(57)【要約】本発明は、血液学的な疾患を処置し、そして臓器移植の受容を促進するのに有用な造血性キメラ化を確立する方法に関するものであって、該方法はブスルファン、同時刺激遮断薬、および容易に達成可能な数のＴ−細胞欠乏骨髄細胞を投与することを含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
移植した組織を持つ被験者における固形臓器の移植の拒絶反応を抑制する方法であって、
ａ）アルキル化剤を該被験者に投与し；そして、
ｂ）続いて、固形臓器の移植とほぼ同時に該被験者にＴ細胞欠乏骨髄細胞を投与して、その結果、該固形の臓器または組織／細胞の移植の拒絶反応を抑制する
ことを含む、該方法。
【請求項２】
アルキル化剤はブスルファンである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
更に、被験者におけるＴ細胞同時刺激シグナルを遮断する免疫抑制組成物を該被験者に投与する工程を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
免疫抑制組成物は、ＣＤ２８とＣＤ８０またはＣＤ８６のいずれかとの結合を妨害する第１リガンド、およびＣＤ１５４とＣＤ４０との結合を妨害する第２リガンドを含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
第１リガンドは可溶性ＣＴＬＡ４分子である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
第１リガンドはＣＴＬＡ４−Ｉｇである、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
第２リガンドは抗−ＣＤ１５４ｍＡｂである、請求項４に記載の方法。
【請求項８】
第１リガンドは可溶性ＣＴＬＡ４分子であって、第２リガンドは抗−ＣＤ１５４ｍＡｂである、請求項４に記載の方法。
【請求項９】
移植した組織を持つ被験者において混合造血性キメラ化を確立する方法であって、
ａ）Ｔ細胞欠乏骨髄細胞を該被験者に投与し；
ｂ）アルキル化剤を該被験者に投与し；そして、
ｃ）該被験者におけるＴ細胞同時刺激シグナルを遮断する免疫抑制組成物を投与して、
その結果、該被験者において造血性キメラ化を確立する
ことを含む、該方法。
【請求項１０】
アルキル化剤はブスルファンである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
免疫抑制組成物は、ＣＤ２８とＣＤ８０またはＣＤ８６のいずれかとの結合を妨害する第１リガンド、およびＣＤ１５４とＣＤ４０との結合を妨害する第２リガンドを含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
第１リガンドは可溶性ＣＴＬＡ４分子である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
第１リガンドはＣＴＬＡ４−Ｉｇである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
第２リガンドは抗−ＣＤ１５４ｍＡｂである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
第１リガンドは可溶性ＣＴＬＡ４分子であって、且つ第２リガンドは抗−ＣＤ１５４ｍＡｂである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１６】
被験者中に移植された臓器または組織の拒絶反応を抑制する、請求項９に記載の方法。
【請求項１７】
Ｔ細胞欠乏骨髄を少なくとも２つの用量で投与する、請求項９に記載の方法。
【請求項１８】
移植した組織を持つ被験者において混合造血性キメラ化を確立する方法であって、
ａ）該被験者にＴ細胞欠乏骨髄細胞を投与し；
ｂ）該被験者においてＴ細胞同時刺激シグナルを遮断する免疫抑制組成物を投与し；そして、
ｃ）該被験者にブスルファンを投与して、
その結果、該被験者において混合造血性キメラ化を確立する
ことを含む、該方法。
【請求項１９】
免疫抑制組成物は、ＣＤ２８とＣＤ８０またはＣＤ８６のいずれかとの結合を妨害する第１リガンドおよびＣＤ１５４とＣＤ４０との結合を妨害する第２リガンドを含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
第１リガンドは可溶性ＣＴＬＡ４分子である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
第１リガンドはＣＴＬＡ４−Ｉｇである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
第２のリガンドは抗−ＣＤ１５４ｍＡｂである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２３】
第１リガンドは可溶性ＣＴＬＡ４分子であって、第２リガンドは抗−ＣＤ１５４ｍＡｂである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２４】
請求項９または１８のいずれかに記載の方法により造血性キメラ化を確立することによって、被験者における異常血色素症を処置する方法。
【請求項２５】
異常血色素症はβタラセミアである、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
異常血色素症は鎌状細胞疾患である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
移植組織は固形の器官または組織／細胞の移植体である、請求項１、９または１８のいずれかに記載の方法。
【請求項２８】
工程（ｂ）および（ｃ）は同時である、請求項９または１８のいずれかに記載の方法。
【請求項２９】
工程（ｂ）および（ｃ）は工程（ａ）に続く、請求項９または１８のいずれかに記載の方法。
【請求項３０】
ブスルファンを固形の器官または組織／細胞の移植前の１日以内に投与する、請求項２、１０または１８のいずれかに記載の方法。
【請求項３１】
ブスルファンを固形の器官または組織／細胞の移植前の１２時間以内に投与する、請求項２、１０または１８のいずれかに記載の方法。
【請求項３２】
ブスルファンは、固形の器官または組織／細胞の移植前の６時間以内に投与する、請求項２、１０または１８のいずれかに記載の方法。
【請求項３３】
移植した組織は皮膚移植片である、請求項１、９または１８のいずれかに記載の方法。
【請求項３４】
必要のある被験者における臓器移植の拒絶反応を軽減する方法であって、
ａ）Ｔ細胞欠乏骨髄細胞および免疫抑制組成物の第１の用量を該被験者に投与し；
ｂ）臓器または組織／細胞の移植体を該被験者に設置し；
ｃ）ブスルファンを該被験者に投与し；そして、
ｄ）Ｔ細胞欠乏骨髄細胞および免疫抑制剤の第２の用量を投与して、
その結果、臓器または組織／細胞の移植の拒絶反応を軽減する
ことを含む、該方法。
【請求項３５】
免疫抑制剤はＣＤ２８とＣＤ８０またはＣＤ８６のいずれかとの結合を妨害する第１リガンド、およびＣＤ１５４とＣＤ４０との結合を妨害する第２リガンドとの組み合わせである、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
第１リガンドは可溶性ＣＴＬＡ４分子である、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
第１リガンドはＣＴＬＡ４−Ｉｇである、請求項３５に記載の方法。
【請求項３８】
第２リガンドは抗−ＣＤ１５４ｍＡｂである、請求項３５に記載の方法。
【請求項３９】
第１リガンドは可溶性ＣＴＬＡ４分子であって、第２リガンドは抗−ＣＤ１５４ｍＡｂである、請求項３５に記載の方法。
【請求項４０】
可溶性ＣＴＬＡ４はＣＴＬＡ４Ｉｇであって、ＣＤ１５４と結合する抗体はＭＲ１である、請求項８、１５、２３または３９のいずれかに記載の方法。
【請求項４１】
可溶性ＣＴＬＡ４はＣＴＬＡ４Ｉｇであって、ＣＤ１５４と結合する抗体はATCC HB 11809、HB 11815、HB 11816、HB 11817、HB 11819、HB 11821およびHB 11822からなる群から選ばれる、請求項８、１５、２３または３９のいずれかに記載の方法。
【請求項４２】
移植した組織を持つ被験者における固形臓器移植の拒絶反応を抑制する方法であって、
ａ）Ｔ細胞欠乏骨髄細胞を投与し；
ｂ）ブスルファンを該被験者に投与し；そして、
ｃ）ＣＴＬＡ４Ｉｇおよびモノクローナル抗体ＭＲ１を該被験者に投与して、
その結果、該固形の臓器または組織／細胞の移植の拒絶反応を抑制する
ことを含む、該方法。
【請求項４３】
移植した組織を持つ被験者における固形の臓器移植の拒絶反応を抑制する方法であって、
ａ）Ｔ細胞欠乏骨髄細胞を投与し；
ｂ）ブスルファンを該被験者に投与し；そして、
ｃ）ＣＴＬＡ４Ｉｇ、並びにATCC HB 11809、HB 11815、HB 11816、HB 11817、HB 11819、HB 11821およびHB 11822からなるモノクローナル抗体を該被験者に投与して、
その結果、該固形の器官または組織／細胞の移植の拒絶反応を抑制する
ことを含む、該方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本明細書に開示する発明は、アメリカ国立衛生研究所に与えられた特許DK/AI40519、CA74364-03およびAI44644の下、政府の支援で行なわれた。該政府は、本発明の一定の権利を有し得る。
【０００２】
本出願中に、様々な刊行物を引用する。これらの刊行物の全ての開示は、本発明が属する分野における現状をより十分に記載するために、本明細書の一部を構成する。
【０００３】
（技術分野）
本発明は、被験者において混合造血性キメラ化を確立する方法に関する。より具体的には、本発明は臓器または組織／細胞の移植の拒絶反応を抑制する方法、臓器または組織／細胞の移植を受容する被験者において免疫学的な寛容性を誘発する方法、および異常血色素症を有する被験者を処置する方法を包含する。
【０００４】
（背景技術）
移植は、多数の形態の末期の臓器機能不全に関する好ましい処置方法として出現した。臨床的な移植における結果の改善は、拒絶反応を抑制するためのますます強力な非特異的免疫抑制剤の開発によって主に達成されている（Lancetによる345：1321-1325 (1995)）。
【０００５】
短期間の結果は改善されているが、長期間の結果はなお不十分である。現在、寿命の長い免疫抑制剤が、移植した臓器の慢性的な拒絶反応と闘うために必要とされており、そしてこれらの薬物の使用により心血管疾患、感染症および悪性の危険が劇的に増大する。慢性的な免疫抑制の必要がない同種組織の受け入れ(acceptance)を促進するための方法の開発は、これらの生命を脅かす合併症の危険を低下させるだけではなく、例えば、異常血色素症、遺伝的な免疫不全症および可能ならば自己免疫疾患などの疾患に対する臓器、組織および細胞の移植の適用を大きく拡張する。
【０００６】
混合造血性キメラ化は、免疫学的な寛容性の状態を誘発する（OwenによるScience, 102：400-401 (1945)；BillinghamらによるNature, 172：603-606 (1953)）。造血性キメラ化を誘発するための多数のプロトコールが、条件づけ療法（これは、ガンマ線照射法および／または末梢免疫系の欠乏を含む）を必要とする（IldstadらによるNature, 307：168-170 (1984)；SharabiらによるJ. Exp. Med., 169：493-502 (1989)；TomitaらによるJ. Immunol., 153：1087-1098 (1994)；MayumiらによるJ. Exp. Med., 169：213-238 (1989)；および米国特許出願番号5,876,692および6,217,867）。残念ながら、これらの療法に関連する毒性（例えば、末梢Ｔ細胞の欠乏に伴って起こり得る、過剰な免疫抑制および／または記憶の損失についての可能性、または全身照射を用いる場合の悪性の危険の増大）についての関心は、血液学的な疾患の処置(correction)または固形臓器移植の免疫寛容の誘発のためのこれらの方法の臨床的な利用を制限し得る。
【０００７】
同時刺激シグナルの同時遮断(blockade)および生理学的用量を越える量の非Ｔ細胞欠乏ドナー骨髄の投与は、移植前の条件付けに対する必要性を除く（DurhamらによるJournal of Immunology. 165：1-4 (2000)；WekerleらによるNature Medicine, 6：464-469 (2000)）。しかしながら、これらのプロトコールは非Ｔ細胞欠乏骨髄の量を必要とするが、現在得るベく臨床的に実行することはできず、また達成されるドナーキメラ化の程度は異常血色素症を有効に処置するには低すぎるかもしれない。加えて、これらのプロトコールは、非分離の骨髄細胞の使用に頼っている。具体的には、Ｔ細胞は該調製物から除去されない。 該調製物中のＴ細胞の残余は造血性幹細胞の生着を増大させることができるが、致死の可能性がある移植片対宿主疾患の危険は骨髄接種材料(innoculum)でのＴ細胞の量に比例する。骨髄中のＴ細胞のパーセントは比較的に低いが、これらのプロトコールに必要とされる骨髄の大量投与は、臨床的な骨髄移植において使用されている現在の方法よりも莫大に多いＴ細胞を移す。その上、これらのプロトコールによって達成されるドナーキメラ化の大きさは、異常血色素症（例えば、鎌状細胞貧血症およびタラセミア）の病態生理学を有効に処置したりあるいは正常にする(correct)するにはあまりに低過ぎることがある。
【０００８】
タラセミアは、ヘモグロビン鎖合成の異常なパターンを含めた遺伝的な障害である。タラセミアを処置するための骨髄移植の最初の成功報告は、1982年に示された（ThomasらによるLancet, 2：227-229 (1982)）。ブスルファンは通常、多数の臨床的な骨髄移植療法におけるレシピエントの条件づけのために他の化学療法剤と合わせて多数回投与の様式で使用する（BrodskyらによるCancer Invest., 7：509-513 (1989)）。ブスルファンは早期の造血性幹細胞の特異的な減少を与えるアルキル化剤であって、そしてこのものは抗−増殖性化学療法薬として使用されることが多い（SantosらによるHuman bone marrow transplantation. Washington, American Assoc. of Blood Banks, (1976)；BaschらによるStem Cells, 15：314-323 (1997)）。ブスルファンは、該アルキル化剤、シクロホスファミドと一緒に用いて骨髄細胞の生着を促進したり、またタラセミア患者においてキメラ化を確立することができる（LucarelliらによるAnn NY Acad Sci, 445：428-431 (1985)；MentzerおよびCowanによるJ. Pediatr. Hematol Oncol, 22 (6)：598-601 (2000)）。加えて、ブスルファンはサブ除去した(subablative)用量で使用され、同系マウスモデルにおける幹細胞の生着を促進する（YeagerらによるBone Marrow Transplant., 9：199-204 (1992））。同様に、米国特許出願番号6,217,867に開示されている通り、シクロホスファミドおよび全身照射を用いて骨髄の生着を達成することができるが、生着はシクロホスファミドのみでは達成されなかった。上記におけるプロトコールはタラセミアを処置するのにいくらか成功したが、これらのプロトコールは患者にとって毒性である。従って、患者にとってより低い毒性であるプロトコールを開発することが所望され得る。
【０００９】
鎌状細胞疾患（ＳＣＤ）は、ヘモグロビンのアミノ酸配列における突然変異を含む遺伝的障害である。鎌状細胞疾患を持つヒトは、偶発性の急性合併症および慢性で進行性の多くのシステムの低下を患っている。医学的な処置は寿命を伸ばすが、幹細胞移植のみが有効な治癒を与える。しかしながら現在、鎌状細胞疾患に対する幹細胞移植の２つの主な障害：（１）上記の通常の骨髄移植に関連する高い罹患率および死亡率、および（２）許容できる幹細胞ドナーの不足、が存在する（WaltersらによるBiol. Blood Marrow Transplant., 2：100-104 (1996)；PlattらによるNew England. J. Med., 335：426-428 (1996)）。
【００１０】
通常の骨髄移植は鎌状細胞疾患を治癒することができるが、ドナー細胞生着を達成するために毒性の骨髄切除の前条件づけ療法を必要とする（WaltersらによるBlood, 95：1918-1924 (2000)；VermylenらによるBone Marrow Transplant., 22：1-6 (1998)）。これらの集中的なプレパラティブ療法は、多数の毒性副作用（これは、潜在的な臓器の機能不全および悪性の長期間の危険を含む）を有する。ある患者個体群において、移植の罹患率および死亡率は鎌状細胞疾患の罹患率および死亡率に勝ることがある（PlattらによるNew England. J. Med., 335：426-428 (1996)）。幹細胞移植を用いる早期処置方法（これは、より多くの疾患に関連する合併症が起こった後に移植する場合と比較して、生存率および疾患なしの生存率を増加させることが分かっている）と遅延型方法（この間、完全な(definirive)療法を開始する(institute)ことができるより高齢者まで、医学的な管理により、鎌状細胞疾患の症状を寛解する）との間のジレンマが現在発生している（WaltersらによるBiol. Blood Marrow Transplant., 2：100-104 (1996)；PlattらによるNew England. J. Med., 335：426-428 (1996)）。残念ながら、この後者のコースは十分な幹細胞の移植の機会を減少することがある。
【００１１】
適合関連するドナーの不足は、移植に好適な鎌状細胞疾患患者の数を非常に制限している。実際に、シアトル(Seattle)コンソーシアム研究においては、疾患の激しさに基づくとわずか６．５％の潜在的な鎌状細胞疾患患者だけが幹細胞移植に好適であって、そしてこれらのわずか１４％だけがＨＬＡ適合に関連するドナーを有した（WaltersらによるBiol. Blood Marrow Transplant., 2：100-104 (1996)；WaltersらによるBlood, 95：1918-1924 (2000)）。適合するドナーの不足は、同種生着を得るために使用する攻撃的な療法に起因する、移植が媒介する毒性の問題を複雑にする。従って、成功するべき広範囲な移植として、低レベルの罹患率および死亡率を有する同種キメラ化の発生方法が要求される。鎌状細胞疾患の場合の臨床的な移植の経験は、レシピエント幹細胞の全ての置き換えがない場合でさえも治癒を達成することができることを示唆している（WaltersらによるBlood, 95：1918-1924 (2000)；VermylenらによるBone Marrow Transplant., 22：1-6 (1998)；KrishnamurtiらによるNew. Engl. J. Med., 344: 68 (2001)）。ウォーターズ(Walters)らは、通常の脊髄切断(myeloablative)前条件づけを用いて処置した４／５０患者が意図せずに、混合ドナー／レシピエントの造血を発生したことを報告している（WaltersらによるBlood, 95：1918-1924 (2000)）。重要なことに、安定な混合キメラ化を有するこれらの患者は更なる鎌状関連合併症を全く発生しなかった。これらの結果並びに他の疾患モデルにおける同様な結果が示す通り、非脊髄切断であって且つ意図的に、安定な混合キメラ化を与えるプロトコールについての関心が高まっている（ChamplらによるCurr. Opin. Oncol., 11：87-95 (1999)；SpitzerらによるBiol. Blood Marrow Transplant., 6：309-320 (2000)；Craddock, Curr. Opin. Hematol., 6：383-387 (1999)）。解決すべき１問題は、免疫寛容の問題である。その理由は、安定な混合キメラ化を得るには宿主細胞およびドナー細胞の両方が共存しなければいけないからである。初期のプロトコールは移植免疫寛容を誘発するために比較的に非特異的な免疫抑制剤が使用されたが、最近のマウス研究は、ドナー特異的な免疫寛容および長期間の混合キメラ化を開発するための標的方法として、Ｔ細胞活性化経路を遮断することに集中している（TomitaらによるJ. Immunol., 153：1087-1098 (1994)；SykesらによるNature Medicine, 3：783-787 (1997)；WekerleらによるJ. Exp. Med., 187：2037-2044 (1998)；DurhamらによるJ. Immunol., 165：1-4 (2000)；SalomonらによるAnnu. Rev. Immunol., 19：225-252 (2001)）。これらの研究により、骨髄移植時でのＣＤ２８／Ｂ７経路またはＣＤ４０／ＣＤ４０Ｌ経路によって媒介されるＴ細胞同時刺激シグナルの破壊によるドナー反応性宿主Ｔ細胞のアネルギーが生じて、そして該移植片に対する長期間の免疫寛容を得ることが示されている。
【００１２】
免疫寛容誘発方法の設計において、いくつかの特徴を考慮すべきである。第１に、該方法はレシピエント被験者の免疫系においてドナー特異的なＴ細胞の存在する個体群を制御する手法を提供する。第２に、該方法は、将来得ることができるドナー特異的なＴ細胞を制御する手法を提供する。第３に、該方法は免疫寛容の誘発および維持の間での不可逆な免疫学的な障害から同種移植片を防止しなければいけない。
【００１３】
（発明の概要）
従って、本発明は目的の利用に応じて滴定可能な大きさの造血性キメラ化を確立するための方法を提供する。例えば、臓器移植の免疫寛容の誘発のためのより低レベルのキメラ化および異常血色素症（例えば、鎌状細胞疾患または様々なタラセミア）の処置のためのより高レベルのキメラ化が挙げられる。キメラ化は、脊髄切断の条件づけまたは処置がなくて確立することが好ましい。しかしながら、脊髄切断の条件づけまたは処置は、追加処置として本発明の方法の前、その間またはその後に提供することができる。
【００１４】
１態様において、混合造血性キメラ化を確立する方法は、Ｔ細胞欠乏骨髄細胞を被験者に投与すること、およびアルキル化剤を該被験者に投与することを含む。この方法は更に、該被験者に、免疫抑制剤を投与する更なる工程および／または更なる用量のＴ細胞欠乏骨髄細胞を投与する工程を含むことができる。上記の方法はまた、本明細書に記載する通り、異常血色素症を処置するのにおよび／または被験者における臓器または組織移植の拒絶反応を抑制するのに有用である。
【００１５】
別の態様において、本発明は被験者における異常血色素症を処置するための方法を提供する。好ましい態様において、該方法は被験者にＴ細胞欠乏骨髄細胞および免疫抑制剤を投与し、そして該被験者にアルキル化剤を投与することを含む。該方法はまた、該被験者に第２の用量のＴ細胞欠乏骨髄細胞および／または免疫抑制剤を投与する別の工程を含み得る。これらの方法はまた、該被験者に更なる用量の免疫抑制剤および／またはアルキル化剤を投与する１つ以上の更なる工程によって実施することもできる。ある態様において、異常血色素症はβタラセミアまたは鎌状細胞疾患である。
【００１６】
別の態様において、臓器または組織の移植の拒絶反応を抑制する方法は、移植を受けた被験者にアルキル化剤およびＴ細胞欠乏骨髄細胞を投与することを含むことを供する。該アルキル化剤を、移植に先立つ２４時間以内にレシピエント被験者に投与することができる。
【００１７】
本発明は更に、被験者における臓器移植の拒絶反応を軽減する方法を提供し、該方法は被験者に（１）第１の用量のＴ細胞欠乏骨髄細胞、（２）免疫抑制剤、アルキル化剤、第２の用量のＴ細胞欠乏骨髄細胞および免疫抑制剤を投与する工程を含む。該アルキル化剤は、該骨髄を投与する前、その間またはその後に投与することができる。更に、第２の用量の骨髄を、アルキル化剤の投与の前、その間またはその後に投与することができる。加えて、該方法は該被験者に免疫抑制剤および／またはアルキル化剤を投与する別の工程を含むことができる。
【００１８】
本明細書で説明する通り、上記の方法において有用な免疫抑制剤は、好ましくはＴおよびＢ細胞同時刺激分子の相互作用を妨害する分子を有する組成物を含む。特に、好ましい免疫抑制剤としては例えば、ＣＤ２８抗原とＢ７抗原との結合を妨害する分子、およびｇｐ３９抗原とＣＤ４０抗原との結合を妨害する分子を含む。それらの薬物としては例えば、可溶性形態のＣＴＬＡ４（例えば、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ）、可溶性形態のＣＤ２８（例えば、ＣＤ２８−Ｉｇ）、抗−Ｂ７ｍＡｂｓおよび抗−ｇｐ３９（抗−ＣＤ４０Ｌ）ｍＡｂｓを含む。
【００１９】
加えて、本明細書に記載する通り、上記の方法において使用するのに好ましいアルキル化剤はアルキルスルホネートである。該アルキルスルホネートはブスルファンであることがより好ましい。
【００２０】
本明細書に記載する本発明をより十分に理解することができるように、以下の記載を述べる。
【００２１】
（詳細な記載）
（定義）
本明細書において使用する全ての科学用語および技術用語は、特に断らなければ当該分野において通常使用する意味を有する。本明細書において使用する通り、以下の用語または語句は具体的に記載する意味を有する。
【００２２】
本明細書で使用する「移植拒絶反応」とは、生存可能な移植片組織のレシピエント被験者からのほとんど完全なまたは完全な消失として定義される。皮膚移植片の場合に、「拒絶反応」とは生存可能な上皮移植片組織のほとんど完全なまたは完全な消失として定義される。
【００２３】
本明細書において使用する「混合造血性キメラ化」とは、免疫反応の非存在（または、検出することができない存在）下での、ドナーおよびレシピエントの血液前駆体および成熟細胞（例えば、血液由来細胞）の存在として定義する。
【００２４】
本明細書に記載する「同時刺激経路」とは、Ｔ細胞および抗原提示細胞（ＡＰＣｓ）上での同時刺激シグナルの相互作用から生じる生化学的な経路として定義される。同時刺激シグナルは、抗原に対する免疫学的な反応の大きさを測定するのに役立つ。１つの同時刺激シグナルは、ＡＰＣｓ上でのＴ細胞受容体ＣＤ２８、ＣＴＬＡ４およびＢ７分子の相互作用によって供される。本明細書において使用する「Ｂ７」は、Ｂ７−１（これはまた、ＣＤ８０とも呼ばれる）、Ｂ７−２（これは、ＣＤ８６とも呼ばれる）、Ｂ７−３（これは、ＣＤ７４とも呼ばれる）およびＢ７ファミリー（例えば、Ｂ７−１、Ｂ７−２および／またはＢ７−３の組み合わせ）を含む。別の例は、ＣＤ４０とｇｐ３９（これは、ＣＤ１５４とも呼ばれる）との相互作用によって供される。本明細書において使用する通り、ｇｐ３９はまた、ＣＤ１５４またはＣＤ４０Ｌとも呼ばれる。用語ｇｐ３９、ＣＤ１５４およびＣＤ４０Ｌは、本明細書において相互交換可能で使用する。
【００２５】
本明細書で使用する「同時刺激遮断」とは、上記の同時刺激経路を妨害したりまたは遮断する薬物を１つ以上、被験者に投与するプロトコールとして定義される。同時刺激遮断を妨害する薬物としては例えば、可溶性ＣＴＬＡ４、可溶性ＣＤ２８、抗−Ｂ７モノクローナル抗体（ｍＡｂｓ）、可溶性ＣＤ４０および抗−ｇｐ３９ｍＡｂｓを含むが、これらに限定されない。これらの薬物はまた、「免疫抑制剤」とも考えられる。「免疫抑制剤」は、免疫反応の発生を防止したりまたは被験者の免疫系を弱めるタイプの分子の１つ以上を有する組成物として定義される。
【００２６】
本明細書で使用する「ｇｐ３９に関連するモノクローナル抗体」、「抗−ｇｐ３９ｍＡｂｓ」、「抗−ＣＤ１５４ｍＡｂ」または「抗−ＣＤ４０ＬｍＡｂｓ」とは、いずれかの抗体分子、その断片、またはｇｐ３９を認識したりおよび結合する組換え結合性タンパク質もしくはその断片を含む。
【００２７】
本明細書で使用する「Ｂ７抗原を認識したりおよび結合する可溶性リガンド」としては例えば、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ、ＣＤ２８−Ｉｇ、またはＣＴＬＡ４およびＣＤ２８の他の可溶性形態（これは、組換えおよび／または突然変異体のＣＴＬＡ４およびＣＤ２８を含む）を含み、そしていずれかの抗体分子、その断片またはＢ７抗原を認識したりおよび結合する組換え結合性タンパク質を含む。これらの薬物はまた、ＣＤ２８とＢ７との結合、およびｇｐ３９とＣＤ４０との結合を妨害するリガンドとも考えられる。本明細書で使用する「Ｔ細胞欠乏(depleted)骨髄」とは、骨から取り出されそして抗−Ｔ細胞プロトコールヘ曝露された骨髄と定義される。抗−Ｔ細胞プロトコールは、骨髄からＴ細胞を除去するための方法と定義される。Ｔ細胞を選択的に除去する方法は、当該分野においてよく知られる。抗−Ｔ細胞プロトコールの例としては、Ｔ細胞特異的抗体（例えば、抗−ＣＤ３、抗−ＣＤ４、抗−ＣＤ５、抗−ＣＤ８および抗−ＣＤ９０モノクローナル抗体）に骨髄を曝露させることが挙げられ、ここで該抗体はＴ細胞にとって細胞毒性である。別法として、該抗体を磁気粒子と結合させて、磁場を用いて骨髄からＴ細胞を除去することができる。抗−Ｔ細胞プロトコールの別例としては、骨髄Ｔ細胞を抗−リンパ球血清または抗−胸腺細胞グロブリンに曝露させることが挙げられる。
【００２８】
本明細書で使用する「免疫寛容性用量のＴ細胞欠乏骨髄」とは、潜在的なドナー反応性Ｔ細胞を失活させる目的で被験者に投与する、最初の用量のＴ細胞欠乏骨髄と定義される。
