(57)【要約】特定の対象遺伝子群の、少なくとも一つ及び／またはそれらの規制領域に関連する造血細胞の増殖異常の検知及び差別化方法であって、標的核酸内のメチル化または非メチル化ＣpＧジヌクレオチッドの識別をする、少なくとも一種の試薬または一連の試薬によって、前記対象から得られた、生物学的試料における標的核酸に接触することからなる方法。正常な造血細胞と増殖異常の造血細胞を識別する前記方法。急性リンパ球性白血病と急性骨髄性白血病を識別する前々記方法及び前記方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象中のＡＢＬ１、ＡＢＬ１、ＡＰＡＦ１、ＡＰＣ、ＡＲ、ＡＲＨＩ、ＢＡＫ１、ＢＡＸ、ＢＣＬ２、ＣＡＳＰ１０、ＣＡＳＰ８、ＣＡＳＰ９、ＣＣＮＤ２、ＣＤＣ２、ＣＤＣ２５Ａ、ＣＤＨ１、ＣＤＨ３、ＣＤＫ４、ＣＤＫＮ１Ａ、ＣＤＫＮ１Ｂ、（p２７Ｋip１）、ＣＤＫＮ１Ｃ、ＣＤＫＮ２a、ＣＤＫＮ２Ｂ、ＣＳＮＫ２Ｂ、ＤＡＰＫ１、ＥＧＲ４、ＥＬＫ１、ＥＳＲ１、ＦＯＳ、ＧＰＩb beta、ＧＰＲ３７、ＧＳＫ３β、ＧＳＴＰ１、ＨＩＣ-１、ＨＯＸＡ５、ＩＧＦ２、ＭＤＲ１、ＭＧＭＴ、ＭＬＨ１、ＭＯＳ、Ｈumos、ＭＰＬ、ＭＹＣ、ＭＹＣＬ１、ＭＹＯＤ１、Ｎ３３、ＰＩＴＸ２、ＰＭＬ、ＰＭＳ２、ＰＲＡＭＥ、ＰＴＥＮ、ＲＢ１、ＲＢＬ２、ＳＤＣ４、ＳＦＮ、ＴＣＬ１Ａ、ＴＧＦＢＲ２、ＴＰ７３、ＷＴ１、Ｎ-ＭＹＣ、Ｌ-ＭＹＣ、Ｃ-ＡＢＬ、ＥＬＫ１、Ｔubulin、ＣＳＦ１、ＣＤ１Ｒ３、ＣＳＮＫ２Ｂ、Ｍe４９１／ＴＤ６３、ＡＲ、ＣＤＫ４、Ｈumos、ＣＤＣ２５Ａ、ＣＭＹＣex３からなる群の、少なくとも一つの遺伝子及び／またはそれらの規制領域に関連する造血細胞の増殖異常の検知及び差別化方法であって、標的核酸内のメチル化または非メチル化ＣpＧジヌクレオチッドの識別をする、少なくとも一種の試薬または一連の試薬によって、前記対象から得られた、生物学的試料における標的核酸に接触することからなる方法。
【請求項２】
正常な造血細胞と増殖異常の造血細胞を識別する請求項１に記載の方法。
【請求項３】
急性リンパ性白血病と急性骨髄性白血病を識別する請求項１に記載の方法。
【請求項４】
ＣＤＫＮ１Ａ、ＣＤＫ４、ＡＲが健康な造血細胞と増殖異常の造血細胞を識別することに使用される請求項１または２に記載の方法の使用。
【請求項５】
Ｎ３３、ＥＧＲ４、ＣＤＫＮ１Ａ、ＳＤＣ４、ＭＰＬ、ＴＰ７３、ＢＡＫ１、ＣＳＮＫ２Ｂ、ＡＲＨＩ、ＣＡＳＰ１０が急性リンパ性白血病及と急性骨髄性白血病を識別することに使用される請求項１または３に記載の方法の使用。
【請求項６】
下記の各ステップからなる請求項１〜５の何れか１項に記載の方法。
ゲノムＤＮＡ含有の生物学的試料を得、ゲノムＤＮＡを抽出し、５位置が非メチル化であるゲノムＤＮＡ試料中のシトシン塩基を処理して、その塩基対挙動がシトシンに類似していないウラシルまたは他の塩基に変換し、前以って処理されたゲノムＤＮＡの断片を増幅し、一つ以上のシトシン位置のメチル化状態を同定する。
【請求項７】
試薬が重亜硫酸塩、亜硫酸水素塩、酸性亜硫酸塩の溶液であることを特徴とする、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
増幅がポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって行なわれることを特徴とする、請求項６または７に記載の方法。
【請求項９】
増幅が耐熱性ＤＮＡポリメラーゼによって行なわれることを特徴とする、請求項６〜８の何れか１項に記載の方法。
【請求項１０】
１００〜２０００塩基対の長さを有する、１０以上の異なる断片が増幅されることを特徴とする、請求項６〜９の何れか１項に記載の方法。
【請求項１１】
増殖ステップが、ＳＥＱ ＩＤ Ｎo．：３８７〜ＳＥＱ ＩＤ Ｎo．：５３４からなるプライマーオリゴヌクレオチッドの集合を使用して実施される、請求項６〜１０の何れか１項に記載の方法。
【請求項１２】
幾つかのＤＮＡ切片の増幅が一つの反応器を使用して実施されることを特徴とする、請求項６〜１１の何れか１項に記載の方法。
【請求項１３】
増幅ステップが、特に健全な及び／または病んだ造血細胞に関連するＤＮＡを、造血細胞の特殊なゲノムメチル化状態に基づき、バックグラウンドＤＮＡに対して、優先的に増幅するものであることを特徴とする、請求項６〜１２の何れか１項に記載の方法。
【請求項１４】
少なくとも一つの遺伝子及び／または、ＡＢＬ１、ＡＢＬ１、ＡＰＡＦ１、ＡＰＣ、ＡＲ、ＡＲＨＩ、ＢＡＫ１、ＢＡＸ、ＢＣＬ２、ＣＡＳＰ１０、ＣＡＳＰ８、ＣＡＳＰ９、ＣＣＮＤ２、ＣＤＣ２、ＣＤＣ２５Ａ、ＣＤＨ１、ＣＤＨ３、ＣＤＫ４、ＣＤＫＮ１Ａ、ＣＤＫＮ１Ｂ、（p２７Ｋip１）、ＣＤＫＮ１Ｃ、ＣＤＫＮ２a、ＣＤＫＮ２Ｂ、ＣＳＮＫ２Ｂ、ＤＡＰＫ１、ＥＧＲ４、ＥＬＫ１、ＥＳＲ１、ＦＯＳ、ＧＰＩb beta、ＧＰＲ３７、ＧＳＫ３β、ＧＳＴＰ１、ＨＩＣ-１、ＨＯＸＡ５、ＩＧＦ２、ＭＤＲ１、ＭＧＭＴ、ＭＬＨ１、ＭＯＳ、Ｈumos、ＭＰＬ、ＭＹＣ、ＭＹＣＬ１、ＭＹＯＤ１、Ｎ３３、ＰＩＴＸ２、ＰＭＬ、ＰＭＳ２、ＰＲＡＭＥ、ＰＴＥＮ、ＲＢ１、ＲＢＬ２、ＳＤＣ４、ＳＦＮ、ＴＣＬ１Ａ、ＴＧＦＢＲ２、ＴＰ７３、ＷＴ１、Ｎ-ＭＹＣ、Ｌ-ＭＹＣ、Ｃ-ＡＢＬ、ＥＬＫ１、Ｔubulin、ＣＳＦ１、ＣＤ１Ｒ３、ＣＳＮＫ２Ｂ、Ｍe４９１／ＴＤ６３、ＡＲ、ＣＤＫ４、Ｈumos、ＣＤＣ２５Ａ、ＣＭＹＣex３からなる群の、それらの規制領域内のメチル化状態が、各増幅産物のオリゴヌクレオチッドまたはペプチッド核酸（ＰＮＡ）オリゴマーのハイブリッド化によって検知されることを特徴とする、請求項６〜１３の何れか１項に記載の方法。
【請求項１５】
オリゴヌクレオチッドまたはペプチッド核酸（ＰＮＡ）オリゴマーが、ＳＥＱ ＩＤ Ｎo．：５３５〜ＳＥＱ ＩＤ Ｎo．：１２５８の群から得られることを特徴とする、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
増幅産物がラベルされることを特徴とする、請求項６〜１５の何れか１項に記載の方法。
【請求項１７】
増幅産物のラベルが蛍光ラベルであることを特徴とする請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
増幅産物のラベルが放射性核種であることを特徴とする請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
増幅産物のラベルが質量分析計で検出可能な、代表的な質量を有する検知可能な、分子断片であることを特徴とする請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
増幅産物または増幅物の断片ラベルが質量分析計で検出されることを特徴とする請求項６〜１９の何れか１項に記載の方法。
【請求項２１】
生産された断片が、単一の正または負の正味電荷を有することを特徴とする請求項１９または２０の何れか１項に記載の方法。
【請求項２２】
マトリックス補助レーザー脱離／イオン化質量分析（ＭＡＬＤＩ）または電子放散質量分析（ＥＳＩ）によって、検知が実施され、視覚化されることを特徴とする請求項１９〜２１の何れか１項に記載の方法。
【請求項２３】
下記のステップからなる請求項１〜５の何れか１項に記載の方法。
a）ゲノムＤＮＡ含有の生物学的試料を得、
b）ゲノムＤＮＡを抽出し、
c）少なくとも一つまたはそれ以上の、下記の遺伝子のＣpＧからなるゲノムＤＮＡを一つまたはそれ以上のメチル化感受性制限酵素によって消化すること、
ＡＢＬ１、ＡＢＬ１、ＡＰＡＦ１、ＡＰＣ、ＡＲ、ＡＲＨＩ、ＢＡＫ１、ＢＡＸ、ＢＣＬ２、ＣＡＳＰ１０、ＣＡＳＰ８、ＣＡＳＰ９、ＣＣＮＤ２、ＣＤＣ２、ＣＤＣ２５Ａ、ＣＤＨ１、ＣＤＨ３、ＣＤＫ４、ＣＤＫＮ１Ａ、ＣＤＫＮ１Ｂ、（p２７Ｋip１）、ＣＤＫＮ１Ｃ、ＣＤＫＮ２a、ＣＤＫＮ２Ｂ、ＣＳＮＫ２Ｂ、ＤＡＰＫ１、ＥＧＲ４、ＥＬＫ１、ＥＳＲ１、ＦＯＳ、ＧＰＩb beta、ＧＰＲ３７、ＧＳＫ３β、ＧＳＴＰ１、ＨＩＣ-１、ＨＯＸＡ５、ＩＧＦ２、ＭＤＲ１、ＭＧＭＴ、ＭＬＨ１、ＭＯＳ、Ｈumos、ＭＰＬ、ＭＹＣ、ＭＹＣＬ１、ＭＹＯＤ１、Ｎ３３、ＰＩＴＸ２、ＰＭＬ、ＰＭＳ２、ＰＲＡＭＥ、ＰＴＥＮ、ＲＢ１、ＲＢＬ２、ＳＤＣ４、ＳＦＮ、ＴＣＬ１Ａ、ＴＧＦＢＲ２、ＴＰ７３、ＷＴ１、Ｎ-ＭＹＣ、Ｌ-ＭＹＣ、Ｃ-ＡＢＬ、ＥＬＫ１、Ｔubulin、ＣＳＦ１、ＣＤ１Ｒ３、ＣＳＮＫ２Ｂ、Ｍe４９１／ＴＤ６３、ＡＲ、ＣＤＫ４、Ｈumos、ＣＤＣ２５Ａ、ＣＭＹＣex３
d）消化ステップc）で生成するＤＮＡの検知。
【請求項２４】
ＤＮＡ消化物がステップd）に先立ち増幅される請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
増幅がポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって行なわれることを特徴とする請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
一つ以上のＤＮＡ断片の増幅が一つの反応器中で行なわれることを特徴とする請求項２４及び／または２５に記載の方法。
【請求項２７】
ポリメラーゼが耐熱性ＤＮＡポリメラーゼであることを特徴とする請求項２４〜２６の何れか１項に記載の方法。
【請求項２８】
ＳＥＱ ＩＤ Ｎo．：９５〜ＳＥＱ ＩＤ Ｎo．：３８６及びそれに相補的な配列からなる群より得られた配列の一つを有する、前処理されたゲノムＤＮＡの分離核酸。
【請求項２９】
特に一つのオリゴヌクレオチッドまたはペプチッド核酸（ＰＮＡ）オリゴマーであるオリゴマー、であって、請求項２８記載のＳＥＱ ＩＤ Ｎo．：９５〜ＳＥＱ ＩＤ Ｎo．：３８６の配列の一つである、前処理されたゲノムＤＮＡに、ハイブリッド化するかまたは同じである、少なくとも、１０ヌクレオチッドの塩基配列の一つからなる、オリゴマー。
【請求項３０】
塩基配列が少なくとも一つのＣpＧまたはＴpＧジヌクレオチッド配列を含む請求項２９に記載のオリゴヌクレオチッド。
【請求項３１】
少なくとも一つのＣpＧまたはＴpＧジヌクレオチッドのシトシンがオリゴマーのほぼ中央３番目に存在することを特徴とする請求項３０に記載のオリゴヌクレオチッド。
【請求項３２】
特に一つのオリゴヌクレオチッドまたはペプチッド核酸（ＰＮＡ）オリゴマーである、オリゴマーが、ＳＥＱ ＩＤ Ｎo．：５３５〜ＳＥＱ ＩＤ Ｎo．：１２５８からなる群から得られる配列の一つである。
【請求項３３】
請求項２９〜３２の何れか１項に記載の、少なくとも二つのオリゴヌクレオチッドからなるオリゴヌクレオチッドの集合。
【請求項３４】
ＳＥＱ ＩＤ Ｎo：１２４５、１２４５、１２４６、１２４６、１２４７、１２４７、１２４８、１２４８、１２４９、１２４９、１２５０、１２５０、１２５１、１２５１、１２５２、１２５２、１２５３、１２５３、１２５４、１２５４、１２５５、１２５５、１２５６、１２５６、１２５７、１２５７、１２５８、１２５８である少なくとも二つのオリゴヌクレオチッドからなるオリゴヌクレオチッドの集合。
【請求項３５】
ＳＥＱ ＩＤ Ｎo：８８〜９４である群から得られる一つ以上の分離された核酸。
【請求項３６】
ＳＥＱ ＩＤ Ｎo：１２１１〜１２３１、１２３１、１２３２、１２３２、１２３３、１２３３、１２３４、１２３４、１２３５、１２３５、１２３６、１２３６、１２３７、１２３７、１２３８、１２３８、１２３９、１３９３、１２４０、１２４０、１２４１、１２４１、１２４２、１２４２、１２４３、１２４３、１２４４、１２４４である少なくとも二つのオリゴヌクレオチッドからなるオリゴヌクレオチッドの集合。
【請求項３７】
ＳＥＱ ＩＤ Ｎo：７４〜８７である群から得られる一つ以上の分離された核酸。
【請求項３８】
ＳＥＱ ＩＤ Ｎo．：１〜ＳＥＱ ＩＤ Ｎo．：７３及びそれに相補的な配列の一つ以上に含まれる全てのＣpＧジヌクレオチッドのメチル化状態を検知するための、オリゴマーからなる、請求項３３〜３５及び請求項３７の何れか１項に記載のオリゴマー、ペプチッド核酸（ＰＮＡ）オリゴマー及び／または分離された核酸の集合。
【請求項３９】
ＳＥＱ ＩＤ Ｎo．：１〜ＳＥＱ ＩＤ Ｎo．：７３及びそれに相補的な配列のシトシンのメチル化状態及び／または単一、多形性、ヌクレオチッド（ＳＮＰs）の決定のための試料として、請求項２９〜３４及び請求項３６の何れか１項に記載の、オリゴマーまたはペプチッド核酸（ＰＮＡ）オリゴマーの集合の使用。
【請求項４０】
健全な造血細胞と増殖異常の造血細胞の差別化のための、請求項３４記載のオリゴヌクレオチッドまたは請求項３５記載の核酸の集合の使用。
【請求項４１】
急性リンパ性白血病と急性骨髄性白血病の差別化のための、請求項３６記載のオリゴヌクレオチッドまたは請求項３７記載の核酸の集合の使用。
【請求項４２】
請求項２８記載のＳＥＱ ＩＤ Ｎo．：９５〜ＳＥＱ ＩＤ Ｎo．：３８６の配列の一つ、及び／またはそれに相補的である配列及びその切片の一つであるＤＮＡ配列の増幅のためのプライマーオリゴヌクレオチッドとしての、請求項２９に記載の少なくとも二つのオリゴヌクレオチッドまたはペプチッド核酸（ＰＮＡ）オリゴマーの一つの集合。
【請求項４３】
対応するゲノムＤＮＡのメチル化状態の決定及び／または単一、多形性、ヌクレオチッド（ＳＮＰs）の検知のための請求項２８に記載の前処理されたゲノムＤＮＡの使用。
【請求項４４】
少なくとも一つのオリゴヌクレオチッドが固相に結合することを特徴とする請求項３３、３４または３６の何れか１項に記載のオリゴヌクレオチッドまたはペプチッド核酸（ＰＮＡ）オリゴマーの一つの集合。
