(57)【要約】本発明は、組換え型タンパク質発現、組換え型タンパク質の精製、ＨＣＶ感染の診断、ＨＣＶ感染に対する予防的治療の一般的分野及び慢性肝炎を患う個体の治療の臨床的効率の予後診断／監視又は自然疾病の予後／監視に関する。特に、本発明は、コア−グリコシル化されているＨＣＶエンベロープタンパク質の効率の良い発現のための酵母すなわちＨａｎｓｅｎｕｌａ又はＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓグリコシル化マイナス菌株の使用、これらのタンパク質のための精製方法、及び本発明により精製されたＨＣＶエンベロープタンパク質の診断、予防又は療法における使用のごときさまざまな利用分野における使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
システインが化学的に修飾されており、該修飾が可逆的であるＨＣＶエンベロープタンパク質又はその一部分から形成されているＨＣＶウイルス様粒子。
【請求項２】
前記化学的修飾がスルホン化である、請求項１に記載のＨＣＶウイルス様粒子。
【請求項３】
前記化学物質がジチオジピリジン、ジチオカルバメート又はシステインである、請求項１に記載のＨＣＶウイルス様粒子。
【請求項４】
前記ＨＣＶ外皮タンパク質又はその一部分がＥ１エンベロープタンパク質又はその一部分及び／又はＥ２エンベロープタンパク質又はその一部分である、請求項１に記載のＨＣＶウイルス様粒子。
【請求項５】
前記ＨＣＶエンベロープタンパク質又はその一部分がＥ１ｓエンベロープタンパク質又はその一部分及び／又はＥ２ｓエンベロープタンパク質又はその一部分である、請求項４に記載のＨＣＶウイルス様粒子。
【請求項６】
前記ＨＣＶエンベロープタンパク質又はその一部分が配列番号２〜４の中から選択されるものである、請求項５に記載のＨＣＶウイルス様粒子。
【請求項７】
前記ＨＣＶエンベロープタンパク質又はその一部分が真核細胞内での発現産物である、請求項１〜６のいずれか１項に記載のＨＣＶウイルス様粒子。
【請求項８】
前記真核細胞が真菌細胞である、請求項７に記載のＨＣＶウイルス様粒子。
【請求項９】
前記真核細胞が酵母細胞である、請求項７に記載のＨＣＶウイルス様粒子。
【請求項１０】
前記酵母細胞がＨａｎｓｅｎｕｌａ細胞である、請求項９に記載のＨＣＶウイルス様粒子。
【請求項１１】
前記ＨＣＶエンベロープタンパク質又はその一部分が、ＣＬリーダーペプチド又はその機能的等価物を含有するタンパク質及び前記ＨＣＶエンベロープタンパク質又はその一部分をコードする遺伝子から発現されるものである、請求項８又は９に記載のＨＣＶウイルス様粒子。
【請求項１２】
前記ＨＣＶエンベロープタンパク質又はその一部分がコア−グリコシル化されている、請求項１〜１１のいずれか１項に記載のＨＣＶウイルス様粒子。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれか１項に記載のＨＣＶウイルス様粒子を含んで成る薬剤。
【請求項１４】
請求項１〜１２のいずれか１項に記載のＨＣＶウイルス様粒子を含んで成るワクチン。
【請求項１５】
抗−ＨＣＶ抗体を含むことが推測されている試料中の抗ＨＣＶ抗体の存在を検出する方法であって、
（ｉ）前記ＨＣＶウイルス様粒子と前記抗−ＨＣＶ抗体の複合体化を可能にする条件下で前記試料と請求項１〜１２のいずれか１項に記載のＨＣＶウイルス様粒子を接触させる工程；
（ｉｉ）（ｉ）で形成された複合体を検出する工程；及び
（ｉｉｉ）前記試料中の前記抗−ＨＣＶ抗体の存在を（ｉｉ）から推論する工程、
を含んで成る方法。
【請求項１６】
工程（ｉ）での前記接触が競合的条件下で起こる、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記ＨＣＶウイルス様粒子が固体支持体に結合させられている、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
抗ＨＣＶ抗体を含むことが推測されている試料中の抗ＨＣＶ抗体の存在を検出するための診断用キットであって、請求項１〜１２のいずれか１項に記載のＨＣＶウイルス様粒子を含んで成るキット。
【請求項１９】
前記ＨＣＶウイルス様粒子が固体支持体に結合させられている、請求項１８に記載の診断用キット。
【請求項２０】
ＣＬリーダーペプチド又はその機能的等価物を含有するタンパク質及び前記ＨＣＶエンベロープタンパク質又はその一部分をコードする遺伝子で形質転換された真核細胞を適切な培地で増殖させる工程を含んで成る、請求項１〜１２のいずれか１項に記載のＨＣＶウイルス様粒子を形成するための方法。
【請求項２１】
前記真核細胞において前記ＨＣＶエンベロープタンパク質又はその一部分の発現をひき起こす工程をさらに含んで成る、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記真核細胞における発現産物である前記ＨＣＶエンベロープタンパク質又はその一部分を前記真核細胞から単離する工程をさらに含んで成る、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記真核細胞における発現産物である前記ＨＣＶエンベロープタンパク質又はその一部分を前記真核細胞の培養から単離する工程をさらに含んで成る、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
前記単離が、前記真核細胞を溶解させる工程を含んでいる、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
前記溶解工程がカオトロピック剤の存在下で実施される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
単離されたタンパク質中のＣｙｓ−アミノ酸が化学的に修飾され、前記化学的修飾が可逆的である、請求項２２、２４及び２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
ヘパ結合ロマトグラフィが関与する、請求項２２及び２４〜２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
ＨＣＶ  Ｅ１及び／又はＨＣＶ  Ｅ２タンパク質又はその前記一部分がコア−グリコシル化されていることを特徴とする、ＨＣＶ  Ｅ１及び／又はＨＣＶ  Ｅ２タンパク質の発現のためのＨａｎｓｅｎｕｌａ又はＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓグリコシル化マイナス菌株の使用。
【請求項２９】
免疫検定又はワクチンでの使用に適した、コア−グリコシル化されたＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）エンベロープタンパク質又はその任意の一部分を精製するための方法であって：
−  ＨＣＶ  Ｅ１及び／又はＨＣＶ  Ｅ２タンパク質又はその任意の一部分をコードするエンベロープ遺伝子で形質転換されたＨａｎｓｅｎｕｌａ又はＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓグリコシル化マイナス菌株を適切な培地で増殖させる工程；
−  前記ＨＣＶ  Ｅ１及び／又はＨＣＶ  Ｅ２ 遺伝子又はその任意の一部分の発現をひき起こす工程、及び
−  前記コア−グリコシル化されたＨＣＶ  Ｅ１及び／又はＨＣＶ  Ｅ２タンパク質又はその任意の一部分を前記細胞培養から精製する工程、を含んで成る方法。
【請求項３０】
免疫検定又はワクチンでの使用に適した、コア−グリコシル化されたＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）エンベロープタンパク質又はその任意の一部分を精製するための方法であって：
−  ＨＣＶ  Ｅ１及び／又はＨＣＶ  Ｅ２タンパク質又はその任意の一部分をコードするエンベロープ遺伝子で形質転換されたＨａｎｓｅｎｕｌａ又はＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓグリコシル化マイナス菌株を適切な培地で増殖させる工程；
−  前記ＨＣＶ  Ｅ１及び／又はＨＣＶ  Ｅ２ 遺伝子又はその任意の一部分の発現をひき起こす工程；及び
−  前記細胞内で発現されたコア−グリコシル化済みＨＣＶ  Ｅ１及び／又はＨＣＶ  Ｅ２タンパク質又はその任意の一部分を、形質転換された宿主細胞が溶解してから精製する工程、を含んで成る方法。
【請求項３１】
前記遺伝子又はその任意の一部分が、ＣＬリーダー又はその機能的等価物を含有するものである、請求項２９又は３０に記載の方法。
【請求項３２】
免疫検定又はワクチンでの使用に適した、コア−グリコシル化されたＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）エンベロープタンパク質又はその任意の一部分を精製するための方法であって、
−ｉ−  少なくとも２つのＣｙｓ−アミノ酸を含むＨＣＶ  Ｅ１及び／又はＨＣＶ  Ｅ２タンパク質又はその任意の一部分をコードするエンベロープ遺伝子で形質転換されたＨａｎｓｅｎｕｌａ又はＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓグリコシル化マイナス菌株を適切な培地で増殖させる工程；
−ｉｉ−  前記ＨＣＶ  Ｅ１及び／又はＨＣＶ  Ｅ２ 遺伝子又はその任意の一部分の発現をひき起こす工程；及び
−ｉｉｉ−  前記Ｃｙｓ−アミノ酸が化学的及び／又は酵素的手段で可逆的に保護されている、前記コア−グリコシル化されたＨＣＶ  Ｅ１及び／又はＨＣＶ  Ｅ２タンパク質又はその任意の一部分を前記細胞培養から精製する工程、
を含んで成る方法。
【請求項３３】
免疫検定又はワクチンでの使用に適した、コア−グリコシル化されたＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）エンベロープタンパク質又はその任意の一部分を精製するための方法であって：
−ｉ−  少なくとも２つのＣｙｓ−アミノ酸を含むＨＣＶ  Ｅ１及び／又はＨＣＶ  Ｅ２タンパク質又はその任意の一部分をコードするエンベロープ遺伝子で形質転換されたＨａｎｓｅｎｕｌａ又はＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓグリコシル化マイナス菌株を適切な培地で増殖させる工程；
−ｉｉ−  前記ＨＣＶ  Ｅ１及び／又はＨＣＶ  Ｅ２ 遺伝子又はその任意の一部分の発現をひき起こす工程；及び
−ｉｉｉ−  前記Ｃｙｓ−アミノ酸が化学的及び／又は酵素的手段で可逆的に保護されている、前記細胞内発現されたコア−グリコシル化されたＨＣＶ  Ｅ１及び／又はＨＣＶ  Ｅ２タンパク質又はその任意の一部分を、形質転換された宿主細胞は溶解してから精製する工程、を含んで成る方法。
【請求項３４】
精製がヘパリンアフィニティクロマトグラフィー−を包含するものである、請求項２９〜３３のいずれか１項に記載の組換え型コア−グリコシル化済みＨＣＶ酵母タンパク質又はその任意の一部分を精製するための方法。
【請求項３５】
前記化学的手段がスルホン化である、請求項３２〜３４のいずれか１項に記載の、組換え型コア−グリコシル化済みＨＣＶ酵母タンパク質又はその任意の一部分を精製するための方法。
【請求項３６】
Ｃｙｓ−アミノ酸の前記可逆的保護が化学的及び／又は酵素的手段による不可逆的保護と交換される、請求項３２〜３５のいずれか１項に記載の、組換え型コア−グリコシル化済みＨＣＶ酵母タンパク質又はその任意の一部分を精製するための方法。
【請求項３７】
化学的手段による前記不可逆的保護がヨードアセタミドによるものである、請求項３６に記載の、組換え型コア−グリコシル化済みＨＣＶ酵母タンパク質又はその任意の一部分を精製するための方法。
【請求項３８】
前記化学的手段による不可逆的保護がＮＥＭ又はビオチン−ＮＥＭ又はその混合物によるものである、請求項３６に記載の、組換え型コア−グリコシル化済みＨＣＶ酵母タンパク質又はその任意の一部分を精製するための方法。
【請求項３９】
薬剤として使用するための請求項２８〜３８のいずれか１項に記載の、ＨＣＶ  Ｅ１及び／又はＨＣＶ  Ｅ２タンパク質又はその任意の一部分。
【請求項４０】
診断用キットの調製のための、請求項２８〜３８のいずれか１項に記載のＨＣＶ  Ｅ１及び／又はＨＣＶ  Ｅ２タンパク質又はその任意の一部分の使用。
【請求項４１】
ＨＣＶ感染に対するワクチン／薬剤の製造のための、請求項２８〜３８のいずれか１項に記載の、ＨＣＶ  Ｅ１及び／又はＨＣＶ  Ｅ２タンパク質又はその任意の一部分の使用。
【請求項４２】
−  請求項２８〜３８のいずれか１項に記載のＨＣＶ エンベロープタンパク質又はその任意の一部分を提供する工程；
−  ＨＣＶ抗体−ＨＣＶタンパク質複合体の形成を可能にする条件下で前記ＨＣＶ抗体と共に生体試料をインキュベートする工程；及び
−  前記ＨＣＶ抗体−ＨＣＶタンパク質複合体が形成されたか否かを決定する工程、を含んで成る、生体試料中のＨＣＶ抗体を検出するための免疫検定。
【請求項４３】
請求項２８〜３８のいずれか１項に記載のＨＣＶエンベロープタンパク質又はその任意の一部分を提供すること特徴とする、生体試料中のＨＣＶ抗体を検出するためのキット。
【請求項４４】
酵母中のウイルスエンベロープタンパク質の発現のための、ＣＬリーダー又はその機能的等価物の使用。
【請求項４５】
ＣＬリーダー又はその機能的等価物が先行する、ウイルスエンベロープタンパク質についてコードするＤＮＡ配列を含む発現カセットを含んで成る、酵母の形質転換に適したベクター。
【請求項４６】
請求項４５に記載のベクターで形質転換された宿主生物。
【請求項４７】
Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａにおいて発現されるとグリコシル化された状態となるウイルスエンベロープタンパク質の発現のための該酵母種の使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明は、組換え型タンパク質発現、組換え型タンパク質の精製、ＨＣＶ感染の診断、ＨＣＶ感染に対する予防的治療の一般的分野及び慢性肝炎を患う個体の治療の臨床的効率の予後／監視又は自然疾病の予後／監視に関する。
【０００２】
より詳細には、本発明は、酵母内のＣ型肝炎ウイルスエンベロープタンパク質の発現、ＨＣＶウイルス様粒子の効率の良い発現のための発現構築物、コア−グリコシル化されたウイルスエンベロープタンパク質の発現のための酵母菌株、これらのタンパク質のための精製方法及び本発明により精製されたＨＣＶエンベロープタンパク質の診断、ならびに予防又は療法における使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）感染は、開発国及び開発途上国の両方において大きな健康上の問題である。世界の人口の約１〜５％がこのウイルスに冒されていると推定されている。ＨＣＶ感染は、輸血による肝炎の最も重要な原因であると考えられ、往々にして慢性肝臓障害へと進行する。その上、肝細胞ガン腫の誘発にＨＣＶが関与することを示す証拠が存在している。その結果として、信頼性の高い診断方法及び有効な治療剤に対する需要は高い。同様に、ＨＣＶ感染した血液製剤の高感度かつ特異的なスクリーニング方法及びＨＣＶを培養するための改善された方法も必要とされている。
【０００４】
ＨＣＶは、約３０００のアミノ酸の単一のポリタンパク質前駆体をコードする約９６００塩基の正鎖ＲＮＡウイルスである。翻訳後及び同時修飾と結合されたこの前駆体のタンパク質分解による開裂は、少なくとも３個の構造タンパク質及び６個の非構造タンパク質を結果としてもたらすことが示されてきた。配列相同性に基づいて、構造タンパク質は、１つの単一コアタンパク質及び２つのエンベロープ糖タンパク質すなわちＥ１及びＥ２として機能的に帰属されてきた。Ｅ１タンパク質は、１９２個のアミノ酸から成り、ＨＣＶ遺伝子型に応じて、５〜６個のＮ−グリコシル化部位を含む。Ｅ２タンパク質は、３６３〜３７０個のアミノ酸で構成され、ＨＣＶ 遺伝子型に応じて９〜１１個のＮ−グリコシル化部位を含有する（レビューのためには、Ｍａｊｏｒ及びＦｅｉｎｓｔｏｎｅ、１９９７；Ｍａｅｒｔｅｎｓ及びＳｔｕｙｖｅｒ、１９９７を参照のこと）。Ｅ１ タンパク質はさまざまな可変ドメイン（Ｍａｅｒｔｅｎｓ及びＳｔｕｙｖｅｒ、１９９７）を含有するが、一方Ｅ２タンパク質は３つの超可変ドメインを含み、そのうち主要ドメインは、タンパク質のＮ末端にある（Ｍａｅｒｔｅｎｓ及びＳｔｕｙｖｅｒ、１９９７）。ＨＣＶ糖タンパク質は、ＥＲ内に大部分が局在化しており、ここでこれらのタンパク質は修飾されオリゴマー複合体の形に組立てられる。
【０００５】
真核生物においては、糖残渣は一般に、４つの異なるアミノ酸残基に結合されている。これらのアミノ酸残基は、Ｏ結合（セリン、トレオニン及びヒドロキシリジン）及びＮ結合（アスパラギン）されたものとして分類される。Ｏ結合型糖は、ヌクレオチド糖から粗面小胞体（ＥＲ）又はゴルジ内で合成される。Ｎ結合型糖は、共通の前駆体から合成され、その後処理される。ＨＣＶエンベロープタンパク質はＮ−グリコシル化されていると考えられている。当該技術分野においては、折畳み中間体の安定化ひいては効率の良い折畳み、小胞体内の折畳み不良及び分解の防止、オリゴマー化、生物活性及び糖のタンパク質の輸送のために、Ｎ結合型炭水化物鎖の付加が重要であることが知られている（Ｒｏｓｅら、１９８８；  Ｄｏｍｓら、１９９３；  Ｈｅｌｅｎｉｕｓ、１９９４によるレビューを参照のこと）。ポリペプチド上のトリペプチド配列Ａｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ及びＡｓｎ−Ｘ−Ｔｈｒ（ここでＸは任意のアミノ酸でありうる）は、Ｎ結合型オリゴ糖を結合するためのコンセンサス部位である。ポリペプチドに対するＮ結合型オリゴ糖の付加の後、オリゴ糖はさらに（Ｎ−アセチルグルコサミン、マンノース、フコース、ガラクトース及びシアル酸を含有する）複合体タイプ又は（Ｎ−アセチルグルコサミン及びマンノースを含有する）高マンノースタイプへとプロセッシングされる。ＨＣＶエンベロープタンパク質は、高マンノースタイプのものであると考えられている。酵母の中のＮ結合型オリゴ糖プロセッシングは、哺乳動物のゴルジプロセッシングとは非常に異なるものである。酵母内で、オリゴ糖鎖は、マンノースの工程的付加を通してゴルジ内で伸長され、シアル酸を含まない精巧な高マンノース構造を導く。これとは対照的に、原核生物内で発現されるタンパク質は、決してグリコシル化されることはない。
【０００６】
これまでのところ、疾病に対するワクチン接種は、疾病を制御するための最も費用効果が高く効率の良い方法であることが立証されてきた。しかしながら、有望な結果にもかかわらず、効果のあるＨＣＶワクチンを開発する研究努力は、困難をきわめた。ワクチンの必須条件は、患者の体内での免疫応答の誘発である。従って、ＨＣＶ抗原決定基を同定し、適切な環境の中で患者に投与しなければならない。抗原決定基は、線形及びコンホーメーションエピトープという少なくとも２つの形態に分けることができる。コンホーメーションエピトープは、グリコシル化のごとき同時翻訳及び翻訳後修飾を含めた三次元空間内の分子の折畳みの結果得られる。一般には、コンホーメーションエピトープは、未変性様のＨＣＶエピトープに類似しかつ実際の線形アミノ酸配列よりも保存が良い可能性のあるエピトープを表わしていることから、これらのエピトープは最も効果のあるワクチンを実現するであろうと考えられている。従って、ＨＣＶエピトープタンパク質の偶発的グリコシル化度は、未変性様のＨＣＶ抗原決定基を生成するために最大の重要性をもつものである。しかしながら、ほんのわずかな量のビリオンしか結果としてもたらさないＨＣＶを培養することには克服しがたい問題点が存在すると思われる。さらに、少量のタンパク質、過剰グリコシル化タンパク質又はグリコシル化されていないタンパク質のいずれかを結果としてもたらす組換え型タンパク質の発現及び精製に関する莫大な問題が存在する。
【０００７】
ＨＣＶエンベロープタンパク質は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、昆虫細胞、酵母細胞の中で組換え型技術により産生されてきた。しかしながら、より高等な真核生物内での発現は、場合によってワクチンを生産するための大量の抗原の入手の問題をその特徴としてきた。Ｅ．ｃｏｌｉのごとき原核生物における発現は、グリコシル化されていないＨＣＶエンベロープタンパク質を結果としてもたらす。酵母におけるＨＣＶエンベロープタンパク質の発現は、過剰グリコシル化を結果としてもたらした。ＷＯ９６／０４３８５の中ですでに実証されているように、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ内でのＨＣＶエンベロープタンパク質Ｅ２の発現は、高度にグリコシル化されたタンパク質を導く。この過剰グリコシル化は、タンパク質エピトープの遮へいを導く。（Ｍｕｓｔｉｌｌｉら、１９９９）はＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ内でのＨＣＶ  Ｅ２の発現の結果コア−グリコシル化がもたらされるということを断言しているものの、細胞内発現された材料の結果は、その一部分が少なくとも過剰グリコシル化されていることを実証し、一方この材料の残りの部分の適正なプロセッシングは示されなかった。細胞内供給源に由来するＨＣＶエンベロープタンパク質に対するニーズは、充分受入れられている（ＭａｅｒｔｅｎｓらのＷＯ９６／０４３８５およびＨｅｉｌｅらの２０００年の文献）。この結果は、哺乳動物細胞培養由来のＥ２タンパク質で免疫化されたチンパンジーの血清とのこの材料の反応性が低いことによって例証されている（図５参照）。このことはさらに、酵母由来のＨＣＶエンベロープタンパク質での免疫化が抗原投与に対する防御を提供できないことはＲｏｓａおよび共同研究者（１９９６）によって示され、立証されている。
【０００８】
従って、同時に未変性様のグリコシル化パターンをもつＨＣＶエンベロープタンパク質の大規模で費用効果の高い量のＨＣＶエンベロープタンパク質を結果としてもたらす効率的な発現システムに対する必要性が存在している。
【０００９】
発明の概要
かくして、発現及び精製システムが存在しないか又は効率が悪いものであることに起因して、適正にグリコシル化されたＨＣＶエンベロープタンパク質の大量生産が阻害されていると思われる。かかる過剰グリコシル化された又はグリコシル化されていないタンパク質は往々にして生物学的に活性でなくかつ／又は不適正なタンパク質構造しかもたない。その結果として、未変性抗ＨＣＶ抗体は、これらのタンパク質上の抗原決定基の重要なサブセットを認識できない。例えば、Ｈｏｕｇｈｔｏｎ（１９９７）を参照のこと。
【００１０】
本発明は、初めて酵母内で未変性様（ｎａｔｉｖｅ−ｌｉｋｅ）のグリコシル化パターンをもつ大量のＨＣＶタンパク質を製造し、それについて記載していることから、これらの問題を解決するものである。
【００１１】
本発明の１つの目的は、コア−グリコシル化されていることを特徴とするＨＣＶ  Ｅ１及び／又はＨＣＶ  Ｅ２タンパク質又はその任意の一部分の発現のためにＨａｎｓｅｎｕｌａ又はＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓグリコシル化マイナス菌株を使用することにある。
【００１２】
本発明のもう１つの目的は、免疫検定又はワクチンでの使用に適した、コア−グリコシル化されたＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）エンベロープタンパク質又はその任意の一部分を産生するための方法であって、（ｉ）ＨＣＶ  Ｅ１及び／又はＨＣＶ  Ｅ２タンパク質又はその任意の一部分をコードするエンベロープ遺伝子で形質転換されたＨａｎｓｅｎｕｌａ又はＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓグリコシル化マイナス菌株を適切な培地で増殖させる工程；（ｉｉ）前記ＨＣＶ  Ｅ１及び／又はＨＣＶ  Ｅ２  遺伝子又はその任意の一部分の発現をひき起こす工程；及び（ｉｉｉ）前記コア−グリコシル化されたＨＣＶ  Ｅ１及び／又はＨＣＶ  Ｅ２タンパク質又はその一部分を形質転換された宿主細胞の溶解時点で精製する工程、を含んで成る方法を提供することにある。より詳細には、前記遺伝子又はその任意の一部分が、ＣＬ−リーダー又はその機能的等価物を含有する、上述の通りの方法を提供することも本発明の目的である。
【００１３】
本発明の１つの目的は、免疫検定又はワクチンでの使用に適した、コア−グリコシル化されたＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）エンベロープタンパク質又はその任意の一部分を精製するための方法であって：−ｉ−  少なくとも２つのＣｙｓ−アミノ酸を含むＨＣＶ  Ｅ１及び／又はＨＣＶ  Ｅ２タンパク質又はその任意の一部分をコードするエンベロープ遺伝子で形質転換されたＨａｎｓｅｎｕｌａ又はＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓグリコシル化マイナス菌株を適切な培地で増殖させる工程；−ｉｉ−  前記ＨＣＶ  Ｅ１及び／又はＨＣＶ  Ｅ２  遺伝子又はその任意の一部分の発現をひき起こす工程；及び−ｉｉｉ−  前記Ｃｙｓ−アミノ酸が化学的及び／又は酵素的手段で可逆的に保護されている、前記コア−グリコシル化されたＨＣＶ  Ｅ１及び／又はＨＣＶ  Ｅ２タンパク質又はその一部分を前記細胞培養から精製する工程、を含んで成る方法を提供することにある。
【００１４】
本発明のもう１つの目的は、ヘパリンアフィニティクロマトグラフィーを包含する、上述の通りの組換え型コア−グリコシル化済みＨＣＶ酵母タンパク質又はその任意の一部分を精製するための方法を提供することにある。
【００１５】
本発明の１つの目的は、前記化学的手段がスルホン化である、上述の通りの組換え型コア−グリコシル化済みＨＣＶ酵母タンパク質又はその任意の一部分を精製するための方法を提供することにある。
【００１６】
本発明の１つの目的は、Ｃｙｓ−アミノ酸の前記可逆的保護がヨードアセタミド、ＮＥＭまたはビオチン−ＮＥＭまたはその混合物のごとき化学的及び／又は酵素的手段による不可逆的保護と交換される、上述の通りの組換え型コア−グリコシル化済みＨＣＶ酵母タンパク質又はその任意の一部分を精製するための方法を提供することにある。
【００１７】
薬剤として使用するための上記の目的に従った、ＨＣＶ  Ｅ１及び／又はＨＣＶ  Ｅ２タンパク質又はその任意の一部分も本発明の１つの目的である。
【００１８】
本発明のもう１つの目的は、診断用キットの調製のため、及びＨＣＶ感染に対するワクチン／薬剤の製造のために、上述の通りのＨＣＶ  Ｅ１及び／又はＨＣＶ  Ｅ２タンパク質又はその任意の一部分を使用することにある。
【００１９】
（ｉ）本発明の１つの目的は、請求項１〜１０のいずれか１項に記載のＨＣＶ エンベロープタンパク質又はその任意の一部分を提供する工程；（ｉｉ）ＨＣＶ抗体−ＨＣＶタンパク質複合体の形成を可能にする条件下で前記ＨＣＶ抗体と共に生体試料をインキュベートする工程；及び（ｉｉｉ）前記ＨＣＶ抗体−ＨＣＶタンパク質複合体が形成されたか否かを決定する工程、を含んで成る、生体試料中のＨＣＶ抗体を検出するための免疫検定を提供することにある。
【００２０】
本発明の１つの目的は、上述の通りのＨＣＶエンベロープタンパク質又はその任意の一部分を含んで成る、生体試料中のＨＣＶ抗体を検出するためのキットを提供することにある。
【００２１】
本発明の１つの目的は、酵母中のウイルスエンベロープタンパク質の発現のために、ＣＬリーダーを使用することにある。
【００２２】
本発明の１つの目的は、ＣＬリーダー又はその一部分が先行する、ウイルスエンベロープタンパク質についてコードするＤＮＡ配列を含む発現カセットを含んで成る、酵母の形質転換に適したベクター、ならびに該ベクターで形質転換された宿主生物を提供することにある。
【００２３】
本発明のもう１つの目的は、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ内での発現時点でグリコシル化された状態となるウイルスエンベロープタンパク質を発現するために該酵母種を使用することにある。
【００２４】
本発明の全ての目的は、以下で記載されているような実施形態により達成されると考えられている。
【００２５】
定義づけ
以下の定義づけは、本発明で用いられる、異なる用語及び表現を説明する役割を果たすものである。
【００２６】
本発明は、酵母中で発現される一方で未変性様のグリコシル化パターンを有するＨＣＶエンベロープタンパク質に関する。
【００２７】
「ＨＣＶエンベロープタンパク質」という語は、グリコシル化部位以外にＥ１又はＥ２領域のいずれかの少なくとも１つのＨＣＶエピトープを定義づけするアミノ酸配列（及び又はアミノ酸アナログ）を含むポリペプチド又はそのアナログ（例えばミモトープ）に関係する。これらのエンベロープタンパク質は両方共組換え型発現されたエンベロープタンパク質の単量体、ヘテロ−オリゴマー又はホモオリゴマー形態であり得る。標準的には、エピトープを定義づける配列は、ＨＣＶのＥ１又はＥ２領域のいずれかのアミノ酸配列に対応する（同一の形でか又はエピトープを破壊しない未変性アミノ酸残基のアナログの置換を介して）。
【００２８】
ＨＣＶエピトープはグリコシル化部位と同じ場所に位置してもよいということがわかるだろう。
【００２９】
一般に、エピトープ定義づけ配列の長さはアミノ酸３〜４個、より標準的には５、６又は７個、さらに標準的には８又は９個そしてさらに一層標準的には１０個以上となる。コンホーメーションエピトープに関しては、エピトープ定義づけ配列の長さは、これらのエピトープが抗原の３次元形状により形成されている（例えば折畳み）と考えられていることから、幅広く変動を受ける可能性がある。かくして、エピトープを定義づけするアミノ酸は、比較的数が少ないが、折畳みを介して適正なエピトープコンホーメーションへともっていかれる状態で一定長の分子に沿って広く分布させられている可能性がある。エピトープを定義づけする残基と残基との間の抗原の部分は、エピトープのコンホーメーション構造にとってさほど重要でない可能性がある。例えば、これらの介在する配列の欠失又は置換は、エピトープでコンホーメーションにとってきわめて重要な配列が維持される（例えば、ジスルフィド結合に関与するシステイン、グリコシル化部位など）ことを条件として、コンホーメーションエピトープに影響を及ぼさないかもしれない。コンホーメーションエピトープは同様に、ホモ−オリゴマー又はヘテロ−オリゴマーのサブユニットの２つ以上の必須領域によって形成され得る。
【００３０】
本明細書で使用されている指定されたポリペプチドのエピトープというのは、指定されたポリペプチド内のエピトープと同じアミノ酸配列をもつエピトープ及びその免疫学的等価物を意味する。かかる等価物は同様に、例えば現在知られている配列をもつ菌株、亜型（遺伝子型）又は型（群）特異的変異体又は遺伝子型１ａ、１ｂ、１ｃ、１ｄ、１ｅ、１ｆ、２ａ、２ｂ、２ｃ、２ｄ、２ｅ、２ｆ、２ｇ、２ｈ、２ｉ、３ａ、３ｂ、３ｃ、３ｄ、３ｅ、３ｆ、３ｇ、４ａ、４ｂ、４ｃ、４ｄ、４ｅ、４ｆ、４ｇ、４ｈ、４ｉ、４ｊ、４ｋ、４ｌ、５ａ、５ｂ、６ａ、６ｂ、６ｃ、７ａ、７ｂ、７ｃ、８ａ、８ｂ、９ａ、９ｂ、１０ａ、に属する菌株又はその他の新たに定義づけされたあらゆるＨＣＶ（亜）型を包含する。エピトープを構成するアミノ酸は、線形配列の一部である必要はなく、任意の数のアミノ酸が散在してコンホーメーションエピトープを形成していてもよい。
【００３１】
