(57)【要約】定方向進化によりキメラポリヌクレオチドを作製する方法が記載される。前記方法において、目的のスプライスポイントは、好ましくは、ランダム選択またはポリヌクレオチドのアラインメントに関する情報を用いるかのいずれかによって、スプライスポイントの数を規定し、かつスプライスポイントを選択するアルゴリズムの使用により、ポリヌクレオチドの基本セットのポリヌクレオチド内に同定される。アルゴリズムは、スプライスポイント間の所望の距離の規定、および／またはスプライスポイントの偏向選択のための重みづけ因子を含むさらなる因子を含みうる。キメラポリヌクレオチドは、プライマー（例えば、二重プライマーまたは非オーバーラッププライマー）およびポリメラーゼ連鎖反応またはコンビナトリアルストラテジーを用いて作製される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）ポリヌクレオチドの基本セットを提供する工程、ここで基本セットは２つ以上の異なるポリヌクレオチドを含む；
ｂ）基本セット中のポリヌクレオチド内のスプライスポイントを同定する工程、ここで基本セット中の各ポリヌクレオチドは、同数のスプライスポイントを有する；
ｃ）各スプライスポイントに対してオリゴヌクレオチド二重プライマーセットを作製する工程、ここでセット中の各二重プライマーは、「プレ」領域、およびそれに連結され、かつすぐに続く「ポスト」領域を含有し、ここで「プレ」領域は基本セット中の１つのポリヌクレオチド内のスプライスポイントに対するオリゴヌクレオチドプライマーを含み、および「ポスト」領域は、基本セット中の別のポリヌクレオチド内のスプライスポイントに対するオリゴヌクレオチドプライマーの相補体を含み、および二重プライマーのセットは、各スプライスポイントに対するプレおよびポスト領域の全ての考えられうる組み合わせを含む二重プライマーを含む；
ｄ）ポリメラーゼ連鎖反応において二重プライマーセットを使用し、断片の組み合わせを増幅する工程；
を含み、それにより多数のキメラポリヌクレオチドを作製し、各キメラポリヌクレオチドが基本セット中の少なくとも２つのポリヌクレオチド由来の断片を含む、キメラポリヌクレオチドの作製方法。
【請求項２】
ａ）ポリヌクレオチドの基本セットを提供する工程、ここで基本セットは２つ以上の異なるポリヌクレオチドを含む；
ｂ）基本セットのポリヌクレオチド内の目的のスプライスポイントを同定する工程、ここで基本セット中の各ポリヌクレオチドが同数のスプライスポイントを有し、スプライスポイントが、各ポリヌクレオチドを正しい順序でＭ連続断片に分ける；
ｃ）基本セット中の各ポリヌクレオチドに対するＭ断片の各断片に対してオーバーラップしないオリゴヌクレオチドを作製する工程；
ｄ）連続した断片に対応するオリゴヌクレオチドを正しい順序で連結する工程；
ｅ）正しい順序の断片の組み合わせを選択する工程；
を含み、それにより多数の正しい順序のキメラポリヌクレオチドを作製し、ここで各キメラポリヌクレオチドが基本セット中の各ポリヌクレオチド由来の断片を含む、キメラポリヌクレオチドの作製方法。
【請求項３】
工程（ｄ）が：
ｄ１）２つの連続した断片に対応するオリゴヌクレオチドを正しい順序で連結する工程；
ｄ２）正しい順序の断片の組み合わせを選択する工程；
ｄ３）正しい順序の２つの連続した断片の全てのセットについて工程（ｄ１）および（ｄ２）を繰り返す工程；
ｄ４）工程（ｄ２）および（ｄ３）の産物を混合し、正しい順序で連結する工程、
により行われ、
それにより、多数の正しい順序のキメラポリヌクレオチドを作製し、各キメラポリヌクレオチドが基本セット中の各々のポリヌクレオチド由来の断片を含む、請求項２記載の方法。
【請求項４】
基本セットが２つより多くの異なるポリヌクレオチドを含む請求項１または２記載の方法。
【請求項５】
基本セットの少なくとも２つのポリヌクレオチドが互いに高相同性を有する請求項１または２記載の方法。
【請求項６】
基本セットの少なくとも１つのポリヌクレオチドが遺伝子全体を含む請求項１または２記載の方法。
【請求項７】
基本セットのポリヌクレオチドの全てが遺伝子全体を含む請求項６記載の方法。
【請求項８】
基本セットのポリヌクレオチドのいずれも遺伝子全体を含まない請求項１または２記載の方法。
【請求項９】
基本セットの少なくとも１つのポリヌクレオチドが合成核酸を含む請求項１または２記載の方法。
【請求項１０】
少なくとも１つの非天然制限ポイントを基本セットの少なくとも１つのポリヌクレオチドに導入する工程をさらに含む請求項2記載の方法。
【請求項１１】
キメラポリヌクレオチドが基本セット中の各ポリヌクレオチド由来の断片を含有するポリヌクレオチドを含む請求項１または２記載の方法。
【請求項１２】
スプライスポイントが、スプライスポイントの位置を規定するアルゴリズムの使用により同定される請求項１または２記載の方法。
【請求項１３】
スプライスポイントがランダム選択により同定される請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
アルゴリズムがポリヌクレオチドのアラインメントに関する情報を組み込んでいる請求項１２記載の方法。
【請求項１５】
アルゴリズムがスプライスポイント間の所望の距離を規定する請求項１２記載の方法。
【請求項１６】
アルゴリズムがスプライスポイントの選択を偏向させるための重みづけ因子を組み込んでいる請求項１２記載の方法。
【請求項１７】
重みづけ因子が、基本セットのポリヌクレオチド中の目的の領域のスプライスポイントの選択を偏向させる請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
重みづけ因子が、基本セットのポリヌクレオチド間の相同性の予め選択されたパーセントを有する領域のスプライスポイントの選択を偏向させる請求項１６記載の方法。
【請求項１９】
重みづけ因子が、基本セットのポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドの構造的に同定可能な領域のスプライスポイントの選択を偏向させる請求項１６記載の方法。
【請求項２０】
キメラポリヌクレオチドが固相上に作製される請求項１または２記載の方法。
【請求項２１】
産物のほどけた一本鎖末端がエキソヌクレアーゼで簡単に消化される、ポリメラーゼ連鎖反応中に１回以上の「洗練」工程をさらに含む請求項１記載の方法。
【請求項２２】
ポリメラーゼ連鎖反応を支持できない産物に高ストリンジェンシーでハイブリダイズし、それによりポリメラーゼ連鎖反応中の伸長を妨げる、１つ以上の「ポイズンプライマー」を利用する工程をさらに含む請求項１または２記載の方法。
【請求項２３】
工程（ｄ２）において、正しい順序の断片の組み合わせが、選択的ポリメラーゼ連鎖反応増幅により選択される請求項３記載の方法。
【請求項２４】
工程（ｄ２）において、正しい順序の断片の組み合わせが、断片の不正確な順序の組み合わせのブロッキングにより選択される請求項３記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
関連出願
本出願は、2001年５月３に出願された米国仮出願第60/288,527の利益を請求する。上記出願の全体の教示が本明細書中に参考として援用される。
【０００２】
発明の背景
