(57)【要約】本願開示内容は、胸腺の機能を刺激することで患者の免疫系を改変可能であるか否かを判断するための方法を提供するものである。好ましい実施形態では、患者において性ステロイドを除去し、得られる胸腺因子の産生を監視する。特に、患者の血流中におけるこれらの因子の濃度を観察する。もうひとつの実施形態では、新しいＴ細胞の濃度を監視する。アブレーションから数時間または数日以内といった初期の応答が見られることから、患者の胸腺が性ステロイドのアブレーションによって再生しようとしていることが分かる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者の胸腺への性ステロイドシグナル伝達を破壊することを通して前記胸腺の活性化し易さを判定することを特徴とする胸腺機能判定方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法において、前記胸腺への前記性ステロイドシグナル伝達を破壊する方法が、前記患者の性腺を摘出するための外科的な性腺摘除によるものであることを特徴とする方法。
【請求項３】
請求項１に記載の方法において、前記胸腺への前記性ステロイドシグナル伝達を破壊する方法が、１種またはそれ以上の製薬の投与によるものであることを特徴とする方法。
【請求項４】
請求項３に記載の方法において、前記製薬が、ＬＨＲＨ類縁体と、抗ＬＨＲＨレセプター抗体と、抗ＬＨＲＨワクチンと、これらの組み合わせと、からなる群から選択されることを特徴とする方法。
【請求項５】
請求項４に記載の方法において、前記ＬＨＲＨ類縁体が、ＬＨＲＨアゴニストと、ＬＨＲＨアンタゴニストとから選択されることを特徴とする方法。
【請求項６】
請求項５に記載の方法において、前記ＬＨＲＨ類縁体が、ユーレキシン（Ｅｕｌｅｘｉｎ）と、ゴセレリンと、リュープロライドと、ジオキサラン（Ｄｉｏｘａｌａｎ）誘導体と、トリプトレリンと、メテレリンと、ブセレリンと、ヒストレリンと、ナファレリンと、ルトレリンと、リュープロレリンと、デスロレリンと、アバレリックス（Ａｂａｒｅｌｉｘ）と、セトロレリックスと、ゾラデックスと、リュープロン（Ｌｅｕｐｒｏｎ）と、からなる群から選択されることを特徴とする方法。
【請求項７】
請求項３に記載の方法において、前記患者の胸腺が、少なくとも部分的に不活性化されたものであることを特徴とする方法。
【請求項８】
請求項３に記載の方法において、前記患者が思春期後であることを特徴とする方法。
【請求項９】
請求項５に記載の方法において、前記ＬＨＲＨアンタゴニストが速効性ＬＨＲＨアンタゴニストであることを特徴とする方法。
【請求項１０】
前記ＬＨＲＨアンタゴニストが、アバレリックスとセトロレリックスとからなる群から選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
請求項４に記載の方法において、１種またはそれ以上のＬＨＲＨアゴニストおよび１種またはそれ以上のＬＨＲＨアンタゴニストを投与することによって、減少を誘導することを特徴とする方法。
【請求項１２】
請求項１に記載の方法において、患者の血液および／または血漿中の１種またはそれ以上の胸腺形成性サイトカイン（ｔｈｙｍｏｐｏｉｅｔｉｃ ｃｙｔｏｋｉｎｅ）の濃度を監視するステップを含むことを特徴とする方法。
【請求項１３】
請求項１２に記載の方法において、前記サイトカインがインターロイキン７であることを特徴とする方法。
【請求項１４】
請求項１２に記載の方法において、
ａ．破壊前に患者から血液試料を得るステップと、
ｂ．前記破壊の後で患者から少なくとも１種の血液試料を得るステップと、
ｃ．各試料中に存在する胸腺形成性サイトカイン（単数または複数）の量を測定するステップと、
ｄ．破壊後の患者における前記胸腺形成性サイトカイン（単数または複数）の早期の増加が前記患者の胸腺の活性化を示すように前記試料中の前記胸腺形成性サイトカイン（単数または複数）を互いに比較するステップとを含むことを特徴とする方法。
【請求項１５】
請求項１４に記載の方法において、前記増加が前記破壊の約１週間以内に生じることを特徴とする方法。
【請求項１６】
請求項１４に記載の方法において、前記増加が前記破壊の約４〜５日以内に生じることを特徴とする方法。
【請求項１７】
請求項１４に記載の方法において、前記増加が前記破壊の約２〜３日以内に生じることを特徴とする方法。
【請求項１８】
請求項１４に記載の方法において、前記増加が前記破壊の約２４時間以内に生じることを特徴とする方法。
【請求項１９】
請求項１に記載の方法において、患者の血液および／または血漿中の１種またはそれ以上の胸腺形成性ホルモン（ｔｈｙｍｏｐｏｉｅｔｉｃ ｈｏｒｍｏｎｅ）の濃度を監視するステップを含むことを特徴とする方法。
【請求項２０】
請求項１９に記載の方法において、前記ホルモンが、サイモシン、チムリンとおよびＦＴＳと、からなる群から選択されることを特徴とする方法。
【請求項２１】
請求項１９に記載の方法において、
ａ．破壊前に患者から血液試料を得るステップと、
ｂ．前記破壊の後で患者から少なくとも１種の血液試料を得るステップと、
ｃ．各試料中に存在する胸腺形成性ホルモン（単数または複数）の量を測定するステップと、
ｄ．破壊後の患者における前記胸腺形成性ホルモン（単数または複数）の増加が前記患者の胸腺の活性化を示すように前記試料中の前記胸腺形成性ホルモン（単数または複数）を互いに比較するステップと、を含むことを特徴とする方法。
【請求項２２】
請求項２１に記載の方法において、
前記増加が前記破壊の約１週間以内に生じることを特徴とする方法。
【請求項２３】
請求項２１に記載の方法において、前記増加が前記破壊の約４〜５日以内に生じることを特徴とする方法。
【請求項２４】
請求項２１に記載の方法において、前記増加が前記破壊の約２〜３日以内に生じることを特徴とする方法。
【請求項２５】
請求項２１に記載の方法において、前記増加が前記破壊の約２４時間以内に生じることを特徴とする方法。
【請求項２６】
ａ）血液試料を患者から得るステップと、
ｂ）患者の胸腺への性ステロイドによるシグナル伝達を破壊するステップと、
ｃ）前記破壊後に前記患者から少なくとも１種の血液試料を得るステップと、
ｄ）各試料についてタンパク質分析を実施するステップと、
ｅ）前記破壊後に採取した試料中には見られるが、前記破壊の前に採取した試料中には低濃度でしか含まれていないか、あるいは全く含まれていない、新たなタンパク質を同定するステップと、を含むことを特徴とする胸腺因子を同定する方法。
【請求項２７】
請求項２６に記載の方法において、前記血液試料を処理して血漿を分離し、該血漿試料についての分析を実施することを特徴とする方法。
【請求項２８】
請求項２７に記載の方法において、前記血漿試料に二次元ゲル電気泳動を施すことを特徴とする方法。
【請求項２９】
請求項１に記載の方法において、患者の血液中での新たなＴ細胞の産生を監視するステップを含むことを特徴とする方法。
【請求項３０】
請求項２９に記載の方法において、細胞中のＴＲＥＣの有無を検出することによって前記新たなＴ細胞の産生を監視することを特徴とする方法。
【請求項３１】
請求項３０に記載の方法において、
ａ）阻害の前後に患者の血液をサンプリングするステップと、
ｂ）試料中の細胞をソートし、強化されたＴ細胞集団を得るステップと、
ｃ）試料中の細胞のＤＮＡを単離するステップと、
ｄ）ＴＲＥＣに特異なプライマーを用いて、単離したＤＮＡのＰＣＲを実施するステップと、を含むことを特徴とする方法。
【請求項３２】
請求項３１に記載の方法において、前記ＰＣＲプライマーが、ＤＮＡ配列番号１と、ＤＮＡ配列番号２と、ＤＮＡ配列番号３と、ＤＮＡ配列番号４と、からなる群から選択されることを特徴とする方法。
【請求項３３】
請求項３１に記載の方法において、阻害後のＴＲＥＣの増加が胸腺の活性化を示すものであることを特徴とする方法。
【請求項３４】
請求項３３に記載の方法において、前記増加が前記破壊の約１週間以内に生じることを特徴とする方法。
【請求項３５】
請求項３３に記載の方法において、前記増加が前記破壊の約４〜５日以内に生じることを特徴とする方法。
【請求項３６】
請求項３３に記載の方法において、前記増加が前記破壊の約２〜３日以内に生じることを特徴とする方法。
【請求項３７】
請求項３３に記載の方法において、前記増加が前記破壊の約２４時間以内に生じることを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
技術分野
本願開示内容は免疫学の分野のものである。特に、胸腺に対する性ステロイドの影響を阻害することで胸腺が再活性化される能力を診断することに関する。
【０００２】
発明の背景
胸腺はＴリンパ球産生の中心となる部位であるため、免疫系における重要な臓器だと言えるだろう。胸腺の役割として、骨髄由来の適当な前駆細胞を血液中から取り込み、この前駆細胞をＴ細胞抗原受容体（ＴＣＲ）の産生に必要な遺伝子再配列などのＴ細胞系譜に関与させることがあげられる。これに関連しているのが、Ｔ細胞数を増すことであらゆる外来抗原を認識して排除できる機会を増やす、驚くべき細胞分裂である。実際に起こり得る多様性がこのように桁外れに多いことはすなわち、生体が遭遇するかもしれないあらゆる抗原に対して複数のリンパ球がさまざまな結合強度（親和性）でこれを認識し、さまざまな度合いで応答できるようになるということを意味する。
【０００３】
しかしながら、Ｔ細胞による抗原認識の奇妙な特徴のひとつに、Ｂ細胞とは異なり、ＴＣＲはＭＨＣ分子に物理的に結合したペプチド断片しか認識しない点がある。通常、これは自己ＭＨＣ（すなわち非外来ＭＨＣ）であり、この機能は胸腺で選択される。この過程は正の選択と呼ばれ、皮質上皮細胞だけにみられる特徴である。ＴＣＲが自己ＭＨＣ／ペプチド複合体との結合に失敗すると、Ｔ細胞は「無視」されて死滅する。Ｔ細胞が成熟していくためには、ＴＣＲによるシグナル伝達が多少なりとも必要なのである。
【０００４】
皮質での選択後、発達中の胸腺細胞は機能的に成熟して移動できるようになり、ナイーブ（まだ抗原とは接触していない）Ｔ細胞として血流中に出ていく。この細胞は、抗原を探しながらリンパ液と血液との間を循環する。３〜４週間経過しても刺激されることがなければ、ナイーブＴ細胞は後から胸腺を出てきた他の細胞（ｒｅｃｅｎｔ ｔｈｙｍｉｃ ｅｍｉｇｒａｎｔ）によって末梢Ｔ細胞プールから追い出されやすくなる。このように胸腺には輸出機構と末梢Ｔ細胞の交換機構が備わっているため、恒常性により適切なレベルを保ちつつ良質のＴ細胞が継続して補充されるのである。
【０００５】
胸腺は、内部のＴ細胞のうち〜１％を毎日血流中に放出する、機能的免疫系には欠かせないものであるが、哺乳動物だけが持つ明らかな特異点のひとつに、性ステロイドが産生されると胸腺に重篤な萎縮が起こることがあげられる。これは幼い子どもにも起こり得るものであるが、思春期頃からが深刻である。健常な個体であれば、新たなＴ細胞が産生・放出されなくなっても常に臨床的な結果が即座に出てくるとは限らない。事実、年齢とともに胸腺は萎縮し、子どもの場合と比べると１％にも満たないが、それでも新しいＴ細胞を極めて低いレベルで血流中に放出し続けている。
【０００６】
しかしながら、これらのＴ細胞は末梢Ｔ細胞サブセットを最適なレベルに維持するには不十分である。ただ、これは胸腺が完全に休止しているわけではないことを意味し、これを治療の対象にできる可能性が高くなる。老化が進むにつれて胸腺での輸出能が落ちると、末梢Ｔ細胞の状態は定量的な側面と定性的な側面の両方で次第に変化することになる。一方では、加齢に伴い、刺激を受けなかったＴ細胞が次々と死んで血液中のＴ細胞の絶対数が次第に減少する。他方では、抗原と接触するたびに、関連の抗原特異性ナイーブＴ細胞（それまで抗原と出会っていない）が刺激されて増殖する。いずれかのサブセットが効果器細胞へと発展して病原体の体を取り除くことになるが、この効果器細胞も最終的には抗原誘発細胞死によって死滅する。さらに、別のサブセットが記憶細胞になり、将来の病原体との接触に対して生体を長期的に保護する。このためナイーブＴ細胞のレベルが下がり、抗原に応答する機能が低下する。
【０００７】
また、老化が起こるとＴｃ細胞（ＣＤ８を発現）に対してＴｈ細胞（ＣＤ４を発現することが特徴）が選択的に減少するため、Ｔｈ１細胞とＴｈ２細胞との比のバランスが崩れる。健常な子どもでは先に述べたとおり胸腺から輸出される新たなＴ細胞が継続的に供給され、これによって末梢のナイーブＴ細胞プールが連続して補充されるため、上記のようなことは起こらない。
【０００８】
Ｔ細胞が失われる条件は老化だけではなく、たとえばＨＩＶ／ＡＩＤＳ羅患時と以後の化学療法や放射線療法でも極めて深刻なＴ細胞の喪失が起こる。繰り返すが、胸腺が萎縮しているため免疫系の回復に１〜２年を要する思春期後に比して、胸腺に異常のない子どもでは免疫系が（Ｔ細胞による免疫の回復を通して）比較的短期間（２〜３ヶ月）で回復する。
【０００９】
このため、免疫応答の性質と度合いに影響し得るパラメータとして、抗原のレベルとタイプ、ワクチン接種部位、適切なＡＰＣ（抗原提示細胞）の可用性、個体の全身の健康状態、Ｔ細胞プールとＢ細胞プールの状態など、いくつかのパラメータがあげられる。このうち、思春期に入る頃から深刻になる性ステロイドによる胸腺輸出の活動停止が顕著であることから、Ｔ細胞が最も脆弱である。
【００１０】
したがって、ワクチン接種プログラムはいずれも必然的に、広いレパートリーの特異性を示すナイーブＴ細胞のレベルと、Ｔｈ１細胞とＴｈ２細胞との比ならびにＴｈ細胞とＴｃ細胞との正しい比の両方に関して、潜在的なレスポンダーＴ細胞のレベルが最適である場合にのみ行うべきだということになる。サイトカインのレベルとタイプについても所望の応答を得るのに適切なものとなるように操作する必要がある。
【００１１】
たとえば脳下垂体へのＬＨＲＨシグナル伝達を阻害して萎縮した胸腺を再活性化する能力が、ＴＣＲタイプのレパートリーの異なるナイーブＴ細胞からなる新たなグループを生成する潜在的な手段となる。このプロセスは、最適な胸腺形成につながる正常な調節分子と経路とを用いて、胸腺を思春期前の状態まで効果的に戻すものである。
【００１２】
