(57)【要約】ＧＦＲα／ＲＥＴを活性化するキメラＧＤＮＦファミリーリガンドを開示する。ＧＦＲα１／ＲＥＴを活性化するがＧＦＲα２−ＲＥＴをもＧＦＲα３−ＲＥＴをも活性化しないキメラが含まれる。該キメラは、哺乳類細胞に栄養支持をもたらしたり、あるいは哺乳類細胞の分化を引き起こしたり、あるいはその両方に有用であり、該細胞が、種々の疾患、特にパーキンソン病に罹患した患者におけるものである場合に特に有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＧＦＲα１−ＲＥＴを活性化するがＧＦＲα２−ＲＥＴをもＧＦＲα３−ＲＥＴをも実質的に活性化しない増殖因子。
【請求項２】
キメラＧＤＮＦファミリーリガンドまたはその誘導体を含む、請求項１記載の増殖因子。
【請求項３】
領域Ｆ２ａおよびＦ２ｃ内に置換を有するペルセフィンを含み、領域Ｆ２ａ内の置換が、ＧＤＮＦ、ニュールツリンもしくはアルテミンの領域Ｆ２ａと同じ１〜８個のアミノ酸またはそれらの同類アミノ酸置換を含み、領域Ｆ２ｃ内の置換が、ＧＤＮＦ、ニュールツリンもしくはアルテミンの領域Ｆ２ｃと同じ１〜８個のアミノ酸またはそれらの同類アミノ酸置換を含む、請求項２記載の増殖因子。
【請求項４】
該置換ペルセフィンが、独立して配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９または配列番号１０の対応領域から選ばれる領域Ｆ２ａおよびＦ２ｃ内の置換を有する配列番号１、配列番号２または配列番号３に記載のペルセフィンを含む、請求項３記載の増殖因子。
【請求項５】
配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５または配列番号１６を含む、請求項４記載の増殖因子。
【請求項６】
該置換ペルセフィンが、配列番号１７、配列番号１８および配列番号１９よりなる群から選ばれるアミノ酸残基６３−６６の置換ならびに配列番号２０、配列番号２１および配列番号２２よりなる群から選ばれるアミノ酸残基７６−８２の置換を有する配列番号１に記載のヒトペルセフィンを含む、請求項４記載の増殖因子。
【請求項７】
配列番号２３、配列番号２４または配列番号２５を含む、請求項６記載の増殖因子。
【請求項８】
配列番号２６、配列番号２７または配列番号２８よりなる、請求項６記載の増殖因子。
【請求項９】
医薬上許容される製剤中に請求項１記載の増殖因子を含んでなる組成物。
【請求項１０】
請求項１記載の増殖因子をコードするポリヌクレオチドを含んでなる核酸。
【請求項１１】
該コード化増殖因子がキメラＧＤＮＦファミリーリガンドまたはその同類置換誘導体である、請求項１０記載の核酸。
【請求項１２】
該コード化増殖因子が、領域Ｆ２ａおよびＦ２ｃ内に置換を有するペルセフィンを含み、領域Ｆ２ａ内の置換が、ＧＤＮＦ、ニュールツリンもしくはアルテミンの領域Ｆ２ａと同じ１〜８個のアミノ酸またはそれらの同類アミノ酸置換を含み、領域Ｆ２ｃ内の置換が、ＧＤＮＦ、ニュールツリンもしくはアルテミンの領域Ｆ２ｃと同じ１〜８個のアミノ酸またはそれらの同類アミノ酸置換を含む、請求項１１記載の核酸。
【請求項１３】
該コード化置換ペルセフィンが、独立して配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９または配列番号１０の対応領域から選ばれる領域Ｆ２ａおよびＦ２ｃ内の置換を有する配列番号１、配列番号２または配列番号３に記載のペルセフィンを含む、請求項１２記載の核酸。
【請求項１４】
該コード化増殖因子が、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５または配列番号１６を含む、請求項１３記載の核酸。
【請求項１５】
該コード化増殖因子が、配列番号１７、配列番号１８および配列番号１９よりなる群から選ばれるアミノ酸残基６３−６６の置換ならびに配列番号２０、配列番号２１および配列番号２２よりなる群から選ばれるアミノ酸残基７６−８２の置換を有する配列番号１に記載のヒトペルセフィンを含む、請求項１３記載の核酸。
【請求項１６】
該コード化増殖因子が配列番号２３、配列番号２４または配列番号２５を含む、請求項１５記載の核酸。
【請求項１７】
該コード化増殖因子が配列番号２６、配列番号２７または配列番号２８よりなる、請求項１５記載の核酸。
【請求項１８】
機能しうる様態で請求項１０記載のポリヌクレオチドに結合した発現調節要素を含んでなるベクター。
【請求項１９】
請求項１８記載のベクターを含んでなる宿主細胞。
【請求項２０】
細菌細胞、酵母細胞、植物細胞、昆虫細胞または哺乳類細胞である、請求項１９記載の宿主細胞。
【請求項２１】
哺乳類細胞に栄養支持をもたらすための又は哺乳類細胞の分化を引き起こすための又はそれらの両方のための方法であって、請求項１記載の増殖因子の有効量または該増殖因子の発現をコードするポリヌクレオチドの有効量で該細胞を処理することを含んでなる方法。
【請求項２２】
該処理工程が更に、ＧＦＲα１ポリペプチドを該細胞に投与することを含む、請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
該細胞が患者におけるものであり、該処理が、該増殖因子を該患者に投与することを含む、請求項２１記載の方法。
【請求項２４】
該投与が、該増殖因子を発現する細胞を該患者に移植することを含む、請求項２３記載の方法。
【請求項２５】
該細胞が、末梢性ニューロパシー、筋萎縮性側索硬化症、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、糖尿病、エイズ、虚血性卒中、急性脳傷害、急性脊髄傷害、神経芽細胞腫のような神経系腫瘍、多発性硬化症、感染症、化学療法の副作用、または特発性便秘またはパーキンソン病、脊髄外傷もしくはアヘン剤鎮痛剤の使用に伴う便秘のような腸疾患に罹患した患者におけるニューロン細胞であるか、あるいは該細胞が、小細胞肺癌に罹患した患者における非ニューロン細胞である、請求項２４記載の方法。
【請求項２６】
個体における細胞の変性または機能不全の予防または治療方法であって、請求項１記載の増殖因子の治療的に有効な量または該増殖因子の発現をコードするポリヌクレオチドの治療的に有効な量を該個体に投与することを含んでなる方法。
【請求項２７】
該投与が、該増殖因子を発現する細胞を該個体に移植することを含む、請求項２６記載の方法。
【請求項２８】
該個体が、（ａ）末梢性ニューロパシー、筋萎縮性側索硬化症、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、糖尿病、エイズ、虚血性卒中、急性脳傷害、急性脊髄傷害、神経芽細胞腫のような神経系腫瘍、多発性硬化症、感染症、化学療法の副作用、または特発性便秘またはパーキンソン病、脊髄外傷もしくはアヘン剤鎮痛剤の使用に伴う便秘のような腸疾患から生じたニューロン変性、（ｂ）小細胞肺癌、（ｃ）好酸球減少症、好塩基白血球減少症、リンパ球減少症、単球減少症、好中球減少症、貧血、血小板減少症またはそれらに関する幹細胞機能不全から生じた造血細胞の変性または機能不全、または（ｄ）心筋症またはうっ血性心不全から生じた心筋の変性または機能不全に罹患している、請求項２５記載の方法。
【請求項２９】
領域Ｈａ、Ｆ２ａおよびＦ２ｃ内に置換を有するペルセフィンを含んでなる、ＧＦＲα１−ＲＥＴおよびＧＦＲα２−ＲＥＴを活性化するがＧＦＲα３−ＲＥＴを実質的に活性化しない増殖因子であって、
（ａ）領域Ｈａ内の置換が、ニュールツリンの領域Ｈａと同じ１〜９個のアミノ酸またはそれらの同類アミノ酸置換を含み、
（ｂ）領域Ｆ２ａ内の置換が、ニュールツリンの領域Ｆ２ａと同じ１〜８個のアミノ酸またはそれらの同類アミノ酸置換を含み、
（ｃ）領域Ｆ２ｃ内の置換が、ニュールツリンの領域Ｆ２ｃと同じ１〜８個のアミノ酸を含むことを特徴とする増殖因子。
【請求項３０】
請求項２９記載の増殖因子をコードするポリヌクレオチドを含んでなる核酸。
【請求項３１】
哺乳類細胞に栄養支持をもたらすための又は哺乳類細胞の分化を引き起こすための又はそれらの両方のための方法であって、請求項２９記載の増殖因子の有効量または該増殖因子の発現をコードするポリヌクレオチドの有効量で該細胞を処理することを含んでなる方法。
【請求項３２】
個体における細胞の変性または機能不全の予防または治療方法であって、請求項２９記載の増殖因子の治療的に有効な量または該増殖因子の発現をコードするポリヌクレオチドの治療的に有効な量を該個体に投与することを含んでなる方法。
【請求項３３】
領域Ｈａ、Ｆ２ａおよびＦ２ｃ内に置換を有するペルセフィンを含んでなる、ＧＦＲα１−ＲＥＴおよびＧＦＲα３−ＲＥＴを活性化するがＧＦＲα２−ＲＥＴを実質的に活性化しない増殖因子であって、
（ａ）領域Ｈａ内の置換が、アルテミンの領域Ｈａと同じ１〜９個のアミノ酸またはそれらの同類アミノ酸置換を含み、
（ｂ）領域Ｆ２ａ内の置換が、アルテミンの領域Ｆ２ａと同じ１〜８個のアミノ酸またはそれらの同類アミノ酸置換を含み、
（ｃ）領域Ｆ２ｃ内の置換が、アルテミンの領域Ｆ２ｃと同じ１〜８個のアミノ酸を含むことを特徴とする増殖因子。
【請求項３４】
請求項３３記載の増殖因子をコードするポリヌクレオチドを含んでなる核酸。
【請求項３５】
哺乳類細胞に栄養支持をもたらすための又は哺乳類細胞の分化を引き起こすための又はそれらの両方のための方法であって、請求項３３記載の増殖因子の有効量または該増殖因子の発現をコードするポリヌクレオチドの有効量で該細胞を処理することを含んでなる方法。
【請求項３６】
個体における細胞の変性または機能不全の予防または治療方法であって、請求項３３記載の増殖因子の治療的に有効な量または該増殖因子の発現をコードするポリヌクレオチドの治療的に有効な量を該個体に投与することを含んでなる方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の背景）
本発明は、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ／Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｎ  Ａｇｉｎｇ  Ｇｒａｎｔ第５Ｒ０１−ＡＧ１３７３０号によるアメリカ合衆国政府の援助によりなされた。アメリカ合衆国政府は本発明において一定の権利を有する。
【０００２】
（１）発明の分野
本発明は、一般には、栄養因子または増殖因子、より詳しくは、ＧＦＲα１−ＲＥＴを活性化するがＧＦＲα２−ＲＥＴをもＧＦＲα３−ＲＥＴをも実質的に活性化しないキメラＧＤＮＦファミリーの増殖因子、それらに由来する増殖因子、およびそれらに関する方法に関する。
【０００３】
（２）関連技術の記載
複合生物における組織の発生および維持は、細胞の増殖、分化、生存および機能の過程にわたる厳密な制御を要する。これらの過程が制御される主要メカニズムは、「増殖因子」として公知のポリペプチドの作用によるものである。これらの構造的に多様な分子は特異的細胞表面受容体を介して作用して、これらの作用をもたらす。
【０００４】
「神経栄養因子」と称される増殖因子は、ニューロンの分化を促進し、成熟表現型を維持し、栄養支持をもたらして、ニューロンの成長、機能および生存を促進する。神経栄養因子は神経系または神経支配組織に存在する。神経成長因子（ＮＧＦ）は、同定され特徴づけられた最初の神経栄養因子であった（Ｌｅｖｉ−Ｍｏｎｔａｌｃｉｎｉら，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｚｏｏｌ．１１６：３２１，１９５１）。ＮＧＦは、交感神経ニューロン、神経堤由来感覚ニューロン、および基底前脳コリン作動性ニューロンの生存および成長を促進する非共有結合性ホモ二量体として存在する。内分泌系および免疫系の非ニューロン細胞（炎症細胞を含む）に対する作用を含むＮＧＦの他の作用が、例えば、Ｌｅｖｉ−ＭｏｎｔａｌｃｉｎｉおよびＢｏｏｋｅｒ，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ４６：３８４−３９１，１９６０；Ｊｏｈｎｓｏｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２１０：９１６−９１８，１９８０；Ｃｒｏｗｌｅｙら，Ｃｅｌｌ  ７６：１００１−１２，１９９４；ＳｎｉｄｅｒおよびＪｏｈｎｓｏｎ，Ａｎｎ  Ｎｅｕｒｏｌ  ２６：４８９−５０６，１９８９；Ｈｅｆｔｉ，Ｊ  Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ  ２５：１４１８−３５，１９９４；ＳｃｕｌｌｙおよびＯｔｔｅｎ，Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  Ｉｎｔ  １９：４５９−４６９，１９９５；ＯｔｔｅｎおよびＧａｄｉｅｎｔ，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｄｅｖｌ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  １３：１４７−１５１，１９９５；ならびにＨｏｒｉｇｏｍｅら  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２６９：２６９５−２７０７，１９９４に開示されている。
【０００５】
最近、増殖因子は、それらのアミノ酸配列における類似性に基づき、いくつかのクラス（すなわち、ファミリーまたはスーパーファミリー）に属することが明らかとなった。これらのファミリーには、例えば、繊維芽細胞増殖因子ファミリー、ニューロトロフィンファミリーおよびトランスフォーミング増殖因子−ベータ（ＴＧＦ−β）ファミリーが含まれる。ファミリーメンバーの配列類似性の一例を挙げると、ＴＧＦ−βファミリーメンバーは、このスーパーファミリーのメンバーを特徴づける７つの基本構成システイン残基を有する。
【０００６】
ＮＧＦファミリーは、増殖因子のそのようなファミリーの原型である。発見されたこのファミリーの第２のメンバーである脳由来神経栄養因子は、ＮＧＦ単量体の３個の内部ジスルフィドを形成する全６個のシステインの保存性のため、ＮＧＦと関連していることが示されている（Ｂａｒｄｅ，Ｐｒｏｇ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｓ  ２：２３７−２４８，１９９０およびＬｉｅｂｒｏｃｋら，Ｎａｔｕｒｅ  ３４１：１４９−１５２，１９８９）。２つの因子の高度に保存された部分の脳由来神経栄養因子により得られた情報を用いることにより、このニューロトロフィンファミリーの追加的なメンバー（ＮＴ−３，ＮＴ−４／５）が、いくつかの研究グループにより短期間のうちに見出された（Ｋｌｅｉｎ，ＦＡＳＥＢ  Ｊ  ８：７３８−４４，１９９４）。
【０００７】
最近、ＮＧＦおよび他のニューロトロフィンには構造的に関連していないがＴＧＦ−βには構造的に類似しているメンバーを含む神経栄養因子の新規ファミリーが同定された。米国特許第５，７３９，３０７号および米国特許出願０８／９３１，８５８および０９／２２０，５３１に記載されているとおり、ＴＧＦ−βスーパーファミリーのこのサブファミリーの公知メンバーは、グリア細胞株由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、ニュールツリン（ｎｅｕｒｔｕｒｉｎ）、ペルセフィン（ｐｅｒｓｅｐｈｉｎ）およびアルテミン（ａｒｔｅｍｉｎ）を含む。ＧＤＮＦ、ニュールツリン、ペルセフィンおよびアルテミンが同一の増殖因子ファミリー（ＧＤＮＦリガンドファミリーとも称される）内に位置づけられているのは、それらの物理的構造および生物活性の類似性に基づくものである。例えば、ヒトペルセフィンは、ヒトＧＤＮＦに対しては約４０％の配列同一性および約４３％の配列保存性を、ヒトニュールツリンに対しては約４９％の配列同一性および約５０％の配列保存性を、そしてヒトアルテミンに対しては約４５％の配列同一性および約４８％の配列保存性を有する。また、これらの４つのタンパク質は、ＴＧＦ−βファミリーメンバーに典型的な７つのシステイン残基を有する。
【０００８】
ＧＤＮＦファミリーリガンドは、胚から培養されたドーパミン作動性腹側中脳ニューロンの生存を支持する。また、ＧＤＮＦ、ニュールツリンおよびペルセフィンは、インビトロ生存およびインビボ傷害の両方の状況において脊髄および顔面運動ニューロンの生存を支持し、このため、これらのリガンドは、神経変性疾患の治療における潜在的治療剤と目されている（Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６６：１０６２−１０６４，１９９４；Ｈｏｒｇｅｒら，Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１８：４９２９−３７，１９９８；Ｋｌｅｉｎら，Ｎａｔｕｒｅ  ３８７：７１７−７２１，１９９７；Ｌｉｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６０：１１３０−１１３２，１９９３；Ｍｉｌｂｒａｎｄｔら，Ｎｅｕｒｏｎ  ２０：２４５−５３，１９９８；Ｏｐｐｅｎｈｅｉｍら，Ｎａｔｕｒｅ  ３７３：３４４−３４６，１９９５；総説としてはＧｒｏｎｄｉｎおよびＧａｓｈ，Ｊ  Ｎｅｕｒｏｌ．２４５（１１  Ｓｕｐｐｌ  ３）：３５−４２，１９９８）。しかし、ＧＤＮＦおよびニュールツリンは共に、末梢交感神経ニューロン、副交感神経ニューロン、感覚ニューロンおよび腸ニューロンの生存を支持するが（Ｂｕｊ−Ｂｅｌｌｏら，Ｎｅｕｒｏｎ  １５：８２１−８２８，１９９５；Ｅｂｅｎｄａｌら，Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  Ｒｅｓ  ４０：２７６−２８４，１９９５；Ｈｅｕｃｋｅｒｏｔｈら，Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ  ２００：１１６−２９，１９９８；Ｋｏｔｚｂａｕｅｒら，Ｎａｔｕｒｅ  ３８４：４６７−４７０，１９９６；Ｔｒｕｐｐら，Ｊ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １３０：１３７−１４８，１９９５）、ペルセフィンは、現在までに試験されているいずれの末梢ニューロンの生存をも支持しない（Ｍｉｌｂｒａｎｄｔら，前掲）。
【０００９】
