、ソーティングしたＴ細胞１０5個をＸ−ＶＩＶＯ−２０中で異なる数のＤＣと共に、または異なる濃度のプレート結合抗ＣＤ３＋可溶性抗ＣＤ２８と共に、９６ウエルプレートを用いてインキュベートした。調節特性を評価するためには、１０5個のバルクＣＤ４+Ｔ細胞を９６ウエルプレート中で５ｘ１０3個（いくつかの実験では１ｘ１０3個）のＤＣと共に培養した。精製ＣＤ４+ＣＤ２５+またはＣＤ４+ＣＤ２５-Ｔ細胞を異なる濃度で添加した。４−５日培養した後、［3Ｈ］Ｔｄｒ（３７ＫＢｑ／ウエル）を添加し、さらに１６時間培養した。液体シンチレーションカウンターを用いて増殖を測定した。
Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ実験：２４ウエルプレートを用いてＴｒａｎｓｗｅｌｌ実験を実施した。１０6個のバルクＣＤ４+Ｔ細胞を５ｘ１０3個のＤＣで刺激した。さらに、１０6個のＣＤ４+ＣＤ２５+またはＣＤ４+ＣＤ２５-Ｔ細胞を培養物に直接添加するか、またはＴｒａｎｓｗｅｌｌチェンバー（Ｍｉｌｌｉｃｅｌｌ，０．４μｍ：Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に入れた。５日間培養後、Ｔ細胞を９６ウエルプレート３枚に移した（１０5個／ウエル）。［3Ｈ］Ｔｄｒで１６時間パルスした後、液体シンチレーションカウンターを用いて増殖を測定した。
【実施例】
【００２７】
実施例１：ＣＤ４+ＣＤ２５+Ｔ細胞は、同種異系およびポリクローナルな刺激の両方に対して増殖応答が低い。
増殖可能性が低いことは、マウス系において十分特定された調節性ＣＤ４+ＣＤ２５+Ｔ細胞に高度に特徴的である（Ｓａｋａｇｕｃｈｉ，Ｓ．ら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５５：１１５１−１１６４（１９９５））。ヒトＣＤ４+亜集団の増殖能を分析するため、ＣＤ４+  Ｔ細胞をＣＤ２５の発現について磁性によりソーティングした。ＭＡＣＳ  ＣＤ４陰性選択キットを用い、その後でＣＤ２５について陽性選択を用いることによって、ＣＤ４+ＣＤ２５+Ｔ細胞の９５％以上純粋な集団を得た（図１Ａ）。これらの細胞は、我々が試験した健常な成人の血液中の末梢ＣＤ４+Ｔ細胞の約６％（２．８−１７．２％，ｎ＝２０）を構成していた。
成熟ＤＣは最も強力な抗原提示細胞として知られている（Ｂａｎｃｈｅｒａｕ，Ｊ．，Ｓｔｅｉｎｍａｎ，Ｒ．Ｍ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３９２：２４５−２５２（１９９８））。しかし、ＣＤ４+ＣＤ２５+Ｔ細胞は十分成熟した同種異系ＤＣでｉｎ  ｖｉｔｒｏで刺激された場合、増殖応答を実質的にまったく示さなかった。これはＣＤ４+ＣＤ２５-Ｔ細胞（図２Ａ、Ｂ）または全ＣＤ４+集団（図２Ｂ）とはっきりとした対照をなした。興味深いことに、ＣＤ２５+Ｔ細胞を枯渇させたＣＤ４+集団は、同種異系ＤＣで刺激された場合、全ＣＤ４+集団よりも高い増殖を示した（図２Ｂ）。
次に、ＣＤ４+ＣＤ２５+Ｔ細胞は成熟ＤＣで反復刺激した場合にのみ増殖するのかどうかを確認した。再刺激後、ＣＤ２５-Ｔ細胞の増殖応答は幾分増大したが、ＣＤ２５+Ｔ細胞の応答は非常に低いままであった（図２Ｃ）。同種異系成熟ＤＣによるプライミングおよび再刺激は、再刺激の２ラウンド終了後にＣＤ２５-集団の３０から５０倍の増大をもたらした。対照的に、ＣＤ２５+集団には著しい増大は見られなかった（データはここに示していない）。最初の接種物と比較すると絶対数が軽度（約１０％）に低下したＣＤ４+ＣＤ２５+Ｔ細胞が、反復刺激後に、著しいアポトーシスまたは壊死が明らかに存在しない状態で回収された（データはここに示していない）。