新規特性を有するタンパク質の産生は、バイオテクノロジー工業および基本生命科学研究コミュニティの数十年間にわたる目的である。操作対象のタンパク質は、酵素（新規化学作用、基質特異性、変化した溶解性または変化した安定性について操作される）；レセプター；抗体（変化したリガンド認識について操作される）；DNA結合タンパク質（新規部位を認識するか、または細胞内の事象のシグナルを提供するように操作される）；および他のタンパク質が挙げられる。所望の目的への２つ大きな道は、合理的設計および定方向進化である。
【０００３】
合理的デザインの１つのタイプは、存在するタンパク質に直接には関連しない配列が、折りたたまれた実体を産生するために特定化され、合成される新規アプローチを含む。しかし、タンパク質折りたたみの知識は、新規タンパク質の実際的産生のためには不十分である。合理的デザインのための別のアプローチは、存在するタンパク質を使用し、特定の変化（例えば、基質または補因子特異性を変化させるためのアミノ酸残基修飾）を取り込ませる。例えば、首尾良い、しかし限られたアプローチは、親遺伝子によってコードされる領域が独立して折りたたまれるが、連結領域により結合されるタンパク質を製造するために２つ以上の遺伝子がインフレームで結合された融合タンパク質の産生である。
【０００４】
タンパク質および経路設計の問題への定方向進化法の導入は、過去10年間で相当な注目および興奮を引きつけている。合理的タンパク質設計が進歩してきたが、新規酵素および構造を開発するために天然の選択に基づく方法を使用するアイディアは大きなアピールを有する。定方向進化の最初の方法は、変異誘発および選択のサイクルに基づいた（例えば、Shao,Z.およびArnold, F.H., Curr.Opin.Struct.biol. 6(4):513-8 (1996)参照）。このストラテジーを用いて成功が記録されたが、所望の特徴を有する酵素を進化させる多くの試みは、常に十分に理解されない理由のために失敗した。さらに、定方向進化において、自然選択のような、全ての中間体が合理的に成功する出発物質から所望の結果の物質への経路が存在しなければならない。この手順における弱点は、非常に小さなジャンプにおいて進行する必要性であり、到達可能である進化スペースの容積を制限する。
【０００５】
より最近では、大雑把に「遺伝子シャッフリング」と呼ばれる方法が試みられている（例えば、Crameri, A.ら、Nature 391(6664):288-291 (1998)参照）。最初に、相同性遺伝子の基本セットが制限され、断片がランダムに連結される。かかるプロトコールにおける産物のほとんどは、ナンセンスDNAであったが、極少数のケースで、関連遺伝子の相同性断片が正しい順序で連結された。混合DNAで形質転換された宿主に選択基準を適用することにより、所望の新規特性を有する比較的少数のキメラが同定され得た。キメラ遺伝子（または遺伝子産物）は、２つ以上の親遺伝子に由来する領域を含む；安定な折りたたみの合理的な機会を有する、キメラタンパク質は、インフレームで、順序に結合された関連する遺伝子の基本セット由来の断片から構成される遺伝子に由来した。この方法は、２、３の以上の点変異により基＿本遺伝子とは異なる安定に折りたたまれたキメラの産生を可能にし、自然進化により一般には到達できなかったさらなる進化経路を提供した。しかし、安定に折りたたむ能力を有し、所望の活性を有する非常に小さなパーセンテージの断片のみが作製された。さらに、基本セットにより及ぶ進化スペースの領域を作る潜在的キメラの数は多数である。
【０００６】
定方向進化法へのポリメラーゼ連鎖反応（PCR）の導入（例えば、Crameri, A. ら、Nature 391(6664):288-291 (1998); Newton, C.R.およびGraham,A., PCR(BIOSis Scientific Publishers, Oxford, U.K., 1994）;およびPelletier, J.N.,Nat.Biotechnol. 19 (4):314-5 (2001)参照)は、天然のスプライス部位での関連するDNA断片の秩序ある連結を可能にした。しかし、断片が合理的な融解およびアニーリング温度で互いにプライムしなければならないので、それらが相互プライミング可能であるように十分な関連性を必要とするような高い類似性の領域でのみ２つの遺伝子の間でスプライスが起こる。さらに、全ての可能なキメラを産生し、スクリーニングする方法はまだわかっていない。生産的方法で進化スペースを調べるための方法が依然必要とされている。
【０００７】
発明の要旨
本発明は、定方向進化を含む目的のためにキメラポリヌクレオチドを作製する方法に関する。本方法は、キメラポリヌクレオチドのプレ特定化されたセットの作製を含む。これは、前インシリコ遺伝子シャッフリングにより促進されうる。本方法において、３つ以上の異なるポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドの基本セットが使用される。ある態様では、基本セットのポリヌクレオチドの少なくとも２つは、プライミングするために互いにアニールするのに十分な相同性を有する。基本セットの１つ以上のポリヌクレオチドは、遺伝子全体を含みうる；あるいは、基本セットのポリヌクレオチドのいずれも遺伝子全体を含み得ない。所望される場合、基本セットの１つ以上のポリヌクレオチドは、合成核酸を含みうるか、および／または１つ以上の非天然スプライスポイントを取り込みうる。
【０００８】
目的のスプライスポイントは、基本セットのポリヌクレオチド内に同定され、ここで基本セット内の各ポリヌクレオチドは同数のスプライスポイントを有する。スプライスポイントは、天然に存在するスプライスポイントの位置を規定するアルゴリズムの使用により同定されうる（断片が互いにプライミングできるのに十分な相同性の領域により規定される）。天然の相同性に依存しない合成方法のために、スプライスポイントは、ランダム選択により同定されうる；あるいは、それらは、ポリヌクレオチドのアラインメントに関する情報を使用して同定されうる。アルゴリズムは、スプライスポイント間の所望の距離の定義づけ、および／または基本セットのポリヌクレオチド中の目的の領域内のスプライスポイントの偏向選択（bias selection）；基本セットのポリヌクレオチド間の相同性の予め選択されたパーセンテージを有する領域中のスプライスポイントの偏向選択；および／または基本セットのポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドの構造的に同定可能な領域内のスプライスポイントの偏向選択の重みづけ因子（weighingfactor）等のスプライスポイントの偏向選択のための重みづけ因子を含むさらなる因子を含みうる。
【０００９】
ある態様では、二重プライマーが、キメラポリヌクレオチドを産生するために使用される。オリゴヌクレオチド二重プライマーセットは、各スプライスポイントについて作製され、ここでセット中の各二重プライマーは、「プレ」領域、それに連結されてすぐに続く「ポスト」領域を含む。「プレ」領域は、基本セット中の１つのオリゴヌクレオチド中のスプライスポイントのためのオリゴヌクレオチドプライマーを含み、「ポスト」領域は、基本セット中の別のポリヌクレオチド中の対応するスプライスポイントの補完のためのオリゴヌクレオチドプライマーを含む。二重プライマーのセットは、各スプライスポイントに関するプレおよびポスト領域の全ての可能な組み合わせを含む二重プライマーを含む。二重プライマーセットは、断片の組み合わせを増幅するためのポリメラーゼ連鎖反応に使用され、従って多数のキメラポリヌクレオチドを作製し、ここで各キメラポリヌクレオチドは基本セット中の少なくとも２つのポリヌクレオチドに由来する断片を含む。
