(57)【要約】以下を含む移植前の臓器を維持および灌流するための貯蔵溶液が記載される。（ａ）生理的に許容される量の、カリウム、一酸リン酸、二酸リン酸、クロリド、ナトリウムおよび炭酸水素イオンを含む等張平衡溶液；（ｂ）５０−２５０ｍＭのグルコース；（ｃ）０．２−２０ｍＭのアルカノイルＬ−カルニチンまたは生理的に許容されるその塩；（ｄ）１−１００ｍＭのＬ−カルニチンまたは生理的に許容されるその塩；（ｅ）水。該貯蔵溶液は、抗酸化剤および／またはキレート化剤などのその他の成分を含んでいてもよい。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下を含む移植前の臓器の維持および灌流用の貯蔵溶液：
（ａ）生理的に許容される量のカリウム、一酸リン酸、二酸リン酸、クロリド、ナトリウムおよび炭酸水素イオンを含有する等張平衡溶液；
（ｂ）５０−２５０ｍＭのグルコース；
（ｃ）０．２−２０ｍＭのアルカノイルＬ−カルニチンまたはその生理的に許容される塩の１つ；および／または、
（ｄ）１−１００ｍＭのＬ−カルニチンまたはその生理的に許容される塩の１つ；
（ｅ）水。
【請求項２】
等張平衡イオン溶液が、Ｋ２ＨＰＯ４．３Ｈ２Ｏ；ＫＨ２ＰＯ４；ＫＣｌ；ＮａＨＣＯ３からなる群から選択される化合物を含む、請求項１に記載の貯蔵溶液。
【請求項３】
以下を含む、請求項１または２に記載の溶液。
【表１】
2004529205.tif 000013
【請求項４】
アルカノイルＬ−カルニチンが：アセチル；プロピオニル；バレリル；イソバレリル；ブチリル；およびイソブチリルＬ−カルニチンからなる群から選択される、請求項１から３のいずれかに記載の貯蔵溶液。
【請求項５】
アルカノイルＬ−カルニチンがイソバレリルＬ−カルニチンである、請求項４に記載の貯蔵溶液。
【請求項６】
Ｌ−カルニチンまたはアルカノイルＬ−カルニチンの生理的に許容される塩が、塩化物、臭化物、オロチン酸塩、酸アスパラギン酸塩、酸クエン酸塩、クエン酸マグネシウム塩、酸リン酸塩、フマル酸塩および酸フマル酸塩、フマル酸マグネシウム塩、乳酸塩、マレイン酸塩および酸マレイン酸塩 、ムケート、酸シュウ酸塩 、パモ酸塩、酸パモ酸塩、酸硫酸塩、グルコースリン酸塩、酒石酸塩 、酸酒石酸塩 、酒石酸マグネシウム塩、２−アミノエタンスルホン酸塩、マグネシウム２−アミノエタンスルホン酸塩、酒石酸コリン塩およびトリクロロ酢酸塩からなる群から選択される、請求項１から５のいずれかに記載の貯蔵溶液。
【請求項７】
Ｌ−カルニチンまたはアルカノイルＬ−カルニチンの生理的に許容される塩がフマル酸塩である、請求項６に記載の貯蔵溶液。
【請求項８】
以下を含む請求項１から７のいずれかに記載の溶液。
【表２】
2004529205.tif 000014
【請求項９】
移植前の臓器を維持および灌流するための請求項１から８のいずれかに記載の貯蔵溶液であって、臓器が、心臓、肝臓、膵臓、肺および腎臓からなる群から選択される貯蔵溶液。
【請求項１０】
貯蔵される臓器が肝臓である、請求項９に記載の溶液。
【請求項１１】
さらに、酸素由来のフリーラジカルの形成を阻害するのに十分な量の少なくとも１つの抗酸化剤を含む、請求項１から１０のいずれかに記載の溶液。
【請求項１２】
抗酸化剤が、アロプリノール、グルタチオン、ベータ−カロテン、カタラーゼ、スーパーオキシドジスムターゼ 、ジメチルチオウレア（ＤＭＴＵ）、ジフェニルフェニレンジアミン（ＤＰＰＤ）、マンニトール、およびシアニダノールからなる群から選択される、請求項１１に記載の貯蔵溶液。
【請求項１３】
さらにジクロロ酢酸を含む、請求項１から１２のいずれかに記載の溶液。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は移植前の臓器の貯蔵および灌流用溶液に関する。
【背景技術】
【０００２】
ここ１０年の間に、正所性臓器移植は、特に例えば肝臓、心臓、膵臓、肺および腎臓疾患などの末期臓器疾患を患う患者にとってかけがえのない治療法となってきた。
