(57)【要約】本発明は、ＦＲＰ−４遺伝子の発現を変化させる、またはＦＲＰ−４タンパク質の活性を変化させる作用物質を送達することにより、リン酸恒常性および腎臓リン酸輸送を調節する方法を提供する。本発明の方法は、骨石灰化の調節、腎臓リン酸輸送、腫瘍性骨軟化症関連症状の軽減、およびリン酸恒常性関連疾患の治療に有用である。本発明はさらに、ＦＲＰ−４タンパク質またはこのタンパク質をコードするポリヌクレオチドを被検体に送達することにより、リン酸再吸収を減少させる方法を提供する。さらに、本発明は、ＦＲＰ−４遺伝子の発現を検出してモニターする方法、および腫瘍性骨軟化症に関連する腫瘍細胞の表現型を調節する方法を提供する。最後に、本発明は、ＦＲＰ−４遺伝子およびタンパク質の活性を修飾する組成物を同定するための候補作用物質のスクリーニング方法を提供する。
2004503602.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＦＲＰ−４遺伝子によりコードされるポリペプチドの活性を被検体内において変化させる工程を含む、被検体においてリン酸恒常性を調節する方法。
【請求項２】
ＦＲＰ−４遺伝子によりコードされるポリペプチドの活性を変化させる有効量の作用物質を被検体に送達することによりリン酸恒常性が調節される、請求項１の方法。
【請求項３】
ＦＲＰ−４ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの発現を被検体内において変化させる工程を含む、被検体においてリン酸恒常性を調節する方法。
【請求項４】
ＦＲＰ−４遺伝子によりコードされるポリペプチドの活性を変化させる有効量の作用物質を被検体に送達する工程を含む、被検体における腎臓リン酸輸送を調節する方法。
【請求項５】
ＦＲＰ−４ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの発現を変化させる有効量の作用物質を被検体に送達する工程を含む、腎臓リン酸輸送を調節する方法。
【請求項６】
ＯＯＭ関連腫瘍細胞内のＦＲＰ−４ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの発現を変化させる工程を含む、腫瘍性骨軟化症関連症状を軽減する方法。
【請求項７】
低リン酸血症、リン酸塩尿、１、２５−ジヒドロキシビタミンＤの低い血清濃度および骨軟化症からなる群から症状が選択される、請求項６の方法。
【請求項８】
ＯＯＭ関連腫瘍細胞内のＦＲＰ−４ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの発現を変化させる工程を含む、骨石灰化を調節する方法。
【請求項９】
ＦＲＰ−４遺伝子によりコードされるポリペプチドの活性を変化させる有効量の作用物質を被検体に送達する工程を含む、被検体における腫瘍性骨軟化症関連症状を軽減する方法。
【請求項１０】
低リン酸血症、リン酸塩尿、１、２５−ジヒドロキシビタミンＤの低い血清濃度および骨軟化症からなる群から症状が選択される、請求項９の方法。
【請求項１１】
ＦＲＰ−４遺伝子によりコードされるポリペプチドの活性を変化させる作用物質を被検体に送達する工程を含む、リン酸恒常性関連疾患を治療する方法。
【請求項１２】
疾患が、Ｘ染色体低リン酸血症くる病、腫瘍性骨軟化症、横紋筋融解症、心筋症、腫瘍性石灰症、腎不全および骨石灰化からなる群から選択される、請求項１１の方法。
【請求項１３】
有効量のＦＲＰ−４タンパク質を被検体に送達する工程を含む、被検体内でリン酸再吸収を減少させる方法。
【請求項１４】
ＦＲＰ−４タンパク質をコードする有効量のポリヌクレオチドを被検体に送達する工程を含む、被検体におけるリン酸再吸収を減少させる方法。
【請求項１５】
中程度のハイブリダイズストリンジェンシー条件下で適切なサンプルを適切なポリヌクレオチドプローブに接触させる工程、およびハイブリダイズした任意の相補的ポリヌクレオチドを検出し、その結果、細胞を検出する工程を含む、ＦＲＰ−４遺伝子によりコードされているポリペプチドを発現する細胞を検出する方法。
【請求項１６】
適切なサンプルを適切なプライマー対に接触させる、ポリメラーゼ連鎖反応を実施する、および任意の増幅されたポリヌクレオチド検出し、その結果、細胞を検出する工程を含む、ＦＲＰ−４遺伝子にコードされているポリペプチドを発現する細胞を検出する方法。
【請求項１７】
中程度のハイブリダイズストリンジェンシー条件下で、細胞由来の適切なサンプルを適切なＦＲＰ−４ポリヌクレオチドプローブに接触させる工程、およびハイブリダイズした任意の相補的ポリヌクレオチドを検出する、それにより腫瘍性骨軟化症関連腫瘍細胞を検出する工程を含む、腫瘍性骨軟化症関連腫瘍細胞を検出する方法。
【請求項１８】
細胞由来の適切なサンプルを適切なＦＲＰ−４プライマー対に接触させる工程、ポリメラーゼ連鎖反応を実施する工程、および任意の増幅されたポリヌクレオチドを検出し、それにより腫瘍性骨軟化症関連腫瘍細胞を検出する工程を含む、腫瘍性骨軟化症関連腫瘍細胞を検出する方法。
【請求項１９】
細胞内においてＦＲＰ−４ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの発現を変化させる作用物質を送達する工程を含む、腫瘍性骨軟化症関連腫瘍細胞の表現型を調節する方法。
【請求項２０】
細胞内においてＦＲＰ−４遺伝子の発現を変化させる作用物質を送達する工程を含む細胞の表現型を調節する方法。
【請求項２１】
ＦＲＰ−４遺伝子の発現を調節する候補の治療的作用物質をスクリーニングする方法であって、標的細胞を試験作用物質と接触させる工程、およびＦＲＰ−４遺伝子の発現をモニターする工程を含み、ＦＲＰ−４遺伝子の発現を修飾する試験作用物質が候補の治療的作用物質である、方法。
【請求項２２】
候補作用物質がポリペプチド、ポリヌクレオチド、リボザイムおよび有機低分子からなる群から選択される生物化合物または化学化合物である、請求項２１の方法。
【請求項２３】
ＦＲＰ−４遺伝子によりコードされるポリペプチドの生物学的活性を変化させる能力を有する候補作用物質をスクリーニングする方法であって、ＦＲＰ−４ポリペプチドを発現する標的細胞を試験作用物質と接触させる工程、および発現されたポリペプチド産物の活性をモニターする工程を含み、ポリペプチドの活性を修飾する試験作用物質が候補作用物質である、方法。
【請求項２４】
候補作用物質がポリペプチド、ポリヌクレオチド、リボザイムまたは有機低分子からなる群から選択される生物化合物または化学化合物である、請求項２３の方法。
【請求項２５】
被検体内のＦＲＰ−４ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの発現を変化させる工程を含む、被検体において骨石灰化を調節する方法。
【請求項２６】
ＦＲＰ−４遺伝子によりコードされるポリペプチドの活性を変化させる有効量の作用物質を被検体に送達する工程を含む、被検体において骨石灰化を調節する方法。
【請求項２７】
ＦＲＰ−４ポリヌクレオチドまたはＦＲＰ−４遺伝子が、ヒト、サルおよびげっ歯類ＦＲＰ−４ポリヌクレオチドまたはＦＲＰ−４遺伝子からなる群から選択される、請求項１〜２６の方法。
【請求項２８】
ＦＲＰ−４タンパク質の活性を調節する候補作用物質が候補の治療的作用物質である、標的細胞を候補作用物質と接触させる、およびＦＲＰ−４タンパク質の活性をモニターする工程を含む、ＦＲＰ−４タンパク質の活性を調節する候補作用物質をスクリーニングする方法。
【請求項２９】
ＦＲＰ−４タンパク質の活性を調節する候補リガンドをスクリーニングする方法であって、標的細胞を候補作用物質と接触させる工程、およびＦＲＰ−４タンパク質の活性をモニターする工程を含み、ＦＲＰ−４タンパク質の活性を変化させる候補作用物質が候補リガンドである、方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
フォスファトニン関連遺伝子およびその使用法
技術分野
本発明は、リン酸輸送関連疾患を治療するために、フリッズルド（ｆｒｉｚｚｌｅｄ）関連タンパク質４（ＦＲＰ−４）をコードする遺伝子およびＦＲＰ−４ポリペプチドを使用する方法に関するものである。
【０００２】
発明の背景
細胞内に存在する全てではないが多くの遺伝子が、任意の所定の時間において発現することはよく知られている。生物学の基本的な疑問は、異なる細胞において、どの遺伝子が転写されるか、および転写物の相対的な量の知識を必要とする。典型的には、所定の遺伝子がいつおよびどの程度発現されるかが、一度に１個の遺伝子に関して解析されてきた。
【０００３】
したがって、ある細胞内において発現されている全ての遺伝子の同一性、およびこれらの遺伝子の発現レベルに関する情報は、活性化、分化、老化、ウイルス形質転換、形態形成、および有糸分裂などの、多くの細胞過程の研究を容易にするだろう。同一または異なる環境刺激下で、様々な個人または種由来の、特定の細胞または同一の細胞の発現している遺伝子を比較することは、細胞の分子生物学に貴重な洞察を提供する。
【０００４】
リン酸は、ヒトの体の正常な機能性に必須である多くの細胞過程において必須の役割を果たしている。リン酸恒常性は第一には腎臓により、主としてリン酸の腎臓尿細管再吸収の変動を通じて制御される。腎臓のリン酸輸送機能の変更および引き続く血清リン酸濃度の擾乱はしばしば、深刻な生化学的および臨床的問題につながる。異常な血清リン酸レベルに関連することが知られているいくつかの疾患は、小児における遺伝性くる病、成人における後天性骨軟化症、横紋筋融解症、心筋症、腫瘍性石灰症または他の腎不全および関連する二次性症候群を含む。Ｋｕｍａｒ（１９９７）Ｎｅｐｈｒｏｌ．Ｄｉａｌ．Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．１２：１１〜１３。
【０００５】
低リン酸血症に関連するいくつかの既知の骨疾患のうち、Ｘ染色体低リン酸血症くる病（ＨＹＰ）および腫瘍性骨軟化症（ＯＯＭ）が近年精力的に研究されてきた。Ｒｏｗｅ（１９９４）Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．９４：４５７〜４６７。一つは遺伝性で、そしてもう一つは後天性であるけれども、ＨＹＰおよびＯＯＭは非常に類似した臨床特徴を有する。両者は、低リン酸血症、リン酸塩尿および１、２５−ジヒドロキシビタミンＤの低い血清濃度などの症状により特徴付けられる。不適切なリン酸レベルは、骨格ミネラリゼーション不良につながり、それは続いて骨奇形（くる病）または骨軟化（骨軟化症）を引き起こす。
【０００６】
低リン酸血症または高リン酸血症関連症候群の生化学的および臨床的研究は、リン酸取り込みの分子機構を理解することに焦点を当ててきた。最近の展開は、腎臓リン酸輸送制御に特異的に関与する１つまたは複数の液性因子の存在を示唆する数系統の証拠を提供した。Ｋｕｍａｒ（１９９７）前記。ＨＹＰの研究においては、新規遺伝子ＰＥＸが低リン酸血症の表現型と関連している。ＰＥＸ遺伝子は膜結合エンドペプチダーゼのファミリーに強い相同性を有する。したがって、ＰＥＸタンパク質は、推定上のホルモン基質の細胞プロセシングにおいて機能することが推論される。Ｒｏｗｅ（１９９７）Ｅｘｐ．Ｎｅｐｈｒｏｌ．５：３５５〜３６３。ＯＯＭは、主として間葉系起源の組織学的には別の様々な腫瘍（血管周囲細胞腫）により引き起こされることが可能である。ＯＯＭ患者から腫瘍を除去することは直ちに不良症状を逆転させ、そして骨疾患の完全な治癒を結果として生じる、これは腎臓リン酸輸送を阻害する能力のある腫瘍分泌性の循環因子を示している。
【０００７】
リン酸恒常性制御に特異的に関与する一つまたは複数の液性因子に関する、よく記載されている状況証拠にも関わらず、推定因子「フォスファトニン（ｐｈｏｓｐｈａｔｏｎｉｎ）」はまだ同定されていない。因子を精製または、フォスファトニン活性を有するタンパク質をコードする遺伝子をクローン化するいくつかの試みは、一部には確立された腫瘍培養においては推定因子の分泌レベルを維持することが困難であるために、失敗に終わってきた。
【０００８】
リン酸制御の他に、骨石灰化におけるある不良ならびにＯＯＭのいくつかの効果が、骨ミネラル恒常性を媒介する因子、ならびに骨代謝を直接的に阻害または促進する因子により媒介される可能性が高い。リン酸代謝および骨石灰化を支配する非常に相互作用のある経路はまた、タンパク質合成、プロセシングおよび分泌を調整するために機能するポリペプチド因子により間接的に影響を受けるかもしれない。例えば、ＯＯＭ誘導性変化は、リソソームプロテアーゼのレベルを増加または減少させることにより、硫酸ヘパリンまたは他のグリコサミノグリカンを含む因子のバランスを変化させることにより、リン酸代謝および骨石灰化を変化させるかもしれない。そのような因子は、骨粗鬆症、骨軟化症、くる病、低リン酸血症、ファルコニン（Ｆａｌｃｏｎｉｎ）症候群および腎臓性骨形成異常症を含む、広範囲の病態に対する改良型の治療のための標的を提供する。そのような因子の同定はリン酸制御疾患に対する有用な洞察を提供する。
【０００９】
ＯＯＭに関連している腫瘍細胞において差異的に発現している遺伝子、特に腎臓リン酸輸送を制御する責任を有しているそれら、を同定するための必要性が存在する。興味ある細胞に特異的な遺伝子発現パターンの解析は、フォスファトニン活性に相当する遺伝子の同定につながるだけでなく、他の腫瘍関連疾患状態に関連する遺伝子活性に関する分子情報もまた提供する。例えば、ＯＯＭに関連している腫瘍細胞は、新規の血管新生因子の原料として考慮されてもよく、または異なる型の腫瘍と遺伝子発現を比較するために使用されることが可能であろう。腫瘍由来制御因子の同定はまた、腎不全または遺伝性のくる病などの不規則なリン酸恒常性を有する非ガン疾患を診断および治療することもまた助けることが可能である。さらに、骨形成および代謝を直接調節する因子の同定は、骨疾患において治療介入の重要な道具を提供するであろう。最終的には、これがリン酸代謝および骨形成に関与する機構の理解につながるであろう。
【００１０】
発明の説明
本発明は、ＦＲＰ−４遺伝子の発現を変化させる、またはＦＲＰ−４タンパク質の活性を変化させる作用物質を送達することにより、リン酸恒常性および／または腎臓リン酸輸送を調節する方法を提供する。本発明の方法は、骨石灰化を調節すること、腎臓リン酸輸送を調節すること、腫瘍性骨軟化症関連症状を軽減すること、およびリン酸恒常性関連疾患を治療することの一つまたは複数に有用である。
【００１１】
本発明はさらに、被検体にＦＲＰ−４タンパク質またはＦＲＰ−４タンパク質をコードするポリヌクレオチドを送達することによりリン酸再吸収を減少させる方法を提供する。さらに、本発明は、ＦＲＰ−４遺伝子の発現を検出およびモニターする方法を提供する。
【００１２】
ある実施態様においては、本発明は、ＦＲＰ−４遺伝子の発現を変化させる作用物質を送達することにより腫瘍性骨軟化症関連腫瘍細胞の表現型を調節する方法を提供する。さらに、本発明は、ＦＲＰ−４遺伝子およびタンパク質の活性を修飾する組成物を同定するための候補作用物質のスクリーニング方法を提供する。
【００１３】
本発明は、腫瘍性骨軟化症関連遺伝子（ＯＯＭ）（例えば、ＦＲＰ−４）をコードするポリヌクレオチドなどの、本明細書において同定されている方法において有用である単離されたポリヌクレオチドを提供する。本発明のポリヌクレオチドはＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡまたはゲノムＤＮＡを含むことを意図する。リポソームおよびベクターなどの遺伝子送達媒体（ｇｅｎｅ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｖｅｈｉｃｌｅ）を含む発現システム、およびこのポリヌクレオチドを含む宿主細胞は本発明によりさらに提供される。
【００１４】
本発明はまたは本発明のポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質を提供する。ある実施態様においては、このタンパク質は、本明細書に記載されている方法を用いることにより検出可能な、腫瘍性骨軟化症関連活性を有する。
【００１５】
さらに、ユニークな、発現された遺伝子配列を含む核酸を単離するだけでなく、発明のポリヌクレオチドにハイブリダイズする核酸プローブおよびプライマーを提供する。
【００１６】
本発明はさらに、アンチセンスオリゴヌクレオチド、抗体、ハイブリドーマ細胞株、およびそれぞれを含む組成物を含む。
【００１７】
本発明はまた、発明のポリヌクレオチドを用いて遺伝子発現をモニターする方法も提供する。
【００１８】
遺伝子発現をモニターする方法は、腫瘍性骨軟化症関連ポリペプチドを発現する細胞を検出するために、および腫瘍性骨軟化症に関連する腫瘍細胞を検出するために有用である。
【００１９】
本発明はさらに、本発明のポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質の活性を変化させるために、およびリン酸輸送体関連疾患の症状、および異常な骨石灰化により特徴付けられる疾患を治療するために、発明のポリヌクレオチドの発現を調節する方法を提供する。これらの疾患は、腫瘍性骨軟化症、Ｘ染色体低リン酸血症くる病、横紋筋融解症、骨粗鬆症、心筋症、腫瘍性石灰症、腎不全および骨石灰化を含むが、これらに限定されるものではない。
【００２０】
本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドまたはその相補体の発現を調節する候補作用物質をスクリーニングする方法であって、試験作用物質を腫瘍性骨軟化症に関連する腫瘍細胞に接触させる工程、およびポリヌクレオチドの発現をモニターする工程を含み、そのポリヌクレオチドの発現を修飾する試験作用物質が候補作用物質である、方法も提供する。
【００２１】
本発明はまた、ＦＲＰ−４タンパク質の活性を調節する能力を有するリガンドまたは複数のリガンドの単離、および該リガンドの治療用途のためのアッセイ法を提供する。