ＧＤＮＦファミリーリガンドは、受容体およびシグナル伝達経路を共有している（Ｃｒｅｅｄｏｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９４：７０１８−７０２３，１９９７；Ｄｕｒｂｅｃら，Ｎａｔｕｒｅ  ３８１；７８９−７９３，１９９６；Ｔｒｕｐｐら，Ｎａｔｕｒｅ  ３８１：７８５−７８９，１９９６；Ｂａｌｏｈら，Ｎｅｕｒｏｎ  １８：７９３−８０２，１９９７）。これらのタンパク質は多成分受容体複合体を介して作用し、この場合、密接に関連したＧＦＲαと称される補助受容体のメンバーにＧＤＮＦファミリーの増殖因子が結合すると、膜貫通シグナル伝達成分であるＲｅｔタンパク質−チロシンキナーゼ（ＲＥＴ）が活性化される。ＧＦＲα補助受容体ファミリーの特徴的特性は、そのメンバーが膜貫通ドメインを有さず、グリコシル−ホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）結合を介して細胞表面に結合することである（Ｄｕｒｂｅｃら，Ｎａｔｕｒｅ  ３８１：７８９−７９３，１９９６；Ｊｉｎｇら，Ｃｅｌｌ  ８５：１１１３−１１２４，１９９６；Ｔｒｅａｎｏｒら，Ｎａｔｕｒｅ  ３８２：８０−８３，１９９６；Ｔｒｕｐｐら，Ｎａｔｕｒｅ  ３８１：７８５−７８９，１９９６；Ｂａｌｏｈら，１９９７，前掲）。ＧＦＲαファミリーのメンバーには、ＧＦＲα１（ＧＤＮＦＲα、ＴｒｎＲ１およびＲｅｔＬ１として従前公知である）、ＧＦＲα２（以前はＴｒｎＲ２、ＮＴＮＲαおよびＲｅｔＬ２）、ＧＦＲα３（以前はＴｒｎＲ３）（ＧＦＲα  Ｎｏｍｅｃｌａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ，Ｎｅｕｒｏｎ  １９：４８５，１９９７）、そして恐らくは、現在のところニワトリでしか同定されていない受容体（ｃＧＦＲα４）であるＧＦＲα４が含まれる（Ｅｎｏｋｉｄｏら，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ８：１０１９−１０２２，１９９８）。
【００１０】
ＧＤＮＦファミリーリガンドが最高のアフィニティーで結合しＲＥＴを最も強力に活性化する好ましいＧＦＲα受容体が、それぞれのＧＤＮＦファミリーリガンドに関して存在することが、広範なインビトロおよびインビボ実験からの結果から確認されている。これらの好ましい相互作用としては、ＧＤＮＦ−ＧＦＲα１、ニュールツリン−ＧＦＲα２、およびアルテミン−ＧＦＲα３が挙げられる（Ｂａｌｏｈら，１９９７，前掲；Ｂａｌｏｈら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ  ９５：５８０１−５８０６，１９９８；Ｊｉｎｇら，１９９６，前掲；Ｊｉｎｇら，Ｊ  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：３３１１１−３３１１７，１９９７；Ｋｌｅｉｎら，Ｎａｔｕｒｅ  ３８７：７１７−７２１，１９９７；Ｔｒｅａｎｏｒら，１９９６，前掲）。ペルセフィンは、公知哺乳類ＧＦＲαのいずれにも結合せずそれらを活性化もしないが、ニワトリＧＦＲα４には結合する（Ｍｉｌｂｒａｎｄｔら，前掲；Ｂａｌｏｈら，１９９８，前掲；Ｅｎｏｋｉｄｏら，前掲）。しかし、これらの好ましい相互作用にもかかわらず、異なるリガンド−受容体ペア間の明らかなクロストークも存在する。別の公知相互作用としては、ニュールツリン−ＧＦＲα１、アルテミン−ＧＦＲα１、およびＧＤＮＦ−ＧＦＲα２が挙げられる（Ｂａｌｏｈら，１９９８，前掲；Ｓａｎｉｃｏｌａら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９４：６２３８−６２４３，１９９７；Ｓｕｖａｎｔｏら，Ｈｕｍ．Ｍｏｌｅｃ．Ｇｅｎｅｔ．６：１２６７−１２７３，１９９７）。したがって、天然に存在する公知のＧＦＲα１−ＲＥＴ活性化ＧＤＮＦファミリーリガンドのうち、同様に別のＧＦＲα−ＲＥＴ複合体を活性化しないものは存在しない。
【００１１】
各ＧＦＲα受容体の役割に関する幾つかの情報が得られている。ＧＦＲα１欠損マウスの最近の分析は、ＧＦＲα１が腎臓器官発生および腸神経系発生における生理学的に決定的に重要な唯一のＧＤＮＦ受容体であることを示している（Ｃａｃａｌａｎｏら，Ｎｅｕｒｏｎ  ２１：５３−６２，１９９８；Ｅｎｏｍｏｔｏら，Ｎｅｕｒｏｎ  ２１：３１７−３２４，１９９８）。しかし、ＧＤＮＦ欠損マウスは、ＧＦＲα１欠損マウスより著しい末梢神経節喪失を有し、このことは、ＧＤＮＦが、末梢ニューロンの生存を支持するために他の受容体（多分、ＧＦＲα２−ＲＥＴ）を利用しうることを示唆している（Ｃａｃａｌａｎｏら，前掲；Ｅｎｏｍｏｔｏら，前掲）。それにもかかわらず、ドーパミン作動性腹側中脳ニューロンに対するＧＤＮＦ、ニュールツリンおよびアルテミンの作用がＧＦＲα１−ＲＥＴ受容体系により媒介されることが、いくつかの証拠から示されている。まず第１に、ＧＲＦα３は腹側中脳では発現されず、アルテミンはＧＦＲα２を利用し得ないため、アルテミンによるこれらのニューロンの生存促進は、それがＧＦＲα１−ＲＥＴを活性化しうることによるものであると考えられる（Ｂａｌｏｈら，前掲）。第２に、ＧＦＲα２の発現は黒質の緻密質領域では弱く散在性であり、チロシンキナーゼヒドロキシラーゼ染色性（ＴＨ）ニューロンとは共局在化しないが、これは、ＧＦＲα１が、より有意に強い発現を示し、ＴＨ染色性ニューロンと共局在化するのとは対照的である（Ｈｏｒｇｅｒら，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１８：４９２９−４９３７，１９９８）。最後に、ＧＤＮＦおよびニュールツリンの両方がドーパミン作動性腹側中脳ニューロンの生存を支持する能力はＧＦＲα１ノックアウトマウスにおいては失われ、このことは、少なくとも胚においては、ドーパミン作動性腹側中脳ニューロンの生存促進がＧＦＲα１−ＲＥＴシグナリングのみによるものであることを示している（Ｃａｃａｌａｎｏら，１９９８）。
【００１２】
それらの種々のＧＮＤＦファミリーリガンドとＧＦＲαとの間のインビトロ相互作用は現在では比較的良く理解されているが、この特異性およびクロストークの分子的基礎は未だ明らかではない。ＧＤＮＦの結晶構造は、その一次配列のシステインの間隔から予想されるとおり、それが、ＴＧＦ−β２の構造に有意に類似したジスルフィド結合性二量体であることを示している（Ｄａｏｐｉｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５７：３６９−３７３，１９９２；ＥｉｇｅｎｂｒｏｔおよびＧｅｒｂｅｒ，Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．４：４３５−４３８，１９９７；ＳｃｈｌｕｎｇｇｅｒおよびＧｒｕｔｔｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ  ３５８：４３０−４３４，１９９２）。しかし、その構造自体は、受容体−結合表面に関する理論的情報を与えているに過ぎない。さらに、受容体−結合表面に関する他のＴＧＦ−βスーパーファミリーメンバーに対する類推は根拠の無いものでありうるであろう。なぜなら、ＧＤＮＦにより利用される受容体と該ＴＧＦ−βにより利用される受容体とは著しく異なり、それらの構造類似性は、あったとしてもほとんど無い程度のものであろうからである。
【００１３】
神経栄養因子は、胎児生体における生存および発生ならびに成体における構造的完全性、機能および可塑性を含むニューロン機能の多数の態様を調節する、と現在では一般に考えられている。急性神経系傷害および慢性神経変性疾患は共に、構造的損傷により、そして恐らくは疾患誘発性アポトーシスにより特徴づけられるため、神経栄養因子はこれらの障害において何らかの役割を果たしている可能性がある。実際のところ、神経栄養因子はこれらの神経変性状態（これは恐らく、我々の社会を現在悩ましている社会的および経済的に最も深刻な疾患であろう）の治療のための重要な治療剤でありうることが、かなりの証拠から示唆されている。例えば、ＧＤＮＦは、いくつかのパーキンソン病モデル動物において症状を緩和することが示されている（ＧｒｏｎｄｉｎおよびＧａｓｈ，前掲において概説されている）。それにもかかわらず、それらの異なるリガンドおよび受容体の間には明らかなクロストークが存在するため、特定の受容体に選択的なＧＤＮＦファミリーの増殖因子を得ることが望ましいであろう。特に、中枢神経系傷害または神経変性疾患をＧＤＮＦ、ニュールツリンまたはアルテミンで治療することにより副作用を招きうるＧＦＲα２−ＲＥＴまたはＧＦＲα３−ＲＥＴ発現の幾つかの中枢および末梢部位が存在するため、ＧＦＲα１−ＲＥＴの活性化において、より特異的である、ＧＤＮＦファミリーリガンドのメンバーが必要とされている。ＧＦＲα１−ＲＥＴだけを活性化するＧＤＮＦファミリーリガンドの同定はまた、各ＧＦＲ受容体の相対的役割の更なる解明につながるであろう。
【００１４】
（発明の概要）
したがって、本発明者らは、ＧＦＲα１−ＲＥＴを活性化するがＧＦＲα２−ＲＥＴをもＧＦＲα３−ＲＥＴをも実質的に活性化しない或る増殖因子が構築されうることを見出すことに成功した。「実質的」なる語への言及は、該増殖因子がＧＦＲα１−ＲＥＴに選択的であり、ペルセフィン（これは、ＧＦＲα２−ＲＥＴまたはＧＦＲα３−ＲＥＴへの結合またはその活性化において無効であるとみなされている）の場合より著しい程度ではＧＦＲα２−ＲＥＴをもＧＦＲα３−ＲＥＴをも活性化せず、および／または、ＧＦＲα２−ＲＥＴの活性化においてはＧＤＮＦの、あるいはＧＦＲα３−ＲＥＴの活性化においてはアルテミンの好ましくは５０％以下、より好ましくは４０％以下、より一層好ましくは３０％以下、最も好ましくは２０％以下の有効性を有することを意味すると意図される。
【００１５】
したがって、１つの実施形態において、本発明は、ＧＦＲα１−ＲＥＴを活性化するがＧＦＲα２−ＲＥＴをもＧＦＲα３−ＲＥＴをも実質的に活性化しない増殖因子に関する。そのような増殖因子は、キメラＧＤＮＦファミリーリガンドまたはその誘導体でありうる。該誘導体は、ペプチジル誘導体または非ペプチジル誘導体でありうる。好ましいペプチジル誘導体は、同類アミノ酸置換を有するＧＤＮＦファミリー増殖因子である。この実施形態の或る態様においては、該増殖因子は、ＧＦＲα１−ＲＥＴに作用しないペルセフィンに基づくものでありうる。したがって、該キメラ増殖因子は、好ましくは、天然に存在するペルセフィンとは異なるアミノ酸をＦ２ａおよび／またはＦ２ｃ領域内に有する置換されたペルセフィンを含む。Ｆ２は、ＧＤＮＦに関して決定されたアミノ酸のフィンガー２伸長を表し（ＥｉｇｅｎｂｒｏｔおよびＧｅｒｂｅｒ，１９９７，前掲）、Ｆ２ａおよびＦ２ｃ領域は、図１に示すフィンガー２の部分である。
【００１６】
該置換ペルセフィンのＦ２ａ領域は、好ましくは、ＧＤＮＦ、ニュールツリンまたはアルテミンの領域Ｆ２ａと同じ１〜８個のアミノ酸を含む。すなわち、該置換ペルセフィンのＦ２ａ領域において、１〜８個のアミノ酸は、ＧＤＮＦ、ニュールツリンまたはアルテミンのＦ２ａ領域の場合と同じであり同じ位置に存在しうる。あるいは、該置換ペルセフィンのＦ２ａ領域内の特定の位置のアミノ酸は、ＧＤＮＦ、ニュールツリンまたはアルテミンのＦ２ａ領域内のその位置のアミノ酸の同類アミノ酸置換でありうる。ペルセフィンは、ＧＤＮＦおよびニュールツリンの整列Ｆ２ａ領域内には存在する７１位と７２位との間のアミノ酸を欠く。したがって、ペルセフィンのＦ２ａ領域内のアミノ酸置換に対する言及は、ＧＤＮＦ、ニュールツリンまたはアルテミンからのその整列位置におけるアミノ酸での７１位と７２位との間の挿入または同類アミノ酸置換を含むと意図される。
【００１７】
また、この実施形態の置換ペルセフィンのＦ２ｃ領域は、好ましくは、ＧＤＮＦ、ニュールツリンまたはアルテミンの領域Ｆ２ｃと同じ１〜８個のアミノ酸を含む。すなわち、該置換ペルセフィンのＦ２ｃ領域において、１〜８個のアミノ酸は、ＧＤＮＦ、ニュールツリンまたはアルテミンのＦ２ｃ領域の場合と同じであり同じ位置に存在しうる。あるいは、該置換ペルセフィンのＦ２ｃ領域内の特定の位置のアミノ酸は、ＧＤＮＦ、ニュールツリンまたはアルテミンのＦ２ｃ領域内のその位置のアミノ酸の同類アミノ酸置換でありうる。
【００１８】
好ましくは、本発明の増殖因子は、Ｆ２ａおよび／またはＦ２ｃ領域内に置換を有する置換ヒトペルセフィン（配列番号１）、マウスペルセフィン（配列番号２）またはラットペルセフィン（配列番号３）を含む。該ペルセフィン配列はまた、Ｆ２ａおよびＦ２ｃ領域以外に同類アミノ酸置換を有するこれらのペルセフィン配列の変異を含みうる。該置換ペルセフィン配列内のＦ２ａおよびＦ２ｃ領域は、ヒトＧＤＮＦ（配列番号４）、マウスＧＤＮＦ（配列番号５）、ラットＧＤＮＦ（配列番号６）、ヒトニュールツリン（配列番号７）、マウスニュールツリン（配列番号８）、ヒトアルテミン（配列番号９）、マウスアルテミン（配列番号１０）のＦ２ａおよびＦ２ｃ領域からのアミノ酸置換を有する。好ましくは、本発明の増殖因子は、独立してヒトＧＤＮＦ、ヒトニュールツリンまたはヒトアルテミンの対応領域から選ばれるＦ２ａおよびＦ２ｃ領域の置換を有する置換ヒトペルセフィンを含む。より詳しくは、該増殖因子は、配列番号２３、配列番号２４または配列番号２５を含み、最も好ましい増殖因子は、配列番号２６、配列番号２７または配列番号２８よりなる。
【００１９】
本発明はまた、本発明のＧＦＲα１−ＲＥＴ選択的増殖因子の医薬上許容される製剤を含む組成物を含む。
【００２０】
もう１つの実施形態においては、本発明は、ＧＦＲα１−ＲＥＴを活性化するがＧＦＲα２−ＲＥＴをもＧＦＲα３−ＲＥＴをも実質的に活性化しない増殖因子をコードするポリヌクレオチドを含む核酸に関する。該コード化増殖因子は、好ましくは、キメラＧＤＮＦファミリーリガンドまたはその同類置換誘導体である。該コード化キメラ増殖因子は、好ましくは、ＧＤＮＦ、ニュールツリンまたはアルテミンのＦ２ａ領域またはＦ２ｃ領域内のアミノ酸と同じであり同じ位置に存在する１〜８個のアミノ酸で置換されたそれぞれＦ２ａおよび／またはＦ２ｃ領域を有するペルセフィンを含む。あるいは、該コード化Ｆ２ａ領域またはＦ２ｃ領域アミノ酸置換は、ＧＤＮＦ、ニュールツリンまたはアルテミンのＦ２ａ領域またはＦ２ｃ領域内のその位置のアミノ酸の同類アミノ酸置換を含みうる。好ましくは、該コード化置換ペルセフィンは、該Ｆ２ａおよび／またはＦ２ｃ領域内にアミノ酸置換を有する置換ヒトペルセフィン（配列番号１）、マウスペルセフィン（配列番号２）またはラットペルセフィン（配列番号３）である。該コード化ペルセフィン配列はまた、該Ｆ２ａおよびＦ２ｃ領域以外に同類アミノ酸置換を有するこれらのペルセフィン配列の変異を含みうる。該コード化キメラペルセフィン配列は、ヒトＧＤＮＦ（配列番号４）、マウスＧＤＮＦ（配列番号５）、ラットＧＤＮＦ（配列番号６）、ヒトニュールツリン（配列番号７）、マウスニュールツリン（配列番号８）、ヒトアルテミン（配列番号９）またはマウスアルテミン（配列番号１０）のＦ２ａおよびＦ２ｃ領域からのアミノ酸置換を有する。好ましくは、該コード化配列は、独立してヒトＧＤＮＦ、ヒトニュールツリンまたはヒトアルテミンの対応配列から選ばれるＦ２ａおよびＦ２ｃ領域の置換を有する置換ヒトペルセフィンを含む。より詳しくは、該コード化配列は、配列番号２３、配列番号２４または配列番号２５を含み、最も好ましいコード化増殖因子は、配列番号２６、配列番号２７または配列番号２８よりなる。
【００２１】
もう１つの実施形態においては、本発明は、ＧＦＲα１−ＲＥＴを活性化するがＧＦＲα２−ＲＥＴをもＧＦＲα３−ＲＥＴをも実質的に活性化せず好ましくはキメラＧＤＮＦファミリーリガンドである増殖因子をコードするポリヌクレオチドに、機能しうる様態で結合した発現調節要素を含むベクターを含む。本発明はまた、該ベクターで形質転換された宿主細胞を含む。
【００２２】
もう１つの実施形態においては、本発明は、改変されたＮ末端を有するキメラＧＤＮＦファミリーリガンドを提供する。該Ｎ末端は除去されていたり、トランケート化されていたり、あるいは別のＧＤＮＦファミリーメンバーまたは別のタンパク質（例えば、別のＴＧＦ−βスーパーファミリーメンバーのメンバー）のＮ末端で置換されていることが可能である。これらのキメラは、該ＧＤＮＦファミリーリガンドのＧＦＲα−ＲＥＴ活性化能を保有する。
【００２３】
本発明の増殖因子は、哺乳類細胞において栄養支持をもたらすために又は分化を引き起こすために使用することができる。したがって、もう１つの実施形態においては、本発明は、哺乳類細胞に栄養支持をもたらすための又は哺乳類細胞の分化を引き起こすための又はそれらの両方のための方法を含む。該方法は、ＧＦＲα１−ＲＥＴを活性化するがＧＦＲα２−ＲＥＴをもＧＦＲα３−ＲＥＴをも実質的に活性化しない増殖因子の有効量で該細胞を処理することを含む。該増殖因子は、好ましくは、キメラＧＤＮＦファミリーリガンドまたはその同類置換誘導体である。該キメラ増殖因子は、好ましくは、ＧＤＮＦ、ニュールツリンまたはアルテミンのＦ２ａ領域またはＦ２ｃ領域内のアミノ酸と同じであり同じ位置に存在する１〜８個のそのアミノ酸で置換されたそれぞれＦ２ａおよび／またはＦ２ｃ領域を有するペルセフィンを含む。あるいは、該Ｆ２ａ領域またはＦ２ｃ領域のアミノ酸置換は、ＧＤＮＦ、ニュールツリンまたはアルテミンのＦ２ａ領域またはＦ２ｃ領域内のその位置のアミノ酸の同類アミノ酸置換を含みうる。好ましくは、該置換ペルセフィンは、該Ｆ２ａおよび／またはＦ２ｃ領域内にアミノ酸置換を有する置換ヒトペルセフィン（配列番号１）、マウスペルセフィン（配列番号２）またはラットペルセフィン（配列番号３）である。該ペルセフィン配列はまた、該Ｆ２ａおよびＦ２ｃ領域以外に同類アミノ酸置換を有するこれらのペルセフィン配列の変異を含みうる。該置換またはキメラペルセフィン配列内のＦ２ａおよびＦ２ｃ領域は、好ましくは、ヒトＧＤＮＦ（配列番号４）、マウスＧＤＮＦ（配列番号５）、ラットＧＤＮＦ（配列番号６）、ヒトニュールツリン（配列番号７）、マウスニュールツリン（配列番号８）、ヒトアルテミン（配列番号９）またはマウスアルテミン（配列番号１０）のＦ２ａおよびＦ２ｃ領域からのアミノ酸置換を有する。好ましくは、本発明の増殖因子は、独立してヒトＧＤＮＦ、ヒトニュールツリンまたはヒトアルテミンの対応領域から選ばれるＦ２ａおよびＦ２ｃ領域の置換を有する置換ヒトペルセフィンを含む。より詳しくは、該増殖因子は、配列番号２３、配列番号２４または配列番号２５を含み、最も好ましい増殖因子は、配列番号２６、配列番号２７または配列番号２８よりなる。該哺乳類細胞は、ＧＦＲα１−ＲＥＴを含有する任意の細胞、好ましくは、ニューロン細胞、造血細胞または心筋細胞でありうる。該処理は更に、ＧＦＲα１ポリペプチドを該細胞に投与することを含みうる。
【００２４】
この実施形態の変法においては、該細胞を、ＧＦＲα１−ＲＥＴを活性化するがＧＦＲα２−ＲＥＴをもＧＦＲα３−ＲＥＴをも実質的に活性化しない増殖因子の発現をコードするポリヌクレオチドを含む核酸で処理することができる。該コード化増殖因子は、好ましくは、キメラＧＤＮＦファミリーリガンドまたはその同類置換誘導体である。また、該細胞を、ＧＦＲα１ポリペプチドで、またはＧＦＲα１ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドで処理することも可能である。
【００２５】
この実施形態の１つの態様においては、該細胞は患者におけるものであることが可能であり、該処理は、該増殖因子を該患者に投与することを含む。該方法はまた、該増殖因子をコードするポリヌクレオチドを該患者に投与すること、または該増殖因子を発現する細胞を該患者に移植することを含む。該細胞は、末梢性ニューロパシー、筋萎縮性側索硬化症、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、糖尿病、エイズ、虚血性卒中、急性脳傷害、急性脊髄傷害、神経芽細胞腫のような神経系腫瘍、多発性硬化症、感染症、化学療法の副作用、または特発性便秘またはパーキンソン病、脊髄外傷もしくはアヘン剤鎮痛剤の使用に伴う便秘のような腸疾患に罹患した患者におけるニューロン細胞でありうる。該細胞はまた、例えば、小細胞肺癌に罹患した患者におけるような非ニューロン細胞でありうる。該細胞はまた、好酸球減少症、好塩基白血球減少症、リンパ球減少症、単球減少症、好中球減少症、貧血、血小板減少症または幹細胞機能不全に罹患した患者における造血細胞、あるいは心筋症またはうっ血性心不全に罹患した患者における心筋細胞でありうる。
