(57)【要約】本発明は、個体の表現型プロフィールに基づいた個別治療に関する。より詳細には、本発明は、薬物アモナフィドを用いた個別処置のための代謝表現型の使用に関する。本発明の別の目的は、薬物アモナフィドを用いた処置の個別化のための方法を提供することである。本発明の別の目的は、複数決定基の代謝表現型を使用して、Ｎ−（アリール置換）−ナフタリドイミド化合物のクラスの個体に対する処置レジメンを個別化する方法を提供することであり、ここで、個体の複数決定基の代謝表現型が、決定され；そしてＮ−（アリール置換）−ナフタリドイミド化合物のクラスの安全かつ治療的に有効な用量が、個体の複数決定基の代謝表現型に基づいて決定されそして／または選択される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｎ−（アリール置換）−ナフタリドイミド化合物のクラスについての複数決定基の代謝表現型を特徴付けるためのキットであって、ここで、多数の表現型決定基が、それぞれの代謝特徴に対応するものとして同定され；
該キットは、以下：
ａ）該Ｎ−（アリール置換）−ナフタリドイミド化合物のクラスについての代謝経路に特異的なプローブ基質；
ｂ）該プローブ基質に応答した、生物学的サンプル中の該代謝経路の代謝産物を検出するための手段；および
ｃ）検出された代謝産物に基づいて、該複数決定基の代謝表現型のそれぞれの表現型決定基を特徴付けるための手段、
を備える、キット。
【請求項２】
前記Ｎ−（アリール置換）−ナフタリドイミド化合物のクラスがアモナフィドを含む、請求項１に記載のキット。
【請求項３】
ｂ）の後に
ｉ）前記生物学的サンプル中の前記代謝経路の各々について、それぞれの検出された代謝産物の比率を定量するための手段、
をさらに含む、請求項２に記載のキット。
【請求項４】
前記比率が、濃度比、モル比、キラル比、曲線下面積の比、およびシグナルピークの高さの比からなる群より選択される、請求項３に記載のキット。
【請求項５】
前記プローブ基質が前記代謝経路によって代謝されることが公知の少なくとも１つのプローブ基質である、請求項１に記載のキット。
【請求項６】
前記プローブ基質が前記代謝経路のインデューサーまたはインヒビター以外である、請求項５に記載のキット。
【請求項７】
前記手段ｂ）および／またはｃ）が、前記代謝産物の各々に特異的な親和性複合体化因子を含む、請求項１または３に記載のキット。
【請求項８】
前記親和性複合体化因子が抗体である、請求項７に記載のキット。
【請求項９】
前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項８に記載のキット。
【請求項１０】
前記抗体がポリクローナル抗体である、請求項８に記載のキット。
【請求項１１】
前記親和性複合体化因子が分子インプリントされたポリマーである、請求項７に記載のキット。
【請求項１２】
前記親和性複合体化因子がアプタマーである、請求項７に記載のキット。
【請求項１３】
前記親和性複合体化因子がレセプターである、請求項７に記載のキット。
【請求項１４】
前記親和性複合体化因子がアンチカリンである、請求項７に記載のキット。
【請求項１５】
リガンド結合アッセイを実施するための手段をさらに含む、請求項７に記載のキット。
【請求項１６】
請求項１５に記載のキットであって、ここで、前記リガンド結合アッセイが、イムノアッセイ、酵素結合イムノソルベント検定法（ＥＬＩＳＡ）、マイクロアレイ形式のイムノアッセイ、およびマイクロアレイ形式のＥＬＩＳＡからなる群より選択される、キット。
【請求項１７】
前記リガンド結合アッセイが高速イムノアッセイ（ディップスティックアッセイ）である、請求項１５に記載のキット。
【請求項１８】
前記高速イムノアッセイが、高速分析物測定プラットホーム（ＲＡＭＰ）技術に基づく、請求項１７に記載のキット。
【請求項１９】
前記高速イムノアッセイが、発光イムノアッセイ技術に基づく、請求項１７に記載のキット。
【請求項２０】
前記リガンド結合アッセイが、バイオセンサーを用いて実施される、請求項１５に記載のキット。
【請求項２１】
前記バイオセンサーが、イムノセンサーである、請求項２０に記載のキット。
【請求項２２】
前記バイオセンサーの検出手段が電気化学センサーである、請求項２０に記載のキット。
【請求項２３】
前記バイオセンサーの検出手段が光学センサーである、請求項２０に記載のキット。
【請求項２４】
前記バイオセンサーの検出手段が微重量測定センサーである、請求項２０に記載のキット。
【請求項２５】
前記微重量測定センサーが水晶微量天秤（ＱＣＭ）である、請求項２４に記載のキット。
【請求項２６】
請求項１に記載のキットであって、前記手段ｂ）が定性検出装置を含む、キット。
【請求項２７】
請求項１に記載のキットであって、ここで、前記複数決定基の多数の表現型決定基の各々が、酵素特異的決定基である、キット。
【請求項２８】
請求項２７に記載のキットであって、ここで、複数決定基の代謝表現型が、少なくとも１つの薬物代謝酵素についての個体の代謝能力の指標である少なくとも１つの決定基を含む、キット。
【請求項２９】
前記少なくとも１つの薬物代謝酵素がＮ−アセチルトランスフェラーゼ−２（ＮＡＴ２）である、請求項２８に記載のキット。
【請求項３０】
前記少なくとも１つの薬物代謝酵素がＣＹＰ１Ａ２をさらに含む、請求項２９に記載のキット。
【請求項３１】
請求項３０に記載のキットであって、ここで、前記少なくとも１つの薬物代謝酵素が、Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ−１（ＮＡＴ−１）、ＣＹＰ２Ｄ６、ＣＹＰ２Ａ６、ＣＹＰ２Ｅ１、ＣＹＰ３Ａ４、ＣＹＰ２Ｃ９、ＣＹＰ２Ｃ１９、ＵＧＴ、ＧＳＴ、およびＳＴからなる群より選択される少なくとも１つの薬物代謝酵素をさらに含む、キット。
【請求項３２】
請求項３に記載のキットであって、ここで、前記ａ）が、複数のプローブ基質を含み、そして各プローブ基質は、少なくとも１つの目的の代謝経路に特異的である、キット。
【請求項３３】
請求項１に記載のキットであって、以下：
ｄ）前記Ｎ−（アリール置換）−ナフタリドイミド化合物のクラスの毒性または効力に影響を与えることが公知の薬物クリアランスに関する少なくとも１つの決定基を測定するための手段をさらに含み；ここで、該少なくとも１つの決定基を、少なくともプローブ基質代謝の速度と一緒に考慮して、個体に投与される該Ｎ−（アリール置換）−ナフタリドイミド化合物のクラスの非毒性量および有効量を決定する、キット。
【請求項３４】
請求項３３に記載のキットであって、ここで、前記薬物クリアランスに関する少なくとも１つの決定基が、前記個体の体表面積または前記個体の肝臓酵素レベルに基づく、キット。
【請求項３５】
請求項１に記載のキットであって、以下：
ｄ）前記Ｎ−（アリール置換）−ナフタリドイミド化合物のクラスの毒性または効力に影響を与えることが公知の薬物感受性に関する少なくとも１つの決定基を測定するための手段をさらに含み；ここで、該薬物感受性に関する少なくとも１つの決定基を、少なくともプローブ基質代謝の速度と一緒に考慮して、個体に投与される該Ｎ−（アリール置換）−ナフタリドイミド化合物のクラスの非毒性量および有効量を決定する、キット。
【請求項３６】
請求項３５に記載のキットであって、ここで、前記薬物感受性に関する少なくとも１つの決定基が、前記個体の白血球数（ＷＢＣ）に基づく、キット。
【請求項３７】
前記Ｎ−（アリール置換）−ナフタリドイミド化合物のクラスが、アモナフィドを含む、請求項３６に記載のキット。
【請求項３８】
請求項３４に記載のキットであって、以下：
ｅ）前記Ｎ−（アリール置換）−ナフタリドイミド化合物のクラスの毒性または効力に影響を与えることが公知の薬物感受性に関する少なくとも１つの決定基を測定するための手段をさらに含み；ここで、該薬物感受性に関する少なくとも１つの決定基を、少なくともプローブ基質代謝の速度と一緒に考慮して、個体に投与される該Ｎ−（アリール置換）−ナフタリドイミド化合物のクラスの非毒性量および有効量を決定する、キット。
【請求項３９】
請求項３８に記載のキットであって、ここで、前記薬物感受性に関する少なくとも１つの決定基が、前記個体の白血球数（ＷＢＣ）に基づく、キット。
【請求項４０】
前記Ｎ−（アリール置換）−ナフタリドイミド化合物のクラスが、アモナフィドを含む、請求項３９に記載のキット。
【請求項４１】
個体についてのＮ−（アリール置換）−ナフタリドイミド化合物のクラスの個別処置レジメンのためのシステムであって、
該個体の複数決定基の代謝表現型を決定するための手段；ならびに
該個体の複数決定基の代謝表現型に基づく、Ｎ−（アリール置換）−ナフタリドイミド化合物の安全性および治療有効量を決定および／または選択するための手段、
を含む、システム。
【請求項４２】
前記Ｎ−（アリール置換）−ナフタリドイミド化合物のクラスが、アモナフィドを含む、請求項４１に記載のシステム。
【請求項４３】
前記複数決定基の代謝表現型を決定するための手段が、請求項１〜４０に記載のキットである、請求項４２に記載のシステム。
【請求項４４】
Ｎ−（アリール置換）−ナフタリドイミド化合物のクラスを用いて処置可能な状態を有する個体についての、安全かつ治療有効量を決定するためのキットであって、該キットは、以下：
ａ）該個体の複数決定基の代謝表現型を決定するための手段；および
ｂ）該複数決定基の代謝表現型によって示された該Ｎ−（アリール置換）−ナフタリドイミドのクラスについての該個体の代謝表現型に対応する、該個体の代謝プロフィールに基づいて、該個体についてのＮ−（アリール置換）−ナフタリドイミド化合物の安全かつ治療有効量を決定するための手段、
を含む、キット。
【請求項４５】
前記Ｎ−（アリール置換）−ナフタリドイミド化合物のクラスがアモナフィドを含む、請求項４４に記載のキット。
【請求項４６】
前記複数決定基の代謝表現型を決定するための手段が、請求項１〜４０のいずれか１項に記載のキットである、請求項４５に記載のキット。
【請求項４７】
個体の代謝表現型プロフィールを提供するためのアッセイシステムであって、該アッセイは、以下：
ａ）生物学的サンプルを受けるための手段であって、該手段は、該手段中に含まれる多数の親和性複合体化因子を含み、該サンプルは、Ｎ−（アリール置換）−ナフタリドイミド化合物のクラスについての既知量の少なくとも１つのプローブ基質を用いて処置された個体から得られ、該プローブ基質は、代謝産物の代謝経路に特異的である、手段；
ｂ）該親和性複合体化因子に結合した該酵素特異的代謝産物の存在を決定するための手段；および
ｃ）該代謝産物の比率を定量して、対応する表現型決定基を提供するための手段、
を含み、
ここで、該表現型決定基は、該個体の代謝表現型プロフィールを提供する、
アッセイシステム。
【請求項４８】
前記Ｎ−（アリール置換）−ナフタリドイミド化合物のクラスがアモナフィドを含む、請求項４７に記載のアッセイシステム。
【請求項４９】
前記プローブ基質が前記代謝経路のインデューサーまたはインヒビター以外である、請求項４８に記載のアッセイシステム。
【請求項５０】
前記アッセイがリガンド結合アッセイである、請求項４９に記載のアッセイシステム。
【請求項５１】
請求項５０に記載のアッセイシステムであって、ここで、前記リガンド結合アッセイが、イムノアッセイ、酵素結合イムノソルベント検定法（ＥＬＩＳＡ）、マイクロアレイ形式のイムノアッセイ、およびマイクロアレイ形式のＥＬＩＳＡからなる群より選択される、アッセイシステム。
【請求項５２】
請求項５１に記載のアッセイシステムであって、前記生物学的サンプルを受ける手段が、前記多数の親和性複合体化因子を各ウェルに含むマルチウェルマクロプレートである、アッセイシステム。
【請求項５３】
前記多数の親和性複合体化因子がアッセイベースの形式において各ウェルに結合する、請求項５２に記載のアッセイシステム。
【請求項５４】
前記結合因子に結合する前記代謝産物の存在を検出するための前記手段が、電荷結合デバイス（ＣＣＤ）画像である、請求項５３に記載のアッセイシステム。
【請求項５５】
前記代謝産物の比率を定量するための前記手段が、濃度計である、請求項４７に記載のアッセイシステム。
【請求項５６】
Ｎ−（アリール置換）−ナフタリドイミド化合物のクラスを用いた処置の個別化のためのシステムであって、該システムは、以下：
ａ）表現型決定基を同定するために、酵素特異的アッセイを、該Ｎ−（アリール置換）−ナフタリドイミド化合物のクラスについてのプローブ基質を用いて処置された個体から得られた生物学的サンプルにおいて実施するための手段；
ｂ）該決定基に従って薬物代謝の速度を決定するための手段；
を含み、
ここで、該個体についての該Ｎ−（アリール置換）−ナフタリドイミド化合物のクラスの安全かつ治療有効量が、該速度に基づいて決定および／または選択される、システム。
【請求項５７】
前記アッセイが請求項４７に従う、請求項５６に記載のシステム。
【請求項５８】
前記Ｎ−（アリール置換）−ナフタリドイミド化合物のクラスがアモナフィドを含む、請求項５７に記載のシステム。
【請求項５９】
請求項５８に記載のシステムであって、ここで、前記酵素特異的アッセイが、イムノアッセイ、酵素結合イムノソルベント検定法（ＥＬＩＳＡ）、マイクロアレイ形式のイムノアッセイ、およびマイクロアレイ形式のＥＬＩＳＡからなる群より選択される、システム。
【請求項６０】
請求項５９に記載のシステムであって、ここで、前記薬物代謝の速度が、表現型決定基の比率に対応し、該表現型決定基が、酵素特異的決定基である、システム。
【請求項６１】
請求項６０に記載のシステムであって、ここで、前記比率が、濃度比、モル比、キラル比、曲線下面積の比、およびシグナルピークの高さの比からなる群より選択される、システム。
【請求項６２】
前記表現型決定基が、Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ−２（ＮＡＴ２）についての表現型決定基を含む、請求項６１に記載のシステム。
【請求項６３】
前記表現型決定基が、ＮＡＴ２およびＣＹＰ１Ａ２についての表現型決定基を含む、請求項６２に記載のシステム。
【請求項６４】
請求項６３に記載のシステムであって、ここで、前記表現型決定基が、Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ−１（ＮＡＴ１）、ＣＹＰ２Ａ６、ＣＹＰ２Ｄ６、ＣＹＰ２Ｅ１、ＣＹＰ３Ａ４、ＣＹＰ２Ｃ９、ならびにＣＹＰ２Ｃ１９、ＵＧＴ、ＧＳＴ、およびＳＴのうちの任意の１つ以上についての表現型決定基をさらに含む、システム。
【請求項６５】
Ｎ−（アリール置換）−ナフタリドイミド化合物のクラスの治療効果を評価する薬物処置試験に参加するための多数の個体を選択するためのキットであって、該キットは、以下：
ａ）該Ｎ−（アリール置換）−ナフタリドイミド化合物のクラスについての複数決定基の代謝表現型を特徴付けるための手段；および
ｂ）該Ｎ−（アリール置換）−ナフタリドイミド化合物のクラスを代謝するのに有効であると特徴付けられた代謝表現型を有する個体を選択するための手段、を含む、キット。
【請求項６６】
前記Ｎ−（アリール置換）−ナフタリドイミド化合物のクラスが、アモナフィドを含む、請求項６５に記載のキット。
【請求項６７】
前記複数決定基の代謝表現型が、請求項１〜４０に記載のキットに従って決定される、請求項６６に記載のキット。
【請求項６８】
Ｎ−（アリール置換）−ナフタリドイミド化合物のクラスを用いた処置のために多数の個体を選択するためのキットであって、該キットは、以下：
ａ）該Ｎ−（アリール置換）−ナフタリドイミド化合物のクラスの毒性を促進することが公知の少なくとも１つの対立遺伝子バリエーションを欠く個体を同定するために、該個体を遺伝子型決定するための手段；および
ｂ）該Ｎ−（アリール置換）−ナフタリドイミド化合物のクラスを代謝するのに有効であると特徴付けられた代謝表現型を有する個体を選択するための手段、を含む、キット。
【請求項６９】
前記Ｎ−（アリール置換）−ナフタリドイミド化合物のクラスが、アモナフィドを含む、請求項６８に記載のキット。
【請求項７０】
前記少なくとも１つの対立遺伝子バリエーションを欠く前記個体の各々に投与される前記Ｎ−（アリール置換）−ナフタリドイミド化合物のクラスの安全かつ治療有効量を決定するための手段をさらに含む請求項６８に記載のキットであって、該有効量は、該Ｎ−（アリール置換）−ナフタリドイミド化合物のクラスを代謝することが公知の少なくとも１つの酵素に特異的な表現型決定基によって決定される場合に、個体特異的な薬物代謝速度に対応する、キット。
【請求項７１】
前記Ｎ−（アリール置換）−ナフタリドイミド化合物のクラスが、アモナフィドを含む、請求項７０に記載のキット。
【請求項７２】
請求項７１に記載のキットであって、ここで、前記代謝表現型を特徴付ける手段が、前記Ｎ−（アリール置換）−ナフタリドイミド化合物のクラスを代謝することが公知の前記少なくとも１つの酵素に対して特異的なリガンド結合アッセイを含む、キット。
【請求項７３】
前記Ｎ−（アリール置換）−ナフタリドイミド化合物のクラスが、アモナフィドを含む、請求項７２に記載のキット。
【請求項７４】
請求項７３に記載のキットであって、ここで、前記リガンド結合アッセイが、イムノアッセイ、酵素結合イムノソルベント検定法（ＥＬＩＳＡ）、マイクロアレイ形式のイムノアッセイ、およびマイクロアレイ形式のＥＬＩＳＡからなる群より選択される、キット。
【請求項７５】
前記薬物代謝速度が、少なくともＮＡＴ２酵素についての表現型決定基の比率に対応する、請求項７４に記載のキット。
【請求項７６】
請求項７５に記載のキットであって、ここで、前記比率が、濃度比、モル比、キラル比、曲線下面積の比、およびシグナルピークの高さの比からなる群より選択される、キット。
【請求項７７】
請求項７６に記載のキットであって、ここで、前記リガンド結合アッセイが、以下の酵素：ＣＹＰ１Ａ２、ＮＡＴ１、ＣＹＰ２Ａ６、ＣＹＰ２Ｄ６、ＣＹＰ２Ｅ１、ＣＹＰ３Ａ４、ＣＹＰ２Ｃ９、およびＣＹＰ２Ｃ１９、ＵＧＴ、ＧＳＴ、およびＳＴのうちの少なくとも１つのについての表現型決定基を決定するための手段をさらに提供する、キット。
【請求項７８】
候補薬物処置の治療効果を評価する薬物処置試験に参加するための多数の個体を選択するためのキットであって、該キットは、以下：
ａ）該薬物の毒性を促進することが公知の少なくとも１つの対立遺伝子バリエーションを欠く個体を同定するために、該個体の各々を遺伝子型決定するための手段；および
ｂ）各個体の該薬物を代謝する能力を決定するために、ａ）の該同定された個体の、複数決定基の代謝表現型を特徴付けるための手段、
を含む、キット。
【請求項７９】
前記薬物が、Ｎ−（アリール置換）−ナフタリドイミド化合物のクラスを含む、請求項７８に記載のキット。
【請求項８０】
前記Ｎ−（アリール置換）−ナフタリドイミド化合物のクラスが、アモナフィドを含む、請求項７９に記載のキット。
【請求項８１】
前記複数決定基の代謝表現型が、少なくとも１つの薬物代謝酵素についての個体の代謝能力の指標である少なくとも１つの決定基を含む、請求項８０に記載のキット。
【請求項８２】
請求項８１に記載のキットであって、ここで、前記少なくとも１つの薬物代謝酵素が、Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ−１（ＮＡＴ１）、Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ−２（ＮＡＴ２）、ＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ２Ａ６、ＣＹＰ２Ｄ６、ＣＹＰ２Ｅ１、ＣＹＰ３Ａ４、ＣＹＰ２Ｃ９、ＣＹＰ２Ｃ１９、ＵＧＴｓ、ＧＳＴｓ、およびＳＴからなる群より選択される、キット。
【請求項８３】
前記薬物代謝の速度が、前記少なくとも１つの酵素についての前記表現型決定基の比率に対応する、請求項８２に記載のキット。
【請求項８４】
前記比率が、濃度比、モル比、キラル比、曲線下面積の比、およびシグナルピークの高さの比からなる群より選択される、請求項８３に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の背景）
（ａ）発明の分野
本発明は、治療の個別化に関連する。より詳細には、本発明は、薬物アモナフィドを用いる個別化した処置における代謝表現型決定（ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｎｇ）の使用に関する。
【０００２】
（ｂ）先行技術の説明
先行技術の説明
ヒトに投与される薬物（または生体異物）の大部分に関して、これらの運命は、より低毒性でありかつ親油性の形態に肝臓で代謝され、引続き尿中に排出されることである。これらの代謝は、連続して作用する２つの系（第Ｉ相および第ＩＩ相）を包含する：第Ｉ相の酵素として、酸化反応を触媒する少なくとも２０の酵素を含むシトクロムＰ４５０系、ならびにカルボキシルエキストラーゼ（ｃａｒｂｏｘｙｌｅｘｔｅｒａｓｅ）、アミダーゼ（ａｍｉｄａｓｅ）、エポキシドヒドロラーゼ、キニーネレダクターゼ、アルコールデヒドロゲナーゼおよびアルデヒドデヒドロゲナーゼ、キサンチンオキシダーゼ、ならびにフラビン含有モノオキシゲナーゼが挙げられる。これらの酵素は、ミクロソーム画分中に局在化する。第ＩＩ相の酵素として、Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ（ＮＡＴ）、ＵＤＰ−グルコロニルトランスフェラーゼ（ＵＧＴ）、スルホトランスフェラーゼ（ＳＵＴ）、およびグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）を含む少なくとも５つの酵素を含む抱合系が挙げられる。複雑なヒト薬物代謝系の詳細な説明は、ＫｕｍａｒおよびＳｕｒａｐａｎｅｎｉ（Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｒｅｓ．Ｒｅｖ．（２００１）２１（５）：３９７−４１１および特許出願ＷＯ  ０１／５９１２７  Ａ２）に提供される。
【０００３】
薬物の代謝およびその身体を介する動態（薬物動態学）は、その効果、毒性、および他の薬物との相互作用を決定することにおいて重要である。薬物動態学を支配する３つのプロセスは、薬物の吸収、種々の組織への分布、薬物代謝産物の消失である。種々の代謝の改変が、薬物の物理化学的および薬理学的性質（溶解性、レセプターへの結合、および排出速度を含む）の大部分を変えるので、これらのプロセスは、薬物代謝に深く関わっている。薬物を改変する代謝経路はまた、種々の天然に存在する基質（例えば、ステロイド、脂肪酸、プロスタグランジン、ロイコトリエン、およびビタミン）を受容する。これらの経路における酵素は、従って、天然の化合物、薬物、発癌物質、変異誘発物質、および生体異物間の生化学的および薬理学的相互作用の重要な部位である。
【０００４】
薬物代謝における遺伝的な差異が、個体間の薬物の効力および毒性のレベルの顕著な差異をもたらすと長い間考えられてきた。狭い治療的指標を有する薬物または生理活性化を必要とする薬物（例えば、コデイン）について、これらの多型性は、重要であり得る。さらに、有望な新規薬物が、臨床試験において標的グループ中の個体のセグメントのみに影響し得る毒性に基いて、しばしば排除される。薬物遺伝学（ｐｈａｍａｃｏｇｅｎｏｍｉｃｓ）研究における進歩（この研究の中で、薬物代謝酵素は、重要な部分を構成する）は、薬物の効力および毒性の問題に対して発揮され得る手段および情報を広げることを約束する（Ｅｖａｎｓ、Ｗ．Ｅ．およびＲ．Ｖ．Ｒｅｌｌｉｎｇ（１９９９）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８６：４８７−４９１を参照のこと）。
【０００５】
薬物代謝反応は、第Ｉ相としてカテゴリー化され、薬物分子を官能化し、そしてさらなる代謝のために準備する。第ＩＩ相は抱合性である。一般的に、第Ｉ相反応の産物は、部分的にまたは完全に不活性であり、第ＩＩ相反応の産物は、排出される主要な種である。しかし、第Ｉ相反応の産物は、最初に投与された薬物よりも、しばしば反応性である；この代謝活性化の原理は、プロドラッグ（例えば、Ｌ−ドーパ）によって利用される。さらに、いくつかの無毒の化合物（例えば、アトラトキシン（ａｔｌａｔｏｘｉｎ）、ベンゾ［ａ］ピレン）は、これらの経路を介して毒性の中間体に代謝される。通常、第Ｉ相反応は、薬物代謝において律速である。化合物または他の化合物への曝露の前に、第Ｉ相の酵素の発現を誘導し得るが、これにより、代謝経路を介する基質の流れが増加する（Ｋｌａｓｓｅｎ，Ｃ．Ｄ．、Ａｍｄｕｒ，Ｍ．Ｏ．およびＪ．Ｄｏｕｌｌ（１９９６）、Ｃａｓａｒｅｔｔ  ａｎｄ  Ｄｏｕｌｌ’ｓ  Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ：Ｔｈｅ  Ｂａｓｉｃ  Ｓｉｅｎｃｅ  ｏｆ  Ｐｏｉｓｏｎｓ、ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ＮＹ、１１３−１８６頁；Ｋａｔｚｕｎｇ，Ｂ．Ｇ．（１９９５）、Ｂａｓｉｃ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ、Ａｐｐｌｅｔｏｎ  ａｎｄ  Ｌａｎｇｅ、Ｎｏｒｗａｌｋ、ＣＴ、４８−５９頁；Ｇｉｂｓｏｎ，Ｇ．Ｃ．およびＳｋｅｔｔ，Ｐ．（１９９４）、Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｄｕｇ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ、Ｂｌａｃｋｉｅ  Ａｃａｄｅｍｃ  ａｎｄ  Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ、Ｌｏｎｄｏｎを参照のこと）。
【０００６】
薬物代謝酵素（ＤＭＥ）は、広範な基質特異性を有する。これは、多数のそして種々の抗体集団が、これらの抗原について高度に特異的である免疫系と対照され得る。広範で種々の分子を代謝するＤＭＥの能力は、代謝レベルでの薬物相互作用についての可能性を生じる。例えば、１つの化合物によるＤＭＥの誘導は、酵素による別の化合物の代謝に影響し得る。
【０００７】
ＤＭＥは、それらが触媒する反応の型および関与する補酵素に従って分類されてきた。第Ｉ相の酵素の主要なクラスとして、シトクロムＰ４５０およびフラビン含有モノオキシゲナーゼが挙げられるが、これらに限定されない。第Ｉ相型触媒サイクルおよび反応に関連する酵素の他のクラスとして、ＮＡＤＰＨシトクロム４５０レダクターゼ（ＣＰＲ）、ミクロソームのシトクロム  ｂ５／ＮＡＤＨシトクロム  ｂ５レダクターゼ系、フェレドキシン／フェレドキシンレダクターゼレドックスペア、アルド／ケトレダクターゼ、およびアルコールデヒドロゲナーゼが挙げられるが、これらに限定されない。第ＩＩ相の酵素の主要なクラスとして、ＵＤＰグルクロニルトランスフェラーゼ、スルホトランスフェラーゼ、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ、Ｎ−アシルトランスフェラーゼ、およびＮ−アセチルトランスフェラーゼが挙げられるが、これらに限定されない。
【０００８】
（シトクロムＰ４５０およびＰ４５０触媒サイクル関連酵素）
酵素のシトクロムＰ４５０スーパーファミリーのメンバーは、種々の基質（天然の化合物（例えば、ステロイド、脂肪酸、プロスタグランジン、ロイコトリエンおよびビタミン）ならびに薬物、発癌物質、変異誘発物質および生体異物を含む）の酸化的代謝を触媒する。シトクロムＰ４５０はまた、ｐ４５０ヘム−チオレートタンパク質として公知であり、通常、多成分電子伝達鎖（ｐ４５０含有モノオキシゲナーゼ系と呼ばれる）における最終的なオキシダーゼとして作用する。触媒される特定の反応として、ヒドロキシル化、エポキシ化、Ｎ−酸化、スルホ酸化、Ｎ−、Ｓ−、および脱アルキル化、脱硫酸化、脱アミノ化、ならびにアゾ、ニトロ、およびＮ−オキシド基の還元が挙げられる。これらの反応は、動物のグルココルチコイド、コルチゾール、エストロゲン、およびアンドロゲンのステロイド生成；昆虫の殺虫剤耐性；植物の除草剤耐性および花着色；ならびに微生物による環境バイオレメディエーションに関連する。薬物、発癌物質、変異誘発物質、および生体異物に対するシトクロムｐ４５０の作用は、解毒、または基質のより毒性産物への変換を生じ得る。シトクロムＰ４５０は、肝臓に豊富に存在するが、他の組織にもまた存在する；この酵素は、ミクロソームに局在する（Ｇｒａｈａｍ−Ｌｏｒｅｎｃｅ，Ｓ．およびＰｅｔｅｒｓｏｎ，Ｊ．Ａ．（１９９６）ＦＡＳＥＢ  Ｊ．１０：２０６−２１４）。
【０００９】
細菌、真菌、植物および動物を含む種々の生物において、４００のシトクロムＰ４５０が同定されている（Ｇｒａｈａｍ−Ｌｏｒｅｎｃｅ、前出）。Ｂ−クラスは、原核生物および真菌において見出されるが、Ｅ−クラスは、細菌、植物、昆虫、脊椎動物、および哺乳動物において見出される。５つのサブクラスまたはグループが、Ｅ−クラスのシトクロムＰ４５０のより大きなファミリー内に見出される。
【００１０】
全てのシトクロムＰ４５０は、ヘム補因子を使用し、そして構造的特性を共有する。ほとんどのシトクロムＰ４５０は、４００〜５３０のアミノ酸長である。この酵素の二次構造は、約７０％のαヘリックスおよび約２２％のベータシートである。タンパク質のＣ−末端部分におけるヘム結合部位周辺の領域は、シトクロムＰ４５０間で保存される。このヘム鉄リガンド領域における１０のアミノ酸サイン配列が同定されており、これは、５番目の配位部位においてヘム鉄を結合することに関連する保存されたシステインを含む。真核生物のシトクロムＰ４５０において、膜貫通領域は、通常、タンパク質の最初の１５〜２０のアミノ酸に見出され、一般的に、約１５の疎水性残基に続く正に荷電した残基からなる（Ｇｒａｈａｍ−Ｌｏｒｅｎｃｅ、前出）。
【００１１】
シトクロムＰ４５０酵素は、細胞増殖および発生に関連する。この酵素は、ＤＮＡとともに、付加物を形成する反応性の中間体に化合物を代謝することによって、化学的変異誘発および発癌誘発において役割を有する（Ｎｅｂｅｒｔ，Ｄ．Ｗ．およびＧｏｎｚａｌｅｚ，Ｆ．Ｊ．（１９８７）、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５６：９４５−９９３）。これらの付加物は、腫瘍形成をもたらすヌクレオチドの変化およびＤＮＡ再配列を引き起こし得る。肝臓および他の組織におけるシトクロムＰ４５０の発現は、生体異物（例えば、多環式芳香族炭水化物、ペルオキシソームの増殖、フェノバルビタール、およびグルココルチコイドデキサメタゾン）によって誘導される（Ｄｏｇｒａ，Ｓ．Ｃ．ら、（１９９８）、Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２５：１−９）。シトクロムＰ４５０タンパク質は、Ｐ４５０遺伝子ＣＹＰ１Ｂ１の変異が、原発性先天性緑内障を引き起こすように、眼の発生に関連する。
【００１２】
シトクロムＰ４５０は、炎症および感染と関連する。肝臓のシトクロムＰ４５０活性は、種々の感染および炎症刺激により大いに影響され、これらのいくつかは、抑制され、そしていくつかは誘導される（Ｍｏｒｇａｎ，Ｅ．Ｔ．（１９９７）、Ｄｒｕｇ  Ｍｅｔａｂ．Ｒｅｖ．２９：１１２９−１１８８）。インビボで観察される効果は、炎症促進性サイトカインおよびインターフェロンによって模倣され得る。２つのシトクロムＰ４５０タンパク質に対する自己抗体は、自己免疫性多発性内分泌腺症−カンジダ症−多胚葉性ジストロフィー（ＡＰＥＣＥＤ）、多腺性自己免疫症候群（ｐｏｌｙｇｌａｎｄｕｌａｒ  ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）を有する個体中で見出された。
【００１３】
シトクロムＰ４５０における変異は、以下に挙げる代謝障害に関連付けられてきた。先天性副腎過形成（ｃｏｎｇｅｎｉｔａｌ  ａｄｒｅｎａｌ  ｈｙｐｅｒｐｌａｓｉａ）、乳児期および幼児期の一般的な副腎疾患のほとんど；プソイドビタミン欠乏くる病；脳腱黄色腫症、進行性神経学的機能障害によって特徴付けられる脂肪貯蔵疾患（ｌｉｐｉｄ  ｓｔｏｒａｔｅ  ｄｉｓｅａｓｅ）、早熟アテローム性動脈硬化（ｐｒｅｍａｔｕｒｅ  ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）、および白内障；ならびに抗凝血性薬物クマリンおよびワルファリンに対する遺伝的耐性（Ｉｓｓｅｌｂａｃｈｅｒ，Ｋ．Ｊ．ら、（１９９４）、Ｈａｒｒｉｓｏｎ’ｓ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｉｎｔｅｒｎａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，Ｉｎｃ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ、１９６８−１９７０頁；Ｔａｋｅｙａｍａ，Ｋ．ら、（１９９７）、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７７：１８２７−１８３０；Ｋｉｔａｎａｋａ，Ｓ．ら、（１９９８）、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３３８：６５３−６６１）。シトクロムＰ４５０タンパク質アロマターゼの非常に高いレベルの発現が、重度の女性化乳房（女性化）を有する少年由来の線維層板肝細胞癌中に見出された（Ａｇａｒｗａｌ，Ｖ．Ｒ．（１９９８）、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｍｅｔａｂ．８３：１７９７−１８００）。
【００１４】
シトクロムＰ４５０触媒サイクルは、ＮＡＤＰＨシトクロムＰ４５０レダクターゼ（ＣＰＲ）によるシトクロムＰ４５０の還元を介して完成される。シトクロムｂ５およびＮＡＤＰＨシトクロムｂ５レダクターゼからなる別のミクロソーム電子伝達系は、シトクロムＰ４５０触媒サイクルへの電子の微量供与体として広く調査されている。しかし、Ｌａｍｂ，Ｄ．Ｃ．ら（１９９９；ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．４６２：２８３−８）による最近の報告は、ミクロソームシトクロム  ｂ５／ＮＡＤＰＨ  シトクロム  ｂ５レダクターゼ系によって効率的に還元および支持され得るＣａｎｄｉａ  ａｌｂｉｃａｎｓのシトクロムＰ４５０（ＣＹＰ５１）を同定する。従って、この代替的な電子ドナー系によって指示される多くのシトクロムＰ４５０が存在するようである。
【００１５】
シトクロムｂ５レダクターゼはまた、赤血球中で酸化されたヘモグロビン（メトヘモグロビン、またはフェリヘモグロビン（これは、酸素を運搬できない））の活性ヘモグロビン（フェロヘモグロビン）への還元を担う。高レベルの酸化剤または効率的に還元されない異常ヘモグロビン（ヘモグロビンＭ）が存在する場合に、メトヘモグロビン血症が起こる。メトヘモグロビン血症はまた、赤血球のシトクロムｂ５レダクターゼにおける遺伝的機能不全からも生じ得る（Ｍａｎｓｏｕｒ，Ａ．およびＬｕｒｅｉ，Ａ．Ａ．（１９９３）、Ａｍ．Ｊ．Ｈｅｍａｔｏｌ．４２：７−１２にレビューされる）。
【００１６】
シトクロムＰ４５０ファミリーのメンバーはまた、ビタミンＤ合成および異化に密接に関連する。ビタミンＤは、２つの生物学的に等価なプロホルモン（植物組織において産生されるエルゴカルシフェロール（ビタミンＤ２）、および動物組織で産生されるコレカルシフェロール（ビタミンＤ３））として存在する。後者の形態、コレカルシフェロールは、７−デヒドロコレステロールの近紫外線（すなわち、２９０−３１０ｎｍ）への曝露によって形成され、通常は、太陽光への皮膚の最小時間の曝露によってさえ、生じる（Ｍｉｌｌｅｒ，Ｗ．Ｌ．およびＰｏｒｔａｌｅ，Ａ．Ａ．（２０００）、Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  １１：３１５−３１９でレビューされる）。
【００１７】
両プロホルモン形態は、肝臓において、酵素、２５−ヒドロキシラーゼによって、２５−ヒドロキシビタミンＤ（２５（ＯＨ）Ｄ）までさらに代謝される。２５（ＯＨ）Ｄは、ビタミンＤを形成する最も豊富な前駆体であり、これは、腎臓において、酵素、２５−ヒドロキシビタミンＤ  １α−ヒドロキシラーゼ（１α−ヒドロキシラーゼ）によって、活性な形態である１α、２５−ジヒドロキシビタミンＤ（１α、２５（ＯＨ）２Ｄ）まで、さらに代謝されるはずである。１α、２５（ＯＨ）２Ｄ産生の調節は、主に合成経路におけるこの最終段階である。１α−ヒドロキシラーゼの活性は、酵素産物（１α、２５（ＯＨ）２Ｄ）の循環レベルおよび副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）、カルシトニン、インスリン、カルシウム、リン、成長ホルモン、およびプロラクチンのレベルを含むいくつかの生理学的因子に依存する。さらに、腎外の１α−ヒドロキシラーゼ活性が報告され、このことは、１α、２５（ＯＨ）２Ｄ産生の組織特異的、局所的調節はまた、生物学的に重要であり得ることを示唆する。１α、２５（ＯＨ）２Ｄの２４，２５−ジヒドロキシビタミンＤ（２４，２５（ＯＨ）２Ｄ）への触媒（酵素、２５−ヒドロキシビタミンＤ  ２４−ヒドロキシラーゼ（２４−ヒドロキシラーゼ）を含む）はまた、腎臓でも起こる。２４−ヒドロキシラーゼはまた、基質として２５（ＯＨ）２Ｄを使用し得る（Ｓｈｉｎｋｉ，Ｔ．ら、（１９９７）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９４：１２９２０−１２９２５；Ｍｉｌｌｅｒ，Ｗ．Ｌ．およびＰｏｒｔａｌｅ，Ａ．Ａ．前述；ならびにこの中の参考文献）。
【００１８】
ビタミンＤ２５−ヒドロキシラーゼ、１α−ヒドロキシラーゼ、および２４−ヒドロキシラーゼは、全てＮＡＤＰＨ依存であり、このファミリーの他のメンバーと高い相同性の程度を示すＩ型（ミトコンドリアの）シトクロムＰ４５０酵素である。ビタミンＤ  ２５−ヒドロキシラーゼはまた、広い基質特異性を示し、胆汁酸中間体の２６−ヒドロキシル化ならびにコレステロールの２５、２６、および２７−ヒドロキシル化を行い得る（Ｄｉｌｗｏｒｔｈ，Ｆ．Ｊ．ら（１９９５）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：１６７６６−１６７７４；Ｍｉｌｌｅｒ，Ｗ．Ｌ．およびＰｏｒｔａｌｅ，Ａ．Ａ．前出；ならびにこの中の参考文献）。
【００１９】
ビタミンＤ（１α、２５（ＯＨ）２Ｄ）の活性形態は、カルシウムおよびリン酸ホメオスタシスに関連し、骨髄細胞および皮膚細胞の分化を促進する。ビタミンＤ欠乏は、低カルシウム血症、低リン酸血症、およびビタミンＤ依存性（感受性）くる病、骨密度および骨特有の臨床的特性（アヒル歩行に伴う内反膝またはＯ脚を含む）の欠損により特徴付けられる疾患を引き起こすビタミンＤ代謝に関連する酵素（例えば、１α−ヒドロキシラーゼ）の欠乏を生じる。ビタミンＤ  ２５−ヒドロキシラーゼの欠乏は、脳腱黄色腫症、アキレス腱、脳、肺、および多くの他の組織におけるコレステロールおよびコレスタノールの沈着によって特徴付けられる脂質貯蔵疾患を引き起こす。この疾患は、進行性神経学的機能不全（思春期後の小脳性運動失調、アテローム性動脈硬化症、および白内障を含む）とともに存在する。ビタミンＤ  ２５−ヒドロキシラーゼの欠乏は、くる病を引き起こさず、このことは、２５（ＯＨ）Ｄ合成のための代替的な経路の存在を示唆する（Ｇｒｉｆｆｉｎ、Ｊ．Ｅ．およびＺｅｒｗｅｋｈ，Ｊ．Ｅ．（１９８３）、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．７２：１１９０−１１９９；Ｇａｍｂｌｉｎ，Ｇ．Ｔ．ら、（１９８５）、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．７５：９５４−９６０；ならびにＷ．Ｌ．およびＰｏｒｔａｌｅ，Ａ．Ａ．前出）。
【００２０】
フェレドキシンおよびフェレドキシンレダクターゼは、少なくとも１つのヒトシトクロムＰ４５０種、ＣＹＰ２７遺伝子によってコードされるシトクロムｐ４５０ｃ２７を支持する電子伝達アクセサリータンパク質である（Ｄｉｌｗｏｒｔｈ，Ｆ．Ｊ．ら、（１９９６）、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３２０：２６７−７１）。Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｒｉｓｅｕｓシトクロムＰ４５０、ＣＹＰ１０４Ｄ１は、Ｅ．ｃｏｌｉで異種として発現され、そして外因性フェレドキシンおよびフェレドキシンレダクターゼ酵素によって還元されることが見出され（Ｔａｙｌｏｒ，Ｍ．ら、（１９９９）、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２６３：８３８−４２）、このことは、多くのシトクロムＰ４５０種が、フェレドキシン／フェレドキシンレダクターゼペアによって支持され得ることを示唆する。フェレドキシンレダクターゼはまた、アクチノマイシンＤ、抗腫瘍抗生物質の反応性のフリーラジカル種に還元する薬物代謝系モデルにおいて見出された（Ｆｌｉｔｔｅｒ，Ｗ．Ｄ．およびＭａｓｏｎ，Ｒ．Ｐ．（１９８８）、Ａｒｃｈ．Ｃｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．２６７：６３２−９）。
【００２１】
（フラビン含有モノオキシゲナーゼ（ＦＭＯ））
フラビン含有モノオキシゲナーゼ（ＦＭＯ）は、基質の例外的範囲の求核性の窒素、硫黄、およびリンヘテロ原子を酸化する。シトクロムＰ４５０と同様に、ＦＭＯは、ミクロソームに存在し、そしてＮＡＤＰＨおよびＯ２を使用する；シトクロムＰ４５０と重複する多数の基質がまた存在する。ＦＯＭの組織分布として、肝臓、腎臓および肺が挙げられる。
【００２２】
哺乳動物において５つの異なる公知のアイソフォームのＦＭＯ（ＦＭＯ１、ＦＭＯ２、ＦＭＯ３、ＦＭＯ４、およびＦＭＯＳ）が存在し、これらは、組織特異的な様式で発現される。アイソフォームは、それらの基質特異性およびその他の性質（例えば、種々の化合物による阻害および反応の立体特異性）において異なる。ＦＭＯは、１３のアミノ酸サイン配列を有し、この化合物は、配列のＮ末端をの２／３にまたがり、そしてＦＡＤ結合領域および多くのＮ−ヒドロキシル化酵素において見出されているＦＡＴＧＹモチーフを含む（Ｓｔｅｈｒ，Ｍ．ら（１９９８）、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．２３：５６−５７）。
【００２３】
特定の反応として、求核性第三級アミンのＮ−オキシドへの酸化、第二級アミンのヒドロキシルアミンおよびニトロンへの酸化、第一級アミンのヒドロキシルアミンおよびオキシムへの酸化、ならびに硫黄含有化合物およびホスフィンのＳ−およびＰ−オキシドへの酸化が挙げられる。ヒドラジン、ヨウ化物、セレン化物、およびホウ素含有化合物もまた基質である。ＦＭＯは、これらの化学においてシトクロムＰ４５０と類似するようであるが、一般的に、これらは、シトクロムＰ４５０とは、例えば、ＦＭＯのより高い加熱不安定性、およびシトクロムＰ４５０の非イオン性界面活性剤感受性に基いてインビトロで区別され得る；しかし、同定におけるこれらの性質の使用は、温度安定性および界面活性剤感受性に関連するＦＯＭアイソフォームの間のさらなるバリエーションにより複雑になる。
【００２４】
ＦＭＯは、いくつかの薬物および生体異物の代謝において重要な役割を果たす。ＦＭＯ（肝臓中のＦＭＯ３）は、（Ｓ）−ニコチンの（Ｓ）−ニコチンＮ−１’−オキシド（これは、尿中に排出される）への代謝を主に担う。ＦＭＯはまた、胃潰瘍の処置に広く使用されるシメチジン（Ｈ２−アンタゴニスト）のＳ−酸化に関連する。ＦＭＯの肝臓での発現形態は、シトクロムＰ４５０と同じ調節制御下にはない。ラットにおいて、例えば、フェノバルビタール処置は、シトクロムＰ４５０の誘導をもたらすが、ＦＭＯ１の抑制をもたらす。
【００２５】
ＦＭＯの内因性基質として、システアミン（これは、ジスルフィドシスタミンに酸化される）、およびトリメチルアミン（ＴＭＡ）（これは、トリメチルアミンＮ−オキシドに代謝される）が挙げられる。ＴＭＡは、腐敗している魚のような臭いがし、そしてＦＭＯ３アイソフォームにおける変異は、汗、尿、および呼気に排出されるひどい悪臭の大量の遊離アミンをもたらす。これらの症状は、魚臭症候群（ｆｉｓｈ−ｏｄｏｒ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）と呼ばれるに到っている。
【００２６】
（リジルオキシダーゼ）
リジルオキシダーゼ（リジン６−オキシダーゼ、ＬＯ）は、コラーゲンとエラスチンを架橋することにより結合組織マトリックスの形成に関連する銅依存性アミンオキシダーゼである。ＬＯは、約５０ｋＤａのＮ−グリコシル化された先駆体タンパク質として分泌され、メタロプロテアーゼによって酵素の成熟形態に切断されるが、前駆体の形態もまた、活性である。ＬＯ中の銅原子は、これらの細胞外マトリックスタンパク質においてリジン残基の酸化的脱アミノ化を容易にするための、酸素へのおよび酸素からの電子伝達に関連する。銅の配位は、ＬＯ活性に必須ではあるが、食事での銅の取りこみが不十分であることは、アポ酵素の発現に影響しない。しかし、機能的なＬＯの欠如は、食事での銅の欠乏に関連する骨格組織の疾患および血管組織の障害に関連する。ＬＯはまた、種々のセミカルバジド、ヒドラジン、およびアミノニトライト、ならびにヘパリンによって阻害される。一般的に、β−アミノプロピオニトリルが、インヒビターとして使用される。ＬＯ活性は、オゾン、カドミウム、および局所的な組織傷害に応答して放出されるホルモン（例えば、トランスホーミング増殖因子−β、血小板由来増殖因子、アンギオテンシンＩＩ、および線維芽細胞増殖因子）の増加したレベルに応答して増加する。ＬＯ活性における異常は、メンケズ症候群および後角（ｏｃｃｉｐｉｔａｌ  ｈｏｒｎ）症候群と関連付けられている。酵素のサイトゾル形態は、異常な細胞増殖と関係付けられてきた（Ｒｕｃｋｅｒ，Ｒ．Ｂ．ら、（１９９８）、Ａｍ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｎｕｔｒ．６７：９９６Ｓ−１００２ＳならびにＳｍｉｔｈ−Ｍｕｎｇｏ．Ｌ．Ｉ．およびＫａｇａｎ，Ｈ．Ｍ．（１９９８）、Ｍａｔｒｉｘ  Ｂｉｏｌ．１６：３８７−３９８にレビューされる）。
【００２７】
（ジヒドロ葉酸レダクターゼ）
ジヒドロ葉酸レダクターゼは（ＤＨＦＲ）、ジヒドロ葉酸のテトラヒドロホレートへのＮＡＤＰＨ依存性の還元（グリシンおよびプリンのデノボ合成において必須の工程）ならびにデオキシウリジンモノホスフェート（ｄＵＭＰ）のデオキシチミジンモノホスフェート（ｄＴＭＰ）への変換を触媒する偏在性酵素である。基礎となる反応は以下である：
７，８−ジヒドロ葉酸＋ＮＡＤＰＨ→５，６，７，８−テトラヒドロフォレート＋ＮＡＤＰ＋
この酵素は、トリメトプリム（ｔｒｉｍｅｔｈｒｏｐｒｉｍ）およびメトトレキサートを含む多くのジヒドロ葉酸アナログによって阻害され得る。ＤＮＡ合成のために大量のＴＭＰが必要であるため、迅速に分裂している細胞は、ＤＨＦＲの活性を必要とする。ＤＮＡウイルス（すなわち、ヘルペスウイルス）の複製はまた、高レベルのＤＨＦＲ活性を必要とする。結果として、ＤＨＦＲを標的とする薬物は、癌の化学療法およびＤＮＡウイルスの複製を阻害するために使用されてきた。（同様の理由のために、チミジレートシンテターゼはまた、標的酵素である。）ＤＨＦＲを阻害する薬物は、迅速に分裂している細胞（またはＤＮＡウイルス感染細胞）に対して優先的に細胞毒性であるが、特異性を有さず、このことは、分裂細胞の無差別な破壊をもたらす。さらに、得られた輸送の欠如または１以上のＤＨＦＲ遺伝子の複製の結果として、癌細胞は、薬物（例えば、メトトレキサート）に対して耐性を生じ得る（Ｓｔｒｙｅｒ，Ｌ（１９８８）、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．Ｗ．Ｈ  Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．、Ｉｎｃ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ．５１１−５６１９頁）。
【００２８】
（アルド／ケトレダクターゼ）
アルド／ケトレダクターゼは、広範な基質特異性を有する単量体ＮＡＤＰＨ依存性オキシドレダクターゼである（Ｂｏｈｒｅｎ，Ｋ．Ｍ．ら、（１９８９）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：９５４７−５１）。これらの酵素は、カルボニル含有化合物（カルボニル含有糖および芳香族化合物を含む）の対応するアルコールへの還元を触媒する。従って、種々のカルボニル含有薬物および生体異物が、このクラスの酵素によって代謝されるようである。
【００２９】
ファミリーメンバーであるアルドースレダクターゼによって触媒される公知の反応の１つは、グルコースのソルビトールへの還元であり、次いでこれは、ソルビトールデヒドロゲナーゼによってフルクトースへさらに代謝される。通常の条件化で、グルコースのソルビトールへの還元は、副経路である。しかし、高血糖性の状態において、ソルビトールの蓄積は、糖尿病合併症の発症に関連する。この酵素ファミリーのメンバーはまた、いくつかの肝臓癌において高度に発現される（Ｃａｏ，Ｄ．ら、（１９９８）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．ＣＨｅｍ．２７３：１１４２９−３５）。
【００３０】
（アルコールデヒドロゲナーゼ）
アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）は、単純なアルコールを対応するアルデヒドに酸化する。ＡＤＨはサイトゾル酵素であり、補因子ＮＡＤ＋を好み、そしてまた亜鉛イオンにも結合する。肝臓は、最も高レベルのＡＤＨを含む（腎臓、肺、および胃粘膜ではより低いレベルを有する）
公知のＡＤＨアイソフォームは、４０ｋＤａのサブユニットから構成される二量体タンパク質である。これらのサブユニット（ａ、ｂ、ｇ、ｐ、ｃ）をコードする５つの遺伝子座が公知であり、そしてこの遺伝子座のいくつかは、特徴付けされた対立遺伝子改変体（ｂ”ｂ２、ｂ３、ｇ１、ｇ２）を有する。このサブユニットは、ホモ二量体およびヘテロ二量体を形成し得る；サブユニットの組成は、活性な酵素の特異的性質を決定する。従って、ホロ酵素は、クラスＩ（サブユニット組成、ａａ、ａｂ、ａｇ、ｂｇ、ｇｇ）、クラスＩＩ（ｐｐ）およびクラスＩＩＩ（ｃｃ）としてカテゴリー化されてきた。クラスＩのＡＤＨアイソザイムは、エタノールおよび他の低級脂肪族アルコールを酸化し、そしてピラゾールによって阻害される。クラスＩＩのアイソザイムは、より長鎖の脂肪族および芳香族アルコールを好み、メタノールは酸化できず、そしてピラゾールによって阻害されない。クラスＩＩＩのアイソザイムは、さらに長鎖の脂肪族アルコール（５つの炭素以上）および芳香族アルコールを好み、ピラゾールによって阻害されない。
【００３１】
短鎖アルコールデヒドロゲナーゼとして、種々の基質特異性を有する多くの関連する酵素が挙げられる。このグループとして、哺乳動物酵素である、Ｄ−β−ヒドロキシブチレートデヒドロゲナーゼ、（Ｒ）−３−ヒドロキシブチレートデヒドロゲナーゼ、１５−ヒドロキシプロスタグランジンデヒドロゲナーゼ、ＮＡＤＰＨ−依存性カルボニルレダクターゼ、コルチコステロイド１１−β−デヒドロゲナーゼ、およびエストラジオール１７−β−デヒドロゲナーゼ、ならびに細菌の酵素である、アセトアセチル−ＣｏＡレダクターゼ、グルコース１−デヒドロゲナーゼ、３−β−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ、２０−β−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ、リビトールデヒドロゲナーゼ、３−オキソアシルレダクターゼ、２，３−ジヒドロ−２，３−ジヒドロキシベンゾエートデヒドロゲナーゼ、ソルビトール−６−ホスフェート  ２−デヒドロゲナーゼ、７−α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ、ｃｉｓ−１，２−ジヒドロキシ−３，４−シクロヘキサジエン−１−カルボキシレートデヒドロゲナーゼ、ｃｉｓ−トルエンジヒドロジオールデヒドロゲナーゼ、ｃｉｓ−ベンゼングリコールデヒドロゲナーゼ、ビフェニル−２，３−ジヒドロ−２，３−ジオールデヒドロゲナーゼ、Ｎ−アシルマンノサミン  １−デヒドロゲナーゼ、および２−デオキシ−Ｄ−グルコネート  ３−デヒドロゲナーゼが挙げられる（Ｋｒｏｚｏｗｓｋｉ，Ｚ．（１９９４）、Ｊ．Ｓｔｅｒｏｉｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．５１：１２５−１３０；Ｋｒｏｚｏｗｓｋｉ，Ｚ．（１９９２）、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．８４：Ｃ２５−３１；およびＭａｒｋｓ，Ａ．Ｒ．ら、（１９９２）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：１５４５９−１５４６３）。
【００３２】
（ＵＤＰグルクロニルトランスフェラーゼ）
ＵＤＰグルクロニルトランスフェラーゼ（ＵＧＴ）ファミリーのメンバーは、補因子ウリジンジホスフェート−グルクロン酸（ＵＤＰ−グルクロン酸）から基質へのグルクロン酸基の転移を触媒する。この転移は一般に、求核性ヘテロ原子（Ｏ、Ｎ、またはＳ）に対するものである。基質としては、第Ｉ相反応によって機能を与えられた生体異物、ならびにビリルビン、ステロイドホルモン、および甲状腺ホルモンのような内因性化合物が挙げられる。グルクロン酸抱合産物は、基質の分子量が約２５０ｇ／ｍｏｌよりも小さい場合、尿中に排出される一方、より大きいグルクロン酸抱合された基質は、胆汁中に排出される。
【００３３】
ＵＧＴは、肝臓、腎臓、腸、皮膚、脳、脾臓、および鼻粘膜のミクロソームに位置し、これらは、シトクロムＰ４５０酵素およびフラビン含有モノオキシゲナーゼと同じ小胞体膜の側に存在し、したがってＵＧＴは、第Ｉ相薬物代謝産物を評価するために理想的に配置されている。ＵＧＴは、自身を小胞体膜に固着させるＣ末端膜貫通ドメイン、およびそのＣ末端区分の約５０アミノ酸残基の保存シグネチャードメインを有する。
【００３４】
薬物代謝に関与するＵＧＴは、２つの遺伝子ファミリー、ＵＧＴ１およびＵＧＴ２によってコードされる。ＵＧＴ１ファミリーのメンバーは、単一の遺伝子座の選択的スプライシングにより生じ、補因子結合および膜挿入に関与する可変性の基質結合ドメインおよび定常領域を有する。ＵＧＴ２ファミリーのメンバーは、異なる遺伝子座によってコードされ、そして２つのファミリー、ＵＧＴ２ＡおよびＵＧＴ２Ｂに分けられる。２Ａサブファミリーは、嗅上皮において発現され、そして２Ｂサブファミリーは、肝臓ミクロソームにおいて発現される。ＵＧＴ遺伝子における変異は、高ビリルビン血症；生まれつきの重度の高ビリルビン血症と特徴付けられるクリグラー−ナジャー症候群；およびジルベール病と呼ばれるより軽い形態の高ビリルビン血症に関連する。
【００３５】
（スルホトランスフェラーゼ）
スルフェートの結合は、ｏ−グルクロン酸抱合を生じて高い水溶性の硫酸エステルを生成する同じ基質の多くで起こる。スルホトランスフェラーゼ（ＳＴ）は、補因子３’−ホスホアデノシン−５’−ホスホスルフェート（ＰＡＰＳ）からこの基質へＳＯ３−を転移することによってこの反応を触媒する。ＳＴの基質は、主にフェノールおよび脂肪族アルコールであるが、芳香族アミンおよび脂肪族アミンも含む。これらは対応するスルファメートを生成するために結合される。これらの反応の生成物は、主に尿に排出される。
【００３６】
ＳＴは、広い範囲の組織において見出され、この組織として肝臓、腎臓、腸管、肺、血小板、および脳が挙げられる。この酵素は一般に、サイトゾル酵素であり、そしてしばしば複数の形態が同時に発現される。例えば、ラット肝臓サイトゾルには１ダースより多くの形態のＳＴが存在する。これらの生化学的に特徴付けられたＳＴは、基質の優先性に基き５つのクラス（アリールスルホトランスフェラーゼ、アルコールスルホトランスフェラーゼ、エストロゲンスルホトランスフェラーゼ、チロシンエステルスルホトランスフェラーゼ、および胆汁酸塩スルホトランスフェラーゼ）に分類される。
【００３７】
ラットにおいてＳＴの酵素活性は、性別および年齢で大きく変化する。発育的なキューと性関連ホルモンとの組み合わさった効果が、ＳＴ発現プロフィールおよびシトクロムＰ４５０のような他のＤＭＥのプロフィールにおける差異を導くと考えられる。特にネコにおけるＳＴの高発現は、その低レベルのＵＤＰグルクロニルトランスフェラーゼ活性を部分的に補填する。
【００３８】
いくつかの形態のＳＴが、ヒト肝臓サイトゾルから精製され、そしてクローン化されている。異なる熱安定性および基質優先性を有する２つのフェノールスルホトランスフェラーゼが存在する。熱安定性の酵素は、フェノール（例えば、パラニトロフェノール、ミノキシジル、およびアセトアミノフェン）の硫酸化を触媒し；熱不安定性の酵素は、モノアミン基質（例えば、ドーパミン、エピネフリン、およびレボドパ（ｌｅｖａｄｏｐａ））を好む。他のクローン化されたＳＴとして、エストロゲンスルホトランスフェラーゼおよびＮ−アセチルグルコサミン−６−Ｏ−スルホトランスフェラーゼが挙げられる。この最後の酵素は、細胞生化学、細胞の分化において重要であり得る炭化水素構造の改変、およびプロテオグリカンの成熟におけるＳＴの他の主要な役割の実例である。実際、スルホトランスフェラーゼにおける遺伝的な欠損は、成熟ケラタン硫酸プロテオグリカンの合成の不全により特徴付けられる障害、黄斑角膜ジストロフィー、に関係する（Ｎａｋａｚａｗａ，Ｋ．ら（１９８４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５９：１３７５１−７）。
【００３９】
（ガラクトシルトランスフェラーゼ）