【００２９】
本明細書で使用する「生着性用量のＴ細胞欠乏骨髄」とは、混合造血性キメラ化を確立する目的で被験者に投与する、続く用量のＴ細胞欠乏骨髄と定義される。従って、生着性用量のＴ細胞欠乏骨髄を、免疫寛容性用量のＴ細胞欠乏骨髄の後に投与する。
【００３０】
本明細書で使用する「組織移植片」とは、レシピエント被験者に移植される臓器の全てまたはその一部の組織として定義される。ある態様において、該組織は１つ以上の固形の臓器由来である。組織または臓器としては例えば、皮膚、心臓、肺、すい臓、腎臓、肝臓、骨髄、すい島細胞、細胞懸濁液および遺伝的に改変された細胞を含むが、これらに限定されない。該組織は、ドナー被験者から取り出したりまたはインビトロで増殖することができる。該移植体は、自家移植片、同系移植片、同種移植片もしくは異種移植片、またはそれらの組み合わせであり得る。
【００３１】
本明細書で使用する「投与する」または「投与するための」とは、静脈内（ｉ.ｖ.）投与、腹膜内（ｉ.ｐ.）投与、筋肉内（ｉ.ｍ.）投与、皮下投与、経口投与、坐剤としてもしくは局所接触としての投与、または徐放性装置（例えば、小さな浸透圧性ポンプ）のインプラントを含めたいずれかの方法によって、被験者に与えることを意味する。
【００３２】
本明細書で使用する「野生型ＣＴＬＡ４」または「非突然変異性ＣＴＬＡ４」は、Ｂ７を認識しおよび結合するかまたはＢ７を妨害して、その結果ＣＤ２８および／またはＣＴＬＡ４（例えば、内因性ＣＤ２８および／またはＣＴＬＡ４）との結合を遮断する、図１９（米国特許第5,434,131号、第5,844,095号、第5,851,795号にも記載）に示す天然に存在する全長ＣＴＬＡ４のアミノ酸配列、またはそのいずれかの部分もしくは誘導体を有する。ある態様において、野生型ＣＴＬＡ４の細胞外ドメインは、＋１位でのメチオニンで始まりそして＋１２４位でのアスパラギン酸で終わるか、あるいは野生型ＣＴＬＡ４の細胞外ドメインは−１位でのアラニンで始まり、そして＋１２４位でのアスパラギン酸で終わる。野生型ＣＴＬＡ４は、Ｎ−末端細胞外ドメイン、膜貫通ドメインおよびＣ−末端細胞質内ドメインを有する細胞表面タンパク質である。該細胞外ドメインは、標的分子（例えば、Ｂ７分子）と結合する。細胞中、天然に存在する野生型ＣＴＬＡ４タンパク質は未成熟ポリペプチド（これは、Ｎ−末端でシグナルペプチドを含む）として翻訳される。該未成熟なポリペプチドは、翻訳後のプロセッシング（これは、シグナルペプチドの切断および除去を含む）を受けて、未成熟形態におけるＮ−末端と異なる新たに生成するＮ−末端を有するＣＴＬＡ４切断産物を生成する。当該分野の当業者は、更なる翻訳後のプロセッシングが生じ得て、これにより該ＣＴＬＡ４切断産物の新たに生成するＮ−末端から１つ以上のアミノ酸が除去されることを認めるであろう。あるいは、該シグナルペプチドを完全に除去することができずに、共通の開始アミノ酸メチオニンの前で始まる分子を得る。従って、成熟ＣＴＬＡ４タンパク質は、＋１位でのメチオニンまたは−１位でのアラニンで開始することができる。該ＣＴＬＡ４分子の成熟形態は、Ｂ７と結合する細胞外ドメインまたはそのいずれかの部分を含む。
【００３３】
本明細書で使用する「ＣＴＬＡ４(突然)突然変異分子」とは、図１９に示す野生型ＣＴＬＡ４またはそのいずれかの部分もしくは誘導体を意味し、このものは１つの突然変異または複数の突然変異（野生型ＣＴＬＡ４の細胞外ドメイン中が好ましい）を有する。ＣＴＬＡ４突然変異分子は、野生型ＣＴＬＡ４分子の配列に類似するが同一ではない配列を有するが、なおＢ７と結合する。該突然変異としては例えば、保存的（例えば、ロイシンをイソロイシンで置換）または非保存的（例えば、グリシンをトリプトファンで置換）構造または化学的性質、アミノ酸の欠失、付加、フレームシフトまたは切断を有するアミノ酸で置換された１つ以上のアミノ酸残基を含み得る。ＣＴＬＡ４突然変異分子としては例えば、それらの内に存在するかまたはそれらと結合する非−ＣＴＬＡ４分子を含むことができる。該突然変異分子は、可溶性であったり（すなわち、循環性である）、あるいは細胞表面と結合することができる。別のＣＴＬＡ４突然変異分子としては例えば、米国特許出願番号09/865,321、60/214,065および60/287,576；米国特許第6,090,914号、第5,844,095号および第5,773,253号；Peach, R. J.らによるin J Exp Med 180：2049-2058 (1994)に記載ものを含む。ＣＴＬＡ４突然変異分子は、合成的にまたは組換え的に製造することができる。
【００３４】
「ＣＴＬＡ４」とは、Ｉｇ末端と結合した野生型ＣＴＬＡ４の細胞外ドメイン、またはＢ７と結合するその一部分を含む可溶性融合タンパク質である。ある態様は、野生型ＣＴＬＡ４の細胞外ドメイン（図１９に示す）（これは、＋１位のメチオニンで始まり、そして＋１２４位のアスパラギン酸で終わるか；または、−１位のアラニンで始まり、そして＋１２４位のアスパラギン酸で終わる）；＋１２５位での接合性アミノ酸残基グルタミン；および＋１２６位のグルタミン酸から＋３５７位のリシンを含有する免疫グロブリン部分を含む（ＣＴＬＡ４ＩｇをコードするＤＮＡは、ブダペスト条約の下、アメリカンタイプカルチャーコレクション(ＡＴＣＣ)、10801 University Blvd., Manassas, VA 20110-2209に1991年5月31日に寄託され、そしてＡＴＣＣ受託番号ATCC68629と一致した；Linsley, P.らによる1994 Immunity 1：793-80）。ＣＴＬＡ４Ｉｇ−２４、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）セルライン発現性ＣＴＬＡ４Ｉｇは、ＡＴＣＣ識別番号CRL-10762で１９９１年５月３１日に寄託されている。本発明の方法および／またはキットにおいて使用する可溶性ＣＴＬＡ４Ｉｇ分子は、シグナル（リーダー）ペプチド配列を含んでもまたは含まなくてもよい。典型的に、本発明の方法および／またはキットにおいて、該分子はシグナルペプチド配列を含まない。
【００３５】
「Ｌ１０４ＥＡ２９ＹＩｇ」とは、アミノ酸変化Ａ２９Ｙ（２９位でアラニンをチロシンアミノ酸残基で置換）およびＬ１０４Ｅ（＋１０４位でロイシンをグルタミン酸アミノ酸残基で置換）を有する野生型ＣＴＬＡ４の細胞外ドメインまたはその一部分を含み、Ｂ７分子と結合し、Ｉｇ末端と結合した可溶性ＣＴＬＡ４突然変異分子である融合タンパク質である（これは、図１５に含まれる；Ｌ１０４ＥＡ２９ＹＩｇをコードするＤＮＡは、ATCC番号PTA-2104で２０００年６月２０日に寄託されている；米国特許同時継続出願番号09/579,927、60/287,576および60/214,065（これらは、本明細書の一部を構成する））。本発明の方法および／またはキットにおいて使用する該可溶性Ｌ１０４ＥＡ２９ＹＩｇ分子は、シグナル（リーダー）ペプチド配列を含んでも含まなくてもよい。典型的に、本発明の方法および／またはキットにおいて、該分子はシグナルペプチド配列を含まない。
【００３６】
本明細書で使用する「可溶性」とは、細胞と結合したりまたは連結しない（すなわち、循環している）、いずれかの分子またはその断片および誘導体を意味する。例えば、ＣＴＬＡ４、Ｂ７またはＣＤ２８は、免疫グロブリン（Ig）分子とそれぞれＣＴＬＡ４、Ｂ７またはＣＤ２８の細胞外ドメインとを連結させることによって可溶性とすることができる。あるいは、例えばＣＴＬＡ４などの分子は、その膜貫通ドメインを除去することによって可溶性とすることができる。典型的に、本発明の方法において使用する該可溶性分子は、シグナル（リーダー）配列を含まない。
【００３７】
本明細書で使用する「可溶性ＣＴＬＡ４分子」とは、非細胞表面結合性（すなわち、循環性）のＣＴＬＡ４分子（野生型または突然変異型）、またはＢ７と結合するＣＴＡＬ４分子のいずれかの官能性部分を意味する。このものとしては例えば、ＣＴＬＡ４Ｉｇ融合タンパク質（例えば、ATCC 68629）（ここで、該ＣＴＬＡ４の細胞外ドメインは免疫グロブリン（Ｉｇ）分子と融合して、該融合分子を可溶性とする）またはその断片および誘導体；生物学的に活性なまたは化学的に活性なタンパク質の部分と融合しまたは結合したＣＴＬＡ４の細胞外ドメインを有するタンパク質（例えば、パピローマウイルスＥ７遺伝子産物（ＣＴＬＡ４−Ｅ７）、黒色腫関連抗原ｐ９７（ＣＴＬＡ４−ｐ９７）またはＨＩＶ ｅｎｖタンパク質（ＣＴＬＡ４−ｅｎｖ ｇｐｌ２０）、またはそれらの断片および誘導体；ハイブリッド（キメラ）融合タンパク質（例えば、ＣＤ２８／ＣＴＬＡ４Ｉｇ）またはその断片および誘導体；膜貫通ドメインを除去して該タンパク質を可溶性としたＣＴＬＡ４分子（Oaks, M. K.らによる2000 Cellular Immunology 201：144-153）またはその断片および誘導体を含むが、これらに限定されない。「可溶性ＣＴＬＡ４分子」はまた、その断片、部分または誘導体、およびＣＴＬＡ４結合活性を有する可溶性ＣＴＬＡ４突然変異分子をも含む。本発明の方法において使用する可溶性ＣＴＬＡ４分子は、シグナル（リーダー）配列を含んでもまたは含まなくてもよい。典型的に、本発明の方法において、該分子はシグナルペプチド配列を含まない。
【００３８】
本明細書で使用する「ＣＴＬＡ４の細胞外ドメイン」とは、ＣＴＬＡ４リガンド（例えば、Ｂ７分子）を認識しおよび結合するＣＴＬＡ４の部分（例えば、Ｂ７分子）である。例えば、ＣＴＬＡ４の細胞外ドメインは、＋１位のメチオニンから＋１２４位のアスパラギン酸を含む（図１９）。あるいは、ＣＴＬＡ４の細胞外ドメインは、−１位のアラニンから＋１２４位のアスパラギン酸を含む（図１９）。該細胞外ドメインは、Ｂ７分子と結合するＣＴＬＡ４の断片または誘導体を含む。図１９に示すＣＴＬＡ４の細胞外ドメインはまた、Ｂ７分子に対するＣＴＬＡ４分子の結合アビディティーを変える突然変異をも含み得る。
【００３９】
本明細書で使用する用語「突然変異」とは、野生型分子のヌクレオチド配列またはアミノ酸配列における変化、例えば野生型ＣＴＬＡ４細胞外ドメインのＤＮＡ配列および／またはアミノ酸配列における変化を意味する。ＤＮＡにおける突然変異はコドンを変化させて、これにより該アミノ酸配列における変化を生じ得る。ＤＮＡ変化としては例えば、置換、欠失、挿入、選択的スプライシングまたは切断を含み得る。アミノ酸変化としては例えば、置換、欠失、挿入、付加、切断もしくはプロセッシングまたは該タンパク質の切断誤りを含み得る。あるいは、ヌクレオチド配列における突然変異は当該分野でよく理解されている通り、アミノ酸配列におけるサイレント突然変異を生じ得る。その点に関して、特定のヌクレオチドコドンは同じアミノ酸をコードする。
【００４０】
例えば、アミノ酸：アルギニン（Ｒ）をコードするヌクレオチドコドンＣＧＵ、ＣＧＧ、ＣＧＣおよびＣＧＡ；またはアミノ酸：アスパラギン酸（Ｄ）をコードするコドンＧＡＵおよびＧＡＣを含む。従って、タンパク質は、特定のヌクレオチド配列が異なるが、なお同一の配列を有するタンパク質分子をコードする、１つ以上の核酸分子によってコードされ得る。該アミノ酸をコードする配列は、以下の通りである。
2004535364.tif 000002
【００４１】
該突然変異分子は、１つ以上の突然変異を有し得る。
【００４２】
本明細書で使用する「非−ＣＴＬＡ４タンパク質配列」または「非−ＣＴＬＡ４分子」とは、Ｂ７と結合せず且つＣＴＬＡ４とその標的との結合を妨害しない、いずれかのタンパク質分子を意味する。例えば、免疫グロブリン（Ｉｇ）定常部またはその部分を含むが、これらに限定されない。該Ｉｇ定常部は、ヒトまたはサルのＩｇ定常部、例えばヒトＣ(ガンマ)１（これは、ヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３領域を含む）であることが好ましい。該Ｉｇ定常部を突然変異させて、そのエフェクター機能を低下させることができる（米国特許第5,637,481号、第5,844,095号および第5,434,131号）。
【００４３】
本明細書で使用する「断片」または「部分」とは、ＣＴＬＡ４分子のいずれかの部分またはセグメントであって、これはＣＴＬＡ４の細胞外ドメインまたは標的（例えば、Ｂ７分子）を認識しおよび結合するその部分もしくはセグメントであることが好ましい。
【００４４】
本明細書で使用する「Ｂ７」とは、Ｂ７ファミリー分子を意味し、このものは例えば、ＣＴＬＡ４および／またはＣＤ２８を認識しおよび結合することができるＢ７−１（ＣＤ８０）、Ｂ７−２（ＣＤ８６）およびＢ７−３を含むが、それらに限定されない。
【００４５】
本明細書で使用する「Ｂ７−陽性細胞」とは、細胞表面上で発現するＢ７分子のタイプの１つ以上を有するいずれかの細胞である。
【００４６】
本明細書で使用する「誘導体」は、その親分子の配列相同性および活性を有する分子である。例えば、ＣＴＬＡ４の誘導体は、野生型ＣＴＬＡ４の細胞外ドメインに対して少なくとも７０％類似であるアミノ酸配列を有し、且つＢ７を認識しおよび結合する可溶性ＣＴＬＡ４分子（例えば、ＣＴＬＡ４Ｉｇまたは可溶性ＣＴＬＡ４突然変異分子Ｌ１０４ＥＡ２９ＹＩｇ）を含む。
【００４７】
本明細書で使用する、受容体、シグナルまたは分子を「遮断する」または「抑制する」とは、当該分野で認識されている試験によって検出される、該受容体、シグナルまたは分子の活性化を妨害することを意味する。例えば、細胞媒介性の免疫反応の遮断は、移植拒絶反応の低下を測定するか、または異常血色素症に関連する症状を低下させることによって検出することができる。遮断または抑制は、部分または全部であり得る。
【００４８】
本明細書で使用する「Ｂ７との相互作用を遮断する」とは、Ｂ７とそのリガンド（例えば、ＣＤ２８および／またはＣＴＬＡ４）との結合を妨害して、その結果Ｔ−細胞とＢ７−陽性細胞との相互作用を妨害することを意味する。Ｂ７との相互作用を妨害する薬物としては例えば、ＣＴＬＡ４、ＣＤ２８またはＢ７分子のいずれかを認識しおよび結合する抗体（またはその部分もしくは誘導体）（例えば、Ｂ７−１、Ｂ７−２）などの分子；該分子の可溶性形態（またはその部分もしくは誘導体）（例えば、可溶性ＣＴＬＡ４）；ＣＴＬＡ４／ＣＤ２８／Ｂ７−媒介性相互作用によって細胞シグナルを妨害するように設計されたペプチド断片または他の小分子を含むが、これらに限定されない。好ましい態様において、該遮断薬物は、可溶性のＣＴＬＡ４分子（例えば、ＣＴＬＡ４Ｉｇ（ATCC 68629）またはＬ１０４ＥＡ２９ＹＩｇ（ATCC PTA-2104）、可溶性Ｂ７分子（例えば、Ｂ７１g（ATCC 68627））、抗−Ｂ７モノクローナル抗体（例えば、ATCC HB-253、ATCC CRL-2223、ATCC CRL-2226、ATCC HB-301、ATCC HB-11341、およびAndersonらによる米国特許第6,113,898号またはYokochiらによる1982. J. Immun., 128 (2)：823-827に記載のモノクローナル抗体）、抗−ＣＴＬＡ４モノクローナル抗体（例えば、ATCC HB-304および引用文献８２〜８３に記載されているモノクローナル抗体）、および／または抗−ＣＤ２８モノクロ−ナル抗体（例えば、Hansen（Hansenらによる1980. Immunogenetics 10：247-260）またはMartin（Martinらによる1984. J. Clin. Immun., 4 (1)：18-22）らによって記載されているATCC HB 11944およびmAb 9.3）である。
【００４９】
本明細書で使用する「免疫系疾患」とは、Ｔ−細胞とＢ７−陽性細胞との相互作用によって媒介されるいずれかの疾患を意味し、例えば自己免疫疾患、移植片関連障害および免疫増殖性疾患を含むが、これらに限定されない。免疫系疾患の例としては、移植片対宿主疾患（ＧＶＨＤ）（例えば、骨髄移植から生じ得る疾患、または免疫寛容の誘発において生じる疾患）、または移植片移植拒絶反応、慢性拒絶反応および組織もしくは細胞の同種もしくは異種の移植片（これは、固形の臓器、皮膚、すい島、筋肉、肝細胞、ニューロンを含む）に関連する免疫系障害を含む。免疫増殖性疾患の例としては、乾癬、Ｔ−細胞リンパ腫、Ｔ−細胞急性リンパ芽球性白血病、精巣血管中心性(angiocentric)Ｔ−細胞リンパ腫、良性リンパ性脈管炎、ループス（例えば、エリテマトーデス、ループス腎炎）、橋本甲状腺炎、一次性粘液水腫、グレーブス病、悪性貧血、自己免疫萎縮性胃炎、アジソン病、糖尿病（例えば、インスリン依存性糖尿病、Ｉ型糖尿病、ＩＩ型糖尿病）、グッドパスチャー症候群、重症筋無力症、天疱瘡、クローン病、交感神経性眼炎、自己免疫ブドウ膜炎、多発性硬化症、自己免疫溶血性貧血、特発性血小板減少症、原発性胆汁性肝硬変、慢性活動性肝炎、潰瘍性大腸炎、シェーグレン症候群、リウマチ性疾患（例えば、関節リウマチ、多発性筋炎および混合結合組織病）を含むが、これらに限定されない。
【００５０】
本明細書に記載する本発明をより十分に理解することができるように、以下の記載を記す。
【００５１】
（方法）
本明細書に開示する発明は、被験者において混合造血性キメラ化を確立するための方法を提供する。該被験者としては例えば、ヒト、サル、ブタ、ウマ、魚、イヌ、ネコおよびウシを含むが、これらに限定されない。造血性キメラ化は、免疫反応を抑制するのに、例えば移植（例えば、組織または固形臓器の移植）の拒絶反応を抑制するのに有用であり得たり、および／または異常血色素症（例えば、鎌状細胞疾患およびタラセミア）を処置するのに有用であり得る。本明細書に示す通り、臓器または組織の移植体は、移植に受け入れられる(amenable)器官または組織のいずれかのタイプ由来であり得る。例えば、組織は臓器（例えば、皮膚、骨髄、心臓、肺、腎臓、肝臓、すい臓、すい島細胞、または細胞懸濁液および遺伝子的に改変された細胞を含む）から選ぶことができるが、このことに限定されない。１態様において、該組織移植体は皮膚である。該組織をドナー被験者から取り出すことができ、またはインビトロで増殖することができる。該移植体は、自家移植片、同系移植片、同種移植片もしくは異種移植片、またはそれらの組み合わせであり得る。
【００５２】
１態様において、本発明は免疫系障害および／または異常血色素症を処置するための方法を提供し、該方法は免疫抑制剤の存在または非存在でアルキル化剤およびＴ細胞欠乏骨髄を投与することを含む。
【００５３】
本発明の実施によれば、該方法は更に、１回以上の用量のＴ細胞欠乏骨髄細胞（免疫寛容性用量および／または生着性用量）を該被験者に投与することを含む。また、本発明の実施によれば、該方法は１回以上の用量のアルキル化剤を該被験者に投与することを含む。加えて、該方法は１回または複数回投与の時点で該被験者に１つ以上の免疫抑制剤を投与することを含むことができる。
【００５４】
１態様において、第１の用量のＴ細胞欠乏骨髄（免疫寛容性用量）および免疫抑制剤を、臓器移植とほぼ同時に投与する。該骨髄および免疫抑制剤は、ブスルファンの投与前に投与することが好ましい。該方法はまた、ブスルファンの投与後に、少なくとも１タイプの免疫抑制剤を投与する更なる工程を含み得る。加えて、該方法は更に、第２の用量のＴ細胞欠乏骨髄（生着性用量）を該被験者に投与することを含み得る。
【００５５】
本明細書に示す通り、該アルキル化剤は抗増殖性薬（例えば、細胞増殖を抑制する薬物）であることが好ましい。好ましいアルキル化剤の１例は、アルキルスルホネート（例えば、ブスルファン）である。アルキルスルホネートの他の例としては、アルキルｐ−トルエンスルホネート、アルキルトリフルオロメタンスルホネート、ｐ−ブロモフェニルスルホネート、アルキルアリールスルホネートおよびその他を含む。アルキル化剤の他の例としては、例えばナイトロジェンマスタード（メクロレタミン(mechlorethamine)、クロランブシル、メルファラン、ウラシルマスタード）、オキサザポスポリン(oxazaposporine)（シクロホスファミド、ペルホスファミド(perfosfamide)、トロホスファミド(trophosphamide)、およびニトロソ尿素を含むが、これらに限定されない。
【００５６】
本発明の好ましい態様はアルキルスルホネート、ブスルファンを抗増殖性薬として使用するが、本発明の他の態様は他の抗増殖性薬物、化学療法性薬物を用いて実施することができる。ある態様において、アルキル化化学療法剤は特に有用であろう。他のアルキル化化学療法剤の例としては、カルムスチン(carmustine)、クロランブシル、シスプラチン、ロムスチン(lomustine)、シクロホスファミド、メルファラン、メクロレタミン、プロカルバジン、チオテパ、ウラシルマスタード、トリエチレンメラミン、ピポブロマン(pipobroman)、ストレプトゾシン、イホスファミド、ダカルバジン、カルボプラチンおよびヘキサメチルメラミンを含むが、これらに限定されない。
【００５７】
他の薬物と合わせた該アルキル化剤の被験者ヘの投与は、多数の異なる方法で達成することができる。例えば、該アルキル化剤を、静脈内、筋肉内または腹膜内投与することができる。あるいは、該剤を、経口または皮下で投与することができる。ブスルファンを投与するためのいくつかの方法が、米国特許第5,430,057号および第5,559,148号に開示されている。投与の他の方法は、当該分野の当業者によって認められるであろう。同様に、Ｔ細胞欠乏骨髄を、当該分野の当業者によって知られる多数の異なる方法で投与することができる。他の例は、静脈内注射による。ある態様において、該アルキル化剤はＴ細胞欠乏骨髄の投与前の２４時間以内に投与することができる。
【００５８】
更に、該アルキル化剤およびＴ細胞欠乏骨髄の量は、通常の実験法によって決定することができたり、経験的に最適化することができる。治療学的薬物または免疫抑制剤の用量は、多数の因子に依存する。該因子としては例えば、被験者のタイプ（すなわち、種）、使用する薬物（例えば、ブスルファン、可溶性ＣＴＬＡ４または抗−ｇｐ３９ｍＡＢ）、抗原チャレンジの位置、影響を受ける組織のタイプ、処置する疾患のタイプ、該疾患の激しさ、被験者の健康および該薬物を用いた処置に対する反応を含むが、これらに限定されない。従って、該薬物の用量は、各々の被験者、薬物および投与様式によって変わり得る。本明細書に記載する通り、ブスルファンの用量を滴定して、所望する効果を達成するのに必要とされる最適な用量を決定することができる。例えば、ブスルファンは、被験者の体重の０．１〜２０ｍｇ／ｋｇの量で、例えば４ｍｇ／ｋｇ、８〜１６ｍｇ／ｋｇ、４〜１６ｍｇ／ｋｇで投与することができる（Slavin, S.らによるBlood, 91：756-763 (1998)；Lucarelliらによる上記）。同様に、Ｔ細胞欠乏骨髄の量を、通常の実験法の間に滴定して、所望する効果を達成するのに十分な量を決定することができる。
【００５９】
ある態様において、該アルキル化剤（例えば、ブスルファン）を、移植（例えば、組織または固形臓器の移植）前に投与する。ある態様は、該固形臓器移植の１日以内、１２時間以内、または６時間以内に投与することを含む。しかしながら、臓器または組織の移植と合わせたブスルファンの与える効果がなお達成される限り、該ブスルファンをより早く投与することができる。別の態様において、臓器移植後にブスルファンを投与することを所望することができる。
【００６０】
該アルキル化剤および／またはＴ細胞欠乏骨髄の投与は、被験者が固形臓器移植を受けるのとほぼ同時に行なうことができる。該アルキル化剤または骨髄をほぼ同時に投与することとは、臓器または組織の移植体を投与する方法のための製造物の一部分として該アルキル化剤または骨髄を被験者に投与することを示す。臓器移植に正確に同時に（すなわち、数分以内に）投与することは要求されない。当該分野の当業者は、該組成物の投与のタイミングが変わり得ることを認めるであろう。例えば、Ｔ細胞欠乏骨髄細胞の投与はブスルファンの投与の前、その後、または同時に行なうことができる。同様に、該投与のタイミングは、免疫抑制剤の投与または臓器移植のタイミングの観点により変わり得る。
【００６１】
本明細書に開示する通り、好ましい免疫抑制剤は、免疫反応を抑制する薬物である。該薬物はＴ細胞の増殖を低下させたりまたは抑止することが、より好ましい。いくつかの薬物は、Ｔ細胞と他の抗原提示細胞との相互作用を抑制することによって、Ｔ細胞増殖を抑制し得る。抗原提示細胞の他の例は、Ｂ細胞である。Ｔ細胞と抗原提示細胞との相互作用を妨害し、その結果Ｔ細胞増殖を抑制する薬物の例としては例えば、Ｂ７抗原に対するリガンド、ＣＴＬＡ４抗原に対するリガンド、ＣＤ２８抗原に対するリガンド、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）に対するリガンド、ｇｐ３９抗原に対するリガンド、ＣＤ４０抗原に対するリガンド、ＣＤ４に対するリガンドおよびＣＤＳに対するリガンドを含むが、これらに限定されない。Ｂ７抗原に対するリガンドの例としては、可溶性ＣＴＬＡ４（例えば、ATCC 68629、ATCC PTA 2104）、可溶性ＣＤ２８（例えば、ATCC 68628）、またはＢ７抗原もしくはその断片を認識しそして結合するモノクローナル抗体（例えば、ATCC HB-253、ATCC CRL-2223、ATCC CRL-2226、ATCC HB-301、ATCC HB-11341；Andersonらによる米国特許第6,113,898号またはYokochiらによる1982. J. Immun., 128 (2) 823-827に記載されるモノクローナル抗体）を含むが、これらに限定されない。他の好ましい薬物は、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ（ATCC 68629）である。他の可溶性ＣＴＬＡ４分子（これは、可溶性ＣＴＬＡ４突然変異分子（ATCC PTA 2104）を含む）もまた特に有用であり得る。
【００６２】
ＣＴＬＡ４またはＣＤ２８抗原に対するリガントとしては、ＣＴＬＡ４を認識しそして結合するモノクローナル抗体（例えば、ATCC HB-304、並びにLinsleyらによる米国特許第6,090,914号およびLinsleyらによる1992. J. Ex. Med 176：1595-1604に記載するモノクローナル抗体）、および／またはＣＤ２８を認識しそして結合するモノクローナル抗体（例えば、Hansen（Hansenらによる1980. Immunogenetics 10：247-260）またはMartin（Martinらによる1984. J. Clin. Immun., 4 (1)：18-22）らによって記載されているATCC HB 11944およびmAb 9.3）、あるいはそれらの断片を認識しそして結合するモノクローナル抗体を含む。ＣＴＬＡ４またはＣＤ２８に対する他のリガンドは例えば、可溶性Ｂ７分子（例えば、Ｂ７Ｉｇ（例えば、ATCC 68627））を含む。
【００６３】
ｇｐ３９に対するリガントの例としては、可溶性ＣＤ４０、またはｇｐ３９抗原（例えば、抗−ＣＤ４０Ｌ）もしくはその断片を認識しそして結合するモノクローナル抗体を含むが、これらに限定されない。ｇｐ３９（抗−ＣＤ４０Ｌ）ｍＡｂの１例は、ＭＲ１（Bioexpress, Lebanon, NH）である。抗−ヒトｇｐ３９ｍＡｂの別例としては、欧州特許第EP 807175A2に記載されているATCC HB 11822、ATCC HB 11816、ATCC HB 11821、ATCC HB 11808、ATCC HB 11823を含むが、これらに限定されない。
【００６４】
ＣＤ４０に対するリガンドの例としては、可溶性ｇｐ３９、またはＣＤ４０抗原もしくはその断片を認識しそして結合するモノクローナル抗体を含むが、これらに限定されない。当該分野の当業者は、他の薬物またはリガンドをＣＤ２８とＢ７および／またはｇｐ３９とＣＤ４０との相互作用を抑制するのに使用することができることを容易に理解するであろう。それらの薬物は、例えばＣＴＬＡ４／ＣＤ２８とＢ７との相互作用を妨害したりおよび／またはｇｐ３９とＣＤ４０との相互作用を妨害する薬物などの該薬物の公知の性質によって選ばれて、本発明の方法において使用されるであろう。薬物がこれらの相互作用を妨害することを知ることにより、当該分野の当業者は本明細書の開示に基づいてこれらの薬物を用いて本発明の方法を容易に実施することができる。
【００６５】
加えて、他の免疫抑制剤を本発明の方法を本発明の方法において使用することができる。例えば、シクロスポリン、アザチオプリン(azathioprine)、メトトレキセート、リンパ球免疫グロブリン、抗−ＣＤ３抗体、Ｒｈｏ(Ｄ)免疫グロブリン、副腎皮質ステロイド、スルファサルジン(sulfasalzine)、ＦＫ−５０６、メトキサレン、ミコフェノール酸モフェチル（ＣＥＬＬＣＥＰＴ）、ウマ抗ヒト胸腺細胞グロブリン（ＡＴＧＡＭ)、ヒト化抗−ＴＡＣ（ＨＡＴ）、バシリキシマブ（ＳＩＭＵＬＥＣＴ）、ウサギ抗−ヒト胸腺グロブリン（ＴＨＹＭＯＧＬＯＢＵＬＩＮ）、シロリムス(sirolimus)またはサリドマイドを含む。
【００６６】
好ましい態様において、免疫抑制剤を被験者に同時投与する（すなわち、それらは組み合せ処置として投与する）。より好ましい態様において、該組み合わせは、ＣＤ２８抗原のＢ７抗原との結合を妨害する第１のリガンドと、ｇｐ３９抗原（これは、ＣＤ１５４とも記す）とＣＤ４０抗原との結合を妨害する第２のリガンドとの組み合わせである。上記の通り、該第１のリガンドは可溶性ＣＴＬＡ４分子（例えば、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ）であることが好ましい。該第２のリガンドは、抗−ｇｐ３９ｍＡｂ（すなわち、ｇｐ３９抗原またはその断片を認識しそして結合するモノクローナル抗体）であることが好ましい。１例は、ＭＲ１である。
【００６７】