【００２６】
もう１つの実施形態においては、本発明は、個体における細胞の変性または機能不全の予防または治療方法を含む。該方法は、ＧＦＲα１−ＲＥＴを活性化するがＧＦＲα２−ＲＥＴをもＧＦＲα３−ＲＥＴをも実質的に活性化しない増殖因子の治療的に有効な量を該個体に投与することを含む。該増殖因子は、好ましくは、キメラＧＤＮＦファミリーリガンドまたはその同類置換誘導体である。該キメラ増殖因子は、好ましくは、ＧＤＮＦ、ニュールツリンまたはアルテミンのＦ２ａ領域またはＦ２ｃ領域内のそのアミノ酸と同じであり同じ位置に存在する１〜８個のアミノ酸で独立して置換されたそれぞれＦ２ａ領域および／またはＦ２ｃ領域を有するペルセフィンを含む。あるいは、該Ｆ２ａ領域またはＦ２ｃ領域のアミノ酸置換は、ＧＤＮＦ、ニュールツリンまたはアルテミンのＦ２ａ領域またはＦ２ｃ領域内のその位置のアミノ酸の同類アミノ酸置換を含みうる。好ましくは、該置換ペルセフィンは、該Ｆ２ａおよび／またはＦ２ｃ領域内にアミノ酸置換を有する置換ヒトペルセフィン（配列番号１）、マウスペルセフィン（配列番号２）またはラットペルセフィン（配列番号３）である。該ペルセフィン配列はまた、該Ｆ２ａおよびＦ２ｃ領域以外に同類アミノ酸置換を有するこれらのペルセフィン配列の変異を含みうる。該置換またはキメラペルセフィン配列内のＦ２ａおよびＦ２ｃ領域は、好ましくは、ヒトＧＤＮＦ（配列番号４）、マウスＧＤＮＦ（配列番号５）、ラットＧＤＮＦ（配列番号６）、ヒトニュールツリン（配列番号７）、マウスニュールツリン（配列番号８）、ヒトアルテミン（配列番号９）またはマウスアルテミン（配列番号１０）のＦ２ａおよびＦ２ｃ領域からのアミノ酸置換を有する。好ましくは、該増殖因子は、独立してヒトＧＤＮＦ、ヒトニュールツリンまたはヒトアルテミンの対応領域から選ばれるＦ２ａおよびＦ２ｃ領域の置換を有する置換ヒトペルセフィンを含む。より詳しくは、該増殖因子は、配列番号２３、配列番号２４または配列番号２５を含み、最も好ましい増殖因子は、配列番号２６、配列番号２７または配列番号２８よりなる。該哺乳類細胞は、ＧＦＲα１−ＲＥＴを含有する任意の細胞、好ましくは、ニューロン細胞、造血細胞または心筋細胞でありうる。該処理は更に、ＧＦＲα１ポリペプチドを該個体に投与することを含みうる。
【００２７】
この方法の変法においては、該増殖因子をコードするポリヌクレオチドを該個体に投与することができる。さらに、該増殖因子を発現する細胞を該個体に移植することができる。また、該増殖因子での処理は、ＧＦＲα１ポリペプチドまたはＧＦＲα１ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを該個体に同様に投与することにより促進されうる。あるいは、ＧＦＲα１ポリペプチドを発現する細胞を該個体に移植することができる。
【００２８】
該増殖因子または該増殖因子をコードするポリヌクレオチドは、以下のものに罹患した個体に投与することが可能である：（ａ）末梢性ニューロパシー、筋萎縮性側索硬化症、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、糖尿病、エイズ、虚血性卒中、急性脳傷害、急性脊髄傷害、神経芽細胞腫のような神経系腫瘍、多発性硬化症、感染症、化学療法の副作用、または特発性便秘またはパーキンソン病、脊髄外傷もしくはアヘン剤鎮痛剤の使用に伴う便秘のような腸疾患から生じたニューロン変性、（ｂ）小細胞肺癌、（ｃ）好酸球減少症、好塩基白血球減少症、リンパ球減少症、単球減少症、好中球減少症、貧血、血小板減少症またはそれらに関する幹細胞機能不全から生じた造血細胞の変性または機能不全、または（ｄ）心筋症またはうっ血性心不全から生じた心筋の変性または機能不全。
【００２９】
もう１つの実施形態においては、ＧＦＲα１−ＲＥＴおよびＧＦＲα２−ＲＥＴを活性化するがＧＦＲα３−ＲＥＴを実質的に活性化しないニュールツリンの模擬体を提供する。これらの模擬体は、ニュールツリンからの領域Ｈａ、Ｆ２ａおよびＦ２ｃ内のアミノ酸置換、またはそれらに関する同類アミノ酸置換を有するペルセフィンを含む。これらの模擬体をコードするポリヌクレオチドを含む核酸も提供する。これらの模擬体は、例えば、哺乳類細胞に栄養支持をもたらすための又は哺乳類細胞の分化を引き起こすための方法において、あるいは個体における細胞の変性または機能不全を予防または治療するための方法において、ニュールツリンの代わりに使用されうる。同様に、ＧＦＲα１−ＲＥＴおよびＧＦＲα３−ＲＥＴを活性化するがＧＦＲα２−ＲＥＴを実質的に活性化しない、アルテミンの模擬体も提供する。これらの模擬体は、アルテミンからの領域Ｈａ、Ｆ２ａおよびＦ２ｃ内のアミノ酸置換、またはそれらに関する同類アミノ酸置換を有するペルセフィンを含む。これらの模擬体をコードするポリヌクレオチドを含む核酸も提供する。これらの模擬体は、例えば、哺乳類細胞に栄養支持をもたらすための又は哺乳類細胞の分化を引き起こすための方法において、あるいは個体における細胞の変性または機能不全を予防または治療するための方法において、アルテミンの代わりに使用されうる。
【００３０】
したがって、本発明により達成される幾つかの利点のなかで注目されうる点は、栄養支持を必要とする或る細胞、特にニューロンの萎縮、変性または死を予防するのに使用されうるキメラＧＤＮＦファミリーリガンドの提供；遺伝子治療に使用するキメラＧＤＮＦファミリーリガンドをコードするポリヌクレオチドの提供；組換え技術によりキメラＧＤＮＦファミリーリガンドを入手するための方法の提供；標的細胞、特にニューロンに栄養支持をもたらすための方法の提供；および細胞変性、特にニューロンの機能不全および変性が関わる状態の治療方法の提供である。
【００３１】
（図面の簡単な記載）
図１は、ラットＧＤＮＦ（配列番号６を含む）、マウスニュールツリン（配列番号８を含む）、マウスアルテミン（配列番号１０を含む）およびマウスペルセフィン（配列番号２を含む）のアミノ酸配列アライメントを示す。ここで、該配列は、最初の基本システインのＮ末端側かつ第７基本システインのＣ末端側の領域を含み、この場合、該基本システインが太い枠で示されており、ＧＤＮＦに関して決定された二次構造要素（α−ヘリックスは「α」、βストランドは「β」、そして３１０−ヘリックスは「３」）（ＥｉｇｅｎｂｒｏｔおよびＧｅｒｂｅｒ，Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．４：４３５−４３８，１９９７）が該アライメントの上に示されており、ホモログスキャニング（ｈｏｍｏｌｏｇｕｅ−ｓｃａｎｎｉｎｇ）突然変異誘発に関して明らかにされた領域が灰色の区域内に示されており、該領域の名称［フィンガー１はＦ１ａ−Ｆ１ｂ、ヒール（ｈｅｅｌ）はＨａ−Ｈｄ、フィンガー２はＦ２ａ−Ｆ２ｄ］が、与えられた領域の下に示されている。
【００３２】
図２Ａは、野生型およびタグ付きＧＤＮＦ構築物の概要図を示し、ここで、ＧＤＮＦのプロタンパク質コンベルターゼ切断の部位が矢印で示されており（ＳＳ−シグナル配列、ＰＲＯ−プロドメイン、ＭＡＴＵＲＥ−プロセシングされた成熟単量体）、該ＲＸＸＲ切断部位の２残基後に挿入された６−ヒスチジンおよびＦＬＡＧ（登録商標）タグを有するＧＤＮＦが「Ｇ−ｈｆ−ＧＤＮＦ」として示されており、該ＧＤＮＦプロ配列が該ニュールツリンプロ配列で置換された、該ヒスチジンおよびＦＬＡＧ（登録商標）タグを有するＧＤＮＦが「Ｎ−ｈｆ−ＧＤＮＦ」として示されている。
【００３３】
図２Ｂは、ＣＯＳ細胞内でのタグ付きＧＤＮＦタンパク質の産生を示す、ＦＬＡＧ（登録商標）イムノブロットのイメージであり、ここで、該イムノブロットは、４０アミノ酸のＮ末端伸長が２個のアミノ酸および該縦列Ｈｉｓ−ＦＬＡＧタグにより置換されたＧＤＮＦをＮ−ｈｆ−ＧＤＮＦが産生することを示している。
【００３４】
図２Ｃは、タグ付き完全長およびトランケート化ＧＤＮＦが該ＧＦＲα１−ＲＥＴ受容体を活性化しうること、およびペルセフィン自体のプロ領域を有するタグ付きペルセフィン（Ｐ−ｈｆ−ＰＳＰＮ）またはニュールツリンのプロ領域を有するタグ付きペルセフィン（Ｎ−ｈｆ−ＰＳＰＮ）がＧＦＲα１−ＲＥＴを活性化し得ないことを示すグラフである。
【００３５】
図３Ａは、ＧＤＮＦ、ペルセフィンおよび該ホモログスキャニング突然変異体からの成熟領域の概要図であり、ここで、ＧＰＧは、主としてＧＤＮＦ（図の白抜き部分）を含むがペルセフィンの相同部分により置換された陰影により示されたＧＤＮＦ部分を有するキメラを示し、さらに、突然変異体ＧＰＧ−Ｈｃは、ＰＳＰＮ内のこれらの残基の喪失に対応する成熟ＧＤＮＦのアミノ酸８８−９９の欠失体であり、これらの突然変異体の置換体の配列は図１に示されている。
【００３６】
図３Ｂは、トランスフェクト化ＣＯＳ細胞ライセートからのホモログスキャニング突然変異体の抗ＦＬＡＧ（登録商標）イムノブロットの写真であり、矢印により示された２つの主要バンドは、該突然変異体のプロセシングされていない形態（上）および成熟形態（下）を表す。なぜなら、その下側のバンドは、サイズにおいて、図２Ｂに示す分泌産物に対応するからである。
【００３７】
図４Ａは、ホモログスキャニングＧＤＮＦ突然変異体による相対的ＧＦＲα１−ＲＥＴ受容体活性化を示すグラフであり、ここで、値は、ＧＤＮＦによるレポーター活性化に対する割合（％）として表されており、代表的な実験からの三重の測定の平均および標準偏差が、野生型ＧＤＮＦ活性化の３３％および６６％における任意（ａｒｂｉｔｒａｒｙ）境界線と共に示されている。
【００３８】
図４Ｂは、該ＧＤＮＦ結晶構造の空間実体模型を示し、ここで、上側の表示は該ＧＤＮＦ二量体の側面図であり、下側の表示は該二量体の下の観察位置からのものであり、決定的に重要な推定ＧＦＲα１−ＲＥＴ相互作用ドメインＨｂ、Ｆ２ａおよびＦ２ｃが示されている。
【００３９】
図４Ｃは、ホモログスキャニングＧＤＮＦ突然変異体による相対的ＧＦＲα２−ＲＥＴ受容体活性化を示すグラフであり、ここで、値は、ＧＤＮＦによるレポーター活性化に対する割合（％）として表されており、代表的な実験からの二重の測定の平均および標準偏差が、野生型ＧＤＮＦ活性化の３３％および６６％における任意境界線と共に示されている。
【００４０】
図４Ｄは、該ＧＤＮＦ結晶構造の空間実体模型を示し、ここで、上側の表示は該ＧＤＮＦ二量体の側面図であり、下側の表示は該二量体の下の観察位置からのものであり、決定的に重要な推定ＧＦＲα２−ＲＥＴ相互作用ドメインＨａ、Ｆ２ａおよびＦ２ｃが示されている。
【００４１】
図５Ａは、ゲイン・オブ・ファンクション（ｇａｉｎ−ｏｆ−ｆｕｎｃｔｉｏｎ；機能獲得）分析のためのＧ−ｈｆ−ＧＮＤＦ、Ｐ−ｈｆ−ＰＳＰＮおよびＧＤＮＦ／ペルセフィン置換キメラ（ＰＧＰ）の概要図であり、ここで、該図の下の括弧内のペルセフィンアミノ酸配列が、前記ＧＤＮＦ配列により置換された。
【００４２】
図５Ｂは、ＰＧＰ−Ｆ２ａｃが該ＧＦＲα１−ＲＥＴ受容体を活性化しうること、ならびに他のＰＧＰキメラおよびＰ−ｈｆ−ＰＳＰＮがＧＦＲα１−ＲＥＴを活性化し得ないことを示すグラフである。
【００４３】
図５Ｃは、示されている因子（２５ｎｇ／ｍＬ）で処理された、トランスフェクトされていない（ＲＥＴ）またはＦＬＡＧ（登録商標）タグ付きＧＦＲα１（ＲＥＴ＋ＧＦＲα１）でトランスフェクトされたｎｅｕｒｏ２ａ細胞からの抗ＦＬＡＧ（登録商標）免疫沈澱ライセートのＲＥＴイムノブロットのイメージであり、該全ライセートの画分はＲＥＴ二重線を示しており、そのうちの上側のバンドは該成熟細胞表面形態に対応する。
【００４４】
図５Ｄは、一過性にトランスフェクトされたＣＯＳ細胞の馴らし培地から精製された示されている因子の存在下でのＮＢＬ−Ｓ神経芽細胞腫細胞によるＢｒｄＵの取込みの柱状グラフであり、試験したすべての用量において、突然変異体ＰＧＰ−Ｆ２ａｃが、ＧＤＮＦと同様のレベルでＮＢＬ−Ｓ細胞の増殖を刺激することを示している。
【００４５】
図５Ｅは、因子の不存在下（ＣＴＲＬ）、またはレチノイン酸（ＲＡ；１０μＭ）の存在下、または示されている構築物を発現するＣＯＳ細胞からの馴らし培地の存在下で培養したＳＨ−ＳＹ５Ｙ神経芽細胞腫細胞の写真であり、ＧＤＮＦおよびＰＧＰ−Ｆ２ａｃはこれらの細胞における神経突起成長を刺激するが、ペルセフィンはそれを刺激しないことが示されている。
【００４６】
図６Ａは、Ｎ−ｈｆ−ＧＤＮＦ、Ｐ−ｈｆ−ＰＳＰＮ、ＰＧＰ−Ｆ２ａｃ、ＰＮＰ−Ｆ２ａｃおよびＰＡＰ−Ｆ２ａｃの構造を示す概要図である。
【００４７】
図６Ｂは、図６Ａに示されている５つの分子がＧＦＲα１−ＲＥＴ（左側）およびＧＦＲα２−ＲＥＴ（右側）を活性化しうること又は活性化し得ないことを示す２つのグラフである。
【００４８】
図７Ａは、Ｇ−ｈｆ−ＧＤＮＦ、Ｐ−ｈｆ−ＰＳＰＮ、ＰＧＰ−Ｆ２ａｃ、ＰＮＰ−Ｆ２ａｃ、ＰＮＰ−Ｈａ／Ｆ２ａｃおよびＰＮＰ−Ｈａの構造を示す概要図である。
【００４９】
図７Ｂは、図７Ａに示されている６つの分子がＧＦＲα２−ＲＥＴを活性化しうること又は活性化し得ないことを示すグラフである。
【００５０】
図７Ｃは、Ｎ−ｈｆ−ＧＤＮＦ、Ｎ−ｈｆ−アルテミン、ＰＡＰ−Ｆ２ａｃ、ＰＡＰ−Ｈａ／Ｆ２ａｃおよびＰ−ｈｆ−ＰＳＰＮの構造を示す概要図である。
【００５１】
図７Ｄは、図７Ｃに示されている５つの分子がＧＦＲα３−ＲＥＴを活性化しうること又は活性化し得ないことを示すグラフである。
【００５２】
図８Ａは、示されている受容体成分でトランスフェクトされ高カリウム＋血清（Ｋ２５＋Ｓ）、低カリウム（Ｋ５）、または低カリウム＋ＧＤＮＦ（ＧＤＮＦ）の存在下で３日間培養された小脳顆粒細胞の生存を示すグラフである。
【００５３】
図８Ｂは、示されている因子の存在下で培養されたＧＦＲα１−ＲＥＴまたはＧＦＲα２−ＲＥＴでトランスフェクトされた小脳顆粒細胞の生存を示すグラフである。
【００５４】
（好ましい実施形態の記載）
本発明は、ＧＦＲα２−ＲＥＴをもＧＦＲα３−ＲＥＴをも実質的に活性化することなくＧＦＲα１−ＲＥＴを選択的に活性化する増殖因子に関する。そのような増殖因子は、好ましくは、ＧＦＲα１−ＲＥＴ複合体を活性化しうるキメラＧＤＮＦファミリーリガンド増殖因子であり、したがって、インビボまたはインビトロにおいて末梢および中枢ニューロン集団の生存を促進するのに有用である。
【００５５】
１つの実施形態においては、本発明は、ＧＦＲα２−ＲＥＴ複合体をもＧＦＲα３―ＲＥＴ複合体をも実質的に活性化することなく哺乳類ＧＦＲα１−ＲＥＴを活性化しうる点で、従前公知の天然に存在するＧＤＮＦリガンドファミリーメンバーＧＤＮＦ、アルテミン、ニュールツリンおよびペルセフィンとは異なる新規キメラを提供する。これらの新規キメラの具体例としては、ＰＧＰ−Ｆ２ａｃ（例えば、配列番号１２、２３および２６）、ＰＮＰ−Ｆ２ａｃ（例えば、配列番号１４、２４および２７）およびＰＡＰ−Ｆ２ａｃ（例えば、配列番号１６、２５および２８）が挙げられ、ここで、該Ｆ２ａ領域内のアミノ酸６３−６６および／または該Ｆ２ｃ領域内のアミノ酸７６−８２（図１に記載の完全長ペルセフィンのアミノ酸６８−７１および８１−８７に対応する）がＰＧＰ−Ｆ２ａｃにおけるＧＤＮＦ、ＰＮＰ−Ｆ２ａｃにおけるニュールツリンまたはＰＡＰ−Ｆ２ａｃにおけるアルテミンからの対応アミノ酸で置換されていること以外は、該配列はヒトペルセフィン（例えば、配列番号１）、マウスペルセフィン（配列番号２）またはラットペルセフィン（配列番号３）と同一である。ペルセフィン配列はＧＦＲα１−ＲＥＴ、ＧＦＲα２−ＲＥＴまたはＧＦＲα３−ＲＥＴのいずれにも結合せずそれらを活性化もしないが、ペルセフィンのこれらのアミノ酸をＧＤＮＦ、ニュールツリンまたはアルテミンからの同じ整列部位のアミノ酸で置換すると、ＧＦＲα１−ＲＥＴに結合しそれを活性化する能力が該キメラ分子に付与される。しかし、ペルセフィンのアミノ酸６３−６６および７６−８２が、ＧＦＲα２−ＲＥＴ（ニュールツリンおよびＧＤＮＦ）およびＧＦＲα３−ＲＥＴ（アルテミン）を同様に活性化しうる増殖因子からの領域により置換されている場合であっても、該キメラはそれらの受容体を活性化しない。
【００５６】
本発明で用いる、ＧＤＮＦファミリーリガンドによるＧＦＲα−ＲＥＴ複合体を実質的に活性化する能力は、そのリガンドがＭＡＰキナーゼ経路を、ＧＤＮＦがＧＦＲα１−ＲＥＴ活性化によりその経路を活性化する能力の好ましくは少なくとも約４０％、より好ましくは少なくとも約５０％、最も好ましくは少なくとも約８０％のレベルで活性化する能力と定義される。これは、例えば、ＧＤＮＦに関して既に記載されているＧａ１４−Ｅ１ｋ／Ｇａ１４−Ｌｕｃレポーター系（Ｗｏｒｂｙら，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７３：３５０２−３５０８，１９９８；Ｗｏｒｂｙ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：２３６１９−２３６２２，１９９６）と共に個々のＧＦＲα受容体をコードする発現プラスミドで形質転換されたＲＥＴ発現細胞を活性化した後にルシフェラーゼ活性を測定することにより測定することができる。
【００５７】
本発明で用いる、第１基本システインから始まるペルセフィンアミノ酸６５−７１（Ｆ２ａ領域としても公知である−図１）および８１−８７（Ｆ２ｃ領域）に「対応」または「類似」した他のＧＤＮＦファミリーリガンド内の領域は、類似した推定三次構造に従い領域を整列（アライン）するように設計された一般に用いられるアライメント方法により、それらのペルセフィン領域と整列した増殖因子の領域を包含する意である。一例として、Ｌａｓｅｒｇｅｎｅバイオコンピューティング・ソフトウェア（ＤＮＡＳＴＡＲ，ＩＮＣ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）における多配列アライメントのＣｌｕｓｔａｌ法（Ｈｉｇｇｉｎｓら，Ｃａｂｉｏｓ  ８：１８９−１９１，１９９２）が挙げられる。この方法では、進行的（ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ）様態でマルチプルアライメントを行い、ここで、一連のペアワイズアライメントから算出された類似性スコアを用いて、より大きなアライメントグループを集合させる。最大アライメントスコア（これは、与えられた進化間隔にわたって２つの関連タンパク質において生じる与えられたアミノ酸変化の確率を表す残基ウェイト（重み）表から求められた、該アライメントにおける別々の残基間の全スコアの平均である）を見出すことにより、最適配列アライメントを得る。該アライメントにおけるギャップの空き（ｏｐｅｎｉｎｇ）および延長に関するペナルティが該スコアに寄与する。このプログラムで使用したデフォルトパラメーターは以下のとおりである：マルチプルアライメントに関するギャップペナルティ＝１０；マルチプルアライメントに関するギャップ長ペナルティ＝１０；ペアワイズアライメントにおけるｋタプル値＝１；ペアワイズアライメントにおけるギャップペナルティ＝３；ペアワイズアライメントにおけるウィンドウ値＝５；ペアワイズアライメントにおいてセーブされたダイアゴナル＝５。そのアライメントプログラムに使用した残基ウェイト表はＰＡＭ２５０（Ｄａｙｈｏｆｆら，ｉｎ  Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｄａｙｈｏｆｆ編，ＮＢＲＦ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｖｏｌ．５，ｓｕｐｐｌ．３，ｐ．３４５，１９７８）である。