ガラクトシルトランスフェラーゼは、溶液中で遊離している糖タンパク質または糖脂質の一部である末端Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）オリゴサッカリド鎖にガラクトース（Ｇａｌ）を転移するグリコシルトランスフェラーゼのサブセットである（Ｋｏｌｂｉｎｇｅｒ，Ｆ．ら（１９９８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：４３３−４４０；Ａｍａｄｏ，Ｍ．ら（１９９９）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １４７３：３５−５３）。ガラクトシルトランスフェラーゼは、ゴルジ体中に存在することに加えて、細胞表面上および可溶性細胞外タンパク質として検出された。β１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼは、Ｇａｌ（β１−３）ＧｌｃＮＡｃ結合を有するＩ型糖鎖の形態をとる。公知のヒトおよびマウスのβ１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼは、８つの保存領域と共に短いサイトゾルドメイン、単一の膜貫通ドメイン、および触媒ドメインを有するようである（Ｋｏｌｂｉｎｇｅｒ，Ｆ．（前出）およびＨｅｎｎｅｔ，Ｔ．ら（１９９８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：５８−６５）。マウスＵＤＰガラクトース：β−Ｎ−アセチルグルコサミン  β１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼ−Ｉにおいて領域１は、アミノ酸残基７８〜８３に位置し、領域２はアミノ酸残基９３〜１０２に位置し、領域３はアミノ酸残基１１６〜１１９に位置し、領域４はアミノ酸残基１４７〜１５８に位置し、領域５はアミノ酸残基１７２〜１８３に位置し、領域６はアミノ酸残基２０３〜２０６に位置し、領域７はアミノ酸残基２３６〜２４６に位置し、そして領域８はアミノ酸残基２６４〜２７５に位置する。マウスＵＤＰ−ガラクトース：β−Ｎ−アセチルグルコサミン  β１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼ−Ｉの領域８において見出される配列の改変体はまた、細菌ガラクトシルトランスフェラーゼにおいても見出され、このことは、この配列がガラクトシルトランスフェラーゼ配列モチーフを定義することを示唆する（Ｈｅｎｎｅｔ，Ｔ．（前出））。近年の研究は、ｂｒａｉｎｉａｃタンパク質がβ１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼであることを示唆している（Ｙｕａｎ，Ｙ．ら（１９９７）Ｃｅｌｌ  ８８：９−１１；およびＨｅｎｎｅｔ，Ｔ．（前出））。
【００４０】
ＵＤＰ−Ｇａｌ：ＧｌｃＮＡｃ−１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ（−１，４−ＧａｌＴ）（Ｓａｔｏ，Ｔ．ら（１９９７）ＥＭＢＯ  Ｊ．１６：１８５０−１８５７）は、Ｇａｌ（β１−４）ＧｌｃＮＡｃ結合を有するＩＩ型糖鎖の形成を触媒する。β１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼの場合では、この酵素の可溶性形態が、膜結合形態の切断により形成される。β１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ間で保存されているアミノ酸は、触媒ドメインにジスルフィド結合を介して連結された２つのシステインおよび推定ＵＤＰガラクトース結合部位を含む（Ｙａｄａｖ，ＳおよびＢｒｅｗ，Ｋ（１９９０）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：１４１６３−１４１６９；Ｙａｄａｖ，Ｓ．Ｐ．およびＢｒｅｗ，Ｋ．（１９９１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：６９８−７０３；およびＳｈａｐｅｒ，Ｎ．Ｌ．ら（１９９７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：３１３８９−３１３９９）。β１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼは、糖タンパク質または糖脂質において糖鎖を合成することに加え、種々の特殊な役割を有する。哺乳動物において、β１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼは、ｃｃ−ラクトアルブミンを有するヘテロダイマーの一部として、乳腺ラクトース生成を泌乳する際において機能する。精子表面上のβ１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼは、卵子を特異的に認識するレセプターとして機能する。細胞表面β１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼはまた、細胞接着、細胞／基底膜の相互作用、ならびに正常の細胞および転移性細胞の移動においても機能する（Ｓｈｕｒ，Ｂ．（１９９３）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．５：８５４−８６３；およびＳｈａｐｅｒ，Ｊ．（１９９５）Ａｄｖ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．３７６：９５−１０４）。
【００４１】
（グルタチオンＳトランスフェラーゼ）
グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）によって触媒される基本的な反応は、求電子体と還元型グルタチオン（ＧＳＨ）との結合である。ＧＳＴは、主にサイトゾルに存在するホモダイマー性またはヘテロダイマー性のタンパク質であるが、ある程度のレベルの活性は、ミクロソームにも存在する。主要なアイソザイムは、共通の構造および触媒特性を共有し；ヒトにおいて、これらは４つの主要なクラス、α、Ｍｕ、Ｐｉ、およびθに分類されている。最も大きな２つのクラス、αおよびＭｕは、それぞれの等電点（ｐＩ  約７．５〜９．０（α）およびｐＩ  約６．６（Ｍｕ））により同定される。各ＧＳＴは、ＧＳＨに対する共通の結合部位および可変性の疎水結合部位を有する。各アイソザイムにおけるこの疎水結合部位は、特定の求電子基質に特異的である。ＧＳＴ中の特定のアミノ酸残基が、これらの結合部位および触媒活性に重要であるとして同定されている。残基Ｑ６７、Ｔ６８、Ｄ１０１、Ｅ１０４、およびＲ１３１はＧＳＨとの結合のために重要である（Ｌｅｅ，Ｈ−Ｃら（１９９５）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：９９−１０９）。残基Ｒ１３、Ｒ２０、およびＲ６９は、ＧＳＴの触媒活性のために重要である（Ｓｔｅｎｂｅｒｇ  Ｇら（１９９１）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２７４：５４９−５５）。
【００４２】
たいていの場合、ＧＳＴは、潜在的な変異誘発性化学物質および発癌性化学物質の不活性化および解毒に関して有益な機能を果たす。しかし、いくつかの場合は、これらの作用が有害であり、後に変異原作用および発癌作用を生じる化学物質の活性化を引き起こす。ラットおよびヒトのＧＳＴのいくつかの形態は、発癌の検出において補助となる信頼性のある新生物発生前のマーカーである。細菌株（例えば、変異誘発性についての周知のエイムス試験において用いられるＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）でのヒトＧＳＴの発現は、変異誘発におけるこれらの酵素の役割を確立する手助けとなった。マウスにおいて肝臓腫瘍を生成するジハロメタンは、ＧＳＴによって活性化されると考えられる。この見解は、ジハロメタンが未トランスフェクト細胞よりもヒトＧＳＴを発現する細菌細胞において、より変異誘発性であることの発見によって支持される（Ｔｈｉｅｒ，Ｒ．ら（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：８５６７−８０）。エチレンジブロミドおよびエチレンジクロリドの変異誘発性は、ヒトαＧＳＴ、Ａｌ−１を発現する細菌細胞において増大されるが、アフラトキシン（ａｌｌａｔｏｘｉｎ）Ｂ１の変異誘発性は、ＧＳＴの発現を増強することにより、実質的に減少する（Ｓｉｍｕｌａ，Ｔ．Ｐ．ら（１９９３）Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ  １４：１３７１−６）。したがって、ＧＳＴ活性の制御は、変異誘発および発癌の制御において有用であり得る。
【００４３】
ＧＳＴは、多くの癌の薬物処置に対する獲得性の耐性（多剤耐性（ＭＤＲ）として公知の現象）に関係する。ＭＤＲは、癌を有する個体がシクロホスファミドのような細胞毒性の薬物で処置され、その後この薬物および種々の他の細胞毒性剤に対しても耐性となる場合に生じる。増加したＧＳＴレベルは、これらの薬剤耐性癌のいくつかと関連している。そして、この増加がこの薬物に応答して起こり、次いでこの薬剤は、ＧＳＴに触媒されるＧＳＨ結合反応により不活性化されると考えられる。次いでこの増加したＧＳＴレベルは、ＧＳＴに結合する他の細胞毒性剤から癌細胞を保護する。腫瘍において増加したＡｌ−１のレベルは、シクロホスファミド処置により誘導された薬物耐性と結びついた（Ｄｉｒｖｅｎ  Ｈ．Ａ．ら（１９９４）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５４：６２１５−２０）。したがって、癌性組織におけるＧＳＴ活性の制御は、癌を有する個体におけるＭＤＲの処置の際に有用であり得る。
【００４４】
（γグルタミルトランスペプチダーゼ）
γグルタミルトランスペプチダーゼは、遍在的に発現される酵素であり、γグルタミルアミド結合を切断することによって細胞外グルタチオン（ＧＳＨ）分解を開始する。ＧＳＨの分解は、生合成経路のための局所的なシステインプールを細胞に提供する。γグルタミルトランスペプチダーゼはまた、細胞の抗酸化防御に寄与し、そして酸化ストレスにより発現が誘導される。細胞表面に局在する糖タンパク質は、癌細胞において高レベルで発現される。癌細胞の表面に存在する高レベルのγグルタミルトランスペプチダーゼの活性は、前駆体薬物の活性化に利用され、高い局所的濃度の抗癌治療剤を生じ得ることが、研究により示唆されている（Ｈａｎｉｇａｎ，Ｍ．Ｈ．（１９９８）Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．Ｉｎｔｅｒａｃｔ．１１１−１１２：３３３−４２；Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ，Ｎ．およびＩｋｅｄａ，Ｙ．（１９９８）Ａｄｖ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．Ｒｅｌａｔ．Ａｒｅａｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．７２：２３９−７８；Ｃｈｉｋｈｉ，Ｎ．ら（１９９９）Ｃｏｍｐ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｂ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１２２：３６７−８０）。
【００４５】
（アシルトランスフェラーゼ）
Ｎ−アシルトランスフェラーゼ酵素は、アミノ酸結合体の活性化カルボキシル基への転移を触媒する。内因性の化合物および生体異物は、サイトゾル、ミクロソーム、およびミトコンドリアにおいてアシルＣｏＡシンセターゼにより活性化される。次いでアシルＣｏＡ中間体は、サイトゾルまたはミトコンドリアのＮ−アシルトランスフェラーゼによってアミノ酸（代表的には、グリシン、グルタミン、またはタウリンであるが、オルニチン、アルギニン、ヒスチジン、セリン、アスパラギン酸、および種々のジペプチドでもある）と結合され、アミド結合を有する代謝産物を形成する。この反応は、Ｏ−グルクロン酸抱合に相補的であるが、アミノ酸結合は、しばしばグルクロン酸抱合から生じる反応性かつ毒性の代謝産物を生成しない。
【００４６】
このクラスの十分に特徴付けられた酵素の１つは、胃腸管において界面活性剤として役立つ胆汁酸結合体を生成する要因である胆汁酸−ＣｏＡ：アミノ酸Ｎ−アシルトランスフェラーゼ（ＢＡＴ）である（Ｆａｌａｎｙ，Ｃ．Ｎ．ら（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：１９３７５−９；Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｍ．Ｒ．ら（１９９１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：１０２２７−３３）。ＢＡＴはまた、部分肝切除術後の肝細胞癌を有する個体の予後のための予測的な指標としても有用である（Ｆｕｒｕｔａｎｉ，Ｍ．ら（１９９６）Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ２４：１４４１−５）。
【００４７】
（アセチルトランスフェラーゼ）
アセチルトランスフェラーゼは、ヒストンのアセチル化における役割について広く研究されている。ヒストンのアセチル化は、真核細胞においてクロマチン構造の弛緩を引き起こし、影響を受けたゲノムの領域（または一般的にはゲノム）において転写因子がＤＮＡテンプレートのプロモーターエレメントに接近することを可能にする。対照的に、ヒストンの脱アセチル化は、クロマチン構造を閉鎖し、そして転写因子の接近を制限することにより転写の減少を引き起こす。このため、細胞の転写を刺激する一般的な手段は、ヒストンの脱アセチル化を阻害する化学剤（例えば、酪酸ナトリウム）の使用であり、これによって（たとえ、人為的であっても）遺伝子発現の全体的な増加が引き起こされる。アセチル化による遺伝子発現の改変はまた、他のタンパク質のアセチル化によっても引き起こされる。このようなタンパク質としてｐ５３、ＧＡＴＡ−１、ＭｙｏＤ、ＡＣＴＲ、ＴＦＩＩＥ、ＴＦＩＩＦ、および高速移動群タンパク質（ＨＭＧ）が挙げられるが、これらに限定されない。ｐ５３の場合、アセチル化は、ＤＮＡの結合の増大を引き起こし、ｐ５３により調節されている遺伝子の転写の刺激を誘導する。原型のヒストンアセチラーゼ（ＨＡＴ）は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｓｅ由来のＧｃｎ５である。Ｇｃｎ５は、テトラヒメナｐ５５、ヒトＧｃｎＳ、およびヒトｐ３００／ＣＢＰを含むアセチラーゼファミリーのメンバーである。ヒストンのアセチル化は、（Ｃｈｅｕｎｇ，Ｗ．Ｌ．ら（２０００）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １２：３２６−３３３およびＢｅｒｇｅｒ，Ｓ．Ｌ（１９９９）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １１：３３６−３４１）において概説される。いくつかのアセチルトランスフェラーゼ酵素は、いくつかの他の主要なクラスの酵素（アセチルコリンエステラーゼおよびカルボキシルエステラーゼを含むがこれらに限定されない）に共通のα／βヒドロラーゼの折り畳みを有する。
【００４８】
（Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ）
芳香族アミンおよびヒドラジン含有化合物は、肝臓および他の組織のＮ−アセチルトランスフェラーゼ酵素によりＮ−アセチル化に供される。いくつかの生体異物は、同じ酵素によってある程度Ｏ−アセチル化され得る。Ｎ−アセチルトランスフェラーゼは、補因子アセチルコエンザイムＡ（アセチルＣｏＡ）を利用して、２工程のプロセスでアセチル基を転移するサイトゾル酵素である。第１の工程で、アセチル基は、アセチルＣｏＡから活性部位のシステイン残基へ転移され；第２の工程で、アセチル基は、基質のアミノ酸へ転移されて、そしてこの酵素は再生される。
【００４９】
ほとんどの他のＤＭＥクラスとは対照的に、限られた数の公知のＮ−アセチルトランスフェラーゼが存在する。ヒトにおいて、２つの高い類似の酵素、ＮＡＴ１およびＮＡＴ２が存在し；マウスは、この酵素の第３の形態、ＮＡＴ３を有するようである。ヒト形態のＮ−アセチルトランスフェラーゼは、独立した調節（ＮＡＴ１は、広範に発現されるが、ＮＡＴ２は、肝臓および腸でのみ発現される）および重複した基質優先性を有する。両方の酵素は、たいていの基質をある程度受け入れるようであるが、ＮＡＴ１は、いくつかの基質（パラアミノ安息香酸、パラアミノサリチル酸、スルファメトキサゾール、およびスルファニルアミド）を選択するのに対し、ＮＴＡ２は、その他の基質（イソニアジド、ヒドララジン、プロカインアミド、ダプソン、アミノグルテチミド、およびスルファメタジン）を選択する。
【００５０】
１９５０年代の抗結核薬イソニアジドを投与された個体の臨床的な観察は、この化合物のアセチル化が速い群およびアセチル化が遅い群についての概要を導いた。これらの表現型は、その後、酵素活性または安定性に影響を及ぼすＮＡＴ２遺伝子における変異に起因することが示された。遅いイソニアジドアセチル化群の表現型は、中東人の母集団において非常に一般的であり（約７０％）、そして白色人種（約５０％）およびアジア人（＜２５％）の母集団においてはあまり一般的ではない。さらに近年、ＮＡＴ１における機能的な多型性が、検出され、試験を受けた母集団のおよそ８％がアセチル化が遅い群の表現型を示した（Ｂｕｔｃｈｅｒ，Ｎ．Ｊ．ら（１９９８）Ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｅｔｉｃｓ  ８：６７−７２）。ＮＡＴ１は、いくつかの公知の芳香族アミン発癌物質を活性化し得るので、広範に発現されるＮＡＴ１酵素における多型性は、癌の危険を決定する際に重要であり得る。
【００５１】
（アミノトランスフェラーゼ）
アミノトランスフェラーゼは、アミノ酸の変換を触媒するピリドキサル５’−リン酸（ＰＬＰ）−依存性酵素のファミリーを含む。アスパルテートアミノトランスフェラーゼ（ＡｓｐＡＴ）は、最も広く研究されているＰＬＰ含有酵素である。アスパルテートアミノトランスフェラーゼ（ＡｓｐＡＴ）は、ジカルボキシルＬ−アミノ酸、アスパルテートおよびグルタメートの可逆的な変換を触媒して、これには、２−オキソ酸、オキサルアセテート、および２−オキソグルタレートが対応する。このファミリーの他のメンバーとして、ピルビン酸アミノトランスフェラーゼ、分枝鎖アミノ酸アミノトランスフェラーゼ、チロシンアミノトランスフェラーゼ、芳香族アミノトランスフェラーゼ、アラニン：グリオキシレートアミノトランスフェラーゼ（ＡＧＴ）、およびキヌレニンアミノトランスフェラーゼが挙げられる（Ｖａｃｃａ，Ｒ．Ａ．ら（１９９７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：２１９３２−２１９３７）。
【００５２】
Ｉ型原発性高シュウ酸尿症は、常染色体劣性障害であり、肝臓特異的ペルオキシソーム酵素、アラニン：グリオキシレートアミノトランスフェラーゼ−１の欠損を引き起こす。この障害の表現型は、グリオキシレート代謝における欠損である。ＡＧＴの非存在下において、グリオキシレートは、アミノ基転移されてグリシンになるよりも酸化されてオキサレートになる。この結果は、腎臓および尿路における不溶性カルシウムオキサレートの堆積であり、最終的には腎不全を引き起こす（Ｌｕｍｂ，Ｍ．Ｊ．ら（１９９９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：２０５８７−２０５９６）。
【００５３】
キヌレニンアミノトランスフェラーゼは、Ｌ−トリプトファン代謝産物であるＬ−キヌレニンの不可逆的なアミノ基転移を触媒し、キヌレン酸を生成する。この酵素はまた、Ｌ−２−アミノアジペートと２−オキソグルタレートとの間の可逆的なアミノ基転移反応を触媒し、２−オキソアジペートおよびＬ−グルタメートを生成し得る。キヌレン酸は、グルタミン酸作動性の神経伝達の推定モジュレーターである。したがって、キヌレニンアミノトランスフェラーゼの欠損は、多栄養性効果（ｐｌｅｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｅｆｆｅｃｔ）に関連し得る（Ｂｕｃｈｌｉ，Ｒら（１９９５）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：２９３３０−２９３３５）。
【００５４】
（カテコール−？−メチルトランスフェラーゼ）
カテコール−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ（ＣＯＭＴ）は、カテコール基質（例えば、Ｌ−ド−パ、ドーパミン、またはＤＢＡ）のヒドロキシル基のうちの１つへの、Ｓ−アデノシルメチオニン（ＡｄｏＭｅｔ；ＳＡＭ）ドナーのメチル基の転移を触媒する。３’−ヒドロキシル基のメチル化は、４’−ヒドロキシル基のメチル化よりも好まれ、そしてＣＯＭＴの膜結合アイソフォームは、可溶性形態よりも位置特異的である。この酵素の可溶性形態の翻訳は、全長ｍＲＮＡ（１．５ｋｂ）における内部の開始コドンの使用により生じるか、または内部のプロモーターから転写されるそれより短いｍＲＮＡ（１．３ｋｂ）の翻訳により生じる。仮定的なＳＮ２様メチル化反応は、Ｍｇ２＋を必要とし、Ｃａ２＋によって阻害される。ＣＯＭＴへのドナーおよび基質の結合は、連続的に起こる。Ｍｇ２＋非依存様式において、ＡｄｏＭｅｔは最初にＣＯＭＴに結合し、次いでＭｇ２＋の結合およびカテコール基質の結合が起こる。
【００５５】
組織中のＣＯＭＴの量は、通常必要とされる活性の量と比較して相対的に高い。したがって阻害は問題である。にもかかわらず、インヒビターがインビトロでの用途（例えば、ガラテス（ｇａｌａｔｅｓ）、トロポロン（ｔｒｏｐｏｌｏｎｅ）、Ｕ−０５２１、および３’，４’―ジヒドロキシ―２−メチル−プロピオフェトロポロン（３’，４’−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ−２−ｍｅｔｈｙｌ−ｐｒｏｐｉｏｐｈｅｔｒｏｐｏｌｏｎｅ））のために、および臨床的な用途（例えば、ニトロカテコールベースの化合物およびトルカポン（ｔｏｌｃａｐｏｎｅ））のために開発されている。これらのインヒビターの投与は、Ｌ−ドパの半減期の増加および引き続くドーパミン形成を引き起こす。ＣＯＭＴの阻害はまた、種々の他のカテコール構造化合物（エピネフリン／ノルエピネフリン、イソプレナリン、リミテロール、ドブタミン、フェノールドパム、アポモルヒネ、およびα−メチルドパ、が挙げられるがこれらに限定されない）の半減期を増大するようである。ノルエピネフリンの欠損は、臨床的なうつ病と結び付けられている。したがって、ＣＯＭＴインヒビターの使用は、うつ病の処置において有用であり得る。ＣＯＭＴインヒビターは一般に、最小の副作用で十分に寛容され、そして最終的に肝臓で代謝され、体内にわずかな代謝産物の堆積のみが残る（Ｍａｎｎｉｓｔｏ，Ｐ．Ｔ．およびＫａａｋｋｏｌａ，Ｓ．（１９９９）Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ５１：５９３−６２８）。
【００５６】
（銅−亜鉛スーパーオキシドジスムターゼ）
銅−亜鉛スーパーオキシドジスムターゼは、酸化的な損傷に対する細胞の防御に関与する小型のホモダイマー金属酵素である。この酵素は、１つのサブユニットあたり１つの亜鉛原子および１つの銅原子を含み、そしてスーパーオキシドアニオンのＯ２およびＨ２Ｏ２への不均化を触媒する。不均化の割合は、拡散制限であり、したがって基質と酵素活性部位との間の有利な静電気性の相互作用の存在により増強される。酵素のこのクラスの例は、すべての真核生物細胞の細胞質および種々の細菌種のペリプラズムにおいて同定されている。銅−亜鉛スーパーオキシドジスムターゼは、タンパク質分解性の消化ならびに尿素およびＳＤＳによる変性に対して高く耐性である頑強な酵素である。この酵素の小型の構造に加えて、金属イオンおよびサブユニット内ジスルフィド結合の存在は、酵素の安定性の要因であると考えられている。この酵素は、７０℃と同等の高い温度で可逆的な変性を受ける（Ｂａｔｔｉｓｔｏｎｉ，Ａ．ら（１９９８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：６５５−５６６１）。
【００５７】
スーパーオキシドジスムターゼの過剰発現は、トランスジェニックアルファルファの凍結耐容性を増強し、そして環境毒素（例えば、ジフェニルエーテル除草剤、アシフルオルフェン（ａｃｉｆｌｕｏｒｆｅｎ））に対する耐性を与えるとみなされている（ＭｃＫｅｒｓｉｅ，Ｂ．Ｄ．ら（１９９３）Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１０３：１１５５−１１６３）。さらに、酵母細胞は、酵母細胞がスーパーオキシドジスムターゼ発現のアップレギュレートにより過酸化物ストレスへさらに順応される過酸化水素への曝露の後、凍結−融解損傷により耐性となる。この研究において、低温保存のプロセスを通じた生物の生存性を決定するのに重要であると長く考えられているグルタチオン代謝の調節に影響を及ぼす変異よりも、酵母スーパーオキシドジスムターゼ遺伝子への変異は、凍結−融解耐性に対してより有害な効果を有した（Ｊｏｎｇ−Ｉｎ  Ｐａｒｋ，Ｊ−Ｉら（１９９８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：２２９２１−２２９２８）。
【００５８】
スーパーオキシドジスムターゼの発現はまた、結核を引き起こす生物であるＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓにも関連する。スーパーオキシドジスムターゼは、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓにより分泌される１０個の主要なタンパク質のうちの１つであり、その発現は、酸化ストレスに応答しておよそ５倍にアップレギュレートされる。Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓは、非病原性のマイコバクテリウム属であるＭ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓよりも多くのスーパーオキシドジスムターゼをほぼ２桁の大きさで発現し、そしてずっと高い比率で発現された酵素を分泌する。結果は、Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓよりもＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓによって３５０倍多くの酵素が分泌され、酸化ストレスに対する実質的な耐性を与えるということである（Ｈａｒｔｈ，Ｇ．およびＨｏｒｗｉｔｚ，Ｍ．Ａ．（１９９９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：４２８１−４２９２）。
【００５９】
銅−亜鉛スーパーオキシドジスムターゼおよび抗酸化能を有する他の酵素の発現の減少は、癌の初期段階であると考えられている。銅−亜鉛スーパーオキシドジスムターゼの発現は、正常な前立腺組織と比較して、前立腺上皮内新形成および前立腺癌腫においてより低いことが示されている（Ｂｏｓｔｗｉｃｈ，Ｄ．Ｇ．（２０００）Ｃａｎｃｅｒ  ８９：１２３−１３４）。
【００６０】
（ホスホジエステラーゼ）
ホスホジエステラーゼは、ホスホジエステル化合物中の２つのエステル結合のうちの１つの加水分解を触媒する酵素のクラスを形成する。したがってホスホジエステラーゼは、種々の細胞プロセスに重要である。ホスホジエステラーゼは、細胞の増殖および複製に必須であるＤＮＡおよびＲＮＡエンドヌクレアーゼおよびエキソヌクレアーゼ、ならびにＤＮＡの位相的な再配置の間に核酸鎖を分解および再連結するトポイソメラーゼを含む。Ｔｙｒ−ＤＮＡホスホジエステラーゼは、ＤＮＡ修復において、トポイソメラーゼＩとＤＮＡとの間で形成される最終の共有結合中間体を加水分解することにより機能する（Ｐｏｕｌｉｏｔ，Ｊ．Ｊ．ら（１９９９）Ｓｃｉｅｃｅ  ２８６：５５２−５５５；Ｙａｎｇ，Ｓ．−Ｗ．（１９９６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３：１１５３４−１１５３９）。
【００６１】
酸性スフィンゴミエリナーゼは、膜リン脂質スフィンゴミエリンを加水分解し、セラミドおよびホスホリルコリンを生成するホスホジエステラーゼである。ホスホリルコリンは、多くの細胞内シグナル伝達経路に関与するホスファチジルコリンの合成の際に用いられ、一方セラミドは、神経組織において高濃度で見出される膜脂質であるガングリオシドの生成に必須の前駆体である。酸性スフィンゴミエリナーゼの欠損は、リソソームにおけるスフィンゴミエリン分子の蓄積を引き起こし、これはニーマン‐ピック病を引き起こす（Ｓｃｈｕｃｈｍａｎ，Ｅ．Ｈ．およびＳ．Ｒ．Ｍｉｒａｎｄａ（１９９７）Ｇｅｎｅｔ．Ｔｅｓｔ．１：１３−１９）。
【００６２】
グリセロホスホリルジエステルホスホジエステラーゼ（また、グリセロホスホジエステルホスホジエステラーゼとしても公知）は、デアセチル化リン脂質グリセロホスホジエステルを加水分解して、ｓｎ−グリセロール−３−ホスフェートおよびアルコールを生成するホスホジエステラーゼである。グリセロホスホコリン、グリセロホスホエタノールアミン、グリセロホスホグリセロールおよびグリセロホスホイノシトールは、グリセロホスホリルジエステルホスホジエステラーゼに対する基質の例である。Ｅ．ｃｏｌｉからのグリセロホスホリルジエステルホスホジエステラーゼは、グリセロホスホジエステル基質に対する広範な特異性を有する（Ｌａｒｓｏｎ，Ｔ．Ｊ．ら（１９８３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４８：５４２８−５４３２）。
【００６３】
環状ヌクレオチドホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ）は、環状ヌクレオチドｃＡＭＰおよびｃＧＭＰの調節における重要な酵素である。ｃＡＭＰおよびｃＧＭＰは、第二の細胞内メッセンジャーとして機能して、種々の細胞外シグナル（ホルモン、光、および神経伝達物質を含む）を伝達する。ＰＤＥは、環状ヌクレオチドを、それらの対応するモノホスフェートに分解し、それによって、環状ヌクレオチドの細胞内濃度およびそれらのシグナル伝達に対する効果を調節する。シグナル伝達の調節因子としてのそれらの役割に起因して、ＰＤＥは、化学療法標的として広範に研究されている（Ｐｅｒｒｙ，Ｍ．Ｊ．およびＧ．Ａ．Ｈｉｇｇｓ（１９９８）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．２：４７２−８１；Ｔｏｒｐｈｙ，Ｊ．Ｔ．（１９９８）Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐ．Ｃｒｉｔ．ＣａｒｅＭｅｄ．１５７：３５１−３７０）。
【００６４】
哺乳動物ＰＤＥのファミリーは、それらの基質特異性および親和性、補助因子に対する感受性、ならびに阻害剤に対する感受性に基づいて分類されている（Ｂｅａｖｏ，Ｊ．Ａ．（１９９５）Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｒｅｖ．７５：７２５−７４８；Ｃｏｎｔｉ，Ｍ．ら（１９９５）Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ  Ｒｅｖ．１６：３７０−３８９）。これらのファミリのいくつかは個別の遺伝子を含み、それらの多くは、スプライス変異体として異なる組織で発現される。ＰＤＥファミリーにおいて、複数のイソチームおよびこれらのイソチームの複数のスプライス変異体が、存在する（Ｃｏｎｔｉ，Ｍ．およびＳ．Ｌ．Ｃ．Ｊｉｎ（１９９９）Ｐｒｏｇ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．６３：１−３８）。複数のＰＤＥファミリー、イソチームおよびスプライス変異体の存在は、環状ヌクレオチドに関係する調節経路の多様性および複雑性を示す（Ｈｏｕｓｌａｙ，Ｍ．Ｄ．およびＧ．Ｍｉｌｌｉｇａｎ（１９９７）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．２２：２１７２２４）。
【００６５】
１型ＰＤＥ（ＰＤＥ１）は、Ｃａ２＋／カルモジュリン依存性であり、そして少なくとも３つの遺伝子によってコードされるようであり、各々は、少なくととも２つの異なるスプライス変異体を有する（Ｋａｋｋａｒ，Ｒ．ら（１９９９）Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ．Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．５５：１１６４−１１８６）。ＰＤＥ１は、肺、心臓、および脳に見出されている。いくつかのＰＤＥ１イソチームは、ホスホリル化／脱ホスホリル化によって、インビトロで調節される。これらのＰＤＥ１イソチームのホスホリル化は、カルモジュリンに対する酵素の親和性を減少させ、ＰＤＥ活性を減少させ、そしてｃＡＭＰの定常状態レベルを増加させる（Ｋａｋｋａｒ，前出）。ＰＤＥ１は、環状ヌクレオチドおよびカルシウムシグナル伝達の療法におけるＰＤＥ１の関連性に起因して、中枢神経系、心臓血管系および免疫系の障害のための有用な治療標的を提供しうる（Ｐｅｒｒｙ，Ｍ．Ｊ．およびＧ．Ａ．Ｈｉｇｇｓ（１９９８）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．２：４７２−４８１）。
【００６６】
ＰＤＥ２は、ｃＧＭＰ刺激ＰＤＥであり、これは、小脳、新皮質、心臓、腎臓、肺、肺動脈、および骨格筋において見出されている（Ｓａｄｈｕ，Ｋ．ら（１９９９）Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．４７：８９５−９０６）。ＰＤＥ２は、カテコールアミン分泌（特にアルドステロンの調節において）に対するｃＡＭＰの効果を媒介すると考えられ（Ｂｅａｖｏ，前出）、そして嗅覚のシグナル伝達における役割を果たす（Ｊｕｉｌｆｓ，Ｄ．Ｍ．ら（１９９７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９４：３３８８−３３９５）。
【００６７】
ＰＤＥ３は、ｃＧＭＰおよびｃＡＭＰの両方に対する高い親和性を有し、従って、これらの環状ヌクレオチドは、ＰＤＥ３に対す競合基質として作用する。ＰＤＥ３は、心筋収縮性を刺激する際に、血小板凝集を阻害する際に、血管および気道の平滑筋を緩和する際に、Ｔリンパ球および培養された血管平滑筋細胞の増殖を阻害する際に、ならびに脂肪組織からの遊離脂肪酸のカテコールアミン誘導放出を調節する際に、役割を果たす。ホスホジエステラーゼのＰＤＥ３ファミリーは、特定のインヒビター（例えば、シロスタミド（ｃｉｌｏｓｔａｍｉｄｅ）、エノキシモン（ｅｎｏｘｉｍｏｎｅ）、およびリキサジノン（ｌｉｘａｚｉｎｏｎｅ））に感受性である。ＰＤＥ３のイソチームは、ｃＡＭＰ依存性タンパク質キナーゼによって、またはインスリン依存性キナーゼによって調節され得る（Ｄｅｇｅｒｍａｎ，Ｅ．ら（１９９７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：６８２３−６８２６）。
【００６８】
ＰＤＥ４は、ｃＡＭＰに特異的であり、気道平滑筋、血管内皮、および全ての炎症細胞に局在化され；そしてｃＡＭＰ依存性ホスホリル化によって活性化され得る。ｃＡＭＰレベルの評価は、炎症細胞活性化の抑制および気管支平滑筋の緩和に導き得るので、ＰＤＥ４は、新規な抗炎症剤のための可能な標的として広範に研究され、特に、喘息の処置の発見に重点が置かれている。ＰＤＥ４インヒビターは、喘息、慢性閉塞性肺疾患、およびアトピー性湿疹の処置のための臨床試験を現在受けている。ＰＤＥ４の４つの全ての既知のイソチームは、インヒビターであるロリプラムに感受性であり、このロリプラムは、マウスにおける行動記憶を改善することが示されている化合物である（Ｂａｒａｄ，Ｍ．ら（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９５：１５０２０−１５０２５）。ＰＤＥ４インヒビターはまた、急性肺損傷、内毒素血症、慢性関節リウマチ、多発性硬化症、ならびに種々の神経学的および胃腸適応症に対する可能な治療剤として研究されている（Ｄｏｈｅｒｔｙ，Ａ．Ｍ．（１９９９）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．３：４６６−４７３）。
【００６９】
ＰＤＥ５は、基質としてのｃＧＭＰに対して高度に選択的であり（Ｔｕｒｋｏ，Ｉ．Ｖ．ら（１９９８）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３７：４２００−４２０５）、そして２つのアロステリックｃＧＭＰ特異的結合部位を有する（ＭｃＡｌｌｉｓｔｅｒ−Ｌｕｃａｓ，Ｌ．Ｍ．ら（１９９５）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：３０６７１−３０６７９）。これらのアロステリック結合部位へのｃＧＭＰの結合は、触媒活性の直接的な調節についてよりむしろ、ｃＧＭＰ依存性タンパク質キナーゼによるＰＤＥ５のホスホリル化について重要であるようである。高レベルのＰＤＥ５は、血管平滑筋、血小板、肺および腎臓において見出されている。インヒビターであるザプリナスト（ｚａｐｒｉｎａｓｔ）は、ＰＤＥ５およびＰＤＥ１に対して有効である。ＰＤＥ５に対する特異性を提供するためのザプリナストの改変は、スライデナフィル（ｓｉｌｄｅｎａｆｉｌ）を生じた（ＶＩＡＧＲＡ；Ｐｆｉｚｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  ＮＹ）（男性勃起機能障害のための治療剤）（Ｔｅｒｒｅｔｔ，Ｎ．ら（１９９６）Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．６：１８１９−１８２４）。ＰＤＥ５のインヒビターは、現在、心臓血管治療のための薬剤として研究されている（Ｐｅｒｒｙ，Ｍ．Ｊ．およびＧ．Ａ．Ｈｉｇｇｓ（１９９８）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．２：４７２−４８１）。
【００７０】
ＰＤＥ６（フォトレセプター環状ヌクレオチドホスホジエステラーゼ）は、光伝達カスケードの重要な成分である。Ｇタンパク質トランスデューシンと関連して、ＰＤＥ６は、ｃＧＭＰを加水分解して、フォトレセプター膜におけるｃＧＭＰゲートカチオンチャネルを調節する。ｃＧＭＰ結合活性部位に加えて、ＰＤＥ６はまた、２つの高親和性ｃＧＭＰ結合部位を有し、この部位は、ＰＤＥ６機能において調節的役割を果たすと考えられる（Ａｒｔｅｍｙｅｖ，Ｎ．Ｏ．ら（１９９８）Ｍｅｔｈｏｄｓ  １４：９３−１０４）。ＰＤＥ６における欠陥は、網膜疾患に関連している。ｒｄマウスにおける網膜再生（Ｙａｎ，Ｗ．ら（１９９８）Ｉｎｖｅｓｔ．Ｏｐｔｈａｌｍｏｌ．Ｖｉｓ．Ｓｃｉ．３９：２５２９−２５３６）、  ヒトにおける常染色体劣性色素性網膜炎（Ｄａｎｃｉｇｅｒ，Ｍ．ら（１９９５）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ３０：１−７）、およびイアリィシュセッタードッグにおける杆状体／網膜錐体形成異常症（Ｓｕｂｅｒ，Ｍ．Ｌ．ら（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：３９６８−  ９７２）  が、ＰＤＥ６Ｂ遺伝子の変異に寄与している。
【００７１】
ＰＤＥのＰＤＥ７ファミリーは、複数のスプライス変異体を有する１つの既知のメンバーのみからなる（Ｂｌｏｏｍ，Ｔ．Ｊ．およびＪ．Ａ．Ｂｅａｖｏ（１９９６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３：１４１８８−１４１９２）。ＰＤＥ７はｃＡＭＰ特異的であるが、それらの生理学的機能に付いては、他にほとんど知れれていない。ＰＤＥ７をコードするｍＲＮＡは、骨格筋、心臓、脳、肺、腎臓、および膵臓に見出されているが、ＰＤＥ７タンパク質の発現は、特定の組織型に制限される（Ｈａｎ，Ｐ．ら（１９９７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：１６１５２−１６１５７；Ｐｅｒｒｙ，Ｍ．Ｊ．およびＧ．Ａ．Ｈｉｇｇｓ（１９９８）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．２：４７２−４８１）。ＰＤＥ７は、ＰＤＥ４ファミリーに非常に密接に関連する；しかし、ＰＤＥ７は、ロリプラム（ＰＤＥ４の特異的インヒビター）によって阻害されない（Ｂｅａｖｏ，前出）。
【００７２】
ＰＤＥ８は、ｃＡＭＰ特異的であり、そしてＰＤＥ４ファミリーに密接に関連する。ＰＤＥ８は、甲状腺、精巣、眼、肝臓、骨格筋、心臓、腎臓、卵巣、および脳において発現される。ＰＤＥ８のｃＡＭＰ加水分解活性は、ＰＤＥインヒビターであるロリプラム、ビンポセチン、ミルリノン、ＩＢＭＸ（３−イソブチル−１−メチルキサンチン）、またはザプリナストによって阻害されないが、ＰＤＥ８は、ジピリダモルによって阻害される（Ｆｉｓｈｅｒ，Ｄ．Ａ．ら（１９９８）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２４６：５７０−５７７；Ｈａｙａｓｈｉ，Ｍ．ら（１９９８）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２５０：７５１−７５６；Ｓｏｄｅｒｌｉｎｇ，Ｓ．Ｈ．ら（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９５：８９９１−８９９６）。
【００７３】
ＰＤＥ９は、ｃＧＭＰ特異的であり、そしてＰＤＥのＰＤＥ８ファミリーに最も密接に類似する。ＰＤＥ９は、腎臓、肝臓、肺、脳、脾臓、および小腸において発現される。ＰＤＥ９は、シルデナフィル（ＶＩＡＧＲＡ；Ｐｆｉｚｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  ＮＹ）、ロリプラム、ビンポセチン、ジピリダモル、またはＩＢＭＸ（３−イソブチル−１メチルキサンチン）によって阻害されないが、それらは、ＰＤＥ５インヒビターであるザプリナストに感受性である（Ｆｉｓｈｅｒ，Ｄ．Ａ．ら（１９９８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：１５５５９−１５５６４；Ｓｏｄｅｒｌｉｎｇ，Ｓ．Ｈ．ら（１９９８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：１５５５３−１５５５８）。
【００７４】
ＰＤＥｌ０は、二重基質ＰＤＥであり、ｃＡＭＰおよびｃＧＭＰの両方を加水分解する。ＰＤＥ１０は、脳、甲状腺、および精巣において発現される（Ｓｏｄｅｒｌｉｎｇ，Ｓ．Ｈ．（１９９９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９６：７０７１−７０７６；Ｆｕｊｉｓｈｉｇｅ，Ｋ．ら（１９９９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：１８４３８−１８４４５；Ｌｏｕｇｈｎｅｙ，Ｋ．ら（１９９９）Ｇｅｎｅ  ２３４：１０９１１７）。
【００７５】
ＰＤＥは、約２７０〜３００アミノ酸の触媒ドメイン、結合補助因子に対して応答性であるＮ末端調節ドメイン、およびいくつかの場合において、未知の機能の親水性Ｃ末端ドメインから構成される（Ｃｏｎｔｉ，Ｍ．およびＳ．−Ｌ．Ｃ．Ｊｉｎ（１９９９）Ｐｒｏｇ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．６３：１−３８）。保存された推定亜鉛結合モチーフ（ＨＤＸＸＨＸＧＸＸＮ）は、全てのＰＤＥの触媒ドメインにおいて同定されている。Ｎ末端調節ドメインは、ＰＤＥ２、ＰＤＥ５、およびＰＤＥ６において非触媒ｃＧＭＰ結合ドメインを含み；ＰＤＥ１においてカルモジュリン結合ドメインを含み；そしてＰＤＥ３およびＰＤＥ４においてホスホリル化部分を含むドメインを含む。ＰＤＥ５において、Ｎ末端ｃＧＭＰ結合ドメインは、約３８０アミノ酸残基に広がり、そして保存された配列モチーフＮ（Ｒ／Ｋ）ＸｎＦＸ３ＤＥの直列型繰返しを含む（ＭｃＡｌｌｉｓｔｅｒ−Ｌｕｃａｓ，Ｌ．Ｍ．ら（１９９３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：２２８６３−２２８７３）。ＮＫＸｎモチーフは、ｃＧＭＰ結合のために重要であることが、変異誘発によって示されている（Ｔｕｒｋｏ，Ｉ．Ｖ．ら（１９９６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：２２２４０−２２２４４）。ＰＤＥファミリーは、触媒ドメイン内において、約３０％のアミノ酸同一性を示す；しかし、同じファリミー内のイソチームは、代表的に、この領域において約８５〜９５％の同一性を示す（例えば、ＰＤＥ４Ａ  対  ＰＤＥ４Ｂ）。さらに、ファミリー内において、触媒ドメインの外側に、広範にわたる類似性（＞６０％）が存在する；一方で、ファミリー間において、このドメインの外側に配列類似性は、ほとんどまたは全く存在しない。
【００７６】
免疫応答および炎症応答の構成機能の多くは、ｃＡＭＰの細胞内レベルを増加する薬剤によって阻害される（Ｖｅｒｇｈｅｓｅ，Ｍ．Ｗ．ら（１９９５）Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．４７：１１６４−１１７１）。種々の疾患が、増加したＰＤＥ活性に寄与し、そして環状ヌクレオチドの減少したレベルと関連している。例えば、マウスにおける潜在性糖尿病（ｄｉａｂｅｔｅｓ  ｉｎｓｉｐｉｄｕｓ）の形態は、増加したＰＤＥ４活性と関連し、アトピー性の個体の白血球における低いＫｍのｃＡＭＰ  ＰＤＥ活性の増加が報告され、そしてＰＤＥ３は、心臓疾患と関連している。
【００７７】
ＤＰＥの多くのインヒビターが同定され、そして臨床的評価を受けている（Ｐｅｒｒｙ，Ｍ．Ｊ．およびＧ．Ａ．Ｈｉｇｇｓ（１９９８）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．２：４７２−４８１；Ｔｏｒｐｈｙ，Ｔ．Ｊ．（１９９８）Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｒｉｔ．Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ．１５７：３５１−３７０）。ＰＤＥ３インヒビターは、抗血栓剤、抗高血圧剤、そしてうっ血性心臓不全の処置に有用な強心剤として開発されている。ロリプラム（これは、ＰＤＥ４インヒビターである）は、鬱病の処置において使用され、そしてＰＤＥ４の他のインヒビターが、抗炎症剤としての評価を受けている。ロリプラムはまた、リポ多糖類（ＬＰＳ）誘導ＴＮＦ−αを阻害することが示され、これは、インビトロでＨＩＶ−１複製を増強することが示されている。従って、ロリプラムは、ＨＩＶ−１複製を阻害し得る（Ａｎｇｅｌ，Ｊ．Ｂ．ら（１９９５）ＡＩＤＳ  ９：１１３７−１１４４）。さらに、ロリプラムは、サイトカイン（例えば、ＴＮＦ−ａおよびＴＮＦ−ｂ、ならびにインターフェロンｇ）の産生を抑制するその能力の基づいて、脳脊髄炎の処置において有効であることが示されている。ロリプラムはまた、遅発性ジスキネジーの処置に有効であり得、そして実験動物モデルにおける多発性硬化症を処置する際に有効である（Ｓｏｍｍｅｒ，Ｎ．ら（１９９５）Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１：２４４−２４８；Ｓａｓａｋｉ，Ｈ．ら（１９９５）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２８２：７１−７６）。
【００７８】
テオフィリンは、気管支喘息および他の呼吸器疾患において使用される非特異的ＰＤＥインヒビターである。テオフィリンは、気道平滑筋の機能に対して、および呼吸疾患の処置における抗炎症または免疫調節能力において、作用すると考えられる（Ｂａｎｎｅｒ，Ｋ．Ｈ．およびＣ．Ｐ．Ｐａｇｅ（１９９５）Ｅｕｒ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｊ．８：９９６−１０００）。ペントキシフィリンは、間欠性跛行および糖尿病誘導末梢血管疾患の処置に使用される別の非特異的ＰＤＥインヒビターである。ペントキシフィリンはまた、ＴＮＦ−ａ産性をブロックすることが知られており、そしてＨＩＶ−１複製を阻害しうる（Ａｎｇｅｌら，前出）。
【００７９】
ＰＤＥは、種々の細胞型の細胞増殖に影響することが報告され（Ｃｏｎｔｉら（１９９５）Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ  Ｒｅｖ．１６：３７０−３８９）、そし種々の癌に関係している。前立腺癌細胞系列ＤＵ１４５およびＬＮＣａＰの増殖は、ｃＡＭＰ誘導体およびＰＤＥインヒビターの送達によって阻害された（Ｂａｎｇ，Ｙ．Ｊ．ら（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：５３３０−５３３４）。これらの細胞はまた、上皮の形態からニューロンの形態に、表現型が永久に転換することを示した。ＰＤＥインヒビターが、血管間膜細胞の増殖（Ｍａｔｏｕｓｏｖｉｃ，Ｋ．ら（１９９５）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９６：４０１−４１０）およびリンパ球増殖（Ｊｏｕｌａｉｎ，Ｃ．ら（１９９５）Ｊ．Ｌｉｐｉｄ  Ｍｅｄｉａｔ．Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌ．１１：  ６３−７９）を調節する能力を有することがまた示唆されている。腫瘍の特定の細胞コンパートメントへのＰＤＥの細胞内送達を含み、細胞死を生じる癌処置が記述されている（Ｄｅｏｎａｒａｉｎ，Ｍ．Ｐ．およびＡ．Ａ．Ｅｐｅｎｅｔｏｓ（１９９４）Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ７０：７８６−７９４）。
【００８０】
（ホスホトリエステラーゼ）
ホスホトリエステラーゼ（ＰＴＥ、パラオキソナーゼ（ｐａｒａｏｘｏｎａｓｅ））は、毒性有機リン化合物を加水分解し、そして種々の組織から単離されてる酵素である。この酵素は、鳥類および昆虫には欠失しているようであるが、哺乳動物に豊富にあり、このこ有機リン化合物に対する鳥類および昆虫の減少した許容性を説明する（Ｖｉｌａｎｏｖａ，Ｅ．およびＳｏｇｏｒｂ，Ｍ．Ａ．（１９９９）Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．２９：２１−５７）。ホスホトリエステラーゼは、哺乳動物による殺虫剤の解毒において中心的な役割を果たす。ホスホトリエステラーゼ活性は、個体間で変化し、そして成人よりも乳児において低い。ノックアウトマウスは、有機ホスフェートベースの毒素、ジアゾキソン（ｄｉａｚｏｘｏｎ）およびクロルピリホソキソン（ｃｈｌｏｒｐｙｒｉｆｏｓｏｘｏｎ）に対して顕著に感受性である（Ｆｕｒｌｏｎｇ，Ｃ．Ｅ．，ら（２０００）Ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ  ２１：９１−１００）。ＰＴＥは、農薬および殺虫剤に加えて、有機ホスフェート含有化学廃棄物および戦争に使用される薬剤（例えば、パラチオン）の解毒を可能にする酵素として魅力的な興味を有する。いくつかの研究はまた、アテローム性動脈硬化症およびリポタンパク質代謝に関係する疾患におけるホスホトリエステラーゼに関係する。
【００８１】
（チオエステラーゼ）
脂肪酸の生合成に関係する２つの可溶性チオエステラーゼが哺乳動物組織から単離されており、１つは、長鎖脂肪アシルチオエステルに対してのみ活性であり、そしてもう１つは、広範囲の脂肪−アシルの鎖長のチオエステルに対して活性である。これらのチオエステラーゼは、脂肪酸のデノボ生合成における鎖終結工程を触媒する。鎖終結は、脂肪アシル鎖を、脂肪酸シンターゼアシルキャリアタンパク質（ＡＣＰ）サブユニットの４’−ホスホペンテテイン（ｐｈｏｓｐｈｏｐａｎｔｅｔｈｅｉｎｅ）補欠分子族に連結するチオエステル結合の加水分解に関係する（Ｓｍｉｔｈ，Ｓ．（１９８１ａ）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．７１：１８１−１８８；Ｓｍｉｔｈ，Ｓ．（１９８１ｂ）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．７１：１８８−２００）。
【００８２】
Ｅ．ｃｏｌｉは、２つの可溶性チオエステラーゼを含み、長鎖アシルチオエステルに対してのみ活性なチオエステラーゼＩ（ＴＥＩ）および広範な鎖長特異性を有するチオエステラーゼＩＩ（ＴＥＩＩ）である（Ｎａｇｇｅｒｔ，Ｊ．ら（１９９１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：１１０４４−１１０５０）。Ｅ．ｃｏｌｉ  ＴＥＩＩは、  哺乳動物チオエステラーゼのこの２つの型のいずれとも配列類似性を示さず、このチオエステラーゼは、デノボでの脂肪酸生合成における鎖終結酵素として機能する。哺乳動物チオエステラーゼとは異なり、Ｅ．  ｃｏｌｉ  ＴＥＩＩは、特徴的なセリン活性部位ｇｌｙ−Ｘ−ｓｅｒ−Ｘ−ｇｌｙ配列モチーフを欠き、そしてセリン改変剤であるジイソプロピルフルオロホスフェートによって不活性化されない。しかし、ヨードアセトアミドおよびジエチルピロカルボネートによるヒスチジン５８の改変は、ＴＥＩＩ活性を消滅させた。ＴＥＩＩの過剰発現は、Ｅ．Ｃｏｌｉにおける脂肪酸含量を変更せず、このことは、それが、脂肪酸生合成における鎖終結酵素として機能しないことを示唆する（Ｎａｇｇｅｒｔら，前出）。この理由のために、Ｎａｇｇｅｒｔら（前出）は、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＴＥＩＩについての生理学的基質が、ＡＣＰ−ホスホパンテテイン−脂肪酸エステルの代わりに、補酵素Ａ（ＣｏＡ）−脂肪酸エステルであり得ることを提案した。
【００８３】
（カルボキシルエステラーゼ）
哺乳動物カルボキシルエステラーゼは、種々の組織および細胞型で発現される多重遺伝子ファミリーを構成する。イソチームは、有意な配列相同性を有し、そしてアミノ酸配列に基づいて主に分類される。アセチルコリンエステラーゼ、ブチリルコリンエステラーゼ、およびカルボキシエステラーゼは、エステラーゼのセリンスーパーファリミー（Ｂ−ｅｓｔｅｒａｓｅｓ）に分類される。他のカルボキシルエステラーゼとしては、サイログロブリン、トロンビン、第ＩＸ因子、グリオタクチン、およびプラスミノゲンが挙げられる。カルボキシルエステラーゼは、分子からのエステルおよびアミド基の加水分解を触媒し、そして薬物、環境毒、および発癌物質の解毒に関係する。カルボキシルエステラーゼに対する基質としては、短鎖および長鎖のアシルグリセロール、アシルカルニチンカルボネート、塩酸ジピベフリン、コカイン、サリチル酸塩、カプサイシン、パルミトイル−補酵素Ａ、イミダプリル、ハロペリドール、ピロリジジンアルカロイド、ステロイド、酢酸ｐ−ニトロフェニル、マラチオン、ブタニリカイン、およびイソカルボキシアジドが挙げられる。これらの酵素は、しばしば低い基質特異性を示す。カルボキシルエステラーゼはまた、プロドラッグのそれらの各々の遊離酸への転換のために重要であり、この遊離酸は、薬物の活性形態であり得る（例えば、ロバスタチン、血中コレステロールを低下させるために使用される）（Ｓａｔｏｈ，Ｔ．およびＨｏｓｏｋａｗａ，Ｍ．（１９９８）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．３８：２５７−２８８に総説される）。
【００８４】
ニューロリギン（ｎｅｕｒｏｌｉｇｉｎ）は、（ｉ）Ｎ末端シグナル配列を有し、（ｉｉ）細胞表面レセプターに類似し、（ｉｉｉ）カルボキシエステラーゼドメインを含み、（ｉｖ）脳において高度に発現され、そして（ｖ）カルシウム依存的な様式でニューレキシン（ｎｅｕｒｅｘｉｎ）に結合する分子のクラスである。カルボキシエステラーゼへの相同性にも関わらず、ニューロリギンは、活性部位セリン残基を欠き、このことは、触媒よりむしろ基質結合における役割を意味する（Ｉｃｈｔｃｈｅｎｋｏ，Ｋ．ら（１９９６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：２６７６−２６８２）。
【００８５】
（スクワレンエポキシダーゼ）
スクワレンエポキシダーゼ（スクワレンモノオキシゲナーゼ、ＳＥ）は、ミクロソーム膜結合性の、ＦＳＤ依存性オキシドレダクターゼであり、これは、真核生物細胞のステロール生合成経路における最初の酸素付加工程を触媒する。コレステロールは、ＬＤＬレセプター媒介経路または生合成経路を介して獲得される細胞質膜の必須な構造成分である。後者の場合において、コレステロール分子中の全ての２７個の炭素原子は、アセチル−ＣｏＡ由来である（Ｓｔｒｙｅｒ，Ｌ．，前出）。ＳＥは、スクワレンを、２，３（Ｓ）オキシドスクワレンに転換し、これは、次いで、ラノステロールに転換され、次いで、コレステロールに転換される。コレステロールの生合成に関連する工程は、以下に要約される（Ｓｔｒｙｅｒ，Ｌ（１９８８）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．Ｗ．Ｈ  Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．，Ｉｎｃ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ．５５４−５６０頁およびＳａｋａｋｉｂａｒａ，Ｊ．ら（１９９５）  ２７０：  １７−２０）：
アセテート（アセチル−ＣｏＡから）  ？  ３−ヒドロキシ−３−メチル−グルタリルＣｏＡ  ？  メバロネート  ？  ５−ホスホメバロネート  ？  ５−ピロホスホメバロネート  ？  イソペンテニルピロホスフェート  ？  ジメチルアリルピロホスフェート  ？  ゲラニルピロホスフェート  ？  ファルネシルピロホスフェート  ？  スクワレン  ？  スクワレンエポキシド  ？  ラノステロール  ？  コレステロール。
