(57)【要約】本発明は、新規な単離されたＭＥＭＸポリヌクレオチドおよびこのＭＥＭＸポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドを提供する。ＭＥＭＸポリペプチド、またはＭＥＭＸポリペプチド、ポリヌクレオチド、もしくは抗体の任意の誘導体、改変体、変異体、もしくはフラグメントに免疫特異的に結合する抗体もまた提供される。本発明は、さらに、ＭＥＭＸポリペプチド、ポリヌクレオチド、および抗体が、広範な病理状態の検出および処置において、ならびに他の用途において使用される方法を提供する。
2004509602.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離されたポリペプチドであって、以下：
（ａ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、または１６からなる群より選択されるアミノ酸配列の成熟形態；
（ｂ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、または１６からなる群より選択されるアミノ酸配列の成熟形態の改変体であって、ここで、該成熟形態における任意のアミノ酸が、異なるアミノ酸配列に変化しており、ただし、該成熟形態の配列のうちの２０％以下のアミノ酸残基が、このように変化している、改変体；
（ｃ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、または１６からなる群より選択されるアミノ酸配列；
（ｄ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、または１６からなる群より選択されるアミノ酸配列の改変体であって、ここで選択された配列に示される任意のアミノ酸が、異なるアミノ酸に変化しており、ただし、該配列のうちの２０％以下のアミノ酸残基が、このように変化している、改変体；ならびに
（ｅ）（ａ）〜（ｄ）のいずれかのフラグメント、
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、ポリペプチド。
【請求項２】
請求項１に記載のポリペプチドであって、該ポリペプチドが、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、または１６からなる群より選択される配列の天然に存在する対立遺伝子改変体である、ポリペプチド。
【請求項３】
請求項２に記載のポリペプチドであって、ここで、前記対立遺伝子改変体が、単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）の翻訳産物である、ポリペプチド。
【請求項４】
請求項１に記載のポリペプチドであって、該ポリペプチド、は、本明細書中で記載される改変体ポリペプチドであり、ここで、前記選択された配列に示される任意のアミノ酸が、保存的置換を提供するよう変化される、ポリペプチド。
【請求項５】
単離された核酸分子であって、該核酸分子が、以下：
（ａ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、または１６からなる群より選択されるアミノ酸配列の成熟形態；
（ｂ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、または１６からなる群より選択されるアミノ酸配列の成熟形態の改変体であって、ここで、選択された配列の該成熟形態における任意のアミノ酸が、異なるアミノ酸に変化しており、ただし、該成熟形態の配列のうちの２０％以下のアミノ酸残基が、このように変化している、改変体；
（ｃ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、または１６からなる群より選択されるアミノ酸配列；
（ｄ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、または１６からなる群より選択されるアミノ酸配列の改変体であって、該選択された配列に示される任意のアミノ酸が、異なるアミノ酸に変化しており、ただし、該配列のうちの２０％以下のアミノ酸残基が、このように変化している、改変体；
（ｅ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、または１６からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドまたは該ポリペプチドの任意の改変体の、少なくとも一部をコードする核酸フラグメントであって、ここで、該選択された配列の任意のアミノ酸が、異なるアミノ酸に変化しており、ただし、該配列のうちの１０％以下のアミノ酸残基が、このように変化している、核酸フラグメント；ならびに
（ｆ）該核酸分子のいずれかの相補体、
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸配列を含む、核酸分子。
【請求項６】
請求項５に記載の核酸分子であって、ここで、該核酸分子が天然に存在する対立遺伝子核酸改変体のヌクレオチド配列を含む、核酸分子。
【請求項７】
改変体ポリペプチドをコードする、請求項５に記載の核酸分子であって、ここで、該改変体ポリペプチドが、天然に存在するポリペプチド改変体のポリペプチド配列を有する、核酸分子。
【請求項８】
請求項５に記載の核酸分子であって、ここで、該核酸分子が、前記改変体ポリペプチドをコードする単一ヌクレオチド多型を含む、核酸分子。
【請求項９】
請求項５に記載の核酸分子であって、ここで、該核酸分子が以下：
（ａ）配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、または１５からなる群より選択されるヌクレオチド配列；
（ｂ）ヌクレオチド配列であって、ここで、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、または１５からなる群より選択されるヌクレオチド配列における１つ以上のヌクレオチドが、該選択された配列によって与えられるヌクレオチドから異なるヌクレオチドに変化しており、ただし、２０％以下のヌクレオチドが、このように変化している、ヌクレオチド配列；
（ｃ）配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、または１５からなる群より選択される配列の核酸フラグメント；ならびに
（ｄ）核酸フラグメントであって、ここで、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、または１５からなる群より選択されるヌクレオチド配列における１つ以上のヌクレオチドが、該選択された配列によって与えられるヌクレオチドから異なるヌクレオチドに変化しており、ただし、２０％以下のヌクレオチドが、このように変化している、核酸フラグメント、
からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む、核酸分子。
【請求項１０】
請求項５に記載の核酸分子であって、ここで、該核酸分子が、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、または１５からなる群より選択されるヌクレオチド配列または該ヌクレオチド配列の相補体に、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、核酸分子。
【請求項１１】
請求項５に記載の核酸分子であって、ここで、該核酸分子が、前記選択されたヌクレオチド配列のコード配列に示される任意のヌクレオチドが、該選択された配列によって与えられるヌクレオチドから異なるヌクレオチドに変化しており、ただし、該選択されたコード配列におけるヌクレオチドの２０％以下がこのように変化している、ヌクレオチド配列、該第一のポリヌクレオチドの相補体である単離された第二のポリヌクレオチド、またはこれらのいずれかのフラグメントを含む、核酸分子。
【請求項１２】
請求項１１に記載の核酸分子を含む、ベクター。
【請求項１３】
前記核酸分子に作動可能に連結されたプロモーターをさらに含む、請求項１２に記載のベクター。
【請求項１４】
請求項１２に記載のベクターを含む、細胞。
【請求項１５】
請求項１に記載のポリペプチドに免疫特異的に結合する、抗体。
【請求項１６】
前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項１５に記載の抗体。
【請求項１７】
前記抗体がヒト化抗体である、請求項１５に記載の抗体。
【請求項１８】
サンプル中の請求項１に記載のポリペプチドの存在または量を決定するための方法であって、該方法は、以下：
（ａ）該サンプルを提供する工程；
（ｂ）該サンプルを該ポリペプチドに免疫特異的に結合する抗体に導入する工程；および
（ｃ）該ポリペプチドに結合した抗体の存在または量を決定して、それによって該サンプル中のポリペプチドの存在または量を決定する工程、
を包含する、方法。
【請求項１９】
サンプル中の請求項５に記載の核酸分子の存在または量を決定するための方法であって、該方法は、以下：
（ａ）該サンプルを提供する工程；
（ｂ）該サンプルを該核酸分子に結合するプローブに導入する工程；および
（ｃ）該核酸分子に結合した該プローブの存在または量を決定して、それによって該サンプル中の該核酸分子の存在または量を決定する工程、
を包含する、方法。
【請求項２０】
請求項１に記載のポリペプチドに結合する因子を同定する方法であって、該方法は、以下：
（ａ）該ポリペプチドを該因子に導入する工程；および
（ｂ）該因子が該ポリペプチドに結合するか否かを決定する工程、
を包含する、方法。
【請求項２１】
病状を処置する際に使用するための潜在的な治療剤を同定するための方法であって、ここで、該病状が、請求項１に記載のポリペプチドの異常な発現または異常な生理学的相互作用に関連しており、該方法が、以下：
（ａ）請求項１に記載のポリペプチドを発現し、かつ該ポリペプチドに起因する特性または機能を有する、細胞を提供する工程；
（ｂ）該細胞を、候補物質を含む組成物と接触させる工程；および
該物質が該ポリペプチドに起因し得る特性または機能を変化させるか否かを決定し、これによって、該物質の存在下で観察される変化が、該細胞を該物質を欠く組成物と接触させる際には観察されない場合には、該物質は、潜在的な治療剤として同定される、工程
を包含する、方法。
【請求項２２】
請求項１に記載のポリペプチドの活性を調節するための方法であって、該方法は、請求項１に記載のポリペプチドを発現する細胞サンプルを、該ポリペプチドの活性を調節するに十分な量の該ポリペプチドに結合する化合物に導入する工程を包含する、方法。
【請求項２３】
請求項１に記載のポリペプチドと関連する病状を処置または予防する方法であって、該方法は、そのような処置または予防が所望される被験体に、該被験体における該病状を処置または予防するに十分な量で請求項１に記載のポリペプチドを投与する工程を包含する、方法。
【請求項２４】
前記被験体がヒトである、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
請求項１に記載のポリペプチドと関連する病状を処置または予防する方法であって、該方法が、そのような処置または予防が所望される被験体に、該被験体における該病状を処置または予防するに十分な量でＭＥＭＸ核酸を投与する工程を包含する、方法。
【請求項２６】
前記被験体がヒトである、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
請求項１に記載のポリペプチドと関連する病状を処置または予防する方法であって、該方法が、そのような処置または予防が所望される被験体に、該被験体における該病状を処置または予防するに十分な量でＭＥＭＸ抗体を投与する工程を包含する、方法。
【請求項２８】
前記被験体がヒトである、請求項１５に記載の方法。
【請求項２９】
請求項１に記載のポリペプチドおよび薬学的に受容可能なキャリアを含有する、薬学的組成物。
【請求項３０】
請求項５に記載の核酸分子および薬学的に受容可能なキャリアを含有する、薬学的組成物。
【請求項３１】
請求項１５に記載の抗体および薬学的に受容可能なキャリアを含有する、薬学的組成物。
【請求項３２】
請求項２９に記載の薬学的組成物を１つ以上の容器に含む、キット。
【請求項３３】
請求項３０に記載の薬学的組成物を１つ以上の容器に含む、キット。
【請求項３４】
請求項３１に記載の薬学的組成物を１つ以上の容器に含む、キット。
【請求項３５】
ヒト疾患に関連する症候群を処置するための医薬の製造における治療剤の使用であって、該疾患は、請求項１に記載のポリペプチドと関連する病状から選択され、ここで該治療剤は、請求項１に記載のポリペプチドである、使用。
【請求項３６】
ヒト疾患に関連する症候群を処置するための医薬の製造における治療剤の使用であって、該疾患は、請求項１に記載のポリペプチドと関連する病状から選択され、ここで該治療剤は、ＭＥＭＸ核酸である、使用。
【請求項３７】
ヒト疾患に関連する症候群を処置するための医薬の製造における治療剤の使用であって、該疾患は、請求項１に記載のポリペプチドと関連する病状から選択され、ここで該治療剤は、ＭＥＭＸ抗体である、使用。
【請求項３８】
請求項１に記載のポリペプチドと関連する病状の活性または潜伏性または該病状に対する素因のモジュレーターをスクリーニングするための方法であって、該方法が、以下：
（ａ）請求項１に記載のポリペプチドと関連する病状に対する危険性が増加した試験動物に試験化合物を投与する工程であって、ここで、該試験動物は請求項１に記載のポリペプチドを組み換え発現する、工程；
（ｂ）工程（ａ）の該化合物を投与する工程の後に該試験動物中の該ポリペプチドの活性を測定する工程；および
（ｃ）該試験動物における該タンパク質の活性を、該ポリペプチドが投与されていないコントロール動物における該ポリペプチドの活性と比較する工程であって、ここで、該コントロール動物に対する該試験動物中の該ポリペプチドの活性における変化は、該試験化合物が請求項１に記載のポリペプチドと関連する病状の潜伏性のまたは病状に対する素因のモジュレーターであることを示す、工程、
を包含する、方法。
【請求項３９】
請求項３８に記載の方法であって、ここで、前記試験動物が、試験タンパク質導入遺伝子を発現するか、または野生型試験動物に対して増加したレベルで、プロモーターの制御下で該導入遺伝子を発現する、組換え試験動物であり、ここで、該プロモーターは、該導入遺伝子のネイティブな遺伝子プロモーターではない、方法。
【請求項４０】
第１の哺乳動物被験体における請求項１に記載のポリペプチドの変化したレベルと関連する疾患の存在または素因を決定するための方法であって、該方法が、以下：
（ａ）該第１の哺乳動物被験体由来のサンプル中の該ポリペプチドの発現レベルを測定する工程；および
（ｂ）工程（ａ）の該サンプル中の該ポリペプチドの量を、該疾患を有さないことが既知であるかまたは該疾患にかかりやすいわけではないことが既知の、第２の哺乳動物被験体由来のコントロールサンプル中に存在する該ポリペプチドの量と比較する工程であって、
ここで、該コントロールサンプルと比較した場合の該第１の被験体における該ポリペプチドの発現レベルにおける変化が、該疾患の存在または素因を示す、工程
を包含する、方法。
【請求項４１】
第１の哺乳動物被験体における請求項５に記載の核酸分子の変化したレベルと関連する疾患の存在または素因を決定するための方法であって、該方法が、以下：
（ａ）該第１の哺乳動物被験体由来のサンプル中の該核酸の量を測定する工程；および
（ｂ）工程（ａ）の該サンプル中の該核酸の量を、該疾患を有さないことが既知であるかまたは該疾患にかかりやすいわけではないことが既知の、第２の哺乳動物被験体由来のコントロールサンプル中に存在する該核酸の量と比較する工程であって、
ここで、該コントロールサンプルと比較した場合の該第１の被験体における該核酸のレベルにおける変化が、該疾患の存在または素因を示す、工程
を包含する、方法。
【請求項４２】
哺乳動物において病理学的状態を処置する方法であって、該方法が、該病理学的状態を緩和するに十分な量でポリペプチドを該哺乳動物に投与する工程を包含し、ここで、該ポリペプチドが、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、もしくは１６またはそれらの生物学的に活性なフラグメントからなる群より選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドに少なくとも２０％同一なアミノ酸配列を有するポリペプチドである、方法。
【請求項４３】
哺乳動物の病理学的状態を処置する方法であって、該方法が、該病理学的状態を緩和するに十分な量で請求項１５に記載の抗体を該哺乳動物に投与する工程を包含する、方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、一般に、核酸およびその核酸によりコードされるポリペプチドに関する。より詳細には、本発明は、膜結合ポリペプチドまたは分泌ポリペプチドをコードする核酸、ならびにこれらの核酸およびポリペプチドを産生するためのベクター、宿主細胞、抗体および組換え方法に関する。
【０００２】
（発明の背景）
（７回膜貫通レセプター）
７回膜貫通タンパク質は、膜固定を容易にするように働き（例えば、Ｍｕｅｌｌｅｒ，２０００．Ｃｕｒｒ．Ｍｅｄ．Ｓｈｅｍ．７：８６１〜８８８を参照のこと）、そして低分子量リガンドへの結合部位に適応すると考えられる、ほとんど疎水性の残基を含む、７つのαらせんを有する膜貫通タンパク質である。
【０００３】
最もよく特徴づけされた７回膜貫通レセプタータンパク質は、グアニンヌクレオチド−結合シグナル伝達タンパク質（Ｇ−プロテイン）−結合レセプター（Ｇｕａｎｉｎｅ　ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｂｉｎｄｉｎｇ　ｓｉｇｎａｌ−ｔｒａｎｓｄｕｃｉｎｇ　ｐｒｏｔｅｉｎ（Ｇ−ｐｒｏｔｅｉｎ）−ｃｏｕｐｌｅｄ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＧＰＣＲ）である。これは、細胞内Ｇタンパク質の活性化合物によって細胞質膜を通じて化学シグナルを伝達する。例えば、ＷａｔｓｏｎおよびＡｒｋｉｎｓｔａｌｌ、ＴＨＥ　Ｇ−ＰＲＯＴＥＩＮ　ＬＩＮＫＥＤ　ＲＥＣＥＰＴＯＲＳ、Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，１９９４第１〜２９４頁を参照のこと。さらに、ＧＰＣＲは、生体医学リサーチにおいて確証された薬物標的の最も顕著なファミリーを構成する。なぜなら、全ての承認された薬物の約６０％がこのタンパク質のファミリーのメンバーを選択的に相互作用することによってその治療効果を発揮し、そして疾患状態の宿主において治療介入のための重要な分子標的として働くからである。
【０００４】
ＧＰＣＲは、広範な種々の生物学的プロセス（例えば、神経伝達、化学遊走性、心臓機能、嗅覚、および視覚）の活性を調節する細胞外シグナルを伝達する。数百のＧＰＣＲが、広範な種々の刺激（光子、神経伝達物質、および種々の分子構造のホルモン）に応答してこれらのＧタンパク質の１つ以上を通じてシグナル伝達する。ＧＰＣＲは、グアニンヌクレオチド結合シグナル伝達タンパク質（Ｇプロテイン）（これは、ＧＴＰ結合状況で、下流の膜局在化エフェクターに結合しそして活性化する）の活性を通じてその細胞内作用を媒介する、調節性ＧＴＰａｓｅの多様なファミリーとして機能する。この機構（これによって、これらのリガンドはレセプター／Ｇプロテイン系の活性化を誘発する）は、非常に複雑であり、そして多面的である。ＧＰＣＲの顕著なメンバーとしては、例えば、アンジオテンシンＩＩ、ＣＣＫ／ガストリン、インターロイキン８、エンドセリンなどが挙げられる。例えば、ｖａｎ　Ｎｅｕｒｅｎ，１９９９，Ｊ．Ｒｅｃｅｐｔ．Ｓｉｇｎａｌ　Ｔｒａｎｓｄｕｃｔ．Ｒｅｓ．９：３４１〜３５３を参照のこと。
【０００５】
ＧＰＣＲスーパーファミリーは、進化的に保存されており、そして細胞外アミノ末端および細胞質カルボキシ末端を有する、推定７回膜貫通（ＴＭ）ドメインを有することによって構造的に特徴付けられる。ＧＰＣＲは、７回の独立した折り畳みユニットからなり、このユニットは、緊密にパックされたコアを有するタル状（ｂａｒｒｅｌ−ｌｉｋｅ）構造にアレンジされた膜貫通ドメインを有する。ＧＰＣＲによる、保存された７−ＴＭ構造のユニバーサル適応（結果として、ＴＭコアにそって３つの細胞内ループおよび３つの細胞外ループを付与する）は、一般に、その構造的安定性および機能的多様性を達成することが最低限必要であると考えられている。今日まで、原核生物および真核生物で同定されたほぼ２，０００のＧＰＣＲはどれも、７ＴＭドメインより少なくしか含まないことが公知である。
【０００６】
最近の研究では、一次配列の整列（アラインメント）は、ＧＰＣＲ膜貫通領域との高い程度の相同性を実証した。テンプレートとしてバクテリオロドプシンの精密なモデルを用いて、３９ＧＰＣＲの３次元（３Ｄモデル）を作成した。５つの陽イオン性神経伝達物質レセプター（すなわち、セロトニン作動性５−ＨＴ２、ドーパミン作動性Ｄ２、ムスカリン作動性ｍ２、アドレナリン作動性α２、およびβレセプター）をプロトタイプとして採用し、詳細に研究した。陽イオン性神経伝達物質レセプターの３Ｄモデルは、その一次構造比較とともに、このアゴニスト結合部位がレセプターの細胞外表面付近に配置されていること、および膜にまたがるヘリックス（らせん）３、４、５、６、および７の残基を含むことを示す。この結合部位は、膜貫通らせん３の真ん中に位置する陰性に荷電されたＡｓｐ、ならびにらせん４、５、６および７上に保存された芳香族残基を含む疎水性ポケットからなる。さらに、全てのＧＰＣＲは、不変のヒンジ残基を保有することが示されている。この残基は、アゴニスト結合の間の高次構造（コンフォメーション）変化の原因であり従ってレセプターに対するＧプロテインの解離および会合に影響すると考えられる。Ｇプロテインの結合の調節は、疎水性相互作用および水素結合を介する、この領域内の高次構造変化に起因する。細胞外で生じるレセプターリガンド認識事象の情報は、細胞内区画に対するＧＰＣＲの膜貫通部分内の高次構造の再配列を通じて移動される。従って、ＧＰＣＲは、細胞の外部と細胞の細胞質との間の機能的かつ１方向性（単方向性）の連絡を確立する。
【０００７】
一般に、ＧＰＣＲ活性には、直後に反応性の消失（脱感作と呼ばれる）が続き、次いで回復または再感作の期間が続く。シグナル伝達電位におけるこれらの変化は、ＧＰＣＲリン酸化および細胞内の異なる位置への輸送を含む機構を主に介して、厳密に調節されている。
【０００８】
（グルタミン酸およびアスパラギン酸レセプター）
グルタミン酸およびアスパラギン酸レセプターは、中枢神経系（ＣＮＳ）に豊富であり、イオンチャネル型応答および代謝調節型応答の両方による応答を誘発する。代謝調節型反応クラスに含まれるのはグルタミン酸レセプターである。グルタミン酸レセプターは、一般に７つの単鎖膜貫通タンパク質（ｓｅｖｅｎ，ｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎ　ｔｒａｎｓｍｅｎｂｒａｎｅ−ｓｐａｎｎｉｎｇ　ｐｒｏｔｅｉｎ）からなる。代謝調節レセプターおよびＮ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸のイオンチャネル型レセプターをコードする多くのｃＤＮＡが、近年同定されている。選択的スプライシングのプロセスの結果として、およびｍＲＮＡの単一塩基編集によってさえ、多様なレセプター型が顕著に増大していることがまた示されている。例えば、ＧｉｌｍａｎおよびＧｏｏｄｍａｎ’ｓＴｈｅ　Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｂａｓｉｓ　ｏｆ　Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、第９版、Ｈａｒｄｍａｎ，ＪＧら（編）、ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ，１９９６、第２７８〜２８２頁を参照のこと。
【０００９】
近年、精神分裂病の病態生理学においてグルタミン酸レセプターの役割を検討するのが関心事である。実際、精神分裂病のドーパミン仮説理論は、精神分裂病の陽性症状しか説明できない。一方、グルタミン酸仮説は、この病態のより包括的な視点を提供する。Ｎｏｏｒｂａｔａら（Ｐｉｒａｃｅｔａｍ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｔｒｅａｔｍｅｎｔ　ｏｆ　ｓｃｈｉｚｏｐｈｅｒｅｎｉａ：ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｇｕｌｔａｍａｔｅ　ｈｙｐｏｔｈｅｓｉｓ　ｏｆ　ｓｃｈｉｚｏｐｈｅｒｅｎｉａ．ＰＭＩＤ：１０５８３７００）は、ハロペリドールとピラセタム（グルタミン酸レセプターを陽性に調節する向知性の因子）の組み合わせが、この疾患を処置するのに、ハロペリドール単独よりも効果的であるか否かを検討するための臨床試験を行った。彼らは、精神分裂病のＤＳＭ　ＩＶ基準に適合する３０例の患者を試験した。患者を無作為の様式に割り当て、１４例には、ハロペリドール（３０ｍｇ／日）およびピラセタム（３２００ｍｇ／日）の両方を投与し、１６例の患者には、ハロペリドール（３０ｍｇ／日）およびプラセボのみを投与した。両方のプロトコールは、臨床試験の期間にわたって、陽性症状、陰性症状、一般的病態生理学的症状のスコア、およびＰＡＮＳＳスケールの総スコアを有意に低下させたことが見出された。それにもかかわらず、これらの研究者はまた、ハロペリドールおよびピラセタムの併用が、精神分裂病患者の処置において、ハロペリドール単独を上回る有意な優位性を示したことを実証した。彼らは、ピラセタム、多数の向知性クラスの薬物およびグルタミン酸レセプターの陽性の調節因子が、代表的な神経遮断薬（神経弛緩薬）との併用で、精神分裂病患者の処置に治療的に利点であり得ると結論した。
【００１０】
頭部外傷後に放出された興奮性アミノ酸の過剰な活性はまた、動物モデルおよびヒトでの研究において、進行性の傷害に寄与することが実証されている。例えば、Ｍｏｒｒｉｓら、１９９９．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ　９１（５）：７３７〜７４３を参照のこと。グルタミン酸レセプターに対するアンタゴニストとして作用するいくつかの薬学的因子が、この進行の制限において見込まれている。Ｎ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸レセプターアンタゴニストセルフォテル（Ｓｅｌｆｏｔｅｌ）（ＣＧＳ　１９７５５）の有効性を、重篤な頭部傷害患者の２つの平行した研究において評価した。この研究では、重篤な頭部外傷とは、蘇生後グラスゴーコーマスケールのスコアが４〜８と規定した。しかし、セルフォテル（Ｓｅｌｆｏｔｅｌ）の臨床試験は、患者の幾人かでの重篤な副作用によって、完了前に終わった。この臨床試験の結果は、脳におけるグルタミン酸レセプターの特性のより良好な理解の必要性、ならびにこのレセプターのより効果的なアゴニストおよびアンタゴニストを発見する必要性を実証する。
【００１１】
（カリウムチャネル）
カリウムチャネルは、興奮性膜の電位依存性カリウムイオン透過性を媒介する。このタンパク質が、膜を横切る電位差に応答して開放コンフォメーション（高次構造）または閉鎖コンフォメーションのどちらを想定するかに依存して、このタンパク質は、カリウム選択性チャネルを形成し、これを通じてカリウムイオンはその電気化学的勾配にそって通過し得る。
【００１２】
カリウムチャネルは、統合型（組み込み型）膜タンパク質であることが示されている。ｓ４セグメントは、おそらく電圧センサーであり、そしてあらゆる第３位置で、一連の陽性に荷電したアミノ酸によって特徴付けられる。さらに、このテールは、特異的細胞内区画に対するこのチャネルの活性および／またはこのチャネルの標的化の調節において重要であり得る。このチャネルタンパク質は、遅延型整流クラスに属し、そしてショー（Ｓｈａｗ）カリウムチャネルサブファミリーに属する。
【００１３】
ＩＫｒ（カリウムイオンチャネル、迅速応答）遮断（ブロック）は、急性心筋虚血と上昇した交感神経活性との間の相互作用によって誘発された心室性細動を予防するのには効果がない。これは、部分的には、アドレナリン作動性活性が、Ｉｋｒブロック（遮断）の５０％より大きい活性電位延長効果を相殺し、従って作用の一次機構を損なうという事実に依存する。遅延型整流カリウムチャネル（ＩＫｒ）の即時型成分のブロックと比較的弱いβアドレナリン作動性遮断（ブロック）とを合わせる、新規な抗不整脈剤であるエルセンチリド（ｅｒｓｅｎｔｉｌｉｄｅ）（ＣＫ−３５７９）の抗細動性効果を、致死的不整脈の意識下イヌモデルで試験した。Ａｄｍｓｏｎら、１９９８、Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ　Ｒｅｓ．４０（１）：５６〜６３を参照のこと。最大トレッドミル運動の間、２分間の回旋動脈閉塞（ＣＡＯ）を受けている、治癒した心筋梗塞（ＭＩ）を有する１９匹のイヌで、エルセンチリド（ｅｒｓｅｎｔｉｌｉｄｅ）を試験した。一定ペースの心拍で、左星形神経節の刺激の間およびベースラインで、８匹の麻酔下開胸イヌにおいて、エルセンチリドの前および後に、心外膜単相性作用電位期間（ｅｐｉｃａｒｄｉａｌ　ｍｏｎｏｐｈａｓｉｃ　ａｃｔｉｏｎ　ｐｏｔｅｎｔｉａｌ　ｄｕｒａｔｉｏｎ）を測定した。コントロールの試験では、運動試験および虚血試験の間、１９匹のイヌのうち１３匹が心室性細動（ＶＦ）を有したが、６匹は有さなかった。引き続く運動試験の間、高リスク動物のうち８２％（１３匹のうち１１匹）でエルセンチリドは、ＶＦを防止し、そして最初の試験で、不整脈なしの６匹のイヌでは不整脈促進（ｐｒｏ−ａｒｒｈｙｔｈｍｉｃ）効果を示さなかった。エルセンチリドは、運動の全てのレベルにおいて、そして急性心筋虚血の間、心拍数を低下させた。抗細動性効果は、心房ペーシングによってコントロールレベルに心拍数を維持した４匹のイヌのうち３匹で維持された。エルセンチリドはまた、３６０ｍｓ長の周期で３０％まで（１７９＋／−６ｍｓ〜２３３＋／−５ｍｓ，ｐ＜０．００１）左心室性単相作用電位期間（ｍｏｎｏｐｈａｓｉｃ　ａｃｔｉｏｎ　ｐｏｔｅｎｔｉａｌ　ｄｕｒａｔｉｏｎ）を延長し、そして交感神経刺激の間のその期間の短縮を妨げることが見出された。従って、これらの著者らは、エルセンチリドを用いた、ＩＫｒおよび弱いβアドレナリン作動性ブロックの組み合わせが、非常に効果的であり、そして安全な抗不整脈介入であって、どのような抗アドレナリン作動性効果の薬物がないことにおける限界をも克服し得ると結論した。このような組み合わせは、不整脈の危険性が高い、心筋梗塞後患者の管理において非常に有用であり得る。
【００１４】
ＮａｉｒおよびＧｒａｎｔ（１９９７．Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ　Ｄｒｕｇｓ　Ｔｈｅｒ．１１（２）：１４９−１６７）は、抗不整脈薬を概説する。低い副作用プロフィールを維持しながら悪性心室不整脈に対して効果的な抗不整脈剤を開発することの最終目的は、つかみ所がないままとして評価された。この研究において、クラスＩＩＩ薬物、アミオダロンおよびソタロールは、最良の利用可能な薬剤とみなされた。しかし、両薬物は、純粋なクラスＩＩＩの効果の範囲以外の特性を保持し、そしてこれらの使用は、種々の用量関連副作用によって限定される。現在開発中であるより選択的なクラスＩＩＩ特性を有するいくつかの薬物が、存在する。
【００１５】
ＮａｉｒおよびＧｒａｎｔ（１９９７）による上述の概説には、最適な特徴である有効な理論クラスＩＩＩ薬物に関する概観、および活発な調査の下にある多数のクラスＩＩＩ薬物の特性に関する要旨が提供される。内曲不整脈に対する理想的なクラスＩＩＩ抗不整脈剤は、遅延した発症および急速なオフセットの動力学を伴う用量依存の延長の作用ポテンシャル期間を提供するべきである。この薬物は、遅延した作用の発症、および生理学的心臓速度の回復に対するその効果の急速な分解を伴って、心室頻脈または細動の間に達成される急速な心臓速度で、選択的に心臓組織の難治性期間を延長する。正常または遅延した心臓速度での難治性期間に対する影響をほとんど伴わずに、トルサード・ド・ポアントを誘導する能力は減少される。これらの理想的な特性と対照的に、最近利用可能な治験薬は、作用ポテンシャル期間に対して逆の用量依存効果を有し、より遅延した心臓速度で難治性期間に最も効果を与える。この特性は、ある部分、遅延した整流カリウムチャネル（ｒｅｃｔｉｆｉｅｒ　ｐｏｔａｓｓｉｕｍ　ｃｈａｎｎｅｌ）（ＩＫｒ）の急速に活性化している成分の優先的なブロックから生じ、ゆっくりと活性化する成分（ＩＫ）にほとんどまたは全く影響を与えない。ＩＫを選択的にブロックする好ましいブロック動力学を有する薬物の開発は、有効な抗不整脈特性を維持しながら、より低い前不整脈事象（ｐｒｏａｒｒｈｙｔｈｍｉｃ　ｅｖｅｎｔ）を引き起こし得る。
【００１６】
（タンパク質ホスファターゼＩ）
タンパク質ホスファターゼ１は、グリコーゲン代謝における重要な酵素（これには、ホスホリラーゼｂ、グリコーゲンシンターゼおよびホスホリラーゼキナーゼが挙げられる）の局在ための足場として作用すると考えられる。この酵素は、インスリン感受性組織に優先的に発現され、そしてインタクトな細胞におけるグリコーゲン蓄積のホルモンコントロールを媒介することが見出された。
【００１７】
肝臓グリコーゲン合成は、インスリン依存性糖尿病ラットおよび副腎摘出された飢餓ラットにおいて損傷しており、そしてこれがグリコーゲンシンターゼホスファターゼによるグリコーゲンシンターゼの不完全な活性化に起因することが公知であるが、根本的な分子機構は、描かれていない。グリコーゲンシンターゼホスファターゼは、肝臓グリコーゲン結合サブユニット（ＧＬと呼ばれる）と複合体化したタンパク質ホスファターゼ１（ＰＰ１）の触媒サブユニットを含む。インスリン依存性糖尿病ラットおよび副腎摘出された飢餓ラットの肝臓抽出物において、ＧＬレベルは、免疫ブロッティングによって、コントロール抽出物のレベルと比較して実質的に減少されたことが示されたが、一方、ＰＰ１触媒サブユニットのレベルは、これらの処置によって影響されなかった。Ｄｏｈｅｒｔｙら、１９９８、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３３３：２５３−２５７を参照のこと。糖尿病マウスへのインスリン投与は、ＧＬレベルを回復させ、そして延長投与は、このレベルをコントロールレベルよりも上昇させ、一方、再給餌は、副腎摘出された飢餓ラットにおけるＧＬレベルを部分的に回復させた。インスリンおよび飢餓／給餌によるＧＬタンパク質レベルの調節は、ＧＬ　ｍＲＮＡレベルにおける変化と相関することが示され、これは、インスリンによる肝臓グリコーゲン関連形態のＰＰ１の長期調節、故に肝臓グリコーゲンシンターゼの活性が、主にＧＬ　ｍＲＮＡレベルの変化を介して媒介されることを示す（ＰＭＩＤ：９６５７９６３、ＵＩ：９８３２４８８４）。
【００１８】
（レチノール結合タンパク質）
レチノール結合タンパク質（ＲＢＰ）は、血液中のレチノール（ビタミンＡ１）の特定のキャリアである。血液中の低いＲＢＰレベルは、角膜軟化症患者中の低い血清レチノールレベルと関連することが見出された。家族性ハイポ−ＲＢ蛋白血症は、良好な栄養にもかかわらず、はしか感染の間に発端者の子供を角膜軟化症にかかりやすくすることが見出された。例えば、Ａｔｔａｒｄ−Ｍｏｎｔａｌｔｏらは、掌、足の裏、および顔に間欠性オレンジ変色を有し、そしてビタミンＡおよび血清特異的レチノール結合タンパク質の両方の持続した低いレベルと関連するカロチン血症を有する少女を記載する。これらの著者らは、低い血清レチノール結合タンパク質濃度が、肝臓によるビタミンＡの遅延した取り込みおよび放出を引き起こすと仮定した。カロチンのビタミンＡへの変換は、結果的に阻害され、そしてこれが、過剰カロチン血症を引き起こす。ビタミンＡ補給は、血清ビタミンＡ濃度を上昇し得ず、そしてカロチン血症を軽減しなかった。
【００１９】
Ｓｅｅｌｉｇｅｒらは、レチノール結合タンパク質合成の遺伝性欠損に起因した、レチノール欠損における目の表現型を報告した。２人の冒された姉妹（年齢１７歳および１３歳）は、ＲＢＰ４遺伝子におけるミスセンス変異に関して複合ヘテロ接合体であった。この冒された姉妹の各々は、幼少初期から夜間視力の問題を有していたが、そうでなけでば良好であった。視力は、１７歳では２０／４０にそして１３歳では２０／２５にわずかに減少した。この冒された姉妹の各々は、検出可能な血清ＲＢＰおよび正常なレチニルエステルを有さず、レチノールレベルは、正常の２０％未満であった。
【００２０】
ＲＢＰ遺伝子は、第１０染色体の長いアームにマップされ、そしてウシβラクトグロブリンと相同である。
【００２１】
（発明の要旨）
本発明は、一部、新規ポリペプチドをコードする新規ポリヌクレオチド配列の発見に基づく。これらのポリペプチドをコードする核酸、ならびにその誘導体およびフラグメントは、本明細書中以後に、集合的に「ＭＥＭＸ」として示される。
【００２２】
従って、１つの局面において、本発明は、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、もしくは１５の配列、またはこれらのフラグメント、ホモログ、アナログ、もしくは誘導体を含む、単離された核酸分子を提供する。この核酸分子としては、例えば、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４または１６のアミノ酸配列を含むポリペプチドに少なくとも８０％同一であるポリペプチドをコードする核酸配列が挙げられ得る。この核酸は、例えば、ゲノムＤＮＡフラグメント、またはｃＤＮＡ分子であり得る。
【００２３】
本明細書中に記載される１つ以上の核酸を含むベクター、および本明細書中に記載されるベクターまたは核酸を含む細胞が、本発明にまた、含まれる。
【００２４】
本発明はまた、上記の核酸分子のいずれかを含むベクターで形質転換された宿主細胞に関する。
【００２５】
別の局面において、本発明は、ＭＥＭＸ核酸および薬学的に受容可能なキャリアまたは希釈剤を含む薬学的組成物を含む。
【００２６】
さらなる局面において、本発明は、実質的に精製されたＭＥＭＸポリペプチド（例えば、ＭＥＭＸ核酸によってコードされる任意のＭＥＭＸポリペプチド、ならびにそのフラグメント、ホモログ、アナログ、および誘導体）を含む。本発明はまた、ＭＥＭＸポリペプチドおよび薬学的に受容可能なキャリアまたは希釈剤を含む薬学的組成物を含む。
【００２７】
なおさらなる局面において、本発明は、ＭＥＭＸポリペプチドに特異的に結合する抗体を提供する。この抗体は、例えば、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体、ならびにこれらのフラグメント、ホモログ、アナログ、および誘導体であり得る。本発明はまた、ＭＥＭＸ抗体および薬学的に受容可能なキャリアまたは希釈剤を含む薬学的組成物を含む。本発明はまた、上記の核酸分子のいずれかによってコードされるポリペプチド上のエピトープに結合する単離された抗体に関する。
【００２８】
本発明はまた、上記の薬学的組成物のいずれかを含むキットを含む。
【００２９】
本発明はさらに、ＭＥＭＸ核酸（例えば、ＭＥＭＸ核酸を含むベクター）を含む細胞を提供する工程、およびこの核酸によってコードされるＭＥＭＸポリペプチドを発現するのに十分な条件下で細胞を培養する工程によって、ＭＥＭＸポリペプチドを産生する方法を提供する。この発現されたＭＥＭＸポリペプチドは、次いで、細胞から収集される。好ましくは、この細胞は、内在性ＭＥＭＸポリペプチドをほとんどまたは全く産生しない。この細胞は、例えば、原核生物細胞または真核生物細胞であり得る。
【００３０】
本発明はまた、サンプル中のＭＥＭＸポリペプチドまたは核酸を、そのサンプルを、そのポリペプチドもしくは核酸に特異的に結合する化合物と接触させること、およびもし存在すれば、複合体の形成を検出することによって同定する方法に関する。
【００３１】
本発明はさらに、ＭＥＭＸポリペプチドを化合物と接触させ、そしてそのＭＥＭＸポリペプチドの活性が改変されたか否かを決定することによって、ＭＥＭＸポリペプチドの活性を調節する化合物を同定する方法を提供する。
【００３２】
本発明はまた、ＭＥＭＸポリペプチドをその化合物と接触させ、そしてその化合物がＭＥＭＸポリペプチドの活性を調節するか、ＭＥＭＸポリペプチドに結合するか、それともＭＥＭＸポリペプチドをコードする核酸分子に結合するか決定することによって同定したＭＥＭＸポリペプチド活性を調節する化合物に関する。
【００３３】
別の局面において、本発明は、被験体において、ＭＥＭＸ関連障害の存在またはＭＥＭＸ関連障害に対する素因を決定する方法を提供する。その方法は、その被験体からのサンプルを提供する工程、およびその被験体サンプルにおけるＭＥＭＸポリペプチドの量を測定する工程を包含する。その被験体のサンプルにおけるＭＥＭＸポリペプチドの量は、次いで、コントロールサンプル中のＭＥＭＸポリペプチドの量と比較される。その被験体タンパク質サンプル中のＭＥＭＸポリペプチドの量における、コントロールタンパク質サンプル中のＭＥＭＸポリペプチドの量に比較しての変更は、その被験体が、組織増殖関連状態を有することを示す。コントロールサンプルは、好ましくは、整合した個体（すなわち、同様の年齢、性、その他の一般的条件の個体であるが、組織増殖関連状態を有すると疑われていない個体）から得られる。あるいは、そのコントロールサンプルは、その被験体が組織増殖関連状態を有すると疑われないときの時点で、被験体から得られ得る。いくつかの実施形態において、ＭＥＭＸは、ＭＥＭＸ抗体を使用して検出される。
【００３４】
さらなる局面において、本発明は、被験体において、ＭＥＭＸ関連障害の存在、またはＭＥＭＸ関連障害に対する素因を決定する方法を提供する。その方法は、被験体からの核酸サンプル（例えば、ＲＮＡもしくはＤＮＡ、またはその両方）を提供する工程、およびその被験体の核酸サンプル中のＭＥＭＸ核酸の量を測定する工程を包含する。その被験体核酸中のＭＥＭＸ核酸サンプルの量は、次いで、コントロールサンプル中のＭＥＭＸ核酸の量と比較される。コントロールサンプル中のＭＥＭＸの量と比較してのサンプル中のＭＥＭＸ核酸の量の変化は、その被験体が組織増殖関連状態を有することを示す。
【００３５】
なおさらなる局面において、本発明は、ＭＥＭＸ関連障害を処置または予防または遅延するための方法を提供する。その方法は、そのような処置または予防または遅延が所望される被験体に、ＭＥＭＸ核酸、ＭＥＭＸポリペプチド、またはＭＥＭＸ抗体を、被験体における組織増殖関連状態を処置、予防、遅延するために十分な量で投与する工程を包含する。
【００３６】