【００２２】
本発明はさらに、ＦＲＰ−４タンパク質の活性を調節する能力を有する候補作用物質、および該候補作用物質の治療用途の評価および開発のためのアッセイ法を提供する。
【００２３】
本発明を実行するための方法
本開示を通して、様々な刊行物、特許および公表された特許明細書が、確認を行う引用文献として参照される。これらの刊行物、特許および公表された特許明細書の開示は、本発明が属する最新の技術をより完全に説明するために、本開示にて、参照として本明細書に組み入れられる。
【００２４】
定義
本発明の実施は、他に示されない限り、免疫学、分子生物学、微生物学、細胞生物学および組み換えＤＮＡの従来の技術を使用する。これらの方法は、以下の刊行物において説明される。例えば、サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、「分子クローニング：実験マニュアル（ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ： Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ）， 第２版」（１９８９）；「分子生物学における最新プロトコール（ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ）」（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら編， （１９８７））；「酵素学における方法シリーズ（ｔｈｅ ｓｅｒｉｅｓ ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ）」（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ．）；「ＰＣＲ：実践アプローチ（ＰＣＲ： Ａ ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ ＡＰＰＲＯＡＣＨ）」（Ｍ．ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎら， ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ ａｔ Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ（１９９１））；「ＰＣＲ ２：実践アプローチ（ＰＣＲ ２： Ａ ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ ＡＰＰＲＯＡＣＨ）」（Ｍ．Ｊ．ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎ， Ｂ．Ｄ．ＨａｍｅｓおよびＧ．Ｒ．Ｔａｙｌｏｒ編， （１９９５））；「抗体、実験マニュアル（ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ， Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ）」（ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ編（１９８８））；および「動物細胞培養（ＡＮＩＭＡＬ ＣＥＬＬ ＣＵＬＴＵＲＥ）」（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編（１９８７））を参照のこと。
【００２５】
本明細書および特許請求の範囲において使用されるように、文脈にて他に明らかに指示されない限り、単数形の「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、複数の指示物を含む。例えば、「細胞」という用語は、その混合物を含めた、複数の細胞を含む。
【００２６】
「〜を含む」という用語は、組成物および方法が、詳述される要素を含むが、他を除外するものではないことを意味するが意図される。組成物および方法を定義するために用いられた場合、「本質的に〜からなる」は、組み合わせに対して本質的な重要性をもつあらゆる他の要素を除外することを意味する。したがって、本明細書において定義されるような本質的な要素からなる組成物は、単離法および精製法、ならびにリン酸緩衝食塩水、保存剤などの薬学的に許容される担体からの微量混入物を除外するものではない。「〜からなる」は、本発明の組成物を投与するための他の成分、および実質的な方法の段階の微量要素を超えたものについては除外することを意味する。これらの変遷用語の各々によって定義される態様は、本発明の範囲内である。
【００２７】
「ポリヌクレオチド」および「核酸分子」という用語は、任意の長さのヌクレオチドの重合体形態を指すように、交換可能に使用される。ポリヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、および／またはそれらの類似体を含み得る。ヌクレオチドは、任意の三次元構造を有することが可能であり、既知または未知の任意の機能を果たし得る。「ポリヌクレオチド」という用語は、例えば、一本鎖、二重鎖および三重鎖らせん分子、遺伝子または遺伝子断片、エキソン、イントロン、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、リボザイム、ｃＤＮＡ、組み換えポリヌクレオチド、分枝ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離ＤＮＡ、任意の配列の単離ＲＮＡ、核酸プローブ、およびプライマーを含む。核酸分子はまた、修飾核酸分子をも含み得る。
【００２８】
「遺伝子」は、転写および翻訳された後に生じる、特定のポリペプチドまたはタンパク質をコードすることができる、少なくとも１つのオープンリーディングフレームを含むポリヌクレオチドを指す。
【００２９】
「ＦＲＰ−４遺伝子」は、配列番号２において示されるアミノ酸配列のような、フリッズルド関連タンパク質−４ポリペプチドをコードする特定の染色体上の特定の場所に位置するヌクレオチドの、順序づけられた配列を含むポリヌクレオチドである。遺伝子という用語には、発現を調節するプロモーターおよびエンハンサーのような、隣接するポリヌクレオチド配列を含むことが意図される。本明細書において使用されるように、ＦＲＰ−４遺伝子という用語は、分岐種からの全ての真正相同な配列、即ち、異なる種において同じ活性をもつポリペプチドをコードする相同配列を指す。それは特に、ヒト、サルおよびげっ歯動物のＦＲＰ−４遺伝子を含むことが意図される。
【００３０】
「ＦＲＰ−４ポリヌクレオチド」は、フリッズルド関連タンパク質−４ポリペプチド、そのようなペプチドの一部分、またはＦＲＰ−４遺伝子の一部分をコードするポリヌクレオチドの任意の順序づけられた配列を意味する。したがって「ＦＲＰ−４ポリヌクレオチド」は、例えば生物学的に同等のポリヌクレオチドのような、完全なＦＲＰ−４遺伝子に由来するポリヌクレオチド配列を含めた、ｃＤＮＡ、プローブ、プライマー、および他の分子を含む。
【００３１】
生物学的に同等のポリヌクレオチドは、対立遺伝子、スプライシング変異体および相同体のような、上記に説明されるポリヌクレオチドとは異なるが、同じ表現型効果をもたらすポリヌクレオチドである。これらの、変化はあるが表現型としては同等のポリヌクレオチドは、「生物学的に同等なポリヌクレオチド」および「同等な核酸」と呼ばれる。本発明のこの方法はまた、本明細書のポリヌクレオチドと比較した場合、そこから産生されるポリペプチドの表現型を変化させない非コード領域における変化によって特徴付けられるポリヌクレオチドをも包含する。本発明は、中程度の、または高いストリンジェンシーの条件下で、本発明のポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドの使用について、さらに考察する。
【００３２】
本発明の方法において有用な、生物学的に同等のポリヌクレオチドは、配列相同性検索を用いて同定される。生物学的に同等のポリヌクレオチドの幾つかの態様は、本発明の範囲内である。例えば、配列データ内の多義性、遺伝子コードの縮重によるアミノ酸配列を変化させないヌクレオチドの変化、保守的なアミノ酸置換、およびヌクレオチド配列における対応する変化、ならびに機能には影響を与えない、スプライシング変異体または配列間における小さな欠失もしくは挿入による、位置合わせした配列における長さの変異、について修正するデフォルトパラメータ下において、配列アライメントプログラムを用いて決定した、少なくとも７５％、または少なくとも８０％、または少なくとも９０％または少なくとも９５％の配列相同性を有することに特徴付けられるポリヌクレオチド。
【００３３】
当技術分野においては様々なソフトウェアプログラムが利用可能である。プログラムの例としては、ＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＸ、ＴＢＬＡＳＴＮ、およびＴＢＬＡＳＴＸを含む、ＢＬＡＳＴ系プログラム（ＢＬＡＳＴは、ウェブサイトｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／から入手可能である）、ＦａｓｔＡ、Ｃｏｍｐａｒｅ、ＤｏｔＰｌｏｔ、ＢｅｓｔＦｉｔ、ＧＡＰ、ＦｒａｍｅＡｌｉｇｎ、ＣｌｕｓｔａｌＷ、およびＰｉｌｅＵｐがあるが、これらに限定しない。これらのプログラムは、ＧＣＧ社のウィスコンシンパッケージ（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｐａｃｋａｇｅ）のような配列解析ソフトウェアの包括的パッケージとして、市販されている。他の同様な解析およびアラインメントプログラムは、ＤＮＡ Ｓｔａｒ’ｓ ＭｅｇＡｌｉｇｎ、またはＧｅｎｅＪｏｃｋｅｙのアラインメントプログラムのように、様々なプロバイダーから購入できる。または、配列解析およびアラインメントプログラムは、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓｄｓｃ．ｅｄｕ／ＲｅｓＴｏｏｌｓ／ｃｍｓｈｐ．ｈｔｍｌ．にあるＣＭＳ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｒｅｓｏｕｒｃｅのような、ウェブサイトからアクセス可能である。遺伝子またはその部分に対応する、ＤＮＡまたはタンパク質の配列を含む任意の配列データベースは、配列解析のために使用することができる。一般に使用されるデータベースは、ＧｅｎＢａｎｋ、ＥＭＢＬ、ＤＤＢＪ、ＰＤＢ、ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ、ＥＳＴ、ＳＴＳ、ＧＳＳおよびＨＴＧＳを含むが、これらに限定しない。配列類似性は、タグ配列をＤＮＡ配列データベースに対してアラインメントを行うことによって判別できる。または、タグ配列は、６つの読み枠に翻訳できる；全ての可能な読み枠の予測されるペプチド配列についてその後、ＢＬＡＳＴＸプログラムを用いて実施されるようにタンパク質データベースに保存された個々の配列と比較される。
【００３４】
１つまたは複数の前述のアラインメントプログラムによって説明される、相同性の程度を決定するためのパラメータは、当技術分野においては十分に確立されている。それらは、ｐ値、配列同一性のパーセントおよび配列類似性のパーセントを含むが、これらに限定しない。ｐ値は、アラインメントが偶然に生じる確率である。１つのアラインメントについては、ｐ値は、カーリン（Ｋａｒｌｉｎ）ら（１９９０）ＰＮＡＳ ８７：２２４６に従って算出できる。複数のアラインメントについては、ｐ値は、ＢＬＡＳＴにおいてプログラムされるもののような発見的手法を用いて算出できる。配列同一性のパーセントは、２つの配列のアラインメントが最適に行われた場合に、照会配列と既知の配列の間のヌクレオチドまたはアミノ酸のマッチ数の比率によって決定される。配列類似性のパーセントは、類似性のパーセントを算出する際には、異なっているが類似のアミノ酸を正として計算する点を除き、同一性のパーセントと同じ方法で算出される。したがって、ある塩基性アミノ酸からその他のアミノ酸への変化、またはある疎水性アミノ酸からその他のアミノ酸への変化のような、機能を変化させずにしばしば生じる保存的な変化は、それらが同一であるが如く計算される。タグ配列は、比較可能な長さのアラインメント領域が、３０％未満の配列同一性、より好ましくは２０％未満の同一性、なおもより好ましくは１０％未満の同一性を表す場合は、いかなる既知の配列とも実質的な相同性を欠くと考えられる。
【００３５】
当技術分野における当業者に知られる様々なクローニング法を用いて、ＦＲＰ−４遺伝子の既知の配列に基づき、遺伝子の断片、または対応する転写産物の全長コード配列、または遺伝子を同定することができる。本発明の方法を実施するために有用なポリヌクレオチドは、同じ転写単位内の付加的なコード配列のような付加的な配列と、プロモーター、リボソーム結合部位、およびポリアデニル化部位のような調節因子と、同じまたは異なるプロモーターの調節下にある付加的な転写単位、クローニング、発現および宿主細胞の形質転換を行わせるような配列と、本発明の態様を提供するために望ましいとされ得るような任意の構築物を含み得る。
【００３６】
「ＦＲＰ−４ポリペプチド」は、配列番号２において示されるような、ＦＲＰ−４ ｃＤＮＡの翻訳によって特定されるアミノ酸の順序づけられた配列を含む分子である。本用語は、ＦＲＰ−４の完全なＦＲＰ−４アミノ酸配列（配列番号２）、ならびに、オルタナティブスプライシングによって生じたポリペプチド分子、ならびに、完全配列に由来するプロテアーゼ分解産物および合成ペプチドのような、完全な分子の他の部分を指すために使用される。それはまた、ヒト、サル、およびげっ歯動物を含む（これらに限定されるものではないが、）様々な種に由来する、オルソロガスなＦＲＰ−４ポリペプチドをも指す。
【００３７】
「遺伝子産物」は、遺伝子が転写および翻訳された場合に生じるアミノ酸（例えばペプチドまたはポリペプチド）を指す。
【００３８】
「配列タグ」または「タグ」または「ＳＡＧＥタグ」は、遺伝子転写産物のある位置において生じる、定義されたヌクレオチド配列を含む短いオリゴヌクレオチドである。タグの長さは一般に、約２０ヌクレオチド未満、好ましくは９から１５ヌクレオチドの間、より好ましくは１０ヌクレオチドである。タグは、対応する転写産物およびそれが転写された遺伝子を同定するために使用することができる。タグの同定を容易にし実用性を高めるために、タグは、外来のヌクレオチド配列をさらに含み得る。そのような補助配列は、制限エンドヌクレアーゼ切断部位、ならびに、配列決定およびクローニングのための周知のプライマー配列を含む、がこれらに限定しない。
【００３９】
配列は、それらが塩基対合則によって関係している場合、もう一方の配列の補足物である、またはもう一方の配列に相補的である。例えば、ＤＮＡにおいては、一方の鎖における配列Ａ−Ｇ−Ｔは、他方の鎖におけるＴ−Ｃ−Ａに相補的である。与えられた配列によって、相補的な配列が決定される。
【００４０】
本明細書において使用されるように、「調節する」という用語は、例えば、リン酸恒常性、腎臓のリン酸輸送、骨の石灰化、および腫瘍性骨軟化症−またはその関連症状に関係する過程または生物学的機能を、変化させるまたは修飾することを意味する。
【００４１】
「ペプチド」という用語は、２つ以上のサブユニットアミノ酸、アミノ酸類似体、またはペプチド模倣物からなる化合物を指すために、その最も広い意味において使用される。サブユニットは、ペプチド結合によって連結できる。別の態様においては、サブユニットは、例えばエステル、エーテル等のような、他の結合によって連結できる。本明細書において使用されるように、「アミノ酸」という用語は、グリシンおよびＤ型またはＬ型の光学異性体の双方、およびアミノ酸類似体およびペプチド模倣物を含む、天然および／または非天然のアミノ酸または合成アミノ酸のいずれかを指す。３つ以上のアミノ酸のペプチドは、ペプチド鎖が短い場合、一般にオリゴペプチドと呼ばれる。ペプチド鎖が長い場合、そのペプチドは一般にポリペプチドまたはタンパク質と呼ばれる。
【００４２】
「ｃＤＮＡ」という用語は、細胞または生物体において存在するｍＲＮＡ分子から逆転写酵素のような酵素を用いて生成される、相補的ＤＮＡを指す。「ｃＤＮＡライブラリ」は、逆転写酵素によって全てがｃＤＮＡ 分子に変換され、その後「ベクター」に挿入される、細胞または生物体において存在する全てのｍＲＮＡ分子の集積である。
【００４３】
「プローブ」は、ポリヌクレオチドの操作の文脈中において使用された場合、標的にハイブリダイズすることにより、関心対象のサンプル中に潜在的に存在する標的を検出するための試薬として提供されるオリゴヌクレオチドを指す。通常、プローブは、標識、または、ハイブリダイゼーション反応の前もしくは後のいずれかに標識を付着することができる方法を含む。適した標識は、放射性同位体、蛍光色素、化学発光化合物、色素、および酵素を含むタンパク質を含むが、これらに限定しない。
【００４４】
