(57)【要約】本発明は、複雑な混合物に入っている化学成分を分離する時に用いるに有用な固体および方法に関し、ここでは、前記混合物に入っている化学成分の中の少なくとも１成分が選択的に吸着され得るようにする。本発明の固体は、無機物質とこの無機物質の少なくとも１つの表面に位置する部分（Ｒ１０）を含んで成り、ここで、前記無機物質は無機酸化物であり、そして前記表面部分を−ＣＨ２ＯＨ、−ＣＨ（ＯＨ）２、−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ３、−ＣＨ２ＣＨ２ＯＨ、−Ｃ（ＯＨ）２ＣＨ３、−ＣＨ２ＣＨ（ＯＨ）２および−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２（ＯＨ）から成る群から選択する。前記固体の表面にまた結合部分も位置させてもよく、それを場合により前記無機物質にリンカーを通して付着させてもよい。【特許請求の範囲】
【請求項１】
無機酸化物である無機物質を含んで成っていて前記無機物質の少なくとも１つの表面に−ＣＨ２ＯＨ、−ＣＨ（ＯＨ）２、−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ３、−ＣＨ２ＣＨ２ＯＨ、−Ｃ（ＯＨ）２ＣＨ３、−ＣＨ２ＣＨ（ＯＨ）２および−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２（ＯＨ）から成る群から選択される部分Ｒ１０基が位置する固体。
【請求項２】
前記無機物質の少なくとも１つの表面にＲ１０が二価部分または原子を介して付着している請求項１記載の固体。
【請求項３】
Ｒ１０が−ＣＨ２ＯＨ、−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ３および−ＣＨ２ＣＨ２ＯＨから成る群から選択される構成要素である請求項１記載の固体。
【請求項４】
Ｒ１０が−ＣＨ２ＯＨである請求項１記載の固体。
【請求項５】
前記無機物質が無機金属酸化物、ケイ酸塩またはアルミノケイ酸塩である請求項１記載の固体。
【請求項６】
前記無機物質が磁気反応性である請求項１記載の固体。
【請求項７】
前記無機金属酸化物がシリカ、アルミナ、シリカ−アルミナ、ジルコニア、ジルコン酸塩、チタニア、孔が制御されているガラスまたはこれらの混合物である請求項５記載の固体。
【請求項８】
前記無機金属酸化物がクロマトグラフィー等級のシリカである請求項５記載の固体。
【請求項９】
前記無機金属酸化物がシリカゲルである請求項５記載の固体。
【請求項１０】
（ｉ）無機物質、（ｉｉ）前記無機物質の少なくとも１つの表面に位置する−ＣＨ２ＯＨ、−ＣＨ（ＯＨ）２、−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ３、−ＣＨ２ＣＨ２ＯＨ、−Ｃ（ＯＨ）２ＣＨ３、−ＣＨ２ＣＨ（ＯＨ）２および−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２（ＯＨ）から選択される部分Ｒ１０および（ｉｉｉ）分析物と結合し得る少なくとも１種の結合部分を含んで成る固体。
【請求項１１】
前記少なくとも１種の結合部分がリガンド、蛋白質、ペプチド、抗原および核酸から成る群から選択される請求項１０記載の固体。
【請求項１２】
前記少なくとも１種の結合部分が前記無機物質に少なくとも１種のリンカーを介して付着している請求項１０記載の固体。
【請求項１３】
前記少なくとも１種の結合部分が前記無機物質に少なくとも１種のリンカーを介して付着しており、ここで、前記少なくとも１種の結合部分がレセプタ、抗体、抗原、ＤＮＡまたはＲＮＡである請求項１０記載の固体。
【請求項１４】
前記少なくとも１種のリンカーが場合により置換されていてもよい二価の化学基である請求項１０記載の固体。
【請求項１５】
Ｒ１０部分を固体１ｎｍ２当たり約１から約１０個含んで成る請求項１０記載の固体。
【請求項１６】
結合部分を固体１ｎｍ２当たり０．０４から約４個含んで成る請求項１５記載の固体。
【請求項１７】
前記無機物質がシリカでありそしてＲ１０が−ＣＨ２ＯＨである請求項１６記載の固体。
【請求項１８】
前記無機物質がシリカゲルである請求項１７記載の固体。
【請求項１９】
前記無機物質がクロマトグラフィー等級のシリカである請求項１７記載の固体。
【請求項２０】
前記場合により置換されていてもよい化学基がｎ−Ｒ−基［ここで、ｎは−Ｒ−基の数であり、ｎは少なくとも２の整数であり、ここで、ｎ−１−Ｒ−基が、場合により、−Ｏ−、−Ｓ−、カルボニル、チオカルボニル、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＳＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｓ−、−ＯＣ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）Ｏ−、−Ｃ（Ｓ）Ｓ−、−ＳＣ（Ｓ）−、−Ｎ（Ｒ４）−、−Ｎ（Ｒ４）Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ４）−、−Ｃ（Ｒ５）＝Ｎ−、−Ｎ＝Ｃ（Ｒ５）−、−Ｃ（Ｒ５）＝ＮＯ−、−ＯＮ＝Ｃ（Ｒ５）−（ここで、Ｒ４およびＲ５は、独立して、Ｈ、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、置換シクロアルキル、アルケニル、置換アルケニル、シクロアルケニル、置換シクロアルケニル、アルキニル、置換アルキニル、シクロアルキニル、置換シクロアルキニル、アリール、置換アリール、アラルキルまたは置換アラルキルである）、−Ｐ−、−Ｐ（ＯＨ）Ｏ−、アリーレン、置換アリーレン、シクロアルキレン、置換シクロアルキレン、シクロアルケニレン、置換シクロアルケニレン、二価のヘテロシクリルもしくは置換ヘテロシクリルに置き換わっていてもよい］を含んで成るヒドロカルビルである請求項１４記載の固体。
【請求項２１】
前記少なくとも１種のリンカーが前記結合部分から前記無機物質までの測定長が原子約１から約３０個分の場合により置換されていてもよい二価の化学基であり、ここで、前記化学基が−Ｒ−基［ここで、前記−Ｒ−基は、−ＣＨ２−、−Ｃ（Ｒ１）Ｈ−、−Ｃ（Ｒ２）＝Ｃ（Ｒ３）−および−Ｃ≡Ｃ−（ここで、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は、独立して、Ｈ、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、置換シクロアルキル、アルケニル、置換アルケニル、シクロアルケニル、置換シクロアルケニル、アルキニル、置換アルキニル、シクロアルキニル、置換シクロアルキニル、アリール、置換アリール、アラルキルまたは置換アラルキルである）から成る群から選択される一員であるが、場合により、前記−Ｒ−基は−Ｏ−、−Ｓ−、カルボニル、チオカルボニル、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＳＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｓ−、−ＯＣ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）Ｏ−、−Ｃ（Ｓ）Ｓ−、−ＳＣ（Ｓ）−、−Ｎ（Ｒ４）−、−Ｎ（Ｒ４）Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ４）−、−Ｃ（Ｒ５）＝Ｎ−、−Ｎ＝Ｃ（Ｒ５）−、−Ｃ（Ｒ５）＝ＮＯ−、−ＯＮ＝Ｃ（Ｒ５）−（ここで、Ｒ４およびＲ５は、独立して、Ｈ、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、置換シクロアルキル、アルケニル、置換アルケニル、シクロアルケニル、置換シクロアルケニル、アルキニル、置換アルキニル、シクロアルキニル、置換シクロアルキニル、アリール、置換アリール、アラルキルまたは置換アラルキルである）、−Ｐ−、−Ｐ（ＯＨ）Ｏ−、アリーレン、置換アリーレン、シクロアルキレン、置換シクロアルキレン、シクロアルケニレン、置換シクロアルケニレン、二価のヘテロシクリルもしくは置換ヘテロシクリルに置き換わっていてもよい］を少なくとも１つ含んで成る請求項１２記載の固体。
【請求項２２】
前記少なくとも１種のリンカーが前記少なくとも１種の結合部分と前記無機物質に独立してエーテル、チオエーテル、エステル、チオエステル、カーボネート、カルバメート、ホスフェート、ホスホネート、ホスホエステル、ホスホルアミデート、アミン、アミド、イミド、尿素、チオ尿素、スルホンアミド、スルホキサイド、スルホン、ジスルフィド、オキシム、Ｏ−アシルオキシム、Ｏ−カルバモイルオキシム、Ｏ−アシルオキシアルキルオキシム、Ｏ−アシルオキシアルキルオキシオキシム、Ｏ−オキシミノホスフェート、Ｏ−オキシミノホスホネート、Ｏ−オキシミノホスホルアミデートまたはＣ＝Ｃ結合を介して付着している請求項１２記載の固体。
【請求項２３】
前記少なくとも１種のリンカーが臭化シアン、Ｎ−ヒドロキシスクシニミドエステル、カルボニルジイミダゾール、還元アミノ化、トルエン−４−スルホン酸２−フルオロ−１−メチル−ピリジニウム活性化、１−エチル−３−（３−ジメチルプロピル）カルボジイミド介在アミド結合形成、塩化トシル、塩化トレシル、ジビニルスルホン、アズラクトン、シアヌル酸クロライド、ヨードアセチルまたはブロモアセチル活性化、マレイミド、ピリジルジスルフィド、エポキシ化合物、２−イミノチオラン５，５−ジチオ−ビス−（２−ニトロ安息香酸）、ヒドラジド、ジアゾニウムまたはマンニッヒ縮合で生じたものである請求項１２記載の固体。
【請求項２４】
混合物の状態で他の少なくとも１種の成分と一緒に混ざり合っている分析物を単離する方法であって、
（１）前記少なくとも１種の結合部分が前記分析物に対して特定の親和力を有する請求項１０記載の固体を前記混合物と接触させ、
（２）前記分析物を前記少なくとも１種の結合部分と結合させ、
（３）前記分析物が結合した前記固体から前記他の少なくとも１種の成分を除去し、
（４）前記固体を回収し、そして
（５）前記分析物を前記固体から単離する、
ことを含んで成る方法。
【請求項２５】
段階（３）において、前記固体をある流体で洗浄することで洗浄液を得た後に前記洗浄液を廃棄することで前記他の少なくとも１種の成分を除去し、段階（５）において、溶離剤を前記固体の上に置きそしてその溶離剤を集めることを通して前記分析物を単離する請求項２４記載の方法。
【請求項２６】
前記固体がＲ１０部分を１ｎｍ２当たり約１から約１０個含んで成る請求項２４記載の方法。
【請求項２７】
前記固体が結合部分を固体１ｎｍ２当たり約０．０４から約４個含んで成る請求項２６記載の方法。
【請求項２８】
前記無機物質が無機の金属酸化物、金属のケイ酸塩またはアルミノケイ酸塩である請求項２４記載の方法。
【請求項２９】
前記無機物質が磁気反応性である請求項２８記載の方法。
【請求項３０】
前記無機金属酸化物がシリカ、アルミナ、シリカ−アルミナ、ジルコニア、ジルコン酸塩、チタニア、孔が制御されているガラスまたはこれらの混合物である請求項２８記載の方法。
【請求項３１】
前記無機金属酸化物がクロマトグラフィー等級のシリカである請求項２８記載の方法。
【請求項３２】
前記無機金属酸化物がシリカゲルである請求項２８記載の方法。
【請求項３３】
前記無機金属物質がシリカでありそしてＲ１０が−ＣＨ２ＯＨである請求項２４記載の方法。
【請求項３４】
前記シリカがシリカゲルである請求項３３記載の方法。
【請求項３５】
前記シリカがクロマトグラフィー等級のシリカである請求項３３記載の方法。
【請求項３６】
前記結合部分がビオチンでありそして前記分析物がアビジン、ストレプトアビジン、アビジンに付着している物質またはストレプトアビジンに付着している物質である請求項２４記載の方法。
【請求項３７】
前記結合部分がアビジンまたはストレプトアビジンでありそして前記分析物がビオチンまたはビオチニル化されている請求項２４記載の方法。
【請求項３８】
非特異的結合が起こる或は非特異的結合を起こす少なくとも１種の官能基を含有する無機酸化物である無機物質を含んで成る固体が不純物と非特異的に結合する度合を低くする方法であって、
（１）前記固体を準備し、
（２）前記無機物質の前記少なくとも１種の官能基を反応体と反応させて前記無機物質の少なくとも１つの表面に−ＣＨ２ＯＨ、−ＣＨ（ＯＨ）２、−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ３、−ＣＨ２ＣＨ２ＯＨ、−Ｃ（ＯＨ）２ＣＨ３、−ＣＨ２ＣＨ（ＯＨ）２および−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２（ＯＨ）から成る群から選択される部分Ｒ１０を生じさせかつＲ１０を前記無機物質の表面に前記無機物質が不純物を含んで成る混合物と接触した時に前記不純物と前記固体が起こす非特異的結合の度合が低くなるに充分な量で存在させる、
ことを含んで成る方法。
【請求項３９】
前記無機物質の組成の中に段階（２）の前には存在していなかった部分または原子を介してＲ１０を前記無機物質に付着させる請求項３８記載の方法。
【請求項４０】
Ｒ１０が−ＣＨ２ＯＨ、−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ３および−ＣＨ２ＣＨ２ＯＨから成る群から選択される構成要素である請求項３８記載の方法。
【請求項４１】
Ｒ１０が−ＣＨ２ＯＨである請求項４０記載の方法。
【請求項４２】
前記無機物質が無機金属酸化物である請求項３８記載の方法。
【請求項４３】
前記無機金属酸化物が磁気反応性である請求項４２記載の方法。
【請求項４４】
前記無機金属酸化物がシリカ、アルミナ、シリカ−アルミナ、ジルコニア、ジルコン酸塩、チタニア、孔が制御されているガラスでありそしてこれが有する官能基がヒドロキシルを含んで成る請求項４２記載の方法。
【請求項４５】
前記無機金属酸化物がクロマトグラフィー等級のシリカである請求項４２記載の方法。
【請求項４６】
前記無機金属酸化物がシリカゲルである請求項４２記載の方法。
【請求項４７】
