(57)【要約】【課題】【解決手段】ＨＢｓＡｇ−Ｓの外側ループ内の露出部位をコードするＨＢｓＡｇ−Ｓコード配列の部分に挿入コード配列を受容するように改変され、且つ集合してＶＬＰになることができるＨＢｓＡｇ−Ｓを依然としてコードするＨＢｓＡｇ−Ｓコード配列を含む単離されたポリヌクレオチド。該ポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質、組換えＶＬＰ、及びそれらの様々な使用も記載されている。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＨＢｓＡｇ−Ｓの外側ループ内の露出部位をコードするＨＢｓＡｇ−Ｓコード配列の部分に挿入コード配列を受容するように改変され、且つ集合してＶＬＰになることができるＨＢｓＡｇ−Ｓを依然としてコードするＨＢｓＡｇ−Ｓコード配列を備える単離されたポリヌクレオチド。
【請求項２】
前記ＨＢｓＡｇ−Ｓコード配列が、集合して分泌能を有するＶＬＰになることができるＨＢｓＡｇ−Ｓをコードする請求項１に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項３】
前記ＨＢｓＡｇ−Ｓコード配列が、その宿主細胞中に保持されているＨＢｓＡｇ−Ｓをコードする請求項１に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項４】
前記ＨＢｓＡｇ−Ｓコード配列が、集合して崩壊したネイティブＨＢｓＡｇエピトープを含むＶＬＰになることができるＨＢｓＡｇ−Ｓをコードする請求項１〜３の何れか１項に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項５】
請求項１に記載の単離されたポリヌクレオチドであって、前記ＨＢｓＡｇ−Ｓの前記部分に、
（１）ＨＢｓＡｇ−Ｓのアミノ酸１１４乃至１６０若しくは１６９、
（２）ＨＢｓＡｇ−Ｓのアミノ酸１２０乃至１６０、
（３）ＨＢｓＡｇ−Ｓの「ａ」決定基、
（４）ＨＢｓＡｇ−Ｓのアミノ酸１２０乃至１５０、
（５）ＨＢｓＡｇ−Ｓのアミノ酸１２４乃至１４７、
（６）ＨＢｓＡｇ−Ｓのアミノ酸１２４−１４５、１２４−１４２、１２４−１４０、１２４−１３８、１２４−１３６、１２４−１３４、１２４−１３２、１２４−１３０、１２４−１２８、若しくは１２４−１２６、又は
（７）ＨＢｓＡｇ−Ｓのアミノ酸１２７及び１２８
をコードする挿入コード配列を受容するように前記ＨＢｓＡｇ−Ｓコード配列が改変されたポリヌクレオチド。
【請求項６】
コドン１２７と１２８の間に挿入コード配列を受容するように改変されたＨＢｓＡｇ−Ｓコード配列であって、集合してＶＬＰになることができるＨＢｓＡｇ−Ｓを依然としてコードするＨＢｓＡｇ−Ｓコード配列を備える単離されたポリヌクレオチド。
【請求項７】
ＨＢｓＡｇ−Ｓの外側ループ内の露出部位をコードするＨＢｓＡｇ−Ｓコード配列の部分に制限部位が存し、且つ集合してＶＬＰになることができるＨＢｓＡｇ−Ｓを依然としてコードするＨＢｓＡｇ−Ｓコード配列を備える単離されたポリヌクレオチド。
【請求項８】
前記制限部位の導入が、コードされるＨＢｓＡｇ−Ｓのアミノ酸配列に影響を与えない請求項７に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項９】
前記制限部位が、ＨＢｓＡｇ−Ｓコード配列のコドン１２７及び１２８の間のＡｇｅＩ部位である請求項７又は８に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１０】
ネイティブＨＢｓＡｇ−Ｓコード配列中のコドン１２７がＡＣＴからＡＣＣに改変され、コドン１２８がＧＣＴからＧＧＴに改変される請求項７、８、又は９に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１１】
最大約５乃至１００のアミノ酸、約１０乃至９０のアミノ酸、約２０乃至８０のアミノ酸、約３０乃至７０のアミノ酸、又は約４０乃至６０のアミノ酸の挿入コード配列を受容するように改変され、且つ集合してＶＬＰになることができるＨＢｓＡｇ−Ｓを依然としてコードする先行する請求項の何れか１項に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１２】
最大約３６又は６０アミノ酸の挿入コード配列を受容するように改変された先行する請求項の何れか１項に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１３】
挿入コード配列をさらに備えた先行する請求項の何れか１項に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１４】
前記挿入コード配列がＨＢＶ起源である請求項１３に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１５】
前記挿入コード配列が異種起源である請求項１３に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１６】
前記異種の挿入コード配列が、微生物、ウイルス、動物、又は植物起源である請求項１５に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１７】
前記挿入コード配列がＨＣＶ配列の挿入コード配列である請求項１３に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１８】
前記挿入コード配列が、（１）免疫性タンパク質若しくはエピトープを含むその一部、又は（２）結合タンパク質若しくは結合ドメインをコードするその一部をコードする請求項１３〜１７の何れか１項に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１９】
前記挿入コード配列が、Ｅ２タンパク質のＨＶＲ１配列の抗原性部分をコードする請求項１７に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項２０】
前記挿入コード配列の発現産物が正しい表面配向で提示されたＶＬＰに集合することができるＨＢｓＡｇ−Ｓを発現して与えることができる先行する請求項の何れか１項に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項２１】
前記ＨＢｓＡｇ−Ｓコード配列がＨＢｓＡｇ−Ｍコード配列を備える先行する請求項の何れか１項に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項２２】
前記ＨＢｓＡｇ−Ｓコード配列がＨＢｓＡＧ−Ｌコード配列を備える先行する請求項の何れか１項に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項２３】
ＨＢｓＡＧ−Ｓコード配列をコードする単離されたポリヌクレオチドを作製する方法であって、（１）ＨＢｓＡｇ−Ｓコード配列を単離する工程と、（２）ＨＢｓＡｇ−Ｓの外側ループ内の露出部位をコードするＨＢｓＡｇ−Ｓコード配列の部分に挿入コード配列を受容するように改変され、且つ集合してＶＬＰになることができるＨＢｓＡｇ−Ｓを依然としてコードするようにＨＢｓＡｇ−Ｓコード配列を修飾する工程とを備えた方法。
【請求項２４】
請求項１〜２２の何れか１項のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項２５】
請求項１〜２２の何れか１項のポリヌクレオチド又は請求項２４のベクターを含む宿主細胞。
【請求項２６】
分泌能を有するＶＬＰを産生するように改変された請求項２４に記載の宿主細胞。
【請求項２７】
細菌、真菌、昆虫、又は哺乳類起源、又は癌細胞の請求項２４又は２５に記載の宿主細胞。
【請求項２８】
請求項１〜２２の何れか１項に記載のポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質、ポリヌクレオチド、又はペプチド。
【請求項２９】
自己集合してＶＬＰになることができる請求項２８に記載のタンパク質、ポリヌクレオチド、又はペプチド。
【請求項３０】
請求項２８又は２９のタンパク質、ポリヌクレオチド、又はペプチドを備えたＶＬＰ。
【請求項３１】
ＨＢｓＡｇ−ＳとＨＢｓＡＧ−Ｓの外側ループ内の露出部位内に位置する挿入物とを備えた請求項３０に記載のＶＬＰ。
【請求項３２】
ＨＢｓＡｇ−Ｓと、
（１）ＨＢｓＡｇ−Ｓのアミノ酸１１４乃至１６０又は１６９、
（２）ＨＢｓＡｇ−Ｓのアミノ酸１２０乃至１６０、
（３）ＨＢｓＡｇ−Ｓの「ａ」決定基、
（４）ＨＢｓＡｇ−Ｓのアミノ酸１２０乃至１５０、
（５）ＨＢｓＡｇ−Ｓのアミノ酸１２４乃至１４７、
（６）ＨＢｓＡｇ−Ｓのアミノ酸１２４−１４５、１２４−１４２、１２４−１４０、１２４−１３８、１２４−１３６、１２４−１３４、１２４−１３２、１２４−１３０、１２４−１２８、又は１２４−１２６、又は
（７）ＨＢｓＡｇ−Ｓのアミノ酸１２７及び１２８内の挿入物と
を備えた請求項３０又は３１に記載のＶＬＰ。
【請求項３３】
異種の挿入物をさらに備えた請求項３０〜３２の何れか１項に記載のＶＬＰ。