本発明の１態様において、ＣＴＬＡ４ＩｇおよびＭＲ１は、ＣＴＬＡ４／ＣＤ２８／Ｂ７およびｇｐ３９／ＣＤ４０の同時刺激活性を遮断するために組み合わせて投与する。別の態様は、ＣＴＬＡ４Ｉｇおよび抗ヒトｇｐ３９ｍＡｂを含み得る。抗ヒトｇｐ３９ｍＡｂの例としては、欧州特許第EP 807175A2に記載されている、ATCC HB 11822、ATCC HB 11816、ATCC HB 11821、ATCC HB 11808、ATCC HB 11823を含むが、これらに限定されない。本明細書に示す通り、この組み合わせは「同時刺激遮断」と呼ばれる。例えば、可溶性ＣＴＬＡ４分子は、被験者の体重の０．１〜２０．０ｍｇ／ｋｇの量で、好ましくは０．５〜１０．０ｍｇ／ｋｇの量で投与することができる。
【００６８】
被験者における異常血色素症の処置に関する本発明の１方法において、該方法はまた、第２の用量のＴ細胞欠乏骨髄を該被験者に投与する別の工程を含み得る。同様に、該方法は、更なる用量の免疫抑制剤を該被験者に投与する１つ以上の工程を含み得る。
【００６９】
ある態様において、異常血色素症はベータタラセミアである。他の態様において、異常血色素症は鎌状細胞疾患である。異常血色素症の処置(correction)は、多数の方法において測定することができる。１例は、レシピエント被験者の血液中のヘモグロビンバンド（例えば、主なバンドまたは少量のバンド）の量を測定することによる。
【００７０】
本発明の好ましい態様において、該方法は第１の用量のＴ細胞欠乏骨髄を投与し、そして可溶性ＣＴＬＡ４およびｇｐ３９ｍＡｂの組み合わせを被験者に同時投与し、続いて更なる用量の可溶性ＣＴＬＡ４およびｇｐ３９ｍＡｂを該被験者に投与し、その後に、アルキル化剤を該被験者に投与し、そして第２の用量のＴ細胞欠乏骨髄を該被験者に投与することを含む。上記の方法は、造血性キメラ化を確立するのに、ベータタラセミアを処置するのに、および組織または臓器移植の拒絶反応を抑制するのに特に有用である。
【００７１】
（組成物）
本発明は、被験者においてキメラ化を確立するのに有用である組成物を提供する。したがって、該組成物は免疫反応を抑制するのに、例えば組織または臓器の移植の拒絶反応を抑制するのに有用であろう。該組成物はまた、異常血色素症を処置するのにも有用であろう。
【００７２】
本明細書に記載する通り、該組成物はアルキル化剤（例えば、ブスルファン）および１つ以上のタイプの免疫抑制剤を含むことが好ましい。加えて、該組成物はＴ細胞欠乏骨髄を含むことができる。該Ｔ細胞欠乏骨髄は、処置する被験者に免疫学的に適合することが好ましい。
【００７３】
好ましい態様において、該組成物はブスルファンおよび／または可溶性ＣＴＬＡ４と抗−ｇｐ３９ｍＡｂとの組み合わせを含む。具体例は、ＣＴＬＡ４ＩｇおよびＭＲ１を含む。
【００７４】
本発明の組成物は、上記の通り、医薬的に許容し得る担体中で投与することが好ましい。当該分野の当業者は、該組成物が該特定の薬物を同時投与することを必要としないことを理解する。例えば、ブスルファンを該同時刺激処断薬と別々に投与することができ、そしてこのものはなお、本明細書に記載する方法において使用する組成物として作用する。あるいは、該組成物は単一の担体中に、ブスルファン、可溶性ＣＴＬＡ４および抗ｇｐ３９ｍＡｂｓを含むことができる。他の態様が可能である。
【００７５】
本発明はまた、本発明の組成物を他の医薬的な薬物と一緒に使用して、免疫系疾患および／または異常血色素症を処置することをも包含する。例えば、免疫疾患または異常血色素症は、本発明の分子を上記の免疫抑制剤および加えていずれか１つ以上の副腎皮質ステロイド、シクロスポリン（Mathiesen 1989 Cancer Lett. 44 (2)：151-156）、プレドニゾン、アザチオプリン、メトトレキセート（R. Handschumacherによる「Drugs Used for Immunosuppression」1264-1276頁）、ＴＮＦαブロッカーもしくは拮抗薬（New England Journal of Medicine, vol. 340：253-259, 1999；The Lancet vol. 354：1932-39, 1999, Annals of Internal Medicine, vol. 130：478-486）、いずれかの炎症性サイトカインを標的とするいずれかの他の生物学的な薬物、非ステロイド性抗炎症薬／Ｃｏｘ−２インヒビター、ヒドロキシクロロキン(hydroxychloroquine)、スルファアサラゾピリン(sulphasalazopryine)、金塩、エタネルセプト、インフリキシマブ、ラパマイシン、ミコフェノーレートモフェチル、アザチオプリン、タクロリスムス(tacrolismus)、バシリキシマブ、サイトキサン(cytoxan)、インターフェロンベータ−１ａ、インターフェロンベータ−１ｂ、グラチラマーアセテート(glatiramer acetate)、ミトキサントロン塩酸、アナキンラ(anakinra)および／または他の生物薬（これらに限定されない）と合わせて処置することができる。
【００７６】
加えて、本発明は、本発明の組成物を抗ウイルス薬と一緒に用いてウイルス感染症を併発している被験者における免疫寛容を促進することを企図する。
【００７７】
更に、治療学的な組み合わせ、例えば上で定義するいずれかの方法において使用するためのキットを提供し、このものは遊離な形態または医薬的に許容し得る塩形態の可溶性ＣＴＬＡ４分子を含み、免疫抑制剤、免疫調節剤または抗炎症性薬および／またはアルキル化剤を含有する医薬組成物の少なくとも１つを同時にまたは連続して使用する。該キットは、その投与のための指示を含み得る。該免疫抑制剤、免疫調節薬または抗炎症性薬は、遊離の形態でまたは医薬的に許容し得る塩形態であり得る。加えて、該アルキル化剤は遊離の形態でまたは医薬的に許容し得る塩形態であり得る。
【００７８】
可溶性ＣＴＬＡ４分子は、ＣＴＬＡ４／ＣＤ２８／Ｂ７相互作用を妨害する好ましいリガンドである。突然変異型配列または野生型配列を有するＣＴＬＡ４分子は、該ＣＴＬＡ４膜貫通セグメントを欠失することによって可溶とすることができる（Oaks, M. K.らによる2000 Cellular Immunology 201：144-153）。
【００７９】
あるいは、突然変異型配列または野生型配列を有する可溶性ＣＴＬＡ４分子は融合タンパク質であり得て、ここで該ＣＴＬＡ４分子は非−ＣＴＬＡ４分子（例えば、免疫グロブリン（Ｉｇ）分子）と融合して該ＣＴＬＡ４分子を可溶とする。例えば、ＣＴＬＡ４融合タンパク質は、免疫グロブリン定常ドメインと融合したＣＴＬＡ４の細胞外ドメイン（これは、ＣＴＬＡ４Ｉｇ分子（図２０）を生じる）を含み得る（Linsley, P. S.らによる1994 Inimunity 1：793-80）。
【００８０】
臨床的なプロトコールとして、免疫グロブリン領域は、被験者における有害な免疫反応を誘発しないことが好ましい。該好ましい分子は、免疫グロブリン定常部（これは、ヒトまたはサルの免疫グロブリン定常部を含む）である。適当な免疫グロブリン部の１例は、ヒトＣγ１である。これは、エフェクター機能を媒介して、例えばＦｃ受容体と結合したり、補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）を媒介したり、または抗体依存性細胞障害（ＡＤＣＣ）を媒介することができるヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３領域を含む。該免疫グロブリン分子は、その内に１つ以上の突然変異（例えば、ＣＨ２ドメイン中には、エフェクター機能（例えば、ＣＤＣまたはＡＤＣＣ）を低下させるために）を有し得る。ここで、該突然変異は、免疫グロブリンのＦｃ受容体との結合能力を増減させることによって、該免疫グロブリンのそのリガンドに対する結合能力を改変する。例えば、免疫グロブリン内の突然変異としては、ヒンジドメイン内のいずれかのもしくは全てのシステイン残基の改変を含むことができ；例えば＋１３０、＋１３６および＋１３９位でのシステインがセリンで置換される（図２０）。該免疫グロブリン分子はまた、図２０に示す通り、＋１４８位のプロリンをセリンで置換することをも含み得る。更に、該免疫グロブリン分子内の突然変異は＋１４４位のロイシンをフェニルアラニンで置換すること、＋１４５位のロイシンをグルタミン酸で置換すること、または＋１４７位のグリシンをアラニンで置換することを含み得る。
【００８１】
可溶性ＣＴＬＡ４分子または可溶性ＣＴＬＡ４突然変異分子における使用のための更なる非ＣＴＬＡ４分子としては例えば、ｐ９７分子、ｅｎｖ ｇｐｌ２０分子、Ｅ７分子および卵分子（Dash, B.らによる1994 J：Gen. Virol. 75 (Pt 6)：1389-97；Ikeda, T.らによる1994 Gene 138 (1-2)：193-6；Falk, K.らによる1993 Cell. ImmunoL 150 (2)：447-52；Fujisaka, K.らによる1994 Virology 204 (2)：789-93）を含むが、これらに限定されない。他の分子もまた可能である（Gerard, C.らによる1994 Neuroscience 62 (3)：721；Byrn, R.らによる1989 63 (10)：4370；Smith, D.らによる1987 Science 238：1704；Lasky, L.による1996 Science 233：209）。
【００８２】
本発明の該可溶性ＣＴＬＡ４分子は、該分子のＣＴＬＡ４部分の細胞外ドメインのＮ−末端と結合したシグナルペプチド配列を含み得る。該シグナルペプチドは、該分子の分泌を許容するであろういずれかの配列であり得て、該分子はオンコスタチンＭ（Malikらによる(1989) Molec. Cell. Biol. 9：2847-2853）もしくはＣＤ５（Jones, N. H.らによる(1986) Nature 323：346-349）由来のシグナルペプチド、またはいずれかの細胞外タンパク質由来のシグナルペプチドを含む。
【００８３】
本発明の可溶性ＣＴＬＡ４分子は、ＣＴＬＡ４の細胞外ドメインのＮ末端で結合したオンコスタチンＭシグナルペプチド、および該細胞外ドメインのＣ末端で結合したヒト免疫グロブリン分子（例えば、ヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３）を含むことができる。この分子は、−２６位のメチオニンから−１位のアラニンを有するアミノ酸配列を含有するオンコスタチンＭシグナルペプチド；＋１位のメチオニンから＋１２４位のアスパラギン酸を有するアミノ酸配列を含有するＣＴＬＡ４部分；＋１２５位の接合アミノ酸残基グルタミン；および、＋１２６位のグルタミン酸から＋３５７位のリシンを有するアミノ酸配列を含有する免疫グロブリン部分を含む。
【００８４】
具体的には、上に記載の突然変異型ＣＴＬＡ４配列を含有する本発明の可溶性ＣＴＬＡ４突然変異分子は、該突然変異型ＣＴＬＡ４断片と融合するヒトＩｇＣγｌ分子を含有する融合分子である。
【００８５】
１態様において、該可溶性ＣＴＬＡ４突然変異分子は、該細胞外ドメイン内に単一部位突然変異を含有するＣＴＬＡ４断片と融合したＩｇＣγｌを含む。ＣＴＬＡ４の細胞外ドメインは、＋１位のメチオニンから＋１２４位のアスパラギン酸を含む（例えば、図１９）。該ＣＴＬＡ４の細胞外部分は、−１位のアラニンから＋１２４位のアスパラギン酸を含み得る（例えば、図１９）。単一部位突然変異の例としては、以下のものを含む。ここで、＋１０４位のロイシンはいずれかの他のアミノ酸に改変する。
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【００８６】
更に、本発明は２つの突然変異を持つＣＴＬＡ４の細胞外ドメインを有し、ＩｇＣγｌ分子と融合した突然変異分子を提供する。例えば、＋１０４位のロイシンを別のアミノ酸（例えば、グルタミン酸）に改変し、そして＋１０５位のグリシン、＋２５位のセリン、＋３０位のトレオニンまたは＋２９位のアラニンをいずれか他のアミノ酸に改変したものを含む。
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【００８７】
更に、本発明は３つの突然変異を含有するＣＴＬＡ４の細胞外ドメインを有し、Ｉｇ Ｃγｌ分子と融合した突然変異分子を提供する。例えば、＋１０４位のロイシンを別のアミノ酸（例えば、グルタミン酸）に改変し、＋２９位のアラニンを別のアミノ酸（例えば、チロシン）に改変し、そして＋２５位のセリンを別のアミノ酸に改変したものを含む。
（表４）
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【００８８】
可溶性ＣＴＬＡ４突然変異分子は、該分子のＣＴＬＡ４部分とＩｇ部分の間に位置する接合アミノ酸残基を有することができる。該接合アミノ酸は、グルタミンを含むいずれかのアミノ酸であり得る。該接合アミノ酸は、当該分野で知られる分子的なまたは化学的な合成方法によって導入することができる。
【００８９】
本発明は、突然変異分子のＣＴＬＡ４部分の細胞外ドメインのＮ末端と結合したシグナルペプチド配列を含むＣＴＬＡ４突然変異分子を提供する。該シグナルペプチドは、該突然変異分子の分泌を許容するであろういずれかの配列（これは、オンコスタチンＭ（Malikらによる1989 Molec. Cell. Biol. 9：2847-2853）もしくはＣＤ５（Jones, N. H.らによる1986 Nature 323：346-349）由来のシグナルペプチド、またはいずれかの細胞外タンパク質由来のシグナルペプチドを含む）であり得る。
【００９０】
本発明は、ＣＴＬＡ４の細胞外ドメイン内の単一部位突然変異を含有する可溶性ＣＴＬＡ４突然変異分子（例えば、Ｌ１０４ＥＩｇ（図１４に含まれる）またはＬ１０４ＳＩｇ）を提供する。ここで、Ｌ１０４ＥＩｇおよびＬ１０４ＳＩｇはそれらのＣＴＬＡ４配列内での突然変異であり、したがって＋１０４位のロイシンはそれぞれグルタミン酸またはセリンで置換されている。該単一部位突然変異分子は更に、＋１位のメチオニンから＋１２４位のアスパラギン酸を含有するＣＴＬＡ４部分、＋１２５位の接合アミノ酸残基グルタミン、および＋１２６位のグルタミン酸から＋３５７位のリシンを含有する免疫グロブリン部分を含む。該突然変異分子の免疫グロブリン部分はまた突然変異され得て、その結果＋１３０、＋１３６および＋１３９位のシステインはセリンで置換され、そして＋１４８位のプロリンはセリンで置換される。あるいは、単一部位可溶性ＣＴＬＡ４突然変異分子は、−１位のアラニンから＋１２４位のアスパラギン酸を含有するＣＴＬＡ４部分を有し得る。
【００９１】
本発明は、ＣＴＬＡ４の細胞外ドメイン内に二重部位突然変異を含有する可溶性ＣＴＬＡ４分子（例えば、Ｌ１０４ＥＡ２９ＹＩｇ、Ｌ１０４ＥＡ２９ＬＩｇ、Ｌ１０４ＥＡ２９ＴＩｇまたはＬ１０４ＥＡ２９ＷＩｇ）を提供する。ここで、＋１０４位のロイシンはグルタミン酸で置換されており、そして＋２９位のアラニンはそれぞれ、チロシン、ロイシン、トレオニンまたはトリプトファンで置換されている。＋１位のメチオニンで開始し、そして＋３５７位のリシンで終止し、且つシグナル（リーダー）ペプチド配列を有する、Ｌ１０４ＥＡ２９ＹＩｇ、Ｌ１０４ＥＡ２９ＬＩｇ、Ｌ１０４ＥＡ２９ＴＩｇおよびＬ１０４ＥＡ２９ＷＩｇについての配列は、それぞれ図１５〜１８に示す配列に含まれる。該二重部位突然変異分子は更に、＋１位のメチオニンから＋１２４位のアスパラギン酸を含有するＣＴＬＡ４部分、＋１２５位の接合アミノ酸残基グルタミン、および＋１２６位のグルタミン酸から＋３５７位のリシンを含有する免疫グロブリン部分を含む。該突然変異分子の免疫グロブリン部分はまた突然変異され得て、その結果＋１３０、＋１３６および＋１３０位のシステインはセリンで置換され、そして＋１４８位のプロリンはセリンで置換される。あるいは、これらの突然変異分子は、−１位のアラニンから＋１２４位のアスパラギン酸を含有するＣＴＬＡ４部分を有し得る。
【００９２】
本発明は、ＣＴＬＡ４の細胞外ドメイン内に二重部位突然変異を含有する可溶性ＣＴＬＡ４突然変異分子（例えば、Ｌ１０４ＥＧ１０５ＦＩｇ、 Ｌ１０４ＥＧ１０５ＷＩｇおよびＬ１０４ＥＧ１０５ＬＩｇ）を提供する。ここで、＋１０４位のリシンはグルタミン酸で置換されており、そして＋１０５位のグリシンはそれぞれフェニルアラニン、トリプトファンまたはロイシンで置換されている。該二重部位突然変異分子は更に、＋１位のメチオニンから＋１２４位のアスパラギン酸を含有するＣＴＬＡ４部分、＋１２５位の接合アミノ酸残基グルタミン、および＋１２６位のグルタミン酸から＋３５７位のリシンを含有する免疫グロブリン部分を含む。該免疫グロブリン部分はまた突然変異され得て、その結果＋１３０、＋１３６および＋１３９位のシステインはセリンで置換され、そして＋１４８位のプロリンはセリンで置換される。あるいは、これらの突然変異分子は、−１位のアラニンから＋１２４位のアスパラギン酸を含有するＣＴＬＡ４部分を有し得る。
【００９３】
本発明は、二重部位突然変異分子であるＬ１０４ＥＳ２５ＲＩｇを提供する。ここで、このものは＋１位のメチオニンから＋１２４位のアスパラギン酸を包含するＣＴＬＡ４部分、＋１２５位の接合アミノ酸残基グルタミン、および＋１２６位のグルタミン酸から＋３５７位のリシンを含有する免疫グロブリン部分を含む。ＣＴＬＡ４の細胞外ドメインを有する部分は突然変異され得て、その結果＋２５位のセリンはアルギニンで置換され、且つ＋１０４位のロイシンをグルタミン酸で置換されている。あるいは、Ｌ１０４ＥＳ２５ＲＩｇは−１位のアラニンから＋１２４位のアスパラギン酸を含有するＣＴＬＡ４部分を有し得る。
【００９４】
本発明は、ＣＴＬＡ４の細胞外ドメイン内に二重部位突然変異を含有する可溶性ＣＴＬＡ４突然変異分子（例えば、Ｌ１０４ＥＴ３０ＧＩｇおよびＬ１０４ＥＴ３０ＮＩｇ）を提供する。ここで、＋１０４位のロイシンはグルタミン酸で置換されており、そして＋３０位のトレオニンはそれぞれ、グリシンまたはアスパラギンで置換されている。該二重部位突然変異分子は更に、＋１位のメチオニンから＋１２４位のアスパラギン酸を含有するＣＴＬＡ４部分、＋１２５位の接合アミノ酸残基グルタミン、および＋１２６位のグルタミンから＋３５７位のリシンを含有する免疫グロブリン部分を含む。該突然変異分子の免疫グロブリン部分はまた突然変異され得て、その結果＋１３０、＋１３６および＋１３９位のシステインはセリンで置換され、そして＋１４８位のプロリンはセリンで置換される。あるいは、これらの突然変異分子は、−１位のアラニンから＋１２４位のアスパラギン酸を含有するＣＴＬＡ４部分を有し得る。
【００９５】
本発明は、ＣＴＬＡ４の細胞外ドメイン内に三重部位突然変異を含有する可溶性ＣＴＬＡ４突然変異分子（例えば、Ｌ１０４ＥＡ２９ＹＳ２５ＫＩｇ、Ｌ１０４ＥＡ２９ＹＳ２５ＮＩｇ、Ｌ１０４ＥＡ２９ＹＳ２５ＲＩｇ）を提供する。ここで、＋１０４位のロイシンはグルタミン酸で置換されており、＋２９位のアラニンはチロシンで置換されており、そして＋２５位のセリンはそれぞれ、リシン、アスパラギンまたはアルギニンで置換されている。該三重部位突然変異分子は更に、＋１位のメチオニンから＋１２４位のアスパラギン酸を含有するＣＴＬＡ４部分、＋１２５位の接合アミノ酸残基グルタミン、および＋１２６位のグルタミン酸から＋３５７位のリシンを含有する免疫グロブリン部分を含む。該突然変異分子の免疫グロブリン部分はまた突然変異され得て、その結果＋１３０、＋１３６および＋１３９位のシステインはセリンで置換され、そして＋１４８位のプロリンはセリンで置換される。あるいは、これらの突然変異分子は、−１位のアラニンから＋１２４位のアスパラギン酸を含有するＣＴＬＡ４部分を有し得る。
【００９６】
可溶性ＣＴＬＡ４突然変異分子の別の態様は、Ｂ７と結合するキメラＣＴＬＡ４／ＣＤ２８ホモログ突然変異分子を含む（Peach, R. J.らによる1994 J Exp Med 180：2049-2058）。これらのキメラＣＴＬＡ４／ＣＤ２８突然変異分子の例としては、ＨＳ１、ＨＳ２、ＨＳ３、ＨＳ４、ＨＳ５、ＨＳ６、ＨＳ４Ａ、ＨＳ４Ｂ、ＨＳ７、ＨＳ８、ＨＳ９、ＨＳ１０、ＨＳ１１、ＨＳ１２、ＨＳ１３およびＨＳ１４（米国特許第5,773,253号）を含む。
【００９７】
本発明の好ましい態様は、例えばＣＴＬＡ４Ｉｇ分子（図２０に示す；これは、＋１位のメチオニンで開始し、そして＋３５７位のリシンで終止する）などの可溶性ＣＴＬＡ４分子、および可溶性ＣＴＬＡ４突然変異体Ｌ１０４ＥＡ２９ＹＩｇ（図１５に示す；これは、＋１位のメチオニンで開始し、そして＋３５７位のリシンで終止する）である。本発明は更に、本発明の可溶性ＣＴＬＡ４分子に対応するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含有する核酸分子を提供する。１態様において、該核酸分子はＤＮＡ（例えば、ｃＤＮＡ）またはそのハイブリッドである。ＣＴＬＡ４ＩｇをコードするＤＮＡ（図２０）は、１９９１年５月３１日にアメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）（10801 University Blvd., Manassas, VA 20110-2209）に寄託されており、このものはＡＴＣＣ受託番号ATCC 68629を有する。Ｌ１０４ＥＡ２９ＹＩｇをコードするＤＮＡ（これは、図１５に含まれる配列）は、ＡＴＣＣに２０００年６月１９日に寄託され、このものはＡＴＣＣ受託番号PTA-2104号を有する。あるいは、該核酸分子はＲＮＡまたはそのハイブリッドである。
【００９８】
加えて、本発明は本発明のヌクレオチド配列を含むベクターを提供する。発現ベクターの例としては、以下のものを含むが、これらに限定されない：哺乳動物宿主細胞のベクター（例えば、ＢＰＶ−１、ｐＨｙｇ、ｐＲＳＶ、ｐＳＶ２、ｐＴＫ２（モレキュラークローニング；A Laboratory Manual, ２版, Sambrook, FritchおよびManiatisによる1989, Cold Spring Harbor Press）；ｐＩＲＥＳ（Clontech）；ｐＲｃ／ＣＭＶ２、ｐＲｃ／ＲＳＶ、ｐＳＦＶｌ（Life Technologies）；ｐＶＰａｋｃベクター、ｐＣＭＶベクター、ｐＳＧ５ベクター（Stratagene））、レトロウイルスベクター（例えば、ｐＦＢベクター（Stratagene））、ｐＣＤＮＡ−３（Invitrogen）またはそれらの改変体、アデノウイルスベクター、アデノ関連ウイルスベクター、バキュロウイルスベクター、酵母菌ベクター（例えば、ｐＥＳＣベクター（Stratagene））を含むが、これらに限定されない。
【００９９】
宿主ベクター系をまた提供する。該宿主ベクター系は、適当な宿主細胞中での本発明のベクターを含む。適当な宿主細胞の例としては、原核生物細胞および真核生物細胞を含むが、これらに限定されない。本発明の実施によれば、真核生物細胞はまた適当な宿主細胞である。真核生物細胞の例としては、いずれかの動物細胞（これは、一次または不死化の酵母菌（例えば、サッカロミセスセレビシエ、スキゾサッカロミセス・ポンベおよびピチア・パススリシス(Pichia pastoris)）および植物細胞を含む。骨髄腫、ＣＯＳおよびＣＨＯ細胞は、宿主細胞として使用することができる動物細胞の例である。あるＣＨＯ細胞としては例えば、ＤＧ４４（Chasinらによる1986 Som. Cell. Molec. Genet. 12：555-556；Kolkekarによる1997 Biochemistry 36：10901-10909)、ＣＨＯ−Ｋ１（ATCC番号CCL-61）、ＣＨＯ−Ｋ１ Ｔｅｔ−Ｏｎセルライン（Clontech）、ＣＨＯ（ECACC 85050302（CAMR, Salisbury, Wiltshire, UK）と記す）、ＣＨＯクローン１３（GEIMG, Genova, IT））、ＣＨＯクローンＢ（GEIMG, Genova, IT）、ＣＨＯ−Ｋ１／ＳＦ（ECACC 93061607（CAMR, Salisbury, Wiltshire, UK）と記す）、およびＲＲ−ＣＨＯＫ１（ECACC 92052129（CAMR, Salisbury, Wiltshire, UK）と記す）を含むが、これらに限定されない。典型的な植物細胞としては例えば、タバコ（全植物、細胞培養物またはカルス）、トウモロコシ、ダイズおよびイネの細胞を含む。トウモロコシ、ダイズおよびイネの種もまた許容され得る。
【０１００】
本発明のＣＴＬＡ４突然変異分子は、天然に存在するポリペプチドとして、または天然、合成、半合成または組換えのいずれかの供給源から単離することができる。したがって、該ＣＴＬ４突然変異ポリペプチド分子は、いずれかの種（これは、特にウシ、ヒツジ、ブタ、マウスおよびウマを含むが、ヒトが好ましい哺乳動物）由来の天然に存在するタンパク質として単離することができる。あるいは、該ＣＴＬＡ４突然変異ポリペプチド分子は、原核生物宿主細胞または真核生物宿主細胞中で発現する組換えポリペプチドとして単離することができたり、または化学的に合成されるポリペプチドとして単離することができる。
【０１０１】
当該分野の当業者は容易に標準的な単離方法を用いて、単離されたＣＴＬＡ４突然変異分子を得ることができる。単離の性質および程度は、該単離される分子の供給源および使用目的によるであろう。
【０１０２】
ＣＴＬＡ４突然変異分子およびその断片または誘導体は、組換え方法によって産生することができる。したがって、野生型ＣＴＬＡ４分子をコードする単離されるヌクレオチド配列は突然変異を導入するために操作されて、その結果該ＣＴＬＡ４突然変異ポリペプチド分子をコードするヌクレオチド配列を生じる。例えば、該ＣＴＬＡ４突然変異分子をコードするヌクレオチド配列は、プライマーおよびＰＣＲ増幅方法を用いた部位特異的な突然変異誘発法によって得ることができる。該プライマーは、所望する突然変異を導入するために設計された特定の配列を含むことができる。あるいは、該プライマーを、ランダム突然変異を導入するためにランダム化されるかまたは半ランダム化された配列を含むように設計することができる。標準的な組換え法（Molecular Cloniyzg；A Laboratory Maiiual, 2版, Sambrook, FritchおよびManiatisによる1989, Cold Spring Harbor Press）およびＰＣＲ法（米国特許第4,603,102号）を、ＣＴＬＡ４突然変異ポリペプチドをコードするＣＴＬＡ４突然変異ポリヌクレオチドを得て且つ単離するのに使用することができる。
【０１０３】
本発明は免疫系疾患の処置における使用のための医薬組成物を含み、該組成物は医薬的に有効な量の可溶性ＣＴＬＡ４分子を含む。ある態様において、該免疫系疾患は、ＣＤ２８／ＣＴＬＡ４／Ｂ７相互作用によって媒介される。該可溶性ＣＴＬＡ４分子は、野生型配列を持つ可溶性ＣＴＬＡ４分子、および／またはＣＴＬＡ４の細胞外ドメイン内に１つ以上の突然変異を有する可溶性ＣＴＬＡ４分子であることが好ましい。該医薬組成物としては、可溶性ＣＴＬＡ４タンパク質分子および／または核酸分子、および／または該分子をコードするベクターを含むことができる。好ましい態様において、該可溶性ＣＴＬＡ４分子は、図２０または１５のいずれかに示す通り、ＣＴＬＡ４の細胞外ドメインのアミノ酸配列（それぞれ、ＣＴＬＡ４ＩｇまたはＬ１０４ＥＡ２９Ｙである）を有する。該可溶性ＣＴＬＡ４突然変異分子は本明細書に開示するＬ１０４ＥＡ２９ＹＩｇであることがより一層好ましい。該組成物は加えて、他の治療学的な薬物（これは、薬物毒、酵素、抗体または接合体を含むが、これらに限定されない）を含み得る。
【０１０４】
当該分野における標準的な実施の通り、当該分野の当業者によって知られる許容し得る担体または補助剤と一緒に混合する、本発明の分子を含有する医薬組成物を提供する。該医薬組成物は、適当な担体および補助剤を含むことが好ましく、これらは本発明の分子（例えば、可溶性ＣＴＬＡ４分子、例えばＣＴＬＡ４ＩｇまたはＬ１０４ＥＡ２９Ｙ）と組み合わせる場合に、その分子の活性を保持し、そして被験者の免疫系に対して非反応性であるいずれかの物質を含む。これらの担体および補助剤は例えば、イオン交換剤、アルミナ、ステアリン酸アルミニウム、レシチン、血清タンパク質（例えば、ヒト血清アルブミン）、緩衝物質（例えば、リン酸、グリシン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、飽和植物性脂肪酸の部分的なグリセリド混合物、リン酸緩衝生理食塩水、水、乳液（例えば、油／水の乳液）、塩または電解質（例えば、硫酸プロタミン、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素カリウム、塩化ナトリウム、亜鉛塩、コロイド状シリカ、トリケイ酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、セルロースベースの基質およびポリエチレングリコール）を含むが、これらに限定されない。他の担体もまた、減菌溶液；錠剤（これは、被覆した錠剤およびカプセル剤を含む）を含むことができる。典型的に、それらの担体は、賦形剤（例えば、デンプン、ミルク、糖（例えば、スクロース、グルコース、マルトース）、あるタイプの粘土、ゼラチン、ステアリン酸もしくはその塩、ステアリン酸のマグネシウムもしくはカルシウム、タルク、植物性の脂肪もしくは油、ガム、グリコールまたは他の公知の賦形剤を含む。それらの担体はまた、芳香添加物および着色添加物または他の成分をも含むことができる。それらの担体を含有する組成物は、よく知られる通常の方法によって製剤化される。それらの組成物はまた、様々な脂質組成物（例えば、リポソーム）、並びに様々な高分子量の組成物（例えば、ポリマーミクロスフェア）に製剤化することもできる。
【０１０５】