（ｉ）無機酸化物である無機物質、（ｉｉ）前記無機物質の少なくとも１つの表面に位置する−ＣＨ２ＯＨ、−ＣＨ（ＯＨ）２、−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ３、−ＣＨ２ＣＨ２ＯＨ、−Ｃ（ＯＨ）２ＣＨ３、−ＣＨ２ＣＨ（ＯＨ）２および−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２（ＯＨ）から選択される部分Ｒ１０および（ｉｉｉ）少なくとも１種のリンカーを含んで成る固体。
【請求項４８】
前記少なくとも１種のリンカーが場合により置換されていてもよい二価の化学基である請求項４７記載の固体。
【請求項４９】
前記場合により置換されていてもよい化学基がｎ−Ｒ−基［ここで、ｎは−Ｒ−基の数であり、ｎは少なくとも２の整数であり、ここで、ｎ−１−Ｒ−基が、場合により、−Ｏ−、−Ｓ−、カルボニル、チオカルボニル、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＳＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｓ−、−ＯＣ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）Ｏ−、−Ｃ（Ｓ）Ｓ−、−ＳＣ（Ｓ）−、−Ｎ（Ｒ４）−、−Ｎ（Ｒ４）Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ４）−、−Ｃ（Ｒ５）＝Ｎ−、−Ｎ＝Ｃ（Ｒ５）−、−Ｃ（Ｒ５）＝ＮＯ−、−ＯＮ＝Ｃ（Ｒ５）−（ここで、Ｒ４およびＲ５は、独立して、Ｈ、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、置換シクロアルキル、アルケニル、置換アルケニル、シクロアルケニル、置換シクロアルケニル、アルキニル、置換アルキニル、シクロアルキニル、置換シクロアルキニル、アリール、置換アリール、アラルキルまたは置換アラルキルである）、−Ｐ−、−Ｐ（ＯＨ）Ｏ−、アリーレン、置換アリーレン、シクロアルキレン、置換シクロアルキレン、シクロアルケニレン、置換シクロアルケニレン、二価のヘテロシクリルもしくは置換ヘテロシクリルに置き換わっていてもよい］を含んで成るヒドロカルビルである請求項４８記載の固体。
【請求項５０】
前記少なくとも１種のリンカーが前記基の末端部から前記無機物質までの測定長が原子約１から約３０個分の場合により置換されていてもよい二価の化学基であり、ここで、前記化学基が−Ｒ−基［ここで、前記−Ｒ−基は、−ＣＨ２−、−Ｃ（Ｒ１）Ｈ−、−Ｃ（Ｒ２）＝Ｃ（Ｒ３）−および−Ｃ≡Ｃ−（ここで、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は、独立して、Ｈ、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、置換シクロアルキル、アルケニル、置換アルケニル、シクロアルケニル、置換シクロアルケニル、アルキニル、置換アルキニル、シクロアルキニル、置換シクロアルキニル、アリール、置換アリール、アラルキルまたは置換アラルキルである）から成る群から選択される一員であるが、場合により、前記−Ｒ−基は−Ｏ−、−Ｓ−、カルボニル、チオカルボニル、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＳＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｓ−、−ＯＣ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）Ｏ−、−Ｃ（Ｓ）Ｓ−、−ＳＣ（Ｓ）−、−Ｎ（Ｒ４）−、−Ｎ（Ｒ４）Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ４）−、−Ｃ（Ｒ５）＝Ｎ−、−Ｎ＝Ｃ（Ｒ５）−、−Ｃ（Ｒ５）＝ＮＯ−、−ＯＮ＝Ｃ（Ｒ５）−（ここで、Ｒ４およびＲ５は、独立して、Ｈ、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、置換シクロアルキル、アルケニル、置換アルケニル、シクロアルケニル、置換シクロアルケニル、アルキニル、置換アルキニル、シクロアルキニル、置換シクロアルキニル、アリール、置換アリール、アラルキルまたは置換アラルキルである）、−Ｐ−、−Ｐ（ＯＨ）Ｏ−、アリーレン、置換アリーレン、シクロアルキレン、置換シクロアルキレン、シクロアルケニレン、置換シクロアルケニレン、二価のヘテロシクリルもしくは置換ヘテロシクリルに置き換わっていてもよい］を少なくとも１つ含んで成る請求項４７記載の固体。
【請求項５１】
前記少なくとも１種のリンカーが前記無機物質にエーテル、チオエーテル、エステル、チオエステル、カーボネート、カルバメート、ホスフェート、ホスホネート、ホスホエステル、ホスホルアミデート、アミン、アミド、イミド、尿素、チオ尿素、スルホンアミド、スルホキサイド、スルホン、ジスルフィド、オキシム、Ｏ−アシルオキシム、Ｏ−カルバモイルオキシム、Ｏ−アシルオキシアルキルオキシム、Ｏ−アシルオキシアルキルオキシオキシム、Ｏ−オキシミノホスフェート、Ｏ−オキシミノホスホネート、Ｏ−オキシミノホスホルアミデートまたはＣ＝Ｃ結合を介して付着している請求項４７記載の固体。
【請求項５２】
前記少なくとも１種のリンカーが臭化シアン、Ｎ−ヒドロキシスクシニミドエステル、カルボニルジイミダゾール、還元アミノ化、トルエン−４−スルホン酸２−フルオロ−１−メチル−ピリジニウム活性化、１−エチル−３−（３−ジメチルプロピル）カルボジイミド介在アミド結合形成、塩化トシル、塩化トレシル、ジビニルスルホン、アズラクトン、シアヌル酸クロライド、ヨードアセチルまたはブロモアセチル活性化、マレイミド、ピリジルジスルフィド、エポキシ化合物、２−イミノチオラン５，５−ジチオ−ビス−（２−ニトロ安息香酸）、ヒドラジド、ジアゾニウムまたはマンニッヒ縮合で生じたものである請求項４７記載の固体。
【請求項５３】
Ｒ１０部分を固体１ｎｍ２当たり約１から約１０個含んで成る請求項４７記載の固体。
【請求項５４】
前記無機物質がシリカでありそしてＲ１０が−ＣＨ２ＯＨである請求項５３記載の固体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、複雑な混合物から化学成分を分離する時に用いるに有用な固体組成物および方法に関し、ここでは、前記化学成分の中の少なくとも１成分が選択的に吸着され得るようにする。本発明は、また、そのような混合物に入っている他の成分が非特異的（ｎｏｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ）に結合する度合を低くする方法にも関する。
【背景技術】
【０００２】
ある混合物に入っている成分を分離することは数多くの科学分野、例えば化学、生化学および分子生物学などの分野にとって重要である。ある混合物に入っている成分を分離することができれば、興味の持たれる成分、即ち分析物（ａｎａｌｙｔｅ）を単離することが可能になる。その分析物を単離した後、その分析物の特性を研究または用いることができる。そのような分離を行うことができないと、用いる測定技術が如何なる測定技術であろうとも、その興味の持たれる成分の特性がその混合物に入っている他の成分によって隠されるか或は影響を受け得ることから、その分析物の特性を測定するのは困難であり得る。このように、分離技術は科学研究における基礎であると見なすことができる。
【０００３】
分析物が入っている混合物が複雑な混合物であると成分の分離が困難である。複雑な混合物の良い例には、特定の分析物が望まれておりかつ分離精製が必要とされている生物学的発酵の培地、細胞培養物、形質転換的に産出された牛乳、または形質転換植物が入っているスラリーが含まれる。そのような複雑な混合物に入っている成分の分離は一般に親和分離技術（ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ）を用いて行われる。そのような親和分離技術は、一般に、混合物に入っている分析物と結合するが他の成分とは実質的に反応しないことで前記他の成分が取り除かれないまま残存するように具体的に設計した官能性を持たせた固相をその混合物と接触させることを伴う。その結合しなかった成分を除去、例えば前記固相を水または緩衝液で洗浄することで除去すると、その分析物が前記固相と結合した状態で残存し、そのようにして、その分析物を結合しなかった成分から分離する。次に、その分析物を前記固相から通常は緩衝液を変えることで分離して分析物を遊離分子として回収することで、その分析物を単離する。
【０００４】
精製で用いるに適した種類の価値有る「親和（ａｆｆｉｎｉｔｙ）」技術が開発されてきた。そのような技術はいろいろな名称、即ちアフィニティークロマトグラフィー（ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）、親和沈澱、免疫親和分離などと呼ばれているが、それらは全部同じ原理、即ち目標分析物と非常に選択的に結合する特定の官能性または結合部分（ｂｉｎｄｉｎｇ  ｍｏｉｅｔｙ）を固体状支持体に化学的に付着させておくことに頼っている。蛋白質の精製で用いられる最も一般的な結合部分は、他の蛋白質、例えば蛋白質Ａもしくは蛋白質Ｇ、またはモノクローナル抗体、キレート化した（ｃｈｅｌａｔｅｄ）金属イオン、ポリペプチド、または小型有機分子などである。モノクローナル抗体は標的蛋白質に対して高い選択性を示し得ることから、特に蛋白質の精製で注目され得る。この上に示したように、分析物が入っている混合物を結合部分が付着している親和性固体状支持体（ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｓｏｌｉｄ  ｓｕｐｐｏｒｔ）と接触させる。その分析物が前記支持体が有する結合部分と結合し、そしてその混合物の残りを除去する。次に、その分析物を前記結合部分から溶離（ｅｌｕｔｉｏｎ）によって取り出すが、これは、一般に、その溶媒を変えることで達成される。非常に高い精製率（ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒｓ）を実現することができる。親和技術に関する文献は広範に存在する（非特許文献１−８）。
【０００５】
モノクローナル抗体の選択および生産に関する最近の進展によって、モノクローナル抗体を結合部分として用いることが基になった親和技術が蛋白質および生物薬剤（ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）を精製する時の非常に強力な技術になってきた。モノクローナル抗体はこれ自身が蛋白質であり、しばしば、蛋白質Ａまたは蛋白質Ｇをリガンド（ｌｉｇａｎｄ）として用いた親和精製を利用して細胞培養物または発酵物から精製される。また、新規な小型の有機蛋白質Ａ疑似物（ｍｉｍｅｔｉｃｓ）もモノクローナル抗体精製で用いるに有用なリガンドであるとして記述された。
【０００６】
親和精製は強力な技術であることが確かめられてはいるが、それの完全な可能性はまだ充分には実現されていない。支持体を小型ビード（ｂｅａｄｓ）、即ち０．０５から０．５ｍｍ付近の桁の小型ビードに成形しそして前記ビード［しばしば媒体（ｍｅｄｉａ）と呼ばれる］をクロマトグラフィー用カラムに充填することが最も一般的に実施されている。次に、精製を受けさせるべき混合物を前記カラムに通すと、分析物が前記媒体に付着している結合部分と結合する。次に、前記カラムを広範に洗浄することで、その吸蔵されていた混合物を除去する。次に、溶離用溶媒を前記カラムに通すことで、当該分析物を溶液の状態で遊離させる。このような過程を大規模に行うには、その媒体にカラム用途で遭遇する重さおよび乱流を取り扱うに良好な物理的強度を持たせる必要がある。
【０００７】
親和分離で現在用いられている特定の支持体は、カラムクロマトグラフィーとして用いられているか或は他のある種の装置として用いられているかに拘らず、低表面積の材料、例えば炭水化物が基になった材料または重合体などである。そのような低表面積の支持体の容量（ｃａｐａｃｉｔｙ）は低い可能性がある。そのように容量が低いことから、目標種の回収に必要な媒体の充填量が相対的に多くなってしまう。しかしながら、媒体の充填量が多いと、圧力降下を考慮すると、カラムを通る流量が低い流量に制限される。また、カラムクロマトグラフィーは高圧で実施される可能性があり、その場合には、その媒体の容量を大きくする目的で、より小さいビードが用いられる。このビードがそのような圧力を取り扱い得るようにそれにより高い強度を持たせる必要があることから、炭水化物のゲルを架橋させることが行われているが、それによって、その結果として生じるビードの容量が低くなってしまう。従って、高い容量を有しかつ更に高圧液クロで用いられた時に物理的に強健な親和支持体（ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｓｕｐｐｏｒｔｓ）を提供することが求められている。
【０００８】
高い表面積を有する支持体を開発することが、高い容量の親和分離用媒体を得る１つのアプローチである。材料の容量が高ければ高いほど、目標種の回収に要する親和支持体の量が少なくなり、カラムの圧力降下が低くなり、流量が高くなり、かつ吸蔵される供給材料汚染物の量が少なくなる。高い表面積は１０−５００ｍ２／ｇの範囲であり得る。高い表面積を与える可能性がある材料はシリカゲル、シリカ、アルミナ、ジルコニア、炭水化物、および重合体材料、例えば巨視孔性アクリル系ビード（ｍａｃｒｏｐｏｒｅ  ａｃｒｙｌｉｃ  ｂｅａｄｓ）などである。シリカゲルの場合の表面積は非常に低い１ｍ２／ｇから非常に高い８００ｍ２／ｇを超える表面積に及んで多様であり得、孔サイズ様式は非常に小さい２５Å未満から１５００Åを超える度合に及んで多様であり得る。その上、無機酸化物が基になった材料の方が柔らかな炭水化物が基になった支持体よりも通常は物理的にずっと強健である。
【０００９】