【請求項３４】
前記挿入物が細菌、ウイルス、動物、又は植物起源のものである請求項３３に記載のＶＬＰ。
【請求項３５】
前記挿入物がＨＣＶタンパク質である請求項３３に記載のＶＬＰ。
【請求項３６】
前記挿入物が、（１）免疫性タンパク質若しくはエピトープを含むその一部、又は（２）結合タンパク質若しくは結合ドメインをコードするその一部である請求項３３〜３５配列の何れか１項に記載のＶＬＰ。
【請求項３７】
ＶＬＰを作製する方法であって、
（１）ＨＢｓＡｇ−Ｓと発現時にＶＬＰへと集合することができる挿入物とをコードするベクターを細胞にトランスフェクトする工程と、
（２）前記挿入物を含むＨＢｓＡｇ−Ｓの発現とＶＬＰの集合とが可能な条件下で、前記細胞を培養する工程と、
（３）前記ＶＬＰを単離する工程と
を備えた方法。
【請求項３８】
請求項３３〜３６の何れか１項に記載のＶＬＰと生理学的に許容される担体とを含む薬学的組成物。
【請求項３９】
患者に免疫応答を生じせしめる方法であって、請求項３３〜３６の何れか１項に記載の有効量のＶＬＰ、又は請求項３８に記載の薬学的組成物を前記患者に投与する工程を備え、前記ＶＬＰが免疫原性挿入物を含む方法。
【請求項４０】
患者に免疫応答を生じせしめる方法であって、（１）ＨＢＶ免疫原性調製物を前記患者に投与する工程と、（２）請求項３３〜３６の何れか１項に記載の有効量のＶＬＰ又は請求項３８に記載の薬学的組成物を前記投与する工程とを備え、前記ＶＬＰが免疫原性挿入物を含む方法。
【請求項４１】
請求項３３〜３６の何れか１項に記載のＶＬＰ又は請求項３８に記載の薬学的組成物を含む免疫原性調製物。
【請求項４２】
前記ＶＬＰが複数の異種挿入物を含むハイブリッドＶＬＰである請求項３３〜３６の何れか１項に記載のＶＬＰ又は請求項３８に記載の薬学的組成物。
【請求項４３】
請求項３３〜３６の何れか１項に記載の複数のＶＬＰを含むＶＬＰ組成物であって、各ＶＬＰが単一の異種挿入物を含むＶＬＰ組成物。
【請求項４４】
請求項３３〜３６の何れか１項に記載の複数のＶＬＰを含むＶＬＰ組成物であって、各ＶＬＰが複数の異種挿入物を含むハイブリッドＶＬＰであるＶＬＰ組成物。
【請求項４５】
患者の疾病又は疾患を治療する方法であって、請求項３３〜３６の何れかに記載の有効量のＶＬＰ又は請求項３８又は４２〜４４の何れか１項の組成物を前記患者に投与することを備えた方法。
【請求項４６】
ある物質を標的細胞に送達するための請求項３３〜３６の何れかに記載のＶＬＰ又は請求項３８若しくは４２〜４４の何れか１項に記載の組成物の使用。
【請求項４７】
ある物質を標的細胞に送達するように改変されたＶＬＰを作製する方法であって、
（１）ＨＢｓＡｇ−Ｓと発現時にＶＬＰへと集合することができる挿入物とをコードするベクターを細胞にトランスフェクトする工程であって、前記挿入物が前記物質と前記標的細胞に特異的な結合物質とをコードする工程と、
（２）前記挿入物を含むＨＢｓＡｇ−Ｓの発現とＶＬＰの集合とが可能な条件下で、前記細胞を培養する工程と、
（３）前記ＶＬＰを単離する工程と
を備えた方法。
【請求項４８】
ある物質を標的細胞に送達する方法であって、
（１）前記標的細胞に対して結合物質を提示するＶＬＰを調製する工程と、
（２）前記標的細胞を含有する媒体に前記ＶＬＰを接触させる工程と
を備えた方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の分野】
本発明は、改良されたウイルス成分（ｓｕｂｖｉｒａｌ）粒子、それらのヌクレオチド及びタンパク質コード配列、並びにそれらの様々な使用に関する。
【０００２】
【背景技術】
Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）により発現される小エンベロープタンパク質（ＨＢｓＡｇ−Ｓ）は、ヌクレオキャプシドの関与なしに宿主由来の脂質と自己集合して空のエンベロープ粒子を形成する能力を有する。球形又は繊維状であり、直径が２２ｎｍであるこれらの様々な形のウイルス成分粒子は、プレゴルジコンパートメントの内腔に発芽した後、分泌される。
【０００３】
これらの粒子の合成中に、ＨＢｓＡｇ−Ｓが共翻訳的に小胞体（ＥＲ）膜に挿入され、その結果、内腔の露出した短いＮ−末端配列、５７ａａ細胞質ループによって隔てられた２個の膜貫通領域、主要Ｂ細胞エピトープ（「ａ」−決定基）を含有する内腔外部７０ａａドメイン、及び糖鎖付加部位が生じる。「ａ」−決定基は、少数のエピトープから成り、ＨＢｓＡｇ−Ｓの約１２４〜１４７アミノ酸間に存在する二重ループ構造内に位置する（他の研究者らは、「ａ」決定基を１２０アミノ酸〜１５０アミノ酸の間として同定している。）。１個の２２ｎｍ粒子には約１００分子のＨＢｓＡｇ−Ｓが含有されると推定される。ウイルス成分ＨＢｓＡｇ粒子は、世界中でＢ型肝炎ワクチン接種の際に効果的に使用されている。
【０００４】
ウイルス様粒子（ＶＬＰｓ）は粒子であるため、一般的に、変性タンパク質又は可溶性タンパク質よりも効果的な免疫反応が誘導される。ＶＬＰｓは、ワクチンとして従来の免疫原以上に多くの利点を有する。異種性発現系中で、様々な感染性因子に由来する抗原をＶＬＰｓとして合成することができる。ある種のキャプシド又はエンベロープタンパク質の自己集合能力に加え、これらの粒子を大量に産生させることが可能であり、容易に濃縮、精製される。キメラＶＬＰｓを用いたワクチン接種により、アジュバントなしでも挿入物特異的なＢ及び／又はＴ−細胞反応の両者を誘導することが可能である。さらに、ＶＬＰｓは複製不能であり非感染性である。
【０００５】
ＨＢｓＡｇ粒子を使用して、外来性エピトープを備えたキメラ粒子が作られている。しかし、従来のキメラにおける挿入物の位置では、外来挿入物の表面配向を最適化することができず、ＨＢｓＡｇの自己集合能についても十分な能力の発揮を期待できない。さらに、得られたＶＬＰｓにおいて分泌力が低下している可能性がある。
【０００６】
本発明は、従来技術に伴うＨＢｓＡｇ粒子に関する課題を解決すること、又は、少なくとも改良ＶＬＰｓ、それらのヌクレオチド及びタンパク質コード配列、並びに改良ＶＬＰｓの様々な使用方法を提供することにより代替手段を提供することを目的とする。
【０００７】
【発明の開示】
本発明は、ＨＢｓＡｇ−Ｓの外側ループ内の露出部位をコードするＨＢｓＡｇ−Ｓコード配列の部分に挿入コード配列を受容するように改変され、且つ集合してＶＬＰになることができるＨＢｓＡｇ−Ｓを依然としてコードするＨＢｓＡｇ−Ｓコード配列を備える単離されたポリヌクレオチドを提供する。
【０００８】
本発明において、「挿入物」なる用語は、タンパク質、又はポリペプチド若しくはペプチド等のその一部と定義される。
【０００９】
本発明において、コード配列と関連して使用する場合、「ＨＢｓＡｇ−Ｓ」なる用語には、アビへパドナウイルス及びオルトヘパドナウイルスの任意の株など（これに限定されない）ＨＢＶの任意の株に由来する、全てのＨＢｓＡｇ−Ｓ配列（例えば、ヒト感染性ＨＢＶ遺伝子型Ａ〜Ｇ、及び血清学的グループａｙｗ１、ａｙｗ２、ａｙｗ３、ａｙｗ４、ａｙｒ、ａｄｗ２、ａｄｗ４、ａｄｒｑ＋、及びａｄｒｑ−であるが、これらに限定されない）が含まれる。
【００１０】
本発明において、ＨＢｓＡｇ−Ｓの外側ループの起始点と終末点については相反する報告が存在するということが理解されるであろう。従って、外側ループは若干変動する可能性があり、好ましくはアミノ酸１０１〜１５９、１０１〜１６３、又は９９〜１６９である。
【００１１】
さらに、本明細書では「ＨＢｓＡｇ−Ｓ」と呼称するが、当業者であれば、ＨＢＶは相互に関連する３個のエンベロープタンパク質、ＨＢｓＡｇ−Ｓ、ＨＢｓＡｇ−Ｍ及びＨＢｓＡｇ−Ｌをコードするということを理解できるであろう。ＨＢｓＡｇ−Ｍは、ＨＢｓＡｇ−Ｓから成り、５５アミノ酸のＮ末端伸長部分（ｐｒｅＳ２−ドメイン）を有し、ＨＢｓＡｇ−ＬはＨＢｓＡｇ−Ｓ、ｐｒｅＳ２ドメインから成り、１０８又は１１９アミノ酸（サブタイプにより異なる）のＮ末端伸長部分（ｐｒｅＳ１−ドメイン）を有する。従って、本発明において、本明細書でＨＢｓＡｇ−Ｓコード配列という用語を用いるときには、ＨＢｓＡｇ−Ｍ又はＨＢｓＡｇ−Ｌの一部を形成するＨＢｓＡｇ−Ｓコード配列が含まれるということを理解できるであろう。
【００１２】
さらに、本明細書でＨＢｓＡｇ−Ｓの外側ループという場合には、アミノ酸の位置という点で、このループの正確な位置に関して異なった文献報告がなされていることが当業者であれば理解できるであろう。例えば、外側ループは、アミノ酸１０１〜１５９、１０１〜１６３、及び９９〜１６９に広がる領域と記述されている。本明細書において、前記外側ループに対応するアミノ酸領域という用語を用いる場合、これには、外側ループに対応する公表された他のアミノ酸領域も含まれるということが理解されなければならない。
【００１３】
ＨＢｓＡｇ−Ｓコード配列は、分泌能を有するＶＬＰへと集合することができるＨＢｓＡｇ−Ｓをコードし得る。分泌能力を有するＶＬＰｓは、より簡便に分離、精製することができる。或いは、ＨＢｓＡｇ−Ｓコード配列には、集合して、宿主細胞内に保持されるＶＬＰになるＨＢｓＡｇ−Ｓをコードし得る。当業者によく知られた標準的技術を用いて非分泌性ＶＬＰｓを単離してもよい。例えば、クロマトグラフィー又は無関係な細胞性物質からＶＬＰｓを選択的に精製する他の何らかの技術を用いて、細胞可溶化物からＶＬＰｓを単離してもよい。