免疫系疾患のための治療学的な医薬組成物を含有するキットをまた、本発明に包含する。１態様において、本発明の１つ以上の医薬組成物を含有するキットを使用して、免疫系疾患を処置する。例えば、該医薬組成物は、Ｂ７−陽性細胞上でＢ７分子と結合することによって該Ｂ７分子がＴ−細胞上でＣＴＬＡ４および／またはＣＤ２８と結合するのを遮断する、可溶性ＣＴＬＡ４突然変異分子の有効な量を含む。更に、該キットは、本発明の医薬組成物と合わせて用いる１つ以上の免疫抑制剤を含み得る。潜在的な免疫抑制剤としては例えば、副腎皮質ステロイド、非ステロイド性抗炎症薬（例えば、Ｃｏｘ−２インヒビター）、シクロスポリンプレドニゾン、アザチオプリン、メトトレキセート、ＴＮＦαのブリッカーまたは拮抗薬、インフリキシマブ、炎症性サイトカインを標的とするいずれかの生物学的な薬物、ヒドロキシクロロキン、スルファサラゾピリン、金塩、エタネルセプトおよびアナキンラを含むが、これらに限定されない。
【０１０６】
以下の実施例は、被験者においてキメラ化を確立するために、ブスルファンおよびＴ細胞欠乏骨髄を用いた効果を例示するのに提示する。該実施例はまた、臓器組織移植拒絶反応を抑制しそして異常血色素症を処置するために、ブスルファン、Ｔ細胞欠乏骨髄および同時刺激遮断薬を用いた効果をも例示する。該方法論および結果は、処置の意図する目標および使用する方法に非常によって変わり得る。該実施例は、いかなる形でも本発明の範囲を限定することを意図するものではない。
【０１０７】
（実施例）
一般的な方法
マウス：
成体雄性６〜８週齢Ｃ５７ＢＬ／６（Ｈ−２ｂ）、Ｂａｌｂ／Ｃ（Ｈ−２ｄ）、Ｃ３Ｈ／ＨｅＪ（Ｈ−２ｋ）、Ｃ５７ＢＬ／６Ｓｃｉｄ（Ｈ−２ｂ）マウスを、Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME）から得た。Ｃ５７ＢＬ／６ＪＨｂｂｄ３ｔｈ雄性マウス（Ｈ−２ｂ）は、Dr. David Archerによって提供された。すべてのマウスを、特定の病原体のない条件下で施設のガイドラインに従って収容した。
【０１０８】
骨髄の調製および処置レジメ：
骨髄を、通常の方法を用いて脛骨、大腿骨および上腕骨からフラッシュした。抗−ＣＤ３（Pharmingen, San Diego, CA）または抗−ＣＤ９０抗体、磁気細胞ソーティング（ＭＡＣｓ）分離カラムシステム（Miltenyi, Auburn, CA）を用いた鉄(II)−磁気Ｔ細胞欠乏を行ない、そしてフローサイトメトリー（抗−ＣＤ３、抗−ＣＤ４、抗−ＣＤ８および抗−ＣＤ５の抗体, Pharmingen, San Diego, CA）によって確認した。赤血球の溶解は、トリズマ(Trizma)塩基の塩化アンモニウム溶液を用いて行なった。該骨髄細胞を２×１０７細胞／５００μＬの減菌生理食塩水で再懸濁し、該レシピエント被験者に静脈内注射した。ある実験において、ハムスター抗−マウスＣＤ４０Ｌ（MR1, Bioexpress, Lebanon, NH）およびＣＴＬＡ４−Ｉｇ（Bristol-Myers Squibb, Princeton, NJ）を０、２、４、６、１４および２８日目に投与した（５００μｇ／静脈内投与）；０日目は骨髄移植の日を示す。ＣＤ４＋Ｔ細胞のインビトロ欠乏は、１００μｇの抗−ＣＤ４ ｍＡｂ（ＧＫ１．５）を−３、−２、−１、０日目およびその後１週間に１回１００μｇ／ｋｇを腹膜内投与することによって達成した；０日目は、該移植の日を表す。
【０１０９】
皮膚移植：
十分な厚さの皮膚移植片（〜１ｃｍ２）をレシピエントマウスの背側の胸部に移植し、そしてバンドエイド（登録商標）を用いて７日間固定した。
【０１１０】
フローサイトメトリー分析：
末梢血液を、蛍光色素接合抗体（抗−ＣＤ３、抗−ＣＤ５、抗−ＣＤｌｌｂ、抗−ＧＲ１、抗−Ｂ２２０、抗−Ｈ−２Ｋｄ、抗−Ｈ−２Ｋｂ、抗−Ｖβｌｌ、抗−Ｖβ５．１／５．２、抗−Ｖβ８．１／８．２（Pharmingen）、抗−ＣＤ４、抗−ＣＤ８（Caltag Laboratories, Burlingame, CA）または免疫グロブリンイソ型コントロール（Pharmingen）を用いて染色し、続いて赤血球を溶解させそして全血溶解キット（R+D Systems, Minneapolis, MN）を用いて洗浄することによって分析した。染色された細胞を、FACSCaliburフローサイトメーター（Becton Dickinson, Mountain View, CA）上でCellquestソフトウェアを用いて分析した。
【０１１１】
細胞毒性アッセイ：
Ｂａｌｂ／ｃ  ＣＬ.７細胞を標的として使用し、そして７５０μＣＩ５１Ｃｒ（NEN Life Science Products, Boston, MA）と一緒に３７℃で９０分間、−１×１０７／ｍＬで懸濁させた。標的細胞を３回洗浄し、そして１×１０４標的／ウェルでプレートした。エフェクターはナイロンウールを通過させた脾細胞として調製し、このものを適当な割合で４つにプレートした。全溶解は、２％トリトン−Ｘを標的に加え、そしてエフェクター細胞非存在でＲ−１０を添加することにより同時溶解させることによって測定した。５時間後に、該上清を収集し、γ−計数器によって分析した。具体的な溶解パーセントは、式：
１００×（未知のｃｐｍ−同時ｃｐｍ）／（全ｃｐｍ−同時ｃｐｍ）
を用いることによって測定した。
【０１１２】
ＩＦＮγ  ＥＬＩＳｐｏアッセイ：
同種特異的なＴ−細胞反応を、実験上のＣ５７ＢＬ／６マウス由来のナイロンウールを通過させた脾細胞を用いたＩＦＮγ酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳｐｏｔ）によって測定した。該捕獲抗体、ラット抗−マウスＩＦＮγ（クローンＲ４−６Ａ２；Pharmingen）を、エステル−セルロース−ブトムプレート（Millipore, France）内で４℃で終夜、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（１００μＬ／ウェル）中、４μｇ／ｍＬでインキュベートした。洗浄後に、様々な希釈のエフェクター細胞を加えた。終夜の過渡的な接着によって得られる刺激物質、ドナー樹状細胞を照射し（２０００ラド）、そして刺激物質のエフェクターに対する比率が１：１０で加えた。エフェクター細胞を刺激物質のあるなしで３７℃で１４〜１６時間インキュベートした。培養期間後に、ビオチニル化した抗−マウスＩＦＮγ（クローンＸＭＧ１．２；Pharmingen）を４μｇ／ｍＬ（ウェル当たり１００μＬ）で加えた。４℃で２〜３時間後に、非結合抗体を除去し、そしてホースラディシュペルオキシダーゼ−アビジンＤ（Sigma, St. Louis, MO）を加えた。スポットを、０．０１５％Ｈ２Ｏ２と一緒に基質３−アミノ−９−エチル−カルバゾール（Sigma）と一緒に展開させた(develop)。各々のスポットはＩＦＮγ分泌型細胞であり、そして各ウェル中でカウントしたスポットの数を該希釈時にプレートした細胞の総数で割ることによって、該周波数を測定した。
【０１１３】
ＣＦＳＥアッセイ：
脾臓細胞および腸間膜リンパ節細胞を、実験マウスから収集した。赤血球を溶解してナイロンウールを通した後に、細胞を１０μＭカルボキシフルオロセインスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ；Molecular Probes, Eugene, OR）中でインキュベートした。次いで、照射した（１８００ラド）Ｂａｌｂ／ｃ、Ｃ５７ＢＬ／６またはＣ３Ｈマウスに１×１０７〜１×１０９のＣＦＳＥ標識化細胞を静脈内で与えた。６６〜７２時間後に、脾臓細胞をレシピエントから収集し、該赤血球を溶解し、そして残りの細胞を上記の通り、抗−ＣＤ４および抗−ＣＤ８（Pharmingen）を用いて染色し、そしてフローサイトメトリーによって分析した。該細胞中でのＣＦＳＥ濃度は、各分裂後に５０％だけ低下する。
【０１１４】
血液学的な追跡：
ヘマベット(Hemavet)（登録商標）シリーズの多種血液学装置（1500 R series, CDC technologies, Oxford, CT）を用いて、全血球計算値を測定した。
【０１１５】
ヘモグロビン電気泳動：
ヘモグロビン電気泳動は、シスタミンヘモグロビン酢酸セルロースゲル電気泳動法（WhitneyらによるBiochem. Genet., 16：667-672 (1978）を用いて実施した。要するに、２μＬの全血を７μＬの溶液（これは、８３ｍＭのシスタミン、０．２５％の水酸化アンモニウムおよび０．０１Ｍのジチオトレイトール（ＤＴＴ）を含有する）と一緒に混合した。該混合物を、酢酸セルロースゲル（Helena Labs, Beaumont, TX）に適用する前に１５分間インキュベートし、そしてSupraHeme緩衝液（Helena Labs）中で３５０ボルトで４５分間電気泳動した。ヘモグロビンの視覚化のために、ゲルをポンシュー(Ponceau)Ｓ（Sigma, St. Louis, MO）を用いて染色した。
【０１１６】
網状赤血球のカウント数：
網状赤血球を、ＲＮＡ特異的標識チアゾールオレンジ（Sigma, St. Louis, MO）、抗−ＣＤ４５およびＴｅｒ−１１９抗体（Pharmingen, San Diego, CA）を用いて全血を染色することによって定量化した。網状赤血球を、Ｔｅｒ１１９陽性、チアゾールオレンジ陽性およびＣＤ４５陰性である細胞として定義する。
【０１１７】
実施例１
同時刺激経路の遮断およびブスルファンの投与により、骨髄抑制の非存在で混合キメラ化を滴定することが可能となる。
本実施例は、ブスルファンの被験者ヘの投与により、骨髄抑制の非存在で混合キメラ化を滴定することが可能となることを証明する。
【０１１８】
Ｃ５７ＢＬ／６（Ｂ６）レシピエントマウス（Ｈ−２ｂ, ＣＤ４５．２）に、１回ブスルファン用量（０ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇまたは３０ｍｇ／ｋｇの腹膜内；ＬＤ５０用量が１３６ｍｇ／ｋｇ以下；髄レスキューを有する（Yeagerらによる上記））を２×１０７  Ｂ６．ＳＪＬ（Ｈ−２ｂ, ＣＤ４５．１）Ｔ細胞欠乏骨髄細胞を静脈内注入の１日前に投与した。上に記載する通り、末梢赤血球フローサイトメトリーによって測定されるドナー造血性キメラ化のレベルは、投与したブスルファンの用量に正比例した（図１Ａ）。ブスルファンをＴ細胞欠乏骨髄細胞の投与の６時間または１２時間前に投与した場合に、同様な結果が得られた。
【０１１９】
同時刺激遮断において混合同種キメラ化および移植免疫寛容性を誘発する同様な「ミクロな条件付け(conditioning)」療法の能力を調べた。「免疫寛容性」用量のドナー骨髄細胞を同時刺激経路の遮断薬（例えば、ＣＤ２８／Ｂ７およびＣＤ４０／ＣＤ４０Ｌ；同時刺激遮断薬）と合わせて投与することは、ドナー反応性末梢Ｔ細胞を失活させる（SayeghらによるTransplantation, 64：1646-1650 (1997)；PearsonらによるTransplantation, 61：997-1004 (1996)；MarkeesらによるJ. Clin. Invest., 101：2446-2455 (1998)）。
【０１２０】
開始ドナー細胞注入の５日後に、１回用量のブスルファンを投与し、続いて翌日に第２の「生着性」用量の同種間Ｔ細胞欠乏骨髄を投与した。特に、Ｂ６マウスに、同種間Ｔ細胞欠乏骨髄を静脈内投与し（Ｂａｌｂ／ｃ（Ｈ−２ｄ）２×１０７細胞；０日目および６日目）、そしてブスルファンの用量を変えながら（０ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇおよび３０ｍｇ／ｋｇ；５日目に）、同時刺激遮断薬（５００μｇ  ＣＴＬＡ４−Ｉｇおよび抗−ＣＤ４０Ｌ；０日目、２日目、４日目、６日目、１４日目および２８日目）を投与した。コントロール群は、処置なし、Ｔ細胞欠乏骨髄のみ、ブスルファンとＴ細胞欠乏骨髄、ブスルファンのみ、同時刺激遮断薬のみ、またはＴ細胞骨髄と同時刺激遮断薬のいずれかを与えた動物を含めた。
【０１２１】
該実験的な処置を与えたすべての動物が、＞２２０日間持続する高レベルな多系統造血性キメラ化を発生した（図１Ｂ）。コンジェニックな実験と同様に、キメラ化のレベルは、ブスルファンの用量に正比例した。コントロール群の動物は、いずれの時点でも造血性キメラ化を示さなかった（図１Ｂおよび１Ｃ）。同種間移植において見られる造血性キメラ化のレベルはコンジェニックなＴ細胞欠乏骨髄を与えたマウスにおいて見られるレベルと同様であり、このことはドナー細胞および同時刺激遮断薬の添加が同種間Ｔ細胞欠乏骨髄移植に対する免疫学的な障壁を有効に除くことを示す。
【０１２２】
初期の実験はレシピエントの条件付けなしで生着性用量（これは、最近の報告で使用された量のわずか１０分の１である）のＴ細胞欠乏骨髄を用いて高レベルのキメラ化を達成しているが（WekerleらによるNature Medicine, 6：464-469 (2000)；DurhamらによるJournal of Immunology. 165：1-4 (2000)）、より低用量のＴ細胞欠乏骨髄が安定な混合キメラ化を誘発することができるであろうことが考え得る。
【０１２３】
生着性用量のＴ細胞欠乏骨髄（６日目）を、２×１０７〜０まで滴定した。移植の＞１２０日後に、末梢性ドナー細胞は生着性用量のＴ細胞欠乏骨髄と直接的に相関した（２×１０７−６５％、１×１０７−５７％、５×１０６−３７％、２×１０６−２６％；図１Ｄ）。安定なマクロキメラ化(macrochimerism)は、２×１０６と同じ低い生着性用量のＴ細胞欠乏骨髄細胞（非骨髄抑制性療法を用いた上記の報告よりも１０倍低い用量のＴ細胞欠乏骨髄細胞）を用いることによって得た。
【０１２４】
これらの結果は、得られたキメラ化のレベルは骨髄の用量を変えるかまたはブスルファンの用量を改変するかのいずれかによって滴定することができることを示す。他の実験において、照射した骨髄または脾臓細胞を、「免疫寛容性」容量の骨髄で置き換えることができる。
【０１２５】
トミタ(Tomita)らは、３Ｇｙ全身照射（ＷＢＩ）が同系多能性造血性幹細胞の確かな長期間の生着を得るのに必要とされる最少用量であると報告している。加えて、彼等はＷＢＩベースの骨髄移植プロトコールに関連する毒性プロフィールを評価し、そして３Ｇｙが本質的に非骨髄抑制であると結論付けた（トミタらによるBlood, 83：939-948 (1994)）。更に、３Ｇｙ  ＷＢＩおよび同時刺激遮断薬を含む同様なプロトコールが同種間モデルにおいて確かなレベルのキメラ化を得るのに十分であることが分かっている（WekerleらによるJ. Exp. Med., 187：2037-2044 (1998)）。
【０１２６】
比較のために、ブスルファンベースプロトコール（０、２、４および６日目に、２×１０７Ｂａｌｂ／ｃ  Ｔ細胞欠乏骨髄を５００μｇの同時刺激遮断薬と一緒にＣ５７ＢＬ／６レシピエントに与える；−１日目に２０ｍｇ／ｋｇのブスルファンを与える；ｎ＝５）の毒性、および照射ベースプロトコール（２×１０７Ｂａｌｂ／ｃドナー骨髄細胞を、０日目に４５０μｇの抗−ＣＤ４０Ｌと、２日目に５００μｇのＣＴＬＡ４−Ｉｇと、および０日目に３Ｇｙと一緒にＣ５７ＢＬ／６レシピエントに与える；ｎ＝５）の毒性を評価した。図２に示す通り、両方のプロトコールは本質的に非骨髄抑制である（白血球数最下点(nadir)；照射ベースプロトコールの１３日目は２．８６×１０３／ｍｍ３であり、ブスルファンベースプロトコールの１３日目は４．０４×１０３／ｍｍ３である）。更に、２００以上の動物を、ブスルファンベース療法を用いて処置すると、１だけが死亡した（麻酔が原因）。これらの結果は、滴定可能な高レベルのキメラ化をガンマ線照射なしで達成することができることを証明する。
【０１２７】
実施例２
同時刺激遮断薬／ブスルファン療法は、異常血色素症を処置する。
この実施例は、実験的な異常血色素症モデルにおけるミクロ条件付けした同時刺激遮断キメラ化誘発プロトコールの効果を証明する。
【０１２８】
該キメラ化誘発プロトコールがβ−タラセミアのＨｂｂｔｈ２マウスモデルにおける赤血球コンパートメントの置換を促進することができる大きさを評価した（SheheeらによるProc. Natl. Acad. Sci. USA, 90：3177-3181 (1993)）。マウス成体β−主グロブリン遺伝子の挿入破壊によって作製されるこのβ−タラセミアモデルは、ホモ接合体の出生時の死亡を与え、一方でヘテロ接合体は生き残るが、ヒトβタラセミア中間体に似た表現型（これは赤血球の短時間の生存、貧血症および網状赤血球を特徴とする）を示す。
【０１２９】
βタラセミアのヘテロ接合体レシピエント（Ｈ−２ｂ）を、免疫寛容性用量（２×１０７細胞）のＢａｌｂ／ｃ  Ｔ細胞欠乏骨髄（０日目）、同時刺激遮断薬（０、２、４、６日目）、２０ｍｇ／ｋｇのブスルファン（５日目）および生着性用量（２×１０７細胞）のＢａｌｂ/ｃ  Ｔ細胞欠乏骨髄（６日目）を用いて処置した。コントロールレシピエントに、ブスルファンなしで同時刺激遮断薬およびＴ細胞欠乏骨髄を与えた。白血球と赤血球とのキメラ化、ヘモグロビンレベル（Ｈｂ）および網状赤血球計数の評価を、プロトコール誘発の前、並びに骨髄移植の２週間後、４週間後およびその後毎月１回行なった。
【０１３０】
Ｂ６レシピエントを用いる上記の実験と同様に、同時刺激遮断薬とＴ細胞欠乏骨髄のみを与えたレシピエントにおいてではなく、同時刺激遮断薬、Ｔ細胞欠乏骨髄およびブスルファンを用いて処置したレシピエントにおいて、白血球キメラ化が発生した。更に、機能的なＢａｌｂ／ｃの主要なＨＢβアレルによる病理的なＨＢβバンドのほぼ完全に近い置換が、コントロール群ではなく、キメラレシピエントにおいて観察された（図３Ａ）。レーン１は処置していないタラセミアＨｂ（少量バンドおよび単一バンド）を示し、そしてレーン２はドナー（Ｂａｌｂ／ｃ、少量バンドおよび主バンド）を示す。レーン３〜４は、５日目にブスルファン（２０ｍｇ／ｋｇ）、同種間Ｔ細胞欠乏骨髄（Ｂａｌｂ／ｃ）（０日目および６日目）および同時刺激遮断薬を与えたタラセミアの動物（＞１５０日目）を示す。異常なタラセミアＨｂは、正常なＢａｌｂ／ｃヘモグロビンによってほとんど完全に置換される。レーン５および６は、ブスルファン非存在であるが骨髄および同時刺激遮断薬を用いて処置したタラセミア動物由来のＨｂを示す。存在するＨｂのみがレシピエント由来であることは明白な証拠である。
【０１３１】
プロトコール誘発の前に、タラセミア末梢血における網状赤血球のパーセントは、ブスルファンを与えていない動物において１２．０％（図３Ｂ；クローズド円、ｎ＝３）、およびブスルファンを用いて処置した動物において１３．７％（図３Ｂ；クローズド正方形；ｎ＝３）であった。プロトコール誘発後の１２０日目までに、ブスルファンを用いて処置したこれらの動物はそれらの網状赤血球が正常化され（４．２％）、一方で非キメラ化動物はそれらの末梢血において異常な高レベルの網状赤血球（１０．１％）を維持した。該灰色バーは、野生型Ｂ６動物における正常な網状赤血球のカウント数である（ｎ＝１０）。誤差のバーは、該平均値の標準誤差である。キメラのタラセミアマウスにおける網状赤血球数およびヘモグロビンレベル（Ｈｂ）は正常化され、このことは該障害の病因が除去されたことを示す。
【０１３２】
実施例３
同時刺激遮断薬／ブスルファンプロトコールは、臓器組織移植の免疫寛容性を促進する。
この実施例は、ミクロ条件付けした同時刺激遮断のキメラ化誘発プロトコールの、固形臓器組織の移植に及ぼす影響を証明する。「ミクロ条件付け」且つ同時刺激遮断のプロトコールがプロトコールの開始時に置かれた固形臓器の同種移植片に対する免疫寛容性を誘発することができるかどうかを調べるために、免疫学的に硬直した(rigorous)（Ｂａｌｂ／ｃからＢ６）皮膚移植片モデルを使用した。
【０１３３】
上記の通り、Ｂ６マウスに２×１０７Ｂａｌｂ／ｃ  Ｔ細胞欠乏骨髄細胞、同時刺激遮断薬およびブスルファン（２０ｍｇ／ｍｇ）を与えた。加えて、動物に０日目にＢａｌｂ／ｃ皮膚移植片を与えた。
【０１３４】
コントロール群（処置せず、オープンひし形、ｎ＝３；Ｔ細胞欠乏骨髄とブスルファン、オープン三角形、ｎ＝３；または同時刺激遮断薬とブスルファン；オープン正方形、ｎ＝３）全てが、Ｂａｌｂ／ｃ同種移植片を直ちに拒絶した（図４Ａ）。ブスルファン非存在でＴ細胞欠乏骨髄と同時刺激遮断薬を与えたレシピエント（クローズド正方形、ｎ＝７）は、非常に大きく延長された生存を示したが（図４Ａ）、最後にはそれらの同種移植片を拒絶した。
【０１３５】
それに対して、ブスルファン、Ｔ細胞欠乏骨髄および同時刺激遮断薬を与えた動物（クローズド円形、ｎ＝７）はそれらの皮膚移植片を＞２５０日の間許容し、拒絶反応の証拠はなかった（図４Ａ）。同様な結果が、相互系統の組み合わせにおいて得られた。重要なことに、臨床的な展望から、ドナー特異的な皮膚移植片の同時設置は造血性キメラ化の発生を妨げなかった。
【０１３６】
プロトコール開始の１００日後に、動物を第２のドナー（Ｂａｌｂ／ｃ、Ｈ−２ｄ）および第三者（ｃ３Ｈ、Ｈ−２ｋ）の皮膚移植片を用いて再チャレンジさせた。１００日目に、一次の皮膚移植片は骨髄中で生存し、同時刺激遮断薬群（クローズド正方形、ｎ＝７）の場合は８６％であって、一方で同時刺激遮断薬、骨髄、ブスルファン（クローズド円形、ｎ＝７）は１００％の許容性を享受した。第２のドナー皮膚移植片の設置後に、ブスルファンなしで骨髄および同時刺激遮断薬を与えた動物は一次的なおよび二次的なドナー皮膚移植片の両方を直ちに拒絶した（生存時間の中央値（ＭＳＴ）は７日である）。それに対して、同時刺激遮断薬、骨髄、ブスルファンを用いて処置した動物に置いた一次的な皮膚移植片は、二次的なドナー特異的皮膚移植片を再移植した後でさえも不確定に（＞２５０日）生存した。
【０１３７】
次いで、骨髄、同時刺激およびブスルファンを与えた動物を、最初の移植のほぼ１００日後にドナー（Ｂａｌｂ／ｃ）または第三者（Ｃ３Ｈ／ＨｅＪ）の皮膚移植片を用いて再チャレンジした（図４Ｂ）。コントロール動物は、Ｂａｌｂ／ｃおよびＣ３Ｈ／ＨｅＪの皮膚移植片の両方を直ぐに拒絶した（それぞれ、ＭＳＴは１０日および１２日である）。キメラ動物は該第三者の皮膚移植片を直ぐに拒絶し（図４Ｂ、オープン円形、ＭＳＴは１０日）、一方で第２のドナー移植片は１５０日間にわたって１００％の生存率を続けた（図４Ｂ、クローズド円形）。同様な結果は、別の実験において得られた。
【０１３８】
混合キメラ化の誘発なしのＴ細胞欠乏骨髄および同時刺激経路遮断薬の投与（すなわち、ブスルファン非存在で同時刺激遮断薬およびＴ細胞欠乏骨髄を与えた群）は、一次の同種移植片生存を有意に延長するが、免疫寛容性の持続を促進しなかった（最初の移植片のＭＳＴは１０７日であり、ドナー特異的な再移植片のＭＳＴは８日であった）。それに対して、ブスルファン、Ｔ細胞欠乏骨髄細胞および同時刺激遮断薬を与えたマウスは、高レベルのキメラであり、第２のドナー特異的なＢａｌｂ／ｃ皮膚移植片を一律に許容し（ＭＳＴは＞１２５日）、そしてＣ３Ｈ／ＨｅＪ移植片を直ぐに拒絶した（ＭＳＴは１０日、図４Ｂ）。重要なことに、最初のＢａｌｂ／ｃ皮膚移植片およびキメラ状態は、再チャレンジ後は乱れなかった(unperturbed)（図４Ａ）。
【０１３９】
加えて、１回用量の２×１０７Ｔ細胞欠乏骨髄細胞を皮膚移植の日に用い、Ｔ細胞欠乏骨髄の使用の−２４、−１２または−６時間前に１回用量のブスルファンを用いた場合に、強い免疫寛容性および安定なキメラ化が達成された。
【０１４０】
実施例４
ドナー骨髄および同時刺激遮断薬は抗−ドナーＴ細胞反応を過渡的に除去するが、混合キメラ化は永続的な免疫寛容性に必要である。
早い時点（１０日目）および遅い時点（＞１００日目）の両方でドナー皮膚移植片を用いてチャレンジ後の抗−ドナーＴ細胞細胞溶解性（ＣＴＬ）反応およびＩＦＮγ（ＥＬＩＳｐｏｔ）反応を生じる免疫寛容性および非免疫寛容性のマウスの能力を調べた。脾臓のＴ細胞を、Ｔ細胞欠乏骨髄と同時刺激遮断薬、Ｔ細胞欠乏骨髄とブスルファン、Ｔ細胞欠乏骨髄と同時刺激遮断薬とブスルファン、処置なしのいずれかを与えたＢａｌｂ／ｃ皮膚移植片のＢ６レシピエント、または未処置のＢ６動物から調製した。
【０１４１】
処置していないＢ６マウスは、皮膚移植の１０日後に多数のＩＦＮγ産生細胞（図５Ａ）および強いＣＴＬ反応（図５Ｂ）の両方を生じた。誘発期間中（１０日目）、ＩＮＦγ産生細胞およびＣＴＬ反応の生成の両方が、同時刺激遮断薬物を与えたすべての群において抑制され、そして同時刺激薬および骨髄を与えた動物において（ブスルファンの存在または非存在で、図５Ａおよび図５Ｂ）本質的に抑止(abrogate)された。
【０１４２】
しかしながら、より遅い時点で（最初の皮膚移植および免疫寛容性プロトコールの導入の１００日後）、ブスルファンなしでＴ細胞欠乏骨髄および同時刺激遮断薬を用いて処置した動物は、第２のドナー皮膚移植片を用いて再チャレンジ後に有意な数のドナー反応性ＩＦＮγ産生細胞および抗−ドナーＣＴＬ活性を生じ；それに対して、Ｔ細胞欠乏骨髄、同時刺激遮断薬およびブスルファンを用いて処置した動物は、抗ドナーＣＴＬ活性またはＩＦＮγ反応のいずれもマウントしなかった（図５Ａおよび５Ｃ）。両方の群は、同様な抗第三者（ｃ３Ｈ、Ｈ−２ｋ）反応をマウントした。同様な結果は、２つの別の実験において観察された。
【０１４３】
これらの結果は、同時刺激遮断薬の存在下でＴ細胞欠乏骨髄によって確立されたドナー抗原に対する最初の過渡的な低反応は、恐らく新しい胸腺の移出(emigrants)の出現または調節性Ｔ細胞機能の遅延により時間を越えて弱くなることを示す。それに対して、生着性用量の骨髄の使用前に、１回非骨髄抑制性用量のブスルファンを添加することにより、有意なドナー造血性キメラ化が可能となって、強い長期間持続性のドナー特異的免疫寛容性を生じる。
【０１４４】
実施例５
レシピエントＣＤ４＋Ｔ細胞は、キメラ化および免疫寛容性の発生のために必要であるが、維持のためには必要ではない。
従来の報告は、ＣＤ４０／ＣＤ４０Ｌ遮断およびドナー特異的注入によって誘発される長期間の生存がＣＤ４＋細胞の関与を必要とすることを示している（MarkeesらによるJ. Clin. Invest., 101：2446-2455 (1998)）。しかしながら、混合キメラ化の確立によって免疫寛容性を誘発するプロトコールもまたＣＤ４＋Ｔ細胞を必要とするかどうかということは知られていない。
【０１４５】
この問題を探求するために、骨髄レシピエントを、免疫寛容性誘発の前およびその間に、抗−ＣＤ４モノクローナル抗体を用いてインビトロでＣＤ４＋Ｔ細胞を欠乏させた。ＣＤ４＋細胞のない場合に、ドナー骨髄、２０ｍｇ／ｋｇのブスルファンおよび同時刺激遮断薬（上記の通り）を用いて処置した動物は一様にキメラ化することはできず、このことはキメラ化誘発の間のＣＤ４＋細胞の本質的な役割を意味する（皮膚移植片の場合、ＭＳＴは２９日であった）。
【０１４６】
ＣＤ４＋細胞はまた免疫寛容性／キメラ化の維持に必要であるかどうかをも調べるために、我々はＣＤ４＋細胞の長期間のキメラ（＞３００日）を欠乏させた。ＣＤ４＋細胞が中心的な役割を果たす誘導期間に対して、維持期の間では、ＣＤ４＋細胞の欠乏は皮膚移植片の生存率またはキメラ状態のいずれかをも乱さなかった。
【０１４７】
顕著な調節機構が他の同時刺激遮モデルにおける免疫寛容性の維持において重要な役割を果たし得るという強い証拠が存在するので、我々はまた調節の証拠を調べるために養子移植実験をも行なった（HoneyらによるJ. ImmunoL, 163：4805-4810 (1999)）。我々は、免疫寛容性キメラ化マウス由来のＴ細胞、未処置のＢ６マウス由来のＴ細胞、または免疫寛容と未処置のＴ細胞の混合物を、Ｂａｌｂ／ｃおよびＣ３Ｈ皮膚移植片を与えたＣ５７ＢＬ／６  Ｓｃｉｄマウス（Ｂ６  Ｓｃｉｄ）中に養子移植した。療法の設立後のほぼ１５０日目に（６日目に最後のＴ細胞欠乏骨髄および２８日目に最後の同時刺激遮断薬）、我々のプロトコールを用いてＢａｌｂ／ｃ皮膚移植片（第三者の場合は拒絶するが）に対して特異的に免疫寛容性となったマウスの脾臓から、Ｔ細胞を調製した。次いで、Ｂ６  Ｓｃｉｄマウスに、キメラ免疫寛容性の動物（Ｔ細胞欠乏骨髄、同時刺激遮断薬、ブスルファン）から移した(transfer)５×１０６Ｔ細胞、未処置のＢ６マウス由来の５×１０６Ｔ細胞と混合した免疫寛容性動物由来の細胞、または未処置のＢ６マウス由来の細胞のみを与えた。
【０１４８】
未処置の動物由来のＴ細胞は、ドナー（図５Ｄ、クローズド正方形）および第三者の移植片を直ぐに拒絶した（それぞれ、ＭＳＴは１０日および１２日、図５Ｄ、オープン円形）。それに対して、免疫寛容性動物由来のＴ細胞を与えた動物の１００％（クローズド円形）はＢａｌｂ／ｃ皮膚移植片を許容し（＞７５日）、一方で第三者の同種移植片を拒絶した（ＭＳＴは１２日、図５Ｄ）。しかしながら、未処置のＴ細胞を免疫寛容性Ｔ細胞と一緒に混合する場合、Ｂａｌｂ／ｃ皮膚移植片の速い拒絶反応が観察された（ＭＳＴは１２日、図５Ｄ、クローズド三角形）。
【０１４９】
これらのデータは、Ｔ細胞欠乏骨髄、ブスルファンおよび同時刺激遮断薬の我々のプロトコールを与えた動物由来のＴ細胞が頑強であって、髄ドナーに対して特異的に免疫寛容であることを確認するものであり、そして調節機構は免疫寛容誘発期間中、重要な役割を果たし得るが、免疫寛容がこのモデルにおいて維持されることによって、それらは主要な機構である見込みはないことを示唆する。
【０１５０】
実施例６
アロ反応性Ｔ細胞のクローン欠失は、免疫寛容維持についての主要な機構である。
免疫寛容状態がドナー反応性Ｔ細胞のクローン欠失に関連するかどうかを測定するために、免疫寛容誘発の前、その間およびその後でのＶβ  ＴＣＲセグメントの使用を調べた。
【０１５１】
Ｂａｌｂ／ｃマウスはＴ細胞を有するＶβ１１およびＶβ５を欠乏させ、一方でＢ６マウスはＭＨＣクラスＩＩ分子、Ｉ−Ｅを発現せず、そして〜４−５％のＣＤ４＋Ｔ細胞についてＶβ１１を、および〜２−３％のＣＤ４＋Ｔ細胞についてはＶβ５．１／５．２を使用する（DysonらによるNature, 349：531-534 (1991)；BillらによるJ. Exp. Med., 169：1405-1419 (1989)）。
