(57)【要約】本発明は、ＦＸＲオーファン核ホルモン受容体により調節される遺伝子を調節するための方法および組成物に関する。好ましい態様において、本方法は、コレステロール除去における主な経路に責任がある酵素であるＣｙｐ７ａをコードする遺伝子の調節を伴う。本発明はまた、ＦＸＲ核ホルモン受容体に結合し、そして活性化または阻害する化合物をスクリーニングするための方法にも関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＦＸＲの活性化を調節することを含む、細胞においてコレステロール異化作用を修飾するための方法。
【請求項２】
Ｃｙｐ７ａをコードする遺伝子の発現を調節することを含む、細胞においてコレステロール異化作用を修飾するための方法。
【請求項３】
コレステロール異化作用が、Ｃｙｐ７ａをコードする遺伝子の発現を、前記細胞で天然に起こるものを越える発現レベルに上方制御することにより、増加される、請求項２の方法。
【請求項４】
Ｃｙｐ７ａをコードする遺伝子の発現の上方制御が、ＦＸＲ受容体の活性化を阻害することにより、達成される、請求項３の方法。
【請求項５】
有効量のＦＸＲ受容体アンタゴニストを前記細胞に投与し、Ｃｙｐ７ａをコードする遺伝子の発現の上方制御を達成する、請求項４の方法。
【請求項６】
哺乳動物における高コレステロール血症の治療または予防のための方法であって、こうした哺乳動物に、有効量のＦＸＲ受容体アンタゴニストを投与することを含む、前記方法。
【請求項７】
化合物が、ＦＸＲ受容体を活性化するかまたは該受容体の活性化を阻害するか決定することを含む、薬理学的に活性である化合物に関しスクリーニングするための方法。
【請求項８】
コレステロール異化作用を調節することが可能である化合物に関し、スクリーニングするための方法である、請求項７の方法。
【請求項９】
化合物がＦＸＲ活性化を阻害し、それによりコレステロール異化作用を増加させるかどうか決定することを含む、請求項８の方法。
【請求項１０】
ＦＸＲおよびＲＸＲの混合物を、化合物と接触させ、そして前記化合物がＦＸＲ−ＲＸＲヘテロ二量体形成を促進するかどうか決定することを含む、ＦＸＲ仲介遺伝子転写を調節するのに有用な化合物に関し、スクリーニングする方法。
【請求項１１】
ＦＸＲおよびＲＸＲの混合物を、化合物と接触させ、そして前記化合物がＦＸＲ−ＲＸＲヘテロ二量体のアゴニスト促進形成を阻害するかどうか決定することを含む、ＦＸＲアンタゴニスト活性に関し、化合物をスクリーニングする方法。
【請求項１２】
混合物が既知のＦＸＲアゴニストをさらに含む、請求項１１の方法。
【請求項１３】
ＲＸＲが、ＲＸＲ突然変異体（ＲＸＲｍ）であり、該変異体が、機能するＤＮＡ結合ドメインを含み、そしてＲＸＲリガンドによる実質的な活性化を妨げるが、それ以外は、ＲＸＲ突然変異受容体がＦＸＲとヘテロ二量体を形成する能力に実質的に影響を与えない、リガンド結合ドメイン中の突然変異を有する、請求項１０、１１または１２の方法。
【請求項１４】
コレステロール異化作用調節活性に関し、化合物をスクリーニングするための方法であって：
（１）（ｉ）ＦＸＲ受容体、
（ｉｉ）ＲＸＲ受容体、
（ｉｉｉ）リガンド−ＦＸＲ−ＲＸＲ複合体のＤＮＡ結合ドメインが特異的に結合するヌクレオチド配列を含む、標識ＤＮＡプローブ
を含む第一の混合物を提供し；
（２）（ｉ）ＦＸＲ受容体、
（ｉｉ）機能するＤＮＡ結合ドメインを含み、そしてＲＸＲリガンドによる実質的な活性化を妨げるが、それ以外は、ＲＸＲ突然変異受容体がＦＸＲとヘテロ二量体を形成し、またはこうしたヘテロ二量体が活性化補助因子を補充する能力に実質的に影響を与えない、リガンド結合ドメイン中の突然変異を有する、ＲＸＲ突然変異受容体（「ＲＸＲｍ」）、
（ｉｉｉ）リガンド−ＦＸＲ−ＲＸＲ複合体のＤＮＡ結合ドメインが特異的に結合するヌクレオチド配列を含む、標識ＤＮＡプローブ
を含む第二の混合物を提供し；
（３）前記の第一および第二の混合物を、スクリーニングしようとする化合物と接触させ；
（４）該化合物が、ＤＮＡプローブに対するＦＸＲ−ＲＸＲヘテロ二量体の結合を引き起こすかどうか決定し；そして
（５）スクリーニングしようとする化合物が、ＤＮＡプローブに対するＦＸＲ−ＲＸＲｍヘテロ二量体の結合を引き起こすかどうか決定する
ことを含む、前記方法。
【請求項１５】
第一および第二の混合物を、既知のＦＸＲリガンドと接触させ、そして前記の既知のＦＸＲリガンドがＦＸＲ−ＲＸＲヘテロ二量体のＤＮＡプローブに対する結合を引き起こす能力を阻害する化合物を選択することをさらに含む、請求項１４の方法。
【請求項１６】
ＤＮＡプローブに対するＦＸＲ−ＲＸＲｍへテロ二量体の実質的な結合を引き起こさない化合物を選択することをさらに含む、請求項１５の方法。
【請求項１７】
ＦＸＲ仲介遺伝子転写を調節するのに有用な化合物に関し、スクリーニングする方法であって、ＦＸＲ、ＲＸＲおよびＦＸＲ／ＲＸＲ活性化補助因子の混合物を、化合物と接触させ、そして前記化合物がＦＸＲ−ＲＸＲヘテロ二量体による活性化補助因子補充を促進するかどうか決定することを含む、前記方法。
【請求項１８】
ＦＸＲアンタゴニスト活性に関し、化合物をスクリーニングする方法であって、ＦＸＲ、ＲＸＲ、ＦＸＲ／ＲＸＲ活性化補助因子および既知のＦＸＲアゴニストの混合物を、化合物と接触させ、そして前記化合物がＦＸＲ−ＲＸＲヘテロ二量体によるアゴニスト促進活性化補助因子補充を阻害するかどうか決定することを含む、前記方法。
【請求項１９】
ＲＸＲが、ＲＸＲ突然変異受容体（「ＲＸＲｍ」）であり、該変異体が、機能するＤＮＡ結合ドメインを含み、そしてＲＸＲリガンドによる実質的な活性化を妨げるが、それ以外は、ＲＸＲ突然変異受容体がＦＸＲとヘテロ二量体を形成し、またはこうしたヘテロ二量体が活性化補助因子を補充する能力に実質的に影響を与えない、リガンド結合ドメイン中の突然変異を有する、請求項１７または１８の方法。
【請求項２０】
ＲＸＲｍが、ヒトＲＸＲαのＡｓｐ３３２→Ｐｒｏ突然変異体である、請求項１３、１４、１５、１６または１９の方法。
【請求項２１】
活性化補助因子が、ＦＸＲ−ＲＸＲヘテロ二量体と、リガンド依存的方式で相互作用するペプチドモチーフを含む、ポリペプチドまたはその活性断片である、請求項１７、１８または１９の方法。
【請求項２２】
活性化補助因子が、ＣＢＰ、ＳＲＣ−１およびＰＤＢ／ＤＲＩＰ２０５／ＴＲＡＰ２２０より選択される、請求項１７、１８、または１９の方法。
【請求項２３】
活性化補助因子がＧＲＩＰ１である、請求項１７、１８、または１９の方法。
【請求項２４】
ＤＮＡプローブが、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４のヌクレオチド配列を含む、請求項１４、１５、または１６の方法。
【請求項２５】
ＦＸＲ仲介遺伝子転写を調節するのに有用な化合物に関し、スクリーニングする方法であって：
（ａ）哺乳動物細胞を、機能可能なプロモーターの調節下にあるＦＸＲをコードする遺伝子でトランスフェクションし；
（ｂ）前記細胞を、ＤＮＡ配列に連結されたプロモーターの調節下にある機能可能なレポーター遺伝子でトランスフェクションし、ここで該ＤＮＡ配列は、リガンド活性化ＦＸＲまたはＦＸＲ複合体が結合し、前記レポーター遺伝子の転写を開始する機能可能な応答配列をコードする；
（ｃ）前記細胞を、スクリーニングしようとする化合物の存在下で培養し；そして
（ｄ）ＦＸＲ活性化の指標として、レポーター遺伝子の転写または発現に関し、前記細胞をモニターする
ことを含む、前記方法。
【請求項２６】
前記細胞が、機能可能なプロモーターの調節下にあるＲＸＲまたはＲＸＲｍをコードする遺伝子でトランスフェクションされる、請求項２５の方法。
【請求項２７】
前記細胞が、機能可能なプロモーターの調節下にある胆汁酸輸送分子をコードする遺伝子でトランスフェクションされる、請求項２５の方法。
【請求項２８】
前記細胞が、機能可能なプロモーターの調節下にある胆汁酸輸送分子をコードする遺伝子でトランスフェクションされる、請求項２７の方法。
【請求項２９】
前記細胞が、既知のＦＸＲリガンドの存在下で培養され、そしてレポーター遺伝子の転写または発現の減少が、スクリーニングしようとする化合物がＦＸＲアンタゴニストであることの指標である、請求項２５、２６、２７または２８の方法。
【請求項３０】
該方法を用い、コレステロール異化作用を増加させるのに有用な化合物を同定する、請求項２９の方法。
【請求項３１】
請求項１０、１１、１３、１４、１５、１６、１７、２５、２６、２７または２８の方法により選択される、非天然発生化合物。
【請求項３２】
療法的または予防的に有効な量の請求項３１の化合物を、薬学的に許容しうるキャリアーと組み合わせて含む、薬剤組成物。
【請求項３３】
有効量の請求項３２の薬剤組成物を投与することを含む、高コレステロール血症に関し、哺乳動物を治療する方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
関連出願に対するクロスレファレンス
本出願は、１９９９年３月２６日提出の仮特許出願６０／１２６，３３４から優先権を請求する。
【０００２】
背景
コレステロールは、膜生合成、ステロイドおよび胆汁酸生合成、カベオラ形成および共有結合タンパク質修飾を含む、多様な細胞活性に必須である。異なる代謝経路において、コレステロールが広く利用されていることは、最小血液濃度が維持されていなければならないことを意味する。一方、過剰な循環コレステロールは、アテローム性動脈硬化心臓疾患発生の主なリスク要因であり、該疾患は、毎年５００，０００人の死亡の原因となる、米国における最も大きな死因である。
【０００３】
循環コレステロールレベルは、細胞取り込み、合成および分解により制御される（ＢｒｏｗｎおよびＧｏｌｄｓｔｅｉｎ， Ｃｅｌｌ， ８９：３３１−３４０（１９９７））。過剰なコレステロールの除去は、コレステロールが不溶性脂質であり、その大部分が細胞膜に埋まっている事実により、複雑になっている。コレステロール分解の主な経路は、胆汁酸への代謝的変換であり、胆汁酸は、より疎水性でなく、そしてしたがって、コレステロールより容易に細胞から除去される。胆汁酸への変換は、もっぱら肝臓で行われる。本変換の１つの化学的経路は、本経路の律速酵素である、コレステロール７α−水酸化酵素（Ｃｙｐ７ａ）により開始される。ヒトでは、コレステロールは、７α−水酸化酵素およびステロール２７−水酸化酵素経路両方により、胆汁酸に変換される。
【０００４】