【請求項４５】
集合の全てのメンバーが固相に結合することを特徴とする請求項３３、３４または３６の何れか１項に記載のオリゴヌクレオチッドまたはペプチッド核酸（ＰＮＡ）オリゴマーの一つの集合。
【請求項４６】
請求項３３、３４または３６の何れか１項に記載のオリゴマーの少なくとも一つが固相に結合する（ことを特徴とする）、ＳＥＱ ＩＤ Ｎo．：１〜ＳＥＱ ＩＤ Ｎo．：７３及びそれに相補的な配列の一つが含まれる、ＣpＧジヌクレオチッドの対応するゲノムメチル化状態に関連する、疾病の解析のための、異なるオリゴマーまたはペプチッド核酸（ＰＮＡ）オリゴマー（アレー）の配置を行なう方法。
【請求項４７】
請求項４４または４５に記載の、異なるオリゴマーまたはペプチッド核酸（ＰＮＡ）オリゴマー（アレー）の配置。
【請求項４８】
正方形または六角形格子の、平面固相上に配置されることを特徴とする、請求項４７に記載の異なるオリゴヌクレオチッドオリゴマー配列及び／またはＰＮＡオリゴマー配列のアレー。
【請求項４９】
請求項１〜４８の何れか１項に記載の、少なくとも一つの核酸からなる、遺伝子のメチル化状態に関連する造血細胞の増殖異常の解析のための核酸またはペプチッド核酸アレー。
【請求項５０】
固相表面がシリコン、ガラス、ポリスチレン、アルミニウム、鋼鉄、鉄、銅、ニッケル、銀または金からなることを特徴とする請求項４７〜４９の何れか１項に記載のアレー。
【請求項５１】
請求項２９〜３７の何れか１項に記載の重亜硫酸塩（＝酸性亜硫酸塩、亜硫酸水素塩）試薬及びオリゴヌクレオチッド及び／またはＰＮＡオリゴマーからなるキット。
【請求項５２】
疾病素因の検知、下位部類、診断、予診、処置及び／または造血細胞増殖異常の監視の間の差別化のための、ＳＥＱ ＩＤ Ｎo．：７４〜ＳＥＱ ＩＤ Ｎo．：９４及びＳＥＱ ＩＤ Ｎo．：５３５〜ＳＥＱ ＩＤ Ｎo．：１２５８の配列のオリゴヌクレオチッドまたはペプチッド核酸（ＰＮＡ）オリゴマーの使用。
【請求項５３】
疾病素因の検知、下位部類、診断、予診、処置及び／または造血細胞増殖異常の監視の間の差別化のための核酸内のシトシンメチル化の解析で使用される、ＳＥＱ ＩＤ Ｎo．：９５〜ＳＥＱ ＩＤ Ｎo．：３８６及びそれに相補的な配列の群から得られる配列の一つであるＤＮＡ配列。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
腫瘍の種類の予測は腫瘍の診断において、重要な問題の一つであるから、癌におけるほとんど全ての治療法の決定にとって、種類の予測は非常に重要である。
異なる種類の癌及び下位部類の種類の癌に応じて、異なる特別な処置が必要になる。どの治療レジメが使用されるかというような重要な治療法の決定は、それ故に、腫瘍の種類を正確に認識することに、決定的に依存する。現時点における腫瘍の部類は一般的に、形態的、組織病理学的または免疫学的要因、及び単分子マーカー[R.W.McKenna、Clin Chem. 46、1252 (2000); F.R.Appelbaum、Semin Hematol.36、401 (1999)]による。しかし、現在使用されている診断方法はいずれも、腫瘍の部類が十分に正確に行なわれてはいない。異なる方法を結合し、個々の病理学者の経験に基づいて部類を修正している。
【背景技術】
【０００２】
最近、幾つかのグループがマイクロアレーベースの発現の解析によって、腫瘍部類の正確な決定をすることができることを示した。ゴルブ（Golub）及びその共同研究者達は、約７０００種の遺伝子の発現レベルを選別し、１０〜１００遺伝子間で、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）と急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）を十分に識別できることを示した[T.R.Golub et al.、Science 286、531 (1999)]。同様なアプローチで、アリザデー（Alizadeh）及びその共同研究者達は、治療及び病気の結果への反応に関し十分に相違点を有する広汎性、大Ｂ細胞リンパ腫の未だ知られていない下位部類を発見した[A.A.Alizadeh et al.、Nature 403、503 (2000)]。また、包括的な転写の解析は悪性黒色腫のフェノタイプ的特徴を予測できることが示された。[M.Bittner et al.、Nature 406、535(2000)]。
【０００３】
マイクロアレーベースのメッセンジャーＲＮＡを使用した大スケール解析はメッセンジャーＲＮＡの不安定性により第一に妨害される[T.Emmert-Buck et al.、Am J Pathol.156、1109 (2000)]。また、発現は、日常的に、且つ高い信頼度で検出される因子２の最小値のみを変化させる[R.J.Lipshutz、S.P.A Fodor、T.R.Gingeras、D.J.Lockhart、Nature Genetics 21、20 (1999);D.W.Selinger、K.J.Cheung、R.Mei、E.M.Johansson、C.S.Richmond、Nature Biotechnology 18、1262(2000)]。更に、試料調製は発現が瞬間的にそれに続いて起こる或引き金を変化させるという事実によって複雑になる。概略の発現への影響が齎す個々の寄与を解決できないこと、及び変化しつつある漸進的性質の計量化の困難さが、データ解析を複雑にしている。
【０００４】
ＣpＧ島内での異常なＤＮＡメチル化はヒト悪性腫瘍において、広範な遺伝子スペクトルの消去または過発現に繋がる[P.A.Jones、Cancer Res 65、2463 (1996)]。異常なメチル化が、また、或腫瘍の遺伝子のイントロン部分及びコード部分のＣpＧリッチの規制要素で起こることが示されている[M.F.Chan、G.Liang、P.A.Jones、Curr Top Microbiol Immunol 249、75 (2000)]。限定ランドマークゲノムスキャニングを使用して、コステロ及び共同研究者達は、メチル化のパターンは腫瘍タイプに特異性であることを示すことができた[J.F.Costello et al.、Nat Genet 24、132 (2000)]。著しく特徴的なＤＮＡのメチル化パターンは、乳癌の細胞列で示され得た[T.H.-M.Huang、M.R.Perry、D.E.Laux、Hum Mol Genet 8、459 (1999)]。大スケールのメッセンジャーＲＮＡ発現を監視することによって、メチル化状態の広範囲のゲノム評価が癌組織の分子指標を示し、それ故に、腫瘍の種類の予測と発見をすることができる。
【０００５】
白血病は骨髄細胞に発生する悪性の癌であり、骨髄細胞の増殖が制御不能になることが特徴である。白血病の大部分は、骨髄性またはリンパ球性として、進展する細胞タイプによって部類される。両種類とも、急性または慢性である。急性白血病は、骨髄または血液中に、未成熟で機能を喪失した細胞が蓄積する急速に進展する病気である。多くの場合、骨髄はもはや充分な量の正常な赤血球及び白血球及び血小板を造ることができない。赤血球が欠乏する貧血症は実質的に全ての白血病患者におこる。正常な白血球が欠乏すると、感染を防ぐ体の機能が損なわれる。血小板の不足は負傷した場合、出血し易くなる。慢性白血病は、よりゆっくり進展し、過成熟で、機能を備えた多数の細胞を生産する。
【０００６】
２００１年の米合衆国における推定３１，５００件の新しい白血病患者の内訳は、急性、慢性がほぼ同比率であった。高齢者に多く発症が見られ、過半数が６０歳以上であった。通常、白血病には成人が小児の十倍罹る。白血病は最も普遍的な子供の癌であり、急性リンパ球性白血病（以後ＡＬＬの略語を使用する）は小児白血病の８０％を占める。成人の白血病の最も普遍的タイプは急性骨髄性白血病（以後ＡＭＬの略語を使用する）で、年間推定１０，０００人が新たに発症する。今年の急性リンパ球性白血病は約３，５００件であろう。
【０００７】
環境的及びウイールス性の原因に加えて、細胞信号、細胞死、細胞増殖のような細胞経路に各種の遺伝子が関与し、そして細胞老化が白血病の進展に関連すると考えられる。そのような遺伝子の例は、Bcl2、ALL1である。
【０００８】
５−メチルシトシンは最も頻繁に現われる真核生物細胞のＤＮＡにおける共有塩基変成物である。これは、例えば、転写の規制、遺伝子刷り込み及び腫瘍化である役割を演じる。それ故、遺伝子情報の一成分としての５−メチルシトシンの同定は非常に興味ある問題である。しかし、５−メチルシトシンの位置は、シトシンと同じ塩基対挙動を示すので、配列によっては同定できない。その上、５−メチルシトシンによって齎される後成的情報はＰＣＲ増幅の間に完全に失われる。
【０００９】
比較的新しく、現時点で最も頻繁に使用されているＤＮＡ中の５−メチルシトシンの解析方法は、重亜硫酸塩と、それに続くアルカリ加水分解で塩基対挙動がチミンに一致する、ウラシルに変換されるところのシトシンとの特殊な反応に基づいている。しかし、５−メチルシトシンはこの条件下で、変換されずに残る。その結果、もとのＤＮＡはそのような方法で変換され、元来、シトシンとはハイブリッド化では区別できないメチルシトシンが、今や、残存シトシンとして、通常の分子生物学的技法、例えば、増幅及びハイブリッド化または配列化によって検出され得る。これら全ての技法は今や完全に利用されている塩基対に基づいている。感受性によって、従来技法は解析されるＤＮＡをアガロースマトリックス中に包含させ、それによって、ＤＮＡの拡散及び変性を防ぎ（重亜硫酸塩は単鎖ＤＮＡのみと反応する）、全ての沈殿及び精製段階を迅速な透析で置き換える方法によって限定される（Olek A、Oswald J、Walter J. 重亜硫酸塩を基にした、シトシンのメチル化の解析のための、変化し改善された方法。Nucleic Acids Res.1996 Dec 15; 24 (24): 5064〜6）。図でその潜在能力が説明される方法を使用して、個々の細胞の解析が可能になる。しかし、現時点では、塩基対長約３，０００までの個々の分野が解析されているのみで、数千に亘るメチル化事例について、グローバルな細胞解析を行なうことは不可能である。また、この方法は少量のサンプルからの非常に小さい断片の解析については信頼性がない。この方法では、拡散防止をしているにも拘らず、マトリックスを通して、サンプルが失われる。更に他の５−メチルシトシンの検出方法の概観は、以下の論文記事から収集できる：Rein、T.、DePamphilis、M.L.、Zorbas、H.、Nucleic Acids Res. 1998、26、 2255。
【００１０】
現在のところ、幾つかの例外を除いて[例えば、Zeschnigk M、Lich C、Buiting K、Doerfler W、Horsthemke B. SNRPN遺伝子坐における対立遺伝子のメチル化の差異に基づく、アンジェルマン（Angelman）及びプレダー−ウィリー（Prader-Willi）症候群の診断のための、メチル化単一チューブＰＣＲ試験。Eur J Hum Genet.1997 Mar-Apr; 5 (2): 94〜8 ]、重亜硫酸塩技法だけが研究に使用された。しかし、常に、既知の遺伝子の短く、特殊な断片は、重亜硫酸塩処理に続いて増幅され、完全に配列化され[Olek A、 Walter J.H-19メチル化刷り込みの前移植個体発生。Nat Genet.1997 Nov;17 (3): 275〜6]  または、個々のシトシン位置が一次伸長反応によって検出される[Gonzalgo ML、Jones PA. メチル化感受性の単鎖ヌクレオチッドプライマー伸長を使用した、特殊サイトにおけるメチル化の差異の迅速な数量化（Ms-SNuPE）。Nucleic Acids Res.1997 Jun 15; 25 (12):2529〜31、WO Patent 9500669] または、酵素的に消化される[Xiong Z. Laird PW. COBRA:感受性で、量的なＤＮＡメチル化アッセイ。Nucleic Acids Res.1997 Jun 15; 25 (12):2532〜4]。それに加えて、ハイブリッド化による検出も述べられている[Olek et al.、WO9928498]。
【００１１】
個々の遺伝子におけるメチル化検出の重亜硫酸塩技法を扱った刊行物は以下のものである。Grigg G、Clark S.ゲノムＤＮＡにおける残存５−メチルシトシンの配列化。Bioasseys.1994 Jun;16 (6):431〜6、431;Zeschnigk M、Schmitz B、Dittrich B、Buiting K、Horsthemke B、Doerfler W. ヒトゲノムにおける刷り込み切片：ゲノム配列によって決められる、Prader-Willi / Angelman 症候群範囲における、異なるＤＮＡメチル化パターン。Hum Mol Genet. 1997 Mar; 6 (3): 387〜95；Feil R、Charlton J、Bird AP、Walter J、Reik W. 個々の染色体のメチル化解析：重亜硫酸塩ゲノム配列のための改善されたプロトコル。Nucleic Acids Res.1994 Feb 25; 22 (4): 695〜6；Martin V、Ribieras S、Song-Wang X、Rio MC、Dante R.。ゲノム配列が、pＳ2遺伝子の５’領域におけるＤＮＡの次亜メチル化とヒト乳癌細胞列におけるその発現の間の相関を示す。Gene.1995 May 19; 157 (1〜2): 261〜4；WO 97 46705、WO 95 15373及びWO 45560。