【０１５２】
コントロール群（同時刺激遮断薬、Ｔ細胞欠乏骨髄またはブスルファン）は、ドナー反応性Ｖβ１１＋またはＶβ５＋ＣＤ４＋Ｔ細胞を欠乏しなかった（図６Ａ)。該Ｖβ１１＋およびＶβ５．１／５．２＋レベルは、野生型Ｂ６レベル（それぞれ、４〜５％および２〜３％）と一致した。それに対して、Ｂａｌｂ／ｃ  Ｔ細胞欠乏骨髄、ブスルファンおよび同時刺激遮断薬療法のレシピエントは、６０日までにＣＤ４＋Ｖβ１１＋およびＣＤ４＋Ｖβ５＋のＴ細胞のほとんど完全な欠失を発生した。ＣＤ４＋Ｔ細胞（これは、約１５〜２０％のＢａｌｂ／ｃにおいて発現する）およびＢ６  ＣＤ４＋Ｔ細胞を有するＶβ８のパーセントは全ての群において同様であって、このことはＴ細胞欠乏が事実上ドナー特異的であることを示す（図６Ａ)。同様な結果は、複数の実験からの＞１００マウスにおいて観察された。
【０１５３】
ＭＭＴｖシステムはアロ反応性についての代理マーカーとして機能するので、インビボでの同種増殖性移植片対宿主疾患（ＧｖＨＤ）アッセイを実施して、残りのアロ反応性の存在を直接的に調べた（LyonsらによるJournal of Immunological Methods, 171 : 131-137 (1994)）。キメラ（Ｔ細胞欠乏骨髄、同時刺激遮断薬、ブスルファン）、非キメラ（Ｔ細胞欠乏骨髄、同時刺激遮断薬）、および未処置の動物由来のＴ細胞を脾臓および腸間膜リンパ節（ＬＮ）から収集した（Ｔ細胞は、移植の＞１００日後に実験動物から収集した）。１０μＭ  ＣＦＳＥを用いて標識化した後に、Ｔ細胞を予め１８００ラドで致死を越えて照射したレシピエントマウス（Ｂａｌｂ／ｃまたはＣ３Ｈ）中に移した。７２時間後に、脾細胞を収集してフローサイトメトリーによって分析した。
【０１５４】
未処置および非キメラ化群の両方由来のＣＤ４＋およびＣＤ８＋  Ｔ細胞はＢａｌｂ／ｃ宿主に対する反応の際に大量の細胞分裂を生じるが、免疫寛容マウス由来のＴ細胞は抗−ドナー増殖性反応を全く生じなかった（図６Ｂ）。しかしながら、第三者（Ｃ３Ｈ）に対する強い増殖性反応は、全ての群において同様であった（図６Ｂ）。レパートリー分析と合わせて、この移植片対宿主疾患モデルにおいて細胞分裂をすることができるＣＤ４＋またはＣＤ８＋のＴ細胞の非存在は、このプロトコールを用いて達成される免疫寛容状態によりドナー特異的Ｔ細胞のほぼ完全な除去を与えるという更なる証拠を提供する。比較結果を、別の実験において観察した。
【０１５５】
実施例７
非骨髄抑制同種間骨髄移植は、鎌状細胞疾患を処置する。
全てのマウスヘモグロビンを欠き、そして代わりにヒトα、γおよび鎌状−β−グロビンを大量に産生するトランスジェニックなノックアウトマウス（PasztyらによるScience, 278：876-878 (1997)）を用いて、鎌状細胞疾患を処置するための本明細書に記載する移植療法の能力を調べた。このマウスモデルは、ヒト鎌状細胞疾患患者に存在する複雑な多数の臓器疾患の特徴のほとんどを複製する。
【０１５６】
本明細書に記載する結果は、初めて、ブスルファンを用いた非骨髄抑制の前条件付けを同時刺激遮断薬と組み合わせることにより、安定な混合キメラ化によってマウスの鎌状細胞疾患の一貫した表現型療法を与えることができることを証明する。更に、この療法は完全なＭＨＣ−非適合性ドナー骨髄の場合に達成される。
【０１５７】
方法
鎌状マウスはLawrence Berkley National LaboratoryでのDr. Pasztyによって供され、このものはエモリー(Emory)大学で現在維持している。ヒトαおよびβ鎌状グロビンを排他的に発現する移植レシピエント（雄性；７〜１２週齢）は選択的な交配によって繁殖され、そして混合性の遺伝的背景で存在する（系統：ＦＶＢ／Ｎ；１２９；ＤＢＡ／２；Ｃ５７ＢＬ／６および黒色スイス(Black Swiss)）。Ｂａｌｂ／ｃマウスを骨髄ドナーとして使用した。Ｂａｌｂ／ｃおよびＣ３Ｈ／ＨｅＪマウスは、ドナー特異的免疫寛容性の試験のために使用し、そしてＣ５７ＢＬ／６マウスは血液学的に正常なコントロールマウスとして使用した。
【０１５８】
レシピエントマウスに、上記の通り、２×１０７Ｂａｌｂ／ｃ  Ｔ−細胞欠乏（抗−ＣＤ３、抗−ＣＤ４、抗-ＣＤ８の抗体、Miltenyi Inc., Auburn, CA）骨髄（ＴＤＢＭ）を０日目に、ＢＵＳＵＬＦＥＸ（ススルファン  ２０ｍｇ／ｋｇ、腹膜内注入, Orphan Medical, Minnetonka, MN）を−１日目に、並びに５００μｇのハムスター抗マウス−ＣＤ４０ＬｍＡｂ（MR1, BioExpress, Lebanon, NH）および５００μｇのヒトＣＴＬＡ４−Ｉｇ（Bristol-Myers Squibb, Princeton, NJ）（同時刺激遮断薬として）を骨髄移植に対して０、２、４、６日目に腹膜内注入で与えた。コントロールマウスに、同時刺激遮断薬およびＴ細胞欠乏骨髄を与え、ブスルファンは与えなかった。ベースラインの血液学的なパラメーターを移植の１週間前に測定し、そしてキメラ化を移植後、２週間間隔、４週間間隔および１ヶ月間隔で調べた。
【０１５９】
蛍光色素−接合抗体（抗−ＣＤ３、抗−ＣＤ５、抗−ＣＤ１１ｂ、抗−ＧＲ１、抗−Ｂ２２０、抗−Ｈ−２Ｋｄ、抗−Ｈ−２Ｋｂ、抗−Ｖβ５．１／５．２（Pharmingen, Inc., San Diego, CA）、抗−ＣＤ４、抗−ＣＤ８（Caltag Laboratories, Burlingame, CA））または免疫グロブリンイソタイプコントロール（Pharmingen）を用いて染色し、続けて赤血球を溶解し、そして全血溶解キット（R+D Systems, Minneapolis, MN）を用いて洗浄することによって、末梢血を分析した。
【０１６０】
染色した細胞を、WinList（Verity Software House Inc., Topsham, ME）またはCellquest（Beckton Dickinson, Mountain View, CA）ソフトウェアのいずれかをＦＡＣＳｃａｎまたはＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメーター（Beckton Dickinson）のいずれかについて用いて分析した。ＷＢＣキメラ化を、ドナー（抗−Ｈ２Ｋｄ）抗体またはレシピエント（抗−Ｈ２Ｋｂ）抗体のいずれかおよび特異的な系統マーカーを用いることによって染色し、そしてフローサイトメトリーによって分析することによって測定した。Ｖβ欠失は、Ｖβ５抗体および特異的な系統マーカーを用いて染色し、そしてフローサイトメトリーによって分析することによって測定した。
【０１６１】
全血球計算値を、ＨＥＭＡＶＥＴ１５００血液分析器（1500 Rシリーズ, CDC technologies, Oxford, CT）を用いて行なった。網状赤血球数を、赤血球に特異的な抗体（抗Ｔｅｒ−１１９, Pharmingen）および白血球に特異的な抗体（抗−ＣＤ４５, Pharmingen）、並びにＲＮＡの蛍光標識、チアゾールオレンジ（Sigma Inc., St. Louis, MO）を用いて標識化した末梢血のフローサイトメトリーによって実施した。網状赤血球数は末梢赤血球のパーセントとして定義し、Ｔｅｒ−１１９−陽性、チアゾールオレンジ−陽性、およびＣＤ４５−陰性であった。「ストレス」網状赤血球はまた、トランスフェリン受容体に対する抗体（ＣＤ７１, Pharmingen）を用いて標識化することによって分析した。
【０１６２】
赤血球個体群の半減期は、本質的に上記の通り（ChristianらによるExp. Hematol., 24：82-88 (1996)）、パルスビオチニル化実験によって測定した。要するに、５０ｍｇ／ｋｇのＮ−ヒドロキシスクシンイミドビオチン（Calbiochem, San Diego, CA；このものは、最初にＮ,Ｎ−ジメチルアセトアミド中に５０ｍｇ／ｍＬの濃度で溶解し、そして使用する直前に２５０μＬの通常の生理食塩水にまで希釈する）を生着または未処置の鎌状動物に（静脈内）注射した。このことにより、末梢血に対するビオチンパルス標識を得た。血液は、後方眼か静脈そう(retro-orbital venous plexus)または尾の切れ目のいずれかから、ビオチニル化後に規則的な間隔で得た。ビオチニル化された末梢赤血球のパーセントは、蛍光ストレプトアビジンチトクロム(cychrome)（Pharmingen）（これは、ビチチニル化細胞を同定する）および蛍光Ｔｅｒ−１１９−フィコエリトリン抗体（Pharmingen）（これは、赤血球を同定する）を用いたフローサイトメトリーによって測定した。ビオチニル化の減衰は、末梢循環由来のブオチニル化した赤血球のクリアランスに直接的に関連し、従ってこのものを用いて赤血球個体群の半減期を測定することができる。
【０１６３】
血漿膜ホスファチジルセリンの曝露は、アネキシン−Ｖ（Pharmingen）結合アッセイにおいて陽性である細胞のパーセントによって測定した。アネキシン−Ｖ結合アッセイは、アネキシン結合緩衝液（Pharmingen）中、室温で３０分間、１×１０６末梢血球を５μＬアネキシン−Ｖおよび適当な系統特異的抗体と一緒にインキュベートすることによって実施した。次いで、細胞をアネキシン結合緩衝液を用いて１回洗浄し、そしてフローサイトメトリーによって分析して、アネキシン−Ｖ−陽性細胞を測定した。
【０１６４】
赤血球スクランブラーゼ酵素アッセイを、本質的に上記の通り（BeversらによるBiol. Chem., 8-9：973-986 (1998)）実施した。要するに、２×１０６末梢血球を、１ｍＭのＣａＣｌ２を含有するリン酸緩衝生理食塩水中、３７℃で３０分間、蛍光ホスファチジルコリンアナログであるパルミトイル−Ｃ６−(Ｎ−(７−ニトロベンゾ−２−オキサ−１,３−ジアゾール(diazol)−４−イル)−ホスファチジルコリン（ＮＢＤ−ＰＣ；Avanti Polar Lipids, Birmingham, AL）の３ナノモル／ｍＬと一緒にインキュベートした。次いで、細胞を氷上で冷却し、そして１０ｍｇ／ｍＬの脱脂肪性ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（Sigma, Inc）含有緩衝液中で洗浄して、内部移行していない(non-internalized)リン脂質を交換した。次いで、細胞をフローサイトメトリーによる分析前に４０℃で２０分間、適当な系統特異的な抗体（Pharmingen）と一緒にインキュベートした。
【０１６５】
赤血球キメラ化は、ドナーおよびレシピエントのヘモグロビンのディファレンシャルヘモグロビン電気泳動によって測定した。ドナーβ−グロビンはマウスの「主(major)」および「少量(minor)」のβ−グロビン異性体からなり、これはヒト鎌状β−グロビンとは異なる電気泳動移動度を有する。ヘモグロビン電気泳動は、ヘレナ・チタン(Helena Titan)III電気泳動システム（Helena laboratories, Beaumont, TX）を用いて行なった。ゲルをスキャンし、そしてドナーまたはレシピエントのヘモグロビンのパーセントをコダック１−Ｄイメージ分析ソフトウェア（Kodak Inc., Rochester, NY）を用いたデンシトメトリーによって測定した。
【０１６６】
ＣＦＳＥアッセイを用いて、ドナー抗原に対する免疫寛容を測定した。脾臓細胞および腸間膜リンパ節細胞を、実験マウスから収集した。 赤血球の溶解およびナイロンウールの通過後に、細胞を１０μＭ  ＣＦＳＥ（Molecular Probes, Eugene, OR）中でインキュベートした。次いで、照射した（１８００ラド）Ｂａｌｂ／ｃまたはＣ３Ｈのマウスに、１×１０７〜１×１０９のＣＦＳＥ標識化細胞を静脈内で与えた。６６〜７２時間後に、脾細胞をレシピエントから収集し、赤血球を溶解し、そして残りの細胞を抗−ＣＤ４抗体および抗−ＣＤ８抗体またはイソタイプコントロールを用いて染色し、そして上記の通り、フローサイトメトリーによって分析した。
【０１６７】
レシピエント造血性臓器中での造血バランスを測定するために、マウスに麻酔をかけ、そしてそれらの脾細胞および骨髄を通常の方法を用いて収集した。造血バランスは、赤血球（Ｔｅｒ−１１９−陽性、ＣＤ４５−陽性）網状赤血球（Ｔｅｒ−１１９−陽性、ＣＤ４５−陰性、チアゾール−陽性）、または白血球（Ｔｅｒ−１１９−陰性、ＣＤ４５−陽性）のいずれかである骨髄細胞および脾臓細胞のパーセントを測定することによって具現化した。
【０１６８】
結果
ブスルファンおよび同時刺激遮断薬を用いた安定なキメラの作製
上記の通り、鎌状マウスを療法（これは、−１日目にブスルファン（２０ｍｇ／ｋｇ）（０日目は骨髄移植の日である）、０日目にＢａｌｂ／ｃマウス由来のＴ細胞欠乏骨髄を用いて移植、並びに０、２、４および６日目に抗−ＣＤ４０ＬおよびＣＴＬＡ４−Ｉｇの各々５００μｇを用いた同時刺激遮断を含む）を用いて処置した。この群の動物は、「ブスルファン処置」群と呼ぶ。残りの動物は、コントロールプロトコール（これは、骨髄移植および同時刺激遮断薬を与えるが、ブスルファン処置はない）を与えた。このプロトコールは十分に免疫寛容性であって、多数の系統のマウスにおいて非骨髄抑制性である。
【０１６９】
ブスルファン処置動物中、１１／１３は多数系統白血球混合キメラ化（１８４日目に平均値は４３＋１０％）を達成し、これは移植の３ヶ月後にピークに達し、＞１５０日間安定であった（図７Ａ）。同時刺激遮断薬のみ（ブスルファンはない）を与えたマウスは、同じ実験期間中、低〜検出することができないレベルの末梢白血球キメラ化（＜２．５％）を示した（図７Ａ）。ブスルファン処置の動物における末梢キメラ化は、図７Ｂに示す通りそれらの造血性臓器において反映された（骨髄（５８％）、脾臓（５１％）および胸腺（５２％））。骨髄移植を与えたマウスはＧＶＨＤの徴候を示さず、すなわちそれらの体重は安定なままであって、移植後の部検は全ての臓器の正常な組織学を示した。
【０１７０】
末梢白血球キメラ化を、同種間の野生型およびβ−タラセミアのマウスにおいてブスルファンおよび同時刺激遮断薬を用いた場合の結果（上記）と比較することができ、一方で末梢赤血球キメラ化は鎌状移植レシピエントにおいて著しく高かった。酢酸セルロース電気泳動によって分離したドナー（正常なＢａｌｂ／ｃ  β−グロビン、主要なおよび少量のアレル）ヘモグロビンおよびレシピエント（ヒト鎌状β−グロビン）ヘモグロビンの定量化は、２週間以内で７８〜９０％のドナーキメラ化を示し、このものは生着鎌状マウスのすべてについて１ヶ月までに１００％に達した（図８）。レシピエントマウスは元々ヒト鎌状β−グロビンのみを有し（レーン１）、一方でドナーマウスはマウスβ−グロビンの主要なおよび少量のアレルを有した（レーン２）。レーン３は、ドナーβ−グロビンでの完全な末梢置換を有する代表的な生着マウスを示す。該末梢血のドナーヘモグロビンによる完全な置換は移植後の１ヶ月以内に起こり、これは全ての生着マウスにおいて全観察期間中（移植後の＞１５０日）、安定であった（Ｈｕはヒト、Ｍｕはマウスである）。白血球キメラ化と比較して末梢赤血球系のキメラ化のより高いレベルは、鎌状赤血球の速い代謝回転および分解を有する環境における正常な赤血球の蓄積および生存率の増大と一致する。
【０１７１】
同時刺激遮断薬のみを用いて（すなわち、ブスルファンはない）処置した９コントロールマウスのうちの５は、最少の白血球キメラ化（＜２．５％；図７Ａ）にも関わらず有意な赤血球のキメラ化（１０〜５４％；図９）を発生した。図９のレーン１は、ヒトβ−鎌状ヘモグロビンのみを有する生着のない代表的なマウスを示す。レーン２は、レシピエント（ヒトβ−鎌状ヘモグロビン）およびドナー（マウスの主要なおよび少量のβ−ヘモグロビンアレル）の両方を有するＲＢＣキメラ化を用いた移植３ヶ月後の代表的なマウスを示す。
【０１７２】
キメラマウスは、ドナー抗原に対して特異的に免疫寛容である。
Ｂａｌｂ／ｃマウスはＩ−Ｅを発現し、従ってＶβ５を有するＴ細胞を欠乏し、一方で鎌状マウスはＩ−Ｅを発現せず、〜２−３％のＣＤ４＋Ｔ細胞上でＶβ５．１／２を特異的に使用する（DysonらによるNature, 349：531-549 (1991)；BillらによるJ. Exp. Med., 169：1405-1419 (1989)）。予測された通り、非生着性の動物はドナー反応性のＶβ５＋ＣＤ４＋Ｔ細胞を欠乏することができなかった（図１０Ａ）。それに対して、生着性の動物は、６０日までにＣＤ４＋Ｖβ５＋Ｔ細胞のほぼ完全な欠乏を発生した。１５〜２５％のＢａｌｂ／ｃで正常に発現したＣＤ４＋Ｔ細胞および鎌状ＣＤ４＋Ｔ細胞を有するＶβ８のパーセントは全ての群において同様であり、このことはＴ細胞欠乏が本質的にドナー特異的であることを示す。これらの結果は、骨髄由来のＩ−Ｅを有するドナー細胞がブスルファン処置マウスにおけるＴ細胞レパートリーの選択に影響を及ぼし、最終的には強い(robust)長期間のドナー特異的免疫寛容を与えることを示唆する。
【０１７３】
ブスルファン処置動物において見られる長期間のキメラ化と同時に、これらの動物はまた同種間Ｂａｌｂ／ｃ骨髄移植片に対する特異的な免疫寛容を示した（図１０Ｂ）。ＧＦＳＥ色素を用いた硬直性インビボ同種増殖性（ＧＶＨＤ）アッセイを実施して、消えない(lingering)アロ反応性の存在について調べた（LyonsらによるJ. Immunol. Meth., 171：131-137 (1994)）。生着および非生着の動物由来のＴ細胞を脾臓および腸間膜リンパ節から収集した（Ｔ細胞は、移植の＞１００日後に実験動物から収集した）。１０μＭ  ＣＦＳＥを用いて標識化後に、Ｔ細胞を予め１８００ラドで致死を超えて照射したレシピエントマウス（Ｂａｌｂ/ｃ（ドナー）またはＣ３Ｈ（第三者））中に移した。脾細胞を７２時間後に収集し、そしてフローサイトメトリーによって分析した。
【０１７４】
非生着性群由来のＣＤ４＋およびＣＤ８＋のＴ細胞はＢａｌｂ／ｃおよび第三者（Ｃ３Ｈ）宿主に対する反応の際に大規模な細胞分裂を受けるが、図１０Ｂのヒストグラムは該生着マウスが抗−ドナー増殖性反応を全く生じないことを示す。予想通り、第三者（Ｃ３Ｈ）に対する明確な増殖反応が生着マウスにおいて存在した（図１０Ｂ）。これらの結果により、キメラ動物において細胞分裂することができるドナーアロ反応性ＣＤ４＋またはＣＤ８＋のＴ細胞の特異的な非存在を確認する。従って、免疫寛容性動物はドナーに対する増殖をまったく示さないが、第三者（Ｃ３Ｈ、Ｈ−２ｋ）移植片に対する正常な増殖反応を示した。非生着動物は、このＧＶＨＤモデルにおいてドナーおよび第三者の両方の抗原に対して同様に反応する。
【０１７５】
キメラマウスは、鎌状細胞疾患を治癒する。
生着鎌状マウスは、様々なパラメーターによってそれらの鎌状細胞疾患の表現型治癒を示した。図１１Ａおよび１１Ｂに示す通り、ブスルファン条件付け移植後に、末梢血スメア中での不可逆的な鎌状細胞の著しい非存在が生じた。図１１Ａにおける矢印は、処置していない血液中での代表的な鎌状細胞を指す。生着マウスはまた、ヘモグロビン（Ｈｂ；４．５ｇ／ｄＬは１０ｇ／ｄＬに矯正された）、ヘマトクリット（ＨＣＴ；１６％は４０％に矯正された）および末梢チアゾール陽性網状赤血球の％（Ｒｅｔｉｃ．；４９％は３．５％に矯正された）を含めたそれらの血液学的な異常症の正常化（図１１Ｃ）を示し、このことはそれらの溶血性貧血の逆転と一致する。その上、未処置の鎌状マウスにおいて見られる異常に増大した白血球（ＷＢＣｓ）は生着マウスにおいて矯正された（２０，０００／μＬが５１００／μＬに）。血液学的なパラメーターの正常化は、全実験期間中（＞１５０日）安定であった。移植３ヶ月後に行なった代表的な実験における、Ｃ５７ＢＬ／６コントロール、非生着マウス（黒色）および生着マウス（白色）についての中央値＋／−ＳＥＭを示す。
【０１７６】
新たに出現したキメラ赤血球の健康状態を、３つの生理学的なマーカーによって評価した。第１に、赤血球個体群の半減期を、ChristianらによるExp. Hematol., 24：82-88 (1996) に記載する通り、パルスビオチニル化実験によって測定した（図１１Ｄ）。非処置および生着の鎌状マウスに、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド−ビオチンを静脈内注射して、該末梢血をビオチンで標識化した。赤血球（これは、Ｔｅｒ−１１９−陽性でＣＤ４５−陰性のビオチニル化細胞として同定）の半減期は、フローサイトメトリーによる時間を超えた該ビオチニル化赤血球の減衰によって測定した。未処置の鎌状動物由来の赤血球（充填正方形）は、正常なコントロールＣ５７ＢＬ／６マウス（充填三角形；半減期は１８日）と比較して、非常に短い末梢半減期（０．８日）を有した。生着した動物（オープン正方形）は正常なマウスのものとは区別することができる赤血球半減期を有しており、これは疾患性赤血球コンパートメントの正常な赤血球による置換の場合と一致する。第２に、生着および非生着のマウスにおけるトランスフェリン陽性な「ストレス」網状赤血球の産生を測定した。これらの細胞は過敏性の(overactive)赤血球新生の指標であって、これらは微小血管系における鎌状網状赤血球の接着の増大に寄与すると考えられている（SerkeらによるBr. J. Haematol., 81：432-439 (1992)；SwerlickらによるBlood, 82：1891-1899 (1993)；およびJoneckisらによるBlood, 82：3548-3555 (1993)）。図１１Ｅは、生着マウスにおけるこれらの細胞のパーセントが２７％から３％にまで低下することを示しており、このことはこれらの動物における赤血球の代謝回転の正常化と一致することを示す。第３に、血漿膜ホスファチジルセリンの曝露（これは、鎌状赤血球中で増大することが知られる）を調べた（WoodらによるBlood, 8：1873-1880 (1996)；KuypersらによるBlood, 87：1179-1187 (1996)）。ホスファチジルセリンは、マクロファージおよび単球によるこれらの細胞のクリアランスの増大に寄与し、そして異常な内皮接着性に寄与し得ると考えられている（ClosseらによるBr. J. Haematol., 107：300-302 (1999)）。２つのアッセイを使用した。１アッセイはアネキシン−Ｖ結合を測定し、これにより曝露したホスファチジルセリン残基を直接的に測定する（VermesらによるJ. Immunol. Meth., 184：39-51 (1995)）。そして、第２のアッセイはＮＢＤ−ＰＣ内部移行を測定し、これにより血漿膜上でのホスファチジルセリンの曝露を引き起こすスクランブラーゼ酵素を測定する（FraschらによるJ. Biol. Chem., 275：23065-23073 (2000)；BeversらによるBiol. Chem., 8-9：973-986 (1998)；およびBrattonらによるJ. Biol. Chem., 272：26159-26165 (1997)）。図１１Ｅは、鎌状マウスが一貫して移植前に高いホスファチジルセリンの曝露を示すが（アネキシン−Ｖ結合によって測定する）、生着マウスはこのホスファチジルセリン曝露が有意に低下することを示す、ことを示す。図１１Ｅはまた、生着後に活性なスクラブラーゼが生じるのを伴って、赤血球の数が劇的に減少することを示し、このことは上記のホスファチジルセリンの曝露の減少と一致する。
【０１７７】
生着マウスにおける脾臓はまた、鎌状表現型の逆転の徴候を示す。
マウス鎌状細胞の病態生理学の特徴の１つは、正常な動物と比較した脾臓の大きさの著しい増大である（PastzyらによるScience, 278：876-878 (1997)）。このことは、末梢赤血球の速い分解を補充する脾臓造血に対する莫大な要求に関連する。図１２Ａに示す通り、脾臓は生着マウスにおける大きさが有意に減少する（未処置のマウスにおける全体重の７．３％から、移植３ヶ月後に測定した生着マウスにおける全体重の０．６％にまで）。図１２Ｂは、脾臓が非処置の鎌状マウスにおいて大きな赤血球新生臓器として機能するが、それは生着同齢集団(cohort)における再計画 (re-programming）を受け、そして白血球造血および赤血球造血の間でのより正常なバランスを再開することを示す。図１２Ｃおよび１２Ｄは、未処置および生着マウス由来の脾臓の組織学的な比較を示し、これは生着マウスが特徴的な機能亢進造血の回復および鎌状細胞疾患に特徴的な赤血球隔離を有することを示す。図１２Ｃは、鎌状動物由来の脾臓が非常に異常であって、鎌状赤血球の貯蔵および造血性の増大の領域を有することを示す。例えば、該矢印は代表的な赤血球の貯蔵を指す。赤血球貯蔵がないことは、生着マウスにおいて明らかである。
【０１７８】
腎臓組織学は、生着マウスにおいて正常である。
末梢血および造血性臓器の両方において観察される欠失に加えて、鎌状マウスはまた鎌状細胞疾患を有する患者において見られるのと同様な固形臓器病理学を示し得る（PastzyらによるScience, 278：876-878 (1997)）。このマウス鎌状疾患モデルの初期の記載（PastzyらによるScience, 278：876-878 (1997)）のとおり、我々は非処置の鎌状動物の多数の臓器（これは、例えば腎臓、肝臓、肺および心臓を含む）における病理的な変化を述べた。臓器の構造および組織学に及ぼす骨髄移植の効果を測定するために、未処置および生着の動物において部検を実施し、そして組織学分析のための組織を調製した。生着動物は、調べた全ての臓器（これは、腎臓、肝臓、心臓および肺を含む）の正常な組織学を有した。これらの動物において生じる組織学的な正常化の代表例である図１３Ａおよび１３Ｂは、非処置および生着のマウスにおける腎臓組織学の比較を示す。図１３Ａは、非処置鎌状マウスにおいて一貫して観察される膜性増殖性糸球体腎炎を示す。矢印は厚い糸球体腎膜を指し、該矢印の頭は狭い糸球体腔を指す。図１３Ｂは、生着動物が正常な腎臓組織学（これは、糸球体きょう膜(capsular)腔および糸球体膜の厚さの正常化を含む）を有することを示す。
【０１７９】
実施例８
以下は、本発明のＣＴＬＡ４分子をコードするヌクレオチド配列を得るために使用する方法の記載を提供する。
【０１８０】
ＣＴＬＡ４Ｉｇをコードするプラスミドを最初に構築し、このものは米国特許第5,434,131号、第5,885,579号および第5,851,795号に記載される通り、ＣＴＬＡ４Ｉｇ分子を発現することが分かった。次いで、単一部位突然変異分子（例えば、Ｌ１０４ＥＩｇ）をＣＴＬＡ４Ｉｇをコードする配列から得て、発現し、そして様々なＢ７分子についての結合速度を調べた。該Ｌ１０４ＥＩｇヌクレオチド配列（これは、図１４に示す配列を含む）を、二重部位ＣＴＬＡ４突然変異配列（これは、図１５〜１８に示す配列を含む）を得るための鋳型として使用し、これをタンパク質として発現し、そして結合速度について調べた。該二重部位ＣＴＬＡ４突然変異配列としては例えば、Ｌ１０４ＥＡ２９ＹＩｇ、Ｌ１０４ＥＡ２９ＬＩｇ、Ｌ１０４ＥＡ２９ＴＩｇおよびＬ１０４ＥＡ２９ＷＩｇを含む。三重部位突然変異体をも得た。
【０１８１】
ＣＴＬＡ４Ｉｇの構築
ＣＴＬＡ４の細胞外ドメインおよびＩｇＧガンマ(gammal)ドメインを含有するＣＴＬＡ４Ｉｇをコードする遺伝的な構築物を、米国特許第5,434,131号、第5,844,095号および第5,851,795号（これは、本明細書の一部を構成する）に記載されるとおり構築した。該ＣＴＬＡ４遺伝子の細胞外ドメインは、公知の配列に相当する合成オリゴヌクレオチドを用いたＰＣＲによってクローニングした（DariavachらによるEur. Journ. Immunol. 18：1901-1905 (1988)）。
【０１８２】
ＣＴＬＡ４についてのシグナルペプチドはＣＴＬＡ４遺伝子において同定されていないので、重なりオリゴヌクレオチドを用いる２つの工程で、ＣＴＬＡ４の予想配列のＮ−末端をオンコスタチンＭのシグナルペプチドと融合した（MalikらによるMol. and Cell. Biol. 9：2847 (1989)）。第１の工程では、オリゴヌクレオチドCTCAGTCTGGTCCTTGCACTCCTGTTTCCAAGCATGGCGAGCATGGCAATGCACGTGGCCCAGCC（配列番号１６）（これは、ＣＴＬＡ４のN末端７アミノ酸と融合させるオンコスタチンＭシグナルペプチド由来のＣ末端１５アミノ酸をコードする）を前進プライマーとして使用し、そしてTTTGGGCTCCTGATCAGAATCTGGGCACGGTTG（配列番号１７）（これは、ＣＴＬＡ４受容体をコードするアミノ酸配列のアミノ酸残基１１９〜１２５をコードし且つＢｃ１  Ｉ制限酵素部位を含有する）を後退プラマーとして使用した。この工程についての鋳型は、Ｈ３８細胞由来の全ＲＮＡの１マイクログラムから合成したｃＤＮＡであった（Drs. SalahudinおよびGallo, NCI, Bethesda, MDによって供されたＨＴＬＶ  ＩＩ感染のＴ−細胞白血病セルライン）。該第１の工程由来のＰＣＲ産物の一部を、重なり前身プライマー（これは、オンコスタチンＭシグナルペプチドのＮ末端部分をコードし、そしてＨｉｎｄ  ＩＩＩ制限エンドヌクレアーゼ部位：CTAGCCACTGAAGCTTCACCAATGGGTGTACTGCTCACACAGAGGACGCTGCTCAGTCTGGTCCTTGCACTC（配列番号１８）を含有する）および同じ後退プライマーを用いて再増幅させた。ＰＣＲ反応の産物を、Ｈｉｎｄ  ＩＩＩおよびＢｃ１  Ｉを用いて消化し、そしてＩｇＣ（ガンマ）１のヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３領域に相当するアミノ酸配列をコードするＢｃｌ  １／Ｘｂａ  Ｉ切断ｃＤＮＡ断片と一緒に、Ｈｉｎｄ  ＩＩＩ／Ｘｂａ  Ｉ切断発現ベクターＣＤＭ８またはＨｉｎｄ  ＩＩＩ／Ｘｂａ  Ｉ切断発現ベクターｐｉＬＮ（これは、πＬＮとしても知られる）中にライゲートさせた。
【０１８３】