ｉｎ ｖｉｖｏで、胆汁酸は肝細胞および腸微生物により代謝され、多数の異なる産物を生じる。化学的に関連する産物が非常に多く、そして複雑な生化学経路が存在するため、個々の構成要素を単離し、そしてその影響を調べることが困難になっている。ＥｌｌｉｏｔｔおよびＨｙｄｅ， Ａｍ． Ｊ． Ｍｅｄ．， ５１：５６８−５７９（１９７１）を参照されたい。例えば、ケノデオキシコール酸（ＣＤＣＡ；５β−コラン酸−３α，７α−ジオール）およびコール酸（ＣＡ；５β−コラン酸−３α，７α，１２α−トリオール）は、胆汁酸生合成の２つの主な最終産物である（Ｃｈｉａｎｇ， Ｆｒｏｎｔ． Ｂｉｏｓｃｉ．， ３：Ｄ１７６−１９３（１９９８）； Ｖｌａｈｃｅｖｉｃら， Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ， １３：５９０−６００（１９９１））。共にもっぱら肝臓で産生され、ここでタウリンまたはグリシンとの結合により、さらに代謝される可能性がある。これらの胆汁酸は、腸に分泌され、回腸で再吸収され、そして門脈循環を介し、肝臓に再び輸送される。腸の通行中、主な胆汁酸、例えばＣＤＣＡおよびＣＡは、微生物仲介７α−脱水酸化を受け、そしてそれぞれ、リトコール酸（ＬＣＡ；５β−コラン酸−３α−オール）およびデオキシコール酸（ＤＣＡ；５β−コラン酸−３α，１２α−ジオール）に変換される（ＥｌｌｉｏｔｔおよびＨｙｄｅ， Ａｍ． Ｊ． Ｍｅｄ．， ５１：５６８−５７９（１９７１）； Ｈｙｌｅｍｏｎ， “Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ｏｆ Ｂｉｌｅ Ａｃｉｄｓ ｉｎ Ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ Ｍｉｃｒｏｆｌｏｒａ”， Ｓｔｅｒｏｌｓ ａｎｄ Ｂｉｌｅ Ａｃｉｄｓ，中， Ｈ． ＤａｎｉｅｌｓｓｏｎおよびＪ． Ｓｊｏｖａｌｌ監修（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｅｌｓｅｖｉｅｒ）ｐｐ．３３１−１４４（１９８５））。
【０００５】
その代謝機能に加え、胆汁酸はまた、自身の生合成を負に制御する情報伝達分子としても作用する。特に、胆汁構成要素は、Ｃｙｐ７ａ酵素の発現を阻害することにより、胆汁酸産生を制限する負のフィードバックループ中で作用する。いくつかの胆汁酸構成要素が、この負のフィードバック制御を誘導することが可能であることが知られているが、胆汁酸シグナルを伝達する胆汁酸センサーの性質、および該センサーが伝達する機構は、これまでのところ未知である。しかし、Ｃｙｐ７ａの阻害は転写レベルで起こることが知られており、そして負の胆汁酸応答配列がＣｙｐ７ａプロモーター中に見出されてきている。胆汁酸はまた、異なる経路を通じ、コレステロールの胆汁酸への変換に関与する酵素である、ステロール２７−水酸化酵素を下方制御することも示されてきている。Ｔｗｉｓｋら， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｊ．， ３０５：５０５−５１１（１９９５）を参照されたい。
【０００６】
核受容体は、ステロイド、甲状腺およびレチノイドホルモンの転写効果を仲介する、リガンド調節転写因子である。これらの受容体は、その標的遺伝子のプロモーター中のシス作用配列でＤＮＡに特異的に結合する、保存されたＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）、および特定のホルモンまたは他の因子による、受容体の特異的な活性化を可能にするリガンド結合ドメイン（ＬＢＤ）を有する。核受容体の標的遺伝子の転写活性化は、循環リガンドがＬＢＤに結合し、そして活性化補助因子の補充を促進する、受容体中のコンホメーション変化を誘導した際、起こる。活性化補助因子補充は、受容体複合体を生じ、該複合体は、特定のＤＮＡ領域に高い親和性を有し、そして特定の遺伝子の転写を調節することが可能である。アゴニスト結合後の活性化補助因子の補充は、受容体が転写を活性化するのを可能にする。受容体アンタゴニストの結合は、活性化補助因子の補充が標的遺伝子の基本的転写装置との非生産的な相互作用を生じるように、受容体の異なるコンホメーション変化を誘導する。当業者に明らかになるであろうように、特定の遺伝子に対し、負の転写コントロールを達成する受容体のアゴニストは、遺伝子の発現を実際に減少させるであろう。逆に、こうした受容体のアンタゴニストは、遺伝子の発現を増加させるであろう。
【０００７】
少なくとも２つの種類の核受容体活性化補助因子が同定されてきている。第一の種類は、ＣＢＰおよびＳＲＣ−１関連タンパク質を含み、ヒストンアセチラーゼ活性により、クロマチン構造を調節する。第二の種類は、ＰＢＤ／ＤＲＩＰ ２０５／ＴＲＡＰ ２２０を含み、基本的な転写機構と直接相互作用すると仮定される、大きな転写複合体の一部である。
【０００８】
特定の同定されたホルモンに反応する、既知の古典的な核ホルモン受容体に加え、既知のリガンドを欠くいくつかのオーファン受容体が同定されてきている。これらのオーファン受容体には、例えばＦＸＲ、ＣＡＲβ、ＰＰＡＲα、ＰＰＡＲδ、ＴＲ２−１１、ＬＸＲα、ＧＣＮＦ、ＳＦ１、ＲＯＲα、Ｎｕｒｒ１、ＤＡＸおよびＥＲＲ２が含まれる。オーファン受容体ＦＸＲ（ファルネソイドＸ活性化受容体）は、Ｃｙｐ７ａを阻害することが知られる。該受容体は、ＲＸＲリガンドにより活性化されることが可能であるＲＸＲ（９−シスレチノイン酸受容体）とのヘテロ二量体として、その応答配列に結合する。
【０００９】
オーファン受容体は、脂肪酸、プロスタノイド、並びにファルネソールおよびコレステロールの代謝物を含む、いくつかの代謝シグナルのセンサーとして作用すると仮定されてきている。ｌａｃオペロンに対する先駆的な研究以来、中間代謝物が細菌および酵母において、情報伝達分子として働くことがよく確立されてきている（Ｇａｎｃｅｄｏ， Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｍｏ． Ｂｉｏｌ． Ｒｅｖ．， ６２：３３４−３６１（１９９８）； Ｕｌｌｍａｎｎ， Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ， ６７：２９−３４（１９８５））。哺乳動物細胞における代謝物調節の理解は、代謝的シグナルおよびその同族センサーを同定する必要があるため、妨げられてきている。
【００１０】
肝臓における胆汁酸情報伝達経路に関する以前の研究は、損なわれていない動物または培養肝細胞を用いて行われた。本設計の研究を用いた研究者らは、これらの系では、胆汁酸が腸微生物および／または肝特異的酵素によるいくつかの異なる産物への代謝変換にさらされるため、どの化合物が究極的な胆汁酸情報伝達分子であるか、発見することが不可能であった。したがって、コレステロールおよび胆汁酸シグナルのセンサーとして作用する受容体は、同定されなかった。
【００１１】
胆汁酸によるコレステロール異化作用の阻害は、胆汁酸として排出される可能性があるコレステロールの量を制限するため、胆汁酸およびコレステロール代謝を制御する核受容体の同定は、高コレステロール血症または本受容体により制御される遺伝子の活性化レベルに関連する他の異常を持つ個体に対する治療様式（ｍｏｄａｌｉｔｙ）を発展させる際の大きな利点になるであろう。現在、コレステロール異化作用に対し胆汁酸により強いられる負のフィードバックなど、胆汁酸制御遺伝子の転写または発現に干渉することができず、これが、これらの遺伝子に関連する異常、例えば高コレステロール血症を持つ個体を治療する際の深刻なつまずきをもたらす。胆汁酸核受容体調節遺伝子の制御における欠損に関連するいかなる異常も、受容体活性の修飾により、改善されるであろう。核胆汁酸センサーは、標的遺伝子転写を刺激するかまたは抑制することにより、胆汁酸に対して反応することが示されてきている。これらの活性は、これらの遺伝子中の陽性ＦＸＲ応答配列により仲介される。例えば、胆汁酸は、肝臓および回腸／腎特異的胆汁酸輸送体（Ｔｏｒｃｈｉａら， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ． ２２５：１２８−１３３（１９９６））、ステロール２７−水酸化酵素（Ｃｙｐ２７）（Ｔｗｉｓｋら， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｊ．， ３０５：５０５−５１１（１９９５））およびステロール１２α水酸化酵素（Ｃｙｐ１２）（Ｅｉｎａｒｓｓｏｎら， Ｊ． Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．， ３３：１５９１−１５９５（１９９２））の転写を協調的に抑制する。したがって、胆汁酸受容体標的遺伝子の刺激または抑制により改善される可能性がある有害な代謝異常は、胆汁酸受容体リガンドにより、治療することが可能である。
【００１２】
結果的に、胆汁酸により制御される遺伝子の発現を調節する化合物および方法に対する要求がある。胆汁酸制御遺伝子の転写制御を修飾する薬理学的介入を提供することが可能である化合物を同定するためのスクリーニング法に対するさらなる要求が存在する。こうした化合物および方法は、胆汁酸制御遺伝子転写の修飾から利益を得るであろう患者、例えば高コレステロール血症を患う個体に価値があるであろう。
【００１３】
発明の概要
本発明は、Ｃｙｐ７ａをコードする遺伝子の発現を調節することを含む、細胞においてコレステロール異化作用を修飾する方法を提供する。
【００１４】
さらなる態様において、本発明は、哺乳動物における高コレステロール血症の治療または予防のための方法であって、こうした哺乳動物に、有効量のＦＸＲ受容体アンタゴニストを投与することを含む、前記方法を提供する。
【００１５】
別の態様において、本発明は、スクリーニングしようとする化合物が、ＦＸＲ受容体を活性化するかまたは該受容体の活性化を阻害するか決定することを含む、コレステロール異化作用を調節することが可能である化合物を含む、薬理学的に活性である化合物をスクリーニングするための方法を提供する。
【００１６】
さらなる態様において、本発明は、ＦＸＲおよびＲＸＲの混合物を、化合物と接触させ、そして前記化合物がＦＸＲ−ＲＸＲヘテロ二量体形成を促進するかどうか決定することを含む、ＦＸＲ仲介遺伝子転写を調節するのに有用な化合物をスクリーニングする方法を提供する。
【００１７】