そのような酸化物が基になった材料を結合部分が付着している媒体として親和分離技術で用いる場合、それらに必要な高い表面積を持たせることは可能であるが、望まれない材料が非選択的に結合する度合が高いと言った欠点を持ち得る。その表面積の必ずしも全部が親和分離で利用されるとは限らず、そのいくらかは実際に非選択的吸着を起こす表面領域を与えるであろう。例えば、蛋白質はシリカと非常に強力に結合することが良く知られてはいるが、その結合は時には不可逆的でありかつ非選択的である。従って、結合部分を非常に選択的にすることができても、その表面の未使用領域は非選択的であろう。その正味の影響は、その高い表面積を有する材料の選択性を低くすると言った影響であり、それによって、その過程全体の精製率が低くなってしまう。いろいろな酸化物である支持体、特にシリカ、例えばシリカゲルなどがそのような非選択的吸着を起こすことが、そのような材料が親和分離用支持体として広範に現在用いられていない理由である。
【非特許文献１】
Ａｂｅｒｃｒｏｍｂｉｅ，Ｄ．Ｍ．他、「Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ」（Ｒｉｃｋｗｏｏｄ，Ｄ．＆  Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．編集）（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ、ワシントンＤ．Ｃ．１９８３）
【非特許文献２】
Ａｒｇｏｓ，Ｐ．他、「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ」（Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ，Ｍ．Ｐ．編集）（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、サンディエゴ、ＣＡ、１９９０）
【非特許文献３】
Ｇａｇｎｏｎ，Ｐ．「Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｔｏｏｌｓ  ｆｏｒ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」（Ｖａｌｉｄａｔｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、ツーソン、１９９６）
【非特許文献４】
Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｇ．Ｔ．、Ｍａｌｌｉａ，Ａ．Ｋ．およびＳｍｉｔｈ，Ｐ．Ｋ．、「Ｉｍｍｎｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｌｉｇａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ」（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．、サンディエゴ、１９９２）
【非特許文献５】
Ｍｏｈａｎ，Ｓ．Ｂ．他、「Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ」（Ｒｉｃｋｗｏｏｄ，Ｄ．＆  Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．編集）（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ、オックスフォード、１９９７）
【非特許文献６】
Ｓｃｏｐｅｓ，Ｒ．Ｋ．、「Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ−Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ」（Ｃａｎｔｏｒ，Ｃ．Ｒ．編集）（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ、ニューヨーク、１９９４）
【非特許文献７】
Ｗｈｅｅｌｗｒｉｇｈｔ，Ｓ．Ｍ．、「Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  Ｓｃａｌｅ  ｕｐ  ｏｆ  Ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ  Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ」（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．、ニューヨーク、１９９１）
【非特許文献８】
Ｗｉｌｓｏｎ，Ｒ．Ｃ．他、「Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｆｒｏｍ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｔｏ  Ｌａｒｇｅ−Ｓｃａｌｅ  Ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ」（Ｃｏｍｓｔｏｃｋ，Ｍ．Ｊ．編集）（Ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ、ワシントンＤ．Ｃ．、１９９０）
【非特許文献９】
Ｗｅｅｔａｌｌ、「Ｃｏｖａｌｅｎｔ  Ｃｏｕｐｌｉｎｇ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｉｎｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｕｐｐｏｒｔ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ」、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、ＸＬＩＶ巻、Ｋ．Ｍｏｓｂａｃｋ編集、１３４−１４８頁、１９７６
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明の目的の１つは、高い表面積を有する材料にこれが有する選択的親和結合に適した高い容量を維持しながら非選択的吸着が改善された表面組成を与えることを記述することにある。
【００１１】
そのような組成は、遺伝子工学で作られた有機体が合成した特定の生物学的種、例えば蛋白質などが存在する複雑な生物学的混合物から「親和分離（ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ）」を行う時に非常に価値がある。例えば、そのような複雑な混合物は、細胞もしくは細菌を用いて目標蛋白質を産生させた発酵汁（ｂｒｏｔｈｓ）であってもよい。そのような発酵汁は、有機体の増殖を支える蛋白質、炭水化物、ならびに発酵で生じた生成物の複雑な混合物である。また、その発酵で目標種も生じ得るが、それは、前記有機体が産生して前記汁の中に入り込んだものである。ある場合には、細胞の中に目標種が生じることもある。従って、その細胞を粉砕して均一にすることで目標物を溶解させる必要があることから回収は複雑である。特に、そのような混合物は目標種の単離精製にとって厄介である。目標種を発酵汁から単離精製する分離精製方式は非常に複雑で高価である。そのような単離精製の費用は特に大規模生産の時に高い。そのような問題は難題であると言った性質を有することから、精製単離の分野は広範である。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明の固体組成物は、無機物質とこの無機物質の少なくとも１つの表面に位置する部分Ｒ１０を含んで成り、ここで、前記無機物質は無機酸化物であり、そして前記Ｒ１０基は−ＣＨ２ＯＨ、−ＣＨ（ＯＨ）２、−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ３、−ＣＨ２ＣＨ２ＯＨ、−Ｃ（ＯＨ）２ＣＨ３、−ＣＨ２ＣＨ（ＯＨ）２および−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２（ＯＨ）から成る群から選択される構成要素（ｅｎｔｉｔｙ）である。
【００１３】
Ｒ１０が−ＣＨ２ＯＨ、−ＣＨ（ＯＨ）２、−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ３、−ＣＨ２ＣＨ２ＯＨ、−Ｃ（ＯＨ）２ＣＨ３、−ＣＨ２ＣＨ（ＯＨ）２および−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２（ＯＨ）から成る群から選択される構成要素である時、そのような固体状支持体（ｓｏｌｉｄ  ｓｕｐｐｏｒｔ）は、複雑な混合物の中にいくらか存在する非分析物成分（ｎｏｎ−ａｎａｌｙｔｅ  ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ）と非特異的に結合する度合が低いと言った顕著な特徴を有する。Ｒ１０の員は電荷がゼロで親水性であると言った共通の特性を有する。特別な如何なる理論にも固執するものではないが、そのような固体状支持体の表面に前記Ｒ１０構成要素、即ち−ＣＨ２ＯＨ、−ＣＨ（ＯＨ）２、−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ３、−ＣＨ２ＣＨ２ＯＨ、−Ｃ（ＯＨ）２ＣＨ３、−ＣＨ２ＣＨ（ＯＨ）２および−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２（ＯＨ）のいずれかを位置させると、そのような表面が前記混合物に入っている非分析物成分と結合する時のエントロピー変化の方が前記混合物の水相に残存する非分析物成分のそれよりも低いと考えている。いずれかの成分、例えば非分析物または分析物が溶液から表面と結合すると、その非分析物が前記表面に位置するようになることでエントロピーが低くなることを伴う。結合が好都合に起こるには、表面に位置することによってエントロピーが低くなることに打ち勝つように、非分析物と表面の間に相互作用、例えばコランビック電荷（Ｃｏｌｕｍｂｉｃ  ｃｈａｒｇｅ）相互作用または疎水性相互作用などが存在する必要がある。しかしながら、Ｒ１０の構成要素のいずれか１種または任意混合物を用いた被覆を行うと親水性表面がもたらされるばかりでなく表面の正味の電荷がゼロになることで、エントロピーを下げるに必要な相互作用が低下し、従って、非分析物の非結合（ｎｏｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ）が低下する。
【００１４】
無機物質を含んで成っていて前記無機物質の少なくとも１つの表面に部分Ｒ１０および分析物と結合し得る少なくとも１種の結合部分が位置する固体も本発明の範囲内である。前記部分Ｒ１０を好適には無機酸化物の表面の一部に位置させかつ結合部分を前記表面の残りの部分に位置させる。そのような結合部分をこれが特定の分析物と結合するように選択し、それによって、親和分離で非常に選択的な結合を起こすようにする一方で、その表面をＲ１０基で覆うことで、他の種が非選択的に結合する度合を低くする。好適な態様では、無機酸化物の表面の大部分ではないとしても有意な部分をＲ１０基で覆い、例えば基質１ｎｍ２当たり約１から１０個の基の濃度で覆いそしてその残りの部分を結合部分で覆う。
【００１５】
また、無機物質を含んで成っていて結合部分が場合によりリンカー（ｌｉｎｋｅｒ）を通して前記無機酸化物の表面に位置する固体も本発明の範囲内である。リンカー化合物を前記無機酸化物と反応させた後に前記リンカーを結合部分と反応させることで、そのようなリンカーを無機酸化物の表面に位置させることができる。従って、本発明は、表面に位置するリンカー基とＲ１０部分を含んで成る無機物質も意図する。次に、その固体を最終使用者に輸送してもよく、その使用者は、分離で用いるに適するように具体的に設計した結合部分を前記リンカーに付着させることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
無機物質
本発明の構成で用いるに適した無機物質には、クロマトグラフィー用媒体として商業的に入手可能な製品が含まれる。そのような物質を本技術分野で公知の方法を用いて調製することも可能である。また、そのような無機物質は、後で以下に記述する結合部分のための支持体であると見なすことができ、そのような無機物質を本明細書では時として「支持体（ｓｕｐｐｏｒｔ）」と呼ぶ。本発明の無機物質は一般に無機酸化物であり、より適切には無機の金属酸化物、ケイ酸塩またはアルミノケイ酸塩（ａｌｕｍｉｎｏｓｉｌｉｃａｔｅ）である。無機金属酸化物が好適である。本発明で用いるに適した無機酸化物は、他の化学官能性と結合または反応し得る遊離ヒドロキシル基を有する。そのヒドロキシル基を通して表面のＲ１０部分および結合部分および／またはリンカーを反応または結合させる。適切な無機酸化物には一般にヒドロキシル基の数が固体状無機酸化物１平方ナノメートル当たり約１から約１０の酸化物が含まれる。
【００１７】
好適な無機金属酸化物の例には、シリカ、例えばクロマトグラフィー等級のシリカまたはシリカゲル、アルミナ、シリカ−アルミナ、ジルコニア、ジルコン酸塩、孔が制御されているガラス（ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｐｏｒｅ  ｇｌａｓｓ）またはチタニアなどが含まれる。そのような無機金属酸化物は好適にはシリカ、より好適にはクロマトグラフィー等級のシリカまたはシリカゲルである。また、磁気反応性（ｍａｇｎｅｔｉｃａｌｌｙ  ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ）無機金属酸化物、例えばＷＯ  ９８／３１４６１（これの開示は引用することによって本明細書に組み入れられる）に開示されているケイ質（ｓｉｌｉｃｅｏｕｓ）酸化物で被覆されている磁気粒子も適切である。また、混合無機金属酸化物、例えばシリカとアルミナのコゲル（ｃｏｇｅｌｓ）または共沈物なども使用可能である。ケイ酸ナトリウムから生じさせた固体が適切なケイ酸塩の例であり、そしてゼオライトが適切なアルミノケイ酸塩の例である。本発明の固体の物理的形態は粒子、繊維および板の形態であってもよい。
表面部分（Ｒ１０）