【００１４】
前記ＨＢｓＡｇ−Ｓコード領域は、挿入コード配列が受容できるように改変されたネイティブＨＢｓＡｇ−Ｓポリヌクレオチドであり得る。この点において、前記ネイティブＨＢｓＡｇ−Ｓコード配列は、（ｉ）ＨＢｓＡｇ−Ｓのアミノ酸１１４〜１６０又は１６９、（ｉｉ）ＨＢｓＡｇ−Ｓのアミノ酸１２０〜１６０、（ｉｉｉ）ＨＢｓＡｇ−Ｓの「ａ」決定基、（ｉｖ）ＨＢｓＡｇ−Ｓのアミノ酸１２０〜１５０、（ｖ）ＨＢｓＡｇ−Ｓのアミノ酸１２４〜１４７、（ｖｉ）ＨＢｓＡｇ−Ｓのアミノ酸１２４〜１４５、１２４〜１４２、１２４〜１４０、１２４〜１３８、１２４〜１３６、１２４〜１３４、１２４〜１３２、１２４〜１３０、１２４〜１２８、若しくは１２４〜１２６、又は（ｖｉｉ）ＨＢｓＡｇ−Ｓのアミノ酸１２７〜１２８をコードするネイティブＨＢｓＡｇ−Ｓポリヌクレオチドの部分に、挿入コード配列を受容するように適合させてもよい。
【００１５】
挿入コード配列の具体的な位置は、本発明の核酸分子の用途に応じて、当業者が変更してもよい。例えば、挿入コード配列がＨＢｓＡｇ−Ｓの「ａ」決定基をコードするポリヌクレオチドの前記部分の中にあり、コードされる組換えＨＢｓＡｇ−Ｓがデルタ肝炎ウイルスを封入するために必要である場合には、組換えＨＢｓＡｇ−Ｓが確実に肝炎デルタウイルスを封入することができるように、前記挿入コード配列は、「ａ」決定基内の糖鎖付加部位に対するコード配列から十分に隔てられていなければならない。これらの要件を満たす本発明の一例としては、挿入コード配列がネイティブＨＢｓＡｇ−Ｓのコドン１２７〜１２８の間に導入される場合が挙げられる。
【００１６】
従って、本発明は、コドン１２７〜１２８の間に挿入コード配列を受容するように適合され、且つ集合してＶＬＰになることができるＨＢｓＡｇ−Ｓを依然としてコードしているネイティブＨＢｓＡｇ−Ｓコード配列を備える単離されたポリヌクレオチドも提供する。
【００１７】
さらに、抗−ＨＢｓＡｇ抗体（抗−ＨＢｓ）によって生じ得る影響を限定し、好ましくは回避するために、本発明のポリヌクレオチドは、挿入物を受容するように適合され、且つＨＢｓＡｇに対する抗体の影響を過度に受けないＨＢｓＡｇ−Ｓタンパク質をコードすることが好ましい。この点において、好ましくは、ポリヌクレオチドの発現時に、ネイティブＨＢｓＡｇの１以上のエピトープを破壊する位置に挿入コード配列を受容するように、本発明ポリヌクレオチドを改変する。
【００１８】
本発明において、「破壊する」という用語には、（ｉ）エピトープに対する任意の抗体がそのエピトープに結合不可能になるようにエピトープを除去すること、（ｉｉ）あるエピトープに対する抗体が、低下した結合親和性でエピトープに結合し得るようにエピトープを改変することが含まれる。
【００１９】
従って、本発明は、ＨＢｓＡｇ−Ｓの外側ループ内の露出部位をコードする前記ＨＢｓＡｇ−Ｓコード配列の部分に挿入コード配列を受容するように改変されたＨＢｓＡｇ−Ｓコード配列であって、且つ集合してＶＬＰになることができるＨＢｓＡｇ−Ｓを依然としてコードするＨＢｓＡｇ−Ｓコード配列を備え、前記挿入コード配列の挿入位置が、前記ポリヌクレオチドの発現時に、発現産物がネイティブＨＢｓＡｇの破壊されたエピトープを少なくとも一つ含むような位置である単離されたポリヌクレオチドも提供する。
【００２０】
ネイティブＨＢｓＡｇ−Ｓコード配列が挿入コード配列を受容するように為された改変に加えて、ネイティブ配列が特定の課題に関してより適切になるように、ネイティブ配列に対してこれ以外の改変を行ってもよい。このようなさらなる変更には、一般的に「設計上の工夫」と呼ばれ、ある宿主において最適化な発現を確保するためのコドンの改変、及び、その配列のクローニングが容易になるように該配列に加えられるその他の変更が含まれる。当業者であれば、このような更なる変更は明白であろう。
【００２１】
例えば、前記ＨＢｓＡｇ−Ｓコード配列は、ネイティブ配列と実質的に異なるが、遺伝コードの縮重のためＨＢｓＡｇ−Ｓを依然としてコードするネイティブＨＢｓＡｇ−Ｓポリヌクレオチドの変種（ｖａｒｉａｎｔ）であり得る。他の変異体には、望ましい性質を有する変異体ＨＢｓＡｇ−Ｓ又は１以上の保存的なアミノ酸変化を有するＨＢｓＡｇ−Ｓをコードする変種、又は集合してＶＬＰを形成する能力を保持する短縮型のネイティブＨＢｓＡｇ−Ｓをコードするポリヌクレオチドが含まれる。
【００２２】
ＨＢｓＡｇ−Ｓの非必須部分をコードするヌクレオチドを除去することによって、当業者は短縮型ＨＢｓＡｇ−ＳをコードするＨＢｓＡｇ−Ｓポリヌクレオチドを慣用的な方法で調製し得る。欠失変異体を調製し、その発現産物が集合してＶＬＰｓを形成できるかどうかを評価することによって、又はコンピューターモデルを使用して三次構造及び発現の際の挿入物の提示に不可欠なアミノ酸を決定することによって、ＨＢｓＡｇ−Ｓ配列の非必須部分を慣用的な方法で決定し得る。好ましくは、前記欠失変異体は、自己集合して分泌能を有するＶＬＰｓを形成することができるタンパク質をコードする。特に、前記欠失変異体は少なくとも７５％のネイティブＨＢｓＡｇ−Ｓ、より好ましくは少なくとも８０％のネイティブＨＢｓＡｇ−Ｓのアミノ酸、さらに好ましくは少なくとも９０％、さらに好ましくは少なくとも９５〜９９％のネイティブＨＢｓＡｇ−Ｓのアミノ酸をコードする。
【００２３】
前記挿入コード配列は、当業者にとって知られた数多くの方法で、ＨＢｓＡｇ−Ｓコード配列中に受容させ得る。挿入コード配列を導入することができる制限部位をコードするようにＨＢｓＡｇ−Ｓコード配列を操作し得る。
【００２４】
従って、本発明は、ＨＢｓＡｇ−Ｓの外側ループ中の露出部位をコードするＨＢｓＡｇ−Ｓコード配列の部分に制限部位を規定し、且つ集合してＶＬＰを形成することができるＨＢｓＡｇ−Ｓを依然としてコードするＨＢｓＡｇ−Ｓコード配列を備える単離されたポリヌクレオチドを提供する。
【００２５】
必要に応じて、前記ＨＢｓＡｇ−Ｓコード配列中に設計された実際の制限部位は当業者によって改変させ得る。制限部位を含めることによって、コードされるＨＢｓＡｇ−Ｓのアミノ酸配列に影響が及ばないことが好ましい。一例として、コドン１２７〜１２８の間にコード配列を挿入するときには、ＨｂｓＡｇ−Ｓコード配列の切断を可能にするＡｇｅＩの制限部位をコードし且つコドン１２７及び１２８の間に挿入コード配列を受容するようにＨＢｓＡｇ−Ｓコード配列を操作してもよい。特に、ネイティブＨＢｓＡｇ−Ｓコード配列中のコドン１２７をＡＣＴからＡＣＣに改変し、コドン１２８をＧＣＴからＧＧＴに改変しうる。
【００２６】
前記挿入コード配列の大きさは、集合してＶＬＰになることができるＨＢｓＡｇ−Ｓを前記ＨＢｓＡｇ−Ｓコード配列が依然としてコードする上限まで、必要に応じて変更してもよい。前記挿入コード配列は、最大約５〜１００アミノ酸、より具体的には約１０〜９０アミノ酸、約２０〜８０アミノ酸、約３０〜７０アミノ酸、又は約４０〜６０アミノ酸をコードし得る。具体例として、前記挿入コード配列は約３５〜６０アミノ酸をコードする。
【００２７】
前記挿入コード配列は、ＨＢＶを含む任意の起源に由来するものであり得るが、より一般的には異種由来のものであろう。挿入コード配列の例には、細菌性、ウイルス性、動物及び植物配列が含まれる。具体的なウイルス配列にはＨＣＶ配列が含まれるが、前記挿入コード配列は、ＨＢｓＡｇ−Ｓの一部として発現したときに有用な挿入物をコードする任意の配列であり得ることが理解できるであろう。このような挿入物には、（ｉ）免疫性タンパク質又はエピトープを含有するその一部、及び（ｉｉ）結合タンパク質又は結合ドメインをコードするその一部が含まれる。
【００２８】
本発明のある形態において、前記挿入コード配列がＨＣＶ配列である場合、その挿入物はＥ２タンパク質のＨＶＲ１配列の抗原部分をコードし得る。
【００２９】
好ましくは、本発明のポリヌクレオチドの発現によって、集合してＶＬＰになり、適切な表面配向で前記挿入コード配列の発現産物を提示するＨＢｓＡｇ−Ｓが与えられる。
【００３０】
本発明において、「適切な表面配向（ｃｏｒｒｅｃｔ　ｓｕｒｆａｃｅ　ｏｒｉｅｎｔａｔｉｏｎ）」なる用語は、発現された挿入物のコンフォメーションが、免疫原性又は結合能などの（これらに限定されない）少なくとも１つの有用な生物学的活性を保持するようになっていることを意味する。好ましくは、適切な表面配向とは、発現された挿入物が、そのネイティブ型で発現された場合と実質的に同様の三次構造を有することを意味する。
【００３１】
本発明は、ＨＢｓＡＧ−Ｓコード配列をコードする単離されたポリヌクレオチドを作製する方法であって、（１）ＨＢｓＡｇ−Ｓコード配列を単離する工程と、（２）ＨＢｓＡｇ−Ｓの外側ループ内の露出部位をコードするＨＢｓＡｇ−Ｓコード配列の部分に挿入コード配列を受容するように改変され、且つ集合してＶＬＰになることができるＨＢｓＡｇ−Ｓを依然としてコードするようにＨＢｓＡｇ−Ｓコード配列を修飾する工程とを備えた方法を提供する。
【００３２】
本発明は、本発明の前記ポリヌクレオチドを含むベクター、このようなベクターを用いて遺伝的に改変された宿主細胞、前記ポリヌクレオチドによってコードされるＶＬＰ等の粒子の作製にも関する。