オリゴマーアレー製造の従来技術の概観は１９９９年１月出版のNature Genetics特別版[Nature Genetics特別版、２１巻、１９９９年１月]、に引用されている文献から得られる。
【００１２】
蛍光ラベルされたプローブは、しばしば、固定化ＤＮＡアレーのスキャニングに使用される。特殊なプローブの５’−ＯＨへＣy３及びＣy５染料が簡単に付着するので、蛍光ラベルとしては特に好適である。ハイブリッド化プローブの蛍光物質の検出は、例えば、コンフォカール顕微鏡で行なわれる。Ｃy３及びＣy５染料及び他の多くのものは市販されている。
【００１３】
マトリックス補助レーザー脱離イオン化質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）は生物分子の分析に非常に有用である[Karas M、Hillenkamp F.１００００ダルトンを超える分子の蛋白質のレーザー脱離イオン化。Anal Chem.1988 Oct 15; 60 (20): 2299〜301]。被分析物は吸着性マトリックスに埋め込まれる。マトリックスは短時間のレーザー照射で蒸発し、被分析分子は分解することなく、気化する。被分析物はマトリックス分子との衝突によってイオン化する。電荷をかけてイオンを非電場飛行管へ送りこむ。イオン間の質量差により、イオンは異なる速度に加速される。小さい質量のイオンは大きい質量のイオンより早い時期に検出器に到達する。
【００１４】
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析はペプチッド及び蛋白質の分析に非常に好適である。核酸の分析にはやや困難性がある[Gut I G、 Beck S.DNA及びマトリックス補助レーザー脱離イオン化質量分析。現時の技術革新及び将来の傾向。1995、1; 147〜57 ]。核酸の感度はペプチッドのそれに比較して、１００倍も劣り、断片サイズが増加すると、感度は不均一的に低下する。核酸は骨格に大きな負電荷を有するため、マトリックスによるイオン化プロセスが、かなり非効率になる。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析においては、マトリックスの選択が重要である。ペプチッドの脱離に関しては。非常に細かい結晶を生じる、幾つかの、効果的なマトリックスが発見された。現在、ＤＮＡに対して敏感な幾つかのマトリックスがあるが、感度の差は短縮されない。感度差は、ＤＮＡをペプチッドに類似するように、化学変化させることにより、減少させることができる。通常の骨格のフォスフェートをチオフォスフェートで置換した、核酸のフォスフォロチオエートが簡単なアルキル化−化学によって、中性荷電ＤＮＡに変換され得る[Gut IG、 Beck S .選択的ＤＮＡアルキル化方法及び質量分析による検出。Nucleic Acids Res.1995 Apr 25; 23 (8): 1367〜73]。この変化したＤＮＡへの電荷タグの結合はペプチッドと同等の感度にまで増加する。更に、電荷タグは未変化基質の検出をかなり困難にする不純物、に対する分析安定性を高めさせる。
【００１５】
ゲノムＤＮＡは細胞、組織または他の試験サンプルのＤＮＡから、標準法を使用して得られる。この標準法は、フリッチェアンドマニアティス出版、の分子クローン：実験室マニュアル、１９８９年、のような参考書に記載されている。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
本発明は、著しく大きい遺伝子及びＣpＧジヌクレオチッドのメチル化解析を並行して行なうのに適した、新規な、マイクロアレーベースのアッセーを提示する。急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）または急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）患者から得られた試料は、ＤＮＡのメチル化パターンにのみ基づいて部類することができる。
【００１７】
本発明は、下記の遺伝子群の少なくとも一つである核酸が、関心のあるゲノム配列中のメチル化または非メチル化ＣpＧジヌクレオチッド間の識別が可能な試薬または一連の試薬に接触することを特徴とする、造血細胞の増殖異常の進展に関連する特徴、のための生物学的試料の解析方法を提供する。ＡＢＬ１、ＡＢＬ１、ＡＰＡＦ１、ＡＰＣ、ＡＲ、ＡＲＨＩ、ＢＡＫ１、ＢＡＸ、ＢＣＬ２、ＣＡＳＰ１０、ＣＡＳＰ８、ＣＡＳＰ９、ＣＣＮＤ２、ＣＤＣ２、ＣＤＣ２５Ａ、ＣＤＨ１、ＣＤＨ３、ＣＤＫ４、ＣＤＫＮ１Ａ、ＣＤＫＮ１Ｂ、（p２７Ｋip１）、ＣＤＫＮ１Ｃ、ＣＤＫＮ２a、ＣＤＫＮ２Ｂ、ＣＳＮＫ２Ｂ、ＤＡＰＫ１、ＥＧＲ４、ＥＬＫ１、ＥＳＲ１、ＦＯＳ、ＧＰＩb beta、ＧＰＲ３７、ＧＳＫ３β、ＧＳＴＰ１、ＨＩＣ-１、ＨＯＸＡ５、ＩＧＦ２、ＭＤＲ１、ＭＧＭＴ、ＭＬＨ１、ＭＯＳ、Ｈumos、ＭＰＬ、ＭＹＣ、ＭＹＣＬ１、ＭＹＯＤ１、Ｎ３３、ＰＩＴＸ２、ＰＭＬ、ＰＭＳ２、ＰＲＡＭＥ、ＰＴＥＮ、ＲＢ１、ＲＢＬ２、ＳＤＣ４、ＳＦＮ、ＴＣＬ１Ａ、ＴＧＦＢＲ２、ＴＰ７３、ＷＴ１、Ｎ-ＭＹＣ、Ｌ-ＭＹＣ、Ｃ-ＡＢＬ、ＥＬＫ１、Ｔubulin、ＣＳＦ１、ＣＤ１Ｒ３、ＣＳＮＫ２Ｂ、Ｍe４９１／ＴＤ６３、ＡＲ、ＣＤＫ４、Ｈumos、ＣＤＣ２５Ａ、ＣＭＹＣex３。
【００１８】
本発明はゲノムＤＮＡの遺伝的及び／または後成的パラメーターを確認する方法を提供する。この方法は改善された診断、処置及び造血細胞の増殖異常、特に、前記異常の下位部類と、この異常の遺伝的疾病素因の改善された同定及びこれらの間の差別化のために使用される。本発明は改善され、告知された患者の処置を許容して、造血細胞の増殖異常の高度に特異的な類別が可能な技術状態の改善を提示する。
特に好ましい、本発明の実施態様においては、急性リンパ球性白血病と急性骨髄性白血病の差別化を可能にする方法及び核酸を提供する。
更に、本発明はシトシンのメチル化及び単一多形性核酸の解析が可能である。
好ましい態様において、この方法は以下の各ステップからなる。
本発明の第一ステップでは、ゲノムＤＮＡ試料が、細胞列または血液などの給源から分離される。抽出はこの分野の専門家にとって標準的な、界面活性剤による細胞溶解物を使い、超音波及びガラスビーズの旋回力を含む手段で、行なわれる。ゲノムＤＮＡ抽出核酸は解析に使用される。
好ましい態様においては、ＤＮＡは次ぎのステップに先立ち分解される。この方法は、標準的技術の中の一つであり、限定されないが、特に制限エンドヌクレアーゼが使用される。
【００１９】
この方法の第二のステップでは、ゲノムＤＮＡサンプルは、５’位置が非メチル化であるシトシンが、ハイブリッド化挙動がシトシンに類似しないウラシル、チミンまたはその他の塩基に変換される方法で処理される。以後これを前処理と称する。
【００２０】
前記ゲノムＤＮＡの処理は、好ましくは、重亜硫酸塩（亜硫酸塩、酸性亜硫酸塩）で処理され続いて、アルカリ加水分解によって、非メチル化シトシン核塩基をウラシルまたは塩基対挙動がシトシンに類似しない他の塩基に変換するされる。重亜硫酸塩溶液が反応に使用されれば、非メチル化シトシン塩基に付加される。そして、変性剤または溶剤及びラジカル捕捉剤が加えられなければならない。それに続くアルカリ加水分解は非メチル化シトシン核塩基のウラシルへの変換を促進する。化学的に変換されたＤＮＡはメチル化シトシンの検知に使用される。
【００２１】
前処理されたＤＮＡの断片が、ＳＥＱ ＩＤ Ｎo．：３８７〜ＳＥＱ ＩＤ Ｎo．：５３４からなるプライマーオリゴヌクレオチッドの集合を使用し、好ましくは耐熱性ポリメラーゼ使用して増幅される。統計的、現実的に考慮すると、好ましくは、１００〜２０００塩基対の長さを有する、１０以上の異なる断片が増幅される。幾つかのＤＮＡ切片の増幅が一つの同一の反応器を使用して実施される。通常、増幅はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって行なわれる。
【００２２】
本発明の方法は、デザインがこの分野の専門家にとって自明であるような、二者択一的プライマーを使用して実施できる。これらプライマーは、その配列が、各々相互に相補的であるか、または、補遺ＳＥＱ ＩＤ Ｎo．：９５〜ＳＥＱ ＩＤ Ｎo．：３８６で特定される塩基配列の、少なくとも１８塩基対長の切片と同一である。前記プライマーオリゴヌクレオチッドは、好ましくは、如何なるＣpＧジヌクレオチッドをも含まないことが特徴である。特に、前記プライマーオリゴヌクレオチッドの配列が、バックグラウンドＤＮＡまたは非関連のＤＮＡの増幅を最小限に抑えることにより、選択的にアニールし、且つ、関与する造血細胞の特殊なＤＮＡを増幅するように、デザインされる方法の実施の態様が好ましい。本発明の内容において、バックグラウンドＤＮＡとは、この場合、関連する組織とは健全な、または、病んだ造血細胞のことであるが、関連する組織特異性メチル化パターンを有さないゲノムＤＮＡを意味する。
【００２３】
本発明によれば、増殖中は、少なくとも一つのプライマーオリゴヌクレオチッドが固相に結合することが好ましい。異なるオリゴヌクレオチッド及び／またはＰＮＡオリゴマー配列は、正方形または六角形格子の平面固相上に配置され、固相表面はシリコン、ガラス、ポリスチレン、アルミニウム、鋼鉄、鉄、銅、ニッケル、銀または金からなり、ニトロセルロースまたはプラスチックなどの他の物質も使用可能である。
【００２４】
増幅によって得られた断片は、直接または間接的に検知可能なラベルを帯びることができる。好ましいラベルは、蛍光ラベル、放射性核種、質量分析計で検出可能な、代表的な質量を有する検知可能な、分子断片であり、生産された断片が、質量分析計で、よりよく検知されるように、単一の正または負の正味電荷を有することが好ましい。検知はマトリックス補助レーザー脱離／イオン化質量分析（ＭＡＬＤＩ）または電子放散質量分析（ＥＳＩ）によって実施され、視覚化される。
【００２５】
本発明の第二ステップで得られた増幅産物は引き続き、アレーまたはオリゴヌクレオチッド及び／またはＰＮＡ試料にハイブリッド化される。この内容で、ハイブリッド化は下記の方法により行なわれる。ハイブリッド化の間使用される試料の集合は、好ましくは、少なくとも１０オリゴヌクレオチッドまたはＰＮＡオリゴマーからなる。このプロセスで、増幅産物は固相に結合する前に、オリゴヌクレオチッドにハイブリッド化する試料となる。特に好ましい態様では、オリゴヌクレオチッドは、ＳＥＱ ＩＤ Ｎo．：５３５〜ＳＥＱ ＩＤ Ｎo．：１２５８の群から得られる。例示で述べられる更に好ましい態様は、オリゴヌクレオチッドは、ＳＥＱ ＩＤ Ｎo．：１２１１〜ＳＥＱ ＩＤ Ｎo．：１２５８の群から得られる。続いて、非ハイブリッド化断片は除去される。前記オリゴヌクレオチッドは、その配列が、相互に相補的であるか、または、補遺で特定される塩基配列の少なくとも一つのＣpＧまたはＴpＧジヌクレオチッドを含んでいる切片と同一である。更に好ましい態様において、ＣpＧジヌクレオチッドまたはＴpＧジヌクレオチッドのシトシンでは、チアミンは、１０量体の５’末端から数えて、５番目から９番目のヌクレオチッドである。一つのオリゴヌクレオチッドが各ＣpＧまたはＴpＧジヌクレオチッドとして存在する。
【００２６】
本発明の方法の第５ステップで、非ハイブリッド化増幅産物が除去される。
【００２７】
本発明の最終ステップで、ハイブリッド化増幅産物が検知される。この段階で、増幅産物に付加されたラベルはオリゴヌクレオチッド配列が局在する固相の各位置を同定できることが好ましい。
【００２８】
本発明において、好ましい増幅産物のラベルは、蛍光ラベル、放射性核種または質量分析計で検出可能な、代表的な質量を有する検知可能な、分子断片である。質量分析計は、増幅産物、増幅産物の断片または増幅産物へ相補的な試料である。検知はマトリックス補助レーザー脱離／イオン化質量分析（ＭＡＬＤＩ）または電子放散質量分析（ＥＳＩ）によって実施され、視覚化される。生産された断片が、質量分析計で、よりよく検知されるように、単一の正または負の正味電荷を有することが好ましい。
【００２９】
前述の方法はゲノムＤＮＡの遺伝的及び／または後成的パラメーターの確認のために使用されるのが好ましい。
【００３０】
この方法を実施するために、本発明は、更に、下記に列挙した遺伝子群並びにこれら遺伝子群のシトシンメチル化検知のためのオリゴヌクレオチッド及び／またはＰＮＡオリゴマー、の変化したＤＮＡを提供する。ＡＢＬ１、ＡＢＬ１、ＡＰＡＦ１、ＡＰＣ、ＡＲ、ＡＲＨＩ、ＢＡＫ１、ＢＡＸ、ＢＣＬ２、ＣＡＳＰ１０、ＣＡＳＰ８、ＣＡＳＰ９、ＣＣＮＤ２、ＣＤＣ２、ＣＤＣ２５Ａ、ＣＤＨ１、ＣＤＨ３、ＣＤＫ４、ＣＤＫＮ１Ａ、ＣＤＫＮ１Ｂ、（p２７Ｋip１）、ＣＤＫＮ１Ｃ、ＣＤＫＮ２a、ＣＤＫＮ２Ｂ、ＣＳＮＫ２Ｂ、ＤＡＰＫ１、ＥＧＲ４、ＥＬＫ１、ＥＳＲ１、ＦＯＳ、ＧＰＩb beta、ＧＰＲ３７、ＧＳＫ３β、ＧＳＴＰ１、ＨＩＣ-１、ＨＯＸＡ５、ＩＧＦ２、ＭＤＲ１、ＭＧＭＴ、ＭＬＨ１、ＭＯＳ、Ｈumos、ＭＰＬ、ＭＹＣ、ＭＹＣＬ１、ＭＹＯＤ１、Ｎ３３、ＰＩＴＸ２、ＰＭＬ、ＰＭＳ２、ＰＲＡＭＥ、ＰＴＥＮ、ＲＢ１、ＲＢＬ２、ＳＤＣ４、ＳＦＮ、ＴＣＬ１Ａ、ＴＧＦＢＲ２、ＴＰ７３、ＷＴ１、Ｎ-ＭＹＣ、Ｌ-ＭＹＣ、Ｃ-ＡＢＬ、ＥＬＫ１、Ｔubulin、ＣＳＦ１、ＣＤ１Ｒ３、ＣＳＮＫ２Ｂ、Ｍe４９１／ＴＤ６３、ＡＲ、ＣＤＫ４、Ｈumos、ＣＤＣ２５Ａ、ＣＭＹＣex３。
