(57)【要約】核酸の混合物を含有するサンプル中の標的核酸の検出方法。該方法は、（ａ）固相表面を提供すること；（ｂ）該固相表面に、標的核酸の一セグメントに相補的なオリゴヌクレオチドプローブを結合すること；（ｃ）該表面をサンプルと接触させて、それにより該プローブに標的核酸を結合させること；（ｄ）結合された標的核酸を、４種のヌクレオチド型および複製生物触媒とともにインキュベートしてそれにより複数鎖の核酸アセンブリーを形成させること（ここで該ヌクレオチド型の最低１種が標識により結合される）；ならびに（ｅ）該複数鎖の核酸アセンブリー上の標識を検出して、それにより標的核酸を検出することを含んで成る。サンプル中の標的核酸配列を同定するためのシステムおよび該方法での使用のためのキットもまた開示される。
2004526409.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）固相表面を提供すること；
（ｂ）前記固相表面に、標的核酸の一セグメントに相補的なオリゴヌクレオチドプローブを結合すること；
（ｃ）前記表面を、核酸の混合物を含有するサンプルと接触させて、それにより前記プローブに前記標的核酸を結合させること；
（ｄ）結合された標的核酸を、４種のヌクレオチド型および複製生物触媒とともにインキュベートしてそれにより複数鎖の核酸アセンブリーを形成させること（ここで前記ヌクレオチド型の最低１種が標識により結合される）；ならびに
（ｅ）前記複数鎖の核酸アセンブリー上の前記標識を検出して、それにより前記標的核酸を検出すること
を含んで成る、前記サンプル中の前記標的核酸の検出方法。
【請求項２】
前記核酸が一本鎖でありかつ前記複数鎖の核酸アセンブリーが二本鎖である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記標識が、蛍光体、色素および酸化還元活性物質よりなる群から選択される、請求項１記載の方法。
【請求項４】
前記固相表面が、変換器として作用しうる官能性化された固相表面である、請求項１記載の方法。
【請求項５】
前記官能性化された固相表面がガラスもしくはポリマー支持体を含んで成る、請求項４記載の方法。
【請求項６】
前記支持体が電極もしくは圧電性結晶である、請求項５記載の方法。
【請求項７】
前記標識が認識剤である、請求項１−６のいずれか記載の方法。
【請求項８】
請求項１の段階１（ｅ）が：
（ｅ１）前記核酸アセンブリーを、前記認識剤により結合されるシグナル増幅剤とともにインキュベートして認識対を形成させること；
（ｅ２）前記認識対を、前記シグナル増幅剤の基質とともにインキュベートすること（ここで、前記シグナル増幅剤は前記基質に作用して検出可能な生成物を生じさせる）；および
（ｅ３）前記生成物を検出してそれにより前記標的核酸を検出すること
の段階を含んで成る、請求項７記載の方法。
【請求項９】
前記認識対が、ビオチン−アビジン、受容体−リガンド、糖−レクチンおよび抗原−抗体よりなる群から選択される、請求項７もしくは８のいずれか記載の方法。
【請求項１０】
前記検出可能な生成物が、前記固相表面上で沈殿させること、色を生じさせること、蛍光を発することもしくは電気化学的シグナルを生じさせることにより検出される、請求項７−９のいずれか記載の方法。
【請求項１１】
前記複製生物触媒が、標的核酸がＤＮＡである場合にポリメラーゼ、もしくは標的核酸がＲＮＡである場合に逆転写酵素である、請求項１−１０のいずれか記載の方法。
【請求項１２】
前記シグナル増幅剤が、検出可能なシグナルを生じさせることが可能な分子を含んで成る、請求項７−１１のいずれか記載の方法。
【請求項１３】
前記分子が酵素である、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
前記酵素がアルカリホスファターゼ、グルコースオキシダーゼもしくはワサビペルオキシダーゼである、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
前記基質が５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルリン酸である、請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
前記標的核酸がＤＮＡもしくはＲＮＡである、請求項１−１５のいずれか記載の方法。
【請求項１７】
前記ＤＮＡもしくはＲＮＡが、ウイルスＤＮＡ、細胞ＤＮＡ、ウイルスＲＮＡおよび細胞ＲＮＡよりなる群から選択される、請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
シグナル増幅剤により生じられる検出可能な生成物の量が、光学的にもしくは電子的に変換される、請求項１−１７のいずれか記載の方法。
【請求項１９】
検出可能な生成物の量が前記固相表面により変換される、請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
検出可能な生成物の量が溶液中で変換される、請求項１８記載の方法。
【請求項２１】
前記官能性化された固相表面が電気化学的プローブを含んで成る、請求項１−１９のいずれか記載の方法。
【請求項２２】
前記検出が、ファラデーインピーダンス分光法もしくは電流測定的測定に基づく、請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
前記官能性化された固相表面がマイクロバランス水晶振動子プローブを含んで成る、請求項１−１９のいずれか記載の方法。
【請求項２４】
前記検出が、微小重力測定水晶振動子マイクロバランス（ＱＣＭ）分析に基づく、請求項２３記載の方法。
【請求項２５】
前記固相表面が電極であり、前記標識が酸化還元活性物質であり、かつ、請求項１の段階１（ｅ）が：
（ｅ１）前記核酸アセンブリーを、アセンブリー中の酸化還元標識により電極に電気的に接触される酸化還元活性の生物触媒とともにインキュベートすること；
（ｅ２）前記電極および生物触媒を、生物触媒基質の存在下でインキュベートして、それにより電極の電流応答を生じさせること；ならびに
（ｅ３）電極の電流応答を検出してそれにより前記標的核酸を検出すること
の段階を含んで成る、請求項１記載の方法。
【請求項２６】
前記酸化還元活性物質が、電気活性の有機化合物、遷移金属錯体および有機色素よりなる群から選択される、請求項２５記載の方法。
【請求項２７】
前記電気活性の有機化合物が、ビピリジニウム誘導体、キノンおよびピリジニウム塩よりなる群から選択される、請求項２６記載の方法。
【請求項２８】
前記遷移金属錯体が、フェロシイン誘導体、Ｒｙ（ＩＩ）−ポリピリジンおよびＯｓ（ＩＩ）−ポリピリジン錯体よりなる群から選択される、請求項２６記載の方法。
【請求項２９】
前記有機色素が、フラビン誘導体およびアクリジン誘導体よりなる群から選択される、請求項２６記載の方法。
【請求項３０】
前記酸化還元活性の生物触媒が、オキシダーゼ、レダクターゼおよびデヒドロゲナーゼよりなる群から選択される酵素である、請求項２５記載の方法。