本発明のＨＣＶ抗原は、ＨＣＶのＥ１及び／又はＥ２（エンベロープ）ドメイン由来のコンホーメーションエピトープを含む。ウイルスエンベロープタンパク質に対応すると考えられているＥ１ドメインは、現在、ＨＣＶポリタンパク質のアミノ酸１９２−３８３にわたると推定されている（Ｈｉｊｉｋａｔａら、１９９１）。（グリコシル化された）哺乳動物系内での発現時点で、それはＳＤＳ−ＰＡＧＥを介して決定されるように、およそ３５ｋＤａの分子量をもつと考えられている。以前ＮＳ１と呼ばれていたＥ２タンパク質は、ＨＣＶポリタンパク質のアミノ酸３８４−８０９又は３８４−７４６にわたるものであり（グラコヴィ（Ｇｒａｋｏｖｉ）ら、１９９３）、又エンベロープタンパク質であるものと考えられている。（グリコシル化された）ワクシニア系における発現時点で、それは約７２ｋＤａの見かけのゲル分子量を有すると考えられている。これらのタンパク質の終点は近似であるものと了解される（例えば、Ｅ２のカルボキシ末端は、例えばアミノ酸７３０、７３５、７４０、７４２、７４４、７４５、好ましくは７４６、７４７、７４８、７５０、７６０、７７０、７８０、７９０、８００、８０９、８１０、８２０で終わる７３０〜８２０個のアミノ酸領域内のどこかにあり得る）。Ｅ２タンパク質は同様に、Ｅ１、及び／又はコア（ａａ１−１９１）及び／又はＰ７（ａａ７４７−８０９）、及び／又はＮＳ２（ａａ８１０〜１０２６）、及び／又はＮＳ３（ａａ１０２７−１６５７）、及び／又はＮＳ４Ａ（ａａ１６５８−１７１１）及び／又はＮＳ４Ｂ（ａａ１７１２−１９７２）及び／又はＮＳ５Ａ（ａａ１９７３−２４２０）、及び／又はＮＳ５Ｂ（ａａ２４２１−３０１１）と共に発現され得る。同様にして、Ｅ１タンパク質は、Ｅ２及び／又はコア（ａａ１〜１９１）、及び／又はＰ７（ａａ７４７〜８０９）、及び／又はＮＳ２（ａａ８１０〜１０２６）、及び／又はＮＳ３（ａａ１０２７〜１６５７）、及び／又はＮＳ４Ａ（ａａ１６５８〜１７１１）、及び／又はＮＳ４Ｂ（ａａ１７１２〜１９７２）、及び／又はＮＳ５Ａ（ａａ１９７３〜２４２０）、及び／又はＮＳ５Ｂ（ａａ２４２１〜３０１１）と共にでも発現され得る。これらのその他のＨＣＶタンパク質と合わせた発現は、適正なタンパク質折畳みを得るために重要であり得る。
【００３２】
本明細書で使用する「Ｅ１」という語には、天然のＥ１と免疫学的に交叉反応する末端切断形態及びアナログが包含され、遺伝子型１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又はその他の新しく同定されたあらゆるＨＣＶ型又は亜型が含まれる。本明細書で使用する「Ｅ２」という語には、天然のＥ２と免疫学的に交叉反応する末端切断形態及びアナログが包含され、遺伝子型１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又はその他の新しく同定されたあらゆるＨＣＶ型又は亜型が含まれる。例えば、コドン３８３〜３８４の間の多数のコドンの挿入ならびに、アミノ酸３８４〜３８７の欠失がＫａｔｏら、（１９９２）によって報告されてきた。かくして、本発明の実施例の部で使用された分離株は本発明の範囲を制限することを意図したものではないことそしてＨＣＶの１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０型又はその他のあらゆる新遺伝子型からのあらゆるＨＣＶ分離株が本発明を実践するための適切なＥ１及び／又はＥ２配列供給源であることも了解される。同様にして、上述のように、本発明のＨＣＶエンベロープタンパク質と同時発現されるＨＣＶタンパク質は、あらゆるＨＣＶ型から、ひいては本発明のＨＣＶエンベロープタンパク質と同じ型からも誘導可能である。
【００３３】
本明細書で使用する「Ｅ１／Ｅ２」というのは少なくとも１つのＥ１成分と少なくとも１つのＥ２成分を含有するエンベロープタンパク質のオリゴマー形態を意味する。
【００３４】
「特異的オリゴマーの」Ｅ１及び／又はＥ２及び／又はＥ１／Ｅ２エンベロープタンパク質という語は、集合体でない組換え発現されたＥ１及び／又はＥ２エンベロープタンパク質の考えられる全てのオリゴマー形態を意味する。Ｅ１及び／又はＥ２特異的オリゴマーエンベロープタンパク質は同様に、ホモ−オリゴマーＥ１又はＥ２エンベロープタンパク質（以下参照）とも呼ばれる。「単一又は特異的オリゴマーの」Ｅ１及び／又はＥ２及び／又はＥ１／Ｅ２エンベロープタンパク質という語は、単一の単量体Ｅ１又はＥ２タンパク質（厳密な意味での単一）ならびに特異的オリゴマーＥ１及び／又はＥ２及び／又はＥ１／Ｅ２組換え発現済みタンパク質を意味する。本発明によるこれらの単一又は特異的オリゴマーエンベロープタンパク質は、さらに、（Ｅ１）ｘ（Ｅ２）ｙという式で定義づけできる。なお式中、ｘとｙが両方共０ではないことを条件として、ｘは０〜１００の１つの数、ｙは０〜１００の１つの数でありうる。ｘ＝１及びｙ＝０の場合、前記エンベロープタンパク質は、単量体Ｅ１を包含する。
【００３５】
本明細書で使用する「ホモ−オリゴマー」という語は、複数のＥ１又はＥ２単量体を含むＥ１又はＥ２の複合体を意味し、例えば、Ｅ１／Ｅ１ 二量体、Ｅ１／Ｅ１／Ｅ１ 三量体又はＥ１／Ｅ１／Ｅ１／Ｅ１ 四量体及びＥ２／Ｅ２二量体、Ｅ２／Ｅ２／Ｅ２三量体又はＥ２／Ｅ２／Ｅ２／Ｅ２四量体、Ｅ１五量体及び六量体、Ｅ２五量体及び六量体又は、Ｅ１又はＥ２のあらゆる高次ホモ−オリゴマーが全て、この定義の範囲内の「ホモ−オリゴマー」である。オリゴマーは、例えば、共に当該出願人によるＷＯ９４／２５６０１及び欧州出願第９４８７０１６６．９号として公開された国際出願の中で記載されたものを包含するＣ型ウイルスの異なる型又は亜型から得られるＥ１又はＥ２の異なる単量体を１、２又は数個含有することができる。かかる混合オリゴマーは、本発明の範囲内でなおもホモ−オリゴマーであり、ＨＣＶのより一般的な診断を可能にし得る。
【００３６】
本発明において使用されるＥ１及びＥ２抗原は、全長ウイルスタンパク質、実質的にはその全長バージョン、その機能的フラグメント（例えば、少なくとも１つのエピトープ及び／又はグリコシル化部位）であり得る。さらに、本発明のＨＣＶ抗原は同様に、問題のコンホーメーションエピトープの形成を遮断又は防止しないその他の配列をも包含することができる。コンホーメーションエピトープの有無は、抗体（コンホーメーションエピトープに対しモノクローナルの又はポリクローナルの血清）を用いて問題の抗原をスクリーニングしその反応性を線形エピトープのみを保持する抗原の変性済みバージョンの反応性と比較することによって容易に決定可能である。ポリクローナル抗体を用いた、かかるスクリーニングにおいては、まず第１に変性済み抗原でポリクローナル血清を吸着し、それが問題の抗原に対する抗体を保持するかどうかを見ることが有利であり得る。
【００３７】
「タンパク質」という語は、アミノ酸の重合体を意味し、産物の特定の長さを意味するものではない。かくして、ペプチド、オリゴペプチド及びポリペプチドがタンパク質の定義内に含まれる。この語は同様に、例えばグリコシル化、アセチル化、ホスホリル化などのごとき、タンパク質の発現後修飾を意味することもまた除外することもない。この定義内に入るのは、アミノ酸の単数又は複数のアナログ（例えば、非天然アミノ酸、ＰＮＡなどを含む）を含有するポリペプチド、置換されたリンケージ、ならびに、天然に発生する及び天然に発生しない両方の当該技術分野において既知のその他の修飾を伴うポリペプチドである。
【００３８】
本発明のタンパク質はグリコシル化される。グリコシル化されたタンパク質というのは、単数又は複数の炭水化物基特に糖基を含有するタンパク質を意味する。一般に全ての真核細胞はタンパク質をグリコシル化することができるＨＣＶ遺伝子型の異なるエンベロープタンパク質配列を整列させた後、適切な折畳み及び反応性のためにＨＣＶ  Ｅ１タンパク質上の６個のグリコシル化部位の全てが必要とされるわけではないということを推論することができる。例えば、ＨＣＶ亜型１ｂＥ１タンパク質は６個のグリコシル化部位を含有するが、これらのグリコシル化部位の一部分は、或る種の他の（亜）型には存在しない。型１ｂ、６ａ、７、８及び９の中に存在する第４の炭水化物モチーフ（Ａｓｎ２５０上）は、今日知られているその他全ての型において不在である。この糖付加モチーフは、突然変異を受けて、改善された反応性をもつ１ｂＥ１型タンパク質を生成することができる。同様に、２ｂ型配列は、Ｖ５領域内に追加のグリコシル化部位を示す（Ａｓｎ２９９上）。遺伝子型２Ｃに属する分離株Ｓ８３には、その他全ての分離株上で存在するにもかかわらずＶ１領域内の第１の炭水化物モチーフさえ欠如している（Ｓｔｕｙｖｅｒら、１９９４）。しかしながら、完全に保存された糖付加モチーフの間でさえ、炭水化物の存在は折畳みのために必要とされなかったものの、免疫監視機構の回避において１つの役割を果たす可能性がある。かくして、グリコシル化の役割の同定は、グリコシル化モチーフの突然変異誘発によって、さらにテストすることができる。グリコシル化モチーフの突然変異誘発（ＮＸＳ又はＮＸＴ配列）は、Ｎ，Ｓ、又はＴについてのコドンがＮの場合にはＮと異なるアミノ酸及び／又はＳ及びＴの場合にはＳ又はＴと異なるアミノ酸をコードするような形で、これらのコドンを突然変異させることによって達成可能である。あるいはまた、ＮＰＳ又はＮＰＴが炭水化物で頻繁に修飾されないことがわかっていることから、Ｘ位置をＰへ突然変異させることができる。折畳み及び／又は反応性のためにどの炭水化物−付加モチーフが必要でどれが不要であるかを立証した後、かかる突然変異の組合せを行なうことができる。かかる実験は、参照により本明細書に一体化されるＷＯ９６／０４３８５（実施例８）の中で広範に記載されてきた。
【００３９】
本発明内で用いられるグリコシル化という語は、相反する規定のないかぎり、Ｎ−グリコシル化を意味する。
【００４０】
特に、本発明は、コア−グリコシル化されたＨＣＶエンベロープタンパク質又はその一部分に関する。この点において、「コア−グリコシル化」という語は、図３中（ボックス構造）の（Ｈｅｒｃｏｖｉｃｓ及びＯｒｌｅａｎ、１９９３）により記載された通りの構造に「類似した」構造を意味する。かくして、言及された炭水化物構造は１０個の単糖を含有する。とりわけ、前記開示は参照により本明細書に一体化されている。「類似の」という語は、構造に対し約４個よりも多くない付加的単糖しか付加されていないこと、又は構造から約３個よりも多くない単糖しか除去されていないことを意味する。従って、炭水化物構造は、最も好ましくは、１０個の単糖ただし最小限７個の単糖から成り、さらに好ましくは、８個又は９個の単糖、そして最大１５個、より好ましくは１４、１３、１２、又は１１個の単糖から成る。含まれる単糖は好ましくは、グルコース、マンノース又はＮ−アセチルグルコサミンである。
【００４１】
「シグナル配列」という語は、１つのタンパク質を粗面ＥＲにターゲティングし、こうしてＮ−グリコシル化にとっての前提条件となるアミノ酸配列を意味する。シグナル配列は、シグナルペプチダーゼと呼ばれる宿主特異的プロテアーゼによりこのＥＲの管腔側で開裂される。本発明のシグナル配列は、酵母シグナルペプチダーゼによりＨＣＶエンベロープタンパク質から適正に除去される。好ましいシグナル配列は、配列番号１に記されている通りのアミノ酸配列をもつリゾチームＣ（ＣＬ−リーダー；１，４−ベータ−Ｎ−アセチルムラミダーゼＣ，ＥＣ３．２．１．１７）のシグナル配列である。
【００４２】
この配列のアミノ酸は、ＨＣＶエンベロープタンパク質のＮ−グリコシル化の存在及びシグナル配列が適正に開裂されていることによって立証されるように、粗面ＥＲに対しＨＣＶエンベロープタンパク質をターゲティングする官能基すなわち機能的等価物に影響を与えることなくその他のものと交換できるということが了解される。
【００４３】
本発明は、酵母内で発現された時点で「適正にプロセッシングされた」ＨＣＶエンベロープタンパク質に関する。「適正にプロセッシングされた」という語は、本発明の糖タンパク質の少なくとも約４０％、ただしより好ましくは約５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％さらには９９％が正確に意図された部位で開裂されていること、すなわち、完全なシグナル配列、ただしシグナル配列のみが除去されることを意味している。あるいはまた、酵母中でタンパク質が発現した実質的部分が「適正にプロセッシングされていない」場合、本発明のグリコシル化されたエンベロープタンパク質は、充分に異なった生化学特性が異なる発現産物の間に存在する場合には、なおも精製可能である。
【００４４】
特に、本発明は、ＨＣＶエンベロープ遺伝子又はその任意の一部分がＣＬ−リーダー又はその機能的等価物を含有する、上述のような免疫検定又はワクチン中で使用するのに適したコア−グリコシル化されたＣ型肝炎（ＨＣＶ）エンベロープタンパク質又はその任意の一部分を精製するための方法に関する。
【００４５】
特に、本発明は、酵母内でのウイルスエンベロープタンパク質の発現のための、ＣＬリーダー又はその機能的等価物の使用に関する。
【００４６】
特に、本発明は、ＣＬリーダー又はその機能的等価物が先行しているウイルスエンベロープタンパク質をコードするＤＮＡ 配列を含む発現カセットを含んで成る、酵母の形質転換に適したベクターに関する。
【００４７】
特に、本発明は、上述のようなベクターで形質転換された宿主生物に関する。
【００４８】
本発明のＨＣＶエンベロープタンパク質の発現は、数多くの方法により達成できる。例えば、下等真核生物（例えば酵母）の中で本発明のＨＣＶエンベロープタンパク質を発現することができる。その他の宿主生物としては哺乳動物細胞のごとき高等真核細胞が含まれる。
【００４９】
宿主生物内の発現を得るため、さまざまなベクターのうちのいずれかを使用することができる。下等真核生物特に酵母のごとき宿主生物は標準的に、独立して宿主細胞内で複製できるか又は宿主細胞ゲノム内に組込まれ得るベクターで形質転換される。これらのベクターは通常、ＵＲＡ３、ＬＥＵ２、ＡＤＥ２、ＨＩＳ４、ＴＲＰ１、ＡＬＧ７のごとき選択マーカー又はＧ４１８のごとき耐性遺伝子又はその他のあらゆる抗生物質を含有する。ベクタは同様にプロモーター、リーダー配列、問題のコーディング配列及び転写終結配列を含む「発現カセット」をも含有する。好ましくは、実施例１に記載されているベクタが使用される。酵母を形質転換するための手順は、通常酵母の種によって変動するが、当該技術分野において周知であり、電気穿孔、スフェロプラスト形質転換及び酢酸リチウム又はその他のアルカリカチオンの形質転換が含まれる。
【００５０】
本発明では、形質転換された宿主細胞を溶解させた時点で細胞内発現されたＨＣＶエンベロープタンパク質又はその一部分を得ることが好ましい。形質転換された宿主細胞の溶解は、当該技術分野において周知のさまざまな技術により達成できる。好ましくは、例えば５０ｍＭのリン酸塩中の６ＭのＧｕ．ＨＣｌ、ｐＨ７．４のごときカオトロピック剤を含有する溶液の中での再懸濁が後続する凍結−解凍サイクルに付される。
【００５１】
「発現された」及び「組換え発現された」という語は、本明細書で互換性ある形で使用される。本発明の背景内で用いられる「発現された」及び「組換え発現された」という語は、本発明のタンパク質が下等真核生物内で組換え発現方法によって産生されるという事実を意味している。発現技術は、例えばＳａｍｂｒｏｏｋら、（１９８９）の中で記載されているように、当該技術分野で周知のものである。「下等真核生物」という語は、酵母、真菌、などのごとき宿主細胞を意味している。下等真核生物は一般に（ただし必然的にではなく）単細胞である。好ましい下等真核生物は、酵母、特にＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、  Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ、Ｐｉｃｈｉａ（例えばＰｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ）、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ（例えばＨａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、  Ｙａｒｏｗｉａ、  Ｓｃｈｗａｎｉｏｍｙｃｅｓ、  Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、  Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓなどの中に入る種である。本発明は、好都合な酵母宿主として特にＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ及びＨａｎｓｅｎｕｌａを考慮している。好ましくは、酵母グリコシル化マイナス菌株、さらに一層好ましくはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓグリコシル化マイナス菌株が、本発明の中で使用されている。グリコシル化マイナス菌株は、突然変異の性質は必ずしもわかっていないがＨａｎｓｅｎｕｌａ内のグリコシル化に匹敵する糖タンパク質のグリコシル化を結果としてもたらす、１つの突然変異を担持する菌株として定義づけされる。特に、グリコシル化マイナス菌株が１つの突然変異を担持し、その結果、インベルターゼタンパク質のＰＡＧＥ上の移動度の有意なシフトがもたらされると考えられている。インベルターゼは、過剰グリコシル化された形態のみでＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ中に通常存在するタンパク質である（Ｂａｌｌｏｕら、１９９１）。グリコシル化マイナス菌株は、ｍｎｎ２、及び／又はＯＣＨ１及び／又はｍｎｎ９の欠如した菌株を含む。
【００５２】
「高等真核生物」というのは、哺乳動物、は虫類、昆虫などのごとき高等動物に由来する宿主細胞を意味する。現在好ましい高等真核生物宿主細胞は、チャイニーズハムスタ（例えばＣホモ−オリゴマー）、サル（例えばＣＯＳ及びベロー細胞）、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）、ブタ腎臓（ＰＫ１５）、ウサギ腎臓１３細胞（ＲＫ１３）ヒト骨肉腫細胞系統１４３Ｂ、ヒト細胞系統ＨｅＬａ及びＨｅｐＧ２のごときヒト肝臓ガン細胞系統、及び昆虫細胞系統（例えばＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）に由来する。宿主細胞は、懸濁液中又はフラスコ培養、組織培養、器官培養などの中で提供され得る。あるいはまた、宿主細胞は遺伝子導入動物でもあり得る。
【００５３】
特に、本発明は、ＨＣＶ  Ｅ１及び／又はＨＣＶ  Ｅ２タンパク質又はその一部分がコア−グリコシル化されていることを特徴とする、ＨＣＶ  Ｅ１及び／又はＨＣＶ  Ｅ２タンパク質又はその任意の一部分の発現のためのＨａｎｓｅｎｕｌａの使用に関する。
【００５４】
特に本発明は、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａにおいて発現されるとコア−グリコシル化された状態となるウイルスエンベロープタンパク質の発現のためのこの酵母種の使用にも関する。
【００５５】
特に、本発明は、ＨＣＶ  Ｅ１及び／又はＨＣＶ  Ｅ２タンパク質発現のためのＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  グリコシル化マイナス菌株又はその任意の一部分の使用において、前記ＨＣＶ  Ｅ１及び／又はＨＣＶ  Ｅ２タンパク質又はその前記部分がコア−グリコシル化されていることを特徴とする使用に関する。
【００５６】
本明細書でタンパク質に適用されている通りの「精製された」という語は、望ましいタンパク質が組成物中の合計タンパク質成分の少なくとも３５％を構成している組成物を意味する。所望のタンパク質は、合計タンパク質成分の好ましくは少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも約５０％、さらに好ましくは少なくとも約６０％、さらに一層好ましくは少なくとも約７０％、さらに一層好ましくは少なくとも約８０％、さらに一層好ましくは少なくとも約９０％、そして最も好ましくは少なくとも約９５％を含んで成る。該組成物は、本明細書で使用されているような純度の決定に影響を及ぼすことなく、炭水化物、塩、脂質、溶媒などのごときその他の化合物を含有できる。「単離された」ＨＣＶタンパク質というのは、少なくとも３５％の純度をもつＨＣＶタンパク質組成物を意味する。
【００５７】
「本質的に精製されたタンパク質」という語は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ診断方法のためにそして治療用化合物として使用できるように精製されたタンパク質を意味する。これらのタンパク質は、実質的に細胞タンパク質、ベクター由来のタンパク質又はその他のＨＣＶウイルス成分を含まない。通常これらのタンパク質は、均質になるまで精製され（少なくとも純度８０％、好ましくは９０％、より好ましくは９５％、より好ましくは９７％、より好ましくは９８％、より好ましくは９９％、さらに一層好ましくは９９．５％）、最も好ましくは、汚染するタンパク質は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び銀染色などの従来の方法により検出可能でなくてはならない。存在する場合、本発明のＨＣＶエンベロープタンパク質又はその一部分のシステイン残基は、精製手順の間保護されている。この保護は、不可逆的又は可逆的保護を介したものである。精製のためには、参照により本明細書に一体化されるＷＯ９９／６７２８５及びＷＯ９６／０４３８５の中で広範に利用され記載されているとおりの精製プロトコルが特に参照される。
【００５８】
本発明は、上述のように少なくとも１つのシステイン残基、ただし好ましくは２つ以上のＨＣＶエンベロープタンパク質が化学的又は酵素的手段によって不可逆的に保護されうる、上述のようなＨＣＶエンベロープタンパク質を包含している。特に化学的手段による不可逆的保護は、アルキル化、好ましくは例えば活性ハロゲン、エチレンイミン又はＮ−（ヨードエチル）トリフルオロ−アセタミドのごときアルキル化剤を用いたＨＣＶエンベロープタンパク質のアルキル化を意味する。この点において、システインのアルキル化が、硫黄原子上の水素が（ＣＨ２）ｎＲにより置換えられている（なお式中ｎは０、１、２、３又は４であり、ＲはＨ、ＣＯＯＨ、ＮＨ２、ＣＯＮＨ２、フェニル又はそれらの任意の誘導体である）システインを基準にしているというふうに了解すべきである。アルキル化は、例えば、ＸをＩ、Ｂｒ、Ｃｌ又はＦのごときハロゲンとして活性ハロゲンＸ（ＣＨ２）ｎＲのごとき当該技術分野で既知のあらゆる方法によって実施可能である。活性ハロゲンの例としては、ヨウ化メチル、ヨード酢酸、ヨードアセタミド、及び２−ブロモエチルアミンがある。アルキル化のその他の方法としては、ＮＥＭ（Ｎ−エチルマレイミド）又はビオチン−ＮＥＭ、その混合物又は、両方共−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ２による−Ｈの置換を結果としてもたらすエチレンイミン又はＮ−（ヨードエチル）トリフルオロアセタミドの使用が含まれる（Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ、１９９６）。本明細書で使用されるような「アルキル化剤」という語は、本明細書に記載されているようなアルキル化を実施することのできる化合物を意味する。かかるアルキル化は最終的に、その他のアミノ酸を模倣できる修飾されたシステインを結果としてもたらす。エチレンイミンによるアルキル化は、結果として、リジンに似た構造をもたらし、そのため、トリプシンのための新しい開裂部位が導入されることになる（Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ、１９９６）。同様にして、ヨウ化メチルの利用は、結果としてメチオンに似たアミノ酸をもたらし、一方ヨードアセテート及びヨードアセタミドの利用は、結果として、それぞれグルタミン酸及びグルタミンに似たアミノ酸をもたらす。同様に、これらのアミノ酸は好ましくは、システインの直接的突然変異において用いられる。従って、本発明は、本明細書に記載されているようなＨＣＶエンベロープタンパク質の少なくとも１つのシステイン残基が天然アミノ酸、好ましくはメチオニン、グルタミン酸、グルタミン又はリジンに突然変異させられる、本明細書で記載するとおりのＨＣＶエンベロープタンパク質に関係する。「突然変異させられる」という語は、これらのアミノ酸をコードする核酸の部位特異的突然変異誘発、すなわち例えばＰＣＲを用いた部位特異的突然変異誘発又はＳａｍｂｒｏｏｋら、（１９８９）に記載されているようなオリゴヌクレオチド媒介突然変異誘発を介したものなどの、当該技術分野において周知の方法を意味する。本発明の実施例の部については、相反する規定のないかぎり、アルキル化はアルキル化剤としてのヨード−アセタミドの使用を意味するものと理解すべきである。
【００５９】
さらに、本発明のＨＣＶタンパク質又はその一部分のシステイン残基は可逆的に保護できるというとことが了解される。可逆的な保護の目的は、ＨＣＶタンパク質を安定化させることにある。特に、可逆的な保護の後、硫黄含有官能基（例えばチオール及びジスルフィド）は、非反応性条件下で保持される。硫黄含有官能基はかくしてその他の化合物と反応できず、例えば、以下のようなジスルフィド結合を形成又は交換する傾向は全くもたない。
【化１】
2004532029.tif 000002
【００６０】
チオール及び／又はジスルフィド残基間の記載された反応は、分子間プロセスに限定されず、同様に分子内でも起こり得る。
【００６１】
本明細書で使用される「可逆的に保護する」という語は、システイン残基に対して修飾作用物質を共有結合させることならびに、チオール基の酸化還元状態が精製手順のその後の工程全体にわたり影響されない状態にとどまるような形でＨＣＶタンパク質の環境を操作すること（遮へい）を意図している。
【００６２】
システイン残基の可逆的保護は、化学的又は酵素的に実施可能である。
【００６３】
本明細書で使用する「酵素的手段による可逆的保護」は、例えばパルミトイルアシルトランスフェラーゼのごときチオ−エステル化の触媒として作用することに関与するアシルトランスフェラーゼなどのアシル−トランスフェラーゼのごとき酵素により媒介される可逆的保護を意図している（以下及びＤａｓら、１９９７を参照のこと）。
【００６４】
本明細書で使用する「化学的手段による可逆的保護」は、次のものによる可逆的保護を意図している：
（１）例えばスルホン化及びチオエステル化によるようなシステイニルを可逆的に修飾する修飾剤による：
スルホン化は、ジスルフィド架橋に関与するチオール又はシステインがＳ−スルホネートに修飾される反応である：
【化２】
2004532029.tif 000003
（ＡｎｄｒeＤａｒｂｒｅ）又は
【化３】
2004532029.tif 000004
（亜硫酸分解： Ｋｕｍａｒら、１９８６）。スルホン化のための試薬は、例えばＮａ２ＳＯ３又はテトラチオン酸ナトリウムである。後者のスルホン化試薬は、１０〜２００ｍＭ、より好ましくは５０〜２００ｍＭの濃度で使用される。任意にはスルホン化は、例えばＣｕ２＋（１００μＭ〜１ｍＭ）又はシステイン（１〜１０ｍＭ）のごとき触媒の存在下で実施可能である。
反応は、タンパク質変性ならびに未変性条件下で実施可能である（Ｋｕｍａｒら、１９８５；Ｋｕｍａｒら、１９８６）
チオエステル結合形成又はチオエステル化は、以下の式によって特徴づけされる：
【化４】
2004532029.tif 000005
なお式中、Ｘは好ましくは化合物Ｒ’ＣＯ−Ｘ内のハロゲニドである。
（２）例えば重金属、特にＺｎ２＋、Ｃｄ２＋（Ｍａｔｔｓら、１９９１）、モノ−、シチオ及びジスルフィド−化合物（例えばアリル−及びアルキルメタンチオスルホネート、ジチオピリジン、ジチオモルホリン、ジヒドロリポアミン、エルマン試薬、アルドロチオールＴＭ（アルドリッチ（Ａｌｄｒｉｃｈ））（Ｒｅｉｎら、１９９６）、ジチオカルバメート）、又はチオール化剤（例えばグルタチオン、Ｎ−アセチルシステイン、システインアミン）などにより本発明のシステイニルを可逆的に修飾する修飾用作用物質による。ジチオカルバメートは、スルフヒドリル基と反応する能力を付与するＲ１、Ｒ２ＮＣ（Ｓ）ＳＲ３官能基を有する広範なクラスの分子を含んで成る。チオール含有化合物が、好ましくは０．１〜５０ｍＭ、より好ましくは１〜５０ｍＭ、さらに一層好ましくは１０〜５０ｍＭの濃度で使用される。
（３）１０μＭ〜１０ｍＭ、より好ましくは１〜１０ｍＭの濃度範囲内での例えばＤＴＴ、ジヒドロアスコルベート、ビタミンｓ及び誘導体、マンニトール、アミノ酸、ペプチド及び誘導体（例えばヒスチジン、エルゴチオネイン、カルノシン、メチオニン）、没食子酸塩、ヒドロキシアニソール、ヒドロキシトルエン、ハイドロキノン、ヒドロキシメチルフェノール及びその誘導体のごとき、チオール状態を保存する（安定化させる）修飾用作用物質、特に酸化防止剤の存在による。
（４）例えば（ｉ）金属イオン（Ｚｎ２＋、Ｍｇ２＋）、ＡＴＰのごとき補因子、（ｉｉ）ｐＨ制御（例えば、タンパク質については大部分のケースにおいてｐＨ〜５又はｐＨは好ましくはチオールｐＫａ−２；例えば逆相クロマトグラフィーにより精製されたペプチドについてはｐＨ〜２に）のごときチオール安定化条件による。
【００６５】
（１）、（２）、（３）、及び（４）で記載した通りの可逆的保護の組合せは、同じように純粋かつ再生されたＨＣＶタンパク質を結果としてもたらす可能性がある。実際には、組合せ化合物、例えばＺ１０３（Ｚｎカルノシン）を、好ましくは１〜１０ｍＭの濃度で使用することができる。可逆的保護は又、上述の修飾基又は遮へい以外に、ペプチドバックボーンを分断することなく酵素的又は化学的に逆転させることのできるあらゆるシステイニル保護方法をも意味する。この点において、本発明は、詳細には、例えばチオエステル結合がチオエステラーゼ、塩基性緩衝液条件（Ｂｅｅｋｍａｎら、１９９７）又はヒドロキシルアミン処理（Ｖｉｎｇｅｒｈｏｅｄｓら、１９９６）によって開裂される、従来の化学合成（以上参照）によって調製されるペプチドを特に基準としている。
【００６６】
チオール含有ＨＣＶタンパク質は、例えば、（１）ジスルフィド結合を含む開裂可能なコネクタアーム（例えば固定化された ５，５’−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）（Ｊａｙａｂａｓｋａｒａｎら、１９８７）及び活性化されたチオール−セファロース４Ｂ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）上の電子対共有クロマトグラフィー）又は（２）固定化されたリガンドとしてのアミノヘキサノイル−４−アミノフェニルアルシンを含有するアフィニティクロマトグラフィー樹脂上で精製可能である。後者のアフィニティマトリックスは、酸化還元調節を受けるタンパク質及び酸化的ストレスについての標的であるジチオールタンパク質のために使用されてきた（Ｋａｌｅｆら、１９９３）。
【００６７】
ペプチドの可溶化及び抽出を増大させるために、可逆的保護を使用することもできる（Ｐｏｍｒｏｙ＆Ｄｅｂｅｒ、１９９８）。
【００６８】
可逆的保護及びチオール安定化化合物は、単量体、重合体又はリポソームの形態で提示できる。
【００６９】
システイン残基の可逆的保護状態の除去は、例えば以下のことによって、化学的又は酵素的に達成可能である：
−  特に１〜２００ｍＭ、より好ましくは５０〜２００ｍＭの濃度での還元剤、特にＤＴＴ、ＤＴＥ、−２−メルカプトエタノール、ジチオナイト、ＳｎＣｌ２、水素化ホウ酸ナトリウム、ヒドロキシルアミン、ＴＣＥＰ；
−  例えばｐＨ増大によるチオール安定化条件又は作用物質の除去；
−  特に０．０１〜５μＭ、より一層詳細には０．１〜５μＭの濃度範囲内の、特にチオエステラーゼ、グルタレドキシン、チオレドキシンのごとき酵素；
−  上述の化学的及び／又は酵素条件の組合せ。
【００７０】
システイン残基の可逆的保護状態の除去は、例えば細胞内又は個体内のごときｉｎ  ｖｉｖｏ又はｉｎ  ｖｉｔｒｏで実施できる。
【００７１】
精製手順内では、システイン残基は不可逆的に遮断されてもされなくてもよく、又、以上で挙げたようなあらゆる可逆的修飾用作用物質により置換されてもされなくてもよいということがわかるだろう。
【００７２】
本発明による還元剤は、システイン残基中の硫黄例えば「Ｓ−Ｓ」ジスルフィド架橋の還元、システイン残基の脱スルホン化（ＲＳ−ＳＯ３−→ＲＳＨ）を達成するあらゆる作用物質である。酸化防止剤は、チオール状態を保存するか又は「Ｓ−Ｓ」形成及び／又は交換を保存するあらゆる試薬である。「Ｓ−Ｓ」ジスルフィド架橋の還元は、ジスルフィドをチオール（−ＳＨ）に還元させる化学反応である。ＷＯ９６／０４３８５中に開示されているジスルフィド架橋破壊用作用物質及び方法は、ここで本明細書中に参照により一体化される。「Ｓ−Ｓ」還元は、（１）酵素カスケード経路によってか又は（２）還元化合物によって得ることができる。チオレドキシン、グルタレドキシンのごとき酵素が、ジスルフィドのｉｎ  ｖｉｖｏ還元に関与するものとして知られており、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで「Ｓ−Ｓ」架橋を還元する上で有効であることも示されてきた。ジスルフィド結合は、ＤＴＴでの反応について一定である対応する速度よりも１０４倍前後大きい見かけの二次速度で、ｐＨ７．０で還元済みチオレドキシンにより急速に開裂される。還元反応速度は、１ｍＭのＤＴＴ又はジヒドロリポアミドと共にタンパク質溶液を予めインキュベートすることにより劇的に増大させることができる（Ｈｏｌｍｇｒｅｎ、１９７９）。