コレステロールは、真核生物細胞の生存のために必須であるが、異常に高い血清コレステロールレベルは、高等生物の動脈におけるアテローム性動脈硬化症性のプラークの形成を生じる。本質的な血管（冠状動脈）の壁上への高度に不溶性脂質物質の堆積は、減少した血流および適切な血流が妨げられた組織の潜在的な壊死を生じる。ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼは、３−ヒドロキシル−３−メチルグルタリルＣｏＡ（ＨＭＧ−ＣｏＡ）のメバロネートへの転換に関与し、これは、コレステロールの生合成における第一の約束された工程を表す。ＨＭＧ−ＣｏＡは、形質コレステロールレベルを低下させるように設計された多くの薬学的組成物の標的である。しかし、ＭＨＧ−ＣｏＡの阻害はまた、他の生化学的経路に必要とされる非ステロール中間体（例えば、メバロネート）の減少した合成を生じる。ＳＥは、ステロール合成経路において後に起こる速度制限反応を触媒し、そしてコレステロールは、ＳＥによって触媒される工程に続く経路のただ１つの最終の生成物である。結果として、ＳＥは、他の必要な中間体をの減少を引き起こさない抗高脂血症薬物の設計のための理想的な標的である（Ｎａｋａｍｕｒａ，Ｙ．ら（１９９６）２７１：８０５３−８０５６）。
【００８６】
（エポキシドヒドロラーゼ）
エポキシドヒドロラーゼは、エポキシド含有化合物への水の添加を触媒し、それによってエポキシドを、それらの対応する１，２−ジオールに加水分解する。それらは、細菌性ハロアルカンデハロゲナーゼに関係し、そして酵素のα／βヒドラーゼ折り畳みファミリーの他のメンバー（例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｕｒｅｏｆａｃｉｅｎｓ由来のブロモペルオキシダーゼＡ２、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ由来のヒドロキシムコン酸セミアルデヒドヒドロラーゼ、およびＸａｎｔｈｏｂａｃｔｅｒ  ａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ由来のハロアルカンデハロゲナーゼ）への配列類似性を示す。エポキシエヒドラーゼは、本来広範に分布し、そして哺乳動物、無脊椎動物、植物、真菌および細菌において見出されている．この酵素のファミリーは、生体異物エポキシド化合物の解毒に重要であり、この化合物は、生物に導入された場合に、しばしば、高度に求電子的であり、そして破壊的である。エポキシヒドロラーゼ反応の例としては、以下が挙げられる：シス−９，１０−エポキシオクタデカ−９（Ｚ）−エン酸（ロイコトキシン）を加水分解して、その対応するジオールであるスレオ−９，１０−ジヒドロキシオクタデカ−１２  （Ｚ）−エン酸（ロイコトキシンジオール）を形成すること、およびシス−１２，１３−エポキシオクタデカ−９（Ｚ）−エン酸（イソロイコトキシン）を加水分解して、その対応するジオールであるスレオ−１２，１３−ジヒドロキシオクタデカ−９（Ｚ）−エン酸（イソロイコトキシンジオール）を形成すること。ロイコトキシンは、膜透過性およびイオン輸送を変更し、そして炎症反応を引き起こす。さらに、エポキシド発癌物質は、薬物および環境毒の解毒における中間体としてのシトクロムＰ４５０によって生成されることが知られている。
【００８７】
これらの酵素は、Ａｓｐ（求核性試薬）、Ａｓｐ（ヒスチジン支持酸）、および（水活性化ヒスチジン）から構成される触媒性の三つ組を有する。エポキシドヒドラーゼの反応機構は、標的分子のエポキシド環の１級炭素原子上のＡｓｐ残基の１つの求核的攻撃によって開始される、共有結合エステル中間体を介して進行し、共有結合エステル中間体に導く（Ｍｉｃｈａｅｌ  Ａｒａｎｄ，Ｍ．ら（１９９６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：４２２３−４２２９；Ｒｉｎｋ，Ｒ．ら（１９９７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：１４６５０−１４６５７；Ａｒｇｉｒｉａｄｉ，Ｍ．Ａ．ら（２０００）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：１５２６５−１５２７０）。
【００８８】
（チロシン触媒に関係する酵素）
スクシネート、およびピルベートまたはフマレート、およびアセトアセテートのいずれかへのアミノ酸であるチロシンの分解は、多数の酵素を必要とし、そして多数の中間体化合物を生成する。さらに、多くの生体異物化合物は、チロシン異化作用経路の一部である１つ以上の反応を使用して代謝され得る。この経路は、細菌において主に研究されているが、チロシン分解は、種々の生物において起こることが知られており、そして同じ生物学的反応の多くに関係しているようである。
【００８９】
チロシンのスクシネートおよびピルベートへの分解に関係する酵素としては以下が挙げられる（例えば、Ａｒｔｌｉｒｏｂａｃｔｅｒ種において）：４−ヒドロキシフェニルピルビン酸オキシダーゼ、４−ヒドロキシフェニルアセテート３−ヒドロキシラーゼ、３，４−ジヒドロキシフェニルアセテート２，３−ジオキシゲナーゼ、５−カルボキシメチル−２−ヒドロキシムコン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ、トランス，シス−５−カルボキシメチル−２−ヒドロキシムコン酸イソメラーゼ、ホモプロトカテチュ酸イソメラーゼ／デカルボキシラーゼ、シス−２−オキソヘプタ−３−エン−１、７−ジオエートヒドラターゼ、２，４−ジヒドロキシヘプタ−トランス−２−エン−１，７−ジオエートアルドラーゼ、およびコハク酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ。
【００９０】
フマレートおよびアセトアセテートへのチロシンの分解に関係する酵素は、以下を含む（例えば、Ｐｓｅｕｄｏｎｔｏｎａｓ種において）：４−ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼ、ホモゲンチシン酸１，２‐ジオキシゲナーゼ、マレイルアセトアセテートイソメラーゼ、およびフマリルアセトアセタアーゼ。４−ヒドロキシフェニル酢酸１−ヒドロキシラーゼがまた、コハク酸／ピルビン酸経路からの中間体が受け入れられる場合、関係し得る。
【００９１】
異なる生物におけるチロシン代謝に関係するさらなる酵素としては、４−クロロフェニルアセレート−３，４−ジオキシゲナーゼ、芳香族アミノトランスフェラーゼ、５−オキソペンタ−３−エン−１，２，５−トリカルボン酸デカルボキシラーゼ、２−オキソ−ヘプタ−３−エン−１，７−ジオエートヒドラターゼ、および５−カルボキシメチル−２−ヒドロキシムコン酸イソメラーゼが挙げられる（Ｅｌｌｉｓ，Ｌ．Ｂ．Ｍ．ら（１９９９）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２７：３７３−３７６；Ｗａｃｋｅｔｔ，Ｌ．Ｐ．およびＥｌｌｉｓ，Ｌ．Ｂ．Ｍ．（１９９６）Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｍｅｔｈ．２５：９１−９３；およびＳｃｈｍｉｄｔ，Ｍ．（１９９６）Ａｍｅｒ．Ｓｏｃ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｎｅｗｓ  ６２：１０２）。
【００９２】
ヒトにおいて、チロシン分解経路の酵素の後天的または遺伝的欠陥が、遺伝性チロシン血症を生じ得る。この疾患の１つの形態である遺伝性チロシン血症１（ＨＴ１）は、酵素フマリルアセトアセテートヒドロラーゼの欠失によって引き起こされ、この酵素は、チロシンをフマレートおよびアセチアセテートに代謝する生物におけるこの経路の最後の酵素である。ＨＴ１は、乳児期に始まる進行性の肝臓損傷および肝臓癌についての増加した危険性によって特徴付けられる（Ｅｎｄｏ，Ｆ．ら（１９９７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：２４４２６−２４４３２）。
【００９３】
１つの系の酵素は、数種の薬物および薬物代謝産物と作用し得る。薬物の代謝速度は、各系内の酵素的な多型の存在により、個体間および人種間で異なる。代謝の表現型は、代謝能が低い群（ｐｏｏｒ  ｍｅｔａｂｏｌｉｚｅｒ）（ＰＭ）、代謝能が高い群（ｅｘｔｅｎｓｉｖｅ  ｍｅｔａｂｏｌｉｚｅｒ）（ＥＭ）、および極度に代謝能が非常に高い群（ｕｌｔｒａ−ｅｘｔｅｎｓｉｖｅ  ｍｅｔａｂｏｌｉｚｅｒ）（ＵＥＭ）として一般に特徴付けされている。代謝表現型の知識は、以下の理由で臨床学的に有用である：
１）表現型は、有毒な化学物質、疾患および癌に対する個体の感受性に相関し得ること；
２）表現型は、個体の安全な治療に有効な薬物処置レジメンを迅速に決定するための有用な情報を医者に提供し得ること；および
３）個体の表現型は、治療薬物の設計のための有用な理論的根拠を提供し得ること。
【００９４】
これまで、個体の表現型、薬物処置適合性および感受性を同定する目的で、複数の表現型決定基を特徴付けするための能力は、複数の代謝経路の複雑さ、およびこれらの決定をするための有効かつ効果的な手順の欠如によって制限されてきた。現在、所定の代謝酵素に関する個体の表現型の決定は、直接的な代謝表現型決定または所定の表現型に対する個体の遺伝子型の間接的な推定のいずれかによって実施され得る。
【００９５】
直接的な表現型決定は、所定の酵素によって代謝されることが公知のプローブ基質の使用を含む。プローブ基質の代謝速度が測定され、そしてこの代謝速度は、代謝表現型を決定するために使用される。直接的な表現型決定のための激しい労働および費用がかかる手順は、長年の間知られており、これらの手順は、臨床環境に容易に適合可能でもないし、複数の表現型決定基を測定するために実用的でもない。例えば、酵素表現型は、高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、キャピラリー電気泳動（ＣＥ）または立体選択的キャピラリーガスクロマトグラフィーにより、個体由来の尿サンプル中の薬物またはプローブ基質の代謝のモル（またはキラル）比を測定することによって決定され得る。これらの測定方法は、時間を消費し、煩雑であり、そして臨床実験において容易に利用可能でないシステムおよび装置を用いる。複数の代謝表現型の決定基の迅速な決定のための方法論は、利用可能ではなく、結果として、個体の表現型に関する有用な情報は、臨床環境において慣用的な基礎に基づいて考慮されない。
【００９６】
間接的な表現型決定は、非機能的な測定に基づいて表現型を割り当てることとして定義される。これらの非機能的な測定としては、遺伝子型決定、ハプロタイプ決定、遺伝子の発現およびタンパク質の発現分析が挙げられる。特許出願ＷＯ００／６３６８３号は、上記の分析を実施するために開発された種々の方法の広範な記載を提供する。
【００９７】
遺伝子型決定は、ポリメラーゼ連鎖反応アッセイ（ＰＣＲ）または制限酵素断片長の多型アッセイ（ＰＣＲ−ＲＦＬＰ）を用いるＰＣＲによって、特定の酵素をコードする遺伝子の遺伝子配列を分析することによって実施される。この遺伝子は、増加または減少した酵素のレベルまたは活性に関連し得る、遺伝子の変異の存在について試験され、これにより、特定の表現型（すなわち、代謝が遅い群（ｓｌｏｗ  ｍｅｔａｂｏｌｉｚｅｒ）  対  代謝が速い群（ｆａｓｔ  ｍｅｔａｂｏｌｉｚｅｒ））を生じる。この遺伝子型は、個体の遺伝子型が測定されるべきものの理論的測定である。ハプロタイプ決定は、異なる遺伝子の対立遺伝子の遺伝子型が考慮される、遺伝子型決定の延長である。例えば、ヒトが野生型（ｗｔ）遺伝子配列および１つの変異体（ｍｔ）遺伝子配列を有する場合、この個体は、ｗｔ／ｍｔハプロタイプを有する。遺伝子の発現およびタンパク質の発現分析は、それぞれ、ｍＲＮＡ／ｃＤＮＡおよびタンパク質レベルの測定として定義される。
【００９８】
間接的な表現型決定は、結果として、理論的な表現型の変化により生じ得るいくつかの因子により制限され得る。例えば、遺伝子型が常に表現型と相関しているわけではないことは、十分に確立されており、同様に、遺伝子の発現は、常にタンパク質の発現と相関しているわけではなく、そしてタンパク質の発現は、常にタンパク質の機能と相関しているわけではない。間接的な表現型決定は、タンパク質の機能（翻訳後のタンパク質改変、多剤療法、および誘発因子またはインヒビターへの曝露が挙げられるが、これらに限定されない）に影響を与える多くの因子の原因ではない。さらに、他の限定因子としては、完全な遺伝子型決定を実施する潜在的な複雑さを含む。変異配列が、遺伝子型決定アッセイにおいて試験され得る前に、まず、この変異配列が、同定されなければならない。同定に続いて、この変異は、表現型に対する決定的な効果と連結されなければならない。ある酵素に関して、変異は非常に少ないようであり、そして発見された酵素は、十分特徴付けされ、一方、ある酵素に関して、複数の変異が、規則的に見出される新しい変異を伴なって存在する（例えば、ＣＹＰ２Ｄ６は、５３個以上の変異を有し、そして４８個の対立遺伝子変異体を有する）。従って、ＣＹＰ２Ｃ１９の遺伝子型決定は、比較的少ない測定を用いて実施され得るが、ＣＹＰ２Ｄ６の完全でかつ正確な遺伝子型決定は、複雑であり、そして複数の測定を必要とする。
【００９９】
間接的な表現型決定は、複雑であり、そして直接的な表現型決定技術は、臨床設定に対して容易にアクセスされない。
【０１００】
医者は、代謝に関する、個体の代謝能力（表現型）または代謝の遺伝子型の知識なしで、処置レジメンを慣用的に指示する。従って、試行錯誤の処置レジメンが、しばしば、重篤な副作用および有用な処置時間の損失を犠牲にして始められる。
【０１０１】
薬物治療に対する個体の応答（治療の効果および副作用の発生の両方）を予測するための方法の必要性は、当業者によって認識されている。薬物の代謝の重要性は、以下のように説明され得る。特定の系の阻害が毒性を導く場合、この系の成分の低い遺伝子発現またはタンパク質発現は、毒性の高い危険性を有する個体を同定するために使用され得る。同様に、高い発現レベルを有する個体は、危険性が低いと考えられる。しかし、危険性が低い個体として分類された個体がまた、薬物の低い代謝を有する場合、この薬物は、かなり長期間、この系に残ったままであり、そしてこの系の機能を除去するための時間を有し、結果として、毒性に導く。逆に、個体が、低い系の活性を有するが、薬物代謝が速い群である場合、この系を阻害することによって、任意の所定の位置に存在する十分な薬物が存在せず、毒性を誘導する可能性がある。従って、個体の薬物代謝の能力の知識は、個体の薬物治療の本質的な成分である。
【０１０２】
個体ベースにおいて、複数の代謝表現型決定基を迅速かつ正確に同定する能力は、個体のために安全でかつ有効な処置レジメンを選択するのに迅速に適用され得る、有用な個体特異的情報を医者に提供する。同様に、複数の決定基の代謝表現型の知識はまた、研究開発および薬物開発のおける有用な適用を見出す。特に、個体の表現型は、薬物処置実験の前に同定され得る。さらに、複数の決定基の代謝表現型の知識は、新規の薬物の開発（いわゆる、合理的な薬物設計）の開発における適用を有する。
【０１０３】
（発明の要旨）
本発明の１つの目的は、Ｎ−（アリール置換）−ナフタリドイミド（Ｎ−（ａｒｙｌ  ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｄ）−ｎａｐｈｔｈａｌｉｄｉｍｉｄｅ）化合物のクラスを用いた処置の個別化のための方法を提供することである。
【０１０４】
本発明の別の目的は、薬物アモナフィドを用いた処置の個別化のための方法を提供することである。
【０１０５】
本発明の別の目的は、複数決定基の代謝表現型を使用して、Ｎ−（アリール置換）−ナフタリドイミド化合物のクラスの個体に対する処置レジメンを個別化する方法を提供することであり、ここで、個体の複数決定基の代謝表現型が、決定され；そしてＮ−（アリール置換）−ナフタリドイミド化合物のクラスの安全かつ治療的に有効な用量が、個体の複数決定基の代謝表現型に基づいて決定されそして／または選択される。
【０１０６】
本発明の別の目的は、複数決定基の代謝表現型を使用して、アモナフィドの個体に対する処置レジメンを個別化する方法を提供することであり、ここで、個体の複数決定基の代謝表現型が、決定され；そしアモナフィドの安全かつ治療的に有効な用量が、個体の複数決定基の代謝表現型に基づいて決定されそして／または選択される。
【０１０７】
本発明の別の目的は、Ｎ−（アリール置換）−ナフタリドイミド化合物のクラスで処置可能な状態を有する個体を処置する方法を提供することであり、この方法は以下：個体の複数決定基の代謝表現型を決定するための工程；ならびに個体に安全で、かつ治療有効用量のＮ−（アリール置換）−ナフタリドイミド化合物を投与する工程を包含し、ここで、この用量は、複数決定基の代謝表現型によって表される場合、Ｎ−（アリール置換）−ナフタリドイミド化合物のクラスの個体の代謝表現型に対応する個体の代謝プロフィールに基づいて決定される。
【０１０８】
本発明の別の目的は、アモナフィドで処置可能な状態を有する個体を処置する方法を提供することであり、この方法は以下：個体の複数決定基の代謝表現型を決定する工程；ならびに個体に安全で、かつ治療有効用量のアモナフィドを投与する工程を包含し、ここで、この用量は、複数決定基の代謝表現型によって表される場合、アモナフィドの個々の代謝表現型に対応する個体の代謝プロフィールに基づいて決定される。
【０１０９】
本発明の別の目的は、生物学的サンプル中の酵素特異的代謝産物の存在を検出するためのアッセイシステムを提供することであり、この生物学的サンプルは、この代謝産物の代謝経路に特異的な、Ｎ−（アリール置換）−ナフタリドイミド化合物のクラスの公知の量の少なくとも１つのプローブ基質で処置された個体から得られ、このアッセイは、以下：生物学的サンプルを受容するための手段であって、この手段は、生物学的サンプルに含まれる多数の親和性複合体化因子を含む、手段；この親和性複合体化因子に結合した酵素特異的代謝産物の存在を検出するための手段；および対応する表現型決定基を提供するために代謝産物の比率を定量する手段を含み、ここで、この表現型決定は、個体の代謝表現型プロフィールを提供する。
【０１１０】
本発明の別の目的は、生物学的サンプル中の酵素特異的代謝産物の存在を検出するためのアッセイシステムを提供することであり、この生物学的サンプルは、この代謝産物の代謝経路に特異的な、アモナフィドの公知の量の少なくとも１つのプローブ基質で処置された個体から得られ、このアッセイは、以下：生物学的サンプルを受容ための手段であって、この手段は、生物学的サンプルに含まれる多数の親和性複合体化因子を含む、手段；この親和性複合体化因子に結合した酵素特異的代謝産物の存在を検出するための手段；および対応する表現型決定基を提供するために代謝産物の比率を定量する手段を含み、ここで、この表現型決定基は、個体の代謝表現型プロフィールを提供する。
【０１１１】
本発明の別の目的は、Ｎ−（アリール置換）−ナフタリドイミド化合物のクラスでの処置の個別化のために、酵素特異的アッセイを使用する方法を提供することであり、この方法は、以下の工程を包含する：Ｎ−（アリール置換）−ナフタリドイミド化合物のクラスのプローブ基質で処置した個体から得られる生物学的サンプルにおいて、表現型決定基を同定するためにアッセイする工程；この決定基に従って薬物代謝の速度を決定する工程；ならびにこの代謝速度に基づいて、個体のために、安全でかつ治療有効用量のＮ−（アリール置換）−ナフタリドイミド化合物のクラスを決定する工程および／または選択する工程。
【０１１２】
本発明の別の目的は、アモナフィドでの処置の個別化のために、酵素特異的アッセイを使用する方法を提供することであり、この方法は、以下の工程を包含する：アモナフィドのプローブ基質で処置した個体から得られる生物学的サンプルにおいて、表現型決定基を同定するためにアッセイする工程；この決定基に従って薬物代謝の速度を決定する工程；ならびにこの代謝速度に基づいて、個体のために、安全でかつ治療有効用量のアモナフィドを決定する工程および／または選択する工程。
【０１１３】
本発明の別の目的は、Ｎ−（アリール置換）−ナフタリドイミド化合物のクラスでの処置のために複数の個体をスクリーニングする方法を提供することであり、この方法は、以下の工程を包含する：Ｎ−（アリール置換）−ナフタリドイミド化合物のクラスの毒性を促進することが公知の、少なくとも１つの対立遺伝子バリエーションを欠く個体を同定するために、個体を遺伝子型決定する工程；およびＮ−（アリール置換）−ナフタリドイミド化合物のクラスを代謝するために有効として特徴付けられた、代謝表現型を有する個体を選択する工程。
【０１１４】
本発明の別の目的は、アモナフィドでの処置のために複数の個体をスクリーニングする方法を提供することであり、この方法は、以下の工程を包含する：アモナフィドの毒性を促進することが公知の、少なくとも１つの対立遺伝子バリエーションを欠く個体を同定するために、個体を遺伝子型決定する工程；およびアモナフィドを代謝する各個体の能力を決定するために有効として特徴付けられた、代謝表現型を有する個体を選択する工程。
【０１１５】
候補薬物処置の治療効果を評価する薬物処置試験において、関与した複数の個体をスクリーニングする方法であって、この方法は、以下の工程を包含する：薬物の毒性を促進することが公知の、少なくとも１つの対立遺伝子バリエーションを欠く個体を同定するために、個体の各々を遺伝子型決定する工程；および薬物を代謝するために、前工程で同定した個体の複数決定基の代謝表現型を特徴付けする工程。
【０１１６】
本発明の別の目的は、非毒性プローブ薬物を使用して、個体のＮＡＴ２−特異的表現型決定基を決定して、薬物アモナフィドに対して罹患しやすい代謝能力を予測する方法を提供することである。従って、同定した薬物を代謝する個体の能力に関する有用な情報を提供し、そして同定した薬物に対する毒性応答の可能性を予測する。このようにして、本発明は、アモナフィドを代謝する代謝能力について個体をスクリーニングし、そして対応する表現型特異的投薬レジメンを決定するために、容易に使用され得る。
【０１１７】
従って、本発明の別の目的は、薬物アモナフィドに関する個体の処置レジメンを選択するための方法を提供することである。
【０１１８】
本発明のなお別の目的は、アモナフィド処理の臨床処置試験のために候補者を選択するための方法を提供することである。
【０１１９】
本発明のなお別の目的は、アモナフィドでの処置の個別化のために、複数決定基の表現型決定を使用する方法を提供することである。
【０１２０】
本発明の１つの局面に従って、薬物での処置の個別化の方法が提供され、ここで、薬物投薬量は、個体に基づいて決定され；この方法は以下の工程を包含する：ａ）個体を表現型決定し、この薬物を代謝する能力を決定する工程；およびｂ）この薬物の有効量を計算し、この個体に特異的な薬物代謝の速度に対応して、この個体に対して処方する工程。
【０１２１】
本発明の別の局面に従って、アモナフィドでの処置の個別化のために、ＮＡＴ２−特異的ＥＬＩＳＡ（酵素結合イムノソルベント検定法）を使用する方法を提供し、この方法は、以下の工程：ａ）プローブ基質を用いて処置した個体から得られる生物学的サンプルにおいて、ＮＡＴ２−特異的決定基を同定するためにＥＬＩＳＡを行う工程；ｂ）少なくともこのＮＡＴ２−特異的決定基に従って、薬物代謝の速度を計算する工程；およびｃ）薬物代謝の速度に対応して、アモナフィドの個体投薬量を決定する工程を包含し、ここで、薬物代謝の速度は、このプローブ基質の代謝の速度に対応し、そしてこの個体におけるアモナフィドの速度を指示するものである。
【０１２２】
本発明のさらなる局面に従って、アモナフィドを用いた処置の個別化のために、複数の表現型決定基に特異的なＥＬＩＳＡ（酵素結合イムノソルベント検定法）を使用し、そしてＮＡＴ２およびＣＹＰ１Ａ２の表現型決定基を含む方法を提供し、この方法は、以下：ａ）プローブ基質を用いて処置した個体から得られる生物学的サンプルにおいて、この複数の表現型決定基を決定するためにＥＬＩＳＡを行う工程；ｂ）少なくともＮＡＴ２−およびＣＹＰ１Ａ２−特異的決定基に従って、薬物代謝の速度を計算する工程；およびｃ）薬物代謝の速度に対応して、アモナフィドの個体投薬量を決定する工程を包含し、ここで、薬物代謝の速度は、個体におけるアモナフィドの代謝の速度を指示するものである。
【０１２３】
本発明のなお別の局面に従って、アモナフィドを用いて個体を選択的に処置する方法を提供し、この方法は、以下：ａ）アモナフィドの毒性を促進することが公知の、少なくとも１つの対立遺伝子バリエーションを欠く個体を同定するために、個体を遺伝子型決定し、そして候補処置グループからこれらの個体を除去する工程；ｂ）この少なくとも１つの対立遺伝子バリエーションを欠くとして同定されたこれらの個体を表現型決定して、アモナフィドを代謝する各個体の能力を決定する工程；およびｃ）少なくとも１つの対立遺伝子バリエーションを欠く各々の個体に対して処方するために、この薬物の有効量を計算する工程を包含し、この有効量は、少なくともＮＡｔ２酵素に対して特異的な表現型決定基によって決定される場合に、薬物代謝の個体特異的な速度に対応し、ここで、少なくとも１つの対立遺伝子バリエーションを欠く個体の各々は、別個に決定された投薬量のアモナフィドを用いて処置される。
【０１２４】
本発明のなおさらなる局面に従って、薬物処置試験において関与した候補者をスクリーニングする方法を提供し、この方法は、以下：ａ）薬物の毒性を促進することが公知の、少なくとも１つの対立遺伝子バリエーションを同定するために、各候補者を遺伝子型決定し、そして試験グループからこれらの候補者を除去する工程；ｂ）この少なくとも１つの対立遺伝子バリエーションを欠くとして同定されたこれらの候補者を表現型決定して、この薬物を代謝する各候補者の能力を決定する工程；およびｃ）この試験のために、この薬物に対して有効な代謝速度を有すると同定された候補者を選択する工程を包含し、ここで、この有効な代謝速度は、この薬物を代謝することが公知の少なくとも１つの酵素に特異的な少なくとも１つの表現型決定基に基づいて、決定される。
【０１２５】
本発明のなおさらなる局面に従って、アモナフィドを用いて個体を選択的に処置する方法を提供し、この方法は、以下の工程を包含する：ａ）この個体を、アモナフィドのプローブ基質で処置した後に、アモナフィドで処置可能な状態を有すると同定された個体の生物学的サンプルにおいて、決定基特異的代謝産物を検出する工程；ｂ）このサンプル中の決定基特異的代謝産物の量に基づいて、少なくとも１つの表現型決定基を特徴付けする工程；ｃ）この少なくとも１つの表現型決定基が、効果的に代謝するアモナフィドに適する代謝表現型に対応するか否かを決定する工程；およびｄ）この個体がアモナフィド処置に適する場合に、この少なくとも１つの表現型決定基に従って計算されるような、個体の代謝速度に特異的な個体用量を決定する工程。本発明の目的のために、以下の用語が定義される。
【０１２６】
用語「表現型決定基」とは、個体の酵素特異的能力の定性的または定量的な指標を意味することが意図される。
【０１２７】
治療に関して本明細書中で示される場合に、用語「個別化」とは、個体ベースにおいて予め決定された式に従って計算される場合に、少なくとも個体の表現型に対して特異性を有する治療を意味することが意図される。
【０１２８】
用語「生物学的サンプル」とは、生物学的実体から得られるサンプルを意味することが意図され、以下が挙げられるが、これらに限定されない：組織、脳脊髄液、血漿、血清、唾液、血液、鼻粘膜、尿、滑液、マイクロキャピラリーマイクロダイアリシスおよび吸息。
【０１２９】
（本発明の詳細な説明）
本発明は、薬物処置の個別化のための代謝表現型の使用に関連する。詳細には、本発明は、Ｎ−（アリール置換）ナフタリドイミドと名付けられる化合物のクラスを使用する処置の個別化に関する。より詳細には、本発明は、薬物を代謝する個体の能力の表現型の性質に基いて薬物アモナフィド（ａｍｏｎｏｆｉｄｅ）を使用する処置の個別化に関連する。アモナフィドは、ＮＡＴ２およびＣＹＰ１Ａ２代謝経路によって代謝されることが知られる。本発明は、個体の特定の表現型を特徴付けるために使用され得るＮＡＴ２およびＣＹＰ１Ａ２経路に対する表現型決定基を素早くかつ正確に決定するための方法を提供する。さらに、本発明は、所定の薬剤を代謝する個体の能力を例証する、個体の表現型プロファイルを特徴付けるために使用される得る複数の表現型決定基を決定するための方法を提供する。多くの薬剤が、主要な酵素学的経路によって代謝されるが、しばしば、任意の所定の時期に起きる他の酵素学的な現象によって、この経路に対する個体の表現型が影響を受ける（例えば、阻害される）場合がある。結果として、対応する薬物処置療法を選択する前に、個体の表現型プロファイルを特徴付けるのが好まれ得る。個体の代謝表現型の知識は、所定の薬剤を代謝する個体の能力に基く表現型特定の用量を決定する際に、臨床的に適用され得る。薬物を代謝する個体の能力を示す他の因子はまた、治療の個別化を得るための表現型プロファイルと共に、本発明において適用を見出し得る。
【０１３０】
従って、本発明は、ＮＡＴ２に対する表現型決定基を決定する方法に従って例示される。ＮＡＴ２に対する代謝決定基の決定は、１つの決定方法または以下の酵素の内の少なくとも１つを含む任意の他の薬剤代謝酵素についての表現型プロファイルを決定する方法を組み合わせて実行され得る：ＮＡＴ１、ＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ２Ａ６、ＣＹＰ２Ｄ６、ＣＹＰ２Ｅ１、ＣＹＰ３Ａ４、ＣＹＰ２Ｃ９、およびＣＹＰ２Ｃ１９、ＵＧＴ、ＧＳＴ、ＳＴ。これらの酵素のいくつかのための最適なプローブ基質の代謝は、図１〜９に図解される。これらの酵素は、多くの薬剤の代謝に関連し、そして結果として、これらの酵素は、個体の薬剤処置療法、それ故に、臨床的な試行研究の結果に重要な関連がある。これらの酵素および本明細書中に記載されるこれらに対応する表現型決定基は、本発明の複数決定基の代謝表現型の例示の目的で、決定基の代表的な例として提供される。しかし、本発明は、それらに限定されない。
【０１３１】
本発明は、薬剤処置の個別化において使用するためのこれらの酵素学的経路の複数の表現型決定基を同定する能力を提供する。本発明は、Ｎ−（アリール置換）ナフタリドイミドと名付けられる化合物のクラスと共に、癌の個別化された処置の方法を提供する。特に、本発明は、薬剤アモナフィドと共に、癌の個別化された処置の方法を提供する。
【０１３２】
Ｎ−（アリール置換）ナフタリドイミドと名付けられる化合物のクラスの例の多くは、以下の特許に記載される；ＵＳ４６１４８２０；ＵＳ４６６５０７１；ＵＳ４５９４３４６；ＵＳ４９９２６６；ＵＳ４２０４０６３；およびＵＳ４８７４８６３、ならびに刊行物；Ｂｒａｎａら，１９９７，Ｊ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  ４０，４４９〜４５４；Ｂｒａｎａら，１９９９，Ｊ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  ４２，５４８２〜５４８６；Ｇａｍａｇｅら，２０００，Ｊ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  ４４，１４０７〜１４１５。多くのＮ−（アリール置換）ナフタリドイミドクラスの化合物のメンバー基本構造は、図１に例示される。本発明は、これらの特許に記載されるすべての化合物ならびにアリールアミノ−ナフタリドイミド、アリールヒドロキシ−ナフタリドイミドおよびそれらの全てのアシル誘導体が挙げられるが、これらに限定されない、この基本構造を有する他の全ての誘導体のための治療の個別化を含む。さらに、本発明は、全ての薬学的に受容可能な塩またはこれら化合物の組成物の個別化を含む。
【０１３３】
アモナフィド（ベンズイソキノリンジオン、ＮＳＣ３０８８４７）は、ナフタリン酸（ｎａｐｈｔａｌｉｃ  ａｃｉｄ）のイミド誘導体である。ナフタリン酸は、細胞複製に阻害的な効果があるので、興味深い。ナフタリン酸の側鎖が、末端に窒素を有する２つのメチレン基からなる場合、ナフタリン酸の細胞毒性の活性は、最大になる。アモナフィドは、この必要条件を満たし、そしてＬ１２１０およびｐ３８８白血球細胞株ならびにＢ１６メラノーマおよびＭ５０７６肉腫細胞株に対して有意な活性を実証する。アモナフィドは、部位特異的な挿入薬剤であり、トポイソメラーゼＩＩインヒビターである（Ｗａｒｎｉｎｇら，（１９７９）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．７：  ２１７〜２３０；Ｈｓｉａｎｇら，（１９８９）Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．３６：３７１〜３７６）。
【０１３４】
マウス、イヌおよびラットにおける臨床毒性試験は、アモナフィドが、可逆性の造血性毒性、消化系毒性、腎臓の毒性および肝臓の毒性を産生することを示す。さらに、神経毒性を示す兆候は、イヌにおいて１回の大量瞬時投与および毎日高用量を５日間投与する計画の両方で見られた。
【０１３５】
（臨床的な薬理学）
Ｎ−アセチル化は、芳香族の薬剤およびヒヂラジン薬剤の代謝のための重要な経路である（ＷｅｂｅｒおよびＨｅｉｎ（１９８５）Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｒｅｖ．３７：２５〜７９）。Ｎ−アセチル化によって代謝され、通常使用される薬剤の例として、プロカインアミド、ダプソン、アミノグルテチミド、イソニアジド、ヒドララジン、サルファサラジンおよびカフェインが挙げられる。アセチル化群（ａｃｅｔｙｌａｔｏｒ）の表現型は、北アメリカ人の集団において優性である遅い表現型（ホモ接合性）に対する対立遺伝子を有する、常染色体の遺伝である。アセチル化が遅い群の推定発生率は、６０％であり、アセチル化が迅速な（ｒａｐｉｄ）群かまたは未定のアセチル化群かのいずれかを考慮に入れて、残りは４０％である。真のアセチル化が「迅速な」群は、通常の迅速ではない対立遺伝子に対してホモ接合体（５％の集団）である。ここで、未定の表現型（いくつかの著者から迅速なと呼ばれる）は、約３５％の集団を含む、ホモ接合体である。アセチル化群の表現型は、有意な民族的かつ地理的な関連がある（ＷｅｂｅｒおよびＨｅｉｎ，上述；Ｃｌａｒｋ（１９８５）Ｄｒｕｇｓ  ２９：３４２〜３７５）。特に、アセチル化が遅い群の表現型は、東洋人およびエスキモー人において相対的に異常である（＜１０％）。ここで、中西部の集団は、ほとんど限定的にアセチル化が遅い群で構成される。
【０１３６】
予備的なヒト病理学的研究は、アモナフィドの分布量が多く、そして体組織に非常に結合されることを報告している。アモナフィドは、十分に代謝され、そして代謝産物は、血漿および尿の両方において検出される。アモナフィドは、Ｎ−アセチル化とＮ−酸化の両方によって代謝される（Ｆｅｌｄｅｒら，（１９８７）Ｄｒｕｇ  Ｍｅｔａｂ．Ｄｉｓｐｏｓ．１５：７７３〜７７８）。Ｎ−アセチル−アモナフィドは、親薬剤におよそ等位であり、ここで、Ｎ−オキシド−アモナフィドは、本質的に不活性であることが示されている（Ｆｅｌｄｅｒら，上述）。Ｎ−アセチル−アモナフィドが細胞毒性なので、アセチル化の程度は、試験された種々の用量に見られる薬物動態的なかつ毒性における可変性を説明し得る（Ｆｅｌｄｅｒら，上述）。
【０１３７】
第Ｉ相の研究は、ＵＴＳＡ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｔｅｘａｓ  ａｔ  Ｓａｎ  Ａｎｔｏｎｉｏ）（サンアントーニオーのテキサス大学）（Ｓａｅｚら，（１９８９）Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｏｎｃｏｌ．７：１３５１〜１３５８），ＯＳＵ（Ｏｈｉｏ  Ｓｔａｔｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）（オハイオ州立大学）（Ｌｅｉｂｙら，（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ａｍ．Ａｓｓｏｃ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２９：２７８）およびＭＤＡ（Ｍ．Ｄ．Ａｎｄｅｒｓｏｎ）（Ｌｅｇｈａら，（１９８７）  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｒｅａｔ．Ｒｅｐ．７１：１１６５〜１１６９）で実施された。１回の大量瞬時投与として行なわれた場合、最大耐量（ＭＴＤ）は、８００ｍｇ／ｍ２であった。用量限界毒性（ｄｏｓｅ−ｌｉｍｉｔｉｎｇ  ｔｏｘｉｃｉｔｙ）は、骨髄抑制であった（Ｓｅａｚら，上述）。１日５回の投薬が、２１日間与えられた場合、ＭＴＤは、４００ｍｇ／ｍ２であり（Ｌｅｇｈａら，上述）、または２５０ｍｇ／ｍ２であった（Ｌｅｉｂｙら，上述）。再び骨髄抑制は、用量限界毒性であった。他の報告された毒性は、吐き気、嘔吐および脱毛症の調節を緩和した。３つ全てのセンターは、迅速なアモナフィド注入による急性毒性を報告した。これは、局所炎症反応、発汗、顔面紅潮、耳鳴り、頭痛および／または眩暈からなった。注入の持続時間の１時間の延長は、これらの影響を最小にした。異なる投与計画に関して、スケジュールの依存性がないことが示された。大量瞬時投与用量ＭＴＤは、２つの研究と異なった。ＵＴＳＡのグループ（Ｓｅａｚら，上述）は、亜ＭＴＤ用量で、非常に不定でかつ個別化された造血性毒性を示したが、これらは、８００ｍｇ／ｍ２のＭＴＤに達した。ＯＳＵの研究（Ｌｅｉｂｙら，上述）は、１１２５ｍｇ／ｍ２のＭＴＤを示したが、かなりのかつ不定の毒性を示した。同じグループはまた、２８８ｍｇ／ｍ２を５日間投与する計画と、大量瞬時投与（１１２５ｍｇ／ｍ２）を比較し、そして、５日間投与する計画が、より多くの薬剤を与え得たので、好ましかったと結論した（Ｌｅｉｂｙら，上述）。別の５日間投与する計画で、ＭＤＡの研究（Ｌｅｉｂｙら，上述）は、４００ｍｇ／ｍ２のより高いＭＴＤを見出した。第ＩＩ相の推奨用量は、２００ｍｇ／ｍ２および４００ｍｇ／ｍ２であった（危険性が少ない個体において３００〜３２０ｍｇ／ｍ２）。
【０１３８】
１９９０年から１９９８年まで、３３回の第ＩＩ相試験および１回の第ＩＩＩ相試験が、Ｇｙｎｅｃｏｌｏｇｉｃ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  Ｇｒｏｕｐ  （ＧＯＧ），ｔｈｅ  Ｓｏｕｔｈ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  Ｇｒｏｕｐ  （ＳＷＯＧ），ｔｈｅ  Ｅａｓｔｅｒｎ  Ｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｅ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  Ｇｒｏｕｐ  （ＥＣＯＧ），ｔｈｅ  Ｃａｎｃｅｒ  ａｎｄ  １０  Ｌｅｕｋｅｍｉａ  Ｇｒｏｕｐ  Ｂ  （ＣＡＬＢＧ），およびｔｈｅ  Ｉｌｌｉｎｏｉｓ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｎｔｅｒ  Ｔｒｉａｌを含む異なるグループによって行なわれた。全部で９８１人の個体が、多くの腫瘍の型に対するアモナフィドを服用した。多くの研究に関して、アモナフィドの用量およびスケジュールは、３週間ごとに５日間、毎日３００ｍｇ／ｍ２であった。
【０１３９】
３回の第ＩＩ相の試験が、最初の化学療法の系として、転移性の乳癌において行なわれた：２人は、３時間以上で、８００〜９００ｍｇ／ｍ２の用量投与計画を４週間繰り返し（Ｋｎｒｎｅｋら，（１９９４）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃｎａｃｅｒ  ３０Ａ（３）：３９８〜４００）、そして１人は、３週間ごとに５日間連続して、毎日３００ｍｇ／ｍ２を４サイクルで投与し、続いてＣＡＦを投与した（Ｃｏｓｔａｎｚａら，（１９９５）Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１：６９９−７０４）。第ＩＩＩ相試験のみ、個体は、３週間ごとに５日間連続して１日４回３００ｍｇ／ｍ２を４サイクル投与され、続いてＣＡＦを投与された（Ｃｏｓｔａｎｚａら，（１９９９）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．１７（５）：１３９７〜１４０６）。アモナフィドは、進行型の乳癌を患う個人の処置のための活性な化合物であることが見出され、グレード３また４の血小板減少症を患う個体において１８％から５０％までの範囲の応答率を示した。
【０１４０】
ＮＡＴ２酵素多型性は、アモナフィドの代謝に重要な役割を担っているようである。１９９１年に、Ｒａｔａｉｎら（Ｒａｔａｉｎら，（１９９１）Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ．５０（５）：５７３〜５７９）は、アモナフィドで処置された癌の個体におけるプローブとして、カフェインを使用したアセチル化のための表現型の手順を調べた。アモナフィドとカフェインの両方のアセチル化が速い群およびアセチル化が遅い群が同定された。アセチル化代謝産物の産生は、骨髄抑制の主要な決定基の内の１つである、なぜなら、アセチル化が速い群は、アセチル化が遅い群よりも多くの毒性を有したからである（Ｒａｔａｉｎら，（１９９１）Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ．５０（５）：５７３〜５７９）。しかし、アモナフィドの血漿濃度−時間曲線下の領域は、アセチル化が速い群より有意に大きかった。アセチル化が速い群は、血漿濃度−時間曲線下でより高い間隔およびより低い領域を有することが予想される。これは、Ｎ−アセチル化によって代謝された他の薬物と比較して異常な発見であることを示した。多くの薬剤に関して、アセチル化が遅い群は、有害な現象に関して大きな危険を有する。インビトロの研究によって、アモナフィドが、ＣＹＰ１Ａ２の基質であり、そしてアモナフィドの酸化が、アセチル化代謝産物によって阻害されることが実証されたので、アモナフィドの予期しない挙動は、Ｎ−アセチル−アモナフィドによるアモナフィド酸化の阻害によるものであった（Ｒａｔａｉｎら，（１９９５）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．１３：７４１〜７４７）。アセチル化群の表現型に基いて、新しい推奨用量としては、アセチル化が遅い群（３７５ｍｇ／ｍ２／日）およびアセチル化が速い群（２５０ｍｇ／ｍ２／日）が提案される（Ｒａｔｅｉｎら，（１９９３）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５３：２３０４〜２３０８）。速い表現型は、グレード４毒性実験で予想され、そして遅い表現型は、投薬下で、有意であり得るので、３００ｍｇ／ｍ２の固定された用量のアモナフィドは、全ての個体に対して不適切であると考えられた（Ｒａｔｅｉｎら，（１９９１）Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ．５０（５）：５７３〜５７９）。これらの新しい用量レベルで、毒性における有意な個人間の可変性もあるので、次の研究は、アモナフィドの投薬を個別化するための薬力学的なモデルの開発を試みた。最適なモデルは、アセチル化群の表現型、前処理白血球細胞の計測（ＷＢＣ）および性別によって定義された（Ｒｅｔａｉｎら、（１９９６）Ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｅｉｔｃｓ  ６：９３〜１０１）。
【０１４１】
対照的に、本発明の実施形態は、ＮＡＴ２表現型間に計算された個体のモル比の定量値に直接的な関連におけるアモナフィドを使用した、投薬の個別化を提供する。従って、投薬は、薬剤を代謝する個体特定の能力を説明するために、分類化とは対照的に、個別化され得る。さらに、本発明は、複数の表現型決定基（特に、ＣＹＰ１Ａ２の機能）のモニタリングを可能にする。複数の表現型決定基の分析は、アモナフィドの代謝におけるＮ−アセチル化（ＮＡＴ２）とＮ−酸化（ＣＹＰ１Ａ２）の両方の役割の結果として、個別化において本質的な役割を担い得る。
【０１４２】
さらに、本発明は、特定の遺伝子型を有する個体を同定するために間接的な表現型の使用を記載する。特定の遺伝子型は、アモナフィド毒性の極めて高危険性に関連する。本発明のこの実施形態に従って、「高危険性」遺伝子型を有しない個体は、表現型であり、そしてこれらの個体のモル比に従って、投薬される。高危険性個体は、アモナフィドを処方されない。アモナフィドでの処置のための個体の表現型のスクリーニングのために表現型を組み合わせた遺伝子型の使用によって、高危険性遺伝子型のキャリアであると見出されたこれらの個体は、表現型を必要とせず、このような処置の候補として排除される。
【０１４３】
表現型を使用する個体のスクリーニングは、試行の前に、目的の安全かつ効果的な薬剤を代謝する能力を示すこれら個体の選択を実行し得るので、薬剤開発プロセスへの表現型試験の統合は、薬剤処置試験試行において関与する個体数の減少を可能にする。特に、薬剤処置試行に代謝的に不適合であるとして同定されたこれら個体は、薬剤での処置を行なう前にスクリーニングされ得る。本発明のこの局面は、安全に薬剤を代謝する能力を有するとして同定された、これらの個体のみ選択的に処置する手段を提供する。さらに個体数の減少は、費用の減少を生じ、そして、この薬剤が、市場で一番になるのを可能にする。さらに、表現型のスクリーニング方法の臨床的な使用は、表現型プロファイルに従って処置を個別化する能力を提供する。特に、その薬剤表現型に対する代謝の計算された比に対応する、用量に特定の決定基は、個体を基礎として可能になる。
【０１４４】
前試行スクリーニングは、試行算入の前に、すべての個体の表現型に関連する。次いで、表現型の状態は、ＳＡＥ（Ｓｅｖｅｒｅ  Ａｄｖｅｒｓｅ  Ｅｖｅｎｔｓ）に対する高い危険性において、これらの個体を同定するのに使用され、そして、これらは、試行において含まれないことを保証する。次いで、残りの個体は、ＮＡＴ２活性のレベルに関連して個別化された薬剤用量で処置される。個別化された用量は、個体が、薬剤を安全に代謝する能力に対応した、安全で有効な処置を受けられたことを保証する。同様に、本発明に従って、個別化された処置は、臨床的な環境における適用を見出す。ここで、薬剤処置投与量は、個体の表現型プロファイルまたは代謝の計算された比に従って個別化される。
【０１４５】
本発明に従って、１つまたはそれより多い以下の酵素のための表現型決定基は、個体を基礎する表現型プロファイルを提供するために特徴付けられ得る。
【０１４６】
（ＮＡＴ２）
（多型性）
個体は、Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ（ＮＡＴ２）経路を介した薬剤のＮ−アセチル化の比において遺伝的に多型性である（Ｍｅｙｅｒ，Ｕ．Ａ．（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９１：１９８３〜１９８４）。２つの主要な代謝表現型は、Ｎ−アセチル化が速い群およびＮ−アセチル化が遅い群に区別され得る。Ｎ−アセチル化多型性に個別化される薬剤は、スルホンアミド（スルファメタジン）、抗うつ薬（フェネルジン）、抗不整脈薬（プロカインアミド）、および抗高血圧薬（ヒドラジン）を含む。アセチル化群の表現型のいくつかの有害な治療学的な結果は、末梢神経性の神経障害および肝炎である。反対の様式において、プロカインアミドのＮ−アセチル化は、軽減された毒性を有する治療学的に活性な代謝を産生する。Ｎ−アセチル化多型性はまた、いくつかの環境性の発癌性のアリールアミンの解毒経路に関連し、アセチル化が遅い群である化学染料の労働者の間でより高い頻度の膀胱癌が存在する。
【０１４７】
ＮＡＴ２遺伝子は、多型性であり、検出された９の変異および１４の変異対立遺伝子がある。６の変異対立遺伝子は、９９％の白人のアセチル化が遅い群に原因がある（ＮＡＴ２＊５Ａ、ＮＡＴ２＊５Ｂ、ＮＡＴ２＊５Ｃ、ＮＡＴ２＊６Ａ、ＮＡＴ２＊７ＢおよびＮＡＴ２＊１３）。ＮＡＴ２＊４対立遺伝子は、野生型対立遺伝子である。
【０１４８】
（人種間の違い）
ＰＭ（代謝能が低い群）およびＥＭ（代謝能が高い群）の度数は（常染色体劣性形質）、Ｎ−アセチル化多型に関して、人種間でかなりの違いを示した。コーカサス人において、この度数は、それぞれ約６０％および４０％であるが、東洋人において、この度数は、それぞれ２０％および８０％である（Ｍｅｙｅｒ，米国（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９１：１９８３−１９８４）。薬物代謝研究において、各民族のグループを、多型の証拠について別個に研究することが適切であり、そしてそのアンチモード（ａｎｔｉｍｏｄｅ）は、人種ごとに推定されるべきではない。
【０１４９】
（直接的な表現型決定−ＮＡＴ２の表現型決定基）
異なるプローブ基質を使用して、ＮＡＴ２表現型を決定し得る。本発明に従って、適切なプローブ基質は、限定するわけではないが、カフェインである。カフェインは、広範に使用され、そして比較的安全である。表現型は、一般に、カフェインを飲んだ後に回収される個体の尿サンプル中に存在する、カフェイン代謝産物（５−アセトアミノ−６−アミノ−１−メチルウラシル（ＡＡＭＵ）または５−アセトアミノ−６−ホルミルアミノ−１−メチルウラシル（ＡＦＭＵ））と１−メチルキサンチン（１Ｘ）との比から決定され得る。これらの代謝産物の構造は、図９に例示される。これらの代謝産物の比は、個体のＮ−アセチル化（ＮＡＴ２）表現型の決定を提供する。
【０１５０】
ＡＡＭＵ（またはＡＦＭＵ）／１Ｘ。
【０１５１】
本発明に従って、カフェイン代謝産物のモル比を使用して、以下のような個体のアセチル化表現型を決定するために使用される。１．８０未満の比を有する個体は、アセチル化が遅い群（ｓｌｏｗ  ａｃｅｔｙｌａｔｏｒ）である。
【０１５２】
（間接的な表現型決定（遺伝子型決定））
ＮＡＴ２遺伝子型決定の例は、６個の変異対立遺伝子のうち５個を含む５４７ｂｐフラグメントの増幅に関し、これは、コーカサス人のアセチル化が遅い群の９９％に対応する。これらの５個の対立遺伝子および野生型対立遺伝子の分析は、４個の変異を試験することによって実施され得る（Ｓｍｉｔｈ  ＣＡＤら、Ｊ．Ｍｅｄ  Ｇｅｎｅｔ（１９９７）３４：７５８−７６０）。
【０１５３】
このＰＣＲ増幅は、以下のプライマーを用いて実施した：
５’−ＧＣＴＧＧＧＴＣＴＧＧＡＡＧＣＴＣＣＴＣ−３’
５’−ＴＴＧＧＧＴＧＡＴＡＣＡＴＡＣＡＣＡＡＧＧＧ−３’。
【０１５４】
４個の制限消化酵素を用いるこのフラグメントの分析は、６個の対立遺伝子（ＮＡＴ２＊４（ｗｔ）および変異ＮＡＴ＊５Ａ、ＮＡＴ２＊５Ｂ、ＮＡＴ２＊５Ｃ、ＮＡＴ２＊６およびＮＡＴ２＊７）の検出を可能にする。６個の対立遺伝子の各々は、変異の異なる組合せを有し、そして各変異が特定の制限消化酵素部位（ＫｐｎＩ、ＤｄｅＩ、ＴａｑＩまたはＢａｍＨＩ）を変える場合に、５４７ｂｐのフラグメントの４個別々の消化の実施により、異なる対立遺伝子の同定を可能と成る。
【０１５５】
（ＣＹＰ１Ａ２）
ＣＹＰ１Ａ２は、ヒトの肝臓において、総ＣＹＰ４５０酵素の１５％を構成する。
【０１５６】
（多型性）
ＣＹＰ１Ａ２は、多型性であり得るが、なおしっかりと確立すべきである。これまで、変異対立遺伝子は、同定されてこなかった。３つの代謝表現型は、迅速な代謝、中間の代謝および遅い代謝に区別される。ＣＹＰ１Ａ２は、いくつかの薬物および以下を含む食事性構築物を代謝する：レシキモド、イミキモド、タクリン、アセトアミノフェン、アンチピリン、１７β−エストラジオール、カフェイン、クロイプラミン（ｃｌｏｉｐｒａｍｉｎｅ）、クロザピン、フルタミド（アンチアンドロジェニック（ａｎｔｉａｎｄｒｏｇｅｎｉｃ））、イミプラミン、パラセタモール、フェナセチン、タクリンおよびテオフィリン。
【０１５７】
さらに、ＣＹＰ１Ａ２は、環境性プロ発癌物質、特に複素環式アミンおよび芳香族アミンを活性化する。１つの研究において、Ｎ−アセチル化が速い群（ｆａｓｔ  Ｎ−ａｃｅｔｙｌａｔｏｒ）であり、そして高度のＣＹＰ１Ａ２活性を有する個体が、結腸直腸癌の大きな危険性があることを示す（状況の３５％  対  コントロールの１６％、ＯＲ＝２．７９（Ｐ＝０．００−２））。
【０１５８】
（誘導および阻害）
ＣＹＰ１Ａ２は、複数の薬物、ならびにオメプラゾール、ランソプラゾール、ポリ芳香族ヒドロカーボンおよびタバコの煙のような環境性因子によって誘導される。ＣＹＰ１Ａ２は、経口避妊薬、ケトコナゾール、α−ナフトフラボン、フルボキサミン（セロトニン取り込みインヒビター）、およびフラフィリンによって阻害される。
【０１５９】
（人種間の違い）
ＣＹＰ１Ａ２の活性は、所定の群において広範に変化する（６０から７０倍）。遅いＣＹＰ１Ａ２表現型、中間のＣＹＰ１Ａ２表現型および迅速なＣＹＰ１Ａ２表現型は、区別される。これらの３つのＣＹＰ１Ａ２表現型の割合は、人種と国との間で変化する：中間の％：アメリカ人、アメリカ系黒人、中国人、日本人、イタリア人およびオーストラリア人のそれぞれ５０％、７０％、６０％、＞９５％、６０％、２０％。薬物代謝研究において、各人種は、表現型の証拠のためにそれぞれ研究されることが適切であり、そしてそのアンチモードは、人種ごとに推定されるべきではない。
【０１６０】
（テオフィリン）
薬物投薬量の表現型決定のために必要な一般的な例は、テオフィリンの場合である。テオフィリンは、喘息の処置において使用される。しかし、テオフィリンの毒性は、引き続き一般的な臨床的問題であり、そして生命を危険性のある心臓血管毒性および神経学的毒性を含む。テオフィリンは、ＣＹＰ１Ａ２代謝系を介して人体から一掃される。キノロン抗生物質またはセロトニン再摂取インヒビターによるＣＹＰ１Ａ２の阻害は、結果として、テオフィリン毒性を生じ得る。これらの理由のために、ＣＹＰ１Ａ２の確実な表現型決定試験の有用性は、明らかである。
【０１６１】
（ＣＹＰ１Ａ２の直接表現型決定基）
異なるプローブ基質（カフェイン、テオフィリン）を使用して、ＣＹＰ１Ａ２表現型を決定し得る。本発明によると、適切なプローブ基質としては、カフェイン、テオフィリンまたはアセトアミノフェンが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１６２】
これらのうちで、カフェインが好ましいプローブ基質である。カフェインは、広範に消費され、そして比較的安全である。カフェイン、およびその代謝産物である１，７−ジメチルキサンチン（１，７  ＤＭＸ）および１，７−ジメチル尿酸（１，７  ＤＭＵ）の構造を、図３に示す。
【０１６３】
本発明によると、カフェイン代謝産物のモル比を使用して、以下のように、個体のＣＹＰ１Ａ２表現型を決定する：
【０１６４】
【数１】
2004519674.tif 000002
それぞれ、４および１２のモル比は、遅い中間体および迅速なＣＹＰ１Ａ２代謝群を分離する（Ｂｕｔｌｅｒら、（１９９２）  Ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｅｔｉｃｓ  ２：１１６−１１７）。
【０１６５】
（ＣＹＰ１Ａ２の間接表現型決定（遺伝子型決定（ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ）））
現在まで、変異誘発遺伝子は、ＣＹＰ１Ａ２遺伝子について同定されていない。従って、間接的な遺伝子型決定は、ＣＹＰ１Ａ２について現在可能ではない。
【０１６６】
（ＣＹＰ３Ａ４）
ＣＹＰ  ３Ａファミリーは、ヒト肝臓における全ＣＹＰ  ４５０酵素の約２５％を構成する。
【０１６７】
（多型）
ＣＹＰ３Ａ４イソエンザイムの発現における高程度の個体間の可変性が、ヒト肝臓において示された（＞２０倍）。しかし、ＣＹＰ３Ａ４代謝の活性は、単様式で分布し、結果として、現在、この集団の異なるサブセットについてのカテゴリーの分類がない。さらに、現在、この遺伝子のコード領域における共通の対立遺伝子改変体の証拠がない。最近、希な対立遺伝子改変体が、エキソン７（ＣＹＰ３Ａ４＊２）において同定された。限定されたデータは、この変異がｗｔ  ＣＹＰ３Ａ遺伝子と比較して変化した基質依存性動力学を生じ得ることを示唆した。ＣＹＰ３Ａの活性における大きな個体間可変性は、転写調節における差違を示し得ると考えられている。ＣＹＰ３Ａの５’隣接領域における別の対立遺伝子改変体は、ＣＹＰ３Ａ４＊１Ｂ（これは、転写開始部位から２９０位においてＡ→Ｇ転移を含む）を同定した。このヌクレオチド置換は、減少したレベルのＣＹＰ３Ａ活性と関連し得ることが推測されている。継続中の研究は、ＣＹＰ３Ａ４活性に関連する共通の対立遺伝子改変体の存在を研究している。
【０１６８】
ＣＹＰ３Ａ４は、いくつかの薬物および食品成分（デラビルジン（ｄｅｌａｖｉｒｄｉｎｅ）、インジナビル（ｉｎｄｉｎａｖｉｒ）、リトナビル（ｒｉｔｏｎａｖｉｒ）、サキナビル（ｓａｑｕｉｎａｖｉｒ）、アムプレナビル（ａｍｐｒｅｎａｖｉｒ）、ジドビジン（ｚｉｄｏｖｉｄｉｎｅ）（ＡＺＴ）、ネルフィナビル（ｎｅｌｆｉｎａｖｉｒ）メシレート、エファビレンズ（ｅｆａｖｉｒｅｎｚ）、ネビラピン（ｎｅｖｉｒａｐｉｎｅ）、イミキモド（ｉｍｉｑｕｉｍｏｄ）、レシキモド（ｒｅｓｉｑｕｉｍｏｄ）、ドネゼピル（ｄｏｎｅｚｅｐｉｌ）、ロバスタチン、シンバスタチン、プラバスタチン、フルバスタチン、アトルバスタチン（ａｔｏｒｖａｓｔａｔｉｎｅ）、セリバスタチン（ｃｅｒｉｖａｓｔａｔｉｎ）、ロスバスタチン（ｒｏｓｕｖａｓｔａｔｉｎ）、ベンザフィブレート（ｂａｎｚａｆｉｂｒａｔｅ）、クロフィブラート、フェノフィブラート、ゲムフィブロジル、ニアシン、ベンゾジアゼピン、エリスロマイシン、デキストロメトロファンジヒドロピリジン、シクロスポリン、リドカイン、ミダゾラム、ニフェジピン、およびテルフェナジンを含む）を代謝する。
【０１６９】
さらに、ＣＹＰ３Ａ４は、環境的な前発癌物質（特に、Ｎ’−ニトロソノルニコチン（ＮＮＮ）、４−メチルニトロソアミノ−１−（３−ピリジル−１−ブタノン）（ＮＮＫ）、５−メチルクリセン、および４，４’−メチレン−ビス（２−クロロアニリン）（タバコの煙の生成物））を活性化する。
【０１７０】
（誘導および阻害）
ＣＹＰ３Ａ４は、多数の薬物（デキサメタゾン、フェノバルビタール、プリミドン、および抗菌性リファンピシンを含む）により誘導される。逆に、ＣＹＰ３Ａ４は、エリスロマイシン、グレープフルーツジュース、インジナビル、ケトコナゾール、ミコナゾール、キニーネおよびサキナビルによって阻害される。
【０１７１】
（人種間の差違）
いくつかの研究により、ＣＹＰ３Ａ４の活性は人種間で変わることが示された。経口投与後のＣＹＰ３Ａ４基質薬物の血漿レベルは、日本人、メキシコ人、東南アジア人およびナイジェリア人では、様々な国に在住している白人と比較して２倍〜３倍高いことが報告された。さらに、ＣＹＰ３Ａ４＊１Ｂ対立遺伝子は、ヨーロッパ系アメリカ人または中国人と比較して、アフリカ系アメリカ人においてより頻繁であることが報告された（それぞれ、４．２％対０％対６６．７％）。希なＣＹＰ３Ａ４＊２対立遺伝子は、白人の２．７％において見出され、そして黒人および中国人では存在しなかった。薬物代謝研究において、各人種が多型の証拠について別々に研究され得ることが適切であり、そしてそのアンチモードが人種ごとに推定されるべきではない。
