(57)【要約】本発明は、ヒトのｃＭＯＡＴ遺伝子における多型、およびそれによってコードされる対応する新規の対立形質ポリペプチドに関する。本発明はまた、ｃＭＯＡＴ遺伝子における対立遺伝子の変異を分析するための方法および素材、およびｃＭＯＡＴ輸送可能薬物を伴う疾患の処置における、ｃＭＯＡＴ多型の使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトのｃＭＯＡＴにおける多型の診断方法であって、該方法が、１もしくはそれ以上の下記の位置：
・配列番号１での位置によって定義されるｃＭＯＡＴ遺伝子のコード領域における位置 78, 1350, 1584, 1686, 2647, 3208, 3664 および 4391；
・配列番号２での位置によって定義されるｃＭＯＡＴ遺伝子の５'ＵＴＲ領域における位置 1349, 1875 および 1879；
・配列番号３での位置によって定義されるｃＭＯＡＴ遺伝子のイントロン領域における位置 12704 および 29446；
・配列番号４での位置によって定義されるｃＭＯＡＴ遺伝子のイントロン領域における 位置 292；
・配列番号５での位置によって定義されるｃＭＯＡＴ遺伝子のイントロン領域における位置 232 および 457；
・配列番号６での位置によって定義されるｃＭＯＡＴ遺伝子のイントロン領域における位置 50 および 68；および
・配列番号７での位置によって定義されるｃＭＯＡＴポリペプチドにおける位置 417, 495, 529, 849, 1036 および 1188；
でのヒトの配列を決定すること、およびｃＭＯＡＴにおける多型を参照することによってヒトの状態(status)を決定することを含む方法。
【請求項２】
ｃＭＯＡＴによって輸送され得る薬物の薬理遺伝学を評価するための、請求項１に定義した診断方法の使用。
【請求項３】
ヒトのｃＭＯＡＴ遺伝子の少なくとも２０個の塩基を含み、かつ下記：
【表１】
2004524846.tif 000026
【表２】
2004524846.tif 000027
【表３】
2004524846.tif 000028
の何れか１つから選択される対立遺伝子変異体を含む ポリヌクレオチド。
【請求項４】
請求項１に定義した多型を検出し得るヌクレオチドプライマー。
【請求項５】
請求項１に定義したｃＭＯＡＴ遺伝子多型を検出し得る 対立遺伝子に特異的なプライマー。
【請求項６】
請求項１に定義したｃＭＯＡＴ遺伝子多型を検出し得る、対立遺伝子に特異的なオリゴヌクレオチド・プローブ。
【請求項７】
結合試験における、遺伝子マーカーとしての 請求項１で定義したｃＭＯＡＴ遺伝子多型の使用。
【請求項８】
ｃＭＯＡＴによって輸送され得る薬物で処置する必要があるヒトを処置する方法であって、該方法が、
i)ヒトのｃＭＯＡＴにおける多型の診断であって、該診断が、好ましくは１もしくはそれ以上の下記：
・配列番号１での位置によって定義されるｃＭＯＡＴ遺伝子のコード領域における位置 78, 1350 ,1584 ,1686 ,2647 ,3208 ,3664 および 4391；
・配列番号２での位置によって定義されるｃＭＯＡＴ遺伝子の５'ＵＴＲ領域における位置 1349, 1875 および 1879；
・配列番号３での位置によって定義されるｃＭＯＡＴ遺伝子のイントロン領域における位置 12704 および 29446；
・配列番号４での位置によって定義されるｃＭＯＡＴ遺伝子のイントロン領域における 位置 292；
・配列番号５での位置によって定義されるｃＭＯＡＴ遺伝子のイントロン領域における位置 232 および 457；
・配列番号６での位置によって定義されるｃＭＯＡＴ遺伝子のイントロン領域における位置 50 および 68；
・配列番号７での位置によって定義されるｃＭＯＡＴ遺伝子のポリペプチドにおける位置 417, 495, 529, 849, 1036 および 1188；
の位置での配列を決定し、かつｃＭＯＡＴにおける多型を参照することによって、ヒトの状態を決定し；そして
ii) 有効量の薬物を投与する
ことを含む方法。
【請求項９】
少なくとも１つの、下記：
・配列番号７の位置 417 のイソロイシン；
・配列番号７の位置 495 のグルタミン酸；
・配列番号７の位置 529 のトリプトファン；
・配列番号７の位置 849 のアルギニン；
・配列番号７の位置 1036 のスレオニン；および
・配列番号７の位置 1188 のバリン；
または、フラグメントが少なくとも１つの対立遺伝子変異体を含む場合、少なくとも１０個のアミノ酸を含むそれらのフラグメント；
を含むヒトのｃＭＯＡＴポリペプチド対立遺伝子変異体。
【請求項１０】
請求項９で定義したヒトのｃＭＯＡＴポリペプチドの対立遺伝子変異体に対して特異的な抗体。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、ヒトのｃＭＯＡＴ遺伝子 およびそれによってコードされる 対応する新規の対立形質ポリペプチドにおける多型に関する。本発明はまた、ｃＭＯＡＴ遺伝子における対立遺伝子変異を分析するための方法および物質、そしてｃＭＯＡＴ輸送可能薬剤を伴う疾患の処置におけるｃＭＯＡＴ多型の使用に関する。
【０００２】
肝臓は、内因性親油性化合物および外来性親油性化合物を、グルタチオン、グルクロン酸、または硫酸で、アニオン性複合体（anionic conjugates）に変える。これらの複合体は、１９０kDaの膜糖タンパクによって、小管状(先端)膜を通って胆嚢に輸送される。この先端の複合体−輸送ＡＴＰアーゼは、基質特異性と多剤耐性タンパク質（ＭＲＰ １）の配列における類似性のために、小管多剤耐性タンパク質(ｃＭＲＰ)と言う。他の名称には、小管多選択性組織アニオントランスポーター(ｃＭＯＡＴ)、および多剤耐性タンパク質２(ＭＲＰ ２)が含まれる。
【０００３】