【００１０】
別の態様では、基本セットのポリペプチド内の目的のスプライスポイントが同定される場合、スプライスポイントは、各ポリヌクレオチドを正しい順序のM連続断片に分ける。非オーバーラップオリゴヌクレオチドは、基本セット中の各ポリヌクレオチドについてＭ断片の各断片に対して作製される；これらのオリゴヌクレオチドはプライマーではない。なぜなら、それらは、オーバーラップを有さず、アニールせず、かわりにコンビナトリアルに結合される（例えば、順序のリガーゼ反応により）。連続断片に対応するオリゴヌクレオチドは、正確な順序で連結され、多数の正確な順序のキメラポリヌクレオチドが作製され、ここで各キメラポリヌクレオチドは、基本セット中の小さいくらかの、または全てのポリヌクレオチド由来の断片を含む。ある態様では、２つの連続断片に対応するオリゴヌクレオチドのペアは、ダイマーを作製するために連結され、ダイマーは続いて連続的に連結され、正確な順序のキメラポリヌクレオチドが作製される。
【００１１】
いずれかの方法では、得られたポリペプチドは、基本セット中の少なくとも２つのポリヌクレオチド由来の断片を含む；ある態様では、キメラポリヌクレオチドは、基本セット中の各ポリヌクレオチド由来の断片を含むポリヌクレオチドを含む。所望の場合、ポリヌクレオチドの作製の間に固相が使用され得、キメラポリヌクレオチドは固相に結合される。さらなる工程が、他のキメラポリヌクレオチドの利益となるように所定のキメラポリヌクレオチドの作製を制限するために含まれうる：例えば、ポリメラーゼ連鎖反応の間に１以上の「洗練（polish）」工程が含まれ得、ここで産物のほどけた（loose）一本鎖末端がエキソヌクレアーゼで簡単に（briefly）消化される。別の例では、１つ以上の「ポイズン（poisoned）プライマー」が使用され得、ここでポイズンプライマーは、ポリメラーゼ連鎖反応を支持することができない産物に高ストリンジェンシーでハイブリダイズし、それによりポリメラーゼ連鎖反応の間の伸長を妨げる。
【００１２】
本明細書中に記載される方法は、ポリペプチドが調製されうる新規キメラポリヌクレオチドのフレキシブルな作製を可能にする。本方法は、基本セット中のポリヌクレオチドのための進化スペースの生産的サンプルを提供し、密接には相同性でない基本セット中のポリヌクレオチドの使用を可能にし、それにより定方向進化の伝統的な様式によって以前には入手不可能であったキメラポリヌクレオチドが作製される。
【００１３】
発明の詳細な説明
本発明は、ポリヌクレオチドの基本セットの定方向進化を使用する、ポリペプチド（「キメラポリペプチド」）をコードするポリヌクレオチド等のキメラポリヌクレオチドの作製方法に関する。
【００１４】
ポリヌクレオチドの基本セット
本明細書中に記載されるように、「ポリヌクレオチド」は、ヌクレオチド（例えば、遺伝子、遺伝子断片、cDNA、mRNA）のポリマー鎖であり、「ポリペプチド」はアミノ酸のポリマー鎖（例えば、タンパク質）である。「基本セット」は、２つ以上のポリヌクレオチド、好ましくは３〜12ポリヌクレオチド等の３つ以上のポリヌクレオチドの群であり：ポリヌクレオチドの基本セットは、定方向進化のための出発物質として使用される。基本セットのポリヌクレオチドは、任意の長さであり得る；一般に、それらは20ヌクレオチド長よりも大きい（例えば、約50ヌクレオチド長以上、好ましくは約75ヌクレオチド長以上、より好ましくは約100核酸長以上）；所望であれば、任意の1つのポリヌクレオチドの短い断片のみがキメラポリヌクレオチドの作製の間に使用されることを含む。ある態様では、基本セットは、高い配列相同性または同一性を有する少なくとも２つのポリヌクレオチドを含む；好ましい態様では、基本セットの少なくとも２つのポリヌクレオチドは、ポリメラーゼ連鎖反応の間にプライミングのために互いにアニールするのに十分な相同性を有する。別の態様では、基本セットは、１つ以上の領域において構造的相同性を有するポリペプチドをコードする少なくとも２つのポリヌクレオチドを含む。
【００１５】
２つの核酸配列の相同性または同一性パーセントを決定するために、配列は、最適な比較の目的のために整列される（例えば、他の核酸分子との最適なアラインメントのためにギャップが１つの核酸分子の配列に導入されうる）。次いで、対応するヌクレオチド位置のヌクレオチドが比較される。一方の配列中のある位置が他方の配列中の対応する位置と同じヌクレオチドで占められている場合、分子はその位置で相同である。本明細書中で使用される場合、核酸「相同性」は核酸「同一性」と等価である。２つの配列間の相同性パーセントは、配列により共有される同一位置の数の関数である（すなわち、相同性パーセントは同一位置の数／位置の総数×100に等しい）。好ましい態様では、基本セット中の少なくとも２つのポリヌクレオチドは、少なくとも50％以上の相同性；より好ましくは70％以上の相同性；さらにより好ましくは80％以上の相同性；さらにより好ましくは90％以上の相同性を有する。本明細書中で使用される「高」相同性は、80％以上の相同性をいう。
【００１６】
本発明のある態様では、基本セットの１つ以上のポリヌクレオチドは、全長遺伝子を含む。本明細書中で使用される「遺伝子」は、典型的には、特定のポリペプチド（例えば、タンパク質）をコードする染色体上に位置しうる、ヌクレオチド（例えば、DNAまたはRNA）の特定の配列をいう。本発明の別の態様では、基本セットの１つ以上のポリヌクレオチドは、部分的な遺伝子（例えば、遺伝子の１つ以上のエキソンを含有するポリヌクレオチド）を含む。本発明のさらに別の態様では、基本セットのポリヌクレオチドは、合成ヌクレオチド配列を含む。
【００１７】
基本セットのポリヌクレオチドは、天然に存在する核酸（例えば、生物中で見出される核酸、例えば、ゲノムDNA、相補DNA（cDNA）、染色体DNA、プラスミドDNA、mRNA、tRNA、および／またはrRNA）を含みうる。ポリヌクレオチドはまた、修飾核酸を含む。「修飾」核酸は、例えば、上記のような天然に存在するが、１つ以上のヌクレオチドが変化させる（例えば、付加、欠損、または修飾）ように修飾される核酸を含む。別の態様では、基本セットのポリヌクレオチドは、周知および／または市販の手順、例えば、自動化核酸合成機を用いて、固相上に調製される核酸が挙げられるがこれらに限定されない合成核酸を含みうる。さらに別の態様では、１つ以上の型の核酸の組み合わせが存在しうる（例えば、天然に存在する、および／または修飾および／または合成核酸）。所望される場合、天然に存在する、修飾および／または合成核酸は、修飾ヌクレオチドを含みうる。本明細書中で使用される場合、修飾ヌクレオチドは、天然に存在するヌクレオチドとは異なるように構造的に変化されたヌクレオチドである。
【００１８】
基本セットのポリヌクレオチドは、標準的な手順を用いて種々の生物学的および／または化学的材料から得られうる。例えば、天然に存在するポリヌクレオチド（例えば、遺伝子）は、診断および／または予後の目的のために収集された家畜またはヒト臨床試験サンプル由来の器官、組織、および／または細胞から得られうる。例えば、細胞は溶解され、得られた溶解物は、当業者が精通する技術を用いて処理され、核酸（例えば、DNAおよび／またはRNA）の水溶液が得られる（例えば、Ausebel, F.ら、Current Protocols inMolecular Biology, Wiley, New York (1988); Maniatisら、Molecular Cloning: ALaboratory Mannual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York(1982)参照）。適切である場合、核酸は、例えば、制限エンドヌクレアーゼでの処理または他の部位特異的化学的切断法により切断されて、所望のポリヌクレオチドを含む断片が得られうる。ポリヌクレオチドはまた、例えば、自動化核酸合成機を用いてヌクレオチドモノマーから合成されうるか、または組換えDNA方法論を用いて得られうる。