「プライマー」は、一般に、標的にハイブリダイズすることにより、関心対象のサンプル中に潜在的に存在する標的または「鋳型」に結合するフリーの３’−ＯＨ基を有し、その後標的に相補的なポリヌクレオチドの重合を促進する、短いポリヌクレオチドである。「ポリメラーゼ連鎖反応」（「ＰＣＲ」）は、「上流」および「下流」のプライマー、および、ＤＮＡポリメラーゼ、および典型的な例として熱安定性ポリメラーゼ酵素のような重合の触媒からなる「プライマー対」または「プライマーセット」を用いて、標的ポリヌクレオチドから複製コピーが作られる反応である。ＰＣＲの方法は当技術分野においては周知であり、例えば、「ＰＣＲ：実践アプローチ（ＰＣＲ： Ａ ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ ＡＰＰＲＯＡＣＨ）」（Ｍ．ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎら， ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ ａｔ Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ（１９９１））において開示されている。ＰＣＲまたは遺伝子クローニングのような、ポリヌクレオチドの複製コピーを作製する全ての過程は、本明細書においては集合的に「複製」と呼ばれる。プライマーはまた、サザンブロット法またはノーザンブロット法のような、ハイブリダイゼーション反応におけるプローブとしても使用できる。サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、上記。
【００４５】
「プロモーター」は、ＲＮＡポリメラーゼが結合し、転写を開始する、ＤＮＡ分子上の領域である。あるオペロンにおいては、プロモーターは通常、オペレーターに近接しているが外部にある、オペレーター末端に位置する。プロモーターのヌクレオチド配列により、それに付着する酵素の性質およびＲＮＡ合成速度の双方が決定される。
【００４６】
「遺伝的に修飾された」という用語は、続いて細胞またはその子孫細胞の遺伝子型または表現型が改変されるように、外来の遺伝子または外来の核酸配列を含むこと、および／または発現することを意味する。「外来の核酸」は、プロモーター、エンハンサーおよび遺伝子活性化因子を含むが、これらに限定しない。例えば、遺伝的に修飾された細胞は、その天然の環境においてＦＲＰ−４ポリペプチドをコードするが発現はされないポリヌクレオチドを含み、遺伝子活性化因子の上流への挿入によって、発現が始められた、または発現レベルが増強されたもしくは低減されたような細胞を含む。
【００４７】
本明細書において使用されるように、「発現」または「発現された」は、それによってポリヌクレオチドがｍＲＮＡに転写される、または、転写が増強される過程を指す。その他の態様においては、ＲＮＡは、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質に翻訳される。ポリヌクレオチドがゲノムＤＮＡに由来する場合、適切な真核宿主が選択された場合には、発現はｍＲＮＡのスプライシングを含み得る。
【００４８】
「ハイブリダイゼーション」は、１つまたは複数のポリヌクレオチドが反応し、ヌクレオチド残基の塩基間の水素結合を経て安定化される複合体を形成する反応を指す。水素結合は、ワトソン−クリック塩基対合、フーグスティーン結合によって、または任意の他の配列特異的な仕方で生じ得る。複合体は、二重鎖構造を形成する２つの鎖、複鎖複合体を形成する３つ以上の鎖、自己ハイブリダイズ一本鎖、またはそれらの任意の組み合わせを含み得る。ハイブリダイゼーション反応は、ＰＣＲ反応の開始、またはポリヌクレオチドのリボザイムによる酵素的切断のような、より広範な過程における段階を構成し得る。
【００４９】
ハイブリダイゼーション反応は、異なるストリンジェンシー下において従来的なハイブリダイゼーション技術を用いて実行し得る。一般に、低いストリンジェンシーのハイブリダイゼーション反応は、約４０℃にて、１０×ＳＳＣまたは同等のイオン強度／温度の溶液中において行われる。中程度のストリンジェンシーのハイブリダイゼーション反応は、典型的な例では、約５０℃にて、６×ＳＳＣ中において行われ、高いストリンジェンシーのハイブリダイゼーション反応は、一般的には、約６０℃にて、１×ＳＳＣ中において行われる。または、ＳＡＧＥタグのような集積オリゴヌクレオチドを用いてプローブとしたハイブリダイゼーション反応のために、ＴＭＡＣハイブリダイゼーション技術を使用することができる。ＴＭＡＣハイブリダイゼーションを用いることの利点は、反応条件がオリゴヌクレオチドのＧ＋Ｃ含量に依存しないこと、および、融解温度が、使用されるオリゴマーの長さのみによって決定されることである。
【００５０】
２つの一本鎖ポリヌクレオチド間にて、逆平行配置においてハイブリダイゼーションが生じた場合、その反応は「アニーリング」と呼ばれ、それらのポリヌクレオチドは「相補的」と説明される。ハイブリダイゼーションが第一ポリヌクレオチドの１つの鎖と第二ポリヌクレオチドの間において生じ得る場合、二重鎖ポリヌクレオチドは、もう一方のポリヌクレオチドと「相補的」または「相同」であり得る。「相補性」または「相同性」（一方のポリヌクレオチドがもう一方と相補的である程度）は、一般的に許容される塩基対合則に従って、互いに水素結合を形成すると予測される反対側の鎖における塩基の割合によって定量化できる。第二のポリヌクレオチドに１００％相補的であるポリヌクレオチドは、互いの「補足物」であると理解される。
【００５１】
「組成物」は、活性な作用物質ならびに不活性な（例えば、検出可能な試薬および標識または薬学的に許容される担体）、またはアジュバントのように活性な、その他の化合物または組成物との組み合わせを意味することが意図される。
【００５２】
「薬学的組成物」は、組成物をインビトロ、インビボまたはエクスビボにおける診断的または治療的使用に適したものにする、活性作用物質と、不活性または活性な担体との組み合わせを含むことが意図される。
【００５３】
本明細書において使用されるように、「薬学的に許容される担体」という用語は、リン酸緩衝食塩水、水、およびエマルジョン（例えば、水中油型または油中水型エマルジョン）といった任意の標準薬学的担体、および様々なタイプの湿潤剤を包含する。組成物はまた、安定化剤および保存剤を含み得る。担体、安定化剤およびアジュバントの例については、マーティン（Ｍａｒｔｉｎ）、レミントンの製剤科学、第１５版（ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ ＰＨＡＲＭ．ＳＣＩ．， １５ｔｈ Ｅｄ．， Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌ．Ｃｏ．， Ｅａｓｔｏｎ（１９７５））を参照のこと。
【００５４】
「有効量」とは、有益なまたは望ましい結果をもたらすのに十分な量である。有効量は、１回または複数回の投与、適用または投薬によって施すことができる。
【００５５】
「被検体」「個体」または「患者」は、本明細書においては交換可能なように使用され、脊椎動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトを指す。哺乳動物は、マウス、サル、ヒト、家畜、競技用動物、およびペットを含むが、これらに限定しない。
【００５６】
「対照」は、比較の目的のために実験において用いられる、代替の被検体またはサンプルである。対照は、「正」または「負」のものが可能である。例えば、実験の目的が、遺伝子の変化した発現レベルと特定のタイプの癌との相関を決定することである場合、一般に、正の対照（そのような変化を有し、およびその疾患に特徴的な症候群を表す、被検体または被検体由来のサンプル）、および負の対照（変化した発現、およびその疾患の臨床的症候群を欠く、被検体または被検体由来のサンプル）を使用することが好ましい。
【００５７】
「遺伝子送達媒体」は、挿入されたポリヌクレオチドを宿主細胞に運ぶことができる任意の分子として定義される。遺伝子送達媒体の例は、リポソーム、カチオン性リポソーム、ウイルス（例えば、バキュロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルスおよびレトロウイルス）、バクテリオファージ、コスミド、プラスミド、真菌ベクター、ならびに、様々な真核宿主および原核宿主における発現について説明されている、および、遺伝子治療および簡単なタンパク質発現のために使用できる、本技術分野において典型的に使用される他の組み換え媒体である。
【００５８】
「ウイルスベクター」は、インビボ、エクスビボまたはインビトロのいずれかにおいて宿主細胞にまで送達されるポリヌクレオチドを含む、組み換えにより作製されたウイルスまたはウイルス粒子として定義される。ウイルスベクターの例には、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ関連ウイルスベクターおよび同様のものが含まれる。遺伝子導入がレトロウイルスベクターによって仲介される局面においては、ベクター構築物は、レトロウイルスゲノムまたはその部分を含むポリヌクレオチド、および挿入されたポリヌクレオチドを指す。本明細書において使用されるように、「レトロウイルス仲介の遺伝子導入」または「レトロウイルス形質導入」は、同じ意味を有し、細胞に入り、そのゲノムを宿主細胞ゲノムに組み込むウイルスによって、遺伝子または核酸配列が宿主細胞に安定して導入される過程を指す。ウイルスは、その通常の感染機構を経て宿主細胞に入ることができる、または、細胞に入るように、異なる宿主細胞表面受容体もしくはリガンドに結合するように改変されることが可能である。本明細書において使用されるように、レトロウイルスベクターは、ウイルスの侵入機構またはウイルス様の侵入機構を通じて、外来の核酸を細胞に導入できるウイルス粒子を指す。
【００５９】
レトロウイルスはそれらの遺伝情報をＲＮＡの形態で保有している；しかし、ウイルスが一旦細胞に感染すると、ＲＮＡはＤＮＡの形態に逆転写され、それは感染された細胞のゲノムＤＮＡに組み込まれる。組み込まれたＤＮＡの形態はプロウイルスと呼ばれる。
【００６０】
遺伝子導入が、アデノウイルス（Ａｄ）またはアデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）のようなＤＮＡウイルスベクターに仲介される局面においては、ベクター構築物は、ウイルスゲノムまたはその部分を含むポリヌクレオチド、および挿入されるポリヌクレオチドを指す。アデノウイルス（Ａｄ）は、比較的よく特徴付けられた、５０を超える血清型を含む相同のウイルス群である（例えば国際公開公報第９５／２７０７１号を参照のこと）。Ａｄは、増殖させるのが容易で、宿主ゲノムへの組み込みを必要としない。組み換えＡｄ由来のベクター、特に組み換えおよび野生型ウイルスの発生の可能性を低減するものも構築されている（国際公開公報第９５／００６５５号；同第９５／１１９８４号を参照のこと）。野生型ＡＡＶは、高い感染性、および宿主細胞ゲノムに組み込まれる高い特異性を有する（ＨｅｒｍｏｎａｔおよびＭｕｚｙｃｚｋａ（１９８４） ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８１：６４６６〜６４７０；Ｌｅｂｋｏｗｓｋｉら（１９８８） Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． ８：３９８８〜３９９６）。
【００６１】
プロモーター、およびポリヌクレオチドを機能的に連結することができるクローニング部位の双方を含むベクターは、当技術分野においては周知である。そのようなベクターは、インビトロまたはインビボにおいてＲＮＡを転写することができ、ストラタジーン社（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ， Ｌａ Ｊｏｌｌａ， ＣＡ）およびプロメガバイオテック社（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｂｉｏｔｅｃｈ， Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩ）のようなメーカーから購入できる。発現および／またはインビトロの転写を最適化するために、余計な、潜在的な、不適切な代替翻訳開始コドン、または、転写レベルもしくは翻訳レベルのいずれかにおいて、発現を阻害もしくは低減し得る他の配列を取り除くために、クローンの５’および／または３’の非翻訳部分を除去する、加える、または変化させることが必要となり得る。または、発現を増強するために、開始コドンの５’に直接、コンセンサスリボソーム結合部位を挿入することができる。
【００６２】
遺伝子送達媒体はまた、ＤＮＡ／リポソーム複合体、および標的とされるウイルスタンパク質ＤＮＡ複合体を含めた、幾つかの非ウイルスベクターをも含む。標的指向抗体またはその断片をも含むリポソームは、本発明の方法において使用することができる。細胞への送達を増強するために、本発明の核酸またはタンパク質を、例えばＴＣＲ、ＣＤ３またはＣＤ４のような細胞表面抗原に結合する抗体またはその結合断片に連結することができる。
【００６３】
ポリヌクレオチドは、当技術分野において既知の方法を用いてベクターゲノムに挿入される。例えば、挿入配列およびベクターＤＮＡは、適した条件下において、制限酵素と接触させ、互いに対合でき、リガーゼによって結合され得るような、各分子上の相補的な末端を作製することができる。または、合成核酸リンカーを、制限酵素により切断されたポリヌクレオチドの末端にライゲーションできる。これらの合成リンカーは、ベクターＤＮＡにおける特定の制限部位に対応する核酸配列を含む。さらに、終止コドンおよび適切な制限部位を含むオリゴヌクレオチドを、例えば以下の幾つかまたは全てを含むベクターへの挿入のためにライゲーションできる：哺乳動物細胞における安定したまたは一過性のトランスフェクタントの選択のための、ネオマイシン耐性遺伝子のような、選択可能なマーカー遺伝子；高レベルの転写のための、ヒトＣＭＶの前初期遺伝子由来のエンハンサー／プロモーター配列；ｍＲＮＡの安定性のための、ＳＶ４０由来の転写終結シグナルおよびＲＮＡプロセシングシグナル；適したエピソームの複製のための、ＳＶ４０ポリオーマ複製起点およびＣｏｌＥ１；汎用性のあるマルチクローニング部位；挿入されたポリヌクレオチドの３’側の安定化因子、および、センスＲＮＡおよびアンチセンスＲＮＡのインビトロ転写のための、Ｔ７およびＳＰ６ ＲＮＡプロモーター。当技術分野においては、他の方法が既知であり、利用可能である。
【００６４】
「宿主細胞」は、ベクターのための、または外来のポリヌクレオチド、ポリペプチドおよび／もしくはタンパク質の取り込みのためのレシピエントとなり得る、またはレシピエントであった、任意の個々の細胞または細胞培養を含むことを意図される。それはまた、１つの細胞の子孫細胞を含むことを意図され、天然の、偶発的な、または意図的な突然変異によって、子孫細胞は元の親細胞に（形態的に、またはゲノムもしくは全ＤＮＡの相補性において）必ずしも完全に同一ではない。細胞は、原核細胞または真核細胞が可能であり、細菌細胞、酵母細胞、植物細胞、昆虫細胞、動物細胞、および、例えばマウス、ラット、サルまたはヒトのような哺乳動物細胞を含むが、これらに限定しない。
【００６５】
「抗体」は、抗原に結合できる免疫グロブリン分子である。本明細書において使用されるように、本用語は、完全な免疫グロブリン分子のみならず、必要とされる特異性を有する抗原認識部位を含む、免疫グロブリン分子の抗イディオタイプ抗体、突然変異体、断片、融合タンパク質、ヒト化タンパク質および修飾体をも包含する。
【００６６】
本明細書において使用されるように、「発現」は、ポリヌクレオチドがｍＲＮＡに転写され、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質に翻訳される過程を指す。ポリヌクレオチドがゲノムＤＮＡに由来する場合、適切な真核宿主が選択された場合には、発現はｍＲＮＡのスプライシングを含み得る。発現に必要とされる制御因子は、ＲＮＡポリメラーゼを結合するためのプロモーター配列、およびリボソーム結合のための転写開始配列を含む。例えば、細菌発現ベクターは、ｌａｃプロモーターのようなプロモーター、および転写開始のためのシャイン・ダルガーノ配列、および開始コドンＡＵＧを含む（Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）、上記）。同様に、真核発現ベクターは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩのための異種または同種のプロモーター、下流のポリアデニル化シグナル、開始コドンＡＵＧ、およびリボソームの離脱のための終止コドンを含む。そのようなベクターは、商品として得ることができる、または、例えば一般的なベクターの構築について下記にて説明される方法のような、当技術分野において既知の方法において説明される配列によって構築することができる。
【００６７】
「被検体」は、脊椎動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトである。哺乳動物は、マウス、サル、ヒト、家畜、競技用動物、およびペットを含むが、これらに限定しない。
【００６８】
「対照」は、比較の目的のために実験において使用される代替の被検体またはサンプルである。対照は「正」または「負」のものが可能である。
【００６９】
本適用の方法におけるアッセイ法に適した「候補作用物質」は、例えば、化学的、栄養学的または生物学的供給源からの、任意のタイプの分子が可能である。作用物質は、天然に生じる、または合成によって作製されることが可能である。例えば、作用物質は、典型的には有機分子であり、好ましくは、５０ Ｄａより大きくかつ約２，５００ Ｄａ未満の分子量を有する小さな有機化合物であるが、数多くの化学的クラスを包含し得る。そのような分子は、タンパク質または核酸との構造的相互作用に必要な官能基を含み得る。例としては、化学的作用物質は、新奇の、未試験の化学薬品、既知の治療的作用物質のアゴニスト、アンタゴニスト、または修飾体が可能である。
【００７０】
候補作用物質はまた、ペプチド、糖類、脂肪酸、抗体、ステロイド、プリン、ピリミジン、毒素結合サイトカイン、その誘導体または構造的類似体、または生物学的反応修飾因子の効果を模倣するよう製造された分子を含むが、これらに限定するものでなく、生体分子の間に認めることができる。栄養学的供給源に由来する候補作用物質の例は、植物もしくは動物の供給源からの抽出物、またはその抽出物を含むが、これらに限定しない。