“ｃＭＯＡＴ”という用語を、本明細書で一般的に用いる。ヒトのｃＭＯＡＴと ＭＲＰ １のアミノ酸配列相同性は、４９％である。ｃＭＯＡＴは、肝細胞中で優勢で発現され、先端の膜のドメインに位置する。ｃＭＯＡＴは、ヒトの Dubin-Johnson 症候群では発現されず、従って親油性アニオン複合体の胆汁への分泌の遺伝的な欠損を併有する。ラットのホモログｃＭＯＡＴは、対応する遺伝子での異なる点変異を有する、ラットの２つの変異株では見られない。これらの変異体ラットは、高ビリルビン血症であり、そしてＡＴＰ依存性の肝細胞からの複合体の胆汁への輸送において欠陥がある。
【０００４】
胆汁の流れの障害(胆汁鬱帯)は、複合体輸出ポンプの発現の下降調整に関係し得る。そしてｃＭＯＡＴは、重要な推進力として、胆汁の流れに寄与する(Keppler D. and Konig J. FASEB J, 1997.11,509-516 および Ishikawa et al. Biosci Rep 1997; 17: 189-207 のレビューを参照のこと)。
【０００５】
ｃＭＯＡＴはまた、生体異物および脂質低下治療に用いられる薬物、例えばスタチン類の輸送に関わることが示されている。スタチン類は、アテローム硬化血管疾患の患者の第一選択治療薬と言われる。ｃＭＯＡＴ遺伝子とその産物は、他の疾患においても、重要であると考えられている。
【０００６】
本明細書中のｃＭＯＡＴポリヌクレオチドのエクソン領域における多型の全ての位置は、特記しない限り、または文脈から明らかでない限り、配列番号１における位置に対応する。記述時点では、EMBL U49248 と等価である。
【０００７】
本明細書中のｃＭＯＡＴポリヌクレオチドの５'ＵＴＲ またはプロモーター領域における多型の全ての位置は、特記しない限り、または文脈から明らかでない限り、配列番号２における位置に対応する。記述時点では、EMBL AF1446309 と等価である。
【０００８】
本明細書中のｃＭＯＡＴのイントロン領域における多型の全ての位置は、用いられた文脈に依存して、配列番号３、４、５、または６における位置に対応する。記述時点では、配列番号３が、微生物の人工染色体 RP11-483F11 (Sanger Centre, Hinxton, Cambridgeshire, CB10 1SA, UK.); EMBL AL 133353 の一部であり、配列番号３の位置 １が公表されているＢＡＣ配列受入番号 AL 133353 において、位置 129361 である。
【０００９】
本明細書中のｃＭＯＡＴポリペプチドにおける多型の全ての位置は、特記しない限り、または文脈から明らかでない限り、配列番号７における位置に対応する。
【００１０】
１つの目標は、特定の医薬を用いる治療に最も適した患者を識別する助けとするために、多型の知識を用いることである(これは、しばしば“薬理遺伝学”と呼ばれる)。薬理遺伝学はまた、薬剤選択方法を助ける薬学的研究に用いられ得る。多型は、ヒトゲノムをマッピングするのに用いられ、そして疾患の遺伝的素因を解明するために用いられる。薬理遺伝学および多型検出の別の使用については、その背景を詳細に記載した下記の参考文献を参照されたい：Linder et al. (1997), Clinical Chemistry, 43,254; Marshall (1997), Nature Biotechnology, 15,1249; International Patent Application WO 97/40462, Spectra Biomedical; and Schafer et al. (1998), Nature Biotechnology, 16,33。
【００１１】
臨床試験は、医薬処置に対する患者の応答が、しばしば不均一であることを示している。従って、医薬の設計および薬物治療への改善された方法に対する要請がある。
【００１２】
多型における点変異は、次のように記載される：天然のアミノ酸（１または３文字命名法）、位置、新しいアミノ酸。（仮定の）例において、“D25K”または“Asp25Lys”は、位置 25 のアスパラギン酸（Ｄ）が、リジン（Ｋ）に変えられたことを意味する。１つのポリペプチドにおける多重変異は、大括弧の間にコンマによって分けられた個々の変異で示される。
【００１３】
本発明は、ｃＭＯＡＴにおける多型の発見に基づく。特に、我々は、ｃＭＯＡＴ遺伝子のコード配列における８個の多型（そのうちの６個は発現されたタンパク質の配列で変化を起こす）、発現されたタンパク質の配列で変化を起こす３個の多型、および７個のイントロン多型を見出している。
【００１４】
本発明の１つの態様によって、ヒトのｃＭＯＡＴにおける多型の診断方法を提供する。該方法は、少なくとも１つの多型の位置でヒトの配列を決定し、そしてｃＭＯＡＴにおける多型を参照することによって、ヒトの状態(status)を決定することを含む。好ましい多型の位置は、１もしくはそれ以上の下記の位置である：
・配列番号１での位置によって定義されるｃＭＯＡＴ遺伝子のコード領域における位置 78、1350、1584、1686、2647、3208、3664 および 4391；
・配列番号２での位置によって定義されるｃＭＯＡＴ遺伝子の５'ＵＴＲ領域における位置 1349、1875 および l879；
・配列番号３での位置によって定義されるｃＭＯＡＴ遺伝子のイントロン領域における位置 12704 および 29446；
・配列番号４での位置によって定義されるｃＭＯＡＴ遺伝子のイントロン領域における位置 292；
・配列番号５での位置によって定義されるｃＭＯＡＴ遺伝子のイントロン領域における位置 232 および 457；
・配列番号６での位置によって定義されるｃＭＯＡＴ遺伝子のイントロン領域における位置 50 および 68；そして
・配列番号７での位置によって定義されるｃＭＯＡＴポリペプチドにおける位置 417、495、529、849、1036、および 1188.