【００７３】
タンパク質ジスルフィド架橋を還元することのできるチオール化合物は、例えばジチオトレイトール（ＤＴＴ）、ジチオエリスリトール（ＤＴＥ）、β−メルカプトエタノール、チオカルバメート、ビス（２−メルカプトエチル）スルホン及びＮ，Ｎ’−ビス（メルカプトアセチル）ヒドラジン及び亜ジチオン酸ナトリウムである。
【００７４】
ＨＣＶタンパク質の還元のためには、モノクローナル抗体内のジスルフィド架橋の還元において非常に有用であることが示された（Ｔｈａｋｕｒら、１９９１）、アスコルビン酸塩又は塩化第１スズ（ＳｎＣｌ２）のごときチオール基無しの還元剤も使用することができる。さらにｐＨ値の変化はＨＣＶタンパク質の酸化還元状態に影響を及ぼし得る。水素化ホウ素ナトリウム処理が、ペプチド内のジスルフィド架橋の還元のために有効であることが示されてきた（Ｇａｉｌｉｔ、１９９３）。トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）が、低いｐＨでジスルフィドを還元できる（Ｂｕｒｎｓら、１９９１）。還元剤としてＤＴＴ又は水素化ホウ素ナトリウムが用いられる場合、セレノールがジスルフィドからチオールへの還元の触媒として作用する。市販のジセレニドであるセレノシステアミンが、触媒の前駆体として使用された（Ｓｉｎｇｈ及びＫａｔｓ、１９９５）。
【００７５】
ここでも又、以上で引用された文書の全ての定義を含めた内容全体が本出願に参考により一体化されるということを強調しておく。従って、ＨＣＶタンパク質の酸素還元状態を修飾するための上述の方法及び化合物は、全ての本発明の中で考慮される。
【００７６】
ヘパリンは、複数のウイルスに結合するものとして知られており、従って、ＨＣＶエンベロープに対する結合はすでに示唆されている（Ｇａｒｓｏｎら、１９９１）。この点において、ヘパリンに対するＨＣＶエンベロープタンパク質の潜在的結合を分析するために、ヘパリンをビオチニル化することができ、その後ＨＣＶエンベロープタンパク質とヘパリンの相互作用を例えばＨＣＶエンベロープタンパク質でコーティングされたマイクロタイタープレート上で分析することができる。このようにして異なる発現系を綿密に検査することができる。例えば、哺乳動物細胞培養からのＨＣＶ  Ｅ１での結合が存在しない一方で、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ内で発現されたＨＣＶ  Ｅ１の一部分との強い結合が観察されている。この点において、「ヘパリンアフィニティクロマトグラフィー」という語は、ＨＣＶエンベロープタンパク質に特異的に結合することのできる固定化されたヘパリンに関係する。高マンノースタイプのタンパク質は、Ｌｅｎｓ  ｃｕｌｉｎａｒｉｓ、  Ｇａｌａｎｔｈｕｓ  ｎｉｖａｌｉｓ、  Ｎａｒｃｉｓｓｕｓ  ｐｓｅｕｄｏｎａｒｃｉｓｓｕｓ、  Ｐｉｓｕｍ  ｓａｔｉｖｕｍ又はＡｌｌｉｕｍ  ｕｒｓｉｎｕｍのごとき凝集素を結合させる。さらに、Ｎ−アセチルグルコサミンは、ＷＧＡ（小麦胚凝集素）のごときレクチン及びその等価物によって結合され得る。従って、例えばワクチン又は免疫検定用の抗原の産生中の精製（レクチン−クロマトグラフィー）を目的として細胞培養上清、細胞溶解物及びその他の流体から本発明のＨＣＶエンベロープタンパク質を分離するために、固体相に結合したレクチンを利用することができる。
【００７７】
特に本発明は、免疫検定又はワクチンでの使用に適した、コア−グリコシル化されたＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）エンベロープタンパク質又はその任意の一部分を精製するための方法であって：
−  ＨＣＶ  Ｅ１及び／又はＨＣＶ  Ｅ２タンパク質又はその任意の一部分をコードするエンベロープ遺伝子で形質転換されたＨａｎｓｅｎｕｌａ又はＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓグリコシル化マイナス菌株を適切な培地で増殖させる工程；
−  前記ＨＣＶ  Ｅ１及び／又はＨＣＶ  Ｅ２  遺伝子又はその任意の一部分の発現をひき起こす工程；及び
−  前記コア−グリコシル化されたＨＣＶ  Ｅ１及び／又はＨＣＶ  Ｅ２タンパク質又はその一部分を前記細胞培養から精製する工程、を含んで成る方法に関する。
【００７８】
本発明はさらに、免疫検定又はワクチンでの使用に適した、コア−グリコシル化されたＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）エンベロープタンパク質又はその任意の一部分を精製するための方法であって：
−  ＨＣＶ  Ｅ１及び／又はＨＣＶ  Ｅ２タンパク質又はその任意の一部分をコードするエンベロープ遺伝子で形質転換されたＨａｎｓｅｎｕｌａ又はＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓグリコシル化マイナス菌株を適切な培地で増殖させる工程；
−  前記ＨＣＶ  Ｅ１及び／又はＨＣＶ  Ｅ２ 遺伝子又はその任意の一部分の発現をひき起こす工程；及び
−  前記細胞内で発現されたコア−グリコシル化済みＨＣＶ  Ｅ１及び／又はＨＣＶ  Ｅ２タンパク質又はその一部分を形質転換された宿主細胞の溶解時点で精製する工程、を含んで成る方法に関する。
【００７９】
本発明はさらに、免疫検定又はワクチンでの使用に適した、コア−グリコシル化されたＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）エンベロープタンパク質又はその任意の一部分を精製するための方法であって、
−ｉ−  少なくとも２つのＣｙｓ−アミノ酸を含むＨＣＶ  Ｅ１及び／又はＨＣＶ  Ｅ２タンパク質又はその任意の一部分をコードするエンベロープ遺伝子で形質転換されたＨａｎｓｅｎｕｌａ又はＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓグリコシル化マイナス菌株を適切な培地で増殖させる工程；
−ｉｉ−  前記ＨＣＶ  Ｅ１及び／又はＨＣＶ  Ｅ２  遺伝子又はその任意の一部分の発現をひき起こす工程；及び
−ｉｉｉ−  前記Ｃｙｓアミノ酸が化学的及び／又は酵素的手段で可逆的に保護されている、前記コア−グリコシル化されたＨＣＶ  Ｅ１及び／又はＨＣＶ  Ｅ２タンパク質又はその一部分を前記細胞培養から精製する工程、を含んで成る方法に関する。
【００８０】
本発明はさらに、免疫検定又はワクチンでの使用に適した、コア−グリコシル化されたＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）エンベロープタンパク質又はその任意の一部分を精製するための方法であって、
−ｉ−  少なくとも２つのＣｙｓ−アミノ酸を含むＨＣＶ  Ｅ１及び／又はＨＣＶ  Ｅ２タンパク質又はその任意の一部分をコードするエンベロープ遺伝子で形質転換されたＨａｎｓｅｎｕｌａ又はＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓグリコシル化マイナス菌株を適切な培地で増殖させる工程；
−ｉｉ−  前記ＨＣＶ  Ｅ１及び／又はＨＣＶ  Ｅ２  遺伝子又はその任意の一部分の発現をひき起こす工程；及び
−ｉｉｉ−  前記Ｃｙｓアミノ酸が化学的及び／又は酵素的手段で可逆的に保護されている、前記細胞内発現されたコア−グリコシル化されたＨＣＶ  Ｅ１及び／又はＨＣＶ  Ｅ２タンパク質又はその一部分を形質転換された宿主細胞の溶解時点で精製する工程、を含んで成る方法に関する。
【００８１】
本発明は特に、精製にはヘパリンアフィニティクロマトグラフィーが包含される、本明細書に記載されている通りの組換え型コア−グリコシル化済みＨＣＶ酵母タンパク質又はその任意の一部分を精製するための方法に関する。
【００８２】
従って本発明は同様に、前記化学的手段がスルホン化である、以上で記載されている通りの組換え型コア−グリコシル化済みＨＣＶ酵母タンパク質又はその任意の一部分を精製するための方法にも関する。
【００８３】
従って本発明は同様に、Ｃｙｓ−アミノ酸の前記可逆的保護が化学的及び／又は酵素的手段による不可逆的保護と交換される、以上で記載されている通りの組換え型コア−グリコシル化済みＨＣＶ酵母タンパク質又はその任意の一部分を精製するための方法にも関する。
【００８４】
従って本発明は同様に、化学的手段による前記不可逆的保護がヨードアセタミドである、以上で記載されている通りの組換え型コア−グリコシル化済みＨＣＶ酵母タンパク質又はその任意の一部分を精製するための方法にも関する。
【００８５】
従って本発明は同様に、前記化学的手段による不可逆的保護がＮＥＭ又はビオチン−ＮＥＭ又はその混合物である、以上で記載されている通りの組換え型コア−グリコシル化済みＨＣＶ酵母タンパク質又はその任意の一部分を精製するための方法にも関する。
【００８６】
「組換え型ポリヌクレオチド又は核酸」という語は、その由来又は操作によって（１）それが天然に結びつけられているポリヌクレオチドの全て又は一部分と結びつけられていない、（２）それが天然に結びつけられているポリヌクレオチド以外のポリヌクレオチドに連結されている、又は（３）天然には発生しない、ゲノム、ｃＤＮＡ、半合成又は合成由来のヌクレオチド又は核酸を意味する。
【００８７】
「組換え型宿主細胞」、「宿主細胞」、「細胞」、「細胞系統」、「細胞培養」及び、単細胞実体として培養された微生物又は高等真核細胞系統を表わす語は、組換え型ベクター又はその他の転移ポリヌクレオチドのための受容体として使用可能な又は使用されてきた細胞を意味し、トランスフェクションを受けたもとの細胞の子孫を含む。自然の、偶発的又は計画的な突然変異に起因して単一の親細胞の子孫が必ずしも、もとの親と形態学的に又はゲノム又は全ＤＮＡ補体に関し完全に同一でない可能性があるということが了解される。
【００８８】
「レプリコン」という語は、細胞内で１つの自立したポリヌクレオチド複製単位として挙動するプラスミド、染色体、ウイルス、コスミドなどのごときあらゆる遺伝エレメントのことである。
【００８９】
「ベクター」という語は、所望の読取り枠の複製及び／又は発現を提供する配列をさらに含むレプリコンのことである。
【００９０】
「制御配列」という語は、それが連結されたコーディング配列の発現をもたらすのに必要なポリヌクレオチド配列を意味する。かかる制御配列の性質は、宿主生物に応じて異なる。原核生物においては、かかる制御配列は一般にプロモーター、リボソーム結合部位、及びターミネーターを包含している。真核生物においては、一般にかかる制御配列は、プロモーター、ターミネーター及び、一部のケースではーを包含する。「制御配列」という語は、最小限で、その存在が発現に必要である全ての構成エレメントを包含するよう意図されており、同様に、その存在が有利である付加的な構成エレメント、例えば分泌を支配するリーダー配列をも包含し得る。
【００９１】
「プロモーター」という語は、ｍＲＮＡ産生が隣接する構造性遺伝子のための通常の転写開始部位で開始するような要領で、ＤＮＡ鋳型に対するＲＮＡポリメラーゼの結合を可能にするコンセンサス配列で構成されているヌクレオチド配列である。
【００９２】
「作動可能な形で連結された」という表現は、かく記載された構成エレメントが、その意図された要領で機能できるようにする関係にある並置を意味する。コーディング配列に対して作動可能な形で連結された制御配列は、コーディング配列の発現が制御配列と相容性ある条件下で達成されるような形で連結されている。
【００９３】
「読取り枠」（ＯＲＦ）というのは、ポリペプチドをコードし停止コドンを含まないポリヌクレオチド配列の１領域である。この領域は、コーディング配列の一部分又は全コーディング配列を表わす可能性がある。
【００９４】
「コーディング配列」というのは、適切な調節配列の制御下に置かれた場合に、ポリペプチドへと翻訳される及び／又はｍＲＮＡへと転写されるポリヌクレオチドである。コーディング配列の境界は、５’末端の翻訳開始コドン及び３’末端の翻訳停止コドンによって決定される。コーディング配列はｍＲＮＡ、ＤＮＡ（ｃＤＮＡを包含する）及び組換え型ポリヌクレオチド配列を包含し得るが、これらに制限されるわけではない。
【００９５】
「免疫原性」という語は、単独の場合又は１つの担体に結合された場合、アジュバンドの存在下又は不在下のいずれであるかにかかわらず、体液性及び／又は細胞性応答をひき起こす１つの物質の能力を意味する。「中和」という語は、感染性作用物質の感染性を部分的に又は完全に遮断する免疫応答を意味する。「ワクチン」又は「薬剤」というのは、部分的であるか完全であるかに関わらず、又急性又は慢性のいずれの疾患に対するものであるかに関わらず、ＨＣＶに対する保護を惹起する能力をもつ免疫原性組成物である。ワクチンは、個体の治療にとっても有用であり得、その場合、それは治療用ワクチンと呼ばれる。従ってワクチンは、ＨＣＶペプチド、タンパク質又はポリヌクレオチドを包含する。ＨＣＶに対する保護は、特にヒトを基準としているが、ヒト以外の霊長類、ｔｒｉｍｅｒａマウス（Ｚａｕｂｅｒｍａｎら、１９９９）、又はその他の哺乳動物をも基準とする。
【００９６】
本発明のコア−グリコシル化されたタンパク質は、そのままの状態で、ビオチニル化された形で（ＷＯ９３／１８０５４中で説明されるように）及び／又はＮｅｕｔｒａｌｉｔｅ  Ａｖｉｄｉｎ（モレキュラープローブ社（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ  Ｉｎｃ）、米国オレゴン州ユージーン）に複合体化された状態で使用することができる。又「ワクチン組成物」が、活性物質に加えて、それだけでは組成物を受ける個体にとって有害な抗体の産生を誘発せず、保護を惹起することもない適切な賦形剤、希釈剤、担体及び／又はアジュバントを含んで成る、ということも指摘しておくべきである。適切な担体は、標準的には、タンパク質、多糖、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、重合体ａａ、ａａ共重合体及び不活性ウイルス粒子のごとき、大きくゆっくりと代謝される巨大分子である。かかる担体は、当業者にとっては周知である。組成物の有効性を増強するための好ましいアジュバントとしては、制限的な意味なく、以下のものが含まれる：水酸化アルミニウム、ＷＯ９３／１９７８０中に記載されているような３−Ｏ−脱アシル化モノホルホリル脂質Ａ、ＷＯ９３／２４１４８に記載されているようなリン酸アルミニウム、米国特許第４，６０６，９１８号に記載されているようなＮ−アセチル−ムラミル−Ｌ−トレオニン−Ｄ−イソグルタミン、Ｎ−アセチル−ノルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミル−Ｌ−アラニン２−（１’２’ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）エチルアミン及び、モノホスホリル脂質Ａ、解毒されたエンドトキシン、トレハロース−６，６−ジミコレ−ト及び細胞壁骨格（ＭＰＬ＋ＴＤＭ＋ＣＷＳ）を２％のスクアレン／Ｔｗｅｅｎ８０エマルジョン中に含有するＲＩＢＩ（イムノケムリサーチ社（Ｉｍｍｕｎｏ  Ｃｈｅｍ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｃ．）、米国モンタナ州ハミルトン）。３つの成分ＭＰＬ，ＴＤＭ又はＣＷＳのいずれかを、単独でも又は２つずつ組合わせた状態でも使用することができる。ＭＰＬを、ＲＩＢＩ．５２９と呼ばれるその合成アナログによって置換することもできる。さらに、Ｓｔｉｍｕｌｏｎ（ケンブリッジバイオサイエンス（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、米国マサチューセッツ州ウォーチェスター）又はＳＡＦ−１（Ｓｙｎｔｅｘ）のごときアジュバント、ならびにＱＳ２１及び３−デ−Ｏ−アセチル化モノホスホリル脂質Ａ（ＷＯ９４／００１５３）又はＭＦ−５９（チロン（Ｃｈｉｒｏｎ））又はポリ〔ジ（カルボキシラトフェノキシ）フォスファゼン〕、ベースのアジュバント（ヴィールスリサーチインスティチュート（Ｖｉｒｕｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ））、又はＯｐｔｉｖａｘ（ヴァクセル（Ｖａｘｃｅｌ）、サイテックス（Ｃｙｔｅｘ））のごときブロック共重合体ベースのアジュバント、又はＡｌｇａｍｍｕｌｉｎ  及びＧａｍｍａＩｎｕｌｉｎ  （アニュテック（Ａｎｕｔｅｃｈ））、 不完全フロインドアジュバント（ＩＦＡ）又はＧｅｒｂｕ調製物（ゲルブバイオテヒニーク（Ｇｅｒｂｕ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｋ））のごときインシュリンベースのアジュバントの組合せのごときアジュバントも��用可能である。非ヒト利用分野そして研究目的のためにも、完全フロインドアジュバント（ＣＦＡ）を使用することができるということを理解すべきである。「ワクチン組成物」はさらに、水、食塩水、グリセロ−ル、エタノ−ル、湿潤剤又は乳化剤ｐＨ緩衝物質、防腐剤などのごとき本質的に非毒性で非治療用のものである賦形剤及び希釈剤を含有することになる。標準的には、ワクチン組成物は、注入物質として、液体溶液又は懸濁液のいずれかとして調製される。注入に先立ち液体ビヒクル上で溶解させるか、又は液体ビヒクル中に懸濁させるために適した固体形態も同じく調製可能である。該調製は同様に、アジュバント効果を増強させるためリボソ−ム内に乳化又はカプセル化することもできる。ポリペプチドは同様に、サポニン例えばＱｕｉｌ  Ａ（ＩＳＣＯＭＳ）と合わせてＩｍｍｕｎｅ  Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  Ｃｏｍｐｌｅｘｅ（免疫促進性複合体）の中に取込むこともできる。ワクチン組成物は、本発明のポリペプチドならびにその他の上述の成分のいずれかを免疫学的に有効な量だけ含む。「免疫学的に有効な量」というのは、単一用量又は一連の用量。一部として個体に対しその量を投与することが予防又は治療のために有効であることを意味している。この量は、治療すべき個体の健康及び身体条件、治療されるべき個体の分類学的群（例えばヒト、非ヒト霊長類、霊長類など）、有効な免疫応答をしかける個体の免疫系の能力、望まれる保護の度合、ワクチンの処方、治療担当医の査定、感染性ＨＣＶの菌株及びその他の関連性ある要因によって変動する。この量は、日常的な試行を通して決定できる比較的広い範囲内に入ることになると予想される。通常、この量は、１用量につき０．０１〜１０００μｇ、より詳細には０．１〜１００μｇとなる。ワクチン組成物は、従来、非経口投与、標準的には注射例えば皮下又は筋内注射により投与される。その他の投与方法に適した付加的な製剤形態としては経口製剤形態及び坐薬がある。投与治療は単一用量計画又は多用量投与計画でありうる。ワクチンは、その他の免疫調節剤と合わせて投与することができる。従って、当該発明は、ＨＣＶに対する免疫性を予防的に誘発するための本明細書中に定義されたオリゴマー粒子の使用に関する。ワクチンは同様に、以上で指摘したような個体の治療のためにも有用で有り得、その場合、それは「治療用ワクチン」と呼ばれる、という点に留意すべきである。
【００９７】
本発明は同様に、ＨＣＶコア、Ｅ１、Ｅ２、Ｐ７、ＮＳ２、ＮＳ３、ＮＳ４Ａ、ＮＳ４Ｂ、ＮＳ５Ａ及び／又はＮＳ５Ｂ タンパク質又はその一部をも含む上述の通りの組成物にも関する。本発明のコア−グリコシル化されたタンパク質Ｅ１、Ｅ２、及び／又はＥ１／Ｅ２は例えば、その他のＨＣＶ抗原例えばコア、Ｐ７、ＮＳ３、ＮＳ４Ａ、ＮＳ４Ｂ、ＮＳ５Ａ及び／又はＮＳ５Ｂと組合わせることもできる。これらのＮＳ３タンパク質の精製は、好ましくは、システイン残基の可逆的修飾、そしてさらに一層好ましくは、システインのスルホン化を包含することになる。スルホン化を含めた、かかる可逆的修飾を得るための方法がＮＳ３タンパク質についてメルテンスら、（ＰＣＴ／ＥＰ９９／０２５４７）の中で記載されてきた。後者の文書における全ての定義づけを含めた全内容が参照により本明細書に一体化されるという点を強調しておくべきである。
【００９８】
以上のことから、本発明が同様に、ＨＣＶワクチン組成物の製造のための、以上で定義された通りのコア−グリコシル化されたエンベロープタンパク質又は以上で定義された通りの組成物の使用にも関していることは明白である。特に。本発明は、慢性ＨＣＶのキャリヤにおいてＨＣＶに対する免役性を誘発するための本明細書で定義した通りのコア−グリコシル化されたエンベロープタンパク質の使用にも関する。より詳細には、本発明は、例えば、リバビリンなどのＨＣＶ治療用の小さい薬物の投与と組合せた形、又は組合わせない形のいずれかでの周知のインタフェロン療法のごときその他のあらゆる療法の前、同時又は後の慢性ＨＣＶキャリヤにおいてＨＣＶに対する免疫性を誘発するための、本明細書に定義された通りのコア−グリコシル化されたエンベロープタンパク質の使用に関する。かかる組成物は同様に、肝臓移植の前後、又は例えば針で刺したけがなどのような推定感染の後にも利用されうる。さらに、本発明は、同様に、生体試料中に存在するＨＣＶ抗体を検出するべく本発明のコア−グリコシル化されたエンベロープタンパク質を収納したキットに関する。本明細書で使用する「生体試料」という語は、血清、血漿、リンパ液、皮ふ、気道、腸管及び尿生殖路の外部切片、卵母細胞、涙、唾液、乳汁、血球、腫瘍、器官、胃分泌物、粘液、脊髄液、例えば排泄物、尿、精液などのごとき外分泌物を含む（ただしこれらに限られるわけではない）、個体から単離された組織又は流体の試料を意味する。本発明のコア−グリコシル化されたエンベロープタンパク質は免疫原性がきわめて高く、体液性及び細胞性の両方の免疫応答を刺激することから、本発明は同様に、本発明の精製された単一のＨＣＶエンベロープタンパク質又は、オリゴマー粒子を含む、ＨＣＶ関連Ｔ細胞応答を検出するためのキットにも関する。ＨＣＶＴ細胞応答は、例えば、実施例の部に記載されている通りに又はレロー−ロール（Ｌｅｒｏｕｘ−Ｒｏｅｌｓ）らのＰＣＴ／ＥＰ９４／０３５５５に記載されている通りに測定することができる。この文書の全ての定義づけを含めた全内容が参照により本明細書に一体化されるという点を強調しておくべきである。
【００９９】
特に、本発明は、薬剤として使用するための本明細書に記載されているようなＨＣＶ  Ｅ１及び／又はＥ２タンパク質又はその任意の一部分に関する。
【０１００】
特に、本発明は、ＨＣＶ感染に対するワクチン／薬剤の製造のための、上述の通りのＨＣＶ  Ｅ１及び／又はＥ２タンパク質又はその任意の一部分の使用に関する。
【０１０１】
同様に、本発明は、コア−グリコシル化されたエンベロープタンパク質が、一連の時間及び化合物の一部として使用されることを特徴とする、ＨＣＶに対する免疫性を誘発するための本明細書に記載された通りのコア−グリコシル化されたエンベロープタンパク質の使用に関する。この点において、「一連の時間及び化合物」という語は、免疫応答を惹起するために用いられる化合物を個体に対し時間的間隔をおいて投与することを意味すると理解すべきである。後者の化合物は、次の成分のうちのいずれかを含むことができる：コア−グリコシル化されたエンベロープタンパク質、ＨＣＶ  ＤＮＡワクチン組成物、ＨＣＶポリペプチド。
【０１０２】
この点において、一連のものには、以下のような投与が含まれる：
（Ｉ）例えばコア−グリコシル化されたエンベロープタンパク質の、時間的間隔をおいた投与、又は
（ＩＩ）前記コア−グリコシル化されたエンベロープタンパク質オリゴマー粒子及び前記ＨＣＶ  ＤＮＡワクチン組成物を同時に、又は交互の時間的間隔を含めた、異なる時間的間隔で投与できる、ＨＣＶ  ＤＮＡワクチン組成物と組合せた形での、例えばコア−グリコシル化されたエンベロープタンパク質のごときＨＣＶ抗原の投与、又は
（ＩＩＩ）時間的間隔を置いた、場合によってはその他のＨＣＶペプチドと組合わせた形での（Ｉ）又は（ＩＩ）のいずれか。
【０１０３】
この点において、ＨＣＶ  ＤＮＡワクチン組成物が、Ｅ１−、Ｅ２−、Ｅ１／Ｅ２−ペプチド、ＮＳ３ペプチド、その他のＨＣＶペプチド又は前記ペプチドの一部分を含めたＨＣＶエンベロープペプチドをコードする核酸を含んで成ることは明白であるはずである。その上、前記ＨＣＶペプチドは、Ｅ１−、Ｅ２−、Ｅ１／Ｅ２−ペプチド、その他のＨＣＶペプチド又はその一部分を含めたＨＣＶエンベロープペプチドを含んで成ることを了解すべきである。「その他のＨＣＶペプチド」という語は、あらゆるＨＣＶペプチド又はそのフラグメントを意味する。上述のスキームの項目ＩＩにおいて、ＨＣＶ  ＤＮＡワクチン組成物は、好ましくはＨＣＶエンベロープペプチドをコードする核酸を含んで成る。上述のスキームの項目ＩＩにおいて、ＨＣＶ  ＤＮＡワクチン組成物は、より一層好ましくは、場合によってはＨＣＶ−ＮＳ３ＤＮＡワクチン組成物と組合せた形でＨＣＶエンベロープペプチドをコードする核酸で構成されている。この点において、ＨＣＶ  ＤＮＡワクチン組成物が転写調節エレメントに作動可能な形で連結された上述のとおりのＨＣＶペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含むプラスミドベクターを含んで成ることは明白であるはずである。本明細書で使用するように「プラスミドベクター」とは、それが連結されたもう１つの核酸を輸送する能力をもつ核酸分子を意味する。一般に、制限的な意味はないものの、プラスミドベクターは、そのベクター形態で染色体に結合されていない環状２本鎖ＤＮＡループである。本明細書で使用されている「ポリヌクレオチド配列」は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）のごときポリヌクレオチドそして該当する場合には、リボ核酸（ＲＮＡ）を意味する。この語は、等価物として、ヌクレオチドアナログ及び１本鎖（センス又はアンチセンス）及び２本鎖ポリヌクレオチドから作られたＲＮＡ又はＤＮＡのいずれかのアナログを包含するものとして理解されるべきである。本明細書で使用されている「転写調節エレメント」という語は、生きた脊椎動物の細胞の中に導入した時点で、該ポリヌクレオチドによりコードされた翻訳産物を産生するべく細胞メカニズムを導くことができるような形で必須調節エレメントを含有するヌクレオチド配列を意味する。作動可能な形で連結されたという語は、構成エレメントがその通常の機能を果たすように構成されている並置を意味する。かくして、ヌクレオチド配列に対し作動可能な形で連結された転写調節エレメントは、前記ヌクレオチド配列の発現をもたらす能力をもつ。当業者であれば、異なる転写プロモーター、ターミネーター、担体ベクター又は特異的遺伝子配列をうまく使用することが可能であるということを認識できる。
【０１０４】
あるいはまた、アデノウイルス、カナリア痘瘡ウイルス、ＭＶＡなどのごとき生きたベクターを通してＤＮＡワクチンを送達することも可能である。
【０１０５】
本発明のＨＣＶエンベロープタンパク質又はその一部分は、ＨＣＶの検出及び／又はＨＣＶの遺伝子型特定、ＨＣＶ疾患の予後／監視のため又は治療用作用物質として、免疫検定内に組込むのに特に適している。
【０１０６】
本発明による免疫検定方法は、ＨＣＶの感染を受けた個体からの血清中で抗体により認識された線形（ペプチドの場合）及びコンホーメーションエピトープを維持する本発明のＨＣＶエンベロープタンパク質を利用している。本発明のＨＣＶ  Ｅ１及びＥ２抗原は、抗体を検出するために既知の抗原を利用する実質的に任意の検定方式で利用することができる。当然のことながら、ＨＣＶ  コンホーメーションエピトープを変性する方式は避けるか適合させるべきである。これらの検定全てに共通の特長は、成分中に存在するそのようなあらゆる抗体に抗原が結合できるようにする条件の下で、ＨＣＶ抗体を含有することが推測されている身体成分と抗原を、接触させるという点にある。かかる条件は、標準的には、余剰の抗原を用いたイオン強度、生理的温度及びｐＨとなる。供与体との抗原のインキュベーションの後には、抗原を含む免疫複合体の検出が行なわれる。
【０１０７】
免疫検定の設計は、大きく変貌を遂げ、数多くの方式が当該技術分野において知られている。例えば、プロトコルは、固定支持体又は免疫沈降を使用することができる。大部分の検定には、標識づけされた抗体又はポリペプチドの使用が関与している。標識は、例えば酵素、螢光、化学発光、放射性又は染料分子でありうる。免疫複合体からのシグナルを増幅する検定も同様に知られている。その例としては、ビオチン及びアビジン又はストレプトアビジンを利用する検定及び、ＥＬＩＳＡ及びＲＩＡ検定のごとき酵素標識づけ及び媒介された免疫検定がある。
【０１０８】
免疫検定は、不均質又は均質方式、及び標準型又は競合型であってよいが、これらに限られない。不均質方式では、ポリペプチドは、標準的に、インキュベーション後ポリペプチドからの試料の分離を容易にするため固体マトリックス又は支持体に結合されている。使用可能な固体支持体の例としては、ニトロセルロース（例えば膜又はマイクロタイターウエル形態）、ポリ塩化ビニル（例えばシート又はマイクロタイターウエル状）、ポリスチレンラテックス（例えば、ビーズ又はマイクロタイタープレート状）、ポリフッ化ピリニデン（ＩｍｍｕｎｏｌｏｎＴＭとして知られている）、ジアゾ化紙、ナイロン膜、活性化ビス及びプロテインＡビーズがある。例えば、不均質方式では、Ｄｙｎａｔｅｃｈ  ＩｍｍｕｎｏｌｏnＴＭ１又はＩｍｍｕｎｏｌｏｎＴＭ２マイクロタイタープレートを使用することができる。抗原性ポリペプチドを含有する固体支持体は、標準的に、試験試料からそれを分離した後に、及び結合された抗体の検出に先立って洗浄される。標準方式と競合方式の両方が、当該技術分野で知られている。
【０１０９】
均質方式では、試験試料は、溶解状態の抗原の組合せと共にインキュベートされる。例えば、それは、形成されているあらゆる抗原抗体複合体を沈降させることになる条件下にあってよい。これらの検定のための標準方式及び競合方式が、当該技術分野において知られている。
【０１１０】
標準方式では、抗体抗原複合体内のＨＣＶ抗原の量は、直接監視される。これは、抗−ＨＣＶ抗体上のエピトープを認識する標識づけされた抗異種（例えば抗ヒト）抗体が複合体形成に起因して結合するか否かを決定することによって達成され得る。競合方式では、試料中のＨＣＶ抗体の量は、複合体内の既知の量の標識づけされた抗体（又はその他の競合するリガンド）の結合に対する競合効果を監視することによって、演繹される。
【０１１１】
抗ＨＣＶ抗体を含む形成された複合体（又は競合検定の場合には、競合する抗体の量）は、方式に応じて、一定の既知の技術のいずれかによって検出される。例えば、複合体中の標識づけされていないＨＣＶ抗体は、標識（例えば酵素標識）で複合体化された抗−異種Ｉｇの抱合体を用いて検出可能である。
【０１１２】
免疫沈降又は凝集検定方式においては、ＨＣＶ抗原と抗体の間の反応は、溶液又は懸濁液から沈降して沈降物の目に見える層又はフィルムを形成するネットワークを形成する。供与体中にいかなる抗−ＨＣＶ抗体も存在しない場合、目に見える沈降物は全く形成されない。
【０１１３】
コンホーメーションエピトープで構成された本発明のＨＣＶエンベロープタンパク質又はその特定の部分は、標準的には、これらの免疫検定中で使用するためキットの形で包装されることになる。キットは、通常は、別々のコンテナ内に、未変性ＨＣＶ抗原；対照抗体製剤形態（ポジティブ及び／又はネガティブ）、検定方式が必要とする場合には標識づけされた抗体及び標識が直接シグナルを生成しない場合にはシグナル生成用試薬（例えば酵素基板）を収納することになる。未変性ＨＣＶ抗原はすでに固体マトリクスに結合されていてもよいし、又はそれをマトリクスに結合するための試薬を伴って別々であってもよい。キットの中には、通常、検定を実施するための説明書（例えば書面、テープ、ＣＤ−ＲＯＭ）が包含される。
【０１１４】
選択された固相には、ガラスビーズ、ニトロセルロース、微粒子、反応トレイのマイクロウェル）試験管、及び磁気ビーズが含まれ得る。シグナル生成用化合物としては、酵素、発光性化合物、色原体、放射性元素及び化学発光性化合物が含まれ得る。酵素の例としては、アルカリ性ホスファターゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ及びベータ−ガラクトシダーゼが含まれる。ー化合物には、ビオチン、抗ビオチン及びアビジンが含まれる。ー化合物結合成員の例としては、ビオチン、抗ビオチン及びアビジンが含まれる。リウマチ因子様物質の効果を遮断するために、試験試料は、リウマチ因子様物質の効果を遮断するのに充分な条件に付される。これらの条件には、混合物を形成するべく一定量の抗−ヒトＩｇＧと試験試料を接触させること及び、実質的にリウマチ因子様物質を含まない反応混合物製品を形成するのに充分な時間、充分な条件下で混合物をインキュベートすることが含まれる。
