(57)【要約】本発明はヒトの神経伝達関連タンパク質(NTRAN)、およびNTRANを同定しコードするポリヌクレオチドを提供する。本発明はまた、発現ベクター、宿主細胞、抗体、アゴニストおよびアンタゴニストをも提供する。本発明はまた、NTRANの異常発現に関連する疾患を診断、治療または予防する方法をも提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）乃至（e）からなる群から選択した単離されたポリペプチド。
（ａ） SEQ ID NO:1-8（配列番号１乃至8）からなる群から選択したアミノ酸配列を含むポリペプチド
（ｂ） SEQ ID NO：1-5およびSEQ ID NO:7-8からなる群から選択した或るアミノ酸配列と少なくとも９０％が同一であるような天然アミノ酸配列を含むポリペプチド
（ｃ）   （ｂ）SEQ ID NO:6のアミノ酸配列に対して少なくとも９２％が同一であるような天然アミノ酸配列を含むポリペプチド
（ｄ） SEQ ID NO：1-8からなる群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドの生物学的活性断片
（ｅ） SEQ ID NO:1-8からなる群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドの免疫原性断片
【請求項２】
SEQ ID NO:1-8からなる群から選択したアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項３】
請求項1のポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド。
【請求項４】
請求項２のポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド。
【請求項５】
SEQ ID NO:9-16からなる群から選択したポリヌクレオチド配列を含む、請求項４に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項６】
請求項３に記載のポリヌクレオチドに機能的に連結したプロモーター配列を含む組換えポリヌクレオチド。
【請求項７】
請求項６に記載の組換えポリヌクレオチドを用いて形質転換した細胞。
【請求項８】
請求項６に記載の組換えポリヌクレオチドを含む遺伝形質転換体。
【請求項９】
請求項１のポリペプチドを生産する方法であって、
（ａ） 前記ポリペプチドの発現に好適な条件下で、請求項１のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに機能的に連結したプロモーター配列を含む組換えポリヌクレオチドで形質転換される細胞を培養する過程と、
（ｂ） そのように発現した前記ポリペプチドを回収する過程とからなり、前記組換えポリヌクレオチドが、請求項１に記載の前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに機能的に連結したプロモーター配列を含むことを特徴とする方法。
【請求項１０】
前記ポリペプチドが、SEQ ID NO:1-8からなる群から選択した或るアミノ酸配列を持つことを特徴とする、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
請求項１に記載のポリペプチドと特異結合するような単離された抗体。
【請求項１２】
以下の（ａ）乃至（e）からなる群から選択した単離されたポリヌクレオチド。
（ａ） SEQ ID NO：9-16からなる群から選択したポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド
（ｂ） SEQ ID NO:9-16からなる群から選択したポリヌクレオチド配列と少なくとも９０％が同一であるような天然のポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド
（ｃ） （ａ）のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド
（ｄ） （ｂ）のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド
（ｅ） （ａ）〜（ｄ）のRNA等価物
【請求項１３】
請求項12に記載のポリヌクレオチドの少なくとも６０の連続したヌクレオチドを含む単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１４】
請求項12に記載のポリヌクレオチドの配列を有する標的ポリヌクレオチドをサンプル中から検出する方法であって、
（ａ） 前記サンプル中の前記標的ポリヌクレオチドに相補的な配列を持つ少なくとも２０の連続したヌクレオチドを持つプローブを用いて前記サンプルをハイブリダイズする過程と、
（ｂ） 前記ハイブリダイゼーション複合体の存在・不存在を検出し、該複合体が存在する場合にはオプションでその量を検出する過程、とを含み、前記プローブと前記標的ポリヌクレオチドあるいはその断片との間でハイブリダイゼーション複合体が形成される条件下で、プローブが前記標的ポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズすることを特徴とする方法。
【請求項１５】
前記プローブが少なくとも６０の連続したヌクレオチドを含むことを特徴とする請求項14に記載の方法。
【請求項１６】
請求項12に記載のポリヌクレオチドの配列を有する標的ポリヌクレオチドをサンプル中から検出する方法であって、
（ａ） ポリメラーゼ連鎖反応増幅を用いて前記標的ポリヌクレオチドまたはその断片を増幅する過程と、
（ｂ） 前記の増幅した標的ポリヌクレオチドまたはその断片の存在・不存在を検出し、該標的ポリヌクレオチドまたはその断片が存在する場合にはオプションでその量を検出する過程を含むことを特徴とする方法。
【請求項１７】
請求項１のポリペプチドと、薬剤として許容できる賦形剤とを含むことを特徴とする組成物。
【請求項１８】
前記ポリペプチドが、SEQ ID NO:1-8からなる群から選択したアミノ酸配列を含むことを特徴とする請求項17の組成物。
【請求項１９】
機能的なNTRANの発現の低下に関連する疾患や病態の治療方法であって、そのような治療が必要な患者に請求項17の組成物を投与することを含むことを特徴とする治療方法。
【請求項２０】
請求項１に記載のポリペプチドのアゴニストとして有効性を確認するために化合物をスクリーニングする方法であって、
（ａ） 請求項１のポリペプチドを含むサンプルを化合物に曝すステップと、
（ｂ） 前記サンプルにおいてアゴニスト活性を検出するステップとを含むことを特徴とするスクリーニング方法。
【請求項２１】
請求項20に記載の方法によって同定したアゴニスト化合物と、薬剤として許容できる賦形剤とを含むことを特徴とする組成物。
【請求項２２】
機能的NTRANの発現の低下に関連する疾患や病態の治療方法であって、そのような治療が必要な患者に請求項21の組成物を投与することを含むことを特徴とする治療方法。
【請求項２３】
請求項１に記載のポリペプチドのアンタゴニストとして有効性を確認するために化合物をスクリーニングする方法であって、
（ａ） 請求項１のポリペプチドを含むサンプルを化合物に曝すステップと、
（ｂ） 前記サンプルにおいてアンタゴニスト活性を検出するステップとを含むことを特徴とするスクリーニング方法。
【請求項２４】
請求項２３に記載の方法によって同定したアンタゴニスト化合物と、薬剤として許容できる賦形剤とを含むことを特徴とする組成物。
【請求項２５】
機能的なNTRANの過剰な発現に関連する疾患や病態の治療方法であって、そのような治療が必要な患者に請求項24の組成物を投与することを含むことを特徴とする治療方法。
【請求項２６】
請求項１に記載のポリペプチドに特異結合する化合物をスクリーニングする方法であって、
（ａ） 請求項１のポリペプチドを適切な条件下で少なくとも１つの試験化合物と混合する過程と、
（ｂ） 請求項１のポリペプチドの試験化合物との結合を検出し、それによって請求項１のポリペプチドに特異結合する化合物を同定する過程を含む方法。
【請求項２７】
請求項１に記載のポリペプチドの活性を調節する化合物をスクリーニングする方法であって、
（ａ） 請求項１のポリペプチドの活性が許容される条件下で、請求項１のポリペプチドを少なくとも１つの試験化合物と混合する過程と、
（ｂ） 請求項１に記載のポリペプチドの活性を試験化合物の存在下で算定する過程と、
（ｃ） 試験化合物の存在下での請求項１のポリペプチドの活性を、試験化合物の不存在下での請求項１のポリペプチドの活性と比較する過程を含み、試験化合物の存在下での請求項１のポリペプチドの活性の変化が、請求項１のポリペプチドの活性を調節する化合物を標示するような方法。
【請求項２８】
請求項５の配列を含む標的ポリヌクレオチドの発現を変容させるのに効果的な化合物をスクリーニングする方法であって、
（ａ） 前記標的ポリヌクレオチドの発現に好適な条件下で、該標的ポリヌクレオチドを含むサンプルを化合物に曝露する過程と、
（ｂ） 前記標的ポリヌクレオチドの発現改変を検出する過程と、
（ｃ） 可変量の前記化合物の存在下と前記化合物の不存在下で、前記標的ポリヌクレオチドの発現を比較する過程とを含むことを特徴とする方法。
【請求項２９】
試験化合物の毒性を算定する方法であって、
（ａ） 核酸を含む生物学的サンプルを前記試験化合物で処理する過程と、
（ｂ） 処理した前記生物学的サンプルの核酸と、請求項１２のポリヌクレオチドの少なくとも２０の連続するヌクレオチドを持つプローブをハイブリダイズさせる過程であって、このハイブリダイゼーションゼーションが、前記プローブと前記生物学的サンプル中の標的ポリヌクレオチドとの間で特異的なハイブリダイゼーション複合体が形成される条件下で行われ、前記標的ポリヌクレオチドが、請求項１２のポリヌクレオチドまたはその断片のポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドである、前記過程と、
（ｃ） ハイブリダイゼーション複合体の収量を定量する過程と、
（ｄ） 前記処理された生物学的サンプル中のハイブリタイゼーション複合体の量を、処理されていない生物学的サンプル中のハイブリタイゼーション複合体の量と比較する過程とを含み、前記処理された生物学的サンプル中のハイブリタイゼーション複合体の量の差が、前記試験化合物の毒性を標示するような方法。
【請求項３０】
生物学的サンプル中のNTRANの発現に関連する症状または疾患に対する診断試験法であって、
（ａ） 前記生物学的サンプルと請求項11の抗体との混合を、前記抗体が前記ポリペプチドに結合し、抗体とポリペプチドとの複合体を形成するのに適した条件下で行う過程と、
（ｂ） 前記複合体を検出する過程とを含み、前記複合体の存在が、前記生物学的サンプル中の前記ポリペプチドの存在と相関することを特徴とする方法。
【請求項３１】
前記抗体が、
（ａ） キメラ抗体
（ｂ） 単鎖抗体
（ｃ） Fab断片
（ｄ） F（ab'）2 断片
（ｅ） またはヒト化抗体である抗体。
【請求項３２】
請求項１１に記載の抗体と、許容できる賦形剤とを含む組成物。
【請求項３３】
被検者でのNTRANの発現に関連する病状又は疾患の診断方法であって、請求項３２に記載の組成物の有効量を前記被検者に投与する過程を含むことを特徴とする方法。
【請求項３４】
前記抗体が標識されることを特徴とする請求項３２に記載の組成物。
【請求項３５】
被検者でのNTRANの発現に関連する病状又は疾患の診断方法であって、請求項３４に記載の組成物の有効量を前記被検者に投与する過程を含むことを特徴とする方法。
【請求項３６】
請求項11に記載の抗体の特異性を有するポリクローナル抗体を調製する方法であって、
（ａ） 抗体反応を誘発する条件下で、SEQ ID NO:1-8からなる群から選択したアミノ酸配列またはその免疫原性断片を含むポリペプチドを用いて動物を免疫化する過程と、
（ｂ） 前記動物から抗体を単離する過程と、
（ｃ） 前記単離された抗体を前記ポリペプチドでスクリーニングし、それによって、SEQ ID NO：1-8からなる群から選択したアミノ酸配列を含むポリペプチドに特異結合するポリクローナル抗体を同定する過程とを含むような方法。
【請求項３７】
請求項36に記載の方法で産出したポリクローナル抗体。
【請求項３８】
請求項37に記載のポリクローナル抗体及び適切なキャリアーを含む組成物。
【請求項３９】
請求項１１に記載の抗体の特異性を有するモノクローナル抗体を作製する方法であって、
（ａ） 抗体反応を誘発する条件下で、SEQ ID NO:1-8からなる群から選択したアミノ酸配列またはその免疫原性断片を含むポリペプチドを用いて動物を免疫化する過程と、
（ｂ） 前記動物から抗体産出細胞を単離する過程と、
（ｃ） 前記抗体産出細胞と不死化した細胞とを融合して、モノクローナル抗体を産出するハイブリドーマ細胞を形成する過程と、
（ｄ） 前記ハイブリドーマ細胞を培養する過程と、
（ｅ） SEQ ID NO：1-8からなる群から選択したアミノ酸配列を含むポリペプチドに特異結合するようなモノクローナル抗体を前記培養物から単離する過程とを含むことを特徴とする方法。
【請求項４０】
請求項39に記載の方法で産出したモノクローナル抗体。
【請求項４１】
請求項40に記載のモノクローナル抗体及び適切なキャリアーを含む組成物。
【請求項４２】
Fab発現ライブラリをスクリーニングすることにより産出されることを特徴とする請求項１１に記載の抗体。
【請求項４３】
組換え免疫グロブリンライブラリのスクリーニングにより前記抗体を産出することを特徴とする請求項１１に記載の抗体。
【請求項４４】
サンプル中のSEQ ID NO:1-8からなる群から選択したアミノ酸配列を含むポリペプチドを検出する方法であって、
（ａ） 請求項１１に記載の抗体と前記ポリペプチドとの特異結合を許容する条件下で、前記抗体と１サンプルとをインキュベートする過程と、
（ｂ） 特異結合を検出する過程とを含み、該特異結合が、SEQ ID NO：1-8からなる群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドがサンプル中に存在することを標示することを特徴とする方法。
【請求項４５】
SEQ ID NO:1-8 からなる群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドを精製する方法であって、
（ａ） 請求項１１に記載の抗体と前記ポリペプチドとの特異結合を許容する条件下で、前記抗体と１サンプルとをインキュベートする過程と、
（ｂ） 前記サンプルから前記抗体を分離し、SEQ ID NO:1-8からなる群から選択したアミノ酸配列を含む精製ポリペプチドを得る過程とを含むことを特徴とする方法。
【請求項４６】
マイクロアレイの少なくとも１つが請求項１３に記載のポリヌクレオチドであることを特徴とするマクロアレイ。
【請求項４７】
ポリヌクレオチドを含むサンプルの発現プロファイルを作製する方法であって、
（ａ） サンプル中のポリヌクレオチドを標識化する過程と、
（ｂ） ハイブリダイゼーション複合体が形成されるのに適した条件下で請求項４６のマイクロアレイのエレメントとサンプル中の標識化ポリヌクレオチドとを接触させる過程と、
（ｃ） サンプル中のポリヌクレオチドの発現を定量する過程とを含む方法。
【請求項４８】
或る固体基板上の固有の物理的位置に付着された種々のヌクレオチド分子を有するアレイであって、少なくとも１つの前記ヌクレオチド分子が、或る標的ポリヌクレオチドの少なくとも30の連続したヌクレオチド群と特異的にハイブリダイズ可能な最初のオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド配列を含み、前記の標的ポリヌクレオチドが請求項１２に記載のポリヌクレオチドであることを特徴とするアレイ。
【請求項４９】
請求項４８に記載のアレイで、前記の最初のオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの配列が前記の標的ポリヌクレオチドの少なくとも30の連続したヌクレオチドに完全に相補的であることを特徴とするアレイ。
【請求項５０】
請求項４８に記載のアレイで、前記の最初のオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの配列が前記の標的ポリヌクレオチドの少なくとも60の連続したヌクレオチドに完全に相補的であることを特徴とするアレイ。
【請求項５１】
請求項48に記載のアレイで、前記の最初のオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの配列が前記の標的ポリヌクレオチドに完全に相補的であることを特徴とするアレイ。
【請求項５２】
請求項48に記載のアレイで、マイクロアレイであることを特徴とするアレイ。
【請求項５３】
請求項48に記載のアレイで、前記のオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの最初の配列を含むヌクレオチド分子にハイブリダイズした前記の標的ポリヌクレオチドを有することを特徴とするアレイ。
【請求項５４】
請求項48に記載のアレイで、リンカーが少なくとも１つの前記のヌクレオチド分子と前記の固体基板を連結していることを特徴とするアレイ。
【請求項５５】
請求項48に記載のアレイで、基板上の固有の物理的位置の各々が複数のヌクレオチド分子を含み、任意の単一の固有の物理的位置でのその複数のヌクレオチド分子は同一の配列を有し、基板上の固有の物理的位置の各々は、基板上の別の固有の物理的位置でのヌクレオチド分子の配列とは異なる配列を有するヌクレオチド分子を含むことを特徴とするアレイ。
【請求項５６】
SEQ ID NO:1のアミノ酸配列を含む請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項５７】
SEQ ID NO:2のアミノ酸配列を含む請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項５８】
SEQ ID NO:3のアミノ酸配列を含む請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項５９】
SEQ ID NO:4のアミノ酸配列を含む請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項６０】
SEQ ID NO:5のアミノ酸配列を含む請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項６１】
SEQ ID NO:6のアミノ酸配列を含む請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項６２】
SEQ ID NO:7のアミノ酸配列を含む請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項６３】
SEQ ID NO:8のアミノ酸配列を含む請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項６４】
SEQ ID NO:9のポリヌクレオチド配列を含む請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項６５】
SEQ ID NO:10のポリヌクレオチド配列を含む請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項６６】
SEQ ID NO:11のポリヌクレオチド配列を含む請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項６７】
SEQ ID NO:12のポリヌクレオチド配列を含む請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項６８】
SEQ ID NO:13のポリヌクレオチド配列を含む請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項６９】
SEQ ID NO:14のポリヌクレオチド配列を含む請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項７０】
SEQ ID NO:15のポリヌクレオチド配列を含む請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項７１】
SEQ ID NO:16のポリヌクレオチド配列を含む請求項12に記載のポリヌクレオチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、神経伝達関連タンパク質の核酸配列およびアミノ酸配列に関する。本発明はまた、これらの配列を利用した、自己免疫／炎症疾患、心血管障害、神経疾患、発生または発達障害、癌を含む細胞増殖異常、輸送障害、精神障害、代謝障害および内分泌障害の診断・治療・予防に関する。本発明は更に、神経伝達関連タンパク質の核酸配列およびアミノ酸配列の発現における外因性化合物の効果についての評価に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトの神経系は全ての身体機能を調節しているが、このヒト神経系は、脳と脊髄からなる中枢神経系（CNS）および、神経インパルスを感覚器官からCNSに伝導する求心性神経経路と運動インパルスをCNSから効果器官に伝導する遠心性神経経路からなる末梢神経系（PNS）からなっている。PNSはさらに骨格筋のような随意運動を調節する体性神経系と、心臓、肺および内臓(viscera)の不随意運動を調節する自律神経系に分けることができる。CNS関連のタンパク質は、ニューロンシグナルの伝達、細胞接着、神経再生、軸索誘導、神経発生その他の機能を持っている。
【０００３】
大脳皮質、すなわち上位脳は最大の構造であり、脳梁で連結された左右の半球からなっている。大脳皮質は知覚、随意筋骨格運動、および、意識、言語、感情および記憶に関連する広範囲の活動に関係する、統合機能、感覚および運動機能にかかわっている。大脳は神経系の下位センターと共同して機能する。延髄、脳橋、中脳、小脳、基底核、黒質、視床下部および視床等の脳の下位領域は動脈圧および呼吸、平衡および唾液分泌等の摂食反射を含む無意識の活動を制御する。
【０００４】
中枢神経系（CNS）は、脊髄レベル、下位脳レベルおよび上位脳レベルすなわち皮質レベルにある1兆以上のニューロンからなっている。ニューロンは細胞間で電気的または化学的なシグナルを伝送する。脊髄、すなわち骨質の脊柱管の中の細い管として存在する中枢神経系の延長部分、は上行感覚経路と下行運動経路を含み、脳幹および大脳半球の膜につながった膜で覆われている。脊髄は胴体および手足の運動出力および感覚入力系の殆ど全てを含み、脊髄内のニューロン回路は歩行等の律動的な動きおよびさまざまな反射も制御している。延髄、脳橋、中脳、小脳、基底核、黒質、視床下部および視床等の脳の下位領域は動脈圧および呼吸、平衡および唾液分泌等の摂食反射を含む無意識の活動を制御する。怒り、興奮、性的反応および痛みまたは快感への反応は下位脳に由来する。大脳皮質、すなわち上位脳は最大の構造であり、脳梁で連結された左右の半球からなっている。大脳皮質は知覚、随意筋骨格運動、および意識、言語、感情および記憶に関連する広範囲の活動に関係する統合機能、感覚および運動機能にかかわっている。大脳は神経系の下位センターと共同して機能する。
【０００５】
神経系の構成と発達
神経細胞（ニューロン）は細胞体、軸索、樹状突起および軸索終末という４つの領域を含んでいる。細胞体は、核その他の細胞小器官を含んでいる。樹状突起は細胞体から外方向に伸びる突起であり、感覚器官または他のニューロンの軸索からのシグナルを受け取る。これらのシグナルは電気インパルスに変換され、細胞体に伝送される。軸索（そのサイズは1ミリから1メートル以上まで広範囲に及ぶ）は細胞体からの神経インパルスを外へ伝導する単一の突起である。微小管および神経フィラメントを含む細胞骨格繊維が軸索の全長にわたって走り、タンパク質、膜小胞その他の高分子を細胞体から軸索に沿って軸索終末まで輸送する機能を持っている。一部の軸索は、希突起膠細胞（CNS）またはシュワン細胞（PNS）の膜でできた髄鞘によって覆われている。有髄軸索は同じ直径の無髄軸索に比べて電気インパルスを速く伝導する。軸索終末は軸索の細胞体と離れた側の先端にある(Lodish, H. 他 (1986) Molecular Cell Biology Scientific American Books New York NY, 715-719ページを参照）。
【０００６】
CNS関連のタンパク質は、ニューロンシグナルの伝達、細胞接着、神経再生、軸索誘導、神経発生その他の機能において役割を持っている。CNS関連タンパク質の中には膜に埋め込まれた部分を形成していたり、膜に結合しているものがある。例えば、神経膜タンパク質35（NMP35）は神経膜に緊密に関連し、ラット成体の神経系で高度に発現していることが知られている(Schweitzer, B. 他 (1998) Mol. Cell. Neurosci. 11:260-273)。シナプトフィジン（SY）は小型シナプス小胞の主要な膜内在性タンパク質である。ヒトとマウスにおけるSYの染色体位置はX染色体のサブバンドXp11.22-p11.23である。この領域はWiskott-Aldrich症候群、3種類のX遺伝子連関の高カルシウム尿腎結石症、そして色素性網膜炎(網膜色素変性症)2、先天性停止性夜盲症およびAland Island眼病等の眼疾患を含むいくつかの遺伝病に関与しているとされている(Fisher, S. E. 他 (1997) Genomics 45:340-347)。ペリフェリン、すなわち網膜緩慢変性タンパク質（rds）は光受容体の外側セグメントディスクの周縁に存在する膜内在性の糖タンパク質である。哺乳動物においては、rdsは関係する非グリコシル化タンパク質との異好性相互作用を通じてディスク周縁を安定化すると考えられている。rdsは杵体および錐体光受容体の異常な発達とその後のゆっくりとした変性を特徴とするマウスの神経学的突然変異である(Kedzierski, W.J. 他 (1999) Neurochem. 72:430-438)。
【０００７】
ヒト成人の1兆を超えるニューロンの各々が千個以上の標的細胞と接続している(Tessier-Lavigne, M. 他 (1996) Science 274:1123-1133)。これらの神経接続は胚の発生中に形成される。分化する各ニューロンが先端に成長円錐を持った軸索を送り出す。分子的なガイダンスに導かれて、成長円錐は胚の環境の中でシナプス標的まで移動する。軸索の伸展は神経の発達中に起こるが、成熟した哺乳動物のCNSにおいては起こらない。CNSに傷害を受けると、成長阻止分子の発現が増加し、それに対する成長促進分子の方は減少する。発達時の軸索誘導を支配するタンパク質は、傷害された中枢ニューロンの再生の失敗に寄与する。こうしたタンパク質としては、セマフォリン３Aおよびセマフォリン３A受容体タンパク質であるニューロピリン１およびプレキシンA1が挙げられる(Pasterkamp, R.J. および Verhaagen, J.(2001) Brain Res. Brain Res. Rev. 35:36-54)。
【０００８】
セマフォリンは、成長する軸索にアクセスできない領域を指定する局所シグナルを提供することにより、胚発生中に機能している(Puschel, A.W. 他 (1995) Neuron 14:941-948)。セマフォリンは少なくとも30の異なるメンバーからなり、脊椎動物、無脊椎動物および数種のウイルスにも見出される。すべてのセマフォリンは長さが約５００アミノ酸のセマ（sema）ドメインを有する。セマフォリン受容体であるニューロピリン（neuropilin）は、in vitroで神経突起の伸展を促進することが示されている。ニューロピリンの細胞外領域はＣＵＢ、ディスコイディン（discoidin）、およびＭＡＭドメインという３つの異なるドメインから成っている。ニューロピリンのCUBモチーフおよびMAMモチーフはタンパク質間相互作用において幾つかの役割を果たすことが示唆されており、更にセマドメインおよびＣ末端ドメインを介してセマフォリン類の結合に関与していると考えられる（Raper, J.A.（2000）Curr. Opin. Neurobiol. 10:88-94の概説を参照）。
【０００９】
発生中の軸索の誘導には正と負の効果（すなわち化学誘引と化学反発）の両方が関わっている。スリット(Slit)・ファミリーのタンパク質は軸索の枝分かれ、延長および反発の推進に関与しているとされてきた。スリット・ファミリーのメンバーは昆虫、両生類、鳥類、齧歯類およびヒトを含むさまざまな生物で同定されている(Guthrie, S. (1999) Current Biology 9:R432-R435)。スリットタンパク質は反発誘導(抑制性ガイド)受容体Roundabout (ロボ)のリガンドであるが、スリットは数例のアッセイでは延長も起こしている。スリットの翻訳後処理された或る形が、このタンパク質の活性型であるようだ(Guthrie, S. 前出，Brose, K. 他 (1999) Cell 96:795-806)。
【００１０】
軸索の成長は細胞表面および細胞外マトリクス（ECM）分子がらみの接触仲介性機構によっても部分的に誘導されている。フィブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニンのメンバー、テネイシン、コラーゲンおよびトロンボスポンジンの各ファミリー、およびさまざまなプロテオグリカンを含んだ多くのECM分子は神経突起の生成と伸長に対してプロモーターとして、あるいはインヒビターとして作用しうる(Tessier-Lavigne 他, 前出)。ECM分子の受容体としては、インテグリン、免疫グロブリン・スーパーファミリのメンバーおよびプロテオグリカン等が挙げられる。ECM分子およびその受容体はニューロンの接着、維持および分化にも関与しているとされている(Reichardt, L.F. 他 (1991) Ann. Rev. Neurosci. 14:531-571)。プロテオグリカンのtesticanは海馬の錐体細胞のシナプス後エリアに局在していて、受容体活性、神経調節、シナプス可塑性および神経伝達において役割を果たしている可能性がある(Bonnet, F. 他 (1996) J. Biol. Chem. 271:4373-4380)。
【００１１】
ニューロトロフィン（neurotrophin）は脊椎動物神経系の、発達、維持および機能を調節する。ニューロトロフィンは２つの異なるクラスの受容体（受容体チロシンキナーゼのTrkファミリーと、TNF受容体スーパーファミリーのメンバーであるp75NTR）を活性化する。ニューロトロフィンは、これらの受容体を通じて多くのシグナル経路を活性化する。それらの経路としては、rasおよび、cdc-42/ras/rho Gタンパク質ファミリーのメンバーによって仲介されるものや、MAPキナーゼ、PI-3キナーゼ、およびJunキナーゼの各カスケードによって仲介されるものがある。発達中に、限定量のニューロトロフィンが生存因子として機能し、生存するニューロンの数と、適切な標的神経感応の必要条件との間の一致を保証する。ニューロトロフィンはまた、細胞運命決定、軸索成長、樹状突起剪定、神経感応のパターン化、および、神経伝達物質およびイオンチャネルなど、正常な神経機能に必須なタンパク質の発現を調節する。これらのタンパク質も、神経機能の多くの様相を調節する。成熟した神経系においては、これらは神経の生存を調節し続けると共に、シナプス機能とシナプス可塑性を制御する(Huang, E.J.および Reichardt, L.F. (2001)Ann. Rev. Neurosci. 24:677-736)。neuritinは神経活性によって、また、神経突起生成を促進するニューロトロフィンによって誘発されるタンパク質である。
【００１２】
neurexophilinは合成後にタンパク質分解で処理される神経ペプチド様タンパク質である。これらneurexophilinは、ニューロン特異的な細胞表面タンパク質、αニューレキシン（α-neurexin）のリガンドである。neurexophilinとneurexinはニューロンシグナル経路に参加している可能性がある(Missler, M. および T.C. Sudhof (1998) J. Neurosci. 18:3630-3638; Missler, M. 他 (1998) J. Biol. Chem. 273:34716-34723)。ninjurinは細胞接着と傷害の後の神経再生で役割を果たすニューロン細胞表面タンパク質である。ninjurinは後根神経節ニューロン内およびシュワン細胞内の神経傷害の後で上方調節される（Araki, T. and Milbrandt, J. (1996) Neuron 17:353-361)。ninjurin２は成熟した知覚および腸内ニューロンで発現し、突起の伸展を促進する。ninjurin2は傷ついた神経の遠位セグメントの周囲のシュワン細胞においてninjurin1, 神経CAMおよびL1と同様の時間経過で上方調節される (Araki, T. および Milbrandt, J. (2000) J. Neurosci. 20:187-195)。
【００１３】
ニューレキシンIVは胚と幼虫におけるPNS内の軸索絶縁に必須である。軸索の絶縁は、活動電位の適正な伝播のために非常に重要である。ニューレキシンIVの脊椎動物相同体であるCaspr（paranodinとも呼ばれる）は、ランビエ節の髄鞘下領域（軸索とシュワン細胞の間）に局在する隔壁様の接合構造に見られる。Caspr/paranodin は血液-脳関門の形成、および神経膜成分と軸索細胞骨格ネットワークの間の連結に関与しているとされている(Bellen, H.J. et al. (1998) Trends Neurosci. 21:444-449)。
【００１４】
哺乳動物のNumbはホスホチロシン結合（PTB）ドメイン含有タンパク質であり、哺乳動物の神経系の細胞運命決定と皮質の神経発生に関わっている可能性がある。Numbの結合パートナーであるLNXタンパク質は４つのPDZドメインと１つのリングフィンガードメインを含み、Numbに関わるシグナル経路に参加している可能性がある。PDZドメインは、細胞膜表面におけるシグナル伝達イベントに関わっている多機能タンパク質複合体のアセンブリのアダプタの役割をするタンパク質の中で見つかっている(Ponting, C.P. (1997) Bioessays 19:469-479)。LNXタンパク質は、SHC（チロシンリン酸化成長因子受容体および下流エフェクターと関連するアダプタ・タンパク質）等の他のPTB含有タンパク質の結合に重要である可能性をもったチロシンリン酸化部位を含んでいる(Dho, S.E. 他 (1998) J. Biol. Chem. 273:9179-9187)。
【００１５】
ホメオボックス転写因子は神経細胞関連組織のパターン化および分化を指図する。これらのタンパク質の存在と機能は線虫、節足動物および脊椎動物に遍在しているようである。これらのタンパク質の一例としてDRG11が挙げられる。このタンパク質は哺乳動物の知覚ニューロンで発現しているホメオボックス転写因子であり、神経堤の発生に関与しているらしい(Saito, T. 他 (1995) Mol. Cell Neurosci. 6:280-292)。不快な刺激を検知する皮膚感覚ニューロンは脊髄の後角に突き出るが、筋肉伸長受容体の神経支配を行うものは前角に突き出る。DRG11は、侵害知覚ニューロンから、脊髄の後角にあるその中心的標的までの、空間・時間的に適切なプロジェクションを形成するために必要である(Chen, Z.F. 他 (2001) Neuron 31:59-73)。
【００１６】
シナプス
一つのニューロンともう一つのニューロンとの間の接触はシナプスと呼ばれる特化した部位で起こる。多くの神経系機能は多様なシナプスタンパク質によって調節される。例としてはシナプトフィジン、シナプシン、成長関連タンパク質43 (GAP-43)、SV-2およびp65（これらはシナプスの細胞内区画に分布）が挙げられる。シナプス終末はさらに、カルシウム輸送、神経伝達、シグナル伝達、成長および可塑性に関与するその他多くのタンパク質を含んでいる。この部位において、一つのニューロン（シナプス前細胞）からの軸索終末がもう一つのニューロン（シナプス後細胞）にシグナルを送る。シナプスは電気的または化学的に接続しうる。電気的シナプスは２つのニューロンを接続するギャップ結合からなり、シナプス前細胞からシナプス後細胞に電気インパルスを直接通す。化学的シナプスにおいては、シナプス前細胞の軸索終末が特定の神経伝達物質分子を含む膜小胞を含んでいる。神経終末における電位の変化の結果、電位依存性チャネルを通じてカルシウムイオンが流れ込み、これにトリガされてシナプス小胞からエキソサイトーシスによって神経伝達物質が放出される。神経伝達物質はシナプス前神経細胞とシナプス後細胞を分離しているシナプス間隙を急速な拡散によって横断する。神経伝達物質は次に受容体に結合し、シナプス後細胞の原形質膜にある伝達物質依存性イオンチャネルを開き、細胞内の電位の変化を誘発する。このシナプス後細胞の膜電位の変化により、神経インパルスのその後の伝達が興奮または抑制されうる。
【００１７】
シナプス前カルシウムチャネルの活動はシステイン・ストリングタンパク質（CSP）によって調節される。CSPは神経伝達だけでなくその他の細胞種のエキソサイトーシスにおいても機能する分泌性小胞タンパク質である。CSPはDnaJ/hsp40（熱ショックタンパク質）シャペロンファミリーに属している。カルシウムレベルに対するCSPの効果はカルシウム放出に後続すると思われており、またエキソサイトーシスが関わっていると思われ、おそらくGタンパク質とも関連すると考えられる(Braun, J.E. 他 (1995) Neuropharmacology 34:1361-9136; Magga, J.M. 他 (2000) Neuron 28:195-204; Dawson-Scully, K. 他 (2000) J. Neurosci. 20:6039-6047; Chamberlain, L.H. 他 (2001) J. Cell Sci. 114:445-455)。ニューレグリン（NRG）は、シナプス内の伝達物質放出またはイオンチャネル受容体の発現を調節することによって、電気的神経活性と分子コンポーネントの間を仲介する。NRGは、興奮性ニューロンと抑制性ニューロンとを協調させることによって移動運動その他の高次機能の調節に関与するシグナル伝達因子である可能性もある。
【００１８】
N-および P/Q-タイプ Ca2+ チャネルはシナプス前神経終末に高密度で局在し、神経興奮-分泌カップリングに必須な要素である。Ca2+の流入を仲介して伝達物質の放出を開始させるほか、これらチャネルはシナプス小胞ドッキング/融合機構のタンパク質と直接相互作用すると考えられている。ＮタイプおよびP/QタイプのCa2+チャネルは神経終末内に、高密度クラスターでsyntaxinと共に局在している。NタイプおよびP/QタイプCa2+チャネルのアルファ1Bおよびアルファ1Aサブユニットの細胞内ループII-III(LII-III)内のシナプスタンパク質相互作用（synprint）部位は、syntaxin、SNAP-25およびシナプトタグミンに結合する。シナプス前Ca2+チャネルはエキソサイトーシス機構が必要とするCa2+シグナルを提供するだけでなく、小胞のドッキング、プライミングおよび融合の過程に不可欠な構造要素を含んでいる(Catterall, W.A. (1999) Ann. N Y Acad. Sci. 868:144-159)。シナプトタグミンは調節型および構成型小胞輸送の両方に関与するタンパク質の大きなファミリーである。このファミリーには神経タイプ（シナプトタグミンI-VおよびXI）および遍在タイプ（シナプトタグミンVI-IX）が含まれる。Ca(2+)依存性のシナプトタグミン活性化は突起の伸展に関与している(Mikoshiba, K. 他 (1999) Chem. Phys. Lipids 98:59-67)。
【００１９】
シナプス小胞の膜に関連しているタンパク質としてはvamp （シナプトブレビン）、rab3A、シナプトフィジン、シナプトタグミン（p65）およびSV2などがある。これらの膜タンパク質は、神経伝達物質の取り込み、小胞の標的化、およびシナプス前原形質膜との融合を調節することにより、調節されたエキソサイトーシスにおいて機能する(Elferink, L.A. および Scheller, R.H.(1993) J. Cell Sci. Suppl.17:75-79)。ペリフェリン、すなわち網膜緩慢変性タンパク質（rds）は光受容体の外側セグメントディスクの周縁に存在する膜内在性糖タンパク質である。哺乳動物においては、rdsは関係する非グリコシル化タンパク質との異好性相互作用を通じてディスク周縁を安定化すると考えられている(Kedzierski, W.J. 他 (1999) Neurochem. 72:430-438)。
【００２０】
V-ATPアーゼのAc39サブユニットとしても知られているphysophilinはオリゴマータンパク質であり、シナプス小胞タンパク質のシナプトフィジンと結合して、エキソサイトーシス融合ポアを形成しうる複合体を構成する。Ac39はシナプトソーム複合体内に存在するが、この複合体はシナプトフィジンのほかに大量のシナプトブレビンIIおよび、V-ATPアーゼのV0セクターのサブユニットｃおよびAc115を含んでいる。ラットの脳におけるIn situ ハイブリダイゼーションにより、Ac39/physophilin mRNAは概して神経に分布することが示されるが、この分布は空間、時間的にサブユニットcおよびシナプトフィジンの分布と相関する。免疫組織化学解析により、Ac39/physophilinはサブユニットAと同一かつシナプトフィジンとよく似たパターンで主にニューロピル内に集中していることが示される。ダブル標識免疫蛍光によると、Ac39/physophilinはニューロピルの中でサブユニットAと完全に共局在していて、シナプトフィジンとは部分的に共局在している(Carrion-VazquezM. 他 (1998) Eur. J. Neurosci.10:1153-1166)。
【００２１】
原形質膜のドーパミン・トランスポータ（DAT）はシナプスから放出されたドーパミンの再取り込みに必須である。ドーパミンの取り込みは温度および時間に依存し、コカイン等のさまざまな化学物質によって阻害される。DATノックアウト・マウスは極端に過度な活発性とコカインおよびアンフェタミンの両方への耐性を示していて、DATに対するコカインの主要な作用と一致している(Giros, B. 他 (1996) Nature 379:606-612)。DATの厳密な調節に動揺があると、ニューロンがさまざまな傷害によって損傷しやすくなる。もっとも顕著なのは、パーキンソン病の元になると考えられている線条体のDAT発現ドーパミン神経終末の選択的な変性である。DATの発現により神経集団の選択的脆弱性を予見できるが、このことはDAT機能を変容させることをめざした治療戦略がさまざまな疾患において大きな恩恵をもたらす可能性を示唆している(Gary, W.M. 他 (1999) Trends Pharmacol. Sci. 20:424-429)。
【００２２】
43 KDシナプス後タンパク質、すなわちアセチルコリン受容体関連43 KDタンパク質（RAPSYN）はシナプス部位においてニコチン性アセチルコリン受容体のつなぎ留めあるいは安定化に役割を果たしていると考えられている。RAPSYNは膜結合にかかわっており、アセチルコリン受容体を、裏打ちするシナプス後細胞骨格にリンクしている可能性がある(Buckel, A. 他 (1996) Genomics 35:613-616)。Neuritinはタンパク質であり、その遺伝子は神経活動によって、及び神経発生を推進するニューロトロフィン（neurotrophin）によって誘導されることが知られている。Neuraxinはラット中枢神経系の構造タンパク質であり、免疫学的に微小管関連タンパク質5（MAP5）と関係していると考えられている。Neuraxin は新しいタイプのニューロン特異的タンパク質であり、12個のセントラル・ヘプタデカリピート(heptadecarepeats)と推定上のタンパク質及び膜相互作用部位という異例のアミノ酸組成を特徴とする。neuraxinをコードする遺伝子は半数体ラット・ゲノム内で唯一独自であり、高等脊椎動物で保存されている。neuraxinは神経膜・微小管相互作用に関与しているとされており、齧歯類のCNS全体に発現している(Rienitz, A. 他 (1989) EMBO J. 8:2879-2888)。
【００２３】
神経伝達物質および神経伝達物質輸送タンパク質
神経伝達物質は、アセチルコリン、モノアミン（セロトニン、ドーパミン、ヒスタミン等）、アミノ酸（ガンマアミノ酪酸（GABA）、グルタミン酸、アスパラギン酸等）、および神経ペプチド（エンドルフィンおよびエンケファリン等）を含む３０ほどの小さな分子からなる多様なグループを含んでいる(McCance, K.L. and Huether, S.E. (1994)  PATHOPHYSIOLOGY, The Biologic Basis for Disease in Adults and Children, 第二版, Mosby, St. Louis, MO, 403-404ページ）。これらの分子の多くは2つ以上の機能を持ち、その効果は興奮性（例えばシナプス後細胞の原形質膜を脱分極して神経インパルスの伝達を刺激）あるいは抑制性（例えば原形質膜を過分極して神経インパルスの伝達を抑制）である。
【００２４】