【請求項３１】
前記オキシダーゼが、グルコースオキシダーゼ、乳酸オキシダーゼおよびコリンオキシダーゼよりなる群から選択される、請求項３０記載の方法。
【請求項３２】
前記レダクターゼが、硝酸レダクターゼ、亜硝酸レダクターゼおよびグルタチオンレダクターゼよりなる群から選択される、請求項３０記載の方法。
【請求項３３】
前記デヒドロゲナーゼがグルコースデヒドロゲナーゼである、請求項３０記載の方法。
【請求項３４】
電極の前記電流応答が、電流測定的測定、示差パルスボルタンメトリーおよび時間電流測定よりなる群から選択される電気化学的方法により検出される、請求項２５記載の方法。
【請求項３５】
段階ｅ２において、前記生物触媒が前記生物触媒基質に作用して検出可能な生成物を生じさせ、そして前記生成物が検出されてそれにより前記標的核酸の検出を可能にする、請求項２５記載の方法。
【請求項３６】
（ａ）それぞれが変換器として作用しうる官能性化された固相表面の複数のアレイを含んで成るバイオチップ（前記表面のそれぞれは標的核酸配列の異なるセグメントに相補的なプローブをそれに結合されており、前記アレイのそれぞれは異なる標的核酸配列に特異的である）；
（ｂ）４種のヌクレオチド型（ここで、前記ヌクレオチド型の最低１種が標識により結合される）、および
（ｃ）複製生物触媒
を含んで成る、核酸の混合物を含有するサンプル中の標的核酸配列の同定システム。
【請求項３７】
前記異なる標的核酸配列が別個の病原性微生物の核酸配列である、請求項３６記載のシステム。
【請求項３８】
前記異なる標的核酸配列が別個の遺伝病に関係する核酸配列である、請求項３６記載のシステム。
【請求項３９】
前記異なる標的核酸配列が別個の組織の核酸配列である、請求項３６記載のシステム。
【請求項４０】
前記異なる標的核酸配列が別個の個体の核酸配列である、請求項３６記載のシステム。
【請求項４１】
（ａ）変換器として作用しかつそれに結合されたプローブを有する官能性化された固相表面；
（ｂ）４種のヌクレオチド型（ここで、前記ヌクレオチド型の最低１種が標識により結合される）、および
（ｃ）複製生物触媒
を含んで成る、核酸の混合物を含有するサンプル中の標的核酸配列の検出のためのキット。
【請求項４２】
（ｄ）認識対（ここで、前記認識対の１メンバーがシグナル増幅剤に結合される）、および
（ｅ）前記シグナル増幅剤の基質
をさらに含んで成る、請求項４１記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は核酸を検出するための方法およびシステムに関する。
【０００２】
（発明の背景）
以下の参考文献を数字により明細中で引用する：
１．Ｅｋｉｎｓ，Ｒ．，Ｃｈｕ，Ｆ．Ｗ．，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１７、２１７（１９９９）。
２．Ｔａｋｅｎａｋａ，Ｓ．，Ｙａｍａｓｈｉｔａ，Ｋ．，Ｔａｋａｇｉ，Ｍ．，Ｏｔｏ，Ｙ．，Ｋｏｎｄｏ，Ｈ．，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．７２、１３３４（２０００）。
３．Ｂａｒｄｅａ，Ａ．，Ｄａｇａｎ，Ａ．，Ｂｅｎ−Ｄｏｖ，Ｉ．，Ａｍｉｔ，Ｂ．，Ｗｉｌｌｎｅｒ，Ｉ．，Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．、８３９（１９９８）。
４．Ｗａｎｇ，Ｊ．，Ｊｉａｎｇ，Ｍ．，Ｎｉｅｌｓｅｎ，Ｔ．Ｗ．，Ｇｅｔｔｓ，Ｒ．Ｃ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２０、８２９１（１９９８）。
５．Ｐａｔｏｌｓｋｙ，Ｆ．，Ｋａｔｚ，Ｅ．，Ｂａｒｄｅａ，Ａ．，Ｗｉｌｌｎｅｒ，Ｉ．，Ｌａｎｇｍｕｉｒ、１５、３７０３（１９９９）。
６．Ｐａｔｏｌｓｋｙ，Ｆ．，Ｌｉｃｈｔｅｎｓｔｅｉｎ，Ａ．，Ｗｉｌｌｎｅｒ，Ｉ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１２２、４１８（２０００）。
７．Ｐａｔｏｌｓｋｙ，Ｆ．，Ｒａｎｊｉｔ，Ｋ．Ｔ．，Ｌｉｃｈｔｅｎｓｔｅｉｎ，Ａ．，Ｗｉｌｌｎｅｒ，Ｉ．，Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．、１０２５（２０００）。
８．Ｓｏｕｔｈｅｒｎ，Ｅ．Ｍ．ＴＩＧ、１２、１１０（１９９６）
９．第ＷＯ  ００／３２８１３号明細書
１０．米国特許第５，６９５，９２６号明細書
病原体もしくは常染色体劣性疾患の遺伝物質の検出は医学および診断学の今後の挑戦の１つである。感受性の遺伝子検出のための現在の方法は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅および二次的シグナル増幅経路を包含する。今後の遺伝子分析の主要な最終目標は、別個の病原体の平行した検出およびそれらの定量的アッセイを包含する。ＰＣＲの固有の限界が、定量的および平行した高スループット分析のための該方法の応用を妨げる。
【０００３】
ＤＮＡのマイクロアレイもしくは「ＤＮＡチップ」は、遺伝物質の同時分析のための実質的な研究の努力を引き付けている（８）。これらのシステムの大部分において、被検体サンプルがＰＣＲ周期により増幅され、また、マイクロアレイが、増幅能力を欠く検出作用領域として作用する（１）。
【０００４】
以前の報告は、ＤＮＡの電気化学的（２）もしくは微小重力測定（３）水晶振動子マイクロバランス検出を取り扱った。いくつかの最近の研究は、ＤＮＡの検出過程を増幅するための試みについて報告している。すなわち、樹状の過剰分枝（ｈｙｐｅｒｂｒａｎｃｈｅｄ）オリゴヌクレオチドを使用して電極へのＤＮＡの結合を高めた（４）。被検体ＤＮＡとプローブオリゴヌクレオチドとの間の一次的ハイブリダイゼーションの後に続く電気的変換器上での不溶性生成物の生物触媒される（ｂｉｏｃａｔａｌｙｚｅｄ）沈殿が、検出事象を増幅するのに使用されている（５）。また、標識されたリポソームが、変換器上で生成されるプローブ−オリゴヌクレオチド／ＤＮＡ−被検体複合体へのそれらの会合により一次的ＤＮＡ検出事象を増幅する微小膜作用領域として使用されている（６）。同様に、標的ＤＮＡの分析の樹状型増幅（ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ−ｔｙｐｅ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）が、オリゴヌクレオチドで官能性化された金のナノ粒子の使用により達成されている（７）。ファラデーインピーダンス分光法もしくは圧電性結晶の周波数変化が、別個の増幅された検出過程を変換するのに使用された。
【０００５】
