(57)【要約】本発明は、腫瘍の治療および／または免疫発現の薬剤組成物を製造するためのアミノ酸、アミノ酸類似体、糖リン酸、糖リン酸類似体およびこのような物質の混合物および／または糖分解酵素複合体／Ｍ２−ＰＫの会合の調節および／またはアミノ基転移酵素の阻害および／またはｐ３６へのリンゴ酸脱水素酵素の結合の分解による種からなる群から選ばれる物質の使用を教示する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
腫瘍の治療および／または免疫発現の薬剤組成物を製造するための“アミノ酸、アミノ酸類似体、糖リン酸、糖リン酸類似体およびこのような物質の混合物”および／または糖分解酵素複合体／Ｍ２−ＰＫの会合の調節および／またはアミノ基転移酵素の阻害および／またはｐ３６へのリンゴ酸脱水素酵素の結合の分解による種からなる群から選ばれる物質の使用。
【請求項２】
物質が“セリン、シクロセリン、ヴァリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、メチオニン、システイン、アミノイソブチレート、アミノオキシアセテート、Ｃｈｂａ、フルクトース−１，６−ビスホスフェート、グリセラート−２，３−ビスホスフェート、グリセラート−３−ホスフェート、リボース−１，５−ビスホスフェート、リブロース−１，５−ビスホスフェート、このような化合物の類似体およびこのような物質の混合物”からなる群から選ばれる、請求項１記載の使用。
【請求項３】
物質が式Ｉの化合物
【化１】
2004524326.tif 000006
（式中、Ｒ１は−ＮＲ４Ｒ５またはアミノ酸残基であり、必要な場合は誘導体化され、Ｒ２は−ＣＯＯＨ、−ＣＮまたは−ＮＲ４Ｒ５であり、Ｒ４およびＲ５は等しくまたは異なり、かつＨ、Ｃ１−Ｃ１８−アルキル、−アリール、または−アラルキルであり、必要な場合は−Ｊ、−Ｃｌ、および／または−Ｆと置換してよく、Ｒ３は＝０である）およびこのような化合物の混合物からなる群から選ばれる、請求項１記載の使用。
【請求項４】
薬剤組成物が静脈内投与用に調整される、請求項１ないし３のいずれか１項記載の使用。
【請求項５】
薬剤組成物が体重ｋｇにつき一日投与量０．１〜８０ｍｇで投与するために調整される、請求項１ないし４のいずれか１項記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、物質代謝プロセスの調節のための糖リン酸、糖リン酸類似体、アミノ酸および／またはアミノ酸類似体の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
種々の疾病は細胞物質代謝に関連している。特に腫瘍組織内でのエネルギー産生は少なくとも部分的に健常組織の場合と異なる作用を介して進行する。この腫瘍特異的作用は、特異的に腫瘍組織に作用し、比較的少ない副作用を有する腫瘍治療の出発点である。この場合、選択的に腫瘍成長を阻害し、および／または腫瘍細胞のアポトーシスが導入される。
【０００３】
腫瘍は代謝変化に支配されることが知られている。この物質代謝の変化は、グルコースが優先的に核酸合成に使用されることをもたらす。同時に新規のエネルギー、アミノ酸グルタミンが推論される。グルタミンは全組織中に高濃度で存在する。典型的に腫瘍組織は一般に腫瘍組織中の血管の組織崩壊成長に基づく特色ある低酸素症すなわち酸素の欠乏を有する。これは明らかに低酸素条件への適合が腫瘍成長中の重要なステップである。それ故、糖分解によるエネルギー産生のためのグルコースの嫌気性転換は多くの腫瘍組織集合体の共通の特徴である。それに関する一般に先導的な文献に関しては、文献箇所C.V. Dangら、TIBS 24: 68〜72、1999を参照されたい。