神経伝達物質およびその受容体は神経機能の制御を目的とする薬物の標的である。例えば、GABAはCNSにおける主要な抑制性神経伝達物質であり、GABA受容体はGABA仲介性効果を強化することにより作用するベンゾジアゼピンおよびバルビツール酸等の鎮静剤の主要な標的である(Katzung, B.G. (1995) Basic and Clinical Pharmacology, 第六版,  Appleton & Lange, Norwalk, CT, 338-339ページ)。
【００２５】
２つの主要なクラスの神経伝達物質トランスポータが神経系の機能に必須である。第一のクラスはニューロンとグリア細胞の原形質膜内の取り込みキャリアであり、細胞外の空間から細胞に神経伝達物質を輸送する。この過程は原形質膜の両側のNa+勾配に依存し、Na+の共役輸送では特にそうである。２つのタンパク質ファミリが特定されている。第一のファミリはグリシン、プロリン等のアミノ酸、ノルアドレナリン、ドーパミン、セロトニン等のモノアミンおよびGABAのトランスポータを含む。共通な構造部分としては12個の推定膜貫通型αヘリックスドメイン、細胞質N-およびC-末端、および膜貫通型ドメインを3〜4つに分けている大きなグリコシル化細胞外ループが挙げられる。この相同タンパク質のファミリは、Na+および Cl-イオンと神経伝達物質との、細胞内への共役輸送からエネルギーを引き出している（Na+/Cl-神経伝達物質トランスポータ）。第2のファミリはグルタミン酸等の興奮性アミノ酸のトランスポータを含んでいる。共通の構造部分としては、6〜10個の推定膜貫通型ドメイン、細胞質N-およびC-末端、および細胞外ループのグリコシル化が含まれる。興奮性アミノ酸トランスポータはCl-に依存せず、細胞内K+イオンを必要とする可能性がある（Na+/K+神経伝達物質トランスポータ）(Liu, Y. 他 (1999) Trends Cell Biol. 9:356-363)。
【００２６】
神経伝達物質トランスポータの第2のクラスは小胞膜内に存在し、シナプス伝達中の小胞内容物のエキソサイトーシスの前に神経伝達物質を細胞質から小胞に濃縮する。小胞輸送においては、H+-ATPaseによって生成される小胞膜両側の電気化学的勾配を使用する。神経伝達物質の小胞への輸送には、２つのタンパク質ファミリが関わっている。１つのファミリは主にプロトン交換を使って分泌性小胞内への輸送を駆動するが、これにはモノアミンとアセチルコリンのトランスポータが含まれる。例えば、モノアミン・トランスポータは細胞質伝達物質の各分子につき２つの小胞内のプロトンを交換する。第2のファミリはGABAトランスポータを含むが、これはシナプス小胞の正電荷に依存する。これら２つのクラスの小胞トランスポータは互いに配列の類似性がなく、その構造は原形質膜キャリアのそれとは別個である(Schloss, P. 他 (1994) Curr. Opin. Cell Biol. 6:595-599; Liu, Y. 他 (1999) Trends Cell Biol. 9:356-363)。
【００２７】
GABAは優勢な抑制性神経伝達物質であり、哺乳動物の神経系に広範に分布している。GABAは特異的な高親和性のNa+およびCl-依存性のトランスポータによってシナプス間隙から除去されるが、これらのトランスポータはシナプス前およびシナプス後ニューロンと周囲のグリア細胞に局在していると考えられている。少なくとも4つのGABAトランスポータ（GAT1〜GAT4）がクローン化されている(Liu, Q.-R. 他 (1993) J. Biol. Chem. 268:21062112)。培養細胞へ、およびさまざまな組織から単離された原形質膜小胞への[3H]-GABAの取り込みの研究によると、GABAトランスポータの異質性にはかなりの違いがある。GABAトランスポータ類は、基質親和性および特異性の相違、別個のブロッカー薬理、およびさまざまな組織局在を示す。例えば、発現したGAT1〜GAT4のGABA取り込みのKm値はそれぞれ6、79、18および0.8 mMである。GAT2はGABAを輸送するだけでなく、ベタインも輸送する。GAT3とGAT4はβアラニンとタウリンも輸送する。薬理学的な研究によると、GAT1とGAT4によるGABA輸送はGAT2とGAT3によるものと比べて2,4ジアミノ酪酸とguavicineへの感受性が高い。in situハイブリッド形成の示すところによると、GAT1とGAT4の発現は脳に特異的である。GAT2とGAT3のmRNAは肝臓、腎臓等の組織で検出されている(Schloss 前出; Borden, L.A. (1996) Neurochem. Int. 29:335-356; Nelson, N. (1998) J. Neurochem. 71:1785-1803)。
【００２８】
ヒトの研究によると、GABAトランスポータの機能は癲癇海馬において減少している。GABA感作性の神経伝達の減少は分裂症(統合失調症)の病理生理にも関与するとされている(Simpson, M.D. 他 (1992) Psychiatry Res. 42:273-282)。
【００２９】
ジアゼパム結合インヒビター（DBI）はエンドゼピン（endozepine）およびアシル・コエンチーム（CoA）結合タンパク質としても知られているが、このインヒビターは、GABAの効果を下方調節すると考えられている、内在性GABA受容体リガンドである。DBIは中鎖及び長鎖アシルCoAエステルに非常に高い親和性で結合し、アシルCoAエステルの細胞内キャリアとして機能している可能性がある(*125950 Diazepam Binding Inhibitor; DBI, Online Mendelian Inheritance in Man (OMIM); PROSITE PDOC00686 Acyl-CoA-binding protein signature)。
【００３０】
グリシンは塩素イオンチャネル受容体（リガンド依存性イオンチャネル・スーパーファミリーのメンバー）を活性化することによって哺乳動物の神経系における主要な抑制性神経伝達物質として機能する(Betz, H. (1990) Neuron 5:383-392)。グリシンはまた、NメチルDアスパラギン酸（NMDA）受容体のアロステリック活性化を通じて興奮性伝達を助長する(Johnson, J.W. and P. Ascher (1987) Nature 325:529-531)。グリシントランスポータの形態としてはGLYT 1およびGLYT ２などがある。GLYT1の変異体 (GLYT1 a/b) は選択的スプライシングによって生成される(Liu, Q.-R. 他 (1993) J. Biol. Chem. 268:22802-22808)。GLYT1aが神経組織と非神経組織の両方で転写されるのに対して、GLYT1bは神経組織でのみ検出される(Borowsky, B. et al. (1993) Neuron 10:851-863)。高レベルのGLYT1a/b mRNA が海馬と皮質で見られ、このことは興奮性シナプス伝達の調節への関与を示唆している。GLYT1aがニューロン、グリアあるいはその両方で発現されているかどうかは明らかでない。これと対照的に、GLYT1bは殆ど線維路(fiber tracts)でのみ見出されていて、このことはグリア細胞への局在を示唆している(Schloss 前出)。GLYT2は主に脳幹および脊髄で発現されている（Schloss 前出）。
【００３１】
2番目に同定されたグリシン・トランスポータ（GLYT2）は細胞内アミノ端が長い点がGLYT1a/bと異なっている。これのmRNAが主に局在しているのは脳幹と脊髄であり、Nメチル・アミノ酢酸への感受性が低いことから、GLYT2がストリキニーネ感受性の抑制性グリシン受容体のシグナル変換を終結させていることが示唆される。GLYT1bを含む細胞が脱分極化するとトランスポータが逆に働き、グリシンを放出してNMDA受容体において神経調節アミノ酸の役割を果たさせるのではないかと提案されている(Attwell, D. and M. Bouvier (1992) Curr. Biol. 2:541-543)。こうした逆輸送による神経伝達物質のCa 2+非依存性非小胞放出はグルタミン酸及びセロトニンについて実証されている。この証拠は、この伝達物質トランスポータが神経伝達物質の活動の開始と終止の両方に重要であることを示唆している(Schloss 前出)。
【００３２】
クレアチン・トランスポータはGABAのトランスポータと強く関係している。クレアチン・トランスポータ種の相同体同士の一次配列同一性は極めて高い（98〜99％）。薬理学的研究によって高親和性クレアチン取り込み（27〜43mM）が実証されているが、この取り込みは高親和性のクレアチン類似物質によってブロックされる。クレアチン・トランスポータは、脳、副腎、小腸、大腸、前立腺、胸腺、卵巣、脾臓、膵臓、胎盤、へその緒、甲状腺、舌、咽頭、椎間板、顎および鼻の上皮を含むさまざまな哺乳動物組織において広範に発現している。マウスの遺伝子地図によれば、クレアチン・トランスポータはX染色体の一つの領域に局在していて、その領域はヒトのXq28領域と連結保存になっているが、ここはいくつかの神経筋病の遺伝子のあるところである(Nash, S.R. 他 (1994) Receptors Channels 2:165-174)。)
Na+ /Cl-依存性トランスポータファミリのタンパク質をコードしている数々のcDNAクローンの基質はまだ特定されていない。これらはオーファントランスポータである。オーファントランスポータの基質の特定は困難であったが、その理由はin situハイブリダイゼーションおよび免疫組織化学の示すところによればこれらのトランスポータが表現型の異なる神経集団、例えばグルタミン感作性、GABA感作性またはセロトニン感作性ニューロンによって合成されているためである。これらのトランスポータのうちの一つであるNTT4はクレアチン・トランスポータに最高度の相同性を示す。これは膜貫通型7と8の間に異例に長いループを持っているという点で、このファミリの他のメンバーと構造的に異なっている(Liu, Q.-R. 他 (1993) FEBS Lett. 315:114-118; Schloss 前出)。
【００３３】
グルタミン酸は、哺乳類の中枢神経系の主要な興奮性神経伝達物質である。起電性(Na+ / K+)共有グルタミン酸トランスポータは神経終末およびグリア細胞の原形質膜に存在し、興奮性シナプスで放出されたグルタミン酸の除去を仲介して細胞外濃度を神経毒性レベルより低く保つ。グルタミン酸トランスポータは3つのナトリウムイオンおよび1つのプロトンとの共役輸送の後でカリウムイオンを反対の方向に移行することにより、この過程を実現する(Zerangue, N. and M.P. Kavanaugh (1996) Nature 383:634-637)。
【００３４】
グルタミン酸トランスポータの膜トポロジーによれば、タンパク質のN末端部分に６つの膜貫通ヘリックスの存在が明らかになっている(Slotboom, D.J. 他 (1999) Microbiol. Mol. Biol. Rev. 63:293-307)。グルタミン酸トランスポータのC末端側半分はよく保存され、移行経路の主要部分を構成していて、基質および共役輸送イオンの結合部位を含んでいる(Zhang, Y. and B.I. Kanner (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:1710-1715)。
【００３５】
筋萎縮性側索硬化症（ALS）の運動皮質において、シナプスのグルタミン酸の再取り込みの障害とグルタミン酸トランスポータの発現の減少が見出されている。in vitroおよびin vivoで長期的にアンチセンス・オリゴヌクレオチドを投与することによりグルタミン酸トランスポータの各サブタイプの合成を阻害したところ、このタンパク質の発現とグルタミン酸トランスポータの機能が選択的かつ特異的に減少した。グリアのグルタミン酸トランスポータが失われると、細胞外グルタミン酸レベルの上昇、興奮性毒性に特徴的な神経変性および漸進的な麻痺が見られた。神経グルタミン酸トランスポータが失われても、線条体の細胞外グルタミン酸は上昇しなかったが、軽い神経毒性を生じ、癲癇をもたらした(Rothstein, J.D. 他 (1996) Neuron 16:675-686)。
【００３６】
小胞モノアミン・トランスポータ（VMAT）は細胞質モノアミン神経伝達物質を分泌性小胞に蓄積させ、それが調節性のエキソサイトーシスで放出される。VMATはプロトン電気化学的勾配を使ってプロトンとモノアミンの起電性交換体として機能する。VMATトランスポータとしてはVMAT1およびVMAT2などがある。VMATタンパク質は１２の膜貫通型セグメントを持ち、その両端は細胞質側にある。VMATタンパク質はニューロンおよび神経内分泌細胞内の特定の小胞集団に会合している(Henry, J.-P. et al. (1994) J. Exp. Biol. 196:251-262)。
【００３７】
小胞輸送は降圧剤レセルピンおよびこれと近縁だがより中枢で作用するテトラベナジンによって阻害される。輸送の機構とVMATの生化学は、これらの薬を使い、トランスポータのソースとしてウシ副腎から得たクロム親和性顆粒を主に使って解析されてきた(Peter, D. 他 (1994) J. Biol. Chem. 269:7231-7237)。
【００３８】
ヒトの研究によると、レセルピンは鬱病に似た症候を引き起こすことがあり、このことは気分と行動の制御に小胞トランスポータの活動が重要であることを示唆している。精神刺激薬のアンフェタミンは分泌性小胞内のアミンの貯蔵も乱すが、このことは小胞モノアミン輸送の変化が行動に影響しうることを示唆している(Sulzer, D. and S. Rayport (1990) Neuron 5:797-808)。
【００３９】
神経伝達物質トランスポータの欠陥に起因するヒトの病気としては、分裂症(統合失調症)、トゥーレット症候群、パーキンソン病、脳虚血、筋萎縮性側索硬化症、鬱病および癲癇等が挙げられる。例えば、癲癇および分裂症等のCNS疾患の病理生理学において、GABA感作性神経伝達の減少が関与するとされている。筋萎縮性側索硬化症（ALS）の患者の運動皮質において、シナプスのグルタミン酸の再取り込みの障害とグルタミン酸トランスポータの発現の減少が見出されている。グリアのグルタミン酸トランスポータが失われると、細胞外グルタミン酸レベルの上昇、興奮性毒性に特徴的な神経変性および漸進的な麻痺が見られた。神経グルタミン酸トランスポータが失われると軽い神経毒性が生じ、結果として癲癇を招く(Rothstein, J.D. 他 (1996) Neuron 16:675-686)。
【００４０】
ドーパミン、ノルエピネフリンおよびセロトニンのトランスポータはコカイン、抗鬱剤およびアンフェタミンを含む臨床関係の精神刺激剤の標的として特に重要である。コカインおよび抗鬱剤は、さまざまなレベルの特異性で除去(clearance)を制限することにより、アミンのシナプス濃度を上げる働きをするトランスポータ拮抗物質である。アンフェタミンは小胞のアミン貯蔵の枯渇に呼応して、トランスポータ仲介性の流出を増す働きがある(Barker, E.L. and R.D. Blakely (1995) Psychopharmacology 28:321-333; Sulzer, D. and S. Rayport (1990) Neuron 5:797-808; Wall, S.C. 他 (1995) Mol. Pharmacol. 47:544-550)。
【００４１】
神経伝達に重要と見られるもう一つの分子ファミリはコリン・トランスポータ様CTL1タンパク質である。プロトタイプのCTL1はコリン輸送突然変異の抑制因子として酵母の中で特定されたが、哺乳動物の相同体も特定されている。このタンパク質は約10個の推定膜貫通型ドメインとトランスポータ様モチーフを含むが、正準なコリン・トランスポータではないようである。コリン輸送は神経伝達に重要であるが、その理由はコリンがコリン感作性ニューロンに大量に必要とされるアセチルコリンの前駆体であるためである(O'Regan, S. 他 (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97:1835-40)。
【００４２】
転写調節タンパク質も、神経系および神経伝達の要素の発達に必須である。ホメオボックス転写因子というクラスの転写因子は神経細胞関連の組織パターン化と分化を誘導する。これらのタンパク質の存在と機能は線虫、節足動物および脊椎動物に遍在しているようである。これらのタンパク質の一例としてDRG11が挙げられる。このタンパク質は哺乳動物の知覚ニューロンで発現しているホメオボックス転写因子であり、神経堤の発生に関与しているらしい(Saito, T. 他 (1995) Mol. Cell Neurosci. 6:280-292)。
【００４３】
神経シグナルは神経筋接合部(NMJ)を通じて伝達される。運動軸索が放出する分子アグリンが筋繊維内のシナプス後装置の形成を誘発する。ジストログリカン、MuSKおよびrapsyn等のタンパク質がアグリンシグナルの伝達に関与する。アグリンはさらにmyonucleiにおける遺伝子転写の上方調節および、プレシナプス分化の制御において機能を持っている(Ruegg, M.A. および Bixby, J.L. (1998) Trends Neurosci. 21:22-27)。
【００４４】
神経学的タンパク質ドメイン
CNS関連タンパク質はホスホプロテインでもありうる。例えば、ARPP-21（サイクリックAMP調節性ホスホプロテイン）は線条体その他脳のドーパミンを受容する（dopaminoceptive）領域に非常に豊富に存在する細胞質性神経ホスホプロテインである。ARPP-21 mRNAの定常状態は発達に関連して調節されている。しかし、新生および成熟した動物においては、ARPP-21 mRNAは黒質の6ヒドロキシドーパミン病変の後でも、あるいはD1またはD2ドーパミン受容体を上方調節する薬理学的治療によっても変異しない(Ehrlich, M. E. 他 (1991) Neurochem. 57:1985-1991）。
【００４５】
CNS関連シグナル伝達タンパク質はPDZドメインを含むことがある。PDZドメインは、細胞膜表面におけるシグナル伝達イベントに関わっている多機能タンパク質複合体のアセンブリのアダプタの役割をするタンパク質の中で見つかっている。PDZドメインは、いくつかのジストロフィン関連タンパク質および神経一酸化窒素シンターゼ（NOS）を含む膜関連タンパク質の中で一般にみられる(Ponting, C. P. 他 (1997) Bioessays 19:469-479)。PSD-95/SAP90はシナプス後肥厚（PSD）での神経細胞に見られる膜関連グアニル酸キナーゼである (Takeuchi, M. 他 (1997) J. Biol. Chem. 272:11943-11951)。PSD-95/SAP90は３つのPDZドメイン、１つのSH3ドメインおよび１つのグアニル酸キナーゼドメインを含んでいる。PDZドメインは、NMDA受容体や、Shakerタイプカリウムチャネルおよび脳の一酸化窒素シンターゼとの相互作用を仲介する。SAPAPs (SAP90/PSD-95-関連タンパク質) は原形質膜における PSD-95/SAP90の局在化を促進する。
【００４６】
CNS関連タンパク質は上皮成長因子（EGF）ドメインを含むことがある。Notchタンパク質は反復EGFドメインの細胞外領域を含む膜貫通タンパク質である。Notchタンパク質類（例えばキイロショウジョバエ（Drosophila melanogaster）の神経原性タンパク質Notch）は一般に発達過程の阻害に関わっている。Notchファミリのその他のメンバーはCaenorhabditis elegansのlin-12およびglp-1遺伝子である。遺伝学的研究の示すところによると、lin-12およびglp-1タンパク質は、特定の発達的細胞相互作用における受容体として機能している。その細胞相互作用は、数種の胚欠陥に関わっている可能性がある(Tax, F. E. 他 (1994) Nature 368:150-154)。Pecanex（D. melanogasterの母性効果神経原性遺伝子座）は、或る大きな膜貫通タンパク質をコードしていると考えられている。pecanex遺伝子の母性発現がない場合、胚はNotch突然変異胚の特徴である過剰神経化に似た重度の過剰神経化を発症する(LaBonne, S. G. 他 (1989) Dev. Biol. 136:1-116)。
【００４７】
他のCNS関連シグナル伝達タンパク質はWWドメインを含んでいる。WWドメインは２つの高度に保存されたトリプトファンを持ったタンパク質モチーフである。このドメインはHuntingtin相互作用タンパク質を含む数々のシグナル伝達及び調節タンパク質に存在している。いくつかの繊維芽細胞成長因子（FGF）相同因子（すなわちFHFポリペプチド）も、マウスおよびヒト組織におけるmRNA発現パターンからみて、神経系発達に関与しているとされている。FHFファミリのポリペプチドのメンバーは構造的にプロトタイプのFGFと区別可能であるが、このことはFGF関係タンパク質の異例な役割と整合している(1996) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93:9850-9857 and Hartung, H. 他 (1997) Mech. Dev. 64:31-39）。
【００４８】
神経学的過程に関連する疾患
アルツハイマー病（AD）はCNSの変性疾患であり、成人の中期から後期において漸進的な記憶の喪失と認知の衰退をもたらす。ADはアミロイド沈着および神経内の神経原線維変化を含む広範囲の神経病理学的特徴を持っている。神経変性及びADに至る発病経路はよくわかっていないが、この病気にかかりやすくする遺伝子座が少なくとも3つ特定されている(Schellenberg, G.D. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. 92:8552-8559; Sherrington, R. 他 (1995) Nature 375:754-760)。
【００４９】
家族性英国痴呆症（FBD）は、星状細胞とミクログリアに囲まれたアミロイド斑、神経原線維変化、神経損失、および進行性の痴呆を伴う常染色体優性疾患である。13番染色体のBRI遺伝子は4 kDのペプチドである A-Briをコードしている。この膜固着性のタンパク質はアミロイド沈着の主要な構成成分であり、FBD患者のCNSの病巣におけるその存在がこの疾患に寄与している可能性がある(El-Agnaf, O.M.A. 他 (2001) Biochemistry 40:3449-3457)。
【００５０】
星状細胞腫およびさらに悪性のグリア芽細胞腫は脳における最も一般的な原発腫瘍であり、原発脳腫瘍の65％以上を占めている。これらの腫瘍は星状細胞系統のグリア細胞で生じる。病原体の感染の後、星状細胞は抗原提示細胞として機能し、リンパ球及びマクロファージの活動を調節する。星状細胞は、通常なら病原体の感染の後でのみ生成されるサイトカインおよびインターロイキンを構成的に発現する(de Micco, C. (1989) J. Neuroimmunol. 25:93-108)。星状細胞の分化に関係する遺伝子を特定する過程で、植物病原関係（PR）タンパク質に構造的に関係しているタンパク質をコードする一つのcDNAが星状細胞cDNAライブラリから単離された(Murphy, E.V. 他 (1995) Gene 159:131-135)。神経膠腫病原関係タンパク質（GliPR）はグリア芽細胞腫において高度に発現しているが、胎児や成人の脳あるいはその他の神経系腫瘍においてはそうではない。PRタンパク質はタバコモザイクウイルス等の植物のウイルス感染によって誘導される小さな（10〜20 kDa）のプロテアーゼ耐性タンパク質のファミリである。PRタンパク質の合成は植物における原始的な免疫反応の一部であると考えられている (van Loon, L.C. (1985) Plant Mol. Biol. 4:111-116)。GliPRは、タンパク質の殆ど3分の2を構成する領域にわたってPR-1タンパク質ファミリと最大50％の相同性を示し、その中には金属結合ドメインを形成するように適切な間隔で配置されたアミノ酸の三つ組His-Glu-Hisが含まれている（Murphy 他、前出）。
【００５１】
Trkファミリーの受容体によって開始されたシグナル伝達は神経原性腫瘍において動的な役割を果たす。プロトオンコジーンTｒｋは神経成長因子（NGF）ニューロトロフィンのための高親和性受容体チロシンキナーゼをコードする。再構成されたTrkオンコジーンが結腸および甲状腺乳頭癌などの非神経腫瘍でしばしば観察される。プロトオンコジーンTrkは神経芽細胞腫および髄芽細胞腫のような神経由来の腫瘍の成長、分化およびアポトーシスを制御する(Nakagawara, A. (2001) Cancer Lett.169:107-114)。
【００５２】
Neuronal Thread Proteins (NTP) は脳及び神経管外胚葉腫瘍細胞株に見られる免疫学的に関係のある分子のグループである。神経細胞におけるNTPの発現は、増殖、分化、脳の発達、アルツハイマー病（AD）の脳、及び再生神経発芽に関連する病理学的状態において増加する(de la Monte, S.M. 他 (1996) J. Neuropathol. Exp. Neurol. 55:1038-1050)。末期AD脳ライブラリから単離された組換えNTP（AD7c-NTP）に対して生成されたモノクローナル抗体は、AD脳組織の白質、神経網繊維および周核体において高レベルのNTP免疫活性を示した。in vitroの研究により、NTPの増加調節、リン酸化および周核体から細胞突起および成長円錐への転座が、成長因子に誘導された神経突起発芽および神経分化中に起こることも示された。さらに、NTPの免疫反応性の増加がダウン症候群の脳で10〜20歳の年齢において、広範囲のAD神経変性が確立する前に、そして対照の脳でNTP発現が低レベルまたは不在である年齢において始まることが見出された。これらの知見は、脳内のNTPの異常な発現と蓄積がダウン症候群のAD神経変性の早期マーカーでありえることを示している(de la Monte, S.M. 他 (1996) J. Neurol. Sci. 135:118-125)。さらに、AD脳組織におけるNTPの発現及び蓄積の増加と対応して脳脊髄液（CSF）におけるNTPの増加が平行して起こり、CSF内のNTPの増加はこの病気の早期に検出可能である。
【００５３】
Fe65タンパク質ファミリの新しいメンバーであるFe65様タンパク質（Fe65L2）は、アルツハイマー・ベータアミロイド前駆体タンパク質（APP）の細胞質ドメインと相互作用するリガンドの一つである。APPを発現している遺伝子組換えマウスはアルツハイマー病の顕著な行動及び病理学的な特徴の一部を模倣することが知られているが、その中には年齢に関係した学習及び記憶機能障害、神経損失、グリオーシス、神経突起変化(neuritic changes)、アミロイド沈着及び異常なtauリン酸化が含まれる(Duilio, A. et al. (1998) Biochem. J. 330:513-519)。
【００５４】
筋萎縮性側索硬化症（ALS）は運動ニューロンの死滅、突然変異SOD1のペルオキシダーゼ活性の変化、細胞内の銅のホメオスタシスの変化、タンパク質の凝集、およびグルタミン酸トランスポータの機能の変化による興奮毒性を特徴としている。運動ニューロンの変性には神経フィラメントとペリフェリンがある程度関与しているらしい。ALSはときおり神経フィラメントの重鎖遺伝子の突然変異を伴っている(Al-Chalabi, A. および Leigh, P.N.(2000) Curr. Opin. Neurol. 13:397-405)。神経フィラメント（NF）および/またはペリフェリンを含む異常な封入体などの細胞骨格異常、NF軽（NF-L）タンパク質のｍRNAレベルの減少、およびNF重（NF-H）遺伝子の突然変異がALSにおいて観察されている。ペリフェリンを含む中間フィラメント封入体はALSに寄与している可能性がある(Julien, J.P. および Beaulieu, J.M. (2000) J. Neurol. Sci.180:7-14)。
【００５５】
Miller-Dieker 症候群 (MDS)あるいは孤発性滑脳症（脳回欠損症候群）（ILS）は脳の表面が滑らかで、皮質が厚くて４つの異常な層があり、ニューロンの場所が間違っているという特徴を持っている。いずれの状態もLIS1遺伝子の欠失または突然変異の結果生じている可能性がある。脳回欠損遺伝子産物Lis1は進化的に保存された、神経移動に必須な細胞内マルチタンパク質複合体のコンポーネントであるが、これらの複合体は細胞増殖および細胞内輸送装置のコンポーネントである可能性がある(Leventer, R.J. 他 (2001) Trends Neurosci. 24:489-492)。核移動タンパク質であるNudCはLis1と相互作用する(Morris, S. M. 他 (1998) Curr. Biol. 8:603-606)。
【００５６】
色素性網膜炎(網膜色素変性症)はゆっくりと進行する１群の遺伝性網膜疾患であり、青年期に夜間視力および周辺視野の喪失を引き起こす。ショウジョウバエのオプシン遺伝子のある劣性ナンセンス突然変異は光受容体の変性を引き起こす。一部の家族においては、ロドプシンとペリフェリン/RDSをコードする遺伝子がマップ上でこの病気の遺伝座に非常に近い。ロドプシンとペリフェリン/RDSの突然変異は全ての常染色体優性ケースの約３０％で見られている(Shastry, B.S. (1994) Am. J. Med. Genet. 52:467-474)。
【００５７】
シナプスタンパク質はアルツハイマー病（AD）および虚血を含むその他の疾患、シナプス関連タンパク質が神経終末に異常蓄積するかあるいはシナプスタンパク質が神経除去の後で改変されるようなさまざまな疾患および腫瘍疾患に関与している(Masliah, E. and Terry, R.(1993) Brain Pathol. 3:77-85)。シナプス小胞の主要な内在性膜タンパク質であるシナプトフィジン（SY）の染色体位置はX染色体のサブバンドXp11.22-p11.23である。この領域はWiskott--Aldrich症候群、3種類のX染色体連関の高カルシウム尿腎結石症、そして、色素性網膜炎2、先天的停止性夜盲症およびAland Island眼病等の眼疾患を含むいくつかの遺伝病に関与するとされている(Fisher, S. E. 他 (1997) Genomics 45:340-347)。
【００５８】
BRI遺伝子ファミリーのBRI2アイソフォームの突然変異はヒトの痴呆に関連している(Vidal, R. 他 (2001) Gene 266:95--102)。
【００５９】
神経シグナル伝達系の分子および細胞コンポーネントの変化は、抗欝剤による長期治療の後で観察される気分および認知への効果と相関している。２つのセリン/トレオニンキナーゼ、Ca2+ /カルモジュリン依存タンパク質キナーゼIIおよびサイクリックAMP依存タンパク質キナーゼが抗欝剤治療の後の脳内で活性化される。これに伴って起こるプレシナプス終末および微小管を含む細胞内区画内の選択されたタンパク質基質のリン酸化の変化が、抗欝剤で観察されるシナプス伝達の調節に寄与している可能性がある (Popoli, M. 他 (2001) Pharmacol. Ther. 89:149-170)。レセルピンは鬱病に似た症候を引き起こすことがあり、このことは気分と行動の制御に小胞トランスポータの活動が重要であることを示唆している。精神刺激薬のアンフェタミンは分泌性小胞内のアミンの貯蔵も乱すが、このことは小胞モノアミン輸送の変化が行動に影響しうることを示唆している(Sulzer, D. and S. Rayport (1990) Neuron 5:797-808)。
【００６０】
癲癇および分裂症等のCNS疾患の病理生理学において、GABA感作性神経伝達の減少が関与しているとされている。筋萎縮性側索硬化症（ALS）の患者の運動皮質において、シナプスのグルタミン酸の再取り込みの障害とグルタミン酸トランスポータの発現の減少が見出されている。グリアのグルタミン酸トランスポータが失われると、細胞外グルタミン酸レベルの上昇、興奮性毒性に特徴的な神経変性および漸進的な麻痺が見られた。神経グルタミン酸トランスポータが失われると軽い神経毒性が生じ、結果として癲癇を招く(Rothstein, J.D. 他 (1996) Neuron 16:675-686)。GABAトランスポータの機能は癲癇海馬において減少している。  ドーパミン、ノルエピネフリンおよびセロトニンのトランスポータはコカイン、抗鬱剤およびアンフェタミンを含む臨床関係の精神刺激剤の標的として特に重要である。コカインおよび抗鬱剤は、さまざまなレベルの特異性で除去を制限することにより、アミンのシナプス濃度を上げる働きをするトランスポータ拮抗物質である。アンフェタミンは小胞のアミン貯蔵の枯渇に呼応して、トランスポータ仲介性の流出を増す働きがある(Barker, E.L. and R.D. Blakely (1995) Psychopharmacology 28:321333; Sulzer, D. and S. Rayport (1990) Neuron 5:797808; Wall, S.C. 他 (1995) Mol. Pharmacol. 47:544550)。
【００６１】
中枢神経系は、細菌産物および免疫媒介物質に応答して抗炎症ホルモンカスケードを精緻化することにより、生得的な免疫系を制御する。中枢神経系はさらに迷走神経を通じて伝わるアセチルコリン仲介性遠心性シグナルを通じても応答する。マクロファージで発現するニコチン性コリン作用性受容体はこれらのシグナルを検出し、サイトカイン応答を弱めることにより応答する(Tracey K.J. 他 (2001) FASEB J.15:1575-1576)。
【００６２】
dysferlinは、常染色体劣性肢帯筋ジストロフィータイプ2B (LGMD2B) と遠位筋ジストロフィー（三好ミオパチーー）の患者の突然変異遺伝子のタンパク質産物である。dysferlinは線虫(Caenorhabditis elegans)の精子形成因子FER-1と相同である。もう一つのヒトFER-1様タンパク質（ｆｅｒｌｉｎ）であるｏｔｏｆｅｒｌｉｎは常染色体劣性非症候性難聴（DFNB9）の原因である。すべてのｆｅｒｌｉｎはラットのシナプトタグミンIIIのC2Aドメインと非常に高レベルの相同性を持つ複数のC2ドメインに対応する配列を特徴としている(Britton S. 他 (2000) Genomics 68:313-321)。
【００６３】
RNAの発現
アテローム性動脈硬化症とそれに伴う冠動脈疾患および脳卒中は工業化諸国においてもっとも一般的な死因である。数種の主要な危険因子は同定されているが、この複雑な病気の原因を明らかにし、治療を提供するような完全な分子的な特性付けはまだ実現していない。アテローム性動脈硬化症の血管病巣の成長と退化を分子的に特徴付けするためには、成長、安定性、消失、破裂、そして最も致死的な閉塞性血栓の誘発を含む、病変の特性に寄与する遺伝子を同定することが必要である。
【００６４】
アテローム性動脈硬化症の発生の初期ステップは「脂肪線条」の形成である。コレステロールが豊富な低密度リポタンパク質（LDL）のようなリポタンパク質は血管内膜の細胞外スペースに蓄積し、修飾を受ける。LDLの酸化は循環する酸化防止物質の防御効率が悪い内皮下層スペースでもっとも活発に起こる。LDLの酸化の程度が標的細胞との相互作用に影響する。「最小限酸化された」LDL（MM-LDL）はLDL受容体に結合できるが、酸化されたLDL（Ox-LDL）やこれまでに同定されている「スカベンジャー」受容体（スカベンジャー受容体タイプAおよびB、CD36、CD68/macrosialinおよびLOX-1など）には結合できない(Navab 他 (1994) Arterioscler Thromb Vasc Biol 16:831-842; Kodama 他 (1990) Nature 343:531-535; Acton 他.(1994) J Biol Chem 269:21003-21009; Endemann 他 (1993) J Biol Chem 268:11811-11816; Ramprasad 他 (1996) Proc Natl Acad Sci 92:14833-14838; Kataoka 他 (1999) Circulation 99:3110-3117).。MM-LDLは単球の接着と侵入を促進でき、内皮細胞による単球走化タンパク質１（MCP-1）の放出を刺激し、マクロファージ内でCD36およびスカベンジャー受容体A（SRA）の発現を誘発できる(Cushing 他 (1990) Proc Natl Acad Sci 87:5134-5138; Yoshida 他 (1998) Arterioscler Thromb Vasc Biol 18:794-802; Steinberg (1997) J Biol Chem 272:20963-20966)。SRAと他のスカベンジャー受容体はOx-LDLを結合し、リポタンパク質粒子の取り込みを増強することができる。
【００６５】
単核食細胞は脈管内膜に入り、マクロファージに分化し、Ox-LDLなどの修飾された脂質を摂取する。ほとんどの細胞タイプにおいては、コレステロール含量はLDL受容体と生合成酵素とのフィードバック調節によって厳密に制御されている(Brown および Goldstein (1986) Science 232:34-47)。しかし、マクロファージにおいてはスカベンジャー受容体の追加により無調節でコレステロールが取り込まれることになり(Brown および Goldstein (1983) Annu Rev Biochem 52:223-261)、多数の細胞内脂質液滴が蓄積して「泡細胞」表現型を生成する。コレステロールでいっぱいになり、死んだマクロファージが病変動脈の早期の「脂肪線条」斑の塊と典型的な「進行型」病巣の大部分に寄与している。数多くの研究が、アテローム性硬化血管壁斑の成長と破裂とに寄与するさまざまな泡細胞応答を記述している。これらの応答の中には、多数の成長因子とサイトカイン（近傍の細胞の増殖と接着を促進）、ケモカイン（循環している単球を成長している斑にさらに引き付ける）、タンパク質（細胞外マトリクスの再編を起こす）および組織因子（血栓をトリガしうる）の産生が含まれる(Ross (1993) Nature 362:801-809; Quin 他 (1987) Proc Natl Acad Sci 84:2995-2998)。かくして、アテローム性硬化症の斑形成のほとんどの段階で大量に発生するコレステロールの詰まったマクロファージは、アテローム性硬化過程の開始と最終的な斑の破裂および閉塞性血栓とに寄与する。
【００６６】
Ox-LDLの取り込み中、マクロファージはサイトカインおよび成長因子を産生し、これらが、アテローム発生を調節する、平滑筋細胞増殖および細胞外マトリクス産生などのさらなる細胞イベントを誘発する。さらに、これらのマクロファージは炎症に関与する遺伝子（誘導性一酸化窒素シンターゼなど）を活性化する可能性がある。したがって、泡細胞形成中に差次的に発現する遺伝子はアテローム性硬化過程のマーカーになると予想できる。
【００６７】
受容体および膜関連タンパク質
シグナル伝達は、細胞が細胞外シグナルに応答する一般的プロセスである。原形質膜でのシグナル伝達は、ホルモン、神経伝達物質または成長因子などのシグナル分子が細胞膜受容体に結合することから開始される。このように活性化された受容体によって細胞内の生化学的カスケードが誘発され、このカスケードは転写因子などの細胞内標的分子の活性化で終る。シグナル伝達のこのプロセスは、細胞増殖、分化及び遺伝子転写を含む全てのタイプの細胞機能を制御する。
【００６８】
生体膜はオルガネラと、小胞および細胞自体とを囲む。生体膜は、脂質の２重層シートから成る高度に選択的な透過性障壁であって、シートの構成素材は、ホスホグリセリド、脂肪酸、コレステロール、リン脂質、糖脂質、プロテオグリカン、およびタンパク質である。膜にはイオンポンプや、イオンチャネル、および特異的受容体類があり、受容体は外部刺激を受け、生化学的シグナルを膜の内側に伝達する。これらの膜にはまた、セカンドメッセンジャータンパク質類があって、これらのポンプやチャネルや受容体と相互作用し、これらのシグナルの伝達を増幅し調節する。
【００６９】
原形質膜タンパク質
原形質膜タンパク質（MP）は２群に分けられ、その分類基準は膜からのタンパク質の抽出方法である。膜の外にあるタンパク質すなわち膜表在性タンパク質の放出させるには、極端なイオン強度またはpHを用いるか、尿素などの、タンパク質相互作用の撹乱物質を用いる。膜の内側にあるタンパク質すなわち膜内在性タンパク質を放出させる唯一の方法は、膜の脂質２重層を界面活性剤で溶解することである。
【００７０】
既知の膜内在性タンパク質の大部分は膜貫通タンパク質(TM)であり、細胞外、膜貫通および細胞内ドメインを特徴とする。ＴＭドメイン群は通常、１５〜２５の疎水性アミノ酸からなり、これらのアミノ酸は１つのα螺旋構造をとると予測される。ＴＭタンパク質はバイトピック（bitopic）(タイプIおよびタイプII)と、ポリトピック（polytopic）(タイプIIIおよびタイプIV)  (Singer, S.J. (1990) Annu. Rev. Cell Biol. 6:247-96) に分類され、バイトピックタンパク質は膜を1回貫通するが、ポリトピックタンパク質には、複数の膜貫通セグメントがある。TM タンパク質は種々の重要な細胞機能を果たしており、これには、シグナル伝達に関与する細胞表面受容体タンパク質としての作用が含まれる。これらの機能は、成長因子受容体および分化因子受容体、またショウジョウバエのpecanexやfrizzledタンパク質のような受容体相互作用タンパク質、LIV-1 タンパク質、NF2 タンパク質、およびGNS1/SUR4真核生物膜内在性タンパク質によって示される。ＴＭタンパク質はまた、イオンまたは代謝産物のトランスポータ（例えばギャップ結合チャネル（コネキシン類）とイオンチャネル類）として作用し、また、細胞接着タンパク質（例えばレクチン類とインテグリン類とフィブロネクチン類）として作用する。ＴＭタンパク質は、小胞オルガネラを形成する分子（例えばカベオリン（caveolin）類）、または、細胞認識分子（例えば分化クラスター（CD）抗原、糖タンパク質、およびムチン類）に存在する。
【００７１】
多くの膜タンパク質（MP）には、タンパク質を特定の亜細胞内部位に局在させるよう働く、アミノ酸配列モチーフがある。これらのモチーフの例に、PDZドメイン群や、KDEL、RGD、NGR、およびGSL配列モチーフ群や、フォンウィルブランド因子A（vWFA）ドメイン群や、EGF様ドメイン群がある。RGD、NGR、およびGSLモチーフ含有ペプチド類は、腫瘍血管系の標的癌を治療するための薬物送達剤として用いられている (Arap, W. 他 (1998) Science, 279:377-380)。さらに、膜タンパク質にはまた、糖質認識ドメイン群(CRD)のような細胞外分子や細胞内分子と相互作用するように働くアミノ酸配列モチーフ群がある。
【００７２】
アミノ酸残基側鎖の化学修飾により、MP類が他の分子（例えば膜リン脂質）と相互作用する方法が変わる。このような化学修飾の例に、グリコサミノグリカン類や、少糖類、リン脂質類、アセチル部分およびパルミトイル部分、ADPリボース、リン酸、および硫酸基との、共有結合の形成がある。
【００７３】
膜タンパク質をコードするRNAは選択的スプライス部位を持つことがあり、これらの部位により、同一遺伝子がコードするタンパク質群が、異なるメッセンジャーRNAとアミノ酸配列とを持ち得る。スプライス変異膜タンパク質は、他のリガンドやタンパク質のアイソフォームと相互作用し得る。
【００７４】
受容体
受容体の用語は他の分子を特異的に認識するタンパク質を意味する。そのカテゴリーは広く、様々の機能を持つタンパク質が含まれる。大部分の受容体は、細胞外リガンドと結合して、成長、分化、飲食細胞運動および免疫応答の領域において細胞内応答を生じる細胞表面タンパク質である。他の受容体は、小胞からのタンパク質の選択的な輸送を促進し、細胞内の特定の部位に酵素を局在化させる。この用語はまた、リガンドの受容体として既知の、あるいは未知の化学的組成物と作用するタンパク質や、他の細胞構成成分と相互作用するタンパク質にも適用され得る。例えば、ステロイドホルモン受容体はDNAの転写物に結合し、調節する。
【００７５】
細胞表面受容体は一般に原形質膜内在性タンパク質である。これらの受容体はカテコールアミンのようなホルモン、ペプチドホルモン、成長因子、分化因子、甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン、ガラニン、ソマトスタチン、およびタキキニンおよび循環系で運ばれるシグナル伝達分子を認識する。  免疫系細胞上の細胞表面受容体は、抗原、抗体、および主要組織適合性複合体（MHC）結合ペプチドを認識する。他の細胞表面受容体はリガンド類に結合し、リガンドはその細胞によって取り込まれる。この受容体介在性エンドサイトーシスは、低密度リポタンパク質（LDL）、トランスフェリン、グルコース末端糖タンパク質、マンノース末端糖タンパク質、ガラクトース末端糖タンパク質、免疫グロブリン、ホスホビテロゲニン（phosphovitellogenin）類、フィブリン、プロテイナーゼ-阻害剤複合体、プラスミノーゲン活性化因子、およびトロンボスポンジンの取り込み時に機能する(Lodish, H. 他 (1995) Molecular Cell Biology, Scientific American Books, New York NY, p. 723; Mikhailenko, I. 他(1997) J. Biol. Chem. 272:6784-6791).