特に規定されない限り、本明細書において使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する当業者に一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと類似かまたは等価な方法および材料が、本発明の実施または試験において使用され得るが、適切な方法および材料が以下に記載される。本明細書において言及される全ての刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献は、その全体が参考として本明細書において援用される。矛盾する場合には、定義を含めて本明細書が支配する。さらに、材料、方法、および実施例は、例示のみであって、限定することを意図しない。
【００３７】
本発明のその他の特徴および利点は、以下の詳細な説明、および特許請求の範囲から明らかである。
【００３８】
（発明の詳細な説明）
本発明は、新規ヌクレオチドおよびそれによってコードされるポリペプチドを提供する。本発明には、新規核酸配列およびこれらのポリペプチドが含まれる。これらの配列を、包括的に「ＭＥＭＸ核酸」または「ＭＥＭＸポリヌクレオチド」と称し、そして対応するコードされるポリペプチドを、「ＭＥＭＸポリペプチド」または「ＭＥＭＸタンパク質」と称する。他に示さない限り、「ＭＥＭＸ」とは、本明細書中に開示される新規な配列のいずれかをいうことを意味する。表１は、ＭＥＭＸ核酸およびこれらにコードされるポリペプチドの要約を提供する。
【００３９】
【表１】
2004509602.tif 000003
ＭＥＭＸ核酸およびこれらにコードされるポリペプチドは、種々の用途および関連において有用である。本発明による種々のＭＥＭＸの核酸およびポリペプチドは、ドメインの存在、および以前に記載されたタンパク質に対する配列関連性に従うタンパク質ファミリーのメンバーとして有用である。さらに、ＭＥＭＸ核酸およびポリペプチドはまた、ＭＥＭＸポリペプチドが属するファミリーのメンバーであるタンパク質を同定するために使用され得る。
【００４０】
例えば、ＭＥＭ１は、７回膜貫通受容体タンパク質ファミリーのタンパク質のメンバーに相同である。従って、ＭＥＭ１核酸およびポリペプチド、抗体および本発明に従う関連する化合物は、免疫治療、ウイルス感染、神経学的障害（例えば、アルツハイマー病またはパーキンソン病）、癌（例えば、乳房または神経芽細胞腫）、腎臓病学、および雌性生殖の健康における治療的および診断的適用において有用である。
【００４１】
ＭＥＭ２、ＭＥＭ３およびＭＥＭ４は、Ｇｌｕｔａｍａｔｅ　Ｒｅｃｅｐｔｏｒファミリーのタンパク質のメンバーに相同的である。従って、本発明に従う、ＭＥＭ２〜ＭＥＭ４の核酸およびポリペプチド、抗体および関連分子は、肺および／または脳に標的化される治療および診断適用において、有用である。脳において、それは、精神分裂病を処置するか、または頭部損傷に続く神経損傷を減少するための標的レセプターとして機能し得る。
【００４２】
ＭＥＭ５は、Ｐｏｔａｓｓｉｕｍ　Ｃｈａｎｎｅｌ　Ｐｒｏｔｅｉｎファミリーのタンパク質のメンバーに相同的である。従って、本発明に従う、ＭＥＭ５核酸およびポリペプチド、抗体ならびに関連化合物は、心臓およびタンパク質の筋肉障害の処置（例えば、抗不整脈薬剤）、凝固不全における、不完全に凝固する第ＸＩ因子の補充、およびコバラミン不全（例えば、悪性貧血）における治療的および診断的適用において有用である。
【００４３】
ＭＥＭ６は、Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ　Ｉ　Ｐｒｏｔｅｉｎファミリーのタンパク質のメンバーに相同的である。従って、本発明に従うＭＥＭ６核酸およびポリペプチド、抗体ならびに関連分子は、糖尿病およびグリコゲン代謝の調節不全に由来する関連障害の処置における治療および診断適用において有用である。
【００４４】
ＭＥＭ７およびＭＥＭ８は、Ｒｅｔｉｎｏｌ−Ｂｉｎｄｉｎｇ　Ｐｒｏｔｅｉｎファミリーのタンパク質のメンバーに対して相同的である。従って、本発明に従う、ＭＥＭ７およびＭＥＭ８核酸およびポリペプチド、抗体ならびに関連分子は、視覚関連障害（例えば、角膜軟化症）、ならびに癌および／または類似の腫瘍性病状の処置における治療および診断適用において有用である。
【００４５】
ＭＥＭＸ核酸およびポリペプチドはまた、ＭＥＭＸ活性または機能を阻害または増強する分子についてスクリーニングするために使用され得る。本発明に従うＭＥＭＸ核酸およびポリペプチドについてのさらなる利用が、本明細書中に開示される。
【００４６】
（ＭＥＭ１）
本発明に従うＭＥＭ１配列は、７回膜貫通レセプターファミリーのタンパク質に関連するポリペプチドをコードする核酸配列を含む。７回膜貫通レセプタータンパク質に類似する新規なタンパク質をコードする新規な核酸（ＣｕｒａＧｅｎ　ＡＣＣ番号ＡＬ０２１３９２、ＡＬ０３１５８８およびＡＬ０３１５９７と称される）のヌクレオチド配列［配列番号１］が図１に示される。オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）が、ａｔｇ開始コドンで始まり、そしてｔｇａ終止コドンで終わることが同定された。開始コドンから上流にあり、そして終止コドンから下流にある推定未翻訳領域が、下線によって示され、そして開始コドンおよび終止コドンが太文字で示される。コードされたタンパク質のアミノ酸配列［配列番号２］が、図２に一文字表記で表される。
【００４７】
核酸配列データベースのＢｌａｓｔＮ検索において（図３を参照のこと）、例えば、ＭＥＭ１核酸配列は、以下を含む配列（ＨＳ１１６３Ｊ１と称される）とに対して陽性である、２１８塩基のうちの２０３塩基（９３％）および、それに同一な、２１８塩基のうちの２０３塩基（９３％）を有する：マウスＣｅｌｓｒ１およびラットＭＥＧＦ２に類似なタンパク質を含む新規なＫＩＡＡ０２７９様ＥＧＦ様ドメインについての遺伝子の３’領域；Ｃ．ｅｌｅｇｅｎｓ　Ｂ００３５．１６および細菌ｔＲＮＡ（５’−メチルアミノメチル−２−チオウリジレート）−メチルトランスフェラーゼに類似するタンパク質についての新規な遺伝子；ならびにマウスＢ９９に類似するタンパク質についての新規な遺伝子の３’領域。
【００４８】
アミノ酸データベースの検索において、本発明のＭＥＭ１タンパク質は、７回膜貫通レセプタータンパク質前駆体ＭｏｕｓｅＡ（ｐｔｎｒ：ＰＩＲ−ＩＤ：Ｔ１４１１９、図４を参照のこと）と陽性である、１８６アミノ酸残基のうちの１７２残基（９１％）およびそれに同一な、１８６残基のうちの１６２残基（８７％）を有し、この７回膜貫通レセプタータンパク質前駆体ＭｏｕｓｅＡは、マウスにおける胚形成の間に発現される７回膜貫通レセプタータンパク質のＣｅｌｓｒファミリーのメンバーである。ＢｌａｓｔＰ検索において（図５を参照のこと）、本発明のタンパク質は、７回膜貫通レセプタータンパク質前駆体ＭｏｕｓｅＡのアミノ酸残基と陽性である、２６３２アミノ酸残基のうちの２３４５残基（８９％）およびそれに同一な、２６３２残基のうちの２１３９残基（８１％）を有することが見出された。
【００４９】
多重配列整列が図６に示され、関連配列と本発明のタンパク質を比較するＣｌｕｓｔａｌＷ分析において、本発明のタンパク質がライン２に示される。
【００５０】
７回膜貫通レセプターファミリーのタンパク質に類似するタンパク質をコードする本発明の新規な核酸は、その配列［配列番号１］が図１に提供される核酸、またはそのフラグメントを含む。本発明はまた、その塩基のいずれかが、図１に示される対応する塩基から変化され得るが、そのレチノール結合活性および生理学的機能を維持するタンパク質をなおもコードする変異体または改変体核酸、またはこのような核酸のフラグメントを含む。本発明はさらに、その配列がたった今記述された配列に相補的である核酸を含み、これは、たった今記述された核酸のいずれかに相補的な核酸フラグメントを含む。本発明はさらに、その構造が化学改変を含む、核酸または核酸フラグメント、あるいはその相補体を含む。このような改変は、非限定的な例として、改変塩基、およびその糖ホスフェート骨格が改変または誘導体化される核酸を含む。これらの改変は、少なくとも部分的に、改変された核酸の化学的安定性を増強するために実施され、その結果、それらは、例えば、被験体での治療適用におけるアンチセンス結合核酸として使用され得る。変異体または改変体核酸、およびそれらの相補体において、２０％以上までの塩基がそのように変化され得る。
【００５１】
本発明の新規なタンパク質は、その配列［配列番号２］が図２に提供される７回膜貫通レセプタータンパク質に類似するタンパク質を含む。本発明はまた、その残基のいずれかが、図２に示される対応する残基から変化され得るが、そのレチノール結合活性および生理学的機能に類似するタンパク質を維持するタンパク質をなおもコードする変異体または改変体タンパク質、またはその機能的フラグメントを含む。変異体または改変体タンパク質において、２０％以上までの残基がそのように変化され得る。本発明はさらに、本発明のタンパク質のいずれかに免疫特異的に結合する抗体および抗体フラグメント（例えば、Ｆａｂまたは（Ｆａｂ）２など）を包含する。
【００５２】
（ＭＥＭ２、ＭＥＭ３、およびＭＥＭ４）
本発明に従うＭＥＭ２、ＭＥＭ３、およびＭＥＭ４配列は、ヒトグルタメートレセプターファミリーのタンパク質に関連するポリペプチドをコードする核酸を含む。ヒトグルタメートレセプターＭＥＭ２（Ｉｎｔｅｒｎａｌ同定番号２１６５９２５９　ＥＸＴ　１）；ＭＥＭ３（Ｉｎｔｅｒｎａｌ同定番号２１６５９２５９　ＥＸＴ　２）；およびＭＥＭ４（Ｉｎｔｅｒｎａｌ同定番号２１６５９２５９　ＥＸＴ　３）の３つの改変体が、本発明において開示される。これらの異なる配列は、明らかに、核酸レベルでのスプライス改変体（または類似の欠失）から生じ、そして以前に報告されたグルタメートレセプター（ＳＰＴＲＥＭＢＬ−ＡＣＣ：Ｏ６０３９１）の肺特異的なスプライス形態と類似する。３つのスプライス改変体の各々を以下に議論する。
【００５３】
（スプライス改変体２１６５９２５９　ＥＸＴ　１（ＭＥＭ２））
本発明のＭＥＭ２（Ｉｎｔｅｒｎａｌ　Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ番号２１６５９２５９　ＥＸＴ　１）の１つのスプライス改変体のヌクレオチド配列が、図７［配列番号３］に示される。オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）が、ａｔｇ開始コドンで始まり、そしてｔｇａ終止コドンで終わることが同定された。開始コドンおよび終止コドンが、太文字で示される。コードされたタンパク質が、図８［配列番号４］に一文字アミノ酸表記を使用して示される。
【００５４】
このスプライス改変体において、差異がアミノ酸残基３６０に見出され、ここで、７３個のアミノ酸残基が、欠失されることが示された（すなわち「スプライスアウト」）。これらのアミノ酸残基はまた、最も良好なＢｌａｓｔ−Ｘタンパク質適合（ＳＰＴＲＥＭＢＬ−ＡＣＣ：Ｏ６０３９１）に存在する。これらの７３アミノ酸残基がまた、ヒト脳由来の報告されたグルタメートレセプター（ＳＷＩＳＳＰＲＯＴ−ＡＣＣ：Ｑ１４９５７）においてスプライスアウトされることに注意することは重要である。従って、この改変体は、肺および脳の両方に存在するグルタメートレセプターのアイソフォームを表し得る。
【００５５】
本発明の２１６５９２５９　ＥＸＴ　１のアセンブリを導くＢＬＡＳＴ比較が図９に示される。上記のように、本発明の配列は、ゲノム配列（ＳＰＴＲＥＭＢＬ−ＡＣＣ：Ｏ６０３９１）と適合する。これらの配列の構築および確認において、１つの修正が、ＳｅｑＣａｌｌｉｎｇＴＭアセンブリについてなされ、これは、個のアセンブリのヌクレオチド１０４にＧを加えた。配列決定微量出現（ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　ｔｒａｃｅ　ａｐｐｅａｒａｎｃｅ）はまた、別のＧが、塩基対１０４でこの配列に存在しうることを示唆することに注意した。さらに、Ｇを加えることは、タンパク質におけるフレームシフトを補正し、そして他の報告されたレセプターとのより良好なＢｌａｓｔ−Ｘ適合を生じた。この遺伝子２１６５９２５９　ＥＸＴ　１は、以前に報告された遺伝子（ＳＰＴＲＥＭＢＬ−ＡＣＣ：Ｏ６０３９１）とは異なる。公的なデータベースにおけるタンパク質（ＳＰＴＲＥＭＢＬ−ＡＣＣ：Ｏ６０３９１）は、本発明の２１６５９２５９　ＥＸＴ　１配列において失われた７３アミノ酸を含む。本発明で開示されたアセンブリ（２１６５９２５９　ＥＸＴ　１）（これは、胎児肺組織由来である）は、報告されたタンパク質のスプライス改変体を表す。これは、ゲノム配列（ＧＥＮＢＡＮＫ−ＩＤ：ＡＣ００４５２８）の塩基２２８０６〜２３０２５の省略を表す。
【００５６】
公的なデータベースにおけるタンパク質（ＳＰＴＲＥＭＢＬ−ＡＣＣ：Ｏ６０３９１）はさらに、ゲノム配列（ＧＥＮＢＡＮＫ−ＩＤ：ＡＣ００４５２８）のエキソン（すなわち、塩基対２５８５５−２６０００）の開始において、６個のアミノ酸残基を含む。本発明で開示された配列において、しかし、同じエキソンは、塩基対２５８７３〜２６０００ｂｐの間の領域のみを含み、そしてゲノム配列の塩基対２５８５５〜２５８７３の間に存在する１８のヌクレオチドを含まない。従って、本発明のタンパク質改変体２１６５９２５９　ＥＸＴ　１は、ヒトおよびラットの参照配列に存在し、これらの失われた塩基によってコードされる、６個のアミノ酸を欠く。
【００５７】
さらに、公的なデータベースに見出されるタンパク質（ＳＰＴＲＥＭＢＬ−ＡＣＣ：Ｏ６０３９１）はまた、本発明において、ＧｅｎＳｃａｎによって予測される４３０ｂｐを含む最後のエキソンを欠く。このエキソンは、終止コドンＴＧＡで終わる。改変体２１６５９２５９　ＥＸＴ　１を同定する際に使用されるＢＬＡＳＴＸ比較が図１０に示される。
【００５８】
改変体２１６５９２５９　ＥＸＴ　１の多重配列整列が図１１に示され、関連配列と本発明のタンパク質を比較するＣｌｕｓｔａｌＷ分析において、本発明のタンパク質がライン３に示される。７３残基および６残基の欠失が示され、これはＣ末端伸長である。
【００５９】
（スプライス改変体２１５９６２５９　ＥＸＴ　２（ＮＥＭ３））
本発明の第二のスプライス改変体であるＭＥＭ３（Ｉｎｔｅｒｎａｌ　Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ番号２１６５９２５９　ＥＸＴ　２）のヌクレオチド配列［配列番号５］が図１２に示される。オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）は、ａｔｇ開始コドンで始まり、そしてｔｇａ終止コドンで終わることが同定された。開始コドンおよび終止コドンが、太文字で示される。コードされたタンパク質［配列番号６］が、図１３に一文字アミノ酸表記を使用して示される。
【００６０】
ＭＥＭ２（２１６５９２５９　ＥＸＴ　１改変体）に見出される３つの特徴の２つはまた、このスプライス改変体とともに存在することが示された。しかし、ＭＥＭ２（２１６５９２５９　ＥＸＴ　１）について注意された１８ヌクレチドの省略は、このフラグメントが種々のグルタメートレセプターに存在するという事実の観点から含まれるべきであることが考えられた。従って、これらのヌクレオチドによってコードされたアミノ酸は、この改変体のアミノ酸配列に含まれる。
【００６１】
本発明の２１６５９２５９　ＥＸＴ　２改変体のアセンブリに導くＢＬＡＳＴＮ比較が、図１４に含まれる。改変体２１６５９２５９　ＥＸＴ　２を同定する際に使用されるＢＬＡＳＴＸ比較が、図１５に示される。
【００６２】
図１６に与えられる多重配列整列は、ＭＥＭ３改変体２１６５９２５９　ＥＸＴ　２の多重配列整列であり、関連配列と本発明のタンパク質を比較するＣｌｕｓｔａｌＷ分析において、本発明のタンパク質がライン３に示される。７３残基の欠失が示され、これはカルボキシル末端伸長である。
【００６３】
（スプライス改変体２１５９６２５９　ＥＸＴ　３（ＭＥＭ４））
本発明の第三のスプライス改変体であるＭＥＭ４（Ｉｎｔｅｒｎａｌ　Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ番号２１６５９２５９　ＥＸＴ　３）のヌクレオチド配列［配列番号７］が図１７のヌクレチド配列に示される。オープンリーディングフレームは、ａｔｇ開始コドンで始まり、そしてｔｇａ終止コドンで終わることが同定された。開始コドンおよび終止コドンは、太文字である。コードされたタンパク質のアミノ酸配列［配列番号８］が、図１８に一文字表記を使用して示される。
【００６４】
ＭＥＭ２（２１６５９２５９　ＥＸＴ　１）に見出される３つの特徴のうちの１つはまた、この改変体に生じる。このフラグメントが種々のグルタメートレセプターに存在することが示されているという事実のために、ＭＥＭ２（２１６５９２５９　ＥＸＴ　１）について注意された１８ヌクレオチドの省略、ならびに７３アミノ酸の欠失の両方は、このスプライス改変体の配列に含まれた。従って、この欠失によって表されるアミノ酸配列は、この改変体のアミノ酸配列に含まれる。
【００６５】
ＭＥＭ４のアセンブリに導くＢＬＡＳＴＮ比較が、図１９に示される；ＭＥＭ４を同定する際に使用されるＢＬＡＳＴＸ比較が、図２０に示される。ＳＰＴＲＥＭＢＬ−ＡＣＣ：Ｏ６０３９１配列の９０１残基のうちの９００についての適合が、２１６５９２５９　ＥＸＴ　３の配列と１００％同一であるが、公的なタンパク質（ＳＰＴＲＥＭＢＬ−ＡＣＣ：Ｏ６０３９１）は、本発明のスプライス改変体に含まれる末端の１４３アミノ酸を欠くことが見出されている。
【００６６】
改変体２１６５９２５９　ＥＸＴ　３と関連タンパク質配列を比較するＣｌｕｓｔａｌＷ分析が図２１に示され、本発明のタンパク質がライン３に示される。さらに、カルボキシル末端伸長が示される。
【００６７】
本発明のＭＥＭ２、ＭＥＭ３およびＭＥＭ４（すなわち、２１６５９２５９　ＥＸＴ　１；２１６５９２５９　ＥＸＴ　２；および２１６５９２５９　ＥＸＴ　３）の３つのスプライス改変体の比較整列が、図２２に示される。
【００６８】
グルタメートレセプターをコードする本発明の新規な核酸は、その配列が、図７［配列番号３］；図１２［配列番号５］；および図１７［配列番号７］に提供される核酸、またはそのフラグメントを含む。本発明はまた、その塩基のいずれかが、図７、１２および１７に示される対応する塩基から変化され得るが、そのグルタメート様レセプター活性および生理学的機能を維持するタンパク質をなおもコードする変異体または改変体核酸、またはこのような核酸のフラグメントを含む。本発明はさらに、その配列がたった今記述された配列に相補的である核酸を含み、これは、たった今記述された核酸のいずれかに相補的な核酸フラグメントを含む。本発明はさらに、その構造が化学改変を含む、核酸または核酸フラグメント、あるいはその相補体を含む。このような改変は、非限定的な例として、改変塩基、およびその糖ホスフェート骨格が改変または誘導体化される核酸を含む。これらの改変は、少なくとも部分的に、改変された核酸の化学的安定性を増強するために実施され、その結果、それらは、例えば、被験体での治療適用におけるアンチセンス結合核酸として使用され得る。変異体または改変体核酸、およびそれらの相補体において、２０％以上までの塩基がそのように変化され得る。
【００６９】
本発明の新規なタンパク質は、以下のタンパク質を含む：図８［配列番号４］；図１３［配列番号６］；および図１８［配列番号８］。本発明はまた、その残基のいずれかが、図８、図１３および図１８に示される対応する残基から変化され得るが、そのグルタメート様レセプター活性および生理学的機能を維持するタンパク質をなおもコードする変異体または改変体タンパク質、またはその機能的フラグメントを含む。変異体または改変体タンパク質において、２０％以上までの残基がそのように変化され得る。本発明はさらに、本発明のタンパク質のいずれかに免疫特異的に結合する抗体および抗体フラグメント（例えば、Ｆａｂまたは（Ｆａｂ）２など）を包含する。
【００７０】
（ＭＥＭ５）
本発明に従うＭＥＭ５配列は、カリウムチャネルタンパク質に関連するポリペプチドをコードする核酸配列を含む。イオンチャネル様タンパク質をコードする１１１０ヌクレオチド（Ｉｎｔｅｒｎａｌ　Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ番号１６４１８８４＿ＥＸＴ）の新規なヌクレオチド配列［配列番号９］が図２３に示される。８２８ヌクレオチドのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）は、ａｔｇ開始コドンで始まり、そしてｔｇａ終止コドンで終わることが同定された（図２３［配列番号９］を参照のこと）。推定未翻訳領域（一方は、開始コドンから上流、そして他方は終止コドンの下流）が、図２３の下線によって示されるが、開始コドンおよび終止コドンは、太文字である。２７５アミノ酸残基を含むコードされたタンパク質の配列［配列番号１０］が、図２４に一文字アミノ酸表記を使用して示される。
【００７１】
配列データベース（図２５を参照のこと）の検索において、例えば、本発明のタンパク質の核酸配列が、ヒトカリウムチャネルタンパク質Ｋ＋Ｈｎｏｖ４２（ｐａｔｐ：Ｙ３４１３０；国際公開番号ＷＯ９９４３６９６　Ａ１を参照のこと）に同一である、２８６アミノ酸残基のうちの２８６残基（１００％）およびそれと陽性である２８６アミノ酸残基のうちの２８６残基（１００％）を有することが見出されたことが見出された。
【００７２】
疎水性プロットは、本発明のタンパク質が、短いＮ末端の親水性配列（１〜４４ａａ）、続いて疎水性領域（４１〜６５ａａ、ピークの疎水性＝１）、続いて親水性Ｃ末端を有することを示す。ＳｉｇｎａｌＰ分析は、シグナルペプチドが存在しないことを示唆するが、４１〜６５の疎水性部分が、それにも関わらず、切断可能なシグナルペプチドであり得る。
【００７３】
本発明の新規な核酸は、その配列［配列番号９］が、図２３に提供される核酸、またはそのフラグメントを含む。本発明はまた、その塩基のいずれかが、図２３に示される対応する塩基から変化され得るが、その活性および生理学的機能を維持するタンパク質をなおもコードする変異体または改変体核酸、またはこのような核酸のフラグメントを含む。本発明はさらに、その配列がたった今記述された配列に相補的である核酸を含み、これは、たった今記述された核酸のいずれかに相補的な核酸フラグメントを含む。本発明はさらに、その構造が化学改変を含む、核酸または核酸フラグメント、あるいはその相補体を含む。このような改変は、非限定的な例として、改変塩基、およびその糖ホスフェート骨格が改変または誘導体化される核酸を含む。これらの改変は、少なくとも部分的に、改変された核酸の化学的安定性を増強するために実施され、その結果、それらは、例えば、被験体での治療適用におけるアンチセンス結合核酸として使用され得る。変異体または改変体核酸、およびそれらの相補体において、２０％以上までの塩基がそのように変化され得る。
【００７４】
本発明の新規なタンパク質は、その配列［配列番号１０］が図２４に提供されるタンパク質を含む。本発明はまた、その残基のいずれかが、図２４に示される対応する残基から変化され得るが、そのカリウムチャネル活性および生理学的機能を維持するタンパク質をなおもコードする変異体または改変体タンパク質、またはその機能的フラグメントを含む。変異体または改変体タンパク質において、２０％以上までの残基がそのように変化され得る。本発明はさらに、本発明のタンパク質のいずれかに免疫特異的に結合する抗体および抗体フラグメント（例えば、Ｆａｂまたは（Ｆａｂ）２など）を包含する。
【００７５】
（ＭＥＭ６）
本発明に従うＭＥＭ６配列は、グリコゲンに結合する、ホスファターゼ１タンパク質ファミリーに関連するポリペプチドをコードする核酸配列を含む。グリコゲン結合タンパク質ホスファターゼ１様タンパク質をコードする新規な核酸（Ｉｎｔｅｒｎａｌ　Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ番号ＡＣ０１６４８５＿Ａ）のヌクレオチド配列［配列番号１１］が図２６に示される。オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）は、ａｔｇ開始コドンで始まり、そしてｔｇａ終止コドンで終わることが同定された。開始コドンから上流にあり、そして終止コドンから下流にある推定未翻訳領域が、下線によって示され、そして開始コドンおよび終止コドンが、太文字で示される。コードされたタンパク質のアミノ酸配列［配列番号１２］が、図２７に一文字表記を使用して示される。
【００７６】
配列データベースの検索において、例えば、核酸配列［配列番号１１］は、タンパク質ホスファターゼ１（ＧＬ−サブユニット）（ＧＥＮＢＡＮＫ−ＩＤ：Ｙ１８２０８；図２８を参照のこと）に対するラットｍＲＮＡと同一である、９０３アミノ酸残基のうちの７６３残基（８４％）を有することが見出された。本発明のタンパク質のアミノ酸配列［配列番号１２］は、ラット由来の２８４残基の肝臓グリコゲン結合サブユニットタンパク質ホスファターゼ−１（ＡＣＣ：Ｑ６３７５９；図２９を参照のこと）と同一である、２８４アミノ酸残基のうちの２５５残基（８９％）およびそれと陽性である２８４残基のうちの２７０残基を有することが見出された。
【００７７】
多重配列整列が図３０に示され、本発明のタンパク質を関連タンパク質配列と比較するＣｌｕｓｔａｌＷ分析において、本発明のタンパク質がライン２に示される。
【００７８】
グリコゲン結合タンパク質ホスファターゼ１をコードする本発明の新規な核酸は、その配列［配列番号１１］が、図２６に提供される核酸、またはそのフラグメントを含む。本発明はまた、その塩基のいずれかが、図２６に示される対応する塩基から変化され得るが、そのグリコゲン結合タンパク質ホスファターゼ１様活性および生理学的機能を維持するタンパク質をなおもコードする変異体または改変体核酸、またはこのような核酸のフラグメントを含む。本発明はさらに、その配列がたった今記述された配列に相補的である核酸を含み、これは、たった今記述された核酸のいずれかに相補的な核酸フラグメントを含む。本発明はさらに、その構造が化学改変を含む、核酸または核酸フラグメント、あるいはその相補体を含む。このような改変は、非限定的な例として、改変塩基、およびその糖ホスフェート骨格が改変または誘導体化される核酸を含む。これらの改変は、少なくとも部分的に、改変された核酸の化学的安定性を増強するために実施され、その結果、それらは、例えば、被験体での治療適用におけるアンチセンス結合核酸として使用され得る。変異体または改変体核酸、およびそれらの相補体において、２０％以上までの塩基がそのように変化され得る。
【００７９】
本発明の新規なタンパク質は、その配列［配列番号１２］が図２７に提供されるグリコゲン結合タンパク質ホスファターゼ１様タンパク質を含む。本発明はまた、その残基のいずれかが、図２７に示される対応する残基から変化され得るが、そのグリコゲン結合タンパク質ホスファターゼ１様活性および生理学的機能を維持するタンパク質をなおもコードする変異体または改変体タンパク質、またはその機能的フラグメントを含む。変異体または改変体タンパク質において、２０％以上までの残基がそのように変化され得る。本発明はさらに、本発明のタンパク質のいずれかに免疫特異的に結合する抗体および抗体フラグメント（例えば、Ｆａｂまたは（Ｆａｂ）２など）を包含する。
【００８０】
（ＭＥＭ７）
本発明に従うＭＥＭ７配列は、レチノール結合タンパク質ファミリーに関連するポリペプチドをコードする核酸配列を含む。レチノール結合タンパク質に類似する新規なタンパク質をコードする核酸（Ｉｎｔｅｒｎａｌ　Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ番号ＡＣ０１８６５３＿Ａ）のヌクレオチド配列［配列番号１３］が図３１に示される。オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）は、ａｔｇ開始コドンで始まり、そしてｔｇａ終止コドンで終わることが同定された。開始コドンから上流にあり、そして終止コドンから下流にある推定未翻訳領域が、下線によって示され、そして開始コドンおよび終止コドンが、太文字で示される。コードされたタンパク質のアミノ酸配列［配列番号１４］が、図３２に一文字表記を使用して示される。
【００８１】
配列データベースの検索において、例えば、本発明のタンパク質のＭＥＭ７アミノ酸配列［配列番号１４］は、ヒトサイトスタチンＩタンパク質（ｐａｔｐ：Ｗ２７５６１；図３３を参照のこと）に同一である、７０アミノ酸残基のうちの６８残基（９７％）、およびそれと陽性である７０残基のうちの７０残基（１００％）を有することが見出された。
【００８２】
レチノール結合タンパク質に類似するタンパク質をコードする本発明の新規な核酸は、その配列［配列番号１３］が、図３１に提供される核酸、またはそのフラグメントを含む。本発明はまた、その塩基のいずれかが、図３１に示される対応する塩基から変化され得るが、そのレチノール結合活性および生理学的機能に類似するそのタンパク質を維持するタンパク質をなおもコードする変異体または改変体核酸、またはこのような核酸のフラグメントを含む。本発明はさらに、その配列がたった今記述された配列に相補的である核酸を含み、これは、たった今記述された核酸のいずれかに相補的な核酸フラグメントを含む。本発明はさらに、その構造が化学改変を含む、核酸または核酸フラグメント、あるいはその相補体を含む。このような改変は、非限定的な例として、改変塩基、およびその糖ホスフェート骨格が改変または誘導体化される核酸を含む。これらの改変は、少なくとも部分的に、改変された核酸の化学的安定性を増強するために実施され、その結果、それらは、例えば、被験体での治療適用におけるアンチセンス結合核酸として使用され得る。変異体または改変体核酸、およびそれらの相補体において、２０％以上までの塩基がそのように変化され得る。
【００８３】
本発明の新規なタンパク質は、その配列［配列番号１４］が図３２に提供されるレチノール結合タンパク質に類似するタンパク質を含む。本発明はまた、その残基のいずれかが、図３２に示される対応する残基から変化され得るが、レチノール結合活性およびその生理学的機能に類似するそのタンパク質を維持するタンパク質をなおもコードする変異体または改変体タンパク質、またはその機能的フラグメントを含む。変異体または改変体タンパク質において、２０％以上までの残基がそのように変化され得る。本発明はさらに、本発明のタンパク質のいずれかに免疫特異的に結合する抗体および抗体フラグメント（例えば、Ｆａｂまたは（Ｆａｂ）２など）を包含する。
【００８４】
（ＭＥＭ８）
本発明に従うＭＥＭ８配列は、レチノール結合タンパク質ファミリーに関連するポリペプチドをコードする核酸配列を含む。レチノール結合タンパク質に類似する新規なタンパク質をコードする新規な核酸（ＣｕｒａＧｅｎ　Ａｃｃ．番号ＡＣ０１８６５３Ａ＿ｄａ１）のヌクレオチド配列［配列番号１５］が図３４に示される。オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）は、ａｔｇ開始コドンで始まり、そしてｔｇａ終止コドンで終わることが同定された。開始コドンから上流にあり、そして終止コドンから下流にある推定未翻訳領域が、下線によって示され、そして開始コドンおよび終止コドンが、太文字で示される。コードされたタンパク質のアミノ酸配列［配列番号１６］が、図３５に一文字表記を使用して示される。
【００８５】
両方のデータベース分析において（図３６を参照のこと）、本発明のタンパク質のアミノ酸配列［配列番号１６］は、１３５アミノ酸残基のヒトサイトスタチンＩＩＩタンパク質（ｐａｔｐ：Ｗ３０８９１）と陽性である、１３５アミノ酸残基のうちの１３５残基（１００％）、およびそれと同一である１３５残基のうちの１３３残基（９８％）を有することが見出された。
【００８６】
多重配列整列が図３７に示され、本発明のタンパク質を関連タンパク質配列と比較するＣｌｕｓｔａｌＷ分析において、本発明のタンパク質がライン２に示される。
【００８７】
レチノール結合タンパク質に類似するタンパク質をコードする本発明の新規な核酸は、その配列［配列番号１５］が、図３４に提供される核酸、またはそのフラグメントを含む。本発明はまた、その塩基のいずれかが、図３４に示される対応する塩基から変化され得るが、そのレチノール結合活性および生理学的機能に類似するそのタンパク質を維持するタンパク質をなおもコードする変異体または改変体核酸、またはこのような核酸のフラグメントを含む。本発明はさらに、その配列がたった今記述された配列に相補的である核酸を含み、これは、たった今記述された核酸のいずれかに相補的な核酸フラグメントを含む。本発明はさらに、その構造が化学改変を含む、核酸または核酸フラグメント、あるいはその相補体を含む。このような改変は、非限定的な例として、改変塩基、およびその糖ホスフェート骨格が改変または誘導体化される核酸を含む。これらの改変は、少なくとも部分的に、改変された核酸の化学的安定性を増強するために実施され、その結果、それらは、例えば、被験体での治療適用におけるアンチセンス結合核酸として使用され得る。変異体または改変体核酸、およびそれらの相補体において、２０％以上までの塩基がそのように変化され得る。
【００８８】
本発明の新規なタンパク質は、その配列［配列番号１６］が図３５に提供されるレチノール結合タンパク質に類似するタンパク質を含む。本発明はまた、その残基のいずれかが、図３５に示される対応する残基から変化され得るが、レチノール結合活性およびその生理学的機能に類似するそのタンパク質を維持するタンパク質をなおもコードする変異体または改変体タンパク質、またはその機能的フラグメントを含む。変異体または改変体タンパク質において、２０％以上までの残基がそのように変化され得る。本発明はさらに、本発明のタンパク質のいずれかに免疫特異的に結合する抗体および抗体フラグメント（例えば、Ｆａｂまたは（Ｆａｂ）２など）を包含する。
【００８９】
（ＭＥＭＸ核酸）
本発明の核酸は、ＭＥＭＸポリペプチドまたはＭＥＭＸタンパク質をコードする核酸を含有する。本明細書において使用されるように、用語ポリペプチドおよびタンパク質は、交換可能である。
【００９０】
いくつかの実施形態において、ＭＥＭＸ核酸は、成熟ＭＥＭＸポリペプチドをコードする。本明細書中で使用される場合、本明細書中に記載されるポリペプチドまたはタンパク質の「成熟」形態は、天然に存在するポリペプチドあるいは前駆体形態またはプロタンパク質の産物に関係する。天然に存在するポリペプチド、前駆体またはプロタンパク質としては、非制限例として、対応する遺伝子によってコードされる完全長遺伝子産物が挙げられる。あるいは、本明細書中で記載されるオープンリーディングフレームによってコードされる、ポリペプチド、前駆体またはプロタンパク質として規定されている。産物「成熟」形態は、さらに非制限例として、遺伝子産物が産生される細胞中で発生し得る、１以上の天然に存在するプロセッシング工程の結果として発生する。ポリペプチドまたはタンパク質の「成熟」形態に導くこのようなプロセッシング工程の例としては、オープンリーディングフレームの開始コドンによってコードされる、Ｎ−末端メチオニン残基の切断、またはシグナルペプチドまたはリーダー配列のタンパク分解性切断が挙げられる。従って、残基１〜Ｎ（ここで、残基１は、Ｎ−末端メチオニンである）を有する、前駆体ポリペプチドまたはタンパク質から生じる成熟形態は、Ｎ−末端メチオニンの除去後に残った残基２〜Ｎ末端を有する。あるいは、残基１〜Ｎを有する前駆体ポリペプチドまたはタンパク質から生じる成熟形態（ここで、残基１〜残基ＭのＮ末端シグナル配列が切断される）は、残った残基Ｍ＋１〜残基Ｎを有する。本明細書中でさらに使用されるように、ポリペプチドまたはタンパク質の「成熟」形態は、タンパク質分解性切断事象以外の、翻訳後改変事象の工程から生じ得る。このようなさらなるプロセスとしては、非制限例として、グリコシル化、ミリストイル化、またはリン酸化が挙げられる。一般に、成熟ポリペプチドまたは成熟タンパク質は、結果として、これらのプロセスの１つのみの作用、またはそれらの任意の組み合わせから得られ得る。
【００９１】
ＭＥＭＸ核酸としては、とりわけ、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、または１５で提供される配列の核酸あるいはそれらのフラグメントである。さらに、本発明には、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、または１５の変異体核酸または改変体核酸あるいはそれらのフラグメントが挙げられ、任意のこれらの塩基は、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、または１５に示される対応する塩基から変化され得、ＭＥＭＸ様の活性および生理学的機能（すなわち、新脈管形成の調節、ニューロン発生）の少なくとも１つを維持するタンパク質をさらにコードする。本発明には、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、または１５の核酸配列の相補体（それらのフラグメント、誘導体、アナログおよびそれらのホモログを含む）がさらに挙げられる。本発明は、その構造が化学的改変を含む、核酸または核酸フラグメントあるいはそれらの相補体をさらに含む。
【００９２】
本発明の１つの局面は、ＭＥＭＸタンパク質またはそれらの生物学的に活性な部分をコードする単離された核酸分子に関する。また、ＭＥＭＸをコードする核酸（例えば、ＭＥＭＸ　ｍＲＮＡ）を同定するためにハイブリダイゼーションプローブとして使用するための十分な核酸フラグメントおよびＭＥＭＸ核酸分子の増幅または変異のためのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）プライマーとして使用するためのフラグメントも含まれる。本明細書において使用されるように、用語「核酸分子」は、ＤＮＡ分子（例えば、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）、ＲＮＡ分子（例えば、ｍＲＮＡ）、ヌクレオチドアナログを使用して産生されるＤＮＡまたはＲＮＡのアナログ、ならびにそれらの誘導体、フラグメントおよびホモログを含むことが意図される。核酸分子は、一本鎖または二本鎖であり得るが、好ましくは、二本鎖ＤＮＡである。
【００９３】
「プローブ」とは、種々の長さの核酸配列をいい、好ましくは、使用に依存して、少なくとも約１０ヌクレオチド（ｎｔ）、１００ｎｔ、または例えば、約６，０００ｎｔほどの大きさの間である。プローブは、同一、類似または相補的な核酸配列の検出において使用される。より長いプローブは、通常、天然供給源または組換え供給源から入手され、非常に特異的であり、そしてオリゴマーよりもはるかに遅くハイブリダイズする。プローブは、一本鎖または二本鎖であり得、そしてＰＣＲ、メンブレンベースのハイブリダイゼーション技術またはＥＬＩＳＡのような技術において特異性を有するように設計される。
【００９４】
「単離された」核酸分子は、この核酸の天然の供給源中に存在するその他の核酸分子から分離されているものである。単離された核酸分子の例としては、ベクター中に含まれる組換えＤＮＡ分子、異種宿主細胞中に維持される組換えＤＮＡ分子、部分的または実質的に精製された核酸分子、および合成ＤＮＡまたはＲＮＡ分子が挙げられるが、これらに限定されない。好ましくは、「単離された」核酸は、この核酸が由来する生物のゲノムＤＮＡ中でこの核酸に天然に隣接する配列（すなわち、この核酸の５’末端および３’末端に位置する配列）を含まない。例えば、種々の実施形態で、単離されたＭＥＭＸ核酸分子は、この核酸が由来する細胞のゲノムＤＮＡ中でこの核酸に天然で隣接する、約５０ｋｂ、２５ｋｂ、５ｋｂ、４ｋｂ、３ｋｂ、２ｋｂ、１ｋｂ、０．５ｋｂ、または０．１ｋｂ未満のヌクレオチド配列を含み得る。さらに、「単離された」核酸分子、例えば、ｃＤＮＡ分子は、組換え技術により産生される場合、その他の細胞物質または培養培地を実質的に含まないか、または化学的に合成される場合、化学物質前駆体もしくはその他の化学物質を実質的に含まないものであり得る。
【００９５】
本発明の核酸分子、例えば、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、もしくは１５のヌクレオチド配列を有する核酸分子、またはこれらのヌクレオチド配列の任意の相補体は、標準的な分子生物学的技法および本明細書で提供される配列情報を用いて単離され得る。ハイブリダイゼーションプローブとして、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、または１５の核酸の全部または一部を使用して、ＭＥＭＸ核酸配列は、標準的なハイブリダイゼーションおよびクローニング技術（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（編）、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ　ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ　ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹＹ　ＭＡＮＵＡＬ第２版、Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ、１９８９；およびＡｕｓｕｂｅｌら、（編）、ＣＵＲＲＥＮＴ　ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ　ＩＮ　ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ　ＢＩＯＬＯＧＹ、Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、ＮＹ、１９９３）を用いて単離され得る。
【００９６】
本発明の核酸は、標準的なＰＣＲ増幅技法に従って、テンプレートとしてｃＤＮＡ、ｍＲＮＡあるいはゲノムＤＮＡ、および適切なオリゴヌクレオチドプライマーを用いて増幅され得る。このように増幅された核酸は、適切なベクター中にクローン化され、そしてＤＮＡ配列分析により特徴付けられ得る。さらに、ＭＥＭＸヌクレオチド配列に対応するオリゴヌクレオチドは、標準的な合成技術、例えば、自動化ＤＮＡ合成機を用いることにより調製され得る。
【００９７】
本明細書で用いられる用語「オリゴヌクレオチド」は、一連の連結されたヌクレオチド残基をいい、このオリゴヌクレオチドは、ＰＣＲ反応で用いられ得る十分な数のヌクレオチド塩基を有する。短いオリゴヌクレオチド配列は、ゲノム配列もしくはｃＤＮＡ配列に基づき得るか、またはそれから設計され得、そして特定の細胞もしくは組織において、同一、類似もしくは相補的ＤＮＡまたはＲＮＡを増幅し、確認し、もしくはその存在を示すために用いられる。オリゴヌクレオチドは、約１０ｎｔ、５０ｎｔ、または１００ｎｔの長さ、好ましくは約１５ｎｔ〜３０ｎｔの長さを有する核酸配列の部分を含む。１つの実施形態では、１００ｎｔより少ない長さの核酸分子を含むオリゴヌクレオチドは、さらに、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、または１５の少なくとも６個連続するヌクレオチド、あるいはその相補体を含む。オリゴヌクレオチドは、化学的に合成され得、そしてプローブとして用いられ得る。
【００９８】