ＣＴＬＡ４Ｉｇに相当するアミノ酸配列をコードするＤＮＡは、１９９１年５月３１日にブタペスト条約の下、ＡＴＣＣに寄託されており、このものはＡＴＣＣ受託番号68629と一致した。
【０１８４】
ＣＴＬＡ４Ｉｇコドンベースの突然変異誘発
ＣＤ８０および／またはＣＤ８６分子からのより遅い解離速度（「オフ」速度）、すなわち改善された結合能力を有する突然変異ＣＴＬＡ４Ｉｇ分子を同定するために、突然変異誘発およびスクリーニング方法を開発した。この態様において、突然変異は、ＣＴＬＡ４の細胞外ドメインのＣＤＲ−１、ＣＤＲ−２（これはまた、Ｃ'鎖としても知られる）および／またはＣＤＲ−３領域内の残基中でおよび／または該残基について行なった（これは、米国特許第6,090,914号、第5,773,253号および第5,844,095号；米国一部継続出願番号60/214,065；並びに、Peach, R. J.らによるJ. Exp. Med., 1994, 180：2049-2058に記載する通りである。ＣＤＲ様領域は、各ＣＤＲ領域を包含し、そして該ＣＤＲモチーフの上流および／または下流をいくつかのアミノ酸によって伸張する）。これらの部位は、キメラＣＤ２８／ＣＴＬＡ４融合タンパク質の研究（Peach らによるJ. Exp. Med., 1994, 180：2049-2058）、およびアミノ酸残基側鎖が溶媒に曝露されるであろうと予想するモデル、並びにＣＤ２８およびＣＴＬＡ４の間の特定の位置のアミノ酸残基の一致度または相同性の欠如に基づいて選択した。また、同定する残基に空間的に近い位置にある（５〜２０オングストローム単位）いずれの残基も本発明の部分と考える。
【０１８５】
Ｂ７分子（例えば、ＣＤ８０、ＣＤ８６）に対する親和性を改変した可溶性ＣＴＬＡ４突然変異分子を合成しそしてスクリーニグするために、２工程の方法を適用した。該実験は、第１にＣＴＬＡ４の細胞外部分の特定のコドンでの突然変異のライブラリーを得ること、および次いでＢＩＡコア分析によってこれらをスクリーニングして、Ｂ７に対する反応性が改変された突然変異体を同定することを含む。ビアコアアッセイシステム（Pharmacia, Piscataway, N. J.）は、表面プラスモン共鳴検出器システム（これは、本質的にＣＤ８０ＩｇまたはＣＤ８６Ｉｇのいずれかと、検出器中に位置するデキストラン被覆のセンサーチップとの共有結合を含む）を使用する。次いで、該被験分子をセンサーチップを含有するチャンバー中に注入して、センサーチップのデキストラン被覆側面と物理的に会合する分子量(mass)の変化に基づいて結合する相補タンパク質の量を評価することができ；そして、該分子量の変化は検出器システムによって測定することができる。
【０１８６】
具体的には、単一部位突然変異ヌクレオチド配列を、ＣＴＬＡ４Ｉｇをコードする非突然変異型（例えば、野生型）ＤＮＡ（米国特許第5,431,131号、第5,844,095号、第5,851,795号および第5,885,796号；ＡＴＣＣ受託番号68629）を鋳型として用いて得た。突然変異性オリゴヌクレオチドＰＣＲプライマーを、該コドンの１位および２位でいずれの塩基を許容するが、３位ではグアニンまたはチミンのみを許容することによって、特定のコドン（ＸＸＧ／ＴまたはＮＮＧ／Ｔとしても記される）のランダム突然変異誘発のために設計した。この方法において、アミノ酸をコードした特定のコドンを、各２０アミノ酸についてコードするためにランダムに突然変異することができる。その点に関して、ＸＸＧ／Ｔ突然変異により、該２０アミノ酸の各々をコードする３２の可能なコドンを得る。ＣＴＬＡ４Ｉｇ（ＭＹＰＰＰＹ）のＣＤ３−様ループに対して近位の突然変異をコードするＰＣＲ産物をＳａｃＩ／ＸｂａＩを用いて消化し、そして同じように切断したＣＴＬＡ４Ｉｇ（図２０に含まれる）πＬＮ発現ベクター中にサブクローニングした。この方法を用いて、単一部位ＣＴＬＡ４突然変異分子Ｌ１０４ＥＩｇ（図１４に含まれる）を得た。
【０１８７】
ＣＴＬＡ４ＩｇのＣＤＲ−１−様ループに近位の突然変異のために、サイレントＮｈｅＩ制限部位を最初にＰＣＲプライマー定方向突然変異誘発によってこのループに５’導入した。ＰＣＲ産物をＮｈｅＩ／ＸｂａＩを用いて消化し、そして同様に切断したＣＴＬＡ４またはＬ１０４ＥＩｇ発現ベクター中にサブクローニングした。この方法を用いて、二重部位ＣＴＬＡ４突然変異分子Ｌ１０４ＥＡ２９ＹＩｇ（これは、図１５に含まれる）を得た。特に、単一部位ＣＴＬＡ４突然変異分子、Ｌ１０４ＥＩｇをコードする核酸分子を鋳型として用いて、二重部位ＣＴＬＡ４突然変異分子、Ｌ１０４ＥＡ２９ＹＩｇを得た。
【０１８８】
ＣＴＬＡ４突然変異分子をコードする二重部位突然変異ヌクレオチド配列（例えば、Ｌ１０４ＥＡ２９ＹＩｇ）（これは、２０００年６月１９日にアメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）、10801 University Blvd., Manassasに寄託（VA 20110-2209）され、ＡＴＣＣ受託番号PTA-2104と一致する）は、鋳型としてＬ１０４ＥＩｇを用いて上記の通り、突然変異誘発方法を繰り返すことによって得た。この方法を用いて、多数の二重部位突然変異体ヌクレオチド配列（例えば、ＣＴＬＡ４分子であるＬ１０４ＥＡ２９ＹＩｇ（これは、図１５に示す配列に含まれる）、Ｌ１０４ＥＡ２９ＬＩｇ（これは、図１６に示す配列に含まれる）、Ｌ１０４ＥＡ２９ＴＩｇ（これは、図１７に示す配列に含まれる）およびＬ１０４ＥＡ２９ＷＩｇ（これは、図１８に示す配列に含まれる）をコードする配列）を得た。三重部位突然変異体（例えば、Ｌ１０４ＥＡ２９ＹＳ２５ＫＩｇ、Ｌ１０４ＥＡ２９ＹＳ２５ＮＩｇ、およびＬ１０４ＥＡ２９ＹＳ２５ＲＩｇをコードする突然変異体）をも得た。
【０１８９】
可溶性ＣＴＬＡ４分子を該ヌクレオチド配列から発現させ、そしてこのものを上記の実施例３に記載する第二相臨床研究に使用した。
【０１９０】
当該分野の当業者は認めるであろう通り、特にＰＣＲ増幅法による核酸配列の複製は、ＤＮＡ鎖ヘの塩基の変化を容易に導入する。しかしながら、いくつかのコドンが同じアミノ酸を重複してコードするので、ヌクレオチドの変化が必ずしもアミノ酸の変化に翻訳されるわけではない。元のまたは野生型の配列由来のヌクレオチドのいずれかの変化、サイレント（すなわち、該翻訳されたアミノ酸における変化を全く生じない）またはそれ以外（本明細書に明示的に記載しない）を、本発明の範囲内に包含する。
【０１９１】
実施例９
以下の実施例は、実施例８に記載する構築物から発現する単一および二重部位突然変異体のＣＴＬＡ４ポリペプチド（これらは、非突然変異型ＣＴＬＡ４Ｉｇ分子と比較してＢ７分子に対するより高い結合アビディティーを示す）を同定するのに使用するスクリーング方法を提供する。
【０１９２】
現在のインビトロおよびインビボ研究は、ＣＴＬＡ４Ｉｇそのものが抗原特異的な活性Ｔ細胞の初回抗原刺激を完全に遮断することができないことを示している。Ｔ細胞増殖の抑制を測定するための、ＣＴＬＡ４Ｉｇ、およびＣＤ８０またはＣＤ８６のいずれかに特異的なモノクローナル抗体を用いたインビトロ研究は、抗−ＣＤ８０モノクローナル抗体がＣＴＬＡ４Ｉｇ抑制を増大しないことを示している。しかしながら、抗−ＣＤ８６モノクローナル抗体は該抑制を増大し、このことはＣＴＬＡ４ＩｇがＣＤ８６相互作用を遮断する際には有効ではないことを示す。これらのデータは、ＣＤ８０媒介性細胞反応の抑制がＣＤ８６媒介性反応の場合よりもおよそ１００倍低いＣＴＬＡ４Ｉｇ濃度を必要とするというLinsley（Immunity. (1994), 1：793-801）らによる早期の発見を支持している。これらの発見に基づいて、野生型ＣＴＬＡ４よりもＣＤ８６に対するより高いアビディティーを有する可溶性ＣＴＬＡ４突然変異分子がＣＴＬＡ４Ｉｇよりも抗原特異的活性細胞の初回抗原刺激を遮断することができるであろうことが推測された。
【０１９３】
この最後に、上記の実施例８に記載する該可溶性ＣＴＬＡ４突然変異分子を新規なスクリーニング法を用いてスクリーニングして、ＣＤ８０およびＣＤ８６に対する結合アビディティーを改善するＣＴＬＡ４の細胞外ドメイン中のいくつかの突然変異を同定した。このスクリーニング方法は、「オフ」速度測定は濃度依存性であるので（O'Shannessyらによる(1993) Anal. Biochem., 212：457-468）、タンパク質の精製または定量化の必要がなく、明らかにより遅い「オフ」速度を有する突然変異体を直接に同定するための有効な方法を提供した。
【０１９４】
ＣＯＳ細胞は、個別にミニプレップ精製したプラスミドＤＮＡを用いて形質移入し、そして数日間伝播させた。３日間条件付けした培地を、可溶性のＣＤ８０ＩｇまたはＣＤ８６Ｉｇを用いて被覆したＢＩＡコアバイオセンサーチップ（Pharmacia Biotech AB, Uppsala, Sweden）に適用させた。突然変異タンパク質の特異的な結合および解離は、表面プラスモン共鳴（O'Shannessy, D. J.らによる1997 Anal. Biochem. 212：457-468）によって測定した。全ての実験は、ＢＩＡコア（登録商標）またはＢＩＡコア（登録商標）２０００バイオセンサーを用いて２５℃で行なった。リガンドは、標準的なＮ−エチル−Ｎ'−(ジメチルアミノプロピル)カルボジイミドＮ−ヒドロキシスクシンイミドカップリング法（Johnsson, B.らによる(1991) Anal. Biochem. 198：268-277；Khilko, S. N.らによる(1993) J. Biol. Chem 268：5425-15434）を用いて研究グレードのＮＣＭ５センサーチップ（Pharmacia）を用いて固定化した。
【０１９５】
スクリーニング法
２４ウェルの組織培地プレート中で増殖させたＣＯＳ細胞を、突然変異ＣＴＬＡ４Ｉｇを用いて過渡的に形質移入させた。分泌型可溶性突然変異ＣＴＬＡ４Ｉｇを含有する培地を、３日後に集めた。
【０１９６】
条件付けしたＣＯＳ細胞培地をＣＤ８６ＩｇまたはＣＤ８０Ｉｇを用いて誘導したＢＩＡコアバイオセンサーチップ上にフローさせ（Greeneらによる1996 J. Biol. Chem. 271：26762-26771に記載）、そして野生型ＣＴＬＡ４Ｉｇの場合に観察されるものよりもより遅いオフ速度を有する突然変異分子を同定した。選択した培地試料に相当するＤＮＡを配列決定し、より多くのＤＮＡを調製して、より大量スケールのＣＯＳ細胞の過渡的な形質移入を行なった。そのものから、ＣＴＬＡ４Ｉｇ突然変異タンパク質を培地のタンパク質Ａの精製後に調製した。
【０１９７】
ＢＩＡコア分析条件および平衡結合データ分析は、J. Greeneらによる1996 J. Biol. Chem. 271：26762-26771および米国特許出願番号09/579,927および60/214,065（これらは、本明細書の一部を構成する）に記載する通り実施した。
【０１９８】
ＢＩＡコアデータ分析
センサーグラム(senosorgram)ベースラインを、分析前にゼロ反応単位（ＲＵ）まで規準化した。試料はニセ(mock)誘導化フロー細胞について行なって、溶液間のバルク屈折率差に因するバックグラウンドＲＵ値を測定した。平衡解離定数（Ｋｄ）は、Ｒｅｑ対Ｃのプロットから算出した。ここで、Ｒｅｑはニセ誘導化チップを用いた反応を引いた定常状態の反応であって、Ｃは分析物のモル濃度である。結合曲線は、商業的な非線形カーブフィッティングソフトウェア（Prism, GraphPAD Software）を用いて分析した。
【０１９９】
実験データを最初に、１受容体と１リガンドとの結合についてのモデル（１−部位モデル、すなわち１ラングミュアシステム、Ａ＋Ｂ＝ＡＢ）にフィットさせ、そして平衡解離定数（Ｋｄ＝[Ａ]・[Ｂ]／[ＡＢ]）は、式：
Ｒ＝Ｒ最大値・Ｃ／(Ｋｄ＋Ｃ)
から算出した。引き続いて、データを式：
Ｒ＝Ｒ最大値１・Ｃ／(Ｋｄ１＋Ｃ)＋Ｒ最大値２Ｃ・／(Ｋｄ２＋Ｃ）
によって記載される、２つの非相互作用の独立した結合部位を有する受容体とリガンドとの結合の最も単純な２−部位モデルにフィットさせた。
【０２００】
これら２個のモデルのフィットの良好さは、実験データを比較することによって視覚的に、および平方和のＦ検定によって統計学的に分析した。２部位モデルがより有意に良くフィットする（ｐ＜０．１）場合以外には、より単純な１部位モデルをベストフィットとして選択した。
【０２０１】
会合分析および解離分析は、ＢＩＡ式２．１ソフウェア（Pharmacia）を用いて行なった。会合速度定数ｋｏｎは、均一な１部位相互作用および平行の２部位相互作用の両方を仮定した２つの方法で算出した。１部位相互作用については、ｋｏｎ値は式：
Ｒｔ＝Ｒｅｑ(１−ｅｘｐ−ｋｓ(ｔ−ｔｏ)）
（式中、Ｒｔはある時間での反応である。Ｒｅｑは定常状態の反応である。ｔ０は注射の開始時間である。そして、ｋｓ＝ｄＲ／ｄｔ＝ｋｏ・Ｃｋｏｆｆ（式中、Ｃは単量体結合部位の観点で算出される分析物の濃度である）である）
に従って算出した。２部位相互作用の場合には、ｋｏｎ値は式：
Ｒｔ＝Ｒｅｑ１(１−ｅｘｐ−ｋｓ１(ｔ−ｔ０）)＋Ｒｅｑ２(１−ｅｘｐｋｓ２(ｔ−ｔ０)）
に従って算出した。各モデルについて、ｋｏｎ値は、ｋｓ対Ｃのプロットの算出した勾配（約７０％までの最大会合）から決定した。
【０２０２】
会合データは、１部位（ＡＢ＝Ａ＋Ｂ）モデルまたは２部位（ＡｉＢｊ＝Ａｉ＋Ｂｊ）モデルに従って分析し、そして速度定数（ｋｏｆｆ）は最適のフィット曲線から算出した。剰余が機械のバックグラウンド（２〜１０ＲＵ、機械による）よりも大きい場合以外には、該結合部位モデルを使用し、この場合は２結合部位モデルを使用した。受容体占有率の半減期は、関係：ｔ１／２＝０．６９３／ｋｏｆｆを用いて算出した。
【０２０３】
フローサイトメトリー
マウスｍＡｂ  Ｌ３０７．４（抗−ＣＤ８０）を、Becton Dickinson（San Jose, California）およびＩＴ２．２（抗−Ｂ７−０［これはＣＤ８６としても知られる］）（Pharmingen（San Diego, California)）から購入した。免疫染色のために、ＣＤ８０陽性および／またはＣＤ８６陽性のＣＨＯ細胞を、１０ｍＭ  ＥＤＴＡを含有するリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中でインキュベートすることによってそれらの培養容器から除去した。ＣＨＯ細胞（１〜１０×１０５）を最初に、ｍＡｂｓまたは免疫グロブリン融合タンパク質と一緒に１０％胎児ウシ血清（ＦＢＳ）を含有するＤＭＥＭ中でインキュベートし、次いで洗浄し、そして蛍光イソチオシアネート接合ヤギ抗マウスまたは抗ヒト免疫グロブリン第２工程試薬（Tago, Burlingame, California）と一緒にインキュベートした。細胞を最終的に洗浄し、そしてこのものをＦＡＣＳｃａｎ（Becton Dickinson）を用いて分析した。
【０２０４】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびサイズ排除クロマトグラフィー
ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、トリス／グリシン４〜２０％アクリルアミドゲル（Novex, San Diego, CA）を用いて実施した。分析用ゲルをクーマシーブルーを用いて染色し、そして湿ったゲルのイメージをデジタルスキャニングによって観察した。ＣＴＬＡ４Ｉｇ（２５μg）およびＬ１０４ＥＡ２９ＹＩｇ（２５μｇ）を、ＴＳＫ−ＧＥＬ  Ｇ３００  ＳＷｘＬカラム（7.8 x 300mm, Tosohaas, Montgomeryville, PA）（これは、０．０２％のＮＡＮ３を含有するリン酸緩衝生理食塩水中で平衡化させる；流速は１．０ｍＬ／分）を用いてサイズ排除クロマトグラフィーによって分析した。
【０２０５】
ＣＴＬＡ４ＸＣ１２０ＳおよびＬ１０４ＥＡ２９ＹＸＣ１２０Ｓ:
１本鎖ＣＴＬＡ４ＸＣｌ２０Ｓは、これまでに記載されている（Linsleyらによる(1995) J. Biol. Chem., 270：15417-15424）通り製造した。要するに、オンコスタチンＭ  ＣＴＬＡ４（ＯＭＣＴＬＡ４）発現プラスミドを鋳型として使用し、前進プライマーGAGGTGATAAAGCTTCACCAATGGGTGTACTGCTCACACAG（配列番号１９）をベクター中の配列と整合するように選択し；そして、後退プライマーGTGGTGTATTGGTCTAGATCAATCAGAATCTGGGCACGGTTC（配列番号２０）をＣＴＬＡ４の細胞外ドメイン内の最後の７アミノ酸（すなわち、アミノ酸１１８〜１２４）に相当するように選択し、そして制限酵素部位および停止コドン（ＴＧＡ）を含ませた。後退プライマーは、Ｃ１２０Ｓ（１２０位でシステインをセリンに）突然変異を特定化した。特に、上に示す後退プライマーのヌクレオチド配列（ヌクレオチド３４〜３６）を以下のヌクレオチド配列：ＡＧＡ、ＧＧＡ、ＴＧＡ、ＣＧＡ、ＡＣＴまたはＧＣＴの１つと置換する。当該分野の当業者が理解する通り、該ヌクレオチド配列ＧＣＡは、システインについてのコドンＴＧＣの逆転相補配列である。同様に、ヌクレオチド配列ＡＧＡ、ＧＧＡ、ＴＧＡ、ＣＧＡ、ＡＣＴまたはＧＣＴはセリンについてのコドンの逆転相補配列である。ポリメラーゼ連鎖反応産物をＨｉｎｄＩＩＩ／ＸｂａＩを用いて消化し、そして発現ベクターπＬＮ（Bristol-Myers Squibb Company, Princeton, NJ）中に直接的にサブクローニングした。Ｌ１０４ＥＡ２９ＹＸＣ１２０Ｓを同一の方法で製造した。各構築物をＤＮＡ配列決定によって検証した。
【０２０６】
高アビディティー突然変異体の同定および生物学的なキャラクタリゼーション
２４アミノ酸を突然変異誘発のために選択し、そして得られた２３００突然変異タンパク質をＣＤ８６Ｉｇ結合について、表面プラスモン共鳴（ＳＰＲ；上記の通り）によってアッセイした。各々の部位での突然変異誘発の優位な効果を上記の表ＩＩにまとめる。ＣＤＲ−１領域（Ｓ２５−Ｒ３３）中でのいくつかのアミノ酸のランダム突然変異誘発は明らかにリガンド結合を改変しなかった。Ｅ３１およびＲ３３、並びに残基Ｍ９７−Ｙ１０２の突然変異誘発は、明らかにリガンドとの結合を低下させた。残基：Ｓ２５、Ａ２９およびＴ３０、Ｋ９３、Ｌ９６、Ｙ１０３、Ｌ１０４およびＧ１０５の突然変異誘発は、遅い「オン」および／または遅い「オフ」速度を有するタンパク質を与えた。これらの結果は、ＣＤＲ−１（Ｓ２５−Ｒ３３）領域およびＭ９７−Ｙ１０２内またはその近くの残基がリガンドとの結合に影響を及ぼすという従来の発見（Peachらによる(1994) J. Exp. Med., 180：2049-2058）を確認する。
【０２０７】
部位：Ｓ２５、Ｔ３０、Ｋ９３、Ｌ９６、Ｙ１０３およびＧ１０５の突然変異誘発は、ＣＤ８６Ｉｇからのより遅い「オフ」速度を有するいくつかの突然変異タンパク質の同定を提供した。しかしながら、これらの例において、該遅い「オフ」速度は、ＣＤ８６Ｉｇに対する全アビディティーを有する突然変異タンパク質を与える遅い「オン」速度によって損なわれ(compromise)、このことは野生型ＣＴＬＡ４Ｉｇの場合に観察されるのと明らかに類似する。加えて、Ｋ９３の突然変異誘発は、観察される速度変化に関与し得る有意な凝集を生じた。
【０２０８】
Ｌ１０４のランダム突然変異誘発、続くＣＯＳ細胞形質移入、および固定化されたＣＤ８６Ｉｇ上の培地試料のＳＰＲによるスクリーニングにより、野生型ＣＴＬＡ４Ｉｇよりもほぼ２倍遅い「オフ」速度を有する突然変異タンパク質を含有する６個の培地試料を得た。これらの突然変異体の相当するｃＤＮＡを配列決定した場合に、各々はロイシン〜グルタミン酸突然変異（Ｌ１０４Ｅ）をコードすることが分かった。明らかに、ロイシン１０４のアスパラギン酸ヘの置換（Ｌ１０４Ｄ）は、ＣＤ８６Ｉｇ結合に影響を及ぼさなかった。
【０２０９】
次いで、突然変異誘発を表ＩＩに示す各部位で繰り返し、この時、上記の通り野生型ＣＴＬＡ４Ｉｇの代わりにＰＣＲ鋳型としてＬ１０４Ｅを使用した。固定化されたＣＤ８６Ｉｇを再度用いたＳＰＲ分析により、野生型ＣＴＬＡ４Ｉｇよりもほぼ４倍遅い「オフ」速度を持つタンパク質を有する、アラニン２９の突然変異誘発からの６個の培地試料を同定した。最も遅いものは、チロシン置換（Ｌ１０４ＥＡ２９Ｙ）、ロイシン（Ｌ１０４ＥＡ２９Ｌ）、トリプトファン（Ｌ１０４ＥＡ２９Ｗ）、トレオニン（Ｌ１０４ＥＡ２９Ｔ）であった。明らかに、遅くない「オフ」速度突然変異体は、アラニン２９を野生型ＣＴＬＡ４Ｉｇ中で単独でランダム突然変異させた場合に同定された。
【０２１０】
精製したＬ１０４ＥおよびＬ１０４ＥＡ２９ＹＩｇの相対的な分子量および凝集状態を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびサイズ排除クロマトグラフィーによって評価した。Ｌ１０４ＥＡ２９ＹＩｇ（〜１μｇ；レーン３）およびＬ１０４ＥＩｇ（〜１μｇ；レーン２）は、還元条件下（〜５０ｋＤａ；＋βＭＥ；＋２−メルカプトエタノール）および非還元条件（〜１００ｋＤａ；−βＭＥ）下で、ＣＴＬＡ４Ｉｇ（〜１μｇ；レーン１）と見かけ上同じ電気泳動度を有した（図２１Ａ)。サイズ排他クロマトグラフィーは、Ｌ１０４ＥＡ２９ＹＩｇ（図２１Ｃ）が二量体ＣＴＬＡ４Ｉｇ（図２１Ｂ）と見かけ上同じ移動度を有することを示した。主なピークはタンパク質二量体を示し、一方で図２１Ｂにおけるより速く溶出する少量のピークはより高分子量の凝集物を示す。約５．０％のＣＴＬＡ４Ｉｇはより高分子量の凝集物として存在するが、Ｌ１０４ＥＡ２９ＹＩｇまたはＬ１０４ＥＩｇの凝集物であるという証拠は全くなかった。したがって、Ｌ１０４ＥＩｇおよびＬ１０４ＥＡ２９ＹＩｇの場合に見られるＣＤ８６Ｉｇとのより強い結合は、突然変異誘発によって誘発される凝集に帰することはできなかった。
【０２１１】
平衡および速度論的な結合分析
平衡および速度論的な結合分析は、表面プラスモン共鳴（ＳＰＲ）を用いてタンパク質Ａ精製のＣＴＬＡ４Ｉｇ、Ｌ１０４ＥＩｇおよびＬ１０４ＥＡ２９ＹＩｇについて行なった。該結果は、上記の表Ｉに示す。観察された平衡解離定数（Ｋｄ；表Ｉ）を、濃度範囲（５．０〜２００ｎＭ）で得られる結合曲線から算出した。Ｌ１０４ＥＡ２９ＹＩｇは、Ｌ１０４ＥＩｇまたはＣＴＬＡ４ＩｇよりもＣＤ８６Ｉｇに対してより強く結合する。Ｌ１０４ＥＩｇ（６．０６ｎＭ）またはＣＴＬＡ４Ｉｇ（１３．９ｎＭ）よりも低いＬ１０４ＥＡ２９ＹＩｇのＫｄ（３．２１ｎＭ）は、Ｌ１０４ＥＡ２９ＹＩｇのＣＤ８６Ｉｇとのより高い結合アビディティーを示す。Ｌ１０４ＥＩｇ（４．４７ｎＭ）またはＣＴＬＡ４Ｉｇ（６．５１ｎＭ）よりも低いＬ１０４ＥＡ２９ＹＩｇ（３．６６ｎＭ）のＫｄ（３．６６ｎＭ）は、Ｌ１０４ＥＡ２９ＹＩｇとＣＤ８０Ｉｇとのより高い結合アビディティーを示す。
【０２１２】
速度論的な結合分析は、ＣＤ８６Ｉｇについての「オン」速度と同様に、ＣＤ８０に対するＣＴＬＡ４Ｉｇ、Ｌ１０４ＥＩｇおよびＬ１０４ＥＡ２９ＹＩｇの結合についての比較上の「オン」速度が同様であることを示した（表Ｉ）。しかしながら、これらの分子についての「オフ」速度は等しくなかった（表Ｉ）。ＣＴＬＡ４Ｉｇと比較して、Ｌ１０４ＥＡ２９ＹＩｇはＣＤ８０Ｉｇからのほぼ２倍より遅い「オフ」速度を有し、そしてＣＤ８６Ｉｇからのほぼ４倍より遅い「オフ」速度を有していた。Ｌ１０４Ｅは、Ｌ１０４ＥＡ２９ＹＩｇとＣＴＬＡ４Ｉｇとの間の中間の「オフ」速度を有していた。これらの突然変異の導入は「オン」速度に有意な影響を及ぼさないので、Ｌ１０４ＥＡ２９ＹＩｇを用いた場合に観察されるＣＤ８０ＩｇおよびＣＤ８６Ｉｇについてのアビディティーは「オフ」速度の低下に主に帰するのであろう。
【０２１３】
ＣＤ８６ＩｇおよびＣＤ８０Ｉｇに対するＬ１０４ＥＡ２９ＹＩｇのアビディティーの増大は各単量体が二量体として会合する様式に影響を及ぼす突然変異に帰するものであるかどうか、または各単量体に導入される構造変化を増大するアビディティーが存在するかどうかを測定するために、ＣＴＬＡ４およびＬ１０４ＥＡ２９Ｙ細胞外ドメインの１本鎖構築物を、上記およびLinsleyらによる(1995) J. Biol. Chem., 270：15417-15424 (84)によって記載されている通り、システイン１２０のセリンへの突然変異誘発後に調製した。それらのリガンド結合性質をＳＰＲによって分析する前に、該精製タンパク質であるＣＴＬＡ４ＸＣ１２０ＳおよびＬ１０４ＥＡ２９ＹＸＣ１２０Ｓはゲル浸透クロマトグラフィー（Linsleyらによる(1995)、上記）によって単量体であることが分かった。ＣＤ８６Ｉｇに対する両方の単量体タンパク質についての結合アフィニティーは、それらそれぞれの二量体について観察される場合よりもおよそ３５〜８０倍低いという結果を示した（表Ｉ）。このことは、ＣＴＬＡ４の二量化が高アビディティーなリガンド結合に必要であると確立した従来公知のデータを支持するものである（Greeneらによる(1996) J. Biol. Chem., 271：26762-26771）。
【０２１４】
Ｌ１０４ＥＡ２９ＹＸＣ１２０Ｓは、ＣＤ８０ＩｇおよびＣＤ８６Ｉｇの両方に対してＣＴＬＡ４ＸＣ１２０Ｓよりもおよそ２倍高いアフィニティーで結合した。該増大したアフィニティーは、両方のリガンドからのおよそ３倍遅い会合速度に起因した。したがって、Ｌ１０４ＥＡ２９Ｙによるより強い結合アフィニティーは、該分子が二量化するという改変によるよりもむしろ各単量体鎖に導入されたアビディティーを増大させる構造変化に最も帰するようであった。
【０２１５】
アビディティーを増大指せる突然変異の位置および構造分析
ＣＴＬＡ４の細胞外ＩｇＶ様ドメインの溶液構造は、ＮＭＲ分光分析によって測定した（Metzlerらによる(1997) Nature Struct. Biol., 4：527531）。このことにより、三次元折りたたみにおけるロイシン１０４およびアラニン２９の正確な位置が可能となった（図２２の左図および右図）。ロイシン１０４は、非常に高く保存されたＭＹＰＰＹアミノ酸配列の近くに位置する。アラニン２９は、ＣＤＲ−１（Ｓ２５−Ｒ３３）領域のＣ末端近くに位置し、そのものはＭＹＰＰＹ領域に空間的に近接する。これら２つの領域の塩基における残基間の有意な相互作用が存在する一方で、Ｌ１０４およびＡ２９は共に該タンパク質内に近接する疎水性コア部分を含むが、Ｌ１０４およびＡ２９の間には見かけ上直接的な相互作用は存在しない。該２つのアビディティーを増大する突然変異体の構造結果を、モデリングによって評価した。Ａ２９突然変異は、ＣＤＲ−１（Ｓ２５−Ｒ３３）領域とＭＹＰＰＹ領域との間の間隙に容易に収容され得て、そしてこのものはＭＹＰＰＹ領域の立体配座を安定化させるように機能することができる。野生型ＣＴＬＡ４の場合に、Ｌ１０４はＭＹＰＰＹ領域の近くのＬ９６およびＶ９４と広範な疎水性相互作用を形成する。グルタミン酸突然変異は、以下の２つの理由でＬ１０４の場合に似た立体配座をとることは非常にあり得ないであろう。第１は、ＣＤＲ−１（Ｓ２５−Ｒ３３領域）に対する有意な摂動が存在しない場合には該構造内により長いグルタミン酸側鎖を収容するには十分な空間が存在しないことである。第２に、該疎水性領域内でグルタミン酸側鎖の負電荷を覆う(burying)ことのエネルギー性コストが大きいであろうことである。代わりに、モデル研究により、該グルタミン酸側鎖は該表面上にフリップアウトされてその電荷は溶媒和によって安定化することができると予想される。該領域内の他の残基に対する最少の歪みを伴って、該立体配座の変化はＧ１０５によって容易に収容され得る。
【０２１６】
突然変異体と、ＣＤ８０またはＣＤ８６を発現するＣＨＯ細胞との高アビディティー結合
安定に形質移入されたＣＤ８０＋およびＣＤ８６＋のＣＨＯ細胞とＣＴＬＡ４Ｉｇおよび突然変異分子のＦＡＣＳ分析（図２３）を、本明細書に記載する通り実施した。ＣＤ８０陽性およびＣＤ８６陽性のＣＨＯ細胞を、ＣＴＬＡ４Ｉｇ、Ｌ１０４ＥＡ２９ＹＩｇまたはＬ１０４ＥＩｇの濃度を増大させながら一緒にインキュベートして、次いで洗浄した。結合性免疫グロブリン融合タンパク質を、フルオレセインイソチオシアネート接合ヤギ抗−ヒト免疫グロブリンを用いて検出した。
【０２１７】
図２３に示す通り、ＣＤ８０陽性またはＣＤ８６陽性のＣＨＯ細胞（１．５×１０５）は、示した濃度のＣＴＬＡ４Ｉｇ（クローズド正方形）、Ｌ１０４ＥＡ２９ＹＩｇ（円形）またはＬ１０４ＥＩｇ（三角形）と一緒に２３℃で２時間インキュベートし、洗浄し、そしてフルオレセインイソチオシアネート接合ヤギ抗−ヒト免疫グロブリン抗体と一緒にインキュベートした。総計５，０００の生存可能な細胞についての結合をＦＡＣＳｃａｎを用いて分析し（１個について決定）、そして平均蛍光強度（ＭＦＩ）をＰＣ−ＬＹＳＹＳを用いたデータヒストグラムから決定した。データを、第２工程試薬のみと一緒にインキュベートした細胞について測定したバックグラウンド蛍光で補正した（ＭＦＩ＝７）。コントロールＬ６ｍＡｂ（８０μｇ／ｍＬ）は、ＭＦＩ＜３０を示した。これらの結果は、４つの独立した実験の代表である。
【０２１８】
ヒトＣＤ８０を形質移入したＣＨＯ細胞に対するＬ１０４ＥＡ２９ＹＩｇ、Ｌ１０４ＥＩｇおよびＣＴＬＡ４Ｉｇの結合は、およそ等価である（図２３Ａ）。Ｌ１０４ＥＡ２９ＹＩｇおよびＬ１０４ＥＩｇは、ＣＴＬＡ４ＩｇよりもヒトＣＤ８０を安定に形質移入したＣＨＯ細胞とより強く結合する（図２３Ｂ）。
【０２１９】
機能アッセイ