受容体プロテインキナーゼ
多くの成長因子受容体(例えば、上皮性成長因子、血小板由来成長因子、線維芽細胞成長因子、および成長調節因子αトロンビン等)には固有のプロテインキナーゼ活性がある。成長因子が受容体に結合すると、受容体のセリン、トレオニン、またはチロシン残基の自己リン酸化が誘発される。これらのリン酸化部位は他の細胞質シグナル伝達タンパク質結合の認識部位となる。これらのタンパク質は、細胞表面での最初の受容体の活性化を最終的に特異的細胞内標的分子の活性化に結びつけるシグナル伝達経路に関与する。チロシン残基自己リン酸化の場合、これらのシグナル伝達タンパク質にはSrc 相同性(SH)ドメインと呼ばれる共通ドメインが含まれている。SH2ドメインおよびSH３ドメインはホスホリパーゼC-γ、PI-3-K p85 調節サブユニット、Ras-GTPアーゼ活性化タンパク質およびpp60csrc に存在する。(Lowenstein, E.J. 他 (1992) Cell 70:431442).サイトカインファミリの受容体は異なった共通結合ドメインを共有しており、成長ホルモン(GH)、インターロイキン、エリスロポエチンおよびプロラクチンが含まれる。
【００７６】
他の受容体およびセカンドメッセンジャー結合タンパク質は内在性セリン/トレオニンプロテインキナーゼ活性を有する。これらにはアクチビン/TGF-β/BMP-スーパファミリ受容体、カルシウムおよびジアシルグリセロール活性化/リン脂質依存性プロテインキナーゼ(PK-C)およびRNA依存性プロテインキナーゼ(PK-P)が含まれる。さらに、線虫Twitchinを含む他のセリン/トレオニンプロテインキナーゼはフィブロネクチン様、免疫グロブリンC２様ドメインを有する。
【００７７】
Ｇタンパク質共役受容体
今までに同定されている遺伝子の最も大きいファミリーの１つによってコードされるＧタンパク質共役受容体（GPCR）は、原形質膜での細胞外シグナルの伝達において中心的役割を果たす。GPCRが治療の標的として成功していることは歴史的に証明されている。
【００７８】
GPCRは、７つの疎水性膜貫通ドメインを有することを特徴とする膜内在性タンパク質であり、それらのドメインがまとまって逆平行アルファ（α）螺旋の束を形成するようになる。GPCRのサイズは、４００以下から１０００以上のアミノ酸に及ぶ（Strosberg, A.D. (1991) Eur. J. Biochem. 196:1-10、Coughlin, S.R. (1994) Curr. Opin. Cell Biol. 6:191-197）。GPCRのアミノ末端は、細胞外にあり、長さが可変で、多くの場合グリコシル化される。カルボキシル末端は、細胞質内にあり、通常はリン酸化される。細胞外ループは、細胞内ループと交互に現れ、膜貫通ドメインに連結している。第２及び第３細胞外ループを結びつけるシステインジスルフィド架橋は、アゴニスト及びアンタゴニストと相互作用し得る。GPCRの最も保存されたドメインは、膜貫通ドメイン及び最初の２つの細胞質ループである。膜貫通ドメインによって、受容体の構造的及び機能的特徴がある程度決まる。大抵の場合、αへリックスの束がリガンド結合ポケットを形成する。細胞外Ｎ末端セグメント、または３つの細胞外ループの内の１つまたは複数のループが、リガンド結合にも関与し得る。リガンド結合によって、受容体の細胞内部分に構造的変化が誘発されて受容体が活性化される。次に、この活性化された受容体の大きな第３の細胞内ループがヘテロ３量体であるグアニンヌクレオチド結合Ｇタンパク質複合体と相互作用し、このGタンパク質複合体が更に細胞内のシグナル伝達作用を媒介する。この細胞内のシグナル伝達作用には、サイクリックAMP（cAMP）、ホスホリパーゼC、およびイノシトール三リン酸などのセカンドメッセンジャーの活性化、並びに活性化されたGPCRとイオンチャネルタンパク質との相互作用が含まれる(Watson, S.およびS. Arkinstall (1994) The G-protein Linked Receptor Facts Book, Academic Press, San Diego CA, 2-6ページ、Bolander, F.F. (1994) Molecular Endocrinology, Academic Press, San Diego CA,162-176ページ、Baldwin, J.M. (1994) Curr. Opin. Cell Biol. 6:180190等参照)。
【００７９】
GPCRには、感覚性シグナルメディエータ（例えば光及び嗅覚刺激性分子）の受容体、アデノシン、γアミノ酪酸（GABA）、肝細胞成長因子、メラノコルチン、ニューロペプチドY、オピオイドペプチド、オプシン、ソマトスタチン、タキキニン、血管作用性腸管ポリペプチドファミリー及びバソプレシン、生体アミン（例えばドーパミン、エピネフリン及びノルエピネフリン、ヒスタミン、グルタミン酸（代謝調節作用）、アセチルコリン（ムスカリン様作用）及びセロトニン）、ケモカイン、炎症の脂質メディエータ（例えばプロスタグランジン及びプロスタノイド、血小板活性化因子及びロイコトリエン）及びペプチドホルモン（例えばボンベシン、ブラジキニン、カルシトニン、C5aアナフィラトキシン、エンドセリン、卵胞刺激ホルモン（FSH）、ゴナドトロピン放出ホルモン（GnRH）、ニューロキニン及び甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン（TRH）及びオキシトシン）がある。まだ同定されていない刺激の受容体として作用するGPCRは、オーファン受容体として知られている。
【００８０】
GPCR突然変異は、機能または構造的活性化の減少を招き得るものであり、多数のヒト疾患に関係してきた（前出のCoughlin）。例えば、色素性網膜炎はロドプシン遺伝子の突然変異から発生し得る。更に、甲状腺刺激ホルモン受容体の体細胞活性化突然変異は、機能亢進甲状腺アデノーマの原因となることが報告されており、恒常的活性化に感受性が高い或るGPCRが癌原遺伝子のように振舞い得ることを示唆している（Parma, J. 他 (1993) Nature 365:649-651）。以下のリガンド即ち黄体形成ホルモン（思春期早発症）、バソプレシンV2（X連鎖の腎原発性糖尿病）、グルカゴン（糖尿病及び高血圧）、カルシウム（副甲状腺機能亢進症、低カルシウム尿症(hypocalcuria)、高カルシウム血症）、副甲状腺ホルモン（短肢小人症）、b3-アドレナリン受容体（肥満症、非インスリン依存型糖尿病）、成長ホルモン放出ホルモン（小人症）及び副腎皮質刺激ホルモン（糖質コルチコイド欠乏症）に対するGPCR受容体には、ヒトの疾患に関連する突然変異も含まれる（Wilson, S. 他 (1998) Br. J. Pharmocol. 125:1387-.1392、Stadel, J.M. 他 (1997) Trends Pharmacol. Sci. 18:430-437）。GPCRは、抑うつ症、分裂病、不眠症、高血圧、不安、ストレス、腎不全その他幾つかの心血管障害にも関与している（Horn, F. および G. Vriend (1998) J. Mol. Med. 76:464-468）。
【００８１】
更に、GPCRの活性化及び阻害に直接作用する数百の新薬が過去２０年のうちに認知されてきた。これらの薬剤の治療標的は、癌、骨粗鬆症、子宮内膜症のみならず心血管障害、胃腸障害、中枢神経系疾患を含めた広範囲の疾病及び疾患に及ぶ（前出のWilson、同Stadel）。例えば、ドーパミンアゴニストのＬドーパはパーキンソン病の治療に用いられ、ドーパミンアンタゴニストは精神分裂病及びハンチントン病の初期段階の治療に用いられる。アドレナリン受容体のアゴニスト及びアンタゴニストは、喘息、高血圧その他の心血管障害及び不安の治療に用いられてきた。 ムスカリン様アゴニストは、緑内障及び頻脈の治療に用いられ、セロトニン5HT1Dアンタゴニストは片頭痛に対して用いられ、ヒスタミンH1アンタゴニストはアレルギー性及びアナフィラキシー性反応、枯草熱、痒み及び動揺病に対して用いられる（前出のHorn）。
【００８２】
核受容体
核受容体はホルモンやセカンドメッセンジャーなどの小さな分子を結合し、ひいては特定の染色体DNAエレメントへの受容体結合親和性を高める。他の核タンパク質への親和性も改変される可能性がある。こうした結合およびタンパク質間相互作用が遺伝子発現を調節し変調させる可能性がある。こうした受容体の例としては、ステロイドホルモン受容体ファミリー、レチノイン酸受容体ファミリーおよび甲状腺ホルモン受容体ファミリーなどが挙げられる。
【００８３】
リガンド依存性受容体イオンチャネル
リガンド依存性受容体イオンチャネルは2つのカテゴリーに分かれる。第1のカテゴリーである細胞外リガンド依存性受容体イオンチャネル(ELG)は、神経伝達物質結合を迅速なシナプス神経伝達のような電気シグナルに急速に変換する。ELG機能は翻訳後修飾によって調節される。第二のカテゴリーである細胞内リガンド依存性受容体イオンチャネル(ILG)は多くの細胞内セカンドメッセンジャーによって活性化され、チャネル開放応答に作用する際、翻訳後修飾を必要としない。
【００８４】
ELGは、活動電位の発生の閾値にまで興奮性細胞を脱分極する。非興奮性細胞においては、ELGはアゴニストの存在時に限られたカルシウムイオン流入を可能にする。ELGにはアセチルコリン、L-グルタミン酸、グリシン、ATP、セロトニン、GABAおよびヒスタミンのような神経伝達物質によって直接制御されるチャネルが含まれる。ELG遺伝子は構造的かつ機能的に強い類似性を有するタンパク質をコードする。ILGは異なった、関連しない遺伝子ファミリによってコードされ、また、cAMP、 cGMP、カルシウムイオン、 ATPおよびアラキドン酸の代謝産物に対する受容体群を含む。
【００８５】
マクロファージスカベンジャー受容体
マクロファージスカベンジャー受容体類は広いリガンド特異性を持っており、低密度リポタンパク質（LDL）や外来抗原との結合に関与し得る。スカベンジャー受容体タイプIおよびIIは三量体膜タンパク質であり、各サブユニットには小さいN末端細胞内ドメインと、１つの膜貫通ドメインと、１つの大きな細胞外ドメインと、C末端システインリッチドメインとがある。細胞外ドメインには１つの短いスペーサードメインと、１つのα螺旋コイルドコイルドメインと、１つの３重螺旋コラーゲン性ドメインとがある。これらの受容体は或る範囲のリガンド群と結合することが示され、リガンドの例には、化学修飾されたリポタンパク質およびアルブミンと、ポリリボヌクレオチドと、ポリサッカライドと、リン脂質と、アスベストとがある（Matsumoto, A. 他 (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. 87:9133-9137; および Elomaa, O. 他 (1995) Cell 80:603-609）。スカベンジャー受容体が主要な役割を果たすと思われるのはアテローム発生においてであり、これは、動脈壁内の、修飾されたLDLの取り込みを媒介して働き、また宿主防御においては、細菌性エンドトキシンと、細菌と、原虫とに結合して働く。
【００８６】
T細胞受容体
T細胞は免疫系において作動体および調節因子としての二つの役割を果たしており、感染細胞で細胞死を誘発し、他の免疫細胞の増殖を刺激するシグナルの伝達と抗原認識を連関する。T細胞の集団は広範囲の異なった抗原を認識できるが、個々のT細胞は一つの抗原のみを、抗原提示細胞表面上の主要組織適合分子(MHC)との複合型ペプチドとしてT細胞受容体(TCR)に提示された場合のみに認識できる。大部分のT細胞上のTCRは免疫グロブリン様膜内在性糖タンパク質からなる。この免疫グロブリン様膜内在性糖タンパク質は、似た分子量のαとβの二つのポリペプチドサブユニットを含む。両方のTCRサブユニットは、可変領域と定常領域の両方を有する細胞外ドメイン、膜を1回貫通する膜貫通ドメイン、および短い細胞内ドメインを有する(Saito, H. 他 (1984) Nature 309:757-762)。TCRサブユニットの遺伝子は、異なった遺伝子区分の体細胞性再構成によって作成される。適切なMHC状況における抗原とTCRとの相互作用によって、免疫系の細胞要素の増殖、成熟および機能を誘発するシグナルカスケードが開始される(Weiss, A. (1991) Annu. Rev. Genet. 25: 487-510)。リンパ腫、白血病、自己免疫疾患および免疫不全疾患においてTCR遺伝子の再編成とTCR発現の変化が注目されている(Aisenberg, A.C. 他 (1985) N. Engl. J. Med. 313:529-533; Weiss, 前出)。
【００８７】
ネトリン受容体：
ネトリンは拡散性誘引物質および忌避物質として働いて発達中の神経系内で遊走している細胞や軸索をその標的に誘導する分子のファミリーである。このネトリンの受容体には線虫(C. elegans)タンパク質UNC-5および、最近脊椎動物中に同定された相同体が含まれる(Leonardo, E.D. 他 (1997) Nature 386:833-838)。これらの受容体は免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーであり、またZU5 ドメインと呼ばれる特徴的ドメインも含んでいる。ネトリン受容体ファミリーのマウスメンバーにおける突然変異であるRcm(吻側小脳形成異常)では、明らかに神経細胞異常遊走の結果である小脳および中脳欠損を生じている(Ackerman, S.L.. et al. (1997) Nature 386:838-842)。
【００８８】
VPS10 ドメイン含有受容体
VPS10含有受容体ファミリのメンバーはすべて、酵母の液胞ソーティング・タンパク質10 (VPS10) 受容体に相同性を持つドメインを含んでいる。このファミリーには、マウス胚性および出生後早期の神経系発達時に発現するSorCS、モザイク受容体SorLA、およびニューロテンシン受容体sortilinが含まれる(Hermey, G. 他 (1999) Biochem. Biophys. Res. Commun. 266:347-351; Hermey, G. 他 (2001) Neuroreport 12:29-32).このファミリーの最近同定されたメンバーであるSorCS2は発達中および成熟したマウスの中枢神経系に高度に発現される。その発現の主要部位は底板であり、ドーパミン性脳核および視床背側核を含む脳領域においても一過性に高度に検出される(Rezgaoui, M. (2001) Mech. Dev. 100:335-338)。
【００８９】
膜結合タンパク質
テトラスパンファミリータンパク質
膜４回貫通型スーパーファミリー(TM4SF)、別名テトラスパンファミリーは多重遺伝子族であり、タイプIII膜内在性タンパク質をコードする（Wright, M.D. および Tomlinson, M.G. (1994) Immunol. Today 15:588）。このTM4SFは、細胞膜を４回貫通する膜タンパク質からなる。TM4SFのメンバーの例には、血小板および内皮細胞の膜タンパク質と、黒色腫関連抗原、白血球表面糖タンパク質、結腸癌腫抗原、腫瘍関連抗原、および住血吸虫表面タンパク質がある（Jankowski, S.A. (1994) Oncogene 9:1205-1211）。TM4SFの各メンバーは、約２５〜３０％のアミノ酸配列同一性を互いに共有する。  多数のTM4SFメンバーが関与すると示唆されている作用は、シグナル伝達、細胞接着の制御、細胞の成長と増殖との調節（例えば発生および発癌）、並びに細胞運動性（例えば腫瘍細胞転移）である。TM4SFタンパク質の発現は多様な腫瘍に関連し、発現のレベルは、細胞が成長する際や活性化する際に改変され得る。
【００９０】
腫瘍抗原
腫瘍抗原は表面分子であり、腫瘍細胞では正常細胞と異なる発現をする。腫瘍抗原は、腫瘍細胞を免疫的に正常細胞と区別し、ヒトの癌に関する診断と治療の標的を提供する（Takagi, S. 他 (1995) Int. J. Cancer 61: 706-715; Liu, E. 他 (1992) Oncogene 7: 1027-1032）。
【００９１】
イオンチャネル
イオンチャネルは、事実上、身体のあらゆる細胞の原形質膜内に見られる。例えば、塩素イオンチャネルは多様な細胞機能を媒介し、その機能の例には、膜電位の調節と、上皮膜を通ってのイオンの吸収と分泌とがある。塩素イオンチャネルが、ゴルジ体とエンドサイトーシス小胞の細胞内の膜にある場合、オルガネラのpHをも調節する（例えばGreger, R. (1988) Annu. Rev. Physiol. 50:111-122を参照）。塩素イオンチャネル類の電気生理的および薬理学的特性、例えばイオンコンダクタンス、電流-膜電位関係、およびモジュレーター(修飾因子）類への感受性は、筋肉、神経細胞、線維芽細胞、上皮細胞、および白血球に、別々の塩素イオンチャネルがあることを示唆する。多くのチャネルは、１個若しくは数個のプロテインキナーゼによるリン酸化部位を有する。 プロテインキナーゼには、プロテインキナーゼA、プロテインキナーゼC、チロシンキナーゼ及びカゼインキナーゼIIがあり、これらはすべて細胞のイオンチャネル活性を調節する。細胞内におけるタンパク質の不適切なリン酸化は、細胞周期の進行および細胞分化における変化に関連する。細胞周期における変化は、アポトーシスの誘発や癌の誘発に関連することが示されている。細胞分化における変化は、生殖系、免疫系、および骨格筋の、疾患や障害に関連することが示されている。
【００９２】
小脳顆粒神経細胞は非不活化カリウム電流を持ち、これは神経伝達物質からの受容体刺激による発火頻度を調節し、また、静止膜電位を制御する。非不活化電流を示すカリウムチャネル類の例に、ether a go-go (EAG) チャネルがある。KCR1と名付けられた膜タンパク質は、ラットEAGと特異的にそのC末端領域で結合し、小脳非不活化カリウム電流を調節する。KCR1は、１２の膜貫通ドメイン群と、細胞内にアミノ酸末端およびカルボキシル末端を含むと予測される。これらの膜貫通領域の構造的特徴はトランスポータスーパーファミリーの領域に類似しているように見えるが、KCR1と既知のトランスポータとの間に相同性は見られないことから、KCR1は新規クラスのトランスポータに属すことが示唆される。KCR1は、非不活化カリウムチャネルの調節成分と考えられる (Hoshi, N. 他 (1998) J. Biol. Chem. 273:23080-23085)。
【００９３】
ＡＢＣ輸送体
ATP結合カセット（ABC）輸送体、別名「輸送ATPアーゼ」は膜タンパク質のスーパーファミリーであり、原核生物と真核生物とにおける輸送機能とチャネル機能とを媒介する（Higgins, C.F. (1992) Annu. Rev. Cell Biol. 8:67-113）。ABCタンパク質類は、類似した全体構造と、顕著な配列相同性とを共有する。すべてのABCタンパク質には約２００アミノ酸残基の或る保存されたドメインがあり、これには１つ以上のヌクレオチド結合ドメインが含まれている。ABC輸送体遺伝子群における突然変異は、高ビリルビン血症II／Dubin-Johnson症候群、劣性スタルガルト病、X染色体連鎖副腎白質ジストロフィー、多剤耐性、小児脂肪便症、および嚢胞性線維症など、様々な疾患に関与する。
【００９４】
細胞間伝達に関連する膜タンパク質
細胞間伝達は、多細胞生物の発生と生存とに必須である。細胞は、タンパク質シグナル伝達分子の分泌と取り込みとによって互いに通信する。細胞内へのタンパク質の取り込みを達成する手段がエンドサイトーシスであり、ここでは、シグナル伝達分子と原形質膜表面との相互作用が、しばしば特異的受容体への結合を通じて行われる結果、形質膜由来小胞を形成し、これらの小胞が分子を取り囲み、細胞質内に運ぶ。細胞からのタンパク質の分泌を達成する手段がエキソサイトーシスであり、ここでは、細胞内の分子が、トランスゴルジ網に由来する、膜に囲まれた輸送小胞内に詰められる。これらの小胞は原形質膜と融合し、小胞の内容物を周囲の細胞外空間に放出する。エンドサイトーシスとエキソサイトーシスとの結果、原形質膜成分の除去と追加とが起こり、また、これらの成分のリサイクルは、原形質膜と、膜に囲まれた内部区画との双方の、完全性、同一性、および機能性の維持に必須である。
【００９５】
Nogo は中枢神経系ミエリンの成分として同定され、成熟した脊椎動物における軸索再生を防ぐ。Nogo-66 受容体の切断および軸索表面からのグリコホスファチジルイノシトール結合タンパク質は神経細胞をNogo-66に対して非感受性にして中枢神経系障害からの回復を促進する(Fournier, A.E. 他 (2001) Nature 409:341-346)。
【００９６】
リソソームは、自己貪食時の細胞内物質分解の部位であり、また、エンドサイトーシス後の細胞外分子の分解の場でもある。リソソーム酵素は、トランスゴルジ網から出芽する小胞内に詰められる。これらの小胞はエンドソームと融合して成熟リソソームを形成し、成熟リソソーム内では、エンドサイトーシスによって取り込まれた物質の加水分解性消化が起こる。リソソームはオートファゴソームと融合し、独特な区画を形成し得る。この区画の中では、オルガネラや他の細胞内成分の分解が起こる。
【００９７】
輸送小胞、例えばエンドソームによるタンパク質選別は、多様な生理的過程にとって重要な結果をもたらす。このような過程の例に、細胞表面成長、異なる細胞内オルガネラ群の生合成、エンドサイトーシス、および、ホルモンと神経伝達物質との制御された分泌がある（Rothman, J.E. および Wieland, F.T. (1996) Science 272:227-234）。特に、神経変性障害その他の神経病理には、エンドソームのタンパク質選別時、または、エンドソーム生合成の際の生化学的欠陥が関連する（Mayer R.J. 他 (1996) Adv. Exp. Med. Biol. 389:261-269）。
【００９８】
ペルオキシソーム類は、分泌経路とは独立したオルガネラである。これらは、細胞内の、過酸化物を生成する多くの酸化反応の場である。ペルオキシソームは、真核細胞のオルガネラの中でもサイズや数が独特であり、また、酵素内容は、生物と細胞タイプと代謝の需要によって異なる（Waterham, H.R. および Cregg, J.M. (1997) BioEssays 19:57-66）。ペルオキシソームタンパク質に遺伝子欠損があるとペルオキシソーム欠損症を生じ、この欠損が関連付けられる多数のヒト病理の例に、ツェルヴェーガー症候群、近位肢型点状軟骨異形成（rhizomelic chondrodysplasia punctata）、X染色体連鎖副腎白質ジストロフィー、アシルCoAオキシダーゼ欠損症、二頭酵素欠損症、古典的Refsum病、DHAPアルキルトランスフェラーゼ欠損症、および無カタラーゼ血症がある（Moser, H.W. および Moser, A.B. (1996) Ann. NY Acad. Sci. 804:427-441）。また、Gartner, J. 他 (1991; Pediatr. Res. 29:141-146) は、ツェルヴェーガー症候群の患者における低密度ペルオキシソーム様細胞内分画に関連する或る22 kDaの膜内在性タンパク質を発見した。
【００９９】
正常な胚発生と、生殖細胞成熟の制御とを変調する多数の分泌タンパク質は、それぞれの膜結合受容体と相互作用する。胚発生時の細胞運命は、アクチビン（activin）／TGF-βスーパーファミリーのメンバー、カドヘリン、IGF-2、および他のモルフォゲンによって決定される。また、生殖細胞と生殖組織との増殖、成熟、および再分化は、例えばIGF-2、インヒビン、アクチビン、およびフォリスタチン（follistatins）によって調節される（Petraglia, F. (1997) Placenta 18:3-8; Mather, J.P. 他 (1997) Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 215:209-222）。トランスフォーミング成長因子β(TGFベータ) シグナル伝達は、II型TGFベータ受容体(TbetaRII) とリン酸化I型TGFベータ受容体(TbetaRI)の連続して作用する二つの受容体セリン/トレオニンキナーゼによって媒介される。TbetaRI結合タンパク質1 (TRECAP1)はI型トランスフォーミング成長因子β受容体の静止形態と活性形態を識別し、TGFベータシグナル伝達に関連している(Charng, M.J 他(1998) J. Biol. Chem. 273:93659368)。
【０１００】
レチノイン酸受容体α(RAR α) はレチノイン酸によって誘発される成熟を媒介し、骨髄の発達に関与する。顆粒球分化中にレチノイン酸によって誘発される遺伝子には、造血特異的遺伝子のE3が含まれているが、E3は骨髄造血時の活性RARαの直接の標的となる。
【０１０１】
μ-オピオイド受容体(MOR)は、モルフィン、コデイン、メサドンおよびフェンタニル並びにヘロインなどの鎮痛薬の作用を媒介する。MORはGタンパク質活性化カリウムチャネルに機能的に結合する(Mestek A. 他 (1995) J. Neurosci. 15:2396-2406)。多様なMORサブタイプが存在する。ソマトスタチン2、ドパミンD2、プロスタグランディンEP3、およびセロトニン受容体サブタイプ 5ヒドロキシトリプタミン4 および5ヒドロキシトリプタミン7 を含む多数のGタンパク質共役受容体と同様にMOR-1で選択的スプライシングが見られる(Pan, Y.X. 他 (1999) Mol. Pharm. 56:396403)。
【０１０２】
膜表在性タンパク質および固着膜タンパク質
いくつかの膜タンパク質は膜貫通しておらず、膜アンカー(固着)または膜内在性タンパク質との相互作用を介して原形質膜に固着している。膜アンカーは翻訳後のあるタンパク質に共役的に結合しており、プレニル、ミリスチルおよびグリコシルホスファチジルイノシトール基のような部分が含まれる。膜表在性タンパク質および固着タンパク質の膜局在化は受容体媒介シグナル伝達などのプロセスにおける機能にとって重要である。例えば、Rasのプレニル化は原形質膜への局在化に必要であり、またシグナル伝達における正常作用および発ガン性作用に必要とされる。
【０１０３】
発現プロファイリング
アレイ技術は、単一の多型遺伝子の発現や、多数の関連遺伝子または無関係の遺伝子の発現プロファイルを探求する簡単な方法を提供し得る。単一遺伝子の発現を試験するときは、アレイを用いて或る特定遺伝子又はその変異体の発現を検出する。発現プロファイルを調べると、組織特異的であり、毒性試験でテストする物質によって影響され、シグナル伝達カスケードの一部であり、細胞の生存に基本的に必要な機能を実行する、または特定の遺伝的素因、状態、疾患または障害に特に関連する遺伝子を同定するためのプラットホームをアレイは提供する。
【０１０４】
B細胞リンパ芽球
RPMI 6666はホジキン病の29歳の男性の末梢血から得られたB細胞リンパ芽球細胞株である。RPMI 6666細胞は未成熟なリンパ球産生免疫グロブリンであり、細胞結合エプスタインバーウイルス（EBV）粒子を提示する。RPMI 6666細胞は、ヒトB細胞のシグナル伝達の研究および、これらの細胞で産生される因子の同定に使用されてきた。グラム陰性菌の外膜はリポ多糖（LPS）複合体を発現するが、この複合体はエンドトキシンと呼ばれ、生物学的な効果を持っている。毒性はLPSの脂質成分（脂質A）に関連していて、免疫原性はLPSの多糖成分に関連している。LPSはさまざまな炎症反応を誘発し、代替的(properdin) 経路によって補体を活性化するため、しばしばグラム陰性菌感染の病理にかかわっている。グラム陰性菌はおそらく微量のエンドトキシンを成長時に放出している。たとえば、特に若い培地からは少量のエンドトキシンが可溶型で放出されうることが知られている。しかし、だいたいにおいてエンドトキシンは細菌が分解するまで細胞壁に結合したままである。 in vivo における分解は細菌の自己溶解、補体とリゾチームによって仲介された外部溶解、および細菌細胞の食細胞消化の結果として起こる。LPSは、グラム陰性菌の溶解によって血流中に放出されると、まずLPSタンパク質として同定される数種の血漿タンパク質に結合されると考えられている。LPS結合タンパク質複合体は、B細胞、マクロファージ、および単球上のCD14受容体および、内皮細胞上のその他の受容体と相互作用する。LPSでヒトB細胞を活性化すると、有糸分裂が誘起され、免疫グロブリン合成も起こる。
【０１０５】
新規の神経伝達関連タンパク質およびそれらをコードするポリヌクレオチド群の発見により、新規の組成物群を提供することで、当分野の要望に応えることができる。これら新規の組成物は、自己免疫／炎症疾患、心血管疾患、神経疾患、発達障害、癌を含む細胞増殖異常、輸送障害、精神疾患、代謝疾患、および内分泌疾患の診断・治療・予防において有用であり、また、神経伝達関連タンパク質の核酸配列およびアミノ酸配列の発現における外因性化合物群の効果についての算定にも有用である。
【発明の開示】
【発明の効果】
【０１０６】
本発明は、総称して「NTRAN」、個別には「NTRAN-1」、「NTRAN-2」、「NTRAN-3」、「NTRAN-4」、「NTRAN-5」、「NTRAN-6」、「NTRAN-7」および「NTRAN-8」と呼ばれるような、実質的に精製されたポリペプチドである神経伝達関連タンパク質を提供する。或る実施態様において本発明は、（ａ）SEQ ID NO:1-8からなる群から選択したアミノ酸配列からなるポリペプチド、（ｂ）SEQ ID NO:1-8からなる群から選択したアミノ酸配列と少なくとも９０％が同一である天然のアミノ酸配列を含むポリペプチド、（ｃ）SEQ ID NO:1-8からなる群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドの生物学的活性断片、または（ｄ）SEQ ID NO:1-8からなる群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドの免疫原性断片を含む群から選択した単離されたポリペプチドを提供する。一実施態様では、SEQ ID NO:1-8のアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチドを提供する。
【０１０７】
また、本発明は（ａ）SEQ ID NO:1-8からなる群から選択したアミノ酸配列を含むポリペプチド、（ｂ）SEQ ID NO:1-8からなる群から選択したアミノ酸配列と少なくとも９０％の相同性を有する天然のアミノ酸配列を含むポリペプチド、（ｃ）SEQ ID NO:1-8からなる群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドの生物学的活性断片、および（ｄ）SEQ ID NO:1-8からなる群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドの免疫原性断片からなる群より選択されたポリペプチドをコードするような単離されたポリヌクレオチドを提供する。一実施態様では、ポリヌクレオチドはSEQ ID NO:1-8からなる群から選択したポリペプチドをコードする。別の実施態様では、ポリヌクレオチドはSEQ ID NO:9-16からなる群から選択される。
【０１０８】
本発明は更に、（ａ）SEQ ID NO:1-8からなる群から選択したアミノ酸配列を含むポリペプチド、（ｂ）SEQ ID NO:1-8からなる群から選択したアミノ酸配列と少なくとも90%が同一である天然のアミノ酸配列を含むポリペプチド、（ｃ）SEQ ID NO:1-8からなる群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドの生物学的活性断片、および（ｄ）SEQ ID NO:1-8からなる群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドの免疫原性断片からなる群から選択したポリペプチドをコードするようなポリヌクレオチドと機能的に連結したプロモーター配列を有する組換えポリヌクレオチドを提供する。一実施態様では、本発明は組換えポリヌクレオチドを用いて形質転換した細胞を提供する。別の実施態様では、本発明は組換えポリヌクレオチドを含む遺伝形質転換体を提供する。
【０１０９】
更に本発明は、（ａ）SEQ ID NO:1-8からなる群から選択されたアミノ酸配列からなるポリペプチドと、（ｂ）SEQ ID NO:1-8からなる群から選択されたアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有する天然のアミノ酸配列からなるポリペプチドと、（ｃ）SEQ ID NO:1-8からなる群から選択されたアミノ酸配列を有するポリペプチドの生物学的に活性な断片と、（ｄ）SEQ ID NO:1-8とからなる群から選択されたアミノ酸配列を有するポリペプチドの免疫原性断片とからなる群から選択されたポリペプチドを製造する方法を提供する。製造方法は、（ａ）組換えポリヌクレオチドを用いて形質転換した細胞をポリペプチドの発現に適した条件下で培養する過程と、（ｂ）そのように発現したポリペプチドを回収する過程とを有し、組換えポリヌクレオチドはポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに機能的に連結したプロモーター配列を有する。
【０１１０】
本発明は更に、（ａ）SEQ ID NO:1-8からなる群から選択したアミノ酸配列を含むポリペプチド、（ｂ）SEQ ID NO:1-8からなる群から選択したアミノ酸配列と少なくとも９０％同一である天然のアミノ酸配列を含むポリペプチド、（ｃ）SEQ ID NO:1-8からなる群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドの生物学的活性断片、および（ｄ）SEQ ID NO:1-8からなる群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドの免疫原性断片からなる群から選択されたポリペプチドに特異結合するような単離された抗体を提供する。
【０１１１】
本発明は更に、（ａ）SEQ ID NO:9-16からなる群から選択したポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、（ｂ）SEQ ID NO:9-16からなる群から選択したポリヌクレオチド配列と少なくとも９０％の同一性を有する天然のポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、（ｃ）（ａ）に相補的なポリヌクレオチド、（ｄ）（ｂ）に相補的なポリヌクレオチド、および（ｅ）（ａ）〜（ｄ）のRNA等価物からなる群から選択された単離されたポリヌクレオチドを提供する。一実施態様では、ポリヌクレオチドは少なくとも６０の連続したヌクレオチドを有する。
【０１１２】
本発明は更に、サンプル中の標的ポリヌクレオチドを検出する一方法を提供する。ここで、標的ポリヌクレオチドは、（ａ）SEQ ID NO:9-16からなる群から選択した或るポリヌクレオチド配列を持つポリヌクレオチド、（ｂ）SEQ ID NO:9-16からなる群から選択した或るポリヌクレオチド配列との少なくとも９０％の同一性を有する天然ポリヌクレオチド配列を持つポリヌクレオチド、（ｃ）（ａ）のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド、（ｄ）（ｂ）のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド、および（ｅ）（ａ）〜（ｄ）のRNA等価物、からなる群から選択した、或るポリヌクレオチドの配列を持つ。検出方法は、（ａ）サンプル中の前記の標的ポリヌクレオチドに相補的な配列を含む、少なくとも２０の連続したヌクレオチドを含むプローブを用いて該サンプルをハイブリダイズする過程と、（ｂ）ハイブリダイゼーション複合体の存在・不存在を検出し、複合体が存在する場合にはオプションでその量を検出する過程からなり、プローブと標的ポリヌクレオチドあるいはその断片の間でハイブリダイゼーション複合体が形成されるような条件下で、プローブは標的ポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズする。一実施態様では、プローブは少なくとも６０の連続したヌクレオチドを含む。
【０１１３】
本発明はまた、サンプル中の標的ポリヌクレオチドを検出する方法を提供する。ここで、標的ポリヌクレオチドは、（ａ）SEQ ID NO:9-16からなる群から選択したポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、（ｂ）SEQ ID NO:9-16からなる群から選択したポリヌクレオチド配列と少なくとも９０％の同一性を有する天然のポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、（ｃ）（ａ）のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド、（ｄ）（ｂ）のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド、および（ｅ）（ａ）〜（ｄ）のRNA等価物からなる群から選択された配列のポリヌクレオチドを有する。検出方法は、（ａ）ポリメラーゼ連鎖反応増幅を用いて標的ポリヌクレオチドまたはその断片を増幅する過程と、（ｂ）前記の増幅した標的ポリヌクレオチドまたはその断片の存在・不存在を検出し、該標的ポリヌクレオチドまたはその断片が存在する場合にはオプションでその量を検出する過程を含む。
【０１１４】
本発明は更に、有効量のポリペプチドと薬剤として許容できる賦形剤とを含む組成物を提供する。有効量のポリペプチドは、（ａ）SEQ ID NO:1-8からなる群から選択したアミノ酸配列を含むポリペプチド、（ｂ）SEQ ID NO:1-8からなる群から選択したアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有する天然のアミノ酸配列を含むポリペプチド、（ｃ）SEQ ID NO:1-8からなる群から選択したアミノ酸配列を含むポリペプチドの生物学的活性断片、および（ｄ）SEQ ID NO:1-8からなる群から選択したアミノ酸配列の免疫原性断片からなる群から選択される。一実施例では、SEQ ID NO:1-8からなる一群から選択されたアミノ酸配列を含む組成物を提供する。更に、本発明は、機能的NTRANの発現の低下に関連した疾患やその症状の治療を要する患者にこの組成物を投与することを含む治療方法を提供する。
【０１１５】
本発明はまた、（ａ）SEQ ID NO:1-8からなる群から選択した或るアミノ酸配列を持つポリペプチド、（ｂ）SEQ ID NO:1-8からなる群から選択した或るアミノ酸配列との少なくとも９０％の同一性を有する天然アミノ酸配列を持つポリペプチド、（ｃ）SEQ ID NO:1-8からなる群から選択したアミノ酸配列を持つポリペプチドの生物学的活性断片、および（ｄ）SEQ ID NO:1-8からなる群から選択した或るアミノ酸配列を持つポリペプチドの免疫原性断片、からなる群から選択したポリペプチドのアゴニストとしての有効性を確認するために、或る化合物をスクリーニングする方法を提供する。スクリーニング方法は、（ａ）該ポリペプチドを有するサンプルを或る化合物に曝す過程と、（ｂ）サンプル中のアゴニスト活性を検出する過程からなる。別法では、本発明は、この方法によって同定されたアゴニスト化合物と好適な医薬用賦形剤とを含む組成物を提供する。更なる別法では、本発明は、機能的NTRANの発現の低下に関連した疾患やその症状の治療方法を提供し、その内にはそのような治療を必要とする患者にこの組成物を投与することが含まれる。
【０１１６】
本発明は更に、（ａ）SEQ ID NO:1-8からなる群から選択した或るアミノ酸配列を持つポリペプチド、（ｂ）SEQ ID NO:1-8からなる群から選択した或るアミノ酸配列との少なくとも９０％の同一性を有する天然アミノ酸配列を持つポリペプチド、（ｃ）SEQ ID NO:1-8からなる群から選択したアミノ酸配列を持つポリペプチドの生物学的活性断片、および（ｄ）SEQ ID NO:1-8からなる群から選択したアミノ酸配列を持つポリペプチドの免疫原性断片、からなる群から選択したポリペプチドのアンタゴニストとしての有効性につき、或る化合物をスクリーニングする方法を提供する。スクリーニング方法は、（ａ）該ポリペプチドを含むサンプルを或る化合物に曝す過程と、（ｂ）サンプル中のアンタゴニスト活性を検出する過程からなる。別の一実施態様で本発明は、この方法で同定したアンタゴニスト化合物と薬物として許容し得る賦形剤とを有する組成物を提供する。更なる別法では、本発明は、このような治療を必要とする患者へのこの組成物の投与を含む、機能的NTRANの過剰な発現に関連した疾患やその症状の治療方法を提供する。
【０１１７】
本発明は更に、（ａ）SEQ ID NO:1-8からなる群から選択したアミノ酸配列を含むポリペプチド、（ｂ）SEQ ID NO:1-8からなる群から選択したアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有する天然のアミノ酸配列を含むポリペプチド、（ｃ）SEQ ID NO:1-8からなる群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドの生物学的活性断片、または（ｄ）SEQ ID NO:1-8からなる群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドの免疫原性断片を含む群から選択されたポリペプチドに特異結合する化合物をスクリーニングする方法を提供する。スクリーニング方法は、（ａ）ポリペプチドを適切な条件下で少なくとも１つの試験化合物と混合させる過程と、（ｂ）試験化合物とのポリペプチドの結合を検出し、それによってポリペプチドに特異結合する化合物を同定する過程とを含む。
【０１１８】
本発明は更に、（ａ）SEQ ID NO:1-8からなる群から選択したアミノ酸配列、（ｂ）SEQ ID NO:1-8からなる群から選択したアミノ酸配列と少なくとも９０％の相同性を有する天然のアミノ酸配列を含むポリペプチド、（ｃ）SEQ ID NO:1-8からなる群から選択したアミノ酸配列の生物学的活性断片、または（ｄ）SEQ ID NO:1-8からなる群から選択したアミノ酸配列の免疫原性断片を含むポリペプチドの活性を調節する化合物をスクリーニングする方法を提供する。スクリーニング方法は、（ａ）ポリペプチドの活性が許容された条件下で、ポリペプチドを少なくとも１つの試験化合物に結合させる過程と、（ｂ）ポリペプチドの活性を試験化合物の存在下で算定する過程と、（ｃ）試験化合物の存在下でのポリペプチドの活性を試験化合物の不存在下でのポリペプチドの活性と比較する過程とを含み、試験化合物の存在下でのポリペプチドの活性の変化は、ポリペプチドの活性を調節する化合物を標示する。
【０１１９】
更に本発明は、SEQ ID NO:9-16からなる群から選択した或るポリヌクレオチド配列を持つ標的ポリヌクレオチドの発現を改変する効果につき、或る化合物をスクリーニングする一方法を提供する。この方法は、（ａ）この標的ポリヌクレオチドを有するサンプルを或る化合物に曝露する過程と、（ｂ）この標的ポリヌクレオチドの発現の改変を検出する過程と、（ｃ）可変量のこの化合物の存在下でのこの標的ポリヌクレオチドの発現と、この化合物の不在下での発現とを比較する過程とからなる。
【０１２０】
本発明は更に、試験化合物の毒性の算定方法を提供する。この方法には、以下の過程がある。（ａ）核酸群を有する生体サンプルを試験化合物で処理する過程。（ｂ）処理済み生体サンプルの核酸群をハイブリダイズする過程。この過程には、次のようなプローブを用いる。（i）SEQ ID NO:9-16からなる群から選択した或るポリヌクレオチド配列を持つポリヌクレオチド、（ii）SEQ ID NO:9-16からなる群から選択した或るポリヌクレオチド配列との少なくとも９０％の同一性を有する天然ポリヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド、（iii）（i）に相補的な配列を持つポリヌクレオチド、（iv）（ii）のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド、（v）（i）〜（iv）のRNA等価物、からなる群から選択した或るポリヌクレオチドの少なくとも２０の連続したヌクレオチド群からなるプローブである。ハイブリダイゼーションは、前記プローブと生物学的サンプル中の標的ポリヌクレオチドの間に特定のハイブリダイゼーション複合体が形成されるような条件下で発生し、前記標的ポリヌクレオチドは、（i）SEQ ID NO:9-16からなる群から選択したポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、（ii）SEQ ID NO:9-16からなる群から選択したポリヌクレオチド配列と少なくとも９０％が同一である天然のポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、（iii）（i）のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド、（iv）（ii）のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド、および（v）（I）〜（iv）のRNA等価物からなる群から選択する。或いは、標的ポリヌクレオチドは、上記（i）〜（v）からなる群から選択したポリヌクレオチド配列の断片を有する。毒性の算定方法には更に、（ｃ）ハイブリダイゼーション複合体の量を定量する過程と、（ｄ）処理した生物学的サンプルのハイブリダイゼーション複合体の量を、非処理の生物学的サンプルのハイブリダイゼーション複合体の量と比較する過程を含み、処理した生物学的サンプルのハイブリダイゼーション複合体の量との差は、試験化合物の毒性を意味する。
【０１２１】
（本発明の記載について）
本発明のタンパク質、ヌクレオチド配列及び方法について説明するが、その前に、説明した特定の装置、材料及び方法に本発明が限定されるものではなく、改変し得ることを理解されたい。また、ここで使用する専門用語は特定の実施例を説明する目的で用いたものに過ぎず、特許請求の範囲にのみ限定される本発明の範囲を限定することを意図したものではないことも併せて理解されたい。
【０１２２】
請求の範囲及び明細書中で用いている単数形の「或る」及び「その（この）」の表記は、文脈から明らかにそうでないとされる場合を除いて複数のものを指す場合もあることに注意しなければならない。従って、例えば「或る宿主細胞」と記されている場合にはそのような宿主細胞が複数あることもあり、「或る抗体」と記されている場合には単数または複数の抗体、及び、当業者に公知の抗体の等価物等についても言及しているのである。
【０１２３】
本明細書中で用いる全ての技術用語及び科学用語は、特に定義されている場合を除き、当業者に一般に理解されている意味と同じ意味を有する。本明細書で説明するものと類似あるいは同等の任意の装置、材料及び方法を用いて本発明の実施または試験を行うことができるが、ここでは好適な装置、材料、方法について説明する。本発明で言及する全ての刊行物は、刊行物中で報告されていて且つ本発明に関係して用い得る細胞株、プロトコル、試薬及びベクターについて説明及び開示する目的で引用しているものである。本明細書のいかなる開示内容も、本発明が先行技術の効力によってこのような開示に対して先行する権利を与えられていないことを認めるものではない。
【０１２４】
（定義）
用語「NTRAN」は、天然、合成、半合成或いは組換え体など任意のソースからの、任意の種（特にウシ、ヒツジ、ブタ、ネズミ、ウマ及びヒトを含む哺乳動物）から得られる実質的に精製されたNTRANのアミノ酸配列を指す。
【０１２５】
用語「アゴニスト」は、NTRANの生物学的活性を強化または模倣する分子を指す。アゴニストの例として、タンパク質、核酸、糖質、小分子その他の任意の化合物や成分を挙げることができるが、これらはNTRANと直接相互作用することによって、或いはNTRANが関与する生物学的経路の構成エレメントに作用することによって、NTRANの活性を調節する。
【０１２６】
用語「対立遺伝子変異配列(または変異体)」は、NTRANをコードする遺伝子の別の形を指す。対立遺伝子変異体は、核酸配列における少なくとも１つの突然変異から生じ得る。また、変容したRNAまたはポリペプチドを生じ得る。ポリペプチドの構造または機能は、変容することもしないこともある。遺伝子は、その天然型の対立遺伝子変異体を全く有しないか、１個若しくは多数の対立遺伝子変異体を有し得る。対立遺伝子変異配列を生じさせる通常の突然変異性変化は一般に、ヌクレオチドの自然な欠失、付加または置換に帰するものである。これら各種の変化は、単独或いは他の変化と共に、所与の配列内で1回以上、生じ得る。
【０１２７】
NTRANをコードする「変容した(または改変された)」核酸配列としては、様々なヌクレオチドの欠失、挿入、或いは置換を持つ結果、NTRANと同一のポリペプチドを、或いは、NTRANの機能的特徴の少なくとも１つを備えるポリペプチドを生じる配列を含む。この定義には、NTRANをコードするポリヌクレオチド配列にとって正常な染色体の遺伝子座ではない位置での、対立遺伝子変異配列との不適当或いは予期しないハイブリダイゼーション、並びにNTRANをコードするポリヌクレオチドの特定のオリゴヌクレオチドプローブを用いて容易に検出可能な或いは検出困難な多型性を含む。コードされるタンパク質も「変容する／改変される」ことがあり、また、サイレント変化を生じた結果、機能的に等価なNTRANとなる、アミノ酸残基の欠失、挿入、或いは置換を含み得る。意図的なアミノ酸置換は、生物学的或いは免疫学的にNTRANの活性が保持される範囲で、残基の、極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性、及び／または両親媒性についての類似性に基づいて成され得る。例えば、負に帯電したアミノ酸にはアスパラギン酸及びグルタミン酸があり、正に帯電したアミノ酸にはリジン及びアルギニンがある。親水性値が近似している非荷電極性側鎖を有するアミノ酸には、アスパラギンとグルタミン、セリンとトレオニンがある。親水性値が近似している非荷電側鎖を有するアミノ酸には、ロイシンとイソロイシンとバリン、グリシンとアラニン、フェニルアラニンとチロシンが含まれうる。
【０１２８】
用語「アミノ酸」及び「アミノ酸配列」は、オリゴペプチド、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質配列、或いはそれらの任意の断片を指し、天然分子または合成分子を指す。「アミノ酸配列」が或る天然タンパク質分子の配列を指す場合、「アミノ酸配列」及び類似の用語は、記載したそのタンパク質分子に関連する完全で元のままのアミノ酸配列に限定するものではない。
【０１２９】