【０１７２】
人種内のＣＹＰ３Ａ４活性の可変性のため、ＣＹＰ３Ａ４依存性処置剤を投与する前に、個体のＣＹＰ３Ａ４代謝産物の表現型を迅速かつ容易に決定するためのシステムおよび方法を提供することが有利である。特に、このようなシステムおよび方法は、治療の個別化、特に、多くの高脂質血症薬（ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼインヒビター（スタチン）、フィブレート、胆汁酸金属イオン封鎖剤およびニコチン酸（ナイアシン）を含む）を用いる治療の個別化において大きな利点を有すると考えられる。
【０１７３】
（シクロスポリン）
薬物投与における表現型決定の必要性の一例は、器官移植個体の処置におけるシクロスポリンの場合である。シクロスポリンは、新しい器官が拒絶されるのを保護するために、移植後に投与される免疫抑制剤（薬）である。この薬物の血漿レベルは、重要である。なぜなら、高レベルでは腎毒性が生じるが、低レベルでは、器官拒絶を生じ得るからである。シクロスポリンは、ＣＹＰ３Ａ４系により代謝される。いくつかの研究は、有効かつ安全なシクロスポリンの用量の維持におけるＣＹＰ３Ａ４活性のモニタリングの重要性を示した。これらの理由のため、ＣＹＰ３Ａ４の信頼性のある表現型決定試験の有用性が明らかである。
【０１７４】
（ＣＹＰ３Ａ４の直接表現型決定基）
異なるプローブ基質（ダプソン、テストステロン、ニフェジピン、ミダゾラム、エリスロマイシン、デキストロメトルファン、コルチゾール）を使用して、ＣＹＰ３Ａ４表現型を決定し得る。本発明によると、適切なプローブ基質としては、ミダゾラム、デキストロメトルファン、エリスロマイシン、ダプソン、テストステロン、ニフェジピンおよびコルチゾールが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１７５】
これらの中で、ミダゾラムが好ましいプローブ基質である。ミダゾラムおよびそのヒドロキシル化代謝産物である、１’−ヒドロキシミダゾラムの構造を、図１に示す。本発明によると、ミダゾラムおよびその代謝産物のモル比を使用して、以下のように、個体のＣＹＰ３Ａ４表現型を決定する：
【０１７６】
【数２】
2004519674.tif 000003
個体の比は、ＣＹＰ３Ａ４酵素活性の指標とみなされ、ここで小さな比は、より乏しい代謝を示し、大きな比は、より広範な代謝を示す。ＣＹＰ３Ａ４代謝の活性は、単様式で分布し、従って、アンチモードは存在しない。直接表現型決定により決定されるＣＹＰ３Ａ４活性のレベルが使用される。
【０１７７】
（ＣＹＰ３Ａ４の間接表現型決定基（遺伝子型決定））
現在まで、たった２つの変異誘発遺伝子しかＣＹＰ３Ａ４遺伝子について同定されていない（ＣＹＰ３Ａ４＊１ＢおよびＣＹＰ３Ａ４＊２）。研究により、これらの変異とＣＹＰ３Ａ４活性における大きな個体間変化とが相関され得ていない。現在までのこの点についての確認にもかかわらず、間接的表現型決定の使用は、本発明に従って意図されている。継続中の研究は、本発明のこの局面を研究し続けている。
【０１７８】
（ＮＡＴ１）
ＮＡＴ１酵素は、多くの化合物のＮ−アセチル化を触媒する。これは、肝臓ならびに単核白血球において発現される。
【０１７９】
（多型）
ＮＡＴ１遺伝子は、長い間、単形性として分類されていた。しかし、現在、ＮＡＴ１は、他のＮ−アセチルトランスフェラーゼ遺伝子（ＮＡＴ２）と同様に、多型であることが示されている。研究により、１つの野生型対立遺伝子（ＮＡＴ１＊４）、および６個の変異誘発遺伝子（ＮＡＴ１＊３、ＮＡＴ１＊５、ＮＡＴ１＊１０、ＮＡＴ１＊１１、ＮＡＴ１＊１４、およびＮＡＴ１＊１７）が存在することが示された。ＮＡＴ１は、２つの表現型：アセチル化が遅い群およびアセチル化が迅速な群（例えば、それぞれ、ＮＡＴ１＊４対ＮＡＴ１＊１０遺伝子型）を有する。
【０１８０】
ＮＡＴ１は、いくつかの薬物および食品成分（ｐ−アミノ安息香酸、ｐ−アミノサリチル酸、およびダプソンを含む）を代謝する。
【０１８１】
さらに、ＮＡＴ１は、環境性の前発癌性物質、特に、ジアミノベンジジン、Ｎ−ヒドロキシ−４−アミノビフェニル、および複素環式芳香族アミン（ＭｅＩＱｘおよびＰｈＩＰ）を活性化する。ある研究において、ＮＡＴ１＊１０対立遺伝子（従って、Ｎ−アセチル化が迅速な群である）を有する個体は、結腸直腸癌の危険性が大きく（ＯＲ＝１，９；９５％  ＣＩ＝１．２−３．２）、一方、別の研究において、これらの個体は、膀胱癌の危険性が大きい（ベンジジンを代謝する）ことが示された。
【０１８２】
（人種間の差違）
ＮＡＴ１の活性は、所定の人種において広範に変動する。遅いＮＡＴ１表現型および迅速なＮＡＴ１表現型が顕著である。迅速な代謝表現型に関連するＮＡＴ１＊１０遺伝子型は、３つの異なる人種（インド人、マレーシア人および中国人）においてモニタリングされた。ＮＡＴ１＊１０対立遺伝子の頻度は、それぞれ、１７％、３９％および３０％であった。ＮＡＴ１＊４遺伝子型（代謝が遅い群に関連する）は、同じ人種において、それぞれ、５０％、３０％および３５％の頻度を有した。従って、薬物代謝研究において、各人種が多型の証拠について別々に研究され得ることが適切であり、そしてそのアンチモードが人種ごとに推定されるべきではない。
【０１８３】
（ダプソン）
薬物投与における表現型の必要性の古典的な例は、ダプソンの場合である。ダプソンは、マラリアの処置に使用され、そしてＡＩＤＳの個体におけるＰｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ  ｃａｒｉｎｉｉ肺炎の処置のために研究されている。有害な影響としては、発疹、貧血、メトヘモグロビン血症、顆粒球減少症、および肝不全が挙げられる。ダプソンは、ＮＡＴ１代謝系により身体から清澄化される。ある研究は、遅いアセチル化とダプソンに対する増加した有害な反応との間の相関を示した（アセチル化が遅い群およびアセチル化が迅速な群について、それぞれ、４６％対１７％）。これらの理由のため、信頼性のある表現型決定試験の有用性が明らかである。
【０１８４】
（ＮＡＴ１の表現型決定基）
異なるプローブ基質（例えば、ｐ−アミノサリチル酸（ｐＡＳＡ）、およびｐ−アミノ安息香酸（ｐＡＢＡ））を使用して、ＮＡＴ１表現型を決定し得る。本発明によると、適切なプローブ基質としては、ｐ−アミノサリチル酸およびｐ−アミノ安息香酸が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１８５】
これらの中で、ｐＡＳＡが好ましいプローブ基質である。ｐＡＳＡおよびそのアセチル化代謝産物であるｐ−アセチルアミノサリチル酸の構造を、図２に例示する。
【０１８６】
本発明によると、ｐＡＳＡおよびそのアセチル化代謝産物のモル比を使用して、以下のように、個体のＮＡＴ１表現型を決定する：
【０１８７】
【数３】
2004519674.tif 000004
（ＮＡＴ１の間接表現型決定基（遺伝子型決定））
ＮＡＴ１対立遺伝子のＮＡＴ１＊４（ｗｔ）および変異体ＮＡＴ１＊１４は、ＰＣＲ−ＲＦＬＰまたは対立遺伝子特異的ＰＣＲのいずれかによって決定され得る（Ｈｉｃｋｍａｎ，Ｄ．ら、（１９９８）；Ｇｕｔ  ４２：４０２−４０９）。ＰＣＲ−ＲＦＬＰ法は、Ａ５６０Ｇ変異を含む遺伝子のフラグメントの増幅を必要とする。これは、以下のプライマーを用いて行われる：
５’−ＴＣＣＴＡＧＡＡＧＡＣＡＧＣＡＡＣＧＡＣＣ−３’
５’−ＧＴＧＡＡＧＣＣＣＡＣＣＡＡＡＣＡＧ−３’。
【０１８８】
このＰＣＲ増幅は、１７５ｂｐのフラグメントを産生し、これはＢｓａＩ制限酵素と共にインキュベートされる。ＮＡＴ１＊４対立遺伝子は、切断され、そして１５５ｂｐのフラグメントおよび２０ｂｐのフラグメントを産生し、一方、変異体ＮＡＴ１＊１４は、切断されない。
【０１８９】
ＮＡＴ１＊１４対立遺伝子は、以下のプライマーを使用して、対立遺伝子特異的ＰＣＲを使用して確認される：
５’−ＴＣＣＴＡＧＡＡＧＡＣＡＧＣＡＡＣＧＡＣＣ−３’
５’−ＧＧＣＣＡＴＣＴＴＴＡＡＡＡＴＡＣＡＴＴＴＴ−３’。
【０１９０】
（ＣＹＰ２Ａ６）
ＣＹＰ２Ａ６は、ヒト肝臓における全ＣＹＰ  ４５０酵素の４％を構成する。ＣＹＰ２Ａ６は、薬物代謝の２．５％に関与していると推定される。
【０１９１】
（多型）
ＣＹＰ２Ａ６は、２つの変異誘発遺伝子、ＣＹＰ２Ａ６＊２およびＣＹＰ２Ａ６＊３を有する機能的多型であり、それぞれ、不活性な酵素または酵素の非存在を生じる。２つの代謝表現型：代謝能が低い群および代謝能が高い群が区別され得る。ＣＹＰ２Ａ６は、いくつかの薬物（神経遮断薬および揮発性麻酔薬、ならびに天然化合物、クマリン、ニコチンおよびアフラトキシン  Ｂ１を含む）を代謝する。
【０１９２】
さらに、ＣＹＰ２Ａ６は、タバコの煙のいくつかの成分（例えば、ＮＮＫ）、ならびに６−アミノクリセンを活性化する。タバコの煙の活性化およびニコチンの代謝の役割は、喫煙に関連する癌の発生におけるＣＹＰ２Ａ６の役割を示唆した。
【０１９３】
（誘導および阻害）
ＣＹＰ２Ａ６は、バルビツレート、抗癲癇薬およびコルチコステロイドによって誘導される。
【０１９４】
（人種間の差違）
ＣＹＰ２Ａ６は、顕著な個体間の可変性を示し、そして人種に関連する差違が示された。２つの表現型の割合は、人種と国との間で変化した：遺伝子型のｗｔ％（代謝能が高い群）：フィンランド人、イギリス人、日本人、台湾人、およびアフリカ系アメリカ人について、それぞれ、８５、７６、５２、８３、９７．５ｗｔ％。薬物代謝研究において、各人種が多型の証拠について別々に研究され得ることが適切であり、そしてそのアンチモードが人種ごとに推定されるべきではない。
【０１９５】
（ニコチン）
薬物投与における表現型決定の必要性の例は、禁煙の問題のためのニコチンの送達である。ＣＹＰ２Ａ６は、ニコチン代謝の主な手段である。迅速ＣＹＰ２Ａ６代謝型は、はるかに速い速度でニコチンを排除する。増加したＣＹＰ２Ａ６活性、従って、増加したニコチン代謝を有する個体の同定は、ニコチン送達システムの助けを借りて禁煙を試み始めた時に、高用量のニコチンを必要とする個体を同定し得る。あるいは、これらの個体は、禁煙を助けるための非ニコチン送達システムから恩恵を受け得る。
【０１９６】
（ＣＹＰ２Ａ６の直接表現型決定基）
プローブ基質（クマリン）を使用して、ＣＹＰ２Ａ６表現型を決定し得る。本発明によると、適切なプローブ基質としては、クマリンが挙げられるが、これに限定されない。クマリンおよびその代謝産物である７−ヒドロキシクマリンの構造を、図４に示す。
【０１９７】
本発明によると、クマリンおよびその代謝産物の７−ヒドロキシクマリンのモル比を使用して、以下のように、個体のＣＹＰ２Ａ６表現型を決定する：
【０１９８】
【数４】
2004519674.tif 000005
（ＣＹＰ２Ａ６の間接表現型決定基（遺伝子型決定））
現在、３つの対立遺伝子が、ＣＹＰ２Ａ６遺伝子について同定されている（野生型対立遺伝子（ＣＹＰ２Ａ６＊１）および２つの変異誘発遺伝子（ＣＹＰ２Ａ６＊２およびＣＹＰ２Ａ６＊３）。この野生型対立遺伝子は、機能的酵素全部をコードする。ＣＹＰ２Ａ６＊２変異誘発遺伝子は、不活性な酵素をコードし、そしてＣＹＰ２Ａ６＊３対立遺伝子は、いずれの酵素も産生しない。
【０１９９】
個体の遺伝子型の決定は、組み合わせたＬＡ−ＰＣＲおよびＰＣＲ−ＲＦＬＰ手順によって行われ得る。この手順において、特定のオリゴヌクレオチドプライマーが、ＣＹＰ２Ａ６／７遺伝子を増幅するために使用された。増幅されたＣＹＰ２Ａ６／７遺伝子は、次いで、ＰＣＲテンプレートとして使用され、特定のオリゴヌクレオチドプライマーを使用してエキソン３および４を増幅し、５４４ｂｐのフラグメントを増幅する。このフラグメントは、次いで、ＦｓｐＩ制限酵素で消化され、４８９ｂｐのフラグメントが再び単離される。この４８９ｂｐのフラグメントは、次いで、ＤｄｅＩおよびＸｃｍＩの両方と共にインキュベートされる。この消化パターンは、電気泳動によって決定された。野生型対立遺伝子は、３３０、８７および７２ｂｐのフラグメントを産生し、ＣＹＰ２Ａ６＊２対立遺伝子は、１８９、１４１、８７および７２ｂｐのフラグメントを生成し、そしてＣＹＰ２Ａ６＊３対立遺伝子は、２７０、８７、７２および６０ｂｐのフラグメントを生成する（Ｎａｋａｊｉｍａら（２０００）、Ｃｌｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  ＆  Ｔｈｅｒ．６７（１）：５７−６９）。
【０２００】
（プライマー）
ＣＹＰ２Ａ６／７  ＬＡ−ＰＣＲ
５’−ＣＣＴＣＣＣＴＴＧＣＴＧＧＣＴＧＴＧＴＣＣＣＡＡＧＣＴＡＧＧＣ−３’
５’−ＣＧＣＣＣＣＴＴＣＣＴＴＴＣＣＧＣＣＡＴＣＣＴＧＣＣＣＣＣＡＧ−３’。
【０２０１】
エキソン  ３／４  ＰＣＲ
５’−ＧＣＧＴＧＧＴＡＴＴＣＡＧＣＡＡＣＧＧＧ−３’
５’−ＴＧＣＣＣＣＧＴＧＧＡＧＧＴＴＧＡＣＧ−３’。
【０２０２】
（ＣＹＰ２Ｃ１９）
ＣＹＰ２Ｃ１９は、酸化的薬物代謝の約２％の原因である。ＣＹＰ２Ｃ１９は、薬物代謝の約８％に関与すると推定される。
【０２０３】
（多型）
個体は、ＣＹＰ２Ｃ１９代謝に関して遺伝的に多型である。２つの代謝表現型：代謝能が高い群および代謝能が低い群が区別され得る。２つの遺伝的多型が同定されており（ＣＹＰ２Ｃ１９＊２およびＣＹＰ２Ｃ１９＊３）、これらは一緒に、東洋人の代謝能が低い群の全ておよびコーカサス人の代謝能が低い群の約８３％を説明する。これらの変異の両方は、終止コドンを誘導し、結果として、短縮型の非機能的酵素を生じる。
【０２０４】
ＣＹＰ２Ｃ１９は、様々な化合物（三環式抗うつ剤のアミトリプチリン、イミプラミンおよびクロミプラミン、鎮静剤のジアゼパム、ヘキソバルビタール、胃のプロトンポンプインヒビター、オメプラゾール、パントプラゾール、およびランソプラゾール、ならびに抗ウイルス剤のネルフィナビル（ｎｅｌｆｉｎａｖｉｒ）メシレート、抗マラリア薬のプログアニル、およびβ−ブロッカーのプロパノロール（ｐｒｏｐａｎｏｌｏｌ）を含む）を代謝する。
【０２０５】
（誘導および阻害）
ＣＹＰ２Ｃ１９は、フルコナゾール、フルボキサミン、フルオキセチン、セルトラリン、およびリトナビルにより阻害される。これは、リファンピンによって誘発される。
【０２０６】
（人種間の差違）
ＣＹＰ２Ｃ１９の代謝能が低い群の表現型の発生は、大きな人種間の可変性を示す。代謝能が低い群は、ヨーロッパ人および白人のアメリカ人の４％未満を構成する。一方、韓国人は、１２．６％、中国人は、１７．４％、そして日本人は２２．５％の代謝能が低い群の頻度を有する。さらに、ＣＹＰ２Ｃ１９変異誘発遺伝子は、人種間の可変性を示し、ＣＹＰ２Ｃ１９＊２頻度は、中国人における２８．９％〜ヨーロッパ系アメリカ人におけるたった１３％の範囲である。ＣＹＰ２Ｃ１９＊３対立遺伝子は、ヨーロッパ系アメリカ人またはアフリカ系アメリカ人には存在せず、一方、韓国人および日本人の両方において１１．７％の頻度で生じる。
【０２０７】
薬物代謝研究において、各人種が多型の証拠について別々に研究され得ることが適切であり、そしてそのアンチモードが人種ごとに推定されるべきではない。
【０２０８】
（オメプラゾール）
例として、薬物投与におけるＣＹＰ２Ｃ１９代謝表現型決定の利点は、オメプラゾールの場合に明らかである。オメプラゾールは、Ｈｅｌｉｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ（Ｈ  ｈｙｌｏｒｉ）感染の処置において、アモキシシリンと共に使用される薬物であり、そして、ＣＹＰ２Ｃ１９代謝経路により身体から清澄化される。研究は、ＣＹＰ２Ｃ１９の代謝能が低い群のより速い根絶速度を観察した従って、代謝能が高い群は、代謝能が低い群において観察されるＨ  ｐｙｌｏｒｉの同じ根絶レベルを達成するために、より高い用量のオメプラゾールを必要とし得る。これらの理由のため、ＣＹＰ２Ｃ１９の信頼性のある表現型決定試験の有用性が明らかである。特に、正確かつ簡便な臨床的アッセイにより、医師は、個体に基づく個体の安全かつ効果的な処置レジメンを迅速に同定し得る。
【０２０９】
（ＣＹＰ２Ｃ１９の直接表現型決定基）
本発明の実施形態によると、尿サンプル中のＳ−（＋）メフェニトインおよびＲ−（−）メフェニトインの比を使用して、個体のＣＹＰ２Ｃ１９表現型の決定を提供し得る。これらの代謝産物は、好ましいプローブ基質のメフェニトインの使用に基づくＣＹＰ２Ｃ１９表現型の決定における定量的マーカーとして使用される。しかし、本発明は、これらのいずれにも制限されないことが十分に意図される。Ｒ−（−）およびＳ−（＋）メフェニトイン、ならびに４−ヒドロキシメフェニトインの構造を、図５に示す。
【０２１０】
個体のＣＹＰ２Ｃ１９表現型を決定するために使用される、Ｓ−（＋）メフェニトインおよびＲ−（−）メフェニトイン代謝産物のキラル比は、以下のとおりである：
【０２１１】
【数５】
2004519674.tif 000006
１に近いキラル比（＞０．８）は、迅速なＣＹＰ２Ｃ１９代謝型を示す。
【０２１２】
（ＣＹＰ２Ｃ１９の間接表現型決定基（遺伝子型決定））
上記のように、ＣＹＰ２Ｃ１９は、２つの顕著な改変体対立遺伝子を有し、これらは、全ての日本人およびコーカサス人の８３％の代謝能が低い群の原因である。研究は、変異誘発遺伝子のホモ接合性の存在と代謝能が低い群の状態との間の優れた相関を示した。ＣＹＰ２Ｃ１９を遺伝子型決定するための手順の例としては、機能的ＣＹＰ２Ｃ１９＊１対立遺伝子と比較して、ヌクレオチドの点変異、欠失および挿入を指向するように設計された一連のポリメラーゼ連鎖反応−制限フラグメント長多型反応が挙げられる（Ｆｕｒｕｔａら（１９９９）、Ｃｌｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｔｈｅｒａ  ６５（５）：５５２−５６１；Ｔａｎｉｇａｗａｒａら、（１９９９）  Ｃｌｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｔｈｅｒａ  ６６（５）：５２８−５５３４）。ＣＹＰ２Ｃ１９＊２およびＣＹＰ２Ｃ１９＊３の、エキソン５またはエキソン４のＰＣＲ増幅は、それぞれ、以下のプライマーを使用して行われる：
ＣＹＰ２Ｃ１９＊２  エキソン５プライマー
５’−ＡＡＴＴＡＣＡＡＣＣＡＧＡＧＣＴＴＧＧＣ−３’
５’−ＴＡＴＣＡＣＴＴＴＣＣＡＴＡＡＡＡＧＣＡＡＧ−３’
ＣＹＰ２Ｃ１９＊３  エキソン４プライマー
５’−ＡＡＣＡＴＣＡＧＧＡＴＴＧＴＡＡＧＣＡＣ−３’
５’−ＴＣＡＧＧＧＣＴＴＧＧＴＣＡＡＴＡＴＡＧ−３’。
【０２１３】
ＣＹＰ２Ｃ１９＊２におけるＧ６８１Ａ変異の存在は、次いで、ＳｍａＩ制限酵素で消化することによって検出される。野生型対立遺伝子は、１２０ｂｐおよび４９ｂｐのフラグメントを産生し、一方、ＣＹＰ２Ｃ１９＊２対立遺伝子は切断されないままである。ＣＹＰ２Ｃ１９＊３対立遺伝子は、エキソン４のＰＣＲ産物をＢａｍＨＩと共にインキュベートすることによって検出される。野生型対立遺伝子は、２３３ｂｐおよび９６ｂｐのフラグメントを産生し、一方、ＣＹＰ２Ｃ１９＊３対立遺伝子は、切断されないままである。
【０２１４】
伸長型代謝表現型は、機能的酵素をコードする少なくとも１つの対立遺伝子を有する個体に割りあてられる。不完全型代謝表現型は、２つ以上の機能的ＣＹＰ２Ｃ１９対立遺伝子を欠く個体に割りあてられる。
【０２１５】
（ＣＹＰ  ２Ｃ９）
代謝酵素のＣＹＰ  ２Ｃ９ファミリーは、肝臓における代謝酵素の約８％に関連する。ＣＹＰ  ２Ｃ９は、薬物代謝の約１５％に関与すると推測されている。
【０２１６】
（多型）
個体は、遺伝的に、ＣＹＰ  ２Ｃ９代謝に関して多型である。２つの代謝表現型：代謝能が高い群および代謝能が低い群が区別される。３つの遺伝的多型（１つの野生型（ＣＹＰ  ２Ｃ９＊１）および２つの変異体（ＣＹＰ  ２Ｃ９＊２およびＣＹＰ  ２Ｃ９＊３）が明確に同定されている。ＣＹＰ  ２Ｃ９＊２対立遺伝子は、ｍＲＮＡの発現における５〜１０倍の増加を生じ、そしてフェニトインおよびトルブタミドの代謝に対する３倍高い酵素活性を有することが見出された。逆に、この遺伝子型は、Ｓ−ワルファリンの代謝に対して低いレベルの活性を有するようである。ＣＹＰ  ２Ｃ９＊３対立遺伝子は、これらの基質の３つ全てに対して減少した代謝活性を示すようである。
【０２１７】
ＣＹＰ  ２Ｃ９は、様々な化合物（Ｓ−ワルファリン、フェニトイン、トルブタミド、チエニル酸（ｔｉｅｎｉｌｉｃ  ａｃｉｄ）、ならびに多数の非ステロイド系抗炎症薬（例えば、ジクロフェナク、ピロキシカム、テノキシカム、イブプロフェン、およびアセチルサリチル酸）を含む）を代謝する。
【０２１８】
（誘導および阻害）
ＣＹＰ  ２Ｃ９は、フルコナゾール、メトロニダゾール、ミコナゾール、ケトコナゾール、イタコナゾール（ｉｔａｃｏｎａｚｏｌｅ）、リトナビル（ｒｉｔｏｎａｖｉｒ）、クロピドロゲル（ｃｌｏｐｉｄｒｏｇｅｌ）、アミオダロン、フルボキサミン、スルファメトキサゾール、フルバスタチンおよびフルオキセチンにより阻害される。これは、リファンピンおよびリファブチンにより誘導される。
【０２１９】
（人種間差異）
ＣＹＰ２Ｃ９遺伝子型は、顕著な人種間可変性を示す。ＣＹＰ２Ｃ９＊２は、中国人および台湾人の集団において存在せず、そして、アフリカ系アメリカ人種の１％のみに存在するが、イギリス人集団の１９．２％およびコーカサス人の８％を占める。ＣＹＰ２Ｃ９＊３はよりまれであり、そして、コーカサス人の６％、中国人の２％、台湾人の２．６％およびアフリカ系アメリカ人集団の０．５％に存在する。
【０２２０】
薬物代謝研究において、各人種集団が、多型の証拠について別々に研究され得、そして、そのアンチモードは、１つの人種集団から別の人種集団に外挿されるべきではないことが合理的である。
【０２２１】
（Ｓ−ワルファリン）
例えば、薬物投薬におけるＣＹＰ２Ｃ９代謝性表現型決定の利点は、Ｓ−ワルファリンの場合に明らかである。Ｓ−ワルファリンは、抗凝固性薬物である。研究は、ＣＹＰ２Ｃ＊２またはＣＹＰ２Ｃ９＊３ハプロタイプのいずれかの存在が、標的抗凝固性強度を獲得するために必要な用量の減少を生じることを実証した。さらに、これらの個体はまた、増加した発生率の出血性合併症に罹患する。従って、ＣＹＰ２Ｃ９遺伝子改変体は、処方されたワルファリンの用量の抗凝固性効果を調節する。これらの理由のために、ＣＹＰ２Ｃ９についての信頼のおける試験の有用性が明らかである。特に、正確なおよび簡便な臨床アッセイは、内科医が、個々に基づいた個体のための安全なおよび効果的な処置レジメンを迅速に同定することを可能にする。
【０２２２】
（ＣＹＰ２Ｃ９の直接的な表現型決定基）
本発明の実施形態に従って、尿サンプル中の（Ｓ）−イブプロフェンおよびそのカルボキシル化代謝産物、（Ｓ）−２−カルボキシイブプロフェンの比率は、個体のＣＹＰ２Ｃ９表現型の決定基を提供するために使用され得る。これらの代謝産物は、好ましいプローブ基質（Ｓ）−イブプロフェンの使用に基づいたＣＹＰ２Ｃ９表現型の決定における定量的なマーカーとして使用される。（Ｓ）−イブプロフェンおよびその代謝産物（Ｓ）−２−カルボキシイブプロフェンの構造が図６に示される。しかし、本発明はそれに対していかなる点においても制限されないことが十分に意図される。実際、個々のＣＹＰ２Ｃ９変異によって引き起こされる基質特異的な変更の性質に起因して、多数のプローブ基質が、ＣＹＰ２Ｃ９の完全に参考となる表現型決定について必要であり得る。
【０２２３】
個体のＣＹＰ２Ｃ９表現型を決定するために使用される（ｓ）−イブプロフェンおよびその（Ｓ）−２−カルボキシイブプロフェン代謝産物のモル比は、以下のようである：
（Ｓ）−イブプロフェン／（Ｓ）−２−カルボキシイブプロフェン
（ＣＹＰ２Ｃ９の間接的な表現型決定基（遺伝子型決定））
以前に述べられたように、ＣＹＰ２Ｃ９は、２つの優性改変体対立遺伝子、ＣＹＰ２Ｃ９＊２およびＣＹＰ２Ｃ９＊３を有する。ＣＹＰ２Ｃ９を遺伝子型決定するための手順の例としては、一連のポリメラーゼ連鎖反応−機能的なＣＹＰ２Ｃ９＊１対立遺伝子と比較して、ヌクレオチド点変異、欠失および挿入を検出するために設計された制限フラグメント長多型反応を含む（Ｔａｕｂｅら、（２０００）Ｂｌｏｏｄ  ９６（５）：１８１６−１８１９）。ＣＹＰ２Ｃ９＊２についてのエクソン３のＰＣＲ増幅は、以下のプライマーを使用して行なわれる：
ＣＹＰ２Ｃ９＊２エクソン３プライマー
５’−ＣＡＡＴＧＧＡＡＡＧＡＡＡＴＧＧＡＡＧＧＡＧＧＴ−３’
５’−ＡＧＡＡＡＧＴＡＡＴＡＣＴＣＡＧＡＣＣＡＡＴＣＧ−３’
強制のミスマッチが、ＡｖａＩＩ消化についての制限部位を作製するために、順方向プライマーの最後から２番目の塩基に含まれる。この増幅由来のＰＣＲ産物は、長さが２５１ｂｐである。ＡｖａＩＩ消化の後、ＣＹＰ２Ｃ９＊１（ｗｔ）対立遺伝子手順は、１７０ｂｐおよび６０ｂｐのフラグメントを生成する。ＣＹＰ２Ｃ＊２対立遺伝子は、２２９ｂｐのフラグメントを生成する。
【０２２４】
ＣＹＰ２Ｃ９＊３対立遺伝子は、制限部位を自然に破壊または生成しない。従って、制限部位は、順方向プライマーに導入され、その結果、ミスマッチと組み合わせた１０６１位（Ａ１０６１）におけるアデノシンは、ＮｓｉＩ制限酵素についての制限部位を作製する。従って、ＣＹＰ２Ｃ９＊１（ｗｔ）対立遺伝子のＰＣＲ増幅フラグメントは、Ａ１０６１に制限部位を有する。逆に、ＣＹＰ２Ｃ９＊３におけるＡ１０６１Ｃの変異は、この制限部位を除去する。順方向プライマーはまた、天然のＡｖａＩＩ制限配列を含む。逆方向プライマーはまた、１１８６位に強制のミスマッチを有し、ＮｓｉＩ制限酵素についての制限部位を提供する（ＣＹＰ２Ｃ９＊１およびＣＹＰ２Ｃ９＊３対立遺伝子の両方由来のＰＣＲ増幅フラグメントは、この制限部位を有する）。制限酵素消化の前のこのセットのプライマーのＰＣＲ産物は、長さが１６０ｂｐである。ＮｓｉＩおよびＡｖａＩＩでの制限消化の後、ＣＹＰ２Ｃ９＊１対立遺伝子は、１３０ｂｐのフラグメントを生成し、そして、ＣＹＰ２Ｃ９＊３対立遺伝子は、１４０ｂｐのフラグメントを生成する。
ＣＹＰ２Ｃ９＊３プライマー
５’−ＴＧＣＡＣＧＡＧＧＴＣＣＡＧＡＧＡＴＧＣ−３’
５’−ＡＧＣＴＴＣＡＧＧＧＴＴＴＡＣＧＴＡＴＣＡＴＡＧＴＡＡ−３’
２つの対立遺伝子改変体から生じる酵素活性における基質特異的変化に起因して、表現型決定は、個体の基質に基づいて相関する。
【０２２５】
（ＣＹＰ２Ｄ６）
ＣＹＰ２Ｄ６は、ヒト肝臓における総ＣＹＰ４５０酵素の１〜３％を構成する。ＣＹＰ２Ｄ６は、薬物代謝産物の約２０％に関与すると仮定されている。
【０２２６】
（多型性）
ＣＹＰ２Ｄ６は、ヒトにおける多型発現を実証する最初のＰ４５０であった。３つの代謝性表現型が区別され得る：乏しい（ＰＭ）、広範な（ＥＭ）および超広範な（ＵＥＭ）表現型。ＣＹＰ２Ｄ６遺伝子は、広範に多型性である。例えば、１９９７年の研究は、６７２の関連していない個体のスクリーニングにおいて、ＣＹＰ２Ｄ６遺伝子の４８の変異および５３の対立遺伝子を実証した。正常な（広範な）野生型機能を有する対立遺伝子の例は、ＣＹＰ２Ｄ６＊１、ＣＹＰ２Ｄ６＊２Ａ、およびＣＹＰ２Ｄ６＊２Ｂであり；機能を消失させる対立遺伝子は、ＣＹＰ２Ｄ６＊３、ＣＹＰ２Ｄ６＊４Ａ、ＣＹＰ２Ｄ６＊４Ｂ、ＣＹＰ２Ｄ６＊５、ＣＹＰ２Ｄ６＊６Ａ、ＣＹＰ２Ｄ６＊６Ｂ、ＣＹＰ２Ｄ６＊７、ＣＹＰ２Ｄ６＊８、ＣＹＰ２Ｄ６＊１１およびＣＹＰ２Ｄ６＊１２であり；そして減少した機能を生じる対立遺伝子は、ＣＹＰ２Ｄ６＊９、ＣＹＰ２Ｄ６＊１０Ａ、およびＣＹＰ２Ｄ６＊１０Ｂである。超広範な表現型は、多数のコピーのＣＹＰ２Ｄ６遺伝子の存在から生じるようである（例えば、１つの個体は、１３のコピーの遺伝子が同定される）。
【０２２７】
ＣＹＰ２Ｄ６は、多数の種々の薬物および食事成分（以下を含むがこれらに限定されない）を代謝する：
（抗ウイルス剤：）
エファビレンツ（Ｅｆａｖｉｒｅｎｚ）、ネビラピン（ｎｅｖｉｒａｐｉｎｅ）、リトナビル（ｒｉｔｏｎａｖｉｒ）、サキノビル（ｓａｑｕｉｎｏｖｉｒ）、ネルフィナビル（ｎｅｆｌｉｎａｖｉｒ）、メシレート（ｍｅｓｙｌａｔｅ）、およびインディナビル（ｉｎｄｉｎａｖｉｒ）
（向精神薬：）
アミフラミン（ａｍｉｆｌａｍｉｎｅ）、塩酸アミトリプチン、クロミプラミン、クロザピン、デシプラミン、ハロペリドール、塩酸イミプラミン、マプロチリン、塩酸メトキシフェナミン、ミナプリン、塩酸ノルトリプリン、パロキセチン、ペルフェナジン、レモキシプリド、チオリダジン、トモキセイン、トリフルぺリドール、ズクロペンチキソール（ｚｕｃｌｏｐｅｎｔｈｉｘｏｌ）、リスペリドン、およびフルオキセチン（ｆｌｕｏｘｅｔｉｎｅ）。
【０２２８】
（心臓血管剤：）
アプリジン、ブフラロール、デブリソキン、エンカイニド、フレカイニド、グアノキサン、インドラミン、メトプロロール、メキシレチン、ｎ−プロピルアマニン（ｎ−ｐｒｏｐｙｌａｍａｌｉｎｅ）、プロパフェノン、プロプラノロール、スパルテイン、マレイン酸チモロール、塩酸ベラパミル。
【０２２９】
（雑多な薬剤：）
クロルプロパマイド、コデイン、臭化水素酸デキストロメトルファン、メタンフェタミン、ペルヘキシレン（ｐｅｒｈｅｘｉｌｅｎｅ）、および塩酸フェンホルミン。
【０２３０】
さらに、ＣＹＰ２Ｄ６は、多数の発癌物質の代謝に関与しているが、いずれの主要な代謝剤としても報告されていない。１つの研究において、ＣＹＰ２Ｄ６を速く代謝する個体およびゆっくりＮ−アセチル化を行なう個体は、肺細胞癌の危険がより大きいことが示されている（ＯＲ＝２．６；９５％  ＣＩ＝１．６−４）。
【０２３１】
（誘導および阻害）
ＣＹＰ２Ｄ６は、インビトロで、キニジンによって、そして、ウイルスプロテアーゼインヒビターによって、ならびに、Ｄ−フェンフルラミンおよびＬ−フェンフルラミンのような食欲抑制薬剤によって阻害される。
【０２３２】
（人種間差異）
ＣＹＰ２Ｄ６の活性は、所定の集団において広範に変化する。ＣＹＰ２Ｄ６の乏しい（ＰＭ）、広範な（ＥＭ）および超広範な（ＵＥＭ）表現型が区別される。ＣＹＰ２Ｄ６遺伝子は、常染色体劣性形質として遺伝し、そして、白色のヨーロッパ人および北米人集団の９０％および１０％をそれぞれ、広範な（ＥＭ）および乏しい（ＰＭ）代謝表現型に分離する。別の研究において、異なった人種集団のＰＭの割合が観察され、そして、白色の北米人およびヨーロッパ人は、５〜１０％がＰＭであり、アフリカ系アメリカ人は１．８％、ネイティブのタイ人は１．２％、中国人は１％、およびネイティブのマレー人集団は２．１％がＰＭを有することが見出された。これに対して、ＰＭ表現型は、日本人集団において完全に存在していないようである。薬物代謝研究において、各人種集団は、多型性の証拠について別々に研究され得、そして、アンチモードは、１つの人種集団から別の人種集団に外挿されるべきではないことが合理的である。
【０２３３】
（デキストロメトルファン／抗うつ剤）
薬物投薬における表現型決定が必要な例は、デキストロメトルファンの場合である。デキストロメトルファンは、向精神効果を有する非オピオイド性の鎮咳薬である。しかし、デキストロメトルファン用量は、個別の個体の耐性に基づいて、０〜６ｍｇ／ｋｇで変化する。デキストロメトルファンは、ＣＹＰ２Ｄ６代謝系を介して活性化される。デキスストロメトルファンは、乏しい代謝剤  対  広範な代謝剤における異なった目的の効果および個々の効果を定性的および定量的に産生した（平均性能  ＋／−標準誤差、ＥＭについて９５＋／−０．５％  対  ＰＭについて８６＋／−６％；ｐ＜０．０５）。ＣＹＰ２Ｄ６表現型決定のための薬物の別の重要なクラスは、三環系抗うつ剤である。ＣＹＰ２Ｄ６のＰＭ表現型およびＵＥＭ表現型の両方は、有害な反応の危険を有する。これらの薬物の標準用量を与えられたＰＭ個体は、毒性の血漿濃度を発生し、潜在的に、口渇、高血圧、鎮静、振戦、または、いくつかの場合において生命を脅かす心毒性を含む、不快な副作用を生じる。逆に、これらの薬物のＵＥＭ個体への投与は、治療不全を生じ得る。なぜなら、標準用量における活性薬物の血漿濃度が、はるかに低すぎるためである。これらの理由のために、ＣＹＰ２Ｄ６についての信頼できる表現型決定試験の有用性が明らかである。
【０２３４】
（ＣＹＰ２Ｄ６の表現型決定基）
異なったプローブ基質が、ＣＹＰ２Ｄ６表現型を決定するために使用され得る（デキストロメトルファン、デブリソキン、ブフラロール、アンチピリン、テオフィリンおよびヘキソバルビタール）。本発明に従う、適切なプローブ基質としては、デキストロメトルファン、デブリソキン、およびブフラロールを含むがこれらに限定されない。
【０２３５】
これらの中で、デキストロメトルファンが、好ましいプローブ基質である。デキストロメトルファンおよびその脱メチル化代謝産物のデキストロルファンの構造が図７に示される。
【０２３６】
本発明に従って、デキストロメトルファンおよびその代謝産物のモル比が、以下のように、個体のＣＹＰ２Ｄ６表現型を決定するために使用される：
デキストロメトルファン／デキストロルファン
０．３０のアンチモードが、広範の代謝剤と乏しい代謝剤との間を区別するために使用され、それにより、０．３０未満のアンチモードは、広範な代謝剤を示し、そして、０．３０を超えるアンチモードは、乏しい代謝剤を示す。
【０２３７】
（ＣＹＰ２Ｄ６の間接的な表現型決定基（遺伝子型決定））
前述のように、ＣＹＰ２Ｄ６遺伝子は、４８の変異および５３の対立遺伝子を同定する１つの研究を有する広範に多型性である。ＣＹＰ２Ｄ６の遺伝子型決定のための手順の例は、特定のプライマーを使用するＸＬ−ＰＣＲによる、全体のＣＹＰ２Ｄ６コード領域（５．１ｋｂ産物）の増幅を含む。次いで、この産物は、一連のポリメラーゼ連鎖反応−機能的なＣＹＰ２Ｄ６＊１対立遺伝子と比較して、ヌクレオチド点変異、欠失および挿入を検出するように設計された制限フラグメント長多型性反応について使用される（Ｇａｒｃｉａ−Ｂａｒｃｅｌｏら、（２０００）Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４６（１）：１８−２３）。例えば、Ｃ１８８Ｔ転移変異を検出するために、以下のプライマーがＣＹＰ２Ｄ６遺伝子を最初に増幅し、次いで、変異の特定の領域を増幅するために、使用され得る：
全長ＣＹＰ２Ｄ６遺伝子
５’−ＣＣＡＧＡＡＧＧＣＴＴＴＧＣＡＧＧＣＴＴＣＡ−３’
５’−ＡＣＴＧＡＧＣＣＣＴＧＧＧＡＧＧＴＡＧＧＴＡ−３’
Ｃ１８８Ｔ変異
５’−ＣＣＡＴＴＴＧＧＴＡＧＴＧＡＧＧＣＡＧＧＴＡＴ−３’
５’−ＣＡＣＣＡＴＣＣＡＴＧＴＴＴＧＣＴＴＣＴＧＧＴ−３’
次いで、Ｃ１８８Ｔ変異の存在は、ＨｐｈＩ制限酵素での消化によって検出される。
【０２３８】
一般的に、最も頻繁な変異が調査され、そして、これらは最も頻繁な対立遺伝子および遺伝子型に対応する。
【０２３９】
代謝能が高い表現型は、機能的な酵素をコードする少なくとも１つの対立遺伝子を有する個体に割り当てられる。乏しい代謝表現型は、２つ以上の機能的なＣＹＰ２Ｄ６対立遺伝子を欠く個体に割り当てられる。
【０２４０】
（ＣＹＰ２Ｅ１）
ＣＹＰ２Ｅ１は、ヒト肝臓において総ＣＹＰ４５０酵素の約５％を構成する。
【０２４１】
（多型性）
ＣＹＰ２Ｅ１遺伝子は、ヒト集団において多型性であることが実証されている。研究によって、１０のＣＹＰ２Ｅ１対立遺伝子（１つのｗｔ  ＣＹＰ２Ｅ１＊１、および９つの変異体、ＣＹＰ２Ｅ１＊２、ＣＹＰ２Ｅ１＊３、ＣＹＰ２Ｅ１＊４、ＣＹＰ２Ｅ１＊５Ａ、ＣＹＰ２Ｅ１＊５Ｂ、ＣＹＰ２Ｅ１＊６、ＣＹＰ２Ｅ１＊７Ａ、ＣＹＰ２Ｅ１＊７Ｂ、およびＣＹＰ２Ｅ１＊７Ｃ）の存在を実証された。ＣＹＰ２Ｅ１酵素活性に対するこれらの多型性の正確な関連は、明らかにされていないが、いくつかの研究は、変異体対立遺伝子ＣＹＰ２Ｅ１＊５ＡおよびＣＹＰ２Ｅ１＊５Ｂは、増加した転写および増加した酵素活性を生じることを示唆する。
【０２４２】
ＣＹＰ２Ｅ１は、いくつかの薬物および食事成分（イソフルラン、ハロタン、メトキシフルラン、エンフルラン、プロポフォール、チアミラール、セボフルラン、エタノール、アセトン、アセトアミノフェン、ニトロソアミン、ニトロソジメチルアミン、およびｐ−ニトロフェノールを含む）を代謝する。
【０２４３】
さらに、ＣＹＰ２Ｅ１は、環境の前発癌物質、特にニトロソジメチルアミン、ニトロソピロリドン、ベンゼン、四塩化炭素、および３−ヒドロキシピリジン（タバコ煙産物）を活性化する。１つの研究において、高いＣＹＰ２Ｅ１（ＣＹＰ２Ｅ１＊５ＡまたはＣＹＰ２Ｅ１＊５Ｂ）活性を有する個体は、胃癌について、より大きな危険性を有することが示されている（ＯＲ＝２３．６−２５．７）。
【０２４４】
（誘導および阻害）
ＣＹＰ２Ｅ１は、多数の薬物およびタバコ煙のような環境因子によって、ならびに飢餓、慢性的なアルコール消費によって、そして未制御の糖尿病において、誘導される。ＣＹＰ２Ｅ１は、クロルメチアゾール（ｃｈｌｏｒｍｅｔｈｉａｚｏｌｅ）、トランス−１，２−ジクロロエチレン、ジスルフェラン（Ｄｄｉｓｕｌｆｅｒａｎ）（シメチジン）によって、およびイソフラボノイドゲニステインおよびエクオール（ｅｑｕｏｌ）によって阻害される。
【０２４５】
環境因子による誘導または阻害は、特定の薬物を代謝するための個体の能力を厳しく変更する。従って、本発明は、治療の個別化におけるさらなる適用を見出し得る。これによって、環境因子は、例えば、ＣＹＰ２Ｅ１のような所定の薬物に関する目的の酵素および／または代謝経路に特異的な個体の代謝に影響する。さらに、環境因子は、個々に基づいてそして継時的に変化するので、本発明は、所定の時間における環境因子に起因する目的の酵素および／または代謝経路に特異的な個々の代謝における変異を検出するために使用され得、そして、安全および有効な個別の処置レジメンの決定における価値ある表現型特異的情報を提供する。慣例的に本発明を使用することによって、個々の処置レジメンは、環境的な影響を説明するためおよび処置の効果を最大にするために改変され得る。
【０２４６】
（人種間差異）
ＣＹＰ２Ｅ１表現型の割合は、人種集団と国との間で変化する：まれなｃ２（ＣＹＰ２Ｅ１＊５ＡまたはＣＹＰ２Ｅ１＊５Ｂ）対立遺伝子の頻度は、コーカサス人で約４％であり、そして、日本人で２０％であり、そして、別々の多型の研究は、コーカサス人において約１０％の頻度を有し、そして、日本人集団において２５％の頻度を有するまれなＣ対立遺伝子（ＣＹＰ２Ｅ１＊５ＡまたはＣＹＰ２Ｅ１＊６）を記載する。１つの研究において、日本人の男性は、コーカサス人の男性と比較してはるかに低いレベルのＣＹＰ２Ｅ１活性を有することが示された。従って、薬物代謝研究において、各人種集団は、多型性の証拠について別々に研究され得、そのアンチモードは、１つの人種集団から別の人種集団に外挿されるべきではないことが合理的である。
【０２４７】
（アセトアミノフェン）
薬物投薬において表現型決定が必要な例は、アセトアミノフェンの場合である。アセトアミノフェンは、広範に使用される鎮痛剤である。しかし、アセトアミノフェンは、低い頻度で肝毒性を引き起こす。肝毒性は、反応性代謝産物（Ｎ−アセチル−ｐ−ベンゾキノンイミン）（これは、求核試薬への結合が可能である）へのＣＹＰ２Ｅ１を介するその変換に起因する。これらの理由のために、ＣＹＰ２Ｅ１についての信頼できる表現型決定試験の有用性が明らかである。
【０２４８】
（ＣＹＰ２Ｅ１の直接的な表現型決定基）
本発明に従って、適切なプローブ基質は、制限されることなく、クロルゾキサゾンである。
【０２４９】
本発明に従って、クロルゾキサゾンおよびその代謝産物のモル比は、以下のように個体のＣＹＰ２Ｅ１表現型を決定するために使用される：
６−ヒドロキシクロルゾキサゾン／クロルゾキサゾン
クロルゾキサゾンおよびその代謝産物６−ヒドロキシクロルゾキサゾンの構造は、図８に示される。
【０２５０】
（ＣＹＰ２Ｅ１の間接的な表現型決定基（遺伝子型決定））
以前に述べられたように、ＣＹＰ２Ｅ１遺伝子は、複数の表現型を有する。最も一般的な変異についてＣＹＰ２Ｅ１を遺伝子型決定するための手順の例は、Ｐｓｔ／ＲｓａＩおよびＤｒａＩ変異と呼ばれる手順（ＣＹＰ２Ｅ１＊５Ａ、ＣＹＰ２Ｅ１＊５ＢおよびＣＹＰ２Ｅ１＊６の遺伝子型決定を可能にする）であり、特定のプライマーを使用して、ＰｓｔＩおよびＲｓａＩ制限部位またはＤｒａＩ制限部位のいずれかを含むフラグメントを増幅する工程を含む（Ｎｅｄｅｌｃｈｅｖａら、（１９９６）Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ２７２：２１８−２２５）。次いで、増幅された産物を、適切な制限酵素（ＰｓｔＩまたはＰｓａＩ／ＤｒａＩ）とインキュベートし、そして消化産物を電気泳動して分離した。ＰｓｔＩまたはＲｓａＩ部位でのｗｔ配列を有する対立遺伝子から、ＰＣＲによって生成された５１０ｂｐのフラグメントを、３６０ｂｐおよび１５０ｂｐのフラグメントに切断した。変異体対立遺伝子からは、５１０ｂｐのフラグメントは、切断されないままであった。ＤｒａＩ変異部位におけるｗｔ配列を有する対立遺伝子から、３７０ｂｐのＰＣＲ増幅フラグメントが、２４０ｂｐおよび１３０ｂｐのフラグメント対に切断されるが、変異体対立遺伝子は、切断されない。
ＰｓｔＩ／ＲｓａＩプライマー
５’−ＣＣＣＧＴＧＡＧＣＣＡＧＴＣＧＡＧＴ−３’
５’−ＡＴＡＣＡＧＡＣＣＣＴＣＴＴＣＣＡＣ−３’
ＤｒａＩプライマー
５’−ＡＧＴＣＧＡＣＡＴＧＴＧＡＴＧＧＡＴＣＣＡ−３’
５’−ＧＡＣＡＧＧＧＴＴＴＣＡ−ＴＣＡＴＧＴＴＧＧ−３’
ＣＹＰ２Ｅ１＊５Ａ変異体対立遺伝子は、ＲｓａＩ変異体およびＤｒａＩ変異体の両方を含むが、ＣＹＰ２Ｅ１＊５Ｂ変異体対立遺伝子は、ＲｓａＩ変異体のみを含む。ＲｓａＩ変異体は、増加した発現および増加した酵素活性に関連している。従って、ＣＹＰ２Ｅ１＊５対立遺伝子のいずれかの２つのコピーを有する個体は、広範な代謝表現型を割り当てられていると考えられ得る。逆に、ＣＹＰ２Ｅ１＊２変異体は、減少したタンパク質発現および減少した酵素活性に関連している。従って、ＣＹＰ２Ｅ１＊２対立遺伝子にホモ接合性のヒトは、乏しい代謝表現型を割り当てられ得る。
【０２５１】
（複数の表現型決定因子の特徴づけ）
このような酵素特異的代謝経路に基づいて、上に例示されるように、その表現型決定基を同定するためのいくつかのアプローチが、本発明に従って開発された。複数の表現型の特徴付けは、多数の適用を提供する。多くの第Ｉ相（例えば、チトクロームＰ４５０）および第ＩＩ相（例えば、Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ）代謝酵素についての個体の代謝表現型の決定により、多数の適用についてのこの単一プロフィールの使用が可能になる。薬物が、１つ以上の酵素によって代謝される場合、酵素の各々の表現型の状態は、第１に、個体が安全に所定の薬物を経口摂取し得るか否かを決定するために、そして、第２に、彼らが薬物を摂取可能な場合に、この個体についての最適な用量を決定するために、重要であり得る。
【０２５２】
アモナフィドの場合、ＮＡＴ２に加えて、ＣＹＰ１Ａ２は、この薬物の代謝において対して重要ではないが、有意な役割を果たし得ることが示唆されている。従って、複数の表現型決定基を特徴付ける能力はまた、表現型決定に基づいて、アモナフィドを用いる治療の個別化において重要な役割を果たし得ることが意図される。
【０２５３】
さらに、複数の表現型の知識は、同一の分類または属内の多数の薬物の比較を容易にし、異なった代謝酵素は、これらの薬物の代謝に関与する。例えば、特定の分類の薬物を必要とする個体を考えると、その中で、主に処方される３つが存在する。薬物がＣＹＰ１Ａ２によって代謝される場合、ＣＹＰ２Ｄ６によって代謝される薬物およびＣＹＰ３Ａ４によって代謝される残りの薬物、およびこれらの薬物の代謝が乏しい個体は、毒性の危険を有し、次いで、その個体を処置するために選択された薬物は、その個体の表現型プロフィールに基づいて決定され得る。例えば、個体が、ＣＹＰ２Ｄ６およびＣＹＰ３Ａ４について、代謝が乏しい場合、ＣＹＰ１Ａ２によって代謝される第１の薬物は、個体を処置するために考えられる第１の薬物であり得る。
【０２５４】
複数の表現型決定基についての個体の代謝プロフィールの決定に対する別の利点は、その代謝に主に関与しない酵素の代謝状態に関する薬物の効果である。例えば、薬物は、ＣＹＰ２Ｃ９によって代謝され得、そして、ＣＹＰ３Ａ４の活性を阻害する。まず初めに、個体が非常に低いレベルのＣＹＰ３Ａ４を有する場合、この阻害は、その個体のＣＹＰ３Ａ４表現型に対してほとんど影響を有し得ない。しかし、個体が、広範にＣＹＰ３Ａ４を代謝する場合、この薬物は、大いにＣＹＰ３Ａ４代謝状態を変更し得る。これは、過剰投与の場合に重大な問題を引き起こし得、ここで、個体は、多数の薬物を摂取し得、そして、１つの薬物の添加は、既存の薬物処置の安全および効率に影響し得る。
【０２５５】
以下に記載される実施例Ｉ〜ＩＩＩは、これらの表現型決定基を特徴付けるための選択されたプロトコルを例示する。さらに、実施例ＩＶ〜ＶＩＩＩは、これらのプロトコルから獲得された代謝表現型決定情報についてのそれぞれの適用および用途を概略する。
【０２５６】
代謝表現型は、直接的（酵素活性を測定することによって）かまたは間接的に（酵素活性のレベルを推測することによって）決定され得る。一般的に、直接的な表現型決定について、プローブ基質または基質（表４に例示される基質のような）が、表現型決定される個体に投与される。生物学的サンプル（例えば、尿サンプル）を、プローブ基質を投与した約４時間後に、引き続き個体から回収した。この尿サンプルは、リガンド結合技術に従って、分析される。
【０２５７】
（リガンド結合アッセイ）
安定した複合体を形成するために抗体による抗原の分子認識の特異性は、溶液中の分析的なイムノアッセイおよび固体状態の界面のイムノセンサー（ｉｍｍｕｎｏｓｅｎｓｏｒ）の両方に基づいている。リガンド結合アッセイとしてのこれらの分析方法の基礎となる基本的な概念は、標的分析物と高度に特異的な結合試薬との間のリガンド結合反応の産物の観察に基づいている。
【０２５８】
イムノアッセイ技術の開発は、特に臨床実験室についての成功談であり、そして、なお研究の活気に満ちた領域でありつづけている。さらなる発達および自動化が、臨床科学におけるイムノアッセイ分析の可能性を広げるであろう。これに加えて、イムノアッセイを使用するトレース分析についての新しい領域が、最近１０年で定義された：トレース物質の環境的分析および食品産業における品質管理。これらの適用はまた、連続的なモニタリング型を必要とするので、これらの特徴をカバーする連続的に作動する異質なイムノアッセイシステムとしてのイムノセンサーの考えが着想された。イムノセンサーは、現在、免疫化学分野における主要な発達であると考えられている。この分野の圧倒的な数の論文にかかわらず、臨床診断におけるイムノセンサーの商業的な適用はほとんど存在しない。その理由は、一部には、固定化、配向、およびトランスデューサー表面の抗体または抗体関連試薬の特異的性質に関連する未解決の基本的な問題である。さらに、重要な問題は、臨床適用が、慣例的な医療実験室におけるイムノセンサーデバイスから最も恩恵をうけ得るということである。この新しい技術の臨床的有用性に関するコンセンサスが存在する場合のみ、開発者の高い期待と現実との間のギャップが縮まり得る。イムノセンサーデバイスの設計者は、新しい分析技術由来の実験室医療の一般的および特別な必要性に気付いていなければならない。
【０２５９】
新しい分析計は、単純でありそして分析物の測定に「厳格」であるべきである。測定は、緊急事態の条件下でさえ、正確に（ｐｒｉｃｉｓｅｌｙ）かつ正確に（ａｃｃｕｒａｔｅｌｙ）行なわれなければならない。この分析計は、十分に自動化され、そして、１時間未満で転換し、迅速な測定を行なうことが可能でなければならない。さらに、分析物の決定は、好ましくは、マトリックス（例えば、血清、血漿、尿または脳脊髄液）のサンプル前処理がなしであるべきである。新しい分析計を有して決定される全てのパラメーターは、以下の基準を満たさなければならない、この基準は種々のガイドラインにおいて定義される：薬物または正常サンプルおよび病理サンプル成分による、低い不正確さ、小さいロットごとのバリエーション、高い分析感受性、至適分析特異性ならびに長い校正安定性および低い干渉を有する正確さ。
【０２６０】
臨床実験室において、イムノセンサーによる将来のイムノアッセイの置換は、単に新しい方法論の優位性および多能に依存する。注意すべき試験についての適用性は、つまり一過的に個体に移植される場合、ドリフト問題またはマトリックス干渉がなく、所望の分析物の信頼できるかつ正確な分析に依存する。種々の開発の途方もない成長に起因して、この総説は、包括的であることは意図されない。従って、主要な焦点は、イムノセンサーの報告された臨床適用の説明および評価である。より完全な理解のために、種々の分野におけるイムノセンサーの技術的局面および適用に関する最近５年以内のいくつかの優れた総説を参照する。他の関連した総説は、抗体操作の発達および最新のイムノアッセイ技術を扱う。
【０２６１】
（イムノアッセイおよびイムノセンサーの両方についての生体親和性インターフェイスとしての抗体）
全てのイムノセンサー系における分析物の測定についての特異性は、イムノアッセイの場合と同様に、親和性複合体化因子（結合分子）の適用に依存することを最初に明らかにすべきである。この中心的な特徴は、両方の技術に共有される。したがって、免疫グロブリン（抗体フラグメントおよびキメラ抗体を含む）についてのタンパク質工学、あるいは、代替的な結合成分（アプタマー（ａｐｔｍｅｒ）はこの１例である）または構造（分子インプリンティング（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｉｍｐｒｉｎｔｉｎｇ）はこの１例である）による抗体の置換における新しい発展は、利用可能であれば、いずれの技術にも適用可能である。特に、抗体工学における可能性は、抗体の親和性および細密な特異性、ならびにレポーター分子と結合した融合タンパク質としてのフラグメントの発現を変化し得る。
【０２６２】
（抗体についての固定化手順）
抗体は、このイムノセンサーの表面（これは、大部分はフロースルーセルの部分である）に厳密に固定化されなければならない。この抗体の最適密度および調整された（しかしランダムではない）配向は、最も重要である。感知表面の異なる型に起因して、この操作は利点（例えば、反応動力学パラメータの改善）を有し得るが、また、好ましくない影響（例えば、増大した非特異的結合、部分的に破壊されたパラトープ）も有し得る。抗体の志向性結合には４つの異なる型が存在する：表面上のＦｃレセプター（例えば、プロテインＡまたはプロテインＧ）あるいは組換えＡｒＧ融合タンパク質への結合；抗体のＦｃ部分に共有結合した構造への、他の結合パートナーの結合（例えば、Ｆｃ上のビオチン残基は、表面コーティングされたストレプトアビジンに結合する）；Ｃ２  Ｆｃドメイン上の酸化炭水化物部分を介する固体支持体への結合；およびそのＣ末端領域のスルフヒドリル基を介する、このデバイスの表面へのＦａｂフラグメントまたはｓｃＦｖフラグメントの結合。
【０２６３】
多数の化学反応が、固体表面への固定化に適用され得る。抗体またはその炭水化物部分と固相材料（シリカ、シラン処理シリカ、Ｔａ−またはＴｉ−酸化物、プラスチック、セファロースおよび金属フィルム）との間の規定された結合は、グルタルアルデヒド、カルボジイミド、スクシンイミド（ｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ）エステル、マレインイミド、過ヨウ素酸塩またはガラクトースオキシダーゼによって形成される。さらに、アリールジアジリジンで誘導体化されたアルブミンを光リンカー（ｐｈｏｔｏｌｉｎｋｅｒ）として用いる、抗体の光固定化が適用可能である。生理吸着（ｐｈｙｓｉｏｓｏｒｐｔｉｏｎ）は、このフロースルーセルにおける機械的応力によって引き起こされるこの層の局所的不安定性に起因して、推奨されない。圧電性センサの石英表面に抗体を固定化するための刺激的な新しい方法は、石英結晶上へのエチレンジアミンプラズマ重合フィルムの蒸着に基づく。このフィルムは、極度に薄くかつ均一であり、さらに誘導体化され得そして免疫グロブリンに結合され得るアミノ官能基を組み込み、志向性が制御されかつ高度に再利用可能な感知表面を生じる。最近の別の発展は、平面支持されたリン脂質二分子層（ＳＬＢ）であり、これは、ベシクルの融合およびＬａｎｇｍｕｉｒ−Ｂｌｏｄｇｅｔｔ法によって固体支持体上に形成され得る。ＳＬＢは、二次元の流動性を維持し、そして溶液中の表面結合リガンドとレセプター分子との間に多価結合を適応させる。
【０２６４】
貴金属表面（例えば、金）（特に、光学的イムノセンサーにおいて）については、自己集合単分子層（ＳＡＭ）技術が第１の選択のようである。一般に、ＳＡＭは、誘導体化された有機官能基を有する長鎖（Ｃ１２以上）のｎ−アルキルチオールで作製され、この有機官能基は、未だ完全には理解されていない機構によってチオール基を介して金フィルムに容易に結合する。ＳＡＭの官能基は、抗体のＦｃ部分と架橋し（１つの方法は、ビオチン  ストレプトアビジン系を介して）、一方、このマトリックスの自己組織化は、この表面が、非特異的結合作用に特有になる（ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ）ことを防ぐ。さらに、短鎖（チオクト酸およびメルカプトプロピオン酸は２つの例である）のＳＡＭ改変金属表面へのＩｇＧの共有結合は、光学的イムノセンサーのための有効な親和性ベースの層であることが示された。
【０２６５】
（抗体でコートされたセンサ表面の再生）
従来の均一および不均一なイムノアッセイは、それぞれ不連続的に作動する。しかし、臨床診断において用いられるイムノセンサーデバイスは、ある程度連続的に記録し得ることが非常に所望される。使い捨て検出要素の繰り返しの使用は、ある程度連続的な動作を模倣し得るが、これはここでは考慮されない。本物のイムノセンサーにおいて、センサコートされた表面上の分析物／抗原の相互作用は可逆的である。フロースルーセルデバイスの所定の短いインキュベーション時間を用いると、抗原と抗体との間の反応は、平衡状態から遠く離れる。迅速な可逆性および高度な感受性は、相互に排他的である。一貫して、適切な分析感度は、増加した親和性（＞１０１０Ｍ−１）または少なくとも高度に改善されたオンレート（ｏｎ−ｒａｔｅ）を有する抗体が適用される場合にのみ、保証される。
【０２６６】
イムノセンサーの表面に結合した抗体の結合部位の再生は、ストリンジェントな手順を必要とする。酸性またはアルカリ性の溶液、グアニジウムクロリド、またはイオン強度ショックを用いる抗体の再生は、結合能力に対して潜在的に有害であり、そして固定された抗体の寿命の減少および潜在的なドリフト（ｄｒｉｆｔ）問題を導き得る。
【０２６７】
これに加えて、フロースルー系において抗体と溶解性分析物との間の短い反応時間を用いると、適用された抗体の交差反応性が増大し得ることを考慮しなければならない。この抗原の高度に特異的な認識は、この抗原が結合する際の抗体のＦａｂ部分におけるコンホメーション変化の複雑さに起因して、動力学によって制御されるプロセスである。
【０２６８】
「抗体再生」問題を解決するための異なるアプローチが存在する：１つのアプローチは、抗原性分析物を、表面結合抗体に対する弱い親和性を有する関連抗原の高濃度の溶液で置換することである。しかし、これは適切な抗原性の代わりのものの利用可能性に依存する。これは常に実現可能であるわけではなく、そして小さな分析物に対してのみ適用可能である。第２のアプローチは、分子全体としてまたはＦａｂフラグメントとして、抗体の化学的安定性を改善するために抗体工学の技術を使用することである。ファージディスプレイ技術は、このような強力なツールである。これは、改善された安定性を有する抗体フラグメントの選択に役立ち得る。ペプチドリンカーによって結合された、Ｌ鎖およびＨ鎖の可変領域を含む単鎖Ｆｖフラグメント（ｓｃＦｖ）の変異体のライブラリーは、部位特異的変異誘発とランダム変異誘発との組合せによって作製される。この選択は、異なる物理的または化学的圧力下で行われ得、より熱力学的に安定なｓｃＦｖ変異体を生成する。興味深い第３のアプローチは、イムノセンサーについての偽再生手順である。電流測定センサは、特定の抗体とメタクリレートモノマーおよびグラファイトとの混合物によって形成される導電性免疫複合体でコーティングされる。重合後、このデバイスは使用できる状態である。このポリマーが研磨紙で徹底的に研磨される場合に、繰り返しの測定が可能になる。これらの記述は、競合的な構成を有するイムノセンサー（ここで、抗体ではなく、抗原性化合物が表面に固定化される）にはあてはまらない。
【０２６９】
（イムノセンサー適用のための代替的な分析物結合化合物）
（アプタマー）
アプタマーは、高い親和性および特異性で種々の標的分子を認識する能力を有する、一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡオリゴヌクレオチド配列である。これらのリガンド結合オリゴヌクレオチドは、種々の診断形式において抗体の性質を模倣する。これらは、独特な全体的な形状へと折り畳まれ、標的構造に対する複雑な結合溝（ｆｕｒｒｏｗ）を形成する。アプタマーは、指数関数的な濃縮によるリガンドの系統的進化として公知のインビトロ選択プロセスによって同定される（ＳＥＬＥＸ）。アプタマーは、これらを感知表面に堆積させる場合に、抗体を超える利点を有し得る。さらに、親和性定数は一貫して抗体のものよりも低く、かつこれらの化合物の安定性は依然として疑問であるにもかかわらず、任意の量における高度に再現可能な合成アプローチに起因して、これらは、複雑な生物学的マトリックスにおける診断適用のために特に有用であり得る。アプタマーベースのスキームは、依然としてその初期段階にあり、そして改変されたヌクレアーゼに耐性のＲＮＡおよびＤＮＡアプタマーが、種々の治療形式および診断形式についてまもなく利用可能になると期待される。バイオセンサにおける使用のためのアプタマーの可能性は、シリカのミクロスフェア表面上に固定され、そしてイメージングファイバーの遠位先端部のマイクロウェルに分散される、抗トロンビンＤＮＡアプタマーを使用する光ファイバーバイオセンサの設計において概略される。このデバイスを用いると、低濃度でのトロンビンの決定が可能となった。刺激的な新しい可能性は、シグナル伝達特性におけるリガンド依存的な変化および触媒的に活性な、いわゆる「アプタ−ザイム（ａｐｔａ−ｚｙｍｅ）」（これは、触媒作用への分子認識の直接の変換を可能にする）を用いる、シグナル伝達アプタマーの導入によって発展する。
【０２７０】
（アンチカリン（Ａｎｔｉｃａｌｉｎ））