【００３３】
前記ポリヌクレオチドは、増殖に関する選択可能なマーカーを含有するプラスミドなどのベクター中に導入し得る。２、３の例を挙げると、該ベクターには、ファージラムダＰＬプロモーター、ＣＭＶプロモーター、Ｅ．ｃｏｌｉ　ｌａｃ、ｔｒｐ及びｔａｃプロモーター、ＳＶ４０初期及び後期プロモーター、並びにレトロウイルスＬＴＲのプロモーターなどの適切なプロモーターが含まれ得る。その他の適切なプロモーターも当業者にとっては自明であろう。本発明のポリヌクレオチドの発現を促進するように設計したベクターは、さらに転写開始部位、転写終結部位、及び転写領域に翻訳のためのリボソーム結合部位を含有し得る。該構築物によって発現される成熟した転写産物のコード部分は、好ましくは、翻訳されるポリペプチドの先頭に翻訳開始コドンを含有し、翻訳されるポリペプチドの末端に適切に位置する終止コドンを含有する。
【００３４】
ベクターなどの形態をとる本発明のポリヌクレオチドを含有する宿主細胞は、当業者によって、必要に応じて改変し、慣用的な方法で選択し得る。宿主細胞は、Ｅ．ｃｏｌｉなどの細菌由来、酵母などの真菌由来、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａなどの昆虫細胞、及びＣＨＯ、ＣＯＳ、ＨｕＨ−７などの癌細胞株のような、哺乳類細胞であり得る。
【００３５】
リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストランを介したトランスフェクション、カチオン性脂質を介したトランスフェクション、エレクトロポレーション、形質導入又は感染など、当業者によく知られた数多くの方法の何れかによって宿主細胞中にベクターを導入し得る。
【００３６】
本発明は、本明細書に記載された本発明のポリヌクレオチドの任意の一つによってコードされたタンパク質、ポリペプチド、及びペプチドも提供する。これらのタンパク質、ポリペプチド、及びペプチドは集合してウイルス様粒子（ＶＬＰ）になり得、本発明の一部を構成する。
【００３７】
このように、本発明は、本発明のタンパク質、ポリペプチド、及びペプチドを備えたウイルス様ペプチド（「ＶＬＰ」）も提供する。
【００３８】
本発明のＶＬＰの一つは、ＨＢｓＡｇ−ＳとＨＢｓＡＧ−Ｓの外側ループ内の露出部位内に位置する挿入物とを含み、前記ＨＢｓＡｇ−Ｓは集合して、前記挿入物を取り込むＶＬＰになることができる。
【００３９】
好ましくは、本発明のＶＬＰは、ＨＢＳＡｇの崩壊したネイティブエピトープを備える。この点に関し、前記挿入物の位置は、前記挿入物の前記領域中に存在するネイティブエピトープが崩壊する位置であることが好ましい。
【００４０】
本発明の他のＶＬＰは、集合能を有するＨＢｓＡｇ−Ｓと、（１）ＨＢｓＡｇ−Ｓのアミノ酸１１４乃至１６０又は１６９、（２）ＨＢｓＡｇ−Ｓのアミノ酸１２０乃至１６０、（３）ＨＢｓＡｇ−Ｓの「ａ」決定基、（４）ＨＢｓＡｇ−Ｓのアミノ酸１２０乃至１５０、（５）ＨＢｓＡｇ−Ｓのアミノ酸１２４乃至１４７、（６）ＨＢｓＡｇ−Ｓのアミノ酸１２４−１４５、１２４−１４２、１２４−１４０、１２４−１３８、１２４−１３６、１２４−１３４、１２４−１３２、１２４−１３０、１２４−１２８、又は１２４−１２６、又は（７）ＨＢｓＡｇ−Ｓのアミノ酸１２７及び１２８内の挿入物とを備える。
【００４１】
本発明の前記ＶＬＰは様々な分野において有用であるものと思われ、具体的な応用は、前記挿入物の生物活性に依存するところが大きい。例えば、本発明のＶＬＰは、肝炎δウイルス（ＨＤＶ）を封入することができる可能性があり、標的細胞にＨＤＶを輸送するために使用し得る。
【００４２】
このように、本発明は、ＨＢｓＡｇ−ＳとＨＢｓＡＧ−Ｓの外側ループ内の露出部位内に位置する挿入物とを備え、前記ＨＢｓＡｇ−Ｓは集合して、前記挿入物を取り込むＶＬＰになることができるＨＤＶ封入ＶＬＰも提供する。好ましくは、前記挿入物は、ＨＢｓＡｇ−Ｓの１２７及び１２８に、又はその付近に、より具体的には、アミノ酸１２７と１２８の間に位置する。
【００４３】
前記挿入コード配列の大きさは、挿入物を取り込む前記ＶＬＰがなお集合能を維持する上限まで、必要に応じて変更してもよい。従って、前記挿入物は、最大約５〜１００アミノ酸、より具体的には約１０〜９０アミノ酸、約２０〜８０アミノ酸、約３０〜７０アミノ酸、又は約４０〜６０アミノ酸をコードし得る。具体例として、前記挿入コード配列は約３５〜６０アミノ酸をコードする。
【００４４】
前記挿入物は、ＨＢＶを含む任意の起源に由来するものであり得るが、より一般的には異種由来のものであろう。挿入物の例には、細菌性、ウイルス性、動物及び植物配列が含まれる。具体的なウイルス挿入物にはＨＣＶタンパク質配列が含まれるが、前記挿入物は、ＨＢｓＡｇ−Ｓの一部として発現したときに有用な挿入物をコードする任意の配列であり得ることが理解できるであろう。このような挿入物には、（ｉ）免疫性タンパク質又はエピトープを含有するその一部、及び（ｉｉ）結合タンパク質又は結合ドメインをコードするその一部が含まれる。
【００４５】
上述のように、本発明のＨＢｓＡｇ−Ｓタンパク質はＨＤＶを封入するように改変してもよい。このため、本発明は、ＨＤＶ配列を備える本明細書に記載された本発明のＶＬＰも提供する。
【００４６】
好ましくは、本発明のＶＬＰは、前記挿入物が正しい表面配向性で提示された粒子を形成するように改変されたＨＢｓＡｇ−Ｓをコードする。
【００４７】
本発明は、ＶＬＰを作製する方法であって、（１）ＨＢｓＡｇ−Ｓと発現時にＶＬＰへと集合することができる挿入物とをコードするベクターを細胞にトランスフェクトする工程と、（２）前記挿入物を含むＨＢｓＡｇ−Ｓの発現とＶＬＰの集合とが可能な条件下で、前記細胞を培養する工程と、（３）前記ＶＬＰを単離する工程とを備えた方法を提供する。
【００４８】
上述のように、本発明のＶＬＰは、その中に含有される挿入物の生物学的活性によってのみ制約を受ける数多くの用途を有する。従って、本発明は、本発明のＶＬＰと生理学的に許容される担体とを含有する薬学的組成物も提供する。
【００４９】
本発明のＶＬＰｓの用途の１つは、免疫学の分野である。従って、本発明は、患者に免疫反応を与える方法であって、本発明の免疫原性挿入物とともにＶＬＰを含有する有効量の免疫原を患者に投与する工程を備えた方法も提供する。
【００５０】
本発明の免疫原性調製物を投与する前にＨＢＶワクチンを投与することによって、本発明の免疫原性調製物に対する強化された免疫反応を惹起することが可能となろう。従って、本発明は、患者に免疫反応を与える方法であって、（ｉ）前記患者にＨＢＶ免疫原性調製物を投与する工程と、（ｉｉ）本発明の免疫原性挿入物を有するＶＬＰを含有する有効量の免疫原を前記患者に投与する工程とを備えた方法も提供する。
【００５１】
さらに、本発明は、本発明のＶＬＰを含有する免疫原性調製物を提供する。該免疫原性調製物中のＶＬＰｓは、全て、同じ免疫原性挿入物を含有してもよい。或いは、前記免疫原性調製物は、各々が異なる免疫原性挿入物を含有する複数のＶＬＰｓを含有してもよい。広範囲の免疫反応の惹起が必要なときには、複数の異なるＶＬＰｓを含有する免疫原性調製物は特に有用である。例えば、各種のウイルス準種に対する防御を与えるのに必要とされるウイルスワクチンを設計する場合、異なる免疫原性挿入物を有する少なくとも２つのＶＬＰｓの「カクテル」を含有する免疫原性調製物を投与することが望ましいかもしれない。
【００５２】
本発明のＶＬＰｓが治療的に活性な物質を含む場合、それらは、患者の疾病を治療するためにも使用し得る。従って、本発明は、患者の疾病又は疾患を治療する方法であって、有効量の本発明のＶＬＰｓを前記患者に投与することを備えた方法も提供する。
【００５３】
複数の異なるＶＬＰｓを含有する調製物に代えて、本発明は、少なくとも２つの異なる挿入物を発現するＶＬＰを含有する調製物も提供する。この点において、各々が外来性エピトープ又は結合タンパク質などの異なる挿入物を含有する、異なるＨＢｓＡｇ−タンパク質によりハイブリッドＶＬＰｓを組み立て得る。
【００５４】
ＶＬＰ免疫原性調製物又は「カクテル」は、複数の感染性因子に対する防御的又は治療的に有益な免疫反応をもたらす単一のワクチンを投与するために使用してもよい。
【００５５】
本発明のＶＬＰｓを使用して選択的に標的細胞に結合させてもよい。この点において、前記ＶＬＰｓは、結合物質に対する結合ドメインを含む細胞にＶＬＰを誘導させることができる結合物質（リガンドを結合するタンパク質又はその一部）を提示してもよい。次いで、治療薬剤などの物質を標的細胞へと輸送するように標的化されたＶＬＰｓを使用し得る。
【００５６】
従って、本発明は、ある物質を標的細胞に輸送する方法であって、（ｉ）標的細胞に対して結合物質を提示するＶＬＰを調製する工程と、（ｉｉ）標的細胞を含有する媒体とＶＬＰとを接触させる工程とを備えた方法も提供する。
【００５７】
本発明のＶＬＰｓは治療薬物を与えてもよく、従って、本発明は、罹患者の疾病を治療する方法であって、前記疾病に対する治療剤を与える有効量のＶＬＰを前記罹患者に投与する工程を備えた方法も提供する。
【００５８】