【００５８】
Ｃｌｕｓｔａｌ法を用いて該ＧＤＮＦファミリーリガンドを整列させる場合（例えば、図１を参照されたい）、該Ｆ２ａおよびＦ２ｃ領域は、第１基準システイン残基から始まるペルセフィンのアミノ酸６０−６６および７６−８３よりなる（配列番号１〜３に記載のとおり）。図１に示すとおり、ペルセフィンのＮ末端から番号付けした場合、これらの領域は、それぞれアミノ酸６５−７１および８１−８８に対応する。Ｃｌｕｓｔａｌ法によりペルセフィンをＧＤＮＦと整列させると、該Ｆ２ａおよびＦ２ｃ領域は、配列番号４〜６に記載のＧＤＮＦのそれぞれアミノ酸６３−７１および８０−８７、ならびに完全長ＧＤＮＦ（図１）のそれぞれアミノ酸１０３−１１０および１２０−１２７に対応し、ヒトＧＤＮＦ（配列番号４）におけるそれぞれ配列ＲＰＩＡＦＤＤＤおよびＹＨＩＬＲＫＨＳを有する。ニュールツリンでは、Ｆ２ａおよびＦ２ｃは、配列番号７および８におけるそれぞれアミノ酸６４−７１および８１−８８、ならびに完全長ニュールツリン（図１）のそれぞれアミノ酸６９−７６および８６−９３であり、ヒトニュールツリン（配列番号７）における配列ＲＰＴＡＹＥＤＥおよびＹＨＴＶＨＥＬＳを有する。アルテミンでは、Ｆ２ａおよびＦ２ｃは、配列番号９および１０におけるそれぞれアミノ酸６７−７３および８３−９０、ならびに完全長アルテミン（図１）のそれぞれアミノ酸８２−８８および９８−１０５であり、ヒトアルテミン（配列番号９）における配列ＲＰＴＲＹＥＡおよびＷＲＴＶＤＲＬＳを有する。
【００５９】
ペルセフィンＦ２ａ領域の７アミノ酸６０−６６は、ＧＤＮＦの８アミノ酸６３−７０またはニュールツリンの６４−７１に対応する。なぜなら、Ｃｌｕｓｔａｌ分析は、ＧＤＮＦまたはニュールツリンと整列させた場合にペルセフィンにおいてアミノ酸６６と６７との間にギャップを作るからである（例えば図１を参照されたい）。したがって、ＧＤＮＦまたはニュールツリンからのこの領域内の第８アミノ酸はペルセフィン（およびアルテミン）内には存在しない。
【００６０】
現在公知または未知のいずれかのペルセフィンのアミノ酸６０−６６および７６−８３（配列番号１〜３における番号付けのとおり）を、いずれかのＧＦＲα１−ＲＥＴ活性化ＧＤＮＦファミリーリガンド（現在公知または未知のもの）からの類似領域で置換すると、ＧＦＲα２−ＲＥＴをもＧＦＲα３−ＲＥＴをも活性化することなくＧＦＲα１−ＲＥＴを活性化する増殖因子が生じるであろうと考えられるため、この実施形態の範囲は、本明細書に開示するＧＤＮＦファミリーメンバーに限定されるものではなく、任意のＧＤＮＦファミリーメンバーを包含するものである。本発明はまた、該ペルセフィンが１つの種由来であり６０−６６および７６−８３内の各置換アミノ酸が同一または異なる種のものでありうるキメラを含む。
【００６１】
また、ＧＦＲα１−ＲＥＴを活性化する能力を保有するためには、該キメラは、それが由来するＧＤＮＦファミリーリガンドの厳密なアミノ酸配列を必ずしも含む必要はないと考えられる。むしろ、該キメラ内の同類置換は本発明の範囲内である。同類アミノ酸置換は、類似した側鎖を有する残基が相互に交換されうることを指す。同類置換アミノ酸は、それらの側鎖の化学的特性により分類することができる。例えば、アミノ酸の１つのグループは、中性および疎水性側鎖を有するアミノ酸（Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｐ、Ｗ、ＦおよびＭ）を含み、もう１つのグループは、中性および極性側鎖を有するアミノ酸（Ｇ、Ｓ、Ｔ、Ｙ、Ｃ、ＮおよびＱ）を含み、もう１つのグループは、塩基性側鎖を有するアミノ酸（Ｋ、ＲおよびＨ）を含み、もう１つのグループは、酸性側鎖を有するアミノ酸（ＤおよびＥ）であり、もう１つのグループは、脂肪族側鎖を有するアミノ酸（Ｇ、Ａ、Ｖ、ＬおよびＩ）であり、もう１つのグループは、脂肪族ヒドロキシル側鎖を有するアミノ酸（ＳおよびＴ）であり、もう１つのグループは、アミン含有側鎖を有するアミノ酸（Ｎ、Ｑ、Ｋ、ＲおよびＨ）であり、もう１つのグループは、芳香族側鎖を有するアミノ酸（Ｆ、ＹおよびＷ）であり、もう１つのグループは、硫黄含有側鎖を有するアミノ酸（ＣおよびＭ）である。好ましい同類アミノ酸置換グループは、Ｒ−Ｋ；Ｅ−Ｄ、Ｙ−Ｆ、Ｌ−Ｍ；Ｖ−Ｉ、およびＱ−Ｈである。
【００６２】
また、本発明で用いる本発明のキメラは、修飾された配列を含有するキメラがＧＦＲα１−ＲＥＴ活性化能を保有する限り、本発明で同定された配列の修飾、例えば、１以上のアミノ酸が挿入された又は欠失した又は異なるアミノ酸若しくは修飾もしくは異常アミノ酸で置換された配列、および１以上のアミノ酸のグリコシル化またはリン酸化のような修飾を含みうる。ＧＦＲα−ＲＥＴ活性化活性に必要だと考えられる構造Ｃｙｓ残基が保有される限り、Ｎ末端、Ｃ末端または該アミノ酸配列内にアミノ酸を付加したり、Ｎ末端、Ｃ末端または該アミノ酸配列内からアミノ酸を除去することが可能である。したがって、配列番号１〜１０に記載の配列（これらは、ＧＤＮＦファミリーメンバーの第１および第７基準システイン間のみの配列である）は、これらの増殖因子の活性に必要な最小長であると考えられる。
【００６３】
また、ＧＦＲα１−ＲＥＴ活性化増殖因子からのアミノ酸でのペルセフィンアミノ酸の置換は、アミノ酸６０−６６および７６−８３（配列番号１〜３の番号付け）のすべてを必ずしも含む必要はないことが公知である。例えば、ＧＦＲα１−ＲＥＴ活性化キメラＰＧＰ−Ｆ２ａｃ、ＰＮＰ−Ｆ２ａｃおよびＰＡＰ−Ｆ２ａｃはすべて、Ｆ２ａアミノ酸残基６３−６６およびＦ２ｃアミノ酸残基７６−８２（すべての公知ＧＤＮＦファミリーメンバーにおいては残基８３はＳである）の置換のみを含む。また、これらの領域内のＧＤＮＦ、ニュールツリンおよびアルテミンアミノ酸とペルセフィンの対応アミノ酸との比較は、同様にペルセフィン内に存在しない唯一のＧＤＮＦ、ニュールツリンおよびアルテミンアミノ酸は、６５、７７、７８、８０および８１位のアミノ酸、ならびにペルセフィンにおけるアミノ酸６６と６７との間で「欠落」したアミノ酸であることを示している。６６と６７との間のその「欠落」アミノ酸は、公知ＧＤＮＦ配列においてはＤであり、公知ニュールツリンにおいてはＥであり、それらは共に酸性アミノ酸である。しかし、このアミノ酸は、ＧＦＲα１を活性化するアルテミンにおいても欠落している。したがって、ペルセフィンキメラにおいてその欠落アミノ酸を付与することは、ＧＦＲα１を活性化する該キメラの能力に影響を及ぼすとは考えられない。６５位において、該公知ペルセフィンはＡまたはＴを有し、それらは共に、生理的ｐＨにおいて非荷電であり、該ＧＦＲα１活性化増殖因子はＥまたはＤを有し、それらは共に酸性である。７７位において、該ペルセフィンはＱを有し、これは非荷電で極性であり、一方、公知ＧＦＲα１−ＲＥＴ活性化増殖因子はＲまたはＨを有し、これらは塩基性である。７８位において、該ペルセフィンはＱ（非荷電で極性）またはＲ（塩基性）を有し、一方、該ＧＦＲα１−ＲＥＴ活性化増殖因子はＴ（非荷電で極性）またはＩ（無極性）を有する。８０位において、該ペルセフィンはＰ（無極性）を有し、一方、該ＧＦＲα１−ＲＥＴ活性化増殖因子はＤ、Ｈ（共に酸性）、Ｒ（塩基性）およびＱ（非荷電で極性）を有する。最後に、８１位において、該ペルセフィンはＱ（非荷電で極性）を有し、一方、該ＧＦＲα１−ＲＥＴ活性化増殖因子はＨ（塩基性）、Ｅ（酸性）またはＫ（塩基性）を有する。この分析に基づけば、残基６５および７７における置換のみが、「非機能的」（すなわち、ＧＦＲα１−ＲＥＴを活性化しない）ペルセフィンから「機能的」（ＧＦＲα１−ＲＥＴ活性化）ＧＤＮＦファミリーリガンドへの、特定の電荷または極性への決定的な変化に相当する。したがって、これらの「ホットスポット」は、ＧＦＲα１−ＲＥＴ活性化に特に重要でありうる。したがって、ＧＦＲα１−ＲＥＴ活性化は、（ａ）アミノ酸６３−６６の１〜４個がＧＦＲα１−ＲＥＴ活性化ＧＤＮＦファミリーリガンドまたはその同類置換変異体の対応アミノ酸で置換された（少なくとも、酸性アミノ酸でのアミノ酸６５の置換が含まれる）、および（ｂ）アミノ酸７６−８２の１〜７個がＧＦＲα１−ＲＥＴ活性化ＧＤＮＦファミリーリガンドまたはその同類置換変異体の対応アミノ酸で置換された（塩基性アミノ酸でのアミノ酸７７の置換が含まれる）ペルセフィンで達成されうると考えられる。６５位における好ましい置換はＥおよびＤである。７７位における好ましい置換はＫ、ＲまたはＨであり、最も好ましいのはＲおよびＨである。
【００６４】
もう１つの実施形態においては、本発明は、Ｆ２ａ、Ｆ２ｃおよびＨａ領域の全３個がＧＦＲα−ＲＥＴ活性化ＧＤＮＦファミリーリガンドの等価領域で置換されたペルセフィンを含むキメラＧＤＮＦファミリーリガンドを提供する。該Ｈａ領域は、ペルセフィン配列番号１〜３のアミノ酸３３−４１（完全長ペルセフィンのアミノ酸３８−４６と等価：図１）および他のＧＤＮＦファミリーリガンドの等価領域（Ｃｌｕｓｔａｌ分析により決定されたもの）（図１）を含む。該Ｈａ領域の付加は、該Ｈａ領域の起源に応じて、ＧＦＲα２−ＲＥＴまたはＧＦＲα３−ＲＥＴを活性化する能力を付与する。該Ｈａ領域（およびＦ２ａおよびＦ２ｃ）がニュールツリンに由来する場合には（例えば、ＰＮＰ−Ｈａ／Ｆ２ａｃ：図７Ａ）、該キメラはＧＦＲα２−ＲＥＴを活性化するであろう。該Ｈａ領域（およびＦ２ａおよびＦ２ｃ）がアルテミンに由来する場合には（例えば、ＰＡＰ−Ｈａ／Ｆ２ａｃ：図７Ｃ）、該キメラはＧＦＲα３−ＲＥＴを活性化するであろう。これらのキメラによるＧＦＲα２−ＲＥＴまたはＧＦＲα３−ＲＥＴの活性化は、一般には、該天然（例えば、ニュールツリンまたはアルテミン）リガンドによるそのＧＦＲα―ＲＥＴの活性化の約７０％であることが判明している（例えば、図７を参照されたい）。ニュールツリンはＧＦＲα３に実質的に結合せずそれを活性化もしないため、ＰＮＰ−Ｈａ／Ｆ２ａｃのようなキメラは、ＧＦＲα１−ＲＥＴおよびＧＦＲα２−ＲＥＴのみを活性化し、ＧＦＲα３−ＲＥＴをも、同様の追加的な結合および活性化要件を有する他のＧＦＲα−ＲＥＴ複合体をも活性化しないと予想されるであろう。同様に、アルテミンは、ＧＦＲα２に実質的に結合せずそれを活性化もしないため、ＰＡＰ−Ｈａ／２ａｃのようなキメラは、ＧＦＲα１−ＲＥＴおよびＧＦＲα３−ＲＥＴのみを活性化し、ＧＦＲα２−ＲＥＴをも、同様の追加的な結合および活性化要件を有する他のＧＦＲα−ＲＥＴ複合体をも活性化しないと予想されるであろう。
【００６５】
したがって、ＰＮＰ−Ｈａ／Ｆ２ａｃおよびＰＡＰ−Ｈａ／Ｆ２ａｃは、それぞれニュールツリンおよびアルテミンの模擬体を代表するものである。本発明で用いる、ＧＤＮＦファミリーリガンドの模擬体は、ＧＤＮＦファミリーリガンドと同じＧＦＲα−ＲＥＴ受容体を活性化するが異なるＧＤＮＦファミリーリガンドを主に含むキメラである。ＰＮＰ−Ｈａ／Ｆ２ａｃおよびＰＡＰ−Ｈａ／Ｆ２ａｃのような模擬体は、それぞれニュールツリンおよびアルテミンと同じＧＦＲα−ＲＥＴ受容体を活性化するため、それらは、任意の治療方式において、それらのＧＤＮＦファミリーリガンドの代わりに使用されうる（例えば、ニュールツリンに関しては米国特許第５，８４３，９１４号に、アルテミンに関しては米国特許出願第０９／２１８，６９８号に記載されており、それらを共に参照により本明細書に組み入れることとする）。
【００６６】
ＧＦＲα１−ＲＥＴ活性化リガンドからのＦ２ａおよびＦ２ｃ領域のみを有するペルセフィンキメラの場合と同様に、Ｆ２ａ、Ｆ２ｃおよびＨａキメラ領域を有するペルセフィンキメラは、同類置換および修飾アミノ酸を含みうる。該ＧＦＲα１−ＲＥＴ活性化リガンドからのキメラ領域はまた、既に記載されているとおり、部分的に過ぎない置換を含みうる。
【００６７】
もう１つの実施形態においては、本発明は、改変Ｎ末端領域を有するキメラＧＤＮＦファミリーリガンドを提供する。第１システイン残基のＮ末端側の領域は、ＧＦＲα／ＲＥＴを活性化するのに必ずしも必要でないことが見出された（実施例１を参照されたい）。したがって、任意の他のＧＤＮＦファミリーリガンドからのＮ末端領域を有する又は約１００アミノ酸以下の任意の他の配列（Ｎ末端領域の不存在を含む）を有する任意のＧＤＮＦファミリーリガンドは、該野生型リガンドが活性化するＧＦＲα−ＲＥＴを活性化すると予想されるであろう。したがって、この実施形態は、該第１システイン残基のＮ末端側に０〜１００アミノ酸を有するＧＤＮＦファミリーメンバーを含む。このＮ末端領域は、シグナル配列またはシグナル配列を含むプレプロ領域のような機能的配列を含みうる。多数のタンパク質は、成熟タンパク質配列のＮ末端のシグナル配列と共に細胞内で合成されることが当技術分野でよく知られており、そのようなリーダー配列を保持するタンパク質はプレタンパク質と称される。該プレ領域は、細胞下細胞小器官への又は該細胞の外部への該タンパク質の輸送を指令するシグナルペプチドとして機能しうる。該タンパク質のプレ部分は、該タンパク質の細胞プロセシング中に切断される。多数のタンパク質は、プレ−リーダー配列に加えて、成熟タンパク質の安定な前駆体であるタンパク質上の領域を表す異なるプロ配列を含有する。他のＴＧＦ−βファミリーメンバーで生じることが知られているプロセシング事象を考慮すると、本発明者らは、細胞内で合成されるＧＤＮＦファミリーリガンドの形態がプレ−プロ−リガンドであると考えている。したがって、一般には、該ＧＤＮＦファミリーリガンドプレ−領域の後に、該成熟リガンドのＮ末端アミノ酸の直前のＲＸＸＲコンセンサス部位で好ましくは終わると考えられるプロ−ドメインが続く。プレおよびプロの両領域と共に合成されるタンパク質は、プレプロタンパク質と称される。
【００６８】
したがって、本発明の範囲内には、別のＧＤＮＦファミリーリガンドまたは別のタンパク質からのプレ−プロ−領域を含有するＧＤＮＦファミリーリガンド、およびそのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが含まれる。該ポリペプチドは該プレ−プロ−領域の切断後に成熟リガンドを与えることが可能であり、該ポリヌクレオチドは、該非アルテミンプレ−プロ−領域の切断後に成熟アルテミンを与えるポリペプチドを得るために、発現系内で使用されうる。そのような非ＧＤＮＦファミリーリガンドプレ−プロ−領域ポリペプチドおよびコード化ポリヌクレオチドは、当技術分野でよく知られている。
【００６９】
したがって、該ＧＤＮＦファミリーリガンドのキメラは、いずれかのタンパク質、プロ−タンパク質またはプレ−プロ−タンパク質からのＮ末端領域を含みうる。これは、例えば、該タンパク質を特定の細胞領域または細胞外へ標的化するのに利用されうる。あるいは、Ｎ末端領域の一部のみを含有する又はそれを完全に欠くＧＦＲα−ＲＥＴ活性化トランケート化ＧＤＮＦファミリーメンバー（キメラを含む）が製造されうる。
【００７０】
本発明において本発明者らはいずれの理論にも束縛されることを意図するものではないが、本発明で同定されたキメラＧＤＮＦファミリーリガンドは、ＴＧＦ−βスーパーファミリーの他の因子に関して知られたものと一致した様態で、それらの生物学的に活性な形態においては二量体として存在しうる。該キメラは、ホモ二量体またはヘテロ二量体として使用されうる。生理的条件下では該キメラの単量体はホモ二量体に会合すると考えられる。
【００７１】
本発明の好ましいキメラは、組換えＤＮＡ技術により、純粋な形態で製造される。「純粋な形態」または「精製された形態」または「実質的に精製された形態」は、キメラ組成物が、該キメラではない他のタンパク質を実質的に含有しないことを意味する。好ましくは、実質的に精製されたキメラ組成物は、存在する全タンパク質または他の巨大分子種に対して、モル比率で少なくとも約５０％のキメラを含む。より好ましくは、実質的に精製されたキメラ組成物は、存在する全タンパク質または他の巨大分子種の少なくとも約８０％〜約９０モル％を含み、より一層好ましくは、少なくとも約９５モル％以上を含む。
【００７２】
組換えキメラは、該キメラをコードするＤＮＡ配列を適当な形質転換宿主細胞内で発現させることにより製造することができる。当技術分野で良く知られた方法を用いて、該キメラをコードするＤＮＡを発現ベクターに連結し、宿主細胞内に形質転換し、該形質転換細胞による該キメラの発現に適した条件を確立することができる。
【００７３】
組換えキメラを製造するために、任意の適当な発現ベクター、例えば、哺乳類発現ベクターｐＣＢ６（Ｂｒｅｗｅｒ，Ｍｅｔｈ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ４３：２３３−２４５，１９９４）または大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｐＥＴ発現ベクター、特に、ｐＥＴ−３０ａ（Ｓｔｕｄｉｅｒら，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ  １８５：６０−８９，１９９０）を使用することができる。哺乳類および細菌細胞内での発現のための他の適当な発現ベクターは、酵母または昆虫細胞内で使用する発現ベクターと同様、当技術分野で公知である。バキュロウイルス発現系も使用することができる。
【００７４】
多数の細胞型が、組換えキメラの発現のための宿主細胞として適当でありうる。哺乳類宿主細胞には、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ヒト腎臓２９３細胞、ヒト表皮Ａ４３１細胞、ヒトＣｏｌｏ  ２０５細胞、３Ｔ３細胞、ＣＶ−１細胞、他の形質転換霊長類細胞系、正常二倍体細胞、初代外植片、初代組織のインビトロ培養由来の細胞株、ＨｅＬａ細胞、マウスＬ細胞、ＢＨＫ、ＨＬ−６０、Ｕ９３７、ＨａＫおよびＪｕｒｋａｔ細胞が含まれるが、これらに限定されるものではない。適当な宿主細胞として機能しうる酵母株には、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）、クルイベロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）株、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、および異種タンパク質を発現しうる他の任意の酵母株が含まれる。宿主細菌株には、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、バシラス・サチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、サルモネラ・ティフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、および異種タンパク質を発現しうる他の任意の細菌株が含まれる。該ポリペプチドを酵母または細菌内で製造する場合、生物学的に活性なポリペプチドを得るために、例えば、公知の化学的または酵素的方法を用いて適当な部位のリン酸化またはグリコシル化により該ポリペプチドを修飾することが必要かもしれない。