本発明はさらに、ＦＸＲ、ＲＸＲおよび既知のＦＸＲアゴニストの混合物を、化合物と接触させ、そして前記化合物がＦＸＲ−ＲＸＲヘテロ二量体のアゴニスト促進形成を阻害するかどうか決定することを含む、ＦＸＲアンタゴニスト活性に関し、化合物をスクリーニングする方法を提供する。
【００１８】
コレステロール異化作用調節活性に関し、化合物をスクリーニングするための１つのこうした方法は：（１）（ｉ）ＦＸＲ受容体、（ｉｉ）ＲＸＲ受容体、および（ｉｉｉ）リガンド−ＦＸＲ−ＲＸＲ複合体のＤＮＡ結合ドメインが特異的に結合する配列を含む、標識ＤＮＡプローブを含む第一の混合物を提供し；（２）（ｉ）ＦＸＲ受容体、（ｉｉ）機能するＤＮＡ結合ドメインを含み、そしてＲＸＲリガンドによる活性化を妨げるが、それ以外は、ＲＸＲ突然変異受容体がＦＸＲとヘテロ二量体を形成し、またはこうしたヘテロ二量体が活性化補助因子を補充する能力に実質的に影響を与えない、リガンド結合ドメイン中の突然変異を有する、ＲＸＲ突然変異受容体（「ＲＸＲｍ」）、（ｉｉｉ）リガンド−ＦＸＲ−ＲＸＲ複合体のＤＮＡ結合ドメインが特異的に結合する配列を含む、標識ＤＮＡプローブを含む第二の混合物を提供し；（３）前記の第一および第二の混合物を、スクリーニングしようとする化合物と接触させ；（４）スクリーニングしようとする化合物が、ＤＮＡプローブに対するＦＸＲ−ＲＸＲヘテロ二量体の結合を引き起こすかどうか決定し；そして（５）スクリーニングしようとする化合物が、ＤＮＡプローブに対するＦＸＲ−ＲＸＲｍヘテロ二量体の結合を引き起こすかどうか決定する、ことを含む。スクリーニング法の別の態様において、該方法は、第一および第二の混合物を、既知のＦＸＲリガンドと接触させ、そして前記の既知のＦＸＲリガンドがＦＸＲ−ＲＸＲヘテロ二量体のＤＮＡプローブに対する結合を引き起こす能力を阻害する化合物を選択することをさらに含む。上述の方法を用い、第一の混合物および第二の混合物中に既知のＦＸＲリガンドを含み、そして工程（４）および（５）で、スクリーニングしようとする化合物がＤＮＡプローブに対するヘテロ二量体の結合を阻害するか決定することにより、ＦＸＲアンタゴニスト活性を有する化合物に関しスクリーニングしてもよい。さらに、活性化補助因子が、ＦＸＲ−ＲＸＲヘテロ二量体と、リガンド依存的方式で相互作用するペプチドモチーフを含む、ポリペプチドまたはその活性断片である方法を、本発明と共に用いてもよい。
【００１９】
本発明の別の態様は、ＦＸＲ仲介遺伝子転写を調節するのに有用な化合物に関し、スクリーニングするための方法であって、ＦＸＲ、ＲＸＲおよびＦＸＲ／ＲＸＲ活性化補助因子の混合物を、化合物と接触させ、そして前記化合物がＦＸＲ−ＲＸＲヘテロ二量体による活性化補助因子補充を促進するかどうか決定することを含む、前記方法を提供する。
【００２０】
本発明の別のさらなる態様は、ＦＸＲアンタゴニスト活性に関し、化合物をスクリーニングする方法であって、ＦＸＲ、ＲＸＲ、ＦＸＲ／ＲＸＲ活性化補助因子および既知のＦＸＲアゴニストの混合物を、化合物と接触させ、そして前記化合物がＦＸＲ−ＲＸＲヘテロ二量体によるアゴニスト促進活性化補助因子補充を阻害するかどうか決定することを含む、前記方法を提供する。
【００２１】
本発明のさらに別のスクリーニング法態様は：（ａ）哺乳動物細胞を、機能可能なプロモーターの調節下にあるＦＸＲをコードする遺伝子でトランスフェクションし；（ｂ）前記細胞を、ＤＮＡ配列に連結されたプロモーターの調節下にある機能可能なレポーター遺伝子でトランスフェクションし、ここで該ＤＮＡ配列は、リガンド活性化ＦＸＲまたはＦＸＲ複合体が結合し、前記レポーター遺伝子の転写を開始する機能可能な応答配列をコードする；（ｃ）前記細胞を、スクリーニングしようとする化合物の存在下で培養し；そして（ｄ）ＦＸＲ活性化の指標として、レポーター遺伝子の転写または発現に関し、前記細胞をモニターすることを含む、細胞系である。都合よくは、細胞はまた、ＲＸＲまたはＲＸＲｍをコードする遺伝子でトランスフェクションしてもよく、後者は、ＲＸＲを活性化するものからＦＸＲを活性化する化合物を区別する手段を提供する。既知のＦＸＲリガンドの存在下で行う場合、該方法は、ＦＸＲアンタゴニストを同定するのに有用である。本方法のさらなる修飾は、細胞を、機能可能なプロモーター調節下にある胆汁酸輸送分子をコードする遺伝子でトランスフェクションすることを含む。輸送分子の発現は、細胞膜を横断する親水性分子の輸送を達成し、したがって、ＦＸＲ受容体の活性化を調節する能力を検出することを可能にする。
【００２２】
さらなる態様において、本発明は、上述のスクリーニング法により同定される化合物、ＦＸＲ転写調節により仲介される障害、例えば異常なコレステロールレベルを治療するまたは予防する際用いるための薬剤組成物および方法を提供する。
本発明の他の態様は、請求の範囲にしたがい、当業者に認識されるであろう。
【００２３】
発明の詳細な説明
本発明は、ＦＸＲ受容体として同定されてきている胆汁酸核受容体（ＢＡＲ）により制御される遺伝子の転写を調節するための方法を提供する。本発明はまた、ＦＸＲを活性化しまたは阻害し、そして該方法において有用である化合物を同定するための方法も提供する。
【００２４】
胆汁抽出物がオーファン受容体ＦＸＲを特異的に活性化することが見出されてきている。本受容体を活性化する活性内因性胆汁酸情報伝達分子が均質に精製され、そしてケノデオキシコール酸（ＣＤＣＡ）と同定された。さらなる解析および構造−活性研究により、ＣＡ、ＤＣＡおよびＬＣＡもまた、ＦＸＲを活性化することが明らかになった。さらに、ＬＣＡはｉｎ ｖｉｔｒｏで活性化補助因子補充を促進することも見出された。
【００２５】
胆汁酸構成要素がＦＸＲオーファン受容体に結合し、そして活性化することが可能であることを実証するため、ブタ胆汁（Ｓｉｇｍａ）の抽出物を調製し、そしていくつかのオーファン核受容体に対し、試験した。試験しようとする受容体を、ＣＯＳ細胞由来のＣＶ−１細胞で発現させた。該細胞は、Ｂｏｙｅｒら， Ａｍ． Ｊ． Ｐｈｙｓｉｏｌ， ２６６：Ｇ３８２−Ｇ３８７（１９９４）に記載される。
【００２６】
胆汁酸応答性を再構成するための標準的モデル異種細胞系を用いることにより、試験しようとする過程を不明瞭にする可能性がある代謝事象の非存在下で、活性をモニターすることが可能である。細胞が、受容体を発現する適切なＤＮＡ、レポーター遺伝子、応答配列、およびそれらに匹敵するもので、一過的にトランスフェクションすることが可能である限り、潜在的なまたは既知の胆汁酸核受容体リガンドの活性化を試験するのに、いかなる適切な異種細胞系を用いてもよい。１つまたはそれ以上の必要な遺伝子を恒常的に発現する細胞もまた、用いてもよい。哺乳動物遺伝子の一過的発現に適しており、そして培養中に維持しやすい細胞系が、当業者に公知である。
【００２７】
表１．オーファン受容体活性化アッセイのためのレポーター／受容体対
【００２８】
【表１】
2004510682.tif 000002
【００２９】
胆汁酸による多様なオーファン受容体の活性化を試験するため、ＣＶ−１細胞を、当業に知られる方法にしたがい、適切なレポーター構築物と共に、図１に示される受容体の発現ベクターで、一過的にトランスフェクションした。適切なレポーター遺伝子構築物は、生化学および分子生物学の分野の当業者に公知である。図１に報告されるアッセイで用いたレポーター／受容体対は、表１に列挙される。すべてのトランスフェクションは、内部コントロールとして、ＣＭＸ−βｇａｌをさらに含んだ。これらの研究に用いる適切な構築物は、好都合に、ｐＣＭＸにクローニングしてもよい。ｐＣＭＸは、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの転写のため、サイトメガロウイルスプロモーター／エンハンサーに続き、バクテリオファージＴ７プロモーターを含む。当業に知られる他のベクターを、本発明の方法において用いてもよい。
【００３０】
本明細書に記載される研究に使用するのに適した、以下の以前記載されるタンパク質の全長をコードする遺伝子を、ｐＣＭＸにクローニングした：ラットＦＸＲ（寄託番号Ｕ１８３７４）、ヒトＲＸＲα（寄託番号Ｘ５２７７３）、ヒトＴＲβ（寄託番号Ｘ０４７０７）、ヒトＬＸＲα（寄託番号Ｕ２２６６２）、マウスＰＰＡＲα（寄託番号Ｘ５７６３８）、マウスＰＰＡＲδ（寄託番号Ｕ１０３７５）、ヒトＴＲ２−１１（寄託番号Ｍ２９９６０）、マウスＧＣＮＦ（寄託番号Ｕ１４６６６）、マウスＳＦ１（寄託番号Ｓ６５８７８）。本出願中のすべての寄託番号は、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号を指す。受容体断片を含むＧａｌ４融合体は、以下のタンパク質配列を、ｐＳＧ４２４（ＳａｄｏｗｓｋｉおよびＰｔａｓｈｎｅ， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， １７：７５３９（１９８９））由来の酵母ＧＡＬ４ ＤＮＡ結合ドメイン（アミノ酸１−１４７）のＣ−末端に融合させることにより、構築した：ＧＡＬ−Ｌ−ＲＸＲ（ヒトＲＸＲα Ｇｌｕ ２０３−Ｔｈｒ ４６２）、ＧＡＬ−Ｌ−ＦＸＲ（ラットＦＸＲ ＬＢＤ Ｌｅｕ １８１ −Ｇｌｎ ４６９）、ＧＡＬ−ＲＯＲα（ヒトＲＯＲα１ Ａｒｇ １４０−Ｇｌｙ ５２３、寄託番号Ｕ０４８９７）、ＧＡＬ−Ｎｕｒｒｌ（マウスＮｕｒｒｌ， Ｃｙｓ ３１８−Ｐｈｅ ５９８、寄託番号Ｓ５３７４４）、ＧＡＬ−ＤＡＸ（ヒトＤＡＸ−１、寄託番号Ｕ３１９２９）、ＧＡＬ−ＥＲＲ２（ヒトＥＲＲ２、Ｇｌｕ １７１−Ｖａｌ ４３３、寄託番号Ｘ５１４１７）、ＧＡＬ−ＣｏＡ（ヒトＳＲＣ−１ Ａｓｐ ６１７−Ａｓｐ ７６９、寄託番号Ｕ５９３０２）。
【００３１】
ＲＸＲ ＬＢＤ発現構築物Ｌ−ＲＸＲは、ヒトＲＸＲα ＬＢＤ（Ｇｌｕ ２０３−Ｔｈｒ ４６２）の上流に融合しているＳＶ４０ ＴＡｇ核局在化シグナル（ＡＰＫＫＫＲＫＶＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １））を含む。ＶＰ−Ｌ−ＦＸＲは、ラットＦＸＲ ＬＢＤ（Ｌｅｕ １８１−Ｇｌｎ ４６９）のアミノ末端に連結している、７８アミノ酸のヘルペスウイルスＶＰ１６トランス活性化ドメインを含む。試験しようとする受容体または受容体ドメインの活性化との比較のためのコントロール遺伝子として用いるＣＭＸ−βｇａｌは、ｐＣＨ１１０（寄託番号Ｕ０２４４５）由来の大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）β−ガラクトシダーゼコード配列を含む。ここでは、本遺伝子を好都合に用いたが、入手可能であり、そしてその活性化を測定する、好都合なアッセイが存在する場合、関連しないいかなる遺伝子を、本発明の方法でコントロールとして用いてもよい。