本発明のＶＬＰｓを使用してＨＣＶ免疫原性調製物を調製し得る。本発明はかかる用途に限定されるものではなく、上記ポリヌクレオチド、タンパク質又はその一部、ＶＬＰｓ及びＨＣＶ免疫原及びワクチンに適用される方法を全て包含する。本実施例では、ＨＣＶに適用される本発明の使用について説明が為されている。
【００５９】
【発明を実施するための最良の形態】
一般的な材料と方法
プラスミド：プラスミドｐＳＶＨＢｓ（Ｈａｒｖｅｙら、１９９７年）をテンプレートとして使用して、ＨＢｓＡｇ−Ｓの遺伝子を増幅した。「ａ」決定基領域をコードするＨＢｓＡｇ−ＳのｃＤＮＡ中にＡｇｅｌ制限部位を作出するために、２つのオリゴヌクレオチド（Ｏｎ＃２３及びＯｎ＃２４、表１）を設計した。マルチクローニング部位上流のｐＳＶＬベクターの領域でアニールする前記ＨＢｓＡｇ−Ｓ特異的なオリゴヌクレオチド、Ｏｎ＃２４及びＯｎ＃１７（表１）を使用して、ＨＢｓＡｇ−Ｓ特異的なｃＤＮＡの５’側の半分を増幅した。
【００６０】
マルチクローニング部位のｐＳＶＬベクターの下流領域にアニールするＨＢｓＡｇ−Ｓの特異的なオリゴヌクレオチド、Ｏｎ＃２３及びＯｎ＃９（表１）を使用して、ＨＢｓＡｇ−Ｓ特異的なｃＤＮＡの３’側半分を増幅した。両ＰＣＲ産物には、前記ＨＢｓＡｇ−Ｓ　ＯＲＦの外側のＥｃｏＲｌ制限部位及び前記ＨＢｓＡｇ−Ｓ　ＯＲＦ内のＡｇｅｌ制限部位が含まれる。
【００６１】
構築物ｐＤ３−ＨＢｓ／Ａｇｅｌを得るために、両ＰＣＲ断片をＥｃｏＲｌ及びＡｇｅｌで消化し、ベクターｐＣＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）をＥｃｏＲｌで消化して、これらのＤＮＡ分子を連結した。Ａｇｅｌ部位で前記２つの断片を連結したために、ＨＢｓＡｇ−Ｓ内のアミノ酸１２７／１２８に相当する位置に、Ａｇｅｌ制限部位を有する完全なＨＢｓＡｇ−Ｓ　ＯＲＦが復活した。Ａｇｅｌ制限部位導入のために、野生型ＨＢｓＡｇ−Ｓタンパク質のアミノ酸１２８アラニンに対するコドンを、グリシンに変異した。
【００６２】
構築物ｐＤ３−ＨＢｓＡｇ／Ａｇｅｌ−７をクローンニングするために、オリゴヌクレオチドＯｎ＃３３及びＯｎ＃３４（表１）をアニールして、Ａｇｅｌ制限部位を介してｐＤ３−ＨＢｓ／Ａｇｅｌに連結した。同様の方法で、Ｏｎ＃３５及びＯｎ＃３６（表１）を使用して構築物ｐＤ３−ＨＢｓＡｇ／Ａｇｅｌ−２２を作製した。その他の構築物では、１ｂ系統に特異的なＨＣＶ　ｃＤＮＡテンプレート（Ｔｒｏｗｂｒｉｄｇｅ及びＧｏｗａｎｓ、１９９８年）を使用して、Ｅ２特異的産物を増幅した。前記ＰＣＲ産物をＡｇｅｌで消化した後、Ｄ３−ＨＢｓ／Ａｇｅｌに挿入した。
【００６３】
プラスミドｐＤ３−ＨＢｓＡｇ／Ａｇｅｌ−３５−１ａを構築するために、遺伝子型ＨＣＶ１ａ―ｃＤＮＡのテンプレートを使用した（Ｋｏｌｙｋｈａｌｏｖら、１９９７年）。下記のオリゴヌクレオチド群を使用した。ｐＤ３−ＨＢｓＡｇ／Ａｇｅｌ−３５−１ａにはＯｎ＃６３及びＯｎ＃６４（表１）。ｐＤ３−ＨＢｓＡｇ／Ａｇｅｌ−３６−１ｂにはＯｎ＃６２及びＯｎ＃４４（表１）。ｐＤ３−ＨＢｓＡｇ／Ａｇｅｌ−６０にはＯｎ＃６２及びＯｎ＃６９。ｐＤ３−ＨＢｓＡｇ／Ａｇｅｌ−８２にはＯｎ＃６２及びＯｎ＃７０（表１）。
【００６４】
【表１】
2004504067.tif 000002
細胞株及びトランスフェクション：ヒトの肝細胞癌の細胞株ＨｕＨ−７（Ｎａｋａｂａｙａｓｈｉら、１９８２年）を、ＧｌｕｔａＭａｘ−１（Ｇｉｂｃｏ　ＢＲＬ）、１０％ウシ胎児血清、ペニシリン、及びストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ　ＢＲＬ）を補充したＤＭＥＭ培地中で培養した。
【００６５】
トランスフェクション：既述のごとく（Ｇｒａｈａｍ及びｖａｎ　ｄｅｒ　Ｅｂ、１９７３年）、ＨｕＨ−７細胞をＣａ３（ＰＯ４）２法でトランスフェクトした。５日後に前記上澄み液を採取して、Ａｂｂｏｔｔ　ＰｒｉｓｍのＨＢｓＡｇアッセイ（Ａｂｂｏｔｔ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）でＨＢｓＡｇを測定した。前記細胞培養液中のＨＢｓＡｇ−Ｓの量は、市販のワクチンと比較して概算した（Ｅｎｇｅｒｉｘ−Ｂ、２０μｇ／ｍｌ、ＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ　Ｂｅｅｃｈａｍ）。既述のごとく（Ｂｅｒｇｅｒら、１９８８年）、様々なプラスミドのトランスフェクション効率を、分泌アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）活性に関して標準化した。ＳＥＡＰ活性の範囲内の変動は３倍未満であった。
【００６６】
ペプチド：ＨＣＶ　Ｅ２−タンパク質、ＨＶＲ１−１ａ、及びＨＶＲ１−１ｂに対応するＨＶＲ１領域を表す前記ペプチドは、ＢｒｉｓｂａｎｅのＱｕｅｅｎｓｌａｎｄ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　ｆｏｒ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｒｅｓｅａｒｃｈで合成され、少なくとも５０％の純度であった。
【００６７】
・ＨＣＶ　ＨＶＲ１−１ａ遺伝子型：ＥＴＨＶＴＧＧＳＡＧＲＴＴＡＧＬＶＧＬＬＴＰＧＡＫＱＮ
・ＨＣＶ　ＨＶＲ１−１ｂ遺伝子型：ＤＴＨＴＴＧＧＶＡＧＲＤＴＬＲＦＴＧＦＦＳＦＧＰＫＱＫ
無関係のペプチドは、ヒト乳頭腫ウイルスタイプ１６のＥ７タンパク質から得た。これはＣｈｉｒｏｎ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓによって合成され、ＨＬＰＣ及び質量分光法で品質管理が行われた。
【００６８】
・ＨＰＶ−Ｅ７：　ＤＳＴＬＲＬＣＶＱＳＴＨＶＤＩＲＴＬ
ＥＬＩＳＡ：ＰＢＳ中のペプチド（０．５μｇ／ウェル）を４℃でマイクロタイタープレート（Ｍａｘｉｓｏｒｂ　Ｎｕｎｃ）に１晩結合させ、その後、室温で２時間、ゼラチン（０．２５％）及びＴｗｅｅｎ２０（０．１％）を加えたＰＢＳ中で各ウェルをブロッキングした。前記血清はゼラチン（０．１２５％）及びＴｗｅｅｎ２０（０．０５％）を加えたＰＢＳ中において、適切な希釈度で、３７℃で１時間インキュベートした。
【００６９】
西洋ワサビペルオキシダーゼ（Ｄａｋｏ）を抱合した抗マウス又は抗ヒト免疫グロブリン抗体を使用して、抗体結合を検出した。数度の洗浄課程を終えた後に、クエン酸リン酸緩衝液中のＡＢＴＳ（２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンズ−チアゾリン−６−スルホン酸、Ｓｉｇｍａ）及びＨ２Ｏ２の存在下で、抗体結合を可視化した。蔗糖クッション上、及びＣｓＣｌグラジエントを使用して、ＨＶＲ１−１ｂペプチドを発現する細胞培養由来ＶＬＰｓを精製した（下記参照）。
【００７０】
並行して、非トランスフェクトＨｕＨ−７細胞由来の細胞培地を同様に処理し、適切な密度を有する偽分画を収集した。前記分画を濃縮し、その粒子をＭｉｃｒｏｃｏｎ　ＹＭ−１００濾過器具（Ａｍｉｃｏｎ）を使用してＣｓＣｌから精製した。市販のワクチンを標準として使用して概算したところによれば、各ウェルは、ＰＢＳ中の約５００ｎｇのＶＬＰｓで被覆されていた。患者の血清サンプルを細胞培地中でプレインキュベートして、バックグラウンドシグナルを減少させ、その後ＥＬＩＳＡで分析した。
【００７１】
ヒト血清：前記血清ＤＫは、オーストラリアＨＣＶ単離株がクローニングされた患者から得た。（Ｔｒｏｗｂｒｉｄｇｅ及びＧｏｗａｎｓ、１９９８年）。
【００７２】
動物：生後６−１５週のＣ５７Ｂｌ／６及びＢａｌｂ／ｃマウスを使用した。所定の実験内では、マウスは同腹子、又は年齢及び性が同一であった。前記マウスは、特定病原体感染防止条件下で飼育した。Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌアジュバントの存在下で、２５０ｎｇ〜５００ｎｇの組換えＨＢｓＡｇ　ＶＬＰｓで、２〜４匹のマウス群を、その尾の基部の皮下に免疫化した。負の対照として使用したマウスは、アジュバントのみで免疫化した。２度目の免疫化から１４日目後から、間隔をあけて、マウスの眼窩後方の神経叢から血を採取し、前記血清をＥＬＩＳＡで使用した。
【００７３】
遠心分離：２０％ショ糖クッション（ＳＴＥバッファー中のショ糖が２０％：１００ｍＭ　ＮａＣｌ、１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ、ｐＨ８、１ｍＭ　ＥＤＴＡ）上に、ＶＬＰｓを含有する細胞培養上清を重層し、２３，０００ｒｐｍで１６時間遠心分離機にかけた（ＡＨ−６２９ローター、Ｓｏｒｖａｌｌ）。前記部分精製したＶＬＰｓをＨｅｐｅｓバッファー中に再懸濁し、ワクチン接種処置に使用した。
【００７４】
前記ＶＬＰｓの浮遊密度を決定するために、及び精製の目的で、前記再懸濁ＶＬＰｓを１０％〜４０％（ｗ／ｗ）ＣｓＣｌステップグラジエント（ＳＴＥバッファー中）に負荷して、３６，０００ｒｐｍで２２時間遠心分離機（ＳＷ４１Ｔｉ、Ｂｅｃｋｍａｎ）にかけ、２００μｌの分画を試験管の底から採取した。ＶＬＰｓを含有する前記分画をＰｒｉｓｍ　ＨＢｓＡｇアッセイ（Ａｂｂｏｔｔ）によって同定した。前記陽性の分画を脱塩して濃縮し、Ｍｉｃｒｏｃｏｎ　ＹＭ−１００（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）濾過器具を使用してＰＢＳで洗浄した。