第ＷＯ  ００／３２８１３号明細書（９）は、標的の一部分に相補的でありかつそれに標的がハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを担持する検出作用領域を有するセンサー装置とサンプルを接触させることを含んで成る、サンプル中の標的オリゴヌクレオチドの検出方法を開示する。該方法はさらに、標的の別の部分に相補的でありかつハイブリダイズされた標的オリゴヌクレオチドに結合した後に検出作用領域上で検出される確認オリゴヌクレオチドを提供する。
【０００６】
Ｃｒｏｓらへの米国特許第５，６９５，９２６号明細書（１０）は、サンドイッチハイブリダイゼーション技術によるサンプル中の単一の標準ヌクレオチド配列の検出手順を開示する。該手順は、１１〜１９ヌクレオチドの受動的に固定された捕捉プローブおよび非放射活性的に標識された検出プローブを使用する。
【０００７】
（発明の要約）
サンプル中の標的核酸を検出するための方法およびシステムを提供することが、本発明の一目的である。
【０００８】
本明細中の「検出する」もしくは「検出」という用語は、サンプル中の標的核酸の定性的決定および同定の双方、ならびに、ときに、サンプル中の標的核酸のレベルの定量的測定を集合的に指す。
【０００９】
本発明は、変換器表面に結合された特異的プローブ（１種もしくは複数）への標的核酸のハイブリダイゼーションの実時間でのモニター方法、および場合によっては例えば酵素的手段によるシグナルの増幅方法を提供する。
【００１０】
本発明の第一の局面によれば：
（ａ）固相表面を提供すること；
（ｂ）該固相表面に、標的核酸の一セグメントに相補的なオリゴヌクレオチドプローブを結合すること；
（ｃ）該表面を、核酸の混合物を含有するサンプルと接触させて、それにより該プローブに標的核酸を結合させること；
（ｄ）結合された標的核酸を、４種のヌクレオチド型および複製生物触媒とともにインキュベートしてそれにより複数鎖の核酸アセンブリー（ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ａｓｓｅｍｂｌｙ）を形成させること（ここで該ヌクレオチド型の最低１種が標識により結合される）；ならびに
（ｅ）該複数鎖の核酸アセンブリー上の標識を検出して、それにより標的核酸を検出すること
を含んで成る、該サンプル中の標的核酸の検出方法が提供される。
【００１１】
標的核酸は、ウイルスもしくは細胞の核酸のようないかなるＤＮＡもしくはＲＮＡであってもよい。本発明の方法は、サンプル中のこうした標的核酸の定性的および／もしくは定量的検出を可能にすることを意図している。
【００１２】
サンプルは、核酸を含有する生物学的試料もしくはその分画生成物；核酸を自由にしかつ可溶化するよう処理された生物学的試料；ヌクレオチド配列をより小さな核酸配列に消化するような様式で処理された試料；ＰＣＲ過程もしくはいずれかの他の核酸増幅過程により得られる核酸のサンプル；などであってよい。好ましくは、標的核酸は、天然に、もしくは適切な処理後に二本鎖核酸分子から生じられるかのいずれかの一本鎖である。
【００１３】
オリゴヌクレオチドプローブは、典型的に、しかし排他的にでなく、核酸鎖の約１らせんを完了するヌクレオチドの数、すなわち約１２ヌクレオチドを含んで成る。１２オリゴヌクレオチドの配列は、一方で安定なハイブリダイゼーションを確実にし、そして他方では、１２ｍｅｒのオリゴヌクレオチドは、より長い配列の場合においてよりも不正確な核酸に結合する機会を減少させる。サンプルがゲノムＤＮＡの消化された試料、もしくは核酸を含んで成るその分画生成物である場合には、不正確なオリゴヌクレオチド、すなわち標的オリゴヌクレオチド以外のオリゴヌクレオチドに結合する若干の確率（捕捉するオリゴヌクレオチドの長さとともに増大する）が存在する。この確率は、より短いオリゴヌクレオチドの場合に前述されたとおりより小さい。他方、結合の特異性はより長い標的分子に関してオリゴヌクレオチドの長さとともに増大する。約１２ヌクレオチドの配列は、それが一方で結合の安定性を確実にしかつ他方で不正確な結合を減少させる限りは最適であるため、好ましい。しかしながら、本発明はこうした長さのオリゴヌクレオチドプローブに限定されず、また、当業者は、該方法の要件にプローブの長さを合わせる方法を知っているであろう。
【００１４】
固相表面は、オリゴヌクレオチドプローブが結合することができるいかなる表面であってもよい。
【００１５】
ヌクレオチドの４種の型はｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰである。複製生物触媒（ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｂｉｏｃａｔａｌｙｓｔ）は、標的核酸がＤＮＡである場合はポリメラーゼ、例えばＤＮＡポリメラーゼＩ、クレノウフラグメント、もしくは標的核酸がＲＮＡである場合は逆転写酵素であってよい。
【００１６】
標識は電子的、光学的などを包含するいずれかの型の検出手段により直接もしくは間接的にのいずれかで検出されることが可能ないかなる分子であってもよい。直接に検出可能な標識の例は、蛍光体、色素および酸化還元活性物質（ｒｅｄｏｘ−ａｃｔｉｖｅ  ｓｕｂｓｔａｎｃｅ）を包含する。間接的に検出可能な標識の例は、高親和性で第二の分子により特異的に結合されるかもしれない第一の分子を包含する。第一の分子は「認識剤」と命名される一方、第二の分子は「認識パートナー」と命名される。認識剤および認識パートナーは一緒に「認識対（ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｃｏｕｐｌｅ）」を構成する。シグナル増幅剤は認識パートナーを含んでよく、それが順に認識剤に結合する。シグナル増幅剤は検出されるかもしれないシグナルを生じさせる。
【００１７】
認識対は、例えば、ビオチン−アビジンもしくはビオチン−ストレプトアビジン、受容体−リガンド、糖−レクチン、抗原−抗体（「抗体」という用語は、モノクローナルもしくはポリクローナル抗体、可変部、抗原−ビオチン結合部分などを含んで成る抗体の一画分を指すと理解されるべきである）などの群から選択される対の１つであってよい。認識剤は前述の対の１メンバーであってよい一方、その場合は、認識パートナーは認識対の対応するメンバーであることができる。
【００１８】
本発明の第一の局面の好ましい一態様において、本発明の方法の段階（ｅ）は、以下の下位段階：
（ｅ１）核酸アセンブリーを、認識剤により結合されるシグナル増幅剤とともにインキュベートして認識対を形成させること；
（ｅ２）該認識対を、シグナル増幅剤の基質とともにインキュベートすること（ここで、シグナル増幅剤は基質に作用して検出可能な生成物を生じさせる）；および
（ｅ３）該生成物を検出してそれにより標的核酸を検出すること
を含んで成る。
【００１９】
シグナル増幅剤は検出可能なシグナルを生じさせることが可能ないかなる分子であってもよい。こうした分子の好ましい一例は酵素である。適する酵素の制限しない例は、アルカリホスファターゼ、グルコースオキシダーゼおよびワサビペルオキシダーゼを包含する。
【００２０】