【００３２】
ＲＸＲｍは、単一点突然変異（Ａｓｐ ３２２→Ｐｒｏ）を含む、ヒト９−シスレチノイン酸受容体リガンド結合ドメインである。本突然変異受容体ドメインは、ＤＮＡに結合し、そしてＦＸＲとヘテロ二量体複合体を形成する能力を保持するが、野生型受容体ドメインのように、低濃度のリガンドに反応する能力は欠く。この不全ＬＢＤにより、胆汁酸核受容体（ＦＸＲ）に結合しそして活性化する化合物を特異的にスクリーニングするが、ヘテロ二量体のＲＸＲ部分を通じて活性化する化合物をスクリーニングしない活性化アッセイが可能になる。
【００３３】
胆汁により、どの単数または複数のオーファン受容体が活性化され、そしてどのオーファン受容体を外因的に操作し、胆汁酸応答遺伝子の転写を修飾することが可能であるか決定するため、トランスフェクション細胞をブタ胆汁抽出物で処理した。胆汁抽出物は、以下のように調製した。胆汁（Ｓｉｇｍａ、１ ｇ）を水に溶解し、そしてｐＨ ４．０に調整した。水不溶性成分をさらに、メタノールで抽出した。メタノール可溶性成分を乾燥させ、そして１００μｇ／ｍｌで再溶解した。
【００３４】
活性化アッセイに用いるＣＶ−１細胞を、１０％ 樹脂木炭除去（ｓｔｒｉｐｐｅｄ）ウシ胎児血清、５０ Ｕ／ｍｌ ペニシリンＧおよび５０μｇ／ｍｌ ストレプトマイシン硫酸を補ったダルベッコの修飾イーグル培地（ＤＭＥＭ−ＦＢＳ）中で、５％ ＣＯ２中、３７℃で増殖させた。トランスフェクション１日前、フェノールレッド不含ＤＭＥＭ−ＦＢＳを用い、細胞を５０−８０％コンフルエントに蒔いた。
【００３５】
細胞をリポフェクションにより、一過的にトランスフェクションした。レポーター構築物（３００ ｎｇ／１０５細胞）およびサイトメガロウイルス駆動発現ベクター（２０−５０ ｎｇ／１０５細胞）を、内部コントロールとしてのＣＭＸ−β−ｇａｌ（５００ ｎｇ／１０５細胞）と共に、添加した。２時間後、リポソームを除去し、そして試験胆汁酸および他の化合物を含む、フェノールレッド不含ＤＭＥＭ−ＦＢＳで、およそ４５時間、細胞を処理した。
【００３６】
胆汁酸核受容体活性化の候補であるいかなる化合物も、本方法により試験することが可能である。一般的には、いくつかの異なる濃度で化合物を試験し、受容体活性化が存在する場合、検出され、そして認識されるであろう機会を最適化する。リガンドへの曝露後、細胞を採取し、そしてβ−ガラクトシダーゼ活性（コントロール）および特定のレポーター遺伝子の活性に関し、アッセイした。本明細書に開示されるすべてのアッセイは、３つ組で行い、そして実験内で、１５％未満の変動であった。各実験は３回またはそれ以上反復し、同様の結果を得た。
【００３７】
レポーター遺伝子の活性は、好都合に、内部コントロールに対し規準化し、そして未処理細胞に比較した倍活性化としてデータをプロットしてもよい。胆汁抽出物によるオーファン受容体の活性化を示すデータに関し、図１を参照されたい。図に示されるように、胆汁抽出物はＦＸＲの強力な活性化因子（５６倍）であったが、試験した他のオーファン受容体に対しては、ほとんどまたはまったく影響を持たなかった。
【００３８】
上に論じられるように、ＦＸＲはＲＸＲ（９−シスレチノイン酸受容体）とのヘテロ二量体として、その応答配列に結合する。本へテロ二量体は、ファルネソイドリガンドにより、またはＲＸＲ結合リガンドにより、活性化することが可能である（Ｆｏｒｍａｎら， Ｃｅｌｌ ８０３−８１２（１９９５）； Ｚａｖａｋｉら， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． （ＵＳＡ）， ９４：７９０９−７９１４（１９９７））。胆汁抽出物によるＦＸＲ−ＲＸＲヘテロ二量体の活性化は、ＦＸＲまたはＲＸＲいずれかのリガンドの存在を反映する可能性があるため、ＦＸＲ特異的活性化因子に関しスクリーニングするのに、ＲＸＲリガンドに対する応答が欠損しているＦＸＲ−ＲＸＲ複合体を生成した。ＲＸＲリガンド結合ドメインの利用可能性により、ＲＸＲの影響の非存在下での胆汁酸核受容体の活性化を検出し、そうでなければ起こるであろう、偽陽性結果を防ぐスクリーニングアッセイの生成が可能になる。
【００３９】
ＲＸＲ突然変異体が本方法で機能するため、該受容体は、ＲＸＲリガンドにより最小に活性化され、そしてＲＸＲリガンドに曝露された際、活性化補助因子を補充することができないが、ＦＸＲと二量体化し、ＦＸＲとのヘテロ二量体としてＤＮＡに結合する能力を保持しなければならない。最後に、突然変異体は、胆汁酸核受容体の正常活性に、実質的に干渉してはならない。これらの性質を確実にするため、突然変異リガンド結合ドメインに対し、以下に記載するように試験を行った。他の突然変異体もまた、同じ方式で試験し、本発明の方法で使用する適切性を決定してもよい。
【００４０】
ＬＢＤ中に単一点突然変異（Ａｓｐ ３２２→Ｐｒｏ）を含むＲＸＲ突然変異体（ＲＸＲｍ）は、これらのアッセイで特によく機能することが見出されてきている。野生型ＲＸＲ（ＧＡＬ−Ｌ−ＲＸＲ）またはＲＸＲｍ（ＧＡＬ−Ｌ−ＲＸＲｍ）のいずれかのリガンド結合ドメインに融合している酵母ＧＡＬ４ ＤＮＡ結合ドメインを含むキメラ受容体を、胆汁酸によるオーファン受容体の活性化に関する図１のデータに関し記載されるのと同じ方法で、合成ＲＸＲ特異的リガンド（ＬＧ２６８、６−［１−（３，５，５，８，８−ペンタメチル−５，６，７，８−テトラヒドロナフタレン−２−イル）シクロプロピル］ニコチン酸）に対する反応に関し、試験した。ＣＶ−１細胞を、ＣＭＸ−βｇａｌ、ＵＡＳＧ ｘ ４およびＧＡＬ−Ｌ−ＲＸＲまたはＧＡＬ−Ｌ−ＲＸＲｍ ＬＢＤ突然変異体いずれかで、一過的にトランスフェクションした。トランスフェクション後、細胞を、図２に示される濃度のＬＧ２６８で処理した。突然変異ＲＸＲリガンド結合ドメインを有する二量体は、野生型ＲＸＲリガンド結合ドメインを有する二量体より、活性化強度において１０倍の減少を示した。図２を参照されたい。全長ＲＸＲおよびＲＸＲｍ受容体で、同様の結果が観察された（データ未提示）。
【００４１】
本突然変異体の適切性をさらに確認するため、野生型ＲＸＲおよびＲＸＲｍが、リガンドに反応して、ＤＮＡに結合し、そして活性化補助因子を補充する能力を比較した。まず、１．２μｌのｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳ＲＸＲ（図３、上部のパネル）またはＲＸＲｍ（図３、下部のパネル）、５μｇの精製組換えＧＳＴ−ＧＲＩＰ１活性化補助因子（以下に記載）、および３２Ｐ標識ＤＲ１プローブ（５’−ＡＧＣＴＡＣＣＡＧＧＴＣＡＡＡＧＧＴＣＡＣＧＴＡＧＣＴ；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２）の混合物を、増加する量のＲＸＲリガンドＬＧ２６８（０−１０００ ｎＭ）と共にインキュベーションすることにより、電気泳動移動度シフト実験を行った。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２のＤＲ１プローブは、本明細書に開示されるすべてのＲＸＲホモ二量体試験に用いた。リガンド占有ヘテロ二量体が、用いた検出法に関し、十分なアビディティーでプローブに結合する限り、ＤＮＡ結合ドメイン標的配列に実質的に相同ないかなる核酸プローブも、こうしたアッセイに用いてもよい。同様に、混合物中の複合体の存在を検出するのに十分に感度が高い、ヌクレオチドプローブのためのいかなる好都合な標識も、本方法に用いるのに意図される。
【００４２】
インキュベーション中、複合体が形成され、ここで二量体が活性化補助因子を補充し、そして標識ＤＮＡプローブに結合する。インキュベーション後、非変性条件下で混合物を電気泳動に供する。本アッセイでは、４５ ｍＭ ホウ酸および１ ｍＭ ＥＤＴＡを含む４５ ｍＭ Ｔｒｉｓ−塩基緩衝液中で、５％ ポリアクリルアミドゲルを通じ、室温で、複合体を電気泳動した。ゲルをオートラジオグラフィーに供し、標識複合体および他の構成要素を検出した。
【００４３】
図３では、ＣｏＡは、活性化補助因子ＧＲＩＰ１由来の３つの受容体相互作用ドメインを含むＧＳＴ融合体を示す。電気泳動移動度シフトの結果は、ＲＸＲｍが、野生型ＲＸＲに比較し、１００倍減少した強度で、活性化補助因子を補充することを示す。突然変異および野生型受容体は共に、ＤＮＡに結合する（図３、レーン１）が、ＲＸＲｍは、野生型受容体による最大補充に十分な濃度で、活性化補助因子を補充できなかった（図３、上部および下部のパネル、レーン２−６を比較されたい）。
【００４４】
図３に示されるＲＸＲ−活性化補助因子複合体の量の定量化は、オートラジオグラムのホスホイメージャー解析により測定し、そしてＬＧ２６８濃度の関数としてプロットすることにより、決定した。データは、ＲＸＲｍによる活性化補助因子の補充は、およそ１００倍高い濃度のリガンドを必要とすることを示した（図４）。ＲＸＲ突然変異体は、ＦＸＲとのヘテロ二量体としてＤＮＡに結合する能力を保持する（図５およびデータ未提示）が、低濃度のリガンドに強く反応する能力を欠くため、ＦＸＲ−ＲＸＲｍへテロ二量体を用い、多様なリガンドを用いた試験において、ＦＸＲサブユニットの活性化を立証することが可能である。したがって、こうしたヘテロ二量体を、ＦＸＲ核胆汁酸受容体を活性化する化合物、およびしたがって該受容体により制御される遺伝子の転写を修飾することが可能な化合物に関するスクリーニング法に、好都合に使用してもよい。
【００４５】
解析法の確認は、ＲＸＲおよびＦＸＲリガンドによる活性化に関し、ＦＸＲ−ＲＸＲおよびＦＸＲ−ＲＸＲｍ二量体を試験することにより、達成した。ＣＶ−１細胞を、図５に示される受容体ドメインを宿するプラスミドでトランスフェクションし、そして１００ ｎＭのＬＧ２６８（左のパネル）またはブタ胆汁のメタノール抽出物（２００μｇ／ｍｌ、右のパネル）いずれかで処理した。ＬＧ２６８は、ＲＸＲ（ＧＡＬ−Ｌ−ＲＸＲ）およびＦＸＲ−ＲＸＲヘテロ二量体を活性化したが、ＦＸＲ−ＲＸＲｍは、ＲＸＲ特異的リガンドＬＧ２６８に対し、ほとんど反応を示さなかった（図５、左のパネル）。対照的に、胆汁抽出物は、ＦＸＲ−ＲＸＲｍを活性化する能力を保持したが、ＧＡＬ−Ｌ−ＲＸＲｍに対し、ほとんどまたはまったく影響を持たなかった（図５、右のパネル）。ＲＸＲｍを、不全ＡＦ２トランス活性化ドメインを含む、異なるＲＸＲ突然変異体（Ｐｈｅ ４５０→Ａｌａ、Ｓｃｈｕｌｍａｎら， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ．， １６：３８０７−３８１３（１９９６））に置き換えた場合、同様の結果が得られた（データ未提示）。したがって、この種類のアッセイは、ＲＸＲリガンドおよびＦＸＲリガンドによる活性化を特異的に区別することが可能である。これらの特定のデータは、胆汁抽出物がＦＸＲ特異的活性化因子を含むことを示す。