別の実施形態では、本発明の単離された核酸分子は、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、または１５に示されるヌクレオチド配列、あるいはこのヌクレオチド配列の一部分の相補体である核酸分子を含む。配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、または１５に示されるヌクレオチド配列に相補的である核酸分子は、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、または１５に示されるヌクレオチド配列に十分相補的である核酸分子であり、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、または１５に示される核酸配列に対しミスマッチがほとんどまたは全くなく水素結合し得、それによって安定な二本鎖を形成する。
【００９９】
本明細書で用いる用語「相補的」は、核酸分子のヌクレオチド単位間のＷａｔｓｏｎ−ＣｒｉｃｋまたはＨｏｏｇｓｔｅｅｎ塩基対形成をいい、そして用語「結合」は、２つのポリペプチドまたは化合物または関連ポリペプチドまたは化合物またはその組合せ間の物理的または化学的相互作用を意味する。結合は、イオン性、非イオン性、ファンデルワールス性、疎水性相互作用などを含む。物理的相互作用は直接的であるかまたは間接的であり得る。間接的相互作用は、別のポリペプチドまたは化合物を介するか、またはその効果に起因し得る。直接的結合は、別のポリペプチドもしくは化合物を介して、またはその効果に起因して生じない、その他の実質的な化学的中間体がない相互作用をいう。
【０１００】
さらに、本発明の核酸分子は、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、または１５の核酸配列の一部のみ（例えば、プローブまたはプライマーとして使用され得るフラグメント、あるいはＭＥＭＸの生物学的に活性な部分をコードするフラグメント）を含み得る。本明細書中に提供されるフラグメントは、少なくとも６個の（連続する）核酸配列または少なくとも４個の（連続する）アミノ酸配列（それぞれ、核酸の場合には、特異的なハイブリダイゼーションを可能にし、またはアミノ酸の場合には、エピトープの特異的な認識を可能にするに十分な長さ）として規定され、そして全長配列未満のせいぜいいくらかの部分である。フラグメントは、選択された核酸配列またはアミノ酸配列の任意の連続する部分に由来し得る。誘導体は、直接的にかまたは改変もしくは部分的置換によってかのいずれかでネイティブな化合物から形成される核酸配列またはアミノ酸配列である。アナログは、ネイティブな化合物に類似する構造を有する（しかし、同一ではない）が、特定の成分または側鎖に関してそれとは異なる核酸配列またはアミノ酸配列である。アナログは、合成物であり得るか、または進化的に異なる起源に由来し得、そして野生型と比較して、類似の代謝活性または反対の代謝活性を有し得る。
【０１０１】
誘導体およびアナログは、以下に記載のように、誘導体またはアナログが、修飾された核酸またはアミノ酸を含む場合、全長、または全長以外のものであり得る。本発明の核酸またはタンパク質の誘導体またはアナログは、種々の実施形態において、本発明の核酸もしくはタンパク質に、同一の大きさの核酸またはアミノ酸配列にわたって、または整列した配列に比較した場合（この整列は、当該分野で公知であるコンピューター相同性プログラムによって実施される）、少なくとも約７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、もしくは９９％もの同一性（好ましい同一性は、８０〜９９％）で実質的に相同であるか、あるいはそのコードする核酸がストリンジェントの、中程度にストリンジェントの、または低いストリンジェントの条件下で上記のタンパク質をコードする配列の相補体にハイブリダイズし得る、領域を含む分子を包含するが、これらに限定されない。例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら、ＣＵＲＲＥＮＴ　ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ　ＩＮ　ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ　ＢＩＯＬＯＧＹ、Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、ＮＹ、１９９３、および以下を参照のこと。例示のプログラムは、Ｇａｐプログラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　Ａｎａｌｙｓｉｓ　Ｐａｃｋａｇｅ、Ｖｅｒｓｉｏｎ　８　ｆｏｒ　ＵＮＩＸ（登録商標）、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　Ｃｏｍｐｕｔｅｒ　Ｇｒｏｕｐ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｐａｒｋ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）（デフォルト設定を使用、これは、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎのアルゴリズム（Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．、１９８１、２：４８２−４８９、これらは、その全体が参考として本明細書中に援用される）を使用する）である。
【０１０２】
「相同な核酸配列」もしくは「相同なアミノ酸配列」、またはその改変体とは、上記で考察したように、ヌクレオチドレベルまたはアミノ酸レベルにおける相同性によって特徴付けられる配列をいう。相同なヌクレオチド配列は、ＭＥＭＸポリペプチドのアイソフォームをコードする配列をコードする。アイソフォームは、例えば、ＲＮＡの選択的スプライシングの結果として、同一の生物の異なる組織において発現され得る。あるいは、アイソフォームは、異なる遺伝子によってコードされ得る。本発明において、相同なヌクレオチド配列は、ヒト以外の種（哺乳動物が挙げられるが、これに限定されず、従って、例えば、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ウマおよび他の生物が挙げられ得る）のＭＥＭＸポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。相同なヌクレオチド配列はまた、天然に生じる対立遺伝子改変体および本明細書に記載されるヌクレオチド配列の変異体が挙げられるが、これらに限定されない。しかし、相同的ヌクレオチド配列は、ヒトＭＥＭＸタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含まない。相同核酸配列は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４または１６の保存的アミノ酸置換（以下を参照のこと）、およびＭＥＭＸ活性を有するポリペプチドをコードする核酸配列を含む。ＭＥＭＸタンパク質の生物学的活性は以下に記載されている。相同的アミノ酸配列は、ヒトＭＥＭＸポリペプチドのアミノ酸配列をコードしない。
【０１０３】
ヒトＭＥＭＸ遺伝子のクローニングから決定されたヌクレオチド配列は、他の細胞型（例えば、他の組織由来）におけるＭＥＭＸホモログ、ならびに他の哺乳動物由来のＭＥＭＸホモログを同定および／またはクローニングする際の使用のために設計されるプローブおよびプライマーの作製を可能にする。このプローブ／プライマーは、代表的には、実質的に精製されたオリゴヌクレオチドを含む。このオリゴヌクレオチドは、代表的には、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、または１５の、少なくとも約１２個、約２５個、約５０個、約１００個、約１５０個、約２００個、約２５０個、約３００個、約３５０個または約４００個以上の連続するセンス鎖ヌクレオチド配列；または配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、もしくは１５のアンチセンス鎖ヌクレオチド配列；あるいは配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、または１５の天然に存在する変異体の少なくとも約１２個、約２５個、約５０個、約１００個、約１５０個、約２００個、約２５０個、約３００個、約３５０個または約４００個以上の連続するセンス鎖ヌクレオチド配列に、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列の領域を含む。
【０１０４】
ヒトＭＥＭＸヌクレオチド配列に基づくプローブは、同じまたは相同なタンパク質をコードする転写物またはゲノム配列を検出するために使用され得る。種々の実施形態において、このプローブはさらに、プローブに付着した標識基を含み、例えば、この標識基は放射性同位体、蛍光化合物、酵素、または酵素補因子であり得る。このようなプローブは、ＭＥＭＸタンパク質を誤って発現する細胞または組織を同定するための診断試験キットの一部として、例えば、被験体由来の細胞のサンプル中のＭＥＭＸをコードする核酸のレベルを測定すること（例えば、ＭＥＭＸ　ｍＲＮＡレベルを検出すること、またはゲノムＭＥＭＸ遺伝子が変異しているかまたは欠失しているか否かを決定すること）によって使用され得る。
【０１０５】
「ＭＥＭＸの生物学的に活性な部分を有するポリペプチド」は、本発明のポリペプチドの活性に類似するが必ずしも同一ではない活性を示すポリペプチドをいい、用量依存性の有無に関わらず、特定の生物学的アッセイにおいて測定されるような成熟形態を含む。「ＭＥＭＸの生物学的に活性な部分」をコードする核酸フラグメントは、ＭＥＭＸの生物学的活性（ＭＥＭＸタンパク質の生物学的活性は、以下に記載される）を有するポリペプチドをコードする、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、または１５の一部を単離し、ＭＥＭＸタンパク質のコードされた部分を発現させ（例えば、インビトロでの組換え発現によって）、そしてＭＥＭＸのコードされた部分の活性を評価することによって調製され得る。例えば、ＭＥＭＸの生物学的に活性な部分をコードする核酸フラグメントは、必要に応じて、ＡＴＰ結合ドメインを含み得る。別の実施形態おいて、ＭＥＭＸの生物学的に活性な部分をコードする核酸フラグメントは、１つ以上の領域を含む。
【０１０６】
（ＭＥＭＸの改変体）
本発明はさらに、遺伝コードの縮重に起因して、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、または１５に示されるヌクレオチド配列とは異なる核酸分子を包含する。それにより、これらの核酸は、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、または１５に示されるヌクレオチド配列によりコードされるタンパク質（例えば、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４または１６のポリペプチド）と同じＭＥＭＸタンパク質をコードする。
【０１０７】
配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、または１５に示されるヒトＭＥＭＸヌクレオチド配列に加えて、ＭＥＭＸのアミノ酸配列における変化を導くＤＮＡ配列多型は、集団（例えば、ヒト集団）内に存在し得ることが、当業者によって理解される。ＭＥＭＸ遺伝子中のこのような遺伝的多型は、天然の対立遺伝子のバリエーションに起因して、集団内の個体間に存在し得る。本明細書中で使用される場合、用語「遺伝子」および「組換え遺伝子」は、ＭＥＭＸタンパク質、好ましくは哺乳動物のＭＥＭＸタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含む核酸分子をいう。このような天然の対立遺伝子のバリエーションは、代表的には、ＭＥＭＸ遺伝子のヌクレオチド配列において１〜２０％の変動性を生じ得る。天然の対立遺伝子バリエーションの結果であり、そしてＭＥＭＸの機能的活性を変化させない、ＭＥＭＸ内の任意および全てのこのようなヌクレオチドのバリエーションならびに得られるアミノ酸多型は、本発明の範囲内であると意図される。
【０１０８】
さらに、他の種由来のＭＥＭＸタンパク質をコードし、従って、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、または１５のヒト配列とは異なるヌクレオチド配列を有する核酸分子は、本発明の範囲内にあることが意図される。本発明のＭＥＭＸのｃＤＮＡの天然の対立遺伝子改変体およびホモログに対応する核酸分子は、本明細書中に開示されるヒトＭＥＭＸ核酸に対するその相同性に基づいて、ストリンジェントハイブリダイゼーション条件下で、標準的なハイブリダイゼーション技術に従うハイブリダイゼーションプローブとしてヒトｃＤＮＡまたはその一部を用いて単離され得る。例えば、可溶性ヒトＭＥＭＸ　ｃＤＮＡは、ヒトの膜結合ＭＥＭＸに対するその相同性に基づいて単離され得る。同様に、膜結合ヒトＭＥＭＸ　ｃＤＮＡは、可溶性ヒトＭＥＭＸに対するその相同性に基づいて単離され得る。
【０１０９】
従って、別の実施形態では、本発明の単離された核酸分子は、少なくとも６ヌクレオチド長であり、そしてストリンジェント条件下で配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、または１５のヌクレオチド配列を含む核酸分子にハイブリダイズする。別の実施形態では、この核酸は、少なくとも１０、２５、５０、１００、２５０、５００または７５０ヌクレオチド長である。別の実施形態では、本発明の単離された核酸分子は、コード領域にハイブリダイズする。本明細書中で用いられる場合、用語「ストリンジェント条件下でハイブリダイズする」は、ハイブリダイゼーションおよび洗浄に関して、互いに少なくとも６０％相同なヌクレオチド配列が代表的には互いにハイブリダイズしたままである条件を記載することを意図する。
【０１１０】
ホモログ（すなわち、ヒト以外の種由来のＭＥＭＸタンパク質をコードする核酸）または他の関連配列（例えば、パラログ（ｐａｒａｌｏｇｓ））は、特定のヒト配列の全てまたは一部をプローブとし、核酸ハイブリダイゼーションおよびクローニングに関して当該分野で周知の方法を使用して、低い、中程度の、または高いストリンジェンシーのハイブリダイゼーションによって入手され得る。
【０１１１】
本明細書で用いられる場合、語句「ストリンジェントハイブリダイゼーション条件」は、その条件下で、プローブ、プライマーまたはオリゴヌクレオチドが、その標的配列にハイブリダイズするが、その他の配列にはハイブリダイズしない条件をいう。ストリンジェントな条件は配列依存性であり、そして異なる状況で異なる。より長い配列は、より短い配列より高い温度で特異的にハイブリダイズする。一般に、ストリンジェントな条件は、規定されたイオン強度およびｐＨで、特定の配列の熱融解点（Ｔｍ）より約５℃低いように選択される。このＴｍは、標的配列に相補的なプローブの５０％が、平衡状態で標的配列にハイブリダイズする（規定されたイオン強度、ｐＨおよび核酸濃度下）温度である。標的配列は一般に過剰で存在するので、Ｔｍでは、５０％のプローブが平衡状態で占有されている。代表的には、ストリンジェントな条件は、ｐＨ７．０〜８．３で、塩濃度が約１．０Ｍナトリウムイオンより少なく、代表的には約０．０１〜１．０Ｍナトリウムイオン（またはその他の塩）、そして温度が短いプローブ、プライマーまたはオリゴヌクレオチド（例えば、１０ｎｔ〜５０ｎｔ）について少なくとも約３０℃、そしてより長いプローブ、プライマーおよびオリゴヌクレオチドについて少なくとも約６０℃であるような条件である。ストリンジェントな条件はまた、ホルムアミドのような、脱安定化剤の添加で達成され得る。
【０１１２】
ストリンジェント条件は、当業者に公知であり、そしてＣＵＲＲＥＮＴ　ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ　ＩＮ　ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ　ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　Ｓｏｎｓ，Ｎ．Ｙ．（１９８９），６．３．１−６．３．６に見出され得る。好ましくは、この条件は、互いに少なくとも約６２０％、約７０％、約７２％、約８２％、約９０％、約９２％、約９８％または約９９％相同な配列が、代表的には互いにハイブリダイズしたままであるような条件である。ストリンジェントハイブリダイゼーション条件の非限定的な例は、６×ＳＳＣ、５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１ｍＭ　ＥＤＴＡ、０．０２％　ＰＶＰ、０．０２％　Ｆｉｃｏｌｌ、０．０２％　ＢＳＡ、および５００ｍｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡを含む高塩緩衝液中での６５℃でのハイブリダイゼーションである。このハイブリダイゼーションに、０．２×ＳＳＣ、０．０１％　ＢＳＡ中での５０℃での１回以上の洗浄が続く。ストリンジェント条件下で配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、または１５の配列にハイブリダイズする、本発明の単離された核酸分子は、天然に存在する核酸分子に対応する。本明細書中で使用される場合、「天然に存在する」核酸分子とは、天然に存在する（例えば、天然のタンパク質をコードする）ヌクレオチド配列を有する、ＲＮＡ分子またはＤＮＡ分子をいう。
【０１１３】
第２の実施形態では、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、または１５またはそれらのフラグメント、アナログもしくは誘導体のヌクレオチド配列を含む核酸分子に、中程度のストリンジェンシー条件下でハイブリダイズし得る核酸配列が提供される。中程度のストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件の非限定的な例は、５５℃での６×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、０．５％　ＳＤＳおよび１００ｍｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡ中でのハイブリダイゼーション、続いて１×ＳＳＣ、０．１％　ＳＤＳ中での３７℃での１回以上の洗浄である。用いられ得る中程度のストリンジェンシーの他の条件は、当該分野で周知である。例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら（編），１９９３，ＣＵＲＲＥＮＴ　ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ　ＩＮ　ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ　ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　Ｓｏｎｓ，ＮＹおよびＫｒｉｅｇｌｅｒ，１９９０，ＧＥＮＥ　ＴＲＡＮＳＦＥＲ　ＡＮＤ　ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ，Ａ　ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ　ＭＡＮＵＡＬ，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ　Ｐｒｅｓｓ，ＮＹを参照のこと。
【０１１４】
第３の実施形態では、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、もしくは１５、またはそれらのフラグメント、アナログもしくは誘導体のヌクレオチド配列を含む核酸分子に、低ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズし得る核酸が提供される。低ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件の非限定的な例は、３２０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、５０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５ｍＭ　ＥＤＴＡ、０．０２％　ＰＶＰ、０．０２％　Ｆｉｃｏｌｌ、０．２％　ＢＳＡ、１００ｍｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡ、１０％（重量／容量）デキストラン硫酸中での４０℃でのハイブリダイゼーション、続いて２×ＳＳＣ、２５ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、５ｍＭ　ＥＤＴＡおよび０．１％　ＳＤＳ中での５０℃での１回以上の洗浄である。用いられ得る低ストリンジェンシーの他の条件は、当該分野で周知である（例えば、種交差（ｃｒｏｓｓ−ｓｐｅｃｉｅｓ）ハイブリダイゼーションについて用いられるように）。例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら（編），１９９３，ＣＵＲＲＥＮＴ　ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ　ＩＮ　ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ　ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　Ｓｏｎｓ，ＮＹならびにＫｒｉｅｇｌｅｒ，１９９０，ＧＥＮＥ　ＴＲＡＮＳＦＥＲ　ＡＮＤ　ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ，Ａ　ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ　ＭＡＮＵＡＬ，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ　Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ；ＳｈｉｌｏおよびＷｅｉｎｂｅｒｇ，１９８１，Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ　７８：６７８９−６７９２を参照のこと。
【０１１５】
（Ｉ．保存的変異）
集団中に存在し得る、ＭＥＭＸ配列の天然に存在する対立遺伝子改変体に加えて、当業者は、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、または１５のヌクレオチド配列への変異によって変化が導入され得、それによって、ＭＥＭＸタンパク質の機能的能力を変更することなく、コードされるＭＥＭＸタンパク質のアミノ酸配列に変化がもたらされることをさらに理解する。例えば、「非必須」アミノ酸残基にてアミノ酸置換をもたらすヌクレオチド置換は、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、または１５の配列において行われ得る。「非必須」アミノ酸残基は、生物学的活性を有意に変更することなく、ＭＥＭＸの野生型配列から、変更され得る残基であり、一方、「必須」アミノ酸残基は、生物学的活性に必要とされる。例えば、本発明のＭＥＭＸタンパク質の間で保存されているアミノ酸残基は、特に変更を受け入れ難いと予測される。
【０１１６】
本発明の別の局面は、活性に必須ではないアミノ酸残基における変化を含む、ＭＥＭＸタンパク質をコードする核酸分子に関する。このようなＭＥＭＸタンパク質は、アミノ酸配列が、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４または１６とは異なるが、生物学的活性をなお保持する。１つの実施形態では、単離された核酸分子は、タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含み、ここで、このタンパク質は、それぞれ、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４または１６のアミノ酸配列に少なくとも約７２０％の相同性であるアミノ酸配列を含む。好ましくは、この核酸分子によってコードされるタンパク質は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４または１６に少なくとも約８０％相同性であり、より好ましくは配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４または１６に、少なくとも約９０％、約９２％、約９８％相同性であり、そして最も好ましくは少なくとも約９９％相同性である。
【０１１７】
タンパク質に相同なＭＥＭＸタンパク質をコードする単離された核酸分子は、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、または１５のヌクレオチド配列に１以上のヌクレオチドの置換、付加または欠失を導入することにより作製され得、その結果、１以上のアミノ酸の置換，付加または欠失が、コードされるタンパク質に導入される。
【０１１８】
変異は、標準技術（例えば、部位特異的変異誘発およびＰＣＲ媒介変異誘発）によって配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、または１５のヌクレオチド配列に導入され得る。好ましくは、保存的アミノ酸置換が、１以上の推定非必須アミノ酸残基にて作製される。「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置換される、アミノ酸置換である。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当該分野で定義されている。これらのファミリーとしては、以下が挙げられる：塩基性側鎖を有するアミノ酸（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β分枝側鎖を有するアミノ酸（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）および芳香族側鎖を有するアミノ酸（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）。従って、ＭＥＭＸ中の推定された非必須アミノ酸残基は、同じ側鎖のファミリー由来の別のアミノ酸残基で置換される。あるいは、別の実施形態では、変異は、ＭＥＭＸコード配列の全てまたは一部に沿って（例えば、飽和変異誘発（ｓａｔｕｒａｔｉｏｎ　ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）によって）ランダムに導入され得、そして得られる変異体は、ＭＥＭＸの生物学的活性についてスクリーニングされて、活性を維持する変異体を同定し得る。配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、もしくは１５の変異誘発に続いて、コードされるタンパク質は、当該分野で公知の任意の組換え技術によって発現され得、そしてこのタンパク質の活性が決定され得る。
【０１１９】
１つの実施形態では、変異ＭＥＭＸタンパク質は、以下についてアッセイされ得る：（ｉ）他のＭＥＭＸタンパク質、他の細胞表面タンパク質、または生物学的に活性なそれらの部分と、タンパク質：タンパク質相互作用を形成する能力、（ｉｉ）変異ＭＥＭＸタンパク質と、ＭＥＭＸのレセプターとの間の複合体形成；（ｉｉｉ）変異ＭＥＭＸタンパク質が細胞内標的タンパク質またはその生物学的に活性な部分に結合する能力；（例えば、アビジンタンパク質）；（ｉｖ）ＭＥＭＸタンパク質に結合する能力；あるいは（ｖ）抗ＭＥＭＸタンパク質抗体に特異的に結合する能力。
【０１２０】
（アンチセンスＭＥＭＸ核酸）
本発明の別の局面は、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、または配列番号１５のヌクレオチド配列を含む核酸にハイブリダイズ可能かまたは相補的でる単離された単離されたアンチセンス核酸分子、あるいはそのフラグメント、アナログ、または誘導体に関する。「アンチセンス」核酸は、タンパク質をコードする「センス」核酸に相補的である（例えば、二本鎖ｃＤＮＡ分子のコード鎖に相補的であるかまたはｍＲＮＡ配列に相補的である）ヌクレオチド配列を含む。特定の局面では、少なくとも約１０、２５、５０、１００、２５０もしくは５００ヌクレオチドまたはＭＥＭＸコード鎖全体、またはそれらのタンパク質のみに相補的な配列を含む、アンチセンス核酸分子が提供される。配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、または配列番号１６のＭＥＭＸタンパク質のフラグメント、ホモログ、誘導体およびアナログをコードする核酸分子、または配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、または配列番号１５のＭＥＭＸの核酸配列に相補的なアンチセンス核酸がさらに提供される。
【０１２１】
１つの実施形態では、アンチセンス核酸分子は、ＭＥＭＸをコードするヌクレオチド配列のコード鎖の「コード領域」に対するアンチセンスである。用語「コード領域」とは、アミノ酸残基に翻訳されるコドンを含む、ヌクレオチド配列の領域（例えば、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、または配列番号１６のいずれかに対応するヒトＭＥＭＸのタンパク質コード領域）をいう。別の実施形態では、このアンチセンス核酸分子は、ＭＥＭＸをコードするヌクレオチド配列のコード鎖の「非コード領域」に対するアンチセンスである。用語「非コード領域」とは、コード領域に隣接する、アミノ酸に翻訳されない、５’配列および３’配列をいう（すなわち、５’非翻訳領域および３’非翻訳領域ともいわれる）。
【０１２２】
本明細書中に開示されるＭＥＭＸをコードするコード鎖配列（例えば、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、または配列番号１５）を考慮すれば、本発明のアンチセンス核酸は、ＷａｔｓｏｎおよびＣｒｉｃｋまたはＨｏｏｇｓｔｅｅｎの塩基対合の規則に従って設計され得る。アンチセンス核酸分子は、ＭＥＭＸ　ｍＲＮＡのコード領域全体に相補的であり得るが、オリゴヌクレオチドが、ＭＥＭＸ　ｍＲＮＡのコード領域または非コード領域の一部にのみに対するアンチセンスであることが、より好ましい。例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＭＥＭＸ　ｍＲＮＡの翻訳開始部位の周囲の領域に相補的であり得る。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、例えば、約５、約１０、約１５、約２０、約２５、約３０、約３５、約４０、約４５または約５０ヌクレオチド長であり得る。本発明のアンチセンス核酸は、当該分野で公知の手順を用いて、化学的合成または酵素連結反応を用いて構築され得る。例えば、アンチセンス核酸（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド）は、天然に存在するヌクレオチド、または、この分子の生物学的安定性を増大させるように、もしくはアンチセンス核酸とセンス核酸との間で形成される二重鎖の物理的安定性を増大させるように設計された種々に改変されたヌクレオチドを用いて、化学的に合成され得る（例えば、ホスホロチオエート誘導体およびアクリジン置換ヌクレオチドが用いられ得る）。
【０１２３】
アンチセンス核酸を作製するために用いられ得る改変されたヌクレオチドの例としては以下が挙げられる：５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４−アセチルシトシン、５−（カルボキシヒドロキシメチル）ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、β−Ｄ−ガラクトシルクエオシン（ｇａｌａｃｔｏｓｙｌｑｕｅｏｓｉｎｅ）、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−アデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、β−Ｄ−マンノシルクエオシン（ｍａｎｎｏｓｙｌｑｕｅｏｓｉｎｅ）、５’−メトキシカルボキシメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、ワイブトキソシン、プソイドウラシル、クエオシン（ｑｕｅｏｓｉｎｅ）、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、５−メチル−２−チオウラシル、３−（３−アミノ−３−Ｎ−２−カルボキシプロピル）ウラシル、（ａｃｐ３）ｗ、および２，６−ジアミノプリン。あるいは、このアンチセンス核酸は、核酸がアンチセンス方向でサブクローニングされた発現ベクターを用いて生物学的に生成され得る（すなわち、挿入された核酸から転写されたＲＮＡは、以下の節にさらに記載される、目的の標的核酸に対するアンチセンス方向である）。
【０１２４】
本発明のアンチセンス核酸分子は、代表的には被験体に投与されるか、またはインサイチュで生成され、その結果それらは、ＭＥＭＸタンパク質をコードする細胞性ｍＲＮＡおよび／もしくはゲノムＤＮＡとハイブリダイズするか、またはそれに結合し、それによってこのタンパク質の発現を阻害する（例えば、転写および／または翻訳を阻害することによって）。ハイブリダイゼーションは、安定な二重鎖を形成する従来のヌクレオチド相補性によってか、または例えばＤＮＡ二重鎖に結合するアンチセンス核酸分子の場合には、二重らせんのメジャーグルーブ（ｍａｊｏｒ　ｇｒｏｏｖｅ）における特異的相互作用を介してであり得る。本発明のアンチセンス核酸分子の投与経路の例としては、組織部位での直接的注射が挙げられる。あるいは、アンチセンス核酸分子は、選択された細胞を標的化するように改変され得、次いで全身に投与される。例えば、全身投与のために、アンチセンス分子は、それらが選択された細胞表面上に発現されたレセプターまたは抗原に特異的に結合するように改変され得る。これは、例えば、そのアンチセンス核酸分子を細胞表面レセプターまたは抗原に結合するペプチドまたは抗体に連結することによる。このアンチセンス核酸分子はまた、本明細書中に記載されるベクターを用いて細胞に送達され得る。アンチセンス分子の十分な細胞内濃度を達成するために、アンチセンス核酸分子が強力なｐｏｌ　ＩＩプロモーターまたはｐｏｌ　ＩＩＩプロモーターの制御下に置かれているベクター構築物が、一般的に好ましい。
【０１２５】
なお別の実施形態において、本発明のアンチセンス核酸分子は、α−アノマー核酸分子である。α−アノマー核酸分子は、相補的ＲＮＡと特異的な二本鎖ハイブリッドを形成する。ここで、通常のβ−ユニットとは対照的に、鎖は、互いに平行に走行する（Ｇａｕｌｔｉｅｒら、１９８７、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．１５：６６２５〜６６４１を参照のこと）。このアンチセンス核酸分子はまた、２’−ｏ−メチルリボヌクレオチド（Ｉｎｏｕｅら、１９８７、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．１５：６１３１〜６１４８を参照のこと）またはキメラＲＮＡ−ＤＮＡアナログ（Ｉｎｏｕｅら、１９８７、ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ．２１５：３２７〜３３０を参照のこと）を含み得る。
【０１２６】
このような改変としては、非制限的な例として、改変塩基、および糖リン酸バックボーンが改変または誘導体化された核酸が挙げられる。これらの改変は、少なくとも一部が、改変された核酸の化学的安定性を増強するために実施され、その結果、それらは、例えば、被験体での治療的適用におけるアンチセンス結合核酸として使用され得る。
【０１２７】
（ＭＥＭＸリボザイムおよびＰＮＡ部分）
なお別の実施形態において、本発明のアンチセンス核酸は、リボザイムである。リボザイムは、一本鎖核酸（例えば、ｍＲＮＡ）を切断し得るリボヌクレアーゼ活性を有する触媒性ＲＮＡ分子であり、これらは、その一本鎖核酸に対して相補領域を有する。従って、リボザイム（例えば、ハンマーヘッド型リボザイム（ＨａｓｅｌｈｏｆｆおよびＧｅｒｌａｃｈ、１９８８、Ｎａｔｕｒｅ　３３４：５８５〜５９１を参照のこと））を使用して、ＭＥＭＸ　ｍＲＮＡ転写物を触媒的に切断し、それによってＭＥＭＸ　ｍＲＮＡの翻訳を阻害し得る。ＭＥＭＸをコードする核酸に特異性を有するリボザイムは、本明細書中に開示されるＭＥＭＸ　ＤＮＡのヌクレオチド配列（すなわち、配列番号１）に基づいて設計され得る。例えば、活性部位のヌクレオチド配列が、ＭＥＭＸをコードするｍＲＮＡ内で切断されるヌクレオチド配列に相補的である、テトラヒメナＬ−１９　ＩＶＳ　ＲＮＡの誘導体が構築され得る。例えば、Ｃｅｃｈら、米国特許第４，９８７，０７１号；およびＣｅｃｈら、米国特許第５，１１６，７４２号を参照のこと。あるいは、ＭＥＭＸ　ｍＲＮＡを使用して、ＲＮＡ分子のプールから、特異的リボヌクレアーゼ活性を有する触媒性ＲＮＡを選択し得る。例えば、Ｂａｒｔｅｌら、１９９３、Ｓｃｉｅｎｃｅ　２６１：１４１１〜１４１８を参照のこと。
【０１２８】
あるいは、ＭＥＭＸ遺伝子発現は、ＭＥＭＸの調節領域（例えば、ＭＥＭＸのプロモーターおよび／またはエンハンサー）に相補的なヌクレオチド配列を標的化し、標的細胞中でＭＥＭＸ遺伝子の転写を妨害する三重らせん構造を形成することによって阻害され得る。一般には、Ｈｅｌｅｎｅ．、１９９１、Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ　Ｄｒｕｇ　Ｄｅｓ．６：５６９〜８４；Ｈｅｌｅｎｅら（１９９２）Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．６６０：２７〜３６；およびＭａｈｅｒ（１９９２、Ｂｉｏａｓｓａｙｓ　１４：８０７〜１５を参照のこと。
【０１２９】
種々の実施形態において、ＭＥＭＸの核酸は、塩基部分、糖部分またはリン酸骨格で改変され、例えば、その分子の安定性、ハイブリダイゼーションまたは可溶性を改善し得る。例えば、核酸のデオキシリボースリン酸骨格を改変して、ペプチド核酸を生成し得る（Ｈｙｒｕｐら、１９９６、Ｂｉｏｏｒｇ　Ｍｅｄ　Ｃｈｅｍ　４：５〜２３を参照のこと）。本明細書中で使用される場合、用語「ペプチド核酸」または「ＰＮＡ」は、デオキシリボースリン酸骨格が偽ペプチド骨格によって置換され、そして４つの天然の核酸塩基のみが保持されている核酸模倣物（例えば、ＤＮＡ模倣物）をいう。ＰＮＡの中性の骨格は、低いイオン強度の条件下でＤＮＡおよびＲＮＡに対する特異的ハイブリダイゼーションを可能にすることが示されている。ＰＮＡオリゴマーの合成は、前出のＨｙｒｕｐら（１９９６）；Ｐｅｒｒｙ−Ｏ’Ｋｅｅｆｅら、１９９６、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　９３：１４６７０〜６７５において記載されるような標準的固相ペプチド合成プロトコルを用いて行われ得る。
【０１３０】
ＭＥＭＸのＰＮＡは、治療的適用および診断的適用において使用され得る。例えば、ＰＮＡは、例えば転写または翻訳の停止を誘導することまたは複製を阻害することによる、遺伝子発現の配列特異的調節のためのアンチセンスまたは抗遺伝子剤として使用され得る。ＭＥＭＸのＰＮＡはまた、例えばＰＮＡ指向性ＰＣＲクランピングによる遺伝子における一塩基対変異の分析においてか；他の酵素（例えば、Ｓ１ヌクレアーゼ）と組み合わせて使用される場合の人工制限酵素としてか（Ｈｙｒｕｐ　Ｂ．、１９９６、前出）；またはＤＮＡ配列およびハイブリダイゼーションのプローブもしくはプライマーとして（Ｈｙｒｕｐら（１９９６）上記；Ｐｅｒｒｙ−Ｏ’Ｋｅｅｆｅ、１９９６、前出）、使用され得る。
【０１３１】
別の実施形態において、ＭＥＭＸのＰＮＡは、例えば、それらの安定性または細胞の取り込みを増強するために、ＰＮＡに脂溶性基または他のヘルパー基を結合することによって、ＰＮＡ−ＤＮＡキメラの形成によってか、またはリポソームもしくは当該分野において公知の薬物送達の他の技術の使用によって、改変され得る。例えば、ＰＮＡおよびＤＮＡの有利な特性を組み合せ得る、ＭＥＭＸのＰＮＡ−ＤＮＡキメラが生成され得る。ＰＮＡ部分が高い結合親和性および特異性を提供する一方で、そのようなキメラは、ＤＮＡ認識酵素（例えば、ＲＮａｓｅ　ＨおよびＤＮＡポリメラーゼ）がＤＮＡ部分と相互作用するのを可能にする。ＰＮＡ−ＤＮＡキメラは、塩基のスタッキング、核塩基間の結合数および方向を考慮して選択される適切な長さのリンカーを使用して連結され得る。ＰＮＡ−ＤＮＡキメラの合成は、行われ得る（例えば、Ｆｉｎｎら、１９９６、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．２４：３３５７〜６３を参照のこと）。例えば、ＤＮＡ鎖は、標準的なホスホラミダイトカップリング化学を用いて固体支持体上で合成され得、そして改変されたヌクレオシドアナログ（例えば、５’−（４−メトキシトリチル）アミノ−５’−デオキシ−チミジンホスホルアミダイト）が、ＰＮＡとＤＮＡの５’末端との間に使用され得る（Ｍａｇら、１９８９、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ　Ｒｅｓ．１７：５９７３〜８８を参照のこと）。次いで、ＰＮＡモノマーが段階様式でカップリングされ、５’ＰＮＡセグメントおよび３’ＤＮＡセグメントを有するキメラ分子を生成する（Ｆｉｎｎら、１９９６、前出）。あるいは、５’ＤＮＡセグメントおよび３’ＰＮＡセグメントを用いて、キメラ分子が合成され得る（例えば、Ｐｅｔｅｒｓｅｎら、１９７５、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．５：１１１９〜１１１２４を参照のこと）。
【０１３２】