【０００３】
しかし、移植された臓器の拒絶は、いまだに重大な問題である。
【０００４】
例えば、肝臓移植の場合、手術後１年間の死亡率は１５−２５％であり、これに拒絶が寄与している（Strasberg S. M. et al., Hepatology 1994,20: 829）。
【０００５】
移植される肝臓が損傷を受ける局面は、以下とされている：
１）ドナーから取り出す際の高温(heat)虚血；
２）低温貯蔵段階における低温(cold)虚血；
３）レシピエントにおける臓器の再灌流；
（Transplantation 53: 957-978、1992）。
【０００６】
移植する臓器の貯蔵のための基本戦略は、臓器の温度を３７℃から約４−６℃に下げることにより、細胞の異化工程を遅延させることである（低体温(hypothermia)）。
【０００７】
低体温は、様々な細胞内酵素によって触媒される代謝速度および加水分解速度を低下させるが、細胞代謝を完全に阻害するわけではない。これは、内皮類洞区画および肝細胞区画の両方において細胞変化を導くプロセスをもたらし得る。
【０００８】
実際、単離した肝臓を灌流せずに冷却すると、ＡＴＰおよびＡＤＰレベルが迅速に減少してしまい（J. Surg. Res. 23: 339-347、1977; Cryobiology 31: 441-452,1994）、残余エネルギー要求が、貯蔵グリコーゲンからの無酸素性解糖によって細胞がＡＴＰを産生する能力を上回ってしまい、その結果、乳酸が蓄積し、細胞内アシドーシスが起こる。
【０００９】
ＡＴＰからＡＤＰ、次いでＡＭＰおよびアデニンへの分解は、低体温の間に、ヒポキサンチンの蓄積をもたらし、それと同じにキサンチンデヒドロゲナーゼがキサンチンオキシダーゼに変換し、それに伴って細胞内カルシウムの上昇およびプロテアーゼの活性化が起こる（McCord J. M.、N. Engl. J. Med. 1985,312: 158）。
【００１０】
再灌流状態において、この結果ヒポキサンチンからキサンチン、そして尿酸への分解が起こり、それに伴って活性酸素中間体（ＲＯＩ）の発生および酸化型の障害が起こる。
【００１１】
さらに、酵素、例えばＮａ／Ｋ ＡＴＰａｓｅなどの酵素活性の低下により、電解質バランス状態に変化が生じ、その結果水の流入および細胞の膨潤が起こる。
【００１２】
近年、移植する臓器の低温貯蔵の間のＡＴＰ含量と、ヒトにおける移植の成功との間に直接的相関関係があることが立証された（Hepatology 1988,8: 471）。
【００１３】
そのような欠点を克服するために、無酸素性低体温（貯蔵段階中）および正常体温再灌流（再移植段階中）の危険な効果に対抗するように研究された組成を有する貯蔵溶液が用いられている。
【００１４】
そのような溶液の処方は臓器の生存状態を改良し、保存期間を長くするために改良され続けている。
【００１５】
移植前の臓器の貯蔵に有用な溶液は既に知られている。
【００１６】
Transplantaion 2000 Apr. 15; 69 (7): 1261-5において、ＵＷ溶液として知られるウィスコンシン大学（University of Wisconsin）からの溶液が、異化工程を遅延させることができ、移植前の臓器の良好な保存を保証することができると報告されている。
【００１７】
ＵＷ溶液の組成は以下を目的とした薬理学的戦略に基いたものである。
１）アデニンおよびリン酸などの前駆体の添加によりＡＴＰの再合成を促進する；
２）リン酸バッファーの存在によりアシドーシスを妨げる；
３）アロプリノールによりキサンチンオキシダーゼ活性を阻害する；
４）細胞内において見られる組成（高Ｋ＋）と類似の組成を用いてイオン再分布を最小限にする；そして特に、
５）ラクトビオネート(lactobiobate)、ラフィノースおよびデンプンなどの高分子量コロイドの添加により、浸透圧による細胞膨潤を妨げる。
【００１８】