【０１１５】
特に、本発明は、診断用キットの調製のための、本明細書に記載されているようなＨＣＶ  Ｅ１及び／又はＨＣＶ  Ｅ２タンパク質又はその任意の一部分の使用に関する。
【０１１６】
特に、本発明は、
−  本明細書に記載されているようなＨＣＶエンベロープタンパク質又はその任意の一部分を提供する工程；
−  ＨＣＶ抗体−ＨＣＶタンパク質複合体の形成を可能にする条件下で前記ＨＣＶ抗体と共に生体試料をインキュベートする工程；及び
−  前記ＨＣＶ抗体−ＨＣＶタンパク質複合体が形成されたか否かを決定する工程、を含んで成る、生体試料中のＨＣＶ抗体を検出するための免疫検定に関する。
【０１１７】
特に本発明は、本明細書に記載されているような、ＨＣＶエンベロープタンパク質又はその任意の一部分を含んで成る、生体試料中のＨＣＶ抗体を検出するためのキットに関する。
【０１１８】
本発明は、ここで特に有利な実施形態を記載する以下の例を参考にして例示される。ただし、これらの実施形態は単なる一例であって、いかなる形であれ本発明を制限するためのものとみなされ得ないものである。
【０１１９】
実施例１
ＰＦＰＭＴ−ＭＦα−Ｅ１−Ｈ６シャトルベクターの構築
Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ形質転換のためのプラスミドを以下のように構築した。ｐＦＰＭＴ−ＭＦα−Ｅ１−Ｈ６シャトルベクターを多工程手順で構築した。最初に、ＨＣＶ  Ｅ１ｓタンパク質をコードする核酸配列ＣＳＮ２１をＣＨＨリーダー配列（ＣＨＨ＝Ｃａｒｃｉｎｕｓ  ｍａｅｎａｓ血糖上昇ホルモン）に従ってクローニングし、これをその後ＭＦαリーダー配列に変更した（ＭＦα＝Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｒｉｓｉａｅα−交接因子）。
【０１２０】
最初に、シームレスクローニング方法によりＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩフラグメントとしてＣＨＨ−Ｅ１−Ｈ６単位を包含したｐＵＣ１８誘導体を構築した（パジェット（Ｐａｄｇｅｔｔ），Ｋ．Ａ．および、ゾルゲ（Ｓｏｒｇｅ），Ｊ．Ａ．１９９６）。さらに、Ｅ１ｓ−Ｈ６−コーディングＤＮＡフラグメント及びｐＣＨＨ−Ｈｉｖ−由来の受容体プラスミドを以下に記載する通りＰＣＲにより得た。
【０１２１】
Ｅ１ｓ−Ｈ６−コーディングＤＮＡフラグメントの生成
プラスミドＰＧＥＭＴＥ１ｓＨ６（配列番号６、図１）からＰＣＲにより、［６−Ｈｉｓ−残基で伸長されたＥ１ｓのアミノ酸１９２〜３２６から成るＨＣＶ１ｂＥ１ｓ型タンパク質についてコードする（配列番号５）］Ｅ１−Ｈ６ＤＮＡフラグメントを単離した。さらに、以下のプライマーを使用した。
−ＣＨＨＥ１−Ｆ：
【化５】
2004532029.tif 000006
（配列番号７）；
Ｅａｍ１１０４Ｉ部位には下線が付され、ドットは開裂部位をマークしている。太字で印刷された塩基は、プライマーＣＨＨ−ｌｉｎｋｓの塩基に対し相補的である。マークの付いていない塩基は、センス方向でＥ１の開始領域（１９２〜３２６）中にアニールする。
−ＣＨＨＥ１−Ｒ：
【化６】
2004532029.tif 000007
（配列番号８）；
Ｅａｍ１１０４Ｉ部位には下線が付され、ドットは開裂部位をマークしている。太字で印刷された塩基は、プライマーＭＦ３０−ｒｅｃｈｔｓの塩基に対し相補的である。その後のクローニング手順に有用なＢａｍＨＩ部位を形成する塩基はイタリックで印刷されている。マークの付いていない塩基は、停止コドン及び停止コドンとＢａｍＨＩ部位との間の３つの塩基を含め、Ｅ１−Ｈ６単位の末端中にアンチセンス方向にアニールする。
【０１２２】
反応混合物は、以下の通りに構成されていた。２０ｎｇのＥｃｏ３１１−線形化ｐＧＥＭＴＥ１ｓＨ６、各々０．２μＭのプライマーＣＨＨＥ１−Ｆ及びＣＨＨＥ１−Ｒ、ｄＮＴＰ’Ｓ（各々０．２μＭで）、１×緩衝液２（Ｅｘｐａｎｄ  Ｌｏｎｇ  Ｔｅｍｐｌａｔｅ  ＰＣＲシステム；ベーリンガー：カタログ番号１６８１  ８３４）、２．５ｕのポリメラーゼ混合物（Ｅｘｐａｎｄ  Ｌｏｎｇ  Ｔｅｍｐｌａｔｅ  ＰＣＲシステム；ベーリンガー：カタログ番号１６８１  ８３４）を含有する合計体積５０μＬ。
【０１２３】
以下の工程から成るプログラム１を使用した
１．  変性：９５℃で５分
２．  ９５℃での変性３０秒、６５℃でのアニーリング３０秒、及び６８℃での伸長１３０秒を１０サイクル。
３．  ４℃での終結。
【０１２４】
その後５０μＬの１０×緩衝液２（Ｅｘｐａｎｄ  Ｌｏｎｇ  Ｔｅｍｐｌａｔｅ  ＰＣＲシステム；ベーリンガー；カタログ番号１６８１  ８３４）、４０μＬのＨ２Ｏ及び５μＬの［ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰ（各２ｍＭ）；１０ｍＭ５−メチルｄＣＴＰ］を、プログラム１に由来する試料に添加し、以下の工程から成るプログラムに従って増幅を実施した。
１．  変性；９５℃で５分
２．  ９５℃での変性４５秒、６５℃でのアニーリング３０秒、６８℃での伸長１３０秒を５サイクル。
３．  ４℃で終結。
【０１２５】
ｐＣＨＨ−Ｈｉｒ由来の受容体プラスミドの生成
ｐＣＨＨ−Ｈｉｒプラスミド（配列番号９；図２）からＰＣＲにより受容体プラスミドを製造し、これは、Ｈｉｒコーディング配列がＰＣＲ産物内には存在しないという点を除いて、ほぼ完全なｐＣＨＨ−Ｈｉｒプラスミドで構成されている。このＰＣＲのためには、以下のプライマーを使用した。
１．ＣＨＨ−Ｌｉｎｋｓ：
【化７】
2004532029.tif 000008
（配列番号１０）；
Ｅａｍ１１０４Ｉ部位には下線が付され、ドットは開裂部位をマークしている。太字で印刷された塩基は、プライマーＣＨＨＥ１−Ｆの塩基に対し相補的である。マークの付いていない塩基はアンチセンス方向でＣＨＨ配列の末端中にアニールする。
２．ＣＨＨ−Ｌｉｃｈｔｓ：
【化８】
2004532029.tif 000009
（配列番号１１）；
Ｅａｍ１１０４Ｉ部位には下線が付され、ドットは開裂部位をマークしている。太字で印刷された塩基は、プライマーＣＨＨＥ１−Ｒの塩基に対し相補的である。マークの付いていない塩基は、インサートから離れるような方向で、ｐＣＨＨ−ＨｉｒのクローニングされたＣＨＨ−Ｈｉｒｕｄｉｎ  ＨＬ２０の後ろのｐＵＣ１８配列中にアニールする。
【０１２６】
反応混合物は、以下の通りに構成されていた。２０ｎｇのＡｓｐ７１８Ｉ−線形化ｐＣＨＨ−Ｈｉｒ、各々０．２μＭのプライマーＣＨＨ−ｌｉｎｋｓ及びＭＦ３０−ｒｅｃｈｔｓ、ｄＮＴＰ（各々０．２μＭで）、１×緩衝液２（Ｅｘｐａｎｄ  Ｌｏｎｇ  Ｔｅｍｐｌａｔｅ  ＰＣＲシステム；ベーリンガーカタログ番号１６８１  ８３４）、２．５ｕのポリメラーゼ混合物（Ｅｘｐａｎｄ  Ｌｏｎｇ  Ｔｅｍｐｌａｔｅ  ＰＣＲシステム；ベーリンガー：カタログ番号−１６８１  ８３４）を含有する合計体積５０μＬ。
【０１２７】
上述の通りのプログラムを使用した。
【０１２８】
その後５μＬの１０×緩衝液２（Ｅｘｐａｎｄ  Ｌｏｎｇ  Ｔｅｍｐｌａｔｅ  ＰＣＲシステム；ベーリンガー；カタログ番号１６８１  ８３４）、４０μＬのＨ２Ｏ及び５μＬの［ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰ(各２ｍＭ)；１０ｍＭ５−メチルｄＣＴＰ］を、プログラム１に由来する試料に添加し、上述の通りにプログラムに従って増幅を実施した。
【０１２９】
ベクターｐＣＨＨＥ１の生成
上述の通りＰＣＲにより生成されたｐＣＨＨ−Ｈｉｒ由来の受容体プラスミドとＥ１ｓ−Ｈ６−コーディングＤＮＡフラグメントを、供給業者の仕様書に従って、ＰＣＲ産物精製キット（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ））を用いて精製した。その後、精製されたフラグメントをＥａｍ１１０４Ｉで別々に消化した。その後、Ｅ１ｓ−Ｈ６ＤＮＡフラグメントを供給業者の仕様書に従って、Ｔ４リガーセ（ベーリンガー）を用いてｐＣＨＨ−Ｈｉｒ由来の受容体プラスミド内に連結させた。
【０１３０】
連結混合物でＥ．Ｃｏｌｉ．ＸＬ−Ｇｏｌｄ細胞を形質転換し、ＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩでの消化により、複数のアンピシリン耐性コロニーのプラスミドＤＮＡを分析した。陽性クローンを選択し、これをｐＣＨＨＥ１と呼称した。
【０１３１】
ベクターｐＦＰＭＴ−ＣＨＨ−Ｅ１Ｈ６の生成
ｐＣＨＨＥ１ｋのＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩフラグメントをＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩで消化したベクターｐＦＰＭＴ１２１（配列番号１２：図３）と連結させた。供給業者の指示に従ってＴ４リガーゼ（ベーリンガー）を使用した。Ｅ．ＣｏｌｉＤＨ５αＦ細胞を形質転換するために連結混合物を使用した。プラスミドＤＮＡの制限パターン上でいくつかの形質転換体を分析し、陽性クローンを保留し、これをｐＦＰＭＴ−ＣＨＨ−Ｅ１Ｈ６と呼称した（配列番号１３：図４）。
【０１３２】
ｐＦＭＰＴ−ＭＦα−Ｅ１−Ｈ６の生成
最後に、以下のような３つのフラグメントの連結により、シャトルベクターｐＦＭＰＴ−ＭＦα−Ｅ１−Ｈ６を生成した。
１．  ６．９６１ｋｂのＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩで消化されたｐＦＰＭＴ１２１（配列番号１２：図３）
２．  ０．２４５（ｋｂ）のｐＵＣ１８−ＭＦａのＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩフラグメント（配列番号６２：図３６）及び
３．  ｐＦＰＭＴ−ＣＨＨ−Ｅ１Ｈ６に由来する０．４５４ｋｂのＰＣＲ産物の０．４４２ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ／ＢａｍＨＩフラグメント。
【０１３３】
以下のプライマーを用いて、ＰＣＲにより、フラグメントＮｏ．３を発生させる０．４５４ｋｂのＰＣＲ産物を得た。
１．プライマーＭＦａ−Ｅ１ｆ−Ｈｉ：
【化９】
2004532029.tif 000010
（配列番号１４）及び
２．プライマーＥ１ｂａｃｋ−Ｂａｍ
【化１０】
2004532029.tif 000011
（配列番号１５）
【０１３４】
反応混合物は、以下の通りに構成されていた。反応混合物体積５０μＬ、ｐＦＰＭＴ−ＣＨＨ−Ｅ１−Ｈ６（ＥｃｏＲＩ線形化；１５ｎｇ／μＬ）、０．５μＬ；プライマーＭＦａ−Ｅ１ｆ−Ｈｉ（５０μＭ）、０．２５μＬ；プライマーＥ１ｂａｃｋ−Ｂａｍ（５０μＭ）；０．２５μＬ；ｄＮＴＰ（全て２ｍＭで）、５μＬ；ＤＭＳＯ、５μＬ；Ｈ２Ｏ、３３．５μＬ；Ｅｘｐａｎｄ  Ｌｏｎｇ  Ｔｅｍｐｌａｔｅ  ＰＣＲシステム（ベーリンガーマンハイム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）；カタログ番号１６８１  ８３４）緩衝液２（１０倍に濃縮）、５μＬ；Ｅｘｐａｎｄ  Ｌｏｎｇ  Ｔｅｍｐｌａｔｅ  ＰＣＲシステムポリメラーセー混合物（１Ｕ／μＬ）、０．５μＬ。
【０１３５】
以下の工程から成るＰＣＲプログラムを使用した。
１．  変性：９５℃で５分
２．  ９５℃での変性４５秒、５５℃でのアニーリング４５秒、及び６８℃での伸長４０秒を２９サイクル。
３．  ４℃での終結。
【０１３６】
使用されたプライマーに基づいて、結果としてもたらされた０．４５４ｋｂのＰＣＲ産物は、Ｅ１（１９２−３２６）のコドンとそれに続く６個のヒスチジンコドン及び「ｔａａ」停止コドンを含み、これは上流で、（クローニング関連ＨｉｎｄＩＩＩ部位プラス６塩基対オーバーハングを含む）ＭＦαプレプロＳＡの２２の３’末端塩基対によりフランキングされ、下流で（クローニング関連）ＢａｍＨＩ部位及び６塩基対オーバーハングによりフランキングされていた。
【０１３７】
連結反応のためには、供給業者の条件（試料体積２０μＬ）に従って、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（ベーリンガーマンハイム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ））を使用した。
【０１３８】
Ｅ．ｃｏｌｉＨＢ１０１細胞を連結混合物で形質転換させ、複数の形質転換体から単離されたプラスミドの制限分析の後陽性クローンを保留した。陽性プラスミドを選択し、これをｐＦＰＭＴ−ＭＦα−Ｅ１−Ｈ６（配列番号１６、図５）と呼称した。
【０１３９】
実施例２
ｐＦＰＭＴ−ＣＬ−Ｅ１−Ｈ６シャトルベクターの構築
Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａの形質転換のためのプロスミドを以下のように構築した。ｐＦＰＭＴ−ＣＬ−Ｅ１−Ｈ６シャトルベクターを、ｐＦＰＭＴ−ＭＦα−Ｅ１−Ｈ６（配列番号１６、図５）から出発して３工程で構築した。
【０１４０】
第１工程では、ｐＵＣ１８ベクター内にｐＦＰＭＴ−ＭＦαのＭＦα−Ｅ１−Ｈ６読み取り枠をサブクローニングした。従って、（ＦＭＤプロモータープラスＭＦα−Ｅ１＝Ｈ６を含む）ｐＦＰＭＴ−ＭＦα−Ｅ１−Ｈ６の１．７９８ｋｂのＳａｌI／ＢａｍＨＩ  フラグメントを、供給業者の条件に従ってＴ４リガーゼ（ベーリンガー）を用いてｐＵＣ１８のＳａｌI／ＢａｍＨＩベクターフラグメントに連結させた。この結果、図６に描かれているプラスミド（配列番号１７）が得られ、さらにこれをｐＭａ１２−１（ｐＵＣ１８−ＦＭＤ−ＭＦα−Ｅ１−Ｈ６）と呼称した。Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５αＦ’細胞を形質転換するために連結混合物を使用した。複数のアンピシリン耐性コロニーを採収し、採収したクローンから単離したプラスミドＤＮＡの制限酵素消化により分析した。ＭＦα−Ｅ１−Ｈ６コーディング配列のＤＮＡ配列を決定することにより、陽性クローンをさらに分析した。ＭＦαプレプロ配列を鳥類リゾチームプレ配列のコドンで置換するべくＰＣＲ誘導型突然変異誘発のために適正なクローンを使用した（「ＣＬ」：鳥類リゾチームのアミノ酸１〜１８に対応する；配列番号１）。適用されたＰＣＲ誘導型突然変異誘発方法の原理は、プライマーの５’末端にある所望の改変を伴う全プラスミドの増幅に基づいている。下流側の工程では、線形ＰＣＲ産物の終りは、自己連結に先立ち修飾され、所望の改変済みプラスミドをもたらす。
【０１４１】
ＰＣＲ反応のためには、以下のプライマーが用いられた。
１．プライマー  ＣＬ  ｈｉｎ；
【化１１】
2004532029.tif 000012
（配列番号１８）
２．プライマー  ＣＬ  ｈｅｒ  ｎｅｕ；
【化１２】
2004532029.tif 000013
（配列番号１９）
【０１４２】
プライマーの下線のある５’領域は、鳥類リゾチームプレ配列の約半分のコドンを含有する。プライマーＣＬｈｅｒｎｅｕは、ＳｐｅＩ制限部位（イタリック体）を包含する。プライマーの下線の付されていない領域は、Ｅ１（ＣＬ  ｈｉｎ）のアミノ酸残基１９２〜１９９についてコドン、又はＥｃｏＲＩ部位を越えてＦＭＤプロモーターの位置−１９（ＥｃｏＲＩ部位から因子）までの「ａｔｇ」開始コドンとアニールする。該プライマーは完全なｐＭａ１２−１を増幅し、かくしてＭＦａプレプロ配列のコドンを鳥類リゾチームプレ配列のコドンを置換する。
【０１４３】
反応混合物は、以下のように構成されていた；ｐＵＣ１８−ＦＭＤ−ＭＦα−Ｅ１−Ｈ６（ｐＭａ１２−1；１．３ｎｇ／μＬ）、１μＬ；プライマー  ＣＬ  ｈｉｎ（１００μＭ）、２μＬ；プライマー  ＣＬ  ｈｅｒ  ｎｅｕ（１００μＭ）、２μＬ；ｄＮＴＰ（全て２．５ｍＭ）、８μＬ；Ｈ２Ｏ、７６μＬ；Ｅｘｐａｎｄ  Ｌｏｎｇ  Ｔｅｍｐｌａｔｅ  ＰＣＲシステム（ベーリンガー；カタログ番号１６８１  ８３４）緩衝液２（１０倍に濃縮）、１０μＬ；Ｅｘｐａｎｄ  Ｌｏｎｇ  Ｔｅｍｐｌａｔｅ  ＰＣＲシステムポリメラーセー混合物（１Ｕ／μＬ）、０．５μＬ。
【０１４４】
以下の工程から成るＰＣＲプログラムを使用した；
１．  変性：９５℃で１５分
２．  ９５℃での変性３０秒、６０℃でのアニーリング１分、及び７２℃での伸長１分を３５サイクル。
３．  ４℃での終結。
【０１４５】
結果として得られたＰＣＲ産物を、その適正なサイズ（３．５ｋｂ）についてアガロースゲル電気泳動により検査した。その後ＰＣＲ産物の３’−Ａオーバーハング形態をＴ４ポリメラーセー反応によって除去し、結果として、３’−及び５’−ＯＨ基を伴う平滑末端がもたらされた。従ってＰＣＲ産物をＴ４ポリメラーゼ（ベーリンガー；１Ｕ／μＬ）で処理した。すなわち、残った９５μＬのＰＣＲ反応混合物に対して１μＬのＴ４ポリメラーゼ及び４μＬ ｄＮＴＰ（全て２．５ｍＭで）を添加した。３７℃で２０分間試料をインキュベートした。その後、ＤＮＡをエタノールで沈降させ１６μＬのＨ２Ｏ中で取り上げた。
【０１４６】
その後、５’−リン酸塩をキナーゼ反応により平滑末端ＰＣＲ産物に添加した。従って、１６μＬの平滑末端ＰＣＲ産物に対して、１μＬのＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（ベーリンガー；１Ｕ／μＬ）、２μＬの１０倍濃縮Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ反応緩衝液（ベーリンガー）及び１μＬのＡＴＰ（１０ｍＭ）を添加した。試料を３７℃で３０分間インキュベートした。
【０１４７】
その後、ＤＮＡを１％のアガロースゲル上に適用し、供給業者の条件に従ってゲル抽出キット（キアゲン）を用いて適正な産物バンドを単離した。その後５０ｎｇの精製済み産物を供給業者の条件に従ってＴ４リガーゼ（ベーリンガー）を用いて自己連結させた。１６℃で７２時間インキュベートした後、連結混合物中のＤＮＡをエタノールで沈降させ、２０μＬの水中で溶解させた。
【０１４８】
その後、Ｅ．ｃｏｌｉＤＨ５α−Ｆ’細胞を１０μＬの連結試料で形質転換した。複数のアンピンリン耐性クローンのプラスミドＤＮＡを制限酵素消化を用いて検査した。陽性クローンを保留し、これをｐ２７ｄ−３と呼称した（ｐＵＣ１８−ＦＭＤ−ＣＬ−Ｅ１−Ｈ６、配列番号２０、図７）。その後、ＣＬ−Ｅ１−Ｈ６読取り枠をＤＮＡ配列決定によって確認した。
【０１４９】
最終工程では、以下に記載する通りにｐＦＰＭＴＭ−ＣＬ−Ｅ１−Ｈ６シャトルベクターを構築した。ｐ２７ｄ−３の０．４８６ｋｂＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩフラグメント（ＣＬ−Ｅ１（１９２−３２６）−Ｈ６を包含するものを）をＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩで消化されたｐＦＰＭＴ１２１（配列番号１２、図３）と連結させた。反応のためには供給業者の推奨事項に従って、Ｔ４リガーゼ（ベーリンガー）を使用した。連結試料中のＤＮＡをエタノールで沈降させ、１０μｌのＨ２Ｏ中に溶解させた。１０μＬの連結試料を用いて、Ｅ．ｃｏｌｉＤＨ５αＦ’細胞を形質転換させ、複数のアンピシリン耐性コロニーのプラスミドＤＮＡをＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩでの消化により分析した。プラスミドクローンｐ３７−５（ｐＦＰＭＴ−ＣＬ−Ｅ１−Ｈ６：配列番号２１、図８）は、０．４８６ｋｂ及び６．９６１ｋｂの所望のフラグメントサイズを示した。配列決定により、ｐ３７−５のＣＬ−Ｅ１−Ｈ６の適正な配列を確認した。
【０１５０】
実施例３
ｐＦＰＭＴ−ＭＦα−Ｅ２−Ｈ６及びｐＭＰＴ−ＭＦα−Ｅ２−Ｈ６シャトルベクターの構築
Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐoｌｙｍｏｒｐｈａの形質転換用プラスミドを以下の通りに構築した。ＭＦα−Ｅ２ｓ（ＨＣＶ  Ｅ２アミノ酸３８４−６７３）−ＶＩＥＧＲ−Ｈｉｓ６（配列番号５）をコードするＤＮＡ配列を、プラスミドｐＳＰ７２Ｅ２Ｈ６（配列番号２２、図９）から１．３３１ｋｂのＥｃｏＲＩ／ＢｇｌＩＩフラグメントとして単離した。このフラグメントを、供給業者の推奨事項に従って、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（ベーリンガーマンハイム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ））を用いてＥｃｏＲＩ／ＢｇｌＩＩで消化されたｐＦＰＭＴ１２１（配列番号１２、図Ｃ＋２）又はｐＭＰＴ１２１（配列番号２３、図１０）のいずれかと連結させた。Ｅ．ｃｏｌｉを形質転換させ制限酵素消化により異なる形質転換体から単離されたプラスミドＤＮＡを検査した後、陽性クローンを保留し、結果として得られたシャトルベクターをそれぞれｐＦＰＭＴ−ＭＦα−Ｅ２−Ｈ６（配列番号２２、図１１）及びｐＭＰＴ−ＭＦα−Ｅ２−Ｈ６（配列番号２３、図１２）と呼称した。
【０１５１】
実施例４
ｐＦＰＭＴ−ＣＬ−Ｅ２−Ｈ６シャトルベクターの構築
３工程手順で、シャトルベクターｐＦＰＭＴ−ＣＬ−Ｅ２−Ｈ６を組み立てた。Ｅ２コーディング配列がＳｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ  ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓのα−アミラーゼのシグナル配列の後ろでクローニングさせた。これは、シームレスクローニング方法（パジェット（Ｐａｄｇｅｔｔ），Ｋ．Ａ．および、ゾルゲ（Ｓｏｒｇｅ）Ｊ．Ａ，１９９６）により行われた。
【０１５２】
Ｅ２ｓ−Ｈ６コーディングＤＮＡフラグメントの生成
最初に、Ｅ２−Ｈ６をコードするＤＮＡ配列（リンカーペプチド「ＶＩＥＧＲ」及び６Ｈｉｓ残基、配列番号５で伸長されたＨＣＶ  Ｅ２のアミノ酸３８４−６７３）をｐＳＰ７２Ｅ２Ｈ６プラスミド（配列番号２４、図１１）から、ＰＣＲにより増幅させた。使用したプライマーは、ＭＦ３０Ｅ２／Ｆ及びＭＦ３０Ｅ／Ｒと記され、以下の配列を有している。
−プライマーＭＦＥ２／Ｆ；
【化１３】
2004532029.tif 000014
（配列番号２６）；ＥａｍＩ１０４Ｉ部位には下線が付され、ドットは酵素の開裂部位をマークしている。Ｓ．ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓシグナル配列の前後のコドンは太字で印刷されている；マークの付いていない塩基はＥ２のコドン（ＨＣＶ  Ｅ２のアミノ酸３８４〜３９０）とアニールする。
−プライマーＭＦ３０Ｅ２／Ｒ
【化１４】
2004532029.tif 000015
（配列番号２７）；ＥａｍＩ１０４Ｉ部位には下線が付され、ドットは酵素の開裂部位をマークしている。太字で印刷された塩基は、プライマーＭＦ３０−Ｒｅｃｈｔｓの塩基に対し相補的である。（以下参照）、構築物に導入されるべきＢａｍＨＩ部位は、イタリック体で印刷されている。マークされていない配列は停止コドン及びＥ２（３８４−６７３）−ＶＩＥＲ−Ｈ６（配列番号５）の６つの末端Ｈｉｓコドンとアニールする。
【０１５３】
反応混合物は、以下の通りに構成されていた；２０ｎｇのｐＳＰ７２Ｅ２Ｈ６の１．３３ｋｂＥｃｏＲＩ／ＢｇｌＩＩフラグメント各々０．２μＭのプライマーＭＦ３０Ｅ２／Ｆ及びＭＦ３０Ｅ２／Ｒ、ｄＮＴＰ（各々０．２μＭで）、１×緩衝液２（Ｅｘｐａｎｄ  Ｌｏｎｇ  Ｔｅｍｐｌａｔｅ  ＰＣＲシステム；ベーリンガー、カタログ番号１６８１  ８３４）、２，５Ｕのポリメラーゼ混合物（Ｅｘｐａｎｄ  Ｌｏｎｇ  Ｔｅｍｐｌａｔｅ  ＰＣＲシステム；ベーリンガー、カタログ番号１６８１  ８３４）を含有する合計体積５０μＬ。
【０１５４】
以下の工程から成るプログラム３を使用した
１．  変性；    ９５℃で５分
２．  ９５℃での変性３０秒、６５℃でのアニーリング３０秒、及び６８℃での伸長１分を１０サイクル。
３．  ４℃での終結。
【０１５５】
その後、１０μＬの１０×緩衝液２（Ｅｘｐａｎｄ  Ｌｏｎｇ  Ｔｅｍｐｌａｔｅ  ＰＣＲシステム；ベーリンガー、カタログ番号１６８１  ８３４）、４０μＬのＨ２Ｏ及び５μＬの［ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰ（各２ｍＭ）；１０ｍＭ、５−メチル−ｄＣＴＰ］をＰＣＲプログラム３に由来する試料に添加し、以下の工程から成るプログラム４で続行した。
１．  変性；９５℃で５分
２．  ９５℃での変性４５秒、６５℃でのアニーリング３０秒、６８℃での伸長１分で５サイクル。
３．  ４℃で終結。
【０１５６】
ＰＭＦ３０由来の受容体プラスミドの生成
第２のフラグメントはプラスミドｐＭＦ３０（配列番号２８、図１３）に由来し、アンプリコンは、Ｓ．ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓの成熟α−アミラーゼのコドンを除いて、完全なｐＭＦ３０プラスミドであり、クローニングに関連する修飾をプライマー設計により導入した。以下のプライマーセットを使用した。
−プライマーＭＦ３０−Ｌｉｎｋｓ；
【化１５】
2004532029.tif 000016
（配列番号２９；ＥａｍＩ１０４Ｉ部位には下線が付され、ドットは酵素の開裂部位をマークしている。太字で印刷された「ｃｃｔ」は、プライマーＭＦ３０Ｅ２／Ｆの太字で印刷された「ａｇｇ」に対し相補的である。（以上参照）；マークの付いていない及び太字印刷された塩基は、ｐＭＦ３０内のＳ．ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓのα−アミラーゼのコドンの２６の末端塩基とアニールする）−プライマーＭＦ３Ｕ−Ｒｅｃｈｔｓ；
【化１６】
2004532029.tif 000017
（配列番号２９；ＥａｍＩ１０４Ｉ部位には下線が付され、ドットは酵素の開裂部位をマークしている。太字で印刷された「ｃｔｇ」は、プライマーＭＦ３０Ｅ２／Ｒの太字印刷された「ｃａｇ」に対し相補的である。（以上参照）マークの付いていない塩基はｐＭＦ３０中のＳ．ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓのα−アミラーゼの停止コドンの下流側のｐＵＣ１８配列とアニールする。）
【０１５７】
反応混合物は、以下の通りに構成されていた；２０ｎｇの−ＢｇｌＩＩ−線形化ｐＭＦ３０、各々０．２μＭのプライマーＭＦ３０−Ｌｉｎｋｓ及びＭＦ３０−Ｒｅｃｈｔｓ、ｄＮＴＰ（各々０．２μＭで）、１×緩衝液１（Ｅｘｐａｎｄ  Ｌｏｎｇ  Ｔｅｍｐｌａｔｅ  ＰＣＲシステム；ベーリンガー：カタログ番号１６８１  ８３４）、２．５Ｕのポリメラーゼ混合物（Ｅｘｐａｎｄ  Ｌｏｎｇ  Ｔｅｍｐｌａｔｅ  ＰＣＲシステム；Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ：カタログ番号１６８１  ８３４）を含有する合計体積５０μＬ。両方のプログラムで１分から４分に延長された伸長時間を除き、上述のものと同じＰＣＲプログラム（プログラム３及び４）を使用した。
【０１５８】
ベクターｐＡＭＹ−Ｅ２の生成
ＰＣＲにより得たｐＭＦ３０由来の受容体プラスミド及びＥ２ｓ−Ｈ６コーディングＤＮＡフラグメントを１％のアガロースゲル上のゲル電気泳動によりそのそれぞれのサイズに基づき検査した。供給業者の指示に従って、ＰＣＲ産物精製キット（キアゲン）でＰＣＲ産物を精製した。その後、精製したフラグメントをＥａｍ１１００４Ｉで別々に消化した。供給業者の推奨事項に従ってＴ４リガーゼ（ベーリンガー（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ））を用いることで、ｐＭＦ３０由来の受容体プラスミドとのＥ２ｓ−Ｈ６フラグメントの連結を実施した。連結混合物を用いて、Ｅ．ｃｏｌｉＤＨ５αＦ’細胞を形質転換し、複数のクローンのプラスミドＤＮＡをＥｃｏＲＩ／Ｂａｍ  ＨＩ消化により分析した。陽性クローンを選択し、そのプラスミドをさらにｐＡＭＹ−Ｅ２と呼称し、以下に記載するようなさらなる修飾のために利用した。
【０１５９】
ベクターｐＵＣ１８−ＣＬ−Ｅ２−Ｈ６の生成
α−アミラーゼシグナル配列のコドンを鳥類リゾチームプレ配列のコドンと置換する目的で、ｐＡＭＹ−Ｅ２をＰＣＲ誘導突然変異誘発に付した。これは、さらに「ＣＬ」と呼称され、鳥類リゾチームＯＲＦの最初の１８個のアミノ酸（配列番号１）に対応している。この突然変異誘発のためには、以下のプライマーが用いられた：
−プライマー  ＣＬ  ｈｉｎ：
【化１７】
2004532029.tif 000018
（配列番号３０）及び
−プライマー  ＣＬ２  ｈｅｒ：
【化１８】
2004532029.tif 000019
（配列番号３１）
【０１６０】
プライマーの下線のある５’領域は、鳥類リゾチームプレ配列の約半分のＤＮＡ配列を含有する。プライマーＣＬ２  ｈｅｒは、ＳｐｅＩ（イタリック体）及びＥｃｏＲＩ（イタリック体、２重下線付き）制限部位を包含する。プライマーの下線の付されていない領域は、Ｅ２（ＣＬ２  ｈｉｎ）のアミノ酸残基３８４−３９２のコドン、又はＥｃｏＲＩ部位を越えてＦＭＤプロモーターの位置−１９（ＥｃｏＲＩ部位から因子）までの「ａｔｇ」開始コドンとアニールする。該プライマーは、完全なｐＡＭＹ−Ｅ２ベクターを増幅し、かくしてα−アミラーゼシグナル配列のコドンを鳥類リゾチームプレ配列のコドンと置換する。
【０１６１】
ＰＣＲ反応は、以下のプログラムに従って実施した：
１．  変性；９５℃で１５分、
２．  ９５℃での変性３０秒、６０℃でのアニーリング１分、及び７２℃での伸長１分を３５サイクル。
３．  ４℃での終結。
【０１６２】
以下の反応混合物を使用した：ｐＡＭＹ−Ｅ２（１ｎｇ／μＬ）、１μＬ；プライマーＣＬ  ｈｉｎ（１００μＭ）、２μＬ；プライマー  ＣＬ２  ｈｅｒ（１００μＭ）、２μＬ；ｄＮＴＰ（全て２．５ｍＭ）、８μＬ；Ｈ２Ｏ、７６μＬ；  Ｅｘｐａｎｄ  Ｌｏｎｇ  Ｔｅｍｐｌａｔｅ  ＰＣＲシステム（ベーリンガー（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ））；Ｃａｔ  Ｎｏ  １６８１  ８３４）緩衝液２（１０倍に濃縮）、１０μＬ：Ｅｘｐａｎｄ  Ｌｏｎｇ  Ｔｅｍｐｌａｔｅ  ＰＣＲシステムポリメラーゼ混合物（１Ｕ／μＬ）、０．７５μＬ。
【０１６３】
結果として得られたＰＣＲ産物を、１％のアガロースゲル上でゲル電気泳動により検査した。連結に先立ちＰＣＲフラグメントを以下のように修飾した。３’−ＡオーバーハングをＴ４ポリメラーゼによって除去し、結果として、３’−及び５’−ＯＨ基を伴う平滑末端がもたらされた。さらに残った９５μＬのＰＣＲ反応混合物に対して１μＬのＴ４ポリメラーゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ；１Ｕ／μＬ）を４μＬｄＮＴＰと共に（全て２．５ｍＭで）を添加した。３７℃で２０分間試料をインキュベートした。その後、ＤＮＡをエタノールで沈降させ１６μＬの脱イオン水中に溶解させた。これに続いて平滑末端ＰＣＲ産物に５’−リン酸塩を添加するためキナーゼ処理を行なった１６μＬの溶解した平滑末端ＰＣＲ産物に対して、１μＬのＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（ベーリンガー）；１Ｕ／μＬ）、２μＬの１０倍濃縮Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ反応緩衝液（ベーリンガー）及び１μＬのＡＴＰ（１０ｍＭ）を添加した。試料を３７℃で３０分間インキュベートした。
【０１６４】
その後、キナーゼ処理した試料を、１％のアガロースゲル上で分離した。供給業者の推奨事項に従って、ゲル抽出キット（キアゲン）を用いてアガローススライスからＤＮＡを抽出した。その後５０ｎｇの精製済み産物を、供給業者の条件に従ってＴ４リガーゼ（ベーリンガー）を用いて自己連結させた。１６℃で１６時間インキュベートした後、連結混合物中のＤＮＡをエタノールで沈降させ、２０μＬの水中で溶解させた（連結試料）。
【０１６５】
Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５α−Ｆ’細胞を１０μＬの連結試料で形質転換した。複数のアンピシリン耐性クローンを単離されたプラスミドＤＮＡの制限分析を用いて特徴づけした。陽性クローンをＰＵＣ１８−ＣＬ−Ｅ２−Ｈ６と呼称し、これを以下で記載する通りのさらなる修飾のために使用した。
【０１６６】
シャトルベクターｐＦＰＭＴ−ＣＬ−Ｅ２−Ｈ６の生成