他の実施形態において、オリゴヌクレオチドは、以下のような他の付属の基を含み得る：ペプチド（例えば、インビボで宿主細胞レセプターを標的化するため）、または細胞膜を横切る輸送を容易にする因子（例えば、Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら、１９８９、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８６：６５５３〜６５５６；Ｌｅｍａｉｔｒｅら、１９８７、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８４：６４８〜６５２；ＰＣＴ公開番号ＷＯ８８／０９８１０を参照のこと）、または血液脳関門（例えば、ＰＣＴ公開番号ＷＯ８９／１０１３４を参照のこと）。さらに、オリゴヌクレオチドは、ハイブリダイゼーション誘発切断剤（例えば、Ｋｒｏｌら、１９８８、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　６：９５８〜９７６を参照のこと）、またはインターカレーター剤（例えば、Ｚｏｎ、１９８８、Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．５：５３９〜５４９を参照のこと）を用いて改変され得る。この目的のために、オリゴヌクレオチドは、別の分子（例えば、ペプチド、ハイブリダイゼーション誘発架橋剤、輸送剤、ハイブリダイゼーション誘発切断剤など）に結合され得る。
【０１３３】
（ＭＥＭＸポリペプチド）
本発明のＭＥＭＸポリペプチドは、その配列が配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、または配列番号１６において提供される配列のＭＥＭＸ様タンパク質を含む。本発明はまた、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、または配列番号１６において示される対応する残基からいずれかの残基が変化され得る変異タンパク質または改変タンパク質を含むが、なおそのＭＥＭＸ様活性および生理学的機能、またはその機能的フラグメントを維持するタンパク質をコードする。いくつかの実施形態において、変異タンパク質または改変体タンパク質において、２０％までまたはそれ以上の残基がそのように変化され得る。本発明は、上記の改変体ＭＥＭＸ核酸によってコードされるペプチドを含む。いくつかの実施形態において、本発明に従うＭＥＭＸポリペプチドは、成熟ポリペプチドである。
【０１３４】
一般に、ＭＥＭＸ様機能を保持するＭＥＭＸ様改変体は、配列中の特定位置の残基が他のアミノ酸により置換される任意の改変体を含み、そしてさらに、親タンパク質の２つの残基間に挿入され得る付加残基もしくは残基、および親配列由来の欠失され得る１つ以上の残基を含む。任意のアミノ酸置換、挿入または欠失が、本発明に包含される。順境において、この置換は上記に定義されるように、保存的置換である。
【０１３５】
本発明の１つの局面は、単離されたＭＥＭＸタンパク質、およびその生物学的に活性な部分、またはそれらの誘導体、フラグメント、アナログもしくはホモログに関する。抗ＭＥＭＸ抗体を惹起するための免疫原としての使用に適切なポリペプチドフラグメントもまた提供される。１つの実施形態において、ネイティブなＭＥＭＸタンパク質は、標準的なタンパク質精製技術を用いる適切な精製スキームによって、細胞または組織供給源から単離され得る。別の実施形態において、ＭＥＭＸタンパク質は、組換えＤＮＡ技術によって産生される。組換え発現に代わるものとして、ＭＥＭＸタンパク質またはポリペプチドは、標準的なペプチド合成技術を用いて化学合成され得る。
【０１３６】
「単離された」または「精製された」タンパク質またはその生物学的に活性な部分は、ＭＥＭＸタンパク質の由来する細胞または組織供給源由来の細胞性物質または他の夾雑タンパク質を実質的に含まないか、あるいは化学合成される場合に化学前駆体または他の化学物質を実質的に含まない。用語「細胞性物質を実質的に含まない」は、ＭＥＭＸタンパク質の調製物を含み、この調製物において、このタンパク質が単離または組換え産生される細胞の細胞性成分から、このタンパク質は分離されている。１つの実施形態において、用語「細胞性物質を実質的に含まない」は、非ＭＥＭＸタンパク質（本明細書中において「夾雑タンパク質」とも呼ばれる）を約３０％未満（乾燥重量にて）、より好ましくは非ＭＥＭＸタンパク質を約２０％未満、なおより好ましくは非ＭＥＭＸタンパク質を約１０％未満、そして最も好ましくは非ＭＥＭＸタンパク質を約２０％未満有する、ＭＥＭＸタンパク質の調製物を含む。ＭＥＭＸタンパク質またはその生物学的に活性な部分が組換え産生される場合、好ましくは、調製物はまた培養培地を実質的に含まない。すなわち、培養培地は、そのタンパク質調製物の容量の約２０％未満、より好ましくは約１０％未満、そして最も好ましくは約２０％未満を示す。
【０１３７】
用語「化学前駆体または他の化学物質を実質的に含まない」は、タンパク質が、そのタンパク質の合成に関与する化学前駆体または他の化学物質から分離されているＭＥＭＸタンパク質の調製物を含む。１つの実施形態において、用語「化学前駆体または他の化学物質を実質的に含まない」は、化学前駆体または非ＭＥＭＸの化学物質を約３０％未満（乾燥重量にて）、より好ましくは化学前駆体または非ＭＥＭＸポリペプチドを約２０％未満、なおより好ましくは化学前駆体または非ＭＥＭＸポリペプチドを約１０％未満、そして最も好ましくは化学前駆体または非ＭＥＭＸポリペプチドを約２０％未満有する、ＭＥＭＸタンパク質の調製物を含む。
【０１３８】
ＭＥＭＸタンパク質の生物学的に活性な部分は、全長ＭＥＭＸタンパク質より少ないアミノ酸を含み、そしてＭＥＭＸタンパク質の少なくとも１つの活性を示す、ＭＥＭＸタンパク質のアミノ酸配列（例えば、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、または配列番号１６に示されるアミノ酸配列）に十分に相同なアミノ酸配列、またはＭＥＭＸタンパク質のアミノ酸配列に由来するアミノ酸配列を含むペプチドを含む。代表的には、生物学的に活性な部分は、ＭＥＭＸタンパク質の少なくとも１つの活性を有するドメインまたはモチーフを含む。ＭＥＭＸタンパク質の生物学的に活性な部分は、例えば、長さが１０、２５、５０、１００またはそれより多いアミノ酸であるポリペプチドであり得る。
【０１３９】
本発明のＭＥＭＸの生物学的に活性な部分は、ＭＥＭＸタンパク質ファミリー間に保存される上記の同定されたドメインの少なくとも１つを含み得る（例えば、ＴＳＲモジュール）。さらに、タンパク質の他の領域が欠失している他の生物学的に活性な部分は、組換え技術によって調製され得、そしてネイティブなＭＥＭＸタンパク質の機能的活性のうちの１つ以上について評価され得る。
【０１４０】
実施形態において、ＭＥＭＸタンパク質は、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、または配列番号１６に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質である。他の実施形態に実質的に相同であり、そして以下に詳細に議論されるように、天然の対立遺伝子改変体または変異誘発に起因してアミノ酸配列が異なるが、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、または配列番号１６のタンパク質の機能的活性を保持する。従って、別の実施形態において、ＭＥＭＸタンパク質は、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、または配列番号１６のアミノ酸配列に少なくとも約４５％、そしてより好ましくは、約５５％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％でさえ相同なアミノ酸配列を含み、そして、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、または配列番号１６のＭＥＭＸタンパク質の配列を有する対応するポリペプチドのＭＥＭＸの機能的活性を保持するタンパク質である。
【０１４１】
（Ｉ．２つ以上の配列間の相同性の決定）
２つのアミノ酸配列または２つの核酸の相同性の百分率を決定するために、配列は、至適な比較の目的のために整列される（例えば、ギャップは、配列間の最適な整列について比較される配列のいずれかに導入され得る）。次いで、対応するアミノ酸位置またはヌクレオチド位置でのアミノ酸残基またはヌクレオチドが比較される。第１の配列中の位置が、第２の配列中の対応する位置と同じアミノ酸残基またはヌクレオチドで占められる場合、分子はその位置で相同である（すなわち、本明細書中で使用される場合、アミノ酸または核酸の「相同性」は、アミノ酸または核酸の「同一性」と等価である）。
【０１４２】
核酸配列の相同性は、２つの配列間の同一性の程度として決定され得る。相同性は、当該分野において公知のコンピュータープログラム（例えば、ＧＣＧプログラムパッケージにおいて提供されるＧＡＰソフトウェア）を用いて決定され得る。ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ　１９７０　Ｊ　Ｍｏｌ　Ｂｉｏｌ　４８：４４３〜４５３を参照のこと。核酸配列比較のための以下の設定（ＧＡＰ作製ペナルティー、５．０、およびＧＡＰ伸長ペナルティー、０．３）を用いてＧＣＧ　ＧＡＰソフトウェアを使用すると、上記で言及される類似の核酸配列のコード領域は、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、または配列番号１６に示されるＤＮＡ配列のＣＤＳ（コードする）部分と、好ましくは少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％の同一性の程度を示す。
【０１４３】
用語「配列同一性」は、２つのポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列が、特定の比較領域にわたって、残基毎を基準として同一である程度をいう。用語「配列同一性のパーセンテージ」は、以下により算出される：この比較領域にわたって最適に整列された２つの配列を比較すること、両方の配列において同一の核酸塩基（例えば、核酸の場合にはＡ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、Ｕ、またはＩ）が存在する位置の数を決定し、一致した位置の数を導くこと、この一致した位置の数を、比較領域の内の位置の総数（すなわち、ウインドウサイズ）で除算すること、およびその結果を１００で乗算して、配列同一性のパーセンテージを導くこと。用語「実質的な同一性」は、本明細書中で使用される場合、ポリヌクレオチド配列の特徴を示し、ここでこのポリヌクレオチドは、比較領域にわたり参照配列と比較して、少なくとも８０％の配列同一性、好ましくは少なくとも８５％の配列同一性、そして頻繁には９０〜９５％の配列同一性、より通常には少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を含む。用語「陽性（ｐｏｓｉｔｉｖｅ）残基の百分率」は、以下により算出される：その比較領域にわたって最適に整列された２つの配列を比較すること、同一のアミノ酸および保存的アミノ酸置換が、上記のように両方の配列において存在する位置の数を決定し、一致した位置の数を導くこと、この一致した位置の数を、比較領域中の位置の総数（すなわち、ウインドウサイズ）で除算すること、およびその結果を１００で乗算して、陽性残基の百分率を導くこと。
【０１４４】
（キメラタンパク質および融合タンパク質）
本発明はまた、ＭＥＭＸキメラタンパク質または融合タンパク質を提供する。本明細書中で使用される場合、ＭＥＭＸ「キメラタンパク質」またはＭＥＭＸ「融合タンパク質」は、非ＭＥＭＸポリペプチドに作動可能に連結された、ＭＥＭＸポリペプチドを含む。「ＭＥＭＸポリペプチド」は、ＭＥＭＸポリペプチドに対応するアミノ酸配列を有するポリペプチドをいい、これに対して、「非ＭＥＭＸポリペプチド」は、ＭＥＭＸタンパク質に対して実質的に相同ではないタンパク質（例えば、ＭＥＭＸタンパク質とは異なり、かつ同一でかまたは異なる生物体に由来するタンパク質）に対応するアミノ酸配列を有するポリペプチドをいう。従って、ＭＥＭＸ融合タンパク質において、このＭＥＭＸポリペプチドは、ＭＥＭＸタンパク質のすべてまたは一部分に対応し得る。１つの実施形態では、ＭＥＭＸ融合タンパク質は、ＭＥＭＸタンパク質の少なくとも１つの生物学的に活性な部分を含む。別の実施形態では、ＭＥＭＸ融合タンパク質は、ＭＥＭＸタンパク質の少なくとも２つの生物学的に活性な部分を含む。融合タンパク質において、用語「作動可能に連結された」は、ＭＥＭＸポリペプチドおよび非ＭＥＭＸポリペプチドが、インフレームで互いに融合されていることを示すことが意図される。非ＭＥＭＸポリペプチドは、ＭＥＭＸポリペプチドのＮ末端またはＣ末端に融合され得る。
【０１４５】
例えば、１つの実施形態では、ＭＥＭＸ融合タンパク質は、第２のタンパク質の細胞外ドメインに作動可能に連結されたＭＥＭＸポリペプチドを含む。このような融合タンパク質は、ＭＥＭＸ活性を調節する化合物についてのスクリーニングアッセイでさらに利用され得る（このようなアッセイは、以下に詳細に記載される）。
【０１４６】
別の実施形態においては、この融合タンパク質は、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）−ＭＥＭＸ融合タンパク質であり、ここではＭＥＭＸ配列が、ＧＳＴ配列のカルボキシル末端に融合される。このような融合タンパク質は、組換えＭＥＭＸの精製を容易にし得る。
【０１４７】
別の実施形態においては、この融合タンパク質は、ＭＥＭＸ−免疫グロブリン融合タンパク質であり、ここでは１つ以上のドメインを含むＭＥＭＸ配列が、免疫グロブリンタンパク質ファミリーのメンバーに由来する配列に融合される。本発明のこのＭＥＭＸ−免疫グロブリン融合タンパク質は、薬学的組成物中に取り込まれ、そして被験体に投与されて、細胞の表面上でＭＥＭＸリガントとＭＥＭＸタンパク質との間の相互作用を阻害し、それによってインビボのＭＥＭＸ媒介シグナル伝達を抑制し得る。１つの非限定例においては、意図される本発明のＭＥＭＸリガンドは、ＭＥＭＸレセプターである。このＭＥＭＸ−免疫グロブリン融合タンパク質を用い、ＭＥＭＸ同族リガンドのバイオアベイラビリティに影響を与え得る。ＭＥＭＸリガンド／ＭＥＭＸ相互作用の阻害は、増殖障害および分化障害（例えば、癌）の両方の処置、および細胞生存を調節（例えば、促進または阻害）するために、治療的に有用であり得る。さらに、本発明のこのＭＥＭＸ−免疫グロブリン融合タンパク質は、被験体中で抗ＭＥＭＸ抗体を産生するための免疫原として用いられ得、ＭＥＭＸリガンドを精製し、そしてＭＥＭＸリガンドとのＭＥＭＸの相互作用を阻害する分子を同定するスクリーニングアッセイで用いられ得る。
【０１４８】
本発明のＭＥＭＸキメラまたは融合タンパク質は、標準的な組換えＤＮＡ技法により産生され得る。例えば、異なるポリペプチド配列をコードするＤＮＡフラグメントを、従来の技術に従って、例えば、連結のための平滑末端または突出（ｓｔａｇｇｅｒ）末端、適切な末端を提供するための制限酵素消化、必要に応じて突出（ｃｏｈｅｓｉｖｅ）末端の充填、所望しない連結を避けるためのアルカリホスファターゼ処理、および酵素的連結を使用することにより、インフレームで一緒に連結する。別の実施形態では、融合遺伝子を、自動化ＤＮＡ合成機を含む従来技術により合成し得る。あるいは、遺伝子フラグメントのＰＣＲ増幅を、キメラ遺伝子配列を生成するために引き続きアニールおよび再増幅され得る、２つの連続遺伝子フラグメント間の相補的オーバハングを生じるアンカープライマーを用いて実施し得る（例えば、Ａｕｓｂｅｌら（編）ＣＵＲＲＥＮＴ　ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ　ＩＮ　ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ　ＢＩＯＬＯＧＹ、Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、１９９２を参照のこと）。さらに、融合部分（例えば、ＧＳＴポリペプチド）をすでにコードした多くの発現ベクターが市販されている。ＭＥＭＸをコードする核酸は、この融合部分がＭＥＭＸタンパク質にインフレーム連結されるように、このような発現ベクター中にクローン化され得る。
【０１４９】
（ＭＥＭＸアゴニストおよびアンタゴニスト）
本発明はまた、ＭＥＭＸアゴニスト（模倣物）として、またはＭＥＭＸアンタゴニストとして機能するＭＥＭＸタンパク質の改変体に関する。ＭＥＭＸタンパク質の改変体、例えば、変異誘発（例えば、ＭＥＭＸタンパク質の離散した点変異または短縮）により生成され得る。ＭＥＭＸタンパク質のアゴニストは、天然に存在する形態のＭＥＭＸタンパク質と実質的に同じ生物学的活性、またはその生物学的活性のサブセットを保持し得る。ＭＥＭＸタンパク質のアンタゴニストは、天然に存在する形態のＭＥＭＸタンパク質の１つ以上の活性を、例えば、ＭＥＭＸタンパク質を含む細胞シグナル伝達カスケードの下流または上流メンバーに競合的に結合することにより阻害し得る。従って、特異的生物学的効果が、限られた機能の改変体を用いた処理により惹起され得る。１つの実施形態では、天然に存在する形態のこのタンパク質の生物学活性のサブセットを有する改変体を用いた被験体の処置は、天然に存在する形態のＭＥＭＸタンパク質を用いた処置に対して被験体におけるより少ない副作用を有する。
【０１５０】
ＭＥＭＸアゴニスト（模倣物）として、またはＭＥＭＸアンタゴニストのいずれかとして機能するＭＥＭＸタンパク質の改変体は、ＭＥＭＸタンパク質アゴニストまたはアンタゴニスト活性のためのＭＥＭＸタンパク質の変異体、例えば短縮型変異体のコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングすることにより同定され得る。１つの実施形態では、ＭＥＭＸ改変体の多彩なライブラリーは、核酸レベルのコンビナトリアル変異誘発により生成され、そして多彩な遺伝子ライブラリーによりコードされる。ＭＥＭＸ改変体の多彩なライブラリーは、例えば、合成オリゴヌクレオチドの混合物を、潜在的なＭＥＭＸ配列の縮重セットが、個々のポリペプチドとして、あるいは、その中にＭＥＭＸ配列のセットを含む（例えば、ファージディスプレイのための）より大きな融合タンパク質のセットとして発現可能であるように、遺伝子配列に酵素的に連結することにより産生され得る。縮重オリゴヌクレオチド配列から潜在的なＭＥＭＸ改変体のライブラリーを産生するために用いられ得る種々の方法がある。縮重遺伝子配列の化学的合成は、自動化ＤＮＡ合成機中で実施され得、次いでこの合成遺伝子は、適切な発現ベクター中に連結される。遺伝子の縮重セットの使用は、１つの混合物において、潜在的なＭＥＭＸ配列の所望のセットをコードする配列のすべての供給を可能にする。縮重オリゴヌクレオチドを合成する方法は当該分野で公知である（例えば、Ｎａｒａｎｇ（１９８３）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　３９：３；Ｉｔａｋｕｒａら（１９８４）Ａｎｎｕａｌ　Ｒｅｖ　Ｂｉｏｃｈｅｍ　５３：３２３；Ｉｔａｋｕｒａら（１９８４）Ｓｃｉｅｎｃｅ　１９８：１０５６；Ｉｋｅら（１９８３）Ｎｕｃｌ　Ａｃｉｄ　Ｒｅｓ　１１：４７７を参照のこと）。
【０１５１】
（Ｉ．ポリペプチドライブラリー）
さらに、ＭＥＭＸタンパク質コード配列のフラグメントのライブラリーを用いて、ＭＥＭＸタンパク質の改変体のスクリーニングおよび引き続く選択のためのＭＥＭＸフラグメントの多彩な集団を生成し得る。１つの実施形態では、コード配列フラグメントのライブラリーは、ＭＥＭＸコード配列の二本鎖ＰＣＲフラグメントを、１分子あたり約１つのみのニックが生じる条件下、ヌクレアーゼで処理すること、二本鎖ＤＮＡを変性させること、異なるニック産物からのセンス／アンチセンス対を含み得る二本鎖ＤＮＡを形成するためにこのＤＮＡを再生すること、Ｓ１ヌクレアーゼを用いた処理により再形成された二本鎖から一本鎖部分を除去すること、および得られるフラグメントライブラリーを発現ベクター中に連結することにより生成し得る。この方法により、ＭＥＭＸタンパク質の種々のサイズのＮ末端および内部フラグメントをコードする発現ライブラリーが派生し得る。
【０１５２】
点変異または短縮により作成されたコンビナトリアルライブラリーの遺伝子産物をスクリーニングするため、および選択された性質を有する遺伝子産物のｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするための種々の技法が当該分野で公知である。このような技法を、ＭＥＭＸタンパク質のコンビナトリアル変異誘発により生成された遺伝子ライブラリーの迅速スクリーニングに適用可能である。大きな遺伝子ライブラリーをスクリーニングするための、高スループット分析に適した最も広く用いられる技法は、代表的には、遺伝子ライブラリーを複製可能な発現ベクター中にクローニングすること、得られるベクターのライブラリーで適切な細胞を形質転換すること、およびこのコンビナトリアル遺伝子を、所望の活性の検出が、その産物が検出された遺伝子をコードするベクターの単離を容易にする条件下で発現することを含む。ライブラリー中の機能的変異体の頻度を増大する新規技法であるリクルーシブエンセブル変異誘発（ｒｅｃｒｕｓｉｖｅ　ｅｎｓｅｍｂｌｅ　ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）（ＲＥＭ）を、スクリーニングアッセイと組み合わせて用い、ＭＥＭＸ改変体を同定し得る（例えば、ＡｒｋｉｎおよびＹｏｕｒｖａｎ（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　　８９：７８１１−７８１５；Ｄｅｌｇｒａｖｅら（１９９３）Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　６：３２７−３３１を参照のこと）。
【０１５３】
（抗ＭＥＭＸ抗体）
ＭＥＭＸタンパク質に対する抗体、またはＭＥＭＸタンパク質のフラグメントもまた、本発明に含まれる。本明細書中で使用される場合、用語「抗体」は、免疫グロブリン分子、および免疫グロブリン（Ｉｇ）分子の免疫学的に活性な部分（すなわち、抗原に特異的に結合する（免疫反応する）抗原結合部位を含む分子）をいう。このような抗体としては、ポリクロナール抗体、モノクロナール抗体、キメラ抗体、単鎖抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメントおよびＦ（ａｂ’）２フラグメント、ならびにＦａｂ発現ライブラリーが挙げられるが、これらに限定されない。一般に、ヒト由来の抗体分子は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥおよびＩｇＤの任意のクラスに関連し、これらは分子内に存在する重鎖の性質によってお互いに異なる。特定のクラスは同様にサブクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２など）を有する。さらに、ヒトにおいては、軽鎖はκ鎖またはλ鎖であり得る。本明細書中で抗体に対する参照は、ヒト抗体種のすべてのこのようなクラス、サブクラスおよび型に対する参照を含む。
【０１５４】
本発明の単離されたＭＥＭＸ関連タンパク質は、抗原、またはその一部もしくはそれらのフラグメントとして役立つことが意図され得、そしてさらに、免疫原として使用され、ポリクロナール抗体およびモノクロナール抗体の調製のための標準的な技術を用いて、抗原に免疫特異的に結合する抗体を生成し得る。全長タンパク質が使用され得るか、あるいは本発明は、免疫原として使用するための抗原の抗原性ペプチドフラグメントを提供する。抗原性ペプチドフラグメントは、全長タンパク質のアミノ酸配列（例えば、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４または１６において示されるアミノ酸配列）の少なくとも６アミノ酸残基を含み、そしてそれらのエピトープを含み、その結果このペプチドに対して惹起された抗体は、全長タンパク質またはこのエピトープを含む任意のフラグメントと特定の免疫複合体を形成する。好ましくは、抗原性ペプチドは、少なくとも１０アミノ酸残基、または少なくとも１５アミノ酸残基、または少なくとも２０アミノ酸残基、または少なくとも３０アミノ酸残基を含む。この抗原性ペプチドにより含まれる好ましいエピトープは、そのペプチド表面上に位置するタンパク質の領域であり；通常、これらは親水性領域である。
【０１５５】
本発明の特定の実施形態では、抗原性ペプチドにより包含される少なくとも１つのエピトープは、ＭＥＭＸタンパク質の表面上に位置するＭＥＭＸ関連タンパク質の領域、例えば、親水性領域である。ヒトＭＥＭＸ関連タンパク質配列の疎水性分析は、ＭＥＭＸ関連タンパク質のどの領域が特に親水性であるか、そしてそれ故、抗体産生を標的にするために有用な表面残基をコードするようであるかを示す。抗体産生を標的にする手段として、親水性および疎水性の領域を示すヒドロパシープロットを、例えば、フーリエ変換とともにまたはなしの、Ｋｙｔｅ　ＤｏｏｌｉｔｔｌｅまたはＨｏｐｐ　Ｗｏｏｄｓ法を含む、当該分野で周知の任意の方法により生成し得る。例えば、それらの全体が本明細書に参考として援用される、ＨｏｐｐおよびＷｏｏｄｓ、１９８１、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　７８：３８２４−３８２８；ＫｙｔｅおよびＤｏｏｌｉｔｔｌｅ　１９８２、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５７：１０５−１４２を参照のこと。抗原性タンパク質またはその誘導体、フラグメント、アナログもしくはホモログ内の１つ以上のドメインに対して特異的な抗体はまた、本明細書中で提供される。
【０１５６】
本発明のタンパク質、またはその誘導体、フラグメント、アナログ、ホモログもしくはオルソログは、これらのタンパク質成分に免疫特異的に結合する抗体の産生における免疫原として利用され得る。
【０１５７】
当該分野において公知の種々の手順が、本発明のタンパク質、またはその誘導体、フラグメント、アナログ、ホモログもしくはオルソログに対して指向されるポリクロナール抗体またはモノクロナール抗体の産生のために使用され得る（例えば、ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ：Ａ　ＬＡＭＯＲＡＴＯＲＹ　ＭＡＮＵＡＬ，Ｈａｒｌｏｗ　Ｅ，およびＬａｎｅ　Ｄ，１９９８，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ（本明細書中に参考として援用される）を参照のこと）。これらの抗体のうちのいくつかは、以下で考察される。
【０１５８】
（Ｉ．ポリクロナール抗体）
ポリクロナール抗体の産生のために、種々の適切な宿主動物（例えば、ウサギ、ヤギ、マウスまたは他の動物）は、ネイティブなタンパク質、その合成改変体、または前記の誘導体を用いる１以上の注射によって免疫され得る。適切な免疫原性調製物は、例えば、天然に存在する免疫原性タンパク質、免疫原性タンパク質を提示する化学的に合成されたポリペプチド、または組換え的に発現される免疫原性タンパク質を含み得る。さらに、このタンパク質は、免役されている哺乳動物において免疫原性であることが公知である第２のタンパク質に結合体化され得る。このような免疫原性タンパク質の例としては、キーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシサイログロブリン、および大豆トリプシンインヒビターが挙げられるが、これらに限定されない。この調製物はさらに、アジュバントを含み得る。種々のアジュバントが免疫学的応答を増加させるために使用され、このようなアジュバントとしては、Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ（完全および不完全）、ミネラルゲル（例えば、水酸化アルミニウム）、界面活性物質（例えば、リゾレシチン、プルロニック（ｐｌｕｒｏｎｉｃ）ポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油乳濁液、ジニトロフェノールなど）、ヒトにおいて使用可能なアジュバント（例えば、Ｂａｃｉｌｌｅ　Ｃａｌｍｅｔｔｅ−ＧｕｅｒｉｎおよびＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｐａｒｖｕｍ）または類似の免疫刺激剤が挙げられるが、これらに限定されない。使用され得るアジュバントのさらなる例としては、ＭＰＬ−ＴＤＭアジュバント（モノホスホリルリピドＡ、合成トレハロースジコリノミコレート）が挙げられる。
【０１５９】
免疫原性タンパク質に対して指向されるポリクロナール抗体分子は、哺乳動物から（例えば、血液から）単離され得、そして周知の技術（例えば、プロテインＡまたはプロテインＧを用いるアフィニティクロマトグラフィー（これは、主に免疫血清のＩｇＧ画分を提供する））によってさらに精製され得る。続いて、または代替的に、求められている免疫グロブリンの標的である特定の抗原またはその抗原のエピトープがカラムに固定され、免疫アフィニティクロマトグラフィーによって免疫特異的抗体を精製し得る。免疫グロブリンの精製は、例えば、Ｄ．Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎ（Ｔｈｅ　Ｓｃｉｅｎｔｉｓｔ（Ｔｈｅ　Ｓｃｉｅｎｔｉｓｔ，Ｉｎｃ．，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ　ＰＡより発行）、第１４巻、第８号（２０００年４月１７日）、２５〜２８頁）によって考察される。
【０１６０】
（ＩＩ．モノクローナル抗体）
本明細書で用いられる用語「モノクローナル抗体」（ＭＡｂ）または「モノクローナル抗体組成物」は、独特の軽鎖遺伝子産物および独特の重鎖遺伝子産物からなる唯一の分子種の抗体分子を含む抗体分子の集団をいう。特に、モノクローナル抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）は、すべての分子の集団に同一である。従って、ＭＡｂは、抗原への独特の結合親和性によって特徴付けられる抗原の特定のエピトープと免疫反応可能な抗原結合部位を含む。
【０１６１】
モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ方法（例えば、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ，（１９７５．Ｎａｔｕｒｅ　２５６：４９５）に記載されるような方法）を使用して調製され得る。ハイブリドーマ方法において、マウス、ハムスター、または他の適切な宿主細胞は、免疫因子で代表的に免疫され、免疫因子に特異的に結合する抗体を産生するか、または産生し得るリンパ球を誘発する。あるいは、リンパ球は、インビトロで免疫され得る。
【０１６２】
免疫因子としては、代表的に、タンパク質抗原、そのフラグメントまたはその融合タンパク質が挙げられる。一般的には、以下のいずれかである：ヒト起源の細胞が望まれる場合は、末梢血リンパ球が使用され、または非ヒト哺乳動物供給源が望まれる場合は、脾臓細胞またはリンパ節細胞が使用される。次いで、適切な融合因子（例えば、ポリエチレングリコール）を使用して、リンパ球を不死化細胞株に融合し、ハイブリドーマ細胞を形成する（Ｇｏｄｉｎｇ，ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ　ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ：ＰＲＩＮＣＩＰＬＥＳ　ＡＮＤ　ＰＲＡＣＴＩＣＥ，Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ（１９８６）第５９−１０３頁）。不死化細胞株は、哺乳動物細胞、特にげっ歯類、ウシおよびヒト起源の骨髄腫細胞に通常形質転換される。通常ラットまたはマウスの骨髄腫細胞株が使用されるハイブリドーマ細胞は、１以上の物質（融合されていない不死化細胞の増殖も生存も阻害する）を適切に含む適切な培養培地中で培養され得る。例えば、親の細胞が酵素、ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴまたはＨＰＲＴ）を欠く場合、ハイブリドーマからの培養培地は、代表的にヒポキサンチン、アミノプテリン、およびチミジンを含み（「ＨＡＴ培地」）、それらの物質はＨＧＰＲＴ欠失細胞の増殖を阻害する。
【０１６３】
好ましい不死化細胞株は、効率的に融合する細胞株であり、それらは選択された抗体産生細胞の安定な高レベルの抗体の発現を支持し、そしてＨＡＴ培地のような培地に敏感である。より好ましい不死化細胞株はマウス骨髄腫細胞株であり、それらを、例えば、Ｓａｌｋ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　Ｃｅｌｌ　Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ　Ｃｅｎｔｅｒ，Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ，ＣａｌｉｆｏｒｎｉａおよびＡｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖｉｒｇｉｎｉａから得ることが可能である。ヒト骨髄腫およびマウス−ヒト骨髄腫細胞株はまた、ヒトモノクローナル抗体の産生について記載される（Ｋｏｚｂｏｒ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３３：３００１（１９８４）；Ｂｒｏｄｅｕｒら、ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ　ＡＮＴＩＢＯＤＹ　ＰＲＯＤＵＣＴＩＯＮ　ＴＥＣＨＮＩＱＵＥＳ　ＡＮＤ　ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮ，Ｍａｒｃｅｌ　Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ，（１９８７）第５１−６３頁）。
【０１６４】
次いで、ハイブリドーマ細胞が培養される培養培地は、抗原に対するモノクローナル抗体の存在についてアッセイされ得る。好ましくは、ハイブリドーマ細胞によって産生されるモノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈降によって決定されるか、またはインビトロ結合アッセイ（例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）または酵素結合イムノソルベント検定法（ＥＬＩＳＡ））によって決定される。このような技術およびアッセイは、当該分野で公知である。モノクローナル抗体の結合親和性は、例えば、ＭｕｎｓｏｎおよびＰｏｌｌａｒｄ，（１９８０．Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０７：２２０）のスキャッチャード分析によって決定され得る。好ましくは、標的抗原に対する高い程度の特異性および高結合親和性を有する抗体が、単離される。
【０１６５】
所望のハイブリドーマ細胞が同定された後、希釈手順を限定することによって、クローンをサブクローニングし得、そして標準方法によって増殖し得る。例えば、この目的のために適切な培養培地としては、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｅａｇｌｅ’ｓ　ＭｅｄｉｕｍおよびＲＰＭＩ−１６４０培地が挙げられる。あるいは、ハイブリドーマ細胞は、哺乳動物内の腹水としてインビボで増殖され得る。
【０１６６】
サブクローンによって分泌されたモノクローナル抗体は、従来の免疫グロブリン精製手順（例えば、タンパク質Ａセファロース、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、またはアフィニティークロマトグラフィー）によって、培養培地または腹水から、単離または精製され得る。
【０１６７】
モノクローナル抗体はまた、組換えＤＮＡ方法（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号に記載される方法）によって作製され得る。本発明のモノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、従来の手順を使用して（例えば、マウス抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合し得るオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって）容易に単離され得、そして配列決定され得る。本発明のハイブリドーマ細胞は、このようなＤＮＡの好ましい供給源として役立つ。一旦単離されると、ＤＮＡは、発現ベクターに配置され得、次いでそれらは、宿主細胞（例えば、さもなければ免疫グロブリンタンパク質を産生しないサルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、または骨髄腫細胞）にトランスフェクトされ、組換え宿主細胞内でのモノクローナル抗体の合成を得る。ＤＮＡはまた、例えば、相同なマウス配列の代わりにヒト重鎖および軽鎖定常ドメインをコードする配列の置換（米国特許第４，８１６，５６７号；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ、１９９４、Ｎａｔｕｒｅ　３６８，８１２−１３）によってか、または非免疫グロブリンポリペプチドについてのコード配列のすべてまたは一部の配列をコードする免疫グロブリンへの共有結合的な連結によって改変され得る。このような非免疫グロブリンポリペプチドは、本発明の抗体の定常領域に置換され得るか、または本発明の抗体の１つの抗原結合部位の可変領域に置換され得、キメラ二価の抗体を作製する。
【０１６８】
（ＩＩＩ．ヒト化抗体）
本発明のタンパク質抗原に対する抗体は、さらにヒト化抗体またはヒト抗体を含み得る。これらの抗体は、投与された免疫グロブリンに対するヒトの免疫応答を引き起こさないヒトへの投与に適する。抗体のヒト化形態は、キメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖またはそれらのフラグメント（例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２または他の抗体の抗原結合配列）であり、それらは主にヒト免疫グロブリンの配列から構成され、そして非ヒト免疫グロブリンに由来する最小の配列を含む。ヒト化は、ヒト抗体の対応する配列についてのげっ歯類ＣＤＲまたはＣＤＲ配列の置換によって、Ｗｉｎｔｅｒおよび共同研究者の方法（Ｊｏｎｅｓら、１９８６、Ｎａｔｕｒｅ，３１：５２２−５２５；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、１９８８、Ｎａｔｕｒｅ，３３２：３２３−３２７；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９８８、２３９：１５３４−１５３６）の後に達成され得る。（米国特許第５，２２５，５３９号もまた参照のこと。）いくつかの場合において、ヒト免疫グロブリンのＦｖ骨格（ｆｒａｍｅｗｏｒｋ）残基は、対応する非ヒト残基によって置換される。ヒト化抗体はまた、患者の抗体においても、移入されたＣＤＲまたは骨格配列においても見出されない残基を含み得る。一般に、ヒト化抗体は、すべての少なくとも１つ、および代表的には２つの可変領域を実質的に含む。これらの領域内で、すべてのまたは実質的にすべてのＣＤＲ領域は非ヒト免疫グロブリンの領域に対応し、そしてすべてまたは実質的にすべての骨格領域はヒト免疫グロブリンコンセンサス配列の領域に対応する。ヒト化抗体はまた、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）、代表的には、ヒト免疫グロブリンの少なくとも一部を必要に応じて含む（Ｊｏｎｅｓら、１９８６、上記；Ｒｉｅｃｈａｍａｎｎら、１９８８、上記；およびＰｒｅｓｔａ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．，２：５９３−５９６（１９９２））。
【０１６９】
（ＩＶ．ヒト抗体）
ＣＤＲを含む軽鎖および重鎖の両方の全体配列がヒト遺伝子から本質的に生じる抗体分子に、ヒト抗体は十分に関連する。このような抗体を、「ヒト抗体」、または「十分なヒト抗体」と本明細書中で呼ぶ。ヒトモノクローナル抗体は、トリオーマ（ｔｒｉｏｍａ）技術によって調製され得る；ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（例えば、Ｋｏｚｂｏｒら、１９８３　Ｉｍｍｕｎｏｌ　Ｔｏｄａｙ　４：７２を参照のこと）およびヒトモノクローナル抗体を産生するためのＥＢＶハイブリドーマ技術（例えば、Ｃｏｌｅら、１９８５：ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ　ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ　ＡＮＤ　ＣＡＮＣＥＲ　ＴＨＥＲＡＰＹ，Ａｌａｎ　Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，第７７−９６頁を参照のこと）。ヒトモノクローナル抗体は、本発明の実行において使用され得、そしてヒトハイブリドーマの使用によってか（例えば、Ｃｏｔｅら、１９８３．Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　ＵＳＡ　８０：２０２６−２０３０を参照のこと）、またはインビトロでのＥｐｓｔｅｉｎ　Ｂａｒｒ　Ｖｉｒｕｓを用いたヒトＢ細胞による形質転換によって（Ｃｏｌｅら、１９８５：ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ　ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ　ＡＮＤ　ＣＡＮＣＥＲ　ＴＨＥＲＡＰＹ，Ａｌａｎ　Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，第７７−９６頁を参照のこと）産生され得る。
【０１７０】
