(57)【要約】鋳型（好ましくは５００Ｄａ超の分子サイズの分子、又はより大きなもの、例えば細胞、ウイルス又は組織試料）を溶解し、又は液体中で懸濁する。当該液体を凍結し、そして「インプリント」された、凍結した液体を残すように鋳型を除去する（例えば溶解又は電気泳動によって、あるいは機械的に）。これにより、鋳型物質を選択的に吸着することが可能となる。これは分離媒体、センサー及びアッセイにおける認識因子として、並びに触媒として有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
鋳型材料に選択的に結合することができる選択的結合材料を調製するための方法であって、
（ａ）鋳型材料及び分散媒を含んで成る組成物を調製し；
（ｂ）当該組成物を凍結し；そして
（ｃ）凍結した組成物から少なくとも部分的に鋳型材料を除去し、鋳型材料が除去された結合部位を有する、凍結した分散媒をそのままの状態で維持せしめること、
を含んで成る方法。
【請求項２】
段階（ｃ）において、鋳型材料が機械的に除去される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
段階（ｃ）において、鋳型材料がそれらの溶媒を用いて洗浄することによって除去される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
段階（ｃ）において、鋳型材料が電気透析によって除去される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
選択的結合材料を調製し、そして使用するための方法であって、
（ａ）鋳型材料及び分散媒を含んで成る組成物を調製し；
（ｂ）当該組成物を凍結し；そして
（ｃ）凍結した組成物を、凍結した組成物中の鋳型材料と選択的に相互作用する分子種を含む溶液と接触させること、
を含んで成る方法。
【請求項６】
前記段階（ｃ）が、分子認識、選択的結合、検査、アッセイ、触媒を達成するために使用される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
鋳型材料が、タンパク質、生物学的受容体、核酸、染色体、細胞、ウイルス、微生物、組織試料、炭水化物、オリゴ糖、多糖、核タンパク質、ムコタンパク質、リポタンパク質、合成タンパク質、糖タンパク質、グルコサミノグリカン、ステロイド、免疫抑制剤、ホルモン、ヘパリン、抗生物質、ビタミン及び薬物から選択される、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
分散媒が水、水性溶媒、無機性の液体、有機溶媒、金属、可融性の有機化合物、可融性の無機化合物、ポリマー及びガスから選択される、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記分散媒が液体であり、そして段階（ａ）で調製された前記組成物が鋳型材料の溶液である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
溶液が水によるものであり、そして鋳型材料がタンパク質である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
鋳型材料が固体の支持体上に固定化される、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法の方法。
【請求項１２】
異なる融点を有する鋳型材料が二層間に分配される、請求項ｊ１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
鋳型材料が除去された結合部位を有する凍結した分散媒から成る、請求項１〜４又は６〜１２のいずれか１項に記載の方法によって調製される、選択的結合材料。
【請求項１４】
分離マトリックスとしての請求項１３に記載の材料の使用。
【請求項１５】
鋳型材料又はその類似物を検査し、又はアッセイするためのセンサー又はアッセイのための認識因子としての請求項１２に記載の材料の使用。
【請求項１６】
触媒としての、請求項１２に記載の材料の使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
技術分野
本発明は、選択的結合材料、それらの調製及び使用に関する。
【０００２】
背景技術
Ｐｏｌｙａｋｏｖは、１９３０年代に鋳型分子の存在下でケイ酸を濃縮することによって調製した基質特異的材料について説明した（Ｚｈｕｒ． Ｆｉｚ． Ｋｈｉｍ．２：７９９（１９３１）；１０：１００（１９３７）；４：４５４（１９３３））。更に最近の研究者は、鋳型分子の存在下で重合化される、有機モノマーを使用してきた（例えば、米国特許第５１１０８３３号、第５７２８２９６号、第５７５６７１７号、ＷＯ ９６４１１７３）。
【０００３】
発明の開示
最初の観点において、本発明は、鋳型材料に選択的に結合することができる選択的結合材料を調製するための方法であって、
（ａ）鋳型材料及び分散媒を含んで成る組成物を調製し；
（ｂ）当該組成物を凍結し；そして
（ｃ）凍結した組成物から少なくとも部分的に鋳型材料を除去し、鋳型材料が除去された結合部位を有する、凍結した分散媒をそのままの状態で維持せしめること、
を含んで成る方法、を提供する。
【０００４】