胸腺は神経内分泌系（Ｋｅｎｄａｌｌ、１９８８）との間における双方向の情報伝達に大きく影響される。胸腺の機能にとって特に重要なのが、栄養効果（ＴＳＨおよびＧＨ）と萎縮効果（ＬＨ、ＦＳＨおよびＡＣＴＨ）（Ｋｅｎｄａｌｌ、１９８８；Ｈｏｍｏ−Ｄｅｌａｒｃｈｅ、１９９１）の両方を含む、脳下垂体、副腎、性腺の相互関係である。特に、胸腺生理学の特性のひとつに、思春期前後に体内を循環する性ステロイドの産生量が増えるのに比例して構造と機能とが徐々に衰えることがあげられる（ＨｉｒｏｋａｗａおよびＭａｋｉｎｏｄａｎ、１９７５；Ｔｏｓｉら、１９８２；Ｈｉｒｏｋａｗａら、１９９４）。ホルモンの正確な標的とホルモンが胸腺の萎縮を誘導する機序については、今のところ明らかになっていない。
【００１３】
胸腺は末梢Ｔ細胞プールを産生して維持する中心となる部位であるため、免疫による障害の出現率が高齢者で増加している主な原因が上記の萎縮にあるのではないかと考えられてきた。特に、Ｔ細胞の細胞溶解活性や細胞分裂応答などのＴ細胞依存性免疫機能が低下することで明らかになる免疫系の欠如が認められると、これが以後の生涯で免疫不全や自己免疫疾患、腫瘍荷重の出現率が増える形で表れてくる（Ｈｉｒｏｋａｗａ、１９９８）。
【００１４】
胸腺の萎縮による影響は末梢においてもＴ細胞プールへの胸腺からの入力の減少という形で表れ、結果としてＴ細胞受容体（ＴＣＲ）レパートリーが少なくなる。また、サイトカインプロファイルの変動（Ｈｏｂｂｓら、１９９３；Ｋｕｒａｓｈｉｍａら、１９９５）、ＣＤ４＋サブセットおよびＣＤ８＋サブセットの変化、ナイーブＴ細胞ではなく記憶細胞への偏り（Ｍａｃｋａｌｌら、１９９５）も認められる。さらに、加齢に伴って、Ｔ細胞の枯渇後に免疫系が正常なＴ細胞数まで再生する能力が最終的に失われてしまうほど胸腺形成（ｔｈｙｍｏｐｏｉｅｓｉｓ）の効率が悪くなる（Ｍａｃｋａｌｌら、１９９５）。
【００１５】
しかしながら、Ｄｏｕｅｋら（１９９８）による近年の研究で、胸腺の出力はヒトではおそらく老齢期でも起こるであろうことが明らかになった。すなわち、ＴＣＲ遺伝子再構成の摘出（ｅｘｃｉｓｉｏｎａｌ）ＤＮＡ産物を用いて、高齢患者でＨＩＶ感染後に新たに生成されて循環しているナイーブＴ細胞を示したのである。化学療法の経験のある患者では、思春期前の患者に比べて思春期後の患者で、Ｔ細胞プール、特にＣＤ４＋Ｔ細胞の再生速度が大幅に減少することから、上記出力の速度と以後の末梢Ｔ細胞プールの再生についてはさらに検討する必要がある（Ｍａｃｋａｌｌら、１９９５）。これは、ＴｉｍｍおよびＴｈｏｍａｎによる近年の研究（１９９９）でさらに実証されている。彼らは、ＢＭＴ（骨髄移植）後の老齢マウスではＣＤ４＋Ｔ細胞の再生が認められるが、胸腺でのナイーブＴ細胞の産生量が減ることと相まって、末梢の微小環境が老化することで記憶細胞に偏るのではないかということを示した。
【００１６】
胸腺は基本的に、さまざまな支質細胞（主に上皮細胞サブセット）の間に点在する発達中の胸腺細胞からなるものであり、この支質細胞によって微小環境が構成され、Ｔ細胞が最適な状態で発達するのに必要な成長因子と細胞間相互作用とが得られる。胸腺細胞と上皮サブセットとの間にその分化および成熟を左右する共生発達の関係（Ｂｏｙｄら、１９９３）があるということは、他方の状態に影響するかもしれない何らかの細胞型のレベルで性ステロイドの阻害が起こり得ることを意味する。放射線キメラを利用した過去の研究で、骨髄（ＢＭ）幹細胞は年齢に影響されず（Ｈｉｒｏｋａｗａ、１９９８；ＭａｃｋａｌｌおよびＧｒｅｓｓ、１９９７）、若いＢＭ細胞と同程度に胸腺再増殖の可能性があることが明らかになっているため、胸腺細胞自体の内部に固有の問題があるということは考えにくい。さらに、高齢動物の胸腺細胞にも少なくとも若干は分化能力が残っている（ＭａｃｋａｌｌおよびＧｒｅｓｓ、１９９７；ＧｅｏｒｇｅおよびＲｉｔｔｅｒ、１９９６；Ｈｉｒｏｋａｗａら、１９９４）。しかしながら、Ａｓｐｉｎａｌｌによる近年の研究（１９９７）で、ＴＣＲγ鎖の遺伝子再構成の段階で起こった前駆ＣＤ３−ＣＤ４−ＣＤ８−トリプルネガティブ（ＴＮ）集団に欠陥があることが明らかになった。
【００１７】
特定の抗原に向かうあるいは特定の抗原から離れる、発達しているＴＣＲレパートリーを歪める（ｓｋｅｗｉｎｇ）
胸腺への造血前駆細胞の取り込み量を増やせるということは、樹状細胞の性質およびタイプを操作できることを意味する。たとえば、最終的には胸腺（および生体の他の場所）の樹状細胞で発現された状態になる特定の遺伝子（単数または複数）で前駆体を形質移入することができる。このような遺伝子は、自己免疫疾患、アレルギー、移植片抗原など、免疫応答が有害である特定の抗原をコードするものを含み得る。
【００１８】
また、これらの遺伝子は、腫瘍細胞や侵入してくる微生物など、免疫応答が望ましい抗原を（ペプチドとしても）コードすることもできる。後者の場合、ペプチドの濃度と親和性が、負の選択を誘導しない程度に低く、かつ、正の選択を促進できる程度に高くなるように操作することになる。本願発明者らは、正の選択が複数の細胞型に関与し得ることを明らかにした。すなわち、皮質上皮によって特定の分化分子および第三者細胞ＭＨＣ／ペプチドリガンド（ｔｈｉｒｄ ｐａｒｔｙ ｃｅｌｌｓ ｔｈｅ ＭＨＣ／ｐｅｐｔｉｄｅ ｌｉｇａｎｄｓ）が得られる。
【００１９】
また、ケモカインやサイトカイン、胸腺形成とＴ細胞の発達、活性化、正または負の選択、移行、全身症状のあらゆる面に影響する他の分子などの可溶性調節分子をコードするものなどの遺伝子を加えるまたは削除することによって、前駆体を遺伝的に改変してもよい。この方法を利用すれば、胸腺の発達またはＴ細胞の応答性を亢進または遅延させることが可能である。また、これを用いてＴ細胞レパートリーを特定の抗原に向けて歪め、たとえば抗ウイルス防御および抗腫瘍防御を得ることも可能である。さらに、この方法を利用して、胸腺の微小環境の性質、組織および機能を調節することもできる。
【００２０】
寛容の誘導
自己に対する寛容を生む最も効果的な手段は、胸腺内の樹状細胞によって最も効率よく媒介される、自己反応性となり得る細胞を負の選択による胸腺内での欠失（あるいはアネルギーまたは負の調節細胞の誘導）によるものである。必然的に、この抗原を発現している樹状細胞を胸腺に取り込むことができれば、外因性または名目上の抗原に対する寛容の構築を最もよく達成することができよう。このような寛容の形態は、阻害性の免疫調節細胞が出現すると一層効果的になる場合がある。しかしながら、後者の発達の根底にある機序はほとんど分かっていないが、胸腺でも発生し、樹状細胞を伴う可能性のあるものである。
【００２１】
標的抗原が分かっている反応亢進性Ｔ細胞の場合、造血幹細胞を、特定の抗原をコードする遺伝子で形質移入する。これらの細胞は、発達して胸腺で樹状細胞になると、名目上の抗原に対して反応性となる可能性のある新しいＴ細胞を取り除くことになる。
【００２２】
胸腺の機能が回復することで得られる臨床上の多大なる利益が、特に高齢のＨＩＶ患者および化学療法を受けた後の患者における免疫不全の治療時の重要な戦略のひとつになる。また、Ｔ細胞が機能的に異常な患者を治療し、すべてのＴ細胞を除去することで疾患をなくし、さらには性ステロイドの産生を阻害して胸腺機能を再活性化し、患者の正常な免疫性を回復させることができる。ワクチン接種プログラムの場合、Ｔ細胞の状態の面で、さらには結果として免疫応答の性質、程度および品質面で、胸腺の再活性化が大きく改善されることになる。また、胸腺の再活性化時にドナー細胞を提示することで、同種移植片および異種移植片に対する寛容を持てるようにＴ細胞集団を改変することもできる。さらに、再生中のＴ細胞集団を遺伝子療法によって胸腺の再活性化時に遺伝的に改変することも可能である。
【００２３】
発明の開示
本開示内容は、性ステロイドの産生を阻害することによって生じる再生に対する胸腺の感受性を判定するための診断方法を提供するものである。本発明の一態様では、この方法を用いると、上記の感受性を早期に、好ましくは阻害の開始から１週間以内、より好ましくは４から５日以内、さらに好ましくは２〜３日以内、最も好ましくは２４時間以内に判断することができる。
【００２４】
特定の態様では、ＬＨＲＨのアゴニストまたはアンタゴニスト、抗エストロゲン抗体、抗アンドロゲン抗体を投与すること、受動（抗体）または能動（抗原）抗ＬＨＲＨワクチン接種またはこれらの組み合わせ（「ブロッカー」）によって、胸腺への性ステロイドによるシグナル伝達を遮断する。
【００２５】
本発明の一態様では、ＬＨＲＨアゴニストを投与して阻害を引き起こす。好ましくは、アバレリックスまたはセトロレリックスなどの速効性アンタゴニストを投与する。別の態様では、ゾラデックスまたはリュープロンなどのＬＨＲＨアゴニストを投与して阻害を引き起こす。
【００２６】
本発明の一態様では、徐放性ペプチド放出製剤によってブロッカー（単数または複数）を投与する。徐放性ペプチド放出製剤については一例がＷＯ９８／０８５３３号に開示されており、その内容を本明細書に援用する。
【００２７】
本発明の一態様では、阻害の開始前と開始後に患者の血液試料中の胸腺誘導因子の量を測定して診断を行う。
【００２８】
さらに別の態様では、従来は同定されていなかった胸腺因子を本発明を用いて同定する。
【００２９】
もうひとつの態様では、胸腺の活性を測定することによって診断を行う。上記だけでなく、これは、Ｔ細胞レセプターｅｘｃｉｓｉｏｎ ｃｉｒｃｌｅ（ＴＲＥＣ）と呼ばれるＤＮＡからなる小さな環の細胞が存在することで同定される、新たに産生されたＴ細胞のレベルを判断して行われる。これらのＴＲＥＣは、特に抗原に対するＴ細胞レセプターの形成時に遺伝子再配列の結果として、胸腺におけるＴ細胞発達の正常な部分として産生される。（ＣＤ３、ＣＤ４およびＣＤ８を染色するフローサイトメトリーで測定した場合の）Ｔ細胞総数の基本的な増加と、抗ＣＤ３架橋により刺激に対する応答性のｉｎ ｖｉｔｒｏでのシフトとを利用して胸腺機能を監視することもできるが、何らかの変化が検出可能になるまでには数日から数週間は要するものと思われる。
【００３０】
発明の詳細な説明
免疫系を構築して維持し、これによって感染や疾患から体を防御する上で根本的に重要でありながら、その機能が年齢依存的に最大能力の５％未満まで大幅に低下する点は胸腺機能の特性のひとつである。これは思春期後に最も顕著になることから、性ステロイドの何らかの役割が関与していると思われる。
【００３１】
性ステロイドの阻害は、直接的または間接的に、萎縮を効果的に逆行させる胸腺機能の重要な再活性化につながる。しかしながら、患者の年齢、疾患、治療方法が多岐にわたることを勘案すると、多くの患者がこの処置に対して異なった応答を示すと思われ、中には極めて弱い応答も含まれるであろう。したがって、性ステロイドの非存在下で活性化に対する胸腺の応答性を早い段階で示す新たな診断用インジケータを提供し、Ｔ細胞による障害を合理的に臨床管理する方法を体系化する。
【００３２】
胸腺は内分泌器官であるため、胸腺機能の再活性化では２〜４週間後に新しいＴ細胞が血流中に放出されるだけでなく、これよりも前に、再活性化の間ですら胸腺から放出されるサイトカインのレベルも上昇する。これは血液または血漿中で検出可能である。本願開示内容では、これらの関連の細胞および分子を利用して性ステロイドの阻害に対する患者の胸腺の応答性を検出する。本明細書では、この判断を行うための一組の診断技法について説明する。
【００３３】
胸腺への性ステロイドによるシグナル伝達の破壊
容易に理解できるように、胸腺への性ステロイドシグナル伝達を当業者間で周知のいろいろな方法で破壊することができるため、そのうちいくつかを本明細書で説明する。たとえば、胸腺での性ステロイド産生を阻害するか、あるいは１種またはそれ以上の性ステロイド受容体を遮断することで、性ステロイドアゴニストまたはアンタゴニスト、あるいは能動（抗原）または受動（抗体）抗性ステロイドワクチン接種を投与する場合のように所望の破壊が達成される。性ステロイドの産生については、１種またはそれ以上の性ステロイド類縁体を投与して阻害することも可能である。臨床例の中には、物理的な性腺摘除によって性腺を永久的に除去する方がよいこともある。
【００３４】
実施例では、性ステロイド類縁体、好ましくは黄体形成ホルモン放出ホルモン（ＬＨＲＨ）の類縁体を投与することによって、胸腺への性ステロイドシグナル伝達を破壊する。性ステロイド類縁体とこれを治療や化学的な性腺摘除に利用することについては周知である。このような類縁体としては、アバレリックス（米国特許第６，１９７，３３７号明細書）、セトロレリックス、デスロレリン（米国特許第４，２１８，４３９号明細書に記載）、ユーレキシン（仏国特許出願公開第７９２３５４５号明細書、国際公開第ＷＯ８６／０１１０５号パンフレット、ポルトガル国特許出願公開第１００８９９号明細書）、ゴセレリン（米国特許第４，１００，２７４号明細書、米国特許第４，１２８，６３８号明細書、英国特許出願公開第９１１２８５９号明細書、英国特許出願公開第９１１２８２５号明細書）、リュープロライド（米国特許第４，４９０，２９１号明細書、米国特許第３，９７２，８５９号明細書、米国特許第４，００８，２０９号明細書、米国特許第４，００５，０６３号明細書、独国特許出願公開第２５０９７８３号明細書、米国特許第４，９９２，４２１号明細書に記載）、欧州特許出願公開第４１３２０９号明細書に記載されているものなどのジオキサラン誘導体、トリプトレリン（米国特許第４，０１０，１２５号明細書、米国特許第４，０１８，７２６号明細書、米国特許第４，０２４，１２１号明細書、欧州特許出願公開第３６４８１９号明細書、米国特許第５，２５８，４９２号明細書に記載）、メテレリン（欧州特許出願公開第２３９０４号明細書に記載）、ブセレリン（米国特許第４，００３，８８４号明細書、米国特許第４，１１８，４８３号明細書、米国特許第４，２７５，００１号明細書に記載）、ヒストレリン（欧州特許出願公開第２１７６５９号明細書に記載）、ナファレリン（米国特許第４，２３４，５７１号明細書、国際公開第ＷＯ９３／１５７２２号パンフレット、欧州特許出願公開第５２５１０号明細書に記載）、ルトレリン（米国特許第４，０８９，９４６号明細書に記載）、リュープロレリン（Ｐｌｏｓｋｅｒらに記載）ならびに、欧州特許出願公開第１８１２３６号明細書、米国特許第４，６０８，２５１号明細書、米国特許第４，６５６，２４７号明細書、米国特許第４，６４２，３３２号明細書、米国特許第４，０１０，１４９号明細書、米国特許第３，９９２，３６５号明細書、米国特許第４，０１０，１４９号明細書に記載されているものなどのＬＨＲＨ類縁体があげられるが、これに限定されるものではない。以上、各参考文献の開示内容を本明細書に援用する。
【００３５】