【００７１】
候補作用物質は、合成化合物または天然化合物のライブラリを含む、広範な種類の供給源から得ることができる。または、細菌、真菌、植物、および動物の抽出物の形態における天然化合物のライブラリが、利用可能である、または容易に作製でき、天然の、または合成によって作製されたライブラリまたは化合物は、化学的、物理的および生化学的な従来法によって、容易に修飾され、コンビナトリアル・ライブラリを作製するために使用できる。既知の薬理学的作用物質は、アシル化、アルキル化、エステル化、アミド化等のような、無作為の、または管理された化学的修飾を受け、構造的類似体を作製することが可能である。
【００７２】
リガンドは、ＦＲＰ−４遺伝子産物またはタンパク質と相互作用し得る、任意のタンパク質、またはタンパク質の部分があり得る。そのようなリガンドは、可溶性または膜結合性であり得る。リガンドは、天然に生じるタンパク質、または、合成もしくは組み換えによって作製されたタンパク質であり得る。リガンドはまた、ＦＲＰ−４タンパク質と相互作用する場合にリガンドとして作用する、非タンパク性分子（例えば小分子）でもよく、また、本明細書の上記にて候補作用物質として説明される分子であってもよい。リガンドとＦＲＰ−４のリガンド結合ドメインとの間の相互作用は、任意の共有結合相互作用または非共有結合相互作用を含むが、これらに限定しない。リガンド結合ドメインは、ＦＲＰ−４リガンドと直接的または間接的に相互作用する、ＦＲＰ−４分子の任意の領域であり得る。
【００７３】
本明細書において使用されるように、「サイトカイン」という用語は、例えば成長または増殖の誘導のような、様々な効果を細胞に及ぼす数多くの因子のうち任意のものを指す。本発明の実施において、単独でまたは組み合わせて使用できるサイトカインは以下に限定するものではないが、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、造血幹細胞因子（ＳＣＦ）、インターロイキン−３（ＩＬ−３）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、インターロイキン−１２（ＩＬ−１２）、Ｇ−ＣＳＦ、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、インターロイキン−１α（ＩＬ−１α）、インターロイキン−１１（ＩＬ−１１）、ＭＩＰ−１、白血病抑制因子（ＬＩＦ）、ｃ−ｋｉｔリガンド、トロンボポエチン（ＴＰＯ）およびｆｌｔ３リガンドを含む。本発明はまた、１つまたは複数のサイトカインが培地から特異的に排除されるような培養条件をも含む。サイトカインは、例えばジェネンテック社（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ， Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ， ＣＡ）、アムジェン社（Ａｍｇｅｎ， Ｔｈｏｕｓａｎｄ Ｏａｋｓ， ＣＡ）、Ｒ＆Ｄシステムズ社（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ， Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ， ＭＮ）およびイミュネックス社（Ｉｍｍｕｎｅｘ， Ｓｅａｔｔｌｅ， ＷＡ）のような、幾つかの販売者から購入できる。常にはっきりとは明言されないが、野生型サイトカインまたは精製したサイトカイン（例えば、組み換えによって作製された、またはそのムテイン）と同様の生物学的活性を有する分子は、本発明の精神および範囲内にて使用されるよう意図されるということが意味される。
【００７４】
「培養する」という用語は、様々な種類の培地上または培地中における細胞または生物体のインビトロの増殖を指す。培養において増殖されるある細胞の子孫細胞は、親細胞と完全に同一ではない可能性がある（即ち、形態的に、遺伝的に、または表現型的に）ことが理解される。「増殖された」は、細胞のいかなる増殖または分裂をも意味する。
【００７５】
交換可能なように、および単数形または複数形のいずれかにおいて使用される、「癌」、「新生物」および「腫瘍」という用語は、それらを宿主生物に対して病的なものにする、悪性転換を受けた細胞を指す。一次癌細胞（即ち、悪性転換の部位の近傍から得られる細胞）は、十分に確立された技術、特に組織学的検査によって、非癌性細胞から容易に識別することができる。本明細書において使用されるように、癌細胞の定義は、一次癌細胞のみならず、癌祖先細胞に由来するいかなる細胞をも含む。これは、転移した癌細胞、および癌細胞に由来するインビトロの培養および細胞系を含む。通常固形腫瘍として症状発現するあるタイプの癌を指す場合、「臨床的に検出可能な」腫瘍は、腫瘍塊に基づいて；例えば、ＣＴスキャン、磁気共鳴映像法（ＭＲＩ）、Ｘ線、超音波または触診のような手法によって、検出できるものである。この定義を満たすには、生化学的所見または免疫学的所見のみでは不十分であり得る。腫瘍細胞はしばしば、腫瘍特異的である抗原を発現する。「腫瘍関連抗原」または「ＴＡＡ」という用語は、腫瘍に関連する、または腫瘍に特異的な抗原を指す。
【００７６】
本明細書において使用されるように、「固相支持体」は、特定のタイプの支持体に限定されない。かなり多数の支持体が利用可能であり、当業者に知られている。固相支持体は、シリカゲル、樹脂、誘導プラスチックフィルム、ガラスビーズ、綿、プラスチックビーズ、アルミナゲルを含む。適した固相支持体は、望ましい最終用途および様々な合成プロトコールについての適切性に基づいて選択できる。例えば、ペプチド合成については、固相支持体とは、ポリスチレン（例えば、Ｂａｃｈｅｍ Ｉｎｃ．， Ｐｅｎｉｎｓｕｌａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ等から得られるＰＡＭ樹脂）、ＰＯＬＹＨＩＰＥ（登録商標）樹脂（Ａｍｉｎｏｔｅｃｈ， Ｃａｎａｄａから入手できる）、ポリアミド樹脂（Ｐｅｎｉｎｓｕｌａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから入手できる）、ポリエチレングリコールとグラフト共重合されたポリスチレン樹脂（ＴｅｎｔａＧｅｌ（商標）、Ｒａｐｐ Ｐｏｌｙｍｅｒｅ， Ｔｕｂｉｎｇｅｎ， Ｇｅｒｍａｎｙ）またはポリジメチルアクリルアミド樹脂（Ｍｉｌｌｉｇｅｎ／Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ， Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａから得られる）のような樹脂を指し得る。ペプチド合成についての好ましい態様においては、固相支持体は、ポリジメチルアクリルアミド樹脂を指す。
【００７７】
「トランスジェニック動物」は、遺伝的に操作された動物、または遺伝的に操作された動物の子孫を指す。トランスジェニック動物は、少なくとも１つの非関連生物体に由来する（細菌、ウイルス、植物、または他の動物に由来するような）遺伝物質を含み得る、または、遺伝子産物の発現を阻害するような突然変異を含み得る。
【００７８】
「腫瘍性骨軟化症（ＯＯＭ）」、「腫瘍性低リン酸血症骨軟化症（ＯＨＯ）」または「腫瘍関連骨軟化症」の用語は、主に、低リン酸血症、高リン酸塩尿、１、２５−ジヒドロキシビタミンＤの異常に低い血清濃度および骨軟化症により特徴付けられる腫瘍獲得性の症候群を意味している。前立腺および肺のガン、線維性骨異形成症、線状脂腺性母斑症候群、神経線維腫症および燕麦細胞癌もまたＯＯＭに関連しているけれども、ＯＯＭ関連腫瘍は主として血管周囲細胞腫などの間葉系起源である。したがって、ＯＯＭ症候群は腫瘍随伴性の病因学を有すると記載することが可能である。患者における腫瘍の手術的除去はしばしば、ＯＯＭに関連する生化学的および臨床的不良の完全な、またはほぼ完全な解決につながる。
【００７９】
「フォスファトニン」および「フォスファトニン関連」の用語は、リン酸恒常性の制御に特異的に関わるポリペプチド液性因子を意味するために相互交換可能的に使用される。「フォスファトニン活性」を有する因子は無機リン酸の腎臓再吸収を下方調節する。フォスファトニン活性は、フォスファトニンおよび付加的な調節因子を組み合わせた機能を組み入れる。
【００８０】
腫瘍性骨軟化症関連遺伝子は、対照腫瘍（ＯＯＭに関連していない病理学的に類似の腫瘍）に対して相対的に過剰発現または低発現していると同定された遺伝子を含む。腫瘍性骨軟化症において、増加調節または下方調節されている遺伝子は、いくつかの異なる生化学経路に関与するタンパク質をコードするかもしれない。これらは、リン酸制御、骨石灰化、およびタンパク質合成、プロセシングおよび分泌を含む。
【００８１】
リン酸代謝制御は腫瘍性骨軟化症の症状を媒介することにおいて中心的な役割を果たす。ＯＯＭ腫瘍においてその発現が変更されている遺伝子は多様な機構を通じてリン酸代謝に影響を与えることが可能である。例えば、腫瘍は、量が増加したフォスファトニン（その活性は腎臓におけるリン酸再吸収を阻害することを含む分泌性体液因子）を直接生産するかもしれない。または、ＯＯＭ腫瘍細胞は、フォスファトニンの効果を引き出す責任があるフォスファトニン受容体および細胞内タンパク質などの、フォスファトニン効果を媒介するために必要な付属ポリペプチドの腎臓における発現を変化させる１つまたは複数の因子を生産することが可能であろう。
【００８２】
ＯＯＭ腫瘍細胞により変更された遺伝子発現はまた、より複雑な機構によりリン酸代謝を変化させることも可能である。例えば、腫瘍生産因子は、通常はフォスファトニンにより、またはフォスファトニンに応答して直接調整されている遺伝子の発現を上方調節することが可能であろう。そのようなＯＯＭ腫瘍生産因子は、リン酸取りこみまたはリン酸分泌のいずれかを制御するために必要であるリン酸輸送分子および他の細胞タンパク質の発現を増加させることが可能であろう。または、ＯＯＭ腫瘍因子は細胞外制御因子またはリン酸担体、またはフォスファトニンの発現を変化させることが可能であろう。
【００８３】
リン酸代謝を調節するＯＯＭ関連遺伝子は、異常なリン酸代謝に関連する様々な疾患病態のための治療的作用物質を開発するための有用な候補である。これらは、腎臓性骨形成異常症、腎臓移植後のリン酸恒常性の変化、末期腎疾患（ＥＲＳＤ）および急性腎疾患、骨不良、低リン酸血症、高リン酸血症、副甲状腺機能低下症、および偽性副甲状腺機能低下症などの腎臓病態を含む。
【００８４】
リン酸代謝関連因子は、また様々な別機構を通じて、疾患病態の有用な媒介因子を提供することもできるだろう。例えば、ＥＲＳＤの間、その経路内のフォスファトニンまたは他のタンパク質は、小腸におけるリン酸吸収を阻害するかもしれない。そのような因子はまた、腎臓の近位尿細管においてリン酸取りこみを増強するかもしれない。したがって、これらの因子の活性の調節は、この疾患の症状を調整するために使用することができる。
【００８５】
低リン酸血症または低血清リン酸レベルにより特徴付けられる病態において、血清リン酸レベルを低下させることに関与している任意のタンパク質を阻止する、またはその機能を阻害することは、効果的な治療となりうるであろう。この型の治療は、Ｘ染色体低リン酸血症くる病、ビタミンＤ依存性くる病、フランコーニ（Ｆｒａｎｃｏｎｉ）症候群、腎移植後病態および腫瘍性骨軟化症を含む範囲の病態において有用であることができるであろう。
【００８６】
増加したリン酸レベルまたは高リン酸血症により特徴付けられる疾患は、フォスファトニン経路において、血清リン酸レベルを低下させるために作用する任意のタンパク質を指向する治療により、影響されうるだろう。高リン酸血症に関連付けられる疾患は、副甲状腺機能低下症（分泌されるＰＴＨのレベルが細胞外のカルシウムおよびリン酸のレベルを維持するために不十分であり、低カルシウム血症および高リン酸血症につながる）；偽性副甲状腺機能低下症（生化学的な副甲状腺機能低下症、低カルシウム血症および高リン酸血症、ＰＴＨの分泌増加およびＰＴＨの生物学的作用への抵抗性により特徴付けられる疾患群）；全身感染、重篤な高熱、挫傷、非外傷性横紋筋融解および血液ガンの細胞傷害性治療後の腫瘍溶解症候群により引き起こされる、細胞から細胞外液への経細胞リン酸シフト、を含む。
【００８７】
リン酸代謝の調節の他に、その発現がＯＯＭ腫瘍細胞において変更されている因子は、そのポリペプチド産物が、骨石灰化を媒介するために直接骨形成原細胞に作用する遺伝子を含むことが可能である。ＯＯＭに関連しているそのようなタンパク質は、ミネラリゼーション不良に関連している疾患を促進するまたは阻害するのいずれかであってもよい。骨石灰化経路内のタンパク質の可能性のある機能は、骨石灰化の阻害、骨石灰化の早期段階の制御、および骨細胞分化および骨発生の調整を含む。
【００８８】
様々な型のポリペプチド因子が、骨石灰化を調節することが見出されるかもしれない。例えば、細胞外マトリックスタンパク質（ＥＣＭ）は骨の重要な構成物質である。骨、軟骨および歯を形成する組織においては、他の結合組織のそれらとは異なって、マトリックスは石灰化されるユニークな能力を有する。さらに、細胞生存性および形態形成の調整は、様々に多くののＥＣＭタンパク質との適切な接触により影響されることがよく知られている。したがって、ＯＯＭ腫瘍生産ＥＣＭタンパク質は、骨細胞に直接作用することにより、骨ミネラル恒常性の天然の過程を変化させることが可能であろう。または、ＯＯＭ腫瘍細胞は、骨細胞分化、成長および代謝を制御する核酸可能な可溶性因子を生産することが可能であろう。そのような因子はまた、骨石灰化を制御する治療的作用物質の開発の有用な標的を提供する。
【００８９】
多数の重篤な病的病態が骨石灰化における不良に関連している。これらは、骨粗鬆症（低骨質量および骨組織の微細構造変質により特徴付けられる代謝性骨疾患）；骨軟化症（成長休止後に生じる、および骨のみが関与し、成長板は関与しない骨石灰化における不良）；くる病（骨基質、すなわち類骨の成長骨におけるミネラリゼーションの疾患；成長板（骨端）および新規に形成されたトラベキュラ（ＴＲＡＥＢＡＣＵＬＡＲ）および皮質骨の両方が関与する）；低リン酸血症（アルカル性ホスファターゼの組織非特異的アイソザイムの活性低下により特徴付けられる稀な遺伝性の型のくる病または骨軟化症（１００，０００出生に１人）；およびファンコーニ（Ｆａｎｃｏｎｉ）症候群および腎臓尿細管酸性血症（グルコース、リン酸、アミノ酸、重炭酸塩、尿酸、クエン酸および他の有機酸、および低分子量タンパク質の再吸収障害を含む、およびくる病および骨軟化症に関連している、腎臓近位尿細管の輸送能力の一般的な不良）を含む。
【００９０】
骨形成、ミネラリゼーション、および維持に関与している基礎的な過程を調節することが発見されているＯＯＭ腫瘍生産因子が、これらの疾患の進行を阻害するために有用な標的を提供することが可能であろう。
【００９１】
骨石灰化における不良により特徴付けられる疾患の他に、骨の病的病態は、ページェット病、オステオミエロイティス（ＯＳＴＥＯＭＹＥＬＯＩＴＩＳ）、骨肉腫および疲労骨折などの骨再形成における不良を含む。骨石灰化不良の事例のように、骨代謝および骨細胞発生を直接調節するＯＯＭ腫瘍細胞から同定されたポリペプチド因子は、別の骨病理により特徴付けられる疾患を治療するための新規の治療的作用物質を開発するための有用な標的である。さらに、ある事例においては、ＯＯＭ腫瘍関連因子の発現は、診断試験がそのような病態を同定するために有用なマーカーにこれらの遺伝子をする、骨疾患の診断として見出されてもよい。
【００９２】
治療適用
本発明は、ＦＲＰ−４遺伝子の活性を変化させる、またはＦＲＰ−４タンパク質の活性を変化させることにより、被検体において、リン酸恒常性および／または骨石灰化を調節する方法を提供する。本発明のある一つの実施態様においては、リン酸恒常性は、ＦＲＰ−４の活性を変化させる有効量の作用物質を被検体に送達することにより調節される。発明を実施するために有用な作用物質は、有機低分子、ポリペプチド、および抗体を含むが、これらに限定しない。ＦＲＰ−４タンパク質の活性を阻害する作用物質はリン酸再吸収を増加させるために有用であり、一方ＦＲＰ−４活性を刺激する作用物質はリン酸再吸収を減少させるために有用である。したがって、本発明の方法は、低リン酸血症または高リン酸血症のいずれかにより特徴付けられる病態に関して使用されることが可能である。
【００９３】
本発明の別個の実施態様においては、リン酸恒常性はＦＲＰ−４遺伝子の発現を変化させる作用物質を送達することにより調節される。そのような作用物質は、制限することなく、アンチセンスＲＮＡ分子およびリボザイム、アンチセンスオリゴヌクレオチドを含む遺伝子送達媒体、およびＦＲＰ−４遺伝子の発現を特異的に阻害する有機低分子またはポリペプチドを含むことが可能である。ＦＲＰ−４遺伝子の発現の阻害は、被検体においてリン酸再吸収を増加させるために有用である。
【００９４】
本発明はまた、ＦＲＰ−４タンパク質の活性を変化させる作用物質を送達することにより、および／またはＦＲＰ−４遺伝子の発現を変化させる作用物質を送達することにより、腎臓リン酸輸送を調節する方法を提供もする。さらに、本発明は、腫瘍性骨軟化症などの、低リン酸血症または高リン酸血症関連疾患の症状を軽減する方法を包含する。本発明の方法を実施するためにポリヌクレオチド、ポリペプチドおよび治療的作用物質およびその誘導体を、本明細書に記載されている治療法のために、薬学的組成物において、単独または他の活性作用物質と組合わせて、使用することが可能である。軽減されることが可能な症状は、低リン酸血症、リン酸塩尿、１、２５−ジヒドロキシビタミンＤの低い血清濃度および骨軟化症を含むが、これらに限定しない。
【００９５】
ある実施態様においては、腫瘍性骨軟化症などの低リン酸血症関連疾患を治療するために、またはそれに関連する症状を緩和するために、下記のスクリーニングアッセイ法により同定される作用物質を含む薬学的組成物の有効量が、被検体に投与される。好ましくは、薬学的組成物は、腫瘍性骨軟化症を有する被検体においてＦＲＰ−４タンパク質機能を調節する能力を有する；および、それにより、被検体において正常な血清リン酸レベルを回復する能力を有する。