ＣＤ４+ＣＤ２５+Ｔ細胞の増殖応答が非常に低いことは、これらの細胞集団をプレート結合抗ＣＤ３＋可溶性抗ＣＤ２８でポリクローナルに刺激した場合にも明らかであった（図２Ｄ）。Ｔ細胞増殖因子であるＩＬ−２およびＩＬ−１５が増殖可能性に影響を及ぼしうるかどうかを試験するため、種々の用量をＣＤ４+ＣＤ２５+およびＣＤ４+ＣＤ２５-Ｔ細胞に添加し、これらの細胞を固定化抗ＣＤ３＋可溶性抗ＣＤ２８（図２Ｄ、上のパネル）または成熟同種異系ＤＣ（図２Ｄ、下のパネル）で刺激した。一連の予備実験は、高用量（１００−１０００  Ｕ／ｍｌ）の場合にのみＩＬ−２がＣＤ２５+Ｔ細胞の増殖を促進することを明らかにした。ＩＬ−１５は、５０−１００ｎｇ／ｍｌという非常に高い用量でのみ類似の効果を有した。これらのサイトカインを混合した場合、それらは強い相乗効果を有し、１０Ｕ／ｍｌのＩＬ−２および１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１５という用量がＣＤ４+ＣＤ２５+Ｔ細胞の増殖を促進するに十分であった。ポリクローナルまたは同種異系Ｔ細胞刺激がない状態でＩＬ−２および／またはＩＬ−１５を添加しても、ＣＤ２５+またはＣＤ２５-Ｔ細胞サブセットの顕著な増殖は誘導されなかった（データはここに示していない）。
【００２８】
実施例２：ＣＤ４+ＣＤ２５+Ｔ細胞は、ＣＤ４+ＣＤ２５-Ｔ細胞に対して明確な表現型的相違を示す。
ＣＤ４+ＣＤ２５+Ｔ細胞集団をさらに特定するため、ＣＤ４+ＣＤ２５+およびＣＤ４+ＣＤ２５-上の種々の表面分子の発現を、刺激したＣＤ４+ＣＤ２５-Ｔ細胞上の分子の発現と比較した（図１Ｂ）。３つの集団の全てがＣＤ３およびＣＤ４の相同発現を示した。ＦＡＣＳ分析の結果、単球、Ｂ細胞、ＣＤ８+Ｔ細胞またはＮＫ細胞等の細胞の混入は全く見られなかった（データはここに示していない）。予め刺激しない場合、すなわちｅｘ  ｖｉｖｏでＣＤ２５+集団はすでに細胞内で高レベルにおよび細胞表面ＣＴＬＡ−４  （ＣＤ１５２）で低レベルに発現していた。Ｅｘ  ｖｉｖｏで単離されたＣＤ４+ＣＤ２５+  Ｔ細胞はさらにＣＤ１２２（ＩＬ−２Ｒβ鎖）およびＨＬＡ−ＤＲ（約５０％）を構成的に発現し、そして主として（約８０％）記憶Ｔ細胞表現型に類似したＣＤ４５ＲＯ細胞から成っていた。きわめて対照的に、ｅｘ  ｖｉｖｏで単離されたＣＤ４+ＣＤ２５-Ｔ細胞は、ＣＴＬＡ−４（細胞内にも表面上にも）、ＣＤ１２２またはＨＬＡ−ＤＲを発現せず、ＣＤ４５ＲＯよりもＣＤ４５ＲＡを発現する細胞の方が多かった。しかし、プレート結合抗ＣＤ３＋可溶性抗ＣＤ２８で活性化した後、ほとんどのＣＤ４+ＣＤ２５-は強くＣＤ２５+となり（ＣＤ２５の発現レベルはＣＤ４+ＣＤ２５+Ｔ細胞と比較して約１対数分だけ高かった）、そして予想通り、高レベルのＨＬＡ−ＤＲおよびＣＤ１２２を示した（ここでもＣＤ４+ＣＤ２５+Ｔ細胞と比較して約１対数分だけ高かった）。さらに、細胞内および表面ＣＴＬＡ−４の両者は、２４−４８時間以内にアップレギュレーションされたが、予想通りその後急速にダウンレギュレーションされた（図１Ｃ）。