胸腺の再生を刺激することについては、基本的には性ステロイドの作用および／またはＬＨＲＨ類縁体の直接的な作用を阻害して行うものであるが、相互に作用して胸腺の作用を高めることのできる別の物質を含まなければならない場合もある。このような化合物としては、インターロイキン７、上皮成長因子ファミリおよび線維芽細胞成長因子ファミリのメンバ、ケラチノサイト成長因子があげられるが、これに限定されるものではない。これらの別の化合物についてはＬＨＲＨ類縁体を最初に適用するときに１回だけ与えることを前提にしている。また、胸腺特異性になるように標的できるステロイド受容体ベースのモジュレータを開発して使用してもよい。
【００３６】
化学的な性腺摘除用薬剤の送達
本発明による化合物の送達は、当業者間で周知の多くの方法で達成可能なものである。化学的なインヒビターを投与して胸腺への性ステロイドシグナル伝達を阻害する標準的なやり方のひとつに、３ヶ月間有効なＬＨＲＨアゴニストを単回用量で用いる方法がある。この方法では、３ヶ月が経過するずっと前にアゴニストが患者の体から排泄されてしまうため、単純に１回のｉ．ｖ．（静脈内）またはｉ．ｍ．（筋肉内）注射を行うだけでは不十分なことがある。代わりにデポ注射またはインプラントを利用してもよいし、あるいは、インヒビターの徐放が可能な他のインヒビター送達手段。同様に、ここで必要な機能を保ちつつ、たとえば化学薬品を変性させるなどの方法で体内におけるインヒビターの半減期を延ばすための方法を利用してもよい。
【００３７】
さらに有用な送達機序の一例として、皮膚にレーザを照射する方法や皮膚表面で高圧神経衝撃トランジェント（ｈｉｇｈ ｐｒｅｓｓｕｒｅ ｉｍｐｕｌｓｅ ｔｒａｎｓｉｅｎｔ）（応力波または神経衝撃トランジェントとも呼ばれる）を発生させる方法があげられるが、これに限定されるものではない。いずれの方法でも、同じ場所に担体を併用または併用せずに、化合物（単数または複数）を接触させる処理を同時にまたは後から行う。好ましい接触方法のひとつに、処置を行っている間は皮膚の上にパッチを載せたままにしておく方法がある。
【００３８】
ひとつの送達手段では、適切な波長が維持され、厳密に焦点の合ったレーザ光線を利用して、患者の皮膚に小さなパーフォレーションを作るか、皮膚を変質させる。米国特許第４，７７５，３６１号明細書、米国特許第５，６４３，２５２号明細書、米国特許第５，８３９，４４６号明細書、米国特許第６，０５６，７３８号明細書を参照のこと（いずれも本明細書に援用する）。実施例では、レーザ光線の波長は０．２から１０ミクロンである。より好ましくは、波長は約１．５から３．０ミクロンである。最も好ましくは、波長は約２．９４ミクロンである。一実施形態では、レンズを用いてレーザ光線の焦点を合わせ、皮膚の表皮をとおして皮膚表面に照射スポットを形成する。別の実施形態では、レーザ光線の焦点を合わせ、皮膚の表皮細胞のみをとおして照射スポットを形成する。
【００３９】
レーザ光線を規定するにあたって、波長、エネルギフルエンス、パルス時間幅および照射スポットサイズをはじめとする、いくつかの要素が考慮されることがある。実施例では、エネルギフルエンスは０．０３〜１００，０００Ｊ／ｃｍ２の範囲である。より好ましくは、エネルギフルエンスは、０．０３〜９．６Ｊ／ｃｍ２の範囲である。光線の波長は、Ｅｒ：ＹＡＧなどのレーザ材料にある程度は左右される。パルス時間幅は、コンデンサ群、フラッシュランプ、レーザロッドの材料などによって生成されるパルス幅から必然的に得られる。パルス幅は１ｆｓ（フェムト秒）から１，０００μｓの間であると最適である。
【００４０】
この方法によれば、レーザで形成するパーフォレーションまたは変質を必ずしも１回のレーザパルスで形成しなくてもよい。実施例では、表皮細胞をとおしてのパーフォレーションまたは変質を、各々が標的組織厚の一部のみを貫通または変化させる複数のレーザパルスを用いて形成する。
【００４１】
この目的を達成するために、パルス１回分のエネルギを求めて所望のパルス数で割ることで、複数のパルスで表皮細胞を貫通または変化させるのに必要なエネルギをおおざっぱに見積もることができる。たとえば、あるサイズのスポットで表皮細胞全体をとおしてパーフォレーションまたは変質を形成するのに１Ｊのエネルギが必要な場合、各々がそのエネルギの１／１０である１０のパルスを用いて定性的に同様のパーフォレーションまたは変質を形成することができる。放射線照射の間は患者が標的組織を動かさず、各パルスの間に生成される熱が有意に拡散しないことが望ましい（ヒトの反応時間は１００ｍｓ程度）ため、好ましい実施形態では、レーザからのパルスの繰り返し数を１００ｍｓ未満の時間で完全なパーフォレーションを形成できるような数にしなければならない。あるいは、標的組織とレーザの向きを機械的に固定し、これよりも長い放射線照射時間のあいだ標的位置の変化が起こらないようにすることも可能である。
【００４２】
血流をほとんど発生させないか全く発生させない形で皮膚を貫通するには、表皮細胞層などの外側の表面を介するが毛細管層ほど深部ではない位置で皮膚を穿孔または変質する。このとき、皮膚での光線直径が約０．５ミクロン〜５．０ｃｍの範囲になるようにレーザ光線の焦点を皮膚に正確に合わせる。任意に、スポットを幅約０．０５〜０．５ｍｍで長さ最大２．５ｍｍのスリット形にしてもよい。幅はどのようなサイズであってもよく、除去対象となる流体または適用対象となる医薬品の所望の透過率と照射部分の組織構造とによって制御される。焦点レンズの焦点距離はどのような長さであってもよいが、一実施例では３０ｍｍである。
【００４３】
波長、パルス長、エネルギフルエンス（レーザエネルギ出力（ジュール）および焦点での光線サイズ（ｃｍ２）の関数）、照射スポットサイズを調節することで、表皮細胞への影響をアブレーション（パーフォレーション）と非焼灼性の変性（変質）との間で変えることが可能である。表皮細胞のアブレーションと非焼灼性の変質はいずれもその後に適用される製剤の透過性を高めるものである。
【００４４】
たとえば、パルスエネルギ以外の変数を一定に維持したままパルスエネルギを小さくすると、組織への作用を焼灼性と非焼灼性との間で変化させることができる。パルス長約３００μｓのＥｒ：ＹＡＧレーザを用いて、パルスまたは輻射エネルギ１回分で２ｍｍのスポットを皮膚に照射する場合、パルスエネルギが約１００ｍＪを超えると部分的または完全なアブレーションが形成され、パルスエネルギが約１００ｍＪ未満であると部分的なアブレーションまたは非焼灼性の変質が表皮細胞に形成される。任意に、複数のパルスを利用して、体液の透過性を高めるのに必要または医薬品送達用の閾値パルスエネルギをパルス数にほぼ等しい分だけ減少させてもよい。
【００４５】
あるいは、スポットサイズ以外の変数を一定に維持したままスポットサイズを小さくしても、組織への作用を焼灼性と非焼灼性との間で変化させることができる。たとえば、スポット面積を半分にすることで同じ効果を得るのに必要なエネルギも半分になる。レーザの輻射出力を顕微鏡対物レンズ（ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ）の対物レンズ（たとえばニューヨーク州メルビルのニコン社から入手可能なものなど）に結合することで、０．５ミクロンまで抑えて照射を行うことができる。このような場合、おおよそ顕微鏡の解像限界までのスポットに光線の焦点を合わせることができるが、これはおそらく約０．５ミクロン程度である。実際、光線のプロファイルがガウスであれば、対象となる照射部分のサイズを実測光線サイズよりも小さくすることができ、顕微鏡の画像解像度を超えることが可能なのである。この場合、組織を非焼灼的に変質させるには、エネルギフルエンスを３．２Ｊ／ｃｍ２にすると良いであろうと思われるが、この場合に二分の一ミクロンのスポットサイズであれば必要なパルスエネルギは約５ｎＪになる。このように低いパルスエネルギはダイオードレーザで容易に得ることができ、ガラスなどの吸収用フィルタを用いて光線を減衰させれば、Ｅｒ：ＹＡＧレーザなどでも得ることができるものである。
【００４６】
任意に、輻射エネルギの波長以外の変数を一定に維持したまま輻射エネルギの波長を変えることで、組織への作用を焼灼性と非焼灼性との間で変化させるようにしてもよい。たとえば、Ｅｒ：ＹＡＧ（エルビウム：ＹＡＧ；２．９４ミクロン）レーザの代わりにＨｏ：ＹＡＧ（ホルミウム：ＹＡＧ；２．１２７ミクロン）を使用すると組織によるエネルギの吸収量が小さくなり、少な目のパーフォレーションまたは変質が形成される。
【００４７】
レーザによって生成されるピコ秒およびフェムト秒のパルスを利用し、皮膚に変質またはアブレーションを形成するようにしてもよい。これは、時間幅１フェムト秒から１ｍｓの範囲で１回のパルスを送達する調節済みのダイオードまたは関連のマイクロチップレーザで達成可能なものである（パルス長を１フェムト秒まで抑えて用いることについて開示した、本明細書に援用するＤ．Ｓｔｅｒｎらの「Ｃｏｒｎｅａｌ Ａｂｌａｔｉｏｎ ｂｙ Ｎａｎｏｓｅｃｏｎｄ，Ｐｉｃｏｓｅｃｏｎｄ， ａｎｄ Ｆｅｍｔｏｓｅｃｏｎｄ Ｌａｓｅｒｓ ａｔ ５３２ ａｎｄ ６２５ ｎｍ」、Ｃｏｒｎｅａｌ Ｌａｓｅｒ Ａｂｌａｔｉｏｎ、第１０７巻、第５８７〜５９２頁（１９８９）を参照のこと）。
【００４８】
もうひとつの送達方法では、皮膚での高圧神経衝撃トランジェントを利用して透過性を得る。本明細書に援用する米国特許第５，６１４，５０２号明細書および米国特許第５，６５８，８９２号明細書を参照のこと。立ち上がり時間と最大応力（または圧力）とを定めた応力波（たとえばレーザで生成する場合はレーザ応力波（ＬＳＷ））などの高圧神経衝撃トランジェントを用いて、表皮細胞や粘膜などの上皮組織の層をとおして本願開示内容にあるものなどの化合物を安全かつ効率的に移動させることができる。これらの方法を利用すれば、正味電荷とは関係なく広範囲にわたるサイズの化合物を送達することができる。また、本方法で用いる神経衝撃トランジェントでは組織の損傷が回避される。
【００４９】
神経衝撃トランジェントに曝露する前は、表皮細胞などの上皮組織層は外来化合物を通さないことが多い。このため、上皮層よりも下にある細胞に化合物を拡散させることができない。上皮層を神経衝撃トランジェントに曝露すると、上皮層をとおして化合物を拡散させることができる。拡散速度は通常、神経衝撃トランジェントの性質と送達対象となる化合物のサイズとによって決まる。
【００５０】
皮膚の表皮細胞などの特定の上皮組織層をとおしての貫通速度も、ｐＨ、皮膚支持体組織の代謝、表皮細胞外の領域と表皮細胞内の領域との圧差ならびに皮膚の解剖組織上の部位および生理状態をはじめとする、ほかのいくつかの要因に左右される。さらに、皮膚の生理状態は、健康状態、年齢、性別、人種、スキンケア、病歴に左右される。たとえば、事前に有機溶剤または界面活性剤に触れると皮膚の生理状態に影響する。
【００５１】
また、上皮組織層をとおして送達される化合物の量も上皮層が透過性である時間と透過性にされる上皮層の表面積の大きさとに左右されることになる。神経衝撃トランジェントの特性と特徴を、神経衝撃トランジェントを生成するエネルギ源によって制御する。本明細書に援用する国際公開第ＷＯ９８／２３３２５号パンフレットを参照のこと。しかしながら、この特徴は、神経衝撃トランジェントが伝播する接触媒質の線形特性と非線形特性とによって変わってくる。接触媒質によって生じる線形の減衰は主に神経衝撃トランジェントの高周波成分を減衰する。これによって帯域幅が小さくなり、これに伴って神経衝撃トランジェントの立ち上がり時間が長くなる。一方、接触媒質の非線形特性は立ち上がり時間を短くする。立ち上がり時間が短くなるのは、音と粒子の速度が応力（圧力）に依存するためである。応力が大きくなると、音と粒子の速度も上昇する。これによって神経衝撃トランジェントの立ち上がりが急勾配になる。立ち上がり時間の急勾配の増加を実質的なものとするのに波をどのくらいの時間伝搬させることになるかは、線形の減衰、非線形係数、最大応力の相対強度によって決まる。
【００５２】
神経衝撃トランジェントの立ち上がり時間、規模、持続時間については、一時的に上皮組織層の透過性を高める非破壊的な（すなわち非衝撃波）神経衝撃トランジェントが得られるように選択する。通常、立ち上がり時間は少なくとも１ｎｓであり、より好ましくは約１０ｎｓである。
【００５３】
神経衝撃トランジェントの最大応力または圧力は上皮組織または細胞層によって異なる。たとえば、表皮細胞をとおして化合物を移動させる場合、神経衝撃トランジェントの最大応力または圧力を少なくとも４００バール、より好ましくは少なくとも１，０００バールに設定しなければならないが、約２，０００バールを超えないようにする。
【００５４】
上皮粘膜層では最大圧力を３００バールから８００バール、好ましくは３００バールから６００バールの間に設定するものとする。
【００５５】
神経衝撃トランジェントは、持続時間が数十ｎｓ前後で上皮組織と互いに影響しあうのが短時間しかないと好ましい。
【００５６】
神経衝撃トランジェントとの相互作用後、上皮組織が永久的に損傷されることはなく、最大約３分間透過性を維持するだけである。
【００５７】
また、この新しい方法では、高振幅の別個のパルスを数回患者に印加するだけである。患者に施される神経衝撃トランジェントの数は一般に１００未満であり、より好ましくは５０未満、最も好ましくは１０未満である。複数の光学パルスを用いて神経衝撃トランジェントを生成する場合、連続したパルス間の時間は１０から１２０秒であるが、これは上皮組織の永久的な損傷を防ぐには十分な長さである。
【００５８】
神経衝撃トランジェントの特性については、従来技術において標準の方法を用いて測定することが可能である。たとえば、Ｄｏｕｋａｓら、Ｕｌｔｒａｓｏｕｎｄ Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．、２１：９６１（１９９５）に記載されているようなポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）トランスデューサ法を用いて、最大応力または圧力、立ち上がり時間を測定することができる。
【００５９】
神経衝撃トランジェントは、さまざまなエネルギ源によって生成可能なものである。神経衝撃トランジェントの発射を担う物理現象は、通常、（１）熱弾性生成、（２）光破壊または（３）アブレーションという３通りの機序から選択される。
【００６０】
たとえば、高エネルギのレーザ源を適用して標的材料を焼灼することで神経衝撃トランジェントを開始することができ、その後この神経衝撃トランジェントを接触媒質によって上皮組織または細胞層に結合する。接触媒質は、たとえば、非線形である限りは液体またはゲルである。よって、水、ひまし油などの油、ホスフェート緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）などの等張媒質またはコラーゲンゲルなどのゲルを接触媒質として用いることができる。