しかしこの組成物の基本的戦略は経験的なものであり、この効果は「保護の総和」として知られる現象に由来する効果であるという説がある（Southard J. H. et al., Transplantation 1990,49: 251）。
【００１９】
Transplantation Proc. 1999; August; 31 (5): 2069-70において、セルシオ（Celsior）溶液が移植前の臓器の貯蔵に有用であると報告されている。
【００２０】
塩類溶液 EuroCollinsは臓器の貯蔵に有用なもう１つの公知の溶液であり、以下の表１の組成を有する。
【００２１】
【表１】
2004529205.tif 000002
【００２２】
この溶液は長い間ヨーロッパにおいて臓器、特に腎臓の貯蔵のための標準溶液であると考えられていた。この処方は細胞内環境を模倣した電解質組成を得ることに基く。さらに、この溶液においては高グルコース濃度（約１９０ｍＭ）の添加により高浸透圧（４２０ｍＯｓｍｏｌ）が得られている。
【００２３】
上記溶液は欠点がないとはいえず、様々な改変がなされてきた。
【００２４】
ＵＷ溶液によって示される主な欠点はそれが高粘度であることから臓器の灌流中にとりわけ内皮細胞に損傷を与える可能性があることおよび各成分が不可欠であるかどうか不明であるのにもかかわらずそれぞれが高コストであることである（Transplant Proc. 1999; August; 31 (5): 2069- 70）。
【００２５】
セルシオ溶液は、溶液ＵＷと比較した場合に、肝臓の貯蔵に好適な溶液ではないという欠点を示す（Transplant. 2000; Oct. 27; 70 (8): 1140-2）。
【００２６】
EuroCollins 溶液は数々の欠点を示す。
１−高グルコース濃度により低温低酸素状態の間に膨大な乳酸が産生されることから、アシドーシスの問題が悪化する；
２−臓器の貯蔵中の細胞の膨潤を妨止できない；
３−溶液ＵＷと比較してより良好とはいえない（Transplantation 2000 Apr. 15; 69 (7): 1261-5）。
【００２７】
カルニチンの医薬分野での使用はすでに知られている。
【００２８】
Ann. Thorac. Surg. 2001; 71: 254-9において、単離したウサギの心臓における、心臓麻痺性虚血の治療のためのＬ−カルニチンの使用が記載されている。この研究では、単離されたウサギの心臓を、Ｌ−カルニチンを添加した全血で灌流した場合に、単離されたウサギの心臓において心臓機能の回復に対してＬ−カルニチンが保護効果を示すことを報告している。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２９】
移植前の臓器の貯蔵のための溶液の調製におけるカルニチンの使用は今まで記載されていない。
【課題を解決するための手段】
【００３０】
このたび、カルニチンおよび／またはアルカノイルＬ−カルニチンを、単離した臓器のための貯蔵溶液に添加することにより、臓器の貯蔵および灌流のための驚くべき能力が示された。これは先に言及した公知の溶液より優れたものである。
【００３１】
本発明による溶液は、Ｌ−カルニチンおよび／またはアルカノイルＬ−カルニチンが存在する点で既知の溶液とは異なる。
【００３２】
本発明による溶液は、移植前の臓器の貯蔵および灌流における使用に好適である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３３】
そのような臓器の非限定的な例としては、心臓、肝臓、膵臓、肺および腎臓が挙げられる。
【００３４】
好ましくは、本発明による溶液は、Ｌ−カルニチンおよびアルカノイルＬ−カルニチンを含み、ここでアルカノイルＬ−カルニチンは、アセチル；プロピオニル；バレリル；イソバレリル；ブチリルおよびイソブチリルＬ−カルニチンからなる群から選択される。
【００３５】
一般的な態様において、本発明による移植前の臓器の維持および灌流用の貯蔵溶液は以下を含む：