ＣＴＬＡ−４／ＣＤ１５２発現の速度論は、ＣＤ４+ＣＤ２５+Ｔ細胞が刺激された場合は顕著に異なることが判明した。これらの細胞もまた（わずかとはいえ構成的にすでに存在している）ＣＤ１５２表面発現をアップレギュレーションし、ＣＤ１５２の発現は、強度に１週間以上にわたって一定を保たれた（図１Ｃ）。抗ＣＤ２８、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ６９、ＣＤ９５、ＣＤ９５Ｌ、ＣＤ１５４  （ＣＤ４０Ｌ）等のいくつかの他のｍＡｂを用いた染色では、ＣＤ４+ＣＤ２５+とＣＤ４+ＣＤ２５-Ｔ細胞との間で再現性はなく、著しい相違も明らかにされなかった。
【００２９】
実施例３：ＣＤ４+ＣＤ２５+Ｔ細胞は、ＴＣＲを介して刺激された場合、ＣＤ４+およびＣＤ８+Ｔ細胞の活性化を細胞接触依存的および用量依存的に抑制する。
ＣＤ２５+Ｔ細胞の推定上の調節特性を分析するため、共培養実験を実施した。最初の一連の試験で、我々は特定のドナーから全ＣＤ４+集団ならびにＣＤ２５+およびＣＤ２５-画分を単離した。次に、全ＣＤ４+Ｔ細胞をＣＤ４+ＣＤ２５+またはＣＤ４+ＣＤ２５-  Ｔ細胞亜集団と指示された比で混合し、同種異系成熟ＤＣで刺激した（図３Ａ）。ＣＤ４+ＣＤ２５+Ｔ細胞は全ＣＤ４+Ｔ細胞の増殖を著しい程度に抑制し、そして１：１の比では増殖を実質的にブロックした（ｃｐｍはＣＤ２５+Ｔ細胞増殖のバックグラウンドレベルを表す；図２Ａ−Ｄ参照）。ＣＤ２５+Ｔ細胞の代わりにＣＤ２５-Ｔ細胞を添加すると、増殖がわずかに増大した（データはここに示していない）。ＣＤ４+ＣＤ２５-はポリクローナルに（図１Ｂ参照）または同種異系ＤＣによって（データはここに示していない）刺激されると迅速にＣＤ２５およびＣＤ１２２（すなわち、ＩＬ−２Ｒの両方の鎖）を発現するので、この所見はＣＤ４+ＣＤ２５+Ｔ細胞サブセットの抑制活性が単にＩＬ−２の消費またはＩＬ−２Ｒを介したその受動的吸着によるものではないことを示した。ＣＤ４+ＣＤ２５+Ｔ細胞はまた、ダウンレギュレーションの強さはより小さいが、全ＣＤ８+Ｔ細胞に対して抑制活性を発揮した（図３Ｂ）。
さらなる１組の実験において、同遺伝子型ＤＣによるＣＤ４+ＣＤ２５+Ｔ細胞の活性化は、それらの調節特性の誘導にとって十分かどうかを確認した。この目的のため、同一ドナー（ドナーＩ）から成熟ＤＣおよびＣＤ４+ＣＤ２５+Ｔ細胞を生成させ／単離した。さらに、別のドナー（ドナーＩＩ）から全ＣＤ４+Ｔ細胞およびＣＤ４+ＣＤ２５+Ｔ細胞サブセットを単離した。次に、全ＣＤ４+Ｔ細胞（ドナーＩＩ）を、ドナーＩまたはドナーＩＩから単離した種々の数のＣＤ４+ＣＤ２５+Ｔ細胞の不存在下（図３Ｃ、ＣＤ４+のみ）または存在下で、同種異系成熟ＤＣ（ドナーＩ）で刺激した（図３Ｃ）。ドナーＩＩ由来の全ＣＤ４+Ｔ細胞は、同種異系のドナーＩ由来ＤＣで刺激した場合、予想通り活発に増殖した（図３Ｃ、ＣＤ４+のみ）。ドナーＩ由来ＣＤ４+ＣＤ２５+Ｔ細胞（すなわち、用いたＤＣに対して同遺伝子型）の存在下では、全ドナーＩＩ由来ＣＤ４+Ｔ細胞の増殖（すなわち、同種反応性）は全く抑制されなかった（図３Ｃ）。しかし、ドナーＩＩ由来ＣＤ４+ＣＤ２５+Ｔ細胞（すなわち、用いたＤＣに対して同種異系）が添加されると強度の抑制が起こった（図３Ｃ）。ＤＣ、全ＣＤ４+Ｔ細胞およびＣＤ４+ＣＤ２５+Ｔ細胞が３人の異なるドナーに由来する実験においても、抑制が観察された。これらのデータは、ＣＤ４+ＣＤ２５+Ｔ細胞のＴＣＲ媒介性活性化は、それらの細胞に調節機能を発揮させるために必要であること、および同遺伝子型ＤＣはＣＤ４+ＣＤ２５+Ｔ細胞の抑制活性を誘導するには不十分であることを示した。