【００７５】
例１　１−ＨＢｓＡｇ−Ｓ／ＨＣＶ−ＨＶＲ１キメラタンパク質
方法／結果
本発明者等は、ＨＢｓＡｇ−Ｓウイルス様粒子中に挿入すべき外来配列として、免疫優性ＨＶＲ１領域を使用した。これらのＶＬＰｓを合成するために、本発明者等は、ＨＢｓＡｇ−Ｓ遺伝子を改変して、「ａ」決定基の主要な親水性外側ループの露出領域にＨＶＲ１を挿入することを可能にする新しいＡｇｅＩ制限部位を作製した。挿入されたＨＣＶ特異的Ｂ細胞エピトープの表面配向を確保するために、前記構築物をこのように設計した。ＨＢｓＡｇ−Ｓ　ＯＲＦ内のこの新しいＡｇｅＩ部位では、１２８番目の位置でアラニンがグリシンに置換された（図１Ａ）。図１Ａ中の番号は、ＨＢｓＡｇ−Ｓ内のアミノ酸の位置を示す。四角内のヌクレオチド配列は、ＡｇｅＩ部位を表す。
【００７６】
鎖長の異なるＨＣＶ特異的ペプチドをコードする一連のｃＤＮＡ配列をＡｇｅＩ部位に挿入した。各挿入断片は、グリシンで始まり、オーストラリアＨＣＶ−１ｂ分離株（ＴｒｏｗｂｒｉｄｇｅとＧｏｗａｎｓ、１９９８）由来のＥ２タンパク質ＨＶＲ１配列が続き、挿入断片のＣ末端終端はスレオニンとグリシンである。種々のプラスミドが、ＨＶＲ１領域の４ａａ、１９ａａ、又は全２７ａａをコードした（図１Ｂ）。完全なＨＶＲ１領域をコードするプラスミドは、図示したように、Ｅ２タンパク質の下流の５ａａ、６ａａ、３０ａａ、又は５２ａａも含んだ（図１Ｂ）。さらに、完全なＨＶＲ１ポリペプチドとＨＣＶ−１ａ単離株（Ｋｏｌｙｋｈａｌｏｖ等、１９９７）由来の下流５ａａを発現する一構築物（ｐＤ３−ＨＢｓＡｇ／ＡｇｅＩ−３５−１ａ）も作製した。
【００７７】
図１Ｂでは、１番目のアミノ酸はＨＣＶ−Ｅ２タンパク質配列部分にはないグリシンであり、最後の２個のアミノ酸（スレオニンとグリシン）はＨＣＶ−Ｅ２挿入断片下流のＡｇｅＩヌクレオチド配列によってコードされる。点刻された長方形はＥ２のＨＶＲ１領域を示し、クロスハッチの長方形はＨＶＲ１領域下流のＥ２配列を表す。点刻及びクロスハッチの長方形の上の数字は、対応するＨＶＲ１領域及びＥ２下流領域のコードされたアミノ酸の数を示す。１１１番と１５６番のアミノ酸の間のＨＢｓＡｇ−Ｓ配列は、外側の親水性ドメインを表す。
【００７８】
例２　細胞培養上清中の組換えＨＢｓＡｇ及びＨＤＡｇ−Ｌの検出
方法／結果
ＨｕＨ−７細胞を、ＨＢｓＡｇタンパク質、ＨＤＡｇ−Ｌ、及びｐＳＥＡＰを発現するプラスミドと同時トランスフェクトした。上清を回収し、化学発光アッセイによりＨＢｓＡｇを測定した（図２Ａ）。ＳＥＡＰアッセイにより光カウント数を規格化した。異なる組換えＨＢｓＡｇタンパク質の存在下でＨＤＡｇ−Ｌの分泌を確認するため、同一の上清を使用した。ショ糖クッション液を通して、上清１０ｍｌをペレット化し、試料緩衝液に再懸濁し、ＨＤＡｇに特異的なイムノブロットにより分析した（図２Ｂ）。
【００７９】
Ａ１２８Ｇ変異では、ｐＤ３−ＨＢｓＡｇ／ＡｇｅＩからの分泌レベルが野生型ＨＢｓＡｇの約７０％まで明らかに低下した。７ａａを挿入すると、光カウント数が約５０％に減少し、さらにＨＶＲ１の長さを伸ばすと、分泌効率が明らかにいっそう大きく低下した。その結果、８２ａａの挿入断片を含むＨＢｓＡｇは、負の対照とほぼ同じ光カウント数を示した（図２Ａ）。しかし、光カウント数の減少は、改変に起因する、組換えＨＢｓＡｇタンパク質の分泌効率の減少、又はａｎｔｉ−ＨＢｓＡｇ　ＩｇＭ抗体の親和性の低下（Ｐｒｉｓｍ　ＨＢｓＡｇアッセイ、Ａｂｂｏｔ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）のいずれかを反映しているのかもしれない。
【００８０】
この問題に取り組むため、大型肝炎δ抗体（Ｌ−ＨＤＡｇ）を発現するプラスミドとの同時トランスフェクトを行った。Ｌ−ＨＤＡｇは、ＨＢｓＡｇ−Ｓが封入に十分であり、機能性ＨＢＶエンベロープタンパク質の存在下でのみ封入され、分泌され得る（Ｃｈａｎｇ等　１９９１、Ｗａｎｇ等　１９９１）。この場合、上清中のＬ−ＨＤＡｇをイムノブロット分析により測定することによって、分泌を定量化した（図２Ｂ）。
【００８１】
この実験の結果から、外側ループにさらに３５ａａ又は３６ａａを含む組換えＨＢｓＡｇ−Ｓタンパク質（図２Ｂ、５及び６レーン）が、野生型ＨＢｓＡｇ−Ｓ（図２Ｂ、１レーン）と同等の効率でＬ−ＨＤＡｇの分泌を持続させることが示された。したがって、これらの組換えＨＢｓＡｇ−Ｓタンパク質が野生型ＨＢｓＡｇと全く同じ効率で分泌される可能性がある。さらに、Ｌ−ＨＤＡｇが分泌されることは、これらの組換えＨＢｓＡｇ−Ｓタンパク質が、この相互作用に必要な構造上の特徴を保持していることも示している。
【００８２】
一方、６０ａａの挿入断片を含有する組換えエンベロープタンパク質が同時発現すると、Ｌ−ＨＤＡｇ分泌の持続能力が低下し（図２Ｂ、７レーン）、ＨＢｓＡｇ−Ｓ中に８２ａａが挿入された組換えタンパク質は、Ｌ−ＨＤＡｇの分泌を持続することができなかった（図２Ｂ、８レーン）。これらのより大きな挿入断片が、これらのタンパク質の安定性、組換えＨＢｓＡｇ−Ｓの分泌能力を妨げ、及び／又はＬ−ＨＤＡｇの分泌を妨げる構造変化をもたらしたのかもしれない。
【００８３】
例３　組換え粒子のキャラクタリゼーション
方法／結果
３５ａａ挿入断片を含む上記ＨＢｓＡｇ調製物は、分泌されて、Ｐｒｉｓｍ　ＨＢｓＡｇアッセイにより認識されたと考えられるが、粒子を形成したかどうかを判定することが重要であった。この目的のために、野生型ＨＢｓＡｇ−Ｓを発現するプラスミド又は組換えＨＢｓＡｇ／ＡｇｅＩ−３６−１ｂタンパク質を、ＨｕＨ−７細胞中に個別にトランスフェクトし、その細胞培地を回収し、粒子を濃縮し、２０％ショ糖クッション液を通して遠心した後にＣｓＣｌ密度勾配法により精製した。
【００８４】
個々の勾配画分のＨＢｓＡｇ含量をＰｒｉｓｍ　ＨＢｓＡｇアッセイで測定した。野生型及び組換えＨＢｓＡｇは、密度１．２ｇ／ｍｌの画分中に検出された（図３）。この密度は野生型ＨＢｓＡｇ粒子の密度を意味するため（Ｄｕｂｏｉｓ等　１９８０、Ｍｏｒｉａｒｔｙ等　１９８１）、このことは、組換えＨＢｓＡｇが野生型ＨＢｓＡｇと同様にして粒子を生成したことの確たる証拠を提供するものである。
【００８５】
このことを確認するため、想定される粒子を電子顕微鏡法で検討した。ＨＢＶ慢性保菌者から、並びにＨＢｓＡｇ／ＡｇｅＩ−３６−１ｂを発現するプラスミドをトランスフェクトしたＨｕＨ−７細胞の上清から粒子を採取し、次いでショ糖クッション液及び上述のＣｓＣｌ勾配法で精製した。いずれの試料も約２２ｎｍの粒子を含有し（図４）、組換えＨＢｓＡｇ由来の粒子を野生型から識別することは、実質的に不可能であった。組換えタンパク質から採取した試料中には、フィラメント及びデーン粒子は存在しなかった。
【００８６】
例４　組換え粒子のヒト血清との反応性
方法／結果
次に、組換え２２ｎｍ粒子の表面にＨＣＶ　ＨＶＲ１領域が出現したかどうか、及びその抗原性が含まれているかどうかを判定するために、組換え粒子を検査した。ＨＣＶのオーストラリア単離株（遺伝子型１ｂ）は、同種骨髄移植を受けた後に急性Ｃ型肝炎に罹った単一個体（ＤＫ）からクローン化されたので（ＴｒｏｗｂｒｉｄｇｅとＧｏｗａｎｓ　１９９８）、ＨＶＲ１領域に対して作られる抗体について、まずＨＶＲ１特異的ペプチドを用い、その後組換え粒子を用いるＥＬＩＳＡによってこの患者の血清を検査した。標準のオーストラリアＨＣＶ１−１ｂ単離株及びＨＶＲ１−１ａ単離株（Ｋｏｌｙｋｈａｌｏｖ等　１９９７）の配列を示すＨＶＲ１特異的ペプチドを使用した。
【００８７】
このＤＫ血清は、ＨＶＲ１−１ｂペプチドとは特異反応を示したが、ＨＶＲ１−１ａペプチド又は無関係なペプチドとは反応しなかった（図５Ａ）。次いで、本発明者等は、ＶＬＰｓが提示するＨＶＲ１−１ｂエピトープがその抗原性を保有するかどうかを調べた。この血清は、発現されたＨＶＲ１−１ｂエピトープを有するＶＬＰｓと専ら反応し、野生型ＶＬＰｓや偽画分とは反応しなかった（図５Ｂ）。このことから、ＨＢｓＡｇ−Ｓの「ａ」決定基内に提示されたＨＶＲ１エピトープが、自然感染の間、その抗原性を保有し、ＨＶＲ１の構造と同一又は類似の構造でＶＬＰｓ表面に現れる可能性が高いことが示された。
【００８８】
例５　組換えＶＬＰｓはマウスでは免疫原性である。
【００８９】
方法／結果
プラスミドＨＢｓＡｇ／ＡｇｅＩ−３５−ｌａ又はＨＢｓＡｇ／ＡｇｅＩ−３６−１ｂ（図１Ｂ）から発現される粒子を部分的に精製し、マウスに注射した。２つの実験で、合計４匹のマウスをＨＶＲ１−１ａ粒子で免疫し、４匹のマウスをＨＶＲ１−１ｂ粒子で免疫した。ＥＬＩＳＡで測定されたように、ＨＢｓＡｇ−Ｓ／ＨＶＲ１−１ａ粒子を注射した全４匹のマウス血清は、ＨＶＲ１−１ａペプチドと反応性があった。最後のブースター注射をしてから９日又は１９日に採取した血清は、ＨＶＲ１−１ａペプチドに対し１：４００〜１：３２００の抗体価を示した（データ示さず）。
【００９０】