【００９６】
ＦＲＰ−４遺伝子およびタンパク質調節作用物質の送達は、Ｘ染色体低リン酸血症くる病、腫瘍性骨軟化症、横紋筋融解症、心筋症、腫瘍性石灰症、腎不全、および骨石灰化を含むリン酸恒常性関連疾患の治療に有用である。
【００９７】
別の実施態様においては、リン酸再吸収を減少させるために、ＦＲＰ−４ポリペプチドを含む薬学的組成物の有効量が被検体に投与される。薬学的組成物は、分泌タンパク質である、ＦＲＰ−４ポリペプチドを含み、そしてリン酸恒常性関連疾患を有する患者において異常に上昇した血清リン酸レベルを低下しうることが望ましい。または、ＦＲＰ−４ポリペプチド含有薬学的組成物はさらに、リン酸恒常性制御において所望の機能を促進する活性作用物質を含む。適切な活性作用物質は、これらに制限するものではないが、成熟ＦＲＰ−４タンパク質の翻訳後修飾およびプロセシングに関与する酵素または補因子；または循環中およびリン酸恒常性の部位においてＦＲＰ−４ポリペプチドの活性型を維持する責任がある因子、を含む。
【００９８】
または、抗ＦＲＰ−４リガンド抗体は、抗イディオタイプ抗体を免疫原として投与することにより誘導されることが可能である。一例として、本明細書に記載されているように調製された抗体調製物は、宿主動物において抗イディオタイプ抗体を誘導するために使用できる。適切な希釈剤中の組成物を宿主動物に投与する。投与（通常は繰り返し投与）の後、宿主は抗イディオタイプ抗体を生産する。Ｆｃ領域への免疫原性応答を除去するために、宿主動物と同一の種により生産される抗体を使用することができ、また、投与される抗体のＦｃ領域を除去することができる。宿主動物における抗イディオタイプ抗体の誘導に続いて、抗体組成物を提供するために血清または血漿が採集される。組成物は当技術分野において既知の方法により精製されることが可能である（例えば親和性クロマトグラフィー）。
【００９９】
様々な送達システムが既知である、および治療的作用物質を投与するために使用されることが可能である、例えば、リポソームへの封入、微粒子、マイクロカプセル、組換え細胞による発現、受容体媒介性エンドサイトーシス（例えば、ＷｕおよびＷｕ（１９８７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：４４２９〜４４３２、を参照）、レトロウイルスまたは他のベクターなどの一部分としての治療用核酸の構築など。送達方法は、制限することなく、経皮、遺伝子治療、動脈内、筋肉内、静脈内、鼻腔内、および経口経路を含む、および持続性送達システムを含む。特定の実施態様においては、本発明の薬学的組成物を治療が必要な領域に局所的に投与することが望ましいかもしれない；これは、例えば、そして制限のためではなく、手術中の局所注入、注射により、またはカテーテルを用いて、または治療薬をコードする配列の標的化遺伝子送達により達成されてもよい。
【０１００】
それらの意図した目的に関して有効であるとして本明細書において同定された薬学的組成物は、腎臓における異常なリン酸輸送に関連する疾患に罹患しやすい、または発症する危険性がある被検体または個人に投与されることが可能である。作用物質が、マウス、ラットまたはヒト患者などの被検体に投与されるとき、作用物質は薬学的に許容される担体に付加され、そして被検体に対して全身的にまたは局所的に投与されることが可能である。治療量は経験的に決定されることが可能であり、そして、治療される患者の病理、治療される被検体、および作用物質の効力および毒性により変動するであろう。
【０１０１】
インビボ投与は、治療の経過に渡って、１回の用量で、連続的にまたは分断的に、実行されることが可能である。最も効果的な投与方法および用量を決定する方法は、当業者には周知であり、そして治療に使用される組成物、治療目的、治療される標的細胞、および治療される被検体により変動するであろう。単回または複数回投与は、治療医師により選択される用量レベルおよびパターンを用いて実施されることが可能である。作用物質の適切な用量製剤および投与法は以下に見出すことが可能である。
【０１０２】
本発明の方法を実施するために有用な作用物質および組成物は、医薬品メーカーにおいて、および薬学的組成物における活性原料成分などの従来の処理とともに投与されることにより、ヒトおよび他の動物の治療のために使用されることが可能である。
【０１０３】
薬学的組成物は、経口的に、鼻腔内的に、非経口的に、経皮的にまたは吸入治療により投与されることが可能で、錠剤、トローチ、顆粒、カプセル、丸薬、アンプル、座薬、およびエアロゾルの形をとってもよい。それらはまた、遺伝子治療、懸濁液、溶液および水性または非水性希釈剤中の活性原料成分の乳濁液、シロップ、顆粒、または粉末の形を取ってもよい。本発明の作用物質の他に、薬学的組成物は他の治療に有用な作用物質と組み合わせることが可能である。
【０１０４】
発現解析
本発明はまた、中程度のハイブリダイズストリンジェンシー条件下で適切なサンプルを適切なポリヌクレオチドプローブに接触させること、および任意の相補的ヌクレオチドを検出し、それにより細胞を検出することにより、ＦＲＰ−４遺伝子にコードされているポリペプチドを発現する細胞を検出するための方法もまた提供する。
【０１０５】
適切なポリヌクレオチドプローブは、ＦＲＰ−４　ｃＤＮＡの一部分に相補的なオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド分子を調製することにより、配列番号：１において示されているＦＲＰ−４　ｃＤＮＡの配列に由来することが可能である。１０または２０ヌクレオチドから約５０ヌクレオチドのサイズ範囲にあるオリゴヌクレオチドプローブは、自動ＤＮＡ合成機を用いて生産されることが可能である。または、ポリヌクレオチドプローブは、様々なＤＮＡポリメラーゼ酵素を用いたＰＣＲまたはニックトランスレーションなどの当技術分野において周知の方法を用いて、ＦＲＰ−４　ｃＤＮＡ配列を含む単離されたポリヌクレオチドから調製されることが可能である。そのようなプローブは典型的には長さが５０から５００塩基対のサイズ範囲である。適切なポリヌクレオチドプローブは反復ＤＮＡモチーフを含むべきではなく、および標的ＦＲＰ−４配列以外の遺伝子に高い相同性を有するべきではない。
【０１０６】
発明はさらには、ＦＲＰ−４　ｃＤＮＡ配列由来のプライマー対を用いて、適切なサンプルに関してＲＴ−ＰＣＲを実施することにより、ＦＲＰ−４遺伝子によりコードされるポリペプチドを発現する細胞を検出するための方法を提供する。ＲＴ−ＰＣＲは当技術分野においてよく確立された方法を用いて実施されることが可能である。適切なプライマー対は、ＦＲＰ−４　ｃＤＮＡの反対側の鎖上の配列に相補的である、類似のアニーリング温度のオリゴヌクレオチドであろう。プライマーは、長さが５０から１０００塩基対の、好ましくは２５０から７５０塩基対の範囲のＦＲＰ−４　ｃＤＮＡの一部を増幅するであろう。ＰＣＲ実施のための最適な条件は、適切なＰＣＲ条件を同定するために、プライマー濃度、マグネシウム濃度、アニーリング温度、およびサイクル数などの反応条件が変更される、一連の別の反応条件を比較することにより、過度の実験をすることなく決定されることが可能である。
【０１０７】
ＦＲＰ−４発現の検出およびモニターの方法は、腫瘍性骨軟化症に関連する腫瘍細胞を検出するために有用である。そのような解析に適切なサンプルは、被検体から取り出された組織サンプルから取得することができる。インビボで実施されるとき、その方法は、腫瘍性骨軟化症誘導腫瘍の位置を決定するために有用である。ＦＲＰ−４発現レベルを検出するための方法は、ＦＲＰ−４発現レベルを定量化するために使用されることが可能である。さらに、異常なリン酸代謝を示す発現レベルを決定するために、正常および疾患細胞においてＦＲＰ−４発現レベルを比較することが有用である。したがって、本発明は、本発明の方法を用いる治療の適切な候補である被検体を同定するためにこれらの方法を使用することを想定する。最終的には、ＦＲＰ−４遺伝子発現を検出する方法はまた、そのような遺伝子送達媒体が被検体に投与される場合、ＦＲＰ−４遺伝子配列を含む遺伝子送達媒体をモニターするためにも有用である。
【０１０８】
上記の方法はさらに、上記で定義される活性化細胞の使用により修飾されることが可能である。
【０１０９】
細胞の表現型の調節
本発明はさらに、ＦＲＰ−４ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの発現を変化させる作用物質を送達することを含む、腫瘍性骨軟化症関連腫瘍細胞の表現型を調節する方法を提供する。そのような作用物質を受けるのに適切な被検体は、上記のＦＲＰ−４遺伝子発現解析法を実施することにより同定することが可能である。
【０１１０】
さらに、本発明はＦＲＰ−４遺伝子の発現を変化させる作用物質を送達する工程を含む、リン酸恒常性関連細胞の表現型を調節する方法を提供する。この方法は、被検体においてＦＲＰ−４発現およびリン酸恒常性を調節するために有用である。ＦＲＰ−４の発現を増強する作用物質は腎臓におけるリン酸再吸収を減少させるために有用であり、一方ＦＲＰ−４の発現を阻害する作用物質はリン酸再吸収を増加させるために有用である。
【０１１１】
候補作用物質のスクリーニングアッセイ法
本発明はＦＲＰ−４遺伝子の発現、またはＦＲＰ−４タンパク質の活性を調節する様々な作用物質をスクリーニングする方法を提供する。これらの作用物質は、被検体においてリン酸恒常性を調節するために、腎臓リン酸輸送を調節するために、または腫瘍性骨軟化症関連症状を軽減するために、リン酸恒常性関連疾患を治療するために、および腫瘍性骨軟化症関連腫瘍細胞、あるいはリン酸恒常性または骨石灰化関連細胞の表現型を変化させるために有用である。本発明の目的のために、「作用物質」は、これらに限定するはしないが、単純または複雑な有機または無機分子、ペプチド、タンパク質（例えば抗体）、ポリヌクレオチド（例えばアンチセンス）またはリボザイムなどの生物学的または化学的化合物を含むことが意図される。ありとあらゆる化合物、例えば、ポリペプチドおよびポリヌクレオチドなどの多量体、および様々なコア構造に基づいた合成有機化合物、を合成することが可能であり、そしてこれらはまた「作用物質」の用語の中にもまた含まれる。さらに、様々な天然原料は、植物または動物抽出物などの、スクリーニング用の化合物を提供することができる。必ずしも明白に述べることができるわけではないが、作用物質が単独で使用されるか、または、発明のスクリーニングにより同定された作用物質と同一のまたは異なる生物学的活性を有する、別の作用物質と組合わせて使用されることは理解されるべきであろう。
【０１１２】
一つの好ましい実施態様は、腫瘍性骨軟化症関連腫瘍細胞から生産されるＦＲＰ−４ポリペプチドと相互作用する能力を有する低分子をスクリーニングする方法である。本発明の方法に関しては、「低分子」は、ある一つの実施態様において、ＦＲＰ−４ポリペプチドなどの興味あるタンパク質に結合する。およびそれによりタンパク質機能を変化させる能力を有する、低分子量（ＭＷ）を有する分子である。好ましくは、低分子のＭＷは１，０００未満である。タンパク質機能を変化させる能力を有する低分子をスクリーニングする方法は当技術分野において既知である。例えば、細胞内での低分子−タンパク質相互作用を検出するための小型化アレイ化アッセイ法がＹｏｕら（１９９７）Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．４：９６１〜９６８により議論されている。
【０１１３】
インビトロスクリーニング法を実施するために、この型の腫瘍細胞を含む適切な細胞培養または組織培養が最初に提供される。細胞は培養細胞または、ＦＲＰ−４またはその相補体が発現される遺伝的に修飾された細胞であることが可能である。または、細胞は組織生検由来であることが可能である。細胞は、密度依存性制限なく指数増殖を達成するための条件下（温度、増殖、または培養液およびガス（ＣＯ２））および適切な時間量の間、培養される。対照として試験される、作用物質を受けないものである、付加的な別個の細胞培養を維持することもまた望ましい。
【０１１４】
当業者には明らかなように、適切な細胞をマイクロタイタープレート中で培養してもよく、そしていくつかの作用物質が、遺伝子型変化、表現型変化または細胞死に注意することにより同時にアッセイしてもよい。
【０１１５】
作用物質が上記の低分子などのＤＮＡまたはＲＮＡ以外の組成物である時、作用物質は直接細胞培養物に添加されてもよく、また追加のために培養液に添加されてもよい。当業者には明らかなように、実験的に決定されることが可能である「有効な」量が添加されなければならない。作用物質がポリヌクレオチドである時、それは遺伝子銃またはエレクトロポレーションの使用により直接添加されてもよい。または、本明細書に記載されているように、遺伝子送達媒体または他の方法を用いて細胞内に挿入されてもよい。
【０１１６】
本発明はまたＦＲＰ−４リガンドと競合する能力を有する作用物質のスクリーニングアッセイ法を提供する。多数の競合的結合アッセイ法が当技術分野において既知である。一般的には、競合的結合アッセイ法は限られた量のリガンドを用いて、標識化された標準が候補作用物質と結合を競合する能力によっている。競合的アッセイ系の例としては、放射標識免疫検定法（ＲＩＡ）、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、好ましくは酵素結合抗体免疫アッセイ法（ＥＬＩＳＡ）、「サンドウィッチ」免疫アッセイ法、免疫放射定量測定法、蛍光免疫アッセイ法、および免疫電気泳動法が含まれるが、これらに限定するものではない。
【０１１７】
一般的には、そのようなアッセイ法においては、リガンドは検出可能な部分を用いて標識され（これ以降「トレーサー」と呼ばれる検出可能に標識されたリガンド）および候補作用物質とともにＦＲＰ−４リガンドドメインへの結合の競合的アッセイ法において使用されるであろう。利用可能な多数の検出可能標識は、以下に限定するものではないが、放射性同位元素（例えば３５Ｓ、１４Ｃ、１２５Ｉ、３Ｈおよび１３１Ｉ、Ｃｏｌｉｇｅｎら編、「免疫学の最新プロトコール（Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）」、第１および第２巻（１９９１）、Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、ニュヨーク、ニュヨーク州）；蛍光標識（例えば、希土類元素キレート（ユーロピウムキレート）、フルオレセインおよびその誘導体、ローダミンおよびその誘導体、ダンシル、リッサミン（ｌｉｓｓａｍｉｎｅ）、フィコエリトリン、およびテキサスレッドが利用可能である、「免疫学の最新プロトコール」も参照）；酵素−基質標識（例えば、米国特許第４，２７５，１４９号）；および酵素−基質組み合わせ（たとえば過酸化水素を基質として有するホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）；発色基質としてパラニトロフェニルリン酸を、発色基質としてβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ（β−Ｄ−Ｇａｌ）を有するアルカリホスファターゼ（ＡＰ）を含んでいる。そのようなアッセイ法においては、トレーサーは一般的には、様々な濃度の非標識候補作用物質の存在下で、ＦＲＰ−４のリガンド結合ドメインまたは生物学的に活性のある部分とともにインキュベーションされる。結果が良い候補化合物の濃度を増加させることによって、効果的にトレーサーのＦＲＰ−４への結合が競合される（ＧｏｏｄｍａｎおよびＧｌｉｍａｎ‘ｓ（第９版）「治療薬の薬理学的基礎（Ｔｈｅ　Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｂａｓｉｓ　ｏｆ　Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）」、１９９６；Ｂ．Ｃ．Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ、Ｄ．Ｇ．Ｌｏｗｅ、Ｂ．Ｌｉ、Ｂ．Ｄ．ＢｅｎｎｅｔｔおよびＪ．Ａ．Ｗｅｌｌｓ、ＥＭＢＯ　Ｊ．１３：２５０８（１９９４））。
【０１１８】
アッセイ法はまた被検体において実施されることも可能である。この方法は被検体がラット、マウスまたはサルなどの動物である場合、作用物質の臨床試験に先立って使用されることが可能である簡便な動物モデルシステムをこの方法は提供する。このシステムにおいて、もし転写物発現が変化されるならば、（すなわち、増加調節される（腫瘍抑制機能の回復など）、作用物質耐性遺伝子またはガン遺伝子に関して下方調節または除去されるならば）、あるいは病的細胞を有する未治療の動物と各々比較して、転写物発現を含む細胞の存在と関連するまたは相関する症状が緩和されるならば、候補作用物質は潜在的な医薬品である。比較の基礎を与える、健康で治療されていない細胞または動物の別個の陰性対照群を有することも有用でありうる。被検体に作用物質を投与した後、変化した遺伝子発現またはタンパク質機能に関して適切な細胞または組織サンプルが収集される。
【０１１９】
本明細書に記載されているようにスクリーニングおよびインビトロまたはインビボ法を実施するために必要な作用物質および指示書を含むキットもまた主張される。
【０１２０】
発明はさらに本明細書に記載されているスクリーニングアッセイ法により同定される新規作用物質および前記のように治療のためのその使用法に関係する。
【０１２１】
ＦＲＰ−４リガンドのスクリーニングアッセイ法
本発明はＦＲＰ−４タンパク質活性の活性を調節するリガンドのスクリーニングのアッセイ法も提供する。本明細書の上記に記載されているスクリーニングアッセイ法の中の一つをリガンドスクリーニングのために使用してもよい。候補リガンドは、候補作用物質に関するものと同じ原料から取得してもよい。