【００６１】
また、たとえば神経衝撃トランジェントの生成後に化合物に対して表皮細胞が透過性である時間を引き延ばすことによって移動性を高める界面活性剤を接触媒質に含むようにしてもよい。界面活性剤には、たとえばイオン性洗剤または非イオン性洗剤が考えられ、よって、たとえばラウリル硫酸ナトリウム、臭化セチルトリメチルアンモニウム、ラウリルジメチルアミンオキシドを含むことができる。
【００６２】
吸収する標的材料は光学的に誘発されるトランスデューサとして作用する。光を吸収すると標的材料には急激な熱膨張が起こって焼灼され、神経衝撃トランジェントが起こる。一般に、金属およびポリマーのフィルムは可視スペクトル領域および紫外スペクトル領域での吸収係数が大きい。
【００６３】
使用するレーザの波長で光を完全に吸収する限り、多くのタイプの材料をレーザ光線と併用の標的材料として用いることができる。標的材料については、アルミニウムまたは銅などの金属、黒いポリスチレンなどのポリスチレンなどのプラスチック、セラミック、高濃縮染料溶液で構成することが可能である。標的材料は印加するレーザエネルギの断面積よりも寸法の大きなものでなければならない。また、光が皮膚表面に衝突しないように、標的材料は光学的貫通深さよりも厚くなければならない。さらに、標的材料は機械的に支持できるだけの十分な厚さのものでなければならない。標的材料が金属製の場合、一般的な厚さは１／３２から１／１６インチである。プラスチックの標的材料では、厚さは１／１６から１／８インチである。
【００６４】
また、限られた狭い範囲の（ｃｏｎｆｉｎｅｄ）アブレーションによって神経衝撃トランジェントを強めることもできる。限られた狭い範囲のアブレーションでは、石英の光学ウィンドウなどのレーザ光線透過材料を標的材料と密着させて配置する。この透明材料を用いて標的材料を焼灼してプラズマを限局すると、結合係数が桁違いに大きくなる（Ｆａｂｒｏら、Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｐｈｙｓ．、６８：７７５、１９９０）。透明材料には、石英、ガラスまたは透明プラスチックを用いることが可能である。
【００６５】
標的材料と限局用の透明材料との間に空間ができるとプラズマが膨張する余裕ができ、標的に加わる運動量が小さくなってしまうため、炭素含有エポキシなどの最初は液体状である接着剤を用いて透明材料を標的材料に接着し、このような空間をなくすようにすると好ましい。
【００６６】
たとえば電気光学的装置または音響光学的装置を用いてＱスイッチレーザまたはモード同期レーザを利用するなどの従来技術において周知の標準的な光学的変調技法によってレーザ光線を生成することができる。赤外スペクトル、可視スペクトルおよび／または赤外スペクトルにおいてパルスモードで動作できる標準的な市販レーザとしては、Ｎｄ：ＹＡＧ、Ｎｄ：ＹＬＦ、Ｃ０２、エキシマ、染料、Ｔｉ：サファイア、ダイオード、ホルミウム（および他の希土材料）、金属蒸気レーザがあげられる。これらの光源はパルス幅が調節可能であり、数十ピコ秒（ｐｓ）から数百マイクロ秒まで可変である。この新規な方法で使用する光学パルス幅は１００ｐｓから約２００ｎｓで可変であり、好ましくは約５００ｐｓから４０ｎｓの間である。
【００６７】
また、体外砕石機によって神経衝撃トランジェントを生成することも可能である（一例が、Ｃｏｌｅｍａｎら、Ｕｌｔｒａｓｏｕｎｄ Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．、１５：２１３〜２２７、１９８９に記載されている）。これらの神経衝撃トランジェントは立ち上がり時間が３０から４５０ｎｓであり、レーザで生成する神経衝撃トランジェントの場合よりも長い。この新たな方法用に体外砕石機を用いて適切な立ち上がり時間の神経衝撃トランジェントを形成するために、上記の式（１）によって求められる距離だけ非線形の接触媒質（水など）中で神経衝撃トランジェントを伝播させる。たとえば、立ち上がり時間１００ｎｓでピーク圧力が５００バールの神経衝撃トランジェントを生成する砕石機を用いる場合、上皮細胞層と接触する前に神経衝撃トランジェントが接触媒質を介して移動しなければならない距離は約５ｍｍである。
【００６８】
砕石機によって生成される神経衝撃トランジェントを加工する方法のもうひとつの利点として、波の引張成分（ｔｅｎｓｉｌｅ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ）が広がり、非線形の接触媒質中を伝播することで減衰される点があげられる。この伝播距離を調整し、圧力が波の圧縮成分の最大圧力のわずか約５から１０％の引張成分を持つ神経衝撃トランジェントを生成する必要がある。したがって、加工された（ｓｈａｐｅｄ）神経衝撃トランジェントが組織を損傷することはない。
【００６９】
使用する砕石機のタイプは重要ではない。電気水力学式砕石機、電磁式砕石機または圧電式砕石機のいずれかを用いることができる。
【００７０】
また、圧電トランスデューサなどのトランスデューサを用いて神経衝撃トランジェントを生成することも可能である。好ましくは、トランスデューサが接触媒質と直接接触し、光学的、熱的または電気的に場を印加して神経衝撃トランジェントを生成した後に急激に変位する。たとえば、絶縁破壊を利用することができ、この絶縁破壊は一般に高電圧スパークまたは圧電トランスデューサによって誘導される（特定の体外砕石機で用いられているものと同様である。Ｃｏｌｅｍａｎら、Ｕｌｔｒａｓｏｕｎｄ Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．、１５：２１３〜２２７、１９８９）。圧電トランスデューサの場合、電界を印加した後にトランスデューサが急激に膨張して接触媒質の急激な変位を発生させる。
【００７１】
また、光ファイバを用いて神経衝撃トランジェントを生成することも可能である。光ファイバ送達系は特に扱いやすく、上皮組織層に隣接して位置する標的材料に光線を照射し、到達しにくい場所で神経衝撃トランジェントを生成するのに利用できるものである。これらのタイプの送達系は、カテーテルおよび関連の可撓性装置に統合し、人体のほとんどの器官への照射に利用できるため、レーザと光学的に結合させる場合に好ましいものである。また、所望の立ち上がり時間と最大応力の神経衝撃トランジェントを得るには、これに光学源（ｏｐｔｉｃａｌ ｓｏｕｒｃｅ）の波長を合わせて特定の標的材料で適切な吸収を生成する方法が簡単である。
【００７２】
あるいは、爆発的に生じる神経衝撃に応答して強力な（ｅｎｅｒｇｅｔｉｃ）材料で神経衝撃トランジェントを生成することもできる。放電またはスパークを発生させることで、この強力な材料を起爆装置で爆発させる。
【００７３】
神経衝撃トランジェントと併せて静水圧を利用し、上皮組織層を介しての化合物の移動性を高めることができる。神経衝撃トランジェントによって誘発される作用は数分間持続するため、神経衝撃トランジェントの印加後に皮膚の表皮細胞などの上皮組織層の表面に静水圧を加えることで、濃度勾配に沿って上皮細胞層を介して受動的に拡散していく薬剤の移動速度を増すことができる。
【００７４】
胸腺機能の診断用インジケータ
Ａ．周知のマーカー
特定のマーカーが胸腺の活性化と関連している。これらのマーカー１つまたは任意の組み合わせの濃度に従って、胸腺の活性化レベルを監視することができる。胸腺機能の活性化前と活性化後のマーカー分子のレベルの変化を、バイオインフォマティクスを利用して調べることができる。たとえば、性ステロイドの阻害前と阻害後に患者の試料で血漿（すなわち遠心分離によってすべての細胞が枯渇した血液）の二次元ゲル電気泳動を実施する。ゲル上で異なった形で表れてくる「ドット」を記録し、コンピュータで分析する。
【００７５】
１．インターロイキン−７（Ｉｌ−７）
胸腺皮質の上皮細胞によって産生される主なリンパ球産生性サイトカインおよび胸腺形成性サイトカインであるＩＬ−７は、未成熟の胸腺細胞の増殖および分化に不可欠である（ｖｏｎ Ｆｒｅｅｄｅｎ−Ｊｅｆｆｒｙら、１９９５；Ｋｏｍｓｃｈｌｉｅｓら、１９９５；Ｐｅｓｃｈｏｎら、１９９４）。トリプルネガティブな細胞の発達にはＩＬ−７との相互作用が必要（Ｏｏｓｔｅｒｗｅｇｅｌら、１９９７；Ｍｏｏｒｅら、１９９３）であり、これは主に、ｂｃｌ−２の発現を誘導し、未成熟な胸腺細胞のプログラム細胞死を阻害することによって作用する（Ａｋａｓｈｉら、１９９７；Ｍａｒａｓｋｏｖｓｋｙら、１９９７）。ＩＬ−７だけで処置すると、高齢マウスでは、ＴＣＲ  β鎖再構成の位置に対応して、ＣＤ４４＋ＣＤ２５＋（ＴＮ２）サブセットおよびＣＤ４４−ＣＤ２５＋（ＴＮ３）サブセットでのアポトーシスの増加と胸腺形成の縮小の両方とも逆転する（Ａｎｄｒｅｗ ＆ Ａｓｐｉｎａｌｌ、２００１）ことが明らかになっている。
【００７６】
Ｔ細胞を枯渇させての骨髄移植後のマウスでの免疫の回復については、ＩＬ−７の投与後に亢進された旨の文献報告があることから、骨髄移植後にＴ細胞の新たな産生を調節する機序のひとつにＩＬ−７の産生があるのではないかと思われる（Ｂｏｌｏｔｉｎら、１９９６）。骨髄移植の前と後にＥＬＩＳＡによって患者のＩＬ−７血清濃度を分析したところ、リンパ球の絶対数と反比例の関係にあることが明らかになった（Ｂｏｌｏｔｉｎら、１９９９）。ＨＩＶに感染した小児患者および成人患者でＩＬ−７濃度を測定する研究でも、ＩＬ−７とＣＤ４の絶対数との間には強い逆相関があり、ＣＤ３およびＣＤ８の数についてもＣＤ４ほどではないが有意な相関があることが示されている（Ｆｒｙら、２００１）。
【００７７】
循環しているＩＬ−７がなぜ増加するのかという根本的な機序は不明であるが、Ｔ細胞数が減少することで利用できるＩＬ−７レセプターも少なくなり、これによってＩＬ−７の産生には何ら変化がないまま遊離ＩＬ−７の濃度が高くなるのではないかと考えられている。すなわち、ＩＬ−７レセプターを発現するリンパ球との結合（Ｂｏｌｏｔｉｎら、１９９９）によって、循環しているＩＬ−７の濃度が恒常的に調節される。もうひとつの機序に、可溶性メディエータを介してのＴ細胞とＩＬ−７産生細胞との相互作用によって、あるいはリンパ球の微小環境と直接的に接触することによって、リンパ球減少症（ｌｙｍｐｈｏｐｏｅｎｉａ）に応答してＩＬ−７が直接的に上方制御されることがある（Ｆｒｙら、２００１）。
【００７８】
正常なＩＬ−７レベル
６ヶ月から５．５歳の子どもでは、ＩＬ−７の正常な平均濃度は１０．７±３．９ｐｇ／ｍｌである。２２．２歳から５３．５歳の成人では、平均はかなり低くなり、３．１±２．５ｐｇ／ｍｌになる。ＩＬ−７レベルは１歳未満の乳児で最も高く、子どもや成人では低いため、年齢によってＩＬ−７レベルが決まるのではないかと考えられている（Ｂｏｌｏｔｉｎら、１９９９）。これは、化学療法および骨髄移植を受けた、青年期はじめの患者で胸腺形成能の年齢依存性の低下が認められることを示した過去の研究を裏付けるものである（Ｍａｃｋａｌｌら、１９９５；Ｗｅｉｎｂｅｒｇら、１９９５）。さらに、高齢マウスから得た骨髄ストロマに関する研究では、ＩＬ−７の分泌が加齢と共に減少することが明らかになった（Ｓｔｅｐｈａｎら、１９９８）。
【００７９】
本願開示内容の実施形態によれば、胸腺への性ステロイドによるシグナル伝達を遮断する薬剤（単数または複数）投与の前後に患者の血液または血清中のＩＬ−７の濃度を監視する。薬剤（単数または複数）投与後２〜３日以内、好ましくは２４時間以内、より好ましくは２〜３時間以内にＩＬ−７濃度が上昇すれば、すなわち胸腺が性ステロイド活性の遮断に応答していることになる。ＩＬ−７の濃度を定期的に監視し、胸腺の活性化のレベルを経時的に判断する。
【００８０】
２．胸腺血清因子（ＦＴＳ）
現在、同様のリガンドおよびレセプターを使うことによる免疫と神経内分泌系のクロストークが広く一般に認められている。胸腺−視床下部／脳下垂体がなす軸によって、上昇方向のフィードバックループが上皮由来の胸腺因子の影響を受ける双方向の回路が構成される。ペプチドホルモンおよび神経ペプチドの放出を調節するだけでなく、胸腺のホルモンは主に、骨髄からの前駆細胞の表現型の成熟を促進し、成熟Ｔ細胞の機能を調節するよう作用する（ＲｉｔｔｅｒおよびＣｒｉｓｐｅ、１９９２）。したがって、胸腺のホルモンは、免疫不全から神経内分泌疾患に至るまで、広範囲にわたる病的状態において重要なものとなり得る。
【００８１】
ＦＴＳまたはチムリンは、胸腺の被膜下細胞および髄質細胞だけが分泌するノナペプチドホルモンである（ＲｉｔｔｅｒおよびＣｒｉｓｐｅ、１９９２）。Ｔ細胞の分化の初期と後期の両方やＴ細胞の機能に不可欠なことであるが、ＦＴＳはいくつかのＴ細胞マーカーの発現も誘導し、同種細胞毒性、サプレッサー機能、ＩＬ−２の産生などのＴ細胞の機能を亢進する（ＲｉｔｔｅｒおよびＣｒｉｓｐｅ、１９９２）。
【００８２】
子どものＦＴＳ力価は、生後数日の２．６９±１．１０から生後数年の４．７７±０．４４へと年齢を重ねるにつれて次第に大きくなり、その後３６歳の０．６６±０．２６、さらには高齢へと進むにつれて次第に小さくなる（Ｃｏｎｓｏｌｉｎｉら、２０００）。胸腺は生理学的に神経内分泌の制御下にあるため、ペプチドホルモンおよび神経ペプチドはＦＴＳレベルの年齢関連変動に影響する。上述したように、ホルモン活性の損なわれた状態は年齢依存の胸腺萎縮と関連していることが明らかになっている（Ｃｏｎｓｏｌｏｎｉら、２０００）。特に、思春期後に血清性ステロイド濃度が上昇した後は胸腺の萎縮が最も顕著である（Ｆａｂｒｉｓら、１９９７）。さらに、胸腺上皮細胞によるＦＴＳの分泌は成長ホルモンによって亢進される（Ｍｏｃｃｈｅｇｉａｎｉら、１９９０）。
【００８３】
細胞性免疫では亜鉛が重要であることが明らかになっている（Ｐｒａｓａｄら、１９８８）が、ＦＴＳはひとつの亜鉛分子と結合すると生物学的に活性化されるため（Ｚｎ−ＦＴＳ）、これは驚くべきことではない（Ｂａｃｈ、１９８３）。亜鉛の代謝回転は年齢を重ねるにつれて小さくなるのが普通である（ＰａｎｅｒａｉおよびＳａｃｅｒｄｏｔｅ、１９９７）ため、高齢者のＦＴＳレベルが低いのは亜鉛の欠乏と関連しているのではないかと考えられる（ＭｏｃｃｈｅｇｉａｎｉおよびＦａｂｒｉｓ、１９９５）。特に、高齢患者に亜鉛治療を施すと胸腺の分泌活性が回復することが明らかになった（Ｍｏｒｃｃｈｅｇｉａｎｉら、１９９０）。しかしながら、青春期の患者から得られた血漿に亜鉛イオンを加えるｉｎ  ｖｉｔｒｏでの研究ではＦＴＳの生物学的活性が回復しなかったことから、青春期におけるＦＴＳレベルの低下は亜鉛欠乏ではなく胸腺の活性低下の方に大きく関連してることが分かる（Ｃｏｎｓｏｌｉｎｉら、２０００）。