【００１９】
所望される場合、基本セットのポリヌクレオチドは、定方向進化を促進する特性を導入することにより修飾されうる。例えば、特定の酵素により認識される一般的な制限部位は、標準的な方法によりポリヌクレオチドに導入されうる（例えば、PCRベース変異等による部位特異的変異誘発）。本明細書中で使用される「導入された」または「非天然の」制限部位は、以前には制限部位が存在しなかった点で、またはアラインメントがクロス配列（cross-sequence）プライミングには不十分な天然の相同性を有する点でポリヌクレオチドに組み込まれる制限部位である。例えば、以前に存在していた異なる制限部位（例えば、異なる酵素により認識される制限部位）が組み込まれうる。好ましい態様では、コードの縮重により、ポリヌクレオチドによりコードされるアミノ酸配列に影響を与えることなく、制限部位が導入されうる。一般的な制限部位は、例えば、基本セット中の他の全てのポリヌクレオチド中の同族を置換するために用いられる、ある配列由来の指定されたスプライス位置等のプライミングに適切な短い領域でありうる。
【００２０】
キメラポリヌクレオチドの設計：「インシリコ」調製
本発明の方法では、キメラポリヌクレオチドは、基本セットのポリヌクレオチドに基づいて設計される。本明細書中で使用される「キメラポリヌクレオチド」は、基本セット中の少なくとも２つのポリヌクレオチド由来の断片を含むポリヌクレオチドである。好ましい態様では、キメラポリヌクレオチドは、基本セット中の各ポリヌクレオチド由来の１つ以上の断片を含む。本明細書中で使用されるポリヌクレオチドの「断片」は、ポリヌクレオチド全体よりも短い：例えば、基本セット中のポリヌクレオチドが300ヌクレオチド長である場合、そのポリヌクレオチドの断片は、ポリヌクレオチドの１〜299の連続したヌクレオチドを含む。通常、断片は、ポリヌクレオチド中の２つのスプライスポイント間にあるポリヌクレオチドの一部を含むか、またはポリヌクレオチドの末端（すなわち、5'または3'末端）とポリヌクレオチド内のスプライスポイントの間にあるポリヌクレオチドの一部を含む。ポリヌクレオチド内の「スプライスポイント（splicepoint）」は、ポリヌクレオチドが断片化される位置である。
【００２１】
キメラポリヌクレオチドを作製するために、基本セットのポリヌクレオチド内の目的のスプライスポイントが同定される。前記セット中の各ポリヌクレオチドは、インシリコで同じ数のスプライスポイントを有するが、インビトロでキメラポリヌクレオチドを産生する場合に、スプライスポイント間の断片の全てが使用される必要はない。ある態様では、基本セットのポリヌクレオチド内の天然のスプライスポイントを規定および整列するアルゴリズムが使用される。別の態様では、ランダムスプライスポイントを選択するアルゴリズムが使用される。本明細書中で使用される用語「アルゴリズム」は、好ましくは（必須ではない）コンピューターの補助を伴って、操作の反復を頻繁に含む有限数の工程で問題（例えば、スプライスポイントの同定）を解決するための段階手順をいう。
【００２２】
いずれかの態様では、アルゴリズムは、所望のスプライスポイントの数および基本セット中の配列のアラインメントを含む、所望のパラメータを組み込みうる。さらなる態様では、アルゴリズムは、スプライスポイント間（PCRプライミングを促進するために、例えば、約８〜20塩基対離れて）の所望の距離に関するパラメータをさらに含みうる；所望される場合、アルゴリズムは、基本セットのポリヌクレオチドのハイブリダイズした断片の融点に関するパラメータをさらに含みうる（例えば、TmaxおよびTmin；例えば、約50〜75℃のTm）。
【００２３】
所望される場合、基本セットのポリヌクレオチド配列中の目的の領域（例えば、相同性がポリメラーゼ連鎖反応（PCR）の間のハイブリダイゼーションに好都合である領域）中に位置するスプライスポイントが同定される予備工程が付加され得る。正確なマッチの数のペア様スライドボックス（pairwisesliding box）調査が形成されうる；なぜなら、浮動小数点（floating point）計算が必要とされないので、これはTmを用いる計算よりも速い。低利用性の配列領域は、スプライスポイントとして使用される領域から廃棄され得、特定の断片内の低利用性の配列もまた廃棄されうる。次いで、相同性領域内のスプライスポイントは、全体のアラインメントを調査することなく同定されうる。この予備工程は、例えば、基本セットがスーパーファミリーアラインメントから得られたオーバーラップしたオリゴヌクレオチドのセットを含む場合、PCR（下記ように）を用いてキメラを構築するために特に有用である；いくつかの配列は、ポリヌクレオチドの短い断片に対応する、１つのみのオリゴヌクレオチドをキメラのセットに与えるかもしれない。
【００２４】
あるいはまたはさらに、所望される場合、アルゴリズムは、「重みづけ（weighing）」または「偏向（biasing）」因子を組み入れうる。ある態様では、スプライスポイントのための都合のよい領域は、カットオフ基準として特定化された領域または特定化された数または特定化された領域中の正確なマッチを用いて同定されうる。例えば、偏向因子は、特定のスプライスポイント（ポリヌクレオチドの始まりまたは終わり付近等）が拒絶されうるようにセットされうる。特定化された領域内のスプライスポイントのセットは、Tm計算、およびTminが天然セットのコンセンス配列に達するまで、基本セット中の各ポリヌクレオチドの増加性調整によって天然セットに付加される他の配列から同定されうる。ある態様では、Tmは、約50〜75℃に設定される；これは、典型的には、約２つの間違いを有する、14〜20塩基対領域のハイブリダイゼーションに対応する。重みづけ因子は、特定の相同性（例えば、高相同性、または低相同性）を有する基本セットのポリヌクレオチドの領域中のスプライスポイントの選択を偏向（bias）するように設計されうる；あるいはまたはさらに、重みづけ因子は、スプライスポイントの選択のための構造的「マスク(mask)」を取り込み得、これは、基本セットのポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドの構造的に同定可能な領域（例えば、介在性領域；ループ；膜貫通配列；ドメインまたはサブドメイン境界；補因子、リガンド、補欠分子族のための結合部位の境界および内部区画；および制御エレメントに関する境界および内部区画等）中のスプライスポイントの選択を偏向する。
【００２５】
例えば、アルゴリズムのある態様では、基本セットのポリヌクレオチドで始まり、アレイ形態中の配列アラインメントA(i,j)、ここでiはポリヌクレオチドの数であり、jはアラインメントにおける配列位置である；A(i,j)はベースキャラクターまたは空白でありうる。スライドボックスアルゴリズムは、アラインメントの下方（down）に幅ｎのボックスをもたらし、各位置での全ての塩基対に関する融点Ｔ（i,j）を計算する。この計算は、所望であれば間違いを含みうる。T(i,j)の過半数が高い場合、ｎは減少し、T(i,j)は、最大数がThotおよびTcoldの特定化された制限間になるまで、再計算される。制限内のT(i,j)の数が、開始点およびボックスサイズとともに保存される。最高のｍオーバーラップが報告されうる。この方法は、高度に相同性な配列を有する基本セットについて特に良好に作用する。