【００７５】
また、本発明のキメラは、該キメラをコードするヌクレオチド配列を体細胞または生殖細胞が含有するトランスジェニック植物（例えば、米国特許第５，６７９，８８０号を参照されたい）またはトランスジェニック動物、例えば、ウシ、ヤギ、ブタまたはヒツジ内で発現させることができる。
【００７６】
該発現キメラは、ゲル濾過およびイオン交換クロマトグラフィーのような公知精製方法を用いて精製することができる。精製はまた、該キメラポリペプチドに特異的に結合する物質（例えば、該成熟キメラに対して産生させたポリクローナルもしくはモノクローナル抗体またはそれらのフラグメント）を使用するアフィニティークロマトグラフィーを含みうる。コンカナバリンＡ−アガロース、ＨＥＰＡＲＩＮ−ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ（登録商標）またはＣＩＢＡＣＲＯＭ  ＢＬＵＥ  ３ＧＡ  ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（登録商標）のような、タンパク質の精製で典型的に使用される他のアフィニティー樹脂も使用することができる。該キメラの精製はまた、フェニルエーテル、ブチルエーテルまたはプロピルエーテルのような樹脂を使用する疎水性相互作用クロマトグラフィーを含む１以上の工程を含みうる。
【００７７】
また、精製を促進するために、該キメラを融合タンパク質として発現されることが可能であると予想される。そのような融合タンパク質は、例えば、ヒスチジンタグに融合したキメラアミノ酸配列、およびマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）またはチオレドキシン（ＴＲＸ）のアミノ酸配列に融合したキメラアミノ酸配列を含む。同様に、本発明のキメラを、ＦＬＡＧ（登録商標）エピトープのような異種エピトープでタグ付けし、ついで、該エピトープに特異的に結合する抗体を使用するイムノアフィニティークロマトグラフィーにより精製することができる。そのような融合タンパク質およびタグ付きタンパク質の発現および精製のためのキットは商業的に入手可能である。好ましい融合タンパク質は、例えば、実施例１に記載のヒスチジンタグおよびＦＬＡＧ（登録商標）タグを含有するものである。
【００７８】
該組換えキメラはまた、単量体単位として発現させることが可能であり、そのような単量体形態は、還元条件下の製造により製造することができる。そのような場合には、タンパク質の解離／会合を促進することが知られている前記物質の１つを使用して、リフォールディングおよび再生が達成されうる。例えば、該単量体形態を、ジチオトレイトールと共にインキュベートし、ついで酸化型グルタチオン二ナトリウム塩と共にインキュベートし、ついで、尿素のようなリフォールディング剤を含有するバッファーと共にインキュベートすることができる。
【００７９】
また、本発明のキメラは、当業者に公知の方法を用いる化学合成により製造することができる。
【００８０】
本発明はまた、本明細書に記載のキメラのいずれかをコードするヌクレオチド配列を含む単離されたポリヌクレオチドを含む。本発明で用いるポリヌクレオチドはＤＮＡおよび／またはＲＮＡを含み、したがって、ＤＮＡ配列として配列表に列挙されているヌクレオチド配列はまた、チミジン残基がウラシルで置換された同じＲＮＡ配列を含む。
【００８１】
本発明はまた、本発明の範囲内に含まれるキメラコード化ヌクレオチド配列のいずれかに、機能しうる様態で結合した発現調節要素を含むベクターを含む。本発明はまた、そのようなベクターで形質転換された任意の種の宿主細胞を含む。
【００８２】
さらにもう１つの実施形態においては、キメラコード化ポリヌクレオチドまたはその相補体に特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチドを提供する。特異的ハイブリダイゼーションは、本発明においては、ポリヌクレオチド（オリゴヌクレオチドを含む）と特異的基準ポリヌクレオチド（例えば、キメラをコードするヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）との間のハイブリッドの形成と定義され、ここで、該ポリヌクレオチドは、該特異的キメラに、他のＧＤＮＦファミリーリガンドより優先的にハイブリダイズする。特異的ハイブリダイゼーションは、好ましくは、高いストリンジェンシーの条件下で行い、そのような条件は、当業者に良く知られているとおり、ハイブリダイゼーション中および洗浄操作中の幾つかの要因（温度、イオン強度、ハイブリダイゼーションまたは洗浄時間の長さ、およびホルムアミドの濃度を含む）を調節することにより容易に決定されうる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ＦｒｉｔｓｃｈおよびＭａｎｉａｔｉｓ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第２版，Ｖｏｌｓ．１−３，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ  Ｎ．Ｙ．１１８０３，１９８９を参照されたい）。
【００８３】
本発明のキメラは、ニューロンおよび非ニューロン細胞の生存および成長を促進すると予想されるであろう（例えば、本明細書中の実施例２および４を参照されたい）。前記のとおり、ＧＤＮＦ、ニュールツリン、アルテミンおよびペルセフィンは、末梢および中枢神経系内の広範囲のニューロン集団に影響を及ぼし、本発明のキメラも、そのような効果を有すると予想されるであろう。さらに、現在までに単離されている全ての他の増殖因子は、多数の異なる細胞型に作用することが示されている（例えば、ＳｃｕｌｌｙおよびＯｔｔｅｎ，Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  Ｉｎｔ  １９：４５９−４６９，１００５；Ｈｅｆｔｉ，Ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ２５：１４１８−１４３５，１９９４（それらを参照により本明細書に組み入れることとする）を参照されたい）。非ニューロン組織に対する神経栄養因子の作用の一例としては、神経栄養因子の原型であるＮＧＦは、新生ラット内に注射された場合にマスト細胞にも作用してそれらの数を増加させることが挙げられる（Ａｌｏｅ，Ｊ  Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ  １８：１−１２，１９８８）。また、マスト細胞はｔｒｋ受容体を発現し、ＮＧＦに応答し、したがってＮＧＦはマスト細胞分泌促進および生存促進因子である（Ｈｏｒｉｇｏｍｅら，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２６９：２６９５−２７０７，１９９４）。さらに、ＴＧＦ−βスーパーファミリーのメンバーは、種々の機能および発生学的起源の多数の細胞型に作用する。例えば、ＧＦＲα１のＧＤＮＦ活性化は腎臓器官発生において決定的に重要であるらしい。したがって、本発明のキメラは、末梢および中枢の両方の種々の異なるニューロン細胞ならびに非ニューロン細胞に対する栄養活性を有すると考えられる。
【００８４】
本発明はまた、細胞の変性または機能不全を有する患者における細胞に栄養支持をもたらすのに有効な量の本発明のキメラを含む治療用または医薬用組成物、および治療的に有効な量の該キメラをエクスビボ（ｅｘ  ｖｉｖｏ）またはインビボで細胞に投与することを含む方法を含む。「栄養支持」なる語は、ある細胞がその正常な機能の少なくとも１以上を維持または回復するよう、本発明のキメラのような増殖因子が十分な栄養を該細胞に与えること意味するものとして本発明で用いられている。
【００８５】
本発明の組成物および方法は、多数の変性疾患および未分化（ａｎａｐｌａｓｔｉｃ）疾患の治療に有用である。そのような細胞の変性、機能不全または未分化にニューロンが関わる場合、該疾患は、末梢性ニューロパシー、筋萎縮性側索硬化症、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、糖尿病、エイズ、虚血性卒中、急性脳傷害、急性脊髄傷害、神経芽細胞腫のような神経系腫瘍、多発性硬化症、末梢神経外傷または傷害、神経毒に対する暴露、代謝疾患、例えば糖尿病または腎不全、および感染因子または化学療法により引き起こされた損傷を含むが、これらに限定されるものではない。また、本発明のキメラの組成物は、腸疾患、例えば特発性便秘またはパーキンソン病、脊髄外傷もしくはアヘン剤鎮痛剤の使用に伴う便秘の治療に使用することができる。そのような細胞の変性または機能不全に非ニューロン細胞（例えば、骨髄細胞）が関わる場合には、血液細胞の機能不全の障害、例えば白血球減少症、例えば好酸球減少症および／または好塩基白血球減少症、リンパ球減少症、単球減少症、好中球減少症、貧血、血小板減少症、および前記のいずれかに関する幹細胞の機能不全を含む（これらに限定されるものではない）疾患の治療に、キメラが有用でありうる。心筋症およびうっ血性心不全のような疾患においては、そのような細胞の変性または機能不全に心筋細胞が関わることもある。また、小細胞肺癌を、本発明のキメラのポリペプチドまたはポリヌクレオチド組成物で治療することが可能である。
【００８６】
該キメラでの腸疾患の治療は腸ニューロパシーの治療を含む。腸神経系は、胃腸運動性を含む胃腸系の機能を制御する神経の複雑な集合体である。ＮＴ−３での初期臨床研究は、この神経栄養因子が、正常なボランティアにおいて及び末梢ニューロパシーに罹患した患者において胃腸運動性を増強することを示している。（Ｈｅｕｃｋｅｒｏｔｈら，Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ  ２００：１１６−２９，１９９８）。同様に、本発明のキメラおよびその他のＧＤＮＦファミリーリガンドは、腸ニューロンに対して活性を示すと考えられている。その結果、該キメラは、重篤な特発性便秘に罹患した患者およびパーキンソン病、脊髄外傷、アヘン剤鎮痛剤の使用などに伴う便秘に罹患した患者におけるような腸ニューロパシーの治療に有用であると考えられる。
【００８７】
本発明のキメラが特定の細胞型または組織の治療に有効であるか否かは、当技術分野で公知の種々のアッセイのいずれかを用いて当業者により容易に判定されうる。例えば、細胞に対する栄養支持の付与に関しては、栄養因子は、有益な生化学的および形態学的効果を与えることが可能であり、いくつかの状況下では、細胞の生存を促進するであろう。ニューロンに関しては、栄養支持のニューロンの減少は、正常な機能および成長に必要な代謝活性（すなわち、グルコースの取り込み、ＲＮＡ合成およびタンパク質合成）の減少を引き起こすことが、当技術分野で公知である（ＤｅｃｋｗｅｒｔｈおよびＪｏｈｎｓｏｎ，Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１２３：１２０７−１２２２，１９９３）。栄養支持の除去はまた、ニューロンの細胞体のサイズの減少を引き起こす。おそらく栄養因子の代謝効果の喪失の結果として、栄養因子の減少は突起成長の減少または停止を引き起こし、神経突起の退縮を引き起こしうる。ニューロン生物学のこれらの態様に関する栄養因子の要求性に加えて、該ニューロンは、生存の維持のために神経栄養因子を必要とすることがある。したがって、生存アッセイが、神経栄養因子の作用の検出または定量にしばしば用いられる手段である。しかし、栄養支持は、ニューロンの数には又は生存に対する効果には無関係な形態学的、生化学的および／または機能的変化としても現れうる。
【００８８】
前記のとおり、増殖因子は、細胞に対する栄養支持の付与に加えて、細胞分化を引き起こしうる。したがって、本発明のキメラおよびそれをコードするポリヌクレオチドは、癌細胞のような未分化細胞の分化を引き起こすのに有益に使用されうると考えられる。特に、該キメラは、神経芽細胞腫のような神経系腫瘍の治療に使用することができる。また、小細胞肺癌はＲＥＴを発現することが公知である。したがって、該キメラは、小細胞肺癌の治療にも使用することができると考えられる。
【００８９】
また、栄養支持および／または分化の惹起は、キメラをＧＦＲα１ポリペプチド（および／または、ニュールツリンまたはアルテミン模擬体の場合にはそれぞれＧＦＲα２またはＧＦＲα３）と共に投与することにより、あるいは、ＧＤＮＦに関してＴｒｅａｎｏｒら，Ｎａｔｕｒｅ  ３８２：８０−８３，１９９６に既に記載されている方法を用いて、該キメラをコードするポリヌクレオチドおよび適当なＧＦＲαポリヌクレオチドを投与することにより達成されうると予想される。ＧＦＲα１の配列は当技術分野で公知である。例えば、ヒトポリペプチド配列に関しては、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＰ ００５２５５を、ヒトＧＦＲα１をコードするポリヌクレオチド配列に関しては、ＮＭ ００５２６４を参照されたい。
【００９０】
本発明のキメラは、ＲＥＴの不存在下でＧＦＲα１（および該ニュールツリンまたはアルテミン模擬体の場合にはそれぞれＧＦＲα２またはＧＦＲα３）に結合すると考えられ、生じたリガンド／補助受容体複合体は、標的細胞により発現されたＲＥＴ受容体に結合しそれを活性化しうると考えられる。したがって、キメラおよび適当なＧＦＲαでの処理は、該キメラに通常は応答性である細胞の感受性を増加させると予想され、また、ＲＥＴを発現するが該キメラに通常は応答性でない細胞に栄養支持を与えると予想されるであろう。好ましくは、該キメラおよびＧＦＲαポリペプチドは同一種（すなわち、ヒト）に由来する。また、ＧＦＲαポリペプチドは可溶性形態であること、すなわち、細胞膜との望ましくない潜在的相互作用を避けるためにそれがＧＰＩ結合を欠いていることが好ましい。本発明で用いるＧＦＲαポリペプチドは、ＧＰＩアンカーを伴う又は伴わない該成熟タンパク質、および、本発明のキメラおよびＲＥＴの両方に結合しそのような結合によりＲＥＴの活性化をもたらしうるＧＦＲα断片、特に、ＧＰＩアンカーを欠く可溶性断片を含むことが意図される。
【００９１】
本発明の治療用または医薬用組成物は、例えば静脈内、皮下、筋肉内、経皮、鞘内または脳内経路を含む当技術分野で公知のいずれかの適当な経路により投与することができる。投与は、注射によるような迅速なもの、あるいは遅（ｓｌｏｗ）注入または徐放製剤の投与のような一定時間にわたるものでありうる。中枢神経系内の組織の治療には、投与は、脳脊髄液（ＣＳＦ）内への注射または注入でありうる。本発明のキメラを中枢神経系内の細胞に投与することを意図する場合には、投与は、該キメラが血液脳関門を越えて透過するのを促進しうる１以上の物質によるものでありうる。
【００９２】
また、本発明のキメラは、所望の薬学的または薬力学的特性をもたらす物質に結合または共役させることができる。例えば、キメラを、血液脳関門を越える透過または輸送を促進することが当技術分野で知られている任意の物質（例えば、トランスフェリン受容体に対する抗体）に結合させ、静脈内注射により投与することができる（例えば、Ｆｒｉｄｅｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５９：３７３−３７７，１９９３を参照されたい）。さらに、溶解度、安定性、半減期および他の薬学的に有利な特性の所望の特性を得るために、キメラを、ポリエチレングリコールのような重合体に安定に結合させることができる（例えば、Ｄａｖｉｓら，Ｅｎｚｙｍｅ  Ｅｎｇ  ４：１６９−７３，１９７８；Ｂｕｒｎｈａｍ，Ａｍ  Ｊ  Ｈｏｓｐ  Ｐｈａｒｍ  ５１：２１０−２１８，１９９４を参照されたい）。
【００９３】
好ましくは、本発明のキメラは、該キメラの運搬を標的化細胞に限定するために標的化部分を含有するリポソームまたは重合体のような担体と共に投与する。標的化部分の具体例には、特定の細胞表面分子に対する抗体、リガンドまたは受容体が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００９４】
非経口的でない投与の場合には、該組成物はまた、粘膜の孔径を増加させる吸収増強剤を含みうる。そのような吸収増強剤には、デオキシコール酸ナトリウム、グリココール酸ナトリウム、ジメチル−β−シクロデキストリン、ラウロイル−１−リソホスファチジルコリン、および粘膜のリン脂質ドメインに対して構造的類似性を有する他の物質が含まれる。
【００９５】
該組成物は、通常、医薬製剤の形態で使用する。そのような製剤は、薬学分野で良く知られた方法で製造される。１つの好ましい製造では、生理食塩水溶液のビヒクルを使用するが、他の医薬上許容される担体、例えば、生理的濃度の他の無毒性塩、５％  グルコース水溶液、無菌水なども使用することが可能であると予想される。また、適当なバッファーが該組成物中に存在することが望ましいかもしれない。所望により、そのような溶液を凍結乾燥させ、即時（ｒｅａｄｙ）注射用に無菌水の添加により再生されるように用意された無菌アンプル内に保存することができる。主溶媒は水性または非水性でありうる。また、本発明のキメラを、治療を要する組織内に移植されうる生物学的に適合しうる固体または半固体のマトリックス内に組込むことが可能である。
【００９６】
該担体はまた、該製剤のｐＨ、浸透圧モル濃度、粘度、透明度、色、無菌性、安定性、解離速度またはにおいを修飾または維持するための他の医薬上許容される賦形剤を含有しうる。同様に、該担体は、放出または吸収または血液脳関門透過性を修飾または維持するための更に他の医薬上許容される賦形剤を含有しうる。そのような賦形剤としては、単位投与形または複数回投与形態としての非経口投与のための、あるいは連続的または周期的注入による脳脊髄液内への直接注入のための製剤を製剤化するために通常および慣習的に使用される物質が挙げられる。
【００９７】
該剤形の薬物動力学的パラメーターおよび用いる投与経路に応じて、用量の投与を繰返すことが可能である。
【００９８】
また、キメラを含有する或る製剤は経口的に投与されることになると予想される。そのような製剤は、好ましくは、適当な担体で固体剤形としてカプセル化され製剤化される。適当な担体、賦形剤および希釈剤の幾つかの具体例には、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、デンプン、ガムアカシア、リン酸カルシウム、アルギナート、珪酸カルシウム、微晶質セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、ゼラチン、シロップ、メチルセルロース、メチル−およびプロピルヒドロキシベンゾアート、タルク、マグネシウム、ステアラート、水、鉱油などが含まれる。該製剤は更に、滑沢剤、湿潤剤、乳化および懸濁化剤、保存剤、甘味剤または香味剤を含みうる。当技術分野で良く知られた方法を用いることにより、該組成物は、患者への投与後に有効成分の迅速的、持続的または遅延的放出をもたらすよう製剤化することができる。該製剤はまた、タンパク質分解を減弱させ吸収を促進する物質（例えば、界面活性剤）を含有しうる。