この上に示したように、Ｒ１０基を−ＣＨ２ＯＨ、−ＣＨ（ＯＨ）２、−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ３、−ＣＨ２ＣＨ２ＯＨ、−Ｃ（ＯＨ）２ＣＨ３、−ＣＨ２ＣＨ（ＯＨ）２および−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２（ＯＨ）から成る群から選択する。Ｒ１０は好適には−ＣＨ２ＯＨ、−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ３、−ＣＨ２ＣＨ２ＯＨおよび−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２（ＯＨ）から成る群から選択した構成要素である。より好適には、Ｒ１０は−ＣＨ２ＯＨ、−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ３および−ＣＨ２ＣＨ２ＯＨから成る群から選択した構成要素である。最も好適には、Ｒ１０は−ＣＨ２ＯＨである。
【００１８】
前記部分Ｒ１０を無機物質の少なくとも１つの表面に位置させる。「位置させる」は、Ｒ１０を出発無機物質の表面に存在する官能性に直接付着させてもよいことを意味する。Ｒ１０を無機物質の周囲に存在する表面領域に位置させるか或は無機物質の内部に入り込んでいてこの物質の周囲に（孔）開口部を有する孔の中に存在する表面領域に位置させてもよい。
【００１９】
また、Ｒ１０を二価部分または原子（−Ｘ−）を介して無機物質表面に付着させて式−Ｘ−Ｒ１０で表される基を生じさせることで、それを無機物質の表面に「位置させる」ことも可能である。この態様において、Ｒ１０を連結させる二価部分または原子は、前記出発無機物質を反応体と反応させる前には前記物質の組成の中に存在していない。そのような部分または原子は、Ｒ１０を生じさせる目的で用いた反応体に由来し、例えばシラン反応体に由来する残存金属原子（例えばケイ素原子）などであり得る。その残存する部分または原子は前記無機物質に直接付着、好適には、前記無機物質の表面に存在するヒドロキシル基を通して付着している。そのような反応体が有する−Ｘ−基は反応体から反応体で異なるが、金属原子または他の化学部分であってもよい。例えば、Ｘは金属原子、例えばケイ素、アルミニウム、ジルコニウムなどに由来するものであってもよい。その選択する無機物質によってまた−Ｘ−の選択およびこれに関連した反応体も決まり得る。一般的には、−Ｘ−を含有する如何なる反応体も当該無機物質が有する反応性官能性と反応し得る反応体であろう。無機酸化物の場合に適切な反応体は、典型的に、ヒドロキシル基と反応し得る反応体である。
【００２０】
ある化合物、例えばＲ１０を生じ得る化合物を無機物質と反応させる化学は本技術分野で公知であり、例えばＳｍｉｔｈ、「Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、１９９４；Ｍａｒｃｈ、「Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、第４版、１９９２；Ｌａｒｏｃｋ、「Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ」、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、第２版、１９９９；Ｇｒｅｅｎｅ他、「Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、第３版、１９９９；Ｂｒｏｏｋ、「Ｓｉｌｉｃｏｎ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ，Ｏｒｇａｎｏｍｅｔａｌｌｉｃ，ａｎｄ  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、２０００；Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ他、「Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｌｉｇａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ」、１９９２；Ｗｅｅｔａｌｌ、「Ｃｏｖａｌｅｎｔ  Ｃｏｕｐｌｉｎｇ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｉｎｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｕｐｐｏｒｔ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ」、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、ＸＬＩＶ巻、Ｋ．Ｍｏｓｂａｃｋ編集、１３４−１４８頁、１９７６；Ａｂｂｏｔｔの米国特許第４，２９８，５００号およびＡｒｋｌｅｓの米国特許第５，３７１，２６２号（これらの資料の開示は引用することによって本明細書に組み入れられる）で公知である。例えば無機物質の表面に位置するＲ１０基を含んで成る固体の調製は、Ｒ１０の前駆体基を持つ反応体またはコーティング剤（ｃｏａｔｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）、例えばアルコキシシラン、ジアルコキシシランまたはトリアルコキシシランなどを用いて実施可能である。例えば、アセトキシメチルはヒドロキシメチルの前駆体基であり得る。次に、そのようなコーティング剤を無機物質の表面と反応させた後、その前駆体に加水分解を受けさせて、Ｒ１０基が付着している無機物質を生じさせる。
【００２１】
−ＣＨ２ＯＨがシリカ表面にＲ１０として位置するシリカを生じさせる方法を図１３および１４に示す。図１３に、シリカの表面に存在するシラノール基、即ちＨＯ−Ｓｉ−−−にＳｉ−Ｒ１０基を導入するためのコーティング剤であるアセトキシメチルトリエトキシシラン［化合物（２）を参照］の調製を示し、ここで、Ｒ１０はヒドロキシメチルである［図１４に示す反応を参照、ここで、化合物（５）は、表面に直接付着しているＳｉ−Ｒ１０（ここで、Ｒ１０はヒドロキシメチルである）を有するシリカである］。言い換えれば、図１４に示した方法は、Ｒ１０基をシリカの表面にＳｉ原子（これは、この上に反応体に由来する残基であるとして記述した残存部分または原子Ｘの例であり、これは出発無機物質の一部ではない）を介して導入する方法である。
【００２２】
Ｒ１０［ここで、Ｒ１０は−ＣＨ（ＯＨ）２である］を含んで成るシリカを生じさせる方法を図１５および１６に示す。図１５に、−ＣＨ（ＯＨ）２基をシリカの表面にＲ１０基として導入するためのコーティング剤であるジアセトキシメチルトリエトキシシラン［化合物（７）を参照］の調製を示す［図１６に示す反応および化合物（９）を参照］。
【００２３】
図１７に、２−ヒドロキシエチルをシリカの表面に導入するためのコーティング剤であるアセトキシエチルトリエトキシシラン［化合物（１１）を参照］を生じさせる方法を示す。
【００２４】
シリカとこのシリカの表面に付着している１，２−ジヒドロキシエチルをＲ１０基として含んで成る固体を生じさせる２種類の方法を図１８および１９に示す。
【００２５】
また、Ｒ１０基がシラン反応体に由来する残存金属（例えばＳｉ）を介して固体の表面に付着している無機物質を含んで成る固体も本発明の範囲内であり、ここで、結果として生じたＳｉ−Ｒ１０基は各々３個の共有結合を介して無機物質に付着している［例えば、図１４、１６、１８および１９に示した反応スキームの最終生成物（これはシラノール基を３個有するコーティング剤を反応させる結果として生じさせたものである）を参照］。
【００２６】
図２１および２２に見られるように、また、残存原子がまた１個または２個の共有結合を介して無機物質に付着し得るようにコーティング剤を選択してもよいか或は特定の態様にはＳｉ原子の架橋を含めてもよいと考えている。そのような架橋はＳｉ−Ｏ−Ｓｉ結合または別の結合、例えばＳｉ−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−Ｓｉ、Ｓｉ−Ｏ−アルキレン−Ｏ−ＳｉまたはＳｉ−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−アルキレン−Ｏ−Ｓｉなどであってもよい。図２２に示した反応スキームの最終生成物、即ち化合物（２０）は、Ｓｉ−Ｒ１０基がシリカの表面に単一の付着点を有する本発明の固体の態様を示すものである。この態様は、固体状の無機物質とモノ−エトキシシランの反応で生じさせた態様である（モノ−エトキシシランであるコーティング剤の調製に関しては図２１を参照）。
結合部分
本発明の固体に更に少なくとも１種の結合部分を含めてもよく、この結合部分を前記無機物質の表面に場合によりリンカーを介して付着させてもよいか或は他の様式で位置させてもよい。この結合部分は、他の部分または分子が基になった分析物と結合、例えば疎水相互作用による結合、共有結合またはコランビック相互作用で結合し得る分子または分子断片のいずれかである。そのような部分は分離産業の技術者に良く知られている。生分離（ｂｉｏｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ）産業で典型的に用いられる部分には、（例えばビオチン、アビジンおよびストレプトアビジン）、天然または天然ではない蛋白質、ペプチド、抗原および核酸が含まれる。本発明の固体の結合部分として用いる蛋白質は好適にはレセプタ（ｒｅｃｅｐｔｏｒ）または抗体である。
【００２７】
また、本発明の固体における結合部分はリガンド、レセプタ、抗体、抗原、ＤＮＡまたはＲＮＡ［核酸用ハイブリッド形成プローブ（ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｐｒｏｂｅｓ）を包含］であるのも好適である。リガンドがアビジンまたはストレプトアビジンであるの場合の分析物はビオチンまたはビオチニル化され（ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ）ていてもよく、その逆も当てはまる。
【００２８】
本技術分野で公知の方法（例えばＨｅｒｍａｎｓｏｎ他、「Ｉｍｍｏｂｉｌｌｉｚｅｄ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｌｉｇａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ」、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、１９９２そしてＲ１０部分の付着に関してこの上に引用した他の文献）を用いて、そのような結合部分を無機物質に付着させる。無機酸化物を含んで成る固体の場合、そのような結合部分を出発無機酸化物が有する表面官能基、例えばヒドロキシルなどとの反応で付着させることができる。
【００２９】
別法として、リンカーを介して結合部分を無機物質に付着させることも可能である。そのようなリンカーは二価の化学基であってもよく、これは場合により置換されていてもよい。場合により置換されていてもよい二価の化学基はｎ−Ｒ−基［ここで、ｎは−Ｒ−基の数であり、ｎは少なくとも１の整数であるが、好適には３０以下、より好適には１５以下である］を含んで成っていてもよい。より典型的には、そのような二価の化学基の長さは、結合部分から無機物質までの距離を測定して、原子約１から約３０個分、好適には原子約１から約２０個分、より好適には原子約５から約１５個分である。このような化学基−Ｒ−は、−Ｃ（Ｒ１）Ｈ−、−Ｃ（Ｒ２）＝Ｃ（Ｒ３）−および−Ｃ≡Ｃ−［ここで、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は、独立して、Ｈ、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、置換シクロアルキル、アルケニル、置換アルケニル、シクロアルケニル、置換シクロアルケニル、アルキニル、置換アルキニル、シクロアルキニル、置換シクロアルキニル、アリール、置換アリール、アラルキルまたは置換アラルキルである］から成る群から選択可能であるが、場合により、前記−Ｒ−基は−Ｏ−、−Ｓ−、カルボニル、チオカルボニル、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＳＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｓ−、−ＯＣ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）Ｏ−、−Ｃ（Ｓ）Ｓ−、−ＳＣ（Ｓ）−、−Ｎ（Ｒ４）−、−Ｎ（Ｒ４）Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ４）−、−Ｃ（Ｒ５）＝Ｎ−、−Ｎ＝Ｃ（Ｒ５）−、−Ｃ（Ｒ５）＝ＮＯ−、−ＯＮ＝Ｃ（Ｒ５）−［ここで、Ｒ４およびＲ５は、独立して、Ｈ、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、置換シクロアルキル、アルケニル、置換アルケニル、シクロアルケニル、置換シクロアルケニル、アルキニル、置換アルキニル、シクロアルキニル、置換シクロアルキニル、アリール、置換アリール、アラルキルまたは置換アラルキルである］、−Ｐ−、−Ｐ（ＯＨ）Ｏ−、アリーレン、置換アリーレン、シクロアルキレン、置換シクロアルキレン、シクロアルケニレン、置換シクロアルケニレン、二価のヘテロシクリルもしくは二価の置換ヘテロシクリルに置き換わっていてもよい。そのような化学基の例は、ｎ−Ｒ−基［ここで、ｎはこの上に記述した通りである］を含んで成る「ヒドロカルビル」であり、ここで、少なくとも１つの−Ｒ−基が−ＣＨ２−であるが、場合により、（ｎ−１）−Ｒ−基がこの上に挙げたＲ基、例えば−Ｏ−、−Ｓ−などに置き換わっていてもよい。
【００３０】
本明細書では、置換を受けさせるＲ基の主な化学的特徴、例えばヒドロカルビルの炭化水素特徴などを変えないペンダント型置換基を含有させることを意味する目的で「置換」を用いる。
【００３１】