用語「増幅」は、核酸配列の付加的複製物を作製することに関連する。増幅は通常、当業者によく知られたポリメラーゼ連鎖反応（PCR）技術を用いて行う。
【０１３０】
用語「アンタゴニスト」は、NTRANの生物学的活性を阻害或いは減弱する分子を指す。アンタゴニストは、NTRANと直接に相互作用するか或いはNTRANが関与する生物学的経路の諸成分に作用してNTRANの活性を調節する、抗体などのタンパク質、核酸、糖質、小分子、任意の他の化合物や組成物を含み得る。
【０１３１】
「抗体」の語は、抗原決定基と結合することができる、そのままの免疫グロブリン分子やその断片、例えばFab、F(ab')2 及びFv断片を指す。NTRANポリペプチドを結合する抗体は、免疫抗原として、そのままのポリペプチド、または当該の小ペプチドを含む断片を用いて作製可能である。動物（マウス、ラット、ウサギ等）を免疫化するために用いるポリペプチドまたはオリゴペプチドは、ＲＮＡの翻訳、または化学合成によって得られるポリペプチドまたはオリゴペプチドに由来し得るもので、所望によりキャリアータンパク質に抱合することも可能である。通常用いられるキャリアーであってペプチドと化学結合するものは、ウシ血清アルブミン、サイログロブリン及びスカシガイのヘモシアニン（KLH）等がある。その結合ペプチドは、前記動物を免疫化するために用いる。
【０１３２】
用語「抗原決定基」は、特定の抗体と接触する分子の領域（即ちエピトープ）を指す。タンパク質またはタンパク質断片を用いて宿主動物を免疫化する場合、タンパク質の多数の領域が、抗原決定基（タンパク質の特定の領域または３次元構造）に特異結合する抗体の産生を誘導し得る。抗原決定基は、或る抗体への結合について、無損傷抗原（即ち免疫応答を誘導するために用いられる免疫原）と競合し得る。
【０１３３】
用語「アプタマー（aptamer）」は、核酸またはオリゴヌクレオチド分子であって、特定の分子ターゲットに結合する分子を指す。アプタマーはin vitroでの進化プロセスに由来する（例えば、SELEX（Systematic Evolution of Ligands by EXponential Enrichmentの略、試験管内選択法）、米国特許第5,270,163号に記述）。これは、大規模な組み合わせライブラリ群から標的特異的アプタマー配列を選択するプロセスである。アプタマー組成は、２本鎖または１本鎖であってもよく、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、ヌクレオチド誘導体、または他のヌクレオチド様分子を含み得る。アプタマーのヌクレオチド成分は、修飾された糖基（例えばリボヌクレオチドの2'-OH基が2'-Fまたは2'-NH2で置換し得る）を有することが可能で、そのような糖基はヌクレアーゼへの抵抗性または血液中でのより長い寿命など、所望の特性を向上し得る。循環系からアプタマーが除去される速度を遅くするために、アプタマーを他の分子（例えば高分子量のキャリア）に抱合させることができる。アプタマーは、たとえば架橋剤の光活性化によって、それらの同種リガンドと特異的に架橋させることができる。（Brody, E.N. および L. Gold (2000) J. Biotechnol. 74:5-13等を参照）。
【０１３４】
「intramer」の用語はin vivoで発現されるアプタマーを意味する。たとえば、ワクシニアウイルスに基づく或るＲＮＡ発現系は、白血球の細胞質内で特定のＲＮＡアプタマーが高レベルで発現するために使用されている（Blind, M. 他 (1999) Proc. Natl Acad. Sci. USA 96:3606-3610）。
【０１３５】
「spiegelmer」の語はＬ-ＤＮＡ、Ｌ-ＲＮＡその他の左旋性ヌクレオチド誘導体またはヌクレオチド様分子を含むアプタマーを指す。左旋性ヌクレオチドを含むアプタマーは、右旋性のヌクレオチドを含む基質に通常作用する天然の酵素による分解に耐性がある。
【０１３６】
用語「アンチセンス」は、特定の核酸配列のセンス（コーディング）鎖と塩基対を形成し得る任意の組成物を指す。アンチセンス組成物としては、DNAや、RNAや、ペプチド核酸（PNA）や、ホスホロチオ酸、メチルホスホン酸またはベンジルホスホン酸等の修飾されたバックボーン結合を有するオリゴヌクレオチドや、2'-メトキシエチル糖または2'-メトキシエトキシ糖等の修飾された糖類を有するオリゴヌクレオチドや、或いは5-メチルシトシン、2-デオキシウラシルまたは7-デアザ-2'-デオキシグアノシン等の修飾された塩基を有するオリゴヌクレオチドを含みうる。アンチセンス分子は、化学合成または転写を含む任意の方法で製造することができる。相補的アンチセンス分子は、ひとたび細胞に導入されたら、細胞が産生した天然の核酸配列との塩基対を形成し、転写または翻訳を妨害する二重鎖を形成する。「負」または「マイナス」という表現は、ある参考ＤＮＡ分子のアンチセンス鎖を意味し、「正」または「プラス」という表現はある参考ＤＮＡ分子のセンス鎖を意味しうる。
【０１３７】
用語「生物学的に活性」は、天然分子の構造的、調節的、或いは生化学的な機能を有するタンパク質を指す。同様に、用語「免疫学的に活性」または「免疫原性」は、天然或いは組換え体のNTRAN、合成のNTRANまたはそれらの任意のオリゴペプチドが、適当な動物或いは細胞内の特定の免疫応答を誘発して特定の抗体と結合する能力を指す。
【０１３８】
「相補(的)」または「相補性」の語は、塩基対形成によってアニーリングする2つの一本鎖核酸の間の関係を指す。例えば、「5'-AGT-3'」は、その相補配列「3'-TCA-5'」との対を形成する。
【０１３９】
「〜のポリヌクレオチド配列を含む（持つ）組成物」または「〜のアミノ酸配列を含む（持つ）組成物」は広い意味で、所定のポリヌクレオチド配列若しくはアミノ酸配列を含む任意の組成物を指す。この組成物には、乾燥製剤または水溶液が含まれ得る。NTRANをコード、若しくはNTRANの断片をコードするポリヌクレオチド配列を持つ組成物は、ハイブリダイゼーションプローブとして使用され得る。このプローブは、凍結乾燥状態で保存可能であり、糖質などの安定化剤と結合させることが可能である。ハイブリダイゼーションにおいては、塩（例えばNaCl）、界面活性剤（例えばドデシル硫酸ナトリウム；SDS）及びその他の構成成分（例えばデンハート液、粉乳、サケの精子のDNA等）を含む水溶液中にプローブを分散させることができる。
【０１４０】
「コンセンサス配列」は、不要な塩基を分離するためにDNA配列の解析を繰り返し行い、XL-PCRキット（PE Biosystems,Foster City CA）を用いて５'及び／または３'の方向に伸長され、再度シークエンシングされた核酸配列、またはGELVIEW 断片構築システム（GCG, Madison, WI）またはPhrap (University of Washington, Seattle WA)等の断片構築用のコンピュータプログラムを用いて１つ或いはそれ以上のオーバーラップするcDNAやEST、またはゲノムDNA断片から構築された核酸配列を指す。伸長及び構築の両方を行ってコンセンサス配列を決定する配列もある。
【０１４１】
「保存的なアミノ酸置換」は、元のタンパク質の特性を殆ど変えないと予測される置換を指す。即ち、置換によってそのタンパク質の構造や機能が大きくは変わらず、そのタンパク質の構造、特にその機能が保存される。下表は、タンパク質中で元のアミノ酸と置換できて、保存アミノ酸置換と認められるアミノ酸を示している。
2004523236.tif 000002
【０１４２】
保存アミノ酸置換では通常、（ａ）置換領域におけるポリペプチドのバックボーン構造、例えばβシートやα螺旋構造、（ｂ）置換部位における分子の電荷または疎水性、及び／または（ｃ）側鎖の大部分を保持する。
【０１４３】
「欠失」は、１個以上のアミノ酸残基が欠如するアミノ酸配列の変化、或いは１個以上のヌクレオチドが欠如する核酸配列の変化を指す。
【０１４４】
用語「誘導体」は、化学修飾されたポリヌクレオチドまたはポリペプチドを指す。例えば、アルキル基、アシル基、ヒドロキシル基またはアミノ基による水素の置換は、ポリヌクレオチド配列の化学修飾に含まれ得る。ポリヌクレオチド誘導体は、天然分子の生物学的または免疫学的機能を少なくとも１つは保持しているポリペプチドをコードする。ポリペプチド誘導体は、グリコシル化、ポリエチレングリコール化（pegylation）、或いは任意の同様なプロセスであって、誘導起源のポリペプチドの少なくとも１つの生物学的若しくは免疫学的機能を保持するプロセスによって、修飾されたポリペプチドである。
【０１４５】
「検出可能な標識」は、測定可能な信号を発生し得る、ポリヌクレオチドやポリペプチドに共有結合或いは非共有結合するレポーター分子や酵素を指す。
【０１４６】
「差次的発現」は少なくとも2つの異なったサンプルを比較することによって決められる、増加（上方調節）、あるいは減少（下方調節）、または欠損した、遺伝子またはタンパク質の発現を指す。このような比較は例えば、処理済サンプルと不処理サンプル、または病態のサンプルと正常サンプルの間で行われ得る。
【０１４７】
「エキソンシャフリング」は、異なるコード領域（エキソン）の組換えを意味する。1つのエキソンは、コードされるタンパク質の1つの構造的または機能的ドメインを代表し得るため、安定したサブストラクチャー群の新たな組み合わせによって、新しいタンパク質が組立てられることが可能であり、新しいタンパク質機能の進化を促進できる。
【０１４８】
「断片」は、NTRANまたはNTRANをコードするポリヌクレオチドの固有の部分であって、その親配列（parent sequence）と配列は同一であるが親配列より長さが短いものを指す。断片は、定義された配列の全長から１ヌクレオチド／アミノ酸残基を差し引いた長さよりも短い長さを有し得る。例えば或る断片は、５〜１０００の連続したヌクレオチドまたはアミノ酸残基を有し得る。プローブ、プライマー、抗原、治療用分子として、或いはその他の目的のために用いられる断片は、少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７５、１００、１５０、２５０若しくは５００の連続したヌクレオチド或いはアミノ酸残基の長さであり得る。断片は、分子の特定領域から選択的に選択し得る。例えば、ポリペプチド断片は、定義された或る配列内に見られるような或るポリペプチドの最初の２５０または５００アミノ酸（またはポリペプチドの最初の２５％または５０％）から選択された或る長さの連続したアミノ酸を有し得る。これらの長さは明らかに例として挙げているものであり、本発明の実施例では、配列表、表及び図面を含む明細書に裏付けされた任意の長さであってよい。
【０１４９】
SEQ ID NO:9-16 の断片は、例えば、この断片を得たゲノム内の他の配列とは異なる、SEQ ID NO:9-16 を明確に同定する固有のポリヌクレオチド配列の領域を含む。SEQ ID NO:9-16のある断片は、例えば、ハイブリダイゼーションや増幅技術、またはSEQ ID NO:9-16を関連ポリヌクレオチド配列から区別する類似の方法に有用である。SEQ ID NO:9-16の断片の正確な長さ及び断片が対応するSEQ ID NO:9-16の領域は、断片に対する意図した目的に基づき当業者が慣例的に決定することが可能である。
【０１５０】
SEQ ID NO:1-8 のある断片は、SEQ ID NO:9-16のある断片によってコードされる。SEQ ID NO:1-8 のある断片には、SEQ ID NO:1-8を特異的に同定する固有のアミノ酸配列領域が含まれている。例えば、SEQ ID NO:1-8 のある断片は、SEQ ID NO:1-8を特異認識する抗体を産出するための免疫原性ペプチドとして有用である。SEQ ID NO:1-8 のある断片の正確な長さ、及びその断片が対応するSEQ ID NO:1-8 の領域は、断片に対する意図した目的に基づき当業者が慣例的に決定することが可能である。
【０１５１】
「完全長」ポリヌクレオチド配列とは、少なくとも１つの翻訳開始コドン（例えばメチオニン）、それに続くオープンリーディングフレーム及び翻訳終止コドンを有する配列である。「完全長」ポリヌクレオチド配列は、「完全長」ポリペプチド配列をコードする。
【０１５２】
「相同性」の語は、２つ以上のポリヌクレオチド配列または２つ以上のポリペプチド配列の配列類似性、互換性、または配列同一性を意味する。
【０１５３】
ポリヌクレオチド配列についての用語「一致率」または「〜％同一」とは、標準化されたアルゴリズムを用いてアラインメントされる、２つ以上のポリヌクレオチド配列間の一致する残基の百分率のことである。このようなアルゴリズムは、２配列間のアラインメントを最適化するために、比較する配列において、標準化された再現性のある方法でギャップを挿入するので、２つの配列をより有意に比較できる。
【０１５４】
ポリヌクレオチド配列間の一致率は、MEGALIGN version 3.12e配列アラインメントプログラムに組込まれているようなCLUSTAL Vアルゴリズムのデフォルトのパラメータを用いて決定できる。このプログラムは、LASERGENE ソフトウェアパッケージ(一組の分子生物学的分析プログラム)(DNASTAR, Madison WI)の一部である。このCLUSTAL Vは、Higgins, D.G. 及び P.M. Sharp (1989) CABIOS 5:151-153、Higgins, D.G. 他 (1992) CABIOS 8:189-191に記載されている。ポリヌクレオチド配列をペアワイズでアラインメントする際のデフォルトパラメータは、Ktuple=2、gap penalty=5、window=4、「diagonals saved」=4と設定される。「weighted（重み付けされた）」残基重み付け表が、デフォルトとして選択される。一致率は、アラインメントされたポリヌクレオチド配列間の「percent similarity（類似性パーセント）」としてCLUSTAL Vによって報告される。
【０１５５】
或いは、一般的に用いられ且つ自由に入手できる配列比較アルゴリズム一式が、米国国立バイオテクノロジー情報センター（NCBI）Basic Local Alignment Search Tool（BLAST）から提供されており（Altschul, S.F. 他 (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410）、これはメリーランド州ベセスダにあるNCBI及びインターネット（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）を含む幾つかの情報源から入手可能である。このBLASTソフトウェア一式には、既知のポリヌクレオチド配列と様々なデータベースの別のポリヌクレオチド配列とのアラインメントに用いられる「blastn」を含む、様々な配列分析プログラムが含まれる。「BLAST 2 Sequences」と呼ばれるツールも入手可能であり、２つのヌクレオチド配列の直接のペアワイズで比較するために用いられる。「BLAST 2 Sequences」は、http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/bl2.htmlにアクセスして、対話形式で利用ができる。「BLAST 2 Sequences」ツールは、blastn および blastp（以下に記載）の両方に用い得る。BLASTプログラムは、一般的には、ギャップ（gap）などのパラメータをデフォルト設定にセットして用いる。例えば、２つのヌクレオチド配列を比較するために、デフォルトパラメータに設定された「BLAST 2 Sequences」ツールVersion 2.0.12（2000年4月21日）を用いてblastnを実行してもよい。デフォルトパラメータの設定例を以下に示す。
Matrix:BLOSUM62
Reward for match: 1
Penalty for mismatch: -2
Open Gap:5 及びExtension Gap：2 penalties
Gap x drop-off: 50
Expect: 10
Word Size: 11
Filter:on
【０１５６】
一致率は、ある定義された配列の全長（例えば特定のSEQ IDナンバーで定義された配列）で測定し得る。或いは、より短い長さ、例えば、定義された、より大きな配列から得られた断片（例えば少なくとも２０、３０、４０、５０、７０、１００または２００の連続したヌクレオチドの断片）の長さと比較して一致率を測定してもよい。ここに挙げた長さは単なる例示的なものに過ぎず、表、図及び配列リストを含めた本明細書に記載された配列に裏付けられた任意の配列長さの断片を用いて、一致率を測定し得る長さを説明し得ることを理解されたい。
【０１５７】
高度の同一性を示さない核酸配列が、それにもかかわらず遺伝子コードの縮重が原因で類似のアミノ酸配列をコードする場合がある。この縮重を利用して核酸配列内で変化を生じさせて、全ての核酸配列が実質上同一のタンパク質をコードするような多数の核酸配列を生成し得ることを理解されたい。
【０１５８】
ポリペプチド配列に用いられる用語「一致率」または「〜％同一」とは、標準化されたアルゴリズムを用いてアラインメントされる２つ以上のポリペプチド配列間の一致する残基の百分率のことである。ポリペプチド配列アラインメントの方法は公知である。保存的アミノ酸置換を考慮するアラインメント方法もある。既に詳述したこのような保存的置換は通常、置換部位の電荷および疎水性を保存するので、ポリペプチドの構造を（したがって機能も）保存する。
【０１５９】
ポリペプチド配列間の一致率は、MEGALIGN version 3.12e配列アラインメントプログラムに組込まれているようなCLUSTAL Vアルゴリズムのデフォルトのパラメータを用いて決定できる（参照先と共に上述）。CLUSTAL Vを用いて、ポリぺプチド配列をペアワイズアラインメントする際のデフォルトパラメータは、Ktuple=1、gap penalty=3、window=5、「diagonals saved」=5と設定される。デフォルトの残基重み付け表としてPAM250マトリクスが選択される。ポリヌクレオチドアラインメントと同様に、CLUSTAL Vは、アラインメントされたポリペプチド配列対間の「percent similarity」として一致率を報告する。
【０１６０】
或いは、NCBI BLASTソフトウェア一式を用いてもよい。例えば、２つのポリペプチド配列をペアワイズで比較する場合、「BLAST 2 Sequences」ツールVersion 2.0.12（2000年4月21日）のblastpをデフォルトパラメータに設定して用い得る。デフォルトパラメータの設定例を以下に示す。
Matrix:BLOSUM62
Open Gap:11 及びExtension Gap：1 penalties
Gap x drop-off: 50
Expect: 10
Word Size: 3
Filter:on
【０１６１】
一致率は、ある定義されたポリペプチド配列（例えば特定のSEQ IDナンバーで定義された配列）の全長と比較して測定し得る。或いは、より短い長さ、例えば、定義された、より大きなポリペプチド配列から得られた断片（例えば少なくとも１５、２０、３０、４０、５０、７０または１５０の連続した残基の断片）の長さと比較して一致率を測定してもよい。ここに挙げた長さは単なる例示的なものに過ぎず、表、図及び配列リストを含めた本明細書に記載された配列に裏付けられた任意の配列長さの断片を用いて、或る長さであってその長さに対して一致率を測定し得る長さを説明し得ることを理解されたい。
【０１６２】
「ヒト人工染色体（HAC）」は、約６kb 〜１０MbのサイズのDNA配列を含み得る、染色体の複製、分離及び維持に必要な全てのエレメントを含む直鎖状の小染色体である。
【０１６３】
用語「ヒト化抗体」は、もとの結合能力を保持しつつよりヒトの抗体に似せるために、非抗原結合領域のアミノ酸配列が変えられた抗体分子を指す。
【０１６４】
「ハイブリダイゼーション」とは、所定のハイブリダイゼーション条件下で、ある一本鎖ポリヌクレオチドがある相補的な一本鎖と塩基対を形成するアニーリングのプロセスである。特異的ハイブリダイゼーションは、２つの核酸配列が高い相補性を共有することを示すものである。特異的ハイブリダイゼーション複合体は許容的アニーリング条件下で形成され、「洗浄」ステップ後もハイブリダイズされたままである。洗浄ステップは、ハイブリダイゼーションプロセスのストリンジェンシーを決定する際に特に重要であり、よりストリンジェントな条件では、非特異結合（即ち完全には一致しない核酸鎖間の対の結合）が減少する。核酸配列のアニーリングに対する許容的条件は、当業者が慣例的に決定できる。アニール条件はどのハイブリダイゼーション実験でも一定であり得るが、洗浄条件は、所望のストリンジェンシー、したがってハイブリダイゼーション特異性を得るように、実験ごとに変更し得る。許容的アニーリング条件は、例えば、温度が６８℃で、約６×SSC、約１％（w/v）のSDS、並びに約１００μｇ／ｍｌのせん断して変性したサケ精子DNAの存在下である。
【０１６５】
一般に、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは或る程度、洗浄ステップを実行する温度を基準にして表すことができる。このような洗浄温度は通常、所定のイオン強度及びpHにおける特定の配列の融点（Tm）より約５〜２０℃低くなるように選択する。このTmは、所定のイオン強度及びpHの条件下で、完全に一致するプローブに標的配列の５０％がハイブリダイズする温度である。Tmを計算する式及び核酸のハイブリダイゼーション条件はよく知られており、Sambrook 他 (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第2版, 1-3巻, Cold Spring Harbor Press, Plainview NYに記載されており、特に2巻の9章を参照されたい。
【０１６６】
本発明のポリヌクレオチド間の高いストリンジェンシー条件のハイブリダイゼーションでは、約０．２×SSC及び約0.１％のSDSの存在の下、約６８℃で１時間の洗浄過程を含む。別法では、６５℃、６０℃、５５℃、４２℃の温度で行う。SSC濃度は、約０.１％のSDS存在下で、約０.１〜２×SSCの範囲で変化し得る。通常は、ブロッキング剤を用いて非特異ハイブリダイゼーションを阻止する。このようなブロッキング剤には、例えば、約１００〜２００μg/mlの、せん断した変性サケ精子DNAがある。特定条件下で、例えばRNAとDNAのハイブリダイゼーションに有機溶剤、例えば約３５〜５０％v/vの濃度のホルムアミドを用いることもできる。洗浄条件の有用なバリエーションは、当業者には自明であろう。ハイブリダイゼーションは、特に高ストリンジェント条件下では、ヌクレオチド間の進化的な類似性を示唆し得る。このような類似性は、ヌクレオチド及びヌクレオチドにコードされるポリペプチドについて、類似の役割を強く示唆している。
【０１６７】
用語「ハイブリダイゼーション複合体」は、相補的な塩基間の水素結合によって形成された、２つの核酸配列の複合体を指す。ハイブリダイゼーション複合体は、溶解状態で形成し得る（C0tまたはR0t解析等）。或いは、一方の核酸配列が溶解状態で存在し、もう一方の核酸配列が固体支持体（例えば紙、膜、フィルタ、チップ、ピンまたはガラススライド、或いは他の適切な基板であって細胞若しくはその核酸が固定される基板）に固定されているような２つの核酸配列間に形成され得る。
【０１６８】
用語「挿入」或いは「付加」は、１個以上のアミノ酸残基或いはヌクレオチドがそれぞれ追加されるアミノ酸配列或いは核酸配列の変化を指す。
【０１６９】
「免疫応答」は、炎症、外傷、免疫異常症、伝染性疾患または遺伝性疾患に関連する症状を指し得る。これらの症状は、細胞及び全身の防御系に作用し得る種々の因子、例えばサイトカイン、ケモカイン、その他のシグナル伝達分子の発現によって特徴づけることができる。
【０１７０】
用語「免疫原性断片」は、例えば哺乳動物などの生きている動物に導入すると免疫応答を引き起こし得る、NTRANのポリペプチド断片またはオリゴペプチド断片を指す。用語「免疫原性断片」はまた、本明細書で開示するまたは当分野で既知のあらゆる抗体生産方法に有用な、NTRANのポリペプチド断片またはオリゴペプチド断片を含む。
【０１７１】
用語「マイクロアレイ」は、基板上の複数のポリヌクレオチド、ポリペプチドまたはその他の化合物の構成を指す。
【０１７２】
用語「エレメント」または「アレイエレメント」は、マイクロアレイ上に固有の指定された位置を有する、ポリヌクレオチド、ポリペプチドまたはその他の化合物を指す。
【０１７３】
用語「活性を調節(modulate)」は、NTRANの活性を変化させることを指す。例えば、調節によって、NTRANのタンパク質活性、或いは結合特性、またはその他の生物学的特性、機能的特性或いは免疫学的特性の変化が起きうる。
【０１７４】
「核酸」及び「核酸配列」の語は、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチドまたはこれらの断片を指す。「核酸」及び「核酸配列」の語は、ゲノム起源または合成起源のDNAまたはRNAであって一本鎖または二本鎖であるか或いはセンス鎖またはアンチセンス鎖を表し得るようなDNAまたはRNAや、ペプチド核酸（PNA）や、任意のDNA様またはRNA様物質を指すこともある。
【０１７５】
「機能的に連結した」は、第１の核酸配列と第２の核酸配列が機能的な関係にある状態を指す。例えば、プロモーターがコード配列の転写または発現に影響を及ぼす場合には、そのプロモーターはそのコード配列に機能的に連結している。機能的に連結したDNA配列群は非常に近接するか連続的に隣接することがあり、また、２つのタンパク質コード領域を結合するために必要な場合は同一リーディングフレーム内にあり得る。
【０１７６】
「ペプチド核酸（PNA）」は、末端がリジンで終わるアミノ酸残基のペプチドのバックボーンに結合した、少なくとも約５ヌクレオチドの長さのオリゴヌクレオチドを含む、アンチセンス分子または抗遺伝子剤を指す。末端のリジンは、この組成に溶解性を与える。PNAは、相補的一本鎖DNAまたはRNAに優先的に結合して転写の伸長を停止するものであり、ポリエチレングリコール化して細胞におけるPNAの寿命を延長し得る。
【０１７７】
NTRANの「翻訳後修飾」には、脂質化、グリコシル化、リン酸化、アセチル化、ラセミ化、タンパク質分解切断及びその他の当分野で既知の修飾を含み得る。これらのプロセスは、合成或いは生化学的に生じ得る。生化学的修飾は、NTRANの酵素環境に依存し、細胞の種類によって異なることとなる。
【０１７８】
「プローブ」とは、同一配列或いは対立遺伝子核酸配列、関連する核酸配列の検出に用いる、NTRANやそれらの相補配列、またはそれらの断片をコードする核酸配列のことである。プローブは、単離されたオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドであって、検出可能な標識またはレポーター分子に結合したものである。典型的な標識には、放射性アイソトープ、リガンド、化学発光試薬及び酵素がある。「プライマー」とは、相補的な塩基対を形成して標的のポリヌクレオチドにアニーリング可能な、通常はDNAオリゴヌクレオチドである短い核酸である。プライマーは次に、DNAポリメラーゼ酵素によって標的DNA鎖に沿って延長され得る。プライマー対は、例えばポリメラーゼ連鎖反応（PCR）による核酸配列の増幅（及び同定）に用い得る。
【０１７９】
本発明に用いるようなプローブ及びプライマーは通常、既知の配列の少なくとも１５の連続したヌクレオチドを含んでいる。特異性を高めるために長めのプローブ及びプライマー、例えば開示した核酸配列の少なくとも２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００または１５０の連続したヌクレオチドからなるようなプローブ及びプライマーを用いてもよい。これよりもかなり長いプローブ及びプライマーもある。表、図面及び配列リストを含む本明細書に裏付けされた任意の長さのヌクレオチドを用いることができるものと理解されたい。
【０１８０】
プローブ及びプライマーの調製及び使用方法については、Sambrook, J. 他 (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第2版, 1-3巻, Cold Spring Harbor Press, Plainview NY、Ausubel, F.M. 他, (1987) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publ. Assoc. & Wiley-Intersciences, New York NY、Innis他 (1990) PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications Academic Press, San Diego CA等を参照されたい。PCRプライマー対は、その目的のためのコンピュータプログラム、例えばPrimer（Version 0.5, 1991, Whitehead Institute for Biomedical Research, Cambridge MA）を用いるなどして既知の配列から得ることができる。
【０１８１】
プライマーとして用いるオリゴヌクレオチドの選択は、そのような目的のために本技術分野で既知のソフトウェアを用いて行う。例えばOLIGO 4.06ソフトウェアは、各１００ヌクレオチドまでのPCRプライマー対の選択に有用であり、オリゴヌクレオチド及び最大５,０００までの大きめのポリヌクレオチドであって３２キロベースまでのインプットポリヌクレオチド配列から得たものを分析するのにも有用である。類似のプライマー選択プログラムには、拡張能力のための追加機能が組込まれている。例えば、PrimOUプライマー選択プログラム（テキサス州ダラスにあるテキサス大学南西部医療センターのゲノムセンターから一般向けに入手可能）は、メガベース配列から特定のプライマーを選択することが可能であり、従ってゲノム全体の範囲でプライマーを設計するのに有用である。Primer3プライマー選択プログラム（Whitehead Institute/MIT Center for Genome Research（マサチューセッツ州ケンブリッジ）より入手可能）を用いれば、プライマー結合部位として避けたい配列を指定できる「非プライミングライブラリ（mispriming library）」を入力できる。Primer3は特に、マイクロアレイのためのオリゴヌクレオチドの選択に有用である。（後二者のプライマー選択プログラムのソースコードは、それぞれの情報源から得てユーザー固有のニーズを満たすように変更してもよい）。PrimerGenプログラム（英国ケンブリッジ市の英国ヒトゲノムマッピングプロジェクト-リソースセンターから一般向けに入手可能）は、多数の配列アラインメントに基づいてプライマーを設計し、それによって、アラインメントされた核酸配列の最大保存領域または最小保存領域の何れかとハイブリダイズするようなプライマーの選択を可能にする。従って、このプログラムは、独自のものであれ保存されたものであれ、オリゴヌクレオチド及びポリヌクレオチドの断片の同定に有用である。上記選択方法のいずれかによって同定したオリゴヌクレオチド及びポリヌクレオチドの断片は、ハイブリダイゼーション技術において、例えばPCRまたはシークエンシングプライマーとして、マイクロアレイエレメントとして、或いは核酸のサンプルにおいて完全または部分的相補的ポリヌクレオチドを同定する特異プローブとして有用である。オリゴヌクレオチドの選択方法は、上記の方法に限定されるものではない。
【０１８２】
「組換え核酸」は天然の配列ではなく、配列の、２つ以上の離れたセグメントを人工的に組み合わせた配列である。この人為的組合せはしばしば化学合成によって達成するが、より一般的には核酸の単離セグメントの人為的操作によって、例えばのSambrookらの文献（前出）に記載されているような遺伝子工学的手法によって達成する。組換え核酸の語は、単に核酸の一部を付加、置換または欠失して変容した核酸も含む。しばしば組換え核酸には、プロモーター配列に機能的に連結した核酸配列が含まれる。このような組換え核酸は、例えばある細胞を形質転換するために使用されるベクターの一部とすることが可能である。
【０１８３】
或いはこのような組換え核酸は、ウイルスベクターの一部であって、ベクターは例えばワクシニアウイルスに基づくものであり得る。そのようなベクターは哺乳動物に接種され、その組換え核酸が発現されて、その哺乳動物内で防御免疫応答を誘導するように使用することができる。
【０１８４】
「調節エレメント」は、通常は遺伝子の非翻訳領域に由来する核酸配列であり、エンハンサー、プロモーター、イントロン及び５'及び３'の非翻訳領域（UTR）を含む。調節エレメントは、転写、翻訳またはRNA安定性を調節する宿主タンパク質またはウイルスタンパク質と相互作用する。
【０１８５】
「レポーター分子」は、核酸、アミノ酸または抗体の標識に用いられる化学的または生化学的な部分である。レポーター分子には、放射性核種、酵素、蛍光剤、化学発光剤、発色剤、基質、補助因子、阻害因子、磁気粒子及びその他の当分野で既知の成分がある。
【０１８６】
DNA配列に対する「RNA等価物」とは、基準となるDNA配列と同じ直鎖の核酸配列から構成されるが、窒素性塩基のチミンがウラシルで置換され、糖鎖のバックボーンがデオキシリボースではなくリボースからなる。
【０１８７】
用語「サンプル」は、その最も広い意味で用いられている。NTRAN、NTRANをコードする核酸、またはその断片を含むと推定されるサンプルは、体液と、細胞や細胞から単離した染色体や細胞内小器官（オルガネラ）や膜からの抽出物と、細胞と、溶液中に存在するまたは基板に固定されたゲノムDNA、RNA、cDNAと、組織と、組織プリント等を含み得る。
【０１８８】
用語「特異的結合」及び「特異的に結合する」は、タンパク質若しくはペプチドと、アゴニスト、抗体、アンタゴニスト、小分子、若しくは任意の天然若しくは合成の結合組成物との間の相互作用を指す。この相互作用は、タンパク質の特定の構造（例えば抗原決定基即ちエピトープ）であって結合分子が認識するものが存在するか否かに依存している。例えば、抗体がエピトープ「Ａ」に対して特異的である場合、結合していない標識した「Ａ」及び抗体を含む反応液に、エピトープＡを含むポリペプチド或いは結合していない無標識の「Ａ」が存在すると、抗体と結合する標識Ａの量が減少する。
【０１８９】
用語「実質的に精製された」は、自然の環境から取り除かれてから、単離あるいは分離された核酸配列あるいはアミノ酸配列であって、自然に会合している他の成分が少なくとも約６０％除去されたものであり、好ましくは約７５％以上除去、最も好ましくは９０％以上除去されたものを指す。
【０１９０】
「置換」とは、一つ以上のアミノ酸またはヌクレオチドをそれぞれ別のアミノ酸またはヌクレオチドに置き換えることである。
【０１９１】
用語「基板」は、任意の好適な固体或いは半固体の支持物を指し、膜及びフィルター、チップ、スライド、ウエハ、ファイバー、磁気または非磁気ビーズ、ゲル、チューブ、プレート、ポリマー、微小粒子、毛細管が含まれる。基板は、ウェル、溝、ピン、チャネル、孔等、様々な表面形態を有することができ、基板表面にはポリヌクレオチドやポリペプチドが結合する。
【０１９２】
「転写イメージ(transcript image)」または「発現プロファイル」は、所定条件下での所定時間における特定の細胞の種類または組織による遺伝子発現の集合的パターンを指す。
【０１９３】
「形質転換(transformation)」とは、外因性DNAが受容細胞に導入されるプロセスのことである。形質転換は、本技術分野で知られている種々の方法に従って自然条件または人工条件下で生じ得るものであり、外来性の核酸配列を原核宿主細胞または真核宿主細胞に挿入する任意の既知の方法を基にし得る。形質転換の方法は、形質転換する宿主細胞の種類によって選択する。限定するものではないが形質転換方法には、ウイルス感染、電気穿孔法（エレクトロポレーション）、熱ショック、リポフェクション及び微粒子銃を用いる方法がある。「形質転換（された）細胞」には、導入されたDNAが自律的に複製するプラスミドとして或いは宿主染色体の一部として複製可能である、安定的に形質転換された細胞が含まれる。さらに、限られた期間に一過的に導入DNA若しくは導入RNAを発現する細胞も含まれる。
【０１９４】
ここで用いる「遺伝形質転換体(transgenic organism)」とは任意の生物体であり、限定するものではないが動植物を含み、生物体の１個以上の細胞が、ヒトの関与によって、例えば本技術分野でよく知られているトランスジェニック技術によって導入された異種核酸を有する。 核酸の細胞への導入は、直接または間接的に、細胞の前駆物質に導入することによって、計画的な遺伝子操作によって、例えば微量注射法によって或いは組換えウイルスでの感染によって行う。別の例においては、レンチウイルスなどの組換えウイルスベクターを感染させることによって核酸を導入できる(Lois, C. 他 (2002) Science 295:868-872)。遺伝子操作の語は、古典的な交雑育種或いは試験管内受精を指すものではなく、組換えDNA分子の導入を指すものである。本発明に基づいて予期される遺伝形質転換体には、バクテリア、シアノバクテリア、真菌及び動植物がある。本発明の単離されたDNAは、本技術分野で知られている方法、例えば感染、形質移入、形質転換またはトランス接合（transconjugation）によって宿主に導入することができる。本発明のDNAをこのような生物体に移入する技術はよく知られており、前出のSambrook ら (1989) 等の参考文献に記載されている。
【０１９５】
特定の核酸配列の「変異体」は、核酸配列１本全部の長さに対して該特定の核酸配列と少なくとも４０％の配列同一性を有する核酸配列であると定義する。定義づけには、デフォルトパラメータに設定した「BLAST 2 Sequences」ツールVersion 2.0.9（1999年5月7日）を用いてblastnを実行する。このような核酸対は、所定の長さに対して、例えば少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を示し得る。或る変異体は、例えば「対立遺伝子」変異体（前述）、「スプライス」変異体、「種」変異体または「多型性」変異体として説明し得る。スプライス変異体は参照分子との有意な同一性を有し得るが、mRNAプロセッシング中のエキソンの選択的スプライシングによって通常、より多くまたはより少数のヌクレオチドを有することになる。対応するポリペプチドは、追加機能ドメインを有するか或いは参照分子に存在するドメインが欠落していることがある。種変異体は、種によって異なるポリヌクレオチド配列である。結果的に生じるポリペプチドは通常、相互に有意のアミノ酸同一性を有する。多型性変異体は、所与の種の個体間での特定の遺伝子のポリヌクレオチド配列中での変異である。多型変異配列はまた、ポリヌクレオチド配列の１つのヌクレオチドが異なる「１塩基多型性」（SNP）も含み得る。SNPの存在は、例えば特定の個体群、病状または病状性向を示し得る。
【０１９６】
特定のポリペプチド配列の「変異体」は、ポリペプチド配列の１本の長さ全体で該特定ポリペプチド配列に対して少なくとも４０％の配列同一性を有するポリペプチド配列として定義される。定義づけには、デフォルトパラメータに設定した「BLAST 2 Sequences」ツールVersion 2.0.9（1999年5月7日）を用いてblastpを実行する。このようなポリペプチド対は、一方のポリペプチドの或る所定の長さに対して、例えば少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を示し得る。
【０１９７】
（発明）
本発明は新規のヒトの神経伝達関連タンパク質（NTRAN）の発見、NTRANをコードするポリヌクレオチド、および、自己免疫／炎症疾患、心血管疾患、神経疾患、発達障害、癌を含む細胞増殖異常、輸送疾患、精神疾患、代謝疾患、および内分泌疾患の診断、治療、ならびに予防に対するこれらの組成の使用に基づいている。
【０１９８】
表１は、本発明の完全長ポリヌクレオチド配列及びポリペプチド配列の命名の概略である。各ポリヌクレオチド及びその対応するポリペプチドは、１つのIncyteプロジェクト識別番号（IncyteプロジェクトID）と相関する。各ポリペプチド配列は、ポリペプチド配列識別番号（ポリペプチドSEQ ID NO）とIncyteポリペプチド配列番号（IncyteポリペプチドID）によって表示した。各ポリヌクレオチド配列は、ポリヌクレオチド配列識別番号（ポリヌクレオチドSEQ ID NO）とIncyteポリヌクレオチドコンセンサス配列番号（IncyteポリヌクレオチドID）によって表示した。列6は本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオチドに対応する物理的な完全長クローンのIncyte ID番号を示している。完全長クローンは、列3に示したポリペプチド配列と少なくとも95％の配列同一性を持つポリペプチドをコードしている。
【０１９９】
表２は、GenBankタンパク質（genpept）データベースとPROTEOMEデータベースとに対するBLAST分析で同定した、本発明のポリペプチド群に相同な配列群を示す。列１および列２はそれぞれ、本発明の各ポリペプチドに対するポリペプチド配列識別番号（ポリペプチド SEQ ID NO :）およびそれに対応するIncyte ポリペプチド配列番号（Incyte ポリペプチド ID）を示す。列３は、GenBankの最も近い相同体のGenBank識別番号（Genbank ID NO :）と最も近いPROTEOME データベース相同体のPROTEOME データベース識別番号 (PROTEOME ID NO:) を示す。列４は、各ポリペプチドとその相同体との間の一致を表す確率スコアを示す。列５は、GenBankとPROTEOME データベースの相同体の注釈を示し、更に該当箇所には関連する引用文献も示す。これら全ては引用することを以って本明細書の一部とする。
【０２００】
表３は、本発明のポリペプチドの様々な構造的特徴を示す。列１および列２はそれぞれ、本発明の各ポリペプチドのポリペプチド配列識別番号（SEQ ID NO :）およびそれに対応するIncyte ポリペプチド配列番号（Incyte ポリペプチド ID）を示す。列３は、各ポリペプチドのアミノ酸残基数を示す。列４および列５はそれぞれ、GCG配列分析ソフトウェアパッケージのMOTIFSプログラム（Genetics Computer Group, Madison WI）によって決定された、リン酸化およびグリコシル化の可能性のある部位を示す。列６は、シグネチャ配列、ドメイン、およびモチーフを含むアミノ酸残基を示す。列７は、タンパク質の構造／機能の分析のための分析方法を示し、該当箇所にはさらに分析方法に利用した検索可能なデータベースを示す。
【０２０１】
表２及び表３は共に、本発明の各々のポリペプチドの特性を要約しており、それらの特性が、請求の範囲に記載されたポリペプチドが神経伝達関連タンパク質であることを確立している。たとえば、SEQ ID NO:1はヒトのコリントランスポータ様タンパク質である CTL2 (GenBank ID g6996444)とM1残基からS704残基まで98％同一であることがBasic Local Alignment Search Tool (BLAST)によって示された（表2参照）。BLAST確率スコアはごくわずかであり、それは、観測されたポリペプチド配列を偶然に得る確率を示す。
【０２０２】
別の例において、SEQ ID NO:2はラットのRobo2受容体 (GenBank ID g6164831)とM1からA1050まで92％同一であることがBLAST解析によって示された。BLAST確率スコアも無視しうるものである。SEQ ID NO:2はまた、Robo受容体と一致するドメインを有するが、これは、隠れマルコフモデル（HMM）を基にした保存されたタンパク質ファミリードメインのPFAMデータベースにおいて、統計的に有意な一致を検索して決定された（表3参照）。BLIMPS 解析よりのデータは、SEQ ID NO:2 がRobo2受容体相同体である、さらに実証的な証拠を提供する。
【０２０３】
別の例において、SEQ ID NO:3は知覚ニューロンで特異的に発現するラットのホメオドメイン転写因子 (GenBank ID g1144015)とY57からV298まで76％同一であることがBLAST解析によって示された。BLAST確率スコアは2.0e-93である。SEQ ID NO:3はまた、ホメオドメインを有するが、 これは、隠れマルコフモデル（HMM）を基にした保存されたタンパク質ファミリードメインのPFAMデータベースにおいて、統計的に有意な一致を検索して決定された。BLIMPS及びPROFILESCAN解析よりのデータは、SEQ ID NO:3 がホメオドメインタンパク質である、さらに実証的な証拠を提供する。
【０２０４】
さらに別の例において、SEQ ID NO:4はニューロンの発達に関連するヒトの線維芽細胞成長因子(GenBank ID g1563889)とM1からP233まで96％同一であることがBLAST解析によって示された。BLAST確率スコアは2.4e-116である。SEQ ID NO:4はまた、線維芽成長因子ドメインを有し、これは、隠れマルコフモデル（HMM）を基にした保存されたタンパク質ファミリードメインのPFAMデータベースにおいて、統計的に有意な一致を検索して決定された。BLIMPS、MOTIFS、及びPROFILESCAN解析よりのデータは、SEQ ID NO:4 がFHFである、さらに実証的な証拠を提供する。
【０２０５】
さらに別の例において、SEQ ID NO:5はDnaJ/hsp40 （熱ショックタンパク質）シャペロンファミリのメンバーであるラットのシステインストリングタンパク質(GenBank ID g2642629)と残基N7からD198まで68％同一であることがBLAST解析によって示された。BLAST確率スコアは2.4e-116である。BLAST確率スコアは9.4e-74である。SEQ ID NO:5はまた、DnaJドメインを有するが、 これは、隠れマルコフモデル（HMM）を基にした保存されたタンパク質ファミリードメインのPFAMデータベースにおいて、統計的に有意な一致を検索して決定された。BLIMPS、PROFILESCANおよびMOTIFS解析から得られたデータによって、SEQ ID NO:5がDnaJ/hsp40シャペロンファミリーのメンバーであることがさらに実証される。さらに別の例において、SEQ ID NO:6はマウスのシナプトタグミンX (GenBank ID g6136792)と残基M1からP533まで91％同一であり、BLAST確率スコアは7.6e-266であった。SEQ ID NO:6はまた、１つのC2ドメインを有するが、これは、隠れマルコフモデル（HMM）を基にした保存されたタンパク質ファミリードメイン群のPFAMデータベースにおいて、統計的に有意な一致を検索して決定された（表3参照）。BLIMPS、MOTIFS、及びPROFILESCAN解析よりのデータは、SEQ ID NO:6 がシナプトタグミンであるという、さらに確証的な証拠を提供する。SEQ ID NO:7-8 は、同様にして解析され注釈された。SEQ ID NO:１-8の解析のためのアルゴリズム及びパラメータが表７で記述されている。
【０２０６】
表４に示すように、本発明の完全長ポリヌクレオチド配列は、cDNA配列またはゲノムDNA由来のコード（エキソン）配列を用いて、或いはこれら２種類の配列を任意に組み合わせて構築(アセンブリ)した。列１は本発明の各ポリヌクレオチドに対するポリヌクレオチド配列識別番号（ポリヌクレオチドSEQ ID NO）および対応するIncyteポリヌクレオチドコンセンサス配列番号（Incyte ID）、および塩基対での各ポリヌクレオチド配列の長さを示している。列２は、本発明の全長ポリヌクレオチド配列を構築するために使われたｃDNA配列および／またはゲノム配列のヌクレオチド開始位置（5'）と終了位置（3'）を示し、またSEQ ID NO：9-16を同定するための、またはSEQ ID NO：9-16と関連するポリヌクレオチド配列とを区別するための技術（例えば、ハイブリダイゼーション技術または増幅技術）で有用なポリヌクレオチド配列の断片のヌクレオチド開始位置（5'）と終了位置（3'）を示す。
【０２０７】
表４の列２で記述されたポリヌクレオチド断片は、特にたとえば組織特異的なｃDNAライブラリまたはプールされたcDNAライブラリに由来するIncyte cDNAを指す場合がある。或いは列2に記載したポリヌクレオチド断片は、完全長ポリヌクレオチド配列のアセンブリに寄与するGenBank cDNAまたはESTを指す場合もある。さらに、列2のポリヌクレオチド断片は、ENSEMBL（The Sanger Centre、英国ケンブリッジ）データベースから由来した配列（即ち「ENST」命名を含む配列）を同定し得る。或いは、列2で記述されたポリヌクレオチド断片は、NCBI RefSeq Nucleotide Sequence Records データベースから由来する場合もあり（即ち「NM」または「NT」の命名を含む配列）、またNCBI RefSeq Protein Sequence Recordsから由来する場合もある（即ち「NP」の命名を含む配列）。または列２で記述されたポリヌクレオチド断片は、「エキソンスティッチング（exon-stitching）」アルゴリズムにより結び合わせたcDNA及びGenscan予測エキソンの両方からなる構築物を意味する場合がある。例えば、FL_XXXXXX_N1_N2_YYYYY_N3_N4  として同定されるポリヌクレオチド配列はアルゴリズムが適用される配列のクラスターの識別番号がXXXXXXであり、アルゴリズムにより生成される予測の番号がYYYYY であり、（もし存在すれば）N1,2,3..が解析中に手動で編集された可能性のある特定のエキソンであるような「縫合された(stitched)」配列である(実施例５参照)。または、列2のポリヌクレオチド断片は「エキソンストレッチング（exon-stretching）」アルゴリズムにより結び合わせたエキソンの構築物を指す場合もある。例えば、FLXXXXXX_gAAAAA_gBBBBB_1_N として同定されるポリヌクレオチド配列は「ストレッチ」配列である。ここでXXXXXXはIncyteプロジェクト識別番号、gAAAAAは「エキソンストレッチング」アルゴリズムを適用したヒトゲノム配列のGenBank識別番号、gBBBBBは一番近いGenBankタンパク質相同体のGenBank識別番号またはNCBI RefSeq 識別番号、N は特定のエキソンを指す（実施例５を参照）。あるRefSeq配列が「エキソンストレッチング」アルゴリズムのためのタンパク質相同体として使用された場合では、RefSeq識別子（「NM」、「NP」、または「NT」によって表される）が、GenBank識別子（即ち、gBBBBB）の代わりに使用される場合もある。