【００８４】
本願開示内容の実施形態では、胸腺への性ステロイドによるシグナル伝達を遮断する薬剤（単数または複数）投与の前後に患者の血液または血清中のＦＴＳの濃度を監視する。薬剤（単数または複数）投与後２〜３日以内、好ましくは２４時間以内、より好ましくは２〜３時間以内にＦＴＳ濃度が上昇すれば、すなわち胸腺が性ステロイド活性の遮断に応答していることになる。ＦＴＳの濃度を定期的に監視し、胸腺の活性化のレベルを経時的に判断する。
【００８５】
３．サイモシンおよびサイモポエチン
ヒトで２０歳以後は減少しはじめるＦＴＳとは対照的に、サイモシン−α１およびサイモピエチン（ｔｈｙｍｏｐｉｅｔｉｎ）の血清濃度は１０歳という早い時期で減少するように見える（Ｂｏｄｅｙらが検討、１９９７）。オスのラットでは、性腺摘除によってサイモシン−α１とサイモシン−β４の血清濃度が上昇するように見える（ＷｉｎｄｍｉｌｌおよびＬｅｅ、１９９９）。
【００８６】
本発明の実施形態では、胸腺への性ステロイドによるシグナル伝達を遮断する薬剤（単数または複数）の投与前後に、サイモポエチン、サイモシン−α１、サイモシン−β４またはこれらの組み合わせの濃度を測定する。薬剤（単数または複数）投与後２〜３日以内、好ましくは２４時間以内、より好ましくは２〜３時間以内に、これらの化合物のうちいずれかまたはその組み合わせの濃度が上昇すれば、すなわち胸腺が性ステロイド活性の遮断に応答していることになる。これらの化合物のうちいずれかまたはその組み合わせの濃度を定期的に監視し、胸腺の活性化のレベルを経時的に判断する。
【００８７】
Ｂ．新たに同定されたマーカー
胸腺活性化用の周知のマーカーだけでなく、本願開示内容の方法に基づいていくつかの別のマーカーを同定して使用した。
【００８８】
これらのマーカーを得るための手順は、以下のすでに同定されているマーカーの場合に近いものとすることができる。たとえば、２Ｄゲル電気泳動を利用して、さまざまなスポットの強度を経時的に監視することができる。これらのスポットは通常は個々のタンパク質に対応しているが、ときには２種類またはそれ以上のタンパク質から得られるスポットに重複や一致が見られることがある。分子の同一性については固相アミノ酸配列決定によって明らかにする。このようにして胸腺の活性化の結果として発現が変化（増大または減少）するものと同定した新たな分子（単数または複数）は、性ステロイドの喪失に対する胸腺の応答性についての新しい診断試験の基礎になるものである。
【００８９】
Ｔ細胞の分析
Ｔ細胞産生の監視は胸腺の活性化を判断する上で使用できるもうひとつの方法である。末梢全血のフローサイトメトリー分析、マーカーＫｉ６７を監視することによる増殖細胞の検出、ＴＲＥＣ分析などの手法は、このような監視の分野における当業者間で周知の方法の例である。本発明の実施形態では、胸腺への性ステロイドによるシグナル伝達を遮断する薬剤（単数または複数）を投与する前後にＴ細胞数ならびに増殖Ｔ細胞数を求める。薬剤（単数または複数）投与後２〜３日以内、好ましくは２４時間以内、より好ましくは２〜３時間以内に、これらのＴ細胞のうちいずれかまたはその組み合わせの数が増えれば、すなわち胸腺が性ステロイド活性の遮断に応答していることになる。これらのＴ細胞のうちいずれかまたはその組み合わせの濃度を定期的に監視し、胸腺の活性化のレベルを経時的に判断する。
【００９０】
小動物での研究
材料および方法
動物
モナッシュ大学のＣｅｎｔｒａｌ Ａｎｉｍａｌ ＳｅｒｖｉｃｅｓからオスのＣＢＡ／ＣＡＨマウスおよびＣ５７Ｂ１６／Ｊマウスを入手し、従来の条件下で飼育した。週齢は４〜６週間から２６ヶ月までの範囲であり、関連がある場合はこれを明記する。
【００９１】
性腺摘除
キシラジン（ロンプン；オーストラリアのニューサウスウェールズ州ボタニーのバイエルオーストラリアリミテッド）０．３ｍｇと塩酸ケタミン（ケタラール；オーストラリアのニューサウスウェールズ州Ｃａｒｉｎｇｂａｈのパークデービス）１．５ｍｇとを生理食塩水に入れた溶液０．３ｍｌを腹腔内注射し、動物を麻酔した。陰嚢を切開して精巣を露出させ、縫合糸で結紮した後、周囲の脂肪組織と一緒に摘出して外科的な性腺摘除を行った。
【００９２】
ブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）の取り込み
ＢｒｄＵ（ミズーリ州セントルイスのシグマケミカルコーポレーション）（ＰＢＳ１００μｌ中１００ｍｇ／体重ｋｇ）を４時間の間隔でマウスに２回腹腔内注射した。対照のマウスにはビヒクル単独の注射を行った。２回目の注射の１時間後、胸腺を切断解剖し、ＦＡＣＳ分析用に細胞浮遊液を生成するか、あるいはすみやかにＴｉｓｓｕｅ Ｔｅｋ（インディアナ州Ｏ．Ｃ．Ｔ．ｃｏｍｐｏｕｎｄ，Ｍｉｌｅｓ ＩＮＣ）に埋め込み、液体窒素中でスナップ凍結させ（ｓｎａｐ−ｆｒｏｚｅｎ）、使用するまで−７０℃で保管した。
【００９３】
フローサイトメトリーによる分析
マウスをＣＯ２窒息で屠殺し、胸腺、脾臓、腸間膜リンパ節を摘出した。器官を冷たいＰＢＳ／１％ＦＣＳ／０．０２％アジド中にて２００μｍの篩で静かに押しつぶし、遠心分離（６５０ｇ、５分、４℃）し、ＰＢＳ／ＦＣＳ／Ａｚのいずれか一方に再懸濁させた。赤血球溶解液（８．９ｇ／リットル塩化アンモニウム）中にて１０分間４℃で脾臓細胞をインキュベートし、洗浄し、ＰＢＳ／ＦＣＳ／Ａｚに再懸濁させた。血球計算盤と臭化エチジウム／アクリジンオレンジとを用いて細胞濃度および生存度を２回重複して求め、蛍光顕微鏡（Ａｘｉｏｓｋｏｐ；ドイツのオーバーコッヘンのカールツアイス）下で観察した。
【００９４】
３色免疫蛍光法では、抗αβＴＣＲ−ＦＩＴＣまたは抗γδＴＣＲ−ＦＩＴＣ、抗−ＣＤ４−ＰＥおよび抗−ＣＤ８−ＡＰＣ（いずれもカリフォルニア州サンディエゴのファーミンジェンから入手）を用いて常法に従って胸腺細胞を標識し、続いてフローサイトメトリー分析を行った。αβＴＣＲ−ＦＩＴＣ／ＣＤ４−ＰＥ／ＣＤ８−ＡＰＣまたはＢ２２０−Ｂ（シグマ）とＣＤ４−ＰＥおよびＣＤ８−ＡＰＣとのいずれかで脾臓およびリンパ節の懸濁液を標識した。カリフォルニア州バーリンゲームのカルタグラボラトリーズインコーポレイテッドから購入したストレプトアビジンＴｒｉ−ｃｏｌｏｒ複合体でＢ２２０−Ｂを発色させた。
【００９５】
ＢｒｄＵ検出では、ＣＤ４−ＰＥおよびＣＤ８−ＡＰＣで細胞を表面標識し、続いて、従来すでに説明されている（ＣａｒａｙｏｎおよびＢｏｒｄ、１９８９）ようにして固定および膜透過処理を行った。簡単に説明すると、染色した細胞を１％ＰＦＡ／０．０１％Ｔｗｅｅｎ−２０中にて４℃でＯ／Ｎに固定した。洗浄後の細胞を、ＤＮａｓｅ（１００Ｋｕｎｉｔｚ単位、西ドイツのベーリンガー・マンハイム）５００μｌ中にて３０分間３７℃でインキュベートし、ＤＮＡを変性させた。最後に、抗ＢｒｄＵ  ＦＩＴＣ（ベクトン・ディッキンソン）を用いて細胞をインキュベートした。
【００９６】
４色免疫蛍光法では、抗ラットＩｇ−Ｃｙ５（英国、アマシャム）によって共通に検出される、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、Ｂ２２０およびＭａｃ−１で胸腺細胞を標識し、ネガティブ細胞（ＴＮ）を分析用に選び出した。これをさらにＣＤ２５−ＰＥ（ファーミンジェン）およびＣＤ４４−Ｂ（ファーミンジェン）で染色し、続いて、従来すでに説明されている（ＧｏｄｆｒｅｙおよびＺｌｏｔｎｉｋ、１９９３）ようにしてストレプトアビジンＴｒｉ−ｃｏｌｏｕｒ（カリフォルニア州、カルタグ）での染色を行った。次に、上述したようにしてＢｒｄＵ検出を行った。
【００９７】
ＦａｃｓＣａｌｉｂｕｒ（ベクトン・ディッキンソン）にて試料を分析した。０°および９０°の光散乱プロファイルに基づいて生存可能なリンパ球を選び出し、Ｃｅｌｌ  ｑｕｅｓｔソフトウェア（ベクトン・ディッキンソン）を用いてデータを分析した。
【００９８】
免疫組織学
凍結保存した胸腺切片（４μｍ）を、クライオスタット（レイカ）を用いて切断し、１００％アセトン中にてすみやかに固定した。
【００９９】
２色免疫蛍光法では、この実験室で生成したモノクローナル抗体のパネルである、ＭＴＳ  ６、１０、１２、１５、１６、２０、２４、３２、３３、３５および４４（Ｇｏｄｆｒｅｙら、１９９０、表１）で切片を二重標識し、多価ウサギ抗サイトケラチンＡｂ（カリフォルニア州カーピンテリアのダコ）を用いて上皮細胞決定基の同時発現を評価した。結合したｍＡｂをＦＩＴＣ標識ヒツジ抗ラットＩｇ（Ｓｉｌｅｎｕｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）と反応させ、抗サイトケラチンをＴＲＩＴＣ標識ヤギ抗ウサギＩｇ（Ｓｉｌｅｎｕｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）と反応させた。
【０１００】
ＢｒｄＵ検出では、切片を抗サイトケラチンに続いて抗ウサギＴＲＩＴＣで染色するか、あるいは特定のｍＡｂで染色し、これを抗ラットＩｇ−Ｃγ３（アマシャム）と反応させた。続いて、従来すでに説明されている（Ｐｅｎｉｔら、１９９６）ようにしてＢｒｄＵ検出を行った。簡単に説明すると、７０％エタノール中にて３０分間切片を固定した。半乾燥させた切片を４ＭのＨＣｌ中にてインキュベートし、ホウ酸緩衝液（シグマ）中で洗浄して中和し、続いてＰＢＳ中で２回洗浄した。抗ＢｒｄＵ−ＦＩＴＣ（ベクトン・ディッキンソン）を用いてＢｒｄＵを検出した。
【０１０１】
３色免疫蛍光法では、抗サイトケラチンと一緒に特定のＭＴＳ  ｍＡｂで切片を標識した。次に、上述したようにしてＢｒｄＵ検出を実施した。
【０１０２】
レイカの蛍光顕微鏡とニコンの共焦点顕微鏡とを用いて切片を分析した。
【０１０３】
移行についての検討
キシラジン（ロンプン；オーストラリアのニューサウスウェールズ州ボタニーのバイエルオーストラリアリミテッド）０．３ｍｇと塩酸ケタミン（ケタラール；オーストラリアのニューサウスウェールズ州Ｃａｒｉｎｇｂａｈのパークデービス）１．５ｍｇとを生理食塩水に入れた溶液０．３ｍｌを腹腔内注射し、動物を麻酔した。
【０１０４】
胸腺細胞手法のＦＩＴＣ標識の詳細は他の資料に記載されているものと同様である（Ｓｃｏｌｌａｙら、１９８０；Ｂｅｒｚｉｎｓら、１９９８）。簡単に説明すると、胸腺の葉を露出させ、各葉に３５０μｇ／ｍｌＦＩＴＣ（ＰＢＳ中）約１０μｍを注射した。創傷を外科用ステープルで縫合し、完全に麻酔からさめるまでマウスを温めた。注射の約２４時間後にＣＯ２窒息によってマウスを屠殺し、リンパ系器官を分析用に摘出した。
【０１０５】
細胞数を計数した後、抗ＣＤ４−ＰＥおよび抗ＣＤ８−ＡＰＣで試料を染色し、続いてフローサイトメトリーで分析した。（自己蛍光細胞および重複物（ｄｏｕｂｌｅｔｓ）を排除するために）移行細胞をＣＤ４またはＣＤ８のいずれかを発現しているｌｉｖｅ−ｇａｔｅｄ  ＦＩＴＣ＋細胞として同定した。ＦＩＴＣ＋  ＣＤ４細胞およびＣＤ８細胞のパーセンテージを加え、リンパ節と脾臓のそれぞれについて総移行率を求めた。また、Ｂｅｒｚｉｎｓら（１９９８）に説明されているようにして１日あたりの輸出速度を算出した。
【０１０６】
対応のないスチューデントのｔ検定またはノンパラメトリックなＭａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ検定を用いて分析したデータを利用し、少なくとも３回重複して行った実験について対照と試験結果との間の統計的有意性を判定した。対照値とは有意に異なっている実験値を、＊ｐ≦０．０５、＊＊ｐ≦０．０１、＊＊＊ｐ≦０．００１として示す。
【０１０７】
結果
胸腺細胞集団に対して年月がおよぼす影響
（ｉ）胸腺の重量および胸腺細胞数
時が経過するにつれて胸腺の重量（図１Ａ）と胸腺細胞の総数（図１Ｂ）がいずれも極めて有意に（ｐ≦０．０００１）減少する。若い成体での相対胸腺重量（胸腺ｍｇ／体重ｇ）は平均値で３．３４であり、これが１８〜２４月齢で０．６６まで減少する（脂肪が蓄積するため正確な計算には限度がある）。胸腺の重量が減少するのは胸腺細胞の総数が減少することによる可能性がある。１〜２月齢では胸腺の胸腺細胞数は〜６．７×１０７個であり、これが２４月齢までに細胞数〜４．５×１０６個まで減少する。性腺を摘除して胸腺に対する性ステロイドの影響を排除すると、再生が起こり、性腺摘除後４週間が経過するまでに胸腺は重量と細胞充実性のいずれも若い成体の場合と等しくなる（図１Ａおよび図１Ｂ）。興味深いことに、性腺摘除後２週間で胸腺細胞数は有意に（ｐ≦０．００１）増加（〜１．２×１０８）し、これが性腺摘除後４週間が経過するまでに正常な若い成体のレベルまで回復する（図１Ｂ）。
【０１０８】
胸腺で生成されるＴ細胞数が減少してもこれが末梢に反映されることはなく、末梢では時が経過しても脾臓細胞数は一定のままである（図２Ａ）。時が経過して末梢に到達するＴ細胞数が減少しても脾臓とリンパ節でのＢ細胞とＴ細胞との比には何ら影響がない（図２Ｂ）ため、末梢に恒常性の機序が働いていることは明らかであった。しかしながら、ＣＤ４＋Ｔ細胞とＣＤ８＋Ｔ細胞との比は時の経過に伴って２月齢の２：１から２年の時点での比１：１（図２Ｃ）まで有意に減少（ｐ≦０．００１）した。性腺摘除後に末梢に到達するＴ細胞数が増えても末梢のＴ細胞数には何ら変化は観察されなかった。性腺摘除後、脾臓のＴ細胞数は変化せず、Ｂ細胞：Ｔ細胞の比も脾臓とリンパ節のいずれにおいても変化しなかった（図２Ａおよび図２Ｂ）。性腺摘除後２週間が経過した時点で末梢のＣＤ４：ＣＤ８比の経時的な減少は依然として顕著であったが、これは性腺摘除後４週間が経過するまでに完全に反転した（図２Ｃ）。
【０１０９】
（ｉｉ）αβＴＣＲ、γδＴＣＲ、ＣＤ４およびＣＤ８の発現
時の経過に伴って見られる胸腺細胞数の減少が特定の細胞集団が枯渇した結果として生じたものであるか否かを判定するために、特徴のあるマーカーで胸腺細胞を標識して別々の部分母集団を分析できるようにした。また、これによって性腺摘除後の胸腺再増殖の動力学を分析できるようになった。主な胸腺細胞部分母集団の割合を正常な若い胸腺の割合と比較した（図３）ところ、時が経過しても均一のままであることが明らかになった。また、αβＴＣＲおよびγδＴＣＲの発現によって胸腺細胞がさらに分割されてもこれらの集団の割合には経時的に何ら変化がないことが明らかになった（データ図示せず）。性腺摘除後２週間および４週間の時点で、胸腺細胞の部分母集団は同じ割合のままであり、胸腺細胞数が性腺摘除後に最大１００倍まで増加するため、すべての胸腺細胞サブセットが徐々に増えるのではなく同期的に増えることが分かる。