用語「アルキル」は、分枝または分枝していない飽和ヒドロカルビル基、好適には炭素原子数が１から３０、より好適には１から２０、更により好適には１から６のヒドロカルビル基を指す。「アルキル」の例にはメチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｓ−ブチル、イソブチル、ｔ−ブチル、ｎ−ペンチル、１−メチルブチル、２−メチルブチル、イソペンチル、ネオペンチル、１，１−ジメチルプロピル、ｎ−ヘキシル、１−メチルペンチル、２−メチルペンチル、３−メチルペンチル、１，１−ジメチルブチル、２，２−ジメチルブチル、イソヘキシルおよびネオヘキシルが含まれる。用語「シクロアルキル」は飽和環状ヒドロカルビル基、好適には炭素原子数が３から１０、より好適には３から６の飽和環状ヒドロカルビル基を指す。「シクロアルキル」の例にはシクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、ビシクロヘプチルおよびデカリンが含まれる。「アルケニル」はＣ＝Ｃ結合を少なくとも１つ有する分枝または分枝していないヒドロカルビル基であり、ここで、前記ヒドロカルビル基の炭素原子数は好適には２から３０、より好適には２から２０、更により好適には２から６である。「アルケニル」の例にはビニル、アリル、１−プロペニル、イソプロペニル、２−ブテニル、１，３−ブタジエニル、３−ペンテニルおよび２−ヘキセニルが含まれる。「シクロアルケニル」はＣ＝Ｃ結合を少なくとも１つ有する炭素原子数が好適には３から１０、好ましくは３から６の環状ヒドロカルビル基を指す。「アルキニル」は−Ｃ≡Ｃ−結合を少なくとも１つ有する炭素原子数が好適には２から３０、より好適には２から２０、更により好適には２から６の分枝または分枝していないヒドロカルビル基である。「アルキニル」の例にはエチニル、１−プロピニル、２−プロピニル、２−ブチニル、３−ブチニルおよび２−ペンテン−４−イニルが含まれる。「シクロアルキニル」は−Ｃ≡Ｃ−結合を少なくとも１つ有する炭素原子数が好適には３から１０、より好適には３から６の環状ヒドロカルビル基である。「シクロアルキニル」の例にはペンチニルおよびヘキシニルが含まれる。「アリール」は炭素原子数が好適には６から１４の芳香環状ヒドロカルビル基である。「アリール」の例にはフェニル、ナフチル、アントラシルおよびフェナントリルが含まれ、フェニルが好適なアリールである。「アラルキル」は１つ以上のアリール基で置換されているアルキル基である。
【００３２】
「アラルキル」の例にはベンジル、フェネチル、ジフェニルメチルおよびトリチルが含まれ、ベンジルが好適なアラルキルである。「二価のヘテロシクリル」は、環原子であるＯ、ＳもしくはＮ原子またはＯ、Ｓおよび／またはＮ原子の混合物を１から４個有する環原子数が典型的に３から１０、好適には３から７、より好適には４から６の二価環状基である。二価ヘテロシクリルの例には、チイレン、オキシラン、アジリジン、１Ｈ−アジリン、２Ｈ−アジリン、２Ｈ−チエート（ｔｈｉｅｔｅ）、チエタン、２Ｈ−オキセート（ｏｘｅｔｅ）、オキセタン、アゼート（ａｚｅｔｅ）、アゼチジン、１，２−オキサゼチジン、チオフェン、フラン、ピロール、イミダゾール、オキサゾール、イソキサゾール、チアゾール、イソチアゾール、ピラゾール、１，３−ジオキソラン、１，２，３−チアジアゾール、１，３，４−チアジアゾール、１，２，４−チアジアゾール、１，２，３−オキサジアゾール、１，２，４−オキサジアゾール、１，３，４−オキサジアゾール、１，２，５−オキサジアゾール、１，２，３−トリアゾール、１，２，４−トリアゾール、テトラゾール、オキサジアゾール、ピリジン、キノリン、イソキノリン、キノリジン、キナゾリン、プテリジン（ｐｔｅｒｉｄｉｎｅ）、カルバゾール、ベンゾキサゾール、１，３−オキサジン、２Ｈ−１，３−オキサジン、フェナジン、フェノチアジン、ピリダジン、ピリミジン、ピラジン、ベンゾ［ｂ］フラン、ベンゾ［ｂ］チオフェン、インドール、イソインドール、インダゾール、プリン、イソベンゾフラン、テトラヒドロフラン、１，４−ジオキサン、ピロリジン、テトラヒドロピラン、１，２−ジヒドロピリジン、１，４−ジヒドロピリジン、ピペリジン、ピペラジン、モルホリン、チオモルホリン、クロマン、イソクロマン、クロメン、１Ｈ−アゼピン、３Ｈ−アゼピン、１，２−ジアゼピン、１，３−ジアゼピン、１，４−ジアゼピン、トリアゼピンおよびアゾシンの二価基が含まれる。「ヘテロアリール」は芳香複素環式基を指す。「アルキレン」、「アルケニレン」、「アルキニレン」、「シクロアルキレン」、「シクロアルケニレン」および「アリーレン」はそれぞれアルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、シクロアルケニルおよびアリール基の二価均当物である。
【００３３】
「置換アルキル」は、ヒドロキシ、スルフヒドリル、アルコキシ、アルキルチオ、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アリールアミノ、Ｎ，Ｎ−アリールアルキルアミノ、ジアリールアミノ、アジド、アミジノ、ウレイド、フルオロ、クロロ、ブロモ、ヨード、ニトロ、シアノ、アシル（好適にはアセチルおよびベンゾイル）、チオアシル、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、アルキルスルホンアミド、アルキルスルファモイル、カルボキシル、アルキルカルボニルオキシ（好適にはアセトキシ）、アリールカルボニルオキシ（好適にはベンゾイルオキシ）、アルコキシカルボニルオキシ、アリールオキシカルボニルオキシ、カルバモイル、アリール（好適にはフェニル）、スチリル、シクロアルキル、シクロアルケニルおよびヘテロシクリル（好適にはヘテロアリール）から成る群から選択される１から５個、好適には１から３個の置換基で置換されているアルキルである。
【００３４】
「置換アルケニル」は、ヒドロキシ、スルフヒドリル、アルコキシ、アルキルチオ、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アリールアミノ、Ｎ，Ｎ−アリールアルキルアミノ、ジアリールアミノ、アジド、アミジノ、ウレイド、フルオロ、クロロ、ブロモ、ヨード、ニトロ、シアノ、アシル（好適にはアセチルおよびベンゾイル）、チオアシル、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、アルキルスルホンアミド、アルキルスルファモイル、カルボキシル、アルキルカルボニルオキシ（好適にはアセトキシ）、アリールカルボニルオキシ（好適にはベンゾイルオキシ）、アルコキシカルボニルオキシ、アリールオキシカルボニルオキシ、カルバモイル、アリール（好適にはフェニル）、スチリル、シクロアルキル、シクロアルケニルおよびヘテロシクリル（好適にはヘテロアリール）から成る群から選択される１から５個、好適には１から３個の置換基で置換されているアルケニルである。
【００３５】
「置換アルキニル」は、ヒドロキシ、スルフヒドリル、アルコキシ、アルキルチオ、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アリールアミノ、Ｎ，Ｎ−アリールアルキルアミノ、ジアリールアミノ、アジド、アミジノ、ウレイド、フルオロ、クロロ、ブロモ、ヨード、ニトロ、シアノ、アシル（好適にはアセチルおよびベンゾイル）、チオアシル、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、アルキルスルホンアミド、アルキルスルファモイル、カルボキシル、アルキルカルボニルオキシ（好適にはアセトキシ）、アリールカルボニルオキシ（好適にはベンゾイルオキシ）、アルコキシカルボニルオキシ、アリールオキシカルボニルオキシ、カルバモイル、アリール（好適にはフェニル）、スチリル、シクロアルキル、シクロアルケニルおよびヘテロシクリル（好適にはヘテロアリール）から成る群から選択される１から５個、好適には１から３個の置換基で置換されているアルキニルである。
【００３６】
「置換シクロアルキル」は、アルキル、アルケニル、アルキニル、アラルキル、ヒドロキシ、スルフヒドリル、アルコキシ、アルキルチオ、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アリールアミノ、Ｎ，Ｎ−アリールアルキルアミノ、ジアリールアミノ、アジド、アミジノ、ウレイド、フルオロ、クロロ、ブロモ、ヨード、ニトロ、シアノ、アシル（好適にはアセチルおよびベンゾイル）、チオアシル、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、アルキルスルホンアミド、アルキルスルファモイル、カルボキシル、アルキルカルボニルオキシ（好適にはアセトキシ）、アリールカルボニルオキシ（好適にはベンゾイルオキシ）、アルコキシカルボニルオキシ、アリールオキシカルボニルオキシ、カルバモイル、アリール（好適にはフェニル）、スチリル、シクロアルキル、シクロアルケニルおよびヘテロシクリル（好適にはヘテロアリール）から成る群から選択される１から５個、好適には１から３個の置換基で置換されているシクロアルキルである。
【００３７】
「置換シクロアルケニル」は、アルキル、アルケニル、アルキニル、アラルキル、ヒドロキシ、スルフヒドリル、アルコキシ、アルキルチオ、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アリールアミノ、Ｎ，Ｎ−アリールアルキルアミノ、ジアリールアミノ、アジド、アミジノ、ウレイド、フルオロ、クロロ、ブロモ、ヨード、ニトロ、シアノ、アシル（好適にはアセチルおよびベンゾイル）、チオアシル、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、アルキルスルホンアミド、アルキルスルファモイル、カルボキシル、アルキルカルボニルオキシ（好適にはアセトキシ）、アリールカルボニルオキシ（好適にはベンゾイルオキシ）、アルコキシカルボニルオキシ、アリールオキシカルボニルオキシ、カルバモイル、アリール（好適にはフェニル）、スチリル、シクロアルキル、シクロアルケニルおよびヘテロシクリル（好適にはヘテロアリール）から成る群から選択される１から５個、好適には１から３個の置換基で置換されているシクロアルケニルである。
【００３８】
「置換シクロアルキニル」は、アルキル、アルケニル、アルキニル、アラルキル、ヒドロキシ、スルフヒドリル、アルコキシ、アルキルチオ、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アリールアミノ、Ｎ，Ｎ−アリールアルキルアミノ、ジアリールアミノ、アジド、アミジノ、ウレイド、フルオロ、クロロ、ブロモ、ヨード、ニトロ、シアノ、アシル（好適にはアセチルおよびベンゾイル）、チオアシル、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、アルキルスルホンアミド、アルキルスルファモイル、カルボキシル、アルキルカルボニルオキシ（好適にはアセトキシ）、アリールカルボニルオキシ（好適にはベンゾイルオキシ）、アルコキシカルボニルオキシ、アリールオキシカルボニルオキシ、カルバモイル、アリール（好適にはフェニル）、スチリル、シクロアルキル、シクロアルケニルおよびヘテロシクリル（好適にはヘテロアリール）から成る群から選択される１から５個、好適には１から３個の置換基で置換されているシクロアルキニルである。
【００３９】
「置換アリール」は、アルキル、アルケニル、アルキニル、アラルキル、ヒドロキシ、スルフヒドリル、アルコキシ、アルキルチオ、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アリールアミノ、Ｎ，Ｎ−アリールアルキルアミノ、ジアリールアミノ、アジド、アミジノ、ウレイド、フルオロ、クロロ、ブロモ、ヨード、ニトロ、シアノ、アシル（好適にはアセチルおよびベンゾイル）、チオアシル、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、アルキルスルホンアミド、アルキルスルファモイル、カルボキシル、アルキルカルボニルオキシ（好適にはアセトキシ）、アリールカルボニルオキシ（好適にはベンゾイルオキシ）、アルコキシカルボニルオキシ、アリールオキシカルボニルオキシ、カルバモイル、スチリル、シクロアルキル、シクロアルケニル、アリール（好適にはフェニル）およびヘテロシクリル（好適にはヘテロアリール）から成る群から選択される１から５個、好適には１から３個の置換基で置換されているアリールである。
【００４０】
「置換ヘテロシクリル」は、アルキル、アルケニル、アルキニル、アラルキル、ヒドロキシ、スルフヒドリル、アルコキシ、アルキルチオ、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アリールアミノ、Ｎ，Ｎ−アリールアルキルアミノ、ジアリールアミノ、アジド、アミジノ、ウレイド、フルオロ、クロロ、ブロモ、ヨード、ニトロ、シアノ、アシル（好適にはアセチルおよびベンゾイル）、チオアシル、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、アルキルスルホンアミド、アルキルスルファモイル、カルボキシル、アルキルカルボニルオキシ（好適にはアセトキシ）、アリールカルボニルオキシ（好適にはベンゾイルオキシ）、アルコキシカルボニルオキシ、アリールオキシカルボニルオキシ、カルバモイル、アリール（好適にはフェニル）、スチリル、シクロアルキル、シクロアルケニルおよびヘテロシクリル（好適にはヘテロアリール）から成る群から選択される１から５個、好適には１から３個の置換基で置換されているヘテロシクリルである。
【００４１】
「置換アリーレン」、「置換シクロアルキレン」、「置換シクロアルケニレン」、「置換されている二価のヘテロシクリル」および「置換アラルキル」は、「置換アリール」、「置換シクロアルキル」、「置換シクロアルケニル」および「置換ヘテロシクリル」の二価均当物である。
【００４２】
前記リンカーの化学基−Ｒ−と無機物質をつなげている結合は前記リンカーと無機物質の反応で利用した化学に依存する。このような結合はエーテル、チオエーテル、エステル、チオエステル、カーボネート、カルバメート、ホスフェート、ホスホネート、ホスホエステル、ホスホルアミデート、アミン、アミド、イミド、尿素、チオ尿素、スルホンアミド、スルホキサイド、スルホン、ジスルフィド、オキシム、Ｏ−アシルオキシム、Ｏ−カルバモイルオキシム、Ｏ−アシルオキシアルキルオキシム、Ｏ−アシルオキシアルキルオキシオキシム、Ｏ−オキシミノホスフェート、Ｏ−オキシミノホスホネート、Ｏ−オキシミノホスホルアミデートまたはＣ＝Ｃ結合であり得る。化学基−Ｒ−と結合部分をつなげている結合もまたこの上に挙げた結合の１つであってもよい。
【００４３】