【００４６】
さらなるデータにより、活性化がＦＸＲのＡＦ２トランス活性化ドメインを必要とすることが示された（データ未提示）。さらに、胆汁酸は、期待される動力学で活性化を誘導した（活性化は細胞に対するリガンド添加１時間以内で観察される；データ未提示）。総合すると、本明細書に提供されるデータは、ＦＸＲが内因性胆汁酸センサーであり、ＦＸＲを適切なリガンドで外因的に操作し、ＦＸＲを介した活性化に依存する遺伝子、例えばコレステロール代謝の調節に関与する重要な遺伝子の制御を修飾することが可能であることを立証する。
【００４７】
化学的分画計画を考案し、ＦＸＲに結合しそして活性化する胆汁抽出物中の胆汁構成要素を同定し、そして精製した。最初の工程として、メタノール−水・胆汁酸抽出物を、シリカゲルクロマトグラフィーにより、分画した。簡潔には、抽出物をカラムに適用し、そして続いて、８：１および４：１の比のクロロホルム−メタノールで、その後１００％メタノールで溶出した。５６のフラクションを収集し、プールし、そしてＦＸＲ−ＲＸＲｍを活性化する能力に関し、試験した。活性フラクションをさらに、分離薄層クロマトグラフィー（ＰＴＬＣ）により精製し、そして５つのフラクション（Ａ−Ｅ）に分離した。
【００４８】
これらのフラクション中の成分によるＦＸＲ活性化に関し試験するため、ＣＶ−１細胞を、図６に示される受容体ドメインを宿するプラスミドでトランスフェクションし、そして２５μｇ／ｍｌの５つのＰＴＬＣフラクション各々で処理した。フラクションＢ（ＰＴＬＣ ０．３５＜Ｒｆ＜０．５２）が最も活性であった（ＲＸＲ活性化に比較し、ＦＸＲ−ＲＸＲｍの３０倍高い活性化）。図６を参照されたい。
【００４９】
ＰＴＬＣフラクションＢの活性成分を、Ｃ１８カラム上の逆相ＨＰＬＣにより、さらに精製した。吸光度を２００ ｎｍでモニターした。３つの主なピークが分離された（ピークＸ、ＹおよびＺ；図７）。これらの３つのピークを別個に収集した。残ったフラクションをプールし、第四のフラクション（Ｗ）とした。上述のように、ＦＸＲ−ＲＸＲｍの活性化に関し、４つのフラクションを試験した。簡潔には、ＣＶ−１細胞を、図８に示される受容体ドメインを宿するプラスミドでトランスフェクションし、そして２５μｇ／ｍｌの濃度の各ＨＰＬＣフラクションで処理した。フラクションＷ、ＸおよびＹはほとんどまたはまったく活性を持たなかった（図８）。驚くべきことに、ピークＺは、ＦＸＲ−ＲＸＲｍの劇的な１０２倍の活性化を誘導したが、ＲＸＲにはまったく影響を持たなかった。これらのデータは、ピークＺ中の成分が、強力にＦＸＲを活性化するだけでなく、いかなるＲＸＲ活性化成分も含まなかったことを示す。したがって、ピークＺ中の成分を、構造解析に選択した。
【００５０】
ピークＺ中の成分をメチル化した後、タンデム型ガスクロマトグラフィー−質量分析（ＧＣ−ＭＳ）を行った。ガスクロマトグラムは、ピークＺが１つの優勢なピークを含むことを示し、活性構成要素がほぼ均質に精製されていることを示す。化合物Ｚは、本アッセイにおいて、１４．４１分の保持時間を有し、そして合成ケノデオキシコール酸（ＣＤＣＡ）標準と区別不能であった。ピークＺ成分のマススペクトルもまた、ケノデオキシコール酸（ＣＤＣＡ）標準のものと区別不能であった。本成分の同一性をさらに確認するため、１３Ｃ−ＮＭＲ、１Ｈ−ＮＭＲ、ＤＥＰＴ、ＤＱＦＣＯＳＹおよびＨＭＱＣスペクトル（データ未提示）を得て、そしてＣＤＣＡ標準と同一であることが見出された。本アッセイにおいて、胆汁酸核受容体を活性化するブタ胆汁抽出物中の構成要素は、したがって、ＣＤＣＡと同定された。
【００５１】
既知のＦＸＲ−ＲＸＲ（図９；左のパネル）およびＦＸＲ−ＲＸＲｍ（図９；右のパネル）を活性化する能力に関し、多様な商業的に入手可能な胆汁酸（Ｓｉｇｍａ）を試験した。比較のため、試験リガンドとして、ＲＸＲリガンドＬＧ２６８および幼若ホルモンＩＩＩもまた含んだ。これらのアッセイに関し、ＣＶ−１細胞は、ＣＭＸ−βｇａｌ、ＥｃＲＥ ｘ ６およびＦＸＲ ＋ ＲＸＲ（左のパネル）またはＦＸＲ ＋ ＲＸＲｍ（右のパネル）でトランスフェクションし、そして示される胆汁酸（１００μＭ）、幼若ホルモンＩＩＩ（ＪＨ ＩＩＩ、５０μＭ）またはＬＧ２６８（１００ ｎＭ）で処理した。胆汁酸は、図において、以下のように示される：ＣＡ、コール酸；ＣＤＣＡ、ケノデオキシコール酸；ＤＣＡ、デオキシコール酸；ＬＣＡ；リトコール酸；ＵＤＣＡ、ウルソデオキシコール酸。胆汁酸抽出物の研究から期待されるように、合成ＣＤＣＡは、ＦＸＲの非常に有効な活性化因子であることが立証された（３４６倍の活性化；図９、左のパネル）。ＣＤＣＡは、ＲＸＲα；ＰＰＡＲα、γおよびδ；ＶＤＲ；Ｔ３Ｒβ；ＲＡＲ；ＰＸＲ；ＬＸＲαおよびＣＡＲβを含む、他の受容体を活性化できなかった（データ未提示）。
【００５２】
第二の胆汁酸、ＣＤＡおよびＬＣＡもまた、非常に有効であり、それぞれ、ＦＸＲ−ＲＸＲの２４６および１０６倍の活性化を誘導した。ＦＸＲ−ＲＸＲｍで、定性的に同様の結果が見られ（図９、右のパネル）、これらの胆汁酸がすべて、ＦＸＲサブユニットを通じて作用することが示された。ＣＤＣＡの７β−エピマーであるウルソデオキシコール酸（ＵＤＣＡ、５β−コラン酸−３α，７β−ジオール）は、不活性であったが、７−位でのヒドロキシル基のケトンでの置換は、ＣＤＣＡおよびＵＤＣＡの間の中間の活性をもつ化合物（７−ケトリトコール酸、５β−コラン酸−３α−オール−７−オン）を生じた（図９、１５）。したがって、７位周囲の配置がＦＸＲ活性の重要な決定因子であり、７α−ＯＨ＞＞７−ケト＞＞７β−ＯＨである。７−ケトリトコール酸および３，７−ジケトコール酸（５β−コラン酸−３，７−ジオン）の比較により、３α−ヒドロキシル基に比較し、３−位のケトンが好ましいことが示唆される。６位にヒドロキシル基を持つ、いくつかのジ−およびトリ−ヒドロキシ胆汁酸は不活性であり（ムロコール酸、ヒオコール酸およびα−ムリコール酸）、デヒドロコール酸（５β−コラン酸−３，７，１２−トリオン）も同様であった。総合すると、これらのデータは、３，７−および３，１２−置換胆汁酸は、ＦＸＲの非常に有効な活性化因子であることを示唆する。図１２は、重要な胆汁酸の化学的構造およびＦＸＲ活性化因子としての効能の比較の要約である。
【００５３】
ファルネソイド代謝物は、先にＦＸＲを活性化することが示されている（Ｆｏｒｍａｎら， Ｃｅｌｌ， ８１：６８７−６９３（１９９５））ため、最も活性があるファルネソイド活性化因子の１つ、幼若ホルモンＩＩＩ（ＪＨ ＩＩＩ、５０μＭ）の活性を試験した。本化合物は、活性であるが、最も有効な胆汁酸に比較し、はるかに弱い活性しか持たない（図９）。
【００５４】
ＣＤＣＡおよびＣＡは共に、古典的な経路を介し産生される主な胆汁酸であるが、ＣＤＣＡはＦＸＲの非常に有効な活性化因子であるのに対し、ＣＡは不活性であった。ＣＡおよび結合体化胆汁酸は共に、容易には細胞膜を横断しない、比較的親水性の化合物である。胆汁酸核受容体の活性化が本アッセイでまったく検出されないのは、化合物自体が活性でないためではなく、単に、化合物が十分に高い濃度で細胞に進入できないためである可能性があった。補助なしには細胞膜を横断できない化合物による活性化に関し、有効に試験することが可能である、胆汁酸核受容体活性化に関する第二のアッセイを考案した。
【００５５】
肝臓および回腸は、これらの化合物の有効な取り込みのため、組織特異的胆汁酸輸送タンパク質を発現する（Ｃｒａｄｄｏｃｋら， Ａｍ． Ｊ． Ｐｈｙｓｉｏｌ．， ２７４：Ｇ１５７−１６９（１９９８））。これらの輸送体のいずれも、上記に用いられるＣＶ−１／ＣＯＳ細胞で発現されない。したがって、ＣＶ−１細胞を、ヒト肝臓胆汁酸輸送体（寄託番号Ｌ２１８９３）でコトランスフェクションした。本輸送体を使用することにより、胆汁酸または胆汁酸由来化合物、あるいは親水性性質のため、容易に細胞に進入できないが、胆汁酸との構造的類似性により、輸送体により輸送される化合物の選択を、細胞内胆汁酸核受容体の活性化に関し、試験することが可能になる。腎または回腸組織由来の胆汁酸輸送体もまた、有効に用いることが可能である。いかなる適切な非特異的輸送体もまた、用いてもよい。
【００５６】
親水性胆汁酸による胆汁酸核受容体活性化のアッセイには、ＣＶ−１細胞を、ＣＭＸ−βｇａｌ、ＥｃＲＥ ｘ ６およびＦＸＲ ＋ ＲＸＲ単独（図１０、左のパネル）、およびさらに肝臓胆汁酸輸送体（図１０、右のパネル）でトランスフェクションした。トランスフェクション後、細胞を１００μＭの濃度の示される胆汁酸で処理した。
【００５７】
ＣＡは、胆汁酸輸送体の非存在下で不活性であった（図１０、左のパネル）が、肝臓胆汁酸輸送体の共発現は、ＣＡがＦＸＲの劇的な１７０倍の活性化を示すことを可能にした（図１０、右のパネル）。同様に、ＣＡ、ＣＤＣＡ、ＤＣＡおよびＬＣＡのグリシンおよびタウリン結合体が、第一のアッセイで弱いかまたは不活性であったが、これらのより親水性である胆汁酸は、肝臓胆汁酸輸送体を発現する細胞において、非常に有効であった（図１０、左および右のパネルを比較されたい）。回腸特異的胆汁酸輸送体で同様の結果が見られた（データ未提示）。したがって、本アッセイは、細胞内ＣＡが有効なＦＸＲ活性化因子であり、活性遊離胆汁酸のグリシンおよびタウリン結合体も同様であることを立証することが可能であった。本アッセイを用い、胆汁酸輸送体により輸送される化合物およびされない化合物を両方、試験することが可能である。結果はまた、ＦＸＲおよび胆汁酸輸送体が、重複する特異性を共有することも立証する。
【００５８】