本発明は遺伝子的及び後成的パラメーター及び特に、ゲノムＤＮＡのシトシンのメチル化パターンが、特に、改善された診断、処置及び造血細胞の増殖異常の監視のために好適であるとの発見に基づいている。更に、本発明は造血細胞の増殖異常の下位部類または造血細胞の増殖異常の素因の検知の間の差別化が可能である。
【００３１】
本発明の核酸はゲノム遺伝子の遺伝的及びまたは後成的パラメーターの解析に使用可能である。
この目的は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎo．：９５〜ＳＥＱ ＩＤ Ｎo．：３８６の配列及びそれに相補的な配列の、前処理されたゲノムＤＮＡの、少なくとも１８塩基対長の配列を含む核酸を使用して成し遂げられる。
変化した核酸はこれまで遺伝的及び後成的パラメーターに関与する疾病の確認には結びつかなかった。
【００３２】
本発明の目的は、更に、前処理ＤＮＡの解析、ゲノムシトシンのメチル化状態、及び、少なくとも１０のヌクレオチッド長を有する、ＳＥＱ ＩＤ Ｎo．：９５〜ＳＥＱ ＩＤ Ｎo．：３８６の配列の前処理ゲノムＤＮＡにハイブリッド化する、少なくとも、一つの塩基配列を含む、前記オリゴヌクレオチッドの検知を行なうことにある。本発明のオリゴマー試料は、先ず、造血細胞の増殖異常の進展に関連する特徴のための生物学的試料の解析の間に特異的遺伝的、後成的パラメーターの確認を可能にする、重要且つ効果的な材料からなる。前記オリゴヌクレオチッドは改善された診断、処置及び造血細胞の増殖異常の監視及び前記異常の素因の検知を可能にする。更に、これらは造血細胞癌の異なる下位部類の差別化を可能にする。オリゴマーの塩基配列は、好ましくは、少なくとも、一つのＣpＧまたはＴpＧジヌクレオチッドを含む。試料は、特に、好ましくはペアリングの性質を有する、ＰＮＡ（ペプチッド核酸）の形で存在する。特に、ＣpＧジヌクレオチッドのシトシンが１３量体の５’末端から５番目から９番目のヌクレオチッドであるような、本発明におけるオリゴヌクレオチッドが好ましい。ＰＮＡオリゴマーの場合は、ＣpＧジヌクレオチッドのシトシンが９量体の５’末端から４番目から６番目のヌクレオチッドであるものが好ましい。
【００３３】
本発明におけるオリゴマーは、通常、所謂、集合で使用される。これは、ＳＥＱ ＩＤ Ｎo．：９５〜ＳＥＱ ＩＤ Ｎo．：３８６の各ＣpＧジヌクレオチッドのための少なくとも一つのオリゴマーを含む。この集合は好ましくは、ＳＥＱ ＩＤ Ｎo．：５３５〜ＳＥＱ ＩＤ Ｎo．：１２５８の各ＣpＧジヌクレオチッドのための少なくとも一つのオリゴマーを含む。更に、ＳＥＱ ＩＤ Ｎo．：１２１１〜ＳＥＱ ＩＤ Ｎo．：１２５８からなる集合が好ましい。
【００３４】
本発明におけるオリゴヌクレオチッドの集合の場合は、少なくとも一つのオリゴヌクレオチッドが固相に結合することが好ましい。更に一集合内の全てのオリゴヌクレオチッドが固相に結合することが好ましい。
【００３５】
更に本発明は、前記ゲノムＤＮＡ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎo．：９５〜ＳＥＱ ＩＤ Ｎo．：３８６の配列及びそれに相補的な配列の）の処理ヴァージョンを使用して、ゲノムＤＮＡのシトシンメチル化状態の検知を行なうために使用される、少なくとも、１０n（オリゴヌクレオチッド及び／またはＰＮＡオリゴマー）の集合に関する。これらの試料は、改善された診断、処置及び造血細胞の増殖異常の監視をすることができる。特に、これらは造血細胞異常の異なる下位部類の差別化及び前記異常の素因の検知を可能にする。特に、好ましい集合はＳＥＱ ＩＤ Ｎo．：７４〜ＳＥＱ ＩＤ Ｎo．：１２５８からなる。
【００３６】
オリゴマーの集合は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎo．：９５〜ＳＥＱ ＩＤ Ｎo．：３８６の配列の一つである前処理ゲノムＤＮＡを使用した単一、多形性ヌクレオチッド（ＳＮＰs）の検出にも使用される。
【００３７】
本発明においては、異なるオリゴヌクレオチッド及び／またはＰＮＡオリゴマー（所謂、アレー）の配置が、それが同様に固相に結合するという方法で示すところの、本発明によって、有効とされることが好ましい。異なるオリゴヌクレオチッド及び／またはＰＮＡオリゴマー配列のアレーは、正方形または六角形格子の平面固相上に配置されるのが特徴である。固相表面は、好ましくは、シリコン、ガラス、ポリスチレン、アルミニウム、鋼鉄、鉄、銅、ニッケル、銀または金からなる。しかし、ニトロセルロース及び、ペレットまたは樹脂体の形態とされ得るナイロンのようなプラスチックも使用可能である。
【００３８】
それ故、本発明の更なる主題は、改善された診断、処置及び造血細胞の増殖異常の監視、造血細胞癌の異なる下位部類の差別化及び／または前記異常の素因の検知のために、担体物質に固定されたアレーを製造する方法である。前記方法において、本発明における少なくとも一つのオリゴマーは固相に結合する。そのようなアレーを製造する方法は、例えば、固相化学及び耐光保護グループなどを内容とする米国特許公報第５，７４４，３０５号から知ることができる。
【００３９】
本発明の更なる主題は、改善された診断、処置及び造血細胞の増殖異常の監視のためのＤＮＡチップに関する。更にＤＮＡチップは、造血細胞の増殖異常の素因の検知及び造血細胞癌の異なる下位部類の差別化を行なうことができる。ＤＮＡチップは、本発明における少なくとも一つの核酸を含む。ＤＮＡチップは、例えば、米国特許公報第５，８３７，８３２号から知ることができる。
【００４０】
更に、本発明の主題は、例えば、重亜硫酸塩含有試薬、その配列が各場合ごとに、補遺（ＳＥＱ ＩＤ Ｎo．：９５〜ＳＥＱ ＩＤ Ｎo．：３８６）で特定される塩基配列の１８塩基長に相当するか、または、それに相補的である、少なくとも二つのオリゴヌクレオチッドを含む、プライマーオリゴヌクレオチッドの集合、オリゴヌクレオチッド及び／またはＰＮＡオリゴマー、並びに、実施用器具及び前記方法の評価からなるキットである。しかし、キットは本発明の主旨に則って、これまで述べた構成要素の部分のみをも、含むことができる。
【００４１】
本発明におけるオリゴマーまたはそのアレー並びに本発明のキットは、改善された診断、処置及び造血細胞の増殖異常の監視のために使用される。更に、前記発明は、造血細胞癌の異なる下位部類の差別化及び造血細胞の増殖異常の素因の検知にまでその使用が拡大される。本発明においては、その方法は、好ましくは、ゲノムＤＮＡ内の、重要な、遺伝的及び／または後成的パラメーターの解析、特に、改善された診断、処置及び造血細胞の増殖異常の監視、前記異常の素因の検知、前記異常の下位部類の差別化のために使用される。
【００４２】
本発明の方法は、例えば、改善された診断、処置及び造血細胞の増殖異常の進展の監視、前記異常の素因の検知、前記異常の下位部類の差別化のために使用される。
【００４３】
本発明の方法の更なる態様は、前処理なしでの、ゲノムＤＮＡのメチル化状態の解析方法である。方法の第一段階では、ゲノムＤＮＡ試料が組織または細胞の供給源から分離されねばならぬ。このような供給源は細胞系、組織学的スライド、体液、または組織埋蔵パラフィンを含む。抽出は、この分野の専門家にとって標準的な手段で、界面活性剤溶液、超音波、及びガラスビーズ旋回流を含む手段によって行なわれる。一度核酸が抽出された、ゲノム二重鎖ＤＮＡが解析に使用される。
【００４４】
好ましいＤＮＡの態様では、これは従来技術では標準的であるが、処理に先立ち、特に、制限エンドヌクレアーゼによって分割される。第二段階では、ＤＮＡは一種以上のメチル化感受性、制限酵素で消化される。消化は制限サイトにおけるＤＮＡの加水分解が、特異的ＣpＧジヌクレオチッドのメチル化状態を伝達するように行なわれる。
【００４５】
第三ステップにおいては、制限断片が増幅される。検知は、従来の標準技術で行なわれ、例えば、以下に限定されないが、ゲル電気泳動分析、ハイブリッド化解析、ＰＣＲ産物への検知可能なタッグの挿入、ＤＮＡアレー解析、ＭＡＬＤＩまたはＥＳＩ分析による。
【００４６】
特に、技法を修得した監視機の使用によって、ＣpＧマーカー位置fpr、特別なフェノタイプ的部類、を決めるために、以下の技法を使用して、そのとき、解析されたところの、データポイントの大きな集合を生成する、多数の患者サンプルについて、上で述べられた分子生物学的技法の一つを使用した、ＣpＧ位置のメチル化状態の解析。
【００４７】
部類予測の問題は既に、マイクロアレー遺伝子発現データ[M.P. Brown et al.、Proc Natl Acad Sci USA 97、262 (2000);T Gaasterland S Bekiranov、Nature Gnenetics 24、204 (2000)]の解析に使用して成功している。support vector machine（ＳＶＭ）と呼ばれる、方法を修得した管理機を使用して入力される[V Vapnik、Statistical Learning Theory (Wiley、New York 1998); N.Christianini、J.Shawe-Taylor、An Introduction to Support Vector Machines (Cambridge University Press、Cambridge 2000)] 。ＳＶＭは練習用試料の二つの部類間の通常の判別が可能である。この場合各試料の調べるＣpＧサイトのメチル化パターン（ＣＧ／ＴＧ比）が表示される。ＳＶＭのような修得される監視技術はデータラベルで示される従来技術を活用するという利点を有する。更に、ＳＶＭは個々のディメンジョン間の高い線型相互依存を計算でき、データのオーバーフィッティングを回避できる[V Vapnik、Statistical Learning Theory (Wiley、New York 1998)]。
【００４８】
部類の予測へのＣpＧサイトの貢献度の定量化のために、我々は先ず、試験試料の部類に対する、これらの判別力にしたがって、二試料tテストを使用して、全てのＣpＧサイトのランクを決めた。ＳＶＭはＣpＧサイトのランク番号を増加させて、訓練された。予測のエラーが最小になるＣpＧサイトのランク番号は、特別な部類が互いに選別される番号に依存する。これは一方、潜在的に情報の喪失へ繋がる解析特定のＣpＧ位置を消去するという事実によって説明される。他方、統計的修得理論[V Vapnik、Statistical Learning Theory (Wiley、New York 1998)]によって示唆されるように、試料の限定された番号に関して、我々のＣpＧサイトの番号では、フリーパラメーターの番号が減少するに従がって、部類予測の信頼性は一般に増加する。分類問題の固有の仕事に特有な複雑さは、これら二つの拮抗する効果が平衡し、部類予測が最適の挙動を示す時期を決定する。これは、広範なゲノム解析が部類予測を改善するだけでなく[J.Weston et al.、in Advances in neural information processing systems (MIT Press、Cambridge、MA 2001 ) 、問題の複雑さについての情報をも提供する。
【００４９】
本発明は患者または各個人の不利益であるか、またはそれに関して発生した事態の診断及び／または予測に関する。本発明における方法によって得られる、患者または各個人のゲノムＤＮＡの重要な遺伝的及び／または後成的パラメーターが、他の遺伝的及び／または後成的パラメーター集合と比較され、この両者間の差異が、患者または各個人の不利益であるか、またはそれに関して発生した事態の診断及び／または予測に、基本的に役立つ。
【００５０】
本発明の内容において、ハイブリッド化という語は、二重鎖構造のＤＮＡ試料におけるWatson-Crickペアリングのラインに沿った、完全に、相補的な配列に一つのオリゴヌクレオチッドが結合することとして理解される。
【００５１】
本発明の内容において、遺伝的パラメーターとは、ゲノムＤＮＡ及びこれらの規制のために更に必要とされる配列の突然変異及び多形性体である。突然変異を意味するのは、特に、挿入、欠失、ポイント突然変異、逆位、多形性及び特に好ましくはＳＮＰs（単一ヌクレオチッド多形性）である。
【００５２】
本発明の内容において、後成的パラメーターとは、特に、シトシンのメチル化及びゲノムＤＮＡに基づく、更に変化したＤＮＡ及びこれらの規制のために更に必要とされる配列である。更に、後成的パラメーターは、例えば、直接、前記方法では解析できないが、ＤＮＡのメチル化には、これもまた関与する、ヒストンのアセチル化を含む。
【００５３】
以下に、配列に基礎を置いて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれら例示によっては限定されない。
【００５４】
ＳＥＱ ＩＤ Ｎo．：１〜ＳＥＱ ＩＤ Ｎo．：７３は５’及び／または以下の遺伝子のゲノムＤＮＡの領域の規制を示す。ＡＢＬ１、ＡＢＬ１、ＡＰＡＦ１、ＡＰＣ、ＡＲ、ＡＲＨＩ、ＢＡＫ１、ＢＡＸ、ＢＣＬ２、ＣＡＳＰ１０、ＣＡＳＰ８、ＣＡＳＰ９、ＣＣＮＤ２、ＣＤＣ２、ＣＤＣ２５Ａ、ＣＤＨ１、ＣＤＨ３、ＣＤＫ４、ＣＤＫＮ１Ａ、ＣＤＫＮ１Ｂ、（p２７Ｋip１）、ＣＤＫＮ１Ｃ、ＣＤＫＮ２a、ＣＤＫＮ２Ｂ、ＣＳＮＫ２Ｂ、ＤＡＰＫ１、ＥＧＲ４、ＥＬＫ１、ＥＳＲ１、ＦＯＳ、ＧＰＩb beta、ＧＰＲ３７、ＧＳＫ３β、ＧＳＴＰ１、ＨＩＣ-１、ＨＯＸＡ５、ＩＧＦ２、ＭＤＲ１、ＭＧＭＴ、ＭＬＨ１、ＭＯＳ、Ｈumos、ＭＰＬ、ＭＹＣ、ＭＹＣＬ１、ＭＹＯＤ１、Ｎ３３、ＰＩＴＸ２、ＰＭＬ、ＰＭＳ２、ＰＲＡＭＥ、ＰＴＥＮ、ＲＢ１、ＲＢＬ２、ＳＤＣ４、ＳＦＮ、ＴＣＬ１Ａ、ＴＧＦＢＲ２、ＴＰ７３、ＷＴ１、Ｎ-ＭＹＣ、Ｌ-ＭＹＣ、Ｃ-ＡＢＬ、ＥＬＫ１、Ｔubulin、ＣＳＦ１、ＣＤ１Ｒ３、ＣＳＮＫ２Ｂ、Ｍe４９１／ＴＤ６３、ＡＲ、ＣＤＫ４、Ｈumos、ＣＤＣ２５Ａ、ＣＭＹＣex３。これらの配列は遺伝子バンクから得られ、現時点では予測できない、例えば、マイナーな欠失及び多形性に限定されない配列の物質の全ての小さい変化を含む。