ピルビン酸キナーゼ（ＰＫ）は糖分解の鍵となる酵素であり、ピルビン酸へのホスフェノールピルビン酸のエネルギー供給転換の触媒となる。４種の組織特異的イソ型が知られている。ＰＫ型Ｌ、Ｒ、Ｍ１およびＭ２（E. Eigenbrodtら、Critical Reviews in Oncogenesis、Vol. 3、M. Perucho、Ed.、CRC-Press、Boca Raton、Florida、91〜115頁、1992参照）。Ｍ２−ＰＫは胚形態であり、全ての他の形態を増殖性細胞と腫瘍細胞に置換する（G.E.J Staalら、Biochemical and Molecular Aspects of Selected Cancers、T.G. Pretlowら、Eds.、Academic Press Inc.、San Diego、1、313〜337頁、1991、ならびにU. Brinckら、Virchows Archiv 424、177〜185頁、1994参照）。ラットのＭ２−ＰＫ蛋白質は５３０アミノ酸からなり、残基中でのみヒトＭ２−ＰＫから区別される（T. Noguchiら、J. Biol. Chem.、261、13807〜13812頁、1986、ならびにK. Taniら、Gene、73、509〜516頁、1988参照）。Ｍ２−ＰＫは高活性四量体および低活性二量体の形態で存在しうる糖分解酵素である。高活性四量体の形態のみが糖分解酵素複合体中で会合する。糖分解酵素複合体は、糖分解酵素、ＮＤＰＫ、アデニル酸キナーゼ、ＲＮＡ、Ａ−ｒａｆおよびプロテインキナーゼカスケードの成分の会合である。Ｍ２−ＰＫの両形態間の移行は、最終的に腫瘍組織中の糖分解転換を調節する（S.Mazurekら：J. Cell. Physiol. (1996) 167:238〜250；S.Mazurekら：Anticancer Res. (1998) 18:3275〜3282；S.Mazurekら、J. Bioenerg. Biomembr.、29、315〜330頁、1997参照）。つまりＭ２−ＰＫの活性は糖分解経路の通過を制御する。Ｍ２−ＰＫが二量体の形態で存在するときは、グルコース炭素原子が分岐合成プロセスに導入される。Ｍ２−ＰＫが四量体としておよび糖分解酵素複合体中で会合する形態で存在するときは、グルコースは非常に効果的にエネルギー獲得下でピルビン酸および乳酸に転換される。Ｍ２−ＰＫの過発現は、酸化ホスホリル化がＰＫによるＡＴＰの産生に不要であるので、細胞に低酸素レベルの条件下での生存を許容する。一般に悪性腫瘍と腫瘍患者の血液中に増加したＭ２−ＰＫ量が見出される。
【０００４】
文献箇所E. Eigenbrodtら、Biochemical an Molecular Aspects of Selected Cancers、Vol. 2、311頁以下、1994から、糖分解の阻害のためにグルコース類似体を使用することが知られている。そこから公知の他の３０アプローチは、たとえば好適な複合体形成または複合体形成の阻害による糖分解イソ酵素の阻害への使用である。結果的に腫瘍組織がいわば餓死される。前記化合物における問題点は、その中の多数が細胞毒性でありおよび／または腫瘍組織に対する特異性が不充分であることである。
【０００５】
文献箇所Eigenbrodtら、in Critical Reviews in Oncogenesis (1992)(Perucho、M. ed.) CRC-Press、Boca Raton、Florida; 3:91〜115頁から、フルクトース−１，６−ビスホスフェートがＭ２−ＰＫの高活性四量体形態への移行を引き起こし、それによって糖分解流出を腫瘍組織中で調節できることが知られている。この文献箇所から、さらにアラニンおよびロイシンがＭ２−ＰＫを阻害することが知られている。