【０１１０】
したがって、高齢動物の胸腺で細胞数の減少が認められるのは、Ｔ細胞集団に有意な変化が検出されることなくあらゆる細胞表現型がバランスよく減少した結果であるように思われる。胸腺の再生は、すべてのＴ細胞部分母集団を逐次的ではなく同時に補充しながら同期的に行われる。
【０１１１】
胸腺細胞の増殖
図４に示されるように、４〜６週齢で胸腺細胞の１５〜２０％が増殖している。このうちの大半（〜８０％）はＤＰであり、ＴＮサブセットが〜６％（図５Ａ）で二番目に大きい集団を構成している。したがって、免疫組織学的には大半の分裂が被膜下および皮質に見られる（データ図示せず）。髄領域にも若干の分裂が見られ、ＦＡＣＳ分析によって分裂しているＳＰ細胞の割合（ＣＤ４Ｔ細胞９％とＣＤ８Ｔ細胞２５％）が明らかになっている（図５Ｂ）。
【０１１２】
老化胸腺では細胞数が有意に減少するが、胸腺細胞の増殖は一定のままであり、２年で１２〜１５％まで減少（図４）し、増殖中の集団の表現型は２ヶ月の胸腺（図５Ａ）に似ている。１歳での分裂が若い成体に見られる分裂を反映していることが免疫組織学的に明らかになったが、２年の時点では、増殖は主に外皮質で見られ、脈管系を囲んでいる（データ図示せず）。性腺摘除後２週間の時点で、胸腺細胞数は有意に増加するが、増殖している胸腺細胞の割合には変化がないことから、ここでも細胞が同期増殖していることが分かる（図４）。性腺摘除後２週間が経過するまでに、胸腺細胞増殖の局在位置と分裂している細胞が２月齢の胸腺の状況を真似る度合いとが免疫組織学的に明らかになった（データ図示せず）。増殖中の集団を示す各部分母集団の割合を分析すると、増殖中の集団に含まれるＣＤ８Ｔ細胞のパーセンテージに有意な（ｐ＜０．００１）増加が認められた（２月齢および２歳で１％、性腺摘除後２週間で〜６％まで増加）（図５Ａ）。
【０１１３】
図５Ｂは、若いマウス、高齢マウス、性腺摘除を行ったマウスの各サブセットでの増殖の度合いを示している。ＤＮサブセットでは増殖の有意な（ｐ≦０．００１）崩壊がある（２ヶ月の時点で３５％であったものが２年までに４％へ）。ＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖も有意に（ｐ≦０．００１）減少し、老化胸腺の髄では分裂の痕跡が認められないという免疫組織学による所見（データ図示せず）が反映されていた。性腺摘除後４週間が経過するまでにＤＮ増殖の減少が正常な若いレベルに戻ることはない。しかしながら、ＣＤ８＋Ｔ細胞サブセットでの増殖は性腺摘除後２週間の時点で有意に（ｐ≦０．００１）増加し、性腺摘除後４週間の時点で正常な若いレベルに戻っている。
【０１１４】
ＤＮサブセットでの増殖の減少について、マーカーＣＤ４４およびＣＤ２５を用いてさらに分析した。胸腺細胞の前駆細胞だけでなくＤＮ部分母集団にもαβＴＣＲ＋ＣＤ４−ＣＤ８胸腺細胞が含まれており、これがＳＰ細胞への遷移時に両方のコレセプターを下方制御していたと思われる（ＧｏｄｆｒｅｙおよびＺｌｏｔｎｉｋ、１９９３）。これらの成熟細胞を選び出すことで、真のＴＮコンパートメント（ＣＤ３−ＣＤ４−ＣＤ８−）を分析することができ、この分析によって時の経過に伴う増殖率または性腺摘除後における増殖率に何ら違いはないことが分かった（図５Ｃ）。しかしながら、ＣＤ４４およびＣＤ２５を発現している部分母集団を分析したところ、ＴＮ１サブセット（ＣＤ４４＋ＣＤ２５−）の増殖に正常な若い頃の２０％から１８月齢の時点での約６％への有意な（ｐ＜０．００１）減少が認められ（図５Ｄ）、これが性腺摘除後４週間が経過するまでに回復した。ＴＮ１サブセットで増殖が減少した分だけＴＮ２部分母集団（ＣＤ４４＋ＣＤ２５＋）では増殖が有意に（ｐ≦０．００１）増えたが、これも性腺摘除後２週間が経過するまでに正常な若いレベルに戻った（図５Ｄ）。
【０１１５】
胸腺の微小環境に対して年月がおよぼす影響
ポリクローナル抗サイトケラチンＡｂで二重標識した、ＭＴＳシリーズからのＭＡｂの包括的なパネルを用いる免疫蛍光法によって、時の経過に伴う胸腺の微小環境の変化について検討した。
【０１１６】
これらのＭＡｂによって認識される抗原については、胸腺の上皮サブセット、脈管関連（ｖａｓｃｕｌａｒ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ）抗原、支質細胞と胸腺細胞の両方に存在するものという３つのグループに細分化することができる。
【０１１７】
（ｉ）上皮細胞抗原
２年齢のマウス胸腺を抗ケラチン染色（ｐａｎ−上皮）したところ、上皮細胞の重篤な組織破壊が認められると共にはっきりと識別できる皮髄境界領域が欠如し、通常の胸腺アーキテクチャが失われていることが明らかになった。ＭＡｂ、ＭＴＳ  １０（髄）、ＭＴＳ  ４４（皮質）を用いてさらに分析を行ったところ、皮質のサイズが時の経過に伴って明らかに減少し、髄上皮にはそれほど大きな減少が見られない（データ図示せず）ことが分かった。上皮細胞のない領域またはケラチンネガティブエリア（ＫＮＡ、ｖａｎ Ｅｗｉｊｋら、１９８０；Ｇｏｄｆｒｅｙら、１９９０；Ｂｒｕｉｊｎｔｊｅｓら、１９９３）．）が一層はっきりとしており、抗サイトケラチン標識で明らかなように老化胸腺のサイズが大きくなった。また、老化胸腺の見た目には胸腺上皮の「嚢胞状」構造があり、これは髄領域で特に顕著（データ図示せず）である。抗サイトケラチン染色によって、脂肪蓄積、胸腺サイズの激しい減少、皮髄境界領域の完全性の低下が疑う余地なく明らかに認められる（データ図示せず）。胸腺は性腺摘除後２週間が経過するまでに再生しはじめる。これは、胸腺の葉のサイズ、ＭＴＳ  ４４によって明らかになる皮質上皮の増加、髄上皮の局在において明白である。髄上皮はＭＴＳ  １０によって検出され、２週間の時点で皮質全体に散在したＭＴＳ  １０で染色された上皮のサブポケットが依然として残っている。性腺摘除後４週間が経過するまでに、明確な髄および皮質があり、識別できる皮髄境界領域がある（データ図示せず）。
【０１１８】
ＭＴＳ  ２０マーカーおよび２４マーカーで原始上皮細胞を検出（Ｇｏｄｆｒｅｙら、１９９０）し、老化胸腺の退化をさらに示すことができるのではないかと思われる。いずれもＥ１４に豊富に存在し、単離された髄上皮細胞クラスターを４〜６週間で検出するが、老化胸腺の強度を再度高める（データ図示せず）。性腺摘除後、これらの抗原はいずれも若い成体の胸腺でのレベルと同じレベルで発現され（データ図示せず）、ＭＴＳ  ２０およびＭＴＳ  ２４が皮髄境界領域に位置する上皮の不連続なサブポケットに逆戻りしている。
【０１１９】
（ｉｉ）脈管関連抗原
Ｔ細胞前駆細胞の胸腺への移行と成熟Ｔ細胞の胸腺から末梢への移出を血液胸腺障壁（ｂｌｏｏｄ−ｔｈｙｍｕｓ ｂａｒｒｉｅｒ）が担っているのではないかと考えられる。
【０１２０】
ＭＡｂ  ＭＴＳ  １５は胸腺の血管内皮に特異的であり、粒状の拡散染色パターン（Ｇｏｄｆｒｅｙら、１９９０）が得られる。老化胸腺では、ＭＴＳ  １５の発現量が大幅に増え、脈拍数と血管・末梢脈管系スペースのサイズの増大を反映している（データ図示せず）。
【０１２１】
コラーゲン、ラミニン、フィブリノゲンなどの重要な構造・細胞接着分子を含む胸腺の細胞外マトリックスをｍＡｂ  ＭＴＳ  １６によって検出する。正常な若い胸腺全体に散在させると、ＭＴＳ  １６の発現の性質が老化胸腺で一層広範囲かつ相関性のあるものになる。ＭＴＳ  １６の発現は性腺摘除の２週間後にさらに亢進されるが、性腺摘除の４週間後には発現は２月齢の胸腺で見られる状況を表している（データ図示せず）。
【０１２２】
（ｉｉｉ）共有抗原
ＭＡｂ  ＭＴＳ  ６によって検出される、正常な若い胸腺でのＭＨＣ  ＩＩの発現は、皮質上皮で強い陽性（粒状）であり（Ｇｏｄｆｒｅｙら、１９９０）、髄上皮では染色が弱い。老化胸腺ではＭＨＣ  ＩＩの発現の減少が認められ、性腺摘除後２週間の時点で発現が実質的に増加する。性腺摘除後４週間が経過するまでに発現は再度減少し、２月齢の胸腺に類似して見える（データ図示せず）。
【０１２３】
胸腺細胞の移出
幼齢マウスではＴ細胞の約１％が毎日胸腺から移行する（Ｓｃｏｌｌａｙら、１９８０）。本願発明者らは、数は有意に（ｐ≦０．０００１）減少したが、１４月齢、さらには２年齢ですら、正常な幼齢マウスに匹敵する比例率で移行が起こっている（図５）ことを見出した。後から胸腺を出てきた細胞のＣＤ４：ＣＤ８比は２ヶ月の時点での〜３：１から２６ヶ月の時点での〜７：１に増大した。性腺摘除後１週間が経過するまでに、末梢に移出している細胞の数は実質的に増加し、全体としての移行率は１〜１．５％のままであった。
【０１２４】
具体例
（例１：Ｔ細胞の枯渇）
異常なＴ細胞を除去するために、患者のＴ細胞を枯渇させた。このステップの標準的な方法のひとつに、以下のような方法がある。Ａｔｇａｍ（外来抗Ｔ細胞グロブリン、ファルマシア・アップジョン）１５ｍｇ／ｋｇを毎日注射する形で抗Ｔ細胞抗体を１０日間の期間にわたってＴ細胞活性化のインヒビターであるシクロスポリンＡ  ３ｍｇ／ｋｇと併用して３〜４週間の連続輸注でヒトの患者に与え、続いて必要に応じて毎日９ｍｇ／ｋｇの錠剤を与えた。患者の胸腺におけるＴ細胞の初期発達にこの処置が影響することはなかった。これは、ヒトの胸腺のサイズと構成ではこのような影響を持つのに必要な量の抗体を送達することができないためである。この処置を約４〜６週間続け、性ステロイドをなくして胸腺を再構築できるようにした。Ｔ細胞再活性の予防とインターロイキンまたは細胞接着分子などのセカンドレベルシグナルのインヒビターとを併用し、Ｔ細胞のアブレーションを亢進してもよい。
【０１２５】
多くの場合、疾患を引き起こす抗原特異性のＴ細胞だけを減らすことは不可能であるため、病的なものを含むＴ細胞の集団全体を枯渇させる。このように末梢のＴ細胞を枯渇させると、疾患が著しく抑制される。しかしながら、同時に、Ｔ細胞が不足しているため、患者が極めて感染症にかかりやすい状態にあり、特にウイルス感染しやすい状態にあることを意味する、全身性免疫不全の状態が惹起される。適切なＴ細胞の助けがないと、Ｂ細胞の応答ですら正常に機能しなくなる。
【０１２６】
（例２：性ステロイドアブレーション療法）
ＬＨＲＨアゴニストを送達する形で患者に性ステロイドアブレーション療法を施した。これについては、Ｌｅｕｃｒｉｎ（デポ注射；２２．５ｍｇ）またはゾラデックス（インプラント；１０．８ｍｇ）のいずれかの形で、どちらも３ヶ月効果のある単回用量で与えた。この方法は、胸腺を再活性化できる程度まで性ステロイドレベルを低下させる上で有効であった。場合によっては、性ステロイドアブレーション療法を行っている間、性ステロイドの副腎での産生を抑える、Ｃｏｓｕｄｅｘ（５ｍｇ／日）などのサプレッサも１日１錠の量で送達する必要がある。副腎で産生される性ステロイドはヒトのステロイドの１０〜１５％前後を占めている。
【０１２７】
血液中の性ステロイドを最低値まで減少させるには約１〜３週間を要した。これと一致していたのは、胸腺の再活性化であった。場合によっては、さらに３ヶ月間にわたる注射／インプラントまで処置を延長する必要がある。
【０１２８】
（例３：別の送達方法）
ＬＨＲＨアゴニストを３ヶ月間デポまたはインプラント投与する代わりに、別の方法を用いてもよい。一例として、Ｅｒ：ＹＡＧレーザなどのレーザを患者の皮膚に照射し、表皮細胞の妨害作用が低減するように皮膚を焼灼または変質させることができる。
【０１２９】
Ａ．レーザアブレーションまたは変質：２枚の平らな共振器ミラーと、活性媒質としてのＥｒ：ＹＡＧ結晶と、電源と、レーザ光線の焦点を合わせるための手段とで構成される固体パルスＥｒ：ＹＡＧレーザを用いて、赤外線レーザ光パルスを形成した。レーザ光線の波長は２．９４ミクロンとした。シングルパルスを用いた。
【０１３０】
動作パラメータについては以下のとおりとした。１パルスあたりのエネルギを４０、８０または１２０ｍＪ、焦点での光線サイズを２ｍｍとし、１．２７、２．５５または３．８２Ｊ／ｃｍ２のエネルギフルエンスを得た。パルス時間幅を３００μｓとして、エネルギフルエンス率０．４２、０．８５または１．２７×１０４Ｗ／ｃｍ２を得た。
【０１３１】
続いて、一定量のＬＨＲＨアゴニストを皮膚に適用し、放射線照射部位に塗り拡げた。ＬＨＲＨアゴニストを放射線照射部位に保持できるようにこれを軟膏の形にしてもよい。任意に、アゴニストを閉塞パッチし、放射線照射部位上の適所にこれを保持するようにしてもよい。
【０１３２】
任意に、光線スプリッタを用いてレーザ光線を分岐させ、複数のアブレーションまたは変質部位を得るようにしてもよい。このようにすることで、皮膚をとおしてＬＨＲＨアゴニストを一層短時間で血流まで流動させることができる。部位数をあらかじめ決定し、所望の期間のあいだ患者の系内にアゴニストを維持できるようにすればよい。
【０１３３】
Ｂ．圧力波：一定用量のＬＨＲＨアゴニストをプラスチック製の可撓性ワッシャ（直径約１インチ、厚さ約１／１６インチ）などの適当な容器に入れ、圧力波を作り出す予定の部位の皮膚にのせる。次に、この部位を厚さ約１ｍｍの黒いポリスチレンシートなどの標的材料で被覆する。Ｑスイッチ式固体ルビーレーザ（パルス持続時間は２０ｎｓであり、１パルスあたり最大２ジュールを生成可能）を用いてレーザ光線を生成し、これを標的材料に衝突させて１回の神経衝撃トランジェントを発生させる。黒いポリスチレンの標的はレーザ光を完全に吸収するため、皮膚はレーザ光に曝露されずに神経衝撃トランジェントにのみ曝露されることになる。このやり方では痛みは発生しない。アゴニストの循環血液濃度を維持すべく、上記の手順を毎日繰返してもよいし、必要に応じて行うようにしてもよい。
【０１３４】
（例４：試料の収集）
選択した患者について、性ステロイドの産生を抑制すべくＬＨＲＨ類縁体を与える前に、ＬＨＲＨ類縁体の適用後短い間隔で（一般に最初の２４〜７２時間のあいだ）すみやかに血液を採取した。血液を遠心分離（７５０ｇａｖ）し、Ｔ細胞を沈殿させ、血漿を回収した。この血漿試料の特定の胸腺マーカー分子濃度を分析し、試料を比較した。
【０１３５】
（例５：末梢全血のフローサイトメトリー分析）