【０２０８】
或いは、接頭コードは、手動で編集された構成配列、ゲノムDNA配列から予測された構成配列、または組み合わされた配列解析方法から由来する構成配列を同定する。次の表は、構成配列の接頭コードと、接頭コードに対応する配列分析方法の例を列記する(実施例４と５を参照)。
2004523236.tif 000003
【０２０９】
場合によっては、最終コンセンサスポリヌクレオチド配列を確認するために表4に示すような配列の適用範囲と重複するIncyte cDNAの適用範囲が得られたが、それに関連するIncyte cDNA識別番号は示さなかった。
【０２１０】
表５は、Incyte cDNA配列を用いて構築された完全長ポリヌクレオチド配列のための代表的なcDNAライブラリを示している。代表的なcDNAライブラリは、上記のポリヌクレオチド配列を構築及び確認するために用いられたIncyte cDNA配列によって最も頻繁に代表されるIncyte cDNAライブラリである。cDNAライブラリを作製するために用いた組織及びベクターを表５に示し、表６で説明している。
【０２１１】
本発明はまた、NTRANの変異体も含む。好適なNTRANの変異体は、NTRANの機能的或いは構造的特徴の少なくともどちらか一方を有し、かつ該NTRANアミノ酸配列に対して少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性、或いは少なくとも約９０％のアミノ酸配列同一性、更には少なくとも約９５％のアミノ酸配列同一性を有する。
【０２１２】
本発明はまた、NTRANをコードするポリヌクレオチドを含む。特定の実施例において、本発明は、NTRANをコードするSEQ ID NO:9-16からなる群から選択した配列を含むポリヌクレオチド配列を含む。SEQ ID NO:9-16のポリヌクレオチド配列には、配列表に示したように等価RNA配列をも含むが、そこでは窒素塩基チミンの出現はウラシルに置換され、糖のバックボーンはデオキシリボースではなくリボースで構成される。
【０２１３】
本発明には、NTRANをコードするポリヌクレオチド配列の変異配列も含まれる。詳細には、このような変異体ポリヌクレオチド配列は、NTRANをコードするポリヌクレオチド配列と少なくとも７０％のポリヌクレオチド配列同一性、或いは少なくとも８５％のポリヌクレオチド配列同一性、更には少なくとも９５％ものポリヌクレオチド配列同一性を有することとなる。本発明の特定の実施形態は、SEQ ID NO:9-16からなる一群から選択された核酸配列と少なくとも７０％、或いは少なくとも８５％、更には少なくとも９５％ものポリヌクレオチド配列同一性を有するSEQ ID NO:9-16からなる一群から選択された配列を含むポリヌクレオチド配列の変異配列を提供する。上記したポリヌクレオチド変異配列は何れも、NTRANの機能的或いは構造的特徴の少なくとも１つを有するアミノ酸配列をコードしうる。
【０２１４】
更にあるいは別法では、本発明のポリヌクレオチドの変異体はNTRANをコ−ドするポリヌクレオチド配列のスプライス変異体である。スプライス変異体はNTRANをコードするポリヌクレオチド配列との有意な配列同一性を持つ部分複数を有し得るが、mRNAプロセッシング中のエキソンの選択的スプライシングによる配列ブロックの付加または欠失により、通常、より多数またはより少数のポリヌクレオチドを有することになる。或るスプライス変異配列には、約７０％未満、または約６０％未満、あるいは約５０％未満のポリヌクレオチド配列同一性が、NTRANをコードするポリヌクレオチド配列との間で全長に渡って見られるが、このスプライス変異配列のいくつかの部分には、NTRANをコードするポリヌクレオチド配列の各部との、少なくとも約７０％、あるいは少なくとも約８５％、または少なくとも約９５％、なおまたは１００％の、ポリヌクレオチド配列同一性を有することとなる。例えば、SEQ ID NO:16の配列を含むポリヌクレオチドは、SEQ ID NO:10の配列を含むポリヌクレオチドのスプライス変異体である。上記した任意のスプライス変異体は、NTRANの少なくとも1つの機能的あるいは構造的特徴を含むアミノ酸配列をコ-ドすることができる。
【０２１５】
遺伝暗号の縮重により、NTRANをコードする種々のポリヌクレオチド配列が作り出され、中には、既知のいかなる天然遺伝子のポリヌクレオチド配列群とも最小の類似性しか有しない配列もあることは、当業者には理解されよう。したがって本発明には、可能コドン選択に基づく組合せの選択によって産出し得るようなありとあらゆる可能性のあるポリヌクレオチド配列変異体を網羅し得る。これらの組み合わせは、天然NTRANのポリヌクレオチド配列に適用される標準的なトリプレット遺伝暗号を基に作られる。また、こうした全ての変異が明確に開示されていると考慮されたい。
【０２１６】
NTRANとその変異配列とをコードするヌクレオチド配列は一般に、好適に選択されたストリンジェンシー条件下で、天然NTRANのヌクレオチド配列とハイブリダイズ可能であるが、非天然のコドンを含めるなどの実質的に異なったコドン使用を有するNTRAN或いはその誘導体をコードするヌクレオチド配列を作ることは有益であり得る。宿主が特定のコドンを利用する頻度に基づいて、特定の真核宿主又は原核宿主に発生するペプチドの発現率を高めるようにコドンを選択することが可能である。コードされるアミノ酸配列を改変せずに、NTRAN及びその誘導体をコードするヌクレオチド配列を実質的に改変する別の理由には、天然配列から作られる転写物より例えば長い半減期など好ましい特性を備えるRNA転写物を作ることもある。
【０２１７】
本発明には、NTRAN、とその誘導体群とをコードする、DNA配列又はそれらの断片を完全に合成化学によって作製することも含まれる。作製後にこの合成配列を、当分野で良く知られた試薬を用いて、多くの入手可能な発現ベクター及び細胞系の何れの中にも挿入可能である。更に、合成化学を用いて、NTRANをコードする配列、またはその任意の断片の中に突然変異体を導入することも可能である。
【０２１８】
更に本発明には、種々のストリンジェンシー条件下で、請求項に記載されたポリヌクレオチド配列、特に、SEQ ID NO:9-16 及びそれらの断片とハイブリダイズ可能なポリヌクレオチド配列が含まれる(例えば、Wahl, G.M.及びS.L. Berger (1987) Methods Enzymol.152:399-407、Kimmel, A.R. (1987) Methods Enzymol. 152:507-511等を参照)。アニーリング及び洗浄条件を含むハイブリダイゼーションの条件は、「定義」に記載されている。
【０２１９】
DNAシークエンシングの方法は当分野では公知であり、本発明のいずれの実施例もDNAシークエンシング方法を用いて実施可能である。DNAシークエンシング方法には酵素を用いることができ、例えばDNAポリメラーゼIのクレノウ断片、SEQUENASE（US Biochemical, Cleveland OH）、Taqポリメラーゼ（Applied Biosystems）、熱安定性T7ポリメラーゼ（Amersham, Pharmacia Biotech, Piscataway NJ）を用いることができる。或いは、例えばELONGASE増幅システム（Life Technologies, Gaithersburg MD）において見られるように、ポリメラーゼと校正エキソヌクレアーゼを併用することができる。好適には、MICROLAB2200液体転移システム（Hamilton, Reno, NV）、PTC200サーマルサイクラー（MJ Research, Watertown MA）及びABI CATALYST 800サーマルサイクラー（Applied Biosystems）等の装置を用いて配列の準備を自動化する。次に、ABI 373 或いは 377 DNAシークエンシングシステム（Applied Biosystems）、MEGABACE 1000 DNAシークエンシングシステム（Molecular Dynamics, Sunnyvale CA）または当分野で既知の他の方法を用いてシークエンシングを行う。結果として得られた配列を当分野でよく知られている種々のアルゴリズムを用いて分析する（例えば、Ausubel, F.M. (1997) Short Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York NY, 7.7ユニット、Meyers, R.A. (1995) Molecular Biology and Biotechnology, Wiley VCH, New York NY, 856-853ページを参照）。
【０２２０】
当分野で周知のPCR法をベースにした種々の方法で、部分的なヌクレオチド配列を利用して、NTRANをコードする核酸配列を伸長し、プロモーターや調節エレメントなど、上流にある配列を検出する。例えば、使用し得る方法の１つである制限部位PCR法は、ユニバーサルプライマー及びネステッドプライマーを用いてクローニングベクター内のゲノムDNAから未知の配列を増幅する方法である(例えば、Sarkar, G. (1993) PCR Methods Applic. 2:318-322を参照)。別の方法に逆PCR法があり、これは広範な方向に伸長させたプライマーを用いて環状化した鋳型から未知の配列を増幅する方法である。鋳型は、既知のゲノム遺伝子座及びその周辺の配列を含む制限酵素断片から得る(例えば、Triglia, T. 他 (1988) Nucleic Acids Res. 16:8186を参照)。第３の方法としてキャプチャPCR法があり、これはヒト及び酵母菌人工染色体DNAの既知の配列に隣接するDNA断片をPCR増幅する方法に関与している。（Lagerstrom, M.他(1991) PCR Methods Applic 1:111-119等を参照）。この方法では、PCRを行う前に複数の制限酵素の消化及びライゲーション反応を用いて未知の配列領域内に組換え二本鎖配列を挿入することが可能である。また、未知の配列を検索するために用い得る別の方法については当分野で知られている（Parker, J.D.他 (1991) Nucleic Acids Res. 19:3055-3060等を参照）。更に、PCR、ネステッドプライマー及びPromoterFinderライブラリ（Clontech, Palo Alto CA）を用いてゲノムDNAをウォーキングすることができる。この手順は、ライブラリをスクリーニングする必要がなく、イントロン／エキソン接合部を見付けるのに有用である。全てのPCRベースの方法に対して、市販されているソフトウェア、例えばOLIGO 4.06プライマー分析ソフトウェア（National Biosciences, Plymouth MN）或いは別の好適なプログラムを用いて、長さが約２２〜３０ヌクレオチド、GC含有率が約５０％以上、温度約６８℃〜７２℃で鋳型に対してアニーリングするようにプライマーを設計し得る。
【０２２１】
完全長cDNAをスクリーニングする際は、より大きなcDNAを含むようにサイズ選択されたライブラリを用いるのが好ましい。更に、ランダムプライマーのライブラリは、しばしば遺伝子の５'領域を有する配列を含み、オリゴd(T)ライブラリが完全長cDNAを作製できない状況に対して好適である。ゲノムライブラリは、５'非転写調節領域への配列の伸長に有用であろう。
【０２２２】
市販のキャピラリー電気泳動システムを用いて、シークエンシングまたはPCR産物のサイズを分析し、またはそのヌクレオチド配列を確認することができる。具体的には、キャピラリーシークエンシングは、電気泳動による分離のための流動性ポリマーと、４つの異なるヌクレオチドに特異的であるような、レーザで活性化される蛍光色素と、発光された波長の検出に利用するCCDカメラとを有し得る。出力／光の強度は、適切なソフトウェア（Applied Biosystems社のGENOTYPER、SEQUENCE NAVIGATOR等）を用いて電気信号に変換し得る。サンプルのロードからコンピュータ分析及び電子データ表示までの全プロセスがコンピュータ制御可能である。キャピラリー電気泳動法は、特定のサンプルに少量しか存在しないようなDNA小断片のシークエンシングに特に適している。
【０２２３】
本発明の別の実施例では、NTRANをコードするポリヌクレオチド配列またはその断片を組換えDNA分子内でクローニングして、適切な宿主細胞内にNTRAN、その断片または機能的等価物を発現させることが可能である。遺伝暗号固有の宿重に起因して、実質的同一或いは機能的等価のアミノ酸配列をコードするような別のDNA配列を作製してNTRANの発現に利用し得る。
【０２２４】
種々の目的でNTRANをコードする配列を改変するために、当分野で一般的に知られている方法を用いて、本発明のヌクレオチド配列を組換えることができる。この目的には、遺伝子産物のクローン化の、あるいはプロセッシング及び／または発現の調節が含まれるが、これらに限定されるものではない。遺伝子断片及び合成オリゴヌクレオチドのランダムなフラグメンテーション及びＰＣＲ再アセンブリによるＤＮＡシャッフリングを用い、ヌクレオチド配列を組み換えることが可能である。例えば、オリゴヌクレオチドを介した部位特異的変異誘導を利用して、新規な制限部位の作製、グリコシル化パターンの変更、コドン優先の変更、スプライス変異体の生成等を起こす突然変異を導入し得る。
【０２２５】
本発明のヌクレオチドを、MOLECULARBREEDING (Maxygen Inc., Santa Clara CA; 米国特許第5,837,458号; Chang, C.-C. 他 (1999) Nat. Biotechnol. 17:793-797; Christians, F.C. 他 (1999) Nat. Biotechnol. 17:259-264; Crameri, A. 他 (1996) Nat. Biotechnol. 14:315-319)などのDNAシャフリング技術を用いてシャフリングして、NTRANの生物学的または酵素的な活性、或いは他の分子や化合物と結合する能力などのNTRANの生物学的特性を変更或いは改良することができる。DNAシャッフリングは、遺伝子断片のPCRを介する組換えを用いて遺伝子変異体のライブラリを作製するプロセスである。ライブラリはその後、所望の特性を持つ遺伝子変異配列群を同定する、選択またはスクリーニングにかける。次にこれらの好適な変異体をプールし、更に反復してDNAシャッフリング及び選択／スクリーニングを行ってもよい。従って、人工的な育種及び急速な分子の進化によって多様な遺伝子が作られる。例えば、ランダムポイント突然変異を有する単一の遺伝子の断片を組み換えて、スクリーニングし、その後所望の特性が最適化されるまでシャッフリングすることができる。或いは、所与の遺伝子を同種または異種のいずれかから得た同一遺伝子ファミリーの相同遺伝子の断片と組み換え、それによって天然に存在する複数の遺伝子の遺伝多様性を、定方向の、制御可能な方法で最大化させることができる。
【０２２６】
別の実施例によれば、当分野でよく知られている化学的方法を用いて、NTRANをコードする配列の全部或いは一部を合成し得る（Caruthers. M.H.ら (1980) Nucleic. Acids Symp. Ser 7:215-223、Horn, T.ら (1980) Nucleic. Acids Symp. Ser. 7:225-232等を参照）。或いは、化学的方法を用いてNTRANそれ自体またはその断片を合成し得る。例えば、種々の液相または固相技術を用いてペプチド合成を行うことができる(たとえば、 Creighton, T. (1984) Proteins, Structures and Molecular Properties, WH Freeman, New York NY, 55-60ページ; Roberge, J.Y. 他 (1995) Science 269:202204を参照）。自動合成はABI 431Aペプチドシンセサイザ（Applied Biosystems）を用いて達成し得る。更に、NTRANのアミノ酸配列または任意のその一部は、直接的な合成の際に改変することにより、及び／または他のタンパク質からの配列群または任意のその一部と組み合わせることにより、或る天然ポリペプチドの配列を有するポリペプチドまたは変異体ポリペプチドを作製することが可能である。
【０２２７】
このペプチドは、分取用高速液体クロマトグラフィーを用いて実質的に精製し得る（Chiez, R.M.およびF.Z. Regnier (1990) Methods Enzymol. 182:392-421などを参照）。この合成ペプチドの組成は、アミノ酸分析またはシークエンシングによって確認できる（前出のCreighton, 28-53ページ等を参照）。
【０２２８】
生物学的に活性なNTRANを発現させるために、NTRANをコードするヌクレオチド配列またはその誘導体を好適な発現ベクターに挿入しうる。この発現ベクターは、好適な宿主に挿入されたコーディング配列の転写及び翻訳の調節に必要なエレメントを含む。これらのエレメントには、ベクター及びNTRANをコードするポリヌクレオチド配列とにおける調節配列群（エンハンサー、構成型及び発現誘導型のプロモーター、５'及び３'の非翻訳領域など)が含まれる。このようなエレメントは、強度及び特異性が様々である。特異的開始シグナルを用いて、NTRANをコードする配列をより効果的に翻訳することも可能である。このようなシグナルには、ATG開始コドンと、コザック配列などの近傍の配列が含まれる。NTRANをコードする配列及びその開始コドン、上流の調節配列が好適な発現ベクターに挿入された場合は、更なる転写調節シグナルや翻訳調節シグナルは必要ないこともある。しかしながら、コーディング配列或いはその断片のみが挿入された場合は、インフレームのATG開始コドンを含む外因性の翻訳調節シグナルが発現ベクターに含まれるようにすべきである。外因性の翻訳エレメント及び開始コドンは、様々な天然物及び合成物を起源とし得る。用いられる特定の宿主細胞系に好適なエンハンサーを含めることで発現の効率を高めることが可能である。（Scharf, D. 他 (1994) Results Probl. Cell Differ. 20:125-162.等を参照）。
【０２２９】
当業者に周知の方法を用いて、NTRANをコードする配列、好適な転写及び翻訳調節エレメントを含む発現ベクターを作製することが可能である。これらの方法には、in vitro組換えDNA技術、合成技術、及びin vivo遺伝子組換え技術が含まれる(例えば、 Sambrook, J. 他. (1989) Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Plainview NY, 4章及び8章, および１6-17章; およびAusubel, F.M. 他. (1995) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York NY, ch. 9章、13章および16章を参照)。
【０２３０】
種々の発現ベクター／宿主系を利用して、NTRANをコードする配列の保持及び発現が可能である。限定するものではないがこのような発現ベクター／宿主系には、組換えバクテリオファージ、プラスミドまたはコスミドDNA発現ベクターで形質転換させた細菌や、酵母菌発現ベクターで形質転換させた酵母菌など微生物や、ウイルス発現ベクター（例えばバキュロウイルス）に感染した昆虫細胞系や、ウイルス発現ベクター（例えばカリフラワーモザイクウイルス、CaMVまたはタバコモザイクウイルスTMV）または細菌発現ベクター（例えばTiまたはpBR322プラスミド）で形質転換させた植物細胞系、動物細胞系がある。（前出のSambrook、前出のAusubel、Van Heeke, G. and S.M. Schuster (1989) J. Biol. Chem. 264:5503-5509、; Engelhard、E.K. ら (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:3224-3227、Sandig, V. ら (1996) Hum. Gene Ther. 7:1937-1945、Takamatsu, N. (1987) EMBOJ. 6:307-311、;『マグローヒル科学技術年鑑』(The McGraw Hill Yearbook of Science and Technology) (1992) McGraw Hill New York NY, 191-196ページ、Logan, J. and T. Shenk (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:3655-3659、Harrington, J.J. ら (1997) Nat. Genet. 15:345-355等を参照）。レトロウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルスまたはワクシニアウイルス由来の発現ベクター、または種々の細菌性プラスミド由来の発現ベクターを用いて、ヌクレオチド配列を標的器官、組織または細胞集団へ輸送することができる（Di Nicola, M. 他 (1998) Cancer Gen. Ther. 5(6):350-356、Yu, M. 他 (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90(13):6340-6344、Buller, R.M. 他 (1985) Nature 317(6040):813-815; McGregor, D.P. 他 (1994) Mol. Immunol. 31(3):219-226、Verma, I.M. 及び N. Somia (1997) Nature 389:239-242等を参照）。本発明は使用される宿主細胞によって限定されるものではない。
【０２３１】
細菌系では、多数のクローニングベクター及び発現ベクターが、NTRANをコードするポリヌクレオチド配列の使用目的に応じて選択可能である。例えば、NTRANをコードするポリヌクレオチド配列の日常的なクローニング、サブクローニング、増殖は、PBLUESCRIPT(Stratagene, La Jolla CA)またはPSPORT１プラスミド(Life Technologies)などの多機能の大腸菌ベクターを用いて達成することができる。ベクターのマルチクローニング部位にNTRANをコードする配列を連結反応するとlacＺ遺伝子が破壊され、組換え分子を含む形質転換された細菌の同定のための比色スクリーニング法が可能となる。更にこれらのベクターは、クローニングされた配列におけるin vitro転写、ジデオキシのシークエンシング、ヘルパーファージによる一本鎖のレスキュー、入れ子状態の欠失の生成にも有用であろう(例えば、Van Heeke, G. および S.M. Schuster (1989) J. Biol. Chem. 264:55035509を参照)。例えば、抗体の産生のためなどに多量のNTRANが必要な場合は、NTRANの発現をハイレベルで誘導するベクターが使用できる。例えば、強力な誘導SP６バクテリオファージプロモーターまたは誘導T7バクテリオファージプロモーターを含むベクターが使用できる。
【０２３２】
酵母の発現系を使用してNTRANを産出し得る。α因子、アルコールオキシダーゼ、PGHプロモーター等の構成型或いは誘導型のプロモーターを含む多数のベクターが、出芽酵母菌（Saccharomyces cerevisiae） またはピキア酵母（Pichia pastoris）に使用可能である。更に、このようなベクターは、発現したタンパク質の分泌か細胞内への保持のどちらかを誘導し、安定した増殖のために宿主ゲノムの中に外来配列を組み込むことを可能にする(例えば、Ausubel, 1995,前出、Bitter, G.A. 他 (1987) Methods Enzymol.153:516-544、及びScorer. C. A. 他 (1994) Bio/Technology 12:181-184を参照)。
【０２３３】
植物系を使用してNTRANを発現することも可能である。NTRANをコードする配列の転写は、ウイルスプロモーター、例えば単独あるいはTMV由来のオメガリーダー配列と組み合せて用いられるようなCaMV由来の35Sおよび19Sプロモーターによって促進される（Takamatsu, N. (1987) EMBO J. 6:307-311）。或いは、RUBISCOの小サブユニット等の植物プロモーターまたは熱ショックプロモーターを用いてもよい（例えば、Coruzzi, G. 他 (1984) EMBO J. 3 : 1671-1680 ; Broglie, R. 他 (1984) Science 224 : 838-843 ; および Winter, J. 他 (1991) Results Probl. Cell Differ. 17 : 85-105を参照）。これらの作製物は、直接DNA形質転換にまたは病原体を媒介とする形質移入によって、植物細胞内に導入可能である。（『マグローヒル科学技術年鑑』(The McGraw Hill Yearbook of Science and Technology) (1992) McGraw Hill New York NY, 191-196ページ等を参照。
【０２３４】
哺乳動物細胞においては、多数のウイルスベースの発現系を利用し得る。アデノウイルスが発現ベクターとして用いられる場合、後期プロモーター及び３連リーダー配列からなるアデノウイルス転写／翻訳複合体にNTRANをコードする配列を連結し得る。アデノウイルスゲノムの非必須のE1またはE3領域へ挿入することにより、宿主細胞内でNTRANを発現する感染ウイルスを得ることができる(例えば、Logan, J. および T. Shenk (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:3655-3659を参照)。更に、ラウス肉腫ウイルス（RSV）エンハンサー等の転写エンハンサーを用いて、哺乳動物宿主細胞における発現を増大させ得る。SV40またはEBVをベースにしたベクターを用いてタンパク質を高レベルで発現させることもできる。
【０２３５】
ヒト人工染色体（HAC）を用いて、プラスミドに含まれ得る断片やプラスミドから発現し得る断片より大きなDNAの断片群を送達することもできる。治療のために約６kb〜１０MbのHACsを作製し、従来の送達方法（リポソーム、ポリカチオンアミノポリマー、またはベシクル）で送達されている(例えば、Harrington. J.J. 他 (1997) Nat. Genet.15:345-355.を参照)。
【０２３６】
哺乳動物系の組換えタンパク質の長期にわたる産生のためには、株化細胞におけるNTRANの安定した発現が望ましい。例えば、NTRANをコードする配列を細胞株に形質転換するために、発現ベクター類と、同じベクター上の或いは別のベクター上の選択可能マーカー遺伝子とを用い得る。用いる発現ベクターは、ウイルス起源の複製要素、および／または内因性の発現要素を持ち得る。ベクターの導入後、選択培地に移す前に強化培地で約１〜２日間細胞を増殖させることができる。選択可能マーカーの目的は選択培地への抵抗性を与えることであり、選択可能マーカーが存在することにより、導入された配列をうまく発現するような細胞の成長及び回収が可能となる。安定的に形質転換された細胞の耐性クローンは、その細胞型に適した組織培養技術を用いて増殖可能である。
【０２３７】
任意の数の選択系を用いて、形質転換細胞株を回収できる。限定するものではないがこのような選択系には、tk−単純細胞のために用いられるヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子と、apr−細胞のために用いられるアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子がある(例えば、Wigler, M. 他 (1977) Cell 11:223-232; 及びLowy, I. 他(1980) Cell 22:817-823を参照)。また、選択の基礎として代謝拮抗物質、抗生物質或いは除草剤への耐性を用いることができる。例えばdhfrはメトトレキセートに対する耐性を与え、neoはアミノグリコシッドネオマイシン及びG-418に対する耐性を与え、alsはクロルスルフロンに対する耐性を、patはホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼに対する耐性を各々与える( Wigler, M. 他 (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:35673570; ColbereGarapin, F. 他 (1981) J. Mol. Biol. 150:114 等を参照）。この他の選択可能な遺伝子、例えば、代謝物のための細胞の必要条件を変えるtrpB及びhisDは、文献に記載されている(Hartman, S.C. および R.C. Mulligan (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:80478051を参照）。可視マーカー、例えばアントシアニン、緑色蛍光タンパク質（GFP；Clontech）、βグルクロニダーゼ及びその基質βグルクロニド、またはルシフェラーゼ及びその基質ルシフェリン等を用いてもよい。これらのマーカーを用いて、トランスフォーマントを特定するだけでなく、特定のベクター系に起因する一過性或いは安定したタンパク質発現を定量することが可能である(Rhodes, C.A. (1995) Methods Mol. Biol. 55:121-131等を参照)。
【０２３８】
マーカー遺伝子発現の存在／不存在によって目的の遺伝子の存在が示唆されても、その遺伝子の存在及び発現の確認が必要な場合もある。例えば、NTRANをコードする配列がマーカー遺伝子配列の中に挿入された場合、NTRANをコードする配列を含む形質転換された細胞は、マーカー遺伝子機能の欠落により特定可能である。または、１つのプロモーターの制御下で、或るマーカー遺伝子を、NTRANをコードする配列とタンデムに配置することも可能である。誘導または選択に応答したマーカー遺伝子の発現は通常、タンデム遺伝子の発現も示す。
【０２３９】
一般に、NTRANをコードする核酸配列を含み、NTRANを発現する宿主細胞は、当業者に周知の種々の方法を用いて特定することが可能である。 これらの方法には、DNA−DNA或いはDNA−RNAハイブリダイゼーションや、PCR法、核酸或いはタンパク質の検出及び／または数量化のための膜系、溶液ベース、或いはチップベースの技術を含むタンパク質生物学的試験法または免疫学的アッセイが含まれるが、これらに限定されるものではない。
【０２４０】
特異的なポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体のどちらかを用いるNTRANの発現の検出及び計測のための免疫学的な方法は、当分野で周知である。 このような技法には、酵素に結合したイムノソルベントアッセイ（ELISA）、ラジオイムノアッセイ（RIA）、蛍光標示式細胞分取器（FACS）などがある。NTRAN上の２つの非干渉エピトープに反応するモノクローナル抗体を用いた、２部位のモノクローナルベース イムノアッセイ（two-site, monoclonal-based immunoassay）が好ましいが、競合結合アッセイも用いることもできる。これらのアッセイ及びこれ以外のアッセイは、当分野で公知である（Hampton. R. 他 (1990) Serological Methods, a Laboratory Manual. APS Press. St Paul. MN, Sect. IV、Coligan, J. E. 他 (1997) Current Protocols in Immunology, Greene Pub. Associates and Wiley-Interscience, New York NY、Pound, J.D. (1998) Immunochemical Protocols, Humans Press, Totowa NJ等を参照）。
【０２４１】
多岐にわたる標識方法及び抱合方法が、当業者に知られており、様々な核酸アッセイおよびアミノ酸アッセイにこれらの方法を用い得る。NTRANをコードするポリヌクレオチドに関連する配列を検出するための、標識されたハイブリダイゼーションプローブ或いはPCRプローブを生成する方法には、オリゴ標識化、ニックトランスレーション、末端標識化、または標識されたヌクレオチドを用いるPCR増幅が含まれる。或いは、NTRANをコードする配列またはその任意の断片を、mRNAプローブを産出するためのベクターにクローニングすることも可能である。このようなベクターは、当分野において知られており、市販もされており、T7、T3またはSP6等の好適なRNAポリメラーゼ及び標識されたヌクレオチドを加えて、in vitroでRNAプローブの合成に用いることができる。このような方法は、例えばAmersham Pharmacia Biotech、Promega（Madison WI）、U.S. Biochemical等から市販されている種々のキットを用いて実行することができる。検出を容易にするために用い得る好適なレポーター分子或いは標識には、基質、補助因子、インヒビター、磁気粒子のほか、放射性核種、酵素、蛍光剤、化学発光剤、発色剤等がある。
【０２４２】
NTRANをコードするヌクレオチド配列で形質転換された宿主細胞は、細胞培地でのこのタンパク質の発現及び回収に好適な条件下で培養され得る。形質転換細胞から製造されたタンパク質が分泌されるか細胞内に留まるかは、使用される配列、ベクター、或いはその両者に依存する。NTRANをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターは、原核細胞膜及び真核細胞膜を透過してのNTRANの分泌を誘導するシグナル配列を含むように設計できることは、当業者には理解されよう。
【０２４３】
更に、宿主細胞株の選択は、挿入した配列の発現を調節する能力または発現したタンパク質を所望の形に処理する能力によって行い得る。限定するものではないがこのようなポリペプチドの修飾には、アセチル化、カルボキシル化、グリコシル化、リン酸化、脂質化及びアシル化がある。タンパク質の「プレプロ」または「プロ」形を切断する翻訳後のプロセシングを利用して、タンパク質の標的への誘導、折りたたみ及び／または活性を特定することが可能である。翻訳後の活性のための固有の細胞装置及び特徴のある機構を有する種々の宿主細胞（例えばCHO、HeLa、MDCK、MEK293、WI38等）は、American Type Culture Collection（ATCC, Manassas, VA）から入手可能であり、外来タンパク質の正しい修飾及び処理を確実にするように選択し得る。
【０２４４】
本発明の別の実施例では、NTRANをコードする、天然核酸配列、修飾された核酸配列、または組換え核酸配列を、或る異種配列にライゲーションすることにより、上記した任意の宿主系内で、或る融合タンパク質の翻訳を生じ得る。例えば、市販の抗体によって認識できる異種部分を含むキメラNTRANタンパク質が、NTRAN活性のインヒビターに対するペプチドライブラリのスクリーニングを促進し得る。また、異種タンパク質部分及び異種ペプチド部分も、市販されている親和性基質を用いて融合タンパク質の精製を促進し得る。限定されるものではないがこのような部分には、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（GST）、マルトース結合タンパク質（MBP）、チオレドキシン（Trx）、カルモジュリン結合ペプチド（CBP）、6-His、FLAG、c-myc、赤血球凝集素（HA）がある。GSTは固定化グルタチオン上で、MBPはマルトース上で、Trxはフェニルアルシンオキシド上で、CBPはカルモジュリン上で、そして6-Hisは金属キレート樹脂上で、同族の融合タンパク質の精製を可能にする。FLAG、c-myc及び赤血球凝集素（HA）は、これらのエピトープ標識を特異的に認識する市販されているモノクローナル抗体及びポリクローナル抗体を用いて、融合タンパク質の免疫親和性精製を可能にする。また、NTRANをコードする配列と異種タンパク質配列との間に、タンパク質分解切断部位を融合タンパク質が持つように遺伝子操作すると、NTRANが精製の後に異種部分から切断され得る。融合タンパク質の発現及び精製方法は、前出のAusubel (1995) 10章に記載されている。市販されている種々のキットを用いて融合タンパク質の発現及び精製を促進することもできる。
【０２４５】
本発明の別の実施例では、TNTウサギ網状赤血球可溶化液またはコムギ胚芽抽出系(Promega)を用いてin vitroで放射能標識したNTRANの合成が可能である。これらの系は、T7、T3またはSP6プロモーターと機能的に連結したタンパク質コード配列の転写及び翻訳をカップルさせる。翻訳は、例えば35Sメチオニンのような放射能標識したアミノ酸前駆体の存在下で起こる。
【０２４６】
本発明のNTRANまたはその断片を用いて、NTRANに特異結合する化合物をスクリーニングすることができる。少なくとも１つまたは複数の試験化合物を用いて、NTRANへの特異的な結合をスクリーニングすることが可能である。試験化合物の例には、抗体、オリゴヌクレオチド、タンパク質（例えば受容体）または小分子が挙げられる。
【０２４７】
或る実施態様では、このように同定された化合物は、NTRANの天然リガンドに密接に関連し、例えばリガンドやその断片であり、または天然基質や、構造的または機能的な擬態物質（mimetic）、あるいは自然結合パートナーである。（Coligan, J.E. 他 (1991) Current Protocols in Immunology 1(2)の5章等を参照）。同様に、化合物は、NTRANが結合する天然受容体、あるいは例えばリガンド結合部位などの少なくとも受容体のある断片に密接に関連する場合がある。何れの場合も、既知の技術を用いてこの化合物を合理的に設計することができる。一実施例では、これらの化合物に対するスクリーニングには、分泌タンパク質或いは細胞膜上のタンパク質の何れか一方としてNTRANを発現する好適な細胞の作製が含まれる。好適な細胞には、哺乳動物、酵母、ショウジョウバエ、または大腸菌からの細胞が含まれる。NTRANを発現する細胞またはNTRANを含有する細胞膜分画を試験化合物と接触させて、NTRANまたは化合物の何れかの結合、刺激または阻害を分析する。
【０２４８】
或るアッセイは、単に試験化合物をポリペプチドに実験的に結合させ、フルオロフォア、放射性同位体、酵素抱合体またはその他の検出可能な標識によりその結合を検出することができる。例えば、このアッセイは、少なくとも１つの試験化合物を、溶液中の或いは固体支持物に固定されたNTRANと混合するステップと、NTRANとこの化合物との結合を検出するステップを含み得る。別法では、標識された競合物の存在下での試験化合物の結合の検出及び測定を行うことができる。更にこのアッセイでは、無細胞再構成標本、化学ライブラリまたは天然産物の混合物を用いて実施することができ、試験化合物は、溶液中で遊離させるか固体支持体に固定させる。
【０２４９】
本発明のNTRANまたはその断片を用いて、NTRANの活性を調節(モジュレート)する化合物をスクリーニングすることが可能である。このような化合物には、アゴニスト、アンタゴニスト、部分的アゴニスト、または逆アゴニスト等が含まれる。一実施例では、NTRANが少なくとも１つの試験化合物と結合する、NTRANの活性が許容される条件下でアッセイを実施し、試験化合物の存在下でのNTRANの活性を試験化合物不在下でのNTRANの活性と比較する。試験化合物の存在下でのNTRANの活性の変化は、NTRANの活性を調節する化合物の存在を示唆する。別法では、試験化合物をNTRANの活性に適した条件下でNTRANを含むin vitroすなわち無細胞再構成系と結合させてアッセイを実施する。これらアッセイの何れにおいても、NTRANの活性をモジュレートする試験化合物は間接的にモジュレートする場合があり、その際は試験化合物と直接接触する必要がない。少なくとも１つから複数の試験化合物をスクリーニングすることができる。
【０２５０】
別の実施態様では、胚性幹細胞（ES細胞）における相同組み換えを用いて動物モデル系内で、NTRANまたはその哺乳動物相同体をコードするポリヌクレオチドを「ノックアウト」する。このような技術は当技術分野において周知であり、ヒト疾患動物モデルの作製に有用である（米国特許第5,175,383号及び第5,767,337号等を参照）。例えば129/SvJ細胞株等のマウスES細胞は初期のマウス胚に由来し、培地で増殖させることができる。このES細胞は、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子（neo: Capecchi, M.R. (1989) Science 244:1288-1292）等のマーカー遺伝子で破壊した目的の遺伝子を含むベクターで形質転換する。このベクターは、相同組換えにより宿主ゲノムの対応する領域に組み込まれる。別法では、Cre-loxP系を用いて相同組換えを行い、組織特異的または発生段階特異的に目的遺伝子をノックアウトする（Marth, J.D. (1996) Clin. Invest. 97:1999-2002; Wagner, K.U. 他 (1997) Nucleic Acids Res. 25:4323-43 30）。形質転換したES細胞を同定し、例えばC57BL/6マウス系等から採取したマウス細胞胚盤胞に微量注入する。胚盤胞を偽妊娠メスに外科的に導入し、得られるキメラ子孫の遺伝形質を決め、これを交配させてヘテロ接合性系またはホモ接合性系を作製する。このようにして作製した遺伝子組換え動物は、可能性のある治療薬や毒性薬剤で検査することができる。
【０２５１】
NTRANをコードするポリヌクレオチドをin vitroでヒト胚盤胞由来のES細胞において操作することが可能である。ヒトES細胞は、内胚葉、中胚葉及び外胚葉の細胞の種類を含む少なくとも８つの別々の細胞系統に分化する可能性を有する。これらの細胞系統は、例えば神経細胞、造血系統及び心筋細胞に分化する（Thomson, J.A. 他 (1998) Science 282:1145-1 147）。
【０２５２】
NTRANをコードするポリヌクレオチドを用いて、ヒト疾患をモデルとした「ノックイン」ヒト化動物（ブタ）または遺伝子組換え動物（マウスまたはラット）を作製することが可能である。ノックイン技術を用いて、NTRANをコードするポリヌクレオチドの或る領域を動物ES細胞に注入し、注入した配列を動物細胞ゲノムに組み込ませる。形質転換細胞を胞胚に注入し、胞胚を上記のように移植する。遺伝子組換え子孫または近交系について研究し、可能性のある医薬品を用いて処理し、ヒトの疾患の治療に関する情報を得る。別法では、例えばNTRANを乳汁内に分泌するなどNTRANを過剰に発現する哺乳動物近交系は、便利なタンパク質源となり得る（Janne, J. 他 (1998) Biotechnol. Annu. Rev. 4:55-74）。
【０２５３】
（治療）
NTRAN の領域と細胞骨格結合タンパク質の領域との間に、例えば配列及びモチーフの文脈における化学的及び構造的類似性が存在する。さらに、NTRAN を発現する組織は肺腫瘍およびBリンパ芽球などであり、また、表６にも見られる。したがって、NTRAN は自己免疫/炎症疾患、心血管疾患、神経疾患、発達または発生障害、癌を含む細胞増殖異常、輸送疾患、精神疾患、代謝疾患および内分泌疾患に関与していると考えられる。NTRANの発現若しくは活性の増大に関連する疾患の治療においては、NTRANの発現または活性を低下させることが望ましい。また、NTRANの発現または活性の低下に関連する疾患の治療においては、NTRANの発現または活性を増大させることが望ましい。
【０２５４】
従って、一実施例において、NTRANの発現または活性の低下に関連した疾患の治療または予防のために、患者にNTRANまたはその断片や誘導体を投与することが可能である。限定するものではないがこのような疾患の例として自己免疫／炎症疾患が含まれ、その中には後天性免疫不全症候群（AIDS）、アジソン病（慢性原発性副腎機能不全）、成人呼吸窮迫症候群、アレルギー、強直性脊椎炎、アミロイド症、貧血、喘息、アテローム性動脈硬化、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性甲状腺炎、自己免疫性多腺性内分泌カンジダ症外胚葉ジストロフィー（APECED）、気管支炎、胆嚢炎、接触皮膚炎、クローン病、アトピー性皮膚炎、皮膚筋炎、糖尿病、肺気腫、リンパ球傷害因子性偶発性リンパ球減少症、新生児溶血性疾患（胎児赤芽球症）、結節性紅斑、萎縮性胃炎、糸球体腎炎、グッドパスチャー症候群、痛風、グレーブス病、橋本甲状腺炎、過好酸球増加症、過敏性腸症候群、多発性硬化症、重症筋無力症、心筋または心膜炎症、骨関節炎、骨粗しょう症、膵炎、多発性筋炎、乾癬、ライター症候群、リウマチ様関節炎、強皮症、シェーグレン症候群、全身性アナフィラキシー、全身性エリテマトーデス、全身性強皮症、血小板減少性紫斑病、潰瘍性大腸炎、ぶどう膜炎、ウェルナー症候群、癌合併症、血液透析、体外循環、ウイルス感染症、細菌感染症、真菌感染症、寄生虫感染症、原虫感染症、蠕虫感染症、外傷が含まれ；心血管疾患として、うっ血性心不全、虚血性心疾患、狭心症、心筋梗塞、高血圧性心疾患、変性弁膜性心疾患、石灰化大動脈弁狭窄症、先天性二尖大動脈弁、僧帽弁輪部石灰化（mitral annular calcification）、僧帽弁脱出、リウマチ熱、リウマチ性心疾患、感染性心内膜炎、非細菌性血栓性心内膜炎、全身性紅斑性狼瘡の心内膜炎、カルチノイド心疾患、心筋症、心筋炎、心膜炎、腫瘍性心疾患、先天性心臓疾患、心臓移植の合併症、動静脈瘻、アテローム性動脈硬化症、高血圧、脈管炎、レイノー病、静脈奇形、動脈解離、静脈瘤、血栓静脈炎及び静脈血栓、血管の腫瘍、血栓崩壊の合併症、バルーン血管形成術（balloon angioplasty）、血管置換術、大動脈冠動脈バイパス術移植手術（coronary artery bypass graft surgery）が含まれ；  神経の疾患の中には、癲癇、虚血性脳血管障害、脳卒中、大脳新生物、ピック病、ハンチントン病、痴呆、パーキンソン病及びその他の錐体外路障害、筋萎縮性側索硬化及びその他の運動ニューロン障害、進行性神経性筋萎縮症、色素性網膜炎(網膜色素変性症)、遺伝性運動失調、多発性硬化症及び他の脱髄疾患、細菌性及びウイルス性髄膜炎、脳膿瘍、硬膜下膿瘍、硬膜外膿瘍、化膿性頭蓋内血栓性静脈炎、脊髄炎及び神経根炎、ウイルス性中枢神経系疾患と、クールー及びクロイツフェルト‐ヤコブ病、Gerstmann-Straussler-Scheinker症候群を含むプリオン病と、致死性家族性不眠症、神経系性栄養病及び代謝病、神経線維腫症、結節硬化症、小脳網膜血管芽腫（cerebelloretinal hemangioblastomatosis）、脳三叉神経血管症候群、ダウン症を含む中枢神経系性精神遅滞及び他の発達障害、脳性麻痺、神経骨格異常症、自律神経系障害、脳神経疾患、脊髄疾患筋ジストロフィー、および他の神経ミオパシー、末梢神経系疾患、皮膚筋炎及び多発性筋炎と、遺伝性、代謝性、内分泌性、及び中毒性ミオパシーと��重症筋無力症、周期性四肢麻痺と、気分性及び不安性の障害、分裂病（統合失調症）性疾患を含む精神障害と、季節性感情障害（SAD）と、静座不能、健忘症、緊張病、糖尿病性ニューロパシー、錐体外路性終末欠陥症候群(遅発性ジスキネジア)、ジストニー、パラノイド精神病、帯状疱疹後神経痛、及びトゥーレット病と、進行性核上麻痺、大脳皮質基底核変性症及び家族性前頭側頭型痴呆が含まれ；発生または発達障害の中には尿細管性アシドーシス、貧血、クッシング症候群、軟骨形成不全性小人症、デュシェンヌ／ベッカー型筋ジストロフィー、癲癇、性腺形成異常、WAGR症候群（ウィルムス腫瘍、無虹彩症、尿生殖器異常、精神遅滞）、スミス‐マジェニス症候群(Smith- Magenis syndrome)、脊髄形成異常症候群、遺伝性粘膜上皮異形成、遺伝性角皮症、遺伝性神経病（シャルコー‐マリー‐ツース病、神経線維腫症）、甲状腺機能低下症、水頭症、発作障害（Syndenham舞踏病(Syndenham's chorea)、脳性小児麻痺）、二分脊椎、無脳症、頭蓋脊椎披裂、先天性緑内障、白内障、感音難聴が含まれ；細胞増殖異常としてはたとえば、日光性角化症、動脈硬化、アテローム性動脈硬化、滑液包炎、硬変、肝炎、混合型結合組織病（MCTD）、骨髄線維症、発作性夜間ヘモグロビン尿症、真性多血症、乾癬、原発性血小板血症、並びに腺癌及び白血病、リンパ腫、黒色腫、骨髄腫、肉腫、及び奇形癌など癌、具体的には、副腎、膀胱、骨、骨髄、脳、乳房、頚部、胆嚢、神経節、消化管、心臓、腎臓、肝臓、肺、筋肉、卵巣、膵臓、副甲状腺、陰茎、前立腺、唾液腺、皮膚、脾臓、精巣、胸腺、甲状腺、子宮の癌が含まれ；輸送に関連した心臓病としては、狭心症、徐脈性不整脈、頻脈性不整脈、高血圧症、QT延長症候群、心筋炎、心筋症、ネマリンミオパシー、中心核ミオパシー、脂質ミオパシー、ミトコンドリアミオパシー、甲状腺中毒性ミオパシー、エタノールミオパシー、皮膚筋炎、封入体筋炎、感染性筋炎、及び多発性筋炎が含まれ；輸送に関連する神経疾患としてはアルツハイマー病, 記憶喪失, 双極性障害, 痴呆, 鬱病, 癲癇, トゥーレット病, パラノイド精神病, および精神分裂病(統合失調症)が含まれ；輸送に関連するその他の疾患としては神経線維腫症、帯状疱疹後神経痛、３叉神経ニューロパシー、サルコイドーシス、鎌状赤血球性貧血、ウィルソン病、白内障、不妊症、肺動脈狭窄症、常染色体性感音性難聴、高／低血糖症、グレーブス病、甲状腺腫、クッシング病と、アジソン病、グルコース‐ガラクトース吸収不良症候群、高コレステロール血症、副腎性白質ジストロフィー、ツェルヴェーガー症候群、メンケス病、後角症候群、フォンギールケ症候群、シスチン尿症、イミノグリシン尿症、Hartup病、ファンコーニ病が含まれ；精神疾患としては急性ストレス疾患, アルコール依存症, アンフェタミン依存症, 拒食症, 非社会性人格障害, 注意欠陥多動性障害, 自閉症, 不安症, 回避的人格障害, 双極性障害, 境界性人格障害, 短期的な精神異常, 神経性大食症, 大麻依存症, コカイン依存症, 行為障害, 気分循環性障害, 精神錯乱, 妄想性障害, 痴呆, 依存性人格障害, 鬱病, 気分変調性障害, 幻覚剤依存症, 演技性人格障害, 吸入物依存症, 躁鬱病, 多発脳梗塞性痴呆, 自己愛性人格障害, ニコチン依存症, 強迫神経症, オピオイド依存症, 反抗性���害, パニック障害, 妄想性人格障害, フェンシクリジン依存症, 恐怖症, 心的外傷後ストレス障害, 分裂病性感情障害, 分裂性人格障害, 精神分裂症, 鎮静剤依存症, 分離不安障害, および睡眠障害が含まれ；  代謝系の疾患としては、アジソン病、脳腱黄色腫症、先天性副腎過形成、クマリン耐性（coumarin resistance）、嚢胞性繊維症、糖尿病、脂肪性肝硬変、フルクトース-１、６−ジホスファターゼ欠乏症、ガラクトース血症、甲状腺腫、グルカゴノーマ、糖原病、遺伝性果糖不耐症、副腎髄質機能亢進症（Hyperadrenalism）、低アドレナリン症、副甲状腺機能亢進症、副甲状腺機能低下症、高コレステロール血症、甲状腺機能亢進症、低血糖症、甲状腺機能低下症、高脂質血症、高脂血症、脂質ミオパシー、脂肪異栄養症、リソソーム蓄積症、マンノシドーシス、ノイラミニナーゼ欠損症、肥満、骨粗しょう症、フェニルケトン尿症、プソイドビタミンD欠損くる病、炭水化物代謝障害(例えば、先天性II型異常赤血球産生症性貧血、糖尿病、インスリン依存型真性糖尿病、非インスリン依存型真性糖尿病、ガラクトースエピメラーゼ欠乏症、糖原病、リソソーム蓄積症、果糖尿、五炭糖尿症)、およびピルビン酸代謝の先天性異常、脂肪肝のような脂質代謝異常、胆汁うっ滞、原発性胆汁性肝硬変、カルニチン欠乏症、カルニチンパルミトイルトランスフェラーゼ欠乏症、ミオアデニレートデミナーゼ欠乏症、高トリグリセリド血症、ファブリー病などの脂質貯蔵病、ゴーシェ病、ニーマン‐ピック病、異染性白質ジストロフィー、副腎性白質ジストロフィー、GM２ガングリオシドーシス、セロイドリポフスチン症、無β‐リポ蛋白血症、タンジアー病、高リポ蛋白血症、脂肪異栄養症、脂肪腫症、急性皮下脂肪組織炎、播種性脂肪壊死症、有痛脂肪症、リポイド副腎過形成、微小変化ネフローゼ、脂肪腫、アテローム性動脈硬化症、高コレステロール血症、高トリグリセリド血症を伴った高コレステロール血症、原発性低αリポ蛋白血症、甲状腺症機能低下症、腎臟病、肝疾患、レシチン：コレステロールアシルトランスフェラーゼ欠乏症、脳腱黄色腫症、シトステロール血症、低コレステロール血症、テイ‐サックス病、サンドホフ病、高脂質血症、高脂血症、脂質ミオパシー、およびMenke's diseaseのような銅代謝疾患、ウイルソン病、およびエーレルス‐ダンロー症候群IX型糖尿病が含まれ；  内分泌疾患の中には原発性脳腫瘍及び腺腫、妊娠性梗塞、下垂体切除、動脈瘤、血管奇形、血栓症、感染症、免疫異常、頭部外傷による合併症などの病変から起こる視床下部及び下垂体の障害と、性機能低下及びシーハン症候群、尿崩症、カルマン病、ハンド‐シュラークリスチャン病、レテラー−ジーヴェ病、サルコイドーシス、エンプティセラ(トルコ鞍空虚)症候群、小人症を含む下垂体低下に関連した障害と、良性腺腫によって発生しやすい抗利尿ホルモン(ADH)不適合分泌症候群（SIADH）及び先端巨大症、巨人症を含む下垂体亢進に関連した障害と、甲状腺腫及び粘液水腫、細菌感染性急性甲状腺炎、ウイルス感染性亜急性甲状腺炎、自己免疫性甲状腺炎（橋本病）、クレチン病を含む甲状腺機能低下症に関連した障害と、甲状腺中毒症及びその様々な型、グレーブス病、前脛骨粘液水腫、中毒性多結節性甲状腺腫、甲状腺癌、プラマー病を含む��状腺機能亢進症と、Conn病（chronic hypercalemia）を含む副甲状腺機能亢進症と、Ｉ型及びII型糖尿病及び合併症などの膵臓疾患と、過形成及び副腎皮質の癌腫や腺腫、アルカローシスに関連した高血圧、アミロイド症、低カリウム血、クッシング病、リドル症候群、Arnold-Healy-Gordon症候群、褐色細胞腫瘍、アジソン病、副腎機能不全などの副腎に関連した障害と、女性の異常プロラクチン産生及び不妊症、子宮内膜症、月経周期の摂動、多嚢胞性卵巣疾患、高プロラクチン血症、ゴナドトロピン単独欠損症（isolated gonadotropin deficiency）、無月経、乳汁漏出症、半陰陽、多毛症及び男性化、乳癌、閉経期後の骨粗鬆症、男性のライジッヒ細胞不全(Leydig cell deficiency)、男性更年期、生殖細胞無形成、ライジッヒ細胞腫瘍に関連した性機能亢進、アンドロゲン受容体の欠如に関連したアンドロゲン耐性、５α−還元酵素症候群、女性化乳房症などの生殖腺ステロイドホルモンに関連した疾患とが含まれる。