リポカリン（ｌｉｐｏｃａｌｉｎ）は、疎水性および／または化学的に感受性の有機化合物の貯蔵または輸送のためのタンパク質のファミリーを構成する。レチノール結合タンパク質は、ヒトの生理学における例である。ビリン結合タンパク質（リポカリンファミリーのメンバーであり、そしてチョウＰｉｅｒｉｓ  ｂｒａｓｓｉｃａｅに由来する）は、ジゴキシゲニン（これは、例として与えられる）のような可能性のある抗原を特異的に複合体化するために、構造的に新形態となり得ることが実証された。これらの結合タンパク質は、保存されたβ−バレル（これは、８つの逆平行のβ鎖から作製され、中心の核の周りに巻きついている）を共有する。円錐系構造の最も広い末端で、これらの鎖は、４つのループによって対になった様式で連結され、リガンド結合部位を形成する。リポカリン骨格は、いわゆる「アンチカリン」の作製のために利用され得、これは組換え抗体フラグメントの見込みのある代替物を提供する。これは、４つのループにわたって分散した種々のアミノ酸残基を、標的化されたランダム変異誘発に対して個々に区別する（ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ）ことによって作製される。このクラスのタンパク質は、診断アッセイおよびイムノセンサーにおいて適用可能であることが依然として示される。なお規定される必要のある決定的な点としては、このアンチカリンの合成および安定性、親和性定数の大きさ、ならびに多種のリガンドに対して作製（ｃｒａｆｔ）されるための多能性が挙げられる。
【０２７１】
（分子インプリンティング技術）
これは、特定の基質、または構造的類似体の群について選択的に予め決定した、高分子吸収剤の調製に基づく技術である。プラスチック材料の官能性および架橋性モノマー（例えば、メタクリル酸およびスチレン）は、低エネルギーの相互作用を生じるために、テンプレートリガンドと相互作用される。引き続いて、重合が誘導される。このプロセスの間に、目的の分子は、非共有結合の自己集合アプローチによって、または可逆的な共有結合アプローチによってのいずれかで、このポリマーに包括される。重合を止めた後、このテンプレート分子を洗い流す。得られるテンプレートのインプリントを、強固なポリマー中で維持し、このテンプレートについての立体構造（サイズ、形状）および化学的作用（相補的な官能基の特別な構成）を記憶させる。分子的にインプリントされたポリマー（ＭＩＰ）は、テンプレート（＝分析物）を、抗原−抗体相互作用の特異性と同様の特異性で結合し得る。
【０２７２】
固相での抽出およびクロマトグラフィーでの主な用途に加えて、分子的にインプリントされたポリマーは、競合結合アッセイにおいて抗体の非生物学的代替物として既に利用されている。分析物（例えば、シクロスポリンＡ、アトラジン、コルチゾール、１７ｂ−エストラジオール、テオフィリン、ジアゼパム、モルヒネ、およびＳ−プロパノロール（ｐｒｏｐｒａｎｏｌｏｌ））に対する一連の適用は、分子インプリンティングが、イムノアッセイおよびイムノセンサーについての見込みのある技術であることを示唆する。
【０２７３】
（イムノアッセイおよびイムノセンサー技術）
（イムノアッセイ）
イムノアッセイは、サンプル分析物の決定のために、抗体または抗体関連試薬を使用する。この分析ツールは、１９５９年（この時に、ＢｅｒｓｏｎおよびＹａｌｏｗが、最初にラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）の原理を説明した）以来、進化的な歴史を遂げた。ＲＩＡにおいて、固定されかつ限定された量の抗体が、固定されかつ限定された量の放射標識抗原トレーサおよび可変濃度の分析物と反応される。抗体のリガンド結合の選択性は、これらの生体分子が、複雑な生物学的マトリックス（例えば、血液、血漿、または尿）においてでさえ高度に特異的な分析方法において使用されることを可能にする。抗体−分析物相互作用の選択性を、宿主動物の免疫化プロセスにおいて実施された抗体の莫大なアレイ、および大量の容易に検出可能な標識放射性同位元素、酵素学的または電気化学的に誘導された吸光度または蛍光または化学発光の有効性と組み合せることによって、イムノアッセイは、異常に低い検出限界を有しながら、広範な種々の分析物について設計され得る。
【０２７４】
（バイオセンサおよびイムノセンサー）
バイオセンサは、生物学的エレメントを半導体の表面上に組み込み、分析物およびシグナルトランスデューサとの可逆的な生体特異性相互作用を可能にする、分析デバイスである。この生物学的エレメントは、生体認識のために認定された分子（例えば、酵素、レセプター、ペプチド、一本鎖ＤＮＡ、または生細胞までも）の層である。抗体または抗体フラグメントが生物学的エレメントとして適用される場合、このデバイスはイムノセンサーと呼ばれる。従来の分析機器と比較して、バイオセンサは、これらの２つの構成要素の統合された構造によって特徴付けられる。多くのデバイスは、フロースルーセルに接続され、操作の流動−注入分析（ＦＩＡ）モードを可能にする。バイオセンサは、高度に感受性の検出システムを達成するために、高度な分析特異性を現代のエレクトロニクスの処理能力と組み合せる。
【０２７５】
２種類の異なる型のバイオセンサが存在する：生体触媒性バイオセンサおよび生体親和性ベースのバイオセンサ。生体触媒性バイオセンサは、生物学的化合物として主に酵素を使用し、シグナル伝達生化学反応を触媒する。生体親和性ベースのバイオセンサ（結合事象自体をモニターするために設計される）は、生体分子認識について、特異的結合タンパク質、レクチン、レセプター、核酸、膜、全体の細胞、抗体または抗体関連物質を使用する。後者の２つの場合において、これらのバイオセンサはイムノセンサーと呼ばれる。
【０２７６】
バイオセンサは、診断ツールとして（主に、ポイントオブケアテスティング（ｐｏｉｎｔ−ｏｆ−ｃａｒｅ  ｔｅｓｔｉｎｇ）において）広範に使用される。おそらく、今日のバイオセンサの成功した商品化の大部分は、使い捨て試薬カートリッジを備える種々の携帯型システムを使用する、毛細管グルコースのほぼ個別のインビトロ測定である。
【０２７７】
（イムノセンサーの原理）
一般的なイムノセンサーの設計は、図１０に示される。４種類のイムノセンサー検出デバイスが存在する：電気化学的（電位差測定、電流測定、または電気伝導度測定／静電容量的）、光学的、微重量測定的、および温度的。全ての型は、直接的非標識イムノセンサーとして、または間接的標識イムノセンサーとしてのいずれかで動作され得る。直接センサは、免疫複合体の形成の間の物理的変化を直接検出し得、一方、間接センサは、シグナル発生標識（これは、この複合体に組み込まれる場合に、より感受性かつ汎用性の検出方法を可能にする）を使用する。
【０２７８】
間接イムノセンサーにおいて適用されてきた非常に多様な異なる標識が存在する。原則的に、これらはイムノアッセイにおいて使用されるのと同じ標識である。なかでも最も価値ある標識は、酵素（例えば、ペルオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）、カタラーゼまたはルシフェラーゼ）、電気活性（ｅｌｅｃｔｒｏａｃｔｉｖｅ）化合物（例えば、フェロセンまたはＩｎ２＋塩）、および一連の蛍光標識（ローダミン、フルオレセイン、Ｃｙ５、ルテニウムジイミン錯体、およびリン光ポルフィリン色素を含む）である。特に、２つの蛍光体の間のレーザー誘導蛍光共鳴エネルギー輸送は、方法論的な利点を提供し、そして光ファイバー検出に拡張され得る。
【０２７９】
間接イムノセンサーは、適用される標識の分析特性に起因して高度に感受性であるが、直接センサデバイスの概念は、依然として興味をそそり、そしてイムノアッセイ系についての本当の代替的発展を表す。その潜在的な単純性は、複数の利点を保持し、イムノセンサーを進行性かつ未来指向性にする。
【０２８０】
本発明は、以下の実施例を用いて例示されるが、この実施例はいかようにも限定的には理解されない。当業者は、本明細書中で詳細に記載される本発明の特定の実施形態についての多くの均等物を認識するか、または慣用的な実験のみを用いて確認し得る。このような均等物は、特許請求の範囲に含まれることが意図される。
【０２８１】
（電気化学的センサ）
電位差測定イムノセンサー。ネルンストの式は、全ての電位差測定トランスデューサの基礎的な原理を提供する。この式に従うと、電位の変化は、特定のイオン活性に対して対数的に比例する。電位差測定トランスデューサの電極（ほぼゼロの電流で表面の電位変化を測定し得る）は、以下の方法論を適用することによって構築される。
【０２８２】
膜貫通電位。このトランスデューサの原理は、検出膜を横切る電位の蓄積に基づく。イオン選択電極（ＩＳＥ）は、このサンプルとセンサ表面との間に電荷の分離を生じるイオン選択膜を使用する。同様に、この膜上に固定された抗原または抗体は、半導体の表面で溶液から対応する化合物を結合し、そして膜貫通電位を変化させる。
【０２８３】
電極電位。このトランスデューサは、膜貫通電位センサと類似している。しかし、電極単独は、免疫複合体成形のための表面であり、分析物の濃度に関連して電極電位を変化する。
【０２８４】
電界効果トランジスタ（ＦＥＴ）。ＦＥＴは、電極表面での電荷をモニターするために使用される半導体デバイスであり、これは、いわゆるソース電極とドレイン電極との間の金属ゲートの上に組み立てられる。この表面電位は、分析物の濃度と共に変化する。ＩＳＥとＦＥＴとの統合は、イオン選択電界効果トランジスタ（ＩＳＦＥＴ）において実現化される。この技術はまた、イムノセンサーにも適用され得る。
【０２８５】
電位差測定センサの利点は、操作の単純さ（これは、自動化のために用いられ得る）、および半導体ＦＥＴセンサの小さなサイズである。しかし、全ての電位差測定法は、感受性（電流測定トランスデューサよりも劣る）およびサンプル中に存在する他のイオンの結合またはこれらイオンからのシグナル伝達の影響の非特異的作用という主な問題を今も受けている。特に、シグナル対ノイズの比は、分析上の問題を引き起こし、この問題は回避が難しい。従って、これらの技術を避ける傾向がここ数年において認められた。しかし、ＩＳＦＥＴは、特に、ζ電位の差動ＩＳＦＥＴベースの測定の新規な概念が用いられる場合、超高感度臨床イムノセンサー適用についての候補と考えられ得る。流動電位は、流れ方向における電位差であり、電荷のバランスの局所的なひずみから生じる過剰のイオンの流れによって引き起こされる。ζ電位（流動電位に直接的に相関する）は、散在性外層における固体−液体界面での電位変化を反映する。これは、タンパク質蓄積物とセンサ表面に効率的に反応し、従ってこれは免疫複合体反応物の検出に適切である。
【０２８６】
（電流測定イムノセンサー）
電流測定イムノセンサーは、一定の電圧で電気化学的反応によって生成される電流を測定するために設計される。直接的検出に利用可能な適用はわずかしかない。なぜなら、大部分のタンパク質分析物は、電気化学的反応において酸化還元パートナーとして元来作用し得ないためである。したがって、電気化学的に活性な標識は、直接または酵素反応のプロドラッグとして、検出電極での分析物の電気化学的反応のために必要である。酸素電極およびＨ２Ｏ２電極が最も通俗的である。酸素電極は、検出Ｐｔ陰極（０．７Ｖで分極する）およびＡｇ／ＡｇＣｌ参照電極を備える、電解質を有するチャンバからなる。このチャンバは気体透過性であり、Ｏ２透過膜によって覆われる。
【０２８７】
カタラーゼによってＨ２Ｏ２から生成される酸素に加えて、他の電流測定的に検出可能な化合物（例えば、フェロセン誘導体またはＩｎ２＋塩）が存在する。新規なアプローチは、酸化還元ポリマー［ＰＶＰ−Ｏｓ（ビピリジル）２Ｃｌ）の使用であり、このポリマーは特定の抗体と共に同時固定化される。さらに、電気化学的に活性な生成物を伴う酵素についての例が存在する。例えば、ＡＰは、フェニルホスフェートまたはｐ−アミノフェニルホスフェート（４−ＡＰＰ）化合物の加水分解を触媒し、電気化学的に活性なフェノールまたはｐ−アミノフェノールを生じる。さらに、酵素（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、グルコースオキシダーゼ、グルコース−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼ）および引き続くＮＡＤＨなどの電流測定的酸化はまた、標識として首尾よく適用された。
【０２８８】
しかし、間接的検出系を有する電流測定イムノセンサーの主な不利は、優れた感受性によって補われる。これは、電位差測定系における対数関係と比較した、直線的な分析物濃度範囲に起因する。電極表面上での酸化還元パートナーについての、系に固有の輸送速度の限界に対して、特別な注意がなされなければならない。
【０２８９】
（電気伝導度測定イムノセンサーおよび静電容量的イムノセンサー）
これらのイムノセンサートランスデューサは、特異的にイオンを生成または消費する生化学的酵素反応によって引き起こされる、一定電圧での溶液における電気的伝導性の変化を測定する。静電容量の変化は、電気化学的な系を使用して測定され、ここで、生理活性エレメントは、貴金属（大部分はＡｕまたはＰｔ）電極の対に固定される。生物学的マトリックスの高いイオン強度が、シグナル伝達反応によって引き起こされる比較的少量の伝導率の変化を記録することを困難にするので、利用可能な臨床適用はわずかしか存在しない。この問題を回避するために、最近では、生物学的な検出機能を模倣するイオンチャネルコンダクタンスイムノセンサーが開発された。この技術の基礎は、分子イオンチャネル（これは、つながれたグラミシジンＡで作製され、そして脂質二分子膜を横切って整列される）の集団のコンダクタンスが、抗体−抗原結合事象によって変化するという事実である。イオンチャネル複合体に連結された種々の抗体を用いる異なる適用が、提供される。
【０２９０】
別のアプローチは、表面伝導率の変化の測定である。例えば、尿中のメタンフェタミン（ＭＡ）の測定のための電気伝導度イムノセンサー（ｉｍｍｕｎｏｓｅｎｓｏｒ）が近年開発された。抗ＭＡ抗体を、一対の白金電極の表面上に固定した。免疫複合体の形成は、この電極間の伝導率における減少を引き起こした。交流電圧で実施される、逆数キャパシタンス（ｒｅｃｉｐｒｏｃａｌ  ｃａｐａｃｉｔａｎｃｅ）の測定は、電気伝導度デバイスと比較して有利であり、そして２つの目的に役立つ。第一は、センサーの貴金属表面上の絶縁単層を試験するためである。自己アセンブルする単層は、絶縁特性を有する。このことに加えて、これらは、イムノセンサーが、非特異的結合現象によって影響を及ぼされるのを防止する。たとえわずかな単層の脱着であっても、キャパシタンスの本質的な増加を引き起こす。従って、デバイスの実際の品質を点検し得る。第二の適用は、抗体がアルキルチオール層に連結された場合の、抗原結合の間における絶縁層の有効な誘電体厚の変化の測定である。当然のことながら、これは、アルキルチオール単層のｖ−置換が絶縁を損なわないということが前提である。従って、電気的キャパシタンスの著しい減少が観察され、そして分析物を定量するために使用される。ナノ構造の単層における側方拡散（ｌａｔｅｒａｌ  ｄｉｆｆｕｓｉｏｎ）の破壊的影響は、スプレッダー−バー技術の使用により防止される。
【０２９１】
（光学的センサー）
光学的イムノセンサーは、生体分析のために最も一般的であり、そして現代における最大のトランスデューサ群である。これは、他のトランスデューサ技術と比較して、可視光を適用することの利点に起因する。さらなる利点は、非破壊的な操作様式ならびに迅速なシグナルの生成および読み取りである。特に、光学的導波管および精密なオプトエレクトロニクスのようなファイバーバンドル光学（「オプトーデス（ｏｐｔｏｄｅｓ）」）の導入は、臨床的適用のためのこれらの分析用デバイスの用途の増加を提供する。
【０２９２】
吸収、蛍光、発光、散乱または屈折率（ＲＩ）における変化は、光が感知表面で反射される場合に生じる。これらの情報は、光学的センサー技術の物理的基礎である。通常、適用される検出器は、フォトダイオードまたは光電子増倍管である。
【０２９３】
免疫学的反応、標識化免疫種、または酵素学的反応産物のいずれかの直接的な未標識光学的検出の多数の適用が存在する。大半の標識は蛍光であるが、生体発光種および化学発光種もまた可能である。未標識のエバネセント波関連センサーが、明らかに優れた方法を表し、これが精密なイムノアッセイに対する有益な代替物であることに言及することには価値がある。にもかかわらず、未標識系は、未解決の問題（例えば、非特異的結合作用および低分子量を有する分析物に対する貧弱な分析感受性）を被る傾向にある。Ｋｕｂｉｔｓｃｈｋｏらは、努力されているにもかかわらず、すべてのイムノセンサーが依然として、ヒト血清中の分析物（特に、低分子量を有する分析物）の決定について、市販のイムノアッセイよりも１の規模で感受性が低いことを記載している。著者らは、シグナルを増強するための大規模標識（例えば、ラテックス粒子）の使用を主張している。この著者らは、ナノ粒子の最適化が、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ、ＭＷ２８，０００Ｄａ）の検出のための二回折格子カプラーイムノセンサーを増強することを実証した。このセンサーの優れた動作特性は、将来のデバイスが如何に作動すべきかを明確に示した。しかし、非特異的結合の問題もまた、参照感知領域をチップに適用することによって制御され得る。
【０２９４】
（全反射分光学（ＴＩＲＳ））
以下の分析用デバイスの共通の原理は、異なる屈折率（ＲＩ）を有する２つの材料を備えた光学的センサーにおいて、全反射は、層を通して感知インターフェイスの方により高いＲＩで指向する特定角度の光ビームにおいて生じるということである。これにより、エバネセント波は、より小さいＲＩを有する材料において生成される。入射光ビームの波長の電気的ベクトル（ｅｌｅｃｔｒｉｃａｌ  ｖｅｃｔｏｒ）であるこの波長は、指数関数的に減衰した振幅で媒体中へとさらに透過する。この媒体の部分に付着した生体分子は、エバネセント波と不可避的に相互作用し、従って、反射光の特有の減少へと導く。この分解能は、相互作用の長さと正比例する。減衰した全反射を測定する赤外分光学は、一般に、クレッチュマン配置（Ｋｒｅｔｓｃｈｍａｎｎ  ｃｏｎｆｉｇｕｒａｔｉｏｎ）に組み込まれ；センサーの表面上の光学的吸収フィルムは、入射ビームの波長の関数として、減衰した光強度の測定を可能にする。全反射蛍光（ＴＩＲＦ）について、分析は、入射光が、センサー表面付近で蛍光特性を有する分子を励起して、蛍光エバネセント波を作り出すという事実から利益を得る。発生する蛍光が最終的に検出される。この技術は主に、放射性標識された抗体または抗原の光学的検出のために開発された。後者の場合、蛍光キャピラリー充填デバイス（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｃａｐｉｌｌａｒｙ  ｆｉｌｌ  ｄｅｖｉｃｅ；ＦＣＦＤ）が、言及するに価値がある。ＦＣＦＤは、平面の光学的導波管およびキャピラリーギャップによって互いに分離されたガラス板を使用することにより設計される。発蛍光団で標識した抗原を、ガラス板の表面に付着させ、一方で抗体を、光学的導波管の表面に固定する。
【０２９５】
別の現象である光学的回折は、光学的バイオセンサーアッセイ（ＯＢＡＴＭ）系によって使用される；生体分子は、シラン処理されたウェーハの表面に付着される。タンパク質でコーティングした表面を、フォトマスクを通して照射して、活性タンパク質および不活性タンパク質の別個の断続的な領域を作り出す。レーザー光での照射に際して、リガンド結合プロセスによって生じた回折格子は、入射光を回折する。分析物を含まないネガティブサンプルは、回折を生じない。なぜなら、回折格子を作り出す抗原−抗体結合が生じないからである。回折シグナルの存在または非存在は、ポジティブサンプルとネガティブサンプルとの間を識別する。シグナル強度は、分析物濃度の定量的測定を提供する。
【０２９６】
（楕円偏光法）
既知の方向の直線偏光が、表面から斜位の入射で反射される場合、反射光は楕円偏光される。楕円の形状および方向は、入射の角度、入射光の偏光方向、および表面の反射特性に依存する。平面の固体表面上への生体分子の吸着に際して、反射光の位相および振幅は変更され、そして楕円偏光法技術によって記録され得る。光の偏光におけるこれらの変化は、ＲＩおよびコーティング厚の変更に起因する。楕円偏光計を使用して実施された、わずかにいくつかの適用が存在する（例えば、コレラ毒素−ガングリオシドＧＭ１レセプター−リガンド反応の研究）。
【０２９７】
（光学的誘電体導波管）
光学的導波管は、低指数の誘電体材料（ｌｏｗｅｒ  ｉｎｄｅｘ  ｄｉｅｌｅｃｔｒｉｃ  ｍａｔｅｒｉａｌ）の間または低指数の誘電体材料中に包埋された高ＲＩ材料製のガラス、石英またはポリマーのフィルムまたはファイバーである。高指数のフィルムまたはファイバーに導入された直線偏光ヘリウム−ネオンレーザー光波動が、全反射の臨界角よりも大きな角度で境界に到達する場合、これは、導波管内部に制限される。表面プラズモン共鳴と同様に、エバネセント場は、センサーの表面で発生する。しかし、この場合、エバネセント場は、誘電体層における光自身の励起によって生成される。大半のレーザー光は、デバイス内に透過され、そして生物学的に活性な物質が表面にわたって配置されている場合には、これが媒体を通して伝わるので複数の反射が生じる。しかし、いくらかの光は、生体層（ｂｉｏｌａｙｅｒ）を貫通する。この光は、透過光を妨害する位相においてシフトを有して、導波管中に反射し戻される。従って、生体層の特性における変化は、干渉における変化を検出することによって追跡され得る。
【０２９８】
導波管はしばしば、ファイバーの形態で作製される。これらの光ファイバー導波管系は、危険な分析物に使用される場合に、センサーに利点を与える。平面導波管系もまた、干渉計に適用可能である。これらは、付着した生体分子を有する導波管表面の方に指向されたレーザー光を使用し、これは引き続き、互いに対して垂直な二つの部分的な電気的（ＴＥ）および磁気的（ＴＭ）場波動（ｆｉｅｌｄｗａｖｅ）に分割される。サンプル表面との相互作用は、異なるＲＩおよび表面厚の値によって、ＴＥとＴＭとの間で相対的な相を変化させる。種々の立体配置（例えば、Ｆａｂｒｙ−Ｐｅｒｏｔモノモードチャネル干渉計、Ｍａｃｈ−Ｚｅｈｎｄｅｒ干渉計または関連のツーモード薄膜導波管差異干渉計（ｔｗｏ−ｍｏｄｅ  ｔｈｉｎ−ｆｉｌｍ  ｗａｖｅｇｕｉｄｅ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｍｅｔｅｒ））が、首尾良く確立された。
【０２９９】
別の技術は、導波管の表面にエッチングされた薄波形成形（ｔｈｉｎ  ｃｏｒｒｕｇａｔｉｏｎ）を使用する。この格子カプラーデバイスは、入力レーザービームまたは出力レーザービームのいずれかの結合角（ｃｏｕｐｌｉｎｇ  ａｎｇｌｅ）の測定を可能にする。両方のビームは、センサー表面のエバネセント場におけるＲＩと相関する。近年、長期格子ファイバーイムノセンサー（ｌｏｎｇ−ｐｅｒｉｏｄ  ｇｒａｔｉｎｇ  ｆｉｂｅｒ  ｉｍｍｕｎｏｓｅｎｓｏｒ）は、高感度（ナノモル濃度範囲まで低い分析を可能にする）であり、かつ再現性を有することが証明された。格子カプラーはまた、光学的導波管光モード分光学（ｏｐｔｉｃａｌ  ｗａｖｅｇｕｉｄｅ  ｌｉｇｈｔｍｏｄｅ  ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ；ＯＷＬＳ）のために使用される。ＯＷＬＳ法の基本原理は、直線偏光は、導波管層への回折格子によって結合されるということである。非結合は、限定された入射角で生じる共鳴現象であり、これは、導波管の表面を被膜している媒体のＲＩに依存する。導波管層において、光は、全反射によってエッジへと導かれ、このエッジにおいて、この光がフォトダイオードにより検出される。光の入射角を変動させることによって、有効なＲＩがＴＥおよびＴＭの両方について計算されるモードスペクトルが得られる。
【０３００】
（表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ））
種々の検出系の中でも、ＳＰＲは最も一般的な検出系である。市場には、２つの読み取り系が存在する：Ｂｉａｃｏｒｅ（Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）からのＢＩＡｃｏｒｅＴＭ系およびＦｉｓｏｎｓ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｅｎｓｏｒ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＵＫ）からのＩＡｓｙｓＴＭ。小さな市場での位置づけにある他の系は、Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  Ｓｅｎｓｉｎｇ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ（Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）からのＢＩＯＳ−１、Ｄｅｎｋｉ  Ｋａｇａｋｕ  Ｋｅｉｋｉ（Ｊａｐａｎ）からのＳＰＲ−２０、Ｔｅｘａｓ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ（ＵＳＡ）からのＳＰＥＥＴＡ、Ｗｉｎｄｓｏｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（ＵＫ）からのＩＢＩＳ、およびＱｕａｎｔｅｃｈ（ＵＳＡ）からのＤＰＸである。最初の２つの市販のエバネセント波デバイスが、精密な装置でありかつユーザーフレンドリーな制御ソフトウェアであることが理由で、研究室において広く行き渡っている。しかし、ＢＩＡｃｏｒｅＴＭが、最大の市場での位置づけを有する。
【０３０１】
ＳＰＲ測定８０の基本原理を図１１に示す。偏光を、高ＲＩの層から低ＲＩを有する層の方へと指向させて、全反射を生じさせる。サンプルを、低ＲＩの層に付着させる。２つの媒体の間のインターフェイスに、約５０ｎｍの金の薄膜を挿入する。光は低ＲＩ媒体中には伝搬しないが、界面強度は０ではない。インターフェイスを通して連続することの物理的要件は、光エネルギーによって、金属フィルムにおいて表面電子「プラズモン」を励起するための理由である。結果として、電子は発振し始める。これは、低ＲＩ媒体中に規定された距離で貫通する、指数関数的に崩壊するエバネセント波を生じ、これは、反射光の強度における特徴的な減少を説明する。従って、表面インターフェイスでのＲＩの変化における直接的な洞察は、ここで起こる生体特異的な相互作用によって引き起こされる、反射光の強度および共鳴角をモニタリングすることによって可能とされる。ＢＩＡｃｏｒｅＴＭ系では、光はたった一度しか感知層に影響を及ぼさないが、ＩＡｓｙｓＴＭでは、そのデバイスの共鳴鏡の立体配置に起因して、数回の伝搬接触が存在する。ＢＩＡｃｏｒｅＴＭ  ＳＰＲ装置は、偏光したレーザー光がカルボキシメチル化デキストラン活性化デバイスインターフェイスで反射される場合のＲＩ変化の高感度測定によって特徴付けられる。ＩＡｓｙｓＴＭ  ＳＰＲデバイスもまた、カルボキシメチル化デキストラン活性化表面を使用する。しかし、そのデキストラン層は、金表面には付着されずにチタンに付着され、これは高屈折性の誘電体共振層を形成する。ガラスプリズムは、チタン層の対立側において密接に付着されず、低ＲＩの挿入シリカ層のためのスペースを作り出す。この層により、レーザー光ビームは、エバネセント場を介して共鳴層に結合する。従って、ＩＡｓｙｓＴＭは、導波管技術によるＳＰＲ共鳴鏡の組み合わせのように見える。結果として、共鳴での反射光強度の減少は、この系において観察されない。特定のシグナルは、反射した偏光の位相における変化である。
【０３０２】
ＳＰＲイムノセンサーの新規な改変物である示差的ＳＰＲ（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ＳＰＲ）は、光の入射角の調節を適用することによって、センサーの感度をさらに改善する。反射曲線は、ロックイン増幅器で測定され、そして第一誘導物および第二誘導物において記録される。
【０３０３】
光は、ＲＩを有するプリズムから、低ＲＩを有する層の方に指向され、全反射を生じる。光は媒体中には伝搬しないが、界面強度は０ではない。インターフェイスを通して連続することの物理的要件は、光エネルギーによって、金属フィルムにおいて表面プラズモンを励起する原因であり、それらを発振させる。これは、低指数媒体中に規定された距離で貫通する、指数関数的なエバネセント崩壊を生じ、そして反射光の強度における特徴的な減少を生じさせる。
【０３０４】
（微重量センサー（ｍｉｃｒｏｇｒａｖｉｍｅｔｒｉｃ  ｓｅｎｓｏｒ））
抗原／抗体の複合体の形成によって誘導される質量変化の直接的な測定はまた、音響センサーによって可能となる。操作の原理は、センサーの基材における音響剪断波の伝搬に基づく。音波の位相および速度は、抗原をコーティングしたセンサー表面上への抗体分子の特異的吸着によって影響を及ぼされる。圧電性材料（例えば、石英（ＳｉＯ２）、酸化亜鉛（ＺｎＯ）など）は、発振性電場において励起される場合に、１０メガヘルツのオーダーで特定の超音波周波数で機械的に共鳴する。共鳴周波数は、プレート厚および石英材料における音波の速度に対して等しい、石英プレートの両側の電極間の距離によって決定される。換言すると、電磁的エネルギーは、音響エネルギーに変換され、ここで圧電気は、異方性結晶構造を有する材料の電気的分極と関連付けられる。音波操作をモニタリングするために最も適用される技術は、発振法である。これは、デバイスが回路の周波数制御エレメントを構成する立体配置を意味する。発振法は、共鳴センサーの一連の共鳴周波数を測定する。
【０３０５】
微重量センサーデバイスは、厚み剪断モード（ｔｈｉｃｋｎｅｓｓ−ｓｈｅａｒ  ｍｏｄｅ；ＴＳＭ）を適用する水晶微量天秤（ＱＣＭ）デバイスと、表面音波（ＳＡＷ）検出原理を適用するデバイスとに分けられる。これらのセンサーは、到達したかなりの技術的精密性を有する。
【０３０６】
さらなる生体分析的適用デバイスとしては、屈曲性薄板波（ｆｌｅｘｕｒａｌ  ｐｌａｔｅ  ｗａｖｅ；ＦＰＷ）、剪断平面音響平面（ｓｈｅａｒ  ｈｏｒｉｚｏｎｔａｌ  ａｃｏｕｓｔｉｃ  ｐｌａｔｅ；ＳＨ−ＡＰＭ）、表面横波（ｓｕｒｆａｃｅ  ｔｒａｎｓｖｅｒｓｅ  ｗａｖｅ；ＳＴＷ）、および薄棒音波（ｔｈｉｎ−ｒｏｄ  ａｃｏｕｓｔｉｃ  ｗａｖｅ；ＴＲＡＷ）が挙げられる。
【０３０７】
ＱＣＭセンサーの物理的原理とＳＰＲセンサーの物理的原理との間には、基本的な差異があるにしても、かなりの類似性が存在する。ＱＣＭおよびＳＰＲは両方とも、波の伝搬現象であり、そして共鳴構造を示す。弾性ＱＣＭ波および表面プラズモン波は非放射性である（すなわち、エバネセント波が存在する）。エバネセント場における物理的特性の変化は、共鳴のシフトへと導く。従って、物理的関係の線形近似は、イムノセンサーにおける免疫学的適用を可能にする。
【０３０８】
（ＴＳＭセンサー）
ＴＳＭセンサーは、ＡＴカット圧電性結晶ディスクから、最も一般的には、生物学的流体におけるその化学的安定性および極端な温度に対する耐性が理由で石英から構成される。ディスクは、発振性電場の適用のために対立側にある２つの金属電極に付着される。ＴＳＭは、５〜２０ＭＨｚの範囲で泳動する。代表的なＴＳＭデバイスの回路図を図１２に示す。化学的に不活性であることに加えて、利点は、このデバイスの低コスト性および大量生産された石英ディスクの信頼できる品質である。この系の主な欠点は、１０００Ｄａの分子量を有する分析物について非感受性であること、そしてすべての未標識イムノセンサー系においてみられるような、非特異的に結合するインターフェイスである。非特異的な結合作用は、確証的な結合事象から識別することが困難である。これは、センサーデバイスには基準線が配置され得ないという事実による。しかしデバイスの周波数を適切に選択することによって、ＳＨ−ＡＰＭデバイスについて、これらのスプリアスレスポンスは抑制され得る。このセンサーは、ヒト血清マトリクスにおける測定に適用可能である。
【０３０９】
ＴＳＭ技術の第一の適用の１つが、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）血清についてのイムノセンサーであった。このセンサーは、トランスデューサ表面上に組換えウイルスペプチドを固定することによって、そしてヒト血清中において直接的に抗ＨＩＶ抗体を検出することによって実現された。
【０３１０】
（ＳＡＷセンサー）
ＳＡＷセンサーは、厚ＳＴカット石英ディスク、およびインターディジタル電極から両方向に音響レイリー波（この透過は、表面に付着した生体分子によって減衰される）を生成するインターディジテイティッド金属電極アレイを使用する。ＳＡＷセンサーの発振周波数は、３０〜５００ＭＨｚの範囲である。生物学的サンプルでのＳＡＷイムノセンサーの操作は、表面波が液相においてかなり減衰されるという事実によって損なわれる。従って、この技術の領域は、気相操作に制限される可能性が最も高い。
【０３１１】
本発明は、対応するプローブ基質および／または代謝物、ならびに個々の表現型を明らかにするために算出されたそのモル比について、本明細書中以降において記載したようなＥＬＩＳＡとして例示する。
【０３１２】
【表１】
2004519674.tif 000007
実施例Ｉでは、プローブ基質および代謝誘導物の合成、ならびにＮ−アセチルトランスフェラーゼ（ＮＡＴ２）およびＣＹＰ１Ａ２についてのＥＬＩＳＡ開発の詳細な説明を示す。ＮＡＴ２およびＣＹＰ１Ａ２  ＥＬＩＳＡ方法および代謝表現型決定のためのキットの開発について記載された、材料および方法ならびに全般的な一般的プロセスは、他の代謝酵素（ＮＡＴ１，ＣＹＰ１Ａ２，ＣＹＰ２Ａ６，ＣＹＰ２Ｄ６，ＣＹＰ２Ｅ１，ＣＹＰ３Ａ４，ＣＹＰ２Ｃ９およびＣＹＰ２Ｃ１９を含む）についての代謝表現型決定ＥＬＩＳＡキット、ならびに複数決定基の代謝表現型決定（ｍｕｌｔｉ−ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔ  ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｎｇ）の系および方法の開発に適用され得、そして適用される。
【０３１３】
（実施例Ｉ）
（ＥＬＩＳＡ  ＮＡＴ２による表現型決定基の決定）
異なるプローブ基質を使用して、ＮＡＴ２表現型を決定し得る（Ｋｉｌｂａｎｅ，Ａ．Ｊ．ら．（１９９０）Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ．，４７：４７０−４７７；Ｔａｎｇ，Ｂ−Ｋ．ら．（１９９１）Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ．，４９：６４８−６５７）。本発明によると、カフェインは、好ましいプローブである。なぜなら、カフェインは、広範に消費されており、かつ比較的安全であるからである（Ｋａｌｏｗ，Ｗ．ら．（１９９３）Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ．，５３：５０３−５１４）。このプローブに関する研究において、表現型は一般的に、カフェイン代謝産物である５−アセトアミノ−６−アミノ−１−メチルウラシル（ＡＡＭＵ）または５−アセトアミノ−６−ホルミルアミノ−１−メチルウラシル（ＡＦＭＵ）と、１−メチルキサンチン（１Ｘ）との比率から決定された。これらの研究では、個体に、経口用量のカフェイン含有物質、およびＨＰＬＣによって決定された、尿中濃度の標的代謝産物（Ｋｉｌｂａｎｅ，Ａ．Ｊ．ら．（１９９０）Ｃｌｉｎ．２０  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ．，４７：４７０−４７７；Ｔａｎｇ，Ｂ−Ｋ．ら．（１９９１）Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ．，４９：６４８−６５７）またはＣＥ（Ｌｌｏｙｄ，Ｄ．ら（１９９２）Ｊ．Ｃｈｒｏｍ．，５７８：２８３−２９１）を与えた。
【０３１４】
ＮＡＴ２表現型の決定を必要とする臨床的プロトコールの数は急速に増加しつつあり、そして本発明に従って、酵素結合イムノソルベント検定法（ＥＬＩＳＡ）が、これらの研究における用途のために開発された（Ｗｏｎｇ，Ｐ．，Ｌｅｙｌａｎｄ−Ｊｏｎｅｓ，Ｂ．およびＷａｉｎｅｒ，Ｉ．Ｗ．（１９９５）Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ａｎａｌ．，１３：１０７９−１０８６）。ＥＬＩＳＡは、血漿および尿サンプル中の少量の薬物および他の抗原性成分の決定において首尾良く適用されており、いかなる抽出工程をも含まず、そして実施するのに単純である。
【０３１５】
本発明に従って、コーヒー飲用後に収集された個体の尿サンプル中に存在する２つのカフェイン代謝産物［５−アセトアミノ−６−アミノ−１−メチルウラシル（ＡＡＭＵ）または５−アセトアミノ−６−ホルミルアミノ−１−メチルウラシル（ＡＦＭＵ）、および１−メチルキサンチン（１Ｘ）］に対する抗体を、動物において惹起した。これらの比率は、個体のＮ−アセチル化（ＮＡＴ２）表現型の決定を提供する。引き続いて、これらの抗体を使用してこの比率を決定するために、競合的抗原酵素結合イムノソルベント検定法（ＥＬＩＳＡ）を開発した。
【０３１６】
本発明の抗体は、これらの代謝産物のモル比の測定を可能にする、カフェインの２つの異なる代謝産物に対して惹起された、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体のいずれかであり得る。
【０３１７】
本発明に従って、カフェイン代謝産物のモル比を使用して、以下のように、個体のアセチル化表現型を決定する。１．８０未満の比率を有する個体は、アセチル化が遅い群である。
【０３１８】
（材料および方法）
（材料）
シアノメチルエステル、イソブチルクロロホルメート、ジメチルスルフェート、ナトリウムメトキシド（９５％純粋）、およびトリブチルアミンを、Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ，ＵＳＡ）から購入した；西洋ワサビペルオキシダーゼを、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ（Ｍｏｎｔｒｅａｌ，Ｑｕｅ．，Ｃａｎａｄａ）から購入した；コーニングイージーウォッシュポリスチレンマイクロタイタープレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ  ｅａｓｙ  ｗａｓｈ  ｐｏｌｙｓｔｙｒｅｎｅ  ｍｉｃｒｏｔｉｔｅｒ  ｐｌａｔｅ）を、Ｃａｎｌａｂ（Ｍｏｎｔｒｅａｌ，Ｑｕｅ．，Ｃａｎａｄａ）から購入した；ｏ−メチルイソウレアヒドロクロリドを、Ｌａｎｃａｓｔｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｗｉｎｄｈａｍ，ＮＨ，ＵＳＡ）から入手した；ヤギ抗ウサギＩｇＧに結合体化されたアルカリホスファターゼは、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ，ＵＳＡ）からであった；冷アルコール沈殿によるウシ血清アルブミン画分Ｖの初回分画（ＢＳＡ）、完全フロイントアジュバントおよび不完全フロイントアジュバント、ジエタノールアミン、１−メチルキサンチン、ｐ−ニトロフェノール二ナトリウムリン酸塩、ｏ−フェニレンジアミンヒドロクロリド、ブタ皮膚ゼラチン、ウサギ血清アルブミン（ＲＳＡ）；抗体の交差反応性を試験するために使用された、ＳｅｐｈａｄｅｘＴＭＧ２５微粉（ｆｉｎｅ）、ＴｗｅｅｎＴＭ２０およびリガンドは、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）から入手した。ＷｈａｔｍａｎＴＭＤＥ５２ジエチルアミノエチルセルロースは、Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃ  Ｓｐｅｃｉａｌｔｉｅｓ  Ｉｎｃ．（Ｂｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｏｎｔ．，Ｃａｎａｄａ）から入手した。ジオキサンは、Ａ＆Ｃ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  Ｌｔｄ．（Ｍｏｎｔｒｅａｌ，Ｑｕｅ．，Ｃａｎａｄａ）から入手し、そして水素化カルシウムに対して４時間還流し、そして使用前に蒸留した。使用された他の試薬は、分析用等級であった。
【０３１９】
（合成手順）
ＡＡＭＵ−ヘミコハク酸（ｈｅｍｉｓｕｃｃｉｎｉｃ  ａｃｉｄ）（ＶＩＩＩ）および１−メチルキサンチン−８−プロピオン酸（ＩＸ）の産生のための合成経路を、図１３に示す。
【０３２０】
（２−メトキシ−４−イミノ−６−オキソ−ジヒドロピリジン（ＩＩＩ）の合成）
化合物ＩＩＩを、Ｐｆｅｉｄｅｒｅｒ（Ｐｆｅｉｌｄｅｒｅｒ，Ｗ．（１９５７）Ｃｈｅｍ．Ｂｅｒ．，９０：２２７２−２２７６）の手順に従って、以下のように合成する。２５０ｍＬの丸底フラスコに、１２．２ｇのＯ−メチルイソウレア塩酸塩（１１０．６ｍｍｏｌ）、１１．８１ｍＬのメチルシアノアセテート（１３４ｍｍｏｌ）、１２．４５ｇのナトリウムメトキシド（２３０．５ｍｍｏｌ）および８０ｍＬのメタノールを添加する。この懸濁液を撹拌し、そして６８〜７０℃で５時間還流する。室温に冷却した後に、この懸濁液を半融ガラス漏斗（Ｐｙｒｅｘ，４０−６０ＡＳＴＭ，６０ｍＬ）を通して濾過し、そしてフィルタ上のＮａＣｌをメタノールで洗浄する。この濾液を、ＷｈａｔｍａｎＴＭ  ｎｏ．１濾紙を通して５００ｍＬの丸底フラスコ内へと重力によって濾過し、そして溶媒を、ロータリーエバポレーターを用いて５０℃で減圧下でエバポレートする。残渣を温蒸留水で可溶化し、そして氷酢酸を用いてｐＨ３〜４に酸性化することによって、生成物を沈殿させる。室温で２時間（または一晩）後、この懸濁液を、半融ガラス漏斗（Ｐｙｒｅｘ，４０−６０ＡＳＴＭ，６０ｍＬ）を通して減圧濾過する。この生成物を水、アセトンで洗浄し、そして乾燥する。この生成物を、水を溶媒とし、そして脱色用チャコール（活性炭、Ｎｏｒｉｔ（登録商標）  Ａ＜１００メッシュ、脱色）を使用して、再結晶する。収率は７６％である。
【０３２１】
（１−メチル−２−メトキシ−４−イミノ−６−オキソ−ジヒドロピリミジン（ＩＶ）の合成）
化合物ＩＶを、Ｐｆｅｉｄｅｒｅｒ（Ｐｆｅｉｌｄｅｒｅｒ，Ｗ．（１９５７）Ｃｈｅｍ．Ｂｅｒ．，９０：２２７２−２２７６）の手順に従って、以下のように合成する。２５０ｍＬの丸底フラスコに、１１ｇの化合物ＩＩＩ（７７．０ｍｍｏｌ）および１１７ｍＬの１Ｎ  ＮａＯＨ（新たに調製した）を添加する。この懸濁液を撹拌し、そして水浴および破砕した氷を使用して、１５℃に冷却する。次いで、１１．７ｍｌのジメチルスルフェート（１２３．６ｍｍｏｌ）を、パスツールピペットを用いて６０分間にわたって滴下する。添加の際に、最終的に沈殿が生じる。この懸濁液を１５℃で３時間撹拌し、そして４℃で一晩静置する。生成物を、半融ガラス漏斗（Ｐｙｒｅｘ，４０−６０ＡＳＴＭ，６０ｍＬ）を通しての減圧濾過によって回収する。収率は３８％である。
【０３２２】
（１−メチル−４−イミノウラシル（Ｖ）の合成）
化合物Ｖを、Ｐｆｅｉｄｅｒｅｒ（Ｐｆｅｉｌｄｅｒｅｒ，Ｗ．（１９５７）Ｃｈｅｍ．Ｂｅｒ．，９０：２２７２−２２７６）の手順に従って、以下のように合成する。２５０ｍＬの丸底フラスコに、１１．２６ｇの化合物ＩＶ（７２．６ｍｍｏｌ）および１３８ｍＬの１２Ｎ  ＨＣｌを添加し、そしてこの懸濁液を室温で１６〜２０時間撹拌する。この懸濁液を破砕した氷で冷却し、そして生成物を、半融ガラス漏斗（Ｐｙｒｅｘ，４０−６０ＡＳＴＭ，６０ｍＬ）を通しての減圧濾過によって回収する。この生成物を、濾液のｐＨが約４になるまで、パスツールピペットを使用して、４℃の水で洗浄する（約１５０ｍＬ）。生成物をアセトンで洗浄し、そして乾燥する。収率は７３％である。
【０３２３】
（１−メチル−４−イミノ−５−ニトロウラシル（ＶＩ）の合成）
化合物ＶＩを、Ｌｅｓｐａｇｎｏｌら（Ｌｅｓｐａｇｎｏｌ，Ａ．ら（１９７０）Ｃｈｉｍ．Ｔｈｅｒ．，５：３２１−３２６）の手順に従って、以下のように合成する。２５０ｍＬの丸底フラスコに、６．５ｇの化合物Ｖ（４６ｍｍｏｌ）および７０ｍＬの水を添加する。この懸濁液を撹拌し、そして１００℃で還流する。１０ｍＬの水に溶解した６．５ｇの亜硝酸ナトリウム（９３．６ｍｍｏｌ）を、パスツールピペットを用いてこの反応混合物にゆっくりと添加する。次いで、４８ｍＬの氷酢酸を、パスツールピペットを用いて添加する。添加の際に、沈殿が生じ、そしてこの懸濁液は紫色になる。この懸濁液を撹拌し、そしてさらに５分間加熱し、そして室温で、次いで破砕した氷上で冷却する。生成物を、半融ガラス漏斗（Ｐｙｒｅｘ，１０−１５ＡＳＴＭ，６０ｍＬ）を通しての減圧濾過によって回収する。これを４℃の水で洗浄して酢酸を除去し、次いでアセトンで洗浄する。最後の微量の酢酸およびアセトンを、高度な減圧下で除去する。収率は５９％である。
【０３２４】
（１−メチル−４，５−ジアミノウラシル（ＶＩＩ）の合成）
化合物ＶＩＩを、Ｌｅｓｐａｇｎｏｌら（Ｌｅｓｐａｇｎｏｌ，Ａ．ら（１９７０）Ｃｈｉｍ．Ｔｈｅｒ．，５：３２１−３２６）の手順に従って、以下のように合成する。１００ｍＬの丸底フラスコに、２ｇの化合物ＶＩ（１１．７ｍｍｏｌ）および２５ｍＬの水を添加する。この懸濁液を撹拌し、そして油浴中で６０℃に加熱する。ヒドロ亜硫酸ナトリウム（８８％）（４０．４ｍｍｏｌ）を、スパチュラを用いて、紫色が消えるまで（約５ｇすなわち２４．３ｍｍｏｌ）ゆっくりと添加する。この懸濁液をさらに１５分間加熱する。この懸濁液を破砕した氷上で冷却し、そして４℃で一晩静置する。生成物を、半融ガラス漏斗（Ｐｙｒｅｘ，３０−４０ＡＳＴＭ，１５ｍＬ）を通しての減圧濾過によって回収する。この生成物を水およびアセトンで洗浄し、そして乾燥する。最後の微量のアセトンを、高度な減圧下で除去する。収率は５９％である。
【０３２５】
（ＡＡＭＵ−ヘミコハク酸（ＶＩＩＩ）の合成）
化合物ＶＩＩＩを、以下のように合成する。２０ｍＬのビーカーに、０．３０ｇの化合物ＶＩＩ（１．９２ｍｍｏｌ）および５ｍＬの水を添加する。この懸濁液を撹拌し、そして３Ｎ  ＮａＯＨ溶液を用いて、ｐＨを８〜９の間に調整する。次いで、０．３３ｇの無水コハク酸（３．３ｍｍｏｌ）をこの得られる溶液に添加し、そしてこの混合物を、無水コハク酸が溶解するまで撹拌する。このプロセスの間に、この溶液のｐＨを８と９との間に維持する。この反応は、全ての無水コハク酸が溶解し、そしてｐＨが８より高く維持される場合に、完了する。ヘミスクシネートを、１２Ｎ  ＨＣｌを用いてｐＨ０．５に酸性化することによって、沈殿させる。この生成物をＷｈａｔｍａｎＴＭ  Ｎｏ．１濾紙での濾過によって回収し、そして水で洗浄してＨＣｌを除去する。次いで、これをアセトンで洗浄し、そして乾燥する。
【０３２６】
（他のＡＡＭＵ誘導体およびＡＦＭＵ誘導体）
図１４および１５に示される誘導体もまた、尿サンプル中のこれらのカフェイン代謝産物の濃度を測定するために使用され得る、ＡＡＭＵまたはＡＦＭＵに対する抗体を惹起するために使用され得る。
【０３２７】
（１−メチルキサンチン−８−プロピオン酸（ＩＸ）の合成）
この生成物を、Ｌｅｓｐａｇｎｏｌら（Ｌｅｓｐａｇｎｏｌ，Ａ．ら（１９７０）Ｃｈｉｍ．Ｔｈｅｒ．，５：３２１−３２６）の改変された手順に従って、以下のように合成する。化合物ＶＩＩＩの０．２ｇのサンプル（０．７８ｍｍｏｌ）を、２〜３ｍｌの１５％  ＮａＯＨ溶液中に溶解する。得られる溶液を、全ての溶媒が蒸発するまで１００℃で撹拌し、次いで、この温度でさらに５時間維持する。得られる固体を室温で冷却し、そして１０ｍＬの水に溶解する。この生成物を、１２Ｎ  ＨＣｌでのｐＨ２．８への酸性化によって、沈殿させる。４℃で２．５時間冷却した後に、生成物をＷｈａｔｍａｎＴＭ  Ｎｏ．１濾紙での濾過によって回収し、そして水およびアセトンで洗浄し、そして乾燥する。これを、チャコールを使用してこの溶液を脱色しながら、水−メタノール（２０：８０、ｖ／ｖ）から再結晶する。
【０３２８】
（１Ｘの他の誘導体）
図１６および１７に示すような、１Ｘの他の誘導体もまた、１Ｘに対する抗体を惹起するために使用され得、これによって尿サンプル中の１Ｘの濃度を測定するためのＥＬＩＳＡの開発を可能にする。
【０３２９】
（ＡＡＭＵの合成）
ＡＡＭＵを、化合物ＶＩＩから、Ｆｉｎｋら（Ｆｉｎｋ，Ｋ．ら（１９６４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２４９：４２５０−４２５６）の手順に従って、以下のように合成する。１００ｍＬの丸底フラスコに、１．０８ｇの化合物ＶＩＩ（６．９ｍｍｏｌ）および２０ｍＬの無水酢酸を添加した。この懸濁液を撹拌し、そして１６０〜１６５℃で６分間還流する。室温で冷却した後に、この懸濁液を、半融ガラス漏斗（Ｐｙｒｅｘ，１０−１５ＡＳＴＭ，１５ｍＬ）を通して減圧濾過する。生成物を水およびアセトンで洗浄し、そして乾燥する。この生成物を、水で再結晶する。
【０３３０】
（ＮＭＲ分光法）
化合物ＶＩＩＩおよびＩＸの１Ｈおよび１３Ｃ  ＮＭＲスペクトルを、５００ＭＨｚの分光光度計（ＶａｒｉａｎＴＭ  ＸＬ  ５００ＭＨｚ，Ｖａｒｉａｎ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｓａｎ  Ｆｅｒｎａｎｄｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用して、重水素化ジメチルスルホキシドを溶媒として使用して得る。
【０３３１】
（ウシ血清アルブミンおよびウサギ血清アルブミンに対するハプテンの結合体化）
ＡＡＭＵ−ヘミコハク酸（ＶＩＩＩ）および１−メチルキサンチンプロピオン酸（ＩＸ）を、以下の混合酸無水物法に従って、ＢＳＡおよびＲＳＡに結合体化させる。５ｍＬの丸底フラスコに、３１．７ｍｇの化合物ＶＩＩＩ（０．１２ｍｍｏｌ）または１４．９ｍｇの化合物ＩＸ（０．０６ｍｍｏｌ）を添加する。次いで、５２．２μＬのトリ−ｎ−ブチルアミン（０．２４ｍｍｏｌ）および９００μＬのジオキサン（水素化カルシウムで乾燥して新たに蒸留した）を添加する。この溶液を、破砕した氷を使用して水浴中で１０℃に冷却する。次いで、１２．６μＬのイソブチルクロロホルメート（０．１２ｍｍｏｌ、最近購入または開封した）を４℃で添加し、そしてこの溶液を１０〜１２℃で３０〜４０分間撹拌する。上記溶液を撹拌している間に、第二の溶液を以下のように調製する。ガラスチューブ中で、７０ｍｇのＢＳＡまたはＲＳＡ（０．００１ｍｍｏｌ）を、１．８３ｍＬの水に溶解する。次いで、１．２３ｍＬのジオキサン（新たに乾燥し、そして蒸留した）を添加し、そしてＢＳＡまたはＲＳＡの溶液を氷上で冷却する。上記撹拌の３０〜４０分後に、氷上で冷却した７０μｌの１Ｎ  ＮａＯＨ溶液を、ＢＳＡまたはＲＳＡの溶液に添加し、そして得られる溶液を、第一の溶液を含むフラスコに一度に注ぐ。この溶液を１０〜１２℃で３時間撹拌し、そして１リットルの水に対して２日間、室温で透析する（水を１日に２回交換する）。この結合体のタンパク質濃度および１モルあたりのＢＳＡまたはＲＳＡに取り込まれたＡＡＭＵまたは１Ｘのモル量を、以下に記載する方法によって決定する。これらの生成物を、１ｍＬのアリコートとして−２０℃で貯蔵する。
【０３３２】
（Ｌｏｗｒｙらの方法によるタンパク質決定）
（Ｌｏｗｒｙ，Ｏ．Ｈ．ら（１９５１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９３：２６５−２７５）
Ａ）溶液
溶液Ａ：  ２ｇのＮａ２ＣＯ３を５０ｍＬの水、１０ｍＬの１０％  ＳＤＳおよび１０ｍＬの１Ｎ  ＮａＯＨに溶解し、１００ｍＬになるまで水を添加する。新たに調製する。
溶液Ｂ：  １％  ＮａＫ酒石酸塩
溶液Ｃ：  １％  ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ
溶液Ｄ：  １Ｎ  フェノール（新たに調製した）：３ｍＬのＦｏｌｉｎ  ＆  Ｃｉｏｃａｌｔｅｕのフェノール試薬（２．０Ｎ）および３ｍＬの水。
溶液Ｆ：  ９８ｍＬの溶液Ａ、１ｍＬの溶液Ｂ、１ｍＬの溶液Ｃ。新たに調製する。
ＢＳＡ：  １ｍｇ／ｍＬ。０．１０ｇウシ血清アルブミン（画分Ｖ）／１００ｍＬ。
【０３３３】
Ｂ）アッセイ
【０３３４】
【表２】
2004519674.tif 000008
これらの溶液をボルテックスし、そして室温で１時間静置する。
【０３３５】
各溶液の吸光度を、ブランクとして水を使用して、７５０ｎｍで読み取る。
【０３３６】
【表３】
2004519674.tif 000009
これらの溶液をボルテックスし、そして室温で１時間静置する。
【０３３７】
各溶液の吸光度を、ブランクとして水を使用して、７５０ｎｍで読み取る。
【０３３８】
タンパク質濃度を、標準曲線を使用し、そして希釈因数（Ｄ．Ｆ．）を考慮して計算する。
ａ．  Ｄ．Ｆ．（希釈因数）。希釈因数は、７５０ｎｍにおける未知のものの吸光度が、標準の吸光度の範囲内にあるようなものでなければならない。
【０３３９】
（１モルあたりのＢＳＡまたはＲＳＡに取り込まれたＡＡＭＵまたは１Ｘのモル量を決定する方法）
この方法は、おおよその推定を与える。この方法は、カップリングが予測どおりに進行したか否かを決定することを可能にするので、有用である。
【０３４０】
Ａ）溶液
−  １０％  ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）
−  １％  ＳＤＳ溶液
−  １％  ＳＤＳ溶液（１ｍＬ）中の０．５ｍｇ／ｍＬまたは１ｍｇ／ｍＬのＡＡＭＵ−ＢＳＡ（またはＡＡＭＵ−ＲＳＡ）。
−  １％  ＳＤＳ溶液（１ｍＬ）中の０．５ｍｇ／ｍＬまたは１ｍｇ／ｍＬのＢＳＡまたはＲＳＡ。
【０３４１】
Ｂ）手順
−  ＡＡＭＵ結合体溶液の吸光度を、ブランクとして１％  ＳＤＳ溶液を使用して、２６５ｎｍで測定する。
−  ＢＳＡ（またはＲＳＡ）溶液の吸光度を、ブランクとして１％  ＳＤＳ溶液を使用して、２６５ｎｍで測定する。
−  １モルあたりのＢＳＡ（またはＲＳＡ）に取り込まれたＡＡＭＵのモル量を、以下の式を用いて計算する：
【０３４２】
【数６】
2004519674.tif 000010
ここで：
ｙは、ＡＡＭＵのモル量／ＢＳＡ（またはＲＳＡ）のモル量であり；
ε２６５（ＡＡＭＵ）は、ＡＡＭＵの吸光率であり、これは、１０４Ｍ−１ｃｍ−１であり；そして
［ＢＳＡ］は、ＢＳＡ（ｍｇ／ｍＬ）／６８，０００／ｍｍｏｌｅである。
【０３４３】
１モルあたりのＢＳＡまたはＲＳＡに取り込まれた１Ｘのモル量を計算するためには、同じ手順を使用するが、以下の式を使用する：
【０３４４】
【数７】
2004519674.tif 000011
ここで：
ｙは、１Ｘのモル量／ＢＳＡ（またはＲＳＡ）のモル量であり；
ε２５２（１Ｘ）は、１Ｘの吸光率であり、これは、１０４Ｍ−１ｃｍ−１であり；そして
［ＢＳＡ］は、ＢＳＡ（ｍｇ／ｍＬ）／６８，０００／ｍｍｏｌｅである。
【０３４５】
（西洋ワサビペルオキシダーゼに対するハプテンのカップリング）
ＡＡＭＵ誘導体（ＶＩＩＩ）および１Ｘ誘導体（ＩＸ）を、以下の手順によって西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）に結合体化させる。５ｍＬの丸底フラスコに、３１．２ｍｇの化合物ＶＩＩＩ（または２８．３ｍｇの化合物ＩＸ）を添加する。次いで、５００μＬのジオキサン（塩化カルシウムで新たに乾燥した）を添加する。この懸濁液を撹拌し、そして水浴および破砕した氷を使用して１０℃に冷却する。次いで、１１４μＬのトリブチルアミンおよび３１μＬのイソブチルクロロホルメート（最近開封または購入した）を添加する。この懸濁液を１０℃で３０分間撹拌する。この懸濁液を撹拌している間に、１３ｍｇの西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）を２ｍＬの水に溶解することによって、溶液を調製する。この溶液を破砕した氷上で４℃で冷却する。３０分間撹拌した後に、４℃の１００μＬの１Ｎ  ＮａＯＨ溶液をこのＨＲＰ溶液に添加し、そしてこのアルカリ性のＨＲＰ溶液を５ｍＬのフラスコに一度に注ぐ。この懸濁液を１０〜１２℃で４時間撹拌する。遊離の誘導体を、平衡化したＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５ＴＭカラム（１．６×３０ｃｍ）を通して、０．０５Ｍのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）で溶出することによって、このＨＲＰ結合体から分離する。１．０〜１．２ｍＬの画分を、フラクションコレクターで回収する。この溶出の間に、２つのバンドが観察された：ＨＲＰ結合体のバンドおよびこのＨＲＰ結合体のバンドの後の淡黄色のバンド。ＨＲＰ結合体は、画分１１〜１６の間に溶出する。ＨＲＰ結合体を含む画分を、ネジ式のキャップのついた１５ｍＬの組織培養チューブにプールする。アリコートの希釈（通常は、５０μＬ＋６５０μＬの緩衝液）の後に、ＨＲＰ結合体の濃度を、４０３ｎｍにおいて決定する。
【０３４６】
［ＨＲＰ結合体］（ｍｇ／ｍＬ）＝Ａ４０３×０．４×Ｄ．Ｆ．
紫外線（ＵＶ）吸収スペクトルを、３２０ｎｍと２２０ｎｍとの間で記録する。ＡＡＭＵ−ＨＲＰおよび１Ｘ−ＨＲＰに対するそれぞれ２６４ｎｍおよび２７０ｎｍにおけるピークの存在は、カップリングが予測どおりに進行したことを示す。
【０３４７】
上記測定の後に、５μＬの４％チオメルサール溶液を、１ｍＬあたりのＡＡＭＵ−ＨＲＰ結合体溶液または１Ｘ−ＨＲＰ結合体溶液に添加する。これらの結合体を、４℃で貯蔵する。
【０３４８】
（抗体産生）
４匹の成体雌性ニュージーランド白ウサギ（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｃａｎａｄａ，Ｓｔ−Ｃｏｎｓｔａｎｔ，Ｑｕｅ．，Ｃａｎａｄａ）を、抗体産生のために使用する。この研究において使用するプロトコルは、Ｃａｎａｄｉａｎ  Ｃｏｕｎｃｉｌ  ｏｎ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅからの指針に従って、ＭｃＧｉｌｌ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅによって認可された。本発明の抗体は、モノクローナル抗体であってもポリクローナル抗体であってもよい。
【０３４９】
２４０ｍｇのＢＳＡ結合体化抗原を含む等張生理食塩水（０．６ｍＬ）を、０．６ｍＬのフロイント完全アジュバント中で乳化させる。１匹のウサギあたりこの乳濁液の０．５ｍＬのアリコート（１００ｍｇの抗原）を、筋内または皮下に注射する。引き続いて、３週間の間隔で、フロイント不完全アジュバント中に乳化した５０ｍｇの抗原でウサギをブーストする。ブーストの１０〜１４日後に、耳の静脈穿刺によって血液を収集する。抗血清を、０．０１％のアジ化ナトリウムの存在下４℃で貯蔵する。
【０３５０】
（寒天プレートにおける二重免疫拡散法）
ＰＢＳ中の０．８％寒天ゲルを、６０×１５ｍｍのペトリ皿中で調製する。ＡＡＭＵ（または１Ｘ）に結合体化したウサギ血清アルブミン（１ｍｇ  ｍＬ−１の１００μＬ）を、中心のウェルに添加し、そして１００μＬのウサギ抗血清を、周辺のウェルに添加する。免疫拡散を、加湿したチャンバ内で３７℃で一晩実施し、そしてゲルを目視により観察する。