（ＣＬ−Ｅ２（３８４−６７３）−ＶＩＥＧＲ−Ｈ６を包含する）ｐＵＣ１８−ＣＬ−Ｅ２−Ｈ６から０．９６６ｋｂのＥｃｏＲＩ／Ｂａｍ  ＨＩフラグメントを単離し、ＥｃｏＲＩ／Ｂａｍ  ＨＩで消化されたｐＦＰＭＴ１２１（配列番号１２、図３）の中に連結させた。反応のためには、供給業者の条件に従って、Ｔ４リガーゼ（ベーリンガー）を使用した。連結試料をエタノールで沈降させ、１０μＬの水中で溶解させた。これを用いて、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５αＦ’細胞を形質転換し、制限分析の後に陽性クローンを保留し、それぞれのプラスミドをｐＦＰＭＴ−ＣＬ−Ｅ２−Ｈ６（配列番号３２、図４）と呼称した。
【０１６７】
実施例５
ｐＦＰＭＴ−ＣＬ−Ｋ−Ｈ６−Ｅ１シャトルベクターの構築
シャトルベクターの構築は、２工程から成る。
【０１６８】
第１工程では、ｐＵＣ１８−ＦＭＤ−ＣＬ−Ｈ６−Ｋ−Ｅ１−Ｈ６構築物を、部位特異的突然変異誘発によって構築した。ｐＵＣ１８−ＦＭＤ−ＣＬ−Ｅ１−Ｈ６を鋳型として使用した（配列番号２０；図７）。以下のプライマーを使用した。
−プライマー  Ｈ６Ｋ  ｈｉｎ  ｎｅｕ：
【化１９】
2004532029.tif 000020
（配列番号３７）
−プライマー  Ｈ６ＫＲＫ  ｈｅｒ  ｎｅｕ：
【化２０】
2004532029.tif 000021
（配列番号３８）
（付加的なコドンを提供する塩基には下線が付されている）。
【０１６９】
ＰＣＲ反応混合物は、以下の通りに構成されていた：ｐＵＣ１８−ＦＭＤ−ＣＬ−Ｅ１−Ｈ６（２ｎｇ／μＬ）、１μＬ；プライマー  Ｈ６Ｋ  ｈｉｎ  ｎｅｕ（１００μＭ）  ２μＬ：プライマー  Ｈ６ＫＲＫ  ｈｅｒ  ｎｅｕ（１００μＭ）、２μＬ；ｄＮＴＰ（各々２．５ｍＭ）、８μＬ；Ｈ２Ｏ、７６μＬ；Ｅｘｐａｎｄ  Ｌｏｎｇ  Ｔｅｍｐｌａｔｅ  ＰＣＲシステム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ；Ｃａｔ  Ｎｏ  １６８１  ８３４）緩衝液２（１０倍に濃縮）、１０μＬ：Ｅｘｐａｎｄ  Ｌｏｎｇ  Ｔｅｍｐｌａｔｅ  ＰＣＲシステムポリメラーゼ混合物（１Ｕ／μＬ）、０．７５μＬ
【０１７０】
使用されたＰＣＲプログラムは、以下の工程で構成されていた：
−  変性；９５℃で１５分
−  ９５℃での変性３０秒、６０℃でのアニーリング１分、７２℃での伸長５分を３５サイクル。
−  ４℃で終結。
【０１７１】
ＰＣＲ試料のアリコートを１％のアガロースゲル上で分析してそのサイズを検査し、それは適正なものであった（〜４．２ｋｂ）。
【０１７２】
その後、ＰＣＲ産物からの３’−Ａオーバーハングを、Ｔ４ポリメラーゼ反応によって除去し、３’−及び５’−ＯＨ基を伴う平滑末端を結果としてもたらした。従って、ＰＣＲ反応の残りの９５μＬに対して、１μＬのＴ４ポリメラーゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ；１Ｕ／μＬ）及び４μＬのｄＮＴＰ（各２．５ｍＭ）を添加した。試料を３７℃で２０分間インキュベートした。その後、試料中のＤＮＡをエタノールで沈降させ、１６μＬのＨ２Ｏ中で溶解させた。
【０１７３】
その後、キナーゼ反応により、平滑末端ＰＣＲ産物に５’−リン酸塩を添加した。従って、１６μＬの溶解した平滑末端ＰＣＲ産物に対して、１μＬのＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（ベーリンガー）；１Ｕ／μＬ）、２μＬの１０倍濃縮Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ反応緩衝液（ベーリンガー）及び１μＬのＡＴＰ（１０ｍＭ）を添加した。試料を３７℃で３０分間インキュベートした。
【０１７４】
その後、試料を、１％のアガロースゲル上に適用し、供給業者の条件に従ってゲル抽出キット（キアゲン）を用いて適正な産物バンドを単離した。その後５０ｎｇの精製済み産物を、供給業者の推奨事項に従ってＴ４リガーゼ（ベーリンガー）を用いて自己連結させた。１６℃で７２時間インキュベートした後、連結混合物中のＤＮＡをエタノールで沈降させ、１０μＬの水中に溶解させた。
【０１７５】
Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５α−Ｆ’細胞を５μＬの連結試料で形質転換した。複数のアンピシリン耐性コロニーを制限酵素消化により分析し、陽性クローンを保留し、対応するプラスミドを次のように呼称した；ｐＵＣ１８−ＦＭＤ−ＣＬ−Ｈ６−Ｅ１−Ｋ−Ｈ６（配列番号３９、図１７）。
【０１７６】
第２工程では、２フラグメント連結によりトランスファベクターを構築した。以下では、ＢｃｌＩ付着末端を伴う構築フラグメントが関与した。ＢａｌＩは、メチル化されていないＤＮＡ上でのみその部位を開裂できることから、Ｅ．ｃｏｌｉ  ｄａｍ−菌株を、関与するプラスミドｐＵＣ１８−ＦＭＤ−ＣＬ−Ｈ６−Ｋ−Ｅ１−Ｈ６（配列番号３９、図１７）及びｐＦＰＭＴ−ＣＬ−Ｅ１（配列番号３６、図１６）で形質転換させた。各々の形質転換から、アンピシリン耐性コロニーを採取し、液体培養中で増殖させ、メチル化されていないプラスミドＤＮＡをさらなる使用のために調製した。（ＦＭＤプロモーター、ＣＬ−Ｈ６−Ｋ単位のコドン及びＥ１の開始部分を包含する）未メチル化プラスミドｐＵＣ１８−ＦＭＤ−ＣＬ−Ｈ６−Ｋ−Ｅ１−Ｈ６の１．２７３ｋｂのＢｃｌＩ／Ｈｉｎｄ  ＩＩＩフラグメント、及び（ＦＭＤプロモーターを除きｐＦＰＭＴ１２１にあるエレメントならびにＣ末端Ｈｉｓタグを伴わないＢｃｌＩ部位から始まったＥ１読取り枠の欠如部分を包含する）プラスミドｐＦＰＭＴ−ＣＬ−Ｅ１の６．０５７ｋｂのＢｃｌＩ／ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントを調製し、供給業者の仕様に従って合計体積２０μＬでＴ４リガーゼ（ベーリンガー）を用いて１６℃で７２時間連結させた。その後、連結混合物を脱塩する目的でこの混合物を無菌脱イオン水上で浮遊する１片のニトロセルロース膜の上に置いた（室温で３０分間のインキュベーション）。５μＬの脱塩試料での電気泳動によりＥ．ｃｏｌｉ  ＴＯＰ１０細胞を形質転換した。制限酵素消化により、結果として得られた複数のアンピシリン耐性コロニーのプラスミドＤＮＡを分析した。陽性クローンを保留し、これをｐＦＰＭＴ−ＣＬ−Ｈ６−Ｋ−Ｅ１（配列番号４０、図１８）と呼称した。
【０１７７】
実施例６
Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａの形質転換及び形質転換体の選択
Ｈ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ菌株ＲＢ１１を、実施例１〜５に記載されている通りの異なる親シャトルベクターでの修飾（Ｒｏｇｇｅｎｋａｍｐ，Ｒ．）ら、１９８６）を用いて、形質転換させた（基本的にＫｌｅｂｅ，  Ｒ．Ｊ．）ら、１９８３）に記載の通りのＰＥＧ媒介ＤＮＡ摂取プロトコル）。各々の形質転換について、７２ウラシル原栄養コロニーを選択し、以下の手順により菌株生成のために使用した。各コロニーについて、２ｍＬの液体培養を、４８時間試験管の中で（３７℃；１６０ｒｐｍ；角度４５℃）、選択培地（ＹＮＢ／グルコース、Ｄｉｆｃｏ）内に接種し増殖させた。この工程は、第１継代工程として定義づけされる。第１の継代工程の培養の１５０μＬのアリコートを用いて、２ｍＬの新鮮なＹＮＢ／グルコース培地に接種した。ここでも又、上述のように培養をインキュベートした（第２の継代工程）。一緒にかかる継代工程を８回実施した。２ｍＬの非選択的ＹＰＤ培地（Ｄｉｆｃｏ）を接種するために、第３及び第８の継代工程の実施後の培養アリコートを使用した。３７℃で４８時間のインキュベーション（１６０ｒｐｍ；角度４５℃；いわゆる第１の安定化工程）の後、これらのＹＰＤ培養の１５０μＬのアリコートを用いて、上述のとおりにインキュベートした新鮮な２ｍＬのＹＰＤ培養を接種した（第２の安定化工程）。その後第２の安定化工程の培養のアリコートを、選択的ＹＮＢ／寒天を含有する平板上で、画線培養した。これらの平板を、肉眼的コロニーが目に見えるようになるまで４時間インキュベートした。各分離の明確な単一のコロニーを菌株として定義し、さらなる発現分析のために使用した。
【０１７８】
発現分析を小規模振とうフラスコ培養上で実施した。上述のＹＮＢ／寒天平板からコロニーを採取し、２ｍＬのＹＰＤ内に接種し、上述のように４８時間インキュベートした。この２ｍＬのアリコートを、２ｍＬの振とうフラスコ培養のための種培養として用いた。培地として、ＹＰグリセロール（１％）を用い、振とうフラスコを回転振とう機（２００ｒｐｍ、３７℃）上でインキュベートした。４８時間の増殖後、発現カセットの誘発のため１％のＭｅＯＨを培養に加えた。異なる時間的間隔で、１ｍＬアリコートの細胞ペレットを収集し、さらなる分析まで−２０℃で保管した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ／ウエスタンブロッティングにより、特異的タンパク質発現を分析した。従って、細胞ペレットを試料緩衝液（トリスＨＣｌ−ＳＤＳ）中で可溶化させ、９５℃で１５分超の間インキュベートした。
【０１７９】
１５％のポリアクリル−アミドゲル上でタンパク質を分離し、ニトロセルロース膜上にブロッティングした（湿式ブロット；重炭酸塩緩衝液）。特異的マウス抗Ｅ１（ＩＧＨ２０１）又はマウス抗Ｅ２（ＷＯ９６／０４３８５の中でメルテンスら、によって記載されたＩＧＨ２１６）を第１の抗体として用いて、ブロットを発達させ、ウサギ抗マウス−ＡＰを第２の抗体として使用した。ＮＢＴ−ＢＣＩＰで染色を実施した。
【０１８０】
さらなる調査のため、陽性菌株を保留した。
【０１８１】
振とうフラスコ発現実験の中で、これらの陽性クローンのうちの５個を使用した。それぞれの菌株のコロニーをＹＮＢ平板から採取し、２ｍＬのＹＰＤを接種するのに使用した。これらの培養を上述の通りにインキュベートした。この細胞懸濁液を用いて、５００ｍＬ入り振とうフラスコ内で１００ｍＬのＹＰＤ培地の第２の種培養を接種した。この振とうフラスコを３７℃、２００ｒｐｍで４８時間回転振とう機上で培養した。この種培養の２５ｍＬのアリコートを用いて、２５０ｍＬのＹＰグリセロール（１％）培地に接種し、バッフル付き２ｌ入り振とうフラスコの中で上述の条件下でインキュベートした。接種から４８時間後に、１％のＭｅＯＨ（プロモーター誘発）を添加し、振とうフラスコをさらに上述の条件下でインキュベートした。誘発から２４時間後に、実験を停止し、遠心分離により細胞ペレットを収集した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ／ウエスタンブロッティングにより５つの異なるクローンの発現レベルを分析した（条件は上述の通り）。ゲル上の各クローンの滴定系列を投入し、生産性の最も高い菌株をさらなる発酵及び精製試行のために選択した。
【０１８２】
驚くべきことに、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ（Ｇｅｌｌｉｓｓｅｎ，Ｇ．２０００）に近い関係をもつ酵母菌株であるＨ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａは、基本的に過剰グリコシル化無しの、ひいてはＨＣＶ組換え型ワクシニアウイルスに感染した哺乳動物の細胞により発現されるＨＣＶウイルス様粒子に匹敵するサイズの糖部分を伴うＨＣＶタンパク質を発現することができる。
【０１８３】
Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ菌株ＲＢ１１は、ＵＣＬのマイコテーク（ＭＵＣＬ）ルーヴァンカトリック大学菌学研究所（Ｐｌａｃｅ  Ｃｒｏｉｘ  ｄｕ  Ｓｕｄ  ３ｂｔｅ  ６、Ｂ−１３４８  Ｌｏｕｖａｉｎ−ｌａ−Ｎｅｕｖｅ、ベルギー）にブタペスト条約の条件に基づき２００２年４月１９日に寄託され、ＭＵＣＬ受託番号ＭＵＣＬ４３８０５を有する。
【０１８４】
実施例７
ｐＳＹ１ａＭＦＥｌｓＨ６ａベクターの構築
Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  発現プラスミドを以下の通りに構築した。Ｅ１コーディング配列をｐＧＥＭＴ−Ｅ１ｓＨ６（配列番号６、図１）からのＮｓＩ１／Ｅｃｏ５２Ｉフラグメントとして単離し、これを（Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼを用いて）平滑末端化し、供給業者の仕様に従ってＴ４ＤＮＡリガーゼ（ベーリンガー）を用いてｐＹｌＧ５ベクター（配列番号４１、図１９）内でクローニングした。クローニングは、Ｅ１ｓ−Ｈ６コーディングフラグメントが直接的にかつａＭＦコーディング配列と同一枠内で接合されるようなものであった。連結混合物をＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５αＦ’細胞内で形質転換させた。その後、複数のアンピシリン耐性クローンのプラスミドＤＮＡを制限消化により分析し、陽性クローンを保留し、ｐＹＩＧ５Ｅ１Ｈ６（ＩＣＣＧ３４７０；配列番号４２、図２０）と呼称した。
【０１８５】
（Ｈｉｓ−ｔａｇ  を伴うＥ１ｓコーディング領域及びαＭＦ−配列を含有する）発現カセットを、ＢａｍＨＩで消化したＥ．ｃｏｌｉ／Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ｐＳＹ１シャトルベクター（配列番号２１、図４３）内にｐＹＩＧ５Ｅ１Ｈ６のＢａｍＨＩフラグメント（２７９０ｂｐ）として移した。供給業者の条件に従って、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（ベーリンガー）で連結を実施した。連結混合物をＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５αＦ’細胞へと形質転換し、複数のアンピシリン耐性コロニーのプラスミドＤＮＡを制限酵素消化により分析した。陽性クローンを保留し、これをｐＳＹ１ａＭＦＥ１ｓＨ６ａ（ＩＣＣＧ３４７９；配列番号４４、図２２）と呼称した。
【０１８６】
実施例８
ｐＳＹＹＩＧＳＥ２Ｈ６ベクターの構築
Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  発現プラスミドｐＳＹＹＩＧＳＥ２Ｈ６を以下の通りに構築した。Ｅ２コーディング配列をｐＢＳＫ−Ｅ２ｓＨ６（配列番号４５、図２３）からのＳａｌＩ／ＫｐｎＩフラグメントとして単離し、これを（Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼを用いて）平滑末端化し、その後、供給業者の仕様に従ってＴ４ＤＮＡリガーゼ（ベーリンガー）を用いてｐＹｌＧ５ベクター（配列番号４１、図１９）内でクローニングした。クローニングは、Ｅ２−Ｈ６コーディングフラグメントが直接的にかつａＭＦコーディング配列と同一枠内で接合されるようなものであった。次に、連結混合物をＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５αＦ’細胞内で形質転換させ、複数のアンピシリン耐性クローンのプラスミドＤＮＡを制限消化により分析し、陽性クローンを保留し、ｐＹＩＧ５ＨＣＣＬ−２２ａＨ６（ＩＣＣＧ２４２４；配列番号４６、図２４）と呼称した。
【０１８７】
（Ｈｉｓ−ｔａｇ  を伴うＥ２（３８４−６７３）コーディング領域及びαＭＦ−配列を含有する）発現カセットを、ＢａｍＨＩで開かれたＥ．ｃｏｌｉ／Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ｐＳＹ１シャトルベクター（配列番号４３、図２１）内にｐＹＩＧ５ＨＣＣＬ−２２ａＨ６のＢａｍＨＩフラグメント（３２８１ｂｐ）として移した。供給業者の条件に従って、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（ベーリンガー）で連結を実施した。連結混合物をＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５αＦ’細胞へと形質転換し、複数のアンピシリン耐性コロニーのプラスミドＤＮＡを制限酵素消化により分析した。制限陽性クローンを保留し、これをｐＳＹＩＧＳＥ２Ｈ６（ＩＣＣＧ２４６６；配列番号４７、図２５）と呼称した。
【０１８８】
実施例９
ｐＳＹ１Ｙ１Ｇ７Ｅ１ｓベクターの構築
Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  発現プラスミドｐＳＹ１ＹＩＧ７Ｅ１ｓを以下の通りに構築した。Ｅ１コーディング配列をｐＧＥＭＴ−Ｅ１ｓ（配列番号６、図１）からのＮｓＩ１／Ｅｃｏ５２Ｉフラグメントとして単離し、これを平滑末端化し、供給業者の仕様に従ってＴ４ＤＮＡリガーゼ（ベーリンガー）を用いてｐＹｌＧ７ベクター（配列番号４８、図２６）内でクローニングした。クローニングは、Ｅ１コーディングフラグメントが直接的にかつａＭＦコーディング配列と同一枠内で接合されるようなものであった。連結混合物をＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５αＦ’細胞へと形質転換させ、複数のアンピシリン耐性クローンのプラスミドＤＮＡを制限消化により分析し、陽性クローンを保留し、ｐＹＩＧ７Ｅ１（配列番号４９、図２７）と呼称した。
【０１８９】
（Ｅ１（１９２−３２６）コーディング領域及びＣＬリーダー配列を含有する）発現カセットを、ＢａｍＨＩで消化したＥ．ｃｏｌｉ／Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ｐＳＹ１シャトルベクター（配列番号４３、図２１）内にｐＹＩＧ７Ｅ１のＢａｍＨＩフラグメント（２７９０ｂｐ）として移した。供給業者の条件に従って、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（ベーリンガー）で連結を実施した。連結混合物をＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５αＦ’細胞へと形質転換し、複数のアンピシリン耐性コロニーのプラスミドＤＮＡを制限酵素消化により分析した。陽性クローンを保留し、これをｐＳＹ１ＹＩＧ７Ｅ１ｓ（配列番号５０、図２８）と呼称した。
【０１９０】
実施例１０
Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの形質転換及び形質転換体の選択
Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ内で過剰発現されたタンパク質について報告されることの多い過剰グリコシル化の問題を克服するために、突然変異体スクリーニングをセットした。このスクリーニングは、自然発生的劣性オルトバナジウム酸塩耐性突然変異体を選択するＢａｌｌｏｕの方法（Ｂａｌｌｏｕ  Ｌ．ら、１９９１）に基づいていた。初期菌株選択は、未変性ゲル電気泳動の後に見られるようなインベルターゼのグリコシル化パターンに基づいて実施された。グリコシル化能力が低減した菌株を、さらなる組換え型タンパク質発現実験のために保留し、これは菌株ＩＹＣＣ１５５より優勢であった。突然変異の性質についてはこれ以上研究しなかった。
【０１９１】
前記グリコシル化欠損菌株ＩＹＣＣ１５５を、基本的にエルブル（ＥＩｂｌｅ，  Ｒ．１９９２）によって記載されているような酢酸リチウム方法により、実施例７〜９で記載した通りにプラスミドで形質転換させた。選択的ＹＮＢ＋２％の寒天平板（Ｄｉｆｃｏ）から複数のＵｒａ相補菌株を採収し、２ｍｌのＹＮＢ＋２％グルコースを接種するために使用した。これらの培養を３７℃で７２時間、軌道振とう機上で２００ｒｐｍでインキュベートし、Ｅ１特異的マウスモノクローナル抗体（ＩＧＨ２０１）で発達させたウエスタンブロットにより、Ｅ１の発現のため、培養上清及び細胞内画分を分析した。さらなる実験のため、生産性の高いクローンを保留した。
【０１９２】
ここで使用されるＳ．ｃｅｒｉｖｉｓｉａｅグリコシル化欠損突然変異内のタンパク質の発現は、野生型Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ菌株に比べて低いバイオマス収量ひいては所望のタンパク質のより低い収量を導く、かかる菌株の最適以下の増殖特性により妨げられている。所望のタンパク質の収量は、なおも哺乳動物細胞中よりも実質的に高いものであった。
【０１９３】
実施例１１
ｐＰＩＣＺａｌｐｈａＤ’ＥｌｓＨ６及びｐＰＩＣＺａｌｐｈａＥ’Ｅ１ｓＨ６ベクターの構築
ｐＰＩＣＺａｌｐｈａＡベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；配列番号５１、図２９）から出発して、シャトルベクターｐＰＩＣＺａｌｐｈａＥ’Ｅ１ｓＨ６を構築した。第１工程では、それぞれＫＥＸ２又はＳＴＥ１３処理用プロテアーゼの開裂部位のすぐ後ろでＥ１コーディング配列のクローニングを可能にするように、前記ベクターを適合させた。従って、ＸｈｏＩ及びＮｏｔＩでｐＰＩＣ  ＺａｌｐｈａＡを消化した。消化物を１％のアガロースゲル上で分離させ、３５１９ｋｂのフラグメント（ベクターの大部分）を、ゲル抽出キット（キアゲン）を用いて単離させ精製した。このＦＧを、その後、供給業者の条件に従って特異的オリゴヌクレオチドの存在下でＴ４ポリメラーゼ（ベーリンガー）を用いて連結させて、ｐＰＩＣ  Ｚａｌｐｈａ  Ｄ’（配列番号５２、図３０）又はｐＰＩＣ  ＺａｌｐｈａＥ’（配列番号５３、図３１）を生成した。
【０１９４】
以下のオリゴヌクレオチドを使用した。
−  ｐＰＩＣ  ＺａｌｐｈａＤを構築するためには；
【化２１】
2004532029.tif 000022
（配列番号５４）及び
【化２２】
2004532029.tif 000023
（配列番号５５）
これは、アニーリングの後、以下のリンカーオリゴヌクレオチドを生成する：
【化２３】
2004532029.tif 000024
（配列番号５４）
【化２４】
2004532029.tif 000025
（配列番号５５）
−  ｐＰＩＣ  ＺａｌｐｈａＥを構築するためには、
【化２５】
2004532029.tif 000026
（配列番号５６）
【化２６】
2004532029.tif 000027
（配列番号５７）
これは、アニーリングの後、以下のリンカーオリゴヌクレオチドを生成する：
【化２７】
2004532029.tif 000028
（配列番号５６）
【化２８】
2004532029.tif 000029
（配列番号５７）
【０１９５】
これらのシャトルベクターｐＰＩＣＺａｌｐｈａＤ’及びｐＰＩＣＺａｌｐｈａＥ’は、それぞれの処理用プロテアーゼ、ＫＥＸ２及びＳＴＥ１３の開裂部位の直ぐ後ろにクローニング部位を新たに導入した。
【０１９６】
Ｅ１−Ｈ６コーディング配列をｐＧＥＮＴ−ＥｌｓＨ６（配列番号６、図１）からＮｓＩ１／Ｅｃｏ５２Ｉフラグメントとして単離させた。１％のアガロースゲル上での消化物の分離の後、ゲル抽出キット（キアゲン）を用いて、フラグメントを精製した。結果として得たフラグメントを（Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼを用いて）平滑末端化し、それぞれの処理用プロテアーゼ開裂部位の直ぐ後ろでｐＰＩＣＺａｌｐｈａＤ’又はｐＰＩＣＺａｌｐｈａＥ’のいずれかの中に連結させた。
【０１９７】
連結混合物をＥ．ｃｏｌｉＴＯＰ１０Ｆ’細胞に形質転換し、複数のゼオシン耐性コロニーのプラスミドＤＮＡを制限酵素消化により分析した。陽性クローンを保留し、それぞれｐＰＩＣＺａｌｐｈａＤ’Ｅ１ｓＨ６（ＩＣＣＧ３６９４；配列番号５８、図３２）及びｐＰＩＣＺａｌｐｈａＥ’ＥｌｓＨ６（ＩＣＣＧ３４７５；配列番号５９、図３３）を呼称した。
【０１９８】
実施例１２
ｐＰＩＣＺａｌｐｈａＤ’Ｅ２ｓＨ６及びｐＰＩＣＺａｌｐｈａＥ’Ｅ２ｓＨ６ベクターの構築
実施例１１で記載された通りにシャトルベクターｐＰＩＣＺａｌｐｈａＤ’及びｐＰＩＣＺａｌｐｈａＥ’を構築した。
【０１９９】
Ｅ２−Ｈ６コーディング配列をｐＢＳＫ−Ｅ２ｓＨ６（配列番号４５、図２３）からＳａｌＩ／ＫｐｎＩフラグメントとして単離させた。１％のアガロースゲル上での消化物の分離の後、ゲル抽出キット（キアゲン）を用いて、フラグメントを精製した。結果として得たフラグメントを（Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼを用いて）平滑末端化し、それぞれの処理用プロテアーゼ開裂部位の直ぐ後ろでｐＰＩＣＺａｌｐｈａＤ’又はｐＰＩＣＺａｌｐｈａＥ’のいずれかの中に連結させた。
【０２００】
連結混合物をＥ．ｃｏｌｉＴＯＰ１０Ｆ’細胞に形質転換し、複数のゼオシン耐性コロニーのプラスミドＤＮＡを制限酵素消化により分析した。陽性クローンを保留し、それぞれｐＰＩＣＺａｌｐｈａＤ’Ｅ２ｓＨ６（ＩＣＣＧ３６９２；配列番号６０、図３４）及びｐＰＩＣＺａｌｐｈａＥ’Ｅ２ｓＨ６（ＩＣＣＧ３４７６；配列番号６１、図３５）を呼称した。
【０２０１】
実施例１３
Ｐｉｃｈａ  Ｐａｓｔｏｒｉｓの形質転換及び形質転換体の選択
実施例１１及び１２に記載されている通りのＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓシャトルプラスミドを、供給業者の条件（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に従ってＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ細胞へと形質転換させた。Ｅ１−及びＥ２−産生菌株をさらなる特徴づけのために保留した。
【０２０２】
過剰グリコシル化が通常不在（Ｇｅｌｌｉｓｓｅｎ、Ｇ．２０００）であり以前のＧＳＴ融合としてデング熱ウイルスＥタンパク質を発現するために使用されている（Ｓｕｇｒｕｅ）、Ｒ．Ｊ．ら、  １９９７）という事実のために周知の酵母菌株であるＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓの中で、ＨＣＶウイルス様粒子を発現させた。注目すべきことに、結果として得られたＰ．  ｐａｓｔｏｒｉｓ発現されたＨＣＶウイルス様粒子は、野生型Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ菌株で見られるものに匹敵するグリコシル化を示した。より詳細に言うと、Ｐ．  ｐａｓｔｏｒｉｓにより産生されたＨＣＶウイルス様粒子は、過剰グリコシル化される（形質転換されたＰ．  ｐａｓｔｏｒｉｓ細胞から単離されたタンパク質のウエスタンブロットの中で検出される発現産物の分子量に基づく）。
【０２０３】
実施例１４
Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ及びＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓのための培養条件
Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ
セルバンキング
選択された組換え型クローンから、マスターセルバンク及びワーキングセルバンクを調製した。対数増殖中期の振とうフラスコ培養（発酵種培養の場合と同様のインキュベーション条件、以下参照）からクリオ−バイアル（ｃｒｙｏ−ｖｉａｌs）を調製した。凍結防止剤としてグリセロール（最終濃度５０％）を添加した。
【０２０４】
発酵
低温保存されたワーキングセルバンクから種培養を開始し、４８時間２００ｒｐｍ、３７℃で２Ｌ入り振とう三角フラスコの中で５００ｍＬの培地（２％のスクロールを補足したＹＮＢ、Ｄｉｆｃｏ）内でこれを増殖させた。
【０２０５】
発酵は、標準的には、１５Ｌの作業体積でＢｉｏｓｔａｔ  Ｃ発酵装置の中で実施された（ビー．ブラウン社（Ｂ．Ｂｒａｕｎ  Ｉｎｔ．，）ドイツ、メルズンゲン（Ｍｅｌｓｕｎｇｅｎ，  Ｇｅｒｍａｎｙ））。発酵培地は、炭素源として１％の酵母エキス、２％のペプトン及び２％のスクロースを含有していた。消泡剤としてポリエチレングリコールを使用した。
【０２０６】
標準的に温度、ｐＨ及び溶存酸素を、発酵中制御した。表１に適用可能な設定点をまとめる。溶存酸素を、撹拌及び／通気によりカスケード制御した。ＮａＯＨ（０．５Ｍ）又はＨ３ＰＯ４溶液（８．５％）を添加することによってｐＨを制御した。
【０２０７】
【表１】
2004532029.tif 000030
【０２０８】
発酵を１０％の種培養の添加により開始した。増殖期間中、スクロース濃度をＨＰＬＣ分析によりオフラインで監視した（Ｐｏｌｙｓｐｈｅｒｅ  Ｃｏｌｕｍｎ  ＯＡＫＣ  Ｍｅｒｃｋ）
【０２０９】
増殖期中溶存酸素をカスケード制御により制御した（撹拌／通気）。スクロースが完全に代謝した後、濃度を約０．５％に維持するべくＥｔＯＨを段階的に添加することで補充しながら内部で産生したエタノールにより異種ｐＮ産生を駆動した（オフラインＨＰＬＣ分析、ｐｏｌｙｓｐｈｅｒ  ＯＡＫＣカラム）。この誘導期の間、溶存酸素を、空気流速及び撹拌機速度の手動式調整により、５％の空気飽和未満に制御した。
【０２１０】
標準的には、細胞ペレットを得るためタンジェンシャルフローろ過を介した濃縮とそれに続く濃縮した細胞懸濁液の遠心分離により、誘導から４８〜７２時間後に発酵物を収獲した。直ちに分析されない場合には、細胞ペレットを−７０℃で保管した。
【０２１１】
Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ
セルバンキング
選択された組換え型クローンから、マスターセルバンク及びワーキングセルバンクを調製した。対数増殖中期の振とうフラスコ培養（発酵種培養の場合と同様のインキュベーション条件、以下参照）からクリオ−バイアルを調製した。凍結防止剤としてグリセロール（最終濃度５０％）を添加した。
【０２１２】
発酵
低温保存された（−７０℃）ワーキングセルバンクから種培養を開始し、４８時間２００ｒｐｍ、３７℃で２Ｌ入り三角振とうフラスコの中で５００ｍＬの培地（ＹＰＤ、Ｄｉｆｃｏ）内でこれを増殖させた。
【０２１３】
発酵は、標準的には、１５Ｌの作業体積でＢｉｏｓｔａｔ  Ｃ発酵装置の中で実施された（Ｂ．Ｂｒａｕｎ  Ｉｎｃ．、Ｍｅｌｓｕｎｇｅｎ、ドイツ）。発酵培地は、炭素源として１％の酵母エキス、２％のペプトン及び１％のグリセロールを含有していた。消泡剤としてポリエチレングリコールを使用した。
【０２１４】
標準的に温度、ｐＨ、空気中及び溶存酸素を、発酵中制御した。表２に適用可能な設定点をまとめる。溶存酸素を、撹拌及び／通気によりカスケード制御した。ＮａＯＨ（０．５Ｍ）又はＨ３ＰＯ４溶液（８．５％）を添加することによってｐＨを制御した。
【０２１５】
【表２】
2004532029.tif 000031
【０２１６】
発酵を１０％の種培養の添加により開始した。増殖期中、グリセロール濃度をオフラインで監視し（Ｐｏｌｙｓｐｈｅｒｅ  Ｃｏｌｕｍｎ  ＯＡＫＣ  ｍｅｒｃｋ）、完全なグリセロール消費から２４時間後に１％メタノールを添加して異種タンパク質の発現を誘導した。細胞ペレットを得るためタンジェンシャルフローろ過を介した濃縮とそれに続く濃縮した細胞懸濁液の遠心分離により、誘導から２４時間後に発酵を収獲した。直ちに分析されない場合には、細胞ペレットを−７０℃で保管した。
【０２１７】
Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ
振とうフラスコ培養中に、組換え型Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓでの小規模タンパク質産生実験をセットした。ＹＰＤ培地（Ｄｉｆｃｏ）内で一晩、種培養を増殖させた。初期培地のｐＨを４．５に補正した。回転振とう機上で３７℃、２００〜２５０ｒｐｍで振とうフラスコをインキュベートした。
【０２１８】
小規模産生は、標準的に２Ｌ入り振とうフラスコ内で５００ｍＬの規模で実施し、１％の酵母エキス、２％のペプトン（共にＤｉｆｃｏ）及び２％のグリセロールを炭素源として含有する発現培地で１０％の接種から始めた。接種条件は、種培養の場合と同様であった。誘導は、接種から約７２時間後に１％のＭｅＯＨの添加により開始した。遠心分離により、誘導から２４時間後に細胞を収集した。直ちに分析されない場合、細胞ペレットを−７０℃に保管した。
【０２１９】
実施例１５
選択された酵母細胞内で発現されたＭＦａ−Ｅ１−Ｈ６及びＭＦａ−Ｅ２−Ｈ６タンパク質からのリーダーペプチドの除去