リンカーを物質（例えば無機物質）と反応させる化学は文献（Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ他、「Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｌｉｇａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ」、１９９２およびＷｅｅｔａｌｌ、「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ」、ＸＬＩＶ巻、１３４−１４８頁、１９７６を参照）に充分に記述されている。リンカーを無機物質と反応させる特定の化学は用いる無機物質およびリンカーに依存する。同様に、リンカーを結合部分と反応させる化学も用いるリンカーおよび結合部分に依存する。適切なリンカー／結合部分を連成させる化学の具体例を表１に示す。表１に従い、結合部分をリンカーにアミノ、スルフヒドリル、カルボニルもしくはヒドロキシ基、または結合部分が有する活性水素原子を介して連成させることができる。
【００４４】
【表１】
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【００４５】
リンカー基を含んで成る固体状支持体を作成する時、Ｒ１０基を無機物質に加えることに関連してリンカー基を作り出す順は多様であり得る。リンカーを付着させた後にＲ１０を無機表面の上に作り出してもよいか、或はリンカーを反応させる前にそれを作り出してもよい。別法として、Ｒ１０もしくはリンカーまたは両方の前駆体を作り出しそして／または付着させた後に前記前駆体を反応させて最終的なＲ１０および／またはリンカーを作り出すことも可能である。
【００４６】
無機表面に存在させるリンカー基の濃度は多様であり得る。本発明の特定態様では、結合部分が大きな蛋白質分子を含むようにして、それらが支持体の表面積の大きな部分に「影を付ける」ようにすることも可能である。その結果として、そのような支持体の表面に存在させるリンカー部位の濃度を相対的に高くする必要がなくなる。その濃度は意図した結合部分／分析物複合体の大きさを基にして最適化可能である。
【００４７】
Ｒ１０および結合部分の濃度を決める要因には、Ｒ１０基および結合部分の同定、無機物質に存在させる反応性部位の濃度、リンカー基の濃度および分析物の同定が含まれる。
【００４８】
Ｒ１０の濃度は、一般に、ＢＥＴで測定した表面積を基にして、支持体表面積１平方ナノメートル（ｎｍ２）当たり約１から約１０基の範囲であり得る。特定態様では、結合部分の濃度は、主に、この組成物を用いて回収することを求める分析物に依存する。この上に示したように、結合部分の濃度は、また、用いる任意のリンカーいずれかの濃度にも依存し得る。しかしながら、一般的には、結合部分の濃度を１平方ナノメートル当たり０．０４から約４個の基の範囲にしてもよい。加うるに、結合部分をリンカーに必ずしも１：１の化学量論で付着させる必要はない。特定態様、例えば結合部分を大きな蛋白質分子から生じさせる態様では、そのような結合部分を数個のリンカー基によって付着させてもよい。より小型の結合部分（ｂｉｎｄｅｒ  ｍｏｉｅｔｉｅｓ）を用いる他の態様では、結合部分を化学量論的量未満の量で用い、そしていくらか存在する未反応のリンカー基に「キャップをかぶせる（ｃａｐｐｅｄ）」ことで、本発明を分離で用いる時の妨害を回避する。
【００４９】
Ｒ１０および結合部分の量を、また、出発無機物質が有する官能基をどれくらいの数で反応させるか或はＲ１０、結合部分および／または任意のリンカーで「覆う」かで述べることも可能である。例えば、前記無機物質が有する表面ヒドロキシ基の約５０％から約９９％をＲ１０表面部分で覆いそして表面ヒドロキシ基の約１％から約５０％を結合部位で覆い、その結合部分を場合によりリンカーで無機物質に付着させてもよい。
【００５０】
本発明の固体の特定態様では、前記無機物質が有する表面ヒドロキシ基の約７５％から約９９％をＲ１０表面部分で覆いそして表面ヒドロキシ基の約１％から約２５％を結合部分で覆い、その結合部分を無機物質に直接またはリンカーで間接的に付着させてもよい。
【００５１】
この上に示したように、少なくとも１種の結合部分とＲ１０を含んで成る本発明の固体を用いて、その結合部分と結合することが知られている分析物を単離することができる。従って、本発明は、混合物の状態で他の少なくとも１種の成分と一緒に混ざり合っている分析物を単離する方法を包含し、前記方法は、下記の段階：
１．  前記少なくとも１種の結合部分が前記分析物に対して特定の親和力を有する本発明の固体を前記混合物と接触させ、
２．  前記分析物を前記少なくとも１種の結合部分と結合させ、
３．  前記分析物が結合した前記固体から前記他の少なくとも１種の成分を除去し、
４．  前記固体を回収し、そして
５．  前記分析物を前記固体から単離する、
段階を含んで成る。
【００５２】
本発明の方法の１つの態様では、前記結合部分を所望分析物との特定の結合が生じるに充分な量で存在させる。段階（３）において、前記固体をある流体で洗浄しそしてその洗浄液（ｗａｓｈａｔｅ）を廃棄することで、前記他の少なくとも１種の成分を除去し、そして段階（５）において、溶離剤（ｅｌｕａｎｔ）を前記固体の上に置きそしてその溶離剤を集めることを通して前記分析物を単離する。
【００５３】
そのように分析物を単離する方法では、前記無機物質の表面が有するヒドロキシ基の約５０％から約９９％を表面部分（ｓｕｒｆａｃｅ  ｍｏｉｅｔｉｅｓ）で覆いそして表面のヒドロキシ基の約１％から約５０％を結合部分（この結合部分を無機物質に直接またはリンカーで間接的に付着させる）で覆うのが好適である。
【００５４】
分析物を単離する本方法では、前記無機物質の表面が有するヒドロキシ基の約７５％から約９９％を表面部分で覆いそして表面のヒドロキシ基の約１％から約２５％を結合部分（この結合部分を無機物質に直接またはリンカーで間接的に付着させる）で覆うのが更に好適である。
【００５５】
分析物を単離する方法の好適な態様における前記無機物質はシリカゲルまたはクロマトグラフィー等級のシリカである。より好適には、そのような無機物質はシリカゲルである。
【００５６】
本発明は、また、固体［これは、無機物質（この無機物質は非特異的結合が起こるか或はさもなければ非特異的結合を起こす少なくとも１種の官能基を含んで成る）を含んで成る］が不純物（不純物は分析物を含有する混合物に入っている非分析物成分、即ち分析物以外の種である）と非特異的に結合する度合を低くする方法も包含する。前記無機物質は上述した無機酸化物を含んで成り、そしてこの方法は、下記の段階：
１．  前記固体を準備し、
２．  前記少なくとも１種の官能基を反応体と反応させて前記無機物質の少なくとも１つの表面に部分Ｒ１０［ここで、Ｒ１０は、−ＣＨ２ＯＨ、−ＣＨ（ＯＨ）２、−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ３、−ＣＨ２ＣＨ２ＯＨ、−Ｃ（ＯＨ）２ＣＨ３、−ＣＨ２ＣＨ（ＯＨ）２および−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２（ＯＨ）から成る群から選択される］を生じさせる、
段階を含んで成る。
【００５７】
このように非特異的結合の度合を低くする方法におけるＲ１０は、好適には、−ＣＨ２ＯＨ、−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ３、−ＣＨ２ＣＨ２ＯＨおよび−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２（ＯＨ）から成る群から選択される構成要素である。より好適には、Ｒ１０は、−ＣＨ２ＯＨ、−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ３および−ＣＨ２ＣＨ２ＯＨから成る群から選択される構成要素である。最も好適には、Ｒ１０は−ＣＨ２ＯＨである。Ｒ１０を前記無機物質の表面に前記無機物質が不純物を含んで成る混合物と接触した時に前記固体が前記不純物と非特異的に結合する度合が低くなるに充分な量で存在させる。
【００５８】
本方法は、特に、ヒドロキシル官能性が表面に位置する無機金属酸化物、ケイ酸塩またはアルミノケイ酸塩が起こす非特異的結合の度合を低くしようとする時に有用である。特に、無機金属酸化物、例えばシリカ（シリカゲルおよびクロマトグラフィー等級のシリカ）、アルミナ、シリカ−アルミナ、ジルコニア、ジルコン酸塩、孔が制御されているガラス、チタニア、これらの共沈物および混合物などにとって有用である。本方法は、また、磁気反応性無機酸化物（例えばケイ質酸化物で被覆されている磁気粒子）でも有用である。
【００５９】
固体状支持体が起こす非特異的結合を最小限にすることを考慮すべき支持体表面と蛋白質または他の種の結合の種類は３種類である。
【００６０】
そのような支持体の表面電荷は、理想的には、吸着を実施するｐＨにおいてゼロであるべきである。その理由は、蛋白質の中には−ＣＯＯＨまたは−ＮＨ２基が過剰に存在することが理由で蛋白質は正味の電荷を持っているからである。ｐＨが約７の複雑な蛋白質混合物の場合、その混合物に存在する蛋白質の等電点が＜７であるとすると、それは正味負の電荷を持ち、そして逆に前記混合物に存在する蛋白質の等電点が＞７であるとすると、それは正味正の電荷を持つであろう。未反応のシリカ表面の等電点は約２であり、その結果として、ｐＨ＝７付近の時にそれを複雑な混合物と接触させると、それは強力に負に帯電し、従って、正に帯電している蛋白質はシリカ表面に非選択的に吸着されるであろう。このことは、シリカ表面が蛋白質と強力に非選択的に結合することを説明するものである。従って、この上に述べたように、そのような支持体の表面電荷は、理想的には、吸着を実施するｐＨにおいてゼロであるべきである。
【００６１】
最小限にすべき２番目の種類の結合相互作用は疎水性結合である。疎水相互作用は単一部位で起こる静電または二極相互作用よりも弱いが、それが数多くの隣接部位の間に集合して来ると目立って来る。溶媒の塩濃度が相対的に高くなると疎水相互作用が優勢になる。そのような塩のイオンが帯電している表面と相互作用することで、蛋白質から「電荷が選別される（ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ｔｈｅ  ｃｈａｒｇｅ）」可能性がある。高い塩（ｈｉｇｈ  ｓａｌｔ）が存在すると表面との静電相互作用が減じる一方で、表面が疎水特性を有すると疎水相互作用が優勢になる。従って、支持体がそのような相互作用を起こす度合を最小限にするには、表面組成が疎水性にならないようにすべきである。
【００６２】
表面と蛋白質が起こす３番目の種類の結合相互作用は水素結合または二極相互作用である。興味の持たれることに、溶媒が水の場合、そのような相互作用は、エントロピーを考慮すると、溶媒の方が表面よりも容易に起こる。即ち、蛋白質が水素結合を通して表面と結合することを「選択」、即ち水系（これもまた水素結合相互作用である）の中に入っている溶液の状態であることを選択すると、その方がエントロピーが高い状態であることから、溶液の状態の方が好都合である。従って、蛋白質を水溶液から精製しようとする場合、非選択的結合を最小限にするには表面に二極性組成を持たせるのが好ましい。そのような表面は典型的に低い静電荷密度において親水性である。
【００６３】
本発明は前記３種類の相互作用の各々を取り扱うものでありかつ本発明の新規な特徴の１つは水が基になった系から蛋白質を精製するに適するように表面組成に非常に低い表面電荷密度を持たせたことに加えて表面を親水性にした点にあると考えている。無機酸化物が基になった支持体、例えばシリカ、好適にはシリカゲルなどに上述したＲ１０基、例えば−ＣＨ２ＯＨ、−ＣＨ（ＯＨ）２、−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ３、−ＣＨ２ＣＨ２ＯＨ、−Ｃ（ＯＨ）２ＣＨ３、−ＣＨ２ＣＨ（ＯＨ）２および−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２（ＯＨ）など、好適には−ＣＨ２ＯＨによる化学的修飾を受けさせて表面を覆うことで、そのような表面組成を達成する。前記Ｒ１０基は親水性ではあるが、非常に弱い酸であり、このことは、前記Ｒ１０基はｐＨが約１２未満付近の時には本質的に解離しておらず、従って帯電していないことを意味する。そのような表面組成に蛋白質の複雑な混合物が向けられた時に起こる電荷相互作用は最小限であるが、水素結合相互作用は、溶媒和している蛋白質のエントロピー状態の方が表面と水素結合している蛋白質のそれよりも高いことが理由で、溶媒である水による水素結合の方が容易に起こるであろう。その上、そのような表面組成によって、そのように高容量の親和性支持体（ｈｉｇｈ  ｃａｐａｃｉｔｙ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｓｕｐｐｏｒｔ）が望まれない蛋白質と非選択的に結合する度合が最小限になり、それによって、高い精製率が高容量でもたらされる。
【００６４】
また、無機物質の表面に位置するＲ１０部分と少なくとも１種のリンカーを含んで成る固体も本発明の範囲内である。そのような固体は、この固体を使用者に「そのまま」販売することができる中間体であると見なすことができる。その後、所望分析物を単離するに先立って、その使用者は結合部分を前記リンカー基と反応させることができる。また、場合により、前記リンカー基にキャップをかぶせてもよいか、或は他の様式で、それを結合部分と反応させる前にさらなる化学が必要であるような前駆体の形態にすることも可能である。
【００６５】
以下の実施例は本発明の面のいくらかを説明する目的で示すものであり、本発明の範囲を限定すると解釈されるべきでない。本発明は本明細書に開示した本発明の精神からも必須属性からも逸脱することなく本実施例で示さなかった態様でも具体化可能である。例えば、本分野の技術者は本発明を本請求の範囲に記述した如く実施することができかつ本請求の範囲に示した要素に相当する要素を有する如何なる態様も請求する発明の範囲内に含まれる。
【実施例】
【００６６】
実施例１および２
通常のシリカ媒体が起こす非特異的結合