【０００６】
炎症性疾患ならびに自己免疫反応に対する新規作用物質との関連性において、文献箇所U. Mangoldら、Eur. J. Biochem.、266:1〜9、1999から、２−シアノ−３−ヒドロキシル−ブチ−２−［４−トリフルオロメチル−フェニル］−アミド（以下Ｃｈｂａ）が糖分解に干渉することが知られている。
【０００７】
アミノ基転移酵素は、アミノ基転移反応時にアミノ基が２−アミノ酸から２−ケトン酸に転換する酵素である。これは転移酵素の下位基である。置換基は、リン酸ピリドキサルである。アミノ基転移酵素の阻害は、アミノ酸の増加をもたらす。文献箇所E. Eigenbrodtら、Biochemical an Molecular Aspects of Selected Cancers、Vol. 2、311頁以下、1994から、アミノオキシアセテートおよびシクロセリンがグルタミン酸ピルビン酸アミノ基転移酵素を阻害し、細胞の増殖を阻害できることが知られている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、癌細胞の増殖と共に新生腫瘍の成長を阻害し、ならびにたとえば敗血症性ショック、自己免疫疾患、移殖組織拒絶反応ならびに急性および慢性炎症性反応のような過剰防御反応を、しかも同時に単に血液、免疫系および健常組織細胞の健常細胞に対する少量ないし皆無の細胞毒性で阻害することができる作用物質を提供する技術的問題を基礎においている。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
この技術的問題の解決のために、本発明は、腫瘍の治療および／または免疫発現の薬剤組成物を製造するための“アミノ酸、アミノ酸類似体、糖リン酸、糖リン酸類似体およびこのような物質の混合物”および／または糖分解酵素複合体／Ｍ２−ＰＫの会合の調節および／またはアミノ基転移酵素の阻害および／またはｐ３６への（ミトコンドリア）リンゴ酸脱水素酵素の結合の分解による種からなる群から選ばれる物質の使用を教示する。
【００１０】
本発明は、第一に腫瘍組織中で四量体および二量体の比率Ｍ２−ＰＫが約５０：５０になるという認識に基づく。この認識に関連して、この比率の変化つまり両形態の一方への移行が腫瘍治療に好適であることが知られた。つまりＭ２−ＰＫの完全な四量化時に核酸合成と従って増殖とが阻害されることが見出された。それに対して完全な二量化時には、アポトーシスの結果を伴うグルコースからのエネルギー獲得の阻害を引き起こし、これが同様に積極的な治療効果となる。つまり驚くべきことに、この両効果を腫瘍治療に利用することができる。この場合、この物質代謝状態が腫瘍組織特異的であるので、細胞毒性作用が全く予想されない。
【００１１】
ピルビン酸キナーゼ同位酵素供給時の変化のほかに、腫瘍発生時にＮＡＤ依存性のシトソルのグリセロール３−リン酸脱水素酵素の消滅をもたらす。これは水素が糖分解グリセリンアルデヒド３−リン酸脱水素酵素反応からリンゴ酸アスパラギン酸シャトルを介してミトコンドリア中へ輸送されなければならないことを引き起こす。ピルビン酸および乳酸へのグルタミンの分解の活性を引き起こす（グルタミン加水分解）。グルタミン加水分解はＭ２−ＰＫが不活性である条件下においてピルビン酸−およびエネルギー供給を保証する。リンゴ酸アスパラギン酸シャトルの重要な成分は、シトソル中にリン蛋白質ｐ３６への結合によって保持されるミトコンドリアのリンゴ酸脱水素酵素の前駆体である。シトソル中のｐ３６へのミトコンドリアのリンゴ酸脱水素酵素結合は、アミノ酸と糖リン酸ならびにその類似体とによって中止させることができる。
【００１２】