【００９９】
具体的な用量は、患者のおおよその体重もしくは体表面積または占有される体腔容積に応じて算出される。該用量はまた、用いる個々の投与経路に応じて算出されるであろう。治療のための適当な投与量を決定するのに必要な計算の更なる厳密化は、当業者により日常的に行われている。そのような計算は、過度な実験をしなくても、インビトロにおける特定の細胞型に関する該キメラの活性に基づいて当業者により行われうる。培養内の種々の末梢および中枢ニューロンに対する本発明のキメラの活性が後記に記載されており、特定の標的細胞型に対するその活性は通常の実験により測定することができる。厳密な投与量は、標準的な用量反応研究に関連づけて決定される。実際に投与する該組成物の量は、治療する状態、投与する組成物の選択、個々の患者の年齢、体重および応答、患者の症状の重症度ならびに選択した投与経路を含む関連状況を考慮して、診療医により決定されると理解されるであろう。本発明の１つの実施形態においては、本発明のキメラは、該キメラの生物学的に活性な形態または該キメラの前駆体（すなわち、身体により該キメラの生物学的活性形態に容易に変換されうる分子）を産生しうるベクターまたは細胞を患者に移植することにより治療用に投与することができる。１つのアプローチにおいては、該キメラを分泌する細胞を、患者への移植のために半透膜内に封入することができる。いくつかの実施形態においては、該細胞を形質転換して、該キメラおよび適当なＧＦＲαの両方を、好ましくは可溶性形態で発現させ分泌させる。患者がヒトである場合には、該細胞がヒト由来であること、および該キメラがヒトＧＤＮＦファミリーリガンド由来であることが好ましい。しかし、本発明の製剤および方法は獣医学用およびヒトへの適用に用いることが可能であり、本発明で用いる「患者」なる語はヒトおよび獣医学的患者を含むと意図される。
【０１００】
細胞は、患者への移植または生着で使用するためにエクスビボで増殖させることができる（Ｍｕｅｎｃｈら，Ｌｅｕｋ  ＆  Ｌｙｍｐｈ  １６：１−１１，１９９４）。本発明のもう１つの実施形態においては、本発明のキメラは、移植または生着のための細胞のエクスビボでの生存または増殖を促進するために使用することができる。現在の方法は、赤血球、単球、好中球およびリンパ球の造血前駆細胞を増殖させるためにエリトロポエチン、コロニー刺激因子、幹細胞因子およびインターロイキンのような因子を含有するバイオリアクター培養系を使用している（Ｖｅｒｆａｉｌｌｉｅ，Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  １２：４６６−４７６，１９９４）。これらの幹細胞は、ヒトドナーの骨髄から又はヒト末梢血から又は臍帯血細胞から単離することができる。特定の病態の結果として又は悪性疾患の治療のための高用量の化学療法の結果としてこれらの細胞を欠く患者を治療するために、該増殖血液細胞を使用する（Ｇｅｏｒｇｅ，Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  １２（Ｓｕｐｐｌ  １）：２４９−２５５，１９９４）。化学療法後の細胞移植の場合には、化学療法の前に骨髄細胞を摘出し、同様に悪性細胞を除去するように働く方法を用いて該細胞をエクスビボで増殖させ、化学療法後に該増殖細胞を該患者に戻すよう移植することにより、自家移植を行うことができる（総説としては、ＲｕｍｍｅｌおよびＶａｎ  Ｚａｎｔ，Ｊ  Ｈｅｍａｔｏｔｈｅｒａｐｙ  ３：２１３−２１８，１９９４を参照されたい）。
【０１０１】
また、適当なＧＦＲαを伴う又は伴わない本発明のキメラは、神経系内の前駆細胞のエクスビボ増殖に使用されうると考えられている。現在、細胞の移植または生着は、例えばパーキンソン病（Ｂｊｏｒｋｌｕｎｄ，Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ  ２：６８３−６８９，１９９２）および脊髄傷害における変性により或るニューロン集団が喪失した疾患に対する治療法として開発中である。ニューロン前駆細胞を動物およびヒトのドナーから又はヒト胎児組織から得、ついで、本発明のキメラを使用して培養内で増殖させることができる。ついでこれらの細胞を患者に生着させることが可能であり、この場合、それらは、変性により喪失した細胞の幾つかに取って代わるように働くであろう。ニューロトロフィンはニューロン前駆細胞の生存および増殖を刺激しうることが示されているため（例えば、交感神経芽細胞のＮＴ−３刺激（Ｂｉｒｒｅｎら，Ｄｅｖｅｌｏｐ  １１９：５９７−６１０，１９９３））、該キメラは、神経系の発生中にも同様に機能する可能性があり、ニューロン細胞のエクスビボ増殖において有用でありうるであろう。
【０１０２】
以下の実施例においては、本発明の好ましい実施形態を記載する。本明細書中の特許請求の範囲の範囲内の他の実施形態は、本明細書に開示する発明の明細または実施を考慮すれば当業者に明らかであろう。本明細書および以下の実施例は単なる例示とみなされ、本発明の範囲および精神は特許請求の範囲に示されていると意図される。
【０１０３】
核酸の分子的操作を含む本明細書に開示する方法は当業者に公知である。全般的には、Ｆｒｅｄｒｉｃｋ  Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら（１９９５），“Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ”，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ、およびＪｏｓｅｐｈ  Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９），“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”，第２版，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ（それらを共に参照により本明細書に組み入れることとする）を参照されたい。
【０１０４】
実施例１
本実施例では、ＧＤＮＦのＮ末端伸長が活性に要求されないことを例示する。
【０１０５】
成熟ラットＧＤＮＦとマウスニュールツリン、アルテミンおよびペルセフィンとのアライメントを図１に示す。このアミノ酸配列比較およびアライメントは、ＤＮＡｓｔａｒソフトウェアパッケージのＭｅｇＡｌｉｇｎプログラムを使用して行った。ラットＧＤＮＦは、その構造が決定されているため（ＥｉｇｅｎｂｒｏｔおよびＧｅｒｂｅｒ，Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．４：４３５−４３８，１９９７）、本実施例における全ての突然変異誘発のための基礎となった。本実施例および他の全ての実施例では、ラットＧＤＮＦ（配列番号１２）およびマウスニュールツリン（配列番号１４）およびペルセフィン（配列番号２）およびヒトアルテミン（配列番号１５）のアミノ酸配列を、すべての構築物に使用した。該ＧＤＮＦファミリーリガンド間での注目される最も大きな違いは、最初の構造システインの前のＮ末端伸長であり、これは、ＧＤＮＦにおける４０アミノ酸（配列番号１８）からニュールツリン（配列番号１８）およびペルセフィン（配列番号１〜３のアミノ酸１−５）における僅か５アミノ酸まで様々であり、異なるファミリーメンバー間の類似性をほとんど示さない。さらに、ＧＤＮＦ、ニュールツリンおよびアルテミンは、多数のＲＸＸＲコンセンサス・ズブチリシン様プロタンパク質コンベルターゼ（ＳＰＣ）切断部位を有し（Ｍｏｌｌｏｙら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：１６３９６−１６４０２，１９９２）、したがってこれらの伸長の多数のアイソフォームが可能である。示されているものは、ＧＤＮＦおよびニュールツリンのＮ末端配列決定（Ｋｏｔｚｂａｕｅｒら，Ｎａｔｕｒｅ  ３８４：４６７−４７０，１９９６）、ＰＳＰＮにおける単一切断部位（Ｍｉｌｂｒａｎｄｔら，前掲）、ならびにマウスおよびヒトアルテミン間で保存された切断部位（Ｂａｌｏｈら，前掲）と一致している。
【０１０６】
ＧＤＮＦの大きなＮ末端伸長がその活性に必要であるか否かを判定するために、哺乳類細胞によるＧＤＮＦおよびニュールツリンの差次的（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ）プロセシングを用いた。ＧＤＮＦに結合したニュールツリン由来のプレ−プロ領域を有するキメラ構築物を作製し、それらのプロセシング、およびそれらがＧＦＲα１−ＲＥＴ受容体複合体を活性化する能力の両方を評価した（図２）。縦列６×ヒスチジンおよびＦＬＡＧ（登録商標）タグを、ＧＤＮＦまたはニュールツリンのＲＸＸＲ切断部位の後に挿入して、該タンパク質の精製および追跡を可能にした（図２Ａ）。突然変異体Ｇ−ｈｆ−ＧＤＮＦでは、６Ｈｉｓ−ＦＬＡＧ（登録商標）タグを成熟ＧＤＮＦの第３および第４残基の間に挿入して、配列Ｎ−．．．ＲＬＫＲ∧ＳＰＤ−ＨＨＨＨＨＨＤＹＫＤＤＤＤＫ−ＱＡＡＡＬＰＲＲＥＲＮＲＱＡＡＡＡＳＰＥＮＳＲＧＫＧＲＲＧＱＲＧＫＮＲＧＣＶＬＴＡＩＨＬＮＶＴＤＬＧＬＧＹＥＴＫＥＥＬＩＦＲＹＣＳＧＳＣＥＡＡＥＴＭＹＤＫＩＬＫＮＬＳＲＳＲＲＬＴＳＤＫＶＧＱＡＣＣＲＰＶＡＦＤＤＤＬＳＦＬＤＤＳＬＶＹＨＩＬＲＫＨＳＡＫＲＣＧＣＩを得た。突然変異体Ｐ−ｈｆ−ＰＳＰＮでは、該タグを成熟ＰＳＰＮの第３および第４残基の間に挿入して、Ｎ−．．．ＲＬＰＲ∧ＡＬＡ−ＨＨＨＨＨＨＤＹＫＤＤＤＤＫ−ＧＳＣＲＬＷＳＬＴＬＰＶＡＥＬＧＬＧＹＡＳＥＥＫＶＩＦＲＹＣＡＧＳＣＰＱＥＡＲＴＱＨＳＬＶＬＡＲＬＲＧＲＧＲＡＨＧＲＰＣＣＱＰＴＳＹＡＤＶＴＦＬＤＤＱＨＨＷＱＱＬＰＱＬＳＡＡＡＣＧＣＧＧを得た。すべての突然変異体は、融合ＰＣＲ突然変異誘発により製造した。ＰＣＲ産物を、プラスミドｐＣＢ６（Ｂｒｅｗｅｒ，Ｍｅｔｈ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．４３：２３３−２４５，１９９４）のＭｌｕＩおよびＸｂａＩ部位内に直接的にクローニングし、該インサートの全体を配列決定した。突然変異体Ｎ−ｈｆ−ＧＤＮＦでは、残基１−３８を成熟ＧＤＮＦからトランケート化し、ＮＲＴＮのプレ−プロ領域に結合させた。得られた配列は、Ｎ−．．．ＲＲＡＲ∧ＰＧＡ−ＨＨＨＨＨＨＤＹＫＤＤＤＤＫ−ＲＧＣＶＬＴＡＩＨＬＮＶＴＤＬＧＬＧＹＥＴＫＥＥＬＩＦＲＹＣＳＧＳＣＥＡＡＥＴＭＹＤＫＩＬＫＮＬＳＲＳＲＲＬＴＳＤＫＶＧＱＡＣＣＲＰＶＡＦＤＤＤＬＳＦＬＤＤＳＬＶＹＨＩＬＲＫＨＳＡＫＲＣＧＣＩであった。
【０１０７】
該突然変異体タンパク質を、以下のとおりにＣＯＳ細胞内で産生させた。ＣＯＳ細胞内での突然変異体タンパク質の製造では、ＤＥＡＥ−デキストラン／クロロキン法（ＳｅｅｄおよびＡｒｕｆｆｏ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８４：３３６５−３３６９，１９８７）を用いて、発現プラスミドをトランスフェクトした。ＣＯＳ細胞を１０ｃｍまたは１５ｃｍディッシュ上にプレーティングし、トランスフェクトし、１％  ウシ胎仔血清を含有するダルベッコ変法イーグル培地に移した。４〜５日後、馴らし培地を集め、清澄化し、Ｃｅｎｔｒｉｐｒｅｐ−１０濃縮器（Ａｍｉｃｏｎ）を使用して濃縮するか又はニッケルクロマトグラフィー（Ｑｉａｇｅｎ）により精製した。抗ＦＬＡＧ（登録商標）Ｍ２モノクローナル抗体（Ｓｉｇｍａ）でのイムノブロッティングにより、タンパク質を可視化した。ＦＬＡＧ（登録商標）タグ付きタンパク質の相対量を、同様に抗ＦＬＡＧ（登録商標）Ｍ２抗体を使用するＥＬＩＳＡにより測定した。ＧＤＮＦ  Ｅ−ＭＡＸ  ＥＬＩＳＡキットをその製造業者の説明（Ｐｒｏｍｅｇａ）に従い使用して、精製馴らし培地サンプル中のＧＤＮＦの絶対濃度を該Ｇ−ｈｆ−ＧＤＮＦ構築物に関して測定した。図２Ｂに示すとおり、単量体Ｇ−ｈｆ−ＧＤＮＦは〜２５ｋＤで、Ｎ−ｈｆ−ＧＤＮＦは〜２１．５ｋＤで移動し、これらは、ＧＤＮＦおよびニュールツリンからの予想ＲＸＸＲ切断部位におけるプロセシングと符合した。したがって、Ｎ−ｈｆ−ＧＤＮＦは、該４０アミノ酸Ｎ末端伸長が２つのアミノ酸および該縦列Ｈｉｓ−ＦＬＡＧ（登録商標）タグにより置換されたＧＤＮＦを産生する。ＣＯＳ細胞内で発現させた場合には、ＧＤＮＦ自身のプロ領域またはニュールツリンプロ領域を有するタグ付きＧＤＮＦ（それぞれＧ−ｈｆ−ＧＤＮＦまたはＮ−ｈｆ−ＧＤＮＦ）の同様の量を、ニッケルクロマトグラフィーを使用して馴らし培地から精製することができた。予想されたプロセシング事象に対応する種だけが観察されたが、このことは、ニュールツリンおよびＧＤＮＦのプロドメインが、それらの異なるＮ末端伸長の適切なプロセシングを指令するのに十分なものであることを示している。
【０１０８】
これらのタンパク質が高アフィニティーＧＤＮＦ受容体ＧＦＲα１−ＲＥＴを活性化する能力を評価するために、既に記載されているとおりに（Ｂａｌｏｈら，前掲）、Ｇａｌ４−Ｅｌｋｌ／Ｇａｌ４−ルシフェラーゼレポーター系を使用した。この系は、受容体活性化の簡便な尺度を与えるようＧａｌ４−Ｅｌｋ１融合タンパク質にＧａｌ４−ルシフェラーゼレポーターを活性化させるＭＡＰキナーゼ経路のＲＥＴ活性化のレベルをモニターする（Ｗｏｒｂｙら，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７３：３５０２−３５０８，１９９８；Ｙｏｒｋら，Ｎａｔｕｒｅ  ３９２：６２２−６２６，１９８８）。ＲＥＴ−３Ｔ３細胞を１２ウェルプレート内に８５，０００細胞／ウェルでプレーティングし、Ｓｕｐｅｒｆｅｃｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して該レポータープラスミド（２５０ｎｇ／ウェル  Ｇａｌ４−Ｌｕｃ，５０ｎｇ／ウェル  Ｇａｌ４−Ｅｌｋ）、トランスフェクションの正規化のためのＣＭＶ−ｌａｃＺ（５０ｎｇ／ウェル）、ＣＭＶ−ＧＦＲα１（２５０ｎｇ／ウェル）発現プラスミド、突然変異体ＧＦＬ構築物（２５０ｎｇ／ウェル）および担体としての６５０ｎｇ／ウェル  ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（合計１．５μｇ  ＤＮＡ／ウェル）でトランスフェクトした。細胞を、トランスフェクション後の朝に０．５％血清含有培地に移し、３６時間後に回収した。二重または三重のサンプルの平均ルシフェラーゼ活性を、該コトランスフェクト化ｌａｃＺレポーターのβ−ガラクトシダーゼ活性に対して正規化した。図２Ｃに示すとおり、このアッセイにおいては、野生型ＧＤＮＦ、Ｇ−ｈｆ−ＧＤＮＦおよびＮ−ｈｆ−ＧＤＮＦのすべてが、比較しうるＧＦＲα１−ＲＥＴ活性化を示したが、該ＰＳＰＮまたはニュールツリンプロ領域を有するタグ付きＰＳＰＮ構築物は該受容体を活性化しなかった。これらの結果は、ＧＤＮＦはＧＦＲα１を介してＲＥＴに結合しそれを活性化しうるがＰＳＰＮはそうではないという従来の受容体活性化および結合実験（Ｂａｌｏｈら，前掲；Ｍｉｌｂｒａｎｄｔら，前掲）と一致する。さらに、これらのデータは、ＧＤＮＦのＮ末端伸長が、ＧＦＲα１−ＲＥＴ受容体複合体を活性化するその能力に要求されず、該エピトープタグの配置がＧＤＮＦの機能を妨げないことを示している。
【０１０９】
第１構造システイン−ノット（ｋｎｏｔ）システイン前のＮ末端伸長は、ＴＧＦ−βスーパーファミリーメンバー間で高度に可変性である。ＴＧＦ−β２の場合、それは短いα−ヘリックスとして存在し、該スーパーファミリーの他のメンバーと比較して追加的なジスルフィド結合により安定化される（Ｄａｏｐｉｎら，前掲；ＳｃｈｌｕｎｅｇｇｅｒおよびＧｒｕｔｔｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ  ３５８：４３０−４３４，１９９２）。しかし、現在結晶化されているＴＧＦ−βスーパーファミリーの他の唯一のメンバーであるＧＤＮＦおよびＯＰ−１においては、３５〜３７残基のＮ末端伸長は分離されておらず、したがって、溶液中で一貫したコンホメーションをとらない（ＥｉｇｅｎｂｒｏｔおよびＧｅｒｂｅｒら，前掲；Ｇｒｉｆｆｉｔｈら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９３：８７８−８８３，１９９６）。該Ｎ末端伸長のトランケート化は、ＧＤＮＦがその受容体を活性化する能力に影響を及ぼさなかった。これは、同様に該Ｎ末端伸長が受容体結合または生物活性に要求されないことを示唆しているＧＤＮＦに対するモノクローナル抗体を特徴づける実験（Ｘｕら，Ｊ，Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．７０：１３８３−１３９３，１９９８）と一致している。
【０１１０】
実施例２
本実施例では、ＧＦＲα１−ＲＥＴおよびＧＦＲα２−ＲＥＴの活性化に決定的に重要なＧＤＮＦ領域を同定するためのホモログスキャニング（ｈｏｍｏｌｏｇｕｅ  ｓｃａｎｎｉｎｇ）の使用を例示する。
【０１１１】
ＧＤＮＦの結晶構造は公知であるが、ＧＤＮＦ−ＧＦＲα受容体の結合および特異性の分子的決定基は現在のところ同定されていない。ＧＦＲα１−ＲＥＴ受容体複合体を活性化するＧＤＮＦの能力に要求されるＧＤＮＦの領域を同定するために、実施例１に記載の受容体活性化アッセイと共に、ホモログスキャニング突然変異誘発を用いた。ＰＳＰＮからの非保存配列のブロックをＧＤＮＦ内に置換することにより、１０個のＧＤＮＦ突然変異体（「ＧＰＧ」突然変異体と称される）を作製した（図３；配列の変化に関しては図１を参照されたい）。この方法は、ＧＦＲα１−ＲＥＴを活性化するＧＤＮＦおよびＰＳＰＮの能力における相違をもたらす部位の包括的な突然変異誘発を可能にし、該突然変異体の構造的完全性を維持する可能性が高い。なぜなら、該置換は、相同な（そして構造的に類似であるらしい）タンパク質からのものであるからである。これらの突然変異体用の発現プラスミドを、融合ＰＣＲを用いて実施例１に記載のとおりに製造した。すべてはＮ−ｈｆ−ＧＤＮＦ構築物に基づくものであった。すべての突然変異体は、ＣＯＳ細胞内にトランスフェクトした場合には同様の量で産生され、それぞれのプロセシングは正常であるらしかった（図３Ｂ）。
【０１１２】