【００１５】
ヒトという用語は、ｃＭＯＡＴ介在疾患に罹患している または罹患の疑いがあるヒトの両方、および該疾患に対して 疾病素質または感染性を試験されている無症候性のヒトを含む。それぞれの位置で、ヒトは対立遺伝子において同型接合体であっても異型接合体であってもよい。
【００１６】
本発明の１つの具体的態様において、好ましくは、本明細書に記載された診断方法が、配列番号１での位置によって定義されるｃＭＯＡＴ遺伝子のコード領域における多型が、下記の何れか１つである方法である。
【００１７】
【表１】
2004524846.tif 000002
【００１８】
本発明の１つの具体的態様において、好ましくは、本明細書中に記載された診断方法は、配列番号２での位置によって定義されるｃＭＯＡＴ遺伝子の５'ＵＴＲ領域における多型が下記の何れかである方法である。
【表２】
2004524846.tif 000003
【００１９】
本発明の１つの具体的態様において、好ましくは本明細書中に記載された診断方法は、ｃＭＯＡＴ遺伝子のイントロン領域における多型が下記の何れか１つである方法である。
【表３】
2004524846.tif 000004
【００２０】
本発明の１つの具体的態様において、好ましくは、本明細書中で記載された診断方法は、ｃＭＯＡＴタンパク質における多型が下記の何れかである方法である：
・配列番号７：Val 417 Ile,  Lys 495 GIu,  Arg 529 Trp,  Leu 849 Arg,  Ile 1036 Thr および Glu 1188 Val.
【００２１】
診断方法は、好ましくは、増幅抵抗性変異系、制限酵素断片長多型、およびプライマー伸長法から選択される方法によって、配列を決定する方法である。
個々の状態は、1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 またはそれ以上の何れかの位置で、対立遺伝子変異を参照することによって決定され得る。
【００２２】
核酸の試験試料は、便宜的には、個体の血液、気管支肺胞洗浄液、痰、もしくは他の体液、または組織の試料である。試験試料は、同様に、試験試料における配列に対応する核酸配列であってもよい。すなわち、試料の核酸の全部または一部が、対立遺伝子変異の分析前に、何れかの慣用の方法、例えばＰＣＲを用いて始めに増幅させ得る。
【００２３】
本発明の１もしくはそれ以上の多型の位置で、変異ヌクレオチドが存在するか否かを検出するのに用いられ得る 非常に多くの分析方法があることは、当業者に明らかである。一般的に、対立遺伝子変異の検出は、変異識別方法を必要とし、所望により増幅反応を、そして所望によりシグナル発生系を必要とする。表１は、いくつかの変異検出方法を挙げており、その幾つかはＰＣＲに基づく。これらは、幾つかのシグナル発生系との組み合わせで、すなわち表２に挙げたものから選択して用い得る。さらなる増幅方法を表３に挙げた。多くの現在の対立遺伝子変異体の検出方法が、Nollau ら著, Clin. Chem. 43,1114-1120,1997; および標準的なテキスト、例えば“Laboratory Protocols for Mutation Detection”, Ed., U. Landegren 著, Oxford University Press, 1996 および“PCR”, 2nd Edition, Newton and Graham 著, BIOS Scientific Publishers Limited, 1997 において、レビューされている。
【００２４】
【表４】
2004524846.tif 000005
【００２５】
表１−変異検出方法
・一般的な方法：ＤＮＡ配列決定、ハイブリダイゼーションによる配列決定；
・スキャニング：ＰＴＴ＊、ＳＳＣＰ、ＤＧＧＥ、ＴＧＧＥ、切断、ヘテロ二本鎖分析、ＣＭＣ、酵素ミスマッチ切断（＊：プロモーター多型の検出には有用ではない）；
・ハイブリダイゼーションをベースとした方法：固相ハイブリダイゼーション；ドット・ブロット法、ＭＡＳＤＡ、リバース・ドット・ブロット法、オリゴヌクレオチド・アレイ(ＤＮＡチップ)；
・溶液相ハイブリダイゼーション：Taqman(登録商標)[米国特許第 5,210,015 号、および米国特許第 5,487,972 号(Hoffmann-La Roche)]、分子ビーコン[Tyagi et al (1996), Nature Biotechnology, 14,303; WO 95/13399 (Public Health Inst., New York)]；
・伸長をベースとした方法：ARMS(登録商標)、ALEX(登録商標)[欧州特許第 332,435 B1 号(Zeneca Limited), COPS-Gibbs et al (1989), Nucleic Acids Research, 17, 2347]；
・組み込みをベースとした方法：Mini-sequencing, APEX；
・制限酵素をベースとした方法：RFLP(制限酵素部位生成ＰＣＲ)
・ライゲーションをベースとした方法：OLA
・他：インベーダー・アッセイ．
【００２６】
表２−シグナル発生または検出システム
・蛍光：FRET, 蛍光クエンチング, 蛍光偏光[英国特許第 2,228,998 号(Zeneca Limited)]；
・他：化学蛍光, 電気化学的蛍光、ラマン、放射能、比色計、ハイブリダイゼーション保護アッセイ、質量分析．
【００２７】
表３−さらなる増幅方法
・ＳＳＲ、ＮＡＳＢＡ、ＬＣＲ、ＳＤＡ、ｂ−ＤＮＡ.
【００２８】
表４−タンパク質変異検出方法
・イムノアッセイ；
・免疫組織学；
・ペプチド配列決定.