検出可能な生成物は別個の既知技術により検出してよい。例えば、生成物は、固相表面上で沈殿させることにより、色を生じさせることにより、蛍光を発することによりもしくは電気化学的シグナルを生じさせることにより検出してよい。シグナル増幅剤により生じられる検出可能な生成物の量は、溶液中でもしくは固相表面によるかのいずれかで、光学的にもしくは電子的に変換してよい。
【００２１】
好ましくは、固相表面は、それが標識により直接もしくは間接的に生じられるシグナルの変換器として作用することを可能にするように官能性化される。例えば、表面は電極もしくは圧電性結晶のようなガラスもしくはポリマー支持体を含んでよい。本発明の一態様によれば、固相表面は、標的核酸の電気的／電気化学的測定、例えばファラデーインピーダンス分光法測定もしくは電流測定的検出のための電気化学的プローブを含んで成る。加えて、検出はまた、固相表面と周囲の媒体との間の界面電子伝達速度の制御に基づくそれ自体既知の多数の他の電気化学的技術により実施してもよい。本発明の本電気化学的態様のために、固相表面はプローブが結合される伝導性マトリックス上に形成される。こうした電気的に伝導するマトリックスは、例えば金、白金、銀もしくは銅のような金属により作成もしくは被覆してよい。
【００２２】
本発明の別の態様によれば、固相表面は、生成物の検出がプローブの共鳴周波数の変化の測定に基づく場合には水晶振動子マイクロバランス（ＱＣＭ）プローブである。微小重力測定ＱＣＭ技術はそれ自体既知であり、そして例えばＰＣＴ出願第ＷＯ  ９７／０４３１４号明細書に記述される。
【００２３】
本発明のなおさらなる一態様によれば、固相表面は電極であり、標識は酸化還元活性物質であり、そして、本発明の方法の段階１（ｅ）が：
（ｅ１）核酸アセンブリーを、アセンブリー中の酸化還元標識により電極に電気的に接触される酸化還元活性の生物触媒とともにインキュベートすること；
（ｅ２）該電極および生物触媒を、生物触媒基質の存在下でインキュベートして、それにより電極の電流応答を生じさせること；ならびに
（ｅ３）電極の電流応答を検出してそれにより標的核酸を検出すること
の段階を含んで成る。
【００２４】
酸化還元活性物質は、例えば、電気活性の（ｅｌｅｃｔｒｏ−ａｃｔｉｖｅ）有機化合物、遷移金属錯体もしくは有機色素であってよい。電気活性の有機化合物の例は、ビピリジニウム誘導体、キノンおよびピリジニウム塩を包含する。遷移金属錯体の例はフェロシイン誘導体、Ｒｙ（ＩＩ）−ポリピリジンおよびＯｓ（ＩＩ）−ポリピリジン錯体を包含する。有機色素の例はフラビン誘導体およびアクリジン誘導体を包含する。
【００２５】
酸化還元活性の生物触媒は、例えばオキシダーゼ、レダクターゼもしくはデヒドロゲナーゼのような酵素であってよい。オキシダーゼの例は、グルコースオキシダーゼ、乳酸オキシダーゼおよびコリンオキシダーゼを包含する。これらの酵素は、キノン誘導体のような酸化還元活性物質およびフェロシイン誘導体のような遷移金属錯体と相互作用しうる。レダクターゼの例は硝酸レダクターゼ、亜硝酸レダクターゼおよびグルタチオンレダクターゼを包含する。これらの酵素はビピリジニウム誘導体のような酸化還元活性物質と相互作用しうる。デヒドロゲナーゼの一例はグルコースデヒドロゲナーゼである。
【００２６】
システムの電流応答は、例えば電流測定的測定、示差パルスボルタンメトリー（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｐｕｌｓｅ  ｖｏｌｔａｍｍｅｔｒｙ）もしくは時間電流測定（ｃｈｒｏｎｏａｍｐｅｒｉｍｅｔｒｙ）のような電気化学的方法により検出してよい。
【００２７】
酸化還元分子は、直接、または、その生物電気触媒的変換に向かって活性化される酵素のような酸化還元活性の生物触媒の酸化もしくは還元のその媒介により、検出することができる。加えて、標的核酸はまた、生物触媒が生物触媒基質に作用して検出可能な生成物を生じさせることを可能にすることによっても検出されるかもしれない。生成物はその後、上述されたとおり検出される。これらの検出方法の１種、２種もしくは全部のいずれかを使用してよい。
【００２８】
本発明の第二の局面において：
（ａ）そのそれぞれが変換器として作用しうる官能性化された固相表面の複数のアレイを含んで成るバイオチップ（該表面のそれぞれは標的核酸配列の異なる一セグメントに相補的なプローブをそれに結合されており、該アレイのそれぞれは異なる標的核酸配列に特異的である）；
（ｂ）４種のヌクレオチド型（ここで、該ヌクレオチド型の最低１種が標識により結合される）、および
（ｃ）複製生物触媒
を含んで成る、核酸の混合物を含有するサンプル中の標的核酸配列の同定システムが提供される。
【００２９】
該システムの標識、生物触媒および他の成分は上に定義されたとおりである。
【００３０】
本発明の本局面において、複数のサンプルの平行した分析を、官能性化された固相表面のマイクロアレイ上で実施してよい。例えば、サンプル中の感染性ウイルスの正体を決定することが望ましい場合は、固相表面の一アレイが１つの型のウイルスの遺伝物質の別個のセグメントに相補的なプローブを含むことができ、第二のアレイが第二の型のウイルスに相補的なプローブを含むことができる、などのＤＮＡチップもしくはバイオチップを使用してよい。バイオチップへのサンプルの適用、およびシグナルを生じさせるアレイの位置をつきとめることは、感染性のウイルスの同定を可能にすることができる。類似の検出システムを、組織型分類、遺伝子分析および法廷の応用において遺伝子の突然変異体および遺伝病を同定するのに使用してよい。
【００３１】
本発明の第三の局面において：
（ａ）変換器として作用しかつそれに結合されたプローブを有する官能性化された固相表面；
（ｂ）４種のヌクレオチド型（ここで、ヌクレオチド型の最低１種が標識により結合される）、および
（ｃ）複製生物触媒
を含んで成る、核酸の混合物を含有するサンプル中の標的核酸配列の検出のためのキットが提供される。
【００３２】
好ましくは、該キットは以下の成分：
（ｄ）認識対の１メンバーがシグナル増幅剤に結合される認識対、および
（ｅ）シグナル増幅剤の基質
をさらに含んで成る。
【００３３】
該システムの標識、生物触媒および他の成分は上で定義されたとおりである。
【００３４】
（発明の詳細な記述）
実施例Ｉ
本発明の方法の一態様を図１に図解で描く。以下のオリゴヌクレオチドを以下の実施例においてプローブとして使用した：
（１）’５−ＨＳ−（ＣＨ２）６−ＣＣＣＣＣＡＣＧＴＴＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴ−３’（配列番号１）
（４）’５−ＨＳ−（ＣＨ２）６−ＣＧＴ  ＴＴＧ  ＡＴＴ  ＡＣＴ  ＧＧＣ  ＣＴＴ  ＧＣＧ  ＧＡＴＣ−３’（配列番号２）
（５）’５−ＨＳ−（ＣＨ２）６−ＡＴＴＴＧＴＡＧＣＣＣＴＴＴＣＧＴＣＣＣＣＴＡＴＧＴＴＡＧＣ−３’（配列番号３）
配列（１）は７２２９塩基を包含するｍｐ１３の環状ウイルス遺伝子に相補的である。
【００３５】