適当な抗体カクテル２０μｌを全血２００μｌに加え、暗所でＲＴにて３０分間インキュベートした。ＲＢＣを除去するために、各チューブにＦＡＣＳ溶解緩衝液（米国、ベクトン・ディッキンソン）２ｍｌを加え、暗所でＲＴにて１０分間ボルテックスおよびインキュベートした。試料を６００ｇｍａｘで遠心分離し、上清を取り除き、細胞をＦＡＣＳ緩衝液中で２回洗浄した。最後に、ＦＡＣＳ分析用に細胞を１％ＰＦＡに再懸濁させた。
【０１３６】
（例６：Ｋｉ６７分析）
増殖している細胞を検出するために、１×ＦＡＣＳ浸透化溶液（米国、ベクトン・ディッキンソン）５００μｌ中にて、溶解試料を暗所でＲＴにて２０分間インキュベートした。洗浄後の試料を抗Ｋｉ６７−ＰＥまたは抗Ｋｉ６７−ＦＩＴＣ（あるいはアイソタイプの適当な対照）と一緒に暗所でＲＴにて３０分間インキュベートした。次に、試料を洗浄し、分析用に１％ＰＦＡに再懸濁させた。
【０１３７】
抗体カクテル：
１．ＣＤ２７／ＣＤ４５ＲＡ／ＣＤ４５ＲＯ／ＣＤ４またはＣＤ８
２．ＣＤ６２Ｌ／ＣＤ４５ＲＡ／ＣＤ４５ＲＯ／ＣＤ４またはＣＤ８
３．γδＴＣＲ／αβＴＣＲ／ＣＤ２８／ＣＤ４またはＣＤ８
４．ＣＤ６９／ＣＤ２５／ＣＤ１５２／ＣＤ３
５．ＣＤｌｌｂ／ＣＤｌｌｃ／ＣＤ５６／ＣＤ３
６．ＣＤ１９／ＣＤ１１７／ＣＤ３４／ＣＤ３
７．ＣＤ３／ＣＤ４／ＣＤ８／ＨＬＡ−ＤＲ
８．Ｋｉ６７については、
ａ）ＣＤ４またはＣＤ８／ＣＤ４５ＲＯ／ＣＤ２７に続いてＫｉ６７−ＰＥまたはＩｇＧｌ−ＰＥ
ｂ）αβＴＣＲ／ＣＤ８ａ／ＣＤ８ｂに続いてＫｉ６７−ＦＩＴＣまたはＩｇＧｌ−ＰＥ
【０１３８】
（例７：細胞内サイトカインの検出）
可溶性の精製抗ＣＤ３（５μｇ／ｍｌ）および抗ＣＤ２８（１０μｇ／ｍｌ）を用いて、３７℃にて６時間、５％ＣＯ２で、全血２００μｌを刺激した。最後の４時間のあいだにブレフェルジンＡ（最終濃度１０μｇ／ｍｌ）を加え、活性化された細胞からのサイトカインの分泌を制限した。刺激後、２０ｍＭのＥＤＴＡをＰＢＳに加えた溶液２０μｌと一緒に試料をＲＴにて１５分間インキュベートした。次に、試料を抗ＣＤ４−ＦＩＴＣおよび抗ＣＤ８−ＣｙＣｈｒｏｍｅで表面染色した。溶解および浸透化後、抗ＩＬ−４−ＰＥおよび抗ＩＦＮγ−ＡＰＣまたはアイソタイプの適当な対照で細胞を染色した。刺激していない細胞を活性化についての対照として用いた。
【０１３９】
（例８：ＰＢＭＣの調製）
Ｔ細胞刺激アッセイおよびＴＲＥＣ分析に精製リンパ球を用いた。末梢血１０〜５０ｍｌをＲＰＭＩ−ヘパリンで１：１に希釈した。血液：フィコール比２：１でフィコール−ハイパックの上に希釈血液を慎重に重ねた。チューブを（８００ｇｍａｘ）でＲＴにて２５分間遠心機にかけた。遠心分離後、血漿層を取り出して性ステロイド濃度の分析用に−２０℃で保管した。バッフィーコート層を取り出し、ＲＰＭＩ−ヘパリンで希釈した。チューブを（６００ｇｍａｘ）にて２５℃で１５分間遠心機にかけ、続いて４００ｇｍａｘでさらに１０分間もう一度洗浄した。上清を取り出し、血球計算器を用いて細胞数の計数を二回重複して行った。刺激アッセイに使用しなかった細胞を寒剤中に再懸濁させ、−７０℃で一晩保管した後、ＴＲＥＣ分析の前に液体窒素に移した。性ステロイドの濃度を分析するのに先だって、フィコール精製後に回収された血漿を−２０℃で保管した。
【０１４０】
（例９：Ｔリンパ球刺激アッセイ）
マイトジェン刺激のために、ＰＲＭＩ−ＦＣＳ  １００μｌ中１×１０５／ウェルの濃度で９６穴の丸底プレートにＰＢＭＣを蒔いた。１〜１０μｇ／ｍｌの用量でＰＨＡを用いて、３７℃、５％ＣＯ２で細胞をインキュベートした。ＴＣＲ特異的な刺激については、あらかじめ精製抗ＣＤ３（１〜１０μｇ／ｍｌ）および抗ＣＤ２８（１０μｇ／ｍｌ）をコーティングしておいたプレート上で４８時間細胞をインキュベートした。プラーク形成後（４８〜７２時間）、それぞれのウェルに３Ｈ−チミジン１μＣｉを加え、さらに１６〜２４時間プレートをインキュベートした。プレートをフィルタマット上に回収し、β−カウンタ（米国パッカード・コールター）での液体シンチレーションを使って３Ｈ−チミジンの取り込み量を判定した。
【０１４１】
（例１０：ＴＲＥＣ分析）
フローサイトメトリーで新たなヘルパーＴ細胞（Ｔｈ；ＣＤ４＋、ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ２７＋など）と細胞障害性Ｔ細胞（Ｔｃ；ＣＤ８＋、ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ２７＋など）とを精製することによってＴＲＥＣを検出し、続いて特定のＤＮＡプローブおよびＲＴ−ＰＣＲを用いてＴＲＥＣ分析を行う。
【０１４２】
Ａ．細胞のソート
凍結試料をすみやかに解凍し、１ｍＭのＥＤＴＡと１％ヒト血清とを含有するＦＡＣＳ緩衝液中で洗浄し、遠心分離（６００ｇｍａｘ、５分間、４℃）した。抗ＣＤ４−ＦＩＴＣ、抗ＣＤ３−ＡＰＣおよび抗ＣＤ４５ＲＡ−ＰＥを用いて、ＲＴにて３０分間細胞をインキュベートし、洗浄し、３％ホルマリンのＰＢＳ溶液１ｍｌを滴下することによって固定した。試料をさらに３０分間インキュベートし、洗浄し、ソート用に５００μｌのＦＡＣＳ緩衝液中に再懸濁させた。このようにして、ＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＡ＋、ＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＡ−、ＣＤ３＋ＣＤ４−ＣＤ４５ＲＡ＋、ＣＤ３＋ＣＤ４−ＣＤ４５ＲＡ−という４つの集団を得た。
【０１４３】
Ｂ．ＤＮＡの単離
ＰＣＲグレードのエッペンドルフ０．５ｍｌに細胞を直接ソートし、遠心分離（８分、２５００ｇｍａｘ）し、プロテイナーゼＫ（ＰＫ）消化緩衝液（細胞２×１０５個／０．８ｍｇ／ｍＬの溶液２０μｌ）中に再懸濁させた。プロテイナーゼＫ（ＰＫ）については使用する直前にＰＣＲ消化緩衝液に加えた。５６℃で１時間試料をインキュベートし、続いて９５℃で１０分間インキュベートしてプロテイナーゼを不活性化させた。ＲＴ−ＰＣＲに先だって、溶解試料を−７０℃で保管した。
【０１４４】
Ｃ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｅａｃｏｎｓを用いたリアルタイム−ＰＣＲ
この手法は、Ｚｈａｎｇら、１９９９に説明されている。シグナル結合ＴＲＥＣのプライマーを５’−ＡＡＡＧＡＧＧＧＣＡＧＣＣＣＴＣＴＣＣＡＡＧＧＣＡＡＡ−３’（配列番号１）および５’−ＡＧＧＣＴＧＡＴＣＴＴＧＴＣＴＧＡＣＡＴＴＴＧＣＴＣＣＧ−３’（配列番号２）とした。コーディング結合ＴＲＥＣのプライマーを５’−ＣＣＴＧＴＴＴＧＴＴＡＧＧＧＣＡＣＡＴＴＡＧＡＡＴＣＴＣＴＣＡＣＴＧ−３’（配列番号３）および５’−ＣＴＡＡＴＡＡＴＡＡＧＡＴＣＣＴＣＡＡＧＧＧＴＣＧＡＧＡＣＴＧＴＣ−３’（配列番号４）とした。プロテイナーゼＫ消化を利用して細胞からＤＮＡを抽出した。ＰＣＲ条件は以下のとおりとした。９５℃で５分間、続いて９０℃、６０℃および７２℃でそれぞれ３０秒を表記のとおり３０サイクルまたは３５サイクル。各ＰＣＲ反応には、５０μｌプラチナＴａｑ緩衝液中に、１ＵのプラチナＴａｑポリメラーゼ、ＭｇＣｌ２  １．８ｍＭ、ｄＮＴＰ  ０．２ｍＭ、各プライマー１２．５μＭ、３２Ｐ標識ｄＣＴＰ  １．７ｎｍｏｌ（５μＣｉ）を含むようにした。
【０１４５】
実施例１１：ラジオイムノアッセイ
１２５Ｉ−テストステロンラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）を用いて患者の性ステロイド血清（フィコール−Ｐａｑｕｅ遠心分離後に凍結）濃度を検出した。アッセイの前に、試薬、試料および対照をすべて室温にしておいた。対照のチューブは、緩衝液のみ、非特異的結合（ＮＳＢ）チューブ、０ｎｇ／ｍｌのテストステロン標準（Ｂ０）のいずれかとした。各チューブに緩衝液のみの標準（０〜１０ｎｇ／ｍｌのテストステロン）または被検試料を加え、続いて放射線標識したテストステロンの非特異的結合を制限するために性結合グロブリンインヒビター（ＳＢＧＩ）を加えた。各チューブに１２５Ｉ−テストステロンを加え、続いて抗テストステロン抗体を加えた（ＮＳＢチューブ以外）。次に、３７℃で２時間チューブをインキュベートした。続いてすべてのチューブに二次抗体を加え、ボルテックス後にさらに６０分間インキュベートした。チューブを１５分間遠心機にかけ（１０００ｇｍａｘ）、上清を取り出し、パッカードコブラオート−γカウンタで沈殿物を計数した。３回分の結果（単位はｃｐｍ）を平均し、テストステロン結合比率（Ｂ／Ｂ０）を求める式を用いて標準曲線を作成した。
【０１４６】
【数１】
2004523730.tif 000002
【０１４７】
上記の標準曲線から各被検試料のテストステロンレベルを求めた。２Ｄゲル電気泳動を利用して血漿のタンパク質分析を行い、続いてコンピュータベースのバイオインフォマティクスを行って、胸腺機能のインジケータの有無を判定した。
【図面の簡単な説明】
【図１】
Ａ及びＢは性腺摘除前後の胸腺細胞数の変化を示す図である。胸腺が萎縮した結果、時の経過に伴って胸腺細胞数が有意に減少する。細胞数は性腺摘除後２週間が経過するまでに若い成体のレベルまで増加した。性腺摘除後３週間が経過するまでに細胞数は若い成体の値から有意に増加し、性腺摘除後４週間が経過するまでに安定している。＊＊＊＝若い成体（２ヶ月）の胸腺とは有意に異なっている。ｐ＜０．００１。
【図２】
Ａ，Ｂ，及びＣにおいて、（Ａ）脾臓の数値は時が経過したり性腺を摘除したりしても一定のまま維持される。末梢のＢ：Ｔ細胞比も一定のままである（Ｂ）が、ＣＤ４：ＣＤ８比は時の経過に伴って有意に（ｐ＜０．００１）小さくなり、性腺摘除後４週間が経過するまでに正常な若い成体のレベルまで回復する。
【図３】
ＣＤ４対ＣＤ８胸腺細胞個体群の蛍光標示式細胞分取器（ＦＡＣＳ）の経時および性腺摘除後のプロファイルを示す図である。それぞれのプロットの上に各象限のパーセンテージを示してある。胸腺細胞の部分母集団は時が経過しても一定のままであり、性腺摘除後に胸腺細胞が同期的に増加する。
【図４】
ＢｒｄＵパルスを取り込ませて検出した場合の胸腺細胞の増殖を示す図である。増殖中の胸腺細胞の割合は時が経過したり性腺を摘除したりしても一定のままである。
【図５】
Ａ，Ｂ，Ｃ，及びＤは齢と性腺摘除とが胸腺細胞サブセットの増殖に対してどのような影響をおよぼすかを示す図である。（Ａ）増殖中の個体群全体を構成する各サブセットの割合――増殖中の個体群のうちＣＤ８＋Ｔ細胞の割合が有意に増加している。（Ｂ）増殖している各部分母集団のパーセンテージ――ＴＮサブセットとＣＤ８サブセットは２ヶ月目よりも２年の時点での増殖が有意に少ない。性腺摘除後２週間の時点で、ＴＮ個体群は若い頃の正常な増殖レベルに戻ったがＣＤ８個体群では増殖の有意な増加が認められる。このレベルは性腺摘除後４週間までに若い頃の正常なレベルと等しくなる。（Ｃ）ＴＮの増殖量は時が経過したり性腺を摘除したりしても全体として一定のままである。しかしながら、（Ｄ）ＴＮ１部分母集団では増殖が経時的に有意に減少し、性腺摘除後４週間が経過するまでには正常なレベルに戻らない。＊＊＊＝極めて有意、ｐ＜０．００１、＊＊＝有意、ｐ＜０．０１。
【図６】
マウスにＦＩＴＣを胸腺内注射した。２４時間後に末梢におけるＦＩＴＣ＋細胞の数を算出した。できたばかりの胸腺移行物（ＲＴＥ）の割合は一貫して胸腺細胞数年齢（ｔｈｙｍｕｓ ｃｅｌｌ ｎｕｍｂｅｒ ａｇｅ）の約１％に保たれて性腺摘除後２週間で有意に減少したが、ＲＴＥ細胞数は時の経過に伴って有意に（ｐ＜０．０１）減少した。性腺摘除後、これらの値は増加しているが、性腺摘除後２週間の時点で依然として若いマウスの場合よりも有意に低かった。時の経過に伴ってＣＤ４＋とＣＤ８＋ＲＴＥとの比の有意な増大が認められたが、これは性腺摘除後１週間が経過するまでに正常になった。
【図７】
Ａ，Ｂ，及びＣは化学療法剤であるシクロホスファミドで処置した後の胸腺での細胞数の変化を示す図である。処置後１週間および２週間の時点で、非性腺摘除（シクロホスファミド単独）群と比較して性腺摘除を行った動物の方が胸腺で急激な増加が認められる点に注意されたい。また、シクロホスファミド単独の群よりも摘除群の脾臓およびリンパ節での数値がかなり増加した。細胞数は４週間が経過するまでに正常になる（処置群ごとにそれぞれの時点でｎ＝３〜４）。
【図８】
Ａ，Ｂ，及びＣは外科的な性腺摘除後１週間で放射線照射（６２５ラド）した後の胸腺での細胞数の変化を示す図である。処置後１週間および２週間の時点で、非性腺摘除（放射線照射単独）群と比較して性腺摘除を行った動物の方が胸腺で急激な増加が認められる点に注意されたい。（処置群ごとにそれぞれの時点でｎ＝３〜４）。
【図９】
Ａ，Ｂ，及びＣは放射線照射と性腺摘除とを同日に行った後の胸腺での細胞数の変化を示す図である。処置後２週間の時点で、非性腺摘除群と比較して性腺摘除を行った動物の方が胸腺で急激な増加が認められる点に注意されたい。しかしながら、観察された差異は処置の１週間前にマウスに性腺摘除を施した場合（図７）ほど顕著ではない。（処置群ごとにそれぞれの時点でｎ＝３〜４）。
【図１０】
化学療法剤であるシクロホスファミドと外科的な性腺摘除または化学的な性腺摘除とを同日に行う処置後の胸腺（Ａ）、脾臓（Ｂ）、リンパ節（Ｃ）での細胞数の変化を示す図である。処置後１週間および２週間の時点で、非性腺摘除（シクロホスファミド単独）群と比較して性腺摘除を行った動物の方が胸腺で急激な増加が認められる点に注意されたい。また、シクロホスファミド単独の群よりも摘除群の脾臓およびリンパ節での数値がかなり増加した。（処置群ごとにそれぞれの時点でｎ＝３〜４）。化学的な性腺摘除は、シクロホスファミド処置後の免疫系の再生という点では外科的な性腺摘除に匹敵する。
【図１１】
単純ヘルペスウイルス１型（ＨＳＶ−１）でのフットパッド免疫付与後のリンパ節の細胞充実性を示す図である。高齢の非性腺摘除群よりも高齢の性腺摘除後の方が細胞充実性が高くなった点に注意されたい。一番下のグラフは、ＣＤ２５対ＣＤ８細胞についてＦＡＣＳで選び出した活性化細胞の総数を示している。
【図１２】
ＨＳＶ−１接種後に活性化されたＬＮ（リンパ節）のＣＴＬ（細胞障害性Ｔ細胞）におけるＶβ１０の発現について示す図である。高齢マウスでクローン反応が減少し、予想した応答が性腺摘除後に元通りになる点に注意されたい。
【図１３】