Ｓ．Ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのａ−交接因子（ａＭＦ）リーダー配列を伴うＨＣＶ  Ｅ１及びＥ２タンパク質構築物のＨａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ及びＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅグリコシル化マイナス菌株の中の発現産物をさらに分析した。両方の遺伝子型１ｂＨＣＶ  Ｅ１ｓ（ａａ１９２−３２６）及びＨＣＶ  Ｅ２ｓ（ＶＩＥＧＲ（配列番号６９）−配列で伸長されたａａ３８３−６７３）は、共にＣ末端ｈｉｇタグ付けされた（Ｈ６、ＨＨＨＨＨＨ、配列番号６３；このＨＣＶタンパク質は本例ではさらにＭＦ−Ｅ１−Ｈ６及びＭＦ−Ｅ２−Ｈ６と記される）タンパク質として発現されたため、酵母細胞の塩化グアニジニラム（ＧｕＨＣｌ）可溶化後の発現済み産物の迅速かつ効率の良い精製がＮｉ−ＩＤＡ（Ｎｉ−イミノジ酢酸）上で実施された。簡単に言うと、細胞ペレットを５０ｍＭのリン酸塩、６ＭのＧｕＨＣｌ、ｐＨ７．４（９ｖｏｌ／ｇの細胞）中に再懸濁させた。３２０ｍＭ（４％ｗ／ｖ）の亜硫酸ナトリウム及び６５ｍＭ（２％ｗ／ｖ）の４チオン酸ナトリウムの存在下で室温（ＲＴで一晩、タンパク質をスルホン化した。溶解物を、遠心分離（１０．０００ｇ、３０分、４℃）による凍結−解凍サイクルの後に清澄させ、エンピゲン（アイブライト＆ウィルソン（Ａｉｂｒｉｇｈｔ＆Ｗｉｌｓｏｎ）、英国）及びイミタゾールを、それぞれ１％（ｗ／ｖ）及び２０ｍＭの最終濃度まで上清に添加した。試料をろ過し（０．２２μＭ）、Ｎｉ−ＩＤＡセファロースＦＦカラム上に投入し、５０ｍＭのリン酸塩、６ＭのＧｕＨＣｌ、１％のエンピゲン（緩衝液Ａ）に２０ｍＭのイミダゾールを補足したものを用いてこれを平衡化した。その後、カラムをそれぞれ２０ｍＭ及び５０ｍＭのイミダゾールを含有する緩衝液Ａを用いて、２８０ｎｍという達成基線レベルまで洗浄した。緩衝液Ｄ、５０ｍＭリン酸塩、６ＭのＧｕＨＣｌ、０．２％（Ｅ１について）又は１％（Ｅ２について）エンピゲン、２００ｍＭイミダゾールを適用することによって、ｈｉｓタグ付生成物を溶出させた。溶出した材料を、Ｅ１（ＩＧＨ２０１）、又はＥ２（ＩＧＨ２１２）に対し向けられた特異的モノクローナル抗体を用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウエスタンブロットにより分析した。
【０２２０】
Ｅ１産物を、Ｅｄｍａｎ分解により直ちに分析した。
【０２２１】
この工程で、ＳＤＳ−ＰＡＧＥはすでにＨＣＶ  Ｅ２についてのタンパク質バンドのきわめて複雑なピクチャを顕示したため、サイズ排除クロマトグラフィーによるさらなる分留を実施した。Ｎｉ−ＩＤＡ溶出液を、限外ろ過（ＭＷＣ１０ｋＤａ、ｃｅｎｔｉｐｌｕｓ、Ａｍｉｃｏｎ、ｍｉｌｌｉｐｏｖｅ）により濃縮し、ＰＢＳ、１％エンピゲン又はＰＢＳ、３％エンピゲン中でＳｕｐｅｒｄｅｘＧ２００（１０／３０又は１６／１０；Ｐｈａｒｍａｃｉａ）上に投入した。８０ｋａＤａと４５ｋＤａの間のＭｒをもつＥ２産物を含有する溶出画分、すなわち、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（図３８１上の遊走に基づく図３７中の溶出プロフィールの画分１７−２３をプールし、アルキル化させた（ＲＴで３時間１０ｍＭのＤＴＴでのインキュベーションとそれに続くＲＴで３時間の３０ｍＭのヨードアセタミドでのインキュベーション）。アミノ末端配列決定のための試料はＥｎｄｏＨ（ロシュバイオケミカルズ）で処理するか、又は未処理のまま放置した。アミノ末端配列決定のためのＰＶＤＦ膜上で、グリコシル化及び脱グリコシル化されたＥ２産物をブロットした。グリコシル化及び脱グリコシル化したＥ２のアミドーブラックで染色したブロットは、図３９に示されている。
【０２２２】
Ｅ１及びＥ２の両方の精製済み産物の配列決定から、残念なことに、ＨＣＶウイルス様粒子からのシグナル配列の除去が部分的にしか発生していないという考察が導かれる（表３参照）。さらに、副産物の大部分（分解産物及びなおもリーダー配列又はその一部分を含有する産物）は、グリコシル化されている。このグリコシル化は、部分的であれ、Ｎ−グリコシル化部位をも含有するシグナル配列の未開裂フラグメント上にある。これらの部位とは、グリコシル化された副産物を少なくする結果となるように突然変異させることができる。しかしながら、より一層問題が大きいのは、交互に開裂された一部の産物が所望の無傷のエンベロープタンパク質に比べて１〜４個のアミノ酸の差異しかないという発見事実にある。その結果、適正にプロセッシングされた産物の精製は、異なる発現産物間に充分に弁別できる生化学物特性が欠如しているために、事実上不可能である。分解産物のいくつかは、ａ−交接因子リーダーの開裂にも必要とされかくしてこの必須プロセスを混乱させることなく遮断され得ないＫｅｘ−２様の開裂（例えば、アルギニンの後での開裂であるＥ１のａａ１９６後に見られる開裂）の結果であり得る。
【０２２３】
ｐＳＹ１ＹＩＧ７Ｅ１ｓ（配列番号５０；図２８）でのＳ．Ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＩＹＣＣ１５５の形質転換から誘導された高Ｅ１生産性クローンを、ｐＳＹ１ａＭＦＥ１ｓＨ６ａＹＩＧ１Ｅ１ｓ（配列番号４４；図２２）でのＳ．Ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＩＹＣＣ１５５の形質転換から誘導された高生産性クローンと比較した。Ｅ１タンパク質の細胞内発現を誘導から２〜７日後に、Ｅ１特異的モノクローナル抗体（ＩＧＨ２０１）を用いてウエスタンブロットを用いて評価した。図４０から判断できるように、両方の菌株について２日後に最大の発現が観察されたが、両方の菌株についての発現パターンは全く異なっている。α−交接因子リーダーでの発現は、非常に複雑なバンドパターンを結果とてもたらすが、これは、リーダーのプロセッシングが効率の良いものではないという事実に由来する結果である。こうして、異なるアミノ末端をもち一部が１〜５Ｎ−グリコシル化により修飾されている複数の発現産物が導かれる。しかしながら、ＣＬリーダーで発現されたＥ１については、制限された数の全く異なるバンドが目に見え、このことは、適正なＣＬリーダーの除去レベルが高いこと及び、同じＣＬリーダーが発現されたＨａｎｓｅｎｕｌａ由来のＥ１について観察されるようにＮ−グリコシル化（１〜５鎖）によって、この適正にプロセッシングされた材料のみを修飾することができるという事実を反映している。（実施例６参照）。
【０２２４】
Ｅ１に対し導かれたモノクローナル抗体（ＩＧＨ２０１）を産生するハイブドーマ細胞系統は、欧州細胞培養収集機関、応用微生物学研究センター、ウイルトシャー州、ソールズベリー（Ｓａｌｉｓｂｕｒｙ、Ｗｉｌｔｓｈｉｒｅ）  ＳＰ４  ０ＪＧ、英国においてブタペスト条約の条件下で１９９８年３月１２日に寄託され、受託番号ＥＣＡＣＣ９８０３１２１６を有している。Ｅ２に対して向けられたモノクローナル抗体（ＩＧＨ２１２）は、ＷＯ９６／０４３８５中でメルテンスら、により実施例７．４中に抗体１２Ｄ１１Ｆ２として記載されている。
【０２２５】
【表３】
2004532029.tif 000032
【０２２６】
実施例１６
大規模産生及び精製に適した酵母中のＥ１構築物の発現
Ｓ．Ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ａＭＦリーダーペプチドに置き換えるため、ＣＨＨ（Ｃａｒｃｉｎｕｓ  ｍａｅｎａｓ高血糖ホルモンのリーダー配列）、Ａｍｇ１（Ｓ．Ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓからのアミラーゼのリーダー配列）、Ｇａｍ１（Ｓ．Ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓからのグルコアミラーゼのリーダー配列）、Ｐｈｙ５（真菌性フィターゼからのリーダー配列）、ｐｈｏ１（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓからのリーダー配列）及びＣＬ（鳥類リゾチームＣ、１，４−ベータ−Ｎ−アセチルムラミダーゼＣのリーダー）を含むその他の複数のリーダー配列を使用し、Ｅ１−Ｈ６（すなわちＣ末端ｈｉｓ−タグを伴うＥ１）に連結させた。全ての構築物を、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ内で発現させ、結果として得られた細胞溶解物の各々をウエスタンブロット分析に付した。これによりすでに、ＣＬがリーダーペプチドとして使用される構築物を除いて、リーダー又はシグナル配列又はペプチドの除去程度がきわめて低いという結論を下すことができた。このことは、Ｎｉ−ＩＤＡで精製された材料のＥｄｍａｎ分解により、ＣＨＨ−Ｅ１−Ｈ６構築物について確認された：複数の異なる配列が回収されたものの、適正に開裂された産物を検出することはできなかった（表４参照）。
【０２２７】
【表４】
2004532029.tif 000033
【０２２８】
すでに言及したように、細胞溶解物のウエスタンブロットは、ＣＬリーダーペプチドの高度の適正な除去を表わすＥ１特異的タンパク質バンドのパターンを顕示した。このリーダーは酵母に由来するものでないことから、これは驚くべきことである。ＧｕＨＣｌで可溶化されＮｉ−ＩＤＡで精製された材料のＥｄｍａｎ分解によるアミノ酸配列決定は、実際、Ｅ１タンパク質の８４％が適正に開裂され、材料が基本的に分解産物を含まないということを確認した。なおも１６％の未プロセッシング材料が存在しているが、この材料は未グリコシル化材料であるため、混合物から容易に除去でき、適正に開裂されグリコシル化されたＥ１の特異的豊富化を可能にする。かかる豊富化方法は、レクチン上のアフィニティクロマトグラフィーであり得、その他の代替案も実施例１９で示されている。あるいはまた、その他の豊富化手順を選択し最適化するために、未グリコシル化材料のより高い疎水特性を使用することができる。ＣＬ−Ｅ１−Ｈ６タンパク質からのＣＬリーダーペプチドの適正な除去はさらに質量分析法によって確認され、この質量分析法は、同様に、遺伝子型１ｂＥ１ｓの５Ｎ−グリコシル化部位のうち最高４つまでが占有され得、かくして配列ＮＮＳＳ（アミノ酸２３３〜２３６、配列番号７３）は単一のＮ−グリコシル化部位であるとみなされるということも確認した。
【０２２９】
実施例１７
ＣＬ−Ｅ２−Ｈ６コーディング構築物からのＨａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ内で発現されたＨＣＶ  Ｅ２タンパク質の精製及び生化学的特徴づけ
Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ内で発現されたＣＬ−Ｅ２−ＶＩＥＧＲ−Ｈ６（本例では以下「ＣＬ−Ｅ２−Ｈ６」と記す）タンパク質からのＣＬリーダーペプチドの除去効率を分析した。ＨＣＶ  Ｅ２ｓ（ａａ３８３−６７３）はｈｉｓ−タグ付けされたタンパク質として発現されたことから、Ｎｉ−ＩＤＡについて、収集済み細胞のＧｕＨＣｌ可溶化後の発現済みタンパク質の効率の良い高速精製を行った。簡単に説明すると、３０ｍＭのリン酸塩、６ＭのＧｕＨＣｌ、ｐＨ７．２の中に細胞ペレットを再懸濁させた（細胞１ｇあたり９ｍＬの緩衝液）。タンパク質を、３２０ｍＭ（４％ｗ／ｖ）の亜硫酸ナトリウム及び６５ｍＭ（２％ｗ／ｖ）の四チオン酸ナトリウムの存在下で室温で一晩、スルホン化させた。遠心分離（１０．０００ｇ、３０分、４℃／による凍結−解凍サイクルの後、溶解物を清澄させた。それぞれ１％（ｗ／ｖ）及び２０ｍＭの最終濃度までエンピゲンＢＢ（アイブライト＆ウィルソン）及びイミダゾールを添加した。さらなるクロマトグラフィー工程はすべて、ＡｋｔａＦＰＬＣワークステーション（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）上で実施した。０．２２μｍの孔径の膜（酢酸セルロース）を通して試料をろ過し、Ｎｉ−ＩＤＡカラム（Ｎｉ２＋と共に投入されるキレート化セファロースＦＦ）上に投入し、これを２０ｍＭのイミダゾールで補足された１％エンピゲンＢＢ、ｐＨ７．２（緩衝液Ａ）、６ＭのＧｕＨＣｌ、５０ｍＭのリン酸塩で平衡化した。カラムをそれぞれ２０ｍＭ及び５０ｍＭのイミダゾールを含有する緩衝液Ａで、２８０ｎｍでの吸光度が基線レベルに達するまで洗浄した。緩衝液Ｄ、５０ｍＭのリン酸塩、６ＭのＧＨＣｌ、０．２％のエンピゲンＢＢ（ｐＨ７．２）、２００ｍＭのイミダゾールを適用することにより、ｈｉｓ−タグ付けされた産物を溶出した。Ｅ２に対し向けられた特異的モノクローナル抗体Ｅ２（ＩＧＨ２１２）を用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウエスタンブロットにより、精製された材料を分析した（図４１）。ＩＭＡＣで精製されたＥ２−Ｈ６タンパク質を同様に、Ｅｄｍａｎ分解によるＮ末端配列決定に付した。さらに、タンパク質をＮ−グリコシダーゼＦ（ロシュ（Ｒｏｃｈｅ））（０．２Ｕ／μｇのＥ２、ＰＢＳ／３％エンピゲンＢＢ中で３７℃で１時間のインキュベーション）で処理するか、又は未処理のまま放置した。グリコシル化及び脱グリコシル化されたＥ２−Ｈ６タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥに付し、アミノ酸配列決定のためＰＶＤＦ膜上でブロットした（分析は、アプライドバイオシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）のＰＲＯＣＩＳＥＴＭ４９２タンパク質シーケンサ、上で実施した。この工程で、ＳＤＳ−ＰＡＧＥは幾分かの分解産物を顕示したため、サイズ排除クロマトグラフィーによるさらなる分画を実施した。これに関して、Ｎｉ−ＩＤＡ溶出液を限外ろ過によって濃縮させ（ＭＷＣＯ１０ｋＤａ、ｃｅｎｔｒｉｐｌｕｓ、ミリポアアミコン（Ａｍｉｃｏｎ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ））、ＰＢＳ、１％のエンピゲンＢＢ中でＳｕｐｅｒｄｅｘ  Ｇ２００（ファーマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ））上に投入した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上の移動に基づき、〜３０ｋＤａと〜７０ｋＤａの間のＭｒをもつ無傷のＥ２ｓ関連産物を主として含有する溶出画分をプールし、場合によってアルキル化させた（３７℃で３０分間５ｍＭのＤＴＴでのインキュベーションとそれに続く３７℃で３０分間２０ｍＭのヨードアセタミドでのインキュベーション）。ＩＭＡＣ精製の後に分解産物が存在する可能性は、かくしてサイズ排除クロマトグラフィーを用いた無傷の産物のさらなる分画によって克服できる。予想外に優れた結果を得ることができた。Ｎ末端配列決定に基づいて、ＣＬリーダーペプチドが除去されているＥ２産物の量を推定することができた。タンパク質産物の合計量をＥｄｍａｎ分解により回収されたピークの強度に基づいて、タンパク質のｐｍｏｌとして計算する。その後、各々の特異的タンパク質（すなわち各々の「検出されたＮ末端」）について、合計に対するモル％を推定する。現行の実験では、Ｅ２−Ｈ６の適正なＮ末端のみが検出され、Ｅ２タンパク質内に含まれていないＮ末端アミノ酸を含有するか又はＥ２タンパク質のＥ２−Ｈ６欠如アミノ酸のその他の変異体は存在しなかった。結論としてはＨ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａによりＣＬ−Ｅ２−Ｈ６タンパク質として発現されたＥ２−Ｈ６タンパク質は、９５％以上の適正に開裂されたタンパク質としてそれ以上のいかなるｉｎ  ｖｉｔｒｏ処理も行なわずに、単離された。これは、単離されたタンパク質の２５％中に発生すると推定された、Ｅ２−Ｈ６タンパク質に対するＭＦ−Ｅ２−Ｈ６タンパク質のＨ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａによるリーダーペプチド除去の忠実度と好対照をなすものである（表３参照）。
【０２３０】
実施例１８
ＣＬ−Ｈ６−Ｋ−Ｅ１コーディング構築物からのＨａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ内で発現されたＨＣＶ  Ｅ１タンパク質の精製及び生化学的特徴づけ及びＨ６含有タンパク質のｉｎｖｉｔｒｏ処理
Ｈ．Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ内で発現されたＣＬ−Ｈ６−Ｋ−Ｅ１タンパク質からＣＬリーダーペプチドの除去の効率、ならびにＨ６（ｈｉｓ−タグ）−アダプタペタペプチド及びＥｎｄｏ  Ｌｙｓ−Ｃプロセッシング部位を除去するためのその後のｉｎ  ｖｉｔｒｏプロセッシングの効率を分析した。ＨＣＶ  Ｅ１ｓ（ａａ１９２−３２６）は、Ｎ末端Ｈｉｓ−Ｋ−タグ付けされたタンパク質ＣＬ−Ｈ６−Ｋ−Ｅ１として発現されたことから、実施例１７で記載された通り高速かつ高効率の精製を実施することができた。Ｈ６−Ｋ−Ｅ１（そして場合によってはＣＬ−Ｈ６−Ｋ−Ｅ１）タンパク質のＩＭＡＣ−クロマトグラフィー精製の溶出プロフィールは、図４２に示されている。ゲルのＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び銀染色及びＥ１に対して向けられた特異的モノクローナル抗体（ＩＧＨ２０１）（図４３）、組換え型Ｅ１ｓ産物を含有する溶出画分（６３−６９）をプールし（「ＩＭＡＣプール」）、一晩エンドプロテイナーセＬｙｓ−Ｃ（ロシュ）処理（酵素／基質比１／５０（ｗ／ｗ）、３７℃）に付してＨ６−Ｋ−融合テールを除去した。未処理の融合産物の除去をＮｉ−ＩＤＡカラム上での頁のＩＭＡＣクロマトグラフィー工程によって実施し、かくしてフロースルー画分内でＥｎｄｏ−Ｌｙｓ−Ｃ処理されたタンパク質を収集する。さらに、１０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４・３Ｈ２Ｏ；１％（ｖ／ｖ）のエンピゲンＢ、ｐＨ７．２（緩衝液Ｂ）での１０倍希釈の後、Ｎｉ−ＩＤＡカラム上にエンドブロテイナーゼＬｙｓ−Ｃ消化されたタンパク質試料を適用し、その後、２８０ｎｍでの吸光度が基線レベルに達するまで緩衝液Ｂで洗浄した。フロースルーを異なる画分（１−４０）の形で収集し、これらの画分をＥ１ｓ産物の存在についてスクリーニングした（図４４）。（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上の遊走とそれに続く銀染色又はＥ１に対して向けられた特異的モノクローナル抗体（ＩＧＨ２０１）を用いたウエスタンブロット分析に基づき〜１５ｋＤａと〜３０ｋＤａの間のＭｒでの）Ｎ末端Ｈ６−Ｋ（そして場合によっては残留ＣＬ−Ｈ６−Ｋ）テールが除去されている無傷のＥ１を含有する画分（７〜２８）をプールし、アルキル化した（３７℃で３０分間５ｍＭのＤＴＴでのインキュベーションとそれに続く３７℃で３０分間２０ｍＭのヨードアセタミドでのインキュベーション）。
【０２３１】
この材料をＮ末端配列決定に付した（Ｅｄｍａｎ分解）。さらに、タンパク質試料をＮ−グリコシダーゼＦ（ロシュ）（０．２Ｕ／μｇのＥ１、ＰＢＳ／３％エンピゲンＢＢ中で３７℃で１時間のインキュベーション）で処理するか、又は未処理のまま放置した。グリコシル化及び脱グリコシル化されたＥ１を次にＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、エドマン分解によるさらなる分析のためＰＤＶ下膜上でブロットした（分析は、アプライドパイオシステムのＰＲＯＣＩＳＥＴＭ４９２タンパク質シーケンサ上で実施した）。Ｎ末端配列決定に基づいて、適正にプロセッシングされたＥ１産物の量を推定することができた（プロセッシングには、Ｈ６−Ｋ−配列の適正な開裂が含まれる）。タンパク質産物の合計量は、エドマン分解によって回収されたピークの強度に基づいてタンパク質のｐｍｏｌとして計算される。その後、各々の特異的タンパク質（すなわち各々の「検出されたＮ末端」について、合計に対するモル％を推定する。現行の実験では、Ｅ１の適正なＮ末端のみが検出され、Ｈ６−Ｋ−Ｅ１のその他のプロセッシング変異体のＮ末端は検出されない。それに基づいて、Ｅ１タンパク質に対するＨ６−Ｋ−Ｅ１Ｅ１（そして場合によっては残留ＣＬ−Ｈ６−Ｋ−Ｅ１）タンパク質のＥｎｄｏ  Ｌｙｓ−Ｃによるｉｎ  ｖｉｔｒｏプロセッシングが、９５％超の忠実度で発生すると推定された。
【０２３２】
実施例１９
ヘパリンによるＨＣＶ  Ｅ１の低グリコシル化形態の特異的除去
酵母細胞由来のＨＣＶウイルス様粒子のための特異的精製工程を発見するために、ヘパリンとの結合を評価した。ヘパリンは、複数のウイルスに結合することがわかっており、その結果、ＨＣＶウイルス様粒子に対する結合がすでに示唆されてきた（Ｇａｒｓｏｎ  Ｊ．Ａ．ら、１９９９）。この潜在的結合を分析するため、ヘパリンをビオチニル化し、Ｈ．Ｐｏｌｙｍｏｐｈａからのスルホン化されたＨＣＶ  Ｅ１、Ｈ．Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ由来のアルキル化されたＨＣＶ  Ｅ１（共に実施例１６に記載されている通りに産生される）及びワクシニア発現ベクターでのトランスフェクションを受けた哺乳動物細胞の培養由来のアルキル化されたＨＣＶ  Ｅ１のいずれかでコーティングされたマイクロタイタープレートの中で、ＨＣＶ  Ｅ１との相互作用を分析した。驚くべきことに、強い結合は、Ｈ．Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ由来のスルホン化されたＨＣＶ  Ｅ１でのみ観察され、一方哺乳動物の細胞培養由来のＨＣＶ  Ｅ１での結合は全く存在しなかった。ウエスタンブロットを用いて、我々は、この結合が、低グリコシル化された成熟ＨＣＶ  Ｅ１い対応するＨＣＶ  Ｅ１ｓタンパク質混合物のさらに低い分子量のバンドに特異的であること（図４５）を示すことができた。図４５は同様に、スルホン化を除去した時点でもなお結合が低分子量のＥ１について観察される（レーン４）ことから、このスルホン化がヘパリン結合にとって必須でないということをも顕示している。あるいはまた、アルキル化がこの結合を実質的に低減させているが、これは、この例で用いられている特異的なアルキル化剤（ヨード−アセタミド）によりひき起こされ得る。驚くべきことに、高度のグリコシル化を有する（すなわちより多くのグリコシル化部位が占有されている）ＨＣＶ  Ｅ１タンパク質を伴う調製物を得るためにＨＣＶ  Ｅ１調製物を豊富化することが特異的に可能であることから、この発見事実はさらに、酵母のためのＣＬ−ＨＣＶ−エンベロープ発現カセットの工業的な利用可能性を実証した。
【０２３３】
実施例２０
ウイルス様の粒子（ＶＬＰ）の形成と分析
Ｈ．Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ内で発現されたＨＣＶ  Ｅ１及びＥ２タンパク質（実施例１６〜１８）のＶＬＰへの変換は、基本的に、ＷＯ９９／６７２８５中でＤｅｐｌａら、によって又ＷＯ０１／３０８１５中でボスマン（Ｂｏｓｍａｎ）ら、によって記載されている通りに行なわれた。簡単に言うと、ＨＣＶウイルス様粒子が発現された形質転換済みＨ．Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ細胞の培養の後、細胞を収穫し、実施例１７で記載された通りにＧｕＨＣｌ中で溶解させスルホン化させた。Ｈｉｓ−タグ付けされたタンパク質をその後ＩＭＡＣによって精製し、実施例１７で記載されているように、限外ろ過により濃縮した。
【０２３４】
スルホン化されたＣｙｓ−チオール基でのＨＣＶウイルス様粒子のＶＬＰ形成
単離手順中にスルホン化された濃縮ＨＣＶウイルス様粒子を還元処理に付さずＰＢＳ、１％（ｖ／ｖ）のエンピゲンで平衡化されたサイズ排除クロマトグラフィーカラム（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  Ｇ２００、ｐｈａｒｍａｃｉａ）上に投入した。溶出した画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウエスタンブロット法で分析した。相対Ｍｒ〜２９−〜１５ｋＤ（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ移動に基づき）をもつ画分をプールし、濃縮し、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  Ｇ２００上に投入し、ＰＢＳ、３％（ｗ／ｖ）ベタインで平衡化して、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）を形成させた。画分でプールし、濃縮し、ＰＢＳ、０．５％（ｗ／ｖ）ベタインに対し脱塩した。
【０２３５】
非可逆的に修飾したＣｙｓ−チオール基でのＨＣＶウイルス様粒子のＶＬＰ形成
単離手順中にスルホン化された濃縮ＨＣＶウイルス様粒子を還元処理（ＰＢＳ中の５ｍＭのＤＴＴの存在下でのインキュベーション）に対して、スルホン化されたＣｙｓ−チオール基を遊離Ｃｙｓ−チオール基に変換した。（ｉ）２０ｍＭのヨートアセタミドの存在下での３０分間のインキュベーション又は（ｉｉ）５ｍＭのＮ−エチルマレイミド（ＮＥＭ）及び１５ｍＭのビオチン−Ｎ−エチルマレイミドの存在下での３０分間のインキュベーションにより、不可逆的Ｃｙｓ−チオール修飾を実施した。その後、ヨードアセタミド遮断の場合にはＰＢＳ、１％（ｖ／ｖ）エンピゲン、又はＮＥＭ及びビオチン−ＮＥＭでの遮断の場合にはＰＢＳ、０．２％ＣＨＡＰＳで平衡化されたサイズ排除クロマトグラフィーカラム（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  Ｇ２００、Ｐｈａｒｍａｃｉａ）上に、タンパク質を投入した。溶出した画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウエスタンブロット法で分析した。〜２９−〜１５ｋＤ（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ移動に基づく）の相対Ｍｒをもつ画分をプールし、濃縮し、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）を形成させるために、ＰＢＳ、３％（ｗ／ｖ）ベタインで平衡化された、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  Ｇ２００上に投入した。画分をプールし、濃縮し、ヨードアセタミド遮断の場合にはＰＢＳ、０．５％（ｗ／ｖ）ベタインに対して、又ＮＥＭ及びビオテン−ＮＥＭでの遮断の場合にはＰＢＳ、０．０５％のＣＨＡＰＳで脱塩した。
【０２３６】
可逆的に修飾されたＣｙｓ−チオール基でのＨＣＶウイルス様粒子のＶＬＰ形成
単離手順中にスルホン化された濃縮ＨＣＶウイルス様粒子を還元処理（ＰＢＳ中の５ｍＭのＤＴＴの存在下でのインキュベーション）に付して、スルホン化されたＣｙｓ−チオール基を遊離Ｃｙｓ−チオール基に変換した。ジチオジピリジン（ＤＴＤＰ）、ジチオカルバメート（ＤＴＣ）又はシステインの存在下での３０分間のインキュベーションにより、可逆的Ｃｙｓ−チオール修飾を実施した。その後、ＰＢＳ、１％（ｖ／ｖ）エンピゲンで平衡化されたサイズ排除クロマトグラフィーカラム（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  Ｇ２００、Ｐｈａｒｍａｃｉａ）上に、タンパク質を投入した。溶出した画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウエスタンブロット法で分析した。〜２９−〜１５ｋＤ（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ移動に基づき）の相対Ｍｒをもつ画分をプールし、濃縮し、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）を形成させるために、ＰＢＳ、３％（ｗ／ｖ）ベタインで平衡化された、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  Ｇ２００上に投入した。画分をプールし、濃縮し、ＰＢＳ、０．５％（ｗ／ｖ）ベタインに対して脱塩した。
【０２３７】
Ｈ．Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａで発現されたＥ２−Ｈ６のＶＬＰを得るためのＰＢＳ、３％（ｗ／ｖ）ベタイン中のサイズ排除クロマトグラフィーの溶出プロフィールは、図４６（スルホン化）及び図４７（ヨードアセタミドでアルキル化）の中で示されている。
【０２３８】
Ｈ．Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａで発現されたＥ１のＶＬＰを得るためのＰＢＳ、３％（ｗ／ｖ）ベタイン中のサイズ排除クロマトグラフィーの溶出プロフィールは、図４８（スルホン化）及び図４８（ヨードアセタミドでアルキル化）の中で示されている。結果として得られたＶＬＰは、図５０に示されているように、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウエスタンブロット法により分析された。
【０２３９】
Ｈ．Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａで発現されたＨＣＶウイルス様粒子により形成されたＶＬＰのサイズ分析
動的光散乱によりＶＬＰ粒度を決定した。光散乱実験のためには、光子相関分光法（ＰＣＳ、ソフトウエアにより制御される粒度分析装置（Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  １０００  ＨＳ型、マルバーンインストラメント社（Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｌｔｄ．，）ウスターマルバーン（Ｍａｌｖｅｒｎ，Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒ）英国）を使用した。光子相関分光法又は動的光散乱（ＤＬＳ）は、ブラウン運動を測定しそれを粒度に関係づけする光学的方法である。連続的な可視レーザービームからの光は、懸濁状態にありブラウン運動に基づいて移動する巨大分子又は粒子全体を通して導かれる。レーザー光の一部分は、粒子によって散乱され、この散乱光は、光電子増倍管によって測定される。散乱光の強度の変動は、相関装置内に供給される。こうして適切なデータ解析が実施されるコンピュータへと渡される自動相関関数が生成される。使用されたレーザーは、６３３ｎｍの固定波長をもつ１０ｍｗの単色コヒーレントＨｅ−Ｎｅレーザーであった。各試料について、３〜６個の連続的測定が行なわれた。これらの実験の結果は表５にまとめられている。
【０２４０】
【表５】
2004532029.tif 000034
【０２４１】
Ｈ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａに由来するスルホン化されたＨＣＶ  Ｅ１がなおも、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ由来のアルキル化されたＨＣＶ  Ｅ１と同じ範囲内の１つのサイズをもつ粒子を形成するという観察事実は、驚くべきものである。スルホン化の結果としての負の電荷の高い（最高８個のＣｙｓ−チオール基をＨＣＶ  Ｅ１上で修飾できる）正味の増加がサブユニット間のイオン斥力を誘発するはずであることから、かかる効果は、予想されていなかった。テストされたその他の可逆的システイン修飾的用物質も粒子形成を可能にしたが、このようにして産生されたＨＣＶ  Ｅ１は、スルホン化された材料よりも安定性が悪く、ＨＣＶ  Ｅ１のジスルフィドベースの凝集を結果としてもたらすことが立証された。これらのその他の可逆的遮断薬を使用するためには、条件のさらなる最適化が必要とされる。
【０２４２】
実施例２１
Ｈａｎｓｅｎｕｌａが産生したＨＣＶ  Ｅ１−Ｈ６及びワクシニア感染した哺乳動物細胞が産生したＨＣＶ  Ｅ１の抗原的等価性
ＨＣＶ慢性キャリヤからの血清とＨａｎｓｅｎｕｌａ産生したＨＣＶ  Ｅ１−Ｈ６との反応性を、ＷＯ９９／６７２８５でデプラ（Ｄｅｐｌａ）ら、により記載されている通りに、ＨＣＶ組換え型ワクシニアウイルス感染哺乳動物細胞が産生したＨＣＶ  Ｅ１の反応性と比較した。テスト対象の両方のＨＣＶ−Ｅ１調製物は共に、ＨＣＶ  Ｅ１タンパク質がＮＥＭ及びヒオチン−ＮＥＭでアルキル化されたＶＬＰで構成されていた。ＨＣＶ慢性キャリヤからの血清との両方のＨＣＶ  Ｅ１  ＶＬＰ調製物の反応性は、ＥＬＩＳＡによって決定された。結果は表６にまとめられている。表６から導出できるように、ＨＣＶ組換え型ワクシニアウイルス感染哺乳動物細胞内で発現されたＨＣＶ  Ｅ１と、Ｈ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａの中で発現されたＨＣＶ  Ｅ１の間には反応性の違いは全く認められなかった。