標的核酸２２（例えばＭ１３  ｍｐ８ウイルスＤＮＡ）の一セグメントに相補的なプローブ、チオール化されたオリゴヌクレオチド２０（例えば配列番号１）を、チオール官能基２６により金電極もしくは金水晶振動子固相表面２４上で集成させる。その後、検出作用領域２８（固相表面＋プローブ）を、標的核酸を含有するサンプルＤＮＡと反応させ、そして変換器上の生じる複合体３０をその後、ＤＮＡポリメラーゼＩ、クレノウフラグメント３６（２０Ｕ・ｍＬ−１）の存在下でｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ３２およびビオチニル化ｄＣＴＰ３４（比  １：１：１：２／３１／３、１ｍＭのヌクレオチド濃度）と相互作用させる。重合および標的ＤＮＡとの二本鎖アセンブリー３８の形成は、ウイルスＤＮＡの分析の第一の増幅段階を提供することが予期される。
【００３６】
二本鎖アセンブリー３８中にポリメラーゼにより導入されるビオチン標識４０の形態の認識剤は、アビジン４２−アルカリホスファターゼ４４の形態の結合体、認識パートナー−シグナル増幅剤の結合のための多数の結合部位を提供する。これに次いで、基質５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルリン酸４６が生物触媒される酸化的加水分解されて不溶性のインジゴ生成物４８を形成し、これが変換器２４上で沈殿して、かように標的ＤＮＡの分析のための第二の増幅段階を提供する。
【００３７】
電極上での重合された二本鎖アセンブリーの形成は、正に荷電した酸化還元標識を引き付けると予期され、これは時間クーロメトリーによりアッセイすることができる（Ｓｔｅｅｌｅ，Ａ．Ｂ．，Ｈｅｒｎｌａｎｅｄ，Ｔ．Ｍ．，Ｔａｒｌｏｖ，Ｍ．，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．、７０、４６７０（１９９８））。これは重合過程の連続的モニタリングを可能にする。負に荷電した二本鎖アセンブリーは、負に荷電した酸化還元プローブを寄せつけずかつ変換器表面上での電子伝達抵抗を高めるともまた予期される。溶液中の負に荷電した酸化還元標識への電子伝達に対する障壁は、ファラデーインピーダンス分光法技術によりアッセイすることができる（Ｍｉｌｌａｎ，Ｋ．Ｍ．，Ｓａｒａｕｌｌｏ，Ａ．，Ｍｉｋｋｅｌｓｅｎ，Ｓ．Ｒ．，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．６６、２９４３（１９９４））。さらに、ハイブリダイゼーション、二本鎖アセンブリーの形成、重合および不溶性生成物の沈殿は変換器の質量を変え、そしてこれゆえに一組の標的ＤＮＡの検出段階全体は、圧電性結晶の周波数変化の微小重力測定分析によりアッセイしてよい。
【００３８】
変換器上のプローブオリゴヌクレオチドの被度（ｃｏｖｅｒａｇｅ）は、酸化還元標識としてＲｕ（ＮＨ３）６３＋を使用して、微小重力測定水晶振動子マイクロバランス分析および時間クーロメトリー実験（Ｓｔｅｅｌｅ、前掲引用中）により測定してよい。変換器上のプローブオリゴヌクレオチドの表面被度は、プローブ濃度およびプローブ溶液との変換器のインキュベーションの時間により制御する。６０分間の４．２×１０−６Ｍのプローブ配列番号１との金電極の相互作用に際して、Ｍ１３φの検出について（６．３±０．３）×１０−１１モル・ｃｍ−２に対応する至適の表面被度を伴う表面が生成された。
【００３９】
図２は、プローブ、配列番号１のオリゴヌクレオチドで官能性化された電極のＲｕ（ＮＨ３）６３＋の存在下での（曲線（ｂ））、ならびに１．５および４時間の期間の間の被検体ＤＮＡとのハイブリダイゼーション後の検出作用領域の（それぞれ曲線（ｃ）および（ｄ））時間クーロメトリーの過渡電流（ｔｒａｎｓｉｅｎｔ  ｃｕｒｒｅｎｔ）を示す。
【００４０】
４時間のハイブリダイゼーション後に、連結された酸化還元プローブに関連する電荷は５４μＣであると推定された。ハイブリダイズされた被検体ＤＮＡに連結されたＲｕ（ＮＨ３）６３＋単位の全部が電極と電気的に通信することを想定すれば、表面上のＭ１３  ｍｐ８  ＤＮＡの表面被度は約９．０×１０−１３モル・ｃｍ−２である。従って、検出オリゴヌクレオチド単位の１．５％のみがウイルスＤＮＡとのハイブリダイゼーションを受けた。ハイブリダイズされたＤＮＡの表面被度のこの値は、表面へのウイルスＤＮＡの結合に際して周波数変化Δｆ＝−４４５Ｈｚを示す微小重力測定水晶振動子マイクロバランス（ＱＣＭ）測定によりさらに支持される。この周波数変化は１．１×１０−１３モル・ｃｍ−２のハイブリダイズされたＤＮＡの表面被度につながり、これは約１．７％の検出作用領域へのハイブリダイゼーションに対応する。
【００４１】
図３は、鋳型として作用する被検体ＤＮＡとの二本鎖アセンブリーのポリメラーゼに誘導される形成の結果としての、二本鎖アセンブリーに連結されたＲｕ（ＮＨ３）６３＋と関連する電荷の増大を示す。電荷は時間とともに増大し、重合が表面上で起こることを意味し、そしてそれは重合の約６０分後に平らになる。
【００４２】
被検体ＤＮＡに関連する電荷は２９．２μＣであることが注目されるべきであるが、しかし重合は同一の値に達しなかった。従って、ポリメラーゼに誘導される重合は二本鎖アセンブリーの形成の５４％にしかつながらなかった（平均で３９００塩基が各被検体ＤＮＡと重合した）。これは、表面上での完全に複製される二重鎖アセンブリーの形成についての立体的束縛、もしくはＭ１３複製の間に特異的部位で起こることが既知である１８クレノウフラグメントに誘導される重合の中断に帰されるかもしれない。表面上の部分的重合は、重合がΔｆ＝−１９５Ｈｚの周波数減少を生じる一方で表面への被検体ＤＮＡの結合がΔｆ＝−４４０Ｈｚの周波数変化をもたらすことを示すＱＣＭ実験によりさらに反映される。
【００４３】
図４は、プローブ、配列番号１のオリゴヌクレオチドで官能性化された電極（曲線（ａ））、２．３×１０−９Ｍの被検体ＤＮＡとのそのハイブリダイゼーション後（曲線（ｂ））、二本鎖アセンブリーのポリメラーゼに誘導される形成（曲線（ｃ））、およびアビジン−アルカリホスファターゼ結合体の会合後（曲線（ｄ））、ならびに２０分間の表面上での（３）のその後の生物触媒される沈殿（曲線（ｅ））のファラデーインピーダンススペクトル（ナイキストプロットの形態の）を示す。
【００４４】
電子伝達抵抗Ｒｅｔ（半円形ドメインの直径）は、ウイルスＤＮＡの結合に際して３ｋΩから約２０ｋΩまで増大する。これは、高分子量ＤＮＡの結合が電極表面からの負に荷電した酸化還元標識Ｆｅ（ＣＮ）６３−／Ｆｅ（ＣＮ）６４−を静電的に寄せつけないという事実と矛盾しない。ポリメラーゼに誘導される重合、および二本鎖アセンブリーの形成は、電子伝達抵抗を約Ｒｅｔ＝３３ｋΩにさらに増大させる。重合は、標的ＤＮＡへの二本鎖アセンブリーの部分的重合と一致して、界面間の電子伝達抵抗を二倍にしないことが注目されるべきである。
【００４５】