（ａ）生理的に許容される量のカリウムイオン、一酸リン酸(mono-acidic phosphate)、二酸リン酸(bi-acidic phosphate)、塩素、ナトリウム、炭酸水素を含む平衡等張溶液；
（ｂ）５０−２５０ｍＭのグルコース；
（ｃ）０．２−２０ｍＭのアルカノイルＬ−カルニチンまたはその生理的に許容される塩の１つ；および／または、
（ｄ）１−１００ｍＭのＬ−カルニチンまたはその生理的に許容される塩の１つ；
（ｅ）水。
【００３６】
本発明の第１の好適な態様において、移植前の臓器の貯蔵および灌流用の溶液（これを以下、「カルニバル（Carnival）溶液」と称する）は、表２に示す組成を有する。
【００３７】
【表２】
2004529205.tif 000003
【００３８】
イソバレリルＬ−カルニチンは、好適なアルカノイルＬ−カルニチンである。
【００３９】
Ｌ−カルニチンまたはアルカノイルＬ−カルニチンの生理的に許容される塩とは、望ましくない毒性効果を引き起こさない酸とのあらゆる塩を意味する。これらの酸は薬理学者や薬学の専門家に周知である。
【００４０】
これら塩の非限定的な例として以下のものが挙げられる：塩化物、臭化物、オロチン酸塩、酸アスパラギン酸塩、酸クエン酸塩、クエン酸マグネシウム塩(citrate magnesium)、酸リン酸塩、フマル酸塩および酸フマル酸塩、フマル酸マグネシウム塩(fumarate magnesium)、乳酸塩、マレイン酸塩および酸マレイン酸塩 、ムケート(mucate)、酸シュウ酸塩 、パモ酸塩、酸パモ酸塩、酸硫酸塩、グルコースリン酸塩、酒石酸塩 、酸酒石酸塩 、酒石酸マグネシウム塩(tartrate magnesium)、２−アミノエタンスルホン酸塩、マグネシウム２−アミノエタンスルホン酸塩、酒石酸コリン塩(tartrate coline)およびトリクロロ酢酸塩。
【００４１】
フマル酸塩が好適である。
【００４２】
本発明による好適な溶液の例を表３に示す。
【００４３】
【表３】
2004529205.tif 000004
【００４４】
本発明による溶液はさらに以下のものを含んでいてもよい。
１）酸素由来のフリーラジカルの形成を妨げるのに有用な量の１または複数の抗酸化剤。そのような抗酸化剤の非限定的な例として以下のものが挙げられる：アロプリノール、グルタチオン、ベータ−カロテン、カタラーゼ、スーパーオキシドジスムターゼ 、ジメチルチオウレア（ＤＭＴＵ）、ジフェニルフェニレンジアミン（ＤＰＰＤ）、マンニトール、シアニダノール；およびビタミンＥ、および／または、
２）貯蔵の間に形成される乳酸を減少させるためのジクロロ酢酸。
【００４５】
使用するべき抗酸化剤および／またはジクロロ酢酸の量は当業者に周知であり、文献において広く報告されている。
【００４６】
本発明による溶液は臓器に損傷を与えるメカニズムを防ぐために好適に用いられ、そのため該溶液は、
（ａ）細胞内アシドーシスを阻止または低減させる；
（ｂ）特に再灌流中に、酸素フリーラジカルによってもたらされる損傷を防止する；
（ｃ）再灌流中に高エネルギーリン酸の再生を可能にする；
（ｄ）細胞内空間の膨張から保護する；
（ｅ）細胞の代謝要求を維持する。
【００４７】
本発明による溶液の保護活性を好適な実験モデルにおいて評価した。ここで同目的のために有用であることが知られている参照溶液を用いた。
【００４８】
以下の実施例において本発明をさらに詳しく説明する。
【実施例１】
【００４９】
多くの研究により、ＡＴＰなどの高エネルギーリン酸化合物を再生する移植臓器の能力と移植の成功との間の相関関係が立証されている。実際、例えば肝臓の貯蔵において、最も重要な局面の１つは明らかに移植後のＡＴＰなどの高エネルギーリン酸化合物を再生する能力である。
【００５０】
高エネルギーリン酸化合物は、細胞損傷を防止する多数の調節機構にとって利用できるものでなければならない。例えば、肝臓におけるＮＴＰ（ヌクレオシド三リン酸）のレベルは重要な細胞プロセス、例えば細胞膜およびミトコンドリア膜を横切るイオン交換を調節する勾配の維持、タンパク質合成、胆汁産生および尿素回路を修復するのに十分な量存在しなければならない。