【０２５５】
別の実施例では、限定するものではないが上に列記した疾患を含むNTRANの発現または活性の低下に関連した疾患の治療または予防のために、NTRANまたはその断片や誘導体を発現し得るベクターを被験者に投与することも可能である。
【０２５６】
更に別の実施例では、限定するものではないが上に列記した疾患を含むNTRANの発現または活性の低下に関連した疾患の治療または予防のために、実質的に精製されたNTRANを含む組成物を好適な医薬用担体と共に被験者に投与することも可能である。
【０２５７】
更に別の実施例では、限定するものではないが上に列記した疾患を含むNTRANの発現または活性の低下に関連した疾患の治療または予防のために、NTRANの活性を調節するアゴニストを被験者に投与することも可能である。
【０２５８】
更なる実施例では、NTRANの発現または活性の増大に関連した疾患の治療または予防のために、被験者にNTRANのアンタゴニストを投与することが可能である。限定するものではないが、このような疾患の例には、上記の自己免疫/炎症疾患、心血管疾患、神経疾患、発達または発生障害、癌を含む細胞増殖異常、輸送疾患、精神疾患、代謝疾患および内分泌疾患が含まれる。一実施態様では、NTRANと特異的に結合する抗体が直接アンタゴニストとして、或いはPKINを発現する細胞または組織に薬剤を運ぶターゲッティング或いは送達機構として間接的に用いられ得る。
【０２５９】
別の実施例では、限定するものではないが上に列記した疾患を含むNTRANの発現または活性の増大に関連した疾患の治療または予防のために、NTRANをコードするポリヌクレオチドの相補配列を発現するベクターを被験者に投与することも可能である。
【０２６０】
別の実施例では、本発明の任意のタンパク質、アンタゴニスト、抗体、アゴニスト、相補配列、またはベクターを、別の好適な治療薬と組み合わせて投与することもできる。併用療法で用いる好適な治療薬は、当業者が従来の医薬原理に従って選択し得る。治療薬と組み合わせることにより、上記した種々の疾患の治療または予防に相乗効果をもたらし得る。この方法を用いることにより少量の各薬剤で医薬効果をあげることが可能となり、それによって副作用の可能性を低減し得る。
【０２６１】
NTRANのアンタゴニストは、当分野で一般的な方法を用いて製造することが可能である。 詳しくは、精製されたNTRANを用いて抗体を作ったり、治療薬のライブラリをスクリーニングしてNTRANと特異的に結合するものを同定が可能である。NTRANの抗体も、当分野で一般的な方法を用いて製造することが可能である。このような抗体には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、一本鎖、Fab断片、及びFab発現ライブラリによって作られた断片が含まれる。但し、これらに限定されるものではない。中和抗体（即ち二量体の形成を阻害する抗体）は通常、治療用に好適である。（例えばラクダやラマの）一本鎖抗体は強力な酵素阻害剤である可能性があり、ペプチド擬態物質の設計および免疫吸着剤およびバイオセンサの開発に有用である可能性がある(Muyldermans, S. (2001) J. Biotechnol. 74:277-302)。
【０２６２】
抗体の産生のためには、ヤギ、ウサギ、ラット、マウス、ラクダ、ヒトコブラクダ、ラマ、ヒト及びその他のものを含む種々の宿主が、NTRAN または任意の断片、または免疫原性の特性を備えるそのオリゴペプチドの注入によって免疫化され得る。宿主の種に応じて、種々のアジュバントを用いて免疫応答を高めることもできる。限定するものではないがこのようなアジュバントには、フロイントアジュバントと、水酸化アルミニウム等のミネラルゲルアジュバントと、リゾレシチン、プルロニックポリオル、ポリアニオン、ペプチド、油性乳剤、スカシガイのヘモシニアン、ジニトロフェノール等の界面活性剤とがある。ヒトに用いられるアジュバントの中では、BCG（カルメット‐ゲラン杆菌）及びコリネバクテリウム‐パルバム（Corynebacterium parvum）が特に好ましい。
【０２６３】
NTRANに対する抗体を誘導するために用いられるオリゴペプチド、ペプチド、または断片は、少なくとも約５個のアミノ酸からなるアミノ酸配列を持つものが好ましく、一般的には、約１０個以上のアミノ酸からなる配列となる。これらのオリゴペプチド、ペプチドまたは断片はまた、天然のタンパク質のアミノ酸配列の一部と同一であることが望ましい。NTRANアミノ酸の短いストレッチは、KLHなどの別のタンパク質の配列と融合し、このキメラ分子に対する抗体が産生され得る。
【０２６４】
NTRANに対するモノクローナル抗体は、抗体分子を産生する任意の技術を用いて、培地内の連続した細胞株によって作製し得る。限定するものではないがこのような技術には、ハイブリドーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術及びEBV-ハイブリドーマ技術がある（Kohler, G. 他 (1975) Nature 256:495-497、Kozbor, D. 他 (1985) .J. Immunol. Methods 81:31-42、Cote, R.J. 他 (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:2026-2030、Cole, S.P. 他 (1984) Mol. Cell Biol. 62:109-120等を参照）。
【０２６５】
更に、「キメラ抗体」作製のために発達したヒト抗体遺伝子にマウス抗体遺伝子をスプライシングするなどの技術が、好適な抗原特異性及び生物学的活性を備える分子を得るために用いられる。（例えば、Morrison, S.L.他. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. 81:6851-6855; Neuberger, M.S.他. (1984) Nature 312:604-608; Takeda, S.他 (1985) Nature 314:452,454を参照）。別法では、当分野で既知の方法を用いて、一本鎖抗体の産生のための記載された技術を適用して、NTRAN特異的一本鎖抗体を生成しうる。関連した特異性を有するがイディオタイプ組成が異なるような抗体を、ランダムな組合せの免疫グロブリンライブラリからチェーンシャッフリングによって産生することもできる（Burton D.R. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:10134-10137等を参照）。
【０２６６】
抗体の産生は、リンパ球集団におけるin vivo産生の誘導によって、或いは文献に開示されているように非常に特異的な結合試薬の免疫グロブリンのライブラリまたはパネルのスクリーニングによっても行い得る。（Orlandi, R. 他 (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 3833-3837、Winter, G. 他 (1991) Nature 349:293-299等を参照）。
【０２６７】
NTRANに対する特異的な結合部位を含む抗体も得ることができる。例えば、限定するものではないが、このような断片には、抗体分子のペプシン消化によって作製されるF(ab')2 断片と、F(ab')2 断片のジスルフィド架橋を還元することによって作製されるFab断片とがある。或いは、Fab発現ライブラリを作製することによって、所望の特異性を持つモノクローナルFab断片を迅速且つ容易に同定することが可能となる（Huse, W.D. 他 (1989) Science 246:1275-1281等を参照）。
【０２６８】
種々のイムノアッセイを用いてスクリーニングし、所望の特異性を有する抗体を同定することができる。確立された特異性を有するポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体の何れかを用いる競合的結合アッセイ、または免疫放射定量測定法のための数々のプロトコルが、当分野では周知である。通常このような免疫測定法には、NTRANとその特異性抗体との間の複合体の計測が含まれる。２つの非干渉性NTRANエピトープに反応するモノクローナル抗体を用いるような、２部位モノクローナルベースのイムノアッセイが一般に利用されるが、競合結合アッセイを利用してもよい（前出のPoundの文献）。
【０２６９】
ラジオイムノアッセイ技術と共にScatchard分析などの様々な方法を用いて、NTRANに対する抗体の親和性を評価する。親和性は結合定数Kaで表す。 Kaは、平衡状態においてNTRAN抗体複合体のモル濃度を遊離抗体と遊離抗原のモル濃度で除した値であると定義する。ポリクローナル抗体類は多数のNTRANエピトープに対して親和性が不均一であり、或るポリクローナル抗体製剤に関して判定したKaは、NTRANに対する抗体群の平均の親和性または結合活性を表す。特定のNTRANエピトープに単一特異的なモノクローナル抗体の製剤のＫａは、親和性の真の測定値を表す。Ka値が１０９〜１０１２Ｌ／ｍｏｌの高親和性抗体製剤は、NTRAN抗体複合体が激しい操作に耐えなければならないイムノアッセイに用いるのが好ましい。Ka値が１０６〜１０７Ｌ／ｍｏｌの低親和性抗体製剤は、NTRANが抗体から最終的に活性化状態で解離する必要がある免疫精製（immunopurification）及び類似の処理に用いるのが好ましい。 (Catty, D. (1988) Antibodies, Volume I: A Practical Approach. IRL Press, Washington, DC; Liddell, J. E. および Cryer, A. (1991) A Practical Guide to Monoclonal Antibodies, John Wiley & Sons, New York NY)。
【０２７０】
ポリクローナル抗体製剤の抗体価及び結合活性を更に評価して、後に使う或る適用例に対するこのような試薬の品質及び適性を決定することができる。例えば、少なくとも１〜２ｍｇ／ｍｌの特異的な抗体、好ましくは５〜１０ｍｇ／ｍｌの特異的な抗体を含むポリクローナル抗体製剤は一般に、NTRAN抗体複合体を沈殿させなければならない処理に用いられる。抗体の特異性、抗体価、結合活性、様々な適用例における抗体の品質や使用に対する指針については、一般に入手可能である。（前出のCattyの文献、同Coligan 他の文献等を参照）。
【０２７１】
本発明の別の実施例では、NTRANをコードするポリヌクレオチド、またはその任意の断片や相補配列が、治療目的で使用されうる。ある実施態様では、NTRANをコードする遺伝子のコーディング領域や調節領域に相補的な配列やアンチセンス分子（DNA、RNA、PNA、または修飾したオリゴヌクレオチド）を設計して遺伝子発現を変更することができる。このような技術は当分野では周知であり、センスまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドまたは大きな断片が、NTRANをコードする配列の制御領域またはコード領域に沿ったさまざまな位置から設計可能である。(Agrawal, S., ed. (1996) Antisense Therapeutics, Humana Press Inc., Totawa NJを参照)。
【０２７２】
治療に用いる場合、アンチセンス配列を好適な標的細胞に導入するのに好適な任意の遺伝子送達系を用いることができる。アンチセンス配列は、転写時に標的タンパク質をコードする細胞配列の少なくとも一部に相補的な配列を作製する発現プラスミドの形で細胞内に送達することが可能である(Slater, J.E. 他 (1998) J. Allergy Clin. Immunol. 102(3):469-475; およびScanlon, K.J. 他 (1995) 9(13):1288-1296を参照)。アンチセンス配列はまた、例えばレトロウイルスやアデノ随伴ウイルスベクターなどのウイルスベクターを用いて細胞内に導入することもできる（Miller, A.D. (1990) Blood 76:271、前出のAusubel、Uckert, W. and W. Walther (1994) Pharmacol. Ther. 63(3):323-347等を参照）。その他の遺伝送達機構には、リポソーム系、人工的なウイルスエンベロープ及び当分野で公知のその他のシステムが含まれる（Rossi, J.J. (1995) Br. Med. Bull. 51(1):217-225; Boado、R.J.他 (1998) J. Pharm. Sci. 87(11):1308-1315、Morris, M.C. 他 (1997) Nucleic Acids Res. 25(14):2730-2736. 等を参照）。
【０２７３】
本発明の別の実施例では、NTRANをコードするポリヌクレオチドを、体細胞若しくは生殖細胞の遺伝子治療に用いることが可能である。遺伝子治療を行うことにより、（i）遺伝子欠損症（例えばＸ染色体鎖遺伝（Cavazzana-Calvo, M.他 (2000) Science 288:669-672）により特徴付けられる重症複合型免疫欠損(SCID)-X1の場合）、先天性アデノシンデアミナーゼ（ADA）欠損症に関連する重症複合型免疫欠損（Blaese, R.M. 他 (1995) Science 270:475-480、Bordignon, C.他 (1995) Science 270:470-475）、嚢胞性繊維症（Zabner, J.他 (1993) Cell 75:207-216: Crystal、R.G.他 (1995) Hum. Gene  Therapy 6:643-666、Crystal, R.G.他. (1995) Hum. Gene Therapy 6:667-703）、サラセミア（thalassamia）、家族性高コレステロール血症、第VIII因子若しくは第IX因子欠損に起因する血友病（Crystal, 35  R.G. (1995) Science 270:404-410、Verma, I.M. and Somia. N. (1997) Nature 389:239-242）を治療し、（ii）条件的致死性遺伝子産物を発現させ（例えば制御不能な細胞増殖に起因する癌の場合）、（iii）細胞内の寄生生物（例えばヒト免疫不全ウイルス(HIV)（Baltimore, D. (1988) Nature 335:395-396、Poescbla, E.他 (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93:11395-11399）などヒトレトロウイルス、B型若しくはC型肝炎ウイルス（HBV、HCV）、Candida albicans及びParacoccidioides brasiliensis等の真菌寄生菌、並びにPlasmodium falciparum及びTrypanosoma cruzi等の原生動物寄生体に対する防御機能を有するタンパク質を発現させることができる。NTRANの発現若しくは調節に必要な遺伝子の欠損が疾患を引き起こす場合、導入した細胞の好適な集団からNTRANを発現させて、遺伝子欠損によって起こる症状の発現を緩和することが可能である。
【０２７４】
本発明の更なる実施例では、NTRANの欠損による疾患や異常症は、NTRANをコードする哺乳動物発現ベクターを作製して、これらのベクターを機械的手段によってNTRAN欠損細胞に導入することによって治療する。in vivoあるいはex vitroの細胞に用いる機械的導入技術には、（i）個々の細胞内への直接的なDNA微量注射法、（ii）遺伝子銃、（iii）リポソームを介した形質移入、（iv）受容体を介した遺伝子導入、および（v）DNAトランスポゾンの使用がある（Morgan, R.A. および W.F. Anderson（1993）Annu. Rev. Biochem. 62:191-217、Ivics, Z.（1997）Cell 91:501-510; Boulay, J-L. およびH. Recipon（1998）Curr. Opin. Biotechnol. 9:445-450）。
【０２７５】
NTRAN の発現に有効でありうる発現ベクターには、限定するものではないが、PCDNA 3.1、EPITAG、 PRCCMV2、PREP、 PVAX, PCR2-TOPOTA ベクター (Invitrogen, Carlsbad CA)、 PCMV-SCRIPT、 PCMV-TAG、PEGSH/PERV (Stratagene, La Jolla CA)およびPTET-OFF、PTET-ON、PTRE2、 PTRE2-LUC、 PTK-HYG (Clontech, Palo Alto CA)が含まれる。NTRANを発現させるために、（i）構成的に活性なプロモーター（例えば、サイトメガロウイルス（CMV）、ラウス肉腫ウイルス（RSV）、SV40ウイルス、チミジンキナーゼ（TK）、若しくはβ−アクチン遺伝子等）、(ii)誘導性プロモーター（例えば、市販されているT-REXプラスミド（Invitrogen）に含まれている、テトラサイクリン調節性プロモーター（Gossen, M. 及び H. Bujard (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89:5547-5551; Gossen, M. 他 (1995) Science 268:1766-1769; Rossi, F.M.V. 及び H.M. Blau (1998) Curr. Opin. Biotechnol. 9:451-456））、エクジソン誘導性プロモーター（市販されているプラスミドPVGRXR及びPINDに含まれている：Invitrogen）、FK506／ラパマイシン誘導性プロモーター、またはRU486／ミフェプリストーン誘導性プロモーター（Rossi, F.M.V. 及び H.M. Blau, 前出）、または（iii）正常な個体に由来するNTRANをコードする内在性遺伝子の天然のプロモーター若しくは組織特異的プロモーターを用いることが可能である。
【０２７６】
市販のリポソーム形質転換キット（例えばInvitrogen社のPerFect Lipid Transfection Kit）を用いれば、当業者は実験の各パラメータを最適化する努力をさほど要さず、ポリヌクレオチド群を、培養中の標的細胞群に送達し得る。別法では、リン酸カルシウム法（Graham. F.L. 及び A.J. Eb (1973) Virology 52:456-467）若しくは電気穿孔法（Neumann, B. 他 (1982) EMBO J. 1:841-845）を用いて形質転換を行う。初代培養細胞にDNAを導入するためには、標準化された哺乳動物の形質移入プロトコルの修飾が必要である。
【０２７７】
本発明の別の実施例では、NTRANの発現に関連する遺伝子欠損によって起こる疾患や異常症は、（i）レトロウイルス末端反復配列（LTR）プロモーター若しくは独立したプロモーターのコントロール下でNTRANをコードするポリヌクレオチドと、（ii）好適なRNAパッケージングシグナルと、（iii）追加のレトロウイルス・シス作用性RNA配列及び効率的なベクターの増殖に必要なコーディング配列を伴うRev応答性エレメント（RRE）とからなるレトロウイルスベクターを作製して治療することができる。レトロウイルスベクター（例えばPFB及びPFBNEO）はStratagene社から市販されており、刊行データ（Riviere, I. 他 (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92:6733-6737）に基づいている。上記データを引用することをもって本明細書の一部とする。ベクターは、好適なベクター産生細胞株（VPCL）において増殖され、VPCLは、標的細胞上の受容体に対する親和性を有するエンベロープ遺伝子またはVSVg等の汎親和性エンベロープタンパク質を発現する（Armentano, D. 他 (1987) J. Virol. 61:1647-1650、Bender, M.A. 他 (1987) J. Virol. 61:1639-1646、Adam, M.A. および A.D. Miller (1988) J. Virol. 62:3802-3806、Dull, T. 他 (1998) J. Virol. 72:8463-8471、Zufferey, R. 他 (1998) J. Virol. 72:9873-9880）。Riggに付与された米国特許第5,910,434号（「Method for obtaining retrovirus packaging cell lines producing high transducing efficiency retroviral supernatant」）において、レトロウイルスパッケージング細胞系を得るための方法が開示されており、引用することをもって本明細書の一部とする。レトロウイルスベクターの増殖、細胞集団（例えばCD4+ Ｔ細胞）の形質導入、及び形質導入した細胞の患者への戻しは、遺伝子治療の分野では当業者に公知の方法であり、多数の文献に記載されている（Ranga, U. 他 (1997) J. Virol. 71:7020-7029、Bauer, G. 他 (1997) Blood 89:2259-2267、Bonyhadi, M.L. (1997) J. Virol. 71:4707-4716、Ranga, U. 他 (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95:1201-1206、Su, L. (1997) Blood 89:2283-2290）。
【０２７８】
別法では、アデノウイルス系遺伝子治療の送達系を用いて、NTRANの発現に関連する１若しくは複数の遺伝子異常を有するような細胞にNTRANをコードするポリヌクレオチドを送達する。アデノウイルス系ベクターの作製及びパッケージングについては、当業者に公知である。複製欠損型アデノウイルスベクターは、免疫調節タンパク質をコードする遺伝子を膵臓の無損傷の膵島内に導入する目的で多様に利用し得ることが証明された（Csete, M.E. 他 (1995) Transplantation 27:263-268）。潜在的に有用なアデノウイルスベクターは、Armentanoに付与された米国特許第5,707,618号（「Adenovirus vectors for gene therapy」）に記載されており、引用することをもって本明細書の一部とする。アデノウイルスベクターについては、Antinozzi, P.A. 他 (1999) Annu. Rev. Nutr. 19:511-544 及び Verma, I.M. 及び N. Somia (1997) Nature 18:389:239-242も参照されたい。両文献は、引用することをもって本明細書の一部とする。
【０２７９】
別法では、ヘルペス系遺伝子治療の送達系を用いて、NTRANの発現に関連する１つ或いは複数の遺伝子異常を有する標的細胞にNTRANをコードするポリヌクレオチドを送達する。単純疱疹ウイルス（HSV）系のベクターは、HSVが向性を持つ中枢神経細胞にNTRANを導入する際に特有用たり得る。ヘルペス系ベクターの作製及びパッケージングは、当業者に公知である。複製適格性単純ヘルペスウイルス（HSV）I型系のベクターは、レポーター遺伝子を霊長類の眼に送達するために用いられてきた（Liu, X. 他 (1999) Exp. Eye Res.169:385-395）。HSV-1ウイルスベクターの作製についても、DeLucaに付与された米国特許第5,804,413号（「Herpes simplex virus swains for gene transfer」）に開示されており、該特許の引用をもって本明細書の一部とする。 米国特許第5,804,413号には、ヒト遺伝子治療を含む目的のために好適なプロモーターの制御下において細胞に導入される少なくとも１つの外因性遺伝子を有するゲノムを含む組換えHSV d92についての記載がある。上記特許はまた、ICP4、ICP27及びICP22を欠失した組換えHSV系統の作製及び使用について開示している。HSVベクターについては、Goins, W.F. 他 (1999) J. Virol. 73:519-532 及び Xu, H. ら (1994) Dev. Biol. 163:152-161も参照されたい。両文献は、引用をもって本明細書の一部とする。クローン化ヘルペスウイルス配列の操作、大ヘルペスウイルスゲノム（large herpesvirus genomes）の様々なセグメントを含む多数のプラスミドを形質移入した後の組換えウイルスの産生、ヘルペスウイルスの成長及び増殖、並びにヘルペスウイルスの細胞への感染は、当業者に公知の技術である。
【０２８０】
別法では、αウイルス（正の一本鎖RNAウイルス）ベクターを用いてNTRANをコードするポリヌクレオチドを標的細胞に送達する。プロトタイプのαウイルスであるセムリキ森林熱ウイルス（Semliki Forest Virus, SFV）の生物学的研究が広範に行われており、遺伝子導入ベクターはSFVゲノムに基づいている（Garoff, H. 及び K.-J. Li (1998) Cun. Opin. Biotech. 9:464-469）。αウイルスRNAの複製中に、ウイルスのカプシドタンパク質群を通常はコードする、サブゲノムRNAが作り出される。このサブゲノムRNAは、完全長のゲノムRNAより高いレベルに複製されるため、酵素活性（例えばプロテアーゼ及びポリメラーゼ）を有するウイルスタンパク質に比べてカプシドタンパク質が過剰産生される。同様に、NTRANに対するコード配列をαウイルスゲノムのカプシドをコードする領域に導入することにより、ベクター導入細胞において多数のNTRANコードRNAが産生され、高レベルのNTRANが合成される。通常、αウイルスの感染は、数日以内の細胞溶解を伴う。一方、シンドビスウイルス（SIN）の或る変異体を有するハムスター正常腎臓細胞（BHK-21）群が持続的な感染を確立する能力は、αウイルス類の溶解複製を、遺伝子治療に応用し得るように好適に改変可能であることを示唆する（Dryga, S.A. 他 (1997) Virology 228 :74-83）。αウイルスの宿主域は広いので、様々なタイプの細胞にNTRANを導入できることとなる。或る集団におけるサブセットの細胞の特定形質導入は、形質導入前に細胞の選別を必要とし得る。αウイルスの感染性cDNAクローンの処置方法、αウイルスのcDNA及びRNAの形質移入方法及びαウイルスの感染方法は、当業者に公知である。
【０２８１】
転写開始部位由来のオリゴヌクレオチドを用いて遺伝子発現を阻害することも可能である。転写開始部位(transcription initiation site)とは例えばスタート部位(start site)から数えて約−１０と約＋１０の間である。同様に、三重らせん塩基対の形成方法を用いて阻害が可能となる。三重らせん塩基対形成は、ポリメラーゼ、転写因子または調節分子の結合のために十分に開くような二重らせんの能力を阻害するので、三重らせん塩基対形成は有用である。三重らせんDNAを用いる最近の治療の進歩については文献に記載がある（Gee, J.E. 他 (1994) in: Huber, B.E.and B.I. Carr, Molecular and Immunologic Approaches, Futura Publishing Co., Mt. Kisco, NY, 163-177ページ等を参照）。相補配列またはアンチセンス分子もまた、転写物がリボソームに結合するのを阻止することによってmRNAの翻訳を阻止するべく設計することができる。
【０２８２】
リボザイムは酵素的RNA分子であり、RNAの特異的切断を触媒するためにリボザイムを用いることもできる。リボザイム作用のメカニズムは、相補的標的RNAへのリボザイム分子の配列特異性ハイブリダイゼーションとその後に起こる内ヌクレオチド鎖切断に関与している。例えば、遺伝子操作で作られたハンマーヘッド型リボザイム分子は、NTRANをコードする配列の内ヌクレオチド鎖切断を特異的且つ効果的に触媒する可能性がある。
【０２８３】
任意のRNA標的内の特異的リボザイム切断部位は、GUA、GUU、GUC配列を含めたリボザイム切断部位に対して標的分子をスキャンすることによって先ず同定される。一度同定されると、切断部位を含む標的遺伝子の領域に対応する１５〜２０リボヌクレオチドの短いＲＮＡ配列が、そのオリゴヌクレオチドを機能不全にするような２次構造の特徴をもっていないかを評価することが可能になる。候補標的の適合性の評価も、リボヌクレアーゼ保護アッセイを用いて相補的オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションのアクセス可能性をテストすることによって行うことができる。
【０２８４】
本発明の相補リボ核酸分子及びリボザイムは、核酸分子合成のために当分野で既知の任意の方法を用いて作製し得る。作製方法には、固相フォスフォアミダイト化学合成等の、オリゴヌクレオチドを化学的に合成する方法がある。或いは、NTRANをコードするDNA配列のin vitro及びin vivo転写によってRNA分子を産出し得る。このようなDNA配列は、T7やSP6等の好適なRNAポリメラーゼプロモーターを用いて多様なベクター内に取り込むことが可能である。或いは、相補的RNAを構成的或いは誘導的に合成するようなこれらcDNA作製物を、細胞株、細胞または組織内に導入することができる。
【０２８５】
細胞内の安定性を高め、半減期を長くするためにRNA分子を修飾することができる。限定するものではないが可能な修飾には、分子の５'末端、３'末端、あるいはその両方においてフランキング配列を追加したり、分子の主鎖内においてホスホジエステラーゼ結合ではなくホスホロチオネートまたは2' O-メチルを使用したりすることが含まれる。この概念は、PNAの産出に固有のものであるが、これら全ての分子に拡大することができる。それには、内因性エンドヌクレアーゼによって容易には認識されない、アデニン、シチジン、グアニン、チミン、及びウリジンにアセチル−、メチル−、チオ−及び同様の修飾をしたものの他、非従来型塩基、例えばイノシン、クエオシン（queosine）、ワイブトシン（wybutosine）等を含める。
【０２８６】
本発明の更なる実施例は、NTRANをコードするポリヌクレオチドの発現の改変に有効な化合物をスクリーニングする方法を含む。限定するものではないが特異ポリヌクレオチドの発現改変を起こすのに有効な化合物には、オリゴヌクレオチド、アンチセンスオリゴヌクレオチド、三重らせん形成オリゴヌクレオチド、転写因子その他のポリペプチド転写制御因子、及び特異ポリヌクレオチド配列と相互作用し得る非高分子化学的実体がある。有効な化合物は、ポリヌクレオチド発現のインヒビターまたはエンハンサーのいずれかとして作用することによりポリヌクレオチド発現を改変し得る。従って、NTRAN の発現または活性の増加に関連する疾患の治療においては、NTRAN をコードするポリヌクレオチドの発現を特異的に阻害する化合物が治療上有用であり、NTRAN の発現または活性の低下に関連する疾患の治療においては、NTRAN をコードするポリヌクレオチドの発現を特異的に促進する化合物が治療上有用であり得る。
【０２８７】
特異ポリヌクレオチドの発現を改変する際の有効性に対して、少なくとも１個から複数個の試験化合物をスクリーニングし得る。試験化合物は、当分野で通常知られている任意の方法により得られる。このような方法には、ポリヌクレオチドの発現を変異させる場合と、既存の、商用のまたは専用の、天然または非天然の化合物ライブラリから選択する場合と、標的ポリヌクレオチドの化学的及び／または構造的特性に基づく化合物を合理的にデザインする場合と、組合せ的にまたは無作為に生成した化合物のライブラリから選択する場合に有効であることが知られているような化合物の化学修飾がある。NTRANをコードするポリヌクレオチドを含むサンプルは、このようにして得られた試験化合物の少なくとも１つに曝露する。サンプルには例えば、無傷細胞、透過化処理した細胞、あるいはin vitro 無細胞系すなわち再構成生化学系があり得る。NTRANをコードするポリヌクレオチドの発現における変容は、当分野で通常知られている任意の方法でアッセイする。 通常、NTRANをコードするポリヌクレオチドの配列に相補的なヌクレオチド配列を有するプローブを用いたハイブリダイゼーションにより、特異ヌクレオチドの発現を検出する。ハイブリダイゼーション量を定量し、それによって１つ若しくは複数の試験化合物に曝露される及び曝露されないポリヌクレオチドの発現の比較に対する基礎を形成し得る。試験化合物に曝露されるポリヌクレオチドの発現における変化の検出は、ポリヌクレオチドの発現を改変する際に試験化合物が有効であることを示している。特異ポリヌクレオチドの発現改変に有効な化合物に対して、例えば分裂酵母（Schizosaccharomyces pombe）遺伝子発現系（Atkins, D. 他 (1999) 米国特許第5,932,435号、Arndt, G.M. 他 (2000) Nucleic Acids Res. 28:E15）またはHeLa細胞等のヒト細胞系（Clarke, M.L. 他 (2000) Biochem. Biophys. Res. Commun. 268:8-13）を用いてスクリーニングを実行する。本発明の特定の実施例は、特異的ポリヌクレオチド配列に対するアンチセンス活性のためのオリゴヌクレオチド（デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、ペプチド核酸、修飾オリゴヌクレオチド）の組み合わせライブラリをスクリーニングすることに関与している（Bruice, T.W. 他 (1997) 米国特許第5,686,242号、Bruice, T.W. 他 (2000) 米国特許第6,022,691号）。
【０２８８】
ベクターを細胞または組織に導入する多数の方法が利用可能であり、in vivo、in vitro及びex vivoの使用に対して同程度に適している。ex vivo治療の場合、ベクターを患者から採取した幹細胞内に導入し、クローニング増殖して同一患者に自家移植で戻すことができる。トランスフェクション、リボソーム注入またはポリカチオンアミノポリマーによる送達は、当分野でよく知られている方法を用いて実行することができる（Goldman, C.K. 他 (1997) Nat. Biotechnol. 15:462-466.等を参照）。
【０２８９】
上記の治療方法はいずれも、例えば、ヒト、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ウサギ、サル等の哺乳動物を含めて治療が必要な全ての対象に適用できる。
【０２９０】
本発明のさらなる実施例は、薬物として許容できる或る賦形剤と共に製剤される或る活性成分を一般に有する組成物の投与に関連する。賦形剤には例えば、糖、でんぷん、セルロース、ゴム及びタンパク質がある。様々な剤型が広く知られており、詳細はRemington's Pharmaceutical Sciences（Maack Publishing, Easton PA）の最新版に記載されている。このような組成物は、NTRAN、NTRANの抗体、擬態物質、アゴニスト、アンタゴニスト、またはPMMMのインヒビターなどからなる。
【０２９１】
本発明に用いられる組成物は、任意の数の経路によって投与することができ、限定するものではないが経路には、経口、静脈内、筋肉内、動脈内、骨髄内、クモ膜下腔内、心室内、肺、経皮、皮下、腹腔内、鼻腔内、腸内、局所、舌下または直腸がある。
【０２９２】
肺から投与する組成物は、液状または乾燥粉末状で調製し得る。このような組成物は通常、患者が吸入する直前にエアロゾル化する。小分子（例えば従来の低分子量有機薬）の場合には、速効製剤のエアロゾル送達は当分野で公知である。高分子（例えばより大きなペプチド及びタンパク質）の場合には、当該分野において肺の肺胞領域を介しての肺送達が最近向上したことにより、インスリン等の薬剤を実質的に血液循環へ輸送することを可能にした（Patton, J.S. 他, 米国特許第5,997,848号等を参照）。肺送達は、針注射なしに投与する点で優れており、有毒な可能性のある浸透エンハンサーの必要性をなくす。
【０２９３】
本発明での使用に適した組成物には、所定の目的を達成するために必要なだけの量の活性成分を含有する成分が含まれる。有効投与量の決定は、当業者の能力の範囲内で行う。
【０２９４】
NTRANを有する、またはその断片群を有する高分子群を直接、細胞内に送達すべく、特殊な種々の形状の組成物群が調製され得る。例えば、細胞不透過性高分子を含むリポソーム製剤は、細胞融合及び高分子の細胞内送達を促進し得る。別法では、NTRANまたはその断片をHIV Tat-1タンパク質の短い陽イオン性N末端部に結合することもできる。このようにして生成された融合タンパク質は、或るマウスモデル系の、脳を含む全ての組織の細胞に形質導入することがわかっている（Schwarze, S.R. 他 (1999) Science 285:1569-1572）。
【０２９５】
任意の化合物に対して、先ず細胞培養アッセイ、例えば新生物性細胞の細胞培養アッセイにおいて、あるいは、動物モデル、例えばマウス、ラット、ウサギ、イヌ、サルまたはブタなどにおいて、治療有効量を推定することができる。動物モデルはまた、好適な濃度範囲及び投与経路を決定するためにも用い得る。このような情報を用いて、次にヒトに対する有益な投与量及び投与経路を決定することができる。
【０２９６】
治療有効投与量は、症状や容態を回復させるような活性成分量、たとえばNTRANまたはその断片、NTRANの抗体、NTRANのアゴニストまたはアンタゴニスト、インヒビターなどの量を指す。治療有効性および毒性は、細胞培養または動物実験における標準的な薬学手法によって、例えばED50（集団の５０％の治療有効量）またはLD50（集団の５０％の致死量）統計を計算するなどして判定できる。毒性効果の治療効果に対する投与量の比が治療指数であり、LD50/ED50比として表すことができる。高い治療指数を示すような組成物が望ましい。細胞培養アッセイ及び動物実験から得られたデータは、ヒトに用いるための投与量の範囲を策定するのに用いられる。このような組成物が含まれる投与量は、毒性を殆ど或いは全く含まず、ED50を含むような血中濃度の範囲にあることが好ましい。用いられる投与形態、患者の感受性及び投与の経路によって、投与量はこの範囲内で様々に変わる。
【０２９７】
正確な投与量は、治療が必要な被験者に関する要素を考慮して、現場の医者が決定することになる。充分なレベルの活性成分を与え、或いは所望の効果を維持するべく、用法および用量を調節する。被験者に関する要素としては、疾患の重症度、患者の全身健康状態、被験者の年齢、体重及び性別(ジェンダー)、投与の時間及び頻度、薬剤の併用、反応感受性及び治療に対する応答等を考慮する。作用期間が長い組成物は、特定の製剤の半減期及びクリアランス率によって３〜４日毎に１度、１週間に１度、或いは２週間に１度の間隔で投与し得る。
【０２９８】
通常の投与量は、投与の経路にもよるが約０.１〜１００,０００μgであり、合計で約１gまでとする。特定の投与量及び送達方法に関するガイダンスは文献に記載されており、現場の医者は通常それを利用することができる。当業者は、ヌクレオチドの処方では、タンパク質またはそれらのインヒビター類とは異なる処方を利用することになる。同様に、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの送達は、特定の細胞、状態、位置等に特異的なものとなる。
【０２９９】
（診断）
別の実施例では、NTRANに特異的に結合する抗体が、NTRANの発現によって特徴付けられる疾患の診断、またはNTRANやNTRANのアゴニストまたはアンタゴニスト、インヒビターで治療を受けている患者をモニターするためのアッセイに用いられる。診断目的に有用な抗体は、上記の治療の箇所で記載した方法と同じ方法で調合される。NTRANの診断アッセイには、抗体及び標識を利用してヒトの体液において或いは細胞や組織のエキスにおいてNTRANを検出する方法が含まれる。この抗体は修飾されたものもされていないものも可能であり、レポーター分子との共有結合または非共有結合で標識化できる。レポーター分子としては広くさまざまな種類が本分野で知られており、また使用可能であるが、そのうちのいくつかは上記で説明されている。
【０３００】
NTRANを測定するためのELISA，RIA，及びFACSを含む種々のプロトコルは、当分野では周知であり、変わった或いは異常なレベルのNTRANの発現を診断する元となるものを提供する。正常或いは標準的なNTRANの発現の値は、複合体の形成に適した条件下で、正常な哺乳動物、例えばヒトなどの被験者から採取した体液または細胞とNTRANに対する抗体とを結合させることによって決定する。標準複合体形成量は、種々の方法、例えば測光法で定量できる。被験者、対照および生検組織からの疾患サンプルで発現するNTRANの量を標準値と比較する。標準値と被験者との偏差が疾患を診断するパラメータを確定する。
【０３０１】
本発明の別の実施例によれば、NTRANをコードするポリヌクレオチドを診断のために用いることもできる。用いられることができるポリヌクレオチドには、オリゴヌクレオチド配列、相補的RNA及びDNA分子、そしてPNAが含まれる。ポリヌクレオチドは、検体におけるNTRANの発現が疾患と相関し得るような該検体における遺伝子発現の検出及び定量に用いることができる。この診断アッセイを用いて、NTRANの存在の有無、更に過剰な発現を調べ、治療中のNTRAN値の調節を監視する。
【０３０２】
一実施形態では、NTRANまたは近縁の分子をコードする遺伝子配列を含むポリヌクレオチド配列を検出可能なPCRプローブを用いたハイブリダイゼーションによって、NTRANをコードする核酸配列を同定することが可能である。例えば５'調節領域である高度に特異的な領域か、例えば保存されたモチーフであるやや特異性の低い領域から作られているかというプローブの特異性と、ハイブリダイゼーション或いは増幅のストリンジェンシーとによって、そのプローブがNTRANをコードする天然配列のみを同定するかどうか、或いは対立遺伝子変異配列や関連配列を同定するかどうかが決まることとなる。
【０３０３】
プローブはまた、関連する配列の検出に利用され、NTRANをコードする任意の配列と少なくとも５０％の配列同一性を有し得る。目的の本発明のハイブリダイゼーションプローブには、DNAあるいはRNAが可能であり、SEQ ID NO:9-16の配列、或いはNTRAN遺伝子のプロモーター、エンハンサー、イントロンを含むゲノム配列に由来し得る。
【０３０４】
NTRANをコードするDNAに対して特異的なハイブリダイゼーションプローブの作製方法には、NTRAN及びNTRAN誘導体をコードするポリヌクレオチド配列をmRNAプローブの作製のためのベクターにクローニングする方法がある。ｍＲＮＡプローブ作製のためのベクターは、当業者に知られており、市販されており、好適なＲＮＡポリメラーゼ及び好適な標識されたヌクレオチドを加えることによって、in vitroでＲＮＡプローブを合成するために用いられ得る。ハイブリダイゼーションプローブは、種々のレポーターの集団によって標識され得る。レポーター集団の例としては、32Pまたは35S等の放射性核種、或いはアビジン／ビオチン結合系を介してプローブに結合されたアルカリホスファターゼ等の酵素標識などが挙げられる。
【０３０５】