ヒトＣＤ４陽性Ｔ細胞を、免疫磁気的な陰性の選択（immunomagnetic negative selection）によって単離した（Linsleyらによる(1992) J. Exp. Med. 176：1595-1604）。単離したＣＤ４陽性Ｔ細胞を、滴定濃度のインヒビターの存在下で、フォルボールミリスチン酸酢酸（ＰＭＡ）とＣＤ８０陽性またはＣＤ８６陽性のＣＨＯ細胞とを用いて刺激した。ＣＤ４陽性Ｔ細胞（８〜１０×１０４／ウェル）を、１ｎＭ  ＰＭＡの存在下で、照射したＣＨＯ細胞刺激物質の存在または非存在で培養した。増殖反応を、７２時間培養の最後の７時間、１μＣｉ／ウェルの［３Ｈ］チミジンを添加することによって測定した。ＰＭＡとＣＤ８０陽性ＣＨＯまたはＣＤ８６陽性ＣＨＯで刺激したＴ細胞の、Ｌ１０４ＥＡ２９ＹＩｇおよびＣＴＬＡ４ＩｇのＬ１０４ＥＡ２９ＹＩｇおよびＣＴＬＡ４Ｉｇによる抑制を実施した。該結果を図２４に示す。Ｌ１０４ＥＡ２９ＹＩｇは、ＣＴＬＡ４ＩｇよりもＣＤ８０陽性ＰＭＡで処置したＣＨＯ細胞の増殖を抑制する（図２４Ａ）。Ｌ１０４ＥＡ２９ＹＩｇはまた、ＣＤ８６陽性ＰＭＡで処置したＣＨＯ細胞の増殖を抑制する際にＣＴＬＡ４Ｉｇよりもより有効である（図２４Ｂ）。したがって、Ｌ１０４ＥＡ２９ＹＩｇは、ＣＤ８０およびＣＤ８６両方の媒介によるＴ細胞同種刺激のより強力なインヒビターである。
【０２２０】
図２５は、上で調製しそして更にＣＤ８０およびＣＤ８６を発現するヒトＢリンパ芽球腫セルライン（ＬＣＬ）（ＰＭと呼ばれる）を用いて同種刺激したヒトＴ細胞のＬ１０４ＥＡ２９ＹＩｇおよびＣＴＬＡ４Ｉｇによる抑制を示す（Ｔ細胞は３．０×１０４／ウェルであり、そしてＰＭは８．０×１０３／ウェルである）。一時的な同種刺激を６日間行ない、次いで該細胞を３Ｈ−チミジンで７日間パルスし、その後に放射標識のとり込みを測定した。
【０２２１】
二次的な同種刺激は、以下の通り実施した。７日間、一時的に同種刺激したＴ細胞を、リンパ球分離培地（ＬＳＭ）（ICN, Aurora, OH）を用いて収集し、そして２４時間休止させた。次いで、上記と同じ比率でＰＭを加えることによって、滴定量のＣＴＬＡ４ＩｇまたはＬ１０４ＥＡ２９ＹＩｇの存在下でＴ細胞を再刺激した（二次）。刺激を３日間行ない、次いで該細胞を放射標識を用いてパルスし、そして上記の通り収集した。Ｌ１０４ＥＡ２９ＹＩｇが一次同種刺激したＴ細胞に及ぼす影響を、図２５Ａに示す。Ｌ１０４ＥＡ２９ＹＩｇが二次同種刺激したＴ細胞に及ぼす影響を、図２５Ｂに示す。Ｌ１０４ＥＡ２９ＹＩｇは、ＣＴＬＡ４Ｉｇよりも一次および二次のＴ細胞増殖反応の両方を抑制する。
【０２２２】
サイトカイン産生を測定するために（図２６）、２組の二次同種刺激プレートを設置した。３日後に、培地を商業主によって推奨される条件を用いたＥＬＩＳＡキット（Biosource, Camarillo, CA）を用いてアッセイした。Ｌ１０４ＥＡ２９ＹＩｇは、二次同種間刺激後のＴ細胞ＩＬ−２、ＩＬ−４およびγ−ＩＦＮサイトカイン産生を遮断する際に、ＣＴＬＡ４Ｉｇよりも強力であることを見出した（図２６Ａ〜Ｃ）。
【０２２３】
Ｌ１０４ＥＡ２９ＹＩｇおよびＣＴＬＡ４Ｉｇがサル混合リンパ球反応（ＭＬＲ）に及ぼす影響を、図２７に示す。２匹のサル由来の末梢血単球細胞（ＰＢＭＣ'Ｓ；各サルから３．５×１０４細胞／ウェル）を、リンパ球分離培地（ＬＳＭ）を用いて精製し、そして２μｇ／ｍＬのフィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）と混合した。該細胞を３日間刺激し、次いで収集の１６時間前に放射標識を用いてパルスした。Ｌ１０４ＥＡ２９ＹＩｇは、ＣＴＬＡ４ＩｇよりもサルＴ細胞増殖を抑制した。
【０２２４】
表Ｉ：
平衡定数および見かけの速度定数を、以下の表に示す（値は、３つの異なる実験からの中央値±標準偏差である）：
【表１】
2004535364.tif 000006
【０２２５】
表ＩＩ：
例示する部位でのＣＴＬＡ４Ｉｇの突然変異誘発によるＣＤ８６Ｉｇ結合の影響を、上記の通りＳＰＲによって測定した。優位な効果は、「＋」の印で示す。
【表２】
2004535364.tif 000007
【０２２６】
本発明が属する当該分野の当業者にとって明らかな通り、本発明は本発明の精神または本質的な性質から逸脱することなく、上で具体的に開示する以外の形態で具現化することができる。従って、上で記載する本発明の具体的な態様は、例示であって制限ではないと考えるべきである。
【０２２７】
実施例１０
以下の実施例は、混合キメラ化および同種特異的な免疫寛容性のウイルス媒介性抑制のキャラクタリゼーションを提供する。特に、本実施例は、ＣＤ２８／ＣＤ４０組み合わせ遮断後に同種移植片の生存の延長を妨げることを示す。
【０２２８】
マウスおよびウイルス感染症
成体雄性６〜８週齢のＢａｌｂ／ｃ、Ｂ６およびＣ３Ｈ／ＨｅＪマウスを、ジャクソンラボラトリー（Jackson Laboratory、Bar Harbor, ME）から購入した。マウスを、腹膜内（i. p.）注射した２×１０５ＰＦＵ  ＬＣＭＶ  アームストロング(Armstrong)で感染させた。ウイルスストック液を増殖させ、そして従来通り（AhmedらによるJ. Exp. Med., 160：521 (1984)）定量化した。
【０２２９】
皮膚移植片
十分な厚さの皮膚移植片（〜１ｃｍ２）をレシピエントマウスの背側の胸部に移植し、そしてバンドエイド（Johnson & Johnson, Arlington, TX）を用いて７日間固定した。 次いで、移植片の生存を毎日の視覚検査によって追跡した。拒絶反応は、生存可能な上皮移植片組織の完全な消失として定義した。統計学的な分析を、Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ  Ｕ検定を用いて行なった。
【０２３０】
骨髄の調製および処置プロトコール
皮膚移植片レシピエントを、移植日（０日目）、並びに移植の２、４および６日後に、ハムスター抗−マウスＣＤ４０Ｌ  Ａｂ（ＭＲ１）およびヒトＣＴＬＡ４−Ｉｇの各５００μｇを腹膜内投与して処置した。ＣＤ−４およびＣＤ−８欠乏させた実験グループに、ラット抗−マウスＣＤ４（ＧＫ１．５）またはラット抗−マウスＣＤ８（ＴＩＢ１０５）の１００μｇを−３、−２、−１日目におよび収集するまで毎週、腹膜内で与えた。ブスルファン（Busulfex; Orphan Medical, Minnetonka, MN）を用いて処置したマウスに、術後５日目に６００μｇを与えた。骨髄を脛骨、大腿骨および上腕骨からフラッシュし、そして赤血球をトリス−緩衝塩化アンモニウム溶液を用いて溶解した。細胞を生理食塩水中に再懸濁し、そしてこのものを術後０日および６日目に２×１０７細胞／投与で静脈内（i.v.）注射した。
【０２３１】
ＣＦＳＥ標識化および養子移植
未処置または免疫Ｂ６  Ｔ細胞の標識化および照射したＢａｌｂ／ｃレシピエント中への養子移植は、これまでに記載されている通り（WilliamsらによるJ. Immunol., 165：6849 (2000)）行なった。収集した脾細胞を、フローサイトメトリーによって分析した。
【０２３２】
細胞内ＩＦＮ−ガンマアッセイ
ＬＣＭＶペプチドを用いた再刺激に対する反応の際の細胞内ＩＦＮ−γ発現を、本質的に記載されている通り（Murali-KrishnaらによるImmunity 8：177 (1998)）分析した。ＣＦＳＥ標識化細胞の照射レシピエントの場合には、ブレフェルディン(brefeldin)Ａ（GolgiPlug；BD PharMingen, San Diego, CA）の存在下で、収集した脾細胞をＬＣＭＶ−感染または非感染のＭＣ５７繊維芽細胞と一緒に５時間インキュベートした。ＧＶＨＤアッセイにおいて、ペプチド特異的なＩＦＮ−γ産生を、０．１μｇ／ｍＬの適当なＬＣＭＶペプチドを用いてパルスした非感染性ＩＣ２１マクロファージ細胞を用いて再刺激することによって評価した。表面染色後に、細胞を透過処理し、そして商業主の指示に従ってサイトフィックス(Cytofix)／サイトペルム(Cytoperm)キット（BD PharMingen）を用いてＩＦＮ−γ発現について染色した。
【０２３３】
ＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＰＯＴアッセイ
同種特異的なＴ細胞反応は、ＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＰＯＴアッセイによって測定した。３倍稀釈のレシピエント脾細胞（Ｈ−２ｋまたはＨ−２ｂ）を、予めＩＦＮ−γ捕獲Ａｂで被覆したエステルセルロース底面プレート（Millipore, Bedford, MA）中でウェル当たり５×１０５照射ドナー脾細胞（Ｈ−２ｄ）を用いて終夜刺激した。ＬＣＭＶ特異的反応を測定するために、脾細胞を感染させたＬ９２９（Ｈ−２ｋ）またはＭＣ５７（Ｈ−２ｂ）細胞を用いて終夜再刺激した。プレートを、これまで記載されている通り（WilliamsらによるJ. Immunol. 165：6849 (2000)）被覆しそして展開させた。
【０２３４】
細胞の調製およびフローサイトメトリー
これまでに記載されている通り（Murali-KrishnaらによるImmunity 8：177 (1998)）、ＭＨＣクラスＩ四量体を調製し、そしてβ２−ミクログロブリンおよび適当なペプチドを用いてリフォールディングさせた。ＣＦＳＥ−標識化Ｔ細胞の照射レシピエント脾細胞の分析は、蛍光色素−接合Ａｂｓ（ラットＩｇＧ２ａ  ＰＥ、ラットＩｇＧ２ｂ  ＰＥ、抗−ＣＤ４  ＰＥ、抗−ＣＤ８  ＰＥ；BD PharMingen）およびＡＰＣ標識化四量体を用いて行なった。細胞内染色のために、細胞を抗−ＣＤ８  ＰＥおよびラットＩｇＧ２ｂ  ＡＰＣまたは抗−ＩＦＮ−γ  ＡＰＣ（BD PharMingen）を用いて標識化した。末梢血を、蛍光色素接合Ａｂｓ（ラットＩｇＧ２ａ  ＡＰＣ、抗−ＣＤ４  ＡＰＣ、マウスＩｇＧ２ａ  ＦＩＴＣ、抗−Ｈ−２Ｋｄ  ＦＩＴＣ、マウスＩｇＧ１  ＦＩＴＣ、抗−Ｖβ５  ＦＩＴＣ、ラットＩｇＧ２ｂ  ＦＩＴＣ、抗Ｖβ１１  ＦＩＴＣ；BD PharMingen）を用いて染色し、続いて赤血球を溶解させ、そして全血溶解キット（R & D Systems, Minneapolis, MN）を用いて洗浄することによって分析した。脾臓樹状細胞をこれまでに記載されている通り（RuedlらによるBur J. Immunol. 26：1801 (1996)）、オプチプレパ(Optiprep)カラム（Nycomed, Oslo, Norway）を用いて濃縮し、そして蛍光色素接合Ａｂｓ（ｈａｍ  ＩｇＧ  ＰＥ、抗−ＣＤ１１ｃ  ＰＥ、ｈａｍ  ＩｇＭ  ＦＩＴＣ、抗−ＣＤ４０  ＦＩＴＣ、抗−ＣＤ５４  ＦＩＴＣ、ラットＩｇＧ２ａ  ＦＩＴＣ、抗−ＣＤ８０  ＦＩＴＣ、抗−ＣＤ８６  ＦＩＴＣ、マウスＩｇＧ２ａ  ＦＩＴＣ、抗Ｈ−２Ｋｄ  ＦＩＴＣ、抗−Ｉ−Ａｂ  ＦＩＴＣ；BD PharMingen）を用いて分析した。フローサイトメトリーはＦＡＣＳＣaliberを用いて実施し、ＣＦＳＥ蛍光データをＦＬ１(ＦＩＴＣ)チャンネルを用いて集めた。データを、セルクエスト(CellQuest)ソフトウェア（BD Biosciences, Braintree, MA）を用いて分析した。
【０２３５】
セルライン
線維肉腫セルラインＭＣ５７（Ｈ−２ｂ＋）および肝臓由来セルラインＬ９２９（Ｈ−２ｋ＋）を増殖させ、そして１０％ＦＢＳ、抗生物質および２−ＭＥを用いて補足したＲＰＭＩ  １６４０中を通過させた。
【０２３６】
結果
急性ＬＣＭＶ感染は、ＣＤ２８／ＣＤ４０  Ｔ細胞同時刺激経路の遮断によって誘発される同種移植片生存の延長を破壊する。
最近の証拠により、いくつかのウイルス感染症（例えば、ＬＣＭＶおよびＰＶ）がＣＤ４０経路の遮断およびドナー脾細胞の投与によって媒介される皮膚同種移植片の生存の延長を抑制することが示されている（WelshらによるJ. Virol. 74：2210 (2000)）。ＣＤ２８およびＣＤ４０のＴ細胞同時刺激経路を同時に遮断する場合に、急性ＬＣＭＶ感染症が皮膚移植片の生存時間を変えることができるかどうかを評価した。Ｃ３Ｈ／ＨｅＪマウスに、移植後の０、２、４および６日目にＣＴＬＡ４−Ｉｇおよび抗−ＣＤ４０Ｌと一緒にＢａｌｂ／ｃ皮膚同種移植片を与えた。生存時間の中央値（ＭＳＴ）は、＞８０日であった（ｎ＝５）。ＢＡＬＢ／ｃ皮膚同種移植片および同時刺激遮断を与えたＣ３Ｈ／ＨｅＪマウスは、＞８０日まで生存した（図２９）。それに対して、移植日またはその近くで２×１０５ＬＣＭＶアームストロングの同時感染と合わせて、同じ方法および処置を与えたマウスは、直ちにそれらの移植片を拒絶した（ＭＳＴは２０日；図２９）。急性ＬＣＭＶ感染後、皮膚同種移植片の同時刺激遮断耐性拒絶反応に対する各Ｔ細胞サブセットの相対的な寄与を測定するために、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋のＴ細胞を、それぞれＧＫ１．５およびＴＩＢ１０５  Ａｂｓを用いてインビボで欠乏させた。図２９に示す通り、ＣＤ４＋Ｔ細胞の欠乏は、ＬＣＭＶによる感染後にＢＡＬＢ／ｃ皮膚移植片を拒絶するＣ３Ｈ／ＨｅＪマウスの能力を改変しなかった（ＭＳＴは１８日）。ＣＤ８＋Ｔ細胞の欠乏は、皮膚移植片拒絶反応のわずかな遅延を生じた（ＭＳＴは２６日）。両方のサブセットの欠乏は、同時に長期間の同種移植片の生存を生じ（ＭＳＴは＞６０日）（図２９）、このことは該欠乏が有効であることおよび該ウイルスが同種移植片に対して直接的に有害でないことの両方を示す。
【０２３７】
これらの結果は、ＬＣＭＶがＣＤ２８およびＣＤ４０のＴ細胞同時刺激経路の組み合わせ遮断の面において、移植片拒絶反応の促進を誘発することを示す。該結果はまた、ＣＤ４＋またはＣＤ８＋のＴ細胞のいずれかがＬＣＭＶ誘発性皮膚移植片拒絶反応を媒介するのに十分であることを示す。
【０２３８】
急性ＬＣＭＶ感染症は、部分的な造血性キメラ化、アロ反応性Ｔ細胞の欠乏、およびドナー特異的免疫寛容を誘発の確立を妨げる。
ＬＣＭＶ感染症が強い免疫寛容誘発モデルにおいて同じ効果を有するかどうか、具体的には急性ＬＣＭＶ感染症が同時刺激遮断媒介による混合造血性キメラ化およびドナー特異的免疫寛容の確立を破壊することができるかどうかを測定する。ＣＤ４０／ＣＤ２８同時刺激経路の遮断と合わせて、選択的な幹細胞毒性ブスルファンを用いた処置後のドナー骨髄の投与は、高レベルのキメラ化、ドナー反応性Ｔ細胞の欠失および不定なドナー特異的免疫寛容を与える（AdamsらによるJ. Immunol. 167：1103 (2001)）。
【０２３９】
図３０Ａに示す通り、ＢＡＬＢ／ｃ皮膚および骨髄、並びにブスルファンおよび同時刺激遮断処置を与えた５／５  Ｂ６マウスは、処置したマウスの１００％において２００日以上の皮膚移植片の生存を有していた。逆に、急性ＬＣＭＶ感染を用いて同時に同じ処置を与えた５／５マウスは、それらの移植片を直ちに拒絶した（ＭＳＴは１４日）。これらの結果は、３つの別々の実験の代表である。これまでのモデルと同様に、ＣＤ８＋Ｔ細胞の前欠乏は、ＣＤ４＋Ｔ細胞がいくらか遅延した様式ではあるが、移植片拒絶反応を媒介することができることを示した。欠乏後に、ＣＤ８＋Ｔ細胞は末梢血中で全く検出することができず、一方で感染中の両方のサブセットの同時欠乏は不定な移植片拒絶反応を与え、このことは該欠乏が有効であることを示す。
【０２４０】
上記の方法後に、非感染マウスを進行させて、実質的なレベルの造血性キメラ化を発生させた（図３０Ｂ）。１２５日までに、末梢血白血球の６０％より多くが全てのマウスにおいてＨ−２Ｋｄ＋であった（ｎ＝５）。キメラ化は、試験した全ての系統（これは、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋、Ｂ２２０＋、ＣＤｌｌｂ＋およびＧＲ−１＋細胞を含む）において観察された。逆に、生着の時にＬＣＭＶと合わせて同じ処置を与えたマウスは決して、検出可能な長期間のキメラ化を発生しなかった。ＣＤ８＋Ｔ細胞の前欠乏（図３０Ｂ）は、キメラ化を抑制する感染能力を変えなかった。
【０２４１】
骨髄生着および同時刺激遮断を用いた処置後のドナー特異的免疫寛容は、アロ反応性Ｔ細胞の欠失に少なくともいくらか帰する（WekerleらによるJ. Exp. Med. 187：2037 (1998), DurhamらによるJ. Immunol. 165: 1 (2000)）。ＬＣＭＶ誘発による皮膚移植片拒絶反応がドナー反応性Ｔ細胞の末梢欠失の損傷に関係するかどうかを測定するために、非感染グループ（これは、骨髄および皮膚移植片の両方を受け入れる）におけるＢ６レシピエント由来および感染グループ（これは、骨髄および皮膚移植片の両方を拒絶する）由来のＣＤ４＋Ｔ細胞によるＶβ１１およびＶβ５．１／２の使用を比較した。ＢＡＬＢ／ｃマウスは、Ｉ−Ｅ  ＭＨＣクラスＩＩ分子によって提示される内因性レトロウイルススーパー抗原（マウス乳癌ウイルス（ＭＭＴＶ））に対するそれらの高いアフィニティーに起因して、胸腺におけるＶβ１１およびＶβ５を有するＴ細胞を欠失する。Ｂ６マウスはＩ−Ｅを発現せず、従ってＣＤ４＋Ｔ細胞の〜５−７％についてＶβ１１を、およびＣＤ４＋Ｔ細胞の〜３−５％についてＶβ５．１／２を使用する。この実験において、皮膚生着後に同時刺激遮断薬、骨髄およびブスルファンを用いて処置した非感染マウスは、移植の２８日後までに末梢血中のＶβ１１＋ＣＤ４＋およびＶβ５＋ＣＤ４＋  Ｔ細胞のパーセントの低下を示した。移植後の６０日目に、これらの細胞個体群の発現は末梢血中でほとんど検出することができず、ＢＡＬＢ／ｃマウスのおいて見られるのに類似するパーセントの全ＣＤ４＋個体群を含んでいた。それに対して、生着時に２×１０５ＰＦＵ  ＬＣＭＶアームストロングを与えたマウスは、移植後のいずれかの時点においてもＶβ５＋ＣＤ４＋およびＶβ１１＋ＣＤ４＋のＴ細胞を欠失することはできなかった（図３０のＣおよびＤ）。ＣＤ８＋Ｔ細胞の存在にかかわらず、これらの細胞の個体群の欠失の失敗が生じた。このことは、ＣＤ４０／ＣＤ４０Ｌ経路の破壊後の、ＬＣＭＶ誘発によるアロ反応性Ｔ細胞の末梢欠失の抑制を記載した初期の観察と相関する（TurgeonらによるJ. Surg. Res. 93：63 (2000)）。
【０２４２】
これらの結果は、同時刺激遮断薬および骨髄投与の組み合わせの免疫寛容効果を克服する際の、ＬＣＭＶの役割を示す。該データは、急性感染後の皮膚および造血性同種移植片の速い拒絶反応が存在し、このことによりドナー特異的免疫寛容の誘発を防ぐことを示す。加えて、異所性心臓同種移植片を同じ処置を用いて行ない、そして再びＬＣＭＶはドナー特異的免疫寛容の発生を抑制する。いずれの亜集団も急性感染後のＣＤ４０／ＣＤ２８に独立した移植片の速い拒絶反応を誘発することができると思われるので、この効果はＣＤ８＋またはＣＤ４＋のＴ細胞のいずれかのみに帰するとすることはできない。移植片生存によって予想される通り、ドナー反応性Ｔ細胞は感染マウスにおいては検出されず、一方で免疫寛容療法を与えた非感染マウスは６０日以内にドナーＭＭＴＶスーパー抗原反応性Ｔ細胞サブ個体群を欠失する。
【０２４３】
ＬＣＭＶ感染は、確立された免疫寛容を抑制しない。
ＬＣＭＶによる感染の遅延が免疫寛容キメラマウスにおいて皮膚または骨髄移植片の拒絶反応を誘発することはあり得ないであろう。この仮説を調べるために、移植および免疫寛容誘発の４〜５週間後に、マウスをＬＣＭＶで感染した。５／５マウスは、感染の時点で末梢血中で２０％より大きくキメラ化した。感染後に、皮膚移植片を生存させ、そしてキメラ化の発生を追跡した。図３１のＡおよびＢに示す通り、遅延型ＬＣＭＶ感染を与えたマウスにおける皮膚移植片は不定に生存し、一方で造血性キメラ化は非感染コントロールと比べて正常に発生した。
【０２４４】
ＬＣＭＶ感染はＴＣＲレベルでの同種抗原と交差反応するＴ細胞反応を発生し得て、この反応はＬＣＭＶ誘発による移植片拒絶反応にとって必須である。これまでに得られた結果は、ドナー反応性Ｔ細胞の欠失およびキメラ化免疫寛容マウスにおけるそれらの存在の検出の不能を示している（WekerleらによるJ. Exp. Med., 187：2037 (1998)；DurhamらによるJ. Immunol., 165: 1 (2000)）ので、このことにより、ＬＣＭＶエピトープをも認識するアロ反応性Ｔ細胞が２８日までに検出されるかまたは失活されるであろうことは予想されるであろう。従って、免疫寛容マウスにおいてＬＣＭＶに対して反応するのに利用することができるＴ細胞のレパートリーの改変が期待できるかも知れない。この可能性を調べるために、ＬＣＭＶ特異的な免疫反応を免疫寛容マウスにおいて分析した。いずれかのあるエピトープに対するＴ細胞反応の選択的な機能障害は、ＴＣＲ交差反応性と一致した。
【０２４５】
Ｂ６マウスに、ＢＡＬＢ/ｃ皮膚移植片および骨髄を同時刺激遮断薬およびブスルファン処置と一緒に与えた。コントロールマウスに、同系間骨髄および皮膚移植片を与えた後に、同じ処置療法を与えた。移植の２８日後に、マウスをＬＣＭＶで感染した。８日後に、脾細胞を収集し、ブレフェルディンＡの存在下、ＬＣＭＶペプチドを用いて５時間再刺激し、そして細胞内ＩＦＮ−γ発現のために染色した。被験ペプチドは、核タンパク質(ＮＰ)３９６−４０４、ｇｐ３３−４１、ｇｐ２７６−２８６、ＮＰ２０５−２１４およびクラスＩＩ−制限ペプチドｇｐ６１−８０であった。被験の全エピトープは、同系間皮膚移植片および骨髄移植片を与えた動物において、感染の８日後までに多数のＡｇ−特異的Ｔ細胞を脾臓中で発生した。同種間移植片を与えたマウスにおいて、感染の８日後の脾臓における抗ウイルス性Ｔ細胞の数は、恐らくＨ−２ｂを発現しないＡＰＣｓの流入のために、試験した各エピトープについて中位に低かった（１．５〜２．０倍）。しかしながら、いずれかのあるエピトープの実質的な欠失は全く検出されず、同系間移植片を与えたマウスおよび同種間移植片を与えたマウスの間でのエピトープ階層(hierarchy)におけるいずれの顕著な変化も存在しなかった（図３２を参照）。これらの結果は、混合キメラ化の誘発後に抗ウイルス反応の中位の低下が存在するが、同種抗原に対するいずれかの特異的なエピトープのＴＣＲ交差反応性に関係ないことを示唆する。
【０２４６】
ＬＣＭＶ特異的なＴ細胞は、同種抗原に対する反応の際に分裂しない。
ＬＣＭＶ−特異的なＣＤ８Ｔ細胞もまたアロ反応性であるかどうかという問題に直接に取り組むために、これまでに記載されているＧＶＨＤモデル（WellsらによるJ. Clin. Invest. 100：3173 (1997)）を使用した。ＬＣＭＶ−免疫性Ｂ６マウスからのＴ細胞（感染後の＞３０日）を、蛍光色素ＣＦＳＥ（Molecular Probes, Eugene, OR）を用いて標識化して、このものを照射した（１８００ラド）同種間ＢＡＬＢ／ｃ宿主に静脈内注射した。このモデルにおいて、Ａｇに対して反応性である同種間Ｔ細胞は各々の続く分裂を伴って蛍光を低下させ、このことにより非常に分裂したアロ反応性細胞のフローサイトメトリーによる定量化および分析が可能となった。ＬＣＭＶ−免疫マウスをドナーとして使用することによって、我々はＬＣＭＶ−反応性Ｔ細胞をもまた、Ｄｂ／ＮＰ３９６−４０４、Ｄｂ／ｇｐ３３−４１およびＫｂ／ｇｐ３４−４３クラスＩ  ＭＨＣ四量体を用いて直接に染色することによって、同種抗原に対する反応の際に分裂するかどうかを評価した。脾細胞を、移入の７２時間後に収集し、抗−ＣＤ８Ａｂｓおよび四量体を用いて染色し、そしてフローサイトメトリーによって分析した。
【０２４７】
未処置および免疫マウスの両方由来のＣＤ８＋Ｔ細胞は、同種抗原に対する反応の際に有意に分裂し、両方のグループ由来の細胞の大部分は少なくとも８分裂に達した。それに対して、照射した同系間レシピエント中に注射したいずれのグループ由来のＣＤ８＋Ｔ細胞は、３回よりも多く分裂しなかった。したがって、ゲートの非分裂および最大分裂の（４〜８回の分裂）ＣＤ８＋Ｔ細胞をゲートし、そして各個体群における四量体の結合を分析した（図３３）。ＬＣＭＶ−特異的なＣＤ８Ｔ細胞は、試験した各四量体についてのＬＣＭＶ−免疫Ｔ細胞のレシピエントにおける非分裂個体群で容易に検出することができた。しかしながら、識別可能な染色は、最大に分裂した個体群においてはいずれの四量体についてもバックグラウンドよりも上で検出されなかった（図３３）。該結果を表ＩＩＩにまとめる。四量体結合を検出することができないのは単に非常に分裂した細胞におけるＴＣＲ下方調節の結果ではないことを確認するためのコントロールとして、ＴＣＲβの発現を染色することによって測定した。最大に分裂した細胞中でのＴＣＲの発現の低下は、本アッセイによって観察されなかった。その上、リンパ原性(lymphopenic)宿主において増殖性のＬＣＭＶ−特異的ＣＤ８Ｔ細胞はＭＨＣ四量体との結合の低下を示さないということが、従来の研究（Murali-KrishnaらによるJ. Immunol., 165：1733 (2000)）により確立されている。
【０２４８】
本実験はアロ反応性についての候補としての３つの主なエピトープを除くが、交差反応性が免疫マウス由来のドナー細胞において検出することができるかどうかを、インビトロで全ＬＣＭＶおよび特異的なＬＣＭＶペプチドを用いて再刺激後に測定した。このことを達成するために、上記の通り、３日目にマウス脾細胞をＢＡＬＢ／ｃレシピエントから収集し、感染または非感染のＭＣ５７細胞およびブレフェルディンＡを用いて５時間再刺激し、透過処理し、細胞内ＩＦＮ−γ発現のために染色し、そしてフローサイトメトリーによって分析した。図３４に示す通り、ＩＦＮ−γ発現は感染ＭＣ５７細胞を用いて刺激した非分裂ＣＤ８Ｔ細胞における場合以外にはバックグラウンドより上で観察されなかった。４つのＬＣＭＶエピトープに対する反応を更に、同じ方法で分析した。これらの実験において、感染細胞を用いて刺激するよりもむしろ、収集した脾細胞はＬＣＭＶペプチド（ＮＰ３９６−４０４、ｇｐ３３−４１、ｇｐ２７６−２８６、ＮＰ２０５−２１４）でパルスしたＭＣ５７細胞を用いて再刺激した。これらペプチドのいずれも、分裂したアロ反応性ＣＤ８Ｔ細胞においてバックグラウンドよりも上でＩＦＮ−γ産生を誘発しなかった。それに対して、ＬＣＭＶ−特異的なＣＤ８Ｔ細胞はこれらのペプチドを用いて再刺激後に、非分裂個体群において容易に検出することができた。これらの実験についての１警告は、非常に分裂した細胞における高いバックグラウンドのＩＦＮ−γ産生である。これは、恐らくブレフェルディンＡのインキュベートの間でのこれらの細胞の連続サイクルおよび低レベルの刺激によるのであろう。
表ＩＩＩ．ＬＣＭＶ−特異的なＴ細胞は同種抗原に対する反応の際に分裂しない。
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(脚注)
ＬＣＭＶ免疫（感染後の＞３０日）Ｂ６マウス由来の２×１０７ＣＦＳＥ標識化Ｔ細胞を、照射した（１８００ラド）ＢＡＬＢ／ｃマウス中に静脈内注射した。レシピエントの脾細胞を７２時間後に収集し、そしてＣＤ８の発現、ＣＦＳＥ蛍光およびＭＨＣ四量体との結合についての３呈色フローサイトメトリーによって分析した。数字は、ＭＨＣ四量体と結合する示した分裂個体群におけるＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセントを示す。示す誤差は、中央値の標準誤差である（ｎ＝３）。
【０２４９】
ＬＣＭＶは、アロ反応性のＩＦＮ−γ産生細胞のＣＤ２８／ＣＤ４０に独立した発生を促進する。
ＬＣＭＶ感染後の同種間且つ抗ウイルス性のＴ細胞反応の発生をより確認するために、脾細胞をインビトロでの再刺激後にＩＦＮ−γを産生するそれらの能力について、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイによって追跡した。この実験において、ＢＡＬＢ／ｃ皮膚移植片を与えたＣ３Ｈ／ＨｅＪマウスは、移植の８日後までに脾臓中で〜３−４×１０５同種特異的なＴ細胞を発生し、そしてこれらの細胞数は１５日目にわずかに減少した。同時刺激遮断薬を用いた処置は、両方の時点での該同種間反応を完全に破壊した。皮膚移植片および同時刺激遮断薬を急性ＬＣＭＶ感染と同時に与えたマウスは、８日目までに脾臓中で少数の（〜９×１０４）同種特異的な細胞を発生した。１５日目までに、これらのマウスは同時刺激遮断の免疫抑制効果を克服し、そして非処置コントロールに匹敵するアロ反応（〜２．５×１０５）を発生した。これまでに報告されている通り、皮膚移植片の非存在下での急性ＬＣＭＶ感染は、８日目までにいくつかの同種特異的なＩＦＮ−γ産生細胞（〜３×１０５）を生じさせた。１５日目までに、この効果はＩＦＮ−γ＋細胞を脾臓当たり〜４×１０４にまで著しく低下した（図３５）。
【０２５０】
該ＬＣＭＶ特異的な反応を測定するために、各グループ由来の脾細胞を、感染Ｌ９２９細胞と一緒にＥＬＩＳＰＯＴプレート上で終夜インキュベートした。予想される通り、ＬＣＭＶ感染のみは強力な抗ウイルス性反応を誘発し、これにより〜１．２×１０７のＩＦＮ−γ産生Ｔ細胞を脾臓中で発生し、一方で組み合わせ遮断およびＢＡＬＢ／ｃ皮膚移植片を同時に与えたマウスは更に大量の反応を発生するが、脾臓中でのＬＣＭＶ特異的な細胞の数が〜３倍に低下した（〜４×１０６）。１５日目までに、ＬＣＭＶ感染マウス由来の脾臓は、ＬＣＭＶ特異的な細胞の数が３〜４倍低下することを示した。組み合わせ遮断を与えたマウスにおいて、該低下はいくらか大きかった（図３５）。
【０２５１】
ＬＣＭＶ感染マウスは同種抗原に対する記憶を得たかどうかを評価するために、Ｂ６マウスを感染させ、脾臓中での同種特異的な細胞の数を感染のピーク時（８日目）および免疫記憶の発生後に（感染の＞３０日後）、ＩＦＮ−γＥＬＩＳＰＯＴによって定量化した。ＬＣＭＶ感染マウスは、同種特異的なＴ細胞（７．２９×１０５±１．７８×１０５、ｎ＝３）を感染のピーク時に発生したが、感染の３０日後までに脾臓中のこれらの細胞数は５０〜１００倍（１×１０４±９．９×１０２、ｎ＝３）低下した。それに対して、いくつかの公知の免疫優性およびサブ優性のＬＣＭＶエピトープ（ＮＰ３９６−４０４、ｇｐ３３−４１、ｇｐ２７６−２８６、ＮＰ２０５−２１４）に対して特異的なＴ細胞の数は、同じ期間では脾臓中で１０〜１２倍低下した（１．５２×１０７±１．１３×１０６〜１，４０×１０６±１．１３×１０５、両方のグループについてｎ＝３）。このＬＣＭＶ記憶のレベルは、これまでの報告（Murali-KrishnaらによるImmunity, 8：177 (1998)）のものと同様である。
【０２５２】