【００２６】
アルゴリズムの別の態様では、アルゴリズムは、位置ｋで始まり、ｌ塩基伸長する断片に対する配列ｎとｍの間のT(n,m,k,l)に関するTmaxおよびTminに関する全ての対様値（pairwise value）を計算する。ThotとTcoldとの間の全てのT(n,m,k,l)は、計算された配列ｎおよびｍにおける断片に対応するペアa(i,j,n)およびａ（i',j',m）を生じる。
【００２７】
全てのa(i,j,n)は、エレメントA1として表され得、表は、ペアを用いて構築されうる。例えば、図１に示されるように、エレメントA1は、所望の融点でB1、B2、C1、D1、およびD2（全てのAエレメントは、同じｎ値を有し、各表に関して、全てのＡエレメントは同じ位置で開始するが、異なる長さである）にハイブリダイズする。さらに、B1は、所望されるようにC1、C2およびD2等にハイブリダイズする。エレメントAw、Bx、CyおよびDzの十分に連結したセットは、Bx、Cy、およびDzが全てAy下に存在し、CyおよびDzがBx下に存在し、ならびにDzがCy下に存在するように作製される。
【００２８】
この方法は、カラムA1で始まる各ブランチが完了に続くツリーアルゴリズムを使用することにより実施されうる。例えば、B1はC1に続き得、これはA1でも見出されうる。C1はD1に続き、これはA1で見出されるがB1では見出されない。B1で失われたエレメントは、このブランチに関して１のペナルティを生じる。調査対象の次のブランチは、A1〜B1〜C1〜D2に伸長し、これはA1およびB1において同様に見出される。エレメントにより表される断片がこの位置で配列セットに及びうるのでペナルティはない。任意の位置でエレメントのかかるセットが常には存在せず、その結果、各位置で最も低いペナルティを有するエレメント、および従って断片のセットはそのペナルティスコアとともに記録される。任意の数の「最良の」スプライスポイントが記録されうる。ゼロまたは単一でないペナルティセットが特定の配列位置について同定される場合、Aエレメントのみを失った潜在的セットを同定するため等に、特定化されたカットオフが達せられるまで、Bエレメントで開始する第２の表が構築されうる。ある態様では、基本セットのポリヌクレオチド配列中の目的の領域（例えば、相同性がポリメラーゼ連鎖反応（PCR）中のハイブリダイゼーションのために好都合である領域）にあるスプライスポイントが同定される上記のような予備工程がこのアルゴリズムに付加されうる。
【００２９】
アルゴリズムの第３の態様としては、下記に詳細に説明されるキメラオリゴヌクレオチドを調製するために、帰納的アルゴリズムが、オリゴヌクレオチドの基本セットにおけるオーバーラッピングオリゴヌクレオチドセットの同定に使用されうる。このアルゴリズムは、上記予備工程において、カットオフ基準として特定の領域において正確なマッチの数を用いて、アラインメントにおける好ましい領域を同定することにより開始する。これらの領域内の「天然の」セットは、Tm計算から同定され、他の配列が、Tlowが天然セットのコンセンサス配列に達するまで、追加対象の各配列の増分調節により天然のセットに追加される。例えば、１つの配列が、各スプライスポイントでのマスター配列として割りあてられる；これは任意の割当て、またはセットの他のメンバーとの最良の局所オーバーラップを有する配列を選択することにより、なされうる。低いアニーリング温度を有する配列は、ミスマッチコドンをマスター配列からのコドンに連続的に置換することによりアニーリングされうる。この最小アプローチは、スプライスポイントの最大の多様性を保つ；極端な場合、スプライスポイントでの完全な置換は、以前には無関連のオリゴヌクレオチド間でアニーリングさせるために使用されうる。このアルゴリズムは、互いに低い相同性を有するポリヌクレオチドの基本セットにとりわけ有用である。なぜなら、それは、本来の遺伝子配列がポリメラーゼ連鎖反応(PCR)のための好ましいオーバーラップを産生するために改変されているオーバーラップオリゴのセットの構築物において役にたつからである。これらの方法により調製されたキメラポリヌクレオチドは、ランダムな切断または制限により産生されたものより非常に高い多様性を有する。なぜなら、基本セットのポリヌクレオチド間のオーバーラップが最適化されるからである。
【００３０】
いったんスプライスポイントが同定されると、キメラポリヌクレオチドは、下記に挙げる種々の方法を用いて作製されうる。スプライスポイントを同定するための代表的なアルゴリズムが記載される。一定の態様において、コンビナトリアル合成、または二重プライマーを用いるポリメラーゼ連鎖反応に基づく合成が、使用されうる。
【００３１】
キメラポリヌクレオチドの調製；スプライスポイント選択
本発明の１つの態様において、上記配列アラインメントA(i,j)は、キメラ形成のための基本セットとしての相同なポリヌクレオチドのセットを使用する。最も基本のバリアントにおいて、所望のスプライスポイントの数が特定され、スプライスポイントが、置換なしで繰り返しランダム選択により選ばれる。基本選択機構は、アミノ酸スペースにおける位置を与え、その後３をかけ、コドン境界でのヌクレオチドスペースに変換するためのランダム数ジェネレーター(generator)の使用である。アラインメントA(i,j)、式中、iは指定配列(sequencedesignator)であり、jは使用される位置である。各ベクター成分Pre(i,j)（j＝1,M(1)−1）Iベクターが、ストリング(string)A(i,j)（j＝M(1),M(2)−1）の追加により形成されるように、順序づけられたスプライスポイントのセットM(h)に関して、コンビナトリアル連鎖によりキメラ配列が作製される。入手可能な成分の全てが、各スプライスに存在するベクターの全てと連結される。例えば、IストリングPre(i,j)を用いて開始し、10配列のセットは10プレ成分を有し、最初のスプライス後100キメラなど、5スプライス後106ベクターを形成する。スプライスポイントは、PCRプライミングを可能にするように一般的に十分な長さ離れるように（例えば、少なくとも12〜20bp）束縛されうる；これは、特定の基準を満たすランダム選択を放棄することによりなされうる。代替的には、これよりも近いスプライスポイントが、十分にスペースが開いたスプライスより異なった処理ではあるが可能とされうる。
【００３２】
コンビナトリアル合成によるキメラポリヌクレオチドの調製
本発明の別の態様において、ポリヌクレオチドキメラの作製は、コンビナトリアル合成により行われうる。コンビナトリアル合成法のための代表的なアルゴリズムにおいて、オリゴヌクレオチドの同定は、アラインメントA(i,j)で開始し、ランダム数ジェネレーターがスプライスポイント選択の便利な方法である。コンビナトリアル合成のために、オリゴヌクレオチドは、異なるポリヌクレオチドにおける配列領域を接続する二重末端プライマーとは対照的に、オーバーラップを持たない（下記のように）。コンビナトリアル合成のためのアルゴリズムは、スプライスポイント間の各断片においてヌクレオチド配列を特定することのみを必要とする。１つの末端での開始は、i個のポリヌクレオチドのセットは、開始から最初のオリゴヌクレオチドの領域の間の領域に対してi個の断片、最初のスプライスポイントと２番目の間の領域に対するi個より多くを与える。固定化合成ストラテジーが使用される場合（下記のような）、リンカーがフラグメントのセットの3'または5'のいずれかに対して記載される。代表的なアルゴリズムを図２に示す。