つまり、さらに糖分解酵素複合体／Ｍ２−ＰＫの会合の調節が間接的に、すなわちＭ２−ＰＫへの作用物質の直接的結合なしに行うことができることが知られている。すなわちアミノ基転移反応が阻害される場合および／またはｐ３６へのリンゴ酸脱水素酵素の結合が中止される場合は、これが再びこの側でＭ２−ＰＫと相互作用に入り、それによって会合を調節するアミノ酸の上昇または減少を引き起こす。
【００１３】
本発明により使用した物質により、グルタミン酸リンゴ酸アミノ基転移酵素のほかに、グルタミン酸、オキサロ酢酸アミノ基転移酵素、グルタミン酸−３−ヒドロキシピルビン酸アミノ基転移酵素およびその他の分枝鎖状α−ケトカルボン酸アミノ基転移酵素を阻害することができる。
【００１４】
類似体の意味は、構造的に天然アミノ酸もしくは糖類を由来とする化合物を表す。すなわち該化合物からは区別されるが、基礎となる天然の物質と同一またはより強い糖分解酵素複合体／Ｍ２−ＰＫ会合の調節、アミノ基転移酵素阻害および／またはｐ３６リンゴ酸脱水素酵素結合の分解を生ぜしめる。類似化合物は特に誘導体としてよい。すなわち天然に存在する一群または水素原子は別の非天然存在の一群に置換してよい。これは側鎖にも核構造にも当てはまる。このようにアミノ酸のカルボキシ基は特にシアニド基と置換してよい。糖リン酸の場合は、１個または複数個のリン酸基をシアニド基と置換してよい。アミノ酸類似体は、特にアミノ酸の前駆体、α−ケト酸、ならびに−ＣＯＯＨ基をシアニド基（−ＣＮ）と置換したα−ケト酸である。
【発明の効果】
【００１５】
（例３：結果）
【００１６】
図１は得られた結果である。対照動物に相当な大きさの腫瘍が現れたのに対し、Ｃｈｂａもしくはアミノオキシ酢酸によるものは腫瘍成長の顕著な阻害を確認することができた。腫瘍の大きさが比較的小さい治療開始時には、さらに実質的に完全な腫瘍成長の阻害、さらにアポトーシスも観察することができた。
（例４：増殖阻害の用量依存性）
【００１７】
この例で、本発明により使用した様々な化合物の増殖阻害の用量依存性が示される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
本発明の枠組の中で幾つかの制限されない実施形態が可能である。つまり本発明による薬剤組成物は複数の種々の本発明により使用した化合物を含有してよい。さらに本発明による薬剤組成物は付加的に本発明により使用した作用物質と異なる作用物質を含有してよい。この場合は組合せ調剤である。この場合は使用する種々の作用物質をただ１つの投与形態で調剤してよい。すなわち作用物質は投薬形態で混合される。しかしまた、種々の作用物質を同じまたは異なる形式の空間的に分離した投薬形態で調整することも可能である。
【００１９】
本発明により使用した作用物質に関しては、物質が”セリン、シクロセリン、ヴァリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、メチオニン、システイン、アミノイソブチレート、アミノオキシアセテート、Ｃｈｂａ、フルクトース−１，６−ビスホスフェート、グリセラート−２，３−ビスホスフェート、グリセラート−３−ホスフェート、リボース−１，５−ビスホスフェート、リブロース−１，５−ビスホスフェート、このような化合物の類似体およびこのような物質の混合物”からなる群から選ばれることが可能である。
【００２０】
この物質は、好ましくは式Ｉの化合物と、このような化合物の混合物とからなる群から選ばれている。
【化１】
2004524326.tif 000002
（式中、Ｒ１は−ＮＲ４Ｒ５またはアミノ酸残基であり、必要な場合は誘導体化し、Ｒ２は−ＣＯＯＨ、−ＣＮまたは−ＮＲ４Ｒ５であり、Ｒ４およびＲ５は等しくまたは異なり、かつＨ、Ｃ１−Ｃ１８−アルキル、−アリール、または−アラルキルであり、必要な場合は−Ｊ、−Ｃｌ、および／または−Ｆと置換してよく、Ｒ３は＝０である）。