【０３５１】
（抗血清力価）
マイクロタイタープレートのウェルを、炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．６）中の１０μｇ  ｍＬ−１のウサギ血清アルブミン−ＡＡＭＵ（または１Ｘ）結合体で、３７℃で１時間コートする（１つのウェルあたり１００μＬ）。次いで、これらのウェルを１００μＬのＴＰＢＳ（０．０５％のＴｗｅｅｎＴＭ  ２０を含むリン酸緩衝化生理食塩水）で３回洗浄し、そして占有されていない部位を０．０５％のゼラチンを含む１００ｍＬのＴＰＢＳとの３７℃で１時間のインキュベーションによって、ブロックする。これらのウェルを１００μＬのＴＰＢＳで３回で洗浄し、そしてＴＰＢＳ中に希釈された１００μＬの抗血清を添加する。３７℃で１時間後、これらのウェルをＴＰＢＳで３回洗浄し、そして１％のＢＳＡを含むＰＢＳ中に希釈された、１００μＬのヤギ抗ウサギＩｇＧ−アルカリホスファターゼ結合体を添加する。３７℃で１時間後、これらのウェルをＴＰＢＳで３回、および水で３回洗浄する。これらのウェルに、ジエタノールアミン緩衝液（１０ｍＭ、ｐＨ９．８）中にＭｇＣｌ２（０．５ｍＭ）およびｐ−ニトロフェノールホスフェート（３．８５ｍＭ）を含む溶液１００μＬを添加する。室温で３０分後、マイクロプレートリーダを用いて、吸光度を４０５ｎｍで読み取る。抗体力価を、吸光度を１単位（１ａｕ）変化させるために必要とされる希釈と定義する。
【０３５２】
（ウサギＩｇＧの単離）
ＤＥ５２−セルロース樹脂を、リン酸ナトリウム緩衝液（５００ｍＭ、ｐＨ７．５０）で３回洗浄し、細粉を除去し、そしてこの樹脂を、リン酸ナトリウム緩衝液（１０ｍＭ、ｐＨ７．５０）で平衡化する。この樹脂を、５０×１．６ｃｍのカラムに充填し、そして使用前に２００〜３００ｍＬの平衡化緩衝液で溶出する。５０ｍＬの血液から得た抗血清（３０〜３２ｍＬ）に、２５〜２７ｍＬの１００％飽和硫酸アンモニウム溶液を、パスツールピペットを用いて滴下する。この懸濁液を室温で３時間静置し、そして２０℃、２５６０ｇで３０分間遠心分離する。このペレットを、１５ｍＬのリン酸ナトリウム緩衝液（１０ｍＭ、ｐＨ７．５０）を用いて溶解し、そして緩衝液を１日あたり２回交換しながら、室温で透析する。この透析した溶液を、２０℃、２５６０ｇで１０分間遠心分離して、透析の間に形成された沈殿物を除去する。この上清をイオン交換カラムに適用する。７ｍＬの画分を収集する。適用後、このカラムを、２８０ｎｍにおける吸光度が０．０５ａｕ未満になるまで平衡化緩衝液で溶出する。次いで、このカラムを、５０ｍＭのＮａＣｌを含む平衡化緩衝液で溶出する。２８０ｎｍにおいて０．２より大きな吸高度を有する画分を貯め、そして４℃で貯蔵する。これらの画分のタンパク質濃度を、上記のように決定する。
【０３５３】
（競合的抗原ＥＬＩＳＡ）
添加剤を含まない緩衝液および水を、ミリポアフィルタを通して濾過し、そして１週間維持する。ＢＳＡ、抗体、ＴｗｅｅｎＴＭ  ２０および西洋ワサビペルオキシダーゼ結合体を、使用の直前に、これらの緩衝液および水に添加する。尿サンプルを、通常、１杯のコーヒー（１杯あたり約１００ｍｇのカフェインを含む、インスタントまたは抽出したもの（ｂｒｅｗｅｄ））の飲用の４時間後に収集し、そして−８０℃で貯蔵する。これらの尿サンプルを、リン酸ナトリウム緩衝液（６２０ｍｏｓｍ、ｐＨ７．５０）で１０倍に希釈し、引き続いて水で希釈して、ＥＬＩＳＡにおいて３×１０−６Ｍ以下のＡＡＭＵおよび１Ｘの濃度を与える。抗体およびサンプルの溶液のピペッティングを除く全てのピペッティングを、８チャネルのピペットを用いて行う。最後のウェルから開始して、２．５μｇ  ｍＬ−１の抗体を含む１００μＬの炭酸緩衝液（１００ｍＭ、ｐＨ９．６）を、各ウェルに添加する。室温で９０分後、これらのウェルを、０．０５％のＴｗｅｅｎＴＭ  ２０を含む１００ｍＬのＴＰＢ：等張リン酸ナトリウム緩衝液（３１０ｍｏｓｍ、ｐＨ７．５０）で３回洗浄する。
【０３５４】
最初の洗浄の後に、占有されていない部位を、３％のＢＳＡを含む１００μＬのＴＰＢとの室温で９０分間のインキュベーションによってブロックする。これらのウェルを、１００μＬのＴＰＢで４回洗浄する。この洗浄に続いて、２％のＢＳＡを含む２×ＴＰＢ中の５０μＬの１２ｍｇ  ｍＬ−１  ＡＡＭＵ−ＨＲＰ結合体または１Ｘ−ＨＲＰ結合体、および５０μＬの水、標準（１３の標準；ＡＡＭＵまたは１Ｘ、２×１０−４〜２×１０−８Ｍ）、またはサンプル（二連）のいずれかを添加する。マイクロプレートを、オービタルシェーカーを用いて、室温で３〜４時間穏やかに振盪する。これらのウェルを、１％のＢＳＡを含む１００μＬのＴＰＢで３回、そして０．０５％のＴｗｅｅｎＴＭ  ２０を含む水で３回洗浄する。これらの洗浄したプレートに、０．０６％の過酸化水素および０．０４％のｏ−フェニレンジアミン塩酸塩を含む、クエン酸（２５ｍＭ）および二塩基リン酸ナトリウム緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ５．０）からなる１５０μＬの基質緩衝液を添加する。室温で振盪しながら２０分後、５０μＬの２．５Ｍ  ＨＣｌを用いてこの反応を停止させる。このプレートを３分間振盪した後に、吸光度を、マイクロタイタープレートリーダーを用いて４９０ｎｍにおいて読み取る。
【０３５５】
（結果）
ＡＡＭＵおよび１Ｘに対するポリクローナル抗体は、これらのウシ血清アルブミンへの結合体化の後に、ウサギにおいて首尾よく惹起され得た。各ウサギは、ＥＬＩＳＡによって決定した場合に、３０，０００〜１００，０００の抗体力価を産生した。このことはまた、抗血清およびウサギ血清アルブミンと結合体化した誘導体の寒天プレートにおける二重免疫拡散法の後に、強い沈降線によって示された。このことに基づいて、ａ）ＩｇＧ抗体が、ＤＥ−５２セルロースカラムで単離され、そしてｂ）プローブ基質としてカフェインを使用するＮＡＴ２表現型決定のための競合的抗原ＥＬＩＳＡが、上記「材料および方法」の表題の節において記載された方法に従って、開発された。
【０３５６】
表現型決定のために現在使用される方法とは対照的に、このアッセイは抽出を包含せず、敏感かつ迅速であり、そして臨床研究室における最小の試行で、技術者によって慣用的な基礎に基づいて容易に実施され得る。
【０３５７】
本発明は、以下の実施例を参照することによって、より容易に理解される。これらの実施例は、本発明の範囲を制限するのではなく、本発明を説明するために与えられる。
【０３５８】
（プローブ基質としてカフェインを使用する、ＮＡＴ２表現型決定のための競合的抗原ＥＬＩＳＡ）
添加剤を含まない緩衝液および水を、ミリポアフィルタを通して濾過し、そして１週間維持した。ＢＳＡ、抗体、ＴｗｅｅｎＴＭ  ２０および西洋ワサビペルオキシダーゼ結合体を、使用の直前に、これらの緩衝液および水に添加した。尿サンプルを、通常、１杯のコーヒー（１杯あたり約１００ｍｇのカフェインを含む、インスタントまたは抽出したもの）の飲用の４時間後に収集し、そして−８０℃で貯蔵した。これらを、リン酸ナトリウム緩衝液（６２０ｍｏｓｍ、ｐＨ７．５０）で１０倍に希釈し、引き続いて水で希釈して、ＥＬＩＳＡにおいて３×１０−６Ｍ以下のＡＡＭＵおよび１Ｘの濃度を与えた。抗体およびサンプルの溶液のピペッティングを除く全てのピペッティングを、８チャネルのピペットを用いて行った。最後のウェルから開始して、２．５μｇ  ｍＬ−１の抗体を含む１００μＬの炭酸緩衝液（１００ｍＭ、ｐＨ９．６）を、ピペットで添加した。室温で９０分後、これらのウェルを、０．０５％のＴｗｅｅｎＴＭ  ２０を含む１００ｍＬのＴＰＢ：等張リン酸ナトリウム緩衝液（３１０ｍｏｓｍ、ｐＨ７．５０）で３回洗浄した。
【０３５９】
最初の洗浄の後に、占有されていない部位を、３％のＢＳＡを含む１００μＬのＴＰＢとの室温で９０分間のインキュベーションによってブロックした。これらのウェルを、１００μＬのＴＰＢで４回洗浄した。これに続いて、２％のＢＳＡを含む２×ＴＰＢ中の５０μＬの１２ｍｇ  ｍＬ−１  ＡＡＭＵ−ＨＲＰ結合体または１Ｘ−ＨＲＰ結合体、および５０μＬの水、標準（１３の標準；ＡＡＭＵまたは１Ｘ、２×１０−４〜２×１０−８Ｍ）、またはサンプル（二連）のいずれかを添加した。マイクロプレートを、オービタルシェーカーを用いて、室温で３〜４時間穏やかに振盪した。これらのウェルを、１％のＢＳＡを含む１００μＬのＴＰＢで３回、そして０．０５％のＴｗｅｅｎＴＭ  ２０を含む水で３回洗浄した。これらの洗浄したプレートに、０．０６％の過酸化水素および０．０４％のｏ−フェニレンジアミン塩酸塩を含む、クエン酸（２５ｍＭ）および二塩基リン酸ナトリウム緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ５．０）からなる１５０μＬの基質緩衝液を添加した。室温で振盪しながら２０分後、５０μＬの２．５Ｍ  ＨＣｌを用いてこの反応を停止させた。このプレートを３分間振盪した後に、吸光度を、マイクロタイタープレートリーダーを用いて４９０ｎｍにおいて読み取った。
【０３６０】
２連で得られたＡＡＭＵ−Ａｂおよび１Ｘ−Ａｂ決定の競合抗原ＥＬＩＳＡ曲線を、図１８に表す。各較正曲線は、２つの較正曲線の平均を示す。棒線の高さは、２つの較正曲線間の吸光度値の偏差である。棒線がないデータの点は、吸光度値の偏差がデータ点を表す記号の大きさ以下であることを示す。ＥＬＩＳＡの実験条件下において：バックグラウンドは、０．１０ａｕ未満であった；ＡＡＭＵおよび１Ｘの実質的な検出限界は、それぞれ、２×１０−７Ｍおよび２×１０−６Ｍであり、濃度は、以前の表現型決定研究からの尿サンプルにおける濃度よりも５００分の１および５０分の１であった（Ｋｉｌｂａｎｅ，Ａ．Ｊ．ら（１９９０）Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ．，４７：４７０−４７７）；ＡＡＭＵおよび１Ｘのイントラアッセイおよびインターアッセイの変動係数は、０．０１〜０．０５ｍＭの濃度範囲にわたって１５〜２０％であった。
【０３６１】
ＥＬＩＳＡに関する種々の条件を試験し、そして多数の価値のある観察がなされた：ゼラチン（これは、血漿中のカフェインの競合抗原ＥＬＩＳＡ決定において使用された（Ｆｉｃｋｌｉｎｇ，Ｓ．Ａ．ら（１９９０）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．，１２９：１５９−１６４））は、０．５ａｕと１．０ａｕとの間で変化する過度のバックグラウンドの吸光度に起因して、本発明者らのＥＬＩＳＡには使用することができなかった；ＴｗｅｅｎＴＭ２０の非存在下において、１５分あたりの吸光度変化は、少なくとも３の因数で減少し、そして較正曲線は、概して、不安定であった；サンプルの吸光度の変動係数は、サンプルの結合因子およびハプテンが個々に混合物の代わりとしてウェルに添加された場合、３〜４の因数で増加した。
【０３６２】
ＡＡＭＵ−Ａｂおよび１Ｘ−Ａｂの交差反応性を、広範な種々のカフェイン代謝産物および構造アナログを用いて試験した（以下の表５）。ＡＡＭＵ−Ａｂは、ＡＡＭＵを結合することに非常に特異的のようであり、一方、１Ｘ−Ａｂは、１Ｘを結合することに相対的に特異的のようであった。しかし、１１％の交差反応性を、１−メチル尿酸（１Ｕ）（主要なカフェイン代謝産物）で観察した。
【０３６３】
【表４】
2004519674.tif 000012
ａ．数字０は、阻害がないことか、またはＥＬＩＳＡにおいて試験された最も高い化合物濃度（５×１０−３Ｍ）において阻害が４０％よりも高くないこと、のいずれかを示し；この競合抗原ＥＬＩＳＡにおいて５０％の阻害に必要とされた５−アセトアミノ−６−アミノ−１−メチルウラシル（ＡＡＭＵ）および１−メチルキサンチン（１Ｘ）の濃度は、それぞれ、１．５×１０−６Ｍおよび１０−５Ｍであった。
【０３６４】
しかし、１Ｕの相対的に高いレベルの交差反応性は、１Ｘの決定およびＮＡＴ２表現型の割当て有意に妨害しないようである。なぜなら、１Ｕ：１Ｘの比率は、９７％の集団中２．５：１よりも大きくないからである（Ｔａｎｇ，Ｂ−Ｋ．ら（１９９１）Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ．，４９：６４８−６５７）。これは、この比率が３×１０−６Ｍの固定された１Ｘ濃度において０から８．０の間を変化する場合の、見かけの１Ｘ濃度の測定によって確認される（以下の表６）。２．５および３．０の１Ｕ：１Ｘ比率において、見かけの増加は、それぞれ、２２％および３２％であった。
【０３６５】
【表５】
2004519674.tif 000013
以下の観察は、ＮＡＴ２表現型決定に関する競合抗原ＥＬＩＳＡの妥当性を証明した。
【０３６６】
１）ＥＬＩＳＡは、キャピラリー電気泳動（ＣＥ）によって表現型決定された３０の個体のうちの２９に、正確な表現型を割当てた（Ｌｌｏｙｄ，Ｄ．ら（１９９２）Ｊ．Ｃｈｒｏｍ．，５７８：２８３−２９１）。
【０３６７】
２）ＣＥ方法において、表現型は、ＥＬＩＳＡに使用されるＡＡＭＵ／１Ｘモル比よりも、ＡＦＭＵ／１Ｘピーク高さの比率を使用して決定された。ＥＬＩＳＡによって決定されたモル比およびＣＥによって決定されたピーク高さの比率が回帰分析によって補正された場合、計算された回帰式は、ｙ＝０．４８＋０．８７ｘであり、０．８４の相関係数（ｒ）であった。これらの２つの比率が厳密に等しくないこと、ならびにＫａｌｏｗおよびＴａｎｇ（Ｋａｌｏｗ，Ｗ．ら（１９９３）Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ．，５３：５０３−５１４）が、ＡＡＭＵよりもＡＦＭＵを用いることはＮＡＴ２表現型の誤った分類を導き得ると指摘していることを考慮すれば、２つの方法の間には顕著な合致が存在する。
【０３６８】
３）ＥＬＩＳＡは、１４６の個体群内のＮＡＴ２表現型分布を決定する際に使用された。図１９は、ＥＬＩＳＡによって尿サンプル中のＡＡＭＵ／１Ｘ比率を測定することによって決定された場合の、この群のＮＡＴ２表現型のヒストグラムを表す。１．８０のアンチモード（ａｎｔｉｍｏｄｅ）を仮定すると、この試験集団は、６０．４％のアセチル化が遅い群および３９．６％のアセチル化が速い群を含んだ。これは、以前に報告された分布と一致する（Ｋａｌｏｗ，Ｗ．ら（１９９３）Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ．，５３：５０３−５１４；Ｋｉｌｂａｎｅ，Ａ．Ｊ．ら（１９９０）Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ．，４７：４７０−４７７）。
【０３６９】
（ＥＬＩＳＡキットを用いた、尿サンプル中の５−アセトアミノ−６−アミノ−１−メチルウラシル（ＡＡＭＵ）および１−メチルキサンチンの決定）
【０３７０】
【表６】
2004519674.tif 000014
（ＡＦＭＵのＡＡＭＵへの変換）
競合抗原ＥＬＩＳＡによって尿サンプル中のＡＡＭＵ濃度を決定するために、ＡＦＭＵのＡＡＭＵへの変換を必要とする。
・尿サンプルを解凍し、室温まで温めた。
・このサンプルをピペッティング前にボルテックスを用いて完全に懸濁した。
・１００μＬの尿サンプルを１．５ｍＬのマイクロチューブに添加する。
・１００μＬの１Ｎ  ＮａＯＨ溶液を添加する。
・室温で１０分間放置する。
・１００μＬの１Ｎ  ＨＣｌ溶液で中和する。
・７００μＬの緩衝液Ａ（１バイアルのＡ粉末／５０ｍＬで溶解している）を添加する。
【０３７１】
（ＥＬＩＳＡによる［ＡＡＭＵ］および［１Ｘ］の決定のための尿サンプルの希釈）
ＡＡＭＵおよび１Ｘの決定に必要とされる尿サンプルの希釈は、競合抗原ＥＬＩＳＡの感度ならびに尿サンプル中のＡＡＭＵおよび１Ｘ濃度の関数である。尿サンプルをある率で希釈することが提案され、その結果、ＡＡＭＵおよび１Ｘ濃度は、マクロタイタープレートのウェル中で約３×１０−６Ｍである。一般的に、１００〜４００および５０〜１００の希釈率が、ＡＡＭＵおよび１Ｘに対して、それぞれ使用されている。
【０３７２】
【表７】
2004519674.tif 000015
ａ．尿サンプルを含むマイクロチューブを、ピペッティングする前にボルテックスする。
この希釈された尿サンプルは、−２０℃で保存する。
緩衝液Ｂ：１バイアルのＢの内容物／１００ｍＬで溶解している。
【０３７３】
（ＥＬＩＳＡによる、希釈尿サンプル中の［ＡＡＭＵ］および［１Ｘ］の決定）
（警告）
基質は発癌性である。緩衝液Ｅ（基質緩衝液）を取り扱う場合、手術用の手袋を装着のこと。各サンプルを、２連で決定する。優れたピペッティング技術が要求される。この技術が熟達した場合、２連の吸光度値は、５％未満内であるべきである。緩衝液Ｃ、ＤおよびＥを、新しく調製する。緩衝液Ｅ−Ｈ２Ｏ２を、マイクロタイタープレートウェル中でピペッティングする直前に調整する。
【０３７４】
（サンプルの調製：）
コンピューターを用いて表９を準備し、そして印刷する。この表は、９６ウェルマイクロタイタープレートの各ウェルの内容物を示す。表９中の対応するウェルの位置に、尿サンプルの名前（または番号）を入力する。各尿サンプルの希釈率（Ｄ．Ｆ．）を選択し、表９中の対応する位置に入力する。緩衝液Ｂを用いた各尿サンプルの希釈を表９中の対応する位置に入力する；例えば、１００のＤ．Ｆ．に関して（１００μＬの１０×希釈尿サンプル＋９００μＬの緩衝液Ｂ）、１００／９００を入力する。異なる希釈物の調製に関する上記の「・・・尿サンプルの希釈」の手順を参照のこと。異なる希釈の尿サンプルを１．５ｍＬのマイクロチューブに調製する。コンピューターを用いて表１０を準備し、そして印刷する。表１０に示される順序で以下の４８個のマイクロチューブを調製する。
【０３７５】
【表８】
2004519674.tif 000016
【０３７６】
【表９】
2004519674.tif 000017
【０３７７】
【表１０】
2004519674.tif 000018
【０３７８】
【表１１】
2004519674.tif 000019
（ＥＬＩＳＡの条件）
最終列から始めて、５０μＬ／ウェルのＡＡＭＵ−ＨＲＰ（または１Ｘ−ＨＲＰ）結合体溶液を添加する。ウェル番号９６から始めて、５０μＬ／ウェルの希釈された尿サンプル、標準、ブランクをマイクロピペット（０−２００μＬ）を用いて２連で添加する（表９を参照のこと）。プレートを覆い、そして数秒間ボルテックスすることで穏やかに混合する。プレートを室温で３時間放置する。マイクロタイタープレート洗浄機を使用して緩衝液Ｃを用いて１００μＬ／ウェルで３回洗浄する。０．０５％ＴｗｅｅｎＴＭ２０溶液を用いて１００μＬ／ウェルで３回洗浄する。１５０μＬ／ウェルの緩衝液Ｅ−Ｈ２Ｏ２（マイクロタイタープレートウェルに添加する直前に調製される）を添加する。室温で軌道振盪機を用いて２０〜３０分振盪する。５０μＬ／ウェルの２．５Ｎ  ＨＣｌ溶液を添加する。室温で軌道振盪機を用いて３分振盪する。４９０ｎｍでマイクロタイタープレートリーダーを用いてウェルの吸光度を読む。データのシートを印刷し、そして適切にデータシートを同定する。
【０３７９】
（データからの尿サンプルにおける［ＡＡＭＵ］および［１Ｘ］の計算）
コンピュータを使用して表１２を作成する。マイクロタイタープレートリーダーのデータシートを使用して、ブランク、コントロール（遊離ハプテンが存在しない）、標準およびサンプルの平均吸光度値を表１２に入力する。σプロット（または他のプロットソフトウェア）を使用して片対数プロット上に較正曲線（標準濃度の関数として４９０ｎｍでの吸光度）を描く。較正曲線から未知のマイクロタイターウェルにおける［ＡＡＭＵ］（または［１Ｘ］）を見出し、そして表１３にデータを入力する。未知の［ＡＡＭＵ］（または［１Ｘ］）に希釈因子を掛け、そして表１３の対応する枠に結果を入力する。
【０３８０】
【表１２】
2004519674.tif 000020
【０３８１】
【表１３】
2004519674.tif 000021
【０３８２】
【表１４】
2004519674.tif 000022
（ＣＹＰ１Ａ２）
異なるプローブ基質を使用し、ＣＹＰ１Ａ２表現型（カフェイン、テオフィリン）を決定し得る。本発明に従って、適切なプローブ基質として、カフェイン、テオフィリンまたはアセトアミノフェンが挙げられるが、限定ではない。
【０３８３】
これらの内、カフェインは、好ましいプローブ基質である。カフェインは、広く消費され、そして比較的安全である。以前の研究において、表現型は、１，７−ジメチルキサンチン（１，７  ＤＭＸ）＋１，７−ジメチル尿酸（１，７  ＤＭＵ）および１，３，７−トリメチルキサンチン（１，３，７  ＴＭＸ、カフェイン）の比から一般的に決定されている。これらの研究において、個体に、カフェイン含有基質の経口投与を与え、そして標的代謝産物の尿濃度を、ＨＰＬＣ（Ｋｉｌｂａｎｅ，Ａ．Ｊ．ら（１９９０）Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ  ４７：４７０−４７７；Ｔａｎｇ，Ｂ．−Ｋ．ら（１９９１）  Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ  ４９：６４８−６５７）またはＣＥ（Ｍｅａｃｈｅｒｓら（１９９８）Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ  ３：２０５−２１８）によって決定する。
【０３８４】
キノロン抗生物質またはセロトニン再取り込みインヒビターによるＣＹＰ１Ａ２の阻害は、テオフィリン毒性を生じ得る。これらの理由により、信頼性のある表現型決定試験の有用性は、明らかである。
【０３８５】
酵素結合イムノソルベント検定法（ＥＬＩＳＡ）は、血漿および尿サンプルにおける低量の薬物および他の抗原性化合物の決定において首尾良く適用されており、そして実施は単純である。本発明者らは、プローブ基質としてカフェインを用いるＮ−アセチルトランスフェラーゼ−２（ＮＡＴ２）表現型決定に対するＥＬＩＳＡを以前に開発している（Ｗｏｎｇ，Ｐ．，Ｌｅｙｌａｎｄ−Ｊｏｎｅｓ，Ｂ．，およびＷａｉｎｅｒ，Ｉ．Ｗ．（１９９５）Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ａｎａｌ．１３：１０７９−１０８６）。本発明者らは、ＮＡＴ２表現型決定に対するＥＬＩＳＡの妥当性を続いて試験し、そして立証している（Ｌｅｙｌａｎｄ−Ｊｏｎｅｓら、（１９９９）Ａｍｅｒ．Ａｓｓｏｃ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．４０：Ａｂｓｔｒａｃｔ  ３５６）。ＮＡＴ２表現型決定に対するＥＬＩＳＡは、ＨＰＬＣおよびＣＥよりも実施が単純である。
【０３８６】
本発明に従って、カフェイン消費の後に集められた個体の尿サンプルにおいてカフェインならびに２つのカフェイン代謝産物（１，７−ジメチルキサンチン（１，７  ＤＭＸ）および１，７−ジメチル尿酸（１，７  ＤＭＵ））のモル比を測定するために、現今、開発中の抗体がある。この比は、個体のＣＹＰ１Ａ２表現型の決定を提供する。引き続いて、これらの抗体を使用して、この比を測定するための抗原酵素結合イムノソルベント検定法（ＥＬＩＳＡ）がある。本発明の抗体は、カフェインおよびカフェインの２つの異なる代謝産物に対して惹起されたポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体であり得、このことが、カフェインおよびこれらの代謝産物のモル比の測定を可能にする。
【０３８７】
本発明に従って、カフェイン代謝産物のモル比を使用して、個体のＣＹＰ１Ａ２表現型を以下のように決定する：
【０３８８】
【数８】
2004519674.tif 000023
４のモル比および１２のモル比は、遅い、中程度のおよび速いＣＹＰ１Ａ２代謝群に選別する（Ｂｕｔｌｅｒら、（１９９２）Ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｅｔｉｃｓ  ２：１１６−１１７）。
【０３８９】
（材料および方法）
（材料）
Ｎ−アセチル−ｐ−アミノフェノール（アセトアミノフェン）、ジオキサン、ガラス再蒸留された（ｇｌａｓｓ  ｒｅｄｉｓｔｉｌｌｅｄ）９８〜１００％の蟻酸、およびクロロ蟻酸イソブチルを、Ａ＆Ｃ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  Ｌｔｄ．（Ｖｉｌｌｅ  Ｓｔ−Ｌａｕｒｅｎｔ，Ｑｕｅ．Ｃａｎａｄａ）から購入し；西洋ワサビペルオキシダーゼをＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ（Ｍｏｎｔｒｅａｌ，Ｑｕｅ．，Ｃａｎａｄａ）から購入し；ＥＬＩＳＡプレート（９６ウェル  Ｅａｓｙ  ＷａｓｈＴＭ改変された平底、高い結合；Ｃｏｒｎｉｎｇ  ｇｌａｓｓ  ｗａｒｅｓ，Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ，ＵＳＡ）およびＦａｌｃｏｎ  ９６ウェルマイクロテスト組織培養プレート、番号３０７２（Ｂｅｃｋｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  Ｌａｂｗａｒｅ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ，ＮＪ，ＵＳＡ）をＦｉｓｈｅｒ（Ｍｏｎｔｒｅａｌ，Ｑｕｅｂｅｃ，Ｃａｎａｄａ）から購入し；ヤギ抗ウサギＩｇＧ、キーホールカサガイヘモシアニン（Ｋｅｙｈｏｌｅ  ｌｉｍｐｅｔ  ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ）（ＫＬＨ）に結合されたアルカリホスファターゼは、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ，ＵＳＡ）からであり；無水酢酸、アセトニトリルＨＰＬＣグレード、ベンジル尿素（ｂｅｎｚｙｌｕｒｅａ）、ウシ血清アルブミン（カタログ番号  Ａ−３８０３）、Ｎ−ブロモスクシンイミド、カフェイン代謝産物；１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩溶液（ＥＤＡＣ）、４−ブロモ酪酸エチル，６−ブロモヘキサン酸エチル，シアノ酢酸メチル、重水素化クロロホルム（ＣＤＣｌ３）、重水素化ジメチルスルホキシド（ｄ６），重水（Ｄ２Ｏ），１，４−ジアミノブタン、ジエタノールアミン、ジメチルホルムアミド、硫酸ジメチル、ジ−ｔｅｒｔ−ブチルジカルボネート、クロロ蟻酸エチル、Ｆｒｅｕｎｄアジュバント（完全および不完全）、グルタルアルデヒド（５０％  ｖ／ｖ）、１−メチルキサンチン、ｐ−ニトロフェノールリン酸水素二ナトリウム塩（ｐ−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｏｌｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｄｉｓｏｄｉｕｍ  ｓａｌｔ）、活性炭担時パラジウム、１０重量％（乾燥基準）、ｏ−フェニレンジアミン塩酸塩、ポリオキシエチレン、モノラウリル酸ソルビタン（ＴｗｅｅｎＴＭ２０）、ブタ皮膚ゼラチン、プロテインＡ−セファロース４Ｂ，ＳｅｐｈａｄｅｘＴＭ  Ｇ２５  ｆｉｎｅ、水素化ナトリウム、ナトリウムメトキシド、テオフィリン、トリブチルアミン、ＴｗｅｅｎＴＭ  ２０は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ−Ｌｏｕｉｓ，Ｍｉｓｓｏｕｒｉ，ＵＳＡ）から購入し；シリカゲルの粒子サイズ０．０４０〜０．０６３ｍｍ（２３０〜４００メッシュ）ＡＳＴＭ  Ｅｍｅｒｃｋ  Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，ＧｅｒｍａｎｙをＶＷＲ（Ｍｏｎｔｒｅａｌ，Ｑｕｅ．，Ｃａｎａｄａ）から購入する。ジオキサンを水素化カルシウム上で４時間環流させることで乾燥し、そして使用前に蒸留する。他の試薬はＡＣＳグレードである。
【０３９０】
（合成手順）
カフェイン、１，７−ジメチルキサンチン、１，７−ジメチル尿酸誘導体の生成のための合成経路が図２０および２１に示される。
【０３９１】
（７−エトキシカルボキシペンチル−１，３−ジメチルキサンチン（ＩＩ）の合成）
化合物ＩＩは、Ｄａｌｙら（Ｄａｌｙ、Ｊ．Ｗ．、Ｍｕｅｌｌｅｒ、Ｃ．、Ｓｈａｍｉｎ、Ｍ．（１９９１）Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ、４２：３０９−３２１）に記載の手順に類似した手順によって合成される。最初に、３２０ｍｇのテオフィリン（Ｉ）（１．７８ｍｍｏｌ）を、７ｍＬの乾燥ジメチルホルムアミドに溶解させ、次いで、２９０ｍｇの炭酸カリウム（２．１ｍｍｏｌ）を、反応混合物に加える。次いで、３５８μＬの６−ブロモヘキサン酸エチル（２．０２ｍｍｏｌ）をゆっくり加え、そしてこの懸濁液を６０℃で１４時間加熱する。この懸濁液を、炭酸カリウムを除去するために濾過する。炭酸カリウムをいくらかのジメチルホルムアミドで洗浄した後、溶媒をロータリーエバポレーターでそして高真空ポンプで、減圧下でエバポレートする。残渣をクロロホルムに溶解させ、そして溶液を硫酸マグネシウム（ＭｇＳＯ４）で乾燥する。溶媒をロータリーエバポレーターで、減圧下でエバポレートする。８３．７％の収率に対応する、４８０ｍｇの生成物（わずかに黄色の油状物、１．４９ｍｍｏｌ）を得る。
【０３９２】
（７−カルボキシペンチル−１，３−ジメチルキサンチン（ＩＩＩ）の合成）  化合物ＩＩＩを、以下のように合成する。最初に２２５ｍｇの化合物ＩＩ（０．７ｍｍｏｌ）を７ｍＬのジメチルホルムアミドに溶解させる。次いで、４ｍＬの１０％ＮａＯＨ溶液を加え、そしてこの溶液を３０分間、還流させる（１００〜１２５℃）。溶媒を、減圧下で、ロータリーエバポレーターおよび高真空ポンプでエバポレートする。残渣を７ｍＬの水に溶解させ、そして溶液を６Ｎ  ＨＣｌでｐＨ４に酸性化する。溶液を４℃に冷却することによって、針様の結晶として生成物を結晶化する。結晶を、１５ｍＬ焼結ガラスロート（１０−１５ＡＳＴＭ）を通して減圧下で濾過し、そして乾燥する。８５％の収率に対応する合計１７５ｍｇの生成物を得る（０．５９５ｍｍｏｌ）。
【０３９３】
（７−メトキシカルボキシルペンチル−１−メチルキサンチン（Ｖ）の合成）  化合物Ｖを、以下のように合成する。最初に、１１６ｍｇの１−メチルキサンチン（ＩＶ）（０．７ｍｍｏｌ）を、４ｍＬのジメチルホルムアミドに溶解させる。次いで、１２９ｍｇの炭酸カリウム（０．９３ｍｍｏｌ）を加え、そして得られた溶液を攪拌する。次いで、０．４ｍＬのジメチルホルムアミド中の１２５μＬのエチル−６−ブロモヘキサノエート（０．７ｍｍｏｌ）を、ゆっくり３回で加える。反応混合物を、５０℃で１．５時間、そして６５℃で１時間加熱する。冷却後、この懸濁液を濾過し、そして濾液を減圧下で、ロータリーエバポレーターおよび高真空ポンプでエバポレートする。この生成物を溶出液として酢酸エチル−ヘキサン溶液（９：１、ｖ／ｖ）を使用して、シリカゲルカラム（４０×１ｃｍ）でフラッシュクロマトグラフィーによって精製する。
【０３９４】
（７−カルボキシペンチル−１−メチルキサンチン（ＶＩ）の合成）
化合物ＶＩを、以下のように合成する。最初に、３１ｍｇの化合物Ｖ（０．１ｍｇ）を、１ｍＬのジメチルホルムアミドを溶解させ、次いで、６６０μＬの１０％ＮａＯＨを加える。得られた溶液を３０分間還流させる（１００〜１２０℃）。室温に冷却後、減圧下で、ロータリーエバポレーターおよび高真空ポンプでエバポレートする。残渣を水に溶解させ、６Ｎ  ＨＣｌ溶液でｐＨ４に酸性化する。冷却時に、溶液は、白色の針状結晶を生成し、これを濾過し、そして乾燥する。収率８２％に対応する、合計２３ｍｇの生成物（０．０８２ｍｍｏｌ）を得る。
【０３９５】
（６−アミノ−１−ベンジルウラシル（ＩＸ）の合成）
化合物ＩＸを、以下のように、ＨｕｔｚｅｎｌａｕｂおよびＰｆｅｉｄｅｒｅｒ（Ｈｕｔｚｅｎｌａｕｂ，  Ｗ．，ａｎｄ  Ｐｆｅｉｄｅｒｅｒ，Ｗ．（１９７９）．Ｌｉｅｂｉｇｓ  Ａｎｎ．Ｃｈｅｍ．１８４７−１８５４）の手順と類似の手順に従って合成する。最初に、８．６４ｇのナトリウムメトキサイド（１６０ｍｍｏｌ）を７１ｍＬのメタノールに溶解する。この溶液を攪拌し、７．５５ｇのベンジルウレア（５０ｍｍｏｌ）および４．７１ｍＬのメチルシアノアセテート（５３．４ｍｍｏｌ）を加える。この懸濁液を５．５時間６８〜７０℃で還流し、そして室温に冷却する。濾過の後、メタノールを減圧下で、ロータリーエバポレーターでエバポレートする。残渣を温かい蒸留水中に溶解させ、そして生成物を氷酢酸でｐＨ３〜４に酸性化させることによって沈殿させる。２時間（または一晩）室温の後、懸濁液を焼結ガラス漏斗を通して減圧下で濾過する。生成物を水で洗浄し、そして乾燥する。収率は６２〜６５％である。
【０３９６】
（６−アミノ−１−ベンジル−５−ブロモウラシル（Ｘ）の合成）
化合物Ｘを、以下のように、Ｈｕｔｚｅｎｌａｕｂ  ａｎｄ  Ｐｆｅｉｄｅｒｅｒ（Ｈｕｔｚｅｎｌａｕｂ，  Ｗ．，ａｎｄ  Ｐｆｅｉｄｅｒｅｒ，Ｗ．（１９７９）．Ｌｉｅｂｉｇｓ  Ａｎｎ．Ｃｈｅｍ．１８４７−１８５４）の手順に従って合成する。最初に、３．２ｇの６−アミノ−１−ブチルベンジルウラシル（１５．８ｍｍｏｌ）を、１００℃で６０ｍＬの酢酸および３ｍＬの無水酢酸中に溶解する。次いで、２．８５ｇのＮ−ブロモスクシンイミド（１６ｍｍｏｌ）を、次の３０分間にわたって少量ずつ加える。この反応混合物を、１時間攪拌し、室温に冷却する。沈殿を濾過し、少量の冷エタノールで洗浄し、そして乾燥する。収率７６％に対応する、合計３．３６ｇの白色結晶を得る（１２ｍｍｏｌ）。
【０３９７】
（６−アミノ−１−ベンジル−５−［Ｎ−４’−アミノブチル）アミノ］ウラシル（ＸＩ）の合成）
化合物ＸＩを、以下のように合成する。最初に、３ｇの化合物Ｘ（１０．７１ｍｍｏｌ）を、３０ｍＬの水中５０％  １，４−ジアミノブタン（ｂｐ１５８−１６０℃；ｄ０．８７７）（ｖ／ｖ）中に溶解させ、そしてこの溶液を一晩室温で攪拌する。この溶液を、減圧下で、ロータリーエバポレーターおよび高真空ポンプでエバポレートする。得られた油状物を、最小量の酢酸エチル−メタノール溶液（４：１；ｖ／ｖ）中に溶解させ、そして溶出液として酢酸エチル−メタノール溶液を用いて、焼結ガラス漏斗（１５０ｍＬ）中に充填したシリカゲルでの乾燥フラッシュクロマトグラフィーによって精製する。それぞれの連続的な画分において、溶媒の極性を、６０％酢酸エチル／４０％メタノールから４５％酢酸エチル／５５％メタノール（ｖ／ｖ）に変化させて、増加させる。生成物を、淡黄色の油状物として単離する。得られた精製された生成物の量は、１．６９ｇ（６．１ｍｍｏｌ）であり、５７％の収率に対応する。
【０３９８】
（６−アミノ−１−ベンジル−５−［Ｎ−４’−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−アミノ］ウラシル（ＸＩＩ）の合成）
化合物ＸＩＩを、以下のように合成する。最初に、１．６３ｇの化合物ＸＩ（５．９ｍｍｏｌ）を、５．４ｍＬの１Ｎ  ＮａＯＨ溶液に溶解する。次いで、２７０ｍｇの重炭酸ナトリウム（３．２ｍｍｏｌ）および２．７ｍｌの水を加える。次いで、５．４ｍＬのイソプロパノール中のジ−ｔｅｒｔ−ブチルジカルボネート溶液（１．８８ｇ（８．６１ｍｍｏｌ）を、５．４ｍＬイソプロパノールに溶解させる）を、化合物ＸＩの溶液にゆっくり添加する。３時間室温で攪拌後、１３．４ｍＬの水を加え、未反応のジ−ｔｅｒｔ−ブチルジカルボネートを２０ｍＬの石油エーテルで２回抽出する。反応混合物のｐＨを、１０％クエン酸溶液の添加で７に調節し、そして溶液を２回４０ｍＬの酢酸エチルで抽出する。有機層を硫酸ナトリウム（Ｎａ２ＳＯ４）で乾燥させ、減圧下で、ロータリーエバポレーターで濃縮する。生成物を、この濃縮された溶液にいくらかの軽石油エーテルを添加することによって沈殿させる。得られた生成物の量は、０．９９ｇのオフホワイト色の結晶化合物ＸＩＩ（２．６２ｍｍｏｌ）であり、４４％の収率に対応する。
【０３９９】
（６−アミノ−１−ベンジル−５−［（Ｎ−４’−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノブチル−Ｎ−エトキシカルボニル）−アミノ］ウラシル（ＸＩＩＩ）の合成）
化合物ＸＩＩＩを、以下のように合成する。最初に、８０６ｍｇの化合物ＸＩＩ（２．１４ｍｍｏｌ）を７．５ｍＬの水中に懸濁させ、そして強力に攪拌する。次いで、０．５ｍＬのクロロギ酸エチル（５．２２ｍｍｏｌ）を加える。次いで、３．７５ｍＬの１Ｎ  ＮａＯＨ溶液を滴下し、得られた溶液を、室温で２．５時間攪拌する。白色固体生成物を濾過し、水で徹底的に洗浄し、そして乾燥する。８２．７％の収率の対応する、合計７４１ｍｇの生成物を得る（１．７７ｍｍｏｌ）。
【０４００】
（６−アミノ−１−ベンジル−５−［（Ｎ−４’−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノブチル−Ｎ−エトキシカルボニル）−アミノ］−３−メチルウラシル（ＸＩＶ）の合成）
化合物ＸＩＶを以下のように合成する。最初に、７１２ｍｇの化合物ＸＩＩＩ（１．７７ｍｍｏｌ）を、５．８ｍＬの水に懸濁させる。次いで、２．３ｍＬの１Ｎ  ＮａＯＨ溶液を加え、得られた溶液を４０℃に加熱し、そして激しく攪拌する。次いで、０．２３ｍＬジメチルスルフェート（２．４３ｍｍｏｌ）をゆっくり加え、そして得られた溶液を４０℃で１．５時間攪拌する。沈殿（反応の間に形成される）を、濾過し、水で洗浄し、そして乾燥する。生成物を溶出液としてジクロロメタン中の４％メタノールの溶液を使用して、シリカゲルカラム（４０×１ｃｍ）でフラッシュクロマトグラフィーによって沈殿物から精製する。生成物を酢酸エチルから再結晶化させる。収率６５％に対応する、合計４９８ｍｇの化合物ＸＩＶ（１．１５ｍｍｏｌ）を得る。
【０４０１】
（６−アミノ−５−［（Ｎ−４’−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノブチル−Ｎ−エトキシカルボニル）−アミノ］−３−メチルウラシル（ＸＶ）の合成）
化合物ＸＶを以下のように合成する。最初に、４４０ｍｇの化合物ＸＩＶ（１．０２ｍｍｏｌ）を１２ｍＬのメタノールに溶解させ、そして２５２ｍｇのギ酸アンモニウム（４ｍｍｏｌ）とともに混合する。次いで、２４０ｍｇのチャコール担持パラジウム（１０％）を窒素雰囲気下で加える。触媒的水素化を室温で３時間行う。触媒を濾過により除去し、そして濾液を減圧下で、ロータリーエバポレーターおよび高真空ポンプでエバポレートする。収率９７％に対応する、合計３４１ｍｇ（０．９９ｍｍｏｌ）の生成物を得る。
【０４０２】
（７−（４’−アミノブチル）−１−メチル尿酸（ＸＶＩ）の合成）
化合物ＸＶＩを以下のように合成する。最初に、３００ｍｇの化合物ＸＶ（０．８７５ｍｍｏｌ）を４．５ｍＬの乾燥ジメチルホルムアミド中に溶解させ、そして得られた溶液を１４４ｍｇの水素化ナトリウム（６ｍｍｏｌ）と混合する。この混合物を室温で２０分間攪拌し、そして１１０〜１１５℃で３０分間攪拌する。色は、暗い黄色にゆっくり変化する。冷却後、６．５ｍＬの水を加え、そして溶液を６Ｎ  ＨＣｌでｐＨ０に酸性化する。この溶媒を、減圧下で、ロータリーエバポレーターおよび高真空ポンプでエバポレートし、そして粗生成物を酢酸エチル−メタノール溶液（１：４、ｖ／ｖ）に溶解させる。無機塩を濾過により除き、そして黄色の濾液を溶出液として酢酸エチル−メタノール（３：７、ｖ／ｖ）の溶液を使用して、シリカゲルカラム（４０×１ｃｍ）でフラッシュクロマトグラフィーによって精製する。純粋な生成物を含む画分を、減圧下で、ロータリーエバポレーターでエバポレートする。イソプロパノールでの残渣の粉砕後、生成物を淡黄色固体として得る。収率４５％に対応する、合計９８．９ｍｇ生成物を得る（０．３９１ｍｍｏｌ）。
【０４０３】
（ＮＭＲ分光法）
合成物の１ＨＮＭＲスペクトルを、５００ｍＨｚスペクトロメーター（Ｖａｒｉａｎ  ＸＬ  ５００ｍＨｚ、Ｖａｒｉａｎ  Ａｎｌｙｔｉｃａｌ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ、Ｓａｎ  Ｆｅｒｎａｎｄｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用して得る。
【０４０４】
（西洋ワサビペルオキシダーゼへのハプテンの結合）
カフェインおよび１，７−ジメチルキサンチン誘導体および１，７−ジメチル尿酸誘導体（無水コハク酸でのスクシニル化の後）を、以下の手順によって、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）に結合させる。５ｍＬの丸底フラスコに、０．１２ｍｍｏｌの誘導体を加える。次いで、塩化カルシウムで新たに乾燥させた５００μＬのジオキサンを加える。この懸濁液を、攪拌し、粉砕した氷を使用して水浴中で１０℃に冷却する。次いで、３１μＬイソブチルクロロホルメート（０．２４ｍｍｏｌ）（最近開封されるかまたは購入される）および１１４μＬトリブチルアミン（０．４７ｍｍｏｌ）を加える。この懸濁液を３０分間１０℃で攪拌する。攪拌の間、溶液を、２ｍＬの水中に１３ｍｇの西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）を溶解させることによって調製する。この溶液を粉砕した氷上で４℃に冷却する。３０分間の攪拌後に、１００μＬの１Ｎ  ＮａＯＨ溶液（新たに調製する）を４℃で、ＨＲＰ溶液に加え、そしてアルカリ性ＨＲＰ溶液を５ｍＬのフラスコに１度で加える。懸濁液を４時間１０〜１２℃で攪拌する。遊離している誘導体を、０．１Ｍのリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．０で平衡化され、溶出される、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５ＴＭ  ｆｉｎｅ  ｃｏｌｕｍｎ（１．６×３０ｃｍ）によってＨＲＰ結合体から分離する。１．０〜１．２ｍＬの画分を、手動で、またはフラクションコレクターで集める。溶出の間、２つのバンドが観測され得る：ＨＲＰ結合体およびＨＲＰ結合体の後の淡黄色のバンド。ＨＲＰ結合体バンドは、画分１１〜１６の間で溶出した。ＨＲＰ結合体を含む画分を、ねじ口を有する１５ｍＬの組織培養物中にプールする。ＨＲＰ結合体濃度を、アリコートを希釈した後に、４０３ｎｍで決定する（通常、５０μＬ＋６５０μＬの緩衝液）。
【０４０５】
［ＨＲＰ結合体］（ｍｇ／ｍＬ）＝Ａ４０３×０．４×Ｄ．Ｆ．。
【０４０６】
紫外（ＵＶ）吸収スペクトルを、３２０ｎｍと３２０ｎｍとの間で記録する。カフェイン−ＨＲＰ、１，７−ＤＭＸ−ＨＲＰおよび１，７−ＤＭＵ−ＨＲＰ結合体についてそれぞれ２８０ｎｍ、２８０ｎｍおよび２９０ｎｍのさらなる吸収ピークの存在は、期待したように、結合が進行することの指標である。上記測定の後に、１ｍＬのカフェイン−ＨＲＰ、１，７−ＤＭＸ−ＨＲＰまたは１，７−ＤＭＵ−ＨＲＰ結合体溶液当たり、５μＬの４％チオメルサール溶液を加える。結合体を４℃で保存する。
【０４０７】
（抗体産生）
６匹の成熟雌性Ｎｅｗ  Ｚｅａｌａｎｄ白色ウサギ（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｃａｎａｄａ，Ｓｔ−Ｃｏｎｓｔａｎｔ，Ｑｕｅ．，Ｃａｎａｄａ）を、抗体産生のために使用する。この研究に使用されるプロトコルは、Ｃａｎａｄｉａｎ  Ｃｏｕｎｃｉｌ  ｏｎ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅのガイドラインに従って、ＭｃＧｉｌｌ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅによって許可された。２４０μＧのＫＬＨ結合抗原を含む等張性生理食塩水（０．６ｍＬ）を、０．６ｍＬの完全フロイントアジュバントで乳化する。次いで、０．５ｍＬのエマルジョン（１００μｇの抗原）を、筋肉内または皮下でウサギごとに注射する。ウサギを、引き続き不完全フロイントアジュバント中で乳化した５０μｇの抗原を用いて、３週間の間隔でブーストする。血液を、ブーストの１０〜１４日後に、耳の静脈穿刺によってバキュテーナーチューブ（ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ  ｔｕｂｅ）中に抗凝固剤なしで集め、４℃に維持する。凝固および４℃での遠心分離後、アジ化ナトリウムを抗血清に０．００１％の最終濃度（１ｍＬの抗血清当たり１％アジ化ナトリウム溶液１μＬ）まで加える。抗血清を０．５ｍＬのアリコートとして−２０℃で保存する。
【０４０８】
（抗血清力価）
マイクロタイタープレートのウェルを、１０ｍＭの炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．６）中の１０μｇｍＬ−１のウシ血清アルブミン−カフェイン（または、１，７−ジメチルキサンチン、１，７−ジメチル尿酸）結合体で、一晩４℃（１５０μＬ／ウェル）でコーティングする。次いで、これらを、Ｎｕｎｃ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｗａｓｈ  １２オートクレーブを使用して、ＴＰＢＳ（０．０５％Ｔｗｅｅｎ  ２０を含むリン酸緩衝生理食塩水）で３回洗浄する。占められていない部位を、２時間室温で、０．０５％ブタゼラチンを含む１５０μＬ／ウェルとともにインキュベーションによってブロックする。ウェルをＴＰＢＳで３回洗浄し、ＴＰＢＳ中に希釈される１５０μＬの抗血清を加える。室温で２時間後、ウェルを３回ＴＰＢＳで洗浄し、そして１００μＬの１％ＢＳＡを含むＰＢＳ中で希釈されたヤギ抗ウサギＩｇＧアルカリホスファターゼ結合体を加える。室温で１時間後、このウェルを３回ＴＰＢＳでそして３回水で洗浄する。ウェルに、ジエタノールアミン緩衝液（１０ｍＭ、ｐＨ９．８）中に、ＭｇＣｌ２（０．５ｍＭ）およびｐ−ニトロフェノールホスフェート（３．８５ｍＭ）を含む１５０μＬの溶液を加える。室温で３０分後、吸光度を、マイクロリーダープレートを用いて４０５ｎｍで読む。抗体力価を、吸光度を１単位（１ａｕ）変化させるのに必要とされる希釈として規定する。
【０４０９】
（ＩｇＧ抗体の単離）
ＫＬＨ結合体に対するウサギＩｇＧ抗体を、以下のように、プロテインＡ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４Ｂカラムでのアフィニティークロマトグラフィーによって精製する。０．９×１５ｃｍＰｈａｒｍａｃｉａクロマトグラフィーカラムに、プロテインＡ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４Ｂ懸濁液を１ｍＬの容積で充填する。カラムを、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ（ＰＢＳ）を含む０．０１Ｍ  Ｎａ２ＨＰＯ４−ＮａＨ２ＰＯ４緩衝液（ｐＨ８．０）で十分に洗浄し、次いで、３〜４ｍＬの０．１Ｍのクエン酸三ナトリウム緩衝液（ｐＨ３．０）で洗浄する。次いで、カラムをＰＢＳで十分に洗浄する。次いで、１ｍＬのウサギ抗血清を、１ｍＬのＰＢＳで希釈し、そして得られた溶液を、ゆっくりカラムに適用する。カラムを１５ｍＬのＰＢＳで洗浄し、そして０．１Ｍのクエン酸三ナトリウム緩衝液（ｐＨ３．０）で溶出する。２．２ｍＬの３つの画分を、０．８ｍＬの１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．５）を含む１５ｍＬメモリ付きチューブに集める。精製されたウサギＩｇＧ抗体を、０．０１％アジ化ナトリウムの存在下で４℃で保存する。
【０４１０】
（競合的抗原ＥＬＩＳＡ）
新たに調製された物質緩衝液を除いて、緩衝液および添加剤を含まない水を、０．４５μＭミリポア（ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）フィルターを通して濾過する。ＢＳＡ、抗体、ＴｗｅｅｎＴＭ２０および西洋ワサビペルオキシダーゼを、使用の直前に緩衝液および水に加える。尿サンプルを、１杯のコーヒー（１カップ当たり約１００ｍｇのカフェインをともなうインスタントまたは調製（ｂｒｅｗｅｄ）される）を飲んだ４時間後に普通に集め、そして、１．５ｍＬマイクロチューブに１ｍＬのアリコートとして−２０℃で保存する。ＥＬＩＳＡのために、尿サンプルを、等張性リン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．５（３１０ｍｏｓＭ）で希釈して、マイクロタイタープレートウェルに３×１０−６Ｍ以下のカフェイン、１，７−ＤＭＸおよび１，７−ＤＭＵの濃度を与える。ＥＬＩＳＡプレートのウェルを、Ｎｕｎｃ−Ｉｍｍｕｎｏ  ｗａｓｈ  １２  ｗａｓｈｅｒで洗浄する。６．６μｇｍｌ−１の単離されたＩｇＧ抗体の溶液の１６ミリリットルを、１００ｍＭ炭酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ９．６中に調製し、そして１５０μＬのこの溶液を、８チャンネルピペット（Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ  ＴｒａｎｓｆｅｒｐｅｔｔｅＴＭ−８  ５０−２００μＬ）および２００μＬ  Ｆｌｅｘチップ（Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ製）を使用して、マイクロタイタープレートの各ウェルにピペットで移す。４℃で２０時間、抗体でウェルをコーティングした後に、ウェルを３回、０．０５％ＴｗｅｅｎＴＭ２０（ＩＰＢＴ）を含む等張性リン酸ナトリウム緩衝液で洗浄し、プレートを反転させ、一片のペーパータオル上にその液体を吸収させることによって適切に排出する。１％ＢＳＡを含む３０ミリリットルのＩＰＢＴ溶液の溶液を調製し、そして１５０μＬのこの溶液を、８チャンネルピペット（Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ  ＴｒａｎｓｆｅｒｐｅｔｔｅＴＭ−８  ５０−２００μＬ）および２００μＬイエローチップ（Ｐ２００  Ｇｉｌｓｏｎ  ＰｉｐｅｔｍａｎのためのＳａｒｓｔｅｄｔイエローチップ）を使用して各ウェルにピペットで移す。室温で３時間後、ウェルを３回ＩＰＢＴ溶液で洗浄し、そして排出する。カフェイン、１，７−ＤＭＸおよび１，７−ＤＭＵの決定のために４００μＬのサンプルを、ＳａｒｓｔｅｄｔイエローチップおよびＰ２００  Ｇｉｌｓｏｎ  Ｐｉｐｅｔｍａｎを使用して、１．５ｍＬマイクロチューブで調製する。次いで、２００μＬの各サンプルを、ＳａｒｓｔｅｄｔイエローチップおよびＰ２００  Ｇｉｌｓｏｎ  Ｐｉｐｅｔｍａｎを使用して、図２２に示されるパターンに従って、Ｆａｌｃｏｎ９６ウェルマイクロテスト組織培養プレートに２つ組みでピペットで移す。８チャンネルピペット（Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ  ＴｒａｎｓｆｅｒｐｅｔｔｅＴＭ−８  ５０−２００μＬ）を使用し、そして８チャンネルピペットの先端（２００μＬ  Ｆｌｅｘ  ｔｉｐｓ、Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ製）を各列で変えて、抗体でコーティングした９６ウェルＥＬＩＳＡマイクロタイタープレートの対応するウェルに移す。サンプルの添加の後に、マイクロタイタープレートをカバーし、そして室温で２時間静地する。プレートを静地させている間、過酸化水素およびｏ−フェニレンジアミン塩酸塩を含まない基質緩衝液を調製する（２５ｍＭクエ���酸および５０ｍＭリン酸ナトリウム二塩基性緩衝液、ｐＨ５．０）。マイクロタイタープレートをＩＰＢＴ溶液で３回、そして０．０５％ＴｅｅｎＴＭ２０溶液で３回洗浄し、そして排出する。次いで、５０μＬの過酸化水素および４０ｍｇのｏ−フェニレンジアミンを基質緩衝液に加える。次いで、１５０マイクロリットル（１５０μＬ）の基質緩衝液を、８チャンネルピペット（Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ  ＴｒａｎｓｆｅｒｐｅｔｔｅＴＭ−８  ５０−２００μＬ）および２００μＬ  Ｆｌｅｘ  ｔｉｐｓ（Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ）を使用して、各ウェルに加える。マイクロタイタープレートをカバーし、そして２５〜３０分間室温で振盪させ、そして酵素反応を、８チャンネルピペット（Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ  ＴｒａｎｓｆｅｒｐｅｔｔｅＴＭ−８  ５０−２００μＬ）および２００μＬ  Ｆｌｅｘ  ｔｉｐｓ（Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ）を使用して、５０μＬ／ウェルの２．５Ｎ  ＨＣｌ溶液を加えることによって停止する。穏やかに３分間振盪した後に、吸光度を、マイクロプレートリーダーで、４９０ｎｍで読む。
【０４１１】
（ＥＬＩＳＡのためのカフェイン、１，７−ＤＭＸおよび１，７−ジメチル尿酸溶液の標準溶液）
３１０ｍｏｓＭリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．５（ＩＰＢ）中の６．００×１０−４Ｍの濃度のカフェイン、１，７−ＤＭＸおよび１，７−ＤＭＵ酸それぞれの１００ｍＬストック溶液を、１００ｍＬの容量のフラスコに調製する。この溶液を、完全に可溶化させることを確実にするために攪拌する。ストック溶液を−２０℃で１ｍＬのアリコートとして保存する。
【０４１２】
ＥＬＩＳＡの日に、１つのアリコートを解凍し、そして室温に温める。
【０４１３】
上記化合物の標準溶液を以下の表１５において概説するように調製する。
【０４１４】
【表１５】
2004519674.tif 000024
（抗体特異性）
ＣＹＰ１Ａ２表現型決定のＥＬＩＳＡ測定における正確性を確実にするために、抗体は、それらの個々のカフェイン代謝物に対して特異性を有しなければならず、他の誘導体をほとんどまたは全く認識しない。これらの選択性を確実にするために、ＥＬＩＳＡを、表１６に記載される化合物の標準溶液で行う。理想的な抗体特異性の結果は、表１６に同様に仮定される。
【０４１５】
【表１６】
2004519674.tif 000025
ａ．数字の０は、ＥＬＩＳＡ（５×１０−３Ｍ）で試験される最も高い濃度で、阻害がないかまたは４０％以下の阻害のいずれかを示す；競合的抗原ＥＬＩＳＡにおいて、５０％阻害に必要とされるカフェイン、１，７−ジメチルキサンチンおよび１，７−ジメチル尿酸の濃度が決定される；ｂ、１，３−ジメチルキサンチン、テオフィリン；ｃ、１，７−ジメチルキサンチン、パラキサンチン；ｄ、３，７−ジメチルキサンチン、テオブロミン；ｅ、ＡＡＵ、５−アセトアミド−６−アミノウラシル；ｆ、ＡＡＭＵ、５−アセトアミド−６−アミノ−３−メチルウラシル；ｇ、ＡＡＤＭＵ、５−アセトアミド−６−１，３−ジメチルキサンチン。
【０４１６】
（結果）
カフェイン、１，７−ＤＭＸおよび１，７−ＤＭＵに対する抗体の陽性の作製は、ＥＬＩＳＡによって決定される３０，０００〜１００，０００の抗体力価、抗血清およびウサギ血清アルブミンに結合した誘導体の寒天プレートにおける二重免疫拡散後の強力な沈殿系列、ならびに他のカフェイン誘導体との低い交差反応性によって分かる。これらの結果は、材料および方法と題された上のセクションに記載される方法に従って、競合的抗原ＥＬＩＳＡの発展のための陽性の条件を構成する。
【０４１７】
本発明の１つの実施形態に従って、競合的抗原ＥＬＩＳＡは、プローブ基質としてカフェインを使用してＣＹＰ１Ａ２表現型決定のために開発される。表現型決定に使用される現在の方法とは対照的に、このアッセイは、感度が良く、迅速で、臨床の研究室において最小の訓練を受けた技術者によって慣用的基礎に基づいて容易に実行され得る。
【０４１８】
（実施例ＩＩ）
（ＥＬＩＳＡキットを用いた尿サンプル中のカフェイン、１，７−ジメチルキサンチン（１，７−ＤＭＸ）および１，７−ジメチル尿酸（１，７−ＤＭＵ）の測定）
【０４１９】
【表１７】
2004519674.tif 000026
（ＥＬＩＳＡによる［カフェイン］、［１，７−ＤＭＸ］および［１Ｘ］の測定のための尿サンプルの希釈）
カフェイン、１，７−ＤＭＸおよび１，７−ＤＭＵの測定に必要とされる尿サンプルの希釈は、競合的抗原ＥＬＩＳＡの感度ならびに尿サンプル中のカフェイン、１，７−ＤＭＸおよび１，７−ＤＭＵの濃度の相関的要素である。尿サンプルを因子によって希釈し、ＡＡＭＵおよび１Ｘが、マイクロタイタープレートのウェル中で約３×１０−６Ｍであるようにすることが示唆される。
【０４２０】
【表１８】
2004519674.tif 000027
ａ：尿サンプルを含むマイクロチューブを、ピペッティング前にボルテックスする。希釈された尿サンプルを、マイクロチューブ用のボックス中にて−２０℃で保存する。
緩衝液Ｂ：１バイアルのＢを１００ｍＬの水に溶解する。
【０４２１】
（希釈された尿サンプル中の［カフェイン］、［１，７−ＤＭＸ］および［１，７−ＤＭＵ］のＥＬＩＳＡによる測定）
（注意）
基質は発ガン性である。緩衝液Ｅ（基質緩衝液）を取り扱う場合には外科用手袋を着用すること。各サンプルを二連で繰返し測定する。優れたピペッティング技術が求められる。この技術を習得した場合、二連での吸光度の値は５％未満である。緩衝液Ｃ、Ｄ、Ｅを、新しく調製する。緩衝液Ｅ−Ｈ２Ｏ２を、このマイクロタイタープレートウェル中でのピペットティングの直前に調製する。
【０４２２】
（サンプルの調製：）
表１９をコンピュータを用いて準備し、そしてこれを印刷する。この表は９６マイクロタイタープレートの各ウェルの内容を示す。尿サンプルの名前（または番号）を表１９中の対応するウェルの位置に記入する。各尿サンプルの希釈率（Ｄ．Ｆ．）を選択し、そして表１９中の対応する位置に記入する。緩衝液Ｂを用いた各尿サンプルの希釈を表１９の対応する位置に記入する：例えば、希釈率が１００（１００μＬの１０×に希釈した尿サンプル＋９００μＬの緩衝液Ｂ）の場合、１００／９００と記入する。異なった希釈物の調製についての上記「尿サンプルの希釈．．．」の手順を参照のこと。１００のマイクロチューブのためのスチロフォーム支持体を用いて１．５ｍＬマイクロチューブ中の尿サンプルの異なった希釈物を調製する。表２０をコンピュータを用いて準備し、そしてこれを印刷する。スチロフォーム支持体（１００のマイクロチューブ）を使用する際、表２０に示された順序で、続く４８のマイクロチューブを調製する。
【０４２３】
【表１９】
2004519674.tif 000028
【０４２４】
【表２０】
2004519674.tif 000029
（溶液）
緩衝液Ｃ：        １バイアルのＣの内容物を５０ｍＬの水に溶解する。
【０４２５】
２５ｍＬのＴｗｅｅｎＴＭ２０を添加する。
【０４２６】