多数の突然変異体は活性の若干の減少を示したが、１つ（ＧＰＧ−Ｆ２ａ）だけは、ＧＦＲα１−ＲＥＴ受容体を活性化する能力を完全に喪失したことが、ＧＰＧ突然変異体とＧＤＮＦとの比較から示された（図４Ａ）。この領域をＧＤＮＦの分子モデルにおいて同定した。分子モデリングおよび分析は、ＳｗｉｓｓＰＤＢビューアー（ＧｕｅｘおよびＰｅｉｔｓｃｈ，Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  １８：２７１４−２７２３，１９９７）を使用して行い、モデルは、Ｍｏｌｅソフトウェア（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｔｈｅｒｍｏｄｙｎａｍｉｃｓ）を使用して表した。該ＧＤＮＦ構造は、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋのエントリー１ＡＧＱ（ＥｉｇｅｎｂｒｏｔおよびＧｅｒｂｅｒ，前掲）に従ってモデル化した。１ＡＧＱからの「Ｃ／Ｄ」二量体が示されており、ここで、単量体「Ｃ」の欠落セグメントは、単量体「Ｄ」に関して決定されたとおりに構築されている。該Ｆ２ａ領域は、第２フィンガーに沿ったＧＤＮＦ分子の底に位置づけられる（図４Ｂ；ＥｉｇｅｎｂｒｏｔおよびＧｅｒｂｅｒ，前掲）。完全長ＧＤＮＦの６０％以下の活性を一貫して示した他の唯一の注目すべき突然変異体はＧＰＧ−Ｆ２ｃであり、これは、該分子の底に沿った領域Ｆ２ａに隣接した鎖に位置づけられる。
【０１１３】
ＧＤＮＦはまた、ニュールツリンより低いアフィニティーでではあるが、ＧＦＲα２−ＲＥＴ受容体を活性化しうるが（Ｂａｌｏｈら，Ｎｅｕｒｏｎ  １８：７９３−８０２，１９９７  Ｓａｎｉｃｏｌａら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ  ９４：６２３８−６２４３，１９９７；Ｓｕｖａｎｔｏら，Ｈｕｍ．Ｍｏｌｅｃ．Ｇｅｎｅｔ．６：１２６７−１２７３，１９９７）、ペルセフィンはそれを活性化することができないこと（Ｂａｌｏｈら，１９９８，前掲；Ｍｉｌｂｒａｎｄｔら，１９９８，前掲）が十分に確認されている。したがって、ＧＦＲα１対ＧＦＲα２相互作用に要求されるＧＤＮＦの分子的決定基を比較するために、本発明者らは、この同じパネルの突然変異体がＧＦＲα２−ＲＥＴ受容体複合体を活性化する能力を試験した。該ＧＰＧ突然変異体の幾つかは、ＧＦＲα２を介してＲＥＴを活性化するそれらの能力において、ＧＦＲα１を介する場合より有意に弱められた（図４Ｃ）。これまでと同様に、突然変異体ＧＰＧ−Ｆ２ａは該受容体を活性化することができなかった。興味深いことに、ＧＦＲα１−ＲＥＴの活性化において２番目に著しく損なわれた突然変異体ＧＰＧ−Ｆ２ｃは、ＧＦＲα２−ＲＥＴの活性化を実質的に示さなかった。最後に、ＧＦＲα１−ＲＥＴ対ＧＦＲα２−ＲＥＴを活性化する能力における最も著しい対照を示した突然変異体は突然変異体ＧＰＧ−Ｈａであり、これは、ＧＦＲα２−ＲＥＴを活性化するその能力においてのみ、著しく損なわれた。興味深いことに、該ＧＤＮＦ結晶構造へのこれらの３つの領域の位置づけは、それらが連続的表面を形成していることを示しており、ここで、一方の単量体からのＦ２ａおよびＦ２ｃからの残基は、他方の単量体のヒールからの領域Ｈａに隣接しており、このことは、可能な受容体−リガンド相互作用表面を示唆している（図４Ｄ）。
【０１１４】
要約すると、前記の突然変異誘発データは、第２フィンガーに沿って位置するＧＤＮＦの２つの隣接領域がＧＦＲα１およびＧＦＲα２の両方との相互作用に必要であること（領域Ｆ２ａおよびＦ２ｃ）、およびＧＤＮＦとＧＦＲα２との相互作用には追加的な領域が必要であるらしいことを示唆している。
【０１１５】
実施例３
本実施例では、ＧＤＮＦ、ニュールツリンまたはアルテミンからの領域Ｆ２ａおよびＦ２ｃがＧＦＲα１−ＲＥＴの活性化に十分であることを例示する。
【０１１６】
実施例２に開示したホモログスキャニングスクリーニングは、ＧＦＲα１−ＲＥＴ受容体を活性化するＧＤＮＦの完全な能力に必要な幾つかの領域を示唆している。しかし、ロス・オブ・ファンクション（ｌｏｓｓ  ｏｆ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ；機能喪失）分析を用いるだけでは、決定的に重要な受容体接触残基が直接的に改変されているのかどうか、あるいは該突然変異が、該分子上の他の部位の受容体接触表面を改変する構造変化を誘発するのかどうかを評価することは困難である。前記で同定した決定的に重要な領域のいずれか（単独または組合せ）が、ＧＦＲα１−ＲＥＴ受容体複合体の結合および活性化を可能にするのに十分であるか否かを確認するために、決定的に重要であると推定されるＧＤＮＦ由来領域でペルセフィンの対応領域を置換してペルセフィン突然変異体を作製した。ついで、これらの「ＰＧＰ」突然変異体が、ＧＦＲα１−ＲＥＴ受容体複合体を活性化する能力を獲得したか否かを確認した（図５）。
【０１１７】
最初に、ＧＤＮＦの第２フィンガーに沿った２つの候補領域Ｆ２ａおよびＦ２ｃを評価した。なぜなら、突然変異体ＧＰＧ−Ｆ２ａは完全に不活性であり、突然変異体ＧＰＧ−Ｆ２ｃは、ＧＦＲα１−ＲＥＴの活性化の減少を一貫して示した唯一の他の突然変異体であったからである。ＧＤＮＦからの領域Ｆ２ａまたはＦ２ｃをペルセフィン内に置換するだけでは、生じる突然変異体（ＰＧＰ−Ｆ２ａまたはＰＧＰ−Ｆ２ｃ）がＧＦＲα１−ＲＥＴを活性化するのを可能にするのに十分ではなかった。しかし、両方の領域をペルセフィン内に配置した場合には、生じた突然変異体（ＰＧＰ−Ｆ２ａｃ）は、完全長ＧＤＮＦと比較しうるレベルでＧＦＲα１−ＲＥＴ受容体を活性化する能力を獲得した（図５）。
【０１１８】
ついで、ＧＦＲα１でトランスフェクトされたＮｅｕｒｏ２ａ細胞（これはＲＥＴを内因的に発現する）を、以下のとおりにＧＤＮＦまたは突然変異体ＰＧＰ−Ｆ２ａｃで処理した。ＰＣＲ突然変異誘発によりシグナル配列の後にＦＬＡＧ（登録商標）タグが挿入されたラットＧＦＲα１用の発現プラスミドで、Ｓｕｐｅｒｆｅｃｔを使用してＮｅｕｒｏ２ａ細胞を一過性にトランスフェクトした。細胞を２５ｎｇ／ｍＬの示されている因子で６時間にわたり処理し、該細胞を冷ＰＢＳで１回洗浄し、細胞溶解し、アガロースに共役した抗ＦＬＡＧ（登録商標）Ｍ２モノクローナル抗体（Ｓｉｇｍａ）を使用して免疫沈澱させた。洗浄後、該免疫沈澱サンプルを、抗ＲＥＴ抗体（Ｃ−９；Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）でのイムノブロッティングにより可視化した。ＧＤＮＦおよびＰＧＰ−Ｆ２ａｃの両方が、比較しうる受容体複合体形成を誘発し、このことは、ＰＧＰ−Ｆ２ａｃが、ＧＦＲα１−ＲＥＴに結合しその形成を誘発する能力を獲得したことを示している（図５Ｃ）。
【０１１９】
突然変異体ＰＧＰ−Ｆ２ａｃがまた、ＧＤＮＦと比較しうる生物学的応答を惹起しうるか否かを判定するために、ＮＢＬ−Ｓ神経芽細胞腫細胞系内での増殖を誘導するその能力を測定した。この細胞系はＧＦＲα１およびＲＥＴを発現し、増殖によりＧＦＲα１−ＲＥＴアゴニスト（ＧＤＮＦ、ニュールツリン、アルテミン）に応答する。該ＮＢＬ−Ｓ増殖アッセイは、Ｂａｌｏｈら，１９９８，前掲に記載のとおりに行った。一過性にトランスフェクトされたＣＯＳ細胞馴らし培地から精製された突然変異体ＰＧＰ−Ｆ２ａｃは、すべての用量においてＧＤＮＦと同様にＮＢＬ−Ｓ細胞の強力な増殖を誘導したが、ペルセフィンはそれを誘導しなかった（図５Ｄ）。さらに、ＰＧＰ−Ｆ２ａｃはまた、ＧＦＲα１−ＲＥＴ発現神経芽細胞腫系ＳＨ−ＳＹ５Ｙにおいて、ＧＤＮＦと同様に神経突起成長を誘導することが可能であった（Ｂａｌｏｈら，１９９８，前掲の方法に従い評価した場合）（図５Ｅ）。
【０１２０】
また、ニュールツリンおよびアルテミンはＧＦＲα１−ＲＥＴを活性化することが可能であり（Ｂａｌｏｈら，１９９８，前掲；Ｃｒｅｅｄｏｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ  ９４：７０１８−７０２３，１９９７）、したがって、これらの２つの追加的ＧＦＲα１アゴニストからの同じ領域（Ｆ２ａおよびＦ２ｃ）も、ＧＦＲα１−ＲＥＴ受容体を活性化するのに十分であるか否かを判定した（図６）。興味深いことに、ニュールツリンおよびアルテミンからの領域Ｆ２ａおよびＦ２ｃを有する対応ペルセフィン突然変異体はまた、ＧＤＮＦおよびＰＧＰ−Ｆ２ａｃと比較しうるレベルでＧＦＲα１−ＲＥＴ受容体複合体を活性化することが可能であった（図６Ｂ）。このことは、すべての公知ＧＦＲα１アゴニストからの領域Ｆ２ａおよびＦ２ｃの要素が、ペルセフィンの環境中に配置された場合、ＧＦＲα１−ＲＥＴを活性化するのに十分であることを示している。さらに、これらの領域はＧＦＲα１−ＲＥＴ活性化のみに十分であるらしい。なぜなら、同じ突然変異体は、ＧＤＮＦと比較しうる程度にはＧＦＲα２−ＲＥＴを活性化しなかったからである（図６Ｃ）。突然変異体ＰＮＰ−Ｆ２ａｃおよびＰＧＰ−Ｆ２ａｃはＧＲα２−ＲＥＴの低レベルの活性化（ＧＤＮＦの３０％未満）を惹起したが、ＰＡＰ−Ｆ２ａｃは惹起しなかった。これは、ＧＦＲα２−ＲＥＴを活性化するＧＤＮＦおよびニュールツリンの能力とは一致するが、アルテミンのそのような能力とは一致しない。このことは、領域Ｆ２ａおよびＦ２ｃがまた、ＧＦＲα２−ＲＥＴへの結合およびその活性化に関与しているが、完全な活性化には追加的な領域が必要であることを示している。
【０１２１】
本明細書に記載の突然変異誘発は、ＧＦＲα受容体の相互作用および特異性のための決定的に重要な残基がＧＤＮＦ分子の第２フィンガー領域内に位置することを示している。しかし、ホモログスキャニング突然変異誘発の使用は、異なる受容体特異性に関与する部位を同定するのに理論的には適しているが、受容体結合に関与するすべての残基を示し得ない。なぜなら、これらの幾つかは、ＧＤＮＦおよびペルセフィンにおいて同一だからである。領域Ｆ２ａおよびＦ２ｃからの残基が、ペルセフィンの環境中に配置された場合、ＧＦＲα１−ＲＥＴの活性化に十分であるということは、これらの領域内の残基がＧＦＲαへの結合に直接的に関与しているらしいことを示している。ＧＤＮＦファミリーリガンドはまた、該活性受容体複合体中のＲＥＴに接触することが可能ではあるが、ペルセフィンを含むＧＤＮＦファミリーリガンドの全てのメンバーがＲＥＴを介してシグナルを伝達するということは、この突然変異法により同定された領域がＲＥＴ相互作用に直接的に関与しているということに疑問を投げかけさせるものである。しかし、この分析は、受容体結合アッセイというよりもＧＦＲα−ＲＥＴ受容体複合体の機能的活性化に焦点を絞っているため、ここで産生された非機能的突然変異体の幾つかが尚もＧＦＲα補助受容体に結合する能力を有し更には受容体アンタゴニストとして潜在的に機能しうるという可能性は排除できない。
【０１２２】
現在までの証拠は、ＧＤＮＦの活性受容体複合体の化学量論が（ＧＤＮＦ）１（ＧＦＲα）２（ＲＥＴ）２であると示唆している（Ｊｉｎｇら，Ｃｅｌｌ  ８５：１１１３−１１２４，１９９６）。領域Ｆ２ａおよびＦ２ｃからの残基は実質的にＧＤＮＦ構造の底から突き出し、該分子の両方の単量体上に対称部位を形成する（図４Ｂを参照されたい）。興味深いことに、領域Ｈａ（これは、ＧＤＮＦ−ＧＦＲα２、およびＡＲＴＮ−ＧＦＲα３相互作用に決定的に重要である）からの残基は、反対の単量体のフィンガー２領域からの領域Ｆ２ａおよびＦ２ｃに直に隣接して位置し、該分子の側面および底面に沿った連続的表面を形成する（図４Ｃを参照されたい）。これらの領域はすべて、ＧＦＲαの特異性に決定的に重要であるため、一方の単量体のヒールにより形成される分子表面、および該隣接単量体の第２フィンガーは、ＧＤＮＦ上のＧＦＲα結合表面を形成する。
【０１２３】
他のＴＧＦ−βおよびシステイン−ノット（ｋｎｏｔ）スーパーファミリーメンバーの構造／機能研究の比較は、受容体結合表面の位置における共通の論旨を示している。これらのうちで最も良く特徴づけられているのは、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）の、その受容体ＫＤＲおよびＦｌｔ−１への結合であり、この場合、広範な突然変異誘発および共結晶化（ｃｏ−ｃｒｙｓｔａｌｌｉｚａｔｉｏｎ）が行われている（Ｍｕｌｌｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９４：７１９２−７１９７，１９９７；Ｗｉｅｓｍａｎｎら，Ｃｅｌｌ  ９１：６９５−７０４，１９９７）。ＶＥＧＦの突然変異誘発は、ＫＤＲ結合に決定的に重要な残基のクラスターを同定し、それらの幾つかは、本発明でＧＤＮＦに関して同定された領域Ｆ２ａおよびＦ２ｃと同様に、第２フィンガーの隣接βストランドに沿って位置していた。さらに、たとえＶＥＧＦ二量体中の単量体の配向がＧＤＮＦと異なっていたとしても、ＶＥＧＦ上の受容体結合部位には、フィンガー２からの残基および反対の単量体の同様のヒール領域が関わっている。最後に、ＴＧＦ−βの突然変異誘発は、ＴＧＦ−βＩＩ型受容体に対する種々のＴＧＦ−βアイソフォームの結合アフィニティーがまた、領域Ｆ２ｃと位置的に類似した該分子の第２フィンガーに沿った残基により決定されることを示している（Ｂｕｒｍｅｓｔｅｒら，Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒｓ  １５：２３１−２４２，１９９８；Ｑｉａｎら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：３０６５６−３０６６２，１９９６）。したがって、該受容体系および二量体形成様式はこれらの種々のシステイン−ノットスーパーファミリータンパク質に関しては顕著に異なるものの、それらの受容体相互作用表面の位置は非常に類似している可能性があると考えられる。
【０１２４】
実施例４
本実施例では、ニュールツリンがＧＦＲα２−ＲＥＴを活性化しアルテミンがＧＦＲα３−ＲＥＴを活性化するためには追加的な決定基が決定的に重要であることを例示する。
【０１２５】
突然変異体ＰＧＰ−Ｆ２ａｃおよびＰＮＰ−Ｆ２ａｃがＧＦＲα２−ＲＥＴを活性化し得ないという観察は、実施例２におけるホモログスキャニング突然変異誘発と符合しており（図４）、このことは、ＧＤＮＦがＧＦＲα２−ＲＥＴを活性化するためには、Ｆ２ａおよびＦ２ｃ以外の領域も必要であることを示唆している。特に、突然変異体ＰＧＰ−Ｈａは、ＧＦＲα２−ＲＥＴを活性化するその能力においては有意に弱まり（〜２７％）、一方、それは、ＧＦＲα１−ＲＥＴを活性化する能力においては僅かな減少を示した（〜８０％；図４）。領域Ｈａが、ＧＦＲα２−ＲＥＴの活性化に必要な追加的な分子決定基を含有するか否かを検討するために、領域Ｆ２ａ、Ｆ２ｃおよびＨａがニュールツリン（最高のアフィニティーのＧＦＲα２アゴニスト）からの対応領域により置換されたペルセフィン突然変異体を作製した（ＰＮＰ−Ｈａ／Ｆ２ａｃ；図７Ａ）。突然変異体ＰＮＰ−Ｆ２ａｃは、これまでと同様に、ＧＦＲα２−ＲＥＴ活性化における僅かな減少を惹起したに過ぎず、一方、突然変異体ＰＮＰ−Ｈａ／Ｆ２ａｃはＧＦＲα２−ＲＥＴの活性化において有意に、より良好であったが、それは完全な活性を回復しなかった（通常はＧＤＮＦの７０〜８０％；図７Ｂ）。したがって、前記のホモログスキャニング突然変異誘発に符合して、これらのデータは、ＧＤＮＦおよびＮＲＴＮの領域Ｆ２ａおよびＦ２ｃが、ＧＦＲα１−ＲＥＴを活性化するのに十分であるに過ぎず、ＧＦＲα２−ＲＥＴの完全な活性化のためには追加的な領域（領域Ｈａおよび恐らくは他の領域）が必要であることを示している。
【０１２６】
アルテミンは、ＧＦＲα−ＲＥＴを活性化しうる最近同定されたＧＤＮＦファミリーリガンドメンバーであり、ＧＦＲα３−ＲＥＴを活性化しうる該ファミリーの唯一のメンバーである。実施例３に示すとおり、アルテミンからの領域Ｆ２ａおよびＦ２ｃはＧＦＲα１−ＲＥＴの活性化に十分である。アルテミン−ＧＦＲα３相互作用の分子決定基を特徴づける初期の試みにおいては、ペルセフィン−アルテミンキメラがＧＦＲα３−ＲＥＴ受容体複合体を活性化する能力を調べた（図７ＣおよびＤ）。この目的のために、実施例１と同様の融合ＰＣＲ突然変異誘発法によりキメラＮ−ｈｆ−ＡＲＴＮを調製し、この場合、残基１−１３を成熟ヒトＡＲＴＮからトランケート化し、ＮＲＴＮのプレ−プロ領域に結合させて配列（Ｎ−．．．ＲＲＡＲ∧ＰＧＡ−ＨＨＨＨＨＨＤＹＫＤＤＤＤＫ−ＲＧＣＲ．．．−Ｃ）を得た。予想どおり、Ｎ−ｈｆ−ＡＲＴＮはＧＦＲα３−ＲＥＴの強力な活性化をもたらしたが、Ｎ−ｈｆ−ＧＤＮＦは活性を示さなかった。ＧＦＲα１−ＲＥＴを活性化しうる突然変異体ＰＡＰ−Ｆ２ａｃも（図６を参照されたい）、ＧＦＲα３−ＲＥＴを活性化することができなかった。このことは、アルテミン−ＧＦＲα３相互作用は、ニュールツリン−ＧＦＲα２相互作用と同様に、Ｆ２ａおよび２ｃ以外の領域も必要とすることを示している。領域Ｈａもアルテミン−ＧＦＲα３相互作用に関与していたか否かを判定するために、アルテミンからの領域Ｈａ、Ｆ２ａおよびＦ２ｃを有するペルセフィン突然変異体を作製した（図７Ｃ）。興味深いことに、突然変異体ＰＡＰ−Ｆ２ａｃは完全に不活性であったが、突然変異体ＰＡＰ−Ｈａ／Ｆ２ａｃは有意な活性を再び獲得した（完全長アルテミンの約７０〜８０％；図７Ｄ）。したがって、ニュールツリン−ＧＦＲα２相互作用と同様に、アルテミン−ＧＦＲα３相互作用は、該分子のヒールおよびフィンガー２の両方からの分子決定基を必要とし、一方、ＧＤＮＦ、ニュールツリンまたはアルテミンとＧＦＲα１との相互作用はフィンガー２からの領域Ｆ２ａおよびＦ２ｃを必要とするに過ぎない。
【０１２７】
この分析において、領域Ｆ２ａおよびＦ２ｃはＧＦＲα１−ＲＥＴとの相互作用のための最小要件であるが、ＧＦＲα２−ＲＥＴの活性化には追加的な領域（領域Ｈａを含む）が必要であることが認められた。ＧＦＲα１−ＲＥＴは、ＧＦＬ受容体のなかでは最も乱交性（ｐｒｏｍｉｓｃｕｏｕｓ）であり、４つの公知リガンドのうちの３つと相互作用しうる。このことは、ＧＦＲα１−ＲＥＴが、活性化されるための最小要件（領域Ｆ２ａおよびＦ２ｃ）を有し、ＧＦＲα２−ＲＥＴおよびＧＦＲα３−ＲＥＴの活性化には追加的な領域が必要であることと符合する。領域Ｈａはニュールツリン−ＧＦＲα２およびアルテミン−ＧＦＲα３相互作用に決定的に重要であるが、領域Ｈａ、Ｆ２ａおよびＦ２ｃを含有するペルセフィン突然変異体は完全には活性ではなく、このことは、追加的な領域が必要であるか又はニュールツリンおよびアルテミンからの結合決定基が該ペルセフィン分子の環境中で適切に提示されていないことを示唆している。
【０１２８】
実施例５
本実施例では、ＧＦＲα１−ＲＥＴを活性化するペルセフィンキメラがインビトロにおいてＧＦＲα１特異的アゴニストとして機能することを例示する。
【０１２９】
前記の実施例におけるホモログスキャニング突然変異誘発およびゲイン・オブ・ファンクション（ｇａｉｎ  ｏｆ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ；機能獲得）実験は、ＧＦＲα１−ＲＥＴアゴニスト（ＧＤＮＦ、ニュールツリンおよびアルテミン）に関しては、領域Ｆ２ａおよびＦ２ｃがＧＦＲα１との相互作用に十分なものであるが、ＧＦＲα２およびＧＦＲα３との相互作用のためには追加的な領域が必要であることを示している（図６および７）。このことは、ＧＤＮＦ、ニュールツリンまたはアルテミンからの領域Ｆ２ａおよびＦ２ｃのみを含有するペルセフィン突然変異体がＧＦＲα１−ＲＥＴ特異的アゴニストとして機能しうることを示唆している。
【０１３０】