これらの実施例では、混ぜ物なしでありかつ被覆されていない従来技術のシリカの帯電表面は蛋白質を強力に吸着するが、それは、たいていは等電点およびシリカの表面領域によるものであることを示す。２種類のシリカに試験を受けさせた：実施例１および２。実施例１は、熱処理を１５０℃で４時間受けさせた後の表面積が１６１ｍ２／ｇの低い表面積を有するシリカゲル［微細孔＝７３ｍ２／ｇ；中孔（ｍｅｓｏｐｏｒｅ）＝８８ｍ２／ｇ、細孔容積＝０．３７３ｃｃ／ｇ、平均孔直径＝９３Å］であった。実施例２は、熱処理を１５０℃で４時間受けさせた後の表面積が２５３ｍ２／ｇのより高い表面積／細孔容積を有するシリカゲル［微細孔＝３５ｍ２／ｇ；中孔＝２１８ｍ２／ｇ、細孔容積＝２．４４５ｃｃ／ｇ、平均孔直径＝３８７Å］であった。以下に示す実施例に、混ぜ物なしのシリカサンプルを蛋白質が水溶液に入っている複雑な混合物と接触させる手順を記述する。その後、結果として得た上澄み液に等電焦点ゲル電気泳動法（ｉｓｏｅｌｅｃｔｒｉｃ  ｆｏｃｕｓｓｉｎｇ  ｇｅｌ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）による分析を蛋白質の吸着に関して受けさせた。
【００６７】
エッペンドルフ（ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）管に入れた２００μｌのＤＩ  Ｈ２Ｏに一瓶（３２５μｇ蛋白質／瓶）のＰｈａｒｍａｃｉａ  ３．６−９．３  Ｂｒｏａｄ  ｐＩ  Ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（カタログ番号１７−０４７１−０１）を溶解させた。実施例１を０．００５ｇ加えた。別のエッペンドルフ管に２００μｌのＤＩ  Ｈ２Ｏを入れて、これに一瓶（３２５μｇ蛋白質／瓶）のＰｈａｒｍａｃｉａ  ３．６−９．３  Ｂｒｏａｄ  ｐＩ  Ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（カタログ番号１７−０４７１−０１）を溶解させた後、実施例２を０．００５ｇ加えた。両方のサンプルを回転させながら１時間撹拌した。これらのサンプルにＰｈａｒｍａｃｉａ  ＰｈａｓｔＧｅｌ装置を用いた３−９の等電焦点ゲル電気泳動を受けさせた。その結果を図２に示す。
レーン 記述
２，７    Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ３．６−９．３  Ｂｒｏａｄ  ｐＩ標準
３，４    実施例１
５，６    実施例２
図２は、実施例１および２と接触させたサンプルには帯（蛋白質）が無くなったことを示しており、このことは、そのような蛋白質がシリカの表面に吸着されたことを意味する。高い表面積を有するシリカである実施例２は５．９より高い等電点で蛋白質の全部を吸着した一方、表面積が低い方のシリカである実施例１が蛋白質を吸着したのはより高いｐＩの時のみであった。このデータは、明らかに、被覆されていないシリカは主に強力な静電相互作用によって蛋白質と結合することと、その表面はそのようなｐＨ（約５．５付近であると仮定）の時に負に帯電していることを示している。
実施例３、４および５
疎水処理された支持体が起こす非選択的結合
これらの実施例では、シリカを疎水性基であるメチルまたはオクチル基で被覆しておくと特に溶媒の中程度のイオン濃度、即ち〜０．１Ｍの塩の時に強力な吸着が起こることを示す。実施例３は、Ｗ．Ｒ．Ｇｒａｃｅ  ＆  Ｃｏ．が市販している幅広い孔のシリカ（混ぜ物なしでありかつ被覆されていない）であるＸＷＰ−ゲル  Ｐ  ００５［活性化を１５０℃で２時間受けていて、ＳＡ＝７２ｍ２／ｇ、孔中央値５０ｎｍ］であった。実施例４は、実施例３のシリカにメチル基による被覆を以下に記述するように受けさせておいたものであった。実施例５は、実施例３のシリカにオクチル基による被覆を以下に記述するように受けさせておいたものであった。実施例４の調製は下記の如くであった。２５０ｍｌの丸底フラスコにトルエンを５０ｍｌおよびメチルトリエトキシシランを６．１６ｇ加えた。次に、トルエン／メチルトリエトキシシラン溶液に実施例３を１０．１ｇ加えた。空気を除去する目的でＮ２を５分間流しそして反応全体に渡って流し続けた。このサンプルを還流させながら１１０℃で４時間撹拌した。次に、このサンプルを濾過した後、５０ｍｌのトルエンで３回洗浄した。このサンプルを５０ｍｌのトルエンに入れて再びスラリー状にした後、濾過し、５０ｍｌのトルエンで３回洗浄した。次に、このサンプルを５０ｍｌのトルエンに入れて再びスラリー状にし、濾過し、５０ｍｌのトルエンで３回洗浄した。このサンプルに乾燥を１１０℃で受けさせた後、焼成を１５０℃で４時間受けさせた。
【００６８】
実施例５の調製は下記の通りであった。トルエンを溶媒として用いて、１３．２５ｇのトルエンに溶解させた０．５３ｇのオクチルトリエトキシシランを１０．１ｇの実施例３に湿り開始（ｉｎｃｉｐｉｅｎｔ  ｗｅｔｎｅｓｓ）になるまで含浸させた。次に、このサンプルに空気乾燥をフード内で２時間、乾燥を１１０℃で１時間に続いて、焼成を１５０℃で４時間受けさせた。
【００６９】
０．１ＭのＮａＣｌの中で起こる蛋白質吸着を下記の如く測定した。実施例４および５は疎水性であることから、蛋白質溶液との良好な接触を確保するには湿らせる手順が必要であった。エッペンドルフ管に０．０１４ｇの実施例３を対照として加えた。次に、エタノールを１ｍｌ加え、撹拌した後、遠心分離にかけることで上澄み液を除去した。エタノールを０．５ｍｌおよびＤＩ  Ｈ２Ｏを０．５ｍｌ加え、撹拌した後、遠心分離にかけることで上澄み液を除去した。エタノールを０．２５ｍｌおよびＤＩ  Ｈ２Ｏを０．７５ｍｌ加え、撹拌した後、遠心分離にかけることで上澄み液を除去した。ＤＩ  Ｈ２Ｏを１ｍｌ加え、撹拌した後、遠心分離にかけることで上澄み液を除去した。このようなＤＩ  Ｈ２Ｏによる洗浄を更に４回繰り返した。０．１ＭのＮａＣｌ＋０．０２ＭのＰＢＳ（ｐＨ＝７．４）を１ｍｌ加え、撹拌した後、遠心分離にかけることで上澄み液を除去した。０．１ＭのＮａＣｌ＋０．０２ＭのＰＢＳ（ｐＨ＝７．４）を用いた洗浄を更に４回繰り返した。０．１ＭのＮａＣｌ＋０．０２ＭのＰＢＳ（ｐＨ＝７．４）（５００μｌ）に２瓶のＳｉｇｍａ  ＩＥＦ  Ｍｉｘ  ３．６−９．３  Ｉｓｏｅｌｅｃｔｒｉｃ  Ｆｏｃｕｓｉｎｇ  Ｍａｒｋｅｒ（カタログ番号Ｉ−３０１８）を溶解させた。その溶解させたＩＥＦ  Ｍｉｘをエッペンドルフ管に加えた。
【００７０】
別のエッペンドルフ管に実施例４を０．０１４ｇ加えた。実施例４でも実施例３と同じ湿らす手順および蛋白質添加を実施した。
【００７１】
３番目のエッペンドルフ管に実施例５を０．０１４ｇ加えた。実施例５でも実施例３と同じ湿らす手順および蛋白質添加を実施した。
【００７２】
０．１ＭのＮａＣｌ＋０．０２ＭのＰＢＳ（ｐＨ＝７．４）（２５０μｌ）に１瓶のＳｉｇｍａ  ＩＥＦ  Ｍｉｘ  ３．６−９．３  Ｉｓｏｅｌｅｃｔｒｉｃ  Ｆｏｃｕｓｉｎｇ  Ｍａｒｋｅｒ（カタログ番号Ｉ−３０１８）を溶解させた。これが未処理の標準蛋白質混合物であった。
【００７３】
あらゆるサンプルを回転させながら１時間撹拌した。これらのサンプルにＰｈａｒｍａｃｉａ  ＰｈａｓｔＧｅｌ装置を用いた３−９の等電焦点ゲル電気泳動を受けさせた。その結果を図３に示す。
レーン 記述
１，８    標準蛋白質混合物
２，３    実施例３
４，５    実施例４
６，７    実施例５
図３で分かるであろうように、シリカの表面電荷は溶解している塩、即ち０．１ＭのＮａＣｌによって「選別」されたが、蛋白質の結合は全く起こらず、メチル、特にオクチル基の疎水相互作用は非常に強く、帯の多くが失われた。これらのデータは、明らかに、この上に示した条件では表面組成が疎水性であることから非選択的結合がもたらされる可能性があることを示している。
実施例６、７および８
本発明の実施例
これらの実施例では、蛋白質がシリカの表面と非選択的に結合する度合を低くするには本発明に従うＲ１０基を用いるのが有利であることを示す。実施例６は、これに活性化を２００℃で２時間受けさせる以外は実施例３と同じであった。実施例７は、シリカの表面にＳｉ−Ｒ基（ここで、Ｒはアセトキシメチルである）が付着している中間的表面組成（ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ）であった。実施例８は、シリカの表面にＳｉ−Ｒ１０基（ここで、Ｒ１０基はメチルヒドロキシである）が付着している本発明の表面組成物の例であった。また、実施例８をイオン強度（ｉｏｎｉｃ  ｓｔｒｅｎｇｔｈ）が高い溶媒および低い溶媒と一緒にした時にも利点が示された。
【００７４】
実施例７の調製は下記の如くであった。２５０ｍｌの丸底フラスコにトルエンを５０ｍｌおよびアセトキシメチルトリエトキシシランを２０．４２ｇ加えた。トルエン／アセトキシメチルトリエトキシシラン溶液に実施例６を１５．０５ｇ加えた。空気を除去する目的でＮ２を５分間流しそして反応全体に渡って流し続けた。このサンプルを還流させながら１１０℃で１６時間撹拌した。次に、このサンプルを濾過した後、５０ｍｌのトルエンで３回洗浄した。このサンプルを５０ｍｌのトルエンに入れて再びスラリー状にした後、濾過し、５０ｍｌのトルエンで５回洗浄した。次に、このサンプルを５０ｍｌのトルエンに入れて再びスラリー状にし、濾過し、５０ｍｌのトルエンで５回洗浄した。これに乾燥を１１０℃で受けさせた後、焼成を１５０℃で４時間受けさせた。
【００７５】
実施例８の調製は下記の通りであった。２５０ｍｌの丸底フラスコに実施例７を１０ｇおよび０．０１ＭのＨ２ＳＯ４を１００ｍｌ加えた。空気を除去する目的でＮ２を５分間流しそして反応全体に渡って流し続けた。このサンプルを還流させながら１００℃で１８時間撹拌した。次に、このサンプルを濾過した後、１００ｍｌのＤＩ  Ｈ２Ｏ（８０℃）で２回洗浄した。このサンプルを１００ｍｌのＤＩ  Ｈ２Ｏ（８０℃）に入れて再びスラリー状にした後、濾過し、１００ｍｌのＤＩ  Ｈ２Ｏ（８０℃）で２回洗浄した後、これに乾燥を１１０℃で受けさせた後、焼成を１５０℃で４時間受けさせた。
【００７６】
エッペンドルフ管に実施例７を０．００７ｇ加えた。０．１４ＭのＮａＣｌ＋０．０２ＭのＰＢＳ（ｐＨ＝７．２）（２５０μｌ）に１瓶のＳｉｇｍａ  ＩＥＦ  Ｍｉｘ  ３．６−９．３  Ｉｓｏｅｌｅｃｔｒｉｃ  Ｆｏｃｕｓｉｎｇ  Ｍａｒｋｅｒ（カタログ番号Ｉ−３０１８）を溶解させた後、前記エッペンドルフ管に加えた。このサンプルに実施例７（高塩）の標識を付けた。
【００７７】
２番目のエッペンドルフ管に実施例８を０．００７ｇ加えた。０．１４ＭのＮａＣｌ＋０．０２ＭのＰＢＳ（ｐＨ＝７．２）（２５０μｌ）に１瓶のＳｉｇｍａ  ＩＥＦ  Ｍｉｘ  ３．６−９．３  Ｉｓｏｅｌｅｃｔｒｉｃ  Ｆｏｃｕｓｉｎｇ  Ｍａｒｋｅｒ（カタログ番号Ｉ−３０１８）を溶解させた後、前記エッペンドルフ管に加えた。このサンプルに実施例８（高塩）の標識を付けた。
【００７８】
３番目のエッペンドルフ管に実施例７を０．００７ｇ加えた。０．０２ＭのＰＢＳ（ｐＨ＝７．４）（２５０ｕｌ）に１瓶のＳｉｇｍａ  ＩＥＦ  Ｍｉｘ  ３．６−９．３  Ｉｓｏｅｌｅｃｔｒｉｃ  Ｆｏｃｕｓｉｎｇ  Ｍａｒｋｅｒ（カタログ番号Ｉ−３０１８）を溶解させた後、前記エッペンドルフ管に加えた。このサンプルに実施例７（低塩）の標識を付けた。
【００７９】
４番目のエッペンドルフ管に実施例８を０．００７ｇ加えた。０．０２ＭのＰＢＳ（ｐＨ＝７．４）（２５０ｕｌ）に１瓶のＳｉｇｍａ  ＩＥＦ  Ｍｉｘ  ３．６−９．３  Ｉｓｏｅｌｅｃｔｒｉｃ  Ｆｏｃｕｓｉｎｇ  Ｍａｒｋｅｒ（カタログ番号Ｉ−３０１８）を溶解させた後、前記エッペンドルフ管に加えた。このサンプルに実施例８（低塩）の標識を付けた。
【００８０】
５番目のエッペンドルフ管に２５０ｕｌのＤＩ  Ｈ２Ｏを入れて、これに１瓶のＳｉｇｍａ  ＩＥＦ  Ｍｉｘ  ３．６−９．３  Ｉｓｏｅｌｅｃｔｒｉｃ  Ｆｏｃｕｓｉｎｇ  Ｍａｒｋｅｒ（カタログ番号Ｉ−３０１８）を溶解させた後、前記エッペンドルフ管に加えた。このサンプルに蛋白質混合物標準の標識を付けた。
【００８１】
あらゆるサンプルを回転させながら１時間撹拌した。次に、あらゆるサンプルにＰｈａｒｍａｃｉａ  ＰｈａｓｔＧｅｌ装置を用いた３−９の等電焦点ゲル電気泳動を受けさせた。その結果を図４に示す。
レーン 記述
１，８    蛋白質混合物標準
実施例７（高塩）
実施例８（高塩）
実施例７（低塩）
実施例８（低塩）
この実験の結果は、明らかに、本発明の態様の１つである実施例８は蛋白質帯の全部が存在している点でシリカ表面への非特異的吸着を起こさせないと言った利点を有することを示している（「高塩」および「低塩」両方の条件下のレーン３および７を参照）。
実施例８の特徴付け
本発明の表面組成を以下に記述する分析で特徴付ける。
【００８２】
図５に、−ＣＨ２ＯＨ基を含んで成る表面組成を持たせた実施例８の拡散反射赤外スペクトル（１４００−４０００ｃｍ−１）を示す。Ｓｐｅｃｔｒａ−Ｔｅｃｈの拡散反射付属品が用いられているＮｉｃｏｌｅｔ  Ｍａｇｎａ  ５５０を用いて赤外データを取得した。サンプルをＫＢｒで１：２０に希釈して、４ｃｍ−１の解像度で５１２スキャンを集めた。２９３７および２８９７ｃｍ−１の所のピークは明らかに−ＣＨ２基が存在することを示している。−ＯＨ共鳴の帯は３４８３ｃｍ−１の所の幅広いピークの下に埋もれている。比較の目的で、図６に、−ＣＨ２ＯＣＯＣＨ３基を含んで成る表面組成を持たせた実施例７のスペクトルを示す。新しい共鳴が１７２６、１４２１および１３７４ｃｍ−１の所に存在し、これは、アセトキシ基に関係した特徴的な共鳴である。
【００８３】
図７に、実施例８のＭＡＳ  Ｓｉ２９  ＮＭＲスペクトルを示す。Ｃｈｅｍａｇｎｅｔｉｃｓ  ＣＭＸ  ２００を用いて、これを３９．７６ＭＨｚの共鳴振動数で操作することで、単パルス２９Ｓｉ核磁気共鳴実験を実施した。サンプルを１４ｍｍの鉛筆型ローターの中に充填した。２２度パルスに相当する４μｓのパルス長を６０秒の弛緩遅延（ｒｅｌａｘａｔｉｏｎ  ｄｅｌａｙ）と一緒に用いた。−６２ｐｐｍの所の明瞭な共鳴はＯ３Ｓｉ−ＣＨｘ−であると識別した［Ｖｉｃｉｃ，Ｄ．およびＭａｃｉｅｌ，Ｊ．、Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０５（１９８３）、３７６７−３７７６頁を参照］。
【００８４】