ａ，ｂ，及びｃにおいて、性腺摘除によってＨＳＶ−１免疫付与に対する応答性が回復する。（ａ）高齢マウスでは、若いマウスおよび性腺摘除後のマウスと比較して感染後にリンパ節の細胞充実性全体の有意な減少が認められた。（ｂ）ＨＳＶ−１感染マウスのＬＮにおける活性化（ＣＤ８＋ＣＤ２５＋）細胞の代表的なＦＡＣＳプロファイルである。時が経過するにつれ、あるいは性腺摘除によって、活性化ＣＴＬの割合には何ら差異は認められなかった。（ｃ）高齢マウスのリンパ節での細胞充実性低下が活性化ＣＴＬ数の有意な減少という形で表れてきた。高齢マウスでは性腺摘除によってＨＳＶ−１に対する免疫応答が回復し、ＣＴＬ数は若いマウスの場合に匹敵していた。結果については８〜１２体のマウスの平均±１ＳＤで示す。＊＊＝若い（２月齢）マウスに対してｐ≦０．０１、＾＝高齢（非性腺摘除）マウスに対してｐ≦０．０１。
【図１４】
ＨＳＶ−１で免疫付与したマウスから膝窩リンパ節を取り出し、３日間培養した。バックグラウンドレベルの溶解（５１Ｃｒ放出量で判定）について免疫付与していないマウスを対照として用いてＣＴＬアッセイを実施した。結果を８体のマウスの平均として±１ＳＤで３組（ｉｎ  ｔｒｉｐｒｉｃａｔｅ）示す。高齢マウスではＥ：Ｔ比１０：１および３：１のどちらでもＣＴＬ活性の有意な（ｐ≦０．０１，＊）低減が認められたことから、リンパ節内に存在する特定のＣＴＬのパーセンテージが減少したことが分かる。高齢マウスでは、性腺摘除によってＣＴＬ応答が若い成体のレベルまで回復した。
【図１５】
ａ及びｂはＨＳＶ−１感染に対するＣＤ４＋Ｔ細胞の助けとＶβＴＣＲ応答とについての分析内容を示す図である。ＨＳＶ−１感染後にＤ５で膝窩リンパ節を取り出し、（ａ）ＣＤ２５、ＣＤ８および特定のＴＣＲＶβマーカーおよび（ｂ）ＣＤ４／ＣＤ８Ｔ細胞の発現をｅｘ−ｖｉｖｏにて分析した。（ａ）Ｖβ１０またはＶβ８．１を発現している活性化（ＣＤ２５＋）ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージを１群あたり８体のマウスの平均±１ＳＤとして示す。時が経過するにつれ、あるいは性腺摘除によって、何ら差異は認められなかった。（ｂ）休眠状態のＬＮ個体群では時が経過するにつれてＣＤ４／ＣＤ８比の減少が認められた。これは性腺摘除後に回復した。結果を１群あたり８体のマウスの平均±１ＳＤとして示す。＊＊＊＝若いマウスおよび性腺摘除マウスに対してｐ≦０．００１。
【図１６】
Ｌｙ５近交系マウスの骨髄移植後の胸腺（Ａ）、脾臓（Ｂ）、リンパ節（Ｃ）、骨髄（Ｄ）での細胞数の変化を夫々示す図である。処置後のすべての時点で、非性腺摘除群と比較して性腺摘除を行った動物の方が胸腺で急激な増加が認められる点に注意されたい。また、シクロホスファミド単独の群よりも摘除群の方が脾臓およびリンパ節での数値がかなり増加した（処置群ごとにそれぞれの時点でｎ＝３〜４）。性腺摘除を行ったマウスでは、非性腺摘除動物の場合（データ図示せず）よりも近交系の（Ｌｙ５．２）細胞が有意に増加した。
【図１７】
Ａ及びＢは胎仔肝臓再構築後に性腺摘除を行ったマウスと性腺摘除を行っていないマウスの胸腺細胞数の変化を示す図である。（各被験群についてｎ＝３〜４）。（Ａ）２週間の時点で、性腺摘除を行ったマウスの胸腺細胞数は正常なレベルであり、性腺摘除を行っていないマウスの場合よりも有意に（＊ｐ≦０．０５）高かった。４週間後に性腺摘除を行ったマウスで胸腺の肥大が観察された。性腺摘除を行っていない方の細胞数は対照レベル未満のままである。（Ｂ）ＣＤ４５．２＋細胞――ＣＤ４５．２＋はドナー由来を示すマーカーである。再構築の２週間後、性腺摘除を行ったマウスと性腺摘除を行っていないマウスの両方にドナー由来の細胞が存在した。処置の４週間後、性腺摘除を行った方の胸腺細胞の約８５％がドナー由来であった。性腺摘除を行っていない方の胸腺にはドナー由来の細胞がなかった。
【図１８】
致死量放射線照射および胎仔肝臓再構築後に外科的な性腺摘除を行った後のＣＤ４対ＣＤ８ドナー由来の胸腺細胞個体群のＦＡＣＳプロファイルを示す図である。それぞれのプロットの右側に各象限のパーセンテージを示してある。同年齢の対照プロファイルは８月齢のＬｙ５．１近交系マウス胸腺のものである。性腺摘除を行ったマウスおよび性腺摘除を行っていないマウスのプロファイルをＣＤ４５．２＋細胞について選び出し、ドナー由来の細胞のみを示す。再構築の２週間後、性腺摘除を行ったマウスと性腺摘除を行っていないマウスとで胸腺細胞の部分母集団に違いはない。
【図１９】
Ａ及びＢは致死量放射線照射、胎仔肝臓再構築および性腺摘除後の骨髄およびリンパ球の樹状細胞（ＤＣ）数を示す図である。（各被験群についてｎ＝３〜４体のマウス）。以下の（ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ）グラフにおける対照の（斜線）バーは同年齢の未処置マウスにおける樹状細胞の正常数を表している。（Ａ）ドナー由来の骨髄樹状細胞――再構築の２週間後、性腺摘除を行っていないマウスでＤＣが正常なレベルで存在した。同じ時点でＤＣは性腺摘除を行ったマウスの方が有意に（＊ｐ≦０．０５）多かった。４週間の時点で、性腺摘除を行ったマウスではＤＣ数が対照レベルより高いままだった。（Ｂ）ドナー由来のリンパ球樹状細胞――再構築の２週間後、性腺摘除を行ったマウスのＤＣ数が性腺摘除を行っていないマウスの２倍であった。処置の４週間後、ＤＣ数は対照レベルより高いままだった。
【図２０】
Ａ及びＢは性腺摘除を行ったマウスと性腺摘除を行っていないマウスとについて、胎仔肝臓再構築後の骨髄での総細胞数と骨髄のＣＤ４５．２＋細胞数の変化を示す図である。各被験群についてｎ＝３〜４体のマウス。（Ａ）総細胞数――再構築の２週間後、骨髄細胞の数が正常になり、性腺摘除を行ったマウスと性腺摘除を行っていないマウスとで細胞数に有意な差は認められなかった。再構築の４週間後、性腺摘除を行ったマウスと性腺摘除を行っていないマウスとで細胞数に有意な（＊ｐ≦０．０５）差が認められた。（Ｂ）ＣＤ４５．２＋細胞数。再構築の２週間後、性腺摘除を行ったマウスと性腺摘除を行っていないマウスとで骨髄中のＣＤ４５．２＋細胞数に有意な差は認められなかった。性腺摘除を行ったマウスでは、４週間の時点でＣＤ４５．２＋細胞数が多いままであった。同じ時点で性腺摘除を行っていないマウスにドナー由来の細胞はなかった。
【図２１】
性腺摘除を行ったマウスおよび性腺摘除を行っていないマウスの胎仔肝臓再構築後における骨髄中のＴ細胞、骨髄由来の樹状細胞、リンパ球由来の樹状細胞（ＤＣ）を示す図である。（各被験群についてｎ＝３〜４体のマウス）。以下のグラフにおける対照の（斜線）バーは同年齢の未処置マウスにおけるＴ細胞と樹状細胞の正常な数を表している。（Ａ）Ｔ細胞数――性腺摘除を行ったマウスと性腺摘除を行っていないマウスのいずれも再構築の２週間後および４週間後に数値が減少した。（Ｂ）ドナー由来の骨髄樹状細胞――性腺摘除を行ったマウスと性腺摘除を行っていないマウスのいずれも再構築の２週間後にＤＣ細胞数は正常であった。この時点で、性腺摘除を行ったマウスと性腺摘除を行っていないマウスとで有意な数値差は認められなかった。（Ｃ）ドナー由来のリンパ球樹状細胞――再構築の２週間後および４週間後に数値は正常なレベルであった。２週間の時点で、性腺摘除を行ったマウスと性腺摘除を行っていないマウスとで有意な数値差は認められなかった。
【図２２】
Ａ及びＢは性腺摘除を行ったマウスと性腺摘除を行っていないマウスの胎仔肝臓再構築後における脾臓での総細胞数と脾臓のドナー（ＣＤ４５．２＋）細胞数の変化を示す図である。（各被験群についてｎ＝３〜４体のマウス）。（Ａ）総細胞数――再構築の２週間後、細胞数は減少したが、性腺摘除を行ったマウスと性腺摘除を行っていないマウスとで細胞数に有意な差は認められなかった。再構築の４週間後、細胞数は性腺摘除を行ったマウスで正常なレベルに近づいていた。
（Ｂ）ＣＤ４５．２＋細胞数――再構築の２週間後、性腺摘除を行ったマウスと性腺摘除を行っていないマウスとで脾臓のＣＤ４５．２＋細胞数に関して有意な差は認められなかった。性腺摘除を行ったマウスでは、４週間の時点でＣＤ４５．２＋細胞数が多いままであった。同じ時点で性腺摘除を行っていないマウスにドナー由来の細胞はなかった。
【図２３】
胎仔肝臓再構築後における脾臓のＴ細胞、骨髄由来の樹状細胞およびリンパ球由来の樹状細胞（ＤＣ）を示す図である。（各被験群についてｎ＝３〜４体のマウス）。以下のグラフにおける対照の（斜線）バーは同年齢の未処置マウスにおけるＴ細胞と樹状細胞の正常な数を表している。（Ａ）Ｔ細胞数――性腺摘除を行ったマウスと性腺摘除を行っていないマウスのいずれも再構築の２週間後および４週間後に数値が減少した。（Ｂ）ドナー由来の（ＣＤ４５．２＋）骨髄樹状細胞――性腺摘除を行ったマウスと性腺摘除を行っていないマウスのいずれも再構築の２週間後および４週間後にＤＣ細胞数は正常であった。２週間の時点で、性腺摘除を行ったマウスと性腺摘除を行っていないマウスとで有意な数値差はなかった。
（Ｃ）ドナー由来の（ＣＤ４５．２＋）リンパ球樹状細胞――再構築の２週間後および４週間後に数値は正常なレベルであった。２週間の時点で、性腺摘除を行ったマウスと性腺摘除を行っていないマウスとで有意な数値差はなかった。
【図２４】
Ａ及びＢは性腺摘除を行ったマウスと性腺摘除を行っていないマウスの胎仔肝臓再構築後におけるリンパ節での総細胞数とリンパ節のドナー（ＣＤ４５．２＋）細胞数の変化を示す図である。（各被験群についてｎ＝３〜４）。（Ａ）総細胞数――再構築の２週間後、細胞数は正常なレベルであり、性腺摘除を行ったマウスと性腺摘除を行っていないマウスとで有意な差はなかった。再構築の４週間後、性腺摘除を行ったマウスでは細胞数が正常なレベルであった。（Ｂ）ＣＤ４５．２＋細胞数――性腺摘除を行ったマウスと性腺摘除を行っていないマウスとで再構築の２週間後にリンパ節のドナーＣＤ４５．２＋細胞数に有意な差はなかった。性腺摘除を行ったマウスでは、４週間の時点でＣＤ４５．２細胞数が多いままであった。同じ時点で性腺摘除を行っていないマウスにドナー由来の細胞はなかった。
【図２５】
Ａ，Ｂ，及びＣは性腺摘除を行ったマウスおよび性腺摘除を行っていないマウスの胎仔肝臓再構築後における腸間膜リンパ節のＴ細胞、骨髄由来の樹状細胞、リンパ球由来の樹状細胞（ＤＣ）を示す図である。（各被験群についてｎ＝３〜４体のマウス）。対照の（斜線）バーは同年齢の未処置マウスにおけるＴ細胞数と樹状細胞数である。（Ａ）性腺摘除を行ったマウスと性腺摘除を行っていないマウスのいずれも再構築の２週間後および４週間後にＴ細胞数が減少した。（Ｂ）性腺摘除を行ったマウスと性腺摘除を行っていないマウスのいずれもドナー由来の骨髄樹状細胞は正常であった。４週間の時点でこれらの細胞が減少した。２週間の時点で、性腺摘除を行ったマウスと性腺摘除を行っていないマウスとで有意な数値差はなかった。（Ｃ）ドナー由来のリンパ球樹状細胞――再構築の２週間後および４週間後に数値は正常なレベルであった。２週間の時点で、性腺摘除を行ったマウスと性腺摘除を行っていないマウスとで有意な数値差はなかった。
【図２６】
前立腺癌のＬＨＲＨアゴニスト処置を受けているヒトの患者（全体＞６０歳）にて末梢血リンパ球の表現型組成を分析した。処置前とＬＨＲＨアゴニスト処置開始の４ヶ月後に患者の試料を分析した。処置前には患者全員で血液１ｍｌあたりのリンパ球細胞の総数が対照値の下端であった。処置後、９名中６名の患者に総リンパ球数の実質的な増加が認められた（事例によっては総細胞数の倍増が観察された）。これと相関しているのが、９名中６名の患者における総Ｔ細胞数の増加であった。ＣＤ４＋サブセットでは、この上昇が９名中８名の患者でさらに目立っていることから、ＣＤ４Ｔ細胞のレベルが上昇していることが分かった。ＣＤ８＋サブセットでは、全体的にＣＤ４＋Ｔ細胞の場合よりも程度が低いとはいえ、９名中４名の患者でレベルが上昇するという、それほど特徴的ではない傾向が認められた。
【図２７】
ＬＨＲＨアゴニスト処置の前後にヒトの患者の血液を分析したところ、処置後に、Ｔ細胞、ＣＤ４Ｔ細胞またはＣＤ８Ｔ細胞の全体的な割合には実質的な変化が認められず、ＣＤ４：ＣＤ８比にはさまざまな変化があった。このことから、処置後に総Ｔ細胞数が実質的に増加するにもかかわらず、処置を行ってもＴ細胞サブセットの恒常性維持に対しては最小限の影響しかおよばないことが分かる。値はいずれも対照値に対する相対的なものとした。
【図２８】
ＬＨＲＨアゴニスト処置を受けているヒトの患者の末梢血に含まれるＢ細胞および骨髄細胞（ＮＫ、ＮＫＴおよびマクロファージ）の割合を分析したところ、サブセットごとにさまざまな度合いで変化することが分かった。ＮＫ、ＮＫＴ、マクロファージの割合は処置後も比較的一定のままであったが、Ｂ細胞の割合は９名中４名の患者で減少した。
【図２９】
処置後にヒトの患者の末梢血に含まれるＢ細胞と骨髄細胞の総細胞数を分析したところ、処置後に、ＮＫ（９名中５名の患者）、ＮＫＴ（９名中４名の患者）、マクロファージ（９名中３名の患者）で細胞数に明らかなレベルの上昇が認められた。Ｂ細胞数については、９名中２名の患者でレベルが上昇し、９名中４名の患者では変化なし、９名中３名の患者ではレベルが低下するといった具合で、顕著な傾向は特に認められなかった。
【図３０】
ＬＨＲＨアゴニスト処置後に見られた主な変化は末梢血のＴ細胞個体群でのものであった。特に、ＣＤ４＋Ｔ細胞サブセットでのナイーブ（ＣＤ４５ＲＡ＋）と記憶（ＣＤ４５ＲＯ＋）との比がヒトの患者９名中６名で増加する、ナイーブ（ＣＤ４５ＲＡ＋）ＣＤ４＋細胞の割合の選択的な増加が認められた。
【図３１】
さまざまなレーザパルスエネルギを用いた場合における皮膚のインピーダンスの低下について示す図である。フィット曲線を用いてデータを補間すると、１０ｍＪという低いエネルギを照射した皮膚で皮膚インピーダンスが低下する。
【図３２】
皮膚の医薬品透過について示す図である。インスリンを試料医薬品として用いた場合の皮膚の透過性は放射線照射によって大幅に亢進された。
【図３３】
皮膚に５−アミノレブリン酸（ＡＬＡ）を加え、１回の神経衝撃トランジェント後の皮膚の経時蛍光変化を示す図である。強度のピークは約６４０ｎｍに見られ、処置後２１０分経過すると（点線）高くなる。
【図３４】
神経衝撃トランジェントなしで５−アミノレブリン酸（ＡＬＡ）を加えた後の皮膚の経時蛍光変化を示す図である。どの時点をみても強度がわずかに変化するだけである。
【図３５】
５−アミノレブリン酸（ＡＬＡ）を加え、さまざまなピーク応力下での神経衝撃トランジェント後の皮膚の蛍光変化を比較した図である。表皮細胞の膜透過は最大応力に左右される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【国際調査報告】
2004523730.tif 000202
2004523730.tif 000203