構造−活性研究に加え、いくつかの胆汁酸核受容体リガンドに関し、用量−反応解析を行った。図１１に示されるこれらの解析では、ＣＶ−１細胞を、肝臓胆汁酸輸送体で、上述のようにトランスフェクションし、そして示される多様な濃度の各胆汁酸で処理した。ＣＤＣＡ、ＤＣＡおよびＬＣＡは各々、およそ５０μＭのＥＣ５０を示した。ＦＸＲに対する胆汁酸の構造−活性関係（図９、１０および１２）および用量−反応プロフィール（図１１）は、内因性胆汁酸センサーに関し、報告されたものと同様である（Ｃｈｉａｎｇ， Ｆｒｏｎｔ． Ｂｉｏｓｃｉ， ３：Ｄ１７６−１９３（１９９８）； Ｋａｎｄａら， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｊ．， ３３０：２６１−２６５（１９９８）； Ｔｗｉｓｋら，Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｊ．， ３０５：５０５−５１１； Ｚｈａｎｇら， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２７３：２４２４−２４２８（１９９８））。これは、これらの研究で用いられたモデルが適切であることを立証し、本アッセイにより決定された結果が、ｉｎ ｖｉｖｏの結果とよく相関することを示す。
【００５９】
さらに、胆汁核受容体に関する胆汁酸のＥＣ５０および胆汁酸の生理学的濃度は、緊密に相関する。例えば、ＣＤＣＡおよびＤＣＡの転写効果は、約５０−２５０μＭの濃度で起こる（Ｋａｎｄａら， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｊ．， ３３０： ２６１−２６５（１９９８）； Ｔｗｉｓｋら， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｊ．， ３０５：５０５−５１１（１９９５）； Ｚｈａｎｇら， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２７３：２４２４−２４２８（１９９８））。本濃度は、本研究で発見された胆汁酸核受容体に関するＥＣ５０（５０μＭ）に非常に近く、そして胆汁（ＣＤＣＡ： １０−１５０μＭ； ＤＣＡ： ５μＭ）（Ｍａｔｏｂａら， Ｊ． Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．， ２７：１１５４−１１６２（１９８６））および腸液（ＣＤＣＡ： ５０μＭ； ＤＣＡ： ３２０μＭ ； ＬＣＡ： １２０μＭ）（ＭｃＪｕｎｋｉｎら， Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．， ８０：１４５４−１４６４（１９８１））におけるこれらの化合物の内因性濃度に一致する。胆汁酸核受容体に関するＥＣ５０はまた、肝臓および回腸胆汁酸輸送タンパク質に関し、３−１００μＭの報告されるミカエリス定数（Ｋｍ）にも一致する（Ｂｏｙｅｒら， Ａｍ． Ｊ． Ｐｈｙｓｉｏｌ．， ２６６：Ｇ３８２−Ｇ３８７（１９９４）； Ｗｏｎｇら， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２６９：１３４０−１３４７（１９９４））。実際、胆汁酸核受容体は、胆汁酸輸送体により確立される細胞内濃度で、胆汁酸に有効に反応する。図１０、右のパネルを参照されたい。
【００６０】
上に論じられるように、古典的核受容体は、異種ＤＮＡ結合ドメインにリガンド応答性を与える、モジュラーＬＢＤを含む。胆汁酸核受容体がまた、内因性リガンドの高親和性結合にヘテロ二量体パートナーの相互作用も必要とするか試験するため、ＧＡＬ−Ｌ−ＲＸＲ、ＧＡＬ−Ｌ−ＦＸＲまたはＧＡＬ−Ｌ−ＦＸＲに加えＬ−ＲＸＲを同時発現する細胞において、ＣＤＣＡおよびＬＣＡが受容体を活性化する能力を試験した。期待されるように、ＣＤＣＡおよびＬＣＡは、ＧＡＬ−Ｌ−ＲＸＲキメラを活性化しなかった。図１３を参照されたい。しかし、ＲＸＲ ＬＢＤ（Ｌ−ＲＸＲ）とＧＡＬ−Ｌ−ＦＸＲの同時発現は、ＣＤＣＡおよびＬＣＡ両方に応答性である複合体を生じた（図１３）。１つのＬＢＤのみ（ＲＸＲまたはＦＸＲのいずれか）を発現する細胞は、どちらの胆汁酸によっても活性化されなかった。これらのデータは、胆汁酸応答性がＦＸＲ ＬＢＤにより仲介され、損なわれていないＦＸＲ ＡＦ２トランス活性化ドメインを必要とするだけでなく、受容体活性化が、二量体化パートナーとの関連を必要とすることも明白にする。さらに、時間経過実験により、ＬＣＡおよびＣＤＣＡは、核受容体リガンドに関し、期待される動力学で、ＦＸＲを活性化し、すなわち活性が細胞への添加の１時間以内に観察されることが示された（データ未提示）。
【００６１】
ＣＤＣＡおよびＬＣＡが活性化補助因子補充を誘導する能力を評価するため、ＣＶ−１細胞を、ＣＭＸ−βｇａｌ、ＵＡＳＧ ｘ ４およびＧＡＬ−ＣｏＡ（活性化補助因子ＳＲＣ−１の３つの受容体相互作用ドメインを含むＧＡＬ４融合構築物）でトランスフェクションした。図１４に示される箇所で、細胞はまた、ＲＸＲのリガンド結合ドメイン（Ｌ−ＲＸＲ）および／またはＦＸＲのリガンド結合ドメインに融合しているＶＰ１６トランス活性化ドメイン（ＶＰ−Ｌ−ＦＸＲ）を含む構築物で、コトランスフェクションした。トランスフェクション後、細胞を１００μＭ ＣＤＣＡまたはＬＣＡで処理した。ＣＤＣＡもＬＣＡもいずれも、ＧＡＬ４−活性化補助因子融合タンパク質（ＧＡＬ−ＣｏＡ）およびＦＸＲ ＬＢＤに融合しているＶＰ１６トランス活性化ドメインを含むキメラ（ＶＰ−Ｌ−ＦＸＲ）の間の機能的相互作用を促進することが不可能であった。しかし、ＲＸＲ ＬＢＤの存在下で、胆汁酸は、活性の４−７倍の増加を誘導した（図１４）。
【００６２】
活性化補助因子補充アッセイは、オーファン受容体リガンドの活性を同定し、そして試験する、信頼しうる方法として確立されてきている（Ｂｌｕｍｂｅｒｇら， Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．， １２：１２６９−１２７７（１９９８）； Ｆｏｒｍａｎら， Ｎａｔｕｒｅ， ３９５：６１２−６１５（１９９８）； Ｋｌｉｅｗｅｒら， Ｃｅｌｌ， ９２：７３−８２（１９９８）； Ｋｒｅｙら， Ｍｏｌ． Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．， １１：７７９−７９１（１９９７））。本発明にしたがい、哺乳動物２ハイブリッドｉｎ ｖｉｔｒｏ活性化補助因子補充アッセイを開発し、リガンドが胆汁酸核受容体により制御される遺伝子の転写を修飾する能力の試験として、推定上のリガンドが、ＦＸＲおよび活性化補助因子の間の機能的関連を促進することが可能であるかどうか調べた。
【００６３】
ｉｎ ｖｉｔｒｏ活性化補助因子補充アッセイは、以下の構成要素の混合物にリガンドを添加することにより、行った：胆汁酸核受容体、９−シスレチノイン酸受容体、活性化補助因子、標識胆汁酸核受容体応答配列（プローブ）。活性化補助因子ＧＲＩＰ１の受容体相互作用ドメインを含むポリアミノ酸を、活性化補助因子として用いてもよい。いかなる機能する活性化補助因子または活性化補助因子複合体も、本アッセイで使用するため意図される。これらのアッセイのため、ＧＲＩＰ１を細菌で発現させ、そして精製した。グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼに融合しているマウスＧＲＩＰ１の３つの受容体相互作用ドメイン（Ａｒｇ ６２５−Ｌｙｓ ７６５、寄託番号Ｕ３９０６０）を含む、ＧＳＴ−ＧＲＩＰ１構築物を、ＧＲＩＰ１活性化補助因子の細菌発現のため、生成した。他の適切な活性化補助因子、例えばＰＢＤ／ＤＲＩＰ ２０５／ＴＲＡＰ ２２０が当業に知られ、そして本明細書に開示される本発明の方法に用いてもよい。本アッセイに使用するのに適した応答配列は、胆汁酸核受容体の標的ＤＮＡ配列に実質的に相同である、いかなる核酸プローブであってもよい。
【００６４】
アッセイ系に適合したいかなる応答配列を用いてもよい。核受容体が結合するＤＮＡ結合領域に実質的に相同なオリゴヌクレオチド配列が、本発明の方法で使用するのに意図される。実質的に相同な配列（プローブ）は、アッセイ条件下で、リガンド活性化受容体に結合する配列である。応答配列を当業に知られる方法により修飾し、核受容体に対する応答配列の結合を増加させまたは減少させてもよい。
【００６５】
本明細書に例示される特定のアッセイでは、以下の応答配列を用いた： ｈｓｐ２７ ＥｃＲＥ ｘ ６ （Ｙａｏら， Ｎａｔｕｒｅ， ３６６：４７６−４７９（１９９３））、 ＵＡＳＧ ｘ ４、ＰＰＲＥ ｘ ３（Ｆｏｒｍａｎら， Ｃｅｌｌ， ８１：６８７−６９３（１９９５））、βＲＥ２ ｘ ３（Ｆｏｒｍａｎら， Ｎａｔｕｒｅ， ３９５：６１２−６１５（１９９８））、ＬＸＲＥ ｘ ３（Ｗｉｌｌｙら， Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．， ９：１０３３−１０４５（１９９５））、Ｔ３ＲＥ（ＭＬＶ） ｘ ３（Ｐｅｒｌｍａｎｎら， Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．， ７：１４１１−１４２２（１９９３））、ＳＦ１ ｘ ４ （５’−ＡＧＣＴＴＡＧＣＣＡ ＡＧＧＴＣＡＧＡＧＡ ＡＧＣＴＴ；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３）およびＤＲ０ ｘ ２（５’−ＡＡＧＣＴＴＣＡＧＧ ＴＣＡＡＧＧＴＣＡＧ ＡＧＡＧＣＴＴ；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４）。
【００６６】
推定上のリガンドを、上述の構成要素の混合物に添加し、そして混合した後、混合物を条件下でインキュベーションする。混合物中の複合体の形成は、図１５に示されるように、電気泳動移動度シフトにより解析したが、標識複合体を混合物中の他の構成要素から分離するのに十分である限り、混合物中に形成された複合体を、個々の構成要素から分離するいかなる方法を用いてもよい。例えば、薄層クロマトグラフィー、高圧液体クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、沈降、免疫分離技術、または当業に知られるいかなる他の好都合な方法などの技術を用いてもよい。
【００６７】
期待されるように、ＦＸＲ−ＲＸＲヘテロ二量体は、リガンドの非存在下で活性化補助因子を補充できなかった（図１５、レーン１）。図１５に提供されるデータで重要であるが、ＬＣＡの添加は、ヘテロ二量体の大部分を、活性化補助因子ＧＲＩＰ１を伴う複合体へとシフトさせた（レーン２）。グリコ−ＩＣＡ（レーン３）、およびＬＧ２６８（レーン４）で同様の結果が見られた。ＦＸＲおよびＲＸＲサブユニットを通じた結合の区別をするため、ＲＸＲに関しＲＸＲｍで置換し、活性化補助因子補充アッセイを繰り返した。図１５、レーン５−８を参照されたい。重要なことに、ＬＣＡ（レーン６）およびグリコ−ＬＣＡ（レーン７）は共に、活性化補助因子を補充したが、ＬＧ２６８は不活性であった（レーン８）。これらのｉｎ ｖｉｔｒｏ結果は、ＬＣＡおよびそのグリシン結合体が、ＦＸＲ特異的リガンドであることを立証する。