【００２９】
好ましい変異検出方法は、ARMS(登録商標)、ALEX(登録商標)、COPS、Taqman、分子ビーコン、RFLP、および制限酵素部位をベースとしたＰＣＲ、およびＦＲＥＴ法を含む。
イムノアッセイ法は、当業者に知られており、例えば A Practical Guide to ELISA, D M Kemeny 著, Pergamon Press (1991); Principles and Practice of Immunoassay, 2nd edition, C P Price and D J Newman, (1997), Stockton Press, USA and Canada および Macmillan Reference, the United Kingdom などで知られている。
【００３０】
特に好ましい方法は、ARMS(登録商標)および RFLP をベースとした方法を含む。 ARMS(登録商標)は、特に好ましい方法である。
さらなる態様において、本発明の診断方法は、ｃＭＯＡＴによって輸送された薬剤の薬理学的な評価に用いられる。
【００３１】
例えばレポーターをベースとしたアッセイのようなアッセイが、１もしくはそれ以上の上記の多型が、転写レベル および／または メッセージ安定性に影響を与えるかどうかを検出するために考慮されてもよい。
【００３２】
ｃＭＯＡＴ遺伝子の特定の対立遺伝子変異体を有する個人は、従って、種々の生理学的条件下のタンパク質生合成を制御する能力において違いを示し、そして異なる疾患に対して反応する 異なる能力を示す。さらに、対立遺伝子変異体の結果として生じる違いが、薬物治療への個人の応答において、直接の影響を有しうる。本発明の診断方法は、該薬剤に対する臨床的な応答を予測し、かつ治療的用量を決定するのに有用であり得る。
【００３３】
さらなる態様において、本発明の診断方法は、ｃＭＯＡＴが介在する疾患における個人の疾病素質 および／または かかりやすさを評価するのに用いられる。これは、高脂質タンパク質血症 および心血管疾患の進行に、特に関係する。そして、本発明は、特にこれらの状態の進行の危険があるヒトを認識するために用いられ得る。
【００３４】
さらなる態様において、本発明の診断方法は、ｃＭＯＡＴ遺伝子の１もしくはそれ以上の対立遺伝子変異体を選択的に標的とする新しい薬物治療の開発に用いられる。特定の対立遺伝子変異体と疾病の進行に対する疾病素質または薬物治療への応答の間の関係の認識は、新しい薬物の設計に、有意な影響を与え得る。薬物は、疾病の進行に関係する変異体の生物学的な活性を制御する一方、別の変異体への影響は最少であるよう設計され得る。
【００３５】
さらなる本発明の診断的な態様において、変異体ヌクレオチドが存在するか否かが、所望により加工され、制限酵素によって認識される部位の喪失または取得を参照することによって検出される。
【００３６】
本発明の別の態様によって、本明細書中で定義される １もしくはそれ以上の位置での対立遺伝子変異体多型、または少なくとも１つの新規の多型を含む少なくとも２０塩基のそのフラグメントを含む、ヒトのｃＭＯＡＴ遺伝子またはその相補鎖を提供する。
【００３７】
フラグメントは、少なくとも１７塩基であり、より好ましくは少なくとも２０塩基であり、より好ましくは少なくとも３０塩基である。
【００３８】
本発明の別の態様によって、ヒトのｃＭＯＡＴ遺伝子の少なくとも２０塩基を含み、そして、下記の何れか１つから選択される対立遺伝子変異体を含む ポリヌクレオチドを提供する。
【００３９】
【表５】
2004524846.tif 000006
【００４０】
【表６】
2004524846.tif 000007
【００４１】
【表７】
2004524846.tif 000008
【００４２】
本発明の別の態様によって、多型、好ましくは１もしくはそれ以上の本明細書中に定義した位置に対応する多型、または少なくとも１つの多型を含む少なくとも２０塩基のそのフラグメントを含む、ヒトのｃＭＯＡＴ遺伝子またはその相補鎖を提供する。
【００４３】
フラグメントは少なくとも１７塩基であり、より好ましくは少なくとも２０塩基であり、より好ましくは少なくとも３０塩基である。
本発明は、さらに本発明の多型を検出し得るヌクレオチドを提供する。
【００４４】
本発明の別の態様によって、ｃＭＯＡＴ遺伝子多型、好ましくは本明細書中で定義される位置での ｃＭＯＡＴ遺伝子多型を検出し得る対立遺伝子に特異的なプライマーを提供する。
【００４５】
対立遺伝子に特異的なプライマーを、ＰＣＲ反応のような増幅反応において、一般的にはコンスタント・プライマーと共に用いる。該増幅反応は、特定の配列の位置で１つの対立遺伝子の選択的増幅を介して、例えば ARMS(登録商標)アッセイに用いられるように、対立遺伝子を区別する。対立遺伝子に特異的なプライマーは、好ましくは１７−５０ヌクレオチドであり、より好ましくは約１７−３５ヌクレオチドであり、より好ましくは約１７−３０ヌクレオチドである。
【００４６】
対立遺伝子に特異的なプライマーは、好ましくは検出されるべき対立遺伝子に正確に対応するが、その誘導体にもまた３'末端の約６−８個のヌクレオチドが検出されるべき対立遺伝子に対応し、かつ１０個以下の、例えば８個、６個、４個、２個、または１個以下の残りのヌクレオチドは、プライマーの性質に大きく影響されることなく変えられ得ると予期される。
【００４７】
プライマーは、何れかの慣用の合成方法を用いて製造され得る。該方法の実施例は、標準のテキスト、例えば“Protocols for Oligonucleotides and Analogues; Synthesis and Properties”, Methods in Molecular Biology Series; Volume 20; Ed. Sudhir Agrawal, Humana ISBN: 0-89603-247-7; 1993; 1st Edition で見出され得る。必要であれば、プライマーは、検出を容易にするようラベルされ得る。
【００４８】
本発明の別の態様によって、ｃＭＯＡＴ遺伝子多型、好ましくは本明細書中で定義される１もしくはそれ以上の位置でのｃＭＯＡＴ遺伝子多型を検出し得る、対立遺伝子に特異的なオリゴヌクレオチド・プローブを提供する。
【００４９】
対立遺伝子に特異的なオリゴヌクレオチド・プローブは、好ましくは１７−５０ヌクレオチドであり、より好ましくは約１７−３５ヌクレオチド、より好ましくは約１７−３０ヌクレオチドである。