さらに、ヒト抗体はまた、さらなる技術（ファージディスプレイライブラリー（ＨｏｏｇｅｎｂｏｏｍおよびＷｉｎｔｅｒ，１９９１、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２７：３８１；Ｍａｒｋｓら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１（１９９１））を含む）を使用して産生され得る。同様に、ヒト免疫グロブリン位置をトランスジェニック動物（例えば、内因性免疫グロブリン遺伝子が、部分的または完全に不活化されているマウス）に導入することによって、ヒト抗体は作製され得る。チャレンジの際にヒト抗体産生が観察され、このことはすべての点（遺伝子再配列、アセンブリー、および抗体レパートリーを含む）でヒトにおいて観察されたものに密接に類似する。このアプローチは、例えば、以下に記載される：米国特許第５，５４５，８０７号；同第５，５４５，８０６号；同第５，５６９，８２５号；同第５，６２５，１２６号；同第５，６３３，４２５号；同第５，６６１，０１６号、およびＭａｒｋｓら（１９９２、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　１０：７７９−７８３）；Ｌｏｎｂｅｒｇら（１９９４、Ｎａｔｕｒｅ　３６８：８５６−８５９）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ（１９９４、Ｎａｔｕｒｅ　３６８：８１２−１３）；Ｆｉｓｈｗｉｌｄら（１９９６、Ｎａｔｕｒｅ　Ｂｉｏｔｅｃｈ．　１４：８４５−５１）；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ（１９９６、Ｎａｔｕｒｅ　Ｂｉｏｔｅｃｈ．　１４：８２６）；ならびにＬｏｎｂｅｒｇおよびＨｕｓｚａｒ（１９９５、ＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＲｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３：６５−９３）。
【０１７１】
ヒト抗体は、抗原によるチャレンジに応答して動物の内因性抗体よりもヒト抗体を十分に産生するように改変されたトランスジェニック非ヒト動物を使用して、さらに産生され得る。（ＰＣＴ公開ＷＯ９４／０２６０２を参照のこと。）非ヒト宿主における重免疫グロブリン鎖および軽免疫グロブリン鎖をコードする内因性遺伝子は、耐えられなくなっており、そしてヒト重鎖および軽鎖免疫グロブリンをコードする活性な位置は、宿主のゲノムに挿入される。例えば、要求性ヒトＤＮＡセグメントを含む酵母人工染色体を使用して、ヒト遺伝子は組み込まれる。次いで、すべての所望の改変を提供する動物を、完全な改変の相補体よりもより少ない改変の相補体を含む中間トランスジェニック動物を雑種することによって子孫として得る。このような非ヒト動物の好ましい実施形態は、マウスであり、ＰＣＴ公開ＷＯ９６／３３７３５およびＷＯ９６／３４０９６に開示されるようにＸｅｎｏｍｏｕｓＴＭと呼ばれる。この動物は、ヒト免疫グロブリンを十分に分泌するＢ細胞を産生する。目的の免疫原を有する免疫後の動物から（例えば、ポリクローナル抗体の調製）、あるいは動物由来の不死化されたＢ細胞（例えば、モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ）から、抗体を直接得ることが可能である。さらに、ヒト可変領域を有する免疫グロブリンをコードする遺伝子は、抗体を直接得るために回復され、そして発現され得るか、または抗体のアナログ（例えば、１本鎖Ｆｖ分子）を得るために、さらに改変され得る。
【０１７２】
内因性免疫グロブリン重鎖の発現を欠く非ヒト宿主（マウスとして例証される）を作製するための方法の例は、米国特許第５，９３９，５９８号に記載される。それを、以下の工程を包含する方法によって得ることが可能である：位置の再配列を防ぎ、そして再配列された免疫グロブリン重鎖位置の転写物の形成、および選択マーカーをコードする遺伝子を含む標的ベクターによって影響される欠失を防ぐために、胚幹細胞における少なくとも１つの内因性重鎖位置由来のＪセグメント遺伝子を欠失する工程；およびトランスジェニックマウス（その体細胞および生殖細胞は、選択マーカーをコードする遺伝子を含む）を、胚幹細胞から作製する工程。
【０１７３】
目的の抗体（例えば、ヒト抗体）を産生する方法は、米国特許第５，９１６，７７１号に開示される。それは以下の工程を包含する：重鎖をコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターを、培養中の１つの哺乳動物宿主細胞に導入する工程、軽鎖をコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターを、別の哺乳動物宿主細胞に導入する工程、およびハイブリッド細胞を形成するために２つの細胞融合する工程。ハイブリッド細胞は、重鎖および軽鎖を含む抗体を発現する。
【０１７４】
この手順のさらなる改善において、免疫原上の臨床的に関連するエピトープを同定する方法、および関連するエピトープに高い親和性で免疫特異的に結合する抗体を選択する相関する方法は、ＰＣＴ公開ＷＯ９９／５３０４９に開示される。
【０１７５】
（Ｖ．Ｆａｂフラグメントおよび１本鎖抗体）
本発明に従って、技術は、本発明の抗原性タンパク質に特異的な１本鎖抗体の産生に適用され得る（例えば、米国特許第４，９４６，７７８号を参照のこと）。さらに、方法は、Ｆａｂ発現ライブラリーの構築に適用され得（例えば、Ｈｕｓｅら、１９８９　Ｓｃｉｅｎｃｅ　２４６：１２７５−１２８１を参照のこと）、タンパク質またはその誘導体、フラグメント、アナログまたはホモログについての所望の特異性を有するモノクローナルＦａｂフラグメントの迅速かつ効果的な同定を可能にする。タンパク質抗原に対するイディオタイプを含む抗体フラグメント（（ｉ）抗体分子のペプシン消化によって産生されるＦ（ａｂ’）２フラグメント；（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２フラグメントのジスルフィド架橋を還元することによって産生されたＦａｂフラグメント（ｉｉｉ）パパインおよび還元剤を用いた抗体分子の処理によって産生されたＦａｂフラグメント、および（ｉｖ）Ｆｖフラグメントを含むが、これらに限定ない）は、当該分野で公知の技術によって産生され得る。
【０１７６】
（ＶＩ．二重特異的抗体）
二重特異的抗体は、モノクローナル抗体（好ましくはヒトモノクローナル抗体またはヒト化モノクローナル抗体）であって、これは少なくとも２つの異なる抗原に対して結合特異性を有する。この場合において、結合特異性の１つは、本発明の抗原性タンパク質に対してである。第２の結合標的は、任意の他の抗原であり、そして有利には細胞表面タンパク質あるいはレセプターまたはレセプターサブユニットである。
【０１７７】
二重特異的抗体を作製する方法は、当該分野で公知である。伝統的に、二重特異的抗体の組換え生成は、２つの免疫グロブリンの重鎖／軽鎖の対の同時発現に基づき、ここでこの２つの重鎖は異なる特異性を有する（ＭｉｌｓｔｅｉｎおよびＣｕｅｌｌｏ、１９８３、Ｎａｔｕｒｅ，３０５：５３７−５３９）。免疫グロブリンの重鎖および軽鎖のランダムな組み合わせのために、これらのハイブリドーマ（すなわち、クアドローマ）は、１０の異なる抗体分子の潜在的混合物を作製し、このうち１つのみが正確な二重特異的構造を有する。この正確な分子の精製は、通常アフィニティークロマトグラフィー工程によって達成される。同様の手順は、ＰＣＴ公開ＷＯ９３／０８８２９（１９９３年５月１３日開示）、およびＴｒａｕｎｅｃｋｅｒら、１９９１　ＥＭＢＯ　Ｊ．、１０：３６５５−３６５９において開示される。
【０１７８】
所望の結合特異性（抗体−抗原結合部位）を有する抗体可変ドメインは、免疫グロブリン定常領域配列に融合され得る。この融合は、好ましくは免疫グロブリン重鎖定常ドメインを有し、ヒンジ、ＣＨ２、およびＣＨ３領域の少なくとも部分を含む。この融合物中の少なくとも１つに存在する軽鎖結合のために必要な部位を含む第１の重鎖定常領域（ＣＨ１）を有することが好ましい。この免疫グロブリン重鎖融合体、および所望の場合、この免疫グロブリン軽鎖をコードするＤＮＡは、別々の発現ベクターに挿入され、そして適切な宿主生物体に同時トランスフェクトされる。二重特異的抗体の作製のさらなる詳細は、例えば、Ｓｕｒｅｓｈら、１９８６、Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１２１：２１０を参照のこと。
【０１７９】
ＰＣＴ公開ＷＯ９６／２７０１１に記載される別のアプローチに従って、抗体分子の対の間の界面は、組換え細胞培養物から回収されるヘテロダイマーのパーセンテージを最大化するために操作され得る。好ましい界面は、抗体定常領域のＣＨ３領域の少なくとも一部を含む。この方法において、第１の抗体分子の界面からの１つ以上の小さなアミノ酸側鎖は、より大きな側鎖（例えば、チロシンまたはトリプトファン）で置換される。大きな側鎖についての同一または同様のサイズの代償的な「空洞」は、大きなアミノ酸側鎖を小さなアミノ酸側鎖（例えば、アラニンまたはスレオニン）で置換することによって、第２の抗体分子の界面上に生成される。このことは、ホモダイマーのような他の不必要な最終生成物よりも、ヘテロダイマーの収量を増加するための機構を提供する。
【０１８０】
二重特異的抗体は、全長抗体または抗体フラグメント（例えば、Ｆ（ａｂ’）２二重特異的抗体）として調製され得る。抗体フラグメントから二重特異的抗体を作製するための技術は、文献において記載される。例えば、二重特異的抗体は、化学結合を使用して調製され得る。Ｂｒｅｎｎａｎら（１９８５、Ｓｃｉｅｎｃｅ　２２９：８１）は、インタクトな抗体がタンパク分解的に切断されてＦ（ａｂ’）２フラグメントを作製する手順を記載する。これらのフラグメントは、ビシナルジチオールを安定化し、そして分子間ジスルフィド形成を阻止するために、ジチオール錯化剤亜ヒ酸ナトリウム塩の存在下で還元される。次いで、この作製されたＦａｂ’フラグメントは、チオニトロベンゾエート（ＴＮＢ）誘導体に変換される。次いで、Ｆａｂ’−ＴＮＢ誘導体の１つは、メルカプトエチルアミンでの還元によってＦａｂ’−チオールに再変換され、そしてこれは等モル量の他のＦａｂ’−ＴＮＢ誘導体と混合されて二重特異的抗体を形成する。生成された二重特異的抗体は、酵素の選択的固定化のための薬剤として使用され得る。
【０１８１】
さらに、Ｆａｂ’フラグメントは、Ｅ．ｃｏｌｉから直接回収され得、そして化学的にカップリングされて二重特異的抗体を形成する。Ｓｈａｌａｂｙら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７５：２１７−２２５（１９９２）は、完全にヒト化された二重特異的抗体Ｆ（ａｂ’）２分子の生成を記載する。各Ｆａｂ’フラグメントは、Ｅ．ｃｏｌｉから別々に分泌され、そしてインビトロの化学的カップリングに供され、二重特異的抗体を形成する。従って、形成されたこの二重特異的抗体は、ＥｒｂＢ２レセプターを過剰発現する細胞および正常なヒトＴ細胞に結合し得、そしてヒト胸部腫瘍標的に対するヒト細胞傷害性リンパ球の溶解性活性を誘因し得る。
【０１８２】
組換え細胞培養物から直接二重特異的抗体フラグメントを作製し、そして単離するための種々の技術が記載されてきた。例えば、二重特異的抗体は、ロイシンジッパーを使用して産生される。Ｋｏｓｔｅｌｎｙら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８（５）：１５４７−１５５３（１９９２）。ＦｏｓおよびＪｕｎタンパク質由来のロイシンジッパーペプチドは、遺伝子融合によって２つの異なる抗体のＦａｂ’部分に結合される。この抗体ホモダイマーは、ヒンジ領域で還元されてモノマーを形成し、次いで再酸化されて抗体ヘテロダイマーを形成する。この方法はまた、抗体ホモダイマーの産生のために使用され得る。Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　９０：６４４４−６４４８（１９９３））に記載されるこの「ディアボディー（ｄｉａｂｏｄｙ）」技術は、二重特異的抗体フラグメントを作製するための代替的な機構を提供した。このフラグメントは、短すぎて同じ鎖上の２つのドメインの間を対にできないリンカーによって軽鎖可変領域（ＶＬ）に接続された重鎖可変領域（ＶＨ）を含む。従って、１つのフラグメントのＶＨおよびＶＬドメインは、別のフラグメントの相補的なＶＬおよびＶＨドメインと対になるように強制され、これによって２つの抗原結合部位が形成する。単鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）ダイマーの使用によって二重特異的抗体フラグメントを作製するための別のストラテジーもまた、報告されてきた（Ｇｒｕｂｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：５３６８（１９９４））。
【０１８３】
２より多くの結合価を有する抗体が意図される。例えば、三重特異的抗体が調製され得る（Ｔｕｔｔら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：６０（１９９１））。
【０１８４】
例示的な二重特異的抗体は、２つの異なるエピトープに結合し得、このうち少なくとも１つは、本発明のタンパク質抗原に起源を有する。あるいは、免疫グロブリン分子の抗抗原性アームは、Ｔ細胞レセプター分子のような白血球（例えば、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ２８、またはＢ７）、あるいはＩｇＧに対するＦｃレセプター（Ｆｃ　Ｒ）（例えば、Ｆｃ　ＲＩ（ＣＤ６４）、Ｆｃ　ＲＩＩ（ＣＤ３２）およびＦｃ　ＲＩＩＩ（ＣＤ１６））上の標的化分子に結合するアームに、特定の抗原を発現する細胞に対する細胞の防御機構に焦点を合わせるように結合され得る。二重特異的抗体はまた、特定の抗原を発現する細胞に対する細胞傷害性因子に指向するために使用され得る。これらの抗体は抗原結合アーム、および細胞傷害性因子または放射性核種キレーター（例えば、ＥＯＴＵＢＥ、ＤＰＴＡ、ＤＯＴＡ、またはＴＥＴＡ）に結合するアームを保有する。目的の別の二重特異的抗体は、本明細書中に記載のタンパク質抗原に結合し、そしてさらに組織因子（ＴＦ）に結合する。
【０１８５】
（ＶＩＩ．ヘテロ接合体抗体）
ヘテロ接合体抗体はまた、本発明の範囲内である。ヘテロ接合体抗体は、２つの共有結合した抗体からなる。このような抗体は、例えば、免疫系細胞を不必要な細胞に標的化するために（米国特許第４，６７６，９８０号）、およびＨＩＶ感染の処置のために（ＷＯ９１／００３６０；ＷＯ９２／２００３７３；ＥＰ０３０８９）提案されてきた。この抗体（架橋剤を含む抗体を含む）は、インビトロで、合成タンパク質化学において公知の方法を使用して調製され得ることが意図される。例えば、免疫毒素は、ジスルフィド交換反応の使用またはチオエーテル結合の形成によって構築され得る。この目的のための適切な試薬の例としては、イミノチオレートおよびメチル−４−メルカプトブチルイミデート、ならびに例えば米国特許第４，６７６，９８０号において開示される試薬が挙げられる。
【０１８６】
（ＶＩＩＩ．エフェクター機能操作）
本発明の抗体を、エフェクター機能について、例えば癌の処置における抗体の効力を増大するように改変することが望ましい。例えば、システイン残基は、Ｆｃ領域に導入され得、これによってこの領域における鎖間ジスルフィド結合の形成を可能にする。従って、作製されるこのホモダイマー抗体は、改良されたインターナリゼーションの可能性および／または増加した補体媒介細胞死滅、ならびに抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）を有し得る。Ｃａｒｏｎら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１７６：１１９１−１１９５（１９９２）およびＳｈｏｐｅｓ、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：２９１８−２９２２（１９９２）を参照のこと。増大した抗腫瘍活性を有するホモダイマー抗体はまた、Ｗｏｌｆｆら（Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ、５３：２５６０−２６５６（１９９３））に記載されるヘテロ二官能性架橋剤を使用して調製され得る。あるいは、抗体は操作され得、これは二重のＦｃ領域を有し、そしてこれによって増大した補体溶解およびＡＤＣＣの可能性を有し得る（Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎら、Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ　Ｄｒｕｇ　Ｄｅｓｉｇｎ，３：２１９−２３０（１９８９））。
【０１８７】
（ＩＸ．免疫接合体）
本発明はまた、細胞傷害性の薬剤（例えば、化学療法剤、毒素（例えば、細菌、真菌、植物、または動物起源の酵素学的に活性な毒素、あるいはそれらのフラグメント）、または放射性同位体（すなわち、放射性接合体））に結合した抗体を含む免疫接合体に関する。
【０１８８】
このような免疫接合体の作製において有用な化学療法剤は、上記に記載される。使用され得る酵素学的に活性な毒素およびそれらのフラグメントとしては、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合活性フラグメント、外毒素Ａ鎖（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ由来）、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシン（ｍｏｄｅｃｃｉｎ）Ａ鎖、α−サルシン、Ａｌｅｕｒｉｔｅｓ　ｆｏｒｄｉｉタンパク質、ジアンチン（ｄｉａｎｔｈｉｎ）タンパク質、Ｐｈｙｔｏｌａｃａ　ａｍｅｒｉｃａｎａタンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、およびＰＡＰ−Ｓ）、ｍｏｍｏｒｄｉｃａ　ｃｈａｒａｎｔｉａインヒビター、クルシン（ｃｕｒｃｉｎ）、クロチン（ｃｒｏｔｉｎ）、ｓｅｐａｏｎａｒｉａ　ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓインヒビター、ゲロニン（ｇｅｌｏｎｉｎ）、ミトゲリン（ｍｉｔｏｇｅｌｌｉｎ）、レストリクトシン（ｒｅｓｔｒｉｃｔｏｃｉｎ）、フェノマイシン（ｐｈｅｎｏｍｙｃｉｎ）、エノマイシン（ｅｎｏｍｙｃｉｎ）、およびトリコテセン（ｔｒｉｃｏｔｈｅｃｅｎ）が挙げられる。種々の放射性核種は、放射性結合した抗体の作製のために利用可能である。その例としては、２１２Ｂｉ、１３１Ｉ、１３１Ｉｎ、９０Ｙ、および１８６Ｒｅが挙げられる。
【０１８９】
抗体および細胞傷害性因子の接合体は、種々の二官能性タンパク質結合因子（例えば、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオール）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、イミノチオラン（ｉｍｉｎｏｔｈｉｏｌａｎｅ）（ＩＴ）、イミドエステルの二官能性誘導体（例えば、ジメチルアジピミデート　ＨＣＬ）、活性エステル（例えば、ジスクシンイミジルスベレート）、アルデヒド（例えば、グルタルアルデヒド（ｇｌｕｔａｒｅｌｄｅｈｙｄｅ））、ビスアジド化合物（例えば、ビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミン）、ビス−ジアゾニウム誘導体（例えば、ビス−（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）−エチレンジアミン）、ジイソシアネート（例えば、トリエン２，６−ジイソシアネート）、およびビス−活性フッ素化合物（例えば、１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン））を使用して作製される。例えば、リシン免疫毒素は、Ｖｉｔｅｔｔａら（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３８：１０９８（１９８７））に記載されるように調製され得る。炭素−１４−標識１−イソチオシアナトベンジル−３−メチルジエチレントリアミン五酢酸（ＭＸ−ＤＴＰＡ）は、放射性ヌクレオチドの抗体への結合のための例示的なキレート剤である。ＷＯ９４／１１０２６を参照のこと。
【０１９０】
別の実施形態において、腫瘍の前標的化における利用のために、この抗体は、「レセプター」（例えば、ストレプトアビジン）に結合され得、ここで抗体−レセプター接合体は患者に投与され、続いて除去剤を使用して結合していない接合体が循環から除去され、次いで細胞傷害性因子に次々に結合する「リガンド」（例えば、アビジン）が投与される。
【０１９１】
（ＭＥＭＸ組換え発現ベクターおよび宿主細胞）
本発明の別の局面は、ＭＥＭＸタンパク質、またはそれらの誘導体、フラグメント、アナログ、もしくはホモログをコードする核酸を含むベクター、好ましくは発現ベクターに関する。本明細書中で使用される場合、用語「ベクター」は、これが接続された別の核酸を輸送し得る核酸分子をいう。ベクターの１つの型は「プラスミド」であり、これはさらなるＤＮＡセグメントが連結し得る環状の二本鎖ＤＮＡループをいう。ベクターの別の型はウイルス性ベクターであり、ここでさらなるＤＮＡセグメントはこのウイルス性ゲノムに連結され得る。特定のベクターは宿主細胞中で自発的に複製し得、この中に導入される（例えば、細菌の複製起源を有する細菌ベクターおよびエピソームの哺乳類ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソーム哺乳類ベクター）は、宿主細胞に導入される際に宿主細胞のゲノムに組み込まれ、そしてこれによって宿主のゲノムと同調して複製される。さらに、特定のベクターは、これが作動可能に連結される遺伝子の発現を指向し得る。このようなベクターは、本明細書中で「発現ベクター」といわれる。一般に、組換えＤＮＡ技術において有用な発現ベクターは、しばしばプラスミドの形態である。本明細書において、「プラスミド」および「ベクター」は、このプラスミドはベクターの最も一般的に使用される形態であるため、交換可能に使用され得る。しかし、本発明は、ウイルス性ベクター（例えば、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルス）のような発現ベクターのこのような他の形態を含むことを意図し、これは等価な機能を果たす。
【０１９２】
本発明の組換え発現ベクターは、本発明の核酸を、宿主細胞における核酸の発現に適切な形態で含み、これはこの組換え発現ベクターが、発現のために使用される宿主細胞に基づいて選択される、１つ以上の調節配列を含むこと意味し、これは発現される核酸配列に作動可能に連結される。組換え発現ベクターにおいて、「作動可能に連結」は、目的のヌクレオチド配列が、ヌクレオチド配列の発現を可能にする（例えば、このベクターが宿主細胞に導入される場合、インビトロ転写／翻訳系または宿主細胞において）ような様式で調節配列に連結されることを意味することを意図する。
【０１９３】
用語「調節配列」は、プロモーター、エンハンサーおよび他の発現制御エレメント（例えば、ポリアデニル化シグナル）を含むことを意図する。このような調節配列は、例えば、Ｇｏｅｄｄｅｌ、ＧＥＮＥ　ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ　ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ：ＭＥＴＨＯＤＳ　ＩＮ　ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ　１８５、Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．（１９９０）に記載されている。調節配列は、多くの型の宿主細胞においてヌクレオチド配列の構成的発現を指向する配列、および特定の宿主細胞のみにおいてヌクレオチド配列の発現を指向する配列（例えば、組織特異的調節配列）を含む。発現ベクターの設計が形質転換されるべき宿主細胞の選択、所望のタンパク質の発現のレベルなどのような因子に依存し得ることは当業者に理解される。本発明の発現ベクターは、宿主細胞に導入され、それにより、本明細書に記載されるような核酸によりコードされるタンパク質またはペプチド（融合タンパク質または融合ペプチドを含む）（例えば、ＭＥＭＸタンパク質、ＭＥＭＸタンパク質の変異形態、融合タンパク質など）を生成し得る。
【０１９４】
本発明の組換え発現ベクターは、原核生物細胞または真核生物細胞における、ＭＥＭＸタンパク質の発現のために設計され得る。例えば、ＭＥＭＸタンパク質は、細菌細胞（例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ．ｃｏｌｉ）、昆虫細胞（バキュロウイルス発現ベクターを用いる）、酵母細胞または哺乳動物細胞において発現され得る。適切な宿主細胞は、Ｇｏｅｄｄｅｌ、ＧＥＮＥ　ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ　ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ：ＭＥＴＨＯＤＳ　ＩＮ　ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ　１８５、Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．（１９９０）においてさらに考察される。あるいは、組換え発現ベクターは、例えば、Ｔ７プロモーター調節配列およびＴ７ポリメラーゼを用いて、インビトロで転写および翻訳され得る。
【０１９５】
原核生物におけるタンパク質の発現は、最も頻繁には、融合タンパク質または非融合タンパク質のいずれかの発現を指向する構成的プロモーターまたは誘導性プロモーターを含むベクターを有するＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ．ｃｏｌｉにおいて実行される。融合ベクターは、そこにコードされるタンパク質に、通常、組換えタンパク質のアミノ末端に、多数のアミノ酸を付加する。このような融合ベクターは、代表的には、以下の３つの目的のために役立つ：（ｉ）組換えタンパク質の発現を増加させること；（ｉｉ）組換えタンパク質の溶解度を増加させること；および（ｉｉｉ）親和性精製においてリガンドとして作用することによって組換えタンパク質の精製の際に補助すること。しばしば、融合発現ベクターにおいて、タンパク質分解の切断部位が、融合部分の結合部に導入され、そして融合タンパク質の精製の後に、組換えタンパク質が組換えタンパク質の融合部分から分離されることを可能にする。このような酵素、およびその同族の認識配列は、第Ｘａ因子、トロンビン、およびエンテロキナーゼを含む。代表的な融合発現ベクターとしては、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトースＥ結合タンパク質、またはプロテインＡを、それぞれ、標的の組換えタンパク質に融合するｐＧＥＸ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ　Ｉｎｃ；Ｓｍｉｔｈ　ａｎｄ　Ｊｏｈｎｓｏｎ（１９８８）Ｇｅｎｅ　６７：３１−４０）、ｐＭＡＬ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，Ｍａｓｓ．）およびｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎ．Ｊ．）が挙げられる。
【０１９６】
適切な誘導性非融合Ｅ．ｃｏｌｉ発現ベクターの例としては、ｐＴｒｃ（Ａｍｒａｎｎら（１９８８）Ｇｅｎｅ　６９：３０１−３１５）およびｐＥＴ　１１ｄ（Ｓｔｕｄｉｅｒら、ＧＥＮＥ　ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ　ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ：ＭＥＴＨＯＤＳ　ＩＮ　ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ　１８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．（１９９０）６０−８９）が挙げられる。
【０１９７】
Ｅ．ｃｏｌｉにおける組換えタンパク質発現を最大化するための１つのストラテジーは、組換えタンパク質をタンパク質分解的に切断する能力が損なわれた宿主細菌中でタンパク質を発現させることである。例えば、Ｇｏｔｔｅｓｍａｎ，ＧＥＮＥ　ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ　ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ：ＭＥＴＨＯＤＳ　ＩＮ　ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ　１８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．（１９９０）１１９−１２８を参照のこと。別のストラテジーは、各アミノ酸についての個々のコドンが、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて優先的に利用されるように、発現ベクターに挿入される核酸の核酸配列を変更することである（例えば、Ｗａｄａら（１９９２）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．２０：２１１１−２１１８を参照のこと）。本発明の核酸配列のこのような変更は、標準的なＤＮＡ合成技術によって実行され得る。
【０１９８】
別の実施形態において、ＭＥＭＸ発現ベクターは、酵母発現ベクターである。酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ．ｃｅｒｉｖｉｓａｅにおける発現のためのベクターの例には、ｐＹｅｐＳｅｃ１（Ｂａｌｄａｒｉら、（１９８７）ＥＭＢＯ　Ｊ　６：２２９−２３４）、ｐＭＦａ（ＫｕｒｊａｎおよびＨｅｒｓｋｏｗｉｔｚ、（１９８２）Ｃｅｌｌ　３０：９３３−９４３）、ｐＪＲＹ８８（Ｓｃｈｕｌｔｚら、（１９８７）Ｇｅｎｅ　５４：１１３−１２３）、ｐＹＥＳ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）、およびｐｉｃＺ（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ　Ｃｏｒｐ．，Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）が挙げられる。
【０１９９】
あるいは、ＭＥＭＸは、バキュロウイルス発現ベクターを使用して、昆虫細胞中で発現され得る。培養された昆虫細胞（例えば、ＳＦ９細胞）中でタンパク質の発現のために利用可能なバキュロウイルスベクターには、ｐＡｃシリーズ（Ｓｍｉｔｈら（１９８３）Ｍｏｌ　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ　３：２１５６−２１６５）およびｐＶＬシリーズ（ＬｕｃｋｌｏｗおよびＳｕｍｍｅｒｓ（１９８９）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　１７０：３１−３９）が挙げられる。
【０２００】
なお別の実施形態において、本発明の核酸は、哺乳動物発現ベクターを使用して、哺乳動物細胞中で発現される。哺乳動物発現ベクターの例には、ｐＣＤＭ８（Ｓｅｅｄ（１９８７）Ｎａｔｕｒｅ　３２９：８４０）およびｐＭＴ２ＰＣ（Ｋａｕｆｍａｎら（１９８７）ＥＭＢＯ　Ｊ　６：１８７−１９５）が挙げられる。哺乳動物細胞中で使用される場合、発現ベクターの制御機能は、しばしば、ウイルスの調節エレメントによって提供される。例えば、一般に使用されるプロモーターは、ポリオーマ、アデノウイルス２、サイトメガロウイルス、およびシミアンウイルス４０に由来する。原核生物細胞および真核生物細胞の両方のための他の適切な発現系については、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ　ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ　ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ　ＭＡＮＵＡＬ．第２版、Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８９の第１６章および第１７章を参照のこと。
【０２０１】
別の実施形態において、組換え哺乳動物発現ベクターは、特定の細胞型（例えば、組織特異的調節エレメントを使用して核酸を発現する）中で優先的に核酸の発現を指向し得る。組織特異的調節エレメントは、当該分野で公知である。適切な組織特異的プロモーターの非限定的な例としては、アルブミンプロモーター（肝臓特異的；Ｐｉｎｋｅｒｔら（１９８７）Ｇｅｎｅｓ　Ｄｅｖ　１：２６８−２７７）、リンパ特異的プロモーター（ＣａｌａｍｅおよびＥａｔｏｎ（１９８８）Ａｄｖ　Ｉｍｍｕｎｏｌ　４３：２３５−２７５）、特に、Ｔ細胞レセプタープロモーター（ＷｉｎｏｔｏおよびＢａｌｔｉｍｏｒｅ（１９８９）ＥＭＢＯ　Ｊ　８：７２９−７３３）および免疫グロブリン（Ｂａｎｅｒｊｉら（１９８３）Ｃｅｌｌ　３３：７２９−７４０；ＱｕｅｅｎおよびＢａｌｔｉｍｏｒｅ（１９８３）Ｃｅｌｌ　３３：７４１−７４８）のプロモーター、ニューロン特異的プロモーター（例えば、ニューロフィラメントプロモーター；ＢｙｒｎｅおよびＲｕｄｄｌｅ（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８６：５４７３−５４７７）、膵臓特異的プロモーター（Ｅｄｌｕｎｄら（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ　２３０：９１２−９１６）、および乳腺特異的プロモーター（例えば、ミルク乳清プロモーター；米国特許第４，８７３，３１６号および欧州出願公開第２６４，１６６号）が挙げられる。発生的に調節されるプロモーターもまた含まれる（例えば、マウスホックス（ｍｕｒｉｎｅ　ｈｏｘ）プロモーター（ＫｅｓｓｅｌおよびＧｒｕｓｓ（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ　２４９：３７４−３７９）およびα−フェトプロテインプロモーター（ＣａｍｐｅｓおよびＴｉｌｇｈｍａｎ（１９８９）Ｇｅｎｅｓ　Ｄｅｖ　３：５３７−５４６）。
【０２０２】
本発明はさらに、アンチセンス方向で発現ベクターにクローニングされた本発明のＤＮＡ分子を含む組換え発現ベクターを提供する。すなわち、そのＤＮＡ分子は、ＭＥＭＸ　ｍＲＮＡに対してアンチセンスであるＲＮＡ分子の発現（ＤＮＡ分子の転写によって）を可能にする様式で調節配列に作動可能に連結される。種々の細胞型におけるアンチセンスＲＮＡ分子の連続的な発現を指向する、アンチセンス方向でクローニングされた核酸に作動可能に連結される調節配列が選択され得る。例えば、アンチセンスＲＮＡの構成的発現、組織特異的発現、または細胞型特異的発現を指向する、ウイルスプロモーターおよび／もしくはエンハンサー、または調節配列が選択され得る。アンチセンス発現ベクターは、組換えプラスミド、ファージミド、または弱毒化されたウイルスの形態であり得、ここではアンチセンス核酸は、高効率調節領域の制御下で産生され、その活性は、ベクターが導入される細胞型によって決定され得る。アンチセンス遺伝子を使用する遺伝子発現の調節の議論については、例えば、Ｗｅｉｎｔｒａｕｂら、「Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ　ＲＮＡ　ａｓ　ａ　ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｔｏｏｌ　ｆｏｒ　ｇｅｎｅｔｉｃ　ａｎａｌｙｓｉｓ」、Ｒｅｖｉｅｗｓ−Ｔｒｅｎｄｓ　ｉｎ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、第１巻（１）１９８６を参照のこと。
【０２０３】
本発明の別の局面は、本発明の組換え発現べクターが導入された宿主細胞に関する。用語「宿主細胞」および「組換え宿主細胞」は、本明細書中で、交換可能に使用される。このような用語は、特定の対象の細胞をいうのみでなく、そのような細胞の子孫または潜在的な子孫をいうことが理解される。変異または環境的影響のいずれかに起因して、特定の改変は次の世代において存在し得るので、このような子孫は、実際、親の細胞と同一でないかもしれないが、なお、本明細書中で使用されるような用語の範囲内に含まれる。
【０２０４】
宿主細胞は、任意の原核生物細胞または真核生物細胞であり得る。例えば、ＭＥＭＸタンパク質は、細菌細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）、昆虫細胞、酵母または哺乳動物細胞（例えば、ヒトチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）またはＣＯＳ細胞）で発現され得る。他の適切な宿主細胞は、当業者に公知である。
【０２０５】
ベクターＤＮＡは、従来的な形質転換またはトランスフェクション技術を介して原核生物細胞または真核生物細胞に導入され得る。本明細書中で使用される場合、用語「形質転換」および「トランスフェクション」とは、外来性の核酸（例えば、ＤＮＡ）を宿主細胞中に導入するための当該分野で認識される種々の技術をいうことを意図し、これらには、リン酸カルシウムまたは塩化カルシウム共沈殿、ＤＥＡＥデキストラン媒介トランスフェクション、リポフェクション、またはエレクトロポレーションが含まれる。宿主細胞を形質転換またはトランスフェクトするための適切な方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ　ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ　ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ　ＭＡＮＵＡＬ．第２版、Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８９）および他の実験室マニュアルに見出され得る。
【０２０６】
哺乳動物細胞の安定なトランスフェクションについては、使用される発現ベクターおよびトランスフェクション技術に依存して、細胞のほんの一部のみが外来ＤＮＡをそのゲノム中に組み込み得ることが知られている。これらの要素を同定および選択するために、選択マーカー（例えば、抗生物質に対する耐性）をコードする遺伝子が、一般的には目的の遺伝子とともに宿主細胞に導入される。種々の選択マーカーには、薬物に対する耐性を付与するマーカー（例えば、Ｇ４１８、ハイグロマイシン、およびメトトレキセート）が含まれる。選択マーカーをコードする核酸は、ＭＥＭＸをコードするベクターと同じベクター上で宿主細胞に導入され得るか、あるいは別々のベクター上で導入され得る。導入された核酸とともに安定にトランスフェクトされる細胞は、薬物選択によって同定され得る（例えば、選択マーカー遺伝子を取り込んだ細胞は生存するが、他の細胞は死滅する）。
【０２０７】
本発明の宿主細胞（例えば、培養中の原核生物宿主細胞および真核生物宿主細胞）は、ＭＥＭＸタンパク質を産生（すなわち、発現）するために使用され得る。従って、本発明はさらに、本発明の宿主細胞を使用して、ＭＥＭＸタンパク質を産生するための方法を提供する。１つの実施形態において、この方法は、ＭＥＭＸタンパク質が産生されるような適切な培地中で、本発明の宿主細胞（ここに、ＭＥＭＸタンパク質をコードする組換え発現ベクターが導入されている）を培養する工程を包含する。別の実施形態において、この方法はさらに、培地または宿主細胞からＭＥＭＸを単離する工程を包含する。
【０２０８】
（トランスジェニックＭＥＭＸ動物）
本発明の宿主細胞はまた、非ヒトトランスジェニック動物を作製するために使用され得る。例えば、１つの実施形態において、本発明の宿主細胞は、ＭＥＭＸタンパク質コード配列が導入される、受精した卵母細胞または胚性幹細胞である。次いで、このような宿主細胞は、非ヒトトランスジェニック動物を作製するために使用され得、ここで外因性のＭＥＭＸ配列は、それらのゲノムまたは相同組換え動物（ここで内因性のＭＥＭＸ配列が変更されている）に導入される。このような動物は、ＭＥＭＸタンパク質の機能および／または活性を研究するため、およびＭＥＭＸタンパク質の活性のモジュレーターを同定および／または評価するために有用である。本明細書中で使用される場合、「トランスジェニック動物」とは、非ヒト動物、好ましくは哺乳動物であり、より好ましくは、ラットまたはマウスのような齧歯動物であり、ここでこれらの動物の１つ以上の細胞は、導入遺伝子を含む。トランスジェニック動物の他の例には、非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ウシ、ヤギ、ニワトリ、両生類などを含む。導入遺伝子は、細胞のゲノムに組み込まれ（この細胞からトランスジェニック動物が発生する）、そして成熟動物のゲノムに残存する外因性のＤＮＡであり、それによって、このトランスジェニック動物の１つ以上の細胞型または組織においてコード遺伝子産物の発現を指向する。本明細書中で使用される場合、「相同組換え動物」とは、非ヒト動物であり、好ましくは哺乳動物、より好ましくはマウスであり、ここで、内因性ＭＥＭＸ遺伝子は、この内因性の遺伝子と、動物の発生の前に動物の細胞（例えば、動物の胚細胞）に導入された外因性ＤＮＡ分子との間の相同組換えによって、変更されている。
【０２０９】
本発明のトランスジェニック動物は、ＭＥＭＸをコードする核酸を、（受精した卵母細胞の雄性前核に導入することによって例えば、マイクロインジェクション、レトロウイルス感染によって）、およびこの卵母細胞が偽妊娠雌性フォスター動物（ｆｏｓｔｅｒ　ａｎｉｍａｌ）中で発生することを可能にすることによって作製され得る。配列番号１、３、５、７、９、１１、１３または１５のＭＥＭＸ　ｃＤＮＡ配列は、非ヒト動物のゲノムに導入遺伝子として導入され得る。あるいは、ヒトＭＥＭＸ遺伝子の非ヒトホモログ（例えば、マウスＭＥＭＸ遺伝子）は、ヒトＭＥＭＸ　ｃＤＮＡに対するハイブリダイゼーションに基づいて単離され得（上述にさらに記載される）、そして導入遺伝子として使用され得る。イントロン配列およびポリアデニル化シグナルもまた導入遺伝子中に含まれ、その導入遺伝子の発現の効率を増大させ得る。組織特異的調節配列（単数または複数）は、特定の細胞に対して、ＭＥＭＸタンパク質の発現を指向するために、ＭＥＭＸ導入遺伝子に作動可能に連結される。胚の操作およびマイクロインジェクションを介するトランスジェニック動物（特に、マウスのような動物）を生成するための方法は、当該分野で従来的になっており、そして例えば、米国特許第４，７３６，８６６号；同第４，８７０，００９号；および同第４，８７３，１９１号；ならびにＨｏｇａｎ　１９８６、ＭＡＮＩＰＵＬＡＴＩＮＧ　ＴＨＥ　ＭＯＵＳＥ　ＥＭＢＲＹＯ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．に記載されている。同様の方法は、他のトランスジェニック動物の作製のために使用される。トランスジェニック初代動物は、そのゲノムにおけるＭＥＭＸ導入遺伝子の存在および／またはその動物の組織または細胞中のＭＥＭＸ　ｍＲＮＡの発現に基づいて同定され得る。次いで、トランスジェニック初代動物は、導入遺伝子を有するさらなる動物を繁殖させるために使用され得る。さらに、ＭＥＭＸタンパク質をコードする導入遺伝子を有するトランスジェニック動物は、さらに、他の導入遺伝子を有する他のトランスジェニック動物へと繁殖させ得る。