緩衝液Ｄ：        １バイアルのＤの内容物を２５ｍＬの水に溶解する。
【０４２７】
２５ｍＬのＴｗｅｅｎＴＭ２０を添加する。
【０４２８】
０．０５％  ＴｗｅｅｎＴＭ２０：２５ｍＬのＴｗｅｅｎＴＭ２０を５０ｍＬの水が入っている１００ｍＬのエルレンマイヤーフラスコ中に加える。
【０４２９】
２．５Ｎ  ＨＣＬ：４１．７５ｍＬの１２Ｎ  ＨＣＬ／２００ｍＬの水。
【０４３０】
２５０ｍＬのガラス瓶中で保存。
【０４３１】
カフェイン−ＨＲＰ結合体：９ｍＬの緩衝液Ｃを１５ｍＬガラス試験管に加え
る。９０μＬのカフェイン−ＨＲＰストック溶液
を加える。
【０４３２】
１，７−ＤＭＸ−ＨＲＰ結合体：９ｍＬの緩衝液Ｃを１５ｍＬガラス試験管に
加える。９０μＬの１，７−ＤＭＸ−ＨＲＰ
ストック溶液を加える。
【０４３３】
１，７−ＤＭＵ−ＨＲＰ結合体：９ｍＬの２％ＢＳＡ溶液を１５ｍＬガラス試
験管に加える。９０μＬの１，７−ＤＭＵ−
ＨＲＰストック溶液を加える。
【０４３４】
緩衝液Ｅ−Ｈ２Ｏ２：１バイアルのＥ−基質の内容物を水５０ｍＬに溶解する。２５μＬの３０％Ｈ２Ｏ２溶液（新たに調製）を添加する。
【０４３５】
【表２１】
2004519674.tif 000030
（ＥＬＩＳＡの条件）
最後の行から始まる５０μＬ／ウェルのカフェイン−ＨＲＰ（１，７−ＤＭＸまたは１，７−ＤＭＵ）結合体溶液を添加する。５０μＬ／ウェルの希釈した尿サンプルの二連、標準物、ブランクをマイクロピペット（０〜２００μＬ）を用いて加え、これはウェル番号９６から開始する（表２２参照のこと）。プレートを被覆し、そして数秒間穏やかにボルテックスすることによって混合する。このプレートを３時間室温で放置する。次いで、このプレートを、マイクロタイタープレート洗浄器を使用して１００μＬ／ウェルの緩衝液Ｃで３回洗浄する。次いで、このプレートを１００μＬ／ウェルの０．０５％  ＴｗｅｅｎＴＭ  ２０溶液を用いて３回洗浄する。１５０μＬ／ウェルの緩衝液Ｅ−Ｈ２Ｏ２（マイクロタイタープレートウェル中のピペッティングの直前に調製される）を加える。このプレートをオービタル振盪器（ｏｒｂｉｔａｌ  ｓｈａｋｅｒ）を使用して室温で２０〜３０分間振盪する。５０μＬ／ウェルの２．５Ｎ  ＨＣｌ溶液を加える。このプレートをオービタル振盪器（ｏｒｂｉｔａｌ  ｓｈａｋｅｒ）を使用して室温で３０分間振盪する。このウェルの吸光度はマイクロタイタープレートリーダーを使用して４９０ｎｍで読取られる。このデータ表を印刷し適切に標示する。
【０４３６】
（データからの尿サンプル中の［カフェイン］、［１，７−ＤＭＸ］および［１，７−ＤＭＵ］の計算）
表２２をコンピュータを用いて描画する。マイクロタイタープレートリーダーのデータ表を使用して、表２２のブランク、コントロール（遊離のハプテンが存在しない）、標準物およびサンプルの平均吸光度の値を記入する。較正曲線を、ｓｉｇｍａ−ｐｌｏｔ（または他の描画ソフト）を使用して半対数プロットにおいて（４９０ｎｍでの吸光度を標準濃度の関数として）描く。未知であるマイクロタイターウェル中の［ＡＡＭＵ］（または［１Ｘ］）を較正曲線から見出し、そのデータを表２３に記入する。未知である［カフェイン］（［１，７−ＤＭＸ］または［１，７−ＤＭＵ］）に希釈率をかけて、そしてこの結果を表２３の対応するセルに記入する。
【０４３７】
【表２２】
2004519674.tif 000031
【０４３８】
【表２３】
2004519674.tif 000032
【０４３９】
【表２４】
2004519674.tif 000033
従って、少なくともＮＡＴ２に対して特異的なＥＬＩＳＡシステムを提供する
。あるいは、上で略述したＥＬＩＳＡプロトコルを、目的の酵素の多くに適応し得る。図１７は本発明の実施形態に従った複数決定基（ｍｕｌｔｉ−ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔ）アッセイを例示する。なおさらに（Ｆｕｒｔｈｅｒｓｔｉｌｌ）、本発明の複数決定基アッセイは、標準的なマイクロプレートの各ウェルの中に、図１７で例示されるような一つより多い６×６アレイを提供し得る。好ましくは、各ウェルを、本発明のこの局面に従って４つの６×６アレイで提供する。
【０４４０】
本発明の単一の決定基アッセイシステムまたは複数決定基アッセイシステムは、生物学的サンプル中の薬物特異的な代謝産物の検出のための代謝産物特異的な結合因子を含む。このような結合因子は好ましくは抗体であり、そしてこのアッセイシステムは好ましくは、本明細書中の上記で議論したＮＡＴ２の場合に例示されるようなＥＬＩＳＡである。本発明の実施形態に従った検出方法を図１８に示した。本発明のアッセイシステムは図１９に示され、そしてアモナフィド（ａｍｏｎａｆｉｄｅ）を代謝する代謝経路に特異的な代謝産物を検出するために用いられる手段を提供する。
【０４４１】
本発明は、臨床環境および実験環境の両方における使用について簡便かつ効率的なツールを提供する。本発明は診療所にいる医師による使用に特に適しており、これにより少なくともＮＡＴ２についての表現型決定基を迅速かつ容易に得得る。本発明の実施形態に従って、すぐに使用可能なキットが、少なくともＮＡＴ２決定基の迅速かつ正確な決定に提供される。このアッセイシステムおよびキットは好ましくは、対応するプローブ薬物を消費した後の個体の生物学的サンプル中の好ましい代謝産物の検出を可能にする適切な基質において、多数の代謝産物に特異的な抗体を用いる。本発明の好ましい実施形態に従って、本発明のキットは少なくともＮ−アセチルトランスフェラーゼ−２（ＮＡＴ−２）についての代謝決定基を決定する手段を提供する。あるいは、本発明のキットはＮ−アセチルトランスフェラーゼ−２（ＮＡＴ−２）、および少なくとも以下の酵素の一つのための手段を提供する：ＣＹＰ１Ａ２、Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ−１（ＮＡＴ−１）、ＣＹＰ２Ｄ６、ＣＹＰ２Ａ６、ＣＹＰ２Ｅ１、ＣＹＰ３Ａ４、ＣＹＰ２Ｃ９およびＣＹＰ２Ｃ１９。本発明のこのアッセイシステムは、ＥＬＩＳＡアッセイ、ハイスループットＥＬＩＳＡアッセイまたはディップスティックベースのＥＬＩＳＡアッセイを含むがこれらに限定されない当該分野で公知である多数の形態により提供され得る。
【０４４２】
（実施例ＩＩ  アモナフィドを用いた個別化された治療レジメンの決定における代謝の表現型決定の使用）
薬物に対する個体の曝露は、曲線下面積（ａｒｅａ−ｕｎｄｅｒ−ｔｈｅ  ｃｕｒｖｅ）（一般にＡＵＣと称される）の概念により記述される。ＡＵＣは以下の式によりクリアランスと関連する：
ＡＵＣ＝用量／クリアランス。
【０４４３】
従って、個体のクリアランスが既知である場合、この用量は所望のＡＵＣを達成できるように以下の式によって個別化し得る：
用量＝所望のＡＵＣ×クリアランス。
【０４４４】
個体の薬物クリアランスの速度は重要である。なぜならば、これが循環薬物濃度を決定するからである。効力および毒性の両方を、部分的に、薬物の循環濃度により決定する。
【０４４５】
それゆえに、治療の個別化のために、多数の因子を含むモデルが開発され、このモデルは、特定の医薬について個体のクリアランスの値における役割を担う可能性があり、従って最大効力かつ最小毒性を伴う用量を予測する。薬物代謝が循環薬物濃度の主要な決定因子であるので、個体の薬物代謝の速度を決定することは、治療の個別化のために効を奏するモデルの開発のための重要な因子である。本発明のモデルは、その個体に対するアモナフィドの特異的な用量を決定する際の個体のＮＡＴ２代謝の速度を説明する。
【０４４６】
他の因子は薬物クリアランスを変化させ得る（例えば、体表面積、肝臓の酵素およびタンパク質のレベル（血清アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）、アルブミン、アルカリホスファターゼ、および血清α−１−酸性糖タンパク質（ＡＡＧ）を含む）、および薬物輸送タンパク質（Ｐ−糖タンパク質（ｐｇｐ）を含む））。
【０４４７】
他の個体特異的な特徴は、個体の用量限界（ｄｏｓｅ−ｌｉｍｉｔｉｎｇ）の毒性の決定において役割を担う。本発明の別の局面に従って、他の影響を与える因子を、代謝速度に加えて、アモナフィドを用いた治療の個別化のためのモデルの中で説明し得る。例えば、多くの化学療法のための薬物の場合、骨髄抑制（ｍｙｅｌｏｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ）は用量限界の毒性であり、それゆえに、個体の前処理の白血球（ＷＢＣ）数（ｐｒｅｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｗｈｉｔｅ  ｂｌｏｏｄ  ｃｅｌｌ  ｃｏｕｎｔ）は、毒性を予測する上で重要な因子であり得る。
【０４４８】
多変量解析を使用して、これらの個体の因子を効力および毒性に対する相関について調べる。本発明の一つの実施形態に従って、効力または毒性のいずれかに対して有意な相関を有すると同定された因子を、薬物代謝に沿ったモデルに導入する。
【０４４９】
個体における薬物クリアランスの速度を決定する際の薬物代謝の重要性は、これを多くの薬物の効力および毒性を決定する際の最も重要な因子とならしめる。本発明の文脈で述べられた代謝酵素のいくつかは、代謝について明らかな双峰分布を有し、集団を代謝能が低い群と代謝能が高い群に分離することが可能である。しかし、各表現型群の中に、代謝速度における幅広い変化域が存在する。予め決定されたカットオフ値より大きな代謝速度を有する全ての個体を等価なものであるとみなすのは愚直であり得る。集団を二つまたは三つの表現型群として分類する試みは、双峰分布を有さない酵素についてはさらに困難である。この限定された分類へ個体を類別することは、個体の代謝パターンの完全な活用を可能にし得ない。いくつかの場合において、単純な分類が十分である。例えば、いくつかの個体はＣＹＰ２Ｄ６のような酵素特異的な欠損を有し得、結果として、特定の薬物、例えばＰｒｏｚａｃＴＭが高容量で処方された場合、重篤な合併症の危険にさらされる。しかし、この単純な分類は、表現型を決定する間で計算されたモル分率の関数として、代謝能が高い群への差別的な投薬を可能としない。ＣＹＰ２Ｄ６の代謝能が高い群でこの単純な分類を使用した場合、０．３を超えるモル分率（デキストロメトルファンを薬物プローブとする）を有する全ての個体は同じ用量を受ける。本発明者らは、図２０で例示されるような増大した代謝速度を伴う増大した用量を生み出す用量の尺度の開発を提案している。双峰分布のみが考慮される場合、２つの可能な用量を処方し得る。従って、アモナフィドを用いた治療の個別化は、本発明に従って提案される。結果として、表現型に基いたアモナフィドを用いる分類別の治療は処置の個別化と置き換わり、これによって各個体の代謝が個体の基準に基いて評価され、そして対応する個々の用量が決定される。この様式において、アモナフィドが個体の基準に基いて、代謝についての個体の表現型の能力に対応する用量で処方される。
【０４５０】
いくつかの場合で、複数の酵素が薬物の代謝速度の決定において重要な役割を担う。したがって、このような場合における一つの代謝酵素のみのモニタリングは、治療の個別化についての完全な情報を提供し得ない。複数決定基アッセイの使用は、さらなる代謝関連情報を提供するために複数の酵素を調べ、これによって治療の個別化のためのより正確なモデルを生み出す。例えば、予備的な研究によりアモナフィドがまたシトクロムＰ４５０酵素であるＣＹＰ１Ａ２の基質であることが示唆され、そしてＣＹＰ１Ａ２によるアモナフィドの代謝がＮ−アセチルアモナフィドにより阻害されることを示唆された。それゆえに、複数決定基アッセイの使用は、ＣＹＰ１Ａ２およびＮＡＴ２の代謝の速度を測定し、これはより正確なモデルを提供し得る。
【０４５１】
極端な代謝の表現型を有する個体はしばしば、治療の毒性または非効力のいずれかの高い危険にさらされる。これらの代謝能が非常に高い群または代謝能が非常に低い群はしばしば、遺伝子型決定（ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ）により同定し得る。いくつかの代謝酵素について遺伝子多型が存在し、これは酵素の欠損または活性を有しない生成物酵素を生じる。これらの個体は、酵素のインデューサーまたはインヒビターにより影響を受けず、そして一貫して極端に代謝能が低い群である。これらの遺伝子多型を保持するこれらの個体の同定により、医師は問題の酵素に代謝される薬物の処方を回避することが可能である。逆に、高レベルの酵素および／または増大した酵素活性を生み出すいくつかの遺伝子多型が同定されている。さらに、多型を含む遺伝子の複数のコピーを有するいくつかの個体が同定されている。代謝能が非常に低い群に関しては、これらの個体が毒性の増大した危険性または応答の欠失に起因して、特定の処置のレジメンから排除される。
【０４５２】
それゆえに、どの個体が特定の薬物を用いて処置されるべきであるかを同定するための遺伝子型の使用は、これらの特定の表現型に基く個体治療の個別化の優れた前ぶれであり得る。そのようにする場合、代謝における酵素特異的な無効力に対応する特定の対立遺伝子改変を有する個体は、予備的な表現型決定の手順およびプローブ薬物もしくは基質を用いた処置を受ける前に同定され得る。
【０４５３】
個体の（複数の）表現型プロフィールの知識は、医師が以下をすることを可能にする：
１）その個体が、安全な薬物の処方を可能にする表現型を有するか否かを決定すること
２）最適な薬物の用量を、個体に対する薬物の効力および薬物の安全性に関して決定すること
３）個体の病理また状態の処理に使用する多数の薬物のうちどの薬物が、個体に対する薬物の効力および薬物の安全性に関して、最適な薬物であるかを決定すること。
【０４５４】
一つ以上の酵素についての個体の（複数の）表現型プロフィールの知識は、特定の表現型プロフィールを有する個体において、有意な副作用生じ得るか、または無効力である薬物の検出を可能にする。さらに、表現型プロフィールは、酵素活性に関連した用量を用いる個別化された用量のスキームの開発を可能にする。治療および用量の選択における複数決定基表現型決定プロフィールの実行は、副作用における著しい減少および治療効力の増加をもたらす。
【０４５５】
（アモナフィド）
アモナフィドは、非小細胞肺癌（ｎｏｎ−ｓｍａｌｌ  ｃｅｌｌ  ｌｕｎｇ  ｃａｎｃｅｒ）、前立腺癌および乳癌において抗腫瘍活性を有することが示されてきた。最も一般的な用量限界のアモナフィドの副作用は、顆粒球減少症である。アモナフィドはＮＡＴ２により代謝され、そしてその主要な代謝産物であるＮ−アセチルアモナフィドを形成する。図２１はアモナフィドおよびＮ−アセチルアモナフィドの構造を示す。
【０４５６】
これまでの研究により、ＮＡＴ２アセチル化が速い群は最も重篤な毒性に直面し、そしてアセチル化が遅い群は有意に不十分な用量である（Ｒａｔａｉｎら、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  １３：７４１−４７、１９９５）と結論された。一つの研究によって、アセチル化が速い群およびアセチル化が遅い群に対して、それぞれ２５０および３７５ｍｇ／ｍ２という推奨用量が生み出された（Ｒａｔａｉｎら、（１９９３）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５３：２３０４〜２３０８）。この治療のカテゴリー化は、いくつかの因子により限定される。アセチル化が遅い群およびアセチル化が速い群への個体のカテゴリー的な分離は、毒性のレベルおよび応答の速度において改善を生じ得るが、その一方、これは最適でない。なぜならば、このアプローチは個体の表現型の差異を説明していないからである。ＮＡＴ２活性の速度を決定するために、カフェインをプローブ基質として使用して、そしてカフェイン代謝産物のＡＡＭＵおよび１Ｘのモル分率を計算する。遅いアセチル化群およびアセチル化が速い群への個体の分離のために、１．８０という値を用いた（１．８０未満であれば、アセチル化が遅い群とし、１．８０を超えた場合、アセチル化が速い群とする）。しかし、アセチル化が速い群について、モル分率の範囲は１．８０超えてすぐから１２まで変化し得る。それゆえに、単一の用量をすべてのアセチル化が速い群に割り当てることは愚直であり得る。より適切な方法は、治療モデルの個別化の構成要素として個体の特異的なモル分率を取込むことであるである。
【０４５７】
上述したカテゴリー化方法論においてさらに限定要因は、処置後２４時間のＮ−アセチルアモナフィドレベルの測定の必要性である。この測定は、臨床的に実用的でない。なぜならば、これはアモナフィドに対して特異的なさらなる試験、および添加した血清サンプルの回収を必要とするからである。
【０４５８】
本発明は、アモナフィドでの治療の個別化における使用のための、少なくとも個体特異的ＮＡＴ２表現型に基づく個別化モデルを提供する。本発明の個別化モデルはさらに、他の酵素特異的決定因子ならびに他の因子を含み、これは、アモナフィドのクリアランス（肝臓の酵素レベルを含む）、または毒性（前処理ＷＢＣを含む）に非常に寄与する。このモデルは、個体を、速いまたは遅い表現型の分類で区別せず、そしてすべての個体を１つの群で同じに処置する。むしろ、本発明の１つの実施形態に従うこの個別化モデルは、個体の表現型に対応する個体特異的なモル比とみなす。この個体特異的な情報を使用して、各個体に特異的な用量を産生する。さらに、この投薬モデルは、２４時間のＮ−アセチルアモナフィドの測定を必要としない。
【０４５９】
本発明に従って、アッセイシステムは、臨床的環境において使用され得るアッセイシステムを提供し、それによって、表現型決定基を、尿サンプルから数量化し、そして、少なくともＮＡＴ２を代謝する個体の能力に対応した、個体の処置のためのアモナフィドの用量を決定するために、個体モデルに適用する。その結果として、医師は、予測的および絶対的な投薬に基づく投薬法の任意の選択を提供して、治療の個別化のためのツールが提供される。
【０４６０】
本発明に従って、アッセイシステムは、臨床的環境において使用され得るアッセイシステムを提供し、それによって、表現型決定基を、尿サンプルから数量化し、そして、少なくともＮＡＴ２を代謝する個体の能力に対応した、個体の処置のためのアモナフィドの用量を決定するために、個体モデルに適用する。その結果として、医師は、予測的および絶対的な投薬に基づく投薬法の任意の選択を提供して、治療の個別化のためのツールが提供される。
【０４６１】
本発明が、それらの特定の実施形態と関連して記載される一方、本発明の属する公野において公知または慣用であるように、そして本明細書中で前に記載された本質的特徴に適用されるように、そして添付の特許請求の範囲において従うように、さらなる改変が可能であり、そして本出願が、一般に、本発明の原理に従い、そして本開示からのこのような逸脱を含む、本発明の任意の変更、使用、または適応をカバーすることを意図することが理解される。
【０４６２】
（実施例ＩＩＩ）
（アモナフィド治療のための個別化処置をもちいる臨床試験の設計）
（臨床試験プロトコール）
オープンラベル第二相試験（ｏｐｅｎ  ｌａｂｅｌ  ｐｈａｓｅ  ２）、すなわち転移性の乳癌のためのアントラサイクリンまたはタキサンを含む、前の細胞毒性の化学療法レジメンのあとに再発した個体における、セカンドライン治療としてのアモナフィドの多施設治験。
【０４６３】
（概要）
（プロトコール表題：）
オープンラベル第二相試験（ｏｐｅｎ  ｌａｂｅｌ  ｐｈａｓｅ  ２）、すなわち転移性の乳癌のためのアントラサイクリンまたはタキサンを含む、前の細胞毒性の化学療法レジメンのあとに再発した個体における、セカンドライン治療としてのアモナフィドの多施設治験
（バージョン日（ｖｅｒｓｉｏｎ  ｄａｔｅ）：）
２００２年２月１日
（スポンサー：）
Ｘａｎｔｈｕｓ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｉｎｃ．
（プロジェクト相：）
第二相
（研究説明：）
アモナフィドは、Ｎ−アセチル化によって、活性代謝産物、Ｎ−アセチル−アモナフィドに代謝される。Ｎ−アセチル化における個体相互の違いは、アモナフィド誘導性骨髄抑制における可変性を説明し得る。表現型特異的投薬にも関わらず、まだ骨髄抑制における可変性が群の中に存在する。
【０４６４】
（目的：）
前期：
個体の個体のアセチル化群の表現型を決定し、そして代謝能力に基づいて適切に個別化されたアモナフィドの用量を割り当てる；
アモナフィドを適切に／個別化した用量を割り当てることによって、アモナフィドの減少された毒性を実証する；
表現型特異的投薬ノモグラムを規定する。
【０４６５】
後期：
転移性の乳癌のためのアントラサイクリンまたはタキサンを含む、前の細胞毒性の化学療法レジメンのあとに再発した個体における、アモナフィドの応答率を測定する；
応答の持続時間および疾患進行の時間を測定する；
生存率を収集する。
【０４６６】
（研究設計）
これは、オープンラベル第二相試験、すなわち転移性の乳癌のためのアントラサイクリンまたはタキサンを含む、前の細胞毒性の化学療法レジメンのあとに再発した個体における、セカンドライン治療としてのアモナフィドの多施設治験である。
【０４６７】
それぞれの観点から実行される手順のフローチャートを参照のこと。
【０４６８】
（個体の数）
研究における、約８０〜１００個体（８０を評価した）
（施設の総数）
約１５施設
（封入の診断および主な診断基準）
転移性（ステージＩＶ）乳癌を有する、アントラサイクリンまたはタキサンを含む、前の細胞毒性の化学療法レジメンのあとに再発した個体。個体は、１８歳以上でなければならず、そしてアセチル化群の表現型の情報が投薬の前に得られなければならない。
【０４６９】
（試験物）
アモナフィド（ベンズイソキノリンジオン）
（個体の関与および研究の期間）
個体：
スクリーニング：１４日間まで
処置：４．５時間まで（６周期）
追跡調査：登録の日から１２ヶ月間
電話追跡調査：死亡まで
研究：
記録：６ヶ月間
総研究期間：１２〜１８ヶ月
（併用処置）
−研究に入る前の骨への転移に起因して、痛みの処置のためにビホスホネートをすでに受けている個体は、研究の間処置を継続し得る。
【０４７０】
−重症好中球減少症の場合もしくは熱性好中球減少症の場合、処置としてのみ成長因子を与え得る。
【０４７１】
−貧血の場合、エリトロポイエチンを与え得る。
【０４７２】
（研究手順）
（スクリーニング（−１４日〜０日）
−以下の評価を、処置を始める前の１４日間のうちに完了させなければならない：人口統計学データ、病歴、カルノフスキー成績ステータス、ＮＹＨＡ心臓分類、完全な身体検査、身長および体重、バイタルサイン、妊娠試験（潜在的に出産可能な女性）、胸部Ｘ線、ＥＣＧ（１２リード（ｌｅａｄ））、血液学、血液化学および尿検査。臨床評価には、有害事象の検査を含み、併用薬物および同時疾病もまた行なわれる。
【０４７３】
−基準腫瘍評価には、全ての個体に対する胸部ＣＴスキャン、研究に入る３ヶ月前に異常なスキャンを受けた個体に対する骨のスキャン、および異常な肝臓化学か、またはかつて異常なＣＴスキャン、超音波、もしくはＭＲＩを受けた、腹痛を有する個体に対する腹部ＣＴスキャンが挙げられる。
【０４７４】
表現型の評価：全ての適格な個体は、アセチル化群（ＮＡＴ２）およびシトクロム４５０  ｌＡ２（ＣＹＰｌＡ２）を受け、アモナフィドの投与の前および後に表現型を決定する。カフェインを、表現型決定の基質として使用する。カフェイン（１００ｍｇ）を錠剤として投与する。カフェイン摂取の３時間後、個体は膀胱から排尿し、そして尿を捨てる。尿サンプルは、カフェイン摂取の４〜５時間後に得る。
【０４７５】
（処置段階（４．５時間まで））
−それぞれの処置周期（２１日）で、アモナフィドを５日間毎日注入する。投薬の期間および注入終了後１時間までの間、アモナフィドの注入に関連する有害事象を評価した。
【０４７６】
以下の評価をアモナフィドによる処置の間３週間ごとに完了した：標的の身体検査、カルノフスキー成績ステータス、体重、バイタルサイン、血液学、血液化学および尿検査。臨床評価には、有害事象の検査を含み、併用薬物および同時疾病もまた行なわれる。
【０４７７】
最初の処置の終了の１週間後、個体を臨床的に評価し（標的の身体検査、体重、バイタルサイン、カルノフスキー成績ステータス、有害事象の検査、併用薬物および同時疾病）、そして続いて実験室評価を行う：血液学、血液化学および尿検査。臨床評価。
【０４７８】
表現型評価を行う（第１２日）。
【０４７９】
腫瘍評価を、アモナフィドによる処置の間の６週間ごとに行う（第２、４、６周期の第１日）。
【０４８０】
生活の質の質問表ＥＯＲＴＣ  ＱＬＱ−Ｃ３０およびＱＬＱ−ＢＲ２３を、基準でアモナフィドの投与の前に、および第２、４、６周期の第１日に実行する。
【０４８１】
（処置の終了）
個体を、最後のアモナフィドの処置の周期から１週間後（第２８日）に見て、そして続く試験を完了する：完全な身体検査、カルノフスキー成績ステータス、体重、バイタルサイン、生活の質の質問表ＥＯＲＴＣ  ＱＬＱ−Ｃ３０およびＱＬＱ−ＢＲ２３、胸部Ｘ線、血液学、血液化学および尿検査、妊娠試験（潜在的に出産可能な女性）およびＥＣＧ。臨床評価には、有害事象の検査を含み、併用薬物および同時疾病もまた行なわれる。
【０４８２】
（研究終了訪問（ｓｔｕｄｙ  ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｖｉｓｉｔ））
任意の理由で研究を中断した個体に、研究終了訪問に来るように依頼する。評価されるパラメーターは以下である：完全な身体検査、カルノフスキー成績ステータス、体重、バイタルサイン、生活の質の質問表ＥＯＲＴＣ  ＱＬＱ−Ｃ３０およびＱＬＱ−ＢＲ２３、胸部Ｘ線、血液学、血液化学および尿検査、妊娠試験（潜在的に出産可能な女性）およびＥＣＧ。臨床評価には、有害事象の検査を含み、併用薬物および同時疾病もまた行なわれる。
【０４８３】
（追跡調査訪問）
−研究処置の完了後、または研究処置からの初期の中止の後、個体を、生存の間３ヶ月ごとにフォローする。研究における登録された日付から１２ヶ月間、または死亡まで（それが早く起きた場合）、個体は評価される。評価されるパラメーターは以下である：完全な身体検査、カルノフスキー成績ステータス、体重、バイタルサイン。重大な有害事象の検査を含む臨床評価もまた行なわれる。
【０４８４】
−追跡調査の終了に続いて、生存の評価をするために３ヶ月ごとに個体に電話をする。
【０４８５】
（効能の評価の評価基準）
前期：全体的な応答率（部分および完全）、ならびに疾患進行の時間。
【０４８６】
後期：応答の持続時間および生存性。
【０４８７】
（安全性）
少なくともアモナフィドの１投薬量を受ける全ての個体は、安全分析に含まれる。
【０４８８】
（統計学的な方法、一般的分析計画、多くの個体に対する理論）
全体的な応答率を評価するために、分析の２つのセットを行い、ここで１つは処置を意図するアプローチに基づき（全ての登録した適格な個体）、そして１つは評価可能な個体のみ、すなわち、少なくとも治療の２周期を完了し、そして腫瘍の評価を受けたすべての適格な個体から得られたデータに基づく。疾患進行の時間の分析は、少なくとも１治療周期を受けた全ての適格な個体を含む。
【０４８９】
少なくとも１治療用量を受けた全ての個体は、安全分析に含まれる。有害事象のいずれの頻度も記録し、そして身体領域および毒性程度に従って分類する。
【０４９０】
暫定分析を、２０〜３０個体が研究に登録し、そして少なくとも２治療周期を完了し、そして腫瘍評価を受けた場合に計画する。
【０４９１】
【表２５】
2004519674.tif 000034
。
【０４９２】
（導入）
（進行性乳癌  −疾患の背景）
皮膚癌を除いて、乳癌は女性の間でもっとも一般的な癌であり、北アメリカ女性において診断された癌のほぼ３つに１つの割合である。乳癌はまた、女性における癌関連による死亡の、肺癌に次いで２番目に一般的である。１９９９年において、乳癌は、カナダでは約１８，７００件、Ｕ．Ｓ．ではおよそ１７５，０００件を占めることが推定される（Ｌａｎｄｉｓら、１９９９  ＣＡ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  ４９（１）：  ８−３１）。乳癌は、１９９９年のカナダにおいておよそ５，５００件の死亡、そして１９９７年のＵ．Ｓ．においておよそ４４，０００件の死亡を占めている（Ｃａｎａｄｉａｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ  ２０００，  Ｔｏｒｏｎｔｏ，  Ｃａｎａｄａ，ＮＣＩＣ，  Ｖｏｌ．  ２０００）。
【０４９３】
たとえ、初期乳癌の処置において大きな進歩があったといえども、進行性乳癌のための処置の選択はまだ限定され、そして転移性（ステージＩＶ）乳癌の結果はほぼいつも致死である。
【０４９４】
転移性（ステージＩＶ）乳癌と診断された女性は、１７〜２０ヶ月の中央生存予測値を有し、５年生存率はたったの１５％である。５年生存率は、骨のみに転移した女性において３０〜４０％に達する。予後のより乏しい個体は、内蔵の疾患、特に肝臓転移を有する女性である：彼女らの生存中央値は、たったの８〜１０ヶ月である。
【０４９５】
進行性乳癌の初期の処置は、化学療法、ホルモン治療または療法を使用したアジュバント全身治療からなる。第一線の治療として細胞毒性薬物（例えば５−ＦＵ、ドキソルビシン、およびシクロホスファミド（ＦＡＣ））を用いたアジュバント化学療法を受ける個体において、たったの１６．６％のみが、ほとんどの臨床研究者が規定するように、完全な寛解に達する。（Ｈｏｒｔｏｂａｇｙｉ  １９９８  Ｎ．  Ｅｎｇ．  Ｊ．  Ｍｅｄ．  ３３９（１４）：  ９７４−９８４）。さらに、アジュバント療法の後に再発した個体は、部分的にまたは完全に薬物耐性を有し、首尾良い処置介入には感受性が低い。化学療法に対する疾患の応答性は、第二線、第三線の治療において、応答率および疾患進行の時間の点において減少する。
【０４９６】
薬物耐性の発達に取り組む新しい処置の戦略は、次いで転移性乳癌を有する個体の生存率の上昇にとって不可避である。
【０４９７】
（アモナフィドの背景）
アモナフィド（ベンズイソキノリンジオン、ＮＳＣ  ３０８８４７）は、ナフタレン酸のイミド誘導体である（Ｂｒａｎａら、１９８０  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  ４：  ６１−６６）。ナフタレン酸は、その細胞増殖を抑制する効果のために重要である。ナフタレン酸の細胞毒性は、その側鎖が窒素末端の２つのメチレン基を構成する場合に最高となる。アモナフィドは、この要求を満たし、そしてＬ１２１０およびｐ３８８白血病細胞株ならびにＢ１６メラノーマおよびＭ５０７６肉腫細胞株に対して非常な活性を実証する。アモナフィドは、部位特異的挿入薬剤であり、そしてトポイソメラーゼＩＩインヒビターである（Ｗａｒｎｉｎｇら、１９７９  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．７：  ２１７−２３０；Ｈｓｉａｎｇら、１９８９  Ｍｏｌ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  ３６：  ３７１−３７６）。
【０４９８】
臨床前の毒性は、マウス、イヌ、およびラットにおいて研究され、アモナフィドは、可逆性の造血毒性、胃腸毒性、腎臓毒性および肝臓毒性を産生することが示唆される。さらに、神経毒性を示す兆候が、イヌにおいて、単ボーラスおよび投与されるもっとも高い用量で５日間のスケジュールで毎日の場合の両方で見られた。
【０４９９】
（臨床薬理学）
Ｎ−アセチル化は、芳香環およびヒドラジン薬物の代謝の経路に重要である（ＷｅｂｅｒおよびＨｅｉｎ  （１９８５）  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  Ｒｅｖ．  ３７：２５−７９）。Ｎ−アセチル化によって代謝される通常使用される薬物の例としては、プロカインアミド、ダプソン、アミノグルテチミド、イソチアニド、ヒドララジン、サルファサラジンおよびカフェインが挙げられる。アセチル化群の表現型は、常染色体で遺伝し、北アメリカ人口において優勢な遅い表現型（ホモ接合）の対立遺伝子を有する。アセチル化が遅い群の発生率の推定は６０％であり、残りの４０％はアセチル化が速い群またはアセチル化が不確定な群のいずれかだとみなされる。真のアセチル化が「速い」群は、より一般的でない速い対立遺伝子のためのホモ接合（人口の５％）であり、対して、不確定の表現型（幾人かの著者には速いと呼ばれる）は、ヘテロ接合であり、人口のおよそ３５％がさらされる。非常に少数で、そしてアセチル化群の表現型は地理的に関連がある（ＷｅｂｅｒおよびＨｅｉｎ，上記；  Ｃｌａｒｋ  １９８５  Ｄｒｕｇｓ  ２９：  ３４２−３７５）。特に、アセチル化が遅い群の表現型は、東方人およびエスキモー人において比較的一般的でなく（１０％より低い）、対して中東人口はほとんどアセチル化が遅い群のみである。
【０５００】
予備的なヒト薬理学研究は、アモナフィドの分布の量は大きく、そしてそれが身体の組織に高い結合をすることを報告した。アモナフィドは、広範に代謝され、そして代謝物は血漿および尿の両方で検出される。アモナフィドは、Ｎ−アセチル化およびＮ−酸化の両方によって代謝される（Ｆｅｌｄｅｒら、１９８７  Ｄｒｕｇ  Ｍｅｔａｂ．  Ｄｉｓｐｏｓ．  １５：  ７７３−７７８）。Ｎ−アセチル−アモナフィドは、もとの薬物とおよそ等しい効力があり、対してＮ−オキシド−アモナフィドは基本的に不活性だと報告されている（Ｆｅｌｄｅｒら、１９８７  Ｄｒｕｇ  Ｍｅｔａｂ．  Ｄｉｓｐｏｓ．  １５：  ７７３−７７８）。アセチル化の程度は、薬物動態学的に、および種々の試験される用量に見られる毒性において、可変性とみなされる。なぜならＮ−アセチル−アモナフィドは細胞毒性だからである（Ｆｅｌｄｅｒら、１９８７  Ｄｒｕｇ  Ｍｅｔａｂ．  Ｄｉｓｐｏｓ．  １５：  ７７３−７７８）。
【０５０１】
第Ｉ相試験は、ＵＴＳＡ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｔｅｘａｓ  ａｔ  Ｓａｎ  Ａｎｔｏｎｉｏ）（Ｓａｅｚら、１９８９  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｏｎｃｏｌ．  ７：  １３５１−１３５８）、ＯＳＵ（Ｏｈｉｏ  Ｓｔａｔｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）（Ｌｅｉｂｙら、１９８８  Ｐｒｏｃ．  Ａｍ．  Ａｓｓｏｃ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ２９：  ２７８）およびＭＤＡ（Ｍ．Ｄ．Ａｎｄｅｒｓｏｎ）（Ｌｅｇｈａら、１９８７  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｒｅａｔ．  Ｒｅｐ．  ７１：  １１６５−１１６９）で行なわれた。単ボーラスとして与えられる場合、最高許容用量（ＭＴＤ）は８００ｍｇ／ｍ２である。用量限定毒性は骨髄抑制である（Ｓａｅｚら、１９８９  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｏｎｃｏｌ．  ７：１３５１−１３５８）。毎日の時間５用量を２１日ごとに与えられる場合、ＭＴＤは４００ｍｇ／ｍ２（１２）または２５０ｍｇ／ｍ２である（Ｌｅｉｂｙら、１９８８  Ｐｒｏｃ．  Ａｍ．  Ａｓｓｏｃ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ２９：  ２７８）。再び、骨髄抑制が用量限定毒性である。他の報告された毒性は、中度の吐き気、嘔吐および脱毛であるくらい温和である。全ての３つの施設は、速いアモナフィドの注入による急性毒性を報告した。これは、局所炎症反応、発汗、潮紅、耳鳴り、頭痛および／またはめまいを構成した。注入の持続時間の１時間の延長は、これらの効果を最小にした。異なるレジメンを考慮すると、スケジュール依存性は記述されなかった。このボーラス用量ＭＴＤは、２つの研究で異なった。ＵＴＳＡグループ（Ｓａｅｚら、１９８９  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｏｎｃｏｌ．  ７：  １３５１−１３５８）は、彼らは８００ｍｇ／ｍ２のＭＴＤに達していたけれども、サブＭＴＤ用量で高い可変性および個別化された血液毒性を示した。ＯＳＵ研究（Ｌｅｉｂｙら、１９８８  Ｐｒｏｃ．  Ａｍ．  Ａｓｓｏｃ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ２９：  ２７８）は、１１２５ｍｇ／ｍ２のＭＴＤを報告したが、重大および可変性の毒性を記述した。同じ群はまた、ボーラス用量（１１２５ｍｇ／ｍ２）を、２８８ｍｇ／ｍ２で５日間のスケジュールと比較し、より多くの薬物を与え得るので５日間のスケジュールが好ましいと結論付けた。（Ｌｅｉｂｙら、１９８８  Ｐｒｏｃ．  Ａｍ．  Ａｓｓｏｃ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ２９：  ２７８）。別の５日間のスケジュールにおいて、ＭＤＡ研究（Ｌｅｇｈａら、１９８７  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｒｅａｔ．  Ｒｅｐ．  ７１：  １１６５−１１６９）は、４００ｍｇ／ｍ２のより高いＭＴＤを見出した。推奨する第二相の用量は、２００ｍｇ／ｍ２および４００ｍｇ／ｍ２である（リスクの低い個体では３００〜３２０ｍｇ／ｍ２）。
【０５０２】
１９９０〜１９９８年、３３回の第二相試験および１回の第三相試験が、Ｇｙｎｅｃｏｌｏｇｉｃ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  Ｇｒｏｕｐ  （ＧＯＧ）、ｔｈｅ  Ｓｏｕｔｈ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  Ｇｒｏｕｐ  （ＳＷＯＧ）、ｔｈｅ  Ｅａｓｔｅｒｎ  Ｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｅ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  Ｇｒｏｕｐ  （ＥＣＯＧ），  ｔｈｅ  Ｃａｎｃｅｒ  ａｎｄ  Ｌｅｕｋｅｍｉａ  Ｇｒｏｕｐ  Ｂ  （ＣＡＬＢＧ）、およびｔｈｅ  Ｉｌｌｉｎｏｉｓ  ＣａｎｃｅｒＣｅｎｔｅｒ  Ｔｒｉａｌを含む異なる群によって行なわれた。総数９８１個体が、多くの腫瘍の型のためにアモナフィドを受けた。ほとんどの研究において、アモナフィドの用量およびスケジュールは、、３００ｍｇ／ｍ２を毎日、３週間おきに５日間であった。
【０５０３】
３回の第２相試験は、進行性乳癌において、第一の化学療法として行なわれた：２回は、８００〜９００ｍｇ／ｍ２の投薬レジメンを３時間にわたって、４週間おきに繰り返して行なわれ（Ｋｏｒｎｅｋら、１９９４  Ｅｕｒ．Ｊ．  Ｃａｎｃｅｒ  ３０Ａ（３）：  ３９８−４００；  Ｓｃｈｅｉｔｈａｕｅｒら、１９９１  Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  Ｔｒｅａｔ．  ２０（１）：  ６３−６７））、１回は、３００ｍｇ／ｍ２を毎日連続する５日間、３週間おきに４周期で行なわれ、ＣＡＦ（Ｃｏａｔａｎｚａら、１９９５  Ｃｌｉｎ．Ｃｅｎｃｅｒ  ｒｅｓ．１：６９９〜７０４）によって行なわれた。第三相試験のみ、個体に３００ｍｇ／ｍ２を４回、連続した５日間を３週間ごとに４周期おこない、次いでＣＡＦを行った（Ｃｏｓｔａｎｚａら、１９９９  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｏｎｃｏｌ．１７（５）：１３９７−１４０６）。アモナフィドは、進行性乳癌を有する個体の処置のための活性な化合物であると見出され、血小板減少症のグレード３または４を有する個体において、１８％〜５０％の範囲の応答率であった。
【０５０４】
ＮＡＴ２酵素多型は、アモナフィドの代謝において重要な役割を果たすと思われる。１９９１年、Ｒａｔａｉｎら、（Ｒａｔａｉｎら、  １９９１  Ｃｌｉｎ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  Ｔｈｅｒ  ５０（５）：５７３−５７９）は、アモナフィドで処理した癌を有する個体において、カフェインをプローブ基質として使用してアセチル化の表現型を調査した。カフェインおよびアモナフィドの、アセチル化が遅い群およびアセチル化が速い群が、同定された。アセチル化された代謝物の産物は、骨髄抑制の主要な決定基の１つである。なぜならアセチル化が速い群は、アセチル化が遅い群よりもより大きな毒性を有するからである（Ｒａｔａｉｎら、１９９１  Ｃｌｉｎ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  Ｔｈｅｒ  ５０（５）：５７３−５７９）。しかし、アモナフィドの血漿凝集時間曲線下の領域は、アセチル化が速い群においてより非常に大きく、人はより高いクリアランスおよび血漿凝集時間曲線下のより低い領域を期待する。これは、Ｎ−アセチル化によって代謝されるほかの薬物と比較して、珍しい知見と思われる。ほとんどの薬物にとって、アセチル化が遅い群は、有害事象のより大きなリスクである。アモナフィドの予想外の反応は、Ｎ−アセチル−アモナフィドによってアモナフィドの酸化が抑制されたことに起因し、なぜならインビトロ研究は、アモナフィドはＣＹＰ１Ａ２の基質であり、アモナフィドの酸化はそのアセチル化代謝物によって抑制されるとこを実証したからである（Ｒａｔａｉｎら、１９９５  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｏｎｃｏｌ．  １３：  ７４１−７４７）。アセチル化群の表現型に基づいて、新しい推奨用量は、アセチル化が遅い群（３７５ｍｇ／ｍ２／日）およびアセチル化が速い群（２５０ｍｇ／ｍ２／日）（Ｒａｔａｉｎら、１９９３  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ５３：  ２３０４−２３０８）で準備される。３００ｍｇ／ｍ２のアモナフィドの固定された用量は、全ての個体には不適切とみなされる。というのは、速い表現型は、グレード４毒性を経験すると予測され、そして遅い表現型には非常に低い用量だからである（Ｒａｔａｉｎら、１９９１  Ｃｌｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  Ｔｈｅｒ．  ５９（５）：５７３−５７９）。これらの新しい用量レベルの毒性において、重大な個体間の可変性が存在するので、引き続く研究では、アモナフィドの投薬を個別化するための薬力学的なモデルの開発を試みる。最適なモデルは、アセチル化群の表現型、白血球数（ＷＢＣ）の前処理および性差によって規定された（Ｒａｔａｉｎら、１９９６  Ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｅｔｉｃｓ  ６：９３−１０１）。
【０５０５】
このプロトコールを設計して、進行性乳癌の女性における第二の処置としてのアモナフィドの安全性および効果を評価し、アセチル化群の表現型情報および前処理ＷＢＣに基づく個別化された用量を割当てる。
【０５０６】
（研究目的）
（初期）
この研究の初期の目的は：
（１）個体のアセチル化群の表現型を決定し、代謝能力に基づくアモナフィドの適切な個別化された用量を割当てること；
（２）アモナフィドの減少された毒性を、適切に／個別化された用量またはアモナフィドの割当てによって実証すること；
（３）表現型特異的投薬ノモグラムを規定すること
である。
【０５０７】
（後期）
この研究の後期の目的は：
（１）転移性の乳癌のためのアントラサイクリンまたはタキサンを含む、前の細胞毒性の化学療法レジメンのあとに再発した個体における、アモナフィドの応答率を決定すること；
（２）応答の持続時間および疾患進行の時間を決定すること；
（３）生存データを収集すること
である。
【０５０８】
（治験集団の選択）
全ての個体は、同意手続に参加しなければならない。同意手続の間、その同意を手配する人は、インフォームドコンセントの個々の全ての要件を説明しなければならない。質問のために、および個体が自由意志で決断をするように、適切な時間が割かれなければならない。個体がＥＣ認可インフォームドコンセントの書類に署名して日付を記入する前に、プロトコルではない規定の手順が行われる。本治験は、インフォームドコンセントの書類の署名と日付記入とともに開始する。個体はまた、本治験に参加し得るように臨床試験対象基準および臨床試験除外基準を満たさなければならない。
【０５０９】
（臨床試験対象基準）
個体は、治験の選択に適格であるよう以下の基準の全てを満たさなければならない：
ａ）１８歳を超える女性；
ｂ）組織学的に確認された転移（ＩＶ期）乳癌；
ｃ）アントラサイクリンまたはタキサン（ドセタキセルに基づく治療またはパクリタキセルに基づく治療）を含む先の細胞傷害性化学療法レジメン（ｒｅｇｉｍｅｎ）の後に、再発した個体；
ｄ）放射線撮影手段または理学検査によって測定可能な疾患および／または判定可能な疾患；
ｅ）数ヶ月前（先のアントラサイクリン曝露の場合は６ヶ月、先のタキサン曝露の場合は４ヶ月）に他の抗腫瘍治療を受けていない；
ｆ）１２週の期待生存を有するカルノフスキースコア＝７０（表２５）；
ｇ）左心室駆出時間（ＬＶＥＴ）＞５０％；
ｈ）以下の臨床試験によって証明されるような十分な腎機能：
ｉ）血清クレアチニン＜１．５×ＵＬＮ；
ｊ）以下の臨床試験によって証明されるような十分な肝機能：
ｋ）血清ビリルビン＜１．５×ＵＬＮ；
ｌ）アルカリホスファターゼ≦２．５×ＵＬＮ（肝臓転移の場合、≦５×ＵＬＮ）；
ｍ）血清ＡＳＴまたはＡＬＴ≦２．５×ＵＬＮ（肝臓転移の場合、≦５×ＵＬＮ）；
ｎ）以下の臨床試験によって証明されるような十分な血液学的状態：
ｏ）総ＷＢＣ≧３．０×１０９／Ｌまたは３，０００／ｍｍ３；
ｐ）好中球≧１．５×１０９／Ｌまたは１，５００／ｍｍ３；
ｑ）血小板≧１００×１０９／Ｌまたは１００，０００／ｍｍ３；
ｒ）ヘモグロビン≧１０．０ｇ／ｄＬまたは１０ｇ／１００／ｍＬ；
ｓ）インフォームドコンセントの署名の前の２週間以内に輸血を受けていない；
ｔ）陰性の妊娠検査（尿または血液）および出産可能な女性における効果的な避妊方法。確実な避妊が、この同意書の署名前の４週間に開始されていなければならず、そして本治験の間中および治験の処置が完了した後の少なくとも４週間まで続けられなければならない。出産可能な女性とは、妊婦となることが生物学的に可能である女性として定義される。これは、避妊薬を用いている女性または不妊であるかもしくは避妊薬を用いているかのいずれかである性交渉の相手がいる女性を含む；
ｕ）放射線治療歴は、容認される（この処置の終了が、インフォームドコンセントの署名の３０日間もの前の場合）；
ｖ）本治験に参加すると危険になると治験担当医が考えるような潜在的な疾病がない；
ｗ）処置および追跡調査に関する個体の期待される協力が得られ、かつ記録されなければならない；
ｘ）表現型決定手順は、首尾良く完了されなければならない；そして
ｙ）書面によるインフォームドコンセントが得られ、かつ記録されなければならない。
【０５１０】
【表２６】
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出典：Ｓｃｈａｇ  ＣＣ，Ｈｅｉｎｄｒｉｃｈ  ＲＬ，Ｇａｎｚ  ＰＡ：Ｋａｒｎｏｆｓｋｙ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  Ｓｔａｔｕｓ  Ｒｅｖｉｓｅｄ：Ｒｅｌｉａｂｉｌｉｔｙ，Ｖａｌｉｄｉｔｙ  ａｎｄ  Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ２：１８７−１９３，１９８４。
【０５１１】
（臨床試験除外基準）
個体は、治験の選択に適格であるよう以下の基準のいずれも満たしてはならない：
ａ）インフォームドコンセントの署名の３ヶ月以内の心筋梗塞；
ｂ）インフォームドコンセントの署名の時点での不安定な狭心症、心不全（ＮＹＨＡクラスＩＩＩ〜ＩＶ；表２６を参照のこと）、抑えられていない高血圧；
ｃ）臨床試験対象基準に規定された個体以外の臨床的に顕著に異常な血液学的パラメーター；
ｄ）臨床試験対象基準に規定された個体以外の臨床的に顕著に異常な生化学的パラメーター；
ｅ）脳または軟髄膜の転移の病歴または存在；
ｆ）測定可能および判定可能な疾患の唯一の部位として、腹水滲出、胸水滲出、または骨芽細胞の骨転移；
ｇ）インフォームドコンセントの署名の前の４週間以内の大きな手術。個体は、先の手術から回復していなければならない；
ｈ）インフォームドコンセントの署名の２週間以内に成長因子（すなわち、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ）を用いた処置を受けた個体；
ｉ）インフォームドコンセントの署名の３０日以内のホルモンの抗癌治療；
ｊ）妊婦または授乳中の女性；
ｋ）臨床的に顕著な能動感染；
ｌ）他の悪性疾患歴（治癒した非黒色腫の皮膚癌、または治癒処置されたインサイチュ頸部癌を除く）；
ｍ）他の重篤な疾病または病状；
ｎ）本治験の要件を理解するための個体の能力に影響し得る精神的疾病または精神的状態の病歴を有する個体；
ｏ）３０日以内に新規治験薬を受けた個体；
ｐ）グレード２よりも大きい既存のニューロパシー（運動性またはセンサー）；
ｑ）治験担当医師の意見において、個体が本治験に良い候補とされない任意の他の状態。
【０５１２】
【表２７】
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出典：Ｏｘｆｏｒｄ  Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｍｅｄｅｃｉｎｅ，第２巻，２２２８頁．Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ．１９９７。
【０５１３】
（個体の数）
ヨーロッパおよび北アメリカにおいて実施される本治験に、約１５施設が、参加する。選り抜かれた施設は、腫瘍学を専門とする専門医および臨床試験の経験を有している。
【０５１４】
各設備は、８０〜１００の総個体集団に対して最大６人の個体を参加させる。
【０５１５】
（検査不適格者（Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ｆａｉｌｕｒｅｓ））
臨床試験対象基準および／または臨床試験除外基準を満たせない個体は、検査不適格者として規定される。表現型決定手順を経験するが被験物質を決して受けない個体は、検査不適格者と判定される。治験担当医師は、の検査不適格者についての個体の検査番号、個体のイニシャル、および理由を記録する全て検査不履行の検査記録を保持する。記録のコピーは、治験担当医師の治験ファイルに保持されるべきである。
【０５１６】
（前処置）
被験物質の投与前の３０日以内に個体が受けた全ての関連処置を割り出すために相応の努力がなされる。全ての関連情報は、個体のＣＲＦに記録されなければならない。ＣＲＦに、この手順または薬物の名前および他の必要な情報を含める。
【０５１７】
（併用処置）
（容認される処置）
インフォームドコンセントの署名の前に、骨の転移に起因した痛みを処置するためにヒホスホネートをすでに受けている個体は、本治験の間、ヒホスホネートの処置をさらに続けてもよい。
【０５１８】
重篤な好中球減少症（好中球＜５００×１０９／Ｌまたは５００／ｍｍ３）が５日を超えて続いている場合かまたは発熱性好中球減少症の場合、処置として、成長因子（Ｇ−ＣＳＦおよびＧＭ−ＣＳＦ）のみが投与され得る。
【０５１９】
貧血の場合、造血性（エリスロポエチン）がまた、投与され得る。輸血（血小板（パックされた細胞））もまた、投与され得る。
【０５２０】
（禁止処置）
ホルモンの抗癌治療（タモキシフェン、ラロキシフェン、またはトレミフェン）を用いた処置はまた、本治験の間に容認されない。ホルモン代替治療が本治験への参加の前に開始された場合、この治療は容認される。
【０５２１】
癌に対する免疫応答を調整する因子および免疫抑制性因子を含む他の全身性抗癌剤は、禁止される。
【０５２２】
併用全身性ステロイドの使用は、禁止される。局所的ステロイドおよび吸入ステロイドは、個体が皮膚科学的状態のためかまたはアレルギー／喘息の予防のためにこれらを既に服用している場合、容認される。
【０５２３】
本治験の処置期間の間、これらの指示病変の処置で指向される放射線治療は、容認されない。これらの指示病変で放射線治療を受けた個体は本治験からはずされる。
【０５２４】
他の治験薬をともなう処置は、本治験の間、容認されない。
【０５２５】
（治験設計）
（説明）
これは、アントラサイクリンまたはタキサンを含む先の細胞毒性化学療法レジメンの後に再発した転移性の乳癌を有する個体におけるセカンドライン（ｓｅｃｏｎｄ  ｌｉｎｅ）処置としてのアモナフィドのオープンラベル（ｏｐｅｎ  ｌａｂｅｌ）、第ＩＩ相、多施設治験である。
【０５２６】
本治験の総継続期間は、１２〜１８ヶ月の期間（参加のために６ヶ月、処置のために最大５ヶ月、およびアモナフィドを用いた処置の完了後の個体の追跡調査のために７ヶ月まで）である。
【０５２７】
（手順）
各診察（ｖｉｓｉｔ）で実施される手順のための事象−フローチャートの計画を参照のこと。
【０５２８】
（検査（診察１（−１４日目〜０日目）））
以下の試験を、処置の前の１４日以内に完了させる必要がある：
１）署名入りの記入されたインフォームドコンセントの書類；
２）統計学的資料の収集；
３）最初の診断の日付および説明、ならびに任意の癌治療の書類、そして（利用可能である場合）ＨＥＲ−２／ｎｅｕレセプターに対する主な腫瘍の過剰発現の前試験の結果を含む完全な病歴；
４）完全な理学的試験；
５）身長および体重；
６）バイタル署名（脈拍、血圧、口内温度または鼓室温度）；
７）カルノフスキー動作状態（表２５を参照のこと）；
８）ニューヨーク心臓協会の分類（ＮＹＨＡクラス、表２６を参照のこと）；
９）腫瘍試験；
１０）妊娠検査（出産可能である女性のみ）；
１１）胸部Ｘ線（前後（ＡＰ）および側方）；
１２）ＥＣＧ（１２−誘導（ｌｅａｄ））；
１３）表現型パターンの検査手順（１５．１節を参照のこと）；
１４）血液検査；
１５）血液化学検査；
１６）尿検査；
１７）臨床試験（有害事象、併用薬、合併症）。
【０５２９】
全ての試験の結果は、提供されたＣＲＦに記入される。
【０５３０】
（腫瘍検査）
ベースラインで腫瘍病変は、測定可能かまたは測定不可能として分類される。
【０５３１】
測定可能とは、従来技術（理学検査、Ｘ線、コンピューター断層撮影像（ＣＡＴ）、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）または超音波）を用いて＝２０ｍｍとしてか、あるいはスパイラル（ｓｐｉｒａｌ）ＣＴスキャンを用いて１０ｍｍとして、少なくとも一次元（記録される最も長い直径）で正確に測定され得る任意の病変として定義される。
【０５３２】
測定不可能とは、小さな病変（従来技術を用いて最も長い直径が＜２０ｍｍかまたは、スパイラルＣＴスキャンを用いて最も長い直径が＜１０ｍｍ）および本当に測定不可能な病変（すなわち、骨の病変、軟髄膜疾患、胸水／心内膜液浸出、炎症性胸部疾患、リンパ管炎の皮膚／肺、画像化技術によって確認／追跡されない腹部種瘤および嚢胞性病変）を含む全ての他の病変として定義される。
【０５３３】
全ての測定は、定規またはカリパーを用いて、メートル表示で記録されるべきである。使用される技術は、治験担当医の裁量に任せられるが、各個体について、本治験の間中同じ技術が使用されなければならない。測定は、各個体についての全ての試験に関して同じ治験担当医によってなされるべきである。
【０５３４】
本治験の間中、同じ方法によって目的の病変が測定されることが必須である。その結果、比較が一貫する。本治験を開始する時点で記録された目的の病変が、本治験の間中、継続して判定されることもまた必須である。臨床的に検出された病変は、アモナフィドの最初の投与の２週間以内に、最初に判定されなければならない。ＣＴスキャン、Ｘ線、およびＭＲＩスキャンは、アモナフィドの投与前の２週間以内に行われなければならない。
【０５３５】
ベースライン腫瘍試験としては、全ての個体についての胸部ＣＴスキャン、治験に参加する前の３ヶ月で異常なスキャンを有した個体についての骨スキャン、および異常な肝臓の化学的作用、あるいは過去の異常ＣＴスキャン、超音波またはＭＲＩを有する腹部の痛みを伴う個体についての腹部ＣＴスキャン、が挙げられる。
【０５３６】
全ての器官にあらわれる最大１０個までの全ての測定可能な病変は、目的の病変として同定されるべきであり、そして任意の１個の組織または器官について、最大５個までの病変が、選択されるべきである。全ての病変は、ベースラインで記録および測定され、理想的には、全ての目的の病変は各試験で測定されるべきである。目的の病変は、正確な反復測定について、それらのサイズ（病変の最も長い直径）およびそれらの適性の基準において選択されるべきである。
【０５３７】
（１つの寸法（ｕｎｉｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ）の目的の病変）：
全ての目的の病変についての最も長い直径の合計は、最も長い直径の合計のベースラインとして算出および報告される。最も長い直径のベースライン合計は、疾患の測定可能な寸法の目的の腫瘍応答をさらに特徴付けるための基準として用いられる。
【０５３８】
（２つの寸法（ｂｉｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ）の目的の病変）：
全ての目的の病変についての最も大きい垂直直径による最も長い直径の積の合計は、積のベースライン合計として算出および報告される。これらの積のベースライン合計は、疾患の測定可能な寸法の目的の腫瘍応答をさらに特徴付けるための基準として用いられる。
【０５３９】
（非目的の病変）：
全ての他の病変（または疾患の部位）は、非目的の病変として同定されるべきであり、そしてまた、ベースラインで記録されるべきである。測定は必要なく、これらの病変は「存在」または「不在」として追跡されるべきである。
【０５４０】
（ベースラインの診察（診察２；サイクルの１日目））
サイクルの１日目とは、アモナフィド注入の第１日である。被験物質の投与前に、以下の試験は実施されなければならない：
１）クオリティ・オブ・ライフの質問表ＥＯＲＴＣ  ＱＬＱ−Ｃ３０およびＱＬＱ−ＢＲ２３（表２７を参照のこと）；
２）完全な理学的試験；
３）体重；