【００５０】
該プローブの設計は、分子生物学の当業者に明らかである。該プローブは、何れかの都合のよい長さであり、５０塩基以下、４０塩基以下、より都合よくは３０塩基以下の長さであり、例えば８−２５塩基、または８−１５塩基の長さである。一般的に、該プローブは、対応する野生型またはその遺伝子の中の位置での変異体に、完全に相補的な塩基配列を含む。しかし、必要であれば、オリゴヌクレオチド・プローブの識別力に不適当な影響を与えることがないならば、１もしくはそれ以上のミスマッチを導入し得る。本発明のプローブは、検出を容易にするために、１もしくはそれ以上のラベルをつけ得る。
【００５１】
本発明の別の態様によって、本明細書中で定義した位置の１つでのｃＭＯＡＴ遺伝子多型を検出し得る、対立遺伝子に特異的なプライマー、または対立遺伝子に特異的なオリゴヌクレオチド・プローブを提供する。
【００５２】
本発明の別の態様によって、本発明の対立遺伝子に特異的なオリゴヌクレオチド・プローブ および／または 本発明の対立遺伝子に特異的なプライマーを含む診断キットを提供する。
【００５３】
診断キットは、本発明の方法に使用するための適切なパッケージと指示を含み得る。該キットは、さらに適切な緩衝液と、ポリメラーゼ、例えばｔａｑポリメラーゼなどの熱安定性ポリメラーゼを含み得る。
【００５４】
本発明の別の態様において、本発明の一本鎖ヌクレオチド多型は、結合試験において、遺伝子マーカーとして用いられ得る。これは、その比較的高い頻度(下記参照)のために、特に配列番号１における位置７８および１３５０での多型に適用される。ｃＭＯＡＴ遺伝子は、染色体１０ｑ２４にマップされている(Tanaguchi et al (1996). Cancer Res. 56,4124-4129.)。
【００５５】
頻度が低い多型は、特に下記に記載のハプロタイプに有用であり得る。ハプロタイプは、一本鎖(父系または母系の)染色体上で、結合された多型部位(例えば遺伝子での部位)に見出される対立遺伝子の組である。遺伝子の組換えがランダムであるならば、２ｎ(２は各ＳＮＰでの対立遺伝子の数であり、ｎはＳＮＰの数である)は、ハプロタイプと同数であり得る。臨床的な応答と関連する変異体または多型を同定する１つの方法は、対照の集団において同定され得る全てのハプロタイプを用いた結合試験を行うことである。各ハプロタイプの頻度は、その最も珍しい対立遺伝子の頻度によって制限される。その結果、対立遺伝子頻度の低いＳＮＰは、頻度の低いハプロタイプのマーカーとして特に有用である。ある臨床的な特徴、例えば有害事象または異常事象に関係する特定の変異体または多型は、その集団中で頻度の低いものであり得るため、頻度の低いＳＮＰは、これらの変異体を同定するのに 特に有用であり得る(例えばシスタチオニンβ合成酵素(ＣＢＳ)位置での結合不均衡、およびＣＢＳ位置での遺伝的変異とホモシステインの血漿レベルの間の関係− Ann Hum Genet (1998) 62: 481-90, De Stefano V, Dekou V, Nicaud V, Chasse JF, London J, Stansbie D, Humphries SE, and Gudnason V；およびフォン・ウィルブランド因子(ｖＷＦ)遺伝子位置での変異が血漿ｖＷＦ：Ａｇレベル：ｖＷＦ遺伝子プロモーターにおける３つの新規の一本鎖ヌクレオチド多型の識別に関係する− Blood (1999) 93: 4277-83, Keightley AM, Lam YM, Brady JN, Cameron CL, Lillicrap D 参照)。
【００５６】
本発明の別の態様によって、媒体に保存された 本発明の少なくとも１つの新規の配列を含む、コンピューターで読み出し可能な媒体を提供する。コンピューターで読み出し可能な媒体は、例えば相同性検索、マッピング、ハプロタイプ、遺伝子型、または薬理学的分析において用いられ得る。
【００５７】
本発明の別の態様によると、ｃＭＯＡＴによって輸送可能な薬物で処置する必要があるヒトを処置する方法を提供する。該方法は、
i) ヒトのｃＭＯＡＴにおける多型の診断であって、該診断が、好ましくは１もしくはそれ以上の下記の位置：
・配列番号１での位置によって定義されるｃＭＯＡＴ遺伝子のコード領域における位置78, 1350, 1584, 1686, 2647, 3208, 3664 および 4391；
・配列番号２での位置によって定義されるｃＭＯＡＴ遺伝子の５'ＵＴＲ領域における位置 1349, 1875 および 1879；
・配列番号３での位置によって定義されるｃＭＯＡＴ遺伝子のイントロン領域における位置 12704 および 29446；
・配列番号４での位置によって定義されるｃＭＯＡＴ遺伝子のイントロン領域における位置 292；
・配列番号５での位置によって定義されるｃＭＯＡＴ遺伝子のイントロン領域における位置 232 および 457；
・配列番号６での位置によって定義されるｃＭＯＡＴ遺伝子のイントロン領域における位置 50 および 68；
・配列番号７での位置によって定義されるｃＭＯＡＴポリペプチドにおける位置 417, 495, 529, 849, 1036 および 1188；
での配列を決定し、そしてｃＭＯＡＴ遺伝子における多型を参照することによってヒトの状態(status)を決定する；および
ii) 有効量の薬物を投与する
ことを含む。
【００５８】
好ましくは、ヒトの状態の決定は、臨床的に有用である。臨床的に有用な例は、どのスタチン薬またはスタチン類を投与するかを決定すること および／またはスタチン薬またはスタチン類の有効量を決定することを含む。すでにヒトにおける使用が認可されているスタチン類は、アトルバスタチン、セリバスタチン、フルバスタチン(fluvastatin)、プラバスタチン、およびシンバスタチンを含む。さらなる情報のためには下記の参考文献を参考にされたい：Drugs and Therapy Perspectives (12"'May 1997), 9: 1-6; Chong (1997) Pharmacotherapy 17: 1157-1177; Kellick (1997) Formulary 32: 352; Kathawala (1991) Medicinal Research Reviews, 11: 121-146; Jahng (1995) Drugs of the Future 20: 387-404, and Current Opinion in Lipidology, (1997), 8, 362-368。記載の別のスタチン薬は、Watanabe (1997) Bioorganic and Medicinal Chemistry 5: 437-444 における化合物３ａ(S-4522)である。“ｃＭＯＡＴによって輸送され得る薬剤”は、ヒトにおいて、ｃＭＯＡＴによる輸送が、ヒトにその薬学的な効果を与える薬剤のひとつの態様であることを意味する。例えば、幾つかのスタチン類は、ヒトの身体において、ｃＭＯＡＴによって複合体として輸送され得る。