前記の見解を試験するために、培養内のラット小脳顆粒細胞を使用する細胞生存アッセイを開発した。これらの細胞は内因性ＲＥＴまたはＧＦＲα補助受容体を発現せず、そして効率的にトランスフェクトすることが可能であり、したがって一定の受容体成分を有する細胞生存のモデル系を提供する。ラット小脳顆粒細胞の解離および培養を、ＭｉｌｌｅｒおよびＪｏｈｎｓｏｎ，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１６：７４８７−７４９５，１９９６に既に記載されているとおりに行った。時機良く（ｔｉｍｅｄ）妊娠しているＳｐｒａｇｕｅ−ＤａｗｌｅｙラットをＨａｒｌａｎ  Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）から購入した。生後７日（Ｐ７）に、小脳を解離し、１ｍｍ片に切断し、０．３ｇ／ｍｌ  トリプシン（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ，Ｆｒｅｅｈｏｌｄ，ＮＪ）中、３７℃で１５分間インキュベートした。該切片を、トリプシンの存在下、口焼きされたパスツールピペットでトリチュレートし、得られた細胞懸濁液をＮｉｔｅｘフィルター（サイズ３−２０／１４；Ｔｅｔｋｏ，Ｅｌｍｓｆｏｒｄ，ＮＹ）に通した。０．１ｍｇ／ｍｌ  ポリ−Ｌ−リシンでコートされた４ウェルディッシュ（Ｎｕｎｃ）中、細胞を２．３×１０５細胞／ｃｍ２の密度でプレーティングした。プレーティング培地（Ｋ２５＋Ｓ）は、１０％  透析ウシ胎仔血清、２０ｍＭ  ＫＣｌ、１００Ｕ／ｍｌ  ペニシリンおよび１００ｕｇ／ｍｌ  ストレプトマイシンを含有するＢａｓａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ  Ｅａｇｌｅ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）よりなるものであった。非ニューロン細胞の数を減少させるために、プレーティングの２４時間後に３．３μｇ／ｍｌ  アフィドコリンを該培地に加えた。
【０１３１】
既に記載されている修飾されたリン酸カルシウムプロトコール（Ｍｏｕｌｄｅｒら，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１９：７０５−７１５，１９９９）を用いて、顆粒細胞のトランスフェクションを行った。ＧＦＲα１、ＧＦＲα２およびＲＥＴ用の発現プラスミドはいずれかの文献に記載されている（Ｂａｌｏｈら，１９９７，前掲）。インビトロで第５日（５  ＤＩＶ）の時点で、培地をダルベッコ変法イーグル培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈ）で１時間交換した。この時間中、０．２５Ｍ  ＣａＣｌおよび６７μｇ／ｍｌ  ＤＮＡを含有する等容積の溶液を２×ＨＥＰＥＳ緩衝食塩水［２７４ｍＭ  ＮａＣｌ，１０ｍＭ  ＫＣｌ，１．４ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４−７Ｈ２Ｏ（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｈｏｕｓｔｏｎ，ＴＸ），１５ｍＭおよび４２ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（遊離酸），ｐＨ７．０７］に加え、暗所中、室温で２５分間インキュベートした。３０μＬの該沈殿物（１μｇのＤＮＡ）を４−ウェルディッシュのそれぞれに加え、３７℃で１時間インキュベートした。細胞をダルベッコ変法イーグル培地で２回洗浄し、ついでプレーティング培地に戻した。トランスフェクション効率は約０．２〜０．５％であった。
【０１３２】
トランスフェクションの結果を定量するために、条件当たり（４−ウェルディッシュの）２〜４ウェルの一定の領域内の初期ＥＧＦＰ陽性細胞の数（最小で１５０細胞）を、トランスフェクションの２４時間後に計数し、ついで該培養をダルベッコ変法イーグル培地中で２回リンスし、それを高カリウム／血清（Ｋ２５＋Ｓ）、低カリウム／無血清（Ｋ５−Ｓ）培地のみ、または示されている因子で補足されたＫ５−Ｓに４８時間移した。この時間の後、ニューロン生存の割合（％）を得るために、該ウェルの元の一定の領域内に残存しているＥＧＦＰ陽性細胞の数を再び計数した。
【０１３３】
ＲＥＴまたはＧＦＲα１のみでトランスフェクトされた小脳顆粒細胞は、高カリウムの不存在下またはＧＤＮＦの存在下では生存しないが、ＧＦＲα１およびＲＥＴでコトランスフェクトされた細胞は、高カリウム＋血清の対照条件と比較しうるレベルで、ＧＤＮＦの存在下で生存する（図８Ａ；ＭｉｌｌｅｒおよびＪｏｈｎｓｏｎ，前掲）。他のアッセイに符合して、ＧＦＲα１−ＲＥＴまたはＧＦＲα２−ＲＥＴでトランスフェクトされた小脳顆粒細胞は、ＧＤＮＦまたはニュールツリンの存在下では生存するが、ペルセフィンの存在下では存在しない（図８Ｂ）。しかし、突然変異体ＰＧＰ−Ｆ２ａｃは、ＧＦＲα１−ＲＥＴでトランスフェクトされた細胞の生存を支持し得たに過ぎず、ＧＦＲα２−ＲＥＴでトランスフェクトされた細胞の生存を支持し得なかった。これは、繊維芽細胞内でＧＦＲα２−ＲＥＴ受容体を活性化するその最小能力と符合し（図６Ｃ）、ＧＤＮＦおよびニュールツリンとは異なり、突然変異体ＰＧＰ−Ｆ２ａｃは、このインビトロ細胞生存状況においてＧＦＲα１−ＲＥＴ特異的アゴニストとして機能することを示している。
【０１３４】
前記を考慮すれば、本発明の幾つかの利点が達成され、他の有利な効果が得られることが理解されるであろう。
【０１３５】
前記の方法および組成物には、本発明の範囲から逸脱することなく種々の変更が施されうるため、前記の説明に含まれ添付図面に示されている全ての事項は例示であり、限定的なものではないと解釈される。
【０１３６】
特許および特許出願を含む本明細書に引用されている全ての参考文献を、参照により本明細書に組み入れることとする。本明細書における参考文献の考察は、それらの著者によりなされた主張を単に要約することを意図したものであり、参考文献が先行技術を構成することを容認するものではない。本出願人は、引用されている参考文献の正確さ及び妥当性に異議を申し立てる権利を保有する。
【０１３７】
【化１】
配列番号の要約
2004515205.tif 000002
2004515205.tif 000003
2004515205.tif 000004
2004515205.tif 000005
【図面の簡単な説明】
【図１】
ラットＧＤＮＦ（配列番号６を含む）、マウスニュールツリン（配列番号８を含む）、マウスアルテミン（配列番号１０を含む）およびマウスペルセフィン（配列番号２を含む）のアミノ酸配列アライメントを示す。
【図２】
図２Ａは、野生型およびタグ付きＧＤＮＦ構築物の概要図を示す。
図２Ｂは、ＣＯＳ細胞内でのタグ付きＧＤＮＦタンパク質の産生を示す、ＦＬＡＧ（登録商標）イムノブロットのイメージである。
図２Ｃは、タグ付き完全長およびトランケート化ＧＤＮＦが該ＧＦＲα１−ＲＥＴ受容体を活性化しうること、およびペルセフィン自体のプロ領域を有するタグ付きペルセフィン（Ｐ−ｈｆ−ＰＳＰＮ）またはニュールツリンのプロ領域を有するタグ付きペルセフィン（Ｎ−ｈｆ−ＰＳＰＮ）がＧＦＲα１−ＲＥＴを活性化し得ないことを示すグラフである。
【図３】
図３Ａは、ＧＤＮＦ、ペルセフィンおよび該ホモログスキャニング突然変異体からの成熟領域の概要図である。
図３Ｂは、トランスフェクト化ＣＯＳ細胞ライセートからのホモログスキャニング突然変異体の抗ＦＬＡＧ（登録商標）イムノブロットの写真である。
【図４】
図４Ａは、ホモログスキャニングＧＤＮＦ突然変異体による相対的ＧＦＲα１−ＲＥＴ受容体活性化を示すグラフである。
図４Ｂは、該ＧＤＮＦ結晶構造の空間実体模型を示す。
図４Ｃは、ホモログスキャニングＧＤＮＦ突然変異体による相対的ＧＦＲα２−ＲＥＴ受容体活性化を示すグラフである。
図４Ｄは、該ＧＤＮＦ結晶構造の空間実体模型を示す。
【図５】
図５Ａは、ゲイン・オブ・ファンクション（ｇａｉｎ−ｏｆ−ｆｕｎｃｔｉｏｎ；機能獲得）分析のためのＧ−ｈｆ−ＧＮＤＦ、Ｐ−ｈｆ−ＰＳＰＮおよびＧＤＮＦ／ペルセフィン置換キメラ（ＰＧＰ）の概要図である。
図５Ｂは、ＰＧＰ−Ｆ２ａｃが該ＧＦＲα１−ＲＥＴ受容体を活性化しうること、ならびに他のＰＧＰキメラおよびＰ−ｈｆ−ＰＳＰＮがＧＦＲα１−ＲＥＴを活性化し得ないことを示すグラフである。
図５Ｃは、示されている因子（２５ｎｇ／ｍＬ）で処理された、トランスフェクトされていない（ＲＥＴ）またはＦＬＡＧ（登録商標）タグ付きＧＦＲα１（ＲＥＴ＋ＧＦＲα１）でトランスフェクトされたｎｅｕｒｏ２ａ細胞からの抗ＦＬＡＧ（登録商標）免疫沈澱ライセートのＲＥＴイムノブロットのイメージである。
図５Ｄは、一過性にトランスフェクトされたＣＯＳ細胞の馴らし培地から精製された示されている因子の存在下でのＮＢＬ−Ｓ神経芽細胞腫細胞によるＢｒｄＵの取込みの柱状グラフである。
図５Ｅは、因子の不存在下（ＣＴＲＬ）、またはレチノイン酸（ＲＡ；１０μＭ）の存在下、または示されている構築物を発現するＣＯＳ細胞からの馴らし培地の存在下で培養したＳＨ−ＳＹ５Ｙ神経芽細胞腫細胞の写真である。。
【図６】
図６Ａは、Ｎ−ｈｆ−ＧＤＮＦ、Ｐ−ｈｆ−ＰＳＰＮ、ＰＧＰ−Ｆ２ａｃ、ＰＮＰ−Ｆ２ａｃおよびＰＡＰ−Ｆ２ａｃの構造を示す概要図である。
図６Ｂは、図６Ａに示されている５つの分子がＧＦＲα１−ＲＥＴ（左側）およびＧＦＲα２−ＲＥＴ（右側）を活性化しうること又は活性化し得ないことを示す２つのグラフである。
【図７】
図７Ａは、Ｇ−ｈｆ−ＧＤＮＦ、Ｐ−ｈｆ−ＰＳＰＮ、ＰＧＰ−Ｆ２ａｃ、ＰＮＰ−Ｆ２ａｃ、ＰＮＰ−Ｈａ／Ｆ２ａｃおよびＰＮＰ−Ｈａの構造を示す概要図である。
図７Ｂは、図７Ａに示されている６つの分子がＧＦＲα２−ＲＥＴを活性化しうること又は活性化し得ないことを示すグラフである。
図７Ｃは、Ｎ−ｈｆ−ＧＤＮＦ、Ｎ−ｈｆ−アルテミン、ＰＡＰ−Ｆ２ａｃ、ＰＡＰ−Ｈａ／Ｆ２ａｃおよびＰ−ｈｆ−ＰＳＰＮの構造を示す概要図である。
図７Ｄは、図７Ｃに示されている５つの分子がＧＦＲα３−ＲＥＴを活性化しうること又は活性化し得ないことを示すグラフである。
【図８】
図８Ａは、示されている受容体成分でトランスフェクトされ高カリウム＋血清（Ｋ２５＋Ｓ）、低カリウム（Ｋ５）、または低カリウム＋ＧＤＮＦ（ＧＤＮＦ）の存在下で３日間培養された小脳顆粒細胞の生存を示すグラフである。
図８Ｂは、示されている因子の存在下で培養されたＧＦＲα１−ＲＥＴまたはＧＦＲα２−ＲＥＴでトランスフェクトされた小脳顆粒細胞の生存を示すグラフである。
【図１】
2004515205.tif 000006
【図２】
2004515205.tif 000007
【図３】
2004515205.tif 000008
【図４】
2004515205.tif 000009
【図５】
2004515205.tif 000010
【図６】
2004515205.tif 000011
【図７】
2004515205.tif 000012
【図８】
2004515205.tif 000013
【国際公開パンフレット】
2004515205.tif 000014
2004515205.tif 000015
2004515205.tif 000016
2004515205.tif 000017
2004515205.tif 000018
2004515205.tif 000019
2004515205.tif 000020
2004515205.tif 000021
2004515205.tif 000022
2004515205.tif 000023
2004515205.tif 000024
2004515205.tif 000025
2004515205.tif 000026
2004515205.tif 000027
2004515205.tif 000028
2004515205.tif 000029
2004515205.tif 000030
2004515205.tif 000031
2004515205.tif 000032
2004515205.tif 000033
2004515205.tif 000034
2004515205.tif 000035
2004515205.tif 000036
2004515205.tif 000037
2004515205.tif 000038
2004515205.tif 000039
2004515205.tif 000040
2004515205.tif 000041
2004515205.tif 000042
2004515205.tif 000043
2004515205.tif 000044
2004515205.tif 000045
2004515205.tif 000046
2004515205.tif 000047
2004515205.tif 000048
2004515205.tif 000049
2004515205.tif 000050
2004515205.tif 000051
2004515205.tif 000052
2004515205.tif 000053
2004515205.tif 000054
2004515205.tif 000055
2004515205.tif 000056
2004515205.tif 000057
2004515205.tif 000058
2004515205.tif 000059
2004515205.tif 000060
2004515205.tif 000061
2004515205.tif 000062
2004515205.tif 000063
2004515205.tif 000064
2004515205.tif 000065
2004515205.tif 000066
2004515205.tif 000067
2004515205.tif 000068
2004515205.tif 000069
2004515205.tif 000070
2004515205.tif 000071
2004515205.tif 000072
2004515205.tif 000073
2004515205.tif 000074
2004515205.tif 000075
2004515205.tif 000076
2004515205.tif 000077
2004515205.tif 000078
2004515205.tif 000079
2004515205.tif 000080
2004515205.tif 000081
2004515205.tif 000082
2004515205.tif 000083
2004515205.tif 000084
2004515205.tif 000085
2004515205.tif 000086
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004515205.tif 000087
2004515205.tif 000088
2004515205.tif 000089
2004515205.tif 000090
2004515205.tif 000091
2004515205.tif 000092
2004515205.tif 000093
2004515205.tif 000094
2004515205.tif 000095
2004515205.tif 000096
2004515205.tif 000097
2004515205.tif 000098
2004515205.tif 000099
2004515205.tif 000100
2004515205.tif 000101
2004515205.tif 000102
2004515205.tif 000103
2004515205.tif 000104
2004515205.tif 000105
2004515205.tif 000106
2004515205.tif 000107
2004515205.tif 000108
2004515205.tif 000109
2004515205.tif 000110
2004515205.tif 000111
2004515205.tif 000112
2004515205.tif 000113
2004515205.tif 000114
2004515205.tif 000115
2004515205.tif 000116
2004515205.tif 000117
2004515205.tif 000118
2004515205.tif 000119
2004515205.tif 000120
2004515205.tif 000121
2004515205.tif 000122
2004515205.tif 000123
2004515205.tif 000124
2004515205.tif 000125
2004515205.tif 000126
2004515205.tif 000127
2004515205.tif 000128
2004515205.tif 000129
2004515205.tif 000130
2004515205.tif 000131
2004515205.tif 000132
2004515205.tif 000133
2004515205.tif 000134
2004515205.tif 000135
2004515205.tif 000136
2004515205.tif 000137
2004515205.tif 000138
2004515205.tif 000139
2004515205.tif 000140
2004515205.tif 000141
2004515205.tif 000142
2004515205.tif 000143
2004515205.tif 000144
2004515205.tif 000145
2004515205.tif 000146
2004515205.tif 000147
2004515205.tif 000148
2004515205.tif 000149
2004515205.tif 000150
2004515205.tif 000151
2004515205.tif 000152
2004515205.tif 000153
2004515205.tif 000154
2004515205.tif 000155
2004515205.tif 000156
2004515205.tif 000157
2004515205.tif 000158
2004515205.tif 000159
2004515205.tif 000160
2004515205.tif 000161
2004515205.tif 000162
2004515205.tif 000163
2004515205.tif 000164
2004515205.tif 000165
2004515205.tif 000166
2004515205.tif 000167
2004515205.tif 000168
2004515205.tif 000169
2004515205.tif 000170
2004515205.tif 000171
2004515205.tif 000172
2004515205.tif 000173
2004515205.tif 000174
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004515205.tif 000175
【国際調査報告】
2004515205.tif 000176
2004515205.tif 000177
2004515205.tif 000178