【０２４３】
【表６】
2004532029.tif 000035
【０２４４】
実施例２２
Ｈａｎｓｅｎｕｌａが産生したＨＣＶ  Ｅ１−Ｈ６及びワクシニア感染した哺乳動物細胞により産生されたＨＣＶ  Ｅ１の免疫原性等価性
Ｈａｎｓｅｎｕｌａが産生したＨＣＶ  Ｅ１−Ｈ６の免疫原性を、ＷＯ９９／６７２８５でデプラら、が記載している通りにＨＣＶ組換え型ワクシニア感染哺乳動物細胞により産生されたＨＣＶ  Ｅ１の免疫原性と比較した。テスト対象の両方のＨＣＶ−Ｅ１調製物は共に、ＨＣＶ  Ｅ１タンパク質がヨードアセタミドでアルキル化されたＶＬＰで構成されていた。ＶＬＰ調製物は両方共ミョウバンと共に処方され、Ｂａｌｂ／ｃマウスの体内に注入された（各々３週間の間隔をおいて、各々０．１３％のＡｌｈｙｄｒｏｇｅｌ、Ｓｕｐｅｒｆｏｓ、デンマークを含有する１２５μｌ中５μｇのＥ１から成る三回の筋内／皮下注射）。３回目の免疫化の後１０日目にマウスを放血させた。
【０２４５】
この実験の結果は、図５１に示されている。図５１の上部部分については、哺乳動物細胞内で産生されたＥ１のＶＬＰでの免疫化の後に発生した抗体を決定した。哺乳動物細胞内で産生されたＥ１（「Ｍ」）又はＨａｎｓｅｎｕｌａが産生したＥ１（「Ｈ」）のいずれかを直接ＥＬＩＳＡ固体支持体上にコーティングし、その後カゼインで遮断するＥＬＩＳＡ法（実施例２１参照）により抗体力価を決定した。図５１の下部については、Ｈａｎｓｅｎｕｌａが産生したＥのＶＬＰでの免疫化の後に発生した抗体を決定した。哺乳動物細胞内で産生されたＥ１（「Ｍ」）又はＨａｎｓｅｎｕｌａが産生したＥ１（「Ｈ」）のいずれかを直接ＥＬＩＳＡ固体支持体上にコーティングし、その後カゼインで遮断するＥＬＩＳＡ法（実施例２１参照）により抗体力価を決定した。
【０２４６】
決定した抗体力価は終点力価であった。終点力価は、検定のバックグラウンドの平均を２倍したものに等しいＯＤ（ＥＬＩＳＡに決定されるもの）を結果としてもたらす血清の希釈度として決定される。
【０２４７】
図５１は、両方のＥ１組成物の免疫原性特性の間にいかなる著しい差異も観察されなかったこと、及び決定された抗体力価が、終点力価を実施するべくＥＬＩＳＡの中で使用される抗原と無関係であることを示している。
【０２４８】
酵母由来のＨＣＶ  Ｅ１は、ワクチン接種時点で、哺乳動物の細胞培養に由来するアルキル化されたＨＣＶ  Ｅ１でのワクチン接種時点で得られる防御反応に類似した防御反応を誘発した。後者の応答は、急性感染後のＨＣＶの慢性的進行を防ぐことができた。
【０２４９】
実施例２３
スルホン化されているＨａｎｓｅｎｕｌａ産生ＨＣＶ  Ｅ１−Ｈ６の抗原性及び免疫原生
ＨＣＶ慢性キャリヤの血清とＨａｎｓｅｎｕｌａ産生ＨＣＶ  Ｅ１−Ｈ６血清の反応性をＷＯ９９／６７２８５内のＤｅｐｌａら、により記載されている通りに、ＨＣＶ組換え型ワクシニアウイルス感染哺乳動物細胞により産生されたＨＣＶ  Ｅ１の反応性と比較した。テスト対象のＨＣＶ−Ｅ１調製物は両方共、Ｈａｎｓｅｎｕｌａにより産生されたＨＣＶ  Ｅ１タンパク質がスルホン化され哺乳動物細胞により産生されたＨＣＶ  Ｅ１がアルキル化されたＶＬＰで構成されていた。結果は、表７に示されている。全体的（平均的）反応性は、同一であったが、個々の血清についていくつかの主要な差異が指摘された。このことは、スルホン化された材料が、アルキル化されたＨＣＶ  Ｅ１とは異なる形でそのエピトープの少なくともいくつかを提示するということを暗に意味する。
【０２５０】
スルホン化されたＨａｎｓｅｎｕｌａによって産生されたＨＣＶ  Ｅ１−Ｈ６の免疫原性を、アルキル化されたＨａｎｓｅｎｕｌａによって産生されたＨＣＶ  Ｅ１−Ｈ６の免疫原性と比較した。テスト対象の両方のＨＣＶ−Ｅ１調製物は共に、ＶＬＰで構成されていた。ＶＬＰ調製物は両方共ミョウバンと共に処方され、Ｂａｌｂ／ｃマウスの体内に注入された。（各々３週間の間隔をおいて、各々０．１３％のＡｌｈｙｄｒｏｇｅｌ、Ｓｕｐｅｒｆｏｓ、デンマークを含有する１２５μｌ中５μｇのＥ１から成る三回の筋内／皮下注射）。３回目の免疫化の後１０日目にマウスを放血させた。
【０２５１】
実施例２２に記載されているものと同様に、抗体力価を決定した。驚くべきことに、スルホン化された材料での免疫化は、これらの力価を査定するためにＥＬＩＳＡにおいて使用される抗原の如何に関わらず、より高い抗体力価を結果としてもたらした（図５１：上の図版：アルキル化されたＥ１に対し発生させられた抗体の滴定；下の図版：スルホン化されたＥ１に対して発生させられた抗体の滴定；ＥＬＩＳＡプレート上にコーティングされたアルキル化されたＥ１；「Ｓ」：ＥＬＩＳＡプレート上にコーティングされたスルホン化されたＥ１）。しかしながらこの実験においては、個々の力価は、ＨＣＶ患者からの血清に関して得られた観察事実を確認する分析のために用いられる抗原により異なる。従って、システイン・チオール基が可逆的に修飾されているＨＣＶ  Ｅ１は、より免疫原性であり得、かくしてＨＣＶ（慢性感染）に対し防御するワクチンとして増大した効能を有する。それに加えて、不可逆的遮断によって誘発されるネオエピトープに対する応答の誘発が起こる可能性は低い。
【０２５２】
【表７】
2004532029.tif 000036
【０２５３】
実施例２４
ワクチン接種を受けたチンパンジーからの血清との、Ｈａｎｓｅｎｕｌａで産生されたＨＣＶ  Ｅ１−Ｈ６及びワクシニア感染した哺乳動物細胞によって産生されたＨＣＶ  Ｅ１の同一の抗原反応性
ＨＣＶ組換え型ワクシニアウイルス感染哺乳動物細胞により産生されたＥ１及びＨａｎｓｅｎｕｌａにより産生されたＥ１−Ｈ６（両方共アルキル化されている）の、ワクチン接種を受けたチンパンジーからの血清及びモノクローナル抗体との反応性を比較した。さらに、前記Ｅ１タンパク質をＥＬＩＳＡ内のプレートに直接コーティングしその後カゼインでプレートを飽和させた。ＥＬＩＳＡプレートにコーティングされたＥ１タンパク質を結合させる抗体の終点力価を、全て哺乳動物細胞によって産生されたＥ１で免疫化された動物から得られた特異的マウスモノクローナル抗体及びチンパンジー血清について決定した。終点力価決定は、実施例２２に記載されている通りに行なわれた。使用されたマウスモノクローナル抗体はＩＧＨ２０１（実施例１５を参照）、ＩＧＨ１９８（ＩＧＨ１９８＝ＷＯ９６／０４３８５内のメルテンスら、中の２３Ｃ１２）、ＩＧＨ２０３（ＩＧＨ２０３＝ＷＯ９６／０４３８５内のメルテンスら、中の１５Ｇ６）及びＩＧＨ２０２（ＩＧＨ２０２＝ＷＯ９９／５０３０１内のメルテンスら、中の３Ｆ３）であった。
【０２５４】
図５３から導出できるように、７匹の異なるチンパンジーの反応性は、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ又は哺乳動物細胞のいずれかにより産生されたＥ１タンパク質でテストされたとき同一である。ＨＣＶ  Ｅ１に対するモノクローナル抗体の反応性も同様にほぼ等しいものである。チンパンジーのうち２匹（Ｙｏｒａｎ及びＭａｒｔｉ）が、予防的ワクチン研究に関与し、抗原投与時点で急性感染を一掃することができたのに対し、対照動物は、感染を一掃できなかった。その他の５匹のチンパンジー（Ｔｏｎ、Ｐｈｉｌ、Ｍａｒｃｅｌ、Ｐｅｇｇｙ、Ｆｅｍｍａ）は、治療的ワクチン接種研究に関与し、ＨＣＶ  Ｅ１免疫化の時点で、肝臓生検材料上の組織学的活性指標及び／又は血清中のＡＬＴにより測定されるように、肝臓損傷の低減を示した。
【０２５５】
この実験で得られた結果はＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅとＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ両方においてＥＣＶＥ２タンパク質を発現した。Ｍｕｓｔｉｌｌｉ及び協同研究者（Ｍｕｓｔｉｌｌｉ，Ａ．Ｃ．ら、，１９９９）の発見事実とは明らかに異なっている。しかしながら、精製された酵母により産生されたＥ２は、モノクローナル抗体との反応性が酵母により産生されたＨＣＶ  Ｅ２についてより高いものであったものの哺乳動物細胞により産生されたＨＣＶ  Ｅ２で免疫化されたチンパンジーからの血清ではより低い反応性が観察されたという点において、哺乳動物（ＣＨＯ）細胞によって産生されたＨＣＶ  Ｅ２とは異なっていた。
【０２５６】
実施例２５
蛍光体援用型炭水化物電気泳動（ＦＡＣＥ）によるＨＣＶ  Ｅ１の糖プロファイリング
グリコシル化プロフィールをＷＯ９９／６７２８５でデプラら、によって記載されているように、ＨＣＶ組換え型ワクシニアウイルスに感染した哺乳動物細胞により産生されたＨＣＶ  Ｅ１及びＨａｎｓｅｎｕｌａ産生ＨＣＶ  Ｅ１について比較した。これは、蛍光体援用型炭水化物電気泳動（ＦＡＣＥ）を用いて行なわれた。さらに、オリゴ糖を、ペプチド−Ｎ−グリュシダーゼ（タンパク質Ｇａｓｅ  Ｆ）により哺乳動物細胞又はＨａｎｓｅｎｕｌａにより産生されたＥ１ｓから遊離させ、ＡＮＴＳで標識づけした（ＰＮＧａｓｅ  Ｆ消化に先立ち、ヨートアセタミドでＥ１タンパク質をアルキル化した）。２−３時間４℃で１５ｍＡの電流にて２１％のポリアクリルアミド上でＰＡＧＥにより、ＡＮＴＳ標識づけされたオリゴ糖を分離した。図５４から哺乳動物細胞により産生されたＥ１及びＨａｎｓｅｎｕｌａにより産生されたＥ１−Ｈ６上のオリゴ糖が単糖７〜１１個という重合度でオリゴマルトースのように移動するということが結論づけされた。このことはすなわち、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ発現系が驚くべきことに、過剰グリコシル化されずかつ哺乳動物細胞中で産生されたＥ１タンパク質に添加された糖鎖と類似の長さをもつ糖鎖を有するＥ１タンパク質を導く、ということを表わしている。
【０２５７】
実施例２６；  酵母におけるＨＣＶエンベロープタンパク質の発現
哺乳動物細胞発現系で発現されたＨＣＶエンベロープタンパク質の糖部分に匹敵するサイズの糖部分を伴うＨＣＶエンベロープタンパク質を得るために、いくつかの酵母菌株を詳細に調べた。
【０２５８】
１．１  Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおけるＨＣＶ  Ｅ１のための発現ベクターの構築
Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおける  ＨＣＶ  Ｅ１のための発現ベクターの構築のためには、ＨＣＶ  Ｅ１（ａａ１９２−３２６；配列番号２）ＯＲＦについてコードするＤＮＡフラグメントを、ベクターＩＣＣＧＮｏ．３４７０の中のＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  α−交接因子プレプロ配列に正確に融合させた（図２０）。このベクター内では、そのＣ末端でヘキサヒスチジンタグに融合されたＨＣＶ  Ｅ１の発現は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅハイブリッドＡＤＨ／ＧＡＰＤＨプロモーターの制御下にある（図２０）。このベクターから、プロモーター／遺伝子／ターミネーター発現カセットは、ＢａｍＨＩカセットとして、ＢａｍＨＩで開放されたＥ．ｃｏｌｉ／Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅシャトルベクーｐＳＹ１まで移され、結果としてベクターＩＣＣＧＮｏ．３４７９がもたらされる（図２２）。このシャトルベクターをその後、グリコシル化欠損菌株であるＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ菌株ＩＹＣＣＮｏ．１５５に形質転換させた。
【０２５９】
１．２  Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおけるＨＣＶ  Ｅ２のための発現ベクターの構築
Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおける  ＨＣＶ  Ｅ２のための発現ベクターの構築のためには、ＨＣＶ  Ｅ２（ａａ３８４−６７３；配列番号３）ＯＲＦについてコードするＤＮＡフラグメントを、ベクターＩＣＣＧ  Ｎｏ．２４２４の中のＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  α−交接因子プレプロ配列に正確に融合させた（図２４）。このベクター内では、そのＣ末端でヘキサヒスチジンタグに融合されたＨＣＶ  Ｅ１の発現は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅハイブリッドＡＤＨ／ＧＡＰＤＨプロモーターの制御下にある。このベクターから、プロモーター／遺伝子／ターミネーター発現カセットは、ＢａｍＨＩカセットとして、ＢａｍＨＩで開放されたＥ．ｃｏｌｉ／Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅシャトルベクーｐＳＹ１まで移され、結果としてベクターＩＣＣＧＮｏ．２４６６がもたらされる（図２５）。このシャトルベクターをその後、グリコシル化欠損菌株であるＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ菌株ＩＹＣＣ  Ｎｏ．１５５に形質転換させた。
【０２６０】
１．３  Ｈ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａにおけるＨＣＶ  Ｅ１のための発現ベクターの構築
Ｈ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａにおけるＨＣＶ  Ｅ１のための発現ベクターの構築のためには、ＨＣＶ  Ｅ１（ａａ１９２−３２６）ＯＲＦについてコードするＤＮＡを、ベクターｐＦＰＭＴ−Ｅ１−１１の中のＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  α−交接因子プレプロ配列に正確に融合させた（親ベクターの記載については、Ｇｅｌｌｉｓｓｅｎら、１９９２を参照のこと；ｐＦＰＭＴ−Ｅ１−１１については図５を参照のこと）。このベクターをその後Ｈ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ菌株ＲＢ１１へと形質転換させ、ゲノム組込み及び発現分析のための選択の後ＩＹＣＣ  Ｎｏ．２０５という番号で保管した。
【０２６１】
１．４  Ｈ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａにおけるＨＣＶ  Ｅ２のための発現ベクターの構築
Ｈ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａにおけるＨＣＶ  Ｅ１のための発現ベクターの構築のためには、ＨＣＶ  Ｅ２（ａａ３８４−６７３）ＯＲＦについてコードするＤＮＡを、ベクターｐＦＰＭＴ−Ｅ２−１１の中のＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  Α−交接因子プレプロ配列に正確に融合させた（親ベクターの記載については、Ｇｅｌｌｉｓｓｅｎら、１９９２を参照のこと。このベクターをその後Ｈ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ菌株ＲＢ１１へと形質転換させ、ゲノム組み込み及び発現分析のための選択の後ＩＹＣＣ  Ｎｏ．１６８という番号で保管した。
【０２６２】
１．５  Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓにおけるＨＣＶ  Ｅ１のための発現ベクターの構築
Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓにおけるＨＣＶ  Ｅ１のための発現ベクターの構築のためにはＨＣＶ  Ｅ１（ａａ１９２−３２６）ＯＲＦについてコードするＤＮＡをそれぞれベクターｐＰＩＣＺαＤ及びｐＰＩＣＺαＥ中のＫＥＸ２又はＳＴＥ１３プロテアーゼ認識部位の後方で正確に融合させた。これら２つのベクターは、ｐＰＩＣＺαＡベクター（インビトロジェン社（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．，）米国カリフォルニア州、カールスバッド（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）の修飾されたバージョンであり、これによりＫＥＸ２及びＳＴＥ１３部位の後で直接的融合が可能となるような形で親ベクターが修飾された。結果としてもたらされた菌株は、ＩＣＣＧ  Ｎｏ．３６９４（図３２）及びＩＣＣＧ  Ｎｏ．３４７５（図３３）とそれぞれ命名された。ゲノム組込み及び発現分析のためにスクリーニングするＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ菌株に対する形質転換をメーカーの指示に従って実施した。
【０２６３】
１．６  Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓにおけるＨＣＶ  Ｅ２のための発現ベクターの構築
Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓにおけるＨＣＶ  Ｅ２のための発現ベクターの構築のためにはＨＣＶ  Ｅ２（ａａ３８４−６７３）ＯＲＦについてコードするＤＮＡをそれぞれベクターｐＰＩＣＺαＤ及びｐＰＩＣＺαＥ中のＫＥＸ２又はＳＴＥ１３プロテアーゼ認識部位の後方で正確に融合させた。これら２つのベクターは、ｐＰＩＣＺαＡベクター（インビトロジェン社（米国カリフォルニア州、カールスバッド）の）修飾されたバージョンであり、これによりＫＥＸ２及びＳＴＥ１３部位の後で直接的融合が可能となるような形で親ベクターが修飾された。結果としてもたらされた菌株は、ＩＣＣＧ  Ｎｏ．３６９２（図３４）及びＩＣＣＧ  Ｎｏ．３４７６（図３５）とそれぞれ命名された。ゲノム組込み及び発現分析のためにスクリーニングするＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ菌株に対する形質転換をメーカーの指示に従って実施した。
【０２６４】
１．７  Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのための細胞培養条件
組換え型Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ菌株の種培養を炭素源として２％のスクロースで補足したＹＮＢ（Ｄｉｆｃｏ）の中で増殖させた。これらの種培養を、低温保存したワーキングセルバンクバイアルから開始し、４８時間２００ｒｐｍ，３７℃で２ｌのＥｒｌｅｎｍｅｙｅｒ振とうフラスコに入った５００ｍｌの培地で増殖させた。Ｂｉｏｓｔａｔ  Ｃ発酵槽内で発酵を実施した（ビー．ブラウン社（Ｂ．Ｂｒａｕｎ  Ｉｎｔ．，）ドイツ、メルズンゲン）。培地は１％の酵母抽出物、２％のペプトン及び炭素源としての２％スクロースを含有していた。消泡剤としてポリエチレングリコールを使用した。温度を、ｐＨが４．５で３７℃に制御し、通気は１．０ｖｖｍで恒常に保った。溶存酸素濃度を、増殖期の間に攪拌機の速度を変化させることによって、３０％を超える空気飽和に維持した。発酵を通して、０．４バールの過剰圧力を容器内に維持した。発現期は、３００ｒｐｍという固定した攪拌機速度を含み入れることにより、酸素制限条件下で実施した。発酵を１０％の種培養を添加することで開始させた。炭素源が完全に代謝した時点で、補足的エタノールを段階的に加えて、約０．５％の濃度を維持した。発酵を停止させ、溶存酸素濃度の急激な増加と相関して代謝活性が著しく減少した時点で細胞を収集した。細胞ペレットで−７０℃で保管した。
【０２６５】
１．８  Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａのための細胞培養条件
組換え型Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ種培養を、濃いＹＰＤ倍地（Ｄｉｆｃｏ）内で増殖させた。これらの種培養を、低温保存したワーキングセルバンクバイアルから開始し、４８時間２００ｒｐｍ、３７℃で２ｌのＥｒｌｅｎｍｅｙｅｒ振とうフラスコに入った５００ｍｌの培地で増殖させた。Ｂｉｏｓｔａｔ  Ｃ発酵槽内で発酵を実施した（ビー．ブラウン社ドイツ、メルズンゲン）。培地は１％の酵母抽出物、２％のペプトン及び炭素源としての１％のグリセロールを含有していた。消泡剤としてポリエチレングリコールを使用した。温度ｗｐ、ｐＨが４．８で３７℃に制御し、通気は１．５ｖｖｍで恒常に保った。溶存酸素濃度を、発酵全体を通して攪拌機の速度を変化させることによって、３０％を超える空気飽和に維持した。１０％の種培養を添加することによって、発酵を開始した。増殖期の間、グリセロール濃度をオフラインで監視し、完全にグリセロールが消費されてから２４時間後に、異種タンパク質発現を誘発するために１％のメタノールを添加した。タンジェンシャルフローろ過とによる２４時間の誘発と、それに続く遠心分離工程の後、細胞を収集した。細胞ペレットを−７０℃で保管した。
【０２６６】
結果
Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのグリコシル化突然変異体におけるタンパク質の発現は、かかる菌株の最適以下の増殖特性によって妨害され、このことは野生型のＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ菌株に比べてより低いバイオマス収量ひいては所望のタンパク質のより低い収量を導く。それでも所望のタンパク質の収量は、哺乳動物の細胞の場合よりも実質的に高いものであった。かかる菌株に対する代替案として、過剰グリコシル化が通常不在であり（Ｇｅｌｌｉｓｓｅｎ  ２０００）ＧＳＴ融合としてデング型ウイルスＥタンパク質を発現するべく以前に使用されている（スグルーら、１９９７；６９）という事実のために周知の酵母菌株であるＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓにおいて、ＨＣＶエンベロープタンパク質を発現させた。顕著にも、この結果、野生型Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ菌株の中に見られるものに匹敵する、すなわち過剰グリコシル化を担持するＨＣＶエンベロープタンパク質が、細胞溶解物のウエスタンブロット法で検出された発現産物の分子量に基づいてもたらされることになった。驚くべきことに、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓに密に関係づけされる酵母菌株であるＨａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ（Ｇｅｌｌｉｓｓｅｎ  ２０００）は、本質的に過剰グリコシル化無しで、かくして哺乳動物細胞が発現するものにサイズ的に匹敵する糖部分を作って、ＨＣＶタンパク質を発現することができる。
【０２６７】
結論としては、天然に存在する３つの酵母菌株のうち、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａのみが、過剰グリコシル化されていないＨＣＶエンベロープタンパク質を産生できることがわかった。
【０２６８】
実施例２７：ａ−交接因子リーダー配列の下で、選択された酵母菌株の中で発現されたＨＣＶ  Ｅ１及びＥ２タンパク質の生化学的特性
Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ又はＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅグリコシル化マイナス株内でのＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのａ交接因子リーダー配列を伴うＨＣＶ  Ｅ１及びＥ２タンパク質構築物の発現産物をさらに分析した。ＨＣＶ  Ｅ１ｓ（ａａ１９２−３２６）及びＨＣＶ  Ｅ２ｓ（ａａ３８３−６７３）の両方共がＣ−末端（ｈｉｓ）６−タグ付けされたタンパク質として発現されたことから、発現されＧｕＨＣｌ−可溶化産物の高速でかつ効率の良い精製をＮｉ−ＩＤＡ上で実施した。簡単に説明すると、細胞ペレットを５０ｍＭのリン酸塩、６ＭのＧｕＨＣｌ，ｐＨ７．４（９ｖｏｌ／ｇ細胞）中で再懸濁させた。タンパク質を、３２０ｍＭ（４％ｗ／ｖ）亜硫酸ナトリウム及び６５ｍＭ（２％ｗ／ｖ）の４チオン酸ナトリウムの存在下で室温（ＲＴ）にて一晩スルホン化させた。遠心分離（１０，０００ｇ、３０分、４℃）による凍結−解凍サイクルの後、溶解物を一掃し、それぞれ１％（ｗ／ｖ）及び２０ｍＭの最終濃度になるまでエンピゲン（アイブライト＆ウィルソン、英国）及びイミダゾールを上清に加えた。試料をろ過し、Ｎｉ−ＩＤＡセファロースＦＦカラム上の投入し、これを５０ｍＭのリン酸塩、６ＭのＧｕＨＣｌ、１％のエンピゲン（緩衝液Ａ）に２０ｍＭのイミダゾールを補足したもので平衡化させた。２８０ｎｍでの吸光度が基線レベルに達するまでそれぞれ２０ｍＭ及び５０ｍＭのイミダゾールを含有する緩衝液Ａで、カラムを逐次的に洗浄した。ｈｉｓタグ付けされた産物を、緩衝液Ａ、２００ｍＭのイミダゾール又は５０ｍＭのリン酸塩、６ＭＧｕＨＣｌ、０．２％（Ｅ１について）のエンピゲン２００ｍＭのイミダゾールを適用することによって溶出させた。Ｅ１（ＥＣＡＣＣで受託番号９８０３１２１６として寄託されたＩＧＨ２０１）またはＥ２（ＩＧＨ２１２）に対してむけられた特異的モノクローナル抗体を用いて、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウエスタンブロット法により、精製済み材料を分析した。Ｅ１産物をエドマン分解により直ちに分析した。
【０２６９】
この工程で、ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、ＨＣＶ  Ｅ２についてきわめて複雑なタンパク質バンド写真を顕示したことから、サイズ排除クロマトグラフィーによるさらなる分画を実施した。Ｎｉ−ＩＤＡ溶出液を限外ろ過（ＭＷＣＯ１０ｋＤａ、ｃｅｎｔｒｉｐｌｕｓ，ミリポアアミコン）により濃縮し、ＰＢＳ、１％のエンピゲン又はＰＢＳ、３％のエンピゲンの中でＳｕｐｅｒｄｅｘ  Ｇ２００（１０／３０又は１６／６０；ファーマシア）上に投入した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上の移動に基づき〜８０ｋＤａから〜４５ｋＤａの間のＭｒで、Ｅ２ｓ関連産物を含有する溶出画分をプールし（画分１７〜２３、図３７及び３８）、アルキル化した（ＲＴで３時間１０ｍＭのＤＴＴとのインキュベーションとそれに続くＲＴで３時間３０ｍＭのヨードアセタミドのインキュベーション）。Ｅｎｄｏ  Ｈ（ロシュバイオケミカルズ（ロシュバイオケミカルズ）でアミノ末端配列決定のための試料を処理するか、又はこれを未処理のまま放置した。グリコシル化及び脱グリコシル化されたＥ２ｓ産物を、アミノ末端配列決定のためにＰＶＤＦ膜上でブロッティングした。
【０２７０】
Ｅ１及びＥ２の両方の精製済み産物の配列決定は、ＨＣＶエンベロープタンパク質が部分的にのみ適正にプロセッシングされている（プロセッシングには、シグナル配列の適正な開裂が含まれる）という失望させるような観察事実を導く（表３参照）。さらに大部分の副産物（分解産物及びリーダー配列又はその一部分をなおも含有する産物）はグリコシル化されている。このグリコシル化は、部分的にでさえ、Ｎ−グリコシル化部位をも含有するシグナル配列の未開裂フラグメント上にある。グリコシル化がさらに低い副産物を結果としてもたらすべく、これらの部位を突然変異させることができる。しかしながら、さらに厄介なのは、一部の代替的に開裂された産物が、望ましい無傷のエンベロープタンパク質に比べわずか１〜４個のアミノ酸差しかもたないという発見事実がある。その結果、異なる発現産物間で弁別する充分な生化学特性が欠如していることを理由として、適正にプロセッシングされた産物の精製は、事実上不可能である。分解産物のいくつかは、ａ交接因子リーダーの開裂のために同様に必要とされかくしてこの必須のプロセスを混乱させることなく遮断され得ない、Ｋｅｘ−２様の開裂（例えば、アルギニンの後での開裂であるＥ１のａａ１９６の後で観察される開裂）の結果でありうる。
【０２７１】
実施例２８；大規模産生及び精製のために適した酵母におけるＥ１構築物の発現
ａ−交接因子リーダーに置換するためにその他の複数のリーダー配列が使用され（すなわちＣＨＨ（Ｃａｒｃｉｎｕｓ  ｍａｅｎｕｓ高血糖症ホルモンのリーダー配列）、Ａｍｙ１（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓからのアミラーゼのリーダー配列）、Ｇａｍ１（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓからのグルコアミラーゼのリーダー配列）、Ｐｈｙ５（真菌フィターゼからのリーダー配列）、ｐｈｏ１（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓからの酸性ホスファターゼ由来のリーダー配列）及びＣＬ（リゾチームＣ、１．４−ベーダーＮ−アセチルムラミダーゼＣ））、Ｃ−末端（ｈｉｓ）６タグを伴ってＥ１に連結された。全ての構築物は、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ中で発現され、これらの構築物の各々について、細胞溶解物のウエスタンブロットからすでに、ＣＬ構築物を除き、プロセッシングの度合がきわめて低いという結論を下すことができた。ＣＨＨ−Ｅ１ｓ−（ｈｉｓ）６構築物については、このことは、Ｎｉ−ＩＤＡで精製された材料上でのエドマン分解によって確認された。この方法によっては、いくつかの異なる配列を回収したものの、適正に開裂された産物を検出することは全くできなかった（表４）。
【０２７２】
すでに言及した通り、細胞溶解物のウエスタンブロットは、ＣＬ構築物についての高度の適正なプロセッシングを表わすＥ１特異的タンパク質バンドのパターンを顕示した。このことは、このリーダーが酵母に由来しないため、驚くべきことである。ＧｕＨＣｌで可溶化されたＮｉ−ＩＤＡで精製された材料上のエドマン分解は、実際に、Ｅ１タンパク質の８４％が適正に開裂され、この材料が基本的に分解産物を含まないことを確認した。なおも、未プロセッシング材料の１６％が存在するが、この材料はグリコシル化されていないことから、混合物から容易にこれを除去することができ、適正に開裂されグリコシル化されたＥ１の特異的豊富化が可能となる。このような豊富化方法は、レクチン上のアフィニティクロマトグラフィーであり得、実施例１９には、その他の代替案も示されている。あるいはまた、その他の豊富化手順を選択し最適化するために、グリコシル化されていない材料のより高い疎水特性を使用することもできる。ＣＬ由来の構築物により産生されるようなＥ１の適正なプロセッシング（すなわち、位置１９２での成熟Ｅ１の開始）はさらに、質量スペクトル法によっても確認され、これは又、５つのＮ−グリコシル化部位のうち４つまでが占有され得るということをも確認した。
【０２７３】
蛍光体援用炭水化物電気泳動を用いた糖プロファリングにより、リゾチームリーダーを用いて発現された哺乳動物由来のＥ１及びＨａｎｓｅｎｕｌａ由来のＥ１のオリゴ糖が、単糖７〜１１個という重合度でオリゴマルトースのように、移動するという結論を下すことが可能となる（図５４）。これはさらに、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ発現系が驚くべきことに、過剰グリコシル化されておらずかつ哺乳動物由来のＥ１に類似した長さをもつ糖鎖をもつＥ１を導く、ということをも確認している。
【０２７４】
実施例２９：Ｈａｎｓｅｎｕｌａ由来のＨＣＶ  Ｅ１の抗原的等価性