【００５９】
本発明の別の態様によって、少なくとも１つの下記：
・配列番号７の位置 417 のイソロイシン；
・配列番号７の位置 495 のグルタミン酸；
・配列番号７の位置 529 のトリプトファン；
・配列番号７の位置 849 のアルギニン；
・配列番号７の位置 1036 のスレオニン；および
・配列番号７の位置 1188 のバリン；または
フラグメントが少なくとも１つの対立遺伝子変異体を含む場合、少なくとも１０個のアミノ酸を含む それらのフラグメント；
を含む、ヒトのｃＭＯＡＴポリペプチドの対立遺伝子変異体を提供する。
【００６０】
ポリペプチドのフラグメントは、少なくとも１０個のアミノ酸であり、より好ましくは少なくとも１５個のアミノ酸であり、より好ましくは 少なくとも２０個のアミノ酸である。
【００６１】
本発明の別の態様によって、本明細書中に記載のヒトのｃＭＯＡＴポリペプチドの対立遺伝子変異体に特異的な抗体を提供する。
抗体は、何れかの適切な方法を用いて製造され得る。例えば、精製ポリペプチドは、特定の抗体を製造するのに用いられ得る。“抗体”という用語は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、および抗体構造物の変異型、例えばＦ(ａｂ')２、Ｆａｂ、および一本鎖Ｆｖを含むことを意味する。抗体は、それらがｃＭＯＡＴの対立遺伝子変異体と約１０７Ｍ−１以上のＫａ値で結合すれば、特異的に結合すると定義される。結合親和性は、慣用の方法、例えば Scatchard et al., Ann. N. Y. Acad. Sci., 51: 660 (1949) に記載の方法を用いて決定され得る。
【００６２】
ポリクローナル抗体は、様々なソースから、例えばウマ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、イヌ、トリ、ウサギ、マウス、またはラットから、当業界に周知の手順を用いて、容易に作られ得る。一般的に、抗原を宿主動物に、典型的には非経腸注射で投与する。抗原の免疫原性は、アジュバント、例えばフロイント完全アジュバントもしくはフロイント不完全アジュバントなどを用いて強め得る。追加免疫化後、血清の少量の試料を集め、抗原の反応性を試験する。該決定に有用な様々なアッセイの例は、Antibodies : A Laboratory Manual, Harlow and Lane (eds.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988 に記載のアッセイ、および免疫−交流電気泳動(ＣＩＥＰ)、放射性免疫アッセイ、放射性免疫沈降、酵素結合免疫吸着アッセイ(ＥＬＩＳＡ)、ドット・ブロット・アッセイ、およびサンドイッチアッセイ(米国特許第 4,376,110 号、および第 4,486,530 号参照) のようなアッセイを含む。
【００６３】
モノクローナル抗体は、周知の方法、例えば米国特許第 RE 32,011 号、第 4,902,614 号、第 4,543,439 号 および第 4,411,993 号；Monoclonal Antibodies, Hybridomas: A New Dimension in Biological Analyses, Plenum Press, Kennett, McKearn, and Bechtol (eds.), (1980) に記載の方法を用いて、容易に製造され得る。
【００６４】
本発明のモノクローナル抗体は、代替の方法、例えば Alting-Mees et al.,"Monoclonal Antibody Expression Libraries: A Rapid Alternative to Hybridomas", Strategies in Molecular Biology 3 : 1-9 (1990) (本明細書中で言及することによって組み込まれている)によって記載された方法を用いて製造され得る。同様に、結合パートナーは、リコンビナントＤＮＡ法を用いて構築され、特異的結合抗体をコードする遺伝子の様々な領域を組み込み得る。該方法は、Larrick et al., Biotechnology, 7 : 394 (1989) に記載されている。
【００６５】
一旦 単離され精製されれば、抗体は、確立されたアッセイ・プロトコルを用いて、試料中の抗原の存在を検出するのに用いられ得る。例えば "A Practical Guide to ELISA" by D. M. Kemeny, Pergamon Press, Oxford, England 参照。
【００６６】
本発明は別の態様によって、本発明の抗体を含む診断キットを提供する。
【００６７】
本発明は、下記の実施例を述べることによって例示されるが、これは、本発明を制限しない。全ての温度は摂氏である。
以下の実施例において、特記しない限り、下記の方法および物質を適用している。
【００６８】
AMPLITAQ(登録商標)は、Perkin-Elmer Cetus より市販されており、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼのソースとして用いられる。
一般的な分子生物学の方法は、"Molecular Cloning-A Laboratory Manual" Second Edition, Sambrook, Fritsch and Maniatis (Cold Spring Harbor Laboratory, 1989)、または "Current Protocols in Molecular Biology Volumesl-3, F M Asubel, R Brent and R E Kingston 編; John Wileyより出版 (1998) の何れかに従い得る。