【０１２２】
ある一つの実施態様においては、発明は、ＦＲＰ−４タンパク質の膜結合型または、ポリペプチドまたはその生物学的に活性のある部分に結合するまたは活性を調節するリガンドをスクリーニングするためのアッセイ法を提供する。一例として、細胞ベースのアッセイ法が使用できる。細胞ベースのアッセイ法においては、細胞表面にＦＲＰ−４タンパク質の膜結合型またはその生物学的に活性のある部分を発現する細胞（例えば、哺乳類、酵母など）が候補リガンドに接触され、そして候補リガンドのＦＲＰ−４への結合能力が決定される。試験化合物がＦＲＰ−４タンパク質に結合する能力を決定することは、直接的または間接的のいずれかにより決定されることが可能である。例えば、候補リガンドは、結合が複合体中の標識化合物を検出することにより決定することができるように、検出可能な標識（例えば、放射性同位元素または酵素標識）と結合されてもよい。別の実施態様においては、試験化合物がＦＲＰ−４タンパク質の活性を調節する能力を決定することは、ＦＲＰ−４タンパク質がＦＲＰ−４標的分子を調節する能力を決定することにより達成することが可能である。
【０１２３】
さらに別の実施態様においては、アッセイ法は、ＦＲＰ−４タンパク質またはその生物学的に活性のある部分を試験化合物に接触させる工程、およびＦＲＰ−４タンパク質またはその生物学的に活性のある部分の活性を調節する（たとえば、刺激するまたは阻害する）試験化合物の能力を決定する工程を含む無細胞アッセイ法である。本発明の無細胞アッセイ法は、可溶型または膜結合型ＦＲＰ−４タンパク質の両方の使用に適合する。膜結合型ＦＲＰ−４タンパク質を含む無細胞アッセイ法の事例においては、膜結合型ＦＲＰ−４タンパク質が溶液中に維持されるように、可溶化剤（例えば非イオン性界面活性剤）を利用することが望ましいかもしれない。
【０１２４】
本発明の上記のアッセイ法の１以上の実施態様においては、ＦＲＰ−４タンパク質または候補リガンドのいずれかを当技術分野において既知である方法により基質上に固相化することが望ましいかも知れない。
【０１２５】
本発明のさらに別の局面においては、ＦＲＰ−４に結合するまたは相互作用する（「ＦＲＰ−４結合タンパク質」または「ＦＲＰ−４ｂｐ」）およびＦＲＰ−４活性を調節する他のタンパク質を同定するために、２ハイブリッドアッセイ法または３ハイブリッドアッセイ法において「ベイト（ｂａｉｔ）タンパク質」として使用されることが可能である（例えば、米国特許第５，２８３，３１７号；Ｚｅｒｖｏｓら、１９９３．Ｃｅｌｌ　７２　２２３〜２３２；Ｍａｄｕｒａら、１９９３、Ｊ　Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：１２０４６〜１２０５４；Ｂａｒｔｅｌら、１９９３．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　１４：９２０〜９２４；Ｉｗａｂｕｃｈｉら、１９９３．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ　８：１６９３〜１６９６；およびＢｒｅｎｔ　国際公開公報第９４／１０３００号を参照）。そのようなＦＲＰ−４結合タンパク質は、例えばＦＲＰ−４経路の上流または下流の因子として、ＦＲＰ−４結合タンパク質によるシグナルの増幅に関与している可能性もまた高い。
【０１２６】
ポリヌクレオチド
ＦＲＰ−４をコードする単離されたポリペプチドが本発明により提供される。ＦＲＰ−４遺伝子の配列を含むポリヌクレオチドは、本発明の様々な実施態様を実施するために有用である。さらなる局面においては、ポリヌクレオチドはまた配列も含む。これらのポリヌクレオチドは、遺伝子発現を検出およびモニターするためのプローブ、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を実施するためのプライマー、ＦＲＰ−４ポリペプチドをコードするｃＤＮＡ分子、ＦＲＰ−４ポリヌクレオチドを細胞に送達するための遺伝子送達媒体、ＦＲＰ−４タンパク質を生産するための発現ベクター、およびＦＲＰ−４発現を調節するためのアンチセンスポリヌクレオチドおよびリボザイムを含むが、これらに限定されるわけではない。ヒトＦＲＰ−４　ｃＤＮＡを含むｃＤＮＡ配列は図（配列番号：１）において提供される。当業者には、そのような単離されたポリヌクレオチドを検出および取得するための様々な方法を周知であろう。これらの方法のいくつかの記載が以下に提供される。
【０１２７】
配列番号：１に示されている配列の他に、本発明の方法は、この配列に相補的なアンチセンスポリヌクレオチド、例えばアンチセンスＲＮＡ、を用いて実施されることが可能である。配列番号：１において提供されている配列、およびＶａｎｄｅｒ　Ｋｒｏｌら（１９８８）Ｂｉｏ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　６：９５８において記載されている方法論を用いてアンチセンスＲＮＡを取得することが可能である。
【０１２８】
ポリヌクレオチドは、任意の適切な遺伝子送達法またはベクターにより導入されることが可能である。それらはまた、細胞ベースの治療を生成するために適切な宿主細胞に発現させることも可能である、これらの方法は下により詳細に記載される。
【０１２９】
本発明はまた、野生型細胞と比較してＦＲＰ−４ポリペプチドを増強した発現で生産する遺伝的に修飾された細胞を利用することも可能である。遺伝的に修飾された細胞は、プロモーターまたは遺伝子アクチベーター（米国特許第５，７３３，７６１号を参照）などの上流の制御配列を挿入することにより生産されることが可能である。
【０１３０】
上記で同定されたポリヌクレオチドおよび配列は、検出可能なマーカー、例えば、細胞における核酸および／または遺伝子発現を検出するための酵素標識または放射性同位元素、に結合することが可能である。検出可能なシグナルを与える能力を有する、蛍光、放射性、酵素的または、アビジン／ビオチンなどの他のリガンドを含む、広く多様な適切な検出可能なマーカーが当技術分野において既知である。好ましい実施態様においては、放射性または他の環境的に望ましくない試薬の代わりに、蛍光標識または、ウレアーゼ、アルカリホスファターゼ、またはペルオキシダーゼなどの酵素タグを利用することを希望する可能性が高いであろう。酵素タグの事例においては、相補的核酸含有サンプルへの特異的ハイブリダイゼーションを同定するために、人の目にまたは分光光度的に可視である方法を提供するために活用することができる、発色指示基質が既知である。簡単には、本発明はさらに、相補的一本鎖ポリヌクレオチドのハイブリダイゼーションを許容する（好ましくは中程度に厳格なハイブリダイゼーション条件）、またはより好ましくは非常に厳格なハイブリダイゼーション条件下で、配列番号：１に示されているヌクレオチドの一部（または相当する相補物）である標識された一本鎖ポリヌクレオチド（プローブ）に、標的一本鎖ポリヌクレオチドを接触させることにより、配列番号：１またはその相補物により同定される一本鎖ポリヌクレオチドを検出するための方法を提供する。ハイブリダイゼーションされたポリヌクレオチド対は、ハイブリダイゼーションしていない一本鎖ポリヌクレオチドから分離される。ハイブリダイゼーションされたポリヌクレオチド対は、当業者によく知られており、および、たとえばＳａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）前記において開示されている方法を用いて検出される。
【０１３１】
本発明の別の局面においては、単離されたポリヌクレオチドは、配列番号：２のアミノ酸配列を有するポリペプチド、または保存的アミノ酸を有するその類似体である、腫瘍性骨軟化症関連ポリペプチドをコードする。さらなる局面においては、本発明の単離されたポリヌクレオチドは、配列番号：２のアミノ酸配列を有する突然変異タンパク質ポリペプチド、または非保存的アミノ酸置換を有するその類似体である、腫瘍性骨軟化症関連突然変異タンパク質ポリペプチドをコードする。
【０１３２】
本発明の一つの実施態様においては、腫瘍性骨軟化症関連ポリヌクレオチドはＳＡＧＥ技術を用いて単離される（Ｖｅｌｃｕｌｅｓｃｕら（１９９５）Ｓｃｉｅｎｃｅ　２７０：４８４〜４８７および米国特許第５，６９５，９３７号に開示されている、Ｓｅｒｉａｌ　Ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　Ｇｅｎｅ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ、すなわち「ＳＡＧＥ」）。本発明のポリヌクレオチドに関するＳＡＧＥタグを用いて、腫瘍性骨軟化症関連因子をコードする全長鎖ｃＤＮＡが、適切な腫瘍性骨軟化症細胞に由来するｃＤＮＡライブラリーにハイブリダイゼーションさせることにより単離された。本発明の付加的な実際態様は、配列番号：１〜２に提供される配列および下記の方法を用いて、または公共利用可能なデータベースを相同性検索することにより、単離されることが可能である。
【０１３３】
発明を実施するために配列を取得すること
本発明の方法を実施するために使用されるポリヌクレオチドおよび配列は、化学合成、組換えクローン化法、ＰＣＲまたはそれらの任意の組み合わせを用いて取得することが可能である。化学ポリヌクレオチド合成の方法は当技術分野において周知であり、本明細書において詳細に記載される必要はない。当業者は、ＤＮＡ合成機を利用することにより、または商業サービスに注文することにより所望のポリヌクレオチドを取得するために、本明細書において提供される配列データを使用することが可能である。
【０１３４】
単離された形で、またはベクターまたは宿主細胞内に含まれる形で、ＦＲＰ−４タンパク質をコードするポリヌクレオチドおよび配列を含む組成物が、送達されてもよい。これらの組成物が薬学的に使用される場合、薬学的に許容できる担体とともに組み合わせられる。
【０１３５】
本発明の方法に関して使用される適切な細胞または組織サンプルは、体液、固形組織サンプル、組織培養、またはそれらから由来する細胞およびそれらの子孫、および任意のこれらの原料から調製された切片または塗抹、または腫瘍性腫瘍組織を含むかもしれない任意の他のサンプルを包含する。
【０１３６】
本発明のポリヌクレオチドは本明細書において記載されている技術を用いて単離されること、またはＰＣＲを用いて複製されることが可能である。ＰＣＲ技術は、米国特許第４，６８３，１９５号、４，８００，１５９号、４，７５４，０６５号および４，６８３，２０２号の主題である、およびＰＣＲ：ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ：ＴＨＥ　ＰＯＬＹＭＥＲＡＳＥ　ＣＨＡＩＮ　ＲＥＡＣＴＩＯＮ）（Ｍｕｌｌｉｓら著、Ｂｒｉｃｋｈａｕｓｅｒ　Ｐｒｅｓｓ、ボストン（１９９４））またはＭａｃＰｈｅｒｓｏｎら（１９９１）および（１９９４）前記およびそれらの中で引用されている参考文献に記載されている。または、当業者は、ＤＮＡを複製するために、本明細書において提供されている配列および商業的なＤＮＡ合成機を使用することが可能である。さらにもっと、当業者は、複製および増幅のために、ポリヌクレオチドを適切な複製ベクターに挿入し、そのベクターを適切な宿主細胞に（原核または真核）に挿入することが可能である。そのようにして増幅されたＤＮＡは当業者に周知の方法により細胞から単離されることが可能である。そのようにして取得されたポリヌクレオチドならびに、この方法によりポリヌクレオチドを取得する過程は、さらに本明細書において提供される。
【０１３７】
ＲＮＡは、最初にＤＮＡポリヌクレオチドを適切な宿主細胞に挿入することにより取得されることが可能である。ＤＮＡは任意の適切な方法、例えば適切な遺伝子送達媒体の使用（例えば、リポソーム、プラスミドまたはベクター）またはエレクトロポレーションにより、挿入されることが可能である。細胞が複製する、およびＤＮＡがＲＮＡに転写される時；ＲＮＡはその後、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）前記に開示されているように、当業者に周知の方法を用いて単離されることが可能である。例えば、ｍＲＮＡは、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）前記に開示されている処理にしたがって、様々な溶菌酵素または化学溶液を用いて単離される方法、またはメーカーにより提供される付随する指示書にしたがって、核酸結合樹脂により抽出することが可能である。
【０１３８】
配列番号：１に配列相補性または相同性を示すポリヌクレオチドは、ハイブリダイズプローブとしての用途が見出せる。転写物の完全なコード配列が既知であるので、この配列または相同性配列の任意の部分を本発明の方法において使用することが可能である。
【０１３９】
特異的ハイブリダイゼーションには「完全にマッチする」プローブは必要ではないことが当技術分野において知られている。少数の塩基の置換、欠失または挿入により達成されるプローブ配列の小規模な変化は、ハイブリダイゼーションの特異性に影響を与えない。一般的には、２０％ほどの塩基対ミスマッチ（最適に配置される時）は認容される得る。前述のｍＲＮＡを検出するために有用なプローブは少なくとも約８０％相同領域に同一であることが好ましい。より好ましくは、プローブは、相同性領域に整列化された後、相当する遺伝子配列に８５％同一である；さらにより好ましくは、それは９０％同一性を示す。
【０１４０】
これらのプローブを、様々な腫瘍細胞またはこれらの細胞を含む腫瘍組織を検出、予知、診断またはモニターするために放射測定法（例えばサザンおよびノザンブロット解析）において使用することが可能である。また、本発明のポリヌクレオチドに相当する遺伝子の発現を検出するためにハイスループットスクリーニングアッセイ法において用いるために、プローブを固体支持体またはチップなどのアレイに付着することも可能である。したがって、本発明はまた、ハイスループットスクリーニングにおいて使用される固体支持体に付着された、配列番号：１のポリヌクレオチド、またはその相補体、あるいは配列番号：１の断片を含む、または相当するプローブも提供する。
【０１４１】
相補的な範囲のサイズ並びに、断片の総サイズは、特定の核酸分節の意図される使用または用途に依存するであろう。より小さな断片は一般的には、ハイブリダイゼーション実施態様における用途を見出されるであろう、そして検出したい相補的配列にしたがって、相補的領域の長さは変動してもよく（例えば少なくとも５から１０、から約１００ヌクレオチド）また、全長であってもよい。
【０１４２】
混成体の安定性および選択性を増加させるために、長さが５から１０ヌクレオチドを超える相補的配列を有するヌクレオチドプローブが一般的には好ましく、それにより取得された特定の混成体分子の特異性は改善される。長さが１０ヌクレオチド以上、または５０ヌクレオチド以上、または所望であればもっとより長い遺伝子相補的範囲を有するポリヌクレオチドを設計できることが、より好ましい。そのような断片は、例えば、化学的方法により直接断片を合成することにより、米国特許第４，６０３，１０２号に記載されているような２個のプライミングオリゴヌクレオチドを用いたＰＣＲ技術などの核酸再生技術の適用により、または組換え生産のために選択された配列を組換えベクターに導入することにより、容易に調製できる。好ましいプローブは、長さが約５０〜７５ヌクレオチド、またより好ましくは５０〜１００ヌクレオチドである。
【０１４３】
本明細書において記載されているポリヌクレオチドは、腫瘍性骨軟化症関連腫瘍細胞において発現している遺伝子または遺伝子転写物の検出のためのプライマーとして機能することが可能である。この文脈においては、増幅は、妥当な正確性を持って標的配列を複製する能力を有するプライマー依存性ポリメラーゼを活用する任意の方法を意味する。増幅は、Ｔ７　ＤＮＡポリメラーゼ、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼのクレノーフラグメント、および逆転写酵素などの、天然または組換えＤＮＡポリメラーゼを用いて実施してもよい。プライマーの好ましい長さは、上記でプローブに関して同定されたものと同一である。
【０１４４】
増幅法はＰＣＲが好ましい。しかしながら、各反応に関して使用されるＰＣＲ条件は経験的に決定される。多数の媒介変数が反応の成功に影響する。その中にアニーリング温度および時間、伸長時間、Ｍｇ２＋濃度、ｐＨおよびプライマー、鋳型、およびデオキシリボヌクレオチドの相対的濃度がある。増幅後、結果として生じるＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動と、その後のエチジウムブロマイド染色および紫外線照射を用いた可視化により検出することが可能である。
【０１４５】
本発明の方法はまた、ＤＮＡまたはＲＮＡの複製、および／または一過性のまたは安定的な発現のための他の制御配列だけでなく、ＲＮＡ転写のプロモーターに機能的に連結されたＦＲＰ−４タンパク質をコードする単離されたポリヌクレオチドを利用することも可能である。本明細書において使用されているように、「機能的に連結された」の用語は、プロモーターがＤＮＡ分子からＲＮＡの転写を指令できるような様式で配置されていることを意味する。そのようなプロモーターの例は、ＳＰ６、Ｔ４およびＴ７である。ある実施態様においては、細胞特異的プロモーターが挿入されたポリヌクレオチドの細胞特異的発現のために使用される。挿入されたＤＮＡ部分がそのプロモーターに機能的に連結されることが可能であるクローン化部位ならびに、終結コドンおよび選択可能マーカー配列を有する、プロモーターまたはプロモーター／エンハンサーを含むベクターは当技術分野においてよく知られており、そして市販されている。一般的な方法論およびクローン化戦略に関しては、「遺伝子発現技術（ＧＥＮＥ　ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ　ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ）」（Ｇｏｅｄｄｅｌ編、アカデミックプレス社、（１９９１））およびその中で引用されている参考文献、および様々な適切なベクターに関する地図、機能的特性、商業的供給者およびＧｅｎＥＭＢＬアクセション番号への参照を含む、「ベクター：必須データシリーズ（ＶＥＣＴＯＲＳ：ＥＳＳＥＮＴＩＡＬ　ＤＡＴＡ　ＳＥＲＩＥＳ）」、ＧａｃｅｓａおよびＲａｍｊｉ著、Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　Ｓｏｎｓ、ニューヨーク、１９９４年）を参照。これらのベクターはインビトロまたはインビボでＲＮＡを転写する能力を有することが好ましい。