鋳型材料は、タンパク質、生物学的受容体、核酸、染色体、細胞、ウイルス、微生物、組織試料、炭水化物、オリゴ糖、多糖、核タンパク質、ムコタンパク質、リポタンパク質、合成タンパク質、糖タンパク質、グルコサミノグリカン、ステロイド、免疫抑制剤、ホルモン、ヘパリン、抗生物質、ビタミン及び薬物から選択されることがある。
【０００５】
分散媒は、水、水性溶媒、水溶液、無機性の液体、有機溶媒、金属、可融性の有機化合物、可融性の無機化合物、ポリマー及びガスから選択されることがある。鋳型材料が分子である場合、分散媒は通常その溶媒である。組成物は懸濁液であってもよく、これは通常鋳型材料が複合体、例えば組織試料である場合の状態である。溶融金属は、通常低融点の金属、例えば水銀及びガリウムに限定される。温度及び／又は圧力の調整によって液化され、そして凝固されうる気体も使用され得る。
【０００６】
好ましい組成物は、例えばタンパク質の水溶液である。
【０００７】
組成物は二層の系であってもよく、例えば不混和性溶媒（例えば、水と有機溶媒、例えばクロロホルム又はエーテル）間に分配された鋳型材料を含むものである。これらのうちのより高温で凍結するものだけが段階（ｂ）で凍結され得る。
【０００８】
鋳型材料が可溶性である場合、段階（ｃ）は通常、好ましくは凍結した分散媒が実質的に可溶でない溶媒を用いる（例えば、クロロホルム、アセトニトリル又は氷から材料を除去するための他の有機溶媒又は混合物を用いる）、その溶解を包含する。適当な材料は、電気透析によって除去することができる。粒子材料の場合は特に、機械的な除去が適切なことがある。
【０００９】
本発明は、好ましくは５００Ｄａを超える分子サイズの鋳型分子を使用する。
【００１０】
凍結してインプリントされた液体は、インプリントされていない材料より優れた所定の親和性及び特異性を有し、そして伝統的な架橋型インプリントポリマーよりもはるかに容易に調製され得る。本発明に記載の様に調製された材料は、分離及び精製における吸着剤として、並びにセンサー及びアッセイにおける触媒及び認識材料として使用され得る。
【００１１】
第二の観点において、本発明は、上記方法によって調製されるような選択的結合材料を提供する。
【００１２】
更なる観点において、本発明は、選択的な結合能を活用するその様な材料の使用を提供する。分離マトリックスとしての使用を以下に例示する。センサー又はアレイにおける使用例は、それらを利用する免疫センサー及びアッセイにおける抗体の代わりに我々の材料を用いることを包含することがある。触媒としての使用例は、鋳型材料として遷移状態に類似するものを利用して、その様な遷移状態を介して進行する反応を触媒することができる材料を製造することを包含する。
【００１３】
より更なる観点において、本発明は、選択的結合材料を調製し、そして使用する方法であって：
（ａ）鋳型材料及び分散媒を含んで成る組成物を調製し；
（ｂ）当該組成物を凍結し；そして
（ｃ）凍結した組成物を、凍結した組成物中の鋳型材料と選択的に相互作用する分子種を含む溶液と接触させること、
を含んで成る方法を提供する。
【００１４】
伝統的なインプリントポリマー化は、小さな有機物質、例えば薬物、又はタンパク質若しくは細胞でもありうる鋳型の周囲の硬質ポリマーネットワークの形成を含む。この方法で調製した分子インプリントポリマー（ＭＩＰ）は、支配的に共有結合の相互作用によって共に結合したモノマーから成る。
【００１５】
本発明は、様々な観点において、鋳型の存在下で溶媒又は他の液体を凍結することによる基質特異的材料の形成を説明する。溶媒が、せいぜい機能性モノマーと鋳型との間の複合体の形成を容易にする反応媒体という第二の役割を果たす伝統的なＭＩＰの調製とは反対に、この新規なアプローチは、凍結した溶媒が吸着剤として作用する能力に依拠する。鋳型の存在下で調製された場合、凍結した溶媒は、空にされ、そして鋳型分子の再結合のために使用され得る鋳型分子によって占められた空洞を含む。形成したインプリントの構造は、鋳型分子のものと類似の構造及び形状を有する鋳型又は分子の構造と相補的であるべきである。
【００１６】
鋳型材料が凍結した分散媒から除去されない態様において、鋳型は固定されたままである。当該分子、懸濁液の粒子又は組織の少なくとも一部は、曝露され、そしてその後の作用（認識、結合、触媒、検出等）にとって利用可能なままである。その様な材料は、分離マトリックス、センサー又はアッセイの因子として、並びに触媒として使用され得る。
【００１７】
本発明の実施形態
１．イソプロテレノール特異的吸着剤の調製
Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ２５を、試料当たり３０ｍｇ、フィルトレーションマイクロプレートのウェルに移し、そして０．２ｍｌの、１ｍｇ／ｍｌの（＋）−イソプロテレノール（＋）−酒石酸水素塩溶液中で一晩膨潤させた。過剰な溶液を減圧下での濾過によって除去し、そして吸着剤を０．２ｍｌのクロロホルムで２回で流した。膨潤した吸着剤を−１５℃で１２時間凍結した。吸着剤を−１５℃でのアセトニトリルで４回洗浄した。ブランクの材料は、イソプロテレノールの非存在下であることを除き、同様の方法で調製した。調製した吸着剤の吸着特性は、０．１〜１０ｍｇ／ｍｌに及ぶ濃度の相当する解析物の０．１５ｍｌのアリコートを添加することによって評価した。溶液中のイソプロテレノールの濃度は、２８０ｎｍで分光光度計によって測定した。吸収解析の結果は、鋳型の存在下で調製された氷が、図１のブランク試料よりも鋳型に対してより高い親和性を有することを示す。同時に、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ２５自体はイソプロテレノールに対して親和性を有さない。