【００５５】
ＳＥＱ ＩＤ Ｎo．：９５〜ＳＥＱ ＩＤ Ｎo．：３８６は以下の遺伝子から得られるＤＮＡの前処理された配列を示す。ＡＢＬ１、ＡＢＬ１、ＡＰＡＦ１、ＡＰＣ、ＡＲ、ＡＲＨＩ、ＢＡＫ１、ＢＡＸ、ＢＣＬ２、ＣＡＳＰ１０、ＣＡＳＰ８、ＣＡＳＰ９、ＣＣＮＤ２、ＣＤＣ２、ＣＤＣ２５Ａ、ＣＤＨ１、ＣＤＨ３、ＣＤＫ４、ＣＤＫＮ１Ａ、ＣＤＫＮ１Ｂ、（p２７Ｋip１）、ＣＤＫＮ１Ｃ、ＣＤＫＮ２a、ＣＤＫＮ２Ｂ、ＣＳＮＫ２Ｂ、ＤＡＰＫ１、ＥＧＲ４、ＥＬＫ１、ＥＳＲ１、ＦＯＳ、ＧＰＩb beta、ＧＰＲ３７、ＧＳＫ３β、ＧＳＴＰ１、ＨＩＣ-１、ＨＯＸＡ５、ＩＧＦ２、ＭＤＲ１、ＭＧＭＴ、ＭＬＨ１、ＭＯＳ、Ｈumos、ＭＰＬ、ＭＹＣ、ＭＹＣＬ１、ＭＹＯＤ１、Ｎ３３、ＰＩＴＸ２、ＰＭＬ、ＰＭＳ２、ＰＲＡＭＥ、ＰＴＥＮ、ＲＢ１、ＲＢＬ２、ＳＤＣ４、ＳＦＮ、ＴＣＬ１Ａ、ＴＧＦＢＲ２、ＴＰ７３、ＷＴ１、Ｎ-ＭＹＣ、Ｌ-ＭＹＣ、Ｃ-ＡＢＬ、ＥＬＫ１、Ｔubulin、ＣＳＦ１、ＣＤ１Ｒ３、ＣＳＮＫ２Ｂ、Ｍe４９１／ＴＤ６３、ＡＲ、ＣＤＫ４、Ｈumos、ＣＤＣ２５Ａ、ＣＭＹＣex３。これらの配列は、現時点では予測できない、例えば、マイナーな欠失及び多形性に限定されない、配列の物質の全ての小さい変化を含む。
【００５６】
ＳＥＱ ＩＤ Ｎo．：３８７〜ＳＥＱ ＩＤ Ｎo．：５３４はＳＥＱ ＩＤ Ｎo．：９５〜ＳＥＱ ＩＤ Ｎo．：３８６の前処理されたＤＮＡの増幅のためのプライマーオリゴヌクレオチッドの配列を示す。
ＳＥＱ ＩＤ Ｎo．：[＆ＩＤＯＬＩＧＯＦＩＲＳＴ]〜ＳＥＱ ＩＤ Ｎo．：１２５８はＳＥＱ ＩＤ Ｎo．：１〜ＳＥＱ ＩＤ Ｎo．：７３のゲノムＤＮＡ内のＣpＧ位置の解析に有用なオリゴマーの配列を示す。
ＳＥＱ ＩＤ Ｎo．：１２１１〜ＳＥＱ ＩＤ Ｎo．：１２５８はＳＥＱ ＩＤ Ｎo．：１〜ＳＥＱ ＩＤ Ｎo．：７３のゲノムＤＮＡ内のＣpＧ位置の解析に有用なオリゴマーの配列を示す。
【実施例】
【００５７】
実施例１及び２：デジタルフェノタイプ
下記の実施例において、多重ＰＣＲが急性リンパ球性白血病及び急性骨髄性白血病患者から採取した試料で行なわれた。各試料はＣpＧ位置のメチル化状態を推論するために、下記の実施例１で述べられる方法で処理され、各試料のメチル化情報は順序正しく纏められ、実施例２で詳述されるように解析に使用された。ＣpＧのメチル化状態の両解析方法は、更に、実施例３で述べられる。
【００５８】
実施例１
１７ＡＬＬ試料と８ＡＭＬ試料が全て含まれている。８人の健常ドナーのＢ細胞、抗ＣＤ４及び抗ＣＤ１９抗体により区分されたＭＡＣＳ、がそれぞれ、コントロールとして使用された。１１個の遺伝子がランダムに腫瘍形成に関与する異なる経路を示す遺伝子のパネルから選択された。選択された１１の遺伝子の内の２個の遺伝子がＸ染色体上に存在した。８１ＣpＧジヌクレオチッドの全てがプロモーターのＣpＧリッチの領域に存在し、これらの遺伝子のイントロン性の、コード化配列はメチル化状態を評価した。
【００５９】
配列について、ハイブリッド解析で、ＣpＧジヌクレオチッドのメチル化状態と非メチル化状態を特異的に区別するために、全試料のトータルＤＮＡを重亜硫酸塩処理し、全ての非メチル化シトシンをウラシルに変換し、メチル化シトシンはそのままとする[M.Frommer et al.、Proc Natl Acad Sci USA 89、1827 (1992) ]。関心のある領域は蛍光ラベルしたプライマーを使い、ＰＣＲで、増幅して、非メチル化ＣpＧジヌクレオチッドがＴＧに転換され、メチル化ＣpＧサイトはそのまま保持される。プライマーはＣpＧジヌクレオチッドを含まないＤＮＡ切片に相補的である。これはメチル化、非メチル化対立遺伝子の双方の増幅を一反応で公平に行なわせる。各試料から得られた全てのＰＣＲ産物は、混合され、スライドガラス上で、各ＣpＧ位置毎に一対の固定化オリゴヌクレオチッドへ、ハイブリッド化される。これら検知毎のオリゴヌクレオチッドは、当初から非メチル化である（ＴＧ）かまたはメチル化である（ＣＧ）かの何れかである、ＣpＧサイト周辺の重亜硫酸塩で変換された配列へとハイブリッド化されることが示された。ハイブリッド化条件は、ＴＧまたはＣＧの変化体の間の差異で、単一ヌクレオチッドの検知が容易なように、選択された。二つの信号比は蛍光信号の強さの比較に基づき計算された。メチル化の検知感度は、合成的にメチル化度をアップ及びダウンさせたＤＮＡ断片の異なる混合比の混合物を使用して決定された。これら混合物について、一連の実験は、テストされる各ＣpＧサイトにおけるメチル化度の変化に対応するＣＧ／ＴＧ比の範囲を決定するために行なわれた。
【００６０】
第一段階で、ゲノムＤＮＡは、プロメガ社のウイザードキットを使用して、細胞試料から分離された。
試料から分離されたゲノムＤＮＡは、重亜硫酸塩溶液（亜硫酸水素塩、酸性亜硫酸塩）を使用して処理される。試料中の全ての非メチル化シトシンはチアミジンに、逆に、試料中の５メチルシトシンは変化しないでそのまま残るように処理される。ゲノムＤＮＡの重亜硫酸塩処理は、A.Olek、J.Oswald、J. Walter、Nucleic Acid Res. 24、 5064 (1996)に記載のマイナーな変化によって行なわれた。ゲノムＤＮＡは重亜硫酸塩処理前に、MssI（ＭＢＩFermentas、St.Leon-Rot、Germany）によって処理される。
処理された核酸は、次いで、一反応あたり、８断片をＣy５蛍光ラベルプライマーで増幅する多重ＰＣＲsによって増幅される。使用されるＰＣＲプライマーは、表１に記載され、ＰＣＲ条件は以下に記載される。
【００６１】
重亜硫酸塩処理された、部類予測及びプライマーの発見に使用される、遺伝子のセンス鎖のＰＣＲ増幅は、クラーク及びフロンマー[S.J.Clark、M.Frommer、in Laboratory Methods for the Detection of Mutations and Polymorphisms in DNA、G.R.Taylored.(CRC Press Boca Raton 1997 ) ]のガイドラインによって行なわれた。以下の遺伝子のＣpＧサイトが解析された。ＡＢＬ１、ＡＢＬ１、ＡＰＡＦ１、ＡＰＣ、ＡＲ、ＡＲＨＩ、ＢＡＫ１、ＢＡＸ、ＢＣＬ２、ＣＡＳＰ１０、ＣＡＳＰ８、ＣＡＳＰ９、ＣＣＮＤ２、ＣＤＣ２、ＣＤＣ２５Ａ、ＣＤＨ１、ＣＤＨ３、ＣＤＫ４、ＣＤＫＮ１Ａ、ＣＤＫＮ１Ｂ、（p２７Ｋip１）、ＣＤＫＮ１Ｃ、ＣＤＫＮ２a、ＣＤＫＮ２Ｂ、ＣＳＮＫ２Ｂ、ＤＡＰＫ１、ＥＧＲ４、ＥＬＫ１、ＥＳＲ１、ＦＯＳ、ＧＰＩb beta、ＧＰＲ３７、ＧＳＫ３β、ＧＳＴＰ１、ＨＩＣ-１、ＨＯＸＡ５、ＩＧＦ２、ＭＤＲ１、ＭＧＭＴ、ＭＬＨ１、ＭＯＳ、Ｈumos、ＭＰＬ、ＭＹＣ、ＭＹＣＬ１、ＭＹＯＤ１、Ｎ３３、ＰＩＴＸ２、ＰＭＬ、ＰＭＳ２、ＰＲＡＭＥ、ＰＴＥＮ、ＲＢ１、ＲＢＬ２、ＳＤＣ４、ＳＦＮ、ＴＣＬ１Ａ、ＴＧＦＢＲ２、ＴＰ７３、ＷＴ１、Ｎ-ＭＹＣ、Ｌ-ＭＹＣ、Ｃ-ＡＢＬ、ＥＬＫ１、Ｔubulin、ＣＳＦ１、ＣＤ１Ｒ３、ＣＳＮＫ２Ｂ、Ｍe４９１／ＴＤ６３、ＡＲ、ＣＤＫ４、Ｈumos、ＣＤＣ２５Ａ、ＣＭＹＣex３。
【００６２】
１０ngのＤＮＡが鋳型ＤＮＡとしてＰＣＲ反応に使用された。鋳型ＤＮＡ、１２．５pmolまたは４０pmolの各プライマー（Ｃy５でラベルされた）、０．５〜２ＵのＴaqポリメラーゼ（HotStar Taq、Qiagen、Hilden、Germany）及び１mＭのdＮＴＰsが酵素を添加された反応緩衝液トータル２０μｌ中で培養された。酵素活性化（１５分、９６℃）の後、培養時間と温度の変遷は、９５℃、１分に続いて３４サイクル[９５℃、１分；アニール温度で（補遺の情報参照）４５秒；７２℃、７５秒]及び７２℃、１０分であった。
【００６３】
ＰＣＲ産物の更なる詳細は表２参照。
各試料からの全ＰＣＲ産物は、スライドガラス上で、各ＣpＧ位置毎に、解析により、一対の固定化オリゴヌクレオチッドへ、ハイブリッド化される。これら検知毎のオリゴヌクレオチッドは、当初から非メチル化である（ＴＧ）かまたはメチル化である（ＣＧ）かの何れかである、ＣpＧサイト周辺の重亜硫酸塩で変換された配列へとハイブリッド化されることが示された。使用されたハイブリッド化オリゴヌクレオチッドの更なる詳細は表３参照（情報となるもの及びならないもの）。ハイブリッド化の条件は、ＴＧまたはＣＧの変化体の間の差異で、単一ヌクレオチッドの検知が容易なように、選択された。
【００６４】
５’末端Ｃ６−ａｍｉｎｏ変性のオリゴヌクレオチッドが４倍還元液で、活性化スライドガラス上にスポット化された[T.R.Golub et al.、Science 286、531（1999）]。解析された各ＣpＧ位置について、ＣpＧジヌクレオチッドのメチル化及び非メチル化状態を反映する、二つののオリゴヌクレオチッド、Ｎ(2〜16)−ＣＧ−Ｎ(2〜16)及びＮ(2〜16)−ＴＧ−Ｎ(2〜16)がグラスアレー上にスポットされ、固定される。８１ＣpＧサイトを示す、オリゴヌクレオチッドマイクロアレーは、[D.Chen、Z.Yan、D.L.Cole、G.S.Srivatsa、Nucleic Acids Res 27、389 (1999) ]に既に述べられたように、１１Ｃy５ラベルＰＣＲ断片までの組み合わせによって、ハイブリッド化された。続いて、ハイブリッド化されたスライドの蛍光イメージが、GenePix４０００マイクロアレースキャナ（Axon Instruments）を使用して得られた。ハイブリッド実験は各試料毎に少なくとも３回繰り返された。
【００６５】
メチル化の検知方法の感度は、合成的にメチル化度をアップ及びダウンさせたＤＮＡ断片の異なる混合比の混合物を使用して決定された。これら混合物について、一連の実験は、テストされる各ＣpＧサイトにおけるメチル化度の変化に対応するＣＧ／ＴＧ比の範囲を決定するために行なわれた。図１Ｂには、例示として、二つのＣpＧ位置が、ヒト因子ＶＩＩＩ遺伝子のエクソン１４に存在することが示されている。個々のＣpＧサイトのメチル化度３：０、２：１、１：２及び０：３の混合物が確実に判別され得る。
【００６６】
現実のデータにおける、メチル化の検知を実証するために、二つのＸ染色体遺伝子が遺伝子集合に含まれる。女性の二つのＸ染色体の一つが、メチル化で活性化されたから、男性のそれに比べて、女性のＸ染色体遺伝子のメチル化度が高いことが期待できる。図２Ａで、ＣpＧsは、男性と女性のメチル化レベルの差異の大きさに従がって、順位付けされる。期待したように、Ｘ染色体遺伝子（ＥＬＫ１、ＡＲ）が女性のメチル化が著しく高いことを示している。これは、この方法が正確にメチル化を検知していることを明確に示している。
統計的解析
Support Vector Machines
【００６７】
我々の場合、癌の分類の仕事は、患者のメチル化パターンから白血病の亜類型（ＡＬＬまたはＡＭＬ）を予測できる機械を組み立てることから成る。患者の試料毎に、このパターンが平均（各ハイブリッド化実験は最低限度３回反復され、その結果の平均値）log[８１ＣpＧ位置のＣＧ／ＴＧ比]のベクターとして与えられる。与えられた訓練試料の集合に基づいて、Ｘ＝{xi：xiiRn}既知の診断Ｙ＝{yiyii(ＡＬＬ、ＡＭＬ)}で、判別函数f：
2004528837.tif 000002
ここでnはＣpＧsの数、修得されなければならない。訓練集合{Ｘ、Ｙ}の分類ミスの数ｆは訓練エラーといい、通常は訓練時の練習機によって、最小限度になる。しかし、現実の関心事は練習機の、従来未知の試料についての部類予測能力、所謂、練習機の普遍化性能である。この性能は、通常、独立の試験集合{Ｘ1、Ｙ1}の分類ミスの数である試験エラーによって評価される。
【００６８】
良好な普遍化性能を有する練習機の訓練の大きな問題点は、一方で、必須の性質である、データ分配を充分に取り込むことであり、他方でデータの取り込みすぎを回避することである。Support Vector Machines（ＳＶＭ）は、訓練データを区分し、訓練集合の最も近いポイントへの距離を最大化する線形判別を構成することによって、この問題点の解決を試みる。この超平面を区分する最大マージンは訓練集合の最小包含球の半径の比及び超平面と訓練ポイントの間のマージンを最小にする。これは試験エラーの期待値への所謂半径マージン範囲を最小にすることに対応し、且つ、良好な普遍化性能を約束する[Vapnik V. Statistical Learning Theory. Wiley、New York (1998) ]。
【００６９】
勿論、分類ラベルyi、特徴xi間の依存性が線形でなく、訓練集合が超平面で分類できないなどのより複雑な分類問題がある。非線形判別函数を許容するために、インプットスペースが潜在的により高いディメンジョン特徴スペースに写像函数Ｆ：
2004528837.tif 000003