これらの結果は、ＬＣＭＶ感染がＣＤ４０／ＣＤ２８に独立した機構によって少なくとも同種抗原Ｔ細胞サブセットの活性化を刺激し、そのことによって同時刺激遮断薬の免疫抑制効果を克服し、そして早い移植片拒絶反応を引き起こすことを示す。ＣＦＳＥおよびＥＬＩＳＰＯＴの結果に基づくと、同種抗原に対してＴＣＲ特異性をも有するウイルス特異的なＴ細胞の度数(frequency)は低いようである。
【０２５３】
ＬＣＭＶ感染は、脾臓樹状細胞のＣＤ２８／ＣＤ４０に独立した成熟を誘発する。
ＬＣＭＶ感染が移植免疫寛容を抑制し、そしてアロ反応性Ｔ細胞の活性化を刺激することの他の潜在的な機構を調査した。Ｖβサブセットの欠失を研究しているこれまでの実験により、ＬＣＭＶ感染の存在下でＣＴＬＡ４−Ｉｇおよび抗−ＣＤ４０Ｌがアロ反応性Ｔ細胞の欠失を開始することはできないことが確立されている。ＬＣＭＶ感染は、ＡＰＣｓによるＴ細胞同時刺激経路の誘発および／または上方調節に影響を及ぼすことができるであろう。その上、ＬＣＭＶはアロ反応性Ｔ細胞の欠失を防止する分子または生存因子の発現を誘発し得る。このことを調べるために、同時刺激分子およびＣＤ１１ｃ＋樹状細胞による脾臓中でのＭＨＣの発現に及ぼすＬＣＭＶ感染の効果を分析した。
【０２５４】
マウスに、ＢＡＬＢ／ｃ皮膚移植片および骨髄、同時刺激遮断療法およびブスルファンを与えた。１グループは、０日目にＬＣＭＶアームストロングで感染させ、一方でその他は感染させなかった。脾細胞を６日目に収集し、これまでに記載されている通り（RuedlらによるEur. J. Immunol. 26：1801 (1996)）、オプチプレパカラム（Nycomed）を用いて細胞密度に基づいて分離した。低密度の画分（これは、樹状細胞が多い）を収集し、そしてＣＤ１１ｃ発現のために、ＭＨＣクラスＩおよびＩＩを、ＩＣＡＭ−１、ＣＤ４０、ＣＤ８０並びにＣＤ８６と一緒に染色した。フローサイトメトリーによる分析後に、ＣＤ１１ｃ＋細胞におけるこれらの細胞の発現を分析した。図３６に示す通り、同時刺激遮断薬の存在にも関わらず、ＬＣＭＶ感染により、これら分子の全ての発現が増大した。従って、ＬＣＭＶ感染は樹状細胞のより高い活性化状態を誘発する。ＬＣＭＶ感染が免疫寛容誘発に及ぼす有害な影響は、アロ反応性Ｔ細胞を刺激しそして活性化するＡＰＣｓの能力の増大に帰することができる。
【０２５５】
本実施例は、ＣＴＬＡ４−Ｉｇおよび抗−ＣＤ４０Ｌを用いた組み合わせ療法後に、速い同種移植片の拒絶反応が生じることを示す。ＬＣＭＶ感染はドナー骨髄、ブスルファン、ＣＴＬＡ４−Ｉｇおよび抗−ＣＤ４０Ｌの投与後に、不確定な皮膚同種移植片の生存並びに混合造血性キメラ化の両方を妨害するので、本効果は強い免疫寛容誘発モデルにまで拡張することができる。本効果はＣＤ８Ｔ細胞の非存在下でいくらか遅延するが、それにも関わらず、それは血液中での検出可能なＣＤ８発現を伴わうことなく生じ、そしてＣＤ４Ｔ細胞の欠乏は移植片生存にほとんど全く影響を有しない。ＬＣＭＶ誘発による同種移植片の拒絶反応はドナー反応性ＣＤ４Ｔ細胞を欠失することができないことと相関し、このことはスーパー抗原反応性ＶβＴ細胞サブセットを追跡する(tracking)ことによって測定される。感染の発症の３〜４週間の遅延は移植片の生存または混合キメラ化の誘発に全く影響を有しないので、感染は移植の時またはその近くでおこらなければいけない。これらの研究は、ドナー脾細胞および抗−ＣＤ４０Ｌの投与後のＬＣＭＶ−媒介による皮膚移植片の生存の抑制についての先行報告（WelshらによるJ. Virol., 74：2210 (2000)）を確認し、そしてＬＣＭＶ誘発による移植片の拒絶反応がＣＤ４０に独立したＢ７．１またはＢ７．２の上方制御によって媒介されないことを示すことによってそれらを拡張する。免疫寛容誘発方法の使用についての１関心は、同時発生的なウイルス感染症に対する免疫寛容を誘発する可能性である。該ＬＣＭＶに対する免疫反応が同時刺激遮断薬に基づく免疫寛容誘発療法の使用後に免疫寛容とならないことはかなり関心がもたれ、該発見はＬＣＭＶ  Ｔ細胞反応がＣＤ２８およびＣＤ４０とは大きく独立しているというこれまでの観察（WhitmireらによるJ. Virol., 70：8375 (1996)；AndreasenらによるJ. Immunol.. 164：3689 (2000)；ShahinianらによるScience 261：609 (1993)）と一致する。
【０２５６】
ＬＣＭＶ感染が移植片生存に及ぼす有害な影響についての１つの可能な説明は、抗ウイルス反応の間でのＴＣＲ／ＭＨＣ認識レベルの同種抗原に対する交差反応性の存在であり得ると提案されている（WelshらによるJ. Virol., 74：2210 (2000)）。このシナリオにおいて、抗ウイルス反応は同種抗原に対する特異性をも有するいくつかの細胞を含むであろう。この仮説の支持として、ＬＣＭＶがＨ−２ｄ−特異的ＣＤ８Ｔ細胞をＴ細胞反応のピーク時に誘発することが示されている（YangらによるJ. Immunol., 136：1186 (1986)）。上記の実施例は同様な結果を与えるが、インビボでＨ−２ｄ同種抗原に対して発生するＬＣＭＶ特異的なＣＤ８Ｔ細胞の実質的な交差反応性についての証拠はほとんどない。活性化されたＣＤ８Ｔ細胞数はいくらか包括的に減少するが、遅延型の一次感染（移植の４週間後）は不変のエピトープ階層との抗ウイルス反応を誘発する。その上、細胞内サイトカイン染色およびＭＨＣ四量体を用いる高感度な単細胞アッセイを使用して、同種抗原に対する反応の際のＬＣＭＶ−免疫ＣＤ８Ｔ細胞の分裂が検出されなかった。それにもかかわらず、これまでに報告されている通り、ＬＣＭＶ一次感染はアロ反応性細胞を発生しない。これらの細胞は、移植の１５日後までに数が非常に減少し、そしてＬＣＭＶ−免疫マウスにおいては（感染の＞３０日後）かろうじて検出することができる。これらの実験は、同種抗原に対して交差反応性であるＬＣＭＶ特異的なＣＤ８Ｔ細胞の度数が低く、そして高レベルの交差反応性のＣＤ４Ｔ細胞が存在し得ることを示唆する。
【０２５７】
アロ反応性Ｔ細胞がＬＣＭＶ感染の間に活性化される主な機構は未知のままである。最近の研究は、抗ウイルス反応の間に生成する活性化ＣＤ８Ｔ細胞の大部分がＡｇ特異的であることを示している（Murali KrishnaらによるImmunity 8：177 (1998)；ButzらによるImmunity 8：167 (1998)；ZarozinskiらによるJ. Exp. Med. 185：1629 (1997)）。未処置のマウスにおいてアロ反応性ＣＤ８Ｔ細胞の高い度数が得られるが、ＴＣＲ／ＭＨＣ相互作用のレベルで実質的な交差反応性が存在し得る。しかしながら、我々は照射したＢＡＬＢ／ｃドナーヘ注射後に、ＣＦＳＥ標識化したＬＣＭＶ特異的なＣＤ８Ｔ細胞の同種特異的な活性化の有意なレベルを検出することができなかった。その上、該反応のピーク後に悪化する死亡期を有するので、ＬＣＭＶ誘発によるアロ反応性細胞は他のウイルス特異的な個体群と同様には挙動しない。単離の際に、ＣＤ４およびＣＤ８のＴ細胞サブセットの両方は、免疫寛容の誘発および混合キメラ化を防止することができない。興味深い事に、ＬＣＭＶ感染の間の同時刺激経路の破壊は、ＣＤ８＋Ｔ細胞反応に及ぼす影響はほとんど有しないが、ＣＤ４＋抗ウイルス性Ｔ細胞の発生を遮断する（WhitmireらによるJ. Immunol.. 163：3194 (1999)）。それにも関わらず、ＣＤ４＋Ｔ細胞は免疫寛容誘発による同種抗原に対する免疫寛容誘発の防止を媒介するのに十分である。同種抗原に対する交差反応性はあるレベルで存在するようであるが、このデータはこのことがＬＣＭＶ感染の間での比較的にまれな事象があることを示唆している。免疫寛容の誘発療法を与えたマウスにおいてＬＣＭＶ反応が低下することは関心が持たれる。この観察は、同種間骨髄および同時刺激遮断処置の非特異的な免疫抑制効果に起因し得るであろう。あるいは、Ｈ−２ｄ＋ドナーＡＰＣｓの免疫コンパートメント中での流入は、Ｈ−２ｂ−制限反応を刺激するのに利用可能なＡｇを希釈することができるであろう。更なる研究は、長期間の免疫寛容誘発の効果が他の病原体に対する免疫反応に及ぼす効果を評価することを保証する。
【０２５８】
アロ反応性細胞が一次ＬＣＭＶ感染の間にＴＣＲ交差反応性によって発生する大きさに関わらず、他の機構はＣＤ２８／ＣＤ４０経路のＬＣＭＶ媒介による回避において不可欠な役割を明確に果たしている。例えば、ＭＣＭＶおよびＶＶの両方は、一次感染の間に同種間反応を発生する（YangらによるJ. Immunol., 142：1710 (1989)）が、これらのウイルスによる感染は移植片の生存を損なわないことが示されている（WelshらによるJ. Virol., 74：2210 (2000)）。一次のＣＤ８＋抗ＬＣＭＶ反応そのものは、ＣＤ２８およびＣＤ４０経路と大きく独立していることが示されている（WhitmireらによるJ. Virol., 70：8375 (1996); AndreasenらによるJ. Immunol., 164：3689 (2000)；ShahinianらによるScience 261：609 (1993)）。興味深いことに、最近の研究は、ＶＶに関する反応ではなく、ＬＣＭＶ特異的反応が実質細胞によって推進(drive)され得ることを示している（LenzらによるJ. Exp. Med., 192：1135 (2000)）。このことは、ＶＶではなくＬＣＭＶがエフェクター細胞の十分な活性化に必要な閾値を低下させることができることを示唆する。１可能性は、ＬＣＭＶが特異的な自然免疫機構をトリガーして、これによりＴ細胞反応を発生する際のこれらの経路の回避が可能となることである。また、抗ＬＣＭＶ反応はサイトカインおよび増殖因子を与え、これによりＣＤ２８／ＣＤ４０と独立したアロ反応の発生を助けることができる。別の可能性は、ＬＣＭＶ感染がＣＤ４０／ＣＤ２８と独立した同時刺激経路の発現を誘発することである。この後者の可能性の支持として、上記の実施例はＬＣＭＶ感染が樹状細胞上でのＭＨＣおよび同時刺激分子のＣＤ２８／ＣＤ４０と独立した上方制御を媒介することを示す。したがって、ＬＣＭＶによる感染は、ＡＰＣｓの表面上での別の同時刺激分子の上方制御によって、同時刺激遮断の面においてアロ反応性細胞の活性化を促進することができる。このモデルにおいて、ＣＤ２８またはＣＤ４０経路による同時刺激および樹状細胞の活性化に対する要求は、ＬＣＭＶによる感染によって抑制されるであろう。
【０２５９】
本発明が属する当該分野の当業者にとって明らかであろう通り、本発明は本発明の精神または本質的な性質を逸脱することなく、上で具体的に開示する以外の形態で具現化することができる。したがって、上で記載する本発明のある実施態様は例示するものであって、制限するものではないことを考慮すべきである。本発明の範囲は上記の記載に含まれる実施例に限定されるよりもむしろ添付する特許請求の範囲に記載する通りである。
【図面の簡単な説明】
【０２６０】
【図１Ａ】図１Ａは、時間関数としてのキメラ化パーセントを例示する図面である。キメラ化パーセントは、上記の実施例１に記載する通り、ブスルファンを用いた同系間骨髄移植後の末梢血中に存在するＣＤ４５．１＋のパーセントとして測定する。
【図１Ｂ】図１Ｂは、時間関数としてのキメラ化パーセントを例示する図面である。キメラ化パーセントは、上記の実施例１に記載する通り、ブスルファンを用いた同種間骨髄移植後の末梢血中に存在するＣＤ４５．１＋のパーセントとして測定する。
【図１Ｃ】図１Ｃは、上記の実施例１に記載する通り、Ｔ−細胞欠乏骨髄（ＴＤＢＭ）、同時刺激遮断薬（ＣＢ）、ブスルファン（Ｂｕｓ）または骨髄と同時刺激遮断薬（ブスルファン非存在）のいずれかを与えたグループ由来の末梢血中に存在するドナー細胞（Ｈ−２ｄ＋）のパーセントを示す図面である。末梢血中におけるＣＤ４＋およびＢ２２０＋ドナー細胞の存在は、ブスルファン非存在の場合に、動物がキメラ化できないことを示す。
【図１Ｄ】図１Ｄは、上記の実施例１に記載する通り、ブスルファンを用いた骨髄投与の滴定の結果を示す図面である。
【図２】図２は、上記の実施例１に記載する通り、ブスルファン（２０ｍｇ／ｋｇ、−１日目）、Ｔ−細胞欠乏骨髄（Ｂａｌｂ／ｃ）および同時刺激遮断薬を用いた処置に対する反応（クローズド正方形）、並びに３Ｇｙ照射（０日目）、Ｔ細胞欠乏骨髄（Ｂａｌｂ／ｃ）および同時刺激遮断薬（４５０μｇのＭＲ１を０日目および５００μｇのＣＴＬＡ４−Ｉｇを２日目）に対する反応（クローズド三角形）に及ぼす末梢性Ｃ５７ＢＬ／６白血球（ＷＢＣ'ｓ）の影響を示す図面である。ＷＢＣ'ｓの数は、時間の関数として示す。
【図３Ａ】図３Ａは、上記の実施例２に記載する通り、マウスヘモグロビン成分を示す酢酸セルロースゲルのイメージである図面である。
【図３Ｂ】図３Ｂは、上記の実施例２に記載する通り、時間の関数として網状赤血球のパーセントを示す図面である。
【図４Ａ】図４Ａは、上記の実施例３に記載する通り、時間の関数として皮膚移植を与えて生存した動物のパーセントを示す図面である。
【図４Ｂ】図４Ｂは、上記の実施例３に記載する通り、時間の関数として第三者の皮膚移植片または二次ドナー皮膚移植片を与えた後に生存する動物のパーセントを示す図面である。
【図５Ａ】図５Ａは、上記実施例４および５に記載する通り、処置プロトコールの関数としてＩＦＮγ産生細胞の数を示す図面である。該細胞数を、皮膚移植後の１０日目および皮膚移植後の＞１００日目に測定する。
【図５Ｂ】図５Ｂは、上記の実施例４および５に記載する通り、エフェクターの標的細胞に対する（Ｅ：Ｔ）比率の関数として比溶解のパーセントを示す図面である。
【図５Ｃ】図５Ｃは、上記の実施例４および５に記載する通り、Ｅ：Ｔの比率の関数として比溶解のパーセントを示す図面である。データは、二次ドナー皮膚移植を与えた動物から得た。
【図５Ｄ】図５Ｄは、上記の実施例４および５に記載する通り、時間の関数として皮膚移植を与えた動物の生存パーセントを示す図面である。
【図６Ａ】図６Ａは、上記実施例６に記載する通り、様々なＴ細胞マーカーの発現に対するＣＤ４＋Ｔ細胞のパーセントを示す図面である。
【図６Ｂ】図６Ｂは、上記の実施例６に記載する通り、Ｔ細胞欠乏骨髄および同時刺激遮断薬（ブスルファン非存在）を用いて処置したレシピエント由来のＣＤ８＋Ｔ細胞が、ドナー組織の存在下で未処置Ｂ６Ｔ細胞と比較して最大分裂（８まで）を起こすことを実証する代表的な動物のヒストグラムを示す図面である。しかしながら、免疫寛容動物は、ドナーに対する増殖を全く示さないが、第三者の移植片（Ｃ３Ｈ、Ｈ−２ｋ）に対する正常な増殖反応を示す。
【図７Ａ】図７Ａは、上記の実施例７に記載する通り、ブスルファンおよび同時刺激遮断薬を用いて処置した被験者における時間の関数として、Ｈ２Ｋｄ陽性細胞のパーセントを示す図面である。
【図７Ｂ】図７Ｂは、上記の実施例７に記載する通り、組織または器官の関数としてドナー生着のパーセントを示す図面である。
【図８】図８は、上記の実施例７に記載する通り、末梢血をドナーヘモグロビンで置換することを示したヘモグロビン電気泳動ゲルを示す図面である。
【図９】図９は、上記の実施例７に記載する通り、同時刺激遮断薬（すなわち、ブスルファンなし）のみを与えた被験者における赤血球のキメラ化の確立を示したヘモグロビン電気泳動ゲルを示す図面である。
【図１０Ａ】図１０Ａは、上記の実施例７に記載する通り、非生着、生着およびＢＡＬＢ／ｃマウスについてのＶβ５陽性細胞の数（ＣＤ４陽性Ｔ細胞のパーセントとして）を示す図面である。
【図１０Ｂ】図１０Ｂは、上記の実施例７に記載する通り、生着および非生着の動物由来のＣＦＳＥ標識Ｔ細胞を有するインビボでのアロ増殖モデルを用いたドナーおよび第三者の移植片に対する、Ｔ細胞の増殖能力を示す図面である。
【図１１Ａ】図１１Ａは、上記の実施例７に記載する通り、非処置動物由来の末梢血スメアを示す図面である。
【図１１Ｂ】図１１Ｂは、上記の実施例７に記載する通り、生着動物由来の末梢血スメアを示す図面である。
【図１１Ｃ】図１１Ｃは、上記の実施例７に記載する通り、血液学的なパラメータが生着マウスにおける正常化されることを示す図面である。
【図１１Ｄ】図１１Ｄは、上記の実施例７に記載する通り、生着したマウスの赤血球は正常な半減期を有することを示す図面である。
【図１１Ｅ】図１１Ｅは、上記の実施例７に記載する通り、生着した赤血球個体群が健康であることを示す図面である。
【図１２Ａ】図１２Ａは、上記の実施例７に記載する通り、Ｃ５７ＢＬ／６コントロール、非処置の鎌状動物および生着した動物における全体重のパーセントとして表した、脾臓の重量を示す図面である。
【図１２Ｂ】図１２Ｂは、上記の実施例７に記載する通り、脾臓における造血の平衡が生着したマウスにおいて正常化したことを示す図面である。
【図１２Ｃ】図１２Ｃは、上記の実施例７に記載する通り、非処置のマウス由来の脾臓の組織学的な切片を示す図面である。
【図１２Ｄ】図１２Ｄは、上記の実施例７に記載する通り、生着したマウス由来の脾臓の組織学的な切片を示す図面である。
【図１３Ａ】図１３Ａは、上記の実施例７に記載する通り、非処置のマウス由来の腎臓の組織学的な切片を示す図面である。
【図１３Ｂ】図１３Ｂは、上記の実施例７に記載する通り、生着したマウス由来の腎臓の組織学的な切片を示す図面である。
【図１４】図１４は、上記の実施例８に記載する通り、Ｌ１０４ＥＩｇのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列（配列番号１２）を示す図面である。
【図１５】図１５は、上記の実施例８に記載する通り、Ｌ１０４ＥＡ２９ＹＩｇのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列（配列番号３〜４）を示す図面である。
【図１６】図１６は、上記の実施例８に記載する通り、Ｌ１０４ＥＡ２９ＬＩｇのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列（配列番号５〜６）を示す図面である。
【図１７】図１７は、上記の実施例８に記載する通り、Ｌ１０４ＥＡ２９ＴＩｇのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列（配列番号７〜８）を示す図面である。
【図１８】図１８は、上記の実施例８に記載する通り、Ｌ１０４ＥＡ２９ＷＩｇのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列（配列番号９〜１０）を示す図面である。
【図１９】図１９は、ＣＴＬＡ４受容体のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列（配列番号１１〜１２）を示す図面である。
【図２０】図２０は、ＣＴＬＡ４Ｉｇのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列（配列番号１３〜１４）を示す図面である。
【図２１Ａ】図２１Ａは、ＣＴＬＡ４Ｉｇ（レーン１）、Ｌ１０４ＥＩｇ（レーン２）およびＬ１０４ＥＡ２９ＹＩｇ（レーン３）についてのＳＤＳゲルを示す図面である。
【図２１Ｂ】図２１Ｂは、ＣＴＬＡ４Ｉｇのサイズ排除クロマトグラムを示す図面である。
【図２１Ｃ】図２１Ｃは、Ｌ１０４ＥＡ２９ＹＩｇのサイズ排除クロマトグラムを示す図面である。
【図２２】図２２（左図および右図）は、ＮＭＲ分光学によって測定された溶液構造から得られるＣＴＬＡ４細胞外Ｉｇ  Ｖ様折りたたみのリボン図を示す図面である。図２２（右図）は、アビディティーを増大する突然変異Ｌ１０４およびＡ２９の位置および側鎖の配向を示す、ＣＤＲ−１（Ｓ２５−Ｒ３３）領域およびＭＹＰＰＰＹ（配列番号１５）領域の拡大図を示す。
【図２３Ａ】図２３Ａは、上記の実施例９に記載する通り、Ｌ１０４ＥＡ２９ＹＩｇ、Ｌ１０４ＥＩｇおよびＣＴＬＡ４ＩｇとヒトＣＤ８０をトランスフェクトしたＣＨＯ細胞との結合を示した、ＦＡＣＳアッセイを示す図面である。
【図２３Ｂ】図２３Ｂは、上記の実施例９に記載する通り、Ｌ１０４ＥＡ２９ＹＩｇ、Ｌ１０４ＥＩｇおよびＣＴＬＡ４ＩｇとヒトＣＤ８６をトランスフェクトしたＣＨＯ細胞との結合を示した、ＦＡＣＳアッセイを示す図面である。
【図２４Ａ】図２４Ａは、上記の実施例９に記載する通り、ＣＤ８０陽性ＣＨＯ細胞の増殖の抑制を示したグラフを示す図面である。
【図２４Ｂ】図２４Ｂは、上記の実施例９に記載する通り、ＣＤ８６陽性ＣＨＯ細胞の増殖の抑制を示したグラフを示す図面である。
【図２５Ａ】図２５Ａは、上記の実施例９に記載する通り、Ｌ１０４ＥＡ２９ＹＩｇが一次アロ刺激したＴ細胞の増殖を抑制する際にＣＴＬＡ４Ｉｇよりも有効であることを示したグラフを示す図面である。
【図２５Ｂ】図２５Ｂは、上記の実施例９に記載する通り、Ｌ１０４ＥＡ２９ＹＩｇが二次アロ刺激したＴ細胞の増殖を抑制する際にＣＴＬＡ４Ｉｇよりも有効であることを示したグラフを示す図面である。
【図２６Ａ】図２６Ａは、上記の実施例９に記載する通り、Ｌ１０４ＥＡ２９ＹＩｇがアロ刺激したヒトＴ細胞のＩＬ−２サイトカイン産生を抑制する際に、ＣＴＬＡ４Ｉｇよりも有効であることを示したグラフを示す図面である。
【図２６Ｂ】図２６Ｂは、上記の実施例９に記載する通り、Ｌ１０４ＥＡ２９ＹＩｇがアロ刺激したヒトＴ細胞のＩＬ−４サイトカイン産生を抑制する際に、ＣＴＬＡ４Ｉｇよりも有効であることを示したグラフを示す図面である。
【図２６Ｃ】図２６Ｃは、上記の実施例９に記載する通り、Ｌ１０４ＥＡ２９ＹＩｇがアロ刺激したヒトＴ細胞のガンマ(γ)−インターフェロンサイトカイン産生を抑制する際に、ＣＴＬＡ４Ｉｇよりも有効であることを示したグラフを示す図面である。
【図２７】図２７は、上記の実施例９に記載する通り、Ｌ１０４ＥＡ２９ＹＩｇがフィトヘマグルチニン(ＰＨＡ)刺激によるサルＴ細胞の増殖を抑制する際に、ＣＴＬＡ４Ｉｇよりも有効であることを示したグラフを示す図面である。
【図２８】図２８は、上記の実施例９に記載する通り、Ｌ１０４ＥＡ２９ＹＩｇ、Ｌ１０４ＥＩｇおよび野生型ＣＴＬＡ４ＩｇとＣＤ８６Ｉｇとの平衡結合分析を示したグラフを示す図面である。
【図２９】図２９は、上記の実施例１０に記載する通り、ＬＣＭＶ感染が抗ＣＤ４０Ｌおよび抗ＣＴＬＡ４−Ｉｇを用いた処置後のアロ移植片の生存の拡張を妨害することを示したグラフを示す図面である。
【図３０】図３０は、上記の実施例１０に記載する通り、急性ＬＣＭＶ感染が免疫寛容、混合キメラ化およびドナー反応性Ｔ細胞の欠失を妨害することを示す図面である。Ａ．Ｂ６マウスに、術後の０日目および６日目に、Ｂａｌｂ／ｃ骨髄と一緒にＢａｌｂ／ｃ皮膚移植片を与えた。全てのグループにまた、０、２、４および６日目に抗ＣＤ４０ＬおよびＣＴＬＡ４−Ｉｇを与えた。マウスを更に、移植後の５日目に、造血幹細胞に選択的なブスルファンを用いて処置した。Ｂ．非感染のマウスは、手術後の１２０日まで全動物における末梢血中で＞６０％Ｈ−２Ｋｄ＋細胞を発生させた。感染性マウスは、ＣＤ８Ｔ細胞の欠乏の存在または非存在で混合キメラを発生することができなかった。Ｖβ５(Ｃ)およびＶβ１１(Ｄ)を発現するＣＤ４Ｔ細胞サブセットは、術後６０日まで非感染マウス中で欠乏する。これらのサブセットは通常、Ｂａｌｂ／ｃ細胞によるＩ−Ｅと合わせたＭＭＴＶスーパー抗原の発現に起因して、Ｂ６マウス中ではなくＢａｌｂ／ｃ中で欠乏する。感染マウスは、ＣＤ８Ｔ細胞の欠乏の存在または非存在で、これらＴ細胞サブセットを欠乏することができなかった。全ての誤差のバーは、ＳＥＭを示す。
【図３１Ａ】図３１Ａは、上記の実施例１０に記載する通り、遅延型ＬＣＭＶ感染が免疫寛容の誘発を損なわないことを示す図面である。
【図３１Ｂ】図３１Ｂは、上記の実施例１０に記載する通り、遅延型ＬＣＭＶ感染が混合キメラの発生を損なわないことを示す図面である。
【図３２】図３２は、上記の実施例１０に記載する通り、遅延型感染後の抗ウイルス性Ｔ細胞反応は中位に低下するが、エピトープ階層は不変のままであることを示す図面である。１グループは、同種間（Ｂａｌｂ／ｃ）骨髄移植片および皮膚移植片を与え、一方で別のグループは同系間（Ｂ６）骨髄移植片および皮膚移植片を受けた。
【図３３】図３３は、上記の実施例１０に記載する通り、四量体の陽性ＬＣＭＶ−免疫ＣＤ８Ｔ細胞がアロ抗原に対する反応の際に分裂しないことを示す図面である。レシピエントＢａｌｂ／ｃマウスを照射した。未処置およびＬＣＭＶ−免疫ドナー脾細胞は、Ｔ細胞が豊富であった。細胞を蛍光色素ＣＦＳＥ（モレキュラープローブ社製）を用いて標識化し、照射したレシピエント中に注射した。脾細胞を移植後の３日目に収集し、ＣＤ８および四量体の発現のために染色した。第１のカラムにおいて、脾細胞をＣＤ８発現のためにゲートし、そしてヒストグラムはＣＦＳＥ蛍光を示す。該ヒストグラムの右ヘのピークは非常に高い蛍光の非分裂細胞を意味し、一方で左側への連続的なピークは各細胞分裂を伴う蛍光の低下を測定する。次いで、脾細胞を非分裂の（真中のピーク）および非常に分裂した（４〜８分裂、右カラム）ＣＤ８Ｔ細胞についてゲートし、２免疫優性なＬＣＭＶペプチド中にフォールディングしたクラスＩ四量体と結合するそれら能力について評価した。各グループ当たり３マウス由来の代表的な試料を示す。
【図３４】図３４は、上記の実施例１０に記載する通り、ＩＦＮ−γ＋ＬＣＭＶ免疫細胞はアロ抗原に対する反応の際に分裂しないことを示す図面である。未処置およびＬＣＭＶ−免疫ＣＳＦＥ標識化Ｔ細胞を照射したＢａｌｂ／ｃレシピエント中にトランスフェクトし、実施例３３に記載する通り収集した。脾細胞をＬＣＭＶ−感染または非感染のＭＣ５７線維肉腫細胞と一緒に、ブレフェルジンＡ中で５時間インキュベートした。細胞を固定化し、予め透過処理し、ＣＤ８およびＩＦＮ−γ＋の発現のために染色し、そしてフローサイトメトリーによって分析した。図３３の場合と同様に、脾細胞をＣＤ８発現のためにゲートし（左のカラム）、そしてＣＦＳＥ蛍光を評価した。非分裂の（真中のカラム）および非常に分裂した（４〜８分裂、右のカラム）ＣＤ８Ｔ細胞を、ＩＦＮ−γ染色について測定した。２つの別々の実験の代表的な試料を示す。
【図３５】図３５は、上記の実施例１０に記載する通り、ＬＣＭＶがアロ反応性のＩＦＮ−γ産生Ｔ細胞のＣＤ２８／ＣＤ４０に独立した生成を刺激することを示す図面である。Ｃ３Ｈ／ＨｅＪマウスに、同時刺激遮断薬（ＣＢ）と合わせて、Ｂａｌｂ／ｃ皮膚移植片（ＳＧ）または皮膚移植片のいずれかを与えた。第３のグループに、ＬＣＭＶ感染と同時に皮膚移植片および同時刺激遮断薬を与え、一方で第４のグループには、更なる操作をせずにＬＣＭＶ感染を与えた。マウスの脾臓を示した日に収集し、そしてＬＣＭＶまたはアロ抗原に特異的なＩＦＮ−γ産生細胞の度数を、実施例１０に記載する通り、ＥＬＩＳＰＬＴアッセイを用いて測定した。誤差バーは、ＳＥＭ（全ての群について、ｎ＝３）を表す。
【図３６】図３６は、上記実施例１０に記載する通り、ＬＣＭＶ感染は樹状細胞のＣＤ２８／ＣＤ４０に独立した突然変異を促進することを示す図面である。Ｂ６マウスに、Ｂａｌｂ／ｃ骨髄と同時刺激遮断薬、またはＬＣＭＶ感染と同時の同じ療法のいずれかを与えた。脾臓を、移植後の６日目に収集した。ＣＤｌｌｃ＋樹状細胞を濃縮し、示したＡｂｓを用いて染色し、そしてフローサイトメトリーによって分析した。ヒストグラムは、ＣＤ１１ｃ発現のためにゲートした細胞における示した分子の発現を意味する。充填したヒストグラムは骨髄および同時刺激遮断薬を用いて処置したマウスを意味し、連続の線は同時にＬＣＭＶ感染を与えたマウスを意味し、そして点線はイソタイプのコントロールを意味する。これらのヒストグラムは、２つの別々の実験の代表例である。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１１Ｃ】
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【図１１Ｄ】
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【図１１Ｅ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１９】
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【図２１Ｂ】
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【図２１Ｃ】
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【図２３Ａ】
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【図２３Ｂ】
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【図２４Ａ】
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【図２４Ｂ】
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【図２５Ａ】
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【図２５Ｂ】
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【図２６Ａ】
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【図２６Ｂ】
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【図２６Ｃ】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１Ａ】
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【図３１Ｂ】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【国際公開パンフレット】
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