【００１８】
イソプロテレノールの存在下で調製した同一の材料は、イソプロテレノールと類似の構造を有する化合物を用いた実験においてＨＰＬＣによって解析された。この解析結果は、氷が溶液中に存在した標的化合物に対して最大の親和性を有することを示す（図２）。ＨＰＬＣカラム（１００ｘ４．６ｍｍの内径）は、１ｍｇ／ｍｌの（＋）イソプロテレノール（ＭＩＰ）又は水（ブランク）中で膨潤した約１ｇのＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ２５で充填した。カラムをクロロホルムで洗浄し、そして−１５℃で１２時間凍結した。全てのクロマトグラフィーの実験は、２８０ｎｍでの検出及び１ｍｌ／分の流速を用いて−１０℃で実施した。カラムは、安定な基準線が得られ、そして溶媒が１０％水性アセトニトリルで交換されるまでオンラインで洗浄した。０．１ｍｇ／ｍｌの濃度の、２０μｌの解析物の溶液をインジェクションに使用した。Ｉｐｒ（＋）は（＋）イソプロテレノール、Ｉｐｒ（−）は（−）イソプロテレノール、Ｐｈｅはフェニレフリン、Ｐｒｏはプロプラノロール、Ｅｐｉはエピネフリン、Ｎｅｐはノルエピネフリンである。
【００１９】
２．Ｌ−フェニルアラニン特異的材料の調製
本実験は、Ｗａｔｅｒｓ社の、キャピラリー電気泳動ユニットＱｕａｎｔａ ４０００Ｅを用いて実施した。キャピラリー（ｆｕｓｅｄ ｓｉｌｉｃａ， ８０ｃｍ， １００ｕｍの内径、Ｐｏｌｙｍｉｃｒｏ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｈａｌｌｏｗ， ＵＫ）の３５ｃｍ部分を、冷凍ユニットと繋がれ、そして−１４．５℃の温度に冷却された断熱チューブに挿入した。キャピラリーは、９．５ｍＭ ＨＣｌ中のＬ−Ｐｈｅの２ｍＭ溶液を充填され、そしてキャピラリーの管腔の内側にある液体の完全な凍結を可能にするために、−１４．５℃で１時間インキュベートされた。氷から鋳型を溶出するために、１３ｋＶの電圧をキャピラリーに適用し、そして基準線が安定するまで維持された。９．５ｍＭ ＨＣｌ中で２ｍＭの濃度に希釈されたＤ−Ｐｈｅ， Ｌ−Ｐｈｅ又はラセミ化合物の試料は、キャピラリー内に流体力学的に６秒間インジェクションされた。ランは１３ｋＶを適用することによって実施された（電流は１０μＡである）。同一の実験は、鋳型の非存在下で形成した、ブランクの氷を用いて実施した。この解析結果は、Ｌ−Ｐｈｅの存在下、キャピラリー中で形成した氷が鋳型に対して増大した親和性を有し、そして光学鏡像異性体を分離するために使用され得ることを証明した（図４）。Ｌ−ＰｈｅとＤ−Ｐｈｅの分離は、コントロール（ブランク）の氷が充填されたキャピラリーが使用された場合には観察されなかった。
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は、材料の存在下で形成した氷とその非存在下で形成した氷に対する鋳型材料（「ｍｉｐ」）の吸収を比較する吸着等温線を示す。
【図２ａ】
図２ａは、解析物のうちの１つを存在下で調製した選択的結合材料を含むカラムを通過した各種解析物の容積比Ｋ’を示す。
【図２ｂ】
図２ｂは、解析物のうちの１つを存在下で調製した選択的結合材料を含むカラムを通過した各種解析物の分離係数を示す。
【図３】
図３は、Ｌ−フェニルアラニンの存在下で形成した氷で充填されたキャピラリー中のＤ−フェニルアラニンとＬ−フェニルアラニンの混合物の電気泳動結果を示すトレースである。
【図１】
2004510788.tif 000002
【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図３】
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【国際公開パンフレット】
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2004510788.tif 000007
2004510788.tif 000008
2004510788.tif 000009
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2004510788.tif 000012
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2004510788.tif 000014
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2004510788.tif 000022
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004510788.tif 000023
【国際調査報告】
2004510788.tif 000024
2004510788.tif 000025