によって非線型的に写像され得る。その二元公式によるＳＶＭ計算法はインプットスペースの要因間の内的産物にのみ使用するので、カーネル函数Ｋ（xi、xj）＝＜Ｆ（x）Ｆ（xj）＞の知識はＳＶＭを訓練するのに充分である。写像函数Ｆ及び非線形ＳＶＭがカーネル函数のみを使用した計算で、効果的に訓練できるかを知る必要はない。ここでは、我々は線形カーネルＫ（xi、xj）＝＜xi、xj＞及び２次線形カーネルＫ（xi、xj）＝（＜xixj＞＋１）2２のみを使用する。次のセクションで、種々の特徴の集合で訓練したＳＶＭsを比較する。これらＳＶＭsの予測性能を評価するために、我々はcross-validation methodを使用した[Bishop、C.M.“Neural networks for pattern recognition.” Oxford University Press、New York（1995）]。分類に際して、試料がほぼ大きさの同じ８群に分けられた。次いで、ＳＶＭが一群の試験試料について、他の七群を使用して訓練した後、部類を予測した。ミス分類の数が、試験群の全ての可能な選択について８回を超えるＳＶＭ計算法で計算された。試験エラーについての信頼性のある評価を得るために、ミス分類の数が、８群の試料の５０を超える種々の分割が平均された。
特徴の選択
【００７０】
我々のメチル化データへＳＶＭを適用する最も簡単な方法は、各ＣpＧ位置を分けられたディメンジョンとして使用し、同じ遺伝子からＣpＧサイトの相互依存については仮定をしないことである。白血病についての下位分類では、線形カーネルで、８１のディメンジョンインプットスペースで訓練したＳＶＭは、平均試験エラー１６％であった。２次カーネルの使用では、その結果に目だった改善はみられなかった。
【００７１】
この比較的不十分な性能についての明確な説明は、我々は８１ディメンジョンスペースで僅か２５データポイント（訓練集合では少ない）のみを有していることである。これらの条件下での、分れた超平面の所見は著しく、決断し難い問題である。マージンを最大化するＳＶＭ技術が、最適の普遍化性能を備えた解決策を見出すには不充分であることが解る。分類に関連する情報を維持する間、インプットスペースのディメンジョンを減少させることが必要である。少数のＣpＧ位置だけが、二つの亜類の白血病に結合すると期待され得るから、これが可能である。
【００７２】
多分、ディメンジョンを減少させる最もポピュラーな方法は、プリンシプルコンポーネントアナリシス（ＰＣＡ）である[Bishop、C.M.Neural networks for pattern recognition Oxford University Press、New York（1995）]。集合Ｘの訓練には、ＰＣＡが、最大変化方向に対応する直交ベクターの集合（プリンシプルコンポーネント）を構成する。Ｘの最初のkプリンシプルコンポーネントへの投影は、kディメンジョン直交サブスペースにおいて、２平均最適画像を与える。この投影は分類情報Ｙを明確に使用していないから、ＰＣＡは管理されない修得技術である。
【００７３】
ＳＶＭのインプットスペースのディメンジョンを縮小するために、我々は結合訓練及び試験集合{Ｘ、Ｘ1}で行い、両集合を最初のkプリンシプルコンポーネントへ投影した。これは、訓練集合ＸへＰＣＡが行なったものよりも、かなり良好な成績を与え、そしてこれはラベルされない情報が使用されている事実によって正しいと認められる。しかし、k＝２、５の普遍性の成績は、特徴選別なしのＳＶＭよりも一層悪かった。この理由は、ＰＣＡが、ＡＬＬとＡＭＬの間の判別にとって重要な特徴を抽出する必要がないことである。この場合、細胞系及び、例えば、分類作業に関与しないサブグループである、患者の主要な組織（図４、右。第２行参照）の間を判別する最も変化に富んだ特徴を先ず選択する。図６に示されるように、６個の特徴が単に、第９のプリンシプルコンポーネントに現われる白血病の下位分類に関する情報を与える。第９のコンポーネントを含む普遍化性能は、特徴選別なしのＳＶＭよりもはるかに良好である。しかし、訓練集合の分類ラベルを考慮している、管理された特徴選別法は、より信頼性があり、良好な普遍化を与えることが明確に解る。図４Ａは、フィッシャー基準に従がったベスト２０のＣpＧのメチル化プロフィールを示す。
フィッシャー基準及びt試験
【００７４】
二つの分類間の選別度を評価する標準的基準にはフィッシャー基準が挙げられる[Bishop、C.M.、“Neural networks for pattern recognition.”Oxord University Press、NewYork(1995)]。我々の場合、k番目のＣpＧの判別力が、（mk）ALL/AMLを意味し、（sk）ALL/AMLはyi=ＡＬＬ／ＡＭＬでの全ての（’k）iの標準偏差である。フィッシャー基準は２部類が部類変化に比較して、大きく異なるＣpＧに高いランク付けを与える。非常に類似している基準が、ゴルブとその共同研究者によって、彼等のメッセンジャーＲＮＡの発現データに基づくＡＬＬ／ＡＭＬの分類で使われている[T.R.Golub et al.、Science 286、531 (1999)]。
【００７５】
これらの判別力によるＣpＧランクへの他のアプローチは、部類の有意差を計算するために、試験統計を使用することである。ここで、我々は二つの部類の正常な配分を想定し、部類平均間の有意差に従がって、[Mendenhall、W.、Sincich、T.、エンジニアリングと科学の統計] ＣpＧsをランク付けするべく二つの試料t試験を使用した。図４（右第１行）は、部類内の変化の大平均差及び小平均差が重要な因子であることから、フィッシャー基準に非常に類似しているランキングを示す。
【００７６】
分類性能を改善するために、我々は、フィッシャー基準またはt試験に従がって、最高のkランクのＣpＧsでＳＶＭsを訓練した。図５はフィッシャー基準からのベストの２ＣpＧsで訓練されたＳＶＭを示す。K＝２、５でのエラーは図の上部に記載されている。その結果は普遍化性能に、劇的な改善が見られたことを示している。フィッシャー基準を特徴選別に使用したところ、特徴選別なしのＳＶＭの場合の１６％に比較して、k＝５、ＣpＧs試験エラーは３％にまで減少した。図６は選別ディメンジョンkからの普遍化性能の依存性を示し、フィッシャー基準が、特に、裏付けのある小さいkの良好な普遍化に依存しないディメンジョンを与えることを示す。
【００７７】
前記二つのＣpＧランキング法が非常に良好な普遍性を与えたが、これらは幾つかの潜在的な欠陥を有している。一つの欠陥は特徴と部類ラベルの間のたった線形従属性のみを検知できることである。二つのＣpＧsのシンプルなＸＯＲまたはＯＲ結合さえも、完全に間違っている。他の欠陥は重複する特徴が除去されないことである。我々の場合、高いメチル化の可能性を有する同一の遺伝子の幾つかのＣpＧsが通常存在する。これは、必ず同じ情報を齎すハイランクの特徴の大きな集合となり得る。前記問題点が我々のデータ集合に出現しないという、良好な結果であるが、これらは慎重に考慮されなければならない。
逆行消去
【００７８】
ＰＣＡ、フィッシャー基準及びt試験は、現実に分類され、それ故に、フィルター法と呼ばれる、訓練機に依存しない特徴を構築し、ランク付けを行なう[Blum、A.、Langley、P.訓練機において関与する特徴及び実例の選択。Artificial Intelligence 97、245〜271（1997）]。他のアプローチは訓練機自体を特徴選別に使用することである。これらの技術は、ラッパー法（Wrapper Methods）と呼ばれ、機械の普遍化能力にとって重要な特徴の同定を試みる技術である。ここで我々は、シンプルな近似法としての、訓練エラーを低く抑えるために重要な特徴を使用することを提案する。線形カーネルを伴うＳＶＭの場合は、これら特徴は選別超平面の正常ベクターｗを調べることによって、容易に同定できる。特徴基準のベクターと正常ベクターの間のアングルが小さければ小さいほど、選別のための特徴は益々重要になる。正常ベクターに直交する特徴は判別には全く影響しない。これは、特徴ランキングは正常ベクター（wk）2のコンポーネントによって、容易に与えられることを意味する。勿論このランキングは、完全な特徴集合のＳＶＭ解法が、我々が前記サブ選別で示した最適なものにほど遠いから、それほど現実的なものではない。単純な帰納は、最小の（wk）2を有する特徴が解決にとっては、現実に重要ではなく、特徴集合から安全に除去できることを想定することである。
【００７９】
そして、ＳＶＭは縮小した特徴集合で再訓練でき、その方法は特徴集合が空になるまで繰り返される。このような継続的な特徴の移動は、逆行消去と呼ばれる。[Blum、A.、Langley、P.訓練機において関与する特徴及び実例の選択。Artificial Intelligence 97、245〜271（1997）]。我々のデータ集合に示されるＣpＧランキングは図４Ｄに示され、フィッシャー基準及びt試験ランキングとはかなり異なる。逆行消去は余分な特徴を除去できるように見える。しかし、図の上方及び図６で示されるように、普遍化成績はフィッシャー基準のそれよりも、良くない。その上、逆行消去は、よりディメンジョン依存するように見てとれ、コンピューター使用はより経費高になる。次いで、少なくとも、このデータ集合にとって、シンプルなフィッシャー基準は好ましい特徴選別技術であることが言えることを付け加える。
【００８０】
特徴選別のラッパー法を構築する標準的方法は、各可能な特徴部分集合毎に、訓練機の普遍化性能を評価することである。訓練集合における交差検証は、与えられた特徴集合における機械の普遍化を評価することに使用できる。特徴スペースの徹底的な探索を現実には実行不能にするものは、異なる特徴の組み合わせが、２nという巨大な数になり、より効果的に、特徴スペースを帰納的に探索する多数のケースがある（例えば、逆行消去）[Blum、A.、Langley、P.訓練機において関与する特徴及び実例の選択。Artificial Intelligence 97、245〜271（1997）]。
【００８１】
ここで、我々は、我々のデータ集合における特徴と部類ラベルの間に高度に優れた関係が存在することを示したい。これを実行するために、特徴の二つの組み合わせのスペースを徹底的に探索した。３２４０からの二つのＣpＧの組合わせについて、k＝２ＣpＧs同時、繰り返しなし、全体からn＝８１ＣpＧs、我々は、ＳＶＭの、一つだけ止める、交差確認エラーを２次カーネルで訓練集合について計算した。最小交差確認エラーの全ＣpＧペアから、我々は最小半径マージン比の一つを選択した。このペアは最適特徴の組合わせと見なされ、試験集合におけるＳＶＭの普遍化性能の評価に使用された。
【００８２】
徹底した探索法における平均試験エラーは二つの特徴と２次カーネルの場合におけるフィッシャー基準におけるそれと同じで６％であった。５つの特徴において徹底した計算は既に不可能である。交差検証試行の絶対多数では、徹底した探索とフィッシャー基準により選択されたＣpＧsは同じであった。若干例では、次善のＣpＧsが徹底した探索法で選択された。これらの成績はＡＬＬ／ＡＭＬ判別にとって重要な我々のデータ集合における高度の特徴の組み合わせは存在しないことを明瞭に示した。
【００８３】
実施例２
実施例１で得られたデータは、病気の、または健全な造血細胞の２部類の間のＣpＧメチル化度の差異に従がって、ランク付けしたマトリックス（図３〜８）へとアルゴリズムを使って分類された。最も重要なＣpＧ位置はマトリックスのボトムから急速にトップへと減少する。マトリックスの右側で、個々のＣpＧ位置のp値が示されている。p値はデータ集合のチャンスによって生じる、見取られる分布の確率である。
【００８４】
前記で議論したように、選択された弁別のために、我々はアルゴリズム（support vector machine、SVM）修得について訓練した。ＳＶＭ[F Model、P.Adorjan、A. Olek、C. Piepenbrock、癌の分類に基づくＤＮＡメチル化の特徴選別。2001 Jun;17 増補版1:S157〜164]は与えられた訓練試料の二部類間の最適判別を構成する。この場合、各試料は調べられるＣpＧサイトのメチル化パターン（ＣＧ／ＴＧ比）によって記述される。ＳＶＭは付属の診断で提示される各部類の試料の部分集合について訓練される。診断が訓練時に創出された予測に基づいて、正確に予測されたならば、ＳＶＭに示されていない、独立した試験試料は、その際、評価するべく提示された。
【００８５】
交差検証法はＳＶＭの予測性能を評価するために使用された[C.M.Bishop、“Neural networks for pattern recognition.”Oxord University Press、New York(1995)]。各分類作業について、試料がほぼ同じサイズ毎の８群に細分された。次いで、ＳＶＭが、他の７群を使用した訓練の後に、一群の試験試料について部類を予測した。試験群の全ての可能な選択について、ＳＶＭアルゴリズムの８回の操作に亘って、ミス分類の数が測定された。試験エラーについて信頼できる評価を得るため、例えば、以前の未知試料のミス分類の確率、ミス分類の数が、８群の試料の１０の異なる細分化体に亘って平均された。
【００８６】