NTRANをコードするポリヌクレオチド配列を用いて、NTRANの発現に関連する疾患を診断することが可能である。限定するものではないがこのような疾患の例として自己免疫／炎症疾患が含まれ、その中には後天性免疫不全症候群（AIDS）、アジソン病（慢性原発性副腎機能不全）、成人呼吸窮迫症候群、アレルギー、強直性脊椎炎、アミロイド症、貧血、喘息、アテローム性動脈硬化、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性甲状腺炎、自己免疫性多腺性内分泌カンジダ症外胚葉ジストロフィー（APECED）、気管支炎、胆嚢炎、接触皮膚炎、クローン病、アトピー性皮膚炎、皮膚筋炎、糖尿病、肺気腫、リンパ球傷害因子性偶発性リンパ球減少症、新生児溶血性疾患（胎児赤芽球症）、結節性紅斑、萎縮性胃炎、糸球体腎炎、グッドパスチャー症候群、痛風、グレーブス病、橋本甲状腺炎、過好酸球増加症、過敏性腸症候群、多発性硬化症、重症筋無力症、心筋または心膜炎症、骨関節炎、骨粗しょう症、膵炎、多発性筋炎、乾癬、ライター症候群、リウマチ様関節炎、強皮症、シェーグレン症候群、全身性アナフィラキシー、全身性エリテマトーデス、全身性強皮症、血小板減少性紫斑病、潰瘍性大腸炎、ぶどう膜炎、ウェルナー症候群、癌合併症、血液透析、体外循環、ウイルス感染症、細菌感染症、真菌感染症、寄生虫感染症、原虫感染症、蠕虫感染症、外傷が含まれ；心血管疾患として、うっ血性心不全、虚血性心疾患、狭心症、心筋梗塞、高血圧性心疾患、変性弁膜性心疾患、石灰化大動脈弁狭窄症、先天性二尖大動脈弁、僧帽弁輪部石灰化（mitral annular calcification）、僧帽弁脱出、リウマチ熱、リウマチ性心疾患、感染性心内膜炎、非細菌性血栓性心内膜炎、全身性紅斑性狼瘡の心内膜炎、カルチノイド心疾患、心筋症、心筋炎、心膜炎、腫瘍性心疾患、先天性心臓疾患、心臓移植の合併症、動静脈瘻、アテローム性動脈硬化症、高血圧、脈管炎、レイノー病、動脈瘤、動脈解離、静脈瘤、血栓静脈炎及び静脈血栓、血管の腫瘍、血栓崩壊の合併症、バルーン血管形成術（balloon angioplasty）、血管置換術、大動脈冠動脈バイパス術（coronary artery bypass graft surgery）が含まれ；神経の疾患の中には、癲癇、虚血性脳血管障害、脳卒中、大脳新生物、ピック病、ハンチントン病、痴呆、パーキンソン病及びその他の錐体外路障害、筋萎縮性側索硬化及びその他の運動ニューロン障害、進行性神経性筋萎縮症、色素性網膜炎(網膜色素変性症)、遺伝性運動失調、多発性硬化症及び他の脱髄疾患、細菌性及びウイルス性髄膜炎、脳膿瘍、硬膜下蓄膿症(膿瘍)、硬膜外膿瘍、化膿性頭蓋内血栓性静脈炎、脊髄炎及び神経根炎、ウイルス性中枢神経系疾患と、クールー及びクロイツフェルト‐ヤコブ病、Gerstmann-Straussler-Scheinker症候群を含むプリオン病と、致死性家族性不眠症、神経系性栄養病及び代謝病、神経線維腫症、結節硬化症、小脳網膜血管芽腫（cerebelloretinal hemangioblastomatosis）、脳３叉神経血管症候群、ダウン症を含む中枢神経系性精神遅滞及び他の発達障害、脳性麻痺、神経骨格異常症、自律神経系障害、脳神経疾患、脊髄疾患、筋ジストロフィーおよび他の神経筋障害、末梢神経系疾患、皮膚筋炎及び多発性筋炎と、遺伝性、代謝性、内分泌性、及び中毒性ミオパシーと、重症筋無力症、周期性四肢麻痺と、気分性及び不安性の障害、分裂��（統合失調症）性疾患を含む精神病と、季節性感情障害（SAD）と、静座不能、健忘症、緊張病、糖尿病性ニューロパシー、錐体外路性終末欠陥症候群(遅発性ジスキネジア)、ジストニー、パラノイド精神病、帯状疱疹後神経痛、及びトゥーレット病と、進行性核上麻痺、大脳皮質基底核変性症及び家族性前頭側頭型痴呆が含まれ；  発生または発達障害の中には尿細管性アシドーシス、貧血、クッシング症候群、軟骨形成不全性小人症、デュシェンヌ／ベッカー型筋ジストロフィー、癲癇、性腺形成異常、WAGR症候群（ウィルムス腫瘍、無虹彩症、尿生殖器異常、精神遅滞）、スミス‐マジェニス症候群(Smith- Magenis syndrome)、脊髄形成異常症候群、遺伝性粘膜上皮異形成、遺伝性角皮症、遺伝性神経病（シャルコー‐マリー‐ツース病、神経線維腫症）、甲状腺機能低下症、水頭症、発作障害（Syndenham舞踏病(Syndenham's chorea)、脳性小児麻痺）、二分脊椎、無脳症、頭蓋脊椎披裂、先天性緑内障、白内障、感音難聴が含まれ；  細胞増殖異常としてはたとえば、日光性角化症、動脈硬化、アテローム性動脈硬化、滑液包炎、硬変、肝炎、混合型結合組織病（MCTD）、骨髄線維症、発作性夜間ヘモグロビン尿症、真性多血症、乾癬、原発性血小板血症、並びに腺癌及び白血病、リンパ腫、黒色腫、骨髄腫、肉腫、及び奇形癌など癌、具体的には、副腎、膀胱、骨、骨髄、脳、乳房、頚部、胆嚢、神経節、消化管、心臓、腎臓、肝臓、肺、筋肉、卵巣、膵臓、副甲状腺、陰茎、前立腺、唾液腺、皮膚、脾臓、精巣、胸腺、甲状腺、子宮の癌が含まれ；輸送に関連した心臓病としては、狭心症、徐脈性不整脈、頻脈性不整脈、高血圧症、QT延長症候群、心筋炎、心筋症、ネマリンミオパシー、中心核ミオパシー、脂質ミオパシー、ミトコンドリアミオパシー、甲状腺中毒性ミオパシー、エタノールミオパシー、皮膚筋炎、封入体筋炎、感染性筋炎、及び多発性筋炎が含まれ；輸送に関連する神経疾患としてはアルツハイマー病, 記憶喪失, 双極性障害, 痴呆, 鬱病, 癲癇, トゥーレット病, パラノイド精神病, および精神分裂病(統合失調症)が含まれ；輸送に関連するその他の疾患としては神経線維腫症、帯状疱疹後神経痛、３叉神経ニューロパシー、サルコイドーシス、鎌状赤血球性貧血、ウィルソン病、白内障、不妊症、肺動脈狭窄症、常染色体性感音性難聴、高／低血糖症、グレーブス病、甲状腺腫、クッシング病と、アジソン病、グルコース‐ガラクトース吸収不良症候群、高コレステロール血症、副腎性白質ジストロフィー、ツェルヴェーガー症候群、メンケス病、後角症候群、フォンギールケ症候群、シスチン尿症、イミノグリシン尿症、Hartup病、ファンコーニ病が含まれ；精神疾患としては急性ストレス疾患, アルコール依存症, アンフェタミン依存症, 拒食症, 非社会性人格障害, 注意欠陥多動性障害, 自閉症, 不安症, 回避的人格障害, 双極性障害, 境界性人格障害, 短期的な精神異常, 神経性大食症, 大麻依存症, コカイン依存症, 行為障害, 気分循環性障害, 精神錯乱, 妄想性障害, 痴呆, 依存性人格障害, 鬱病, 気分変調性障害, 幻覚剤依存症, 演技性人格障害, 吸入物依存症, 躁鬱病, 多発脳梗塞性痴呆, 自己愛性人格障害, ニコチン依存症, 強迫神経症, オピオイド依存症, 反抗性障害, パニック障害, 妄想性人格障害, フェンシクリジン依存症, 恐怖���, 心的外傷後ストレス障害, 分裂病性感情障害, 分裂性人格障害, 精神分裂症, 鎮静剤依存症, 分離不安障害, および睡眠障害が含まれ；  代謝系の疾患としては、アジソン病、脳腱黄色腫症、先天性副腎過形成、クマリン耐性（coumarin resistance）、嚢胞性繊維症、糖尿病、脂肪性肝硬変、フルクトース-１、６−ジホスファターゼ欠乏症、ガラクトース血症、甲状腺腫、グルカゴノーマ、糖原病、遺伝性果糖不耐症、副腎皮髄質機能亢進症（Hyperadrenalism）、低アドレナリン症、副甲状腺機能亢進症、副甲状腺機能低下症、高コレステロール血症、甲状腺機能亢進症、低血糖症、甲状腺機能低下症、高脂質血症、高脂血症、脂質ミオパシー、脂肪異栄養症、リソソーム蓄積症、マンノシドーシス、ノイラミニナーゼ欠損症、肥満、骨粗しょう症、フェニルケトン尿症、プソイドビタミンD欠損くる病、炭水化物代謝障害(例えば、先天性II型異常赤血球産生症性貧血、糖尿病、インスリン依存型真性糖尿病、非インスリン依存型真性糖尿病、ガラクトースエピメラーゼ欠乏症、糖原病、リソソーム蓄積症、果糖尿、五炭糖尿症)、およびピルビン酸代謝の先天性異常、脂肪肝のような脂質代謝異常、胆汁うっ滞、原発性胆汁性肝硬変、カルニチン欠乏症、カルニチンパルミトイルトランスフェラーゼ欠乏症、ミオアデニレートデミナーゼ欠乏症、高トリグリセリド血症、ファブリー病などの脂質貯蔵病、ゴーシェ病、ニーマン‐ピック病、異染性白質ジストロフィー、副腎性白質ジストロフィー、GM２ガングリオシドーシス、セロイドリポフスチン症、無β‐リポ蛋白血症、タンジアー病、高リポ蛋白血症、脂肪異栄養症、脂肪腫症、急性皮下脂肪組織炎、播種性脂肪壊死症、有痛脂肪症、リポイド副腎過形成、微小変化ネフローゼ、脂肪腫、アテローム性動脈硬化症、高コレステロール血症、高トリグリセリド血症を伴った高コレステロール血症、原発性低αリポ蛋白血症、甲状腺症機能低下症、腎臟病、肝疾患、レシチン：コレステロールアシルトランスフェラーゼ欠乏症、脳腱黄色腫症、シトステロール血症、低コレステロール血症、テイ‐サックス病、サンドホフ病、高脂質血症、高脂血症、脂質ミオパシー、およびMenke's diseaseのような銅代謝疾患、ウイルソン病、およびエーレルス‐ダンロー症候群IX型糖尿病が含まれ；  内分泌疾患の中には原発性脳腫瘍及び腺腫、妊娠性梗塞、下垂体切除、動脈瘤、血管奇形、血栓症、感染症、免疫異常、頭部外傷による合併症などの病変から起こる視床下部及び下垂体の障害と、性機能低下及びシーハン症候群、尿崩症、カルマン病、ハンド‐シュラークリスチャン病、レテラー−ジーヴェ病、サルコイドーシス、エンプティセラ（トルコ鞍空虚）症候群、小人症を含む下垂体低下に関連した障害と、良性腺腫によって発生しやすい抗利尿ホルモン(ADH)不適合分泌症候群（SIADH）及び先端巨大症、巨人症を含む下垂体亢進に関連した障害と、甲状腺腫及び粘液水腫、細菌感染性急性甲状腺炎、ウイルス感染性亜急性甲状腺炎、自己免疫性甲状腺炎（橋本病）、クレチン病を含む甲状腺機能低下症に関連した障害と、甲状腺中毒症及びその様々な型、グレーブス病、前脛骨粘液水腫、中毒性多結節性甲状腺腫、甲状腺癌、プラマー病を含む甲状腺機能亢進症と、Conn病（chronic hypercalemia）を含む副甲状腺機能亢進症と、Ｉ型及びII型糖尿病及び合併症などの膵臓疾患と、過形成及び副腎皮質の癌腫や腺腫、アルカローシスに関連した高血圧、アミロイド症、低カリウム血、クッシング病、リドル症候群、Arnold-Healy-Gordon症候群、褐色細胞腫瘍、アジソン病、副腎機能不全などの副腎に関連した障害と、女性の異常プロラクチン産生及び不妊症、子宮内膜症、月経周期の摂動、多嚢胞性卵巣疾患、高プロラクチン血症、ゴナドトロピン単独欠損症（isolated gonadotropin deficiency）、無月経、乳汁漏出症、半陰陽、多毛症及び男性化、乳癌、閉経期後の骨粗鬆症、男性のライジッヒ細胞不全(Leydig cell deficiency)、男性更年期、生殖細胞無形成、ライジッヒ細胞腫瘍に関連した性機能亢進、アンドロゲン受容体の欠如に関連したアンドロゲン耐性、５α−還元酵素症候群、女性化乳房症などの生殖腺ステロイドホルモンに関連した疾患とが含まれる。NTRANをコードするポリヌクレオチド配列は、変容したNTRAN発現を検出するために患者から採取した体液或いは組織を利用する、サザーン法やノーザン法、ドットブロット法、或いはその他の膜系の技術、PCR法や、ディップスティック（dipstick）、ピン（pin）、およびマルチフォーマットのELISA式アッセイ、及びマイクロアレイに使用することが可能である。このような定性方法または定量方法は、当分野で公知である。
【０３０６】
或る形態では、関連する疾患、特に上記した疾患を検出するアッセイにおいて、NTRANをコードするヌクレオチド配列が有用であり得る。NTRANをコードするヌクレオチド配列群を、標準的な種々の方法で標識化し、ハイブリダイゼーション複合体の形成に好適な条件下で、患者から採取した体液或いは組織のサンプルに加えることができる。好適なインキュベーション期間が経過したらサンプルを洗浄し、シグナルを定量して標準値と比較する。患者サンプル中のシグナルの量が、対照サンプルと較べて著しく変化している場合は、該サンプル内の、NTRANをコードするヌクレオチド配列群のレベル変化の存在が、関連する障害の存在を標示する。このようなアッセイは、動物実験、臨床試験における特定の治療効果を推定するため、或いは個々の患者の治療をモニターするために用いることもできる。
【０３０７】
NTRANの発現に関連する障害の診断の基礎を提供するために、発現の正常すなわち標準的なプロファイルが確立される。これは、ハイブリダイゼーション或いは増幅に好適な条件下で、動物或いはヒトの何れかの正常な被験者から採取された体液或いは細胞抽出物と、NTRANをコードする配列或いはその断片とを混合することにより達成され得る。実質的に精製されたポリヌクレオチドを既知量用いて行った実験から得た値を正常な被験者から得た値と比較することにより、標準ハイブリダイゼーションを定量することができる。このようにして得た標準値は、疾患の徴候を示す患者から得たサンプルから得た値と比較することができる。標準値からの偏差を用いて疾患の存在を確定する。
【０３０８】
疾患の存在が確定されて治療プロトコルが開始されると、患者の発現レベルが正常な被検者に観察されるレベルに近づき始めたかどうかを測定するため、ハイブリダイゼーションアッセイを定期的に繰り返し得る。連続アッセイから得られた結果を用いて、数日から数ヶ月の期間にわたる治療の効果を示し得る。
【０３０９】
癌に関しては、個体からの生体組織における異常な量の転写物（過少発現または過剰発現）の存在は、疾患の発生素質を示したり、実際に臨床的症状が現れる前に疾患を検出する方法を提供したりし得る。この種のより明確な診断により、医療の専門家が予防方法または積極的な治療法を早くから利用し、それによって癌の発生または更なる進行を防止することが可能となる。
【０３１０】
NTRANをコードする配列群から設計されたオリゴヌクレオチド群の、更なる診断への利用には、PCRの利用が含まれ得る。これらのオリゴマーは、化学的に合成するか、酵素により生産するか、或いはin vitroで産出し得る。オリゴマーは、好ましくはNTRANをコードするポリヌクレオチドの断片、或いはNTRANをコードするポリヌクレオチドと相補的なポリヌクレオチドの断片を含み、最適化した条件下で、特定の遺伝子や条件を識別するために利用される。また、オリゴマーは、やや緩いストリンジェンシー条件下で、近縁のＤＮＡ或いはＲＮＡ配列の検出、定量、或いはその両方のため用いることが可能である。
【０３１１】
或る特定の態様において、NTRANをコードするポリヌクレオチド配列群由来のオリゴヌクレオチドプライマー類を用いて、一塩基多型（SNP）を検出し得る。SNPは、多くの場合にヒトの先天性または後天性遺伝病の原因となるような置換、挿入および欠失である。限定するものではないがＳＮＰの検出方法には、ＳＳＣＰ（single-stranded conformation polymorphism）及び蛍光ＳＳＣＰ（ｆＳＳＣＰ）がある。SSCPでは、NTRANをコードするポリヌクレオチド配列由来のオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、ポリメラーゼ連鎖反応法（PCR）を用いたDNAの増幅を行う。ＤＮＡは例えば、病変組織または正常組織、生検サンプル、体液その他に由来し得る。ＤＮＡ内のＳＮＰは、一本鎖形状のＰＣＲ生成物の２次及び３次構造に差異を生じさせる。差異は非変性ゲル中でのゲル電気泳動法を用いて検出可能である。ｆＳＣＣＰでは、オリゴヌクレオチドプライマーを蛍光性に標識する。それによってＤＮＡシークエンシング機などの高処理機器でアンプリマー（amplimer）の検出が可能になる。更に、インシリコSNP（in silico SNP, isSNP）と呼ばれる配列データベース分析法は、一般的なコンセンサス配列に配列されるような個々のオーバーラップするDNA断片の配列を比較することにより、多型性を同定し得る。これらのコンピュータベースの方法は、ＤＮＡの実験室での調製に、また統計モデル及びＤＮＡ配列クロマトグラムの自動分析を用いたシークエンシングのエラーに起因する配列の変異をフィルタリングして除去する。別の態様では、例えば高処理MASSARRAYシステム（Sequenom, Inc., San Diego CA）を用いた質量分析によりSNPを検出し、特徴付ける。
【０３１２】
SNPはヒトの病気の遺伝的基礎を研究するために使える可能性がある。たとえば、少なくとも１６個の一般的なSNPがインスリン非依存性の糖尿病と関連付けられている。SNPはまた、嚢胞性線維症、鎌状赤血球貧血、慢性肉芽腫性疾病等の単一遺伝子病の疾病転帰の違いを研究するために有用である。たとえば、マンノース結合レクチンの変異体（MBL2）は、嚢胞性線維症の肺での有害な転帰との相関が示されている。SNPはまた、薬理ゲノミックス（命のかかわる毒性など、患者の薬への反応に影響する遺伝的変異体の同定）にも役立つ。たとえば、Nアセチルトランスフェラーゼのある変異は抗結核薬剤イソニアジドに対する高頻度の末梢神経障害と関連付けられているし、ALOX5のコアプロモーターのある変異は５リポオキシゲナーゼ経路を標的とする抗喘息薬剤による治療への臨床的反応を弱くする。異なる集団におけるSNPの分布の解析は、遺伝子浮動、突然変異、組換えおよび選択の研究に有用であると共に、集団の起源と移動の調査にも役立つ(Taylor, J.G. 他 (2001) Trends Mol. Med. 7:507-512; Kwok, P.-Y. and Z. Gu (1999) Mol. Med. Today 5:538-543; Nowotny, P. 他 (2001) Curr. Opin. Neurobiol. 11:637-641)。
【０３１３】
NTRANの発現を定量するために用い得る別の方法の例としては、ヌクレオチド群の放射標識またはビオチン標識、対照核酸の共増幅（coamplification）、および、標準曲線から得た結果の補間もある(例えば、 Melby, P.C. 他 (1993) J. Immunol. Methods 159:235-244; Duplaa, C. 他 (1993) Anal. Biochem. 212:229--236を参照)。目的のオリゴマーが種々の希釈液中に存在し、分光光度法または比色反応によって定量が迅速になるような高処理フォーマットのアッセイを行うことによって、複数のサンプルの定量速度を加速することができる。
【０３１４】
更に別の実施例では、本明細書で記載した任意のポリヌクレオチド配列由来のオリゴヌクレオチドまたはより長い断片を、マイクロアレイにおけるエレメントとして用いることができる。多数の遺伝子の関連発現レベルを同時にモニターする転写イメージング技術にマイクロアレイを用いることが可能である。これについては、以下に記載する。マイクロアレイはまた、遺伝変異体、突然変異及び多型性の同定に用いることができる。この情報を用いることで、遺伝子機能を決定し、疾患の遺伝的根拠を理解し、疾患を診断し、遺伝子発現の機能としての疾病の進行／後退をモニターし、疾病治療における薬剤の活性を開発及びモニターすることができる。特に、患者にとって最もふさわしく、有効な治療法を選択するために、この情報を用いて患者の薬理ゲノムプロファイルを開発することができる。例えば、患者の薬理ゲノムプロファイルに基づき、患者に対して高度に効果的で副作用を殆ど示さない治療薬を選択することができる。
【０３１５】
別の実施例では、NTRAN、NTRANの断片、NTRANに特異的な抗体をマイクロアレイ上のエレメントとして用いることができる。マイクロアレイを用いて、上記のようなタンパク質−タンパク質相互作用、薬剤−標的相互作用及び遺伝子発現プロファイルをモニターまたは測定することが可能である。
【０３１６】
或る実施例は、或る組織または細胞タイプの転写イメージを生成するような本発明のポリヌクレオチドの使用に関連する。転写イメージは、特定の組織または細胞タイプにより遺伝子発現の包括的パターンを表す。包括的遺伝子発現パターンは、所定の条件下で所定の時間に発現した遺伝子の数及び相対存在量を定量することにより分析される（Seilhamer 他、米国特許第5,840,484号の「Comparative Gene Transcript Analysis」を参照。これらを引用することを以って本明細書の一部とする）。従って、特定の組織または細胞タイプの転写物または逆転写物全体に、本発明のポリヌクレオチドまたはそれらの相補体をハイブリダイズすることにより、転写イメージを生成し得る。或る実施例では、本発明のポリヌクレオチドまたはその相補体が１マイクロアレイ上に複数エレメントの１サブセットを含むような高処理フォーマットでハイブリダイゼーションを発生させる。結果として得られる転写イメージは、遺伝子活性のプロファイルを提供し得る。
【０３１７】
転写イメージは、組織、株化細胞、生検またはその生物学的サンプルから単離した転写物を用いて生成し得る。転写イメージは従って、組織または生検サンプルの場合にはin vivo、または株化細胞の場合にはin vitroでの遺伝子発現を反映する。
【０３１８】
本発明のポリヌクレオチドの発現のプロファイルを作製する転写イメージはまた、工業的または天然の環境化合物の毒性試験のみならず、in vitroモデル系及び薬剤の前臨床評価に関連して使用し得る。全ての化合物は、作用及び毒性のメカニズムを暗示する、しばしば分子フィンガープリントまたは毒性シグネチャ(toxicant signatures)と称されるような特徴的な遺伝子発現パターンを惹起する（Nuwaysir, E.F. 他 (1999) Mol. Carcinog. 24:15 3-159、Steiner, S. 及び N.L. Anderson (2000) Toxicol. Lett. 112-113:467-471、該文献は特に引用することを以って本明細書の一部となす）。試験化合物が、既知の毒性を有する化合物のシグネチャと同一のシグネチャを有する場合には、毒性特性を共有している可能性がある。フィンガープリントまたはシグネチャは、多数の遺伝子及び遺伝子ファミリーからの発現情報を含んでいる場合には、最も有用且つ正確である。理想的には、ゲノム全域にわたる発現の測定が最高品質のシグネチャを提供する。たとえ、発現が任意の試験された化合物によって変化しない遺伝子があったとしても、それらの発現レベルを残りの発現データをノーマライズするために使用できるため、それらの遺伝子は重要である。ノーマライズ手順は、異なる化合物で処理した後の発現データの比較に有用である。毒性シグネチャの要素に遺伝子機能を割り当てることが毒性メカニズムの解釈に役立つが、毒性の予測につながる、シグネチャ群の統計的マッチングには、遺伝子機能の知識は必要とされない（例えば２０００年２月２９日にNational Institute of Environmental Health Sciencesより発行されたPress Release 00-02を参照されたい。これについてはhttp://www.niehs.nih.gov/oc/news/toxchip.htmで入手可能である）。従って、毒性シグネチャを用いる中毒学的スクリーニングの際に、全ての発現した遺伝子配列を含めることは重要且つ望ましいことである。
【０３１９】
或る実施例では、核酸を含有する生物学的サンプルを試験化合物で処理することにより試験化合物の毒性を算定する。処理した生物学的サンプル中で発現した核酸は、本発明のポリヌクレオチドに特異的な１つ若しくは複数のプローブでハイブリダイズし、それによって本発明のポリヌクレオチドに対応する転写レベルを定量し得る。処理した生物学的サンプル中の転写物レベルを、未処理生物学的サンプル中のレベルと比較する。両サンプルの転写物レベルの差は、処理されたサンプル中で試験化合物が引き起こす毒性反応を示す。
【０３２０】
別の実施例は、本発明のポリペプチド配列を用いて組織または細胞タイプのプロテオームを分析することに関連する。プロテオームの語は、特定の組織または細胞タイプでのタンパク質発現の包括的パターンを指す。プロテオームの各タンパク質成分は、個々に更に分析の対象とすることができる。プロテオーム発現パターン即ちプロファイルは、所与の条件下で所与の時間に発現したタンパク質の数及び相対存在量を定量することにより分析し得る。従って細胞のプロテオームのプロファイルは、特定の組織または細胞タイプのポリペプチドを分離及び分析することにより作成し得る。或る実施例では、１次元等電点電気泳動によりサンプルからタンパク質を分離し、２次元ドデシル硫酸ナトリウムスラブゲル電気泳動により分子量に応じて分離するような２次元ゲル電気泳動により分離が達成される（前出のSteiner および Anderson）。タンパク質は、通常クーマシーブルーまたは銀染色液または蛍光染色液などの物質を用いてゲルで染色することにより、分散した、独自の位置にある点としてゲル中で可視化される。各タンパク質スポットの光学密度は、通常、サンプル中のタンパク質レベルに比例する。異なるサンプル、例えば試験化合物または治療薬で処理または未処理のいずれかの生物学的サンプルから得られる、同等に位置するタンパク質スポットの光学密度を比較し、処理に関連するタンパク質スポット密度の変化を同定する。スポット内のタンパク質は、例えば化学的または酵素的切断とそれに続く質量分析を用いる標準的な方法を用いて部分的にシークエンシングする。スポット内のタンパク質の同一性は、その部分配列を、好適には少なくとも５個の連続するアミノ酸残基を、本発明のポリペプチド配列と比較することにより決定し得る。場合によっては、決定的なタンパク質同定のための更なる配列が得られる。
【０３２１】
プロテオームのプロファイルは、NTRANに特異的な抗体を用いてNTRAN発現レベルを定量することによっても作成可能である。或る実施例では、マイクロアレイ上でエレメントとして抗体を用い、マイクロアレイをサンプルに曝して各アレイ要素へのタンパク質結合レベルを検出することによりタンパク質発現レベルを定量する（Lueking, A. 他 (1999) Anal. Biochern. 270:103-111、Mendoze, L.G. 他 (1999) Biotechniques 27:778-788）。検出は当分野で既知の様々な方法で行うことができ、例えば、チオールまたはアミノ反応性蛍光化合物を用いてサンプル中のタンパク質を反応させ、各アレイのエレメントにおける蛍光結合の量を検出し得る。
【０３２２】
プロテオームレベルでの毒性シグネチャも中毒学的スクリーニングに有用であり、転写レベルでの毒性シグネチャと並行に分析するべきである。数種の組織の数種のタンパク質に対しては、転写物とタンパク質の存在量の相関が乏しいこともあるので（Anderson, N.L. 及び J. Seilhamer (1997) Electrophoresis 18:533-537）、転写イメージには有意に影響しないがプロテオームのプロファイルを変化させるような化合物の分析においてプロテオーム毒性シグネチャは有用たり得る。更に、体液中の転写物の分析はmRNAの急速な分解のために困難なので、プロテオームのプロファイル作成はこのような場合により信頼し得、情報価値があり得る。
【０３２３】
別の実施例では、タンパク質を含有する生物学的サンプルを試験化合物で処理することにより試験化合物の毒性を算定する。処理された生物学的サンプル中で発現したタンパク質は、各タンパク質の量を定量し得るように分離する。各タンパク質の量を、未処理生物学的サンプル中の対応するタンパク質の量と比較する。両サンプルのタンパク質量の差は、処理サンプル中の試験化合物に対する毒性反応を示す。個々のタンパク質は、個々のタンパク質のアミノ酸残基をシークエンシングし、これら部分配列を本発明のポリペプチドと比較することにより同定する。
【０３２４】
別の実施例では、タンパク質を含有する生物学的サンプルを試験化合物で処理することにより試験化合物の毒性を算定する。生物学的サンプルから得たタンパク質は、本発明のポリペプチドに特異的な抗体を用いてインキュベートする。抗体により認識されたタンパク質の量を定量する。処理された生物学的サンプル中のタンパク質の量を、未処理生物学的サンプル中のタンパク質の量と比較する。両サンプルのタンパク質量の差は、処理サンプル中の試験化合物に対する毒性反応を示す。
【０３２５】
マイクロアレイは、本技術分野で既知の方法を用いて調製し、使用し、そして分析する（Brennan, T.M. 他 (1995) の米国特許第5,474,796号、Schena, M. 他 (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:10614-10619、Baldeschweiler 他の (1995) PCT出願第WO95/251116号、Shalon, D.他の (1995) PCT出願第WO95/35505号、Heller, R.A. 他 (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:2150-2155、Heller, M.J. 他の (1997) 米国特許第5,605,662号等を参照）。様々なタイプのマイクロアレイが公知であり、詳細については、DNA Microarrays: A Practical Approach, M. Schena, 編集. (1999) Oxford University Press, Londonに記載されている。 該文献は、特に引用することを以って本明細書の一部となす。
【０３２６】
本発明の別の実施例ではまた、NTRANをコードする核酸配列を用いて、天然のゲノム配列をマッピングするのに有用なハイブリダイゼーションプローブを作製することが可能である。コード配列または非コード配列のいずれかを用いることができ、或る例では、コード配列より非コード配列の方が好ましい。例えば、多重遺伝子ファミリーのメンバー内でのコード配列の保存により、染色体マッピング中に望ましくないクロスハイブリダイゼーションが生じる可能性がある。核酸配列は、特定の染色体、染色体の特定領域または人工形成の染色体、例えば、ヒト人工染色体（HAC）、酵母人工染色体（YAC）、細菌人工染色体（BAC）、細菌P1産物、或いは単一染色体cDNAライブラリに対してマッピングされる（例えばHarrington, J.J. 他（1997）Nat. Genet. 15:345-355; Price, C.M.（1993）Blood Rev. 7:127-134; Trask, B.J.（1991）Trends Genet. 7:149-154を参照）。一度マッピングすると、本発明の核酸配列を用いて例えば病状の遺伝を特定の染色体領域の遺伝または制限酵素断片長多型（RFLP）と相関させるような遺伝子連鎖地図を発生させ得る。(例えば、 Lander, E.S. and D. Botstein (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:7353-7357を参照)。
【０３２７】
蛍光in situハイブリッド形成法（FISH）は、他の物理的及び遺伝地図データと相関し得る（前出のHeinz-Ulrich, ら (1995) in Meyers, 965-968ページ等を参照）。遺伝地図データの例は、種々の科学雑誌あるいはOnline Mendelian Inheritance in Man（ＯＭＩＭ）のウェブサイトに見ることができる。物理的な染色体地図上のNTRANをコードする遺伝子の位置と、特定の疾患との相関性、あるいは特定の疾患に対する素因との相関性は、この疾患と関連するDNAの領域の決定に役立ち得るため、位置を決定するクローニングの作業を促進し得る。
【０３２８】
確定した染色体マーカーを用いた連鎖分析等の物理的マッピング技術及び染色体標本原位置ハイブリッド形成法を用いて、遺伝地図を拡張することができる。例えばマウスなど別の哺乳動物の染色体上に遺伝子を配置することにより、正確な染色体上の遺伝子座が未知でも、関連するマーカー類をしばしば明らかにし得る。この情報は、位置クローニングその他の遺伝子発見技術を用いて疾患遺伝子を探す研究者にとって価値がある。疾患または症候群に関与する遺伝子が、血管拡張性失調症の11q22-23領域等、特定の遺伝子領域への遺伝的結合によって大まかに位置決めがなされると、該領域にマップされた任意の配列は、更なる調査のための関連遺伝子或いは調節遺伝子を提示している可能性がある（Gatti, R.A.他 (1988) Nature 336:577-580等を参照）転座、反転などに起因する、健常者、保有者、罹病者の三者間における染色体位置の相違を検出する場合にも、本発明のヌクレオチド配列を用い得る。
【０３２９】
本発明の別の実施例では、NTRAN、その触媒作用断片或いは免疫原断片またはそのオリゴペプチドを、種々の任意の薬剤スクリーニング技術における化合物のライブラリのスクリーニングに用いることができる。薬剤スクリーニングに用いる断片は、溶液中に遊離しているか、固体支持物に固定されるか、細胞表面上に保持されるか、細胞内に位置することができる。NTRANと検査する薬剤との結合による複合体の形成を測定してもよい。
【０３３０】
別の薬剤スクリーニング方法は、目的のタンパク質に対して好適な結合親和性を有する化合物を高い処理能力でスクリーニングするために用いられる(Geysen, 他 (1984) PCT application WO84/03564等を参照）。この方法においては、多数の異なる小さな試験用化合物を固体基板上で合成する。試験用化合物は、NTRAN、或いはその断片と反応してから洗浄される。次に、本技術分野でよく知られている方法で、結合したNTRANを検出する。 精製したNTRANはまた、上記した薬剤のスクリーニング技術において用いるプレート上に直接コーティングすることもできる。別法では、非中和抗体を用いてペプチドを捕捉し、ペプチドを固体支持物に固定することもできる。
【０３３１】
別の実施例では、NTRANと結合可能な中和抗体がNTRANと結合するため試験用化合物と特に競合する、競合的薬剤スクリーニングアッセイを用いることができる。この方法では、抗体が、NTRANと１つ以上の抗原決定基を共有するどのペプチドの存在も検出する。
【０３３２】
別の実施態様では、NTRANをコードするヌクレオチド配列群を、将来に開発される分子生物学技術であり、現在知られているヌクレオチド配列群の特性（限定はされないが、トリプレット遺伝暗号及び特異的な塩基対相互作用など）に依存する新技術に用い得る。
【０３３３】
更に詳細説明をしなくとも、当業者であれば以上の説明を以って本発明を最大限に利用できるであろう。従って、これ以下に記載する実施例は単なる例示目的にすぎず、いかようにも本発明を限定するものではない。
【０３３４】
前述した、および以下に記載する全ての特許出願、特許、刊行物の開示を、米国特許出願第60/269,748号、同第60/290,524号、および同第60/343,742号も含めて、言及することをもって本明細書の一部とする。
【実施例】
【０３３５】
１  cDNAライブラリの作製
Incyte cDNA群の由来は、LIFESEQ GOLDデータベース (Incyte Genomics, Palo Alto CA)に記載されたcDNAライブラリ群である。幾つかの組織はホモジナイズしてグアニジニウムイソチオシアネート溶液に溶解し、他の組織はホモジナイズしてフェノールにまたは変性剤群の好適な混合液に溶解した。混合液の１例であるTRIZOL（Life Technologies）は、フェノールとグアニジンイソチオシアネートとの単相溶液である。結果として得られた溶解物は、塩化セシウムのクッション液の上に重層して遠心分離するかクロロホルムで抽出した。イソプロパノールか、酢酸ナトリウムとエタノールか、いずれか一方、或いは別の方法を用いて、溶解物からＲＮＡを沈殿させた。
【０３３６】
ＲＮＡの純度を高めるため、ＲＮＡのフェノールによる抽出及び沈殿を必要な回数繰り返した。場合によっては、ＤＮA分解酵素でＲＮＡを処理した。殆どのライブラリでは、オリゴd(T)連結常磁性粒子（Promega）、OLIGOTEXラテックス粒子（QIAGEN, Chatsworth CA）またはOLIGOTEX mRNA精製キット（QIAGEN）を用いて、ポリ(A+) RNAを単離した。別法では、別のRNA単離キット、例えばPOLY(A)PURE mRNA精製キット（Ambion, Austin TX）を用いて組織溶解物からRNAを直接単離した。
【０３３７】
場合によってはStratagene社へのRNA提供を行い、対応するｃＤＮＡライブラリをStratagene社が作製することもあった。そうでない場合は、UNIZAPベクターシステム（Stratagene）またはSUPERSCRIPTプラスミドシステム（Life Technologies）を用いて本技術分野で既知の推奨方法または類似の方法でcDNAを合成し、cDNAライブラリを作製した（前出のAusubel, 1997, 5.1-6.6ユニット等を参照）。逆転写は、オリゴd(T)またはランダムプライマーを用いて開始した。合成オリゴヌクレオチドアダプターを二本鎖cDNAに連結反応させ、好適な制限酵素でcDNAを消化した。殆どのライブラリに対して、cDNAのサイズ（３００〜１０００bp）選択は、SEPHACRYL S1000、SEPHAROSE CL2BまたはSEPHAROSE CL4Bカラムクロマトグラフィー（Amersham Pharmacia Biotech）、或いは分取用アガロースゲル電気泳動法を用いて行った。 合成オリゴヌクレオチドアダプターを二本鎖cDNAに連結反応させ、好適な制限酵素または酵素でcDNAを消化した。 好適なプラスミドは、例えばPBLUESCRIPTプラスミド（Stratagene）、PSPORT1 プラスミド(Life Technologies)、PCDNA2.1 プラスミド (Invitrogen, Carlsbad CA)、PBK-CMV プラスミド (Stratagene)、PCR2-TOPOTAプラスミド (Invitrogen)、PCMV-ICISプラスミド (Stratagene)、pIGEN (Incyte Genomics, Palo Alto CA)、pRARE (Incyte Genomics)、plNCY（Incyte Genomics）等およびその誘導体である。組換えプラスミドは、Stratagene社のXL1-Blue、XL1-BIueMRFまたはSOLR、或いはLife Technologies社のDH5α、DH10BまたはELECTROMAX DH10Bなど適格な大腸菌細胞に形質転換した。
【０３３８】
2 cDNAクローンの単離
UNIZAPベクターシステム（Stratagene）を用いたin vivo切除によって、或いは細胞溶解によって、実施例1のようにして得たプラスミドを宿主細胞から回収した。プラスミドの精製には、下記の少なくとも１つを用いた。すなわちMagicまたはWIZARD Minipreps DNA精製システム（Promega）、AGTC Miniprep精製キット（Edge Biosystems, Gaithersburg MD）、QIAGEN社のQIAWELL 8 Plasmid、QIAWELL 8 Plus PlasmidおよびQIAWELL 8 Ultra Plasmid 精製システム、R.E.A.L. Prep 96プラスミド精製キットのいずれかである。プラスミドは、沈殿させた後、0.1mlの蒸留水に再懸濁して、凍結乾燥して或いは凍結乾燥しないで４℃で保管した。
【０３３９】
別法では、高処理フォーマットにおいて直接結合ＰＣＲ法を用いて宿主細胞溶解物からプラスミドＤＮＡを増幅した（Rao, V.B. (1994) Anal. Biochem. 216:1-14）。宿主細胞の溶解及び熱サイクリング過程は、単一反応混合液中で行った。サンプルを処理し、それを３８４ウェルプレート内で保管し、増幅したプラスミドＤＮＡの濃度をPICOGREEN色素（Molecular Probes, Eugene OR）及びFLUOROSKANII蛍光スキャナ（Labsystems Oy, Helsinki, Finland）を用いて蛍光分析的に定量した。
【０３４０】
3  シークエンシング及び分析
実施例２に記載したようにプラスミドから回収したIncyte cDNAを、以下に示すようにシークエンシングした。cDNAのシークエンス反応は、標準的方法或いは高処理装置、例えばABI CATALYST 800 サーマルサイクラー（Applied Biosystems）またはPTC-200 サーマルサイクラー（MJ Research）をHYDRAマイクロディスペンサー（Robbins Scientific）またはMICROLAB 2200（Hamilton）液体転移システムと併用して処理した。cDNAのシークエンス反応は、Amersham Pharmacia Biotech社が提供する試薬、またはABIシークエンシングキット、例えばABI PRISM BIGDYE Terminator cycle sequencing ready reaction kit（Applied Biosystems）の試薬を用いて準備した。ｃＤＮＡのシークエンス反応の電気泳動的分離及び標識したポリヌクレオチドの検出には、MEGABACE 1000 DNAシークエンシングシステム（Molecular Dynamics）か、標準ABIプロトコル及び塩基呼び出し(base calling)ソフトウェアを用いるABI PRISM 373または377シークエンシングシステム（Applied Biosystems）か、或いはその他の本技術分野で既知の配列解析システムを用いた。ｃＤＮＡ配列内のリーディングフレームは、標準的方法（前出のAusubel, 1997, 7.7ユニットに概説）を用いて決定した。ｃＤＮＡ配列の幾つかを選択して、実施例８に記載した方法で配列を伸長させた。
【０３４１】
Incyte cDNA配列に由来するポリヌクレオチド配列は、ベクター、リンカー及びポリ(A)配列を除去し、あいまいな塩基対をマスクすることによって有効性を確認した。 その際、BLAST、動的プログラミング及び隣接ジヌクレオチド頻度分析に基づくアルゴリズム及びプログラムを用いた。次に、IncyteのcDNA配列、またはその翻訳を公共のデータベース（例えばGenBankの霊長類及びげっ歯類、哺乳動物、脊椎動物、真核生物のデータベースと、BLOCKS、PRINTS、DOMO、PRODOM）と、ヒト、ラット、マウス、線虫、出芽酵母（Saccharomyces cerevisiae）、分裂酵母（Schizosaccharomyces pombe）、および鵞口瘡カンジダ（Candida albicans ）からの配列を含むPROTEOMEデータベース（Incyte Genomics, Palo Alto CA）、及びPFAM等隠れマルコフモデル（HMM）に基づいたタンパク質ファミリーデータベース並びに、SMARTのようなHMMに基づいたタンパク質ドメインデータベースに対して問い合わせた(Schultz他(1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:5857-5864; Letunic, I. 他 (2002) Nucleic Acids Res. 30:242-244)。（HMMは、遺伝子ファミリーのコンセンサス１次構造を分析する確率的アプローチである。Eddy, S.R. (1996) Cuff. Opin. Struct. Biol. 6:361-365等を参照）。問合せは、BLAST、FASTA、BLIMPS及びHMMERに基づくプログラムを用いて行った。Incyte cDNA配列は、完全長のポリヌクレオチド配列を産出するように構築された。或いは、GenBank cDNA、GenBank EST、ステッチされた配列、ストレッチされた配列またはGenscan予測コード配列（実施例４及び５を参照）を用いてIncyte cDNAの集団を完全長まで伸長させた。Phred、Phrap及びConsedに基づくプログラムを用いて構築し、GenMark、BLAST及びFASTAに基づくプログラムを用いてcDNAの集団をオープンリーディングフレームに対してスクリーニングした。対応する完全長ポリペプチド配列を誘導するべく完全長ポリヌクレオチド配列を翻訳した。或いは、本発明のポリペプチドは完全長翻訳ポリペプチドの任意のメチオニン残基で開始し得る。引き続いて、GenBankタンパク質データベース（genpept）、SwissProt、PROTEOMEデータ-ベース、BLOCKS、PRINTS、DOMO、PRODOM及びProsite等のデータベース、PFAM等の隠れマルコフモデル（HMM）に基づいた、タンパク質ファミリーデータベース、及びSMART等のHMMに基づいたタンパク質ドメインデータベースに対する問合せによって完全長ポリペプチド配列を分析した。完全長ポリヌクレオチド配列はまた、MACDNASIS PROソフトウェア（日立ソフトウェアエンジニアリング, South San Francisco CA）及びLASERGENEソフトウェア（DNASTAR）を用いて分析される。ポリヌクレオチド及びポリペプチド配列アラインメントは、アラインメントした配列と配列の一致率も計算するMEGALIGNマルチシークエンスアラインメントプログラム（DNASTAR）に組み込まれているようなCLUSTALアルゴリズムによって指定されるデフォルトパラメータを用いて作製する。
【０３４２】
Incyte ｃＤＮＡ及び完全長配列の分析及びアセンブリ(構築)に利用したツール、プログラム及びアルゴリズムの概略と、適用可能な説明、引用文献、閾値パラメータを表7に示す。用いたツール、プログラム及びアルゴリズムを表７の列１に、それらの簡単な説明を列２に示す。列３は好適な参照文献であり、全ての文献は引用を以って全文を本明細書の一部となす。適用可能な場合には、列４は２つの配列が一致する強さを評価するために用いたスコア、確率値その他のパラメータを示す（スコアが高いほど、または確率値が低いほど、２配列間の同一性が高くなる）。
【０３４３】
完全長ポリヌクレオチド配列およびポリペプチド配列の組み立て及び分析に用いる上記のプログラムは、SEQ ID NO:9-16のポリヌクレオチド配列断片の同定にも利用できる。 ハイブリダイゼーション及び増幅技術に有用である約２０〜約４０００ヌクレオチドの断片を表４の列2に示した。
【０３４４】
４  ゲノムDNAからのコード配列の同定及び編集
推定上の神経伝達関連タンパク質は、公共のゲノム配列データベース（例えば、gbpriやgbhtg）においてGenscan遺伝子同定プログラムを実行して初めに同定された。Genscanは、様々な生物からのゲノムDNA配列を分析する汎用遺伝子同定プログラムである（Burge, C. 及び S. Karlin (1997) J. Mol. Biol. 268:78-94、Burge, C. 及び S. Karlin (1998) Curr. Opin. Struct. Biol. 8:346-354を参照）。プログラムは予測されたエキソンを連結し、メチオニンから終止コドンに及ぶ構築されたｃＤＮＡ配列を形成する。Genscanの出力は、ポリヌクレオチド及びポリペプチド配列のFASTAデータベースである。Genscanが一度に分析する配列の最大範囲は、３０kbに設定した。これらのGenscan予測cDNA配列の内、どの配列が神経伝達関連タンパク質をコードするかを決定するために、コードされたポリペプチドをPFAMモデルにおいて神経伝達関連タンパク質について問合せて分析した。潜在的な神経伝達関連タンパク質はまた、既に神経伝達関連タンパク質として注釈が付けられていたIncyte cDNA配列への相同性を基に同定された。こうして選択されたGenscan予測配列は、次にBLAST分析により公共データベースgenpept及びgbpriと比較した。必要であれば、genpeptからのトップのBLASTヒットと比較することによりGenscan予測配列を編集し、余分なまたは取り除かれたエキソンなど、Genscanにより予測された配列のエラーを修正した。BLAST分析はまた、任意のIncyte cDNAまたはGenscan予測配列の公共cDNA適用範囲の発見に用いられ、したがって転写の証拠を提供した。。Incyte cDNA適用範囲が利用できる場合には、この情報を用いてGenscan予測配列を修正または確認した。完全長ポリヌクレオチド配列は、実施例３に記載された構築プロセスを用いて、Incyte cDNA配列及び／または公共のcDNA配列でGenscan予測コード配列を構築することにより得た。或いは、完全長ポリヌクレオチド配列は、編集した、または非編集のGenscan予測コード配列に完全に由来する。
【０３４５】
５  ｃDNA配列データとのゲノム配列データの統合(assembly)
ステッチ配列（Stitched Sequence）
部分cDNA配列は、実施例４に記載のGenscan遺伝子同定プログラムにより予測されたエキソンを用いて伸長させた。実施例３に記載されたように構築された部分ｃＤＮＡは、ゲノムＤＮＡにマッピングし、関連するｃＤＮＡ及び１つ若しくは複数のゲノム配列から予測されたGenscanエキソンを含むクラスタに分解した。ｃＤＮＡ及びゲノム情報を統合するべくグラフ理論及び動的プログラミングに基づくアルゴリズムを用いて各クラスタを分析し、引き続いて確認、編集または伸長して完全長配列を産出するような潜在的スプライシング変異体を生み出した。区間全体の長さがクラスタ中の２以上の配列に存在するような配列を同定し、そのように同定された区間は推移性により等しいと考えられた。例えば、１つのｃＤＮＡ及び２つのゲノム配列に区間が存在する場合、３つの区間は全て等しいと考えられる。このプロセスは、無関係であるが連続したゲノム配列をｃＤＮＡ配列により結び合わせて架橋し得る。このようにして同定された区間を、親配列（parent sequence）に沿って現われるようにステッチアルゴリズムで縫い合わせ、可能な最も長い配列および変異配列を作製する。１種類の親配列に沿って発生した区間と区間との連鎖（ｃＤＮＡ−ｃＤＮＡまたはゲノム配列−ゲノム配列）は、親の種類を変える連鎖（ｃＤＮＡ−ゲノム配列）に優先した。結果として得られるステッチ配列は、BLAST分析により公共データベースgenpept及びgbpriに翻訳されて比較された。Genscanにより予測された不正確なエキソンは、genpeptからのトップのBLASTヒットと比較することにより修正した。必要な場合には、追加cDNA配列を用いるかゲノムＤＮＡの検査により配列を更に伸長させた。
【０３４６】
ストレッチ配列（Stretched Sequence）
部分ＤＮＡ配列は、BLAST分析に基づくアルゴリズムにより完全長まで伸長された。先ず、BLASTプログラムを用いて、GenBankの霊長類、げっ歯類、哺乳動物、脊椎動物及び真核生物のデータベースなどの公共データベースに対し、実施例３に記載されたように構築された部分ｃＤＮＡを問い合わせた。次に、最も近いGenBankタンパク質相同体をBLAST分析によりIncyte cDNA配列または実施例４に記載のGenScanエキソン予測配列のいずれかと比較した。結果として得られる高スコアリングセグメント対（HSP）を用いてキメラタンパク質を産出し、翻訳した配列をGenBankタンパク質相同体上にマッピングした。元のGenBankタンパク質相同体と比較して、キメラタンパク質内では挿入または欠失が起こり得る。GenBankタンパク質相同体、キメラタンパク質またはその両方をプローブとして用い、公共のヒトゲノムデータベースから相同ゲノム配列を検索した。このようにして、部分的なDNA配列を相同ゲノム配列の付加によりストレッチすなわち伸長した。結果として得られるストレッチ配列を検査し、完全遺伝子を含んでいるか否かを決定した。
【０３４７】
６  NTRANをコードするポリヌクレオチドの染色体マッピング
SEQ ID NO:9-16を構築するために用いた配列を、BLAST及び他のSmith-Watermanアルゴリズムの実装を用いて、Incyte LIFESEQデータベース及び公共のドメインデータベースの配列と比較した。SEQ ID NO:9-16と一致するこれらのデータベースの配列を、Phrapなどの構築アルゴリズム（表７）を使用して、連続およびオーバーラップする配列のクラスター群に組み入れた。スタンフォード・ヒトゲノムセンター（SHGC）、ホワイトヘッド・ゲノム研究所（WIGR）、Genethon等の公的な情報源から入手可能な放射線ハイブリッド及び遺伝地図データを用いて、クラスタ化された配列が既にマッピングされていたかを決定した。マッピングされた配列がクラスタに含まれている場合は、個々の配列番号を含めてそのクラスタの全配列が地図上の位置に割り当てられた。
【０３４８】
地図上の位置は、ヒト染色体の範囲または区間として表される。センチモルガン単位での或る区間の地図上の位置は、染色体のpアームの末端に関連して測定する（センチモルガン（cM）は、染色体マーカー間の組換え頻度に基づく計測単位である。平均して、１cMは、ヒト中のDNAの１メガベース（Mb）にほぼ等しい。尤も、この値は、組換えのホットスポット及びコールドスポットに起因して広範囲に変化する）。cM距離は、配列が各クラスタ内に含まれるような放射線ハイブリッドマーカーに対して境界を提供するようなGenethonによってマッピングされた遺伝マーカーに基づく。NCBI「GeneMap'99」（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genemap/）などの公的に入手可能なヒト遺伝子マップおよびその他の情報源を用いて、既に同定されている疾患遺伝子群が、上記した区間内若しくは近傍に位置するかを決定できる。
【０３４９】
７  ポリヌクレオチド発現の分析
ノーザン分析は、転写された遺伝情報の存在を検出するために用いられる実験技術であり、特定の細胞種または組織からのRNAが結合される膜への標識されたヌクレオチド配列のハイブリダイゼーションに関与している。（前出のSambrook, 7章、同Ausubel. F.M. 他, 4章及び16章等を参照）。
【０３５０】
BLASTを適用した類似のコンピュータ技術を用いて、GenBankやLifeSeq（Incyte Genomics）等のｃDNAデータベースにおいて同一または関連分子を検索した。ノーザン分析は、多数の膜系ハイブリダイゼーションよりも非常に速い。更に、特定の一致を厳密な一致、或いは類似的な一致として分類するか否かを決定するため、コンピュータ検索の感度を変更することができる。検索の基準は積スコアであり、次式で定義される。
【０３５１】
【数１】
2004523236.tif 000004
【０３５２】
積スコアは、２つの配列間の類似度及び配列が一致する長さの両方を考慮している。積スコアは、０〜１００のノーマライズされた値であり、次のようにして求める。BLASTスコアにヌクレオチドの配列一致率を乗じ、その積を２つの配列の短い方の長さの５倍で除する。高スコアリングセグメント対（HSP）に一致する各塩基に＋５のスコアを割り当て、各不一致塩基対に−４を割り当てることにより、BLASTスコアを計算する。２つの配列は、２以上のHSPを共有し得る（ギャップにより隔離され得る）。２以上のHSPがある場合には、最高BLASTスコアのセグメント対を用いて積スコアを計算する。積スコアは、断片的オーバーラップとBLASTアラインメントの質とのバランスを表す。例えば積スコア１００は、比較した２つの配列の短い方の長さ全体にわたって１００％一致する場合のみ得られる。積スコア７０は、一端が１００％一致し、７０％オーバーラップしているか、他端が８８％一致し、１００％オーバーラップしているかのいずれかの場合に得られる。積スコア５０は、一端が１００％一致し、５０％オーバーラップしているか、他端が７９％一致し、１００％オーバーラップしているかのいずれかの場合に得られる。