ＨＢｓＡｇ／ＡｇｅＩ−３５−１ａ　ＶＬＰｓで免疫した１匹のマウスの代表的な結果を図６Ａに示す。異なる時点で血清を採取し、ＨＶＲ１−１ａペプチド、ＨＶＲ１−１ｂ特異的ペプチド、及び無関係なペプチドに対して試験した（１：５０及び１：２００希釈）。結果は、複数回の試験の平均値と標準偏差を示す。
【００９１】
５６日（最後のブースター注射から９日後）に採取した血清試料は、ＨＶＲ１−１ａペプチドに対する抗体価が１：１６００であり、この抗体レベルは少なくとも９週間持続した。同様に、ＨＢｓＡｇ−Ｓ／ＨＶＲ１−１ｂ粒子を注射した４匹のマウスのうち３匹の血清は、ＨＶＲ１−１ｂペプチドと反応性があった。しかし、ＨＶＲ１−１ｂペプチドに対して得られた抗体価はより低く（１：５０〜１：８００の範囲、データは示さず）、マウス系ではＨＶＲ１−１ｂエピトープの免疫原性がより低いことが示唆された。ＨＢｓＡｇ／ＡｇｅＩ−３６−１ｂ　ＶＬＰｓで免疫した１匹のマウスに対する代表的な結果を図６Ｂに示す。ＨＶＲ１−１ｂペプチドに対する抗体価は１：８００であり、これも少なくとも９週間持続した。
【００９２】
ＨＢｓＡｇ／ＡｇｅＩ−３５−１ａ　ＶＬＰｓで免疫したマウスは、ＨＶＲ１−１ｂペプチドと交差反応性の抗体を発生せず、その逆も同様であった。このことは、ＨＶＲ１−１ｂペプチドとは反応性があるが、ＨＶＲ１−１ａペプチドとは交差反応性を示さない、患者血清の上記ＥＬＩＳＡ試験データと一致する（図５Ａ）。
【００９３】
例６　ＶＬＰｓ併用による免疫
方法／結果
ＨＶＲ１−１ａ及びＨＶＲ１−１ｂエピトープに対して同時に抗体を産生できるかどうかを検討するために、ＨＢｓＡｇ／ＡｇｅＩ−３５−１ａ　ＶＬＰｓとＨＢｓＡｇ／ＡｇｅＩ−３６−１ｂ　ＶＬＰｓの等モル混合物で４匹のマウスを免疫し、個々のペプチドに対する抗体応答をＥＬＩＳＡで試験した。
【００９４】
４匹中３匹のマウスの血清試料は両エピトープと反応し、４匹目のマウスの血清試料は、ＨＶＲ１−１ａエピトープと弱く反応したが（抗体価１：５０〜１：２００）、ＨＶＲ１−１ｂエピトープとは反応しなかった（データは示さず）。ＨＶＲ１−１ａ及び−１ｂの両エピトープと強く反応した３匹のマウスの血清試料（５６日、すなわち最後のブースター注射から９日後に採取）は、ＨＶＲ１−１ａエピトープに対して１：６４００〜１：１２８００の抗体価を示した。ＨＶＲ１−１ｂエピトープに対する抗体価は、１：１６００〜１：６４００であった。いずれの場合でも、これらの抗体価は、個々の組換え粒子による免疫で得られた値よりもかなり高かった。２匹のマウスの代表的な結果を図７に示す。
【００９５】
この結果から、混合組換え粒子による免疫で生じたより高い抗体価が、相乗効果で説明され得ることが示唆される。ペプチドＨＶＲ１−１ａとＨＶＲ１−１ｂの抗体は、最後のブースター免疫後少なくとも１２週持続した。
【００９６】
例７　ＨＢＶ表面抗原に対する免疫が前もって存在しても、組換えＨＢＶ特異的ＶＬＰｓを用いたワクチン再接種は許容される
目的
この例の目的は、ＨＶＲ１−１ａ配列を含む組換えＨＢｓＡｇ粒子を用いたワクチン接種によるａｎｔｉ−ＨＶＲ１抗体の生成に、ＨＢｓＡｇに対する既存の抗体（ａｎｔｉ−ＨＢｓ）が影響するかどうかを検討することであった。
【００９７】
方法／結果
この例で使用した構築物は、プラスミドｐＤ３−ＨＢｓＡｇ／ＡｇｅＩ−３５−１ａであり、使用したＢ型肝炎ワクチンはＥｎｇｅｒｉｘＢであった。
【００９８】
Ｇｌｕｔａｍａｘ−１（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）、１０％ウシ胎児血清、ペニシリン、及びストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）を補充したダルベッコ修正イーグル培地（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）中でヒト肝癌細胞系ＨｕＨ−７（８）を増殖させた。参考文献（４）に記載のＣａ３（ＰＯ４）２法によりＨｕＨ−７細胞をトランスフェクトした。上清を５日後に回収し、Ａｂｂｏｔｔ　Ｐｒｉｓｍ　ＨＢｓＡｇアッセイ（Ａｂｂｏｔｔ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）により、ＨＢｓＡｇ−Ｓの有無を測定した。
【００９９】
免疫のために、上述のように、組換えＶＬＰｓを部分的に精製し、Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌアジュバントの存在下で使用した。
【０１００】
６〜１５週齢のＢａｌｂ／ｃマウスを使用し、同腹仔又は年齢が接近した同性のマウスを実験に用いた。これらのマウスは、特異的病原体のない条件で飼育した。Ｅｎｇｅｒｉｘ−Ｂ（２０μｇ／ｍｌ　ＨＢｓＡｇ、ＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ　Ｂｅｅｃｈａｍ）で免疫するために、１００μｌを尾底部に皮下注射した。組換えＶＬＰｓ約５００ｎｇを上述のワクチン接種に使用した。負の対照として使用したマウスは、アジュバントのみで免疫した。マウスの眼窩後神経叢又は尾静脈から時々採血し、抗体濃度をＥＬＩＳＡで測定した。ＨＶＲ１−１ａペプチド（５００ｎｇ／ウェル）又は酵母由来ＨＢｓＡｇ（５０ｎｇ／ウェル）を塗布したマイクロタイタープレートを用いて、上述の通りＥＬＩＳＡを実施した。
【０１０１】
４グループのＢａｌｂ／ｃマウスを検討した。すなわち、グループ１にはＥｎｇｅｒｉｘＢワクチンのみを与え、グループ２にはＥｎｇｅｒｉｘＢの後にＨＢｓＡｇ／ＨＶＲ１−１ａ　ＶＬＰｓを与え、グループ３にはＨＢｓＡｇ／ＨＶＲ１−１ａ　ＶＬＰｓのみを与え、グループ４にはＨＢｓＡｇ／ＨＶＲ１−１ａ　ＶＬＰｓの後にＥｎｇｅｒｉｘＢを与えた（表２）。ワクチン接種をしていない１動物（＃１５）を対照に使用した。
【０１０２】
【表２】
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Ａ．ａｎｔｉ−ＨＢｓ抗体をすでに保有するマウス及び保有しないマウスのＨＢｓＡｇ／ＨＶＲ１−１ａ　ＶＬＰｓによる免疫
グループ１及び２のマウスを０日と１０日にＥｎｇｅｒｉｘＢで免疫すると、全８匹のマウスが１８日までにＨＢｓＡｇに対して抗体を生成した。図８Ａは、３３日に採取した血清試料に対して実施したａｎｔｉ−ＨＢｓ特異的ＥＬＩＳＡの結果であり、全ての試料が陽性であった。対応する免疫前血清試料は陰性であった（データは示さず）。ＥｎｇｅｒｉｘＢで免疫されていないマウス（グループ３及び動物＃１５）は、ａｎｔｉ−ＨＢｓを生成しなかった。
【０１０３】
５匹のａｎｔｉ−ＨＢｓ陽性マウス（グループ２）を、２４日と６１日にＨＢｓＡｇ／ＨＶＲ１−１ａ　ＶＬＰｓで免疫した。対照及び基準として、既存のａｎｔｉ−ＨＢｓのない３匹の未処置のＢａｌｂ／ｃマウス（グループ３）も、２４日と６１日にＨＢｓＡｇ／ＨＶＲ１−１ａ　ＶＬＰｓで免疫した。グループ２とグループ３のマウスはいずれも、７５日に採取した血清試料で判定してａｎｔｉ−ＨＶＲ１−１ａ抗体を生成した（図８Ｂ）。マウス＃１５から得た血清試料は、ＨＢｓＡｇ粒子又はＨＶＲ１−１ａ特異的ペプチドとは反応性がなかった（図８）。これらの結果から、ＨＶＲ１エピトープを含むＶＬＰｓは、すでに存在するａｎｔｉ−ＨＢｓ応答にかかわらず免疫原性であることが示唆され、その光学濃度（ＯＤ）値（グループ２マウスＯＤ約０．２０〜約０．６、グループ３マウスＯＤ約０．２５〜約０．７）から、ａｎｔｉ−ＨＶＲ１−１ａ抗体応答の強度に実質的な差がないことが示された（図８Ｂ）。
【０１０４】
そのため、各マウスからの血清試料を時間を変えて採取し、抗体価を測定した。各時点での抗体価の算術平均を時間の関数としてプロットした（図９及び図１０）。ＥｎｇｅｒｉｘＢで免疫したマウス（グループ１とグループ２）のすべてが、１８日までに抗体価１：６００〜１：８００のａｎｔｉ−ＨＢｓを生成した。図９Ａは、グループ２のマウスのデータである。６１日目の抗体価の算術平的は１：２４０００であり、最低及び最高抗体価は、それぞれ１：６４００及び１：５１２００であった。この抗体価は、試験最終時点の１９９日まで持続した（図９Ａ）。グループ２の５匹中２匹のマウスが、ａｎｔｉ−ＨＶＲ１−１ａ抗体を６１日までに生成し（抗体価１：３００及び１：８００）、このグループの全てのマウスが７５日までにａｎｔｉ−ＨＶＲ１−１ａ抗体を生成した。最低及び最高抗体価は、それぞれ１：２００及び１：３２００であった（図９Ｂ）。１４３日と１５３日の間（１：２４６０から１：７００へ）の破線（図９Ｂ）で示されるａｎｔｉ−ＨＶＲ１−１ａ抗体価の算術平均の減少は、最高ａｎｔｉ−ＨＶＲ１−１ａ抗体価を有する２匹の動物を眼炎のため１４３日目に屠殺しなければならなかったことによる。ＨＢｓＡｇ／ＨＶＲ１−１ａ　ＶＬＰｓによって誘導されるａｎｔｉ−ＨＶＲ１−１ａ免疫応答は、免疫後さらに少なくとも１００日持続した。ＨＢｓＡｇ／ＨＶＲ１−１ａ　ＶＬＰｓを与えなかったａｎｔｉ−ＨＢｓ陽性マウス（グループ１、表２）は、ａｎｔｉ−ＨＶＲ１−１ａ抗体応答を示さなかった（図８Ｂ、データは示さず）。
【０１０５】