ＳＶＭは、健全なＣＤ１９＋Ｂ細胞及びＣＤ４＋Ｔ細胞、及びＴ及びＢ細胞白血病（両患者の試料及び細胞系から）の間の差異を確認できるように訓練される。試料は最も情報に富んだ二つのＣpＧ位置を使用して、１５％試験エラーによって分類される。５４ＣpＧ位置を試験に供した内容で、試験エラーは、４%まで、著しく減少した。個々のＣpＧサイトはそれらの、サポートベクターマシーンの決定に対する寄与度によってランク付けされる。このマシーンは、健全なＴ及びＢ細胞、及びＡＬＬ間の決定は、主としてＣＤＫ４遺伝子のイントロン１に存在するＣpＧサイト及び腫瘍遺伝子c−ＭＯＳのコード化配列に基づくこと、だが、他の遺伝子の規制領域に存在するＣpＧサイトが大きく貢献することを示している（表１及び図２Ｂ及び２Ｃ）。健全な群に比較して、腫瘍細胞は一貫して、これら特別な、ＣpＧサイトが比較的過メチル化状態にあることを示している。また、分類はＡＬＬ患者試料及び健全なドナーＢ及びＴ細胞の間で、二つのＣpＧ位置を使用して、試験エラーがたった１３％で、行なうことができる。この低ディメンジョンの分類は、両者ともＡＬＬ患者において過メチル化状態にあるところの、ＣＳＮＫ２Ｂ及びＣＤＣ２５Ａからの、ＣpＧサイトのメチル化状態に基づいている。試験エラーは、トータル３１の分類に使用するＣpＧ位置の数を増加することによって、５％にまで改善できる。
【００８７】
次ぎのステップで、我々は、白血病の二つの部類を明らかにすることを試みる。サポートベクターマシーンには最初に部類情報が付加された、ＡＭＬ及びＡＬＬ試料の訓練集合が提示される（両患者の試料及び細胞系から）。予め含まれなかった試料は、そのとき、二つのＣpＧ位置を使用したとき、試験エラーが５%である部類の一つに分類される。この場合の最適ＣpＧサイト数は６と計算され、試験エラーはたったの１％にまで減少する（表１及び図３Ｂ）。最も情報に富んだＣpＧサイトは、ＣＤＫ４遺伝子のイントロン１及びＣＳＮＫ２Ｂのプロモーター領域に存在した。これらサイトの全般的メチル化度はＡＬＬがＡＭＬ細胞よりも再生的に高かった。しかし、この特別な決定に情報を与える、ＣＤＫ４遺伝子におけるＣpＧサイトは、ＡＬＬ及び健全なリンパ球の間を区別する同じ遺伝子におけるそれとは異なる。これは一クラスター内の異なるＣpＧサイトが、フェノタイプの異なるアスペクトで、潜在的に質問に応答する、異なるＣpＧサイト内で、情報を与えることができることを示している。
【００８８】
幾つかの組織特異性遺伝子のＣpＧ島が細胞系でメチル化される証拠がある[F. Antequera、 J.Boyes、A. Bird、Cell 62、503 (1990)]。前記分類が疾病による特異的変化におけるよりも、細胞系の特異的人為構造に基づくことはあり得ないとすることが重要である。だから、我々は白血病細胞系を一群とし、先ず白血病試料を他の部類にした。分類は２ＣpＧ位置に基づいては試験エラー２８％で可能であり、３０ＣpＧサイトを使用したとき、１２%で可能であった。重要なことは、この区別に最も寄与するＣpＧサイトは初期の如何なる分類においても、単に、特異的マーカーである細胞系に基づく場合を除いて、情報に富んではいなかったことである。この知見が、我々が健全なＴ細胞とＴ−ＡＬＬ細胞系の間の疾病による特異的メチル化の差異を明らかにすることを可能にさせた。分類は細胞系と非細胞系を区別できない二つのＣpＧ位置に基づけば、試験エラー０％で行なわれる。重要なＣpＧサイトはc−ＭＯＳ遺伝子のコード化配列に存在する（表１）。結論は、我々の成績は、細胞系の特異的メチル化変化の発生を確認するけれども、これらは腫瘍タイプの分類を妨げないことである。
【００８９】
図７は急性リンパ球性白血病と急性骨髄性白血病間の差別化に使用するパネルからの遺伝子の選別の使用を示す。最も重要な二つのＣpＧ位置を使用した時、試験エラーは５％と計算された。この場合のＣpＧサイトの最適数は計算によれば６であり、試験エラーは１％にまで減少した。最も情報に富んだＣpＧサイトは、ＣＤＫ４遺伝子のイントロン１及びＣＳＮＫ２Ｂのプロモーター領域に存在した。
これらサイトの全般的メチル化度はＡＬＬがＡＭＬ細胞よりも再生的に高かった。しかし、この特別な決定に情報を与える、ＣＤＫ４遺伝子におけるＣpＧサイトは、ＡＬＬ及び健全なリンパ球の間を区別する同じ遺伝子における、それとは異なる。これは一クラスター内の異なるＣpＧサイトが、フェノタイプの異なるアスペクトで、潜在的に質問に応答する、異なるＣpＧサイト内で、情報を与えることができることを示している。
【００９０】
図８は急性リンパ球性白血病と急性骨髄性白血病間の差別化に使用するパネルからの遺伝子の二者択一的選別の使用を示す。この場合、試験エラーは１６．３％であった。
【００９１】
全ての部類の分類の成績は、試験エラー、安全性及び再現性に関して、アッセイに基づくメッセンジャーＲＮＡに比肩し得る。しかし、分類は、メチル化データが現実に、ディメンジョンについて、発現プロフィールよりも、多くの情報を含んでいることを示唆して、非常に少なく、ランダムに選択された遺伝子で行なわれた。
【００９２】
もっと重要なことは、発現プロフィールで、独立した実験間の比較が最高に魅力的なのに比較して、信号強度が異なるメッセンジャーＲＮＡ種の絶対的及び総体的な二つの量に強力に依存することである。信号は一般に、ハウスキーピング遺伝子からの信号に対して較正されるが、メッセンジャーＲＮＡプロフィールは、相変わらず、発現レベルのかすかな変化を検知することはできない[R.J.Lipshutz、S.P.A Fodor、T.R.Gingeras、D.J.Lockhart、Nature Genetics 21、20 (1999) ]。我々のアプローチにおいて、ＣＧ／ＴＧ比が内部較正に使用され、かくして、スライドへハイブリッド化されるプローブの量は成績に影響しない。これは成績の比較を著しく改善し、そのため、例えば、複数の研究機関での試験及び今後の研究で必要になる、膨大な個体のスクリーニングを可能にする。
【００９３】
実施例３：遺伝子Ｎ３３（ＮＭ―００６７６５）内のＣpＧサイトのメチル化状態の同定
遺伝子Ｎ３３の断片（Ｓｅｑ ＩＤ Ｎo：＆[ＧＥＮＥＩＤ−２１８８]）がプライマーＡＡＡＧＣＣＧＣＴＧＣＣＡＴＣＣ及びＴＴＴＣＧＧＣＧＡＣＧＧＴＡＧＧを使用してＰＣＲ増幅された。得られた断片（５４８塩基対長）は４４６位置に情報に富んだＣpＧを含む。増幅されたＤＮＡは制限エンドヌクレアーゼＦauＩ、認識サイトＣＣＣＧＣ、で酵素処理（消化）された。前記エンドヌクレアーゼによる加水分解は増幅産物の４４６位置のＣpＧのメチル化によってブロックされる。酵素被処理物は制御下に使用される。ゲノムＤＮＡはウィザード（wizzard）ＤＮＡ分離キット（Promega社）を使用して試料から分離される。各試料は、メーカー（New England Biolabs）の推薦に従がって、ＡvaＩを使用して、酵素処理（消化）された。
【００９４】
１０ngのゲノム酵素被処理物は、次いで、ＰＣＲプライマーＡＡＡＧＣＣＧＣＴＧＣＣＡＴＣＣ及びＴＴＴＣＧＧＣＧＡＣＧＧＴＡＧＧを使用して増幅される。ＰＣＲ反応はサーモサイクラー（Eppendorf GmbH）を使用し、１０ngのＤＮＡ、６ピコモルの各プライマー、２００μＭの各dＮＴＰ、１．５mＭのＭgＣl22及び１ＵのHotstartTaq（Qiagen AG）を使って行なわれた。その他の条件はTaq ポリメラーゼのメーカーの教えに従がって行なった。上記のプライマーを使用して、遺伝子断片は以下の内容のＰＣＲによって増幅された。即ち、最初の変性ステップは９６℃、１４分；次いで、３０〜４５サイクル（ステップ２：９６℃、６０秒；ステップ３：５２℃、４５秒；ステップ４：７２℃、７５秒）次いで、７２℃、１０分の最終延長からなる。得られたＰＣＲ産物はアガロースゲル電気泳動法で分析された。
【００９５】
ＰＣＲ産物は、サイクルプログラムのステップ２からステップ４までが３４、３７、３９、４２及び４５回繰り返されるときに、ＦauＩで加水分解され、問題のＣpＧ位置がメチル化されなかった位置で、分離された、ＤＮＡを検知可能である。対照的に、ＰＣＲ産物はサイクルプログラムのステップ２からステップ４までが３９、４２及び４５回繰り返されるときに、ＦauＩで加水分解され、低メチル化度のＤＮＡから分離された時にのみ、ＤＮＡを検知可能である。これらの結果は実施例２に記載のＣpＧメチル化マトリックス解析に組込まれた。
【００９６】
【表１】
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【００９７】
表２：ＰＣＲプライマー及び産物
【表２−１】
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【００９８】
【表２−２】
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【００９９】
【表２−３】
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【０１００】
【表２−４】
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【０１０１】
【表２−５】
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【０１０２】
【表２−６】
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【０１０３】
【表２−７】
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【０１０４】
【表２−８】
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【０１０５】
【表２−９】
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【０１０６】
【表２−１０】
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【０１０７】
表３：ハイブリッド化オリゴヌクレオチッド
【表３−１】
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【０１０８】
【表３−２】
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【０１０９】
【表３−３】
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【０１１０】
【表３−４】
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【０１１１】
【表３−５】
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【０１１２】
【表３−６】
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【０１１３】
【表３−７】
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【０１１４】
【表３−８】
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【０１１５】
【表３−９】
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【０１１６】
【表３−１０】
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【０１１７】
【表３−１１】
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【０１１８】
【表３−１２】
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【０１１９】
【表３−１３】
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【０１２０】
【表３−１４】
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【０１２１】
【表３−１５】
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【０１２２】
【表３−１６】
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【０１２３】
【表３−１７】
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【０１２４】
【表３−１８】
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【０１２５】
【表３−１９】
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【０１２６】
【表３−２０】
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【０１２７】
【表３−２１】
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【０１２８】
【表３−２２】
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【０１２９】
【表３−２３】
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【０１３０】
【表３−２４】
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【０１３１】
【表３−２５】
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【０１３２】
【表３−２６】
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【０１３３】
【表３−２７】