次に、Ｔｒａｎｓｗｅｌｌチェンバー実験を実施して、ＣＤ４+ＣＤ２５+Ｔ細胞の調節機能が主として可溶性因子によって媒介されるかどうか、また細胞−細胞接触を必要とするかどうかを調べた（図３Ｄ）。図３Ｄに示すように、ＣＤ４+ＣＤ２５+Ｔ細胞は同種異系ＤＣの存在下で全ＣＤ４+Ｔ細胞の増殖をほぼ完全に抑制する。Ｔｒａｎｓｗｅｌｌチェンバーを用いた上記２つの集団の分離は、ＣＤ４+ＣＤ２５+Ｔ細胞の抑制作用を実質的に排除した。これらの観察は、ＣＤ４+ＣＤ２５+Ｔ細胞の抑制能にとって直接的な細胞接触が必須であることを示唆した。なぜなら、Ｔｒａｎｓｗｅｌｌチェンバーの半透過膜は可溶性因子は自由に通過できるが、直接的な細胞接触は回避されるからである。またＴｒａｎｓｗｅｌｌ実験により、ＣＤ４+ＣＤ２５+Ｔ細胞によるＩＬ−２の消費は抑制に関与する作用機構ではないことが確認された。
【００３０】
調節細胞と応答細胞の間の密接な相互作用が必要であることは自明であるにもかかわらず、抗原提示ＤＣのターゲッティングも可溶性因子の役割もＴｒａｎｓｗｅｌｌ実験によって排除されなかった。したがって、プレート結合抗ＣＤ３Ａｂ（と可溶性抗ＣＤ２８  Ａｂとの組み合わせ）もまた、抗原提示細胞非依存性およびポリクローナル性Ｔ細胞刺激物として用いられた。これで刺激すると、全ＣＤ４+Ｔ細胞のみが強い増殖を示した。上記のように（図２Ｄ）、ＣＤ４+ＣＤ２５+Ｔ細胞は増殖しなかった。両集団の共培養においては、比が１：１の場合、対照と比較して少なくとも７５％の低下が見られた（データはここに示していない）。これらのデータは、主として調節はＡＰＣ機能の調節を介して起こるのではないことを示唆していた。サイトカインＩＬ−１０およびＴＧＦ−β（それぞれいわゆるＴｒ１およびＴｈ３の抑制活性にとって決定的）（Ｇｒｏｕｘ，Ｈ．ら，Ｎａｔｕｒｅ  ３８９：７３７−７４２（１９９７）；Ｆｕｋａｕｒａ，Ｈ．ら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，９８：７０−７７（１９９６））に対する中和抗体は、ＣＤ４+ＣＤ２５+Ｔ細胞の調節活性を排除しなかった。このことは、これらのサイトカインが少なくとも我々が実施したアッセイの中では何ら重要な抑制的役割を果たしていないことを示している。共培養物にＣＤ４+ＣＤ２５+Ｔ細胞の増殖を促進する高用量でＩＬ−２および／またはＩＬ−１５を添加すると（図２Ｄ参照）、それらの細胞の抑制作用が低下した。しかし、抑制活性は排除されなかったように思われる。データを解釈する際には、ＣＤ４+ＣＤ２５+  Ｔ細胞の著しい程度の増殖を考慮に入れなければならないからである（図３Ｄ）。
【００３１】
実施例４：ＣＤ４+ＣＤ２５+Ｔ細胞はＩＬ−１０を優勢に分泌する。
サイトカインプロフィールを分析し、比較するため、新たにソーティングしたＣＤ４+ＣＤ２５+およびＣＤ４+ＣＤ２５-Ｔ細胞をプレート結合抗ＣＤ３＋抗ＣＤ２８で活性化した。次に上清をＥＬＩＳＡによって分析し、そしてＲＮＡ発現をＲＮａｓｅプロテクションアッセイによって分析した。さらに、細胞内サイトカインの染色を実施して、特定のサイトカインを放出する細胞の百分率を測定した。図４に示すように、ＣＤ４+ＣＤ２５-  Ｔ細胞はＩＦＮ−γおよびＩＬ−２を優勢に分泌し、ＩＬ−１０およびＩＬ−４はほとんど分泌せず、Ｔｈ１様プロフィールに似ていた。