【００３３】
上記方法を用いて、キメラポリヌクレオチドに対する構築ブロックとして使用をするためにスプライスポイントの間の所望の数の断片(「M」)が産生されるように、スプライスポイントのセットが、ポリヌクレオチドの基本セット中で定義される。M断片が、基本セットにおける各ポリヌクレオチドに対して連続的に番号をつけられる（例えば、5'から3'まで連続的に）。したがって、基本セット中の各ポリヌクレオチドは、同じ数を有する各ポリヌクレオチドにおける断片である「対応する断片」を有する。好ましい態様において、合成ポリヌクレオチドを含む基本セットに対するコンビナトリアル合成が使用される；他の好ましい態様において、遺伝子断片（すなわち、全体の遺伝子よりも少ない）を含むポリヌクレオチドを含む基本セットに対するコンビナトリアル合成が使用される。
【００３４】
断片数Mを有するN個のポリヌクレオチドを含む基本セットに対して、非オーバーラッピングオリゴヌクレオチドがM個の断片の各々に対して調製される。本明細書で使用される場合、「オリゴヌクレオチド」は、ヌクレオチドの鎖のことを言い、長さは一般的に短い（例えば、40ヌクレオチド未満、好ましくは30ヌクレオチド未満、さらにより好ましくは20ヌクレオチド未満）。各個々のオリゴヌクレオチドは、選択された断片にハイブリダイズする核酸を含有する。オリゴヌクレオチドは、非オーバーラッピングセットを形成する：すなわち、目的のポリヌクレオチドの任意の１つ内にある同じ領域にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドはない。これらのオリゴヌクレオチドは、オーバーラップがなく、アニーリングしないので、プライマーではない。しかしながら、代わりに組合せにより合わされる（例えば、本明細書に記載されるような順次リガーゼ反応による）。
【００３５】
キメラポリヌクレオチドのコンビナトリアル合成を行うために、基本セットにおけるNポリヌクレオチドの各々についてのM断片の段階的増幅および正しい順序の連結（接続）が行われる。ある態様において、オリゴヌクレオチドがロケーションにより、段階的に（一度に１つずつ）連結される（ライゲートされる）。別の態様において、オリゴヌクレオチドは、ロケーションによりペア様で連結される。断片は、それらが各ポリヌクレオチドにおける断片の位置数Mに対応する順序で結合される場合、「正しい順序」である。（例えば、第１断片は第２断片に続き、第５断片は第６断片に続く）。正しく順序づけられた対（例えば、M2M1よりもむしろM1M2）を選択するために、PCRによる増幅が使用されうる；代替的には、正しく順序づけられた対はまた、PCRを使用しないでブロック／非ブロックストラテジーにより選択されうる。N個のポリヌクレオチドの各々のM個の断片の２つの連続した断片（例えば、M1およびM2）に対応するオリゴヌクレオチドを混合し、ランダムにライゲートした。第１断片の5'末端にハイブリダイズするフォワードプライマー、および第２のM断片の3'末端にハイブリダイズするリバースプライマーを用いて正しく順序づけられたフラグメントのセット（例えば、M1およびM2のダイマー）の選択的増幅が行われうる。このプロセスは、断片の他のセットについて繰り返される（例えば、N-ポリペプチドの第３および第４断片、N-ポリペプチドの第５および第６断片）。断片のライゲーションにより作製された正しく順序づけられたセットのオリゴヌクレオチド（例えば、第１および第２断片のライゲーションにより形成される１、２ダイマー）は、オリゴヌクレオチドの続くセットのライゲーションにより作製された正しく順序づけられたセット（例えば、第３および第４断片のライゲーションにより形成される３、４ダイマー）と共に混合され、ランダムにライゲートされる。次に、正しく順序づけられたセット（例えば、M1、M2、M3およびM4のテトラマー）は、第１断片の5'末端に対するフォワードプライマー（例えばM1）、および最後の断片の3'末端に対するリバースプライマー（例えばM4）を用いて、PCRにより選択的に増幅されうる。代替的には、上記で示したように、ブロックおよび非ブロックストラテジーがPCRの代わりに用いられうる。
【００３６】
より大きなオーダーの組合せ（例えば、テトラマー（M1、M2、M3およびM4）、テトラマー（M5、M6、M7およびM8））が、混合され、ライゲートされる。正しく順序づけられたキメラポリヌクレオチドは、第１断片の5'末端に対するフォワードプライマー、および最後の断片の3'末端に対するリバースプライマーを用いて、PCRにより選択的に増幅される。結果として、Nポリヌクレオチドの各々に由来する断片を含有する多数の正しく順序づけされたキメラポリヌクレオチドが作製される。
【００３７】
キメラポリヌクレオチドＩの調製：二重プライマーを用いるポリメラーゼ連鎖反応(PCR)-ベース法
本発明の別の態様において、ポリヌクレオチドキメラの作製は、スプライスポイントに基づくオリゴヌレオチド「二重プライマー」調製により行われる。「プライマー」は、核酸分子の相補的な鎖に塩基特異的様式でハイブリダイズするオリゴヌクレオチドである。かかるプローブおよびプライマーとしては、Nielsenら、Science, 254,1497-1500(1991)に記載されるポリペプチド核酸が挙げられる。好ましい態様において、「プライマー」は、特に、限定されないが本明細書に記載のものを含む周知の方法（例えば、PCR、LCR）を用いて鋳型指向DNA合成の開始点として作用する一本鎖オリゴヌクレオチドのことを言う。二重プライマー法のための代表的なアルゴリズムにおいて、アルゴリズムの開始点は、前記したアラインメントA(i,j)である。プライマーを記載するために全てのキメラ産物の配列を与える必要性はなく、それができる非常に多数のキメラのために、そうすることがいつも所望されるわけではない。A(i,j)、i=1,I、j=1,Jに加えて、所望されるスプライス数Hおよび任意の偏向情報数は、アルゴリズムに含まれる。
【００３８】
図３に示されるように、二重プライマーセット中の各二重プライマーは、２つの領域（「プレ」および「ポスト」領域）を含有する：基本セット中のポリヌクレオチドに対するオリゴヌクレオチドプライマー領域（「プレ」領域）は、基本セット中の別のポリヌクレオチドに対するスプライスポイントの相補性に対するオリゴヌクレオチドプライマー領域（「ポスト」領域）により接続され、直ちに続く。各スプライスポイントM(h)での二重プライマーは、プレおよびポストサブ配列のコンビナトリアル連鎖により形成される。より良好なマッチは、その相補性を有するプレおよびポストの各々に対するTmを計算することにより得られ得、、かつ各遺伝子に対する全体のプライマーのアニーリングに対して所望のTmに対して最も近い値が得られうるまで、段階的に長くするかまたは短くすることにより調整することができる。A(i,j)におけるギャップ特徴は、プレおよびポストがTm調整の前、長さにおいてM特徴であるようにスキップされうる。
【００３９】