【００５１】
本発明の溶液の効力を立証するために行なった実験において、単離したラット肝臓を用い、ここで、低温虚血期間、保存期間、および再灌流期間において、３１Ｐ−ＮＭＲ分光法によってＡＴＰ、ＡＤＰおよび総アデニン性（adeninic）ヌクレオチド（ＮＴＰ）のレベルの変化を分析した（J. Lab. Clin. Med. 1992,120: 559; Transplantation 1994,57: 1576）。
【００５２】
これらの実験の実現のために以下の重要な問題の解決が必要となった。
１）ＮＭＲ磁石の内側での操作に適した灌流チャンバの構築および適切な灌流回路の作成；
２）灌流チャンバと共に用いることができる高周波（ＲＦ）コイルの構築；
３）時間の規定（灌流、保存および再灌流段階の持続時間；これらの各段階の間の分光法による研究の間隔；単一スペクトルの最小持続時間；１つの段階から別の段階への経過時間の最適化）。
【００５３】
灌流回路およびチャンバ
灌流回路の図式を図１に示す。
【００５４】
この回路の構築は、適切な温度および酸素供給条件が臓器において維持されなければならないことを考慮して行なった。臓器は灌流システムから数メートルの距離に置き、灌流システムは、ポンプおよび恒温装置から構成される。実際、これらの器具は測定機器の磁場の外側に置かねばならず、この場合、最小で６メートルの距離であった。
【００５５】
磁石から離れた、恒温容器に入れた灌流培地ＫＨ（Krebs-Henseleit＋グルコース＋ＢＳＡ）（４００ｍｌ）（Krebs H. A. 1930; Biochem. J. 98,720; Henseleit K. 1932; Hoppe-Seylerr’s Z. physiol. Chem. 210,33.）は、マグネティックスターラーによって連続的に混合した。
【００５６】
恒温は、磁石の内側に臓器を含む灌流チャンバにおける温度が３７±０．５℃となるようにした。
【００５７】
培地への酸素供給は膜型人工肺の使用により保証した。
【００５８】
酸素飽和レベルは、用いたシリコンの透過性因子、チューブの口径および厚さ、酸素供給および恒温装置の内側のらせん状に巻かれたチューブの流速および長さに基いて計算した。計算値は３０から３５％Ｏ２という結果であった。
【００５９】
灌流液は、流速２５ｍｌ／分にてぜん動ポンプの補助によって再循環させた。
【００６０】
灌流回路には、内径１ｍｍであって、磁石からの長さが６ｍのポリエチレンチューブを用いた。
【００６１】
磁石内の灌流チャンバの内側の制御された温度の維持を保証するために、恒温装置および灌流回路はともに熱遮断性（thermo isolated）ネオプレンチューブの内側を一緒に通るようにした。
【００６２】
所望の温度及び酸素供給の達成を保証するために臓器灌流の前に少なくとも１時間は回路を活性化および安定化させた。
【００６３】
風防ガラスにおいて構築した灌流チャンバは、ＰＶＣ担体に固定して磁石の内側に挿入できるようにした。これは円柱状形態であって直径３４ｍｍｘ高さ６５ｍｍであった。
【００６４】
肝臓は担体ディスクから適切な距離にカニューレを固定することによって所望の高さに吊るしたまま維持した。
【００６５】
排液は、漏斗型の底に灌流液を回収し、その後回収リザーバを吸引することによって行なった。
【００６６】
虚血および再灌流による正常体温障害は、肝臓障害の発病の決定因子であり、これは肝臓切除および肝臓移植などの外科的手段において生じるものである。
【００６７】
高温虚血時間を可能な限り最小にするために、肝臓摘出の標準的外科手順に変化を与えた。特に、非絶食動物を用いた。動物モデルにおいて、実際、インビボおよびインビトロの研究により、絶食はグリコーゲン含量の減少により引き起こされる正常体温虚血障害を悪化させることが示された。