【０２１０】
相同組換え動物を作製するために、欠失、付加、または置換が導入されて、それによってＭＥＭＸ遺伝子が変化（例えば、機能的に破壊）されている、少なくとも、ＭＥＭＸ遺伝子の一部を含むベクターを調製する。ＭＥＭＸ遺伝子は、ヒト遺伝子（例えば、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３または１５のＤＮＡ）であり得るが、より好ましくは、ヒトＭＥＭＸ遺伝子の非ヒトホモログである。例えば、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３または１５のヒトＭＥＭＸ遺伝子のマウスホモログは、マウスゲノムにおいて内因性ＭＥＭＸ遺伝子を変更するのに適切な相同組換えベクターを構築するために使用され得る。１つの実施形態において、そのベクターは、相同組換えに際して、内因性ＭＥＭＸ遺伝子が、機能的に破壊される（すなわち、機能的タンパク質をもはやコードしない；「ノックアウト」ベクターともいわれる）ように設計される。
【０２１１】
あるいは、このベクターは、相同組換えの際に、内因性ＭＥＭＸ遺伝子が変異されるか、あるいはさもなければ、変更されるが、なお機能性タンパク質をコードするように設計される（例えば、上流の調節領域を変更して、それによって内因性ＭＥＭＸタンパク質の発現を変更し得る）。相同組換えベクターにおいて、ＭＥＭＸ遺伝子の変更された部分は、ＭＥＭＸ遺伝子のさらなる核酸によって、その５’末端および３’末端で隣接され、相同組換えが、ベクターによって運ばれる外因性ＭＥＭＸ遺伝子と胚幹細胞中の内因性ＭＥＭＸ遺伝子との間で起こることを可能にする。さらなる隣接するＭＥＭＸ核酸は、内因性遺伝子との首尾よい相同組換えに十分な長さである。代表的に、数キロベースの隣接するＤＮＡ（５’末端および３’末端の両方）が、ベクターに含まれる。例えば、相同組換えベクターの記載について、Ｔｈｏｍａｓら（１９８７）Ｃｅｌｌ　５１：５０３を参照のこと。このベクターは、胚幹細胞株に導入され（例えば、エレクトロポレーションによって）、この導入されたＭＥＭＸ遺伝子が、内因性ＭＥＭＸ遺伝子と相同組換えされた細胞が、選択される（例えば、Ｌｉら（１９９２）Ｃｅｌｌ　６９：９１５を参照のこと）。
【０２１２】
次いで、この選択された細胞を、動物（例えば、マウス）の胚盤胞へ注入して、凝集キメラを形成する。例えば、Ｂｒａｄｌｅｙ（１９８７）のＴＥＲＡＴＯＣＡＲＣＩＮＯＭＡＳ　ＡＮＤ　ＥＭＢＲＹＯＮＩＣ　ＳＴＥＭ　ＣＥＬＬＳ：Ａ　ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ　ＡＰＰＲＯＡＣＨ、Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ編、ＩＲＬ、Ｏｘｆｏｒｄ　１１３頁〜１５２頁を参照のこと。次いで、キメラ胚を、適切な偽妊娠雌性フォスター動物に移植し得、そしてこの胚を、一定期間置く。それらの胚芽細胞中に相同組換えＤＮＡを保有する子孫を使用して、動物を繁殖し得、ここで、この動物の全ての細胞は、導入遺伝子の生殖系列伝達によって、この相同組換えＤＮＡを含む。相同的組換えベクターおよび相同的組換え動物を構築するための方法が、さらに以下に記載される；Ｂｒａｄｌｅｙ（１９９１）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２：８２３−８２９；ＰＣＴ国際公開番号：ＷＯ９０／１１３５４；ＷＯ９１／０１１４０；ＷＯ９２／０９６８；およびＷＯ９３／０４１６９。
【０２１３】
別の実施形態において、導入遺伝子の調節された発現を可能にする選択された系を含む非ヒトトランスジェニック動物が産生され得る。このような系の１つの例は、バクテリオファージＰ１のｃｒｅ／ｌｏｘＰリコンビナーゼ系である。ｃｒｅ／ｌｏｘＰリコンビナーゼ系の記述については、例えば、Ｌａｋｓｏら、１９９２．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８９：６２３２−６２３６を参照のこと。リコンビナーゼ系の別の例は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＦＬＰリコンビナーゼ系である（Ｏ’Ｇｏｒｍａｎら、１９９１．Ｓｃｉｅｎｃｅ　２５１：１３５１−１３５５を参照のこと）。ｃｒｅ／ｌｏｘＰリコンビナーゼ系が導入遺伝子の発現を調節するために使用される場合、Ｃｒｅリコンビナーゼおよび選択されたタンパク質の両方をコードする導入遺伝子を含む動物が必要となる。このような動物は、例えば、２種のトランスジェニック動物（一方は選択されたタンパク質をコードした導入遺伝子を含み、他方はリコンビナーゼをコードした導入遺伝子を含む）を交配することによる「二重の」トランスジェニック動物の構築によって提供され得る。
【０２１４】
本明細書中に記載されるトランスジェニック非ヒト動物のクローンがまた、Ｗｉｌｍｕｔら、１９９７．Ｎａｔｕｒｅ　３８５：８１０−８１３に記載される方法に従って、産生され得る。簡単には、トランスジェニック動物からの細胞（例えば、体細胞）は単離および誘導され、増殖サイクルから出、そしてＧ０フェイズに入り得る。次いで、静止性細胞が、例えば、電気パルスの使用により、その静止性細胞が単離される同種の動物から摘出された卵母細胞へ融合され得る。次いで、この再構築された卵母細胞は培養され、これにより、これは桑実胚または未分化胚芽細胞に発達し、次いで、偽妊娠雌性養育動物に移される。この雌性養育動物から産まれた子孫は、その細胞（例えば、その体細胞）が単離された動物のクローンである。
【０２１５】
（薬学的組成物）
本発明のＭＥＭＸ核酸分子、ＭＥＭＸタンパク質、および抗ＭＥＭＸ抗体（これはまた、本明細書中で、「活性な化合物」とも呼ばれる）、ならびにそれらの誘導体、フラグメント、アナログ、および相同体が、投与に適した薬学的組成物に組み込まれ得る。このような組成物は、典型的に、核酸分子、タンパク質または抗体、および薬学的に受容可能なキャリアを含む。本明細書中で使用される場合、「薬学的に受容可能なキャリア」は、薬学的な投与に適合した、任意および全ての溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤（ｄｅｌａｙｉｎｇ　ａｇｅｎｔ）などを含むことが意図される。適切なキャリアは、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（当該分野の標準的参考文献）（本明細書中に参考として援用される）の最新版に記載される。このようなキャリアまたは希釈剤の好ましい例としては、水、生理食塩水、ｆｉｎｇｅｒ溶液、デキストロース溶液、および５％ヒト血清アルブミンが挙げられるが、これらに限定されない。リポソームおよび非水性ビヒクル（例えば、不揮発性油）もまた、使用され得る。薬学的に活性な物質におけるこのような媒体および薬剤の使用は、当該分野で周知である。任意の従来の媒体または薬剤が活性な化合物と不適合である範囲を除いて、組成物におけるその使用が考慮される。補助活性化合物はまた、組成物へ組み込まれ得る。
【０２１６】
本発明の薬学的組成物は、その意図される投与の経路と適合するように処方される。投与の経路の例には、非経口（例えば、静脈、皮内、皮下）投与、経口（例えば、吸入）投与、経皮（局所的）投与、経粘膜（ｔｒａｎｓｍｕｃｏｓａｌ）投与、および直腸投与が挙げられる。非経口適用、皮内適用または皮下適用のために使用される溶液または懸濁液は、以下の成分を含み得る：注射用水、生理食塩水溶液、不揮発性油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の合成溶媒のような、滅菌希釈剤；ベンジルアルコールまたはメチルパラベンのような、抗菌剤；アスコルビン酸または重亜硫酸ナトリウムのような、抗酸化剤；エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）のような、キレート剤；酢酸塩、クエン酸塩またはリン酸塩のような、緩衝液、および塩化ナトリウムまたはデキストロースのような、張度の調節のための薬剤。ｐＨは、塩酸または水酸化ナトリウムのような酸または塩基で調整され得る。非経口調製物は、アンプル、使い捨てシリンジ、あるいはガラスまたはプラスチックから作製される多用量のバイアル中に入れられ得る。
【０２１７】
注入使用に適した薬学的組成物は、滅菌水性溶液（ここで、水溶解性）または分散液、および滅菌の注入可能な溶液または分散液の即座の調製のための滅菌粉末を含む。静脈投与において、適切なキャリアには、生理食塩水、静菌水、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ　ＥＬＴＭ（ＢＡＳＦ、Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ、Ｎ．Ｊ．）またはリン酸塩緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）が挙げられる。全ての場合において、組成物は、滅菌性でなければならず、そして容易な注入性（ｓｙｒｉｎｇｅａｂｉｌｉｔｙ）が存在する程度に流動性であるべきである。これは、製造および保存の条件下で安定でなければならず、そして、細菌および真菌のような微生物の汚染行為に対して保護されるべきである。このキャリアは、例えば、以下を含む溶媒または分散媒であり得る：水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）ならびにそれらの適切な混合物。適切な流動性が、例えば、レシチンのようなコーティングの使用によって、分散液の場合に、要求される粒子サイズを維持することによって、および界面活性剤を使用することによって維持され得る。微生物の作用の防止は、種々の抗菌剤および抗真菌剤（例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなど）によって達成され得る。多くの場合、組成物中に等張剤（例えば、砂糖、ポリアルコール（例えば、マンニトール（ｍａｎｉｔｏｌ））、ソルビトール、塩化ナトリウム）を含むことが好ましい。注入可能組成物の長時間吸収は、組成物に吸収を遅らせる薬剤（例えば、アルミニウムモノステアレートおよびゼラチン）を含ませることによってもたらされ得る。
【０２１８】
滅菌注射可能溶液は、必要量のこの活性化合物（例えば、ＭＥＭＸタンパク質あるいは抗ＭＥＭＸ抗体））を、適切な溶媒中に、上記で列挙される成分の１つまたは組み合わせと共に組み込み、必要な場合、続いて濾過滅菌することによって調製され得る。一般的に、分散液は、活性化合物を、塩基性分散媒および上記で列挙される成分から必要とされる他の成分を含む滅菌ビヒクル中へ組み込むことによって調製される。滅菌注射可能液剤の調製のための滅菌散剤の場合において、調製方法は、真空乾燥および凍結乾燥であり、これにより、活性成分および既に滅菌濾過されたその液剤からの任意のさらなる所望の成分の散剤を得る。
【０２１９】
経口組成物は、一般的に、不活性希釈剤または食用キャリアを含む。これらは、ゼラチンカプセルに封入され得るか、または錠剤へと圧縮され得る。経口治療投与の目的のために、この活性化合物は、賦形剤とともに組み込まれ得、そして錠剤、トローチ剤、またはカプセル剤の形態で使用され得る。経口組成物はまた、マウスウォッシュとしての使用のために流体キャリアを使用して調製され得、ここで、この流体キャリア中のこの化合物は、経口的に適用され、そしてさっと動かされ、そして吐き出されるか、または飲み込まれる。薬学的に適合性の結合剤、および／またはアジュバント材料が、この組成物の一部として含まれ得る。錠剤、丸剤、カプセル剤、トローチ剤などが、任意の以下の成分または同様の性質を有する化合物を含み得る：結合剤（例えば、微結晶セルロース、ガムトラガントまたはゼラチン）；賦形剤（例えば、デンプンまたはラクトース）、崩壊剤（例えば、アルギン酸）、Ｐｒｉｍｏｇｅｌ、またはコーンスターチ；滑沢剤（例えば、ステアリン酸マグネシウムまたはＳｔｅｒｏｔｅｓ）；滑り剤（ｇｌｉｄａｎｔ）（例えば、コロイド状二酸化ケイ素）；甘味剤（例えば、スクロースまたはサッカリン）；あるいは香味剤（例えば、ペパーミント、サリチル酸メチル、またはオレンジフレーバー）。
【０２２０】
吸入による投与について、この化合物は、適切な噴霧剤（例えば、二酸化炭素のような気体）を含む圧縮容器またはディスペンサー、あるいは噴霧器から、エアロゾル噴霧の形態で送達される。
【０２２１】
全身的投与はまた、経粘膜手段または経皮手段により得る。経粘膜投与または経皮投与について、浸透されるバリアに適切な浸透剤が、処方において使用される。このような浸透剤は、一般的に、当該分野で公知であり、そして、例えば、経粘膜投与については、界面活性剤、胆汁酸塩、およびフシジン酸誘導体が挙げられる。経粘膜投与は、鼻噴霧または坐剤の使用によって達成され得る。経皮投与については、この活性化合物は、当該分野で一般的に公知である軟膏剤、軟膏、ゲル、またはクリーム剤へ処方される。
【０２２２】
この化合物はまた、直腸送達のための坐剤（例えば、ココアバターおよび他のグリセリドのような従来の坐剤ベースと共に）または保持浣腸の形態で調製され得る。
【０２２３】
１つの実施形態において、この活性化合物は、身体からの迅速な排出に対してこの化合物を保護するキャリアを用いて調製され（例えば、制御放出処方物）、これには、移植片およびマイクロカプセル化された送達系が挙げられる。エチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸のような、生分解性、生体適合性ポリマーが使用され得る。このような処方物の調製のための方法は、当該業者には明らかである。これらの材料はまた、Ａｌｚａ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｎｏｖａ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．から市販され、手に入れることができる。リポソーム懸濁剤（ウイルス抗原に対するモノクローナル抗体を有する、感染させた細胞へ標的化されるリポソームを含む）がまた、薬学的に受容可能なキャリアとして使用され得る。これらは、例えば米国特許第４，５２２，８１１号に記載されるような、当業者に公知の方法に従って調製され得る。
【０２２４】
投与の容易さおよび投薬量の均一性のために、投薬単位形態で、経口組成物または非経口組成物を処方することが、特に有益である。本明細書で使用される投薬単位形態は、処置される被験体のための単位投薬量として適切な物理的に個々の単位をいい；各単位は、必要とされる薬学的キャリアと関連して所望の治療的効果を生じるように計算された、所定量の活性化合物を含む。本発明の投薬単位形態についての詳細は、この活性化合物の特異的な特性、および達成される特定の治療効果、ならびに個体の処置のためのこのような活性化合物を調合する当該分野に固有の制限によって決定されるか、あるいはこれらに直接依存する。
【０２２５】
本発明の核酸分子は、ベクターに挿入され得、そして遺伝子治療ベクターとして使用され得る。遺伝子治療ベクターは、被験体へ、例えば静脈注射、局所投与（例えば、米国特許第５，３２８，４７０号を参照のこと）によって、または定位注射（例えば、Ｃｈｅｎら（１９９４）Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ　９１：３０５４−３０５７を参照のこと）によって送達され得る。遺伝子治療ベクターの薬学的調製物には、受容可能な希釈剤中の遺伝子治療ベクターが挙げられ得、または遺伝子送達ビヒクルが組み込まれる徐放性マトリックスが挙げられ得る。あるいは、完全な遺伝子送達ベクターが組換え細胞からインタクトで産生され得（例えば、レトロウイルスベクター）、薬学的調製物は、遺伝子送達系を産生する１以上の細胞を含み得る。
【０２２６】
薬学的組成物は、投与のための使用説明書と共の容器、包装、またはディスペンサーに含まれ得る。
【０２２７】
（スクリーニング方法および検出方法）
本発明の単離された核酸分子は、以下にさらに説明されるように、ＭＥＭＸタンパク質（例えば、遺伝子治療用途における宿主細胞中の組換え発現ベクターによる）を発現するため、ＭＥＭＸ　ｍＲＮＡ（例えば、生物学的サンプルにおいて）またはＭＥＭＸ遺伝子における遺伝子損傷を検出するため、ならびにＭＥＭＸ活性を調節するために使用され得る。さらに、ＭＥＭＸタンパク質は、ＭＥＭＸタンパク質活性または発現を調節する薬物または化合物をスクリーニングするために、ならびにＭＥＭＸタンパク質の不十分なもしくは過剰な産生によって、あるいはＭＥＭＸ野生型タンパク質と比較して減少したもしくは異常な活性を有するＭＥＭＸタンパク質形態の産生によって特徴付けられる障害を処置するために使用され得る。さらに、本発明の抗ＭＥＭＸ抗体が、ＭＥＭＸタンパク質を検出して単離するため、およびＭＥＭＸ活性を調節するために使用され得る。
【０２２８】
本発明は、さらに、本明細書中で記載されるようなスクリーニングアッセイによって同定される新規の薬剤、および上述の処置のためのそれらの使用に関する。
【０２２９】
（Ｉ．スクリーニングアッセイ）
本発明は、モジュレーター（すなわち、ＭＥＭＸタンパク質に結合するかあるいは例えば、ＭＥＭＸタンパク質発現またはＭＥＭＸタンパク質活性に刺激効果または阻害効果を有する候補物または試験の化合物または薬剤（例えば、ペプチド、ペプチド模倣体、低分子または他の薬物）を同定するための方法（本明細書中において、「スクリーニングアッセイ」とも呼ばれる）を提供する。本発明はまた、本明細書中に記載されるスクリーニングアッセイにおいて同定された化合物を包含する。
【０２３０】
１つの実施形態において、本発明は、ＭＥＭＸのタンパク質またはポリペプチド、あるいはその生物学的に活性な部分の膜結合形態に結合するか、またはそれら膜結合形態の活性を調節する、候補化合物もしくは試験化合物をスクリーニングするためのアッセイを提供する。本発明の試験化合物は、当該分野において公知のコンビナトリアルライブラリー法における任意の多数のアプローチを使用して得られ得、これらのライブラリーには、以下が挙げられる：生物学的ライブラリー；空間的にアドレセス可能な平行固相もしくは溶液相ライブラリー；逆重畳を要する合成ライブラリー法；「１ビーズ１化合物」ライブラリー法；およびアフィニティークロマトグラフィー選択を使用する合成ライブラリー法。生物学的ライブラリーアプローチはペプチドライブラリーに限定されるが、他の４つのアプローチは、ペプチド、非ペプチドオリゴマーもしくは化合物の低分子ライブラリーに適用可能である（例えば、Ｌａｍ（１９９７）Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ　Ｄｒｕｇ　Ｄｅｓｉｇｎ　１２：１４５を参照のこと）。
【０２３１】
本明細書中で使用される場合、「低分子」とは、約５ｋＤ未満の分子量、最も好ましくは約４ｋＤ未満の分子量を有する組成物をいうように意味される。低分子は、例えば、核酸、ペプチド、ポリペプチド、ペプチド模倣体、炭水化物、脂質または他の有機分子もしくは無機分子であり得る。化学的および／または生物学的混合物（例えば、真菌、細菌または藻類抽出物）のライブラリーは、当該分野で公知であり、そして本発明のアッセイのいずれかを用いてスクリーニングされ得る。
【０２３２】
分子ライブラリーの合成のための方法の例は、当該分野において、例えば以下に見出され得る：ＤｅＷｉｔｔら（１９９３）Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　Ｕ．Ｓ．Ａ．９０：６９０９；Ｅｒｂら（１９９４）Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　Ｕ．Ｓ．Ａ．９１：１１４２２；Ｚｕｃｋｅｒｍａｎｎら（１９９４）Ｊ　Ｍｅｄ　Ｃｈｅｍ　３７：２６７８；Ｃｈｏら（１９９３）Ｓｃｉｅｎｃｅ　２６１：１３０３；Ｃａｒｒｅｌｌら（１９９４）Ａｎｇｅｗ　Ｃｈｅｍ　Ｉｎｔ　Ｅｄ　Ｅｎｇｌ　３３：２０５９；Ｃａｒｅｌｌら（１９９４）Ａｎｇｅｗ　Ｃｈｅｍ　Ｉｎｔ　Ｅｄ　Ｅｎｇｌ　３３：２０６１；Ｇａｌｌｏｐら（１９９４）Ｊ　Ｍｅｄ　Ｃｈｅｍ　３７：１２３３。
【０２３３】
化合物のライブラリーは、溶液中で（例えば、Ｈｏｕｇｈｔｅｎ（１９９２）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　１３：４１２〜４２１）、あるいはビーズ上（Ｌａｍ（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ　３５４：８２〜８４）、チップ上（Ｆｏｄｏｒ（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ　３６４：５５５〜５５６）、細菌（Ｌａｄｎｅｒ　米国特許第５，２２３，４０９号）、胞子（Ｌａｄｎｅｒ　米国特許第５，２３３，４０９号）、プラスミド（Ｃｕｌｌら（１９９２）Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ　８９：１８６５〜１８６９）またはファージ上（ＳｃｏｔｔおよびＳｍｉｔｈ（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ　２４９：３８６〜３９０；Ｄｅｖｌｉｎ（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ　２４９：４０４〜４０６；Ｃｗｉｒｌａら（１９９０）Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　Ｕ．Ｓ．Ａ．８７：６３７８〜６３８２；Ｆｅｌｉｃｉ（１９９１）Ｊ　Ｍｏｌ　Ｂｉｏｌ　２２２：３０１〜３１０；Ｌａｄｎｅｒ、米国特許第５，２３３，４０９号）において示され得る。
【０２３４】
１つの実施形態において、アッセイは細胞ベースのアッセイであり、ここで、膜結合形態のＭＥＭＸタンパク質、またはその生物学的に活性な部分を細胞表面上に発現する細胞が、試験化合物と接触され、そしてこの試験化合物が、ＭＥＭＸタンパク質に結合する能力が、決定される。例えば、細胞は、哺乳動物起源または酵母細胞であり得る。この試験化合物がＭＥＭＸタンパク質に結合する能力の決定は、例えば、その試験化合物を放射性同位体標識または酵素標識とカップリングさせて、その結果、この試験化合物のＭＥＭＸタンパク質またはその生物学的に活性な部分に対する結合が、複合体におけるその標識化合物を検出することによって決定され得ることによって達成され得る。例えば、試験化合物は、１２５Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃ、または３Ｈで直接的または間接的のいずれかで標識され得、そしてその放射性同位体が、放射線放射の直接の計数により、またはシンチレーション計数により、検出され得る。あるいは、試験化合物は、例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、またはルシフェラーゼで酵素的に標識され得、そしてこの酵素的標識が、適切な基質の生成物への転換を決定することにより、検出され得る。１つの実施形態において、このアッセイは、膜結合形態のＭＥＭＸタンパク質、またはその生物学的に活性な部分をその細胞表面上に発現する細胞を、ＭＥＭＸと結合する公知の化合物と接触させて、アッセイ混合物を形成する工程、このアッセイ混合物に試験化合物を接触させる工程、ならびにこの試験化合物がＭＥＭＸタンパク質と相互作用する能力を決定する工程を包含し、ここで、この試験化合物がＭＥＭＸタンパク質と相互作用する能力を決定する工程が、この試験化合物が、公知の化合物と比較して、ＭＥＭＸまたはその生物学的に活性な部分と優先的に結合する能力を決定する工程を包含する。
【０２３５】
別の実施形態において、アッセイは、細胞ベースのアッセイであり、これは、膜結合形態のＭＥＭＸタンパク質またはその生物学的に活性な部分を細胞表面上で発現する細胞を、試験化合物と接触させる工程、ならびにこの試験化合物が、ＭＥＭＸタンパク質またはその生物学的に活性な部分の活性を調節（例えば、刺激または阻害）する能力を決定する工程を包含する。この試験化合物が、ＭＥＭＸまたはその生物学的に活性な部分の活性を調節する能力の決定は、例えば、ＭＥＭＸタンパク質が、ＭＥＭＸ標的分子に結合またはこれら標的分子と相互作用する能力を決定することによって、達成され得る。本明細書中において使用する場合には、「標的分子」とは、ＭＥＭＸタンパク質が自然に結合または相互作用する分子であり、例えば、ＭＥＭＸ相互作用タンパク質を発現する細胞表面上の分子、第二の細胞表面上の分子、細胞外環境中の分子、細胞膜の内部表面と会合する分子、または細胞質分子である。ＭＥＭＸ標的分子は、非ＭＥＭＸ分子あるいは本発明のＭＥＭＸタンパク質またはポリペプチドであり得る。１つの実施形態において、ＭＥＭＸ標的分子は、シグナル伝達経路の構成要素であり、これは、細胞膜を通って細胞内への細胞外シグナル（例えば、化合物が膜結合ＭＥＭＸ分子に結合することにより発生するシグナル）の伝達を促進する。その標的は、例えば、触媒活性を有する第二の細胞内タンパク質、または下流シグナル分子のＭＥＭＸとの会合を容易にするタンパク質であり得る。
【０２３６】
ＭＥＭＸタンパク質がＭＥＭＸ標的分子に結合するかまたはその標的分子と相互作用する能力の決定は、直接的結合を決定するための上記方法の１つにより、達成され得る。１つの実施形態において、ＭＥＭＸタンパク質がＭＥＭＸ標的分子に結合するかまたはその標的分子と相互作用する能力の決定は、その標的分子の活性を決定することにより、達成され得る。例えば、この標的分子の活性は、その標的の細胞セカンドメッセンジャー（すなわち、細胞内Ｃａ２＋、ジアシルグリセロール、ＩＰ３など）の誘導を検出すること、適切な基質への標的の触媒活性／酵素活性を検出すること、レポーター遺伝子（検出可能なマーカー（例えば、ルシフェラーゼ）をコードする核酸に作動的に連結されたＭＥＭＸ応答性調節エレメントを含む）の誘導を検出すること、または細胞応答（例えば、細胞生存度、細胞分化、または細胞増殖）を検出することにより、決定され得る。
【０２３７】
なお別の実施形態において、本発明のアッセイは、無細胞アッセイであり、ＭＥＭＸタンパク質またはその生物学的に活性な部分を試験化合物に接触させる工程、ならびにその試験化合物がＭＥＭＸタンパク質またはその生物学的に活性な部分と結合する能力を決定する工程を包含する。この試験化合物の、ＭＥＭＸタンパク質への結合は、上記のように、直接的または間接的にのいずれかで決定され得る。１つのこのような実施形態において、このアッセイは、ＭＥＭＸタンパク質またはその生物学的に活性な部分を、ＭＥＭＸを結合する公知の化合物に接触させて、アッセイ混合物を形成する工程、このアッセイ混合物を試験化合物に接触させる工程、ならびにその試験化合物がＭＥＭＸタンパク質と相互作用する能力を決定する工程を包含し、ここで、この試験化合物がＭＥＭＸタンパク質と相互作用する能力を決定する工程は、この試験化合物が、公知の化合物と比較して、ＭＥＭＸ、またはその生物学的に活性な部分と優先的に結合する能力を決定する工程を包含する。
【０２３８】
さらに別の実施形態において、アッセイは、無細胞アッセイであり、ＭＥＭＸタンパク質またはその生物学的に活性な部分を試験化合物と接触させる工程、ならびにその試験化合物がＭＥＭＸタンパク質またはその生物学的に活性な部分の活性を調節（例えば、刺激または阻害）する能力を決定する工程を包含する。この試験化合物がＭＥＭＸの活性を調節する能力の決定は、例えば、ＭＥＭＸタンパク質が、ＭＥＭＸ標的分子に結合する能力を、直接的結合の決定のための上記方法の１つによって決定することにより、達成され得る。代替の実施形態において、この試験化合物がＭＥＭＸタンパク質の活性を調節する能力の決定は、ＭＥＭＸタンパク質が、ＭＥＭＸ標的分子をさらに調節する能力を決定することにより、達成され得る。例えば、この標的分子の適切な基質に対する触媒活性／酵素活性は、上記のように決定され得る。
【０２３９】
なお別の実施形態において、無細胞アッセイは、ＭＥＭＸタンパク質またはその生物学的に活性な部分を、ＭＥＭＸタンパク質を結合する公知の化合物に接触させてアッセイ混合物を形成する工程、このアッセイ混合物を試験化合物と接触させる工程、ならびにこの試験化合物がＭＥＭＸタンパク質と相互作用する能力を決定する工程を包含し、ここで、この試験化合物がＭＥＭＸタンパク質と相互作用する能力の決定は、ＭＥＭＸタンパク質が、ＭＥＭＸ標的分子と優先的に結合するか、またはその標的分子の活性を優先的に調節する能力を決定する工程を包含する。
【０２４０】
本発明の無細胞アッセイは、ＭＥＭＸタンパク質の、可溶性の形態または膜結合形態の両方の使用に受け入れられる。膜結合形態のＭＥＭＸタンパク質を含む無細胞アッセイの場合には、ＭＥＭＸタンパク質の膜結合形態が溶液中に維持されるように、可溶化剤を利用することが望ましくあり得る。このような可溶化剤の例には、非イオン性界面活性剤が挙げられ、例えば、ｎ−オクチルグルコシド、ｎ−ドデシルグルコシド、ｎ−ドデシルマルトシド、オクタノイル−Ｎ−メチルグルカミド、デカノイル−Ｎ−メチルグルカミド、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１１４、Ｔｈｅｓｉｔ（登録商標）、イソトリデシルポリ（エチレングリコールエーテル）ｎ（Ｉｓｏｔｒｉｄｅｃｙｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ　ｇｌｙｃｏｌ　ｅｔｈｅｒ）ｎ、Ｎ−ドデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホネート、３−（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ−１−プロパンスルホネート（３−（３−ｃｈｏｌａｍｉｄｏｐｒｏｐｙｌ）ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｉｎｉｏｌ−１−ｐｒｏｐａｎｅ　ｓｕｌｆｏｎａｔｅ）（ＣＨＡＰＳ）、または３−（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ−２−ヒドロキシ−１−プロパンスルホネート（３−（３−ｃｈｏｌａｍｉｄｏｐｒｏｐｙｌ）ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｉｎｉｏｌ−２−ｈｙｄｒｏｘｙ−１−ｐｒｏｐａｎｅ　ｓｕｌｆｏｎａｔｅ）（ＣＨＡＰＳＯ）である。
【０２４１】
本発明の上記アッセイ方法の１つより多い実施形態において、ＭＥＭＸタンパク質またはその標的分子のいずれかを固定して、そのタンパク質の一方または両方の非複合形態からの複合形態の分離を促進し、そしてそのアッセイの自動化に適用させることが、望ましくあり得る。試験化合物の、ＭＥＭＸタンパク質への結合、または候補化合物の存在下および非存在下での、ＭＥＭＸタンパク質の標的分子との相互作用は、これらの反応物を収容するために適切な任意の容器内で、達成され得る。このような容器の例には、マイクロタイタープレート、試験管、および微小遠心管が挙げられる。１実施形態において、そのタンパク質の一方または両方がマトリックスに結合することを可能にするドメインを付加する融合タンパク質が、提供され得る。例えば、ＧＳＴ−ＭＥＭＸ融合タンパク質またはＧＳＴ標的融合タンパク質は、グルタチオンセファロースビーズ（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）またはグルタチオン誘導体化マイクロタイタープレート上に吸着され得、次いでこれらは、試験化合物と合わせられるか、あるいは試験化合物および吸着されない標的タンパク質、またはＭＥＭＸタンパク質のいずれかと合わせられ、そしてこの混合物が、複合体形成に貢献する条件下（例えば、塩およびｐＨに関して生理学的条件）でインキュベートされる。インキュベーションに続いて、ビーズまたはマイクロタイタープレートウェルを洗浄して、結合していないあらゆる成分を除去し、ビーズの場合にはマトリックスを固定し、例えば上記のように、複合体を直接的または間接的のいずれかで決定する。あるいは、複合体がマトリックスから解離され得、そしてＭＥＭＸタンパク質の結合レベルまたは活性レベルを、標準的な技術を使用して決定し得る。
【０２４２】
タンパク質をマトリックスに固定するための他の技術がまた、本発明のスクリーニングアッセイにおいて使用され得る。例えば、ＭＥＭＸタンパク質、またはその標的分子のいずれかが、ビオチンとストレプトアビジンとの結合を利用して、固定され得る。ビオチニル化ＭＥＭＸタンパク質、または標的分子は、当該分野において周知の技術を使用して、ビオチン−ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド）から調製され得（例えば、ビオチニル化キット、Ｐｉｅｒｃｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、Ｉｌｌ．）、そしてストレプトアビジンで被覆した９６ウェルのプレート（Ｐｉｅｒｃｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ）のウェルに固定され得る。あるいは、ＭＥＭＸタンパク質、または標的分子と反応性であるがＭＥＭＸタンパク質のその標的分子への結合を妨害しない抗体が、そのプレートのウェルに誘導体化され得、そして結合していない標的またはＭＥＭＸタンパク質が、抗体の結合によってウェル内にトラップされ得る。このような複合体を検出するための方法には、ＧＳＴ固定複合体に関しての上記のものに加えて、ＭＥＭＸタンパク質または標的分子と反応性の抗体を使用する、複合体の免疫検出、ならびにＭＥＭＸタンパク質、または標的分子に関する酵素活性の検出に依存する酵素結合アッセイが挙げられる。
【０２４３】
別の実施形態において、ＭＥＭＸタンパク質発現のモジュレーターは、細胞を候補化合物と接触させ、そして細胞中のＭＥＭＸ　ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現を決定する方法において同定される。候補化合物の存在下でのＭＥＭＸ　ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現レベルは、候補化合物の非存在下でのＭＥＭＸ　ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現レベルと比較される。次いで、候補化合物は、この比較に基づいて、ＭＥＭＸ　ｍＲＮＡまたはタンパク質発現のモジュレーターとして同定され得る。例えば、ＭＥＭＸ　ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現が候補化合物の非存在下より、その存在下における方が大きい（すなわち、統計的に有意に大きい）場合、この候補化合物は、ＭＥＭＸ　ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現の刺激物質として同定される。あるいは、ＭＥＭＸ　ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現が候補化合物の非存在下よりその存在下の方が少ない（統計的に有意に少ない）場合、この候補化合物は、ＭＥＭＸ　ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現のインヒビターとして同定される。細胞中のＭＥＭＸ　ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現レベルは、ＭＥＭＸ　ｍＲＮＡまたはタンパク質を検出するために本明細書中に記載の方法によって決定され得る。
【０２４４】
本発明のなお別の局面において、ＭＥＭＸタンパク質を、ツーハイブリッドアッセイまたはスリーハイブリッドアッセイにおいて「ベイト（餌）（ｂａｉｔ）タンパク質」として使用して（例えば、米国特許第５，２８３，３１７号；Ｚｅｒｖｏｓら（１９９３）Ｃｅｌｌ　７２：２２３−２３２；Ｍａｄｕｒａら、１９９３　Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：１２０４６−１２０５４；Ｂａｒｔｅｌら、１９９３　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　１４：９２０−９２４；Ｉｗａｂｕｃｈｉら、１９９３　Ｏｎｃｏｇｅｎｅ　８：１６９３−１６９６；およびＢｒｅｎｔ　ＷＯ９４／１０３００を参照のこと）、ＭＥＭＸ（「ＭＥＭＸ結合タンパク質」または「ＭＥＭＸ−ｂｐ」）に結合するか、またはこれと相互作用し、そしてＭＥＭＸ活性を調節する他のタンパク質を同定し得る。このようなＭＥＭＸ結合タンパク質はまた、例えば、ＭＥＭＸ経路の上流または下流エレメントとしてＭＥＭＸタンパク質によるシグナル伝達に関与するようである。
【０２４５】
ツーハイブリッドシステムは、分離可能なＤＮＡ結合ドメインおよび活性化ドメインからなる、大部分の転写因子のモジュール的性質に基づく。簡潔には、このアッセイは、２つの異なるＤＮＡ構築物を利用する。一方の構築物においては、ＭＥＭＸをコードする遺伝子が、公知の転写因子（例えば、ＧＡＬ−４）のＤＮＡ結合ドメインをコードする遺伝子に融合される。他方の構築物においては、ＤＮＡ配列のライブラリー由来の、未同定タンパク質（「プレイ（捕食）」または「サンプル」）をコードするＤＮＡ配列が、その公知の転写因子の活性化ドメインをコードする遺伝子に融合される。「ベイト」および「プレイ」タンパク質がインビボで相互作用して、ＭＥＭＸ依存性複合体を形成し得る場合、この転写因子のＤＮＡ結合ドメインおよび活性化ドメインは、非常に近接される。このように近接されることにより、その転写因子に応答性の転写調節部位に作動可能に連結されたレポーター遺伝子（例えば、ＬａｃＺ）の転写を可能にする。レポーター遺伝子の発現が検出され得、そして機能的転写因子を含む細胞コロニーを単離および使用して、そしてＭＥＭＸと相互作用するタンパク質をコードするクローニングされた遺伝子を獲得し得る。
【０２４６】
本発明はさらに、上記のスクリーニングアッセイにより同定される新規な薬剤および本明細書中に記載されるような処置のためのこの薬剤の使用に関する。
【０２４７】
（ＩＩ．検出アッセイ）
本明細書中で同定されるｃＤＮＡ配列の一部分またはフラグメント（および対応する完全な遺伝子配列）は、ポリヌクレオチド試薬として多くの方法で使用され得る。例えば（限定はされない）、これらの配列を使用して、（ｉ）染色体上にそれぞれの遺伝子をマッピングし得；従って遺伝病と関連する遺伝子領域を位置決定し得る；（ｉｉ）微量の生物学的サンプルから個体を同定し得る（組織型決定）；および（ｉｉｉ）生物学的サンプルの法医学的識別を助け得る。これらのいくつかの適用は、以下の節において記載される。
【０２４８】
（染色体マッピング）
一旦遺伝子の配列（または配列の一部分）が単離されると、この配列を用いて染色体上に遺伝子の位置をマッピングし得る。このプロセスは、染色体マッピングとよばれる。従って、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、または１５に示されるＭＥＭＸ配列の一部またはフラグメント、あるいはそのフラグメントはまたは誘導体を用いて、それぞれ、ＭＥＭＸ遺伝子の位置を染色体上にマッピングし得る。ＭＥＭＸ配列を染色体にマッピングすることは、これらの配列を疾患に関連する遺伝子と相関付ける際の重要な第一工程である。
【０２４９】
簡潔には、ＭＥＭＸ遺伝子は、ＭＥＭＸ配列からＰＣＲプライマー（好ましくは、１５〜２５ｂｐの長さ）を調製することにより染色体にマッピングし得る。ＭＥＭＸのコンピューター分析が、ゲノムＤＮＡにおける１つを超えるエキソンにまたがらないプライマー（従って、これは、増幅プロセスを複雑にする）を迅速に選択するために使用され得る。次いで、これらのプライマーは、個々のヒト染色体を含む体細胞ハイブリッドのＰＣＲスクリーニングのために使用され得る。ＭＥＭＸ配列に対応するヒト遺伝子を含むハイブリッドのみが増幅されたフラグメントを生じる。
【０２５０】
体細胞ハイブリッドは、異なる哺乳動物由来の体細胞（例えば、ヒト細胞およびマウス細胞）を融合することにより調製される。ヒトおよびマウスの細胞のハイブリッドが増殖および分裂するにつれ、それらは、無作為な順序で徐々にヒト染色体を失うが、マウス染色体を維持する。マウス細胞は、それらが特定の酵素を欠いているので増殖できないが、ヒト細胞が増殖できる培地を使用することにより、必要な酵素をコードする遺伝子を含む１つのヒト染色体が維持される。種々の培地を使用することによって、ハイブリッド細胞株のパネルが確立され得る。パネルにおける各細胞株は、単一のヒト染色体または少数のヒト染色体いずれかおよびマウス染色体の完全なセットを含み、これにより、個々の遺伝子を特定のヒト染色体にマッピングすることが容易に可能になる（Ｄ’Ｅｕｓｔａｃｈｉｏら（１９８３）Ｓｃｉｅｎｃｅ　２２０：９１９−９２４を参照）。ヒト染色体のフラグメントのみを含む体細胞ハイブリッドはまた、転座および欠失を伴うヒト染色体を使用することにより生成され得る。
【０２５１】
体細胞ハイブリッドのＰＣＲマッピングは、特定の染色体に特定の配列を割り当てるためには迅速な手順である。１つのサーマルサイクラーを用いて一日に３つ以上の配列が割り当てられ得る。ＭＥＭＸ配列を使用して、オリゴヌクレオチドプライマーを設計することにより、二次位置決定（ｓｕｂｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ）が、特定の染色体由来のフラグメントのパネルを用いて達成され得る。
【０２５２】
中期染色体スプレッドに対するＤＮＡ配列の蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）をさらに使用して、一工程で正確な染色体位置を提供し得る。染色体スプレッドは、コルセミド（染色体紡錘体を破壊する）のような化学物質により分裂が中期においてブロックされた細胞を使用して行われ得る。この染色体は、トリプシンで短時間処理され得、次いで、ギムザ染色され得る。薄いバンドおよび濃いバンドのパターンが各染色体で発生し、その結果、この染色体は、個々に同定され得る。ＦＩＳＨ技術は、５００または６００塩基ほどの短さのＤＮＡ配列と共に使用され得る。しかし、１，０００塩基より大きなクローンは、簡単な検出に十分なシグナル強度で、独特の染色体位置に結合する可能性がより高い。好ましくは、１，０００塩基、そしてより好ましくは、２，０００塩基が妥当な時間量で良好な結果を得るために十分である。この技術の総説については、Ｖｅｒｍａら、ＨＵＭＡＮ　ＣＨＲＯＭＯＳＯＭＥＳ：Ａ　ＭＡＮＵＡＬ　ＯＦ　ＢＡＳＩＣ　ＴＥＣＨＮＩＱＵＥＳ（Ｐｅｒｇａｍｏｎ　Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　１９８８）を参照のこと。
【０２５３】