【００２１】
この特に好ましい物質は典型的に２−もしくはα−オキソニトリルもしくはケト酸である（必要な場合はエステル化）。これらの物質類は高い作用性を有するアミノ酸類似体である。
【００２２】
シクロアルキル−およびアリール基との関連性において、ここでホモ−およびヘテロ原子の芳香族基も表されていることを注記しておく。複素環基の例：フラニル、チオフェニル、ピルロリル、イソピルロリル、３−イソピルロリル、ピラゾリル、２−イソイミダゾリル、トリアゾリル、オキサゾリル、イソアキサゾリル、チアゾリル、イソチアゾリル、ピリジル、ピラジニル、ピリミジニル、ピリダジニル、ピペラジニル、トリアジニル、オキサジニル、インデニル、ベンゾフルニル、ベンゾチオフラニル、インドリル、イソインダゾリル、ベンゾオキサゾリルであり、前記群は部分的に水素結合してよい。
【００２３】
以下、例示による化合物を列挙する。
【化１−４０】
2004524326.tif 000003
2004524326.tif 000004
2004524326.tif 000005
【００２４】
式Ｉによるイオン化合物の反対イオンとして、たとえばＮａ＋、Ｋ＋、Ｌｉ＋、および／またはシクロヘキシルアンモニウムが対象となる。
【００２５】
本発明により使用した化合物を用いて製造した薬剤は、経口、筋内、関節周囲、関節内、静脈内、腹膜内、皮下または直腸に投与してよい。しかしＣｈｂａ、アミノオキシ酢酸（ＮＨ２−ＣＯ−ＣＯＯＨ）または糖リン酸もしくは糖リン酸類似体の場合は静脈内投与が特に好ましい。
【００２６】
本発明は、さらに少なくとも１種の本発明により使用した化合物を薬剤学的に好適かつ生理学的に許容される担体および必要な場合は別の好適な作用物質、添加物および佐剤と混合し、所望の投薬形態に調整することを特徴とする薬剤の製造方法を教示する。
【００２７】
好適な固体または液体のガレーン式剤型は、たとえば顆粒、粉末、糖衣錠、錠剤、（マイクロ）カプセル、坐剤、シロップ、ジュース、懸濁液、乳濁液、点滴剤または注射溶液ならびにその製造時に賦形剤、崩壊剤、結合剤、被覆剤、膨潤剤、滑走剤または滑沢剤、香味剤、甘味剤および可溶化剤のような常法の補助剤が使用される遅延性作用物質解除による調剤である。
【００２８】
補助剤として、炭酸マグネシウム、二酸化チタン、ラクトース、マンニットおよびその他の糖類、タルク、乳蛋白質、ゼラチン、デンプン、セルロースおよびその誘導体、魚肝油、ヒマワリ油、ラッカセイ油またはゴマ油のような動物性および植物性油脂、ポリエチレングリコールおよびたとえば滅菌水のような溶剤および一価または多価アルコール類、たとえばグリセリンが挙げられる。
【００２９】
好ましくは薬剤が投与量単位で製造かつ投与され、各単位は活性成分として本発明による式Ｉの化合物の一定の用量を含有する。錠剤、カプセル、糖衣錠または坐剤のような一定の投与量単位の場合は、この用量を１〜５０００ｍｇ、有利には５０〜１０００ｍｇに、アンプル型の注射溶液の場合は１〜５０００ｍｇ、好ましくは５０〜２０００ｍｇに、筋内注入の場合もしくは腹膜内注入の場合１〜１００ｍＭｏｌ、好ましくは１０〜１００ｍＭｏｌにしてよい。静脈内投与のために対応する用量、しかし好ましくは係数０．５〜０．１だけ下げて使用可能である。
【００３０】
体重５０〜１００ｋｇの成人、たとえば体重７０ｋｇの患者の治療のために、作用物質の一日投与量は２０〜５０００ｍｇ、好ましくは５００〜３０００ｍｇが処方される。しかし事情によってはそれよりも高いまたは低い一日投与量を投与してもよい。一日投与量の投与は、個々の投与単位かまたは複数のより少ない投与単位の形態で一回投与によっても、一定の間隔で小分けした用量の多数回投与によっても行ってよい。