【００６８】
最初の体重が１５０ｇである雄性ウィスターラットを用いた。動物をチオペンタールナトリウムの腹腔内注射（ｉ．ｐ．）によって麻酔し、そして正中を切開し、次いで腹膜を切開した。
【００６９】
門脈および下大静脈を露出させ、癒着と脂肪を可能な限り除去して臓器を迅速に切除し、虚血時間を最小にした。
【００７０】
下大静脈と門脈のための結紮糸を準備した。
【００７１】
下大静脈を閉じ、次いで迅速に門脈を閉じた。
【００７２】
最初の血液洗浄灌流のために、予め準備しておいた縫合糸によって固定しておいた門脈にカニューレを挿入し(Abbocath-T 20G; Abbott)、低温リンゲル乳酸溶液（Dawson R. M. C. (ed.)、Elliott D. C. Elliott W. H. and Jones K. M.(1969) Data for biochemical research、2nd ed. Clarendon Press、Oxford.）を含有するシリンジにつないだ。下大静脈を切断して灌流液を流出させるようにした。
【００７３】
次いで臓器を可能な限り迅速に取り出した。
【００７４】
血管を閉じてから磁石の内側で灌流を開始するまでの時間は１０分以内であり、１−２分の高温虚血を伴った。
【００７５】
カニューレを原位置に残して再灌流のために用いた。
【００７６】
行なった実験のプロトコールを以下の図式１に示す。
【００７７】
【化１】
2004529205.tif 000005
【００７８】
血液を除去し、臓器の正常体温虚血時間をできる限り短くするために、４℃で肝臓を原位置でリンゲル乳酸溶液で灌流した。
【００７９】
単離した臓器を次いで磁石の内側で灌流した。これは適切なバイオリアクター内で行ない、基準参照スペクトル３１ＰＮＭＲスペクトルを得るために、３７℃でＫｒｅｂｓ−Ｈｅｎｓｅｌｅｉｔ溶液、３５％Ｏ２を与えた（時間０）。
【００８０】
このようなＮＭＲスペクトルの取得は臓器の間の生物的変動を排除するように行なった；このように、実際、貯蔵後に観察される変動は、動物からの取り出しの直後の同じ臓器、および４０分の灌流において安定化した同じ臓器において測定した値のことをいう。
【００８１】
４０分間の安定化の最後に、臓器を異なる貯蔵溶液で４℃で灌流した。
【００８２】
実験は本発明によるカルニバル溶液を用いて行ない、２種類の公知の貯蔵溶液を参照として用いた：
１）インスリン（４０Ｉ．Ｕ．／Ｌ）およびデキサメタゾン（８ｍｇ／Ｌ）を添加したＵＷ溶液；および、
２）EuroCollins 溶液。
【００８３】
表４は、カルニバル、EuroCollins、およびＵＷ溶液の組成を示す。
【００８４】
【表４】
2004529205.tif 000006
【００８５】
「−」は「不在」を意味し、「＋」は「存在」を意味する。
【００８６】
いくつかの実験では、最初の１時間におけるリン酸化代謝産物の消失の動力学を評価するために、本発明による溶液での臓器の灌流の直後に低温スペクトルを取得した。
【００８７】
得られた結果を表８−１０に報告する。
【００８８】
各スペクトルについて以下に注目した。
１）リン酸化代謝産物の総レベル；
２）無機リン酸およびリン酸一エステルのレベル（Ｐｉ＋ＰＭＥ）；
３）ヌクレオシド三リン酸（ＮＴＰ）のレベル；
４）シグナルα−ＮＴＰ＋ＮＡＤの和としてのＮＡＤのレベル。
【００８９】
スペクトルは１時間の間、１０分間隔で取得した。
【００９０】
肝臓をいくつかの溶液中に４℃で合計２６時間浸漬することによって貯蔵した。
【００９１】
貯蔵時間は、通常の臨床または実験で用いられるよりも長い時間の後に再始動する能力を評価するように選択した。
【００９２】
貯蔵時間（２６時間）の最後に、肝臓を再び磁石の内側に置き、溶液ＫＨで３７℃、３５％Ｏ２で灌流し、リン酸化代謝産物をモニターした。
【００９３】
３１Ｐ−ＮＭＲスペクトルを制限時間１４０分間にわたり１５分ごとに取得した。
【００９４】
得られた結果を表５−７に報告する。