染色体マッピングの試薬は、単一の染色体またはその染色体上の単一部位を印付けするために個々に使用され得るか、または試薬パネルが、複数部位および／または複数染色体を印付けするために使用され得る。遺伝子の非コード領域に対応する試薬は、実際に、マッピング目的のために好ましい。コード配列は、遺伝子ファミリー内に保存されており、従って、染色体マッピングの間に交叉ハイブリダイゼーションの機会が増大する可能性が高い。
【０２５４】
一旦配列が正確な染色体位置にマッピングされると、その配列の染色体上の物理的位置が、遺伝子マップデータと相関され得る。このようなデータは、例えば、ＭｃＫｕｓｉｃｋ，ＭＥＮＤＥＬＩＡＮ　ＩＮＨＥＲＩＴＡＮＣＥ　ＩＮ　ＭＡＮ（Ｊｏｈｎｓ　Ｈｏｐｋｉｎｓ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｗｅｌｃｈ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｌｉｂｒａｒｙを通じてオンラインで入手可能）において見い出される。次いで、同じ染色体領域にマッピングされる遺伝子と疾患との間の関係は、例えば、Ｅｇｅｌａｎｄら（１９８７）Ｎａｔｕｒｅ，３２５：７８３−７８７に記載される連鎖分析（物理的に隣接する遺伝子の同時遺伝）によって同定され得る。
【０２５５】
さらに、ＭＥＭＸ遺伝子と関連する疾患に罹患した個体と、この疾患に罹患していない個体との間のＤＮＡ配列における差異が決定され得る。罹患した個体のいくらかまたは全てにおいて変異が認められるが、非罹患個体のいずれにおいても認められない場合、この変異は特定の疾患の原因因子である可能性が高い。罹患個体と非罹患個体の比較は、一般に、染色体における構造的変化（例えば、染色体スプレッドから可視できるか、またはそのＤＮＡ配列に基づいたＰＣＲを用いて検出可能な、欠失または転座）を最初に探索する工程を包含する。最終的に、いくらかの個体に由来する遺伝子の完全な配列決定を行って、変異の存在を確認し、かつ多型に由来する変異を区別する。
【０２５６】
（組織型決定（ｔｉｓｓｕｅ　ｔｙｐｉｎｇ））
本発明のＭＥＭＸ配列は、わずかな生物学的サンプルから個体を識別するために使用され得る。この技術において、個体のゲノムＤＮＡは、１つ以上の制限酵素で消化され、そしてサザンブロット上でプローブされて、同定のために固有のバンドを生成する。本発明の配列は、米国特許第５，２７２，０５７号に記載の制限フラグメント長多型（ＲＦＬＰ）のためのさらなるＤＮＡマーカーとして有用である。
【０２５７】
さらに、本発明の配列を用いて、個体のゲノムの選択された部分について実際の塩基ごとにＤＮＡ配列を決定する代替的技術を提供し得る。従って、本明細書中に記載のＭＥＭＸ配列を用いて、配列の５’末端および３’末端から２つのＰＣＲプライマーを調製し得る。次いで、これらのプライマーを使用して、個体のＤＮＡを増幅し得、引き続いて、これを配列決定し得る。
【０２５８】
このように調製された個体由来の対応するＤＮＡ配列のパネルは、各個体が、対立遺伝子差異に起因するこのようなＤＮＡ配列の固有のセットを有するので、固有の個体識別を提供し得る。本発明の配列は、個体由来および組織由来の配列のこのような識別を得るために使用され得る。本発明のＭＥＭＸ配列は、ヒトゲノムの部分を固有に表す。対立遺伝子変異は、これらの配列のコード領域においてある程度生じ、そして非コード領域においてより大きな程度に生じる。個々のヒト間での対立遺伝子変異は、各５００塩基につき約１回の頻度で生じると見積もられる。対立遺伝子変異の多さは、ＲＦＬＰを含む単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）に起因する。
【０２５９】
本明細書中で記載の配列の各々は、ある程度、標準（これに対して、個体由来のＤＮＡが、識別の目的で比較され得る）として使用され得る。より多くの多型が非コード領域で生じるので、個体を区別するために、それほど多くの配列が必要であるわけではない。非コード配列は、おそらく１０〜１，０００プライマーのパネルを用いてポジティブな個体識別を不自由なく提供し得る。これらのプライマーは、各々が１００塩基の増幅された非コード配列を生じる。推定コード配列（例えば、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、または１５における配列）が使用される場合、ポジティブな個体識別に関するプライマーのより適切な数は、５００〜２，０００である。
【０２６０】
（予測医療）
本発明はまた、診断アッセイ、予後アッセイ、薬物ゲノム学（ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｏｍｉｃｓ）およびモニタリング臨床試験が、予後（予測）の目的に使用され、これによって個体を予防的に処置する、予測医療の分野に関する。従って、本発明の１つの局面は、ＭＥＭＸタンパク質および／または核酸の発現、ならびにＭＥＭＸの活性を、生物学的サンプル（例えば、血液、血清、細胞、組織）状況下で決定し、これによって、個体が、異常なＭＥＭＸの発現または活性に関連する疾患または障害に罹患しているか否か、あるいはこの障害を発症するリスクがあるか否かを決定する。本発明はまた、個体が、ＭＥＭＸのタンパク質、核酸の発現または活性と関連した障害を発症するリスクがあるか否かを決定するための予後的（または予測的）アッセイを提供する。例えば、ＭＥＭＸ遺伝子における変異が、生物学的サンプルにおいてアッセイされ得る。このようなアッセイは、予後的または予測的な目的に使用され得、これによってＭＥＭＸのタンパク質、核酸の発現または生物学的活性によって特徴付けられるかまたはそれに関連した障害の発症の前に個体を予防的に処置する。
【０２６１】
本発明の別の局面は、個体におけるＭＥＭＸタンパク質、核酸の発現またはＭＥＭＸ活性を決定するための方法を提供し、これによって、その個体についての適切な治療的または予防的薬剤を選択する（本明細書において「薬物ゲノム学」とよばれる）。薬物ゲノム学は、個体の遺伝型（例えば、特定の薬剤に対して応答する個体の能力を決定するために試験された個体の遺伝型）に基づいて、個体の治療的または予防的処置のための薬剤（例えば、薬物）の選択を可能にする。
【０２６２】
本発明のなお別の局面は、臨床試験におけるＭＥＭＸの発現または活性に対する因子（例えば、薬物、化合物）の影響をモニタリングすることに関する。
【０２６３】
これらの因子および他の因子は、以下の節においてさらに詳細に記載される。
【０２６４】
（Ｉ．診断アッセイ）
生物学的サンプルにおけるＭＥＭＸの存在または非存在を検出するための例示的な方法は、試験被験体から生物学的サンプルを得る工程、およびその生物学的サンプルをＭＥＭＸタンパク質またはＭＥＭＸタンパク質をコードする核酸（例えば、ｍＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ）を検出し得る化合物もしくは薬剤とを接触させ、その結果、ＭＥＭＸの存在が、その生物学的サンプルにおいて検出される、工程を包含する。ＭＥＭＸのｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡを検出するための薬剤は、ＭＥＭＸのｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡにハイブリダイズし得る、標識された核酸プローブである。この核酸プローブは、例えば、全長のＭＥＭＸ核酸（例えば、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、または１５の核酸）またはその部分（例えば、少なくとも、１５、３０、５０、１００、２５０もしくは５００ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドであり、そしてストリンジェントな条件下でＭＥＭＸのｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡと特異的にハイブリダイズするに十分である）であり得る。本発明の診断アッセイにおける使用のための他の適切なプローブは本明細書中に記載される。
【０２６５】
ＭＥＭＸタンパク質を検出するための１つの薬剤は、ＭＥＭＸタンパク質と結合し得る抗体、好ましくは、検出可能な標識を有する抗体である。本発明のタンパク質に対する抗体は、タンパク質の局在および／または定量化に関連する、当該分野で公知の方法において使用され得る（例えば、適切な生理学的サンプル内のタンパク質のレベルの測定における使用のため、診断方法における使用のため、タンパク質の画像化における使用のためなど）。所定の実施形態では、タンパク質に対する抗体または抗原結合ドメインを含むその誘導体、フラグメント、アナログまたはホモログは、薬理学的に活性な組成物として使用される。
【０２６６】
本発明のタンパク質に特異的な抗体は、標準技術（例えば、免疫親和性クロマトグラフィまたは免疫沈降）によって、タンパク質を単離するために用いられ得る。このような抗体は、細胞からの天然のタンパク質抗原の精製および宿主細胞において発現される組換え的に産生された抗原の精製を容易にし得る。さらに、抗原タンパク質の発現の量およびパターンを評価するために、このような抗体を用いて（例えば、細胞の溶解液または細胞上清における）抗原タンパク質を検出し得る。このタンパク質に対する抗体は、例えば、所定の処置レジメンの有効性を決定するために、臨床試験の手順の一部として組織におけるタンパク質レベルを診断的にモニターするために用いられ得る。検出は、抗体を検出可能物質にカップリングする（すなわち、物理的に連結する）ことにより容易にされ得る。検出可能な物質の例としては、種々の酵素、補欠分子団、蛍光物質、発光物質、生物発光物質および放射性物質が挙げられる。適切な酵素の例としては、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼまたはアセチルコリンエステラーゼが挙げられ；適切な補欠分子団複合体の例としては、ストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチンが挙げられ；適切な蛍光物質の例としては、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミン（ｄｉｃｈｌｏｒｏｔｒｉａｚｉｎｙｌａｍｉｎｅ）フルオレセイン、ダンシルクロリドまたはフィコエリトリンが挙げられ；発光物質の例としては、ルミノールが挙げられ；生物発光物質の例としては、ルシフェラーゼ、ルシフェリンおよびエクオリンが挙げられ、そして、適切な放射性物質の例としては１２５Ｉ、１３１Ｉ、３５Ｓまたは３Ｈが挙げられる。
【０２６７】
抗体は、ポリクローナルであり得るか、またはより好ましくはモノクローナル抗体であり得る。インタクトな抗体またはそのフラグメント（例えば、ＦａｂまたはＦ（ａｂ’）２）が使用され得る。本明細書中で使用される場合、用語「標識（された）」とは、プローブまたは抗体に関して、そのプローブもしくは抗体への検出可能な物質のカップリング（すなわち、物理的に連結する）による、そのプローブまたは抗体の直接標識、ならびに、直接標識される別の試薬との反応性による、そのプローブもしくは抗体の間接的標識を包含することが意図される。間接的な標識の例としては、蛍光標識された二次抗体を用いる一次抗体の検出、および蛍光標識されたストレプトアビジンを用いて検出され得るようなビオチンでのＤＮＡプローブの末端標識が挙げられる。用語「生物学的サンプル」とは、被験体から単離された、組織、細胞および生物学的流体ならびに被験体に存在する組織、細胞および流体を含むことが意図される。すなわち、本発明の検出方法を用いて、生物学的サンプル中のＭＥＭＸのｍＲＮＡ、タンパク質またはゲノムＤＮＡを、インビトロおよびインビボで検出し得る。例えば、ＭＥＭＸ　ｍＲＮＡの検出のためのインビトロ技術としては、ノーザンハイブリダイゼーションおよびインサイチュハイブリダイゼーションが挙げられる。ＭＥＭＸタンパク質の検出のためのインビトロ技術としては、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ウェスタンブロット、免疫沈降および免疫蛍光が挙げられる。ＭＥＭＸゲノムＤＮＡを検出するためのインビトロ技術としては、サザンハイブリダイゼーションが挙げられる。さらに、ＭＥＭＸタンパク質の検出のためのインビボ技術としては、標識された抗ＭＥＭＸ抗体を被験体に導入することが挙げられる。例えば、その抗体は、放射性マーカーを用いて標識され得る。この被験体における放射性マーカーの存在および位置は、標準的な画像化技術によって検出され得る。
【０２６８】
１つの実施形態において、この生物学的サンプルは、その試験被験体からのタンパク質分子を含む。あるいは、その生物学的サンプルは、その試験被験体からのｍＲＮＡ分子またはその試験被験体からのゲノムＤＮＡ分子を含み得る。好ましい生物学的サンプルは、被験体から従来の手段によって単離された末梢血白血球サンプルである。
【０２６９】
１つの実施形態において、本発明の方法はさらに、コントロール被験体からコントロール生物学的サンプルを得る工程、そのコントロールサンプルを、ＭＥＭＸのタンパク質、ｍＲＮＡもしくはゲノムを検出し得る化合物または薬剤と接触させ、その結果、ＭＥＭＸのタンパク質、ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡの存在がその生物学的サンプルにおいて検出される、工程、およびそのコントロールサンプルにおけるＭＥＭＸのタンパク質、ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡの存在と、その試験サンプルにおけるＭＥＭＸのタンパク質、ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡの存在とを比較する工程を包含する。
【０２７０】
本発明はまた、生物学的サンプルにおけるＭＥＭＸの存在を検出するためのキットを包含する。例えば、このキットは、以下を備え得る：生物学的サンプルにおいてＭＥＭＸのタンパク質またはｍＲＮＡを検出し得る、標識された化合物または薬剤；そのサンプルにおいてＭＥＭＸの量を決定するための手段；およびそのサンプルにおけるＭＥＭＸの量を標準と比較するための手段。この化合物または薬剤は、適切な容器内にパッケージングされ得る。このキットは、さらに、ＭＥＭＸタンパク質または核酸を検出するためにキットを用いるための説明書を備え得る。
【０２７１】
（ＩＩ．予後アッセイ）
本明細書において記載された診断方法をさらに利用して、ＭＥＭＸの異常発現または異常活性に関連した疾患もしくは障害を有するか、またはその発症の危険性を有する被験体を同定し得る。ＭＥＭ１についてのこのような障害は、免疫学的状態、ウィルス感染、神経性疾患、アルツハイマー病またはパーキンソン病、癌（例えば、乳癌または神経芽腫）、腎臓病学、および女性の生殖保健を含む。ＭＥＭ４についてのこのような障害は、肺および／または脳（例えば、精神分裂病、または頭部傷害による神経損傷）を含む障害を含む。ＭＥＭ５についての障害は、心筋および他の筋肉障害（例えば、不整脈）、凝固不全、およびコバラミン不全（例えば、悪性貧血）を含む。ＭＥＭ６についてのこのようなこのような障害は、グリコーゲン代謝の制御不全（例えば、糖尿病）に起因する障害を含む。ＭＥＭ７およびＭＥＭ８についてのこのような障害は、視覚関連障害（例えば、角膜軟化）、癌、および他の新形成病理を含む。
【０２７２】
例えば、本明細書に記載されるアッセイ（例えば、上述の診断アッセイまたは下記のアッセイ）を利用して、ＭＥＭＸのタンパク質、核酸の発現または活性に関連する障害を有するかまたはその発症の危険性を有する被験体を同定し得る。あるいは、この予後アッセイを利用して、疾患または障害を有するかまたはその発症の危険性を有する被験体を同定し得る。従って、本発明は、ＭＥＭＸの異常発現または異常活性に関連する疾患もしくは障害を同定するための方法を提供する。ここで、試験サンプルは、被験体から得られ、そしてＭＥＭＸのタンパク質または核酸（例えば、ｍＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ）が検出され、ここで、ＭＥＭＸのタンパク質または核酸の存在は、ＭＥＭＸの異常発現または異常活性に関連する疾患または障害を有するかまたはその発症の危険性を有する被験体についての診断指標である。本明細書において使用される場合「試験サンプル」とは、目的の被験体から得られた生物学的サンプルをいう。例えば、試験サンプルは、生物学的流体（例えば、血清）、細胞サンプル、または組織であり得る。
【０２７３】
さらに、本明細書に記載される予後アッセイを使用して、被験体に薬剤（例えば、アゴニスト、アンタゴニスト、ペプチド模倣物、タンパク質、ペプチド、核酸、低分子、または他の薬物候補）を投与してＭＥＭＸの異常発現または異常活性に関連する疾患または障害を処置し得るか否かを、決定し得る。例えば、このような方法を使用して、被験体が障害のための薬剤で有効に処置され得るか否かを決定し得る。従って、本発明は、ＭＥＭＸの異常発現または異常活性に関連する障害についての薬剤を用いて、被験体が有効に処置され得るか否かを決定するための方法を提供する。ここで、試験サンプルが得られ、そしてＭＥＭＸのタンパク質または核酸が検出される（例えば、ここで、ＭＥＭＸのタンパク質または核酸の存在は、この薬剤が投与されてＭＥＭＸの異常発現または異常活性に関連する障害が処置され得る被験体についての、診断指標である）。
【０２７４】
本発明の方法はまた、ＭＥＭＸ遺伝子における遺伝的損傷を検出し、それによって、その損傷遺伝子を有する被験体が異常な細胞増殖および／または分化によって特徴付けられる障害についての危険性を有するか否かを決定するためにも使用され得る。種々の実施形態において、この方法は、その被験体からの細胞のサンプルにおいて、ＭＥＭＸタンパク質をコードする遺伝子の統合性に影響を与える少なくとも１つの変更によって特徴付けられる遺伝的損傷の存在または非存在、あるいはＭＥＭＸ遺伝子の誤発現を検出する工程を包含する。例えば、そのような遺伝的損傷は、以下の少なくとも１つの存在を確認することによって検出され得る：（ｉ）ＭＥＭＸ遺伝子からの１つ以上のヌクレオチドの欠失；（ｉｉ）ＭＥＭＸ遺伝子への１つ以上のヌクレオチドの付加；（ｉｉｉ）ＭＥＭＸ遺伝子の１つ以上のヌクレオチドの置換、（ｉｖ）ＭＥＭＸ遺伝子の染色体再配置；（ｖ）ＭＥＭＸ遺伝子のメッセンジャーＲＮＡ転写物のレベルにおける変更、（ｖｉ）ＭＥＭＸ遺伝子の異常改変（例えば、ゲノムＤＮＡのメチル化パターンの異常改変）、（ｖｉｉ）ＭＥＭＸ遺伝子のメッセンジャーＲＮＡ転写物の非野生型スプライシングパターンの存在、（ｖｉｉｉ）ＭＥＭＸタンパク質の非野生型レベル、（ｉｘ）ＭＥＭＸ遺伝子の対立遺伝子の欠失、ならびに（ｘ）ＭＥＭＸタンパク質の不適切な翻訳後修飾。本明細書において記載されるように、当該分野において、ＭＥＭＸ遺伝子における損傷を検出するために使用され得る、多数の公知のアッセイ技術が存在する。好ましい生物学的サンプルは、従来手段によって被験体から単離された末梢血白血球サンプルである。しかし、有核細胞を含む任意の生物学的サンプルが使用され得、これには、例えば、頬粘膜細胞が挙げられる。
【０２７５】
特定の実施形態において、損傷の検出は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（例えば、米国特許第４，６８３，１９５号および同第４，６８３，２０２号を参照のこと）（例えば、アンカーＰＣＲまたはＲＡＣＥ　ＰＣＲ）、あるいは、連結連鎖反応（ＬＣＲ）（例えば、Ｌａｎｄｅｇｒａｎら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ　２４１：１０７７−１０８０；およびＮａｋａｚａｗａら（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　９１：３６０−３６４を参照のこと）におけるプローブ／プライマーの使用を包含する。後者は、ＭＥＭＸ遺伝子における点変異を検出するために特に有用であり得る）（Ａｂｒａｖａｙａら，１９９５　Ｎｕｃｌ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ　２３：６７５−６８２を参照のこと）。この方法は、患者から細胞のサンプルを収集する工程、核酸（例えば、ゲノム、ｍＲＮＡまたはその両方）をそのサンプルの細胞から単離する工程、ＭＥＭＸの遺伝子に特異的にハイブリダイズする１つ以上のプライマーとその核酸サンプルとを、ＭＥＭＸ遺伝子（存在する場合）のハイブリダイゼーションおよび増幅が生じるような条件下で接触させる工程、ならびに増幅産物の存在もしくは非存在を検出する工程、またはその増幅産物のサイズを検出する工程およびその長さをコントロールサンプルと比較する工程を包含し得る。ＰＣＲおよび／またはＬＣＲは、本明細書中に記載される変異を検出するために使用される技術のいずれかとともに予備的増幅工程として使用されることが望ましくあり得ることが予想される。
【０２７６】
代替的な増幅方法としては、以下が挙げられる：当業者に周知な技術を用いた、その増幅された分子の検出の前の、自己維持配列複製（Ｇｕａｔｅｌｌｉら、１９９０、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８７：１８７４−１８７８を参照のこと）、転写増幅系（Ｋｗｏｈら、１９８９、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８６：１１７３−１１７７を参照のこと）、Ｑβレプリカーゼ（Ｌｉｚａｒｄｉら、１９８８、ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　６：１１９７を参照のこと）、または他の任意の核酸増幅方法。これらの検出スキームは、核酸分子が非常に極少数で存在する場合に、そのような核酸分子の検出のために特に有用である。
【０２７７】
代替の実施形態において、サンプル細胞からのＭＥＭＸ遺伝子における変異は、制限酵素切断パターンにおける変更によって同定され得る。例えば、サンプルおよびコントロールのＤＮＡが単離され、増幅され（必要に応じて）、１つ以上の制限エンドヌクレアーゼを用いて消化され、そしてフラグメント長の大きさがゲル電気泳動によって決定され、そして比較される。サンプルＤＮＡとコントロールＤＮＡとの間のフラグメント長の大きさにおける差異は、そのサンプルＤＮＡにおける変異を示す。さらに、配列特異的なリボザイムの使用（例えば、米国特許第５，４９３，５３１号を参照のこと）を使用して、リボザイム切断部位の発生または喪失によって特異的な変異の存在についてスコア付けし得る。
【０２７８】
他の実施形態において、ＭＥＭＸにおける遺伝子変異は、サンプル核酸およびコントロール核酸（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）を、数百または数千のオリゴヌクレオチドプローブを含む高密度アレイに対してハイブリダイズさせることによって同定され得る（例えば、Ｃｒｏｎｉｎら（１９９６）Ｈｕｍａｎ　Ｍｕｔａｔｉｏｎ　７：２４４−２５５；Ｋｏｚａｌら（１９９６）Ｎａｔ．Ｍｅｄ．２：７５３−７５９を参照のこと）。例えば、ＭＥＭＸにおける遺伝子変異は、Ｃｒｏｎｉｎら（前出）に記載されるように光生成ＤＮＡプローブを含む二次元アレイにおいて同定され得る。手短には、プローブの第一ハイブリダイゼーションアレイを用いて、サンプルおよびコントロールにおける長いストレッチのＤＮＡにわたって走査し、連続的に重複するプローブの線形アレイを作成することによって、その配列間の塩基変化を同定し得る。この工程は、点変異の同定を可能にする。この工程に第二のハイブリダイゼーションアレイが続き、これは、検出される全ての改変体または変異体に相補的な、より小さな特化されたプローブアレイを用いることによる特定の変異の特徴付けを可能にする。各変異アレイは、一方が野生型遺伝子に対して相補的であり、そして他方が変異遺伝子に対して相補である並行プローブセットから構成される。
【０２７９】
なお別の実施形態において、当該分野で公知の種々の配列決定反応のいずれかを使用して、ＭＥＭＸ遺伝子を直接配列決定し得、そしてサンプルＭＥＭＸ配列と対応する野生型（コントロール）配列とを比較することによって、変異を検出し得る。配列決定反応の例としては、ＭａｘａｍおよびＧｉｌｂｅｒｔ（１９７７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　７４：５６０またはＳａｎｇｅｒ（１９７７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　７４：５４６３によって開発された技術に基づくものが挙げられる。診断アッセイを実施する場合、種々の自動化配列決定手順のいずれかを利用し得ることもまた意図される（例えば、Ｎａｅｖｅら（１９９５）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　１９：４４８を参照のこと）。これらには、質量分析法による配列決定法（例えば、ＰＣＴ国際公開番号ＷＯ　９４／１６１０１；Ｃｏｈｅｎら（１９９６）Ａｄｖ　Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ　３６：１２７−１６２；およびＧｒｉｆｆｉｎら（１９９３）Ａｐｐｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ　３８．：１４７−１５９を参照のこと）が含まれる。
【０２８０】
ＭＥＭＸ遺伝子における変異を検出するための他の方法としては、切断薬剤からの保護を使用して、ＲＮＡ／ＲＮＡもしくはＲＮＡ／ＤＮＡのヘテロ二重鎖におけるミスマッチ塩基を検出する方法が挙げられる（例えば、Ｍｙｅｒｓら（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ　２３０：１２４２を参照のこと）。一般に、「ミスマッチ切断」の当該分野の技術は、野生型のＭＥＭＸ配列を含む（標識された）ＲＮＡまたはＤＮＡを、組織サンプルから得られた潜在的な変異体ＲＮＡまたはＤＮＡとハイブリダイズさせることによって形成されるヘテロ二重鎖を提供する工程によって始まる。この二本鎖の二重鎖を、二重鎖の一本鎖領域（例えば、そのコントロールとサンプルの鎖との間の塩基対ミスマッチに起因して存在するもの）を切断する薬剤を用いて処理する。例えば、ＲＮＡ／ＤＮＡ二重鎖を、ＲＮａｓｅを用いて処理し得、そしてＤＮＡ／ＤＮＡハイブリッドを、そのミスマッチ領域を酵素的に消化することに対して、Ｓ１ヌクレアーゼを用いて処理し得る。他の実施形態において、ＤＮＡ／ＤＮＡまたはＲＮＡ／ＤＮＡのいずれかの二重鎖を、ミスマッチ領域を消化するために、ヒドロキシルアミンまたは四酸化オスミウム、およびピペリジンを用いて処理し得る。次いで、そのミスマッチ領域の消化後、得られた材料を変性ポリアクリルアミドゲル上で、大きさで分離して、変異の部位を決定する。例えば、Ｃｏｔｔｏｎら、１９８８．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８５：４３９７；Ｓａｌｅｅｂａら、１９９２．Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ．２１７：２８６−２９５を参照のこと。１つの実施形態において、コントロールのＤＮＡまたはＲＮＡは、検出のために標識され得る。
【０２８１】
なお別の実施形態において、ミスマッチ切断反応は、二本鎖ＤＮＡにおけるミスマッチ塩基対を認識する１つ以上のタンパク質（いわゆる「ＤＮＡミスマッチ修復」酵素）を、細胞のサンプルから得られたＭＥＭＸ　ｃＤＮＡにおける点変異を検出およびマッピングするために規定された系において使用する。例えば、Ｅ．ｃｏｌｉのｍｕｔＹ酵素は、Ｇ／ＡミスマッチでＡを切断し、そしてＨｅＬａ細胞からのチミジンＤＮＡグリコシダーゼは、Ｇ／ＴミスマッチでＴを切断する。例えば、Ｈｓｕら、１９９４．Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ　１５：１６５７〜１６６２を参照のこと。例示的な実施形態に従って、ＭＥＭＸ配列（例えば、野生型ＭＥＭＸ配列）に基づくプローブは、試験細胞（単数または複数）由来のｃＤＮＡまたは他のＤＮＡ産物にハイブリダイズされる。二重鎖は、ＤＮＡミスマッチ修復酵素を用いて処理され、そしてその切断産物（もしあれば）は、電気泳動プロトコルなどから検出され得る。例えば、米国特許第５，４５９，０３９号を参照のこと。
【０２８２】
他の実施形態において、電気泳動の移動度における変化は、ＭＥＭＸ遺伝子における変異を同定するために使用される。例えば、一本鎖配座多型（ＳＳＣＰ）は、変異体核酸と野生型核酸との間の電気泳動の移動度における差異を検出するために使用され得る。例えば、Ｏｒｉｔａら、１９８９．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ：８６：２７６６；Ｃｏｔｔｏｎ、１９９３．Ｍｕｔａｔ．Ｒｅｓ．２８５：１２５〜１４４；Ｈａｙａｓｈｉ、１９９２．Ｇｅｎｅｔ．Ａｎａｌ．Ｔｅｃｈ．Ａｐｐｌ．９：７３〜７９を参照のこと。サンプルおよびコントロールＭＥＭＸ核酸の一本鎖ＤＮＡフラグメントは、変性され、そして再生される。一本鎖核酸の二次構造は、配列に従って変化し、電気泳動の移動度において得られる変化は、１つの塩基変化さえも検出し得る。ＤＮＡフラグメントは、標識され得るか、または標識されたプローブを用いて検出され得る。アッセイの感度は、二次構造が、配列中の変化に対してより感受的である、（ＤＮＡよりもむしろ）ＲＮＡを使用することによって増強され得る。１つの実施形態において、本発明の方法は、ヘテロ二重鎖分析を利用して、電気泳動の移動度における変化に基づいて二本鎖のヘテロ二重鎖分子を分離する。例えば、Ｋｅｅｎら、１９９１．Ｔｒｅｎｄｓ　Ｇｅｎｅｔ．７：５を参照のこと。
【０２８３】
なお別の実施形態において、一定勾配の変性剤を含有するポリアクリルアミドゲルにおける変異体または野生型フラグメントの移動は、変性勾配ゲル電気泳動（ＤＧＧＥ）を使用してアッセイされる。例えば、Ｍｙｅｒｓら（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ　３１３：４９５を参照のこと。ＤＧＧＥが分析の方法として使用される場合、ＤＮＡは、例えば、ＰＣＲにより約４０ｂｐの高融点ＧＣリッチＤＮＡのＧＣクランプを付加することによって、完全には変性されないことを確実にするように改変される。さらなる実施形態において、温度勾配は、コントロールおよびサンプルＤＮＡの移動度における差異を同定するために、変性剤勾配の代わりに使用される。例えば、ＲｏｓｅｎｂａｕｍおよびＲｅｉｓｓｎｅｒ、１９８７．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．２６５：１２７５３を参照のこと。
【０２８４】
点変異を検出するための他の技術の例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：選択的オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション、選択的増幅、または選択的プライマー伸長。例えば、オリゴヌクレオチドプライマーは、既知の変異が中心的に配置されるように調製され得、次いで、完全なマッチが見出される場合にのみハイブリダイゼーションを許容する条件下で標的ＤＮＡにハイブリダイズされる。例えば、Ｓａｉｋｉら、１９８６．Ｎａｔｕｒｅ　３２４：１６３；Ｓａｉｋｉら、１９８９．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８６：６２３０を参照のこと。このような対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドは、このオリゴヌクレオチドがハイブリダイズ膜に付着され、そして標識された標的ＤＮＡとハイブリダイズされる場合に、ＰＣＲ増幅された標的ＤＮＡまたは多くの異なる変異にハイブリダイズされる。
【０２８５】
あるいは、選択的ＰＣＲ増幅に依存する対立遺伝子特異的増幅技術は、本発明と合わせて使用され得る。特異的増幅についてのプライマーとして使用されるオリゴヌクレオチドは、分子の中心において（その結果、増幅は、差次的ハイブリダイゼーションに依存する）（例えば、Ｇｉｂｂｓら、１９８９．Ｎｕｃｌｅｉｃ．Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．１７：２４３７〜２４４８を参照のこと）か、あるいは適切な条件下でミスマッチが妨げられ得るかまたはポリメラーゼ伸長を減少し得る、１つのプライマーの３’の最末端で、目的の変異を保有し得る（例えば、Ｐｒｏｓｓｎｅｒ（１９９３）Ｔｉｂｔｅｃｈ．１１：２３８を参照のこと）。さらに、変異の領域において新規な制限部位を導入することは、切断に基づく検出を行うために望ましくあり得る。例えば、Ｇａｓｐａｒｉｎｉら、１９９２．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ　Ｐｒｏｂｅｓ　６：１を参照のこと。特定の実施形態において、増幅はまた、増幅用Ｔａｑリガーゼを使用して実施され得ることが予測される。例えば、Ｂａｒａｎｙ、１９９１．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８８：１８９を参照のこと。このような場合において、連結は、５’配列の３’末端に完全なマッチが存在する場合にのみ生じ、増幅の存在または非存在を探索することによって、特定の部位で既知の変異の存在を検出することを可能にする。
【０２８６】
本明細書中に記載される方法は、例えば、本明細書中に記載れる少なくとも１つのプローブ核酸または抗体試薬を含む、予めパッケージングされた診断キットを利用することによって実施され得、これは、例えば、ＭＥＭＸ遺伝子に関与する疾患または疾病の症状または家族病歴を示す患者を診断するための臨床的設定において簡便に使用され得る。
【０２８７】
さらに、ＭＥＭＸが発現される任意の細胞型または組織（好ましくは、末梢血白血球）は、本明細書中に記載される予後アッセイにおいて利用され得る。しかし、有核細胞を含む任意の生物学的サンプル（例えば、頬粘膜細胞を含む）が、使用され得る。
【０２８８】
（ＩＩＩ．薬理ゲノム学（Ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｏｍｉｃｓ））
ＭＥＭＸ活性（例えば、ＭＥＭＸ遺伝子発現）に対する刺激性または阻害性の影響を有する因子、またはモジュレーターは、本明細書中に記載されるスクリーニングアッセイによって同定されるように、異常なＭＥＭＸ活性に関連する障害を処置（予防的または治療的に）するために個体に投与され得る。例えば、ＭＥＭ１に関するこのような障害として、免疫学的状態、ウイルス感染、神経学的障害、アルツハイマー病もしくはパーキンソン病、癌（例えば、乳癌もしくは神経芽腫）、腎臓病、および女性の生殖の健康（ｆｅｍａｌｅ　ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ　ｈｅａｌｔｈ）。ＭＥＭ４に関する障害として、肺および／または脳に関係している障害が挙げられる（例えば、精神分裂病、または頭部外傷に続く神経損傷）。ＭＥＭ５に関する障害として、心臓および他の筋肉障害（例えば、不整脈）、凝固欠乏症（ｃｌｏｔｔｉｎｇ　ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｉｅｓ）、およびコバラミン欠乏症（例えば、悪性貧血）が挙げられる。ＭＥＭ６に関するこのような障害として、グリコゲン代謝の調節不全に起因する障害（例えば、糖尿病）が挙げられる。ＭＥＭ７およびＭＥＭ８に関するこのような障害として、視覚関連障害（例えば、角膜軟化）、癌、および他の腫瘍性の病状が挙げられる。
【０２８９】
このような処置と合わせて、個体の薬理ゲノム学（すなわち、個体の遺伝子型と外来化合物または薬物に対するその個体の応答との間の関係についての研究）が、考慮され得る。治療剤の代謝における差異は、薬理学的に活性な薬物の用量と血中濃度との間の関係を変更することによって、重篤な毒性または治療の失敗を導き得る。従って、個体の薬理ゲノム学は、個体の遺伝子型の考慮に基づく予防的または治療的処置のために有効な薬剤（例えば、薬物）の選択を許容する。このような薬理ゲノム学は、さらに、適切な投薬量および治療剤レジメンを決定するために使用され得る。従って、ＭＥＭＸタンパク質の活性、ＭＥＭＸ核酸の発現、あるいは個体におけるＭＥＭＸ遺伝子の変異含量が決定されて、それによって個体の治療的または予防的処置のために適切な薬剤（単数または複数）を選択し得る。
【０２９０】
薬理ゲノム学は、罹患された人において変更された薬物の性質および異常な作用に起因する、薬物に応答する臨床的に有意な遺伝性変更を扱う。例えば、Ｅｉｃｈｅｌｂａｕｍ、１９９６．Ｃｌｉｎ　Ｅｘｐ　Ｐｈａｒｍａｃｏｌ　Ｐｈｙｓｉｏｌ．、２３：９８３〜９８５；Ｌｉｎｄｅｒ、１９９７．Ｃｌｉｎ　Ｃｈｅｍ．、４３：２５４〜２６６を参照のこと。一般に、２つの型の薬理ゲノム学状態が、区別され得る。遺伝的状態は、薬物が身体に作用する方法を変更する１つの因子として伝達されるか（変更された薬物作用）、または遺伝的状態は、身体が薬物に作用する方法を変更する１つの因子として伝達される（変更された薬物代謝）。これらの薬理ゲノム学状態は、稀な欠損としてか、または多型としてのいずれかで生じ得る。例えば、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ６ＰＤ）欠損は、一般的な遺伝性酵素病であり、この主な臨床的合併症は、酸化剤薬物（抗マラリア剤、スルホンアミド、鎮痛薬、ニトロフラン）の摂取およびソラマメの摂取（ｃｏｎｓｏｍｐｔｉｏｎ）後の溶血である。
【０２９１】
例示的な実施形態として、薬物代謝酵素の活性は、薬物作用の強度および持続期間の両方の主要な決定因子である。薬物代謝酵素（例えば、Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ２（ＮＡＴ２）およびシトクロムＰ４５０酵素ＣＹＰ２Ｄ６およびＣＹＰ２Ｃ１９）の遺伝的多型の発見は、何故に、幾人かの患者が予期される薬物効果を得ないか、または薬物の標準的かつ安全な用量を摂取した後に過大な薬物応答および深刻な毒性を示すかということに関しての説明を提供した。これらの多型は、集団において２つの表現型（高い代謝能を持つ人（ｅｘｔｅｎｓｉｖｅ　ｍｅｔａｂｏｌｉｚｅｒ）（ＥＭ）および低い代謝能を持つ人（ｐｏｏｒ　ｍｅｔａｂｏｌｉｚｅｒ）（ＰＭ））で発現される。ＰＭの罹患率は、異なる集団の間で異なる。例えば、ＣＹＰ２Ｄ６をコードする遺伝子は高度に多型であり、そしていくらかの変異がＰＭにおいて同定されており、この全ては機能的ＣＹＰ２Ｄ６の非存在に至る。ＣＹＰ２Ｄ６およびＣＹＰ２Ｃ１９の低い代謝能を持つ人は、彼らが標準的な用量を受ける場合に、かなり頻繁に過大な薬物応答および副作用を経験する。代謝産物が活性な治療的部分である場合、そのＣＹＰ２Ｄ６形成代謝産物であるモルヒネによって媒介されるコデインの鎮痛効果について実証されるように、ＰＭは治療的応答を示さない。他の極端なものは、標準的な用量に応答しない、いわゆる超迅速な代謝能を持つ人である。最近、超迅速な代謝の基準となる分子は、ＣＹＰ２Ｄ６遺伝子増幅に起因していることが同定されている。
【０２９２】
従って、ＭＥＭＸのタンパク質の活性、ＭＥＭＸの核酸の発現、あるいは個体におけるＭＥＭＸの遺伝子の変異内容を決定されて、それによって、その個体の治療的または予防的処置のために適切な薬剤を選択し得る。さらに、薬理ゲノム学の研究を使用して、個体の薬物応答性の表現型の同定に対して薬物代謝酵素をコードする多型対立遺伝子の遺伝子型を適用し得る。この知見は、用量または薬物選択に適用される場合、有害な反応または治療の失敗を回避し得、従って、被験体をＭＥＭＸの調節因子（例えば、本明細書中に記載される例示的なスクリーニングアッセイの１つによって同定される調節因子）を用いて処置する場合に治療的または予防的効率を増強し得る。
【０２９３】
（ＩＶ．臨床試験の間の効果のモニタリング）
ＭＥＭＸの発現または活性（例えば、異常な細胞増殖および／または分化を調節する能力）に対する薬剤（例えば、薬物、化合物）の影響をモニタリングすることは、基本的な薬物スクリーニングにおいてのみならず、臨床試験においてもまた適用され得る。例えば、本明細書中に記載されるようなスクリーニングアッセイによって決定される薬剤が、ＭＥＭＸの遺伝子発現、タンパク質レベルを増加するため、またはＭＥＭＸ活性をアップレギュレートする効力を、減少したＭＥＭＸの遺伝子発現、タンパク質レベル、またはダウンレギュレートしたＭＥＭＸの活性を示す被験体の臨床試験においてモニターし得る。あるいは、スクリーニングアッセイによって決定される薬剤が、ＭＥＭＸの遺伝子発現、タンパク質レベルを減少、またはＭＥＭＸの活性をダウンレギュレートする効力を、増加したＭＥＭＸの遺伝子発現、タンパク質レベル、またはアップレギュレートしたＭＥＭＸの活性を示す被験体の臨床試験においてモニターし得る。このような臨床試験において、ＭＥＭＸの発現または活性、および好ましくは、例えば、細胞性増殖障害または免疫障害、または上記個々の節１〜１４に記載するような、ＭＥＭＸに特異的な疾患に関与した他の遺伝子が、「リードアウト（読み出し）（ｒｅａｄ　ｏｕｔ）」または特定の細胞の免疫応答のマーカーとして使用され得る。
【０２９４】
例えば、限定の目的ではないが、ＭＥＭＸを含む遺伝子（これは、ＭＥＭＸ活性（例えば、本明細書中に記載されるようなスクリーニングアッセイにおいて同定される）を調節する薬剤（例えば、化合物、薬物または小さい分子）を用いる処置によって、細胞内で調節される）が、同定され得る。従って、細胞性増殖障害に対する薬剤の効果を研究するために、例えば、臨床試験において、細胞が単離され得、そしてＲＮＡが調製され得、そしてＭＥＭＸおよびこの障害に関与する他の遺伝子の発現のレベルについて分析され得る。遺伝子発現のレベル（すなわち、遺伝子発現パターン）は、本明細書中に記載されるように、ノーザンブロット分析もしくはＲＴ−ＰＣＲによるか、あるいは産生されるタンパク質の量を測定することによるか、本明細書中に記載されるような方法の１つによるか、あるいはＭＥＭＸまたは他の遺伝子の活性のレベルを測定することによって、定量され得る。この様式で、この遺伝子発現パターンは、この薬剤に対する細胞の生理学的応答の指標であるマーカーとして作用し得る。従って、この応答状態は、この薬剤を用いる個体の処置の前、および処置の間の種々の時点で、決定され得る。
【０２９５】