ＣＬリーダーを用いてＨａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ内で産生されたＨＣＶ  Ｅ１をＮｉ−ＩＤＡ上で精製し、最終的に実施例２７で記載されているように０．２％（ｗ／ｖ）のエンピゲンＢＢ中で溶出させた。エンピゲンを、サイズ排除クロマトグラフィー上で３％のベタインについて交換させた。最後に、ＨＣＶ  Ｅ１を、０．５％のベタインを伴うＰＢＳに対し脱塩させた。簡単に説明すると、２００ｍＭのイミダゾールピークを限外ろ過（１０ｋＤのＭＷＣＯ，Ｃｅｎｔｒｉｐｌｕｓ，ミリポアアミコン）により濃縮し、５ｍＭのＤＴＴでの処理により、ｈｉｓでタグ付けされたＥ１、を脱スルホン化させ、ヨードアセタミド（２０ｍＭ）で３０分後にチオール基をアルキル化させた。アルキル化産物を、ＰＢＳ、１％エンピゲンで平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ  Ｇ２００（ファーマシア）上に投入した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウエスタンブロット法により溶出産物を分析した。相対Ｍｒ〜２９−〜１８ｋＤ（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ移動に基づく）をもつ画分をプールし、濃縮し、ＰＢＳ、３％（ｗ／ｖ）ベタインで平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ  Ｇ２００上に投入して強制的にウイルス様粒子形成（ＶＬＰ）を行った。画分をプールし、濃縮し、ＰＢＳ、０．５％（ｗ／ｖ）ベタインに対し脱塩した。
【０２７５】
ＤＴＴでの還元の後、５ｍＭのＮ−エチルマレイミド（ＮＥＭ）／１５ｍＭ  ＮＥＭ。ｂｉｏでのアルキル化によって、ビオチニル化されたｈｉｓタグ付けＥ１ｓを得た。緩衝液中の３％及び０．５％のベタインがそれぞれ０．２（ｗ／ｖ）及び０．０５％（ｗ／ｖ）のＣＨＡＰＳによって置換されたという点を除き、アセトアミド化されたＥ１ｓについて記載された通りに脱塩工程を実施した。
【０２７６】
哺乳動物細胞培養に由来するＨＣＶ  Ｅ１と同様、酵母由来のタンパク質は、動的光散乱により決定されるように２５ｎｍ〜４５ｎｍの間のサイズをもつ粒子を形成する。光散乱実験のためには、光子相関分光法（ＰＣＳ）ソフトウエアにより制御される粒度分析装置（Ｚｅｔａｓｉｚｅｎ１０００ＨＳ型、マルバーンインストラメント社、ウスターマルバーン英国）を使用した。光子相関分光法又は動的光散乱（ＤＬＳ）は、ブラウン運動を測定しそれを粒度に関係づけする光学的方法である。連続的な可視レーザービームからの光は、懸濁状態にありブラウン運動に基づいて移動する巨大分子又は粒子全体を通して導かれる。レーザー光の一部分は、粒子によって散乱され、この散乱光は、光電子増倍管によって測定される。散乱光の強度の変動は、相関装置内に供給される。こうして適切なデータ解析が実施されるコンピュータへと渡される自動相関関数が生成される。使用されるレーザーは、６３３ｎｍの固定波長をもつ１０ｍＷの単色コヒーレントＨｅ−Ｎｅレーザーであった。各試料について、６回の連続的測定が行なわれた。
【０２７７】
ＨＣＶ慢性キャリヤからの血清とのこのＨＣＶ  Ｅ１の反応性をＥＬＩＳＡ内で決定し、ＷＯ９９／６７２８５で記載されている通りに調整された哺乳動物細胞培養からのＨＣＶ  Ｅ１との反応性と比較した。表６から判断できるように、哺乳動物細胞内で発現されたＨＣＶ  Ｅ１とＨａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ内で発現されたＨＣＶ  Ｅ１の間にはいかなる差異も指摘されなかった。
【０２７８】
実施例３０：Ｈａｎｓｅｎｕｌａ由来のＨＣＶ  Ｅ１の免疫原性等価性
ＣＬリーダーで発現されヨードアセトアミドでアルキル化されたＨａｎｓｅｎｕｌａからのＨＣＶ  Ｅ１又は、ＰＣＴ／ＥＰ９９／０４３４２中に記載されたものと同様にアルキル化された哺乳動物細胞培養に由来するＨＣＶ  Ｅ１を、ミョウバンと共に処方し、Ｂａｌｂ／Ｃマウスの体内に注入した（３週間の間隔をおいて、０．１３％のＡｌｈｙｄｒｏｇｅｌ，Ｓｕｐｅｒｆｏｓ，Ｄｅｎｍａｒｋを含有する１２５μｌ中５μｇのＥ１から成る三回の筋内／皮下注射）。３回目の免疫化の後１０日目にマウスを放血させた。誘発された抗体の終点力価を、哺乳動物及びＨａｎｓｅｎｕｌａ由来の両方のＥ１上で各々のマウス系列について決定した。図５１は、いかなる差異も見られなかったこと、及び得られた力価が同様に、滴定を実施するためにＥＬＩＳＡ内で使用される抗原からも独立していることを示している。
【０２７９】
急性感染後のＨＣＶの慢性的進行を防ぐことのできた哺乳動物細胞培養に由来するアルキル化されたＨＣＶ  Ｅ１と同様に、酵母由来のＨＣＶ  Ｅ１は、ワクチン接種時点で類似の防御応答を誘発した。
【０２８０】
実施例３１：可逆的システイン遮断済みＨＣＶ  Ｅ１の産生：抗原及び免疫原性プロフィール
実施例３０では、酵母及び哺乳動物の細胞培養からのアルキル化されたＨＣＶ  Ｅ１の免疫原性が比較された。しかしながら、アルキル化は、不可逆的な修飾である。従って、我々は、ジチオジピリンジン（ＤＴＤＰ）、ジチオカルバメート（ＤＴＣ）、システイン及びスルホン化によるシステインの可逆的修飾をも試してみた。Ｈ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ細胞ペレツト均質化、細胞溶解、タンパク質スルホン化及びＩＤＡセファロース上でのクロマトグラフィーを、実施例２７内で記載された通りに、ｈｉｓタグ付けされたＨＣＶ  Ｅ１ｓについて実施した。スルホン化した産物を、１％のエンピゲンの存在下でＳＥＣ上に、いかなる還元処理も無く投入し、３％（ｗ／ｖ）のペタイン中のＳＥＣによりＶＬＰを形成させた。溶出液を濃縮し、０．５％のベタインに対し脱塩した。あるいはまた、スルホン化されたＨＣＶ  Ｅ１ｓをＰＢＳ中の５ｍＭのＤＴＴで処理し、２０ｍＭという最終濃度までＲＴで３０分後にＤＴＤＰ、ＤＴ又はシステインを添加した。１％のエンピゲン中のＳＥＣ、３％のベタイン中のＳＥＣ上のＶＬＰ形成工程、及び脱塩工程は、実施例４中でアセトアミド修飾されたｈｉｓでタグ付けされたＨＣＶ  Ｅ１ｓについて記載されている通りに実施した。
【０２８１】
ジスルフィド交換及び凝集を防止するため、それぞれの可逆的遮断薬（最終濃度２ｍＭ）の添加後に、ＨＣＶ  Ｅ１ｓ、ｈｉｓを含有する画分を−７０℃で保管した。
【０２８２】
驚くべきことに、我々は、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａから誘導されたスルホン化されたＨＣＶ  Ｅ１がなおも、Ｈａｎｓｅｎｕｌａからのアルキル化されたＨＣＶ  Ｅ１と同じ範囲内のサイズをもつ粒子を形成できるということを観察した。スルホン化の結果としての負の電荷の高い（８個までのスルホン基を、８個のシステインを含有するＨＣＶ  Ｅ１上で誘発することができる）正味の増加がサブユニット間のイオン斥カを誘発するはずであることから、このことは予想外であった。同様に，テスト対象のその他の可逆的システイン修飾作用物質はなおも粒子形成を可能にしたが、この要領で産生されたＨＣＶ  Ｅ１は、スルホン化された材料に比べてさほど安定していないことが立証された。こうして最終的に、ＨＣＶ  Ｅ１のジスルフィドによる凝集が結果としてもたらされた。これらのその他の遮断薬を使用するためには、条件のさらなる最適化が必要とされる。かかる最適化には、酸化防止剤の添加及び又は、当該技術分野に入る７〜８とは異なるｐＨでの材料の保管が含まれ得る。スルホン化された材料は、すでに評価のために使用された。
【０２８３】
実施例３２：スルホン化されたＨＣＶ  Ｅ１の抗原及び免疫原性プロフィール
表７では、Ｈａｎｓｅｎｕｌａに由来するスルホン化されたＨＣＶ  Ｅ１ｓ（ｈｉｓ）６（ＧｕＨＣｌで抽出され、Ｎｉ−ＩＤＡで精製され、最後に０．５％のベタイン無いで粒子として処方されたＣＬリーダー）のヒト血清との反応性を、哺乳動物の細胞培養に由来するアルキル化されたＨＣＶ  Ｅ１、と比較した。全体的（平均的）反応性は同一であったが、個々の血清についていくかの主要な差異が指摘された。このことは、スルホン化された材料が、アルキル化されたＨＣＶ  Ｅ１に比べ異なる形でそのエピトープの少なくともいくつかを提示するということを暗に意味する。
【０２８４】
Ｈａｎｓｅｎｕｌａからのアルキル化又はスルホン化されたＨＣＶ  Ｅ１（ＧｕＨＣｌで抽出され、Ｎｉ−ＩＤＡで精製され、最後に０．５％のベタイン内で粒子として処方されたＣＬリーダー）をミョウバンと共に処方し、６匹のＢａｌｂ／Ｃマウスの体内に注入した。（３週間の間隔をおいて、各々０．１３％のＡｌｈｙｄｒｏｇｅｌ，Ｓｕｐｅｒｆｏｓ，デンマークを含有する１２５μｌ中５μｇのＥ１から成る３回の筋内／皮下注射）。３回目の免疫化の後１０日目にマウスを放血させた。驚いたことに、我々は、スルホン化された材料での免疫化が、力価査定のためにＥＬＩＳＡ内で使用された抗原とは無関係に、より高い抗原力価を結果としてもたらすということを発見した（図５２）。ただし、同じくこの実験では、分析のために用いられた抗原によって個々の力価が異なっており、これは、ＨＣＶ患者からの血清の場合に指摘された観察事実を確認するものである。従って、可逆的な形で修飾されているシステインを伴うＨＣＶ  Ｅ１は、より高い免疫原性を有し、かくしてＨＣＶ慢性感染に対し防御するワクチンとして高い効力を有する可能性がある。さらに、不可逆的遮断により誘発されたネオエピトープの誘発が起こる確率はさらに低くなる。
【０２８５】
実施例３３：ヘパリンによる未プロセッシングＨＣＶ  Ｅ１の特異的除去
酵母細胞からのＨＣＶエンベロープタンパク質のための特異的精製工程を発見するため、ヘパリンとの結合を評価した。ヘパリンは、複数のウイルスに結合することがわかっており、従ってＨＣＶエンベロープタンパク質に対する結合がすでに示唆されてきた（Ｇａｒｓｏｎら、１９９９）。この潜在的結合を分析するために、ヘパリンをビオチニル化し、ＨＣＶ  Ｅ１との相互作用を、Ｈａｎｓｅｎｕｌａからのスルホン化されたＨＣＶ  Ｅ１、Ｈａｎｓｅｎｕｌａからのアルキル化されたＨＣＶ  Ｅ１及び哺乳動物細胞培養からのアルキル化されたＨＣＶ  Ｅ１のいずれかでコーティングされたマイクロタイタープレート内で分析した。驚くべきことに、Ｈａｎｓｅｎｕｌａからのスルホン化されたＨＣＶ  Ｅ１の場合にのみ強い結合が観察され、一方、哺乳動物細胞培養からのＨＣＶ  Ｅ１との結合は完全に不在であった。ウエスタンブロット法を用いて、我々は，この結合が、ＨＣＶ  Ｅ１タンパク質混合物の最低分子量バンドに特異的であることを示すことができた（図４５）。これは、未グリコシル化成熟ＨＣＶ  Ｅ１ｓ及びＣＬリーダーをなおも含有する未グリコシル化ＨＣＶ  Ｅ１ｓと基本的に同一である、ＣＬリーダーを用いて酵母で産生されたＨＣＶ  Ｅ１の場合である。図４５は同様に、スルホン化の除去時点でなお低分子量のＥ１について結合が観察されるため（レーン４）、ヘパリン結合にとってスルホン化は必須でないということも顕示している。あるいはまた、アルキル化がこの結合を実質的に減少させるが、これは、この例で用いた特異的アルキル化作用物質（ヨードーアセトアミド）によってひき起こされる可能性がある。我々は特異的に、適正にプロセッシングされた及び少なくとも部分的にグリコシル化された材料についてＨＣＶ  Ｅ１調製物を豊富化させることができることから、この発見事実はさらに酵母のためのＣＬ−ＨＣＶ−エンベロープタンパク質発現カセットの工業的応用可能性を実証した。
【０２８６】
実施例３４：哺乳動物又は酵母由来のＨＣＶ  Ｅ１とのワクチンの同一の反応性
Ｍｕｓｔｉｌｌｉ及びその協同研究者らは、１９９９年に、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ及びＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｅｔｉｓ中のＨＣＶ  Ｅ２の発現について記載した。しかしながら、モノクローナル抗体との反応性が酵母由来のＨＣＶ  Ｅ２についてより高いものであったのに対して、哺乳動物に由来するＨＣＶ  Ｅ２で免疫化されたチンパンジーからの血清とはより低い反応性が観察されたことから、精製済み産物は、哺乳動物の細胞（ＣＨＯ）に由来するＨＣＶ  Ｅ２とは明らかに異なっていた。
【０２８７】
このような反応性の違いは、図５３に示されているように本明細書で記載されている方法による場合、哺乳動物細胞又は酵母によって産生されたＨＣＶ  Ｅ１間で指摘されなかった。哺乳動物由来のＨＣＶ  Ｅ１での免疫化の後に７つの異なるチンパンジー血清の反応性は、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ又は哺乳動物由来のＨＣＶ  Ｅ１でテストされた場合同一であり、一方、ＨＣＶ  Ｅ１に対するモノクローナル抗体もほぼ等しい反応性を示している。チンパンジーのうちの２匹（Ｙｏｒａｎ及びＭａｒｔｉ）は、予防的ワクチン研究に関与し、抗原投与時点で急性感染を一掃することができたが，一方対照動物は感染を一掃できなかった。その他の５匹のチンパンジー（Ｔｏｎ、Ｐｈｉｌ、Ｍａｒｃｅｌ、Ｐｅｇｇｙ、Ｆｅｍｍａ）は、治療的ワクチン接種研究に関与し、ＨＣＶ  Ｅ１免疫化の時点で、肝臓生検材料上の組織学的活性指数及び／又は血清中のＡＬＴにより測定されるように、肝臓損傷の減少を示した。
【０２８８】
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Ｏｒａｌ  ４．  ３．  Ｃ型肝炎及び関連ウイルスに関する第６回国際シンポジウム中、Ｂｅｔｈｅｓｄａ  ＵＳＡ
【図面の簡単な説明】
【０２８９】
【図１】配列番号６中に定義されている通りの配列を有するベクターｐＧＥＭＴ−Ｅ１ｓＨ６ＲＢの概略的地図である。
【図２】配列番号９中に定義されている通りの配列を有するベクターｐＣＨＨ−Ｈｉｒの概略的地図である。
【図３】配列番号１２中に定義されている通りの配列を有するベクターｐＦＰＭＴ１２１の概略的地図である。
【図４】配列番号１３中に定義されている通りの配列を有するベクターｐＦＰＭＴ−ＣＨＨ−Ｅ１−Ｈ６の概略的地図である。
【図５】配列番号１６中に定義されている通りの配列を有するベクターｐＦＰＭＴ−ＭＦａ−Ｅ１−Ｈ６の概略的地図である。
【図６】配列番号１７中に定義されている通りの配列を有するベクターｐＵＣ１８−ＦＭＤ−ＭＦａ−Ｅ１−Ｈ６の概略的地図である。
【図７】配列番号２０中に定義されている通りの配列を有するベクターｐＵＣ１８−ＦＭＤ−ＣＬ−Ｅ１−Ｈ６の概略的地図である。
【図８】配列番号２１中に定義されている通りの配列を有するベクターｐＦＰＭＴ−ＣＬ−Ｅ１−Ｈ６の概略的地図である。
【図９】配列番号２２中に定義されている通りの配列を有するベクターｐＳＰ７２Ｅ２Ｈ６の概略的地図である。
【図１０】配列番号２３中に定義されている通りの配列を有するベクターｐＭＰＴ１２１の概略的地図である。
【図１１】配列番号２４中に定義されている通りの配列を有するベクターｐＦＰＭＴ−ＭＦａ−Ｅ２−Ｈ６の概略的地図である。
【図１２】配列番号２５中に定義されている通りの配列を有するベクターｐＭＰＴ−ＭＦａ−Ｅ２−Ｈ６の概略的地図である。
【図１３】配列番号２８中に定義されている通りの配列を有するベクターｐＭＦ３０の概略的地図である。
【図１４】配列番号３２中に定義されている通りの配列を有するベクターｐＦＰＭＴ−ＣＬ−Ｅ２−Ｈ６の概略的地図である。
【図１５】配列番号３５中に定義されている通りの配列を有するベクターｐＵＣ１８−ＦＭＤ−ＣＬ−Ｅ１の概略的地図である。
【図１６】配列番号３６中に定義されている通りの配列を有するベクターｐＦＰＭＴ−ＣＬ−Ｅ１の概略的地図である。
【図１７】配列番号３９中に定義されている通りの配列を有するベクターｐＵＣ１８−ＦＭＤ−ＣＬ−Ｈ６−Ｅ１−Ｋ−Ｈ６の概略的地図である。
【図１８】配列番号４０中に定義されている通りの配列を有するベクターｐＦＰＭＴ−ＣＬ−Ｈ６−Ｋ−Ｅ１の概略的地図である。
【図１９】配列番号４１中に定義されている通りの配列を有するベクターｐＹＩＧ５の概略的地図である。
【図２０】配列番号４２中に定義されている通りの配列を有するベクターｐＹＩＧ５Ｅ１Ｈ６の概略的地図である。
【図２１】配列番号４３中に定義されている通りの配列を有するベクターｐＳＹ１の概略的地図である。
【図２２】配列番号４４中に定義されている通りの配列を有するベクターｐＳＹ１ａＭＦＥ１ｓＨ６ａの概略的地図である。
【図２３】配列番号４５中に定義されている通りの配列を有するベクターｐＢＳＫ−Ｅ２ｓＨ６の概略的地図である。
【図２４】配列番号４６中に定義されている通りの配列を有するベクターｐＹＩＧ５ＨＣＣＬ−２２ａＨ６の概略的地図である。
【図２５】配列番号４７中に定義されている通りの配列を有するベクターｐＹＹＩＧＳＥ２Ｈ６の概略的地図である。
【図２６】配列番号４８中に定義されている通りの配列を有するベクターｐＹＩＧ７の概略的地図である。
【図２７】配列番号４９中に定義されている通りの配列を有するベクターｐＹＩＧ７Ｅ１の概略的地図である。
【図２８】配列番号５０中に定義されている通りの配列を有するベクターｐＳＹ１ＹＩＧ７Ｅ１ｓの概略的地図である。
【図２９】配列番号５１中に定義されている通りの配列を有するベクターｐＰＩＣＺａｌｐｈａＡの概略的地図である。
【図３０】配列番号５２中に定義されている通りの配列を有するベクターｐＰＩＣＺａｌｐｈａＤ’の概略的地図である。
【図３１】配列番号５３中に定義されている通りの配列を有するベクターｐＰＩＣＺａｌｐｈａＥ’  の概略的地図である。
【図３２】配列番号５８中に定義されている通りの配列を有するベクターｐＰＩＣＺａｌｐｈａＤ’Ｅ１ｓＨ６の概略的地図である。
【図３３】配列番号５９中に定義されている通りの配列を有するベクターｐＰＩＣＺａｌｐｈａＥ’Ｅ１ｓＨ６の概略的地図である。
【図３４】配列番号６０中に定義されている通りの配列を有するベクターｐＰＩＣＺａｌｐｈａＤ’Ｅ２ｓＨ６の概略的地図である。
【図３５】配列番号６１中に定義されている通りの配列を有するベクターｐＰＩＣＺａｌｐｈａＥ’Ｅ２ｓＨ６の概略的地図である。
【図３６】配列番号６２中に定義されている通りの配列を有するベクターｐＵＣ１８ＭＦａの概略的地図である。
【図３７】ＭＦａ−Ｅ２−Ｈ６を発現するＨａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａから発現されたＩＭＡＣによる精製済みのＥ２−Ｈ６タンパク質のサイズ排除クロマトグラフィーの溶出プロフィール（実施例１５参照）。Ｘ軸は、溶出体積（ｍＬ単位）を表わす。溶出プロフィールを通る垂直線は、収集された画分を表わしている。「Ｐ１」＝プールされた画分４〜９、「Ｐ２」＝プールされた画分３０〜３５そして「Ｐ３」＝プールされた画分３７〜４４。Ｙ軸は、ｍＡｕ（ミリ吸光度単位）で与えられた吸光度を表わす。Ｘ軸は、ｍＬ単位の溶出体積を表わす。
【図３８】サイズ排除クロマトグラフィー（図３７参照）の後に収集された異なるプール及び画分を、非還元性ＳＤＳ−ＰＡＧＥとそれに続くポリアクリルアミドゲルの銀染色により分析した。分析されたプール（「Ｐ１」、「Ｐ２」及び「Ｐ３」）及び画分（１６〜２６）は、銀染色されたゲルの写真の上部に示されている。左（レーン「Ｍ」）には、分子量マーカーのサイズが示されている。
【図３９】図３７に示されている通りのサイズ排除クロマトグラフィー工程の画分１７〜２３をプールし、アルキル化した。その後、タンパク質材料を、脱グリコシル化のためのＥｎｄｏ  Ｈ処理に付した。未処理材料及びＥｎｄｏ  Ｈ処理済み材料を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で分離し、ＰＶＤＦ膜に対しブロッティングした。ブロットをアミドブラックで染色した。  レーン１：Ｅｎｄｏ  Ｈ−処理前のアルキル化されたＥ２−Ｈ６  レーン２：Ｅｎｄｏ  Ｈ−処理後のアルキル化されたＥ２−Ｈ６
【図４０】Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ中で発現されたＥ１の細胞溶解物のウエスタンブロット分析。ウエスタンブロットは、Ｅ１特異的モノクローナル抗体ＩＧＨ２０１を用いて発色させた。  レーン１〜４：Ｅ１−Ｈ６に接合されたニワトリリゾチームリーダーペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むｐＳＹ１ＹＩＧ７Ｅ１ｓ（配列番号５０、図２８）で形質転換されたＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓクローン内での、それぞれ２日、３日、５日又は７日間の発現の後の発現産物。  レーン５〜７：  Ｅ１−Ｈ６に接合されたａ−交接因子リーダーペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むｐＳＹ１ａＭＦＥ１ｓＨ６ａＹＩＧＩ（配列番号４４、図２２）で形質転換されたＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓクローン内での、それぞれ２日、３日、又は５日間の発現の後の発現産物。レーン８：表示された通りのサイズをもつ分子量マーカーレーン９：ＨＣＶ−組換え型ワクシニアウイルス感染した哺乳動物細胞によって産生された精製済みＥ１。
【図４１】Ｈ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａにより発現されこれによりＣＬ−Ｅ２−Ｈ６からＥ２−Ｈ６までプロセッシングされた固定化金属イオンアフィニティクロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）で精製済みのＥ２−Ｈ６タンパク質分析（実施例１７参照）。異なる洗浄画分（レーン２−４）及び溶出画分（レーン５〜７）内のタンパク質を、還元性ＳＤＳ−ＰＡＧＥとそれに続くゲルの銀染色（Ａ、写真上）またはＥ２に対して向けられた特異的モノクローナル抗体を用いたウエスタンブロット法（Ｂ、写真下）により分析した。分子量マーカーのサイズは、左に記されている。
【図４２】Ｈ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａにより産生されたスルホン化されたＨ６−Ｋ−Ｅ１タンパク質の精製のための、Ｎｉ−ＩＤＡカラム上の第１のＩＭＡＣクロマトグラフィー工程の溶出プロフィール（Ｎｉ２＋が投入されたキレート化セファロースＦＦ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ）（実施例１８参照）。カラムは、２０ｍＭのイミダゾールで補足された緩衝液Ａ（５０ｍＭのリン酸塩、６ＭのＧｕＨＣｌ、１％のエンピゲンＢＢ（ｖ／ｖ）、ｐＨ７．２）で平衡化された。試料適用後、カラムを、（クロマトグラム上で示されているように）それぞれ２０ｍＭ及び５０ｍＭのイミダゾールを含有する緩衝液Ａで逐次的に洗浄した。Ｈｉｓでタグ付けされた産物のさらなる洗浄及び溶出工程を、（クロマトグラム上で示されているように）それぞれ５０ｍＭのイミダゾール及び２００ｍＭのイミダゾールで補足された緩衝液Ｂ（ＰＢＳ１％  エピゲンＢＢ、ｐＨ７．２）を逐次的に適用することによって実施した。以下の画分をプールした：洗浄プール１（画分８〜１１、５０ｍＭのイミダゾールでの洗浄）。溶出した材料を、別々の画分６３〜７２として収集するか又は、溶出プール（画分６３〜６９）を製造した。Ｙ軸は、ｍＡＵ（ミリ吸光度単位）で与えられた吸光度を表わす。Ｘ軸は、ｍＬ単位の溶出体積を示している。
【図４３】Ｈ．  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａにより発現され、ＣＬ−Ｈ６−Ｋ−Ｅ１からＨ６−Ｋ−Ｅ１までプロセッシングされたＩＭＡＣで精製されたＨ６−Ｋ−Ｅ１タンパク質の分析（図４２参照）。洗浄プール１（レーン１２）及び溶出画分６３〜７２（レーン２〜１１）中のタンパク質を、還元性ＳＤＳ−ＰＡＧＥとそれに続くゲルの銀染色（Ａ、写真上）によって分析した。Ｅ１に対して向けられた特異的モノクローナル抗体（ＩＧＨ２０１）を用いたウエスタンブロット法により、ＩＭＡＣ前の試料中（レーン２）、フロースループール中（レーン４）、洗浄プール１中（レーン５）、及び溶出プール（レーン６）中に存在するタンパク質を分析した（Ｂ、写真下；レーン３中にはいかなる試料も投入されなかった）。分子量マーカー（レーンＭ）のサイズは、左側に示されている。
【図４４】Ｅｎｄｏ  Ｌｙｓ−ＣでのＨ６−Ｋ−Ｅ１のｉｎ  ｖｉｔｒｏ処理（精製：図４２参照）の結果をもたらされるＥ１の精製のための、Ｎｉ−ＩＤＡカラム上の第２のＩＭＡＣクロマトグラフィー工程の溶出プロフィール（Ｎｉ２＋が投入されたキレート化セファロースＦＦ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ）。フロースルーは、異なる画分（１〜４０）の形で収集し、Ｅ１−産物の存在についてこれをスクリーニングした。Ｈ６−Ｋ−Ｅ１からプロセッシングされた無傷のＥ１を含有する画分（７〜２８）をプールした。ｍＡＵ（ミリ吸光度単位）で与えられた吸光度を表わす。Ｘ軸は、ｍＬ単位の溶出体積を示している。
【図４５】ビオチニル化されたヘパリンと反応する特異的にＥ１ｓタンパク質バンドを示すウエスタンブロット分析（実施例１９も同様に参照のこと）。ＨＣＶ組換え型ワクシニアウイルス感染した哺乳動物培養から精製された又はＨ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａにより発現されたＥ１ｓ調製物を分析した。垂直線から右側の図版は、ビオチニル化されたＥ１特異的モノクローナルＩＧＨ２００で発達されたウエスタンブロット法を示す。垂直線から左側の図版は、ビオチニル化されたヘパリンで現像されたウエスタンブロット法を示す。これらの結果から、主として比較的低いグリコシル化を受けたＥ１ｓがヘパリンに対する高いアフィニティを有するという結論が導かれた。  レーンＭ；分子量マーカー（分子量は左に表示）。  レーン１；単離中にアルキル化された、哺乳動物細胞からのＥ１ｓ。  レーン２；Ｈ．  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａにより発現され、単離中に、スルホン化されたＥ１ｓ−Ｈ６。  レーン３；Ｈ．  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａにより発現され、単離中に、アルキル化されたＥ１ｓ−Ｈ６。  レーン４；レーン２で投入された通りであるものの、スルホン化されたＣｙｓ−チオール基をＣｙｓ−チオールへと変換するためのシチオトレイトールで処理された同じ材料。
【図４６】ベタインに対するエンピゲンＢＢの交換により、ウイルス様粒子を形成させるためのＰＢＳ、３％ベタイン中のランに付された、スルホン化された形の精製済みのＨ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａで発現されたＥ２−Ｅ６のサイズ排除クロマトグラフィーラフィ（ＳＥＣ）プロフィール。さらなる研究のために使用されるＶＬＰを含有するプールされた画分は、「←→」で表わされている。Ｙ軸は、ｍＡＵ（ミリ吸光度単位）で与えられた吸光度を示す。Ｘ軸は、ｍＬ単位で表わした溶出体積を表わす。実施例２０も同様に参照のこと。
【図４７】ベタインに対するエンピゲンＢＢの交換により、ウイルス様粒子を形成させるためのＰＢＳ、３％ベタイン中のランに付された、アルキル化された形の精製済みのＨ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａで発現されたＥ２−Ｅ６のサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）でプロフィール。ＶＬＰを含有するプールされた画分は、「←→」で表わされている。Ｙ軸は、ｍＡＵ（ミリ吸光度単位）で与えられた吸光度を示す。Ｘ軸は、ｍＬ単位で表わした溶出体積を表わす。実施例２０も同様に参照のこと。
【図４８】ベタインに対するエンピゲンＢＢの交換により、ウイルス様粒子を形成させるためのＰＢＳ、３％ベタイン中のランに付された、スルホン化された形の精製済みのＨ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａで発現されたＥ１のサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）でプロフィール。ＶＬＰを含有するプールされた画分は、「←→」で表わされている。Ｙ軸は、ｍＡＵ（ミリ吸光度単位）で与えられた吸光度を示す。Ｘ軸は、ｍＬ単位で表わした溶出体積を表わす。実施例２０も同様に参照のこと。
【図４９】ベタインに対するエンピゲンＢＢの交換により、ウイルス様粒子を形成させるためのＰＢＳ、３％ベタイン中のランに付された、アルキル化された形の精製済みのＨ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａで発現されたＥ１のサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）でプロフィール。ＶＬＰを含有するプールされた画分は、「←→」で表わされている。Ｙ軸は、ｍＡＵ（ミリ吸光度単位）で与えられた吸光度を示す。Ｘ軸は、ｍＬ単位で表わした溶出体積を表わす。実施例２０も同様に参照のこと。
【図５０】図４８及び４９中で記載されているようにサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）後に単離された通りのＶＬＰのＳＤＳ−ＰＡＧＥ（還元性条件下の）及びウエスタンブロット分析。左側図版：銀染色されたＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル。右側図版：Ｅ１対して向けられた特異的モノクローナル抗体（ＩＧＨ２０１）を使用するウエスタンブロット法。レーン１：分子量マーカー（分子量は左側に表示）；レーン２：スルホン化されたＥ１を含有するＶＬＰのプール（図４８参照）；レーン３：アルキル化されたＥ１を含有するＶＬＰのプール（図４９参照）。実施例２０も同様に参照のこと。
【図５１】哺乳動物細胞中で産生されたＥ１を用いたマウスのワクチン接種の後又は（図版上）又はＨａｎｓｅｎｕｌａで産生されたＥ１でのマウスのワクチン接種後（図版下）に血清中に存在する抗体の終点力価を決定するための、ＥＬＩＳＡ固体支持体上に、哺乳動物細胞内で産生されたＥ１（「Ｍ」）又はＨａｎｓｅｎｕｌａで産生されたＥ１（「Ｈ」）をコーティングした。水平方向の棒は、平均抗体力価を表わす。終点力価（希釈倍数）は、Ｙ軸に表わされている。実施例２２も同様に参照のこと。
【図５２】Ｈａｎｓｅｎｕｌａ産生されたＥ１をアルキル化（「Ａ」又は（「Ｓ」）させ、アルキル化されたＨａｎｓｅｎｕｌａ産生Ｅ１でのマウスのワクチン接種後（図版上）又はスルホン化されたＨａｎｓｅｎｕｌａ産生Ｅ１でのマウスのワクチン接種後（図版下）の血清中に存在する抗体の終点力価を決定するためにＥＬＩＳＡ固体支持体上にコーティングした。水平方向棒は、平均抗体力価を表わす。終点力価（希釈倍数）は、Ｙ軸に表わされている。実施例２３も参照のこと。
【図５３】ＨＣＶ組換え型ワクシニアウイルスに感染した哺乳動物細胞によって産生されたＨＣＶ  Ｅ１及びＨ．  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａにより産生されたＨＣＶ  Ｅ１を直接ＥＬＩＳＡプレートにコーティングした。哺乳動物細胞によって産生されたＥ１に対し発生させられたマウスのモノクローナル抗体（図版下）及び哺乳動物細胞により産生されたＥ１でワクチン接種されたチンパンジー（図版上）の血清中の抗体の終点力価を決定した。チンパンジーＹｏｒａｎ及びＭａｒｔｉは予防的にワクチン接種を受けた。チンパンジーＴｏｎ、Ｐｈｉｌ、Ｍａｒｃｅｌ、Ｐｅｇｇｙ及びＦｅｍｍａは、治療的にワクチン接種を受けた。黒色棒線：哺乳動物細胞により産生されたＥ１でコーティングされたＥＬＩＳＡプレート。白色棒線：Ｈａｎｓｅｎｕｌａにより産生されたＥ１でコーティングされたＥＬＩＳＡプレート。終点力価（希釈倍数）はＹ軸に示されている。実施例２４も参照のこと。
【図５４】組換え型ワクチンウイルスに感染した哺乳動物細胞によって産生されたＥ１及びＨａｎｓｅｎｕｌａによって産生されたＥ１−Ｈ６タンパク質から遊離されたオリゴ糖の蛍光体援用炭水化物ゲル電気流動法。  レーン１：単糖類の数（３〜１０、Ｇ３〜Ｇ１０により表示）が左に示されているグルコースラダー標準。  レーン２：哺乳動物細胞によって産生された（アルキル化された）Ｅ１から遊離された２５μｇのＮ結合型オリゴ糖。  レーン３：Ｈａｎｓｅｎｕｌａによって産生された（アルキル化された）Ｅ１−Ｈ６から遊離された２５μｇのＮ結合型オリゴ糖。  レーン４：１００ｐｍｏｌｅｓのマルトテトラオース。  図２５も参照のこと。
【図４２】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【国際調査報告】
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