【００６８】
ＬＣＡおよびグリコ−ＬＣＡは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ活性化補助因子補充アッセイで活性であったが、リガンド結合活性の標準的プローブである、ＣＡ、ＣＤＣＡおよびＤＣＡを含む他の活性胆汁酸は、ＧＲＩＰ１または関連活性化補助因子ＳＲＣ−１およびＡＣＴＲを補充するのにより有効でなかった（データ未提示）。これらの共有される構造、活性および活性化動力学に基づき、ＣＡ、ＣＤＣＡおよびＤＣＡはすべて、ＦＸＲリガンドであるが、最近記載されてきている多くの他の核酸受容体活性化補助因子の１つもまた利用する可能性もある。例えば、Ｂｌｃａｎｃｏら， Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ． １２：１６３８−１６５１（１９９８）； Ｆｏｎｄｅｌｌら， ＰＮＡＳ ＵＳＡ ９６：１９５９−１９６４（１９９９）を参照されたい。
【００６９】
活性化補助因子補充アッセイは、胆汁酸核受容体標的遺伝子を制御する、ＤＮＡの応答配列と機能する結合関係を形成することが可能である化合物を有効に検出した。胆汁酸は、Ｃｙｐ７ａおよびステロール２７−水酸化酵素を含む、いくつかの遺伝子の転写を阻害することが可能である（Ｃｈｉａｎｇ， Ｆｒｏｎｔ． Ｂｉｏｓｃｉ ３：Ｄ１７６−１９３（１９９８））。胆汁酸最終産物により阻害されるのに加え、Ｃｙｐ７ａ転写は、その基質、コレステロールの集積により刺激される。コレステロールに対するこの反応は、オキシステロール受容体、ＬＸＲαにより仲介される（Ｐｅｅｔら， Ｃｅｌｌ ９３：６９３−７０４（１９９８））。したがって、Ｃｙｐ７ａ経路を通じた胆汁酸に対するコレステロール異化作用の調節は、以下の図式に例示されるように、コレステロールにより正のフィードバックに、そして胆汁酸により負のフィードバックにさらされる：
【００７０】
【化１】
2004510682.tif 000003
【００７１】
胆汁酸核受容体の場合のように、ＬＸＲαは、絶対（ｏｂｌｉｇａｔｅ）二量体化パートナーとしてＲＸＲを利用する。ＬＸＲα−ＲＸＲヘテロ二量体は恒常的に活性であり（Ａｐｆｅｌら， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． １４：７０２５−７０３５（１９９４）； Ｆｏｒｍａｎら， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９４：１０５８８−１０５９３（１９９７）； Ｗｉｌｌｙら， Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ． ９： １０３３−１０４５ （１９９５））、これはおそらく内因性ＬＸＲリガンドが存在するためであるが、これらは単独では不活性である。
【００７２】
ＦＸＲおよびＬＸＲαはいくつかの組織（肝臓、腸および腎臓）で同時発現される。したがって、胆汁酸がＬＸＲαによる転写調節に影響を有するかどうか決定するため、一連のアッセイを行った。やはり肝臓でＣｙｐ７ａ転写物を上方制御する甲状腺ホルモン受容体（Ｔ３Ｒ）を用いて、同様の実験を行った（Ｃｒｅｓｔａｎｉら， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ． １９８：５４６−５５３（１９９４）を参照されたい）。ＬＸＲＥ ｘ ３−ＴＫ−Ｌｕｃを用いた受容体活性化アッセイでは、ＬＸＲαおよびＲＸＲは、単独ではほとんど活性を示さなかったが、共に発現させると、恒常的にＬＸＲ受容体を活性化した（データ未提示）。ＲＸＲの同時発現は、Ｔ３応答性に対し、わずかな影響しか持たず、これはＲＸＲの内因レベルが、ＬＸＲαおよびＦＸＲと異なり、Ｔ３Ｒの機能を支持するのに十分であることを示す。
【００７３】
胆汁酸受容体を占有するリガンドがＬＸＲαを阻害するかどうか決定するため、ＣＶ−１細胞をＣＭＸ−βｇａｌ、ＬＸＲＥ ｘ ３および図１６、左のパネルに示される受容体を含む発現ベクターでトランスフェクションした。アッセイは、ＦＸＲ発現ベクターの存在下または非存在下で行った。細胞は、０μＭまたは１００μＭ濃度のＬＣＡまたはＣＤＣＡで処理した。図中の倍抑制は、これらの胆汁酸核受容体リガンドによる、ＬＸＲの恒常的活性の阻害を表す。図１６の右のパネルは、ＬＸＲＥ ｘ ３に関し、Ｔ３Ｒを置換し、上記のようにトランスフェクションした細胞を示す。これらのアッセイでは、１００ ｎＭのＴ３で、単独で、あるいは１００μＭ ＬＣＡまたはＣＤＣＡの存在下で細胞を処理した。右のパネルの倍抑制は、Ｔ３−刺激活性の阻害を表す。
【００７４】
胆汁酸核受容体の非存在下では、胆汁酸はＬＸＲα活性にほとんど影響を持たない。しかし、その存在下では、ＬＣＡおよびＣＤＣＡは、ＬＸＲα活性の劇的な４−８倍の抑制を引き起こす。図１６を参照されたい。本阻害は、ＬＸＲリガンドの添加により、緩和された（データ未提示）。胆汁酸依存抑制は、Ｔ３応答性にまったく影響を持たず、そしてＬＸＲαに特異的であった。このように、ＬＸＲαおよびＦＸＲは、反対の代謝機能を持ち、ＦＸＲは、生理学的に適切な胆汁酸に反応し、ＬＸＲαを阻害する胆汁酸センサーとして作用する。ＬＸＲαは、Ｃｙｐ７ａ転写の正の制御因子であるため、ＬＸＲαおよびＦＸＲ情報伝達の間の本分子連結は、胆汁酸がＬＸＲα依存遺伝子を負に制御する機構を提供する。本明細書に記載されるアッセイは、したがって、これらの遺伝子の転写を修飾することが可能な化合物を選択するのにもまた、有用である。
【００７５】
本発明は、胆汁酸核受容体（ＦＸＲ）を発現する細胞に、胆汁酸核受容体リガンドを投与することを含む、胆汁酸核受容体標的遺伝子転写を調節する方法を提供する。外因性胆汁酸核受容体リガンドを用い、Ｃｙｐ７ａ転写あるいはＦＸＲまたはＬＸＲαにより制御されるいかなる遺伝子の転写の制御も修飾してもよい。胆汁酸応答性遺伝子の修飾は続いて、コレステロール異化作用の修飾を生じる。胆汁酸核受容体を受容体結合アンタゴニストで操作することは、したがって、高コレステロール血症の治療法を提供する。こうしたアンタゴニストは、天然胆汁酸の誘導体、合成または半合成分子であってもよい。ＦＸＲ受容体におけるアゴニストまたはアンタゴニストとして作用する可能性があり、そしてしたがって、コレステロール代謝の調節のため、療法的にまたは予防的に用いることが可能である、推定上のＦＸＲリガンドをスクリーニングするのに、本発明の方法を用いてもよい。本発明はまた、こうした方法により産生される化合物も提供する。
【００７６】
上に記載されそして以下に例示されるアッセイは、胆汁酸核受容体により制御される遺伝子の転写を調節する化合物を選択する方法を提供する。本発明はさらに、以下の実施例に記載されそして例示されるが、実施例は、限定することを意図しない。
【００７７】
【実施例】
実施例１． ＦＸＲ活性に関する一過的トランスフェクションアッセイ
ＣＶ−１細胞を、１０％ 樹脂木炭除去ウシ胎児血清、５０ Ｕ／ｍｌペニシリンＧおよび５０μｇ／ｍｌストレプトマイシン硫酸を補ったダルベッコの修飾イーグル培地（ＤＭＥＭ−ＦＢＳ）中で、５％ＣＯ２中、３７℃で増殖させた。トランスフェクション１日前、フェノールレッド不含ＤＭＥＭ−ＦＢＳを用い、細胞を５０−８０％コンフルエントに蒔いた。細胞は、記載されるように（Ｆｏｒｍａｎら， Ｃｅｌｌ， ８１：６８７−６９３（１９９５））、リポフェクションにより、一過的にトランスフェクションした。エクジソン応答配列（ＥｃＲＥ ｘ ６）に連結しているヘルペスウイルスチミジンキナーゼプロモーター（−１０５／＋５１）を含むルシフェラーゼレポーター構築物（３００ ｎｇ／１０５細胞）およびサイトメガロウイルス駆動発現ベクター（２０−５０ ｎｇ／１０５細胞）を、内部コントロールとしてのＣＭＸ−β−ｇａｌと共に添加した。哺乳動物発現ベクターは、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの転写のため、サイトメガロウイルスプロモーター／エンハンサーに続き、バクテリオファージＴ７プロモーターを含むｐＣＭＸ由来であった。２つのアッセイを平行して行い、１つはＣＭＸ−β−ｇａｌ、ＥｃＲＥ ｘ ６、ＦＸＲおよびＲＸＲを含む発現ベクターでトランスフェクションした細胞を用い、そして１つはＣＭＸ−β−ｇａｌ、ＥｃＲＥ ｘ ６、ＦＸＲおよびＲＸＲｍを含む発現ベクターでトランスフェクションした細胞を用いた。リポソームと共に２時間インキュベーションした後、リポソームを除去し、そして１００μＭ ＣＤＣＡを含むフェノールレッド不含ＤＭＥＭ−ＦＢＳで、細胞をおよそ４５時間、処理した。リガンドに曝露した後、細胞を採取し、そして既知の方法にしたがい、ルシフェラーゼおよびβ−ガラクトシダーゼ活性に関し、アッセイした。すべての点は３つ組でアッセイし、そして１５％未満の変動であった。各実験は３回またはそれ以上繰り返し、同様の結果を得た。
【００７８】
実施例２． 親水性化合物に適したＦＸＲ活性に関する一過的トランスフェクションアッセイ
細胞を、ヒト肝臓胆汁酸輸送体のｐｃＤＮＡ発現ベクターでもコトランスフェクションしたことを除き、実施例１におけるアッセイを行った。
【００７９】
実施例３． 胆汁酸核受容体標的遺伝子の転写を調節する化合物に関するスクリーニングアッセイ
ＣＶ−１細胞を、１０％ 樹脂木炭除去ウシ胎児血清、５０ Ｕ／ｍｌ ペニシリンＧおよび５０μｇ／ｍｌ ストレプトマイシン硫酸を補ったダルベッコの修飾イーグル培地（ＤＭＥＭ−ＦＢＳ）中で、５％ ＣＯ２中、３７℃で増殖させる。トランスフェクション１日前、フェノールレッド不含ＤＭＥＭ−ＦＢＳを用い、細胞を５０−８０％コンフルエントに蒔く。細胞は、製造者（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）の指示にしたがい、Ｎ−［１−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−アンモニウムメチルサルフェートを用い、リポフェクションによりトランスフェクションする。
【００８０】