１つの実施形態において、本発明は、薬剤（例えば、アゴニスト、アンタゴニスト、タンパク質、ペプチド、ペプチド模倣物、核酸、小さい分子、または本明細書中に記載されるスクリーニングアッセイによって同定される他の薬物候補物）を用いる、被験体の処置の効力をモニタリングするための方法を提供し、これは、以下の工程を包含する：（ｉ）薬剤の投与の前に、被験体から投与前サンプルを得る工程；（ｉｉ）この投与前サンプルにおいて、ＭＥＭＸのタンパク質、ｍＲＮＡ、またはゲノムＤＮＡの発現のレベルを検出する工程；（ｉｉｉ）この被験体から１つ以上の投与後サンプルを得る工程；（ｉｖ）この投与後サンプルにおいて、ＭＥＭＸのタンパク質、ｍＲＮＡ、またはゲノムＤＮＡの発現または活性のレベルを検出する工程；（ｖ）この投与前サンプルにおけるＭＥＭＸのタンパク質、ｍＲＮＡ、またはゲノムＤＮＡの発現または活性のレベルを、この投与後サンプル（単数または複数）におけるＭＥＭＸのタンパク質、ｍＲＮＡ、またはゲノムＤＮＡの発現または活性のレベルと比較する工程；ならびに（ｖｉ）従って、この被験体に対する薬剤の投与を変更する工程。例えば、この薬剤の増加した投与は、検出されるよりも高いレベルにＭＥＭＸの発現または活性を増加するために（すなわち、この薬剤の効力を増加するために）望ましくあり得る。あるいは、この薬剤の減少した投与は、検出されるよりも低いレベルにＭＥＭＸの発現または活性を減少するために（すなわち、この薬剤の効力を減少するために）望ましくあり得る。
（処置方法）
本発明は、異常なＭＥＭＸの発現または活性に関連する障害の危険性がある（または感受性）か、またはこの障害を有する被験体を処置する予防的および治療的の両方の方法を提供する。例えば、活性の異常なＭＥＭ１の発現に関連する障害としては、ウイルス感染、神経学的障害（例えば、アルツハイマー病もしくはパーキンソン病）、癌（例えば、乳癌もしくは神経芽腫）、および種々の腎臓障害が挙げられるが、これに限定されない。活性の異常なＭＥＭ２、ＭＥＭ３、およびＭＥＭ４の発現に関連する障害としては、精神学的疾患（例えば、精神分裂病）、または頭部の外傷に続く減数する神経損傷（ｒｅｄｕｃｉｎｇ　ｎｅｕｒｏｎａｌ　ｄａｍａｇｅ）（が挙げられるが、これに限定されない。異常なＭＥＭ５の発現に関連する障害として、心臓および他の筋肉障害（例えば、不整脈障害）、凝固欠乏症における凝固因子ＸＩ（ｃｏｔｔｉｎｇ　Ｆａｃｔｏｒ　ＸＩ　ｉｎ　ｃｏｔｔｉｎｇ　ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｉｅｓ）、およびコバラミン欠乏症（例えば、悪性貧血）が挙げられるが、これに限定されない。異常なＭＥＭ６発現に関連する障害として、グリコゲン代謝関連障害（例えば、糖尿病および関連障害）が挙げられるが、これに限定されない。異常なＭＥＭ７およびＭＥＭ８に関連する障害として、視覚関連障害（例えば、角膜軟化）および癌および／または類似した腫瘍性の病状が挙げられるが、これに限定されない。
【０２９６】
これらの処置方法は、以下で、さらに十分に検討する。
【０２９７】
（Ｉ．疾患および障害）
（その疾患または障害に罹患していない被験体と比較して）増加したレベルまたは生物学的活性によって特徴付けられる疾患および障害は、活性を拮抗する（すなわち、低減または阻害する）治療剤を用いて処置され得る。活性を拮抗する治療剤は、治療的または予防的な様式で、投与され得る。利用され得る治療剤としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：（ｉ）上記ペプチド、またはそのアナログ、誘導体、フラグメントもしくはホモログ；（ｉｉ）上記ペプチドに対する抗体；（ｉｉｉ）上記ペプチドをコードする核酸；（ｉｖ）相同組換えによって上記ペプチドの内因性機能を「ノックアウトする」ために利用される、アンチセンス核酸および「機能不全性」である（すなわち、上記ペプチドに対するコード配列のコード配列内の異種挿入に起因する）核酸の投与、（例えば、Ｃａｐｅｃｃｈｉ、１９８９、Ｓｃｉｅｎｃｅ　２４４：１２８８〜１２９２を参照のこと）；または（ｖ）上記ペプチドとその結合パートナーとの間の相互作用を変化させる、調節因子（すなわち、インヒビター、アゴニストおよびアンタゴニスト（本発明のさらなるペプチド模倣物または本発明のペプチドに対して特異的な抗体を含む））。
【０２９８】
（その疾患または障害に罹患していない被験体と比較して）減少したレベルまたは生物学的活性によって特徴付けられる疾患および障害は、活性を増加させる（すなわち、活性に対するアゴニストである）治療剤を用いて処置され得る。活性をアップレギュレートする治療剤は、治療的または予防的な様式で、投与され得る。利用され得る治療剤としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：上記ペプチド、またはそのアナログ、誘導体、フラグメントもしくはホモログ；あるいはバイオアベイラビリティーを増加させるアゴニスト。
【０２９９】
増加したレベルまたは減少したレベルは、ペプチドおよび／またはＲＮＡを定量することによって、容易に検出され得る。この定量は、患者の組織サンプルを（例えば、生検組織から）入手し、そしてそのサンプルを、その発現したペプチド（または上記ペプチドのｍＲＮＡ）のＲＮＡレベルまたはペプチドレベルについて、構造および／または活性をインビトロでアッセイすることによる。当該分野において周知の方法としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：イムノアッセイ（例えば、ウェスタンブロット分析、免疫沈降後のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）ポリアクリルアミドゲル電気泳動、免疫細胞化学などによる）および／またはｍＲＮＡの発現を検出するためのハイブリダイゼーションアッセイ（例えば、ノーザンアッセイ、ドットブロット、インサイチュハイブリダイゼーションなど）。
【０３００】
（Ｉ．予防的方法）
１つの局面において、本発明は、被験体において異常なＭＥＭＸの発現または活性と関連する疾患または状態を、ＭＥＭＸの発現または少なくとも１つのＭＥＭＸ活性を調節する薬剤をこの被験体に投与することによって予防するための方法を提供する。異常なＭＥＭＸの発現または活性によって引き起こされるかまたはこれらに起因する、疾患にかかる危険がある被験体は、例えば、本明細書中に記載の診断アッセイまたは予後アッセイのいずれか、またはそれらの組み合わせによって、同定され得る。予防薬剤の投与は、疾患または障害が予防されるか、あるいはその進行を遅らせられるように、このＭＥＭＸ異常の特徴である症状の発現の前に行い得る。このＭＥＭＸ異常の型に依存して、例えば、ＭＥＭＸアゴニスト薬剤またはＭＥＭＸアンタゴニスト薬剤が、その被験体を処置するために使用され得る。その適切な薬剤は、本明細書中に記載のスクリーニングアッセイに基づいて決定され得る。本発明の予防方法は、以下の小区分において、さらに議論される。
【０３０１】
（ＩＩ．治療方法）
本発明の別の局面は、治療目的のためにＭＥＭＸの発現または活性を調節する方法に関する。本発明の調節方法は、細胞を、その細胞に関するＭＥＭＸタンパク質活性の活性のうちの１つ以上を調節する薬剤と接触させる工程を包含する。ＭＥＭＸタンパク質活性を調節する薬剤は、核酸またはタンパク質、ＭＥＭＸタンパク質の天然に存在する同族リガンド、ペプチド、ＭＥＭＸペプチド模倣物、または他の小さい分子のような、本明細書中に記載されるような薬剤であり得る。１つの実施形態において、この薬剤は、１つ以上のＭＥＭＸタンパク質活性を刺激する。このような刺激薬剤の例としては、活性なＭＥＭＸタンパク質、およびその細胞に導入されたＭＥＭＸをコードする核酸分子が挙げられる。別の実施形態において、この薬剤は、ＭＥＭＸタンパク質活性のうちの１つ以上を阻害する。このような阻害薬剤の例としては、アンチセンスＭＥＭＸ核酸分子、および抗ＭＥＭＸ抗体が挙げられる。これらの調節方法は、インビトロで（例えば、その薬剤とともにその細胞を培養することによって）、あるいはインビボで（例えば、被験体にその薬剤を投与することによって）実施され得る。このように、本発明は、ＭＥＭＸのタンパク質または核酸分子の、異常な発現または異常な活性によって特徴付けられる、疾患または障害に罹患した個体を処置する方法を提供する。１つの実施形態において、この方法は、ＭＥＭＸの発現または活性を調節する（例えば、アップレギュレートまたはダウンレギュレートする）薬剤（例えば、本明細書中に記載のスクリーニングアッセイによって同定される薬剤）あるいはそのような薬剤の組み合わせを投与する工程を包含する。別の実施形態において、この方法は、ＭＥＭＸのタンパク質または核酸分子を、低減したかまたは異常な、ＭＥＭＸの発現または活性を補償するための治療として、投与する工程を包含する。
【０３０２】
ＭＥＭＸ活性の刺激は、ＭＥＭＸが異常にダウンレギュレートされている状況、および／またはＭＥＭＸ活性の増加が有益な効果を有するようである状況において、望ましい。このような状況の１つの例は、被験体が、異常な細胞増殖および／または細胞分化によって特徴付けられる障害（例えば、癌または免疫関連）を有する場合である。このような状況の別の例は、被験体が免疫不全疾患（例えば、ＡＩＤＳ）を有する場合である。
【０３０３】
本発明の抗体（ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、および完全なヒト抗体を含む）は、治療剤として使用され得る。このような薬剤は、一般的に、被験体における疾患および病理を処置または予防するために使用される。抗体調製物（好ましくは、その標的抗原について高い特異性および高い親和性を有するもの）は、被験体に対して投与され、そして一般的に、その標的との結合に起因して効果を有する。このような効果は、所定の抗体分子と問題の標的抗原との間の相互作用の特異的性質に依存して、２つの種類のうちの１つであり得る。第１の例では、抗体の投与は、標的とそれが天然に結合する内因性リガンドとの結合を抑止または阻害し得る。この場合、抗体は、標的に結合し、そして天然に存在するリガンドの結合部位をマスクし、ここでそのリガンドは、エフェクター分子として働く。従って、レセプターは、リガンドが原因となるシグナル伝達経路を媒介する。
【０３０４】
あるいは、その効果は、標的分子上のエフェクター結合部位への結合の効力によって、抗体が生理学的結果を誘発するものであり得る。この場合、標的（存在し得ないかまたは疾患もしくは病理を欠損し得る内因性リガンドを有するレセプター）が、代理のエフェクターリガンドとして抗体を結合して、レセプターによって、レセプターに基づくシグナル伝達事象を開始する。
【０３０５】
治療的に有効な量の本発明の抗体は、治療目的を達成するために必要とされる量を一般的にいう。上記のように、これは、いくつかの場合において標的の機能を妨害し、そして他の場合において生理学的応答を促進する、抗体とその標的抗原の間の結合相互作用であり得る。投与されるために必要とされる量は、その特異的抗原についての抗体の結合親和性にさらに依存し、そしてまた、その量は、投与される抗体が、その抗体が投与される自由な体積の他の被験体から枯渇される速度に依存する。本発明の抗体または抗体フラグメントの治療的有効用量の一般的な範囲は、非限定的な例として、約０．１ｍｇ／ｋｇ体重〜約５０ｍｇ／ｋｇ体重である。一般的な投薬の頻度は、例えば、毎日２回〜１週間に１回の範囲であり得る。
【０３０６】
（ＩＩＩ．治療剤の生物学的効果の決定）
本発明の種々の実施形態において、適切なインビトロまたはインビボアッセイを行って、特定の治療剤の効果およびその投与が罹患組織の処置を示すか否かを決定する。
【０３０７】
種々の特定の実施形態において、インビトロアッセイが患者の障害に関与する型（単数または複数）の代表的な細胞で行われ、所定の治療剤がこの細胞型（単数または複数）に対して所望の効果を発揮するか否かを決定し得る。治療において使用する化合物は、ヒト被験体において試験する前に適切な動物モデル系において試験され得る。これらの動物モデル系としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ラット、マウス、ニワトリ、ウシ、サル、ウサギなど。同様に、インビボ試験については、当該分野で公知の任意の動物モデル系が、ヒト被験体に対する投与の前に使用され得る。
【０３０８】
（実施例）
（実施例１：種々の細胞および組織におけるＭＥＭ５の発現のリアルタイム定量的（ＲＴＱ）ＰＣＲ評価）
ＭＥＭ５（国際識別番号１６４１８８４１）の定量的な発現を、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　ＡＢＩ　ＰＲＩＳＭ（登録商標）７７００　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍで行ったリアルタイム定量的ＰＣＲ（ＴＡＱＭＡＮ（登録商標））によって正常サンプルおよび腫瘍サンプルにおいて評価した。本実施例に含まれる表において、以下の略語を使用した：
ｃａ．＝癌（ｃａｒｃｉｎｏｍａ）
＊＝転移から定着した（ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ　ｆｒｏｍ　ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ）
ｍｅｔ＝転移（ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ）
ｓ　ｃｅｌｌ　ｖａｒ＝小細胞変異体（Ｓｍａｌｌ　Ｃｅｌｌ　Ｖａｒｉａｎｔ）
ｎｏｎ−ｓ＝ｎｏｎ−ｓｍ＝非小（ｎｏｎ−Ｓｍａｌｌ）
ｓｑｕａｍ＝鱗状（ｓｑｕａｍｏｕｓ）
ｐｌ．ｅｆｆ＝ｐｌ．ｅｆｆｕｓｉｏｎ＝胸水（ｐｌｅｕｒａｌ　ｅｆｆｕｓｉｏｎ）
ｇｌｉｏ＝神経膠腫（ｇｌｉｏｍａ）
ａｓｔｒｏ＝星状細胞腫（ａｓｔｒｏｃｙｔｏｍａ）
ｎｅｕｒｏ＝神経芽細胞腫（ｎｅｕｒｏｂｌａｓｔｏｍａ）。
【０３０９】
９６のＲＮＡサンプルを、βアクチンおよびＧＡＰＤＨのような内部基準について正規化した。ＲＮＡ（〜５０ｎｇの合計または〜１ｎｇのポリＡ＋）を、ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）Ｒｅｖｅｒｓｅ　Ｔｒｉａｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　Ｒｅａｇｅｎｔｓ　Ｋｉｔ（ＰＥ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ；Ｆｏｓｔｅｒ　Ｃｉｔｙ、ＣＡ；カタログ番号Ｎ８０８−０２３４）を使用し、そして製造者のプロトコルに従ってランダムヘキサマーを使用してｃＤＮＡに転換した。反応を２０μｌで行い、そして３０分間４８℃でインキュベートした。次いで、ｃＤＮＡ（５μｌ）を、ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）反応のために、βアクチンおよびＧＡＰＤＨ　ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）Ａｓｓａｙ　Ｒｅａｇｅｎｔｓ（ＰＥ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ；それぞれ、カタログ番号４３１０８８Ｅおよび４３１０８８４Ｅ）およびＴＡＱＭＡＮ（登録商標）Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ　ＰＣＲ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ（ＰＥ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ；カタログ番号４３０４４４７）のような内部基準を使用して、製造者のプロトコルに従って、分離プレートに移した。２５μｌの総反応量で、以下のパラメーターを使用して反応を行った：２分間５０℃；１０分間９５℃；１５秒間９５℃；および１分間６０℃（４０サイクル）。結果を、ログスケールを使用してＣＴ値（所定のサンプルが、蛍光の閾値レベルで交差するサイクル）として記録した。ここで、所定のサンプルと最も低いＣＴ値を有するサンプルとの間のＲＮＡ濃度の差は、２δＣＴとして示された。次いで、このＲＮＡの差の逆数をとり、そして１００を掛けることによって相対発現パーセントを得た。βアクチンおよびＧＡＰＤＨから得られた平均のＣＴ値を、ＲＮＡサンプルを正規化するために使用した。最も高いＣＴ値を生じるＲＮＡサンプルは、さらなる希釈を必要としないが、他の全てのサンプルを、それらのβアクチン／ＧＡＰＤＨ平均ＣＴ値に従って、このサンプルと比較して希釈した。
【０３１０】
正規化ＲＮＡ（５μｌ）を、ｃＤＮＡに転換し、そしてＯｎｅ−Ｓｔｅｐ　ＲＴ−ＰＣＲ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ　Ｒｅａｇｅｎｔｓ（ＰＥ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ；カタログ番号４３０９１６９）および遺伝子特異的プライマーを使用して、製造者の指示に従って、ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）を通じて分析した。プローブおよびプライマーを、入力として標的配列を使用するＰｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ’ｓ　Ｐｒｉｍｅｒ　Ｅｘｐｒｅｓｓ　Ｓｏｆｔｗａｒｅパッケージ（Ａｐｐｌｅ　Ｃｏｍｐｕｔｅｒ’ｓ　Ｍａｃｉｎｔｏｓｈ　ＰＣのためのＶｅｒｓｉｏｎ　Ｉ）または類似のアルゴリズムに従って、各アッセイについて設計した。デフォルトの設定を、反応条件について使用し、そして以下のパラメーターをプライマーの選択の前に設定した：プライマー濃度＝２５０ｎＭ；プライマー溶解温度（Ｔｍ）範囲＝５８°〜６０℃；プライマー最適Ｔｍ＝５９℃；最大プライマー差異＝２℃；プローブは、５’末端Ｇを有さない；プローブＴｍは、プローブＴｍよりも１０℃より高くなければならない；そしてアンプリコンのサイズは、７５ｂｐ〜１００ｂｐでなければならない。選択されるプローブおよびプライマー（以下を参照のこと）は、Ｓｙｎｔｈｅｇｅｎ（Ｈｏｕｓｔｏｎ，ＴＸ，ＵＳＡ）によって合成された。プローブを、結合していない色素を除去するためにＨＰＬＣによって二回精製し、そしてそれぞれプローブの５’末端および３’末端に対するレポーターおよびクエンチャー色素の結合を確認するために質量分析によって評価した。その最終濃度は、以下であった：順方向および逆方向プライマー＝それぞれ９００ｎＭ；およびプローブ＝２００ｎＭ。
【０３１１】
以下のＰＣＲ条件を用いた。各組織および各細胞株由来の正規化されたＲＮＡを、９６ウェルのＰＣＲプレート（Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）の各ウェルにスポットした。２つのプローブ（標的クローン特異的プローブおよび標的プローブで多重化された別の遺伝子特異的プローブ）を含むＰＣＲ反応混合物をＰＥ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　７７００のための１Ｘ　ＴａｑＭａｎＴＭＰＣＲ　Ｍａｓｔｅｒ　ＭＩＸを使用して調製した。この混合物は、以下を含んだ：５ｍＭ　ＭｇＣｌ２；ｄＮＴＰ（ｄＡ、ｄＧ、ｄＣ、およびｄＵを１：１：１：２の比で）；０．２５Ｕ／ｍｌ　ＡｍｐｌｉＴａｑ　ＧｏｌｄＴＭ（ＰＥ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）；０．４Ｕ／μｌ　ＲＮａｓｅインヒビター；および０．２５Ｕ／μｌ逆転写酵素。逆転写を４８℃で３０分間行い、続いて、以下のような増幅／ＰＣＲサイクルを行った：９５℃で１０分間；次いで９５℃で１５秒間および６０℃で１分間の４０サイクル。
【０３１２】
２つのサンプルパネルを本実施例において使用した。パネル１は、そのウェルがヒト悪性組織（すなわち、腫瘍）から樹立された種々のヒト細胞株から単離されたＲＮＡ／ｃＤＮＡを含む、９６ウェルプレート（通常、２つのコントロールウェル、９４の試験サンプル）である。これらの細胞株は、それらの腫瘍形成能、転移可能性、薬物耐性、侵襲性可能性および他の癌関連特性に関して、学術研究機関および商業部門の両方の研究者によって広く特徴付けられてきた。これらは、抗癌剤および有望な治療ストラテジーの臨床前評価のための適切な道具として役立つ。これらの種々のヒト癌細胞株由来のＲＮＡが、国立癌研究所（ＵＳＡ）の発症治療部門（ＤＴＢ）から単離および獲得された。それらの生物学的行動、遺伝子発現、および種々の細胞障害性薬剤に対する耐性に関する基本的情報は、ＤＴＢ（ｈｔｔｐ：／／ｄｔｐ．ｎｃｉ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）によって提供される。
【０３１３】
さらに、ＲＮＡ／ｃＤＮＡを、死亡した高齢者または急死した犠牲者（事故など）に対して行なわれたヒト剖検由来の種々のヒト組織から獲得した。これらの組織が疾患のないことを確認した。ならびにＣｌｏｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．、Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、およびＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのような種々の高品質の販売元から購入した。
【０３１４】
すべてのサンプルからのＲＮＡ完全性は、ガイドとしての２８ｓおよび１８ｓリボソームＲＮＡ染色強度比率（２：１〜２．５：１　２８ｓ：１８ｓ）および変性産物の指標となる低分子量ＲＮＡの非存在を確認するアガロースゲル電気泳動の視覚的評価によって、品質について制御される。
【０３１５】
パネル２は、国立癌研究所の共同ヒト組織ネットワーク（ＣＨＴＮ）または国立疾病研究所（ＮＤＲＩ）と密接に協力した外科医の作業によって獲得されたヒト組織から単離されたＲＮＡ／ｃＤＮＡを含む９６ウェルプレート（通常、２つのコントロールウェル、９４の試験サンプル）である。獲得された組織は、ヒト悪性腫瘍に由来し、そして、この場合に多数の悪性組織が「調和したマージン（ｍａｔｃｈｅｄ　ｍａｒｇｉｎｓ）」を有することを示した。この腫瘍組織および「調和したマージン」は、２人の独立した病理学者（外科的病理学者および再びＮＤＲＩまたはＣＨＴＮの病理学者）によって評価された。この分析は、腫瘍分化グレードの全体の組織病理学的評価を提供する。さらに、大部分のサンプルは、患者の臨床学的段階に関する情報を提供する本来の外科的病理学報告を含む。これらの調和したマージンは、手術区域の周囲の組織（すなわち、すぐ近接）から採取される（正常な隣接組織について、「ＮＡＴ」と命名される）。さらに、ＲＮＡまたはｃＤＮＡを、死亡した高齢者または急死した犠牲者（事故など）に対して行なわれたヒト剖検由来の種々のヒト組織から獲得した。これらの組織が疾患のないことを確認し、そしてＣｌｏｎｔｅｃｈ，Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、およびＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのような種々の高品質の販売元から購入した。
【０３１６】
再び、全てのサンプルからのＲＮＡ完全性を、ガイドとして２８Ｓおよび１８ＳｒＲＮＡ染色強度比率（２：１〜２．５：１　２８Ｓ：１８Ｓの比）を使用し、そして変性産物の指標となる低分子量ＲＮＡの非存在を確認することによって、アガロースゲル電気泳動の視覚的評価によって、品質について制御した。単一のエキソンの長さにわたって増幅するように設計されたプローブおよびプライマーセットを使用して、逆転写酵素の非存在下で、反応物の泳動によってゲノムＤＮＡ混入について、サンプルを品質制御した。
【０３１７】
パネル１を利用する以下のＭＥＭ５配列（国際識別番号１６４１８８４１）のＲＴＱ　ＰＣＲを、表２において指定されるプライマー−プローブセットＡｇ７６５を使用して、表３に示した。
【０３１８】
【表２】
2004509602.tif 000004
【０３１９】
【表３】
2004509602.tif 000005
2004509602.tif 000006
表３の結果は、ＭＥＭ５の配列が、広範な種々の正常細胞株および癌細胞株において発現されることを示す。正常な組織と関連して、特定の脳腫瘍（例えば、ＣＮＳ　ｃａ．（ｇｌｉｏ）ＳＮＢ−１９）、結腸癌（例えば、結腸ｃａ．＊（ＳＷ４８０ｍｅｔ）ＳＷ６２０）、および肺癌（肺ｃａ．（ｎｏｎ−ｃｌ）ＮＣＩ−Ｈ５２２）においてより高度に発現される。
【０３２０】
パネル２を用いて得られたＭＥＭ５についてのさらなる結果を、表４に示す。
【０３２１】
【表４】
2004509602.tif 000007
表４の結果は、ＭＥＭ５が、隣接する非癌性組織と比較して、特定の腫瘍サンプルにおいて優先的に発現されることを示す。これらの腫瘍としては、肝臓転移、腎臓腫瘍、前立腺癌、および卵巣癌が挙げられる。さらに、このパネル中の調和した正常組織を有さないさらなる腫瘍組織においいて高度に発現される。
【０３２２】
従って、表３および表４の結果は、ＭＥＭ５が特定の癌型のための診断プローブとして役立ち得ることを示唆する。
【０３２３】
（実施例２：種々の細胞および組織におけるＭＥＭ７の発現のリアルタイム定量的（ＲＴＱ）ＰＣＲ評価）
ＭＥＭ７（国際識別番号ＡＣ０１８６５３＿Ａ）の定量的な発現を、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　ＡＢＩ　ＰＲＩＳＭ（登録商標）７７００　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍで行ったリアルタイム定量的ＰＣＲ（ＴＡＱＭＡＮ（登録商標））によって正常サンプルおよび腫瘍サンプルにおいて評価した。本実施例に含まれる表において、以下の略語を使用した：
ｃａ．＝癌（ｃａｒｃｉｎｏｍａ）
＊＝転移から定着した（ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ　ｆｒｏｍ　ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ）
ｍｅｔ＝転移（ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ）
ｓ　ｃｅｌｌ　ｖａｒ＝小細胞変異体（Ｓｍａｌｌ　Ｃｅｌｌ　Ｖａｒｉａｎｔ）
ｎｏｎ−ｓ＝ｎｏｎ−ｓｍ＝非小（ｎｏｎ−Ｓｍａｌｌ）
ｓｑｕａｍ＝鱗状（ｓｑｕａｍｏｕｓ）
ｐｌ．ｅｆｆ＝ｐｌ．ｅｆｆｕｓｉｏｎ＝胸水（ｐｌｅｕｒａｌ　ｅｆｆｕｓｉｏｎ）
ｇｌｉｏ＝神経膠腫（ｇｌｉｏｍａ）
ａｓｔｒｏ＝星状細胞腫（ａｓｔｒｏｃｙｔｏｍａ）
ｎｅｕｒｏ＝神経芽細胞腫（ｎｅｕｒｏｂｌａｓｔｏｍａ）。
【０３２４】
９６のＲＮＡサンプルを、βアクチンおよびＧＡＰＤＨのような内部基準について正規化した。ＲＮＡ（〜５０ｎｇの合計または〜１ｎｇのポリＡ＋）を、ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）Ｒｅｖｅｒｓｅ　Ｔｒｉａｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　Ｒｅａｇｅｎｔｓ　Ｋｉｔ（ＰＥ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ；Ｆｏｓｔｅｒ　Ｃｉｔｙ、ＣＡ；カタログ番号Ｎ８０８−０２３４）を使用し、そして製造者のプロトコルに従ってランダムヘキサマーを使用してｃＤＮＡに転換した。反応を２０μｌで行い、そして３０分間４８℃でインキュベートした。次いで、ｃＤＮＡ（５μｌ）を、ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）反応のために、βアクチンおよびＧＡＰＤＨ　ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）Ａｓｓａｙ　Ｒｅａｇｅｎｔｓ（ＰＥ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ；それぞれ、カタログ番号４３１０８８Ｅおよび４３１０８８４Ｅ）およびＴＡＱＭＡＮ（登録商標）Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ　ＰＣＲ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ（ＰＥ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ；カタログ番号４３０４４４７）のような内部基準を使用して、製造者のプロトコルに従って、分離プレートに移した。２５μｌの総反応量で、以下のパラメーターを使用して反応を行った：２分間５０℃；１０分間９５℃；１５秒間９５℃；および１分間６０℃（４０サイクル）。結果を、ログスケールを使用してＣＴ値（所定のサンプルが、蛍光の閾値レベルで交差するサイクル）として記録した。ここで、所定のサンプルと最も低いＣＴ値を有するサンプルとの間のＲＮＡ濃度の差は、２δＣＴとして示された。次いで、このＲＮＡの差の逆数をとり、そして１００を掛けることによって相対発現パーセントを得た。βアクチンおよびＧＡＰＤＨから得られた平均のＣＴ値を、ＲＮＡサンプルを正規化するために使用した。最も高いＣＴ値を生じるＲＮＡサンプルは、さらなる希釈を必要としないが、他の全てのサンプルを、それらのβアクチン／ＧＡＰＤＨ平均ＣＴ値に従って、このサンプルと比較して希釈した。
【０３２５】
正規化ＲＮＡ（５μｌ）を、ｃＤＮＡに転換し、そしてＯｎｅ−Ｓｔｅｐ　ＲＴ−ＰＣＲ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ　Ｒｅａｇｅｎｔｓ（ＰＥ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ；カタログ番号４３０９１６９）および遺伝子特異的プライマーを使用して、製造者の指示に従って、ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）を通じて分析した。プローブおよびプライマーを、入力として標的配列を使用するＰｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ’ｓ　Ｐｒｉｍｅｒ　Ｅｘｐｒｅｓｓ　Ｓｏｆｔｗａｒｅパッケージ（Ａｐｐｌｅ　Ｃｏｍｐｕｔｅｒ’ｓ　Ｍａｃｉｎｔｏｓｈ　ＰＣのためのＶｅｒｓｉｏｎ　Ｉ）または類似のアルゴリズムに従って、各アッセイについて設計した。デフォルトの設定を、反応条件について使用し、そして以下のパラメーターをプライマーの選択の前に設定した：プライマー濃度＝２５０ｎＭ；プライマー溶解温度（Ｔｍ）範囲＝５８°〜６０℃；プライマー最適Ｔｍ＝５９℃；最大プライマー差異＝２℃；プローブは、５’末端Ｇを有さない；プローブＴｍは、プローブＴｍよりも１０℃より高くなければならない；そしてアンプリコンのサイズは、７５ｂｐ〜１００ｂｐでなければならない。選択されるプローブおよびプライマー（以下を参照のこと）は、Ｓｙｎｔｈｅｇｅｎ（Ｈｏｕｓｔｏｎ，ＴＸ，ＵＳＡ）によって合成された。プローブを、結合していない色素を除去するためにＨＰＬＣによって二回精製し、そしてそれぞれプローブの５’末端および３’末端に対するレポーターおよびクエンチャー色素の結合を確認するために質量分析によって評価した。その最終濃度は、以下であった：順方向および逆方向プライマー＝それぞれ９００ｎＭ；およびプローブ＝２００ｎＭ。
【０３２６】
以下のＰＣＲ条件を用いた。各組織および各細胞株由来の正規化されたＲＮＡを、９６ウェルのＰＣＲプレート（Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）の各ウェルにスポットした。２つのプローブ（標的クローン特異的プローブおよび標的プローブで多重化された別の遺伝子特異的プローブ）を含むＰＣＲ反応混合物をＰＥ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　７７００のための１Ｘ　ＴａｑＭａｎＴＭＰＣＲ　Ｍａｓｔｅｒ　ＭＩＸを使用して調製した。この混合物は、以下を含んだ：５ｍＭ　ＭｇＣｌ２；ｄＮＴＰ（ｄＡ、ｄＧ、ｄＣ、およびｄＵを１：１：１：２の比で）；０．２５Ｕ／ｍｌ　ＡｍｐｌｉＴａｑ　ＧｏｌｄＴＭ（ＰＥ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）；０．４Ｕ／μｌ　ＲＮａｓｅインヒビター；および０．２５Ｕ／μｌ逆転写酵素。逆転写を４８℃で３０分間行い、続いて、以下のような増幅／ＰＣＲサイクルを行った：９５℃で１０分間；次いで９５℃で１５秒間および６０℃で１分間の４０サイクル。
【０３２７】
２つのサンプルパネルを本実施例において使用した。パネル１は、そのウェルがヒト悪性組織（すなわち、腫瘍）から樹立された種々のヒト細胞株から単離されたＲＮＡ／ｃＤＮＡを含む、９６ウェルプレート（通常、２つのコントロールウェル、９４の試験サンプル）である。これらの細胞株は、それらの腫瘍形成能、転移可能性、薬物耐性、侵襲性可能性および他の癌関連特性に関して、学術研究機関および商業部門の両方の研究者によって広く特徴付けられてきた。これらは、抗癌剤および有望な治療ストラテジーの臨床前評価のための適切な道具として役立つ。これらの種々のヒト癌細胞株由来のＲＮＡが、国立癌研究所（ＵＳＡ）の発症治療部門（ＤＴＢ）から単離および獲得された。それらの生物学的行動、遺伝子発現、および種々の細胞障害性薬剤に対する耐性に関する基本的情報は、ＤＴＢ（ｈｔｔｐ：／／ｄｔｐ．ｎｃｉ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）によって提供される。
【０３２８】
さらに、ＲＮＡ／ｃＤＮＡを、死亡した高齢者または急死した犠牲者（事故など）に対して行なわれたヒト剖検由来の種々のヒト組織から獲得した。これらの組織が疾患のないことを確認した。ならびにＣｌｏｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．、Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、およびＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのような種々の高品質の販売元から購入した。
【０３２９】
すべてのサンプルからのＲＮＡ完全性は、ガイドとしての２８ｓおよび１８ｓリボソームＲＮＡ染色強度比率（２：１〜２．５：１　２８ｓ：１８ｓ）および変性産物の指標となる低分子量ＲＮＡの非存在を確認するアガロースゲル電気泳動の視覚的評価によって、品質について制御される。
【０３３０】
パネル２は、国立癌研究所の共同ヒト組織ネットワーク（ＣＨＴＮ）または国立疾病研究所（ＮＤＲＩ）と密接に協力した外科医の作業によって獲得されたヒト組織から単離されたＲＮＡ／ｃＤＮＡを含む９６ウェルプレート（通常、２つのコントロールウェル、９４の試験サンプル）である。獲得された組織は、ヒト悪性腫瘍に由来し、そして、この場合に多数の悪性組織が「調和したマージン（ｍａｔｃｈｅｄ　ｍａｒｇｉｎｓ）」を有することを示した。この腫瘍組織および「調和したマージン」は、２人の独立した病理学者（外科的病理学者および再びＮＤＲＩまたはＣＨＴＮの病理学者）によって評価された。この分析は、腫瘍分化グレードの全体の組織病理学的評価を提供する。さらに、大部分のサンプルは、患者の臨床学的段階に関する情報を提供する本来の外科的病理学報告を含む。これらの調和したマージンは、手術区域の周囲の組織（すなわち、すぐ近接）から採取される（正常な隣接組織について、「ＮＡＴ」と命名される）。さらに、ＲＮＡまたはｃＤＮＡを、死亡した高齢者または急死した犠牲者（事故など）に対して行なわれたヒト剖検由来の種々のヒト組織から獲得した。これらの組織が疾患のないことを確認し、そしてＣｌｏｎｔｅｃｈ，Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、およびＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのような種々の高品質の販売元から購入した。
【０３３１】
再び、全てのサンプルからのＲＮＡ完全性を、ガイドとして２８Ｓおよび１８ＳｒＲＮＡ染色強度比率（２：１〜２．５：１　２８Ｓ：１８Ｓの比）を使用し、そして変性産物の指標となる低分子量ＲＮＡの非存在を確認することによって、アガロースゲル電気泳動の視覚的評価によって、品質について制御した。単一のエキソンの長さにわたって増幅するように設計されたプローブおよびプライマーセットを使用して、逆転写酵素の非存在下で、反応物の泳動によってゲノムＤＮＡ混入について、サンプルを品質制御した。
【０３３２】
パネル１を利用する以下のＭＥＭ７配列（国際識別番号ＡＣ０１８６５３＿Ａ）のＲＴＱ　ＰＣＲを、表５において指定されるプライマー−プローブセットＡｇ１３８７を使用して、表６に示した。
【０３３３】
【表５】
2004509602.tif 000008
【０３３４】
【表６】
2004509602.tif 000009
さらに、配列ＭＥＭ７の発現をまた、パネル２の同じプライマー−プローブセットＡｇ１３８７を使用して評価した。結果を表７に示す。
【０３３５】
【表７】
2004509602.tif 000010
ＭＥＭ７についての結果は、正常な腎臓および肺組織、および全てではないが特定の腫瘍について、これらの器官における特定の腫瘍に隣接する正常な組織において、主に発現されることを示す。これらの結果は、ＭＥＭ７が、癌性組織から正常な組織を識別するために使用され得ることを示唆する。
【０３３６】
（他の実施形態）
本発明を、その詳細な説明と共に記載してきたが、前述の説明は、例示であり、かつ添付の特許請求の範囲によって規定される本発明の範囲を限定しないということが意図される。他の局面、利点および改変は、上述の特許請求の範囲内にある。
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は、本発明の７回膜貫通受容体様タンパク質のヌクレオチド配列［配列番号１］を示す。開始コドンおよび終止コドンは、ボールドフォントで示される。
【図２】
図２は、図１に示されるコード配列によってコードされるアミノ酸配列［配列番号２］を示す。
【図３】
図３は、核酸配列［配列番号１］を導くＢＬＡＳＴＮ識別サーチを示す。
【図４】
図４は、アミノ酸配列［配列番号２］についてのＢＬＡＳＴＸ識別サーチを示す。
【図５】
図５は、アミノ酸配列［配列番号２］についてのＢＬＡＳＴＰ識別サーチを示す。
【図６】
図６は、アミノ酸配列［配列番号２］のＣｌｕｓｔａｌＷアライメントを示す。
【図７】
図７は、本発明のグルタミン酸受容体改変体（２１６５９２５９ＥＸＴ１）をコードする配列［配列番号３］を含む、ヌクレオチド配列を示す。開始コドンおよび終止コドンは、ボールドフォントで示される。
【図８】
図８は、図７に示される２１６５９２５９ＥＸＴ１のコード配列によってコードされるアミノ酸配列［配列番号４］を示す。
【図９】
図９は、改変体２１６５９２５９ＥＸＴ１の核酸配列［配列番号３］を導くＢＬＡＳＴＮ識別サーチを示す。
【図１０】
図１０は、改変体２１６５９２５９ＥＸＴ１のアミノ酸配列［配列番号４］についてのＢＬＡＳＴＸ識別サーチを示す。
【図１１】
図１１は、改変体２１６５９２５９ＥＸＴ１のＣｌｕｓｔａｌＷアライメントを示す。
【図１２】
図１２は、本発明のグルタミン酸受容体改変体（２１６５９２５９ＥＸＴ２）をコードする配列［配列番号５］を含む、ヌクレオチド配列を示す。
【図１３】
図１３は、図１２の２１６５９２５９ＥＸＴ２のコード配列によってコードされるアミノ酸配列［配列番号６］を示す。
【図１４】
図１４は、改変体２１６５９２５９ＥＸＴ２の核酸配列［配列番号５］を導くＢＬＡＳＴＮ識別サーチを示す。
【図１５】
図１５は、改変体２１６５９２５９ＥＸＴ２のアミノ酸配列［配列番号６］についてのＢＬＡＳＴＸ識別サーチを示す。
【図１６】
図１６は、改変体２１６５９２５９ＥＸＴ２のＣｌｕｓｔａｌＷアライメントを示す。
【図１７】
図１７は、本発明のグルタミン酸受容体改変体（２１６５９２５９ＥＸＴ３）をコードする配列［配列番号７］を含む、ヌクレオチド配列を示す。
【図１８】
図１８は、図１７に示される２１６５９２５９ＥＸＴ３のコード配列によってコードされるアミノ酸配列［配列番号８］を示す。
【図１９】
図１９は、改変体２１６５９２５９ＥＸＴ３の核酸配列［配列番号７］を導くＢＬＡＳＴＮ識別サーチを示す。
【図２０】
図２０は、改変体２１６５９２５９ＥＸＴ３のアミノ酸配列［配列番号８］についてのＢＬＡＳＴＸ識別サーチを示す。
【図２１】
図２１は、改変体２１６５９２５９ＥＸＴ３のＣｌｕｓｔａｌＷアライメントを示す。
【図２２】
図２２は、本発明のグルタミン酸受容体の３つのスプライス改変体のＣｌｕｓｔａｌＷアライメントを示す。
【図２３】
図２３は、本発明のカリウムチャネルタンパク質のヌクレオチド配列［配列番号９］を示す。開始コドンの５’側の推定の翻訳されない領域は、下線で示されるが、開始コドンおよび終止コドンがボールドフォントで示される。
【図２４】
図２４は、図２３に示されるコード配列によってコードされるアミノ酸配列［配列番号１０］を示す。
【図２５】
図２５は、本発明のタンパク質［配列番号１０］についてのＢＬＡＳＴＸ識別サーチを示す。
【図２６】
図２６は、本発明のフォスファターゼ１様タンパク質をコードする配列［配列番号１１］を含むヌクレオチド配列を示す。開始コドンの５’側および終止コドンの３’側の推定の翻訳されない領域は、下線で示され、そして開始コドンおよび終止コドンがボールドフォントで示される。
【図２７】
図２７は、図２６で示されるコード配列によってコードされるアミノ酸配列［配列番号１２］を示す。
【図２８】
図２８は、本発明のフォスファターゼ１様タンパク質をコードする核酸配列についてのＢＬＡＳＴＮ識別サーチを示す。
【図２９】
図２９は、本発明のフォスファターゼ１様タンパク質についてのＢＬＡＳＴＸ識別サーチを示す。
【図３０】
図３０は、本発明のフォスファターゼ１様タンパク質のＣｌｕｓｔａｌＷアライメントを示す。
【図３１】
図３１は、本発明の、レチノール結合タンパク質に似たタンパク質をコードする配列を含む、ヌクレオチド配列［配列番号１３］を示す。開始コドンの５’側および終止コドンの３’側の推定の翻訳されない領域は、下線で示され、そして開始コドンおよび終止コドンがボールドフォントで示される。
【図３２】
図３２は、図３１で示されるコード配列によってコードされるアミノ酸配列［配列番号１４］を示す。
【図３３】
図３３は、図３２に示される本発明のレチノール結合様タンパク質についてのＢＬＡＳＴＸ識別サーチを示す。
【図３４】
図３４は、本発明の、レチノール結合タンパク質に似たタンパク質をコードする配列を含む、ヌクレオチド配列［配列番号１５］を示す。
【図３５】
図３５は、図３４で示されるコード配列によってコードされるアミノ酸配列［配列番号１６］を示す。
【図３６】
図３６は、図３５で示される本発明のレチノール結合様タンパク質についてのＢＬＡＳＴＰ識別サーチを示す。
【図３７】
図３７は、図３５で示される本発明のレチノール結合様タンパク質のＣｌｕｓｔａｌＷアライメントを示す。
【図３０】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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