【００３１】
以下、本発明は単に実施形態に示した例を利用してより詳しく説明する。
（例１：腫瘍モデル）
【００３２】
腫瘍モデルとして、静脈内注入により治療される免疫適格成長ラットを使用した。これは慣用的に使用される非免疫適格ヌードマウスよりもヒトの治療に類似するモデルである。動物実験はドイツ動物保護法第８条第１項の規定により承認され、社団法人動物保護獣医協会の勧告に準じて実施した。腫瘍受容体としてオスの同系繁殖ラット（スプラーグ−ドーリィ、２００〜２５０ｇ、チャールズリバー、ズルツフェルト、ドイツ）を使用した。
【００３３】
腫瘍細胞としてノヴィコフ肝腫瘍を使用した。テストした複数の実験的に製造した腫瘍の中でノヴィコフ肝腫瘍が悪性の全徴候を示し、形態学的にヒト肝細胞癌に類似する充実性腫瘍の前提条件を最良に満たしている。ノヴィコフ肝腫瘍は、アレックスＢ．ノヴィコフによって１９５１年に４−ジメチルアゾベンゼン（バターイエロー）０．０６％による規定食の食餌によってメスのスプラーグ−ドーリィ−ラットに誘発された［Novikoff B. A transplantatble rat liver tumor induced by 4-dimethylaminoazobenzene. Cancer Res 1951; 17:1010］。腹水腫瘍としても充実性腫瘍としても増殖するこの肝臓腫瘍は、過染色症、多形性、増加した有糸分裂速度および核に有利に移行する核プラズマ関係のような典型的な悪性判定基準を示す。腫瘍細胞中には染色質骨格が不規則的に現れ、核が分裂、円形または楕円形に現れる。
【００３４】
ノヴィコフ肝腫瘍細胞は、ハイデルベルクのドイツ癌研究センターから提供された。この細胞はハンク溶液中に取り込まれ、滅菌して動物体通過のためにスプラーグ−ドーリィ−ラットに腹膜内に注入された。１週間以内に、滅菌して取り出した出血性腹水約５０ｍｌを形成した。ファルコン管内に５分間１３００ｒｐｍで遠心分離後に生成したペレットの調製は、他の腹水成分の細胞の別の洗浄のためにダルベッコＭＥＭ５０ｍｌ（ジブコＢＲＬ、エッゲンシュタイン）による洗浄と１３００ｒｐｍで５分間の遠心分離とによって行った。上澄を傾注し、ペレットをダルベッコ＋胎児子牛血清（ＦＫＳ）４０％の中に混合した。ここで細胞懸濁液各０．７ｍｌと凍結媒体０．７ｍｌをナンク管の中に満たし、気密に密閉し、−２０℃で５分間、−８０℃で１２時間予冷し、それに続き液体窒素の中で凍結した。凍結媒体はダルベッコ４０％、ＦＫＳ４０％およびＤＭＳＯ２０％からなった。
【００３５】
この細胞は投与のために以下のように準備した。浸漬後、ペレットはファルコン管内で３７℃に予熱した媒体（ダルベッコ＋ＦＫＳ４０％）５０ｍｌと反応させ、１３００ｒｐｍで５分間遠心分離した。この上澄を投棄し、この過程を再度繰返した。
【００３６】
上澄の遠心分離および傾注後、ペレットをＨＢＳＳで満たし、１００マイクロリットルをエッペンドルフピペットで取り出し、ノイバウアー計算板でエリトロシン（ビオメド社、ミュンヘン、ドイツ）により活性染色後の活性細胞数の同定のために計数した。細胞懸濁液は、遠心分離および傾注後、懸濁液がｍｌあたり５ｘ１０６活性細胞を含有するまでＨＢＳＳで希釈した。この懸濁液１ｍｌをインシュリン注射器の中に入れ、ラットの背中皮下に注入した。
【００３７】
そのために体毛を剃り７０％アルコールで消毒し、エーテルで麻酔した動物の皮膚の襞を持ち上げ、カニューレ１４号で長手方向に尾部から頭部へ貫刺し、腫瘍組織を皮下に注入した。
（例２：治療）
【００３８】