【００９５】
ＮＭＲ実験条件
主に最適なシグナル／ノイズ比を有するスペクトルを得るためには、３１Ｐ−ＮＭＲ実験の特性は肝臓の灌流に選択された実験の立体的配置に厳密に依存する。
【００９６】
考慮すべき主要な問題は以下の通りである：
ｉ）短いスキャニング時間を用いる必要性；
ｉｉ）核磁気共鳴システムの作動条件の最適化；
ｉｉｉ）試料の形状と組成の不均一性。
【００９７】
用いた実験条件は以下の通りである：
−スペクトルバンド幅  ８．３３ＫＨｚ；
−２０４８点でのサンプリング；
−９００の取得；
−ダミースキャン２；
−２段階位相サイクル；
−９０度でのインパルス（１５０μ秒）；
−反復間隔２秒。
【００９８】
様々な実験条件について、スペクトルは、灌流または再灌流条件において４５０スキャン、そして低体温条件において３００スキャンの蓄積から得、常に反復時間は２秒とした。
【００９９】
得られた３１Ｐ−ＮＭＲスペクトルは、ヌクレオチド三リン酸のα、βおよびγリン酸についてそれぞれ−９．７、−１８．３５および−４．２ｐｐｍのシグナルを示し、主にアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）によるものであり、少量のグアノシン三リン酸（ＧＴＰ）、ウリジン三リン酸（ＵＴＰ）およびシチジン三リン酸（ＣＴＰ）によるものが示された。
【０１００】
αＮＴＰに割り当てられたシグナルは、ニコチンアミド−アデニン−ジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤ）およびニコチンアミド−アデニン−ジヌクレオチドリン酸の共鳴の寄与による。
【０１０１】
主にアデノシン二リン酸（ＡＤＰ）によって示される、ヌクレオチド二リン酸のαおよびβリン酸に関するシグナルは、それぞれ−８．９および−４．４ｐｐｍであった。この最後のシグナルはγＮＴＰからのシグナルによって部分的にマスクされている。
【０１０２】
２つのジエステル化リン酸基（ＤＰＤＥ）を有する化合物に起因する−１１．５ｐｐｍにおけるシグナルは、主にウリジンジホスホグルコースおよびウリジンジホスホグルコネートによって示される。
【０１０３】
リン脂質中間体に関するシグナルは、５．８から４ｐｐｍのスペクトル帯に存在し、ここで一リン酸エステル（ＰＭＥ）からのリン酸基の核が共鳴している。
【０１０４】
灌流チャンバの内側に固定されたキャピラリーに含まれる３００ｍＭのジホスホン酸メチレン（ＭＤＰ）（０．５ｍｌ）を参照として用いた。
【０１０５】
シグナル領域は共鳴スペクトルの再構築のために知られているプログラムの１つを適用することによって評価した（プログラムSPEC ANA;SMIS）。
【０１０６】
結果
リンゲル乳酸溶液（４℃）での肝臓の除去及び洗浄後の４０分間の最初のＫＨ溶液による灌流（３７℃、３５％Ｏ２）は、リン酸化代謝産物レベルの安定化に十分であるようであった。
【０１０７】
β−ＡＴＰおよびα−ＡＴＰの初期レベル（貯蔵前）はそれぞれ８．３±３．１および２２．６±５．４であった（表における値は参照に対するパーセンテージとして表されている）。
【０１０８】
β−ＡＴＰ／Ｐｉ＋ＰＭＥ、α−ＡＴＰ／Ｐｉ＋ＰＭＥおよびβ−ＡＴＰ／α−ＡＴＰの比はそれぞれ８．４±５、２３．４±１０．２および３５．７±１１であった。
【０１０９】
このようにして得られた値をその後の評価に対する時間０についての参照として用いた。
【０１１０】
表５において、カルニバル溶液での貯蔵中および貯蔵後の、得られた代表的スペクトルに関する結果を報告する。
【０１１１】
【表５】
2004529205.tif 000007
【０１１２】
取りだし後に得られた値は参照シグナルとの比として表す。その他のすべての値は参照シグナルに対するパーセンテージとして表す。
【０１１３】
表６において、ＵＷ溶液での貯蔵中および貯蔵後に得られた代表的なスペクトルに関するデータを報告する。
【０１１４】
【表６】
2004529205.tif 000008