結合体アビジン−アルカリホスファターゼの結合、および電極上での生成物（３）のその後の生物触媒される沈殿は、界面間の電子伝達に対する障壁を導入する絶縁層をもたらし、そして電子伝達抵抗はＲｅｔ＝５５ｋΩに増大する。同様に、微小重力測定ＱＣＭ実験は、この濃度の被検体ＤＮＡでは、振動子上の（３）の生物触媒される沈殿が、変換器の質量増大の結果としてΔｆ＝−１３００Ｈｚの周波数減少を生じることを示す。変換器上での（３）の生物触媒される沈殿の程度、ならびに、結果としてＲｅｔおよびΔｆの変換されるシグナルは、被検体サンプル中のＭ１３  ｍｐ８の濃度により制御される（それぞれ図５（Ａ）および５（Ｂ））。２．３×１０−１５Ｍおよび２．３×１０−１６Ｍに対応するＭ１３  ｍｐ８の濃度では、検出作用領域との被検体ＤＮＡのハイブリダイゼーション、およびその後の重合が、それぞれの変換器上でのハイブリダイズされた被検体ＤＮＡの低い被度により、ファラデーインピーダンス分光法もしくはＱＣＭにより検出されることができないことが注目されるべきである。電気化学的変換において、ΔＲｅｔ＝２．８ｋΩの電子伝達抵抗の変化が、（３）の沈殿の結果として２．×１０−１６ＭのＤＮＡの分析に際して観察される。２．３×１０−１５Ｍの標的ＤＮＡの微小重力測定分析において、−３６Ｈｚの周波数変化が、変換器上での（３）の沈殿の結果として観察される。
実施例ＩＩ
一連の対照実験を、標的にされたウイルスＤＮＡの検出に対する開発されたアプローチの高特異性を示すために実施した。すなわち、Ｍ１３  ｍｐ８に相補的でない外来オリゴヌクレオチド、配列番号２は電極もしくは金−水晶振動子上で集成されたが、しかし標的ＤＮＡを分析することに失敗した。また、配列番号１で官能性化された電極もしくはＱＣＭ振動子を２．３×１０−９Ｍの変性仔ウシ胸腺ＤＮＡと相互作用させ、そして生じる変換器をその後、重合、アビジン−アルカリホスファターゼの会合、および不溶性のインジゴ生成物の生物触媒される沈殿にさらした。検出作用領域との仔ウシ胸腺ＤＮＡのハイブリダイゼーションは、インピーダンス分光法もしくはＱＣＭ測定により検出することができなかった。
【００４６】
不溶性生成物の生物触媒される沈殿を刺激するための試みの後に、Δｆ＝−７Ｈｚの周波数変化が観察され、これは検出作用領域へのアビジンアルカリホスファターゼの非特異的結合の結果としてのノイズレベルと考えてよい値であった。配列番号１で官能性化された電極もしくはＱＣＭ振動子を、極めて低濃度（２．３×１０−１５Ｍ）のＭ１３φ  ＤＮＡと混合された２．３×１０−９Ｍの変性仔ウシ胸腺ＤＮＡと相互作用させた、別の実験を実施した。生じるアセンブリーを重合および生物触媒される沈殿にさらし、そして、標的ＤＮＡのみで得られる周波数変化値に非常に近い周波数変化Δｆ＝−３１Ｈｚが測定された。
実施例ＩＩＩ
複製生物触媒として逆転写酵素を使用する水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）の１１１６１塩基のＲＮＡの増幅された検出に、関係するアプローチを使用した。オリゴヌクレオチド、配列番号３を、金電極もしくは金−水晶振動子上にプローブ検出作用領域として固定した（１．４×１０−１１モル・ｃｍ−２）。図６（Ａ）は、配列番号３で官能性化された電極（曲線（ａ））、それぞれの１×１０−１２ＭのＲＮＡとのハイブリダイゼーション後（曲線（ｂ））、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰおよびビオチニル化ｄＣＴＰ（比  １：１：１：２／３：１／３、塩基濃度１ｍＭ）の存在下でのＲＮＡの逆転写酵素（８０単位）複製後（曲線（ｃ））、アビジン−アルカリホスファターゼ結合体の結合後（曲線（ｄ））、ならびに変換器上での不溶性のインジゴ生成物の生物触媒される沈殿に際して（曲線（ｅ））のファラデーインピーダンススペクトルを示す。
【００４７】
これらの段階のそれぞれは、期待されたとおり、電極表面での電子伝達抵抗を増大させる。例えば、ＲＮＡの逆転写酵素増幅は界面間の電子伝達抵抗をΔＲｅｔ＝４．５ｋΩだけ増大させ、また、電極上での不溶性生成物の沈殿は電子伝達抵抗をΔＲｅｔ＝１４．０ｋΩだけ増大させる。ＲＮＡは１×１０−１７Ｍに対応する検出限界を伴い分析することができた。この濃度で、ハイブリダイゼーション過程およびＲＮＡの生物触媒される複製は目に見えなかったが、それでもなお電極上での不溶性生成物のアルカリホスファターゼ沈殿は、増幅経路、およびΔＲｅｔ＝２．２ｋΩだけ増大された界面間の電子伝達抵抗をもたらした。対照実験は、１×１０−９Ｍの外来ＲＮＡとの検出作用領域の相互作用、次いで逆転写酵素の重合経路および不溶性の生成物の生物触媒される沈殿を刺激するための試みが、電極での電子伝達抵抗の微細な変化をもたらした（ΔＲｅｔ＝０．３ｋΩ）ことを示し、ＶＳＶ  ＲＮＡの増幅された検出が選択的であることを示した。
【００４８】
図６（Ｂ）はＲＮＡの微小重力測定水晶振動子マイクロバランス分析を示す。１×１０−１２ＭのＶＳＶ  ＲＮＡとのハイブリダイゼーションはΔｆ＝−７２Ｈｚの周波数減少をもたらし、これは検出作用領域の１％の表面被度を示す。８０Ｕの逆転写酵素の存在下のｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰおよびビオチニル化ｄＣＴＰ（１：１：１：２／３：１／３、塩基濃度１ｍＭ）の存在下でのＲＮＡの複製は−２６Ｈｚの周波数減少をもたらす（図５（Ｂ）、曲線（ｆ））。この周波数減少は、３６％の表面に会合された被検体ＲＮＡの平均の複製につながる。表面上へのアビジン−アルカリホスファターゼ結合体の結合は曲線（ｇ）に示され（Δｆ＝−５２Ｈｚ）、そして不溶性のインジゴ生成物の生物触媒される沈殿は、約Δｆ＝４００Ｈｚに対応する振動子周波数の有意の減少をもたらす（図６（Ｂ）、曲線（ｈ））。
実施例ＩＶ
生物電気触媒カスケードを活性化する酸化還元活性のＤＮＡ複製物（ｒｅｐｌｉｃａ）を形成させる本発明の方法の一態様を図７に図解で描く。チオール化された２７塩基のオリゴヌクレオチドプローブ１００（例えば配列番号１）が金電極１０２上で集成された。核酸１００の表面被度は、微小重力測定水晶振動子マイクロバランス実験（Ｐａｔｏｌｓｋｙ，Ｆ．；Ｌｉｃｈｔｅｎｓｔｅｉｎ，Ａ．，Ｗｉｌｌｎｅｒ，Ｉ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．（２００１）１２３、５１９４−５２０５）により２×１０−１１モル・ｃｍ−２であると測定された。その後、単層で官能性化された電極を、別個の濃度のＭ１３φ  ＤＮＡ  １０４とハイブリダイズさせた。プローブで官能性化された電極とのＭ１３φ  ＤＮＡのハイブリダイゼーションは、０．２Ｍ  ＮａＣｌを包含した０．１Ｍリン酸緩衝溶液、ｐＨ＝７．５中で４時間実施した。微小重力測定水晶振動子マイクロバランス実験は、１×１０−９Ｍに対応する容積濃度のＭ１３φ  ＤＮＡの存在下で、ハイブリダイズされた環状ＤＮＡの表面被度がプライマープローブ被度の１．５％であることを示す。
【００４９】