【００６９】
電気泳動図は、標準的な方法で得られる。データを、ABI377 data collection software によって集め、ABI Prism sequencing analysis (2.1.2) によって、波形が得られた。
【実施例】
【００７０】
（実施例１）
多型の同定
１．方法
ＤＮＡの製法
ＤＮＡを、下記の修飾をしたプロトコルＩ(Molecular Cloning: A Laboratory Manual, p392, Sambrook, Fritsch and Maniatis, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Press, 1989)に従うＥＤＴＡ中に集めた、凍結させた血液試料から製造した。解凍した血液を、リン酸生理緩衝液の代わりに、等量の標準生理クエン酸緩衝液で希釈し、溶血した赤血球細胞を除いた。試料を、フェノールで３回抽出するのではなく、フェノール、次にフェノール／クロロホルム、次にクロロホルムで抽出した。ＤＮＡを、脱イオン水に溶解した。
【００７１】
テンプレートの製法
テンプレートを、以下に示したオリゴヌクレオチドを用いて、ＰＣＲによって製造した。全てのプライマーの組のアニーリング温度は５８℃とし、伸長温度は７２℃とし、変性温度は９４℃とした。一般的に、各反応には、５０ngのゲノムＤＮＡを用い、３５サイクルのＰＣＲにかけた。
エクソンの増幅に用いられた全てのプライマーは、Toh らによって発表されている(Am. J. Hum. Genet., 1999,64: 739-746)。
【００７２】
プロモーターの増幅のためのプライマーと、５'ＵＴＲを以下に挙げた。プライマーの配列は、配列番号２に基づいている。
【表８】
2004524846.tif 000009
【００７３】
３'ＵＴＲの増幅のためのプライマーを以下に挙げており、配列番号１に基づく。
【表９】
2004524846.tif 000010
【００７４】
色素プライマー（dye-primer）配列決定のために、これらのプライマーを修飾し、Ｍ１３ フォワード・プライマーおよびリバース・プライマー配列(ABI protocol P/N 402114, Applied Biosystems)を、フォワード・ヌクレオチド と リバース・オリゴヌクレオチドの それぞれの５'末端に含ませた。
【００７５】
色素プライマー配列
Ｍ１３ フォワード・プライマー および リバース・プライマーを用いた色素プライマー配列決定は、アニーリング温度を４５℃とし、ＤＭＳＯを最終濃度５％で サイクル配列決定混合液に加えた点で修飾された、“AmpliTaq FS”ＤＮＡポリメラーゼを用いた ABI Prism(登録商標) dye primer cycle sequencing core kit のための、ABI protocol P/N 402114 に記載されたように行った。
【００７６】
それぞれの塩基のための伸長反応物を、集め、エタノール／酢酸ナトリウム沈殿を行い、洗浄し、ホルムアミド添加緩衝液中で再度懸濁した。
４．２５％のアクリルアミドゲル自動配列決定装置(ABI 377, Applied Biosystems)にかけた。
【００７７】
２．結果
【表１０】
2004524846.tif 000011
【００７８】
【表１１】
2004524846.tif 000012
【００７９】
【表１２】
2004524846.tif 000013
【００８０】
【表１３】
2004524846.tif 000014
配列番号４は、エクソン１５と、その両端に隣接したイントロン配列である。
【００８１】
【表１４】
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配列番号５は、エクソン ２７／イントロン ２７／エクソン ２８であり、その両端に隣接したイントロン配列である。
【００８２】
【表１５】
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配列番号６は、エクソン３０と、その両端に隣接したイントロン配列である。
対立遺伝子頻度は、２０から２３の個体の分析に基づく。
【００８３】
（実施例２）
ｃＭＯＡＴ遺伝子の５'末端における多型の診断アッセイ
ｃＭＯＡＴ ５'末端は、配列番号２で表され、この実施例２における全ての位置は、配列番号２における位置に関する。ＤＮＡおよびテンプレートの製造は、前に述べた通りである：実施例１参照。
【００８４】
位置：2874 Ｃ／Ｔ
・診断プライマー：2875-2903；
診断プライマーは、野生型の配列に対して、位置２５(Ｇ→Ｔ)と、位置(Ａ→Ｔ)で、２個のミスマッチを含む。
・コンスタント・プライマー：2624−2643；
これらのプライマーを用いたＰＣＲ増幅は、２８０bpの生成物を与える。テンプレートに対する診断プライマーの使用は、多型の部位でＢｓｒ ＧＩ認識配列(ＴＧＴＡＣＡ)を与える。Ｂｓｒ ＧＩ(New England Biolabs)は、従って、２つの多型変異体を区別し得る。ＰＣＲ生成物の消化を、製造者(New England Biolabs)の指示に従って行った。
【表１６】
2004524846.tif 000017
【００８５】
位置 1875 Ｇ／Ａ
・診断プライマー：1849-1874；
診断プライマーは、野生型の配列に対して、位置２２(Ｃ→Ｔ)と、位置２５(Ａ→Ｔ)で、２つのミスマッチを含む。
・コンスタント・プライマー：2145-2164；
これらのプライマーを用いたＰＣＲ増幅は、３１５bpの生成物を与える。テンプレートに対する診断プライマーの使用は、多型の部位でのＢｓｐ Ｈ１認識配列(ＴＣＡＴＧＡ) を与える。従って、ＢｓｐＨ１(New England Biolabs)は、２つの多型変異体を区別し得る。ＰＣＲ生成物の消化を、製造者(New England Biolabs)の指示に従って行った。
【表１７】
2004524846.tif 000018
【００８６】
位置 1879 Ａ／Ｇ
・診断プライマー：1880-1903；
診断プライマーは、野生型の配列に対して、位置２２(Ｃ→Ｇ)と、位置２４(Ｔ→Ａ)で、２つのミスマッチを含む。
・コンスタント・プライマー：1622-1641；