他方、ＣＤ４+ＣＤ２５+Ｔ細胞はＩＬ−１０を優勢に産生し、ＩＬ−２、ＩＬ−４およびＩＦＮ−γは低レベルで産生するのみであり、Ｔｒ１細胞に類似していた。ＲＮＡレベルにおける両亜集団の比較は、ＣＤ２５-  Ｔ細胞と比較してＣＤ２５+Ｔ細胞がより多いＩＬ−１０、より少ないＩＦＮ−γおよび類似したレベルのＩＬ−２ｍＲＮＡを発現することを明らかにした。ＩＬ−１受容体アンタゴニスト（ＩＬ−１Ｒａ）ｍＲＮＡはＣＤ４+ＣＤ２５+Ｔ細胞中に優勢に見出されたが、他方、著しいレベルのＩＬ−１βｍＲＮＡはＣＤ４+ＣＤ２５-Ｔ細胞にのみ存在した。ＴＧＦ−βは、両方の細胞種において類似の低レベルで発現されていた。
【００３２】
実施例５：活性化し、その後固定したＣＤ４+ＣＤ２５+Ｔ細胞はなお調節能を示す。
ＭＡＣＳTMソーティングによって、成人血液由来の全ＣＤ４+Ｔ細胞からＣＤ４+ＣＤ２５-およびＣＤ４+ＣＤ２５+Ｔ細胞を単離した。ＣＤ４+ＣＤ２５+Ｔ細胞を３つの部分に分割した。１つの画分は１０μｇ／ｍｌのプレート結合抗ＣＤ３抗体＋１０μｇ／ｍｌの可溶性抗ＣＤ２８抗体を用いて一晩活性化した。翌日、この画分および非活性化ＣＤ４+ＣＤ２５+Ｔ細胞の１部を２％ホルムアルデヒドで１時間固定した。３つ目の画分は未処理のままにした。細胞を３回洗浄した。
未固定ＣＤ４+ＣＤ２５+およびＣＤ４+ＣＤ２５-Ｔ細胞を単独で、ならびにＣＤ４+ＣＤ２５-Ｔ細胞と１：１の比で混合したＣＤ４+ＣＤ２５+Ｔ細胞の各画分を固定化抗ＣＤ３および可溶性抗ＣＤ２８で活性化した。５日後、［3Ｈ］Ｔｄｒ取り込みによって増殖を測定した。５つの独立した実験のうち代表的なものを図５に示す。図中、記号は以下のものを表す：
ＣＤ４+ＣＤ２５-        未固定ＣＤ４+ＣＤ２５-細胞
ＣＤ４+ＣＤ２５+       未固定ＣＤ４+ＣＤ２５-細胞
Ｒｅｇ．１：１        未固定ＣＤ４+ＣＤ２５+およびＣＤ４+ＣＤ２５-Ｔ細胞、比１：１
Ｒｅｇ．１：１
ＣＤ２５＋ｓｔｉｍ  ｆｉｘ  活性化、固定化ＣＤ４+ＣＤ２５+Ｔ細胞および未固定ＣＤ４+ＣＤ２５-Ｔ細胞、比１：１
Ｒｅｇ．１：１
ＣＤ２５＋ｆｉｘ        非活性化、固定化ＣＤ４+ＣＤ２５+Ｔ細胞および未固定ＣＤ４+ＣＤ２５-Ｔ細胞、比１：１
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】ＣＤ４+ＣＤ２５-Ｔ細胞と比較した、ＣＤ４+ＣＤ２５+Ｔ細胞が明確な表現型的相違を示すことを示す。
【図２】ＣＤ４+ＣＤ２５+Ｔ細胞が同種異系およびポリクローナルな刺激の両方に対して非増殖性／アネルギー性であることを示す。これはＩＬ−２および／またはＩＬ−１５の添加によって部分的にくつがえされるが、中和性抗ＩＬ−１０抗体によってはくつがえされない。
【図３】ＴＣＲを介して刺激された場合、ＣＤ４+ＣＤ２５+Ｔ細胞がＣＤ４+およびＣＤ８+Ｔ細胞の活性化を細胞接触および用量依存的に抑制することを示す。
【図４】ＣＤ４+ＣＤ２５+およびＣＤ４+ＣＤ２５-Ｔ細胞のサイトカインプロフィールが異なることを示す。
【図５】活性化され、固定されたＣＤ４+ＣＤ２５+細胞がなお調節能を有することを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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