４）バイタル署名（脈拍、血圧、口内温度または鼓室温度）；および
５）臨床試験（有害事象、併用薬、合併症）。
【０５４１】
【表２８】
2004519674.tif 000037
2004519674.tif 000038
2004519674.tif 000039
2004519674.tif 000040
各処置サイクルで、アモナフィドは、５日間毎日、注入される。この投薬期間およびこの注入の終了後１時間までの間、アモナフィドの注入に関連した有害事象が試験された。
【０５４２】
処置サイクルとは、アモナフィドの最初の投薬で開始し（このサイクルの１日目）、そしてこの最初の投薬後２１日で終了する期間として定義される。継続サイクルの開始前に、好中球は＞１．５×１０９／Ｌ（１５００／ｍｍ３）、そして血小板は＞１００×１０９／Ｌ（１００，０００／ｍｍ３）でなければならない。
【０５４３】
（サイクル１−１２日目（診察３））
最初の処置の終了後１週間で、個体は臨床的に判定され（目的とされる理学検査、体重、バイタル署名、カルノフスキー動作状態、有害事象の再検査、併用薬、および合併症）、そして、以下の臨床試験は、実施される：血液検査、血液化学検査、および尿検査。表現型パターンの検査手順もまた、この診察で実施される。
【０５４４】
この診察は、この診察の予定と関連して１日のみ進められるかまたは遅延され得る。
【０５４５】
（処置サイクル（診察４、５、６、７、８；サイクル２、３、４、５、６の１日目））
以下のパラメーターは、アモナフィドを用いた処置の間、各サイクル（２１日）で試験される。全ての試験は、アモナフィドの投与前に実施されるべきであり、そして各診察は診察の予定と関連して２日まで進められるかまたは遅延され得る。
１）身体検査
２）体重；
３）カルノフスキー動作状態（Ｋａｒｎｏｆｓｋｙ  ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ｓｔａｔｕｓ）（表２５参照）；
４）バイタルサイン（脈拍、血圧、呼吸、口腔体温または鼓室体温）；
５）血液検査；
６）血液化学検査；
７）尿検査。
【０５４６】
以下に挙げられる臨床診断をまた完了した：
１）有害な事象の再検査；
２）併用薬；
３）合併症。
【０５４７】
各処置のサイクルにおいて、アモナフィドを５日間毎日注入する。注入する期間および注入の終了後１時間までの間、アモナフィドの注入に関連する有害な事象を評価する。
【０５４８】
（腫瘍評価）
適切なＸ線試験（胸部Ｘ線、ＣＴスキャン、またはＭＲＩスキャン）を実施して、腫瘍の反応を評価する。腫瘍評価は、アモナフィドを用いる処置の間、６週おき（サイクル２、４、６の１日目）に行われる。
【０５４９】
腫瘍応答は、表２８に規定されるように固形腫瘍における応答評価規準（ＲＥＣＩＳＴ規準）にしたがって、個人において、完全応答（ＣＲ）、部分応答（ＰＲ）、持続性疾患（ＳＤ）、および疾患の経過（ＰＤ）を規定することで評価される。ＣＣＴスキャンおよびＸ線による評価の間において応答カテゴリーに相違のある場合に、ＣＴスキャンをより精確な技術とみなした。
【０５５０】
【表２９】
2004519674.tif 000041
（最良の全体的応答の評価）
最良の全体的応答は、処置の開始から疾患の進行／再発（処置開始以降に記録されて最小の測定値を進行性疾患についての規準として得る）までの最もよい全体の反応である。
【０５５１】
【表３０】
2004519674.tif 000042
出典：Ｔｈｅｒａｓｓ  Ｐ，  Ａｒｂｕｃｋ  ＳＧ，  Ｅｉｓｅｎｈａｕｓｅｒ  ＥＡ，  Ｗａｎｄｅｒｓ  Ｊら：Ｎｅｗ  Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ  ｔｏ  Ｅｖａｌｕａｔｅ  ｔｈｅ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｉｎ  Ｓｏｌｉｄ  Ｔｕｍｏｒｓ．  Ｊ  Ｎａｔｌ  Ｃａｎｓｅｒ  Ｉｎｓｔ  ９２（３）：２０５〜２１６，２０００。
【０５５２】
脳転移の発症は、たとえ疾患が脳の外側で応答しているとしても、進行の徴候とみなされる。しかし、個人が他の場所で応答する場合、治験担当医は、被験物質の処置を継続することを選択してもよい。放射線照射の必要性は、進行性疾患を示すと考えられる。治験の間に、放射線照射がいずれかの測定可能な病変へ与えられる場合、個人は、放射線照射の日から進行性疾患を有すると評価される。これらの指標病変に放射線療法を受けた個人は、治験から除く。
【０５５３】
（クオリティー・オブ・ライフのアンケート）
アモナフィドを用いた処置の間、ＥＯＲＴＣ  ＱＬＱ−Ｃ３０およびＱＬＣ−ＢＲ２３アンケートを６週ごと（サイクル２、４、６の１日目）に実施する。これらのアンケートは提供される任意の処置または任意の試験／手順（有害な事象についての評価を含む）の実施の前の診察の開始の時点で完了すべきである。
【０５５４】
全ての試験の結果は、定められたＣＲＦに入力されられる。
【０５５５】
（処置の終了または早期の診察の終了（診察９））
全ての個人を、アモナフィドを用いた最後の処置サイクル（２８日目）後に１週間観察して、以下の試験を完了させる：
１）クオリティー・オブ・ライフのアンケートＱＬＱ−Ｃ３０およびＱＬＣ−ＢＲ２３（表２７参照）；
２）精密検査；
３）体重；
４）カルノフスキー動作状態（表２５参照）；
４）バイタルサイン（脈拍、血圧、呼吸、口腔体温または鼓室体温）；
５）胸部Ｘ線（前後（ＡＰ）および側面）
６）妊娠検査（出産可能の女性）
７）血液検査；
８）血液化学検査；
９）尿検査；
１０）心電図（１２誘導）。
【０５５６】
以下に挙げられる臨床診断もまた完了させる：
１）有害な事象の再検査；
２）併用薬；
３）合併症。
【０５５７】
（追診）
アモナフィドを用いた処置治験の完了後か、またはアモナフィドを用いた処置治験の早期の中止後、個人は、参加した日付から１２ヶ月間まで、または（もし早期に起きる場合）死亡までの間の３ヶ月毎に追跡調査される。
１）評価されるパラメータは、以下である：
２）精密検査；
３）体重；
４）カルノフスキー動作状態（表２５参照）；
５）バイタルサイン（脈拍、血圧、呼吸、口腔体温または鼓室体温）。
【０５５８】
以下に挙げる臨床診断もまた完了させる：
１）有害な事象の再検査
（長期の追跡調査）
生存を評価するため、個人と３ヶ月毎に電話で連絡をとった。
【０５５９】
（試験契約の執行または診断からの個人の除外）
追跡調査情報を、継続しないかまたは除外される個人について得る。最終の再追診において実施される手順についての事象のスケジュールを参照のこと。
【０５６０】
治験担当医は、本治験に各個人をとどめるために全ての適切な努力をする。しかし治験担当医がこの治験から個人を除く場合または個人がさらなる参加を断る場合、何らかの治療的介入の前に、もし可能であれば、最終診断を実施する。全ての評価および観測を、治験除外についての理由の記載と共に原本に記録し、ＣＲＦに報告しなければならない。
【０５６１】
有害な治験（臨床または検査室において）に起因して治験から除外された個人は、受けた医療行為に従って処置および追跡される。このような処置の結果に関する全ての妥当な情報を、原本に記録し、ＣＲＦに報告しなければならない。
【０５６２】
以下は、この治験から個人を除外するための、治験担当医にとっての正当な理由である：
１）進行性の疾患。２処置サイクル後に主観的利益または少なくとも持続性の疾患を達成しない任意の患者がこの治験から除かれる；
２）受容不能な毒性；
３）除外の同意：個人が２１日未満、この治験に参加している場合、さらなる個人を彼／彼女に置きかえるため募る；
４）不測の事象：治験担当医の判断において、さらなる処置が個別に設定される任意の事象；
５）試験契約の処置に関連しない臨床的理由のための医者による除外；
６）試験契約の処置の中止を必要とする深刻な有害事象；
７）本治験試験の深刻な違反行為（持続的な個人の欠席および服薬不履行を含む）。
【０５６３】
なぜ個人が必要な診察に来ないのか、または本治験から脱落するのかを決定するための試みがなされるべきである。終了の理由に関わらず、追跡調査の中止の時点での個人についての全てのデータを、原本に記録し、ＣＲＦに報告しなければならない。処置の中止の全ての理由が報告されるべきである。
【０５６４】
（検査室での判定）
１つの検査室のみが、特別な試験が必要とされない限り、全ての判断のために各治験担当医によって使用される。このような場合、さらなる検査室が、この特別な試験のみのために治験担当医によって設計され得る。中央検査室は、表現型の評価のために用いられる。サンプルの取り扱いの詳細およびサンプル採取の手順を以下に提供する。
【０５６５】
（サンプルの収集、調製、標識および輸送）
（表現型の評価のためのサンプルの収集／調製）
個人は、カフェイン摂取３時間に排尿し、そして尿を捨てる。尿サンプルは、食物摂取後４〜５時間後に得られる。
【０５６６】
サンプルを、直ちに６つの５ｍＬポリプロピレンチューブに移し、そして中央検査室に輸送するまで−２０℃にて直立位置で凍結させた。各チューブは、既に印刷されたラベルを用いて標識される。
【０５６７】
（ラベル付け）
サンプルを、行われるアッセイ、プロトコル番号、調査員名、個体番号、ならびにプロトコルの日付および回収の時間を含むラベルで同定する。バーコードを付けたコンピューターで印刷したラベルは、Ｘａｎｔｈｕｓ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｉｎｃ．より提供される。情報を手書きで書く必要がある場合、払拭できないインクのみが用いられるべきである。
【０５６８】
予め印刷されたラベルは、冷蔵または凍結する少なくとも２時間前に室温で試験管に貼り付けられる。適切な接着剤は、このラベルが冷たい試験管に貼り付けられる場合には保障することができない。
【０５６９】
ラベルは、バーコードが試験管の長さに沿ってスキャンされ得るように貼り付けられる。このバーコードは、試験管の外周を囲む場合には読み取ることができない。ラベルは、試験管の周りにらせん状にされることも巻かれることもなく、バーコードの読み取りを妨げないようにする。
【０５７０】
全てのサンプルは、収集後、出荷が始まるまで凍結されたままでなければならない。
【０５７１】
（サンプル出荷指示）
月曜日から水曜日までのみ翌日の急送便で郵送する
ポリスチレン容器にドライアイスを詰める
凍結サンプルをプラスチックバッグに入れ、バッグにラベルを貼り付け、マスタープロトコル／部位／個体識別ラベルを与える
バッグを容器に入れ、ドライアイスで完全に覆う
ＣＲＦページのホワイトコピーを同封する
急送便情報（運送目録番号を含む）とともに事務手続きのコピーをファックスで以下に流す：
Ｒｅｎｅ  Ｐａｕｌｕｓｓｅｎ  Ｐｈ．Ｄ．／Ｙｖｅｓ  Ｂｌａｉｓ  Ｐｈ．Ｄ．
Ｘａｎｔｈｕｓ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｉｎｃ．
Ｆａｘ：  ５１４−８４３−９９４１
ドライアイス中に梱包した凍結尿サンプルを２４時間営業急送便で以下に送付する：
Ｒｅｎｅ  Ｐａｕｌｕｓｓｅｎ  Ｐｈ．Ｄ．／Ｙｖｅｓ  Ｂｌａｉｓ  Ｐｈ．Ｄ．
Ｘａｎｔｈｕｓ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｉｎｃ．
２２５  Ｐｒｅｓｉｄｅｎｔ  Ｋｅｎｎｅｄｙ
Ｓｕｉｔｅ  ＰＫ−５６６０
Ｍｏｎｔｒｅａｌ，Ｑｕｅｂｅｃ  Ｈ２Ｘ  ３Ｙ８
Ｃａｎａｄａ。
【０５７２】
何か問題または質問があれば、ＭｏｎｔｒｅａｌにあるＸａｎｔｈｕｓ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓに連絡をとること：
【０５７３】
【表３１】
2004519674.tif 000043
（安全性の実験確認）
以下の実験室での試験は、スクリーニング時、サイクル１の１２日目、サイクル２、３、４、５、６の１日目および処置の最後に行われる。
【０５７４】
１）血液学：全血球算定（示差的な血小板および白血球数を含む）
２）血液化学：アルブミン、アルカリホスファターゼ、アミラーゼ、総ビリルビン、炭酸水素イオン、ＢＵＮまたは尿素、カルシウム、塩化物、コレステロール、クレアチニン、グルコース、ＬＤＨ、リン、カリウム、ＡＬＴ、ＡＳＴ、ナトリウム、総トリグリセリド、尿酸
３）尿分析：ｐＨ、タンパク質、血液、グルコース。
【０５７５】
（ＣＹＰ１Ａ２およびＮＡＴ−２表現型の決定）
（分析手順）
（ＣＹＰ１Ａ２表現型決定）
ＣＹＰ１Ａ２表現型を、以下の濃度比を測定することにより決定する：
１，７−ジメチルキサンチン  ＋  １，７−ジメチル尿酸
カフェイン
カフェインの濃度と、カフェイン代謝産物である１，７−ジメチルキサンチンおよび１，７−ジメチル尿酸の濃度合計を、確認された酵素イムノアッセイにより決定する。
【０５７６】
（カフェイン酵素イムノアッセイ）
特定の抗体を、ウサギにおいて、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）にスペーサーアームを介して結合体化させたカフェインに対して惹起させた。この抗体をマイクロタイタープレートに固定化する。サンプルのアリコートを、抗体上の限定した数の結合部位について、固定量のカフェイン−西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合体と競合させる。プレートを洗浄した後、無色の基質を添加し、結合したＨＲＰの量に比例して呈色する産物に変換する。反応を停止させた後、呈色（吸光度）を測定する。
【０５７７】
サンプル中のカフェイン濃度を、アッセイに含まれるカフェイン標準曲線から評価する。
【０５７８】
カフェイン酵素イムノアッセイを、予めＸａｎｔｈｕｓ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｉｎｃ．で確認した。
【０５７９】
（１，７−ジメチルキサンチンおよび１，７−ジメチル尿酸の酵素イムノアッセイ）
１，７−ジメチルキサンチンおよび１，７−ジメチル尿酸の濃度の測定に関しては、尿サンプル由来の両分子を選択的に結合する抗体をウサギにおいて開発した。このアッセイは、ＨＲＰ結合体ならびに１，７−ジメチルキサンチンおよび１，７−ジメチル尿酸に特異的な標準曲線を用いて、カフェインについて上記のように行う。
【０５８０】
１，７−ジメチルキサンチンおよび１，７−ジメチル尿酸の酵素イムノアッセイは、予めＸａｎｔｈｕｓ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｉｎｃ．で確認した。
【０５８１】
（ＮＡＴ２表現型決定）
やはりカフェインを用いて、以下の比を測定することにより、Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ−２（ＮＡＴ２）活性を決定する：
１−メチルキサンチン（１Ｘ）
５−アセトアミノ−６−アミノ−３−メチルウラシル（ＡＡＭＵ）
１ＸおよびＡＡＭＵの測定を確認した酵素イムノアッセイにより行う。
【０５８２】
（１−メチルキサンチンの酵素イムノアッセイ）
１Ｘの濃度を、キャリアタンパク質としてのＫＬＨに結合体化した１Ｘ誘導体に対して惹起した特異的ウサギ抗体を用いて測定する。この抗体を、マイクロタイタープレート上に固定化する。固定量の１Ｘ−ＨＲＰ結合体とサンプル（または標準物質）中の１Ｘとの間で限定した数の固定化抗体結合部位について競合させた後に、結合していない材料を洗い流す。基質を添加し、そして結合したＨＲＰの量に比例して呈色する産物に変換する。反応を停止させた後、呈色（吸光度）を測定する。サンプル中の１Ｘの濃度を、アッセイに含まれる１Ｘ標準曲線から決定する。
【０５８３】
１−メチルキサンチンの酵素イムノアッセイを、予めＸａｎｔｈｕｓ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｉｎｃ．で確認した。
【０５８４】
（５−アセトアミノ−６−アミノ−３−メチルウラシルの酵素イムノアッセイ）
尿サンプル中のＡＡＭＵ濃度の測定を、１Ｘについて上記の酵素イムノアッセイと同様の競合的酵素イムノアッセイにより行う。特異的抗体をマイクロタイタープレートに固定化し、そしてＡＡＭＵ−ＨＲＰ結合体およびサンプル由来のＡＡＭＵを抗体上の結合部位について競合させる。基質とのインキュベーションの後に、呈色を測定し、そして尿サンプル中のＡＡＭＵ濃度をアッセイに含まれる標準曲線から決定する。
【０５８５】
ＡＡＭＵの酵素イムノアッセイを、予めＸａｎｔｈｕｓ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｉｎｃ．で確認した。
【０５８６】
（表現型決定の評価）
表現型決定の評価を、スクリーニング時および１サイクルの１２日目に行う。個体は、カフェインを用いたＮ−アセチルトランスフェラーゼ−２（ＮＡＴ−２）およびチトクロームＰ４５０  １Ａ２（ＣＹＰ１Ａ２）活性の表現型決定を受ける。カフェインを、錠剤（１００ｍｇ）としてコップ１杯の水を摂取させて投与する。
【０５８７】
カフェイン摂取して３時間後、個体に排尿させ、尿を廃棄する。尿サンプルを摂取して４〜５時間後に得る。サンプルを、６つの５ｍＬポリスチレン試験管にすぐに入れ、中央実験室に出荷するまで−２０℃で垂直位置で凍結する。各試験管に以前から予め印刷したラベルでラベル付けする。
【０５８８】
さらなる詳細については、採取、調製、ラベル付けおよびサンプル出荷を参照のこと。
【０５８９】
ベースラインでは、個体の尿サンプルの提出後５営業日以内に、調査員に個体のアセチル化群の表現型をファックスで知らせる。
【０５９０】
（試験商品）
（試験商品の投与）
アモナフィド（ａｍｏｎａｆｉｄｅ）（試験商品）を、インフォームドコンセントを受け、そして表現型決定した個体にのみ投与すべきである。
【０５９１】
試験商品の投与に関する全てのデータを、ソースドキュメントに記録し、そして監視訪問の間にチェックする。
【０５９２】
再構成および希釈後に、アモナフィドを５日間、毎日３時間かけて与える。薬物投与のスケジュールは、疾患進行がない場合または最大６サイクルの間で許容できない毒性がない場合に２１日ごとに与える。確立した静脈ラインを通じて、注入を行う。アモナフィドは、デキストロース含有溶液中では非常に不安定であり、これらは、投与に用いられるべきではない。
【０５９３】
個体を、注入完了後１時間にわたり医療監督下に置いて、注入／注入後の有害事象を評価しなければならない。
【０５９４】
アモナフィドの全ての用量を、基線で測定された場合の体表面積１ｍ２あたりの薬物のｍｇ（ｍｇ／ｍ２）に基づいて計算する。個体の身長および体重から体表面積を評価するためのノモグラムを、図２９に示す。
【０５９５】
最初のアモナフィド用量を個体のアセチル化群の表現型および前処置ＷＢＣにより決定する。アセチル化群の表現型決定に基づいて、この個体を、アセチル化が遅い、中間／遅い、中間／速い、または速い群のいずれかとして分類する。この個体を、低前処置ＷＢＣもしく高前処置ＷＢＣ数としてさらに分類する（値≦８または＝８×１０９／Ｌ（８０００／ｍｍ３））。
【０５９６】
以前の臨床研究の結果に基づいて、有意な好中球減少症は、１２〜１５日目に天底数および約２１日目までの回復で理解され得る。血小板減少症もまた生じ得る。好中球は、引き続くサイクルの開始前に、１．５×１０９／Ｌ（１，５００／ｍｍ３）より多く、および血小板は１００×１０９／Ｌ（１００，０００／ｍｍ３）より多くなければならない。
【０５９７】
個体が処置の最初のサイクル後に段階４の骨髄抑制を発生させた場合（天底好中球＜０．５×１０９／Ｌ（５００／ｍｍ３）および／または血小板＜２５×１０９／Ｌ（２５０，０００ｍｍ３））、２回目のサイクルの間の日用量のアモナフィドは、２５％または５０ｍｇ／ｍ２まで減少させるべきである。
【０５９８】
骨髄抑制が処置の最初のサイクル後に段階０または段階１の毒性である場合（天底好中球＞２×１０９／Ｌ（２，０００／ｍｍ３）および血小板＞１５０×１０９／Ｌ（１５０，０００／ｍｍ３））、２回目のサイクルの間の日用量のアモナフィドは、２０〜２５％増加させるべきである。
【０５９９】
（処方、梱包およびラベル付け）
試験商品を、黄色から橙色または赤橙色の凍結乾燥散剤として、１００ｍｇの薬物を含む、５ｍＬの１回使用のバイアルに供給する。このラベルは、以下の情報を含む（適切な場合）：試験商品識別、ロット番号および失効期日、保存条件、警告文書、プロトコル番号、調査員名を書くための部分、個体識別を書くための部分。
【０６００】
（保存および安定性）
無傷のバイアルは、冷蔵下（２〜８℃）で保存されるべきである。通常生理食塩水中で再構成した溶液は、室温でまたは冷蔵下のいずれかで１４日を超えて変質を示さない。しかし、再構成した溶液は抗菌性保存剤を含まず、すぐに使用されるべきである。再構成した製品は、最初に入れた後８時間で廃棄することを勧める。
【０６０１】
（調製）
試験製品再構成／調製のために適切な無菌技術が用いられるべきである。各バイアルは、ｐＨ５〜７を有する２５ｍｇ／ｍＬのアモナフィド濃度のために、注射用滅菌水（米国薬局方）４ｍＬまたは０．９％塩化ナトリウム注射液（米国薬局方）４ｍＬで再構成されるべきである。
【０６０２】
適切な用量のアモナフィドを、投与前に１００ｍＬの通常生理食塩水のバッグに添加する。アモナフィドは、デキストロース含有溶液中では非常に不安定であり、これらは、再構成または投与のために用いられるべきではない。
【０６０３】
（薬物説明義務）
この治験のための試験商品は、このプロトコルに従って、かつ調査員らの監督下でのみ用いられるべきである。調査員らは、Ｘａｎｔｈｕｓ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（ＸＬＳ）  Ｉｎｃ．により他に指示されなければ、ラベルも未使用薬物も破棄しないように着手する。
【０６０４】
監督官庁は、各臨床現場で受け取られた全ての調査試験商品の配備に対して計算を要求する。法律により要求される試験商品の配備に対する情報は、受取日、投与日、投与量、および試験商品が投与された個体からなる。調査員は、全ての未使用試験商品および全ての使用済み試験商品容器の計算に責任を負う。調査員は、正確かつ完全な支出および在庫品記録を維持するためにこの情報を使用する。
【０６０５】
個体の増加に依存して、供給物は、適切な間隔で調査現場に出荷される。ＸＬＳ  Ｉｎｃ．は、この治験についての支出および在庫品記録を提供する。この形式は、薬局において、または試験委託者の監督者により許可された別の領域においてかのいずれかで維持されなければならない。
【０６０６】
各時間に、一定用量を個体のために調製し、以下の情報を記録する：個体の頭文字、個体の研究番号、調製した総用量、使用したバイアルの数、用量を調製したロット番号、および用量を調製した個人の頭文字。薬物計算は、日常の監視訪問の間に監督者により検閲される。監督者は、確実に正しい手順に従い、そして彼／彼女を納得させ、供給物が適切に制御され、そして在庫数が適切に維持され、そして保存条件がラベルの要件に従っているようにする。
【０６０７】
研究の終了時において、最後の薬物説明義務検閲および調停が完了していなければならず、任意の矛盾点を調査しなければならず、そしてそれらの解決策を文書に記録する。全ての使用済み／未使用試験商品は、試験委託者／契約分配センターへ適切な形式で戻さなければならない。
【０６０８】
（偏りを最小限にし／避けるための手段）
（個体識別）
個体を、試験委託者により指定された様式で番号付けする。個体は、彼らの割り当てられた番号、頭文字、誕生日、および性別によってのみ試験委託者により識別されるべきである。調査員は、個体の氏名および上記の識別情報のリストを保持しなければならない。
【０６０９】
（安全性）
（安全性変数）
身体検査ならびに生命徴候および実験評価は、研究の間ずっと行われる。
【０６１０】
（安全性評価方法）
アモナフィドの最初の処置サイクルの後に、各個体を有害事象の徴候および疾患関連徴候および症状を、ＮＣＩ−ＣＴＧ拡大一般毒性基準（表３０を参照のこと）に従って１２日目に評価する。
【０６１１】
各個体を、有害事象の徴候および疾患関連徴候および症状について、ＮＣＩ−ＣＴＧ拡大一般毒性基準（表３０を参照のこと）に従って各処置サイクルの終わりに評価する。
【０６１２】
試験商品に関連してもしなくても、全ての事象をＣＲＦに記録する。
【０６１３】
【表３２】
2004519674.tif 000044
2004519674.tif 000045
2004519674.tif 000046
2004519674.tif 000047
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2004519674.tif 000049
2004519674.tif 000050
ＷＮＬ＝通常限度内。
【０６１４】
（安全性の実験確認）
試験商品の投与後に臨床的に重大な程度まで異常になる値を有する全ての実験室試験は、値が正常または基線に戻るまで繰り返されるべきである。実験室値が相応な期間内に通常または基線まで戻らない場合、因果関係が同定されるべきであり、そして試験委託者に通知すべきである。
【０６１５】
（統計解析）
統計解析を、試験委託者の生物統計部門により行う；調査員らにより独立して行われた任意のさらなる解析または補充の解析は、試験委託者に提出されるべきである。
【０６１６】
（統計および解析計画）
（効能解析）
効能終点の解析を、目的  対  処置（ｉｎｔｅｎｔ−ｔｏ−ｔｒｅａｔ）、およびプロトコル（ｐｅｒ−ｐｒｏｔｏｃｏｌ）集団あたりの両方で行う。安全性終点の解析は、安全性集団で行う。
【０６１７】
主要な効力変数は、疾患進行に対する応答速度および時間全体である。応答速度全体を評価するために、２セットの解析を行う。その一方は、目的  対  処置アプローチ（全個体）であり、もう一方は、評価可能な個体（少なくとも２サイクルの治療を完了し、腫瘍評価を受けた全ての資格のある個体を意味する）のみからのデータに基づくものである。
【０６１８】
疾患進行に対する時間の解析は、試験商品の少なくとも１回の処置サイクルを受けた、選ばれる資格のある個体全てを含む。疾患進行に対する時間は、処置の開始から記録した疾患進行（ＰＤ）までの時間として規定される。何らかの理由で死亡した個体は、ＰＤとみなされ、そして進行の日付は、ＰＤが死亡の前に記録されていなければ死亡日である。
【０６１９】
応答全体および個体の生存の持続期間は、二次的な効力変数である。応答の持続期間は、応答個体に対してのみ評価され、そして測定基準からの時間が、ＰＤを客観的に記録した最初の日付まで完全応答（ＣＲ）または部分的応答（ＰＲ）（常に状態が最初に記録される）について満たされると規定される。
【０６２０】
全ての個体は、生存について追跡され、生存は、処置治療の開始から死亡まで測定される。
【０６２１】
（安全性解析）
安全性の解析は、安全性集団（ＳＡＦ）に基づく。推定統計は、安全性変数に対しては行わない。
【０６２２】
有害事象を、標準的な辞書を用いてコードし、そしてそれらの発生率を、好ましい期間および処置ごとに、全体的にならびにそれらの重篤度および試験商品との関係について記載する。
【０６２３】
同じ解析を全ての段階３および段階４の毒性について行う。
【０６２４】
（評価基準）
登録されなかったかまたは試験商品の少なくとも１回の処置サイクルを受けなかった全ての個体は、目的  対  処置集団（ＩＴＴ）から除く。プロトコル集団あたり（ＰＰＳ）は、全ての包含基準および排除基準を満たし、そして目的の腫瘍応答について評価可能な個体を有するＩＴＴ集団のサブセットである。
【０６２５】
登録されなかったかまたは試験商品の少なくとも１回の用量を受けなかった全ての個体は、安全性解析から除く。
【０６２６】
（禁忌、予防措置、および警告）
アモナフィド臨床研究の間に報告された全てのＡＥの完全な記載については、提供されたアモナフィドの調査員らのパンフレットを参照のこと。
【０６２７】
（有害事象）
（定義）
用語「有害事象」とは、試験委託者により用いられる場合、用語「有害な経験」の類似語である。
【０６２８】
有害事象は、因果関係に拘わらず、試験委託者の試験商品を用いた臨床研究に参加しているヒトで生じた、徴候、症状または実験観察もしくは生理的観察の形態における任意の都合の悪い、所望されない、予定していない臨床事象である。これらとしては、以下が挙げられる：
１）既存の状態の任意の臨床的に重大な悪化；
２）既存の状態の任意の再発；
３）偶発的もしくは意図的（臨床理由についての健康管理専門家により処方されたものより高い用量を意味する）に拘わらず、試験委託者の試験商品の過剰用量から生じたＡＥ；
４）試験委託者の試験商品の乱用（非臨床的理由のための使用を意味する）から生じたＡＥ；または
５）試験委託者の試験商品の使用の中断と関連したＡＥ。
【０６２９】
注：手順はＡＥではないが、手順の理由はＡＥであり得る。
【０６３０】
既存の状態とは、個体がインフォームドコンセントに署名し、そして個体の病歴の一部として記録される前に診断された臨床状態（処置されている状態を含む）である。
【０６３１】
この状態が研究の能動的段階の開始前に存在したか否か、ならびに重篤度および／または頻度が増加したか否かに関する質問が用いられて、事象が、処置発生の有害事象（ＴＥＡＥ）である否かが決定される。ＡＥは、以下の場合に処置発生であるとみなされる：（１）研究の能動的段階が開始した場合に存在せず、そして個体の病歴の一部である慢性状態でない場合；または（２）研究の能動的段階を開始した時点で、または個体の病歴の一部として存在したが、重篤度または頻度が能動的段階の間に増加した場合。
【０６３２】
研究の能動的段階は、試験商品の最初の用量のときに開始される。
【０６３３】
ＩＣＨガイドラインに従うと、重篤な有害事象は、以下の基準のうちの１以上を満たす任意の用量で生じた任意のＡＥである：
１）死亡する（最後の試験商品投与後の３０日以内に生じる）；
２）生命が脅かされる（以下を参照のこと）；
３）個体の入院または既存の入院期間の延長を要する（以下を参照のこと）；  ４）持続的または重大な障害（ｄｉｓａｂｉｌｉｔｙ）または無能（ｉｎｃａｐａｃｉｔｙ）を生じる（以下を参照のこと）；
５）転移性癌を生じる；または
６）先天性異常または出生時欠損を生じる。
【０６３４】
さらに、死亡せず、生命が脅かされず、入院も要しないかもしれない重大な事象は、適切な医学的判断に基づいて、重大な事象が個体を危険に曝し得、そして上記の結果の１つを防止するために医学的介入または外科手術的介入を要し得る場合にＳＡＥとみなされ得る。このような事象の例としては、救急処置室または自宅で集中的な処置を要するアレルギー性気管支痙攣、血液悪液質または入院を要しない痙攣または薬物依存もしくは薬物乱用の発生が挙げられる。
【０６３５】
生命が脅かされる有害事象は、発生した場合にこの事象により個体が死亡するという差し迫った危険な状態にする任意のＡＥである；生命が脅かされる事象は、以下の事象を含まない：より重篤な形態で生じたもの、死亡を引き起こし得るもの、しかし実際に生じた場合には死亡の差し迫った危険を生じないもの。例えば、肝不全の証拠がなく治癒した薬物誘導性肝炎は、たとえ、より重篤な性質の薬物誘導性肝炎が致命的であり得るとしても、生命を脅かすとはみなされない。
【０６３６】
入院は、一晩許可としてのみみなされるべきである。入院または入院期間の延長は、重篤なＡＥについての基準を構成する。ＡＥがない場合、参加している調査員により、入院または入院期間の延長を重篤な有害事象形態（形式ＳＡＥ４５００）を介して報告することはない。これは、以下の状況の場合である：
１）入院または入院期間の延長は、プロトコルにより必要とされる手順のために必要である；
２）入院または入院期間の延長は、施設により従われる日常の手順の一部である（例えば、外科手術後のステント除去）。これは、研究ファイルに記録されるべきである。
【０６３７】
３）調査のための入院は訪問であり、すなわち一年周期の検診は同じ分類に入る。
【０６３８】
さらに、悪化していない既存の状態のために研究の開始前に計画されていた入院は、ＳＡＥを構成しない（例えば、膝の変形性関節症の既存の状態（研究の過程で悪化しなかった）に起因して膝の総置換のための選択的な入院）。
【０６３９】
障害は、個体が通常の生活機能を行う能力の実質的な崩壊と規定される。
【０６４０】
情報がＡＥまたはＳＡＥを構成するか否かという何らかの疑いがある場合は、この情報がＳＡＥとして扱われる。
【０６４１】
（報告可能な事象／情報）
治験依頼者に報告可能なＡＥ（有害事象）としては、以下が挙げられる：
全てのＳＡＥおよびＡＥ（その発現は、治験対象薬またはプロトコールの関係にかかわらず、治験依頼者の治験対象薬（治験薬、プラシーボ、またはコントロール薬剤）での治験の経過の間に、インフォームドコンセント書類にサインしてから個体の最終用量後１５日目（ＡＥ）または３０日目（ＳＡＥ）までに生じるもの）。
【０６４２】
全ての重篤でないＡＥ（その発現が、インフォームドコンセント書類にサインしてから、スクリーニング、および、このプロトコールによって必要な安全性のための確立された追跡期間内に、治験依頼者の治験対象薬での治験の経過の間に生じるもの）。
【０６４３】
以下の事象を、同じ時間枠内で、そしてＳＡＥと同じプロセスを用いて記録し、報告する：
治験経過中に診断された全ての妊娠、およびその結果。個体が治験中に妊娠が確認された場合、治験対象薬の使用の継続は直ちに評価されなければならない。治験対象薬の投与は、個体に対する潜在的利点が、胎児に対する潜在的な危険性を正当化しない場合は、中止されるべきである。承認された薬物の使用は、その薬剤が催奇性効果を有するという証拠が（例えば、添付文書中に）明らかにされなかった場合でも停止され得る。妊娠の報告の全てについて、妊娠および出産の経過、ならびに新生児の状態に関する情報を追跡しなければならない。治験担当医は、タイムリーな様式で、治験監督者に対して、妊娠の結果に関する追跡情報を提供する。この情報は、個体がこの治験への参加を中止するか否かにかかわらず提供される。新生児が健常であれば、さらなる追跡は必要ない。
【０６４４】
ＡＥを伴うかまたは伴わない、治験対象薬の乱用および過剰用量（すなわち、臨床的理由のない使用）。過剰用量（オーバードーズ）とは、個体が、本プロトコールにおいて提供される用量よりも高用量を処方されるかまたは摂ったことを意味する。ある用量が過剰用量であるか否かを決定するのは治験担当医次第である。
【０６４５】
ＡＥありまたはＡＥなしでの、治験対象薬に対する不慮のまたは偶発的な曝露。これは、以下を含む：治験後の治験対象薬関連ＳＡＥ；本治験に参加していない個人における独断的または偶発的使用後に生じるＳＡＥ；および治験担当医によって、臨床的に関連しているとみなされる異常な生物学的兆候またはバイタルサイン（生命兆候）。これらは、同じ時間枠内で、ＡＥまたはＳＡＥと同じプロセスによって報告されるなければならない。
【０６４６】
本治験の間の必要な査察の各時点で、前回の査察後に生じた全てのＡＥを、個々のＣＲＦの有害事象記録に記録しなければならない。記録した情報は、個体の身体的試験および臨床的評価の間に決定された兆候および症状に基づくべきである。これらの情報源から得た情報に加えて、個体に、以下の一般的な質問を問いかけなければならない：「前回の査察後、いかがでしたか？」。兆候および症状については、標準的な医学用語を用いて記録しなければならない。（適用可能な場合は）以下の情報を含まなければならない：特定の状態または事象および変化の方向；この条件が以前に存在したか否か（すなわち、本治験の開始時に存在する急性状態か、または慢性状態の既往か）、そしてもしそうであれば、それが悪化したか否か（例えば、重篤度および／または頻度）；発現の日付；重篤度、治験対象薬との因果関係；行った処置；および結果。これは、スクリーニング期間中に生じるＡＥを含む。ＡＥデータの収集は、治験対象薬中止後１５日間継続しなければならない。（ＳＡＥについては、以下を参照のこと）。
【０６４７】
ＡＥと治験対象薬との間の因果関係は、治験担当医の臨床判断および以下の定義に基づいて、治験担当医によって決定される。
【０６４８】
明確に関連あり：事象が、試験対象薬の投与によって完全に説明可能である；
おそらく関連あり：事象が、個体の臨床状態または他の薬剤／治療ではなく、本試験対象薬の投与によって説明される可能性が最も高い；
可能性としては関連あり；事象が、試験対象薬の投与によって、または個体の臨床状態もしくは他の薬剤／治療によって説明され得る；
おそらく関連なし；事象が、個体の臨床状態または他の薬剤／治療によって説明される可能性が最も高い；
明確に関連なし；事象が、個体の臨床状態または他の薬剤／治療によって完全に説明可能である。
【０６４９】
試験対象薬の投与とＡＥとの間の関係を評価する場合、以下を考慮すべきである：
１）試験対象薬とＡＥとの間の一時的関係；
２）関係の生物学的もっともらしさ；
３）個体の基礎にある臨床状態または付随する薬剤および／または治療；
４）適用可能な場合、試験対象薬の中止（離脱）（ｄｅｃｈａｌｌｅｎｇｅ）でＡＥが減弱したか否か；
５）適用可能な場合、試験対象薬に対する反復曝露（再チャレンジ）の際にＡＥが再出現するか否か。
【０６５０】
試験対象薬関連でない臨床研究からのＳＡＥは、それでもなお、治験担当医、またはプロトコールの実施に関連（すなわち、個体が本治験に参加しているという事実に関連）されるべき治験監督者（または指名者）によって考慮され得る。例えば、プロトコール関連ＳＡＥは、ウォッシュアウト（洗い流し）期間の間に生じる事象であり得るか、またはこのプロトコールに要する手順に関連し得る。
【０６５１】
ＡＥの重篤度は、ＮＣＩＣ  Ｅｘｐａｎｄｅｄ  Ｃｏｍｍｏｎ  Ｔｏｘｉｃｉｔｙ  Ｃｒｉｔｅｒｉａ（表３０）によって評価される。以下の定義を、ＮＣＩＣ  Ｅｘｐａｎｄｅｄ  Ｃｏｍｍｏｎ  Ｔｏｘｉｃｉｔｙ  Ｃｒｉｔｅｒｉａ中に定義されない毒性に関して用いるべきである：
１）軽度（グレード１）：このＡＥは、個体に対して顕著であるが、日常の活動を妨げない；
２）中度（グレード２）：このＡＥは、日常の活動を妨げるが、対症療法または休息に対しては反応する；
３）重篤（グレード３）：このＡＥは、対症療法にもかかわらず、個体が日常の活動を実施する能力を有意に制限する；
４）生命にかかわる（グレード４）：個体は、死に直面している。
【０６５２】
本事象に関する全ての書類（例えば、さらなる臨床検査、診察報告書（カルテ）、退院記録、検死報告書など）は、タイムリーに、治験担当医によって、治験監督者に対して、提供される。
【０６５３】
個体の引き続く経過に関する報告は、この事象が治まるまでか、または永続的障害の場合は、状態が安定するまで、この治験依頼者に提出されなければならない。
【０６５４】
いずれの緊急事態も、本プロトコールの冒頭に列挙された治験監督者に接触することによって、直ちに（２４時間内）に、治験監督者（または指名者）に報告されなければならない。
【０６５５】
いずれのＳＡＥも、因果関係にかかわらず、本プロトコールの冒頭に示された番号に対して完成したＳｅｒｉｏｕｓ  Ａｄｖｅｒｓｅ  Ｅｖｅｎｔ  Ｆｏｒｍ（Ｆｏｒｍ  ＳＡＥ  ４５００）をファックスすること、およびそのファックスが受領されたことを確認することによって、直ちに（２４時間内に）、治験担当医（または指名者）に報告されなければならない。これは、治験依頼者がその管理義務を遵守し得るように行われなければならない。
【０６５６】
個体は、この状態が解消するか、安定するか、またはその原因が同定されるまで、注意深く観察およびモニタリングされるべきである。ＳＡＥに関連する追跡情報は、この事象に関するさらなるデータが利用可能になり次第、本プロトコールの冒頭に示された番号に対して完成したＳｅｒｉｏｕｓ  Ａｄｖｅｒｓｅ  Ｅｖｅｎｔ  Ｆｏｒｍ（Ｆｏｒｍ  ＳＡＥ  ４５００）をファックスすること、および、そのファックスが受領されたことを確認することによって、直ちに（２４時間内に）、治験担当医（または指名者）に報告されなければならない。
【０６５７】
死亡はこの疾患の結果として生じ得る。にもかかわらず、試験対象薬の最後の投与後３０日以内に生じるか、または試験対象薬に関すると考えられ得る全ての死亡は、間隔にかかわらず、ＳＡＥとして取り扱われ、そしてそのように報告されなければならない。
【０６５８】
治験担当者は、地方の条例に従って、倫理委員会（ＥＣ）に対して、有害事象を報告する責任がある。
【０６５９】
このプロトコールの条項に同意して、これらの責任が、治験担当者によって受け入れられる。
【０６６０】
本治験に関する全ての他の疑問および情報については、本プロトコールの冒頭に列挙した治験監督者に問い合わせのこと。
【０６６１】
（データの品質保証）
治験依頼者は、実施した全ての臨床試験において品質管理および保証チエックを実施する。本研究へいずれかの個体を参加させる前、治験依頼者および治験担当者は、このプロトコール、臨床治験担当者に対する案内書、ＣＲＦおよびその終了についての指示、インフォームドコンセントを得るための手順、ならびにＡＥおよびＳＡＥを報告するための手順を検査する。治験依頼者の適格な代理人が、査察すること、および電話で査察場所に連絡することによって本治験の実施をモニターする。査察の間、ＣＲＦで報告された情報は、情報源書類に対して検証される。治験依頼者がＣＲＦを受領した後、治験監督者は、安全性情報に関する書式を検査し、そして治験依頼者の臨床データアソシエイトは、その書類を、読みやすさ、完成度、および論理的整合性について検査する。このデータは、二重入力手順を用いてデータベースに入力される。さらに、治験依頼者の臨床データアソシエイトは、失われたデータ、選択されたプロトコール違反、範囲外データ、および他の矛盾を同定することを補助する自動化バリデーションプログラムを用いる。データ浄化または訂正のための要求は、解決のために治験場所に転送される。
【０６６２】
（治験担当者の管理義務）
（倫理委員会（ＥＣ）承認）
このプロトコールおよびインフォームドコンセント書類は、最初のそして少なくとも毎年のＥＣの承認を得なければならない。署名されたＥＣの承認文書は、承認された文書を同定しなければならない（すなわち、治験担当者名、プロトコール番号および題名、プロトコールおよびインフォームドコンセント文書の日付、ならびにプロトコールおよびインフォームドコンセント文書の承認の日付を列挙する）。個体を募集するために用いられたいずれの広告もＥＣによって検査されるべきである。治験依頼者は、ＥＣからの署名された承認書類が受領され、そして契約上の同意が治験依頼者および臨床現場によって署名されるまで、臨床供給を出荷しない。倫理委員会に関連する規定の複写は、治験依頼者によって利用可能である。
【０６６３】
（治験書類）
治験担当者は、いずれの個体が参加する前にも、以下の書類を治験依頼者に提出しなければならない：
完全かつ署名されたＦＤＡ  Ｆｏｒｍ１５７２（Ｓｔａｔｅｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｏｒ）；
全ての適用可能な地方特有の管理書式；
治験担当者および全ての準治験担当者の現在の署名後の履歴書；
プロトコールおよびインフォームドコンセントについてのＥＣ承認書類の複写。記載済みの継続承認（少なくとも毎年）保証書、およびＥＣに提出された毎年の経過報告書の複写がまた、治験依頼者に提供されなければならない。本治験における任意の変化、または個体に対する危険性を含む予期されない問題は、ＥＣに至急報告されなければならない。治験担当者は、個体に対して明確で緊急な危険性を排除する必要があるとき以外は、ＥＣおよび治験依頼者の承認なくして、治験においていずれの変化も行ってはならない。全てのプロトコールの訂正は、ＥＣに対して提出され、そして承認されなければならない；
用いられるべき、ＥＣの承認したインフォームドコンセント書類の複写；
募集広告のＥＣ承認の記載済みの書類（適用可能である場合）；
適用可能な場合、ＥＣのメンバーおよび彼らの資格の列挙、ならびに委員会の作業手順の説明；
治験担当者によって署名されたＰｒｏｔｏｃｏｌ  Ａｐｐｒｏｖａｌ  Ｐａｇｅ；
完全に実行可能なＣｌｉｎｉｃａｌ  Ｔｒｉａｌ  Ａｇｒｅｅｍｅｎｔ（臨床治験協定）；
名前、場所、証明番号（ｃｅｒｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ）、臨床検査アッセイのために用いるべき臨床検査の証明の日付などを含む記載済みの書類が試験の実施を容易にする。治験依頼者は、臨床検査が変えられる場合、または任意のさらなる臨床検査が用いられるべき場合、通知されなければならない。
【０６６４】
このプロトコールによって要する全ての臨床検査のための測定値の正常な臨床検査および単位の列挙。これは、本治験の間に用いられるべき各臨床検査について必要である。治験依頼者は、測定値の変化が正常な値または単位であるか否かを通知しなければならない。
【０６６５】
本治験中、治験担当者は、本治験に関する以下の管理文書を整然と維持しなければならない：
１）署名したＰｒｏｔｏｃｏｌ  Ａｐｐｒｏｖａｌ  Ｐａｇｅの写真複写；
２）本治験に関与する全ての個人の履歴書；
３）署名済みのＦＤＡ  Ｆｏｒｍ  １５７２の写真複写；
４）以下についてのＥＣ  Ａｐｐｒｏｖａｌ  Ｎｏｔｏｆｉｃａｔｉｏｎ（承認通知）：
ａ）プロトコール；
ｂ）インフォームドコンセント書類；
ｃ）募集広告（適用可能な場合）；
ｄ）訂正（適用可能な場合）；
ｅ）プロトコールおよび  ｆ）インフォームドコンセント書類の年に一度の検査（見直し）
ｇ）重篤な有害事象；
ｈ）治験終止．
５）重篤な有害事象の報告；
６）Ｄｒｕｇ  Ｉｎｖｅｎｔｏｒｙ  Ｆｏｒｍｓ（薬物在庫書式）（薬物受領、薬物調剤および在庫書式）；
７）地方の実験室の名称および住所、測定値の正常な臨床検査値および単位の列挙、ならびに実験室の保証または病院の認定；
８）治験依頼者との対応。
【０６６６】
（インフォームドコンセント）
監督官庁は、臨床治験においてヒト個体の保護を行い、そしてインフォームドコンセントについて一般的用件を記載するため、規定を発行した。
【０６６７】
ある人のインフォームドコンセント提案書類の複写は、その人のＥＣへの提出の前に検査およびコメントのために治験依頼者に提出されるべきである。本治験は、この書類が治験依頼者によって検査されるまで、そしてこの書類がＥＣによって承認されるまで開始されるべきではない。ある場合には、本治験は、この書類が監督官庁に承認されるまで開始されてはならない。
【０６６８】
インフォームドコンセント書類は、この規定において特定されたインフォームドコンセントの全ての要素を含む。いくつかの規定は、個体に対するさらなる情報の開示、および／またはインフォームドコンセント書類におけるさらなる情報の包含を必要とし得る。臨床治験におけるインフォームドコンセントおよびヒト個体の保護に関する規定の複写は、治験依頼者から入手可能である。
【０６６９】
これらの規定においては、適用可能な規定下で緊急の医学的ケアを提供するように医師の権限を制限することを意図しない。さらに、いくつかの規定は、監督官庁が検査を実施し、そして本臨床治験に関する記録を検査することを可能にすることを必要とすることに気づくべきである。
【０６７０】
（ヘルシンキ宣言）
本治験は、ヘルシンキ宣言に起源する倫理原則に従って実施され、そしてＧＣＰおよび適用可能な規定要件に一致する。
【０６７１】
（症例報告の書式）
全てのデータ（臨床検査データおよび治験担当者／治験個人観察）は、治験依頼者によって提供されるＣＲＦ上に記録される。ＥＣＧ、胸部Ｘ線、およびＣＴスキャンは、ＣＲＦ中に要約して報告されなければならない。もともとの報告、トレースおよびフィルムは、将来の参考のために、治験担当者によって保持されなければならない。
【０６７２】
ＣＲＦは、黒色インキで仕上げなければならず、そして訂正はいずれの間違いをも、一本線で消して行わなければならず、修正液を用いて行ってはならない。このような修正は、医薬品臨床試験を管理する規定によって禁じられている。全ての訂正には、名前および日付を付さねばならない。
【０６７３】
もとのＣＲＦは、治験監督者によって一定間隔で集められ、そして本治験の終了後、法的に必要となる限りは、ＣＲＦの複写は、治験担当者によって保持されなければならない。
【０６７４】
ＣＲＦおよび他の適切な記録は、本治験中および／または本治験の中止もしくは完了時に、治験依頼者に提出されるべきである。
【０６７５】
治験担当者はまた、全ての不完全なＣＲＦを提出しなければならない。ＣＲＦは、本治験の完了前に脱落した個体についての回収可能なデータを含む、試験対象薬での個体の経験を記録している。
【０６７６】
（有害事象報告）
治験担当者は、有害事象セクションに記載されているような、治験依頼者に対する全てのＡＥの報告に対して同意する。さらに、治験担当者は、いずれの準治験担当者もが、治験担当者にＡＥを迅速に注意させることを確実にする責任を有する。適用可能な場合、この治験担当者はまた、いずれかＳＡＥについても関与するＥＣに情報を与える責任がある。
【０６７７】
（情報源記録の検査）
治験担当者は、治験依頼者および監督官庁の有資格者が、本治験の間、および後の両方で、査察を実施し、そして規定によって可能にされるように、臨床試験に関する医学的記録を監査および検査する権利を有することに同意する。個体は、名前で同定されることはなく、そして医学的記録の情報の機密が保持される。個体の機密は、開示が規定によって必要にならない限り、維持される。従って、個体の医学的記録の公開を可能にする以下の声明（または類似の声明）は、インフォームドコンセント書類中に含まれる。
【０６７８】
（治験のモニタリング）
本治験は、治験依頼者の代表者によってモニタリングされる。本治験の開始前、本治験の間の一定期間で、および本治験終了時点で、査察が行われる。モニタリング査察の頻度は、参加の割合、個々の査察の間の時間間隔、本治験に参加する個体の数、およびデータ入力カットオフ日付に依存する。管理モニタリング査察の一部として、治験担当者モニターは、ＣＲＦに対する利用可能な情報原書類の１００％をチエックする。電話および郵便およびｅ−メールによる連絡は、追加の査察が必要な場合用いられ得る。治験担当者および治験参加者は、治験依頼者と協力し、全ての適切な書類を提供し、そして本治験を考察するのに有用である。査察の目的は以下を確認することである：
プロトコールの遵守（治験担当者は、承認されたプロトコールからの任意の逸脱を記録し、そして説明すべきである）；
ＣＲＦの完了の完全性および正確性、ならびに施行および在庫記録（これらの査察の適切な時間および間隔は治験担当者によって配分されるべきである）；
規定の遵守。確認は、ＣＲＦに対する情報源書類の比較を必要とする。
【０６７９】
（プロトコールに対する訂正）
治験プロトコールのいずれの有意な変化も訂正を生じる。治験担当者および適切な治験監督者は、この訂正の承認ページに署名することでその承認を示す。一旦プロトコールの訂正が、治験依頼者によって承認されれば、治験担当者は、文書による承諾用に、ＥＣにこの訂正を提出する。ＥＣの委員長によって署名された承認文書は、特に治験担当者、治験依頼者プロトコール番号および題名、プロトコール訂正番号およびプロトコール訂正の日付に言及しなければならない。治験依頼者は、適切な監督機関に対して、プロトコールの訂正の複写を提出する。プロトコールの訂正は、ＥＣによって、承認された後に、実施され得る。
【０６８０】
個体に対して明らかな即時的危険を排除するために意図されるプロトコールの変更の場合、この変更は、直ちに実行され得る。ただし、次いで、この変更は、訂正中で文書化され、そして５作業日以内にＥＣに報告されなければならない。
【０６８１】
（治験担当者の変更）
いずれかの治験担当者が退職、配置転換、または治験実施から離脱した場合、記録を維持する責任は、この責任を受け入れる、別の人（治験依頼者、ＥＣ、他の治験担当者）に移され得る。この治験依頼者は、この変更を通知され、そして同意しなければならない。更新されたＦＤＡ  Ｆｏｒｍ  １５７２は、現在のＦＤＡ  Ｆｏｒｍ  １５７２において報告された治験参加者におけるいずれの変更についても、治験依頼者およびＦＤＡに提出される。
【０６８２】
（治験の終了）
（治験依頼者による終了）
治験依頼者は、以下のいずれかの理由について任意の時点で治験を終了し得る：
１）個体が参加できないこと；
２）プロトコール違反；
３）不正確または不完全なデータ；
４）非安全性、または反倫理的手順；
５）試験対象薬の安全性に疑問；
６）試験対象薬の有効性の欠如の疑い；
７）管理上の決定。
【０６８３】
（治験担当者による終了）
治験担当者が本治験を時期をはやめて終了する場合、治験担当者は以下を行う：
試験対象薬、ＣＲＦ、および試験関連物質のすべてを治験依頼者に返却する；
治験を早期に終了した理由を記載している書面による説明書を提出する。
【０６８４】
（最終治験報告）
治験担当者は、本臨床試験の結論をＥＣに通知する報告書を完成する。この報告は、本治験の完了または終了の３ヶ月内に行うべきである。
【０６８５】
ＥＣへ送られる最終報告をまた、治験依頼者に送付し、そして完成したＣＲＦとともに、治験依頼者への最終概要書を制定し、これにより、治験担当者の管理責任を果たす。
【０６８６】
（機密性）
治験依頼者によって治験担当者に与えられた未公開情報の全ては、秘密を保持され、そして治験依頼者の書面による事前の同意なしに、第三者に公開または開示されない。
【０６８７】
治験依頼者が監督官庁に対する説明のために報告書を作成する場合、最終報告書の裏書は、本治験に大きく貢献した治験担当者の一人以上から探される。この裏書はいくつかの監督官庁に必要である。
【０６８８】
本治験の結果に基づく特許出願は、本治験担当者によってはなされず、そして治験依頼者の書面による承諾なしに、このような出願について任意の第三者に援助が与えられることはない。
【０６８９】
（記録の保管）
本臨床治験に関する通信文書の全ては、適切な治験ファイル内に保存されるべきである。個体の記録、情報源書類、ＣＲＦ、薬物在庫の記録、ならびに本治験に関するＥＣおよび治験依頼者の通信文書は、ファイルに保持されなければならない。本治験に関する、個体、臨床検査、および薬物在庫記録の原本全てが、ＩＣＨ領域における市場適用の最終承認後２年以上、そしてＩＣＨ領域において懸案のもしくは考慮中の市場適用がなくなるまで、または本治験製品の臨床開発の正式な中止から少なくとも２年間が経過するまで、保管されるべきである。しかし、適用可能な規定の要件によって、または治験依頼者の同意によって、必要となる場合、これらの書類は、より長期間保管されるべきである。その後も、記録は、治験依頼者の事前の書面による通知およびこのような記録をさらに保管する機会を考慮することなく破棄されない。
【０６９０】
（公開）
本治験の完了時点で、治験担当者は、この結果を、このデータが公開を保証する場合、承認された（言及された）科学雑誌に公開し得る。治験依頼者は、本治験に基づく原稿が、提出前に彼らの承認を受けることを要求する。これは、治験依頼者によって提供された機密情報の開示に対して保護するためである。原稿案は、雑誌への投稿前に治験依頼者に提出されなければならない。示されるべき論文の要約は、提示を考慮するために、提出の少なくとも３０日前に、治験依頼者に転送されなければならない。提案された刊行物および要約は、直ちに再見される。
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は、本発明の実施形態に従うＮ−（アリール置換）−ナフタリドイミドの基本構造を例示する。
【図２】
図２は、本発明の実施形態に従うＮＡＴ２の酵素学的経路の代謝産物を例示する。
【図３】
図３は、本発明の別の実施形態に従うＣＹＰ１Ａ２の酵素学的経路の代謝産物を例示する。
【図４】
図４は、本発明の別の実施形態に従うＣＹＰ３Ａ４の酵素学的経路の代謝産物を例示する。
【図５】
図５は、本発明の別の実施形態に従うＮＡＴ１の酵素学的経路の代謝産物を例示する。
【図６】
図６は、本発明の別の実施形態に従うＣＹＰ２Ａ６の酵素学的経路の代謝産物を例示する。
【図７】
図７は、本発明の別の実施形態に従うＣＹＰ２Ｃ１９の酵素学的経路の代謝産物謝を例示する。
【図８】
図８は、本発明の別の実施形態に従うＣＹＰ２Ｃ９の酵素学的経路の代謝産物を例示する。
【図９】
図９は、本発明の別の実施形態に従うＣＹＰ２Ｄ６の酵素学的経路の代謝産物を例示する。
【図１０】
図１０は、本発明の別の実施形態に従うＣＹＰ２Ｅ１の酵素学的経路の代謝産物を例示する。
【図１１】
図１１は、固体状態の表面における免疫学的認識の詳細な集積およびシグナル変換を示す一般的な免疫センサーの設計のスキームを例示する。
【図１２】
図１２は、ＳＰＲ技術の原理を例示する。
【図１３】
図１３は、ＴＳＭ免疫センサー装置を例示する。
【図１４】
図１４は、本発明の１つの実施形態に従って使用されるＡＡＭＵおよび１Ｘ誘導体の産生のための合成経路を例示する。
【図１５】
図１５は、本発明の別の実施形態に従う抗体を惹起するために使用され得る他のＡＡＭＵおよび１Ｘ誘導体を示す。
【図１６】
図１６は、本発明の別の実施形態に従う抗体を惹起するために使用され得る他のＡＡＭＵおよび１Ｘ誘導体を示す。
【図１７】
図１７は、本発明の別の実施形態に従う抗体を惹起するために使用され得る他のＡＡＭＵおよび１Ｘ誘導体を示す。
【図１８】
図１８は、本発明の別の実施形態に従う抗体を惹起するために使用され得る他のＡＡＭＵおよび１Ｘ誘導体を示す。
【図１９】
図１９は、本発明の１つの実施形態に従うＡＡＭＵ−Ａｂおよび１Ｘ−Ａｂの吸光度競合性の抗原ＥＬＩＳＡ曲線を例示する。
【図２０】
図２０は、ＡＡＭＵ／１Ｘのモル比の棒グラフである。
【図２１】
図２１は、本発明の１つの実施形態に従うＣＹＰ１Ａ２表現型に対するカフェイン誘導体および１，７−ジメチルキサンチン誘導体の産生のための合成経路を例示する。
【図２２】
図２２は、本発明の１つの実施形態に従うＣＹＰ１Ａ２表現型に対するカフェイン誘導体および１，７−ジメチル尿酸誘導体の産生のための合成経路を例示する。
【図２３】
図２３は、本発明の別の実施形態に従う使用される際のマイクロウェルプレートのアレーを例示する。
【図２４】
図２４は、本発明の実施形態に従うＥＬＩＳＡアレーを例示する。
【図２５】
図２５は、本発明の別の実施形態に従うマイクロウェルプレートの構成の例を例示する。
【図２６】
図２６は、本発明の別の実施形態に従うＥＬＩＳＡ検出システムを例示する。
【図２７】
図２７は、１実施形態を例示する。
【図２８】
図２８は、本発明のなお別の実施形態に従う直接的な表現型対間接的な表現型についての個別化された投薬スキームを例示する。
【図２９】
図２９は、本発明のなお別の実施形態に従う体表面積の決定のための計算図表を例示する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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