二本鎖アセンブリー１０６を、ポリメラーゼ、クレノウフラグメントＩ  １１２の存在下に、酸化還元標識ヌクレオチドとして合成のフェロセンに結び付けられた（ｔｅｔｈｅｒｅｄ）ｄＵＴＰ  １１０を包含するヌクレオチド混合物ｄＮＴＰ  １０８と相互作用させる。フェロセンカルボン酸のＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルは、Ａｄａｍｃｚｙｋ，Ｍ．；Ｆｉｓｈｐａｕｇｈ，Ｊ．Ｒ．；Ｈｅｕｓｅｒ，ｋ．Ｊ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．、（１９９７）８、２５３−２５５に従って製造した。５ｍｇのＮＨＳ−フェロセンエステルをＤＭＦ（１００μＬ）およびＴＥＡ（１０μＬ）の混合物中のアミド−ｄＵＴＰの攪拌された溶液に添加した。反応を室温で４時間保ち、そしてその後ＤＥＡＥ−セルロースカラム（１×２５ｃｍ）上に負荷した。０．０５から０．３５Ｍ  ＴＥＡＢ（ｐＨ＝７．４）までの直線勾配を使用した。フェロセン標識されたｄＵＴＰを含有する画分を収集し、部分的に脱塩しかつ凍結乾燥した。合成のフェロセンに結び付けられたｄＵＴＰの式は以下のとおりである：
【００５０】
【化１】
2004526409.tif 000003
【００５１】
標的ＤＮＡの複製はフェロセン標識された酸化還元活性のＤＮＡ複製物１１４をもたらし、これは電気化学的に分析することができる。さらに、フェロセン単位が、生物触媒酸化レダクターゼ１１６、例えばグルコースオキシダーゼを電極１０２と接触させる電子伝達媒介物質として作用するため、生物触媒基質１１８、例えばグルコースの、検出可能な生成物１２０、例えばグルコン酸への生物電気触媒的酸化は、酸化還元活性の複製物の一次生成のための増幅経路を提供する。
【００５２】
図８は、重合の別個の時間間隔での、プローブ（配列番号１）と１×１０−９ＭのＭ１３φ  ＤＮＡとの間で形成される二本鎖アセンブリーのポリメラーゼに誘導される複製に際して形成されるフェロセンで官能性化された複製物に対応する示差パルスボルタンモグラム（ＤＰＶ）を示す。重合が進行する際に、酸化還元複製物の電気的応答が増大し、そしてそれは約６０分後に飽和に達する傾向がある。図８中の挿入図Ｉは、重合の６０分後に形成される複製された酸化還元活性のＤＮＡの環状ボルタンモグラムを示す。これらの結果は、フェロセン標識されたｄＵＴＰが複製されたＤＮＡに取り込まれることを明瞭に示す。
【００５３】
複製の６０分後のフェロセン単位の酸化還元波のクーロメトリー分析（図８の挿入図ＩＩに示される）は、約３．６×１０−１１モル・ｃｍ−２のフェロセンが電極と電気的に接触されることを示す。変換器として金−水晶振動子を使用する平行した複製過程は、６０分間の重合に際してΔｆ＝−６７Ｈｚの周波数変化を示し、約５９％の複製効率を示す。複製されたＤＮＡに関連する酸化還元標識の表面被度を知れば、フェロセン単位でのＤＮＡ複製物の平均の負荷が複製物あたり約３５０フェロセン単位に対応する（全部の添加された塩基の約９％）ことが推定される。複製の５９％収率で、およびＡ塩基の数を考慮に入れれば、ＤＮＡ複製物中に取り込まれるフェロセン単位の約４０％のみが電極と通信することが注目されるべきである。これはおそらく、離れたフェロセン単位の電極との電気的通信を封鎖するＭ１３φ  ＤＮＡの寸法による。
【００５４】
図９の曲線ｂは、１ｍｇ・ｍＬ−１のグルコースオキシダーゼＧＯｘおよび１００ｍＭのグルコースの存在下でのフェロセンで官能性化された複製物／Ｍ１３  ＤＮＡの二本鎖アセンブリーの環状ボルタンモグラムを示す。電気触媒的陽極電流がフェロセン単位の酸化電位で観察される。対照実験は、電気触媒的電流がＧＯｘもしくはグルコースの非存在下で観察されないことを示す。また、フェロセンに結び付けられたｄＵＴＰの取り込みを伴わないヌクレオチド混合物ｄＮＴＰ／ポリメラーゼでの標的のＭ１３φ  ＤＮＡの複製は、ＧＯｘ／グルコースの存在下でいかなる電気触媒的電流も生じない。従って、結び付けられたフェロセン成分はグルコースのＧＯｘ酸化を媒介する。
【００５５】
Ｍ１３φ  ＤＮＡによる検出作用領域の表面被度はその容積濃度により制御されるため、複製されたフェロセン単位の電気的応答、およびＧＯｘ／グルコースとの相互作用をもたらす電気触媒的陽極電流は、Ｍ１３φ  ＤＮＡの容積濃度により制御される。図１０は、６０分に対応する固定された時間間隔の間に、プローブ作用領域と別個の濃度のＭ１３φ  ＤＮＡとの間で形成された二本鎖アセンブリーの重合に際して生成されるフェロセン−ＤＮＡ複製物の示差パルスボルタンモグラムを示す。Ｍ１３φの容積濃度が増大する際に、システムのＤＰＶ応答が高められる。
【００５６】
図１０の曲線（ｆ）は、プローブで官能性化された電極により外来の変性仔ウシ胸腺ＤＮＡを分析するための試み、次いでフェロセンに結び付けられたｄＵＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＡＴＰおよびｄＧＴＰの存在下でのポリメラーゼに誘導される複製を実施する試みに際して観察されるＤＰＶを示す。いかなる電流測定シグナルの欠如は、電極上でのフェロセンに結び付けられたｄＵＴＰの非特異的吸着が起こらないこと、および、フェロセンに結び付けられた複製物の酸化還元応答の生成がプローブとＭ１３φ  ＤＮＡとの間の二本鎖アセンブリーの特異的形成の結果であることを示す。
【００５７】
別個の濃度の被検体ＤＮＡの存在下で形成される、生じる酸化還元で結び付けられた（ｒｅｄｏｘ−ｔｅｔｈｅｒｅｄ）二本鎖の作用領域をその後、生物電気触媒的増幅システムとしてのＧＯｘ／グルコースと相互作用させた。図９中の挿入図の曲線（ａ）は、別個の濃度のＭ１３φ  ＤＮＡでの、生物触媒的増幅システムとしてのＧＯｘ／グルコースの存在下でのフェロセンに結び付けられたＤＮＡ複製酵素の電流測定的応答に対応する較正曲線を示す。比較のために、ＧＯｘおよびグルコースを伴わない、フェロセンに結び付けられた複製酵素の電流測定的応答（２ｍＶ・ｓ−１の走査速度で記録される）を曲線（ｂ）に提示する。
【図面の簡単な説明】
本発明を理解しかつ実務においてそれをどのように実施してよいかを見るために、付随する図面を参照して制限しない例としてのみ今や態様を記述することができ、ここで：
【図１】
発明にかかる、ＤＮＡのポリメラーゼに誘導される複製および変換器上での不溶性の生成物の生物触媒される沈殿による、Ｍ１３φの検出の増幅された電子的変換の図解である。
【図２】
発明にかかる：（ａ）裸の金電極；（ｂ）プローブで修飾された金電極；（ｃ）１．５時間の２．３×１０−９ＭのＭ１３φとのハイブリダイゼーション後のプローブで修飾された金電極；（ｄ）４時間の２．３×１０−９ＭのＭ１３φとのハイブリダイゼーション後のプローブで修飾された電極、についての時間クーロメトリーの過渡電流を示す。全部の過渡電流は１０ｍＭトリス緩衝液、ｐＨ＝７．４中で５×１０−５ＭのＲｕ（ＮＨ３）６３＋の存在下で記録した。ハイブリダイゼーションは室温で３０％ホルムアミドを包含した０．１Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ＝７．５中で実施した。
【図３】