これらのプライマーを用いたＰＣＲ増幅は、３１５bpの生成物を与える。テンプレートに対する診断プライマーの使用は、多型の部位でのＮｓｉＩ認識配列(ＡＴＧＣＡＴ)を与える。従って、ＮｓｉＩ(New England Biolabs)は、２つの多型変異体を区別し得る。ＰＣＲ生成物の消化は、製造者(New England Biolabs)の指示に従って行った。
【表１８】
2004524846.tif 000019
【００８７】
（実施例３）
ｃＭＯＡＴ遺伝子のコード配列における多型の診断アッセイ
ｃＭＯＡＴ遺伝子配列は、配列番号１で表されている。この実施例３における全ての位置は、特記しない限り配列番号１での位置に関する。
【００８８】
位置 1350 Ｇ／Ａ
・診断プライマー：1352-1379(配列番号１)；
診断プライマーは、野生型の配列に対して、位置２８(Ｔ→Ａ)で、１つのミスマッチを含む。
・コンスタント・プライマー：23107-23128(配列番号３)；
これらのプライマーを用いたＰＣＲ増幅は、２０１bpの生成物を与える。テンプレートに対する診断プライマーの使用は、多型の部位でのＮｃｏＩ認識配列(ＣＣＡＴＧＧ)を与える。従って、ＮｃｏＩ(New England Biolabs)は、２つの多型変異体を区別し得る。ＰＣＲ生成物の消化を、製造者(New England Biolabs)の指示に従って行った。
【表１９】
2004524846.tif 000020
【００８９】
位置 1686 Ｃ／Ｔ
エクソン１２の増幅のための 下記に記載のプライマーを用いて、増幅を行う。これらのプライマーを用いたＰＣＲ増幅は、約５００bpの生成物を与える。多型は、多型の部位での天然のＡｃｃIII認識配列(ＴＣＣＧＧＡ)を壊す。従って、ＡｃｃIII(New England Biolabs)は、２つの多型変異体を区別し得る。ＰＣＲ生成物の消化は、製造者(New England Biolabs)の指示に従って行った。
【表２０】
2004524846.tif 000021
【００９０】
位置 2647 Ｔ／Ｇ
エクソン１８と１９の増幅のための 下記のプライマーを用いて、増幅を行う。これらのプライマーを用いたＰＣＲ増幅は、約７８０bpの生成物を与える。多型は、多型の部位での天然のＥｃｏＲII認識配列(ＣＣＷＧＧ(式中、Ｗは、ＡまたはＴを表す))を破壊する。従って、ＥｃｏＲII(New England Biolabs)は、２つの多型変異体を区別し得る。ＰＣＲ生成物の消化を、製造者(New England Biolabs)の指示に従って行った。
【表２１】
2004524846.tif 000022
【００９１】
位置 3208 Ｔ／Ｃ
増幅は、エクソン２２と２３の増幅のための 下記のプライマーを用いて行う。これらのプライマーでのＰＣＲ増幅は、約７５０bpの生成物を与える。多型は、多型の部位でのＲｓａＩ認識配列(ＧＴＡＣ)を与える。従って、ＲｓａＩ(New England Biolabs)は、２つの多型変異体を区別し得る。ＰＣＲ生成物の消化を、製造者(New England Biolabs)の指示に従って行った。
【表２２】
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【００９２】
ヌクレオチド 3664 Ｔ／Ａ
・診断プライマー：3665-3691；
診断プライマーは、野生型の配列に対して、位置２５(Ｃ→Ｇ)で、１つのミスマッチを含む。
イントロン２４でのコンスタント・プライマーは、Toh et al. Am. J. Hum. Genet., 1999, 64: 739-746 で開示された通りである。
【００９３】
これらのプライマーを用いたＰＣＲ増幅は、２４１bpの生成物を与える。テンプレートに対する診断プライマーの使用は、多型の部位でのＴｓｐ ４５Ｉ認識配列(ＧＴＳＡＣ(式中、ＳはＧまたはＣの何れかである))を破壊する。従って、Ｔｓｐ ４５Ｉ(New England Biolabs)は、２つの多型変異体を区別し得る。ＰＣＲ生成物の消化を、製造者(New England Biolabs)の指示に従って行った。
【表２３】
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【００９４】
位置 4391 Ｔ／Ｇ
・診断プライマー：4392-4112；
診断プライマーは、野生型の配列に対して、位置１８(Ｃ→Ａ)と、位置１９(Ｇ→Ｃ)で、２つのミスマッチを含む。
・コンスタント・プライマー：4252-4272；
これらのプライマーを用いたＰＣＲ増幅は、１６３bpの生成物を与える。テンプレートに対する診断プライマーの使用は、多型の部位でのＳｎａ ＢＩ認識配列(ＴＡＣＧＴＡ)を与える。従って、Ｓｎａ ＢＩ(New England Biolabs)は、多型変異体を区別し得る。ＰＣＲ生成物の消化を、製造者(New England Biolabs)の指示に従って行った。
【表２４】
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ｃＭＯＡＴ エクソン特異的オリゴは、Toh et al. Am. J. Hum. Genet., 1999,64: 739-746 よりである。
【００９５】
プロモーターおよび５'ＵＴＲ オリゴヌクレオチド(配列番号２；Ｆ＝フォワード；Ｒ＝リバース)
・生成物 １Ｆ (1164-1183)；
・生成物 １Ｒ (1710-1729)；
・プロモーター ２Ｆ (1622-1641)；
・生成物 ２Ｒ (2145-2164)；
・生成物 ３Ｆ (2061-2080)；
・生成物 ３Ｒ (2658-2677)．
【００９６】
３'ＵＴＲ オリゴヌクレオチド(配列番号１；Ｆ＝フォワード；Ｒ＝リバース)
・３'ＵＴＲ Ｆ (4707-4726)；
・３'ＵＴＲ Ｒ (5188-5207).
【国際公開パンフレット】
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2004524846.tif 000074
2004524846.tif 000075
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004524846.tif 000076
【国際調査報告】
2004524846.tif 000077
2004524846.tif 000078
2004524846.tif 000079
2004524846.tif 000080