【０１４６】
これらの核酸を含む発現ベクターは、タンパク質およびポリペプチドを生産する宿主ベクター系を取得するために有用である。これらの発現ベクターは、エピソームとして、または染色体ＤＮＡの統合部分としてのいずれかとして、宿主生物内で複製可能でなければならないことが示唆される。適切な発現ベクターはプラスミドを含む。好ましい長さのプライマーは、プローブ、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルス、コスミドなどを含む上記のウイルスベクターに関して同定されたものと同一である。アデノウイルスベクターは、インビトロおよびインビボの両方においてその高い発現レベルおよび効率的な細胞形質転換のため、遺伝子を組織内にインビボにおいて導入するために特に有用である。例えば、原核または真核細胞等の適切な宿主細胞に核酸が挿入され、宿主細胞が複製する際に、タンパク質を組換え体として生産することが可能である。適切な宿主細胞はベクターに依存するであろうし、周知の方法を用いて構築された、哺乳類細胞、動物細胞、ヒト細胞、サル細胞、昆虫細胞、酵母細胞、および細菌細胞を含むことが可能である。Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）前記、を参照。外来性核酸を細胞内に挿入するためにウイルスベクターを使用することの他に、細菌細胞の形質転換；リン酸カルシウム沈殿を用いた哺乳類細胞のトランスフェクション；またはＤＥＡＥ−デキストラン；エレクトロポレーション；または微量注入などの当技術分野において周知の方法により、宿主細胞に核酸が挿入されることが可能である。この方法論に関してはＳａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）前記、を参照。したがって、本発明はまた、タンパク質またはポリペプチドまたは抗体をコードするポリヌクレオチドを含む、哺乳類細胞、動物（ラットまたはマウス）細胞、ヒト細胞、または細菌細胞などの原核細胞などの、宿主細胞もまた提供する。
【０１４７】
ベクターがインビボまたはエクソビボの遺伝子治療に使用されるとき、複製不能レトロウイルスまたはアデノウイルスベクターなどの薬学的に許容されるベクターが好ましい。本発明の核酸を含む薬学的に許容されるベクターは、挿入されたポリヌクレオチドの一過性または安定的発現のためにさらに修飾されることが可能である。本明細書において使用されているように、「薬学的に許容されるベクター」の用語は、制限することなく、核酸を分裂細胞に選択的に標的化するおよび導入する能力を有するベクターまたは送達媒体を含む。そのようなベクターの例は、ウイルスタンパク質を生産する能力がないことにより定義される、「複製不能」ベクターであり、感染宿主細胞内でのベクターの拡散を不可能にする。複製不能レトロウイルスベクターの例はＬＮＬ６である（Ｍｉｌｌｅｒ、Ａ．Ｄ．ら（１９８９）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　７：９８０〜９９０）。遺伝子マーカーのレトロウイルス媒介性遺伝子伝達のために複製不能レトロウイルスベクターを使用する方法論はよく確立されている（Ｃｏｒｒｅｌｌら、（１９８９）ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８６：８９１２；Ｂｏｒｄｉｇｎｏｎ（１９８９）ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８６：８９１２〜５２；Ｃｕｌｖｅｒ、Ｋ．（１９９１）ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８８：３１５５；およびＲｉｌｌ、Ｄ．Ｒ．（１９９１）Ｂｌｏｏｄ　７９（１０）：２６９４〜７００）。臨床研究は、ウイルスベクターに関連する副作用はほとんどまたは全くないことを示した、Ａｎｄｅｒｓｏｎ（１９９２）Ｓｃｉｅｎｃｅ　２５６：８０８〜１３を参照。
【０１４８】
単離された形において、またはベクターまたは宿主細胞内に含まれる形で、本発明のポリヌクレオチドを含む組成物は、さらに本明細書において提供される。これらの組成物が薬学的に使用される時、それらは薬学的に許容される担体と組み合わせられる。
【０１４９】
タンパク質
本発明は、突然変異タンパク質、類似体、およびそれらの断片ばかりでなく、野生型および組換え体として生産されたポリペプチド、ならびに原核宿主細胞および真核宿主細胞由来のタンパク質を含むことが意図されている、上述のポリヌクレオチドから発現されるＦＲＰ−４タンパク質またはＦＲＰ−４ポリペプチドの使用法を提供する。いくつかの実施態様においては、その用語はまた抗体および抗イディオタイプ抗体も含む。ある１つの実施態様においては、これらのタンパク質またはポリペプチドは、フォスファトニン活性を調節するフォスファトニン関連因子である。そのようなポリペプチドは下記で同定される方法を用いて、単離または生産されることが可能である。
【０１５０】
例えば保存的なアミノ酸置換を有する、野生型ポリペプチドまたはタンパク質の機能的同等物または変異体もまた本発明の範囲内にあることは理解される。他の類似体はタンパク質またはポリペプチドを含む融合タンパク質を含む。
【０１５１】
本明細書に記載されているタンパク質またはポリペプチドは、精製、化学合成および組換え法を含む、当業者に周知の多数の過程により取得可能である。全長タンパク質は、上記で同定されるように腫瘍細胞または腫瘍生検から精製されることが可能である。タンパク質を精製するための原料はまた、腫瘍性骨軟化症を有する患者などの、個人からの血清または尿サンプルであってもよい。タンパク質は、抗体を用いた免疫沈降法などの方法、およびゲル濾過、イオン交換、逆相、および本明細書に示されているように融合タンパク質を用いての親和性クロマトグラフィーなどの標準的技術により精製されることが可能である。そのような方法論に関しては、例えばＤｅｕｔｓｃｈｅｒら（１９９９）「タンパク質精製ガイド：酵素学の方法（ＧＵＩＤＥ　ＴＯ　ＰＲＯＴＥＩＮ　ＰＵＲＩＦＩＣＡＴＩＯＮ：ＭＥＴＨＯＤＳ　ＩＮ　ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ）」（Ｖｏｌ．１８２、アカデミックプレス）を参照。したがって、本発明はまた、これらのタンパク質およびポリペプチドを取得するための過程、ならびに、これらの過程により取得可能な産物、および取得される産物もまた提供する。
【０１５２】
タンパク質およびポリペプチドはまた、パーキンエルマー／アプライドバイオシステムズ社、モデル４３０Ａまたは４３１Ａ、フォスターシティ、カリフォルニア州、米国により製造されるものなど市販の自動ペプチド合成機を用いた化学合成により取得されることが可能である。合成されたタンパク質またはポリペプチドは沈殿され、例えば高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によりさらに精製されることが可能である。したがって、本発明はまた、タンパク質配列および試薬（アミノ酸および酵素等）を提供することにより、ならびにアミノ酸を適切な方向および直線配列で連続して連結させることにより、本発明のタンパク質の化学合成のための過程を提供する。
【０１５３】
または、タンパク質およびポリペプチドは、上述の宿主細胞およびベクター系を用いて、たとえばＳａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）前記において記載されているように、周知の組換え法により取得されることが可能である。
【０１５４】
診断法における使用のために検出可能な試薬に結合された本明細書において記載されているポリペプチドおよびタンパク質もまた、本願により提供される。例えば、検出可能に標識されたタンパク質およびポリペプチドを、カラムに結合して、抗体の検出および精製のために使用することが可能である。それらはまた、下記のように抗体生産のための免疫原としても有用である。本発明のタンパク質および断片は、細胞過程を調節する作用物質または医薬品のスクリーニングのためのインビトロアッセイ系においてもまた有用である。
【０１５５】
ＦＲＰ−４タンパク質はまた、滅菌または水性溶液、薬学的に許容される担体、懸濁液および乳濁液などの、様々な液相担体とも組み合わせることが可能である。非水性溶媒の例は、プロピルエチレングリコール、ポリエチレングリコールおよび植物油を含む。抗体を調製するために使用される時、担体はまた、特異的免疫応答を非特異的に増大させるために有用であるアジュバントも含むことが可能である。熟練した当業者はアジュバントが必要であるかを容易に決定し、そして１つを選択することも可能である。しかしながら、説明の目的にのみ、適切なアジュバントは、全フロイントおよび不完全フロイント、鉱物性塩およびポリヌクレオチドを含むが、これらに限定するものではない。
【０１５６】
本発明はまた、単独で、またはお互いとまたは他の作用物質と、および許容可能な担体と組み合わせて、本発明のタンパク質、類似体、突然変異タンパク質、ポリペプチド断片、抗体、抗体断片または抗イディオタイプ抗体の任意のものを含む薬学組成物の使用法も提供する。これらの組成物は本明細書に記載されているように様々な診断および治療法において有用である。
【０１５７】
抗体
本発明はまた、上述のように、ＦＲＰ−４タンパク質またはポリペプチドと特異的に複合体を形成する能力を有する抗体を使用することも想定している。「抗体」の用語はポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を含む。抗体はマウス、ラット、ウサギまたはヒト抗体を含むがこれらに限定しない。
【０１５８】
ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を生産する、ならびにそれらが相当する核酸配列を導き出す、実験方法は当技術分野において既知である。ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ（１９８８）前記およびＳａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）前記を参照。本発明のモノクローナル抗体は、タンパク質またはその断片を動物（例えばマウスまたはウサギ）に導入することにより生物学的に生産されることが可能である。動物中の抗体生産細胞は単離され、そして雑種細胞すなわちハイブリドーマを生産するために、骨髄腫細胞またはヘテロ骨髄腫細胞に融合される。したがって、本発明のモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマ細胞もまた提供される。
【０１５９】
したがって、タンパク質またはその断片、および周知の方法を用いて、当業者はタンパク質またはポリペプチドに結合する能力を有する抗体に関して、ハイブリドーマ細胞および抗体を生産またはスクリーニングすることが可能である。
【０１６０】
試験されるモノクローナル抗体がタンパク質またはポリペプチドに結合するならば、その試験される抗体と本発明のハイブリドーマにより提供される抗体は同等である。試験される抗体が本発明のモノクローナル抗体が、通常はモノクローナル抗体が応答するタンパク質またはポリペプチドに結合することを阻止するかどうかを決定することにより、抗体が本発明のモノクローナル抗体と同一の特異性を有するかを、過度の実験をすることなく決定することもまた可能である。本発明のモノクローナル抗体による結合の減少により示されるように、試験される抗体が本発明のモノクローナル抗体と競合するならば、その時はその２個の抗体が同一のまたは非常に関連したエピトープに結合する可能性が高い。または、本発明のモノクローナル抗体を、それが通常応答するタンパク質とともにプレインキュベーションする、および試験されるモノクローナル抗体が抗原に結合する能力において阻害されているかを決定することが可能である。試験されるモノクローナル抗体が阻害されるならば、その時はおそらく、本発明のモノクローナル抗体と同一のまたは非常に関連したエピトープ特異性を有するだろう。
【０１６１】
「抗体」の用語はまた、全てのアイソタイプの抗体を含むことを意図する。モノクローナル抗体の特定のアイソタイプは、最初の融合から選択することにより直接調製されるか、あるいは、Ｓｔｅｐｌｅｗｓｋｉら（１９８５）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ８２：８６５３またはＳｐｉｒａら（１９８４）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ　７４：３０７に記載されている処理を用いてクラススイッチバリアントを単離するシブ（ｓｉｂ）選択技術を用いることにより異なるアイソタイプのモノクローナル抗体を分泌する親ハイブリドーマから二次的に調製されるかのいずれかによって可能である。
【０１６２】
本発明はまた、上記のポリクローナルおよびモノクローナル抗体の生物学的に活性のある断片の使用も提供する。これらの「抗体断片」は、その抗原すなわち免疫原に選択的に結合するいくらかの能力を保持する。そのような抗体断片は、Ｆａｂ；Ｆａｂ’；Ｆ（ａｂ’）２、ＦｖおよびＳＣＡを含むことが可能であるが、これらに限定するものではない。
【０１６３】
「生物学的に活性のある抗体断片」の具体的な例は抗体のＣＤＲ領域である。これらの断片を作る方法は当技術分野において既知である、例えば、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ（１９８８）前記を参照。
【０１６４】
抗体組成物は、潜在的な免疫系応答の副作用を最小限にすることにより、宿主システムとさらにもっと適合性を有するようにされることが可能である。これは、ヒト化抗体などのキメラ抗体（例えば、抗体の重鎖および軽鎖の様々なドメインが１つ以上の種のＤＮＡによりコードされている抗体）を作製するために抗体を修飾することを含む、様々な方法によって達成できる（Ｏｉら、（１９８６）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　４（３）：２１４）。これは、外来種抗体のＦｃ部分の全部または一部を除去すること、または、例えばヒト／ヒトハイブリドーマ由来の抗体の使用などの、宿主動物と同じ種の抗体を使用することにより達成される。ヒト化抗体（すなわちヒトにおいて非免疫原性）は、たとえば抗体の免疫原性部分を、相当するが、非免疫原性である部分を用いて置換することにより生産されてもよい（すなわちキメラ抗体）。そのようなキメラ抗体は、ある１つの種由来の抗体の応答性または抗原結合部分、および異なる種由来の抗体のＦｃ部分（非免疫原性）を含んでもよい。キメラ抗体の例は、以下に限定はしないが、非ヒト哺乳類−ヒトキメラ、げっ歯類−ヒトキメラ、マウス−ヒトおよびラット−ヒトキメラを含む（Ｒｏｂｉｎｓｏｎら、国際特許出願第１８４１８７号；Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ　Ｍ．、ヨーロッパ特許出願第１７１４９６号；Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、ヨーロッパ特許出願第１７３４９４号；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら、ＰＣＴ出願、国際公開公報第８６／０１５３３号；Ｃａｂｉｌｌｙら、１９８７ Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ８４：３４３９；Ｎｉｓｈｉｍｕｒａら、１９８７　Ｃａｎｃ．Ｒｅｓ．４７：９９９；Ｗｏｏｄら、１９８５、Ｎａｔｕｒｅ　３１４：４４６；Ｓｈａｗら、１９８８Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ　Ｉｎｓｔ．８０：１５５５３、全て参照として本明細書に組み入れられる）。
【０１６５】
「ヒト化」キメラ抗体の一般的な総説はＭｏｒｒｉｓｏｎ　Ｓ．、１９８５　Ｓｃｉｅｎｃｅ　２２９：１２０２およびＯｉら、１９８６　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　４：２１４により提供される。適切な「ヒト化」抗体は、またはＣＤＲまたはＣＥＡ置換により生産することが可能である（Ｊｏｎｅｓら、１９８６　Ｎａｔｕｒｅ　３２１：５５２；Ｖｅｒｈｏｅｙａｎら、１９８８　Ｓｃｉｅｎｃｅ　２３９：１５３４；Ｂｉｅｄｌｅｒｅｔら、１９８８　Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４１：４０５３全て参照として本明細書に組み入れられる）。
【０１６６】
抗体または抗原結合断片はまた、遺伝子工学により生産されてもよい。大腸菌において重鎖および軽鎖の遺伝子の両方を発現する技術は、ＰＣＴ特許出願である；公開番号、国際公開公報第９０１４４３号、国際公開公報第９０１４４３号および国際公開公報第９０１４４２４号およびＨｕｓｅら、１９８９　Ｓｃｉｅｎｃｅ　２４６：１２７５〜１２８１の主題である。