ＣＶ−１細胞は、ＣＭＸ−βｇａｌ、ＲＸＲのリガンド結合ドメイン（Ｌ−ＲＸＲ）およびＦＸＲのリガンド結合ドメイン（Ｌ−ＦＸＲ）を含む構築物、並びに示されるコピー数の応答配列ｈｓｐ２７ ＥｃＲＥ ｘ ６に連結しているヘルペスウイルスチミジンキナーゼプロモーター（−１０５／＋５１）を含むルシフェラーゼレポーター構築物でトランスフェクションする。ＲＸＲ（寄託番号Ｘ５２７７３）のリガンド結合ドメインをＲＸＲｍのリガンド結合ドメインに置き換えた、平行アッセイを行う。トランスフェクション後、フェノールレッド不含ＤＭＥＭ−ＦＢＳ中、多様な濃度の候補胆汁酸受容体アゴニストまたはアンタゴニスト化合物で、細胞をおよそ４５時間、処理する。化合物に曝露した後、細胞を採取し、そしてルシフェラーゼおよびβ−ガラクトシダーゼ活性に関し、アッセイする。
【００８１】
実施例４． 胆汁酸核受容体標的遺伝子の転写を調節する化合物に関するスクリーニングアッセイ
細胞を、ヒト肝臓胆汁酸輸送体のｐｃＤＮＡ発現ベクターでもコトランスフェクションしたことを除き、実施例３にしたがったアッセイを行う。
【００８２】
実施例５． 胆汁酸核受容体標的遺伝子の転写を調節する化合物に関するスクリーニングアッセイ
ＲＸＲｍを含む発現構築物を用いた平行アッセイを省略することを除き、実施例３にしたがったスクリーニングアッセイを行う。
【００８３】
実施例６． 活性化補助因子補充アッセイ
大腸菌でＧＳＴ−ＧＲＩＰ１を発現させ、そしてグルタチオン−セファロースカラム上で精製した。ｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳ＦＸＲ ＋ ＲＸＲ（図１５、左のパネル）またはＦＸＲ ＋ ＲＸＲｍ（図１５、右のパネル）およびＧＳＴ−ＧＲＩＰ１（５μｇ）を、１００，０００ ｃｐｍのクレノウ標識ｈｓｐ２７ ＥｃＲＥプローブ（５’−ＡＧＣＴＣＧＡＴＧＧＡＣＡＡＧＴＧＣＡＴＴＧＡＡＣＣＣＴＴＧＡＡＧＣＴＴ；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ５）と共に、１０ ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ ８、５０ ｍＭ ＫＣｌ、６％ グリセロール、０．０５％ ＮＰ−４０、１ ｍＭ ＤＴＴ、１２．５ ｎｇ／μｌ ポリｄＩ・ｄＣおよび活性化補助因子補充に関し試験しようとするリガンド中で、室温で３０分間インキュベーションした。０．５×ＴＢＥ（４５ ｍＭ Ｔｒｉｓ−塩基、４５ ｍＭ ホウ酸、１ ｍＭ ＥＤＴＡ）中の５％ ポリアクリルアミドゲルを通じ、複合体を室温で電気泳動した。電気泳動移動度は活性化補助因子の補充を示す。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、胆汁抽出物を用いた、ＦＸＲ−ＲＸＲヘテロ二量体およびいくつかの他のオーファン受容体の活性化アッセイからのデータを提供する。各々、当業に知られ、そしてＧｅｎｂａｎｋ寄託番号により、本明細書に同定される受容体は、ＣＡＲβ、ＰＰＡＲα、ＰＰＡＲδ、ＴＲ２−１１、ＬＸＲα、ＧＣＮＦ、ＳＦ１、ＲＯＲα、Ｎｕｒｒ１、ＤＡＸ、およびＥＲＲ２である。
【図２】図２は、合成特異的ＲＸＲリガンドＬＧ２６８による、野生型ＲＸＲリガンド結合ドメインまたは突然変異ＲＸＲ（ＲＸＲｍ）リガンド結合ドメインに融合した酵母ＧＡＬ４ ＤＮＡ結合ドメインを含むキメラ受容体の活性化を比較するデータを提供する。
【図３】図３は、増加する濃度のＲＸＲリガンド、ＬＧ２６８での、野生型ＲＸＲ（ＲＸＲ−ＣｏＡ）または突然変異ＲＸＲ（ＲＸＲｍ−ＣｏＡ）を用いた受容体−活性化補助因子複合体の形成を示す、電気泳動移動度実験の結果を示すオートラジオグラムである。
【図４】図４は、図３に示される結果に関する定量的データを提供する。
【図５】図５は、ＲＸＲリガンドＬＧ２６８および胆汁抽出物によるＲＸＲおよびＦＸＲヘテロ二量体の活性化を比較するデータを提供する。
【図６】図６は、胆汁抽出物の分離薄層クロマトグラフィーから得たフラクションのＦＸＲ、ＲＸＲおよびＲＸＲｍ活性化データを示す。
【図７】図７は、図６由来のフラクションＢの逆相ＨＰＬＣ吸光度追跡を示す。
【図８】図８は、図７由来のＨＰＬＣピークＺがＦＸＲ−ＲＸＲｍを強力に活性化したが、ＲＸＲに対し、まったく影響を持たなかったことを示すデータを提供する。
【図９】図９は、いくつかの異なる遊離胆汁酸によるＦＸＲ活性化レベルを示す。幼若ホルモンＩＩＩおよびＲＸＲリガンドＬＧ２６８をコントロールとして含んだ。ＵＤＣＡはウルソデオキシコール酸（５β−コラン酸−３α，７β−ジオール）を示す。
【図１０】図１０は、肝臓胆汁酸輸送体の存在下または非存在下の、グリシンまたはタウリンいずれかと結合していないまたは結合した、ＣＡ、ＣＤＣＡ、ＤＣＡおよびＬＣＡによるＦＸＲ活性化のレベルを示す。
【図１１】図１１は、ＣＤＣＡ、ＤＣＡおよびＬＣＡに関するＦＸＲ活性化用量−反応データを提供する。各化合物に関するＥＣ５０は、およそ５０μＭであった。
【図１２】図１２は、先の図に提供されるデータから得られた構造−活性情報を要約する。＋＋は、ＦＸＲ−ＲＸＲヘテロ二量体の＞２００倍の活性化を示し、そして＋は１００−１５０倍の活性化を示す。
【図１３】図１３は、ＣＤＣＡおよびＬＣＡが共に、ＧＡＬ−Ｌ−ＦＸＲキメラおよびＲＸＲ ＬＢＤ（Ｌ−ＲＸＲ）を同時発現する細胞において転写を活性化することを示すデータを提供する。
【図１４】図１４は、哺乳動物２ハイブリッドアッセイにおいて、ＲＸＲおよびＦＸＲ ＬＢＤの両方の存在に依存する、ＧＡＬ−４活性化補助因子融合タンパク質（ＧＡＬ−ＣｏＡ）の補充後の活性化を示すデータを示す。
【図１５】図１５は、ＦＸＲおよびＲＸＲまたはＦＸＲおよびＲＸＲｍの存在下で、異なるリガンドによる活性化補助因子補充を示す電気泳動移動度データを示す。
【図１６】図１６は、ＦＸＲの存在下での、ＬＸＲ、ＲＸＲまたは両方によるＬＸＲレポーター遺伝子の活性化（左のパネル）、並びにＦＸＲおよび添加リガンドの存在下での、Ｔ３Ｒβ、ＲＸＲまたは両方によるＴ３Ｒ（トリヨードチロニン受容体）の活性化（右のパネル）を示す。
【図１】
2004510682.tif 000004
【図２】
2004510682.tif 000005
【図３】
2004510682.tif 000006
【図４】
2004510682.tif 000007
【図５】
2004510682.tif 000008
【図６】
2004510682.tif 000009
【図７】
2004510682.tif 000010
【図８】
2004510682.tif 000011
【図９】
2004510682.tif 000012
【図１０】
2004510682.tif 000013
【図１１】
2004510682.tif 000014
【図１２】
2004510682.tif 000015
【図１３】
2004510682.tif 000016
【図１４】
2004510682.tif 000017
【図１５】
2004510682.tif 000018
【図１６】
2004510682.tif 000019
【国際公開パンフレット】
2004510682.tif 000020
2004510682.tif 000021
2004510682.tif 000022
2004510682.tif 000023
2004510682.tif 000024
2004510682.tif 000025
2004510682.tif 000026
2004510682.tif 000027
2004510682.tif 000028
2004510682.tif 000029
2004510682.tif 000030
2004510682.tif 000031
2004510682.tif 000032
2004510682.tif 000033
2004510682.tif 000034
2004510682.tif 000035
2004510682.tif 000036
2004510682.tif 000037
2004510682.tif 000038
2004510682.tif 000039
2004510682.tif 000040
2004510682.tif 000041
2004510682.tif 000042
2004510682.tif 000043
2004510682.tif 000044
2004510682.tif 000045
2004510682.tif 000046
2004510682.tif 000047
2004510682.tif 000048
2004510682.tif 000049
2004510682.tif 000050
2004510682.tif 000051
2004510682.tif 000052
2004510682.tif 000053
2004510682.tif 000054
2004510682.tif 000055
2004510682.tif 000056
2004510682.tif 000057
2004510682.tif 000058
2004510682.tif 000059
2004510682.tif 000060
2004510682.tif 000061
2004510682.tif 000062
2004510682.tif 000063
2004510682.tif 000064
2004510682.tif 000065
2004510682.tif 000066
2004510682.tif 000067
2004510682.tif 000068
2004510682.tif 000069
2004510682.tif 000070
2004510682.tif 000071
2004510682.tif 000072
2004510682.tif 000073
2004510682.tif 000074
2004510682.tif 000075
2004510682.tif 000076
2004510682.tif 000077
2004510682.tif 000078
2004510682.tif 000079
2004510682.tif 000080
2004510682.tif 000081
2004510682.tif 000082
2004510682.tif 000083
2004510682.tif 000084
【国際調査報告】
2004510682.tif 000085
2004510682.tif 000086
2004510682.tif 000087
2004510682.tif 000088
2004510682.tif 000089