この方法のバリエーションとしては、より一様なスペースのスプライスポイントを作製するためのまたは高いかもしくは低い相同性の領域に位置されることを確実にするための選択のバイアスを含む。スプライスポイントは、選択領域（例えば、ループ領域または逆に言えば保存された二次構造の領域）において集中されるかまたは他の領域にあることが妨げられ得、または１つの配列おける領域が、キメラの全ての必須成分として特定されうる。極端な場合において、ほとんどのキメラ配列は、やむをえず基本セット中の単一ポリヌクレオチドに由来され得、短いエレメントが基本セット中の他の（例えば、相同的な）ポリヌクレオチドから選択された位置において交換されうる。バイアシング(biasing)は、オーバーラップスプライスをチェックするレベルで行われうる。
【００４０】
オーバーラップスプライス領域は、除去され得、主な基本セット配列に対して設計されたサブ配列と基本セット中に存在しないキメラ領域との間のハイブリダイゼーションの可能性のために、代替的な処理が与えられうる。除去選択以外の最も経済的なアプローチは、前のオーバーラップスプライスの代替的な型としてオーバーラッププライマー領域を用いて新規スプライスを処理する；キメラ配列は、両方ではないが、スプライス2セットまたはスプライス2aセット由来のプライマーを含みうる。
【００４１】
上記方法を使用して、基本セットのポリヌクレオチド中のスプライスポイントのセットが規定される。各スプライスポイントに対して、オリゴヌクレオチド二重プライマーセットが作製されるので、二重プライマーのセットは、各スプライスポイントに対するプレおよびポスト領域の全ての可能性のある組合せを含有する二重プライマーを含む。基本セット中の各ポリヌクレオチドに対する単一のフォワードおよびリバースプライマー、および各スプライスポイントに対する二重プライマーのセットを使用して、十分なセットのキメラが、ポリメラーゼ連鎖反応法を使用して作製されうる。ポリメラーゼ連鎖反応法は、当該分野において周知である（例えば、米国特許第4,683,202号、同第4,683,195号、同第4,965,188号、同第4,683,202号を参照）。これらの特許の全体の教示は、参照により本明細書に取り込まれる。
【００４２】
キメラポリヌクレオチドの調製方法の改変
所望の場合、キメラポリヌクレオチドの合成の間の成分の付着に固相が使用されうる。固相は、マイクロタイタープレート、膜（例えばニトロセルロース）、ビーズ、計量棒、薄層クロマトグラフィープレート、ピン、チップまたは他の固体媒体などの固体媒体でありうる。第１断片(M1)の固相への5'部分の付着は、断片の連続的なライゲーションが行われうるためにキメラポリペプチドの正しく順序づけられたライブラリーのコンビナトリアル構築を可能にする。１つの態様において、上記コンビナトリアル法のために、リン酸化状態、化学的改変、または１つの断片の（少なくとも）１つの末端での固体支持体への付着により２つの断片間に１つの5'−3'結合のみが形成されうるストラテジーが使用されうる。例えば、M1断片が固体支持体の１つの末端に付着される場合、M1断片とM2断片とのコンビナトリアルライゲージョンは、正しく順序づけられたM1-M2対のみをもたらしうる。付着したM1−M2対へのM3断片の追加に続くライゲーションは、次にM1-M2-M3トリプレットのみを与える（以下同様）。
【００４３】
目的のキメラポリヌクレオチドを濃縮するための任意の「クリーニング」工程
所望の場合、上記方法によるキメラポリヌクレオチドの合成の間に「洗練」工程が取り込まれうる。「洗練」工程において、PCR産物のほどけた(loose)一本鎖末端が、エキソヌクレアーゼ消化を用いて（例えば低い酵素活性で）簡単に消化される。かかる消化は、ポリメラーゼおよびニック修復に対する多くの障害を除去し、プライマーセグメントの末端でミスマッチが生じた場合、有利でありうる。
【００４４】
あるいはまたはさらに、所望される場合、「ポイズン（poisoned）プライマー」の使用により、不必要なPCR中間体が、キメラポリヌクレオチドの合成の間に除去されうる。「ポイズンプライマー」は、PCRを支持し得ない中間体に高ストリンジェンシーでハイブリダイズし、それにより、実行可能なフォワードプライマーと実行可能なリバースプライマーとの間で伸長を妨げるプライマー（核酸）である。例えば、ハイブリダイゼーションを妨げるプライマーの3'末端の修飾（例えば、ポリA等の非相同性尾部の付加）が使用されうる。少数のポイズンプライマーは、PCRに利用可能なポリヌクレオチドのプールから多数の配列をしばしば除去しうる。
【００４５】
キメラポリヌクレオチドは、標準的な技術を用いて分離され、特徴づけられうる。例えば、ある態様では、MALDI-TOF質量分析が用いられうる。MALDI-TOF MSは、生物学的ポリマーを研究に未処理にし、本明細書中で作製されるキメラ分布を特徴付けるための正確な質量分解能を提供しうる（例えば、Ross,P.L.ら、Anal.Chem. 70(10):2067-73 (1998)）。
【００４６】
所望のポリヌクレオチドの産生および選択
次いで、キメラポリヌクレオチドが、標準的な技術を用いて発現されうる。例えば、キメラポリヌクレオチドは、発現用宿主細胞に導入されうる（例えば、Huse, W.D.ら、Science 246: 1275 (1989); Viera, J.ら、Meth.Enzymol. 153:3(1987)を参照）。キメラポリヌクレオチドは、例えば、大腸菌発現系において発現されうる（例えば、Pluckthun, A.およびSkerra, A.,Meth.Enzymol. 178:476-515 (1989); Skerra, A.ら、Biotechnology 9:23-278 (1991)を参照）。それらは、培地および／または細菌の細胞質における分泌のために発現されうる（例えば、Better,M.およびHorwitz, A., Meth.Enzymol. 178:476 (1989)参照）；あるいは、それらは酵母または哺乳動物細胞などの他の生物において発現されうる（例えば、ミエローマまたはハイブリドーマ細胞）。当業者は、多数の発現方法が、本明細書中に記載されるキメラポリヌクレオチドによりコードされるキメラポリペプチドを作製するために使用されうることを理解している。プロモーター、ターミネーター、ならびに転写および翻訳を促進するための他の適切な配列などのさらなる遺伝子エレメントにキメラポリヌクレオチドを融合させることにより、インビトロでの発現（リボソームディスプレイ）が達成されうる。同様に、ファージディスプレイ、細菌発現、バキュロウイルス感染昆虫細胞、真菌（酵母）、植物および哺乳動物細胞発現が得られうる。
【００４７】
目的のキメラポリペプチドの選択は、続いて所望の活性または機能を有するキメラポリペプチドを同定するためのアッセイを行うことにより実施されうる。キメラポリペプチドは、特定の特徴を有する特定のポリペプチドのための適切な手段によりスクリーニングされうる。例えば、触媒活性は、基質変換に関する適切なアッセイにより確認され得、結合活性は標準免疫アッセイおよび／またはアフィニティークロマトグラフィーにより評価されうる。これらの活性に関するアッセイは、細胞が増殖のために所望の活性を必要とするように設計されうる。例えば、毒性化合物を分解する能力等の特定の活性を有するポリペプチドに関するスクリーニングにおいて、栄養プレートへの毒性化合物の致死レベルの取り込みにより、毒性化合物を分解する活性を発現する細胞のみの増殖を可能にする（Wasserfallen, A., Rekik, M.,およびHarayama, S., Biotechnology 9:296-298(1991)）。キメラポリペプチドはまた、病原体を標的かまたは破壊する能力等の他の活性についてスクリーニングされうる。これらの活性に関するアッセイは、目的の病原体が、キメラポリペプチドに曝露されるように設計され得、所望の特性（例えば、病原体の死滅）を示すポリペプチドが選択されうる。