図８に、実施例８のｘ線光電子スペクトルを示す。サンプルをサンプル用スタブ（ｓｔｕｂ）に両面テープで取り付けた後、炭素、酸素およびケイ素スキャンを２時間実施した。スペクトルが２つのピークに適合しており、それらを混入しているＣ（２８４．７ｅＶ）およびアルコールのＣ原子（２８６．７ｅＶ）であると識別した［「Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｘ−ｒａｙ  Ｐｈｏｔｏｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ」、Ｍｏｕｌｄｅｒ，Ｊ．Ｆ．、Ｓｔｉｃｋｅ，Ｗ．Ｆ．、Ｓｏｂｏｌ，Ｐ．Ｅ．およびＢｏｍｂｅｎ，Ｋ．Ｄ．、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  Ｃｏｒｐ、Ｅｄｅｎ  Ｐｒａｉｒｉｅ、ＭＮ、１９９２を参照］。比較の目的で、実施例７のＸＰＳスペクトルを図９に示す。この場合にもまたカルボキシルの炭素に関係したピークが２８９ｅＶの所に存在することを確認した。このような調査は、本発明の態様の１つである実施例８の表面組成はメチルヒドロキシ基、即ち−ＣＨ２ＯＨ、例えば本明細書に定義する如きＲ１０を含んで成ることを示している。
【００８５】
実施例８の生成物に存在するＲ１０基（−ＣＨ２ＯＨ）の濃度は２．０１基／ｎｍ２であり、これは、最終生成物のシリカである支持体の表面積（７２ｍ２／ｇ）の炭素含有量（１．９０７％）から計算した値であった。前記表面積は通常のＢＥＴ表面積方法論を用いて測定した表面積でありそして前記炭素含有量（重量％）はモデルＣ−１４４  ＬＥＣＯ  Ｃａｒｂｏｎ  Ａｎａｌｙｚｅｒを用いて測定した炭素含有量であった。
実施例９（結合部分の付着そして本発明を用いると非特異的結合の度合が低くなることの説明）
２０００ｍｌの丸底フラスコにトルエンを８４２ｇおよび３−アミノプロピルトリエトキシシランを３．１１ｇ加えた。次に、この丸底フラスコに、焼成を２００℃で２時間受けさせておいたＧｒａｃｅ  Ｄａｖｉｓｏｎ  ＸＷＰ  ５００Åシリカを２００ｇ加えた後、沸石（ｂｏｉｌｉｎｇ  ｃｈｉｐｓ）を１５個加えた。前記丸底フラスコを加熱用マントルに入れた後、それにコンデンサを取り付けた。前記加熱用マントルを軌道振とう機（ｏｒｂｉｔａｌ  ｓｈａｋｅｒ）の上部に取り付けて、それを１１５ｒｐｍの速度で作動させた。空気を反応全体に渡って除去する目的でＮ２を前記丸底フラスコおよびコンデンサに通した。サンプルを沸騰（〜１１０℃）に４時間加熱した。このサンプルを濾過し、２ｘ２００ｍｌのトルエンで洗浄した後、これに乾燥を１１５℃で受けさせ、そして次に焼成を１５０℃で２時間受けさせた。このサンプルに中間体Ａの標識を付けた。その結果として生じた−Ｃ３Ｈ６ＮＨ２基の濃度は０．５４であると計算したが、これは、支持体の表面積（ＢＥＴ）（８８ｍ２／ｇ）、前記中間体の炭素含有量（ＬＥＣＯ）（０．３２１％）および窒素含有量（０．１１％）を基にした値であった。前記窒素含有量（重量％）は、Ｃａｒｌｏ  Ｅｒｂａ  ＮＡ  １５００  Ａｎａｌｙｚｅｒを用い、Ｄｕｍａｓ方法に修飾を受けさせた方法を基にした方法を用い、酸素を含有する雰囲気を用いそして伝熱検出（ｔｈｅｒｍａｌ  ｃｏｎｄｕｃｔｉｎｇ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ）を用いて測定した窒素含有量であった。ＡＳＴＭ  Ｄ５３７３（石炭に関する）およびＡＳＴＭ  ５２９１を参照のこと。
【００８６】
ビーカーに入っている中間体Ａを１ＭのＮａＣｌ（８００ｍｌ）と混合した後、磁気撹拌機で撹拌した。初期ｐＨは４．７９であった。１ＭのＨＣｌをｐＨが２になるまで滴下した。２．０のｐＨを１５分間保持した。このサンプルを濾過し、５ｘ２００ｍｌのＤＩ  Ｈ２Ｏで洗浄した後、これに乾燥を１１５℃で受けさせ、そして次に焼成を２００℃で２時間受けさせた。このサンプルに中間体Ｂの標識を付けた。
【００８７】
丸底フラスコに入っている中間体Ｂを６８０ｇのトルエンおよび１７７．２５ｇのアセトキシメチルトリエトキシシランと混合した。前記丸底フラスコに沸石を１５個加えた後、それを加熱用マントルに入れて、それにコンデンサを取り付けた。前記加熱用マントルを軌道振とう機の上部に取り付けて、それを１１５ｒｐｍの速度で作動させた。空気を反応全体に渡って除去する目的でＮ２を前記丸底フラスコおよびコンデンサに通した。サンプルを沸騰（〜１１０℃）に２４時間加熱した後、濾過し、３ｘ２００ｍｌのトルエンで洗浄した後、これに乾燥を１１５℃で受けさせ、そして次に焼成を１５０℃で２時間受けさせた。このサンプルに中間体Ｃの標識を付けた。
【００８８】
丸底フラスコに入っている中間体Ｃを９００ｍｌのジオキサンおよび１００ｍｌの０．１Ｍ  Ｈ２ＳＯ４と混合した。前記丸底フラスコに沸石を１５個加えた後、それを加熱用マントルに入れて、それにコンデンサを取り付けた。前記加熱用マントルを軌道振とう機の上部に取り付けて、それを１１５ｒｐｍの速度で作動させた。空気を反応全体に渡って除去する目的でＮ２を前記丸底フラスコおよびコンデンサに通した。サンプルを沸騰（〜１００℃）に４時間加熱した後、濾過し、２ｘ２００ｍｌのトルエンで洗浄した後、これに乾燥を１１５℃で受けさせ、そして次に焼成を１５０℃で２時間受けさせた。このサンプルに中間体Ｄの標識を付けた。この生成物が有するＲ１０基（−ＣＨ２ＯＨ）の濃度は５．６５であり、これは、中間体Ｄの炭素含有量を計算した後にＣ３Ｈ６ＮＨ２基に起因する炭素の量を引きそして次に実施例８で行った計算を行うことで測定した濃度であった。これを行う時、Ｃ３Ｈ６ＮＨ２基の濃度は０．３９であると計算し、これは、Ｒ１０基を付着させる化学を実施する前の中間体Ａに関するデータから計算した濃度よりも低い。特別な理論に固執するものでないが、窒素含有量の若干の変動（０．０８に対する０．１１）は標準偏差によるか或は恐らくはＲ１０基を作り出す時にＣ３Ｈ６ＮＨ２基が若干滲出したことによるものであろうと考えている。
【００８９】
１０００ｍｌのビーカーに中間体Ｄを２０．７５ｇおよび連成用緩衝液（０．１ＭのＮａ２ＰＯ４＋０．１５ＭのＮａＣｌ；ｐＨ＝７．０）を４００ｍｌ入れて混合した後、５分間撹拌した。このサンプルを濾過して湿った状態のケーキ（ｃａｋｅ）を生じさせ、これを１０００ｍｌのビーカーに入れた後、このビーカーに５０重量％のグルタルアルデヒドを５８７．６６ｇおよびＮａＣＮＢＨ３を５．９１ｇ加えた。このサンプルを４時間撹拌し、濾過し、４００ｍｌの連成用緩衝液で洗浄した後、４００ｍｌの連成用緩衝液に入れて再びスラリー状にすることで新しいサンプルを得、これを濾過し、４００ｍｌの連成用緩衝液で洗浄した後、４００ｍｌの連成用緩衝液に入れて再びスラリー状にすることを更に２回行った。その再び洗浄しそして再びスラリー状にしたサンプルを濾過した後、４００ｍｌの連成用緩衝液で洗浄した。このサンプルに中間体Ｅの標識を付けた。
【００９０】
２５０ｍｌの丸底フラスコに連成用緩衝液を７５．４４ｇおよびＲｅｐｌｉｇｅｎの蛋白質Ａ（蛋白質Ａが１リットル当たり５０ｇの濃度）を２４．５６ｇ加えた。このフラスコにＮａＣＮＢＨ３を２．５２ｇおよび中間体Ｅを加えた後、振とう機で４時間混合した。このサンプルを濾過した後、４ｘ１００ｍｌの連成用緩衝液で洗浄した。次に、この２５０ｍｌの丸底フラスコに連成用緩衝液を７５．４４ｇ、ＮａＣＮＢＨ３を２．５２ｇおよびエタノールアミンを０．４４ｇ加えた後、振とう機で４時間混合した。このサンプルを濾過した後、４ｘ１００ｍｌの連成用緩衝液で洗浄した。このサンプルを２０％のエタノールに入れて４℃で貯蔵した。このサンプルに実施例９の標識を付けた。ＬＥＣＯ  Ｃａｒｂｏｎにより、実施例９はシリカ１ｇ当たり３４．６７ｍｇの蛋白質Ａであると決定した。
【００９１】
−Ｓｉ−ＣＨ２ＯＨが直接付着しているシリカを０．６６ｘ２ｃｍ（Ｉ．Ｄ．）のアフィニティーカラム（ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｃｏｌｕｍｎ）に詰めて、最初に２０ｍＭの燐酸塩緩衝液（ｐＨ７．４）で平衡状態にした。このカラムにテレジノバクター・ツルニラエ（Ｔｅｒｅｄｉｎｏｂａｃｔｅｒ  ｔｕｒｎｉｒａｅ）汁の上澄み液にラビットポリクローナルＩｇＧを０．５ｍｇ／ｍｌ入れることで生じさせた供給材料サンプルを５ｍｌ加えた。次に、前記アフィニティーカラムを前記燐酸塩緩衝液で２８０ｎｍの所の紫外吸光度がベースラインに戻るまで洗浄した。０．１Ｍの酢酸（ｐＨ３．０）を１ｍｌ／分の流量で用いることで前記アフィニティーカラムからＩｇＧを溶離させた（図９の中の狭いピークを参照）。図１０に、２８０ｎｍの所の吸光度を監視することによるアフィニティーカラムの充填、洗浄および溶離のクロマトグラムを示す。
【００９２】
図１０に示した親和精製の溶離液から精製した１００μＬのＩｇＧをサイズエクスクルージョン（ｓｉｚｅ  ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ）クロマトグラフィーカラムに注入して、溶離用緩衝液（０．１ＭのＮａ２ＳＯ４と０．０５ＭのＮａＨ２ＰＯ４、ｐＨ５）を１ｍｌ／分の流量で用いて溶離させた。前記サイズエクスクルージョンクロマトグラフィーカラムから出て来た溶離液のＡ２８０プロファイル（ｐｒｏｆｉｌｅ）を図１１に示し、これはＩｇＧが単一のピークであることを示しており、前記細胞汁に由来する不純物の量は非常に僅かである。比較として、図１２に、出発ラビットポリクローナルＩｇＧを前記細胞汁に添加してそれをサイズエクスクルージョンクロマトグラフィーに同じ条件でかけた時のクロマトグラムを示す。図１１と１２の比較を基にして、実施例９を用いて前記細胞汁から精製したＩｇＧの純度（図１１）の方が出発ＩｇＧのそれ（図１２）よりも高いことは明らかであった。このように、図１１および１２は、本発明の固体を用いるとシリカ媒体が起こす非選択的結合の度合が最小限になることを示している。
【図面の簡単な説明】
【００９３】
【図１】図１に本発明の組成物を図式的に示し、これは、無機物質、Ｒ１０表面部分、任意のリンカー、結合部分および分析物を含んで成る。
【図２】図２に実施例１および２の結果を示し、レーン２および７はＰｈａｒｍａｃｉａ  ３．６−９．３  Ｂｒｏａｄ  ｐＩ  Ｓｔａｎｄａｒｄに相当し、レーン３および４は実施例１に相当し、そしてレーン５および６は実施例２に相当する。この図は、未処理の通常の無機酸化物が非特異的結合を起こすことを説明する図である。
【図３】図３に実施例３−５の結果を示す。
【図４】図４に実施例６−８の結果を示し、これは本発明の例示である。
【図５−８】図５−８に、本発明の特別な態様（実施例８）を特徴付ける目的で実施した分析の結果を含め、図５に実施例８の拡散反射ＩＲスペクトルを示し、比較の目的で図６に実施例７で調製した組成物の同じスペクトルを示し、図７に実施例８のＭＡＳ  Ｓｉ２９  ＮＭＲスペクトルを示し、そして図８に実施例８のＸ線光電子スペクトル（ＸＰＳ）を示す。
【図９】図９に実施例７のＸＰＳスペクトルを示す。
【図１０】図１０に、本発明を用いた実施例９（結合部分を付着させた後の）を用いて調製したカラムの充填、洗浄および溶離のクロマトグラムを示す。
【図１１】図１１に、実施例９で実施したアフィニティークロマトグラフィーの溶離液から得た精製ラビットポリクローナルＩｇＧをサイズエクスクルージョンクロマトグラフィーにかけた時に出て来た流出液が２８０ｎｍの所に示した吸光度を示す。
【図１２】図１２に、実施例９で生じさせた細胞汁に出発ラビットポリクローナルＩｇＧを添加してそれをサイズエクスクルージョンクロマトグラフィーにかけた時に出て来た流出液が２８０ｎｍの所に示した吸光度を示す。
【図１３】図１３に、図１４に示す反応によって−ＣＨ２ＯＨをＲ１０としてもたらすコーティング剤の調製を示す。
【図１４】図１４に、−Ｓｉ−ＣＨ２ＯＨがシリカに直接付着するようにシリカの一部ではないケイ素原子を通してＲ１０（ここで、Ｒ１０は−ＣＨ２ＯＨである）が付着しているシリカの調製を示す（ＨＯ−Ｓｉ−−−は、シリカの表面に存在するシラノール基に相当する）。
【図１５】図１５に、図１６に示す反応によって−ＣＨ（ＯＨ）２をＲ１０としてもたらすコーティング剤の調製を示す。
【図１６】図１６に、−Ｓｉ−Ｒ１０基［ここで、Ｒ１０は−ＣＨ（ＯＨ）２である］がシリカの表面に付着するようにシリカの一部ではないケイ素原子を通してＲ１０が間接的に付着しているシリカの調製を示す（ＨＯ−Ｓｉ−−−は、シリカの表面に存在するシラノール基に相当する）。
【図１７】図１７に、図１８に示す反応によってヒドロキシエチルをＲ１０としてもたらすコーティング剤の調製を示す。
【図１８】図１８に、シリカとこのシリカの表面に付着している−Ｓｉ−Ｒ１０基（ここで、Ｒ１０は１，２−ジヒドロキシエチルである）を含んで成る、即ちＲ１０がシリカの一部ではないケイ素原子を通してシリカ表面に間接的に付着している固体を生じさせる方法を示す。
【図１９】図１９に、シリカとこのシリカの表面に付着している−Ｓｉ−Ｒ１０基（ここで、Ｒ１０は１，２−ジヒドロキシエチルである）を含んで成る、即ちＲ１０がシリカの一部ではないケイ素原子を通してシリカ表面に間接的に付着している固体を生じさせる別の方法を示す。
【図２０】図２０に、−Ｓｉ−Ｒ１０基（ここで、Ｒ１０はヒドロキシメチルである）をシリカの表面に付着させた後に架橋させた本発明の態様を示す（ＨＯ−Ｓｉ−−−は、シリカの表面に存在するシラノール基に相当する）。
【図２１】図２１に、図２２に示す反応によって結果としてシリカの表面に単一点で付着する−Ｓｉ−Ｒ１０基（ここで、Ｒ１０はヒドロキシメチルである）をもたらすであろうコーティング剤の調製を示す。
【図２２】図２２に、−Ｓｉ−Ｒ１０基（ここで、Ｒ１０はヒドロキシメチルである）がシリカの表面に単一点で付着している本発明の態様を示す（ＨＯ−Ｓｉ−−−は、シリカの表面に存在するシラノール基に相当する）。
【図１】
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【図５】
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【図６】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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