【０１６７】
または、一本鎖抗体の生産に関して記載された技術（米国特許第４９４６７７８号；Ｂｉｒｄ、１９８８、Ｓｃｉｅｎｃｅ　２４２、４２３〜４２６；Ｈｕｓｔｏｎら、１９８８、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ８５、５８７９〜５８８３；およびＷａｒｄら、１９８９、Ｎａｔｕｒｅ、３３４、５４４〜５４６）が、Ｈｃｅｎ−２遺伝子産物に対する一本鎖抗体を生産するために適合させることが可能である。一本鎖抗体はＦｖ領域の重鎖および軽鎖断片をアミノ酸架橋により連結することにより形成され、そして一本鎖ポリペプチドを結果として生じる。
【０１６８】
本発明のモノクローナル抗体の特異性を有する、モノクローナル抗体を分泌する他のハイブリドーマの単離は、抗イディオタイプ抗体を生産することにより当業者により達成され得る（Ｈｅｒｌｙｎら、（１９８６）Ｓｃｉｅｎｃｅ　２３２：１００）。抗イディオタイプ抗体は、関心対象のハイブリドーマにより生産されるモノクローナル抗体上に存在する唯一の決定基を認識する抗体である。
【０１６９】
２個のハイブリドーマのモノクローナル抗体間のイディオタイプ同一性は、同一のエピトープ決定基の認識に関して２個のモノクローナル抗体が同一であることを証明する。したがって、モノクローナル抗体上のエピトープ決定基に対する抗体を用いることにより、同一のエピトープ特異性を有するモノクローナル抗体を発現する他のハイブリドーマを同定することが可能である。
【０１７０】
エピトープを模倣したモノクローナル抗体を生産するために抗イディオタイプ技術を使用することもまた可能である。例えば、第一のモノクローナル抗体に対して作製された抗イディオタイプモノクローナル抗体は、第一のモノクローナル抗体により結合されるエピトープの鏡像である超可変領域内に結合ドメインを有するであろう。したがって、この例においては、抗イディオタイプモノクローナル抗体は、これらの抗体産生のための免疫のために使用することが可能であろう。
【０１７１】
本発明において使用されているように、「エピトープ」の用語は、本発明のモノクローナル抗体に関して特異的な親和性を有する任意の決定基を含むことを意図している。エピトープ決定基は通常は、アミノ酸または糖側鎖などの分子の化学的に活性のある表面群からなり、そして通常は特異的な三次元構造の特徴、ならびに特異的な荷電の特徴を有する。
【０１７２】
本発明において使用されている抗体は検出可能な試薬すなわち標識に連結されることが可能である。当業者に既知の多くの異なる標識および標識法が存在する。
【０１７３】
抗体標識複合体は、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ（１９８８）前記により記載されている免疫組織化学などの標準的な免疫化学技術を用いて、サンプル中のタンパク質または断片を検出するために有用である。直接または間接形式のいずれかにおける、競合および非競合免疫アッセイ法は、例えば、酵素結合抗体免疫アッセイ法（ＥＬＩＳＡ）、放射標識免疫検定法（ＲＩＡ）およびサンドウィッチ（イムノメトリック）アッセイ法などの、そのようなアッセイ法の例である。当業者は、過度の実験をすることなく他の免疫アッセイ形式を知るであろうし、そして容易に識別することが可能である。
【０１７４】
低分子量ハプテンへの抗体の結合はアッセイの感度を増加させることが可能である。ハプテンはその後、二次反応の方法により、特異的に検出されることが可能である。例えば、アビジンと反応するビオチン、または特異的抗ハプテン抗体と反応することが可能なジニトロフェリル（ｄｉｎｉｔｒｏｐｈｅｒｒｙｌ）、ピリドキサール、およびフルオレセインなどのハプテンを使用することが一般的である。ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ（１９８８）前記を参照。
【０１７５】
モノクローナル抗体はまた、多くの異なる担体に結合することもまた可能である。したがって、本発明はまた、抗体および別の物質、活性または不活性を含む組成物を利用することも想定している。よく知られている担体の例は、ガラス、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、デキストラン、ナイロン、アミラーゼ、天然および修飾セルロース、ポリアクリルアミド、アガロースおよび磁鉄鉱を含む。担体の性質は、本発明の目的のためには可溶性または不溶性のいずれかであることが可能である。当業者は、モノクローナル抗体の結合のための他の適切な担体を知っているであろうし、また日常的な実験を用いてそれを確かめることが可能であろう。
【０１７６】
抗体、その断片または抗体を生産する細胞株を含む組成物は、本発明により包含される。これらの組成物が薬学的に使用される時、それらは薬学的に許容される担体と組み合わせられる。
【０１７７】
細胞
本発明は、腫瘍性骨軟化症を有する患者から単離された腫瘍塊の選択された表現型の同定、特徴付け、および調節のための方法を提供する。選択された細胞の操作は本発明のこれらの方法を実施するために有用である。
【０１７８】
本発明における使用のためにサンプル細胞が取得されることが可能である腫瘍は、腫瘍性骨軟化症の症状を有する患者を起源とする腫瘍である。これらは、間葉系起源の血管周囲細胞腫および他の腫瘍、前立腺および肺のガン、線維性骨異形成症、線状脂腺性母斑症候群、神経線維腫症ならびに燕麦細胞癌を含むが、これらに限定しない。
【０１７９】
腫瘍細胞は典型的には、切除、生検または内視鏡サンプリングによりガン患者から取得される；細胞は直接使用される、凍結保存される、または維持される、あるいは培養において拡大されてもよい。腫瘍および患者の血液または血液分画の両方のサンプルは、細胞を共培養する前に無菌状態を確実にするために完全に試験されるべきである。標準的な無菌試験は当業者に既知であり、本明細書においては詳細に記載されていない。細胞株を生成するために腫瘍細胞はインビトロにおいて培養されることが可能である。短期間培養を確立する、および様々な腫瘍型から少なくとも１０８の細胞を取得する信頼できる条件は、Ｄｉｌｌｍａｒら（１９９３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．１４：６５〜６９に記載されている。または腫瘍細胞は、使用前に標準的機械法により、例えば、生検サンプルから分散させることが可能である。
【０１８０】
本発明のある一つの局面は、サンプル細胞および対照細胞間の転写物発現パターンの比較を含む。対照細胞の選抜は、最初に選択されたサンプル細胞および興味のある表現型により決定される。対照細胞は、対応物である正常細胞型、対応物である良性細胞型、対応物である非腫瘍細胞型、および腫瘍細胞の非腫瘍前駆細胞の任意のものであることが可能である。例えば、サンプル細胞は、腫瘍性骨軟化症を有する患者から単離された血管周囲細胞腫細胞であることが可能である；対応物である対照細胞は、腫瘍性骨軟化症を有さない患者から単離された血管周囲細胞腫細胞であることが可能である。
【０１８１】
短期間培養を確立する、および様々な腫瘍型から少なくとも１０８の細胞を取得する信頼できる条件は、Ｄｉｌｌｍａｒら（１９９３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．１４：６５〜６９に記載されている。または腫瘍細胞は、使用前に標準的機械法により、例えば、生検サンプルから分散させることが可能である。
【０１８２】
本発明のある一つの局面は、サンプル細胞および対照細胞間の転写物発現パターンの比較を含む。対照細胞の選抜は、最初に選択されたサンプル細胞および興味のある表現型により決定される。対照細胞は、対応物である正常細胞型、対応物である良性細胞型、対応物である非腫瘍細胞型、および腫瘍細胞の非腫瘍前駆細胞の任意のものであることが可能である。例えば、サンプル細胞は、腫瘍性骨軟化症を有する患者から単離された血管周囲細胞腫細胞であることが可能である；対応物である対照細胞は、腫瘍性骨軟化症を有さない患者から単離された血管周囲細胞腫細胞であることが可能である。
【０１８３】
ＳＮＰ技術を用いた遺伝的多型の同定、解析および操作
単離されたＦＲＰ−４遺伝子は、ヒト集団における遺伝子の変異体変種である、単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）を探索および同定するために使用されることが可能である。そのような多型の同定は、ＦＲＰ−４遺伝子内の変異が寄与するヒト疾患を定義づけるために、およびＦＲＰ−４遺伝子によりコードされるタンパク質が関連する疾患過程の完全な治療にとって、有用である。この様式により同定される遺伝子の変異体変種は、その後、これら疾患を治療するための薬学的作用物質の開発、スクリーニングおよび解析において活用されることが可能である。そのようなＳＮＰを検出するための方法は、診断テストを作成するために形式化されることが可能である。さらに、異なる個人の治療的作用物質への応答に影響を与える遺伝子内の様々な変異が同定され、その後、適切な治療の処方に導くために、ＳＮＰの解析を通じて診断されることが可能である。また、ＦＲＰ−４遺伝子内に同定されたＳＮＰは、ＦＲＰ−４遺伝子が位置するゲノム領域内の他の遺伝子および変異を解析するための遺伝子テストの有用な配列マーカーを提供することが可能である。したがって、これらのＳＮＰを多型データベースに組み入れることは有用である。
【０１８４】
当技術の熟練した実施者は、ＳＮＰの同定および解析の一連の方法を熟知している。ハイブリダイゼーションによるシークエンス（Ｄｒｍａｎａｃら、（１９９３）Ｓｃｉｅｎｃｅ　２６０：１６４９〜５２）、ミニシークエンスプライマー伸長（Ｓｙｖａｎｅｎ（１９９９）Ｈｕｍ．Ｍｕｔａｔ．１３（１）：１〜１０）などのハイスループットＤＮＡ配列決定処理、または他の配列決定法が、遺伝子の限定された領域内においてＳＮＰを検出するために使用されることが可能である。または、ＤＮＡマイクロアレイ上のオリゴヌクレオチドへのハイブリダイゼーション（Ｌｉｐｓｈｕｔｚら（１９９９）Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．２１（追補１）：２０〜４）、様々な解析法によるＤＮＡまたはＲＮＡ分子の一本鎖構造多型解析（Ｎａｔａｒａｊ（１９９９　Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、英国）ｐｐ：２７７〜２９７；Ｄｏｒｉｎら（１９９２）Ｎａｔｕｒｅ　３５９：２１１〜２１５）．）Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ　２０（６）：１１７７〜８５）、多型配列をまたぐプライマーを用いてのＰＣＲなどのＰＣＲベースの変異解析、または、細菌ｍｕｔＳタンパク質の使用などによって、ヌクレアーゼ保護からのＳＮＰ含有オリゴヌクレオチドを保護することが利用され得る。自動キャピラリー電気泳動法（Ｌａｒｓｅｎら（１９９９）Ｈｕｍ．Ｍｕｔａｔ．１３（４）：３１８〜２７）、飛行時間型質量分析計（Ｌｉら（１９９９）前記）、高密度マイクロアレイ法（Ｓａｐｏｌｓｋｙら（１９９９）Ｇｅｎｅｔ．Ａｎａｌ．１４（５〜６）：１８７〜９２）、半導体マイクロチップ（Ｇｉｌｌｅｓら（１９９９）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１７（４）：３６５〜７０）ならびに他の方法に基づく多くの高性能なハイスループット技術は、上記の使用を実施するためにＦＲＰ−４遺伝子とともにそれが活用されることが可能であることを証明している。
【０１８５】
本明細書において引用される全ての書籍、記事および特許は参照として組み入れられている。以下の実施例は、本発明を制限することではなく、説明することを意図している。
【０１８６】
実施例
１、 ＦＲＰ−４遺伝子の機能解析
標準的クローン化戦略を用いて、ＦＲＰ−４タンパク質をコードする全長ｃＤＮＡが発現ベクターに挿入され、そしてＦＲＰ−４タンパク質が哺乳類培養細胞にて発現された。生産のために急速に拡大することが可能である安定細胞株もまた確立された。インビトロ発現されたＦＲＰ−４はその後、調整培養液中に分泌分子として生産され、そしてリン酸再吸収を測定する機能アッセイ法のために調製された。
【０１８７】
リン酸輸送アッセイ法
ＦＲＰ−４タンパク質のリン酸輸送調節活性は、当技術分野において既知である方法および技術を用いて解析された。具体的には、ナトリウム依存性リン酸取りこみがが、Ｃａｉら（１９９４）Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３３０：１６４５〜１６４９において記載されている方法にしたがってフクロネズミ腎臓（ＯＫ）細胞中で測定された。簡単には、ＯＫ細胞は集密的になるまで培養され、回収され、そしてその後２４ウェルディッシュにつき１ｘ１０５細胞の密度で再度播種された。細胞は、その後集密的になる時間を過ぎて数日間再増殖され、そしてその後ＦＲＰ−４含有培地ならびに、様々な別の実験および対照因子を含む培地を用いて再給与された。３時間から４８時間に延長したインキュベーション時間の後、培地が除去され、そして播種された細胞が、３２Ｐ標識リン酸水素２カリウムを含む輸送培地を用いて再給与され、そして３７℃にて５分間インキュベーションされた。細胞はその後洗浄され、回収され、そして３２Ｐの取りこみを測定するためにシンチレーション計測器を用いて放射活性が測定された。
【０１８８】
ＦＲＰ−４タンパク質含有調整培地および対照サンプルに関して実施されたＯＫリン酸輸送アッセイ法の結果は、この因子を含まない対照サンプルと比較して、ＦＲＰ−４タンパク質含有調整培地がＯＫ細胞によるリン酸取りこみにおいて統計学的に有意な減少を誘導することを示した。
【０１８９】
本発明は上記の実施態様とともに記載されているけれども、前述の記載および引き続く実施例は、本発明の範囲を制限することではなく、説明することを意図していることは理解されるべきである。本発明の範囲内の他の局面、利点および修飾は、本発明が関係する当業者には明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は配列番号：１、ヒトフリッズルド関連タンパク質、ＦＲＰ−４をコードするポリヌクレオチドを示す。ポリヌクレオチドは２４８０ヌクレオチドを含む、そして位置２５８〜１２９８まで伸びる読取り枠を有する。ヌクレオチド２５８から１２９５に由来する転写解読枠が存在する。開始ＡＴＧおよび終止コドンは太字により同定される。
【図２】図２は相当するアミノ酸配列を示す（配列番号：２）。
【図１】
2004503602.tif 000003
【図２】
2004503602.tif 000004
【国際公開パンフレット】
2004503602.tif 000005
2004503602.tif 000006
2004503602.tif 000007
2004503602.tif 000008
2004503602.tif 000009
2004503602.tif 000010
2004503602.tif 000011
2004503602.tif 000012
2004503602.tif 000013
2004503602.tif 000014
2004503602.tif 000015
2004503602.tif 000016
2004503602.tif 000017
2004503602.tif 000018
2004503602.tif 000019
2004503602.tif 000020
2004503602.tif 000021
2004503602.tif 000022
2004503602.tif 000023
2004503602.tif 000024
2004503602.tif 000025
2004503602.tif 000026
2004503602.tif 000027
2004503602.tif 000028
2004503602.tif 000029
2004503602.tif 000030
2004503602.tif 000031
2004503602.tif 000032
2004503602.tif 000033
2004503602.tif 000034
2004503602.tif 000035
2004503602.tif 000036
2004503602.tif 000037
2004503602.tif 000038
2004503602.tif 000039
2004503602.tif 000040
2004503602.tif 000041
2004503602.tif 000042
2004503602.tif 000043
2004503602.tif 000044
2004503602.tif 000045
2004503602.tif 000046
2004503602.tif 000047
2004503602.tif 000048
2004503602.tif 000049
2004503602.tif 000050
2004503602.tif 000051
2004503602.tif 000052
2004503602.tif 000053
2004503602.tif 000054
2004503602.tif 000055
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004503602.tif 000056
2004503602.tif 000057
【国際調査報告】
2004503602.tif 000058
2004503602.tif 000059
2004503602.tif 000060
2004503602.tif 000061
2004503602.tif 000062
2004503602.tif 000063