【００４８】
以下の実施例は、本発明の説明のために提供されるものであり、本発明の範囲を限定するように解釈されるべきものではない。全ての引用文献の教示は、本明細書中にその全体が援用される。
【実施例】
【００４９】
Ａ．材料および方法
本明細書中に記載される方法は、２つのシステム（小熱ショックタンパク質スーパーファミリーおよび酸化窒素合成における制御系）由来のキメラポリペプチドを評価するために使用される。
【００５０】
Ｎ末端領域が交換された、小熱ショックタンパク質スーパーファミリー内の以前の研究は、Ｎ末端凝集制御を示し、新規特性を有する分子シャペロンを産生した。sHSPスーパーファミリータンパク質内に４つの主要な領域がある；高レベル凝集（Ｎ）およびテトラマー形成／シャペロニン様活性（Ｃ）に関与するＮおよびＣ末端、通常のコアドメイン、およびダイマー形成に関与する伸長したβ６ループ。これらの領域は、基本遺伝子のセット由来のキメラのコンビナトリアル合成に使用されるスプライスポイントの選択で考慮されうる。
【００５１】
出発物質は、４つの小熱ショックタンパク質スーパーファミリー遺伝子（２つ(aAおよびaB結晶)は高度に相同性（同一またはほぼ同一の多くの領域を伴って＞80％）、一方、他の２つ（植物および細菌の配列）はPCRの目的のために低相同性であり、定方向進化の方法の存在により混合され得なかった）からなる遺伝子セットを含む。プライマーは、クローニングベクターおよび発現ベクターへの挿入のための伸長部分を有する４つの遺伝子の末端に対応する４つのフォワードプライマーおよび４つのリバースプライマー、ならびにキメラ産生のための各スプライスポイントでの12個の二重末端プライマーを含む。各プライマーは、Tmまたは65〜70℃でのスプライスポイントに隣接した領域での少なくとも２つの遺伝子へのアニーリングのために設計される。各スプライスポイントでのさらなる４つのプライマーは、遺伝子上のスプライスポイントに及ぶ。
【００５２】
２つの遺伝子および１つのスプライスポイントを用いて、ならびに４つの遺伝子および４つのスプライスポイントまでのより複雑な系において試験を行い、形成されたキメラセットの多様性および完全性を調査する。Techne Genius サーモサイクラーにおいてpfuターボポリメラーゼを用いてPCRを行う。２つのストラテジー（全ての遺伝子およびプライマーを用いて30サイクル、および経時的PCR）を比較する。経時的PCRは、フォワードプライマーおよび遺伝子のみを用いるいくらかの線形サイクルで開始する。最初のスプライスポイントプライマーの添加後、数サイクル（３〜５）のPCRを実行し、次のセットのプライマーを添加する。全ての所望スプライスが含まれるまでこの手順を繰り返し、リバースプライマーを添加し、数サイクルのPCRで合成を完了する。シミュレーションは、この方法がより分布した産物を作製することを示す。
【００５３】
キメラのセットを、電気泳動、制限分析、およびMALDI-TOF質量分析により評価する。最もシンプルな場合には、２つのキメラが、２つの基本セット遺伝子から作製される；遺伝子のいくつかが異なる長さの3'および5'末端伸長部分を有するので、これらは電気泳動で容易に検出可能である。中間の場合は、類似した長さのキメラ間を区別するための天然の制限部位を使用することにより評価されうる。４つの遺伝子および４つのスプライスポイントにより産生される集団は、ｎ（m+1）または1024個のキメラを含む。個々の成分は、質量分析により分布において特徴づけられうる。結果は、所望される場合、サンプルからキメラのサブセットを除去するための異なる制限酵素を使用することにより単純化されうる。
【００５４】
例えば、３つのスプライス部位とともに４つのsHSP遺伝子のセットを使用する実験は256個のキメラを作製する；このセットは、系統的であるのに十分に大きいが、全ての「首尾良い」（良好に発現された）キメラが、原則として、凝集サイズおよび活性について予備的進化に曝されうるのに十分に小さい。キメラ遺伝子のセットは、MALD-TOFによる評価のために十分に小さい。
【００５５】
上記の限定されたキメラセットを作製するためのスプライスポイントの合理的な選択に加えて、sHSPスーパーファミリーは、本明細書中に記載される方法を用いる広範な実験に使用される。sHSPスーパーファミリーは、遺伝子が小さく、潜在的基本セットが広範であり、潜在的選択基準（温度耐性、レポータータンパク質の安定性）が利用可能であるので、これのための良好な選択である。大腸菌発現系は、この研究のために最初に使用されるが、キメラ遺伝子がウイルス被覆成分との融合タンパク質として発現されるファージディスプレイ系もまた使用されうる（例えば、Swimmer,C.ら、PNAS USA 89(9):3750-60 (1992)）；これは、そのDNAに発現タンパク質を連結させる利点を有する。
【００５６】
本明細書中に記載されるアプローチは、酸化窒素合成酵素における制御エレメント、中枢神経系における分子シグナルとしての酸化窒素を産生する酵素のファミリー、および多くの他の生理学的に重要なシグナル伝達経路において調査するために使用される。NOSの配列内の制御に関する領域のセットは、sHSPに関して上記のものと類似した広範なデザインのキメラセットを作製するためにシャッフルされうる。さらに、ランダムキメラは、NOS遺伝子中の限定された領域から作製される；このアプローチは、非常に大きいNOS遺伝子全体からのキメラ作製よりも目的のキメラを多く作製する。キメラ領域は、全長NOS酵素に戻し連結され、新規タンパク質の所望のセットが作製される。変化した制御特性を有するように設計されたNOSキメラが既に作製されている；この領域は、長期遺伝子治療能力を有するシグナルジェネレーターを作製しうる。
【００５７】
本発明は、その好ましい態様に関して詳細に示され、記載されてきたが、当業者は、添付の特許請求の範囲により規定される本発明の意図および範囲から逸脱することなく形態および細部における種々の変化がなされうることを当業者は理解する。
【図面の簡単な説明】
【００５８】
【図１】図１は、k位で始まり、l塩基伸長するヌクレオチド断片のための、基本セットのポリヌクレオチドｎとｍとの融点Ｔ（n,m,k,l）のペア様式値を示す表を示す。各ペアは、エレメント（例えば、A1）として表される；所望の融点を有する各エレメント（例えば、A1）の、他のエレメント（例えば、B1、B2、C1、D1、およびD2）へのハイブリダイゼーションが測定されうる。
【図２】図２は、ポリヌクレオチドの基本セットのためのスプライスポイントをランダムに選択し、キメラポリヌクレオチドの調製のためのオリゴヌクレオチドを設計するためのシンプルなアルゴリズムのフローチャートである。
【図３】図３は、ポリヌクレオチドの基本セットのためのスプライスポイントをランダムに選択し、キメラポリヌクレオチドの調製のための二重末端プライマーを設計するためシンプルなアルゴリズムのフローチャートである。Mは、現在のスプライスポイントの位置である；h,jおよびlは、指名配列（sequence designator）である；jはアラインメント中の配列位置である；kはプライマー成分中の配列位置である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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