発明にかかる、Ｍ１３φ  ＤＮＡでの二本鎖アセンブリーのポリメラーゼに誘導される重合と関連した電荷の時間依存性の変化を示す。電荷の変化は、１０ｍＭトリス緩衝液、ｐＨ＝７．４中で酸化還元標識としてＲｕ（ＮＨ３）６３＋を使用する時間クーロメトリーにより測定する。重合は、１０ｍＭトリス緩衝液ｐＨ＝７．５、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２および５０ｍＭ  ＫＣｌよりなる溶液中、２０Ｕのポリメラーゼ、ｄＧＴＰ；ＤＴＴＰ；ｄＡＴＰ；ｄＣＴＰおよびビオチン標識ｄＣＴＰ（１：１：１：２／３：１／３、各塩基１ｍＭ）の存在下で実施する。（各時間クーロメトリー測定の前に、電極をトリス緩衝液、５ｍＭ中で徹底的に洗浄した）。
【図４】
発明にかかる：（ａ）プローブで官能性化された電極；（ｂ）２．３×１０−９ＭのＭ１３φとのハイブリダイゼーション後；（ｃ）ポリメラーゼに誘導される複製および４５分間の二本鎖アセンブリーの形成後；（ｄ）表面へのアビジン−アルカリホスファターゼ結合体の結合後；（ｅ）０．１Ｍリン酸緩衝液ｐＨ＝７．２中での２×１０−３Ｍの基質の存在下の２０分間の検出可能な生成物の生物触媒される沈殿後、のファラデーインピーダンススペクトル（ナイキストプロット）を示す。ハイブリダイゼーションおよび重合の条件は図２および３の説明文に詳述される。
【図５Ａ】
発明にかかる、電極上の生成物の増幅された生物触媒される沈殿による別個の濃度のＭ１３φの検出に際しての電子伝達抵抗の変化ΔＲｅｔを示す。ΔＲｅｔは、２０分間の生成物の沈殿後の電極での電子伝達抵抗、およびプローブで官能性化された電極での電極伝達抵抗の差異に対応する。
【図５Ｂ】
発明にかかる、変換器上での生成物の生物触媒される沈殿の結果としての別個の濃度のＭ１３φの検出に際してのプローブで官能性化された金−水晶振動子の周波数変化を示す。ハイブリダイゼーション、重合および生成物の生物触媒される沈殿の条件は図４に詳述される。
【図６Ａ】
発明にかかる、水疱性口内炎ウイルスＲＮＡの増幅された検出に際してのファラデーインピーダンススペクトル（ナイキストプロット）を示す。すなわち（ａ）プローブ−（５）で官能性化された電極；（ｂ）４０ｍＭ  ＰＩＰＥＳ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、４００ｍＭ  ＮａＣｌ、８０％ホルムアミド、ｐＨ＝７．５よりなる溶液中での１×１０−１２ＭのＶＳＶ  ＲＮＡとのハイブリダイゼーション後；（ｃ）５０ｍＭトリス緩衝液、４０ｍＭ  ＫＣｌ、８ｍＭ  ＭｇＣｌ２、ｐＨ＝８．３よりなる溶液中での８０Ｕの逆転写酵素、ｄＧＴＰ、ｄＡＴＰ、ＤＴＴＰ、ＤＣＴＰおよびビオチニル化ｄＣＴＰ（１：１：２／３：１：１／３、各塩基１ｍＭ）の存在下での４５分間の重合後；（ｄ）アビジン−アルカリホスファターゼ結合体（容積濃度１ｎＭ）の会合後；（ｅ）リン酸緩衝液ｐＨ＝７．５中での２×１０−３の基質の存在下での２０分間の生成物の生物触媒される沈殿後。
【図６Ｂ】
発明にかかる；（ｆ）逆転写酵素ならびにｄＧＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰおよびビオチニル化ｄＵＴＰの存在下での結合されたＲＮＡの複製の結果としての周波数変化；（ｇ）アビジン−アルカリホスファターゼ結合体の会合に際して；（ｈ）生成物の生物触媒される沈殿に際しての、１×１０−１１２ＭのＶＳＶ−ＲＮＡの分析に際しての金−水晶振動子の時間依存性の周波数変化を示す。重合および生成物の生物触媒される沈殿の条件は図６Ａに詳述される。挿入図：曲線（ｆ）の拡大図。
【図７】
発明にかかる、酸化還元活性のＤＮＡ複製物の生成および該遺伝子の電流測定的な増幅された生物電気触媒分析の図解である。
【図８】
発明にかかる、重合の別個の時間間隔、すなわち（ａ）複製前。（ｂ）５分後。（ｃ）３０分後。（ｄ）６０分後の配列番号１と１×１０−９ＭのＭ１３φ  ＤＮＡとの間で形成される二本鎖アセンブリーのポリメラーゼに誘導される複製に際して形成されるフェロセンで官能性化された複製物に対応する示差パルスボルタンモグラム（ＤＰＶ）を示す。挿入図：（Ｉ）複製の６０分後のフェロセンで結び付けられたＤＮＡの環状ボルタンモグラム、走査速度１００ｍＶ・ｓ−１。（ＩＩ）別個の複製時間間隔でのフェロセンに結び付けられたＤＮＡのＤＰＶ曲線のピーク電流。全部の実験で、検出作用領域は１×１０−９ＭのＭ１３φ  ＤＮＡとハイブリダイズさせた。複製は、２０Ｕ・ｍＬ−１のポリメラーゼ、クレノウフラグメントおよび各１×１０−３ＭのｄＣＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、フェロセン−ｄＵＴＰ、（２）の存在下で、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２および６０ｍＭ  ＫＣｌを包含した２０ｍＭトリス緩衝液、ｐＨ＝７．５中で実施した。
【図９】
発明にかかる：（ａ）２ｍｇ・ｍＬ−１のＧＯｘの存在下での６０°についての複製後の１×１０−９ＭのＭ１３φ  ＤＮＡの分析後に生成されるフェロセンで結び付けられたＤＮＡ。（ｂ）（ａ）に記述されるシステムへの５×１０−２Ｍのグルコースの添加後、に対応する環状ボルタンモグラムを示す。データは、０．１Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ＝７．４中、アルゴン下、走査速度２ｍＶ・ｓ−１で記録した。挿入図：（曲線ａ）：それぞれの酸化還元活性の複製物の生成、および２ｍｇ・ｍＬ−１のＧＯｘ、５×１０−２Ｍのグルコースによるグルコースの媒介される電気生物触媒される酸化による、別個の濃度のＭ１３φ  ＤＮＡの分析に際して観察された生物電気触媒的陽極波のピーク電流。（曲線ｂ）：それぞれのフェロセンに結び付けられた複製物の生成によるがしかしＧＯｘ／グルコース増幅システムの非存在下での別個の濃度のＭ１３φ  ＤＮＡの分析に際しての陽極酸化還元波のピーク電流。全部の環状ボルタンモグラムは、０．１Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ＝７．４中、Ａｒ下、走査速度２ｍＶ・ｓ−１で記録した。
【図１０】
発明にかかる、別個の濃度のＭ１３φ  ＤＮＡ、すなわち（ａ）１×１０−１３Ｍ、（ｂ）１×１０−１２Ｍ、（ｃ）１×１０−１１Ｍ、（ｄ）１×１０−１０Ｍ、（ｅ）１×１０−９Ｍ、（ｆ）５×１０−７Ｍの変性仔ウシ胸腺ＤＮＡを図７中のスキームに従って分析する対照実験、の分析に際して形成されるフェロセンに結び付けられた複製物の示差パルスボルタンモグラム（ＤＶＰ）を示す。実験の全部で６０分に対応する固定された複製時間を使用した。挿入図：別個の濃度のＭ１３φ  ＤＮＡの分析に際して形成されるフェロセン複製物のＤＰＶのピーク電流。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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