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【０１３４】
【表３−２８】
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【０１３５】
【表３−２９】
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【０１３６】
【表３−３０】
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【０１３７】
【表３−３１】
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【０１３８】
【表３−３２】
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【０１３９】
【表３−３３】
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【０１４０】
【表３−３４】
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【０１４１】
【表３−３５】
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【０１４２】
【表３−３６】
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【０１４３】
【表３−３７】
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【０１４４】
【表３−３８】
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【０１４５】
【表３−３９】
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【０１４６】
【表３−４０】
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【０１４７】
表４：健康体細胞及び白血病細胞の間の差別化に使用されるハイブリッド化オリゴヌクオレチッド(図３)
【表４−１】
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【０１４８】
【表４−２】
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【０１４９】
【表４−３】
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【０１５０】
表３：急性リンパ性白血病と急性骨髄性白血病の間の差別化に使用されるハイビリッド化オリゴヌクレオチッド（図５及び図６）
【表３−１】
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【０１５１】
【表３−２】
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【０１５２】
【表３−３】
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【産業上の利用可能性】
【０１５３】
本発明は、急性リンパ球性白血病と急性骨髄性白血病を識別することに関連し、正常な造血細胞と増殖異常の造血細胞を識別する方法及び核酸に関する。
【図面の説明】
【０１５４】
図１
ヒト因子ＶＩＩＩ遺伝子のエクソン１４における二つのＣpＧジヌクレオチッドのメチル化解析及び数量化。較正目的のために、一連のハイブリッド化が、因子ＶＩＩＩ遺伝子のエクソン１４の合成の高メチル化及び低メチル化ＤＮＡ断片の混合物によって行なわれた。低メチル化及び高メチル化ＤＮＡ断片は、メチル化度を代表して、メチル化度、１００％、６６％、３３％及び０％で、混合比０：３、１：２、２：１、３：０で混合された。
図１Ａは、オリゴヌクレオチッドマイクロアレーハイブリッド化による、メチル化の検知である。因子ＶＩＩＩエクソン１４オリゴヌクレオチッドＦ８〜５（ＴＴＡＴＴＡＡＣＧＧＧＡＡＡＴＡＡＴ、ＴＴＡＴＴＡＡＴＧＧＧＡＡＡＴＡＡＴ）及びＦ８〜３（ＡＡＴＡＡＧＴＴＣＧＡＡＡＴＡＧＡＡ，ＡＡＴＡＡＧＴＴＴＧＡＡＡＴＡＧＡＡ）のＣＧ及びＴＧヴァージョンの蛍光信号が示され、この信号は、メチル化度、０％、３３％、６６％及び１００％である試料から発せられたものである。ハイブリッド化信号は、ブルー、グリーン及びイエローで示す、仮の色のイメージで、各２００〜８００，８００〜２０００及び２０００〜８０００の６３５nmにおける蛍光信号である。
図１Ｂは二つのＣpＧメチル化についての異なるメチル化ＤＮＡの測定の配布及び確率である。各ＣpＧ位置について、二種類の検知オリゴマーが使用された。ＣpＧがメチル化されている、オリゴマーはＣＧオリゴマーと呼ばれ、ＣpＧがメチル化されていない、オリゴマーはＴＧオリゴマーと呼ばれる。４種類の化合物５９、３６、４０、６３は同じスライドが作製された。ＣＧ及びＴＧ検知オリゴマーハイブリッド化強度の対数比が計算され、次いで、各々３つの同じ実験を含む実験の部分群が平均された。ＣＧ：ＴＧ比の配布函数は、異なる混合の測定値がうまく分別され、そのため、単一ＣpＧのメチル化レベルの検知が良好に達成されたことを示す。これはメチル化依存部類の予測または部類の発見のために前以って必須のものである。１００％および０％メチル化ＤＮＡ、及び較正実験において調べられた２２ＣpＧサイトの平均化のみを考慮して、メチル化の検知エラーは４％である。対数比はゼロ周辺に対称的に群在せず、マイナス値へシフトする。我々はＧ−Ｔ及びＡ−Ｃの不適合の異なる効果が、強力に、メチル化対立遺伝子の、逆よりも容易に、非メチル化を示すオリゴヌクレオチッドへのハイブリッド化を許容していると推察する。
【０１５５】
図２
性別及びＡＬＬ／ＡＭＬのＣpＧサイト予測及び健全な血液試料
高い確率のメチル化は赤に、不確実なものは黒に、低い確率のメチル化はグリーンに対応する。図の左側のラベルは遺伝子及び識別名である。右側のラベルは二群の平均間の有意差を示す。各行は単一ＣpＧを、各列は一群のメチル化レベルを示す。
図２Ａ
性別
男性、女性間の最大有意差のある２０ＣpＧサイトが示される。唯一非細胞系が使用される。期待されるように、二つのＸ染色体遺伝子由来のＣpＧジヌクレオチッド（ELK1、AR）。
図２Ｂ
健全試料とＡＬＬ試料間の差異
健全試料とＡＬＬ試料間の最大有意差のある５４ＣpＧサイトが示される。高い確率のメチル化は赤に、不確実なものは黒に、低い確率のメチル化はグリーンに対応する。図の左側のラベルは遺伝子及びＣpＧ識別名である。右側のラベルは二群の平均間の有意差を示す。各行は単一ＣpＧを各列は一群のメチル化レベルを示す。
図２Ｃはグレイ目盛での図２Ｂの複製である。高い確率のメチル化は黒に、不確実なものはグレイに、低い確率のメチル化は白に対応する。図の左側のラベルは遺伝子及び識別名である。右側のラベルは二群の平均間の有意差を示す。各行は単一ＣpＧを、各列は一群のメチル化レベルを示す。
図２Ａの記号の説明
１：女性；２：男性
図２Ｂの記号の説明
１：健全；２：ＡＬＬ
【０１５６】
図３
部類予測及び血液試料の部類発見
図３Ａは、訓練データとして全ての使用可能な健全及びＡＬＬ試料を使用する、健全とＡＬＬの判別のために最も重要な二つのＣpＧサイトでの訓練ＳＶＭを示す。赤いポイントは健全試料、黄色のポイントはＡＬＬ試料を示す。円で囲まれたポイントは、健全を予測されるグリーンエリアとＡＬＬを予測されるブルーエリアの間の白い境界線で示されるサポートベクターである。色の濃度は予測の確度に対応する。図３Ｂは、ＡＭＬとＡＬＬの部類の予測のためのサポートベクターマシーンである。赤いポイントはＡＬＬ，黄色のポイントはＡＭＬである。円で囲まれたポイントは、ＡＬＬを予測されるグリーンエリアとＡＭＬを予測されるブルーエリアの間の白い境界線で示されるサポートベクターである。色の濃度は予測の確度に対応する。図３Ｃは部類の発見である。使用される全試料の階層的クラスタリングを示す。健全なものはグリーン、ＡＬＬ及びＡＭＬ患者はブルーで示される。星印を付されたものは細胞系試料を示す。特徴スペースは二つのＸ染色体遺伝子を除く全てのＣpＧサイトからなる。診断はアルゴリズムに対して未知である。
図３Ａの記号の説明：t試験ランキング（健全〜ＡＬＬ）
１：ＭＯＳＣpＧ５；２：ＣＤＫ４ＣpＧ２
図３Ｂの記号の説明：t試験ランキング（ＡＭＬ〜ＡＬＬ）
１：ＣＳＮＫ２ＢＣpＧ２；２：ＣＤＫ４ＣpＧ１０
【０１５７】
図４
図４Ａは主要な成分分析を示す。全データ集合がその最初の主要２成分に投影される。円は細胞系を、三角形は１次患者の組織を示す。黒く塗られた円または三角形はＡＭＬ試料を、白いものはＡＬＬ試料を示す。
図４Ｂはフィッシャー基準である。フィッシャー基準によるランキング２０位までのＣpＧサイトが示される。最高位の特徴は図の最下方にある。高確率メチル化は黒に対応し、不明確なものはグレイに、低確率は白に対応する。
図４Ｃ：二試料t試験
図４Ｄ：逆行消去
【０１５８】
図５はフィッシャー基準の二つのベストな特徴についてのサポートベクターマシーンである。図は訓練データとして使用される全てのＡＬＬ及びＡＭＬ試料を使用して、フィッシャー基準に従がって、二つの最高位のＣpＧサイトでの訓練ＳＶＭを示す。黒いポイントはＡＭＬを、グレイのポイントはＡＬＬ試料である。円で囲まれたポイントはＡＭＬ及びＡＬＬ予測エリア間の白い境界線で限定される、サポートベクターである。バックグラウンドのグレイ値は予測確度に対応する。
図５の記号の説明
１：ＣＳＮＫ２ＢＣpＧ２；２：ＣＤＫ４ＣpＧ３
【０１５９】
図６は、特徴選別の性能のディメンジョン依存性である。図は多数の選別特徴に対する４つの異なる特徴選別法による線形ＳＶＭの普遍化性能を示す。X軸は対数目盛で、ＳＶＭへの特徴インプット数を与え、２から始まる。Y軸は発揮される普遍化性能を与える。最大主成分数が使用される試料数に対応することに注意されたい。
図６の記号の説明
１：特徴数；２：試験エラー；３：フィッシャー基準；４：t試験；５：逆行消去；６：主成分分析。
【０１６０】
図７
図７Ａは健全な及び急性リンパ球性白血病試料間の差異である。メチル化の高確率は赤であり、不確定は黒、低確率はグリーンである。図の左側のラベルは遺伝子及びＣpＧ識別名である。右側のラベルは二群の平均間の有意差を示す。各行は単一ＣpＧを、各列は一群のメチル化レベルを示す。
図７Ｂは、図７Ａで示された、急性リンパ球性白血病及び急性骨髄性白血病間の差異をグレイ目盛で再掲示した。メチル化の高確率は黒に対応し、不確定はグレイであり、低確率は白である。図の左側のラベルは遺伝子及びＣpＧ識別名である。右側のラベルは二群の平均間の有意差を示す。各行は単一ＣpＧを、各列は一群のメチル化レベルを示す。
【０１６１】
図８
図８Ａは急性リンパ球性白血病及び急性骨髄性白血病試料間の差異である。メチル化の高確率は赤に対応し、不確定は黒であり、低確率はグリーンである。図の左側のラベルは遺伝子及びＣpＧ識別名である。右側のラベルは二群の平均間の有意差を示す。各行は単一ＣpＧを、各列は一群のメチル化レベルを示す。
図８Ｂは、図８Ａで示された、急性リンパ球性白血病及び急性骨髄性白血病間の差異をグレイ目盛で再掲示した。メチル化の高確率は赤に対応し、不確定は黒であり、低確率はグリーンである。図の左側のラベルは遺伝子及びＣpＧ識別名である。右側のラベルは二群の平均間の有意差を示す。各行は単一ＣpＧを、各列は一群のメチル
【図面の簡単な説明】
【０１６２】
【図１Ａ】図１Ａは、オリゴヌクレオチッドマイクロアレーハイブリッド化による、メチル化の検知結果を示す。
【図１Ｂ】図１Ｂは、二つのＣpＧメチル化についての異なるメチル化ＤＮＡの測定の配布及び確率を示す。
【図２Ａ】図２Ａは男性、女性間の最大有意差のある２０ＣpＧサイトを示す。
【図２Ｂ】図２Ｂは健全試料とＡＬＬ試料間の差異を示す。
【図２Ｃ】図２Ｃはグレイ目盛での図２Ｂの複製を示す。
【図３Ａ】図３Ａは、訓練データとして、全ての使用可能な健全な、及びＡＬＬ試料を使用した、健全とＡＬＬの判別のために最も重要な二つのＣpＧサイトでの訓練ＳＶＭを示す。
【図３Ｂ】図３Ｂは、ＡＭＬとＡＬＬの部類の予測のためのサポートベクターマシーンを示す。
【図３Ｃ】図３Ｃは部類の発見である。使用される全試料の階層的クラスタリングを示す。
【図４Ａ】図４Ａは主要な成分分析を示す。
【図４Ｂ】図４Ｂはフィッシャー基準を示す。
【図４Ｃ】図４Ｃは二試料t試験結果を示す。
【図４Ｄ】図４Ｄは逆行消去を示す。
【図５】図５はフィッシャー基準の二つのベストな特徴についてのサポートベクターマシーンを示す。
【図６】図６は、特徴選別の性能のディメンジョン依存性を示し、多数の選別特徴に対する４つの異なる特徴選別法による線形ＳＶＭの普遍化性能を示す。
【図７Ａ】図７Ａは健全な及び急性リンパ球性白血病試料間の差異を示す。
【図７Ｂ】図７Ｂは、図７Ａで示された、急性リンパ球性白血病及び急性骨髄性白血病間の差異をグレイ目盛で再掲示したものを示す。
【図８Ａ】図８Ａは急性リンパ球性白血病及び急性骨髄性白血病試料間の差異を示す。
【図８Ｂ】図８Ｂは、図８Ａで示された、急性リンパ球性白血病及び急性骨髄性白血病間の差異をグレイ目盛で再掲示したものを示す。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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