グループ３のマウスは、ＨＢｓＡｇ／ＨＶＲ１−１ａ　ＶＬＰｓのみで免疫され（表２）、このグループのａｎｔｉ−ＨＶＲ１−１ａ抗体価を、すでにａｎｔｉ−ＨＢｓを保有するマウスのそれと比較した（グループ２）。この改変粒子がａｎｔｉ−ＨＢｓ免疫応答を誘導できるかどうかを評価するために、このグループのａｎｔｉ−ＨＢｓ応答を始めに測定した。異なる時点で採取した血清試料の滴定から、ＨＢｓＡｇ／ＨＶＲ１−１ａ　ＶＬＰｓによる免疫が、未改変のＨＢｓＡｇ粒子に対して作製される抗体を誘導することが示された。３匹のマウスのうち２匹が、ａｎｔｉ−ＨＶＲ１−１ａ抗体（下記参照）と同時にａｎｔｉ−ＨＢｓ抗体（図１０Ａ）を７５日までに生成した。ａｎｔｉ−ＨＢｓ抗体の抗体価は、１：２００と１：３２００であった。ＥｎｇｅｒｉｘＢで免疫したマウス（グループ２）（図９Ａ）又はＨｕＨ−７細胞内で合成された野生型ＨＢｓＡｇ粒子（データは示さず）と比較して、これらの抗体価は低く、数匹のマウスではａｎｔｉ−ＨＢｓを検出できなかった。
【０１０６】
したがって、３５ａａを「ａ」決定基領域に挿入すると、ＨＢｓＡｇタンパク質の「ａ」決定基に特異的なエピトープの免疫原性が妨害される。グループ３マウスにおいてａｎｔｉ−ＨＶＲ１−１ａ応答を評価すると、グループ２と同様に、３匹のマウスのうち１匹で６１日（１：５０）までにａｎｔｉ−ＨＶＲ１−１ａ応答を生じ、７５日までには全てのグループ３マウスがＨＶＲ１−１ａに対し免疫応答を生じたことが示された（図１０Ｂ）。７５日目の抗体価の算術平均は１：３３００であり、最低及び最高抗体価はそれぞれ１：４００及び１：６４００であった。これらの抗体価はまた、グループ２マウスで生じるａｎｔｉ−ＨＶＲ１−１ａ抗体価にほぼ等しく、７５日目に採取した血清試料に対して決定されるａｎｔｉ−ＨＶＲ１−１ａ特異的ＯＤ値と相関した（図８）。グループ２マウスと同様に、グループ３マウスのａｎｔｉ−ＨＶＲ１−１ａ抗体応答は、さらに少なくとも１００日間持続した（図１０Ｂ）。
【０１０７】
Ｂ．改変ＨＢｓＡｇ　ＶＬＰｓとその後のＥｎｇｅｒｉｘＢによるマウスの免疫
野生型ＨＢｓＡｇ粒子と「ａ」決定基で改変されたＨＢｓＡｇ粒子とのワクチン接種が相互に干渉しないことを確認するために、ＥｎｇｅｒｉｘＢワクチン接種前のＨＢｓＡｇ／ＨＶＲ１−１ａ　ＶＬＰｓワクチン接種の効果を評価した。グループ４の３匹のマウス（表２）に、ＨＢｓＡｇ／ＨＶＲ１−１ａ　ＶＬＰｓを注射したところ、１５３日目にそれぞれ１：３００、１：６４００、及び１：２５６００のａｎｔｉ−ＨＶＲ１−１ａ抗体価を示した（図１１Ｂ）。１匹のマウスは、１：２００（６１日）〜１：６００（１６０日）のａｎｔｉ−ＨＢｓ抗体価も示した（図１１Ａ）。これらのマウスをその後１６０日、１７２日、１８５日にＥｎｇｅｒｉｘＢで免疫した。全てのマウスが、抗体価が１：６００〜１：１２８００のａｎｔｉ−ＨＢｓ抗体を１８５日までに生成し、抗体価は１９９日目には１：３２００〜１：２５６００に上昇した。したがって、ＨＢｓＡｇ／ＨＶＲ１−１ａ　ＶＬＰｓによる免疫は、標準的なＨＢＶワクチンであるＥｎｇｅｒｉｘＢでの免疫後にＨＢｓＡｇ抗体が合成されるのを妨害しなかった。
【０１０８】
本発明は、当業者には自明な修正及び変更を発明の範囲に包含する。また、本明細書を通して、別段の記載がない限り、「備える（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、又は「備えている（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ　ｏｒ　ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの変形は、規定の要素又は要素群を全て包含するが、他のいかなる完全な要素又は要素群を除外するものではないことを理解すべきである。
【０１０９】
【参考文献】
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【図面の簡単な説明】
【図１】
ＨＣＶ−ＨＶＲ１ペプチドをＨＢｓＡｇ−Ｓの親水性ループに挿入する方法の図解。Ａ）Ａｇｅｌクローニング部位導入前後の、ＨＢｓＡｇ−Ｓヌクレオチド配列及びそれに対応するアミノ酸配列の一部。Ｂ）改変ＨＢｓＡｇ−ＳのＤＮＡ配列のＡｇｅｌクローニング部位にＨＣＶ配列を封入して得た構築物。
【図２】
細胞培養上清中での組換えＨＢｓＡｇとＨＤＡｇ−Ｌの検出。Ａ）棒グラフは、化学発光測定法で測定した組換えＨＢｓＡｇタンパク質の発現を示している。Ｂ）組換えＨＢｓＡｇタンパク質を含有する前記上清の存在下で分泌されたＨＤＡｇ−Ｌの免疫ブロット。−１列目：ＨＢｓＡｇ−野生型、２列目：ＨＢｓＡｇ／Ａｇｅｌ、３列目ＨＢｓＡｇ／Ａｇｅｌ−７、４列目：ＨＢｓＡｇ／Ａｇｅｌ−２２、５列目：ＨＢｓＡｇ／Ａｇｅｌ−３５−１ａ、６列目：ＨＢｓＡｇ／Ａｇｅｌ−３６−１ｂ、７列目：ＨＢｓＡｇ／Ａｇｅｌ−６０、８列目：ＨＢｓＡｇ／Ａｇｅｌ−８２、９列目：ＨＢｓＡｇなし。
【図３】
細胞培養液から単離したＨＢｓＡｇ−ＶＬＰｓの平衡密度勾配分析。Ａ）ＨＶＲ１−１ｂを発現する組換え粒子。Ｂ）野生型粒子。
【図４】
電子顕微鏡による前記粒子の同定。Ａ）担体由来の野生型ＨＢｓＡｇ粒子。Ｂ）構築物ｐＤ３−ＨＢｓＡｇ／Ａｇｅｌ−３６−１ｂ由来の組み換え粒子。
【図５】
ＥＬＩＳＡによるヒト血清と組換え粒子の反応性。Ａ）ＨＶＲ１−１ｂ配列並びにＨＶＲ−１ａ配列に相当するペプチド及び無関係のペプチドに対して、患者ＤＫから採取した前記血清の検査を行った。Ｂ）前記ＨＶＲ１−１ｂエピトープを含有する組換えＨＢｓＡｇ粒子、野生型ＨＢｓＡｇ粒子、及び非形質導入ＨｕＨ−７細胞の細胞培養液由来の偽分画に対して、血清ＤＫの検査を行った。
【図６Ａ】
ＥＬＩＳＡで測定したマウスの組換えＶＬＰｓの免疫原性。ＨＢｓＡｇ／Ａｇｅｌ−３５−１ａ組換え粒子で免疫したマウスから採取した血清サンプル（Ａ）。
【図６Ｂ】
ＥＬＩＳＡで測定したマウスの組換えＶＬＰｓの免疫原性。ＨＢｓＡｇ／Ａｇｅｌ−３６−１ｂ組換え粒子で免疫化したマウスから採取した血清サンプル（Ｂ）。
【図７Ａ】
ＥＬＩＳＡで測定した、ＶＬＰｓの組み合わせで免疫化したマウスにおける抗体の誘導。Ａ）様々な時点で２匹のマウスから血清を採取して、Ｂ）ＨＢｓＡｇ／Ａｇｅｌ−３６−１ａ及びＨＢｓＡｇ／Ａｇｅｌ−３６−１ｂ組換え粒子でそれぞれ免疫化した。１：５０及び１：２００希釈のＨＶＲ１−１ａペプチド、ＨＶＲ１−１ｂ特異的なペプチド、及び無関係のペプチドに対して、血清サンプルの検査を行った。
【図７Ｂ】
ＥＬＩＳＡで測定した、ＶＬＰｓの組み合わせで免疫化したマウスにおける抗体の誘導。Ａ）様々な時点で２匹のマウスから血清を採取して、Ｂ）ＨＢｓＡｇ／Ａｇｅｌ−３６−１ａ及びＨＢｓＡｇ／Ａｇｅｌ−３６−１ｂ組換え粒子でそれぞれ免疫化した。１：５０及び１：２００希釈のＨＶＲ１−１ａペプチド、ＨＶＲ１−１ｂ特異的なペプチド、及び無関係のペプチドに対して、血清サンプルの検査を行った。
【図８】
ＥＬＩＳＡで測定した、マウスにおけるＨＢｓＡｇ粒子の免疫原性。Ａ）抗ＨＢｓの検出；３３日目に採取した血清を１：２００（黒線）及び１：４００（灰色の線）で希釈した。Ｂ）抗ＨＶＲ１−１ａの検出；７５日目に採取した血清を１：５０（黒線）及び１：２００（灰色の線）で希釈した。結果は、複数の検査の平均光学密度及び標準偏差を示す。破線は切り捨て値を示す。
【図９】
最初にＥｎｇｅｒｉｘ−Ｂで予防接種した後、ＨＢｓＡｇ／ＨＶＲ１−１ａ　ＶＬＰｓで予防接種したマウスから得た血清サンプル中の（Ａ）ＨＢｓＡｇに対する抗体価、及び（Ｂ）ＨＶＲ１−１ａエピトープ（２群、表２）。前記サンプルを様々な時点で採取して、時間の関数（日）として示す。アステリスク（＊）はＥｎｇｅｒｉｘ−Ｂで免疫化した０日目と１０日目を現し、ハッシュ（＃）はＨＢｓＡｇ／ＨＶＲ１−１ａ　ＶＬＰｓで免疫化した２４日目と６１日目を表す。前記力価を算術平均とし（点で示す）、棒線は測定した抗体価の最高値と最低値を示す。破線は、１４３日目に２匹のマウスを屠殺しなければならなかったことと、１５３日目以降に３匹のマウスから得られた前記力価の算術平均を示す。
【図１０】
様々な時点で採取したマウスの血清サンプル（３群、表２）中の（Ａ）ＨＢｓＡｇに対する抗体価、及び（Ｂ）ＨＶＲ１−１ａエピトープに対する抗体価を時間の関数（日）として示す。３匹のマウスを２４日目及び６１日目にＨＢｓＡｇ／ＨＶＲ１−１ａ　ＶＬＰｓで免疫した（＃で示す）。前記力価は算術平均として与えられており（点で示す）、棒線は測定した抗体価の最高値と最低値を示す。
【図１１】
ＨＢｓＡｇ／ＨＶＲ１−１ａ　ＶＬＰｓで免疫化し、その後Ｅｎｇｅｒｉｘ−Ｂで免疫化したマウスから採取した血清サンプル中の（Ａ）ＨＢｓＡｇに対する抗体価、及び（Ｂ）ＨＶＲ１−１ａエピトープに対する抗体価（４群、表２）。３匹のマウスを、ＨＢｓＡｇ／ＨＶＲ１−１ａ　ＶＬＰｓで０日、１０日、２４日、６１日、１４３日目に免疫化し（＃記号で示す）、その後、１６０日、１７２日、１８５日目にＥｎｇｅｒｉｘ−Ｂで免疫化した（＊記号で示す）。前記力価は算術平均として与えられており（点で示す）、棒線は測定した抗体価の最高値と最低値を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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