本発明による物質による実験動物への注入は、腫瘍が容積１ｍｌに達すると同時に開始した。腫瘍の大きさは、ＣＴ支援容積測定法によって同定した。そのためにラットを０．３１５ｍｇクエン酸フェンタニール／体重ｋｇ筋内（Ｈｙｐｎｏｒｍ（登録商標）、ヤンセン、ベールゼー、ベルギー）に麻酔した。ソマトムプラス４−スキャナ（ジーメンス、エアランゲン、ドイツ）を用いて層厚２ｍｍ、３２０ｍＡｓで１２０ｋＶｐにより１．５ｍｍおよび２ｍｍ増分ピッチを有するスパイラルＣＴを実施した。軟質組織アルゴリズムを使用した。
【００３９】
被治療ラットにシリコーンチューブ（SilasticR 0.012インチx 0.025インチ、Nr.602-105 HH 061999、ダウコーニング社、ミッドランド、ミシガン州、アメリカ合衆国）はクロロホルムによって長さ５ｃｍの螺旋状部材ＰＥ１０（ポリエチレン）−カテーテル（クレイアダムズ、パーシッパニィ、ニュージャージー州、アメリカ合衆国）の端部に挿入した。その対向端は長さ３０ｃｍの部材ＰＥ２０カテーテルで溶融した。シリコーン部材は受容体の左頸静脈の中に挿入し、前記のように結紮により確保した［Weeks JR. Long term intravenous infusion. In: Meyers RD (Hrsg.) Methods in Psychobiology, Academic Press 1972;2:155］。螺旋状のカテーテル部は皮下組織内に置いて、動物の頭部運動時にカテーテルの位置ずれを防ぐために、必要な余分長に配慮した。他端は、背中の皮膚を通して外側へ導き、コルセットを介して動物に固定した金属螺旋チューブの中に保護し、体重適合連続注入を可能にした注入ポンプと接続した。動物は、注入中に代謝ケージの中にいた。
【００４０】
ランダムにそれぞれグループあたり動物１０匹を腫瘍容積１ｍｌ以上から連続的に１０日間にわたって各物質（アミノオキシ酢酸１．２５ｍＭまたはＣｈｂａ１０μＭ）を投与した。対照群は等容積量のＮａＣｌを与えた。全動物は水とＲ３−ＥＷＯＳ−ＡＬＡＢ飼料（ＡＬＡＢソレントゥナ、スウェーデン）に自由に近接した。１０日後、動物を０．３１５ｍｇクエン酸フェンタニール／体重ｋｇ筋内（ＨｙｐｎｏｒｍＲ、ヤンセン、ベールゼー、ベルギー）に麻酔し、腫瘍を摘出し、その容積を手で排出した水量で同定した。
【産業上の利用可能性】
【００４１】
測定のために常法によりノヴィコフ肝腫瘍細胞を培養した。対照群は作用物質を含有しない溶剤を与えた。別のグループは各化合物の様々な用量を与えた。作用物質を含有もしくは含有しない４培養日後、細胞密度を常法により同定した。図２にアミノオキシ酢酸で得た細胞密度の用量依存性を、図３にＣｈｂａの場合を、図４にグリセラート２，３−ビスホスフェートの場合を、そして図５にフルクトース−１，６−ビス−ホスフェートの場合を示している。全ての場合においてそれぞれより高い用量で実質的に完全な阻害が識別される。
【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１】実験結果の腫瘍の大きさを示すグラフである。
【図２】アミノオキシ酢酸で得た細胞密度の用量依存性を示すグラフである。
【図３】Ｃｈｂａで得た細胞密度の用量依存性を示すグラフである。
【図４】グリセラート２，３−ビスホスフェートで得た細胞密度の用量依存性を示すグラフである。
【図５】フルクトース−１，６−ビス−ホスフェートで得た細胞密度の用量依存性を示すグラフである。
【図１】
2004524326.tif 000007
【図２】
2004524326.tif 000008
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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