【０１１５】
取りだし後に得られた値は参照シグナルとの比として表す。その他のすべての値は参照シグナルに対するパーセンテージとして表す。
【０１１６】
表７において、EuroCollins溶液での貯蔵中および貯蔵後に得られた代表的なスペクトルに関するデータを報告する。
【０１１７】
【表７】
2004529205.tif 000009
【０１１８】
取りだし後に得られた値は参照シグナルとの比として表す。その他のすべての値は参照シグナルに対するパーセンテージとして表す。
【０１１９】
表７においては、１回の再灌流（３０’）スペクトルから得たデータを報告する。というのは、この時点およびこの後には、リン酸化化合物の再合成は観察されなかったからである。
【０１２０】
低温貯蔵の最初の６０分間において観察されたリン酸化代謝産物の消失の動力学により、α−ＡＴＰ＋α−ＡＤＰ＋ＮＡＤのシグナルは、臓器によって異なる様式で、すべての貯蔵溶液について測定の最後まで存在することが示された。
【０１２１】
β−ＡＴＰシグナルはＵＷでの貯蔵での最大３０分間までのみ検出され、EuroCollinsおよびカルニバル溶液については最初のスペクトルにおいても存在しなかった。
【０１２２】
γ−ＡＴＰ＋β−ＡＤＰシグナルは、５０分の取得まで存在していたが、これはＡＤＰの存在のみに起因する。
【０１２３】
６０分におけるリン酸化代謝産物の残余量は、異なる溶液中での２６時間の保存の後の正常体温再灌流におけるＡＴＰの再合成能力と相関はなかった。
【０１２４】
表８、９および１０において、それぞれカルニバル、ＵＷおよびEuroCollins溶液中での灌流後、４℃での貯蔵の開始から８０分および１４０分の正常体温灌流において得られたβ−ＡＴＰおよびα−ＡＴＰについての値と標準偏差を報告する（低温スペクトル、ＮＭＲ分析は臓器除去のおよそ２時間後に行なった）。
【０１２５】
【表８】
2004529205.tif 000010
【０１２６】
（ｎは使用した動物数である）。
【０１２７】
【表９】
2004529205.tif 000011
【０１２８】
（ｎは使用した動物数である）。
【０１２９】
【表１０】
2004529205.tif 000012
【０１３０】
（ｎは使用した動物数である）。
【０１３１】
値は、取りだし後３７℃で取得した同じシグナルに対するパーセンテージとして表す。
【０１３２】
理解されるように、本発明による溶液は、単離した肝臓の正常体温再灌流の間の細胞の生存において保護的役割を果たし、ＡＴＰの再合成を可能とする。これはＵＷを用いて観察された正常体温再灌流の間のものに匹敵する。シグナルの再出現およびそれゆえ再合成の能力は、カルニバル中に貯蔵された臓器のほうが、ＵＷ中に貯蔵されたものと比べて速く、ＵＷでは６０分まで満足できる再合成が観察されない。
【０１３３】
逆に、考慮した期間においてEuroCollins溶液中に貯蔵された臓器は評価できるＡＴＰレベルを示さない。
【０１３４】
さらに代謝産物の濃度は１４０分までＵＷ溶液およびカルニバル溶液について同程度のレベルに維持されたことに注目されたい。
【０１３５】
本発明による溶液は、低温貯蔵期間において、浸透圧性現象による細胞の膨潤をさまたげる。これは定性的に観察されるが、ラクトビオネート、ラフィノースおよびグリシンが添加されたＵＷ溶液と同様である。
【０１３６】
本発明による溶液によると、２６時間の低温保存の後においても肝臓の生物エネルギー的完全性を維持することができ、より高価なＵＷについて得られる結果と匹敵する結果を低コストで提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【０１３７】
【図１】図１は、灌流回路の図式である。
【図１】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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