【０３５３】
或いは、NTRANをコードするポリヌクレオチド配列は、由来する組織に対して分析する。例えば或る完全長配列は、Incyte cDNA配列（実施例３を参照）と少なくとも一部はオーバーラップするように構築される。各cDNA配列は、ヒト組織から作製されたcDNAライブラリに由来する。各cDNA配列は、ヒト組織から作製されたcDNAライブラリに由来する。各ヒト組織は、以下の臓器／組織カテゴリー即ち心血管系、結合組織、消化器系、胎芽構造、内分泌系、外分泌腺、女性生殖器、男性生殖器、生殖細胞、血液及び免疫系、肝、筋骨格系、神経系、膵臓、呼吸器系、感覚器、皮膚、顎口腔系、非分類性／混合性または尿路の１つに分類される。各カテゴリーのライブラリ数を数えて、全カテゴリーの総ライブラリ数で除する。同様に、各ヒト組織は、以下の疾患／条件カテゴリー即ち癌、細胞株、発達、炎症、神経性、外傷、心血管、プール、その他の１つに分類される。 各カテゴリーのライブラリ数を数えて、全カテゴリーの総ライブラリ数で除する。得られるパーセンテージは、NTRANをコードするcDNAの組織特異的および疾患特異的な発現を反映する。cDNA配列およびcDNAライブラリ／組織の情報は、LIFESEQ GOLD データベース（Incyte Genomics, Palo Alto CA）から得ることができる。
【０３５４】
８  NTRANをコードするポリヌクレオチドの伸長
完全長のポリヌクレオチド配列はまた、完全長分子の適切な断片から設計したオリゴヌクレオチドプライマーを用いて該断片を伸長させて生成した。一方のプライマーは既知の断片の５'伸長を開始するべく合成し、他方のプライマーは既知の断片の３'伸長を開始するべく合成した。開始プライマーは、長さが約２２〜３０ヌクレオチド、GC含有率が約５０％以上となり、約６８〜７２℃の温度で標的配列にアニーリングするように、OLIGO 4.06ソフトウェア（National Biosciences）或いは別の適切なプログラムを用いて、cDNAから設計した。 ヘアピン構造及びプライマー−プライマー二量体を生ずるようなヌクレオチドの伸長は全て回避した。
【０３５５】
配列を伸長するために、選択されたヒトｃＤＮＡライブラリを用いた。２段階以上の伸長が必要または望ましい場合には、付加的プライマー或いはプライマーのネステッドセットを設計した。
【０３５６】
高忠実度の増幅が、当業者によく知られている方法を利用したPCR法によって得られた。 PCRは、PTC-200 サーマルサイクラー（MJ Research, Inc.）を用いて９６穴プレート内で行った。反応混合液は、鋳型DNAを有し、また、200 nmolの各プライマーを有する。また、Mg２+と（NH4）2SO4と２−メルカプトエタノールとを含有する反応バッファーと、Taq DNAポリメラーゼ（Amersham Pharmacia Biotech）と、ELONGASE酵素（Life Technologies）と、Pfu DNAポリメラーゼ（Stratagene）とを含有する。プライマー対であるPCI AとPCI Bとに対し、以下のパラメータで増幅した。ステップ１： 94℃で３分間 ステップ２： 94℃で１５秒 ステップ３： 60℃で１分間 ステップ４： 68℃で２分間 ステップ５： ステップ２、３、４を２０回繰り返す ステップ６： 68℃で５分間 ステップ７： ４℃で保存。プライマー対T7、SK+に対しては、上記パラメータに代えて以下のパラメータを用いた。ステップ１： 94℃で３分間 ステップ２： 94℃で１５秒 ステップ３： 57℃で１分間 ステップ４： 68℃で２分間 ステップ５： ステップ２、３、４を20回繰り返す ステップ６： 68℃で５分間 ステップ７： ４℃で保存。
【０３５７】
各ウェルのDNA濃度は、１X TE及び0.5μlの希釈していないPCR産物に溶解した100μlのPICOGREEN定量試薬(0.25(v/v) PICOGREEN; Molecular Probes, Eugene OR)を不透明な蛍光光度計プレート(Corning Costar, Acton MA)の各ウェルに分配してDNAが試薬と結合できるようにして測定する。サンプルの蛍光を計測してDNAの濃度を定量すべく、プレートをFluoroskan II（Labsystems Oy, Helsinki, Finland）でスキャンした。反応混合物のアリコート５〜１０μlを１％アガロースミニゲル上で電気泳動法によって解析し、どの反応が配列の伸長に成功したかを決定した。
【０３５８】
伸長させたヌクレオチドは、脱塩及び濃縮して３８４ウェルプレートに移し、CviJIコレラウイルスエンドヌクレアーゼ（Molecular Biology Research, Madison WI）を用いて消化し、pUC 18ベクター（Amersham Pharmacia Biotech）への再連結反応前に音波処理またはせん断した。ショットガン・シークエンシングのために、消化したヌクレオチドを低濃度（０.６〜０.８％）のアガロースゲル上で分離し、断片を切除し、寒天をAgar ACE（Promega）で消化した。伸長させたクローンをＴ４リガーゼ（New England Biolabs, Beverly MA）を用いてpUC 18ベクター（Amersham Pharmacia Biotech）に再連結し、Pfu DNAポリメラーゼ（Stratagene）で処理して制限部位のオーバーハングを満たし、大腸菌細胞に形質移入した。形質転換した細胞を選択して抗生物質を含む培地に移し、それぞれのコロニーを切りとってLB/2Xカルベニシリン培養液の384ウェルプレートに３７℃で一晩培養した。
【０３５９】
細胞を溶解して、Taq DNAポリメラーゼ(Amersham Pharmacia Biotech)及びPfu DNAポリメラーゼ(Stratagene)を用いて以下の手順でDNAをPCR増幅した。ステップ1: 94℃, 3分、 ステップ 2: 94℃, 15 秒、ステップ 3: 60℃, 1 分、ステップ 4: 72℃, 2 分、 ステップ 5: ステップ2、3および 4を29回反復する。  ステップ6: 72℃, 5 分、ステップ7:  4℃で保存する。上記のようにPICOGREEN試薬(Molecular Probes)でDNAを定量した。DNAの回収率が低いサンプルは、上記と同一の条件を用いて再増幅した。サンプルは20％ジメチルスルホキシド（１：２, v/v）で希釈し、DYENAMIC エネルギートランスファー シークエンシングプライマー、及びDYENAMIC DIRECT kit（Amersham Pharmacia Biotech）またはABI PRISM BIGDYE ターミネーターサイクル シークエンシング反応キット（Terminator cycle sequencing ready reaction kit）（Applied Biosystems）を用いてシークエンシングした。
【０３６０】
同様に、上記手順を用いて完全長ポリヌクレオチド配列を検証し、或いはそのような伸長のために設計されたオリゴヌクレオチド及び適切なゲノムライブラリを用いて５'調節配列を得る。
【０３６１】
９  NTRANをコードするポリヌクレオチドにおける１塩基多型性の同定
一塩基多型（SNP）として知られる一般的なDNA配列変異体がLIFESEQ データベース(Incyte Genomics)を用いてSEQ ID NO:9-16 において同定された。実施例３に記述したように、同じ遺伝子からの配列を一緒にまとめてクラスター化して構築し、これによって遺伝子内のすべての配列変異体の同定ができた。SNPをその他の配列変異体から区別するために、一連のフィルターからなるアルゴリズムが使用された。前段フィルターは最小Phredクオリティスコア１５を要求することによって大多数のベースコールエラーを除去し、配列アラインメントエラーと、スプライス変異体、キメラおよびベクター配列の不適正なトリミングによるエラーを除去した。高度染色体解析の自動化手順により、推定上のSNPの近傍のオリジナルのクロマトグラムファイルを解析した。クローンエラーフィルターは、統計的に生成されたアルゴリズムを使って、実験室の処理中に入ってくる（逆転写酵素、ポリメラーゼまたは体細胞性突然変異などに起因する）エラーを同定した。クラスタリングエラーフィルターは統計的に生成されたアルゴリズムを使って、近い相同体や偽遺伝子のクラスタリングによるエラー、および非ヒト配列によるコンタミネーションに起因するエラーを同定した。最後のフィルターセットは免疫グロブリンまたはT細胞受容体で見つかる重複(duplicates)とSNPを除去した。
【０３６２】
４つの異なるヒトの集団中のSNP部位における対立遺伝子頻度を解析するために、数種のSNPを選択して、高スループットMASSARRAYシステム(Sequenom, Inc.) を使った質量分析で更に特徴付けた。白人集団は９２人（男性４６人、女性４６人）で、８３人がユタ州出身、４人がフランス人、３人がベネズエラ、そして２人がアーミッシュだった。アフリカ系集団は１９４人（男性97人、女性９７人）からなり、その全てがアフリカ系アメリカ人であった。ラテンアメリカ系集団は324人（男性162人、女性162人）からなり、その全てがメキシコのラテンアメリカ系であった。アジア系集団は１２６人（男性６４人、女性６２人）からなり、報告された親の内訳は中国人が４３％、日本人が３１％、コリアンが１３％、ベトナム人が５％、その他のアジア系が８％であった。対立遺伝子頻度は最初に白人集団で解析された。この集団内で対立遺伝子分散を示さなかったSNPはその他３つの集団ではテストしない場合もあった。
【０３６３】
１０  個々のハイブリダイゼーションプローブの標識化及び使用
SEQ ID NO:9-16から導き出されたハイブリダイゼーションプローブを用いて、cDNA、mRNA、またはゲノムDNAをスクリーニングする。約２０塩基対からなるオリゴヌクレオチドの標識について特に記載するが、より大きなヌクレオチド断片に対しても事実上同一の手順が用いられる。オリゴヌクレオチドは、OLIGO 4.06ソフトウェア（National Biosciences）等の最新ソフトウェアを用いて設計し、各オリゴマー５０pmolと、[γ-32P]アデノシン３リン酸 （Amersham Pharmacia Biotech）２５０μCiと、T4ポリヌクレオチドキナーゼ（DuPont NEN, Boston MA）を混合することにより標識する。標識したオリゴヌクレオチドは、SEPHADEX G-25超細繊分子サイズ排除デキストラン ビードカラム（Amersham Pharmacia Biotech）を用いて実質的に精製する。Ase I、Bgl II、Eco RI、Pst I、Xba1またはPvu II（DuPont NEN）のいずれか１つのエンドヌクレアーゼで消化されたヒトゲノムＤＮＡの典型的な膜ベースのハイブリダイゼーション解析において、毎分１０7カウントの標識されたプローブを含むアリコットを用いる。
【０３６４】
各消化物から得たDNAは、０.７％アガロースゲル上で分画してナイロン膜（Nytran Plus, Schleicher & Schuell, Durham NH）に移す。ハイブリダイゼーションは、４０℃で１６時間行う。 非特異的シグナルを除去するため、例えば０.１×クエン酸ナトリウム食塩水及び０.５％ドデシル硫酸ナトリウムに一致する条件下で、ブロットを室温で順次洗浄する。オートラジオグラフィーまたはそれに代わるイメージング手段を用いてハイブリダイゼーションパターンを視覚化し、比較する。
【０３６５】
１１  マイクロアレイ
マイクロアレイの表面上でアレイエレメントの結合または合成は、フォトリソグラフィ、圧電印刷（インクジェット印刷、前出のBaldeschweiler等を参照）、機械的マイクロスポッティング技術及びこれらから派生したものを用いて達成することが可能である。上記各技術において基板は、均一且つ、無孔の表面を持つ固体とするべきである（Schena (1999) 前出）。推奨する基板には、シリコン、シリカ、スライドガラス、ガラスチップ及びシリコンウエハがある。或いは、ドットブロット法またはスロットブロット法に類似の手順を利用して、熱的、紫外線的、化学的または機械的結合手順を用いて基板の表面にエレメントを配置及び結合させてもよい。通常のアレイは、利用可能な、当業者に公知の方法と機械とを用いて作製でき、任意の適正数のエレメントを有し得る(例えばSchena, M. 他. (1995) Science 270:467-470、Shalon, D.他. (1996) Genome Res. 6:639-645、Marshall, A.及びJ. Hodgson (1998) Nat. Biotechnol. 16:27-31等を参照)。
【０３６６】
完全長ｃＤＮＡ、発現配列タグ（EST）、またはその断片またはオリゴマーは、マイクロアレイのエレメントと成り得る。ハイブリダイゼーションに好適な断片またはオリゴマーを、レーザGENEソフトウェア（DNASTAR）等の本技術分野で公知のソフトウェアを用いて選択することが可能である。アレイエレメントは、生物学的サンプル中でポリヌクレオチドを用いてハイブリダイズされる。生物学的サンプル中のポリヌクレオチドは、検出を容易にするために蛍光標識またはその他の分子タグに抱合される。ハイブリダイゼーション後、生物学的サンプルからのハイブリダイズされていないヌクレオチドを除去し、蛍光スキャナを用いて各アレイエレメントでのハイブリダイゼーションを検出する。或いは、レーザー脱離及び質量スペクトロメトリを用いてもハイブリダイゼーションを検出し得る。マイクロアレイ上のエレメントにハイブリダイズする各ポリヌクレオチドの相補性の度合及び相対存在度は、算定し得る。 一実施例におけるマイクロアレイの調製及び使用について、以下に詳述する。
【０３６７】
組織または細胞サンプルの調製
グアニジニウムチオシアネート法を用いて組織サンプルから全RNAを単離し、オリゴ(dT)セルロース法を用いてポリ(A)+RNAを精製する。各ポリ(A)+RNAサンプルを、MMLV逆転写酵素、0.05pg/μlのオリゴ(dT)プライマー（21mer）、１×第一鎖合成バッファー、0.03unit/μlのRNアーゼ阻害因子、500μMのdATP、500μMのdGTP、500μMのdTTP、40μMのdCTP、40μMのdCTP-Cy3（BDS）またはdCTP-Cy5（Amersham Pharmacia Biotech）を用いて逆転写する。逆転写反応は、GEMBRIGHTキット（Incyte）を用いてポリ(A)+RNA 200 ng 含有の25体積ml内で行う。特異的対照ポリ(A)+RNAは、非コード酵母ゲノムDNAからin vitro転写により合成する。37℃で2時間インキュベートした後、各反応サンプル（１つはＣｙ3、もう１つはＣｙ5標識）は、２.５mlの０.５M水酸化ナトリウムで処理し、８５℃で２０分間インキュベートし、反応を停止させてRNAを分解させる。サンプルは、２つの連続するCHROMA SPIN 30ゲル濾過スピンカラム（CLONTECH Laboratories, Inc. (CLONTECH), Palo Alto CA）を用いて精製する。 混合後、２つの反応サンプルは、１mlのグリコーゲン（１mg/ml）、６０mlの酢酸ナトリウム及び３００mlの１００％エタノールを用いてエタノール沈殿させる。サンプルは次に、SpeedVAC（Savant Instruments Inc., Holbrook NY）を用いて完全に乾燥させ、１４μlの５×SSC／０.２％SDS中で再懸濁する。
【０３６８】
マイクロアレイの調製
本発明の配列を用いて、アレイエレメントを作製する。各アレイエレメントは、クローン化したcDNAインサートを有するベクターを含有する細菌細胞から増幅する。ＰＣＲ増幅は、cDNAインサートの側面に位置するベクター配列に相補的なプライマーを用いる。３０サイクルのＰＣＲによって、１〜２ngの初期量から５μgを超える最終量までアレイエレメントを増幅する。増幅されたアレイエレメントは、SEPHACRYL-400（Amersham Pharmacia Biotech）を用いて精製される。
【０３６９】
精製したアレイエレメントは、ポリマーコートされたスライドグラス上に固定する。顕微鏡スライドグラス（Corning）は、処理の間及び処理後に０.１％のSDS及びアセトン中で超音波処理をかけ、蒸留水で充分に洗浄する。スライドグラスは、４％フッ化水素酸（VWR Scientific Products Corporation (VWR), West Chester PA）中でエッチングし、蒸留水中で充分に洗浄し、９５％エタノール中で０.０５％アミノプロピルシラン（Sigma）を用いてコーティングする。コーティングしたスライドガラスは、１１０℃のオーブンで硬化させる。
【０３７０】
米国特許第5,807,522号で説明されている方法を用いて、コーティングしたガラス基板にアレイエレメントを付加する。 該特許は、引用を以って本明細書の一部となす。平均濃度が１００ng/μlのアレイエレメントDNA１μlを高速ロボット装置により開放型キャピラリープリンティングエレメント（open capillary printing element）に充填する。装置はここで、スライド毎に約５nlのアレイエレメントサンプルを加える。
【０３７１】
マイクロアレイには、STRATALINKER ＵＶ架橋剤（Stratagene）を用いてＵＶ架橋する。マイクロアレイは、室温において０.２％ＳＤＳで１度洗浄し、蒸留水で３度洗浄する。リン酸緩衝生理食塩水 (PBS)（Tropix, Inc., Bedford MA）中の０.２％カゼイン中において６０℃で３０分間マイクロアレイをインキュベートした後、前に行ったように０.２％ＳＤＳ及び蒸留水で洗浄することにより、非特異結合部位をブロックする。
【０３７２】
ハイブリダイゼーション
ハイブリダイゼーション反応液は、５×SSC、０.２％SDSハイブリダイゼーション緩衝液にCy3及びCy5標識したcDNA合成産物を各０.２μg含む９μlのサンプル混合体を含めたものである。サンプル混合体は、６５℃まで５分間加熱し、マイクロアレイ表面上へ等分して１.８cm2 のカバーガラスで覆う。アレイを、顕微鏡用スライドよりわずかに大きい空洞を有する防水チェンバーに移す。チェンバーのコーナーに１４０μlの５×SSCを加えることにより、チェンバー内部を湿度100%に保持する。アレイを含むチェンバーは、６０℃で約６．５時間インキュベートする。アレイは、第１洗浄緩衝液中（１×SSC,０.１％SDS）において４５℃で１０分間洗浄し、第２洗浄緩衝液中（０.１×SSC）において各々45℃で10分間、３度洗浄して乾燥させる。
【０３７３】
検出
レポーター標識したハイブリダイゼーション複合体は、Ｃｙ3の励起のためには４８８nm、Ｃｙ5の励起のためには６３２nmでスペクトル線を発生し得るInnova70混合ガス10Ｗレーザ（Coherent, Inc., Santa Clara CA）を備えた顕微鏡で検出する。２０×顕微鏡対物レンズ（Nikon, Inc., Melville NY）を用いて、アレイ上に励起レーザ光の焦点を当てる。アレイを含むスライドを顕微鏡のコンピュータ制御のX-Yステージに置き、対物レンズを通過してラスタースキャンする。本実施例で用いる１.８cm×１.８cmのアレイは、２０μmの解像度でスキャンする。
【０３７４】
２回の異なるスキャンで、混合ガスマルチラインレーザは２つのフルオロフォアを連続的に励起する。発光された光は、波長に基づき分離され、２つのフルオロフォアに対応する２つの光電子増倍管検出器（PMT R1477, Hamamatsu Photonics Systems, Bridgewater NJ）に送られる。アレイと光電子増倍管間に設置された好適なフィルターを用いて、シグナルをフィルターする。用いるフルオロフォアの最大発光の波長は、Cy3では５６５nm、Cy5では６５０nmである。装置は両方のフルオロフォアからのスペクトルを同時に記録し得るが、レーザ源において好適なフィルターを用いて、フルオロフォア１つにつき１度スキャンし、各アレイを通常２度スキャンする。
【０３７５】
スキャンの感度は通常、既知濃度でサンプル混合体に添加されるｃＤＮＡ対照種により発生されるシグナル強度を用いて較正する。アレイ上の特定の位置には相補的ＤＮＡ配列が含まれ、その位置におけるシグナルの強度を重量比1：100,000でハイブリダイゼーション種と相関させる。異なる源泉（例えば試験される細胞及び対照細胞など）からの２つのサンプルを、各々異なるフルオロフォアで標識し、他と異なって発現した遺伝子を同定するために単一のアレイにハイブリダイズする場合には、２つのフルオロフォアで較正するｃＤＮＡのサンプルを標識し、ハイブリダイゼーション混合液に各々等量を加えることによって較正を行う。
【０３７６】
光電子増倍管の出力は、IBMコンパチブルPCコンピュータにインストールされた12ビットRTI-835Hアナログディジタル（A/D）変換ボード（Analog Devices, Inc., Norwood MA）を用いてディジタル化される。ディジタル化されたデータは、青色（低シグナル）から赤色（高シグナル）までの擬似カラー範囲へのリニア20色変換を用いてシグナル強度がマッピングされたようなイメージとして表示される。データは、定量的にも分析される。2つの異なるフルオロフォアを同時に励起および測定する場合には、各フルオロフォアの発光スペクトルを用いて、データはまずフルオロフォア間の光学的クロストーク（発光スペクトルの重なりに起因する）を補正する。
【０３７７】
グリッドが蛍光シグナルイメージ上に重ねられ、それによって各スポットからのシグナルはグリッドの各エレメントに集められる。各エレメント内の蛍光シグナルは統合され、シグナルの平均強度に応じた数値が得られる。シグナル分析に用いるソフトウェアは、GEMTOOLS遺伝子発現分析プログラム（Incyte）である。
【０３７８】
発現
ホジキン病の29歳の男性から採取した末梢血を使ってB細胞リンパ芽球細胞株を調製した。たとえば、SEQ ID NO:15はマイクロアレイ分析での判定で、リポ多糖複合体で処理されたBリンパ芽球（ホジキン）細胞株と未処理株で差次的発現を示した。リポ多糖複合体はさまざまな炎症反応を誘発する。したがって、SEQ ID NO:15 は自己免疫/炎症疾患の治療に有用である。
【０３７９】
SEQ ID NO:16はマイクロアレイ分析による判定では、肺癌組織で差次的発現を示した。肺癌は米国において男性の癌死の最大の原因であり、女性の癌死の第2番目の原因である。肺癌は組織病理学的に異なる4つのグループに分けられる。扁平上皮細胞癌および腺癌を含む３つのグループは非小細胞肺癌として分類されていて、4つ目のグループは小細胞肺癌として分類されている。非小細胞肺癌を合わせると全症例の７０％になる。腫瘍組織を同じドナーの正常組織と比較する対比較が行われた。60歳の患者の中分化肺腺癌組織では、肉眼的に癌のない肺組織と比べてSEQ ID NO:16 の発現が少なくとも2分の1に減少していた。この実験は、SEQ ID NO:16が肺癌の診断および段階決定アッセイに有用であり、また生物学的マーカとして、更に肺癌治療薬として有用かもしれないことを示している。
【０３８０】
１２  相補的ポリヌクレオチド
NTRANをコードする配列或いはその任意の一部に対して相補的な配列は、天然のNTRANの発現を検出、低減または阻害するために用いられる。約１５〜３０塩基対を含むオリゴヌクレオチドの使用について記すが、これより小さな或いは大きな配列の断片の場合でも本質的に同じ方法を用いる。Oligo4.06ソフトウェア（National Biosciences）及びNTRANのコーディング配列を用いて、適切なオリゴヌクレオチドを設計する。転写を阻害するためには、最も独特な５' 配列から相補的オリゴヌクレオチドを設計し、これを用いてプロモーターがコーディング配列に結合するのを阻害する。翻訳を阻害するためには、相補的なオリゴヌクレオチドを設計して、リボソームがNTRANをコードする転写物に結合するのを阻害する。
【０３８１】
１３  NTRANの発現
NTRANの発現及び精製は、細菌若しくはウイルスを基にした発現系を用いて行うことができる。細菌でNTRANを発現させるためには、抗生物質耐性遺伝子及び、cDNAの転写レベルを高める誘導性のプロモーターを含む好適なベクターにcDNAをサブクローニングする。このようなプロモーターには、lacオペレーター調節エレメントと併用するT5またはT7バクテリオファージプロモーター、及びtrp-lac(tac)ハイブリッドプロモーターが含まれるが、これらに限定するものではない。組換えベクターを、BL21（DE3）等の好適な細菌宿主に形質転換する。抗生物質耐性をもつ細菌は、イソプロピルβ-Dチオガラクトピラノシド（IPTG）で誘導されるとNTRANを発現する。真核細胞でのNTRANの発現は、一般にバキュロウイルスとして知られているAutographica californica核多角体病ウイルス(AcMNPV)の組換え型を昆虫細胞株または哺乳動物細胞株に感染させて行う。バキュロウイルスの可欠ポリヘドリン遺伝子を、相同的組換え、或いは転移プラスミドの仲介に関与する細菌仲介遺伝子転移のどちらかによって、NTRANをコードするcDNAと置換する。ウイルスの感染力は維持され、強力なポリヘドリンプロモーターによって高いレベルのcDNAの転写が行われる。組換えバキュロウイルスは、多くの場合はSpodoptera frugiperda（Sf9）昆虫細胞への感染に用いられるが、ヒト肝細胞の感染にも用いられる。後者の感染の場合は、バキュロウイルスの更なる遺伝的変更が必要になる（Engelhard. E. K.他 (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:3224-3227、Sandig, V. 他 (1996) Hum. Gene Ther. 7:1937-1945.等を参照）。
【０３８２】
殆どの発現系では、NTRANが、例えばグルタチオンＳトランスフェラーゼ(GST)、またはFLAGや6-Hisなどのペプチドエピトープ標識と合成された融合タンパク質となるため、未精製の細胞溶解物からの組換え融合タンパク質の親和性ベースの精製を素早く１回で行うことができる。GSTは日本住血吸虫からの26kDaの酵素であり、タンパク質の活性及び抗原性を維持した状態で、固定化グルタチオン上で融合タンパク質の精製を可能とする（Amersham Pharmacia Biotech）。精製の後、GST部分を、特異的に操作した部位でNTRANからタンパク分解的に切断できる。ＦＬＡＧは８アミノ酸のペプチドであり、市販されているモノクローナル及びポリクローナル抗ＦＬＡＧ抗体（Eastman Kodak）を用いた免疫親和性精製を可能にする。６ヒスチジン残基が連続して伸長した6-Hisは、金属キレート樹脂（QIAGEN）上での精製を可能にする。タンパク質の発現及び精製の方法は、前出のAusubel（1995）10章、16章に記載されている。これらの方法で精製したNTRAN  を直接用いて以下の実施例１７、１８、および１９の、適用可能なアッセイを行うことができる。
【０３８３】
１４  機能的アッセイ
NTRAN機能は、哺乳動物細胞培養系において生理学的に高められたレベルでの、NTRANをコードする配列の発現によって評価する。 cDNAを高いレベルで発現する強いプロモーターを含む哺乳動物発現ベクターにcDNAをサブクローニングする。選択されるベクターには、pCMV SPORTプラスミド（Life Technologies）及びpCR 3.1プラスミド（Invitrogen, Carlsbad CA）が含まれ、どちらもサイトメガロウイルスプロモーターを有する。リポソーム製剤或いは電気穿孔法を用いて、５〜１０μgの組換えベクターをヒト細胞株、例えば内皮由来または造血由来の細胞株に一過的に形質移入する。更に、標識タンパク質をコードする配列を含む１〜２μgのプラスミドを同時に形質移入する。標識タンパク質の発現により、形質移入された細胞と形質移入されていない細胞を区別する手段が与えられる。また、標識タンパク質の発現によって、ｃＤＮＡの組換えベクターからの発現を正確に予想できる。標識タンパク質は、例えば緑色蛍光タンパク質（GFP；Clontech）、CD64またはCD64-GFP融合タンパク質から選択できる。自動化された、レーザー光学に基づく技術であるフローサイトメトリー（FCM）を用いて、GFPまたはCD64-GFPを発現する形質移入された細胞を同定し、その細胞のアポトーシス状態や他の細胞特性を評価する。ＦＣＭは、細胞死に先行するか或いは同時に発生する現象を診断する蛍光分子の取込を検出して計量する。このような現象として挙げられるのは、ヨウ化プロピジウムによるＤＮＡ染色によって計測される核ＤＮＡ含量の変化、前方散乱光と90°側方散乱光によって計測される細胞サイズと粒度の変化、ブロモデオキシウリジンの取込量の低下によって計測されるDNA合成の下方調節、特異抗体との反応性によって計測される細胞表面及び細胞内におけるタンパク質の発現の変化、及びフルオレセイン抱合したアネキシンＶタンパク質の細胞表面への結合によって計測される原形質膜組成の変化とがある。フローサイトメトリー法については、Ormerod, M. G. (1994) Flow Cytometry Oxford, New York, NY.に記述がある。
【０３８４】
遺伝子発現に与えるNTRANの影響は、NTRANをコードする配列とCD64またはCD64-GFPのどちらかが形質移入された、高度に精製された細胞集団を用いて評価することができる。CD64またはCD64-GFPは、形質移入された細胞表面で発現し、ヒト免疫グロブリンG（IgG）の保存領域と結合する。形質移入された細胞と形質移入されていない細胞とは、ヒトIgGかCD64に対する抗体のどちらかで被覆された磁気ビーズを用いて効率的に分離することができる(DYNAL. Lake Success. NY)。mRNAは、当分野で周知の方法で細胞から精製することができる。NTRAN及び目的の他の遺伝子をコードするmRNAの発現は、ノーザン分析やマイクロアレイ技術で分析することができる。
【０３８５】
１５  NTRANに特異的な抗体の作製
ポリアクリルアミドゲル電気泳動法(PAGE；例えば、Harrington, M.G. (1990) Methods Enzymol. 1816−3088-495を参照)または他の精製技術で実質的に精製されたNTRAN を用いて、標準的なプロトコルで動物（ウサギ、マウス等）を免疫化して抗体を作り出す。
【０３８６】
或いは、レーザGENEソフトウェア（DNASTAR）を用いてNTRANアミノ酸配列を解析し、免疫原性の高い領域を決定する。そして対応するオリゴペプチドを合成し、このオリゴペプチドを用いて当業者によく知られている方法で抗体を生成する。例えばＣ末端付近或いは隣接する親水性領域等の、適切なエピトープの選択については、当分野で公知である（前出のAusubel, 1995, 11章等を参照）。
【０３８７】
通常は、長さ約１５残基のオリゴペプチドを、Fmocケミストリを用いるABI 431A ペプチドシンセサイザ（Applied Biosystems）を用いて合成し、N-マレイミドベンゾイル-N-ヒドロキシスクシンイミドエステル（MBS）を用いた反応によってKLH（Sigma-Aldrich, St. Louis MO）に結合させて、免疫原性を高める（前出のAusubel, 1995 等を参照）。完全フロイントアジュバントにおいてオリゴペプチド-KLH複合体を用いてウサギを免疫化する。得られた抗血清の抗ペプチド活性及び抗NTRAN活性を検査するには、ペプチドまたはNTRANを基板に結合し、１％BSAを用いてブロッキング処理し、ウサギ抗血清と反応させて洗浄し、さらに放射性ヨウ素標識されたヤギ抗ウサギIgGと反応させる。
【０３８８】
１６  特異的抗体を用いる天然NTRANの精製
天然または組換えNTRANを、NTRAN特異抗体を用いたイムノアフィニティークロマトグラフィーにより実質的に精製する。イムノアフィニティーカラムは、CNBr-活性化SEPHAROSE（Amersham Pharmacia Biotech）のような活性化クロマトグラフィー用レジンとNTRAN抗体とを共有結合させることにより形成する。結合後に、製造者の使用説明書に従ってレジンをブロックし、洗浄する。
【０３８９】
NTRANを含む培養液をイムノアフィニティーカラムに通し、NTRANを優先的に吸着する条件下（例えば洗浄剤が存在する高イオン強度緩衝液）でカラムを洗浄する。そのカラムを、抗体とNTRANとの結合を切るような条件で（例えば、ｐＨ２〜３のバッファー、或いは高濃度の尿素またはチオシアン酸イオンのようなカオトロープで）溶出させ、NTRANを収集する。
【０３９０】
１７  NTRANと相互作用する分子の同定
NTRANまたは生物学的に活性であるNTRAN断片を、125Iボルトンハンター試薬で標識する。(例えば Bolton A.E. および W.M. Hunter (1973) Biochem. J. 133:529-539を参照）。マルチウェルプレートに予め配列しておいた候補の分子を、標識したNTRANと共にインキュベートし、洗浄して、標識されたNTRAN複合体を有する全てのウェルをアッセイする。様々なNTRAN濃度で得られたデータを用いて、候補分子と結合したNTRANの数量及び親和性、会合についての値を計算する。
【０３９１】
別法では、NTRANと相互作用する分子を、Fields, S.及びO. Song(1989, Nature 340:245-246)に記載の酵母２−ハイブリッドシステム（yeast two-hybrid system）や、MATCHMAKERシステム(Clontech)などの２−ハイブリッドシステムに基づく市販キットを用いて分析する。
【０３９２】
NTRANはまた、ハイスループット型の酵母２ハイブリッドシステムを使用するPATHCALLINGプロセス（CuraGen Corp., New Haven CT）に用いて、遺伝子の２つの大きなライブラリによってコードされるタンパク質間の全ての相互作用を決定することができる（Nandabalan, K. 他 (2000) 米国特許第6,057,101号）。
【０３９３】
１８  NTRAN活性の実証
別方法として、NTRANの活性を、電気生理学的アッセイを使ってイオンコンダクタンスを検定して実証することもできる。T7ポリメラーゼで転写され、キャッピングされたNTRAN mRNAを上記に似た方法で、卵胞をくずしたステージ5のアフリカツメガエル卵母細胞に注入する。2〜7日後、2電極ボルテージクランプ法により輸送を測定する。2電極ボルテージクランプ法は保持電圧50mVで行なわれる。データは10Hzでフィルタリングされ、MacLabディジタルアナログコンバータおよびデータ収集解析用のソフトウェア(AD Instruments, Castle Hill, Australia)により記録される。NTRANの外部イオンに対する依存性を調べるために、ナトリウムをコリンまたはNメチルDグルコサミンで置き換え、塩素イオンをグルコン酸、NO3, または SO4 で置き換えることができる (Kavanaugh, M.P. 他 (1992) J. Biol. Chem. 267:22007--22009)。
【０３９４】
別方法として、NTRANのコリン輸送活性またはコリントランスポータ様CTL1タンパク質活性を、NTRANをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換した酵母によるコリンの取り込み測定によって求める。アッセイは25nM[3H]コリン存在下の無窒素培地において30℃ で10分または30分行なわれる。細胞はそれからフィルタリングされ、洗浄される。細胞内の[3H]コリンの量は細胞内のNTRAN活性に比例する(前出のO'Regan, S.)。
【０３９５】
NTRAN活性に対する或るアッセイは、細胞表面におけるNTRANの発現を測定する。 NTRANをコードするcDNAは、好適な哺乳動物細胞系に形質移入する。細胞表面タンパク質は、記載されているようにビオチンで標識する（de la Fuente, M.A. 他 (1997) Blood 90:2398-2405）。NTRAN特異抗体を用いて免疫沈降を実行し、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）及び免疫ブロット技術を用いて免疫沈降サンプルを分析する。標識された免疫沈降素と未標識免疫沈降素の比は、細胞表面に発現したNTRANの量に比例する。
【０３９６】
或いは、NTRAN 活性のためのアッセイは、リガンド／受容体が仲介する細胞増殖の調節のための原型アッセイに基づく。このアッセイでは、スイスマウス3T3細胞におけるDNA合成の速度を測定する。当分野で公知の形質移入方法を用いて、NTRAN をコードするポリヌクレオチドを含むプラスミドを静止状態の3T3培養細胞に加える。 一過性に形質移入された細胞は次に、放射性DNA前駆分子である[3H]チミジンの存在下でインキュベートする。次に、培養した細胞にNTRAN リガンドの可変量を加える。[3H]チミジンの酸沈殿可能DNAへの取り込みは、ラジオアイソトープカウンターを用いて適切な時間間隔で測定する。 取り込み量は、新たに合成されたDNAの量に正比例する。少なくとも１００倍のNTRANリガンド濃度範囲に対する用量反応曲線が直線であることは受容体活性を示唆するものである。ミリリットル当りの活性の１単位は、５０％の反応レベルを産出するNTRANの濃度として定義され、１００％であれば[3H]チミジンを酸沈殿可能DNAに最大限取り込むことを表す（McKay, I.及びI. Leigh, eds. (1993) Growth Factors: A Practical Approach, Oxford University Press, New York NY, .73ページ）。
【０３９７】
或いは、NTRAN活性のためのアッセイは、GPCRファミリータンパク質がＧタンパク質活性化セカンドメッセンジャーシグナル伝達経路を調整する能力に基づく（例えばcAMP; Gauclin, P. 他 (1998) J. Biol. Chem. 273:4990-4996）。当分野で既知の方法を用いて、完全長NTRANをコードするプラスミドを哺乳動物細胞系（例えばチャイニーズハムスター卵巣(CHO)またはヒト胎児腎臓(HEK-293)細胞系）に形質移入する。 培地中の１２穴トレーで形質移入された細胞を成長させ、培養液を廃棄して、接着した細胞をPBSで軽く洗浄する。培地においてリガンド有りまたはリガンドなしで細胞を３０分間インキュベートし、次に培地を除去し、細胞を１Mの過塩素酸で処理して溶解する。溶解産物中のcAMPレベルは、当分野で既知の方法を用いて放射免疫アッセイにより測定する。 リガンドに曝された細胞から得た溶解産物中のcAMPレベルをリガンドなしのものと比較したときの変化は、形質移入された細胞に存在するNTRAN の量に比例する。
【０３９８】
イノシトールリン酸レベルの変化を測定するためには、１×１０5 細胞／穴を含む２４穴プレートで細胞を成長させ、イノシトールを含まない培地及び [3H]ミオイノシトールを用いて２μCi／穴で４８時間インキュベートする。培養液を除去し、１０mMのLiClを含む緩衝液で細胞を洗浄し、その後リガンドを添加する。反応は、過塩素酸の添加により停止する。イノシトールリン酸は、Dowex AG1-X8（Bio-Rad）陰イオン交換樹脂及び液体シンチレーションにより計数された全ての標識されたイノシトールリン酸で抽出及び分離される。リガンドに曝された細胞から得た標識されたイノシトールリン酸のレベルをリガンドなしのものと比較したときの変化は、形質移入された細胞に存在するNTRAN の量に比例する。
【０３９９】
更なる実施例において、NTRANのイオン伝導性機能は電気生理学的試験を用いて実証される。NTRANは、COS7、 HeLa または CHOのような哺乳類細胞株を、NTRANをコードする真核生物発現ベクターで形質転換することによって発現される。真核生物発現ベクターは市販されており、それらを細胞内に導入する技術は当業者には周知である。β−ガラクトシダーゼのような多数の標識遺伝子のいずれか一つを発現させる第二プラスミドの少量は、細胞へと同時形質転換され、外来DNAを吸収し発現させるそれら細胞の迅速な同定を可能とする。細胞は形質転換の後、株化細胞がNTRAN 及びβ−ガラクトシダーゼを発現し蓄積するのに適した条件下で、４８−７２時間に渡ってインキュベートされる。β−ガラクトシダーゼを発現する形質転換細胞は、本技術分野で既知の条件下で適切な比色基質を培地へ添加すると青く染色される。 染色された細胞は、本技術分野で既知の電気生理学技術を用いて膜電気伝導度の違いを試験する。形質転換されていない細胞、及び/又はベクター配列だけ、若しくはβ−ガラクトシダーゼ配列だけのいずれかで形質転換された細胞は、対照として用いられ、並行して試験する。いずれかのNTRANに特異的な抗体を用いて細胞をインキュベートすることによってNTRAN のカチオンまたはアニオン伝導性への寄与が示されうる。それぞれの抗体は、NTRANの細胞外側に結合することにより、イオンチャネル内のポアと、それに伴う伝導性とをブロックする。NTRANの外部イオンに対する依存性を調べるために、ナトリウムをコリンまたはNメチルDグルコサミンで置き換え、塩素イオンをグルコン酸、NO3, または SO4 で置き換えることができる (Kavanaugh, M.P. 他 (1992) J. Biol. Chem. 267:22007--22009)。
【０４００】
更なる実施例において、NTRAN の輸送活性は、アフリカツメガエル卵母細胞への標識された基質の取り込みを測定することによって検査される。  ステージ５及び６の卵母細胞は、NTRAN mRNA (卵母細胞あたり10 ng)で注入され、OR2培地(82,5. 5mMのNaCl、2. 5 mMのKC1、1mMのCaCl2、1mMのMgCl2、1mM Na2HPO4、5 mMのHepes、3. 8 mMのNaOH、 50μg/ml ゲンタマイシン、pH 7. 8) 内で１８℃で３日間インキュベートして、NTRAN の発現を可能とする。卵母細胞は、次に標準取り込み培地(100mMのNaCl、2 mMのKC1、1mMのCaCl2、1mMのMgCl2、10 mMのHepes/Tris、pH 7. 5)へと移される。種々の基質(例えば、アミノ酸、糖、薬物および神経伝達物質)の取り込みは、卵母細胞にH3 基質を添加することによって開始される。30分間インキュベートした後、卵母細胞を Na+遊離培養液中で卵母細胞を3回洗浄して取り込みは中止され、取り込まれた 3Hを測定し、対照と比較する。NTRAN活性は吸収された3H基質の濃度に比例する。
【０４０１】
さらなる実施例において、NTRANプロテインキナーゼ(PK)活性は、γ標識の[32P]-ATP を用いたタンパク質基質のリン酸化と組み込まれた放射活性を定量する。NTRAN はタンパク質基質、32P-ATP、及び適切なキナーゼバッファと共にインキュベートする。生成産物に組み込まれた32Pは、電気泳動法で遊離32P-ATPより分離され、組み込まれた32Pをカウントする。回収した32P の量が、このアッセイでのNTRAN のPK 活性に比例する。リン酸化した特異的アミノ酸残基の判定を、加水分解したタンパク質のホスホアミノ酸解析で行う。
【０４０２】
１９  NTRANリガンドの同定
NTRAN は、CHO（チャイニーズハムスター卵巣）またはHEK（ヒト胎児腎臓）293などの真核細胞株において発現する。 これらの細胞株は、GPCR発現過程が良好であり、発現したNTRAN が下流エフェクターに機能的に共役できるような広範囲のＧタンパク質を含む。候補リガンドの存在下で発現した受容体の活性化に対し、形質転換した細胞をアッセイする。活性は、cAMPまたはCa2+ などの細胞内セカンドメッセンジャーの変化により測定する。当分野で公知の標準的な方法を用いるか、活性化受容体によるタンパク質キナーゼCの刺激に反応して発光タンパク質（例えばホタルルシフェラーゼまたは緑色蛍光タンパク質）がプロモーターの転写調節下にあるようなレポーター遺伝子アッセイを用いて直接測定する（Milligan, C. ら (1996) Trends Pharmacol. Sci. 17:235-237）。アッセイ技術は、これらセカンドメッセンジャーシステムの両方に利用可能であり、アデニリルシクラーゼ活性化FlashPlate Assay（NEN Life Sciences Products）などのマルチウェルプレートフォーマットまたはFluo-4 AM（Molecular Probes）などの蛍光Ca2+ 指示薬でFLIPR蛍光定量的プレート読出しシステム（Molecular Devices）を併用して高処理読出しを可能にする。生理的関連性のあるセカンドメッセンジャー経路が知られていない場合、NTRAN は、ホスホリパーゼC及びCa2+ 可動化に関与する経路を介してNTRAN のシグナル伝達を通すために、広範囲のＧタンパク質と共役することが実証されているようなＧタンパク質Ｇα15/16と同時発現し得る（Offerrnanns, S. and M.I. Simon (1995) J. Biol. Chem. 270:15175-15180）。或いは、内因性GPCRが不足しているように遺伝子操作された酵母系にNTRANを発現し、それによってNTRAN活性化スクリーニングに対してバックグラウンドが存在しない利点を提供し得る。これらの酵母系は、ヒトGPCR及びＧαタンパク質を内因性酵母フェロモン受容体経路の対応する構成要素の代替とする。シグナルに対する正常な酵母反応を、選択的培地の正の成長またはレポーター遺伝子発現に変換するように、下流シグナル伝達経路も変更される（Broach, J.R. and J. Thorner (1996) Nature 384 (supp.):14-16）。既知のGPCRリガンド及びその他の天然の生理活性分子を含む推定上のリガンドに対して受容体をスクリーニングする。組織、生物学的液体及び細胞上澄みからの生物学的抽出物もスクリーニングする。
【０４０３】
当業者は、本発明の範囲及び精神から逸脱することなく本発明の記載した方法及びシステムの種々の改変を行い得る。本発明について説明するにあたり特定の好適実施例に関連して説明を行ったが、本発明の範囲が、そのような特定の実施例に不当に制限されるべきではないことを理解されたい。実際に、分子生物学または関連分野の専門家には明らかな、本明細書に記載されている本発明の実施方法の様々な改変は、特許請求の範囲内にあるものとする。
【０４０４】
（表の簡単な説明）
表１は、本発明の完全長ポリヌクレオチド配列及びポリペプチド配列の命名法の概略を示す。
【０４０５】
表２は、本発明のポリペプチド群のGenBank識別番号と、最も近いGenBank相同体の注釈（annotation）と、PROTEOMEデータベース識別番号と、PROTEOMEデータベース相同体群の注釈とを示す。各ポリペプチドとその相同体が一致する確率スコアも併せて示す。
【０４０６】
表３は、予測されるモチーフ及びドメインを含む本発明のポリヌクレオチド配列の構造的特徴を、ポリペプチドの分析に用いるための方法、アルゴリズム及び検索可能なデータベースと共に示す。
【０４０７】
表４は、本発明のポリヌクレオチド配列を構築するために用いたcDNAやゲノムDNA断片を、ポリヌクレオチド配列の選択した断片と共に示す。
【０４０８】
表５は、本発明のポリヌクレオチドの代表的なcDNAライブラリを示す。
【０４０９】
表６は、表５に示したcDNAライブラリの作製に用いた組織及びベクターを説明する付表である。
【０４１０】
表７は、本発明のポリヌクレオチドとポリペプチドの分析に用いたツール、プログラム、アルゴリズムを、適用可能な説明、参照文献及び閾値パラメータと共に示す。
【０４１１】
【表１】
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【０４１２】
【表２−１】
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【０４１３】
【表２−２】
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【０４１４】
【表３−１】
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【０４１５】
【表３−２】
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【０４１６】
【表３−３】
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【０４１７】
【表３−４】
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【０４１８】
【表３−５】
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【０４１９】
【表３−６】
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【０４２０】
【表３−７】
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【０４２１】
【表４−１】
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【０４２２】
【表４−２】
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【０４２３】
【表４−３】
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【０４２４】
【表４−４】
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【０４２５】
【表５】
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【０４２６】
【表６−１】
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【０４２７】
【表６−２】
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【０４２８】
【表７−１】
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【０４２９】
【表７−２】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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